(57)【要約】  本発明は、ウイルス感染を遅延させるため、特に細胞または組織内でウイルス感染に対する少なくとも１つの応答の調節によって遅延させために有用なカロテノイド、特にフィトエンとフィトフルエンを含む組成物に関する。細胞または組織は、対象の細胞または組織であり得て、それによって対象におけるウイルス感染、または特に細胞もしくは組織培養の形態で単離されたウイルス感染を遅延させることができ、特に抗ウイルス剤をスクリーニングする方法で用いることができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞または組織のウイルス感染を遅延させる方法であって、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせの有効量を前記細胞または組織に投与すること、それによって前記ウイルス感染を遅延させることを含む、方法。
【請求項２】
前記細胞または組織が対象の細胞または組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルス感染を遅延させることが、前記対象の前記細胞または組織内で前記ウイルス感染に対する少なくとも１つの応答を調節することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルス感染に対する前記応答が前記細胞または組織へのウイルス付着を防止することおよび／または遅延させることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルス感染に対する前記応答が前記細胞または組織へのウイルス侵入を防止することおよび／または遅延させることを含む、請求項３〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルス感染に対する前記応答が前記ウイルスを含む前記対象の細胞内で前記ウイルスの複製を遅延させることを含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルス感染に対する前記応答が前記ウイルスを含む前記対象の細胞における前記ウイルスによる少なくとも１つの細胞機能の乗っ取りを遅延させることを含む、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルス感染に対する前記応答が前記ウイルスを含む細胞から少なくとも１つのさらなる細胞への前記ウイルスの伝播を遅延させることを含む、請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルス感染に対する前記応答が前記ウイルス感染を抑制する細胞機構に関連する少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導することを含む、請求項３〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルス感染に対する前記応答が前記ウイルス感染を誘導する細胞機構に関連する少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害することを含む、請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記フィトエンとフィトフルエンの組み合わせの前記有効量が少なくとも０．０５μＭである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象の細胞または組織のウイルス感染を遅延させることにより、前記ウイルス感染の発症の遅延がもたらされる、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象がヒトおよび動物からなる群から選択される、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象の免疫系が無防備状態である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ウイルス感染が複数のウイルス型に起因する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルス感染がインフルエンザウイルスに起因する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルス感染が単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）に起因する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記フィトエンとフィトフルエンの組み合わせが組成物内で投与される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物がアミノ酸、ポリペプチド、ペプチド、脂肪酸、脂肪、糖化合物、フィトエンとフィトフルエン以外のカロテノイド、またはその組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの追加の成分をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記フィトエンとフィトフルエン以外のカロテノイドがキサントフィル群である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記フィトエンとフィトフルエン以外のカロテノイドが非プロビタミンＡカロテノイドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物が薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体をさらに含む医薬組成物である、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物が経口、局所、口腔内、鼻腔内、舌下、皮下、静脈内、または吸入投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物が食用の賦形剤、希釈剤または担体をさらに含む食用組成物である、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が少なくとも１つの追加の抗ウイルス療法との併用で投与される、請求項２３〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞または組織が細胞培養もしくは組織培養の一部を形成する単離細胞または組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記フィトエンとフィトフルエンの組み合わせが組成物内で投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞または組織のウイルス感染を遅延させることにより、前記細胞または前記組織内のウイルス感染に対する少なくとも１つの応答を調節することがもたらされる、請求項２６〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞応答が前記細胞または組織へのウイルスの付着および／もしくは侵入を防止することおよび／もしくは遅延させること；前記ウイルスを含む前記対象の細胞内で前記ウイルスの複製を遅延させること；前記ウイルスを含む細胞における前記ウイルスによる少なくとも１つの細胞機能の乗っ取りを遅延させること；前記ウイルスを含む細胞から少なくとも１つのさらなる細胞への前記ウイルスの伝播を遅延させること；前記ウイルス感染を抑える細胞機構に関連する少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導すること；および前記ウイルス感染を誘導する細胞機構に関連する少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害することからなる群から選択される、請求項２６〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記単離細胞または組織のウイルス感染を遅延させるためのフィトエンとフィトフルエンの組み合わせまたはこれらを含む組成物を投与することが、試験化合物の抗ウイルス活性を決定する際の陽性対照を提供し、前記試験化合物が同じ実験条件下で同じ細胞型または組織に投与される、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
対象の細胞または組織のウイルス感染を遅延させるために使用するためのフィトエンとフィトフルエンの組み合わせまたはフィトエントとフィトフルエンの組み合わせを含む組成物。
【請求項３２】
前記ウイルス感染を遅延させることが前記対象の前記細胞または組織内の前記ウイルス感染に対する少なくとも１つの応答を調節することを含む、請求項３１に記載のフィトエンとフィトフルエンの組み合わせまたはフィトエンとフィトフルエンの組み合わせを含む組成物。
【請求項３３】
前記フィトエンとフィトフルエンの組み合わせの量が少なくとも０．０５μＭである、請求項３１〜３２のいずれか１項に記載のフィトエンとフィトフルエンの組み合わせまたはフィトエンとフィトフルエンの組み合わせを含む組成物。
【請求項３４】
前記ウイルス感染が複数のウイルス型に起因する、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のフィトエンとフィトフルエンの組み合わせまたはフィトエンとフィトフルエンの組み合わせを含む組成物。
【請求項３５】
前記ウイルス感染がインフルエンザウイルスに起因する、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のフィトエンとフィトフルエンの組み合わせまたはフィトエンとフィトフルエンの組み合わせを含む組成物。
【請求項３６】
前記ウイルス感染が単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）に起因する、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のフィトエンとフィトフルエンの組み合わせまたはフィトエンとフィトフルエンの組み合わせを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象でのウイルス感染を遅延させることにおいて、および抗ウイルス剤をスクリ−ニングする方法において有用なカロテノイド特にフィトエンとフィトフルエンを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスは、他の生物の生細胞内でのみ複製する小さい感染病原体である。ウイルスは、動物および植物から、細菌および古細菌を含む微生物まで種々の生物形態に感染することができる。ウイルス感染は、一般的に、罹患した対象において、軽度の症状から、罹患率および死亡率の一因となる重度の症状まで変化し得る疾患症状を引き起こす。
