(57)【要約】本開示は、バイオマーカーを含むバイオマーカーパネルとヒトの肺癌を診断するための方法に関する。肺癌を診断するための方法が提供され、前記方法は、表２に提供されるバイオマーカーより選択された少なくとも１つのバイオマーカーに該当する少なくとも１つのバイオマーカー値をサンプルから検出する段階を備え、前記少なくとも１つのバイオマーカー値に基づいて、前記ヒトは非小細胞肺癌を持っているアジア人に分類されるか、肺癌を有する可能性を決定する。【選択図】図１
2018528441.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表２に記載のバイオマーカータンパク質のうちＮ個を含むバイオマーカーパネルを提供する段階と、
前記パネルのＮ個のバイオマーカータンパク質とそれぞれ対応するバイオマーカー値を付与するために、ヒトより得られた生物学的サンプルから前記バイオマーカータンパク質を検出する段階とを含み、
前記Ｎは少なくとも２である整数であり、
前記肺癌は、前記バイオマーカー値に基づいて診断されることを特徴とするヒトの肺癌を診断するための方法。
【請求項２】
前記バイオマーカー値を検出する段階は、生体内検定を行う段階を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体内検定は、前記バイオマーカータンパク質それぞれに対応する１つの捕捉試薬を含み、アプタマー、抗体及び核酸プローブからなる群より少なくとも１つの捕捉試薬を選択する段階を更に含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの捕捉試薬は、アプタマーであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的サンプルは、全血、血漿及び血清からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的サンプルは血清であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒトはアジア人であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒトは喫煙者であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒトは悪性肺結節を持つことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｎは、少なくとも３であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｎは少なくとも４であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｎは少なくとも５であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｎは少なくとも６であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｎは少なくとも７であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記バイオマーカー値は、補体成分Ｃ９、炭酸脱水酵素（carbonic anhydrase）６（ＣＡ６）、Ｃ-反応性タンパク質（ＣＲＰ）、表皮成長因子受容体１（ＥＧＦＲ１）、マトリックスメタロプロテアーゼ７（ＭＭＰ７）、アルファ（α）１-アンチプロテアーゼ（ＳＥＲＰＩＮＡ３）及び幹細胞成長因子受容体（ＫＩＴ）の測定値を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記バイオマーカー値は、リアルタイムＰＣＲ、マイクロアレイ及びルミネックスマイクロビーズ検定法（Luminex microbead assay）からなる群より測定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記肺癌は統計的な方法で診断されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記統計的な方法は、線形判別分析、ロジスティック回帰分析、ナイーブベイズ分類、サポートベクターマシン及びランダムフォレスト（random forest）からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ヒトの非小細胞肺癌を診断するためのタンパク質バイオマーカーパネルにおいて、前記パネルは、ＫＩＴを含む表２に記載のバイオマーカータンパク質のうちＮ個のバイオマーカータンパク質を含み、Ｎは少なくとも２であることを特徴とするパネル。
【請求項２０】
前記Ｎは少なくとも３であることを特徴とする、請求項１９に記載のパネル。
【請求項２１】
前記Ｎは少なくとも４であることを特徴とする、請求項１９に記載のパネル。
【請求項２２】
前記Ｎは少なくとも５であることを特徴とする、請求項１９に記載のパネル。
【請求項２３】
前記Ｎは少なくとも６であることを特徴とする、請求項１９に記載のパネル。
【請求項２４】
前記Ｎは少なくとも７であることを特徴とする、請求項１９に記載のパネル。
【請求項２５】
前記パネルは、補体成分Ｃ９、炭酸脱水酵素（carbonic anhydrase）６（ＣＡ６）、Ｃ-反応性タンパク質（ＣＲＰ）、表皮成長因子受容体１（ＥＧＦＲ１）、マトリックスメタロプロテアーゼ７（ＭＭＰ７）、アルファ（α）１-アンチプロテアーゼ（ＳＥＲＰＩＮＡ３）及び幹細胞成長因子受容体（ＫＩＴ）の測定値を有することを特徴とする、請求項１９に記載のパネル。
【請求項２６】
前記ヒトはアジア人であることを特徴とする、請求項１９に記載のパネル。
【請求項２７】
前記ヒトは喫煙者であることを特徴とする、請求項１９に記載のパネル。
【請求項２８】
前記ヒトは悪性肺結節を持つことを特徴とする、請求項１９に記載のパネル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非小細胞肺癌診断用タンパク質バイオマーカーパネル及びこれを用いた非小細胞肺癌診断方法に関し、より詳細には、幹細胞成長因子受容体（ＫＩＴ）を含むバイオマーカータンパク質のうち、Ｎ個のタンパク質を持つ、ヒトの非小細胞肺癌を診断するためのタンパク質バイオマーカーパネルに関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の説明では本出願と関連する情報の要約を提供し、提供される情報や参照文献が本出願の従来技術として認められない。
【０００３】
肺癌は、韓国及び世界全体において依然として癌関連死の主要原因である（Torre LA, Bray F, Siegel RL, Ferlay J, Lortet-Tieulent J, et al.（２０１５）Global cancer statistics, ２０１２, CA Cancer JClin.）。２０１１年に韓国で２１,７５３件超の肺癌が新たに発病し、１５,０００人を超える人が肺癌で亡くなったと推定される（Jung KW, Won YJ,Kong HJ, Oh CM, Lee DH, et al.（２０１４）Cancer statisticsin Korea:incidence, mortality, survival, and prevalence）。先進国では肺癌の罹患率と死亡率が減少しているが、喫煙率が増加し続けている開発途上国、特にアジア諸国では肺癌の罹患率と死亡率が急増している（Torre LA, Bray F, Siegel RL, Ferlay J, Lortet-Tieulent J, et al.（２０１５）Global cancer statistics, ２０１２,CA Cancer JClin.）。
【０００４】
早期肺癌を持つ大半の患者は症状が現れないため、６０％を超える患者は治療可能性のない進行段階で診断される（Jemal A, Center MM, DeSantis C, Ward EM（２０１０）Global patterns of cancer incidence and mortality rates and trends.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev １９:１８９３-１９０７;Jett JR（１９９３）CurrentTreatment of Unresectable Lung-Cancer. Mayo Clinic PＲＯＣeedings６８:６０３-６１１.）。肺癌が進んだ患者の５年生存率は１０％未満であるが、１期患者の５年生存率は７０％を超えることができる（Hoffman PC, Mauer AM, Vokes EE（２０００）Lungcancer. Lancet ３５５:４７９-４８５.）。従って、死亡率及び罹患率の減少に重要な肺癌の早期診断という研究目的が肺癌検診法の開発に転換されている。
【０００５】
全米肺検診臨床試験（National Lung Screening Trial（NLST））（Aberle DR, Adams AM, Berg CD, Black WC, Clapp JD, et al.（２０１１）Reduced lung-cancermortality with low-dose computed tomographic screening. N Engl J Med ３６５:３９５-４０９）では、低線量ＣＴ（ＬＤＣＴ）検診では肺癌関連の死亡率が２０％減少することが判明されたが、ＬＤＣＴ検診の２４.２％は陽性であり、これらの結節の９６.４％は誤診であると判断される（Aberle DR, Adams AM, Berg CD, Black WC, Clapp JD, et al.（２０１１）、Reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomographicscreening. N Engl J Med ３６５:３９５-４０９.;Aberle DR, Abtin F, Brown K（２０１３）ComputedTomography Screening for Lung Cancer:Has It Finally Arrived? Implications of the National Lung ScreeningTrial. Journal of Clinical Oncology ３１:１００２-１００８.）。攻撃性腫瘍の発見以外に、ＮＬＳＴにおいてＬＤＣＴで発見した全ての肺癌のうち１８％よりも多い肺癌が無痛症と見られ、ＬＤＣＴによる肺癌診断の危険性を記述するとき、過度な診断も考慮されなければならない（Patz EF, Jr.、Pinsky P, Gatsonis C, Sicks JD,Kramer BS, et al.（２０１４）Overdiagnosis in low-dosecomputed tomography screening for lung cancer. JAMA Intern Med １７４:２６９-２７４）。
【０００６】
