(57)【要約】  本発明は、対象内の自閉症スペクトル障害（ＡＳＤ）を診断するためのシステム、装置、コレクション、技術および方法、加えて治療方法に関する。 具体的には、本開示は、マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）のダイレクトシーケンシングを利用するシステム、装置、コレクション、技術および方法、または対象からの生体試料中に存在している相補的核酸との核酸ハイブリダイゼーションを受け得るリボヌクレオチド配列を有するｍｉＲＮＡプローブの使用に関する。対象がＡＳＤを有するか否か決定するために、試料中にｍｉＲＮＡプローブのハイブリダイゼーションを検出してもよい。本明細書に説明した方法を用いてＡＳＤを検出することで対象に治療指針がもたらされ得る。
2018504123.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３および１４を含んでなる群から選択されるリボヌクレオチド配列を有するプローブセットを有してなる２つ以上のｍｉＲＮＡプローブのコレクション。
【請求項２】
前記コレクションが、生体試料に存在するｍｉＲＮＡに対する１４個のｍｉＲＮＡプローブの相対比率が１以上であることを含んでなる、請求項１に記載のコレクション。
【請求項３】
固体支持体および
固体支持体に付着した請求項１に記載のコレクション
を含んでなる、ｍｉＲＮＡマイクロアレイ。
【請求項４】
対象が、自閉症スペクトル障害を有するか否かを診断する方法であって、
自閉症スペクトル障害を有する可能性のある対象から生体試料を得ること；
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３および１４を含んでなる群から選択されるリボヌクレオチド配列を有するプローブセットを有してなる１つ以上のｍｉＲＮＡプローブのコレクションを提供すること；
該プローブを、生体試料に存在している場合の相補的核酸分子にハイブリダイゼーションさせるために効果的な条件下で、対象からの生体試料を該コレクションと接触させること；
該接触の結果として任意のハイブリダイゼーションを検出すること；および
該検出に基づき対象が自閉症スペクトル障害を有するか否か同定すること
を含んでなる、方法。
【請求項５】
前記同定に基づき治療指針を実行することをさらに含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記治療指針が、次の１つ以上を含む、請求項５に記載の方法：追加診断試験の実行、薬物療法の処方、対象の自閉症スペクトル障害のモニタリング頻度の増加、行動療法およびライフスタイル選択の推奨またはそれらの組み合わせ。
【請求項７】
前記治療指針が、ライフスタイルの選択の推奨を含み、かつ次の１つ以上を含む、請求項６に記載の方法：行動療法の導入、時間管理および課題整理、環境的変化の導入、食生活の変更、運動の変更またはそれらの組み合わせ。
【請求項８】
前記コレクションが、試料に存在するその他のｍｉＲＮＡに対する１４個のｍｉＲＮＡプローブの相対比率が１以上であることを含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記生体試料が、唾液、尿、便、血清、血漿、脳組織または脳脊髄液である、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出が、マイクロアレイ、Ｌｕｍｉｎｅｘ系磁気ビーズまたはＬｕｍｉｎｅｘ系非磁気ビーズ、ノーザンブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ＲＮＡ−ＳｃｏｐｅおよびＳＭＡＲＴ  Ｆｌａｒｅを含む定量的ハイブリダイゼーション系アッセイによって実行される、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出によってｍｉＲＮＡ発現レベルが測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出が、オリゴヌクレオチドプローブ、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎまたは類似の染料でのリアルタイム定量的ＰＣＲ、放射性ヌクレオチド系定量化、およびデジタルドロップレットＰＣＲを含むポリメラーゼ連鎖反応アッセイによって実行される、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
対象が、自閉症スペクトル障害を有するか否か診断する方法であって、
自閉症スペクトル障害を有する可能性のある対象から生体試料を得ること；
生体試料をダイレクトシークエンシング法にかけて生体試料中の核酸分子のヌクレオチド配列情報を提供すること；
生体試料中の核酸分子のヌクレオチド配列情報と、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３および１４を含んでなるプローブセットから選択される１つ以上のｍｉＲＮＡプローブのコレクションのヌクレオチド配列とを比較すること；
１つ以上のｍｉＲＮＡプローブまたはそれらの相補体の任意のコレクションが、生体試料中に存在しているか測定し、かつそれらの発現レベルおよび該比較に基づき互いに対しての発現の相対レベルを測定すること；および
該測定に基づき対象が自閉症スペクトル障害を有するか否か同定すること
を含んでなる、方法。
【請求項１４】
前記同定に基づき治療指針を実行することをさらに含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療指針が、次の１つ以上を含む、請求項１４に記載の方法：追加診断試験の実行、薬物療法の処方、対象の病態のモニタリング頻度の増加、行動療法およびライフスタイル選択の推奨またはそれらの組み合わせ。
【請求項１６】
前記治療指針が、ライフスタイルの選択の推奨を含み、かつ次の１つ以上を含む、請求項１４に記載の方法：行動療法の導入、時間管理および課題整理、環境的変化の導入、食生活の変更、運動の変更またはそれらの組み合わせ。
【請求項１７】
前記コレクションが、生体試料に存在する他のｍｉＲＮＡに対する１４個のｍｉＲＮＡプローブの相対比率が１以上であることを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記生体試料が、唾液、尿、便、血清、脳組織または脳脊髄液である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
対象が、自閉症スペクトル障害を有するか否か測定するための好適なキットであって、
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３および１４を含んでなる群から選択されるリボヌクレオチド配列を有するプローブセットを有してなる２つ以上のｍｉＲＮＡプローブを含んでなるキット。
【請求項２０】
前記２つ以上のｍｉＲＮＡプローブに付着した固体支持体をさらに含んでなる、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
（ａ）陰性対照として用いる、１つのランダムに生成した配列；（ｂ）全ＲＮＡ分解のための標準化対照として用いる、ハウスキーピング遺伝子に由来する、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列；または（ｃ）陽性対照として用いる、少なくとも１つのランダムに生成した配列
の少なくとも１つをさらに含んでなる、請求項１９に記載のキット。
【請求項２２】
対象における自閉症スペクトル障害の治療方法であって、
対象から生体試料を得ること；
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３および１４を含んでなる群から選択されるリボヌクレオチド配列を有するプローブセットを有してなる１つ以上のｍｉＲＮＡプローブのコレクションを提供すること；
該プローブを、生体試料に存在している場合の相補的核酸分子にハイブリダイゼーションさせるために効果的な条件下で、生体試料を該コレクションと接触させること；
該接触の結果として任意のハイブリダイゼーションを検出すること；
該検出に基づき対象が自閉症スペクトル障害を有するか否か同定すること；および
該同定に基づき治療指針を実行すること
を含んでなる、方法。
【請求項２３】
対象における自閉症スペクトル障害の治療方法であって、
自閉症スペクトル障害を有する可能性のある対象から生体試料を得ること；
生体試料をダイレクトシークエンシング法にかけて生体試料中の核酸分子のヌクレオチド配列情報を提供すること；
生体試料中の核酸分子のヌクレオチド配列情報と、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３および１４を含んでなるプローブセットから選択される１つ以上のｍｉＲＮＡプローブのコレクションのヌクレオチド配列とを比較すること；
１つ以上のｍｉＲＮＡプローブまたはそれらの相補体の任意のコレクションが、生体試料中に存在しているか測定し、かつそれらの発現レベルおよび該比較に基づき互いに対しての発現の相対レベルを測定すること；
該測定に基づき対象が自閉症スペクトル障害を有するか否か同定すること；および
該同定に基づき治療指針を実行すること
を含んでなる、方法。
【請求項２４】
前記固体支持体が、スワブ、唾液コレクションバイアルおよび／またはＰＣＲアレイプレートを含んでなる、請求項３に記載のマイクロアレイ。
【請求項２５】
前記固体支持体が、スワブ、唾液コレクションバイアルおよび／またはＰＣＲアレイプレートを含んでなる、請求項３に記載のキット。
【請求項２６】
前記相対比が、１．５：１〜２．５：１である、請求項２に記載のコレクション。
【請求項２７】
前記相対比が、１．５：１〜２．５：１である、請求項８に記載の方法。
【請求項２８】