【０００３】
ウイルス感染に関連する最も放置されている症状の１つは、ヒト呼吸器疾患である。ウイルスに起因するヒト呼吸器疾患の例としては、種々のインフルエンザウイルスに起因するインフルエンザ、コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）に起因する重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、アデノウイルスに起因する呼吸器系の疾病、ならびに呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に起因する気管支炎および小児肺炎が挙げられる。
【０００４】
その他多くの深刻な疾患、例えばエボラウイルス疾患、ＡＩＤＳおよび単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）がウイルスに起因する。ＨＳＶ−１は、神経細胞を攻撃し、他の病態の中でも口唇ヘルペスを引き起こすウイルスである。
【０００５】
一般的に「流感」として知られているインフルエンザは、インフルエンザウイルスに起因する感染症である。インフルエンザは毎年大流行して世界中に蔓延し、重度の疾患は約３００万〜５００万例、および死亡は約２５０，０００〜５００，０００例である。死亡の大部分は年少者、高齢者、および他の健康問題を有する人に起きている。インフルエンザの合併症としては、ウイルス性肺炎、二次性細菌性肺炎、静脈洞感染、および例えば喘息または心不全などの以前の健康上の問題の悪化が挙げられ得る。
【０００６】
一般的に、インフルエンザウイルスは咳またはくしゃみから空気を介して伝播する。これは、大部分は比較的短い距離で起こると考えられている。インフルエンザは、ウイルスによって汚染された表面に触れ、次いで口または目に触れることによっても伝播し得る。一般的な予防方法は、頻繁な手洗いとマスクの装着である。
【０００７】
その抗原決定基によって分類されるインフルエンザＡ型、Ｂ型、Ｃ型の３種の主なインフルエンザ亜型が疾患を引き起こす。インフルエンザビリオンは、核タンパク質（ＮＰ）に密接に結合し、かつ基質タンパク質（Ｍ１）によって内側を覆われ、２つの主要な表面糖タンパク質抗原であるヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を保有するリポタンパク質エンベロープによって囲まれている、一本鎖ＲＮＡゲノムからなる。ＨＡとＮＡ糖タンパク質は、最も変化を受けやすく、例えば、Ｈ１Ｎ１またはＨ３Ｎ２などの異なるインフルエンザウイルス亜型の骨格となる、ＨＡの１６種の免疫クラスと９種の異なるＮＡクラスとがある。インフルエンザＡ型ウイルスは、異なるＨＮ亜型間で高度に保存された、さらなる膜貫通糖タンパク質、Ｍ２を有する。Ｍ２遺伝子は、ビリオン細胞表面上に四量体として発現される９６〜９７個のアミノ酸を有するタンパク質をコードする。Ｍ２遺伝子は、約２４個の細胞外アミノ酸、約１９個の膜貫通アミノ酸、および約５４個の細胞質残基で構成されている。
【０００８】
インフルエンザに対して一般的に使用されている抗ウイルス薬の２つの種類は、ノイラミニダーゼ阻害剤（例えば、「タミフル」の商品名で市販されているオセルタミビル、およびザナミビル）とＭ２タンパク質阻害剤（アダマンタン誘導体）である。ノイラミニダーゼ阻害剤の研究は、それ以外は健康である患者におけるそれらの阻害剤の恩恵が、薬物の服用に関係するリスクより大きくないこと、および他に健康問題がある患者においてその阻害剤の恩恵が全くないことを示唆している。抗ウイルス薬アマンタジンおよびリマンタジンは、ウイルスイオンチャネル（Ｍ２タンパク質）を阻害し、したがってインフルエンザＡ型ウイルスの複製を阻害する。これらの薬物は、感染初期に投与されれば、インフルエンザＡ型に対して時に有効であるが、Ｍ２薬物標的を欠如するインフルエンザＢ型ウイルスに対しては無効である。米国でのＨ３Ｎ２分離株のアマンタジンおよびリマンタジンに対する耐性測定値は、２００５年に９１％まで上昇した。米国疾病管理センター（ＣＤＣ）が高レベルの薬物耐性の理由からＭ２阻害剤の使用の推奨に反対していることが知られている。世界保健機関は、リスクが高い人に対してインフルエンザに対する毎年のワクチン接種を推奨している。しかし、ウイルスは急速に進化することから、１年放置されたウイルスに対して作製されたワクチンは、翌年有用でないこともあり得る。インフルエンザ疾患の処置のために安全で有効な薬剤を求める医療関係者および一般集団のニーズは、現在、満たされていない。
【０００９】
カロテノイドは、植物、藻類および光合成細菌によって合成される天然に存在する６００メンバーを超える有機色素のファミリーである。カロテノイドは、これらの生物すべてによって脂肪および他の基本的有機代謝構築ブロックから生成することが可能である。ヒトはカロテノイドを生成することができないが、食事からのカロテノイドを蓄積することができる。
【００１０】
カロテノイドは、２つの種類、キサントフィル（酸素を含有する）とカロテン（純粋に炭化水素であり、酸素を含有しない）とに分けられる。すべてのカロテノイドはテトラテルペノイドであり、このことはこれらが８個のイソプレン分子から生成され、炭素原子４０個を含有することを意味する。非置換β−イオノン環（β−カロテン、α−カロテン、β−クリプトキサンチンおよびγ−カロテンを含む）を含むカロテノイドは、ビタミンＡ活性を有する（レチナールに変換することができることを意味する）。
【００１１】
カロテンクラスのカロテノイドであるフィトエンおよびフィトフルエンを含む非プロビタミンＡカロテノイドは、肉眼で有色のカロテノイドの生合成経路における前駆体カロテノイド、例えばリコペンである。フィトエンおよびフィトフルエン分子は可視領域で無色であり、このことはそれらが紫外線範囲でのみ光を吸収することを意味する。抗酸化剤、抗炎症剤、紫外線保護剤および皮膚美白剤としてのフィトエンおよびフィトフルエンのヒトの健康に対する恩恵は、これまでに本発明の一部の発明者らと共同研究者によって開示されている。
【００１２】
カロテノイドは、一般的にその抗酸化効果および抗炎症効果によるその健康促進特性が古くから認識されている。このためカロテノイドは、免疫系機能および身体の全般的な筋力に対する抗酸化活性および抗炎症活性の間接的な寄与に基づいて、抗ウイルス剤としても推奨されてきた。
【００１３】
米国特許出願第２００７／００３１３５６号および同第２０１１／００８２２１８号は、炎症誘導性遺伝子の発現に及ぼすβ−カロテンの紫外線媒介作用を開示する。Ｌｉｎ  Ｈ−Ｗら，（２０１２．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  １３４：２１６９−２１７５）は、βーカロテンの抗炎症効果およびＤＮＡウイルス感染に対する抗炎症剤としてのその潜在的な用途を述べている。Ｗｅｒｔｚ  Ｋら，（２００５．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １２４：４２８−４３４）およびＴｏｒｍａ  Ｈら，（２０１４）．Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｒｅｓ  ３０６：７３９−７４７）、Ｂａｌｍｅｒ  Ｊ  ＥとＢｌｏｍｈｏｆｆ  Ｒ．（２００２．Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４３：１７７３−１８０８）、Ｂｅｒｔｒａｍ  Ｊ  ＨとＢｏｒｔｋｉｅｗｉｃｚ  Ｈ．（１９９５．Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ６２（補遺）：ｌ３２７Ｓ−３６Ｓ）は、レチノイン酸媒介細胞遺伝子発現を述べている。
しかし、これらの論文のいずれも、ウイルス感染に対する保護に及ぼす発現遺伝子の潜在的効果に取り組んでいなかった。
【００１４】
米国特許第５，５１４，６６７号は、皮膚および粘膜のヘルペスウイルス感染症の局所処置のために、の抗炎症薬または抗酸化薬である増強薬と併用した抗ウイルス薬を含む局所調製物の使用を開示している。カロテノイドは、薬物の活性を増強する可能性がある抗酸化剤として述べられている。開示される好ましい調製物は、ブフェキサマクと併用したポリ硫酸ペントサン亜鉛を含む。
【００１５】
独国特許出願公開第ＤＥ２０２００５００７４６２号は、慢性ウイルス感染症を防止するための、ビタミンＣ、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０、カロテノイド、セレン、亜鉛および銅を含む薬剤または栄養補助組成物を開示している。
【００１６】
米国特許出願公開第２００９／０１６９５８６号は、酸化感受性材料、例えばヒトの健康にとって有益と考えられているカロテノイドの混合物、例えば、β−カロテン、α−カロテン、ルテイン、ゼアキサンチンおよびクリプトキサンチン、ならびに種々のミネラルおよび他の栄養成分の混合物を豊富に含む、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属藻類の全乾燥藻類を含む、安定した包装剤形を調製するプロセスを開示する。この出願は、真菌感染症およびウイルス感染症を含む種々の状態の処置または予防のために乾燥ドナリエラを含む剤形を用いる方法を開示する。さらに、対象の食事を補充する方法、対象の全身健康を維持または改善する方法、および対象においてフェイク日焼けを促進する方法が開示されている。
【００１７】
米国特許出願公開第２０１１０２１７２４４号は、感染症の処置のために対象の免疫応答を増強するため、または免疫される対象において抗原に対する免疫応答を増強するために、酸化型カロテノイドまたはその成分の使用を開示する。酸化によって変換されたカロテノイドを含有する医薬組成物およびキットも、開示される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
抗ウイルス効果を有する組成物、特にインフルエンザウイルスに対し、効果的で安全に使用できる組成物の必要性は満たされてなく、そのような組成物を有することは極めて有利である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、ウイルス感染を遅延させるために、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせおよびこれを含む組成物の使用を開示する。
