(57)【要約】  糸状真菌細胞のゲノム中の標的部位でのゲノム改変のための組成物および方法が提供される。この方法および組成物は、糸状真菌宿主細胞ゲノム中の標的部位でのＤＮＡ配列の改変を促進するためのガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムに関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状真菌細胞のゲノム中の標的部位でＤＮＡ配列を改変する方法であって、
ａ）ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを糸状真菌細胞の集団に導入することであり、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび前記ガイドＲＮＡは、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが前記真菌細胞の前記ゲノム中の標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、導入すること、ならびに
ｂ）前記集団から、前記標的部位で前記ＤＮＡ配列の改変を有する少なくとも１個の真菌細胞を同定すること
を含み、
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、前記ガイドＲＮＡまたは両方が前記真菌細胞の集団に一時的に導入される、
方法。
【請求項２】
前記標的部位での前記ＤＮＡ配列の改変が、１個または複数個のヌクレオチドの欠失、１個または複数個のヌクレオチドの挿入、１個または複数個のヌクレオチドの置換およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼを前記真菌細胞の集団に導入することを、遺伝子導入技術、形質導入技術、形質転換技術、電気穿孔技術、粒子衝突（微粒子銃粒子送達）技術および細胞融合技術からなる群から選択される方法を使用して達成する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ガイドＲＮＡを前記真菌細胞の集団に導入することを、遺伝子導入技術、形質導入技術、形質転換技術、電気穿孔技術、粒子衝突（微粒子銃粒子送達）技術および細胞融合技術からなる群から選択される方法を使用して達成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記同定する工程が、前記標的部位での前記ＤＮＡ配列の改変を選択するためのまたはスクリーニングするための条件下で前記工程（ａ）からの真菌細胞の集団を培養することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記同定する工程が、不安定な形質転換体をスクリーニングするための条件下で前記工程（ａ）からの細胞の集団を培養することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣａｓエンドヌクレアーゼがＣａｓ９エンドヌクレアーゼまたはその変異体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはその変異体が、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、Ｎ．メニンジティデス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種、Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）およびパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種、Ｐ．ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）からなる群から選択される種由来の完全長Ｃａｓ９またはこの機能的断片を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはその変異体が、配列番号１〜７のいずれか一つに対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記導入する工程が、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを含むＤＮＡ構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記導入する工程が、前記ガイドＲＮＡ用の発現カセットを含むＤＮＡ構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼを直接導入することを含む、請求項１〜９および１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記ガイドＲＮＡを直接導入することを含む、請求項１〜１０および１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットが、前記真菌細胞中での発現に最適化されているＣａｓコーディング配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｃａｓコーディング配列が、配列番号８に対して少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド配列を含むＣａｓ９コーディング配列である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが核局在化シグナルに作動可能に連結されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ガイドＲＮＡ用の発現カセットが、ユーサコマイセート（Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）中でまたはペジゾマイセート（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｅｔｅ）中で機能するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターを含み、前記プロモーターが前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロモーターがトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記プロモーターが、配列番号１１または１２に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ガイドＲＮＡ用の発現カセットが、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子由来のイントロン配列を有するガイドＲＮＡコーディングＤＮＡを含む、請求項１１および１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するイントロン配列が、配列番号９０に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記糸状真菌細胞がユウミコチニア（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）真菌細胞またはペジゾミコチニア（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）真菌細胞である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記糸状真菌細胞が、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）およびエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）からなる群から選択される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記標的部位が、オープンリーディングフレーム、プロモーター、制御配列、ターミネーター配列、制御エレメント配列、スプライス部位、コーディング配列、ポリユビキチン化部位、イントロン部位およびイントロン増強モチーフからなる群から選択される目的の遺伝子の領域内に位置する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記導入する工程が、（ｉ）前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼを安定的に発現する親真菌細胞集団を得ること、および（ｉｉ）前記親真菌細胞集団に前記ガイドＲＮＡを一時的に導入することを含む、請求項１、２、４〜９、１１、１３および１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記導入する工程が、（ｉ）前記ガイドＲＮＡを安定的に発現する親真菌細胞集団を得ること、および（ｉｉ）前記親真菌細胞集団に前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼを一時的に導入することを含む、請求項１〜３、５〜１０、１２および１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的部位での前記ＤＮＡ配列の改変が相同組換えに起因しない、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法が前記真菌細胞の集団にドナーＤＮＡを導入することを含まない、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか一項の記載の方法により製造されている組換え真菌細胞。
【請求項３０】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはその変異体をコードする、操作された核酸であって、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはその変異体が、配列番号１〜７のいずれか一つに対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記核酸が、配列番号８に対して少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、操作された核酸。
【請求項３１】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼが糸状真菌細胞のゲノム中の標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にするガイドＲＮＡをコードする、操作された核酸であって、前記ガイドＲＮＡをコードする核酸が、ユーサコマイセート（Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）中でまたはペジゾマイセート（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｅｔｅ）中で機能するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターを含み、前記プロモーターがトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来する、操作された核酸。
【請求項３２】
前記プロモーターが、配列番号１１または１２に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３１に記載の操作された核酸。
【請求項３３】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼが糸状真菌細胞のゲノム中の標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にするガイドＲＮＡをコードする、操作された核酸であって、前記ガイドＲＮＡをコードする核酸が、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するイントロン配列を有するガイドＲＮＡコーディングＤＮＡを含む、操作された核酸。
【請求項３４】
前記トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するイントロン配列が、配列番号９０に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３３に記載の操作された核酸。
【請求項３５】
前記ガイドＲＮＡをコードする核酸が、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するプロモーターとトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するイントロン配列との両方を含み、前記プロモーターが、配列番号１１または１２に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するイントロン配列が、配列番号９０に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３１または３３に記載の操作された核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０９３９１８、ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０９３９１６およびＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０９３９１４（全てが２０１４年１２月１６日に出願されている）に対する優先権を主張する。
【０００２】
配列表
（３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）に従って）ＥＦＳを介して提出した配列表を参照により本明細書に援用する。ＥＦＳを介して提出した配列表テキストファイルには、２０１５年１２月１３日に作成したファイル「４０５３２−ＷＯ−ＰＣＴ−６＿２０１５−８６８  Ｆｉｎａｌ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」（１５１キロバイトのサイズである）が含まれている。
【背景技術】
【０００３】
細菌および古細菌は、配列特異的にＤＮＡ中に二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｅａｋ）を導入することができる群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムと呼ばれる適応免疫防御を進化させている。Ｃａｓシステムは、短いＲＮＡ配列（ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ）と（ｃｒＲＮＡにおいて可変ターゲティングドメインと呼ばれる一部に対する相同性によって）特定のＤＮＡ配列を標的とするＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）とを含むリボ核タンパク質複合体の活性により機能を発揮し、標的中で二本鎖を切断する。ＣＲＩＳＰＲの遺伝子座は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で初めて認識され（Ｉｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１６９：５４２９−５４３３、Ｎａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１７１：３５５３−３５５６）、その後、同様の散在した短い配列反復が多くの細菌種（ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）が挙げられるがこれらに限定されない）で同定された（Ｇｒｏｅｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：１０５７−１０６５、Ｈｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５：２５４−２６３、Ｍａｓｅｐｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３０７：２６−３０、Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７：８５−９３）。
【０００４】
ゲノムＤＮＡ中における特定の標的部位での切断の誘導を使用して、この部位でまたはこの部位付近で改変を導入することができることは公知である。例えば、遺伝子ターゲティングのための相同組換えは、標的とするＤＮＡ部位が二本鎖切断を含む場合に増強されることが分かっている（例えばＲｕｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２：５１９−５３４、Ｓｍｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：５０１２−５０１９を参照されたい）。Ｃａｓシステムの部位特異的性質を前提して、例えば哺乳動物細胞中での、このシステムに基づくゲノム改変／操作技術が説明されている（例えば「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」という表題のＨｓｕ  ｅｔ  ａｌ．；Ｃｅｌｌ  ｖｏｌ．１５７，ｐ１２６２−１２７８，５  Ｊｕｎｅ  ２０１４を参照されたい）。Ｃａｓベースのゲノム操作の力は、ｃｒＲＮＡのＤＮＡターゲティング領域（可変ターゲティングドメイン）がゲノム中の所望の標的部位に対して相同である組換えｃｒＲＮＡ（または同等に機能するポリヌクレオチド）を設計し、この組換えｃｒＲＮＡとＣａｓエンドヌクレアーゼとを宿主細胞中で（あらゆる好都合な手段によって）機能的複合体へと組み合わせることにより、複雑なゲノム内での任意の特定の位置を事実上標的とする能力に由来する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Ｃａｓベースのゲノム操作技術は多くの異なる宿主細胞型に適用されているが、真菌細胞中でのそのようなシステムの効率的な使用は困難であることが判明している。そのため、真菌細胞中でゲノム標的部位を改変するための／変更するための効率的で効果的なＣａｓベースのゲノム操作法および組成物を開発することが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
真菌細胞（例えば糸状真菌細胞）のゲノム中の標的部位でＤＮＡ配列を改変するためにガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを用いることに関する組成物および方法が提供される。
【０００７】
本開示の態様は、真菌細胞のゲノム中の標的部位でＤＮＡ配列を改変する方法に関する。一部の実施形態では、この方法は、ａ）ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを真菌細胞の集団に導入することであって、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが真菌細胞のゲノム中の標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、導入すること、ならびにｂ）この集団から、標的部位でＤＮＡ配列の改変を有する少なくとも１個の真菌細胞を同定することを含み、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡまたは両方が真菌細胞の集団に一時的に導入される。
【０００８】
一態様では、本開示は、真菌細胞のゲノム中の標的部位でＤＮＡ配列を改変する方法であって、ａ）ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを真菌細胞に導入することであり、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが真菌細胞のゲノム中の標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、導入すること、ならびにｂ）真菌細胞中で標的部位でのＤＮＡ配列の改変が起きているかどうかを同定することを含み、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡまたは両方が真菌細胞に一時的に導入される、方法に関する。
【０００９】
別の態様では、本開示は、真菌細胞のゲノム中の標的部位でＤＮＡ配列を改変する方法に関する。一部の実施形態では、この方法は、ａ）ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを真菌細胞の集団に導入することであって、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが真菌細胞のゲノム中の標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、導入すること、ならびにｂ）この集団から、標的部位でＤＮＡ配列の改変を有する少なくとも１個の真菌細胞を同定することを含み、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡの両方が真菌細胞の集団に非一時的に導入される。
【００１０】
更に別の態様では、本開示は、真菌細胞のゲノム中の標的部位でＤＮＡ配列を改変する方法であって、ａ）ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを真菌細胞に導入することであり、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが真菌細胞のゲノム中の標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、導入すること、ならびにｂ）真菌細胞中で標的部位でのＤＮＡ配列の改変が起きているかどうかを同定することを含み、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡの両方が真菌細胞に非一時的に導入される、方法に関する。
【００１１】
本明細書で説明する方法のある特定の実施形態では、標的部位でのＤＮＡ配列の改変は、１個または複数個のヌクレオチドの欠失、１個または複数個のヌクレオチドの挿入、１個または複数個のヌクレオチドの置換およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００１２】
ある特定の実施形態では、同定する工程は、標的部位でのＤＮＡ配列の改変を選択するためのまたはスクリーニングするための条件下で工程（ａ）からの真菌細胞の集団または真菌細胞を培養することを含む。ある特定の実施形態では、同定する工程は、不安定な形質転換体をスクリーニングするための条件下で工程（ａ）からの真菌細胞の集団または真菌細胞を培養することを含む。
【００１３】
いくつかの異なる型のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが説明されており、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムおよびＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに分類され得る（例えばＬｉｕ  ａｎｄ  Ｆａｎ，ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ：ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２０１４）８５：２０９−２１８での説明を参照されたい）。ある特定の態様では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはこの多様体はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＣａｓ９エンドヌクレアーゼである。このＣａｓ９エンドヌクレアーゼはあらゆる好都合なＣａｓ９エンドヌクレアーゼであることができ、この好都合なＣａｓ９エンドヌクレアーゼとして、下記の細菌種由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよびこの機能的断片が挙げられるがこれらに限定されない：ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種（例えばＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種（例えばＮ．メニンジティデス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ））、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種（例えばＦ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））ならびにパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種（例えばＰ．ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ））。Ｃａｓ９に関して多くのその他の種を使用することができる。例えば、機能的Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの多様体であって、配列番号１〜７のいずれか一つに対して少なくとも７０％の同一性を有し、例えば配列番号１〜７のいずれか一つに対して少なくとも８０％の同一性を有し、少なくとも９０％の同一性を有し、少なくとも９５％の同一性を有し、少なくとも９６％の同一性を有し、少なくとも９７％の同一性を有し、少なくとも９８％の同一性を有し、少なくとも９９％の同一性を有し、例えば最大で１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む機能的Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの多様体を用いることができる。その他の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはこの多様体はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９とは異なる特徴により頑強なＤＮＡ干渉を媒介する。Ｃｐｆ１はｔｒａｃｒＲＮＡを欠いており、Ｔリッチなプロトスペーサー隣接モチーフを用いる。Ｃｐｆ１は、千鳥足状のＤＮＡ二本鎖切断を介してＤＮＡを切断する。例えばＺｅｔｓｃｈｅ  ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１５）１６３：７５９-７７１を参照されたい。
【００１４】
ＣａｓエンドヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡを真菌細胞の集団に導入することを、遺伝子導入技術、形質導入技術、形質転換技術、電気穿孔技術、粒子衝突（微粒子銃粒子送達（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ））技術および細胞融合技術等のあらゆる好都合な方法を使用して達成することができる。
【００１５】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡを真菌細胞に導入することは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセット、ガイドＲＮＡ用の発現カセットまたは両方を含む１種または複数種のＤＮＡ構築物を真菌細胞に導入することを含む。１種または複数種のＤＮＡ構築物がいったん真菌細胞中に入ると、Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡが発現される。ある特定の実施形態では、このＤＮＡ構築物は線状ＤＮＡ構築物である。ある特定の実施形態では、このＤＮＡ構築物は環状ＤＮＡ構築物である。ある特定の実施形態では、このＤＮＡ構築物は組換えＤＮＡ構築物である。
【００１６】
ある特定の実施形態では、導入する工程は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチド、ガイドＲＮＡまたは両方を真菌細胞に直接導入することを含む。直接導入とＤＮＡ構築物の使用との任意の組み合わせを用いることができる（例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを有するＤＮＡ構築物を真菌細胞に導入し、同時にまたは望ましい場合には連続的に、この細胞にガイドＲＮＡを直接導入する）。
【００１７】
本明細書で説明する方法のある特定の実施形態では、ＤＮＡ構築物中のＣａｓ発現カセットは、真菌細胞中での発現に最適化されているＣａｓエンドヌクレアーゼコーディング遺伝子を含む。例えば、糸状真菌細胞中での発現に最適化されているＣａｓエンドヌクレアーゼコーディング遺伝子は、配列番号８（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９（配列番号１）をコードする）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有し、例えば配列番号８に対して少なくとも８０％の同一性を有し、少なくとも９０％の同一性を有し、少なくとも９５％の同一性を有し、少なくとも９６％の同一性を有し、少なくとも９７％の同一性を有し、少なくとも９８％の同一性を有し、少なくとも９９％の同一性を有し、例えば最大で１００％の同一性を有する配列を含む。
【００１８】
ある場合では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、１種または複数種の核ターゲティングシグナル（核局在化シグナル／配列とも称される、ＮＬＳ）に作動可能に連結されている。配列番号９および配列番号１０はそれぞれ、Ｎ末端およびＣ末端でＮＬＳ配列を有する糸状真菌細胞最適化Ｃａｓ９遺伝子の一例とコードされるアミノ酸配列とを提供する。真核生物では多くの異なるＮＬＳが知られている。このＮＬＳとして、１分節（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）型、２分節（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）型および３分節（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）型が挙げられる。あらゆる好都合なＮＬＳを使用することができるが、例としてＳＶ４０  ＮＬＳ、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｂｌｒ２（青色光制御因子（ｂｌｕｅ  ｌｉｇｈｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）２）遺伝子に由来するＮＬＳまたは両方の組み合わせが挙げられる１分節型がやや好都合である。一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物は組換えＤＮＡ構築物であり、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの多様体をコードする糸状真菌細胞最適化ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む。