従って、血清のように非侵襲式で収集した生物学的標本で測定した、感度と特異度を有する肺癌バイオマーカーは、高危険対象、特にＣＴを通じて非決定性肺結節が発見された患者に対して臨床的決定を下すのに役立つことができる。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の個別血清バイオマーカー、主にサイトケラチン１９フラグメント２１.１（Cyfra ２１-１）、癌胎児性抗原、そして組織ペプチド抗原に対して公開されたデータによれば、これらのバイオマーカーは、特に初期段階の疾病に限られた感度と特異度を示す（Pastor A, Menendez R, Cremades MJ, Pastor V, Llopis R, et al.（１９９７）Diagnostic value of SCC, CEA and CYFRA ２１.１ in lung cancer:a Bayesian analysis. European Respiratory Journal １０:６０３-６０９.;BuccheriG, Torchio P, Ferrigno D（２００３）Clinical equivalence oftwo cytokeratin markers in non-small cell lung cancer-A study of tissuepolypeptide antigen and cytokeratin １９ fragments. Chest１２４:６２２-６３２.;Lai RS, Hsu HK, Lu JY, Ger LP, Lai NS（１９９６）CYFRA ２１-１enzyme-linked immunosorbent assay. Evaluation as a tumor marker in non-smallcell lung cancer. Chest １０９:９９５-１０００.）。
【０００７】
分子診断法の発展とゲノム学に対する理解に伴い、現在の検診基準を補完する潜在力のある幾つかの肺癌バイオマーカーが発見された（Hasan N, Kumar R, Kavuru MS（２０１４）Lung cancerscreening beyond low-dose computed tomography:the role of novel biomarkers.Lung １９２:６３９-６４８.;Bigbee WL, Gopalakrishnan V, Weissfeld JL, Wilson DO, Dacic S, etal.（２０１２）A multiplexed serum biomarker immunoassaypanel discriminates clinical lung cancer patients from high-risk individualsfound to be cancer-free by CT screening. J Thorac Oncol ７:６９８-７０８.;Daly S,Rinewalt D, Fhied C, Basu S, Mahon B, et al.（２０１３）Developmentand validation of a plasma biomarker panel for discerning clinical significanceof indeterminate pulmonary nodules. J Thorac Oncol ８:３１-３６.;Gold L, Ayers D, Bertino J, Bock C,Bock A, et al.（２０１０）Aptamer-based multiplexed proteomictechnology for biomarker discovery. PLoS One ５:e１５００４.;Ostroff RM, Bigbee WL, Franklin W, Gold L, Mehan M, et al.（２０１０）Unlocking biomarker discovery:large scale application of aptamerproteomic technology for early detection of lung cancer. PLoS One ５:e１５００３.;Pecot CV, Li M, Zhang XJ, RajanbabuR, Calitri C, et al.（２０１２）Added value of a serumproteomic signature in the diagnostic evaluation of lung nodules. CancerEpidemiol Biomarkers Prev ２１:７８６-７９２.）。Ostroffの他、多数は肺癌の早期診断のためのタンパク質バイオマーカーパネルを発見したことを報告している（Gold L, Ayers D, Bertino J, Bock C, Bock A, et al.（２０１０）Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarkerdiscovery. PLoS One ５:e１５００４.;OstroffRM, Bigbee WL, Franklin W, Gold L, Mehan M, et al.（２０１０）Unlocking biomarker discovery:large scale application of aptamerproteomic technology for early detection of lung cancer. PLoS One ５:e１５００３.）。
【０００８】
しかし、肺癌の疫学と分子生物学は、民族的又は地域的背景によって異なっており、タンパク質バイオマーカーの開発やＣＴ画像化モデルへの統合も行われていない。
【０００９】
アプタマー（aptamer）は新たな生体分子であって、大規模のオリゴ（oligo）ライブラリプールから選別される。一連のＳＥＬＥＸ動作を通じて、特異リガンド（ligand）対象のアプタマーを拡張し、最終的に選定する。アプタマーは化学的に合成可能であり、多様な目的のために変形し易い一本鎖の核酸である。また、アプタマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction）方法により増幅して分析することができ、高容量のＤＮＡアレイ技術に適用することもできる。
【００１０】
アプタマー基盤の高容量定量的検定法は、疾病の状態を診断するために多変量蛋白体の特徴を分別するための優れたプラットフォームとして報告され、証明された。単一のプラットフォームから１０００個を超えるタンパク質を同時に測定することができ、これにより、疾病特異的蛋白体の特徴を見つけ出すために人体サンプルを分析できる機会が得られる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、その目的は、ヒトの非小細胞肺癌を診断する方法を提供することにある。
【００１２】
また、本発明の他の目的は、非小細胞肺癌を発見するためのタンパク質バイオマーカーパネルを提供することにある。
【００１３】
本発明のまた他の目的は、以上で言及したものに制限されず、言及されていない更に他の目的は、以下の記載から本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者に明確に理解させることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記技術的課題を解決するために、本発明の一実施形態は、肺癌、特に非小細胞肺癌を診断するためのタンパク質バイオマーカーパネルを提供する。本発明の一実施形態において、バイオマーカーは実施形態で詳細に説明する多重アプタマー基盤の検定法を用いて識別された。本願で説明する前記多重アプタマー基盤の検定法を用いることによって、本願は非小細胞肺癌の検出及び診断に有用な非小細胞肺癌バイオマーカーリストを説明する。これらのバイオマーカーを識別するために、かつて非小細胞肺癌の存否を診断されたアジア人の標本から小規模セットの候補バイオマーカータンパク質を測定した。各バイオマーカーを分析し、患者群と対照群を区分する性能を互いに比較して表２に記載されたように、より優れた性能を持つ小規模セットのバイオマーカーを選択した。ナイーブベイズ定理（naive Bayesian theorem）によって、実施形態に詳細に説明したように、多変量分類器を生成し分析した。
【００１５】
本発明の目的を達成するために、本発明の一実施形態に係るヒトの肺癌を診断するための方法は、表２に記載のバイオマーカータンパク質のうちＮ個を含むバイオマーカーパネルを提供し、前記Ｎは少なくとも２である整数である段階と、前記パネルのＮ個のバイオマーカータンパク質とそれぞれ対応するバイオマーカー値を付与するために、ヒトより得られた生物学的サンプルから前記バイオマーカータンパク質を検出する段階とを含み、前記肺癌は、前記バイオマーカー値に基づいて診断されることを特徴とする。
【００１６】
前記バイオマーカー値を検出する段階は、生体内検定を行う段階を含むことができる。
【００１７】
前記生体内検定は、前記バイオマーカータンパク質それぞれに対応する１つの捕捉試薬を含むことができ、前記方法は、アプタマー、抗体及び核酸プローブからなる群より少なくとも１つの捕捉試薬を選択する段階を更に含むことができる。
【００１８】
前記少なくとも１つの捕捉試薬は、アプタマーであり得る。
【００１９】
前記生物学的サンプルは、全血、血漿及び血清からなる群より選択され得る。
【００２０】
前記生物学的サンプルは、血清であり得る。
前記ヒトは、アジア人であり得る。
前記ヒトは、喫煙者であり得る。
前記ヒトは、悪性肺結節を持ち得る。
【００２１】
前記Ｎは３、４、５、６、７或いはそれ以上であり得る。
【００２２】
前記バイオマーカー値は、補体成分Ｃ９、炭酸脱水酵素（carbonic anhydrase）６（ＣＡ６）、Ｃ-反応性タンパク質（ＣＲＰ）、表皮成長因子受容体１（ＥＧＦＲ１）、マトリックスメタロプロテアーゼ７（ＭＭＰ７）、アルファ（α）１-アンチプロテアーゼ（ＳＥＲＰＩＮＡ３）及び幹細胞成長因子受容体（ＫＩＴ）の測定値であり得る。
【００２３】
前記バイオマーカー値は、リアルタイムＰＣＲ、マイクロアレイ及びルミネックスマイクロビーズ検定法（Luminex microbead assay）からなる群より測定され得る。
【００２４】
前記肺癌は、統計的な方法で診断され得る。
【００２５】
前記統計的な方法は、線形判別分析、ロジスティック回帰分析、ナイーブベイズ分類、サポートベクターマシン及びランダムフォレスト（random forest）からなる群より選択され得る。
【００２６】
また、本発明の目的を達成するために、ヒトの非小細胞肺癌を診断するためのタンパク質バイオマーカーパネルにおいて、前記パネルは、ＫＩＴを含む表２に記載のバイオマーカータンパク質のうちＮ個のバイオマーカータンパク質を含み、Ｎは少なくとも２であることを特徴とする。
【００２７】
前記Ｎは３、４、５、６、７或いはそれ以上であり得る。
前記パネルは、補体成分Ｃ９、炭酸脱水酵素（carbonic anhydrase）６（ＣＡ６）、Ｃ-反応性タンパク質（ＣＲＰ）、表皮成長因子受容体１（ＥＧＦＲ１）、マトリックスメタロプロテアーゼ７（ＭＭＰ７）、アルファ（α）１-アンチプロテアーゼ（ＳＥＲＰＩＮＡ３）及び幹細胞成長因子受容体（ＫＩＴ）の測定値を有することができる。
前記ヒトは、アジア人であり得る。
前記ヒトは、喫煙者であり得る。
前記ヒトは、悪性肺結節を持ち得る。
【発明の効果】
【００２８】
本発明のタンパク質バイオマーカーパネルによれば、非小細胞肺癌を発見するためのタンパク質バイオマーカーパネルを提供できるという効果を奏する。
【００２９】
本発明の効果は、以上で言及したものに制限されず、言及されていない更にに他の効果は、以下の記載から本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者に明確に理解させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】アルゴリズム教育及び確認のための研究フローチャートである。
【図２】アプタマー基盤の多重検定法を示す。
【図３】正規累積分布関数（ＣＤＦ）に適したモデルと共に未加工データの例を示す。
【図４Ａ】患者-対照群間の候補マーカーを比較した図である。
【図４Ｂ】患者-対照群間の候補マーカーを比較した図である。
【図４Ｃ】患者-対照群間の候補マーカーを比較した図である。