【００２０】
本発明は、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせが、ウイルス粒子の数、より具体的にはインフルエンザウイルス粒子、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのインキュベーション後のウイルス粒子の数を減少させるために、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏでウイルス粒子量を減少させるために非常に有効であるという予想外の発見に一部基づいている。この組み合わせは、ウイルス攻撃に対する細胞および身体の防御機構に関係する遺伝子発現に対して直接効果を有することも示されており、したがって感染に対する保護機構を提供する。この組み合わせは、ウイルスＲＮＡ合成の減少、ＲＮＡ翻訳およびタンパク質合成に関係する遺伝子の発現の誘導において非常に有効であり誘導、したがってウイルス複製を遅延させる。
【００２１】
この組み合わせはまた、細胞内でのウイルスの移動を容易にするモータータンパク質をコードする遺伝子の発現を減少させ、したがってウイルス複製および感染を維持するのに必要なウイルスの移動を減少させることも示された。
【００２２】
この組み合わせはまた、宿主細胞へのウイルスの侵入に不可欠な遺伝子の発現を減少させ、したがってウイルスによるさらなる伝播および感染を減少させることも示された。
【００２３】
この組み合わせは、宿主細胞機能の乗っ取りに関係する遺伝子の発現に影響を及ぼす、特にＤＮＡの複製および転写に不可欠な遺伝子の発現を減少させることも示された。
【００２４】
いかなる特定の理論または作用機構にも束縛されることを望むものではないが、本発明の組成物の抗ウイルス効果は、ウイルス結合および宿主細胞への侵入の減少；ＤＮＡ／ＲＮＡ複製、翻訳および合成の減少；ならびに隣接する宿主細胞へのウイルスの伝播の減少をもたらす多くの細胞抗ウイルス機構の誘導に起因し得る。示唆された活性機序のいずれも、これまでプロビタミンＡ化合物または他のカロテノイドに起因すると考えられなかった。
【００２５】
フィトエンとフィトフルエンが、中心的な免疫系応答の活性化に依存しない生得の細胞防衛機構を介してウイルス感染を遅延させるために有効であるという予想外の発見は、疾患に関連する免疫不全の個体、妊婦、小児、および高齢者を含む、免疫系無防備状態のまたは免疫系未発達の個体が長年必要としてきた抗ウイルス処置に関する解決策を提供する。ウイルス感染およびその合併症に対して非常に感受性が高いこれらの集団は、抗ウイルス療法を最も必要とするが、なおも中心的な免疫系を介してのみ作用する薬剤によって有害なおよび／または不十分な影響を受けることがある。
【００２６】
さらに、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせが中心的な免疫系応答に依存しない生得の細胞防御機構を介してウイルス感染症を遅延させる効果があるという予想外の発見により、分析剤としてのその使用、特に有効な抗ウイルス化合物をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の陽性対照としての使用が可能である。
【００２７】
一態様によれば、本発明は、それを必要とする対象の細胞または組織のウイルス感染を遅延させる方法であって、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせの有効量を対象に投与すること、それによってウイルス感染を遅延させることを含む方法を提供する。
【００２８】
いくつかの実施形態によれば、ウイルス感染を遅延させることは、対象の細胞または組織内でウイルス感染に対する少なくとも１つの応答を調節することを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態によれば、ウイルス感染に対する応答は、対象の細胞または組織へのウイルスの付着および／もしくは侵入を防止するおよび／もしくは遅延させること；ウイルスを含む対象の細胞内でウイルス複製を阻害すること；ウイルスを含む細胞においてウイルスによる少なくとも１つの細胞機能の乗っ取りを遅延させること；ウイルスを含む細胞から、少なくとも１つのさらなる細胞へのウイルスの伝播を遅延させること；ウイルス感染を抑制する細胞機構に関連する少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導すること；およびウイルス感染を誘導する細胞機構に関連する少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害することからなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【００３０】
本明細書で用いる場合、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせの「有効量」という用語は、本明細書に記載の細胞または組織内でウイルス感染に対する少なくとも１つの応答を調節するために有効な量を指す。
【００３１】
いくつかの実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせの有効量は、少なくとも０、０５μＭである。他の実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせの有効量は、少なくとも０．１μＭ、少なくとも０．２μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭ、少なくとも１．０μＭ、少なくとも２．０μＭ、少なくとも４．０μＭ、少なくとも６．０μＭ、少なくとも８．０μＭ、または少なくとも１０．０μＭである。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。いくつかの例示的な実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせの有効量は、約０．０５μｍから約１００μｍである。さらなるいくつかの例示的な実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせの有効量は、約０．２μｍから約１００μｍである。
【００３２】
いくつかの実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせは、組成物内で投与される。
【００３３】
いくつかの現在の例示的な実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンは、それらの天然型である。フィトエン、フィトフルエンまたはその組み合わせは、天然源から単離する、化学的に生成する、または組換え方法を用いて生成することができる。
【００３４】
いくつかの実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせを含む組成物は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、脂肪酸、脂肪、糖化合物、フィトエンとフィトフルエン以外のカロテノイド、またはその組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの追加の成分をさらに含む。これらの実施形態によって組成物中に存在し得るフィトエンとフィトフルエン以外のカロテノイドは、ζ−カロテン、β−カロテン、リコペン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、ルテイン、カンタキサンチン、ノイロスポレンなどからなる群から選択され、それらのすべての立体異性体、誘導体およびその任意の組み合わせを含む。
【００３５】
さらに別の実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエン以外のカロテノイドは、キサントフィル群のカロテノイドである。さらなる実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエン以外のカロテノイドは、非プロビタミンＡカロテノイドである。
【００３６】
一部の実施形態によれば、組成物はプロビタミンＡカロテノイド化合物を本質的に含まない。これらの実施形態によれば、組成物は、組成物の総カロテノイド含有量のうち２０％未満のプロビタミンＡカロテノイド化合物、組成物の総カロテノイド含有量のうち１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、またはそれより少ないプロビタミンＡカロテノイド化合物を含む。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。一部の実施形態によれば、組成物は、組成物の総カロテノイド含有量のうち検出不能量から１０％までのプロビタミンＡカロテノイド化合物を含む。
【００３７】
一部の実施形態によれば、組成物はβ−カロテンを本質的に含まない。これらの実施形態によれば、組成物は、組成物の総カロテノイド含有量のうち２０％未満のβ−カロテン、組成物の総カロテノイド含有量のうち１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、またはそれより少ないβ−カロテンを含む。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。一部の実施形態によれば、組成物は、組成物の総カロテノイド含有量のうち検出不能量から１０％までのβ−カロテンを含む。
【００３８】
特定の実施形態によれば、対象はウイルスに感染している。
【００３９】
一部の実施形態によれば、対象の細胞または組織のウイルス感染を遅延させることにより、ウイルス感染の発症の遅延がもたらされる。
【００４０】
実施形態によれば、対象の細胞または組織のウイルス感染を遅延させることは、ウイルス感染に関連するまたは起因する少なくとも１つの症状の予防、改善、遅延、阻害、重症度の軽減、およびその任意の組み合わせの少なくとも１つがもたらされる。
【００４１】
これらの実施形態によれば、本発明は、対象におけるウイルス感染症を処置する方法であって、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせ、またはそれを含む組成物の治療有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００４２】
いくつかの実施形態によれば、対象はヒトおよび動物からなる群から選択される。特定の例示的な実施形態によれば、対象はヒトである。
【００４３】
