(57)【要約】  いくつかの実施形態によって、腫瘍の外科的除去後の腔内投与に適している幹細胞を含む生体適合性足場（例えば、柔軟な足場）が本明細書に提供され、足場は、幹細胞が足場から離れてがん性または損傷組織の方へ遊走することを可能にし、幹細胞には治療薬および／またはレポータ分子が搭載されている。足場を形成する方法およびその使用の方法も提供される。
2018510005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を含む柔軟な足場を形成する方法であって、前記幹細胞が、哺乳動物の間葉系幹細胞または哺乳動物の神経幹細胞であり、前記方法が、
柔軟かつ腫瘍の外科的除去後の腔内投与に適した足場を提供するステップと、ここで、前記足場が、生体適合性であり、かつ、前記幹細胞が前記足場から離れてがん性または損傷組織の方へ遊走することを可能にするものであり、任意選択的に、前記足場が無菌であり、かつ、任意選択的に、前記足場が生分解性および／または生体吸収性であり、
前記幹細胞を前記足場上または内に適用するステップと、ここで、前記幹細胞には治療薬が導入されており、前記治療薬が、タンパク質毒素、腫瘍溶解性ウイルス、アポトーシス促進性薬剤、または酵素／プロドラッグ治療に有用な酵素であり、かつ、任意選択的に、前記幹細胞にはレポータ分子も導入されている、
を含み、それにより幹細胞を含む前記柔軟な足場を形成する方法。
【請求項２】
前記幹細胞がヒト間葉系幹細胞またはヒト神経幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記足場が、ポリアニオン系多糖類（例えば、ヒアルロン酸［ＨＡ］、カルボキシメチルセルロース［ＣＭＣ］、カルボキシメチルアミロース［ＣＭＡ］、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、デルマタン−６−硫酸およびその組み合わせ）、アルギン酸、キチン、キトサン、フィブリン、デキストラン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（Ｄ）乳酸、ポリグリコール乳酸、ケラチン、ラミニン、エラスチン、コラーゲンおよび他の天然に存在する細胞外マトリックスタンパク質、ゼラチン、ポリジオキサノン、ポリカプロラクトン、ならびにその混成物およびコポリマーから選択される重合および／または架橋された材料を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記足場がエレクトロスピニングされた足場を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
パッチ形状を形成するように足場を成形するステップを更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記足場が生体吸収性ゼラチンスポンジを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記幹細胞が神経幹細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記幹細胞が誘導神経幹細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞が、皮膚繊維芽細胞から得られる誘導神経幹細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療薬が、酵素／プロドラッグ治療に有用な酵素である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
幹細胞を含む足場を形成する方法であって、ここで、前記幹細胞が、哺乳動物の間葉系幹細胞または哺乳動物の神経幹細胞であり、前記幹細胞には治療薬が導入され、かつ、任意選択的に前記幹細胞にはレポータ分子も導入されており、前記方法が、
重合性および／または架橋性材料を提供するステップと、ここで、任意選択的に材料が無菌であり、
前記重合性および／または架橋性材料と前記幹細胞の混合物を形成するために、前記材料を前記幹細胞と混合するステップと、
前記混合物の前記材料を重合および／または架橋するステップと
を含み、それにより前記幹細胞を含む前記足場を形成し、
前記足場が生体適合性であり、前記足場が、前記幹細胞が前記足場から離れてがん性または損傷組織の方へ遊走することを可能にする、方法。
【請求項１２】
前記幹細胞がヒト間葉系幹細胞またはヒト神経幹細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記重合および／または架橋が、脳腫瘍の外科的除去後の腔内投与の際にインサイチューで実行される、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記足場が、脳腫瘍の切除腔の壁の内側を覆うように投与される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記材料が、フィブリノゲンを含み、前記重合が前記混合物にトロンビンを添加することにより実施される、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記材料がゼラチンを含み、前記架橋が、化学架橋剤を添加することにより実施される、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
柔軟な生体適合性足場；および
前記足場上または内に組み込まれた、哺乳動物の間葉系幹細胞または哺乳動物の神経幹細胞である幹細胞
を含む送達媒体であって、
前記幹細胞には、タンパク質毒素、腫瘍溶解性ウイルス、アポトーシス促進性薬剤、および酵素／プロドラッグ治療に有用な酵素のうちの１つまたは複数を含む治療薬が導入され、任意選択的に、前記幹細胞にはレポータ分子も導入されており、
前記足場が生体適合性であり、前記足場が、前記幹細胞が前記足場から離れてがん性または損傷組織の方へ遊走することを可能にする、送達媒体。
【請求項１８】
前記幹細胞がヒト間葉系幹細胞またはヒト神経幹細胞である、請求項１７に記載の送達媒体。
【請求項１９】
前記幹細胞が神経幹細胞である、請求項１７または請求項１８に記載の送達媒体。
【請求項２０】
前記幹細胞が誘導神経幹細胞である、請求項１９に記載の送達媒体。
【請求項２１】
前記幹細胞が間葉系幹細胞である、請求項１７または請求項１８に記載の送達媒体。
【請求項２２】
前記幹細胞が皮膚繊維芽細胞から得られる誘導神経幹細胞である、請求項１９に記載の送達媒体。
【請求項２３】
前記足場が生体吸収性ゼラチンスポンジを含む、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の送達媒体。
【請求項２４】
脳がんの処置を必要とする対象において脳がんを処置する方法であって、前記対象に請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の送達媒体を投与するステップを含み、前記幹細胞が、前記対象にとって同種異系または自己由来である、方法。
【請求項２５】
前記幹細胞が、前記対象にとって自己由来である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記脳がんが膠芽腫である、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記投与が、脳腫瘍の少なくとも一部の外科的除去後に腔内投与によって実施される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記幹細胞が、前記投与後少なくとも１５、２０、３０または４０日間、処置の領域に維持される、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記幹細胞が、前記対象にとって自己由来の誘導神経幹細胞であり、前記投与が、体細胞を前記誘導神経幹細胞に分化転換させた１〜１４または２１日後に実施される、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記体細胞が繊維芽細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記体細胞が皮膚繊維芽細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
がんの処置を必要とするヒト対象におけるがんを処置する方法における請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の送達媒体の使用であって、任意選択的に前記がんが膠芽腫である、使用。
【請求項３３】
前記幹細胞が前記対象にとって自己由来である、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記幹細胞が、前記対象にとって自己由来の誘導神経幹細胞であり、前記投与が、体細胞を前記誘導神経幹細胞に分化転換させた１〜１４または２１日後に実施され、任意選択で前記体細胞が、皮膚繊維芽細胞である、請求項３２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２０１５年３月３１日出願の米国特許仮出願第６２／１４０，８２０号の利益を主張し、その開示はその全体を参照により本明細書の一部をなすものとする。
【背景技術】
【０００２】
膠芽腫（ＧＢＭ）は、最も一般的な原発性脳がんであり、最も致死的な腫瘍の１つである。Ａｄａｍｓｏｎ，Ｃ．ら、「Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｗｈｅｒｅ  ｗｅ  ｈａｖｅ  ｂｅｅｎ  ａｎｄ  ｗｈｅｒｅ  ｗｅ  ａｒｅ  ｇｏｉｎｇ」、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  １８、１０６１〜１０８３頁（２００９年）；Ｅｒｐｏｌａｔ，Ｏ．Ｐ．ら、「Ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｎｅｗｌｙ  ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｂｙ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｐｌｕｓ  ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ：ａ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｔｕｍｏｒｉ  ９５、１９１〜１９７頁（２００９年）。侵襲性ＧＢＭ細胞は、罹患していない脳内へ逃げ込むため完全な外科的切除は不可能であり、小分子化学療法は、侵襲性ＧＢＭの病巣に達することができない。その結果、ＧＢＭは治癒不能であり、生存期間の中央値は１２〜１５カ月にとどまる。Ｓｔｕｐｐ，Ｒ．ら、「Ｅｆｆｅｃｔs  ｏｆ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  ｖｅｒｓｕｓ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｌｏｎｅ  ｏｎ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｉｎ  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｓｔｕｄｙ：５−ｙｅａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＯＲＴＣ−ＮＣＩＣ  ｔｒｉａｌ」、Ｔｈｅ  ｌａｎｃｅｔ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ１０、４５９〜４６６頁（２００９年）。
【０００３】
操作した幹細胞（ＳＣ）治療は、ＧＢＭに対する有望な処置戦略である。Ａｂｏｏｄｙ，Ｋ．Ｓ．ら、「Ｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ」Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  １５、７３９〜７５２（２００８年）；Ａｈｍｅｄ，Ａ．Ｕ．ら、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  cancer  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐａｔｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １２、５４６〜５５２頁（２０１０年）。ＳＣは、ＧＢＭを捜し出す固有の能力を有し、固形およびびまん性ＧＢＭ沈着物へ遊走する。細胞毒性物質で遺伝子操作した場合、ＳＣは、様々な前臨床試験において固形ＧＢＭを根絶する治療を送達する。しかしながら、外科的切除が、ＧＢＭ患者に対する標準的ケアの一部であり、ＧＢＭのＳＣ療法に対する最初の臨床試験は術後患者において試験される。Ａｂｏｏｄｙ，Ｋ．Ｓ．ら、「Ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｍｉｄｉａｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ／ｐｒｏｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｇｌｉｏｍａ：ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（２０１３年）。
【０００４】
細胞傷害性ＳＣ治療に固有の要求を解決し、ヒト患者試験および処置にも適合する送達媒体を作製することは、新しい重要な課題である。
【発明の概要】
【０００５】
いくつかの実施形態によって、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）を含む足場（例えば、柔軟な足場）を形成する方法が本明細書に提供され、前記幹細胞には治療薬および／またはレポータ分子が導入されている。いくつかの実施形態において、本方法は、足場材料を提供するステップ（任意選択的に足場が生体適合性であり、かつ、任意選択的に前記足場が生分解性および／または生体吸収性である）と、前記足場上に前記幹細胞を付着（ｌｏａｄ）させるステップとを含む。いくつかの実施形態において、足場は、腫瘍（例えば、脳腫瘍）の外科的除去後の腔内投与に適している。いくつかの実施形態において、足場は無菌足場として提供される。
【０００６】
いくつかの実施形態において、足場は、ポリアニオン系多糖類（例えば、ヒアルロン酸［ＨＡ］、カルボキシメチルセルロース［ＣＭＣ］、カルボキシメチルアミロース［ＣＭＡ］、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸（dermatin sulfate）、デルマタン−６−硫酸およびその組み合わせ）、アルギン酸、キチン、キトサン、フィブリン、デキストラン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（Ｄ）乳酸、ポリグリコール乳酸（polyglycoliclactic acid）、ケラチン、ラミニン、エラスチン、コラーゲンおよび他の天然に存在する細胞外マトリックスタンパク質、ゼラチン、ポリジオキサノン、ポリカプロラクトン、ならびにその混成物およびコポリマーから選択される重合および／または架橋された材料を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、足場は生体吸収性ゼラチンスポンジを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、細胞は間葉系幹細胞または神経幹細胞である。いくつかの実施形態において、幹細胞は、誘導神経幹細胞である。いくつかの実施形態において、幹細胞は、皮膚繊維芽細胞等の体細胞から（例えば、迅速な分化転換により）得られる誘導神経幹細胞である。
【０００９】
いくつかの実施形態において、治療薬は、タンパク質毒素、腫瘍溶解性ウイルス、アポトーシス促進性薬剤、または酵素／プロドラッグ治療に有用な酵素である。
【００１０】
幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）を含む足場を形成する方法も提供され、前記幹細胞には治療薬および／またはレポータ分子が導入されている。いくつかの実施形態において、本方法は、重合性および／または架橋性材料を提供するステップ（任意選択的に、材料が無菌である）と、重合性および／または架橋性材料と幹細胞の混合物を形成するために前記材料を前記幹細胞と混合するステップと、前記混合物の前記材料を重合および／または架橋するステップとを含み、それにより幹細胞を含む前記足場を形成する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、足場は、生体適合性であり、幹細胞は足場から離れてがん性または損傷組織の方へ遊走することができる。いくつかの実施形態において、重合および／または架橋は、脳腫瘍の外科的除去後の腔内投与の間にインサイチューで実行される。いくつかの実施形態において、足場は、脳腫瘍の切除腔の壁の内側を覆うように投与される。