【図４Ｄ】患者-対照群間の候補マーカーを比較した図である。
【図４Ｅ】患者-対照群間の候補マーカーを比較した図である。
【図４Ｆ】患者-対照群間の候補マーカーを比較した図である。
【図４Ｇ】患者-対照群間の候補マーカーを比較した図である。
【図４Ｈ】患者-対照群間の候補マーカーを比較した図である。
【図４Ｉ】患者-対照群間の候補マーカーを比較した図である。
【図４Ｊ】患者-対照群間の候補マーカーを比較した図である。
【図４Ｋ】患者-対照群間の候補マーカーを比較した図である。
【図４Ｌ】患者-対照群間の候補マーカーを比較した図である。
【図４Ｍ】患者-対照群間の候補マーカーを比較した図である。
【図４Ｎ】患者-対照群間の候補マーカーを比較した図である。
【図５Ａ】７-マーカー単純ベイズ分類器（naive Bayes classifier）に対するＲＯＣ曲線を示す。
【図５Ｂ】７-マーカー単純ベイズ分類器（naive Bayes classifier）に対するＲＯＣ曲線を示す。
【図５Ｃ】７-マーカー単純ベイズ分類器（naive Bayes classifier）に対するＲＯＣ曲線を示す。
【図６Ａ】６-マーカー単純ベイズ分類器に対するＲＯＣ曲線を示す。
【図６Ｂ】６-マーカー単純ベイズ分類器に対するＲＯＣ曲線を示す。
【図６Ｃ】６-マーカー単純ベイズ分類器に対するＲＯＣ曲線を示す。
【図６Ｄ】６-マーカー単純ベイズ分類器に対するＲＯＣ曲線を示す。
【図６Ｅ】６-マーカー単純ベイズ分類器に対するＲＯＣ曲線を示す。
【図６Ｆ】６-マーカー単純ベイズ分類器に対するＲＯＣ曲線を示す。
【図６Ｇ】６-マーカー単純ベイズ分類器に対するＲＯＣ曲線を示す。
【図７Ａ】７-マーカー単純ベイズ分類器とCyfra ２１-１の性能を比較した図である。
【図７Ｂ】７-マーカー単純ベイズ分類器とCyfra ２１-１の性能を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
代表的な実施形態を参照して本発明を具体的に記述する。本発明について列挙される実施形態と関連して説明するが、本発明は前記実施形態に限定されないことが理解できるはずである。これに対し、本発明は請求の範囲により定義されているような本発明の範囲内に含まれることができる全ての代案、変更及び同等物を含む。
【００３２】
当業者らは、本願に記載されたものと類似又は同等な多くの方法と物質は、本発明の範囲内に含まれることができ、また含まれることが理解できるはずである。本発明は、記載された方法と物質に決して限定されない。
【００３３】
他の定義がない限り、本願で用いられた技術及び科学的用語は、本発明が属する技術分野において当業者に一般に通用しているものと同一の意味を有する。たとえ、本願に記載されたものと類似又は同等な任意の方法、装置及び物質が本発明の実行又はテストに使用され得るとしても、好適な方法、装置及び物質をこれから記述する。
【００３４】
本願に引用された全ての文献、公開特許文書及び特許出願は、本願が属する技術分野の水準を表す。本願に引用された全ての文献、公開特許文書及び特許出願は、それぞれの文献、公開特許文書又は特許出願が具体的、かつ明確に参照により統合されるものと示された程度と同じ程度の参照により統合されている。
【００３５】
添付する請求の範囲を含んで本願で用いられる、単数形「１つ（“a”、 “an”及び“the”）」は文脈上、特に明確に指示されていない限り、複数の表現を含み、「少なくとも１つ（at least one）」及び「１つ又はそれ以上（one or more）」と混用される。従って、「アプタマー（an aptamer）」はアプタマーの混合物を含み、「プローブ（a probe）」はプローブの混合物を含む。
【００３６】
本願で用いられた用語である「約（about）」は、数値と関連している項目の基本機能が変更されない程度の微々たる数値の変更又は変化を示す。
【００３７】
本願で用いられた用語である「含む（“comprises”、“comprising”、“includes”、“including”、“contains”、“containing”）」及びこの用語の変化形は、ある要素や要素リストを含む工程、方法、方法限定物（product-by-process）、又は物質の組成が単にこれらの要素だけでなく、明確に列挙していないか、そのような工程、方法、方法限定物、又は物質の組成に固有な他の要素を含むことができる非排他的包含（nonexclusive inclusion）を網羅する。
【００３８】
一実施形態において、バイオマーカーサブセットやバイオマーカーパネルに有用なバイオマーカーの数は、特定のバイオマーカー値の組み合わせのための感度及び特異度値に基づく。ここで、「感度」及び「特異度」という用語は、生物学的サンプルから検出された１つ或いはそれ以上のバイオマーカー値に基づいて、個人が非小細胞肺癌を患っているか否かを正確に把握する能力と関連して用いられる。「感度」とは、非小細胞肺癌を患っているヒトを正確に識別する（各）バイオマーカーの性能を示す。「特異度」は、非小細胞肺癌を患っていないヒトを正確に識別する（各）バイオマーカーの性能を示す。
【００３９】
本願は、バイオマーカー、方法、装置、試薬、システム及び非小細胞肺癌と癌の発見及び診断のためのキットを更に一般的に含む。
【００４０】
ここで用いられる「肺臓（lung）」という用語は、「肺（pulmonary）」という用語と混用され得る。
【００４１】
ここで用いられる「喫煙者」という用語は、タバコの煙を吸い込んだ履歴のある個人のことをいう。
【００４２】
「生物学的サンプル（biological sample）」、「サンプル（sample）」及び「試料（test sample）」とは、個人より獲得するか、その他に異なって導出された物質、生物学的体液、組織又は細胞のことをいうものであって、本願において混用される。これは（全血（whole blood）、白血球（leukocytes）、末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cells）、バフィーコート（buffycoat）、血漿（plasma）及び血清（serum）を含む）血液、喀痰（sputum）、涙（tears）、粘液（mucus）、鼻洗浄液（nasal washes）、鼻咽頭吸引液（nasal aspirate）、呼吸（breath）、小便（urine）、精液（semen）、唾液（saliva）、腹腔洗浄液（peritoneal washing）、嚢胞液（cystic fluid）、羊水（amniotic fluid）、腺液（glandular fluid）、リンパ液（lymph fluid）、細胞液（cytologic fluid）、腹水（ascites）、胸膜液（pleural fluid）、乳頭吸引液（nipple aspirate）、気管支吸引液（bronchial aspirate）、気管支擦過ブラシ（bronchial brushing）、滑液（synovial fluid）、関節吸引液（joint aspirate）、組織分泌物（organ secretions）、細胞（cell）、細胞抽出物（cell extract）及び脳脊髄液（cerebrospinal fluid）を含む。また、これは前記列挙したものから実験的に分離された分画（fractions）を含む。例えば、血液サンプルは血清、血漿又は赤血球細胞又は白血球細胞のような特定形態の血液細胞を含む分画に分離されることできる。所望の場合、サンプルは組織サンプルと及び体液サンプルの組み合わせのように、個人のサンプル組み合わせであり得る。また、前記用語「生物学的サンプル（biological sample）」は例えば、大便サンプル、組織サンプル又は組織生検からのサンプルのような均質化した固体物質を含む物質を含む。また、前記用語「生物学的サンプル」は、組織培養又は細胞培養に由来する物質を含む。生物学的サンプルを得るための適切な方法が使用され得、代表的な方法として、例えば、採血、綿棒法（例えば、口腔上皮細胞綿棒法）及び細針吸引組織検査を含む。細針吸引が可能な代表的な組織は、リンパ節、肺、肺洗浄液、ＢＡＬ（気管支肺胞洗浄液、bronchoalveolar lavage）、甲状腺、乳房及び肝臓 （liver）を含む。また、サンプルは例えば、顕微解剖（例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（laser capture microdissection;LCM）又はレーザーマイクロダイセクション（laser micro dissection;LMD））、膀胱洗浄、塗抹（例えば、ＰＡＰ塗抹）又は乳管洗浄細胞診により収集され得る。個人より得られるか、由来する「生物学的サンプル」は、個人から得た後、適切な方法により処理されたサンプルを含む。
【００４３】
更に、生物学的サンプルは、多数のヒトより生物学的なサンプルを得てそのサンプルをプール（pool）にするか、各個人の生物学的サンプルの部分標本をプールにして導き出せることを理解すべきである。プールにしたサンプルは、一人の個人より得られたサンプルとして処理されることができ、前記プールにしたサンプルから癌の存在が確定されると、どの個人が非小細胞肺癌を持っているかを決定するために個別の生物学的サンプルを再びテストできる。
【００４４】
本明細書の目的のために、「個人の生物学的サンプルに起因するデータ」という文句は、前記データが個人の生物学的なサンプルに由来した任意の形式のデータであるか、生物学的なサンプルを用いて生成したデータであることを意味する。前記データは生成後、ある１つの測定方式の単位から他の測定方式の単位へ変換するように、ある程度再フォーマット、修正、又は数学的に変更されたものであり得る。しかし、前記データは生物学的サンプルに由来するか、生物学的サンプルを用いて生成されたものと理解される。
【００４５】
「標的（target）」、「標的分子（target molecule）」及び「分析物（analyte）」は、生物学的サンプルに存在し得る任意の関心分子を指すために本願において混用される。「関心分子（molecule of interest）」は、例えば、タンパク質の場合にアミノ酸序列での軽微な変化、ジスルフィド結合形成（disulfide bond formation）、グリコシル化（glycosylation）、脂質化（lipidation）、アセチル化（acetylation）、リン酸化（phosphorylation）、又は分子の本質を実質的に変更させない標識成分（labelingcomponent）との結合のようなその他の別の操作（manipulation）又は変更（modification）などの特定分子の軽微な変化（minor variation）を含む。「標的分子」、「標的」又は「分析物」は、１つの形態又は種類の分子又は多重-分子構造の複製セットである。「標的分子」、「標的」及び「分析物」は１つ以上のこのような分子のセットを意味する。標的分子の例には、タンパク質（proteins）、ポリペプチド（polypeptides）、核酸（nucleic acids）、炭水化物（carbohydrates）、脂質（lipids）、多糖類（polysaccharides）、糖タンパク質（glycoproteins）、ホルモン（hormones）、受容体（receptors）、抗原（antigens）、抗体（antibodies）、アフィボディ（affibodies）、自己抗体（autoantibodies）、抗体摸倣体（antibody mimics）、ウイルス（viruses）、病原体（pathogens）、毒性物質（toxic substances）、基質（substrates）、代謝物質（metabolites）、遷移状態類似体（transition stateanalogs）、補助因子（cofactors）、抑制剤（inhibitors）、薬物（drugs）、染料（dyes）、栄養物（nutrients）、成長因子（growth factors）、細胞（cells）、組織（tissues）及び前記列挙したものの断片又は部分が含まれる。