【００１９】
本明細書で説明する方法のある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡコーディング配列を含むおよびガイドＲＮＡを発現することができるＤＮＡ構築物または発現カセットを真菌細胞の集団または真菌細胞に導入する。一部の実施形態では、このＤＮＡ構築物または発現カセットは、ユーサコマイセート（Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）中でまたはペジゾマイセート（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｅｔｅ）中で機能するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターを含み、このプロモーターは、ガイドＲＮＡコーディング配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、このプロモーターはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来する。ある特定の実施形態では、このプロモーターは、配列番号１１または１２に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、このプロモーターは配列番号１１または１２の配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ用のＤＮＡ構築物または発現カセットは、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子由来のイントロン配列を有するガイドＲＮＡコーディングＤＮＡを含む。一部の実施形態では、このトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するイントロン配列は、配列番号９０に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、このトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するイントロン配列は配列番号９０の配列を含む。
【００２０】
ある特定の実施形態では、真菌細胞のゲノム中の標的部位でのＤＮＡ配列の改変は、ドナーＤＮＡの非存在下または真菌細胞にも導入されるドナーＤＮＡの存在下のいずれかで非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に起因する。ある特定のその他の実施形態では、標的部位でのＤＮＡ配列の改変は相同組換えに起因し、任意選択で真菌細胞にも導入されるドナーＤＮＡの存在を介する相同組換えに起因する。一部の実施形態では、この改変（例えば、１個もしくは複数個のヌクレオチドの欠失、１個もしくは複数個のヌクレオチドの挿入、目的のタンパク質をコードする発現カセットの挿入または１個もしくは複数個のヌクレオチドの置換）はドナーＤＮＡ中に元々存在する。一部の実施形態では、ドナーＤＮＡは、染色体ＤＮＡにおいて少なくともＣａｓ／ガイドＲＮＡ複合体の標的部位の両側上の領域またはこの標的部位での領域またはこの標的部位付近の領域に対して相同な配列を有する。一部のその他の実施形態では、ドナーＤＮＡは、染色体ＤＮＡにおいてＣａｓ／ガイドＲＮＡ複合体の標的部位の両側上の領域またはこの標的部位での領域またはこの標的部位付近の領域に対して相同な配列を有しない。ある特定の実施形態では、ドナーＤＮＡは、目的のタンパク質をコードする発現カセットを含む。ある特定の実施形態では、発現カセットによりコードされる目的のタンパク質は酵素である。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マンナナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、これらの多様体、これらの機能的断片またはこれらの内の２種以上のハイブリッドもしくは混合物である。更にその他の特定の実施形態では、目的のタンパク質は、ペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原、これらの多様体、これらの機能的断片またはこれらの内の２種以上のハイブリッドもしくは混合物である。
【００２１】
ドナーＤＮＡと真菌細胞のゲノムとの間の相同組換えが望ましい、ある特定の実施形態では、この真菌細胞中のＮＨＥＪ経路は機能しておらず（不活性化されており）、または低下しており、例えばＮＨＥＪ経路の１種または複数種の成分が不活性化されている、機能していない、またはこの成分の活性が低下している（例えばｋｕ８０、ｋｕ７０、ｒａｄ５０、ｍｒｅ１１、ｘｒｓ２、ｌｉｇ４、ｘｒｓまたはこれらの組み合わせ）。例えば、この真菌細胞は、不活性化されている／活性が低下している形態のｋｕ８０を有することができる。ある特定のその他の実施形態では、この真菌細胞中のＮＨＥＪ経路は機能している。
【００２２】
本方法で使用される真菌細胞は糸状真菌細胞種であることができる。ある特定の実施形態では、この真菌細胞はユウミコチニア（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）真菌細胞またはペジゾミコチニア（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）真菌細胞である。一部の実施形態では、この真菌細胞は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、サーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）およびエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）から選択される。糸状真菌トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、Ｐ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、Ｍ．サーモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、サーモマイセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）が特に興味深い。酵母種等のその他の真菌細胞も用いることができる。
【００２３】
本開示の方法の使用者により選択される標的部位は、オープンリーディングフレーム、プロモーター、制御配列、ターミネーター配列、制御エレメント配列、スプライス部位、コーディング配列、ポリユビキチン化部位、イントロン部位およびイントロン増強モチーフからなる群から選択される目的の遺伝子の領域内に位置することができる。目的の遺伝子の例として、アセチルエステラーゼをコードする遺伝子、アミノペプチダーゼをコードする遺伝子、アミラーゼをコードする遺伝子、アラビナーゼをコードする遺伝子、アラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子、キシペプチダーゼをコードする遺伝子、カタラーゼをコードする遺伝子、セルラーゼをコードする遺伝子、キチナーゼをコードする遺伝子、クチナーゼをコードする遺伝子、デオキシリボヌクレアーゼをコードする遺伝子、エピメラーゼをコードする遺伝子、エステラーゼをコードする遺伝子、α−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、α−グルカナーゼをコードする遺伝子、グルカンリアーゼをコードする遺伝子、エンド−β−グルカナーゼをコードする遺伝子、グルコアミラーゼをコードする遺伝子、グルコースオキシダーゼをコードする遺伝子、α−グルコシダーゼをコードする遺伝子、β−グルコシダーゼをコードする遺伝子、グルクロニダーゼをコードする遺伝子、ヘミセルラーゼをコードする遺伝子、ヘキソースオキシダーゼをコードする遺伝子、ヒドロラーゼをコードする遺伝子、インベルターゼをコードする遺伝子、イソメラーゼをコードする遺伝子、ラッカーゼをコードする遺伝子、リパーゼをコードする遺伝子、リアーゼをコードする遺伝子、マンノシダーゼをコードする遺伝子、オキシダーゼをコードする遺伝子、オキシドレダクターゼをコードする遺伝子、ペクテートリアーゼをコードする遺伝子、ペクチンアセチルエステラーゼをコードする遺伝子、ペクチンデポリメラーゼをコードする遺伝子、ペクチンメチルエステラーゼをコードする遺伝子、ペクチン分解酵素をコードする遺伝子、ペルオキシダーゼをコードする遺伝子、フェノールオキシダーゼをコードする遺伝子、フィターゼをコードする遺伝子、ポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子、プロテアーゼをコードする遺伝子、ラムノ−ガラクツロナーゼをコードする遺伝子、リボヌクレアーゼをコードする遺伝子、トランスフェラーゼをコードする遺伝子、輸送タンパク質をコードする遺伝子、トランスグルタミナーゼをコードする遺伝子、キシラナーゼをコードする遺伝子、ヘキソースオキシダーゼをコードする遺伝子およびこれらの組み合わせが挙げられる。細胞シグナル伝達、形態、増殖速度およびタンパク質分泌に関与する遺伝子に加えて、転写因子、リプレッサー等の制御タンパク質をコードする標的遺伝子、キナーゼ等のその他のタンパク質を改変するタンパク質をコードする標的遺伝子、翻訳後改変（例えばグリコシル化）に関与するタンパク質をコードする標的遺伝子にも、Ｃａｓ媒介型編集を施すことができる。これに関して制限は意図されていない。
【００２４】
本方法の一部の実施形態では、目的の部位でゲノム改変を有する真菌細胞を同定する工程は、標的部位での改変を選択するためのまたはスクリーニングするための条件下で工程（ａ）からの細胞の集団を培養することを含む。そのような条件として、抗生物質選択条件、栄養要求性細胞（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｃｅｌｌ）を選択するためのまたはスクリーニングするための条件および同類のものが挙げられる。
【００２５】
ある特定の実施形態では、導入する工程は、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼを安定的に発現する親真菌細胞集団を得ること、および（ｉｉ）この親真菌細胞集団にガイドＲＮＡを一時的に導入することを含む。逆を言えば、導入する工程は、（ｉ）ガイドＲＮＡを安定的に発現する親真菌細胞集団を得ること、および（ｉｉ）この親真菌細胞集団にＣａｓエンドヌクレアーゼを一時的に導入することを含むことができる。
【００２６】
本開示の態様は、上記で説明した方法により製造されている組換え真菌細胞と、この方法の実施において親細胞として使用するための組換え真菌細胞とに関する。
【００２７】
本開示の態様は、上記で説明したまたは本明細書で開示する方法で使用することができる、操作された核酸（例えば組換えＤＮＡ構築物）を更に含む。一態様では、この操作された核酸は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはこの多様体をコードする。一部の実施形態では、この操作された核酸によりコードされるＣａｓエンドヌクレアーゼまたはこの多様体は、配列番号１〜７のいずれか一つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、この操作された核酸は、糸状真菌中での発現にコドン最適化されているポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、この操作された核酸は、配列番号８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、この核酸は配列番号８の配列を含む。一部の実施形態では、この操作された核酸は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはこの多様体の発現用のプロモーターを含む。
【００２８】
別の態様では、この操作された核酸はガイドＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡをコードする核酸は、糸状真菌細胞ユーサコマイセート（Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）中でまたはペジゾマイセート（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｅｔｅ）中で機能するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターを含む。一部の実施形態では、このプロモーターはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来する。特定の実施形態では、このプロモーターは、配列番号１１もしくは１２に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列またはこの機能的断片を含む。特定の実施形態では、この核酸は配列番号１１または１２の配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡコーディング核酸は、少なくとも１種の異種配列またはガイドＲＮＡコーディング配列に作動可能に連結されているプロモーターを有し、このプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）依存性プロモーターとして糸状真菌細胞中で機能して異種核酸を発現させ、配列番号１１もしくは１２に対して少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％もしくはこれらの間の任意の値）の同一性を有するポリヌクレオチド配列またはこの機能的断片を含む。ある特定の実施形態では、この異種配列またはガイドＲＮＡコーディング配列は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するイントロン配列を含む。特定の実施形態では、この異種配列またはガイドＲＮＡコーディング配列は、Ｕ６  Ｂ−Ｂｏｘ配列（例えば、ＧＴＴＣＧＴＴＴＣのポリヌクレオチド配列を有するＢ−Ｂｏｘ配列）を含むイントロンを含む。このイントロンは、配列番号９０に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を有することができる。特定の実施形態では、このイントロンは、配列番号９０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、この核酸は配列番号９０の配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡコーディング核酸は、本明細書で説明するトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターおよびイントロン配列の両方を含む。一部の実施形態では、操作された核酸または組換えＤＮＡ構築物は、異種配列の下流の転写ターミネーター配列（例えば、配列番号９１に記載の配列またはこの誘導体）を更に含む。
【００２９】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする操作された核酸および／またはＲＮＡをコードする操作された核酸に含まれるプロモーターは糸状真菌細胞に由来する。この糸状真菌細胞を多種多様な糸状真菌細胞のいずれかから選択することができ、具体例としてＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）が挙げられる。ある場合には、このプロモーターはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）プロモーターに由来する。
【００３０】
プロモーターに作動可能に連結されている組換えＤＮＡ構築物は機能的ＲＮＡをコードすることができる。ある特定の態様では、例えば、異種配列はガイドＲＮＡポリヌクレオチドをコードし、例えば、（ｉ）標的ＤＮＡ中のポリヌクレオチド配列に相補的である第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメイン）と（ｉｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメイン（ＣＥＲドメイン）とを含むガイドＲＮＡをコードする。
【００３１】
本開示の態様は、本明細書で説明する少なくとも１種の異種配列に作動可能に連結されているプロモーターを有する組換えＤＮＡ構築物を有するベクターを含む。このベクターはＣａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを更に含むことができる。
【００３２】
本開示は、本明細書で説明する少なくとも１種の異種配列に作動可能に連結されているプロモーターを有する組換えＤＮＡ構築物を含む糸状真菌細胞を更に提供する。ａ）少なくとも１種の異種配列に作動可能に連結されているプロモーターを有する組換えＤＮＡ構築物（例えばベクター）を糸状真菌細胞に導入すること、およびｂ）組換えＤＮＡ構築物（またはベクター）中の異種配列の発現を可能にする条件下で工程ａ）の糸状真菌細胞を培養することによる、糸状真菌細胞中で異種核酸を発現させる方法。
【００３３】
本開示の方法および組成物の追加の実施形態を本明細書で示す。
【００３４】
下記の詳細な説明および本出願の一部を形成する添付図面から、本開示をより完全に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】推定されるＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２２）を表す図である。ＴＡＴＡボックス（下線を引いている）、転写開始部位（下向きの矢印）、Ａ−ボックス（下線を引いている）、イントロン（前向きの矢印）、Ｂ−ボックス（下線を引いている、遺伝子のイントロン内）、ヒトＵ６遺伝子と同一である配列（太字のイタリック体）およびターミネーター（下線を引いている）等の目的のエレメントを示す。
【図２】ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ−Ｍｏ  Ｃａｓプラスミドの概略を示す図である。
【図３】ｐ２１９Ｍプラスミドの概略を示す図である。
【図４】ＰＣＲプライマー部位およびイントロン領域を示す、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ａｄ３Ａ遺伝子の概略を示す図である。
【図５】ＰＣＲプライマー領域およびイントロン領域を示す、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ遺伝子（ＴｒＧＡ）の概略を示す図である。
【図６】テロメア配列を含むｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇＭｏＣａｓｇＰｙｒ２ＴＳ６プラスミドの概略を示す図である。
【図７】ｐＥＴ３０ａ−ＳｐｙＣａｓ９のプラスミドマップを示す図である。
【図８Ａ−８Ｂ】図８Ａは、配列パターンＧＧＮ１８ＮＧＧまたはＧＮ１９ＮＧＧと一致する任意の有望なガイドＲＮＡ可変ターゲティング（ＶＴ）ドメインのフレキシブルクローニングに使用するｐＳＭ１ガイドのプラスミドマップを示す図である。図８Ｂは、パネルＡでのｐＳＭ１ガイドプラスミドの単分子ガイドＲＮＡ発現カセット領域のより詳細なマップを示す図であり、Ｔ７プロモーター、転写開始部位、Ｂｓａ１のＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ部位（例えばアニールされたオリゴを使用して、所望のＶＴドメインを挿入するために使用される）、ＣＥＲドメイン（転写ターミネーター配列ＴＴＴＴＴを含む、図示しない）および単分子ガイドＲＮＡをコードする完全領域の配置を示す。制限酵素ＤＲＡ１を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写前にこのプラスミドを線形化する。転写されると、ガイドＲＮＡのＣＥＲドメインは、同種のＣａｓ９ポリペプチドに結合することができるヘアピン構造を形成することができ、そのため、ＤＮＡ標的部位（ＶＴドメインおよび適切なＰＡＭ部位に相補的な配列を有する）で二本鎖切断を導入することができる機能的Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体が生成される。
【図９Ａ】線形化ＤＮＡ基質の生成で使用したｐＸＡ３プラスミドのマップを示す図である。このプラスミドはｘｙｒ１遺伝子のコーディング配列（配列番号８９）を含み、ＤＮＡ基質を製造するために、このプラスミドを制限酵素ＮｄｅＩによる消化によって線形化した。
【図９Ｂ】ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９切断アッセイの結果を示す写真である（臭化エチジウム染色で可視化した）。ｘｙｒ１に特異的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイのアガロースゲル分析をこの図で示す。レーン１は分子量マーカーを示し；レーン２は、Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡの非存在下での線形化プラスミド基質（ｘｙｒ１遺伝子を含む）を示し；レーン３は、Ｃａｓ９とｘｙｒ１  Ｔａ  ＶＴドメインを有するガイドＲＮＡとの存在下でのプラスミド基質の切断を示し；レーン４は、Ｃａｓ９とｘｙｒ１  Ｔｃ  ＶＴを有するガイドＲＮＡとの存在下でのプラスミド基質の切断を示す。線形化プラスミド基質および切断産物の位置を右側で示す。
【図１０】ＦＯＡに対して耐性を示すおよび増殖にウリジンを必要とする株からのｐｙｒ４遺伝子の配列分析を示す図である。野生型配列（Ｋ２１コントロールＴ４、配列番号６８）とのアラインメントから、ｐｙｒ４遺伝子中の標的部位での配列改変（少数（１〜２ｂｐ）または多く（６８ｂｐ）のヌクレオチドの挿入）の存在が明らかとなった。配列番号６９〜７７はそれぞれ、株Ｔ４  ４−３、Ｔ４  ４−１３、Ｔ４  ４−１１、Ｔ４  ４−１２、Ｔ４  ４−１８、Ｔ４  ４−２０、Ｔ４  ４−１９、Ｔ４  ４−４およびＴ４  ４−７に関する配列である。株Ｔ４  ４−１３（配列番号７０）およびＴ４  ４−１２（配列番号７２）は標的部位において野生型配列から変化していない。
【図１１Ａ−１１Ｂ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成したＣａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体の取込みによる標的部位でのＤＮＡ配列改変を示す写真である。図１１Ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成したＣａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体の直接導入およびその後のフォーゲルのウリジン／ＦＯＡプレート上での増殖後に単離した、ＦＯＡに対して耐性を示すおよび増殖にウリジンを必要とする２種の株（Ｔ４  ２．２およびＴ４  ４．１）のｐｙｒ４特異的ＰＣＲ産物（標的部位を包含する）のアガロースゲル分析を示す。株Ｔ４  ２．２（レーン２）はＴ４  ４．１クローン（レーン３；パネルＢ、レーン２で示すコントールと同等である）と比べて分子量が低いＰＣＲ産物を示し、このことは、ｐｙｒ４遺伝子中での大きな欠失を示す。図１１Ｂは図１１Ａと同様のＰＣＲ／アガロースゲル分析を示すが、Ｔ４株４．１、４．２、４．３および４．４を示し、これらは全てＦＯＡに対して耐性を示し、増殖にウリジンを必要とする。株４．３（レーン５）はコントロール（Ｃ＋、レーン２）と比べて分子量が低いｐｙｒ４遺伝子のＰＣＲ産物を示した。
【図１２】クローンＴ４  ２．２（図１１Ａで示す）およびＴ４  ２．４に由来するｐｙｒ４遺伝子の配列分析を示す図である。配列分析は、Ｔ４  ２．２クローン（最上部のアラインメント）が、導入されたＣａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体の標的部位で６１１個の塩基対の欠失を有することを示す。ガイドＲＮＡのＶＴドメイン配列に対応する配列を四角で囲み、ＰＡＭ部位を円で囲む。最下部のアラインメントは、単離されたＴ４  ２．４株の標的部位におけるｐｙｒ４遺伝子中での１個の塩基対（「Ｇ残基」）の挿入を示す。ガイドＲＮＡのＶＴドメイン配列に対応する配列をアラインメント上の線で示し、ＰＡＭ部位を円で囲む。配列番号７８〜８１はそれぞれ、９−９６（Ｔ４  ２．２株）、Ｐｙｒ  Ｔｒ（野生型配列）、クエリ（野生型配列）およびサブジェクト（Ｔ４  ２．４株）の配列である。
【図１３】クローンＴ４  ４．１および４．２（最上部のアラインメント）、４．３（最下部のアラインメント）および４．４（中央のアラインメント）（これらを図１１Ｂで示す）に由来するｐｙｒ４遺伝子の配列分析を示す図である。野生型ｐｙｒ４配列は全てのアラインメント中で最初の配列（最上部）であり、コンセンサスを全てのアラインメント中で最下部に示す（配列番号８２）。最上部のアラインメントは、ｐｙｒ遺伝子中の標的部位で、Ｔ４  ４．１クローン（このアラインメント中で３番目の配列、配列番号８４）がＴヌクレオチドの挿入を有し、Ｔ４  ４．２（このアラインメント中で２番目の配列、配列番号８３）がＧヌクレオチドの挿入を有することを示す。（このアラインメント中のコンセンサス配列は配列番号８２と同じである）。中央のアラインメントは、Ｔ４  ４．４クローン（このアラインメント中で２番目の配列、配列番号８５）がｐｙｒ４遺伝子中の標的部位でＡヌクレオチドの欠失を有することを示す。（このアラインメント中のコンセンサス配列は配列番号８５と同じである）。最下部のアラインメントは、Ｔ４  ４．３クローン（このアラインメント中で２番目の配列、配列番号８６）中のｐｙｒ４遺伝子配列が標的部位で突然分かれることを示す。（このアラインメント中のコンセンサス配列は配列番号８７であり、図１３におけるコンセンサス配列中の空欄を配列番号８７では「Ｎ」で表す）。更なるアラインメント分析（図示せず）から、Ｔ４  ４．３クローンが、導入されたＣａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体用の標的部位で９８８個の塩基対の欠失を有することを確認した。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本開示は、真菌細胞のゲノム中の標的部位でのＤＮＡの改変で使用される組成物および方法を含む。この方法は、所望の標的部位を認識してこの部位で二本鎖切断を導入する機能的ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を用いる。この二本鎖切断の修復により、標的部位でＤＮＡ配列に改変を導入することができる。
【００３７】
本組成物および本方法をより詳細に説明する前に、本組成物および本方法は説明されている特定の実施形態に限定されず、当然のことながらそれ自体が変わり得ることを理解すべきである。本組成物および本方法の範囲は添付した特許請求の範囲によってのみ限定され得ることから、本明細書で使用する用語は特定の実施形態を説明することを目的とするのみであり、限定することを意図されていないことも理解すべきである。
【００３８】
ある範囲の値が記載されている場合、この範囲の上限と下限との間に介在する各値（別途文脈が明確に指示しない限り下限の単位の１０分の１まで）ならびにこの言及した範囲中におけるあらゆるその他の言及した値または間に介在する値が本組成物および本方法に包含されることが理解される。言及した範囲における任意の特定の除外された限度を条件として、これらのより小さい範囲の上限および下限は独立して、より小さい範囲にふくまれ得、本組成物および本方法にも包含され得る。言及した範囲が一方のまたは両方の限度を含む場合、これらの含まれた限度のいずれかまたは両方を除外する範囲も本組成物および本方法に含まれる。
【００３９】
本明細書では、ある特定の範囲が用語「約」に先行される数値で示される。用語「約」は本明細書において、この用語が先行する正確な数およびこの用語が先行する近いまたは近似的な数である数を文字通り補強するために使用される。ある数が具体的に列挙された数に近い数または近似的な数であるかどうかの判定では、列挙されていない近いまたは近似的な数は、この数が示されている文脈において、具体的に列挙された数の実質的な等価を提供する数であり得る。例えば、ある数値に関して、用語「約」は、この用語が文脈において別途明確に定義されていない限り、この数値の−１０％〜＋１０％の範囲を意味する。別の例では、語句「約６のｐＨ値」は、ｐＨ値が別途具体的に定義されていない限り、５．４〜６．６のｐＨ値を意味する。
【００４０】
本明細書に記載した見出しは、本明細書全体の参照により有することができる本組成物および本方法の様々な態様または実施形態を限定するものではない。従って、真下で定義する用語は、本明細書全体の参照により更に完全に定義される。
【００４１】
本文書は、読みやすくするために多くの節に分かれているが、読者は、ある節での記載をその他の節に適用することができることを認識するだろう。このように、本開示の様々な節に使用される見出しは限定的に解釈されるべきではない。
【００４２】
別途定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本組成物および本方法が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本組成物および本方法の実施または試験では、本明細書で説明するものと類似のまたは等価のあらゆる方法および材料も使用することができるが、代表例の方法および材料をこれより説明する。
【００４３】
本明細書で引用する全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により援用されると具体的におよび個々に示されたかのように参照により本明細書に援用され、引用される刊行物に関連する方法および／または材料を開示するためにおよび説明するために参照により本明細書に援用される。引用したあらゆる刊行物はその開示が本出願日前であるが、本組成物および本方法が先行発明によりそのような刊行物に先行する権利がないということを認めると解釈すべきはない。更に、記載されている公開日は、個々に確認する必要があるであろう実際の公開日とは異なる場合がある。
【００４４】
この詳細な説明に従って、下記の略語および定義を適用する。単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は別途文脈が明確に指示しない限り複数の指示対象を含むことに留意されたい。そのため、例えば「酵素」への言及には複数のそのような酵素が含まれ、「投与量」への言及には、１回または複数回の投与量および当業者に既知のこの等量等への言及が含まれる。
【００４５】
あらゆる任意選択的な要素を除外するように特許請求の範囲を作成することができることに更に留意されたい。そのため、この記載は、特許請求の範囲の要素の列挙または「消極的な（ｎｅｇａｔｉｖｅ）」限定の使用に関連して「のみ（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」および同類のもののような排他的な用語を使用するための先行する根拠として機能することが意図されている。
【００４６】
