(57)【要約】      （修正有）【課題】哺乳類の脂肪組織から細胞集団を濃縮するための装置を提供する。【解決手段】コンテナユニットへ脱離可能に接続された近位端および哺乳類の身体の少なくとも１つの空洞中へ挿入された遠位端を有し、コンテナ組立て体中へ脂肪組織を吸引するために使用する吸引チューブと、細胞懸濁液を得るためにコンテナ組立て体中で脂肪組織を機械的に破壊／破砕するために使用する機械的組織破壊装置であって、破壊が酵素を利用しない、機械的組織破壊装置と、コンテナ組立て体内で細胞の懸濁液を任意に洗浄するために使用する洗浄手段と、遠心分離機中へコンテナ組立て体を任意に移送しかつコンテナ組立て体を遠心分離してそれにより細胞ペレットを得るために使用する移送手段と、コンテナ組立て体内から細胞ペレットを抽出してそれにより濃縮された細胞集団を得るために使用する抽出手段と、を含む。【選択図】図１
0003218433.tif 000002
【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の脂肪組織から細胞集団を濃縮するための方法であって、
コンテナユニットへ脱離可能に接続された近位端および哺乳類の身体の少なくとも１つの空洞中へ挿入された遠位端を有する吸引チューブを用いてコンテナ組立て体中へ脂肪組織を吸引すること、
細胞懸濁液を得るために機械的組織破壊装置を用いて前記コンテナ組立て体中で脂肪組織を機械的に破壊／破砕することであって、破壊が酵素を利用しない、破壊／破砕すること、
前記コンテナ組立て体内で細胞の前記懸濁液を任意に洗浄すること、
遠心分離機中へ前記コンテナ組立て体を任意に移送しかつ前記コンテナ組立て体を遠心分離してそれにより細胞ペレットを得ること、
前記コンテナ組立て体内から前記細胞ペレットを抽出してそれにより濃縮された細胞集団を得ること
を含む、方法。
【請求項２】
前記機械的組織破壊装置は、少なくとも１つの回転可能なブレードまたはロータを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記機械的組織破壊装置は、破砕用の球またはビーズを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記機械的組織破壊装置は、電気式操作部へ脱離可能に接続される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記コンテナ中へ吸引された前記脂肪組織は、機械的破壊／破砕の前に洗浄される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
機械的破壊／破砕に続いて前記細胞ペレットは、相分離に続いて抽出される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
機械的破壊／破砕に続いて前記コンテナ組立て体は、遠心分離機へ移送されかつ遠心分離されてそれにより細胞ペレットを得る、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記機械的破壊／破砕は、洗浄溶液の添加なしで前記吸引脂肪組織溶液中で実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞の前記懸濁液は、機械的破壊／破砕に続いて洗浄される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞の前記懸濁液は、機械的破壊／破砕に続いて洗浄されず、および前記細胞ペレットは、相分離に続いて抽出される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記洗浄溶液は、収集された吸引脂肪組織の前記機械的破壊中に前記コンテナ中へ漏斗で注がれる、請求項１〜５、７および９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記洗浄溶液は、前記吸引脂肪組織が前記コンテナ中へ吹い込まれる前におよび次いで遠心分離の各ステップに続いて前記コンテナ中へ漏斗で注がれる、請求項１〜５、７および９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記洗浄溶液は、細胞特異的抗体、緩衝剤、糖ベースの密度勾配、非糖密度勾配、抗体仲介性磁性細胞選別溶液および非磁性抗体仲介性細胞選別溶液から選択される少なくとも１つの追加の試薬をさらに含有する、請求項１〜５、７および９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記濃縮された細胞集団は、特異的細胞集団を濃縮するためにさらに処理される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記濃縮された細胞集団は、間質細胞画分（ＳＶＦ）である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＳＶＦは、以下の、
約７〜約４０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）細胞および約６〜約３０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）細胞を有すること、ならびに／または
約４〜約１０パーセントの単球（＋）ＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートを有すること
の少なくとも１つにより特徴づけられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＳＶＦは、
約７〜約４０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）細胞および約６〜約３０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）細胞を有すること、ならびに
約４〜約１０パーセントの単球（＋）ＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートを有すること
により特徴づけられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＳＶＦは、約７〜約４０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）細胞および約６〜約３０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）細胞を有することにより特徴づけられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＳＶＦは、約４〜約１０パーセントの単球（＋）ＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートを有することにより特徴づけられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
脂肪を分離するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
以下の、
約７〜約４０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）細胞および約６〜約３０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）細胞を有すること、ならびに／または
約４〜約１０パーセントの単球（＋）ＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートを有すること
の少なくとも１つにより特徴づけられるＳＶＦ画分。
【請求項２２】
約７〜約４０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）細胞および約６〜約３０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）細胞；ならびに約４〜約１０パーセントの単球（＋）ＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートを有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
約７〜約４０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）細胞および約６〜約３０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）細胞を有する、請求項２１に記載のＳＶＦ画分。
【請求項２４】
約４〜約１０パーセントの単球（＋）ＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートを有する、請求項２１に記載のＳＶＦ画分。
【請求項２５】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法によって得られる、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のＳＶＦ画分。
【請求項２６】
医学における請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のＳＶＦ画分の使用。
【請求項２７】
創傷治癒における、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
組織再生のための方法における、請求項２６に記載の使用。
【請求項２９】
免疫調節の方法における、請求項２６に記載の使用。
【請求項３０】
前記濃縮された細胞集団を受容する、操作するおよび前記濃縮された細胞集団の分離を可能にするよう適合されたコンテナ組立て体、
電気式操作部の付着を可能にするよう構成された閉鎖キャップ、
前記電気式操作部へ脱離可能に接続されおよび前記コンテナの基部へ隣接するが前記コンテナの基部と接触をもたない前記コンテナ組立て体内に配置された機械的組織破壊装置、
前記コンテナ組立て体の前記閉鎖キャップにおける入口を通じて吸引チューブを介して前記コンテナ中への脂肪組織の脂肪吸引を作動させる真空ポンプ
を備える、装置。
【請求項３１】
前記機械的組織破壊装置は、少なくとも１つの回転可能なブレードまたはロータを備える、請求項３０に記載の装置。
【請求項３２】
前記機械的組織破壊装置は、破砕用の球またはビーズを備える、請求項３０に記載の装置。
【請求項３３】
圧力濾過によるＳＶＦ細胞の機械的分離のための装置であって、閉鎖位置および開放位置を有するシャッターによって分離可能な、２つの拡張可能なコンテナを備える、装置。
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本考案は概して、独特の構成の間質血管画分（ＳＶＦ）を分離するための非酵素的方法および当該方法を実施するための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪組織は、多重系列経路に沿って分化できる成体幹細胞の豊富なおよびアクセス可能な源を呈している。脂肪組織から得られる吸引脂肪組織は、組織工学および再生医学的適用に適する多能性特徴を有する種々のタイプの幹細胞／前駆細胞のアクセス可能なおよび豊富な源として機能することが立証されてきた［１］。
