(57)【要約】  本発明は、（Ｓ）−ゲルマクレンＤアナログと比較して改善された昆虫忌避特性を有するか、または昆虫誘引特性を有する（Ｓ）−ゲルマクレンＤアナログのアナログを提供する。【選択図】図６
2018504402.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2018504402.tif 000013
（式中、
Ｒ１がＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピルであり、
Ｒ２がＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピルであり、
Ｒ３がメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピルであり、
Ｒ４がＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピルであり、
Ｒ５がＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピルである）
の（Ｓ）−ゲルマクレンＤアナログ。
【請求項２】
独立に、または任意の組合せで、
Ｒ１がＨ、メチルまたはエチルであり、
Ｒ２がＨ、メチルまたはエチルであり、
Ｒ３がメチルまたはエチルであり、
Ｒ４がＨ、メチルまたはエチルであり、
Ｒ５がＨ、メチルまたはエチルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ４のそれぞれがＨであり、
Ｒ３がメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピルであり、
Ｒ５がＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピルである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ５がＨである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
（Ｓ）−１５−メチルゲルマクレンＤである、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２、Ｒ３およびＲ５のそれぞれが独立してメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピルであり、Ｒ１およびＲ４のそれぞれがＨである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ５がＨである、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
（Ｓ）−１４，１５−ジメチルゲルマクレンＤである、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の化合物を調製するための方法であって、
一般式（ＩＩ）：
【化２】
2018504402.tif 000014
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は一般式（Ｉ）で定義した通りである）
のファルネシル二リン酸アナログまたはその塩を、ゲルマクレンＤシンターゼ（ＧＤＳ）とインキュベートすることを含む、方法。
【請求項１０】
ゲルマクレンＤシンターゼが組換え（Ｓ）−ゲルマクレンＤシンターゼポリペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
組換えＧＤＳがＮまたはＣ末端にタグ配列、特定にはポリヒスチジンタグを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＧＤＳがＣ末端ポリヒスチジンタグ、例えばヘキサヒスチジンタグを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＧＤＳがセイタカアワダチソウの配列番号１由来の天然ゲルマクレンＤシンターゼである、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ＧＤＳが、天然ゲルマクレンＤシンターゼ、例えばセイタカアワダチソウの配列番号１であり、１つまたは複数の改変：
フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンまたはアラニンによって置換された４０６位のチロシン残基、
フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンまたはアラニン、ただし特にフェニルアラニンによって置換された２７５位のトリプトファン残基、
フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンまたはアラニン、ただし特にフェニルアラニンによって置換された５２４位のチロシン残基を有する、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＧＤＳがフェニルアラニンによって置換された４０６位のチロシン、２７５位のトリプトファン、５２４位のチロシンの１つまたは複数を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
天然ゲルマクレンＤシンターゼ、例えばセイタカアワダチソウの配列番号１を含み、以下の改変：
フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンまたはアラニンによって置換された４０６位のチロシン残基、
フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンまたはアラニン、ただし特にフェニルアラニンによって置換された２７５位のトリプトファン残基、
フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンまたはアラニン、ただし特にフェニルアラニンによって置換された５２４位のチロシン残基
の１つまたは複数を有する、改変されたＧＤＳポリペプチド。
【請求項１７】
ＧＤＳがフェニルアラニンによって置換された４０６位のチロシン、２７５位のトリプトファン、５２４位のチロシンの１つまたは複数を有する、請求項１６に記載の改変されたＧＤＳポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の改変されたＧＤＳポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１８に記載の核酸分子または請求項１９に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質転換した細胞。
【請求項２１】
請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物および適切な担体を含む昆虫忌避組成物であって、ただし一般式（Ｉ）の化合物が（Ｓ）−１４，１５−ジメチルゲルマクレンＤ（すなわち、Ｒ２がメチルである一般式（Ｉ）の化合物）ではない、昆虫忌避組成物。
【請求項２２】
一般式（Ｉ）の化合物が請求項３から５のいずれか一項に記載の化合物である、請求項２１に記載の昆虫忌避組成物。
【請求項２３】
１つまたは複数の追加の昆虫忌避化合物、例えばアレスリン、ＤＥＥＴ（Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド）、ｐ−メンタン−３，８−ジオール（ＰＭＤ）、ピカリジン、ベイレペル（Ｂａｙｒｅｐｅｌ）、ＫＢＲ３０２３、ネペタラクトン、シトロネラ油、ニーム油、ボグミルトル（Ｂｏｇ  Ｍｙｒｔｌｅ）、ジメチルカルベート、トリシクロデセニルアリルエーテル、ＩＲ３５３５（３−［Ｎ−ブチル−Ｎ−アセチル］−アミノプロピオン酸、エチルエステル）またはアンスラニレート系昆虫忌避剤をさらに含む、請求項２１または２２に記載の昆虫忌避組成物。
【請求項２４】
ヒトまたは動物への適用に適した担体を含む、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の昆虫忌避剤。
【請求項２５】
請求項１、２または６から８のいずれか一項に記載の化合物および適切な担体を含む昆虫誘引組成物であって、ただし化合物が（Ｓ）−１５−メチルゲルマクレンＤ（すなわち、Ｒ２が水素である一般式（Ｉ）の化合物）ではない、昆虫誘引組成物。
【請求項２６】
一般式（Ｉ）の化合物が（Ｓ）−１４，１５−ジメチルゲルマクレンＤである、請求項２５に記載の昆虫誘引組成物。
【請求項２７】
殺虫剤をさらに含む、請求項２５または２６に記載の昆虫誘引組成物。
【請求項２８】
昆虫を誘引するのに有効な濃度で一定日数にわたり誘引物質が放出されるように、ゴム、ポリテン、中空ファイバー、プラスチックサンドウィッチ、プラスチックメンブレンおよびセルロース材料からなる群から選択される徐放性媒体をさらに含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の昆虫誘引組成物。
【請求項２９】
請求項２５から２８のいずれか一項に記載の昆虫誘引組成物を含む、昆虫捕獲デバイス。
【請求項３０】
動物または植物における昆虫侵入の処理において使用するための、請求項２１から２８のいずれか一項に記載の昆虫忌避組成物または昆虫誘引組成物。
【請求項３１】
昆虫侵入により影響を受けた領域に請求項２１から２４のいずれか一項に記載の昆虫忌避組成物を提供することを含む、昆虫を撃退する方法。
【請求項３２】
昆虫侵入により影響を受けた領域に請求項２５から２８のいずれか一項に記載の昆虫誘引組成物を提供することを含む、昆虫を誘引する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、嗅覚リガンド、前記嗅覚リガンドを含む組成物、および前記リガンドを製造するための方法に関する。さらに、基質を前記嗅覚リガンドに変換する改変された酵素も開示する。
【背景技術】
【０００２】
増加し続ける世界の人口、およびその結果高まる農産物の需要によって、より有効で改善された植物品種改良および農作物保護方法がますます必要とされている。昆虫等の農作物害虫は相当な収量の低下をもたらし、現在の害虫防除は殺虫剤の適用に依存している。しかしながら、殺虫剤に対する耐性の発達、および人間の健康と環境に対するそれらの頻繁な悪影響によって、現在使用されている化合物の適切な代替化合物の開発が必要となる。
【０００３】