【００１２】
柔軟な生体適合性足場と、前記足場に組み込まれている幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）とを含む送達媒体であって、前記幹細胞には治療薬および／またはレポータ分子が導入されている送達媒体が更に提供される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、幹細胞は、間葉系幹細胞または神経幹細胞である。いくつかの実施形態において、幹細胞は、誘導神経幹細胞である。いくつかの実施形態において、幹細胞は、皮膚繊維芽細胞等の体細胞から（例えば、迅速な分化転換により）得られる誘導神経幹細胞である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、治療薬は、タンパク質毒素、腫瘍溶解性ウイルス、アポトーシス促進性薬剤、または酵素／プロドラッグ治療に有用な酵素である。
【００１５】
それを必要とする対象において脳がんを処置する方法であって、前記対象に、本明細書に教示される幹細胞を含む送達媒体を投与するステップを含む方法も提供される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、幹細胞は、対象にとって同種異系または自己由来である。いくつかの実施形態において、幹細胞は、前記対象にとって自己由来であるヒト誘導神経幹細胞であり、投与は、体細胞を提供する前記ステップの１、２、３または４〜７、１０、１４または２１日後に実施される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、幹細胞（または、増殖性幹細胞のその後代）は、投与後少なくとも１５、２０、３０または４０日間、処置の領域に維持される。
【００１８】
それを必要とする対象において脳がんを処置する方法における本明細書に教示される幹細胞を含む送達媒体の使用が、更に提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】診断および治療用ｉＮＳＣの生成および特徴づけ。（Ａ）ｈ−ｉＮＳＣの治療用および診断バリアントを作製するために使用した戦略の概略画である。ヒト繊維芽細胞に、Ｓｏｘ２を形質導入し、ＮＳＣ誘導性の神経前駆細胞用培地（ＮＳＣ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｍｅｄｉａ）中に置いた。４日後に、ｈ−ｉＮＳＣを増殖させて、光学的レポータまたは腫瘍破壊性導入遺伝子を形質導入した。（Ｂ）単層、神経幹細胞塊として成長させた、またはネスチンに対する抗体で染色したヒト繊維芽細胞ならびにｈ−ｉＮＳＣの白色光および蛍光顕微鏡写真である。（Ｃ）ｈ−ｉＮＳＣ生成誘導後の異なる日におけるネスチンの発現を示す総括グラフである。（Ｄ）ＮＳＣマーカーであるネスチンのｈ−ｉＮＳＣ−ＧＦＰにおける発現を明らかにする免疫蛍光染色を示す図である。ＧＦＡＰ＋のアストロサイトおよびＴｕｊ１＋のニューロンが、マイトジェン除去により、ｈ−ｉＮＳＣ−ＧＦＰから分化した。一方、多能性マーカーであるＴＲＡ−１６０またはＯＣＴ４に対する染色は観察されなかった。二次抗体チャネルだけを示す蛍光画像を、下段に示す。（Ｅ）正常ヒト繊維芽細胞、ｈ−ｉＮＳＣおよびｈ−ｉＰＳＣにおけるネスチン、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＯＣＴ３／４発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。
【図２】ＧＢＭにホーミングする操作されたｈ−ｉＮＳＣ。（Ａ）ｈ−ｉＮＳＣ−ＧＦＰＦＬを、ｍＣｈｅｒｒｙを発現するヒトＧＢＭ細胞から５００μｍ離して播種し、蛍光インキュベータ顕微鏡内に置いた。経時的蛍光画像を１０分毎に２４時間取り込み、それを使用してリアルタイムでのｉＮＳＣの遊走が明らかになる動画を構築した。（Ｂ）培養０時間および２４時間後における、Ｕ８７−ｍＣＦＬに向かうｈ−ｉＮＳＣ−ＧＦＰＦＬまたはヒト親繊維芽細胞の遊走を示す概略画像である。（Ｃ）２４時間にわたるｈ−ｉＮＳＣ−ＧＦＰＦＬの、ＧＢＭへの指向性がある遊走の経路を示している単一細胞の追跡を示す図である。追加の画像は、ヒト親繊維芽細胞の限定的な遊走を示す。点線は、ＧＢＭ播種の部位を示す。（Ｄ〜Ｆ）リアルタイム運動分析から決定した、ＧＢＭ細胞へのｈ−ｉＮＳＣまたは繊維芽細胞遊走の指向性（Ｄ）、距離（Ｅ）および速度（Ｆ）を示す総括グラフである。（Ｇ〜Ｈ）固形ＧＢＭへのｈ−ｉＮＳＣ遊走を評価するために、Ｕ８７  ＧＢＭスフェロイドを、３次元浮遊系でｈ−ｉＮＳＣと共培養した図である（Ｇ）。蛍光イメージングは、Ｕ８７スフェロイド内へのｈ−ｉＮＳＣ−ＧＦＰＦＬの遊走および腫瘍スフェロイドの中心への経時的侵入を示した（Ｈ）。
【図３】マウス脳に移植したｉＮＳＣのインビボ特徴づけ。（Ａ）未改変ｈ−ｉＮＳＣおよびｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬｕｃを発現するように操作されたｈ−ｉＮＳＣの増殖を示す総括グラフである。（Ｂ〜Ｃ）ｈ−ｉＮＳＣをマウスの前頭葉に移植し、連続生物発光イメージングを使用して３週間にわたってそれらの残存を監視した図である。総括グラフは、ｈ−ｉＮＳＣが徐々に消失するものの、脳内に２５日間残存することを実証した（Ｂ）。脳への移植１４日後におけるｈ−ｉＮＳＣの免疫蛍光分析は、ネスチン＋およびＴｕｊ＋の細胞を示したが、ｈ−ｉＮＳＣと多能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１６０との共局在化は観察されなかった（Ｃ）。
【図４】固形ＧＢＭに対するｈ−ｉＮＳＣ媒介ＴＲＡＩＬ治療。（Ａ〜Ｂ）アポトーシス促進性薬剤であるＴＲＡＩＬを分泌するように操作し、単層（Ａ）でまたは浮動神経幹細胞塊（Ｂ）として成長させたｈ−ｉＮＳＣの成長を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。（Ｃ）１：２または１：２の比で治療用ｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲもしくは対照細胞と混合したｍＣｈｅｒｒｙ＋ヒトＵ８７ＧＢＭスフェロイドの生存率を示す３次元懸濁培養の画像および概要データを示す図である。ＧＢＭスフェロイド生存率を、処置４８時間後にルシフェラーゼイメージングによって決定した。（Ｄ）固形ＧＢＭのｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲ治療を、ＳＣＩＤマウスの脳実質にｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲとＵ８７ＧＢＭ細胞との混合物を異種移植することにより実行した図である。（Ｅ〜Ｆ）対照処置マウスと比較してｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲ治療によって固形Ｕ８７ＧＢＭ進行が阻害されたことを実証している代表的なＢＬＩ画像（Ｅ）および概要データ（Ｆ）を示す図である。（Ｇ）ｈ−ｉＮＳＣ対照と比較してｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲ処置動物における生存の延長を実証しているカプランマイアー曲線を示す図である。（Ｈ）治療後のｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲにおける細胞毒性、分化および多能性マーカーの発現を実証している代表的な画像である。動物のサブセットを治療１４日後に屠殺し、脳切片をネスチン、ＴＲＡＩＬ、ＧＦＡＰ、Ｔｕｊ−１、Ｏｃｔ−４またはＴＲＡ−１６０に対する抗体で染色し、染色とＧＦＰ＋ｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲとの共局在化を可視化した。
【図５】ヒト患者由来ＧＢＭのｈ−ｉＮＳＣプロドラッグ／酵素治療。（Ａ〜Ｄ）ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療の抗腫瘍効果を、異なる２つの３次元培養モデルで決定した図である。ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫを、ＧＦＰ＋ＧＢＭ４患者由来ＧＢＭ細胞と混合（Ａ、Ｂ）または確立したＧＢＭ４スフェロイドに隣接して播種し（Ｃ、Ｄ）、ＧＣＶを添加して腫瘍死滅を開始した。連続蛍光画像は、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ／ＧＣＶ治療によるＧＢＭ４スフェロイド体積の時間依存的な低下を示した。（Ｅ）ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ／ＧＣＶ治療による、７日間にわたるＧＢＭ４スフェロイド体積の減少を実証する総括グラフである。（Ｆ〜Ｊ）ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療について、その１０日前にマウスの脳内に確立したＧＢＭ４腫瘍に対してｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ細胞を注射することによりインビボで評価した図である（Ｆ）。連続ＢＬＩは、ＧＢＭ４腫瘍の進行が、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ／ＧＣＶ治療により有意に阻害されたことを示した（Ｇ）。ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ／ＧＣＶ治療または対照ｈ−ｉＮＳＣで処置したＧＢＭ４腫瘍を持つマウスの生存を実証しているカプラン−マイヤー生存曲線を示す図である（Ｈ）。（Ｉ〜Ｊ）確立したＧＢＭ４腫瘍にｈ−ｉＮＳＣ対照（Ｉ）またはｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ（Ｊ）を送達した２１日後におけるＧＢＭ４体積およびｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ分布を示す、脳全体ならびに高倍率の代表的な画像である。対照処置した動物には大きなＧＢＭ４腫瘍が存在し、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ処置した脳には小さなＧＢＭ４病巣しか検出されなかった。
【図６】外科的に切除したびまん性ＧＢＭの腔内ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療。（Ａ〜Ｃ）３次元懸濁培養を使用して、患者由来ＧＢＭ８スフェロイド（Ａ）に対する合成細胞外マトリックス（ｓＥＣＭ）に封入したｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫの遊走および抗腫瘍有効性を決定した図である。ｓＥＣＭ内に封入したｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫは、マトリックスから遊走し、播種３日後にＧＢＭ８スフェロイドに定着することが判明した図である。ｓＥＣＭ内に封入したｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫが、対照処置スフェロイドと比較してＧＢＭ８スフェロイドの体積を有意に減少させることを実証した代表的な画像および概要データである（Ｃ）。（Ｄ）外科的に切除したＧＢＭの臨床的ｈ−ｉＮＳＣ治療を模倣するために、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫをｓＥＣＭ内に封入し、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬｕｃを発現しているびまん性患者由来ＧＢＭ８腫瘍を切除した後の外科的腔に移植した図である。（Ｅ）術後のわずかなＧＢＭ８腫瘍に対する腔内ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療後の腫瘍再発の有意な阻害を実証している、連続イメージングの代表的な画像および概要データを示す図である。（Ｆ）びまん性ＧＢＭ８患者由来腫瘍細胞の外科的切除を受け、ｓＥＣＭ内に封入し外科的腔に移植した対照ｈ−ｉＮＳＣまたはｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫで処置したマウスのカプラン−マイヤー生存曲線を示す図である。
【図７】フィブリン上の操作されたｈＭＳＣの特徴づけ。（Ａ）フィブリンを使用してＧＢＭ切除腔に薬物放出幹細胞を送達する新規がん治療の略図である。この戦略は、細胞傷害性幹細胞をＴＩＳＳＥＥＬ（登録商標）のフィブリン構成要素と混合することから始まる。ＧＢＭの外科的切除後に、術後腔を、トロンビンの添加によって重合するフィブリン／幹細胞混合物で満たす。フィブリン足場は、腔内に細胞傷害性幹細胞を保持し、治療用幹細胞がＧＢＭ病巣に遊走し、残った腫瘍を根絶することになる殺腫瘍性薬剤を送達できるようになる。（Ｂ）封入された細胞傷害性幹細胞を作製するための、トロンビンの添加によるフィブリンの迅速なゲル化を実証している代表的な白色光画像である。（Ｃ）フィブリン中のｈＭＳＣの成長を経時的に示している蛍光およびＢＬＩを示す代表的な図である。蛍光画像を、１０×で取り込んで細胞形態を描き、２×で取り込んで細胞成長全体を実証する。同時ＢＬＩを実行して細胞体積を検証した。（Ｄ）フィブリンの有り無しで培養したｈＭＳＣ−ｓＴＲの、成長および治療用タンパク質放出速度を比較する要約グラフである。（Ｅ）異なるフィブリンマトリックス中または足場なしで成長させたｈＭＳＣ−ｄｉＴＲにより分泌された細胞傷害性タンパク質のレベルを示す要約データである。「液滴」形成は、フィブリンの液滴中に幹細胞を懸濁し、重合させることにより作製した。「封入したパッチ」は、平板にしたフィブリン液滴中に幹細胞を封入することにより作製した。「表面パッチ」は、平坦化したフィブリン足場の表面に幹細胞を播種することにより作製した。分泌を、播種１、３および６日後に採取した培地サンプルに対するＢＬＩにより決定した。
【図８】フィブリン中のｈＭＳＣの腫瘍指向性遊走。ＧＢＭ細胞へのフィブリン封入された幹細胞の遊走を、経時的運動分析および寒天下共培養系を使用して測定した。（Ａ）共培養戦略の概略画である。ＧＦＰ＋幹細胞をフィブリン中に封入し、寒天充填培養ディッシュの１つのウェルに播種した。ｍＣｈｅｒｒｙ＋Ｕ８７ヒトＧＢＭ細胞を、５００μｍ離れて隣接するウェルに播種した。細胞を、インキュベータ内の蛍光顕微鏡下に置き、画像を１５分毎に６４時間取り込んだ。画像分析ソフトウェアを次いで使用して経時的動画を生成し、単一細胞追跡を実行し、遊走方向、距離および速度を定量化した。イメージング範囲を、青色の点線で描く。（Ｂ）ｈＭＳＣ（緑色）が、フィブリンから遊走し、共培養しているＧＢＭ細胞（赤色）へホーミングすることを示している要約画像である。（Ｃ）経時的にＧＢＭ細胞へホーミングする際のフィブリン足場からのｈＭＳＣの遊走経路を示している単一細胞分析の図である。各線は、１つの細胞の経路を示している。ＧＢＭ細胞不在下で培養した場合のフィブリン中のｈＭＳＣのランダムな動作を示している（Ｄ）蛍光画像および（Ｅ）単一細胞分析を示す図である。（Ｆ）ＧＢＭが存在する場合のフィブリン足場から抜け出たｈＭＳＣの指向性遊走、および、ＧＢＭ細胞が存在しない場合のフィブリンからのｈＭＳＣのランダムな遊走を実証しているロゼッタグラフ（Rosetta graphs）である。（Ｇ）ヒトＧＢＭ細胞の存在下および不在下における、フィブリン中のｈＭＳＣの指向性、距離および速度を示す要約グラフである。全てのパネルにおいて、対照に対して＊Ｐ＜０．０１、および値は、平均±ＳＥＭである。
