【手続補正書】
【提出日】平成26年5月7日(2014.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）（ｉ）ブロッキング基の５’に位置する切断ドメインを有するオリゴヌクレオチドプライマー（前記ブロッキング基は、前記オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端残基の上流５’に連結され、前記ブロッキング基はプライマーの伸長を妨げる。）、（ｉｉ）標的配列を有してもよく又は有さなくてもよい試料核酸、（ｉｉｉ）切断酵素及び（ｉｖ）ポリメラーゼを含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、標的ＤＮＡ配列に前記プライマーをハイブリッド形成する工程；
ｃ）前記プライマーから前記ブロッキング基を除去するために、前記切断ドメイン内の又は前記切断ドメインに隣接した点において、前記切断酵素を用いて、ハイブリッド形成されたプライマーを切断する工程；及び
ｄ）前記ポリメラーゼを用いて、前記プライマーを伸長させる工程；
を含む、標的ＤＮＡ配列を増幅する方法。
【請求項２】
ａ）プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成していないときの活性化されていない立体構造（前記活性化されていない立体構造は、１つ又はそれ以上の２’修飾されたヌクレオシド残基を含むＲＮアーゼＨ切断ドメイン及び前記プライマーの３’末端に又はその付近に連結されたブロッキング基をさらに含む。）；
ｂ）前記プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成されているときの活性化された立体構造（前記活性化された立体構造は３’ブロッキング基を含まず、及びＤＮＡ複製を支持することができる。）；
を含む、５’末端と３’末端を有するＤＮＡ複製のためのプライマー。
【請求項３】
前記２’修飾されたヌクレオシド残基が２’−フルオロヌクレオシドである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ａ）プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成していないときの活性化されていない立体構造（前記活性化されていない立体構造はＲＮアーゼＨ切断ドメイン及び標識を取り込んだプライマーの３’末端に又はその付近に連結されたブロッキング基をさらに含む。）；
ｂ）前記プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成されているときの活性化された立体構造（前記活性化された立体構造は、３’ブロッキング基を含まず、及びＤＮＡ複製を支持することができる。）；
を含む、５’末端と３’末端を有するＤＮＡ複製のためのプライマー。
【請求項５】
ａ）プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成していないときの活性化されていない立体構造（前記活性化されていない立体構造はＲＮアーゼＨ切断ドメイン及び前記プライマーの３’末端ヌクレオチド残基の５‘に位置するブロッキング基をさらに含む。）；
ｂ）前記プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成されているときの活性化された立体構造（前記活性化された立体構造は、３’ブロッキング基を含まず、及びＤＮＡ複製を支持することができる。）；
を含む、５’末端と３’末端を有するＤＮＡ複製のためのプライマー。
【請求項６】
プローブの切断が好熱性ＲＮＡｓｅＨ２酵素によって媒介され、及び切断ドメインがＲＮＡ残基を欠如する、サイクリングプローブ反応を用いて試料内の標的核酸配列を検出する方法。
【請求項７】
切断ドメインが１つ又はそれ以上の２’修飾されたヌクレオシド残基を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
切断ドメインが１つ又はそれ以上の２’ヌクレオシド残基から構成される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
プローブの切断がより低い温度で低下した活性を有する好熱性ホットスタートＲＮＡｓｅＨ２酵素によって媒介される、サイクリングプローブ反応を用いて試料内の標的核酸配列を検出する方法。
【請求項１０】
ａ）切断ドメイン及び３’末端に又は３’末端付近にブロッキング基を含むアクセプターオリゴヌクレオチドと試料を接触させる工程（前記ブロッキング基は連結を阻害する。）；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、標的ＤＮＡ配列に前記アクセプターオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成する工程；
ｃ）前記ブロッキング基を除去するために、前記切断ドメイン内の又は前記切断ドメインに隣接した点において、切断酵素を用いて、オリゴヌクレオチドの前記ハイブリッド形成されたアクセプターを切断する工程；及び
ｄ）リガーゼを用いて、前記アクセプターオリゴヌクレオチドをドナーオリゴヌクレオチドに連結する工程；
を含む、オリゴヌクレオチド連結反応を用いて試料内の標的核酸配列を検出する方法。
【請求項１１】
前記切断ドメインがＲＮアーゼＨ２切断ドメインである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
