(57)【要約】  本開示は、微生物の増殖を抑制する方法、バイオフィルムの形成又は発達を抑制する方法、存在しているバイオフィルムを破壊する方法、バイオフィルムの生物量を減少させる方法、ならびにバイオフィルム及びかかるバイオフィルムを伴う微生物の抗菌剤に対する感受性を増強させる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオフィルムを有効量のオーラノフィンに曝露させることを含む、バイオフィルム生物量を減少させる方法。
【請求項２】
バイオフィルムを有効量のオーラノフィンに曝露させることを含む、バイオフィルムからの微生物の分散を促進する方法。
【請求項３】
前記バイオフィルムは細菌を含む、請求項１又は請求項２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオフィルムはグラム陽性菌を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記バイオフィルムは、チオレドキシン（Ｔｒｘ）経路を有する細菌を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記バイオフィルムは、グルタチオン（ＧＳＨ）とグルタチオン還元酵素経路（ＧＲ）を有していない細菌を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記バイオフィルムは、γ−グルタミン酸システインリガーゼ（ＧｓｈＡ）、グルタチオン合成酵素（ＧｓｈＢ）、及び／又はグルタチオン還元酵素（Ｇｏｒ）を発現しない細菌を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記バイオフィルムは多剤耐性菌を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオフィルムはＳ．ａｕｒｅｕｓを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記バイオフィルムは本質的にＳ．ａｕｒｅｕｓで構成される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記バイオフィルムはＳ．ａｕｒｅｕｓで構成される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓはメチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記バイオフィルムはＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記バイオフィルムは本質的にＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉで構成される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記バイオフィルムはＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉで構成される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記バイオフィルムはＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記バイオフィルムは本質的にＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅで構成される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記バイオフィルムはＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅで構成される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記バイオフィルムは真菌を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記バイオフィルムはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記バイオフィルムはＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記バイオフィルムは、単一菌種のバイオフィルム又は混合菌種のバイオフィルムである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
バイオフィルム形成微生物を有効量のオーラノフィンに曝露させることを含む、バイオフィルムの形成を抑制する方法。
【請求項２４】
前記バイオフィルム形成微生物は細菌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記バイオフィルム形成微生物はグラム陽性細菌である、請求項２３又は請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記バイオフィルム形成微生物は、チオレドキシン（Ｔｒｘ）経路を有する細菌である、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記バイオフィルム形成微生物は、グルタチオン（ＧＳＨ）とグルタチオン還元酵素経路（ＧＲ）を有していない細菌である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記バイオフィルム形成微生物は、γ−グルタミン酸システインリガーゼ（ＧｓｈＡ）、グルタチオン合成酵素（ＧｓｈＢ）、及び／又はグルタチオン還元酵素（Ｇｏｒ）を発現しない細菌である、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記バイオフィルム形成微生物は多剤耐性菌である、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記バイオフィルム形成微生物はＳ．ａｕｒｅｕｓである、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓはＭＲＳＡである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記バイオフィルム形成微生物はＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉである、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記バイオフィルム形成微生物はＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記バイオフィルム形成微生物は真菌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
前記バイオフィルム形成微生物はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
前記バイオフィルム形成微生物はＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
前記オーラノフィンは、バイオフィルムが形成されやすい表面又は界面をコーティングするか、含浸する、又はかかる表面又は界面と接触する、請求項２３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記表面は、医療用若しくは外科用装置、埋め込み型医療機器又はプロステーシスの表面である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記バイオフィルム又はバイオフィルム形成微生物は対象の体表面にあり、前記バイオフィルム又はバイオフィルム形成微生物のオーラノフィンへの曝露は、対象にオーラノフィンを投与することによって行われる、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記バイオフィルム又はバイオフィルム形成微生物は、対象が罹患しているか又は対象が易罹患性である感染症、疾患又は障害に関連している、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記バイオフィルム又はバイオフィルム形成微生物を少なくとも１種のさらなる抗菌剤に曝露させることをさらに含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記さらなる抗菌剤は抗生物質又は抗真菌剤である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗生物質は、リファンピシン、ゲンタマイシン、エリスロマイシン、リンコマイシン及びバンコマイシンから選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
バイオフィルムを有効量のオーラノフィンに曝露させることによって前記バイオフィルム中の微生物の抗菌剤に対する感受性を増強させる方法。
【請求項４５】
前記微生物は細菌である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記微生物はグラム陽性細菌である、請求項４４又は請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記バイオフィルム形成微生物は、チオレドキシン（Ｔｒｘ）経路を有する細菌である、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記バイオフィルム形成微生物は、グルタチオン（ＧＳＨ）とグルタチオン還元酵素経路（ＧＲ）を有していない細菌である、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記バイオフィルム形成微生物は、γ−グルタミン酸システインリガーゼ（ＧｓｈＡ）、グルタチオン合成酵素（ＧｓｈＢ）、及び／又はグルタチオン還元酵素（Ｇｏｒ）を発現しない細菌である、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記微生物は多剤耐性菌である、請求項４４〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記微生物はＳ．ａｕｒｅｕｓである、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓはＭＲＳＡである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記微生物はＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉである、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記微生物はＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記微生物は真菌である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５６】
前記微生物はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５７】
前記微生物はＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗菌剤は抗生物質又は抗真菌剤である、いずれか一項又は請求項４４〜５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗生物質は、リファンピシン、ゲンタマイシン、エリスロマイシン、リンコマイシン及びバンコマイシンから選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
バイオフィルムの形成を抑制するか、バイオフィルム生物量を減少させるか、又はバイオフィルムからの微生物分散を促進する薬品を調製するための、オーラノフィンの使用。
【請求項６１】
バイオフィルムを原因とする感染症、疾患若しくは障害を治療又は予防する薬品を調製するするための、オーラノフィンの使用。
【請求項６２】
バイオフィルム中の微生物の抗菌剤に対する感受性を増強させる薬品を調製するためのするための、オーラノフィンの使用。
【請求項６３】
存在しているバイオフィルムを除去若しくは消失させるか、バイオフィルムの形成を抑制するか、バイオフィルム生物量を減少させるか、バイオフィルムからの微生物の分散を促進するか、バイオフィルム中微生物の抗菌剤に対する感受性を増強させるか、又はバイオフィルムを原因とする感染症、疾患若しくは障害を治療又は予防する方法で使用するための、オーラノフィン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は一般に、微生物の増殖を抑制する方法、バイオフィルムの形成又は発達を抑制する方法、存在しているバイオフィルムを破壊する方法、バイオフィルムの生物量を減少させる方法、ならびにバイオフィルム及びかかるバイオフィルムを伴う微生物の抗菌剤に対する感受性を増強させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルムは、微生物細胞が、水又は適切な流体が利用可能な表面若しくは界面で、又は浮遊状態で、互いに付着してマトリクスを形成する微生物の集合体である。バイオフィルムは、個々の細胞による、固液表面又は気液表面といった表面又は界面の次なる集団を形成する。それに続く、細胞外高分子物質の産生及び細胞接着分子により、表面への微生物の接着、及び微生物同士の接着が促進される。この付着段階に続くのが中間段階であり、ここでは不可逆的に結合した細胞が凝集して表面でマイクロコロニー又は細胞塊となる。バイオフィルムの構造体は細胞の分裂と動員の組み合わせを介して発達、成熟して、遺伝的多様性を有する構造的に異質な形態となり、多糖類、タンパク質及び細胞外核酸などのマトリクスによって一つのまとまりになっている。バイオフィルム内部では、微生物は、クオラムセンシングとして知られるプロセスを使用して互いにコミュニケーションを取り得る。このプロセスによりブドウ球菌、レンサ球菌、及び腸球菌などの細菌におけるバイオフィルムの形成が制御される。その後、様々な機序により、微生物はバイオフィルムから放出され、こうして脱離した微生物細胞は浮遊状態へ戻って成長する。
【０００３】
バイオフィルムは多数のヒト感染症に関与してきており、それらには、例えば、心内膜炎、骨髄炎、慢性中耳炎、異物関連感染症、胃腸管潰瘍、尿路感染症、レジオネラ症、嚢胞性線維症患者における慢性肺感染症、齲蝕及び歯周炎が挙げられる。バイオフィルムは、例えば、気道及び肺の表面（嚢胞性線維症の対象における肺感染症関連など）、骨内（骨髄炎関連など）、ならびに心臓及び心臓弁の表面（心内膜炎関連など）といった、体内の様々な表面に形成され得る。また、バイオフィルムは、カテーテル及びカニューレのような医療器具上、及びステントなど埋め込み型医療機器上にも容易に形成される。医療機器上にバイオフィルムを形成する一部の微生物、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は強毒性であるため、機器の除去がしばしば推奨されるが、コスト及び入院回数の大幅な増加、ならびに患者へのリスク増大につながる。バイオフィルムは、飲料水、貯水槽、パイプ及び空調用ダクトのような水系における重要な病原体保有宿主でもある。また、バイオフィルムは産業上の大きな損害を発生させ、例えば、配水系と水処理系、パルプと製紙装置、熱交換系及び冷却塔といった流体処理における汚染と腐食を引き起こし、また配管及び貯水槽内の油の酸性化の一因となる。
【０００４】
バイオフィルムは生息微生物に強い保護を提供し、例えば、抗菌薬及び宿主免疫応答に対するバイオフィルム内微生物の耐性を、浮遊細胞に比べて実質的に増強させる（最高１０００倍）ことにより保護している。このことは、バイオフィルムの重大性と高度の持続性、及びバイオフィルムにより発生した感染症が関連する罹患率を説明している。
【０００５】
臨床的に重要な多くの微生物はバイオフィルムを形成する。バイオフィルムを形成する細菌の非限定的な例には、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．のようなグラム陽性菌、ならびにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．及びＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．のようなグラム陰性菌が挙げられる。酵母及び糸状菌（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐｐ．、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｓｐｐ．、Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｓｐｐ．、及びＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）のような下等真核生物もバイオフィルムを形成する。