セミオケミカルは、同種または異種の間の同種間および異種間伝達を仲介するクラスの物質である。これらのシグナルが認識されるプロセスは嗅覚と呼ばれ、嗅覚シグナルまたはリガンドが嗅覚認識タンパク質によって認識されるプロセスであり、個々の応答をもたらす。これらの嗅覚認識タンパク質は非常に特異的であり、構造上関連した化合物でさえ識別することができる。セミオケミカルは香料と化粧品または食品と飲料における重要な認識合図であり、害虫、特に昆虫の防除において役割を果たし、したがって非常に需要のある化合物である。しかしながら、通常セミオケミカルは非常に揮発性の高い不安定な化合物であり、それらの化学合成は非常に高価である。
【０００４】
テルペンおよびテルペノイドは、必須の一次分子からより複雑な二次代謝産物に至る、植物で一般に見出される大規模で多様な有機化合物群であり、これらはセミオケミカル性を有することで知られている。テルペノイドを含む殺有害生物剤化合物および製剤はＷＯ２０１３／１９１７５８中に開示される。テルペンおよびテルペノイドは、次いでさらなる改変を受ける炭素骨格を示すイソプレンサブユニットで構成された炭化水素である。主要構成単位イソペンテニル二リン酸（ＩＤＰ）およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＤＰ）を利用して、テルペノイド前駆体ゲラニル二リン酸（ＧＤＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＤＰ）およびゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＤＰ）の合成をもたらす、テルペノイド生合成における初期中心ステップは充分特徴付けられている。テルペンは、そのイソプレンサブユニット数に応じて順に、ヘミテルペン（１つのイソプレンサブユニット）、モノテルペン（２つのイソプレンサブユニット）、セスキテルペン（３つのイソプレンサブユニット）等に分類される。
【０００５】
テルペンおよびテルペノイドは合成による改変の興味深い標的であるが、それら本来の性質の調節によって、改良され変更された機能を有する新たな医療用および農薬化合物をもたらすことができる。多くのテルペノイド、特にセミオケミカル性を有するテルペノイドの炭化水素骨格の複雑性と化学的不安定性は、合成化学者に難題を呈する可能性がある。合成生物学の手法は、生物中の全生化学的経路を利用した天然テルペノイドの調製、または米国特許公開２０１４／０１７３７７１中に開示されたような、昆虫もしくは他の生物を撃退もしくは誘引するための植物中の内在テルペノイド生成の増大に焦点を当てている。しかしながら、テルペノイド合成に関与すると考えられる酵素の基質は細胞中に限定されており、変更された性質を有する改変されたテルペノイドの生成を引き起こさない。
【０００６】
ゲルマクレンＤは、昆虫、特に穀類アブラムシ（シトビオン・アベナエ（Ｓｉｔｏｂｉｏｎ  ａｖｅｎａｅ））等のアブラムシを撃退することが知られており、したがって、改変された特性を有し得るゲルマクレンＤのアナログの生成は興味深い。
【０００７】
Ｃａｓｃｏｎらは、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、４８、９７０２〜９７０４頁（２０１２年）中で、（Ｓ）−ゲルマクレンＤシンターゼ（ＧＤＳ）の基質としてフッ素およびメチル改変ＦＤＰを使用した、様々なゲルマクレンＤアナログの合成を記載している。特定には、彼らは６−Ｆ、１４−Ｆ、１５−Ｆおよび１４−メチルアナログを合成した。
【０００８】
しかしながら、これらのゲルマクレンＤアナログは、ゲルマクレンＤと比較して低い活性を有することが分かった。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の一態様によれば、
一般式（Ｉ）：
【００１０】
【化１】
2018504402.tif 000003
（式中、
Ｒ１がＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピルであり、
Ｒ２がＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピルであり、
Ｒ３がメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピルであり、
Ｒ４がＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピルであり、
Ｒ５がＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピルである）
の（Ｓ）−ゲルマクレンＤアナログを提供する。
【００１１】
Ｃａｓｃｏｎら、（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、４８、９７０２〜９７０４頁（２０１２年））は、１５位（すなわち、前述の一般式（Ｉ）中のＲ３の位置）にメチル基を有する化合物を合成できないことを教示する。しかしながら本発明者らは、Ｃａｓｃｏｎらにより記載された方法の改変法を使用して１５位に置換基を有する化合物を現在首尾よく得ており、それらが非常に驚くべき性質を有することを見出している。
【００１２】
適切には一般式（Ｉ）の化合物中では、Ｒ１はＨ、メチルまたはエチルであり、より適切にはＨまたはメチルである。さらにより適切にはＲ１はＨである。
【００１３】
一般式（Ｉ）の化合物中では、Ｒ２は適切にはＨ、メチルまたはエチルであり、より適切にはＨまたはメチルである。
【００１４】
一般式（Ｉ）の化合物中では、Ｒ３はメチルまたはエチルであり、より適切にはメチルである。
【００１５】
適切には一般式（Ｉ）の化合物中では、Ｒ４はＨ、メチルまたはエチルであり、より適切にはＨまたはメチルである。さらにより適切にはＲ４はＨである。
【００１６】
適切には一般式（Ｉ）の化合物中では、Ｒ５はＨ、メチルまたはエチルであり、より適切にはＨまたはメチルである。さらにより適切にはＲ５はＨである。
【００１７】
Ｒ３がメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピルであり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４が水素である式（Ｉ）の化合物は昆虫忌避特性を有する。
【００１８】
したがって、幾つかの適切な一般式（Ｉ）の化合物中では、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ４のそれぞれがＨであり、
Ｒ３がメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピルであり、
Ｒ５がＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピルである。
【００１９】
より適切には、このような化合物中では、Ｒ５はＨ、メチルまたはエチルであり、特にＨまたはメチルであり、特定にはＨである。
【００２０】
さらにより適切な一般式（Ｉ）の化合物は、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５のそれぞれがＨであり、
Ｒ３がメチルまたはエチルである化合物である。
【００２１】
Ｒ３がメチルでありＲ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５が水素である式（Ｉ）の化合物は、Ｃａｓｃｏｎらによって合成された化合物よりはるかに高い昆虫忌避活性を有することが証明され、したがってこの化合物は非常に適している。
【００２２】
他の適切な式（Ｉ）の化合物は、Ｒ２、Ｒ３およびＲ５のそれぞれが独立してメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピルであり、Ｒ１およびＲ４がＨである化合物である。
【００２３】
より適切には、このような化合物中では、Ｒ５はＨ、メチルまたはエチルであり、特にＨまたはメチルであり、特定にはＨである。
【００２４】
さらにより適切な一般式（Ｉ）の化合物は、
Ｒ１、Ｒ４およびＲ５のそれぞれがＨであり、
Ｒ２およびＲ３のそれぞれが独立してメチルまたはエチルである化合物である。
【００２５】
驚くことに、Ｒ２およびＲ３がいずれもメチルでありＲ１、Ｒ４およびＲ５が水素である一般式（Ｉ）の化合物は逆の活性を示し、強い昆虫誘引特性を有していた。
【００２６】
前に論じたように、非常に適切な一般式（Ｉ）の化合物は、Ｒ３がメチルでありＲ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５が水素である化合物（（Ｓ）−１５−メチルゲルマクレンＤ）、またはＲ２およびＲ３がいずれもメチルでありＲ１、Ｒ４およびＲ５が水素である化合物（（Ｓ）−１４，１５−ジメチルゲルマクレンＤ）である。
【００２７】
一般式（Ｉ）の化合物は、
一般式（ＩＩ）：
【００２８】
【化２】
2018504402.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は一般式（Ｉ）で定義した通りである）
のファルネシル二リン酸アナログまたはその塩を、ゲルマクレンＤシンターゼ（ＧＤＳ）とインキュベートすることにより合成することができる。
【００２９】
適切にはゲルマクレンＤシンターゼは組換え（Ｓ）−ゲルマクレンＤシンターゼポリペプチドであり、これは任意の適切な生物、例えば大腸菌において生成される組換えポリペプチドであってよい。
【００３０】
組換えＧＤＳはＮまたはＣ末端にタグ配列、特定にはポリヒスチジンタグを含むことができる。適切には、ＧＤＳはＣ末端ポリヒスチジンタグ、例えばヘキサヒスチジンタグを含むことができる。
【００３１】
Ｃａｓｃｏｎらの教示に反して、本発明者らは、セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）の配列番号１由来の天然ゲルマクレンＤシンターゼ（Ｉ．Ｐｒｏｓｓｅｒら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２年、６０、６９１〜７０２頁；Ｃ．Ｏ．Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ、１９９９年、１１、３５３〜３６２頁；Ｎ．ＢｕｌｏｗおよびＷ．Ａ．Ｋｏｎｉｎｇ、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０００年、５５、１４１〜１６８頁）を使用して、少量の一般式（Ｉ）の化合物を入手できることを発見している。
【００３２】