本開示を読む際に当業者に明らかであるように、本明細書で説明されているおよび示されている個々の実施形態はそれぞれ、個別の成分と、本明細書で説明する本組成物および本方法の範囲および趣旨から逸脱することなくその他のいくつかの実施形態の内のいずれかの特徴から容易に分離され得るまたはこの特徴と容易に組み合わされ得る特徴とを有する。任意の列挙された方法を、列挙した事象の順序でまたは論理的に可能であるあらゆるその他の順序で実行することができる。
【００４７】
定義
本明細書で使用する場合、「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ」と称されるまたは「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ活性」を有するポリペプチドは、Ｃａｓ遺伝子によりコードされるＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチドに関し、Ｃａｓタンパク質は、１種または複数種のガイドポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に標的ＤＮＡ配列を切断することができる（例えば「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ」という表題の米国特許第８６９７３５９号明細書を参照されたい）。ガイドポリヌクレオチド依存性のエンドヌクレアーゼ活性を保持するＣａｓエンドヌクレアーゼの多様体もこの定義に含まれる。本明細書で詳述するドナーＤＮＡ挿入方法で用いられるＣａｓエンドヌクレアーゼは、標的部位でＤＮＡに二本鎖切断を導入するエンドヌクレアーゼである。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ガイドポリヌクレオチドにより導かれて二本鎖ＤＮＡ中の特定の標的部位（例えば、細胞のゲノム中の標的部位）を認識して切断する。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「ガイドポリヌクレオチド」は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することできるおよびＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識して切断することを可能にするポリヌクレオチド配列に関する。このガイドポリヌクレオチドは単分子または二重分子であることができる。ガイドポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはこれらの組み合わせ（ＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列）であることができる。任意選択で、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１個のヌクレオチド、ホスホジエステル結合または連結修飾を含むことができ、この連結修飾として、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣ、２，６−ジアミノプリン、２’−フルオロＡ、２’−フルオロＵ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８（ヘキサエチレングリコール鎖）分子への連結、または環化をもたらす５’から３’への共有結合的連結が挙げられるがこれらに限定されない。リボ核酸のみを含むガイドポリヌクレオチドは「ガイドＲＮＡ」とも称される。
【００４９】
このガイドポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列に相補的である第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメインまたはＶＴドメインとも称される）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメインまたはＣＥＲドメインと称される）とを含む二重分子（二本鎖ガイドポリヌクレオチドとも称される）であることができる。この二重分子ガイドポリヌクレオチドのＣＥＲドメインは、相補領域に沿ってハイブリダイズされる２個の別々の分子を含む。この２個の別々の分子は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列および／またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であることができる。一部の実施形態では、ＣＥＲドメインに連結されているＶＴドメインを含む二本鎖ガイドポリヌクレオチドの第１の分子は、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｃｒＤＮＡ」と称され、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｃｒＲＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「ｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」と称される。ｃｒヌクレオチドは、細菌中におよび古細菌中に天然に存在するｃｒＲＮＡの断片を含むことができる。一実施形態では、本明細書で開示するｃｒヌクレオチド中に存在する細菌中におよび古細菌中に天然に存在するｃｒＲＮＡの断片のサイズは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはより多くのヌクレオチドから変動することができるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＣＥＲドメインを含む二本鎖ガイドポリヌクレオチドの第２の分子は、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｔｒａｃＲＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｔｒａｃｒＤＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「ｔｒａｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」と称される。ある特定の実施形態では、ＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体を誘導するＲＮＡは、二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである。
【００５０】
ガイドポリヌクレオチドはまた、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列に相補的である第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメインまたはＶＴドメインと称される）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチドドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメインまたはＣＥＲドメインと称される）とを含む単分子であることもできる。「ドメイン」は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列および／またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であることができるヌクレオチドの連続ストレッチを意味する。単一ガイドポリヌクレオチドのＶＴドメインおよび／またはＣＥＲドメインは、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むことができる。一部の実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒヌクレオチド（ＣＥＲドメインを含む）に連結されているｃｒヌクレオチド（ＣＥＲドメインに連結されているＶＴドメインを含む）を含み、この連結は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むヌクレオチド配列である。ｃｒヌクレオチド由来の配列およびｔｒａｃｒヌクレオチド由来の配列で構成されている単一ガイドポリヌクレオチドを、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「単一ガイドＲＮＡ」と称することができ、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「単一ガイドＤＮＡ」と称することができ、（ＲＮＡヌクレオチドとＤＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「単一ガイドＲＮＡ−ＤＮＡ」と称することができる。本開示の一実施形態では、単一ガイドＲＮＡは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ断片およびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ断片を含み、このガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを真菌細胞ゲノム標的部位へと誘導することができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがこのゲノム標的部位に二本鎖切断を導入することを可能にする。
【００５１】
二本鎖ガイドポリヌクレオチドと対比して単一ガイドポリヌクレオチドを使用する一態様は、標的細胞中で単一ガイドポリヌクレオチドを発現させるために作製する必要がある発現カセットが１種のみであるということである。
【００５２】
用語「可変ターゲティングドメイン」または「ＶＴドメイン」は本明細書において互換的に使用され、二本鎖ＤＮＡ標的部位の一方の鎖（ヌクレオチド配列）に相補的であるヌクレオチド配列を含む。第１のヌクレオチド配列ドメイン（ＶＴドメイン）と標的配列との間の相補性の％は少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６３％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％である、または１００％相補的である。ＶＴドメインは、少なくとも１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個または３０個のヌクレオチドの長さであることができる。一部の実施形態では、ＶＴドメインは１２〜３０個のヌクレオチドの連続ストレッチを含む。ＶＴドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列またはこれらの任意の組み合わせで構成され得る。
【００５３】
ガイドポリヌクレオチドの用語「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン」または「ＣＥＲドメイン」は本明細書において互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用するヌクレオチド配列（例えば、ガイドポリヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列ドメイン）を含む。ＣＥＲドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列（例えば本明細書で説明する改変を参照されたい）またはこれらの任意の組み合わせで構成され得る。
【００５４】
単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むことができる。一実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００個のヌクレオチドの長さであることができる。別の実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、限定されないがＧＡＡＡテトラループ配列等のテトラループ配列を含むことができる。
【００５５】
ガイドポリヌクレオチド、ＶＴドメインおよび／またはＣＥＲドメインのヌクレオチド配列改変を、５’キャップ、３’ポリアデニル化テイル、リボスイッチ配列、安定した制御配列、ｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する配列、ガイドポリヌクレオチドの標的を細胞内位置に設定する改変または配列、トラッキングが生じる改変または配列、タンパク質用の結合部位が生じる改変または配列、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣヌクレオチド、２，６−ジアミノプリンヌクレオチド、２’−フルオロＡヌクレオチド、２’−フルオロＵヌクレオチド；２’−Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８分子への連結、５’から３’への共有結合的連結またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができるがこれらに限定されない。これらの改変により、少なくとも１種の追加の有利な特徴をもたらすことができ、この追加の有利な特徴は、安定性の変更または調節、細胞内ターゲティング、トラッキング、蛍光標識、タンパク質用のまたはタンパク質複合体用の結合部位、相補的な標的配列に対する結合親和性の変更、細胞分解に対する耐性の変更および細胞透過性の増加の群から選択される。
【００５６】
本明細書で使用する場合、用語「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム」（および等価物）には、ＤＮＡ標的配列に二本鎖切断を誘導することができる、Ｃａｓエンドヌクレアーゼとガイドポリヌクレオチド（単一または二重）との複合体が含まれる。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ゲノム標的部位の極めて近くでＤＮＡ二本鎖をほどき、ガイドＲＮＡによる標的配列の認識時に両方のＤＮＡ鎖を切断するが、但し、正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が標的配列の３’末端で適切に配向されている場合に限られる。
【００５７】
用語「機能的断片」、「機能的に等価である断片」、「機能的に等価な断片」および同類のものは互換的に使用され、親ポリペプチドの定性的な酵素活性を保持する親ポリペプチドの一部または部分配列を意味する。例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの機能的断片は、ガイドポリヌクレオチドと共に二本鎖切断を生じさせる能力を保持する。機能的断片は親ポリペプチドと比較して定量的な酵素活性が変更されている場合があることに本明細書では留意されたい。
【００５８】
用語「機能的多様体」、「機能的に等価である多様体」、「機能的に等価な多様体」および同類のものは互換的に使用され、親ポリペプチドの定性的な酵素活性を保持する親ポリペプチドの多様体を意味する。例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの機能的多様体は、ガイドポリヌクレオチドと共に二本鎖切断を生じさせる能力を保持する。機能的多様体は親ペプチドと比較して定量的な酵素活性が変更されている場合があることに本明細書では留意されたい。
【００５９】
断片および変異体を、部位特異的な変異誘発および合成構築等のあらゆる好都合な方法により得ることができる。
【００６０】
用語「ゲノム」は、真菌に適用する場合、核内で見出される染色体ＤＮＡだけでなく、細胞の細胞内成分（例えばミトコンドリア）内で見出される細胞小器官ＤＮＡも包含する。
【００６１】
「コドン改変遺伝子」または「コドン優先（ｃｏｄｏｎ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）遺伝子」または「コドン最適化遺伝子」とは、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するように設計されているコドン使用頻度を有する遺伝子のことである。遺伝子をコドン最適化するために行われる核酸変更は、親遺伝子のコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しないことを意味する「同義」である。しかしながら、天然遺伝子および変異遺伝子の両方を特定の宿主細胞用にコドン最適化することができ、従って、これに関して制限は意図されていない。
【００６２】
「コーディング配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を意味する。「制御配列」は、コーディング配列の上流（５’−非コーディング配列）、コーディング配列内またはコーディング配列の下流（３’−非コーディング配列）に位置するヌクレオチド配列を意味しており、関連するコーディング配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性または翻訳に影響を及ぼす。制御配列として、プロモーター、翻訳リーダー配列、５’非翻訳配列、３’非翻訳配列、イントロン、ポリアデニル化標的配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００６３】
「プロモーター」は、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を意味する。プロモーター配列は近位のおよびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントはエンハンサーと称されることが多い。「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーターの固有のエレメントであってもよいしプロモーターのレベルまたは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントであってもよい。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来していてもいし天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されていてもよく、および／または合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。様々なプロモーターが、様々な組織型もしくは細胞型で、または様々な発達段階で、または様々な環境条件に応じて、遺伝子の発現を誘導することができることが当業者に理解される。ほとんどの場合では制御配列の正確な境界が完全には定義されていないことから、いくつかのバリエーションのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有する場合があることが更に認識される。当分野で公知であるように、プロモーターを、このプロモーターの強度および／またはこのプロモーターが活性である条件に従って、例えば構成的プロモーター、強力なプロモーター、弱いプロモーター、誘導性／抑制性プロモーター、組織特異的に／発達的に制御されるプロモーター、細胞周期依存性プロモーター等に分類することができる。
【００６４】
「ＲＮＡ転写物」は、ＲＮＡポリメラーゼにより触媒されるＤＮＡ配列の転写により生じる産物を意味する。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」は、イントロンを有しておらず細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを意味する。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡテンプレートに相補的であるおよび逆転写酵素を使用してｍＲＮＡテンプレートから合成されるＤＮＡを意味する。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含むおよび細胞内でまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ転写物を意味する。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に対して相補的であるおよびある特定の条件下で標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を意味する（例えば米国特許第５，１０７，０６５号明細書を参照されたい）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物の任意の部分（即ち５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロンまたはコーディング配列）との相補性であることができる。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたはポリペプチドに翻訳され得ないがそれにもかかわらず細胞内プロセスに影響を及ぼすその他のＲＮＡを意味する。用語「相補体」および「逆相補体」はｍＲＮＡ転写物に関して本明細書において互換的に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを定義することが意図されている。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「機能的に付着している」または「作動可能に連結されている」は、既知のまたは所望の活性を有するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の制御領域または機能的ドメイン（例えばプロモーター、エンハンサー領域、ターミネーター、シグナル配列、エピトープタグ等）が、この既知のまたは所望の活性に従って、制御領域または機能的ドメインが標的（例えば遺伝子またはポリペプチド）の発現、分泌または機能を制御することを可能にするような様式でこの標的に付着しているまたは連結されていることを意味する。例えば、プロモーターは、コーディング配列の発現を制御することができる場合には、このコーディング配列に作動可能に連結されている（即ち、このコーディング配列はプロモーターの転写制御下にある）。
【００６６】
本明細書で使用される標準的な組換えＤＮＡ技術および分子クローニング技術は当分野で公知である。
【００６７】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は特定のＤＮＡセグメントの合成技術であり、一連の反復的な変性サイクル、アニーリングサイクルおよび伸長サイクルからなり、当分野で公知である。
【００６８】
用語「組換え」は、生物学的な成分または組成物（例えば細胞、核酸、ポリペプチド／酵素、ベクター等）に関して使用される場合、この生物学的な成分または組成物が天然では見出されない状態にあることを示す。換言すると、この生物学的な成分または組成物は、ヒトの介入により天然の状態から改変されている。例えば、組換え細胞には、天然の親（即ち非組換え）細胞中で見出されない１種もしくは複数種の遺伝子を発現する細胞、天然の親細胞とは異なる量で１種もしくは複数種の天然遺伝子を発現する細胞、および／または天然の親細胞とは異なる条件下で１種もしくは複数種の天然遺伝子を発現する細胞が包含される。組換え核酸は、１個もしくは複数個のヌクレオチドで天然配列と異なり得る、異種配列（例えば異種プロモーター、非天然のもしくは変異のシグナル配列をコードする配列等）に作動可能に連結され得る、イントロン配列を欠くことができる、および／または単離型であり得る。組換えポリペプチド／酵素は、１個もしくは複数個のアミノ酸で天然配列と異なり得る、異種配列と融合され得る、トランケートされ得る、もしくはアミノ酸の内部欠失を有し得る、天然細胞中では見出されない様式で発現され得る（例えば、このポリペプチドをコードする発現ベクターの細胞中の存在に起因して、このポリペプチドを過剰発現する組換え細胞から発現され得る）、および／または単離型であり得る。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドまたは組換えポリペプチド／酵素は、野生型対応物と同一であるが非天然型（例えば単離型または富化型）である配列を有することが強調される。
【００６９】
用語「操作された」は、生物学的な成分または組成物（例えば、細胞、核酸、ポリペプチド／酵素、ベクター等）に関して使用される場合、この生物学的な成分または組成物が人により設計されており、「操作された」生物学的な成分または組成物を設計する人が設計時に認識している限りにおいて天然の生物学的な成分もしくは組成物に少なくとも完全に由来しているわけではないまたは完全に一致しているわけではないことを示す。操作された生物学的な成分または組成物（例えば操作された核酸）は、天然に存在する別の生物学的な成分または組成物の様々な部分に由来していてもよい。操作された生物学的な成分または組成物は、生物学的な組換え成分または組換え組成物であってもよい。
【００７０】
用語「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」は、目的のポリヌクレオチド配列（例えば、細胞中で発現させる目的の遺伝子）を担持する染色体外エレメント（「発現ベクター」または「発現カセット」）を意味する。そのようなエレメントは概して、二本鎖ＤＮＡの形態であり、多くのヌクレオチド配列が連結されているまたは目的のポリヌクレオチドを細胞に導入することができる固有の構築物に組み換えられている（任意の起源に由来する）一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの（線状のまたは環状の）自律的に複製する配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であることができる。目的のポリヌクレオチド配列は、標的細胞中で発現させようとするポリペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする遺伝子であることができる。発現カセット／ベクターは概して遺伝子を含み、この遺伝子は、この遺伝子の宿主細胞中での発現を可能にするエレメントに作動可能に連結されている。
【００７１】
用語「発現」は、本明細書で使用する場合、前駆体または成熟型のいずれかでの機能的最終産物（例えばｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡまたはタンパク質）の産生を意味する。
【００７２】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの細胞への挿入（例えば組換えＤＮＡ構築物／発現構築物）に関する「導入される」は、そのような課題を実施するためのあらゆる方法を意味しており、所望の生体分子の導入を達成するための「遺伝子導入」、「形質転換」、「形質導入」、物理的手段または同類のものの内のいずれかの手段を含む。
【００７３】
「一時的に導入される（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ）」、「一時的に導入される（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ）」、「一時的導入」、「一時的に発現する」および同類のものは、非永続的な方法で生体分子が宿主細胞（または宿主細胞の集団）に導入されることを意味する。二本鎖ＤＮＡに関して、一時的導入として、導入されたＤＮＡが宿主細胞の染色体に組み込まれず、そのため増殖中に全ての娘細胞に伝達されない状況と、導入されたＤＮＡ分子（染色体に組み込まれている可能性がある）が、あらゆる好都合な方法を使用して（例えば、ｃｒｅ−ｌｏｘシステムを用いて、エピソームＤＮＡ構築物に関する陽性選択圧を除去することにより、選択培地を使用して染色体からの組込みポリヌクレオチドの全てまたは一部のループアウト（ｌｏｏｐｉｎｇ  ｏｕｔ）を促進することにより等）所望の時間で除去される状況とが挙げられる。これに関して制限は意図されていない。一般に、ＲＮＡ（例えばガイドＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボザイム等）またはポリペプチド（例えばＣａｓポリペプチド）の宿主細胞への導入は、この生体分子が複製されず、細胞増殖中に娘細胞に不確定に伝えられるという点で一時的と考えられる。Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体に関して、一時的導入は、標的とされたＣａｓエンドヌクレアーゼ活性を発揮するために両方の生体分子が必要とされることから、いずれかの成分が一時的に導入される状況をカバーする。そのため、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体の一時的導入として、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡの内のいずれか一方または両方が一時的に導入される実施形態が挙げられる。例えば、ガイドＲＮＡが一時的に導入される、ゲノムに組み込まれたＣａｓエンドヌクレアーゼ用発現カセット（そのため導入は一時的でなはない）を有する宿主細胞は、一時的に導入されたＣａｓ／ガイドＲＮＡ複合体（またはシステム）を有すると言うことができ、なぜならば、この機能的複合体は一時的に宿主細胞中に存在するからである。ある特定の実施形態では、導入する工程は、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼを安定的に発現する親真菌細胞集団を得ること、および（ｉｉ）この親真菌細胞集団にガイドＲＮＡを一時的に導入することを含む。逆を言えば、導入する工程は、（ｉ）ガイドＲＮＡを安定的に発現する親真菌細胞集団を得ること、および（ｉｉ）この親真菌細胞集団にＣａｓエンドヌクレアーゼを一時的に導入することを含むことができる。
【００７４】
「成熟」タンパク質は、翻訳後にプロセシングされたポリペプチド（即ち、一次翻訳産物中に存在する任意のプレペプチドまたはプロペプチドが除去されているポリペプチド）を意味する。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物（即ち、プレペプチドおよびプロペプチドが依然として存在している）を意味する。プレペプチドおよびプロペプチドは細胞内局在化シグナルであり得るがこれに限定されない。
【００７５】
「安定した形質転換」は、核ゲノムおよび細胞小器官ゲノムの両方が挙げられる宿主生物のゲノム中への核酸断片の移動を意味しており、遺伝的に安定した遺伝がもたらされる（結果として得られる宿主細胞が本明細書で「安定した形質転換体」と称される場合もある）。対照的に、「一過性の形質転換」は、組み込まれることなくまたは安定して遺伝することなく遺伝子が発現される、宿主生物の核中へのまたはその他のＤＮＡ含有細胞小器官中への核酸断片の移動を意味している（本明細書では「不安定な形質転換」と称される場合もあり、結果として得られる宿主細胞が本明細書で「不安定な形質転換体」と称される場合もある）。形質転換された核酸断片を含む宿主生物を「トランスジェニック」生物と称する。
【００７６】