【０００３】
脂肪組織の酵素的消化は、吸引脂肪組織を処理するために最も普遍的に実施されてきた。例えば、脂肪由来幹細胞／前駆細胞の分離のための吸引脂肪組織の処理は既に、ラットの脂肪パッドを細かく刻むこと、混入している造血細胞を除去するために洗浄すること、および組織断片をコラゲナーゼとともにインキュベートしてペレット化した間質血管画分（ＳＶＦ）から成熟脂肪細胞の浮遊集団を分離すること、によって実施されてきた［２］。
【０００４】
脂肪吸引術の開発は、当該手順を簡素化した。脂肪吸引の間、外科医は麻酔薬および／またはエピネフリンを含有する塩類溶液を、カニューレを介して皮下組織に注入し、次に当該液および組織を両方とも吸引下で除去して細かく刻んだ組織断片を典型的に生じ、当該断片の大きさは、カニューレの寸法による［３］。
【０００５】
したがって、ヒト脂肪由来幹細胞／間質細胞は、生検および脂肪吸引標本から容易に分離でき［４］、接着性カラムの使用により、吸引脂肪組織の液体部分から得られ［５］、かつ非酵素的な機械的解離手順によってヒト吸引脂肪組織の試料から単離することもできる［６］。
【０００６】
吸引脂肪組織に及ぼす遠心分離の効果を定量的に研究して脂肪移植および脂肪由来幹細胞の分離のための遠心分離条件を最適化する一方で、Ｋｕｒｉｔａ  Ｍらは、脂肪移植における良好な短期的および長期的結果を得るための最適化された遠心力として１２００×ｇを示唆した［７］。
【０００７】
Ｓｈａｈ  Ａらは、ヒト脂肪組織由来間質幹細胞を分離するために脂肪組織を洗浄する非酵素的方法を説明した［８］。
【０００８】
近年、脂肪由来前駆細胞および／または幹細胞を吸引脂肪組織から分離するためのいくつかの機械装置が説明されてきた。
【０００９】
ＵＳ２０１２／２６４２１３［９］は、脂肪吸引の間に得られる流体からの、機械的に放出される脂肪由来前駆細胞および／または幹細胞の収集および処理を容易にする脂肪吸引抽出装置を開示している。
【００１０】
ＵＳ２０１３／０３４５２４［１０］は、機械的破壊と濾過遠心分離との組み合わせを用いて脂肪組織から臨床的に有用な新生細胞を抽出、分離および濃縮して高度に濃縮された幹細胞集団を得るための装置および方法を開示している。
【００１１】
Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＲＷ［１１］は、成体成熟脂肪細胞溶解を提供するために機械的乳化を受ける微小カニューレ吸引脂肪組織を用いること、小さな内腔針を通じて注入できる小粒子形態で組織間質血管画分（ｔＳＶＦ）を保存すること、における差異に関して報告した。
【００１２】
刊行物
［１］Ｇｉｍｌｅ  Ｊ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００７，１００：  １２４９〜１２６０、
［２］Ｒｏｄｂｅｌｌ  ＭおよびＪｏｎｅｓ  ＡＢ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９６６；  ２４１：  １４０〜１４２、
［３］Ｉｌｌｏｕｚ  ＹＧ，  Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ，１９８３；７２：  ５９１〜５９７、
［４］Ｄｕｂｏｉｓ  ＳＧら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２００８；４４９：６９〜７９、
［５］Ｋｅｎｔａｒｏ  Ｄｏｉｌら，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，第１６巻，第３号，２０１４，３８１〜３９１ページ、
［６］Ｂａｐｔｉｓｔａ  ＬＳら，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２００９；  １１（６）：  ７０６〜７１５、
［７］Ｋｕｒｉｔａ  Ｍら，Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ．２００８，１２１（３）：１０３３〜１０４１、
［８］Ｓｈａｈ  Ｓら，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，１５（８），２０１３，９７９〜９８５ページ
［９］ＵＳ２０１２／２６４２１３
［１０］ＵＳ２０１３／０３４５２４
［１１］Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＲＷ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｌｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１６；８：ｅ９４７〜ｅ９６０。
［１２］Ｌｖ，Ｆ．−Ｊ．ら，Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．２０１４；  ３２：１４０８〜１４１９。
【考案の概要】
【００１３】
一般的な説明
本明細書に開示される本考案は概して、脂肪吸引後の間質血管画分（ＳＶＦ）の分離のための装置および方法に関する。
【００１４】
より具体的には、本考案は、機械的破壊／解離の組み合わせを用いて脂肪組織から間質細胞画分を分離すること、洗浄すること、および間質血管画分の濃縮された集団を得るための遠心分離のための機械的方法に関する。当該機械的方法は、濃縮された細胞集団を受容、操作するのに、および当該細胞集団の分離を可能にするのに適した閉鎖型の単回使用の容器またはコンテナまたは装置において実施される。当該容器は、「コンテナ組立て体」（本明細書では「コンテナ」と相互交換可能）の形態であり、いくつかの実施形態において、凹状の基板、上部天井部分および容器が平らな表面上で補助なしで立つことのできる平らな下部基板を有する、円筒状側壁状の形態である。当該容器は、哺乳類動物の身体由来の脂肪細胞を収集するよう構成され、さらには、コンテナの底部で細胞ペレットの保持を促進する（例えば、コンテナの遠心分離後に）のに適合される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、当該コンテナ組立て体は、当該コンテナを密封するように作用する環状の（例えば、スナップオン式、スレッド状）閉鎖キャップ（ふた）を有する。当該閉鎖キャップは、複数の密封可能な入口を有し、含有されるユニット中へのチューブ／カニューレの挿入を可能にする。密封可能な入口は、特定の使用法（例えば、チューブを挿入して洗浄溶液を入れ、本計算書で説明される吸引チューブおよび真空ポンプ等を装着する）にしたがって、種々のチューブおよびカニューレの挿入を可能にするのに適している。
【００１６】
コンテナ組立て体の閉鎖キャップは、コンテナの凹状基板に隣接しているが当該基板と接触がないコンテナ組立て体内に配置される機械的組織破壊装置へ脱離可能に接続され得る（例えば、シャフト／スリーブによって）電気式操作部の装着を可能にするよう構成される。
【００１７】
「機械的組織破壊装置」は、破壊／脱離処理の間中、細胞生存率を維持する組織の破壊／脱離に適した何らかの装置（例えば、閉鎖されて含有される）であり得る。
【００１８】
いくつかの実施形態において、機械的組織破壊装置は、少なくとも１つの回転可能なブレードまたはロータを備える。
【００１９】
他の実施形態において、機械的組織破壊装置は、破砕用の球またはビーズ（例えば、０．５〜２ｍｍ径のガラスビーズまたはジルコニア／シリカビーズ）を備える。
【００２０】
本考案に従って、コンテナ組立て体の滅菌は、その中に配置される閉鎖キャップおよび／または入口の密封効果に影響しない。
【００２１】
「吸引チューブ」（本明細書においては「カニューレ」と相互交換可能）は概して、哺乳類の身体組織（例えば、脂肪層）からの細胞および／または組織の断片の抽出（例えば、吸込みを介して脂肪細胞が身体から吸引されることを可能にする、身体における脂肪除去の部位での小さな切開部を通じる挿入により）を包含する、脂肪吸引または何らかの他の医学的手順に通常使用されるカニューレを指す。典型的には、当該カニューレは、先端が鈍化しおよびその先端に少なくとも１つの開口部（孔）を有する中空のチューブを構成する。当該カニューレは、（その複数回使用を可能にするよう）再利用可能であり得、蒸気オートクレーブによってまたは当該技術分野で公知の何らかの他の標準的な滅菌法によって滅菌され得る。
【００２２】
カニューレの中空チューブは、コンテナ組立て体の閉鎖キャップにおける入口を通じてカニューレ中へとおよび直接的にコンテナ組立て体中へと、哺乳類の身体から吸い込まれた液体および脂肪組織成分（例えば、脂肪細胞、細かく刻んだ脂肪小球の断片、断裂した脂肪細胞）を含む混合物の通過を可能にするよう構成される。
【００２３】
本考案に従って、真空ポンプは、コンテナ（例えば、閉鎖キャップまたは側壁）へ装着されて、吸引チューブを介するコンテナ中への脂肪組織の脂肪吸引を作動させる。
【００２４】
いくつかの実施形態において、真空ポンプは、脂肪吸引ポンプ（例えば、本考案に従って使用できる、当該技術分野で公知の何らかの脂肪吸引外科的吸引ポンプ）である。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「脂肪組織」（本明細書では「脂肪細胞」と相互交換可能）という用語は概して、脂肪組織から分離できる、および間質細胞画分（ＳＶＦ）を分離するために使用できる、何らかのタイプの細胞および／または組織断片を指す。
【００２６】
本考案に従って、ＳＶＦは、吸引脂肪組織の脂肪部分および流体部分の両方に由来してよく、典型的には、異なる程度の成熟度および機能を有する複数の細胞集団からなる異種性混合物を含む。したがって、ＳＶＦは概して、前脂肪細胞、内皮細胞、周皮細胞、線維芽細胞および幹細胞性前駆細胞（ｓｔｅｍ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）とともに、造血細胞部分（例えば、顆粒球、単球およびリンパ球）から構成される。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本考案の方法において得られるＳＶＦは、以下の特長、すなわち、
ＳＶＦは、約４０〜約９１パーセントのＣＤ４５＋細胞を有するとして表現型で識別可能であり、
ＳＶＦは、約５〜約５０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）細胞および約３〜約４０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）細胞を有するとして表現型で識別可能であり、
ＳＶＦは、約７〜約４０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）細胞および約６〜約３０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）細胞を有するとして表現型で識別可能であり、
ＳＶＦは、約２〜約１５パーセントの単球（＋）およびＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートを有するとして表現型で識別可能であり、
ＳＶＦは、約４〜約１０パーセントの単球（＋）およびＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートを有するとして表現型で識別可能であり、
