(57)【要約】  本発明は、新規な電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットに、および、電圧依存性イオンチャネルを活性化または阻害する能力について、候補分子または物理的パラメータをリアルタイムでスクリーニングして特徴付けるための機能的生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）アッセイに関する。
2018504917.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの生物発光ドナー分子に結合しかつ少なくとも１つの蛍光アクセプター分子に結合した電圧依存性カチオンチャネルサブユニットを含む電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、ここで電圧依存性カチオンチャネルサブユニットが、一過性受容体電位（ＴＲＰ）チャネルのサブユニットであり、およびここで、生物発光ドナー分子およびアクセプター分子が、生物発光ドナー分子の発光スペクトルがアクセプター分子の吸光度スペクトルと重複するように選択され、そのため、生物発光ドナー分子によって送達される光エネルギーが、アクセプター分子を励起することができる波長である、前記核酸。
【請求項２】
電圧依存性カチオンチャネルサブユニットが、６つの膜貫通ドメイン、２つの細胞内ループ、１つの膜貫通ループ、および細胞内Ｎ末端およびＣ末端を含むチャネルのサブユニットである、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
サブユニットが、一過性受容体電位チャネルＴＲＰＶ（バニロイド）チャネルサブファミリーのメンバーに属する、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
サブユニットが、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ３、またはＴＲＰＶ４チャネルに属する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５】
電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードするヌクレオチド配列と、少なくとも１つの生物発光ドナー分子をコードするヌクレオチド配列および／または少なくとも１つの蛍光アクセプター分子をコードするヌクレオチド配列との間に、リンカー配列をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項６】
生物発光ドナー分子およびアクセプター分子が、任意にリンカー配列を介して、Ｃ末端、Ｎ末端のいずれか、またはチャネルサブユニットのループに結合している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項７】
（ｉ）生物発光ドナー分子がチャネルサブユニットのＣ末端に結合し、アクセプター分子が該チャネルサブユニットのＮ末端に結合している、
（ｉｉ）生物発光ドナー分子がチャネルサブユニットのＮ末端に結合し、アクセプター分子が該チャネルサブユニットのＣ末端に結合している、
（ｉｉｉ）生物発光ドナー分子がチャネルサブユニットのＣ末端に結合し、アクセプター分子が第１または第２細胞内ループの一部を形成する、
（ｉｖ）生物発光ドナー分子がチャネルサブユニットのＮ末端に結合し、アクセプター分子が第１または第２細胞内ループの一部を形成する、
（ｖ）アクセプター分子がチャネルサブユニットのＣ末端に結合し、生物発光ドナー分子が第１または第２細胞内ループの一部を形成する、
（ｖｉ）アクセプター分子がチャネルサブユニットのＮ末端に結合し、生物発光ドナー分子が第１または第２細胞内ループの一部を形成する、
（ｖｉｉ）生物発光ドナー分子が第１細胞内ループの一部を形成し、アクセプター分子が第２細胞内ループの一部を形成するか、または
（ｖｉｉｉ）生物発光ドナー分子が第２細胞内ループの一部を形成し、アクセプター分子が第１細胞内ループの一部を形成する、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８】
生物発光ドナー分子が、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、腔腸動物ルシフェラーゼ、北アメリカグローワームルシフェラーゼ、クリックビートルルシフェラーゼ、鉄道虫ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、エクオリン、アラクノカンパルシフェラーゼ、またはそれらのいずれかの生物学的に活性なバリアントもしくは断片から選択されるルシフェラーゼから選択されるタンパク質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９】
生物発光ドナー分子が、β−ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼまたはβ−グルコシダーゼから選択される非ルシフェラーゼ生物発光タンパク質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１０】
アクセプター分子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、緑色蛍光タンパク質のバリアント（ＧＦＰ１０）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、増強ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、増強ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、mAmetrine、LSS-mOrange、LSS-mKate、Emerald、Topaz、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、mRFP1、pocilloporin、ウミシイタケＧＦＰ、Monster GFP、paGFP、Kaedeタンパク質もしくはフィコビリタンパク質、またはそれらのいずれかの生物学的に活性なバリアントもしくは断片から選択されるタンパク質である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１１】
アクセプター分子が、Alexa、蛍光色素、Bodipy色素、Ｃｙ色素、フルオレセイン、ダンシル、ウンベリフェロン、蛍光マイクロスフェア、発光ナノ結晶、Marina blue、Cascade blue、Cascade yellow、Pacific blue、Oregon green、テトラメチルローダミン、ローダミン、Texas red、希土類元素キレート、またはそれらの任意の組み合わせもしくは誘導体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＴＲＰチャネル融合サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む、プロモーターおよび任意にエンハンサーに作動可能に連結された発現ベクターであって、ここで前記プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、アデノウイルスプロモーター、アデノウイルスＥ１Ａ、熱ショックタンパク質プロモーター、Mycobacteriaの遺伝子およびＲＮＡからのプロモーター、Mycobacterium bovisＭＰＢ７０、ＭＰＢ５９またはＭＰＢ６４抗原プロモーター、バクテリオファージラムダ由来のＰ１プロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、Ｉｐｐプロモーター、ＰＬλプロモーター、ＰＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、β−ラクタマーゼ、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ７プロモーター、メタロチオネインプロモーター、成長ホルモンプロモーター、真核生物プロモーターと原核生物プロモーターとの間のハイブリッドプロモーター、ユビキチンプロモーター、Ｅ２Ｆ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１／ＤＦ３、α−フェトプロテイン、ｅｒｂ−Ｂ２、界面活性剤、チロシナーゼ、ＰＳＡ、ＴＫ、ｐ２１、ｈＴＥＲＴ、ｈＫＬＫ２、プロバシンまたはサイクリン遺伝子由来プロモーターであり、ここでエンハンサーは、前初期エンハンサー、β−アクチン、またはアデノウイルス逆位末端反復（ＩＴＲ）から選択され、または、ここで前記発現ベクターは、真核生物宿主細胞を形質転換し、かつチャネル融合サブユニットの安定なまたは一過性の発現をもたらすことができる、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり、ここで前記ベクターは、プラスミド、またはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）、レンチウイルス、エプスタイン−バール、単純ヘルペス、パピローマ、ポリオーマ、レトロ、ＳＶ４０、ワクシニアなどのウイルス、任意のレトロウイルスベクター、インフルエンザウイルスベクター、および裸のＤＮＡを含む他の非ウイルスベクターまたはリポソームである、前記発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の発現ベクターを含む組換え細胞であって、ＴＲＰチャネル融合サブユニットが発現され、これが他のホモマーまたはヘテロマーチャネルサブユニットとin vitroおよびin vivoで共同して機能的チャネルを形成することができる、前記組換え細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＴＲＰチャネル融合サブユニットを生産するための方法であって、請求項１３に記載の組換え細胞を培養すること、および、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＴＲＰチャネル融合サブユニットを発現すること、を含む、前記方法。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の、核酸によってコードされるＴＲＰチャネル融合サブユニットであって、前記サブユニットの少なくとも１つのＮ末端先端部、Ｃ末端先端部、またはループが、少なくとも１つの生物発光ドナータンパク質および少なくとも１つのアクセプタータンパク質に結合している、前記ＴＲＰチャネル融合サブユニット。
【請求項１６】
請求項１５に記載の融合サブユニットを含む無細胞組成物であって、機能性融合チャネルまたは融合チャネルサブユニットが、脂質二重層、好ましくはリポソームの二重層中に埋め込まれている、前記無細胞組成物。
【請求項１７】
請求項１３に記載の組換え細胞を得ること、および細胞の膜を破壊することを含む、請求項１６に記載の無細胞組成物の調製方法。
【請求項１８】
チャネルを活性化または阻害することができる化合物候補をリアルタイムでスクリーニングする方法であって、
−候補を、請求項１３の組換え宿主細胞、または請求項１６の無細胞組成物と接触させること、
−生物発光ドナー分子の基質を提供すること；および
−ＢＲＥＴシグナルの変化を測定すること、
を含む、前記方法。
【請求項１９】
基質が、ホタルルシフェリン、細菌ルシフェリン、渦鞭毛藻類ルシフェリン、イミダゾロピラジンバルグリン、セレンテラジン、またはそれらの類似体／誘導体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸、請求項１２のベクター、請求項１３の組換え宿主細胞、または請求項１６の無細胞組成物を含む、ＴＲＰチャネルのアゴニストまたは阻害剤化合物候補をスクリーニングするためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規な電圧依存性イオンチャネル融合サブユニット、および、候補分子または物理的パラメータを、電圧依存性イオンチャネルを活性化または阻害するそれらの能力についてリアルタイムでスクリーニングし特徴づけるための機能的生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）アッセイ、に関する。本発明はまた、少なくとも１つの電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットを含む、細胞ベースまたは無細胞の組成物であって、ここで、生物発光ドナー分子および／またはアクセプター分子が、前記チャネルサブユニットのＣ末端、Ｎ末端、またはループのいずれかに結合している、前記組成物にも関する。生物発光ドナーおよび／または蛍光アクセプター分子に結合した電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットの組み合わせは、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を使用して、電圧依存性イオンチャネルサブユニットの立体配座の変化を検出し、これにより前記チャネルの活性化または阻害を示すことを可能にする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
植物および動物細胞における多数の中心的プロセスは、特定イオンの細胞内濃度の変化、例えばプロトン濃度の変化、および膜を横切る膜電位およびイオン勾配の変化を介して、全体的または部分的に制御される。事実上全ての動物細胞は、タンパク質が包埋された脂質二重層から構成される膜によって囲まれている。この膜は、イオンの移動に対する絶縁体および拡散障壁の両方として機能する。イオントランスポーター／ポンプタンパク質は、膜を横切ってイオンを積極的に押し込み、膜を横切る濃度勾配を確立し、イオンチャネルは、イオンが膜を横切ってその濃度勾配の下へと移動することを可能にする。イオンポンプおよびイオンチャネルは、膜に挿入された一組の電池および抵抗器と電気的に等価であり、したがって、膜の両側に電圧差を生成する。イオンチャネルは、活動電位の生成およびタイミング、エネルギー産生、シナプス伝達、ホルモンの分泌および筋肉の収縮などの多様な細胞プロセスに関与し、調節する。
【０００３】
電圧依存性イオンチャネルは、膜を横切る電圧によって調節される、高速度でイオンを伝導する膜タンパク質である。それらは、神経インパルスの生成および伝搬、ならびに細胞ホメオスタシスにおいて、基本的な役割を果たす。電圧センサーは、膜電場の変化の際に再配置された荷電アミノ酸を有するタンパク質の領域である。センサーの動きは、導電経路のゲートにおける立体配座変化を開始させ、イオンの流れを制御する。分離され精製された最初の電圧依存性イオンチャネルは、高濃度のＮａチャネルが存在するウナギの発電細胞から抽出された。数年後、ウナギのＮａチャネルの配列が、そのｍＲＮＡから推定された。最初のＫチャネル配列は、Drosophila melanogasterのShaker突然変異体から推定された。電圧依存性イオンチャネルタンパク質は、特定のイオンに対して選択的である。かかるイオンには、例えば、カリウム、ナトリウムおよびカルシウムが含まれる。
【０００４】
電圧依存性イオンチャネルはすべての細胞に存在し、電気的活性の生成および情報処理に関与する。したがってそれらの機能の欠陥は、心臓不整脈、てんかん、高血圧などの様々な状態をもたらす可能性がある。多くの薬物は、その特異的な効果を、イオンチャネルのモジュレーションを介して発揮する。例としては、脳における電圧依存性ナトリウムチャネルを遮断する抗てんかん化合物、平滑筋細胞における電圧依存性カルシウムチャネルを遮断する抗高血圧薬、および膵臓中のＡＴＰ調節性カリウムチャネルを遮断する、いくつかのインスリン放出の刺激物質が挙げられる。近年の開発により、イオンチャネルは、創薬のより著しく期待される標的になることが可能となっている。新規なイオンチャネルが同定され、がん、免疫障害および他の疾患の処置の標的となり、それにより既存のイオンチャネル薬物性疾患を、ＣＮＳおよび心臓血管障害をはるかに超える疾患の範囲に拡大する。
【０００５】
種にわたる電圧依存性イオンチャネルタンパク質のアミノ酸配列は、高度に保存されている。電圧ゲート型イオンチャネルとして機能するタンパク質は、細胞が電気インパルスを伝導することを可能にする３つの顕著な特性を有する：（１）膜電位の変化に応答して、開くこと（電圧ゲーティング）；（２）その後のチャネル閉鎖および不活性化；および（３）すべてのイオンチャネルと同様に、浸透するイオンとそうでないイオンに対する、絶妙な特異性。ショウジョウバエ（Drosophila）由来のShakerタンパク質などの電圧ゲート型Ｋ＋チャネルは、４つの同様のサブユニットから組み立てられ、その各々は、６つの膜貫通αヘリックスおよびイオン孔を覆う非ヘリックスＰセグメントを有する。各サブユニットのＳ４αヘリックスは、電圧センサーとして働く。電圧ゲート型Ｎａ＋およびＣａ２＋チャネルは、それぞれがＫ＋チャネルサブユニットに類似する４つの相同ドメインを含有する、単量体タンパク質である。チャネルタンパク質のイオン特異性は、主として、選択されたイオンとＰセグメント中の特定の残基との配位に起因し、こうして、選択されたイオンの活性化エネルギーの通過を、他のイオンと比較して低下させる。電圧感知αヘリックスは、３番目または４番目の残基ごとに正に荷電したリジンまたはアルギニンを有する。それらが十分な大きさの膜脱分極に応答して、膜を横切って外側に移動すると、チャネルが開く。電圧ゲート型Ｋ＋、Ｎａ＋、およびＣａ２＋チャネルタンパク質は、オープンチャネルに移動してそれを不活性化する、１つ以上の細胞質ゾルドメインを含有する。電圧ゲート型チャネルタンパク質および潜在的にはすべてのＫ＋チャネルが、共通の祖先遺伝子から進化したと仮定されている。
【０００６】
電圧依存性イオンチャネルの中で、一過性受容体電位（ＴＲＰ）イオンチャネルは、感覚シグナルのメディエーターとして、そして最近では新規な薬物標的として関心を集めている。６つのＴＲＰサブファミリーがあり、主なものはＴＲＰＭ、ＴＲＰＶおよびＴＲＰＣである。ＴＲＰＭサブファミリーは、細胞分裂、細胞移動、およびカルシウムシグナル伝達におけるＴＲＰＭチャネルの潜在的役割を考慮して、ＴＲＰサブファミリーの最も新規なものと呼ばれている。例えば、ＴＲＰＭ１およびＴＲＰＭ８は腫瘍学の標的として有望であるが、ＴＲＰＭ２およびＴＲＰＭ４は、免疫障害の新規標的として推奨されている。ほとんどのＴＲＰはホモ四量体として機能すると考えられている。同じサブファミリーまたは異なるサブファミリーのメンバー間のヘテロ多量体チャネルの形成は、いくつかの場合（ＴＲＰＣ間など）に記載されており、潜在的に多種多様なチャネルを作り出す可能性がある。典型的なＴＲＰタンパク質は、Ｓ５とＳ６との間に孔形成性リエントラントループを有する６つの推定膜貫通セグメント（Ｓ１〜Ｓ６）を含む。細胞内アミノおよびカルボキシル末端は長さが可変であり、種々のドメインからなる。大きな細胞内ドメインは「ネストボックス」構造と見ることができる：「ワイヤーフレーム」外殻はアクチベーターとモジュレーターのセンサーとして機能し、球状の内部チャンバーは、イオンの流れをモジュレートし得る。多くのＴＲＰのアミノ末端における別の特徴は、アンキリンリピート、すなわち、β−ヘアピンモチーフによって連結された逆平行のαヘリックスの対からなる３３残基モチーフの存在である。アンキリンリピートドメイン（ＡＲＤ）における繰返しの数は、異なるＴＲＰ間で変化し得る：ＴＲＰＣでは３〜４、ＴＲＰＶでは６、ＴＲＰＡでは１４〜１５、ＴＲＰＮでは約２９である。機能的には、ＡＲＤは、チャネルの四量体化ならびにリガンドおよびタンパク質パートナーとの相互作用と関連しているようである。
【０００７】
他の候補の中で、電圧ゲート型ナトリウムチャネルは原形質膜に包埋されたタンパク質である。この種類のタンパク質は神経細胞および筋細胞に見出され、これらの細胞に見られる迅速な電気信号伝達に使用される。電圧ゲート型ナトリウムチャネルの主なサブユニットは、１８００個を超えるアミノ酸のポリペプチド鎖である。膜に包埋された任意のタンパク質のアミノ酸配列を調べると、典型的には、ポリペプチド鎖の１つ以上のセグメントは、その大部分が非極性側鎖を有するアミノ酸で構成されることが見出される。これらのセグメントコイルの各々は、膜の幅にほぼ等しい長さの膜貫通ドメインと呼ばれるものである。さらに膜貫通ドメイン内では、側鎖は必然的に外側に面し、膜の脂質と容易に相互作用する。対照的に、かなり極性のペプチド結合は内側に向いており、膜の脂質環境から分離されている。電圧ゲート型ナトリウムチャネルの場合、ポリペプチド鎖中に２４のかかる膜貫通ドメインが存在する。ナトリウムチャネルは、１つまたは２つのβサブユニットのいずれかと会合し得る、１つの孔形成αサブユニットを含む。αサブユニットは、６つの膜貫通セグメント（Ｓ１〜Ｓ６）および孔形成ループをそれぞれが含む、４つの相同ドメイン（Ｉ〜ＩＶ）からなる。正に荷電した第４の膜貫通セグメント（Ｓ４）は、電圧センサーとして作用し、チャネルゲーティングに関与する。細菌ＮａｖＡｂチャネルの結晶構造は、初期のカリウムチャネル構造と比較して多くの新規な構造的特徴を明らかにし、これには、グルタミン酸側鎖との相互作用により決定されるイオン選択性を有する短い選択性フィルターを含む。興味深いことに、孔領域は、中央の空洞に伸びる脂肪アシル鎖によって浸透され、小さな疎水性の孔塞栓薬が入る可能性がある。補助β１、β２、β３およびβ４サブユニットは、大きな細胞外Ｎ末端ドメイン、単一膜貫通セグメント、およびより短い細胞質ドメインからなる。
【０００８】
電圧ゲート型カルシウム（Ｃａ２＋）チャネルは、多くの生理学的事象を開始させる、細胞内Ｃａ２＋過渡状態への膜電位変化の重要なトランスデューサである。骨格筋横断細管から精製されたＣａ２＋チャネルは、α１、α２、β、γおよびδサブユニットの複合体である。α１サブユニットは、長さ約２０００アミノ酸残基のタンパク質であり、前に特徴づけられた電圧ゲート型ナトリウムチャネルの孔形成αサブユニットのような、アミノ酸配列および予測膜貫通構造を有する。アミノ酸配列は、６つの膜貫通セグメント（Ｓ１〜Ｓ６）および膜貫通セグメントＳ５とＳ６との間の膜関連ループをそれぞれ含む、４つのリピートドメイン（Ｉ〜ＩＶ）に組織化される。細胞内βサブユニットは予測されたαヘリックスを有するが、膜貫通セグメントは有さず、一方γサブユニットは４つの膜貫通セグメントを有する糖タンパク質であり、クローン化α２サブユニットは多くのグリコシル化部位およびいくつかの疎水性配列を有するが、δサブユニットは、α２サブユニットと同じ遺伝子のコード配列の３’末端によりコードされ、これらの２つのサブユニットの成熟形態は、翻訳後タンパク質分解プロセシングおよびジスルフィド結合によって生成される。