いかなる特定の理論または作用機構にも束縛されることを望むものではないが、本明細書に開示するようにウイルス感染を標的にする細胞機構に及ぼすフィトエンとフィトフルエンの組み合わせの直接効果は、対象の全身の免疫系を活性化することなく、または中程度に活性化して、十分な保護を提供することができ、この組み合わせは、免疫系が抑制された対象、または免疫抑制に関連する疾患を有する対象への投与にとって非常に好適となる。
【００４４】
したがって、一部の実施形態によれば、対象は、免疫系無防備状態の対象である。他の実施形態によれば、対象は免疫抑制に関連する疾患に罹患している。さらなる実施形態によれば、対象は免疫抑制処置を受けている、または受けていた。いくつかの例示的な実施形態によれば、免疫無防備状態の対象は、小児、高齢者および妊婦からなる群から選択される。
【００４５】
特定の実施形態によれば、ウイルス感染はインフルエンザウイルスまたはその亜型による感染である。一部の実施形態によれば、ウイルス感染はインフルエンザＡ型ウイルスの亜型による感染である。他の実施形態によれば、ウイルス感染はインフルエンザＢ型ウイルスの亜型による感染である。さらなる実施形態によれば、ウイルス感染はインフルエンザＣ型ウイルスの亜型による感染である。
【００４６】
いくつかの例示的な実施形態によれば、インフルエンザウイルス株は、Ｎ１Ｈ１ＰＲ８およびＨ３Ｎ２からなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【００４７】
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、インフルエンザウイルスの複数の変種による感染を遅延させることに適用できる。
【００４８】
他の現在の例示的な実施形態によれば、ウイルスは単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）である。
【００４９】
なおさらなる実施形態によれば、方法は複数のウイルス型の感染を遅延させることに適用できる。
【００５０】
本発明の教示によるフィトエンとフィトフルエンの組み合わせを含む組成物を投与するための当技術分野で既知のいかなる方法も、本発明の教示に従って用いることができる。
【００５１】
いくつかの実施形態によれば、組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体をさらに含む医薬組成物である。
【００５２】
他の実施形態によれば、組成物は、食用の賦形剤、希釈剤または担体をさらに含む食用組成物である。一部の実施形態によれば、食用組成物は、栄養補助食品組成物または栄養補給剤である。
【００５３】
一部の実施形態によれば、医薬組成物は、経口、鼻腔内、口腔内、舌下、局所、皮下および／または静脈内の経路を介して投与される。他の実施形態によれば、組成物は吸入および／または噴霧化によって投与される。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【００５４】
さらに他の実施形態によれば、本発明の方法は、抗ウイルス剤、ワクチン、抗体、抗酸化剤、伝統生薬、ホメオパシー薬剤、これらを含む組成物およびその組み合わせからなる群から選択される追加の薬剤を対象に投与することをさらに含む。
【００５５】
いくつかの実施形態によれば、本発明によるフィトエンとフィトフルエンの組み合わせを含む組成物および追加の薬剤は、単一組成物で投与される。
【００５６】
他の実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組合せおよび少なくとも１種の追加の薬剤は、個別の組成物で投与される。これらの実施形態によれば、組成物は同時に、付随して、連続しておよび／または交互に投与することができる。
【００５７】
フィトエンとフィトフルエンの組み合わせまたはこれらを含む組成物の投与の頻度、量および期間は、とりわけ、対象の全身健康、年齢、性別、体重およびウイルス感染の発症に依存する。一部の実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせまたはこれらを含む組成物は、一日１回から８回投与される。一部の実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせまたはこれらを含む組成物は、予防的に投与される。
【００５８】
さらなる態様によれば、本発明は、対象の細胞または組織のウイルス感染を遅延させるために用いるための、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせまたはこれらを含む組成物の有効量を提供する。処置される組成物およびウイルスは、上記に記載される通りである。
【００５９】
さらなる態様によれば、本発明は単離された細胞または組織のウイルス感染を遅延させる方法であって、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせまたはこれらを含む組成物の有効量を細胞または組織に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、単離された細胞または組織は、細胞培養または組織培養の一部を形成する。
【００６０】
一部の実施形態によれば、培養物の細胞または組織のウイルス感染を遅延させることにより、ウイルス感染の発症の遅延がもたらされる。一部の実施形態によれば、細胞または組織のウイルス感染を遅延させることにより、細胞または組織内でウイルス感染に対する少なくとも１つの応答の調節がもたらされる。
【００６１】
いくつかの実施形態によれば、細胞応答は、細胞または組織へのウイルスの付着および／もしくは侵入を防止するおよび／もしくは遅延させること；ウイルスを含む対象の細胞内でウイルス複製を遅延させること；ウイルスを含む細胞においてウイルスによる少なくとも１つの細胞機能の乗っ取りを遅延させること；ウイルスを含む細胞から、少なくとも１つのさらなる細胞へのウイルスの伝播を遅延させること；ウイルス感染を抑制する細胞機構に関連する少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導すること；およびウイルス感染を誘導する細胞機構に関連する少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害することからなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【００６２】
一部の実施形態によれば、単離細胞または組織のウイルス感染を遅延させるためのフィトエンとフィトフルエンの組み合わせまたはこれらを含む組成物を投与することは、試験化合物の抗ウイルス活性を決定する際の陽性対照を提供し、試験化合物は同じ実験条件下で同じ細胞型または組織に投与される。一部の実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせまたはこれらを含む組成物は、ウイルス感染を遅延させるために治療効果を有することがわかっている量で投与される。他の実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせまたはこれらを含む組成物は、使用される細胞型または組織に関して較正された量で投与される。
【００６３】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の説明および図面から明白になる。本発明のさらなる実施形態および利用可能性の完全な範囲は、以下に示す詳細な説明から明らかになる。しかし、本発明の趣旨および範囲内での種々の変更および修正が本詳細な説明から当業者には明らかになることから、詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、単なる例として提供することを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】フィトエンとフィトフルエンの組み合わせ（ＣＯＭＰ１）がＭＤＣＫ細胞に対して細胞毒性効果を示さないことを示す。
【図２】フィトエンとフィトフルエンの組み合わせ（ＣＯＭＰ１）がＭＤＣＫ細胞中のインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１ＰＲ８）の密度に及ぼす阻害効果を示す。
【図３】ＣＯＭＰ１で処置した、または処置していないＨＳＶ−１に感染したヒト腎臓細胞のｇｅｎｓｉｎバイオレット染色を示す。有効なＨＳＶ１薬として知られているアシクロビルを陽性対照として使用した。
【図４】フィトエンとフィトフルエンの組み合わせ（ＣＯＭＰ１）がインフルエンザウイルス粒子数に及ぼすｉｎ  ｖｉｖｏ阻害効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
定義
本明細書で用いる場合、「フィトエン」という用語は、そのすべての立体異性体を含む７，７’，８，８’，１１，１１’，１２，１２’−オクタヒドロ−ｐｓｉ−ｐｓｉ−カロテンを指す。フィトエンの合成は、植物におけるカロテノイド合成の第１の関与段階である。フィトエンは、酵素フィトエンシンターゼの作用によって、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）２分子から生成される。フィトエンは、非プロビタミンＡカロテンである。
【００６６】
「フィトフルエン」という用語は、すべてのその立体異性体および誘導体を含む、１５−シス，７，８，１１，１２，７’，８’−ヘキサヒドロ−ｐｓｉ−ｐｓｉ−カロテンを指す。フィトフルエンは、不飽和化反応においてフィトエンから形成され、５つの共役二重結合を形成する。フィトフルエンは、非プロビタミンＡカロテンである。
【００６７】
本明細書に開示されるフィトエンとフィトフルエンのモル量は、以下の式を使用して、分光光度法により測定される：
Ｏ．Ｄ＊希釈係数（＝ｍｇ／ｍＬでの濃度）／フィトエン／フィトフルエン係数、
フィトエン吸光係数は、ヘキサンおよびエタノール中で９１５、酢酸エチル中で８７０であり、
フィトフルエン吸光係数は、ヘキサンおよびエタノール中で１５５７、酢酸エチル中で１４８０であり、およびフィトエンのＯ．Ｄは２８４〜２８８ｎｍで得て、フィトフルエンに関しては３４５〜２４８ｎｍで得る。
【００６８】
本明細書で用いる場合、「遅延させる」または「遅延させた」という用語は、細胞感染を引き起こすために、ウイルスが生存、複製および伝播のために用いるすべての活性および機構を延期する、保留する、抑える、または完全に阻害するために、最も広い範囲で用いられることを意味する。
【００６９】