【０００６】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、院内感染の原因として重要性が高まりつつあるグラム陰性病原体である。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、例えば、尿路及び呼吸器の感染症を引き起こし、カテーテル及び呼吸補助装置のような医療機器上に容易にバイオフィルムを形成する。多剤耐性（ＭＤＲ）Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅも臨床上の大きな問題であり、有病率が上昇していると考えられる。カルバペネム耐性Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＣＲＫＰ）はほぼ全ての抗菌剤に対して耐性を示し、ＣＲＫＰによる感染は死亡率及び罹患率が特に高い。
【０００７】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、全ての医療関連感染症の約３０％を占めるグラム陽性の日和見病原体である。ほとんどのＳ．ａｕｒｅｕｓ感染は第一選択抗生物質に対して耐性を示す。メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）はβラクタム系に対して耐性を示し、メチシリンの他に、頻用される抗生物質、例えば、オキサシリン、ペニシリン、及びアモキシシリンが含まれる。入院患者のＭＲＳＡ治療にかかる年間費用は３４〜４２億ドルと推定されている。
【０００８】
ブドウ球菌がそれほど多くの感染症の原因である理由の一つは、そのバイオフィルム形成能にある。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは宿主組織に特に効果的にコロニーを形成して心内膜炎及び骨髄炎を引き起こすが、医療機器上にもバイオフィルムを形成し、異物関連感染症の一般的な原因となっている。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは典型的に、より急性の感染症を引き起こすが、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは一般に亜急性又は慢性の感染症を引き起こす。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは異物関連感染症の主な原因であるが、心内膜炎を引き起こすことも知られている。これらの疾患は、バイオフィルムから細菌が分散することにより一層複雑になる可能性があり、それが血液を介して広がり敗血症を引き起こし得る。
【０００９】
金銭面において、また患者の健康面において、バイオフィルム関連の感染症、疾患及び病態に多大なコストがかかるということは、バイオフィルムを防止、抑制及び処理するための改善された方法が必要とされており、かつ抗菌剤に対するバイオフィルムの感受性を高める必要性があるということである。
【発明の概要】
【００１０】
本開示は、一般に、微生物の増殖を抑制する方法、バイオフィルムの形成又は発達を抑制する方法、存在しているバイオフィルムを破壊する方法、バイオフィルムの生物量を減少させる方法、ならびにバイオフィルム及びかかるバイオフィルムを伴う微生物の抗菌剤に対する感受性を増強させる方法に関する。本明細書に記載する方法は、例えば、インビボ、エキソビボ、又はインビトロで実施され得る。
【００１１】
本開示は、バイオフィルムの生物量を減少させ、かつ／又はバイオフィルムからの微生物の分散を促進する方法を提供し、かかるバイオフィルムを有効量のオーラノフィンに曝露させることを含む。
【００１２】
本開示はまた、バイオフィルムを分散させる、除去する、又は消失させる方法を提供し、かかるバイオフィルムを有効量のオーラノフィンに曝露させることを含む。いくつかの実施形態では、バイオフィルムは存在しているバイオフィルム、すでに形成されたバイオフィルム、又は定着したバイオフィルムである。
【００１３】
本開示はさらに、バイオフィルム内微生物を死滅させる方法を提供し、かかるバイオフィルムを有効量のオーラノフィンに曝露させることを含む。いくつかの実施形態では、バイオフィルムは存在しているバイオフィルム、すでに形成されたバイオフィルム、又は定着したバイオフィルムである。
【００１４】
いくつかの態様では、バイオフィルムは、例えば多剤耐性菌のような細菌を含む。いくつかの態様では、細菌はグラム陽性菌である。いくつかの態様では、細菌はグラム陰性菌である。特定の例では、バイオフィルムは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むか、それを本質的な構成菌とするか、又はそれを構成菌とする。いくつかの態様では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓはメチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）である。いくつかの実施形態では、バイオフィルムは、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉを含むか、それを本質的な構成菌とするか、又はそれを構成菌とする。他の実施形態では、バイオフィルムは、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含むか、それを本質的な構成菌とするか、又はそれを構成菌とする。さらなる実施形態では、バイオフィルムは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ及び／又はＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓのような真菌を含む。バイオフィルムは、単一菌種のバイオフィルムでも混合菌種のバイオフィルムでもよい。
【００１５】
いくつかの態様では、細菌はチオレドキシン（Ｔｒｘ）経路を有する。いくつかの態様では、細菌は、グルタチオン（ＧＳＨ）とグルタチオン還元酵素の経路（ＧＲ）を有していない。いくつかの態様では、細菌は、γ−グルタミン酸システインリガーゼ（ＧｓｈＡ）、グルタチオン合成酵素（ＧｓｈＢ）、及び／又はグルタチオン還元酵素（Ｇｏｒ）を発現せず、例えば、細菌は、ＧＳＨＡ、ＧＳＨＢ、及び／又はＧＯＲ活性を発現しないことがある。
【００１６】
本開示により、バイオフィルムの形成を抑制する方法も提供され、バイオフィルム形成微生物を有効量のオーラノフィンに曝露させることを含む。
【００１７】
バイオフィルム形成抑制方法のいくつかの態様では、バイオフィルム形成微生物は細菌である。特定の例では、バイオフィルム形成微生物は多剤耐性菌である。方法のいくつかの態様では、バイオフィルム形成微生物はＳ．ａｕｒｅｕｓ（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓはＭＲＳＡである）である。他の態様では、バイオフィルム形成微生物はＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ又はＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである。さらなる態様では、バイオフィルム形成微生物は、例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ又はＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓのような真菌である。
【００１８】
かかる方法では、バイオフィルムが形成されやすい表面又は界面をオーラノフィンでコーティングするか含浸する、又はオーラノフィンと接触させてよい。いくつかの例では、表面は、医療用若しくは外科用装置、埋め込み型医療機器又はプロステーシスの表面である。特定の例では、バイオフィルム又はバイオフィルム形成微生物は対象の体表面にあり、バイオフィルム又はバイオフィルム形成微生物のオーラノフィンへの曝露は、対象にオーラノフィンを投与することによって行われる。そのような場合は、バイオフィルム又はバイオフィルム形成微生物は、対象が罹患しているか又は対象が易罹患性である感染症、疾患又は障害に関連していてよい。本明細書で実証されるように、オーラノフィンは他の抗菌剤と相乗的に作用して、抗微生物作用の有効性を高める。したがって、バイオフィルム又はバイオフィルム形成微生物のオーラノフィンへの曝露を含む、本明細書に記載のいかなる態様の場合も、本開示は、オーラノフィンと、例えば、抗生物質又は抗真菌剤といった少なくとも１種のさらなる抗菌剤との組み合わせに対してバイオフィルム又はバイオフィルム形成微生物を曝露させることを含む、対応するさらなる態様を提供する。特定の例では、抗生物質は、リファンピシン、ゲンタマイシン、エリスロマイシン、リンコマイシン及びバンコマイシンから選択される。
【００１９】
本開示はまた、バイオフィルムを有効量のオーラノフィンに曝露させることによってバイオフィルム中の微生物の抗菌剤に対する感受性を増強させる方法も提供する。
【００２０】
バイオフィルム中微生物の抗菌剤に対する感受性増強方法の特定の実施形態では、微生物は細菌である。例えば、微生物は多剤耐性菌であってよい。本開示のいくつかの態様では、微生物はＳ．ａｕｒｅｕｓである。特定の例では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓはＭＲＳＡである。他の例では、微生物はＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ又はＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである。さらなる実施形態では、微生物は真菌である。例えば、微生物はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ又はＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓであってよい。これらの方法のいくつかの態様では、抗菌剤は抗生物質（例えば、リファンピシン、ゲンタマイシン、エリスロマイシン、リンコマイシン又はバンコマイシン）又は抗真菌剤である。
【００２１】
本開示はまた、バイオフィルムの形成を抑制するか、バイオフィルム生物量を減少させるか、又はバイオフィルムからの微生物分散を促進する薬品を調製するためのオーラノフィンの使用を対象とする。
【００２２】
本開示はさらに、バイオフィルムを原因とする感染症、疾患若しくは障害を治療又は予防する薬品を調製するためのオーラノフィンの使用を対象とする。
【００２３】
本開示はまた、バイオフィルム中微生物の抗菌剤に対する感受性を増強させる薬品を調製するためのオーラノフィンの使用を対象とする。
【００２４】
本開示はまた、存在しているバイオフィルムを分散、除去、若しくは消失させるか、バイオフィルムの形成を抑制するか、バイオフィルム生物量を減少させるか、バイオフィルムからの微生物の分散を促進するか、バイオフィルム内微生物を死滅させるか、バイオフィルム中の微生物の抗菌剤に対する感受性を増強させるか、又はバイオフィルムを原因とする感染症、疾患若しくは障害を治療又は予防する方法で使用するためのオーラノフィンを対象とする（例えば、本明細書の段落［００６３］に掲載の疾患及び障害を参照のこと）。
【００２５】
本開示はまた、存在しているバイオフィルムの分散、除去、又は消失によって治療可能な感染症、疾患若しくは障害を治療又は予防するか、バイオフィルムの形成を抑制するか、バイオフィルム生物量を減少させるか、バイオフィルムからの微生物の分散を促進するか、バイオフィルム内微生物を死滅させるか、又はバイオフィルム中の微生物の抗菌剤に対する感受性を増強させる方法で使用するためのオーラノフィンを対象とする。
【００２６】
以下の図面を参照しながら本開示の実施形態をあくまで非限定的例として本明細書に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１Ａは、様々な濃度のオーラノフィン存在下における陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培地（ＣａＭＨＢ）中の各種Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株の増殖抑制を示し、オーラノフィン非存在下における同一株の増殖のパーセンテージで表している（５９５ｎｍにおける吸光度により決定）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＮＣＴＣ８３２５の増殖抑制。図１Ｂは、様々な濃度のオーラノフィン存在下における陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培地（ＣａＭＨＢ）中の各種Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株の増殖抑制を示し、オーラノフィン非存在下における同一株の増殖のパーセンテージで表している（５９５ｎｍにおける吸光度により決定）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓの臨床分離株０４−２２９−２４５５、０４−２２８−１８２５、０４−２２７−３５６７及び０２−２２８−３６１１、ならびに院内感染型及び市中感染型のＭＲＳＡ株ＩＭＶＳ６７（ｎｍＭＲＳＡ  Ｄ）、ＲＢＨ９８（ＱＬＤ）、ＰＡＨ５８（ＳＷＰ）、ＭＷ２（ＵＳＡ４００）、ＣＨ１６（ＵＫ  ＥＭＲＳＡ−１５）ＲＰＡＨ１８（Ａｕｓ−２）及びＵＳＡ３００の増殖抑制。
【図２】Ｓ．ａｕｒｅｕｓの増殖に対するオーラノフィンの効果を評価する殺菌時間アッセイ（ｔｉｍｅ  ｋｉｌｌ  ａｓｓａｙ）の結果を表す。オーラノフィン、リファンピシン、又はオーラノフィンとリファンピシンの組み合わせの存在下において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ培養時の様々な測定間隔でのコロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍＬ数を測定した（三角形は０．５μｇ／ｍＬオーラノフィン、塗りつぶした四角形は１μｇ／ｍＬオーラノフィン、小円形は５μｇ／ｍＬオーラノフィン、逆三角形は０．２μｇ／ｍＬリファンピシン、菱形は１μｇ／ｍＬリファンピシン、大円形は０．５μｇ／ｍＬオーラノフィンとリファンピシン）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓをオーラノフィンもリファンピシンも存在させずに培養した対照も含めた（塗りつぶしなし四角形）。
【図３】ＴＨＰ−１細胞のＳ．ａｕｒｅｕｓ侵入についてのオーラノフィンによる効果的処置を示す。オーラノフィン添加に先立ち、ＴＨＰ−１細胞をｍｏｉ＝３のＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＳＨ１０００ｇｆｐで１．５時間感染させた。ｐｔは、処置後を表す。
【図４】図４Ａは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムの形成に対するオーラノフィンの効果を評価するバイオフィルム形成防止試験（ｂｉｏｆｉｌｍ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）の結果を表す。細菌を、オーラノフィンの存在下又は非存在下で、９６ウェルプレートに入れ密封環境（ＡｅｒａＳｅａｌ（商標））で培養した。プレートに付着したバイオフィルムを染色するクリスタルバイオレットを添加し、その後、酢酸で可溶化させて６３０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、２４時間後のバイオフィルム形成を測定した。結果を、対照のみの細菌（すなわち、オーラノフィン非存在下で増殖した細菌）の吸光度パーセンテージとして表した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＮＣＴＣ８３２５によるバイオフィルムの形成抑制。図４Ｂは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムの形成に対するオーラノフィンの効果を評価するバイオフィルム形成防止試験（ｂｉｏｆｉｌｍ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）の結果を表す。細菌を、オーラノフィンの存在下又は非存在下で、９６ウェルプレートに入れ密封環境（ＡｅｒａＳｅａｌ（商標））で培養した。プレートに付着したバイオフィルムを染色するクリスタルバイオレットを添加し、その後、酢酸で可溶化させて６３０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、２４時間後のバイオフィルム形成を測定した。結果を、対照のみの細菌（すなわち、オーラノフィン非存在下で増殖した細菌）の吸光度パーセンテージとして表した。ＭＲＳＡ（ＲＰＡＨ１８）によるバイオフィルムの形成抑制。
