(57)【要約】  本発明は、ＩＬ−６のインヒビター、ＩＬ−６受容体のインヒビター、ＮＧＦのインヒビター、又はボツリヌス毒素化合物の群から選択されるさらなる有効成分と組み合わせたＦＧＦ−１８化合物の使用に関する。前記組成物は、変形性関節炎又は軟骨損傷などの軟骨疾患の治療に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のさらなる有効成分と組み合わせた、ＦＧＦ−１８化合物の使用であって、
前記少なくとも１種のさらなる有効成分が、ＩＬ−６のインヒビター、ＩＬ−６受容体のインヒビター、ＮＧＦのインヒビター、又はボツリヌス毒素化合物から成る群から選択される、使用。
【請求項２】
少なくとも２種の有効成分の組み合わせを含む組成物であって、
前記有効成分の１種がＦＧＦ−１８化合物であり、
前記少なくとも１種の他の有効成分が、ＩＬ−６のインヒビター、ＩＬ−６受容体のインヒビター、ＮＧＦのインヒビター、又はボツリヌス毒素化合物から成る群から選択される、組成物。
【請求項３】
軟骨障害の治療に使用するための、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が関節内に投与されるものである、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも１種のさらなる有効成分と組み合わせた、軟骨疾患の治療に使用するためのＦＧＦ−１８化合物であって、
前記少なくとも１種のさらなる有効成分が、ＩＬ−６のインヒビター、ＩＬ−６受容体のインヒビター、ＮＧＦのインヒビター、又はボツリヌス毒素化合物から成る群から選択される、ＦＧＦ−１８化合物。
【請求項６】
前記軟骨障害が変形性関節炎である、請求項３に記載の組成物、又は請求項５に記載の使用のためのＦＧＦ−１８化合物。
【請求項７】
前記軟骨障害が軟骨損傷である、請求項３に記載の組成物、又は請求項５に記載の使用のためのＦＧＦ−１８化合物。
【請求項８】
前記ＦＧＦ−１８化合物が、
ａ）配列番号１の残基２８〜２０７を含むヒトＦＧＦ−１８成熟型を含むか又はこれからなるポリペプチド、又は
ｂ）配列番号２を含むか又はこれからなるポリペプチド、
から成る群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用、組成物、又は使用のためのＦＧＦ−１８化合物。
【請求項９】
前記ボツリヌス毒素化合物がボツリヌス毒素Ａ型である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用、組成物、又は使用のためのＦＧＦ−１８化合物。
【請求項１０】
前記ＩＬ−６のインヒビターが、抗ＩＬ−６抗体又は抗ＩＬ−６ナノボディである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用、組成物、又は使用のためのＦＧＦ−１８化合物。
【請求項１１】
前記ＩＬ−６受容体のインヒビターが、抗ＩＬ−６受容体抗体又は抗ＩＬ−６受容体ナノボディである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用、組成物、又は使用のためのＦＧＦ−１８化合物。
【請求項１２】
前記ＮＧＦのインヒビターが、抗ＮＧＦ抗体又は抗ＮＧＦナノボディである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用、組成物、又は使用のためのＦＧＦ−１８化合物。
【請求項１３】
ＦＧＦ−１８化合物と、
少なくとも１種のさらなる有効成分と同時に又は連続して使用するための説明書と
を含むキットであって、
前記少なくとも１種のさらなる有効成分が、ＩＬ−６のインヒビター、ＩＬ−６受容体のインヒビター、ＮＧＦのインヒビター、又はボツリヌス毒素化合物から成る群から選択される、キット。
【請求項１４】
ＦＧＦ−１８化合物と、
少なくとも１種のさらなる有効成分と、
使用のための説明書と
を含むキットであって、
前記さらなる有効成分が、ＩＬ−６のインヒビター、ＩＬ−６受容体のインヒビター、ＮＧＦのインヒビター、又はボツリヌス毒素化合物から成る群から選択される、キット。
【請求項１５】
前記ＦＧＦ−１８化合物及び前記少なくとも１種のさらなる有効成分が医薬製剤の一部である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用、組成物、使用のためのＦＧＦ−１８化合物、又はキット。
【請求項１６】
前記ＦＧＦ−１８化合物及び前記少なくとも１種のさらなる有効成分が、同一の医薬製剤の一部であるか又は別の医薬製剤の各一部である、請求項１５に記載の使用、組成物、使用のためのＦＧＦ−１８化合物、又はキット。
【請求項１７】
前記医薬製剤が少なくとも１種の賦形剤をさらに含む、請求項１５又は１６のいずれか１項に記載の使用、組成物、使用のためのＦＧＦ−１８化合物、又はキット。
【請求項１８】
前記少なくとも１種の賦形剤が、緩衝剤、界面活性剤、塩、酸化防止剤、等張化剤、増量剤、安定剤、又はこれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項１７に記載の使用、組成物、使用のためのＦＧＦ−１８化合物、又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−６のインヒビター、ＩＬ−６受容体のインヒビター、ＮＧＦのインヒビター、又はボツリヌス毒素化合物からなる群から選択されるさらなる有効成分と組み合わせたＦＧＦ−１８化合物の使用に関する。前記組成物は、変形性関節炎又は軟骨損傷などの軟骨疾患の治療に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
軟骨は、マトリックス（堅いゲル状の基底物質）中に分散している軟骨細胞（間葉細胞に由来する細胞）で構成されている。軟骨マトリックスはこれらの細胞によって産生され、主にＩＩ型コラーゲン線維（Ｉ型コラーゲン線維も含む線維軟骨を除く）、プロテオグリカン、及びエラスチン線維を含む。軟骨は、特に関節、胸郭、耳、鼻、咽喉、気管、及び椎間板に見られる。軟骨には、ガラス状軟骨、弾性軟骨、及び線維軟骨の３つの主要なタイプがあり、その組織学的形態に応じて異なる機能特性を与えている。関節軟骨は、例えば骨の関節表面を覆う粘弾性を有するガラス状軟骨である。関節軟骨の主目的は、関節骨のほとんど摩擦のない運動を確実にするために滑らかな表面を提供することである。
【０００３】
軟骨障害は、身体の患部の炎症、痛み、硬直、及び動きの制限に現れる軟骨の変性／崩壊、及び結合組織の異常を特徴とする疾患を広く意味する。これらの障害は病理に起因する場合もあり、又は外傷若しくは傷害の結果の場合もある。成熟した軟骨細胞は、軟骨中には血管が存在せず栄養素の供給が限られているため、増殖の可能性がほとんどないため、成熟軟骨は自己修復能力が極めて限定されている。損傷又は疾患により引き起こされた軟骨特に関節軟骨の置換は医師にとって大きな挑戦であり、変形性関節炎的な変化がない若年患者では、利用可能な外科的処置は、予測できず、限られた期間しか有効でないと考えられている。従って患者の大部分は治療を求めていないか、又はできるだけ長期間治療を延期するように指導される。治療が必要な場合、標準的な処置は年齢に依存し、関節の全体的置換か若しくは部分的置換か、軟骨片若しくは軟骨細胞の移植か、又は骨髄刺激技術（微小破壊など）かなどと異なる。微小破壊は安価で一般的な処置であり、骨髄由来幹細胞による軟骨沈着を刺激するための軟骨下骨の貫通を含む。しかしながらこの技術は軟骨欠損を十分に修復できず、形成される新しい軟骨は主に線維軟骨であり、短命の修復組織となることが示されている。実際、線維軟骨は、ガラス状関節軟骨と同一の生体力学的特性を有さず、しばしば周囲の軟骨への適切な側方統合を欠いている。このため、新しく合成された線維軟骨は、容易に崩壊し得る（予想される時間枠：５〜１０年）。
【０００４】
変形性関節炎の患者では、これらの軟骨修復技術はすべて失敗に終わる。残りの非外科的治療は、特に物理療法、生活習慣の変更（例えば体重減少）、支持的装置、経口薬物（例えば非ステロイド性抗炎症薬）、及び薬物注射（例えばヒアルロン酸、及びコルチコイド）、及び栄養補助食品からなる。これらの治療法はすべてＯＡ（変形性関節炎）疾患の進行を止めることはできない。疼痛治療も失敗した場合、患者にとって残る選択肢は、関節置換や膝関節の高脛骨骨切除などの手術である。脛骨又は大腿骨切開（骨を切り取って関節の摩耗を再度バランスさせる）は症状を緩和することができ、活動的な生活習慣の維持を助けるが、関節置換の必要性を遅らせることがある。関節の全置換は進行性変形性関節炎の症状を緩和することができるが、一般的には患者の生活習慣及び／又は活動レベルの大きな変更を必要とする。