本明細書で用いる場合、「有効量」という用語は、対象内のｉｎ  ｖｉｖｏで、または細胞もしくは組織培養中のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのいずれかで細胞または組織のウイルス感染を遅延させるのに十分なフィトエンとフィトフルエンの組み合わせの量を意味する。本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞または組織のウイルス感染を遅延させることは、ウイルスに対する少なくとも１つの細胞応答の調節を包含し、それによってウイルスの侵入、複製および伝播の減少のうち少なくとも１つをもたらす。
【００７０】
本明細書で用いる場合、「治療有効量」という用語は、ウイルスに罹患している、もしくは罹患していると疑われる、もしくは罹患しやすい対象を処置するためにさらに有効である上記記載のフィトエンとフィトフルエンの組み合わせの有効量を指す。本明細書で用いる場合、「処置する」という用語は、ウイルス感染の発症を遅延させること、ならびに／またはウイルス感染に関連するもしくは起因する少なくとも１つの症状を予防すること、改善すること、遅延させること、重症度を軽減すること、およびその任意の組み合わせを指す。
【００７１】
一態様によれば、本発明はそれを必要とする対象の細胞または組織のウイルス感染を遅延させる方法であって、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせの有効量を含む組成物を対象に投与し、それによってウイルス感染を遅延させる、または抑制することを含む方法を提供する。
【００７２】
別の態様によれば、本発明は、それを必要とする対象の細胞または組織のウイルス感染を阻害する方法であって、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせの有効量を含む組成物を対象に投与し、それによってウイルス感染を遅延させる、または抑制することを含む方法を提供する。
【００７３】
特定の実施形態によれば、ウイルス感染を遅延させることは、対象の細胞または組織内でウイルス感染に対する少なくとも１つの応答を調節することを含む。
【００７４】
一部の実施形態によれば、ウイルス感染を遅延させることは、細胞もしくは組織へのウイルスの付着および／または侵入を防止するおよび／または阻害することを含む。
【００７５】
一部の実施形態によれば、ウイルス感染を遅延させることは、ウイルスを含む対象の細胞内でウイルス複製を阻害することを含む。
【００７６】
一部の実施形態によれば、ウイルス感染を遅延させることは、ウイルスを含む細胞から、少なくとも１つのさらなる細胞へのウイルスの伝播を阻害することを含む。
【００７７】
一部の実施形態によれば、ウイルス感染を遅延させることは、ウイルスを含む細胞におけるウイルスによる少なくとも１つの細胞機能の乗っ取りを阻害することを含む。
【００７８】
一部の実施形態によれば、ウイルス感染を遅延させることは、ウイルス感染を抑制する細胞機構に関連する少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導することを含む。これらの実施形態によれば、ウイルス感染を抑制する細胞機序に関連する少なくとも１つの遺伝子は、ＲＳＡＤ２（ＮＭ＿０８０６５７）；ＩＦＩＴ１（ＮＭ＿００１５４８）；ＩＦＩＴ３（ＮＭ＿００１５４９）およびその任意の組み合わせからなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【００７９】
一部の実施形態によれば、ウイルス感染を遅延させることは、ウイルス感染を促進する細胞機構に関連する少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害することを含む。これらの実施形態によれば、ウイルス感染を促進する細胞機構に関連する少なくとも１つの遺伝子は、ＤＤＸ１７（ＮＭ＿００６３８６）；ＡＴＦ６（ＮＭ＿００７３４８）；ＴＯＰ１（ＮＭ＿００３２８６）；ＵＳＰ４７（ＮＭ＿０１７９４４）；ＫＩＦ５Ｂ（ＮＭ＿００４５２１）；ＨＴＡＴＳＦ１（ＮＭ＿００１１６３２８０）；ＳＲＰＫ１（ＮＭ＿００３１３７）；ＰＣＢＰ２（ＮＭ＿００５０１６）；ＡＣＢＤ３（ＮＭ＿０２２７３５）およびその任意の組み合わせからなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【００８０】
本発明の方法および組成物で用いるフィトエンとフィトフルエンは、任意の入手可能な原料から得ることができる。フィトエンとフィトフルエンは、天然源から抽出することができ、化学的に合成することができ、または分子遺伝学の方法によって得ることができる。いくつかの例示的な実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンは、カロテノイドを産生する生物、例えば、種々の植物、種々の藻類、および遺伝子組換え生物を含む特定の微生物から採取してもよい。非限定的な例としては、トマト果実、柑橘類果実、ニンジン、藻類、真菌および食用花が挙げられる。フィトエンとフィトフルエンの各々は、異なる原料から抽出してもよく、または同じ原料から採取してもよい。
【００８１】
いくつかの実施形態によれば、フィトエン、フィトフルエンまたはその任意の組み合わせは、トマト果実に由来する。他の実施形態によれば、フィトエン、フィトフルエンまたはその任意の組み合わせは、藻、好ましくはドナリエラ種の藻に由来する。
【００８２】
他の実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンは、生物から抽出されない、および／またはあるいは生物から単離または精製される。したがって、いくつかの実施形態によれば、本発明のフィトエンとフィトフルエンの組み合わせは、フィトエンとフィトフルエンに富む粉末を得るためにインタクトの生物またはその一部を乾燥させて得た、粉末の形態である。乾燥させて本発明のフィトエンとフィトフルエンの組み合わせ提供することができる生物またはその部分としては、例えば、藻類、真菌、微生物、植物、ならびに葉、果実、茎、根、および花などの植物部分が挙げられる。
【００８３】
いくつかの実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンに富む粉末は、さらに精製される。一部の実施形態によれば、精製はカラムクロマトグラフィーまたは超臨界二酸化炭素（ＳＣＣＯ２）による不純物の抽出によって行われる。
【００８４】
天然源からフィトエン、フィトフルエンまたはその組み合わせを得ることに加えて、これらのカロテノイドはまた、任意の公知の化学的もしくは生化学的方法によって、またはこれらのカロテノイドを遺伝子組換え源から回収することによって合成することができる。化学的に、フィトエンは、例えば、フィトエンシンターゼによって媒介され得る反応において、２つのゲラニルゲラニルピロリン酸（Ｃ−２０）から合成することができる。ゲラニルゲラニルピロリン酸は、メバロン酸の変換によって、またはピルビン酸とグリセルアルデヒド−３−リン酸の縮合によって、直接得ることができる。フィトフルエンは、フィトエン不飽和化酵素によって媒介され得る反応であるフィトエンの不飽和化によって合成することができる。
【００８５】
遺伝子組換え源もまた、フィトエンとフィトフルエンの原料になり得る。遺伝子改変表面は、例えば、カロテノイド産生生物においてフィトフルエンの下流で活性である酵素の変異誘発によって得ることができる。そのような合成されたフィトエン、フィトフルエンおよび他のカロテノイドは、本明細書において上記記載のカロテノイドを産生する生物から得られたこれらのカロテノイドの活性と実質的に類似の活性を有する。
【００８６】
組成物中のカロテノイド濃度は、当業者に公知の任意の方法によって測定することができる。一般的に、カロテノイド濃度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）方法によって、または分光光度計で測定される。
【００８７】
カロテノイドの吸収スペクトルは、著しく溶媒依存性であり、特定のカロテノイドの濃度の算出で用いられるカロテノイドの吸光係数（１ｃｍ光路長を有する分光光度計キュベット中の１％溶液の所定の波長での吸光度）は、溶媒が異なれば有意に変化する。特定の組成物中のカロテノイドを分析する場合、特に、分離手順の間に異なる溶媒が使用され得るＨＰＬＣによって分析を行う際には、このことに留意しなければならない。
【００８８】
本発明で開示されるフィトエンとフィトフルエンの組み合わせのモル量は、本明細書において上記のように測定される。
【００８９】
生物またはそのいずれの部分からの抽出、具体的には、フィトエンとフィトフルエンの抽出は、当業者に公知の任意の方法によって行うことができる。いくつかの実施形態によれば、生物またはその部分を溶媒に浸漬させて、生物からの油溶性成分を溶媒に抽出する。抽出は、前処置を適用した後に行なってもよい。例えば、原料がトマト果実の場合、前処理は、果実の粉砕および／またはホモジナイズを含む。抽出プロセスは、原料と溶媒の混合物を加熱するおよび／または撹拌することによって加速することができる。非抽出デブリの除去後に、溶媒を除去してもよい。抽出溶媒の例としては、メチルアルコール、エチルアルコール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノールおよび２‐ブタノールなどの低級モノアルコール；酢酸エチルなどの低級アルキルエステル；ベンゼン、ヘキサンおよびペンタンなどの炭化水素；アセトンおよびメチルエチルケトンなどのケトン；スクアラン、流動パラフィン、ポリデセンなどの油；ジエチルエーテル、テトラヒドロフランおよびジプロピルエーテルなどのエーテル；ならびにアセトニトリルが挙げられる。当業者に周知のように、１種の溶媒ならびに異なる溶媒の組み合わせを用いることができる。特定の実施形態によれば、溶媒はヘキサン、エタノール、酢酸エチルまたはその任意の組み合わせである。
【００９０】
次いで抽出物を、例えば、分子量分画、溶媒分画によって、イオン交換樹脂または吸収性媒体などの任意の媒体、超臨界ＣＯ２などを用いて油溶性抽出物を精製することによって、さらに精製することが可能である。特定の実施形態によれば、抽出溶媒を除去して、油溶性カロテノイド調製物を、化粧品または経口消耗品に適した担体と混合する。そのような担体は、液体製剤を得るための液体、または固形製剤を得るための固体であり得る。フィトエンとフィトフルエン抽出の例は、本発明の一部の発明者および共同研究者に付与された米国特許第６，３８３，４７４号に記載されている。
【００９１】
特定の実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせは、組成物内で投与される。
【００９２】
一部の実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせを含む組成物は、水溶性であるように製剤化される。