【図５】存在しているＳ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムに対するオーラノフィンの効果を示す。アッセイを実施した９６ウェルプレートの写真であり、様々な濃度の化合物（ｃｐｄ）、すなわち、オーラノフィン単独（列１及び２）、オーラノフィンとリンコマイシン（列３及び４）、オーラノフィンとリファンピシン（列５及び６）、及びリファンピシン単独（列７及び８）を含有する各ウェル内のクリスタルバイオレット染色したバイオフィルムが示されている。写真からわかるように、化合物不含（ｃｐｄ不含の対照）及び細菌不含（細菌不含の対照）で増殖させた細菌を含む各対照も含めた。
【図６】既に存在しているＳ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムの生物量に対する、リファンピシン（Ａ及びＢ）又はゲンタマイシン（Ｃ）と組み合わせたオーラノフィンの効果を示す。Ｂ及びＣにおいて、三角形は０μｇ／ｍＬリファンピシン又はゲンタマイシンを表し、四角形は０．９μｇ／ｍＬリファンピシン又は２５μｇ／ｍＬゲンタマイシンを表し、菱形は３μｇ／ｍＬリファンピシン又は７５μｇ／ｍＬゲンタマイシンを表す。
【図７Ａ】図７Ａ及び図７Ｂはオーラノフィン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ変異株が発生するかどうかを評価する、２種の耐性頻度アッセイ（アッセイ１［７Ａ］及びアッセイ２［７Ｂ］）の結果を示す。最小阻止濃度の１倍、１．５倍、２倍及び４倍のオーラノフィンを含有しているＣａＭＨＢ寒天プレートで増殖したＳ．ａｕｒｅｕｓ。可能性のある変異株を採取し、分析した。ＴＳＡプレートでもＳ．ａｕｒｅｕｓを増殖させ、標準条件下でディスク拡散法を行った（リファンピシン又はオーラノフィンで含浸させた３ＭＭディスクを使用し、菌叢上に載せた）。リファンピシンの抑制ゾーン内で増殖しているリファンピシン耐性（ｒｉｆ  ｒｅｓｉｓｔ）コロニーを同定して単離し、オーラノフィン耐性（Ａｕ  ｒｅｓｉｓｔ）と推定される変異株をオーラノフィンの抑制ゾーン縁部から採取した。可能性のある変異株を、オーラノフィン、リファンピシン又はリンコマイシンの存在下又は非存在下でＣａＭＨＢ内で培養した。耐性ではない対照細菌培養（ｗｔ）も増殖試験に含めた。細菌の増殖を評価し、対照（すなわち、抗生物質の非存在下で増殖した細菌）のパーセンテージとして表した。
【図７Ｂ】図７Ａ及び図７Ｂはオーラノフィン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ変異株が発生するかどうかを評価する、２種の耐性頻度アッセイ（アッセイ１［７Ａ］及びアッセイ２［７Ｂ］）の結果を示す。最小阻止濃度の１倍、１．５倍、２倍及び４倍のオーラノフィンを含有しているＣａＭＨＢ寒天プレートで増殖したＳ．ａｕｒｅｕｓ。可能性のある変異株を採取し、分析した。ＴＳＡプレートでもＳ．ａｕｒｅｕｓを増殖させ、標準条件下でディスク拡散法を行った（リファンピシン又はオーラノフィンで含浸させた３ＭＭディスクを使用し、菌叢上に載せた）。リファンピシンの抑制ゾーン内で増殖しているリファンピシン耐性（ｒｉｆ  ｒｅｓｉｓｔ）コロニーを同定して単離し、オーラノフィン耐性（Ａｕ  ｒｅｓｉｓｔ）と推定される変異株をオーラノフィンの抑制ゾーン縁部から採取した。可能性のある変異株を、オーラノフィン、リファンピシン又はリンコマイシンの存在下又は非存在下でＣａＭＨＢ内で培養した。耐性ではない対照細菌培養（ｗｔ）も増殖試験に含めた。細菌の増殖を評価し、対照（すなわち、抗生物質の非存在下で増殖した細菌）のパーセンテージとして表した。
【図８】オーラノフィン耐性の可能性があるＳ．ａｕｒｅｕｓ変異株（Ａｕ  ｒｅｓｉｓｔ）及びリファンピシン耐性の可能性があるＳ．ａｕｒｅｕｓ変異株（ｒｉｆ  ｒｅｓｉｓｔ）を使用したバイオフィルム形成防止試験（ｂｉｏｆｉｌｍ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）の結果を表す。様々な濃度のオーラノフィン（Ａ）又はリファンピシン（Ｂ）の存在下でバイオフィルム形成を評価し、再可溶化させたクリスタルバイオレットの吸光度を対照のパーセンテージとして表した。円形はオーラノフィン耐性の可能性がある変異株を表し、四角形はリファンピシン耐性の可能性がある変異株を表し、三角形はリファンピシン耐性の可能性がある再増殖した変異株を表し、逆三角形はオーラノフィン又はリファンピシンの非存在下で培養した野生型細胞を表す。
【図９】多剤耐性Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ臨床分離株４株、Ｃ２０４７４２（Ａ、上部プレート）、Ｃ６８７６１（Ａ、下部プレート）、Ｃ１８８６８１（Ｂ、上部プレート）及びＣ７１１７３（Ｂ、下部プレート）の増殖に対するオーラノフィンの効果を示す。各菌株の左側プレートは、オーラノフィンとゲンタマイシン（各１００μｇ；左）及びゲンタマイシン単独（１００μｇ；右）を存在させた場合の増殖抑制を示し、右側プレートは、オーラノフィン存在下（１００μｇ）の増殖抑制を示す。
【図１０】様々な濃度のオーラノフィン（Ａ）又はゲンタマイシン（Ｂ）の存在下におけるＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株のＤ２、Ａ９４及びＡＴＣＣ１７９７８の増殖抑制を示し、オーラノフィン非存在下の同一株の増殖をパーセンテージで表している。
【図１１】様々な濃度のオーラノフィン及びゲンタマイシンの存在下におけるＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株Ｄ２の増殖抑制を示し、いずれの抗生物質も非存在下の同一株の増殖をパーセンテージで表している。
【図１２】Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉの分離株であるＤ２（上部プレート）、Ａ９４（中央プレート）、及びＡＴＣＣ１７９７８（下部プレート）の３株の増殖に対するオーラノフィンの効果を示す。各菌株の左側プレートは、オーラノフィン４μｇ（左ディスク）又は１００μｇ（右ディスク）存在下の増殖抑制を示し、右側プレートは、オーラノフィン４μｇ（右ディスク）及びゲンタマイシン１００μｇ（左ディスク）及びオーラノフィン４μｇとゲンタマイシン１００μｇの組み合わせ（下ディスク）存在下の増殖抑制を示す。
【図１３】Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉのバイオフィルム形成に対するオーラノフィン（Ａ）又はゲンタマイシン（Ｂ）の効果を評価するバイオフィルム形成防止試験（ｂｉｏｆｉｌｍ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）の結果を表す。細菌（菌株Ｄ２）を、オーラノフィン又はゲンタマイシンの存在下又は非存在下の９６ウェルプレートに入れ、ＡｅｒａＳｅａｌ（商標）密封環境で培養した。クリスタルバイオレット（プレートに結合している細菌に付着する）を添加し、その後、酢酸で可溶化させて６３０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、２４時間後のバイオフィルム形成を測定した。結果を、「細菌のみ」の対照（すなわち、オーラノフィン非存在下で増殖した細菌）の吸光度パーセンテージとして表した。
【図１４】一連のレドックス変異株のオーラノフィンに対する感受性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書で使用する場合、その冠詞の文法上の目的語が１つ又は１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）であることを意味する。例として、「ａｎ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔ」は、１つの抗菌剤又は１つ以上の抗菌剤を意味する。
【００２９】
本明細書と関連して、用語「ａｂｏｕｔ（約）」は、当業者であれば、同一の機能又は結果の達成に関連して記載値と同等と見なすであろう数値範囲を指すと理解される。
【００３０】
本明細書及び後述の請求の範囲全体を通して、文脈において特に指定がない限り、語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」、ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」などの変形は、記述されている整数又はステップ又は整数群又はステップ群が含まれることを意味し、他のいかなる整数又はステップ又は整数群又はステップ群が排除されることを意味しないことを理解されるであろう。
【００３１】
本明細書で使用する用語「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」は、特定の微生物を含有するバイオフィルムに関連して使用されている場合、かかるバイオフィルムがそれらの微生物を含み得るか、それらの微生物を本質的な構成菌とし得る（すなわち、当該微生物がそのバイオフィルムにおいて主となる微生物種又は微生物タイプである）、又はそれらの微生物を構成菌とする（すなわち、当該微生物がそのバイオフィルムにおいて唯一の微生物種又は微生物タイプである）ことを意味する。
【００３２】
本明細書で使用する用語「抗菌剤」は、単独又は別の薬剤との組み合わせで、微生物の１つ以上の種を死滅させるか又は増殖を抑制することのできる任意の薬剤を指す。抗菌剤には、抗生物質、抗真菌薬、洗浄液、界面活性剤、酸化的ストレスを誘導する薬剤、バクテリオシン及び抗菌性酵素（例えば、リパーゼ、プロナーゼ及びリアーゼ）ならびに他の多様なタンパク質分解酵素とヌクレアーゼ、ペプチド及びファージが挙げられるが、これに限定されるものではない。抗菌剤への言及は、天然及び合成のいずれの抗菌剤への言及も含む。
【００３３】
本明細書で使用する用語「バイオフィルム」は、多細胞性の特徴を示す、マトリクスに覆われた３次元構造の微生物共同体を指す。したがって、本明細書で使用する場合、バイオフィルムという用語には、表面関連バイオフィルムならびにフロック及びグラニュールのような浮遊状態のバイオフィルムが含まれる。バイオフィルムは、単一微生物の種を含んでもよいし、又は混合種複合体であってもよく、かつ、細菌及び真菌、藻類、原虫、又は他の微生物を含み得る。
【００３４】
用語「バイオフィルム形成微生物」は、単一菌種又は混合菌種のバイオフィルムを形成できる任意の微生物を指す。
【００３５】
本発明において、「微生物」への言及には、酵母、単細胞菌類及び糸状菌が含まれる真菌のような、細菌及び下等真核生物への言及が含まれる。
【００３６】
本明細書で使用する用語「多剤耐性」は、任意の２種以上の抗菌剤に対して耐性を示す微生物菌株を意味する。典型的に、かかる用語は、構造及び／又は機能が異なり、かつ異なる薬物分類に属する複数の抗菌剤に対して耐性を示す細菌株を指す。
【００３７】
用語「バイオフィルムの生物量を減少させる」を本明細書で使用する場合、有効量のオーラノフィンに曝露させたバイオフィルムの一領域の生物量を、オーラノフィン曝露直前のかかるバイオフィルムのその領域の生物量に比べて減少させることを意味する。いくつかの実施形態では、「生物量」は、バイオフィルムのマトリクスの細胞外高分子物質（ＥＰＳ）と、バイオフィルムの領域に存在する細胞量とを加えたものである。いくつかの実施形態では、「生物量」は、バイオフィルムの領域に存在する細胞量のみである（すなわち、ＥＰＳ量を「生物量」として計測しない）。いくつかの実施形態では、有効量のオーラノフィンに曝露させたバイオフィルムの領域の生物量は、オーラノフィン曝露直前のかかるバイオフィルムの領域の生物量より少なくとも１０％少なく、例えば、オーラノフィン曝露直前のかかるバイオフィルムの領域の生物量より少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％少ない。いくつかの実施形態では、比較バイオフィルム領域は１０-6ｍ2であり、他の実施形態では、比較バイオフィルム領域は１０-5ｍ2、１０-4ｍ2、又は１０-3ｍ2である。いくつかの実施形態では、生物量が少なくとも９５％減少したバイオフィルムは、「消失した」、「分散した」又は「除去された」とみなされる。いくつかの実施形態では、生物量が少なくとも９９％減少したバイオフィルムは、「消失した」、「分散した」又は「除去された」とみなされる。いくつかの実施形態では、生物量が少なくとも９９．９％減少したバイオフィルムは、「消失した」、「分散した」又は「除去された」とみなされる。いくつかの実施形態では、バイオフィルム生物量の変化の評価は、ｉ）バイオフィルムの領域を洗浄して接着していない（浮遊状態の）微生物を除去する、ｉｉ）バイオフィルム生物量の領域を評価する（すなわち、「オーラノフィン曝露直前」の生物量）、ｉｉｉ）バイオフィルムの領域（又は別の同一領域）をある期間（例えば、２４時間）有効量のオーラノフィンに曝露させる、ｉｖ）バイオフィルムを洗浄して接着していない（浮遊状態の）微生物を除去する、ｖ）バイオフィルム生物量の領域を評価し、「曝露後」生物量を得る、というステップを含む方法により行う。いくつかの実施形態では、本明細書の実施例７に記載の染色を使用してバイオフィルムの生物量を評価する。
【００３８】
「バイオフィルムからの微生物の分散を促進する」という用語を本明細書で使用する場合、有効量のオーラノフィンに曝露させたバイオフィルムの一領域に存在する微生物菌数が、オーラノフィン曝露直前のかかる領域に存在する微生物菌数に比べて減少することを意味する。いくつかの実施形態では、有効量のオーラノフィンに曝露させたバイオフィルム領域内の微生物菌数は、オーラノフィン曝露直前のかかる領域に存在する微生物菌数より少なくとも１０％少なく、例えば、オーラノフィン曝露直前のかかる領域に存在する微生物菌数より少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％少ない。いくつかの実施形態では、バイオフィルムの一領域内の微生物菌数変化の評価は、ｉ）バイオフィルムを洗浄して接着していない（浮遊状態の）微生物を除去する、ｉｉ）残存微生物を計数して「曝露前」微生物菌数を得る（すなわち、「オーラノフィン曝露直前」計測数）、ｉｉｉ）バイオフィルムをある期間（例えば、２４時間）有効量のオーラノフィンに曝露させる、ｉｖ）バイオフィルムを洗浄して接着していない（浮遊状態の）微生物を除去する、ｖ）残存微生物を計数して「曝露後」微生物菌数を得る、というステップを含む方法により行う。いくつかの実施形態では、ある領域の微生物菌数が少なくとも９５％減少したバイオフィルムは、「消失した」、「分散した」又は「除去された」とみなされる。いくつかの実施形態では、ある領域の微生物菌数が少なくとも９９％減少したバイオフィルムは、「消失した」、「分散した」又は「除去された」とみなされる。いくつかの実施形態では、ある領域の微生物菌数が少なくとも９９．９％減少したバイオフィルムは、「消失した」、「分散した」又は「除去された」とみなされる。
【００３９】
用語「バイオフィルム内微生物を死滅させる」を本明細書で使用する場合、有効量のオーラノフィンに曝露させたバイオフィルムの一領域に存在する微生物の生菌数を、オーラノフィン曝露直前のかかる領域に存在する微生物の生菌数に比べて減少させることを意味する。いくつかの実施形態では、バイオフィルムは存在しているバイオフィルム、すでに形成されたバイオフィルム、又は定着したバイオフィルムである。いくつかの実施形態では、有効量のオーラノフィンに曝露させたバイオフィルムの領域内の微生物の生菌数は、オーラノフィン曝露直前のかかる領域に存在する微生物の生菌数より少なくとも１０％少なく、例えば、オーラノフィン曝露直前のかかる領域に存在する微生物の生菌数より少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％少ない。いくつかの実施形態では、バイオフィルムの一領域内の微生物菌数変化の評価は、ｉ）領域バイオフィルムを洗浄して接着していない（浮遊状態の）微生物を除去する、ｉｉ）バイオフィルムを溶液内に手で分散させる（例えば、スクレーパー、超音波処理、及びボルテックスを使用）、ｉｉｉ）系列希釈、プラット（ｐｌａｔ）、及び培養を調製して、バイオフィルム領域内のコロニー形成単位（ｃｆｕ）数を推定する、ｉｖ）バイオフィルムの別の同一領域を提供し、それをある期間（例えば、２４時間）有効量のオーラノフィンに曝露させる、ｖ）バイオフィルムを手で分散させ、上記のようにｃｆｕを推定して、「曝露後」微生物菌数を得る、というステップを含む方法により行う。