【０００５】
現在利用可能な薬物治療は、主に痛みの軽減に向けられている。現時点では、軟骨損傷を回復させる商業的に利用可能な治療法は無い（Lotz、2010参照）。
【０００６】
インターロイキン６（ＩＬ−６）、又はインターロイキン６受容体（ＩＬ−６Ｒ）は、変形性関節炎患者の疼痛を治療するための可能な標的である。これは、例えばマウスのＯＡモデルの関節炎の右膝にＩＬ−６抗体を注射したときに、後肢重量分布（すなわち無能力検査）が低下し、疼痛に対する抗ＩＬ−６抗体の効果が強調されていることが、国際公開第２００５０８０４２９号で実際に証明された。
【０００７】
ボツリヌス毒素Ａ型もまた、ＯＡに関連する疼痛に関して記載されている。疼痛調節におけるその役割を支持する証拠がますます増加している（Boon et al., 2010）。ヒトでのパイロット研究は、脊髄損傷に関連する疼痛を含むいくつかの異なる疼痛症状における有効性を示唆している。肩のＯＡ痛について、ＢｏＮＴ−Ａの関節内注射を用いるいくつかの予備的データが得られている（Singh et al., 2009）。
【０００８】
抗ＮＧＦ化合物は、ＯＡに関連する疼痛に関して記載されている別の範疇の化合物である。現在タネズマブ（Tanezumab）、ファシヌマブ（Fasinumab）、又はフルラヌマブ（Fulranumab）が、ＯＡ患者の疼痛を治療するために開発されており、これらは全て、第Ｉ相又は第ＩＩ相臨床試験の有望な結果（Sanga et al., 2013; Tiseo et al., 2014）に基づいて、関節炎及び／又は慢性疼痛について第ＩＩ相又は第ＩＩＩ相の臨床試験中である。
【０００９】
線維芽細胞増殖因子１８（ＦＧＦ−１８）は、ＦＧＦ−８、及びＦＧＦ−１７と密接に関連する繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのタンパク質のメンバーである。ＦＧＦ−１８は、軟骨細胞及び骨芽細胞の増殖物質であることが証明されている（Ellsworth et al.，2002; Shimoaka.，2002）。ＦＧＦ−１８は、単独（国際公開第２００８０２３０６３号）で又はヒアルロン酸と組み合わせて（国際公開第２００４０３２８４９号）、変形性関節炎及び軟骨損傷などの軟骨障害を治療するために提案されている。
【００１０】
ＦＧＦ−１８について種々の投与処方が提案されている。例えばMoore et al. (2005) は、３週間にわたる毎週２回の投与を開示し、国際公開第２００８０２３０６３号は、３週間にわたる毎週１回の投与を教示している。この後者の投与処方は、臨床試験中である。
【００１１】
国際公開第２００８０２３０６３号に記載されている投与処方は、関節軟骨の修復において良好な結果をもたらすが、軟骨障害の治療の有効性を維持しながら疼痛を低下させ／機能を改善する方法が必要とされている。実際、疼痛は多くの場合に軟骨障害に関連しているのみでなく、これらの疾患の臨床的検出のための主要な症状である。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の目的は、少なくとも１種のさらなる有効成分と組み合わせたＦＧＦ−１８化合物の使用を提供することであり、ここで前記少なくとも１種のさらなる有効成分は、ＩＬ−６のインヒビター、ＩＬ−６受容体のインヒビター、ＮＧＦのインヒビター、又はボツリヌス毒素化合物から成る群から選択される。前記さらなる有効成分と組み合わせたＦＧＦ−１８は、軟骨障害の治療に使用することができる。前記軟骨障害は、例えば変形性関節炎又は軟骨損傷である。
【００１３】
本発明はさらに、少なくとも２種の有効成分の組み合わせを含む組成物を提供し、ここで前記有効成分の１つはＦＧＦ−１８化合物であり、前記少なくとも１種の他の有効成分は、ＩＬ−６のインヒビター、ＩＬ−６受容体のインヒビター、ＮＧＦのインヒビター、又はボツリヌス毒素化合物から成る群から選択される。ある実施態様において、前記少なくとも２種の有効成分の組成物は、軟骨障害の治療に使用するためのものである。前記軟骨障害は、例えば変形性関節炎又は軟骨損傷である。
【００１４】
また、少なくとも１種のさらなる有効成分と組み合わせて軟骨疾患の治療に使用するためのＦＧＦ−１８化合物も包含され、ここで、前記少なくとも１種のさらなる有効成分は、ＩＬ−６のインヒビター、ＩＬ−６受容体のインヒビター、ＮＧＦのインヒビター、又はボツリヌス毒素化合物から成る群から選択される。前記軟骨障害は、例えば変形性関節炎又は軟骨損傷である。
【００１５】
さらに、ＦＧＦ−１８化合物と、少なくとも１種のさらなる有効成分との同時又は連続使用のための説明書とを含むキットが提供され、ここで、前記少なくとも１種のさらなる有効成分は、ＩＬ−６のインヒビター、ＩＬ−６受容体のインヒビター、ＮＧＦのインヒビター、又はボツリヌス毒素化合物から成る群から選択される。
【００１６】
また、ＦＧＦ−１８化合物と少なくとも１種のさらなる有効成分と、使用説明書とを含むキットが包含され、ここで前記さらなる有効成分は、ＩＬ−６のインヒビター、ＩＬ−６受容体のインヒビター、ＮＧＦのインヒビター、又はボツリヌス毒素化合物から成る群から選択される。
【００１７】
本発明全体において、前記ＦＧＦ−１８化合物と前記少なくとも１種のさらなる有効成分は、医薬製剤の一部であり得る。前記ＦＧＦ−１８化合物と前記少なくとも１種のさらなる有効成分は、同一の医薬製剤の一部であるか、又は別個の医薬製剤の各一部である。前記医薬製剤は、少なくとも１種の賦形剤をさらに含み得る。
【００１８】
定義
本明細書で使用される用語「ＦＧＦ−１８化合物」又は「ＦＧＦ−１８」は、ヒトＦＧＦ−１８タンパク質（すなわち、線維芽細胞増殖因子１８）の少なくとも１つの生物活性を維持するタンパク質を意図する。ＦＧＦ−１８は、天然型でも、成熟型でも、組換え型でも、又はその末端切断型でもよい。ヒトＦＧＦ−１８タンパク質の生物活性は、特に軟骨細胞又は骨芽細胞増殖の増加（国際公開第９８１６６４４号参照）又は軟骨形成の上昇（国際公開第２００８０２３０６３号参照）を含む。天然の又は野生型のヒトＦＧＦ−１８は、関節軟骨の軟骨細胞によって発現されるタンパク質である。ヒトＦＧＦ−１８は、最初はｚＦＧＦ−５と命名され、国際公開第９８１６６４４号で詳細に説明されている。配列番号１は、天然のヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸配列に対応し、アミノ酸残基１（Ｍｅｔ）〜２７（Ａｌａ）からなるシグナルペプチドを有する。ヒトＦＧＦ−１８の成熟型は、配列番号１（１８０アミノ酸）の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）までのアミノ酸配列に対応する。
【００１９】
本発明においてＦＧＦ−１８は、例えば国際公開第２００６０６３３６２号に教示されているような組換え法によって製造することができる。発現系及び発現条件に依存して、本発明のＦＧＦ−１８は、出発メチオニン（Ｍｅｔ）残基を有するか又は分泌のためのシグナル配列を有する組換え宿主細胞において、発現される。大腸菌などの原核宿主中で発現される場合、ＦＧＦ−１８は、その配列のＮ末端に追加のＭｅｔ残基を含む。例えばヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸配列は、大腸菌で発現された場合、配列番号１のＮ端（１位）のＭｅｔ残基で始まり、残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）に続く。
【００２０】