「真菌細胞」、「真菌」、「真菌宿主細胞」および同類のものは、本明細書で使用する場合、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）門、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門、ツボカビ（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門および接合菌（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）門（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫにより定義される）と、卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，上記を参照、で言及されている）および全ての栄養胞子形成（ｍｉｔｏｓｐｏｒｉｃ）真菌（（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，上記を参照）とを含む。ある特定の実施形態では、真菌宿主細胞は酵母細胞であり、「酵母」は、有子嚢胞子酵母（エンドミケス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子菌酵母（ｂａｓｉｄｉｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ  ｙｅａｓｔ）、および不完全菌（不完全酵母菌類（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する酵母を意味する。従って、酵母宿主細胞として、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（ＳｃｈｉｚｏＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の細胞が挙げられる。酵母の種として、下記のものが挙げられるがこれらに限定されない：サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の細胞。
【００７７】
用語「糸状真菌細胞」は、ユウミコチニア（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門またはペジゾミコチニア（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門の全ての糸状形態を含む。糸状真菌属の適切な細胞として、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コリナスカス（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、シタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｄｉｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７８】
糸状真菌種の適切な細胞として、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、ヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）、フサリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フサリウム・クロックウェレンズ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フサリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・レチキュラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フサリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フサリウム・サムブシウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フサリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フサリウム・トリコセシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコーラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ニューロスポラ・インターメディア（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・カネスセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）、ペニシリウム・ソリタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｏｌｉｔｕｍ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、タラロマイセス・フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ）、チ��ラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンジブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）
およびトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７９】
用語「標的部位」、「標的配列」、「ゲノム標的部位」、「ゲノム標的配列」（および等価物）は本明細書において互換的に使用され、ゲノム改変（例えば標的部位でのＤＮＡ配列の改変）を促進するためにＣａｓエンドヌクレアーゼ切断が望ましい、真菌細胞のゲノム中のポリヌクレオチド配列を意味する。しかしながら、この用語が使用される文脈では、この用語の意味がわずかに変更され得る。例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の標的部位は一般に非常に特異的であり、正確なヌクレオチド位置に定義され得ることが多いが、ある場合には、所望のゲノム改変用の標的部位は、ＤＮＡ切断が起こる部位のみと比べて広く定義され得る。標的部位は真菌細胞ゲノム中の内在性部位であり得る、或いは、標的部位は真菌細胞に対して異種であり得、そのためゲノム中に天然には存在していない、または標的部位を、天然で生じる場所と比較して異種のゲノム位置で見出すことができる。
【００８０】
本明細書で使用する場合、「核酸」はポリヌクレオチドを意味しており、デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリマーを含む。核酸はまた、断片および改変ヌクレオチドも含むことができる。そのため、用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」および「核酸断片」は、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡおよび／またはＤＮＡのポリマーを示すために互換的に使用され、合成ヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基または改変ヌクレオチド塩基を任意選択で含む。ヌクレオチド（通常は５’−モノフォスフェート形態で見出される）は下記のように一文字記号で言及される：アデノシンまたはデオキシアデノシン（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡの場合）の場合の「Ａ」、シトシンまたはデオキシシトシンの場合の「Ｃ」、グアノシンまたはデオキシグアノシンの場合の「Ｇ」、ウリジンの場合の「Ｕ」、デオキシチミジンの場合の「Ｔ」、プリンの場合の「Ｒ」（ＡまたはＧ）、ピリミジンの場合の「Ｙ」（ＣまたはＴ）、ＧまたはＴの場合の「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴの場合の「Ｈ」、イノシンの場合の「Ｉ」およびあらゆるヌクレオチドの場合の「Ｎ」。
【００８１】
用語「に由来する」は、用語「を起源とする」、「から得られる」、「から入手可能である」、「から単離される」および「から生成される」を包含しており、別の特定の材料中に起源が見出されるまたは別の特定の材料を参照して説明され得る特徴を有するある特定の材料を一般に示す。
【００８２】
本明細書で使用する場合、用語「ハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション反応を行う条件を意味する。この条件は概して、ハイブリダイゼーションが測定される条件の「ストリンジェンシー」の程度により分類される。このストリンジェンシーの程度は、例えば核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）をベースとすることができる。例えば、典型的には、「最高ストリンジェンシー」は約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃下）で起こり、「高ストリンジェンシー」はＴｍよりも約５〜１０℃下で起こり、「中間ストリンジェンシー」はプローブのＴｍよりも約１０〜２０℃下で起こり、「低ストリンジェンシー」はＴｍよりも約２０〜２５℃下で起こる。或いは、または加えて、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションの塩強度条件もしくはイオン強度条件ならびに／または１回もしくは複数回のストリンジェンシー洗浄（例えば、６×ＳＳＣ＝非常に低いストリンジェンシー、３×ＳＳＣ＝低〜中間のストリンジェンシー、１×ＳＳＣ＝中間ストリンジェンシーおよび０．５×ＳＳＣ＝高ストリンジェンシー）をベースとすることができる。機能上、最高ストリンジェンシー条件を使用してハイブリダイゼーションプローブとの厳密な同一性またはほぼ厳密な同一性を有する核酸配列を同定することができ、高ストリンジェンシー条件が使用されるとプローブと約８０％以上の配列同一性を有する核酸配列が同定される。高選択性を必要とする用途の場合、ハイブリッドを形成するのに比較的ストリンジェントな条件を使用することが概して望ましい（例えば、比較的に低い塩条件および／または高い温度条件が使用される）。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「ハイブリダイゼーション」は、当分野で既知であるように、核酸の鎖が塩基対合により相補鎖と結合するプロセスを意味する。より具体的には、「ハイブリダイゼーション」は、ブロットハイブリダイゼーション技術中におよびＰＣＲ技術中に起こるように核酸の一本鎖が相補鎖と二本鎖（即ち塩基対）を形成するプロセスを意味する。中間〜高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件の下で２種の配列が互いに特異的にハイブリダイズする場合、核酸配列は参照核酸配列に対して「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸が結合する複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）をベースとする。例えば、典型的には、「最高ストリンジェンシー」は約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃下）で起こり、「高ストリンジェンシー」はＴｍよりも約５〜１０℃下で起こり、「中間ストリンジェンシー」はプローブのＴｍよりも約１０〜２０℃下で起こり、「低ストリンジェンシー」はＴｍよりも約２０〜２５℃下で起こる。機能上、最高ストリンジェンシー条件を使用してハイブリダイゼーションプローブとの厳密な同一性またはほぼ厳密な同一性を有する配列を同定することができ、中間のまたは低いストリンジェンシー条件を使用してポリヌクレオチド配列相同体を同定することができる、または検出することができる。
【００８４】
中間ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件および高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は当分野で公知である。例えば、中間ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストランおよび２０ｍｈ／ｍＬの変性されて剪断されたサケ精子（ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  ｓｈｅａｒｅｄ  ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ）ＤＮＡを含む溶液中で３７℃にて一晩インキュベートし、続いて約３７〜５０℃にて１×ＳＳＣでフィルタを洗浄することにより実行することができる。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、６５℃および０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０）でのハイブリダイゼーションであることができる。或いは、高ストリンジェンシー条件を、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍＬの変性担体ＤＮＡ中で約４２ｏＣにて実行することができ、続いて、室温にて２×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳで２回洗浄し、４２ｏＣにて０．１×ＳＳＣおよび０．５×ＳＤＳで更に２回洗浄する。そして、非常に高いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６８℃および０．１×ＳＳＣでのハイブリダイゼーションであることができる。プローブ長および同類のもの等の因子を適応させるために、必要に応じて温度、イオン強度等を調整する方法が当業者に知られている。
【００８５】
少なくとも２種の核酸またはポリペプチドの文脈における語句「実質的に類似」または「実質的に同一」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、親配列もしくは参照配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは更に少なくとも９９％同一である配列を含むこと、または機能性を付加することなく本明細書を回避するためにのみ行われるアミノ酸の置換、挿入、欠失もしくは修飾を含まないことを意味する。
【００８６】
核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウ全体にわたり最大の一致のためにアラインされた場合に同一である２種の配列における核酸塩基またはアミノ酸残基を意味する。
【００８７】
用語「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウ全体にわたり２種の適切にアラインされた配列を比較することにより決定される値を意味しており、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、これら２種の配列を最適にアラインさせるために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（即ちギャップ）を含む場合がある。このパーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得、この一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除算し、結果を１００で乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出される。配列同一性パーセントの有用な例として、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％または５０％〜１００％の任意の整数パーセンテージが挙げられるがこれらに限定されない。この同一性を、本明細書で説明するプログラムのいずれかを使用して決定することができる。
【００８８】
配列アラインメントおよび同一性パーセントまたは類似性計算を、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングサイト（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムが挙げられるがこれに限定されない相同配列を検出するために設計された様々な比較方法を使用して決定することができる。本出願の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析に使用する場合、別途指定しない限り、分析結果は、言及したプログラムの「デフォルト値」をベースとすることが理解されるだろう。本明細書で使用する場合、「デフォルト値」は、最初に初期化された場合にソフトウェアで最初にロードされる値またはパラメータの任意のセットを意味することができる。
【００８９】
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ方法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  ８：１８９−１９１により説明されている）と標識されているおよびＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングサイト（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム中で見出されるアラインメント方法に対応する。多重アラインメントの場合、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ方法を使用するタンパク質配列のペアワイズアラインメント（ｐａｉｒｗｉｓｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）用のおよび同一性パーセントの算出用のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸の場合、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを使用した配列のアラインメントの後、同じプログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性パーセント」を得ることができる。
【００９０】
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ方法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  ８：１８９−１９１により説明されている）と標識されているおよびＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングサイト（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム中で見出されるアラインメント方法に対応する。多重アラインメント用のデフォルトパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを使用した配列のアラインメントの後、同じプログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性パーセント」を得ることができる。
【００９１】
別途述べない限り、本明細書で提供される配列の同一性／類似性の値は、下記のパラメータを使用するＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０（ＧＣＧ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して得られた値を意味する：ギャップ生成ペナルティの重み（ｐｅｎａｌｔｙ  ｗｅｉｇｈｔ）５０、ギャップ長伸長ペナルティの重み３およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用するヌクレオチド配列に関する同一性％および類似性％；ＧＡＰ生成ペナルティの重み８およびギャップ長伸長ペナルティの重み２およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５）を使用するアミノ酸配列に関する同一性％および類似性％。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３−５３のアルゴリズムを使用して、一致の数を最大化するおよびギャップの数を最小限に抑える２種の配列全体のアラインメントを見出す。ＧＡＰは、全ての可能なアラインメントおよびギャップ位置を考慮し、一致した塩基の単位でギャップ生成ペナルティおよびギャップ伸長ペナルティを使用して、一致した塩基の最大数および最小のギャップを有するアラインメントを作成する。
【００９２】
多くのレベルの配列同一性が、その他の種からのまたは天然にもしくは合成により改変されているポリペプチド（そのようなポリペプチドは同一のまたは類似した機能または活性を有する）の同定で有用であることが当業者に理解されるだろう。同一性パーセントの有用な例として、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％または５０％〜１００％の任意の整数パーセンテージが挙げられるがこれらに限定されない。実際に、５０％〜１００％の任意の整数のアミノ酸同一性は本開示の説明に有用であり得、例えば５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であり得る。
【００９３】
「遺伝子」は、機能的分子（限定されないが、例えば特定のポリペプチド（例えば酵素）または機能的ＲＮＡ分子（例えば、ガイドＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム等））をコードし、または発現させることができ、このコーディング配列に先行する制御配列（５’−非コーディング配列）および／または後続する制御配列（３’−非コーディング配列）を含む核酸断片を含む。「天然遺伝子」は、それ自体の制御配列と共に天然で見出される遺伝子を意味する。組換え遺伝子は、異なる生物または同一の生物に由来するであろう別の遺伝子の制御配列により制御される遺伝子を意味する。
【００９４】
「変異遺伝子」とは、人の介入により変更されている遺伝子のことである。そのような「変異遺伝子」は、少なくとも１個のヌクレオチドの付加、欠失または置換により、対応する非変異遺伝子の配列とは異なる配列を有する。本開示のある特定の実施形態では、この変異遺伝子は、本明細書で開示するガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムの結果として生じる変更を含む。変異真菌細胞とは、変異遺伝子を含む真菌細胞のことである。
【００９５】
本明細書で使用する場合、「標的型変異」は、本明細書で開示するまたは当分野で既知である標的配列のＤＮＡ中で二本鎖切断を導入することができる二本鎖切断誘導剤を含む方法を使用して、天然遺伝子内の標的とされる配列を変更することにより行われた天然遺伝子中の変異のことである。
【００９６】
用語「ドナーＤＮＡ」または「ドナー核酸配列」または「ドナーポリヌクレオチド」は、一般にはＣａｓ／ガイドポリヌクレオチド複合体の活性（上記で詳述したようにガイドポリヌクレオチドが標的部位を画定する）と関連して、標的部位でもしくは標的部位付近で挿入されるまたは標的部位のもしくは標的部位付近の領域を置き換える目的のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを意味する。そのため、ドナーＤＮＡ中の目的のポリヌクレオチド配列は、標的部位でもしくは標的部位付近で挿入される新規の領域および／または標的部位でもしくは標的部位付近で置き換えられる／編集されるヌクレオチドと比較した場合に改変されているポリヌクレオチド配列を含むことができる。ある特定の実施形態では、ドナーＤＮＡ構築物は、目的のポリヌクレオチド配列に隣接する相同の第１のおよび第２の領域を更に含む。ドナーＤＮＡの相同の第１のおよび第２の領域は、それぞれが真菌細胞ゲノムの標的部位中に存在するまたはこの標的部位に隣接する第１のおよび第２のゲノム領域に対する相同性を共有する。「相同性」は、類似するＤＮＡ配列を意味する。例えば、ドナーＤＮＡ上で見出される「ゲノム領域に対する相同領域」とは、真菌細胞ゲノムの所与の「ゲノム領域」と類似する配列を有するＤＮＡの領域のことである。相同領域は、切断される標的部位での相同組換えを促進するのに十分である任意の長さであることができる。例えば、相同領域は、この相同領域が、対応するゲノム領域との相同組換えを受けるのに十分な相同性を有するように、少なくとも５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５、５〜１００、５〜２００、５〜３００、５〜４００、５〜５００、５〜６００、５〜７００、５〜８００、５〜９００、５〜１０００、５〜１１００、５〜１２００、５〜１３００、５〜１４００、５〜１５００、５〜１６００、５〜１７００、５〜１８００、５〜１９００、５〜２０００、５〜２１００、５〜２２００、５〜２３００、５〜２４００、５〜２５００、５〜２６００、５〜２７００、５〜２８００、５〜２９００、５〜３０００、５〜３１００個またはより多い塩基の長さを含むことができる。「十分な相同性」は、２種のポリヌクレオチド配列が相同組換え反応用の基質として作用するのに十分な構造的類似性を有することを示す。この構造的類似性は、各ポリヌクレオチド断片の全長とポリヌクレオチドの配列類似性とを含む。配列類似性を、配列の全長にわたる配列同一性パーセントで、ならびに／または１００％配列同一性を有する連続ヌクレオチド等の局在化した類似性を含む保存領域および配列の長さの一部にわたる配列同一性パーセントで説明することができる。
【００９７】
標的およびドナーポリヌクレオチドにより共有される相同性または配列同一性の量は多様であり得、約１〜２０ｂｐ、２０〜５０ｂｐ、５０〜１００ｂｐ、７５〜１５０ｂｐ、１００〜２５０ｂｐ、１５０〜３００ｂｐ、２００〜４００ｂｐ、２５０〜５００ｂｐ、３００〜６００ｂｐ、３５０〜７５０ｂｐ、４００〜８００ｂｐ、４５０〜９００ｂｐ、５００〜１０００ｂｐ、６００〜１２５０ｂｐ、７００〜１５００ｂｐ、８００〜１７５０ｂｐ、９００〜２０００ｂｐ、１〜２．５ｋｂ、１．５〜３ｋｂ、２〜４ｋｂ、２．５〜５ｋｂ、３〜６ｋｂ、３．５〜７ｋｂ、４〜８ｋｂ、５〜１０ｋｂの範囲で単位整数値を有する全長および／または全領域を含む、または最大で標的部位の全長を含む。これらの範囲にはこの範囲内の全ての整数が含まれ、例えば１〜２０ｂｐの範囲には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０ｂｐが含まれる。相同性の量を、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性パーセントを含む２種のポリヌクレオチドの完全にアラインされた長さ全体にわたる配列同一性パーセントで説明することもできる。十分な相同性は、ポリヌクレオチドの長さと、全体的な配列同一性パーセントと、任意選択で連続ヌクレオチドの保存領域または局所的な配列同一性パーセントとの任意の組み合わせを含み、例えば、十分な相同性を、標的遺伝子座の領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する７５〜１５０ｂｐの領域として説明することができる。十分な相同性を、高ストリンジェンシー条件下で２種のポリヌクレオチドの特異的にハイブリダイズする予想された能力により説明することもでき、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）およびＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【００９８】
「表現型マーカー」とは、陽性選択可能マーカーであるか陰性選択可能マーカーであるかにかかわらず、視覚マーカーおよび選択可能マーカーが挙げられるスクリーニング可能なまたは選択可能なマーカーのことである。あらゆる表現型マーカーを使用することができる。具体的には、選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカーは、多くの場合は特定の条件下で、ある分子もしくはこの分子を含む細胞を同定すること、この分子もしくは細胞を有利にもしくは不利に選択すること、またはスクリーニングすることを可能にするＤＮＡセグメントを含む。これらのマーカーは活性（限定されないが、ＲＮＡ、ペプチドもしくはタンパク質の産生等）をコードすることができる、またはＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機化合物および有機化合物もしくは組成物および同類のものの結合部位を提供することができる。
【００９９】
選択可能マーカーの例として、制限酵素部位を含むＤＮＡセグメント；クロリムロンエチル、ベノミル、バスタおよびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）等の別の毒性化合物および抗生物質に対する耐性を付与する生成物をコードするＤＮＡセグメント；普通はレシピエント細胞で欠失している生成物（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー、優性異種マーカー−ａｍｄＳ）をコードするＤＮＡセグメント；容易に同定され得る生成物（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ＧＵＳ等の表現型マーカー；緑色蛍光タンパク質（ＧＲＰ）、青緑色（ＣＦＰ）、黄色（ＹＦＰ）、赤色（ＲＦＰ）および細胞表面タンパク質等の蛍光タンパク質）をコードするＤＮＡセグメント；ＰＣＲ用の新たなプライマー部位の生成（例えば、以前は並置されていない２種のＤＮＡ配列の並置）、制限エンドヌクレアーゼおよびその他のＤＮＡ改変酵素、化学物質等が作用するまたは作用しないＤＮＡ配列の包含；ならびに同定を可能にする特定の改変（例えばメチル化）に必要なＤＮＡ配列の包含が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１００】
真菌細胞ゲノムを改変するための方法および組成物
真菌細胞（例えば糸状真菌細胞）のゲノム中の標的部位でＤＮＡ配列を改変するためにガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを用いる方法が提供される。
【０１０１】
本開示の態様は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ／ガイドポリヌクレオチド複合体を真菌細胞に一時的に導入することによる、この細胞のゲノム中の標的部位でＤＮＡ配列を改変する方法を含む。このＣａｓエンドヌクレアーゼ／ガイドポリヌクレオチド複合体は真菌細胞のゲノム中の標的部位で二本鎖切断を導入することができ、この切断の修復により配列改変（例えば挿入または欠失）が起こり得る。