【図９】フィブリン足場は、術後外科的腔内に移植した細胞傷害性ｈＭＳＣの保持および残存を改善する。（Ａ）直接注射によりまたはフィブリンマトリックス中で移植したｈＭＳＣの術後腔内における保持を実証している要約グラフである。移植２時間後に定量的ＢＬＩにより保持を測定して、ｈＭＳＣ体積を検出した。（Ｂ〜Ｃ）直接注射によりまたはフィブリンマトリックス中で切除腔内に移植したｈＭＳＣの残存を実証している代表的な画像および要約データである。ＢＬＩ画像を、移植０、２、４、７、１０、１４および２１日後に縦方向に取り込んで、移植したｈＭＳＣのレベルを追跡した。（Ｄ）フィブリンまたは直接注射によって切除腔内にｈＭＳＣ−ｍＣＦＬを移植した２１日後の脳のエクスビボ蛍光およびＢＬＩイメージングを示す図である。ｈＭＳＣ−ｍＣＦＬシグナルは、フィブリン移植動物において背面と冠横断面の両方に検出されたが、直接注射脳においてシグナルは全く検出されなかった。（Ｅ〜Ｆ）フィブリン中（Ｅ）または直接注射（Ｆ）による切除腔内への送達後の、脳実質におけるｈＭＳＣ−ｍＣＦＬの存在を示している代表的な蛍光画像である。全脳フォトステッチ画像および１０×画像を示す。＊は、切除腔を示す。矢印は、直接注射脳に存在するｈＭＳＣ−ｍＣＦＬの小さい沈着物を示す。
【図１０】フィブリン中にて送達された治療用ｈＭＳＣの、確立した腫瘍に対する抗腫瘍効果。（Ａ）固形ＧＢＭ処置に対するフィブリン中に封入されたｈＭＳＣ−ｓＴＲの有効性を、３次元ＧＢＭスフェロイドおよび浮遊培養を使用して決定した図である。ｍＣｈｅｒｒｙおよびホタルルシフェラーゼを発現している磁気的に標識したヒトＧＢＭスフェロイドを、フィブリン中に封入した磁気的に標識されたｈＭＳＣ−ｓＴＲまたはｈＭＳＣ−ＧＦＰＲＬと培養した。両方の細胞型を、培養ディッシュの上部に置いた磁石を使用して浮遊させ、腫瘍スフェロイド生存率を、ＦＬｕｃ  ＢＬＩを使用して決定した。（Ｂ〜Ｃ）対照処置スフェロイドと比較した、ｈＭＳＣ−ｓＴＲ／フィブリン処置によるヒトＧＢＭスフェロイドの生存率の有意な減少を実証している代表的な画像および要約グラフである。（Ｄ）確立した腫瘍に対するフィブリンに基づくｈＭＳＣ送達の有効性を決定するために、Ｕ８７−ｍＣＦＬ異種移植片をマウスに作製したことを示す図である。フィブリン中のｈＭＳＣ−ｓＴＲまたは対照ｈＭＳＣ−ＧＦＰＲＬを、各確立した腫瘍の上に外科的に移植した。（Ｅ〜Ｆ）連続生物発光イメージングを使用して、各処置群における成長腫瘍を追跡した図である。有意により小さい腫瘍体積が、複数の時点にわたってｈＭＳＣ−ｓＴＲ処置腫瘍に観察された。全てのパネルにおいて、対照に対して＊Ｐ＜０．０１、および値は、平均±ＳＥＭである。
【図１１】切除腔内に送達されたフィブリン中の細胞傷害性ｈＭＳＣは、術後に残ったＧＢＭの再成長を遅延させる。（Ａ）外科的に切除したＧＢＭに対するフィブリン送達された幹細胞治療の有効性を試験するために、マウスにおいて確立したヒトＵ８７−ＧＢＭを外科的に摘除した事を示す図である。治療用幹細胞を、トロンビンの添加により腔内で重合されるフィブリン中で術後腔に移植した。（Ｂ）前切除ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＧＢＭ、術後ＧＢＭ腔、および切除腔に播種した、フィブリン中のＧＦＰ＋ｈＭＳＣ−ｓＴＲを示している代表的な画像である。点線は切除腔を示す。矢印は残ったＧＢＭ病巣を示す。（Ｃ〜Ｄ）対照処置動物と比較したｈＭＳＣ−ｓＴＲ処置動物におけるＧＢＭ再成長の有意な減少を示している連続ＢＬＩの代表的な画像（Ｃ）および要約グラフ（Ｄ）である。複数の時点にわたって有意により小さい腫瘍体積が、ｈＭＳＣ−ｓＴＲ処置腫瘍において観察された。（Ｅ）ｈＭＳＣ−ｓＴＲ治療または対照ｈＭＳＣ−ＧＦＰＲＬｕｃで処置したＧＢＭを切除した動物の生存を示しているカプラン−マイヤー生存分析を示す図である。生存期間の中央値は、対照処置マウスの１５日間に対してｈＭＳＣ−ｓＴＲ処置動物で３６日間であった。（Ｆ）再発性ＧＢＭ（赤色）のボーダーに沿ったＧＦＰ＋ｈＭＳＣ（緑色）の存在を示している事後組織切片の蛍光画像である。核をヘキスト（青色）で対比染色した。全てのパネルにおいて、対照に対して＊Ｐ＜０．０１、および値は、平均±ＳＥＭである。
【図１２】ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）上にあるヒト神経幹細胞（ＮＳＣ）のインビトロ特徴づけ。（Ａ）ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）上で成長させたヒトＮＳＣの播種０および３日後の白色光および蛍光画像である。（Ｂ）ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）上で成長させたヒトＮＳＣの成長を示している要約データである。（Ｃ）足場に付着させた細胞の分布を決定するための、ヒトＮＳＣ（赤色）が付着したＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）の横断面の蛍光イメージングを示す図である。イメージングは、より多数のＮＳＣが、ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）の境界に付着した（矢印により示す）が、ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）の中心は、少数のＮＳＣしか含有しないことを示した。これらの結果は、ＮＳＣがＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）に付着し、マトリックス中で増殖することを示唆している。
【図１３】インビトロ３次元遊走分析。（Ａ）戦略の略図である。培養プレートを、寒天で満たし、ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＧＢＭ細胞を移植して、３次元腫瘍を作製する。３日後に、腫瘍の一部を除去して、切除腔を模倣する。次いでＧＦＰ＋ＮＳＣを持つＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）を腔内に播種する。（Ｂ）播種１および７日後にゲルを横断面に切断し、蛍光イメージングを使用して、ＧＦＰ＋ＮＳＣとｍＣｈｅｒｒｙ＋ＧＢＭとの共局在化を可視化した図である。７日目の切片において多数のＮＳＣが、ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）足場から遊走し、寒天を通ってＧＢＭ（赤色）に定着したことが判明した。これらの遊走細胞を、矢印で示す。これらの結果は、ＮＳＣが、ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）から遊走し、ＧＢＭ病巣にホーミングできることを示唆している。
【図１４】異なる足場上にある、ＧＢＭ切除腔内に移植したＮＳＣのインビボ残存を示すグラフである。マウスにおいてヒトＵ８７−ＧＢＭ細胞を外科的に切除して切除腔を作製した。ルシフェラーゼ＋ＮＳＣを、ＰＬＡまたはＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）上に播種し、切除腔内に播種した。追加の群においてＮＳＣを懸濁液で直接注射した。連続生物発光イメージングを使用して、外科的切除腔におけるＮＳＣの残存を追尾した。直接注射したＮＳＣは、わずか４日間で消失することが判明した。ＮＳＣは、最初にＰＬＡ上に送達され８日間残存し、ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）上に送達したＮＳＣも最初に増殖し、２１日間を超えて残存した。これらのデータは、ＮＳＣが、ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）足場上でＧＢＭ切除腔内に最も長く残存し、この戦略が、最大の処置持続性を達成する可能性が高くなることを示唆している。
【図１５】ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）足場上のＮＳＣプロドラッグ／酵素治療が、培養においてＧＢＭ細胞を死滅させることを示す図である。ヒトＮＳＣを操作して、チミジンキナーゼを発現させた（ＮＳＣ−ＴＫ）。ＮＳＣ−ＴＫを、ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）に付着させ、ヒトＵ８７−ＧＢＭ細胞との共培養アッセイに播種した。ウェルを、ガンシクロビル（ＧＣＶ）プロドラッグで処置して治療を開始したまたは対照として生理食塩水で処置した。細胞生存率アッセイは、ＧＣＶ処置が、Ｕ８７−ＧＢＭ細胞とＮＳＣ両方の生存率を減少させることを示した。
【図１６】ＮＣＳが、ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）で送達された場合にインビボで４０日間を超えて残存することを示す図である。ＮＳＣの残存（量）が、縦軸である。時間（日）が、横軸である。１．直接注射（溶液中のＮＳＣを注射針で送達した）；２. ＰＬＡ−ナノメートル（ナノメートルエレクトロスピニングされたＰＬＡ上のＮＳＣ）；３. ＰＬＡ−マイクロメーター（厚いマイクロメーターＰＬＡ上のＮＳＣ）；および４．ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）（ＧＥＬＦＯＡＭ［登録商標］上のＮＳＣ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書に引用される特許文献の開示の全ては、本明細書に示される開示と一致する範囲で参照により本明細書に組み込まれる。本明細書では本発明および添付の請求項の説明において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上別途明らかな指示がない限り、複数形も同様に含むものとする。
【００２１】
Ｉ．幹細胞
本発明の方法に有用な幹細胞は、多能性または多分化能幹細胞であることができ、間葉系幹細胞および神経幹細胞を含むが、これに限定されない。
【００２２】
「間葉系幹細胞」は、神経細胞を含めた異なる細胞型に分化することができる多能性細胞である。Ｍｏｌｉｎｏ、米国特許出願公開第２０１２／０１４９０９９号を参照のこと。間葉系幹細胞は、当業者に公知の通り、例えば、骨髄、脂肪組織または末梢血から採取することができる。Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、米国特許第６,２６１,５４９号；Ｈａｎｔａｓｈ、ＰＣＴ公開ＷＯ  ２０１４／１１３７０４を参照のこと。
【００２３】
本明細書で使用される「神経幹細胞」とは、ニューロン、アストロサイトまたはオリゴデンドロサイト等の中枢神経系細胞に分化できる多能性細胞のことを指す。神経幹細胞は、中枢神経系から採取することができ、および／または当業者に公知の方法により産生することができる。例えば、Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５,８５１,８３２号、Ｄａａｄｉら、米国特許第８,３３８,１７６号；Ｃｏｎｔｉら、米国特許第８,７８５,１８７号；Ｂｒｏｄｉｅら、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ  ２０１３／１２４８１６；Ｓｈａｈ、ＷＯ  ２０１４／０３５４７４；Ｓｈａｈ、米国特許出願公開第２０１４／００８６９０７号；およびＬｕら、米国特許出願公開第２０１４／０３０８２５６号を参照のこと、これらはそれぞれ参照により本明細書の一部をなす。神経幹細胞は、本明細書に教示されるように分化転換により産生することもできる。
【００２４】
いくつかの実施形態において、誘導神経幹細胞は、ネスチンを発現し、および／またはＮａｎｏｇもしくはＯＣＴ３／４を発現しない。いくつかの実施形態において、誘導神経幹細胞は、神経／アストロサイト細胞に分化することができる。
【００２５】
「分化転換」または「分化転換する」は、分化した体細胞が、多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）段階を経ることなく異なる系統の分化したまたは中間多能性体細胞に直接変換される方法である。分化転換は、１つまたは複数の分化転換因子に細胞を曝露するおよび／または所望の細胞型への分化転換を促進する培地中で細胞を成長させることによって実施できる。分化転換の監視は、分化した体細胞および／または幹細胞の指標となるマーカー発現を監視する等、当業者に公知の方法を使用して実行できる。
【００２６】
分化した体細胞は、組織、体液（例えば、血液、尿）等、任意の利用しやすい供給源から採取することができる。いくつかの実施形態において、体細胞は皮膚繊維芽細胞等の繊維芽細胞である。例えば、皮膚細胞は、例えば同時に行う外科的手順の間に術創の縁から、または独立した手順である伝統的な皮膚パンチを使用して採取することができる。皮膚細胞は、頭皮または前腕由来の収集を含むがこれに限定されない任意の領域から採取することができる。
【００２７】
本明細書に教示されるいくつかの実施形態において、分化転換は、１、２もしくは３〜８、９もしくは１０日間、１、２もしくは４〜５、６もしくは７日間、１もしくは２〜３もしくは４日間、または１２〜２４、４８もしくは７２時間実施される。
【００２８】
本明細書では「分化転換因子」は、ある体細胞型の、別の型への直接変換を促進する転写因子等のタンパク質である。例としては、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１ｌ、Ｏｌｉｇ２、Ｚｉｃ１等があるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、分化転換の方法は、分化転換因子を１つだけ使用する単一因子分化転換である。
【００２９】
「Ｓｏｘ２」は、転写因子であるＳｏｘファミリーのメンバーであり、神経管内の発達細胞および中枢神経系の増殖性前駆細胞において発現される。いくつかの実施形態において、Ｓｏｘ２は、教示される方法において分化転換因子として使用される。いくつかの実施形態において、Ｓｏｘ２を使用して、単一因子分化転換が実施される。
【００３０】
「ネスチン」は、中枢神経系の幹細胞において顕著に発現し、その発現は、分化した中枢神経細胞には一般に存在しない。「ＧＦＡＰ」または「グリア線維性酸性タンパク質」は、アストロサイトを含めた中枢神経系細胞により発現される中間フィラメントタンパク質である。「Ｔｕｊ−１」または「βＩＩＩチューブリン」は、神経マーカーである。
【００３１】
「Ｎａｎｏｇ」および「ＯＣＴ３／４」は、公知の幹細胞マーカーである。
【００３２】
本明細書に教示されるいくつかの実施形態において、分化転換は、フィーダー細胞を使用せずに、例えば神経前駆培地中で実施される。当業者に公知の通り、フィーダー細胞とは、しばしば細胞成長を支持するための層（例えば、培養ディッシュ上のマウス繊維芽細胞層）として同じ培養ディッシュまたは容器内で成長される追加の細胞である。
【００３３】
本明細書において、「神経前駆細胞用培地」は、神経幹細胞（「誘導」神経幹細胞）への体細胞の分化転換（ＴＤ）を促進する１または複数の培地である。いくつかの実施形態において、神経前駆細胞用培地は、成長促進因子および／または栄養混合物を含有する細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＭＥＭ／Ｄ−バリン、ニューロベーサル培地等、その混合物を含める）；ホルモン類、タンパク質、ビタミンおよび／またはアミノ酸を含有する培地補助剤（例えば、Ｎ２補助剤、Ｂ２７補助剤、非必須アミノ酸［ＮＥＡＡ］、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＢＳＡ、インスリン、全てのトランスレチノイン酸等、その混合物を含める）；ならびに任意選択で小分子阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２［ＢＭＰ阻害剤］、ＬＤＮ１９３１８９［ＴＧＦ−β１阻害剤］、ＣＨＩＲ９９０２１［ＧＳＫ３β阻害剤］等、その混合物を含める）から選択される成分の１つまたは複数を含む。成分は、β−メルカプトエタノール、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、およびｃＡＭＰのうちの１つまたは複数を含むこともできる。これら成分のそれぞれの適当な濃度は、当業技術者に公知であり、および／または経験的に決定することができる。成分の濃度例は、以下の実施例２においても提供される。いくつかの実施形態において、神経前駆細胞用培地は、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）  Ｎｅｕｒａｌ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ［商標］  Ｔｅｃｈｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ、カナダ）等、あらかじめ作製された培地である。
【００３４】
いくつかの実施形態において、幹細胞にＴＥＲＴ（テロメラーゼ逆転写酵素）を導入して、その寿命を促進し、および／または細胞培養により、増殖による拡大を受ける能力を強化する。いくつかの実施形態において、ＴＥＲＴは、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（「ｈＴＥＲＴ」）である。
【００３５】