前記相対比が、１．５：１〜２．５：１である、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２０１５年１２月４日に出願された、米国仮特許出願番号第６２／２６３，４６７号および２０１５年１月２１日に出願した第６２／１０６，１０７号について優先権を主張するものであり、それらについて引用することによりそれぞれ全文を本明細書中に統合する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、対象内の自閉症スペクトル障害を診断するためのシステム、装置、コレクション、技術および方法、さらに治療方法に関する。 具体的には、本開示は、マイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）のダイレクトシーケンシングを利用するシステム、装置、コレクション、技術および方法、または対象からの生体試料中に存在している相補的核酸との核酸ハイブリダイゼーションを受け得るリボヌクレオチド配列を有するｍｉＲＮＡプローブの使用に関する。対象が自閉症スペクトル障害を有するか否か決定するために、試料中にｍｉＲＮＡプローブのハイブリダイゼーションを検出してもよい。本明細書に説明した方法を用いて自閉症スペクトル障害を検出することで対象に治療指針(therapy guidance)がもたらされ得る。
【０００３】
発明の背景
自閉症スペクトル障害（ＡＳＤ）は、社会的コミュニケーションおよび社会的交流の持続的な不足、ならびに限定された反復的行動パターン等の症状を特徴とする神経発達性特徴および／または障害の連続体である。これら症状は、早期児童発達（即ち、寿命の最初の２年間）に存在し得、それは社会的、職業的または人生のその他の重要領域において臨床的に顕著な障害を引き起こし得る。２０１０年アメリカ疾病予防管理センター（Center for Disease Control and Prevention）８歳児の健康記録および学校記録の調査によれば、ＡＳＤは、米国内で約６８人中１人に影響している。ＡＳＤの患者数にかかわらず、ＡＳＤには十分なスクリーニングツールが不足し、しばしば診断や治療的発明が遅れている。 
【０００４】
小児科医は、早期診断および根拠に基づく行動療法を照会することを通じて、ＡＳＤを有する児童のために予後を改善させる機会がある。残念ながら、一般的に小児科医が認識するＡＳＤの最初の兆候は、１８〜２４か月の年齢まで現れないコミュニケーションおよび言語の不足である。確かに、早期治療的介入によって、後の人生において患者の予後を顕著に改善し得るため、ＡＳＤの早期検出は重要である。
【０００５】
この年齢グループのＡＳＤ用の現行スクリーニングツールは、乳児チェックリスト（ＩＴＣ；コミュニケーションおよびシンボル行動基準ならびに発育プロファイル（Communication and Symbolic Behavior Scales and Developmental Profile）とも知られている）および幼児自閉症用修正チェックリスト（Modified Checklist for Autism in Toddlers）（Ｍ−ＣＨＡＴ）を含む。ＩＴＣは、年齢９〜２４か月の児童における発育不足を同定するために使用し得るが、顕在的なＡＳＤからの基本的コミュニケーション遅れを区別するための利用には制限がある。Ｍ−ＣＨＡＴは、１６〜３０か月の間に使用し得る。しかしながら、児童の１０％に発生するスクリーング陽性(positive screens)には、追跡アンケートが必要である。よって、ＡＳＤを有する児童の平均診断年齢は３歳前後であり、およそこの半数は、偽陽性であり得る。
【０００６】
ＡＳＤは、実質的遺伝要素を含み、２０００個近い個別遺伝子がＡＳＤに関係することを示してきた。しかしながら、ＡＳＤはこの実質的遺伝要素を含むものの、障害に特異的な遺伝子変異体は一つもない。具体的には、ＡＳＤ罹患率の１％超の割合を占める遺伝子変異体は一つもないため、疾患のスクリーニングの困難性を高めている。
【０００７】
バイオマーカースクリーニングは、出生後いつでも実施することができ、ＡＳＤスクリーニングツールキットの魅力的な付加物の代表である。上記に言及したように、ＡＳＤには顕著な遺伝要素が存在している。ＡＳＤ合致率は、一卵性双生児においては５０〜９０％、対して二卵性双生児においては０〜３０％であり、一方親が同じ兄弟姉妹は、片方の親が違う兄弟姉妹より２倍高い合致率を有していた。これら数字は、ＡＳＤ遺伝性は、５０％にもなり得ることを示唆するものである。潜在的伝達モードには、コピー数の変動、単一ヌクレオチドの変動、および単独遺伝子欠失が含まれる。
【０００８】
ＡＳＤの病因の代替的機序には、エピジェネティック調節／機序を含み、ｍｉＲＮＡを含むこれらエピジェネティック機序は、神経発達性遺伝子のネットワークを修正することでＡＳＤ表現型に寄与し得る。ｍｉＲＮＡの細胞外輸送（エキソソームおよび他の微小胞を介した）は、細胞がそれ自体の遺伝子発現およびそれらの周りの細胞中の遺伝子の発現を修正できることによる確立したエピジェネティック機序である。細胞が周りの遺伝子の発現を修正するためには、小胞性ｍｉＲＮＡを細胞外空間へ押出すことであり、このｍｉＲＮＡは隣接細胞にドッキングして進入し、ｍＲＮＡがタンパク質へ翻訳されることを妨害する。
【０００９】
よって、好ましくは幼児期の早期に、ＡＳＤを正確に診断する改善したスクリーニングツールの必要性が存在している。加えて、無痛性で非侵襲的にＡＳＤを検出できるスクリーニングツールの必要性が存在している。
【発明の概要】
【００１０】
一つの態様において、プローブセットを有してなる２つ以上のｍｉＲＮＡプローブのコレクションは、
AUGCUGACAUAUUUACUAGAGG, UCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU, UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC, UUUUUCAUUAUUGCUCCUGACC, UGAGGCUCUGUUAGCCUUGGCUC, UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG, AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG, CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG, AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC, AACAACAAAAUCACUAGUCUUCCA, UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU, UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU, UAUUGCACAUUACUAAGUUGCAまたは UACCACAGGGUAGAACCACGG（それぞれ配列番号１〜１４）から選択されるリボヌクレオチド配列を含み得る。一実施態様において、コレクションは、生体試料中に存在しているｍｉＲＮＡに対する14個のｍｉＲＮＡプローブの相対比率を１以上で含み得る。相対比率は、１．５：１〜２．５：１の間であってもよい。一実施態様において、ｍｉＲＮＡマイクロアレイは固体支持体を含んでもよく、２つ以上のｍｉＲＮＡプローブのコレクションを固体支持体に付着させてもよい。固体支持体は、スワブ、唾液採取バイアルまたはアッセイプレートであってもよい。
【００１１】
一態様において、対象が自閉症スペクトル障害を有するか否か診断する方法には、自閉症スペクトル障害を有する可能性のある対象から生体試料を得ること；配列番号１〜１４から選択されるリボヌクレオチド配列を有するプローブセットを有してなる１つ以上のｍｉＲＮＡプローブのコレクションを提供すること；プローブを、生体試料に存在している場合の相補的核酸分子にハイブリダイゼーションさせるために効果的な条件下で、対象からの生体試料をコレクションと接触させること；生体試料をコレクションと接触させた結果として任意のハイブリダイゼーションを検出すること；ならびに生体試料中にプローブおよび核酸分子のハイブリダイゼーションが存在しているか否かに基づき(based on whether hybridization of the probes and nucleic acid molecules in the biological sample)対象が自閉症スペクトル障害を有するか否か同定することが含まれる。
【００１２】
一実施態様において、上記方法には、対象が自閉症スペクトル障害を有する場合、治療指針を実行することが含まれる 。治療指針には、次の１つ以上が含まれ得る：追加診断試験の実行、薬物療法の処方、対象の自閉症スペクトル障害のモニタリング頻度の増加、行動療法(behavioral therapy)およびライフスタイル選択の推奨またはそれらの組み合わせ。上記治療指針には、次のようなライフスタイルの選択の推奨が含まれ得る：行動療法(behavioral techniques)の導入、時間管理および課題整理、環境的変化の導入、食生活の変更、運動の変更またはそれらの組み合わせ。
【００１３】
一実施態様において、コレクションは、生体試料に存在するｍｉＲＮＡに対する１４個のｍｉＲＮＡプローブを相対比率１以上で含む。相対比率は、１．５：１〜２．５：１の間であってもよい。一実施態様において、生体試料は、唾液、尿、便、血清、血漿、脳組織、脳脊髄液および／または血液であってもよい。一実施態様において、ハイブリダイゼーションの検出は、マイクロアレイ、Ｌｕｍｉｎｅｘ系磁気ビーズまたはＬｕｍｉｎｅｘ系非磁気ビーズ、ノーザンブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ＲＮＡ−ＳｃｏｐｅおよびＳＭＡＲＴ  Ｆｌａｒｅを含む、定量的ハイブリダイゼーション系アッセイによって実施してもよい。別の実施態様において、ハイブリダイゼーションの検出は、ｍｉＲＮＡ発現レベルを測定し得る。さらに別の実施態様において、ハイブリダイゼーションの検出は、オリゴヌクレオチドプローブ、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎもしくは類似の染料でのリアルタイム定量的ＰＣＲ、放射性ヌクレオチド系定量化またはデジタル液滴ＰＣＲを含む、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイによって実施してもよい。
【００１４】
一態様において、対象が自閉症スペクトル障害を有するか否か診断する方法には、自閉症スペクトル障害を有する可能性のある対象から生体試料を得ること；生体試料をダイレクトシークエンシング法にかけて生体試料中の核酸分子のヌクレオチド配列情報を提供すること；生体試料中の核酸分子のヌクレオチド配列情報と、配列番号１〜１４またはUACCACAGGGUAGAACCACGGから選択された１つ以上のｍｉＲＮＡプローブのコレクションのヌクレオチド配列とを比較すること；１つ以上のｍｉＲＮＡプローブまたはそれらの相補体の任意のコレクションが、生体試料中に存在しているか否か測定し、かつヌクレオチド配列情報の比較に基づき、１つ以上のｍｉＲＮＡプローブまたはそれらの相補体の任意のコレクションの発現レベルおよび互いに対しての発現の相対レベルを測定すること；ならびに試料中に１つ以上のｍｉＲＮＡプローブまたはそれらの相補体の任意のコレクションが存在しているか否かの測定に基づき、対象が自閉症スペクトル障害を有するか否か同定することが含まれる。