本明細書で使用されるＦＧＦ−１８の「末端切断型」という用語は、配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜１９６（Ｌｙｓ）を含むか又はこれからなるタンパク質を指す。好ましくはＦＧＦ−１８タンパク質の末端切断型は、「ｔｒＦＧＦ−１８」と呼ばれるポリペプチド（１７０アミノ酸；ｒｈＦＧＦ−１８又はスプリフェルミン（sprifermin）としても知られている）であり、これは、Ｍｅｔ残基（Ｎ末端中）で始まり、野生型ヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸残基２８（Ｇｌｕ）−１９６（Ｌｙｓ）が続く。ｔｒＦＧＦ−１８のアミノ酸配列を配列番号２に示す（配列番号２のアミノ酸残基２〜１７０は、配列番号１のアミノ酸残基２８〜１９６に対応する）。ｔｒＦＧＦ−１８は、大腸菌で産生されるヒトＦＧＦ−１８の組換え末端切断型である（国際公開第２００６０６３３６２号参照）。ｔｒＦＧＦ−１８は成熟ヒトＦＧＦ−１８と同様の活性を示すことが示されている。例えばこれは、軟骨細胞の増殖及び軟骨の沈着を増加させ、様々な軟骨組織の修復及び再構築をもたらす（国際公開第２００８０２３０６３号参照）。
【００２１】
本明細書で使用される「ＩＬ−６のインヒビター」という用語は、ＩＬ−６（すなわちインターロイキン６）の活性を部分的に又は完全に阻害することができる化合物を指す。本発明による好適な「ＩＬ−６のインヒビター」は、抗体、又はその断片、ならびにナノボディである。このような化合物は例えば、特に限定されないが、シルツキシマブ（siltuximab）（配列番号４〜５参照）又はＰＭＰ６Ｂ６（配列番号６参照）である。ダザキヌマブ（Dazakinumab）、クアザキズマブ（clazakizumab）、シルクマブ（Sirukumab）、オロキズマブ（Olokizumab）、又はＯＰ−Ｒ００３は、既知のＩＬ−６インヒビターの別の例である（具体的な配列は不明である）。
【００２２】
本明細書で使用される「ＩＬ−６受容体のインヒビター」という用語は、ＩＬ−６受容体（すなわちインターロイキン６受容体）の活性を部分的に又は完全に阻害することができる化合物を指す。本発明による好適な「ＩＬ−６受容体のインヒビター」は、抗体、又はその断片、ならびにナノボディである。このような化合物は例えば、特に限定されないが、トシリズマブ（tocilizumab）（配列番号７〜８参照）である。ＳＡ−２３７又はＡＬＸ−００６１は、既知のＩＬ−６受容体インヒビターの別の例である（具体的な配列は不明である）。
【００２３】
本明細書で使用される「ＮＧＦのインヒビター」という用語は、ＮＧＦ（すなわち神経成長因子）の活性を部分的に又は完全に阻害することができる化合物を指す。本発明による好適な「ＮＧＦのインヒビター」は、抗体、又はその断片、ならびにナノボディである。このような化合物は例えば、特に限定されないが、タネズマブ（Tanezumab）（配列番号９〜１０参照）、ファシヌマブ（Fasinumab）（配列番号１１〜１２参照）、フルラヌマブ（Fulranumab）（配列番号１３〜１４参照）である。ＡＮＡ−０２、ＡＢＴ−１１０、ＡＬＤ−９０６、又はＭＥＤＩ−５７８は、既知のＮＧＦ受容体インヒビターの別の例である（具体的な配列は不明である）。
【００２４】
本明細書で使用される用語「ボツリヌス毒素化合物」は、細菌であるボツリヌス菌（Clostridium botulinum）及び関連する菌種によって産生される神経毒性タンパク質を指す。本発明による好適な「ボツリヌス毒素化合物」は、ボツリヌス毒素Ａ型（ＢｏＮＴ−Ａ又はＢｏＮＴ／Ａとしても知られている；配列番号３参照）である。このような化合物は、例えば、アボボツリヌム（abobotulinum）毒素Ａ、オナボツリヌム（Onabotulinum）毒素Ａ、インコボツリヌム（incobotulinum）毒素Ａとして知られている化合物である。
【００２５】
用語「治療サイクル」又は「サイクル」は、ＦＧＦ−１８化合物が少なくとも１種のさらなる有効成分と組み合わされた期間に対応する。例えば１サイクルは、少なくとも１種のさらなる有効成分と組み合わせたＦＧＦ−１８化合物の週に１回の注射の、３回の注射からなることができる。このような「治療サイクル」を繰り返すことができる。例えば第２の「治療サイクル」は、その前のサイクルの最後の注射の３、４、５、又は６ヶ月後に行うことができる。あるいは、第２のサイクルは、第１のサイクルにおける最初の注射の１年後又は２年後に行うこともできる。
【００２６】
本明細書で使用される用語「軟骨障害」は、外傷性損傷などの損傷、軟骨障害、又は関節炎による傷害に起因する障害を包含する。本明細書に記載のＦＧＦ−１８製剤の投与によって治療可能な軟骨障害の例としては、特に限定されないが、関節炎、例えば変形性関節炎、及び軟骨損傷が挙げられる。例えば軟骨石灰化症、多発性軟骨炎、再発性多発軟骨炎、強直性脊椎炎、又は肋軟骨炎などの軟骨又は関節の変性疾患／障害もまた、この用語に包含される。国際軟骨修復協会（The International Cartilage Repair Society）は、軟骨欠損の重篤度を評価するための関節鏡検査のグレード分類システムを提案している：グレード０：（正常）健常な軟骨、グレード１：軟骨に軟らかい部位又は水疱がある、グレード２：軟骨に目に見える小さな裂け目がある、グレード３：病変は深い裂け目を有する（軟骨層の５０％以上）、グレード４：軟骨の裂け目から下層の（軟骨下）骨が露出している（ＩＣＲＳ出版：http://www.cartilage.org/_files/contentmanagement/ICRS_evaluation.pdf、１３ページを参照）。
【００２７】
本明細書で使用される用語「関節炎」は、変形性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、感染性関節炎、乾癬性関節炎、スティル病（若年性関節リウマチの発症）、又は離断性骨軟骨炎などの障害を包含する。好ましくは、これは、軟骨が損傷する疾患又は障害を含む。
【００２８】
「変形性関節炎（osteoarthritis）」という用語は、関節炎の最も一般的な形態を意図するために使用される。「変形性関節炎」という用語は、原発性変形性関節炎と続発性変形性関節炎の両方を包含する（例えば、The Merck Manual、第１７版、４４９頁参照）。変形性関節炎は、軟骨の破壊によって引き起こされることがある。軟骨の塊が壊れて、骨の間の関節に痛みや腫れが生じ得る。時間が経つと、軟骨は完全に磨耗し、骨が一緒に擦れる。変形性関節炎はいずれの関節にも影響を与え得るが、通常は手、肩、及び体重を支える関節、例えば腰、膝、足、脊柱に影響を与える。好適な例では、変形性関節炎は変形性膝関節症又は変形性股関節症であり得る。この用語は、特にＯＡＲＳＩ分類システムに従ってステージ１〜ステージ４又はグレード１〜グレード６に分類される変形性関節炎の形態を包含する。当業者は、当技術分野で使用される変形性関節炎の分類、特に前記ＯＡＲＳＩ評価システム（ＯＯＣＨＡＳとも呼ばれる；例えばCusters et al., 2007参照）を十分に認識している。変形性関節炎は、本発明によるＦＧＦ−１８化合物を投与することによって治療することができる好適な軟骨障害の１つである。
【００２９】
本明細書で使用される用語「軟骨損傷」は、特に外傷から生じる軟骨障害又は軟骨損傷である。軟骨損傷は、特に外傷性の機械的破壊後、特に事故又は外科手術（例えば、微小破壊手術）後に顕著に現れる可能性がある。この用語「軟骨損傷」はまた、軟骨骨折又は骨軟骨骨折、及び半月板損傷を含む。またこの定義の中では、関節の組織のスポーツ関連損傷又はスポーツ関連摩耗が考慮される。この用語はまた、微小損傷又は鈍的外傷、軟骨骨折、骨軟骨骨折、又は半月板損傷を含む。
【００３０】
発明の詳細な説明
驚くべきことに本発明の組成物及び使用は、少なくともスプリフェルミンの活性を維持することが見出された。事実、全体的に、１）本明細書に開示の組成物及び使用に従って投与されるとき、ＦＧＦ−１８化合物の効果は、ＩＬ−６のインヒビター、ＩＬ−６受容体のインヒビター、ＮＧＦのインヒビター、又はボツリヌス毒素化合物により影響を受けないこと、及び２）本明細書に開示の組成物及び使用に従って投与されるとき、ＦＧＦ−１８化合物は、ＩＬ−６のインヒビター、ＩＬ−６受容体のインヒビター、ＮＧＦのインヒビター、又はボツリヌス毒素化合物の作用に影響を与えないこと、が見いだされた。この知見は、組み合わせの各化合物の高分子量のために、予測されていなかった。また驚くべきことに前記活性は、各化合物について非常に低い用量でさえ維持される。全体としての組み合わせはそれぞれの活性を維持するだけでなく、さらに驚くべきことに、ＦＧＦ−１８の同化作用を増強することができる（例えば実施例１及び２参照）。本発明の別の利点は、少なくとも軟骨障害の治療のためのＦＧＦ−１８の有効性を維持しながら、疼痛を軽減し／機能を改善することを可能にすることである。