【００４０】
本明細書で使用する用語「分散」とは、バイオフィルム及びバイオフィルムを構成する微生物に関する場合、細胞が脱離及び分離して浮遊状態の表現型又は分散細胞挙動に戻る過程を意味する。
【００４１】
本明細書で用語「有効量」を使用する場合、その意味には、非毒性ではあるが、所望の効果を得るのに十分な薬剤量という意味が含まれる。必要とされる正確な量は、薬剤（例えば、オーラノフィン）に曝露される微生物種、バイオフィルムに関連する疾患又は障害の重症度、バイオフィルムの大きさ、バイオフィルムが付着する表面の種類、薬剤の投与方法等などの因子に応じて、対象ごと、又はその状況ごとに異なることになる。したがって、正確な「有効量」を指定することは不可能である。しかし、いかなる場合についても、適切な「有効量」は、慣用的な実験を使用するだけで当業者により決定され得る。
【００４２】
本明細書で使用する用語「曝露する」とは、一般に、接触させることを意味する。薬剤（例えば、オーラノフィン）に対するバイオフィルム又はバイオフィルム形成微生物の曝露には、微生物又はバイオフィルムを保有している対象に対して薬剤を投与すること、又は、例えば、バイオフィルム若しくはバイオフィルム形成微生物が存在する表面と薬剤とを接触させることによって微生物又はバイオフィルムを薬剤そのものと接触させることが含まれる。本開示では、用語「曝露する」、「投与する」及び「接触させる」ならびにその変形は、場合によって同義で使用され得る。
【００４３】
本明細書で「ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ（抑制する）」及びその変形、例えば「ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（抑制）」及び「ｉｎｈｉｂｉｔｓ（抑制する）」という用語を微生物の増殖に関して使用する場合、薬剤（例えば、オーラノフィン）又は組成物の殺菌的（ｍｉｃｒｏｂｉｏｃｉｄａｌ）若しくは静菌的な任意の活性を指す。そのような抑制は、程度的なもの及び／又は時間的若しくは空間的なものであってよい。薬剤による微生物増殖抑制は、薬剤の存在下及び非存在下での微生物の増殖を測定することにより評価できる。薬剤によって増殖を、薬剤に曝露されていない同一微生物の増殖と比較して少なくとも又は約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上抑制することができる。
【００４４】
本明細書で「ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ（抑制する）」及びその変形、例えば「ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（抑制）」及び「ｉｎｈｉｂｉｔｓ（抑制する）」という用語をバイオフィルムに関して使用する場合、バイオフィルムの形成及び／又は発達を完全又は部分的に抑制することを意味し、その範囲には、バイオフィルムの発達又はバイオフィルムの形成及び／若しくは発達に関連するプロセスを後退させることも含まれる。さらに、抑制は、永続的であっても一時的であってもよい。抑制は、所望の効果を得るために十分な、ある程度（大きさ及び／又は空間的）であってよく、かつ／又はある時間のものであってよい。抑制は、バイオフィルムの形成又は発達を防止する、遅らせる、低下させる、又は妨げることであってよい。そのような抑制は、大きさ的なもの及び／又は時間的若しくは空間的なものであってよい。オーラノフィンによるバイオフィルムの形成又は発達の抑制は、オーラノフィンの存在下及び非存在下におけるバイオフィルムの質量又は微生物の増殖を測定することにより評価できる。バイオフィルムの形成又は発達は、オーラノフィンによって、オーラノフィンに曝露されていないバイオフィルムの形成又は発達と比較して少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上抑制することができる。
【００４５】
本明細書で使用する用語「ｓｅｎｓｉｔｉｚｅ（感受性を増強させる）」又は「ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ（感受性を増強させる）」とは、抗菌剤に対するバイオフィルム又はバイオフィルム内微生物の感受性をより高めることを意味する。オーラノフィンがバイオフィルム又はバイオフィルム内微生物に与える感受性増強効果は、化合物を投与した場合と投与しない場合の、バイオフィルム又は微生物の第２の抗菌剤に対する感受性（例えば、微生物の増殖又はバイオフィルムの生物量により測定した場合）の差として測定できる。感受性を増強させたバイオフィルム又は微生物（例えば、オーラノフィンなどの薬剤に曝露させたバイオフィルム又は微生物）の抗菌剤に対する感受性は、感受性を増強させていないバイオフィルム又は微生物（すなわち、薬剤に曝露させていないバイオフィルム又は微生物）の感受性と比較して少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％又はそれ以上高められ得る。いくつかの実施形態では、オーラノフィンがバイオフィルム又はバイオフィルム内微生物に与える感受性増強効果は、オーラノフィンと併用して、又は単剤で投与される第２の抗菌薬の最小阻止濃度（ＭＩＣ）の差によって測定できる。例えば、いくつかの実施形態では、オーラノフィンと第２の抗菌薬とを併用した場合のＭＩＣは、第２の抗菌薬単剤で投与した場合のＭＩＣよりも少なくとも１０％低く、例えば、第２の抗菌薬単剤で投与した場合のＭＩＣよりも少なくとも２０％低い、少なくとも３０％低い、少なくとも４０％低い、少なくとも５０％低い、少なくとも６０％低い、少なくとも７０％低い、少なくとも８０％低い、少なくとも９０％低い、少なくとも９５％低い、少なくとも９９％低い、又は少なくとも９９．９％低い。本明細書で使用する用語「表面」には、生物学的表面と非生物学的表面の両方が含まれる。生物学的表面には典型的に、生物の内表面（臓器、組織、細胞、骨、及び膜など）及び生物の外表面（皮膚、毛、表皮付属器官、種子、植物の葉など）の両方が含まれる。生物学的表面には、木材又は線維のような他の天然表面も挙げられる。非生物学的表面は、バイオフィルムの確立と発達を支持する構成物であれば、いかなる人工表面であってもよい。そのような表面は、産業プラント及び設備に存在する場合があり、それらには、埋め込み型及び非埋め込み型の、医療用及び外科用装置ならびに医療機器が含まれる。さらに、本開示の目的の場合、表面は、多孔質（膜など）でも非多孔質でもよく、また、硬性でも軟性でもよい。
【００４６】
本明細書で使用する用語「ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療すること）」、「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」、「ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ（防止すること）」及び「ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（防止）」とは、病態又は症状を改善するか、感染症、病態又は疾患の確立を予防するか、又は、感染症、病態若しくは疾患又は他の望ましくない症状の進行を方法の如何を問わず防止、妨害、遅延、若しくは後退させる、全ての使用を指す。したがって、用語「ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療すること）」及び「ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ（防止すること）」等は、その最も広い意味で解釈されるべきである。例えば、治療は、必ずしも患者が治療を受けて完全回復することを意味しない。
【００４７】
本発明において、「対象」には、例えば、家畜（ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ及びヤギなど）、伴侶動物（ネコ及びイヌなど）及びショー又はパフォーマンス用動物（ウマなど）など、ヒト及びヒト以外の動物が含まれる。
【００４８】
一部では、本開示の実施形態は一般に、バイオフィルム、バイオフィルム形成微生物、又はバイオフィルムを形成しやすい表面をオーラノフィンに曝露させることによる、バイオフィルムの形成又は発達を抑制する方法、バイオフィルムの生物量を減少させる方法、バイオフィルム内微生物の分散を促進する方法、及びバイオフィルム又はバイオフィルム内微生物の抗菌剤に対する感受性を増強させる方法における、オーラノフィンの使用に関する。
【００４９】
オーラノフィン（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノサト−Ｓ−（トリエチルホスフィン）金、又はトリエチルホスフィン金チオグルコーステトラアセタート）は、金誘導体で分子量６７８．５であり、下記構造を有する
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（Ｉ）。
Ｒｉｄａｕｒａ（リドーラ）（登録商標）として市販されているオーラノフィンは、リウマチ及び若年性関節炎の治療に使用される抗関節炎薬である。オーラノフィンは、複数部位における白血球活性化経路を阻害すること、ならびにヒトの好塩基性細胞、肺の肥満細胞及びマクロファージからの炎症メディエーターの放出を阻害することが示されている。オーラノフィンは、サイトゾル内及びミトコンドリア内双方において、関節リウマチの進行に関与する多数のプロテアーゼに対するその阻害効果から、抗関節炎薬として作用すると考えられており、その阻害効果には、セレン含有酵素であるチオレドキシン還元酵素（ＴｒｘＲ）に対するその強い阻害が含まれる。
【００５０】
ごく最近になって、オーラノフィンは、ＨＩＶ感染サルのウイルス巣を制限すること、寄生虫Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｎａ  ｂｒｕｃｅｉ及びＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉの成長を抑制すること、ならびにＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの増殖を抑制することが示されている。オーラノフィンの抗菌作用を調査したいくつかの研究では、結果から、オーラノフィンは、セレンとの複合体形成によりこれらのセレン依存性生物におけるセレン代謝を遮断又は破壊し、それにより、セレン摂取及び酵素への取り込みを防止することが示された。
【００５１】
本明細書に記載し例示するように、オーラノフィンは、バイオフィルムの形成を抑制し、存在するか又はすでに形成されたバイオフィルムの生物量を減少させる。したがって、本明細書は、バイオフィルムの形成又は発達を抑制する方法を提供する。これは、バイオフィルムを形成する微生物を有効量のオーラノフィンに曝露させることにより達成できる。また、バイオフィルムを有効量のオーラノフィンに曝露させることによる、バイオフィルム生物量を減少させる方法及びバイオフィルム内微生物の分散を促進する方法も提供する。実施例に記載の試験で実証されるように、バイオフィルムを有効量のオーラノフィンに曝露させることにより、普通は、かかるバイオフィルム又はバイオフィルム内微生物に対して効果がないはずの抗菌剤に対するそのバイオフィルム及びバイオフィルム内微生物の感受性を増強させることもできる。したがって、バイオフィルムを有効量のオーラノフィンに曝露させることによる、バイオフィルム内微生物の抗菌剤に対する感受性を増強させる方法も提供する。
【００５２】
理論に束縛されることは望まないが、酸化還元経路活性の障害と増強した酸化的ストレスとを少なくとも部分的に関連させることによって、オーラノフィンは休眠細胞（ｐｅｒｓｉｓｔｅｒ  ｃｅｌｌ）に対してその効果を発揮すると考えられる。特に、オーラノフィンは、細菌のチオレドキシン（Ｔｒｘ）経路を阻害すると考えられる（実施例９を参照のこと）。これは、関節リウマチにおいて考えられているオーラノフィンの作用機序と一致しており、そこでは、サイトゾル内及びミトコンドリア内の双方でセレン含有酵素チオレドキシン還元酵素（ＴｒｘＲ）が抑制される（同実施例）。
【００５３】
新たなバイオフィルム形成を抑制する能力と、存在している、すでに形成されたバイオフィルムを破壊、分散又は除去する能力とは、別個の活性であるとみなすことができる。前者の場合、標的は、基質に接着しようとする浮遊細胞であるが、後者の場合、標的は、すでにバイオフィルムのマトリクスに付着し、埋め込まれている微生物細胞である。これら２種類の細胞集団では特性が非常に異なっており、最も顕著なのは、バイオフィルム内微生物の抗菌薬及び宿主免疫応答に対する耐性が浮遊細胞に比べて実質的に高くなっていること（最高１０００倍）である。
【００５４】
バイオフィルムに居住する微生物が抗菌薬に対してこのように高い耐性を示すことは、バイオフィルム関連の病態を呈するほとんどの対象が既に存在しているバイオフィルムを今後も保有することになるため特に問題となる。すなわち、バイオフィルムにより付与された耐性に打ち勝つための非常に高濃度の抗菌薬の使用は、対象に対する毒性が強く、かつ／又は高コストとなり、臨床の場では不可能又は望ましくない場合が多いことを意味する。したがって、存在している、すでに形成されたバイオフィルムを低濃度で破壊、分散又は除去する能力のある化合物は、バイオフィルム関連の病態を治療するうえで特別に価値があると考えられる。
【００５５】
残念なことに、存在しているバイオフィルムに対して低濃度で作用することが知られている化合物はほとんどない。これは、一部には、抗菌化合物のスクリーニングでは典型的に、化合物の浮遊細胞増殖に対する抑制能が評価されるからである。すでに記載したように、この活性は、すでに形成されたバイオフィルムに対する活性とは別個のものであり、すなわち、「抗バイオフィルム形成試験」における化合物の性能は、存在しているバイオフィルムに対する化合物の活性の良好な指標とはならないことを意味する。例えば、抗菌薬リネゾリドの場合、約６μｇ／ｍｌでバイオフィルム形成抑制が観察されるが、存在しているバイオフィルムに対する作用は１００μｇ／ｍｌのＭＩＣでも観察されず（すなわち、少なくとも１５倍のシフト）、同様に、抗菌薬エリスロマイシンの場合、約０．１〜０．３μｇ／ｍｌでバイオフィルム形成抑制が観察されるが、存在しているバイオフィルムに対する作用は３μｇ／ｍｌのＭＩＣでも観察されない（すなわち、少なくとも１０〜３０倍のシフト）。これまで１０００倍超のシフトが観察されている。
【００５６】
対照的に、オーラノフィンでは、約１μｇ／ｍｌにおいてバイオフィルム形成を完全に抑制し（実施例２ならびに図４Ａ及び４Ｂを参照のこと）、わずか３．９μｇ／ｍｌで存在しているバイオフィルムに対する作用がある（実施例３を参照のこと）ことが観察され、これは、４倍に満たないシフトであることを表している。したがって、いくつかの実施形態では、オーラノフィン又はオーラノフィンを含む本明細書に開示の組成物はシフトが１０未満であり、例えば９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満、又は１未満であり、バイオフィルム形成に対するＭＩＣは、８時間のインキュベーション後に、浮遊培養によるバイオフィルム形成を抑制する最低濃度であると定義してよく、また、ある化合物が、存在しているバイオフィルムの生物量を少なくとも１０％減少させる場合、その化合物は「存在しているバイオフィルムに対する作用」があるとみなされ得る。
【００５７】