【０００９】
精子特異的ＣａｔＳｐｅｒチャネルは、細胞内Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）を制御し、それによって精子の水泳行動を制御する。これらは、α様サブユニットの四量体として集合して電流を媒介すると推定される、推定の６ＴＭ電圧ゲート型カルシウム浸透チャネルである。ＣａｔＳｐｅｒサブユニットは、電圧活性化カルシウムチャネル（Ｃａｖ）の個々のドメインに、構造的に最も密接に関連している。ＣａｔＳｐｅｒ１、ＣａｔＳｐｅｒ２およびＣａｔＳｐｅｒｓ３および４は、最近同定された推定２ＴＭ補助ＣａｔＳｐｅｒβタンパク質および２つの推定１ＴＭ関連ＣａｔＳｐｅｒγおよびＣａｔＳｐｅｒδタンパク質と共通して、精巣に限定され、精子の尾部の主要部分に局在する。
【００１０】
二孔チャネルは、カチオン選択性イオンチャネルを形成していると推定される２つのメンバーの小さなファミリーである。それらは、２つのＫＶ様式６回膜貫通ドメインを含むと予測され、それらが膜中に二量体を形成することを示唆する。これらのチャネルは、ＣａｔＳｐｅｒチャネルと密接に関連しており、より遠くは、ＴＲＰチャネルに関連している。
【００１１】
環状ヌクレオチド調節性チャネルまたは環状ヌクレオチドゲート型チャネル（ＣＮＧ）は、脊椎動物の視覚および嗅覚系の一次感覚細胞におけるシグナル伝達を担う。ＣＮＧチャネルは、四量体として形成された電圧非依存性カチオンチャネルである。各サブユニットは６ＴＭを有し、ＴＭ５とＴＭ６との間に孔形成ドメインを有する。ＣＮＧチャネルは桿体光受容体において最初に見出され、ここでロドプシンおよびトランスデューシンを介した光シグナルがホスホジエステラーゼを刺激し、細胞内ｃＧＭＰレベルを低下させる。この結果ＣＮＧチャネルが閉じられ、「暗電流」が減少する。類似のチャネルが、嗅覚ニューロンの繊毛および松果体において見出された。環状ヌクレオチドは、サブユニットタンパク質のＣ末端のドメインに結合する。このカテゴリー内では、過分極によって活性化される環状ヌクレオチドゲート型（ＨＣＮ）チャネルは、約−５０ｍＶの負の電圧で過分極によって活性化されるカチオンチャネルである。環状ヌクレオチドｃＡＭＰおよびｃＧＭＰは、チャネルを直接活性化し、ＨＣＮチャネルの活性化曲線をより正の電圧にシフトさせ、これによってチャネル活性を高める。ＨＣＮチャネルは、心臓細胞およびニューロンを含む多くの興奮性細胞に見られるペースメーカー電流の基礎を成している。ネイティブ細胞では、これらの電流はＩｈ、Ｉｑ、Ｉｆなどのさまざまな名前を有する。４つの既知のＨＣＮチャネルは、６つの膜貫通ドメインを有し、四量体を形成する。チャネルは、ＨＣＮ１およびＨＣＮ４について示されているように、互いにヘテロマーを形成することができると考えられている。
【００１２】
カリウムチャネルは、カリウムイオンをその電気化学的勾配下で伝導させ、これを急速に（バルク水中のＫ＋イオンの拡散速度まで）、かつ選択的に（イオン半径のサブオングストローム差にもかかわらず、特にナトリウムを除外する）行う。生物学的にこれらのチャネルは、多くの細胞において静止電位を設定または再設定するように作用する。ニューロンなどの興奮性細胞では、カリウムイオンの遅延した逆流が活動電位を形成する。カリウムチャネルは、４つの同一のタンパク質サブユニットが会合して、中心イオン伝導孔の周囲に配置された四重対称（Ｃ４）複合体を形成する、四量体構造を有する（すなわち、ホモ四量体）。代替的に、関連するが同一ではない４つのタンパク質サブユニットは会合して、疑似Ｃ４対称性を有するヘテロ四量体複合体を形成し得る。全てのカリウムチャネルサブユニットは、孔の上部を覆い、カリウム選択的透過性の原因となる、特徴的な孔−ループ構造を有する。カリウムイオンチャネルは、イオンが選択性フィルターに入るときに、イオンから水和シェルを除去する。選択性フィルターは、各サブユニットのＰループ内のシグネチャー配列と呼ばれる、５残基の配列ＴＶＧＹＧによって形成される。このシグネチャー配列は高度に保存されているが、ただし、真核生物のカリウムイオンチャネル中のイソロイシン残基が多くの場合に原核細胞チャネルにおいてバリン残基で置換されていることを除く。Ｐループ内のこの配列はユニークな構造を採用しており、それらの電気陰性のカルボニル酸素原子をフィルター孔の中心に向けて整列させ、各カリウム結合部位の周りの水溶媒和性シェルと同様の四角いアンチプリズムを形成する。チャネルの疎水性領域は、カリウムイオンの周囲の環境を中和するために使用されるため、電荷には引き寄せられない。次にそれは反応を加速させる。１０Åの中央孔または中央空洞が、膜貫通チャネルの中心付近に位置し、ここで、チャネル壁の疎水性のために、横方向のイオンに対してエネルギー障壁が最も高い。水で満たされた空洞および孔ヘリックスの極性Ｃ末端は、イオンのエネルギー障壁を軽減する。複数のカリウムイオンを先行させることによる反発は、イオンのスループットを助けると考えられている。空洞の存在は、誘電体障壁または低誘電率膜による反発を克服するための、Ｋ＋イオンを水分の多い高誘電体環境に保つことによるチャネルの機構の１つとして、直観的に理解することができる。
【００１３】
２００６年、Prof. Okumuraは、電圧ゲート型水素イオンチャネル（プロトンチャネル）、すなわち、電圧センサーとホスファターゼという２つのモジュールからなる電圧依存性膜タンパク質を発見した。これらのイオンチャネル分子は、細胞膜中の水素イオンの伝導経路を形成する；しかし、これらは常に開いてはおらず、電圧センサーが電気信号を検出したときにのみ開く。その構造は、細胞膜を通って細胞質に走る長いらせん状の「閉じた和傘（日本の傘）」の形状を示し、広い内部アクセス可能な前庭（inner-accessible vestibule）を特徴とした。タンパク質上の電圧感受性アミノ酸は、膜の中央のフェニルアラニン含有「ガスケット」領域の下に位置し、構造が静止状態であることを示した。
【００１４】
次に当然ながら、イオンチャネルの詳細な構造解明とハイスループットスクリーニング技術の開発が、効果的かつ選択的な新しいイオンチャネル薬物の発見を促進するであろう。従来のスクリーニング法（蛍光色素、放射束、および結合アッセイ）は、イオンチャネル活性の間接的測定である。薬理学と組み合わせた電気生理学的手法は、イオンチャネル機能を研究するための最も詳細かつ直接的な方法を提供する；しかしながら、従来の電気生理学的技術は、大きな化合物ライブラリースクリーニングのスループット要求を満たさない。自動化電気生理学および平面パッチクランプ技術を含む新しい技術も試みられ、試験されている。しかしこれらの方法は、要求される高いスループット速度ではまだ実行されていない。
【００１５】
パッチクランプ技術の主な制限は、そのスループットが低いことである。典型的には、高度に訓練された一人のオペレーターがパッチクランプ技術を用いて試験することができるのは、１日に１０未満の化合物である。さらに、この技術の自動化は容易ではなく、多くの分析を必要とする複雑な結果をもたらす。
【００１６】
Forster（フェルスター）共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、または単に共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）は、励起状態ドナー分子から基底状態アクセプター分子への、エネルギーの非放射性移動である。エネルギー移動効率は、ドナーとアクセプターの間の距離、スペクトルの重なりの程度、およびアクセプターとドナーの双極子の相対的な配向に依存する。ほとんどの場合、蛍光ドナーとアクセプターの両方は、Aequoria victoriaの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の操作されたバリアントである。最も広く使用されているＦＲＥＴ対は、ドナーとしてのシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）とアクセプターとしての黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）であり、このＦＲＥＴシステムは、多数のＧＰＣＲによる直接リガンド結合を定量するために以前から用いられている。
【００１７】
生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）においては、ＦＲＥＴのドナーフルオロフォアをルシフェラーゼで置き換え、アクセプターは任意の適切なフルオロフォアであり得る。ルシフェラーゼの使用は、基質の添加が生物発光を開始し、それにより共鳴エネルギー移動を開始するので、照明の必要性を回避する。匂い受容体を有するＦＲＥＴは、クラスＡ（ａ２−アドレナリン性および副甲状腺ホルモン）およびクラスＢ（セクレチン）のＧＰＣＲについて、既に実証されている。
【００１８】
ＦＲＥＴの主な欠点は、ＢＲＥＴとは対照的に、外部光源によるドナーの励起の必要性の結果である。ＢＲＥＴアッセイは、入射励起光によって引き起こされ得るドナータンパク質の光漂白または光異性化、細胞への光損傷、および細胞またはマイクロプレートからの光散乱または自己蛍光を示さない。さらに、ＦＲＥＴに対するＢＲＥＴの主な利点の１つは、アクセプターの直接励起に起因する発光の欠如である。このバックグラウンドの減少は、相互作用するタンパク質の検出を、ＦＲＥＴに可能な濃度よりもはるかに低い濃度で可能にするはずである。本発明者らは、驚くべきことに、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）が、電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットを用いて標的化合物を検出するのに、特に効率的であることを見出した。
【００１９】
したがって本発明者らは、電圧依存性イオンチャネル受容体研究に完全に適した、進歩的かつ非破壊的な、細胞ベースまたは無細胞組成物のリアルタイムアッセイ技術を、薬物スクリーニングおよびシグナル伝達経路のさらなるマッピングに特に重点を置いて開発した。本発明者らによって電圧依存性イオンチャネル受容体研究のために最適化された、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）アッセイは、自然発生現象、すなわち発光ドナーと蛍光アクセプターとの間のForster共鳴エネルギー移動を利用する。移動効率は、スペクトルの重なりの程度、相対的配向、およびドナーとアクセプターの間の距離に依存する。
【００２０】
本発明の蛍光エネルギー移動は、ＢＲＥＴなどの刺激原理に基づいているため、ＢＲＥＴの代わりにＦＲＥＴに基づく本明細書に記載のバイオセンサーも、良好に機能することが期待され、本発明の範囲内に含まれる。
【発明の概要】
【００２１】
本発明は、１つ以上の生物発光ドナー分子および／または１つ以上の蛍光アクセプター分子を含む電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードする、新規な核酸に関する。本発明によれば、電圧依存性イオンチャネルサブユニットは、電圧依存性カチオンチャネルまたは電圧依存性アニオンチャネルであってよい。
【００２２】
本発明はまた、電圧依存性チャネル融合サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター、かかる発現ベクターを含む組換え細胞、電圧依存性イオンチャネルサブユニットの生産プロセス、および電圧依存性融合サブユニットそれ自体に関する。
【００２３】
本発明はさらに、電圧依存性イオンチャネルの標的ドメインに結合することができる化合物または候補を同定する方法であって、少なくとも１つの生物発光ドナー分子をコードするヌクレオチド配列に結合したおよび／または少なくとも１つの蛍光アクセプター分子をコードするヌクレオチド配列に結合した電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供することによる、前記方法に関する。２〜２４個の膜貫通ドメインを含むことができるこれらの電圧依存性イオンチャネルの複雑な構造が与えられると、ＢＲＥＴドナーおよびアクセプタータグを有するかかる融合サブユニットが、構造的および機能的完全性を持つことは、驚くべきことであった。本発明の好ましい態様において、電圧依存性イオンチャネルサブユニットは、電圧依存性アニオンチャネルのサブユニットを含むことができる。さらに好ましい態様において、電圧依存性イオンチャネルサブユニットは、電圧依存性カチオンチャネルのサブユニットを含むことができる。これらのチャネルは、細胞で発現される場合、Ｎ末端およびＣ末端が細胞質内である限り、任意の供給源のものであってよい。例としては、哺乳類の受容体、またはその生物学的に活性なバリアントもしくは断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１（Ａ）は、ドナーとアクセプターの間のエネルギーの非放射性移動の模式図である。図１（Ｂ）は、ドナー分子とアクセプター分子との間の波長の重なりを示す概略図である。図１Ｃは、ドナー分子とアクセプター分子との間の距離（ｒ）の移動関数の効力の概略図である。図１（Ｃ）はまた、エネルギーＥの移動の効力を表す式を提示し、式中、Ｒ０は、特定のドナー−アクセプター対に対するForsterの距離を表し、移動の最大効力の５０％を可能にする距離として定義される。
【００２５】
【図２】図２は、分子間蛍光プローブ（Ａ）および分子内蛍光プローブ（Ｂ）の模式図である。ドナー分子は「Ｄ」で表され、アクセプターは「Ａ」で表され、関心ある分子は「Ｔ１」、「Ｔ２」または「Ｔ３」である。
【００２６】
【図３】図３は、本発明による電圧依存性イオンチャネルサブユニットに基づく分子内ＢＲＥＴプローブの使用例を示す。（Ａ）管の活性化の状態に依存して、電圧依存性イオンチャネルサブユニットのＮ末端とＣ末端の間の距離および／または配向が改変された。（Ｂ）は、ＢＲＥＴシグナルの不在下および存在下で得られたスペクトルの図である；グラフ内の灰色の陰影は、右側のアクセプターおよび左側のドナーの代表的な光強度を表す。
【００２７】
【図４】図４は、融合チャネルサブユニットＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ１−ｒＬｕｃの発現プラスミドを得るために使用された、クローニング戦略を示す。ｈＴＲＰＶ１をコードするｃＤＮＡを適切なプライマーを用いて増幅した後、ＹＦＰおよびｒＬｕｃが既に融合体（Ａ）にクローン化されている既存の発現ベクターの制限部位ＡｇｅＩにおいて、アンプリコンをＹＦＰおよびｒＬｕｃの間に挿入して融合する。得られた発現ベクターを図４（Ｂ）に示す。同じ戦略を使用して、ｈＴＲＰＶ３融合サブユニットをＹＦＰおよびｒＬｕｃと共にクローニングしたが、ただし挿入は制限部位ＥｃｏＲＩで行った。
【００２８】
【図５】図５は、HEK293T細胞における温度に対するＢＲＥＴシグナルの発生を、HEK293T細胞をＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ１−ｒＬｕｃで、対照条件（菱形、ｎ＝１０）、もしくは６ヨードＣＡＰＳ（四角形、ｎ＝３）の存在下でトランスフェクトした場合、または２，２−ジフェニルテトラヒドロフラン（三角形、ｎ＝１）でトランスフェクトした場合について示す。ΔＢＲＥＴは、２９．５℃での初期測定に対するＢＲＥＴ比の変動を表す。
【００２９】
【図６】図６は、ＢＲＥＴシグナルに対する３７℃でのカプサイシン効果の用量反応を、プローブＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ１−ｒＬｕｃ（ｎ＝３）でトランスフェクトしたHEK293T細胞において示す。読み取りの５分前に、細胞を、ＤＭＳＯ（対照として；四角記号）、またはＴＲＰＶ１の２つのよく知られた阻害剤であるＡＭＧ５１７（三角記号）もしくはカプサゼピン（ＣＰＺ）（菱形記号）のいずれかの存在下で、プレインキュベートした。
【００３０】
【図７】図７は、ｈＴＲＰＶ１またはＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ１−ｒＬｕｃ（Ａ）または空のベクター（Ｂ）でトランスフェクトし、Fura 2を負荷したHEK293T細胞において、１００秒（Ａ）または２０秒（Ｂ）後に注入した１μＭのカプサイシンの存在下、３７℃でのＣａ２＋の測定値を示す。
【００３１】
【図８】図８は、ＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ３−ｒＬｕｃでトランスフェクトしたHEK293T細胞における、培養培地中の２−アミノエチルジフェニルボリナート（２−ＡＰＢ）の注入前後の、ＢＲＥＴシグナルの発生の動態を示す。
【００３２】
【図９】図９（Ａ）および（Ｂ）は、ＡにおいてＹＦＰ−ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ分子内ＢＲＥＴプローブ、およびＢにおいてＴＲＰＶ１とカルモジュリンとの間の分子間ＢＲＥＴプローブを用いた研究で使用された、ＢＲＥＴ試験の概略図である。ＹＦＰおよびＬｕｃは、図９に示すように、ＴＲＰＶ１またはカルモジュリンのいずれかのＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合される。ＴＲＰＶ１の活性化後、ＬｕｃとＹＦＰとの間の距離ｄは、改変されると予想される。ＣおよびＤ：ＹＦＰ−ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ ＢＲＥＴプローブ（Ｃ）またはＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭ構築物を発現する細胞に対する、ＣＡＰＳ注射の効果の動態測定。星印は、ＣＡＰＳ注入の時間を示す。時定数Ｔａｕが示されている。
【００３３】
【図１０ＡＢ】図１０（Ａ）および（Ｂ）は、ＹＦＰ−ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ ＢＲＥＴプローブ（Ａ）またはＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭ構築物（Ｂ）を発現するHEK293T細胞で測定した、ＣＡＰＳの用量反応曲線である。ＣＡＰＳで活性化する前に、細胞を、ＰＢＳ、ＤＭＳＯ（ビヒクル）、１μＭのカプサゼピン（ＣＰＺ）、または１μＭのＡＭＧ５１７のいずれかでプレインキュベートした。図１０（Ｂ）は、プローブＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ１−ｒＬｕｃ（ｎ＝３）でトランスフェクトしたHEK293T細胞における、ＢＲＥＴシグナルに対する３７℃でのカプサイシン効果の用量反応を示す。読み取りの５分前に、細胞を、ＤＭＳＯ（対照として；四角記号）、またはＴＲＰＶ１の２つのよく知られた阻害剤であるＡＭＧ５１７（三角記号）もしくはカプサゼピン（ＣＰＺ）（菱形記号）のいずれかの存在下で、プレインキュベートした。
【００３４】
【図１１Ａ−Ｄ】図１１（Ａ）〜（Ｄ）は、ＢＲＥＴによって測定された、ＴＲＰＶ１の薬理学的特性およびその活性化に対する温度の影響を示す。ＴＲＰＶ１活性化に対するＣＡＰＳの有効性および効力の測定を、ＢＲＥＴにより、ＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ ＢＲＥＴプローブ（Ａ）またはＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭ構築物（Ｃ）のいずれかを発現するHEK293T細胞を２５℃、３１℃、３７℃、または４２℃でインキュベートして実施した。ＢＲＥＴシグナルはまた、細胞培養培地を２５℃から５０℃に加熱した場合に、リアルタイムで記録した（図１１ＢおよびＤ）。図１１（Ｂ）は、１μＭのＣＰＺの存在下（白菱形）または不在下（黒丸）で、ＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ ＢＲＥＴプローブを発現するHEK293T細胞におけるＢＲＥＴシグナルの発生を示す。ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭ構築物を発現する細胞におけるシグナルの発生は、（Ｃ、菱形）に示されている。（Ｃ）では、細胞外培地（四角形）におけるカルシウム枯渇の効果、または細胞とＴＲＰＶ１阻害剤ＣＰＺ（丸）とのプレインキュベーションの効果も試験した。
【００３５】
【図１２】図１２は、１ｍＭのカルバクロール（丸）または２−ＡＰＢ（四角）いずれかの、ＹＦＰ−ＴＲＰＶ３−Ｌｕｃ ＢＲＥＴプローブを発現するHEK293T細胞に対する効果の動態である。
【００３６】
【図１３ＡＢ】図１３（Ａ）および（Ｂ）は、カルバクロール（Ｂ）および２−ＡＰＢ（Ａ）の、ＴＲＰＶ３−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭ構築物を発現するHEK293T細胞に対する効果の用量反応曲線である。
【００３７】
【図１４ＡＢ】図１４（Ａ）および（Ｂ）は、ＴＲＰＶ４アゴニストGSK1016790Aの、ＴＲＰＶ４−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭ構築物を発現するHEK293T細胞に対する効果の、動態（Ａ）および用量反応曲線（Ｂ）である。図１４（Ａ）では、細胞を、１μＭのアゴニストで矢印で示した時間に活性化した。図１４（Ｂ）では、試験は、ＴＲＰＶ阻害剤ルテニウムレッド（１０μＭ）の存在下（四角）または不在下（丸）で行った。
【発明の詳細な説明】
【００３８】
他に特に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有すると解釈される（例えば、細胞培養、ドナー、アクセプター、電圧依存性イオンチャネル、融合サブユニット）。
【００３９】
他に示されない限り、本発明で利用する組換えタンパク質、細胞培養、および分子クローニング技術は、当業者によく知られている標準的な手順である。かかる技術は、例えば次のような文献に記載および説明されている：J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)、T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)、D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press（1995および1996）、およびF. M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988、現時点までの全ての更新を含む）、Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)、およびJ. E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons（現時点までの全ての更新を含む）。
