(57)【要約】本発明は、新規なＩＧＦＲ様レセプター、ならびに、前記レセプターをターゲットするためのアンタゴニスト及びアゴニストを提供する。前記アンタゴニスト及びアゴニストは、医薬としての使用、及び特に、糖尿病の処置が想定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニストであって、
前記ＩＧＦＲ様レセプターは、配列番号：１に対応する配列を含み、
糖尿病の予防的及び／又は治療的処置の方法において用いられる、
アンタゴニスト又はアゴニスト。
【請求項２】
アンタゴニストが、前記ＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合する、請求項１記載のアンタゴニスト又はアゴニスト。
【請求項３】
アンタゴニスト又はアゴニストが、抗体、ｓｉＲＮＡ、核酸、アプタマー、ペプチド、タンパク質、又は小分子有機化合物から選択される、請求項１又は２記載のアンタゴニスト又はアゴニスト。
【請求項４】
抗体が、抗体、抗体変異体、及び抗体フラグメントを含む、請求項３記載のアンタゴニスト又はアゴニスト。
【請求項５】
前記抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項３又は４記載のアンタゴニスト又はアゴニスト。
【請求項６】
前記抗体が、前記ＩＧＦＲ様レセプターのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体であり、該エピトープが、配列：
（ｉ）TSKRTPDGFDSVPLKT（配列番号：２）及び／又は
（ｉｉ）CHQCDPDKYSE（配列番号：３）及び／又は
（ｉｉｉ）MYKWAKPKICSEDLEG（配列番号：４）及び／又は
（ｉｖ）FQRTTFHEASRKYTN（配列番号：５）及び／又は
（ｖ）CTFSRNTPTRTFNY（配列番号：６）
を含む、請求項５記載のアンタゴニスト又はアゴニスト。
【請求項７】
糖尿病が、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病、前糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、及び耐糖能障害を含む、請求項１〜６のいずれか一項記載のアンタゴニスト又はアゴニスト。
【請求項８】
処置が、インスリン抵抗性を予防し、又は、反転させる、請求項１〜７のいずれか一項記載のアンタゴニスト又はアゴニスト。
【請求項９】
処置が、膵島細胞の脱分化を予防し、又は、反転させる、請求項１〜８のいずれか一項記載のアンタゴニスト又はアゴニスト。
【請求項１０】
配列番号：１に対応する配列を含むＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニストを含み、
前記アンタゴニストは、前記ＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合するモノクローナル抗体である、
医薬組成物。
【請求項１１】
前記抗体が、前記ＩＧＦＲ様レセプターのエピトープに特異的に結合し、該エピトープが、配列：
（ｉ）TSKRTPDGFDSVPLKT（配列番号：２）及び／又は
（ｉｉ）CHQCDPDKYSE（配列番号：３）及び／又は
（ｉｉｉ）MYKWAKPKICSEDLEG（配列番号：４）及び／又は
（ｉｖ）FQRTTFHEASRKYTN（配列番号：５）及び／又は
（ｖ）CTFSRNTPTRTFNY（配列番号：６）
を含む、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
配列：
（ｉ）TSKRTPDGFDSVPLKT（配列番号：２）及び／又は
（ｉｉ）CHQCDPDKYSE（配列番号：３）及び／又は
（ｉｉｉ）MYKWAKPKICSEDLEG（配列番号：４）及び／又は
（ｉｖ）FQRTTFHEASRKYTN（配列番号：５）及び／又は
（ｖ）CTFSRNTPTRTFNY（配列番号：６）
を含むＩＧＦＲ様レセプターのエピトープに特異的に結合する、
モノクローナル抗体。
【請求項１３】
糖尿病又は糖尿病の進行リスクを診断する方法に使用するための、ＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合可能な診断用結合剤であり、前記ＩＧＦＲ様レセプターは、配列番号：１の配列に対応する配列を含む、
診断用結合剤。
【請求項１４】
ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニストについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング法であり、
（ａ）前記ＩＧＦＲ様レセプターを発現している安定した細胞系統を提供する工程と、
（ｂ）前記（ａ）の細胞系統を、候補アンタゴニスト又はアゴニストと接触させる工程と、
（ｃ）ＩＧＦＲ様レセプターの下流シグナル伝達イベントを測定する工程であって、アンタゴニストは、前記ＩＧＦＲ様レセプターの下流シグナル伝達イベントが増大することにより特定され、アゴニストは、前記ＩＧＦＲ様レセプターの下流シグナル伝達イベントが減少することにより特定される測定工程とを含み、
ここで、前記ＩＧＦＲ様レセプターは、配列番号：１の配列に対応する配列を含み、
ここで、前記下流シグナル伝達イベントは、ＩｎｓＲリン酸化、ＡＭＰＫリン酸化、ｍＴＯＲリン酸化、ＡＫＴリン酸化、ＥＲＫリン酸化、及び／又はＳ６Ｋリン酸化である、
方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法により得ることができるＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニストであり、
前記ＩＧＦＲアンタゴニストは、抗体、ｓｉＲＮＡ、核酸、アプタマー、ペプチド、タンパク質、又は小分子有機化合物から選択される、
アンタゴニスト又はアゴニスト。
【請求項１６】
対象における膵島細胞の変性を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断法であって、
ｉ）前記対象から得られたサンプルを、ＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合する診断用結合剤と接触させる工程と、
ｉｉ）該結合剤の結合を検出する工程とを含み、
ここで、前記診断用結合剤の検出可能な結合は、対象における膵島細胞の脱分化を示し、
ここで、ＩＧＦＲ様レセプターは、配列番号：１に対応する配列を含む、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断法。
【請求項１７】
膵島細胞の脱分化が、糖尿病又は糖尿病の進行リスクを示す、請求項１６記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断法。
【請求項１８】
サンプルが、血漿サンプルである、請求項１６又は１７記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断法。
【請求項１９】
診断用結合剤が、モノクローナル抗体である、請求項１６〜１８のいずれか一項記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［背景］
インスリン／インスリン様成長因子（ＩＧＦ）は、複数の生理学的及び病理学的プロセスのレギュレーションに関与する、リガンド、細胞表面レセプター、及び結合タンパク質のネットワークを構築している。インスリン／ＩＧＦは、生命の全ての段階において、重要な発達的及び代謝的役割を果たしている。インスリン／ＩＧＦシグナル伝達は、寿命のレギュレーションにも寄与しているが、シグナル伝達の調節不全は、腫瘍に関与している。インスリンレセプター（ＩｎｓＲ）及びＩＧＦ−１レセプター（ＩＧＦ１Ｒ）は、それらの下流の細胞質メディエーターの大部分を共有しているが、実験的及び臨床的証拠のほとんどが、（主にインスリンによる）ＩｎｓＲ活性化が代謝活性を主にもたらし、一方で、（主にＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２による）ＩＧＦ１Ｒ活性化が増殖及び分化イベントをもたらすという概念と一致している（Sarfstein R and Werner H Endocrinology. 2013 May;154(5):1672-9；Siddle K J Mol Endocrinol. 2011 Jun 17;47(1):R1-10）。
【０００２】
ＩｎｓＲ及びＩＧＦ１Ｒは、膜貫通チロシンキナーゼ含有レセプターのファミリーに属する。それらの成熟型において、それらは、２つの細胞外α−サブユニットと、チロシンキナーゼ活性を有する２つの膜貫通βサブユニットとから構成されるヘテロ四量体として存在する。ＩＧＦ−及びインスリンレセプターは、高度な相同性（チロシンキナーゼドメインにおいて８４％、リガンド結合ドメインにおいて４５％〜６５％、及び、アミノ酸配列全体において５０％超）を示す。加えて、これらのレセプターは、ゲノム構築において顕著な類似性を表わす（Sarfstein R and Werner H, loc. cit.; Arnalez F and Helman L. Hematol Oncol Clin North Am. 2012 Jun;26(3):527-42）。
【０００３】
また、インスリンレセプターの半分とＩＧＦレセプターの半分とから構成される「ハイブリッド」レセプター（ＩＧＦ１Ｒαβに結合しているＩＲαβ）も存在する。ハイブリッドは、ＩＧＦＲに対してと同様の親和性で、ＩＧＦに結合するが、ＩｎｓＲより実質的に低い親和性でインスリンに結合する。ハイブリッドレセプターが別個の生理学的役割を有するかどうかは不明である（Sarfstein R and Werner H, loc. cit.; Arnalez F and Helman L., loc. cit）。
【０００４】
インスリンレセプターは、エクソン１１によりコードされる配列の選択的スプライシングの結果として、２つのスプライシング変異アイソフォームで存在する。「Ｂ」アイソフォームは、インスリンのみを認識するが、「Ａ」アイソフォームは、腫瘍により最も一般的に発現されるアイソフォームであり、インスリンならびにＩＧＦ１及び２の両方を認識する。両アイソフォームは、発達中に差動的に発現される。ここで、ＩｎｓＲ−Ａは、胎児組織において優先的に発現され、ＩｎｓＲ−Ｂは、成体組織、特に、肝臓、筋肉、及び脂肪細胞において優先的に発現される。ＩＧＦ１Ｒは、逆パターンの発現を表わし、肝臓には存在せず、脂肪組織には低レベルで存在し、脳には高レベルで存在する。加えて、その強力な抗アポトーシス性で生存促進性の役割と一致して、ＩＧＦ１Ｒは、ほとんどの腫瘍及び悪性細胞において過剰発現される（Pollak M Nat Rev Cancer. 2012 Feb 16;12(3):159-69、Sarfstein R and Werner H, loc. cit.; Siddle K, loc cit）。
【０００５】
ＩＧＦ１及びＩＧＦ２は、内分泌、パラクライン、又はオートクライン様式で発現される場合がある。後者は、トランスフォーメーションされた細胞において一般的である。肝臓は、それらの主な生成部位である。対照的に、インスリン生成は、膵臓β細胞に限定されている。インスリン及びＩＧＦは、それらの特異的なレセプターに高い親和性で結合し、ＩＧＦ２を除いて、非同種のレセプターに低い親和性で結合する。ＩＧＦ２は、ＩｎｓＲ−Ａにも、高い親和性で結合する（Pollak M, loc cit.; Siddle K, loc. cit.）。
【０００６】
リガンド結合により、ＩｎｓＲ及びＩＧＦ１Ｒの構造におけるコンホーメーション変化が誘引され、それらに固有のチロシンキナーゼ活性が活性化される。インスリン及びＩＧＦは、別個の生理学的役割を果たしているが、それらは、同じシグナル伝達経路を利用している。ＩｎｓＲ及びＩＧＦ１Ｒの下流シグナル伝達はほとんど、ＭＡＰＫ／Ｒａｓ−Ｒａｆ−Ｅｒｋ経路、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ（ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ）経路、及びヤーヌスキナーゼ／シグナルトランスデューサー及びアクチベーターの転写（ＪＡＫ／ＳＴＡＴ）経路により伝えられる。最終的に、ＩＧＦ１Ｒの活性化により、細胞増殖の増大及びアポトーシスの減少がもたらされる。一方、インスリン結合によるＩｎｓＲの活性化により、脂質、タンパク質、及び炭水化物の貯蔵及び合成が促進され、その破壊及び循環内への放出が阻害される。インスリンがエネルギー貯蔵又は利用を増大させる第１工程は、促進性グルコーストランスポーターＧｌｕｔ４により媒介される、細胞内へのグルコースのレギュレーションされた輸送による（Chang et al. Mol Med. 2004 Jul-Dec; 10(7-12): 65-71.）。インスリン発現は、特殊化された膵臓β細胞に限定されており、正常な環境下では、循環グルコースレベルにより厳密にレギュレーションされている。古典的なインスリン感受性臓器（肝臓、筋肉、及び脂肪組織）によるインスリン刺激グルコース取込みにより、循環グルコースレベルは低下する。このため、β細胞は、グルコースを感知し、生理学的グルコースレベルを比較的狭い範囲で維持するためにインスリンを放出する、グルコース「サーモスタット」である。繊細に釣り合っているＩｎｓＲシグナル伝達経路の破壊により、制御されていない又は損なわれたインスリン分泌、調節不全の血中グルコースレベル、及び最終的には、膵臓β細胞の破壊又は機能喪失（糖尿病として一般に公知な症状）がもたらされる（Pollak M, loc cit.；Siddle K, loc. cit.; Sarfstein R and Werner H, loc. cit；Arnalez F and Helman L., loc. cit）。
【０００７】
世界中の成人人口の８．３％が患っており、大変な率で増大している糖尿病は、現代の最も一般的な疾患の１つである。糖尿病患者数は、２０１３年の３億８２００万人から、２０３５年までに５億９２００万人に増大すると予測されている。これは、５５％の正味の増加を意味する。主な形態は、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）であり、全ての糖尿病症例の９０％近くを占めている（Hameed et al. World J Diabetes. 2015 May 15; 6(4): 598-612）。
【０００８】
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、世界中で数百万人が患っている自己免疫障害であり、膵臓内のランゲルハンス膵島におけるインスリン生成β細胞の臓器特異的免疫破壊の結果として生じる。それらの細胞が一旦破壊されると、１型糖尿病を有する患者は、血中グルコースの制御を失い、同喪失により、急性症状（例えば、ケトアシドーシス及び重度の低血糖）及び二次合併症（心疾患、盲目、及び腎不全を含む）がもたらされるおそれがある。１型糖尿病は、遺伝的素因、大部分は、未知の環境要因及び確率的イベントの組み合わせの結果として進行すると考えられる。ただし、疾患の開始及び進行を制御する正確な免疫学的、遺伝的、及び生理学的イベントは、解明が続けられている。
【０００９】
初期の２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）は、古典的なインスリンターゲット臓器のインスリン抵抗性（すなわち、正常なインスリンターゲット細胞によるグルコース取込みの低下、多くの場合、過剰なカロリー摂取により誘引される）により生じ、高インスリン血症をもたらす。最初の内は、インスリンレベルのこれらの上昇は、インスリン抵抗性を克服し、高血糖を避けるのに十分である。しかしながら、最終的には、インスリン抵抗性の増大によるのみではなく、膵臓β細胞によるインスリン分泌の減少によっても、高血糖が生じる。
【００１０】
血中グルコースレベルを制御することが、糖尿病処置の主な目的である。Ｔ１Ｄは、一般的には、インスリン投与ならびに食事変化及び運動により管理されている。しかしながら、栄養摂取後のインスリン注射を一生必要とすることは、患者のクオリティ・オブ・ライフを酷く低下させるおそれがある。さらに、インスリン注射の適切な用量及びタイミングを証明するのは難しい。Ｔ１Ｄの治癒又は予防は、発症プロセスに確かに関連するバイオマーカーが存在していないことにより重度に損なわれ、診断時には、β細胞数の著しい減少がもたらされる。今日において、１型糖尿病におけるほとんどの臨床試験の目的は、残存している機能的なβ細胞の塊を、免疫寛容を最適に誘引し、一方で、保護的な免疫応答を保存することにより改善することである。定義上は、処置に先立つ著しいβ細胞破壊のために、これは、疾患が治癒するのは稀であろう。したがって、疾患開始時に好ましく発現された信頼性のあるバイオマーカーは、非常に望ましいであろう。他の方法は、インスリン分泌機能を再構成するために、膵臓又は膵臓β細胞のいずれかの移植に焦点を当てている。しかしながら、この技術は、ドナー臓器の不足により妨害される。Ｔ２Ｄについては、インスリン以外に、合成血糖低下剤を含む他の非インスリン治療剤が利用可能である。しかしながら、同合成血糖低下剤は、多くの場合、その実際上の効果、投与の都合に関して限定的であり、有害な反応を引き起こすおそれがある。
【００１１】
利用可能な糖尿病治療剤の安全性の懸念及び有害な作用、ならびに、今日試験されたいずれかの作用物質によっても疾患が持続的に軽減されないために、疾患をモデュレーションすることができる特定の介在について関心が高まっている。
【００１２】
本発明の目的は、従来技術における必要性に応じることである。
【発明の概要】
【００１３】
本発明者らにより、ヒトＫＩＡＡ１３２４遺伝子によりコードされるタンパク質（エストロゲン誘引遺伝子１２１タンパク質（Ｑ６ＵＸＧ２）としても公知）が、特に、膵臓において、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−２Ｒ、及びＩｎｓＲと共存していることが観察された。エストロゲン誘引遺伝子１２１タンパク質には、オートファジーのレギュレーション及びストレス下での細胞の生存促進の機能が与えられた。エストロゲン誘引遺伝子１２１によりコードされる変異タンパク質も、当技術分野において公知であり、ＭＡＢＡ−１（国際公開公報第２００７／００５９８７号）と指定された。ＭＡＢＡ−１は、エストロゲン誘引遺伝子１２１によりコードされるタンパク質とは、１つの位置において異なっている。ＭＡＢＡ−１は、ガンにおいて役割を果たすと考えられる。このタンパク質をブロックすることにより、ガン細胞の増殖阻害がもたらされるためである。しかしながら、代謝における前記タンパク質の役割については、単独で推測されることはもちろん、何も知られていなかった。この役割は、本発明者らによって、はじめて前記タンパク質に帰するものとされた。
【００１４】
ＩＧＦＲのドメイン構造に類似するそのドメイン構造のために、本発明者らは、このタンパク質に、レセプターの機能を与え、このため、このタンパク質をＩＧＦＲ様レセプターと呼んだ。本発明者らにより、脳下垂体、視床下部、及び膵島細胞におけるそのＩＧＦＲ様レセプターの最も高い発現も観察された。これらは、食物摂取及び代謝を制御する内分泌系を構成している。
【００１５】
さらに、本発明者らは、ＩＧＦＲ様レセプターのノックダウン又はノックアウトのいずれかにより、ＩｎｓＲ及びＩＧＦＲ１のリン酸化の増大がもたらされ、ＡＭＰＫのリン酸化の増大ももたらされ、ＩＧＦＲもしくはＩｎｓＲのいずれか又は両方が、シグナル、例えば、インスリンの結合を伝達した場合に、下流シグナル伝達コンポーネントが活性になることを解明した。したがって、ＩＧＦＲ様は、ＩｎｓＲ及び／又はＩＧＦＲ媒介性シグナル伝達を、負にレギュレーションすると考えられる。また、本発明からの知見、すなわち、ＫＩＡＡ１３２４遺伝子によりコードされるタンパク質が実際にＩＧＦＲ様レセプターとして作用することに関して、本発明者らは、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を詳細に調べることにより、ＫＩＡＡ１３２４遺伝子におけるＳＮＰと、２型糖尿病、ＬＤＬコレステロール、及び／又は冠動脈疾患との強力な関連性を見出した。
【００１６】
要するに、本発明者らによりＩＧＦＲ２及び／又はＩｎｓＲのモデュレーターの機能が与えられた、ヒトＫＩＡＡ１３２４遺伝子によりコードされるタンパク質は、代謝における、特に、インスリンシグナル伝達における、及び同様に、ＬＤＬコレステロール代謝における、ならびに、冠動脈心疾患等の疾患に伴う役割を果たす。この知見は、非常に重要なものである。ＩＧＦＲ及びＩｎｓＲとは別に、インスリンシグナル伝達における更なるプレーヤーが存在する可能性があるとは考えられていなかったためである。ＩＧＦＲ及び／又はＩｎｓＲにおけるその想定される負のレギュレーション機能のために、本発明のＩＧＦＲ様レセプターは、モデュレーターとして魅力的なターゲットであると考えられ、このため、例えば、糖尿病、ＬＤＬコレステロール関連障害、及び冠動脈疾患、ただし、特に、ＩＩ型糖尿病を処置するための医薬の開発についての新たな道を開くことができる。
【００１７】
したがって、前記レセプターのアンタゴニストは、例えば、ＩＩ型糖尿病の発病に一般的に見られるインスリン抵抗性を反転させる、新規で、緊急に必要とされる可能性を開く。一方、アゴニストは、インスリンシグナル伝達をブロックするのに使用することができる。際立ったことに、本発明者らは、ＩＧＦＲ様レセプターが膵臓におけるβ細胞の脱分化に関連することも示すことができた。同脱分化は、最終的に、β細胞の破壊又は機能喪失をもたらす疾患開始における初期イベントである。したがって、ＩＧＦＲ様レセプターは、元に戻せないβ細胞の喪失の前に、糖尿病の早期診断及び処置を可能にする促進性診断ツールでもあり、このため、Ｉ型糖尿病の処置のための道を開く可能性がある
【００１８】
したがって、本発明は、配列番号：１のＩＧＦＲ様レセプターに対して生じた抗体と反応可能なＩＧＦレセプター（ＩＧＦＲ）様レセプターをコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。ここで、前記抗体は、配列
（ｉ）TSKRTPDGFDSVPLKT（配列番号：２）及び／又は
（ｉｉ）CHQCDPDKYSE（配列番号：３）及び／又は
（ｉｉｉ）MYKWAKPKICSEDLEG（配列番号：４）及び／又は
（ｉｖ）FQRTTFHEASRKYTN（配列番号：５）及び／又は
（ｖ）CTFSRNTPTRTFNY（配列番号：６）
の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する。
【００１９】
特に、前記単離されたＤＮＡ配列は、配列番号：１に対応する配列を含むＩＧＦＲ様レセプターをコードすることができる。
【００２０】
単離されたＤＮＡ配列は、特に、配列番号：７に対応する配列（ＮＭ＿０２００７７５．４）を含むことができる。
【００２１】
さらに、本明細書において、本明細書で記載されたＤＮＡ配列を含むベクターが提供される。前記ベクターは、前記ＩＧＦＲ様レセプターをコードするＤＮＡ配列に操作可能に結合している遺伝子調節エレメントをさらに含むことができる。前記ベクターを含むホスト細胞も想定される。
【００２２】
さらに、本明細書において、糖尿病又は糖尿病の進行リスクについての診断マーカーとして使用するための、ＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合可能であり、前記ＩＧＦＲ様レセプターは、配列番号：１の配列に対応する配列を含む、結合剤が提供される。
【００２３】
本発明のＩＧＦＲ様レセプター（前記ＩＧＦＲ様レセプターは、例えば、配列番号：１に対応する配列を含む）のアンタゴニスト及びアゴニストも、本明細書において提供される。前記アンタゴニスト及びアゴニストは、一般的には、医薬としての使用が想定される。具体的には、本明細書で提供されたアンタゴニスト及びアゴニストは、糖尿病の予防的及び／又は治療的処置の方法に使用するのを意図している。ただし、アンタゴニストが好ましい。
【００２４】
本アンタゴニスト及びアゴニストは、前記ＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合するのが想定され、特に、抗体、ｓｉＲＮＡ、核酸、アプタマー、ペプチド、タンパク質、又は小分子有機化合物等から選択することができる。抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であることができる。
【００２５】
特に、前記抗体、好ましくは、モノクローナル抗体は、前記ＩＧＦＲ様レセプターのエピトープに特異的に結合する抗体（例えば、モノクローナル抗体）であることができる。該エピトープは、配列：
（ｉ）TSKRTPDGFDSVPLKT（配列番号：２）及び／又は
（ｉｉ）CHQCDPDKYSE（配列番号：３）及び／又は
（ｉｉｉ）MYKWAKPKICSEDLEG（配列番号：４）及び／又は
（ｉｖ）FQRTTFHEASRKYTN（配列番号：５）及び／又は
（ｖ）CTFSRNTPTRTFNY（配列番号：６）
を含むか、又は、これらからなる。
【００２６】
本明細書で提供された診断的及び／又は治療的使用において、糖尿病は、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病、前糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、及び耐糖能障害を含むことが想定される。