いくつかの実施形態において、幹細胞に、治療薬、レポータ分子、および／または同じものを発現できる核酸を導入する（すなわち、含有させる）。いくつかの実施形態において、治療薬は、タンパク質毒素（例えば、細菌エンドトキシンまたは外毒素）、腫瘍溶解性ウイルス（例えば、条件付きで複製可能な腫瘍溶解性アデノウイルス、レオウイルス、麻疹、単純ヘルペスウイルス［例えば、ＨＳＶ１７１６］、ニューカッスル病ウイルス、ワクシニア等）またはアポトーシス促進性薬剤（例えば、分泌可能な腫瘍壊死因子［ＴＮＦ］関連アポトーシス誘導リガンド［Ｓ−ＴＲＡＩＬ］）である。例えば、Ｓｈａｈら、ＷＯ  ２０１４／０１８１１３；Ｍａｒｔｕｚａら、ＷＯ  ２００９／１４８４８８；Ｓｕｂｂｉａｈら、米国特許出願公開第２００９／０１７５８２６号を参照のこと。
【００３６】
いくつかの実施形態において、治療薬はインターロイキン、サイトカインまたは抗体等の炎症誘発性タンパク質である。
【００３７】
いくつかの実施形態において、治療薬は、酵素／プロドラッグ治療に有用な酵素（例えば、チミジンキナーゼ［例えば、ガンシクロビルと］、カルボキシルエステラーゼ［例えば、ＣＴＰ−１１と］、シトシンデアミナーゼ等）である。
【００３８】
いくつかの実施形態において、治療薬は、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉ分子である。
【００３９】
いくつかの実施形態において、神経幹細胞に、ナノ粒子／薬物コンジュゲートが導入される。
【００４０】
レポータ分子は当業者に公知であり、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子があるが、これに限定されない。例えば、Ｐｏｍｐｅｒら、米国特許出願公開第２０１３／０２６３２９６号を参照のこと。
【００４１】
幹細胞への導入は、細胞に、治療用またはレポータタンパク質を産生できる核酸をトランスフェクトする、細胞にウイルスベクターを形質導入する、細胞に治療薬および／またはレポータ分子を脂質に基づいてもしくはポリマーによって導入する等、当業者に公知の方法を使用して達成することができる。
【００４２】
「トランスフェクトする」は、細胞への異種遺伝物質の移入であり、しばしばベクター（すなわち、別の細胞へ外来遺伝物質を運ぶ媒体として使用される分子）を使用することによる。真核細胞にトランスフェクトする方法は公知であり、エレクトロポレーション、陽イオン性リポソームに基づく試薬の使用、ナノ粒子ポリマーリポソーム等があり得るが、これに限定されない。
【００４３】
「形質導入する」は、ウイルスによる細胞への異種遺伝物質の移入である。そのようなウイルスベクターは公知であり、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター等があり得るが、これに限定されない。
【００４４】
いくつかの実施形態において、治療薬を産生できる核酸および分化転換因子をコードしている核酸が、同じベクター上に提供される。
【００４５】
ＩＩ．送達媒体および使用の方法
本明細書では、「送達媒体」または「足場」とは、本明細書に教示される処置の方法において本明細書に教示される幹細胞を導入または組み込んで送達することができる基質のことである。
【００４６】
足場が組織化された組織の構造部分になる多くの再生医学適用とは対照的に、本発明の足場は、幹細胞が、損傷細胞からの毒性を最小化し、作用部位、特に繊細な中枢神経系におけるその効力を有効にするのに充分な数および生存率を保ちながら、足場から離れてがんまたは損傷組織の方へ遊走できるようにすべきである。
【００４７】
例えば、いくつかの再生医学適用において、細胞は、患者の生命のために残存し、移植部位にとどまって損傷領域を再生しなければならず、一般に薬剤を放出するようには操作されておらず、および／または適当な分化の鍵（ｃｕｅ）を利用して標的組織を形成する。一方、薬物送達適用において、細胞残存は、腫瘍根絶と適合させることができ、細胞は、足場から効率的に遊走して、侵襲性がん病巣を追跡しなければならず、細胞は、細胞毒性物質を放出して腫瘍を死滅させることができ、および／または非遊走性細胞型への分化は、望ましくない。
【００４８】
本明細書では「処置する」または「処置」とは、がん、神経変性障害または神経外傷等の疾患もしくは障害に罹患した患者に、患者の状態（例えば、１つまたは複数の症状）の改善、疾患の進行の遅延、疾患の出現または再発の遅延等を含めた利益をもたらす任意の型の処置のことを指す。
【００４９】
本発明は、主にヒト対象の処置に関するが、本発明は、動物対象、特に獣医学的目的、ならびに薬物スクリーニングおよび／または薬物開発目的のためにマウス、ラット、イヌ、ネコ、家畜およびウマ等の哺乳動物対象に実施することもできる。対象は、乳幼児、若年、青年、成人および老人対象を含めた任意の年齢であり得る。いくつかの実施形態において、幹細胞は、対象にとって同種異系または自己由来である。
【００５０】
処置しようとするがんには、脳がんが含まれ、脳がんは原発性であっても続発性であってもよい。「原発性脳がん」は、中枢神経系細胞の頭蓋内がんである。脳がんのタイプには、膠腫（例えば、膠芽腫または多形膠芽腫［ＧＢＭ］）、髄膜腫、髄芽腫、下垂体腺腫および神経鞘腫瘍がある。「続発性脳がん」は、身体の他の領域から転移した細胞、例えば、乳がん、黒色腫、肺がん、前立腺がん等を含む中枢神経系に位置するがんである。
【００５１】
送達媒体または足場の投与は、当業者に公知の方法を使用して実行できる。例えば、細胞の頭蓋内投与、好ましくは腫瘍内投与を脳がんの処置に実行することができ、または脳腫瘍の少なくとも一部の外科的除去後に腔内投与を実行することができる。
【００５２】
いくつかの実施形態において、幹細胞は、処置しようとする対象にとって自己由来であり、投与は、自己由来体細胞を分化転換した１、２、３もしくは４〜７、１０、１４または２１日後に実施される。
【００５３】
いくつかの実施形態において、細胞は、ヒドロゲルマトリックス（例えば、合成細胞外マトリックス）等のマトリックスに封入される、および／または足場上に播種され、その後その細胞を、例えば頭蓋内に投与または移植することができる。例えば、Ｓｈａｈ、ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ  ２０１４／０３５４７４；Ｓｈａｈ、米国特許出願公開第２０１４／００８６９０７号を参照のこと、それぞれ参照により本明細書の一部をなす。
【００５４】
いくつかの実施形態において、足場は、「柔軟」であり、投与の前またはその間に操作して、細胞の積荷が送達される腫瘍切除腔の壁等の領域に足場を適合させることができる。「柔軟」とは、足場が、足場の構造的完全性を失うことなく容易に曲げられる、および／または可鍛性があることを意味する。柔軟な足場は、投与後の足場の再構築も可能にし得る。
【００５５】
いくつかの実施形態において、平均した足場の厚さは、ナノメートル、マイクロメートルまたはミリメートル範囲である。いくつかの実施形態において、足場は、切除腔の壁の内側を覆うように構成される。いくつかの実施形態において、足場は、がんまたは損傷組織の方向への幹細胞の運動を促進するために、隆起、通路および／もしくは整列した線維を有する。
【００５６】
好ましくは、送達媒体は生体適合性であり、いくつかの実施形態において、送達媒体は生分解性および／または生体吸収性である。本明細書で使用される、「生体適合性」とは、投与した際に対象に対して過度に反応性または有害でない材料のことを指す。本明細書で使用される「生分解性」とは、対象に投与した際にインビボで分解される材料の能力のことを指す。本明細書で使用される「生体吸収性」とは、生組織内に吸収され得ることを意味する。生体吸収性材料の例には、ポリアニオン系多糖類（例えば、ヒアルロン酸［ＨＡ］、カルボキシメチルセルロース［ＣＭＣ］、カルボキシメチルアミロース［ＣＭＡ］、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、デルマタン−６−硫酸およびその組み合わせ）、アルギン酸、キチン、キトサン、フィブリン、デキストラン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（Ｄ）乳酸、ポリグリコール乳酸、ケラチン、ラミニン、エラスチン、コラーゲンおよび他の天然に存在する細胞外マトリックスタンパク質、ゼラチン、ポリジオキサノン、ポリカプロラクトン、ならびにその混成物およびコポリマー等の生体吸収性ポリマーがあるが、これに限定されない。例えば、Ｄａｇｇｅｒら、米国特許出願公開第２００９／０１０５６７１号；Ｌｅｌｋｅｓら、米国特許第８,０４８,４４６号を参照のこと。
【００５７】
いくつかの実施形態において、送達媒体は、エレクトロスピニングされた足場を含む。材料は、当業技術者に公知の方法でエレクトロスピニングすることができる。例えば、それらは、ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトニトリル、メタノール、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサフルオロイソプロパノールおよびジメチルスルホキシド等の適当な溶媒を、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ素酸カリウム、リン酸カリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムおよび乳酸カルシウム等の適当な添加物と共に液状またはナノ粒子形態で、ならびにエレクトロスピニング形式に組み込むことができる当業者に公知の他の任意の添加物、溶媒、ポリマー、生物活性物質、医薬品、金属、金属酸化物または細胞もしくは細胞構成要素と共に使用する溶媒紡糸することができる。
【００５８】
送達媒体には、ポリ（エステルウレタン）尿素（ＰＥＵＵ）、ポリ（エーテルエステルウレタン）尿素（ＰＥＥＵＵ）、ポリ（エステル炭酸塩）ウレタン尿素（ＰＥＣＵＵ）およびポリ（炭酸塩）ウレタン尿素（ＰＣＵＵ）等の湿式電着される生分解性、エラストマー性ポリマーのマトリックスもあり得る。Ｈｏｎｇら、米国特許出願公開第２０１４／０３７７２１３号を参照のこと。
【００５９】
いくつかの実施形態において、細胞はフィブリン糊中に提供される。フィブリン糊は公知であり、フィブリノゲンとトロンビンの混合により形成される。例えば、Ｇｒｅｅｎａｗａｌｔら、米国特許第６,０５６,９７０号；Ｗｈｉｔｍｏｒｅら、米国特許第６,６９９,４８４号；Ｗａｎｇら、米国特許出願公開第２０１１／０２９６５４２号を参照のこと。
【００６０】
いくつかの実施形態において、細胞は、例えば、脳腫瘍の少なくとも一部の外科的除去後の外科壁への投与と同時にフィブリノゲンおよびトロンビンと混合される。
【００６１】
フィブリンは、創傷治癒において足場を形成して、細胞付着を促進する天然の生物ポリマーである。Ｗｅｉｓｅｌ、「Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｉｎ．」  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７０、２４７〜２９９頁（２００５年）を参照のこと。細胞外マトリックスをゆっくり形成するのとは異なり、フィブリン足場は、フィブリノゲンとトロンビンの組み合わせにより、活性化トロンビンによるフィブリノゲンポリペプチドの切断の結果３次元分枝線維へと迅速に会合する。
【００６２】
いくつかの実施形態において、迅速に重合するマトリックスは、外科的時間を短縮することおよび足場ゲル化の間に外科的腔から幹細胞が物理的に流失する危険性を排除することの両方で好ましい。いくつかの実施形態において、ゲル化時間は、２０、１５、１０、５、２または１分間未満である。
【００６３】
好ましい実施形態において、マトリックス材料は、免疫反応を防止するために生体適合性であり、腔内における治療用幹細胞の永続的な構造支持を提供するために生物学的に安定である。材料は、外科的腔内での幹細胞の保持を支持し、細胞傷害性幹細胞から放出される治療薬が、マトリックスを透過し、がん性細胞の死滅を誘導できるようにするべきである。マトリックス材料はまた、マトリックスからがん性細胞への幹細胞の遊走を過度に遅らせるべきでない。
【００６４】
いくつかの実施形態において、送達媒体は、生体吸収性フィブリン材料（例えば、ＴＩＳＳＥＥＬ［登録商標］フィブリンシーラント）である。フィブリンは、機械的剛性が低いので構造に容易に適合させることができる。Ｊａｎｍｅｙら、「Ｔｈｅ  ｈａｒｄ  ｌｉｆｅ  ｏｆ  ｓｏｆｔ  ｃｅｌｌｓ．」  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  ６６、５９７〜６０５頁（２００９年）を参照のこと。フィブリンは、迅速なゲル化時間も有し、数秒間以内および細胞が洗い流されるまたは切除腔壁の垂直面から失われ得る前にマトリックス中に細胞を補足することができる。Ｒｏｗｅら、「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｓｅｅｄｅｄ  ｆｉｂｒｉｎ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．」  Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  ３、５９〜６７頁（２００７）を参照のこと。フィブリンは、重合に影響を及ぼすことなく細胞を大量に封入することもできる。タンパク質マトリックスであるフィブリンゲルは、身体の天然の消失機構により分解され、非毒性分解産物を作製する。またフィブリン足場の止血機能は、外科的切除腔におけるどんな術後出血の管理にも役立ち得る。
【００６５】
いくつかの実施形態において、送達媒体は、生体吸収性の架橋されたゼラチンスポンジ材料（例えばＧＥＬＦＯＡＭ［登録商標］吸収性ゼラチン圧縮スポンジ）である。ゼラチンスポンジは、ゼラチンの溶液を発泡させ、通常凍結乾燥により気泡を乾燥させることにより作製することができる。スポンジのゼラチンを架橋して、インビボでの構造的完全性を維持する。架橋の方法には、化学架橋剤、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、カルボジイミド（例えば、ＥＤＣ）等によるスポンジの処理および／または乾熱による乾燥スポンジの熱処理（例えば、１００〜１６０℃で数時間）があり得る。例えば、Ｓｏｎｇら、米国特許第５,５１２,３０１号；Ｎｕｒら、米国特許第８,４７５,８１２号を参照のこと。
【００６６】
好ましくは、送達媒体は、処置の領域内にある細胞の生存率および／または増殖能を維持し（「残存」）、送達媒体は、生分解性および／または生体吸収性であり得るが、足場から離れる細胞遊走を、少なくとも５日間、少なくとも８日間、少なくとも１０日間、少なくとも１２日間、少なくとも１５日間、少なくとも１８日間、少なくとも２０日間、少なくとも２５日間、少なくとも３０日間、少なくとも３５日間、少なくとも４０日間、少なくとも４５日間またはより長期間可能にする。
【００６７】
本発明は、以下の非限定的な例においてより詳細に説明される。
【実施例】
【００６８】
［実施例１：ヒト皮膚細胞の迅速な分化転換］
ヒト皮膚からｈ−ｉＮＳＣを迅速に生成する能力により、がんを処置するための患者特異的治療が可能になり得る。他の細胞再プログラム戦略よりもｉＮＳＣ生成の効率が有意に高く、このことは、多数のｈ−ｉＮＳＣを少量の皮膚から生成できることを示唆している。患者特異的派生物は、免疫拒絶を回避して、腫瘍死滅を最大化し、処置を持続させることができる。
【００６９】
急速進行性がんの患者を処置するには、細胞ベースの薬物担体は速やかに生成されなければならず、ｈ−ｉＮＳＣは数週間で作製することができる。また、ｉＰＳＣとは異なり、ｈ−ｉＮＳＣは、移植後に奇形腫を形成しない。
【００７０】
本研究において、ＴＤ由来ｈ−ｉＮＳＣ治療の潜在性を、ヒト患者に対する自己由来ＧＢＭ治療として調査した。これらの方法は、これまでの方法より６倍速くヒト皮膚をｈ−ｉＮＳＣに変換することができ、時間は、ＧＢＭ患者治療にとって優先事項であることから、これは重要である。この戦略を使用して、細胞毒性物質および光学的レポータで操作した第１のｈ−ｉＮＳＣを作製した。リアルタイム分子イメージング、３次元細胞培養および複数のヒトＧＢＭ異種移植片モデルの組み合わせを使用して、固形ならびに外科的に切除したＧＢＭに対するｈ−ｉＮＳＣ治療の運命、腫瘍特異的ホーミングおよび有効性を調査した。
【００７１】
［材料および方法］
＜細胞株＞
Ｕ８７、ＧＢＭ８、ＧＢＭ４、２９３Ｔおよびヒト繊維芽細胞（ＣＣＤ−１０９９Ｓｋ、他）を、これまでに記載されている通り成長させた（Ｈｉｎｇｔｇｅｎら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２８、８３２〜８４１頁、２０１０年；Ｗａｋｉｍｏｔｏら、Ｃａｎｓｅｒ  Ｒｅｓ  ６９、３４７２〜３４８１頁、２００９年）。ｈＴＥＲＴおよびＳｏｘ２をコードしているレンチウイルスベクター（ＬＶ）を、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。全てのｃＤＮＡは、テトラサイクリンプロモーターの制御下にあった。