【００９３】
フィトエンとフィトフルエンの組み合わせを含む組成物は、少なくとも１つの脂肪酸、少なくとも１つのアミノ酸、少なくとも１つのペプチド、少なくとも１つのポリペプチド、少なくとも１つの糖化合物、フィトエンとフィトフルエン以外の少なくとも１つのカロテノイド、少なくとも１つの脂質化合物（リン脂質および脂肪を含む）、少なくとも１つの糖タンパク質、少なくとも１つのグリコシド、少なくとも１つのアルカロイド、少なくとも１つのテルペン化合物、少なくとも１つのフェノール化合物、少なくとも１つのポリケタイド、または上記のうちの任意の組み合わせからなる群から選択される追加の化合物をさらに含むことができる。さらなる実施形態によれば、該組成物、および少なくとも１つの脂肪酸、少なくとも１つのアミノ酸、少なくとも１つのペプチド、少なくとも１つのポリペプチド、少なくとも１つの糖化合物、フィトエンとフィトフルエン以外の少なくとも１つのカロテノイド、少なくとも１つの脂質化合物（リン脂質および脂肪を含む）、少なくとも１つの糖タンパク質、少なくとも１つのグリコシド、少なくとも１つのアルカロイド、少なくとも１つのテルペン化合物、少なくとも１つのフェノール化合物、少なくとも１つのポリケタイド、または上記のうちの任意の組み合わせは、付随しておよび／または交互に提供される。
【００９４】
本実施形態による組成物中に存在し得る脂肪酸、アミノ酸および糖化合物は、天然源もしくはＧＭＯ源から得てもよく、あるいは化学的に合成してもよい。
【００９５】
さらに他の実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエン以外のカロテノイドは、キサントフィル群のカロテノイドである。さらなる実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエン以外のカロテノイドは、非プロビタミンＡカロテノイドである。
【００９６】
一部の実施形態によれば、組成物は、プロビタミンＡカロテノイド化合物を本質的に含まない。これらの実施形態によれば、組成物は、組成物の総カロテノイド含有量のうち２０％未満のプロビタミンＡカロテノイド化合物、組成物の総カロテノイド含有量のうち１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満またはそれより少ないプロビタミンＡカロテノイド化合物を含む。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。一部の実施形態によれば、組成物は、組成物の総カロテノイド含有量のうち検出不能量から１０％までのプロビタミンＡカロテノイド化合物を含む。
【００９７】
一部の実施形態によれば、組成物はβ−カロテンを本質的に含まない。これらの実施形態によれば、組成物は、組成物の総カロテノイド含有量のうち２０％未満のβ−カロテン、組成物の総カロテノイド含有量のうち１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満またはそれより少ないβ−カロテンを含む。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。一部の実施形態によれば、組成物は、組成物の総カロテノイド含有量のうち検出不能量から１０％までのβ−カロテンを含む。
【００９８】
一部の実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせの含有量は、組成物の総カロテノイド含有量の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ超である。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。一部の実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせの含有量は、組成物の総カロテノイド含有量の約８０％〜１００％である。他の実施形態によれば、組成物中に存在する唯一のカロテノイドは、フィトエンとフィトフルエン（総カロテノイド含有量の１００％）である。
【００９９】
いくつかの実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせを含む組成物は、レズベラトロルを含まない。さらにまたはあるいは、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせを含む組成物は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＤ）を含まない。
【０１００】
いくつかの実施形態によれば、本発明の実施形態に記載のフィトエンとフィトフルエンの組み合わせを含む組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体または添加剤をさらに含む医薬組成物である。これらの実施形態によれば、医薬組成物は、治療有効量のフィトエンとフィトフルエンの組み合わせを含む。
【０１０１】
当業者は、治療有効量が、処置される感染症または状態、その重症度、使用される処置計画、用いられる薬剤の薬物動態、ならびに処置される患者（動物またはヒト）とともに変化することを認識するであろう。
【０１０２】
フィトエンとフィトフルエンの組み合わせを含む医薬組成物は、経口投与、経鼻投与、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、経皮投与、口腔内投与、皮下投与、坐剤よび局所投与のための種々の剤形で製剤化することができる。一般に、医薬組成物を経口投与可能剤形、経鼻投与可能剤形、または局所投与可能剤形で投与することが好ましい。一部の実施形態によれば、組成物は吸入によって投与される。当業者は、本発明の組成物を不安定にすることなく、またはその治療活性を損なうことなく、特定の投与経路のための多くの製剤を提供するために、本明細書の教示内で製剤を変更してもよい。
【０１０３】
本発明によって医薬組成物を調製するために、本発明によるフィトエンとフィトフルエンの組み合わせの有効量は、投与量を生成するための従来の薬剤配合技術に従って薬学的に許容される担体と十分に混合されることが好ましい。担体は、所望の投与、例えば、経口投与または非経口投与のための製剤形態によって多種多様な形態をとることができる。経口剤形で医薬組成物を調製する際に、任意の通常の医薬用媒体を用いてよい。したがって、懸濁剤、エリキシル剤及び液剤などの液体経口製剤の場合、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存剤、着色剤などを含む適切な担体および添加剤を用いることができる。散剤、錠剤、カプセル剤などの固形経口製剤、および坐剤などの固形製剤の場合、澱粉、糖担体、例えばデキストロース、マンニトール、ラクトースなど、および関連する担体、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などを含む、好適な担体および添加剤を用いることができる。必要に応じて、錠剤またはカプセル剤は、標準的な技術によって腸溶性または徐放性にすることができる。これらの剤形を使用することにより、患者におけるフィトエンとフィトフルエンのバイオアベイラビリティは顕著に上昇し得る。
【０１０４】
非経口製剤の場合、担体は通常、滅菌水または水性塩化ナトリウム溶液を含むが、分散を補助する成分を含む他の成分も含まれ得る。勿論、滅菌水が使用され、かつ無菌的に維持される場合、組成物および担体も滅菌されなければならない。懸濁注射剤も調製することができ、その場合には、適当な液状担体、懸濁化剤などを使用することができる。リポソーム懸濁剤も、薬学的に許容される担体を生成する従来の方法で調製することがでる。
【０１０５】
また、医薬組成物は、遅延放出、持続放出、持効性放出、徐放性、パルス放出、制御放出、加速高速放出、標的化放出、プログラム放出を含む改変型徐放剤形として、および胃内滞留型剤形として製剤化することができる。これらの剤形は当業者にとって既知の従来の方法および技術によって調製することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１版；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，２００５；Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒａｔｈｂｏｎｅら，編，Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，２００３；Ｖｏｌ．１２６を参照されたい）。
【０１０６】
いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は経口投与用の剤形で提供される。他の実施形態によれば、医薬組成物は非経口投与用の剤形で提供される。さらに他の実施形態によれば、医薬組成物は局所投与用の剤形で提供される。さらなる実施形態によれば、医薬組成物は鼻腔内投与用の剤形で提供される。さらに他の実施形態によれば、医薬組成物は吸入剤としての剤形で提供される。
【０１０７】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に提示する医薬組成物は、単位剤形または複数回剤形で提供されることができる。単位剤形は、本明細書で用いる場合、ヒト対象および動物対象への投与に適した物理的に個別の単位を指し、当技術分野で既知のように個別に包装されている。各単回用量は、必要な医薬担体または賦形剤に関連して所望の治療効果を引き起こすのに十分な既定量の有効成分、すなわち、本発明によるフィトエンとフィトフルエンの組み合わせを含む。単位剤形の例としては、アンプル剤、シリンジ、および個別に包装された錠剤とカプセル剤が挙げられる。単位剤形は、画分で、またはその複数で投与されることができる。複数回剤形は、分離した単位剤形で投与されるように単一容器に包装された複数の同一の単位剤形である。複数の剤形の例としては、バイアル、錠剤もしくはカプセル剤の瓶または所定量の液剤の瓶が挙げられる。
【０１０８】
本発明による治療上活性な製剤内に含まれるフィトエンとフィトフルエンの組み合わせの量は、感染を遅延させる、および／または対象の細胞もしくは組織内でウイルス感染に関連する少なくとも１つの細胞機構および／または応答に影響を及ぼす有効量である。特定の例示的な実施形態によれば、有効量は、インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症を遅延させる、または他の実施形態において、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）によって引き起こされる感染症を遅延させる。さらなる実施形態によれば、有効量は、対象におけるインフルエンザまたはＨＤＶ−１感染症を処置する、予防する、または発症を遅延させる。