【００１５】
一実施態様において、さらに方法には、対象が自閉症スペクトル障害を有する場合、治療指針を実行することが含まれる 。治療指針には、次の１つ以上が含まれ得る：追加診断試験の実行、薬物療法の処方、対象の病態のモニタリング頻度の増加、行動療法およびライフスタイル選択の推奨またはそれらの組み合わせ。治療指針には、次の１つ以上のようなライフスタイルの選択の推奨が含まれていてもよい：行動方法の導入、時間管理および課題整理、環境的変化の導入、食生活の変更、運動の変更またはそれらの組み合わせ。
【００１６】
一態様において、対象が自閉症スペクトル障害を有するか否か測定するための好適なキットは、配列番号１〜１４から選択されたリボヌクレオチド配列を有するプローブセットを有してなる２つ以上のｍｉＲＮＡプローブを含んで提供される。一実施態様において、さらにキットは、２つ以上のｍｉＲＮＡプローブに付着させた固体支持体を含んでいてもよい。一実施態様において、さらにキットは、次の少なくとも１つを含んでいてもよい：（ａ）陰性対照として用いるために適合させた、１つのランダムに生成したｍｉＲＮＡ配列；（ｂ）全ＲＮＡ分解のための標準化対照として用いる、ハウスキーピング遺伝子に由来する、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列；または（ｃ）陽性対照として用いる、少なくとも１つのランダムに生成した配列。
【００１７】
一態様において、対象における自閉症スペクトル障害の治療方法には、対象から生体試料を得ること；配列番号１〜１４またはUACCACAGGGUAGAACCACGGから選択されるリボヌクレオチド配列を有するプローブセットを有してなる１つ以上のｍｉＲＮＡプローブのコレクションを提供すること；プローブを、生体試料に存在している場合の相補的核酸分子にハイブリダイゼーションさせるために効果的な条件下で、生体試料をコレクションと接触させること；生体試料をｍｉＲＮＡプローブのコレクションと接触させた結果として任意のハイブリダイゼーションを検出すること；ハイブリダイゼーションの検出に基づき対象が自閉症スペクトル障害を有するか否か同定すること；および対象が自閉症スペクトル障害を有すると同定したことに基づき治療指針を実行することが含まれる。
【００１８】
一態様において、対象における自閉症スペクトル障害の治療方法には、自閉症スペクトル障害を有する可能性のある対象から生体試料を得ること；生体試料をダイレクトシークエンシング法にかけて生体試料中の核酸分子のヌクレオチド配列情報を提供すること；生体試料中の核酸分子のヌクレオチド配列情報と、配列番号１〜１４を含むプローブセットから選択される１つ以上のｍｉＲＮＡプローブのコレクションのヌクレオチド配列とを比較すること；１つ以上のｍｉＲＮＡプローブまたはそれらの相補体の任意のコレクションが、生体試料中に存在しているか否か測定し、かつヌクレオチド配列情報の比較に基づき、１つ以上のｍｉＲＮＡプローブおよび／またはそれらの相補体のコレクションの発現レベルおよび互いに対しての発現の相対レベルを測定すること；生体試料中に１つ以上のｍｉＲＮＡプローブおよび／またはそれらの相補体の任意のコレクションが存在しているか否かの測定に基づき、対象が自閉症スペクトル障害を有するか否か同定すること；ならびに対象が自閉症スペクトル障害を有すると発見された場合、治療指針を実行することが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、対象の特徴の表である。
【図２】図２は、対照の対象からＡＳＤ対象を区別した上位に順位づけされた変数およびそれらの神経発達の程度(neurodevelopment measures)との相関関係を示した表である。
【図３】図３は、対照の対象からＡＳＤ対象を区別した上位に順位づけされた変数に対応するｍｉＲＮＡ配列を示した表である。
【図４Ａ−Ｃ】図４Ａは、上位１４個のｍｉＲＮＡの階層的クラスター分析を示す図である。図４Ｂは、上位１４個のｍｉＲＮＡの部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を示す図である。図４Ｃは、トレーニングデータセットのＲＯＣ−ＡＵＣ分析を示す図であり、ロジスティック回帰分類試験において非常に高いレベルの性能が示された（ＡＵＣ０．９７で感度１００％、特異性９０％）。
【図５Ａ−Ｃ】図５Ａは、０．９２の全体ＲＯＣ−ＡＵＣならびに３つのＡＳＤおよび４つの対象の誤分類を示すＲＯＣ−ＡＵＣ分析を示した図である。図５Ｂは、ＩＤ番号によって同定した誤って分類された対象とともに、ＭＣＣＶからの確率によりプロットした対象の分類を示した図である。図５Ｃは、マン＝ホィットニー検定による最も強く変化した４つのｍｉＲＮＡの箱ひげ図を示す。
【発明の具体的説明】
【００２０】
本発明のシステム、装置、コレクションおよび方法は、一般に患者の生体試料を試験してその患者が自閉症スペクトル障害を有するか否か決定するために用いることができる。具体的には、本開示では、ＡＳＤを検出するためのプローブセットを含んでなり得る、図２および３に配列番号１〜１４として列挙された１４個のｍｉＲＮＡが提供される。図２および３に列挙された、配列番号１〜１４に対応するｍｉＲＮＡ 配列は（順番に）、AUGCUGACAUAUUUACUAGAGG, UCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU, UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC, UUUUUCAUUAUUGCUCCUGACC, UGAGGCUCUGUUAGCCUUGGCUC, UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG, AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG, CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG, AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC, AACAACAAAAUCACUAGUCUUCCA, UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU, UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU, UAUUGCACAUUACUAAGUUGCAおよびUACCACAGGGUAGAACCACGGである。しかしながら、当業者であれば、任意の数の、ＡＳＤと高い統計的相関関係を有するｍｉＲＮＡが、ＡＳＤを検出するためのプローブセットを含んでなり得ることに気付くであろうことを理解されよう。
【００２１】
エピジェネティック調節機序の細胞外本質によって、単純な唾液の採取を通じて中枢神経系からの遺伝物質の測定が可能となるため、本発明の開示は、多くの先行技術の方法の制限（例えば、死後脳組織（例えば、無酸素脳損傷、ＲＮＡ分解、死後インターバル、死戦状態）または末梢白血球（発現変化の関連性、有痛性採血）の分析に関する制限）を最小化する方法を提供する。よって、唾液中の細胞外ｍｉＲＮＡ定量化は、ＡＳＤを有する児童におけるバイオマーカー同定のための魅力的で最小限に侵襲的な技術を提供する。従って、ＡＳＤ対象の唾液には、ＡＳＤ分類の予測であり、適合行動の神経発達性程度に関連する、脳関連ｍｉＲＮＡの差次的発現が検出され得る。
【００２２】
各ｍｉＲＮＡプローブは、特定の環境条件下で相補的リボヌクレオチド配列が生体試料中に存在している際に核酸ハイブリダイゼーションを受けるために、適合させてもよい。ハイブリダイゼーションは、例えば、温度、ｐＨおよび／またはプローブ暴露の継続時間等の環境的条件が修正された（即ち、増加されたまたは減少された）際に達成することができる。一つの例として、ｍｉＲ−６２８−５ｐ、AUGCUGACAUAUUUACUAGAGGに相当する第一ｍｉＲＮＡプローブを有するプローブは、その相補的配列UACGACUGUAUAAAUGAUCUCCとハイブリダイゼーションするために適合させてもよい。
【００２３】
相補的リボ核酸配列は、自閉症スペクトル障害と高い統計的相関関係を有するか否か、または自閉症スペクトル障害を指示するリボ核酸配列（ribonucleic sequence）に相当し得る。よって、生体試料中のハイブリダイゼーションしたリボ核酸配列（ribonucleic sequence）を検出することで、試料中に存在していた相補的リボ核酸配列（ribonucleic sequence）は、対象における自閉症スペクトル障害の存在を終局的に同定するために同定され得る。 
【００２４】
例示的方法では、自閉症スペクトル障害を有する可能性のある対象から生体試料を抽出し得る（いくつかの態様では、例えば、ＲＮＡ抽出を通して精製もしてよい）。生体試料の非限定的例として、唾液、尿、便、血清、血漿、脳組織、脳脊髄液および／または血液が挙げられる。上記の列挙した生体試料は、無痛性、非侵襲性採取が可能となるｍｉＲＮＡの細胞外利用可能性の理由から、幾つかの態様において好適であり得る。
【００２５】
唾液が生体試料として採取された例では、使用した場合の精製方法には、例えば、TRI Reagent LS を用いたOrageneＲＮＡ精製プロトコル、TriZol精製方法または類似の方法による唾液ＲＮＡの精製が含まれてもよい。Oragene精製プロトコルは、概して複数の部分を含む。第一部では、試料を８秒間以上激しく振り、試料を元のバイアル中で５０℃にて水浴内で１時間、またはエア・インキュベーター内で２時間インキュベートさせる。第二部では、２５０−５００μＬアリコートの唾液を微小遠心管に移し、微小遠心管を１５分間９０℃でインキュベートし、室温に冷まし、微小遠心管を１０分間氷上でインキュベートし、唾液試料を３分間最大速度（＞１３，０００ｘｇ）で遠心分離させ、透明な上澄みを新しい微小遠心管に移して沈殿物を廃棄し、２容量の冷９５％ＥｔＯＨを透明な上澄みに添加して混合し、上澄み混合物を３０分間−２０℃でインキュベートし、微小遠心管を最大速度で遠心分離させ、沈殿物を回収する一方で上澄みを廃棄し、沈殿物を３５０μＬの緩衝ＲＬＴ中に溶解させ、３５０μＬの７０％ＥｔＯＨを、溶解したペレット混合物に添加し、ボルテックスして混合する。初めの２つの部分の後にQiagen RNeasy クリーンアップ手順が続いてもよい。