しかしながら、合理的手法を使用し（Ｓ）−ゲルマクレンＤシンターゼ（ＧＤＳ）の化学生物学的性質を活用することによって、新規な基質に関する立体障害の特異的様相を減らすことにより、改善された基質のドッキングを行うことができる。したがって、ＧＤＳと５−エピ−アリストロチェンシンターゼの配列アライメント、および活性部位またはその近辺の芳香族残基の比較によって、本発明者らは、触媒サイクル中基質に極めて近接している可能性がある残基を同定することができた。特定には、ＧＤＳのＹ４０６は５−エピ−アリストロチェンシンターゼ中のＹ４０４に対応する保存残基であり、正確な閉環の発生の保証におそらく関与し、したがって活性部位内の折りたたみ構造ファルネシル鎖の両末端に近接する。このように、（Ｓ）−ゲルマクレンＤの１４および１５位置における水素原子はＧＤＳのＹ４０６およびその電離電子軌道と隣接しているので、このチロシンは、立体的には小さいが電子密度の点で類似したフェニルアラニンによって置換され得る。実際、この部位特異的突然変異導入酵素、（Ｓ）−ゲルマクレンＤシンターゼ、Ｙ４０６Ｆは特に一般式（Ｉ）の化合物の生成に関してシンターゼとしてさらに相当有効であり、Ｒ２がＨである化合物とＲ２がメチルである化合物を、それぞれ４５％と７３％の単離収率で、この改変された酵素を使用して生成した。
【００３３】
したがって、一般式（Ｉ）の化合物の生成において使用するＧＤＳ酵素は、天然酵素の４０６位におけるチロシン残基の代わりに代替の残基を有するように改変することが適切である。チロシン残基は、より小さな残基、例えばフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンまたはアラニンによって置換されることが適切であり、フェニルアラニンが特に適切である。
【００３４】
改変されたＧＤＳポリペプチドは本発明のさらなる態様を形成する。
【００３５】
本発明の他のさらなる態様では、
改変されたＧＤＳポリペプチドをコードする核酸配列、
その核酸配列を含むベクター、および
核酸分子またはベクターでトランスフェクトまたは形質転換した細胞を提供する。
【００３６】
ベクターは、本発明による核酸分子を発現するよう適合させた、発現ベクターであることが適切である。
【００３７】
細胞は真核生物細胞または原核生物細胞であってよい。例えば、細胞は真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、細菌細胞からなる群から選択することができる。
【００３８】
適切な細菌細胞および真菌細胞は大腸菌細胞およびサッカロミセスセレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞を含み、大腸菌細胞が特に適している。
【００３９】
本発明による方法における生物として微生物を使用する場合、宿主生物に応じて当業者が熟知している方法で、それらを増殖または培養する。原則として、０℃と１００℃の間、好ましくは１０℃と６０℃の間の温度で、酸素を供給しながら、通常は糖、窒素源の型で、通常は酵母エキス等の有機窒素源、または硫酸アンモニウム等の塩、鉄塩、マンガン塩およびマグネシウム塩等の微量元素の型で炭素源、ならびに適切な場合はビタミンを含む液体培地中で微生物を増殖させる。
【００４０】
液体培地のｐＨは培養期間中一定に保ってよい、すなわち調節してよい、または調節しなくてもよい。培養物はバッチ形式、半バッチ形式または連続的に増殖することができる。半連続的もしくは連続的に発酵または供給の初期に、栄養分を提供することができる。生成した生成物は、当業者に知られている方法によって、例えば抽出、蒸留、結晶化、適切な場合は塩との沈殿、および／またはクロマトグラフィーによって、前に記載したように生物から単離することができる。この目的のため、生物は事前に破壊できることが有利である。このプロセス中、ｐＨ値はｐＨ４と１２の間、好ましくはｐＨ６と９の間、特に好ましくはｐＨ７と８の間に保つことが有利である。
【００４１】
公知の培養法の概要は、Ｃｈｍｉｅｌによる教則本（Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ１．Ｅｉｎｆｕｈｒｕｎｇ  ｉｎ  ｄｉｅ  Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ［Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］（Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、１９９１））中、またはＳｔｏｒｈａｓによる教則本（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ  ｕｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ  Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ［Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ］（Ｖｉｅｗｅｇ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、１９９４年））中に見出すことができる。
【００４２】
使用する培養培地は、問題の菌株の要件に適切に見合わなければならない。様々な微生物用の培養培地の記載は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ、ＵＳＡ、１９８１年）の教則本「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」中に見出すことができる。
【００４３】
前に記載したように、本発明に従い利用することができるこれらの培地は、１つまたは複数の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび／または微量元素を通常含む。
【００４４】
好ましい炭素源は単糖、二糖または多糖等の糖類である。炭素源の例はグルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、スターチまたはセルロースである。糖精製由来の糖蜜または他の副生成物等の複合体化合物を介して、糖を培地に加えることもできる。様々な炭素源の混合物の添加も有利であり得る。他の考えられる炭素源は、例えばダイズ油、ヒマワリ油、ピーナッツ油および／またはココナッツファット、例えばパルミチン酸、ステアリン酸および／またはリノール酸等の脂肪酸等の油と脂肪、例えばグリセロール、メタノールおよび／またはエタノール等のアルコールおよび／または多価アルコール、および／または例えば酢酸および／または乳酸等の有機酸である。窒素源は通常、有機もしくは無機窒素化合物、またはこれらの化合物を含む物質である。窒素源の例は、溶液状もしくは気体状のアンモニア、または硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムもしくは硝酸アンモニウム等のアンモニウム塩、他の硝酸塩、尿素、アミノ酸、またはコーンスティープリカー、ダイズ粉末、ダイズタンパク質、酵母エキス、肉エキスおよびその他などの複合窒素源を含む。窒素源は個別に、または混合物として使用することができる。
【００４５】
培地中に存在し得る無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、亜リン酸塩および硫酸塩を含む。
【００４６】
例えば硫酸塩、亜硫酸塩、ジチオナイト、テトラチオネート、チオサルフェート、硫化物等の無機硫黄含有化合物、またはメルカプタン（チオール）等の他の有機硫黄化合物を、硫黄含有ファインケミカル、特にメチオニンを生成するための硫黄源として使用することができる。
【００４７】
リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム含有塩を亜リン酸塩源として使用することができる。
【００４８】
溶液中に金属イオンを保つために、キレート化剤を培地に加えることができる。特に適切なキレート化剤は、カテコールまたはプロトカテキュエート等のジヒドロキシフェノール、およびクエン酸等の有機酸を含む。
【００４９】
微生物を培養するため本発明に従い使用する発酵培地は、ビタミン等の他の増殖因子、または例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテネートおよびピリドキシンを含めた増殖プロモーターも通常含む。増殖因子と塩は、例えば酵母エキス、糖蜜、コーンスティープリカー等の複合培地成分に由来することが多い。さらに、適切な前駆体を培養培地に加えることができる。培地化合物の正確な組成は個々の実験に大きく依存し、それぞれの具体例に関して個別に決定される。培地の最適化に関する情報は、教則本「Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｐ．Ｍ．Ｒｈｏｄｅｓ、Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７年）５３〜７３頁、ＩＳＢＮ０１９９６３５７７３）中に見出すことができる。増殖培地、例えばＳｔａｎｄａｒｄ１（Ｍｅｒｃｋ）またはＢＨＩ（脳心臓輸液用、ＤＩＦＣＯ）等は供給業者から得ることもできる。
【００５０】
全ての培地成分は、熱（１．５バールおよび１２１℃で２０分）または濾過滅菌のいずれかにより滅菌する。成分は一括して、または必要な場合は別々のいずれかで滅菌することができる。全ての培地成分は培養の開始時に存在してよく、または望む場合、連続的もしくはバッチ形式で加えることができる。
【００５１】
培養温度は通常１５℃と４５℃の間、好ましくは２５℃〜４０℃であり、一定に保つことができ、または実験中に変えることができる。培地のｐＨは５〜８．５の範囲でなければならず、約７．０であることが好ましい。培養に関するｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアおよびアンモニア水等の塩基性化合物、またはリン酸もしくは硫酸等の酸性化合物を加えることにより、培養中に調節することができる。例えば脂肪酸ポリグリコールエステル等の消泡剤を利用することにより、泡立ちを調節することができる。プラスミドの安定性を維持するため、選択的効果を有する適切な物質、例えば抗生物質を培地に加えることができる。有酸素状態は、酸素または酸素含有気体混合物、例えば周囲空気等を培養物中に導入することによって維持する。培養物の温度は通常２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃である。所望生成物の形成が最大になるまで培養を続ける。この目的は通常１０〜１６０時間以内に達成される。
【００５２】
このようにして得た発酵ブロス、特に多価不飽和脂肪酸を含む発酵ブロスは、７．５重量％〜２５重量％の乾燥質量を通常含有する。
【００５３】