対立遺伝子バリアントを識別するためにオリゴヌクレオチド連結アッセイが使用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記対立遺伝子バリアントが単一のヌクレオチド多型である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）切断ドメイン及び５’末端に又は５’末端付近にブロッキング基を含むドナーオリゴヌクレオチドと試料を接触させる工程（前記ブロッキング基は連結を阻害する。）；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、標的ＤＮＡ配列に前記ドナーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成する工程；
ｃ）前記ブロッキング基を除去するために、前記切断ドメイン内の又は前記切断ドメインに隣接した点において、切断酵素を用いて、前記ハイブリッド形成されたドナーオリゴヌクレオチドを切断する工程；及び
ｄ）リガーゼを用いて、前記ドナーオリゴヌクレオチドをアクセプターオリゴヌクレオチドに連結する工程；
を含む、オリゴヌクレオチド連結反応を用いて試料内の標的核酸配列を検出する方法。
【請求項１５】
前記切断ドメインがＲＮアーゼＨ２切断ドメインである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ａ）標的核酸、アクセプターオリゴヌクレオチド、ドナーオリゴヌクレオチドの組みを含む反応混合物を提供する工程（前記ドナーオリゴヌクレオチドの組みはグアニン、シトシン、アデニン及びチミンヌクレオチドに対応する４つのオリゴヌクレオチド基を含み、各オリゴヌクレオチド基は約７から１１塩基長であるドナーオリゴヌクレオチドを含み、前記ドナーオリゴヌクレオチドの５’末端上の第一のドメインは１つ又は２つの塩基を含み、及び所定の組みの１つのヌクレオチド又は複数のヌクレオチドに対応し、第一のドメインの３’側の第二のドメインはＲＮアーゼＨ２酵素によって切断可能であり、第二のドメインの３’側の第三のドメインは縮重又はユニバーサル塩基を含み、並びに第四のドメインは前記ドナーオリゴヌクレオチドの３’末端に又は３’末端付近に標識及びブロッキング基（前記標識であり得る。）を含み、ドナーオリゴヌクレオチドが連結反応においてアクセプターとしての役割を果たすのを妨げる。）；
ｂ）標的核酸配列にアクセプターオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程；
ｃ）標的核酸配列にドナーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程；
ｄ）ドナーオリゴヌクレオチドとアクセプターオリゴヌクレオチドを連結させるために、リガーゼ酵素を導入する工程；
ｅ）アクセプターに連結されたドナーオリゴヌクレオチド上の標識を検出する工程；
ｆ）ＲＮＡ又は修飾された残基の５’でドナーオリゴヌクレオチドを切断するために、ＲＮアーゼＨ２酵素を導入し、ドナー分子の第一のドメインをアクセプターオリゴヌクレオチドに付着させたままにする工程；及び
ｇ）工程ｃからｆを反復する工程；
を含む、標的核酸を配列決定する方法。
【請求項１７】
ａ）アクセプターオリゴヌクレオチド、ドナーオリゴヌクレオチドを含む反応混合物を提供する工程（前記ドナーオリゴヌクレオチドは、５’ホスファートを有し、及び５’末端に特異的塩基、隣接するＲＮＡ残基、１から８残基の３’突出部を有するヘアピン構造を含み、前記突出部は縮重又はユニバーサル塩基を含み、’末端の又は３’末端付近のブロッキング基及び標識を場合によって含む。）；
ｂ）ドナーオリゴヌクレオチドの３’突出部にアクセプターオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程；
ｃ）ドナーオリゴヌクレオチドとアクセプターオリゴヌクレオチドを連結させるために、リガーゼ酵素を導入する工程；
ｄ）ＲＮＡ残基の５’でドナーオリゴヌクレオチドを切断するために、ＲＮアーゼＨ２酵素を導入し、ドナー分子の５’末端上の第一の塩基をアクセプターオリゴヌクレオチドに付着させたままにする工程；及び
ｅ）工程ｂからｄを反復する工程；
を含む、核酸を合成する方法。
【請求項１８】
ａ）ブロッキング基の５’位置に切断ドメインを有するオリゴヌクレオチドプライマー（前記ブロッキング基は、オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端の末端に又は末端付近に連結されており、前記ブロッキング基は、プライマー伸長を妨げる。）、試料核酸、切断酵素、ポリメラーゼ、標識されたジデオキシヌクレオチド三リン酸及び標識されていないデオキシヌクレオチド三リン酸を含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、ＤＮＡ配列に前記プライマーをハイブリッド形成する工程；
ｃ）前記プライマーから前記ブロッキング基を除去するために、前記切断ドメイン内の又は前記切断ドメインに隣接した点において、前記切断酵素を用いて、ハイブリッド形成されたプライマーを切断する工程；及び
ｄ）前記ポリメラーゼを用いて、前記プライマーを伸長させる工程；及び
ｅ）伸長反応において形成された５’入れ子状断片を分離する工程；
を含む、ＤＮＡ配列を決定する方法。
【請求項１９】
ａ）蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプライマー、試料核酸、ポリメラーゼ、リボヌクレオチド三リン酸及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、試料ＤＮＡ配列に前記プライマーをハイブリッド形成させる工程；