当業者は、本開示の方法、使用及び組成物は、単一菌種及び混合菌種のバイオフィルムに適用可能であり、それらには、例えば、原核生物及び／又は下等真核生物が含まれ得、かつそれらの異なる種をいくつでも含んでよいことを理解するであろう。特定の実施形態では、開示の方法、使用及び組成物は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐｐ．、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｓｐｐ．、Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｓｐｐ．及びＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．を含むが、これに限定されない酵母及び糸状菌のような下等真核生物を含むバイオフィルムに適用可能である。さらなる実施形態では、バイオフィルムは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．及び／又はＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．を含むが、これに限定されない細菌種を含む。いくつかの例では、バイオフィルムは、多剤耐性（ＭＤＲ）細菌（例えば、ＭＲＳＡ、ＣＲＫＰ及び／又はＭＤＲ  Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ若しくはＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含み、本開示に従ってオーラノフィンを使用し、他の抗菌剤では効果のないバイオフィルムの形成又は増殖を抑制又は防止し、バイオフィルムの生物量を減少させ、かつ／又はバイオフィルム内微生物の分散を促進する。したがって、いくつかの態様では、細菌を有効量のオーラノフィンに曝露させることによって多剤耐性菌の増殖を抑制する方法も提供する。
【００５８】
特定の実施形態では、本明細書で提供する方法、使用及び組成物は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｃａｐｒａｅ、Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉ、及びＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ、Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓ．ｍｉｔｉｓ及び／又はＳ．ｍｕｔａｎｓを含むバイオフィルムに適用可能である。例えば、本明細書で提供する方法及び組成物は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むか、それを構成菌とするか、又はそれを本質的な構成菌とするバイオフィルムに適用可能である。特定の例では、本明細書で提供する方法、使用及び組成物は、ＭＲＳＡを含むか、それを構成菌とするか又はそれを本質的な構成菌とするバイオフィルムに適用可能である。さらなる非限定的な例では、本明細書で提供する方法、使用及び組成物は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ又はＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含むか、それを構成菌とするか、又はそれを本質的な構成菌とするバイオフィルムに適用可能である。例えば、本明細書で提供する方法、使用及び組成物は、ＭＤＲ  Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａを含むか、それを構成菌とするか又はそれを本質的な構成菌とするバイオフィルム、及び／又はＭＤＲ  Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉを含むか、それを構成菌とするか又はそれを本質的な構成菌とするバイオフィルムに適用可能である。他の例では、本明細書で提供する方法、使用及び組成物は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、又はＣ．ｎｅｏｆｏｒｍｓなどの真菌を含むか、それを構成菌とするか又はそれを本質的な構成菌とするバイオフィルムに適用可能である。
【００５９】
本明細書で提供する方法、使用及び組成物は、微生物の１種を含むバイオフィルムのほか、微生物の２つ以上の種、すなわち、混合菌種を含むバイオフィルムにも適用可能である。混合菌種のバイオフィルムには、細菌の２つ以上の種、下等真核生物の２つ以上の種（例えば、単細胞菌類、糸状菌及び／又は酵母といった２つ以上の真菌種）、及び／又は細菌の１つ以上の種と下等真核生物の１つ以上の種というように細菌と下等真核生物の両方が含まれてよい。例えば、本明細書で提供する方法、使用及び組成物は、細菌の１つ以上の種ならびに真菌の１つ以上の種、例えば、酵母、単細胞菌類及び／又は糸状菌を含むバイオフィルムに適用可能である。したがって、混合菌種のバイオフィルムは、微生物の２種、３種、４種、５種、１０種、１５種、２０種又はそれ以上の種を含んでよく、バイオフィルム内微生物は、単細胞菌類、糸状菌及び／又は酵母といった、細菌及び／又は下等真核生物であってよい。
【００６０】
バイオフィルム又はバイオフィルム形成微生物のオーラノフィン曝露は、任意の適切な方法によって達成することができ、最適な方法の選択は、十分に当業者の技能の範囲内である。いくつかの実施形態では、バイオフィルムが形成されやすい表面又は界面に有効量の化合物でコーティング、含浸又は接触を行うことによって、バイオフィルム又はバイオフィルム形成微生物をオーラノフィンに曝露させる。バイオフィルム又はバイオフィルム形成微生物は、すでに表面に存在していてよい。他の場合には、バイオフィルム形成微生物は、表面と化合物との接触の後、該表面に付着してよい。オーラノフィンに曝露され得る表面には、家庭内、医療又は産業上の環境（例えば、医療用及び外科用機器、及び病院、加工処理工場及び製造工場の内部の表面）、ならびに対象身体の内表面及び外表面を含むが、これに限定されない産業環境及び家庭内環境の中で存在する表面が含まれる。
【００６１】
したがって、本開示の方法は、バイオフィルム及びバイオフィルム形成微生物が関連するか、特徴であるか、又は原因である感染症ならびに病態、疾患及び障害を治療、予防及び継続管理するために使用できる。例えば、蜂窩織炎、膿痂疹、乳腺炎、中耳炎、細菌性心内膜炎、敗血症、毒素性ショック症候群、尿路感染症、肺感染症（嚢胞性線維症患者の肺感染症を含む）、肺炎、歯垢、齲蝕、歯周炎、細菌性前立腺炎及び外科的手技又は熱傷に関連した感染症といった、バイオフィルム形成に関連する多種多様な微生物感染症が本開示の方法及び組成物に従って治療され得る。例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、蜂窩織炎、膿痂疹、乳腺炎、中耳炎、細菌性心内膜炎、敗血症、毒素性ショック症候群、尿路感染症、肺感染症（嚢胞性線維症患者の肺感染症を含む）、肺炎、歯垢、齲蝕及び外科的手技又は熱傷に関連した感染症を引き起こすか、又は関連する。他の例では、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、肺炎、敗血症、市中感染型化膿性肝膿瘍（ＰＬＡ）、尿路感染症、及び外科的手技又は熱傷に関連した感染症を引き起こすか又はそれに関連し得る。さらなる例では、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉは、菌血症、肺炎、髄膜炎、尿路感染症、及び．及び創傷関連の感染症を引き起こすか又はそれに関連し得る。さらに別の例では、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、気道感染症（肺炎を含む）、皮膚感染症、尿路感染症、菌血症、耳の感染（中耳炎、外耳炎及び内耳炎を含む）、心内膜炎ならびに骨髄炎のような骨及び関節の感染症を引き起こすか又はそれに関連し得る。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓなどのＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓなどのＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、ならびに他の真菌、例えばＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｓｐｐ．、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｓｐｐ．、Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、心臓弁のカテーテル留置又は移植といった、医療用若しくは外科用機器の移植又は使用に関連した感染症を引き起こすか又はそれに関連する場合がある。したがって、本開示の方法、使用及び組成物は、このような疾患及び病態の治療又は予防に有用である。
【００６２】
特定の例では、医療用及び外科用装置ならびに埋め込み型医療機器などの医療機器をオーラノフィンでコーティングするか、含浸する、又はオーラノフィンと接触させる。これらの医療機器には、静脈カテーテル、ドレナージ用カテーテル（例えば、尿カテーテル）、ステント、ペースメーカー、コンタクトレンズ、補聴器、経皮グルコースセンサー、透析装置、薬剤ポンプ関連送達用カニューレ、人工関節のようなプロステーシス、乳房植込み、心臓、心臓弁若しくは他の臓器などの植込み、医療用固定デバイス（例えば、ロッド、スクリュー、ピン、プレート等）、又は包帯のような創傷被覆材及び縫合といった創傷治癒用デバイスが挙げられるが、これに限定されるものではない。開示の関連態様では、オーラノフィンでコーティング又は含浸した医療機器（上記で例示したものなど）を提供する。
【００６３】
他の例では、化合物を対象に投与することによって、オーラノフィンを対象の体表面に適用する。表面は、対象の内部又は外部であり得る。例えば、オーラノフィンは、皮膚ならびに／又は気道、肺、心臓、心臓弁、耳、外耳道、骨の表面及び又は他の任意の体表面といった表面に適用され得る。所望の表面のオーラノフィンへの曝露（及びそれによるバイオフィルム及び／又はバイオフィルム形成微生物のオーラノフィンへの曝露達成）をもたらすために行う対象へのオーラノフィン投与は、当業者により適切であると理解されているいかなる経路でも可能である。適切な投与経路の非限定的例には、鼻腔内、経口、動脈内、静脈内（個別注射、静脈内ボーラス又は持続注入を含む）、筋肉内、皮内、経皮、皮下、腹腔内又は局所投与（眼への局所投与を含む）、ならびにこれらの任意の２つ以上の経路の任意の組み合わせが挙げられる。オーラノフィンは、１回又は２回、３回、４回、５回、６回若しくはそれ以上を含む１回以上の回数、又は所望の転帰（例えば、感染コントロール）達成に必要であれば何回でも、適切な任意の間隔で対象に投与することができる。
【００６４】
方法の特定の実施形態では、オーラノフィンを他の１種以上の抗菌剤と併用する。したがって、バイオフィルムを形成する微生物を有効量のオーラノフィン及び他の１種以上の抗菌剤に曝露させることによってバイオフィルムの形成又は発達を抑制する方法を提供する。また、バイオフィルムを有効量のオーラノフィン及び他の１種以上の抗菌剤に曝露させることによる、バイオフィルムの生物量を減少させる方法、及びバイオフィルム内微生物の分散を促進する方法も提供する。
【００６５】
バイオフィルムが非常に問題となる理由の一つは、バイオフィルム内微生物が、浮遊細胞として存在する場合よりもはるかに抗菌剤及び宿主免疫応答に対して特に耐性を示すことである。本明細書で実証されるように、バイオフィルムをオーラノフィンに曝露させることにより、抗菌剤及び宿主免疫応答の作用に対するバイオフィルム及びバイオフィルム内微生物の感受性が増強し、そのため、普通であればバイオフィルム内微生物に対して効果がないはずのそれらの抗菌剤及び宿主免疫応答が有効となる。したがって、例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むバイオフィルムをリファンピシン又はゲンタマイシンなどの抗生物質に曝露させた場合、抗菌作用はほとんど、又は全く観察されない。しかしながら、バイオフィルムをリファンピシン又はゲンタマイシンに曝露させる前、同時又は曝露後にバイオフィルムをオーラノフィンに曝露させると、リファンピシン又はゲンタマイシンの抗菌作用に対するバイオフィルム及びバイオフィルム内のＳ．ａｕｒｅｕｓの感受性が増強し、相加的又は相乗的な抗菌作用が観察され得る。したがって、バイオフィルムを有効量のオーラノフィンに曝露させ、かつバイオフィルムを抗菌剤に（同時又は順次）曝露させることによって、バイオフィルム内微生物の抗菌剤に対する感受性を増強させる方法を提供する。また、オーラノフィン及び他の１種以上の抗菌剤を対象に投与することによって、バイオフィルム及びバイオフィルム形成微生物が関連するか特徴であるか又は原因である感染症ならびに病態、疾患及び障害を、治療、予防及び継続管理する方法も提供する。
【００６６】
バイオフィルム及び／又はバイオフィルム形成微生物をオーラノフィン及び他の１種以上の抗菌剤に曝露する本開示の方法では、曝露は、同時又は別々に行うことができ、すなわち、曝露は、同時又は順次であり得る。さらに、化合物及び他の１種以上の抗菌剤は、合剤にすることも別々の組成物に製剤化することもできる。薬剤を異なる組成物に製剤化する場合、それらの薬剤は、同一又は異なる経路又は手段で投与又は送達することができる。例えば、対象に化合物及び他の１種以上の抗菌剤を投与する場合、それらを同一組成物に合剤にするか又は別々の組成物に製剤化して、同一経路又は異なる経路による投与、例えば、鼻腔内投与、経口投与、動脈内投与、静脈内投与（個別注射、静脈内ボーラス又は持続注入を含む）、筋肉内投与、皮内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与又は局所投与によって、同時又は順次に投与することができる。
【００６７】
本明細書に記載する方法に好適な抗菌剤例には、抗生物質、抗真菌薬、洗浄液、界面活性剤、酸化的ストレスを誘導する薬剤、バクテリオシン及び抗菌性酵素（例えば、リパーゼ、プロナーゼ及びリアーゼ）ならびに他の各種タンパク質分解酵素及びヌクレアーゼ、ペプチド及びファージが挙げられるが、これに限定されるものではない。抗菌剤は、天然であっても合成であってもよい。使用する抗菌剤は、個々の事例に応じて本開示の特定の適用について選択してよく、当業者は、本開示の範囲が特定の抗菌剤の性質又は固有の特性により限定されるものではないことを理解するであろう。
【００６８】
抗菌剤の非限定的例には、フルオロキノロン系、アミノグリコシド系、グリコペプチド系、リンコサミド系、セファロスポリン系及び関連するベータラクタム系、マクロライド系、ニトロイミダゾール系、ペニシリン系、ポリミキシン系、テトラサイクリン系、ならびにその任意の組み合わせが挙げられる。例えば、本開示の方法には、アセダプソン；アセトスルホンナトリウム；アラメシン；アレキシジン；アムジノシリン；アムジノシリンピボキシル；アミシクリン；アミフロキサシン；メシル酸アミフロキサシン；アミカシン；アミカシン硫酸塩；アミノサリチル酸；アミノサリチル酸ナトリウム；アモキシシリン；アンホマイシン；アンピシリン；アンピシリンナトリウム；アパルシリンナトリウム；アプラマイシン；アスパルトシン；アストロマイシン硫酸塩；アビラマイシン；アボパルシン；アジスロマイシン；アズロシリン；アズロシリンナトリウム；バカンピシリン塩酸塩；バシトラシン；バシトラシンメチレンジサリチル酸塩；亜鉛バシトラシン；バンベリマイシン；ベンゾイルパスカルシウム；ベリスロマイシン；ベタマイシンスルファート；ビアペネム；ビニラマイシン；塩酸ビフェナミン；ビスピリチオンマグスルフェクス；ブチカシン；ブチロシン硫酸塩；硫酸カプレオマイシン；カルバドックス；カルベニシリンナトリウム；カルベニシリンインダニルナトリウム；カルベニシリンフェニルナトリウム；カルベニシリンカリウム；カルモナムナトリウム；セファクロル；セファドロキシル；セファマンドール；セファマンドールナファート；セファマンドールナトリウム；セファパロール；セファトリジン；セファザフルールナトリウム；セファゾリン；セファゾリンナトリウム；セフブペラゾン；セフジニル；セフェピム；セフェピム塩酸塩；セフェテコール；セフィキシム；セフメノキシム塩酸塩；セフメタゾール；セフメタゾールナトリウム；セフォニシド一ナトリウム；セフォニシドナトリウム；セフォペラゾンナトリウム；セフォラニド；セフォタキシムナトリウム；セフォテタン；セフォテタンナトリウム；セフォチアム塩酸塩；セフォキシチン；セフォキシチンナトリウム；セフピミゾール；セフピミゾールナトリウム；セフピラミド；セフピラミドナトリウム；セフピロム硫酸塩；セフポドキシムプロキセチル；セフプロジル；セフロキサジン；セフスロジンナトリウム；セフタジジム；セフチブテン；セフチゾキシムナトリウム；セフトリアキソンナトリウム；セフロキシム；セフロキシムアキセチル；セフロキシムピボキセチル；セフロキシムナトリウム；セファセトリルナトリウム；セファレキシン；塩酸セファレキシン；セファログリシン；セファロリジン；セファロチンナトリウム；セファピリンナトリウム；セフラジン；セトシクリン塩酸塩；セトフェニコール；クロラムフェニコール；クロラムフェニコールパルミチン酸エステル；パントテン酸クロラムフェニコール複合体；クロラムフェニコールコハク酸エステルナトリウム；クロルヘキシジンホスファニル酸塩；クロロキシレノール；重硫酸クロルテトラサイクリン；塩酸クロルテトラサイクリン；シノキサシン；シプロフロキサシン；シプロフロキサシン塩酸塩；シロレマイシン；クラリスロマイシン；クリナフロキサシン塩酸塩；クリンダマイシン；クリンダマイシン塩酸塩；塩酸パルミチン酸クリンダマイシン；クリンダマイシンリン酸エステル；クロファジミン；クロキサシリンベンザチン；クロキサシリンナトリウム；クロルヘキシジン；クロキシキン；コリスチンメタン酸ナトリウム；コリスチン硫酸塩；クメルマイシン；クメルマイシンナトリウム；シクラシリン；サイクロセリン；ダルホプリスチン；ダプソン；ダプトマイシン；デメクロサイクリン；デメクロサイクリン塩酸塩；デメサイクリン；デノフンギン；ジアベリジン；ジクロキサシリン；ジクロキサシリンナトリウム；硫酸ジヒドロストレプトマイシン；ジピリチオン；ジリスロマイシン；ドキシサイクリン；ドキシサイクリンカルシウム；ドキシサイクリンフォスファテックス；ドキシサイクリンハイクラート（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ  ｈｙｃｌａｔｅ）；ドロキサシンナトリウム；エノキサシン；エピシリン；エピテトラサイクリン塩酸塩；エリスロマイシン；エリスロマイシンアシストラート；エリスロマイシンエストレート；エリスロマイシンエチルエチルコハク酸エステル；エリスロマイシングルセプタート；エリスロマイシンラクトビオン酸塩；エリスロマイシンプロピオナート；ステアリン酸エリスロマイシン；エタンブトール塩酸塩；エチオナミド；フレロキサシン；フロキサシリン；フルダラニン；フルメキン；ホスホマイシン；ホスホマイシントロメタミン；フモキシシリン；塩化フラゾリウム；酒石酸フラゾリウム；フシジン酸ナトリウム；フシジン酸；ガンシクロビル及びガンシクロビルナトリウム；ゲンタマイシン硫酸塩；グロキシモナム；グラミシジ；ハロプロジン；ヘタシリン；ヘタシリンカリウム；ヘキセジン；イバフロキサシン；イミペネム；イソコナゾール；イセパマイシン；イソニアジド；ジョサマイシン；カナマイシン硫酸塩；キタサマイシン；レボフラルタドン；レボプロピルシリンカリウム；レキシスロマイシン；リンコマイシン；リンコマイシン塩酸塩；ロメフロキサシン；ロメフロキサシン塩酸塩；メシル酸ロメフロキサシン；ロラカルベフ；マフェニド；メクロサイクリン；メクロサイクリンスルホサリチラート；メガロマイシンカリウムフォスファート；メキドクス；メロペネム；メタサイクリン；塩酸メタサイクリン；メテナミン；ヒプル酸メテナミン；メテナミンマンデル酸；メチシリンナトリウム；メチオプリム；メトロニダゾール塩酸塩；リン酸メトロニダゾール；メズロシリン；メズロシリンナトリウム；ミノサイクリン；ミノサイクリン塩酸塩；ミリンカマイシン塩酸塩；モネンシン；モネンシンナトリウム；ナフシリンナトリウム；ナリジクス酸ナトリウム；ナリジクス酸；ナタイナイシン（ｎａｔａｉｎｙｃｉｎ）；ネブラマイシン；パルミチン酸ネオマイシン；ネオマイシン硫酸塩；ウンデシレン酸ネオマイシン；ネチルマイシン硫酸塩；ノイトラマイシン；ニフイラデン（ｎｉｆｕｉｒａｄｅｎｅ）；ニフラルデゾン；ニフラテル；ニフラトロン；ニフルダジル；ニフリミド；ニフィウピリノール（ｎｉｆｉｕｐｉｒｉｎｏｌ）；ニフルキナゾール；ニフルチアゾール；ニトロシクリン；ニトロフラントイン；ニトロミド；ノルフロキサシン；ノボビオシンナトリウム；オフロキサシン���オンネトプリム（ｏｎｎｅｔｏｐｒｉｍ）；オキサシリン及びオキサシリンナトリウム；オキシモナム；オキシモナムナトリウム；オキソリン酸；オキシテトラサイクリン；オキシテトラサイクリンカルシウム；オキシテトラサイクリン塩酸塩；パルジマイシン；パラクロロフェノール；パウロマイシン；ペフロキサシン；メシル酸ペフロキサシン；ペナメシリン；ベンザチンペニシリンＧ、ペニシリンＧカリウム、ペニシリンＧプロカイン塩、ペニシリンＧナトリウム、ペニシリンＶ、ペニシリンＶベンザチン、ペニシリンＶヒドラバミン、及びフェノキシメチルペニシリンカリウムなどのペニシリン系；ペンチジドンナトリウム；アミノサリチル酸フェニル；ピペラシリンナトリウム；ピルベニシリンナトリウム；ピリジシリンナトリウム；ピルリマイシン塩酸塩；ピバンピシリン塩酸塩；ピバンピシリンパモ酸塩；ピバンピシリンプロベナート；硫酸ポリミキシンＢ；ポルフィロマイシン；プロピカシン；ピラジナミド；ピリチオン亜鉛；酢酸キンデカミン；キヌプリスチン；ラセフェニコール；ラモプラニン；ラニマイシン；レロマイシン；レプロマイシン；リファブチン；リファメタン；リファメキシル；リファミド；リファンピシン；リファペンチン；リファキシミン；ロリテトラサイクリン；硝酸ロリテトラサイクリン；ロサラミシン；ロサラミシンブチラート；ロサミシンプロピオナート；ロサラミシンリン酸ナトリウム塩；ロサラミシンステアラート；ロソキサシン；ロキサルソン；ロキシスロマイシン；サンサイクリン；サンフェトリネムナトリウム；サルモキシシリン；サルピシリン；スコパフンギン；シソマイシン；シソマイシン硫酸塩；スパルフロキサシン；スペクチノマイシン塩酸塩；スピラマイシン；スタリマイシン塩酸塩；ステフィマイシン；ストレプトマイシン硫酸塩；ストレプトニコジド；スルファベンズ（ｓｕｌｆａｂｅｎｚ）；スルファベンズアミド；スルファセタミド；スルファセタミドナトリウム；スルファシチン（ｓｕｌｆａｃｙｔｉｎｅ）；スルファジアジン；スルファジアジンナトリウム；スルファドキシン；スルファレン；スルファメラジン；スルファメータ；スルファメタジン；スルファメチゾール；スルファメトキサゾール；スルファモノメトキシン；スルファモキソール；スルファニラート亜鉛；スルファニトラン；スルファサラジン；スルファソミゾール；スルファチアゾール；スルファザメト；スルフイソキサゾール；アセチルスルフイソキサゾール；スルフィスボキサゾールジオラミン（ｓｕｌｆｉｓｂｏｘａｚｏｌｅ  ｄｉｏｌａｍｉｎｅ）；スルホミキシン；スロペネム；スルタムリシリン（ｓｕｌｔａｍｒｉｃｉｌｌｉｎ）；サンシリンナトリウム；タランピシリン塩酸塩；テイコプラニン；テマフロキサシン塩酸塩；テモシリン；テトラサイクリン；テトラサイクリン塩酸塩；テトラサイクリンメタリン酸塩；テトロキソプリ；チアンフェニコール；チフェンシリンカリウム；チカルシリンクレシルナトリウム；チカルシリンナトリウム；チカルシリン一ナトリウム；チクラトン；塩化チオドニウム；トブラマイシン；硫酸トブラマイシン；トスフロキサシン；トリメトプリム；硫酸トリメトプリム；トリスルファピリミジン；トロレアンドマイシン；��ロスペクトマイシン硫酸塩；チロトリシン；バンコマイシン；バンコマイシン塩酸塩；バージニアマイシン；ゾルバマイシン；ビフォナゾレム（ｂｉｆｏｎａｚｏｌｅｍ）；ブトコナゾール；クロトリマゾール；エコナゾール；フェンチコナゾール；イソコナゾール；ケトコナゾール；ミトコナゾレル（ｍｉｃｏｎａｚｏｌｅｌ）、オモコナゾレル（ｏｍｏｃｏｎａｚｏｌｅｌ）、オキシコナゾレル（ｏｘｉｃｏｎａｚｏｌｅｌ）、セルタコナゾレル（ｓｅｒｔａｃｏｎａｚｏｌｅｌ）、スルコナゾレル（ｓｕｌｃｏｎａｚｏｌｅｌ）、チオコナゾレル（ｔｉｏｃｏｎａｚｏｌｅｌ）；アルバコナゾール；フルコナゾール；イサブコナゾール；イトラコナゾール；ポサコナゾール；ラブコナゾール；テルコナゾール；ボリコナゾール；アバフンギン；アモロルフィン；ブテナフィン；ナフチフィン；テルビナフィン；アニデュラフンギン；キャスポファンギン；ミカファンギン；及びその組み合わせを使用できる。
【００６９】
特定の例では、メチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓを含むバイオフィルムに関する場合、本開示の方法、組成物及び使用に好適な抗菌剤には、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、及びフルクロキサシリンが挙げられるが、これに限定されるものではない。ＭＲＳＡ感染を含むバイオフィルムに関連した方法においてオーラノフィンとの併用に好適な抗菌薬には、クリンダマイシン、コトリモキサゾール、リファンピシン、リンコマイシン、バンコマイシン、テイコプラニン及びムピロシン、ならびにその組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７０】
他の例では、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含むバイオフィルムに関する場合、本開示の方法、組成物及び使用に好適な抗菌剤には、アンピシリン、ピペラシリン、タゾバクタム、アモキシシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ゲンタマイシン、セフタジジム、セフェピム、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、ゲミフロキサシン、ノルフロキサシン、ゲイトフロキサシン（ｇａｉｔｆｌｏｘａｃｉｎ）、モキシフロキサシン、アミカシン、トブラマイシン、クラブラン酸、アズトレオナム、メロペネム、及びエルタペネム、ならびにその組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７１】
さらなる例では、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉを含むバイオフィルムに関する場合、本開示の方法、組成物及び使用に好適な抗菌剤には、イミペネム、メロペネム、セフェピム、シプロフロキサシン、コリスチンメタン酸、アンピシリン／スルバクタム、コリスチン、ミノサイクリン、ピペラシリン、タゾバクタム、チゲサイクリン、ポリミキシンＢ、ポリミキシンＥ、及びアミカシン、ならびにその組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７２】
さらなる例では、酵母及び糸状菌を含むバイオフィルムに関する場合、本開示の方法、組成物及び使用に好適な抗菌剤には、イミダゾール系（例えば、ビフォナゾレム（ｂｉｆｏｎａｚｏｌｅｍ）、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、トリアゾール系（例えば、アルバコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、ボリコナゾール）、チアゾール系（例えば、アバフンギン）、アリルアミン系（例えば、アモロルフィン、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィン）及びエキノカンジン系（アニデュラフンギン、キャスポファンギン、ミカファンギン）を含むがこれに限定されない抗真菌薬が挙げられる。
【００７３】
オーラノフィンは、所望の適応に好適な方法で組成物として製剤化することができる。したがって、本開示の方法で使用するための、オーラノフィンを含む組成物を提供する。オーラノフィンは、当技術分野で公知のいかなる方法でも製造することができる。例えば、米国特許第４１１５６４２号、第４１２２２５４号、第４１２５７１０号、第４１２５７１１号、第４１３１７３２号、第４１３３９５２号及び第４２００７３８号に記載の方法によりオーラノフィンを製造することができる。
【００７４】
オーラノフィンを含む組成物の個々の配合は、必要性のある表面への適用又は送達の方法に依存することになるので、用途ごとに異なってくる。例えば、オーラノフィンを含有する組成物は、インビボ投与用に、例えば、液体、懸濁液、シロップ、点鼻スプレー（ネブライザーを使用する投与用の形態を含む）、点眼薬、粉末、錠剤、カプセル、クリーム、パスタ剤、ゲル又はローションの形態で製剤化され得る。いくつかの例では、組成物により、例えば、外科用包帯、洗口剤又は練り歯磨きの成分を形成する。さらなる例では、オーラノフィンを制御放出用に製剤化する。物体の表面のコーティング又は含浸など、産業用及び家庭用の用途には、組成物を、塗料、ワックス、他にコーティング、エマルジョン、溶液、ゲル、懸濁液、ビーズ、粉末、顆粒、ペレット、フレーク又はスプレーとして製剤化してよい。熟練した対応者は、適切な製剤化は、個々の用途及び実施しようとする送達経路に応じて行われることを認識するであろう。
【００７５】
対象へのインビボ投与では、オーラノフィンを含有している組成物に、１種以上の薬理学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含めてよい。薬理学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤の例は、脱塩水又は蒸留水；生理食塩水；ピーナツ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、コーン油、ゴマ油、ラッカセイ油又はヤシ油といった植物系油；メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン及びメチルフェニルポリソルポキサン（ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ  ｐｏｌｙｓｏｌｐｏｘａｎｅ）といったポリシロキサン系などのシリコーン油；揮発性シリコーン；液体パラフィン、軟パラフィン又はスクワランなどの鉱油；セルロース；メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体；低級アルカノール、例えば、エタノール又はイソプロパノール；低級アラルカノール（ａｒａｌｋａｎｏｌ）；低級ポリアルキレングリコール又は低級アルキレングリコール、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール又はグリセリン；パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル又はオレイン酸エチル；ポリビニルピロリドンなどの脂肪酸エステル類；寒天；カラギーナン；トラガカントゴム又はアカシアゴム、及びワセリンである。
【００７６】
オーラノフィンを含む組成物は、本開示の個々の実施形態で使用するのに好適な量又は濃度のオーラノフィンを用いて製剤化され、例えば、バイオフィルムの形成を抑制するため；バイオフィルムの生物量を減少させるため；バイオフィルム内微生物の分散を促進するため；バイオフィルム又はバイオフィルム内微生物の抗菌剤に対する感受性を増強させるため；微生物の増殖を抑制するため；又は本明細書に記載の微生物又はバイオフィルムにより引き起こされたか又はそれに関連する感染症、疾患若しくは病態を治療又は予防するために十分な濃度又は量で製剤化される。組成物は、表面への直接投与用に製剤化することも、また、希釈してから使用する濃縮組成物として製剤化することもできる。ある場合には、組成物は、錠剤又はカプセル形態のような固形形態であり、オーラノフィンを濃度約０．０１％（ｗ／ｗ）〜約５０％（ｗ／ｗ）、約０．１％（ｗ／ｗ）〜約２０％（ｗ／ｗ）、約０．５％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）、又は約１％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）で含有する。他の場合には、組成物は液体形態である。特定の実施形態では、このような組成物を、化合物約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１１００ｍｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、又は約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬと共に製剤化する。所望の効果を達成するための最適濃度は多数の因子に依存することになり、慣用的な実験を使用して当業者が決定してよい。
【００７７】
本開示の特定の実施形態では、対象への投与用医薬組成物としてオーラノフィンを製剤化し、例えば、本明細書に記載する微生物関連の感染性の疾患又は病態を治療する。組成物を治療的有効量（例えば、疾患若しくは病態の進行を予防又は低下させる量）で対象に投与して、かかる疾患又は病態に対する治療を提供できる。対象に投与するオーラノフィンの正確な量又は用量は幾つかの因子に依存し、それらには、疾患又は病態の重症度、他の使用抗菌剤の有無、投与経路、投与回数、ならびに他の事項、例えば、対象の体重、年齢及び全身健康状態が含まれるが、これに限定されない。特定の用量は、経験的に決定するか、又は、例えば、動物モデルでの試験若しくはそれまでにヒトで行われた試験から外挿することができる。例えば、いくつかの実施形態では、対象に対し、オーラノフィンを体重１ｋｇあたり約０．０５ｍｇオーラノフィン〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量、例えば、少なくとも又は約０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、５．５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、８．５ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、９．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、又はそれ以上の用量で投与する。対象に投与する適切な用量の決定は、十分に当業者の技能の範囲内である。