【００２７】
ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニストもしくはアゴニスト（アンタゴニストが好ましい）による処置は、インスリン抵抗性を予防し、もしくは、反転させることができ、ならびに／又は、膵臓β細胞の脱分化及び／もしくは機能喪失を反転させることができる。
【００２８】
さらに、本明細書において、ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニスト（アンタゴニストが好ましい）を含む、医薬又は医薬組成物が提供される。好ましい実施態様では、前記ＩＧＦＲ様レセプターは、配列番号：１に対応する配列を含むか、又は、同配列からなる。前記アンタゴニスト又はアゴニストは、好ましい実施態様では、前記ＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【００２９】
前記好ましいモノクローナル抗体は、特に、前記ＩＧＦＲ様レセプターのエピトープに結合することが想定される。該エピトープは、配列
（ｉ）TSKRTPDGFDSVPLKT（配列番号：２）及び／又は
（ｉｉ）CHQCDPDKYSE（配列番号：３）及び／又は
（ｉｉｉ）MYKWAKPKICSEDLEG（配列番号：４）及び／又は
（ｉｖ）FQRTTFHEASRKYTN（配列番号：５）及び／又は
（ｖ）CTFSRNTPTRTFNY（配列番号：６）
を含むか、又は、同配列からなる。
【００３０】
さらに、本明細書において、配列
（ｉ）TSKRTPDGFDSVPLKT（配列番号：２）及び／又は
（ｉｉ）CHQCDPDKYSE（配列番号：３）及び／又は
（ｉｉｉ）MYKWAKPKICSEDLEG（配列番号：４）及び／又は
（ｉｖ）FQRTTFHEASRKYTN（配列番号：５）及び／又は
（ｖ）CTFSRNTPTRTFNY（配列番号：６）
の、ＩＧＦＲ様レセプターのエピトープに特異的に結合する、モノクローナル抗体が提供される。
【００３１】
さらに、本明細書において、ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニストについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイ法であり、
（ａ）前記ＩＧＦＲ様レセプターを発現している安定した細胞系統を提供する工程と、
（ｂ）前記（ａ）の細胞系統を、候補アンタゴニスト又はアゴニストと接触させる工程と、
（ｃ）ＩＧＦＲ様レセプターの下流シグナル伝達イベントを測定し、又は、検出する工程であって、アンタゴニストは、前記ＩＧＦＲ様レセプターの下流シグナル伝達イベントをサプレッションすることにより特定され、アゴニストは、前記ＩＧＦＲ様レセプターの下流シグナル伝達イベントを促進することにより特定される測定又は検出工程とを含み、
ここで、前記ＩＧＦＲ様レセプターは、好ましい実施態様では、配列番号：１の配列に対応する配列を含む、方法が提供される。
【００３２】
また、本明細書において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイ法により得ることができるＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニストであり、前記ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニストは、抗体、ｓｉＲＮＡ、核酸、アプタマー、ペプチド、タンパク質、又は小分子有機化合物から選択される、アンタゴニスト又はアゴニストが提供される。
【００３３】
さらに、本発明は、対象における膵島細胞の変性を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断アッセイ法であって、
ｉ）前記対象のサンプル、例えば、血漿サンプルを、ＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合する診断用結合剤、例えば、モノクローナル抗体と接触させる工程と、
ｉｉ）該結合剤の結合を検出する工程とを含み、
ここで、前記結合剤の検出可能な結合は、対象における膵島細胞の脱分化を示し、ここで、ＩＧＦＲ様レセプターは、配列番号：１に対応する配列を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断アッセイ法を提供する。
【００３４】
該診断用結合剤（特に、本発明の抗体、例えば、モノクローナル抗体であることができる）は、例えば、配列
（ｉ）TSKRTPDGFDSVPLKT（配列番号：２）及び／又は
（ｉｉ）CHQCDPDKYSE（配列番号：３）及び／又は
（ｉｉｉ）MYKWAKPKICSEDLEG（配列番号：４）及び／又は
（ｉｖ）FQRTTFHEASRKYTN（配列番号：５）及び／又は
（ｖ）CTFSRNTPTRTFNY（配列番号：６）
の、ＩＧＦＲ様レセプターのエピトープに特異的に結合することが想定される。
【００３５】
膵島細胞の脱分化は、糖尿病又は糖尿病の進行リスクを示すことが想定される。
【００３６】
該診断用結合剤は、好ましくは、組成物、例えば、診断用組成物の形態であることができる。したがって、本発明は、本明細書で記載された診断用結合剤を含み、場合によりさらに、前記診断用結合剤がそのターゲット、すなわち、本明細書で記載されたＩＧＦＲ様レセプターに結合するのを検出するための手段を含む、診断用組成物も提供する。
【００３７】
また、本発明は、膵島細胞の変性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出のための、本発明の結合剤、及び特に、本発明の抗体の使用に関する。治療用又は診断用組成物の製造のためのこれらの抗体の使用も企図される。
【００３８】
さらに、本明細書において、糖尿病を処置する方法であって、ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニストを、対象に投与することを含み、前記ＩＧＦＲ様レセプターは、配列番号：１に対応する配列を含む、方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
本発明は、非限定的な実施例及び添付の図面と合わせて検討することで、詳細な説明を参照して、より良好に理解されるであろう。図は、本発明の方法の実施態様を例証する。
【図１】本明細書全体を通して列記された配列の図示。配列番号：１は、ＩＧＦＲ様レセプターの長い転写物を表わす。予想される成長因子ドメインには、赤で下線が引かれている。マンノース−６−リン酸レセプター結合ドメインには、緑で下線が引かれている。膜貫通領域には、黒で下線が引かれている。細胞質領域には、青で下線が引かれている。抗体が作成された配列番号：２〜６に対応する５つのエピトープは、下線が引かれた太字の文字で強調されている。
【図２】ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、及びインスリンリガンドに隣接するＩＧＦＲ様レセプターの膵臓における発現。Ｅ１４．５マウス胚のGenepaint.org  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、膵臓におけるＩＧＦＲ様レセプター  ｍＲＮＡの特異的な発現が示される（Ｂ）。ＩＧＦ１及びＩＧＦ２  ｍＲＮＡは、膵臓上皮に隣接する組織において発現される（Ａ、Ｃ）。一方、インスリン  ｍＲＮＡは、膵臓の内分泌区画に存在する（Ｄ）。
【図３】ＩＧＦＲ様レセプターノックアウトマウスは、正常な体重で生まれた後早期に死亡する。ＥＵＣＯＭＭアレルの模式図（Ａ）。ＥＵＣＯＭＭアレルは、条件付き可能性を有するノックアウト第１レポータータグ付きインサート（プロモーター駆動カセット）である（Skarnes WC et al. 2011; Nature）。Ｌ１Ｌ２＿Ｂａｃｔ＿Ｐカセットを、第３番染色体の位置１０８４８９４８４（重要なエクソンの上流）に挿入した（Ｂｕｉｌｄ  ＧＲＣｍ３８）。このカセットは、ＦＲＴ部位、続けて、ｌａｃＺ配列及びｌｏｘＰ部位から構成される。この第１ｌｏｘＰ部位に続けて、ヒトベータ−アクチンプロモーターの制御下にある、ネオマイシン、ＳＶ４０  ポリＡ、第２ＦＲＴ部位、及び第２ｌｏｘＰ部位である。第３ｌｏｘＰ部位は、位置１０８４８８６０２におけるターゲットエクソンの下流に挿入される。重要なエクソンは、ｌｏｘＰ部位に隣接している。「条件付きレディ」（ｌｏｘＰ導入）アレルを、このアレルを有するマウスにおいて、ｆｌｐリコンビナーゼ発現により形成することができる。後のｃｒｅ発現により、ノックアウトマウスがもたらされる。ｃｒｅ発現がｆｌｐ発現なしに生じる場合、レポーターノックアウトマウスが生じるであろう（http://www.informatics.jax.org/allele/MGI:4436415）。ＩＧＦＲ様レセプターノックアウトマウスは、誕生時に正常な外観を示すが、その胃にミルクが無かったことにより示されるように授乳しない（Ｂ、スター）。同マウスは、活発でなく、代謝機能不全のサインである呼吸困難を表わす。種々の段階におけるメンデル比は、誕生まで３つの遺伝子型の正常な分布を示すが、生存しているノックアウトマウスの確率は、誕生後から離乳齢までに有意に低下する。おそらく、補償メカニズム及び／又は、不完全なノックアウトをもたらす挿入カセット付近でのスプライシングにより、離乳齢において、ごくわずかな生存が認められる（Ｃ）。ヒストグラムは、Ｐ０での野生型及びヘテロ接合性同腹子対照と比較した、ノックアウトマウスの正常な体重を示す（Ｄ）。
【図４】ＩＧＦＲ様レセプターＫＯマウスの膵臓における、成長、増殖、及び内分泌分化。膵臓切片の共焦点画像から、インスリン抗体（緑色）を使用する、免疫蛍光ラベルβ細胞により示されるように、Ｅ１６．５における正常な内分泌分化が示される（同様の結果を、Ｅ１４．５及びＥ１８．５において得た。図示せず）。膵臓上皮の正常な増殖が、ＥｄＵ（赤色）の包含により示される。Ｅ１４．５、Ｅ１６．５、及びＥ１８．５における総細胞数（ＤＡＰＩにより染色）に対するＥｄＵ陽性細胞の定量から、ノックアウトと野生型の膵臓との間での増殖における有意差は示されない（１つの膵臓／段階の異なる領域から少なくとも３つの切片をカウントした。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表わす）。
【図５】誕生前のＩＧＦＲ様レセプターＫＯマウスにおける膵臓遺伝子発現。リアルタイムｑＰＣＲから、内分泌β細胞分化、成熟、増殖、及びノックアウト膵臓における機能に重要な選択遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現において、Ｅ１８．５における野生型対照と比較して、中程度の変化が示される。この段階では、胚は、未だに母性栄養に頼っている（Ｎ＝４、エラーバーは、ＳＥＭを表わす）。アクチンを、正規化のためのハウスキーピング遺伝子として使用した。
【図６】胎盤栄養供給が中断され、ＩｎｓＲ−ＡがＩｎｓＲ−Ｂに切り替わった時点での、誕生後のＩＧＦＲ様レセプターＫＯマウスにおける膵臓遺伝子発現の変化。内分泌β細胞分化（Ｆｏｘａ２、Ｐｄｘ１、Ｐａｘ６、Ｎｅｕｒｏｄ１、Ｎｋｘ２−２、Ｎｋｘ６−１）、成熟（ＭａｆＡ、ＭａｆＢ、Ｕｃｎ３）、増殖（Ｃｃｎｄ１、Ｃｃｎｄ２、Ｃｄｋ４、Ｃｄｋｎ１ａ、Ｃｄｋｎ１ｂ）、及び機能（Ｓｌｃ２ａ２、Ｓｌｃ３０ａ８、Ｇｊｄ３、Ｋｃｎｊ１１、Ｓｍａｒｃａ１、Ａｂｃｃ８）に重要な選択遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現は、リアルタイムｑＰＣＲにより示されたように、ノックアウト膵臓において、誕生直後の野生型対照と比較して有意に変化している（Ｎ＝２、エラーバーは、ＳＥＭを表わす）。
【図７】ＩＧＦＲ様レセプターにより、膵臓及びＭｉｎ６マウスインスリノーマ細胞における、Ａｋｔ及びＡＭＰＫシグナル伝達が媒介された。膵臓組織全体のライゼートのウェスタンブロットから、ホスホ特異的抗体を使用して、Ａｋｔ及びＡＭＰＫのリン酸化が示される（Ａ）。かなりの数の変異胚から、Ａｋｔ（ｍｔ２、３、５、６）及びＡＭＰＫリン酸化（ｍｔ１、２、３）における増大が示される（Ａ）。同様に、（Ｂ）において、Ｍｉｎ６細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターのノックダウンにより、ウェスタンブロットにより示されたように、Ａｋｔリン酸化の増大がもたらされる。Ｍｉｎ６細胞を、ＩＧＦＲ様レセプターｍＲＮＡをターゲットするｓｉＲＮＡ又は対照としてのスクランブルｓｉＲＮＡによりトランスフェクションした。
【図８】Ｍｉｎ６細胞におけるインスリン／ＩＧＦシグナル伝達についての、ＩＧＦＲ様レセプターのノックダウンの影響。Ｍｉｎ６マウスインスリノーマ細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターのノックダウンにより、ＩＲ／ＩＧＦ１Ｒに対するホスホ特異的抗体を使用するウェスタンブロットにより示されたように、正常な増殖条件下でのＩＲ／ＩＧＦ１Ｒのリン酸化の増大がもたらされ、飢餓条件とは独立していると考えられる。ＩＲ及びＩＧＦ１ＲならびにＩＲＳ−２（ＩＲシグナル伝達の下流のアダプター分子）の総レベルは変わらない。一方、ＩＧＦＲ様レセプターは、ノックダウンサンプルにおいて強力に低下する。このことから、ｓｉＲＮＡノックダウンの有効性が確認される（Ａ）。下流シグナル伝達分子、例えば、ＡＫＴ及びｍＴＯＲのウェスタンブロット分析。同ＡＫＴ及びｍＴＯＲは、ＩＲ活性化の結果として共通してリン酸化される重要な分子である。Ｍｉｎ６細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターノックダウンにより、ＡＫＴ及びｍＴＯＲのリン酸化の増大がもたらされるが、ＥＲＫ及びＳ６ＲＰのリン酸化の増大はもたらされない。ホスホＳ６ＲＰの時間依存的減少により示されたように、飢餓条件は、その同じタイミングでの対照と比較して、ＩＧＦＲ様レセプターノックダウンサンプルにおいて、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、及びＥＲＫリン酸化に影響を有さないと考えられる（Ｂ）。
【図９】膵臓の内分泌、管、及び外分泌細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターの局在。ＩＧＦＲ様レセプター（緑色）、インスリン（赤色）、及びＥ−カドヘリン（シアン）に対する抗体により染色されたＥ１８．５膵臓切片の共焦点画像から、外分泌及び内分泌区画の両方におけるＩＧＦＲ様レセプターの免疫局在性が示される。同区画では、ＩＧＦＲ様レセプターは、インスリンと部分的に共存している。核を、ＤＡＰＩにより染色した。
【図１０】Ｍｉｎ６細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターの細胞内局在。ＩＧＦＲ様レセプター及びゴルジマーカーであるＧＭ１３０に対する抗体により染色されたＭｉｎ６細胞の免疫蛍光画像から、ＩＧＦ２Ｒと同様に、ゴルジ複合体におけるＩＧＦＲ様レセプターの部分的な局在が示される。
【図１１】飢餓によるＩＧＦＲ様レセプターの局在。ＩＧＦＲ様レセプター（赤色）及びＧＭ１３０（緑色）により免疫蛍光ラベルされたＭｉｎ６細胞の共焦点画像から、正常な増殖条件と比較して、飢餓の２時間後に、ｃｉｓ−ゴルジ領域に濃縮されたＩＧＦＲ様レセプターの再分布が示される。
【図１２】ＩＧＦＲ様レセプターのＡＰ−２結合及び分取シグナルの局在。図に、配列番号：１１、配列番号：１２、及び配列番号：１の一部のアミノ酸配列を示す。
【図１３】飢餓条件下でのＩＧＦＲ様レセプターとＡＰ２との相互作用。ウェスタンブロット分析から、ＩＧＦＲ様レセプター及びアダプチンｂに対する抗体を使用する免疫沈降により証明されたように、飢餓によるＭｉｎ６細胞におけるアダプチンｂサブユニット（ＡＰ２複合体の一部）とＩＧＦＲ様レセプターとの共免疫沈降が示される。実質的には、正常な条件下では、アダプチンｂは、共沈降しなかった。
【図１４】ＩＧＦＲ様レセプターは、栄養欠乏により細胞内に輸送されるが、ＩｎｓＲは輸送されない。表面ビオチン化、続けて、ニュートラビジンプルダウン及びウェスタンブロットから、飢餓条件下でのＭｉｎ６細胞における、ＩＧＦＲ様レセプターの表面発現の減少の時間依存的減少が証明されるが、ＩＲの減少は証明されない。
【図１５】ＩＧＦＲ様レセプターノックダウンは、基本的な条件において、オートファジー関連タンパク質のタンパク質発現を変化させない可能性が高い。オートファジー関連分子のウェスタンブロット分析により、正常な増殖条件下でのＭｉｎ６細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターノックダウンによる発現において、見掛けの変化は示されない。
【図１６】マウス糖尿病膵島及び外分泌組織におけるＩＧＦＲ様レセプターの発現。ＩＧＦＲ様レセプター（赤色）、インスリン（シアン）、及びＥ−カドヘリン（緑色）（Ａ）、ならびに、ＩＧＦＲ様レセプター（赤色）、グルカゴン（シアン）、及びウロコルチン３（緑色）（Ｂ）に対する抗体により染色された野生型（＜１２０mg/dL グルコース）及び糖尿病（＞５００mg/dL グルコース）成体膵臓のＬＳＭ画像から、内分泌及び外分泌区画の両方において、糖尿病膵臓におけるＩＧＦＲ様レセプター抗体の免疫反応性の増大が示される。糖尿病状態は、糖尿病膵臓において染色されているインスリン及びウロコルチン３の減少により証明された。右側の画像は、白四角で印を付けられた領域を、より高倍率で表わす。
【図１７】ＩＧＦＲ様レセプターの細胞内及び細胞外ドメインに対する抗体を使用する、膵島細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターの検出。ウェスタンブロット実験から、膵島細胞ライゼートにおける約１３０kDaのタンパク質バンドの特異的な認識が示される。同認識は、配列番号：４及び６の細胞外ドメインに対する抗体による、ＨＥＫ細胞ライゼートには存在しない。比較により、同じバンドは、配列番号：２の細胞内ドメインに対する抗体により、野生型及びヘテロ接合性の総膵臓ライゼートにおいて、特異的に認識されるが、変異胚及び膵島では認識されず、ＨＥＫ細胞では認識されない。
【図１８】ヒトランゲルハンス膵島におけるＩＧＦ３Ｒ発現。ＩＧＦＲ様レセプター（赤色）、ＩＧＦ２Ｒ（Ｍ６ＰＲ）（緑色）、及びインスリン（シアン）に対する抗体により免疫蛍光ラベルされた、ヒトドナーからのランゲルハンス膵島の共焦点画像から、ゴルジ区画における典型的なＩＧＦＲ様レセプター分布ならびにＩＧＦ２Ｒ及びインスリンとの部分的な共存が示される。
【図１９】細胞外ドメインであるＣＲＤ及びＣＴＤにおけるＳＮＰをコードするＫＩＡＡ１３２４／ＩＧＦＲ様。
【図２０】ＳＮＰ付きＫＩＡＡ１３２４とインスリン感受性（Ａ）、アディポカイン及び炎症（Ｂ）、ならびにプロインスリン変換（Ｃ）との関連。
【図２１】インスリン経路におけるＩＧＦＲ様レセプター機能の仮説モデル。ＩＧＦＲ様レセプターがその機能を遂行する可能性がある提唱メカニズムの模式図。１つの仮説において、ＩＧＦＲ様レセプターは、ＩＲシグナル伝達及び再利用のモデュレーターとして作用する可能性がある。ＩＲへのインスリンの結合に基づいて、複合体の会合が、ＩＧＦＲ様レセプターのリクルートをトリガーし、次に、時間及び用量依存的様式において、ＩＧＦＲ様レセプターが、この複合体を、初期エンドソーム／リソソーム区画にターゲットするであろう。リガンドが分解され、ＩＲは、ＩＧＦＲ様レセプターと共に細胞膜に別経路で輸送されるであろう。別の仮説は、インスリンリガンドのＩＧＦＲ様レセプターへの結合が、複合体の内部移行及びインスリンのリソソームにおける分解をトリガーし、これにより、ＩＧＦＲ様レセプターが、特定の環境下で放出された過剰な細胞周辺量のインスリンを除去させるスカベンジャー分子として作用する可能性があることに向けられる。最後に、ＩＧＦＲ様レセプターは、分泌胞の正確なガイド及び輸送により、インスリン顆粒の生合成及び成熟に関与する可能性がある。
【図２２】ＩＧＦＲ様レセプターは、ヒトにおける膵臓β細胞の機能不全を示す。ＩＧＦＲ様レセプター（赤色）及びインスリン（緑色）に対する抗体により染色されたヒト膵臓切片のＬＳＭ画像。核のＤＡＰＩ（青色）による染色から、非糖尿病（４．６％ ＨｂＡ１ｃ値）患者と比較して、糖尿病（６．９％ ＨｂＡ１ｃ値）患者における、インスリンの減少及びＩＧＦＲ様レセプター発現の増大が示される（糖尿病状態の指標として使用されるＨｂＡ１ｃは、血漿中における糖化ヘモグロビンＨｂＡ１ｃのパーセントとして定義される。正常範囲：５．９％未満）。
【図２３】細胞培養物及びマウスにおけるレセプター機能を研究するためのＩＧＦＲ様レセプターノックアウト及びノックイン戦略。（１）コアプロモーター及び転写開始側をターゲットするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ノックアウト戦略の模式図。（２）翻訳停止配列を除去し、ＶｅｎｕｓをインフレームにＩＧＦＲ−Ｉオープンリーディングフレームに融合することによる、Ｖｅｎｕｓ蛍光レポーターのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ノックイン融合の模式図。ＩＧＦＲ−Ｉ遺伝子は、マウスの第３番染色体１０８４５５６９４−１０８５３６５３６に存在している。
【図２４】野生型及びノックアウトＭｉｎ６細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターの細胞内局在。ＩＧＦＲ様レセプター（赤色）及びインスリン（緑色）に対する抗体により染色されたＭｉｎ６細胞の免疫蛍光画像。核を、ＤＡＰＩにより染色した（青色）。
【図２５】Ｍｉｎ６細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターノックアウトの確認。（Ａ）ＩＧＦＲ−Ｉの転写開始側周辺のゲノムＰＣＲから、大きなフラグメントのホモ接合性の内部欠失が示される。（Ｂ）ウェスタンブロットから、ＩＧＦＲ−Ｉヌル変異が確認され、ＩＧＦＲ−Ｉタンパク質が、ノックアウトＭｉｎ６クローンにおいて完全に存在しないことが示される。このことから、免疫細胞化学的結果が確認される。
【図２６】Ｍｉｎ６細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターノックアウト。リン酸化インスリンレセプター（ＩＲ）及び下流シグナル伝達分子、例えば、ＡＭＰＫ、ＡＫＴ、及びｍＴＯＲのウェスタンブロット分析。同分子は、ＩＲ活性化の結果として共通してリン酸化される重要な分子である。Ｍｉｎ６細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターノックアウトにより、ＩＲのリン酸化増大、及びその結果として、ＡＭＰＫリン酸化の増大がもたらされるが、Ａｋｔ又はｍＴｏｒリン酸化の増大はもたらされない。Ｍｉｎ６対照及びノックアウトクローンを、増殖条件（１０％ ＦＣＳ及び高濃度グルコース）下において培養した。
【図２７】ＩＧＦＲ様Ｖｅｎｕｓ融合ノックインＭｉｎ６細胞系統。ＩＧＦＲ−Ｉを、Ｖｅｎｕｓ蛍光レポーターに対して、インフレームにＮ末端融合した。内在性ＩＧＦＲ−Ｉ（抗ＩＧＦＲ−Ｉ、赤色）及びＩＧＦＲ−Ｉ−Ｖｅｎｕｓ（抗ＧＦＰによりＶｅｎｕｓを検出、緑色）の共存が、ゴルジ及びtrans−ゴルジ領域において示される。ホモ二量体化及び、膜貫通ドメイン（ＴＭ）又は成長因子レセプターのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）（ＩＰＲ００９０３０）を介したヘテロ二量体化を阻害するか、又は、trans−ゴルジ、ゴルジ、リソソーム、及び細胞膜区画における細胞内局在を変化させる小分子化合物及び生物製剤を、このノックインＭｉｎ６細胞系統を使用した高コンテンツスクリーニングアプローチを使用して特定することができる。
【図２８】ＩＧＦＲ−Ｉは、ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化させたＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋内分泌前駆細胞において、強力にアップレギュレーションされる。
【図２９】ＩＧＦＲ様レセプターの細胞外ドメインに対する抗体を使用する、マウスＭｉｎ６インスリノーマ細胞及びヒトＭＣＦ７乳ガン細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターの検出。ウェスタンブロット実験から、配列番号：４（ＥＩＧ−Ｂ  １８Ｂ２及び１０Ｄ９）及び配列番号：６（ＥＩＧ−Ｄ  ２６Ｄ７）の細胞外ドメインに対する抗体による、Ｍｉｎ６（弱）及びＭＣＦ７（強）細胞ライゼートにおける、約１３０kDaのタンパク質バンドの特異的認識が示される。ＥＩＧ−Ｂクローンは、ラットにおいて、配列番号：４のペプチドに対して生成されたモノクローナル抗体である。一方、ＥＩＧ−Ｄクローンは、マウスにおいて、配列番号：６に対して生成されたモノクローナル抗体である。
【図３０】ＩＧＦＲ様レセプターは、ゲノムワイド関連メタ研究において、２型糖尿病と関連した。第１番染色体に位置し、２型糖尿病に関連する、ＩＧＦＲ様レセプターをコードするヒトＫＩＡＡ１３２４遺伝子。図は、参照www.type2diabetesgenetics.comから示される。