ｃ）前記ポリメラーゼを用いて、前記プライマーを伸長させる工程；
ｄ）伸長反応の二本鎖産物をＲＮアーゼＨ２酵素を用いて切断する工程；及び
ｅ）伸長反応において形成された５’入れ子状の標識された断片を分離する工程；
を含む、ＤＮＡ配列を決定する方法。
【請求項２０】
ａ）プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成していないときの活性化されていない立体構造（前記活性化されていない立体構造は熱安定的なＲＮＡｓｅＨ切断ドメイン及びプライマーの３’末端に又はその付近に連結されたブロッキング基をさらに含む。）；
ｂ）前記プライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成されているときの活性化された立体構造（前記活性化された立体構造は、３’ブロッキング基を含まず、及びＤＮＡ複製を支持することができる。）；
を含む、５’末端と３’末端を有するＤＮＡ複製のためのプライマー。
【請求項２１】
３’末端及び５’末端を有する一本鎖オリゴヌクレオチド（該一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＲＮＡ残基及び前記オリゴヌクレオチドの３’末端に又は３’末端付近に連結されたブロッキング基を含むリボ核酸ドメインを含む。）。
【請求項２２】
リボ核酸部分が１から３個のリボ核酸塩基又は修飾されたその誘導体からなる、請求項２１に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
リボ核酸ドメインが化合物の３’末端から少なくとも３塩基に位置している、請求項２１に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
リボ核酸ドメインが化合物の３’末端から少なくとも５塩基に位置している、請求項２１に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
リボ核酸ドメインが化合物の３’末端に位置している、請求項２１に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
リボ核酸ドメインが１又は２個のＲＮＡ塩基を含む、請求項２１に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
リボ核酸ドメインが１個のＲＮＡ塩基を含む、請求項２１に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
少なくとも１つのＲＮＡ残基が１つ又はそれ以上の修飾を含有する、請求項２１に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
修飾が一本鎖リボヌクレアーゼによる切断及び水によって触媒される加水分解に対する耐性を付与する、請求項２８に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
修飾がＲＮＡ残基の２’位に存在する、請求項２８に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
修飾が２’フルオロ、２’アルキル、２’メチル、２’アミノ、２’ＬＮＡ、２’ＥＮＡ、２’チオ、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−メチル、５’チオ、５’アミン、５’アルキル、５’メチレン、５’エチレン、３’−ホスファート及び３’−ホスファートジエステルからなる群から選択される、請求項３０に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
修飾がＲＮＡ塩基の３’側のホスファート基に位置する、請求項２８に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
修飾がＲＮＡ塩基の３’側の隣接する残基の５’位に位置する、請求項２８に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
修飾がホスホロチオアート、ホスホロジチオアート及びボロナートからなる群から選択される、請求項２８に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
修飾が５’チオ、５’アミン及び５’アルキル、５’メチレン及び５’エチレンからなる群から選択される、請求項３４に記載の一本鎖オリゴヌクレチド。
【請求項３６】
ブロッキング基がジデオキシヌクレオチド、３’ヒドロキシル修飾されたＤＮＡ残基、２’ヒドロキシル置換又は伸長若しくは連結を妨げることができる３’末端の又は３’末端付近の単量体の塩基基のあらゆる置換除去からなる群から選択される、請求項２１に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
３’ヒドロキシル修飾されたＤＮＡ残基がジデオキシ、３’−ホスファート及び３’−ホスファートジエステルからなる群から選択される、請求項３６に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
３’ホスファートジエステルが３’−ヒドロキシプロピルジエステルである、請求項３７に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
２’ヒドロキシル置換がトリイソプロピルシリル及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルからなる群から選択される、請求項３６に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