【００３１】
本発明は、少なくとも１種のさらなる有効成分（本明細書では、区別せずに別に「追加の有効成分」又は「他の有効成分」とも呼ぶ）と組み合わせたＦＧＦ−１８化合物の使用を提供し、ここで、前記少なくとも１種のさらなる有効成分は、ＩＬ−６のインヒビター、ＩＬ−６受容体のインヒビター、ＮＧＦのインヒビター、又はボツリヌス毒素化合物からなる群から選択される。
【００３２】
ある実施態様において、少なくとも１種のさらなる有効成分と組み合わせたＦＧＦ−１８は、軟骨障害の治療に使用するためのものである。前記軟骨障害は、例えば変形性関節炎又は軟骨損傷である。
【００３３】
さらなる具体的な実施態様において、少なくとも１種のさらなる有効成分と組み合わせたＦＧＦ−１８化合物は関節内に投与される。あるいはＦＧＦ−１８化合物を関節内に投与し、少なくとも１種のさらなる有効成分を静脈内又は皮下に投与する。
【００３４】
ＦＧＦ−１８化合物は、少なくとも１種のさらなる有効成分と同時に（同時投与）又は連続的に（任意の順序で）投与することができる。ＦＧＦ−１８化合物と少なくとも１種のさらなる有効成分が連続して投与される場合、連続投与は好ましくは医師への同一の訪問中に行われる。
【００３５】
また本発明には、少なくとも１種のさらなる有効成分と組み合わせた、軟骨疾患の治療に使用するためのＦＧＦ−１８化合物が包含され、ここで前記少なくとも１種のさらなる有効成分は、ＩＬ−６のインヒビター、ＩＬ−６受容体のインヒビター、ＮＧＦのインヒビター、又はボツリヌス毒素化合物から成る群から選択される。前記軟骨障害は、例えば変形性関節炎又は軟骨損傷である。さらなる有効成分と組み合わせたＦＧＦ−１８化合物は、好ましくは関節内に投与される。あるいはＦＧＦ−１８化合物が関節内に投与され、少なくともさらなる有効成分が静脈内又は皮下に投与される。
【００３６】
ＦＧＦ−１８化合物は少なくとも１種のさらなる有効成分と組み合わせて、同時に（同時投与）又は連続的に（任意の順序で）投与することができる。前記化合物が連続して投与される場合、連続投与は好ましくは医師への同一の訪問中に行われる。
【００３７】
本発明はさらに、少なくとも２種の有効成分の組み合わせを含む組成物を提供し、ここで前記有効成分の１種はＦＧＦ−１８化合物であり、前記少なくとも１種の他の有効成分は、ＩＬ−６のインヒビター、ＩＬ−６受容体のインヒビター、ＮＧＦのインヒビター、又はボツリヌス毒素化合物から成る群から選択される。
【００３８】
ある実施態様において、少なくとも２種の有効成分の組成物は、軟骨障害の治療に使用するためのものである。前記軟骨障害は、例えば変形性関節炎又は軟骨損傷である。
【００３９】
さらなる具体的な実施態様において、少なくとも２種の有効成分の組成物は、関節内に投与される。
【００４０】
本発明の文脈において、少なくとも２種の有効成分の組み合わせを含む組成物は、少なくとも１種の賦形剤をさらに含む。前記少なくとも１種の賦形剤は、例えば緩衝剤、界面活性剤、塩、酸化防止剤、等張化剤、充填剤、安定剤、又はこれらの任意の組み合わせである。
【００４１】
さらに、少なくとも１種のさらなる有効成分と組み合わせて、同時又は連続的使用（任意の順序で）のための説明書と共にＦＧＦ−１８化合物を含むキットが提供され、ここで少なくとも１種のさらなる有効成分は、ＩＬ−６のインヒビター、ＩＬ−６受容体のインヒビター、ＮＧＦのインヒビター、又はボツリヌス毒素化合物から成る群から選択される。ＦＧＦ−１８化合物と少なくとも１種のさらなる有効成分は、それぞれ別個の医薬製剤の一部でもよい。そのような場合、各医薬製剤は少なくとも１つの医薬的に許容し得る担体、賦形剤などをさらに含むことができる。
【００４２】
また、ＦＧＦ−１８化合物と少なくとも１種の他の有効成分を、使用説明書とともに含むキットも包含され、ここで前記少なくとも１種の他の有効成分は、ＩＬ−６のインヒビター、ＩＬ−６受容体のインヒビター、ＮＧＦのインヒビター、又はボツリヌス毒素化合物から成る群から選択される。ＦＧＦ−１８化合物と他の有効成分は、同一の医薬製剤の一部でも、又はそれぞれ別個の医薬製剤の一部でもよい。前記医薬製剤は、少なくとも１種の医薬的に許容し得る担体、賦形剤などをさらに含むことができる。
【００４３】
本発明のＦＧＦ−１８化合物は全体として、好ましくは、ａ）配列番号１の残基２８〜２０７を含むヒトＦＧＦ−１８成熟型を含むか又はこれからなるポリペプチド、又はｂ）ＦＧＦ−１８を含むか又はこれからなるポリペプチド（１７０ＡＡ）（配列番号２）、から成る群から選択される。特にこの化合物は、ヒト野生型成熟ＦＧＦ−１８又はｔｒＦＧＦ−１８から選択される。前記化合物は軟骨沈着を増加させ、軟骨修復を可能にする。ＦＧＦ−１８化合物は関節内に、好ましくは１回の投与当たり３〜６００マイクログラム（μｇ又はｍｃｇ）、好ましくは３〜３００μｇ、又は好ましくは１０〜２００μｇ、又はより好ましくは３０〜１５０μｇ、又はさらにより好ましくは３０〜１２０μｇの用量で投与される。好適な実施態様において治療は、ＦＧＦ−１８化合物の１回の関節内投与当たり、約３、１０、２０、３０、４０、５０、６０、９０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、２４０、又は３００μｇの用量の投与を含む。好適な用量は、ＦＧＦ−１８化合物の１回の関節内投与当たり１０、２０、３０、６０、９０、１２０、１８０、２４０、又は３００μｇの用量を含む。投与されるべきＦＧＦ−１８化合物の用量は、治療される患者がヒトであるか又は非ヒト哺乳動物であるかにより異なることは理解されるべきである。例えばイヌの場合、用量はヒトの場合よりも重要性が５倍小さいことが好ましい。例えばヒト用量が１回の関節内投与当たり３０μｇ〜１２０μｇの範囲である場合、イヌの用量は１回の関節内投与当たり５μｇ〜２０μｇの範囲であり得る。
【００４４】
本発明の全体の文脈においてＩＬ−６インヒビターは、好ましくはＩＬ−６に対する抗体（別名抗ＩＬ−６抗体）又はＩＬ−６を標的とするナノボディ（別名抗ＩＬ−６ナノボディ）である。このようなインヒビターの例は、定義の項に見いだされる。前記ＩＬ−６インヒビターは、１回の投与当たり０．００１〜１，０００ミリグラム（ｍｇ）、好ましくは０．１〜５００ｍｇ、より好ましくは０．２〜２５０ｍｇの用量で投与することができる。好適な実施態様において治療は、ＩＬ−６インヒビターの１回の投与当たり、約０．０１、０．０２、０．０３、０．１、０．２、０．３、０．５、１、１．５、２、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、又は３００ｍｇの用量の投与を含む。あるいは、所定の薬物の既知の投与処方を使用することができる。ＩＬ−６インヒビターの用量は、治療される患者がヒトであるか又は非ヒト哺乳動物であるかにより異なることは理解されるべきである。例えばイヌの場合、好ましくは、用量はヒトの場合よりも重要性が６倍小さい。例えばＩＬ−６インヒビターのヒト用量が１回の投与当たり２ｍｇである場合、イヌの用量は１回の投与当たり約０．３５ｍｇであり得る。医師は、症例毎に患者に応じて、ＩＬ−６インヒビターの投与処方を改変するであろう。
【００４５】
本発明の全体の文脈においてＩＬ−６受容体インヒビターは、好ましくはＩＬ−６受容体に対する抗体（別名抗ＩＬ−６Ｒ抗体）又はＩＬ−６受容体を標的とするナノボディ（別名抗ＩＬ−６Ｒナノボディ）である。このようなインヒビターの例は、定義の項に見いだされる。前記ＩＬ−６受容体インヒビターは、１回の投与当たり０．００１〜５００ミリグラム（ｍｇ）、好ましくは０．１〜２５０ｍｇ、より好ましくは０．５〜２００ｍｇの用量で投与することができる。好適な実施態様において治療は、ＩＬ−６Ｒインヒビターの１回の投与当たり、約０．０１、０．０３、０．１、０．２５、０．３、０．５、１、１．５、２、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、又は３００ｍｇの用量の投与を含む。あるいは、所定の薬物の既知の投与処方を使用することができる。例えばトシリズマブは、静脈内に投与される場合４ｍｇ／ｋｇの用量で、又は皮下投与される場合１６２ｍｇの用量で、関節リウマチの治療において認可されている。ＩＬ−６Ｒインヒビターの用量は、治療される患者がヒトであるか又は非ヒト哺乳動物であるかにより異なることは理解されるべきである。例えばイヌの場合、好ましくは、用量はヒトの場合よりも重要性が６倍小さい。例えばＩＬ−６Ｒインヒビターのヒト用量が１回の投与当たり１５０ｍｇである場合、イヌの用量は１回の投与当たり２５ｍｇであり得る。医師は、症例毎に患者に応じて、ＩＬ−６Ｒインヒビターの投与処方を改変するであろう。