【００４０】
本明細書で使用する、生物発光または蛍光ドナー分子という用語は、適切な基質上での作用または外部供給源によるそれ自体の励起のいずれかに続いて、ルミネセンスを生成することができる、任意の分子を指す。
【００４１】
本明細書で使用する、基質という用語は、生物発光分子と共に使用して、ルミネセンスを生成または吸収することができる、任意の分子を指す。
【００４２】
本明細書において、生物発光または蛍光ドナー分子が基質を改変することを可能にする、との句は、エネルギーを生成する基質上の生物発光タンパク質の任意の酵素活性を指す。
【００４３】
本明細書で使用する、アクセプター分子という用語は、生物発光または蛍光ドナー分子の活性の結果として放出されるエネルギーを受け入れ、それを光エネルギーとして再放出することができる、任意の化合物を指す。
【００４４】
本明細書において、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）とは、生物発光ドナー分子と蛍光アクセプター分子との間のエネルギーの非放射性移動に基づく、近接アッセイである。本明細書において、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、蛍光ドナー分子と蛍光アクセプター分子との間のエネルギーの非放射性移動に基づく、近接アッセイである。
【００４５】
本明細書において、用語「モジュレートするまたはモジュレーション」またはその変形は、生物発光ドナーおよび／またはアクセプター分子の強度および／または発光スペクトルの変化を指す。
【００４６】
本明細書において、用語「空間的位置」は、化合物が電圧依存性イオンチャネルに結合する結果として、または特定の物理的パラメータの変化の結果として変化する、アクセプター分子に対する生物発光ドナー分子の３次元的な配置を指す。
【００４７】
本明細書において、用語「双極子配向」は、生物発光ドナー分子および／またはアクセプター分子のいずれかと関連する双極子モーメントの、三次元空間におけるそれらの配向に対する、三次元空間における方向を指す。双極子モーメントは、分子上の電荷の変化の結果である
【００４８】
本明細書において、「より感受性の高い」という用語は、１つのレポーター系（例えばＢＲＥＴ）と別のレポーター系（例えばＦＲＥＴ）のリガンド非結合形態とリガンド結合形態との間の、共鳴エネルギー移動比におけるより大きな変化を指す。
【００４９】
本明細書において、用語「接触させる」とは、電圧依存性イオンチャネルを活性化または阻害することができる候補分子および／または試料の添加を指す。試料は、検出すべき化合物を含むことが疑われる、任意の物質または組成物であることができる。
【００５０】
電圧依存性イオンチャネルは、創薬の実績ある標的であり、多くのイオンチャネルモジュレーターが、痛み、てんかん、高血圧および他の疾患状態の処置に、現在臨床的に使用されている。それらは、体液分泌、電解質バランス、ならびに生体エネルギーおよび膜興奮性を含む、必須の生理学的機能のための分子基盤を構成する。イオンチャネルは良好な薬物標的を作製するが、これは、それらが生理学的に必須であり、薬理学的にアクセス可能であり、様々な遺伝子によってコードされ、通常、多量体タンパク質アセンブリとして機能するため、高度の機能的および解剖学的特異性をもたらすからである。分子クローニング、異種発現、およびパッチクランプによる電気生理学的特徴付けを介して、イオンチャネル生物学の複雑さは、小分子薬物が特定の所望の機能的効果を達成するための、複数の機会を提供することも明らかである。例えば小分子は、電圧依存性透過性、使用依存性、活性化および不活性化など、イオンチャネルの様々な生物物理学的特性に影響を及ぼし得る。単純なブロッカーまたはオープナーとは対照的に、調節化合物の発見は、異常なレベルのイオンチャネル活性を示す細胞または組織に特異的に作用する薬物の開発を可能にする。
【００５１】
モジュレーターは、細胞内の電圧依存性イオンチャネルの機能的活性を変化させることができる任意の薬剤であり、チャネルオープナー（機能的アゴニスト）、チャネルブロッカー（機能的アンタゴニスト）、または細胞膜でのチャネルの発現レベルを変化させる薬剤を表し得る。発現の増加は、電圧依存性イオンチャネルの数の増加をもたらし、これは全体的な活性の増加をもたらす。逆に、発現の減少は、全体の活性の減少をもたらす。電圧依存性イオンチャネルモジュレーターの開発における主な課題は、他の関連する電圧依存性イオンチャネルサブタイプと比べて特定の標的電圧依存性イオンチャネルに対する選択性、および標的組織内のチャネルに対する選択性を、達成することである。
【００５２】
電圧依存性イオンチャネルは、ゲート状態と呼ばれる多くの異なる立体配座状態で存在することが知られている。電圧ゲート型イオンチャネルの場合、チャネルは、３つのゲート状態のうちの１つで存在すると見ることができる：閉鎖（イオン透過なし）、開放（イオン流入）、および不活性化（イオン透過なし；チャネルは脱分極によって開けることはできない）；ただし、一部のチャネルは不活性化状態を示さないことに留意すべきである。ゲート状態間の遷移は電圧依存性であり、任意の時間において、これらのゲート状態間に平衡が存在し、各状態に存在するチャネルの割合は、細胞膜電位に依存する。
【００５３】
多くの電圧依存性イオンチャネルモジュレーターは、特定のゲート状態（単数または複数）に選択的に結合することが示されている。例えば、電圧ゲート型ナトリウムチャネルブロッカーのラモトリギンは、脳のナトリウムチャネルタンパク質の開放状態および不活性状態に結合すると考えられている。特定のゲート状態への優先的結合は、イオンチャネルモジュレーターへのチャネル親和性の増加、または、薬物の、チャネル上のその結合部位への改善されたアクセスを介して、起こり得る。
【００５４】
本明細書において、用語「電圧依存性イオンチャネル融合サブユニット」は、少なくとも生物発光ドナー分子および少なくとも蛍光アクセプター分子と結合または会合した、電圧依存性イオンチャネルサブユニットを含む。生物発光ドナー分子および蛍光アクセプター分子は、好ましくは、共有結合により結合され、より好ましくは、電圧依存性イオンチャネルのサブユニットとの融合タンパク質として産生されるか、またはリンカー配列を介してサブユニットに任意に結合または融合され得る。生物発光ドナー分子および蛍光アクセプター分子は、同じ電圧依存性イオンチャネルの同じサブユニットまたは異なるサブユニットに、共有結合により結合されるかまたは融合タンパク質として産生されて、会合していてもよい。代替的に、生物発光ドナー分子および蛍光アクセプター分子は、電圧依存性イオンチャネルの同じまたは異なるサブファミリーのサブユニットに、共有結合により結合されるかまたは融合タンパク質として産生されて、会合していてもよい。さらに、生物発光ドナー分子と蛍光アクセプター分子の複数の組み合わせを使用して、試験化合物候補の検出の感度を高めことができる。
【００５５】
生物発光ドナー分子および蛍光アクセプター分子は、電圧依存性イオンチャネルの特定領域を完全に置き換えるか、またはその内部に挿入することができる。当業者が理解するように、生物発光ドナー分子および蛍光アクセプター分子は、蛍光アクセプター分子に対する生物発光ドナー分子の位置および／または双極子配向の空間的変化の結果として電圧依存性イオンチャネルを不活性にするようには、挿入されない。
【００５６】
「実質的に精製された」または「精製された」とは、それが天然の状態で会合している１つ以上の脂質、核酸、他のポリペプチド、または他の汚染分子から分離された、電圧依存性チャネルサブユニットを意味する。実質的に精製されたポリペプチドは、それが天然に会合する他の成分を、少なくとも６０％非含有、より好ましくは少なくとも７５％非含有、より好ましくは少なくとも９０％非含有であることが好ましい。しかしながら現在、本発明のポリペプチドが天然に存在するという証拠は存在しない。
【００５７】
ポリペプチドの文脈における用語「組換え」は、細胞によって、または無細胞発現系において、その天然状態と比較して変化した量または変化した速度で産生される場合のポリペプチドを指す。一態様において、細胞は、ポリペプチドを天然に産生しない細胞である。しかしながら、細胞は、産生されるポリペプチドの量の変化、好ましくは増加を引き起こす、非内因性遺伝子を含む細胞であってもよい。本発明の組換えポリペプチドには、それが産生されるトランスジェニック（組換え）細胞または無細胞発現系の、他の成分から分離されていないポリペプチド、ならびにかかる細胞または無細胞系において産生され、少なくともいくつかの他の成分から実質的に精製されたポリペプチドが、含まれる。
【００５８】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、一般的に交換可能に使用され、非アミノ酸基の付加によって改変されても改変されなくてもよい、単一のポリペプチド鎖を指す。かかるポリペプチド鎖は、他のポリペプチドまたはタンパク質または補因子などの他の分子と、会合し得ることが理解されるであろう。本明細書で使用する用語「タンパク質」および「ポリペプチド」はまた、本明細書に記載のポリペプチドのバリアント、突然変異体、生物学的に活性な断片、改変体、類似体および／または誘導体を含む。
【００５９】
ポリペプチドの％同一性は、ギャップ作成ペナルティーが５、およびギャップ伸長ペナルティーが０．３のＧＡＰ分析（ＧＣＧプログラム）によって決定される。クエリー配列は少なくとも２５アミノ酸長であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも２５アミノ酸の領域にわたって２つの配列を整列させる。より好ましくは、クエリー配列は少なくとも５０アミノ酸長であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも５０アミノ酸の領域にわたって２つの配列を整列させる。より好ましくは、クエリー配列は少なくとも１００アミノ酸長であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１００アミノ酸の領域にわたって２つの配列を整列させる。さらにより好ましくは、クエリー配列は少なくとも２５０アミノ酸長であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも２５０アミノ酸の領域にわたって２つの配列を整列させる。さらにより好ましくは、ＧＡＰ分析は、２つの配列をそれらの全長にわたって整列させる。
【００６０】
本明細書において、「生物学的に活性な断片」は、全長ポリペプチドの規定の活性を保持する、本明細書に記載のポリペプチドの部分である。例えば、電圧依存性イオンサブユニットの生物学的に活性な断片は、標的化合物に結合することができなければならず、その結果立体配座変化が生じる。生物学的に活性な断片は、規定の活性を保持する限り、任意の大きさであり得る。好ましくは、生物学的に活性な断片は、少なくとも１５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも２５０アミノ酸の長さである。
【００６１】
本明細書において、「生物学的に活性なバリアント」は、天然に存在するおよび／または定義された分子と１つ以上のアミノ酸が異なるが、生物学的に活性な断片について上で定義したような規定の活性を保持する分子である。生物学的に活性なバリアントは、天然に存在するものおよび／または定義された分子と、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、同一である。
【００６２】
定義されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して、上記のものよりも高い同一性％は、好ましい態様を包含することが理解されるであろう。したがって、適用可能であれば、最小％同一性の数字に照らして、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、さらにより好ましくは少なくとも９９．９％、関連する指名された配列番号と同一のアミノ酸配列を含む。
【００６３】
「単離されたポリヌクレオチド」であって、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組み合わせ、一本鎖または二本鎖、センスまたはアンチセンス配向または両者の組み合わせを含むものとは、その天然状態で会合または連結されたポリヌクレオチド配列から少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは、それらが天然に会合している他の成分を、少なくとも６０％非含有、好ましくは少なくとも７５％非含有、最も好ましくは少なくとも９０％非含有である。
【００６４】
近年、生物発光共鳴エネルギー移動アプローチ（ＢＲＥＴ）が、タンパク質−タンパク質相互作用および創薬を研究するためにますます使用されている。ルミネセンスは一般に、エネルギーが分子に特異的に伝えられて、励起された状態を生成する現象である。より低いエネルギー状態への復帰には、光子の放出が伴う。ルミネセンスには、蛍光、燐光、化学発光、および生物発光が含まれる。生物発光は、生きている生物が他の生物に見える光を発するプロセスである。ルミネセンスが生物発光の場合、励起状態の生成は、酵素触媒反応に由来する。ルミネセンスは、生物学的相互作用の分析に用いることができる。エネルギー移動効率の、エネルギーのドナーとアクセプターの間の距離への依存性は、タンパク質の標識部位に対して高感度かつ特異的の両方であるリアルタイムの測定を可能にし、こうして、動的な構造変化に関する推論を可能にする。
【００６５】
タンパク質−タンパク質相互作用を評価するための１つの技術は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく。ＦＲＥＴの理論は、１９４８年にTheodore Forsterによって初めて記述された。これは、エネルギーの非放射性移動として、すなわち、光子の放出なしに起こり、エネルギーのドナーとエネルギーのアクセプターとの間の双極子相互作用をもたらすエネルギーの移動として定義される（図１）。したがってこのプロセスでは、１つのフルオロフォアドナーは、その励起状態エネルギーを別のフルオロフォアアクセプターに移動させる。ドナーからアクセプターへのエネルギーの非放射性移動は、アクセプターの励起をもたらす。アクセプターは、それ自身の波長で光子を放射することにより、基底段階に戻る（図１Ａ）。
【００６６】
Forster方程式によれば、ＦＲＥＴ効率は５つのパラメータに依存する：（ｉ）第２のフルオロフォアの吸収スペクトルと第１のフルオロフォアの発光スペクトルの重なり―少なくとも部分的な重なり―（図１Ａおよび１Ｂ）、（ｉｉ）ドナーの放出双極子とアクセプターの吸収双極子との間の、相対的配向、（ｉｉｉ）フルオロフォア間の距離（図１Ｂ）、（ｉｖ）ドナーとアクセプターの量子収率、および（ｖ）アクセプターの吸光係数。
【００６７】
したがって、これらのドナーおよびアクセプターフルオロフォアは、分子内プローブ（図２、図９Ａ）または分子間プローブ（図９Ｂ）のいずれかの分子プローブとして、使用することができる。
【００６８】
ＦＲＥＴは、フルオレセインおよびローダミンなどのフルオロフォアを精製タンパク質の対に化学的に結合させ、標識タンパク質でマイクロインジェクションしたタンパク質混合物または細胞の蛍光スペクトルを測定することによって、in vitroおよびin vivoでタンパク質−タンパク質近接をアッセイするために使用されている。しかしＦＲＥＴには、いくつかの制限が存在する。任意の蛍光技術と同様に、フルオロフォアの光退色および細胞／組織の自己蛍光は、ＦＲＥＴの有用性を著しく制限し得て、高度に自己蛍光性の組織ではＦＲＥＴは本質的に使用不可能である。また、励起光が組織を容易に損傷する場合、この技術は健常細胞に価値を提供できない可能性がある。最後に、検査すべき細胞／組織が光応答性（例えば、網膜）である場合、測定が行われるとすぐに光応答が誘発され得るため、ＦＲＥＴは実用的でない可能性がある。
【００６９】
上述の欠点を克服し、関心対象のタンパク質−タンパク質複合体におけるエネルギードナーおよびアクセプター挿入の複数部位をさらに利用するために、本発明は、電圧依存性イオンチャネルと潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストとの間のリアルタイムの相互作用を直接モニタリングする、ＢＲＥＴに基づくアッセイの開発に依存する。
【００７０】
ＢＲＥＴ法は、ＦＲＥＴ法と非常に類似しているが、ここでドナーが生物発光分子である。したがって外部励起源が不要であり、それによって光退色および細胞／組織の自己蛍光の不都合が回避される。ＢＲＥＴは、実際にはRenilla reniformisおよびAequorea victoriaなどの生きている生物で生成される自然現象である。それらの生物では、生物発光タンパク質であるルシフェラーゼ酵素が、基質であるセレンテラジンの酸化分解を行い、同時に、４８０ｎｍでピークを有する光を放出する。これらの生物では、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）への近接は、エネルギーの非放射性移動を可能にする。エネルギーの良好なアクセプターは、５１２ｎｍで励起され、５３０ｎｍで発光する黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）であってよい。ＢＲＥＴシグナルは、アクセプターの発光ピークにおける光強度とドナーの発光ピークにおける光強度との間の比によって測定される（図３）。ＢＲＥＴシグナルは、純粋なＢＲＥＴシグナルを得るために、同じ実験条件でルシフェラーゼのみの存在下で得られたシグナルを差し引かなければならない。
【００７１】
本発明は、電圧調節されたイオンチャネルのＢＲＥＴ分析を初めて認識する。本発明は、正確で信頼性の高い情報生成を提供する器具類および方法を含む。本発明の目的は、イオンチャネルを標的とし、優れた効率を有するスクリーニングシステムを提供することである。本発明は、電圧依存性チャネルをコードする少なくとも１つの核酸を持つ細胞を含む、標的イオンチャネルに作用する化合物を、スクリーニングするための材料を提供する。
【００７２】
本発明はまた、リガンド結合に起因する電圧依存性イオンチャネル複合体において起こる立体配座変化をプローブするための、有用なツールを提供する。結果として、電圧依存性イオンチャネルサブユニットの異なるＢＲＥＴバイオセンサーを多重化することにより、本発明は、各受容体リガンドに特異的な薬理学的フィンガープリントを設定し、関与する様々なシグナル伝達経路に対する異なるリガンドの別個のシグナル伝達モードを識別することを可能にする。
【００７３】
イオンチャネル機能のハイスループットスクリーニングには、生細胞におけるイオンチャネル活性を報告する、感度の高い簡単なアッセイおよび器具類が必要である。
【００７４】
したがって本発明は、少なくとも１つの生物発光または蛍光ドナー分子をコードするヌクレオチド配列に結合した、および／または少なくとも１つの蛍光アクセプター分子をコードするヌクレオチド配列に結合した、電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸またはポリヌクレオチドに関する。
【００７５】
電圧依存性イオンチャネルサブユニットは、好ましくは、電圧依存性カチオンチャネルまたは電圧依存性アニオンチャネルのサブユニットであり、２〜２４個の膜貫通ドメインを含む。哺乳類の電圧依存性ナトリウムチャネルが同定されており、当該技術分野において知られている。本発明によれば、電圧依存性イオンチャネルは、以下の表１〜１１に記載されている。これらには、そのアイソフォームまたは活性バリアントも含まれる。
【００７６】
好ましい態様において、電圧依存性イオンチャネルサブユニットは、電圧依存性カチオンチャネルまたは電圧依存性アニオンチャネルのサブユニットであり、２〜２４個の膜貫通ドメインを含む。
【表１−１】
2018504917.tif 000003
【表１−２】
2018504917.tif 000004
【表２−１】
2018504917.tif 000005
【表２−２】
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【表２−３】
2018504917.tif 000007
【表３−１】
2018504917.tif 000008
【表３−２】
2018504917.tif 000009
【表３−３】
2018504917.tif 000010
【表３−４】
2018504917.tif 000011
【表３−５】
2018504917.tif 000012
【表３−６】
2018504917.tif 000013
【表４】
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【表５】
2018504917.tif 000015
【表６−１】
2018504917.tif 000016
【表６−２】
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【表７】
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【表８−１】
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【表８−２】
2018504917.tif 000020
【表８−３】
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【表８−４】
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【表８−５】
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【表８−６】
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【表８−７】
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【表８−８】
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【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表１０−１】
2018504917.tif 000030
【表１０−２】
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【表１０−３】
2018504917.tif 000032
【表１１】
2018504917.tif 000033