１つ又はそれ以上のＲＮＡ塩基又は修飾された残基がＲＮアーゼＨ２に対する基質としての役割を果たし、プライマーの３’末端及び／又は５’末端から少なくとも８塩基離れて位置する、請求項２８に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
ａ）標的核酸に対して相補的でない５’配列タグ；
ｂ）５’配列タグ内に又は５’配列タグの３’に位置し、及び相補的な塩基又は配列にハイブリッド形成されたときに切断可能である第一の切断ドメイン；
ｃ）５’配列タグ及び第一の切断ドメインの３’に位置する標的ハイブリッド形成配列（該標的ハイブリッド形成配列は、標的核酸に対して少なくとも部分的に相補的である。）；
ｄ）ハイブリッド形成配列の３’に位置するブロッキング基（該ブロッキング基はプライマーの伸長を妨げる。）；
ｅ）標的ハイブリッド形成配列とブロッキング基の間に位置する第二の切断ドメイン；
を含む、５’末端と３’末端を有するＤＮＡ複製のためのオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項４２】
第二の切断ドメインが標的核酸に対して相補的である場合に、第二の切断ドメインがより高い速度で切断される、請求項４１に記載のプライマー。
【請求項４３】
ａ）３’末端及び５’末端、少なくとも１つのＲＮＡ残基を含むリボ核酸ドメイン及び前記オリゴヌクレオチドの３’末端に又は３’末端付近に連結されたブロッキング基を有する第一の一本鎖オリゴヌクレオチド；及び
ｂ）３’末端及び５’末端、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドに実質的に相補的な領域及び標的ＤＮＡ配列を有する第二の一本鎖オリゴヌクレオチド；
を含む、二本鎖核酸化合物。
【請求項４４】
３’末端及び５’末端、１つ又はそれ以上の修飾されたヌクレオチド残基を含むＲＮアーゼＨ切断ドメイン、蛍光色素及び消光物質を有する一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ（ＲＮアーゼＨ切断ドメインは、蛍光色素と消光物質の間に位置している。）。
【請求項４５】
修飾されたヌクレオチド残基が２’フルオロ、２’アルキル、２’メチル、２’アミノ、２’ＬＮＡ、２’ＥＮＡ、２’チオ、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−メチル、５’チオ、５’アミン、５’アルキル、５’メチレン、５’エチレン、３’−ホスファート及び３’−ホスファートジエステルからなる群から選択される、請求項４４に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４６】
ａ）３’末端に又は３’末端付近にブロッキング基を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、及び前記ブロッキング基に対して５’のＲＮアーゼＨ２切断ドメイン、標的核酸、ＲＮアーゼＨ２酵素及びポリメラーゼを含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、標的核酸に少なくとも１つのプライマーをハイブリッド形成する工程；
ｃ）ＲＮアーゼＨ２酵素を用いてブロッキング基を除去する工程；及び
ｄ）前記ポリメラーゼを用いて、前記プライマーオリゴヌクレオチドを伸長させる工程；
を含む、標的核酸配列を複製する方法。
【請求項４７】
反応混合物が３’末端に又は３’末端付近にブロッキング基及び該ブロッキング基の５’にＲＮアーゼＨ切断ドメインを有する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを含有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＲＮアーゼＨ２酵素が、２５℃での活性レベルと比べて、７５℃での活性の１０倍の増加を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
ブロッキング基がキャップされた３’核酸残基である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
ブロッキング基がＲＮアーゼＨ２切断ドメインと３’末端の間にある、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
ブロッキング基がＣ３スペーサーである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
１つ又はそれ以上のＣ３スペーサーがＲＮアーゼＨ２切断ドメインと３’末端の間に位置しており、及びＣ３スペーサーの少なくとも１つがブロッキング基として作用する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが少なくとも１つの修飾されたオリゴヌクレオチドを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが２つの隣接する２’−フルオロヌクレオチドを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
ａ）（ｉ）複フォワードプライマーの複数とリバースプライマーの複数を含有するプライマーの組み（フォワード又はリバースプライマーの複数の少なくとも１つは、３’末端に又は３’末端付近にブロッキング基及びブロッキング基の５’にＲＮアーゼＨ２切断ドメインを有する各プライマーを含む。）、（ｉｉ）ＲＮアーゼＨ２酵素、（ｉｉｉ）ｄＮＰＴ及び（ｉｖ）核酸ポリメラーゼ酵素を含む反応混合物と標的核酸配列を接触させる工程；