有核細胞のＳＶＦ収量は、本明細書で説明される洗浄のみの方法において得られるものよりも少なくとも３倍高く、
７〜１４日間の期間の細胞培養後の吸引脂肪組織１ｍｌ当たりの細胞量は、さらに後述するように、洗浄のみの方法において得られるものと比較して少なくとも１５倍高く、
ＳＶＦは、細胞の分化能によってならびにフローサイトメトリーにより識別されるような特異的な幹細胞マーカーおよび物理的特性によって測定されるように、洗浄のみの方法において得られるものと比較してより高いパーセントの間葉系前駆幹細胞を含有し、
ＳＶＦは、３３ゲージ〜７ゲージのゲージ数を有する非常に小さな針を介して注射可能である（例えば、哺乳類組織中へと）
のうちの少なくとも１つを特徴とする。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本考案の方法において得られるＳＶＦは、約７〜約４０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）細胞および約６〜約３０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）細胞を有することを、ならびに／または約４〜約１０パーセント単球（＋）ＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートを有することを特徴とする。
【００２９】
いくつかの実施形態において、ＳＶＦは、約５〜約５０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）細胞および約３〜約４０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）細胞を有するとして、表現型で識別可能である。いくつかの実施形態において、ＳＶＦは、約７〜約４０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）細胞および約６〜約３０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）細胞を有するとして、表現型で識別可能である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、ＳＶＦは、約２〜約１５パーセントの単球（＋）ＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートを有するとして表現型で識別可能である。いくつかの実施形態において、ＳＶＦは、約４〜約１０パーセントの単球（＋）ＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートを有するとして表現型で識別可能である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、吸引カニューレの直径は、約０．５ｍｍ〜約１０ｍｍである。
【００３２】
他の実施形態において、吸引カニューレの直径は、約２ｍｍ〜約６ｍｍ、または約３ｍｍ〜約５ｍｍである。
【００３３】
本考案のカニューレは、その遠位端で種々のタイプの先端を有して、脂肪細胞の収集のために脂肪層中への付着および挿入を最適化し得る。当業者が容易に理解するであろうように、カニューレの材料の最適な大きさ（例えば、直径、長さ）およびタイプは、患者の容態、脂肪吸引を実行する医師の具体的な必要条件、収集される脂肪細胞の意図される使用などと関係する種々のパラメータを基に定められる。
【００３４】
当業者が理解するであろうように、吸引（脂肪吸引）処理は、吸引チューブを通じての吸込みおよび通過中に影響される剪断力により、吸引される脂肪組織を部分的に破裂させ得る（例えば、脂肪小球へと）。したがって、含有されるものへと収集される脂肪細胞は、既に部分的に破裂されているかもしれない。一旦脂肪細胞をコンテナ組立て体の中に収集すると、収集された脂肪細胞の機械的破壊が、脂肪吸引中に吸引される流体（例えば、生理学的溶液中の吸引脂肪組織から主として構成されるが、リドカインおよびエピネフリンなどの局所麻酔性物質の残りも含有し得る）中で、または洗浄溶液中で、または外部にありおよびコンテナの閉鎖キャップへ脱離可能に接続された電気式操作部によって制御される機械的組織破壊装置を用いて何らかの添加された溶液から分離された分離吸引脂肪組織中でのいずれかで、実施される。機械的組織破壊装置（典型的には、回転力に影響する少なくとも１つのロータまたはブレードを備えている）は、コンテナの凹状底部へおよび当該凹状底部から低下されおよび牽引されるよう、ならびに適所へ（例えば、脂肪細胞の機械的破壊の間に）ロックされるよう構成される。
【００３５】
機械的組織破壊装置のロータ速度（１分間当たりの速度［ＲＰＭ］で測定される）は、例えば、均質な単一細胞懸濁液を作製すること、細胞の完全性を保存することならびに発泡およびタンパク質変性を防止することによって、身体の脂肪層から吸引される間質血管画分細胞の生存率を維持するのに適合される。
【００３６】
いくつかの実施形態において、ロータは、約５００ＲＰＭ〜約８，０００ＲＰＭで回転する。いくつかの実施形態において、ロータは、約１，０００〜６，０００ＲＰＭで回転する。いくつかの実施形態において、ロータは、約１，１００〜１，５００ＲＰＭで回転する。
【００３７】
本考案に従って利用される機械的破壊は、組織および細胞の収集および操作のいかなる段階においても酵素消化を必要としない。
【００３８】
いくつかの実施形態において、当該機械的破壊は、洗浄溶液の添加なしで、吸引脂肪組織溶液中で実施される。このような実施形態に従って、機械的破壊の完了の際に、機械的に破壊された吸引脂肪組織は、本明細書において説明されるとおり、少なくとも１回洗浄され得る。
【００３９】
他の実施形態において、収集された吸引脂肪組織の機械的破壊に先立って、吸引脂肪組織は、コンテナの閉鎖キャップにおける少なくとも１つの入り口を通じて移送される洗浄溶液（例えば、約４℃〜約３７℃の温度での塩類溶液または何らかの他の適切な生理学的溶液）を用いて広範に洗浄され（例えば、混入血液を除去するため）、ここで各洗浄ステップ後に、コンテナは、コンテナを受容するのに適した遠心分離装置へ移送され、上清およびコンテナの底部（凹状）部分における（例えば、柔らかな）細胞ペレットを形成するのに十分な力でおよび十分な時間遠心分離される。このような実施形態によると、機械的破壊は、洗浄溶液中で実施され、各洗浄ステップの後に１回実施され得または少なくともさらに１回反復され得る。
【００４０】
機械的破壊の後、吸引脂肪組織は、本明細書で説明されるとおり、少なくとも１回さらに洗浄され得る。
【００４１】
いくつかの実施形態において、洗浄溶液は、収集された吸引脂肪組織の機械的破壊の間にコンテナへと漏斗で注がれる（例えば、連続的に）。
【００４２】
他の実施形態において、洗浄溶液は、吸引脂肪組織がコンテナへと吹い込まれる前に、および遠心分離の各ステップ後にコンテナへと漏斗で注がれる。
【００４３】
当業者によって容易に認識されるように、本明細書で説明される各洗浄ステップの後、遠心分離があり、ここで遠心分離の直後に、洗浄溶液（すなわち、上清）が緩徐に吸引される。洗浄は、１回以上反復されてよく、ここで遠心分離は各洗浄ステップ後に実施され、および洗浄溶液は容器の外へと吸引され、かつ新たな溶液が導入される。
【００４４】
いくつかの実施形態において、洗浄溶液は、少なくとも１つの追加の試薬をさらに含有する（特定の細胞画分を濃縮する目的でおよび／または脂肪細胞の分画を支援するため）。このような試薬のいくつかの非限定例としては、細胞特異的抗体、緩衝剤、糖ベースの密度勾配（例えば、スクロース、マンノース、フィコール、硫酸デキストラン）、非糖密度勾配（例えば、パーコール、パーコールプラス、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標））抗体仲介性磁性細胞選別溶液、非磁性抗体仲介性細胞選別溶液（非磁性）が挙げられる。
【００４５】
本考案に従って、遠心分離は、細胞（例えば、間質血管画分）を細胞の浮遊集団（例えば、成熟脂肪細胞）から分離するよう作用する。
【００４６】
いくつかの実施形態において、コンテナは、約２００×ｇ〜約１，５００×ｇで、または約２５０×ｇ〜約５００×ｇで遠心分離され得る（例えば、ＳＶＦ細胞を浮遊脂肪細胞から分離するため）。
【００４７】
コンテナの各遠心分離の後、コンテナを遠心分離機から取り出し、吸引針または、容器内からペレットを抜去するのに適した何らかの機械的手段を用いて、細胞ペレットを緩徐に吸引する。
【００４８】
いくつかの実施形態において、少なくとも１回の洗浄ステップの後、遠心分離を実施することなく相分離が生じた後に、細胞ペレットを緩徐に吸引する。
【００４９】
いくつかの実施形態において、有核細胞を計数する前に、細胞ペレットをストレイナ（例えば、約４０μＭ〜約２００μＭのメッシュの大きさを有する）を通して移送する。
【００５０】
いくつかの実施形態において、細胞ペレットをさらに処理して特異的な所望の細胞集団を濃縮する（例えば、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）系の技術、または当業者に公知の何らかの他の適切な細胞濃縮方法を用いて）。
【００５１】
当業者は、機械的破壊方法（例えば、破壊、洗浄、遠心分離）の間に実施される手順はいずれも、当業者に公知である、本考案の方法と関係する種々のパラメータ（例えば、脂肪組織のタイプ、ロータ速度、ロータタイプ、溶液対脂肪組織比など）に応じて、約４℃〜約３７℃で実施できることを容易に認識するであろう。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本考案の方法は、吸引脂肪組織への塩類溶液（例えば、約３７℃へ事前に加温された）の添加を包含し、この後、脂肪／塩類溶液混合物の機械的破壊を実施し（例えば、室温で）、機械的に破壊された脂肪（塩類溶液を用いる）を遠心分離しストレイナ（ｓｔｒａｉｎｅｄ）またはフィルタを通じて（ｔｒｏｕｇｈ）移送する。
【００５３】
したがって、いくつかの態様において、本考案は、本明細書に説明するようなコンテナまたは容器を提供する。
【００５４】
当該態様の別のものにおいて、本考案は、哺乳類脂肪組織から細胞集団を濃縮するための方法を提供し、当該方法は、
脂肪組織をコンテナ組立て体中へ吸引すること（例えば、コンテナへ脱離可能に接続された近位端および哺乳類の身体の少なくとも１つの空洞中へ挿入された遠位端を有する吸引チューブを用いて）、
コンテナ組立て体中の脂肪組織を機械的に破壊／破砕すること（例えば、機械的組織破壊装置を用いて細胞懸濁液を得、ここで破壊は酵素を利用しない）、
コンテナ組立て体内で細胞の懸濁液を洗浄すること、および
コンテナ組立て体を遠心分離機へ移送すること、およびコンテナ組立て体を遠心分離してそれにより細胞ペレットを得ること
を含む。
【００５５】
いくつかの実施形態において、当該方法は、コンテナ組立て体内から細胞ペレットを抽出して濃縮された細胞集団を得るステップをさらに含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において、得られる濃縮された細胞集団は、以下の特長、すなわち
ＳＶＦは、約４０〜約９１パーセントのＣＤ４５＋細胞を有するとして表現型で識別可能であり、