【０１０２】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、またはガイドポリヌクレオチド（または他の生体分子）の導入を、遺伝子導入技術、形質導入技術、形質転換技術、電気穿孔技術、粒子衝突技術（微粒子銃粒子送達）、細胞融合技術等が挙げられるあらゆる好都合な方法で行うことができる。これらの成分それぞれを、使用者が望むように同時にまたは順次に導入することができる。例えば、最初に、真菌細胞をＣａｓ発現ＤＮＡ構築物で安定的に遺伝子導入し、続いて、安定した遺伝子導入体に（直接的にまたはガイドポリヌクレオチド発現ＤＮＡ構築物を使用して）ガイドポリヌクレオチドを導入することができる。この仕組みは、使用者が、様々なガイドポリヌクレオチドを独立して導入することができる（ある場合では、複数種のガイドポリヌクレオチドを、このことが望まれるべき同一の細胞に導入することができる）安定したＣａｓ遺伝子導入真菌細胞の集団を生成することができることから有利でさえあり得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ発現真菌細胞は使用者により得られ、そのため、使用者は、この細胞に、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを発現することができる組換えＤＮＡ構築物を導入する必要がなく、むしろこのＣａｘ発現細胞にガイドポリヌクレオチド導入することのみが必要である。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする発現カセット（または遺伝子）を含む組換えＤＮＡ構築物を導入することにより、ガイドポリヌクレオチドを真菌細胞に導入する。一部の実施形態では、この発現カセットは真核生物のＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターに作動可能に連結されている。このプロモーターは、ＲＮＡｐｏｌＩＩ依存性プロモーターからＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写時に起こる５’キャップ構造の付加またはポリアデニル化をＲＮＡｐｏｌＩＩＩによる転写が生じないことから特に興味深い。ある特定の実施形態では、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターは、糸状真菌細胞のＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、配列番号１１およびこの機能的多様体、例えば配列番号１２）である。
【０１０４】
（例えば、標的部位でのＣａｓエンドヌクレアーゼ／ガイドＲＮＡ複合体（この複合体は二本鎖エンドヌクレアーゼ活性を有する）の活性により）宿主細胞のゲノムＤＮＡ中で二本鎖切断が導入される場合、細胞のＤＮＡ修復メカニズムは、（このエラーを起こしやすい性質に起因して）二本鎖切断部位での変異を起こし得る切断修復のために活性化される。破損した末端を結合させるための最も一般的な修復メカニズムは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路である（Ｂｌｅｕｙａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  ５：１−１２）。染色体の構造的完全性は概して、この修復により維持されるが、欠失、挿入またはその他の再配列も起こり得る（Ｓｉｅｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｐｕｃｈｔａ，（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：１１２１−３１、Ｐａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７５：２１−９）。
【０１０５】
驚いたことに、本発明者らは、糸状真菌では、二本鎖切断での形質転換ＤＮＡの非相同挿入が、二本鎖切断での染色体ＤＮＡの２つの末端の間の単純な末端結合よりも高度に有利であることを発見した。従って、発現カセット含有ＤＮＡ構築物による形質転換によりＣａｓエンドヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡが提供される場合では、このＤＮＡ構築物またはこの断片が高頻度にて二本鎖切断で挿入される。この挿入は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ上のまたはガイドＲＮＡ発現構築物上のＤＮＡ配列と二本鎖切断の周りの配列との間に相同性がない場合に起こる。
【０１０６】
形質転換により取り込まれたＤＮＡは、ゲノム中で安定した様式で一体化し得る、または一時的に維持され得る。一時的な維持を不安定な表現型により認識することができる。例えば、形質転換ＤＮＡ上に存在するマーカー遺伝子の選択によりＤＮＡ取込みを認識することができる。形質転換および選択の後、形質転換体を数世代にわたり非選択条件下で増殖させた後に選択条件に戻すことができる。安定した形質転換体は、選択条件に戻した後に増殖することができるが、不安定な形質転換体は、形質転換ＤＮＡの喪失に起因して、選択条件に戻した後は増殖することができない。本発明者らは、真菌細胞中でＣａｓエンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡを一時的に発現させることができることを実証している。
【０１０７】
不安定な形質転換体が望まれる実施形態では、自律複製を促すテロメア配列を有するプラスミドを使用することができる。自律複製用に設計されているその他のタイプのプラスミド（例えば、自利複製配列、セントロメア配列またはその他の配列を有するプラスミド）も用いることができる。驚いたことにトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）では、複製開始点、自律複製配列、セントロメア配列またはテロメア配列が未知であるプラスミドを使用することができることを本発明者らは発見した。選択可能マーカーに関して不安定な表現型を示す形質転換体をスクリーニングすることにより、ベクターＤＮＡが挿入されていない効率的な標的部位遺伝子改変が得られる。
【０１０８】
本開示のある特定の実施形態は、真菌のゲノム中でＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットおよび第１の選択可能マーカー（この発現カセットおよび第１の選択可能マーカーのその後の除去（ループアウト）を可能にするために反復配列が任意選択で隣接している）を組み込んでＣａｓエンドヌクレアーゼ発現宿主細胞を製造することを含む。この細胞を様々な方法で用いて、所望の標的部位でＤＮＡ配列の改変等の目的の遺伝子改変を得ることができる。
【０１０９】
例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現宿主細胞を、第２の選択可能マーカーを含むガイドＲＮＡ発現カセットを含むＤＮＡ構築物で形質転換することができる。第２の選択可能マーカーを使用するために選択された宿主細胞は、このＤＮＡ構築物からガイドＲＮＡを発現することができ、このガイドＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの活動およびゲノム中の画定された目的の標的部位の標的化を可能にする。この宿主細胞を、第２の選択可能マーカーに関して不安定な表現型を示す形質転換体に関してスクリーニングすることにより、ＤＮＡ構築物が挿入されていない目的の改変部位を有する宿主細胞を得ることができる。
【０１１０】
別の例として、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現宿主細胞は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの活動およびゲノム中の画定された部位の標的化を可能にするために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されたガイドＲＮＡを取り込むように誘導され得る。ある場合では、ガイドＲＮＡと、ＤＮＡが取り込まれているおよび高頻度でガイドＲＮＡが同時に取り込まれていると予想される細胞の選択を可能にするための選択可能マーカー遺伝子を担持する別のＤＮＡ構築物との両方の取込みを誘導することが望ましいであろう。上記のように、ベクターＤＮＡが挿入されていない目的の遺伝子改変用の選択可能マーカーに関して不安定な表現型を示す形質転換体のスクリーニングが得られる。
【０１１１】
更に別の例として、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現宿主細胞を使用して、「標的株」にＣａｓエンドヌクレアーゼをｉｎ  ｔｒａｎｓで供給することができる「ヘルパー株（ｈｅｌｐｅｒ  ｓｔｒａｉｎ）」を生成することができる。簡潔に言うと、例えば、各株からのプロトプラストの融合により、または糸状真菌の種に応じた菌糸の吻合により、このヘルパー株と標的株との間で異核共存体を生成することができる。異核共存体の維持は、適切な栄養またはその他のマーカー遺伝子または各親株中の変異、および親株は増殖することができないが異核共存体は相補性に起因して増殖することができるような適切な選択培地上での増殖に依存するだろう。異核共存体形成時またはその後のいずれかで、ガイドＲＮＡを遺伝子導入により導入する。ガイドＲＮＡを直接導入してもよいし、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットおよび選択可能マーカー遺伝子を有するＤＮＡ構築物を介して導入してもよい。Ｃａｓエンドヌクレアーゼはヘルパー株の核中で遺伝子から発現され、異核共存体の細胞質中に存在する。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡと会合してゲノム中の所望の標的部位を標的とする活性複合体を生成し、ＤＮＡ配列の改変を誘導する。その後、この異核共存体から胞子を回収し、標的部位でＤＮＡ配列の改変を有する標的株を回収するための選択またはスクリーニングにかける。発現カセットを使用してガイドＲＮＡを導入する場合、ガイドＲＮＡ発現構築物が安定的に維持されていない異核共存体が選択される。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、ＣａｓエンドヌクレアーゼはＣａｓ９エンドヌクレアーゼである（例えば「ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ  Ｃｏｍｐｌｅｘ」という表題の国際公開第２０１３１４１６８０号パンフレットを参照されたい）。Ｃａｓエンドヌクレアーゼの例として、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種（例えばＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種（例えばＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種（例えばＮ．メニンジティデス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ））、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種（例えばＦ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））ならびにパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種（例えばＰ．ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ））に由来するものが挙げられる（例えば、Ｆｏｎｆａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０１３，ｐａｇｅｓ１−１４（参照により本明細書に援用される）で説明されているＣａｓ９エンドヌクレアーゼを参照されたい）。一部の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、例えば真菌細胞中での発現に最適化されている最適化Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子（例えば、下記で説明するように、配列番号８を含むＣａｓ９コーディング遺伝子（例えば配列番号９））によりコードされる。
【０１１３】
ある特定の場合には、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、核局在化シグナルをコードする１種または複数種のポリヌクレオチドに作動可能に連結されており、その結果、細胞中で発現されるＣａｓエンドヌクレアーゼ／ガイドポリヌクレオチド複合体は核へと効率的に運ばれる。あらゆる好都合な核局在化シグナル、例えばＣａｓコドン領域の上流およびこのＣａｓコドン領域を含むフレーム中に存在するＳＶ４０核局在化シグナルをコードするポリヌクレオチド、ならびにＣａｓコドン領域の下流およびこのＣａｓコドン領域を含むフレーム中に存在するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｂｌｒ２（青色光制御因子２）遺伝子に由来する核局在化シグナルをコードするポリヌクレオチドを使用することができる。その他の核局在化シグナルを用いることができる。
【０１１４】
本開示のある特定の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃｒＲＮＡ領域（またはｃｒＲＮＡ断片）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（またはｔｒａｃｒＲＮＡ断片）を含むガイドＲＮＡである。上記で示したように、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体はＣａｓエンドヌクレアーゼを真菌細胞のゲノム標的部位へと誘導することができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがゲノム標的部位に二本鎖切断を導入することを可能にする。ある場合では、ＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体を誘導するＲＮＡは、ｃｒＲＮＡと独立したｔｒａｃｒＲＮＡとを含む二本鎖である。その他の場合では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ領域およびｔｒａｃｒＲＮＡ領域の両方を含む単一ＲＮＡ分子（本明細書において融合ガイドＲＮＡと称される場合がある）である。二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡに対して融合ガイドＲＮＡを使用する利点の１つは、融合ガイドＲＮＡを発現させるために作製する必要がある発現カセットが１種のみであるということである。
【０１１５】
本明細書で開示する方法で用いる宿主細胞は、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）門、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門、ツボカビ（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門および接合菌（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）門（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫにより定義される）と、卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，上記を参照、で言及されている）および全ての栄養胞子形成真菌（（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，上記を参照）とに由来するあらゆる真菌宿主細胞であることができる。ある特定の実施形態では、真菌宿主細胞は酵母細胞であり、例えば、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（ＳｃｈｉｚｏＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の細胞である。酵母の種として、下記のものが挙げられるがこれらに限定されない：サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の細胞。追加の実施形態では、真菌細胞は糸状真菌細胞であり、糸状真菌細胞としてトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）およびエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）の種が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、糸状真菌Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）を本開示の方法の態様で使用する。
【０１１６】
標的部位が必要なプロトスペーサー隣接モチーフ（またはＰＡＭ）を含む限り、本開示の方法を使用して真菌細胞ゲノム中の実質的にいかなる標的部位も標的とすることができる。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭは配列ＮＧＧ（５’から３’へ、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴである）を有し、そのため、ゲノム中の標的部位の選択に対する相当な制限を加えない。その他の既知のＣａｓ９エンドヌクレアーゼは異なるＰＡＭ部位を有する（例えば、Ｆｏｎｆａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０１３，ｐａｇｅｓ１−１４（参照により本明細書に援用される）で説明されているＣａｓ９エンドヌクレアーゼＰＡＭ部位を参照されたい）。
【０１１７】
標的部位の長さは変動することができ、例えば、少なくとも１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個またはより多くのヌクレオチドの長さである標的部位が挙げられる。標的部位は回文構造であることができ、換言すれば、一方の鎖上の配列が相補鎖上で反対方向に同じものを読み取ることが更に可能である。切断部位は標的配列内に存在することができる、または切断部位は標的配列の外側に存在する可能性がある。別のバージョンでは、切断が互いに直接向かい合ったヌクレオチド位置で起きて平滑末端切断が起きる可能性があり、その他の場合では、切り込みが千鳥足状となり、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングのいずれかであることができる一本鎖オーバーハング（「粘着末端」とも呼ばれる）を生じさせる可能性がある。
【０１１８】
ある場合では、真菌細胞のゲノム中の活性多様体標的配列も使用することができ、このことは、標的部位が（ガイドポリヌクレオチドのｃｒＲＮＡ配列内の）ガイドポリヌクレオチド中の関連配列と１００％同一ではないことを意味する。そのような活性多様体は、所与の標的部位に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはより高い配列同一性を含むことができ、活性多様体標的配列は生物学的活性を保持しており、従ってＣａｓエンドヌクレアーゼにより認識されて切断され得る。エンドヌクレアーゼによる標的部位の二本鎖切断を確認するためのアッセイは当分野で既知であり、一般には、認識部位を含むＤＮＡ基質への薬剤の全体的な活性および特異性を測定する。
【０１１９】
目的の標的部位として、目的の遺伝子の領域内に位置する標的部位が挙げられる。目的の遺伝子内の領域の非限定的な例として、オープンリーディングフレーム、プロモーター、転写制御エレメント、翻訳制御エレメント、転写ターミネーター配列、ｍＲＮＡスプライス部位、タンパク質コーディング配列、イントロン部位およびイントロン強化モチーフ（ｉｎｔｒｏｎ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ）が挙げられる。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、真菌細胞のゲノム改変により検出可能な表現型効果が生じ、多くの場合には使用者の所望の結果である。非限定的な例として、選択可能な細胞増殖表現型（例えば抗生物質に対する耐性または感度、栄養要求性特性の獲得または喪失、増殖率の増加または低下等）、検出可能マーカー（例えば蛍光マーカー、細胞表面分子、発色酵素等）の発現、および培養上清中で活性が検出され得る酵素の分泌が挙げられる。
【０１２１】
ある場合では、真菌細胞中でのゲノム改変をあらゆる好都合な方法を使用して直接検出し、この方法として、シークエンシング、ＰＣＲ、サザンブロット、制限酵素分析および同類のもが挙げられ、そのような方法の組み合わせも挙げられる。
【０１２２】
一部の実施形態では、特定の遺伝子を本開示の方法を使用して改変の標的とし、この遺伝子として、酵素（例えば、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクテートリアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼおよびこれらの組み合わせ）をコードする遺伝子が挙げられる。
【０１２３】
本明細書で説明する方法を実行するための多くのバリエーションが存在する。例えば、真菌宿主細胞中で外来性配列として存在するＣａｓ発現カセットを有する代わりに、このカセットを真菌宿主のゲノムに組み込むことができる。この親細胞株の生成により、本明細書の他の場所で詳述するように、使用者が、後に目的のゲノム部位を標的とするであろう所望のガイドＲＮＡを（例えばガイドＲＮＡ発現ベクターとして）簡単に導入することが可能になるだろう。これらの実施形態の内の一部では、組み込まれたＣａｓ遺伝子を、必要に応じてゲノムからのその後のループアウト／除去のためにこのＣａｓ遺伝子に隣接するポリヌクレオチド複製配列を含むように設計することができる。
【０１２４】
本明細書で開示する組成物および方法の非限定的な例または実施形態は下記の通りである。
１．糸状真菌細胞のゲノム中の標的部位でＤＮＡ配列を改変する方法であって、
ａ）ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを糸状真菌細胞の集団に導入することであり、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび前記ガイドＲＮＡは、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが前記真菌細胞の前記ゲノム中の標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる、導入すること、ならびに
ｂ）前記集団から、前記標的部位で前記ＤＮＡ配列の改変を有する少なくとも１個の真菌細胞を同定すること
を含み、
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、前記ガイドＲＮＡまたは両方が前記真菌細胞の集団に一時的に導入される、
方法。
２．前記標的部位での前記ＤＮＡ配列の改変が、１個または複数個のヌクレオチドの欠失、１個または複数個のヌクレオチドの挿入、１個または複数個のヌクレオチドの置換およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１に記載の方法。
３．前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼを前記真菌細胞の集団に導入することを、遺伝子導入技術、形質導入技術、形質転換技術、電気穿孔技術、粒子衝突（微粒子銃粒子送達）技術および細胞融合技術からなる群から選択される方法を使用して達成する、実施形態１または２に記載の方法。
４．前記ガイドＲＮＡを前記真菌細胞の集団に導入することを、遺伝子導入技術、形質導入技術、形質転換技術、電気穿孔技術、粒子衝突（微粒子銃粒子送達）技術および細胞融合技術からなる群から選択される方法を使用して達成する、実施形態１〜３のいずれか一つに記載の方法。
５．前記同定する工程が、前記標的部位での前記ＤＮＡ配列の改変を選択するためのまたはスクリーニングするための条件下で前記工程（ａ）からの真菌細胞の集団を培養することを含む、実施形態１〜４のいずれか一つに記載の方法。
６．前記同定する工程が、不安定な形質転換体をスクリーニングするための条件下で前記工程（ａ）からの細胞の集団を培養することを含む、実施形態１〜５のいずれか一つに記載の方法。
７．前記ＣａｓエンドヌクレアーゼがＣａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの多様体である、実施形態１〜６のいずれか一つに記載の方法。
８．前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの多様体が、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、Ｎ．メニンジティデス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種、Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）およびパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種、Ｐ．ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）からなる群から選択される種由来の完全長Ｃａｓ９またはこの機能的断片を含む、実施形態７に記載の方法。
９．前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの多様体が、配列番号１〜７のいずれか一つまたはその機能的断片に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態８に記載の方法。
１０．前記導入する工程が、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを含むＤＮＡ構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、実施形態１〜９のいずれか一つに記載の方法。
１１．前記導入する工程が、前記ガイドＲＮＡ用の発現カセットを含むＤＮＡ構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
１２．前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼを直接導入することを含む、実施形態１〜９および１１のいずれか一つに記載の方法。
１３．前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記ガイドＲＮＡを直接導入することを含む、実施形態１〜１０および１２のいずれか一つに記載の方法。
１４．前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットが、前記真菌細胞中での発現に最適化されているＣａｓコーディング配列を含む、実施形態１０に記載の方法。
１５．前記Ｃａｓコーディング配列が、配列番号８に対して少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド配列を含むＣａｓ９コーディング配列またはこの機能的断片である、実施形態１４に記載の方法。
１６．前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが核局在化シグナルに作動可能に連結されている、実施形態１〜１５のいずれか一つに記載の方法。
１７．前記ガイドＲＮＡ用の発現カセットが、ユーサコマイセート（Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）中でまたはペジゾマイセート（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｅｔｅ）中で機能するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターを含み、前記プロモーターが前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている、実施形態１１に記載の方法。
１８．前記プロモーターがトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来する、実施形態１７に記載の方法。
１９．前記プロモーターが、配列番号１１もしくは１２に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列またはこの機能的断片を含む、実施形態１７または１８に記載の方法。
２０．前記プロモーターが配列番号１１または１２の配列を含む、実施形態１９に記載の方法。
２１．前記ガイドＲＮＡ用の発現カセットが、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子由来のイントロン配列を有するガイドＲＮＡコーディングＤＮＡを含む、実施形態１１および１７〜２０のいずれか一つに記載の方法。
２２．前記トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するイントロン配列が、配列番号９０に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列またはこの機能的断片を含む、実施形態２１に記載の方法。
２３．前記トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するイントロン配列が配列番号９０の配列を含む、実施形態２２に記載の方法。
２４．前記糸状真菌細胞がユウミコチニア（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）真菌細胞またはペジゾミコチニア（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）真菌細胞である、実施形態１〜２３のいずれか一つに記載の方法。
２５．前記糸状真菌細胞が、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）およびエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）からなる群から選択される、実施形態１〜２４のいずれか一つに記載の方法。
２６．前記標的部位が、オープンリーディングフレーム、プロモーター、制御配列、ターミネーター配列、制御エレメント配列、スプライス部位、コーディング配列、ポリユビキチン化部位、イントロン部位およびイントロン増強モチーフからなる群から選択される目的の遺伝子の領域内に位置する、実施形態１〜２５のいずれか一つに記載の方法。
２７．前記導入する工程が、（ｉ）前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼを安定的に発現する親真菌細胞集団を得ること、および（ｉｉ）前記親真菌細胞集団に前記ガイドＲＮＡを一時的に導入することを含む、実施形態１、２、４〜９、１１、１３および１６〜１９のいずれか一つに記載の方法。
２８．前記導入する工程が、（ｉ）前記ガイドＲＮＡを安定的に発現する親真菌細胞集団を得ること、および（ｉｉ）前記親真菌細胞集団に前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼを一時的に導入することを含む、実施形態１〜３、５〜１０、１２および１４〜１９のいずれか一つに記載の方法。
２９．前記標的部位での前記ＤＮＡ配列の改変が相同組換えに起因しない、実施形態１〜２８のいずれか一つに記載の方法。