ｂ）リバースプライマーの各々は、核酸ポリマーをテンプレートとして使用して、核酸ポリマーへハイブリッド形成し及び第一のプライマー伸長産物を形成することができ、前記第一のプライマー伸長産物はリバースプライマー配列及び構造及び標的核酸配列又はその相補物の少なくとも一部を含み；及び
ｃ）フォワードプライマーの各々は、第一のプライマー伸長産物をテンプレートとして使用して、第一のプライマー伸長産物へハイブリッド形成し及び第二のプライマー伸長産物を形成することができ；
ｄ）３’末端に又は３’末端付近にブロッキング基を含有するプライマーの複数及び相補的配列にハイブリッド形成され及び切断ドメインがＲＮアーゼＨ２酵素によって切断されるまで、前記ブロッキング基の５’のＲＮアーゼＨ２切断ドメインは伸長せず；
ｅ）（ｉ）リバースプライマーが核酸ポリマーにハイブリッド形成し、及び第一のプライマー伸長産物を形成し、並びに（ｉｉ）第二のプライマー伸長産物を形成するために、フォワードプライマーが第一のプライマー伸長産物にハイブリッド形成するような条件に反応混合物を供する工程；
ｆ）核酸ポリマーテンプレートから第一及び第二のプライマー伸長産物を分離し、並びにさらなる第一及び第二のプライマー伸長産物が産生されるような条件下で、得られた混合物をプライマーの組みで処理する工程；及び
ｇ）目的のヌクレオチド配列又はその相補物の少なくとも一部が増幅されている反応混合物を提供するために、工程（ｆ）を反復する工程；
を含む、核酸ポリマー内の標的核酸配列を増幅する方法。
【請求項５６】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインがが化合物の３’末端から少なくとも３塩基に位置している、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが化合物の３’末端から少なくとも５塩基に位置している、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが化合物の３’末端に位置している、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが１つのＲＮＡ塩基を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインがプライマーの３’末端から８塩基離れており、及び少なくとも１つのＲＮＡ残基又はＲＮアーゼＨ２に対する基質としての役割を果たす少なくとも１つの修飾された残基を有する、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
ＲＮアーゼＨ２酵素が、２５℃での活性レベルと比べて、７５℃での活性の１０倍の増加を有する、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
ブロッキング基がキャップされた３’核酸残基である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６３】
ブロッキング基がＲＮアーゼＨ２切断ドメインと３’末端の間にある、請求項５５に記載の方法。
【請求項６４】
ブロッキング基がＣ３スペーサーである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
１つ又はそれ以上のＣ３スペーサーがＲＮアーゼＨ２切断ドメインと３’末端の間に位置しており、及びＣ３スペーサーの少なくとも１つがブロッキング基として作用する、請求項５５に記載の方法。
【請求項６６】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが少なくとも１つの修飾されたオリゴヌクレオチドを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項６７】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが２つの隣接する２’−フルオロヌクレオチドを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項６８】
両プライマーの複数中の各プライマーが３’末端に又は３’末端付近にブロッキング基及び該ブロッキング基の５’にＲＮアーゼＨ切断ドメインを含有する、請求項５５に記載の方法。
【請求項６９】
標的核酸の増幅が蛍光によってモニターされ、生成された蛍光の量が標的核酸増幅の量に直接比例する、請求項５５に記載の方法。
【請求項７０】
標的核酸が多項目式に増幅される、請求項５５に記載の方法。
【請求項７１】
第一のプライマー伸長産物がリバースプライマーの切断ドメインを含有し、及び第二のプライマー伸長産物がリバースプライマーとハイブリッド形成するのに十分に相補的な配列を含有せず、第一のプライマー伸長産物を形成するように、第二のプライマー伸長産物の伸長が第一のプライマー伸長産物の切断ドメインにおいて終結する、請求項５５に記載の方法。
【請求項７２】
第二のプライマー伸長産物がフォワードプライマーの切断ドメインを含有し、及び第一のプライマー伸長産物がフォワードプライマーとハイブリッド形成するのに十分に相補的な配列を含有せず、第二のプライマー伸長産物を形成するように、第一のプライマー伸長産物の伸長が第二のプライマー伸長産物の切断ドメインにおいて終結する、請求項５５に記載の方法。
【請求項７３】