ＳＶＦは、約５〜約５０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）細胞および約３〜約４０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）細胞を有するとして表現型で識別可能であり、
ＳＶＦは、約７〜約４０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）細胞および約６〜約３０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）細胞を有するとして表現型で識別可能であり、
ＳＶＦは、約２〜約１５パーセントの単球（＋）およびＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートを有するとして表現型で識別可能であり、
ＳＶＦは、約４〜約１０パーセントの単球（＋）およびＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートを有するとして表現型で識別可能であり、
有核細胞のＳＶＦ収量は、本明細書で説明される洗浄のみの方法において得られるものよりも少なくとも３倍高く、
７〜１４日間の期間の細胞培養後の吸引脂肪組織１ｍｌ当たりの細胞量は、さらに後述するように、洗浄のみの方法において得られるものと比較して少なくとも１５倍高く、
ＳＶＦは、細胞の分化能によってならびにフローサイトメトリーにより識別されるような特異的な幹細胞マーカーおよび物理的特性によって測定されるように、洗浄のみの方法において得られるものと比較してより高いパーセントの間葉系前駆幹細胞を含有し、
ＳＶＦは、３３ゲージ〜７ゲージのゲージ数を有する非常に小さな針を介して注射可能である（例えば、哺乳類組織中へと）
のうちの少なくとも１つを特徴とするＳＶＦ細胞画分である。
【００５７】
他の実施形態において、当該方法は、ＳＶＦ画分が得られた脂肪を分離し化粧上または治療上の実用の方法においてこれを用いるステップを含む。
【００５８】
本考案は、
ＳＶＦは、約４０〜約９１パーセントのＣＤ４５＋細胞を有するとして表現型で識別可能であり、
ＳＶＦは、約５〜約５０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）細胞および約３〜約４０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）細胞を有するとして表現型で識別可能であり、
ＳＶＦは、約７〜約４０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）細胞および約６〜約３０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）細胞を有するとして表現型で識別可能であり、
ＳＶＦは、約２〜約１５パーセントの単球（＋）およびＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートを有するとして表現型で識別可能であり、
ＳＶＦは、約４〜約１０パーセントの単球（＋）およびＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートを有するとして表現型で識別可能であり、
有核細胞のＳＶＦ収量は、本明細書で説明される洗浄のみの方法において得られるものよりも少なくとも３倍高く、
７〜１４日間の期間の細胞培養後の吸引脂肪組織１ｍｌ当たりの細胞量は、さらに後述するように、洗浄のみの方法において得られるものと比較して少なくとも１５倍高く、
ＳＶＦは、細胞の分化能によってならびにフローサイトメトリーにより識別されるような特異的な幹細胞マーカーおよび物理的特性によって測定されるように、洗浄のみの方法において得られるものと比較してより高いパーセントの間葉系前駆幹細胞を含有し、
ＳＶＦは、３３ゲージ〜７ゲージのゲージ数を有する非常に小さな針を介して注射可能である（例えば、哺乳類組織中へと）
のうちのいずれか１つを特徴とするＳＶＦ画分をさらに提供する。
【００５９】
いくつかの実施形態において、ＳＶＦ画分は、本考案の方法により作製される。
【００６０】
いくつかの実施形態において、ＳＶＦ画分は、本考案の方法によって作製されるかどうかに関わりなく、医学において使用され得る。
【００６１】
本考案は、圧力濾過による間質血管画分（ＳＶＦ）細胞の機械的分離のための方法および装置をさらに提供する。装置は、閉鎖位置および開放位置を有するシャッターによって分離可能な、２つの拡張可能なコンテナを備える。閉鎖位置にあるとき、吸引脂肪組織は、上部コンテナ中へ移送され、沈殿し得る。
【００６２】
その後、シャッターを「オン」の位置にし、脂肪は、プランジャーを下げるよう圧力を誘導することによって、２つのコンテナ間を分離する金属メッシュまたは金属フィルタを通過させられる。
【００６３】
一旦すべての脂肪および流体がメッシュを通じて下部コンテナ中へ通過されると、シャッターを閉鎖位置にする。下部コンテナを分離した後、脂肪は滅菌状態のままであり、その理由は上端がシャッターによって閉鎖されるからである。
【００６４】
分離された下部コンテナを遠心分離し、ＳＶＦ細胞をコンテナの底部で濃縮し、そこから分離し得る。
【００６５】
本考案は、脂肪組織細胞の分離されたＳＶＦ画分をさらに提供し、当該画分は、以下の特長、すなわち、
１．コラゲナーゼ（例えば、Ｉ型コラゲナーゼ）分離によって得られるものと類似のＳＶＦ細胞収量を有すること、
２．７日間および１４日間の培養の両方の後のコラゲナーゼ分離法によって得られるものと類似の培養増殖能を有すること、
３．骨および脂肪の両方への分化能を有すること、
４．培養で継代１回後に間葉系幹細胞表面マーカー発現表現型を有すること、
５．約４％〜約１０％の単球（＋）ＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ゲートを有すること
のうちの少なくとも１つを特徴とする。
【００６６】
当該態様のさらに別のものにおいて、本考案は、再生医学におけるおよび創傷治癒における使用のための、組織（例えば、脂肪、骨、軟骨、皮膚、心臓、肝臓、腎臓、脳）の再生および交換（例えば、外傷後または麻酔手術における）のための、ならびに免疫調節目的のための（例えば、移植片対宿主病および他の自己免疫疾患における、ならびに移植拒絶予防のための）、本考案の方法および装置によって得られる、分離されたＳＶＦ画分を提供する。
【００６７】
いくつかの実施形態において、分離されたＳＶＦ画分は、改善された脂肪の存続および血管再生のために、自家脂肪と併用され得る。
【００６８】
本考案に従って、本明細書で定義される分離されたＳＶＦ画分は、その分離直後または培養後のいずれかで使用され得る（例えば、脂肪由来間葉系幹細胞として）。
【００６９】
当該態様の別のものにおいて、本考案は、組織（例えば、脂肪、骨、軟骨、皮膚、心臓、肝臓、腎臓、脳）の再生および交換（例えば、外傷後または麻酔手術における）のための、免疫調節目的のための（例えば、移植片対宿主病および他の自己免疫疾患における、ならびに移植拒絶予防のための）、あるいは医学的専門家または医療従事者に公知であり得るような何らかの他の医学的目的のための、再生医学におけるまたは創傷治癒における、本明細書で開示されるような、分離されたＳＶＦ画分の使用を提供する。
【００７０】
本考案は、本考案によるＳＶＦ画分を使用する方法をさらに提供し、当該方法は、本明細書で開示されるようなＳＶＦ画分を得て当該技術分野で公知のような当該画分を使用するステップを含む。いくつかの実施形態において、当該方法は、再生医学の方法、創傷治癒を誘導するための方法、組織（例えば、脂肪、骨、軟骨、皮膚、心臓、肝臓、腎臓、脳）の再生および交換（例えば、外傷後または麻酔手術における）のための方法、ならびに免疫調節目的のための（例えば、移植片対宿主病および他の自己免疫疾患における、ならびに移植拒絶予防のための）方法から選択される。
【００７１】
本明細書に開示される対象をより良好に理解するために、および当該対象を実際にどのように実施し得るかを具現化するために、次に実施形態を、添付の図面を参照して非限定的な例として説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本考案のいくつかの実施形態による脂肪細胞を収集するための装置を示す。
【図２】本考案のいくつかの実施形態によるＳＶＦを分離するための装置を示す。
【図３】本考案のいくつかの実施形態によるＳＶＦ細胞を分離するための装置を示す。
【図４】類似の脂肪（図４Ａ）および骨（図４Ｂ）の分化能を呈する、機械的におよび酵素的に分離されたＳＶＦ細胞を示す。酵素的技術、機械的技術または洗浄技術を用いて脂肪から分離された脂肪由来幹細胞を、骨分化培地中でまたは脂肪分化培地でもしくは対照培地で３週間インキュベートした。次に、この細胞をアリザリンレッドを用いて骨について、またはオイルレッドＯを用いて脂肪について染色した。骨および脂肪へのヒトＡＳＣの分化を示す。
【図５】「単球のゲート」におけるＣＤ４５（−）細胞の濃縮された集団を呈する、脂肪の酵素的消化または機械的破壊によって分離されたＳＶＦを示す。図５Ａは、全ての有核細胞を示し、図５Ｂは、ＣＤ４５（−）のみの細胞を示す。
【図６】圧力濾過による間質血管画分（ＳＶＦ）細胞の機械的分離のための装置を示す。当該装置は、１および２と指定される２つの拡張可能なコンテナから構成される。
【図７】２つのコンテナが閉鎖位置および開放位置を有するシャッターによって分離される、圧力濾過による間質血管画分（ＳＶＦ）細胞の機械的分離のための装置を示す。
【考案を実施するための形態】
【００７３】
実施形態に関する詳細な説明
本考案は、間質血管画分の濃縮された集団を得るために機械的破壊、洗浄および遠心分離の組み合わせを用いる、脂肪組織から脂肪細胞を分離するための機械的な方法に関する。
【００７４】
本考案のより良好な理解を有するために、読者は次に、図面に向けられる。
【００７５】
まず図１に関して、装置の内部と連通し、かつ細胞を装置中へ導入するためのカニューレと密封可能におよび脱離可能に係合するよう適合された入口１、密封可能なおよび脱離可能な閉鎖キャップ３、ロータシャフト５のための近位マウント４ならびにロータシャフト５へ装着されるロータ７を有する装置１０の例示的な実施形態が提供される。
【００７６】
装置１０の閉鎖キャプ３は、それを通じて挿入されるカニューレを通り洗浄溶液（例えば、正常塩類溶液、リンゲル溶液、乳酸化リンゲル溶液、ハンクス平衡塩溶液およびこれらの何らかの組み合わせ）を中に入れるための２つの追加の入口９および入口１１をさらに含む。当該溶液または液体または脂肪のレベルは、液位１３以下に典型的に維持される。
【００７７】
図２に示される装置１００に関して、閉鎖キャップ１６の外部にある電気式操作部が示されており、当該操作部は、閉鎖キャップにおける密封可能な開口部１６ａを通じてロータへとシャフト２１によって脱離可能に接続されている。形体２５、２７、１５、１６および２９はそれぞれ、図１に示される形体９、１１、１、３および１３と等価である。
【００７８】
図３に示される装置２００にさらに関して、細胞の収集に適合された当該装置の凹状基部４５がさらに示される。形体３９、４１、３１、および４３はそれぞれ、図１に示される形体９、１１、１、および１３と等価である。
【００７９】