【００７８】
提供される方法の有効性は、当技術分野で公知の任意の方法によって監視又は評価することができる。例えば、下記実施例に記載のようなバイオフィルム形成試験及び微生物増殖試験を用いて、バイオフィルム又は微生物のオーラノフィンへの曝露の効果を決定することができる。対象がオーラノフィン投与による治療を受ける例では、生体試料（例えば、血液、血漿、血清、喀痰、唾液、尿、便、腟分泌物、胆汁、リンパ液、及び脳脊髄液、及び皮膚又は粘膜などの体表のスワブ）は、化合物の投与前、投与中及び／又は投与後に採取可能であり、試料中の微生物の存在を細菌増殖試験を用いて評価し、治療効果を決定することができる。他の例では、対象への化合物の投与前、投与中、及び／又は投与後に採取した試料中の微生物の存在は、１種以上の微生物抗原を検出するイムノアッセイを使用して評価することができ、そのような評価法は当技術分野において周知である。いくつかの実施形態では、本開示の方法のモニタリング又はアセスメントを使用して、１つ以上のパラメータ、例えば、治療期間、用量、又は投与経路を改変することができる。
【００７９】
本明細書に記載する態様及び実施形態は、具体的に記載されているもの以外に変更及び修正を受けやすいことは、当業者には理解されるであろう。本開示には、そのような変更及び修正全てが含まれることを理解されるべきである。また、本開示には、本明細書において個別又は集合的に言及又は指示されるステップ、特徴、組成物及び化合物の全て、ならびに前記ステップ又は特徴の任意の２つ以上のあらゆる組み合わせも含まれる。
【００８０】
本明細書のいかなる参考文献の引用も、そのような参考文献が本出願に「先行する技術」として利用可能であることを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、本明細書におけるいかなる先行文献（又はそれに由来する情報）への参照又はいかなる公知の事項への参照も、その先行文献（又はそれに由来する情報）又は公知の事項が本明細書が関連している努力傾注分野において共通した一般知識の一部をなすことを肯定するもの、又は認めるもの、又は示唆するものではなく、かつ、そのように捉えるべきではない。
【００８１】
以下の非限定的な例を参照にして本開示をさらに説明する。
【実施例】
【００８２】
実施例１．Ｓ．ａｕｒｅｕｓの増殖に対するオーラノフィンの効果
増殖試験
オーラノフィンがＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＮＣＴＣ８３２５、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ臨床分離株の０４−２２９−２４５５、０４−２２８−１８２５、０４−２２７−３５６７及び０２−２２８−３６１１、ならびに院内感染型及び市中感染型のＭＲＳＡ株であるＩＭＶＳ６７（ｎｍＭＲＳＡ  Ｄ）、ＲＢＨ９８（ＱＬＤ）、ＰＡＨ５８（ＳＷＰ）、ＭＷ２（ＵＳＡ４００）、ＣＨ１６（ＵＫ  ＥＭＲＳＡ−１５）ＲＰＡＨ１８（Ａｕｓ−２）及びＵＳＡ３００の増殖を抑制できるか否かの決定に、増殖試験を用いた。
【００８３】
ＤＭＳＯ中での段階希釈に先立ち、オーラノフィン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を２ｍｇ／ｍＬの保存濃度としてＤＭＳＯに調合した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株を陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培地（ＣａＭＨＢ）で一晩増殖させ、約５ｘ１０7ｃｆｕ／ｍＬ（すなわち、１／１００）まで希釈し、その後で１５０μＬを平底９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。希釈したオーラノフィン３マイクロリットルを、２連でウェルに加えた。対照には、リンコマイシン含有エタノールの系列希釈を含め（プレートごとの変更を評価するため）、陽性対照は、２％ＤＭＳＯを含むＣａＭＨＢに細菌のみを有するもの、また陰性（細菌なし）対照は、２％ＤＭＳＯ含有ＣａＭＨＢ１５０μＬとした。プレートを、振盪インキュベーター内で３７℃にて２２〜２４時間インキュベートし、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ  Ｂｉｏ−Ｔｅｋマイクロプレートリーダーを使用して５９５ｎｍの波長における吸光度を測定した。その後、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの増殖を陽性対照（細菌のみ）のパーセンテージとして評価し、ＩＣ50値を決定した。
【００８４】
下記について増殖試験を変形した：
−Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ：一晩培養菌の１／１００希釈を使用してアッセイを設定、使用培地：０．５％酵母抽出物及び１％グルコースを添加したトッド−ヒューウィット液体培地。被検体を４〜５日間インキュベートした。
−Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（＃２）：一晩培養菌の１／１００希釈を使用してアッセイを設定、使用培地：０．５％酵母抽出物を添加したトッド−ヒューウィット液体培地。被検体を２２〜２４時間インキュベートした。
−Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ：一晩培養菌の１／１００希釈を使用してアッセイを設定、使用培地：ルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ：ＬＢ）液体培地。被検体を２２〜２４時間インキュベートした。
【００８５】
オーラノフィンは実験室株Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＮＣＴＣ８３２５）の増殖を効率的に抑制し、０．５μｇ／ｍＬ又は７４０ｎＭのＩＣ50を示した（図１Ａ）。オーラノフィンのこの抑制効果はＳ．ａｕｒｅｕｓの臨床分離株でも観察され、同様のＩＣ50０．４〜０．５μｇ／ｍＬを示した（図１Ｂ）。
【００８６】
殺菌時間アッセイ（ｔｉｍｅ  ｋｉｌｌ  ａｓｓａｙ）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの増殖に対するオーラノフィンの効果も殺菌時間アッセイ（ｔｉｍｅ  ｋｉｌｌ  ａｓｓａｙ）を用いて評価した。指数関数的に増殖するＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＮＣＴＣ８３２５をトリプチックソイ液体培地（ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ：ＴＳＢ）に約５×１０6ｃｆｕ／ｍＬまで希釈し、オーラノフィン、リファンピシン又はオーラノフィンとリファンピシンの両方を加えた。オーラノフィンは、５μｇ／ｍＬ；１μｇ／ｍＬ又は０．５μｇ／ｍＬの濃度で培養物に加えた。リファンピシンは１μｇ／ｍＬ又は０．２μｇ／ｍＬの濃度で培養物に加え、オーラノフィンとリファンピシンを含む培養物ではオーラノフィン０．５μｇ／ｍＬ及びリファンピシン０．２μｇ／ｍＬであった。培養を様々な測定ポイントでサンプリングし、コロニー形成単位を決定した。
【００８７】
オーラノフィンの増殖抑制効果は濃度依存的かつ時間依存的であることが観察された（図２）。
【００８８】
ＴＨＰ−１細胞
ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１をＳ．ａｕｒｅｕｓ（菌株ＳＨ１０００−ＧＦＰ）を用いて感染多重度３で１．５時間感染させた。細胞を３回洗浄し、オーラノフィン（０．５％ＤＭＳＯ中１μｇ／ｍｌ）又は０．５％ＤＭＳＯを加えた。感染後の様々な測定ポイントで細胞を蛍光顕微鏡下で観察した（図３）。オーラノフィンは細胞内及び細胞外のＳ．ａｕｒｅｕｓ増殖を２４時間の期間にわたって抑制した。ＤＭＳＯ処置した感染細胞は細胞内及び細胞外の細菌の蓄積を示し、約７時間で細胞死が生じた（細胞形態により判定）。
【００８９】
実施例２．Ｓ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルム形成に対するオーラノフィンの効果
Ｓ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルム形成に対するオーラノフィンの効果を、ＭｅｒｒｉｔｔらがＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０１１，  １Ｂ．１．１−１Ｂ１．１８で記載したバイオフィルム形成防止試験（ｂｉｏｆｉｌｍ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）にわずかな修正を行って用い評価した。簡単に言うと、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＮＣＴＣ８３２５、ＭＲＳＡ（ＲＰＡＨ１８）及びＭＲＳＡ（ＭＷ２）をトリプチックソイ液体培地（ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ：ＴＳＢ）で一晩増殖させ、１／５０〜１／１００まで希釈を行ってから、１５０μＬを平底９６ウェルプレートのウェルに加えた。ＤＭＳＯに適切な希釈度で希釈した３マイクロリットルのオーラノフィンをウェルに２連で加えた。対照には、リンコマイシン含有エタノールの系列希釈を含め（プレートごとの変更を評価するため）、陽性対照は、２％ＤＭＳＯを含むＴＳＢに細菌のみを有するもの、また陰性（細菌なし）対照は、２％ＤＭＳＯ含有ＴＳＢ１５０μＬとした。プレートをＡｅｒａＳｅａｌ（商標）で密封し、３７℃にて２４時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、６０℃で１時間乾燥させ、クリスタルバイオレットで１時間染色した。プレートを再び水で３回洗浄し、乾燥及び走査を行ってから、３３％酢酸を加えて接着細胞に結合したクリスタルバイオレット染色を再可溶化させた。その後、６３０ｎｍにおける吸光度を測定し、細菌のみの対照のパーセンテージとして表した。
【００９０】
これらの試験条件下で、オーラノフィンは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＮＣＴＣ８３２５及びＭＲＳＡ（ＲＰＡＨ１８）による両方のバイオフィルム形成を濃度約１μｇ／ｍＬで完全に防止した（それぞれ図４Ａ及び４Ｂ）。オーラノフィンによる同様のバイオフィルム形成防止がＭＲＳＡ（ＭＷ２）で観察された（データ省略）。
【００９１】
オーラノフィン（０．３μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬ）は、抗生物質エリスロマイシン、リンコマイシン、ゲンタマイシン及びバンコマイシンと併用、個別使用した場合に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＮＣＴＣ８３２５によるバイオフィルム形成を抑制することも観察された。併用増殖阻止濃度指数（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ：ＦＩＣＩ）を、以下の式を使用して計算した：
（ＭＩＣ［併用時の被験オーラノフィン］／ＭＩＣ［併用時の被験オーラノフィン］）＋（ＭＩＣ［併用時の被験抗生物質）］／ＭＩＣ［単独時の抗生物質］）。
表１は、別々の５試験から得られたデータで決定されたＦＩＣＩを示す。ＦＩＣＩ＜０．５は相乗作用を示唆し、ＦＩＣＩ＞４を拮抗作用と定義し、ＦＩＣＩ＞０．５〜１は相加作用を示し、ＦＩＣＩ１〜４を不関とみなす（ＮＥ＝効果なし、すなわち、併用時ＭＩＣは単独時ＭＩＣと同様である；ＮＤ＝実施せず）。
【表１】
2018504434.tif 000003
【００９２】
実施例３．すでに形成されたＳ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムに対するオーラノフィンの効果
オーラノフィン単独時及び抗生物質と併用時の、すでに形成されたＳ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムに対する効果を評価した。簡単に言うと、実施例２に記載のように９６ウェルプレートにＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＮＣＴＣ８３２５を播種し、３７℃にて２４時間インキュベートした。その後、バイオフィルムをＴＳＢで３回洗浄し、１５０μＬの新鮮ＴＳＢ、及びＤＭＳＯに適切な希釈度で希釈したオーラノフィン３μＬをウェルに２連で加えた。プレートを再びＡｅｒａＳｅａｌ（商標）で密封し、再度３７℃にて２４時間インキュベートした。その後、上記の通りバイオフィルムの検出を行った。
【００９３】
オーラノフィンは、存在しているＳ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムに対し、クリスタルバイオレット染色により決定した用量依存的抑制効果を示した。図５に示すように、２０μｇ／ｍＬ及び４０μｇ／ｍＬの濃度のオーラノフィン処置により、バイオフィルム内の細菌を分散させ、バイオフィルムを本質的に消失させた。逆に、リファンピシンは高濃度でもすでに形成されたバイオフィルムを処理しなかった。オーラノフィンとリファンピシン又はオーラノフィンとリンコマイシンの組み合わせにバイオフィルムを曝露させたところ、これらの化合物の効果は有意に増強した。
【００９４】
オーラノフィンとリファンピシンの組み合わせの増強された処理効果はさらに、５μｇ／ｍＬのオーラノフィン及び１．５μｇ／ｍＬのリファンピシンを単剤及び併用して行ったアッセイで実証された（図６Ａ）。これらの化合物いずれか単剤ではバイオフィルムに対して部分的効果しかなかったが、これら２剤の併用では、バイオフィルムの生物量が陰性対照の約２０％減少した。図６Ｂ及び６Ｃは、０．９μｇ／ｍＬ又は３μｇ／ｍＬのリファンピシン（図６Ｂ）又は２５μｇ／ｍＬ又は７５μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（図６Ｃ）と併用した場合の、様々な濃度でのオーラノフィンの抑制効果を示す。リファンピシン及びゲンタマイシンはいずれも両濃度においてバイオフィルムの質量に全く効果を示さなかったが、各剤とも、わずか３．９０μｇ／ｍＬのオーラノフィンを加えただけでバイオフィルムの質量が有意に減少した。
【００９５】
実施例４．Ｓ．ａｕｒｅｕｓはオーラノフィンに対する耐性を生じない
Ｓ．ａｕｒｅｕｓがオーラノフィンに対して耐性を生じる頻度を決定するため、ディスク拡散法、耐性頻度アッセイ、及び殺菌時間アッセイ（ｔｉｍｅ−ｋｉｌｌ  ａｓｓａｙ）の３種の評価法を別々に実施した。
【００９６】
ディスク法
細菌をＴＳＢ寒天に播種した。３Ｍディスク（４μｇのオーラノフィン、４μｇリファンピシン又はＤＭＳＯのみで含浸）を寒天上に載せた。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、あらゆる細菌抑制ゾーンを測定した。この抑制ゾーン内で増殖する細菌コロニーを採取し、その後、適宜の化合物／抗生物質に対する可能性のある耐性について、上記の増殖試験又はバイオフィルム形成試験を用いて分析した。オーラノフィンの抑制ゾーンの増殖は観察されなかったが、リファンピシン（Ｒｉｆ）の抑制ゾーンから変異株を単離した。これらのＳ．ａｕｒｅｕｓのＲｉｆ変異株を増殖試験で試験し、そのリファンピシン耐性が確認された。
【００９７】
オーラノフィン及びリファンピシンではいずれも周囲にＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＮＣＴＣ８３２５及び各種臨床分離株（ＭＲＳＡ株であるＩＭＶＳ６７（ｎｍＭＲＳＡ  Ｄ）、ＲＢＨ９８（ＱＬＤ）、ＰＡＨ５８（ＳＷＰ）、ＭＷ２（ＵＳＡ４００）、ＣＨ１６（ＵＫ  ＥＭＲＳＡ−１５）ＲＰＡＨ１８（Ａｕｓ−２）及びＵＳＡ３００を含む）の抑制ゾーンができ、耐性菌コロニーはリファンピシンの抑制ゾーンにしか存在しないことが認められた（データ省略）。したがって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＮＣＴＣ８３２５及び各臨床分離株のいずれにおいてもオーラノフィンに対する耐性の発生は観察されなかった。逆に、ほぼ全ての分離株のコロニーがリファンピシンの抑制ゾーンで観察され、リファンピシンの変異頻度は約１０-8であること示唆する先の公開データ（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（２００１）  ４７（５）：  ６４７−６５０）と一致している。