【００２６】
精製方法にはさらに、例えば、QiagenによるRNeasyミニスピンカラムを用いた唾液試料の精製などの第二精製工程が含まれてもよい。当業者であれば、生体試料の精製には、任意の好適な順番で任意の好適な工程数が含まれてもよいことを認識するであろう。精製方法は、対象から採取された生体試料の種類に基づき異なっていてもよい。精製された生体試料の収量および品質は、例えば、ＲＮＡの収量および品質が、既定の閾値を超えているか否か測定するために、Agilent Bioanalyzer等の装置を介して評価し得る。 
【００２７】
生体試料を生成した後、１つ以上のｍｉＲＮＡプローブのコレクションをプローブセットから提供し得る。上記で言及したように、プローブセットには、図２および３に列挙されたリボヌクレオチド配列が含まれ得る。よって、コレクションは、プローブセットからのｍｉＲＮＡプローブのサブセットまたはプローブセットからの全ｍｉＲＮＡプローブを含んでなり得る。当業者であれば、本開示を考慮した後に、コレクションには、プローブセットから任意の好適な数のｍｉＲＮＡプローブ（例えば、１個のｍｉＲＮＡプローブ、２個のｍｉＲＮＡプローブ、３個のｍｉＲＮＡプローブ、４個のｍｉＲＮＡプローブ、５個のｍｉＲＮＡプローブ、６個のｍｉＲＮＡプローブ、７個のｍｉＲＮＡプローブ、８個のｍｉＲＮＡプローブ、９個のｍｉＲＮＡプローブ、１０個のｍｉＲＮＡプローブ、１１個のｍｉＲＮＡプローブ、１２個のｍｉＲＮＡプローブ、１３個のｍｉＲＮＡプローブまたは１４個のｍｉＲＮＡプローブ）が含まれてなり得ることを認識するであろう。
【００２８】
本発明の一態様において、コレクションには、１つ以上の上記ｍｉＲＮＡプローブの生体試料中に存在している相補的ｍｉＲＮＡに対する相対比を含んでなっていてもよい。一つの例として、１：１、１．５：１、１：２、１：３、２．５：１、２：３、１：４または１：５の比を用いてもよいが、当業者であれば、特定のｍｉＲＮＡの生体試料中の相補的ｍｉＲＮＡに対する任意の好適な比を用いてもよいことを認識するであろう。
【００２９】
ｍｉＲＮＡプローブコレクションは、精製した試料に適用して（または接触させて）、特定の環境条件下で、核酸ハイブリダイゼーションを達成してもよい（例えば、制御した温度およびｐＨの環境下でｍｉＲＮＡプローブと相補的核酸とを接触させる）。プローブコレクションを精製した試料に接触させた後、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを実行することにより、任意のハイブリダイゼーションを検出し得る。別の態様において、ハイブリダイゼーションの検出には、オリゴヌクレオチドのプライマーもしくはプローブ、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ、ＦＡＭ、ＲＯＸまたは類似の蛍光染料でのリアルタイム定量的逆転写（ＲＴ）ＰＣＲ、放射性ヌクレオチド系定量化および／またはデジタル液滴定量的ＰＣＲが含まれていてもよい。
【００３０】
別の態様において、ｍｉＲＮＡレベルの検出および／または測定は、多種多様な技術によって実行することができ、限定することなく次のものを含む：シーケンサーを用いた生体試料のダイレクトシーケンシング；上記ｍｉＲＮＡプローブ等のヌクレオチドプローブでのマイクロアレイ；ヌクレオチドプローブでのＬｕｍｉｎｅｘ系磁気ビーズおよび／またはＬｕｍｉｎｅｘ系非磁気ビーズ；ヌクレオチドプローブおよび／またはカスタムしたプライマーでのＰＣＲ；カスタムしたプロテクションプローブでのＲＮａｓｅプロテクションアッセイ；ヌクレオチド系プローブでのノーザンブロット；カスタムしたハイブリダイゼーションプローブでのＲＮＡｓｃｏｐｅおよびＳｍａｒｔ  Ｆｌａｒｅ；ならびに放射性ヌクレオチド取り込み流出（radioactive nucleotide incorporation run-off）およびＰＣＲ系定量化。
【００３１】
生体試料にダイレクトシーケンシング方法（例えば、ショットガンシーケンシングまたはダイレクトシーケンシング）をかけて、生体試料中の核酸分子のヌクレオチド配列情報がもたらされた場合、生体試料中の核酸分子に対するヌクレオチド配列情報は、公知のヌクレオチド配列（例えば、配列番号１〜１４を有する、図２および３中の１つ以上のヌクレオチド配列）と比較させてもよい。上記で言及したヌクレオチド配列（またはそれらの相補体）の１つ以上が検出された場合、生体試料中のヌクレオチド配列の発現レベルおよび／または互いに対する発現の相対レベルを測定し得る。発現のレベルは、一致した配列と既知の配列との比率として正規化されたかまたは報告された「リードカウント」（既知のｍｉＲＮＡ配列と一致した配列）を通じて測定し得る。自閉症スペクトル障害は、１つ以上のヌクレオチド配列（またはそれらの相補体）の検出に基づき、対象内に同定され得る。加えて、ヌクレオチド配列の発現のレベルおよび／または互いに対するヌクレオチド配列の発現の相対レベルを、対象中に自閉症スペクトル障害を同定するために用いてもよい。
【００３２】
本開示は、自閉症スペクトル障害を検出するためのｍｉＲＮＡマイクロアレイも提供する。ｍｉＲＮＡマイクロアレイには、例えば、スワブ等の固体支持体が含まれていてもよい。別の態様では、固体支持体は、アッセイプレートまたは唾液採取バイアルであってもよい。固体支持体は、それに付着した上記のプローブセットからの１つ以上のｍｉＲＮＡを含んでなっていてもよい。  
【００３３】
さらに本開示は、対象が自閉症スペクトル障害を有するか否か測定するためのキットを提供する。キットには、図２および３に示されているような次のｍｉＲＮＡ配列（配列番号１〜１４に相当）：AUGCUGACAUAUUUACUAGAGG, UCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU, UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC, UUUUUCAUUAUUGCUCCUGACC, UGAGGCUCUGUUAGCCUUGGCUC, UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG, AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG, CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG, AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC, AACAACAAAAUCACUAGUCUUCCA, UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU, UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU, UAUUGCACAUUACUAAGUUGCAまたはUACCACAGGGUAGAACCACGGを含んでなる群から選択されるリボヌクレオチド配列を有するプローブセットを有してなる２つ以上のｍｉＲＮＡプローブが含まれていてもよい。さらにキットには、次の少なくとも１つが含まれてもよい：（ａ）陰性対照として用いるために適合させた、１つの、ランダムに生成したｍｉＲＮＡ配列；（ｂ）全ＲＮＡ分解のための標準化対照として用いる、ハウスキーピング遺伝子に由来する、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列；および／または（ｃ）陽性対照として用いる、少なくとも１つのランダムに生成した配列。 ハウスキーピング遺伝子の非限定的例として、乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）、非ＰＯＵドメイン含有八量体結合タンパク質（Non-POU domain-containing octamer-binding protein）（ＮＯＮＯ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）、および／またはペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＨ（peptudyl-prolyl cis-trans isomerase H）（ＰＰＩＨ）が挙げられる。 
【００３４】
対象において自閉症スペクトル障害を検出した上で、対象に治療指針を提供してもよい。このような指針には次のものが含まれていてもよい：追加診断試験の実行、薬物療法の処方、対象の自閉症スペクトル障害のモニタリング頻度の増加、行動療法およびライフスタイル選択の推奨またはそれらの組み合わせ。治療指針には、次のようなライフスタイルの選択を推奨することが含まれていてもよい：行動療法の導入、時間管理および課題整理、環境的変化の導入、食生活の変更、運動の変更またはそれらの組み合わせ。いくつかの態様では、治療指針には、代替的にまたは追加的に１つ以上の次のものが含まれていてもよい：追加診断試験の実行、薬物療法の処方、対象の自閉症スペクトル障害のモニタリング頻度の増加、行動療法およびライフスタイル選択の推奨またはそれらの組み合わせ。
【００３５】
別の態様において、配列ライブラリは、Illumina TruSeq Small RNA Sample Prepプロトコルを用いて精製した生体試料から調製し得る。  
【００３６】
精製した生体試料に配列ライブラリを調製した後、配列ライブラリを、例えば、最新の試薬を１試料あたり３〜１０００万リードの標的深度で用いたIllumina MiSeq、NextSeqまたはHiSeq等のハイスループットシーケンシング装置で処理し得る。リードデータは、参照ゲノム（例えば、ヒトゲノムのＨｇ１９Ｂｕｉｌｄ等）にアラインメントし、例えば、Illumina BaseSpaceソフトウェア等のヒトゲノムのリードデータを処理し、かつヒトゲノムリードデータを参照ゲノムまたは参照ｍｉＲＮＡと比較するために適合させた処理機およびソフトウェアを用いて、最新のｍｉＲＮＡ  データベースまたは図２および３に列挙されたような参照ｍｉＲＮＡに相互参照させてもよい。本明細書では、参照ゲノムは、種の遺伝子一式の代表例としての役割を果たす核酸配列データベースである。参照ゲノムは、（ハプロイドモザイクを形成する）一人の人間からの遺伝子の影響による偏りを受けないように多数の提供者から集めてもよい。Ｂｕｉｌｄ  ２１は、健康なボランティアに由来する配列の１つのコレクションを表すが、本開示では他の好適な参照ゲノムを用いることを検討している。例えば、Bowtie配列アライナー等の配列アライニングおよび／または分析アルゴリズムを用いて、さらにリードデータを処理し、さらなる分析の前にデータを正規化させてもよい。   