【０１０９】
いくつかの実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせの有効量は、少なくとも０．０５μＭである。他の実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせの有効量は、少なくとも０．１μＭ、少なくとも０．２μＭ、少なくとも０．３μＭ、少なくとも０．４μＭ、少なくとも０．５μＭ、少なくとも１．０μＭ、少なくとも２．０μＭ、少なくとも４．０μＭ、少なくとも６．０μＭ、少なくとも８．０μＭ、または少なくとも１０．０μＭである。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態を表す。特定の例示的な実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせの有効量は、約０．０５μＭ〜約１００μＭである。さらなる特定の例示的な実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせの有効量は、約０．２μＭ〜約１００μＭである。
【０１１０】
活性なフィトエンとフィトフルエンの組み合わせまたはこれらを含む組成物の投与は、連続投与（静脈内点滴）から一日当たり数回の経口投与（例えば一日４回）の範囲であってもよく、他の投与経路の中でも、経口投与、局所投与、非経口投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、経皮投与（浸透増強剤を含むことができる）、口腔内投与、および坐剤投与を含むことができる。また、腸溶コーティング経口錠を用いて、経口投与経路からの化合物のバイオアベイラビリティを増強することが可能である。最も有効な剤形は、患者の疾患の重症度、患者の全身健康、年齢、性別および体重に依存する。投与が容易であること、および患者のコンプライアンスが良好であると予想されることから、経口剤形は特に好ましい。
【０１１１】
本発明の組成物は、宿主細胞に対する毒性が極めて低いことから、、ウイルス感染を防止する、もしくはウイルス感染に付随する臨床症状の出現を防止するために予防的に有利に用いることができ、またはウイルス感染の発症を遅延させるために、長期間連続投与することができる。このため、本発明はウイルス感染、特に、インフルエンザおよびＨＳＶ−１感染症の予防的処置の方法も包含する。本発明によるこの態様において、本組成物は、免疫不全または免疫無防備状態である患者、例えは、ＡＩＤＳ患者および移植患者、とりわけ妊婦、高齢者、および小児を含む患者において、ウイルス感染症または関連する疾患の発症を防止するまたは遅延させるために使用される。
【０１１２】
加えて、本発明の組成物は、単独で投与することができ、または追加の活性剤とともに投与することができる。いくつかの実施形態によれば、追加の活性剤は抗ウイルス効果を有することが知られている薬剤である。本発明の組成物は、単一組成物で、または個別の組成物で投与することができる。個別の組成物の投与は、同時に、付随して、連続しておよび／または交互であり得る。
【０１１３】
フィトエンとフィトフルエンの組み合わせまたはこれらを含む組成物は、研究目的の方法で、具体的には有効な抗ウイルス化合物をスクリーニングする方法でも用いることができる。そのような用途はフィトエンとフィトフルエンの組み合わせの特徴的な活性、自然細胞防御機構を調節するが、中心的な免疫系に影響を及ぼさない、あるいは影響があっても軽微であるという活性に基づいている。したがって、さらなる態様によれば、本発明は、単離細胞または組織のウイルス感染を遅延させる方法であって、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせまたはこれらを含む組成物の有効量を該細胞または組織に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態によれば、単離細胞または組織は、細胞培養または組織培養の一部を形成する。当業者に公知のフィトエンとフィトフルエンの組み合わせでの使用に適したいずれの組成物も、本発明の本方法に従って用いることができる。
【０１１４】
一部の実施形態によれば、培養物の細胞または組織のウイルス感染を遅延させることにより、ウイルス感染の発症の遅延がもたらされる。一部の実施形態によれば、細胞または組織のウイルス感染を遅延させることにより、細胞または組織内でウイルス感染に対する少なくとも１つの応答の調節がもたらされる。
【０１１５】
いくつかの実施形態によれば、細胞応答は、細胞もしくは組織へのウイルスの付着および／または侵入を防止するおよび／または阻害すること；ウイルスを含む対象の細胞内でウイルス複製を阻害すること；ウイルスを含む細胞におけるウイルスによる少なくとも１つの細胞機能の乗っ取りを阻害すること；ウイルスを含む細胞から、少なくとも１つのさらなる細胞へのウイルスの伝播を阻害すること；ウイルス感染を抑制する細胞機構に関連する少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導すること；およびウイルス感染を誘導する細胞機構に関連する少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害することからなる群から選択される。それぞれの可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１１６】
一部の実施形態によれば、単離細胞または組織のウイルス感染を遅延させるためのフィトエンとフィトフルエンの組み合わせまたはこれらを含む組成物を投与することは、試験化合物の抗ウイルス活性を決定する際の陽性対照を提供し、該試験化合物は同じ実験条件下で同じ細胞型または組織に投与される。一部の実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせまたはこれらを含む組成物は、ウイルス感染を遅延させる際に治療効果があることが判明した量で投与される。他の実施形態によれば、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせまたはこれらを含む組成物は、用いられる細胞型または組織に関して較正された量で投与される。
【０１１７】
以下の実施例は、本発明の一部の実施形態をより完全に例示するために示される。しかし、これらの実施例はいかなる場合も本発明の幅広い範囲を限定すると、解釈されてはならない。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される原理の多くの変更および修正を容易に考案することができる。
【実施例】
【０１１８】
実施例１：フィトエンとフィトフルエンを含む組成物の調製
フィトエンとフィトフルエンに富み、かつリコペンとζ−カロテンを本質的に枯渇させた独自のトマト植物の果物をトマトオレオレジンの調製のために使用した。トマトレオレジンは、トマト果実を有機溶媒（ヘキサン）を用いて抽出し、続いて有機溶媒を蒸発させることで調製した。
【０１１９】
得られた例示的なオレオレジンは、フィトエンとフィトフルエン（Ｐ＆Ｐ）を１０７ｍｇＰ＆Ｐ／ｍＬの混合濃度で、およびβ−カロテンを３．０４ｍｇ／ｍＬオレオレジンで含有し、他のカロテノイドは検出されないごくわずかな量で存在した。
【０１２０】
オレオレジンを、フィトエンとフィトフルエンの最終総濃度が１〜２ｍＭ（０．７５〜１．０ｍｇＰ＆Ｐ／ｍＬ）となるようにＤＭＳＯに溶解した。この組成物をＣＯＭＰ１と称し、０．１ｍＬサンプルに等分し、使用するまで−２０℃で保管した。使用後の残りは、繰り返し凍結融解を避けるために廃棄した。
【０１２１】
実施例２：フィトエンとフィトフルエンを含む組成物（ＣＯＭＰ１）が遺伝子発現に及ぼす効果
ケラチノサイトを２４ウェルに播種し、培地（ＥＧＦ  ０．２５ｎｇ／ｍＬ、下垂体抽出物（ＰＥ）２５μｇ／ｍＬ、ゲンタマイシン２５μｇ／ｍＬを補充したケラチノサイトＳＦＭ）で４８時間培養した。次いで培地をアッセイ培地（ゲンタマイシン２５μｇ／ｍＬを補充したケラチノサイトＳＦＭ）と交換し、細胞を２４時間インキュベートした。
インキュベーション後、細胞を上記記載のように調製したフィトエンとフィトフルエンを含む組成物（ＣＯＭＰ１）、または含まないもの（対照）のいずれかで処置した。組成物を、フィトエンとフィトフルエンの最終濃度が０．０５〜１μＭとなるように希釈して、細胞培地に加えた。次いで、細胞をさらに２４時間インキュベートした。対照はＤＭＳＯを０．００５％含有した。
【０１２２】
インキュベーション終了後、処理細胞および対照細胞からＲＮＡを抽出した。ＴｒｉＰｕｒｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用し、メーカーの説明書に従って各サンプルから全ＲＮＡを抽出した。次いで、抽出したＲＮＡを解析のために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ２１９遺伝子アレイチップに供した。３０，０００の検査した遺伝子の中で、ＣＯＭＰ１の投与後、３８４の遺伝子の発現が有意に調節されていたことが判明した。調節された遺伝子のうち、表１に記載した１２遺伝子は細胞の抗ウイルス活性に関連している。
【０１２３】
【表１】
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2018528174.tif 000004
2018528174.tif 000005
【０１２４】
フィトエンとフィトフルエンの投与後、遺伝子ＲＳＡＤ２、ＩＦＩＴ１およびＩＦＩＴ３の発現は上昇した。これらの遺伝子は、他の経路の中でも自然免疫応答のＩＮＦ−γ経路に関係している。この経路は、ウイルス感染時に、感染細胞の防御機構の一部として活性化されることが知られている。いかなる特定の理論または作用機構にも束縛されることを望むものではないが、フィトエンとフィトフルエンの投与後のこれらの遺伝子の発現の上昇は、ウイルス感染に対する防御機構を強化すると予想される。
【０１２５】
表１に記載の残りの遺伝子の発現は、減弱された。これらの遺伝子は、通常、宿主細胞においてウイルスがその侵入、複製および増殖のために利用する細胞経路に関係している。いかなる特定の理論または作用機構にも束縛されることを望むものではないが、これらの遺伝子の発現を減弱させることによって、フィトエンとフィトフルエンはウイルス増殖および伝播を妨害し得る。この効果によってもたらされ得る結果は、疾患転帰の減少であり得る。加えて、そのような細胞遺伝子の発現の減少は、細胞の生得の免疫応答から逃避するウイルス株と闘うことによってウイルスの増殖および伝播の機構に負の影響を及ぼす、フィトエンとフィトフルエンによる第二選択の抗ウイルス保護を提供する。