【００４６】
本願で用いられた「ポリペプチド（polypeptide）」、「ペプチド（peptide）」及び「タンパク質（protein）」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本願において混用される。前記ポリマーは線形又は分岐型であることができ、変更されたアミノ酸を含むことができ、非アミノ酸（non-amino acid）により切断され得る。また、前記用語は、自然的に又は人為的に、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識成分との結合のように、その他の別の操作又は変更によって変更されたアミノ酸ポリマーを含む。また、前記用語の定義には例えば、（例えば、非天然アミノ酸などを含む）１つ又はそれ以上のアミノ酸の類似体だけでなく、当業界において公知となった他の変更を含むポリペプチドが含まれる。ポリペプチドは、単鎖又は連結鎖であり得る。タンパク質前駆体（preprotein）又は完全な成熟タンパク質（intact matureprotein）;成熟タンパク質に由来したペプチド又はポリペプチド;タンパク質の断片;スプライスバリアント（splice variant）;タンパク質の再組み合わせ形態、アミノ酸の変更、欠失又は置換を有するタンパク質バリアント;消化物（digests）及びグリコシル化、アセチル化、リン酸化などのような翻訳後修飾（post-translational modification）も前記定義内に含まれる。
【００４７】
本願で用いられた「マーカー（marker）」及び「バイオマーカー（biomarker）」は、個人において正常又は異常な進行の標識又は個人において疾病又は他の状態の標識であるか、それを示す標的分子を指すために混用される。より詳細には、「マーカー」又は「バイオマーカー」は正常又は異常、そして異常であれば、慢性又は急性の特定の生理学的状態又は進行の存在と関連する解剖的、生理学的、生化学的又は分子学的パラメーターである。バイオマーカーは、実験室検定法及び医療的画像化を含む多様な方法によって検出及び測定可能である。バイオマーカーがタンパク質である場合、バイオマーカーや前記バイオマーカーの発現を制御するタンパク質を暗号化する遺伝子の生物学的サンプル又はメチル化状態で、該当遺伝子の発現を該当タンパク質バイオマーカーの量又は存否に対する代替指標（surrogate measure）として使用可能である。
【００４８】
本願で用いられた「バイオマーカー値（biomarker value）」、「値（value）」、「バイオマーカーレベル（biomarker level）」及び「レベル（level）」は、生物学的サンプルからバイオマーカーを検出するための任意の分析方法を用いて測定され、また前記生物学的サンプルでバイオマーカーの、バイオマーカーのための、又はバイオマーカーに対応する存在、不在、絶対的な量又は濃度、相対的な量又は濃度、力価（titer）、レベル（level）、発現レベル、測定されたレベルの比率などを示す測定値を指すために混用される。「値」又は「レベル」の正確な特性は、バイオマーカーを検出するのに用いられた特定分析方法の特定設計及び成分に依存する。
【００４９】
バイオマーカーが個人における異常な進行又は疾病又は他の状態を示すか、それの標識であれば、そのバイオマーカーは、一般に個人における正常な進行又は疾病又は他の状態の不在を示すか、それの標識であるバイオマーカーの発現レベル又は値と比較して、過剰発現（over-expressed）又は過小発現（under expressed）のうち１つで表現される。「上向き調節（up-regulation）」、「上向き調節された（up-regulated）」、「過剰発現（over-expression）」、「過剰発現された（over-expressed）」及びこれらの表現の変化形は、健常な又は正常な個人の類似する生物学的サンプルから典型的に検出されるバイオマーカーの値又はレベル（又は値又はレベルの範囲）よりも更に大きい生物学的サンプルにおけるバイオマーカーの値又はレベルを指すために混用される。また、前記用語は、特定疾病の互いに異なる段階で検出され得るバイオマーカーの値又はレベル（又は値又はレベルの範囲）よりも更に大きい生物学的サンプルにおけるバイオマーカー値又はレベルを指すことができる。
【００５０】
「下向き調節（down-regulation）」、「下向き調節された（down-regulated）」、「過小発現（under-expression）」、「過小発現された（under-expressed）」及びこれらの表現の変化形は、健常な又は正常な個人の類似する生物学的サンプルから典型的に検出されるバイオマーカーの値又はレベル（又は値又はレベルの範囲）よりも更に小さな生物学的サンプルにおけるバイオマーカー値又はレベルを指すために混用される。また、前記用語は、特定疾病の互いに異なる段階で検出され得るバイオマーカーの値又はレベル（又は値又はレベルの範囲）よりも更に小さな生物学的サンプルにおけるバイオマーカー値又はレベルを指すことができる。
【００５１】
また、過剰発現されるか、過小発現されたバイオマーカーは、個人における正常な進行又は疾病又は他の状態の不在の標識であるか、それを示すバイオマーカーの「正常な」発現レベル又は値と比較し、「差別的に発現（differentially expressed）」されるか、「差別的なレベル（differentiallevel）」又は「差別的な値（differential value）」を有するものと言える。従って、バイオマーカーの「差別的な発現」は、バイオマーカーの「正常な」発現レベルの変化とも表現され得る。
【００５２】
「差別的な遺伝子発現（differential gene expression）」及び「差別的な発現（differentialexpression）」という用語は、正常対象や対照対象での発現に比べて、特定の疾病を持つ対象において、より高いか、低いレベルで発現が活性化される遺伝子（又はこれに対応するタンパク質発現産物）を指すために混用される。また、前記用語は、同一の疾病の互いに異なる段階で高いレベルか、低いレベルで発現が活性化される遺伝子（又はこれに対応するタンパク質発現産物）を含む。また、前記用語は、差別的に発現された遺伝子が核酸レベル又はタンパク質レベルで活性化されるか、抑制され得るか、互いに異なるポリペプチド産物を生成する選択的スプライシング（alternative splicing）になり得る。このような差異は、ポリペプチドのｍＲＮＡレベル、表面発現、分泌又は分割（partitioning）などの多様な変化を通じて明確になり得る。差別的な遺伝子発現は、２つ又はそれ以上の遺伝子又はそれらの遺伝子産物間の発現の比較、又は２つ又はそれ以上の遺伝子又はそれらの遺伝子産物間の発現比率の比較、又はむしろ正常な被験者と疾病のある被験者間又は同一の疾病の多様な段階間で相異する同一遺伝子が異なって処理された２つの産物の比較を含むことができる。差別的な発現は例えば、正常及び異常細胞、又は互いに異なる疾病又は疾病段階を経た細胞間での遺伝子又はそれの発現産物で時間に伴う又は細胞的発現パターンでの定量的差異と定性的差異を何れも含む。
【００５３】
「診断する（diagnose）」、「診断すること（diagnosing）」、「診断（diagnosis）」及びこれらの用語の変化形は、個人と関連する１つ又はそれ以上の徴候、症状、データ又はその他の情報に基づいて、個人の健康状態又は状況の発見、判断又は認知をいう。個人の健康状態は健常な／正常（即ち、疾病又は疾患不在）と診断されるか、健康の悪い／異常（即ち、疾病又は疾患の存在又は特性の評価）と診断され得る。前記用語の「診断する」、「診断すること」、「診断」などは、特定の疾病又は疾患と関連して疾病の早期発見、疾病の特性又は分類、疾病の進行、治癒、又は再発の発見、個人の処置又は治療後の疾病に対する反応の発見を含む。非小細胞肺癌の診断は、癌を患っていない個人と、癌を患っている個人の区別を含む。また、これは非小細胞肺癌と喫煙者と良性肺結節の区別を含む。
【００５４】
「予知する（prognose）」、「予知すること（prognosing）」、「予知（prognosis）」及びこれらの用語の変化形は、疾病又は疾患を持っている個人における疾病又は疾患の進行予測（例えば、患者の生存率を予測すること）をいい、このような用語は個人に対する処置又は治療後疾病反応の評価を含む。
【００５５】
「評価する（evaluate）」、「評価すること（evaluating）」、「評価（evaluation）」及びこれらの用語の変化形は、「診断する（diagnose）」及び「予知する（prognose）」の何れも含み、また疾病を持っていない個人における疾病又は疾患の進行に対する判断又は予測だけでなく、疾病が明確に治療された個人における疾病及び疾患が再発する可能性に関する判断又は予測を含む。また、前記用語の「評価する」は例えば、個人が治療剤に対して順調に反応するか、それとも治療剤に対して反応しないか（又は、例えば、毒性を経験するか、他の好ましくない副作用を経験するか）を予測すること、個人に投与する治療剤を選択すること、又は個人に対して施された治療に対する個人の反応を観察するか、発見することのように、治療に対する個人の反応評価を含む。従って、非小細胞肺癌を「評価すること」は例えば、個人の非小細胞肺癌の進行過程を予測すること、非小細胞肺癌が明確に治療された患者から非小細胞肺癌の再発を予測すること、又は非小細胞肺癌治療に対する個人の反応を判断したり予測すること、又は個人の生物学的サンプルから導出されたバイオマーカー値の測定に基づいて個人のための非小細胞肺癌治療法を選択することを含むことができる。
【００５６】
下記の例は、非小細胞肺癌の「診断」又は「評価」、非小細胞肺癌の存否を早期検出、非小細胞肺癌の特定段階、類型又は下位類型、又はその他の分類又は特性を判断、疑いのある肺結節又は腫瘍が良性又は悪性非小細胞肺癌であるか否かの判断、又は非小細胞肺癌の進行（例えば、腫瘍の成長又は転移速度の観察）、快方又は再発の発見／観察と称され得る。
【００５７】
本願で用いられた「追加的な生体医学情報（additional biomedical information）」は、本願に記載されたバイオマーカーの使用を除いて、癌の危険度又はより具体的に非小細胞肺癌の危険度と関連する１つ又はそれ以上の個人の評価物をいう。「追加的な生体医学情報」は個人の外形、ＣＴ画像で発見された肺結節の外形、個人の身長及び／又は体重、個人の性別、個人の民族性、喫煙歴、職業経歴、公知となった発癌物質に対する曝露（例えば、石綿、ラドンガス、化学物質、火災による煙、及び産業／工場又は自動車／船舶／航空機の排出物のように、停滞しているか、動くソースからの放出物を含むことができる空気汚染、受動喫煙に対する曝露、非小細胞肺癌（又は他の癌）の家族歴、肺結節の存在、結節の大きさ、結節の位置、結節の形態（例えば、ＣＴ画像で発見された結節、スリガラス陰影（ground glass opacity;GGO）、固形、非固形、結節の境界面特性（例えば、平滑（smooth）、分葉状（lobulated）、明瞭（sharp and clear）、針状（spiculated）、浸潤（infiltrating））などを含む。喫煙歴は、主に喫煙年数に１日の喫煙箱数を掛けた数を意味する「パックイヤー（pack years）」の観点で定量化される。例えば、平均的に３５年にわたって１日に１箱のタバコを吸った人は３５パックイヤーの喫煙歴を持つものと表現される。追加的な生体医学情報は、公知の一般技術を用いて個人より獲得できる。例えば、日常問診又は健康歴問診などを通じて、個人又は医療従事者から追加的な生体医学情報を得ることができる。代案として、追加的な生体医学情報はＣＴ画像（例えば、低線量ＣＴ画像）及びＸ線を含む一般的な映像技術から得ることができる。追加的な生体医学的情報の評価とバイオマーカーレベルのテストを結合すると、例えばバイオマーカーテストを単独で実施するか、追加的な生体医学情報のうちある特定の項目を単独で評価すること（例えば、ＣＴ画像単独）に比べて、非小細胞肺癌（又は他の非小細胞肺癌関連の用途）の検出に対する感度、特異度及び／又はＡＵＣを向上させることができる。