次いで発酵ブロスをさらに処理することができる。バイオマスは、要件に従い、例えば遠心分離、濾過、デキャンティング等の分離法、またはこれらの方法の組合せによって発酵ブロスから完全または部分的に除去することができ、または前記ブロス中に完全に放置することができる。バイオマスはその分離後に処理することが有利である。
【００５４】
しかしながら、発酵ブロスは、例えば、ロータリーエバポレーター、薄膜式エバポレーター、落下膜式エバポレーターの使用、逆浸透、またはナノ濾過等公知の方法を使用して、細胞を分離せずに濃厚化または濃縮することもできる。最後に、この濃縮発酵ブロスを処理して中に存在した脂肪酸を得ることができる。
【００５５】
前に論じたように、一般式（Ｉ）の化合物はセミオケミカル性を有し、昆虫忌避剤または昆虫誘引物質のいずれかとして作用する。
【００５６】
したがって、本発明のさらなる態様では、一般式（Ｉ）の化合物が（Ｓ）−１４，１５−ジメチルゲルマクレンＤ（すなわち、Ｒ２とＲ３がメチルでありＲ１、Ｒ４およびＲ５がＨである一般式（Ｉ）の化合物）ではないという条件で、前に定義した一般式（Ｉ）の化合物および適切な担体を含む昆虫忌避組成物を提供する。
【００５７】
用語「担体」は、活性成分と組合せて適用を容易にする、天然または合成の有機または無機成分を示す。本発明による組成物は固体または流体であってよく、流体は気体状と液体状を含む。
【００５８】
昆虫忌避組成物において使用するのに適した一般式（Ｉ）の化合物は、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ４のそれぞれがＨであり、
Ｒ３がメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピルであり、
Ｒ５がＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピルである化合物である。
【００５９】
昆虫忌避組成物において、より適切には、一般式（Ｉ）のＲ５はＨ、メチルまたはエチルであり、特にＨまたはメチルであり、特定にはＨである。
【００６０】
昆虫忌避組成物において使用するのにさらにより適した一般式（Ｉ）の化合物は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５のそれぞれがＨでありＲ３がメチルまたはエチルである化合物である。昆虫忌避組成物において、一般式（Ｉ）の化合物は、（Ｓ）−１５−メチルゲルマクレンＤ、すなわちＲ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５がＨでありＲ３がメチルである一般式（Ｉ）の化合物であることが最適である。
【００６１】
昆虫忌避組成物は、１つまたは複数の追加の昆虫忌避化合物、例えばアレスリン、ＤＥＥＴ（Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド）、ｐ−メンタン−３，８−ジオール（ＰＭＤ）、ピカリジン、ベイレペル（Ｂａｙｒｅｐｅｌ）、ＫＢＲ３０２３、ネペタラクトン、シトロネラ油、ニーム油、ボグミルトル（Ｂｏｇ  Ｍｙｒｔｌｅ）、ジメチルカルベート、トリシクロデセニルアリルエーテル、ＩＲ３５３５（３−［Ｎ−ブチル−Ｎ−アセチル］−アミノプロピオン酸、エチルエステル）またはアンスラニレート系昆虫忌避剤を含有することができる。
【００６２】
一実施形態では、昆虫忌避組成物はヒトまたは動物への適用、例えば皮膚への適用に適したものであってよく、この場合、担体は皮膚への医薬的または獣医学的適用に適している。
【００６３】
代替の実施形態では、式（Ｉ）の化合物が（Ｓ）−１５−メチルゲルマクレンＤ（すなわち、Ｒ２が水素である一般式（Ｉ）の化合物）ではないという条件で、式（Ｉ）の化合物および適切な担体を含む昆虫誘引組成物を提供する。
【００６４】
担体は昆虫忌避組成物に関して前に記載したものであってよい。
【００６５】
昆虫誘引組成物において使用するのに適した式（Ｉ）の化合物は、Ｒ２、Ｒ３およびＲ５のそれぞれが独立してメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピルであり、Ｒ１およびＲ４がいずれもＨである化合物である。
【００６６】
昆虫誘引組成物において使用するのにより適した一般式（Ｉ）の化合物では、
Ｒ１とＲ４のそれぞれがＨであり、
Ｒ２とＲ３のそれぞれが独立してメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピルであり、Ｒ５がＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピルまたはシクロプロピル、ただし特にＨである。
【００６７】
昆虫誘引組成物において使用するのに特に適した一般式（Ｉ）の化合物は、
Ｒ１、Ｒ４およびＲ５のそれぞれがＨであり、
Ｒ２およびＲ３のそれぞれが独立してメチルまたはエチルである化合物である。
【００６８】
昆虫誘引組成物では、一般式（Ｉ）の化合物は、（Ｓ）−１４，１５−ジメチルゲルマクレンＤ、すなわちＲ１、Ｒ４およびＲ５のそれぞれがＨでありＲ２およびＲ３のそれぞれがメチルである化合物であることが適切である。
【００６９】
幾つかの場合、昆虫誘引組成物は殺虫剤も含む。
【００７０】
殺虫剤は、昆虫に対して毒性があり農業、公衆衛生、産業、ならびに家事および商業用途に広範囲の適用がある物質である。典型的には、殺虫剤はそれらの構造および作用形式に基づいて分類される。例えば、多くの殺虫剤は昆虫の神経系に働きかけ（例えばコリンエステラーゼ（ＣｈＥ）阻害）、一方他の殺虫剤は増殖調節因子またはエンドトキシンとして働きかける。
【００７１】
さらに、昆虫誘引組成物は、昆虫を誘引するのに有効な濃度で一定日数にわたり誘引物質が放出されるように、ゴム、ポリテン、中空ファイバー、プラスチックサンドウィッチ、プラスチックメンブレンおよびセルロース材料からなる群から選択される徐放性媒体を含むことができる。
【００７２】
本発明の昆虫誘引組成物は昆虫捕獲デバイスと組合せて使用することができ、したがって本発明のさらなる態様では、本発明の昆虫誘引組成物を含む昆虫捕獲デバイスを提供する。
【００７３】
昆虫誘引組成物は、昆虫、例えば蟻、ゴキブリ、ハエ、アブラムシ、蚊または蛾の餌として作用する。特定には、組成物は穀類アブラムシ（シトビオン・アベナエ（Ｓｉｔｏｂｉｏｎ  ａｖｅｎａｅ））等のアブラムシの誘引物質であってよい。
【００７４】
幾つかの場合、組成物は前に記載した徐放性媒体を含有する徐放性組成物であってよい。
【００７５】
昆虫捕獲デバイスは殺虫剤も含むことができ、殺虫剤は昆虫誘引組成物中に含まれ得るか、または代替的に別の組成物として提供することができる。
【００７６】
本発明の一態様によれば、動物または植物における昆虫侵入の処理において使用するための本発明による組成物を提供する。組成物は忌避組成物であってよく、この場合組成物は動物または植物に適用することができる。あるいは、組成物は誘引性組成物であってよく、この場合組成物は、植物近辺の部位、例えば昆虫捕獲デバイス中に適用することができる。
【００７７】
昆虫侵入を被る動物は哺乳動物である可能性があり、それはヒト、またはネコ、イヌ、げっ歯類、蓄牛、ヒツジ、家禽類またはブタ等の非ヒト哺乳動物のいずれかであり得る。
【００７８】
昆虫侵入を被る植物は樹木植物、例えばポプラ、ユーカリノキ、ダグラスファー、マツ、ウォルナット、トネリコ、カバノキ、オーク、チークノキ、トウヒであってよい。あるいは植物は、穀類植物、例えばコーン（ギョクショクショ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ））、キャノーラ（セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ブラッシカラパ亜種（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｓｓｐ．））、アルファルファ（ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ））、コメ（食用作物稲種（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ））、ライ（ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒａｌｅ））、モロコシ（ソルガムビコロ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、ソルガムブルガレ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））、ヒマワリ（ヒグルマ（ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕａｓ））、コムギ（トリチウムアエスチブム（Ｔｒｉｔｉｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ））、ダイズ（グリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ））、タバコ（ナス科タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））、ジャガイモ（バレイショ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））、ピーナッツ（ナンキンマメ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ））、コットン（ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ））、サツマイモ（アメリカイモ（ｌｏｐｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ））、カッサバ（マニオク（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ））、コーヒー（コーヒーノキ亜種（Ｃｏｆｅａ  ｓｐｐ．））、ココナッツ（ココヤシ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ））、パインアップル（パイナップル（Ａｎａｎａ  ｃｏｍｏｓｕｓ））、カンキツ系樹木（シトラス亜種（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｐ．））、ココア（チョコレートノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ））、茶（チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｅｎｅｎｓｉｓ））、バナナ（甘蔗亜種（Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．））