装置１０、１００または２００が、円筒形、四角形、台形および当該技術分野で公知の何らかの他の幾何学的形状であってよく、ならびに熱可塑性ポリマー（例えば、ポリプロピレン）、合成芳香族ポリマー（ポリスチレン）および金属（例えば、アルミニウム）などの、細胞を収集してその無菌性および生存率を維持するのに適した何らかの不活性な、透明なもしくは不透明な、安定なおよび密封可能な（例えば、真空下でおよび気密性の閉鎖キャップを用いて）材料から製造できることは認識されている。
【００８０】
装置の材料および形状にかかわらず、装置の容積は、０．０５リットル〜２リットルであり得る。
【００８１】
操作部は、モータで駆動され得る（例えば、電気式）か手動で操作され得る。
【００８２】
カニューレは、何らかの可撓性の非反応性材料（例えば、シリコーン、塩化ポリビニル）から製造され得る。
【００８３】
実施例１
脂肪を、脂肪吸引によって５０歳女性の大腿から分離した。事前に測定した最高の体格指数（ＢＭＩ）は５２．７であり、およびから安定したＢＭＩ３３．９を５年間にわたって測定した。脂肪を４℃で一晩維持し、翌朝に処理した。
【００８４】
Ｉ型コラゲナーゼによる脂肪からの細胞の分離（比較の系）
吸引脂肪組織の脂肪（２５ｍｌ）を２５ｍｌの塩類溶液を添加することによって洗浄した後、入念に混合し２６０×ｇで５分間遠心分離した。洗浄した脂肪（１０ｍｌ部分中の）を、ＤＭＥＭ中に懸濁した５ｍｇ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼ０．７５ｍｌと混合した。この吸引脂肪組織／コラゲナーゼ混合物を３７℃で１時間回転させた。酵素消化の後、この脂肪／コラゲナーゼ混合物を１対１容積の１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭによって中和し、１００μＭのストレイナを通じて移送した後、３２８×ｇで１５分間遠心分離した。沈降した間質血管画分（ＳＶＦ）細胞を浮遊脂肪細胞から分離し、１００μＭのストレイナを通じて移送し、有核細胞をメチレンブルー含有３％酢酸（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カナダ国バンクーバー市）を用いて計数した。
【００８５】
脂肪からの細胞の機械的な分離
吸引脂肪組織の脂肪（１００ｍｌ）を１００ｍｌの塩類溶液の添加によって洗浄した後、入念に混合し３２８×ｇで１０分間遠心分離した。洗浄した脂肪（１００ｍｌ）をＡＴＬ−６０４フードプロセッサー（Ｇｏｌｄ−ｌｉｎｅ，イスラエル国）中へ取り込み、塩類溶液１００ｍｌを添加した。脂肪／塩類溶液混合物を室温にて１３００ＲＰＭで１５秒間機械的に破壊した。機械的に破壊した脂肪（塩類溶液含有）を３２８×ｇで１０分間遠心分離した。沈降したＳＶＦ細胞を浮遊脂肪細胞から分離し、１００μＭのストレイナを通じて移送した。有核細胞をメチレンブルー含有３％酢酸（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カナダ国バンクーバー市）を用いて計数した。
【００８６】
入念な混合および遠心分離による脂肪からの細胞の分離
吸引脂肪組織の脂肪（２５ｍｌ）を２５ｍｌの塩類溶液の添加によって洗浄した後、入念に混合し３２８×ｇで１０分間遠心分離した。沈降したＳＶＦ細胞を浮遊脂肪細胞から分離した。有核細胞をメチレンブルー含有３％酢酸（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カナダ国バンクーバー市）を用いて計数した。
【００８７】
細胞培養
当該細胞の分離および細胞計数の後、全ての３つの分離プロトコル（コラゲナーゼ、機械的および洗浄）からのＳＶＦ細胞を、６穴プレートの５×１０５個／ウェルの濃度で播種し、７日間培養した。細胞を、１０％ＦＣＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＨｙＣｌｏｎｅ，ニュージーランド国タウラナガ市（Ｔａｕｒａｎａｇａ））、６０μｇ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）および非必須アミノ酸を補充した高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ，英国スコットランド地方ペイズリー町）中で培養した。培養物を、１０％ＣＯ２雰囲気中で３７℃で増殖させた。培地を、細胞播種７２時間後に交換した。培養７日間後に、細胞をトリプシンによって収集して計数した。
【００８８】
結果
表１にみられるように、類似の量の有核細胞がコラゲナーゼおよび機械的な細胞分離法を用いて脂肪から分離された。激しい洗浄にもかかわらず、酵素または機械による脂肪の破壊のない細胞分離は、顕著により少量の細胞を結果的に生じた。
【００８９】
さらに、同一量でのＳＶＦ細胞の７日間の培養は、洗浄のみによって分離された細胞と比較してコラゲナーゼおよび機械により分離された細胞を使用した場合に、顕著により多数の間質細胞を結果的に生じた（表１）。重要なことに、先行報告［８］と同様に、培養後の脂肪１ｍｌ当たりの細胞収量は、洗浄のみによって分離した細胞と比較して酵素的に分離した細胞で３０倍高かった（１．０８×１０５個／脂肪１ｍｌ（酵素的）および０．０３６×１０５個／脂肪１ｍｌ（洗浄））。対照的に、機械的な細胞分離および培養の後の細胞収量は、酵素的な分離後に得られたものと類似していた（１．０８×１０５個／脂肪１ｍｌ（酵素的）および０．６５６×１０５個／脂肪１ｍｌ（機械的））。
【表１】
0003218433.tif 000003
【００９０】
実施例２
脂肪を、脂肪吸引によって４６歳男性の腹壁、臀部および背中から分離した。事前に測定された最高ＢＭＩは６２であり、後に１年を超える期間の間安定なＢＭＩ＝３１であると測定された。脂肪を４度で一晩維持し、翌朝に処理した。
【００９１】
Ｉ型コラゲナーゼによる脂肪からの細胞の分離（比較の系）
吸引脂肪組織の脂肪（８０ｍｌ）を、８０ｍｌの塩類溶液の添加によって洗浄した後、入念に混合し２６０×ｇで５分間遠心分離した。洗浄した脂肪（１０ｍｌ部分中の）を、ＤＭＥＭ中に懸濁した５ｍｇ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼ０．７５ｍｌと混合した。この吸引脂肪組織／コラゲナーゼ混合物を３７度で１時間回転させた。酵素消化の後、この脂肪／コラゲナーゼ混合物を１対１容積の１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭによって中和した後、３２８×ｇで１５分間遠心分離した。沈降した間質血管画分（ＳＶＦ）細胞を、１００μＭストレイナを通じて移送された浮遊脂肪細胞から分離し、有核細胞を、メチレンブルー含有３％酢酸（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カナダ国バンクーバー市）を用いて計数した。
【００９２】
脂肪からの細胞の機械的分離
吸引脂肪組織の脂肪（２５ｍｌ）を２５ｍｌの塩類溶液の添加によって洗浄した後、入念に混合し２６０×ｇで５分間遠心分離した。洗浄した脂肪（２５ｍｌ）をＰｈｉｌｉｐｓ  ＨＲ１６１１フードプロセッサー中へ取り込み、塩類溶液２５ｍｌを添加した。この脂肪／塩類溶液混合物を５２４０ＲＰＭで８秒間室温にて機械的に破壊した。機械的に破壊した脂肪（塩類溶液含有）を３２８×ｇで１０分間遠心分離した。沈降したＳＶＦ細胞を浮遊脂肪細胞から分離し、１００μＭのストレイナを通じて移送した。有核細胞を、メチレンブルー含有３％酢酸（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カナダ国バンクーバー市）を用いて計数した。
【００９３】
細胞培養
当該細胞の分離および細胞計数の後、２つの分離プロトコル（コラゲナーゼおよび機械的）からのＳＶＦ細胞を、５×１０５個／６ｃｍプレートの濃度で播種し、１４日間培養した。細胞を、１０％ＦＣＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＨｙＣｌｏｎｅ，ニュージーランド国タウラナガ市（Ｔａｕｒａｎａｇａ））、６０μｇ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）および非必須アミノ酸を補充した高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ，英国スコットランド地方ペイズリー町）中で培養した。培養物を、１０％ＣＯ２雰囲気中で３７℃で増殖させた。培地を、細胞播種７２時間後に交換した。培養１４日間後に、細胞をトリプシンによって収集して計数した。
【００９４】
細胞表面マーカー染色
細胞収集の後、細胞を、抗ヒトＣＤ４５（ＢＤ  ｈｏｒｉｚｏｎ）、抗ヒトＣＤ３１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ヒトＣＤ１０５、抗ヒトＣＤ３４、抗ヒトＣＤ２９、抗ヒトＣＤ２３５α、抗ヒトＣＤ７３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，米国カリフォルニア州サンディエゴ市）およびｌｉｖｅ／ｄｅａｄ−ｖｉｖｉｄ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，米国オレゴン州ユージーン市）を含む細胞マーカーのパネルによって染色した。標識した細胞をＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，米国カリフォルニア州サンディエゴ市）を用いて分析した。データ解析をｆｌｏｗ−Ｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  ｓｔａｒ，米国オレゴン州アシュランド市）によって実施した。
【００９５】
結果
実施例２に従って、類似の量の細胞がコラゲナーゼ消化または機械的分離を用いて脂肪から分離された（表２）。
【００９６】
さらに、コラゲナーゼおよび機械的に分離した細胞を使用した場合に、ＳＶＦ細胞の１４日間の培養は類似の数の間質細胞の増殖を結果的に生じた（表２）。
【００９７】
組織増殖の１４日後の継代数０における培養間質細胞の表面マーカー発現パターンの評価は、酵素的におよび機械的に分離された細胞の両方で期待された発現パターンを明らかにした。パターンは、ほとんどの培養細胞でごくわずかなパーセントのＣＤ４５（＋）造血細胞および高発現の間葉系幹細胞マーカー（ＣＤ７３の１００％の発現ならびにＣＤ２９およびＣＤ１０５の９０％超の発現）を含んだ（表３）。
【００９８】
したがって、脂肪からのＳＶＦ細胞の機械的分離は、酵素的抽出と同様に多量の有核細胞の抽出を可能にする。さらに、機械的に分離された細胞は、それらが類似の表面マーカー発現パターンを有し培養物中の１４日間の増殖後に同様の量の細胞を産生するので、酵素的に分離された細胞と同様の特性を有する。
【００９９】
【表２】
0003218433.tif 000004
【表３】
0003218433.tif 000005
【０１００】
実施例３
脂肪を、脂肪吸引によって６０歳女性の腹壁および臀部から分離した。事前に測定した最高ＢＭＩは４０であり、その後、１年を超える期間の間安定なＢＭＩ２９が測定された。脂肪を４℃で一晩維持し、翌朝に処理した。
【０１０１】