【図３１】ＩＧＦＲ様レセプターのＳＮＰは、ゲノムワイド関連メタ研究において、冠動脈疾患、ＬＤＬコレステロール、及び２型糖尿病に高度に関連している。ヒト第１番染色体内の１０９．５５〜１０９．８５Mbの拡大図。ドットによりマークされた青色のバーは、疾患との陽性の関連を意味する。代わりに、ドットを伴わない赤色のバーは、陰性の関連を意味する。バーのサイズ（なし、小さい、中程度、及び大きい）は、有意差を意味する。図は、参照www.type2diabetesgenetics.comから示される。
【００４０】
［詳細な説明］
本発明者らは、驚くべきことに、膵臓において、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、及びインスリンリガンドに隣接して発現される新規なＩＧＦＲ様レセプターを発見し、前記ＩＧＦＲ様レセプターが、ＩｎｓＲ及び／又はＩＧＦ１Ｒ媒介性シグナル伝達を負にレギュレーションすることを証明した。したがって、前記レセプターのアンタゴニスト及びアゴニストは、糖尿病の発病において共通して見られるインスリン抵抗性を反転させるための新規で、緊急に必要とされる可能性を開く。一方、アゴニストは、インスリンシグナル伝達をブロックするのに使用することができた。際立ったことに、本発明者らは、ＩＧＦＲ様レセプターが、疾患開始の初期イベントである、膵臓におけるβ細胞の脱分化に関連していることを示すこともできた。同脱分化は、最終的に、β細胞の破壊又は機能喪失をもたらす。したがって、ＩＧＦＲ様レセプターは、元に戻せないβ細胞の喪失の前に、糖尿病の早期診断及び処置を可能にする有望な診断ツールでもある。
【００４１】
本発明者らは、本明細書で記載されたＩＧＦＲ様レセプターをコードするヒトＫＩＡＡ１３２４遺伝子の機能の解明を切り開いた。以前は、ＵＰＦ０５７７タンパク質ＫＩＡＡ１３２４又はエストロゲン誘引遺伝子１２１（ＥＩＧ１２１）タンパク質と呼ばれていたＫＩＡＡ１３２４のタンパク質生成物は、一般的には、ガンマーカーとして公知であった。一方、本発明者らは、このタンパク質に対して、代謝における中心的役割を初めて与えた。「ＩＧＦＲ様レセプター」、「ＩＧＦ様レセプター」、「ＩＧＦ３レセプター」、及び「ＩＧＦ３Ｒ」という用語は、本明細書において、互換的に使用される。
【００４２】
このため、第１態様では、本発明は、配列番号：１のＩＧＦＲ様レセプターに対して生じる抗体と反応可能なＩＧＦレセプター（ＩＧＦＲ）様レセプターをコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。ここで、前記抗体は、配列
（ｉ）TSKRTPDGFDSVPLKT（配列番号：２）及び／又は
（ｉｉ）CHQCDPDKYSE（配列番号：３）及び／又は
（ｉｉｉ）MYKWAKPKICSEDLEG（配列番号：４）及び／又は
（ｉｖ）FQRTTFHEASRKYTN（配列番号：５）及び／又は
（ｖ）CTFSRNTPTRTFNY（配列番号：６）
を含む、少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する。
【００４３】
特に、前記単離されたＤＮＡ配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ６ＵＸＧ２、エントリーバージョン９５（２０１５年７月２２日）のＵＰＦ０５７７タンパク質ＫＩＡＡ１３２４（配列番号：１）又はその機能性変異体をコードすることが想定される。前記タンパク質は、本明細書において、「ＩＧＦＲ様レセプター」とも呼ばれる。
【００４４】
重要なことに、「ＥＩＧ１２１」遺伝子の発現は、従来技術において、エストロゲン過剰に関連する腫瘍増殖におけるその役割について専ら公知であった。該遺伝子のタンパク質生成物、すなわち、本明細書で記載されたＩＧＦＲ様レセプターが、ＩＧＦＲ／ＩＲシグナル伝達をレギュレーションし、配列番号：１、２、３、４、５、もしくは６から選択される配列を含むエピトープに結合する抗体により特異的に認識されるであろうか、又は、糖尿病処置のために、アンタゴニストもしくはアゴニストによりターゲットすることができるかは、予知されず、又は、予知することができなかったかのいずれかである。
【００４５】
本明細書で開示されたＩＧＦＲ様レセプターに対する閾値配列同一性又は配列相同性を有する、本明細書で開示されたＩＧＦＲ様レセプターの機能性変異体も、「ＩＧＦＲ様レセプター」という用語に包含される。前記機能性変異体は、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ６ＵＸＧ２、エントリーバージョン９５（２０１５年７月２２日）のＵＰＦ０５７７タンパク質ＫＩＡＡ１３２４（配列番号：１）に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％の配列同一性を有し、配列番号：１のＩＧＦＲ様レセプターに対して生じた抗体と反応可能であることが想定される。ここで、前記抗体は、配列
（ｉ）TSKRTPDGFDSVPLKT（配列番号：２）及び／又は
（ｉｉ）CHQCDPDKYSE（配列番号：３）及び／又は
（ｉｉｉ）MYKWAKPKICSEDLEG（配列番号：４）及び／又は
（ｉｖ）FQRTTFHEASRKYTN（配列番号：５）及び／又は
（ｖ）CTFSRNTPTRTFNY（配列番号：６）
を含む、少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する。
【００４６】
前記機能性変異体は、好ましくは、ＵＰＦ０５７７タンパク質ＫＩＡＡ１３２４と同じ特性を示す、すなわち、添付の実施例において示されたルーチンな方法によりアクセス可能な、ＩｎｓＲ及び／又はＩＧＦ１Ｒ媒介性シグナル伝達、特に、（ｉ）Ａｋｔリン酸化及び／又は（ｉｉ）ＡＭＰＫリン酸化及び／又は（ｉｉｉ）ｍＴＯＲリン酸化を阻害し、又は、減少させることが、さらに想定される。本明細書で使用する場合、「％同一性」又は「％配列同一性」という用語は、本発明のポリペプチドの配列と対象となる配列との（相同）アライメントにより、これらの２つの配列のより長い方における残基数に関して、対となる同一な残基の％を意味する。％同一性は、同一な残基を残基総数で割り、これに１００を掛けることにより決定される。「相同性」という用語は、本明細書において、その通常の意味で使用され、２つのタンパク質の直線アミノ酸配列における同等の位置における同一のアミノ酸及び保存的置換（例えば、グルタミン酸残基のアスパラギン酸残基による交換）であるとみなされるアミノ酸を含む。好ましくは、配列番号：１で示されるアミノ酸配列は、「参照配列」として好ましい。配列番号：１は、ヒトＵＰＦ０５７７タンパク質ＫＩＡＡ１３２４を示し、本明細書において、ＩＧＦＲ様レセプターとも呼ばれる。（ＩＧＦＲ様レセプターの）「参照配列」及び「野生型配列」という用語は、本明細書において互換的に使用される。あるいは、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＵｎｉＰｒｏｔデータバンクアクセッション番号Ｑ６ＵＸＧ２（２０１５年７月２２日のエントリーバージョン９５）のアミノ酸配列を、参照配列として使用することができる。
【００４７】
％配列相同性又は配列同一性は、例えば、本明細書において、ＢＬＡＳＴＰ、バージョンｂｌａｓｔｐ２．２．５（２００２年１１月１６日、参照Altschul, S. F. et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402）を使用して決定することができる。この実施態様では、％相同性は、好ましくは、参照として野生型タンパク質足場を使用し、対比較において、プロペプチド配列を含むポリペプチド配列全体のアライメント（マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：１１．１）に基づいている。アライメントについてのプラグラムにより選択されたアミノ酸の総数により割った、ＢＬＡＳＴＰプログラム出力の結果として示される「ポジティブ」（相同性アミノ酸）数の％として算出される。
【００４８】
本発明の文脈において、「別の位置に対応する位置」という表現（例えば、領域、フラグメント、ヌクレオチド、又はアミノ酸位置等）は、ヌクレオチド又はアミノ酸位置番号に基づくナンバリングの変換、及びついで、％配列同一性を最大化する様式における配列のアライメントに基づいている。与えられた「対応する領域」内の全ての位置が同一である必要はなく、対応する領域の内でマッチしていない位置が、「対応する位置」とみなすことができるためである。したがって、本明細書で使用する場合、特定のタンパク質配列の「アミノ酸位置［Ｘ］に対応するアミノ酸位置」への言及は、特定のタンパク質配列のアミノ酸位置への言及に加えて、他の認識されたタンパク質、ならびに、構造的ホモログ及びファミリーにおいて同等の位置の集まりへの言及を表わす。同じことを、必要な変更を加えて、「配列に対応する配列」という表現に適用することができる。すなわち、特定のタンパク質配列［Ｘ］「に対応する」配列への言及は、特定のタンパク質配列の配列への言及に加えて、他の認識されたタンパク質、ならびに、構造的ホモログ及びファミリーにおいて同等の位置の集まりへの言及を表わす。
【００４９】
「ＩｎｓＲ」又は「ＩＲ」という用語は、インスリンレセプターを意味し、一般的には、ＩＲ−Ａ（「ショートアイソフォーム」としても公知）及びＩＲ−Ｂ（「ロングアイソフォーム」としても公知）アイソフォームの両方を含む。ＩｎｓＲは、インスリン結合領域を有する２つのα鎖と、キナーゼドメインを有する２つのβ鎖とがジスルフィド結合により結合している四量体として生じる。ＩｎｓＲは、インスリン、ＩＧＦ−１、及びＩＧＦ−２の結合により活性化され、最終的に、ＭＡＰＫ／Ｒａｓ−Ｒａｆ−Ｅｒｋ経路、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ（ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ）経路、及び／又はＪａｎｕｓキナーゼ／シグナルトランスデューサー及び転写活性化（ＪＡＫ／ＳＴＡＴ）経路によるシグナル伝達をもたらす、レセプターチロシンキナーゼである。より正確には、ＩｎｓＲエクトドメインのα鎖へのリガンド結合により、該レセプター内での構造変化が誘引され、β鎖の細胞内チロシンキナーゼドメイン内の種々のチロシン残基の自己リン酸化がもたらされ、インスリンレセプター基質（ＩＲＳ１、２、３、４）、ＳＨＣ、ＧＡＢ１、ＣＢＬ、及び他のシグナル伝達中間体を含む複数の細胞内基質のリクルート及びリン酸化がもたらされる。これらのリン酸化タンパク質はそれぞれ、ＰＩ３Ｋ及びＳＨＰ２のｐ８５レギュラトリーサブユニットを含む、Ｓｒｃ−ホモロジー−２ドメイン（ＳＨ２ドメイン）を含有する他のシグナル伝達タンパク質に対するドッキングタンパク質として機能する。ＩＲＳタンパク質のリン酸化により、２つの主なシグナル伝達経路：ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ／ＰＫＢ経路（同経路は、インスリンの代謝作用の大部分を担っている）及びＲａｓ−ＭＡＰＫ経路（同経路は、一部の遺伝子の発現をレギュレーションし、ＰＩ３Ｋ経路と協同して、細胞増殖及び分化を制御する）の活性化がもたらされる。ＩＲＳ１におけるホスホチロシンへのＰＩ３Ｋの結合及びその後のＰＩ３Ｋの活性化により、代謝をレギュレーションし、インスリンからのシグナルを調和させるシグナル伝達経路である、ＡＫＴ、ＡＭＰＫ、及びｍＴＯＲのリン酸化及び活性化がもたらされる。リガンド結合によるＩｎｓＲ活性化により、ＩＲＳ１のリン酸化及びＧＲＢ２／ＳＯＳのリクルートを介して、Ｒａｓ／ＲＡＦ／ＭＡＰ２Ｋ／ＭＡＰＫ経路もトリガーされる。同経路は、インスリンの細胞増殖、生存、及び細胞分化の媒介に主に関与している。
【００５０】
ＩｎｓＲの実例は、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０６２１３（２０１５年７月２２日のエントリーバージョン２１６）のヒトＩｎｓＲ及びその変異体である。本発明の文脈におけるインスリンレセプターは、好ましくは、そのリガンド、特に、インスリンの結合に基づいて、（ｉ）Ａｋｔリン酸化及び／又は（ｉｉ）ＡＭＰＫリン酸化及び／又は（ｉｉｉ）ｍＴＯＲリン酸化を誘引可能である。
【００５１】
「ＩＧＦ−レセプター１」又は「ＩＧＦ１Ｒ」もしくは「ＩＧＦＲＩ」という用語は、本明細書において、インスリン様成長因子１レセプターチロシンキナーゼを意味するのに使用される。ＩＧＦ１Ｒは、高い親和性でＩＧＦ１に結合し、より低い親和性でＩＧＦ２及びインスリン（ＩＮＳ）に結合する。リガンドの結合により、レセプターキナーゼが活性化され、レセプター自己リン酸化及び複数の基質（インスリンレセプター基質（ＩＲＳ１／２）、Ｓｈｃ、及び１４−３−３タンパク質を含む）のリン酸化がもたらされ、最終的に、３つの主なシグナル伝達経路：ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ／ＰＫＢ経路、Ｒａｓ−ＭＡＰＫ経路、及びＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性化がもたらされる。活性化されたＩＧＦ１Ｒは、細胞増殖及び生存制御に関与する。このため、ＩｎｓＲ及びＩＧＦ１Ｒは、類似するシグナル伝達経路に繰り入れられるが、ＩｎｓＲ媒介性シグナル伝達は、代謝を優先的にレギュレーションし、一方で、ＩＧＦ１Ｒシグナル伝達は、細胞増殖及び生存に関与する。
【００５２】
ＩＧＦ１Ｒの実例は、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０８０６９（２０１５年７月２２日のエントリーバージョン１８５）のヒトＩＧＦ１Ｒ及びその変異体である。本発明の文脈におけるＩＧＦ１Ｒは、好ましくは、そのリガンド、特に、ＩＧＦ１の結合に基づいて、（ｉ）Ａｋｔリン酸化及び／又は（ｉｉ）ＡＭＰＫリン酸化及び／又は（ｉｉｉ）ｍＴＯＲリン酸化を誘引可能である。
【００５３】
「ＩＧＦ１」又は「ＩＧＦＩ」という用語は、インスリンに構造的及び機能的に関連するタンパク質であるが、より高い成長促進活性を有する、インスリン様成長因子Ｉを意味する。実例は、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０５０１９（２０１５年７月２２日のエントリーバージョン１８６）のヒトＩＧＦ１である。本発明の文脈における「ＩＧＦ１」は、好ましくは、ＩＧＦ１レセプターに結合することができ、本明細書のどこかで記載されたＩＧＦ１Ｒシグナル伝達を引き起こすことができる。
【００５４】
「ＩＧＦ２Ｒ」もしくは「ＩＧＦ２Ｒ」又は「ＩＧＦＲＩＩ」という用語は、本明細書において、インスリン様成長因子２／マンノース−６−リン酸（ＩＧＦ−２／Ｍ６Ｐ）レセプターを意味するのに使用される。ＩＧＦ２Ｒは、大型の細胞質外（すなわち、細胞外）ドメイン、１つの膜貫通領域、及び、固有の触媒活性を欠いている短い細胞質テイルから構成される、１つの膜貫通型タンパク質である。該レセプターは、ＩＧＦ−１より高い親和性でＩＧＦ−２に結合し、インスリンには結合しない。ＩＧＦ２Ｒは、別個の部位を介して、リソソーム酵素及び各種の他のＭ６Ｐ含有リガンドと相互作用し、細胞外ＩＧＦ−２濃度をレギュレーションすることにより、増殖刺激性ＩＧＦ−１レセプター経路によるシグナル伝達をモデュレーションすることが報告されている。
【００５５】
ＩＧＦ２Ｒの実例は、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ１１７１７（２０１５年７月２２日のエントリーバージョン１７４）のヒトＩＧＦ２Ｒ及びその変異体である。
【００５６】
「ＩＧＦ２」又は「ＩＧＦＩＩ」という用語は、インスリン様成長因子ＩＩを意味する。実例は、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０１３４４（２０１５年７月２２日のエントリーバージョン１９９）のヒトＩＧＦ２及びその変異体である。本発明の文脈における「ＩＧＦ２」は、好ましくは、ＩＧＦ２レセプターに結合可能である。
【００５７】
本明細書で提供された、単離されたＤＮＡ配列は、配列番号：７で示されたヒトＫＩＡＡ１３２４遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ５７５３５、２０１５年７月１５日更新）又はその変異体の配列に対応する配列を含むことができる。ヒトＫＩＡＡ１３２４遺伝子の変異体は、オルソログを含むことができる。オルソログ又はオルソロガス遺伝子は、公知の遺伝子の配列の一部に類似性を有する一部を有するが、公知の遺伝子とは異なる種に見出される配列を有する遺伝子である。オルソログ及び公知の遺伝子は、共通の祖先の１つの遺伝子から垂直遺伝により得られる。
【００５８】
本明細書で使用する場合、ヒトＫＩＡＡ１３２４遺伝子の変異体又はオルソログは、ＩＧＦＲ様レセプター又はその機能性変異体をコードする、すなわち、好ましくは、ＩｎｓＲ及び／又はＩＧＦ１Ｒ媒介性シグナル伝達、特に、（ｉ）Ａｋｔリン酸化及び／又は（ｉｉ）ＡＭＰＫリン酸化及び／又は（ｉｉｉ）ｍＴＯＲリン酸化を阻害し、又は、減少させることができ、かつ、ヒトＫＩＡＡ１３２４遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ５７５３５、２０１５年７月１５日更新）に対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％の配列同一性、すなわち、配列番号：７で示されたヒトＫＩＡＡ１３２４遺伝子のコード配列に対する配列同一性を有することが想定される。コード配列は、前記ヒトＫＩＡＡ１３２４遺伝子（ＮＧ＿０３２７６３．１）のヌクレオチド２２２．．３７４、４７９３２．．４８０５２、５０５３７．．５０７２９、５７９０４．．５８０５１、５８５２６．．５８６０６、５９５１２．．５９６１７、５９７２６．．５９８７５、７１０８３．．７１１７１、７４２１５．．７４３９２、７５１０４．．７５２３２、７５６３０．．７５７２０、７７４０４．．７７５０９、７７７６４．．７７９０１、７８６４９．．７８９１２、８０４５９．．８０６３２、８３５１２．．８３６９２、８４０１７．．８４１１３、８４６１１．．８４７１２、８５８９２．．８６０１８、８６０９７．．８６２７５、８６７７３．．８６９３８、８８９８２．．８９０５０を結合させることにより得られる。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「単離されたＤＮＡ配列」という用語は、ＤＮＡ配列が得られる細胞及び／又は生物中に本来存在する他の核酸配列、タンパク質、ペプチド、脂質等を含む内在性物質から精製され又は実質的に精製されたＤＮＡ分子を意味し、標準的な精製技術により精製されたＤＮＡならびにリコンビナント技術により調製されたＤＮＡ、及び化学合成されたＤＮＡを含む。
【００６０】
ベクター
本発明の核酸は、ベクターの形態であることもでき、ベクター中に存在することができ、及び／又は、ベクターの一部であることができる。
【００６１】
「ベクター」という用語は、（外来性）遺伝子材料をホスト細胞内に輸送するための媒体として使用される核酸分子を意味し、プラスミド、ウイルス、コスミド、ならびに、人工染色体、例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）を包含するが、これらに限定されない。一般的には、操作されたベクターは、複製起点、マルチクローニングサイト、及び選択マーカーを含む。ベクター自体は、一般的には、インサート（導入遺伝子）と、ベクターの「骨格」として機能するより大きな配列とを含むヌクレオチド配列、一般的には、ＤＮＡ配列である。ベクターは、導入遺伝子インサートと骨格以外に、遺伝子調節エレメント、遺伝子マーカー、抗生物質抵抗性、レポーター遺伝子、ターゲット配列、又はタンパク質精製タグを含む更なるエレメントを包含することができる。導入遺伝子をホスト細胞内で発現させるための発現ベクター（発現構築物）が、本発明の文脈内において特に想定される。同発現ベクターは、一般的には、導入遺伝子に加えて、遺伝子調節配列を含む。
【００６２】
発現ベクターは、一般的には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて（すなわち、適切なホスト細胞、ホスト生物、及び／又は発現系において）ＩＧＦＲ様レセプターの発現を提供することができるベクターである。当業者であれば、特定のベクターの選択は、例えば、ホスト細胞、意図したコピー数のベクター、ＩＧＦＲ様レセプターの一過性又は安定した発現が想定されるかどうか等への依存を含むことを、容易に理解するであろう。
【００６３】
「一過性発現」は、レシピエントホスト細胞内で自律複製できない核酸（例えば、直線又は非直線ＤＮＡ又はＲＮＡ分子）又はベクターの導入により生じる。導入遺伝子の発現は、導入された配列の一過性発現により生じる。
【００６４】
ただし、本明細書で記載された核酸配列の「安定した発現」が、多くの場合、好ましいであろうし、核酸配列をホスト細胞のゲノム内に安定的に組み込むことにより、又は、本発明の核酸配列を含み、ホスト細胞内で自律複製可能なベクターを導入することによるかのいずれかにより達成することができる。
【００６５】
本明細書で提供されたベクターは、前記ＩＧＦＲ様レセプターをコードするＤＮＡ配列に操作可能に結合している、遺伝子調節エレメントを含むことが特に想定される。
【００６６】
「遺伝子調節エレメント」という用語は、操作可能に結合しているコード配列の特定のホスト生物中での発現に必須のＤＮＡ配列を意味する。「遺伝子調節エレメント」という用語は、制御性転写プロモーター、オペレーター、エンハンサー、サイレンサー、転写ターミネーター、転写及び翻訳を行うためにホスト細胞タンパク質と相互作用する５’及び３’非翻訳領域、ならびに、遺伝子発現を制御することができる他のエレメント（開始コドン及び終止コドンを含む）を含む。遺伝子発現に必要とされる調節領域の正確な性質は、生物間で変動する場合がある。原核生物の遺伝子調節エレメントは、例えば、プロモーター、場合により、オペレーター配列及びリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含む。一方、真核生物細胞用の遺伝子調節エレメントは、プロモーター、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル、及びエンハンサーを含む。
【００６７】
遺伝子調節エレメントは、発現される遺伝子に「操作可能に結合している」、すなわち、同遺伝子と機能的な関係にあることが想定される。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合に、コード核酸配列に「操作可能に結合している」。「操作可能に結合している」ＤＮＡ配列は、連続的であることができ、又は、連続的でないことができる。結合は、典型的には、都合の良い制限部位でのライゲーション又は合成オリゴヌクレオチドアダプターもしくはリンカーにより達成される。
【００６８】
ホスト細胞
さらに、本明細書において、本明細書で記載されたベクターを含む、ホスト細胞が提供される。
【００６９】
さまざまなホスト細胞を、本明細書で記載されたＩＧＦＲ様レセプターをコードする核酸配列を発現させるのに利用することができる。ホスト細胞は、当技術分野において公知の遺伝子操作法を使用して調製することができる。ベクターをレシピエントホスト細胞内に導入する方法は、以下、「トランスフォーメーション」又は「トランスフェクション」とも呼ばれる。これらの用語は、本明細書において、互換的に使用される。
【００７０】
ホスト細胞のトランスフォーメーションは、典型的には、材料の取込みを可能にするための、細胞壁及び／又は細胞膜に一過性の細孔又は「孔」を開けることによる。トランスフォーメーションプロトコールの実例は、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、細胞圧搾、デンドリマー、リポソーム、カチオン性ポリマー、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン又はポリエチレンイミン、ソノポレーション、光学的トランスフェクション、インペールフェクション（impalefection）、ナノ粒子（遺伝子銃）、マグネトフェクション（magnetofection）、粒子衝突、アルカリカチオン（セシウム、リチウム）、酵素消化、ガラスビーズとの振とう、ウイルスベクター等の使用を含む。方法の選択は、一般的には、トランスフォーメーションされる細胞の種類、細胞内に導入されるベクター、及び、トランスフォーメーションが行われる条件により決まる。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「ホスト細胞」という用語は、本明細書で記載されたＩＧＦＲ様レセプターをコードするベクター又は単離された核酸配列のためのレシピエントとして機能する、任意の細胞又は細胞培養物を意味する。適切なホスト細胞は、原核生物又は真核生物の細胞を含み、細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、ならびに動物細胞、例えば、昆虫細胞及び哺乳類細胞、例えば、マウス、ラット、マカク、又はヒトも含むが、これらに限定されない。
【００７２】