【００３７】
配列アライニング(sequence aligning)および／または分析を行った後に、試料中に検出されたｍｉＲＮＡに基づき、あるいはシーケンサー中のｍｉＲＮＡデータに対して行った比較に基づき、対象は自閉症スペクトル障害であるか診断され得る。対象が自閉症スペクトル障害を有するという決定に基づき、治療指針を対象に提供してもよい。治療指針の例として、限定することなく、次の：ライフスタイルの選択の推奨が挙げられてもよく、かつ次の１つ以上のものが挙げられる：行動療法の導入、時間管理および課題整理、環境的変化の導入、食生活の変更、運動の変更、追加診断試験の実行、薬物療法の処方、対象の自閉症スペクトル障害のモニタリング頻度の増加、行動療法およびライフスタイル選択の推奨またはそれらの組み合わせ。
【００３８】
図１は、対照対象およびＡＳＤ対象の対象に関する特徴を示した図である。図１に示すように、対照対象およびＡＳＤ対象両方の特徴には、年齢（年数で表した）、性別、自閉症診断観察一覧（Autism Diagnostic Observation Schedule）（ＡＤＯＳ）スコア、バインランドコミュニケーションスコア（Vineland Communication Score）（Ｃｏｍｍ）、バインランド社会化スコア（Vineland Socialization Score）（Ｓｏｃｉａｌ）、日常生活スコア（Activities of Daily Living Score）（ＡＤＬｓ）、集成スコア（Composite Score）（Ｃｏｍｐ）、出生年齢（週で表した）、体重（百分率で表した）、身長（百分率で表した）が含まれる。平均の標準偏差および範囲は、対照対象およびＡＳＤ対象両方において選択特徴に含まれている。表の下にＰ値も選択特徴について計算した。Ｃｏｍｍ、Ｓｏｃｉａｌ、ＡＤＬｓおよびＣｏｍｐを含むバインランドスコアは、対照グループとＡＳＤグループとでは顕著に異なっていることが理解できる。
【００３９】
図２は、対照対象からＡＳＤを区別する上位に順位づけされた変数および神経発達の程度とのそれらの相関関係の表を示す図である。図２に示すように、対照対象からＡＳＤを区別する１４個の上位に順位づけされた変数（ｍｉＲＮＡ） が、特定の列挙されたｍｉＲＮＡに関連する各配列に加えて示されている。さらに、図２には、列挙された各ｍｉＲＮＡと関連する神経発達相関関係の関係強度を指示する値が含まれている。
【００４０】
図３は、対照対象からＡＳＤ対象を区別する上位に順位づけされた変数に相当するｍｉＲＮＡ配列の表を示す図である。図３に列挙された配列およびｍｉＲＮＡは、図２に列挙されたものに相当する。
【００４１】
当業者であれば、本開示を検討した後に変動や修正を行うであろう。開示した特徴および工程は、本明細書に記載された１つ以上の他の特徴および／または工程との任意の組み合わせおよび下位の組み合わせ（複数の独立した組み合わせおよび下位の組み合わせを含む）で実施してもよい。以上に記載または説明した種々の特徴および工程はその他のシステムや方法と組み合わせても、その他のシステムや方法に統合させてもよい。さらに、特定の特徴を省略してもよく、または実効しなくてもよい。
【００４２】
変更、代用および改変の例は、当業者であれば解明可能であり、本明細書に開示された発明の範囲を逸脱することなく成し得ることである。本明細書にて引用した全ての参照文献は、その全体を参照することにより組み入れられ、本出願の一部とする。
【実施例】
【００４３】
実験の概要
唾液のｍｉＲＮＡプロファイルは、自閉症スペクトル障害を有する児童を同定し、適応行動と相関し、神経発達に関係するＡＳＤ候補遺伝子に関係する。具体的には、唾液のｍｉＲＮＡをＡＳＤ対象２４人ならびに年齢および性別が一致した対照対象２１人から精製した。ＡＳＤグループには、軽度のＡＳＤ（ＤＳＭ−５基準および自閉症診断観察一覧）を有し、かつ神経障害、早産または既知の染色体異常の病歴がない人が含まれていた。唾液採取の際に、全対象は、バインランド適応行動基準（Vineland Adaptive Behavior Scales）で徹底的な神経発達性評価を完了した。ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）により少なくとも半数の試料において、合計して２４６個のｍｉＲＮＡが検出されて定量化され、非パラメータ試験、多変量ロジスティック回帰および分類分析、同様にモンテカルロ相互検証（ＭＣＣＶ）でのグループ間比較を実行するために用いた。上位のｍｉＲＮＡについて適応行動の程度との相関関係を検査した。上位の異なって発現したｍｉＲＮＡの最も信頼の高いｍＲＮＡターゲットの機能的エンリッチメント解析を、注釈、可視化および統合発見用データベース（Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery）（ＤＡＶＩＤ）、同様にＡＳＤ候補遺伝子のシモンズ基金自閉症データベース（Simons Foundation Autism Database）（ＡｕｔＤＢ）を用いて行った。 
【００４４】
１４個のｍｉＲＮＡは、ＡＳＤ対象において対照と比較して異なって発現し（ｐ＜０．０５；ＦＤＲ＜０．１５）、発見セットからの最良適合ロジスティック回帰モデルにおいて対象グループを区別するにあたり９５％超の精度を示した。ＭＣＣＶは、１００回のシミュレーションにわたり０．９２の平均ＲＯＣ−ＡＵＣ値を示し、検出のロバスト性をさらに支持した。ほとんどの１４個のｍｉＲＮＡは、バインランド神経発達性スコアと顕著な相関関係を示した  。機能的エンリッチメント解析では、転写活性、神経発達およびＡｕｔＤＢ遺伝子に関係する標的遺伝子クラスターの顕著な過剰表現が検出された。  
【００４５】
軽度のＡＳＤを有する対象でのこの試験的研究における、唾液のｍｉＲＮＡの測定は、発達中の脳に発現している１４個のｍｉＲＮＡの異なる発現、インパクトｍＲＮＡ関連脳発達(impact mRNAs related brain development)を証明し、適応行動の神経発達性の程度と相関した。これらｍｉＲＮＡは、ＡＳＤ用の潜在的スクリーニングツールとしての高い特異性および相互検証された実用性を有するものである。
【００４６】
実験の詳細
対象および評価
対象は採用された者であり、対照対象およびＡＳＤ対象両方の除外基準には、４歳未満もしくは１４歳超の年齢、交絡した神経性障害（即ち、脳性小児麻痺、てんかん）もしくは知覚障害（即ち、聴覚障害もしくは視覚障害）または急性疾患が含まれていた。被後見人、知能発育不全または早産（３２週の妊娠期間未満）もしくは妊娠週令の１０パーセント未満の出生時体重の経歴を有する対象も参加から除外した。知能障害、ＡＳＤまたはＡＳＤの家族歴の診断を有する対象は、対照グループから除外した。既知の症候性表現型（即ち、レット症候群、結節硬化症、アンジェルマン症候群、脆弱性 Ｘ）を有するＡＳＤ対象も除外した。ＡＳＤを有する児童には精神科的症状の確立された併存疾患があるため、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）または不安神経症を有する対象は除外しなかった。
【００４７】
現時点でＡＳＤ診断をされた２４人の対象および２１人の非ＡＳＤ対照対象を含む（図１に示すように）、研究に採用された計４５人の対象について、親の同意および対象の受諾（可能な場合）を得た。ＡＳＤ対象は、ＤＳＭ−５（アメリカ精神医学会、２０１３年）基準に従い診断し、自閉症診断観察一覧（Autism Diagnostic Observation Schedule）（ＡＤＯＳ）、幼児期自閉症評価尺度（the Childhood Autism Rating Scale）（ＣＡＲＳ）、および／またはクリュッグ・アスペルガー指数（the Krug Asperger Index）の年齢に応じた測定基準で評価した。コミュニケーション（Ｃｏｍｍ）、社会的相互作用（Ｓｏｃｉａｌ）および日常生活の行動（ＡＤＬｓ）の機能的神経発達性指標を評価するために、親の面接を通じて医師により第二版バインランド適応行動尺度（Vineland Adaptive Behavior Scales 2nd edition ）を全児童に適用した。病歴、出生歴、家族歴、手術歴、現在の投薬、医療上のアレルギー（medical allergies）、免疫状態および食事の変更を得た。神経学的欠損、視覚的／聴覚的障害または症候性身体的特徴を検査するために、簡単な身体検査を行った。
【００４８】
図１に示すように、年齢（ｐ＝０．１８）、性別（ｐ＝０．８２）、体重（ｐ＝０．９１）、身長（ｐ＝０．８５）または出生年齢（ｐ＝０．２９）についてグループ間で顕著な差異はなかった。ＡＳＤ対象の平均年齢は９．２±２．５歳であり、平均出生体重は３．２±０．６４ｋｇであった。ＡＳＤ対象は、１０．６±４．１の平均ＡＤＯＳスコアを有し、軽度から中度のＡＳＤについてＤＳＭ−５基準で一貫していた。対照対象と比較したところ、それらは、バインランド適応行動尺度（Vineland Adaptive Behavior Scales）（図１）により評価したコミュニケーション（ｐ＜０．００１）、社会的相互作用（ｐ＝０．００１）および日常生活の行動（ｐ＜０．００１）の顕著に低下したレベルを提示した。 
【００４９】
全体として、２４人の児童のＡＳＤグループは、次の合併診断を有していた者数人が含まれていた：ＡＤＨＤ（ｎ＝１５）、不安障害（ｎ＝８）、学習障害または発育遅延（ｎ＝５）、喘息（ｎ＝３）、アレルギー（ｎ＝２）、強迫性障害（ｎ＝２）およびうつ病（ｎ＝１）。このグループにおける報告された薬物治療は次のものを含んでいた：メチルフェニデート興奮剤（ｎ＝８）、セロトニン特異性再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩｓ；ｎ＝７）、グアンファシン（ｎ＝５）、非定型抗精神病薬（ｎ＝５）、クロニジン（ｎ＝１）、気管支拡張剤（ｎ＝３）、抗ヒスタミン（ｎ＝３）、マルチビタミン（ｎ＝８）およびオメガ−３サプリメント（ｎ＝４）。発端者の３人は、改善したグルテン・フリーの食事をとっていて、ＡＳＤ対象には一切の虫歯または歯周病がなかった。５人のＡＳＤ対象は新生児集中治療が必要な出生時の合併症の病歴があったが、１１日を超える治療が必要な者はいなかった。ほとんどのＡＳＤ対象（ｎ＝１７）は、教育的介入（言語療法、理学療法、作業療法）の現歴または既往歴を有していた。次の神経精神障害および神経発達性障害の陽性家族歴を有する数人の発端者もいた（一親等および二親等ならびにいとこに限る）：学習障害（ｎ＝１０）、うつ病（ｎ＝８）、不安障害（ｎ＝７）、ＡＤＨＤ（ｎ＝６）、ＡＳＤ（ｎ＝４）および双極性障害（ｎ＝３）。