【００７７】
本発明による核酸は、表１〜１１に詳述されているかまたは以下から具体的に選択される電圧依存性カチオンチャネルサブユニットの、一部または断片全体をコードすることができる：カルシウム活性化カリウムチャネル、例えばサブファミリーＭ、アルファメンバー１、サブファミリーＮ、メンバー１、サブファミリーＮ、メンバー２、サブファミリーＮ、メンバー３、サブファミリーＮ、メンバー４；カリウムチャネル、サブファミリーＴ、メンバー１、カリウムチャネル、サブファミリーＴ、メンバー２、カリウムチャネル、サブファミリーＵ、メンバー１、ＣａｔＳｐｅｒ（１〜４）および二孔チャネル；環状ヌクレオチド調節チャネル、例えばチャネルアルファ１、チャネルアルファ２、チャネルアルファ３、チャネルアルファ４、チャネルベータ１、チャネルベータ３；過分極活性化環状ヌクレオチドゲート型カリウムチャネル１〜４；カリウムチャネル；サブファミリーＫ、メンバー１〜１８を含む２−Ｐ；カリウムチャネル、例えばサブファミリーＪ、メンバー１〜１８などの内向き整流カリウムチャネル；電圧ゲート型カルシウムチャネル；電圧ゲート型カリウムチャネル、例えばshaker関連サブファミリー、メンバー１〜１０、Shab関連サブファミリー、メンバー１および２、Shaw関連サブファミリー、メンバー１〜４、Shal関連サブファミリー、メンバー１〜３、サブファミリーＦ、メンバー１、サブファミリーＧ、サブファミリー１、メンバー１、サブファミリーＧ、メンバー２、サブファミリーＧ、メンバー３、サブファミリーＧ、メンバー４、サブファミリーＨ（eag関連）、メンバー１〜８、ＫＱＴ様サブファミリー、メンバー１〜５、遅延整流性、サブファミリーＳメンバー１〜３、サブファミリーＶ、メンバー１〜２；電圧ゲート型ナトリウムチャネル、例えばＩ型、アルファサブユニット、Ｉ型、ベータサブユニット、ＩＩ型、アルファサブユニット、ＩＩ型、ベータサブユニット、ＩＩＩ型、アルファサブユニット、ＩＩＩ型、ベータサブユニット、ＩＶ型、アルファサブユニット、Ｖ型、アルファサブユニット、ＶＩＩ型、アルファサブユニット、ＶＩＩＩ型、アルファサブユニット、ＩＸ型、アルファサブユニット、Ｘ型、アルファサブユニット、ＸＩ型、アルファサブユニット；カルシウムチャネル、電圧依存性、例えばＰ／Ｑ型、アルファ１Ａ型サブユニット、Ｎ型、アルファ１Ｂサブユニット、Ｌ型、アルファ１Ｃサブユニット、Ｌ型、アルファ１Ｄサブユニット、Ｒ型、アルファ１Ｅ&#8203;&#8203;サブユニット、Ｌ型、アルファ１Ｆサブユニット、Ｔ型、アルファ１Ｇサブユニット、Ｔ型、アルファ１Ｈ&#8203;&#8203;サブユニット、Ｔ型、アルファＩＩ&#8203;&#8203;サブユニット、Ｌ型、アルファ１Ｓサブユニット；一過性受容体電位カチオンチャネルなどの一過性受容体電位チャネル、例えばサブファミリーＡ、メンバー１、サブファミリーＣ、メンバー１、サブファミリーＣ、メンバー２、疑遺伝子、サブファミリーＣ、メンバー３、サブファミリーＣ、メンバー４、サブファミリーＣ、メンバー５、サブファミリーＣ、メンバー６、サブファミリーＣ、メンバー７、サブファミリーＭ、メンバー１、サブファミリーＭ、メンバー２、サブファミリーＭ、メンバー３、サブファミリーＭ、メンバー４、サブファミリーＭ、メンバー５、サブファミリーＭ、メンバー６、サブファミリーＭ、メンバー７、サブファミリーＭ、メンバー８、ムコリピン、サブファミリーＶ、メンバー１、サブファミリーＶ、メンバー２、サブファミリーＶ、メンバー３、サブファミリーＶ、メンバー４、サブファミリーＶ、メンバー５、サブファミリーＶ、メンバー６；水素電圧ゲート型イオンチャネルなど。
【００７８】
好ましい態様において、電圧依存性カチオンチャネルサブユニットは、６つの膜貫通ドメイン、２つの細胞内ループ、１つの膜貫通ループ、および細胞内Ｎ末端およびＣ末端を含むチャネル、例えば一過性受容体電位（ＴＲＰ）チャネルのサブユニットである。かかるＴＲＰは、ＴＲＰＣ（標準（canonical））チャネル、ＴＲＰＶ（バニロイド）、ＴＲＰＭ（メラスタチン）、ＴＲＰＡ（アンキリン）、ＴＲＰＰ（ポリシスチン）、またはＴＲＰＭＬ（ムコリピン）であってもよい。
【００７９】
特に好ましい態様において、ＴＲＰＶチャネルは、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４、ＴＲＰＶ５、またはＴＲＰＶ６であり、ここで前記ＴＲＰＣチャネルは、ＴＲＰＣ１、ＴＲＰＣ２、ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ４、ＴＲＰＣ５、ＴＲＰＣ６、またはＴＲＰＣ７であり、ここで前記ＴＲＰＭチャネルは、ＴＲＰＭ１、ＴＲＰＭ２、ＴＲＰＭ３、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ５、ＴＲＰＭ６、ＴＲＰＭ７、またはＴＲＰＭ８であり、ここで前記ＴＲＰＰチャネルは、ＴＲＰＰ１、ＴＲＰＰ２、ＴＲＰＰ３またはＴＲＰＰ４であり、またはＴＲＰＡはＴＲＰＡ１である。
【００８０】
特に好ましい態様において、ＴＲＰＶチャネルは、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４、またはＴＲＰＡ１である。
【００８１】
本発明は、１つ以上の生物発光ドナー分子および／または１つ以上の蛍光アクセプター分子を含む電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードする、新規な核酸に関する。
【００８２】
本発明は、少なくとも１つの生物発光ドナー分子に結合した、および／または少なくとも１つの蛍光アクセプター分子に結合した電圧依存性カチオンチャネルサブユニットを含む電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸に関し、ここで前記電圧依存性カチオンチャネルサブユニットは、一過性受容体電位（ＴＲＰ）チャネルのサブユニットである。本発明によれば、生物発光ドナー分子は、アクセプター分子の吸光度スペクトルと重複するので、生物発光ドナー分子によって送達される光エネルギーは、アクセプター分子を励起することができる波長である。したがって、本発明による分子内ＢＲＥＴプローブは、生細胞におけるＴＲＰチャネル構造の立体配座変化およびＴＲＰチャネル活性化をモニターするために、有用である。
【００８３】
好ましい態様によれば、本発明は、少なくとも１つの生物発光ドナー分子に結合した、および少なくとも１つの蛍光アクセプター分子に結合した電圧依存性カチオンチャネルサブユニットを含む電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸に関し、ここで、前記電圧依存性カチオンチャネルサブユニットは、一過性受容体電位（ＴＲＰ）チャネルのサブユニットであり、ここで、前記生物発光ドナー分子およびアクセプター分子は、生物発光ドナー分子の発光スペクトルが、アクセプター分子の吸光度スペクトルと重複するように選択され、したがって、生物発光ドナー分子によって送達される光エネルギーは、アクセプター分子を励起することができる波長である。また、前記電圧依存性カチオンチャネルサブユニットは、好ましくは、本明細書中上記されたように、６つの膜貫通ドメイン、２つの細胞内ループ、１つの膜貫通ループ、および細胞内Ｎ末端およびＣ末端を含むチャネルのサブユニットである。好ましいサブユニットはＴＲＰＶサブファミリーのメンバーに属し、例えば、いかなる限定なしに、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ３およびＴＲＰＶ４である。
【００８４】
本開示の態様は、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システム、タンパク質−タンパク質相互作用を検出する方法、試験化合物の有効性を決定する方法、ＢＲＥＴベクター、上記のそれぞれに関連するキット、を含む。一般に、ＢＲＥＴシステムは、FORSTER機構による、生物発光ドナー分子と蛍光アクセプター分子との間の、エネルギーの非放射性移動を含む。エネルギー移動は、主に、（ｉ）ドナー分子とアクセプター分子それぞれの発光スペクトルと励起スペクトルとの間の重なり、および（ｉｉ）ドナー分子とアクセプター分子との間の約１００オングストローム（Ａ）の近接度に依存する。ＢＲＥＴ中のドナー分子は、化学発光を介して光を生成するため、小動物のイメージングに適している。さらに、ＢＲＥＴシステムは、外部光励起源を使用せず、シグナル対ノイズ比が低いために、生きている対象に潜在的により大きな感度を提供する。
【００８５】
ＢＲＥＴシステムの態様は、とりわけ、少なくとも１つの生物発光ドナー分子をコードするヌクレオチド配列に結合した、および／または少なくとも１つの蛍光アクセプター分子をコードするヌクレオチド配列に結合した、電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、を含む。
【００８６】
好ましくは、本発明の核酸は、少なくとも１つの生物発光ドナー分子に任意にリンカー配列を介して結合した、および、少なくとも１つの蛍光アクセプター分子をコードするヌクレオチド配列に任意にリンカー配列を介して結合した上記の電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む。より正確には、前記生物発光ドナー分子およびアクセプター分子は、Ｃ末端、Ｎ末端、または前記チャネルサブユニットのループのいずれかに、任意にリンカー配列を介して、結合していてもよい。本発明による可能な結合は、以下の通りであってよい：
（ｉ）生物発光ドナー分子がチャネルサブユニットのＣ末端に結合し、アクセプター分子が該チャネルサブユニットのＮ末端に結合している、
（ｉｉ）生物発光ドナー分子がチャネルサブユニットのＮ末端に結合し、アクセプター分子が該チャネルサブユニットのＣ末端に結合している、
（ｉｉｉ）生物発光ドナー分子がチャネルサブユニットのＣ末端に結合し、アクセプター分子が第１または第２細胞内ループの一部を形成する、
（ｉｖ）生物発光ドナー分子がチャネルサブユニットのＮ末端に結合し、アクセプター分子が第１または第２細胞内ループの一部を形成する、
（ｖ）アクセプター分子がチャネルサブユニットのＣ末端に結合し、生物発光ドナー分子が第１または第２細胞内ループの一部を形成する、
（ｖｉ）アクセプター分子がチャネルサブユニットのＮ末端に結合し、生物発光ドナー分子が第１または第２細胞内ループの一部を形成する、
（ｖｉｉ）生物発光ドナー分子が第１細胞内ループの一部を形成し、アクセプター分子が第２細胞内ループの一部を形成する、
（ｖｉｉｉ）生物発光ドナー分子が第２細胞内ループの一部を形成し、アクセプター分子が第１細胞内ループの一部を形成する。
【００８７】
本発明の好ましい側面において、生物発光ドナー分子およびアクセプター分子は、チャネルサブユニットのＮおよびＣ末端に結合する（上記項目（ｉ）および（ｉｉ））。本発明の非常に好ましい側面において、生物発光ドナー分子は、チャネルサブユニットのＣ末端に結合し、アクセプター分子は、チャネルサブユニットのＮ末端に結合する。
【００８８】
別の態様によれば、生物発光ドナー分子およびアクセプター分子は、一過性受容体電位（ＴＲＰ）チャネルの異なるサブユニットにＣ末端、Ｎ末端のいずれかで、または、同じＴＲＰチャネルに属する２つの別個のチャネルサブユニットのループ、もしくはＴＲＰチャネルの異なるファミリーまたはサブファミリーの２つの別個のＴＲＰチャネルに、結合することができる。この態様による核酸は、少なくとも１つの生物発光ドナー分子または１つの蛍光アクセプター分子をコードする少なくともヌクレオチド配列に、任意にリンカー配列を介して結合した上記のような電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードする第１のヌクレオチド配列、および、少なくとも１つの生物発光ドナー分子または１つの蛍光アクセプター分子をコードする少なくともヌクレオチド配列に、任意にリンカー配列を介して結合した上記のような電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードする第２のヌクレオチド配列、を含む。第１のサブユニットが少なくとも１つの生物発光ドナー分子に結合している場合、第２のサブユニットは少なくとも１つの蛍光アクセプター分子に結合し、その逆も同様である。様々な可能な結合は、（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）で上述したものと同じ構成を有し、ただし、生物発光ドナー分子およびアクセプター分子が、同一または別個のＴＲＰチャネルの、別個のサブユニットに結合されるという違いがある。
【００８９】
少なくとも１つの生物発光ドナー分子または少なくとも１つのアクセプター体分子は、一過性受容体電位（ＴＲＰ）チャネルのサブユニットのＣ末端、Ｎ末端のいずれかに、または該サブユニットおよび同じＴＲＰチャネルに属する２つの別個のチャネルサブユニットのループに、結合することができる。
【００９０】
さらに別の態様によれば、本発明は、少なくとも１つの生物発光ドナー分子または少なくとも１つの蛍光アクセプター分子に結合した上記の電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む。生物発光ドナー分子または蛍光アクセプター分子は、任意にリンカー配列を介して、前記チャネルサブユニットのＣ末端、Ｎ末端、またはループのいずれかに結合することができる。ドナー分子またはアクセプター分子の一方または他方が、サブユニットに結合する。ＢＲＥＴプローブの他方のパートナーは、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかで電圧依存性カチオンチャネルサブユニットのモジュレーターまたはエフェクターに結合する。好ましくは、電圧依存性カチオンチャネルサブユニットは、一過性受容体電位（ＴＲＰ）チャネルのサブユニットである。したがってこの態様によれば、生物発光ドナー分子がＴＲＰサブユニット（任意にリンカーを介して、サブユニットのＣ末端、Ｎ末端、またはループのいずれか）に結合される場合、蛍光アクセプター分子は、ＴＰＲサブユニット融合体が属するＴＲＰチャネルのエフェクターまたはモジュレーターのＣ末端またはＮ末端に結合し、逆もまた同様である。この特定の態様によれば、モジュレータータンパク質は、例えば、ＴＲＰＶチャネルにカルシウム依存的に結合することが知られているカルモジュリン（例えば、図９Ｂ）であってもよい。実際に、ＴＰＲＶチャネルの脱感作は細胞内カルシウムの存在に依存し、カルモジュリンは、カルシウム濃度の変化をチャネル立体配座の変化および挙動の変化に変換するセンサーとして作用する。したがって、本発明のこの特定の態様による分子間ＢＲＥＴプローブは、カルモジュリンなどの細胞内エフェクタータンパク質の構造的立体配座変化および動員の両方に起因する、生きた細胞におけるＴＲＰチャネル活性化をモニターするのに、有用である。
【００９１】
モジュレーター、エフェクタータンパク質および／またはリガンドは、上記で定義されており、ＴＲＰチャネルに対して十分に特徴付けられている。上記のように、ＴＲＰＶ１は非選択的カチオンチャネルであり、有害な刺激、熱、プロトン、低ｐＨによって活性化される。ＴＲＰＶ１は以下によっても活性化され得る：エンドバニロイドと呼ばれる化合物のクラスである内因性バニロイドアゴニスト；生体アミンのコンジュゲート、例えばＮ−アラキドニルエタノールアミン、Ｎ−アラキドノイルドパミン、Ｎ−オレオイルエタノールアミン、Ｎ−アラキドノリルセリン、および種々のＮ−アシルタウリンおよびＮ−アシルサルソリノール（acylsalsolinol）のコンジュゲート；酸素化エイコサテトラエン酸、例えばリポキシゲナーゼ産物５−、１２−および１５−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸、プロスタグランジン、およびロイコトリエンＢ４など；さらに、アデノシン、ＡＴＰ、およびポリアミン（例えば、スペルミン、スペルミジン、およびプトレシン）。ＴＲＰＶ１はまた、外因性アゴニスト、例えばカプサイシノイドおよびカプシノイド、ピペリン、オイゲノール、ジンゲロールなど、およびリドカインなどの合成アゴニストによっても、活性化され得る。
【００９２】
ＴＲＰＶ１のように、ＴＲＰＶ２は有害な熱ならびにいくつかの外因性化学リガンド、例えばフェニルボラート、ＤＰＢＡ、カンナビジオールおよびカンナビノールによって活性化される。これは、利尿性アミロライド、テトラエチルアンモニウム、４−アミノピリジン、および１−（２−（トリフルオロメチル）フェニル）イミダゾール、およびモノテルペンアルデヒドシトラールによってブロックされる。
【００９３】
ＴＲＰＶ３は、多数の天然および合成の外因性リガンドによって活性化され、これには例えば、チモール、オイゲノール、クレゾール、センブランジテルペノイド・インセンソールアセタート（incensole acetate）、カルバクロール、２−アミノエトキシジフェニルボロナート（２−ＡＰＢ）、ドロフェニン、ジフェニルボロン酸無水物（ＤＰＢＡ）、および２，２−ジフェニルテトラヒドロフラン（ＤＰＴＨＦ）などを含む。
【００９４】
ＴＲＰＶ４は、細胞膨潤、無害性の暖かさなどの物理的刺激によって、エンドカンナビノイドおよびアラキドン酸代謝物などの内在性化学リガンドによって、ならびにビスアンドログラホリド、α−ホルボールエステル、二量体ジテルペノイドビスアンドログラホリドＡ、およびGSK1016790Aなどの小分子によって、活性化される（Thorneloe KS, et al.,J Pharmacol Exp Ther 326:432-442を参照）。ＴＲＰＶ４のアンタゴニストには、例えばＲＮ−１７３４およびＲＮ−９８９３が含まれる。
【００９５】
ＴＲＰＶ５およびＴＲＰＶ６は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、Ｃａ２＋結合タンパク質S100A10、およびアネキシンＩＩによって活性化される。そのアンタゴニストには、例えば、抗真菌性アゾールエコナゾールなどが含まれる。
【００９６】
前記生物発光ドナー分子およびアクセプター分子は、生物発光ドナー分子の発光スペクトルがアクセプタータンパク質の吸光度スペクトルと重なるように選択されるので、生物発光ドナー分子によって送達される光エネルギーは、アクセプター分子を励起可能な波長である。
【００９７】
生物発光ドナーとは、適切な基質に作用して化学エネルギーを光エネルギーに変換することができる、任意の部分を指す。例えば、それは、基質を活性化生成物に変換する（これは次に緩和とともにエネルギーを放出する）、酵素を指す。活性化生成物（生物発光タンパク質の基質上での活性によって生成される）は、アクセプター分子に移動される、生物発光タンパク質が生成するルミネセンスの供給源である。
【００９８】
生物発光分子のサイズを考えると、本発明による機能的電圧依存性イオンチャネルサブユニットが生成できることは驚くべきことであった。本発明で使用可能な、多数の異なる生物発光ドナー分子が存在する。発光システムは知られており、細菌、原生生物、腔腸動物、軟体動物、魚類、ヤスデ、ハエ、真菌、虫（worm）、甲殻類および甲虫を含む多くの発光生物から、特にPyrophorus属のクリックビートルおよびPhotinus、Photuris、ならびにLuciola属のホタルから単離される。生物発光を示すさらなる生物は、国際公開WO 00/024878およびWO 99/049019に挙げられている。
【００９９】
よく特徴づけられている１つの例は、ルシフェラーゼとして知られているクラスのタンパク質である。ルシフェラーゼタンパク質はエネルギー産生化学反応を触媒し、ここで、特定の生化学物質であるルシフェリン（天然に存在する基質）が、ルシフェラーゼ活性を有する酵素によって酸化される。細菌、藻類、真菌、昆虫、魚類および他の海洋形態の種を含む、原核生物および真核生物の両方が、このような様式で光エネルギーを放出することができ、それぞれは、他の生物とは化学的に異なる特異的ルシフェラーゼ活性およびルシフェリンを有する。ルシフェリン／ルシフェラーゼ系は、形態、化学および機能において非常に多様である。例えば、いくつかの細菌およびキノコによって示されるような、連続した化学発光を促進するルシフェラーゼ活性、および渦鞭毛藻類の場合のように、散発的または刺激誘発性の放出を促進するように適合されたルシフェラーゼ活性がある。化学エネルギーの光エネルギーへの変換を伴う現象として、生物発光は生きている生物には限定されず、生きている生物の存在も必要としない。これは、ルシフェラーゼ活性を必要とする単なる化学発光反応の一種であり、１つまたは複数の段階において、生物学的触媒にルシフェラーゼ活性の起源を有するものである。したがって、必須の活性および化学物質の保存または構築には、生物発光現象を生じさせる手段を有することで、十分である。
【０１００】
ルシフェラーゼ活性を有する生物発光タンパク質の例は、US 5,229,285、5,219,737、5,843,746、5,196,524、および5,670,356に見出すことができる。最も広く使用されている２種類のルシフェラーゼは、（ｉ）ウミシイタケルシフェラーゼ（R. reniformis由来）、セレンテラジンを基質として使用し４８０ｎｍで発光する３５ｋＤａのタンパク質；および（ｉｉ）ホタルルシフェラーゼ（Photinus pyralis由来）、ルシフェリンを基質として使用し５６０ｎｍで発光する６１ｋＤａのタンパク質である。好ましい態様において、生物発光ドナー分子は、ルシフェラーゼの中から選択された、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、腔腸動物ルシフェラーゼ、北アメリカグローワームルシフェラーゼ、クリックビートルルシフェラーゼ、鉄道虫ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、エクオリン（Aequorin）、アラクノカンパ（Arachnocampa）ルシフェラーゼ、またはいずれかの生物学的に活性なバリアントもしくは断片である。ガウシアルシフェラーゼ（Gaussia princeps由来）は、セレンテラジンを迅速な反応で酸化して４７０ｎｍで明るい発光を生じる、２０ｋＤａのタンパク質である。本発明に有用なルシフェラーゼはまた、Anachnocampa sp（WO 2007/019634）から特徴付けられている。これらの酵素は、約５９ｋＤａの大きさであり、スペクトルの青色部分内の発光スペクトルを用いて発光反応を触媒する、ＡＴＰ依存性ルシフェラーゼである。
【０１０１】
代替的な非ルシフェラーゼである生物発光分子は、適切な基質に作用して発光シグナルを生成することができる、任意の酵素であってよい。かかる酵素の具体例は、β−ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、またはβ−グルコシダーゼである。これらの酵素の合成発光基質は当該技術分野において知られており、Tropix Inc.（Bedford, MA, USA）などの会社から市販されている。