、アボカド（ワニナシ（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ））、イチジク（クワ科イチジク属（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ））、グアヴァ（バンジロウ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ））、マンゴー（ウルシ科マンゴー属（Ｍａｎｇｉｆｅｒ  ｉｎｄｉｃａ））、オリーブ（オリーブノキ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ））、パパイヤ（チチウリノキ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ））、カシュー（カシューナットノキ（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ））、マカダミア（マカダミアインテグリフォリア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｒｇｒｉｆｏｌｉａ））、アーモンド（アメンドウ（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ））、テンサイ（サトウダイコン（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））、オートムギ、オオムギ、野菜および観賞植物から選択することができる。
【００７９】
本発明の組成物は、穀類植物（例えば、穀類と豆類、メイズ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ジャガイモ、タピオカ、コメ、モロコシ、キビ、カッサバ、オオムギ、エンドウマメ、例えばコットン、ダイズ、ベニバナ、ヒマワリ、アブラナ、メイズ、アルファルファ、ヤシ、ココナッツ等の脂肪種子植物、またはマメ科植物および他の根系、塊茎もしくは種子穀物の保護に使用することがより適切である。重要な種子穀物は、脂肪種子ナタネ、テンサイ、メイズ、ヒマワリ、ダイズ、およびモロコシである。本発明を適用することができる園芸植物は、レタス、エンダイブ、ならびにキャベツ、ブロッコリ、およびカリフラワーを含めたアブラナ科の野菜、およびカーネーションとフウロソウを含み得る。本発明は、タバコ、ウリ科、ニンジン、イチゴ、ヒマワリ、トマト、コショウ、キク属に適用することができる。マメ科植物にはインゲンマメとエンドウマメが含まれる。インゲンマメには、グアール、イナゴマメ、コロハ、ダイズ、ガーデンビーン、カウピー、ヤエナリ、ライマメ、ソラマメ、レンズマメ、ヒヨコマメ等が含まれる。
【００８０】
本発明の一態様によれば、昆虫侵入により影響を受けた領域に本発明による昆虫忌避組成物を提供することを含む、昆虫を撃退する方法を提供する。
【００８１】
本発明の一態様によれば、昆虫侵入により影響を受けた領域に本発明による昆虫誘引組成物を提供することを含む、昆虫を誘引する方法を提供する。
【００８２】
本明細書中、語彙または必要な含意を表すため文脈が他に必要とする場合を除き、語句「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」等の変形は包括的な意味で使用して、すなわち言及した特徴の存在を明示するが、本発明の様々な実施形態におけるさらなる特徴の存在または追加を除外するわけではない。
【００８３】
ここで本発明を、実施例および図面を参照してより詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】１４，１５−ジメチルファルネシル二リン酸（Ｒ１、Ｒ４およびＲ５がＨでありＲ２およびＲ３がメチルである一般式（ＩＩ）の化合物）とＹ４０６Ｆ−ＧＤＳ−Ｈｉｓ６のインキュベーション由来のペンタン抽出可能生成物のガスクロマトグラムの図である。３２．８３分で溶出した（Ｓ）−１４，１５−ジメチルゲルマクレンＤ（Ｒ１、Ｒ４およびＲ５がＨでありＲ２およびＲ３がメチルである一般式（Ｉ）の化合物）。
【図２】１４，１５−ジメチルファルネシル二リン酸とＹ４０６Ｆ−ＧＤＳ−Ｈｉｓ６のインキュベーション由来の３２．８３分で溶出した生成物の質量スペクトルの図である。
【図３】１５−ジメチルファルネシル二リン酸（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５がＨでありＲ３がメチルである一般式（ＩＩ）の化合物）とＹ４０６Ｆ−ＧＤＳ−Ｈｉｓ６のインキュベーション由来のペンタン抽出可能生成物のガスクロマトグラムの図である。２９．５４分で溶出した１５−メチル（Ｓ）−ゲルマクレンＤ（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５がＨでありＲ３がメチルである一般式（Ｉ）の化合物）。
【図４】１５−ジメチルファルネシル二リン酸とＹ４０６Ｆ−ＧＤＳ−Ｈｉｓ６のインキュベーション由来の２９．５４分で溶出した生成物の質量スペクトルの図である。
【図５】１２−メチルファルネシル二リン酸（Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５がＨでありＲ１がメチルである一般式（ＩＩ）と類似した化合物）のインキュベーション由来のペンタン抽出可能生成物のガスクロマトグラムの図である。２９．３５分で溶出したゲルマクレンＤアナログ（Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５がＨでありＲ１がメチルである一般式（Ｉ）と類似した化合物）。
【図６】穀類アブラムシ、シトビオン・アベナエを用いた結合型ガスクロマトグラフィーエレクトロアンテノグラフィー（ＧＣ−ＥＡＧ）の図である。上部トレース＝ＥＡＧ応答、下部トレース＝ＧＣ応答。Ａ−（Ｓ）−ゲルマクレンＤ（比較化合物Ｉａ）、Ｂ−（Ｒ）−ゲルマクレンＤ（ＩＩＩ）、Ｃ−（Ｓ）−１４−メチルゲルマクレンＤ（Ｄ−（Ｓ）−１２−メチルゲルマクレンＤ、Ｅ−（Ｓ）−１５−メチルゲルマクレンＤ、Ｆ−（Ｓ）−１４，１５−ジメチルゲルマクレンＤ（Ｒ２およびＲ３がメチルである一般式（Ｉ）の化合物）、Ｇ−（Ｓ）−１−フルオロゲルマクレンＤ、Ｈ−ゲルマクレン（ＩＶ）。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
材料および方法
他に言及しない限り、全ての化学物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。他に言及しない限り、全てが分析可能な品質以上であり受領した通りに使用した。
【００８６】
１Ｈ、３１Ｐおよび１３ＣのＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ（登録商標）ＡｖａｎｃｅＩＩＩ６００ＮＭＲ分光光度計、Ｂｒｕｋｅｒ（登録商標）Ａｖａｎｃｅ５００ＮＭＲ分光光度計、またはＢｒｕｋｅｒ（登録商標）ＡｖａｎｃｅＤＰＸ４００ＮＭＲ分光光度計で測定し、それぞれテトラメチルシランから下の百万分率単位の化学シフト値、多重度（ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｑ＝四重項、ｍ＝多重項）、（ほぼ０．５Ｈｚまでの）結合定数およびアサインメントとして報告した。アサインメントはＣＯＳＹ、ＤＥＰＴ９０／１３５、勾配ＨＳＱＣおよび勾配ＨＭＢＣスペクトルに限定する。ＣＤＣｌ３はＮＭＲ分光分析で使用する前に塩基性アルミナを介して濾過した。ＥＩ＋質量スペクトルは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ（商標）ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ（商標）ＸＥ質量分光光度計（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）で測定した。ＧＣＭＳは、Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＤＢ−５ＭＳカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ内径）および０．９秒のスキャンタイムで１秒に１回スキャンするＥＩ＋モードで範囲ｍ／ｚ５０〜８００を検出するＭｉｃｒｏｍａｓｓ（商標）ＧＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ（商標）を備える、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）６８９０ＧＣで実施した。注入は５０℃においてスプリットモード（スプリット比５：１）で実施した。クロマトグラムは（他に言及しない限り）５０℃のオーブン温度で開始し、２５分間１分あたり４℃（１５０℃まで）、および次いで５分間１分あたり２０℃上昇させた（最終温度２５０℃）。
【００８７】
タンパク質の調製と精製
組換えゲルマクレンＤシンターゼおよび突然変異体をＣ末端Ｈｉｓ−タグ融合タンパク質として大腸菌（ＤＥ３）Ｓｔａｒにおいて過剰生成させ、Ｃａｓｃｏｎ，Ｏ．ら、Ｃｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｒｍａｃｒｅｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、４８、９７０２〜９７０４頁（２０１２年）によって記載されたように、Ｎｉ２＋−アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【００８８】
組換えＧＤＳの部位特異的突然変異誘発
製造者の説明書に従い、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して所望の突然変異を導入した。突然変異誘発に使用したプライマーは以下の通りであった：
５’ＣＴＧＧＴＡＧＡＧＣＴＧＴＡＣＴＴＴＧＣＧＧＴＡＣＴＧＧＧＣＧＴＴＴＡＴＴＴＣ  ３’（配列番号２）および
５’ＧＡＡＡＴＡＡＡＣＧＣＣＣＡＧＴＡＣＣＧＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＣＴＣＴＡＣＣＡＧ  ３’（配列番号３）をＷ２７５Ａに対して；
５’ＣＴＧＧＴＡＧＡＧＣＴＧＴＡＣＴＴＴＣＴＧＧＴＡＣＴＧＧＧＣＧＴＴＴＡＴＴＴＣ  ３’（配列番号４）および