【００７２】
ヒトｉＮＳＣ（ｈ−ｉＮＳＣ）を、単一因子Ｓｏｘ２、およびフィーダーを含まない方法にしたがって生成した。簡潔には、ヒト繊維芽細胞２０００００個を６ウェルプレートに播種し、硫酸プロタミン（５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を含有する培地中にｈＴＥＲＴおよびＳｏｘ２を含有するＬＶカクテルを形質導入した。感染２日後に、培地を、ドキシサイクリン（１０μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を含有するＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）  Ｎｅｕｒａｌ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、カナダ）と交換した。培地を、３日毎に交換した。神経幹細胞塊形成を、低付着性フラスコ内での培養により誘導した。
【００７３】
＜レンチウイルスベクター＞
再プログラムベクターに加えて、レンチウイルスベクター：ＬＶ−ＧＦＰ−ＦＬ、ＬＶ−ＧＦＰ−ＲＬｕｃ、ＬＶ−ｍＣ−ＦＬ、ＬＶ−ｓＴＲ、ＬＶ−ｄｉＴＲおよびＬＶ−ｍＲＦＰ−ｈＲＬｕｃ−ｔｔｋを、本研究に使用した。ＧＦＰ−ＲＬｕｃおよびＧＦＰ−ＦＬを、ルシフェラーゼ−ｐｃＤＮＡ３およびｐＡＣ−ｈＲｌｕｃ（Ａｄｄｇｅｎｅ）ベクターを使用してウミシイタケルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼをコードしているｃＤＮＡを増幅することにより、それぞれ構築した。制限部位をプライマーに組み込み、得られた断片をＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩで消化し、ＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ消化したｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）にフレームを一致させてライゲートした。ＧＦＰ−ＦＬまたはＧＦＰ−ＲＬｕｃ断片をＡｇｅＩ（平滑化）およびＳａｌＩで消化し、ＢａｍＨＩ（平滑化）およびＸｈｏＩで消化したｐＴＫ４０２（Ｔａｌ  Ｋａｆｒｉ博士、ＵＮＣ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｃｅｎｔｅｒ、により提供された）にライゲートして、ＬＶ−ＧＦＰＦＬまたはＬＶ−ＧＦＰ−ＲＬｕｃを作製した。同様に、ｍＣＦＬを、ルシフェラーゼ−ｐｃＤＮＡ３からホタルルシフェラーゼをコードしているｃＤＮＡを増幅し、ＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ消化したｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にライゲートし、平滑／ＸｈｏＩ部位を使用してｐＴＫ４０２  ＬＶ骨格にｍＣ−ＦＬ断片をライゲートすることにより作製した。ＬＶ−ｓＴＲおよびＬＶ−ｄｉＴＲを作製するために、ｓＴＲまたはｄｉＴＲをコードしているｃＤＮＡ配列を、注文合成したオリゴヌクレオチド鋳型（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してＰＣＲ増幅した。制限部位をプライマーに組み込み、得られた断片をＢａｍＨ１およびＸｈｏＩで消化し、ＢａｍＨ１／ＸｈｏＩ消化したｐＬＶＸプラスミドにフレームを一致させてライゲートした。ＬＶ−ｓＴＲとＬＶ−ｄｉＴＲの両方は、骨格中にＩＲＥＳ−ＧＦＰ（内部リボソーム侵入部位−緑色蛍光タンパク質）エレメントおよびＣＭＶ駆動されるピューロマイシンエレメントを有する。全てのＬＶ構築物を、これまでに記述されている通りヘルパーウイルスを含まないパッケージング系（Ｓｅｎａ−Ｅｓｔｅｖｅｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １２２、１３１〜１３９頁、２００４年）を使用して２９３Ｔ細胞にＬＶベクターとしてパッケージングした。ｈ−ｉＮＳＣおよびＧＢＭ細胞を、５μｇ／ｍＬ硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ）を含有する培養培地中でビリオンをインキュベートすることにより様々な感染多重度（ＭＯＩ）で、ＬＶを形質導入し、細胞を、蛍光顕微鏡により蛍光タンパク質発現について可視化した。
【００７４】
＜細胞生存率および継代数＞
改変したならびに未改変のｈ−ｉＮＳＣの増殖および継代数を評価するために、ＧＦＰ−ＦＬ、ｓＴＲを発現しているｈ−ｉＮＳＣまたは未改変の細胞を、９６ウェルプレートに播種した。細胞生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して播種２、３、４、５、８および１０日後に評価した。最大継代数を、ｉＮＳＣ、ｉＮＳＣ−ｓＴＲまたはＷＴ−ＮＳＣが、形態、成長速度もしくは形質導入効率を変えずに二次培養された回数を監視することにより評価した。
【００７５】
＜免疫組織化学およびインビトロ分化＞
ｈ−ｉＮＳＣ分化に対するＬＶ導入の効果を決定するために、ｈ−ｉＮＳＣをＬＶ−ＧＦＰ−ＦＬまたはＬＶ−ｓＴＲを形質導入した。改変したまたは未改変の細胞を固定し、透過化処理し、抗ネスチンポリクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ３５３、１：５００、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）と１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、適当な二次抗体（Ｂｉｏｔｉｕｍ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）と１時間インキュベートした。細胞を、その後洗浄し、封入し、蛍光共焦点顕微鏡を使用して撮像した。分化の場合、改変操作したまたは形質導入していないｈ−ｉＮＳＣを、ドキシサイクリン、ＥＧＦおよびＦＧＦを除いたＮ３培地中で１２日間培養した。細胞を、ネスチン、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ３４０５、１：２５０）、またはＴｕｊ−１（Ｓｉｇｍａ、Ｔ８５７８、１：１０００）に対して作った抗体でその後染色し、適当な二次抗体（Ｂｉｏｔｉｕｍ）で検出した。核を、ヘキスト３３３４２で対比染色し、結果を、ＦＶ１２００レーザー共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）を使用して分析した。
【００７６】
＜３次元組織培養＞
３次元浮遊細胞培養は、Ｂｉｏ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  Ｋｉｔ（Ｎａｎｏ３Ｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）を使用して行われた。コンフルエント状態のＧＢＭまたはｈ−ｉＮＳＣの６ウェルプレートを、磁気ナノ粒子アセンブリ（８μＬｃｍ−２細胞培養表面積または５０μＬｍＬ−１培地、ＮａｎｏＳｈｕｔｔｌｅ［ＮＳ］、Ｎａｎｏ３Ｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに終夜インキュベーションして、ナノ粒子に細胞を結合させた。ＮＳを、酸化鉄および細胞取り込みを促進するためのポリ−ｌ−リシンと架橋した金ナノ粒子を混合することにより製作した。（Ｓｏｕｚａ，Ｇ．Ｒ．ら  「Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｅｖｉｔａｔｉｏｎ」  Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５、２９１頁、２０１０年）。処理したＧＢＭおよびｈ−ｉＮＳＣを、その後トリプシンで分離し、再懸濁し、培地２ｍＬを含む超低付着６ウェルプレート中で異なる比（１：１および１：０．５）で混合した。６ウェルプレートおよびプラスチック中蓋インサート用に設計した磁界強度５０Ｇを持つ６個のネオジム磁石の磁気駆動体をウェルプレートの上に置いて、気相液相界面に細胞を浮遊させた。４μｇ／ｍＬのＧＣＶを含有する培地を、ＧＢＭとｔｔｋを発現しているｈ−ｉＮＳＣとの共培養に添加した。蛍光画像を経時的に撮影して、両方の集団（あらかじめ、異なる蛍光で標識した）の細胞生存率を追跡した。３次元細胞培養のＢＬＩの場合、Ｆｌｕｃ基質貯蔵試薬１００μＬ／ウェルを培地に添加し、ＩＶＩＳ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して５分間の取り込み時間で撮像した。画像を処理し、光子放射を、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して定量化した。
【００７７】
＜リアルタイムイメージングおよび運動分析＞
遊走を、新規の２次元および３次元培養系で評価した。
【００７８】
＜２次元遊走＞
ＲＦＰを発現しているｈ−ｉＮＳＣを、２チャンバー細胞カルチャーインサート（ｉｂｉｄｉ、Ｖｅｒｏｎａ、ＷＩ、ＵＳＡ）を使用してガラスボトムマイクロウェルディッシュ（ＭａｔＴｅｋ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）中のマイクロカルチャーインサートに播種した。ＧＦＰを発現しているＵ８７膠腫細胞を隣接するウェル（０．５ｍｍ距離間隔）に平板培養したか、またはウェルを空のままにした。平板培養の２４時間後に、細胞をＶｉｖａＶｉｅｗ生細胞イメージングシステム（Ｏｌｙｍｐｕｓ）内に置き、平衡化させた。インサートを取り外し、細胞を、３つの独立した実験においてウェル当たり６箇所で（充分な細胞数を監視するため）、１０×倍率で２０分毎に３６時間撮像した。ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅをその後使用して動画を生成し、両方で遊走速度、遊走した総距離、および遊走の指向性を決定した。
【００７９】
＜３次元遊走＞
ＧＢＭスフェロイドへのｈ−ｉＮＳＣ遊走を、上記の浮遊培養を使用してｈ−ｉＮＳＣおよびＧＢＭスフェロイドを作製することにより３次元培養系で評価した。ｈ−ｉＮＳＣおよびＧＢＭスフェロイドを、浮遊系で共培養した。リアルタイムイメージングを実行して、浮遊培養でのｈ−ｉＮＳＣによるＧＢＭスフェロイドの侵入を可視化した。
【００８０】
＜共培養生存率アッセイ＞
ｓＴＲまたは対照ＧＦＰ−ＲＬを発現しているｍＮＳＣ（５×１０３個）を、９６ウェルプレートに播種した。２４時間後に、Ｕ８７−ｍＣ−ＦＬ、ＬＮ１８−ｍＣ−ＦＬまたはＧＢＭ８−ｍＣ−ＦＬヒトＧＢＭ細胞（５×１０３個）を、ウェルに播種し、ＧＢＭ細胞生存率を、定量的インビトロ生物発光イメージングにより２４時間後に測定した。また、ＧＢＭ細胞を、カスパーゼ３／７で活性化可能なケージドＤＥＶＤ−アミノルシフェリン（カスパーゼ−Ｇｌｏ  ３／７、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）により、１８時間の時点でのカスパーゼ３／７活性について評価した。
【００８１】
＜インビボでのｈ−ｉＮＳＣ生存および運命＞
インビボでのｈ−ｉＮＳＣの生存を決定するために、ｍＣｈｅｒｒｙＦＬを発現しているｈ−ｉＮＳＣ（７．５×１０６個細胞／マウス）をＰＢＳに懸濁し、マウスの右前頭葉において定位に移植した（ｎ＝７）。ｈ−ｉＮＳＣ生存を、２０日間実行した連続生物発光イメージングによって決定した。細胞の解像度でｈ−ｉＮＳＣの運命を決定するために、動物を移植２１日後に屠殺し、脳を摘出し、切片にした。組織切片を、ネスチン、ＧＦＡＰ、Ｔｕｊ−１、Ｏｃｔ−４およびＴＲＡ−１６０に対する抗体で染色し、ＣＦ（商標）４８８で標識した二次抗体を使用して可視化した。
【００８２】
＜共培養生存率アッセイ＞
３次元浮遊培養を、３つの別々のインビトロ細胞毒性研究に使用した。２つの異なる細胞毒性物質を発現しているｈ−ｉＮＳＣを使用して、確立したＧＢＭ細胞株（Ｕ８７）１つと、患者由来のＧＢＭ株（ＧＢＭ４、ＧＢＭ８）２つを処置した。１）ＴＲＡＩＬ治療の細胞毒性を決定するために、ｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲまたはｈ−ｉＮＳＣ−ｍＣｈｅｒｒｙのスフェロイドを、ｉＮＳＣ：ＧＢＭ比＝１：２または１：１で、Ｕ８７−ＧＦＰ−ＦＬｕｃスフェロイドと浮遊状態で共培養した。ＧＢＭスフェロイドの生存率を、ＦＬｕｃイメージングにより４８時間後に決定した。２）患者由来ＧＢＭに対するプロドラッグ酵素治療の細胞毒性を決定するために、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫスフェロイドを、患者由来ＧＢＭ４−ＧＦＰ−ＦＬｕｃスフェロイドと浮遊状態で共培養、またはスフェロイド形成前にＧＢＭ細胞と混合した。スフェロイドを、ガンシクロビル（ＧＣＶ）の存在下または不在下で培養し、ＧＢＭスフェロイド生存率を、ＦＬｕｃイメージングによりプロドラッグ添加０、２、４または７日後に決定した。３）ｓＥＣＭに封入されたｉＮＳＣプロドラッグ／酵素治療の細胞毒性を決定するために、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫをｓＥＣＭ内に封入し、患者由来ＧＢＭ８−ＧＦＰ−ＦＬｕｃスフェロイドと共に浮遊培養系に置いた。生存率を、ＦＬｕｃイメージングにより決定した。
【００８３】
＜インビボでのｈ−ｉＮＳＣ治療の抗ＧＢＭ有効性＞
異なる３つの異種移植片研究を実行して、ｈ−ｉＮＳＣ治療の抗ＧＢＭ効果を評価した。ｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲおよびｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療を、固形（Ｕ８７）、患者由来のびまん性（ＧＢＭ８）、および外科的に切除した患者由来（ＧＢＭ４）異種移植片モデルに対して試験した。
【００８４】
１）固形ヒトＵ８７腫瘍に対するｈ−ｉＮＳＣ−ＴＲＡＩＬの治療効果を決定するために、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＲＡＩＬまたはｉＮＳＣ−ＧＦＰ−ＲＬｕｃ（７．５×１０５個細胞／マウス）の組み合わせを、Ｕ８７−ｍＣ−ＦＬ細胞（１×１０６個細胞／マウス）と一緒にマウスの右前頭葉において定位に移植した（ｎ＝７）。治療応答を、前述の通りＦＬ生物発光イメージングで腫瘍体積を追跡することによりその後決定した。簡潔には、マウスにＤ−ルシフェリン（生理食塩水１５０μＬ中に４．５ｍｇ／マウス）を腹腔内注射し、５分後に光子放射を、ＩＶＩＳ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して５分間の取り込み時間で決定した。画像を処理し、光子放射を、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して定量化した。更に、マウスを、生存について経時的に追跡した。
【００８５】
２）侵襲性の患者由来ＧＢＭに対するｈ−ｉＮＳＣプロドラッグ／酵素治療の有効性を調査するために、マウスに、ｍＣ−ＦＬを発現しているＧＢＭ８細胞（１．５×１０５個細胞／マウス）を右前頭葉において定位に移植した。３日後に、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ（ｎ＝７、７．５×１０５個細胞／マウス）またはｈ−ｉＮＳＣ−ｍＲＦＰ−ｈＲＬｕｃ（ｎ＝７、７．５×１０５個細胞／マウス）を、腫瘍移植部位に移植した。ＧＣＶを、１００ｍｇ／ｋｇの用量で２週間毎日腹腔内に注射した。腫瘍体積の変化を、上記の通りＦＬｕｃイメージングにより評価し、マウスを生存について経時的に追跡した。
【００８６】