【０１０２】
例として、いくつかの生物発光ドナー分子を次の表１２に列挙する。
【表１２】
2018504917.tif 000034
【０１０３】
生物発光ドナー分子の基質の選択は、生物発光タンパク質によって生成される光の波長および強度に影響を及ぼし得る。広く知られている基質はセレンテラジンであり、これは、刺胞動物、橈脚類、毛顎動物、有櫛動物、十腕類エビ、アミエビ、放散虫およびいくつかの魚類の分類群において生じる。Renillaルシフェラーゼについては、例えば、４１８〜５１２ｎｍの間の発光が生じるセレンテラジン類似体／誘導体が利用可能である。セレンテラジン類似体／誘導体（400A、DeepBlueC）は、Renillaルシフェラーゼを用いて４００ｎｍで発光すると記載されている（WO 01/46691）。セレンテラジン類似体／誘導体の他の例は、EnduRenおよびViviRenである。
【０１０４】
ルシフェリンは、ルシフェラーゼ酵素の存在下で酸化されてオキシルシフェリンおよび光の形態のエネルギーを生成する、生物発光が可能な生物に見られる発光生物学的色素のクラスに関する。ルシフェリン、または２−（６−ヒドロキシベンゾチアゾール−２−イル）−２−チアゾリン−４−カルボン酸は、ホタルPhotinus pyralisから最初に単離された。それ以来、様々な形態のルシフェリンが、主に海洋からの様々な異なる生物、例えば魚類やイカから発見され研究されてきたが、その多くは、例えば虫（worm）、甲虫、および他の様々な昆虫において同定されている
【０１０５】
少なくとも５つの一般的な種類のルシフェリンが存在し、これらはそれぞれ化学的に異なっており、広範囲の異なる補助因子を用いる化学的および構造的に異なるルシフェラーゼによって触媒される。第１はホタルルシフェリンであり、これはホタルルシフェラーゼの基質で、触媒作用のためにＡＴＰを必要とする（EC 1.13.12.7）。第２は細菌ルシフェリンであり、イカや魚にも見出され、長鎖アルデヒドと還元リン酸リボフラビンからなる。細菌ルシフェラーゼは、ＦＭＮＨ依存性である。第３は渦鞭毛藻ルシフェリンであり、夜間海洋燐光に関与する生物である渦鞭毛藻類（海洋プランクトン）に見出される、テトラピロールのクロロフィル誘導体である。渦鞭毛藻ルシフェラーゼは、渦鞭毛藻ルシフェリンの酸化を触媒し、３つの同一の触媒活性ドメインからなる。第４はイミダゾロピラジンバルグリンであり、これは特定の貝虫類および深海魚類、例えば、アンコウ類（Porichthys）に見出される。最後は、セレンテラジン（イミダゾールピラジン）、すなわち、放散虫、有櫛動物、刺胞動物、イカ、橈脚類、毛顎動物、魚やエビに見出される、タンパク質エクオリンの発光体である。
【０１０６】
本発明に用いることができる多数の異なるアクセプター分子が存在する。アクセプター分子は、タンパク質でも非タンパク質でもよい。
【０１０７】
代表的なアクセプタータンパク質としては、限定はされないが、以下を含むことができる：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、緑色蛍光タンパク質のバリアント（ＧＦＰ１０など）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、増強ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、増強ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、mAmetrine、LSS-mOrange、LSS-mKate、Emerald、Topaz、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、mRFP1、ポシロポリン（pocilloporin）、ウミシイタケＧＦＰ、Monster GFP、paGFP、Kaedeタンパク質もしくはフィコビリタンパク質、またはそれらのいずれかの生物学的に活性なバリアントもしくは断片。
【０１０８】
最も頻繁に使用される生物発光または蛍光体は、オワンクラゲ（Aequorea victoria）由来の緑色蛍光タンパク質および、例えば突然変異誘発およびキメラタンパク質技術で得られる他の多くのバリアント（ＧＦＰ）である。ＧＦＰは、それらの発色団の特徴的な成分に基づき分類され、各クラスは別個の励起および発光波長を有する：クラス１、中性フェノールとアニオン性フェノラートの野生型混合物：クラス２、フェノラートアニオン：クラス３、中性フェノール：クラス４、積層したｓ−電子系を有するフェノラートアニオン：クラス５、インドール：クラス６、イミダゾール：およびクラス７、フェニル。ＢＲＥＴに適する操作された系の一例は、仲介タンパク質の不在下で互いに有意な程度に直接相互作用しない、ウミシイタケルシフェラーゼとＧＦＰの増強黄色変異体（ＥＹＦＰ）の対形成である（この場合、Ｇタンパク質結合受容体）。
【０１０９】
非タンパク質性アクセプター分子の例としては、Alexa（商標）（Molecular Probes）、Fluo色素、Bodipy色素（商標）（Life technologies）、Ｃｙ色素（商標）（Life technologies）、フルオレセイン、ダンシル、ウンベリフェロン（７−ヒドロキシクマリン）、蛍光マイクロスフェア、発光ナノ結晶、Marina blue（商標）（Life technologies）、Cascade blue（商標）（Life technologies）、Cascade yellow（商標）（Life technologies）、Pacific blue（商標）（Life technologies）、Oregon green（商標）（Life technologies）、テトラメチルローダミン、ローダミン、Texas red（商標）（Life technologies）、希土類元素キレート、またはそれらの任意の組み合わせもしくは誘導体が含まれる。
【０１１０】
他の代表的なアクセプター分子としては、限定はされないが、以下を含むことができる：ｓｇＧＦＰ、ｓｇＢＦＰ、ＢＦＰ青色シフトＧＦＰ（Ｙ６６Ｈ）、シアンＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ、単量体ＲＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）、ＧＦＰ赤色シフト（ｒｓＧＦＰ）、非ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）、ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）、ＧＦＰｕｖ、ＨｃＲｅｄ、ｒｓＧＦＰ、サファイアＧＦＰ、ｓｇＢＦＰ（商標）、ｓｇＢＦＰ（商標）（スーパーグローＢＦＰ）、ｓｇＧＦＰ（商標）、ｓｇＧＦＰ（商標）（スーパーグローＧＦＰ）、イエローＧＦＰ、半導体ナノ粒子（例えばラマンナノ粒子）、１，５ＩＡＥＤＡＮＳ；１，８−ＡＮＳ；４−メチルウンベリフェロン；５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン；５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）；５−カルボキシナフトフルオレセイン；５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）；５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセイン）；５−ＨＡＴ（ヒドロキシトリプタミン）；５−ヒドロキシトリプタミン（ＨＡＴ）；５−ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）；５−ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン）；６−カルボキシローダミン６Ｇ；６−ＣＲ ６Ｇ；６−ＪＯＥ；７−アミノ−４−メチルクマリン；７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）；７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン；９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン；ＡＢＱ；酸フクシン；ＡＣＭＡ（９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン）;アクリジンオレンジ；アクリジンレッド；アクリジンイエロー；アクリフラビン；Acriflavin Feulgen SITSA；エクオリン（発光タンパク質）；ＡＦＰ（自己蛍光タンパク質；Quantum Biotechnologies）；Alexa Fluor 350（商標）；Alexa Fluor 430（商標）；Alexa Fluor 488（商標）；Alexa Fluor 532（商標）；Alexa Fluor 546（商標）；Alexa Fluor 568（商標）；Alexa Fluor 594（商標）；Alexa Fluor 633（商標）；Alexa Fluor 647（商標）；Alexa Fluor 660（商標）；Alexa Fluor 680（商標）；アリザリンコンプレキソン；アリザリンレッド；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）；ＡＭＣ、ＡＭＣＡ−Ｓ；ＡＭＣＡ（アミノメチルクマリン）；ＡＭＣＡ−Ｘ；アミノアクチノマイシンＤ；アミノクマリン；アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）；アニリンブルー；アントラシルステアレート；ＡＰＣ（アロフィコシアニン）；ＡＰＣ−Ｃｙ７；APTRA-BTC；ＡＰＴＳ；アストラゾンブリリアントレッド4G；アストラゾンオレンジR；アストラゾンRed 6B；アストラゾンイエロー7GLL；アタブリン；ATTO-TAG（商標）CBQCA；ATTO-TAG（商標）FQ；オーラミン；Aurophosphine G；Aurophosphine；BAO 9（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）；BCECF（高ｐＨ）；BCECF（低ｐＨ）；ベルベリンスルフェート；β−ラクタマーゼ；ビマン；ビスベンズアミド；ビスベンズイミド（Hoechst）；ビス−ＢＴＣ；Blancophor FFG；BlancophorSV；BOBO（商標）-1；BOBO（商標）-3；Bodipy 492/515；Bodipy 493/503；Bodipy 500/510；Bodipy 505/515；Bodipy 530/550；Bodipy 542/563；Bodipy 558/568；Bodipy 564/570；Bodipy 576/589；Bodipy 581/591；Bodipy 630/650-X；Bodipy 650/665-X；Bodipy 665/676；Bodipy F1；Bodipy FL ATP；Bodipy Fl-Ceramide；Bodipy R6G SE；Bodipy TMR；Bodipy TMR-Xコンジュゲート；Bodipy TMR-X、SE；Bodipy TR；Bodipy TR ATP；Bodipy TR-X SE；BO-PRO（商標）-1；BO-PRO（商標）-3��ブリリアント・スルフフラビンＦＦ；ＢＴＣ；ＢＴＣ-５Ｎ；カルセイン；カルセインブルー；カルシウムクリムゾン（商標）；カルシウムグリーン；カルシウムグリーン−１ Ｃａ２＋染料；カルシウムグリーン−２ Ｃａ２＋；カルシウムグリーン−５Ｎ Ｃａ２＋；カルシウムグリーン−Ｃ１８ Ｃａ２＋；カルシウムオレンジ；カルコフロールホワイト；カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）；Cascade Blue（商標）；Cascade Yellow；カテコールアミン；ＣＣＦ２（GeneBlazer）；ＣＦＤＡ；クロロフィル；クロモマイシンＡ；クロモマイシンＡ；ＣＬ−ＮＥＲＦ；ＣＭＦＤＡ；クマリンファロイジン；Ｃ−フィコシアニン；ＣＰＭメチルクマリン；ＣＴＣ；ＣＴＣホルマザン；Ｃｙ２（商標）；Ｃｙ３．１８；Ｃｙ３．５（商標）；Ｃｙ３（商標）；Ｃｙ５．１８；Ｃｙ５．５（商標）；Ｃｙ５（商標）；Ｃｙ７（商標）；環式ＡＭＰフルオロセンサー（FiCRhR）；ダブシル；ダンシル；ダンシルアミン；ダンシルカダベリン；ダンシルクロライド；ダンシルＤＨＰＥ；ダンシルフルオライド；ＤＡＰＩ；Dapoxyl；Dapoxyl 2；Dapoxyl 3’DCFDA；ＤＣＦＨ（ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート）；ＤＤＡＯ；ＤＨＲ（ジヒドロローダミン（Dihydorhodamine）１２３）；Ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ；Ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳ（非比）；ＤｉＡ（４−Ｄｉ−１６−ＡＳＰ）；ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＨ）；ＤｉＤ−親油性トレーサー；ＤｉＤ（ＤｉｌＣ１８（５））；ＤＩＤＳ；ジヒドロローダミン（Dihydorhodamine）１２３（ＤＨＲ）；Ｄｉｌ（ＤｉｌＣ１８（３））；ジニトロフェノール；ＤｉＯ（ＤｉＯＣ１８（３））；ＤｉＲ；ＤｉＲ（ＤｉｌＣ１８（７））；ＤＭ−ＮＥＲＦ（高ｐＨ）；ＤＮＰ；ドーパミン；ＤＴＡＦ；DY-630-NHS；DY-635-NHS；ＥＬＦ９７；エオシン；エリスロシン；エリスロシンＩＴＣ；エチジウムブロミド；エチジウムホモダイマー１（ＥｔｈＤ−１）；ユーキライシン；EukoLight；塩化ユーロピウム（ＩＩＩ）；ＥＹＦＰ；ファストブルー；ＦＤＡ；Feulgen（パラローザニリン）；ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導性蛍光）；ＦＩＴＣ；フラゾオレンジ；Fluo-3；Fluo-4；フルオレセイン（ＦＩＴＣ）；フルオレセインジアセテート；フルオロ−エメラルド；フルオロ−金（ヒドロキシスチルバミジン）；Fluor-Ruby；FluorX；FM 1-43（商標）；FM 4-46；Fura Red（商標）（高ｐＨ）；Fura Red（商標）／Fluo-3；Fura-2；Fura-2／BCECF；Genacryl Brilliant Red B；Genacryl Brilliant Yellow 10GF；Genacryl Pink 3G；Genacryl Yellow 5GF；GeneBlazer（CCF2）；グロキサン酸（Gloxalic Acid）；Granular blue；
ヘマトポルフィリン；Hoechst 33258；Hoechst 33342；Hoechst 34580；ＨＰＴＳ；ヒドロキシクマリン；ヒドロキシスチルバミジン（FluoroGold）；ヒドロキシトリプタミン；Indo-1、高カルシウム；Indo-1、低カルシウム；インドジカルボシアニン（ＤｉＤ）；インドトリカルボシアニン（ＤｉＲ）；Intrawhite Cf；JC-1；JO-JO-1；JO-PRO-1；LaserPro；Laurodan；LDS 751(DNA)；LDS 751(RNA)；Leucophor PAF；Leucophor SF；Leucophor WS；リサミンローダミン；リサミンローダミンＢ；カルセイン／エチジウムホモダイマー；LOLO-1；LO-PRO-1；ルシファーイエロー；ライソトラッカーブルー；ライソトラッカーブルーホワイト；ライソトラッカーグリーン；ライソトラッカーレッド；ライソトラッカーイエロー；LysoSensor Blue；LysoSensor Green；LysoSensor Yellow/Blue；マググリーン；マグダラレッド（Phloxin B）；Mag-Fura Red；Mag-Fura-2；Mag-Fura-5；Mag-Indo-1；マグネシウムグリーン；マグネシウムオレンジ；マラカイトグリーン；Marina Blue；マキシロンブリリアントフラビン１０ ＧＦＦ；マキシロンブリリアントフラビン８ ＧＦＦ；メロシアニン；メトキシクマリン；Mitotracker Green FM；Mitotracker Orange；Mitotracker Red；ミトラマイシン；モノブロモビマン；モノブロモビマン（mBBr-GSH）；モノクロロビマン；ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）；ＮＢＤ；ＮＢＤアミン；ナイルレッド；ニトロベンズオキサジドール；ノルアドレナリン；ヌクレアファストレッド；ヌクレアイエロー；Nylosan Brilliant lavin E8G；Oregon Green；Oregon Green 488-X；Oregon Green（商標）；Oregon Green（商標）488；Oregon Green（商標）500；Oregon Green（商標）514；Pacific Blue；Pararosaniline（Feulgen）；PBFI；PE-Cy5；PE-Cy7；PerCP；PerCP-Cy5.5；ＰＥ−Texas Red [Red 613]；Phloxin B（マグダラレッド）；Phorwite AR；Phorwite BKL；Phorwite Rev；Phorwite RPA；ホスフィン３Ｒ；PhotoResist；フィコエリスリンＢ［ＰＥ］；フィコエリスリンＲ［ＰＥ］；ＰＫＨ２６（Sigma）；ＰＫＨ６７；ＰＭＩＡ；ポントクロムブルーブラック；POPO-1；POPO-3；PO-PRO-1；PO-PRO-3；プリムリン；Procion Yellow；ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）；ＰｙＭＰＯ；ピレン；ピロニン；ピロニンＢ；パイロザールブリリアントフラビン７ＧＦ；QSY 7；キナクリンマスタード；Red 613 [PE-TexasRed]；レゾルフィン；RH 414；Rhod-2；ローダミン；ローダミン１１０；ローダミン１２３；ローダミン５ＧＬＤ；ローダミン６Ｇ；ローダミンＢ；ローダミンＢ２００；ローダミンＢエクストラ；ローダミンＢＢ；ローダミンＢＧ；ローダミングリーン；ローダミンファリシジン；ローダミンファロイジン；ローダミンレッド；ローダミンＷＴ；ローズベンガル；Ｒ−フィコシアニン；Ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ）；Ｓ６５Ａ；Ｓ６５Ｃ；Ｓ６５Ｌ；Ｓ６５Ｔ；ＳＢＦＩ；セロトニン；セブロンブリリアントレッド２Ｂ；セブロンブリリアントレッド４Ｇ；セブロンブリリアントレッドＢ；セブロンオレンジ；セブロンイエローＬ；ＳＩＴＳ；ＳＩＴＳ（プリムリン）；ＳＩＴＳ（スチルベンイソチオスルホン酸）；ＳＮＡＦＬカルセイン；ＳＮＡＦＬ−１；ＳＮＡＦＬ−２；ＳＮＡＲＦカルセイン；ＳＮＡＲＦ１；ナトリウムグリーン；SpectrumAqua；SpectrumGreen；SpectrumOrange；Spectrum Red；ＳＰＱ（６−メトキシ−Ｎ−（３−スルホプロピル）キノリニウム）；スチルベン；スルホローダミンＢ can Ｃ；スルホローダミンエクストラ；SYTO 11；SYTO 12；SYTO 13；SYTO 14；SYTO 15；SYTO 16；SYTO 17；SYTO 18；SYTO 20；SYTO 21；SYTO 22；SYTO 23；SYTO 24；SYTO 25；SYTO 40；SYTO 41；SYTO 42；SYTO 43；SYTO 44；SYTO45；SYTO 59；SYTO 60；SYTO 61；SYTO 62；SYTO 63；SYTO 64；SYTO 80；SYTO 81；SYTO 82；SYTO 83；SYTO 84；SYTO 85；SYTOX Blue；SYTOX Green；SYTOX Orange；テトラサイクリン；テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）；Texas Red（商標）；Texas Red X（商標）コンジュゲート；チアジカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）；チアジンレッドＲ；チアゾールオレンジ；チオフラビン５；チオフラビンＳ；チオフラビンＴＣＮ；Thiolyte；チオゾールオレンジ；Tinopol CBS（Calcofluor White）；ＴＭＲ；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；TriColor（PE-Cy5）；ＴＲＩＴＣテトラメチルローダミンイソチオシアネート；True Blue；TrueRed；Ultralite；Uranine B；Uvitex SFC；WW 781；Ｘ−ローダミン；ＸＲＩＴＣ；キシレンオレンジ；Ｙ６６Ｆ；Ｙ６６Ｈ；Ｙ６６Ｗ；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1；YOYO-3、Sybr Green、チアゾールオレンジ（相互キレート色素）、またはそれらの組み合わせ。
【０１１１】
代替的に、アクセプター分子は蛍光ナノ結晶であってもよい。ナノ結晶は、蛍光標識としてのいくつかの利点を有機分子と比べて有し、これには例えば、光分解に対する耐性、改善された輝度、非毒性、およびいくつかのプロセスの同時のモニタリングを可能にするサイズ依存性の狭い発光スペクトルを含む。さらに、ナノ結晶の吸収スペクトルは、第１のピークより上で連続しており、すべてのサイズ、したがってすべての色を、単一の励起波長で励起することができる。
【０１１２】
蛍光ナノ結晶は、様々な方法でタンパク質に結合するか、またはこれに「バイオコンジュゲート」することができる。例えば、「量子ドット」の表面キャップは、ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）または両親媒性ポリマーのいずれかからのカルボキシレート基で負に荷電していてもよい。タンパク質は、直接的に、または、正に荷電し組換えタンパク質に融合されたロイシンジッパーペプチドからなる架橋を介して、ＤＨＬＡナノ結晶に静電的にコンジュゲートすることができる。後者は、目的とする標的に対して特異性を有する一次抗体に結合する。代替的に、抗体、ストレプトアビジンまたは他のタンパク質は、ナノ結晶のポリアクリレートキャップに、従来のカルボジイミド化学によって共有結合される。
【０１１３】