５’ＧＡＡＡＴＡＡＡＣＧＣＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＡＡＡＧＴＡＣＡＧＣＴＣＴＡＣＣＡＧ  ３’（配列番号５）をＷ２７５Ｌに対して；
５’ＧＧＴＡＧＡＧＣＴＧＴＡＣＴＴＴＴＴＣＧＴＡＣＴＧＧＧＣＧＴＴＴＡＴＴＴＣ  ３’（配列番号６）および
５’ＧＡＡＡＴＡＡＡＣＧＣＣＣＡＧＴＡＣＧＡＡＡＡＡＧＴＡＣＡＧＣＴＣＴＡＣＣ  ３’（配列番号７）をＷ２７５Ｆに対して；
５’ＣＧＴＧＡＴＣＧＡＣＡＴＧＣＴＧＧＣＧＡＡＧＡＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣ  ３’（配列番号８）および
５’ＧＧＴＴＧＴＣＧＴＣＡＴＴＣＴＴＣＧＣＣＡＧＣＡＴＧＴＣＧＡＴＣＡＣＧ  ３’（配列番号９）をＹ５２４Ａに対して；
５’ＧＣＧＴＧＡＴＣＧＡＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣ  ３’（配列番号１０）および
５’ＧＧＴＴＧＴＣＧＴＣＡＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣＧＡＴＣＡＣＧＣ  ３’（配列番号１１）をＹ５２４Ｌに対して；
５’ＧＴＧＡＴＣＧＡＣＡＴＧＣＴＧＴＴＣＡＡＧＡＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＣ  ３’（配列番号１２）および
５’ＧＴＴＧＴＣＧＴＣＡＴＴＣＴＴＧＡＡＣＡＧＣＡＴＧＴＣＧＡＴＣＡＣ  ３’（配列番号１３）をＹ５２４Ｆに対して；
５’ＧＡＡＴＣＴＧＡＣＧＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＣＧＡＣＧ  ３’（配列番号１４）および
５’ＣＧＴＣＧＴＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＡＣＣＣＧＴＣＡＧＡＴＴＣ  ３’（配列番号１５）をＹ４０６Ｓに対して；
ＧＡＡＴＣＴＧＡＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＣＧＡＣＧ  ３’（配列番号１６）および
５’ＣＧＴＣＧＴＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＣＧＴＣＡＧＡＴＴＣ  ３’（配列番号１７）をＹ４０６Ｇに対して；
５’ＧＡＡＴＣＴＧＡＣＧＧＧＴＧＧＣＧＣＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＣＧＡＣＧ  ３’（配列番号１８）および
５’ＣＧＴＣＧＴＣＡＧＣＡＴＴＴＴＣＧＣＧＣＣＡＣＣＣＧＴＣＡＧＡＴＴＣ  ３’（配列番号１９）をＹ４０６Ａに対して；
５’ＧＡＡＴＣＴＧＡＣＧＧＧＴＧＧＣＧＴＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＣＧＡＣＧ  ３’（配列番号２０）および
５’ＣＧＴＣＧＴＣＡＧＣＡＴＴＴＴＣＡＣＧＣＣＡＣＣＣＧＴＣＡＧＡＴＴＣ  ３’（配列番号２１）をＹ４０６Ｖに対して；
５’ＧＡＡＴＣＴＧＡＣＧＧＧＴＧＧＣＡＴＴＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＣＧＡＣＧ  ３’（配列番号２２）および
５’ＣＧＴＣＧＴＣＡＧＣＡＴＴＴＴＡＡＴＧＣＣＡＣＣＣＧＴＣＡＧＡＴＴＣ  ３’（配列番号２３）をＹ４０６Ｉに対して；
５’ＧＡＡＴＣＴＧＡＣＧＧＧＴＧＧＣＣＴＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＣＧＡＣＧ  ３’（配列番号２４）および
５’ＣＧＴＣＧＴＣＡＧＣＡＴＴＴＴＣＡＧＧＣＣＡＣＣＣＧＴＣＡＧＡＴＴＣ  ３’（配列番号２５）をＹ４０６Ｌに対して；
５’ＧＡＡＴＣＴＧＡＣＧＧＧＴＧＧＣＴＴＴＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＣＧＡＣＧ  ３’（配列番号２６）および
５’ＣＧＴＣＧＴＣＡＧＣＡＴＴＴＴＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＧＴＣＡＧＡＴＴＣ  ３’（配列番号２７）をＹ４０６Ｆに対して；
５’ＣＴＧＡＣＧＧＧＴＧＧＣＴＧＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＣＧＡＣ  ３’（配列番号２８）および
５’ＧＴＣＧＴＣＡＧＣＡＴＴＴＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＧＴＣＡＧ  ３’（配列番号２９）をＹ４０６Ｗに対して。
【００８９】
製造者によって記載されたようにＱＩＡＧＥＮ  ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して、一晩培養物（アンピシリン５０μｍｏｌ／ｍＬを含有する１０ｍＬのＬＢ培地）からプラスミドを精製した。内部のＷａｌｅｓｂｉｏｇｒｉｄ施設（Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｒｄｉｆｆ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＫ）を使用したＤＮＡ配列分析によって突然変異を確認した。
【実施例１】
【００９０】
１４，１５−ジメチルファルネシル二リン酸（ＩＩｇ）の合成
反応スキーム１に従いβ−ケトエステルＶから表題の化合物を調製した。
【００９１】
【化３】
2018504402.tif 000005
【００９２】
Ａ．（２Ｅ，６Ｅ）エチル３，７−ジエチル−１１−メチルドデカ−２，６，１０−トリエノエート（ＶＩＩ）の合成
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（３８ｍＬ）中のＶ（Ｃａｓｃｏｎら、ＣｈｅｍＰｌｕｓＣｈｅｍ７８、１３３４〜１３３７頁（２０１３年））、（０．３５ｇ、１．５０ｍｍｏｌ）およびトリフルオロメタンスルホン酸リチウム（０．７８ｇ、５．０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、０℃でアルゴン下において、トリエチルアミン（０．７ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ）、次にトリフルオロメタンスルホン酸無水物（０．３２ｍＬ、１．９０ｍｍｏｌ）を加えた。飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（２０ｍＬ）を加えてクエンチする前に、２時間０℃で混合物を撹拌した。この混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し分離水相をＣＨ２Ｃｌ２（２×１０ｍＬ）で抽出した。プールした有機抽出物は、減圧下での乾燥（ＭｇＳＯ４）、濾過および濃縮前に水（３０ｍＬ）とブライン（３０ｍＬ）で洗浄した。これにより黒い油状物としてエノールトリフレートＶＩを得て、これはさらに精製せずに直接使用した（０．５８ｇ、８３％）。
【００９３】
ＴＨＦ（１２ｍＬ）中のＣｕｌ（０．９５ｇ、５．００ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、０℃で臭化エチルマグネシウム（３．０Ｍ溶液、ジエチルエーテル中、３．３３ｍＬ、１０．０ｍｍｏｌ）を一滴ずつ加えた。溶液は３０分間撹拌し、その結果不透明な黒色が形成された。次いで撹拌反応物を−７８℃に冷却し、無水ＴＨＦ（４ｍＬ）中のＶＩ（０．５８ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）の溶液をニードルによって加え、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（２０ｍＬ）を加えてクエンチする前に、２．５時間この温度で反応物を撹拌した。生成したエマルジョンは濃縮ＮＨ４ＯＨ水溶液を加えることによって溶かし、一晩撹拌した。分離水性層は酢酸エチル（３×１０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出物は減圧下での乾燥（ＭｇＳＯ４）、濾過および濃縮前に水（２×３０ｍＬ）とブライン（３０ｍＬ）で洗浄した。残留油状物はシリカゲルでフラッシュクロマトグラフィーにより精製した（１９：１ヘキサン；酢酸エチル）。表題の化合物は無色の油状物として単離した（１８５ｍｇ、５２％）。
【００９４】
ＨＲＭＳ（ｍ／ｚＥＳ＋）：Ｃ１９Ｈ３２Ｏ２に関する計算値２９２．２４０２、実測値２９２．２４０７；
δＨ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）０．９５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｃ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ３），１．０７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５  Ｃ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ３），１．２７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，  ＯＣＨ２ＣＨ３），１．５９（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３Ｃ＝ＣＨ），１．６７（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３Ｃ＝ＣＨ），１．９８−２．０５および２．０３−２．０４（１２Ｈ，ｍ，２×ＣＨ２ＣＨ２および２×ＣＨ＝ＣＣＨ２ＣＨ３），４．２５（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，ＯＣＨ２ＣＨ３），５．０１−５．２０（２Ｈ，ｍ，２×Ｃ＝ＣＨ），５．７２（１Ｈ，ｓ，Ｃ＝ＣＨＣＯ２Ｅｔ）；  
δＣ（６２．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１２．９７，１３．１８，１４．２９，１７．６８および２３．１５（ＣＨ３），２５．３４，２５．６７，２５．７８，２６．８４，３６．４３，３８，２７および５９．１３（ＣＨ２），１１４．７９，１２２．５１および１２４．３１（３×Ｃ＝ＣＨ），１３１．３３  １４１．９１および１６５．５３（３×Ｃ＝ＣＨ），１６６．４５（Ｃ＝Ｏ）。
【００９５】
Ｂ．（２Ｅ，６Ｅ）３，７−ジエチル−１１−メチルドデカ−２，６，１０−トリエノール（ＶＩＩＩ）の合成