【００９８】
耐性頻度アッセイ
２種の耐性頻度アッセイをＳｔｏｋｅｓら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００５）  ２８０：３９７０９−３９７１５）にしたがって設定した。簡単に言うと、オーラノフィンの最小阻止濃度（１μｇ／ｍＬ）の１倍、１．５倍、２倍及び４倍を含有するＴＳＢ寒天プレートにＳ．ａｕｒｅｕｓを画線した。可能性のある変異株を採取し、耐性について評価した。耐性の可能性のある細菌を、オーラノフィン、リファンピシン又はリンコマイシンの系列希釈を含有するＣａＭＨＢ液体培地で一晩培養し、増殖試験で細菌の増殖を測定して対照と比較することによってそれらの耐性特性について評価した。もともとは寒天プレートで増殖させていない、耐性ではない「野生型」細菌も増殖試験に含めた。「Ｒｉｆ耐性細胞」をリファンピシンの抑制ゾーンから採取し、「Ａｕ耐性」の可能性のある変異株をオーラノフィンの抑制ゾーン縁部から採取して試験した。寒天プレートから採取したオーラノフィン耐性の可能性のある細菌は、オーラノフィンを含有している液体培地で増殖が全く観察されなかったことから、実際にはどれも耐性ではないことが観察された（図７Ａ＆Ｂ）。逆に、寒天プレートから採取したリファンピシン耐性の可能性のある細菌は、これらの細菌培養が対照と同一レベルまで増殖したことから、完全に耐性であった。野生型（すなわち、感受性）細菌では増殖は示されなかった。
【００９９】
可能性のある変異株も上記実施例２に記載のバイオフィルム形成防止試験（ｂｉｏｆｉｌｍ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を用いて分析した。この試験では、オーラノフィン又はリファンピシン非存在下でバイオフィルム形成まで培養したＳ．ａｕｒｅｕｓを対照として使用し、耐性の可能性のある細菌のクリスタルバイオレット染色後の吸光度を対照のパーセンテージとして表した。図８で実証されるように、オーラノフィン耐性の可能性のある細菌は約３μｇ／ｍＬ超のオーラノフィン存在下でバイオフィルムを形成することができなかった。逆に、リファンピシン耐性の可能性のある細菌はリファンピシンの全ての濃度に対して耐性を示し、かかる化合物の非存在下で培養した細菌と同様にバイオフィルムを形成した。
【０１００】
殺菌時間アッセイ（ｔｉｍｅ  ｋｉｌｌ  ａｓｓａｙ）
上記実施例１に記載の殺菌時間アッセイ（ｔｉｍｅ  ｋｉｌｌ  ａｓｓａｙ）を観察して、オーラノフィン耐性菌又はリファンピシン耐性菌の経時的な発育を評価した。図２からわかるように、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、若しくは５μｇ／ｍＬのオーラノフィン存在下、又は０．５μｇ／ｍＬのオーラノフィンと０．２μｇ／ｍＬのリファンピシンの併用剤の存在下では、経時的な細菌増殖がないことで示されるように、耐性菌は何も観察されなかった。これに対し、０．２μｇ／ｍＬ及び１μｇ／ｍＬのリファンピシンの存在下では、約１０時間に細菌増殖が増大し始め、リファンピシン耐性の発生を示している。
【０１０１】
リファンピシン耐性変異株のオーラノフィンに対する感受性
リファンピシン耐性変異株のオーラノフィンに対する感受性をディスクアッセイ法を用いて評価した。簡単に言うと、リファンピシン耐性が確認された変異株を含有する培養物をＴＳＢ寒天上に多量に画線してから、４μｇのオーラノフィン、４μｇのリファンピシン、オーラノフィン／リファンピシン（各４μｇ）又はＤＭＳＯのみで含浸したディスクを寒天上に載せた。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、あらゆる細菌抑制ゾーンに注目した。オーラノフィン又はオーラノフィン／リファンピシンを含有しているディスク周囲には抑制ゾーンが形成されたが、リファンピシン又はＤＭＳＯを含有しているディスク周囲には形成されず、このことから、リファンピシン耐性変異株のオーラノフィンに対する感受性及びリファンピシンに対する耐性が維持されていることが示された（データ省略）。
【０１０２】
結論
どのＳ．ａｕｒｅｕｓ株（実験室株及び臨床分離株）もオーラノフィンに対する耐性を発生しなかった。逆に、リファンピシンに耐性である変異株は通常の場合と変わらず耐性となった。さらに、リファンピシン耐性変異株はオーラノフィンに対し感受性のままであった。
【０１０３】
実施例５．多剤耐性Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するオーラノフィンの効果
多剤耐性Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ臨床分離株４株の増殖をオーラノフィンが抑制する能力を評価した。臨床分離株は、Ｃ２０４７４２（アンピシリン及びゲンタマイシンに対して耐性を示す）、Ｃ６８７６１（アンピシリン、トリメトプリム及びスルファメトキサゾールに対して耐性を示す）、Ｃ１８８６８１（アンピシリン、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、セフタジジム、トブラマイシン及びシプロフロキサシンに対して耐性を示す）及びＣ７１１７３（アンピシリン、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、セフタジジム、トブラマイシン、ゲンタマイシン及びシプロフロキサシンに対して耐性を示す）であった。これらの株は、先にＣｈｏｗｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５５：  ３１４０−３１４９に記載されている。
【０１０４】
細菌のコロニーを採取し、ルリア液体培地（ＬＢ）に１／１０００で希釈した。その後、各希釈液を１００μＬずつＬＢプレートに画線した。１００μｇのオーラノフィン又は１００μｇのゲンチマイシン（ｇｅｎｔｉｍｉｃｉｎ）又はオーラノフィンとゲンタマイシン（各１００μｇ）で含浸したディスクを寒天上に載せた。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、あらゆる細菌抑制ゾーンに注目した。図９に示すように、オーラノフィンは、検討した多剤耐性の臨床分離株４株全てに対して抑制活性を示す。場合によっては、菌株Ｃ７１１７３の場合のように、オーラノフィンとゲンタマイシンの併用により殺菌が増強されると考えられる。
【０１０５】
実施例６．Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉに対するオーラノフィンの効果
増殖試験及びディスク法によって、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉの増殖をオーラノフィンが抑制する能力を評価した。
【０１０６】
最初の増殖試験では、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ３株（Ｄ２、Ａ９４及びＡＴＣＣ１７９７８）を、オーラノフィン１．２５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ若しくは４０μｇ／ｍＬ、又はゲンタマイシン１．５６μｇ／ｍＬ、３．１３μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ若しくは２００μｇ／ｍＬ存在下で２２〜２４時間ＬＢで培養した。抗生物質の非存在下でも菌株を増殖させて、これらを対照として使用した。Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ  Ｂｉｏ−Ｔｅｋマイクロプレートリーダーを使用して５９５ｎｍでの吸光度を測定し、細菌増殖を決定した。その後、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉの増殖を陽性対照（細菌のみを２％ＤＭＳＯの存在下で増殖させた）のパーセンテージとして評価した。図１０Ａで実証されるように、全３株ともオーラノフィン感受性であった（ＭＩＣ約１０μｇ／ｍＬ）。逆に、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ  Ｄ２はゲンタマイシンに対して完全な耐性を示し、Ａ９４は部分的な耐性を示し、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ  ＡＴＣＣ１７９７８のみが感受性であった（図１０Ｂ）。
【０１０７】
その後、オーラノフィンとゲンタマイシン併用による細菌増殖に対する効果を決定するための２回目の増殖試験を実施した。簡単に言うと、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉをオーラノフィン０μｇ／ｍｌ、０．３１２５μｇ／ｍｌ、０．１２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ若しくは４０μｇ／ｍｌ、及びゲンタマイシン０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ若しくは１０００μｇ／ｍｌの存在下で２２〜２４時間ＬＢ培地で培養してから、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ  Ｂｉｏ−Ｔｅｋマイクロプレートリーダーを使用して５９５ｎｍにおける吸光度の測定によって増殖を決定した。その後、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉの増殖を陽性対照（細菌のみを２％ＤＭＳＯの存在下で増殖させた）のパーセンテージとして評価した。オーラノフィンとゲンタマイシンを併用した場合にＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ増殖の抑制増強が観察された（図１１）。
【０１０８】
これらの結果は、本質的に上記のように実施したディスク拡散法を用いて確認された。簡単に言うと、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ  Ｄ２、Ａ９４及びＡＴＣＣ１７９７８をＬＢ寒天プレートに播種し、その上に、４μｇ又は１００μｇのオーラノフィン、１００μｇのゲンタマイシン、又は４μｇのオーラノフィンと１００μｇのゲンタマイシンで含浸したディスクを載せた（図１２）。
【０１０９】
実施例７．Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉのバイオフィルム形成に対するオーラノフィンの効果
Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ  Ｄ２のバイオフィルム形成に対するオーラノフィンの効果を、上記実施例２のバイオフィルム形成防止試験（ｂｉｏｆｉｌｍ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）をわずかに修正して用い、評価を行った。簡単に言うと、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ  Ｄ２をＬＢ培地で一晩増殖させ、１／１００に希釈してから、１５０μＬを平底９６ウェルプレートのウェルに加えた。適切な希釈度でＤＭＳＯに希釈したオーラノフィン又はゲンタマイシン３マイクロリットルをウェルに２連で加えた。対照には、培地と２％ＤＭＳＯに細菌のみを有する陽性対照と、２％ＤＭＳＯ含有培地を有する陰性（細菌なし）対照とを含めた。プレートをＡｅｒａＳｅａｌ（商標）で密封し、３７℃にて２４時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、６０℃で１時間乾燥させ、クリスタルバイオレットで１時間染色した。プレートを再び水で３回洗浄し、乾燥及び走査を行ってから、３３％酢酸を加えて接着細胞に結合したクリスタルバイオレット染色を再可溶化させた。その後、５９５ｎｍにおける吸光度を測定し、細菌のみの対照のパーセンテージとして表した。
【０１１０】
これらの試験条件下で、オーラノフィンは、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ  Ｄ２によるバイオフィルムの形成を濃度約２０μｇ／ｍＬで完全に防止した（図１３Ａ）。逆に、ゲンタマイシンは、濃度２０μｇ／ｍＬでもＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ  Ｄ２によるバイオフィルムの形成を防止できなかった（図１３Ｂ）。
【０１１１】
実施例８．他菌種の増殖に対するオーラノフィンの効果
様々なグラム陽性菌種及びグラム陰性菌種の増殖をオーラノフィンが抑制する能力を決定するため、実施例１に記載のように増殖試験を行った。結果を表２に示す．
【表２】
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【０１１２】
実施例９．オーラノフィンの活性は、酸化還元経路活性の障害及び増強した酸化的ストレスに関連している
オーラノフィンは、これまで哺乳類細胞のチオレドキシン還元酵素を抑制することが示唆されており、近年では細菌においても同様のことが示唆されている（Ｈａｒｂｕｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５），  ＰＮＡＳ，  １１２：１４；  ４４５３−４４５８）。チオレドキシン（Ｔｒｘ）経路は細菌細胞を酸化的ストレスから保護しており、多くの（全部ではない）グラム陽性菌及び一部のグラム陰性菌ではこの経路は不可欠である。
【０１１３】
ほとんどのグラム陰性菌は酸化的ストレスに対処するグルタチオン（ＧＳＨ）とグルタチオン還元酵素経路（ＧＲ）という第２の経路を有している。ＧＲはｇｏｒ遺伝子によりコードされる。ＧｓｈＡは、ＧＳＨ生合成経路の２段階のうち最初の段階を触媒するγ−グルタミン酸システインリガーゼをコードする。グルタチオン合成酵素ＧｓｈＢは、グルタチオン生合成経路の最終段階を触媒する。
【０１１４】
オーラノフィンが抗酸化経路に対して作用するか否かを決定するため、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２の非必須遺伝子全てに対し単一ノックアウト変異株を含む、Ｋｅｉｏライブラリーから得た変異株を増殖試験で試験した。
【０１１５】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させたオーラノフィン保存溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）をＤＭＳＯ中に段階希釈し、各希釈液を９６ウェルプレートに２連で加えてＤＭＳＯ最終濃度２％（ｖ／ｖ）とした。一晩培養したＥ．ｃｏｌｉ変異株及び野生型をルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ：ＬＢ）液体培地に１：１００で希釈し、この試料の１５０μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。対照ウェルには、２％ＤＭＳＯ存在下で細菌を含む「未処置」対照及び陰性試料（２％ＤＭＳＯの存在下の増殖培地１５０μｌを含有）を含めた。プレートを３７０Ｃにて２２〜２４時間インキュベートし、５９５ｎｍの波長における吸光度により細菌増殖を評価した。最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、未処置対照と比較して増殖を抑制した化合物の最低濃度と定義した。野生型菌株と比較して、ｇｓｈａ及びｇｓｈｂが欠失した変異株はオーラノフィンに対する感受性がより高かった（図１４を参照のこと）。ＧＳＨ経路の阻害により、Ｔｒｘ経路が酸化的ストレスに対処しなければならなくなる。したがって、この経路がオーラノフィンにより抑制されると、細菌は酸化的ストレスに対処できない。このことは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのようなＧＳＨ経路を欠くグラム陽性菌が、グラム陰性菌よりもオーラノフィンに感受性である理由を一部説明し得る。しかし、このことが唯一の機序ではない可能性が高く、ｇｓｈｂ変異株がｇｓｈａ変異株と同様のオーラノフィン感受性を示さなかったことは興味深い。同様に、ｇｏｒの欠失による影響はほとんどなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
2018504434.tif 000011
【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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