【００４６】
本発明の全体の文脈において、ＮＧＦインヒビターは、好ましくはＮＧＦに対する抗体（別名抗ＮＧＦ抗体）又はＮＧＦを標的とするナノボディ（別名抗ＮＧＦナノボディ）である。このようなインヒビターの例は、定義の項に見いだされる。前記ＮＧＦインヒビターは、１回の投与当たり０．０１〜２５０ミリグラム（ｍｇ）、好ましくは０．１〜１００ｍｇ、より好ましくは０．５〜７５ｍｇの用量で投与することができる。好適な実施態様において治療は、ＮＧＦインヒビターの１回の投与当たり、約０．０３、０．１、０．２５、０．３、０．５、１、１．５、２、３、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は１５０ｍｇの用量の投与を含む。あるいは、所定の薬物の既知の投与処方を使用することができる。ＮＧＦインヒビターの用量は、治療される患者がヒトであるか又は非ヒト哺乳動物であるかにより異なることは理解されるべきである。例えばイヌの場合、好ましくは、用量はヒトの場合よりも重要性が６倍小さい。例えばＮＧＦインヒビターのヒト用量が１回の投与当たり１０ｍｇである場合、イヌの用量は１回の投与当たり１．５ｍｇであり得る。医師は、症例毎に患者に応じて、ＮＧＦインヒビターの投与処方を改変するであろう。
【００４７】
本発明の全体の文脈において、ボツリヌス毒素化合物、好ましくは、ボツリヌス毒素Ａ型（定義の項を参照）は、１回の投与当たり０．１〜１，０００単位（Ｕ）、好ましくは０．２〜５００Ｕ、より好ましくは０．５〜３００Ｕの用量で投与することができる。好適な実施態様において治療は、ボツリヌス毒素化合物の１回の投与当たり、約０．３、０．５、１、５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、又は３００Ｕの用量の投与を含む。あるいは、所定の薬物の既知の投与処方を使用することができる。ボツリヌス毒素化合物の用量は、治療される患者がヒトであるか又は非ヒト哺乳動物であるかにより異なることは理解されるべきである。例えばイヌの場合、好ましくは、用量はヒトの場合よりも重要性が６倍小さい。例えばボツリヌス毒素化合物のヒト用量が１回の投与当たり１００Ｕである場合、イヌの用量は１回の投与当たり約１５Ｕであり得る。医師は、症例毎に患者に応じて、ボツリヌス毒素化合物の投与処方を改変するであろう。
【００４８】
本発明の全体の文脈において、ＦＧＦ−１８化合物と少なくとも１種のさらなる有効成分は医薬製剤の一部である。ＦＧＦ−１８化合物及び／又は少なくとも１種の他の有効成分は医薬組成物として製剤化され、すなわち少なくとも１つの医薬的に許容し得る担体、賦形剤などと一緒に製剤化することができる。「医薬的に許容し得る」の定義は、前記有効成分の生物活性の有効性を妨害せずかつそれが投与される患者に対して毒性でない任意の担体、賦形剤などを包含することを意味する。少なくとも１種の賦形剤は、例えば緩衝剤、界面活性剤、塩、酸化防止剤、等張化剤、増量剤、安定剤又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。例えば非経口投与の場合、活性タンパク質は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン、及びリンゲル液などのビヒクル中の注射用の単位剤形で処方され得る。関節内適用のための製剤は、他の注射製剤にも当てはまるほとんどの要件、すなわち無菌であり、適用部位（例えば膝関節、滑液）の生理学的条件と適合する必要がある。関節内注射に使用される賦形剤は、例えば静脈内又は皮下適用のために、他の注射製剤中に存在してもよい。ＦＧＦ−１８化合物及び／又は少なくとも１種のさらなる有効成分（少なくとも１種のさらなる医薬的に許容し得る担体、賦形剤などを含む）のこのような製剤もまた、本発明の文脈において有用である。
【００４９】
本発明の全体の文脈において、少なくとも１種の他の有効成分と組み合わせたＦＧＦ−１８化合物は、変形性関節炎又は軟骨損傷などの軟骨障害を治療するのに有用であろう。特にこれは、例えば表面細動（早期の変形性関節炎）に起因する滑膜関節における関節軟骨欠損、変形性関節炎に起因する軟骨変性、及び損傷又は疾患による軟骨又は骨軟骨欠損を治療するために使用することができる。少なくとも１種のさらなる有効成分と組み合わせたＦＧＦ−１８化合物はまた、離断性骨軟骨炎によって引き起こされた関節疾患及び変性関節疾患を治療するために使用することができる。再建手術及び形成手術の分野では、少なくとも１種の他の有効成分と組み合わせたＦＧＦ−１８化合物は、広範囲の組織欠損の自己又は同種軟骨の拡張と再構築のための移動に有用であろう。ＦＧＦ−１８組成物は、関節の洗浄、骨髄の刺激、擦過関節形成術、軟骨下穿孔、又は軟骨下骨の微小骨折と組み合わせて、軟骨損傷を修復するために使用することができる。
【００５０】
好適な実施態様において、本発明に従って治療される軟骨障害は、変形性関節炎、例えば変形性膝関節炎又は変形性股関節炎である。治療される変形性関節炎は、例えば、特に限定されないが、原発性変形性関節炎又は続発性変形性関節炎、ならびにＯＡＲＳＩ分類システムに従うとステージ１〜ステージ４又はグレード１〜グレード６に分類される変形性関節炎であり得る。
【００５１】
別の好適な実施態様において、本発明により治療される軟骨障害は、微小骨折などの外科的介入のある及び外科的介入のない軟骨損傷である。さらに、少なくともさらなる有効成分と組み合わせたＦＧＦ−１８化合物の投与による軟骨の増殖後に、新たに形成された軟骨表面を適切に形作るために外科的処置が必要となり得る。
【００５２】
好適な実施態様において治療は、ＦＧＦ−１８化合物を単独で又は少なくとも１種の他の有効成分と一緒に、滑膜周囲投与、滑膜内投与、関節周囲投与、又は関節内投与することを含む。ＦＧＦ−１８化合物は単独で又は少なくとも１種の他の有効成分と一緒に、関節の滑液中への直接注射によって、又は欠陥部分へ直接に、単独で又はタンパク質の延長放出（例えば徐放性製剤）若しくは制限された局所放出のための適切な担体と複合体化して適用することができる。少なくとも１種の他の有効成分がＦＧＦ−１８化合物と同一の投与様式に従って投与されない場合、それは静脈内又は皮下に投与され得る。関節内投与は、股関節、膝、肘、手首、足首、脊椎、足、指、つま先、手、肩、肋骨、肩甲骨、大腿、脛部、かかとの関節から選択される関節で、及び脊椎の骨点（bony point）に沿って行われる。さらに別の好適な実施態様において、関節内投与は股関節又は膝関節において行われる。
【００５３】
軟骨障害の治療のために、少なくとも１種のさらなる有効成分と組み合わせたＦＧＦ−１８化合物は、少なくとも１回の治療サイクルの間投与することができる。治療サイクルは、例えば少なくとも１種のさらなる有効成分と組み合わせたＦＧＦ−１８化合物の１週間に１回の注射を３回行うことからなることができる。このような治療サイクルは繰り返すことができる。例えば、前のサイクルの最後の注射の３、４、５、又は６ヶ月後に、２回目の治療サイクルは実施することができる。あるいは２回目のサイクルは、第１のサイクルの最初の注射の１年後又は２年後に行うこともできる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ＢａＦ３／ＦＧＦＲ３細胞を、ＣＮＴＯ３２８又はＰＭＰ６Ｂ６とともにかつスプリフェルミン有り（四角）又はスプリフェルミン無し（丸）で４８時間培養した。ＣＴＲ＋は、スプリフェルミンのみで培養した細胞で得られたＯ．Ｄ．であり、ＣＴＲ−は、スプリフェルミン無しで培養した細胞で得られたＯ．Ｄ．である。ＣＮＴＯ３２８又はＰＭＰ６Ｂ６及びスプリフェルミン有りで培養した細胞をＣＴＲ＋と比較し、スプリフェルミン無しで培養した細胞をＣＴＲ−と比較した。記号は平均±ＳＥＭを表す。「＊」はｐ＜０．０５で「異なる」ことを意味する。
【図２】ＣＮＴＯ３２８又はＰＭＰ６Ｂ６の存在下でかつスプリフェルミンの存在下（四角）又は非存在下（丸）で、７日間培養したヒト軟骨細胞。細胞密度及びＧＡＧ産生を評価した。記号は平均±ＳＥＭを表す。「＊」は、同一のＣＮＴＯ３２８又はＰＭＰ６Ｂ６濃度（ただしＦＧＦ−１８無し）からｐ＜０．０５で「異なる」ことを意味する。「＃」は、ＣＮＴＯ３２８又はＰＭＰ６Ｂ６を含まない（０ｎｇ／ｍＬ）対照からｐ＜０．０５で「異なる」ことを意味する。