例えば、ＩＧＦＲ様レセプターは、細菌において生成することができる。原核生物に加えて、真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母が、本発明のＩＧＦＲ様レセプターに適したクローニング又は発現ホストである。実例は、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromycesホスト、例えば、K. lactis、K. fragilis（ＡＴＣＣ  １２４２４）、K. bulgaricus（ＡＴＣＣ  １６０４５）、K. wickeramii（ＡＴＣＣ  ２４１７８）、K. waltii（ＡＴＣＣ  ５６５００）、K. drosophilarum（ＡＴＣＣ  ３６９０６）、K. thermotolerans、及びK. marxianus；yarrowia（欧州特許第４０２２２６号）；Pichia pastoris（欧州特許第１８３０７０号）；Candida；Trichoderma reesia（欧州特許第２４４２３４号）；Neurospora crassa；Schwanniomyces、例えば、Schwanniomyces occidentalis；ならびに糸状菌、例えば、Neurospora、Penicillium、Tolypocladium、及びAspergillusホスト、例えば、A. nidulans及びA. nigerを含む。
【００７３】
本発明のグリコシル化抗体構築物の発現に適したホスト細胞を、多細胞生物からも得ることができる。無脊椎動物細胞の例は、植物及び昆虫細胞を含む。数多くのバキュロウイルス株及び変異体と、Spodoptera frugiperda（イモムシ）、Aedes aegypti（カ）、Aedes albopictus（カ）、Drosophila melanogaster（ショウジョウバエ）、及びBombyx mori等のホストからの対応する任意の昆虫ホスト細胞とが特定されている。トランスフェクション用の各種のウイルス株、例えば、Autographa californica NPVのＬ−１変異体及びBombyx mori NPVのＢｍ−５株が、公衆に利用可能である。
【００７４】
また、綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、シロイヌナズナ、及びタバコの植物細胞培養物も、ホストとして使用することができる。植物細胞培養物におけるタンパク質生成に有用なクローニング及び発現ベクターは、当業者に公知である。
【００７５】
有用な哺乳類細胞系統の例は、ＳＶ４０によりトランスフォーメーションされるサル腎臓ＣＶ１系統（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓系統（２９３細胞又は懸濁培養における増殖用にサブクローニングされた２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）；サル腎臓細胞（ＣＶＩ  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８７）；ヒト子宮頸ガン細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；Ｂｕｆｆａｌｏラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、１４１３  ８０６５）；マウス乳ガン（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５  １）；ＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝ガン細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【００７６】
リガンド
本発明者らは、本明細書で記載されたＩＧＦＲ様レセプターにおける複数のドメインを特定してきた。同ＩＧＦＲ様レセプターは、可能性のあるリガンドに対する結合部位を有している場合がある。同結合部位は、特に、本発明の診断用結合剤及びアンタゴニスト又はアゴニストを提供するためのテンプレートとして機能することができる。前記ドメインは、２つのインスリン様成長因子結合ドメイン（ドメイン１：配列番号：１のアミノ酸２７３〜４１３；ドメイン２：配列番号：１のアミノ酸５７９〜６５９）、マンノース−６−リン酸レセプター結合ドメイン（Ｍ６Ｐドメイン、配列番号：１のアミノ酸６５５〜８５７）、膜貫通ドメイン（配列番号：１のアミノ酸９０８〜９３０）、及び細胞質ドメイン（配列番号：１のアミノ酸９３２〜１０１３）を含む。前記ドメインは、図１からも導くことができる。このため、また、本発明は、少なくとも１つの上記ドメインに特異的に結合する結合剤、例えば、抗体（モノクローナル抗体が好ましい）等に関する。
【００７７】
インスリン様成長因子結合ドメインを含むタンパク質（ＩｎｔｅｒＰｒｏ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＩＰＲ００９０３０）は、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ１−６）、１型インスリン様成長因子レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）、レセプタータンパク質チロシンキナーゼＥｒｂｂ−２、Ｅｒｂｂ−３、及びＥｒｂｂ−４（ＥｒｂＢ２、−３、−４）、エフリン型Ａ／Ｂレセプター、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲ様結合タンパク質、ＣＹＲ６１、マトリリン−２、−３、及び−４、デルタ様タンパク質１、キュビリン、スリットホモログ１及び３タンパク質、複数の上皮成長因子様ドメインタンパク質６、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質４、ＷＮＴ１誘引性シグナル伝達経路タンパク質２、ＷＮＴ１誘引性シグナル伝達経路タンパク質１、ＷＮＴ１誘引性シグナル伝達経路タンパク質３、ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質２、低密度リポタンパク質レセプター、上皮成長促進因子、補体成分Ｃ９、トロンボモデュリン、ビタミンＫ依存性タンパク質Ｓ、補体成分Ｃ８アルファ鎖、ウロモデュリン、フューリン、骨形成タンパク質１、ニドゲン−１、インスリンレセプター関連タンパク質、フィブリン−１及び−２、プロタンパク質コンベルターゼサブチリシン／ケキシン６型、結合組織成長因子、フィブリリン−１、−２、及び−３、神経原性遺伝子座ノッチホモログタンパク質１、タンパク質ＮＯＶホモログ、ＣＤ９７抗原、軟骨オリゴマー基質タンパク質、ケラチン、ＩＩ型角質Ｈｂ３、タンパク質ジャギド−１、タンパク質クラムホモログ１、セリンプロテアーゼＨＴＲＡ４、セリンプロテアーゼＨＴＲＡ３、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質２、神経原性遺伝子座ノッチホモログタンパク質２、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー９、プロ低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１、ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１、ナイドジェン−２、スカベンジャーレセプタークラスＦメンバー１、接着Ｇタンパク質結合レセプターＥ１、増殖停止特異的タンパク質６、ケラチン、Ｉ型角質Ｈａ２、潜在型変換成長因子ベータ結合タンパク質１、潜在型変換成長因子ベータ結合タンパク質２、Ｒ−スポンディン−１、−２、及び−４、Ｓｕｓｈｉ、フォンヴィルブランド因子Ａ型、ＥＧＦ及びペントラキシンドメイン含有タンパク質１、ウロモデュリン様１、メケリン、タンパク質アイシャットホモログ、プロタンパク質コンベルターゼサブチリシン／ケキシン４型、Ｓｕｓｈｉドメイン含有タンパク質１、システインリッチ含有ＥＧＦ様ドメインタンパク質２、ネフロネクチン、プロトカドヘリンＦａｔ４、ＢＭＰ／レチノイン酸誘引性神経特異的タンパク質３、細胞外マトリックスタンパク質ＦＲＡＳ１、上皮成長因子様タンパク質６、シグナルペプチドであるＣＵＢ及びＥＧＦ様ドメイン含有タンパク質１、シグナルペプチドであるＣＵＢ及びＥＧＦ様ドメイン含有タンパク質３、潜在型変換成長因子ベータ結合タンパク質４、ヘミセンチン−２、デルタ及びノッチ様上皮成長因子関連レセプター、インスリン様成長因子結合タンパク質様１、セリンプロテアーゼＨＴＲＡ１、プロタンパク質コン���ルターゼサブチリシン／ケキシン５型、タンパク質キナーゼＣ結合タンパク質ＮＥＬＬ１、フォンヴィルブランド因子Ｃ、及びＥＧＦドメイン含有タンパク質、スカベンジャーレセプタークラスＦメンバー２、システインリッチ含有ＥＧＦ様ドメインタンパク質１、Ｋａｚａｌ型セリンプロテアーゼインヒビタードメイン含有タンパク質１、ヘミセンチン−１、タンパク質キナーゼＣ結合タンパク質ＮＥＬＬ２、神経原性遺伝子座ノッチホモログタンパク質４、Ｒ−スポンディン−３、接着Ｇタンパク質結合レセプターＥ３、ムチン−１３、エンドシアリン、カドヘリンＥＧＦ  ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型レセプター２、補体成分Ｃ１ｑレセプター、内皮細胞特異的分子１、シグナルペプチドであるＣＵＢ及びＥＧＦ様ドメイン含有タンパク質２、デルタ様タンパク質４、潜在型変換成長因子ベータ結合タンパク質３、デルタ様タンパク質３、カドヘリンＥＧＦ  ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型レセプター１、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１Ｂ、システインリッチモーターニューロン１タンパク質、フィブリン−５、上皮成長因子様タンパク質７、接着Ｇタンパク質結合レセプターＥ２、神経原性遺伝子座ノッチホモログタンパク質３、タンパク質ジャギド−２等を含むが、これらに限定されない。
【００７８】
このため、本明細書で記載されたＩＧＦＲ様レセプターの可能性あるリガンドは、前述のタンパク質のリガンド、例えば、ＩＲ、ＩＧＦ１Ｒ、インスリン、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＴＧＦＡ／ＴＧＦ−アルファ、アンフィレギュリン、エピジェン／ＥＰＧＮ、ＢＴＣ／ベータセルリン、エピレギュリン／ＥＲＥＧ、ＨＢＥＧＦ／ヘパリン結合ＥＧＦ、ＧＰ３０、ＡＬＢ、ＭＢ、カッパ及びラムダ軽鎖、ＴＦ、ヘモグロビン、ＧＣ、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＡＰＯＡ１、高密度リポタンパク質、ＧＩＦ−コバラミン複合体、ＬＲＰ２、ＬＧＡＬＳ３、ＡＧＲＩＮ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＴＮＦ、コラーゲンＩ及びＩＶ、パールカン、ラミニン、ヘパリン、インテグリン、フィブロネクチン、タンパク質Ｃ、ＥＦＮＡ５、ＥＦＮＢ１、ＥＦＮＢ２、ＥＦＮＢ３、ジャギド１、ジャギド２、及びデルタ１、ニューレグリン、ＮＴＡＫ、ＣＳＰＧ５、ＴＮＦＳＦ９／４−１ＢＢＬ、Ａｃ−ＬＤＬ、ＡＸＬ、ＴＹＲＯ３  ＭＥＲ、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧ４、ＢＴＣ、ＥＲＥＧ、ＨＢＥＧＦ、ＧＲ４、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６、Ｃ１ｑ、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ２）、肺界面活性剤タンパク質Ａ（ＳＰＡ）、ＴＧＦＢＲ２、ならびに、それらのフラグメント及び変異体を含む。
【００７９】
マンノース−６−リン酸レセプター結合ドメインを含むタンパク質（ＩｎｔｅｒＰｒｏ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＩＰＲ００９０１１）は、カチオン独立性マンノース−６−リン酸レセプター、グルコシダーゼ２サブユニットβ、カチオン依存性マンノース−６−リン酸レセプター、タンパク質ＯＳ−９、小胞体レクチン１、及びＮ−アセチルグリコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼサブユニットガンマを含むが、これらに限定されない。
【００８０】
したがって、本明細書で提供されたＩＧＦＲ様レセプターの可能性のあるリガンドは、前述のタンパク質のリガンド、例えば、ＩＧＦ２、ＤＰＰ４、ホスホマンノシル、ＴＲＰＶ４、ＩＧＦ２、リソソーム酵素、ＴＧＦβ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、プロリフェリン、チログロブリン、プロレニン、グランザイムＢ、及びレトン酸（Retonic Acid）を含む。
【００８１】
本発明者らは、ＩＧＦＲ様レセプターのノックダウンにより、ＩＧＦ１Ｒ及びＩＲのリン酸化、ならびに、下流シグナル伝達タンパク質であるＡｋｔ、ｍＴＯＲ、及びＡＭＰＫのリン酸化の増大がもたらされたことを見出した。このため、本発明者らは、ＩＧＦＲ様レセプターが、ＩＧＦ１Ｒ及び／もしくはＩＲの活性化ならびに／又は下流シグナル伝達を阻害し、又は、減弱させることができることを、提唱している。特定の理論に拘束されるものではないが、ＩＧＦＲ様レセプターは、例えば、血液からインスリンを枯渇させ、インスリンをエンドソーム及びリソソーム区画（同区画において、インスリンは分解される可能性がある）に輸送する「インスリンスカベンジャー」レセプターとして機能する可能性があると考えられる。また、ＩＧＦＲ様レセプターは、インスリンレセプター（ＩｎｓＲ）と会合して、ＩｎｓＲを細胞表面から除去する可能性があることも、推測される。いずれにしても、両シナリオにより、機能性ＩＧＦＲ様レセプターの存在下でのＩｎｓＲ活性化ならびにＩｎｓＲ及び／又はＩＧＦ１Ｒ媒介性シグナル伝達（ＩｎｓＲ、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、及び／又はＡＭＰＫのリン酸化を含む）の低下を説明することができる。したがって、インスリン、ＩｎｓＲ、及び／又はインスリン−ＩＲ複合体が、本明細書で提供されたＩＧＦＲ様レセプターについてのリガンドとして特に想定される。
【００８２】
アンタゴニスト及びアゴニスト
さらに、本明細書で記載されたＩＧＦＲ様レセプターのアゴニスト及びアンタゴニストが提供される。本明細書で記載され、添付の実施例で例証されたように、ＩＧＦＲ様レセプターは、ＩｎｓＲ及び／又はＩＧＦ１Ｒ媒介性シグナル伝達、ならびに特に、（ｉ）Ａｋｔリン酸化，（ｉｉ）ＡＭＰＫリン酸化、及び（ｉｉｉ）ｍＴＯＲリン酸化を負にレギュレーションする、すなわち、これらを阻害し、又は、減少させることが見出されてきた。
【００８３】
「アンタゴニスト」という用語は、レセプターへの結合に基づいて生物学的応答自体を引き起こすのではなく、アゴニスト媒介性生物学的応答を阻害し、又は、減少させるレセプターリガンドを意味する。アンタゴニストは、そのレセプターに対して、親和性を有するが、有効性を本質的に有さない。また、この用語は、そのレセプターの活性（オルトステリック）もしくはアロステリック部位に、及び／又は、レセプター機能に通常では関与しない他の結合部位に結合するアンタゴニストも含む。「アンタゴニスト」という用語は、一般的には、完全及び部分的なアンタゴニスト、可逆性及び不可逆性アンタゴニストを含む。本発明によれば、アンタゴニストは、好ましくは、ＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合する。ここで、ＵＰＦ０５７７タンパク質ＫＩＡＡ１３２４の新規な機能が解明された。当業者であれば、ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニストを、例えば、本明細書で記載されたスクリーニングアッセイ法を適用することにより、容易に特定することができるであろう。前述のように、ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニストは、レセプター機能を無効にし、ＩｎｓＲ及び／又はＩＧＦＲシグナル伝達と干渉する、すなわち、これらを阻害し、又は、減少させることが想定され、例えば、インスリン抵抗性を反転させるのに特に有用であることができる。具体的には、ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニストは、ＩｎｓＲ及び／又はＩＧＦ１Ｒ媒介性シグナル伝達、ならびに特に、当技術分野において公知であり、添付の実施例で記載されたルーチンな方法を使用して確認できる、ＩＧＦ１Ｒ、ＩｎｓＲ、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、及び／又はＡＭＰＫのリン酸化を増大させることができることが想定される。
【００８４】
本明細書で使用する場合、「アゴニスト」という用語は、一般的には、結合に基づいて、レセプターを活性化させて、生物学的応答を生じさせるレセプターリガンドを意味する。アンタゴニストとは対照的に、アゴニストは、そのレセプターに対する親和性及び有効性の両方を有する。「アゴニスト」という用語は、一般的には、完全及び部分的なアゴニスト、可逆的及び不可逆的アゴニストを含む。本発明によれば、アゴニストは、好ましくは、ＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合する。前述のように、ＩＧＦＲ様レセプターのアゴニストは、ＩＧＦＲ様レセプターの生物学的応答を引き起こし、又は、増大させる、すなわち、ＩｎｓＲ活性化及び下流シグナル伝達を減少させ、及び／又は、阻害することが想定される。このため、ＩＧＦＲ様のアゴニストは、ＩｎｓＲ及び／又はＩＧＦ１Ｒ媒介性シグナル伝達、ならびに特に、当技術分野において公知であり、添付の実施例で記載されたルーチンな方法を使用して確認できる、ＩｎｓＲ、ＩＧＦ１Ｒ、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、及び／又はＡＭＰＫのリン酸化を減少させることができることが想定される。
【００８５】
本発明の「アンタゴニスト」又は「アゴニスト」は、一般的には、任意の分子、例えば、抗体、ｓｉＲＮＡ、核酸、アプタマー、ペプチド、タンパク質、又は小分子有機化合物であることができる。これらは、本明細書で特定されたＩＧＦＲ様レセプター又はその変異体もしくはフラグメントに結合し、又は、特異的に結合し、ＩＧＦＲ様レセプターにより媒介される生物学的応答をブロックし、又は、減少させるかのいずれかをする（すなわち、アンタゴニストとして作用する）か、あるいは、ＩＧＦＲ様レセプターにより媒介される生物学的応答を誘引し、又は、増大させる（すなわち、アゴニストとして作用する）。
【００８６】
ＩＧＦＲ様レセプターのアゴニスト及びアンタゴニストは、例えば、本明細書で提供されたスクリーニングアッセイ法を使用して、容易に見出すことができる。当業者であれば、例えば、インスリン様成長因子結合ドメイン及び／又はマンノース−６−リン酸レセプター結合ドメインを含むタンパク質のリガンド（例示的なタンパク質及びリガンドは、上記「リガンド」セクションで記載されている）が、ＩＧＦＲ様レセプターに結合可能な作用物質を調製し、アゴニスト又はアンタゴニスト作用を示すためのテンプレートとして使用することができることを、容易に認識するであろう。例えば、タンパク質又はペプチドリガンドの場合、その変異体及びフラグメントを、遺伝子操作のルーチンな方法を使用して容易に調製することができる。例えば、ＩＧＦＲ様レセプターノックダウンホスト細胞（添付の実施例を参照のこと）における抗体結合性を評価することにより容易に試験することができるように、本発明のアゴニスト及びアンタゴニストは、本明細書で記載されたＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合する（すなわち、好ましくは、ＩＧＦＲ様レセプター以外のターゲットに対して交叉反応性を示さない）ことが想定される。
【００８７】
抗体
本明細書で提供されたアンタゴニスト又はアゴニストは、抗体であることができる。本明細書で提供された抗体は、好ましくは、所望の生物学的活性を示す、すなわち、本明細書で記載されたＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合する。具体的には、本発明のアンタゴニスト性抗体は、ＩｎｓＲ及び／又はＩＧＦ１Ｒ媒介性シグナル伝達、ならびに特に、当技術分野において公知であり、添付の実施例で記載されたルーチンな方法を使用して確認できる、ＩＧＦ１Ｒ、ＩｎｓＲ、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、及び／又はＡＭＰＫのリン酸化を増大させることができることが想定される。また、本発明のアンタゴニスト性抗体は、該エピトープ（配列番号：２〜６）に結合することも想定される。また、このため、本発明は、（ａ）少なくとも１つの配列番号：２〜６で示されたエピトープに特異的に結合し、（ｂ）ＩＧＦ１Ｒ、ＩｎｓＲ、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、及び／又はＡＭＰＫのリン酸化を増大させる抗体に関する。このため、「増大させる」は、抗体の存在下における各シグナルが、抗体の不存在下と比較して、前記増大の検出及び／又は定量に使用される各検出法において増大することを示す。さらに、本発明は、（ａ）前述の成長因子結合ドメイン及び／又はマンノース−６−リン酸レセプター結合ドメイン（図１に示す）の内の１つに結合し、（ｂ）ＩＧＦ１Ｒ、ＩｎｓＲ、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、及び／又はＡＭＰＫのリン酸化を増大させる抗体に関する。このため、「増大させる」は、抗体の存在下における各シグナルが、抗体の不存在下と比較して、前記増大の検出及び／又は定量に使用される各検出法において増大することを示す。際立ったことに、ＩＧＦＲ−Ｉは、ＨＥＲ２二量体化領域に高い類似性を示す細胞外ドメインを含有する。同領域は、抗体であるトラスツズマブ（Herceptin（登録商標））によりターゲットされる。ＨＥＲ２は、構成的に活性であり、リガンド独立的様式で作用し、トラスツズマブがその活性をブロックし、ガン増殖を阻害することによりＨＥＲ２をターゲットする他のＨＥＲファミリーメンバーと二量体化することができる。さらに、ＩＧＦＲ−Ｉは、ＥＧＦＲファミリーメンバーに見出される、その膜貫通ドメインにＧｘｘｘＧ二量体化モチーフを含有する。これは、ＩＧＦＲ−Ｉが、ＥＧＦＲ及びＩＲファミリーメンバーとホモ及びヘテロ二量体化して、細胞シグナル伝達アウトカムである代謝ｖｓ分裂促進をレギュレーションすることを示唆している。このため、ＩＧＦＲ様レセプターをターゲットする本発明の抗体は、レセプターホモ及びヘテロ二量体化ならびに／又はリガンド結合と干渉することも想定される。
【００８８】
このような抗体を提供する方法は、当業者に周知であり（例えば、国際公開公報第２０１４／１２４０２０号）、以下に例示されている。ＩＧＦＲ−Ｉエクトドメイン及び全長レセプターを、完全にＮ−グリコシル化され、正確にフォールディングされた、ネイティブなコンホーメーションを有するレセプターを生成するための哺乳類発現系を使用して、高純度に精製することができる。合成膜におけるレセプター再構成は、脂質二重層内でのレセプターの二量体化を可能にするだけでなく、膜環境において、抗原としてのレセプターを提供することにより、本発明の抗体、及び特に、本発明の治療抗体を生成するのにも非常に適している。このため、ＩＧＦＲ−Ｉプロテオリポソームは、細胞膜の合成模倣物であるため、例えば、モノクローナル抗体を生成するのに理想的である。これらの抗体は、該レセプターの細胞外ドメインに対してのみ指向性を有し、レセプターのホモ及びヘテロ二量体化ならびに／又はリガンド結合と干渉することができる。このため、本発明の抗体は、グリコシル化ＩＧＦＲ様レセプター、好ましくは、そのグリコシル化エクトドメインに結合可能であることも想定される。
【００８９】
当技術分野において周知であるように、抗体は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置している、少なくとも１つのエピトープ認識部位により、ターゲット（エピトープ）に特異的に結合可能な免疫グロブリン分子である。本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体ならびに（天然又は合成の）そのフラグメント又は変異体を含む。同フラグメント及び変異体は、必要とされる特異性の抗原結合フラグメントを含む抗体部分と、必要とされる特異性の抗原結合部位又はフラグメント（エピトープ認識部位）を含む抗体の任意の他の改変構成とを含む融合タンパク質を含む。実例は、ｄＡｂ、ナノボディ、アフィボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）、ディアボディ、及び、ＣＨ３ドメインに結合しているｓｃＦｖを含むミニボディを含む。「抗原結合部位」を含む他の抗体フレームワーク又は足場を、本発明に則して利用することができると、理解されるであろう。このため、「抗体」という用語は、これらの足場も含む。言及された足場は、例えば、抗体のＣＤＲをグラフト化することができる非免疫グロブリン系抗体及び足場を含む。このような足場は、例えば、アンチカリン、アビマー、アフィリン等を含む。
【００９０】