トルエン（３．１ｍＬ）中のＶＩＩ（０．１８ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、−７８℃でＤＩＢＡＬ−Ｈ（１．５Ｍトルエン中、１．３０ｍＬ、１．８０ｍｍｏｌ）を加え、溶液はこの温度で２時間撹拌した。反応物は２ＭのＨＣｌ（１０ｍＬ）を加えることによりクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）で希釈し室温で１時間撹拌した。水性層をＣＨ２Ｃｌ２（２×１０ｍＬ）で抽出し、プールした有機層は飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３×１０ｍＬ）、ブライン（２×１５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水し次いで減圧下で濃縮した。粗生成物はシリカゲルでフラッシュクロマトグラフィーにより精製し（３：１ヘキサン−酢酸エチルで溶出）、無色の油状物として表題の化合物を得た（０．１６ｍｇ、７３％収率）。
【００９６】
ＨＲＭＳ（ｍ／ｚＡＰＣＩ［Ｍ＋Ｈ＋−Ｈ２Ｏ］）：Ｃ１７Ｈ２９に関する計算値２３３．２２６９、実測値２３３．２２７５；
δＨ  （４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）０．９４−１．０１（６Ｈ，ｍ，２×ＣＨ２ＣＨ３），１．６０（３Ｈ，ｓ，ＣＨ＝ＣＣＨ３），１．６８（３Ｈ，ｓ，ＣＨ＝ＣＣＨ３）１．９７−２．１３（１２Ｈ，ｍ，６×ＣＨ２），４．１６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，ＣＨ２Ｏ），５．０９（２Ｈ，ｍ，２×Ｃ＝ＣＨ），５．３８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，Ｃ＝ＣＨＣＨ２Ｏ）。
δＣ（６２．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１３．２０，１３．６５，１７．６８および２３．２１（ＣＨ３），２３．５４，２５．６５，２６．２２，２６．９６，３６．５１および３６．７５（ＣＨ２），５９．０９（ＣＨ２ＯＨ），１２２．８９，１２３．４３および１２４．４６（Ｃ＝ＣＨ），１３１．２６，１４１．２５および１４５．６９（Ｃ＝ＣＨ）
【００９７】
Ｃ．トリスアンモニウム（２Ｅ，６Ｅ）−３，７−ジエチル−１１−メチルドデカ−２，６，１０−トリエニル二リン酸１４，１５−ジメチルファルネシル二リン酸（ＩＩｇ）の合成
無水ＤＭＦ（５．３ｍＬ）中のＬｉＣｌ（０．２７ｇ、６．４ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液を０℃（氷浴）に冷却し、次いでＳ−コリジン（０．３ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ）および塩化メタンスルホニル（５０μＬ、０．６４ｍｍｏｌ）を加えた。溶液は１５分間撹拌し、その時間中に白く濁った沈殿が形成された。アルコールＶＩＩ（１００ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１ｍＬ）中溶液として一滴ずつ加え、反応物は０℃で３時間撹拌した。混合物は冷ペンタン（４ｍＬ）で希釈し、次いで氷（２５ｇ）に注ぎ、生成した水性層はペンタン（３×１０ｍＬ）で抽出した。プールした有機層は、乾燥（ＭｇＳＯ４）および濾過の前に、飽和ＣｕＳＯ４溶液（３×１０ｍＬ）、飽和ＮａＨＳＯ４溶液（２×１０ｍＬ）およびブライン（２×１０ｍＬ）で洗浄した。溶液は減圧下で濃縮し、生成した粗製の塩化アリルはさらに精製せずに直接使用した。
【００９８】
無水ＣＨ３ＣＮ（１ｍＬ）中の粗製の塩化アリルの溶液に、トリス−二リン酸水素（テトラブチルアンモニウム）（０．７ｇ、１．８ｍｍｏｌ）を加え、混合物は室温で１５時間撹拌した。溶媒は減圧下で除去し、残渣はイオン交換バッファー（２％ｉ−ＰｒＯＨを含有する２５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３、１ｍＬ）中に溶かした。この溶液を、２倍カラム体積のイオン交換バッファーを用いて予め平衡状態にした、３０当量のＤＯＷＥＸ５０Ｗ−Ｘ８（１００〜２００メッシュ）陽イオン交換樹脂（ＮＨ４＋型）を含有するカラムにゆっくりと通した。カラムは、１５分あたり１倍カラム体積の流速で、２倍カラム体積のイオン交換バッファーを用いて溶出した。イオン交換が終了した後、生成物を含有する分画（ＴＬＣにより判断してｉ−ＰｒＯＨ：ｃ．ＮＨ３：Ｈ２Ｏ  ６：３：１、ハネシアン染色液で染色）を乾燥状態まで凍結乾燥させた。白い固体はＭｅＯＨ（３×１０ｍＬ）で粉砕し、有機抽出物は黄色い固体を得る乾燥状態まで濃縮し、これをＥｔ２Ｏ（３×３ｍＬ）で浄化し白い固体として表題の化合物を得た（６４ｍｇ、３６％）。粉砕由来の残渣は逆相ＨＰＬＣによってさらに精製した（１５０×２１．２ｍｍのＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ（商標）カラム、２０分間１０％Ｂ、次いで２５分間６０％Ｂまで直線勾配、および最後に５分間１００％Ｂまで直線勾配で溶出、溶媒Ａ：２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３水溶液、溶媒Ｂ：ＣＨ３ＣＮ、流速５．０ｍＬ／分、２２０ｎｍで検出、保持時間３９．３分）。精製が終了した後、再度溶液を乾燥状態まで凍結乾燥させ、白くふわふわした固体として、さらに１バッチ分の表題の化合物を得た（３４ｍｇ、１８．９％収率）。
【００９９】
ＨＲＭＳ（ｍ／ｚＥＳ−）：Ｃ１７Ｈ３１Ｏ７Ｐ２に関する計算値４０９．２５４５、実測値４０９．２５３９；
δＨ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）０．８−０．９１（６Ｈ，ｍ，２×ＣＨ２ＣＨ３），１．５０（３Ｈ，ｓ，Ｃ＝ＣＣＨ３），１．５６（３Ｈ，ｓ，Ｃ＝ＣＣＨ３）１．９２−２．０３（１２Ｈ，ｍ，６×ＣＨ２），４．３７（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｏ），５．０７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２×Ｃ＝ＣＨ），５．３２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｃ＝ＣＨＣＨ２Ｏ）；
δＰ（２０２．５ＭＨｚ，２Ｈ２Ｏ）  −１０．４１（ｄ，ＪＰＰ＝２２．５Ｈｚ），  −８．３０（ｄ，ＪＰＰ＝２２．５Ｈｚ）。
【０１００】
一般式（ＩＩ）の他の化合物は、代替のβ−ケトエステルから始めて同様の方法により合成することができる。
【実施例２】
【０１０１】
（Ｓ）−ゲルマクレンＤアナログの調製
ＧＤＰまたは改変されたＧＤＰを使用して酵素変換により、スキーム２に従い適切なファルネシル二リン酸からゲルマクレンアナログを生成した。
【０１０２】
【化４】
2018504402.tif 000006
【０１０３】
2018504402.tif 000007
【０１０４】
（Ｃａｓｃｏｎら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、４８、９７０２〜９７０４頁（２０１２年）およびＣａｓｃｏｎら、ＣｈｅｍＰｌｕｓＣｈｅｍ７８、１３３４〜１３３７頁（２０１３年）中）に以前に記載されたように、ＧＤＳ−Ｈｉｓ６およびＹ４０６ＦＧＤＳ−Ｈｉｓ６とＦＤＰアナログのインキュベーションを最適化して最大の変換をもたらした。
【０１０５】
酵素動態実験の結果
異なる変異体ＧＤＳ酵素を使用した、（Ｓ）−ゲルマクレンＤおよびそのアナログへのファルネシル二リン酸およびそのアナログの変換に関する動態パラメーターを表１〜３中に示す。
【０１０６】
2018504402.tif 000008
【０１０７】
2018504402.tif 000009
【０１０８】
2018504402.tif 000010
【０１０９】
化合物（Ｉｆ）と（Ｉｇ）の両方に関して、改変されたＧＤＳ−Ｙ４０６Ｆ酵素を使用して最適に変換を行った。しかしながら天然（Ｓ）−ゲルマクレンＤおよび他のアナログに関しては、改変された酵素より天然ＧＤＳ酵素を使用した。
【０１１０】
Ａ．（Ｓ）−１４，１５−ジメチルゲルマクレンＤ（化合物Ｉｇ）の調製
（Ｓ）−１４，１５−ジメチルゲルマクレンＤを生成するため、１４，１５−ジメチル−ＦＤＰ（ＩＩｇ）（１９ｍｇ、０．４０ｍＭ最終濃度）とＹ４０６Ｆ−ＧＤＳ−Ｈｉｓ６（１２μＭ最終濃度）を、ペンタン（１０ｍＬ）を上に重ねたインキュベーションバッファー（２０ｍＭのトリス、５ｍＭのβＭＥ、および１０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５、ＧＤＳ用１０％グリセロール、５０ｍＬ最終体積）中で混合させた。混合物は室温で５日間軽く撹拌し、次いで分離水性層を、ＧＣＭＳにより生成物を検出できなくなるまで、さらなる部分のペンタンで完全に抽出した。プールしたペンタン抽出物は乾燥状態まで濃縮し、１％ＡｇＮＯ３を含浸させたシリカゲルでの分取薄層クロマトグラフィーにより残渣を精製し、ペンタン中５％アセトンで溶出した。表題の化合物を無色の油状物として単離した（１４ｍｇ、７３％）。
【０１１１】
ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ、ＥＩ＋）：Ｃ１７Ｈ２８に関する計算値２３２．２１９１、実測値２３２．２１９１；
δＨ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  ０．７９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，（ＣＨ３）２ＣＨ），０．８５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０  Ｈｚ，（ＣＨ３）２ＣＨ），０．８６−０．９０（２Ｈ，ｍ，（ＣＨ３）２ＣＨＣＨＣＨ２），０．９４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ＣＨ３ＣＨ２），１．３７−１．４２（１Ｈ，ｍ，（ＣＨ３）２ＣＨ），１．６８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，ＣＨ３ＣＨ＝Ｃ），１．７０−１．７５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＥｔ），１．８５−１．９０（１Ｈ，ｍ，１×ＣＨ２ＣＨ＝ＣＥｔ），１．９７−２．０２（１Ｈ，ｍ，１×ＣＨ２ＣＨ＝ＣＥｔ），２．０２−２．０９（１Ｈ，ｍ，（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ），２．１４−２．２０（１Ｈ，ｍ，１×ＣＨ３ＣＨ＝ＣＣＨ２），２．２５−２．３２（２Ｈ，ｍ，ＣＨ３ＣＨ２），２．３６−２．４３（１Ｈ，ｍ，１×ＣＨ２Ｃ＝ＣＥｔ），２．４４−２．５２（１Ｈ，ｍ，１×ＣＨ３ＣＨ＝ＣＣＨ２），５．０３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６および１１Ｈｚ，ＣＨ３ＣＨ２Ｃ＝ＣＨ），５．０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０および１６Ｈｚ，ＣＨ３ＣＨ＝ＣＣＨ＝ＣＨ），５．３８（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，ＣＨ３ＣＨ＝Ｃ），５．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，ＣＨ３ＣＨ＝ＣＣＨ＝ＣＨ）；  