【０１２６】
実施例３：ＣＯＭＰ１の連続希釈
組成物の抗ウイルス効果を調べるための適用可能な範囲を決定するため、細胞障害活性を有するＣＯＭＰ１希釈の閾値を調べた。フィトエンとフィトフルエンの濃度に関して標準化した、ＣＯＭＰ１の連続希釈を行った。ＨＳＶ１の実験のために、ＣＯＭＰ１の第１の希釈は、１：５０であり、１〜２％ＤＭＳＯの最終濃度を生じた。この希釈液は、１０％の不活化仔ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する培地を使用して調製した。次いで、２％ＦＣＳを有する感染培地を使用して、連続二倍希釈液を調製し、１：１００から最高１：２５，６００まで（表２）の化合物希釈液を生成した。
【０１２７】
インフルエンザウイルスの場合、１０％不活化仔ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する培地を用いて、原料物質を１：１００に希釈し、１〜２％ＤＭＳＯの最終濃度を生じた。この原料物質を１：４に希釈し、この初回希釈液に、さらに９回連続二倍希釈を行って、１：２００から最高１：２５，６００まで（表２）の最終化合物希釈液を生成する。
【０１２８】
【表２】
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【０１２９】
実施例４：ＣＯＭＰ１の細胞障害性
ヒト・メイディン−ダービー・イヌ腎臓上皮細胞（ＭＤＣＫ細胞）を９６ウェルプレートで培養した。ＣＯＭＰ１の連続二倍希釈液を、インフルエンザウイルスの場合は１：４００〜１：２５，６００の範囲内で、ＨＳＶ−１の場合は１：１００〜１：２５，６００の範囲内（表２）で、培養細胞に３回の反復実験で適用した。類似のＤＭＳＯ希釈液で処置した細胞、ならびに無処置細胞を陰性対照として使用した。３日間のインキュベーション後、細胞を固定し、１％のｇｅｎｓｉｎバイオレットで染色した。色素強度を、分光光度計を用いて５９５ナノメートルの波長でのＯ．Ｄ（光学密度）として検出した。細胞障害性がないことは、ＣＯＭＰ１の異なる希釈液と比較して、無処理対照で観察された同様のＯ．Ｄ．値によって示された。上述の連続希釈液で検査した培養細胞に対してＣＯＭＰ１は細胞障害効果を示さなかった（図１）。１：４００の化合物希釈液は、抗ウイルス活性について検査した最初の希釈液であった（１：１００、１７．７μＭまたは１０μｇ／ｍＬのフィトエンとフィトフルエン）。
【０１３０】
実施例５：培養細胞におけるインフルエンザウイルス増殖に及ぼすＣＯＭＰ１の効果
２％ＦＣＳを含有する１００μＬのＤＭＥＭ培地に溶解したＭＤＣＫ細胞を９６ウェルプレートに播種した（１０，０００細胞／ウェル）。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で少なくとも５時間インキュベートした。最初のインキュベーション時間の後、本明細書において上記記載の実施例３および表２に記載のようにＣＯＭＰ１を調製して、希釈し、添加して、細胞を２４時間インキュベートした（希釈１：４００から最高１：２５，６００まで）。次いで、細胞に、１：２，０００（ウェル当たり５０プラーク形成単位（ＰＦＵ）の最終濃度）希釈したインフルエンザウイルスのＰＲ８Ｎ１Ｈ１株を感染させ、ＣＯＭＰ１の存在下で該ウイルスとともにさらに３日間インキュベートした。並行して、比較のため感染効率および最大ウイルス増殖を評価するために、単独のウイルス感染を実施した。ウイルスのエンベロープタンパク質に対するＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ウイルス粒子を決定し、実験のエンドポイントでウイルス量について定量的表現を得た。
【０１３１】
図２１は、ＣＯＭＰ１（表２の希釈１：４００から最高１：２５，６００まで）によるＭＤＣＫ細胞内のインフルエンザウイルス（Ｎ１Ｈ１ＰＲ８）の粒子数の阻害を表すグラフである。図１に示すように、上記実施例１に記載のように調製されたフィトエンとフィトフルエンの組み合わせを含む組成物（ＣＯＭＰ１）は、用量反応的にインフルエンザウイルスの繁殖を阻害し、４．４μＭのフィトエンとフィトフルエン濃度（希釈１：４００）では６０％超の阻害に達した。ＭＤＣＫ細胞に対する細胞障害活性は、フィトエンとフィトフルエンについて調べた希釈液のいずれについても観察されなかった（図２）。ＭＤＣＫ細胞にさらなるインフルエンザ株（Ｈ３Ｎ２）を感染させたときも、同様の結果を得た（データ不図示）。
【０１３２】
実施例６：培養細胞におけるＨＳＶ１の増殖に及ぼすＣＯＭＰ１の効果
ヒト腎臓（ＨｕＫｉ）細胞を、１０％ＦＣＳを含有するＭＥＭ  ＨＡＡ培地に播種した。１：２００、１：４００と１：８００のいくつかの希釈で（表２に示すフィトエンとフィトフルエンの最終濃度を得る）ＣＯＭＰ１を細胞に加えた。次に、細胞に、ＣＯＭＰ１の存在下でＨＳＶ１（ｖｒ−３−ｐ８）を０．１ＭＯＩ（感染多重度）で１時間感染させ、終了後、ウイルスを洗い流した。次いで、感染細胞をＣＯＭＰ１の存在下でさらに７２時間インキュベートした。次いで、感染細胞の上清を収集し、いくつかのウイルス力価を得るために連続１０倍希釈し、第２の感染実験で使用した。第２の感染を７２時間行い、プラークの形成によって実験を終了し、プラークから細胞が破裂してウイルスが外に放出された。次いで、ＣＯＭＰ１の存在下または非存在下でプラーク数を決定するために、半定量法を適用した。細胞を２０％のエタノールで固定し、１％ｇｅｎｓｉｎバイオレットで染色し、実証のために画像を撮った。有効なＨＳＶ１薬として知られているアシクロビルを実験の間、陽性対照として使用した。
【０１３３】
図３は、ＨＳＶ１増殖に及ぼすＣＯＭＰ１の阻害効果を示す、感染細胞のｇｅｎｓｉｎバイオレット染色である。図に示すように、ウイルス単独を感染させた細胞と比較すると、調べたすべての希釈液（１：２００、１：４００および１：８００）においてより少ないプラークが観察された。このプラークの減少は、測定したすべてのウイルス力価で決定された。このウイルスの効果をさらに定量化するために、各化合物希釈液で得られたウイルス量を収集し、プラークアッセイで使用した。感染の１日前に、ＨＫ細胞（２４ウェルプレート中の３＊１０５細胞／ウェル）を、１０％熱不活化ＦＢＳを補充したＭ１９９培地に播種した。細胞にＨＳＶ１を０．１ＭＯＩで感染させた（保存液のウイルス力価：１０８＊５．５ＰＦＵ／ｍＬ）。ウイルスを絶えず振盪させながら１時間、吸着させ、次いで除去した。細胞をＭ１９９培地で２回洗浄し、次いで２％ＦＢＳのみを補充した、またはＣＯＭＰ１の以下の保存液希釈液、１：２００、１：４００および１：８００を補充したＭ１９９培地を重層した。感染から４８時間後、プラークアッセイを用いて、Ｖｅｒｏ細胞上の上清の力価測定によってウイルス収量を決定した。次いで、形成されたプラークを計数し、次いでＣＯＭＰ１の阻害効果を定量化するためにこの計数値を用いた。図３に示すように、用いた希釈液に関係なく、ＣＯＭＰ１による処置は、ウイルス収量の約５０％の減少を引き起こした。フィトエンとフィトフルエン濃度を４．４μＭ超に上昇させると、ＨＳＶ１の繁殖に対するその阻害効果を増加させる可能性が最も高い。Ｈｕｋｉ細胞に対する細胞障害活性は示された希釈液についても観察されなかった（データ不図示）。
【０１３４】
実施例７：マウスにおけるインフルエンザウイルスのｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に及ぼすＣＯＭＰ１の効果
上記実施例１に記載のように調製したＣＯＭＰ１を本実験で用いた。雌性ＢＡＬＶ／ｃマウス（体重１４〜１６ｇ、５週齢）を用いた。インフルエンザウイルスＰＲ８Ｎ１Ｈ１による感染の８時間前に、各マウスに１：５０希釈液（上記表２のように３５．４μＭ）のＣＯＭＰ１  ５０μＬを点鼻投与した。８時間後に、イソフルランを用いてマウスを麻酔し、５０μＬのウイルス（マウス当たり４０ＰＦＵ）をマウスの鼻に滴下投与した、
【０１３５】
このアッセイに、３つの群を含んだ：
１．インフルエンザウイルスに感染させ、追加の処置を施さないマウス（「病気のマウス」）。
２．上記記載のようにＣＯＭＰ１で処置したマウス。
３．ＣＯＭＰ１で処置したマウスと同じプロトコルで、リン酸オセルタミビル（「タミフル」）で処置したマウス。
【０１３６】
感染から５日後に、再びマウスを麻酔して、各マウスから採取した両肺を、使用するまで−８０℃で保存した。肺内のウイルス濃度を決定するために、各マウスからの肺を、ＦＣＳを含まない１ｍＬのＤＭＥＭ中でＳＰＥＸボールを使用してホモジナイズした。得た懸濁液１００μＬを溶解し、Ｅａｓｙ  Ｍａｇを使用し、メーカーのプロトコルに従ってポリヌクレオチドを単離した。［発明者らに：ホモジナイゼーションおよび溶解プロトコルの両方をメーカーに提供すること］単離したポリヌクレオチドについて、インフルエンザヘマグルチニンをコードする遺伝子に特異的なプライマーを使用して、リアルタイム（ＲＴ）ＰＣＲをＴａｑＭａｎによって行った。予め決定した検量線を使用して、得た閾値サイクル（ｃｔ）値をウイルス濃度（コピー数／ｍＬ）に変換した。
【０１３７】
図４に明確に証明するように、フィトエンとフィトフルエンの組み合わせを３５．４μＭ（約２０μｇ／ｍＬ）の濃度で含むＣＯＭＰ１の阻害効果により、インフルエンザウイルスＰＲ８のｉｎ  ｖｉｖｏ複製が阻害されたが、この阻害は、インフルエンザ症状の予防および治療において有効であることが知られているリン酸オセルタミビルと同程度であった。フィトエンとフィトフルエンのそのような効果が示されるのはこれが初めてである。
【０１３８】
具体的な実施形態についての前述の説明は、本発明の全般的な性質を十分に明らかにしていることから、現在の知識を適用することにより、過度の実験を実施することなく、および一般的概念から逸脱することなく、そのような具体的な実施形態を種々の適用のために容易に修正および／または適応させることが可能であり、したがってそのような適応および修正は、本開示の実施形態の均等物の意味および範囲内であると理解されるべきであり、理解されることを意図する。本明細書で用いられる語法または用語は説明目的のものであり、限定を目的としたものではないことを理解すべきである。開示された種々の機能を実施するための手段、材料および工程は、本発明から逸脱することなく種々の代替形態をとることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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