３０．前記方法が前記真菌細胞の集団にドナーＤＮＡを導入することを含まない、実施形態１〜２９のいずれか一つに記載の方法。
３１．実施形態１〜３０のいずれか一つの記載の方法により製造されている組換え真菌細胞。
３２．Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはこの多様体をコードする、操作された核酸であって、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはこの多様体が、配列番号１〜７のいずれか一つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列またはこの機能的断片を含み、前記核酸が、配列番号８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるポリヌクレオチド配列またはこの機能的断片を含む、操作された核酸。
３３．前記核酸が配列番号８の配列を含む、実施形態３２に記載の操作された核酸。
３４．Ｃａｓエンドヌクレアーゼが糸状真菌細胞のゲノム中の標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にするガイドＲＮＡをコードする、操作された核酸であって、前記ガイドＲＮＡをコードする核酸が、ユーサコマイセート（Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）中でまたはペジゾマイセート（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｅｔｅ）中で機能するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターを含み、前記プロモーターがトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来する、操作された核酸
３５．前記プロモーターが、配列番号１１もしくは１２に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列またはこの機能的断片を含む、実施形態３４に記載の操作された核酸。
３６．Ｃａｓエンドヌクレアーゼが糸状真菌細胞のゲノム中の標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にするガイドＲＮＡをコードする、操作された核酸であって、前記ガイドＲＮＡをコードする核酸が、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するイントロン配列を有するガイドＲＮＡコーディングＤＮＡを含む、操作された核酸。
３７．前記トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するイントロン配列が、配列番号９０に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列またはこの機能的断片を含む、実施形態３６に記載の操作された核酸。
３８．前記ガイドＲＮＡをコードする核酸が、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するプロモーターとトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するイントロン配列との両方を含み、前記プロモーターが、配列番号１１または１２に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記プロモーターが、配列番号１１もしくは１２に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列またはこの機能的断片を含み、前記トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するイントロン配列が、配列番号９０に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列またはこの機能的断片を含む、実施形態３４または３６に記載の操作された核酸。
【実施例】
【０１２５】
下記の実施例では、別途明記しない限り、部および割合は重量によるものであり、度は摂氏である。この実施例は本開示の実施形態を示すが例示のみを目的として提示されることを理解すべきである。上記の議論およびこの実施例から、当業者は本開示の様々な変更および改変を行って本開示を様々な用法および条件に適合させることができる。そのような改変も、添付した特許請求の範囲に含まれるものとする。
【０１２６】
第Ａ節：発現ベクターによるＣａｓ／ガイドＲＮＡの導入
実施例１：Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子の同定
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーターの使用に起因するであろう５’キャップ構造の付加またはポリアデニル化が生じないＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）中でのガイドＲＮＡの産生に望ましい。しかしながら、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）中で機能するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターは説明されていない。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｓｎｒ５２遺伝子、ヒトＵ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子またはトウモロコシＵ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子からの５’上流領域等のその他の種由来の既知のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターがＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）中で機能する能力に関して試験することを検討した。
【０１２７】
より望ましいのは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターとして機能することができる天然Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）配列を同定することであった。ヒトＵ６核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１４４８６）をコードするＤＮＡ配列を使用し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用してＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｖ２ゲノム配列（ｗｗｗ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ）を検索した。このヒト配列に対する類似性を有するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＤＮＡ配列の短い領域を同定した。周囲のＤＮＡ配列の検討および酵母（特にシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（Ｍａｒｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４：１８１６−１８３５））のＵ６遺伝子との比較により、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６遺伝子の多くの特徴を推定的に同定することができた（配列番号２２、下記に示す）。転写配列の開始およびターミネーターを上流のＴＡＴＡボックスと同様に同定した。この転写領域はイントロンで明らかに中断されており、可能性があるＡ−ボックスプロモーターエレメントおよびＢ−ボックスプロモーターエレメントをこの転写領域内で認めることができ、後者をイントロン内で認めることができる（図１を参照されたい）。
【化１】
2018504895.tif 000003
【０１２８】
実施例２：Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）遺伝子を標的とするためのｓｇＲＮＡ配列
単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子がストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質と相互作用することにより、このエンドヌクレアーゼの標的をｉｎ  ｖｉｖｏで真核生物のゲノム（ＲＥＦＳ）中の特定の遺伝子座に設定することができることが分かっている。ｓｇＲＮＡは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの成分であることが自然に観測されるｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡとの間の融合体として設計されているハイブリッド分子である（Ｇａｓｉｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０９：Ｅ２５７９−８６、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−２１、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８２３−２６およびＣｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８１９−２３）。ｓｇＲＮＡの最初の２０個のヌクレオチドはゲノム中の標的部位に相補的である。ｓｇＲＮＡ相補領域に隣接するゲノム中の標的部位に追加の配列（ＰＡＭ、プロトスペーサー隣接モチーフ）が存在することも必要である。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭは配列ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴである）である。
【０１２９】
この実験で使用するｓｇＲＮＡの配列を下記に示し、標的部位に相補的であるように設計されている２０個のヌクレオチドをＮ残基（Ｎ＝Ａ、Ｇ、ＣまたはＵ）として示す（配列番号２３）。
【化２】
2018504895.tif 000004
【０１３０】
ｓｇＲＮＡを、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のゲノム中の様々な遺伝子座を標的とするように設計した。標的部位１（ＴＳ１）と命名した部位でＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ａｄ３Ａ遺伝子（ホスホリボシルアミドイミダゾール−スクシノカルボキシアミドシンターゼ）を標的とするためのｓｇＲＮＡ（ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１と呼ぶ）の配列を下記に示す（配列番号２４）。Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のゲノム配列に相補的である２０個のヌクレオチド領域を小文字で示す。
【化３】
2018504895.tif 000005
【０１３１】
標的部位２（ＴＳ２）と命名した部位でＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｇｌａ１（グルコアミラーゼ）遺伝子を標的とするためのｓｇＲＮＡ（ｇＴｒＧＡ  ＴＳ２と呼ぶ）の配列を下記に示す（配列番号２５）。Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のゲノム配列に相補的である２０個のヌクレオチド領域を小文字で示す。
【化４】
2018504895.tif 000006
【０１３２】
標的部位１１（ＴＳ１１）と命名した部位でＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｇｌａ１（グルコアミラーゼ）遺伝子を標的とするためのｓｇＲＮＡ（ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１と呼ぶ）の配列を下記に示す（配列番号２６）。Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のゲノム配列に相補的である２０個のヌクレオチド領域を小文字で示す。
【化５】
2018504895.tif 000007
【０１３３】
標的部位６（ＴＳ６）と命名した部位でＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２（オロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ）遺伝子を標的とするためのｓｇＲＮＡ（ｇＰｙｒ２  ＴＳ６と呼ぶ）の配列を下記に示す（配列番号２７）。Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のゲノム配列に相補的である２０個のヌクレオチド領域を小文字で示す。
【化６】
2018504895.tif 000008
【０１３４】
実施例３：Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）中での発現用のＣａｓ９ＤＮＡ配列およびＣａｓ９タンパク質配列
コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９コーディング遺伝子（ＮＬＳ配列を含む）を設計し、合成し、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）中での発現に関して試験した（配列番号９）。コードされるタンパク質（配列番号１０）は、Ｎ末端ＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ、配列番号１９）とＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｂｌｒ２（青色光制御因子２）遺伝子に由来するＣ末端ＮＬＳ（配列番号２０）とを有する（両方とも下記の配列番号１０において下線を引いている）。
配列番号９
【化７】
2018504895.tif 000009
【化８】
2018504895.tif 000010
配列番号１０
【化９】
2018504895.tif 000011
【０１３５】
実施例４：Ｃａｓ９発現ベクターの構築
上記に示すＣａｓ９をコードする合成ＤＮＡ配列を、Ｇａｔｅｗａｙクローニング（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）により適切な発現ベクター中に移すことを可能にすべく、この合成ＤＮＡ配列が、隣接するａｔｔＬ１部位とａｔｔＬ２部位との間に存在し得るように、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯに挿入した。下記の特徴を含むＧａｔｅｗａｙ適合性発現ベクター（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇが入手可能であった：Ｇａｔｅｗａｙクローニング部位により離れているＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｋｉ１（ピルベートキナーゼ）遺伝子由来のプロモーター領域およびＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１（セロビオヒドロラーゼＩ）遺伝子由来のターミネーター領域、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）ｃｐｃ１（交差経路制御１）プロモーター領域とアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｔｒｐＣ（グルタミンアミドトランスフェラーゼ活性、インドールグリセロールホスフェートシンターゼ活性およびホスホリボシルアントラニレートイソメラーゼ活性を有する三機能タンパク質）ターミネーター領域とに機能的に連結されている細菌ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ならびに選択用のおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での維持用の細菌ベクター配列。Ｇａｔｅｗａｙクローニング手順（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃａｓ９遺伝子をｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇにクローニングし、ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓを得た（図２を参照されたい）。
【０１３６】
実施例５：ｓｇＲＮＡ発現ベクターの構築
異なる推定上のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性のプロモーターおよびターミネーターが隣接しているｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１  ｓｇＲＮＡをコードする合成ＤＮＡ配列を得た。これらの合成ＤＮＡ配列はそれぞれ、両端に制限酵素認識部位（ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ）も有していた。
【０１３７】
下記の配列は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｓｎｒ５２プロモーターとＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｓｕｐ４ターミネーターとを有するｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１  ｓｇＲＮＡ（下線を引いている）をコードする（名称ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−１。配列番号２８）。
【化１０】
2018504895.tif 000012
【０１３８】
下記の配列は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６のプロモーターおよびターミネーターを有するｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１  ｓｇＲＮＡ（下線を引いている）をコードする（名称ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−２、配列番号２９）。
【化１１】
2018504895.tif 000013
【０１３９】
下記の配列は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６のプロモーター、ターミネーターおよびイントロン（イタリック体）を有するｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１  ｓｇＲＮＡ（下線を引いている）をコードする（名称ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−３、配列番号３０）。
【化１２】
2018504895.tif 000014
【０１４０】
プラスミドｐ２１９Ｍ（図３）は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ４（オロチジンモノホスフェートデカルボキシラーゼ）遺伝子を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクターであり、この遺伝子は、この遺伝子の天然のプロモーターおよびターミネーターを含む。このベクターをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して末端を脱リン酸化した。上記の合成ＤＮＡ分子をそれぞれＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、切断したｐ２１９Ｍとライゲートさせて、ｓｇＲＮＡ発現カセットとｐｙｒ４遺伝子とを含む一連のベクターを作製した。各ベクターを、このベクターがコードするｓｇＲＮＡの名称で命名した（例えば、ｐ２１９Ｍ  ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−１ではｇＡｄ３Ａ発現カセットとＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のｓｎｒ５２プロモーターおよびｓｕｐ４ターミネーターとが組み合わされている）。
【０１４１】
短いＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６プロモーター領域を有するガイドＲＮＡ発現カセットを合成ＤＮＡとして得た。ここで、ＴＳ１１でＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｇｌａ１遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ用の配列を含む一例を示す（配列番号３１、イントロン配列に下線を引いている）。
【化１３】
2018504895.tif 000015
【０１４２】
上記のｇＲＮＡ発現カセットを、プライマーｇＲＮＡフォワードａｆｌＩＩ（５’−ｃｇｔｃａｇｃｔｔａａｇＡＡＴＴＣＣＴＡＡＡＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＡＴＧＧ、配列番号３２）およびｇＲＮＡリバースｓｆｉＩ（５’−ｃｇｔｃａｇｇｇｃｃａｃｇｔｇｇｇｃｃＡＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧ、配列番号３３）を使用するＰＣＲにより増幅させた。これらのプライマーにより、ガイドＲＮＡ発現カセットの５’末端にａｆｌＩＩが付加されて３’末端にｓｆｉＩ部位が付加される。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを製造業者の指示に従って使用して精製した。次いで、ＰＣＲ産物をＳｆｉＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔで再度洗浄した。プラスミドｐＴｒｅｘ２ｇ／Ｈｙｇ  ＭｏＣａｓをＳｆｉＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄアルカリホスファターゼキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．、ＩＮ）を使用して脱リン酸化した。最後に、消化したプラスミドおよびＰＣＲ産物をＲｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡリガーゼキットを使用してライゲートさせてｐＴｒｅｘ２ｇ／Ｈｙｇ  ＭｏＣａｓ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１Ｂを作製した。その他のｓｇＲＮＡ発現カセットを同様の方法でｐＴｒｅｘ２ｇ／Ｈｙｇ  ＭｏＣａｓに挿入した。
【０１４３】
実施例６：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）中におけるＣａｓ９媒介型遺伝子不活性化
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株を２種の別々の発現ベクター（Ｃａｓ９産生用の１種およびｇＲＮＡ産生用の１種）で共形質転換する、またはＣａｓ９およびｇＲＮＡの両方の発現用の単一ベクターで形質転換する、一連の実験を下記に説明する。これらの実験から、Ｕ６イントロンがｇＲＮＡ転写領域内にも存在する場合にのみ、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６遺伝子からの５’上流領域がｇＲＮＡ転写を促進したことが実証される。これらの実験から、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）形質転換体では、標的とされた遺伝子の不活性化が高効率で起こり得ることも実証される。
【０１４４】
ａｄ３Ａ遺伝子の不活性化
４種の主要な分泌セルラーゼをコードする遺伝子（ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１およびｅｇｌ２）が欠失した、公的に入手可能な株ＲＬ−Ｐ３７に由来するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の株を使用した。この株は、機能するｐｙｒ４遺伝子も欠いていた。バイオリスティック形質転換（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（米国特許出願公開第２００６０００３４０８Ａ１号明細書で説明されている）を使用して、等量のｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓとｐ２１９Ｍ  ｇＡｄ３ＡＴＳ１−１、ｐ２１９Ｍ  ｇＡｄ３ＡＴＳ１−２またはｐ２１９Ｍ  ｇＡｄ３ＡＴＳ１−３のいずれかとの混合物で共形質転換した。２％のグルコース、１００ｍｇ／ＬのハイグロマイシンＢおよび２００ｍｇ／Ｌのアデニンを含むフォーゲルの最少培地を含む寒天プレート上で形質転換体を選択した。最初のプレート上での選択後、形質転換体コロニーを同じ選択培地の新鮮なプレートへと採取した。２番目のプレート上での増殖中に、安定したハイグロマイシン耐性形質転換体と不安定なハイグロマイシン形質転換体とを区別することができた。安定した形質転換体はより急速に増殖し、このコロニーは輪郭が滑らかであり、菌糸体はより密集していた。不安定な形質転換体はより遅く増殖し、菌糸体はより低密度であり、コロニーは輪郭がでこぼこで不規則であった。２番目のプレート上での増殖後、グルコースを含み、ハイグロマイシンを含まず、１４ｍｇ／Ｌのアデニンを含むフォーゲルの培地に形質転換体を移し、アデニン栄養要求体であることを示す赤色／褐色コロニーを示す形質転換体をスクリーニングした。ｐ２１９Ｍ  ｇＡｄ３ＡＴＳ１−１により５個の安定した形質転換体および２３個の不安定な形質転換体が得られ、全てがアデニン原栄養体であった。ｐ２１９Ｍ  ｇＡｄ３ＡＴＳ１−２により１１個の安定した形質転換体および３８個の不安定な形質転換体が得られ、１１個全ての安定した形質転換体および不安定な形質転換体の内の２９個がアデニン原栄養体であった。ｐ２１９Ｍ  ｇＡｄ３ＡＴＳ１−３により１９個の安定した形質転換体および２個の不安定な形質転換体が得られ、全てがアデニン栄養要求体であった。明らかに、アデニン栄養要求体は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６のプロモーター、イントロンおよびターミネーターを用いてｓｇＡｄ３ＡＴＳ１の転写を制御するｇＡｄ３ＡＴＳ１−３によってのみ得られた。アデニン栄養要求体は、天然Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ａｄ３Ａ遺伝子座での標的としたＣａｓ９切断を示す。試験したｇＡｄ３ＡＴＳ１−３による全ての形質転換体がアデニン栄養要求体であったことから、Ｃａｓ９媒介型の遺伝子不活性化は効率的であると結論付けることができる。
【０１４５】
ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓとｐ２１９Ｍ  ｇＡｄ３ＡＴＳ１−３とによる共形質転換体におけるａｄ３Ａ遺伝子座での変異を確認するために、１０個の安定したアデニン栄養要求性形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを、Ｃａｓ９標的部位にまで及んでいるまたはこの標的部位の上流もしくは下流である産物を生成するように設計されているいくつかの異なるプライマー対を使用するＰＣＲのテンプレートとして使用した。ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、製造業者の指示に従ってＰＣＲに使用した。いずれの場合においても、伸長時間は、下記で説明するＰＣＲ産物の予想したサイズ用に製造業者により示唆されているものであった。ＰＣＲ産物のサイズをアガロースゲル電気泳動により評価した。
【０１４６】
ＴＳ１標的部位の５’側上の領域を増幅するＡｄ３  ５’フォワードプライマー＋Ａｄ３  ５’リバースプライマー（それぞれ５’−ｔｇａａｃａｃａｇｃｃａｃｃｇａｃａｔｃａｇｃ［配列番号３４］および５’−ｇｃｔｇｇｔｇａｇｇｇｔｔｔｇｔｇｃｔａｔｔｇ［配列番号３５］）を使用して、全ての形質転換体において予想したサイズ（８７２ｂｐ）のＰＣＲ産物を得た。
【０１４７】
ＴＳ１標的部位の５’側上の領域を増幅するＡｄ３  ５’フォワードプライマー＋Ａｄ３ａ  ５００５リバースプライマー（それぞれ５’−ｔｇａａｃａｃａｇｃｃａｃｃｇａｃａｔｃａｇｃ［配列番号３４］および５’−ｇａｔｔｇｃｔｔｇｇｇａｇｇａｇｇａｃａｔ［配列番号３６］）を使用して、全ての形質転換体において予想したサイズ（１２１４ｂｐ）のＰＣＲ産物を得た。
【０１４８】
ＴＳ１標的部位の３’側上の領域を増幅するＡｄ３  ３’フォワードプライマー＋Ａｄ３  ３’リバースプライマー（それぞれ５’−ｃｇａｇｇｃｃａｃｔｇａｔｇａａｇｔｔｇｔｔｃ［配列番号３７］および５’−ｃａｇｔｔｔｔｃｃａａｇｇｃｔｇｃｃａａｃｇｃ［配列番号３８］）を使用して、全ての形質転換体において予想したサイズ（９０４ｂｐ）のＰＣＲ産物を得た。
【０１４９】
ＴＳ１標的部位の３’側上の領域を増幅するＡｄ３ａ  ５００３フォワードプライマー＋Ａｄ３  ｍｉｄリバースプライマー（それぞれ５’−ｃｔｇａｔｃｔｔｇｃａｃｃｃｔｇｇａａａｔｃ［配列番号３９］および５’−ｃｔｃｔｃｔａｔｃａｔｔｔｇｃｃａｃｃｃｔｃｃ［配列番号４０］）を使用して、全ての形質転換体において予想したサイズ（７５７ｂｐ）のＰＣＲ産物を得た。
【０１５０】
上記のＰＣＲ結果から、このゲノムＤＮＡ調製物がＣａｓ９標的部位の上流または下流のいずれかからのＰＣＲ産物を得るのに十分な品質であることを実証された。
【０１５１】
ａｄ３Ａ中のＴＳ１標的部位にまで及んでいるＡｄｆｒａｇフォワードプライマー＋Ａｄｆｒａｇリバースプライマー（それぞれ５’−ｃｔｃｃａｔｔｃａｃｃｃｔｃａａｔｔｃｔｃｃ［配列番号４１］および５’−ｇｔｔｃｃｃｔｔｇｇｃｇｇｔｇｃｔｔｇｇａｔｃ［配列番号４２］）を使用すると、あらゆる形質転換体に関してＰＣＲ産物を得ることができなかった。Ｃａｓ９活性に起因する大きなサイズ変化はないと仮定すると、このＰＣＲ産物の予想されるサイズは約７６４ｂｐであった。
【０１５２】
ａｄ３Ａ中のＴＳ１標的部位にまで及んでいるＡｄｆｒａｇフォワードプライマー＋Ａｄ３  ３’リバースプライマー（それぞれ５’−ｃｔｃｃａｔｔｃａｃｃｃｔｃａａｔｔｃｔｃｃ［配列番号４１］および５’−ｃａｇｔｔｔｔｃｃａａｇｇｃｔｇｃｃａａｃｇｃ［配列番号３８］）を使用すると、あらゆる形質転換体に関してＰＣＲ産物を得ることができなかった。Ｃａｓ９活性に起因する大きなサイズ変化はないと仮定すると、このＰＣＲ産物の予想されるサイズは約２５０４ｂｐであった。
【０１５３】