【図３】ＣＮＴＯ３２８又はＰＭＰ６Ｂ６の存在下でかつスプリフェルミンの存在下（四角）又は非存在下（丸）で、７日間培養したヒト軟骨細胞。コラーゲンＩ型、ＩＩ型、Ｓｏｘ９の発現を評価した。記号は平均±ＳＥＭを表す。「＊」は、同一のＣＮＴＯ３２８又はＰＭＰ６Ｂ６濃度（ただしＦＧＦ−１８無し）からｐ＜０．０５で「異なる」ことを意味する。「＃」は、ＣＮＴＯ３２８又はＰＭＰ６Ｂ６を含まない（０ｎｇ／ｍＬ）対照からｐ＜０．０５で「異なる」ことを意味する。
【図４】ＢａＦ３／ＦＧＦＲ３細胞を、アクテムラ（Actemra）とともにかつスプリフェルミン有り（四角）又はスプリフェルミン無し（丸）で４８時間培養した。ＣＴＲ＋は、スプリフェルミン  １００ｎｇ／ｍＬのみで培養した細胞で得られたＯ．Ｄ．であり、ＣＴＲ−は、スプリフェルミン無しで培養した細胞で得られたＯ．Ｄ．である。アクテムラ及びスプリフェルミンで培養した細胞をＣＴＲ＋と比較し、スプリフェルミン無しで培養した細胞をＣＴＲ−と比較した。記号は平均±ＳＥＭを表す。「＊」はｐ＜０．０５で「異なる」ことを意味する。
【図５】アクテムラの存在下でかつスプリフェルミンの存在下（四角）又はスプリフェルミンの非存在下（丸）で、７日間培養したヒト軟骨細胞。細胞密度及びＧＡＧ産生を評価した。記号は平均±ＳＥＭを表す。「＊」は、同一のアクテムラ濃度（ただしＦＧＦ−１８無し）からｐ＜０．０５で「異なる」ことを意味する。「＃」は、アクテムラを含まない（０ｎｇ／ｍＬ）対照からｐ＜０．０５で「異なる」ことを意味する。
【図６】アクテムラの存在下でかつスプリフェルミンの存在下（四角）又は非存在下（丸）で、７日間培養したヒト軟骨細胞。コラーゲンＩ型、ＩＩ型、Ｓｏｘ９の発現を評価した。記号は平均±ＳＥＭを表す。「＊」は、同一のアクテムラ濃度（ただしＦＧＦ−１８無し）からｐ＜０．０５で「異なる」ことを意味する。「＃」は、アクテムラを含まない（０ｎｇ／ｍＬ）対照からｐ＜０．０５で「異なる」ことを意味する。
【図７】ＢａＦ３／ＦＧＦＲ３細胞を、タネズマブ（Tanezumab）とともにかつスプリフェルミン有り（四角）又はスプリフェルミン無し（丸）で４８時間培養した。ＣＴＲ＋は、スプリフェルミン  １００ｎｇ／ｍＬのみで培養した細胞で得られたＯ．Ｄ．である。タネズマブ及びスプリフェルミンで培養した細胞をＣＴＲ＋と比較した。記号は平均±ＳＥＭを表す。「＊」はｐ＜０．０５で「異なる」ことを意味する。
【図８】ＢａＦ３／ＦＧＦＲ３細胞を、キセオミン（Xeomin）（登録商標）とともにかつスプリフェルミン有り（四角）又はスプリフェルミン無し（丸）で４８時間培養した。ＣＴＲ＋は、スプリフェルミンのみで培養した細胞で得られたＯ．Ｄ．であるり、ＣＴＲ−は、いかなる化合物も無しで培養した細胞で得られたＯ．Ｄ．である。キセオミン（登録商標）及びスプリフェルミンで培養した細胞をＣＴＲ＋と比較し、スプリフェルミン無しで培養した細胞をＣＴＲ−と比較した。「＊」はｐ＜０．０１で「異なる」ことを意味する。
【図９】キセオミン（登録商標）の存在下でかつスプリフェルミンの存在下（四角）又は非存在下（丸）で、７日間培養したウシ軟骨細胞。細胞密度及びＧＡＧ産生を評価した。キセオミン（登録商標）で培養した細胞を、それぞれの対照（０ｍＵ／ｍＬキセオミン、スプリフェルミン有り又は無し）と比較した。記号は平均±ＳＥＭを表す。「＊」はｐ＜０．０１で「異なる」ことを意味する。
【図１０】キセオミン（登録商標）の存在下でかつスプリフェルミンの存在下（四角）又は非存在下（丸）で、７日間培養したウシ軟骨細胞。コラーゲンＩ型、ＩＩ型、Ｓｏｘ９型、及びアグリカンの発現を評価した．キセオミン（登録商標）で培養した細胞を、それぞれの対照（０ｍＵ／ｍＬキセオミン、スプリフェルミン有り又は無し）と比較した。記号は平均±ＳＥＭを表す。「＊」はｐ＜０．０１で異なることを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
配列の説明：
配列番号１：天然ヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸配列。
配列番号２：組換え末端切断型ＦＧＦ−１８（ｔｒＦＧＦ−１８）のアミノ酸配列。
配列番号３：ボツリヌス神経毒Ａ型（キセオミン（登録商標））のアミノ酸配列。
配列番号４：ＣＮＴＯ３２８（シルツキシマブ）の重鎖のアミノ酸配列。
配列番号５：ＣＮＴＯ３２８（シルツキシマブ）の軽鎖のアミノ酸配列。
配列番号６：ＰＭＰ６Ｂ６のアミノ酸配列。
配列番号７：トシリズマブ（アクテムラ（登録商標））の重鎖のアミノ酸配列。
配列番号８：トシリズマブ（アクテムラ（登録商標））の軽鎖のアミノ酸配列。
配列番号９：タネズマブの重鎖のアミノ酸配列。
配列番号１０：タネズマブの軽鎖のアミノ酸配列。
配列番号１１：ファシヌマブの重鎖のアミノ酸配列。
配列番号１２：ファシナマブの軽鎖のアミノ酸配列。
配列番号１３：フルラヌマブの重鎖のアミノ酸配列。
配列番号１４：フルラヌマブの軽鎖のアミノ酸配列。
【実施例】
【００５６】
材料
ＦＧＦ−１８化合物：
本実施例の組換え末端切断型ＦＧＦ−１８（ｔｒＦＧＦ−１８）は、国際公開第２００６０６３３６２号に記載の技術に従って大腸菌（E. coli ）で発現させることにより調製した。以下の実施例において、ｔｒＦＧＦ−１８及びＦＧＦ−１８は互換的に使用される。これは、７ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．３中で調製された。
【００５７】
ボツリヌス毒素化合物：
本実施例のボツリヌス神経毒Ａ型は、キセオミン（登録商標）（Merz, Frankfurt, Germany）である。これは４、７ｍｇ／ｍＬのスクロース、１ｍｇ／ｍＬのＨＡＳ中で調製された。
【００５８】
ＩＬ−６インヒビター：
本実施例のＩＬ−６インヒビターは以下である：
−  ＣＮＴＯ３２８（シルツキシマブ（Siltuximab））は抗ＩＬ−６抗体である。これはＰＢＳで調製された。
−  ＰＭＰ６Ｂ６は、ＩＬ−６を標的とするナノボディである。これはＢＭＭ２で調製された。
【００５９】
ＩＬ−６受容体インヒビター：
本実施例のＩＬ−６受容体インヒビターは、トシリズマブ（アクテムラ（登録商標））である。
【００６０】
ＮＧＦインヒビター：
本実施例のＮＧＦインヒビターはタネズマブである。
【００６１】
実施例１
ＦＧＦ−１８とＩＬ−６のインヒビターとの組み合わせ
方法：
ＢａＦ３／ＦＧＦＲ３ｃバイオアッセイ：
アッセイを開始する前の日に、ＩＬ−３飢餓工程のために、１×１０7個の細胞を７５平方ｃｍフラスコ中のアッセイ培地２０ｍＬに、３７℃、５％ＣＯ2で２４時間接種した。アッセイの日に２０，０００細胞／ウェルを９６ウェルプレート中のアッセイ培地５０μＬに接種し、ここでアッセイ培地は、ＣＮＴＯ３２８を０．１、１、１０、１００、１，０００、及び１０，０００ｎｇ／ｍｌで、又はＰＭＰ６Ｂ６を０．００１、０．０１、０．１、１、１０、及び１００ｎｇ／ｍＬで含有し、スプリフェルミンを１００ｎｇ／ｍＬを含有したか又はしなかった。対照として、細胞に１００ｎｇ／ｍＬのスプリフェルミン単独（陽性対照、グラフ上のＣＴＲ＋）で、ＢＭＭ２  １／２２００とともに、又は化合物無し（両方とも陰性対照、グラフ上のＣＴＲ）で培養した。すべての条件はＮ＝６で行った。細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２日間培養し、代謝活性を、ＷＳＴ−１試薬（Roche）を用いて測定した。
【００６２】
初代ヒト軟骨細胞培養：
細胞を単離した後、１４００〜１８００万個のヒト軟骨細胞を７５ｃｍ2フラスコに接種し、完全ＨＡＭ  Ｆ１２で７〜１２日間培養した。次に細胞を、アキュターゼ（accutase）を用いて採取し、計測した後、異なる濃度のＣＮＴＯ３２８（１、１０、１００、１，０００／ｍＬ）又はＰＭＰ６Ｂ６（０．１、１、１０、及び１００ｎｇ／ｍＬ）を補足した完全ＨＡＭ  Ｆ１２の１ｍＬ中に、スプリフェルミン１００ｎｇ／ｍＬの存在下又は非存在下で、２４ウェルプレートに２００，０００細胞／ウェルで接種した。対照として、細胞はまた、スプリフェルミン１００ｎｇ／ｍＬ単独（陽性対照）、ＢＭＭ２  １／２２００とともに、又は化合物無し（両方とも陰性対照）で培養した。陰性対照の結果は、ＰＭＰ６Ｂ６及びＣＮＴＯ３２８濃度について０ｎｇ／ｍＬの値で示されている。全ての条件はＮ＝３で行った。細胞を３７℃、５％ＣＯ2で７日間培養し、３日後に完全な培地交換を行った。培養の最後に、細胞をアキュターゼ（Sigma-Aldrich）で分離し、細胞濃度をVicell（Beckman Coulter）で評価した。