【００５０】
２１人の典型的な発育中の児童の対照グループにも、次の合併診断を有していた者数人が含まれていた：ＡＤＨＤまたはＡＤＤ（ｎ＝５）、喘息（ｎ＝６）、アトピー性皮膚炎（ｎ＝４）およびアレルギー（ｎ＝２）。対照グループにおける報告された薬物治療は次のものを含んでいた：メチルフェニデート（ｎ＝３）、気管支拡張剤（ｎ＝６）および抗ヒスタミン（ｎ＝５）。改善した食事またはグルテン・フリーの食事をとっていた対照児童はなく、１人の対象には虫歯があった。対照対象１人は、短期間の新生児治療が必要であった出生時の合併症（ＲＳＶ感染）の病歴があった。３人の対照対象は教育的介入（言語療法、理学療法、作業療法）の現歴または既往歴を有していた。学習障害（ｎ＝２）、うつ病（ｎ＝１）、ＡＤＨＤ（ｎ＝１）および双極性障害（ｎ＝１）について、一親等および二親等ならびにいとこの間で陽性家族歴が同定された。
【００５１】
唾液採取およびｍｉＲＮＡ処理
対象は健康児童訪問中に採用した。唾液試料を午前１０時から午後３時の間に非絶食状態で採取した。水道水で漱いだ後に、Oragene RNA採取キット（DNA Genotek；カナダ、オタワ）を用いて吐出物を介しておよそ３ｍＬの唾液を得て、処理するまで室温で保管した。 唾液のｍｉＲＮＡ をTRI Reagent LSを用いて Oragene RNA精製プロトコルに従い精製し、続けてRNeasy ミニカラム（Qiagen）を用いて２巡目の精製をした。ＲＮＡ試料の収量および品質は、Illumina TruSeq Small RNA 試料調製プロトコル（Sample Prep protocol）（Illumina;カリフォルニア、サンディエゴ）を用いたライブラリー構築の前に、Agilent Bioanalyzerを用いて評価した。多重化した試料を、１試料あたり３百万リードの標的深度でｖ３試薬を用いてIllumina MiSeq機器に流した。リードは、Bowtie アルゴリズムを用いたIllumina BaseSpaceソフトウェアでのヒトゲノムのＢｕｉｌｄ  ２０にアライメントされ、分析の前に百万あたりのリード（ＲＰＭ）に正規化させた。本文の結果を裏付けるデータセットは、NCBI Gene Expression Omnibus レポジトリ（受入番号待ち）にて入手可能である。
【００５２】
統計的分析
ＡＳＤ対象と対照対象との顕著なグループ間差異を同定するために、医療データ、人口統計データおよび神経心理学的データの複合分析を行った。個々のｍｉＲＮＡは、診断にかかわらず、試料の少なくとも半分に検出された場合にのみグループ間の比較に用いた。合計して２４６個のｍｉＲＮＡを試験した。ＲＮＡ配列データは正常に分配されなかったため、ｍｉＲＮＡレベルのグループ差異は、複数の比較のため、ベンジャミン−ホッホバーグ偽発見率（Benjamini-Hochberg False Discovery Rate）（ＦＤＲ）修正とともに、非パラメータのウィルコクソン・マン＝ホィットニーＵ試験（Wilcoxon Mann-Whitney U test）を用いて検査された。個々のロジスティック回帰分析にＦＤＲ値＜０．１５のｍｉＲＮＡを最初に用いて、理想的な「最良適合」アプローチにおいて弁別力を評価した。このようにする論理的根拠は、ロジスティック回帰が、元のＲＮＡ配列データの分配について予測せず、かつそれが、１４個の個々の変数の完全セットに対して従属結果（診断、０または１とコード化されている）の従属性を最もよく表現するロジスティック関数Y = [1/(1 + e-(a + b1X1 + b2X2 + bnXn + ...))]を用いたデータ用に最適モードを繰り返し測定するのに非常に効果的であるためである。この最良適合は、最大尤度（Maximum Likelihood）基準を用いて最適な解が得られるまで、各ｍｉＲＮＡ変数に対する部分的回帰係数を調節することによって達成された。この過程の間、各対象試料は、モデルに基づく診断的分類の１つに属するという特異的な尤度を有することが測定され、対象のセットに対する全体的尤度（Ｌ）は、全対象の処理物の尤度スコアから導かれた。各対象につき予測を行っていたため、ロジスティック回帰分析の結果は、ひいては２×２の分類表を作成するために用いられ、そこから我々は感度または真の陽性率（即ち、モデルに基づきＡＳＤであると正確に予測されたＡＳＤ対象の画分）および特異性または真の陰性率（即ち、対照であると正確に予測された対照対象の画分）を測定した。分類のカットオフ値は、Ｙ＝０．５（診断分類コード０と１の中間）である既定値に設定した。カットオフ値の全範囲にわたるカットオフ点を変動させ、各点で感度および特異性を再計算することによって、ひいてはモデル性能全体の不偏の評価をもたらす受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットを構築することが可能となった。
【００５３】
他のデータセットとの比較を容易にするために、ＡＳＤ対象において見られた多くの平均差異は、対照に相対的な正規化Ｚスコア差異として、同様に、各対象グループ内に変動性を組み込む標準化コーエンのｄ値（Cohen's d values）として報告した。我々は、各個別回帰結果について、結果として得られたｐ値とともに、ベータ係数（Coeff）およびワルド統計値（Wald statistics）も報告した。ｍｉＲＮＡレベルの、多様な医療の程度、人口統計の程度および神経心理学の程度に対する比較は、スピアマンの順位相関（Spearman's rank correlation）を用いて行った。
【００５４】
回帰モデリングアプローチの限界の１つは、「最良適合」は、最初の（発見）データセットでしか結果を精密に予測しない可能性である。１４個のｍｉＲＮＡの経験的妥当性をより厳密に評価するために、我々は、バランスのとれたサブサンプリングでの１００倍モンテ−カルロ相互検証（100-fold Monte-Carlo Cross Validation）（ＭＣＣＶ）の結果に基づき、分類試験およびＲＯＣ曲線分析を行った。各反復で、試料の３分の２を用いてｍｉＲＮＡ特徴重要性を評価した。次に、２、３、５、７、１０および１４個の最重要分類ｍｉＲＮＡ特徴を用いて分類モデルを構築し、それらを残されていた残留している３分の１の試料に対して相互検証した。各モデルの性能および信頼区間を測定するために、上記方法を１００回繰り返した。我々が発見段階で行ったロジスティック・モデリングをさらに補集するために、部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）の多変量直線回帰アプローチを用いてこのＭＣＣＶ分析を行った。この方法は、分類資格または診断（Ｙ）を最も良く予測する、１４個のｍｉＲＮＡ特徴の多次元直線組み合わせを抽出する。これら分析は、Ｒ  ｐｌｓパッケージにより提供されたｐｌｓｒを用いて行われ、カレットパッケージを用いて分類および相互検証が行われた。我々は変数を、異なるシミュレーションされたモデルにおける回帰係数の合計によって決定されたその相対的重要性によって順位付けし、４つの最もロバストな、異なって発現したｍｉＲＮＡについて個々のボックスプロットを作成した。
【００５５】
我々は、顕著に変化したｍｉＲＮＡのセットの、表現パターンおよび一般的分離パワーを視認するために、ユークリッド距離測定基準での階層的クラスタリングを用いて類似のパターンは一緒にして、ｍｉＲＮＡをグルーピングし、次いで全１４個のｍｉＲＮＡのＰＬＳ−ＤＡ分析から創出した３次元固有ベクトルにて対象を視認した。
【００５６】
ｍｉＲＮＡデータのシステム−レベル分析は、オンライン情報源であるｍｉＲＮＡデータベース（ｍｉＲＤＢ）を用いて行われ、我々が同定した各成熟配列についての予測標的物がもたらされた （mirBase v21２０１４年８月アノテーションによる）。このデータベースバージョンは、２，５８８個のヒトｍｉＲＮＡおよび９４７，９４１個の標的相互作用を同定する。解明された相互作用は、次いで、各ｍｉＲＮＡについて上位２０％の予測標的物のみを含むようにｍｉＲＤＢ結果に反映されたｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ相互作用の予測強度に基づき、フィルターをかけられた。次いで、これら特定のｍＲＮＡは、アメリカ国立アレルギー・感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）での、Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery（ＤＡＶＩＤ，バージョン６．７）からのオンラインの機能性アノテーションクラスタリング（Functional Annotation Clustering ）ツールを用いて、機能的エンリッチメントの裏付けのために検査した。検査する遺伝子が大量であることを理由として、我々は、ＥＡＳＥスコア閾値を２．０に増やし、複数リンケージ（Multiple Linkage） 閾値を０．７に設定し、類似閾値を０．４５に設定し、最終グループメンバーを（Final Group Membership）を４のサイズに設定した。上位３つのアノテーションクラスターのみが表形式で報告された。ＤＡＶＩＤ機能的クラスターに加えて、我々は、１４個のｍｉＲＮＡの組み合わせたセットに対する予測標的物の上位２０％のリストと、シモンズ基金自閉症データベース（Simons Foundation Autism Database）（ＡｕｔＤＢ）に掲載された７４０個のＡＳＤ関連遺伝子との比較もし、フィッシャーの直接確率検定およびオッズ比計算を用いて潜在的エンリッチメントについて試験した。
【００５７】
異なって発現したｍｉＲＮＡの、脳および組織に特異的な表現パターンは、発育中および成人ヒトの脳にわたって、異なって発現したｍｉＲＮＡの調査を検討することで同定された。我々は、脳に多く発現したｍｉＲＮＡが、それらがＡＳＤに修正されたか否かにかかわらず、唾液にも検出されたか確認するために、脳データも使用した。
【００５８】