３）術後のわずかなＧＢＭに対するｈ−ｉＮＳＣ治療の有効性を決定するために、これまでに報告されている戦略にしたがってマウスにおいて画像誘導ＧＢＭ切除を実行した。患者由来ＧＢＭ８−ＧＦＰ−ＦＬｕｃを、８０％集密度で回収し、右前頭葉において定位（ブレグマの横２ｍｍおよび硬膜から０．５ｍｍ）に移植した（５×１０５個細胞）。定位枠に固定した後、マウスを、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＭＶＸ−１０顕微鏡下に置いた。手術中の顕微白色光、ＧＦＰおよびＲＦＰ画像を、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  ＯＲＣＡ  ０３Ｇ  ＣＣＤ（高分解能）カメラおよびソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して手順の全体を通じて取り込んだ。正中切開を、頭蓋骨上の皮膚に加え、マウスの頭蓋を露出させた。頭蓋内異種移植片を、ＧＦＰ蛍光を使用して同定した。腫瘍を覆っている頭蓋骨のごく一部を、骨ドリルおよび鉗子を使用して外科的に除去し、被っている硬膜を、皮質表面から穏やかにはがし、腫瘍を露出させた。ＧＦＰ蛍光下で、ＧＢＭ８−ＧＦＰＦＬ腫瘍を、外科的切開と吸引の組み合わせを使用して外科的に切除し、ＧＦＰの画像を継続的に取り込んで、ＧＦＰ誘導外科的切除の精度を評価した。腫瘍除去後、得られた切除腔を十分に洗い流し、皮膚を７−０バイクリル縫合糸で閉じた。手順に関連する死亡数は観察されなかった。全ての実験プロトコルは、ノースカロライナ大学Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌの動物実験委員会により承認されており、マウスの飼育は、米国国立衛生研究所実験動物の管理と使用に関する指針、ＵＳＤＡ規則、および米国獣医師会により示される基準にしたがった。外科的切除の後、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫまたはｈ−ｉＮＳＣ−ｍＣ−ＦＬ（５×１０５個細胞）を、ヒアルロン酸ｓＥＣＭヒドロゲル（Ｓｉｇｍａ）に封入し、手術後のＧＢＭ腔に移植した。ＧＢＭの再発を、上記の通りＦＬｕｃイメージングにより可視化し、マウスを生存について追跡した。
【００８７】
＜組織処理＞
最後のイメージングセッションの直後に、マウスを屠殺し、ホルマリンで潅流し、脳を摘出した。組織を、ホルマリンに直ちに浸漬した。３０μｍの冠状切片を、振動ミクロトーム（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して生成した。ネスチン、ＧＦＡＰおよびＴｕｊ−１染色の場合、切片を、ブロッキング溶液（０．３％ＢＳＡ、８％ヤギ血清および０．３％トライトンＸ−１００）中で、室温で１時間インキュベートし、その後ブロッキング溶液に希釈した一次抗体（１）抗ヒトネスチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、（２）抗ＧＦＡＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、（３）抗ＴＲＡＩＬ（ＰｒｏＳｃｉ、Ｐｏｗａｙ、ＣＡ）および（４）抗Ｔｕｊ−１（Ｓｉｇｍａ）と４℃で終夜インキュベートした。切片を、ＰＢＳで３回洗浄し、適当な二次抗体中でインキュベートし、共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して可視化した。
【００８８】
［結果］
＜ヒト繊維芽細胞の、ｈ−ｉＮＳＣへの迅速な分化転換＞
ｈ−ｉＮＳＣ治療の迅速かつ効果的な生成は、侵襲性がんの患者を処置するために必須である。新たな戦略として、ヒト繊維芽細胞に、Ｓｏｘ２を形質導入し、フィーダー細胞なしでｈ−ｉＮＳＣ生成を実行した。次いで、光学的レポータを発現する診断用ｈ−ｉＮＳＣまたは異なる細胞毒性物質を発現する治療用ｈ−ｉＮＳＣを生成した（図１Ａ）。最初に、フィーダーを含まない／Ｓｏｘ２戦略を使用してｈ−ｉＮＳＣを生成する動態を評価した。ヒト繊維芽細胞に、Ｓｏｘ２を形質導入し、ＮＳＣ誘導培地中で培養した（図１Ｂ）。細胞形態の変化を、Ｓｏｘ２発現を活性化している４８時間内で観察した。更に、広範なネスチン発現を検出し、ｈ−ｉＮＳＣは神経幹細胞塊形成を形成することができた。定量化は、ｈ−ｉＮＳＣにおけるネスチン発現が、２日目から１０日目まで一定のままであることを示した（図１Ｃ）。分化を誘導したとき、ｈ−ｉＮＳＣは、アストロサイトマーカーＧＦＡＰおよび神経マーカーＴｕｊ−１を発現した。染色により、細胞が、多能性マーカーＴＲＡ−１６０またはＯＣＴ４を発現しないことが明らかになった（図１Ｄ）。これらの発見を、ＲＴ−ＰＣＲ分析により確認した（図１Ｅ）。ｈ−ｉＮＳＣは、親繊維芽細胞またはヒトｉＰＳＣ（ｈ−ｉＰＳＣ）にはない高レベルのネスチン発現を示した。Ｓｏｘ２過剰発現を使用してｈ−ｉＮＳＣとｈ−ｉＰＳＣの両方の細胞株を生成したので、Ｓｏｘ２発現は、ｈ−ｉＮＳＣとｈ−ｉＰＳＣ両方で高かった。ｈ−ｉＰＳＣとは異なり、ｈ−ｉＮＳＣは、多能性マーカーＮａｎｏｇまたはＯＣＴ３／４を高レベルで発現しなかった。全体として、これらのデータは、単一因子Ｓｏｘ２発現を使用して４８時間以内に多能性ｈ−ｉＮＳＣを作製する能力を実証している。
【００８９】
＜ｈ−ｉＮＳＣは、選択的にＧＢＭへ遊走する＞
固形および侵襲性ＧＢＭ沈着物にホーミングする能力は、ＮＳＣに基づくがん治療で最も有益な特性の１つである。ｈ−ｉＮＳＣの腫瘍向性の性質を調査するために、ヒトＧＢＭ細胞と共培養したｈ−ｉＮＳＣのリアルタイム運動分析を使用した（図２Ａに概説した）。参照のために、ｈ−ｉＮＳＣ遊走を、それを得たヒト親繊維芽細胞と比較した。ｈ−ｉＮＳＣが、共培養したＧＢＭ細胞の方へ迅速に遊走し、２２時間で５００μｍの空隙を覆うことが判明した（図２Ｂ）。単一細胞の遊走経路分析は、ＧＢＭ細胞の存在が、ｈ−ｉＮＳＣを共培養しているＧＢＭ細胞の方への選択的遊走に誘導することを示した（図２Ｃ）。対照的に、ヒト繊維芽細胞は、ごくわずかな遊走しか実証しなかった（図２Ｂ）。ヒト繊維芽細胞の単一細胞遊走分析では、共培養したＧＢＭ細胞の方へごくわずかに移動するランダムな遊走パターンしか確認されなかった（図２Ｃ）。ｈ−ｉＮＳＣの遊走の指向性を、完全な単一方向の運動が１．０の比を与え、完全に無指向性の運動が０．０の比を与えるようにユークリッド距離と全体の累積距離の比を算出することにより分析した。この分析を使用して、ヒト繊維芽細胞（０．２８）よりｈ−ｉＮＳＣで有意に高い（０．６５）平均指向性比を算出した（図２Ｄ）。単一細胞遊走パターンの更なる分析により、ヒト繊維芽細胞（２００μｍ）と比較してｈ−ｉＮＳＣにより遊走された有意に増加した平均ユークリッド距離（３４０μｍ）が実証された（図２Ｅ）。ｈ−ｉＮＳＣによる平均細胞速度は、ヒト繊維芽細胞と比較してより低かった（０．４対０．６２）（図２Ｆ）。最後に、３次元遊走アッセイを実行して、ｈ−ｉＮＳＣの、ＧＢＭ病巣へのインビボ遊走を模倣した。ｍＣｈｅｒｒｙ＋ｈ−ｉＮＳＣスフェロイドを、ＧＦＰ＋ＧＢＭスフェロイドと共培養し、両方の細胞型を、磁力を使用して浮遊させた（図２Ｇ）。ｈ−ｉＮＳＣが、播種の数時間以内にＧＢＭスフェロイドに侵入し始めることを発見した。ｈ−ｉＮＳＣスフェロイドは、ＧＢＭスフェロイドに侵入し続け、８日以内に広範囲に共局在化した。全体として、これらの観察は、ｈ−ｉＮＳＣが腫瘍向性特性を保有し、ＧＢＭ細胞にホーミングするという結論を支持している。
【００９０】
＜ｈ−ｉＮＳＣの残存およびインビボ運命＞
次に操作したｈ−ｉＮＳＣを利用して、脳内におけるインビボでのこれら細胞の生存および運命を調査した。ＧＦＰＦＬおよびｍＣＦＬによってｈ−ｉＮＳＣを操作した後のインビトロ増殖に関する先行する研究は、操作していないｈ−ｉＮＳＣと有意差を示さなかった（図３Ａ）。インビボ研究の場合、ｍＣＦＬで操作したｈ−ｉＮＳＣを、マウスの脳内に定位に移植し、リアルタイム非侵襲イメージングを使用して、細胞生存を経時的に監視した。画像を定期的に取り込むことにより、ｈ−ｉＮＳＣが、移植後２０日間より長く生存することが判明した（図３Ｂ）。事後ＩＨＣにより、ｈ−ｉＮＳＣ−ｍＣＦＬのおよそ半分が、ＮＳＣマーカーであるネスチンを発現しており（図３Ｄ）、他の半分が、ニューロンマーカーＴｕｊ−１に陽性である（図３Ｄ）ことが明らかになった。アストロサイトマーカーＧＦＡＰは観察されなかった。追加のＩＨＣにより、移植したｈ−ｉＮＳＣが、多能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＤＲ−１６０を発現していないことが検証された。
【００９１】
＜殺腫瘍性ｉＮＳＣを使用する悪性および侵襲性ＧＢＭの有効な処置＞
ｈ−ｉＮＳＣに基づくＧＢＭ処置の治療効果を調査するために、ｈ−ｉＮＳＣを先ず操作して、ＩＲＥＳ−ＧＦＰエレメントの上流に、ガウシアルシフェラーゼとフレームが一致した、アポトーシス促進性分子ＴＮＦα関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ；ｄｉＴＲ）の分泌性バリアント（ｉＮＳＣ−ｄｉＴＲ）を発現させた。操作した細胞担体から送達された場合のＴＲＡＩＬの抗がん効果は、これまでに確立されており、したがってＴＲＡＩＬは、新たなｈ−ｉＮＳＣ送達媒体を特徴づけるのに理想的な殺腫瘍性分子である。ＧＦＰレポータの強力な発現が、ｈ−ｉＮＳＣの形質導入後に検出された（図４Ａ）。ｈ−ｉＮＳＣ−ｄｉＴＲは、浮遊状態で培養した場合に神経幹細胞塊を効率的に形成し（図４Ｂ）、未改変細胞と同等の増殖能および継代数を示すことを観察した（データ不掲載）。ネスチン発現および分化能力が、操作したおよび操作していないｈ−ｉＮＳＣにおいて観察された以前のそれと同じであったことは、ＴＲＡＩＬによるｈ−ｉＮＳＣの修飾が幹細胞としてのその特性に干渉しないことを示唆している。
【００９２】
操作したｈ−ｉＮＳＣの抗ＧＢＭ有効性を評価するために、ｈ−ｉＮＳＣ−ｄｉＴＲまたは対照ｉＮＳＣ−ＧＦＰＲＬを、ｍＣｈｅｒｒｙおよびホタルルシフェラーゼ（ｍＣ−ＦＬ）を発現しているヒトＧＢＭ細胞と異なる比で共培養した。インビボ特性を模倣するために、ＧＢＭとｈ−ｉＮＳＣを混合し、３次元浮遊系で４８時間培養した。蛍光およびＢＬＩにより、ｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲと共培養したＧＢＭの生存率における有意な減少が明らかになった。より高いｈ−ｉＮＳＣ：ＧＢＭ比を使用した場合、この減少は有意に一層大きかった（図４Ｃ）。
【００９３】
＜アポトーシス促進性薬剤のｈ−ｉＮＳＣ分泌は、固形ＧＢＭを減少させる＞
ｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲに基づく治療のインビボ有効性を試験するために、ヒト単独性ＧＢＭに対するｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲ処置の効果を決定した。ｍＣ−ＦＬを発現しているヒトＵ８７  ＧＢＭ細胞を、ｉＮＳＣ−ｓＴＲまたは対照ｉＮＳＣ−ＧＦＰと一緒に頭蓋内移植し（図Ｄ）、腫瘍体積を、連続生物発光イメージングを使用して追跡した。ｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲ処置は、３日目までに腫瘍成長の統計的に有意な減少を誘導し、２４日目までにＧＢＭ体積を５０分の１に低下させることが判明した（図４Ｆ）。加えて、対照動物は、わずか２５日間でＧＢＭ成長のため死んだが、ｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲ−処置動物は、５１日間より長く生存した（図４Ｇ）。マウス脳のＩＨＣ検査は、２週間後にｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲによるＴＲＡＩＬの強力な発現を示した。ＧＢＭ中のｈ−ｉＮＳＣ−ｓＴＲは、ネスチンおよびＴｕｊ−１の発現について陽性であり、ＧＦＡＰならびに多能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＤ−１６０について陰性であった（図４Ｈ）。
【００９４】
＜殺腫瘍性ｉＮＳＣを使用する悪性および侵襲性ＧＢＭ  ＣＤ１３３＋の有効な処置＞
患者由来ＣＤ１３３＋ヒトＧＢＭ−始原細胞に対するｈ−ｉＮＳＣプロドラッグ／酵素治療の有効性を決定するために、ＧＦＰおよびホタルルシフェラーゼを発現しているＧＢＭ４細胞（ＧＢＭ４−ＧＦＰＦＬ）を、Ｒｌｕｃ、ＲＦＰおよびチミジンキナーゼ（ＴＫ）活性を含む三官能性キメラレポータを発現しているｈ−ｉＮＳＣと共培養して、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫを生成した。単純ヘルペスウイルスにコードされているチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）は、細胞自殺遺伝子治療の原理の最初の証明に使用され、今なお臨床的および実験的適用において最も広く使用されている系の１つである。ＧＢＭ４−ＧＦＰＦＬおよびｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫを、異なる２つのモデルで、３次元浮遊系で共培養した。第１のモデル（図５Ａ）において、２つの細胞型を混合し、細胞生存を蛍光により経時的に監視した（図５Ｂ）。第２のモデルにおいて、２つの細胞型を並べて培養して、確立されたＧＢＭの処置を模倣した（図５Ｃ）。細胞生存を、蛍光により経時的に監視した（図５Ｄ）。両方の場合において、ＧＢＭ生存の有意な減少が経時的に観察され、混合したモデルにおいてより有意であった（図５Ｅ）。
【００９５】
ＧＢＭ４−ＧＦＰＦＬがん細胞をマウスの脳実質に移植することにより、確立したＧＢＭ４に対するインビボでのｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療の有効性を次に決定した。３日後に、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫまたは対照細胞を、確立した腫瘍に直接投与した（図５Ｆ）。連続生物発光イメージングは、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ処置がＧＢＭ４腫瘍の進行を減衰させ、注射２８日後には腫瘍負荷量を、対照と比較して９分の１に減少させたことを示した（図５Ｇ）。ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ処置動物が、対照処置マウスにおけるわずか３７日間と比較して平均６７日間生存したので、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療は生存にも有意な延長をもたらした（図５Ｈ）。事後ＩＨＣにより、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ注射による腫瘍体積の有意な減少が検証された（図５Ｉ〜５Ｊ）。全体として、これらの結果は、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療が、悪性および侵襲性ＧＢＭに対して有意な治療効果を有し、坦腫瘍マウスの生存を著しく延ばすことを示している。
【００９６】
＜腔内ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療は、外科的に切除したＧＢＭの再発を阻害する＞
外科的切除は、ＧＢＭ患者に対する臨床的標準的ケアの一部である。ＧＢＭの再発を効果的に抑制するには、幹細胞の封入が、腔内治療に必要とされることを本発明者等はこれまでに発見した。合成細胞外マトリックス（ｓＥＣＭ）に封入したｈ−ｉＮＳＣ治療の有効性を決定するために、ＧＢＭ−８  ＧＦＰＦＬ（患者由来ＣＤ１３３＋ヒトＧＢＭ−始原細胞）を、ＨＬＡヒドロゲルに包埋したｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫと共培養した（図６Ａ）。ｍＣｈｅｒｒｙ＋ｈ−ｉＮＳＣが、ｓＥＣＭマトリックスから遊走し、３日以内にＧＦＰ＋ＧＢＭ８スフェロイドに定着することが判明した。更に、ｓＥＣＭ／ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療は、３日目にＧＢＭ８スフェロイドの生存率を激減させた。
【００９７】
外科的に切除したヒトＧＢＭ患者に対するｈ−ｉＮＳＣ治療を模倣するために、ＧＢＭ切除のマウスモデルにおいて、高度にびまん性の患者由来ＧＢＭ８細胞に対してｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療を試験した（図６Ｄ）。ＧＢＭ摘除後に、ＨＬＡ内に包埋したｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫを、外科的切除腔に移植した。連続生物発光イメージングは、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療がＧＢＭ８腫瘍の再発を減衰させ、移植１４日後には腫瘍負荷量を、対照と比較して３５０％減少させることを示した（図６Ｅ）。ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ処置動物が、対照処置マウスにおける４６日間と比較して平均５９日間生存したので、ｈ−ｉＮＳＣ−ＴＫ治療は生存にも有意な延長をもたらした（図６Ｅ）。
【００９８】