抗体は、キメラ抗体（又は、その抗原結合変異体もしくはフラグメント）であることができる。「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から得られた抗体における対応する配列と同一であり、もしくは、同配列に相同的であるか、又は、特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する一方で、鎖の残り部分が、別の種から得られた抗体における対応する配列と同一であり、もしくは、同配列に相同的であるか、又は、別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびに、このような抗体のフラグメントを意味する。
【００９１】
抗体は、ヒト化抗体（又は、その抗原結合変異体もしくはフラグメント）であることができる。「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト抗体から得られた最少配列を含有する抗体を意味する。一般的には、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（「レシピエント抗体」にグラフト化された、非ヒト種、例えば、マウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類から得られた免疫グロブリン（ドナー抗体）の超可変領域からの残基を含むヒト免疫グロブリンである。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基により置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体のいずれにも見出されない残基を含むことができる。これらの改変により、抗体の性能をさらに精錬される。一般的には、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、及び典型的には、２つ全ての可変ドメインを実質的に含むであろう。ここで、全ての又は実質的に全ての超可変ループが、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、全ての又は実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含むであろう。
【００９２】
抗体は、ヒト抗体であることができる。「ヒト抗体」は、ヒトにより生成される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものであり、及び／又は、ヒト抗体を調製するための任意の技術を使用して調製される。ヒト抗体のこの定義には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体が、特別に除外される。ヒト抗体は、当技術分野において公知の種々の技術を使用して生成することができる。同技術は、ファージディスプレイライブラリ（Hoogenboom and Winter, J. MoI Biol, 227:381 (1991)；Marks et al, J. MoI Biol, 222:581 (1991)）を含む。また、ヒトモノクローナル抗体の調製について、Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)及びBoerner et al., J. Immunol, 147(l):86-95 (1991)で記載された方法も利用できる。van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-374 (2001)も参照のこと。ヒト抗体は、抗原を、抗原負荷に応答してこのような抗体を生成するように改変されているが、その内因性遺伝子座が無効になっているトランスジェニック動物、例えば、免疫化ゼノマウス（XENOMOUSE（商標）技術に関して、例えば、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号を参照のこと）に投与することにより調製することができる。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されるヒト抗体に関して、例えば、Li et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)も参照のこと。
【００９３】
化学的改変
本発明に基づいて使用される抗体又はその抗原結合変異体もしくはフラグメントを改変させることができる。本発明の文脈において想定される典型的な改変は、例えば、以下に記載された化学的改変を含む。
【００９４】
一般的には、全ての種類の改変が、ＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合する抗体又はその抗原結合変異体もしくはフラグメントの能力を無効にせず、本明細書のどこかで記載されたように、ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニストとして作用する限り、想定される。
【００９５】
抗体又はその抗原結合変異体もしくはフラグメントの可能性のある化学的改変は、アミノ末端のアシル化もしくはアセチル化、又は、カルボキシ末端のアミド化もしくはエステル化、またあるいは、両方を含む。また、改変は、リシンの側鎖におけるアミノ基又はスレオニンのヒドロキシル基に作用させることもできる。他の適切な改変は、例えば、可変長のポリペプチド鎖（例えば、ＸＴＥＮ技術又はPASylation（登録商標））によるアミノ基の伸張、Ｎ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化、及び炭水化物、例えば、ヒドロキシエチルデンプン（例えば、HESylation（登録商標））又はポリシアル酸（例えば、PolyXen（登録商標）技術）の化学的結合を含む。化学的改変、例えば、アルキル化（例えば、メチル化、プロピル化、ブチル化）、アリール化、及びエーテル化が可能である場合があり、これらも想定される。
【００９６】
本明細書の他の部分で記載されたように、複数のドメインが、本発明のＩＧＦＲ様レセプターにおいて特定されてきた。ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニストとして作用する抗体は、原理的には、好ましくは、ＩＧＦＲ様レセプターの細胞外ドメイン（例えば、インスリン様成長因子結合ドメイン、マンノース−６−リン酸レセプター結合ドメイン）中のどこか、又は、同ドメイン間に結合することが想定される。また、１つ以上の前記ドメインを含むタンパク質（例示的なタンパク質は、上記「リガンド」セクションに列記されている）に結合し、及び特に、前記タンパク質のインスリン様成長因子結合ドメイン又はマンノース−６−リン酸レセプター結合ドメイン中のエピトープに結合する公知の抗体も、一般的には、アンタゴニスト又はアゴニストとして想定され、本明細書で提供されたスクリーニングアッセイ法において、そのアンタゴニスト性又はアゴニスト性挙動を容易にモニターすることができる。
【００９７】
さらに、ＩＧＦＲ様レセプターに対する抗体を、添付の実施例で記載されたように調製することができ、本明細書で提供されたスクリーニングアッセイ法において、そのアゴニスト性又はアンタゴニスト性活性を試験することができる。
【００９８】
本発明に従ってアンタゴニスト又はアゴニストとして提供された抗体は、特に、配列
（ｉ）TSKRTPDGFDSVPLKT（配列番号：２）及び／又は
（ｉｉ）CHQCDPDKYSE（配列番号：３）及び／又は
（ｉｉｉ）MYKWAKPKICSEDLEG（配列番号：４）及び／又は
（ｉｖ）FQRTTFHEASRKYTN（配列番号：５）及び／又は
（ｖ）CTFSRNTPTRTFNY（配列番号：６）
を含む、ＩＧＦＲ様レセプターのエピトープに結合可能であると想定される。
【００９９】
抗体は、好ましくは、本明細書で記載されたＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合する、すなわち、非ターゲット分子、例えば、ＩｎｓＲ、ＩＧＦ１Ｒ、及びＩＧＦ２Ｒに対する交叉反応性を示さない。配列番号：２、３、４、５、及び６を含むエピトープを認識する抗体の特異的結合は、添付の実施例において証明されている。例えば、抗体の結合が、ＩＧＦＲ様レセプターのノックダンにより無効にされることを証明することができた。このことは、非特異的結合が起こらなかったことを示している。
【０１００】
「エピトープ」という用語は、一般的には、結合ドメイン、例えば、抗体もしくは免疫グロブリン、又は、抗体もしくは免疫グロブリンの誘導体もしくはフラグメントが特異的に結合する、抗原上の部位を意味する。「エピトープ」は、抗原性である。このため、エピトープという用語は、本明細書において、「抗原構造」又は「抗原決定基」と呼ばれる場合もある。このため、結合ドメインは、「抗原相互作用部位」である。前記結合／相互作用は、「特異的認識」を定義するとも理解される。「エピトープ」という用語は、直線エピトープ及びコンホーメーションエピトープを包含する。直線エピトープは、アミノ酸の一次配列に含まれる連続的なエピトープであり、典型的には、少なくとも３つ又は少なくとも４つ、及びより通常には、少なくとも５つ又は少なくとも６つ又は少なくとも７つ、例えば、約８〜約１０個のアミノ酸を固有の配列に含む。コンホーメーションエピトープは、タンパク質のフォールディングにより並置される非連続的なアミノ酸により形成される。エピトープのコンホーメーションを決定する方法は、ｘ線結晶学、二次元核磁気共鳴（２Ｄ−ＮＭＲ）分光法、ならびに部位特異的スピンラベル及び電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光法を含むが、これらに限定されない。
【０１０１】
他の分子も、ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニストとして、本明細書において想定される。
【０１０２】
ｓｉＲＮＡ及び核酸は、ヒトＫＩＡＡ１３２４遺伝子（又は、その変異体もしくはオルソログ）の発現を減少させ、又は、阻害する、ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニストとして、特に有用である。「ｓｉＲＮＡ」という用語は、「低分子干渉ＲＮＡ」又は「サイレンシングＲＮＡ」と互換的に使用される。ｓｉＲＮＡは、典型的には、ターゲット核酸の配列、例えば、ヒトＫＩＡＡ１３２４遺伝子のコード配列の相補鎖に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、少なくとも２０個の連続的なヌクレオチドの配列を含む、二本鎖「アンチセンス」ＲＮＡ分子であるが、前記遺伝子の調節配列（プロモーター配列ならびに転写終了及びポリアデニル化シグナルを含む）に指向性を有する場合もある。
【０１０３】
ＩＧＦＲ様レセプターの発現を減少させ、及び／又は、阻害することができる他の核酸は、アプタマー、Spiegelmers（登録商標）、ｎｃ−ＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ、Ｌ−ＲＮＡ  Spiegelmer、サイレンサーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リピート関連（repeat-associated）小分子干渉ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、及びＰｉｗｉタンパク質と相互作用する分子又はＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）を含む。このような非コード核酸分子は、例えば、ＩＧＦＲ様レセプターのｍＲＮＡを分解に向かわせ、又は、ＩＧＦＲ様レセプターのｍＲＮＡ翻訳を中断させるのに利用することができる。各反応物質、特に、ｓｉＲＮＡ分子は、原理的に、ホスト細胞内で直接合成することができ、又は、ホスト細胞内に導入することができる。
【０１０４】
ペプチド及びタンパク質を、一般的に、それらがＩＧＦＲ様レセプターシグナル伝達により媒介される生物学的応答をサプレッションし（アンタゴニスト）、又は、引き起こす（アゴニスト）かどうかに応じて、ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニストとして利用することができる。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用される。タンパク質及びペプチドは、ＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合することが想定される。本明細書において先に示されたように、当業者であれば、ＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合可能なペプチド及びタンパク質のアンタゴニスト又はアゴニストを、例えば、インスリン様成長因子結合ドメイン及び／又はマンノース−６−リン酸レセプター結合ドメインを含むタンパク質（例示的なタンパク質は、上記「リガンド」セクションに列記されている）の公知のリガンドを使用して、容易に見出すことができるであろう。前記リガンドは、遺伝子操作の公知の方法を使用して、その変異体又はフラグメントを調製するためのテンプレートとして使用することができる。前記タンパク質又はペプチドを、その後に、そのアゴニスト性又はアンタゴニスト性活性について、例えば、本明細書で提供されたスクリーニングアッセイ法を使用して試験することができる。低分子量有機分子も、ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニストのいずれかとして作用可能である。低分子量有機分子は、ＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合することが想定される。低分子量有機分子についての高スループットスクリーニングアッセイ法は、当技術分野において容易に利用可能であり、アゴニスト性又はアンタゴニスト性活性を示す場合がある、本明細書で提供されたＩＧＦＲ様レセプターのリガンドを見出すのに利用することができる。
【０１０５】
特異的結合
本明細書で示されたように、ＩＧＦＲ様レセプターに対する結合剤、特に、本明細書で提供されたアンタゴニスト及びアゴニスト、例えば、抗体の特異的結合が好ましい。全ての文法的形式における「に結合する」及び「認識する」という用語は、本明細書において、互換的に使用される。
【０１０６】
「特異的に結合する」という用語は、一般的には、結合剤、特に、アンタゴニスト又はアゴニスト、例えば、抗体が、その意図したターゲット（すなわち、本明細書で記載されたＩＧＦＲ様レセプター）に対して、その非ターゲット分子に対してより高い親和性で結合することを示している。非ターゲット分子は、ＩＧＦレセプター、特に、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０８０６９（２０１５年７月２２日のエントリーバージョン１８５）のヒトＩＧＦ１Ｒ、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ１１７１７（２０１５年７月２２日のエントリーバージョン１７４）のヒトＩＧＦ２Ｒ、及び、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０６２１３（２０１５年７月２２日のエントリーバージョン２１６）のヒトＩｎｓＲ、ならびに、それらの機能性変異体を含む。好ましくは、アゴニスト又はアンタゴニストの親和性は、非ターゲット分子に対するその親和性より、ターゲット分子に対して、少なくとも約５培、好ましくは１０倍、より好ましくは２５倍、さらにより好ましくは５０倍、及び最も好ましくは１００倍以上高いであろう。好ましい抗体は、少なくとも約１０７M-1、及び好ましくは、約１０８M-1〜約１０９M-1、約１０９M-1〜約１０１０M-1、又は、約１０１０M-1〜約１０１２M-1の親和性で結合する。
【０１０７】
このため、好ましくは、「特異的に結合する」という用語は、アンタゴニスト及びアゴニスト、例えば、抗体が、その意図したターゲット（すなわち、ＩＧＦＲ様レセプター）に専ら結合することを示している。
【０１０８】
処置
ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト及びアゴニストは、糖尿病の処置及び診断に特に有用であることが想定される。本明細書で使用する場合、「糖尿病」は、損なわれたインスリン生成及び耐糖能により特徴付けられる、広い分類の障害を意味し、一般的には、１型及び２型糖尿病（若年型及び成人型開始ともそれぞれ呼ばれる）、妊娠糖尿病、前糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、及び耐糖能障害を含む。糖尿病は、インスリン生成β細胞の機能不全又は機能障害の単独で、又は、インスリン抵抗性との組み合わせにおいて生じる。
【０１０９】
「メタボリックシンドローム」という用語は、腹部（中心）肥満、血圧上昇、空腹時血糖の上昇、高血清トリグリセリド、低い高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、及び／又は高い低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルを含む。さらに、メタボリックシンドロームは、２型糖尿病及び／又は冠動脈心疾患を含む心血管疾患に進行するリスクに関連する。
【０１１０】
「β細胞」、「ベータ細胞」、及び「膵島細胞」という用語は、ランゲルハンス膵島に位置する膵臓β細胞を意味するのに、本明細書において互換的に使用される。その主な機能は、インスリンを貯蔵し、放出することである。
【０１１１】
インスリン分泌の欠陥は、全ての形態の糖尿病の基礎をなしている。一方、β細胞の破壊が、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の原因であり、一方、β細胞量の減少および分泌機能の喪失の両方が、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）に関与している。現れた結果から、成熟β細胞のより前駆体様状態への脱分化による機能欠陥が、Ｔ２Ｄにおける分泌障害に重要なドライバーである可能性があることが示唆される。
【０１１２】
本発明のアンタゴニスト及びアゴニストは、β細胞の脱分化を予防し、及び／又は、β細胞の機能喪失を反転させるのに有利に利用することができることが企図される。したがって、本明細書で記載されたアンタゴニスト及びアゴニストは、医薬としての使用が想定される。特に、前記アンタゴニスト及びアゴニストは、糖尿病の予防的及び／又は治療的処置の方法における使用が意図される。
【０１１３】
１型糖尿病は、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）及び若年型糖尿病としても公知である。これらの用語は、本明細書において、互換的に使用される。この形態は、糖尿病の５〜１０％を占めており、膵臓β細胞の細胞媒介性自己免疫破壊により、インスリンをほとんど分泌しなくなるか、又は、インスリンを分泌しなくなると考えられる。本明細書で提供されたＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト及びアゴニストは、β細胞の脱分化及び／又は機能喪失を予防し、又はさらに、反転させることができる。このため、本発明は、Ｔ１Ｄの予防的又は再生的治療の新たな可能性を開くことが想定される。
【０１１４】
２型糖尿病は、成人開始糖尿病とも呼ばれ、全糖尿病の約９０〜９５％を占める。ターゲット組織におけるインスリン抵抗性及び膵臓β細胞からのインスリン分泌の相対的な欠損は、２型糖尿病（ＴＤ２）の主な特徴である。インスリン抵抗性は、本明細書において、ターゲット細胞がインスリンに応答することができず、高血糖をもたらすことにより特徴付けられる症状を示すのに使用される。膵臓における膵臓β細胞は、その後に、インスリンのその生成を増大させ、高インスリン血症をもたらす。特定の理論に拘束されるものではないが、本明細書で記載されたＩＧＦＲ様レセプターは、インスリン又はインスリンレセプターのいずれかについてのスカベンジャーとして作用することが企図される。例えば、ＩＧＦＲ様レセプターは、インスリンレセプターに結合し、インスリンレセプターの内部移行をもたらす可能性がある（インスリンレセプターのスカベンジャー）。また、ＩＧＦＲ様レセプターは、インスリンにも結合して、その内部移行及び場合によりリソソーム分解をもたらす可能性もある（インスリンのスカベンジャー）。これらのＩＧＦＲ様レセプター機能を、本明細書で記載されたアンタゴニストの助けにより阻害することにより、ＩｎｓＲ及び／又はＩＧＦ１Ｒ媒介性シグナル伝達が増大し、これにより、インスリン感受性を回復させることができる。
【０１１５】
添付の実施例でさらに示されたように、本発明者らは、本明細書で記載されたＩＧＦＲ様レセプターが、インスリンの下流シグナル伝達を負にレギュレーションすることを証明した。したがって、ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニストは、ＩｎｓＲの下流シグナル伝達を促進し、又は、回復させることが想定される。一方、ＩＧＦＲ様レセプターのアゴニストは、ＩｎｓＲシグナル伝達を阻害し、又は、減弱させることが考えられる。
【０１１６】
したがって、ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニストは、好ましくは、（ｉ）ＩｎｓＲ及び／もしくはＩＧＦ１Ｒ媒介性Ａｋｔリン酸化を増大させ、（ｉｉ）ＩｎｓＲ及び／もしくはＩＧＦ１Ｒ媒介性ＡＭＰＫリン酸化、ならびに／又は（ｉｉｉ）ｍＴＯＲリン酸化を増大させることにより、有利に、インスリン抵抗性細胞におけるインスリン感受性を向上させることができる。
【０１１７】
診断
本発明者らは、驚くべきことに、本明細書で特定されたＩＧＦＲ様レセプターの発現が、膵臓β細胞の脱分化に関連していることを発見した。β細胞の脱分化は、β細胞が得られる多能性前駆細胞又は別の可逆性脱分化状態に戻るβ細胞表現型における変化を説明するのに使用される用語である。膵臓β細胞の脱分化は、インスリン分泌を含む、重要な機能の喪失をもたらすと考えられる。重要なβ細胞機能の喪失の結果として、調節不全のインスリン分泌が、糖尿病（Ｔ１Ｄ及びＴ２Ｄを含む）における発病の基礎的部分に見られる。グルコース毒性とも呼ばれるプロセスである高血糖は、機能不全のインスリン分泌をもたらす膵臓β細胞の脱分化の主因であると考えられる。
【０１１８】
本出願の出願まで、疾患の開始及び進行について信頼性を有するバイオマーカーは利用可能ではなかった。本発明者らは、本明細書で記載されたＩＧＦＲ様レセプターが、糖尿病の処置に有用な可能性があり、かつ、強力なターゲットであるだけでなく、非常に初期段階において、発病に関与することも発見した。したがって、本明細書で提供されたＩＧＦＲ様レセプターの発現をモニターすることにより、糖尿病の早期診断を可能にし、β細胞のその機能が失われ又は重度に損なわれる前に、（予防的）処置も可能にする可能性がある。
【０１１９】
したがって、本発明は、糖尿病又は糖尿病の進行リスクについての診断マーカーとして使用するための、本明細書で記載されたＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合可能である、結合分子を提供する。好ましくは、前記ＩＧＦＲ様レセプターは、配列番号：１の配列に対応する配列を含む。ただし、前記ＩＧＦＲ様レセプターの変異体も想定される。
【０１２０】
前述を考慮して、患者における膵島細胞の脱分化を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断アッセイ法（すなわち、診断法）も、本明細書において提供される。前記アッセイ法は、
ｉ）記対象から得られたサンプルを、可溶性ＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合する診断用結合剤と接触させる工程と、
ｉｉ）該診断用結合剤の結合を検出する工程とを含み、
ここで、前記診断用結合剤の検出可能な結合は、対象における膵島細胞の脱分化を示し、ここで、ＩＧＦＲ様レセプターは、配列番号：１に対応する配列を含む。
【０１２１】
本明細書のどこかで示されたように、膵臓β細胞の脱分化は、糖尿病又は糖尿病の進行リスクを示すと考えられる。サンプルは、一般的には、任意のサンプル、特に、血漿サンプルであることができる。
【０１２２】
一般的には、診断用結合剤を提供するために、当業者は、ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト及びアゴニストを提供する文脈において示されたのと同じ原理に従うことができる。同様に、本明細書で提供された診断用結合剤は、本明細書で提供されたＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合することが想定される。診断用結合剤は、アンタゴニスト性又はアゴニスト性活性を示すことができ（これにより、例えば、刺激性診断及び（予防的）処置が可能である）、又は、ＩＧＦＲ様レセプターのシグナル伝達における効果を全く有していなくてもよい。診断用結合剤を調製する際に、当業者であれば、本明細書のどこかで記載されたように、例えば、インスリン様成長因子結合ドメイン及び／又はマンノース−６−リン酸レセプター結合ドメインを含むリガンド及びタンパク質を使用し、そのリガンドを、ＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合可能な診断用結合剤を生成するための「テンプレート」として使用することができる。例示的なタンパク質及びリガンドは、本明細書における「リガンド」セクションに記載されている。このアプローチは、ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト及びアゴニストを調製する文脈において記載されており、このような結合剤がアゴニスト性及び／又はアンタゴニスト性の特性を必ずしも示す必要がないことを除いて、診断用結合剤にも完全に適用可能である。