【００６３】
培養７日後に採取した培地中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を、ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）アッセイを使用して定量した。５０μＬの試料を、９６ウェルプレート中の２００μＬのＤＭＭＢ試薬（エタノール中の１６ｍｇ／ｍＬのＤＭＭＢ、ギ酸、及びギ酸窒素）と混合した。５２５ｎｍでの吸光度を読み取り、コンドロイチン硫酸Ｃ標準物質（Sigma Aldrich）の吸光度と比較した。ＧＡＧ濃度（μｇ／ｍＬ）を細胞濃度（百万細胞／ｍＬ）で割ってＧＡＧ産生を（μｇ／百万細胞）で標準化した。
【００６４】
遺伝子発現を定量的ＰＣＲによって分析した。最初にRNeasy minikit（Qiagen）でＲＮＡを単離し、SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix（Sigma-Aldrich）でｃＤＮＡを合成した。次にｃＤＮＡをＲＮアーゼＨによって消化してＲＮＡを消化し、ｑＰＣＲにより、SYBRGREEN Jumpstart Taq Ready Mixを用いて、２００ｎＭの逆進プライマーと前進プライマーの存在下で、サーモサイクラーMX3000P（Agilent Technologies）中で分析した。
【００６５】
結果：
ＢａＦ／ＦＧＦＲ３細胞アッセイ（図１）：
スプリフェルミンの非存在下では、ＣＮＴＯ３２８又はＰＭＰ６Ｂ６の濃度を増加させても、細胞増殖に影響を与えず、Ｏ．Ｄ．は低いままであった。スプリフェルミンの存在下では、予測されたようにＢａＦ３／ＦＧＦＲ３細胞の増殖が増加し、光学密度（Ｏ．Ｄ．）が約０．１２（ＣＴＲ−）から約０．５（ＣＴＲ＋）に上昇した。スプリフェルミンの存在下では、ＣＮＴＯ３２８及びＰＭＰ６Ｂ６は明らかな傾向を示さなかった。Ｏ．Ｄ．のある程度の変動が観察されたが、これは、スプリフェルミン単独で観察されたＯ．Ｄ．の範囲内にとどまった。その結果ＣＮＴＯ３２８もＰＭＰ６Ｂ６も、ＢａＦ３／ＦＧＦＲ３細胞に対するスプリフェルミンの作用に負の影響を及ぼさなかったと結論することができる。
【００６６】
ヒト軟骨細胞  −  増殖及びＧＡＧ産生（図２）：
スプリフェルミンは軟骨細胞の増殖を増加させ、培養の最後には、より高い細胞濃度を与えた（スプリフェルミンの非存在下での約７０万細胞／ウェルと、スプリフェルミンの存在下での約９０万細胞／ウェル）。この作用は、ＣＮＴＯ３２８及びＰＭＰ６Ｂ６の存在下で維持された。同様に、スプリフェルミンの非存在下では、増殖に対する両方の抗ＩＬ−６の作用は観察されなかった。ＧＡＧ産生は、スプリフェルミンの連続的存在下で細胞を培養した場合、わずかに減少した。スプリフェルミンの存在下又は非存在下の両方において、ＣＮＴＯ３２８はＧＡＧ産生に影響を及ぼさないことが見出された。反対にＰＭＰ６Ｂ６は、スプリフェルミンの存在下及び非存在下の両方で、ＧＡＧ産生を用量依存的に増加させることが見出された。
【００６７】
ヒト軟骨細胞  −  遺伝子発現（図３）：
単層培養されたヒトＯＡ軟骨細胞において、スプリフェルミンはコラーゲンＩ発現をダウンレギュレートしたが（０．１２から０．０２５まで）、Ｓｏｘ９発現を増加させ（０．０００６０から０．００１８まで）、コラーゲンＩＩ発現には影響を与えなかった。
【００６８】
ＣＮＴＯ３２８及びＰＭＰ６Ｂ６は、いずれも用量依存的にコラーゲンＩＩ型の発現を増加させることが分かった。１，０００ｎｇ／ｍＬのＣＮＴＯ３２８を用いると、スプリフェルミンの非存在下ではコラーゲンＩＩ型の発現が２．５倍増加し、スプリフェルミンの存在下では驚くべきことに２．９倍増加した。１００ｎｇ／ｍＬのＰＭＰ６Ｂ６の存在下では、コラーゲンＩＩ発現は１．６倍増加し、より驚くべきことにスプリフェルミンの非存在下でも存在下でも、それぞれ及び２．６倍増加した。
【００６９】
同様に、ＣＮＴＯ３２８及びＰＭＰ６Ｂ６はＳｏｘ９発現を増加させたが、これはスプリフェルミンの存在下のみであった。この発現は、スプリフェルミンを用いて培養した軟骨細胞について、ＣＮＴＯ３２８（１００〜１，０００ｎｇ／ｍＬ）又はＰＭＰ６Ｂ６（１０〜１００ｎｇ／ｍＬ））の存在下で、驚くべきことにそれぞれ３．８５倍と２．５倍増加した。
【００７０】
コラーゲンＩの発現は、スプリフェルミン単独の場合と比較して、スプリフェルミンの存在下では、ＣＮＴＯ３２８及びＰＭＰ６Ｂ６によってほとんど変化しなかった。しかしスプリフェルミンの非存在下で、及びＣＮＴＯ３２８とＰＭＰ６Ｂ６の濃度を増加させると、コラーゲンＩの発現は減少した。
【００７１】
結論：
結論として、ＣＮＴＯ３２８及びＰＭＰ６Ｂ６などの抗ＩＬ−６抗体又はその断片はＦＧＦ−１８を妨害しない。ＩＬ−６のインヒビターも、特にＦＧＦ−１８と組み合わせた場合に、ヒトＯＡ軟骨細胞に対する明確な用量依存性の同化作用を示した。驚くべきことに、ＦＧＦ−１８とＩＬ−６インヒビターとの組み合わせは、軟骨形成及び軟骨細胞特異的遺伝子の発現に必要であることが知られているＳｏｘ９発現に相乗効果を有する。この驚くべき作用は、抗ＩＬ−６化合物による炎症環境の低下に起因する可能性があり、従ってＳｏｘ９発現に対するＦＧＦ−１８効果を増強する。全体としてＩＬ−６インヒビターは、ＦＧＦ−１８の同化作用を増加させることができる。
【００７２】
実施例２
ＦＧＦ−１８とＩＬ−６受容体のインヒビターとの組み合わせ
方法：
ＢａＦ３／ＦＧＦＲ３ｃバイオアッセイ：
実施例１に記載したものと同一の方法と同一の条件を使用した。アッセイの日に、２０，０００細胞／ウェルを、９６ウェルプレート中の、０．００１、０．０１、０．１、１、１０、又は１００μｇ／ｍＬのトシリズマブ（Rocheから）を含有し、１００ｎｇ／ｍＬのスプリフェルミンを含有するか又は含有しないアッセイ培地５０μＬに接種した。対照は、スプリフェルミン有り（ＣＴＲ＋）又はスプリフェルミン無し（ＣＴＲ−）で、トシリズマブ製剤の賦形剤（１５ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、５０ｍｇ／ｍＬスクロース、ｐＨ６．５、培地中で１／２００に希釈して最大のトシリズマブ濃度に相当させた）の存在下で含有した細胞で行った。すべての条件はＮ＝６で行った。細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２日間培養し、代謝活性を、ＷＳＴ−１試薬（Roche）を用いて測定した。
【００７３】
初代ヒト軟骨細胞培養：
実施例１に記載したものと同一の方法と同一の条件を使用した。次に細胞を、アキュターゼ（accutase）を用いて採取し、計測した後、異なる濃度のトシリズマブ（Roche）を補足した完全ＨＡＭ  Ｆ１２の１ｍＬ中に、スプリフェルミン１００ｎｇ／ｍＬの存在下又は非存在下で、２４ウェルプレートに２００，０００細胞／ウェルで接種した。対照（０ｎｇ／ｍＬのトシリズマブ）は、スプリフェルミン有り又は無しで、かつトシリズマブ製剤の賦形剤（上記参照）の存在下で行った。すべての条件はＮ＝６で行った。
【００７４】
実施例１と同様の分析方法を使用した（ＧＡＧ定量及び遺伝子発現分析のため）。
【００７５】
結果：
ＢａＦ／ＦＧＦＲ３細胞アッセイ（図４）：
トシリズマブは細胞増殖に対して何の作用も無く、スプリフェルミンを妨害しなかった。スプリフェルミンの非存在下では、トシリズマブの濃度増加は細胞増殖に影響を与えず、Ｏ．Ｄ．は低いままであった。スプリフェルミンの存在下では、ＢａＦ３／ＦＧＦＲ３細胞の増殖は増加し、Ｏ．Ｄ．は約０．１０（ＣＴＲ−）から約０．５（ＣＴＲ＋）まで増加した。スプリフェルミンの存在下では、トシリズマブは明らかな傾向を示さなかった。Ｏ．Ｄ．の小さな変動が観察されたが、スプリフェルミン単独で観察されたＯ．Ｄ．の範囲にとどまった。
【００７６】
ヒト軟骨細胞  −  増殖及びＧＡＧ産生（図５）：