［実施例２：ヒト皮膚細胞の迅速な分化転換のための代替培地］
ヒト皮膚細胞の分化転換を、実施例１において上記の通り実行したが、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｎｅｕｒａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍの代わりに以下のＮ−２培地およびＢ−２７培地の１：１混合物で実行した。化学薬品は、示した通りＧｉｂｃｏ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）またはＳｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘａｓ）から購入した。
Ｎ−２培地：
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ［登録商標］）
１×Ｎ２補助剤（Ｇｉｂｃｏ［登録商標］）
５μｇ／ｍＬインスリン（Ｓｉｇｍａ）
１ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ［登録商標］）
１ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ［登録商標］）
１００μＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（Ｇｉｂｃｏ［登録商標］）
１００Ｍ  β−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）
Ｂ−２７培地：
ニューロベーサル培地（Ｇｉｂｃｏ［登録商標］）
１×Ｂ−２７補助剤（Ｇｉｂｃｏ［登録商標］）
２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ［登録商標］）
【００９９】
１：１の混合物に、終濃度５μｇ／ｍＬになるようにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）を添加した。
【０１００】
この培地を、終濃度１０μＭのＳＢ４３１５４２（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）；終濃度１００ｎＭのＬＤＮ１９３１８９（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）；終濃度１０μＭの全トランスレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）；および終濃度３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で補充した。
【０１０１】
この培地を使用して、Ｓｏｘ２形質導入と共に使用した場合に、ネスチン＋ｉＮＳＣを生成した。
【０１０２】
培地は、インスリン（２５μｇ／ｍＬ）、トランスフェリン（１００μｇ／ｍＬ）、亜セレン酸ナトリウム（３０ｎＭ）および／またはｃＡＭＰ（１００ｎｇ／ｍＬ）を含むように作製することもできる。
【０１０３】
［実施例３：フィブリンシーラント中の細胞傷害性幹細胞の移植は、保持を増加させ、術後膠芽腫再発を阻害する］
腫瘍ホーミング細胞傷害性幹細胞（ＳＣ）治療は、治癒不能な脳がん膠芽腫（ＧＢＭ）の処置に対するヒト患者試験に入っている。しかしながら、前臨床の証拠は、この戦略が、残留、および、外科的に切除したＧＢＭに対する有効性が不十分なことが問題となる可能性を示唆している。ここで、臨床的に利用されるフィブリン糊ＴＩＳＳＥＥＬ（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が、マウスにおいて外科的腔内のヒト細胞傷害性ＳＣの残留を増加させ、術後のわずかなＧＢＭの再成長を有意に抑制するという最初のデータを提供する。薬物放出性のヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を、フィブリンマトリックス中に封入した場合、インビトロ研究は、ｈＭＳＣがフィブリン中で増殖し、迅速に遊走して、共培養しているヒトＧＢＭ細胞へホーミングすることを示した。ＧＢＭ切除マウスモデルにおいて、術後腔に移植した治療用ｈＭＳＣは、ＴＩＳＳＥＥＬ中に封入した場合、直接注射の臨床的標準と比較して２倍多く保持され、３倍多く残存することが判明した。ＴＩＳＳＥＥＬ中に封入された、細胞毒性物質ＴＲＡＩＬ（ｈＭＳＣ−ｓＴＲ）を放出するｈＭＳＣは、３次元培養においてヒトＧＢＭスフェロイドの生存率を有意に減少させ、１１日目には確立したヒトＧＢＭ異種移植片を３分の１に退行させた。術後ヒトＧＢＭに対する模倣治療において、腔内ＴＩＳＳＥＥＬ／ｈＭＳＣ−ｓＴＲ治療は、対照処置動物と比較して術後ＧＢＭ体積を６分の１に減少させ、再発までの時間を４倍に増加させ、生存期間の中央値を手術後１５日から３６日間に増加させた。
【０１０４】
［材料および方法］
＜細胞株およびウイルスベクター＞
Ｕ８７ヒトＧＢＭ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）およびヒトＭＳＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。いくつかの異なるレンチウイルスベクター、１）蛍光および生物発光レポータ：ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬｕｃ、ＧＦＰ−ＲＬｕｃ、２）治療用ベクター：分泌されるＴＲＡＩＬを含有するＬＶ−ｓＴＲ、３）ｓＴＲおよびガウシアルシフェラーゼの融合物をコードするＬＶ−ｄｉＴＲを、これらの研究に使用した。ベクターを上記の通り生成し、ｓＴＲ含有ベクターは、骨格中にＩＲＥＳ−ＧＦＰ（内部リボソーム侵入部位−緑色蛍光タンパク質）エレメントおよびＣＭＶ駆動されるピューロマイシンエレメントを有する。全てのＬＶ構築物を、これまでに記述されている通りヘルパーウイルスを含まないパッケージング系を使用して、２９３Ｔ／１７細胞にＬＶベクターとしてパッケージングした１５、１６。Ｕ８７およびＭＳＣを、５μｇ／ｍＬ硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ）を含有する培養培地中でビリオンをインキュベートすることにより様々な感染多重度（ＭＯＩ）で、ＬＶを形質導入し、細胞を、蛍光顕微鏡により蛍光タンパク質発現について可視化した。ＴＩＳＳＥＥＬフィブリンシーラント（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）を、ノースカロライナ大学病院およびクリニックから購入した。
【０１０５】
＜フィブリン中の播種＞
フィブリンパッチを、ＴＩＳＳＥＥＬ（登録商標）製のシーラーおよびトロンビン調製物を使用して無菌状態で作製した。フィブリン足場を調製するために、シーラー溶液８μＬ（６７〜１０６ｍｇ／ｍＬフィブリノゲン）を、１０００００〜５０００００個のｈＭＳＣと混合した。トロンビン調製物８μＬ（４００〜６２５単位／ｍＬトロンビン）を添加してゲル化を開始し、微量ピペットチップを使用して３０秒間物理的に混合して液滴を作製した。フィブリンパッチを、物理的圧力によって厚さおよそ１ｍｍに液滴を平坦化することにより作製した。その後細胞を導入したフィブリンパッチを、補充したＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、１％Ｌ−グルタミン）で、標準条件下で培養した。
【０１０６】
＜インビトロにおける細胞生存率およびＴＲＡＩＬ分泌＞
足場中のｈＭＳＣの生存率を定義するために、ｈＭＳＣ−ＧＦＰＦＬｕｃ（１×１０５個細胞／足場）を、記述される通りフィブリン液滴中に封入したまたは封入せずにウェルに直接播種した。播種０、２、５および９日後に、高分解能蛍光画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓを使用して取り込み、生物発光画像を、細胞をＤ−ルシフェリン（１．５μｇ／ｍＬ）中でインキュベートすることにより取り込み、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｋｉｎｅｔｉｃイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用してルシフェラーゼ活性を測定した。細胞成長を、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅを使用する蛍光シグナル強度の定量化によりまたはＩＶＩＳ（登録商標）Ｋｉｎｅｔｉｃ画像分析ソフトウェアを使用するルシフェラーゼ活性から決定し、ｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒとして表示した。任意のカラーバーは、標準的光量レベル（青色＝最低；赤色＝最高）を表す。各実験を、３つ組で実行した。
【０１０７】
ＴＲＡＩＬ分泌を決定するために、ｈＭＳＣ−ｄｉＴＲ（１×１０５個細胞／足場）を上記の通り播種した。播種０、２、５および９日後に、分泌されたｄｉＴＲ融合タンパク質を含有する等体積の細胞培養培地を採取し、セレンテラジン（１μｇ／ｍＬ）とインキュベートし、光子放射を照度計で決定した。
【０１０８】
＜経時的イメージングおよび運動分析＞
０．６％アガロース型を調製して、脳組織を模倣した。アガロース溶液３ｍＬを、６ウェル培養プレートの各ウェルに添加し、凝固させた。吸引装置に取り付けた２ｍＬ吸引ピペットを使用して、およそ５００μｍ離してアガロースに腔を作製した。フィブリン中に包埋したｈＭＳＣ−ＧＦＰＲｌｕｃを、アガロース腔のうちの１つに置いた。ヒトＵ８７−ｍＣＦＬｕｃ細胞を隣接する穴に播種し、または腔を空のままにし、ウェルを培地で満たした。細胞／アガロース系、をＶｉｖａＶｉｅｗ生細胞イメージングシステム（Ｏｌｙｍｐｕｓ）内に置き、平衡化させた。蛍光画像を、ウェル当たり６箇所で（充分な細胞数を監視するため）、１０×倍で２０分毎に６４時間取り込んだ。実験は、３つ組で遂行した。次いでＮＩＨ  Ｉｍａｇｅを使用して動画を生成し、「Ｍａｎｕａｌ  Ｔｒａｃｋｉｎｇ」および「Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  Ｔｏｏｌ」プラグインを使用してＭＳＣの遊走経路、遊走の指向性、およびＭＳＣ遊走の速度を定義した。
【０１０９】
＜共培養生存率アッセイ＞
ｈＭＳＣ−ｓＴＲまたはｈＭＳＣ−ＧＦＲＬｕｃ（３×１０５個）を、上記の通りフィブリン足場中に播種した。ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬｕｃを発現しているヒトＵ８７、Ｌｎ２２９およびＵ２５１  ＧＢＭ細胞（２×１０５個細胞）を、フィブリン中に播種したｈＭＳＣの周囲に平板培養した。ＧＢＭ細胞生存率を、異なる時点（０、２、４および６日目）で以前に記述されている定量的インビトロ生物発光イメージングにより測定した１５。３次元共培養アッセイを、Ｂｉｏ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  Ｋｉｔ（Ｎａｎｏ３Ｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）を製品仕様にしたがって使用して３次元細胞スフェロイドを形成することにより予備形成した。簡潔には、ＧＢＭ細胞を、５０μＬｍＬ−１ナノシャトル磁気粒子で終夜処置した。翌日、細胞を、トリプシンで分離し、超低付着６ウェルプレート中で平板培養した。６個のネオジム磁石（磁界強度＝５０Ｇ）の磁気駆動体をウェルプレートの上に置いて、気液界面に細胞を浮遊させ、更に１８〜２４時間培養して、スフェロイドを形成させた。ｈＭＳＣ−ｓＴＲまたはｈＭＳＣ−ＧＦＰＲＬｕｃを、ナノシャトルで標識し、フィブリン中に封入した。３次元共培養懸濁液を作製するために、ＧＢＭスフェロイドおよびｈＭＳＣ／フィブリンを、低付着ウェル内に一緒に置き、磁石を低付着プレート上に置いた。ＧＢＭ細胞生存率を、２４時間後にルシフェラーゼアッセイにより決定した。
【０１１０】
＜インビボモデル＞
幹細胞残存
術後ＧＢＭ腔におけるフィブリン封入された幹細胞の残存を決定するために、Ｕ８７−ｍＣＦＬｕｃを、８０％集密度で回収した。ヌードマウス（６〜８週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に、Ｕ８７−ｍＣＦＬｕｃ（５×１０５個細胞）を右前頭葉において定位に、ブレグマの横２ｍｍおよび硬膜から０．５ｍｍに移植した（ｎ＝８）。腫瘍切除の場合、頭蓋内異種移植片を、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を使用して同定した。Ｕ８７−ｍＣＦＬｕｃ腫瘍を、ｍＣｈｅｒｒｙ励起下での外科的切開および吸引の組み合わせを使用して外科的に切り取った。ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＧＢＭの蛍光画像を連続的に取り込んで、画像誘導外科的切除の精度を評価した。腫瘍除去後に、ｈＭＳＣ−ＧＦＰＦＬｕｃ（１×１０６個細胞）を２つの群に分割し：１）生理食塩水１０μＬに懸濁し、腔の壁に直接注射した、または２）フィブリン６μＬに懸濁し、切除腔内に播種し、トロンビン５μＬの添加によりゲル化させた。ｈＭＳＣレベルを、連続生物発光イメージングにより決定した。マウスに、Ｄ−ルシフェリン（生理食塩水１５０μＬ中に４．５ｍｇ／ｍＬ）を腹膜内注射し、光子総数をＩＶＩＳ（登録商標）Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｉｍａｇｅｒを使用して注射５分後に７分間にわたり測定した。初期のｈＭＳＣ保持を、移植３時間後のイメージングにより決定した。ｈＭＳＣ生存をその後、移植２、４、６、１０、１４および２１日後のイメージングにより決定した。光子放射を、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｋｉｎｅｔｉｃイメージング分析ソフトウェアを使用して決定し、０日目と比較してｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒとして表示した。全ての実験プロトコルは、ノースカロライナ大学Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌの動物実験委員会により承認されており、マウスの飼育は、米国国立衛生研究所実験動物の管理と使用に関する指針、ＵＳＤＡ規則、および米国獣医師会により示される基準にしたがった。
【０１１１】
固形腫瘍治療
ヌードマウスを麻酔し、ＰＢＳ  １００μＬ中のＵ８７−ＧＢＭ細胞（３×１０５個細胞）を、マウスの脊柱腔近くに注射した（動物当たり２つの独立した注射部位）。１週後に、ｈＭＳＣ−ｓＴＲまたは対照ｈＭＳＣ−ＧＦＰＲｌｕｃを持つフィブリン足場を、確立した腫瘍の上に外科的に移植した。腫瘍成長を、上記の通り連続ＦＬｕｃイメージングおよび画像分析により決定し、０日目と比較してｐ／秒／ｃｍ２／ｓｒとして表示した。
【０１１２】
術後のわずかなＧＢＭの治療
術後ＧＢＭの処置に対するフィブリン中に封入されたｈＭＳＣ−ｓＴＲの有効性を調査するために、Ｕ８７−ｍＣＦＬｕｃ（５×１０５個細胞）を、上記の通りマウスの前頭葉に移植した。確立したＧＢＭを画像誘導下で外科的に切除し、フィブリン中のｈＭＳＣ−ｓＴＲまたはｈＭＳＣ−ＧＦＰＲＬｕｃを切除腔内に播種し、マトリックスを、トロンビンの添加により重合させた。腫瘍再成長を、以前に記述した通り連続Ｆｌｕｃイメージングにより監視した。
【０１１３】
＜組織処理＞
最後のイメージングセッションの直後に、マウスを屠殺し、ホルマリンで潅流し、脳を摘出した。組織を、ホルマリンに直ちに浸漬した。３０μｍの冠状切片を、振動ミクロトーム（Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して生成した。切片を、ＰＢＳで３回洗浄し、共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して可視化した。マウスのサブセットにおいて、脳を単離し、Ｄ−ルシフェリンの有り無しでインキュベートし、エクスビボでの全脳生物発光および蛍光イメージングを、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｋｉｎｅｔｉｃシステムを使用して実行した。
【０１１４】
＜統計的分析＞
データを、２群を比較する場合はスチューデントｔ検定により、２群より多くを比較する場合にはＡＮＯＶＡ、その後ダネット後検定により分析した。データを、平均±ＳＥＭで表示し、差異を、Ｐ＜０．０５で有意であると見なした。マウス群（ｎ＝５／群）の生存時間を、ログランク検定を使用して比較した。
【０１１５】
３．結果
＜操作された幹細胞を持っているフィブリン足場の生成および特徴づけ＞