ｍｉＲＮＡレベルの測定は、シーケンサーを用いたダイレクトシーケンシング；上記ｍｉＲＮＡプローブ等のヌクレオチドプローブでのマイクロアレイ；ヌクレオチドプローブでのＬｕｍｉｎｅｘ系磁気ビーズおよび／またはＬｕｍｉｎｅｘ系非磁気ビーズ；ヌクレオチドプローブおよび／またはカスタムしたプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；カスタムしたプロテクションプローブでのＲＮａｓｅプロテクションアッセイ；ヌクレオチド系プローブでのノーザンブロット；カスタムしたハイブリダイゼーションプローブでのＲＮＡｓｃｏｐｅおよびＳｍａｒｔ  Ｆｌａｒｅ；ならびに放射性ヌクレオチド取り込み流出（radioactive nucleotide incorporation run-off）およびＰＣＲ系定量化を含む多種多様な技術によって行うことができる。
【００５９】
唾液ｍｉＲＮＡレベルは、診断および適応性行動の程度との関係を示す
唾液のｍｉＲＮＡのシーケンシングによって、２４６個のｍｉＲＮＡが少なくとも試料の半分に存在していることが検出された。これらのうち、マン＝ホィットニー試験により、１４個のｍｉＲＮＡは、対照と比べてＡＳＤグループ内で発現の顕著な変化を示した（ｐ＜０．０５、ＦＤＲ＜０．１５）（図２に示すように）。ｍｉＲＮＡの１０個は、ＡＳＤ対象において上方調節され、４個は、下方調節された。ＡＳＤと対照対象との間で大量に最大の平均差異を有するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−６２８−５ｐ（それは最も顕著な差異も有していた）（ｐ＝０．０００１、Ｚスコア差異＝１．１３）であった。個々のロジスティック回帰分析からの結果は、ｍｉＲ−６２８−５ｐを最も顕著（ワルド統計値＝１１．２１、ｐ＝０．００１）なものとして強調もし、またそれは、ＲＯＣ分析（図２）からの曲線（ＡＵＣ＝０．９０）の下に２番目に高い領域を示した。個々には、ｍｉＲ−３３５−３ｐが最大ＡＵＣを有し、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐがＡＳＤを予測するにあたり最高精度７６％を有していた（図２）。
【００６０】
我々は、目的の１４個のｍｉＲＮＡが、神経発達性の程度に関連しているか否か測定するために、スピアマンの順位相関（Spearman's rank correlation）分析を行った。この分析によって、バインランドスコアおよび１４個のｍｉＲＮＡ中１３個（唯一ｍｉＲ−１４０−３ｐが顕著な相関関係を示さなかった）に含まれていた複数の程度との顕著な相関関係が明らかとなった。特に、ｍｉＲＮＡの９個が陰性相関関係（即ち、より高いｍｉＲＮＡがより低いバインランドスコアと関連していた）のみを明示した一方、それらの４個は、陽性相関関係のみを示した。さらに、バインランドスコアと陽性相関関係があった全てのｍｉＲＮＡは、ＡＳＤ対象において低減した発現を有するものであった一方、バインランドスコアと陰性相関関係があった全てのｍｉＲＮＡは、ＡＳＤにおいて増加した発現を有していた（図２）。 
【００６１】
図３は、対照対象からＡＳＤ対象を区別する上位に順位づけされた変数に相当するｍｉＲＮＡ配列の表を示す図である。これら配列および図３に列挙されたｍｉＲＮＡは図２に列挙されたものに相当する。  
【００６２】
階層的クラスタリングおよび線形判別分析がｍｉＲＮＡレベルによって試料を区別する 
ＡＳＤ対象および対照対象について階層的クラスタリングを行い、ｍｉＲＮＡデータにおいて目立つパターンを明らかにした（図４Ａ）。ＰＬＳ−ＤＡ結果を用い、１４個の変数マトリックスの３次元表示を使用して、ＡＳＤ対象と対照対象との間の分離度合を視認した。この分析の結果は、クラスタリング結果を補完し、対象グループにおいてほんの控えめな重複を指示した（図４Ｂ）。３次元プロットにおけるこれら重複した対照対象およびＡＳＤ対象に対する医療データ、人口統計データおよび適応行動データの検証では、決定的な説明を同定することができなかった。    
【００６３】
多変量回帰、分類予測およびＲＯＣ分析は高感度および高特異性を指示する
最大診断有用性を評価するための初期の「最良適合」モデルは、分類精度のための単独多変量ロジスティック回帰試験に基づいたものであった。この結果は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線および分類予測表（表４Ｃ）を用いて評価された。このｍｉＲＮＡのセットに対する多変量ＲＯＣは、０．９７４の曲線（ＡＵＣ）の下に領域を明示した。このｍｉＲＮＡセットは、研究参加者内でのＡＳＤの診断を予測するために感度１００％および特異性９５．６％であった。特に、我々は、我々の対象をＡＳＤグループまたは対照グループのいずれかに事前選択していたため、１４個の変数の陽性予測値または陰性予測値を測定しなかった。
【００６４】
ｍｉＲＮＡデータセットの診断有用性の相互検証
１４個のｍｉＲＮＡ変数のデータセットは、モンテ−カルロ相互検証 （Monte-Carlo Cross-Validation）（ＭＣＣＶ）実験にて、全モデル（１４個全てのｍｉＲＮＡを含む）について０．９２の平均ＲＯＣＡＵＣ値で、非常に高いレベルで機能し続けた。さらに、ＭＣＣＶは、１００回のシミュレーションにわたり８４．４％の全体精度で、特異性８７．５％および感度８１％を明示した。最も一般的な結果は、４個の誤分類された対照対象および３個または４個の誤分類されたＡＳＤ対象を含んだ混同マトリックスであった。特に、これらは我々の独自のロジスティック回帰方法を用いて誤分類された対象と同一の対象であり、線形または非線形多変量モデリングアプローチのいずれかが適切であることを示唆する。
【００６５】
経路エンリッチメント解析が神経発達およびＡＳＤ標的物のためのエンリッチメントを同定する
１４個のｍｉＲＮＡの最高信頼性ｍＲＮＡの分析から、各ｍｉＲＮＡについて平均５５５個の予測標的物が産出された（７，７６４個の合計予測相互作用）。これらのおよそ１０％が１個以上のｍｉＲＮＡの標的となり、およそ７，０００個の明白なｍＲＮＡ  相互作用（別添Ａ）を産出した。次いで、この大量の相互作用は、各ｍｉＲＮＡについて予測標的物の上位２０％のみを含むようにｍｉＲＤＢ結果に反映されたｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ相互作用の予測強度に基づきフィルタリングした（別添Ａ）。これによって１，３４７個の独自の強度に予測されたｍＲＮＡ相互作用が同定された。次いで、ＤＡＶＩＤ（バージョン６．７）を用いて、機能的エンリッチメントの裏付けのために特定の高信頼ｍＲＮＡを検査した。合計して１，２４７個の高信頼ｍＲＮＡ標的物が利用可能な機能的アノテーションを有していた。厳密な設定（２．０に設定したＥＡＳＥスコア閾値、併せて複数リンケージ（Multiple Linkage） 閾値を０．７に設定し、類似閾値を０．４５に設定し、最終グループメンバー（Final Group Membership）を４に設定した）を用いたことで、３１０個の合計クラスターマッピングが明らかとなった。次いで、アノテーションクラスターにおける上位準節点（subnodes）を検査し、転写活性化に関連する遺伝子（５個の準節点および２個のアノテーションクラスターに存在）ならびに神経投射（５１個の遺伝子）および軸索投射（同一遺伝子の３１個）に関連する遺伝子が、２倍以上のエンリッチメントで明らかとなった。  
【００６６】
さらに、我々はＡＳＤとの関連性のために高信頼標的遺伝子を、それらとシモンズ基金自閉症データベース（Simons Foundation Autism Database）（ＡｕｔＤＢ）における７４０個のタンパク質をコードする遺伝子と比較することによって調査した。我々の１，３４７個のｍＲＮＡ標的物の高信頼リストには、ＡｕｔＤＢリスト（別添Ｂ）と重複した１０８個（１４．６％）が含まれていた。これは、ＡＳＤ関連遺伝子については、単に偶然で予測していた際（オッズ比＝２．４０、９５ｔｈ  ＣＩ＝１．９４−２．９７、フィッシャーの直接確率ｐ値＝７．１ｅ−１２）と比べて、顕著な２.２倍のエンリッチメントを表していた。これらＡＳＤ関連ｍＲＮＡ標的物の間で特筆すべきは、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質１（ＦＭＲ１） およびフォークヘッドボックスタンパク質Ｐ２（ＦＯＸＰ２）であった。  
【００６７】
エンリッチメントされたＤＡＶＩＤクラスターにマッピングした遺伝子およびＡｕｔＤＢ候補遺伝子は、組み合わされてＡＳＤに対して最も機能的関連性を有するかもしれないと予測された標的ｍＲＮＡを指示した。これは、神経投射および軸索投射のサブノードにマッピングしたＡｕｔＤＢ遺伝子に対して最も高い上昇を指示し、同様にＦＯＸＰ２およびＦＭＲ１を含む、複数のサブノードに対して明白な多面発現効果を有する少数の遺伝子を強調した（別添Ｃ）。 
【００６８】
唾液中の標的ｍｉＲＮＡはヒトの脳に広くかつ高く発現した
我々が同定したｍｉＲＮＡ標的の、潜在的脳関連性の最終検査として、我々は、Ziats およびRennert [14]によって公有財産として寄託された発育中（４か月〜２３歳）のヒトの脳にわたるｍｉＲＮＡに関するＲＮＡ配列データを分析した。この分析によって、我々がＡＳＤ唾液に変化があったことを見出した１４個中の１３個のｍｉＲＮＡに対する結果がもたらされた。特筆すべきことに、全ての１３個のｍｉＲＮＡが、幼児期を通した、小脳、背外側前頭前野（ＰＦＣ）、腹側両面ＰＦＣ、内側ＰＦＣ、眼窩前頭ＰＦＣおよび海馬を含む複数の脳の領域に発現していた。さらに、ｍｉＲＮＡの９個は、高度なリードレベル（＞１０００）で発現していた一方、４個は、比較的低いリードレベル（＜１０００）で発現していた。発現レベルと、年齢および性別のいずれかとの関係性は見られなかった。しかしながら、ｍｉＲＮＡの５個は、脳の領域にわたって発現に変化があり（ｍｉＲ−７−５ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１９１−５ｐおよびｍｉＲ−２４６７−５ｐ）、海馬に対して小脳では最も差異が発生していた。
【００６９】
現在のＡＳＤ診断は、特異性が５０％未満であり、１８〜２４か月の年齢まで有効ではない親へのアンケートに依存している。このアプローチは、ＡＳＤを有する児童を診断するにあたり、かつ彼らを早期の仲介サービスに参加させるにあたり非効率的である。本研究の結果は、唾液に基づくバイオマーカー試験が、診断の年齢を下げてスクリーニングの特異性を改善させ、関連サービスの負担を軽減させる可能性があることを示唆するものである。我々は、理想的なバイオマーカー候補は、１）脳に発現し、２）神経発達に生理学的または機能的に関連し、３）末梢試料から容易に測定され、かつ４）ＡＳＤを有する人に異なって発現されるべきであると示唆する。この研究によって、これら基準に当てはまる唾液中の１４個のｍｉＲＮＡのセットが同定された。