予測されたように、スプリフェルミンは軟骨細胞の増殖を増加させ、培養の最後には、より高い細胞濃度を与えた（スプリフェルミンの非存在下での約７０万細胞／ウェルと、スプリフェルミンの存在下での約９０万細胞／ウェル）。この作用はトシリズマブの存在下で維持され、これは、スプリフェルミンの非存在下では、いずれの濃度であっても増殖に影響を及ぼさなかった。スプリフェルミンの連続的存在下で細胞を培養した場合、ＧＡＧ産生はわずかに減少した。トシリズマブは、ヒト軟骨細胞による用量依存的ＧＡＧ産生を増加させることが分かった。この作用は、スプリフェルミンの存在下でも又は非存在下でも観察することができる。
【００７７】
ヒト軟骨細胞  −  遺伝子発現（図６）：
予測されたように、スプリフェルミンはコラーゲンＩ発現をダウンレギュレートする。この作用はトシリズマブにより影響を受けなかった。興味深いことにスプリフェルミンの非存在下では、トシリズマブは１０μｇ／ｍＬ以上の濃度でのみコラーゲンＩ発現をダウンレギュレートした。スプリフェルミンによるＳｏｘ９の発現の増加も予測された。この作用は、１μｇ／ｍＬを超える濃度のトシリズマブにより低下したが、阻害はされなかった。最後にコラーゲンＩＩ型に対するトシリズマブの作用は不明であった。しかしトシリズマブの存在下では、スプライピン単独（０．００１４〜０．００３相対量）と比較して、１００μｇ／ｍＬでコラーゲンＩＩ発現の２．２倍の有意な増加が観察された。
【００７８】
結論：
トシリズマブはスプリフェルミンの生物活性を妨害しない。トシリズマブはスプリフェルミンの作用に負の影響を与えず、ヒト変形性関節炎の軟骨細胞にいくらかの正の作用を示した（これは、用量依存的にＧＡＧ産生を増加させ、コラーゲンＩ発現を低下させた）。さらに、これはスプリフェルミンの存在下で培養した軟骨細胞におけるコラーゲンＩＩ型発現を２倍増加させた。Ｓｏｘ９発現に対するＩＬ−６Ｒインヒビターの作用は不明であるが、全体としてＩＬ−６インヒビターは、ＦＧＦ−１８の同化作用を増加させることができるようである。
【００７９】
実施例３
ＦＧＦ−１８とＮＧＦのインヒビターとの組み合わせ
方法：
ＢａＦ３／ＦＧＦＲ３ｃバイオアッセイ：
実施例１に記載したものと同一の方法と条件を使用した。アッセイの日に、２０，０００細胞／ウェルを、９６ウェルプレート中の、０．０１、０．１、１、１０、１００、又は１０００ｎＭのタネズマブを含有し、１００ｎｇ／ｍＬのスプリフェルミンを含有するか又は含有しないアッセイ培地５０μＬに接種した。陽性対照（ＣＴＲ＋）は、タネズマブの非存在下で１００ｎｇ／ｍＬのスプリフェルミンで培養した細胞を用いて行った。すべての条件はＮ＝６で行った。細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２日間培養し、代謝活性を、ＷＳＴ−１試薬（Roche）を用いて測定した。
【００８０】
結果（図７）：
タネズマブは細胞増殖に影響を与えず、スプリフェルミンを妨害しなかった。スプリフェルミンの非存在下では、トシリズマブの濃度増加は細胞増殖に影響を与えず、Ｏ．Ｄ．は０のままであった。スプリフェルミンの存在下では、ＢａＦ３／ＦＧＦＲ３細胞の増殖は増加し、Ｏ．Ｄ．は約０（ＣＴＲ−）から約０．１５（ＣＴＲ＋）まで増加した。スプリフェルミンの存在下では、トシリズマブは明らかな傾向を示さなかった。Ｏ．Ｄ．の小さな変動が観察されたが、スプリフェルミン単独で観察されたＯ．Ｄ．の範囲にとどまった。
【００８１】
実施例４
ＦＧＦ−１８とボツリヌス毒素化合物との組み合わせ
方法：
ＢａＦ３／ＦＧＦＲ３ｃバイオアッセイ：
実施例１に記載したものと同一の方法と同一の条件を使用した。アッセイの日に、２０，０００細胞／ウェルを、９６ウェルプレート中の、０．０１、０．１、１、１０、又は１００ｍＵ／ｍＬのキセオミン（Xeomin）（登録商標）を含有し、１００ｎｇ／ｍＬのスプリフェルミンを含有するか又は含有しないアッセイ培地５０μＬに接種した。対照として、細胞をまたスプリフェルミン単独（陽性対照）で、又は化合物無し（陰性対照）で培養した。すべての条件はＮ＝３で行った。細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２日間培養し、代謝活性を、ＷＳＴ−１試薬（Roche）を用いて測定した。
【００８２】
初代ウシ軟骨細胞培養：
実施例１に記載したものと同一の方法と条件を使用した。次に細胞を、アキュターゼを用いて採取し、計測した後、異なる濃度のキセオミン（登録商標）（１、１０、１００、１，０００ｍＵ／ｍＬ）を補足した完全ＨＡＭ  Ｆ１２の１ｍＬ中に、スプリフェルミン１００ｎｇ／ｍＬの存在下又は非存在下で、２４ウェルプレートに１５，０００細胞／ウェルで接種した。対照として、細胞をスプリフェルミン１００ｎｇ／ｍＬ単独（陽性対照）で、又は化合物無し（陰性対照）で培養した。すべての条件はＮ＝４で行った。
実施例１と同様の分析方法を使用した（ＧＡＧ定量及び遺伝子発現分析について）。
【００８３】
結果：
ＢａＦ／ＦＧＦＲ３細胞アッセイ（図８）：
スプリフェルミンの非存在下では、０．０１〜１０Ｕ／ｍＬのキセオミン（登録商標）濃度の増加は細胞増殖に影響を及ぼさなかったが、最も高い試験濃度（１００Ｕ／ｍＬ）では、代謝活性細胞の数が有意に減少した。予測されたように、スプリフェルミンの存在下では、ＢａＦ３／ＦＧＦＲ３細胞の増殖が増加し、Ｏ．Ｄ．が０．０１１（ＣＴＲ−）から０．１９４（ＣＴＲ＋）まで増加した。スプリフェルミンの存在下で、同一の結果が観察された。この代謝活性の低下は、スプリフェルミンの存在下でも非存在下でも観察されるため、これはキセオミンの直接作用であり、スプリフェルミンの生物活性の調節の結果ではないと結論付けることができる。
【００８４】
ウシ軟骨細胞  −  増殖及びＧＡＧ産生（図９）：
予測されたように、スプリフェルミンは軟骨細胞増殖を増加させ、培養の最後には、より高い細胞濃度を与えた（スプリフェルミンの非存在下で７８万細胞／ウェル、スプリフェルミンの存在下で１０４万細胞／ウェル）。この作用は、１〜１，０００ｍＵ／ｍＬのキセオミン（登録商標）の存在下で維持された、同様に、スプリフェルミンの非存在下では、増殖に対するキセオミン（登録商標）の作用は観察されなかった。スプリフェルミンの連続的存在下で細胞を培養した場合、ＧＡＧ産生は９．６から７．２μｇ／１００万細胞まで減少した。スプリフェルミンの存在下でも非存在下でも、１〜１，０００ｍＵ／ｍＬのキセオミン（登録商標）は、ＧＡＧ産生に対する何の作用もないことが分かった。
【００８５】
ウシ軟骨細胞  −  遺伝子発現（図１０）：
予測されたように、連続的存在下のスプリフェルミンは、コラーゲンＩ発現をダウンレギュレート（０．９から０．０５まで）させ、Ｓｏｘ９発現（７．８×１０-5から５．１×１０-4まで）とアグリカン発現（０．１１から０．３まで）を増加させた。スプリフェルミンはまたコラーゲンＩＩ発現に小さな影響を与え、スプリフェルミンの存在下で０．０３１から０．０１８に低下させた。スプリフェルミンの存在下でも非存在下でも、１〜１，０００ｍＵ／ｍＬのキセオミン（登録商標）は、コラーゲンＩ、ＩＩ、Ｓｏｘ９、及びアグリカンの発現に影響を与えなかった。
【００８６】
結論：
結論として、驚くべきことに、ヒト関節に見いだされると予測される最大のキセオミン（登録商標）濃度（約１０Ｕ／ｍＬ）で、１）ＢａＦ３／ＦＧＦＲ３細胞、及び初代軟骨細胞（増殖、フェニル態様、及びマトリックス産生は影響を受けなかった）に対するキセオミン（登録商標）の負の作用は観察されず、及び２）スプリフェルミンの作用に対するキセオミン（登録商標）の妨害は観察されなかった。これは、ＦＧＦ−１８とＡ型のボツリヌス毒素の両方は同一の受容体（すなわちＦＧＦＲＩＩＩ）に結合するため、予想外であった。
【００８７】
参考文献
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15.   The Merck manual, 17th edition, 1999
16.   ICRS publication: http://www.cartilage.org/_files/contentmanagement/ICRS_evaluation.pdf, page 13
【図１】
2018528186.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018528186.tif 000013
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