【００５８】
「曲線下の面積（area under the curve）」又は「ＡＵＣ」は当業界において何れも周知されている受信者操作特性（receiver operating characteristic curve;ROC）曲線の下領域をいう。ＡＵＣ測定は、データ範囲全体にわたって分類器の正確性を比較するのに有用である。より大きなＡＵＣを有する分類器は、２つの関心群（例えば、非小細胞肺癌サンプル及び正常又は対照サンプル）間で未知のものを正確に分類する能力が更に大きい。ＲＯＣ曲線は、２つの集団（例えば、非小細胞肺癌を持つ群と非小細胞肺癌ではない対照群）を区別するにおいて、特定の特性（例えば、本願に記載されたバイオマーカー及び／又は追加的な生体医学情報の任意の項目）の性能をグラフで表現するのに有用である。一般に、集団全体（例えば、患者群及び対照群）にわたる前記特性データは単一特性値に基づいて昇順に整理される。その後、前記特性に対するそれぞれの値に対して、データに対する真陽性率（true positive rate）及び偽陽性率（false positiverate）が計算される。前記真陽性率は、その特性に対する値以上のケースの数字を計算した後、ケース全体の数で割ることによって測定される。前記偽陽性率は、その特性に対する値以上の対照群の数字を計算した後、総対照群の数で割ることによって測定される。たとえ、この定義は対照群に比べて患者群で特性が高くなるシナリオを意味していても、またこの定義は、その特性が対照群と比較して患者群で低いシナリオにも適用される（このシナリオで前記特性に対する値よりも低いサンプルの数を計算できる）。ＲＯＣ曲線はその他の別の単一算出だけでなく、単一特性に対して生成されることができ、単一合計値（single sum value）を提供するために、例えば２つ又はそれ以上の特性を（例えば、足す、引く、掛けるなど）数学的に組み合わせることができ、この単一合計値はＲＯＣ曲線で示すことができる。付加的に、単一算出値が導出される多重特性の組み合わせをＲＯＣ曲線で示すことができる。これらの特性組み合わせは、テストを構成することができる。前記ＲＯＣ曲線は、テストの偽陽性率（１-特異度）に対するテストの真陽性率（感度）を示すグラフである。
【００５９】
本願で用いられたバイオマーカー値に対する「検出（detecting）」又は「測定（determining）」は、バイオマーカー値に対応する信号を発見して記録するのに必要な器具及びその信号を生成するのに必要な（各）物質の使用を何れも含む。多様な実施形態において、前記バイオマーカー値は、蛍光（fluorescence）、化学発光（chemiluminescence）、表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance）、表面弾性波（surfaceacoustic waves）、質量分析法（mass spectrometry）、赤外分光法（infrared spectroscopy）、ラマン分光法（ramanspectroscopy）、原子間力顕微鏡（atomic force microscopy）、走査型トンネル顕微鏡（scanning tunneling microscopy）、電気化学検出法（electrochemicaldetection methods）、核磁気共鳴（nuclear magnetic resonance）、量子ドット（quantum dots）などを含む方法のうち任意の適切な方法を用いて検出される。
【００６０】
本願において「固体支持体（solid support）」は、分子が共有結合又は非共有結合のうち１つを通じて直接又は間接的に付着され得る表面を持つ任意の基質をいう。「固体支持体」は、例えば、膜（membrane）、チップ（chip）（例えば、タンパク質チップ）、スライド（slide）（例えば、ガラススライド又はカバースリップ）、カラム、中空形状、固体、半固体、例えばビーズ（bead）のような細孔（pore）又は空洞（cavity）を持つ粒子、ゲル、光フィーバ物質を含む繊維、マトリックス及びサンプル容器（receptacle）を包含できる多様な物理的形態を有することができる。サンプル容器の例としては、サンプルウェル、チューブ、毛細管、バイアル及びサンプルを固定できる任意の他の管、溝、又は屈曲が含まれる。サンプル容器は、マイクロタイタープレート（microtiter plate）、スライド、微少流体装置などのような多重-サンプルプラットフォーム上に位置し得る。支持体は、天然又は合成物質、有機又は無機物質からなることができる。一般に、試薬を捕獲する固体支持体の組成は付着方法（例えば、共有結合（covalent attachment））に依存する。前記容器の他の例としては、内部で検定及び関連操作が発生し得る微細液滴（microdroplet）及び微少流体（microfluid）が調節されるか、バルク状のオイル／水性油剤が含まれる。適切な固体支持体は、例えば、プラスチック、レジン、多糖類、シリカ又はシリカ基盤物質、機能性ガラス、改質シリコン、炭素、金属、無機ガラス、膜、ナイロン、（例えば、シルク、ウール及びコットンのような）天然繊維、ポリマーなどを含む。前記物質は例えば、捕捉試薬を付着するために用いるカルボキシ（carboxy）、アミノ（amino）又はヒドロキシル（hydroxyl）基のような反応性基を含むことができる固体支持体で構成される。高分子性固体支持体は、例えば、ポリスチレン（polystyrene）、ポリエチレングリコールテトラフタルレート（polyethyleneglycol tetraphthalate）、ポリビニルアセテート（polyvinyl acetate）、ポリビニルクロリド（polyvinyl chloride）、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidone）、ポリアクリロニトリル（polyacrylonitrile）、ポリメチルメタクリレート（polymethyl methacrylate）、ポリテトラフルオロエチレン（polytetrafluoroethylene）、ブチルゴム（butyl rubber）、スチレンブタジエンゴム（styrenebutadienerubber）、天然ゴム（natural rubber）、ポリエチレン（polyethylene）、ポリプロピレン（polypropylene）、（ポリ）テトラフルオロエチレン（（poly）tetrafluoroethylene）、（ポリ）ビニリデンフルオリド（（poly）vinylidenefluoride）、ポリカーボネート（polycarbonate）及びポリメチルペンテン（polymethylpentene）を含むことができる。使用可能な適切な固体支持体粒子は例えば、Luminex（登録商標）-タイプの符号化された粒子（Luminex-type encoded particles）、磁性粒子（magneticparticles）及びガラス粒子（glass particles）のような符号化された粒子（encoded particles）を含む。
（バイオマーカーの例示的用途）
【００６１】
多様な例示的な実施形態において、本願で記述する分析方法のうち１つを含む任意の数の分析方法により、血清や血漿のように、個人の循環系に存在する１つ或いはそれ以上のバイオマーカーに該当する１つ或いはそれ以上のバイオマーカー値を検出してヒト（個人）の非小細胞肺癌を診断するための方法を提供する。これらのバイオマーカーは、例えば、非小細胞肺癌を持っていない人に比べて非小細胞肺癌を持っているヒトにおいて差別的に発現する。個人におけるバイオマーカーの差別的発現の発見は、例えば、非小細胞肺癌の早期診断、良性肺結節と悪性肺結節間の区分（例えば、ＣＴ画像で観察される結節）、非小細胞肺癌の再発の観察、又はその他に臨床的徴候の観察のために用いられることができる。
【００６２】
本願に記載されたバイオマーカーは、多様な臨床的非小細胞肺癌の徴候に用いられることができ、（高危険の個人や集団における）非小細胞肺癌の発見と、例えば、非小細胞肺癌と小細胞肺癌の区別及び／又は腺癌と扁平上皮癌間の区別を通じて（又は組織病理を容易にして）、非小細胞肺癌の特性規定（例えば、非小細胞肺癌の類型、下位類型、又は病期決定）と、肺結節が良性結節か、悪性肺癌かを決定と、非小細胞肺癌の予後の決定と、非小細胞肺癌の進行又は快方の観察と、非小細胞肺癌の再発の観察と、転移の観察と、治療法の選定と、治療剤や他の治療法に対する反応の観察と、ＣＴ検診のための患者分類（例えば、非小細胞肺癌の危険度が高いため、螺旋形ＣＴ検診が最も大きく役立つ患者らを識別してＣＴの陽性予測度を増加させる）と、喫煙履歴などと結節の大きさの結合のように、バイオマーカーテストと追加的な生体医学情報の結合（例えば、ＣＴテストやバイオマーカーテストを単独で行う場合に比べて、診断性能が向上した分析試験の提供）と、肺結節の悪性或いは良性への診断を容易にすることと、一応、ＣＴにより肺結節が観察されると、臨床的意思の決定を容易にする（例えば、結節の大きさと関係なく、バイオマーカーによるテストが陰性である場合のように、結節の危険度が低いと判断されると、ＣＴ検診を繰り返すようにオーダーしたり、結節の大きさと関係なく、バイオマーカーによるテストが陽性である場合のように、結節の危険度が高いと判断されると、生検を考慮すること）と、（例えば、ＣＴ上で非石灰化結節が観察された後、ＣＴ検診、結節の切除、又は開胸術を繰り返し実施するかどうかのように）臨床的なフォローアップに対する意思決定を容易にすることと、を含む。バイオマーカーテストは、高危険の個人に対するＣＴ又は胸部Ｘ線のみ実施する場合よりも陽性予測度を改善できる。本願で説明するバイオマーカーは、ＣＴ検診と共に用いられる場合に有用性を有するだけでなく、胸部Ｘ線、気管支内視鏡、蛍光気管支内視鏡、ＭＲＩ又はＰＥＴ検診のように、その他に非小細胞肺癌のために利用される画像方式と連係して用いられることができる。また、非小細胞肺癌の徴候を画像方式やその他の別の臨床的関連要因により発見する前、又は症状が現れる前に、このような用途のうち特定用途のために前記説明したバイオマーカーが有用に使用され得る。ここではＣＴ検診や他の画像方式により観察された非決定性肺結節を持つ個人を区別し、非小細胞肺癌に対する高危険喫煙者の識別及び非小細胞肺癌にかかった個人の診断を更に含む。
【００６３】