フィブリン足場は、増殖または薬物放出に影響を及ぼさない。治療用幹細胞を、臨床的に適合するフィブリン足場を使用してＧＢＭ外科的切除腔に保持する新たな移植戦略を作製しようと試みた（図７Ａに概説される戦略）。ＧＦＰおよびホタルルシフェラーゼを発現するように操作したヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）（ｈＭＳＣ−ＧＦＰＦＬｕｃ）を、医薬品質のフィブリンシーラントＴＩＳＥＥＬのフィブリン構成要素に再懸濁した。トロンビンの添加により、マトリックスは迅速に重合し、足場中にｈＭＳＣを封入した（図７Ｂ）。ｈＭＳＣ−ＧＦＰＦｌｕｃを導入したこれらのフィブリン足場の蛍光および生物発光イメージング（ＢＬＩ）は、幹細胞が、９日間にわたってマトリックス中で増殖することを示した（図７Ｃ）。定量化は、ｈＭＳＣ−ＧＦＰＦＬｕｃ成長が、フィブリンに封入した細胞またはマトリックスなしに成長させた細胞間で同等であることを示し、これはマトリックスが生存率または増殖に対して効果がないことを示唆している（図７Ｄ）。ｈＭＳＣ薬物放出に対する足場構成の影響を調査するために、以前に利用した通りｈＭＳＣを、ＴＲＡＩＬとガウシアルシフェラーゼとの診断用融合で操作して（ｈＭＳＣ−ｄｉＴＲ）、幹細胞型間の薬物放出における差異を検出した。同数のｈＭＳＣ−ｄｉＴＲを、１）足場なしで、２）機械的に改変していないフィブリン足場中に導入して、３）細胞を導入した後に機械的に平坦化したフィブリン足場中で、または４）作成済みの平坦な足場の表面に播種して、培養した。播種１、３および６日後に採取した培地サンプルのＢＬＩは、ｄｉＴＲ分泌が全ての群において同等であることを実証し（図７Ｅ）、これはｈＭＳＣ−ｄｉＴＲ放出が、足場の存在、足場の形状、または表面播種に対する封入により阻害されなかったことを示唆している。
【０１１６】
＜ｈＭＳＣは、フィブリン足場から遊走し、ＧＢＭ細胞へホーミングする＞
フィブリン足場に播種したｈＭＳＣの遊走および腫瘍栄養性ホーミングを研究するために、経時的運動分析を３次元（３Ｄ）アガロース下遊走系と組み合わせた新規の戦略を開発した。この手法では、組織培養ディッシュを０．６％アガロース溶液で満たして、脳の組成物を模倣する。腔を、アガロース中に作製し、フィブリン足場中のｈＭＳＣ−ＧＦＰＦＬｕｃを腔内に播種する。ヒトＵ８７−ｍＣＦｌｕｃを、５００μｍ離れている第２の腔内に播種して、走化性シグナル勾配を確立する。系をインキュベータ顕微鏡内に置き、動力学的画像を２０分毎に６４時間取り込んで、フィブリン足場上のｈＭＳＣの遊走を定義する。実際ｈＭＳＣはフィブリン足場からアガロースマトリックスを経てＵ８７−ｍＣＦｌｕｃ細胞の方へ移動する（図８Ａに概説した）。
【０１１７】
この戦略を使用して、経時的蛍光イメージングにより、封入したｈＭＳＣがフィブリン足場から遊走し、共培養しているＧＢＭ細胞と共局在化することが実証された（図８Ｂ）。単一細胞の遊走経路分析は、ｈＭＳＣが、共培養しているＧＢＭ細胞へ選択的にホーミングし、６４時間未満で細胞に達することを示した（図８Ｃ）。対照的に、ＧＢＭなしで培養したｈＭＳＣは、足場からわずかな遊走を示し（図８Ｄ）、ＧＢＭ細胞の不在下でランダムな無指向性パターンで遊走した（図８Ｅ）。定量分析およびロゼッタプロットから、ＧＢＭ細胞存在下におけるｈＭＳＣの高い指向性の遊走が更に確認され、ＧＢＭ細胞の反対方向に遊走する細胞はほとんどなかった（図８Ｆ）。別法として、ｈＭＳＣは、ＧＢＭ細胞の不在下で、ランダムな３６０°パターンで遊走した。フィブリン足場内に播種したｈＭＳＣの遊走の指向性を、完全な単一方向の運動の場合に１．０の比を与え、完全に無指向性の運動の場合に０．０の比を与えるように、ユークリッド距離と全体の累積距離の比を算出することにより分析した。この分析を使用すると、フィブリン足場中に封入したｈＭＳＣは、Ｕ８７細胞と共培養した場合平均遊走指向性比０．６３を示し（図８Ｇ）、それは腫瘍細胞の不在下でわずか０．１７に減少した。単一細胞遊走パターンの更なる分析により、Ｕ８７細胞の不在下で培養したｈＭＳＣ（２３９．５μｍ、標準偏差１１８．４μｍ）と比較して、Ｕ８７細胞の存在下で培養したｈＭＳＣにより遊走された平均ユークリッド距離（８７８．２μｍ）の有意な増加が実証された。最後に、単一細胞遊走分析により測定した平均細胞速度における有意差は、Ｕ８７存在下対ＧＢＭ細胞不在下で培養したｈＭＳＣで全く検出されなかった。
【０１１８】
＜フィブリン中に封入し、ＧＢＭ腔内に移植したｈＭＳＣの保持および生存＞
腔内幹細胞の残存に対するフィブリン封入の影響を決定するために、フィブリン封入の有り無しでＧＢＭ腔内に移植した操作されたｈＭＳＣの残留および生存を、ＧＢＭ切除マウスモデルを使用して測定した。確立されたヒトＧＢＭ異種移植片を外科的に摘除した。ｈＭＳＣ−ｍＣＦＬを、フィブリン中に包埋し、腔内に播種し、トロンビンの添加により重合させた。別法として、動物のサブセットにおいて同数のｈＭＳＣ−ｍＣＦＬを、外科的腔の壁に直接注射して、ＧＢＭ患者の臨床試験において現在使用されている足場を含まない移植を模倣した。術後腔におけるｈＭＳＣ−ｍＣＦＬの保持と生存の両方が、フィブリン封入により有意に増加した。移植２時間後の定量的ＢＬＩは、フィブリンに基づく移植により、直接注射と比較して４８％多いｈＭＳＣ−ｍＣＦＬが術後腔に保持されることを示した（図９Ａ）。縦方向のＢＬＩは、フィブリン封入したｈＭＳＣ−ｍＣＦＬの６１％が、２１日間にわたって腔内に残存したことを示した（図９Ｂ〜９Ｃ）。ＢＬＩシグナルが、徐々に低下する前の移植７日後に２．７倍に増加したので、フィブリンマトリックスは、ｈＭＳＣ−ｍＣＦＬが術後腔内で増殖することを当初可能にした。対照的に、術後腔内に直接注射したｈＭＳＣ−ｍＣＦＬは腔から迅速に消失し、移植７日後に１９％の細胞しか残っておらず、１０日目までに完全に消失した（図９Ｂ〜９Ｃ）。移植２１日後に実行したエクスビボ全脳蛍光およびＢＬＩにより、インビボにおけるＢＬＩを確認した。フィブリン封入したｈＭＳＣ−ｍＣＦＬ群の切除腔において有意な光子放射が検出されたが、ｈＭＳＣ−ｍＣＦＬを直接注射した脳においてＢＬＩシグナルは全く検出されなかった（図９Ｄ）。興味深いことに、全脳断面分析は、ｈＭＳＣ−ｍＣＦＬシグナルが切除腔の境界を超えて広がっていることを示し、これはｈＭＳＣが、腔から脳実質内に遊走したことを示唆している。これは、組織切片の高分解能蛍光イメージングにより確認され、多数のｍＣｈｅｒｒｙ＋ｈＭＳＣが、フィブリン封入した脳における切除腔に隣接する組織の内側を覆うことが判明した（図９Ｅ）。直接注射したｈＭＳＣが、組織切片中に検出されたが、ごく少数の細胞しか小さい単一部位にとどまらなかった（図９Ｆ）。全体として、これらのデータは、フィブリン封入が、ＧＢＭ切除腔内での操作した幹細胞の保持および生存を改善し、一方で幹細胞は、マトリックスから脳実質内に遊走できるという最初の実証をもたらす。
【０１１９】
＜抗腫瘍有効性＞
３次元ヒトＧＢＭスフェロイドに対するフィブリン中の治療用ｈＭＳＣの有効性。ＧＢＭに対する細胞傷害性ｈＭＳＣ／フィブリン治療の有効性を最初に特徴づけるために、新規の３次元浮遊共培養戦略を使用して、固形ＧＢＭ病巣に対するインビボ治療をより正確に模倣した（図１０Ａ）。ｈＭＳＣ−ｓＴＲまたはｈＭＳＣ−ＧＦＰＲＬｕｃを磁気材料で標識し、フィブリン中に封入し、磁気的に標識されているｍＣｈｅｒｒｙルシフェラーゼ＋３次元ヒトＧＢＭスフェロイドと共培養した。磁石を培養ディッシュの上に置いて、細胞を浮遊させた。４８時間後に実行したＢＬＩにより、ｈＭＳＣ−ｓＴＲ／フィブリンが、対照処置スフェロイドと比較して固形ＧＢＭスフェロイドの生存率を９２％（Ｕ８７）、８５％（ＬＮ２２９）および８０％（Ｕ２５１）減少させることが明らかになった（図１０Ｂ〜１０Ｃ）。これらの発見は、ｈＭＳＣ−ｓＴＲ／フィブリン治療が、固形ＧＢＭスフェロイドの生存率を減少させ得ることを示唆している。
【０１２０】
＜固形腫瘍に対するｈＭＳＣ／フィブリン治療＞
確立された腫瘍に対するフィブリンに基づく細胞傷害性ｈＭＳＣ治療の有効性を研究するために、Ｕ８７−ｍＣＦＬ細胞をマウスに異種移植し、１０日間成長させた。ｈＭＳＣ−ｓＴＲまたは対照ｈＭＳＣ−ＧＦＰＲＬｕｃを、フィブリン中に封入し、確立された各腫瘍上に外科的に移植した（図９Ｄに概説した）。腫瘍成長の連続ＢＬＩは、ｈＭＳＣ−ｓＴＲ／フィブリン移植が、腫瘍進行を有意に阻害し、処置１１日後に対照処置動物と比較して腫瘍体積を４．２分の１に減少させることを示した（図９Ｅ〜９Ｆ）。全体として、これらの発見は、フィブリン封入したｈＭＳＣ−ｓＴＲ治療が、固形腫瘍の進行を著しく減衰させることを実証している。
【０１２１】
＜術後のわずかなＧＢＭに対する腔内細胞傷害性ｈＭＳＣ／フィブリン治療＞
ＧＢＭの外科的切除は、ヒトＧＢＭ患者に対する臨床的標準的ケアの一部である。したがって、術後のわずかなＧＢＭに対するフィブリン封入したｈＭＳＣ−ｓＴＲの腔内治療の影響を決定した。ヒトＧＢＭ細胞を、マウスの脳実質に異種移植した。１週間後に、腫瘍を外科的に切除した。細胞傷害性ｈＭＳＣ−ｓＴＲまたは対照ｈＭＳＣ−ＧＦＰＲＬｕｃをフィブリンに混合し、切除腔内に移植し、トロンビンの添加により重合させた（図１１Ａに概説した）。手術中の蛍光イメージングを使用して、ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＧＢＭの位置を明らかにし、外科的切除を誘導し、切除腔内へのｈＭＳＣ−ｓＴＲ／フィブリンの効果的な播種を確認した（図１１Ｂ）。連続ＢＬＩにより、対照処置動物における迅速なＧＢＭ再発が明らかになり、１８日目には腫瘍が１１０倍に増加した（図１１Ｃ〜１１Ｄ）。対照的に、ｈＭＳＣ−ｓＴＲ／フィブリン治療は、治療１８日後にＧＢＭ再発を８倍抑制した。生存分析により、ｈＭＳＣ−ｓＴＲ／フィブリン腫瘍抑制によって動物が初期処置後３６日間より長く生存できることが明らかになった（図１１Ｅ）。対照的に、対照動物は、手術後わずか１５日間で再発ＧＢＭのため死んだ。事後組織分析により、ＧＢＭ切除腔のボーダー上の残ったＧＢＭマイクロサテライト病巣においてｈＭＳＣ−ｓＴＲの存在が明らかになった（図１１Ｆ）。
【０１２２】
総合すれば、この結果は、腔内ｈＭＳＣ−ｓＴＲ／フィブリン治療が、術後のわずかなＧＢＭに対して非常に有効な処置であることを強く示唆している。
【０１２３】
【表１Ａ】
2018510005.tif 000003
【表１Ｂ】
2018510005.tif 000004
【０１２４】
［実施例４：ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）足場中の細胞傷害性幹細胞を移植する］
ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ  Ｃｏ．、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、  Ｍｉｃｈｉｇａｎ）中に組み込んだヒト神経幹細胞（ＮＳＣ）の特徴づけを、インビトロで実行した。細胞を、濃縮ＮＳＣ溶液をピペットで移すことにより線維上にのせ、１〜８時間インキュベートして、付着させた。図１２に示すように、より多数のＮＳＣが、ゲルフォームのボーダーに付着したが、ゲルフォームの中心は、少数のＮＳＣしか含有しなかった。これらの結果は、ＮＳＣがゲルフォームに付着し、マトリックス中で増殖することを示唆している。
【０１２５】
図１３に示す通り、インビトロ３次元遊走分析も実行した。培養プレートを、寒天で満たし、ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＧＢＭ細胞を移植して、３次元腫瘍を作製する。３日後に、腫瘍の一部を除去して、切除腔を模倣する。次いでＧＦＰ＋ＮＳＣを持つＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）を腔内に播種する。播種１および７日後にゲルを横断面に切断し、蛍光イメージングを使用して、ＧＦＰ＋ＮＳＣとｍＣｈｅｒｒｙ＋ＧＢＭとの共局在化を可視化した。７日目の切片において多数のＮＳＣが、ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）足場から遊走し、寒天を通ってＧＢＭ（赤色）に定着したことが判明した。これらの遊走細胞を、矢印で示す。これらの結果は、ＮＳＣが、ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）から遊走し、ＧＢＭ病巣にホーミングできることを示唆している。
【０１２６】
ＧＢＭ切除腔内に移植したＮＳＣのインビボ残存を、異なる足場上で比較した（図１４）。マウスにおいてヒトＵ８７−ＧＢＭ細胞を外科的に切除して切除腔を作製した。ルシフェラーゼ＋ＮＳＣを、ＰＬＡまたはＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）上に播種し、切除腔内に播種した。追加の群においてＮＳＣを懸濁液で直接注射した。連続生物発光イメージングを使用して、外科的切除腔におけるＮＳＣの残存を追尾した。直接注射したＮＳＣは、わずか４日間で消失することが判明した。ＮＳＣは、最初にＰＬＡに送達され８日間残存したのに対し、ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）に送達したＮＳＣも最初に増殖し、２１日間を超えて残存した。これらのデータは、ＮＳＣが、ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）足場上でＧＢＭ切除腔内に最も長く残存し、この戦略が、最大の処置持続性を達成する可能性が高くなることを示唆している。
【０１２７】
図１５に示すように、ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）足場上のＮＳＣプロドラッグ／酵素治療は、培養においてＧＢＭ細胞を死滅させる。ヒトＮＳＣを操作して、チミジンキナーゼを発現させた（ＮＳＣ−ＴＫ）。ＮＳＣ−ＴＫを、ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）に導入し、ヒトＵ８７−ＧＢＭ細胞との共培養アッセイに播種した。ウェルを、ガンシクロビル（ＧＣＶ）プロドラッグで処置して治療を開始したまたは対照として生理食塩水で処置した。細胞生存率アッセイは、ＧＣＶ処置が、Ｕ８７−ＧＢＭ細胞とＮＳＣ両方の生存率を減少させることを示した。これらのデータは、ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）／ＮＳＣ−ＴＫ治療が、抗ＧＢＭ効果を有することを示唆している。
【０１２８】
要約すると、ＧＥＬＦＯＡＭ（登録商標）は、切除腔におけるヒトＮＳＣの残存において予想外かつ劇的な増加を示した。この増加は、ナノメートルまたはマイクロメートル規模の線維直径を有するエレクトロスピニングされたＰＬＡ足場と比較した場合にも示された（図１６）。
【０１２９】
［実施例５：脳がんの処置のためのｉＮＳＣ含有ゼラチンスポンジ媒体の使用］
患者が、脳がん（例えば、膠芽腫）と診断され、手術は、その後直ちに腫瘍を除去する予定である（例えば、１、２または３週間以内）。皮膚パンチを患者から取って、皮膚繊維芽細胞を得る。細胞を、本明細書に教示されるように誘導神経幹細胞へと分化転換させ、更に治療薬および／またはレポート分子を細胞に導入する。導入後のｉＮＳＣを、無菌ゼラチンスポンジ（例えば、ＧＥＬＦＯＡＭ［登録商標］）上／内に組み込む。手術中および腫瘍の除去後に、ｉＮＳＣ含有ゼラチンスポンジを、腫瘍を除去した腔内に配置する。ｉＮＳＣは、スポンジから残ったがん細胞の方へ遊走し、その治療薬／レポート分子の有効搭載量を送達し、がん細胞を死滅させる。
【０１３０】
前述は、本発明の解説であり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本発明は、以下の請求項により、そこに含まれる請求項の相当語句で定義される。
【図１−１】
2018510005.tif 000005
【図１−２】
2018510005.tif 000006
【図２−１】
2018510005.tif 000007
【図２−２】
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【図３−１】
2018510005.tif 000009
【図３−２】
2018510005.tif 000010
【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
2018510005.tif 000013
【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
2018510005.tif 000021
【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
2018510005.tif 000035
2018510005.tif 000036