ａｄ３Ａ中のＴＳ１標的部位にまで及んでいるＡｄ３ａ  ２ｋフォワードプライマー＋Ａｄ３ａ  ２ｋリバースプライマー（それぞれ５’−ｃａａｔａｇｃａｃａａａｃｃｃｔｃａｃｃａｇｃ［配列番号４３］および５’−ｇａａｃａａｃｔｔｃａｔｃａｇｔｇｇｃｃｔｃｇ［配列番号４４］）を使用すると、あらゆる形質転換体に関してＰＣＲ産物を得ることができなかった。Ｃａｓ９活性に起因する大きなサイズ変化はないと仮定すると、このＰＣＲ産物の予想されるサイズは約１８１３ｂｐであった。
【０１５４】
形質転換体の内の５個では、ＴＳ１標的部位にまで及んでいるＡｄｆｒａｇフォワードプライマー＋Ａｄ３  ｍｉｄリバースプライマー（それぞれ５’−ｃｔｃｃａｔｔｃａｃｃｃｔｃａａｔｔｃｔｃｃ［配列番号４１］および５’−ｃｔｃｔｃｔａｔｃａｔｔｔｇｃｃａｃｃｃｔｃｃ［配列番号４０］）を使用してもＰＣＲ産物が得られなかった。Ｃａｓ９活性に起因する大きなサイズ変化はないと仮定すると、このＰＣＲ産物の予想されるサイズは約１４３８ｂｐであった。
【０１５５】
公開されているデータに基づくと、Ｃａｓ９媒介型の遺伝子不活性化は概して、標的部位でのＤＮＡ中の二本鎖切断のエラーを起こしやすい修復を含む。最終結果は、この標的部位での小さい欠失または挿入（インデル）である。上記のＰＣＲ分析結果は、標的部位にまで及んでいる予想サイズのＰＣＲ産物を得ることができなかったという驚くべきものであり、このことは、ａｄ３Ａの不活性化が標的部位での小さい挿入または欠失（インデル）に起因していなかったことを示唆する。その代わり、これらのデータは、標的部位での染色体再配置または大きな挿入によりａｄ３Ａの不活性が引き起こされた可能性と一致する。
【０１５６】
グルコアミラーゼ（ＧＡ）遺伝子の不活性化
４種の主要な分泌セルラーゼをコードする遺伝子（ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１およびｅｇｌ２）が欠失した、公的に入手可能な株ＲＬ−Ｐ３７に由来するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の株を使用した。この株は、機能するｐｙｒ４遺伝子も欠いていた。この株を、等量のｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓとｐ２１９Ｍ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ２との混合物でバイオリスティック法を使用して共形質転換した。１％のグルコース、１００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢおよび２ｍｇ／ｍｌのウリジンを含むフォーゲルの最少培地を含む寒天プレート上で形質転換体を選択した。最初のプレート上での選択後、形質転換体コロニーを同じ選択培地の新鮮なプレートへと採取した。２番目のプレート上での増殖中に、安定したハイグロマイシン耐性形質転換体と不安定なハイグロマイシン形質転換体とを区別することができた。１７個の安定した形質転換体と４個の不安定な形質転換体を得た。これらの形質転換体を、グルコースを含まず１％の不溶性デンプンを含むフォーゲルの寒天プレートに移し、グルコアミラーゼの分泌の有無に関してスクリーニングした。グルコアミラーゼを分泌可能なコロニーは、よく増殖して胞子を形成する。グルコアミラーゼを分泌不能なコロニーは非常にまばらな菌糸体で増殖し、明らかに識別可能である。１７個の安定した形質転換体の内の１４個はグルコアミラーゼを分泌不能であり、４個全ての不安定な形質転換体がグルコアミラーゼを分泌しなかった。
【０１５７】
ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓとｐ２１９Ｍ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ２とによる共形質転換体中におけるｇｌａ１（グルコアミラーゼ）遺伝子座での変異を確認するために、５個の安定した、グルコアミラーゼを産生しない形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを、Ｃａｓ９標的部位にまで及んでいるまたはこの標的部位の上流もしくは下流である産物を生成するように設計されている様々なプライマー対を使用するＰＣＲのテンプレートとして使用した。ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、製造業者の指示に従ってＰＣＲに使用した。いずれの場合においても、伸長時間は、下記で説明するＰＣＲ産物の予想したサイズ用に製造業者により示唆されているものであった。ＰＣＲ産物のサイズをアガロースゲル電気泳動により評価した。
【０１５８】
ｇｌａ１中のＴＳ２標的部位にまで及んでいるｇｌａＡプライマー＋ｇｌａＢプライマー（それぞれ５’−ｃｃｇｔｔａｇｔｔｇａａｇａｔｃｃｔｔｇｃｃｇ［配列番号４５］および５’−ｇｔｃｇａｇｇａｔｔｔｇｃｔｔｃａｔａｃｃｔｃ［配列番号４６］）を使用すると、あらゆる形質転換体に関してＰＣＲ産物を得ることができなかった。Ｃａｓ９活性に起因する大きなサイズ変化はないと仮定すると、このＰＣＲ産物の予想されるサイズは約１３７１ｂｐであった。
【０１５９】
ＴＳ２標的部位の５’側上の領域を増幅するｇｌａＡプライマー＋ｇｌａＪプライマー（それぞれ５’−ｃｃｇｔｔａｇｔｔｇａａｇａｔｃｃｔｔｇｃｃｇ［配列番号４５］および５’−ｔｇｃｃｇａｃｔｔｔｇｔｃｃａｇｔｇａｔｔｃｇ［配列番号４７］）を使用して、全ての形質転換体において予想したサイズ（３６４ｂｐ）のバンドを得た。
【０１６０】
ＴＳ２標的部位の３’側上の領域を増幅するｇｌａＫプライマー＋ｇｌａＢプライマー（それぞれ５’−ｔｔａｃａｔｇｔｇｇａｃｇｃｇａｇａｔａｇｃｇ［配列番号４８］および５’−ｇｔｃｇａｇｇａｔｔｔｇｃｔｔｃａｔａｃｃｔｃ［配列番号４６］）を使用して、形質転換体の内の４個において予想したサイズ（５２０ｂｐ）のバンドを得た。形質転換体の内の１個では、このプライマー対によりＰＣＲ産物が得られなかった。
【０１６１】
標的とされたＣａ９作用によるｇｌａ１遺伝子の不活性化を実証することを目的とする別の実験を、ＲＬ−Ｐ３７に由来するおよび不活性なｐｙｒ４遺伝子を有するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の株を使用して実施した。この株のプロトプラストを、ポリエチレングリコール媒介型方法（下記で説明する）を使用してｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１で形質転換した。２％のグルコース、２ｍｇ／ｍｌのウリジン、１．１Ｍのソルビトールおよび１００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むフォーゲルの最少培地の寒天プレート上で形質転換体を選択した。最初のプレート上での選択後、形質転換体コロニーを、ソルビトールを含まない同じ選択培地の新鮮なプレートへと採取した。２番目のプレート上での増殖中に、安定したハイグロマイシン耐性形質転換体と不安定なハイグロマイシン形質転換体とを区別することができた。形質転換体を、グルコースを含まず１％の不溶性デンプンを含むフォーゲルの寒天プレートに移し、グルコアミラーゼの分泌の有無に関してスクリーニングした。グルコアミラーゼを分泌しなかった５個の安定した形質転換体（Ｂ＃１、Ｂ＃２、Ｂ＃４、Ｂ＃５およびＢ＃６と命名した）を更なる分析用に選択した。これらの形質転換体それぞれからゲノムＤＮＡを抽出した。
【０１６２】
ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用し、ＴＳ１１標的部位にまで及んでいる野生型ｇｌａ１遺伝子座から９８３ｂｐの産物を生成するプライマーｇｌａ１ｒｅｐＦおよびｇｌａ１ｒｅｐＲ（それぞれ５’−ｇｔｇｔｇｔｃｔａａｔｇｃｃｔｃｃａｃｃａｃ［配列番号４９］および５’−ｇａｔｃｇｔｇｃｔａｇｃｇｃｔｇｃｔｇｔｔｇ［配列番号５０］）を使用してＰＣＲを実施した。ＰＣＲ条件に、ＰＣＲサイクル毎にプライマーアニーリング温度を徐々に下げること、および標的部位で大きな挿入があったかどうかを確認するための長い伸長時間を含めた。具体的なＰＣＲ条件は下記の通りであった。
工程１：１分にわたり９４Ｃ
工程２：２５秒にわたり９４Ｃ
工程３：３０秒にわたり６３Ｃ（１サイクル当たり０．２Ｃの温度低下）
工程４：８分にわたり７０Ｃ
工程２〜４を更に２４回繰り返した
工程５：４Ｃで保持した
【０１６３】
形質転換体の内の２個（Ｂ＃１およびＢ＃６）から１２ｋｂを超える明瞭なＣＰＲ産物を得ており、このことは、標的部位にまで及んでいるＤＮＡ領域中での１１ｋｂを超える増加を示唆する。その他の３個の形質転換体からは、アガロースゲル電気泳動で低強度バンドとして現れる非特異的ＰＣＲ産物のみを得た。Ｂ＃６からの＞１２ｋｂのＰＣＲ産物配の配列分析により、プラスミドｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１に由来するＤＮＡがＴＳ１１標的部位で挿入されていることが実証された。
【０１６４】
ゲノムＤＮＡ試料Ｂ＃２、Ｂ＃４およびＢ＃５と、プライマー対１５５３Ｒおよび１５５５Ｆ（それぞれ５’−ＣＣＧＴＧＡＴＧＧＡＧＣＣＣＧＴＣＴＴＣＴ［配列番号５１］および５’−ＣＧＣＧＧＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＣＴＴＴＴＴＣ［配列番号５２］）とを使用してＰＣＲを実施した。プライマー１５５３Ｒは、標的部位１１の３’側上のｇｌａ１遺伝子に結合する。プライマー１５５５Ｆは、プラスミドｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１上のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇＢ）遺伝子の開始コドン付近に結合する。上記と同じＰＣＲ条件を使用した。形質転換体Ｂ＃４およびＢ＃５それぞれに関して、４．５ｋｂおよび６．５のＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物は、ｈｙｇＢ遺伝子を有するプラスミドがｇｌａ１遺伝子に挿入された場合にのみ得られるはずである。おそらく、形質転換体Ｂ＃４およびＢ＃５に挿入されたプラスミドＤＮＡが大きかったことから、プライマーｇｌａ１ｒｅｐＦおよびｇｌａ１ｒｅｐＲを使用してＰＣＲ産物を得ることができなった。
【０１６５】
まとめると、ＰＣＲデータから、ｇｌａ１遺伝子中の標的部位でのＣａｓ９およびガイドＲＮＡの発現ベクターの大きなセグメントの挿入により、グルコアミラーゼが不活性化されている安定したハイグロマイシン耐性形質転換体が生じていることが実証された。
【０１６６】
ｐｙｒ２遺伝子の不活性化
Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２遺伝子内の様々な位置を標的とするガイドＲＮＡ発現カセットを含むプラスミドｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓの誘導体によるプロトプラストのＰＥＧ媒介型形質転換により、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株ＱＭ６ａまたはＲＬ−Ｐ３７の形質転換体を生成した。この遺伝子の不活性化により、ウリジン栄養要求性および５−フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）に対する耐性が付与される。最初に、ハイグロマイシンＢを含む培地上で形質転換体を選択した。ハイグロマイシンＢを含む新鮮な寒天プレートに移して安定または不安定と印を付けた。次いで、形質転換体を、２ｍｇ／ｍｌのウリジンおよび１．２ｍｇ／ｍｌのＦＯＡを含むフォーゲルの最少培地の寒天プレートに移した。ＦＯＡの存在下で増殖する能力は、Ｃａｓ９媒介型のｐｙｒ２遺伝子不活性化に起因するウリジン栄養要求性を示す。
【０１６７】
ＦＯＡ耐性でハイグロマイシン安定なおよび不安定な形質転換体の内の一部から、ＰＣＲ分析用にゲノムＤＮＡを抽出した。この分析に使用したプライマーは、標的部位にまで及んでいるおよび約０．８ｋｂの長さであるｐｙｒ２遺伝子座の領域を増幅するように設計されているｐｙｒ２Ｆ（５’−ｇｔａｔａａｇａｇｃａｇｇａｇｇａｇｇｇａｇ［配列番号５３］）およびｐｙｒ２Ｒ（５’−ｇａａｃｇｃｃｔｃａａｔｃａｇｔｃａｇｔｃｇ［配列番号５４］）であった。
【０１６８】
ＦＯＡ耐性であることが分かったＱＭ６ａ形質転換体の内、１８個の安定したハイグロマイシン耐性形質転換体と５個の不安定なハイグロマイシン耐性形質転換体とを、サイズが野生型株でのサイズと類似すると仮定してｐｙｒ２遺伝子座の領域を増幅するのに十分な伸長時間を有するＰＣＲプロトコルを使用して試験した。安定した形質転換体のいずれにおいても、この短い伸長時間ではＰＣＲ産物が得られなかったが、不安定な形質転換体の内の２個でＰＣＲ産物を得た。これら２種のＰＣＲ産物のＤＮＡ配列分析により、予想した標的部位において一方が１個のみのヌクレオチド欠失を有し他方が１１１ヌクレオチドの欠失を有することが分かった。
【０１６９】
ＦＯＡ耐性であることが分かったＲＬ−Ｐ３７形質転換体の内、４個の安定したハイグロマイシン耐性形質転換体と２個の不安定なハイグロマイシン耐性形質転換体とを、伸長時間が短いＰＣＲプロトコルを使用して試験した。安定した形質転換体のいずれにおいても、この短い伸長時間ではＰＣＲ産物が得られなかったが、不安定な形質転換体では両方ともＰＣＲ産物を得た。これら２種のＣＰＲ産物のＤＮＡ配列分析により、予想した標的部位において一方が１個のみのヌクレオチド欠失を有し他方が１３４ヌクレオチドの挿入を有することが分かった。この挿入はｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇベクターの２種の小断片からなった。
【０１７０】
大きなＤＮＡ断片がｐｙｒ２遺伝子座中の標的部位で挿入されたと仮定して、異なる６個の安定したハイグロマイシン耐性ＲＬ−Ｐ３７形質転換体を、ｐｙｒ２遺伝子座の領域の増幅が可能なように設計した、先に説明したＰＣＲプロトコルを使用して分析した。６個全ての形質転換において、この長い伸長時間プロトコルにより大きなＰＣＲ産物（形質転換体に応じて約５ｋｂから＞１２ｋｂ）を得た。これらのＰＣＲ産物の内の５種のＤＮＡ配列分析により、全ての場合でｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇベクターＤＮＡまたはこの断片が組み込まれていることが分かった。
【０１７１】
まとめると、これらのデータから、Ｃａｓ９によって引き起こされる二本鎖切断の修復は、安定した形質転換体における大きなベクター断片の組み込みを主に伴うことが分かる。このことは、遺伝子不活性化の非常に効率的な方法であることができる。このことから、機能する遺伝子を有するが標的部位との配列相同性を有しないＤＮＡ断片またはベクターは、Ｃａｓ９切断および二本鎖切断の形成後の標的部位で部位特異的に組み込まれ得ることも実証される。対照的に、小さい欠失または挿入（インデル）は、不安定な形質転換体におけるＣａｓ９による遺伝子の不活性化と関連している。このことは、ベクターの組み込みが望ましくない場合に遺伝子不活性化のために選択される方法である。
【０１７２】
実施例７：テロメアを有する発現ベクターを使用するｃａｓ９およびｓｇＲＮＡの発現
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡの発現ベクターｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣＡＳ  ｇＰｙｒ２  ＴＳ６の、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）テロメア配列を含むバージョンを構築した（図６に示す）。このベクターに、下記に示すＤＮＡ配列（配列番号５５）を挿入した。下線を引いた領域は反復テロメア配列を含んでおり、それぞれがこの断片の中心方向へ読み取られる。中心部分は、テロメアの反復を確実に維持するために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での選択を可能にするプロモーターおよびターミネーターを有する細菌カナマイシン耐性遺伝子である。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）では、テロメアを有するベクターは各末端でテロメア配列と共に線状化すると予想され、低コピー数で自律的に維持されるはずであるが、染色体ＤＮＡ中への偶発的な組み込みも起こり得る。
【化１４】
2018504895.tif 000016
【０１７３】
このベクターを、プロトプラストのＰＥＧ媒介型形質転換によりＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株ＲＬ−Ｐ３７に挿入した。形質転換体をハイグロマイシン耐性に関して選択し、ハイグロマイシンを含む新鮮な寒天プレートに移した。大部分の形質転換体は不安定なハイグロマイシン耐性表現型を示した。個々の形質転換されたコロニーを、２ｍｇ／ｍｌのウリジンおよび１．２ｍｇ／ｍｌの５−フルオロオロチン酸を含む最少培地寒天プレートに移し、増殖することができてそのためＰｙｒマイナス表現型を有する形質転換体を選択した。１４２個の不安定な形質転換体の内の８個（６％）がＰｙｒマイナスであった。ｐｙｒ２遺伝子座のＰＣＲによる分析およびこれらの形質転換体の内の３個のシークエンシングにより、２個が標的部位で小さい欠失を有し（それぞれ１ｂｐおよび２７ｂｐ）、１個が、ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣＡＳ  ｇＰｙｒ２  ＴＳ６の細菌ベクター部分に由来する６８ｂｐの挿入と組み合わせて１ｂｐの欠失を有することが分かった。その他の５個の形質転換体では、大きなＤＮＡ断片を増幅するように設計したＰＣＲ条件［ＰＣＲ条件：工程１：１分にわたり９４℃、工程２：２５秒にわたり９４℃、工程３：３０秒にわたり６３Ｃ（１サイクル当たり０．２Ｃの温度低下）、工程４：８分にわたり７０℃、工程２〜４を更に２４回繰り返した、工程５：４℃で保持した。ポリメラーゼ：ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）］を使用したにもかかわらずＰＣＲ産物が得られなかった。
【０１７４】
これらの結果から、自律的に複製するベクターからのＣａｓ９およびガイドＲＮＡの発現によりＣａｓ９の標的を特定の遺伝子座（この場合はｐｙｒ２）に設定することが可能であることが実証される。結果として起こる遺伝子の不活性化は、標的部位でベクターＤＮＡを挿入することなしに起こり得る。
【０１７５】
第Ｂ節：Ｃａｓおよび／またはガイドＲＮＡの直接導入
実施例８：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのＣＲＩＳＰＲ  ＳｐｙＣａｓ９の異種発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）遺伝子を合成し、Ｇｅｎｅｒａｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）によりＮｃｏＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位で発現ベクターｐＥＴ３０ａに挿入し、結果としてプラスミドｐＥＴ３０ａ−ＳｐｙＣａｓ９を得た（図７）。図８Ａのプラスミドマップで示すように、発現カセットの完全なコーディング配列は、５’から３’への方向で、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ／トロンビン／Ｓ・Ｔａｇ（商標）／エンテロキナーゼ領域をコードする配列（配列番号１３は開始コドンメチオニンを含む）、ＳＶ４０核局在化シグナルをコードする配列（配列番号１４）、ＳｐｙＣａｓ９をコードする配列（配列番号１５）、およびＢＬＲ核局在化シグナルをコードする配列（配列番号１６）を含み、全てが作動可能に連結されている。この全コーディング配列を配列番号１７に示す。配列番号１３によりコードされるＮ−末端Ｈｉｓ６タグ／トロンビン／Ｓ・Ｔａｇ（商標）／エンテロキナーゼ領域のアミノ酸配列を配列番号１８（１位でメチオニンを含む）に示し、配列番号１４によりコードされるＳＶ４０核局在化シグナルのアミノ酸配列を配列番号１９に示し、配列番号１５によりコードされるＳｐｙＣａｓ９のアミノ酸配列を配列番号１に示し、配列番号１６によりコードされるＢＬＲ核局在化シグナルのアミノ酸配列を配列番号２０に示す。配列番号１７によりコードされるアミノ酸配列を配列番号２１に示す。
【０１７６】
ｐＥＴ３０ａ−ＳｐｙＣａｓ９プラスミドをＲｏｓｅｔｔａ２（Ｄｅ３）ｐｌｙｓＳ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標）、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に形質転換し、形質転換産物を、３４ｐｐｍのクロラムフェニコールおよび５０ｐｐｍのカナマイシンを補充したＬｕｒｉａ  Ａｇａｒプレート上に広げた。コロニーを採取し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（商標）Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）２５ｍｌで２５０ｍｌの振とうフラスコ中にて２４時間にわたり培養した。
【０１７７】
実施例９：ＳｐｙＣａｓ９の精製
ＳｐｙＣａｓ９の精製に、親和性クロマトグラフィー工程、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程およびサイズ排除クロマトグラフィー工程の組み合わせを適用した。簡潔に言うと、ＳｐｙＣａｓ９を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（（Ｒｏｓｅｔｔａ２（Ｄｅ３）ｐｌｙｓＳ、上記で説明した）を２４時間にわたりＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（商標）２５ｍｌで２５０ｍｌの振とうフラスコ中にて培養し、遠心分離により回収した。細胞（約４０グラム）をペレット化し、溶解緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭのＤＴＴおよび１ｍＭのＴＣＥＰ、Ｒｏｃｈｅから購入したプロテアーゼ阻害剤カクテル）４００ｍｌに再懸濁させ、超音波処理器（３５％パワー、２０分、２秒オン／３秒オフ）（ＳＣＩＥＮＴ２−ＩＩ  Ｄ、Ｎｉｎｇｂｏ  Ｓｃｉｅｎｔｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，ＬＴＤ）で溶解させた。溶解物を、４０分にわたる２００００ｇでの遠心分離により清澄化した。
【０１７８】
清澄化した溶解物  約４００ｍｌを、Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（Ｋｙｌｉｎ−Ｂｅｌｌ  Ｌａｂ．Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｈａｉｍｅｎ、Ｃｈｉｎａ）を使用して３０ｒｐｍ／分で振とうしつつ、４℃で一晩、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）５ｍｌと共にインキュベートした。遠心分離後、この樹脂をＸＫ２６／２０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移し、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に接続した。平衡緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で広範囲に洗浄し、続いて洗浄緩衝液（平衡緩衝液中の２５ｍＭのイミダゾール）で広範囲に洗浄した後、平衡緩衝液中の２５０ｍＭのイミダゾールで標的タンパク質を溶出させた。
【０１７９】
親和性工程から集めた活性画分に０．８Ｍの最終濃度まで硫酸アンモニウムを添加し、２０ｍｌのフェニル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に充填した。このカラムを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５中の０．８Ｍから０．０Ｍへの硫酸アンモニウムの勾配で溶出させ、フロースルーを集めた。
【０１８０】
最後に、このタンパク質を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌおよび１０％のグリセロール中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより更に精製した。最高純度の画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ  ３０ＫＤａメンブランフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。最終タンパク質試料を、使用するまで４０％のグリセロール中にて−２０℃の冷凍庫で保存した。
【０１８１】
実施例１０：ガイドＲＮＡの設計および発現ベクターのクローニング
本発明者らは、Ｃａｓ９  Ｔａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒを使用して実行可能な標的部位を同定した。適切なＰＡＭ部位を有する標的配列を、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）のｘｙｒ１遺伝子（キシラン分解に関与する転写因子キシラナーゼ制御因子１（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ  １２２２０８））およびトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）のｐｙｒ４遺伝子（オロチジン−５’−モノホスフェートデカルボキシラーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ  ７４０２０））のセンス鎖またはアンチセンス鎖で同定した。このプログラムを使用して、本発明者らは、配列パターンＧＧＮ１８ＮＧＧまたはＧＮ１９ＮＧＧと一致する３−ヌクレオチドＰＡＭ配列（ＮＧＧ）が続く全ての２０ヌクレオチド長の標的配列を同定した。トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ゲノム配列データベース（ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／Ｔｒｉｒｅ２／Ｔｒｉｒｅ２．ｈｏｍｅ）を使用してＢａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を実施し、２０−ｎｔ配列の特有性をチェックして標的効果を回避した。下記の配列を使用して、２つのｘｙｒ１特異的標的部位（ｘｙｒ１  Ｔａおよびｘｙｒ１  Ｔｃ）用のならびに１つのｐｙｒ４特異的標的部位（ｐｙｒ４  ＴＳ２）用のｐＳＭ１ガイドプラスミド（図８Ａに示す）中でｉｎ  ｖｉｔｒｏガイドＲＮＡ発現構築物を生成した。関連するＰＡＭ部位を有する標的配列と、アニーリングおよびＢＳＡ１制限部位でのｐＳＭ１ガイドプラスミド中へクローニングに使用するオリゴとを示す：
Ｘｙｒ１  Ｔａ
（１）標的配列（５’−３’、ＰＡＭに太字で下線を引いている）：
【化１５】
2018504895.tif 000017
（２）オリゴ１：ＴＡＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧ（配列番号５７）
（３）オリゴ２：ＡＡＡＣＣＡＴＧＣＴＧＴＧＣＧＡＧＧＴＧＣＴ（配列番号５８）
Ｘｙｒ１  Ｔｃ
（１）標的配列（５’−３’、ＰＡＭに太字で下線を引いている）：
【化１６】
2018504895.tif 000018
（２）オリゴ１：ＴＡＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＣ（配列番号６０）
（３）オリゴ２：ＡＡＡＣＧＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＧＣＡ（配列番号６１）
Ｐｙｒ４  ＴＳ２
（１）標的配列５’−３’、ＰＡＭに太字で下線を引いている）：
【化１７】
2018504895.tif 000019
（２）オリゴ１：ＴＡＧＧＣＴＣＡＡＧＡＣＧＣＡＣＴＡＣＧＡＣＡ（配列番号６３）
（３）オリゴ２：ＡＡＡＣＴＧＴＣＧＴＡＧＴＧＣＧＴＣＴＴＧＡＧＣ（配列番号６４）
【０１８２】
下記の配列は、３種のガイドＲＮＡ（即ち、上記のｘｙｒ１  Ｔａ標的部位用、ｘｙｒ１  Ｔｃ標的部位用およびｐｙｒ４  ＴＳ２標的部位用）それぞれの転写用の各ｐＳＭ１ガイドプラスミド構築物に由来するテンプレート配列を示す。下記の各配列は、Ｔ７プロモーター（太字）、ＶＴドメイン（大文字で示す）、ＣＥＲドメイン（小文字で示す）および転写ターミネーター（太字下線）を示す。
Ｘｙｒ１  Ｔａ（配列番号６５）
【化１８】
2018504895.tif 000020
Ｘｙｒ１  Ｔｃ（配列番号６６）
【化１９】
2018504895.tif 000021
Ｐｙｒ４  ＴＳ２（配列番号６７）
【化２０】
2018504895.tif 000022
【０１８３】
実施例１１：ｉｎ  ｖｉｔｒｏＤＮＡ切断アッセイ
Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒのＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７転写キットを製造業者の指示に従って使用して、ｘｙｒ１  Ｔａ用のおよびｘｙｒ１  Ｔｃ用のテンプレートからガイドＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写を少なくとも５時間にわたり３７℃で実行した。転写したガイドＲＮＡを、Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒのＭＥＧＡｃｌｅａｒ（商標）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐキットを使用して精製した。ＲＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で測定した。変性尿素−ＰＡＧＥゲル（１０％）を使用して、製造したガイドＲＮＡの品質を確認した（データは示さない）。
【０１８４】
精製したＣａｓ９タンパク質（２００ｎｇ）を、（１）基質ＤＮＡのみ３００ｎｇ（基質ＤＮＡは、ＮｄｅＩで線形化したプラスミドｐＸＡ３［図９Ａを参照されたい］であり、ｐＸＡ３は、２０ｂｐの標的配列と両方のｘｙｒ１ガイドＲＮＡに関して適切に間隔が空いたＰＡＭ部位とを有するｘｙｒ１遺伝子［配列番号８９］を含む）、（２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したｘｙｒ１  ＴａガイドＲＮＡ  １００ｎｇの存在下での基質ＤＮＡ  ３００ｎｇ、および（３）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したｘｙｒ１  ＴｃガイドＲＮＡ  １００ｎｇの存在下での基質ＤＮＡ  ３００ｎｇと共にインキュベートした。この反応を３７℃で１時間にわたり２０ｕｌの反応体積でＮＥＢ緩衝液３中において実行した。（１×ＮＥＢ３緩衝液の成分は、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴからなる、２５℃でｐＨ７．９）。