ａ）（ｉ）フォワードプライマーの複数とリバースプライマーの複数を含有するプライマーの組み、（ｉｉ）１つ又はそれ以上の修飾されたヌクレオチド残基、蛍光色素及び消光物質を含むＲＮアーゼＨ切断ドメインを含む３’末端及び５’末端を有するオリゴヌクレオチドプローブ（前記ＲＮアーゼＨ切断ドメインは、蛍光色素と消光物質の間に位置している。）、（ｉｉｉ）ＲＮアーゼＨ酵素、（ｉｖ）ｄＮＰＴ並びに（ｖ）核酸ポリメラーゼ酵素を含む反応混合物と標的核酸配列を接触させる工程；
ｂ）リバースプライマーの各々は、核酸ポリマーをテンプレートとして使用して、核酸ポリマーへハイブリッド形成し及び第一のプライマー伸長産物を形成することができ、前記第一のプライマー伸長産物はリバースプライマー配列及び構造及び標的核酸配列又はその相補物の少なくとも一部を含み；及び
ｃ）フォワードプライマーの各々は、第一のプライマー伸長産物をテンプレートとして使用して、第一のプライマー伸長産物へハイブリッド形成し及び第二のプライマー伸長産物を形成することができ；
ｄ）（ｉ）リバースプライマーが核酸ポリマーにハイブリッド形成し、及び第一のプライマー伸長産物を形成する、（ｉｉ）第二のプライマー伸長産物を形成するために、フォワードプライマーが第一のプライマー伸長産物にハイブリッド形成する、及び（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドプローブが第一又は第二のプライマー伸長産物の何れかを結合し、第一又は第二のプライマー伸長産物へのハイブリッド形成後に、ＲＮアーゼＨ酵素によって、プローブがその切断ドメインにおいて切断されるような条件に、反応混合物を供する工程；
ｅ）プローブの切断によって生成された蛍光を測定する工程；
ｆ）核酸ポリマーテンプレートから第一及び第二のプライマー伸長産物を分離し、さらなる第一及び第二のプライマー伸長産物が産生されるような条件下で、得られた混合物をプライマーの組みで処理する工程；及び
ｇ）目的のヌクレオチド配列又はその相補物の少なくとも一部が増幅され、及びプローブの切断によって生成された蛍光を測定することによって増幅が定量される反応混合物を提供するために、工程（ｆ）及び（ｇ）を反復する工程；
を含む、核酸ポリマー内の標的核酸配列の増幅を定量する方法。
【請求項７４】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが化合物の３’末端から少なくとも３塩基に位置している、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが化合物の３’末端から少なくとも５塩基に位置している、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが化合物の３’末端に位置している、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが１つのＲＮＡ塩基を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
ＲＮアーゼＨ２切断ドメインがプライマーの３’末端から８塩基離れており、少なくとも１つのＲＮＡ残基又はＲＮアーゼＨ２に対する基質としての役割を果たす少なくとも１つの修飾された残基を有する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７９】
ＲＮアーゼＨ２酵素が熱安定的である、請求項７３に記載の方法。
【請求項８０】
オリゴヌクレオチドプローブがＲＮアーゼＨ２によって切断される、請求項７３に記載の方法。
【請求項８１】
ａ）標的核酸、プライマー伸長反応混合物及びＲＮアーゼＨ２酵素を含有する試料を混合する工程；
ｂ）反応混合物を少なくとも１つのプライマーとともに温置する工程（前記プライマーは５’末端及び３’末端を有し、前記プライマーは（ｉ）標的核酸に少なくとも部分的に相補的であり、及びＤＮＡ複製を支持することができる領域、（ｉｉ）プライマーが標的核酸にハイブリッド形成するときにＲＮアーゼＨ２酵素によって切断されることができ切断ドメイン、並びに該切断ドメインは、標的核酸が野生型対立遺伝子であるときに、潜在的な塩基変異部位に並置され及び潜在的塩基変異部位に対して相補的であり、（ｉｉｉ）プライマーの３’末端に又は３’末端付近に連結されたブロッキング基を含む。）；及び
ｃ）その質量に基づいて、得られた産物を同定する工程；
を含む、標的核酸試料中の単一の塩基変異を検出する方法。
【請求項８２】
ＲＮアーゼＨ２酵素が熱安定的である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
切断ドメインが少なくとも１つのリボヌクレオチド塩基を含有する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
２つのブロッキング基がプライマーの３’末端に存在する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
ａ）標的核酸、プライマー伸長反応混合物及びＲＮアーゼＨ２酵素を含有する試料を混合する工程；
ｂ）反応混合物を少なくとも１つのプライマーと温置する工程（前記プライマーは５’末端及び３’末端を有し、前記プライマーは（ｉ）前記領域の５’末端上に存在する５’配列ドメイン（該５’配列ドメインは、標的核酸試料に対して非相補的であり、及び相補的塩基又は配列にハイブリッド形成されたときに、ＲＮアーゼＨ２酵素によって切断されることができる第二の切断ドメインを含有する。）、（ｉｉ）前記標的核酸に対して少なくとも部分的に相補的であり、及びＤＮＡ複製を支持することができる領域、（ｉｉｉ）プライマーが標的核酸にハイブリッド形成するときにＲＮアーゼＨ２酵素によって切断されることができる切断ドメイン並びに該切断ドメインは潜在的塩基変異部位に並置され及び潜在的塩基変異部位に対して相補的であり、（ｉｉｉ）プライマーの３’末端に又は３’末端付近に連結されたブロッキング基を含む。）、及び