セレン化カドミウム、硫化カドミウム、ヒ化インジウム、およびリン化インジウムを含むナノ結晶を生産するコロイド法がある。これらの量子ドットは、量子ドット体積内に、直径が１０〜５０原子のわずか１００〜１００，０００個の原子を含むことができる。いくつかの量子ドットは、大きなバンドギャップを有する別の材料に埋め込まれた、１つの材料の小さな領域である。これらは、例えばコア中にＣｄＳｅ、シェル中&#8203;&#8203;にＺｎＳを有する、いわゆるコア−シェル構造、またはオルモシルと呼ばれる特別な形態のシリカであり得る。逆に、より小さなドットは、より青色（より高いエネルギー）の光を放出する。着色は、量子ドットのエネルギー準位に直接関連する。定量的に言えば、蛍光のエネルギー（したがって色）を決定するバンドギャップエネルギーは、量子ドットのサイズの２乗に反比例する。より大きい量子ドットはより高いエネルギー準位を有し、より密接に配置されている。これにより、量子ドットはより少ないエネルギーを含む光子、すなわちスペクトルの赤色端に近い光子を吸収することが可能となる。
【０１１４】
アクセプター分子はまた、蛍光マイクロスフェアであってもよい。これらは典型的にはポリマーから作製され、ポリマーマトリックスに組み込まれた蛍光分子（例えばフルオレセインＧＦＰまたはＹＦＰ）を含み、様々な試薬にコンジュゲートすることができる。蛍光マイクロスフェアは、内部または表面上で標識することができる。内部標識は、典型的に狭い蛍光発光スペクトルを有する非常に明るく安定な粒子を生成する。内部標識によって、表面基は、リガンド（例えば、タンパク質）をビーズ表面にコンジュゲートさせるために利用可能なままである。内部標識されたビーズは、光退色に対してより大きな耐性を示すので、イメージング用途に広く使用されている。
【０１１５】
カルボキシレート修飾蛍光マイクロスフェアは、水溶性カルボジイミド試薬、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）を用いたタンパク質の共有結合に適している。スルフェート蛍光マイクロスフェアは比較的疎水性であり、ほとんどすべてのタンパク質を受動的にほぼ不可逆的に吸着する。アルデヒド−スルフェート蛍光マイクロスフェアは、表面アルデヒド基を付加するように修飾されたスルフェートマイクロスフェアであり、タンパク質と反応する。
【０１１６】
最後に、アクセプター分子は、発光マイクロスフェアであってもよい。これらは典型的にはポリマーから作製され、ポリマーマトリックスに組み込まれた発光分子（例えば、ユーロピウムまたは白金の錯体）を含み、様々な試薬にコンジュゲートすることができる。
【０１１７】
ＢＲＥＴのための適切な対形成を決定する際に考慮すべき基準は、生物発光ドナー分子と比較した、アクセプター分子の相対的発光／蛍光スペクトルである。生物発光タンパク質の発光スペクトルは、アクセプター分子の吸光度スペクトルと重複しており、そのため生物発光タンパク質発光からの光エネルギーは、アクセプター分子を励起することができ、かつ、２つの分子が互いに対して適切な近接および配向にある場合にアクセプター分子の蛍光を促進するような、波長である。例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ／ＥＧＦＰ対形成は、ウミシイタケルシフェラーゼ／ＥＹＥＦ対形成ほど良好ではないことが、観察可能な発光スペクトルピークに基づき実証されている。
【０１１８】
生物発光タンパク質の発光は、基質に対する改変によって操作することができる。ルシフェラーゼの場合、基質はセレンテラジンである。生物発光タンパク質の発光を変化させる背後にある論拠は、ドナー発光とアクセプター発光の間の分解能を改善することである。元のＢＲＥＴシステムは、ウミシイタケルシフェラーゼをドナーとして、ＥＹＦＰ（またはTopaz）をアクセプターとして、およびセレンテラジン誘導体を基質として用いる。これらの成分をＢＲＥＴアッセイで組み合わせると、最大光は、生物発光タンパク質については４７５〜４８５ｎｍの範囲に、アクセプター分子については５２５〜５３５ｎｍの範囲に生成され、４０〜６０ｎｍのスペクトル分解能が得られる。
【０１１９】
ウミシイタケルシフェラーゼは、ＧＦＰ発光に実質的に重なる広い発光ピークを生成し、これは、システムのシグナル対ノイズの減少に寄与する。様々なセレンテラジン誘導体が当該分野で知られており、これには、ウミシイタケルシフェラーゼ活性の結果として様々な波長（野生型セレンテラジンによって生成されるものとは異なる波長）で光を生成する、coel400aが含まれる。当業者は、ドナーの発光ピークが変化したので、その波長で光を吸収し、それによって効率的なエネルギー移動を可能にするアクセプター分子を選択することが必要であることを理解するであろう。ドナーの発光とアクセプターの光吸収ピークとの間のスペクトルの重なりは、効率的なエネルギー移動のための条件の１つである。クラス３および１のＧＦＰは、４００ｎｍで光を吸収し、５０５〜５１１ｎｍで再発光することが知られている。これは、ドナーとアクセプターの発光の間の波長差として約１１１ｎｍをもたらす。
【０１２０】
生物発光ドナーおよびアクセプター分子の対は、当技術分野で知られており、当業者の十分な範囲内にある。ルミネセンスを生成するドナーの能力および、生物発光ドナータンパク質の活性の結果として放出されたエネルギーを受容し、それを光エネルギーとして再放出するするアクセプターの能力に関する知識に基づいて、または、かかる分子のペア間の励起状態エネルギーの移動、スペクトルの重なり、相対的な向き、およびドナーとアクセプターの間の距離に基づいて、多くの生物発光タンパク質およびアクセプター分子の対が、当業者によって選択され得る。
【０１２１】
本発明はまた、上記のような電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードする核酸を含む発現ベクターにも関する。本発明の核酸またはポリヌクレオチドは、いくつかの市販の発現ベクターに挿入することができる。非限定的な例としては、原核生物プラスミドベクター、例えばｐＵＣ−シリーズ、pBluescript（Stratagene）、ｐＥＴシリーズの発現ベクター（Novagen）またはpCRTOPO（Invitrogen）、および哺乳動物細胞における発現に適合するベクター、例えばpREP（Invitrogen）、pcDNA3（Invitrogen）、pCEP4（Invitrogen）、pMC1neo（Stratagene）、pXT1（Stratagene）、pSG5（Stratagene）、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、pLXIN、pSIR（Clontech）、pIRES-EGFP（Clontech）、pEAK-10（Edge Biosystems）、pTriEx-Hygro（Novagen）およびpCINeo（Promega）が含まれる。Pichia pastorisに適したプラスミドベクターの例は、例えば、プラスミドpAO815、pPIC9KおよびpPIC3.5K（すべてInvitrogen）が含まれる。上記の本発明の核酸またはポリヌクレオチドはまた、他のポリヌクレオチドとの翻訳融合が生じるようにベクターに挿入することもできる。他のポリヌクレオチドは例えば、可溶性を増加させおよび／または融合タンパク質の精製を容易にし得るタンパク質をコードすることができる。非限定的な例には、pET32、pET41、pET43が含まれる。ベクターはまた、正確なタンパク質フォールディングを促進するために、１つ以上のシャペロンをコードする追加の発現可能なポリヌクレオチドを含み得る。適切な細菌発現宿主は、例えば、BL21由来の株（例えばBL21(DE3)、BL21(DE3)PlysS、BL21(DE3)RIL、BL21(DE3)PRARE）またはRosetta（登録商標）である。好ましい態様において、本発明による発現ベクターは、真核宿主細胞を形質転換し、かつ前記ＴＲＰチャネル融合サブユニットの安定なまたは一過性の発現を行うことができるＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり、前記ベクターは、プラスミド、ウイルス様アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）、レンチウイルス、エプスタイン−バー、単純ヘルペス、パピローマ、ポリオーマ、レトロ、ＳＶ４０、ワクシニア、任意のレトロウイルスベクター、インフルエンザウイルスベクター、および裸のＤＮＡを含む他の非ウイルスベクター、またはリポソームを含む。
【０１２２】
一般に、ベクターは、１つ以上の複製起点（ｏｒｉ）およびクローニングまたは発現のための継代システム、宿主における選択のための１つ以上のマーカー、例えば抗生物質耐性、および１つ以上の発現カセットを含むことができる。適切な複製起点（ｏｒｉ）には、例えば、Ｃｏｌ Ｅ１、ＳＶ４０ウイルスおよびＭ１３複製起点が含まれる。ベクターに挿入されたコード配列は、例えば、標準的な方法で合成するか、または天然源から単離する。コード配列の、転写調節エレメントおよび／または他のアミノ酸コード配列へのライゲーションは、確立された方法を用いて行うことができる。原核生物または真核細胞における発現を保証する転写調節エレメント（発現カセットの一部）は、当業者に知られている。これらのエレメントは、転写の開始（例えば、翻訳開始コドン、プロモーター、エンハンサーおよび／またはインスレーター）を確実にする調節配列、および内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および任意に転写の終結および転写産物の安定化を確実にするポリＡシグナルを含む。追加の調節エレメントは、転写および翻訳エンハンサー、および／または天然に関連するまたは異種のプロモーター領域を含み得る。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、かかる発現制御配列に作動可能に連結されて、原核生物または真核細胞における発現を可能にする。ベクターはさらに、さらなる調節エレメントとして、分泌シグナルをコードするヌクレオチド配列を含み得る。かかる配列は、当業者に知られている。さらに、使用される発現系に応じて、発現されたポリペプチドを細胞区画に向けることができるリーダー配列を、本発明のポリヌクレオチドのコード配列に付加することができる。かかるリーダー配列は、当該分野で知られている。
【０１２３】
転写の開始を確実にする調節エレメントの可能性のある例には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ｌａｃＺプロモーター、ヒト伸長因子１αプロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＣａＭ−キナーゼプロモーター、Autographa californica多発性核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）多面体プロモーターまたはＳＶ４０−エンハンサーが含まれる。原核生物における発現のために、例えばｔａｃ−ｌａｃ−プロモーター、ｌａｃＵＶ５またはｔｒｐプロモーターを含む多数のプロモーターが記載されている。原核生物および真核細胞におけるさらなる調節エレメントの例は、ＳＶ４０ポリＡ部位またはｔｋポリＡ部位またはＳＶ４０、ｌａｃＺおよびＡｃＭＮＰＶ多面体ポリアデニル化シグナルなどの転写終結シグナルを、ポリヌクレオチドの下流に含む。
【０１２４】
本発明によれば、チャネル融合サブユニットをコードするヌクレオチド配列は、プロモーターおよび任意にエンハンサーに、作動可能に連結されてもよい。好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、アデノウイルスプロモーター、アデノウイルスＥ１Ａ、熱ショックタンパク質プロモーター、Mycobacteriaの遺伝子およびＲＮＡからのプロモーター、Mycobacterium bovisＭＰＢ７０、ＭＰＢ５９またはＭＰＢ６４抗原プロモーター、バクテリオファージラムダ由来のＰ１プロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、Ｉｐｐプロモーター、ＰＬλプロモーター、ＰＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、β−ラクタマーゼ、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ７プロモーター、メタロチオネインプロモーター、成長ホルモンプロモーター、真核生物プロモーターと原核生物プロモーター間のハイブリッドプロモーター、ユビキチンプロモーター、Ｅ２Ｆ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１／ＤＦ３、α−フェトプロテイン、ｅｒｂ−Ｂ２、界面活性剤、チロシナーゼ、ＰＳＡ、ＴＫ、ｐ２１、ｈＴＥＲＴ、ｈＫＬＫ２、プロバシンまたはサイクリン遺伝子由来プロモーターから選択され得るが、これには限定されず、ここで前記エンハンサーは、前初期エンハンサー、β−アクチン、またはアデノウイルス逆位末端反復配列（ＩＴＲ）から選択される。エンハンサーは、前初期エンハンサー、ｂ−アクチン、アデノウイルス逆位末端反復（ＩＴＲ）などから選択することができる。
【０１２５】
本発明の好ましいベクターは、選択可能マーカーを含む発現ベクターである。選択可能なマーカーの例には、ネオマイシン、アンピシリン、およびヒグロマイシン、カナマイシン耐性などが含まれる。特異的に設計されたベクターは、異なる宿主間、例えば細菌−真菌細胞または細菌−動物細胞（例えば、Invitrogenで入手可能なGateway（登録商標）システム）間で、ＤＮＡのシャトリングを可能にする。
【０１２６】
特に好ましい態様において、電圧依存性カチオンチャネルまたは電圧依存性アニオンチャネルのサブユニットは、２〜２４個の膜貫通ドメインを含む。生物発光タンパク質は、本発明の核酸の膜貫通または非膜貫通ループ（ドメイン）またはＣ末端またはＮ末端のいずれかの一部を形成することができる。アクセプター分子はまた、本発明の核酸の膜貫通または非膜貫通ループ（ドメイン）またはＣ末端またはＮ末端のいずれかの一部を形成することもできる。同じ核酸構築物の一部である場合、アクセプター分子はドナー分子と同じ領域に存在することはできないが、アクセプター分子はドナー分子と同等の領域に存在することができる。例えば、ドナーはＣ末端の一部を形成することができ、一方アクセプター分子はＮ末端の一部を形成することができ、その逆も可能である。別の態様において、ドナーは、サブユニットの膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子は、同じサブユニット内の別の膜貫通ループの一部を形成する。さらに別の態様において、アクセプターまたはドナー分子は、サブユニットの膜貫通ループの一部を形成し、他方は、ＮまたはＣ末端部分を占める。さらに別の態様において、アクセプターまたはアクセプター分子は、サブユニットのいずれかの細胞内ループの一部を形成し、他方は、ＮまたはＣ末端部分を占める。ドナーおよびアクセプターは、同じユニット内の異なる細胞内ループに結合することもできる。さらなる態様において、アクセプターまたはドナー分子はいずれかの膜貫通ループの一部を形成し、他方のメンバーは、細胞内ループのいずれかを占める。
【０１２７】
当業者は、試験核酸内のＮ末端、Ｃ末端、膜貫通ドメイン、非膜貫通ループ（ドメイン）および細胞内ドメインを、容易に決定することができる。例えば、様々なバイオインフォマティクス手法を使用して、核酸またはアミノ酸中の膜貫通ドメイン、非膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの位置およびトポロジーを、その配列および電圧依存性受容体配列の既知ドメインとの類似性に基づき、決定することができる。アラインメントおよび核酸および／またはアミノ酸配列の比較は、例えばＢＬＡＳＴプログラムまたはclustalwプログラムを使用することによって、当技術分野において日常的に行われる。既知の膜貫通ドメインまたは細胞内ドメイン含有核酸および／またはタンパク質とのアラインメントに基づいて、当業者はかかるドメインの位置を予測することが可能である。さらに、多くのかかる受容体の三次元構造は知られており、公的な情報源にカタログ化されている。かかる３Ｄ構造との分析および比較に基づいて、電圧依存性受容体のサブユニットをコードする他のかかる核酸配列における、膜貫通ドメインの位置およびトポロジーを予測することが可能であり得る。タンパク質中の膜貫通ドメインの位置およびトポロジーを予測するために利用可能な多くのプログラムもある。例えば、以下の１つまたは組み合わせを使用してもよい：膜にわたるセグメントを予測するTMpred；膜タンパク質のトポロジーを予測するTopPred；単一および複数の配列から二次構造を予測するPRFDATOR；複数の整列した配列からのタンパク質の膜貫通領域を予測するTMAP；および、単一の配列から膜貫通領域を予測する多くの他のプログラム。
【０１２８】
本発明はさらに、本発明の核酸もしくはポリヌクレオチドまたは本発明のベクターで遺伝子操作された、細胞に関する。前記細胞は、細胞培養物中にあるか、または宿主の一部であり得る。前記細胞または前記宿主は、前記ポリヌクレオチドまたはベクター（単数または複数）を、その／それらの存在下でポリペプチド、すなわち本明細書中上記などの核酸によってコードされる融合サブユニット、の発現を媒介する細胞または宿主に導入することによって、産生され得る。細胞または宿主は、任意の原核生物または真核細胞であってよい。宿主は、任意の原核生物または真核細胞であってよい。適切な真核宿主は、哺乳動物細胞、両生類細胞、魚細胞、昆虫細胞、真菌細胞または植物細胞であってもよい。真核細胞は、Spodoptera frugiperda細胞などの昆虫細胞、Saccharomyces cerevisiaeまたはPichia pastoris細胞などの酵母細胞、Aspergillus細胞などの真菌細胞、または脊椎動物細胞であってもよい。適切な原核生物は、E. coli（例えば、E. coli株HB101、DH5a、XL1Blue、Y1090およびJM101）、Salmonella typhimurium、Serratia marcescens、Burkholderia glumae、Pseudomonas putida、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas stutzeri、Streptomyces lividans、Lactococcus lactis、Mycobacterium smegmatisまたはBacillus subtilisであってよい。
【０１２９】
したがって本発明はまた、上記の電圧依存性イオンチャネルサブユニット融合体の発現のための発現ベクターを含有する組換え宿主細胞であって、前記ベクターが、電圧依存性イオンチャネルサブユニットをコードする核酸配列またはその機能的に同等の活性断片を含むポリヌクレオチドを含む、前記組換え宿主細胞に関する。発現された電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットは、融合タンパク質の形態、例えば生物発光ドナー分子および生物発光アクセプター分子との融合体、であることができる。
【０１３０】
ポリヌクレオチドおよびベクター（例えば、ウイルス性および非ウイルス性）を生産する方法は、当技術分野において知られている。好ましくは、前記ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、または遺伝子工学において従来から使用されている他のベクターである。
【０１３１】
したがって、本発明による組換え宿主細胞は発現ベクターを含み、ここで前記チャネル融合サブユニットが発現され、in vitroおよびin vivoで他のホモマーまたはヘテロマーチャネルサブユニットと共同して機能的融合チャネルを形成することができる。本発明は、本発明による前記組換え細胞を培養し、前記チャネル融合サブユニットを発現させることを含む、上記のようなチャネル融合サブユニットの生産方法を含む。
【０１３２】
本発明による組換え宿主細胞は、好ましくは、安定した系統として存在する。
【０１３３】
本発明はまた、Ｎ末端先端部、Ｃ末端先端部またはループが少なくとも１つの生物発光ドナータンパク質および／または少なくとも１つのアクセプタータンパク質に結合している、本発明の核酸によってコードされる融合サブユニットを提供する。単一のサブユニットの代わりに、２つの異なるサブユニットの一部にドナーおよびアクセプターを組み込むこともまた、当業者の技術範囲内である。
【０１３４】
本発明はさらに、蛍光およびフレームイオン化検出（ＧＣ−ＦＩＤ）を用いたガスクロマトグラフ技術などの既存の化学的検出システムより感受性の高い、無細胞組成物および生細胞アッセイに関する。本発明は、試料中の化合物を検出するための方法および核酸に関する。特に、本発明は、少なくとも１つの生物発光ドナー分子をコードするヌクレオチド配列と組み合わさったか、またはこれに結合した、および／または少なくとも１つの蛍光アクセプター分子をコードするヌクレオチド配列に結合した、少なくとも１つの電圧依存性イオンチャネルサブユニットを含む無細胞または全細胞組成物の使用に関する。
【０１３５】
本発明によれば、無細胞組成物は、上記のような電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットまたは機能性融合チャネルを含み、該融合サブユニットは、脂質二重層、好ましくはリポソームの二重層に包埋されている。かかる脂質二重層は、典型的には両親媒性であり、共通の疎水性二重層内部および２つの親水性表面を有する、２つの層を含む。脂質二重層は、天然または人工であり得る。かかる脂質二重層は、例えば哺乳動物または酵母細胞膜由来の細胞または生体膜であり、その中に電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットが挿入されている。
【０１３６】
無細胞組成物を細胞から調製する方法は当技術分野で知られており、上記のように組換え細胞を得ること、および細胞の膜を破壊することからなる。これらの方法は一般に、次の繰り返しのサイクルを含む：凍結および解凍、粉砕、超音波装置での超音波による細胞の処理、均質化、およびフレンチプレスの使用、洗浄剤および／または酵素の添加、ガラスビーズ溶解、分画遠心分離、および様々な勾配媒体を用いたいくつかの密度勾配法。これらの技術は、とりわけ”Current Protocols in Protein Science”; John E. Caligan; Ben M Dunn; Hidde L. Ploegh; David W Speicher; Paul T. Wingfield; Wiley and Sonsに詳細に記載されている。細胞膜抽出物を単離または調製するために、これらの方法の組合せが通常用いられる。一般に、細胞は機械的手段、または洗浄剤の使用のいずれかによって溶解され、膜画分は分画遠心分離によって単離される。本発明による組換え細胞を含有するリポソームは、タンパク質を発現する細胞のリン脂質膜を、水中で例えば超音波処理によって破壊することにより、生成することができる。リン脂質は、水溶液のコアを含むリポソーム球に再集合するであろう。低いせん断速度は、多くの層を有する多層リポソームを生成する。継続的な高せん断超音波処理は、より小さな単層リポソームを形成し、本発明の適用により適している。