ＳＶＦ細胞を、実施例２においてすでに説明した通り、機械的な解離によってまたは洗浄によってのいずれかで、吸引脂肪組織の脂肪から分離した。分離した細胞を、示されるマーカーによって染色し、各マーカーについて陽性である細胞の比率を、死細胞および赤血球を除く全集団から測定した。
【０１０２】
結果
見られるように、ＣＤ４５（＋）造血細胞の比率は、機械的に分離した細胞（２９％）と比較して、洗浄によって分離した細胞でずっと高かった（９１％）（表４）。洗浄によって分離した細胞でのＣＤ４５（＋）の比率の増加は、類似の抽出プロトコルを用いて８１％のＣＤ４５（＋）細胞を見出した先行報告と一致している。特異的な表面マーカーにより間葉系幹細胞前駆細胞を識別する困難にもかかわらず［１２］、これらの細胞はＣＤ４５（＋）集団から生じないことが概して受け入れられる。したがって、洗浄によって分離した細胞におけるＣＤ４５（＋）細胞の増加した比率は、機械的に分離された細胞および酵素的に分離された細胞の両方（表１）と比較してそれらの乏しい培養増殖能を説明し得る。
【表４】
0003218433.tif 000006
【０１０３】
実施例４
分化能
酵素的技術、機械的技術および洗浄による技術によって分離された脂肪由来幹細胞の多分化能を検討した。図４に見られるように、機械的および酵素的な分離によって分離された培養細胞は両方とも、脂肪（図４Ａ）および骨（図４Ｂ）の両方への類似の分化能を示した。洗浄によって分離された細胞は、機械的および酵素的に分離された細胞の両方と比較して低い細胞分化能を示した。したがって、機械的に分離された細胞は、酵素的に分離された細胞に匹敵する多分化能特性および洗浄により分離された細胞と比較して優れた多分化能を示す。
【０１０４】
さらに、皮下脂肪を、脂肪吸引によって５８歳女性の胃から分離した。最高体格指数（ＢＭＩ）が事前に測定され、その安定なＢＭＩから５年間にわたって測定された。脂肪を４℃で一晩維持し、翌朝に処理した。
【０１０５】
Ｉ型コラゲナーゼによる脂肪からの細胞の分離（比較の系）
吸引脂肪組織の脂肪（２５ｍｌ）を、ＤＭＥＭ中に懸濁した５ｍｇ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼ０．７５ｍｌと混合した。この吸引脂肪組織／コラゲナーゼ混合物を３７℃で１時間回転させた。この脂肪／コラゲナーゼ混合物の酵素消化物を１対１容積の１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭによって中和し、１００μＭのストレイナを通じて移送した後、４００×ｇで１５分間遠心分離した。沈降した間質血管画分（ＳＶＦ）細胞を浮遊脂肪細胞から分離し、１００μＭのストレイナを通じて移送し、有核細胞を、メチレンブルー含有３％酢酸（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カナダ国バンクーバー市）を用いて計数した。
【０１０６】
脂肪からの機械的分離細胞
３７℃へ加温した吸引脂肪組織の脂肪（１００ｍｌ）をＡＴＬ−６０４フードプロセッサー（Ｇｏｌｄ−ｌｉｎｅ，イスラエル国）中へ取り込み、事前に３７℃へ加温しておいた塩類溶液１００ｍｌを添加した。この脂肪／塩類溶液混合物を１３００ＲＰＭで１５秒間室温にて機械的に破壊した。機械的に破壊した脂肪（塩類溶液含有）を４００×ｇで１５分間遠心分離した。沈降したＳＶＦ細胞を浮遊脂肪細胞から分離し、１００μＭのストレイナを通じて移送した。有核細胞を、メチレンブルー含有３％酢酸（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カナダ国バンクーバー市）を用いて計数した。
【０１０７】
入念な混合および遠心分離による脂肪からの細胞の分離
３７℃へ加温した吸引脂肪組織の脂肪（１０ｍｌ）を、３７℃へ加温しておいた２５ｍｌの塩類溶液の添加によって洗浄した後、入念に混合し４００×ｇで１５分間遠心分離した。沈降したＳＶＦ細胞を浮遊脂肪細胞から分離した。有核細胞を、メチレンブルー含有３％酢酸（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カナダ国バンクーバー市）を用いて計数した。
【０１０８】
細胞培養
当該細胞の分離および細胞計数の後、全ての３つの分離プロトコル（コラゲナーゼ、機械的および洗浄）からのＳＶＦ細胞を、０．０７５×１０６個／６穴プレートの濃度で播種し、７日間培養した。細胞を、１０％ＦＣＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＨｙＣｌｏｎｅ，ニュージーランド国タウラナガ市（Ｔａｕｒａｎａｇａ））、６０μｇ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）および非必須アミノ酸を補充した高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ，英国スコットランド地方ペイズリー町）中で培養した。培養物を、１０％ＣＯ２雰囲気中で３７℃で増殖させた。培地を、細胞播種７２時間後に交換した。培養７日後に、細胞をトリプシンによって収集して計数した。
【０１０９】
細胞表面マーカー染色
細胞収集の後、細胞を、抗ヒトＣＤ４５（ＢＤ  ｈｏｒｉｚｏｎ）、抗ヒトＣＤ３１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ヒトＣＤ１０５、抗ヒトＣＤ３４、抗ヒトＣＤ２９、抗ヒトＣＤ２３５α、抗ヒトＣＤ７３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，米国カリフォルニア州サンディエゴ市）およびｌｉｖｅ／ｄｅａｄ−ｖｉｖｉｄ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，米国オレゴン州ユージーン市）を含む細胞マーカーのパネルによって染色した。標識した細胞をＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，米国カリフォルニア州サンディエゴ市）を用いて分析した。データ解析をｆｌｏｗ−Ｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  ｓｔａｒ，米国オレゴン州アシュランド市）によって実施した。漸次的ゲーティング戦略は、ＲＢＣ（ＲＢＣの特異的染色）を廃棄する一方で、シングレットおよび生細胞（低ＶｉＶｉＤ染色（アミン反応性生存能色素）によって決定）のみを含有する別個の集団を分離した。次に、ＣＤ４５（−）細胞についてゲーティングを実施して、ＣＤ４５陽性免疫細胞を除去した。ＣＤ４５陰性細胞の追加のゲーティングを実施して、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ７３およびＣＤ２９について陽性の集団を定義した。側方散乱データに対して前方散乱（ＦＳＣ）データをプロットすることが、末梢血試料についての形態の情報を明らかにできることは広く受け入れられている。ｘ軸にプロットされたＦＳＣデータにより、最も左に現れるより小さなリンパ球と大きさが区別でき、一方でＳＳＣデータ（ｙ軸）は、細胞の粒度を基に考えられる同等な大きさの単球と好中球との間で差別化を行う。同じパラメータおよび陽性対照として全血を使用して、異なる集団を、単球と同じ特徴を有するＳＶＦ内で識別した。この領域は、単球のゲートと名付けられた。単球は直径がおよそ１５〜２５μｍであるので、このゲート内のＳＶＦ集団は、ほぼ確実に同じ大きさの範囲である。
【０１１０】
表５に見られるように、類似の量の有核細胞が、酵素的および機械的な細胞分離法を用いて脂肪から分離された。激しい洗浄にもかかわらず、脂肪の酵素的または機械的な破壊のない細胞分離は、顕著により少量の細胞を結果的に生じた。
【０１１１】
さらに、０日での同一の量のＳＶＦ細胞の播種は、洗浄のみによって分離された細胞と比較して酵素的および機械的に分離された細胞を使用した場合、培養の７日後に顕著により多数の脂肪由来間質細胞を結果的に生じた（表５）。
【表５】
0003218433.tif 000007
【０１１２】
重要なことに、培養後の１ｍｌの脂肪当たりの細胞収量は、洗浄のみによって分離された細胞と比較して酵素的におよび機械的に分離された細胞で４５倍および３０倍高かった（表５）。
【０１１３】
同一の量のＳＶＦ細胞の播種は、洗浄のみによって分離された細胞と比較して酵素的におよび機械的に分離されたＳＶＦ細胞を使用した場合、７日後に顕著により多量の間質細胞を結果的に生じた。このことは、異なる細胞分離技術によって細胞集団の異なる組成が分離されたことを示す。
【表６】
0003218433.tif 000008
【０１１４】
異なる技術によって分離されたＳＶＦ細胞の細胞組成をよりよく定義するために、当該細胞の表面マーカー発現を８色フローサイトメトリーパネルによって決定した。異なる技術によって分離されたＳＶＦ細胞内のＣＤ４５（＋）細胞のパーセントの試験は、それぞれ９１％および９０％のＣＤ４５（＋）細胞を生じる機械的に分離された細胞または洗浄によって分離された細胞と比較して、酵素的に分離された細胞でのより低い（７７％）パーセントを明らかにした。間葉系幹細胞は非造血細胞を表すＣＤ４５（−）集団からのみ生じるので、追加の表面マーカーの発現をこの集団で検討した。表６にみられるように、顕著なパーセント（２８％）のＣＤ３１（＋）ＣＤ３４（＋）二重陽性細胞が酵素的に分離された細胞で観察されたのに対し、機械的に分離された細胞および洗浄により分離された細胞の両方においては、この集団は実際には存在しなかった。
【０１１５】
機械的に分離された細胞および洗浄分離された細胞の両方でほとんど明らかでなかった追加の集団は、ＣＤ７３（−）ＣＤ２９（＋）細胞であった。この場合もまた、顕著なパーセント（２５％）の酵素的に分離された細胞が、ＣＤ７３（−）ＣＤ２９（＋）を発現した。したがって、酵素的に分離されたＳＶＦ細胞と機械的に分離された細胞または洗浄により分離された細胞との間で細胞組成の顕著な差が実証された。
【０１１６】
表６は、酵素消化（コラゲナーゼ）によって、脂肪の機械的破壊によってまたは脂肪を洗浄することによって脂肪から分離されたＳＶＦ細胞間でのＣＤ４５（−）細胞中の表面マーカー発現のパーセントの差を実証する。機械的に分離された細胞と洗浄分離された細胞との間での表面マーカー発現の明らかな類似性にもかかわらず、機械的に分離された細胞の培養増殖増加において明白であったように、これらの細胞間には実質的な差が存在する。それゆえ、これらの２つの技術によって分離された細胞間での表面マーカー発現をさらに検討した。
【０１１７】
表７は、脂肪の機械的破壊によってまたは脂肪洗浄によってのいずれかで脂肪から分離されたＳＶＦ細胞間でのＣＤ４５（−）中の表面マーカー発現のパーセントの差を示す。表７に見られるように、ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）集団（１０％増加）におけるおよびＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）集団（２０％増加）における実質的な増加は、洗浄によって分離された細胞と比較して機械的に分離された細胞において明白であった。
【表７】
0003218433.tif 000009
【０１１８】
ＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）集団は、たいていの脂肪由来幹細胞前駆細胞を保有する集団である。表７に見られるように、洗浄により分離された細胞と比較して機械的に分離された細胞画分は、より高いパーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）を有しており、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を形成するそれらの増加した能力を示している。追加の表面マーカーは、ＳＶＦ集団内で代表的なＡＳＣ前駆細胞がＣＤ７３およびＣＤ２９であることを示唆した。表７に見られるように、洗浄により分離された細胞と比較して機械的に分離された細胞は、ＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）の２０％の増加を有する。
【０１１９】
前方光散乱面積（ＦＳＣ−Ａ）および側方散乱面積（ＳＳＣ−Ａ）を用いたＳＶＦ全体の細胞分布の検討は、洗浄と比較して酵素的および機械的な分離における「単球のゲート」と呼ばれるゲートにおける細胞比率の増加を明らかにした（図５Ａ）。酵素的におよび機械的に分離された細胞での「単球のゲート」における細胞の優れた比率は、洗浄によって分離された細胞と比較して機械的に分離された細胞にで５倍増加に到達する、より関連性のあるＣＤ４５（−）集団でさらにより顕著であった（図５Ｂ）。
【０１２０】
酵素的に、機械的におよび洗浄によって分離された細胞の全有核生細胞（図５Ａ）またはＣＤ４５（−）細胞（図５Ｂ）のＦＣＳ−Ａ分布におけるＳＳＣ−Ａをドットプロットで表す。
【０１２１】
重要なことに、表８に見られるように、「単球のゲート」内でのＣＤ４５（−）細胞のほとんどは、脂肪幹細胞前駆細胞を保有するＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）であった。
【０１２２】
それゆえ、本考案は、「単球（＋）ＣＤ３４（＋）のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲート」と呼ばれるＳＶＦ内での新たな細胞集団を提供する。細胞の物理的特性および当該細胞の表面マーカー発現の両方を考慮するこの新規の集団は、酵素的に、機械的におよび洗浄で分離された細胞においてそれぞれ、６．６％、４．３％および０．８８％の総有核細胞を含む。この集団は、培養７日後に同数のＳＶＦ細胞から産生されるＡＳＣ収量の比をよく予測するように、脂肪幹細胞前駆細胞の大部分を含む（表８）。したがって、機械的に分離された細胞および洗浄分離された細胞の間での最も顕著な差は、表９に要約されるように、単球（＋）ＣＤ３４（＋）集団のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートにある。治療上関連のある細胞集団は培養された脂肪由来幹細胞、つまり幹細胞前駆細胞を産生できる細胞集団であることは、一般に受け入れられている。本考案は、当該細胞の物理的特性（単球のゲート）を用いて定義されるＳＶＦ内で幹細胞前駆細胞のサブクラスを定義する。したがって、単球（＋）ＣＤ３４（＋）集団のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートは、ＳＶＦ内の最も治療上関連する集団の幹細胞前駆細胞を定義する。洗浄分離された細胞と比較した機械的に分離されたＳＶＦ細胞での単球（＋）ＣＤ３４（＋）集団のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートの大きな増加（表９）は、機械的に分離された細胞の増強された治療上の効能を示唆する。
【表８】
0003218433.tif 000010
【表９】
0003218433.tif 000011
【０１２３】
結論
洗浄によって分離されるＳＶＦ細胞とは対照的に、機械的に分離された細胞は、至適基準であると今日まで考えられている、酵素的に分離された細胞と類似の改善された特性を示す。このことは、以下の特性において実証される。
【０１２４】
１．脂肪から分離される有核細胞の数
脂肪の機械的破壊は、コラゲナーゼ分離を用いて得られる量と類似のＳＶＦ細胞量を結果的に生じる。このことは、顕著により少ない量を示す、洗浄によって分離された（機械的破壊のない）ＳＶＦ細胞とは対照的であった。
【０１２５】
２．増殖能
機械的に分離されたＳＶＦの培養増殖は、７日間および１４日間の両方の後でコラゲナーゼ分離された細胞を用いて得られた量と類似の細胞量を生じた。このことは、培養において顕著により少ない増殖を示した、洗浄によって分離されたＳＶＦ細胞とは対照的であった。
【０１２６】
３．分化能
機械的に分離された細胞は、骨および脂肪の両方への分化能を示した。機械的に分離された細胞の脂肪分化能は、洗浄によって分離された細胞の脂肪分化能よりもはるかに優れていた。
【０１２７】
４．培養ＳＶＦ細胞の表面マーカー発現
継代０回で、機械的に分離された細胞は、期待された間葉系幹細胞表面マーカー発現パターンを示した。
【０１２８】
５．ＳＶＦにおける単球（＋）ＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートの比率
本データは、脂肪幹細胞を産生するそれらの増加した能力と相関する、洗浄分離された細胞と比較して機械的に分離された細胞でのこの集団内の細胞の比率の大きな増加を実証する。
【０１２９】
実施例５
図６および図７に示される本考案のさらなる装置へ移る。装置は、圧力濾過による間質血管画分（ＳＶＦ）細胞の機械的分離について図示される。図６中の装置は、１および２と指定される２つの拡張可能なコンテナから構成される。この２つのコンテナは、閉鎖された位置および開放された位置を有するシャッターによって分離される（図７）。
【０１３０】
例示的な実施形態によると、ＳＶＦ細胞の分離のための方法は、次のステップのうちの１つ以上を含む。
１．シャッターは閉鎖された位置にあり、２つのコンテナは接続されている。
２．脂肪吸引装置は真空入口へ接続される。吸引ポンプは真空１へ接続され、コンテナ１中へ脂肪吸引が実施される。
３．脂肪吸引終了時に吸引脂肪組織は５分間沈殿するままにされる。
４．真空ポンプは次に真空出口２へ接続され、脂肪吸引流体が真空排出される。
５．滅菌流体を次に真空入り口地点から脂肪へ添加し、コンテナを何度か逆さまにし、吸引脂肪組織を再度５分間沈殿するままにする。
６．液体を再度真空出口２から真空排出する。
７．滅菌流体を真空入り口地点から脂肪へ添加し、脂肪を流体と混合する。
８．コンテナを何度か逆さまにして脂肪を流体と混合する。
９．シャッターを開放位置へ直ちに変え、プランジャーを押下することによって脂肪を金属メッシュに通過させる。
１０．一旦全ての脂肪および流体がフィルタを通じてコンテナ２中に通過したらシャッターを閉じた位置にする。
１１．閉鎖されたシャッターの上からのアクセス流体を真空排出する。
１２．コンテナ２をコンテナ１から離し、脂肪は滅菌状態のままであり、その理由は上端が閉鎖されたシャッターによって閉じられるからである。
１３．コンテナを遠心分離し、ＳＶＦ細胞をコンテナの底部にあるチューブ様部分で濃縮する。
１４．ＳＶＦ細胞を針および注射器によって無菌的に分離する。
【図１】
0003218433.tif 000012
【図２】
0003218433.tif 000013
【図３】
0003218433.tif 000014
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月30日(2018.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】実用新案登録請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の脂肪組織から細胞集団を濃縮するための装置であって、
コンテナユニットへ脱離可能に接続された近位端および哺乳類の身体の少なくとも１つの空洞中へ挿入された遠位端を有し、コンテナ組立て体中へ脂肪組織を吸引するために使用する吸引チューブと、
細胞懸濁液を得るために前記コンテナ組立て体中で脂肪組織を機械的に破壊／破砕するために使用する機械的組織破壊装置であって、破壊が酵素を利用しない、機械的組織破壊装置と、
前記コンテナ組立て体内で細胞の前記懸濁液を任意に洗浄するために使用する洗浄手段と、
遠心分離機中へ前記コンテナ組立て体を任意に移送しかつ前記コンテナ組立て体を遠心分離してそれにより細胞ペレットを得るために使用する移送手段と、
前記コンテナ組立て体内から前記細胞ペレットを抽出してそれにより濃縮された細胞集団を得るために使用する抽出手段と、
を含む、装置。
【請求項２】
前記機械的組織破壊装置は、少なくとも１つの回転可能なブレードまたはロータを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記機械的組織破壊装置は、破砕用の球またはビーズを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記機械的組織破壊装置は、電気式操作部へ脱離可能に接続される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
前記コンテナ中へ吸引された前記脂肪組織は、前記洗浄手段によって機械的破壊／破砕の前に洗浄される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
機械的破壊／破砕に続いて前記細胞ペレットは、前記抽出手段によって相分離に続いて抽出される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７】
機械的破壊／破砕に続いて前記コンテナ組立て体は、前記移送手段によって遠心分離機へ移送されかつ遠心手段によって遠心分離されてそれにより細胞ペレットを得る、請求項１〜５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８】
前記機械的破壊／破砕は、前記機械的組織破壊装置によって洗浄溶液の添加なしで前記吸引脂肪組織溶液中で実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
細胞の前記懸濁液は、前記洗浄手段によって機械的破壊／破砕に続いて洗浄される、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
細胞の前記懸濁液は、機械的破壊／破砕に続いて前記洗浄手段によって洗浄されず、および前記細胞ペレットは、相分離に続いて前記抽出手段によって抽出される、請求項８に記載の装置。
【請求項１１】
前記洗浄溶液は、前記洗浄手段によって収集された吸引脂肪組織の前記機械的破壊中に前記コンテナ中へ漏斗で注がれる、請求項１〜５、７および９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１２】
前記洗浄溶液は、前記洗浄手段によって前記吸引脂肪組織が前記コンテナ中へ吹い込まれる前におよび次いで遠心分離の各ステップに続いて前記コンテナ中へ漏斗で注がれる、請求項１〜５、７および９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１３】
前記洗浄溶液は、細胞特異的抗体、緩衝剤、糖ベースの密度勾配、非糖密度勾配、抗体仲介性磁性細胞選別溶液および非磁性抗体仲介性細胞選別溶液から選択される少なくとも１つの追加の試薬をさらに含有する、請求項１〜５、７および９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１４】