非小細胞肺癌の診断に本願で説明したバイオマーカーを使用できる方式の一例として、非小細胞肺癌があることを認知していない個人において前述したバイオマーカーの１つ或いはそれ以上の差別的発現は、その個人が非小細胞肺癌を持っていることを示すことができ、これにより、治療が最も効果的な初期に、恐らく他の手段により非小細胞肺癌を発見するか、非小細胞肺癌の症状が現れる前に非小細胞肺癌を発見できる。非小細胞肺癌の進行中、１つ或いはそれ以上のバイオマーカーの過剰発現は、非小細胞肺癌が進行中であること、例えば非小細胞肺癌の腫瘍の成長及び／又は転移（従って、予後がよくない）を示すことができ、他方では１つ或いはそれ以上のバイオマーカーの差別的な発現程度の減少は（即ち、後続バイオマーカーテストにおいて患者個人が「正常」発現レベルに向かっているか、近接する場合は）、非小細胞肺癌に対する快方があること、例えば非小細胞肺癌の腫瘍の大きさが減っていること（従って、予後が良いか、更に良くなる）を示すことができる。同様に、非小細胞肺癌治療過程において、１つ或いはそれ以上のバイオマーカーの差別的な発現程度の増加（即ち、後続バイオマーカーテストにおいて患者個人が「正常」発現レベルから遠ざかる場合）は、非小細胞肺癌が進行して治療が効果的でないことを示すことができ、反面、非小細胞肺癌治療過程において、１つ或いはそれ以上のバイオマーカーの差別的な発現程度の減少は、非小細胞肺癌に対する快方があり、治療の成功率が高いことを示すことができる。また、非小細胞肺癌を明確に治療した後、個人において１つ或いはそれ以上のバイオマーカーの差別的な発現程度が増加又は減少することは、非小細胞肺癌の再発を示すことができる。このような状況で、前記個人は非小細胞肺癌の再発がより遅くまで発見されない場合に比べて、より早い病期に治療を再開できる（又は患者が治療を続けている場合、薬の容量及び／又は頻度を増加させるなど、治療法を修正できる）。更に、個人によって異なって現れる１つ或いはそれ以上のバイオマーカーの発現レベルを通じて、特定治療剤に対する前記個人の反応を予見できる。非小細胞肺癌の再発や進行を観察するにおいて、バイオマーカーの発現レベルの変化は、例えば非小細胞肺癌の活性度の決定又は治療法の変化必要性の決定のために、画像検診（例えば、ＣＴ検診）の繰り返しが必要であることを示すことができる。
【００６４】
本願で記述するバイオマーカーの検出は、治療法の成功評価や治療後の非小細胞肺癌の消滅、再発及び／又は進行（転移を含む）を観察のように、非小細胞肺癌治療後又は非小細胞肺癌治療過程と連係して、特に更に有用である。非小細胞肺癌治療法は、例えば、個人に治療剤の処方、手術（例えば、少なくとも非小細胞肺癌の腫瘍の一部を外科的に切開するか、非小細胞肺癌と周辺組織を切除すること）、放射線治療、又はこの分野で用いられる他の種類の非小細胞肺癌治療法、そしてこれらの治療法の組み合わせを含む。肺癌の治療法には、例えば、患者個人に治療剤の処方、手術（例えば、肺腫瘍の少なくとも一部を外科的に切開）、放射線治療、又はこの分野で用いられる他の種類の非小細胞肺癌治療法、そしてこれらの治療法の組み合わせが含まれる。例えば、ｓｉＲＮＡ分子は、遺伝子の発現を防ぐ合成２本鎖のＲＮＡ分子であり、肺癌標的治療法として使用され得る。例えば、前記バイオマーカーのうち任意のバイオマーカーは治療後に少なくとも一度検出され得るか、治療後に複数回（例えば、周期的に）検出され得るか、治療前と治療後の両方で検出され得る。個人における前記バイオマーカーのうち任意のバイオマーカーの時間に伴う発現レベルの変化は、治療後の非小細胞肺癌の進行、快方又は再発の徴候であり得る。前記非小細胞肺癌の進行、快方又は再発の例には、バイオマーカーの発現レベルが治療前に比べて治療後に増加又は減少;バイオマーカーの発現レベルが治療後の早い時点に比べて治療後のより遅い時点に増加又は減少;及びバイオマーカーの発現レベルが治療後のある一時点で正常レベルと異なる場合が含まれる。
【００６５】
具体的な例として、本願に記述されたバイオマーカーのうち任意のバイオマーカーに対するバイオマーカーレベルは、手術前と手術後（例えば、手術後２〜１６週経過）血清や血漿サンプルで測定できる。手術前のサンプルに比べて手術後のサンプルでバイオマーカー発現レベルが増加すると、これは非小細胞肺癌の進行（例えば、手術の失敗）の徴候であり得、手術前のサンプルに比べて手術後のサンプルでバイオマーカー発現レベルが減少すると、これは非小細胞肺癌の快方（例えば、手術により肺腫瘍の除去が成功）の徴候であり得る。放射線治療、治療剤の投与、又は癌予防ワクチンの投与前後のように、その他の別の治療法の実施前後も、バイオマーカーレベルを類似する方式で分析することができる。
【００６６】
バイオマーカーレベルのテストを単一診断テストで行うこと以外に、疾病に対する危険度の増加を示すＳＮＰ又は他の遺伝的病変や変動性の測定と関連してバイオマーカーレベルをテストできる（例えば、Amos et al.，Nature Genetics 40,616-622(2009)参照）。
【００６７】
バイオマーカーレベルのテストを単一診断テストで行うこと以外に、ＣＴ検診のような放射線検診と共にバイオマーカーレベルテストを実施できる。例えば、非小細胞肺癌に対して危険性のある無症状集団（例えば、喫煙者）の検診のように、ＣＴ検診に対する医療的、経済的妥当性を提供できる。例えば、「ＣＴ-前」バイオマーカーレベルテストは、バイオマーカーレベルに基づいて非小細胞肺癌に対して危険度が高いため、ＣＴ検診を優先的に実施すべき者らの識別のように、高危険の個人をＣＴ検診が要求される者に分類するのに利用され得る。ＣＴテストを行う場合、（例えば、血清や血漿サンプルに対するアプタマー分析により）１つ或いはそれ以上のバイオマーカーのバイオマーカーレベルを測定でき、ＣＴやバイオマーカーテストを単独で実施する場合よりも陽性予測度を改善するために、診断スコアを追加的な生体医学情報（例えば、ＣＴテストにより決定された腫瘍媒介変数）と連係して評価できる。バイオマーカーレベルを測定するための「ＣＴ-後」アプタマーパネルは、ＣＴ（又は他の画像方式）で観察される肺結節が陽性であるか、陰性である可能性を決定するのに用いられることができる。
【００６８】
本願で記述されたバイオマーカーうち任意のバイオマーカーの検出は、ＣＴ-後テストに有用であり得る。例えば、バイオマーカーテストはＣＴを単独で実施する場合に比べて相当数の偽陽性テストを除去したり、減少させることができる。また、バイオマーカーテストを通じて患者を容易に治療できる。例えば、肺結節の大きさが５ｍｍよりも小さければ、バイオマーカーテストの結果により早期に患者を「経過観察（watch and wait）」状態で組織検査を行う段階に進むことができる。仮に、肺結節が５〜９ｍｍであれば、バイオマーカーテストを通じて、偽陽性検診による組織検査や胸部切開を施さないことができる。そして、肺結節が１０ｍｍよりも大きければ、バイオマーカーテストを通じて、良性結節を持つ患者個体群に手術を行わないことができる。結節組織検査と関連する重要な病的状態が存在し、結節の位置によって結節組織を獲得するのに困難があるため、バイオマーカーテストに基づいてある患者では組織検査を行う必要性を除去することが有利であり得る。同様に、実際に結節が良性の場合のように、ある患者は手術する必要がなくなることによって、手術と関連する不要な危険とコストを回避できる。
【００６９】
高危険群で放射線検診と連係してバイオマーカーレベルをテストすること（画像検診で観察される肺結節や腫瘍の大きさ、又はその他の特性と関連してバイオマーカーレベルを分析すること）以外に、バイオマーカーに関する情報は他の類型のデータ、特に非小細胞肺癌に対する個人の危険度を示すデータ（例えば、患者の臨床的履歴、職業上の曝露履歴、症状、癌に対する家族歴、喫煙の有無のような危険因子、及び／又は他のバイオマーカーの状態など）と連係して評価できる。これらの多様なデータは、コンピュータやその他の装置で実行され得るコンピュータプログラム／ソフトウェアのように、自動化された方法により分析され得る。
【００７０】
記載されたバイオマーカーは、画像テストにも使用され得る。例えば、その他の用途のうち、非小細胞肺癌の診断、進行／快方又は転移の観察、再発の観察、又は治療法に対する反応の観察のために、造影剤（imaging agent）をバイオマーカーと結合し、非小細胞肺癌の診断の補助役割を果たすことができる。（バイオマーカー及びバイオマーカー値の検出及び測定）
【００７１】
本願で記述されたバイオマーカーに対するバイオマーカー値は、公知の多様な分析方法を用いて検出できる。一実施形態において、バイオマーカー値は捕捉試薬を用いて検出する。本願で用いられる「捕捉剤（capture agent）」又は「捕捉試薬（capture reagent）」は、バイオマーカーに特異的に結合できる分子をいう。多様な実施形態において、前記捕捉試薬は溶液でバイオマーカーに曝露されるか、固体支持体上で固定されてバイオマーカーに曝露され得る。他の実施形態において、前記捕捉試薬は固体支持体上の２次特性と反応する特性を含む。これらの実施形態において、前記捕捉試薬は溶液でバイオマーカーに曝露され、その後、固体支持体上でバイオマーカーを固定するために、捕捉試薬の特性を固体支持体上の特性と共に用いることができる。捕捉試薬は、実施される分析法の類型によって選定される。捕捉試薬は、アプタマー、抗体、抗原、アドネクチン（adnectins）、アンキリン（ankyrins）、その他の抗体類似体などとタンパク質スキャフォールド、自己抗体、キメラ、小分子、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント、単鎖抗体フラグメント、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ（affybody）、ナノボディ、刷込高分子、アヴィメール（avimer）、ペプチド模倣体、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、合成受容体及びこれらの変形体とフラグメントを含むが、これらに限定されない。
【００７２】
一実施形態において、バイオマーカー値は、バイオマーカー／捕捉試薬複合体を用いて検出する。
【００７３】
他の実施形態において、前記バイオマーカー値はバイオマーカー／捕捉試薬複合体から導出され、例えばバイオマーカー／捕捉試薬の相互作用による反応の結果により検出される場合のように、間接的に検出されるが、バイオマーカー値はバイオマーカー／捕捉試薬複合体の形成に依存する。
【００７４】
一実施形態において、前記バイオマーカー値は、生物学的なサンプルのバイオマーカーから直接的に検出される。
【００７５】
一実施形態において、バイオマーカーは、生物学的なサンプルから２つ或いはそれ以上のバイオマーカーの同時検出を許容する多重化フォーマットを用いて検出される。前記多重化フォーマットの一実施形態において、捕捉試薬は固体支持体上の離散位置で直接又は間接的に、共有結合又は非共有結合により固定される。他の実施形態において、多重化フォーマットは互いに異なる固体支持体を用い、それぞれの固体支持体は、例えば量子ドットのように、前記固体支持体と関連する固有な捕捉試薬を有する。他の実施形態において、生物学的なサンプルから検出される多重バイオマーカーのそれぞれの検出のために個別の装置が用いられる。個別装置は、生物学的なサンプルの各バイオマーカーが同時に処理可能に構成される。例えば、マイクロタイタープレートを用いて前記プレートの各ウェル（well）を生物学的なサンプルから検出される多重バイオマーカーのうち１つを固有分析するのに利用できる。
【００７６】
前記実施形態のうち１つ或いはそれ以上において、バイオマーカー値の検出が可能なようにバイオマーカー／捕獲複合体の成分を標識するために蛍光タグを用いることができる。多様な実施形態において、前記蛍光タグを公知の技術を用いて本願に記述されたバイオマーカーのうち任意のバイオマーカーに固有な捕捉試薬に結合でき、その後、前記蛍光タグを該当バイオマーカー値を検出するために用いることができる。適切な蛍光標識には希土類キレート、フルオレセインとこれの派生物、ローダミンとこれの派生物、ダンシル、アロフィコシアニン、ＰＢＸＬ-３、Ｑｄｏｔ ６０５、リサミン、フィコエリスリン、テキサスレッド及びその他にこのような化合物を含む。
【００７７】