【０１３７】
ＢＲＥＴのアッセイ
【０１３８】
好ましい態様において、生物発光タンパク質とアクセプター分子の間で生じるエネルギー移動は、特定の波長を選択する光学フィルター（１つはアクセプター分子発光用、もう一つは生物発光タンパク質発光用）を用いて測定した発光から計算された比により表される（式１参照）。
【０１３９】
式１：Ｅａ／Ｅｄ＝ＢＲＥＴ比（１）、式中、Ｅａはアクセプター分子発光強度として定義され（発光された光は、アクセプターの発光に適合した特定のフィルターを用いて選択される）、Ｅｄは生物発光タンパク質発光強度として定義される（発光された光は、生物発光タンパク質の発光に適合した特定のフィルターを用いて選択される）。
【０１４０】
当業者は、光学フィルターが、ＢＲＥＴに適した波長弁別を可能にする任意の種類のフィルターであってよいことを容易に理解すべきである。例えば、本発明に従って使用される光学フィルターは、干渉フィルター、ロングパスフィルター、ショートパスフィルターなどであってもよい。フィルターを通過する波長の強度（通常、１秒当たりのカウント数（ＣＰＳ）または相対発光単位（ＲＬＵ））は、光電子増倍管（ＰＭＴ）またはＣＣＤカメラを使用して定量化することができる。定量化されたシグナルは次に、ＢＲＥＴ比を計算するために使用され、エネルギー移動効率を表す。ＢＲＥＴ比は、アクセプター発光の強度の増加とともに増加する。
【０１４１】
一般に、アクセプター発光強度のドナー発光強度に対する比が決定され（式１参照）、これは、エネルギー移動効率を反映する任意単位で表される数値である。この比率は、エネルギー移動効率の増加とともに増加する。
【０１４２】
エネルギー移動効率はまた、ドナー発光強度のアクセプター発光強度に対する逆比を用いて表すことができる（式２参照）。この場合、比は、エネルギー移動効率の増加とともに減少する。この計算を実行する前に、発光強度を、バックグラウンド光の存在および基質の自動発光について補正する。この補正は一般に、適切な波長で測定した発光強度を、基質を含有するが本発明の生物発光タンパク質、アクセプター分子またはポリペプチドを含まない対照試料から差し引くことにより、行われる。
【０１４３】
式２：Ｅｄ／Ｅａ＝ＢＲＥＴ比（２）、式中ＥａおよびＥｄは、上で定義した通りである。
【０１４４】
生物発光タンパク質およびアクセプター分子の発光の光強度はまた、分光蛍光光度計、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラまたはダイオードアレイ検出器などのモノクロメーターベースの機器を用いて定量することもできる。分光蛍光光度計を使用して、生物発光タンパク質とアクセプター分子の発光ピークの両方が基質の添加時に検出されるように、発光スキャンを行う。ピークの下の面積は相対的な光強度を表し、上記のように比を計算するために使用される。同じ試料から生物発光タンパク質およびアクセプター分子についての光を測定することができる任意の機器を使用して、本発明のＢＲＥＴシステムをモニターすることができる。
【０１４５】
代替の態様において、エネルギー移動効率は、測定に１つの光学フィルターのみを必要とするレシオメトリック測定を用いて表される。この場合、ドナーまたはアクセプターの光強度は適切な光学フィルターを用いて決定され、試料の別の測定が、フィルターを使用せずに行われる（オープンスペクトルの強度）。この後者の測定では、全光出力（全波長に対して）が定量化される。次に比の計算が、式３または式４のいずれかを使用して行われる。式３については、アクセプター用の光学フィルターのみが必要である。式４については、ドナー用の光学フィルターのみが必要である。
【０１４６】
式３：Ｅａ／Ｅｏ−Ｅａ＝ＢＲＥＴ比、または＝Ｅｏ−Ｅａ／Ｅａ（３）
【０１４７】
式４：Ｅｏ−Ｅｄ／Ｅｄ＝ＢＲＥＴ比、または＝Ｅｄ／Ｅｏ−Ｅｄ（４）、式中、ＥａおよびＥｄは上記で定義した通りであり、Ｅｏは、すべての波長を合わせた発光強度として定義される（オープンスペクトル）。
【０１４８】
さらなる式を式１〜４から導き得ることは、当業者には容易に明らかであろう。例えば、かかる誘導の１つは、生物発光タンパク質および／またはアクセプター分子の発光波長に存在するバックグラウンド光を補正することを含む。
【０１４９】
ＢＲＥＴアッセイを実施する際、発光は、当業者に知られている任意の適切な機器を用いて、各ウェルから決定することができる。ＢＲＥＴ測定は、例えば、少なくともアクセプター分子の発光を、好ましくは２つの波長（アクセプター分子および生物発光タンパク質について）以上を検出できるリーダーを用いて、行うことができる。
【０１５０】
本発明の一態様において、ＢＲＥＴは、マイクロ流体装置を用いて検出される。マイクロ流体装置は、試料のアリコートのみを、一般的には約５０μＬ以下を、マイクロ流体装置のサンプルリザーバに移すために都合よく必要とする。これは、手動または、注射器、キャピラリーなどによる空気注入によって行われる。
【０１５１】
マイクロ流体を使用する自動発光バイオチップデバイスを使用して、必要なすべてのＢＲＥＴ反応工程を実施することができる。マイクロ流体バイオチッププラットフォームにおけるＢＲＥＴ反応を自動化することは、これが複数の手動操作工程を回避し、実験を行う上での人間の時間と労力を低減するので、望ましい。マイクロ流体装置は、複数の試料、試薬、および基質を保存するための保存手段を有する、パターン化されたマイクロチャネルおよびコンパートメントを備えた自己完結型の使い捨てバイオチップを含むことができる。試料または試薬の少なくとも１つ、および次に発光基質を、コンパートメントからマイクロチャネルを通って反応部位へと連続的に移す工程を、自動化することができる。次いで、発光基質をドナー分子と反応させてルミネセンスを生じさせ、これは光検出器によって検出される。ルミネセンスを検出するためのマイクロ流体装置の例は、US 6,949,377に記載されている。
【０１５２】
本発明はさらに、電圧依存性イオンチャネルのアゴニストまたはアンタゴニストを、リアルタイムでスクリーニングする方法に関する。
【０１５３】
組換えＤＮＡ技術を使用して、電圧依存性イオンチャネルサブユニット、例えば表１〜１１に列挙されたチャネルのいずれか、をコードする核酸を単離する。標準的な組換えＤＮＡプロトコルを使用して、核酸をコードする核酸を、少なくとも１つの生物発光または蛍光ドナー分子をコードするヌクレオチド配列に結合した核酸、および／または少なくとも１つの蛍光アクセプター分子をコードするヌクレオチド配列に結合した核酸の、インフレーム融合物の発現を促進する任意のプラスミドに、クローン化する。現在知られているか、または将来発見される任意の手段を用いて、発現構築物を、宿主細胞に同時導入する。宿主細胞を、既知の培養方法を用いて増殖させ、融合タンパク質を組換え宿主細胞中で同時発現させる。
【０１５４】
アゴニスト活性を検出するために、トランスフェクトされた細胞の試料を９６ウェルプレート（Costar 3912）に添加することができる。様々な濃度の既知のアゴニストまたは試験化合物を、細胞試料と共にウェルに添加する。例えば約２０分の短いインキュベーション期間の後、ＢＲＥＴ反応を、細胞試料をＢＲＥＴを誘発する適切な刺激に供することにより、開始させる。刺激は、例えば、基質の添加、温度の上昇、および高周波の照射から選択することができる。当業者は、刺激を電圧依存性イオンチャネル、ドナー分子および／または蛍光アクセプター分子に適合させることができる。様々な波長における光の発光は、Mithras LB940プレートリーダー（Berthold, Germany）または同様の能力を有する機器で測定する。例えば、ＢＲＥＴ最適化フィルター（Berthold, Germany）を使用して、３９５ｎｍでのルシフェラーゼ発光および５１０ｎｍ波長での蛍光発光を検出する。発光は、それぞれ１秒間測定する。ＢＲＥＴアッセイからのデータは、Prism 4.0ソフトウェア（GraphPad Software, Dan Diego, Calif., USA）を使用し、式：Ｒ＝Ｄ＋（Ａ−Ｄ）／（１＋（ｘ／ｃ））、式中、Ａ＝最小応答、Ｄ＝最大応答、およびｃ＝ＥＣ５０（Ｒ＝応答、ｘ＝リガンド濃度）にあてはめる。３つのウェルからの読み取り値を用いて、各データ点を生成する。試験化合物で処理した細胞のデータ点を、既知のアゴニストまたはアンタゴニストで処理していない細胞のデータ点と比較する。ＢＲＥＴシグナルと、未処理細胞または既知のアゴニストまたはアンタゴニストで処理した細胞との比較を使用して、試験化合物をリガンドとして特徴付け、またリガンドが電圧依存性イオンチャネルサブユニットのアゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストであるかどうかを特徴付ける。
【０１５５】
アンタゴニスト活性を検出するために、トランスフェクトした細胞の試料を９６ウェルプレートに加える。既知のアゴニストを細胞に添加し、細胞を１０分間などの時間、インキュベートする。既知のアゴニストとのインキュベーションの後、様々な濃度の既知のアンタゴニストまたは試験化合物を、細胞試料に添加する。細胞を、既知のアンタゴニストまたは試験化合物と共に、例えば１０分間インキュベートする。例えば約２０分の短いインキュベーション期間の後、ＢＲＥＴ反応を、細胞試料をＢＲＥＴを誘発する適切な刺激に供することにより、開始させる。刺激は、例えば、基質の添加、温度の上昇、および高周波の照射から選択することができる。当業者は、刺激を電圧依存性イオンチャネル、ドナー分子および／または蛍光アクセプター分子に適合させることができる。様々な波長における光の発光は、Mithras LB940プレートリーダー（Berthold, Germany）または同様の能力を有する機器で測定する。例えば、ＢＲＥＴ最適化フィルター（Berthold, Germany）を使用して、３９５ｎｍでのルシフェラーゼ発光および５１０ｎｍ波長での蛍光発光を検出する。発光は、それぞれ１秒間測定する。ＢＲＴ ＢＲＥＴアッセイからのデータは、Prism 4.0ソフトウェア（GraphPad Software, Dan Diego, Calif., USA）を使用し、式：Ｒ＝Ｄ＋（Ａ−Ｄ）／（１＋（ｘ／ｃ））、式中、Ａ＝最小応答、Ｄ＝最大応答、およびｃ＝ＥＣ５０（Ｒ＝応答、ｘ＝リガンド濃度）にあてはめる。３つのウェルからの読み取り値を用いて、各データ点を生成する。試験化合物で処理した細胞のデータ点を、既知のアゴニストで処理していない細胞のデータ点と比較する。ＢＲＥＴシグナルと、未処理細胞または既知のアゴニストで処理した細胞との比較を使用して、試験化合物をリガンドとして特徴付け、またリガンドが、電圧依存性イオンチャネルサブユニットまたはより具体的にはＴＲＰチャネルのアンタゴニストであるかどうかを特徴付ける。
【０１５６】
本発明は、チャネルを活性化または阻害することができる化合物候補をリアルタイムでスクリーニングする方法であって、（ｉ）候補を本発明の組換え宿主細胞と、または本発明の無細胞組成物と接触させること、（ｉｉ）生物発光ドナー分子の基質を提供すること；（ｉｉｉ）ＢＲＥＴシグナルの変動を測定すること、を含む前記方法を提供する。
【０１５７】
さらなる態様において、本発明は、本発明の核酸またはポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の組換え細胞または宿主、または本発明の無細胞組成物または組成物、および／または本発明のバイオセンサーを含む、電圧依存性イオンチャネルのアゴニストまたは阻害剤化合物候補をスクリーニングするためのキットを提供する。
【０１５８】
本発明は、電圧依存性イオンチャネルに対するアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る、多種多様な化合物を検出するために使用することができる。この目的のために、本発明はまた、生物学的成分と物理化学的検出器成分とを組み合わせた、バイオセンサーまたは検体の検出のための装置を提供する。これは典型的には３つの部分からなり、第１は、電圧依存性イオンチャネルサブユニットをコードする少なくとも１つのヌクレオチドサブユニットである。第２はトランスデューサまたは検出器エレメントであり、これは、物理化学的様式（例えば、光学的、電気化学的）で働き、化合物の試験物質との相互作用から生じるシグナルを、より容易に測定し定量化することができる別のシグナルに変換する（すなわちトランスデューサ）。第３は、関連付けられた電子またはシグナルプロセッサであり、これは相互作用の結果をユーザーフレンドリーな方法で表示する。本発明は、試験化合物が電圧依存性イオンチャネルのリガンドとして機能するかどうかを評価する方法を提供し、この方法は、（ｉ）少なくとも１つの生物発光ドナー分子をコードするヌクレオチド配列に結合した、および／または少なくとも１つのアクセプター分子をコードするヌクレオチド配列に結合した電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む細胞を、提供すること；（ｉｉ）前記細胞を、試験化合物と接触させること；および（ｉｉｉ）得られた反応または相互作用および出力を決定すること、を含む。本発明はまた、少なくとも１つの生物発光ドナー分子をコードするヌクレオチド配列に結合した、および／または少なくとも１つのアクセプター分子をコードするヌクレオチド配列に結合した電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む、バイオセンサーを提供する。さらに、本発明は、少なくとも１つの生物発光ドナー分子をコードするヌクレオチド配列に結合した、および／または少なくとも１つのアクセプター分子をコードするヌクレオチド配列に結合した電圧依存性イオンチャネル融合サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む、生物発光共鳴エネルギー移動システムを提供する。
【０１５９】
別の態様において、本発明によるスクリーニング方法は、創薬および／または薬物の開発に使用される。また、本発明の範囲内で企図されるのは、医薬組成物を製造する方法であって、（ｉ）本発明による方法を実施すること、（ｉｉ）電位依存性イオンチャネルと相互作用する試験化合物を同定すること；および（ｉｉｉ）前記試験化合物を、薬学的に許容し得る担体と組み合わせること、を含む、前記方法である。
【０１６０】
本発明の融合サブユニットはさらに、温度および／または高周波のチャネルへの影響などの、チャネルのモジュレーター（阻害剤またはアクチベーター）の作用以外の別の刺激の効果を研究するために、有用であり得る。実際に、ＢＲＥＴ発光を誘発する融合チャネルサブユニットの立体配座変化は、該チャネルをそのモジュレーターと接触させることによって、または該チャネルを別の刺激、例えば温度の上昇または高周波の照射などを供することによって、生じ得る。
【０１６１】
本出願を通して種々の参考文献が参照され、これらの刊行物の開示はその全体が参照により本出願に組み込まれて、本発明が関連する技術の状態をさらに完全に記述する。
【実施例】
【０１６２】
例１
例１．１：生細胞上のＴＲＰチャネル活性化をリアルタイムで分析する方法
ＴＲＰＶ１およびＴＲＰＶ３などの電圧依存性イオンチャネルを用いて、特異的アゴニストおよび温度上昇の、ＴＲＰチャネル活性化に対する効果を調べた。例えば、ＴＲＰＶ１の薬理学は十分に特徴づけられており、その様々な特異的アンタゴニストが市販されている。一方、ＴＲＰＶ１は研究されており、４３℃で開くことが知られている。
【０１６３】
２つの方法を使用した。使用した第１の方法は、ＴＲＰなどのチャネルの活性化を評価する直接的な方法であった。この方法は、Ｎ末端およびＣ末端がＹＦＰおよびルシフェラーゼにそれぞれ融合した電圧依存性イオンチャネルＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ３またはＴＲＰＶ４からのＢＲＥＴシグナルを測定することからなる（図３）。例えばアゴニスト曝露または細胞培養温度上昇後のチャネルの活性化は、モノマーサブユニットの立体配座の変化をもたらし、その結果、チャネルのＮ末端およびＣ末端におけるドナーおよびアクセプター分子の距離および配向のいずれかまたは両方が改変される。別の方法は、２つの電圧依存性イオンチャネルサブユニットからのＢＲＥＴシグナルを測定することからなり、各サブユニットは、各モノマー末端先端部の１つにおいてＹＦＰまたはルシフェラーゼのいずれかに融合されている。
【０１６４】
例１．２：発現ベクターの構築
発現ベクターを、分子内プローブＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ１−ＲＬｕｃおよびＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ３−ＲＬｕｃを用いて構築し、ここで、ヒトチャネルサブユニットＴＲＰＶ１およびＴＲＰＶ３（ｈＴＲＰＶ１、ｈＴＲＰＶ３）のタンパク質配列を、図４に示す戦略に従って、３’のウミシイタケルシフェラーゼと５’のＹＦＰの間に挿入した。
【０１６５】
構築物ＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ１−ＲＬｕｃおよびＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ３−ＲＬｕｃは、ｈＴＲＰＶ１およびｈＴＲＰＶ３ ｃＤＮＡをＰＣＲを介して増幅することにより、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＹＦＰ−ＲＬｕｃベクター中のＹＦＰおよびＲＬｕｃの配列間のアンプリコンの融合を可能にする特異的プライマーを用いて得られた（図４）。ｈＴＲＰＶ１およびｈＴＲＰＶ３をコードするｃＤＮＡをマトリックスとして使用し、これはデータベースPlasmID（Harvard Medical School、U.S.A）から提供された。ｈＴＲＰＶ１およびｈＴＲＰＶ３をＰＣＲにより増幅するために使用されたセンスおよびアンチセンスプライマー配列は、以下の通りである：
ｈＴＲＰＶ１センス（Ｓ）：配列番号１
5’TGTGTACCGGTGAATTCTGGTGGAGGCGGATCTATGAAGAAATGGAGCAGCACAGACT-3’
ｈＴＲＰＶ１アンチセンス（ＡＳ）： 配列番号２
5’CACCAGAATTCACCGGTACCTTCTCCCCGGAAGCGGCAGGACTC-3’
ｈＴＲＰＶ３センス（Ｓ）：配列番号３
5’TGTGTACCGGTGAATTCTGGTGGAGGCGGATCTATGAAAGCCCACCCCAAGGAGATGG-3’
ｈＴＲＰＶ３アンチセンス：配列番号４
5’CACCAGAATTCACCGGTACCACCGAGGTTTCCGGGAATTCCTCG-3’
ｈＴＲＰＭ２融合ＡＳ：配列番号５
5’ CACCAGAATTCACCGGTACGTAGTGAGCCCCGAACTCAGCGGC- 3’
融合ｈＴＲＰＭ２ Ｓ：配列番号６ 
5’TGTGTACCGGTGAATTCTGGTGGAGGCGGATCTATGGAGCCCTCAGCCCTGAGGAAAGC- 3’
ｈＴＲＰＶ４融合ＡＳ：配列番号７
5’CACCAGAATTCACCGGTACGAGCGGGGCGTCATCAGTCCTCCACTTGCG- 3’
融合ｈＴＲＰＶ４ Ｓ：配列番号８
5’TGTGTACCGGTGAATTCTGGTGGAGGCGGATCTATGGCGGATTCCAGCGAAGGCCCCCG- 3’
ＹＦＰセンス：配列番号９
5’-TGTCTAAGCTTGGATCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACC-3’
【０１６６】
上記プライマーを用いたところ、融合チャネルサブユニットのＹＦＰをｈＴＲＰＶ１／３にＮ末端で連結し、ｈＴＲＰＶ１／３をＲＬｕｃにＣ末端で連結する領域のアミノ酸配列は、ＶＰＶＮＳＧＧＧＳであった（配列番号１０）。
【０１６７】
ＰＣＲ反応を、１μＭの各プライマー、２５０μＭのｄＮＴＰ、５μｌのＰＣＲ緩衝液Phusion HF II 10X（Thermoscientific）、５％ＤＭＳＯ、１ＵのPhusion酵素HF II 10X（Thermoscientific）、および２５ｎｇのマトリックスＤＮＡを含む緩衝液中、５０μｌの容量で行った。ＰＣＲは、サーモサイクラー（Rotor Gene Q, Qiagen）において、以下の表１３に記載のプログラムに従って行った。
【０１６８】
【表１３】
2018504917.tif 000035
【０１６９】
次いでＰＣＲ産物を、アガロースゲル上でQIAquick Gel Extractionキット（Qiagen）を用いて精製した。次にＰＣＲ産物およびベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＹＦＰ−ＲＬｕｃを、ｈＴＲＰＶ１のクローニングのためのＡｇｅＩ酵素によって、またはｈＴＲＰＶ３クローニングの場合のＥｃｏＲＩ酵素のいずれかによって消化した。ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＹＦＰ−ＲＬｕｃも、ホスファターゼアルカリ酵素（Thermoscientific）を用いて脱リン酸化した。次いで、ＤＮＡを調製し、QIAquickＰＣＲ精製キット（Qiagen）を用いてカラムで精製し、さらにゲルで定量した。オープンベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＹＦＰ−ＲＬｕｃ内の制限部位でのＰＣＲのアンプリコンのライゲーションを、５０ｎｇのオープンベクターを２０ｎｇ〜１００ｎｇ挿入物（３：１以上のモル比）で、１．２ｍＭのＡＴＰと１ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Thermoscientific）を含む１２μｌのライゲーションバッファー１Ｘ（Thermoscientific）中、２３℃で２時間インキュベートすることにより、実施した。次にライゲーション混合物を使用して、熱衝撃によって大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。１００μｌのコンピテントＤＨ５α細菌を、１２μｌのライゲーション混合物の存在下、氷上で１時間インキュベートした。次いで、細菌を４２℃に２０秒間置いた後、氷上に２分間戻した。次いで、５００μｌのLuria-Bertani培地（ＬＢ）（Fischer Scientific）を添加した後、２００ＲＰＭ、３７℃で１時間攪拌し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ−寒天ボックス上に広げ、形質転換に成功した細菌を選択した。