【０１２３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断結合アッセイ法に使用するのに特に有用な結合剤は、モノクローナル抗体、例えば、配列
（ｉ）TSKRTPDGFDSVPLKT（配列番号：２）及び／又は
（ｉｉ）CHQCDPDKYSE（配列番号：３）及び／又は
（ｉｉｉ）MYKWAKPKICSEDLEG（配列番号：４）及び／又は
（ｉｖ）FQRTTFHEASRKYTN（配列番号：５）及び／又は
（ｖ）CTFSRNTPTRTFNY（配列番号：６）
を含む、ＩＧＦＲ様レセプターのエピトープを特異的に認識する抗体を含む。
【０１２４】
本発明の方法に利用される診断用結合剤は、診断結合剤に付着させた検出ラベルをさらに含む。検出ラベルは、診断用結合剤に、直接、又は、可能性のある立体障害を減少させるための種々の長さのスペーサーを介してのいずれかで、（好ましくは、共有）結合させることができる。タンパク質をラベルするための種々の方法が、当技術分野において公知であり、本発明を実施するのに使用することができる。
【０１２５】
「ラベル」又は「ラベル基」という用語は、任意の検出ラベルを意味する。診断用結合剤と共に使用するのに適したラベルは、（ｉ）同位体ラベル（放射性同位元素又は重同位元素であることができる）、例えば、放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、（ｉｉ）磁性ラベル（例えば、磁性粒子）、（ｉｉｉ）酸化還元活性部分、（ｉｖ）光学染料（発色団、蛍光体、及び発蛍光団を含むが、これらに限定されない）、例えば、蛍光ラベル（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、化学発光ラベル、及び、蛍光体（「小分子」発蛍光団又はタンパク質性発蛍光団のいずれかであることができる）、（ｖ）酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、（ｖｉ）ビオチン化基、（ｖｉｉ）二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体用の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ等）を含むが、これらに限定されない。
【０１２６】
「蛍光ラベル」は、その固有の蛍光特性により検出することができる、任意の分子を意味する。適切な蛍光ラベルは、フルオロセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｃａｓｃａｄｅ  ＢｌｕｅＪ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０、Ｃｙ  ５、Ｃｙ  ５．５、ＬＣ  Ｒｅｄ  ７０５、Ｏｒｅｇｏｎ  ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ｄｙｅｓ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、及びＲ−フィコエリスリン（ＰＥ）（Molecular Probes, Eugene, OR）、ＦＩＴＣ、ローダミン、及びＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（Pierce, Rockford, IL）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Amersham Life Science, Pittsburgh, PA）を含むが、これらに限定されない。発蛍光団を含む適切な光学染料は、Molecular Probes Handbook by Richard P. Hauglandに記載されている。例示的なタンパク質性発蛍光団ラベルは、緑色蛍光タンパク質（Renilla、Ptilosarcus、又はAequorea種のＧＦＰ、ＥＧＦＰを含む）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、ルシフェラーゼ、及びβガラクトシダーゼも含むが、これらに限定されない。
【０１２７】
適切なラベルを、診断用結合剤の種類、その化学的特性、及び意図した検出法に応じて選択することは、当業者の知識の範囲内である。本発明の方法に使用するのに特に適した診断用結合剤は、好ましくは、本明細書で記載されたＩＧＦＲ様レセプターを特異的に認識するモノクローナル抗体である。
【０１２８】
有利に、膵臓β細胞の脱分化は、本明細書で記載されたＩＧＦＲ様レセプターを特異的に認識可能な診断用結合剤を利用することにより可視化することができる。前記β細胞の脱分化は、糖尿病又は糖尿病の進行のリスクを示し、β細胞機能不全を先導すると考えられる。したがって、本発明は、最初に、疾患開始のごく初期段階において、糖尿病（１型、２型、妊娠糖尿病、メタボリックシンドローム、及び前糖尿病を含む）の診断を可能にする診断アッセイ法を提供するため、β細胞機能不全及びインスリン生成の喪失又は欠損をもたらす破壊メカニズムを初期に妨害するための新たな可能性を開く。
【０１２９】
ヒトＫＩＡＡ１３２４遺伝子の遺伝子産物が糖尿病において役割を果たすことが見出されたことによって、本発明は、ＫＩＡＡ１３２４遺伝子における公知のＳＮＰのいずれかを、１つ以上のＳＮＰが、実際に、糖尿病、特に、ＩＩ型糖尿病を進行させる傾向に関連する可能性があるのか、又は、同進行のリスクにある可能性があるのかどうかについて割り当てることができる。
【０１３０】
また、本発明は、対象が、糖尿病、特に、ＩＩ型糖尿病を進行させる傾向を有する可能性があるのか、又は、同進行のリスクにある可能性があるのかどうかを判定するために、ヒトＫＩＡＡ１３２４遺伝子（エクソン、イントロン、５’−及び３’−非翻訳領域を含む）において公知のＳＮＰの使用を可能にする。このような判定に好ましいＳＮＰは、以下の表に列記されている。
【０１３１】
【表１】
2018528213.tif 000002
【０１３２】
対象が上記表に列記された位置において、野生型ヒトＫＩＡＡ１３２４遺伝子と比較して、別のヌクレオチド有する可能性がある場合、前記対象は、糖尿病、特に、ＩＩ型糖尿病を進行させる傾向を有する可能性があるのか、又は、同進行のリスクにある可能性がある。すなわち、上記表に列記された位置におけるＳＮＰは、糖尿病、特に、ＩＩ型糖尿病を進行させる傾向、又は、同進行のリスクにあることを示す可能性がある。
【０１３３】
野生型ヒトＫＩＡＡ１３２４遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＧ＿０３２７６３．１のヌクレオチド配列として示された、ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ  ５７５３５（２０１５年７月１５日更新）のものである。
【０１３４】
上記表において言及された位置は、ＫＩＡＡ１３２４についてのＧｅｎｅＩＤ  ５７５３５（２０１６年８月２７日更新）、アノテーションリリース１０８、アッセンブリＧＲＣｈ３７．ｐ１３（ＧＣＦ＿０００００１４０５．２５）、第１番染色体、Ｌｏｃａｔｉｏｎ  ＮＣ＿０００００１．１０（１０９６５６５８５．．１０９７４９４０３）から得られる。
【０１３５】
患者
本明細書で使用する場合、「患者」又は「対象」という用語は、ヒト又は非ヒト動物、一般的には、哺乳類を意味する。哺乳類、例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、サル、類人猿、又は好ましくは、ヒトが特に想定される。このため、本文書で記載された方法、使用、及び化合物は、一般的には、ヒト及び脊椎動物両方の疾患に適用可能である。
【０１３６】
処置
全てのその文法的形式における「処置」という用語は、治療的又は予防的処置を含む。「治療的又は予防的処置」は、臨床的及び／もしくは病理的兆候の完全な予防を目的とする予防的処置、又は、疾患の臨床的及び／もしくは病理的兆候の緩和もしくは軽減を目的とする治療的処置を含む。このため、「処置」という用語は、糖尿病の緩和又は予防も含む。
【０１３７】
本発明の文脈において、「治療効果」という用語は、一般的には、処置の望ましい又は有益な影響、例えば、疾患兆候の緩和又は軽減を意味する。疾患の「兆候」という用語は、本明細書において、その知覚できる表現を説明するのに使用され、臨床的兆候（健康診断中に検出することができ、及び／又は、患者により知覚できる疾患の兆候（すなわち、症候）として以下で定義される）と病理的兆候（細胞及び分子レベルでの疾患の表現を意味する）との両方を含む。ＩＧＦＲ様アンタゴニスト及びアゴニストによる処置の治療効果を、当技術分野においてルーチンな方法を使用して、例えば、患者の血液サンプル中のインスリンレベル及び／又はグルコースレベルを測定して、評価することができる。加えて又は代替的に、各患者の一般外観（例えば、運動、健康）を評価することも可能であり、そのことは専門家が、治療効果が現れているかどうかを評価するのにも役立つ。当業者であれば、本発明の化合物の治療効果を観察するのに適した数多くの他の方法を知っている。
【０１３８】
用量
好ましくは、治療上有効量の、本明細書で記載された化合物が投与される。「治療上有効量」は、治療効果を引き起こす本明細書で記載された化合物の量を意味する。ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニストの正確な用量は、処置の目的（例えば、疾患の軽減維持ｖｓ急性症状の処置）により決まるであろうし、当業者により公知の技術を使用して確認することができるであろう。投与経路、年齢、体重、健康全般、性別、食事、投与のタイミング、薬剤の相互作用、及び症状の重症度について、調節が必要となる場合があり、当業者による通常の試行錯誤により確認することができるであろう。
【０１３９】
投与
各種の経路が、本発明の化合物の投与に適用可能である。同経路は、経口、局所、経皮、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、又は眼内を含むが、これらに限定されない。ただし、任意の他の経路を、必要に応じて、当業者により容易に選択することができる。
【０１４０】
組成物
ＩＧＦＲ様アンタゴニスト又はアゴニストを、医薬組成物の形態で投与することが想定される。好ましくは、前記アンタゴニスト又はアゴニストは、医薬組成物中に、治療上有効量で存在する、本明細書で提供された医薬組成物に使用するのに特に好ましいアンタゴニスト又はアゴニストは、本明細書で記載されたＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合するモノクローナル抗体である。前記抗体は、配列
（ｉ）TSKRTPDGFDSVPLKT（配列番号：２）及び／又は
（ｉｉ）CHQCDPDKYSE（配列番号：３）及び／又は
（ｉｉｉ）MYKWAKPKICSEDLEG（配列番号：４）及び／又は
（ｉｖ）FQRTTFHEASRKYTN（配列番号：５）及び／又は
（ｖ）CTFSRNTPTRTFNY（配列番号：６）
を含む、ＩＧＦＲ様レセプターのエピトープに特異的に結合することが想定される。
【０１４１】
「医薬組成物」という用語は、ヒトに投与するのに適した組成物、すなわち、好ましくは、無菌であり、及び／又は、薬学的に許容し得る成分を含有する組成物を特に意味する。ただし、非ヒト動物への投与に適した組成物も、本明細書において想定される。好ましくは、医薬組成物は、ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニストを、１つ以上の薬学的な賦形剤と共に含む。「賦形剤」という用語は、充填材、バインダー、崩壊剤、コーティング、吸着剤、粘着防止剤、滑剤、保存剤、酸化防止剤、香料、着色剤、甘味料、溶媒、共溶媒、緩衝剤、キレート剤、粘性付与剤、界面活性剤、希釈剤、湿潤剤、担体、希釈剤、保存剤、乳化剤、安定化剤、又は浸透張力調節剤を含む。本発明の医薬組成物は、種々の形態、例えば、固体、液体、気体、又は凍結乾燥の形態で配合することができ、特に、軟膏剤、クリーム剤、経皮パッチ剤、ゲル剤、粉末剤、錠剤、液剤、エアロゾル剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、エリキシル剤、抽出物、チンキもしくは流体抽出物の形態、又は、所望の方法の投与に特に適した形態であることができる。
【０１４２】
本発明の医薬組成物は、１つ以上の更なる作用剤をさらに含むことができる。好ましくは、前記作用剤は、本明細書で記載された疾患の処置に治療上有効であり、組成物中に治療上有効量で存在する。例は、メトホルミン、スルホニルウレア、メグリチニド、チアゾリジンジオン、ＤＰＰ−４阻害剤、ＧＬＰ−１レセプターアゴニスト、ＳＧＬＴ２阻害剤、インスリン及びインスリン誘導体（インスリングルリジン、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル、インスリンイソファン）、ならびにこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０１４３】
したがって、上記を考慮して、本発明は、ＩＧＦＲ様アンタゴニスト又はアゴニストを含む、医薬組成物も提供する。前記医薬組成物は、糖尿病の治療的及び／又は予防的処置の方法における使用を、特に意図している。
【０１４４】
キット
本明細書において、キットも提供される。キットは、２つ以上の部品のキットであることができ、ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニストを、好ましくは、治療上有効量で、かつ、薬学的に許容し得る形態で含む。キットの成分は、容器又はバイアルに収容することができる。キットは、本明細書のどこかで記載されたように、糖尿病を処置するのに有用な更なる作用剤を含むことが想定される。例示的な更なる作用剤は、メトホルミン、スルホニルウレア、メグリチニド、チアゾリジンジオン、ＤＰＰ−４阻害剤、ＧＬＰ−１レセプターアゴニスト、ＳＧＬＴ２阻害剤、インスリン及びインスリン誘導体（インスリングルリジン、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル、インスリンイソファン）、ならびにこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０１４５】
ＩＧＦＲ様アンタゴニスト又はアゴニスト及び更なる作用剤は、同時に又は連続的に、患者に投与することができる。
【０１４６】
スクリーニングアッセイ法
本明細書で使用する場合、「スクリーニングアッセイ法」という用語は、「スクリーニング法」という用語と同等に使用される。このようなアッセイ法又は方法は、好ましくは、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」において行われる。ただし、「ｉｎ  ｖｉｖｏ」で行うこともできる。
【０１４７】
ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト及びアゴニストを、本明細書で提供されたｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイ法を使用して特定することができる。前記アッセイ法は、下記工程：（ａ）前記ＩＧＦＲ様レセプターを発現している安定した細胞系統を提供する工程と、（ｂ）前記（ａ）の細胞系統を、候補アンタゴニスト又はアゴニストと接触させる工程と、（ｃ）ＩＧＦＲ様レセプターの下流シグナル伝達イベントを測定する工程であって、アンタゴニストは、前記ＩＧＦＲ様レセプターの下流シグナル伝達イベントを増大させることにより特定され、アゴニストは、前記ＩＧＦＲ様レセプターの下流シグナル伝達イベントを減少させることにより特定される測定工程とを含み、ここで、前記ＩＧＦＲ様レセプターは、配列番号：１の配列に対応する配列を含む。
【０１４８】
好ましい下流シグナル伝達イベントは、ＩｎｓＲリン酸化、ＡＭＰＫリン酸化、ｍＴＯＲリン酸化、ＡＫＴリン酸化、ＥＲＫリン酸化、及び／又はＳ６Ｋリン酸化である。
【０１４９】
場合により、本明細書で記載されたスクリーニング法において、前記ＩＧＦＲ様レセプターを発現している細胞系統、好ましくは、本発明のスクリーニング法に適用されたのと同じ細胞系統は、候補アンタゴニスト又はアゴニストそれぞれと接触させない。このような細胞系統は、対照として機能する。このような対照細胞系統において、ＩＧＦＲ様レセプターの下流シグナル伝達イベントが測定され、候補アンタゴニスト又はアゴニストと接触している（又は、接触させた）細胞系統において測定されたＩＧＦＲ様レセプターの下流シグナル伝達イベントと比較される。
【０１５０】
前記ＩＧＦＲ様レセプターを発現している細胞系統の好ましい例は、Ｍｉｎ６又はＰＤＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋ｉＰＳＣである。
【０１５１】
本明細書で記載されたように、ＩＧＦＲ様レセプターの下流シグナル伝達イベントは、ＩｎｓＲ及び／又はＩＧＦ１Ｒ媒介性シグナル伝達の負のレギュレーション、及び特に、（ｉ）Ａｋｔリン酸化、（ｉｉ）ＡＭＰＫリン酸化、及び／又は（ｉｉｉ）ｍＴＯＲリン酸化の阻害又は減少をもたらすと考えられる。また、本明細書で提供されたスクリーニングアッセイ法において、（ｉ）Ａｋｔリン酸化、（ｉｉ）ＡＭＰＫリン酸化、及び／又は（ｉｉｉ）ｍＴＯＲリン酸化を促進し、又は、増大させる結合剤は、おそらく、ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニストである。本明細書で提供されたスクリーニングアッセイ法において、何ら効果を有さないか、又はさらに、（ｉ）Ａｋｔリン酸化、（ｉｉ）ＡＭＰＫリン酸化、及び／又は（ｉｉｉ）ｍＴＯＲリン酸化を減少させる結合剤は、おそらく、ＩＧＦＲ様レセプターのアゴニストである。
【０１５２】
安定した細胞系統は、機能性ＩＧＦＲ様レセプターを発現するのに適した任意の細胞系統であることができる。ここで、「機能性ＩＧＦＲ様レセプター」は、（ｉ）Ａｋｔリン酸化、（ｉｉ）ＡＭＰＫリン酸化、及び／又は（ｉｉｉ）ｍＴＯＲリン酸化を減少させ、又は、阻害することにより確認することができる、ＩｎｓＲ及び／又はＩＧＦ１Ｒ媒介性シグナル伝達を、負にレギュレーションするのが特に想定される。
【０１５３】
また、本発明は、本スクリーニング法により得ることができるアンタゴニスト又はアゴニストに関する。
【０１５４】
また、本発明では、ＩＧＦＲ様レセプターが、ホモ二量体化し、又は、ＩＧＦＲ−１、ＩＧＦＲ−２、及び／又はＩｎｓＲとヘテロ二量体化するかどうかを検出するための方法が企図される。前記方法は、タグ付きＩＧＦＲ様レセプターがホモ二量体化し、又は、ヘテロ二量体化するかどうかを検出することを含む。ヘテロ二量体は、ＩＧＦＲ様レセプターと、ＩｎｓＲ、ＩＧＦＲ−１、及び／又はＩＧＦ−Ｒ２とを含む場合がある。
【０１５５】
好ましいタグは、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰ又はＶｅｎｕｓ、５２７nmの発光ピークを有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子変異体である。
【０１５６】
ＩＧＦＲ様レセプターをタグ付けすることは、好ましくは、前記ＩＧＦＲ様レセプターに、インフレームにタグを融合させることにより達成される。これは、当技術分野において公知の技術により、例えば、前記ＩＧＦＲ様レセプターをコードするヌクレオチド配列に、タグをコードするヌクレオチド配列を、例えば、ゲノム編集により、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してノックインすることにより達成することができる。
【０１５７】
また、本発明は、下記項によっても特徴付けられる。
１．配列番号：１のＩＧＦＲ様レセプターに対して生じた抗体と反応可能なＩＧＦレセプター（ＩＧＦＲ）様レセプターをコードする単離されたＤＮＡ配列であり、ここで、前記抗体は、配列
（ｉ）TSKRTPDGFDSVPLKT（配列番号：２）及び／又は
（ｉｉ）CHQCDPDKYSE（配列番号：３）及び／又は
（ｉｉｉ）MYKWAKPKICSEDLEG（配列番号：４）及び／又は
（ｉｖ）FQRTTFHEASRKYTN（配列番号：５）及び／又は
（ｖ）CTFSRNTPTRTFNY（配列番号：６）
を含む、少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する、
単離されたＤＮＡ配列。
【０１５８】
２．配列番号：１に対応する配列を含むＩＧＦＲ様レセプターをコードする、
単離されたＤＮＡ配列。
【０１５９】
３．項１又は２記載のＤＮＡ配列を含む、
ベクター。
【０１６０】
４．前記ＩＧＦＲ様レセプターをコードするＤＮＡ配列の上流に位置している遺伝子調節エレメントをさらに含む、項３記載のベクター。
【０１６１】
５．項３又は４記載のベクターを含む、
ホスト細胞。
【０１６２】
６．糖尿病又は糖尿病の進行リスクを診断する方法に使用するための、ＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合可能な診断用結合剤であり、前記ＩＧＦＲ様レセプターは、配列番号：１の配列に対応する配列を含む、
診断用結合剤。
【０１６３】
７．医薬として使用するための、ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニストであり、前記ＩＧＦＲ様レセプターは、配列番号：１に対応する配列を含む、
アンタゴニスト又はアゴニスト。
【０１６４】
８．ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニストであって、前記ＩＧＦＲ様レセプターは、配列番号：１に対応する配列を含み、糖尿病の予防的及び／又は治療的処置の方法において用いられる、
アンタゴニスト又はアゴニスト。
【０１６５】
９．アンタゴニストが、前記ＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合する、項７又は８記載のアンタゴニスト又はアゴニスト。
【０１６６】
１０．アンタゴニスト又はアゴニストが、抗体、ｓｉＲＮＡ、核酸、アプタマー、ペプチド、タンパク質、又は小分子有機化合物から選択される、項７〜９のいずれか一項記載のアンタゴニスト又はアゴニスト。
【０１６７】
１１．抗体が、抗体、抗体変異体、及び抗体フラグメントを含む、項１０記載のアンタゴニスト又はアゴニスト。
【０１６８】
１２．前記抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、項１０又は１１記載のアンタゴニスト又はアゴニスト。
【０１６９】
１３．前記抗体が、前記ＩＧＦＲ様レセプターのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体であり、該エピトープが、配列：
（ｉ）TSKRTPDGFDSVPLKT（配列番号：２）及び／又は
（ｉｉ）CHQCDPDKYSE（配列番号：３）及び／又は
（ｉｉｉ）MYKWAKPKICSEDLEG（配列番号：４）及び／又は
（ｉｖ）FQRTTFHEASRKYTN（配列番号：５）及び／又は
（ｖ）CTFSRNTPTRTFNY（配列番号：６）
を含む、項１２記載のアンタゴニスト又はアゴニスト。
【０１７０】
１４．糖尿病が、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病、前糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、及び耐糖能障害を含む、項７〜１３のいずれか一項記載のアンタゴニスト又はアゴニスト。
【０１７１】
１５．処置が、インスリン抵抗性を予防し、又は、反転させる、項８〜１５のいずれか一項記載のアンタゴニスト又はアゴニスト。
【０１７２】
１６．処置が、膵島細胞の脱分化を予防し、又は、反転させる、項８〜１６のいずれか一項記載のアンタゴニスト又はアゴニスト。
【０１７３】
１７．配列番号：１に対応する配列を含むＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニストを含み、ここで、前記アンタゴニストは、前記ＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合するモノクローナル抗体である、
医薬組成物。
【０１７４】
１８．前記抗体が、前記ＩＧＦＲ様レセプターのエピトープに特異的に結合し、該エピトープが、配列：
（ｉ）TSKRTPDGFDSVPLKT（配列番号：２）及び／又は
（ｉｉ）CHQCDPDKYSE（配列番号：３）及び／又は
（ｉｉｉ）MYKWAKPKICSEDLEG（配列番号：４）及び／又は
（ｉｖ）FQRTTFHEASRKYTN（配列番号：５）及び／又は
（ｖ）CTFSRNTPTRTFNY（配列番号：６）
を含む、項１７記載の医薬組成物。
【０１７５】
１９．配列
（ｉ）TSKRTPDGFDSVPLKT（配列番号：２）及び／又は
（ｉｉ）CHQCDPDKYSE（配列番号：３）及び／又は