一実施形態において、前記蛍光標識は蛍光染料分子（fluorescent dye molecule）である。一実施形態において、前記蛍光染料分子は、インドリウム環の３-炭素状の置換基が化学的反応基（chemically reactive group）又は複合物質（conjugated substance）を含む少なくとも１つの置換されたインドリウム環システム（indolium ring system）を含む。一実施形態において、前記染料分子は例えば、アレクサフルオル４８８（AlexaFluor（登録商標）４８８）、アレクサフルオル５３２（AlexaFluor ５３２）、アレクサフルオル６４７（AlexaFluor ６４７）、アレクサフルオル６８０（AlexaFluor ６８０）又はアレクサフルオル７００（AlexaFluor ７００）のようなアレクサフルオル分子を含む。他の実施形態において、前記染料分子は例えば、２つの異なるアレクサフルオル分子のような第１型及び第２型の染料分子を含む。他の実施形態において、前記染料分子は第１型及び第２型の染料分子を含み、２つの染料分子は互いに異なる放出スペクトラムを有する。
【００７８】
蛍光発光は、広範な検定フォーマットに適した多様な手段を用いて測定され得る。例えば、分光光度計はマイクロタイタープレート、顕微鏡スライド、プリントされたアレイ、キュベットなどを分析するように設計される（Principles of Fluorescence Spectroscopy by J.R. Lakowicz, SpringerScience+Business Media, Inc.,２００４.Bioluminescence&Chemiluminescence:Progress&CurrentApplications;Philip E. Stanley and Larry J. Kricka editors, World ScientificPublishing Company, January ２００２を参照）。
【００７９】
１つ又はそれ以上の前記実施形態において、化学発光タグはバイオマーカー値を検出することができるように、バイオマーカー／捕獲複合体の成分を示す上で選択的に用いられることができる。適切な化学発光物質は、塩化オキサリル（oxalyl chloride）、ローダミン６Ｇ、Ｒｕ(ｂｉｐｙ)３２、ＴＭＡＥ（tetrakis（dimethylamino）ethylene）、ピロガロール（１,２,３-トリヒドロキシベンゼン）（Pyrogallol（1,2,3-trihydroxibenzene））、ルシゲニン（Lucigenin）、ペルオキシオキサラート（peroxyosalates）、アリールオキサラート（Aryl oxalates）、アクリジニウムエステル（Acridinium esters）、ジオキセタン（dioxetanes）及びその他の化学発光物質を含む。
【００８０】
他の実施形態において、前記検出方法は、バイオマーカー値に対応する検出可能なシグナルを発生する酵素／基質化合物を含む。一般に、前記酵素は、分光光度法（spectrophotometry）、蛍光発光（fluorescence）及び化学発光（chemiluminescence）を含む多様な技術を用いて測定され得る発色性基質の化学的変化を促す。適切な酵素は、例えば、ルシフェラーゼ（luciferases）、ルシフェリン（luciferin）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（malate dehydrogenase；MDH）、ウレアーゼ（urease）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase;HRPO）、アルカリホスファターゼ（alkaline phosphatase）、ベータガラクトシダーゼ（betagalactosidase）、グルコアミラーゼ（glucoamylase）、リゾチーム（lysozyme）、グルコースオキシダーゼ（glucose oxidase）、ガラクトースオキシダーゼ（galactoseoxidase）及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ（glucose-６-phosphate dehydrogenase）、ウリカーゼ（uricase）、キサンチンオキシダーゼ（xanthine oxidase）、ラクトペルオキシダーゼ（lactoperoxidase）、マイクロペルオキシダーゼ（microperoxidase）などを含む。
【００８１】
他の実施形態において、前記検出方法は、測定可能なシグナルを発生する蛍光発光、化学発光、放射性核種（radionuclide）又は酵素／基質化合物の組み合わせであり得る。多重モードシグナリングは、バイオマーカー検定フォーマットにおいて固有の長所を有することができる。
【００８２】
より詳細に、本願に記載されたバイオマーカーに対するバイオマーカー値は、以下に説明するようなシングルフレックスアプタマー検定法（singleplex aptamer assays）、多重化アプタマー検定法（multiplexedaptamer assays）、シングルフレックス又は多重化免疫検定法（immunoassays）、ｍＲＮＡ発現プロフィーリング（mRNA expression profiling）、ｍｉＲＮＡ発現プロフィーリング（miRNAexpression profiling）、質量分光分析法（mass spectrometricanalysis）、組織的（histological）／細胞学的（cytological）方法などを含む公知の分析方法を用いて検出され得る。
（アプタマー基盤の検定法を用いてバイオマーカー値を決定）
【００８３】
生物学的サンプル及びその他のサンプルにおいて、生理学的に重要な分子の検出及び定量のための検定法は、科学的研究及び保健分野で重要な手段である。このような検定法の１つは、固体支持体上に固定された１つ又はそれ以上のアプタマーを含むマイクロアレイの使用を含む。前記アプタマーのそれぞれは、非常に特異な方式及び非常に高い親和力で標的分子に結合することができる（「Nucleic Acid Ligand」という題名のU.S. Patent No. 5,475,096及び「Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip」という題名のU.S. Patent No. 6,242,246,U.S. Patent No. 6,458,543及びU.S. Patent No. 6,503,715を参照）。一応、マイクロアレイがサンプルと接触すれば、アプタマーはサンプルに存在する標的分子にそれぞれ結合し、バイオマーカーに対応するバイオマーカー値の測定を可能にする。
【００８４】
本願で用いられた「アプタマー（aptamer）」とは、標的分子に対する特定結合親和力を有する核酸のことをいう。親和相互作用（affinity interaction）は程度（degree）の問題であるが、同状況において、標的に対するアプタマーの「特定結合親和力（specific binding affinity）」は、前記アプタマーが試料において他の成分に結合するよりも一般に、より高い程度の親和力によりその標的に結合することを意味するということが分かる。「アプタマー」とは、特定ヌクレオチド配列を有する一形態又は一種の核酸分子の複製セットのことをいう。アプタマーは、任意の個数の化学的に変形されたヌクレオチドを含み、適正個数のヌクレオチドを含むことができる。「アプタマー」とは、１つ以上のそのような分子セットのことをいう。互いに異なるアプタマーは、同一又は相異する個数のヌクレオチドを有することができる。アプタマーは、ＤＮＡ又はＲＮＡ又は化学的に変更された核酸であることができ、一本鎖、二本鎖又は二本鎖領域を含むことができ、非常に秩序整然とした構造を含むことができる。アプタマーは、光アプタマーであることもでき、この場合、光反応性又は化学的反応性機能基が対応する標的に共有して結合され得るようにアプタマーに含まれている。本願に記載された任意のアプタマー方法は、同一の標的分子と特異に結合する２つ又はそれ以上のアプタマーの使用を含むことができる。以下に更に記載されているように、アプタマーは、タグを含むことができる。もし、アプタマーがタグを含むのであれば、全てのアプタマーの複製は、同一のタグを有する必要がない。更に、もし互いに異なるアプタマーがそれぞれタグを含むのであれば、この互いに異なるアプタマーは互いに同一のタグ又は相異するタグを有することができる。
【００８５】
アプタマーは、ＳＥＬＥＸ工程を含む任意の公知の方法を用いて識別され得る。一応、識別されると、アプタマーは化学合成方法及び酵素合成方法を含む任意の公知の方法によって製造されるか、又は合成され得る。
【００８６】
本願で用いられた「ＳＯＭＡｍｅｒ（登録商標）」又は遅いオフレートの変更されたアプタマー（Slow Off-Rate Modified Aptamer）は、向上したオフレート特性を有するアプタマーのことをいう。ＳＯＭＡｍｅｒは「向上したオフレートを有するアプタマーを生成するための方法（Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates）」という題名の米国公開特許番号第2009/0004667号に記載の向上したＳＥＬＥＸ方法を用いて製作することができる。
【００８７】
前記用語の「ＳＥＬＥＸ」及び「ＳＥＬＥＸ工程（SELEX process）」は、（１）好適な方式、例えば、タンパク質に高い親和力で結合する方式として、標的分子と相互作用するアプタマーの選別と（２）その選択された核酸の増幅の組み合わせを通称するために、本願において混用される。前記ＳＥＬＥＸ工程は、特定標的又はバイオマーカーに対して高い親和力を有するアプタマーを識別するために用いられることができる。
【００８８】
ＳＥＬＥＸは、一般に、核酸の候補物質混合物を製造する段階、親和複合体（affinity complex）を形成するために、所望の標的分子に候補物質混合物を結合させる段階、結合されていない候補物質核酸から親和複合体を分離する段階、親和複合体から核酸を分離及び単離する段階、核酸を精製する段階、特定アプタマー配列を増幅する段階を含む。選別されたアプタマーの親和力を更に改善させるために、前記工程を複数回実施することができる。前記工程は１つ又はそれ以上の工程ポイントにおいて増幅段階を含むことができる（例えば、「Nucleic Acid ligands」という題名のU.S. Patent No.5,475,096を参照）。前記ＳＥＬＥＸ工程は、標的に共有して結合するアプタマーだけでなく、標的に共有せずに結合するアプタマーを生成するために使用され得る（例えば、「Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by ExponentialEnrichment:Chemi-SELEX」という題名のU.S. Patent No. 5,705,337を参照）。
【００８９】
前記ＳＥＬＥＸ工程は、例えば、生体内（in vivo）の安定性を向上させたり、又は運搬特性を向上させるために、アプタマーに向上した特性を付与する、変更されたヌクレオチドを含む高い親和性アプタマーを識別するために使用され得る。このような変更例は、リボース（ribose）及び／又はフォスフェイト（phosphate）及び／又は塩基位置における化学的置換を含む。ＳＥＬＥＸ工程で識別されたアプタマーは、ピリジンの５’-及び２’-の位置で化学的に変更されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドについて記述している米国特許第5,660,985号（「High Affinity Nucleic AcidLigands Containing Modified Nucleotides」）に記載されている。前記を参考とし、米国特許第5,580,737号は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）及び／又は２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で変更された１つ又はそれ以上のヌクレオチドを含む高特異性アプタマーについて記述している。また、ＳＥＬＥＸ及び光ＳＥＬＥＸから拡張した物理及び化学的特性を有する核酸ライブラリー及びそれらの用途を記述している米国特許公開番号第2009/0098549号（「SELEX及びPHOTOSELEX」）を参考にすることができる。