【０１７０】
ＹＦＰとｈＲＬｕｃとの間への配列ｈＴＲＰＶ１／３の挿入は、配向されていなかった。したがってコロニーをさらにスクリーニングして、正しい配向の挿入物ｈＴＲＰＶ１／３を含むものを選択する必要があった。これは、ＰＣＲ技術を用いて、ＹＦＰのコード配列の５’にハイブリダイズすることができる「センス」プライマーを使用し、ｈＴＲＰＶ１／３の非コード配列の５’にハイブリダイズするアンチセンスプライマーを使用して行った。この解析的ＰＣＲプロトコルは上記のＰＣＲと同様であったが、ただし、細菌を破壊しプラスミドＤＮＡを放出させる、９５℃で５分間の初期変性工程を有するＰＣＲの３０サイクル中に使用したDream Taqポリメラーゼ（Thermoscientific）を除く。ＹＦＰと同相でｈＴＲＰＶ１／３のｃＤＮＡを含有するコロニーは、増幅のみを可能にした。こうして陽性クローンを、１００ｍｌのＬＢ培地で培養する（１６時間、３７℃）。プラスミドＤＮＡを、細菌のアルカリ溶解およびmidiprepキット（Qiagen）を用いた精製により調製する。こうして得たＤＮＡを次に、シークエンシングにより二重チェックした。
【０１７１】
同じプロトコルを使用して、ｈＴＲＰＶ４およびｈＴＲＰＭ２配列をそれぞれ含む発現ベクターを構築することに成功した。
【０１７２】
例１．３：細胞培養およびトランスフェクション
腎臓胚細胞に由来するヒト細胞系HEK293Tを、この実験のために選択した。これらの細胞を、GLUTAmax（Invitrogen）、１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシン（Invitrogen）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Invitrogen）を含有するＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）で培養した。これらの細胞を、トランスフェクションの日に培養フラスコＴ２５またはＴ７５中に７０〜９０％コンフルエンスまで置いた。一過性トランスフェクションは、４：１のＰＥＩ：ＤＮＡ比のOpti-MEM培地（Invitrogen）中のポリエチレンイミン（線状ＰＥＩ、Polysciences, Inc., Warrington, USA）を用いて行った。Ｔ７５フラスコ中で培養された細胞のトランスフェクションには、１μｇ／μｌのＰＥＩ６０μｌを添加した７００μｌのOpti-MEM培地（５分間、ＲＴ）中、１５μｇの全ＤＮＡが必要であった。混合物を５秒間ボルテックスし、室温で２０分間インキュベートした後、細胞培養物に添加した。翌日、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ１％を用いて収集し、用量反応実験のために９６ウェルプラーク（１×１０５細胞／ウェル）、またはその他の実験のために直径１２ｍｍのガラススライドを含む２４ウェルプラーク（１×１０６細胞／ウェル）のいずれかで、２４時間培養した。両方の種類の支持体を、Ｌ−ポリリジン（Sigma）で処理した。
【０１７３】
例１．４：細胞内カルシウムのFura 2-AMによる測定
HEK293T細胞を、野生型ＴＲＰＶ１またはＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ１−ｒＬｕｃをコードするＤＮＡでトランスフェクトした。２４時間後、１５０，０００個の細胞を、９６ウェルプレートのＤＭＥＭ培地に播種する。さらに２４時間、培地を、２μＭのFura 2-AM（Tocris）および０．０２％のプルロニック酸（pluronic acid）を含むＨＢＳＳ緩衝液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、４．２ｍＭのＫＣｌ、０．４ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４ｍＭのＭｇＳＯ４、１ｍＭのＣａＣｌ２、２０ｍＭのHepes、５ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）に交換して、細胞を３７℃で１時間、光刺激なしでインキュベートした。蛍光シグナルの読み取りは、３７℃で予熱した多機能性のFlexstation IIIプラークリーダー（Molecular device）を用いて行った。光シグナルを、プローブを３４０ｎｍおよび３８０ｎｍで連続的に励起した後、５０５ｎｍで１秒間積分した。１００秒の読み取り後、１μＭのカプサイシンを細胞培地に添加した。図７Ａに示された結果は、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍでの励起中に、５０５ｎｍで得られた光強度の比を示す（Ｉ３４０／Ｉ３８０）。
【０１７４】
同じプロトコルを、野生型ＴＲＰＶ３またはＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ３−ｒＬｕｃで同様にトランスフェクトした細胞内の細胞内カルシウムを測定するために、首尾よく使用した。
【０１７５】
例１．５：ＢＲＥＴシグナルの測定
用量反応実験におけるＢＲＥＴシグナルの読み取りは、９６個の不透明ウェルプレートにおいて、３７℃で予熱された多機能性Flexstation IIIプラークリーダー（Molecular device）を用いて実現された。トランスフェクションの３６〜４８時間後、細胞培地を、０．２％ＢＳＡおよび様々な濃度のカプサイシンリガンド（Tocris）を含有するＰＢＳと交換した。３７℃で５分間インキュベートした後、基質であるセレンテラジンＨ（Nanolight Technology）を最終濃度５μＭになるように添加し、光シグナルを４８０ｎｍおよび５３０ｎｍ（すなわち、それぞれルシフェラーゼおよびＹＦＰの発光の波長）で順番に１秒間積分した。３回目の読み取りは、装置のバックグラウンドシグナルを測定するために３００ｎｍで行った。生のＢＲＥＴシグナルは、以下の式によって算出した：
【０１７６】
ＢＲＥＴ＝（Ｉ５３０−１３００）／（Ｉ４８０−１３００）；式中、Ｉは所与の波長で得られた光強度である。
【０１７７】
次にＢＲＥＴシグナルを、タンパク質ＴＲＰＶ１−ｒＬｕｃがＹＦＰの不在下で発現された場合にルシフェラーゼの発光の間に得られたＢＲＥＴシグナルを除去することによって補正した。
【０１７８】
例１．６：データの分析
温度の変動およびFura 2-AMプローブで得られたＢＲＥＴの結果は、Excel（Microsoft）で分析した。用量反応実験で得られた結果を、GraphPad Prism Software v6.00（GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, USA）を用いて分析した。
【０１７９】
例２：分子内ＢＲＥＴプローブを用いた電圧依存性カチオンチャネルの活性化／阻害の直接測定法
ＴＲＰＶ１などのファミリーＴＲＰＶ（バニロイド）チャネルの、電圧依存性カチオンチャネル融合サブユニットの活性化／阻害を、温度または化学的モジュレーターによって研究するために、最初に発現ベクターを、融合チャネルサブユニットをコードするように構築し、ここでＴＲＰＶ１の配列は、Ｎ末端ＹＦＰ融合サブユニットとＣ末端ＲＬｕｃ融合サブユニットの間にはさむように取り込まれている。
【０１８０】
例２．１：分子内ＴＲＰＶ１ ＢＲＥＴプローブの特徴付け
分子内ＢＲＥＴプローブの挙動、すなわち温度に対するＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ１−ｒＬｕｃを調査するために、HEK293T細胞を、融合サブユニットをコードする発現ベクターを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をペルチェサーモスタットで２９℃から５０℃まで徐々に加熱し、ＢＲＥＴシグナルを既知の技術を用いて測定した。
【０１８１】
結果を分析すると、ＢＲＥＴ比は２９℃〜３４℃の間で変化せず、３４℃〜４３℃の間でわずかに増加したことが示された。４３℃を超えると、ＢＲＥＴ値の重要な低下が観察された（図５）。４３℃の温度は、ＴＲＰＶ１チャネルの開口閾値に相当した（Clapham, 2003 Nature 426, 517-524）。
【０１８２】
次いで、同じ細胞をＴＲＰＶ１の２つのアンタゴニスト、すなわち、６ヨードＣＡＰＳおよび２，２−ジフェニルテトラヒドロフランとプレインキュベートして、プローブＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ１−Ｌｕｃの正味のＢＲＥＴの初期値を改変した。２９．５℃で最初に測定された正味のＢＲＥＴの比は、対照条件下では０．４３であり、６ヨードＣＡＰＳの存在下では０．２８であり、２，２−ジフェニルテトラヒドロフランの存在下では０．９３であった。最初のＢＲＥＴレベルのこれらの重要な変化は、ＴＲＰＶ１チャネルの立体配座状態が、より低い温度感受性を有する状態に変化したことを反映していた可能性がある。この仮説によれば、６ヨードＣＡＰＳまたは２，２−ジフェニルテトラヒドロフランの存在下での温度の変化により、プローブの全く異なる挙動が観察された。どちらの場合も、ＢＲＥＴシグナルは３２〜３７℃で増加し、２，２−ジフェニルテトラヒドロフランの場合は５２℃で安定し、６ヨードＣＡＰＳでは４８℃から減少した（図５）。
【０１８３】
プローブＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ１−ｒＬｕｃの化学的アクチベーターに対する感度も評価した。ＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ１−ｒＬｕｃ融合タンパク質を発現するHEK293T細胞におけるＢＲＥＴシグナルを、異なる濃度のカプサイシンの存在下での細胞のインキュベーション後に測定した。ＢＲＥＴシグナルは、カプサイシンの濃度の関数であり、それにより、比の有意な増加を６５０±３３ｎＭのＥＣ５０で示し（図６）、これはカプサイシンのプローブに対する効果を示す。この場合、初期ＢＲＥＴシグナルの比は約０．２８であったが、これは異なる装置システムで実施されたので、前の実験で得られた値と比較することはできなかった。予想通り、ＡＭＧ５１７またはカプサゼピンなどの既知のｈＴＲＰＶ１アンタゴニストは、カプサイシン用量反応曲線の右シフトを誘発し、これは、これらの分子がカプサイシンによりＴＲＰＶ１活性化閾値を低下させるという概念と一致する（図６）。
【０１８４】
融合サブユニットチャネルＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ１−ｒＬｕｃの機能性を、野生型チャネルの機能性と比較した。カルシウム流を、プローブＢＲＥＴ ＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ１−ｒＬｕｃまたは野生型ＴＲＰＶ１のいずれかを発現するHEK293T細胞で、１μＭのアゴニストカプサイシンを添加した後に測定した。我々は、ＹＦＰの励起スペクトルに適合するスペクトル特性を有する放射測定プローブFura 2-AMを使用した。カプサイシンの添加は、野生型ＴＲＰＶ１を発現する細胞ならびに同様の運動および振幅を有するＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ１−ｒＬｕｃを発現する細胞において、細胞内カルシウムの迅速かつ重要な増加をもたらした（図７Ａ）。カプサイシン添加後に空ベクターでトランスフェクトしたHEK293T細胞では、カルシウムの増加は測定されず（図７Ｂ）、図７Ａで測定されたシグナルは、ＴＲＰＶ１の異所性発現に依存することが確認された。
【０１８５】
例２．２：分子内ＴＲＰＶ３ ＢＲＥＴプローブの特徴付け
プローブＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ３−ｒＬｕｃの、化学的アクチベーターに対する感受性を評価した。ＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ３−ｒＬｕｃ融合タンパク質を発現するHEK293T細胞におけるＢＲＥＴシグナルの発生の動態を、３３℃で測定した。規定の時間に、２−アミノエチルジフェニルボリナート（２−ＡＰＢ）などのＴＲＰＶ３アクチベーターを培地中に加え、数秒以内にＢＲＥＴ値の増加を生じさせた（図８）。
【０１８６】
例３：分子間ＢＲＥＴプローブを用いた電位依存性カチオンチャネルの活性化／阻害の直接測定法
例３．１：分子間ＴＲＰＶ１ ＢＲＥＴプローブの特徴付け
ＲＬｕｃがＴＲＰＶ１サブユニットのＣ末端部分に融合され、かつＹＦＰがカルモジュリン（これはＴＲＰＶチャネルにカルシウム依存的に結合することが知られている）に融合された、分子間ＴＲＰＶ１ ＢＲＥＴプローブを使用した（図９Ｂ）。したがってかかる分子間プローブは、細胞内での活性化およびカルシウム侵入後の、カルモジュリンの、ＴＲＰＶ１細胞内部分へのドッキングを測定することを可能にした。次いで、ＴＲＰＶ１チャネル活性化を、この分子間ＢＲＥＴプローブならびに例２．１に記載の分子内ＴＲＰＶ１ ＢＲＥＴプローブを用いて、モニタリングした（図９Ａ）。
【０１８７】
ＹＦＰ−ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ、または、ＴＲＰＶ１−ＬｕｃとＹＦＰ−ＣａＭ、のいずれかを発現するHEK293T細胞を、ＢＲＥＴ分析のために処理した。両方の場合において、基底ＢＲＥＴシグナルが観察され、これは、チャネルの四量体構成内のＲｌｕｃとＹＦＰとの間のエネルギー移動の異なる様式、またはＴＲＰＶ１とカルモジュリンとの間のいくつかの構成的相互作用のいずれかを反映する可能性がある（図９Ｃおよび９Ｄ）。
【０１８８】
本発明による両方の種類のプローブを用いて、カプサイシンへの暴露は、活性化後数秒以内に、異なる時定数と共にであるが基底シグナルを超えるＢＲＥＴの頑強な増加を誘導した（時定数は、ＹＦＰ−ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃプローブについて２秒であり、一方ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭ ＢＲＥＴ試験では２７秒であった）。カプサイシン（ＣＡＰＳ）活性化後のＢＲＥＴシグナルの増加は、生細胞におけるＴＲＰＶ１チャネル活性化を調査するためのこれらのＢＲＥＴ試験の可能性を明確にした。
【０１８９】
カプサイシン（ＣＡＰＳ）のＢＲＥＴシグナルに対する用量反応もまた、分子内および分子間プローブを用いて、ＤＭＳＯの存在下、またはＴＲＰＶ１阻害剤、例えばＡＭＧ５１７またはカプサゼピン（ＣＰＺ）のいずれかの存在下でプレインキュベートしたHEK293T細胞において、測定した。図１０（Ａ）および（Ｂ）はＣＡＰＳ用量反応曲線の右シフトを示し、これによりＣＡＰＳによる活性化閾値の低下を確認した（図１０）。したがって、この薬理学的競合試験は、本発明によるＢＲＥＴプローブの分子内および分子間の両方の種類が、潜在的なＴＲＰＶ１阻害剤またはアクチベーターのハイスループットスクリーニングに適することを確認した。
【０１９０】
さらに、温度の効果を、本発明による分子間および分子内両方のＴＲＰＶ１ ＢＲＥＴプローブで評価した。分子内ＹＦＰ−ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ ＢＲＥＴプローブ（図１１Ａ）または分子間ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃプローブ／ＹＦＰ−ＣａＭ構築物（図１１Ｃ）のいずれかを発現するHEK293T細胞を、２５℃、３１℃、３７℃、または４２℃の徐々に高い温度でペルチェ加熱システムを用いてインキュベートした。ＢＲＥＴシグナルをリアルタイムで、分光光度計に結合された光ファイバーを用いて、HEK293T細胞培養培地を２５℃から５０℃に加熱した場合に記録した。
【０１９１】
ＹＦＰ−ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃプローブを発現する細胞から測定したＢＲＥＴシグナルを考慮すると、複雑なプロファイルにおいて、基底ＢＲＥＴシグナルは２５℃〜３０℃の間で安定したままであり、３０℃から３７℃でわずかに増加し、ここでプラトーに達して４３℃まで保持された。４３℃から、シグナルの大幅な減少が５０℃まで観察された（図１１Ｂ）。
【０１９２】
４３℃がＴＲＰＶ１孔開口の温度閾値であると考えられることから、シグナルのかかる減少は、温度活性化後のＴＲＰＶ１四量体構造内で実験された分子内および／または分子間の立体配座の変化を示す可能性がある。この仮説を検証するために、ＴＲＰＶ１チャネル遮断薬：ＣＰＺの存在下で実験を繰り返した。ＣＰＺの存在下では、シグナルは完全に異なって発生し、３７℃から４７℃までの大幅な上昇を有して、ここで最終的に減少し始めた（図１１Ｂ）。これは、温度上昇に応答してＴＲＰＶ１に生じる立体配座変化が、ＣＰＺ阻害剤の存在下で完全に改変されたことを示した。それにもかかわらず、ＣＰＺがプローブの立体配座変化を改変することができたという事実は、ＹＦＰ−ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ ＢＲＥＴプローブが天然のＴＲＰＶ１チャネルの温度活性化挙動を再現することを示した。さらに、ＹＦＰとルシフェラーゼ両方の発光スペクトルの形状は、２５℃〜５０℃の温度変化によって影響を受けなかった。
【０１９３】
同様の実験を、我々の第２のＢＲＥＴ試験を用いて行い、温度が２５℃から５０℃に上昇した場合のＴＲＰＶ１−ＬｕｃとＹＦＰ−ＣａＭとの間のＢＲＥＴシグナルの変動を測定した（図１１Ｄ）。このＢＲＥＴ対を用いて、弱いＢＲＥＴシグナルが測定され、２５℃〜３７℃の間で安定したままであった。３７℃から、ＢＲＥＴシグナルは４５℃になるまで温度と共に上昇し始め、そこでプラトーに達した。カルシウムを含まない緩衝液中で同じアッセイを行った場合、または細胞をＡＭＧ５１７（強力で選択的なＴＲＰＶ１阻害剤）とプレインキュベートした場合、有意なＢＲＥＴの増加は観察できなかった。シグナルが４３℃〜５０℃の間で安定したままであったという事実は、温度の上昇につれてのルシフェラーゼまたはＹＦＰ基の変性による、我々の測定値の偏りの可能性も排除した。
【０１９４】
温度上昇が、活性化閾値を低下させることによりＴＲＰＶ１チャネルを増強できることを知って、かかる効果が我々のＢＲＥＴ試験を用いて検出され得るかどうかを検査した。したがって、カプサイシンによるＴＲＰＶ１活性化の用量反応曲線を、２５℃、３１℃、３７℃および４２℃で、分子内（図１１Ａ）および分子間（図１１Ｃ）ＢＲＥＴプローブの両方を用いて得た。両方の試験において、温度が２５℃から４２℃に上昇すると、カプサイシンの力が左にシフトしたが、有効性は変化しなかった（図１１Ａおよび１１Ｃ、および下記の表１３）。これらの結果は、両方のＴＲＰＶ１ ＢＲＥＴプローブが天然のＴＲＰＶ１チャネルの温度感受性を模倣したことを示した。
【０１９５】
【表１４】
2018504917.tif 000036
【０１９６】
例３．２：分子内ＴＲＰＶ３ ＢＲＥＴプローブの特徴付け
ＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ３−ｒＬｕｃ ＢＲＥＴプローブの機能および感度を、ＴＲＰＶ３の２つのアゴニスト、すなわち２−アミノエチルジフェニルボリナート（２−ＡＰＢ）およびカルバクロールで処理した、ＹＦＰ−ｈＴＲＰＶ３−ｒＬｕｃ融合タンパク質を発現するHEK293T細胞において確認した。図１２は、ＢＲＥＴシグナルの動態および、カルバクロールと２−ＡＰＢの、ＹＦＰ−ＴＲＰＶ３−Ｌｕｃ ＢＲＥＴプローブを発現するHEK293T細胞に対する効果を示し、それによって融合タンパク質の機能性を確認する。
【０１９７】
例３．１でＴＲＰＶ１について記載したのと同じ様式で、分子内ＴＲＰＶ３ＢＲＥＴプローブを構築し、ここでＲＬｕｃはＴＲＰＶ３のＣ末端部分に融合させ、ＹＦＰはカルモジュリンのＮ末端部分に融合させた。カルバクロールおよび２−ＡＰＢによるＴＲＰＶ３活性化の用量反応曲線を、ＴＲＰＶ３−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭ構築物を発現するHEK293T細胞において得て（図１３Ａおよび１３Ｂ）、それによって分子間ＴＲＰＶ３−Ｌｕｃ ＢＲＥＴプローブの機能性も示された。
【０１９８】
例３．３：分子間ＴＲＰＶ４ ＢＲＥＴプローブの特徴付け
ＲＬｕｃがＴＲＰＶ４のＣ末端に融合され、ＹＦＰがカルモジュリンのＮ末端部分に融合された分子間ＴＲＰＶ４ ＢＲＥＴプローブ。ＴＲＰＶ４アゴニストＧＳＫ１０１６７９０Ａの、ＴＲＰＶ４−Ｌｕｃ／ＹＦＰ−ＣａＭ構築物を発現するHEK293T細胞に対する、動態（図１４Ａ）および用量反応曲線（図１４Ｂ）を得た。図１４Ａにおいて、細胞は、１μＭのアゴニストにより矢印で示された時間に活性化された。図１４Ｂにおいて、試験は、ＴＲＰＶ阻害剤ルテニウムレッド（１０μＭ）の存在下（正方形）または不在下で行った。対照条件について、ＬｏｇＥＣ５０＝−４，８９±０．１２Ｍであることが判明した。ルテニウムレッドの存在下で、ＢＲＥＴ増加を測定することはできなかった。
【０１９９】
例２および例３と同様の戦略を使用して、以下に属する他の電圧依存性カチオンチャネルの活性化または阻害を研究することができる：ＴＲＰＣ（カノニカル）チャネル、ＴＲＰＶ（バニロイド）、ＴＲＰＭ（メラタチン）チャネル、ＴＲＰＡ（アンキリン）チャネル、ＴＲＰＰ（ポリシスチン）チャネル、またはＴＲＰＭＬ（ムコリピン）チャネル、またはナトリウムゲート型チャネル（ＳＣＮチャネル）、カルシウムゲート型チャネル（ＣＡＣＮＡチャネル）、ＣＡＴＰＳＥＲチャネル、ＣＮＧチャネル、電圧依存性カリウムチャネル（ＫＣＮチャネル）、および／または水素電圧ゲート型イオンチャネル。
【図１】
2018504917.tif 000037
【図２】
2018504917.tif 000038
【図３】
2018504917.tif 000039
【図４】
2018504917.tif 000040
【図５】
2018504917.tif 000041
【図６】
2018504917.tif 000042
【図７】
2018504917.tif 000043
【図８】
2018504917.tif 000044
【図９】
2018504917.tif 000045
【図１０】
2018504917.tif 000046
【図１１】
2018504917.tif 000047
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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