（ｉｉｉ）MYKWAKPKICSEDLEG（配列番号：４）及び／又は
（ｉｖ）FQRTTFHEASRKYTN（配列番号：５）及び／又は
（ｖ）CTFSRNTPTRTFNY（配列番号：６）
を含む、ＩＧＦＲ様レセプターのエピトープに特異的に結合する、
モノクローナル抗体。
【０１７６】
２０．ＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニストについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイ法であり、
（ａ）前記ＩＧＦＲ様レセプターを発現している安定した細胞系統を提供する工程と、
（ｂ）前記（ａ）の細胞系統を、候補アンタゴニスト又はアゴニストと接触させる工程と、
（ｃ）ＩＧＦＲ様レセプターの下流シグナル伝達イベントを測定する工程であって、アンタゴニストは、前記ＩＧＦＲ様レセプターの下流シグナル伝達イベントをサプレッションすることにより特定され、アゴニストは、前記ＩＧＦＲ様レセプターの下流シグナル伝達イベントを促進することにより特定される測定工程とを含み、
ここで、前記ＩＧＦＲ様レセプターは、配列番号：１の配列に対応する配列を含む、
方法。
【０１７７】
２１．前記ＩＧＦＲアンタゴニストが、抗体、ｓｉＲＮＡ、核酸、アプタマー、ペプチド、タンパク質、又は小分子有機化合物から選択される、項２０記載の方法により得ることができるＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニスト。
【０１７８】
２２．対象における膵島細胞の変性を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断アッセイ法であって、
ｉ）前記対象から得られたサンプルを、ＩＧＦＲ様レセプターに特異的に結合する診断用結合剤と接触させる工程と、
ｉｉ）該結合剤の結合を検出する工程とを含み、
ここで、前記診断用結合剤の検出可能な結合は、対象における膵島細胞の脱分化を示し、
ここで、ＩＧＦＲ様レセプターは、配列番号：１に対応する配列を含む、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断アッセイ法。
【０１７９】
２３．膵島細胞の脱分化が、糖尿病又は糖尿病の進行リスクを示す、項２２記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断アッセイ法。
【０１８０】
２４．サンプルが、血漿サンプルである、項２２又は２３記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断アッセイ法。
【０１８１】
２５．診断用結合剤が、モノクローナル抗体である、項２２〜２４のいずれか一項記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断アッセイ法。
【０１８２】
２６．糖尿病を処置する方法であって、ＩＧＦＲアンタゴニストを、対象に投与することを含み、前記ＩＧＦＲ様レセプターは、配列番号：１の配列に対応する配列を含む、
方法。
【０１８３】
２７．糖尿病を処置する方法におけるＩＧＦＲ様レセプターのアンタゴニスト又はアゴニストの使用であり、前記ＩＧＦＲ様レセプターは、配列番号：１の配列に対応する配列を含む、
使用。
【０１８４】
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈において他に明確に示さない限り、複数の指示対象を含むことが留意される。このため、例えば、「試薬（ａ  ｒｅａｇｅｎｔ）」への言及は、１つ以上のこのような種々の試薬を含む。「方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、本明細書で記載された方法を改変し、又は、置換することができる、当業者に公知の同等の工程及び方法への言及を含む。
【０１８５】
特に断りない限り、一連の要素に先立つ「少なくとも」という用語は、該一連における全ての要素を意味すると理解されたい。当業者であれば、過度の試行錯誤をすることなく、本明細書で記載された本発明の特定の実施態様に対する多くの同等物を認識し、又は、確認することができるであろう。このような同等物は、本発明に包含されることが意図される。
【０１８６】
本明細書におけるあらゆる箇所で使用される「及び／又は」という用語は、「及び」、「又は」、及び「前記用語により結び付けられた要素の全て又は任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
【０１８７】
本明細書で使用する場合、「約」又は「およそ」という用語は、所定の値又は範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、及びより好ましくは５％以内を意味する。ただし、同用語は、名数も含む。例えば、「約２０」は、２０を含む。
【０１８８】
「未満」又は「超」という用語は、名数を含む。例えば、２０未満は、以下を意味する。同様に、超（ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ）又は超（ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ）は、以上（ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｒ  ｅｑｕａｌ  ｔｏ）又は以上（ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ  ｏｔ  ｅｑｕａｌ  ｔｏ）をそれぞれ意味する。
【０１８９】
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲全体を通して、文脈において他に必要とされない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語及び変位語、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載された整数もしくは工程、又は、整数もしくは工程の群の包含を含み、任意の他の整数もしくは工程又は整数もしくは工程の群を除外しないと理解されるであろう。本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｇ）」もしくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、又は、場合により本明細書で使用する場合、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語により置換することができる。
【０１９０】
本明細書で使用する場合、「からなる」は、特許請求の範囲の要素において特定されていない、任意の要素、工程、又は成分を除外する。本明細書で使用する場合、「から本質的になる」は、特許請求の範囲の基礎的及び新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程を除外しない。
【０１９１】
本発明は、本明細書で記載された特定の方法論、プロトコール、材料、試薬、及び物質等に限定されず、変動することもできることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施態様を説明するためだけの目的のものであり、本発明の範囲を限定することを意図していない。同範囲は、特許請求の範囲によってのみ定義される。
【０１９２】
本明細書のテキスト全体を通して引用された全ての刊行物および特許（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造仕様書、説明書等を含む）は、前述又は後述に関わらず、その全体が参照により組み入れられる。本明細書中のいかなるものも、本発明が、先行発明によるそのような開示よりも先行する資格がないと認めるものとして解釈されるべきではない。参照により組み入れられる情報が、本明細書と矛盾する、又は、一致しない程度において、本明細書が、任意のこのような情報に対して優先されるであろう。
【０１９３】
本発明及びその利点のより良好な理解が、下記実施例から得られるであろう。同実施例は、例証の目的を提供するのみである。本実施例は、本発明の範囲を何ら限定することを意図していない。
【実施例】
【０１９４】
実施例１：材料及び方法
ＩＧＦＲ様レセプターノックアウトマウスの発生
全てのマウスを、ドイツ動物愛護法ならびに、Society of Laboratory Animals（ＧＶ−ＳＯＬＡＳ）及びFederation of Laboratory Animal Science Associations（ＦＥＬＡＳＡ）の認められたガイドラインに従って、HMGUの中央施設に収容した。胚段階でのマウスの殺処分は、規制認可を受ける必要がなかった。
【０１９５】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ親細胞系統ＪＭ８．Ｎ４から得られたターゲットＥＳ細胞クローンを、EUCOMM細胞寄託（EuMMCR）から取得し（Helmholtz Zentrum Muenchen GmbH, Alleles produced for the EUCOMM and EUCOMMTools projects by the Helmholtz Zentrum Muenchen GmbH (Hmgu). MGI Direct Data Submission. 2010-2015）、キメラ発生のために、ＣＤ１胚盤胞に注入した。得られたキメラを、ＣＤ１又はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させた。生殖系伝達を確認するために、子孫を、ＰＣＲによりスクリーニングした。ターゲット変異を有するヘテロ接合性マウスを交雑させて、ＣＤ１又はＣ５７ＢＬ／６Ｊのいずれかのバックグラウンドにおいて、ホモ接合性変異マウスを発生させた。
【０１９６】
遺伝子型を、対照及びノックアウトマウスの尾から抽出されたゲノムＤＮＡを使用して、ＰＣＲにより確認した。ＰＣＲに使用されたプライマーは、下記のとおりとした。フォワードプライマー：5’TGGGTAGCCTTTCTGTATGG-3’（配列番号：８）及びリバースプライマー：5’ GACATAGGGCAGATTTGTGG-3’（配列番号：９）。
【０１９７】
増殖アッセイ法
変異胚における細胞増殖を評価するために、妊娠しているメスの皮下に、０．１mg ＥｄＵ/グラム 体重を注入した。２時間後、動物を殺処分し、Ｅ１４．５、Ｅ１６．５、及びＥ１８．５の胚からの膵臓を切除し、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中の４％ ＰＦＡ中において、４℃で一晩固定した。翌日、臓器を、７．５％、１５％、３０％ スクロース勾配に供して、Tissue Freezing Medium（Leica, Germany）中に包埋し、−８０℃で保存した。２０マイクロメートルの凍結切片を、Click-iT（登録商標）EdU画像化キット（Life Technology）を使用し、製造メーカーの説明に従って染色した。同キットには、インスリンに対する抗体（１：２５０  モルモット、Thermo Schientific；PA1-26938）が含まれる。画像を、２０×対物レンズを備えるLeica SP5共焦点顕微鏡を使用して取得した。データ分析を、IMARISソフトウェア（Bitplane, Switzerland）を使用して行った。
【０１９８】
ＲＴ−ｑＰＣＲ
遺伝子発現分析について、リアルタイム定量ＰＣＲにより、ｍＲＮＡを、ノックアウト及び対照胚の膵臓から、miRNeasy miniキット（Qiagen, Germany）を使用して単離した。ｃＤＮＡを、GoScriptTM Reverse Transcription System（Promega）を使用して合成し、その後に、TaqMan（登録商標） Low Density Arraysを使用するｑＰＣＲに使用し、ViiA 7 system（Applied Biosystems）においてランした。使用されたプローブを、表１に列記する。
【０１９９】
【表２】
2018528213.tif 000003
【０２００】
エストロゲン誘引遺伝子１２１タンパク質（ＥＩＧ）に対するモノクローナル抗体の生成
【０２０１】
ヒトＥＩＧタンパク質からのペプチドを合成し、ＯＶＡ（Peps4LS, Heidelberg, Germany）に結合させた。Ｌｏｕ／ｃラット又はＣ５７ＢＬ／６マウスを、皮下及び腹腔内において、５０μg ペプチド−ＯＶＡ、５nmol ＣＰＧオリゴヌクレオチド（Tib Molbiol, Berlin）、ＰＢＳ ５００μl（マウス  １００μl）、及び不完全フロイントアジュバント ５００μl（マウス  １００μl）の混合物により免疫化した。アジュバントを含まないブーストを、初回の注入後６週間で与えた。融合を、標準的な手法を使用して行った。上清を、アビジンコートＥＬＩＳＡプレート上でのビオチン化ＥＩＧペプチド及び無関係のビオチン化ペプチドによるディファレンシャルＥＬＩＳＡにおいて試験した。ＥＩＧペプチドと特異的に反応したＭＡｂを、ウェスタンブロットにおいてさらに分析した。
【０２０２】
ウサギポリクローナル抗体を、Pineda Antikorper Service, Berlin, Germanyから購入した。
【０２０３】
細胞培養
Ｍｉｎ６は、グルコース刺激に基づいて、インスリンを分泌するその能力について十分特徴付けられている膵臓β細胞系統である。この細胞系統は、Susumu Seino’s Labからのものであった。
【０２０４】
Ｍｉｎ６細胞を、１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ ペニシリン／ストレプトマイシン、及び２−メルカプトエタノールを加えた、Gibcoの高濃度グルコースダルベッコ改変イーグル培地（４１９６６−０５２）において維持した。
【０２０５】
ＨＥＫ２９３細胞を、global biosource center ATCCから購入した。
【０２０６】
ＩＧＦＲ様レセプターノックダウン
Ｍｉｎ６細胞を、細胞密度５×１０４個/cm2で播種し、高濃度グルコースＤＭＥＭ培地中で培養した。２日目及び３日目でのＩＧＦＲ様レセプターｓｉＲＮＡの１回のトランスフェクション後、細胞を、４日目に細胞密度５０〜６０％で、ＲＩＰＡバッファー中において、氷上で溶解させた。リポフェクタミン（リポフェクタミン２０００、Life Technologies, #11668019）系トランスフェクションを、Life Technologiesのプロトコールに従って行った。２００pmol 下記ｓｉＲＮＡ（Dharmacon GE Healthcare）を使用した。On-Target plus mouse 5330417C22Rik (229722) siRNA-SMARTpool L-048745-01-0020及び対照ｓｉＲＮＡ On-target plus non-targeting siRNA #1 D-001810-01-20。
【０２０７】
ＩＧＦＲ様レセプターノックアウト
コアプロモーター及び転写開始側をターゲットする、Ｍｉｎ６細胞でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ＩＧＦＲ−Ｉノックアウト戦略（図２３）
【０２０８】
ＩＧＦＲ様レセプターノックインＶｅｎｕｓ融合
翻訳停止配列を除去し、ＶｅｎｕｓをインフレームにＩＧＦＲ−Ｉオープンリーディングフレームに融合することによる、Ｖｅｎｕｓ蛍光レポーターのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ノックイン融合（図２３）。Ｖｅｎｕｓ蛍光レポーターにインフレームに融合されたＣａｓ９を、ＩＧＦＲ−Ｉの転写開始側に隣接するガイダンスＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と共に、Ｍｉｎ６細胞に共トランスフェクションした。２日後、蛍光細胞をフローソートした。限界希釈物を、１０ｃｍデッシュに撒く。１０〜１４日後、単一クローンを、９６ウェルプレートにピックし、ＩＧＦＲ−Ｉ発現（染色及びＷＢ）及びゲノムＰＣＲによる内部欠失を分析した。
【０２０９】
Ｍｉｎ６の飢餓アッセイ法
Ｍｉｎ６細胞を、細胞密度５×１０４個/cm2で播種し、高濃度グルコースＤＭＥＭ培地中で培養した。ＩＧＦＲ様レセプターノックダウンを行った後、Ｍｉｎ６細胞を、１×ＰＢＳで６回洗浄した。０．２％ ＢＳＡを含有するＨＢＳＳバッファーを、１５分、３０分、６０分、及び１２０分間加えて、細胞を飢餓状態にした。その後に、細胞を、ＲＩＰＡバッファー中において、氷上で溶解させた。
【０２１０】
ウェスタンブロット（半乾燥免疫ブロット）
細胞及び組織を、プロテアーゼ阻害剤（１：１００、Sigma, P8340）及びホスファターゼ阻害剤（１：１００、Sigma Aldrich, #2 P0044及び#3 P5726）のカクテルを含有するＲＩＰＡバッファー（５０mM Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１％ ＩＧＥＰＡＬ、０．１％ ＳＤＳ、０．１％ デオキシコール酸Ｎａ）中において溶解させた。細胞又は組織のライゼートを、１３０００rpmでの１０〜３０分間の遠心分離により洗浄した。タンパク質（１０〜２０μg）を、検出されるタンパク質のサイズに基づいて、６．５〜１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分離し、ＰＶＤＦメンブランにトランスファーした。一次抗体を、５％ ミルク中において、メンブランに加え、４℃で一晩インキュベーションした。タンパク質のバンドを、Hyperfilms（GE healthcare, 28906837）又はBlaufilme CEA-RP（Ernst Christiansen GmbH, EC84A）上において、化学発光検出（ECL, Millipore, WBKLS0500）により可視化した。
【０２１１】
下記抗体を、対応する希釈で使用した。
【０２１２】
ＩＧＦＲ様レセプター  配列番号：２（１：５０００、ウサギ、Pineda, Berlin, Germany）、ＩＧＦＲ様レセプター  配列番号：２（１：１００、ラット及びマウス）、ＩＧＦＲ様レセプター  配列番号：４及び６（１：１０、ラット及びマウス）、Ａｋｔ（１：５０００、Cell Signaling, 4691）、Ｐ−Ａｋｔ（１：５０００、Cell Signaling, 4060）、Ｅｒｋ（１：５０００、Cell Signaling, 4695)、Ｐ−Ｅｒｋ（１：５０００、Cell Signaling, 4370）、ｍ−Ｔｏｒ（１：１０００、Cell Signaling, 2972）、Ｐ−ｍＴｏｒ（１：１０００、Cell Signaling, 5536）、Ａｍｐｋ（１：１０００、Cell Signaling, 2532）、Ｐ−Ａｍｐｋ（１：２５００、Cell Signaling, 2535）、ＩＲＳ−２（１：１０００、Cell Signaling, 4502）、ＩＲβ（１：１０００、Cell Signaling, 3025）、Ｓ６ｒｐ（１：５０００、Cell Signaling, 2217S）、Ｐ−Ｓ６ＲＰ（１：５０００、Cell Signaling, 2211S)、Ｐ−ＩＲ／ＩＧＦＲ（１：１０００、Millipore, 07-841）、α−チューブリン（１：５０００、Sigma, T7451）、マウスアダプチンベータクローン７４（１：５０００、BD Bioscience 610382）。オートファジー関連タンパク質の検出のために、Cell SignalingのAutophagy Antibody Samplerキット（#4445、１：１０００）を使用した。
【０２１３】
免疫蛍光及び画像化
免疫細胞化学について、Ｍｉｎ６細胞を、Ibidi（Munich, Germany）８ウェルチャンバーディッシュ（処理済み）に、細胞密度５×１０４個/ウェルで撒いた。播種後３日で、細胞を、４％ ＰＦＡにより、１０分間直接固定し、続けて、透過溶液（１×ＰＢＳ中の０．１M グリシン、０．２％ Triton-X100）中において１０分間インキュベーションした。１時間のブロッキング後（１×ＰＢＳ中の１０％ ロバ血清、１％ ＢＳＡ及び５％ ＦＣＳ、０．５％ Tween-20）、細胞を、一次抗体：ＩＧＦＲ様レセプター  配列番号：２（ラット及びマウス  １：１０）、ＧＭ１３０（１：３００、BD, 610822）、ＩＧＦ２Ｒ（１：１００、ThermoScientific, PA3-850）を含有するブロッキング溶液中において、４℃で一晩インキュベーションした。下記二次抗体を、ブロッキング溶液中において、室温で２時間加えた。ロバ抗ウサギＩｇＧ−５５５（１：８００、Invitrogen, A31572）、ロバ抗マウスＩｇＧ−４８８（１：８００、Invitrogen, A21202）、及びロバ抗ラットＩｇＧ６４７（１：４００、Dianova, 712-605-150）。ＤＡＰＩ染色（５０ng/ml）後、サンプルを、elvanolによりマウントした。画像を、６３×対物レンズを備えるLeica laser-scanning SP5共焦点顕微鏡において取得した。
【０２１４】
マウス組織における免疫細胞化学について、膵臓を切除し、ＰＢＳ中の４％ ＰＦＡ中において、４℃で２時間固定し、スクロース溶液の勾配系列（ＰＢＳ中の７．５、１５、及び３０％ スクロース）において、各溶液中で少なくとも２時間凍結保護した。最後に、臓器を、Tissue Freezing Medium（Leica 14020108926）中に包埋し、−８０℃で保存した。２０μmの切片を、免疫染色に使用した。簡潔に、この切片を、ＰＢＳ中において洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％ Triton X-100、０．１M グリシン中において、１５分間透過させ、ついで、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中の１０％ ＦＣＳ、３％ ロバ血清、０．１％ ＢＳＡ、及び０．１％ Tween-20）中において、室温で１時間ブロッキングした。一次抗体を、ブロッキング溶液中において希釈し、４℃で一晩インキュベーションした。翌日、切片を、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中の０．１％ Tween-20）中において、各５分で３回洗浄し、ブロッキング溶液中に希釈した二次抗体と共に、室温において３〜５時間インキュベーションし、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジン−２−フェニルリンドール）により染色し、包埋培地（ProLong Gold antifade embedding medium, Life Technologies）中においてマウントした。
【０２１５】
ヒト膵島の全マウント染色について、膵島を、ＰＢＳ中の４％ ＰＦＡ中において、ＲＴで１５分間固定し、ブロッキング溶液中に希釈した一次抗体と共に、４℃で一晩直接インキュベーションし、続けて、ＰＢＳＴ中において、３回洗浄し、ついで、上記のように、二次抗体と共に、ＲＴで３〜５時間インキュベーションした。
【０２１６】
ヒト組織切片の染色について、ヒトドナーからのスナップ凍結膵臓片を、Tissue Freezing medium（Leica 14020108926）中に包埋し、−８０℃で保存した。１０μm厚の切片を、ＰＢＳ中の４％ ＰＦＡ中において、ＲＴで２０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、氷上で５分間透過させた。抗体染色手法を、上記されたように行った。
【０２１７】
使用された一次抗体は、抗ＩＧＦＲ様レセプター  ウサギ、配列番号：２、１：１００、抗ＩＧＦＲ様レセプター、配列番号：２及び配列番号：４  ラット、１：１０、ＩＧＦＲ様レセプター、配列番号：２及び配列番号：６  マウス、１：１０、抗インスリン（ウサギ、１：２５０、Cell Signaling; 3014）、抗インスリン（モルモット、１：２５０；Thermo Scientific; PA1-26938）、抗Ｅ−カドヘリン（ラット、１：５００；DECMA Kremmer）、抗マンノース６Ｐレセプター（ウサギ、１：２００；Thermo Scientific; PA3-850）、及び抗ウロコルチン３（ウサギ、１：３００；Phoenix Pharmaceuticals; H-019-29）とした。使用された二次抗体を、抗ウサギAlexa-555（１：８００；Invitrogen; A31572）、抗ウサギAlexa-488（１：８００、Invitrogen; A21206）、抗ラットAlexa-488（１：８００；life technologies, A-21208）、抗ラットAlexa-647（１：８００；Dianova, 712-605-150）、及び抗モルモットAlexa647（１：８００； Dianova; 706-495-148）、抗マウスAlexa-555（１：８００；Invitrogen; A31570）とした。画像を、Leica DMI 6000顕微鏡において取得した。
【０２１８】
免疫沈降アッセイ法