ｃ）その質量に基づいて、得られた産物を同定する工程；
を含む、標的核酸試料中の単一の塩基変異を検出する方法。
【請求項８６】
ブロッキング基が３’−末端ヌクレオチドから内部に位置している、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
ブロッキング基がＣ３スペーサーである、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
３’末端に又は３’末端付近に、少なくとも第二のブロッキング基をさらに含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
切断ドメイン中の少なくとも１つのＲＮＡ塩基が２’フルオロ、２’アルキル、２’メチル、２’アミノ、２’ＬＮＡ、２’ＥＮＡ、２’チオ、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−メチル、５’チオ、５’アミン、５’アルキル、５’メチレン、５’エチレン、３’−ホスファート及び３’−ホスファートジエステルからなる群から選択される１つ又はそれ以上の修飾されたヌクレオチド残基を含有する、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
反応混合物がＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣｏＣｌ２又はＭｇＣｌ２の１つ又はそれ以上の二価の陽イオンを含有する、請求項８５に記載の方法。
【請求項９１】
反応混合物がＭｇＣｌ２及びＭｎＣｌ２を含有する、請求項８５に記載の方法。
【請求項９２】
反応混合物が３ｍＭＭｇＣｌ２及び６００μＭＭｎＣｌ２を含有する、請求項８５に記載の方法。
【請求項９３】
ＲＮアーゼＨ２酵素がピロコッカス・アビッシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）、スルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ジャンナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）及びピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）を含む群から得られる、請求項８５に記載の方法。
【請求項９４】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５を含む単離された熱安定的リボヌクレアーゼＨ酵素。
【請求項９５】
ａ）標的核酸及びアクセプターオリゴヌクレオチド、ドナーオリゴヌクレオチドの組み（前記ドナーオリゴヌクレオチドの組みは、グアニン、シトシン、アデニン及びチミンヌクレオチドに対応する４つのオリゴヌクレオチド基を含み、各オリゴヌクレオチド基は、ヘアピンを含有する約７から１１塩基長であるドナーオリゴヌクレオチドを含み、ドナーオリゴヌクレオチドの５’末端上の第一の塩基ドメインは１から２個の塩基であり及び与えられた組みの１つのヌクレオチド又は複数のヌクレオチドに対応し、ドナーオリゴヌクレオチドの５’末端上の第二の塩基ドメインはＲＮアーゼＨ２に対する基質である少なくとも１つのＲＮＡ残基又は修飾された残基であり、及び残りの塩基は縮重又はユニバーサルである。）及びＲＮＡ又は修飾された残基の３’側に存在する標識（該標識は、第一の塩基ドメインに対応する。）及びアクセプターオリゴヌクレオチドの３’末端のブロッキング基を含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）アクセプターオリゴヌクレオチド及び標的核酸に対して相補的であるドナーオリゴヌクレオチドに標的核酸をハイブリッド形成させる工程；
ｃ）ドナーオリゴヌクレオチドとアクセプターオリゴヌクレオチドを連結させるために、リガーゼ酵素を導入する工程；
ｄ）ＲＮＡ又は修飾された残基の５’のドナーオリゴヌクレオチドを切断するために、ＲＮアーゼＨ２酵素を導入し、ドナー分子の５’末端上の第一の塩基ドメインをアクセプターオリゴヌクレオチドに付着させたままにする工程；及び
ｅ）工程ｂからｄを反復する工程；
を含む、標的核酸を配列決定する方法。
【請求項９６】
ａ）アクセプターオリゴヌクレオチド、ドナーオリゴヌクレオチドの組み（前記ドナーオリゴヌクレオチドの組みは、グアニン、シトシン、アデニン及びチミンヌクレオチドに対応する４つのオリゴヌクレオチド基を含み、各オリゴヌクレオチド基は、ヘアピン及び約１から５塩基長の５’末端上の突出部を含有するドナーオリゴヌクレオチドを含み、ドナーオリゴヌクレオチドの５’末端上の第一の塩基は与えられた組みのヌクレオチドに対応し、ドナーオリゴヌクレオチドの５’末端上の第二の塩基はＲＮアーゼＨ２に対する基質であるＲＮＡ残基又は修飾された残基であり、残りの塩基はランダム又はユニバーサルである。）を含み、及びＲＮＡ又は修飾された残基の３’側に存在する標識（該標識は、第一の塩基ドメインに対応する。）及びアクセプターオリゴヌクレオチドの３’末端のブロッキング基を場合によって含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）アクセプターオリゴヌクレオチド及びアクセプターオリゴヌクレオチドに対して相補的であるドナーオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる工程；
ｃ）ドナーオリゴヌクレオチドとアクセプターオリゴヌクレオチドを連結させるために、リガーゼ酵素を導入する工程；