【０１８５】
図９Ｂに示すように、精製したＳｐｙＣａｓ９を有するｘｙｒ１特異的ガイドＲＮＡはそれぞれ、基質ＤＮＡを予想される断片へと成功裏に切断することができ（レーン３および４）、このことから、合成したガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の機能が確認される。レーン１は分子量マーカーを示し；レーン２は、Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡの非存在下でのＮｄｅＩによる線形化プラスミドｐＸＡ３基質を示し；レーン３は、Ｃａｓ９とｘｙｒ１  Ｔａ  ＶＴドメインを有するガイドＲＮＡとの存在下での線形化プラスミドｐＸＡ３基質の切断を示し；レーン４は、Ｃａｓ９とｘｙｒ１  Ｔｃ  ＶＴドメインを有するガイドＲＮＡとの存在下での線形化プラスミドｐＸＡ３基質の切断を示す。線形化プラスミドｐＸＡ３基質および産物の位置を右側で示す。
【０１８６】
実施例１２：Ｃａｓ９発現真菌細胞へのガイドＲＮＡの導入
方法
（ｉ）プロトプラストの調製
プロトプラストを調製するために、所望のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の５×１０８個の胞子を、４つのバッフルを有する２５０ｍｌの振とうフラスコ中で発芽培地（米国特許第８，６７９，８１５号明細書で説明されているレシピ）５０ｍｌ中に播種し、１７０ｒｐｍで１７時間にわたり２７℃でインキュベートする。この液体体積を５０ｍｌのコニカルチューブ中に移して１０分にわたり３０００ｒｐｍで回転させることにより、菌糸体を回収する。上清をデカントし、菌糸体ペレットを１．２ＭのＭｇＳＯ４−１０ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝液を使用して２回洗浄し、溶解酵素緩衝液（１．２ＭのＭｇＳＯ４−１０ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．８）を使用してトリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）由来の溶解酵素（Ｓｉｇｍａカタログ＃Ｌ１４１２）を溶解する、５０ｍｇ／ｍｌ）１５ｍｌに再懸濁する。細胞懸濁液を、４つのバッフルを有する２５０ｍｌの振とうフラスコに移し、２００ｒｐｍで少なくとも２時間にわたり室温で振とうする。ガラス漏斗中で折り畳まれたＭｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ａｒｔ．Ｎｏ．４７５８５５）に通すろ過によって、プロトプラストをＧｒｅｉｎｅｒチューブに回収する。ろ過したプロトプラストの上に、０．６Ｍのソルビトール−０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を慎重に添加する。４０００ｒｐｍでの１５分にわたる遠心分離によりプロトプラストを集める。プロトプラストを含む中間相を新しいチューブに移し、１．２Ｍのソルビトール−１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液を少なくとも等体積で添加する。４０００ｒｐｍでの５分にわたる遠心分離によりプロトプラストを集め、１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用して２回洗浄する。ペレットを１．２Ｍのソルビトール−１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５−１０ｍＭのＣａＣｌ２緩衝液  少なくとも１ｍｌに再懸濁し、顕微鏡下でプロトプラストの数を計数する。プロトプラスト懸濁液を、１．２Ｍのソルビトール−１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ−１０ｍＭのＣａＣｌ２  ４部および２５％のＰＥＧ６０００−５０ｍＭのＣａＣｌ２−１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  １部を使用して、後続の形質転換で使用するために１ｍｌ当たり５×１０８個まで希釈する。
【０１８７】
（ｉｉ）形質転換
所望のカーゴ（例えば、ＤＮＡ構築物、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体等）をプロトプラスト２００μＬ（約１×１０８個）に添加し、３０分にわたり氷上で維持する。インキュベーション後、プロトプラストを、最少フォーゲルプレートの最上層とする、冷却した溶融ソルビトール／フォーゲル寒天（最少フォーゲル寒天の１．１Ｍソルビトール）に添加する（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １７Ａ，ｐｐ．７９−１４３およびＤａｖｉｓ，Ｒｏｗｌａｎｄ，ＮＥＵＲＯＳＰＯＲＡ，ＣＯＮＴＲＩＢＵＴＩＯＮＳ  ＯＦ  Ａ  ＭＯＤＥＬ  ＯＲＧＡＮＩＳＭ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２０００））。このプレートを１週間にわたり３０℃でインキュベートする。詳細な工程は米国特許第８，６７９，８１５号明細書（参照により本明細書に援用される）で説明されている。
【０１８８】
実験
不活性化されているｐｙｒ２遺伝子（オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（タンパク質ＩＤ２１４３５）をコードする）を有するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株のプロトプラスト（株Ｔ４  ｍｐｇ１  Δｐｙｒ２）を、ピルビン酸キナーゼ（ｐｋｉ）プロモーターの制御下でＣａｓ９用の発現カセットを含むおよびＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来のｐｙｒ２遺伝子の天然プロモーターの制御下でこのｐｙｒ２遺伝子用の発現カセットを含むＤＮＡ構築物にて上記で説明したように形質転換した。ゲノムに組み込まれているおよびＣａｓ９遺伝子を構成的に発現するＣａｓ９−ｐｙｒ２カセットによる形質転換体を、機能するｐｙｒ２遺伝子を有する細胞（フォーゲルの培地上でのウリジン補充なしでの増殖）を選択することにより同定した。
【０１８９】
上記で説明した、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したＰｙｒ４  ＴＳ２ガイドＲＮＡ（標的部位５’ＧＣＴＣＡＡＧＡＣＧＣＡＣＴＡＣＧＡＣＡ３’を有する、配列番号９２）２０ｕｇを、上記で説明したプロトプラスト形質転換方法により、Ｃａｓ９を発現するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞に導入した。シークエンシングおよびアラインメントによる、ＦＯＡに対して耐性を示すおよび増殖にウリジンを必要とする単離株からのｐｙｒ４遺伝子の分析は、ｐｙｒ４遺伝子標的部位でのＤＮＡ配列の変化の存在を示した。配列変化には、少数のヌクレオチドの挿入（１〜２個のヌクレオチド；クローンＴ４  ４−３、Ｔ４  ４−１１、Ｔ４  ４−１８、Ｔ４  ４−１９、Ｔ４  ４−４およびＴ４  ４−７）およびより大きな挿入（６８個のヌクレオチド、クローンＴ４  ４−２０）が含まれた（図１０）。このことから、Ｃａｓを発現する真菌宿主細胞へのガイドＲＮＡの直接的で一時的な導入を使用して、この細胞のゲノム中の所望の標的部位でＤＮＡ配列を改変することができることが実証される。
【０１９０】
実施例１３：ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＳｐｙＣａｓ９／ガイドＲＮＡ取込み実験
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体を形成するために、精製したＣａｓ９タンパク質２０μｇを、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ６．５（最終体積は４０μＬである）中でＰｙｒ４ＴＳ２ガイドＲＮＡ  ２０μｇと混合し、１５〜３０分にわたり室温でインキュベートして複合体を形成させた。Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡを、上記で説明したようにＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）プロトプラストに形質転換し、フォーゲルのＵｒｉｄｉｎｅ  ＦＯＡプレート上で増殖させた。
【０１９１】
この形質転換からの単離株のＰＣＲ分析を図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。図１１Ａは、２種の単離株（Ｐ３７  ２．２およびＰ３７  ４．１；両方ともＦＯＡに対して耐性を示し、増殖にウリジンを必要とする）のｐｙｒ４特異的ＰＣＲ産物（標的部位を包含する）のアガロースゲル分析を示す。株Ｐ３７  ２．２（レーン２）はＴ４  ４．１クローン（レーン３；図１１Ｂ、レーン２で示すコントールと同等である）と比べて分子量が低いＰＣＲ産物を示し、このことは、ｐｙｒ４遺伝子中での大きな欠失を示す。図１１Ｂは図１１Ａと同様のＰＣＲ／アガロースゲル分析を示し、Ｐ３７株４．１、４．２、４．３および４．４（これらは全てＦＯＡに対して耐性を示し、増殖にウリジンを必要とする）の分析を含む。株４．３（レーン５）はコントロール（Ｃ＋；レーン２）と比べて分子量が低いｐｙｒ４遺伝子のＰＣＲ産物を示し、このことは、ｐｙｒ４遺伝子中での大きな欠失を示す。
【０１９２】
クローンＴ４  ２．２（図１１Ａで示す）およびＴ４  ２．４（図１１Ａまたは図１１Ｂで示さない）に由来するｐｙｒ４遺伝子の配列分析を図１２に示す。野生型ｐｙｒ４の配列はアラインメント中で１番目の配列（最上部）であることに留意されたい。この分析は、Ｔ４  ２．２クローン（最上部のアラインメント）が、導入されたＣａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体の標的部位で６１１個の塩基対の欠失を有することを示す。ガイドＲＮＡのＶＴドメイン配列に対応する配列を四角で囲み、ＰＡＭ部位を円で囲む。最下部のアラインメントは、単離されたＴ４  ２．４株の標的部位におけるｐｙｒ４遺伝子中での１個の塩基対（「Ｇ残基」）の挿入を示す。ガイドＲＮＡのＶＴドメイン配列に対応する配列をアラインメント上の線で示し、ＰＡＭ部位を円で囲む。
【０１９３】
図１３は、クローンＰ３７  ４．１および４．２（最上部のアラインメント）、４．３（最下部のアラインメント）ならびに４．４（中央のアラインメント）（これらを図１１Ｂに示した）に由来するｐｙｒ４遺伝子の配列分析を示す。野生型ｐｙｒ４配列は全てのアラインメント中で１番目の配列（最上部）であり、コンセンサスを全てのアラインメントの最下部で示す。最上部のアラインメントは、ｐｙｒ４遺伝子中の標的部位で、Ｐ３７  ４．１クローン（このアラインメント中で３番目の配列）がＴヌクレオチドの挿入を有し、Ｐ３７  ４．２クローン（このアラインメント中で２番目の配列）がＧヌクレオチドの挿入を有することを示す。中央のアラインメントは、Ｐ３７  ４．４クローン（このアラインメント中で２番目の配列）がｐｙｒ４遺伝子中の標的部位でＡヌクレオチドの欠失を有することを示す。最下部のアラインメントは、Ｐ３７  ４．３クローン中のｐｙｒ４遺伝子配列（このアラインメント中で２番目の配列）が標的部位で突然分かれることを示す。更なるアラインメント分析（図示せず）から、Ｐ３７  ４．３クローンが、導入されたＣａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体の標的部位で９８８個の塩基対の欠失を有することを確認した。
【０１９４】
このことから、真菌宿主細胞へのＣａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体の直接的で一時的な導入により、この細胞のゲノム中における所望の標的部位でＤＮＡ配列を改変することができることが実証される。
【０１９５】
上述の組成物および方法は、理解を明確にするために例示および実施例により若干詳細に説明されているが、本明細書の教示を考慮して、添付した特許請求の範囲の趣旨および範囲から逸脱することなく上述の組成物および方法に対してある程度の変更および改変を行うことができることは当業者に容易に明らかである。
【０１９６】
従って、上述は本組成物および本方法の原理を単に例示しているにすぎない。本明細書で明確に説明されていないまたは示されていないが本組成物および本方法の原理を具体化するならびに本組成物および本方法の趣旨および範囲に含まれる様々な構成を当業者は考案することができることが認識されるだろう。更に、本明細書で列挙した全ての例および条件付き文言は、本組成物および本方法の原理ならびに当分野の促進に寄与する本発明者らによる概念の理解で読者を助けることが主に意図されており、そのように具体的に列挙された例および条件に限定されないと解釈すべきである。更に、本明細書において本組成物および本方法の原理、態様および実施形態を列挙する全ての記載ならびにこの具体例は、この構造および機能の両方の等価物を包含することが意図される。加えて、そのような等価物が、現在知られている等価物と将来創出される等価物（即ち、構造にかかわらず同じ機能を発揮する、創出されるあらゆる要素）との両方を含むことが意図される。従って、本発明および本組成物の範囲は、本明細書で示されたおよび説明された典型的な実施形態に限定されることが意図されていない。
【０１９７】
配列：
配列番号１
ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、ＮＬＳなし（配列番号８および配列番号１５によりコードされる）
【化２１】
2018504895.tif 000023
配列番号２
ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９  Ｃａｓ９
【化２２】
2018504895.tif 000024
配列番号３
ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９  Ｃａｓ９
【化２３】
2018504895.tif 000025
配列番号４
カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９
【化２４】
2018504895.tif 000026
配列番号５
ナイセリア・メニンジティデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９
【化２５】
2018504895.tif 000027
配列番号６
フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）亜種ノビシダ（ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃａｓ９
【化２６】
2018504895.tif 000028
配列番号７
パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）Ｃａｓ９
【化２７】
2018504895.tif 000029
配列番号８
糸状真菌細胞コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９コーディング遺伝子、ＮＬＳなし
【化２８】
2018504895.tif 000030
【化２９】
2018504895.tif 000031
配列番号９
糸状真菌細胞コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９コーディング遺伝子、Ｎ末端ＮＬＳ配列およびＣ末端ＮＬＳ配列あり
【化３０】
2018504895.tif 000032
【化３１】
2018504895.tif 000033
配列番号１０
Ｎ末端ＮＬＳ配列およびＣ末端ＮＬＳ配列を有するストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（配列番号９によりコードされる）
【化３２】
2018504895.tif 000034
配列番号１１
完全なＵ６遺伝子プロモーター配列（転写開始部位を含まない）
【化３３】
2018504895.tif 000035
配列番号１２
トランケートされた／短いＵ６遺伝子プロモーター配列（転写開始部位を含まない）
【化３４】
2018504895.tif 000036
配列番号１３
Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ／トロンビン／Ｓ・Ｔａｇ（商標）／エンテロキナーゼ領域のポリヌクレオチド配列（開始コドンあり）、配列番号１８をコードする
【化３５】
2018504895.tif 000037
配列番号１４
ＳＶ４０  ＮＬＳコーディング配列（配列番号１９をコードする）
ｃｃａａａａａａｇａａａｃｇｃａａｇｇｔｔ
配列番号１５
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化Ｃａｓ９遺伝子（停止コドンなし）
【化３６】
2018504895.tif 000038
【化３７】
2018504895.tif 000039
配列番号１６
ＢＬＲ２核局在化シグナルコーディング配列（配列番号２０をコードする）
ａａｇａａｇａａａａａａｃｔｇａａａｃｔｇ
配列番号１７
プラスミドｐＥＴ３０ａ−ＳｐｙＣａｓ９中におけるＳｐｙＣａｓ９合成遺伝子のヌクレオチド配列。Ｎ末端Ｈｉｓ６タグをコードするオリゴヌクレオチド、ＳＶ４０核局在化シグナルをコードするオリゴヌクレオチド、およびＢＬＲ核局在化シグナルをコードするオリゴヌクレオチドをそれぞれ、太字および下線、イタリック体および下線、ならびに下線で示す。
【化３８】
2018504895.tif 000040
【化３９】
2018504895.tif 000041
配列番号１８
Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ／トロンビン／Ｓ・Ｔａｇ（商標）／エンテロキナーゼ領域のアミノ酸配列（開始メチオニンあり）
Ｍｈｈｈｈｈｈｓｓｇｌｖｐｒｇｓｇｍｋｅｔａａａｋｆｅｒｑｈｍｄｓｐｄｌｇｔｄｄｄｄｋａｍａ
配列番号１９
ＳＶ４０  ＮＬＳ
ＰＫＫＫＲＫＶ
配列番号２０
Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｂｌｒ２（青色光制御因子２）遺伝子のＮＬＳ
ＫＫＫＫＬＫＬ
配列番号２１
プラスミドｐＥＴ３０ａ−ＳｐｙＣａｓ９から発現されるＳｐｙＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列。Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ、ＳＶ４０核局在化シグナルおよびＢＬＲ核局在化シグナルをそれぞれ、太字および下線、イタリック体および下線、ならびに下線で示す。
【化４０】
2018504895.tif 000042
配列番号２２
推定されるＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６遺伝子
【化４１】
2018504895.tif 000043
配列番号２３
ｓｇＲＮＡの配列（Ｎは標的部位に相補的な配列である）
【化４２】
2018504895.tif 000044
配列番号２４
ｓｇＲＮＡ：ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１
【化４３】
2018504895.tif 000045
配列番号２５
ｓｇＲＮＡ：ｇＴｒＧＡ  ＴＳ２
【化４４】
2018504895.tif 000046
配列番号２６
ｓｇＲＮＡ：ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１
【化４５】
2018504895.tif 000047
配列番号２７
ｓｇＲＮＡ：ｇＰｙｒ２  ＴＳ６
【化４６】
2018504895.tif 000048
配列番号２８
合成ＤＮＡ：ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−１（サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｓｎｒ５２プロモーターとＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｓｕｐ４ターミネーターとを有するｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１  ｓｇＲＮＡ（配列番号３））
【化４７】
2018504895.tif 000049
配列番号２９
合成ＤＮＡ：ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−２（Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６のプロモーターおよびターミネーターを有するｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１  ｓｇＲＮＡ（配列番号３））
【化４８】
2018504895.tif 000050
配列番号３０
合成ＤＮＡ：ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−３（Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６のプロモーター、ターミネーターおよびイントロンを有するｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１  ｓｇＲＮＡ（配列番号３））
【化４９】
2018504895.tif 000051
配列番号３１
短いＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６プロモーター領域を有するガイドＲＮＡ発現カセットを合成ＤＮＡとして得た。ここで、ＴＳ１１でＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｇｌａ１遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ用の配列を含む一例を示す。
【化５０】
2018504895.tif 000052
配列番号３２
プライマー：ｇＲＮＡフォワードａｆｌＩＩ
ｃｇｔｃａｇｃｔｔａａｇＡＡＴＴＣＣＴＡＡＡＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＡＴＧＧ
配列番号３３
プライマー：ｇＲＮＡリバースｓｆｉＩ
ｃｇｔｃａｇｇｇｃｃａｃｇｔｇｇｇｃｃＡＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧ
配列番号３４
プライマー：Ａｄ３  ５’フォワード
ｔｇａａｃａｃａｇｃｃａｃｃｇａｃａｔｃａｇｃ
配列番号３５
プライマー：Ａｄ３  ５’リバース
ｇｃｔｇｇｔｇａｇｇｇｔｔｔｇｔｇｃｔａｔｔｇ
配列番号３６
プライマー：Ａｄ３ａ  ５００５リバース
ｇａｔｔｇｃｔｔｇｇｇａｇｇａｇｇａｃａｔ
配列番号３７
プライマー：Ａｄ３  ３’フォワード
ｃｇａｇｇｃｃａｃｔｇａｔｇａａｇｔｔｇｔｔｃ
配列番号３８
プライマー：Ａｄ３  ３’リバース
Ｃａｇｔｔｔｔｃｃａａｇｇｃｔｇｃｃａａｃｇｃ
配列番号３９
プライマー：Ａｄ３ａ  ５００３フォワード
ｃｔｇａｔｃｔｔｇｃａｃｃｃｔｇｇａａａｔｃ
配列番号４０
Ａｄ３  ｍｉｄリバース
ｃｔｃｔｃｔａｔｃａｔｔｔｇｃｃａｃｃｃｔｃｃ
配列番号４１
プライマー：Ａｄｆｒａｇフォワード
ｃｔｃｃａｔｔｃａｃｃｃｔｃａａｔｔｃｔｃｃ
配列番号４２
プライマー：Ａｄｆｒａｇリバース
ｇｔｔｃｃｃｔｔｇｇｃｇｇｔｇｃｔｔｇｇａｔｃ
配列番号４３
プライマー：Ａｄ３ａ  ２ｋフォワード
ｃａａｔａｇｃａｃａａａｃｃｃｔｃａｃｃａｇｃ
配列番号４４
Ａｄ３ａ  ２ｋリバース
ｇａａｃａａｃｔｔｃａｔｃａｇｔｇｇｃｃｔｃｇ
配列番号４５
プライマー：ｇｌａＡ
ｃｃｇｔｔａｇｔｔｇａａｇａｔｃｃｔｔｇｃｃｇ
配列番号４６
プライマー：ｇｌａＢ
ｇｔｃｇａｇｇａｔｔｔｇｃｔｔｃａｔａｃｃｔｃ
配列番号４７
プライマー：ｇｌａＪ
ｔｇｃｃｇａｃｔｔｔｇｔｃｃａｇｔｇａｔｔｃｇ
配列番号４８
プライマー：ｇｌａＫ
ｔｔａｃａｔｇｔｇｇａｃｇｃｇａｇａｔａｇｃｇ
配列番号４９
プライマー：ｇｌａ１ｒｅｐＦ
ｇｔｇｔｇｔｃｔａａｔｇｃｃｔｃｃａｃｃａｃ
配列番号５０
プライマー：ｇｌａ１ｒｅｐＲ
ｇａｔｃｇｔｇｃｔａｇｃｇｃｔｇｃｔｇｔｔｇ
配列番号５１
プライマー：１５５３Ｒ
ＣＣＧＴＧＡＴＧＧＡＧＣＣＣＧＴＣＴＴＣＴ
配列番号５２
プライマー：１５５５Ｆ
ＣＧＣＧＧＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＣＴＴＴＴＴＣ
配列番号５３
プライマー：ｐｙｒ２Ｆ
ｇｔａｔａａｇａｇｃａｇｇａｇｇａｇｇｇａｇ
配列番号５４
プライマー：ｐｙｒ２Ｒ
ｇａａｃｇｃｃｔｃａａｔｃａｇｔｃａｇｔｃｇ
配列番号５５
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）テロメア配列間の細菌カナマイシン耐性遺伝子（プロモーターおよびターミネーターを有する）
【化５１】
2018504895.tif 000053
配列番号５６
Ｘｙｒ１  Ｔａ標的配列（５’−３’、ＰＡＭに太字で下線を引いている）：
【化５２】
2018504895.tif 000054
配列番号５７
Ｘｙｒ１  Ｔａ（２）オリゴ１
ＴＡＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＧＣＡＣＡＧＣＡＴＧ
配列番号５８
Ｘｙｒ１  Ｔａオリゴ２
ＡＡＡＣＣＡＴＧＣＴＧＴＧＣＧＡＧＧＴＧＣＴ
配列番号５９
Ｘｙｒ１  Ｔｃ標的配列（５’−３’、ＰＡＭに太字で下線を引いている）：
【化５３】
2018504895.tif 000055
配列番号６０
Ｘｙｒ１  Ｔｃオリゴ１
ＴＡＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＣ
配列番号６１
Ｘｙｒ１  Ｔｃオリゴ２
ＡＡＡＣＧＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＧＣＡ
配列番号６２
Ｐｙｒ４  ＴＳ２標的配列（５’−３’、ＰＡＭに太字で下線を引いている）
【化５４】
2018504895.tif 000056
配列番号６３
Ｐｙｒ４  ＴＳ２オリゴ１
ＴＡＧＧＣＴＣＡＡＧＡＣＧＣＡＣＴＡＣＧＡＣＡ
配列番号６４
Ｐｙｒ４  ＴＳ２オリゴ２
ＡＡＡＣＴＧＴＣＧＴＡＧＴＧＣＧＴＣＴＴＧＡＧＣ
配列番号６５
Ｘｙｒ１  Ｔａ
【化５５】
2018504895.tif 000057
配列番号６６
Ｘｙｒ１  Ｔｃ
【化５６】
2018504895.tif 000058
配列番号６７
Ｐｙｒ４  ＴＳ２
【化５７】
2018504895.tif 000059
配列番号６８
Ｋ２１  ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｔ４
ｔｇｇｃｃｃｇｔｃｇａｔｔｇｔｃｇｔｇｃｔｃａａｇａｃｇｃａｃｔａｃｇａｃａｔｇｇｔｃｔｃｇｇ
配列番号６９
Ｔ４  ４−３
ｔｇｇｃｃｃｇｔｃｇａｔｔｇｔｃｇｔｇｃｔｃａａｇａｃｇｃａｃｔａｃｇＣＧａｃａｔｇｇｔｃｔｃｇｇ
配列番号７０
Ｔ４  ４−１３
ｔｇｇｃｃｃｇｔｃｇａｔｔｇｔｃｇｔｇｃｔｃａａｇａｃｇｃａｃｔａｃｇａｃａｔｇｇｔｃｔｃｇｇ
配列番号７１
Ｔ４  ４−１１
ｔｇｇｃｃｃｇｔｃｇａｔｔｇｔｃｇｔｇｃｔｃａａｇａｃｇｃａｃｔａｃｇＧａｃａｔｇｇｔｃｔｃｇｇ
配列番号７２
Ｔ４  ４−１２
ｔｇｇｃｃｃｇｔｃｇａｔｔｇｔｃｇｔｇｃｔｃａａｇａｃｇｃａｃｔａｃｇａｃａｔｇｇｔｃｔｃｇｇ
配列番号７３
Ｔ４  ４−１８
ｔｇｇｃｃｃｇｔｃｇａｔｔｇｔｃｇｔｇｃｔｃａａｇａｃｇｃａｃｔａｃｇＧａｃａｔｇｇｔｃｔｃｇｇ
配列番号７４
Ｔ４  ４−２０
【化５８】
2018504895.tif 000060
配列番号７５
Ｔ４  ４−１９
ｔｇｇｃｃｃｇｔｃｇａｔｔｇｔｃｇｔｇｃｔｃａａｇａｃｇｃａｃｔａｃｇＧａｃａｔｇｇｔｃｔｃｇｇ
配列番号７６
Ｔ４  ４−４
ｔｇｇｃｃｃｇｔｃｇａａｔｇｔｔｇｔｇｇｔｃａａｇｇｃｇｃｃｃｔｔｃｇＧａｃａｔｇｇｔｃｔｃｇｇ
配列番号７７
Ｔ４  ４−７
ｔｇｇｃｃｃｇｔｃｇａｔｔｇｔｃｇｔｇｃｔｃａａｇａｃｇｃａｃｔａｃｇＧａｃａｔｇｇｔｃｔｃｇｇ
配列番号７８
９−９６
【化５９】
2018504895.tif 000061
配列番号７９
Ｐｙｒ４  Ｔｒ
【化６０】
2018504895.tif 000062
配列番号８０
クエリ
ｃｔｇｇｃｃｇａｃａａｇａｔｔｇｇｃｃｃｇｔｃｇａｔｔｇｔｃｇｔｇｃｔｃａａｇａｃｇｃａｃｔａｃｇａｃａｔｇｇｔｃｔｃ
配列番号８１
サブジェクト
ｃｔｇｇｃｃｇａｃａａｇａｔｔｇｇｃｃｃｇｔｃｇａｔｔｇｔｃｇｔｇｃｔｃａａｇａｃｇｃａｃｔａｃｇＧａｃａｔｇｇｔｃｔｃ
配列番号８２
Ｐｙｒ４  Ｔｒｙ
【化６１】
2018504895.tif 000063
配列番号８３
Ｐ３７  ＃１３  ４．２  ｒｃ
【化６２】
2018504895.tif 000064
配列番号８４
Ｐ３７  ４．１  ＃１２  ｒｃ
【化６３】
2018504895.tif 000065
配列番号８５
Ｐ３７  ＃１５  ４．４  ｒｃ
【化６４】
2018504895.tif 000066
配列番号８６
Ｐ３７  ＃１４  ４．３
【化６５】
2018504895.tif 000067
配列番号８７
コンセンサス（欠失アラインメント）
【化６６】
2018504895.tif 000068
配列番号８８
野生型ｐｙｒ４完全コーディング配列
【化６７】
2018504895.tif 000069
配列番号８９
Ｘｙｒ１遺伝子コーディング配列
【化６８】
2018504895.tif 000070
【化６９】
2018504895.tif 000071
配列番号９０
Ｕ６イントロン
【化７０】
2018504895.tif 000072
配列番号９１
Ｕ６遺伝子転写ターミネーター配列
ＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴ
配列番号９２
Ｐｙｒ４  ＴＳ２ガイドＲＮＡ用の標的配列
ＧＣＴＣＡＡＧＡＣＧＣＡＣＴＡＣＧＡＣＡ
【図１】
2018504895.tif 000073
【図２】
2018504895.tif 000074
【図３】
2018504895.tif 000075
【図４】
2018504895.tif 000076
【図５】
2018504895.tif 000077
【図６】
2018504895.tif 000078
【図７】
2018504895.tif 000079
【図８Ａ−８Ｂ】
2018504895.tif 000080
【図９Ａ−９Ｂ】
2018504895.tif 000081
【図１０】
2018504895.tif 000082
【図１１Ａ−１１Ｂ】
2018504895.tif 000083
【図１２】
2018504895.tif 000084
【図１３】
2018504895.tif 000085
【配列表】
2018504895000001.app
【国際調査報告】
2018504895.tif 000086
2018504895.tif 000087
2018504895.tif 000088
2018504895.tif 000089
2018504895.tif 000090
2018504895.tif 000091
2018504895.tif 000092