免疫沈降アッセイ法について、Ｍｉｎ６細胞を、０．２％ ＢＳＡを含み、脂肪酸を含まないＨＢＳＳ中において、１５、３０、６０、及び１２０分間飢餓状態にし、プロテアーゼ阻害剤（１：１００、Sigma, P8340）のカクテルを含有する免疫沈降バッファー（２％ ＣＨＡＰＳ、５０mM ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、２００mM ＮａＣｌ、２mM ＥＤＴＡ）中において、氷上で２０分間溶解させた。ライゼートを、１４０００rpm及び４℃での３０分間の遠心分離により洗浄した。約５００μg 全細胞ライゼートを、ラットにおいて生成され、１：１０希釈されたＩＧＦＲ様レセプター  配列番号；２抗体と共に、４℃で１時間インキュベーションし、続けて、protein G Sepharose 4 Fast Flow（GE Healthcare）と共に、４℃で１６時間インキュベーションした。沈殿物を、免疫沈降バッファーにより、５回洗浄し、１００mM ＤＴＴ及び５％ ２−メルカプトエタノールを含有する２×ＳＤＳサンプルバファー（１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４％ ＳＤＳ、２０％ グリセロール、０．２％ ブロモフェノールブルー）中において、９５℃で５分間変性させ、ウェスタンブロット分析に供した。
【０２１９】
表面ビオチン化アッセイ法
Ｍｉｎ６細胞を、２mM EZ-Link（登録商標） Sulfo-NHS-LC-Biotin（Thermo Scientific）と共に、ＰＢＳ  ｐＨ８．０中において、室温で１０分間インキュベーションした。その後、ビオチン化反応を、ＰＢＳ中の１００mM グリシンにより停止させた。ついで、細胞を、氷冷ＰＢＳ中において洗浄し、プロテアーゼ阻害剤のカクテルを含有するＲＩＰＡバッファー中において溶解させた。１４０００rpm及び４℃での３０分間の遠心分離による洗浄後、上清を、NeutrAvidin beads（Thermo Scientiic/Pierce）と共に、４℃で一晩インキュベーションした。翌日、ＲＩＰＡバッファー中において、５回洗浄した後、ビオチンラベルタンパク質を、ビーズから、１００mM ＤＴＴ及び５％ ２−メルカプトエタノールを含有する２×ＳＤＳサンプルバファー中においてボイルすることにより溶出し、ウェスタンブロット分析に供した。
【０２２０】
実施例２：ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、及びインスリンリガンドに隣接するＩＧＦＲ様レセプターの膵臓における発現
簡潔に、Ｅ１４．５マウス胚を取得し、GenePaint（商標）（Tecan）を使用するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に供した。
【０２２１】
Ｅ１４．５マウス胚のGene paint  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、膵臓におけるＩＧＦＲ様レセプター  ｍＲＮＡの特異的な発現が示される（図２Ｂ）。ＩＧＦ１及びＩＧＦ２  ｍＲＮＡは、膵臓上皮に隣接する組織において発現される（図２Ａ、Ｃ）。一方、インスリン  ｍＲＮＡは、膵臓の内分泌区画に存在する（図２Ｄ）。
【０２２２】
実施例３：ＩＧＦＲ様レセプターノックアウトマウス
ＩＧＦＲ様レセプターノックアウトマウスを、実施例１で記載されたように発生させた。
【０２２３】
ＩＧＦＲ様レセプターＫＯマウスは、誕生時に正常な外観を示すが、その胃に乳が無かったことにより示されるように授乳しない（図３Ｂ、スター）。同マウスは、活発でなく、呼吸困難を表わす。種々の段階におけるメンデル比は、誕生まで３つの遺伝子型の正常な分布を示すが、生存しているノックアウトマウスの確率は、誕生後から離乳齢までに有意に低下する。おそらく、補償メカニズム及び／又は、不完全なノックアウトをもたらす挿入カセット付近でのスプライシングにより、離乳齢において、ごくわずかな生存が認められる（図３Ｃ）。ヒストグラムは、Ｐ０での野生型及びヘテロ接合性同腹子対照と比較した、ノックアウトマウスの正常な体重を示す（図３Ｄ）。
【０２２４】
実施例４：ＩＧＦＲ様レセプターＫＯマウスの膵臓における、成長、増殖、及び内分泌分化
簡潔に、ＩＧＦＲ様レセプターノックアウトマウスを発生させ、膵臓を切除し、インスリンに対する抗体を使用する免疫組織化学に供した。細胞増殖を、ＥｄＵを使用して測定した。使用された材料及び方法の詳細な説明は、実施例１で提供される。
【０２２５】
膵臓切片の共焦点画像から、インスリン抗体を使用した、免疫蛍光ラベルβ細胞により示されるように、Ｅ１６．５における正常な内分泌分化が示される（緑色）（同様の結果を、Ｅ１４．５及びＥ１８．５において得た。図示せず）。膵臓上皮の正常な増殖が、ＥｄＵの包含により示される（赤色）。Ｅ１４．５、Ｅ１６．５、及びＥ１８．５における総細胞数（ＤＡＰＩにより染色）に対するＥｄＵ陽性細胞の定量から、ノックアウトと野生型の膵臓との間での増殖における有意差は示されない（１つの膵臓／段階の異なる領域から少なくとも３つの切片をカウントした。エラーバーは、平均の標準誤差を表わす）（図４）。
【０２２６】
実施例５：誕生前のＩＧＦＲ様レセプターＫＯマウスにおける膵臓遺伝子発現
簡潔に、ＩＧＦＲ様レセプターノックアウトマウスを、先に記載されたように発生させた。誕生前後のＫＯマウス及び野生型対照の膵臓を切除し、ｍＲＮＡを単離し、リアルタイム定量ＰＣＲを行った。使用された材料及び方法の詳細な説明は、実施例１で提供される。
【０２２７】
リアルタイムｑＰＣＲから、内分泌β細胞分化、成熟、増殖、及びノックアウト膵臓における機能に重要な選択遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現において、Ｅ１８．５における野生型対照と比較して、中程度の変化が示される。この段階では、胚は、未だに母性栄養に頼っている（図５）。アクチンを、正規化のためのハウスキーピング遺伝子として使用した。内分泌β細胞分化（Ｆｏｘａ２、Ｐｄｘ１、Ｐａｘ６、Ｎｅｕｒｏｄ１、Ｎｋｘ２−２、Ｎｋｘ６−１）、成熟（ＭａｆＡ、ＭａｆＢ、Ｕｃｎ３）、増殖（Ｃｃｎｄ１、Ｃｃｎｄ２、Ｃｄｋ４、Ｃｄｋｎ１ａ、Ｃｄｋｎ１ｂ）、及び機能（Ｓｌｃ２ａ２、Ｓｌｃ３０ａ８、Ｇｊｄ３、Ｋｃｎｊ１１、Ｓｍａｒｃａ１、Ａｂｃｃ８）に重要な選択遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現は、リアルタイムｑＰＣＲにより示されたように、ノックアウト膵臓において、誕生直後の野生型対照と比較して有意に変化している（図６）。
【０２２８】
実施例７：ＩＧＦＲ様レセプターにより、膵臓及びＭｉｎ６における、Ａｋｔ及びＡＭＰＫシグナル伝達が媒介された
簡潔に、ＩＧＦＲ様レセプターノックアウトマウスを発生させ、膵臓を切除した。Ｍｉｎ６細胞を、先に記載されたように、培養し、収集した。Ｍｉｎ６細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターノックダウンを、ＩＧＦＲ様レセプター  ｍＲＮＡをターゲットするｓｉＲＮＡ又は対照としてのスクランブルｓｉＲＮＡによるトランスフェクションにより達成した。細胞及び組織を、Ａｋｔ及びＡＭＰＫに対するホスホ特異的抗体を使用するウェスタンブロットに供した。使用された材料及び方法の詳細な説明は、実施例１で提供される。
【０２２９】
膵臓組織全体のライゼートのウェスタンブロットから、ホスホ特異的抗体を使用して、Ａｋｔ及びＡＭＰＫのリン酸化が示される（図７Ａ）。かなりの数の変異胚から、Ａｋｔ（ｍｔ２、３、５、６）及びＡＭＰＫリン酸化（ｍｔ１、２、３）における増大が示される（図７Ａ）。同様に、（図７Ｂ）において、Ｍｉｎ６細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターのノックダウンにより、Ａｋｔリン酸化の増大がもたらされる。
【０２３０】
実施例８：Ｍｉｎ６におけるインスリン／ＩＧＦシグナル伝達についての、ＩＧＦＲ様レセプターのノックダウンの影響
簡潔に、Ｍｉｎ６細胞を培養し、ＩＧＦＲ様レセプターｍＲＮＡをターゲットするｓｉＲＮＡによりトランスフェクションし、ＩＲ／ＩＧＦ１Ｒに対するホスホ特異的抗体、ならびに、下流シグナル伝達分子であるＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ＥＲＫ、及びＳ６ＲＰに対するホスホ特異的抗体を使用したウェスタンブロットにより研究した。使用された材料及び方法の詳細な説明が、実施例１で提供される。
【０２３１】
Ｍｉｎ６細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターのノックダウンにより、正常な増殖条件下でのＩＲ／ＩＧＦ１Ｒのリン酸化の増大がもたらされ、飢餓条件とは独立していると考えられる。ＩＲ及びＩＧＦ１ＲならびにＩＲＳ−２（ＩＲシグナル伝達の下流のアダプター分子）の総レベルは変わらない。一方、ＩＧＦＲ様レセプターは、ノックダウンサンプルにおいて強力に低下する。このことから、ｓｉＲＮＡノックダウンの有効性が確認される（図８Ａ）。下流シグナル伝達分子、例えば、ＡＫＴ及びｍＴＯＲのウェスタンブロット分析。同ＡＫＴ及びｍＴＯＲは、ＩＲ活性化の結果として共通してリン酸化される重要な分子である。Ｍｉｎ６細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターノックダウンにより、Ａｋｔ及びｍＴＯＲのリン酸化の増大がもたらされるが、ＥＲＫ及びＳ６ＲＰのリン酸化の増大はもたらされないことが示される。ホスホＳ６ＲＰの時間依存的減少により示されたように、飢餓条件は、その同じタイミングでの対照と比較して、ＩＧＦＲ様レセプターノックダウンサンプルにおいて、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、及びＥＲＫリン酸化に影響を有さないと考えられる（図８Ｂ）。
【０２３２】
実施例９：膵臓の内分泌、管、及び外分泌細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターの局在
簡潔に、Ｅ１８．５膵臓を切除し、ＩＧＦＲ様レセプター、インスリン、及びＥ−カドヘリンに対する抗体を使用する免疫組織化学に供した。使用された材料及び方法の詳細な説明が、実施例１で提供される。
【０２３３】
ＩＧＦＲ様レセプター（緑色）、インスリン抗体（赤色）、及びＥカドヘリン（シアン）に対する抗体により染色されたＥ１８．５膵臓切片の共焦点画像から、外分泌及び内分泌区画の両方におけるＩＧＦＲ様レセプターの免疫局在性が示される。同区画では、ＩＧＦＲ様レセプターは、インスリンと部分的に共存している（図９）。核を、ＤＡＰＩにより染色した。
【０２３４】
実施例１０：ＩＧＦＲ様レセプターの細胞内局在
簡潔に、Ｍｉｎ６細胞を、先に記載されたように培養し、ＩＧＦＲ様レセプター及びＧＭ１３０に対する抗体を使用する免疫細胞化学に供した。使用された材料及び方法の詳細な説明は、実施例１で提供される。
【０２３５】
実施例１１：ＩＧＦＲ様レセプターの細胞内局在
簡潔に、免疫蛍光染色及び画像化を、実施例１で記載されたように行った。
【０２３６】
ＩＧＦＲ様レセプター及びゴルジマーカーであるＧＭ１３０に対する免疫蛍光ラベル抗体により染色されたＭｉｎ６細胞の免疫蛍光画像から、ＩＧＦ２Ｒと同様に、ゴルジ複合体におけるＩＧＦＲ様レセプターの部分的な局在が示される（図１０、図１１）。
【０２３７】
正常な増殖条件と比較して、飢餓の２時間後に、ｃｉｓ−ゴルジ領域に濃縮されたＩＧＦＲ様レセプターの再分布を観察することができる（図１１）。
【０２３８】
実施例１１：飢餓条件下でのＩＧＦＲ様レセプターとＡＰ−２との相互作用
簡潔に、Ｍｉｎ６細胞を、先に記載されたように培養し、ＩＧＦＲ様レセプター及びアダプチンβ（ＡＰ２複合体のサブユニット）に対する抗体を使用する免疫沈降及びウェスタンブロットに供した。使用された材料及び方法の詳細な説明は、実施例１で提供される。
【０２３９】
ウェスタンブロット分析から、ＩＧＦＲ様レセプター及びアダプチンβに対する抗体を使用する免疫沈降により証明されたように、飢餓によるＭｉｎ６細胞におけるアダプチンβサブユニット（ＡＰ２複合体の一部）とＩＧＦＲ様レセプターとの共免疫沈降が示される。正常な飢餓条件下では、アダプチンβは、実質的に共沈降しなかった（図１３）。
【０２４０】
実施例１２：ＩＧＦ３Ｒは、栄養欠乏により細胞内に輸送されるが、ＩｎｓＲは輸送されない
簡潔に、Ｍｉｎ６細胞を、先に記載されたように培養し、ＩＧＦＲ様レセプター及びアダプチンβ（ＡＰ２複合体のサブユニット）に対する抗体を使用する表面ビオチン化及びウェスタンブロットに供した。使用された材料及び方法の詳細な説明は、実施例１で提供される。
【０２４１】
表面ビオチン化、続けて、ニュートラビジンプルダウン及びウェスタンブロットから、飢餓条件下でのＭｉｎ６細胞における、ＩＧＦＲ様レセプターの表面発現の減少の時間依存的減少が証明されたが、ＩＲの減少は証明されない。
【０２４２】
実施例１４：オートファジー関連タンパク質の発現におけるＩＧＦＲ様レセプターノックダウンの効果
簡潔に、Ｍｉｎ６細胞を、先に記載されたように培養し、トランスフェクションし、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＡＴＧ７、ＡＴＧ３、べクリン−１、ＬＣ３Ａ／Ｂ、及びＡＴＧ５（すなわち、オートファジー関連タンパク質）に対する抗体を使用するウェスタンブロットに供した。使用された材料及び方法の詳細な説明は、実施例１で提供される。
【０２４３】
ＩＧＦＲ様レセプターノックダウンは、基本的な条件において、オートファジー関連タンパク質のタンパク質発現を変化させない可能性が高い。オートファジー関連分子のウェスタンブロット分析により、正常な増殖条件下において、Ｍｉｎ６細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターノックダウンによる発現において、見掛けの変化は示されない（図１５）。
【０２４４】
実施例１５：マウス糖尿病膵島及び外分泌組織におけるＩＧＦＲ様レセプターの発現
簡潔に、ｗｔ及び糖尿病マウスの膵臓を切除し、ＩＧＦＲ様レセプター、インスリン、及びＥ−カドヘリンに対する抗体を使用する免疫細胞化学に供した。使用された材料及び方法の詳細な説明は、実施例１で提供される。
【０２４５】
ＩＧＦＲ様レセプター（赤色）、インスリン（シアン）、及びＥ−カドヘリン（緑色）（Ａ）、ならびに、ＩＧＦＲ様レセプター（赤色）、グルカゴン（シアン）、及びウロコルチン３（緑色）（Ｂ）に対する抗体により染色された野生型（＜１２０mg/dL グルコース）及び糖尿病（＞５００mg/dL グルコース）成体膵臓のＬＳＭ画像から、内分泌及び外分泌区画の両方において、糖尿病膵臓におけるＩＧＦＲ様レセプター抗体の免疫反応性の増大が示される。糖尿病状態は、糖尿病膵臓において染色されているインスリン及びウロコルチン３の減少により証明された（図１６）。
【０２４６】
実施例１６：ＩＧＦＲ様レセプターの細胞外ドメインに対する抗体を使用する、膵島細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターの検出
簡潔に、ＨＥＫ２９３細胞を培養し、ヒト膵島を、先に記載されたように得た。ｗｔ、ヘテロ接合性、及び変異（ＩＧＦＲ様レセプターノックアウト）マウスからの膵臓を切除した。細胞及び組織を、配列番号：２、４、及び６を認識する抗ＩＧＦＲ様レセプター抗体を使用するウェスタンブロットに供した。
【０２４７】
ウェスタンブロット実験から、膵島細胞ライゼートにおける約１３０kDaのタンパク質バンドの特異的な認識が示される。同認識は、配列番号：４及び６に対する抗体による、ＨＥＫ２９３細胞ライゼートには存在しない。比較により、同じバンドは、配列番号：２に対する抗体により、野生型及びヘテロ接合性の総膵臓ライゼートにおいて、特異的に認識されるが、変異胚及び膵島細胞では認識されず、ＨＥＫ細胞では認識されない（図１７）。
【０２４８】
実施例１７：ヒトランゲルハンス膵島におけるＩＧＦＲ様レセプターの分布
簡潔に、ヒト膵島を取得し、ＩＧＦＲ様レセプター、ＩＧＦ２Ｒ、及びインスリンに対する抗体を使用する免疫細胞化学に供した。使用された材料及び方法の詳細な説明は、実施例１で提供される。
【０２４９】
ヒトランゲルハンス膵島におけるＩＧＦＲ様レセプターの発現。ＩＧＦＲ様レセプター（赤色）、ＩＧＦ２Ｒ（Ｍ６ＰＲ）（緑色）、及びインスリン（シアン）に対する抗体により免疫蛍光ラベルされた、ヒトドナーからのランゲルハンス膵島の共焦点画像から、ゴルジ区画における典型的なＩＧＦＲ様レセプター分布ならびにＩＧＦ２Ｒ及びインスリンとの部分的な共存が示される（図１８）。
【０２５０】
実施例１８：ＩＧＦＲ様レセプターは、ヒトにおける膵臓β細胞の機能不全を示す
簡潔に、ヒト膵島を、健康なドナー及び糖尿病ドナーから取得し、ＩＧＦＲ様レセプター及びインスリンに対する抗体を使用する免疫細胞化学に供した。使用された材料及び方法の詳細な説明は、実施例１で提供される。
【０２５１】
ＩＧＦＲ様レセプター（赤色）及びインスリン（緑色）に対する抗体により染色されたヒト膵臓切片のＬＳＭ画像（核をＤＡＰＩにより染色（青色））から、非糖尿病（４．６％ ＨｂＡ１ｃ値）患者と比較して、糖尿病（６．９％ ＨｂＡ１ｃ値）患者における、インスリンの減少及びＩＧＦＲ様レセプター発現の増大が示される（ＨｂＡ１ｃを、血漿中における糖化ヘモグロビンＨｂＡ１ｃのパーセントとして定義される、糖尿病状態の指標として使用した。正常範囲：５．９％未満）（図２２）。
【０２５２】
実施例１９：野生型及びノックアウトＭｉｎ６細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターの細胞内局在。ＩＧＦＲ様レセプター及びインスリンに対する抗体により染色されたＭｉｎ６細胞の免疫蛍光画像
簡潔に、野生型Ｍｉｎ６クローン及びノックアウトＭｉｎ６クローンを取得し、ゲノムＰＣＲ及びウェスタンブロットにより試験した。ＩＧＦＲ−Ｉタンパク質が、ノックアウトＭｉｎ６クローンにおいて完全に存在しないことが示される（図２５Ａ及びＢ）。ついで、ＷＴ及びＫＯを、ＩＧＦＲ様レセプター（赤色）及びインスリン（緑色）に対する抗体を使用する免疫細胞化学に供した。核を、ＤＡＰＩにより染色した（青色）（図２４）。免疫細胞化学から、ゲノムＰＣＲ及びウェスタンブロットの結果が確認される。使用された材料及び方法の詳細な説明は、実施例１で提供される。
【０２５３】
実施例２０：Ｍｉｎ６（Ｃ２２ＲＩＫ）でのインスリン／ＩＧＦシグナル伝達におけるＩＧＦＲ様レセプターノックアウトの影響
簡潔に、Ｍｉｎ６ノックアウト細胞を、実施例１で記載されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ノックアウト戦略により発生させ、ＩＲ／ＩＧＦ１Ｒに対するホスホ特異的抗体ならびに、下流シグナル伝達分子であるＡｍｐｋ、ＡＫＴ、及びｍＴＯＲに対するホスホ特異的抗体を使用するウェスタンブロット分析により研究した。
【０２５４】
Ｍｉｎ６細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターノックアウトにより、ＩＲのリン酸化増大、及びその結果として、ＡＭＰＫの増大がもたらされるが、Ａｋｔ又はｍＴｏｒリン酸化の増大はもたらされない（図２６）。Ｍｉｎ６対照及びノックアウトクローンを、増殖条件（１０％ ＦＣＳ及び高濃度グルコース）下において培養した。
【０２５５】
実施例２１：ＩＧＦＲ様Ｖｅｎｕｓ融合ノックインＭｉｎ６細胞系統
簡潔に、ＩＧＦＲ−Ｉ  Ｖｅｎｕｓ融合ノックインＭｉｎ６細胞系統を、実施例１で記載されたように発生させ、ＩＧＦＲ様レセプター及びＶｅｎｕｓ蛍光レポーターに対する抗体を使用する免疫組織化学に供した。
【０２５６】
ＩＧＦＲ−Ｉ  Ｖｅｎｕｓ融合物（抗ＧＦＰによりＶｅｎｕｓを検出、緑色）は、内在性ＩＧＦＲ−Ｉ（抗ＩＧＦＲ−Ｉ、赤色）と、ゴルジ及びtrans−ゴルジ領域において共存している。ホモ二量体化及び、膜貫通ドメイン（ＴＭ）又は成長因子レセプターのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）（ＩＰＲ００９０３０）を介したホモ及びヘテロ二量体化を阻害するか、又は、trans−ゴルジ、ゴルジ、リソソーム、及び細胞膜区画における細胞内局在を変化させる小分子化合物及び生物製剤を、このノックインＭｉｎ６細胞系統を使用した高コンテンツスクリーニングアプローチを使用して特定することができる（図２７）。
【０２５７】
実施例２２：誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化させた内分泌前駆細胞におけるＩＧＦＲ様レセプターの局在。
簡潔に、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋内分泌前駆細胞を取得し、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＩＧＦＲ様レセプターに対する抗体を使用する免疫組織化学に供した。
【０２５８】
ＰＤＸ１（水色）、ＮＫＸ６．１（赤色）、及びＩＧＦＲ様レセプター（緑色）に対する抗体により染色された内分泌前駆細胞の共焦点画像から、ＩＧＦＲ様レセプターと、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１との免疫局在が示される（図２８）。核を、ＤＡＰＩにより染色した（青色）。
【０２５９】
実施例２３：抗体を、マウスＭｉｎ６インスリノーマ細胞及びＭＣＦ７ヒト乳ガン細胞系統において、ＩＧＦＲ−ＩエクトドメインのペプチドＢ及びＤに対して生成することができる
ラットモノクローナル抗体ＥＩＧ−Ｂ  １８Ｂ２及びＥＩＧ−Ｂ  １０Ｄ９を生成し、配列番号：４のエピトープを意味するＩＧＦＲ−ＩエクトドメインのペプチドＢに対するウェスタンブロットに使用した。マウスモノクローナル抗体ＥＩＧ−Ｄ  ２６Ｄ７を、配列番号：６のエピトープを意味するＩＧＦＲ−ＩエクトドメインのペプチドＤに対して生成した。
【０２６０】
それらの抗体（ＥＩＧ−Ｂ及びＥＩＧ−Ｄ）により、Ｍｉｎ６（弱）及びＭＣＦ７（強）細胞ライゼートにおける、約１３０kDaのタンパク質バンドの特異的認識が示される。
【０２６１】
実施例２４：ＩＧＦＲ様レセプターのＳＮＰは、ゲノムワイド関連メタ研究において、冠動脈疾患、ＬＤＬコレステロール、及び２型糖尿病と高度に関連している
第１番染色体上のＩＧＦＲ−ＩをコードするヒトＫＩＡＡ１３２４遺伝子及びＩＧＦＲ−Ｉ  ＳＮＰと、特定の疾患、例えば、冠動脈疾患、ＬＤＬコレステロール、及び２型糖尿病との関連（図３１）。それらの研究は、５０万人の被験者によるゲノムワイド関連メタ研究を意味する。
【図１−１】
2018528213.tif 000004
【図１−２】
2018528213.tif 000005
【図２】
2018528213.tif 000006
【図３】
2018528213.tif 000007
【図４】
2018528213.tif 000008
【図５】
2018528213.tif 000009
【図６】
2018528213.tif 000010
【図７】
2018528213.tif 000011
【図８−１】
2018528213.tif 000012
【図８−２】
2018528213.tif 000013
【図９】
2018528213.tif 000014
【図１０】
2018528213.tif 000015
【図１１】
2018528213.tif 000016
【図１２】
2018528213.tif 000017
【図１３】
2018528213.tif 000018
【図１４】
2018528213.tif 000019
【図１５】
2018528213.tif 000020
【図１６−１】
2018528213.tif 000021
【図１６−２】
2018528213.tif 000022
【図１７】
2018528213.tif 000023
【図１８】
2018528213.tif 000024
【図１９−１】
2018528213.tif 000025
【図１９−２】
2018528213.tif 000026
【図１９−３】
2018528213.tif 000027
【図２０−１】
2018528213.tif 000028
【図２０−２】
2018528213.tif 000029
【図２０−３】
2018528213.tif 000030
【図２１】
2018528213.tif 000031
【図２２】
2018528213.tif 000032
【図２３】
2018528213.tif 000033
【図２４】
2018528213.tif 000034
【図２５】
2018528213.tif 000035
【図２６】
2018528213.tif 000036
【図２７】
2018528213.tif 000037
【図２８】
2018528213.tif 000038
【図２９】
2018528213.tif 000039
【図３０】
2018528213.tif 000040
【図３１】
2018528213.tif 000041
【配列表】
2018528213000001.app
【国際調査報告】
2018528213.tif 000042
2018528213.tif 000043
2018528213.tif 000044
2018528213.tif 000045
2018528213.tif 000046
2018528213.tif 000047
2018528213.tif 000048
2018528213.tif 000049
2018528213.tif 000050
2018528213.tif 000051
2018528213.tif 000052
2018528213.tif 000053