【００７０】
発育中のヒトの脳にわたるｍｉＲＮＡ発現パターンの検査は、我々の１４個のバイオマーカー候補セット内のｍｉＲＮＡが、幼児期を通じて複数の脳の領域に一貫して発現していたことを証明した。さらに、これらｍｉＲＮＡの機能的経路分析によって、神経発達に関連する遺伝子ネットワーク、同様にシモンズ基金自閉症データベース（Simons Foundation Autism Database）によるＡＳＤに関連する遺伝子のエンリッチメントが明らかとなった。全ての重複する標的ｍＲＮＡについて論ずることは本報告の範囲を逸脱することであるが、我々は、特筆すべき２つを指摘する：脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質１（ＦＭＲ１）およびフォークヘッドボックスタンパク質Ｐ２（ＦＯＸＰ２）。  ＦＭＲ１タンパク質生成物は、ニューロンに広く発現し、ｍｉＲＮＡ相互作用を通じてシナプス転写を調節し、知的障害の最も一般的な遺伝的要因である脆弱Ｘ症候群では崩壊されている。およそ脆弱Ｘ症候群を有する４０％の児童が、ＡＳＤの基準を満たす。同様に、ＦＯＸＰ２は、発達性言語および言語障害に関わる第一の遺伝子であり、ＦＯＸＰ２のミスセンス変異は、ＡＳＤの顕著な特徴である言語失行症を招いた。これら両方の遺伝子は、１つ以上のサブノードに存在していて、ＦＯＸＰ２は転写活性および神経投射サブノードに高く表されていた。
【００７１】
ＡＳＤ児童および対照児童の唾液中に測定された２４６個のｍｉＲＮＡ標的物のうち、１４個のセットが大幅に顕著な差異を示し、発見データセット全体に作成された多変量非線形ロジスティック回帰モデルにおいてＡＳＤ診断を予測するにあたり９５％超の精度であった。試料の１／３をマスキングしてモンテ−カルロシミュレーションを用いた１００倍相互検証によって、特異性８７．５％および感度８１％、８４．４％の全体精度が明らかとなった。併せて、これら結果は、唾液のｍｉＲＮＡプロファイリングは、現在の「黄金律」Ｍ−ＣＨＡＴスクリーニング方法の全体的特異性をほぼ２倍にする可能性を有することを指示した。
【００７２】
トレーニングセットでは、全てのＡＳＤ対象が正しく分類され、２人の対照対象のみが誤分類された（対象２０４および２０５）。しかしながら、これら対象は、バインランドスコア（両者とも１１３の複合スコアを有していた）または年齢（８歳および１１歳）で極端な変化を提示しなかったが、１人の対象（対象２０５）は言語療法の既往歴を有していた。かれらの唯一の特筆すべき医学的所見は、必要に応じたアルブテロールでの治療による喘息の診断（対象２０４）、および両児童とも対照グループにおける児童の年齢に基づく百分率より平均して体重が重く身長が高かった（グループ平均７８と比較して体重百分率９６および１００；グループ平均７１と比較して身長百分率９２および９７）という事実である。相互検証の過程で誤分類された追加的児童の記録検証からも、一切の、医学的変数または人口統計学的変数の一貫したパターンまたは関連性は明らかとならなかった。
【００７３】
我々がＡＳＤを有する児童に異なって発現していたと同定した多数の唾液のｍｉＲＮＡは、ＡＳＤを有する児童の、死後の小脳皮質（ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−７−５ｐおよびｍｉＲ−１４０−３ｐ）、リンパ芽球様細胞株（ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１９１−５ｐ）および血清（ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ）の研究に以前から記載されてきた。よって、ＡＳＤを有する児童の３つの組織タイプにわたって異なって調節されていた３個のｍｉＲＮＡが存在する（ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐおよびｍｉＲ３０ｅ−５ｐ）。ｍｉＲ−２３ａは、細胞増殖および細胞分化を調節するためにｍｉＲ−２７ａと協力して機能し、ｍｉＲＮＡの一対は、ＡＳＤを含む多数のヒトの病態において異常調節されていたことが報告されてきたことは言及に値する。ｍｉＲ−２３ａのレベルは、両方ともＡＳＤと関連し得る脳虚血または一時的てんかんのようなＣＮＳ損傷への応答においても変動する。よって、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐの異常調節は、ＡＳＤの病態生理学的顕著な特徴を表し得る。
【００７４】
本研究において、最もロバストに修正されたｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−６２８−５ｐ）は、以前のＡＳＤ研究では同定されていなかったものの、それは出生後発育を通してヒトの脳で発現し、ＣＮＳ病理学にかかわってきた。例えば、ヒト神経膠腫におけるｍｉＲＮＡ発現の分析では、ｍｉＲ−６２８−５ｐの顕著に低減した発現が示された。これは、顕著に増加したＡＳＤ対象の唾液中のｍｉＲ−６２８−５ｐ発現とは対照をなす。
【００７５】
この試験的研究の試料規模および断面的性質は別として、別の制限は、記載したＡＳＤ対象および対照対象の年齢であり（４〜１４歳）、ＡＳＤバイオマーカーが理想的に利用されるであろう標的人口（０〜２歳）の代表ではないことである。しかしながら、確立した、知的障害専門家（developmental specialist）によって診断された軽度のＡＳＤ（ＡＤＯＳにより測定された）を有する対象の均質グループを選択することは、対象に長期の診断を要求する。追加的に考慮するのは、年齢が２歳未満の児童をスクリーニングするための唾液採取の実行可能性である。我々は、唾液が、乳歯が生える過程（６か月から１８か月）で豊富に見つかるだけでなく、採取に最も痛みがないことを示唆する。この年齢範囲の児童からの唾液試料に基づいて結果を予測するにあたり、現在のｍｉＲＮＡ利用性を評価するには、さらなる研究が必要である。
【００７６】
本発明の、対象が自閉症スペクトル障害を有するか否か診断する方法は、 別の診断手段を用いて以前にＡＳＤの危険性があると同定された対象の第二診断または確認的診断を提供するためにも用いることができ、当該手段には、限定することなく、乳児チェックリストおよび家族歴または遺伝子検査の評価であるＭ−ＣＨＡＴが含まれる。それは、Ｍ−ＣＨＡＴのような試験が適切ではない、特に言語習得前の対象にも用いることができる。 
【００７７】
本研究の新規の側面は、それが脳、脳発達およびＡＳＤに関連した影響遺伝子(impact gene)で発現し、ＡＳＤを有する児童においては高度に特異的な様式で変化するｍｉＲＮＡのセットを唾液中に同定することである。ＡＳＤの診断のためのこの１４個のｍｉＲＮＡのセットの特異性は、ＡＳＤスクリーニングで用いられている現在の黄金律であるＭ−ＣＨＡＴのものよりほぼ２倍である。コピー数変異体（ＣＮＶｓ）および単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）は、ＡＳＤの重要な遺伝的危険因子とみなされているものの、それらは全体で考慮した場合、件数の３０％未満を占め、１つのＣＮＶとして１％超のＡＳＤ罹患率を説明していない。対照的に、ｍｉＲＮＡ等のエピジェネティックな機序は、特異的機能性分類に関連する遺伝子のコーディネートされたネットワークを変化させる可能性を有する。本発明において予測できなかった発見は、唾液ｍｉＲＮＡの、適応行動の標準的神経発達性程度との関係性、ならびに神経発達方法およびＡＳＤ候補遺伝子の両方に対するｍｉＲＮＡ標的の集中である。これは、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２３ａおよびｍｉＲ−６２８−５ｐ等のｍｉＲＮＡを、ＡＳＤ用の魅力的な潜在的機能性バイオマーカーにする。陽性のＭ−ＣＨＡＴアンケートを有するより若年の児童の人口およびより大きな独立集団複製試料においてｍｉＲＮＡ変化を予測的に確認することで、ＡＳＤを診断するためにｍｉＲＮＡバイオマーカースクリーニングを追加することに対する競合的な裏付けが提供され得る。
【００７８】
ＡＳＤ児童の唾液中のｍｉＲＮＡの異なった発現およぎ診断的利用性
図４Ａは、上位１４個のｍｉＲＮＡの階層的クラスター分析を示す図である。これらｍｉＲＮＡは、対照（対象コードは文字Ｃを含む）と比較して、ＡＳＤ児童（対象コードは文字Ａを含む）において異なって発現した。色は、正常化された存在度の平均Ｚ−スコアを指示する。図４Ａでは、平均クラスター連結でのユークリッド距離測定基準が用いられた。図４Ｂは、上位１４個のｍｉＲＮＡの部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を示す図であり、データセットの変数の５５％を総じて占めた３つの固有ベクトル成分のみを用いて、対象を２つのクラスターに概して分類したことを示した。図４ＣのトレーニングデータセットのＲＯＣ−ＡＵＣ分析は、ロジスティック回帰分類試験で非常に高いレベルの性能を指示した（感度１００％、特異性９０％、０．９７の曲線下領域（ＡＵＣ）値）。
【００７９】
上位１４個のｍｉＲＮＡのモンテ−カルロ相互検証分析
１４個のｍｉＲＮＡバイオマーカーのロバスト性を、含まれた２、３、５、７、１０および１４個のｍｉＲＮＡで、多変量ＰＬＳ−ＤＡを１００回反復して用いて対象を正確に分類する能力を測定し、トレーニング段階で対象の１／３をマスキングすることによって、段階的な様式で評価した。これによって、０．９２の全体ＲＯＣ−ＡＵＣおよび３人のＡＳＤと４人の対象の誤分類が明らかとなった。
【００８０】
図５Ａは、１４個のｍｉＲＮＡバイオマーカーのロバスト性を、含まれた２、３、５、７、１０および１４個のｍｉＲＮＡで、多変量ＰＬＳ−ＤＡを１００回反復して用いて対象を正確に分類する能力を測定し、トレーニング段階で対象の１／３をマスキングすることによって、段階的な様式で評価した。これによって、０．９２の全体ＲＯＣ−ＡＵＣおよび３人のＡＳＤと４人の対象の誤分類が明らかとなった。図５Ｂは、ＩＤ番号によって同定された誤って分類された対象とともに、ＭＣＣＶからの可能性をプロットされた対象の分類を示す図である。図５Ｃは、マン＝ホィットニー試験により最も確実に変化した４個のｍｉＲＮＡの箱ひげ図を示す図である。
【図１】
2018504123.tif 000003
【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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