δＣ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  １２．６６（ＣＨ３ＣＨ２），１３．１８（ＣＨ３ＣＨ＝Ｃ），１４．１３（１×（ＣＨ３）２ＣＨ），１９．２８（１×（ＣＨ３）２ＣＨ）  ２０．７５（（ＣＨ３）２ＣＨＣＨＣＨ２）  ２１．３０（ＣＨ３ＣＨ２），２２．７０（ＣＨ２ＣＥｔ），２７．０９（ＣＨ２ＣＨ＝ＣＥｔ），３２．８３（（ＣＨ３）２ＣＨ），３６．９６（ＣＨ３ＣＨ＝ＣＣＨ２），５２．５７（（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ），１２０．０（ＣＨ３ＣＨ＝Ｃ），１３０．１（ＣＨ＝ＣＥｔ），１３３．６（ＣＨ＝ＣＨＣＨＣＨ（ＣＨ３）２），１３６．１（ＣＨ＝ＣＨＣＨＣＨ（ＣＨ３）２），１３９．４（ＣＨ＝ＣＥｔ），１４０．２（ＣＨ３ＣＨ＝Ｃ）；
ｍ／ｚ（ＥＩ＋）、２３２．２（２２％、Ｍ＋）、２０３．２（８、［Ｍ−Ｅｔ］＋）、１８９．２（１００、［Ｍ−（ＣＨ３）２ＣＨ］＋）、１７５．２（２）、１６１．１（１１）、１４７．１（３０）、１３３．１（３１）、１１９．１（３３）、１０５．１（２５）、９１．１（２９）、７９．１（１８）、６７．１（７）、５５．１（４）。
【０１１２】
Ｂ．（Ｓ）−１５−メチルゲルマクレンＤ（Ｉｆ）の調製
化合物（Ｉｇ）と同様の形式で表題の化合物を生成した。１５−メチル−ＦＤＰ（ＩＩｆ）（１９ｍｇ、０．４０ｍＭ最終濃度）とＹ４０６Ｆ−ＧＤＳ−Ｈｉｓ６（１２μＭ最終濃度）を、ペンタン（１０ｍＬ）を上に重ねたインキュベーションバッファー（２０ｍＭのトリス、５ｍＭのβＭＥ、および１０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５、ＧＤＳ用１０％グリセロール、２００ｍＬ最終体積）中で混合させた。混合物は室温で５日間軽く撹拌し、次いで分離水性層を、ＧＣＭＳにより生成物を検出できなくなるまで、さらなる部分のペンタンで完全に抽出した。プールしたペンタン抽出物は乾燥状態まで濃縮し、１％ＡｇＮＯ３を含浸させたシリカゲルでの分取薄層クロマトグラフィーにより残渣を精製し、ペンタン中５％アセトンで溶出した。表題の化合物を無色の油状物として単離した（８ｍｇ、４５％）。ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ、ＥＩ＋）：Ｃ１７Ｈ２８に関する計算値２３２．２１９１、実測値２３２．２１９１；
δＨ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  ０．７２−０．８０（３Ｈ，ｍ，（ＣＨ３）２ＣＨＣＨＣＨ２），０．８３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，（ＣＨ３）２ＣＨ），０．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，（ＣＨ３）２ＣＨ），１．５６（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３Ｃ＝ＣＨ），１．７１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，ＣＨ３ＣＨ＝Ｃ），１．９５−２．０５，２．１６−２．１８，２．２１−２．２５，２．３０−２．３７および２．５２−２．５４（７Ｈ，ｍ，アリル酸ＣＨｓ），５．１４−５．１８（２Ｈ，ｍ，ＣＨ３ＣＨ＝ＣＣＨ＝ＣＨおよびＣＨ３Ｃ＝ＣＨ），５．４２（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，ＣＨ３ＣＨ＝Ｃ），５．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，ＣＨ３ＣＨ＝ＣＣＨ＝ＣＨ）；
ｍ／ｚ（ＥＩ＋）、２１８．２（２８％、Ｍ＋）、２０３．２（１０、［Ｍ−ＣＨ３］＋）、１８９．２（９）、１７５．１（１００）、１４３．１（１８）、１３３．１（２０）、１１９．１（２２）、１０５．１（２５）、９１．１（２０）、７９．１（１０）、６７．１（４）、５５．１（３）。
【実施例３】
【０１１３】
電気生理学
エレクトロアンテノグラム（ＥＡＧ）の記録を、［Ｍａｄｄｒｅｌｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．５１、７１（１９６９年）中と同じ組成、ただしグルコースを含まない］生理食塩水溶液を充填したＡｇ−ＡｇＣｌガラス電極を使用して行った。単為生殖性の有翅穀類アブラムシ、シトビオン・アベナエの頭部を切除し不関電極内に置き、両触角の先端はそれらを記録電極中に挿入する前に除去した。シグナルは高インピーダンス増幅器（ＵＮ−０６、Ｓｙｎｔｅｃｈ、Ｈｉｌｖｅｒｓｕｍ、オランダ）に通し、カスタマイズされたソフトウェアパッケージ（Ｓｙｎｔｅｃｈ）を使用して分析した。
【０１１４】
ＧＣカラムからの流出物が触角調製物とＧＣ検出器に同時に向かう結合型ガスクロマトグラフィー電気生理学システム（ＧＣ−ＥＡＧ）は以前に記載されている（Ｗａｄｈａｍｓ、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｐｈｅｒｏｍｏｎｅｓ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、Ｒｅａｄｉｎｇ、イングランド、ＵＫ、１９８９年３月２１日〜２３日、ＸＩＶ＋３７６Ｐ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：ニューヨーク、米国、２８９〜２９８頁、（１９９０年））。サンプル中の必要なゲルマクレンＤアナログと任意の汚染物質の分離は、（２．５ｍｌ／分の流速で）担体ガスとしてヘリウムを用いてＨＰ−１（５０ｍ×０．３２ｍｍ、Ｏ．Ｄ．×０．５２μｍ、相厚）カラムを使用し、クールオンカラム注入口とＦＩＤを備えるＡｇｉｌｅｎｔ（登録商標）６８９０ＧＣで実施した。オーブン温度は２分間３０℃に維持し、次いで１分あたり１５℃で２５０℃まで上昇させた。
【０１１５】
ＥＡＧ増幅器とＦＩＤからのアウトプットを同時にモニタリングし、Ｓｙｎｔｅｃｈソフトウェアパッケージを使用して分析した。ＧＣカラムから溶出したピークは、３回以上の対の実験でそれらがＥＡＧ活性を誘導した場合、活性状態であると判断した。
【０１１６】
挙動アッセイ
試験化合物に対する個々の穀類アブラムシ、シトビオン・アベナエの応答性を、Ｐｅｒｓｐｅｘ４アーム嗅覚計（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、Ｊ．；Ｅｎｔ．Ｓｃａｎｄ．１、６３〜７３頁（１９７０年）；Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｂら、Ａｎｉｍａｌ  Ｂｅｈａｖ．７９、４５１〜４５７頁（２０１０年））を使用して観察し、これは２３℃に維持し上から並べた。フィルターペーパーディスクを嗅覚計の底部に置いてアブラムシを誘引し、中間部と上部は非常に堅く取り付けて充分密閉した。筒状の使い捨て１０ｍＬシリンジ（Ｐｌａｓｔｉｐａｋ）からなる４アームは中間部の穴に堅く取り付けて、濾過した空気はそれらを介して、および上部中心内の穴に挿入されポンプに連結したチューブを介して嗅覚計の本体に吸い込んだ。測定した全体の流速は２００ｍＬ／分であり、各アームを介した流速は５０ｍＬ／分であると考えた。３つの対照アームはそれぞれ、１０μＬのヘキサンを適用してこれを３０秒で蒸発させたフィルターペーパー片を含有していた。処理アームは、１０μＬのヘキサン（２０〜２００ｎｇμＬ−１）中の試験化合物を適用して３０秒放置してヘキサンを蒸発させたフィルターペーパー片を含有していた。一匹のアブラムシを中心穴に入れ吸引チューブを素早く再挿入した。各アームおよび中心帯において費やされた時間を、次の１６分間専用ソフトウェア（ＯＬＦＡ、Ｕｄｉｎｅ、イタリア）を使用して記録した。嗅覚計は２分毎に９０°回転させて如何なる方向バイアスも排除した。それぞれのアッセイは１０反復を含み、処理アームと対照アームにおいて費やされた平均時間は対応のあるｔ検定（Ｇｅｎｓｔａｔ）を使用して比較した。
【０１１７】
（Ｒ）−ゲルマクレンＤ（ＩＩＩ）およびゲルマクレン（ＩＶ）と共に式（Ｉ）の化合物および比較化合物に関する結果を以下の表５中に示す。
【０１１８】
【化５】
2018504402.tif 000011
【０１１９】
2018504402.tif 000012
【０１２０】
データは対照（溶媒のみ）または処理アームにおいて費やされた平均時間（±ＳＥ）として記録し、スチューデントのｔ検定を使用して分析した。
【実施例４】
【０１２１】
ＧＣ−ＭＳ分析
１４−メチルファルネシル二リン酸、１４−フルオロファルネシル二リン酸、１５−フルオロファルネシル二リン酸および６−フルオロファルネシル二リン酸の代謝回転から単離した生成物に関するガスクロマトグラムは以前に公開されたものと同様であった（Ｃａｓｃｏｎら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、４８、９７０２〜９７０４頁（２０１２年））。
【図１】
2018504402.tif 000015
【図２】
2018504402.tif 000016
【図３】
2018504402.tif 000017
【図４】
2018504402.tif 000018
【図５】
2018504402.tif 000019
【図６】
2018504402.tif 000020
【配列表】
2018504402000001.app
【国際調査報告】
2018504402.tif 000021
2018504402.tif 000022
2018504402.tif 000023