ｄ）ＲＮＡ又は修飾された残基の５’のドナーオリゴヌクレオチドを切断するために、ＲＮアーゼＨ２酵素を導入し、ドナー分子の５’末端上の第一の塩基をアクセプターオリゴヌクレオチドに付着させたままにする工程；及び
ｅ）工程ｂからｄを反復する工程；
を含む、標的核酸を合成する方法。
【請求項９７】
ジデオキシ三リン酸及びポリメラーゼが、リガーゼ酵素の後に及びＲＮアーゼＨ２酵素の前に添加される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
ポリメラーゼが末端の転移酵素である、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
ａ）（ｉ）ＲＮアーゼＨ２酵素によって切断される切断部位を備える切断ドメインを有するオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記切断部位は、前記オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端に又はその付近において、ブロッキング基の５’に位置し、前記ブロッキング基は、プライマー伸長及び／又はＰＣＲを妨げ、前記切断ドメインは、ＲＮＡ残基及び塩基脱落残基を含む、前記オリゴヌクレオチドプライマー；
（ｉｉ）標的配列を有してもよく又は有さなくてもよい試料核酸；
（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｉｖ）ＲＮアーゼＨ２酵素；及び
（ｖ）場合によって、ＰＣＲを支持するための、逆の方向性の第二のプライマー
を含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、前記反応混合物における標的ＤＮＡ配列に、前記ブロッキングをされたプライマーをハイブリッド形成する工程；
ｃ）前記プライマーから前記ブロッキング基を除去するために、ＲＮアーゼＨ２を用いて、前記ハイブリッド形成されたプライマーを切断する工程；及び
ｄ）前記ポリメラーゼを用いて、前記切断されたプライマーを伸長させる工程；
を含む、標的ＤＮＡ配列を増幅する方法。
【請求項１００】
切断ドメインが、５’から３’の方向でＲｘまたはＲＤｘである配列（式中、ＲはＲＮＡ残基であり、ＤはＤＮＡ残基であり、ｘは塩基脱落残基である）を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
切断ドメインがＲＤｘｘＤの配列を有する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
ｘがＣ３スペーサーである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
対立遺伝子バリアントを識別するためにアッセイが使用される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０４】
前記対立遺伝子バリアントが単一のヌクレオチド多型である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
ａ）（ｉ）ＲＮアーゼＨ２酵素によって切断される切断部位を備える切断ドメインを有するオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記切断部位は、前記オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端に又はその付近において、ブロッキング基の５’に位置し、前記ブロッキング基は、プライマー伸長及び／又はＰＣＲを妨げ、前記切断ドメインは、ＲＮＡ残基を欠如する、前記オリゴヌクレオチドプライマー；
（ｉｉ）標的配列を有してもよく又は有さなくてもよい試料核酸；
（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｉｖ）ＲＮアーゼＨ２酵素；及び
（ｖ）場合によって、ＰＣＲを支持するための、逆の方向性の第二のプライマー
を含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、前記反応混合物における標的ＤＮＡ配列に、前記ブロッキングをされたプライマーをハイブリッド形成する工程；
ｃ）前記プライマーから前記ブロッキング基を除去するために、切断ドメイン内に又はその付近において、ＲＮアーゼＨ２を用いて、前記ハイブリッド形成されたプライマーを切断する工程；及び
ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、前記切断されたプライマーを伸長させる工程；
を含む、標的ＤＮＡ配列を増幅する方法。
【請求項１０６】
切断ドメインが１つ又はそれ以上の２’修飾されたヌクレオシドを含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記切断ドメインが単一の２’−フルオロヌクレオシドである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０８】
切断ドメインが２つの隣接する２’−フルオロヌクレオシド残基である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０９】
切断反応が、以下の二価の陽イオン：マンガン、コバルト、ニッケル又は亜鉛の１つ又はそれ以上の存在下で実施される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１０】
反応混合物中にマグネシウムも存在する、請求項１０９に記載の方法。