前記濃縮された細胞集団を、特異的細胞集団に濃縮するための濃縮手段をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１５】
前記濃縮された細胞集団は、間質細胞画分（ＳＶＦ）である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１６】
前記ＳＶＦは、以下の、
約７〜約４０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）細胞および約６〜約３０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）細胞を有すること、ならびに／または
約４〜約１０パーセントの単球（＋）ＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートを有すること
の少なくとも１つにより特徴づけられる、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記ＳＶＦは、
約７〜約４０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）細胞および約６〜約３０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）細胞を有すること、ならびに
約４〜約１０パーセントの単球（＋）ＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートを有すること
により特徴づけられる、請求項１５に記載の装置。
【請求項１８】
前記ＳＶＦは、約７〜約４０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）細胞および約６〜約３０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）細胞を有することにより特徴づけられる、請求項１５に記載の装置。
【請求項１９】
前記ＳＶＦは、約４〜約１０パーセントの単球（＋）ＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートを有することにより特徴づけられる、請求項１５に記載の装置。
【請求項２０】
脂肪を分離するための分離手段をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項２１】
前記濃縮された細胞集団を受容する、操作するおよび前記濃縮された細胞集団の分離を可能にするよう適合されたコンテナ組立て体、
電気式操作部の付着を可能にするよう構成された閉鎖キャップ、
前記電気式操作部へ脱離可能に接続されおよび前記コンテナの基部へ隣接するが前記コンテナの基部と接触をもたない前記コンテナ組立て体内に配置された機械的組織破壊装置、
前記コンテナ組立て体の前記閉鎖キャップにおける入口を通じて吸引チューブを介して前記コンテナ中への脂肪組織の脂肪吸引を作動させる真空ポンプ
を備える、装置。
【請求項２２】
前記機械的組織破壊装置は、少なくとも１つの回転可能なブレードまたはロータを備える、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
前記機械的組織破壊装置は、破砕用の球またはビーズを備える、請求項２１に記載の装置。
【請求項２４】
圧力濾過によるＳＶＦ細胞の機械的分離のための装置であって、閉鎖位置および開放位置を有するシャッターによって分離可能な、２つの拡張可能なコンテナを備える、装置。
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月2日(2018.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】実用新案登録請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の脂肪組織から細胞集団を濃縮するための装置であって、
コンテナユニットへ脱離可能に接続された近位端および哺乳類の身体の少なくとも１つの空洞中へ挿入された遠位端を有し、コンテナ組立て体中へ脂肪組織を吸引するために使用する吸引チューブと、
細胞懸濁液を得るために前記コンテナ組立て体中で脂肪組織を機械的に破壊／破砕するために使用する機械的組織破壊装置であって、破壊が酵素を利用しない、機械的組織破壊装置と、
前記コンテナ組立て体内で細胞の前記懸濁液を任意に洗浄するために使用する洗浄手段と、
遠心分離機中へ前記コンテナ組立て体を任意に移送しかつ前記コンテナ組立て体を遠心分離してそれにより細胞ペレットを得るために使用する移送手段と、
前記コンテナ組立て体内から前記細胞ペレットを抽出してそれにより濃縮された細胞集団を得るために使用する抽出手段と、
を含む、装置。
【請求項２】
前記機械的組織破壊装置は、少なくとも１つの回転可能なブレードまたはロータを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記機械的組織破壊装置は、破砕用の球またはビーズを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記機械的組織破壊装置は、電気式操作部へ脱離可能に接続される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
前記コンテナ中へ吸引された前記脂肪組織は、前記洗浄手段によって機械的破壊／破砕の前に洗浄される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
機械的破壊／破砕に続いて前記細胞ペレットは、前記抽出手段によって相分離に続いて抽出される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７】
機械的破壊／破砕に続いて前記コンテナ組立て体は、前記移送手段によって遠心分離機へ移送されかつ遠心手段によって遠心分離されてそれにより細胞ペレットを得る、請求項１〜５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８】
前記機械的破壊／破砕は、前記機械的組織破壊装置によって洗浄溶液の添加なしで吸引脂肪組織溶液中で実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
細胞の前記懸濁液は、前記洗浄手段によって機械的破壊／破砕に続いて洗浄される、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
細胞の前記懸濁液は、機械的破壊／破砕に続いて前記洗浄手段によって洗浄されず、および前記細胞ペレットは、相分離に続いて前記抽出手段によって抽出される、請求項８に記載の装置。
【請求項１１】
洗浄溶液は、前記洗浄手段によって収集された吸引脂肪組織の前記機械的破壊中に前記コンテナ中へ漏斗で注がれる、請求項１〜５、７および９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１２】
洗浄溶液は、前記洗浄手段によって前記吸引脂肪組織が前記コンテナ中へ吹い込まれる前におよび次いで遠心分離の各ステップに続いて前記コンテナ中へ漏斗で注がれる、請求項１〜５、７および９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１３】
洗浄溶液は、細胞特異的抗体、緩衝剤、糖ベースの密度勾配、非糖密度勾配、抗体仲介性磁性細胞選別溶液および非磁性抗体仲介性細胞選別溶液から選択される少なくとも１つの追加の試薬をさらに含有する、請求項１〜５、７および９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１４】
前記濃縮された細胞集団を、特異的細胞集団に濃縮するための濃縮手段をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１５】
前記濃縮された細胞集団は、間質細胞画分（ＳＶＦ）である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１６】
前記ＳＶＦは、以下の、
約７〜約４０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）細胞および約６〜約３０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）細胞を有すること、ならびに／または
約４〜約１０パーセントの単球（＋）ＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートを有すること
の少なくとも１つにより特徴づけられる、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記ＳＶＦは、
約７〜約４０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）細胞および約６〜約３０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）細胞を有すること、ならびに
約４〜約１０パーセントの単球（＋）ＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートを有すること
により特徴づけられる、請求項１５に記載の装置。
【請求項１８】
前記ＳＶＦは、約７〜約４０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ＣＤ３４（＋）細胞および約６〜約３０パーセントのＣＤ４５（−）ＣＤ７３（＋）ＣＤ２９（＋）細胞を有することにより特徴づけられる、請求項１５に記載の装置。
【請求項１９】
前記ＳＶＦは、約４〜約１０パーセントの単球（＋）ＣＤ３４（＋）細胞のＣＤ４５（−）ＣＤ３１（−）ゲートを有することにより特徴づけられる、請求項１５に記載の装置。
【請求項２０】
脂肪を分離するための分離手段をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項２１】
濃縮された細胞集団を受容する、操作するおよび前記濃縮された細胞集団の分離を可能にするよう適合されたコンテナ組立て体、
電気式操作部の付着を可能にするよう構成された閉鎖キャップ、
前記電気式操作部へ脱離可能に接続されおよびコンテナの基部へ隣接するが前記コンテナの基部と接触をもたないコンテナ組立て体内に配置された機械的組織破壊装置、
前記コンテナ組立て体の前記閉鎖キャップにおける入口を通じて吸引チューブを介して前記コンテナ中への脂肪組織の脂肪吸引を作動させる真空ポンプ
を備える、装置。
【請求項２２】
前記機械的組織破壊装置は、少なくとも１つの回転可能なブレードまたはロータを備える、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
前記機械的組織破壊装置は、破砕用の球またはビーズを備える、請求項２１に記載の装置。
【請求項２４】
圧力濾過によるＳＶＦ細胞の機械的分離のための装置であって、
前記装置は、２つの拡張可能なコンテナと、閉鎖位置および開放位置を有するシャッターとを備え、
前記２つの拡張可能なコンテナは、前記シャッターによって分離可能に設けられている、装置。