【００９０】
また、ＳＥＬＥＸは、好ましいオフレート特性を有するアプタマーを識別するために用いられることができる。標的分子に結合できるアプタマーを生成するための、向上したＳＥＬＥＸ方法を記述している米国特許出願公開番号第2009/0004667号（「Method for GeneratingAptamers with Improved Off-Rates」）を参考にすることができる。各標的分子からより遅い解離速度を有するアプタマー及び光アプタマーを生成するための方法が記載されている。前記方法は、標的分子と候補物質混合物を接触させる段階と、核酸-標的複合体を形成する段階と、遅いオフレート増幅工程を行う段階とを含み、ここで速い解離速度を有する核酸-標的複合体は解離され、再生成されないが、遅い解離速度を有する複合体は正常に維持される。付加的に、前記方法は、向上したオフレート性能を有するアプタマーを生成するために、候補物質核酸混合物の生成時に変更されたヌクレオチドの使用を含む。
【００９１】
この検定法を変形し、アプタマーが標的分子に共有結合又は「光架橋（photocrosslink）」結合を行うことができるようにする光反応性作用基を含むアプタマーを用いる（例えば、U.S. Patent No. 6,544,776,「Nucleic AcidLigand Diagnostic Biochip」を参考）。この光反応性アプタマーは、光アプタマーとも呼ばれる（例えば、それぞれ「Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by ExponentialEnrichment:PHotoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX」という題名のU.S. Patent NO. 5,763,177,U.S. Patent No. 6,001,577及びU.S. Patent No. 6.291,184;「Photoselection ofNucleic Acid Ligands」という題名のU.S. Patent No. 6,458,539を参照）。前記マイクロアレイがサンプルと接触した後、光アプタマーには標的分子に結合できる機会が与えられ、前記光アプタマーは光活性化し、固体支持体は非特異結合した分子を除去するために洗浄される。光アプタマー上の光活性化した作用基により生成された共有結合のために光アプタマーに結合されている標的分子は、一般に除去されないので、厳格な洗浄条件が使用され得る。この方法において、前記検定法は試料からバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出可能にする。
【００９２】
このような全ての検定フォーマットにおいて、前記アプタマーは、サンプルと接触する前に固体支持体上に固定される。しかし、特定環境においては、サンプルと接触する前にアプタマーが固定されると、最適の検定が行われない恐れもある。例えば、アプタマーを固定化する前（pre-immobilization）は、恐らく長い反応時間による固体支持体表面上の標的分子とアプタマーの非効率的な混合を引き起こす恐れがあるので、標的分子にアプタマーが効率的に結合するように培養期間を長くする必要がある。その上、光アプタマーが検定法に用いられ、固体支持体として用いられた物質に依存する場合、前記固体支持体は、光アプタマーと標的分子との共有結合のために用いられる光を散乱させたり、又は吸収する傾向があり得る。更に、使用方法によって、固体支持体の表面は標識試薬に曝露され影響を受けられるため、アプタマーに結合した標的分子の検出精度が低下する恐れがある。最後に、一般に、固体支持体上のアプタマーの固定化は、サンプルにアプタマーを曝露する前にアプタマーを製造する段階（即ち、固定化）を含み、この製造段階はアプタマーの活性度や機能性に影響を及ぼし得る。
【００９３】
アプタマーが、溶液において標的を捕獲できるようにした後、検出前にアプタマー−標的混合物の特定成分を除去するように考案された分離段階を用いるアプタマー検定法も記述されている（「Multiplexed Analyses of Test Samples」という題名のU.S.Patent Application Publication 2009/0042206を参照）。前記アプタマー検定方法は、核酸（即ち、アプタマー）の検出及び定量化により、サンプルにおいて非核酸標的（例えば、タンパク質標的）の検出及び定量化を可能にする。前記方法は、非核酸標的を検出して定量化するための核酸サロゲート（surrogate）（即ち、アプタマー）を生成し、増幅段階を含む多様な核酸技術がタンパク質標的を含む、好ましい広範囲な標的に適用され得るようにする。
【００９４】
アプタマーは、アプタマーバイオマーカー複合体（又は光アプタマーバイオマーカー共有結合複合体）から検定成分の分離を容易にし、検出及び／又は定量化のためのアプタマーの単離が可能に構成され得る。一実施形態において、この構造体はアプタマーの配列内に切断可能か、又は放出可能な要素を含むことができる。他の実施形態において、付加的な機能、例えば、標識されたり、又は検出可能な成分、スペーサ成分又は特定の結合タグ又は固定化要素をアプタマーに導入することができる。例えば、前記アプタマーは、切断可能な部分（moiety）、標識、標識を分離するスペーサ成分及び放出可能な部分を介してアプタマーに連結されたタグを含むことができる。一実施形態において、切断可能な構成要素は、光切断可能なリンカーである。前記光切断可能なリンカーは、ビオチン部分（biotin moiety）及びスペーサ部分に付着することができるほか、アミンの誘導体化のためのＮＨＳ基を含むことができ、アプタマーにビオチン基を導入する上で用いられることによって、その後検定方法によってアプタマーの放出が可能になる。
【００９５】
溶液において、あらゆる検定成分を処理する均質検定法（homogenous assays）は、シグナルの検出前にサンプル及び試薬の分離を要しない。この方法は速度が速く、かつ使用し易い。この方法は特定標的と反応する分子捕獲又は結合試薬を基にシグナルを生成する。
【００９６】
一実施形態において、シグナルの生成方法はフルオロフォアで標識された（fluorophore-labeled）捕捉試薬と特定バイオマーカー標的の相互作用に起因する異方性シグナルの変化を利用する。前記標識された捕捉剤が標的と反応するとき、増加した分子量により複合体に付着されたフルオロフォアの回転運動が更に鈍くなる。異方性変化を観察することで、結合反応は溶液においてバイオマーカーの定量的な測定に用いることができる。その他の方法としては、蛍光偏光検定法（fluorescence polarization assay）、分子ビーコン法（molecularbeacon methods）、時分割蛍光消光法（time resolved fluorescenequenching）、化学発光（chemiluminescence）、蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer）などが含まれる。
【００９７】
生物学的サンプルにおいてバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出するために使用できる例示的な溶液基盤のアプタマー検定法は、（a）第１タグを含み、バイオマーカーに対して特異親和力を有するアプタマーと生物学的サンプルを接触することによって、混合物を製造する段階、ここでバイオマーカーがサンプルに存在する場合、アプタマー親和複合体が形成され、（b）第１捕獲構成要素を含む第１固体支持体に前記混合物を曝露させ、第１タグを前記第１固体支持体に結合させる段階、（c）前記第１固体支持体に結合されない混合物の任意の成分を除去する段階、（d）前記アプタマー親和複合体のバイオマーカー成分に第２タグを付着する段階、（e）前記第１固体支持体から前記アプタマー親和複合体を分離する段階、（f）前記分離されたアプタマー親和複合体を第２捕獲構成要素を含む第２固体支持体に曝露させ、第２タグを第２捕獲構成要素に結合させる段階、（g）前記アプタマー親和複合体から非錯体（non-complexed）アプタマーを分割することによって、混合物から任意の非錯体されたアプタマーを除去する段階、（h）前記固体支持体からアプタマーを溶出する段階、（i）前記アプタマー親和複合体のアプタマー成分を検出することによって、バイオマーカーを検出する段階を含む。
【００９８】
前記アプタマー親和複合体のアプタマー成分を検出し、バイオマーカー値を検出するために、当業界において公知の方法を用いることができる。親和複合体のアプタマー成分を検出するために、多数の互いに異なる検出方法、例えば混成化検定（hybridization assays）、質量分析（mass spectroscopy）又はＱＰＣＲのような検出方法が使用され得る。一実施形態において、核酸塩基配列分析方法を、アプタマー親和複合体のアプタマー成分を検出し、バイオマーカー値の検出に用いることができる。簡単に言えば、試料は試料に存在する１つ又はそれ以上のアプタマーの配列を確認して定量するために、任意の種類の核酸塩基配列分析方法の対象になり得る。一実施形態において、前記配列はアプタマー分子全体又は前記分子を固有識別するために使用され得る分子の部分を含む。他の実施形態において、識別性塩基配列は、アプタマーに添加された特異的配列であり、このような配列は「タグ（tags）」、「バーコード（barcodes）」又は「ジップコード（zipcodes）」とも呼ばれる。一実施形態において、前記塩基配列分析方法は、アプタマー配列を増幅するか、又は化学的に変形されたＲＮＡ及びＤＮＡを含む核酸を塩基配列分析に適切な他の種類の核酸へ変換させるための酵素的段階を含む。
【００９９】
一実施形態において、前記塩基配列分析方法は、１つ又はそれ以上の複製段階を含む。他の実施形態において、前記塩基配列分析方法は、複製段階のない直接塩基配列分析方法を含む。
【０１００】
一実施形態において、前記塩基配列分析方法は、試料において１つ又はそれ以上のアプタマーを標的とする特定プライマーを用いる直接接近法を含む。他の実施形態において、前記塩基配列分析方法は、試料に存在するあらゆるアプタマーを標的とする多項目同時接近法を含む。
【０１０１】
一実施形態において、前記塩基配列分析方法は、塩基配列分析のために標的化された分子を増幅するための酵素的段階を含む。他の実施形態において、前記塩基配列分析方法は、単一分子の配列を直接的に分析する。生物学的サンプルにおいてバイオマーカーに対応するバイオマーカー値の検出のために使用可能な例示的な核酸塩基配列の分析に基づく方法は、（a）酵素的段階を用いて化学的に変更されたヌクレオチドを含むアプタマーの混合物を変更されていない核酸へ転換する段階、（b）その結果、生成された変更されていない核酸を、例えば、４５４塩基配列分析システム（４５４ Sequencing System）（４５４ Life Sciences/roche）、イルミナ塩基配列分析システム（Illumina Sequencing System）（Illumina）、ＡＢＩＳＯＬｉＤ塩基配列分析システム（Applied Biosystems）、ヘリスコープ単一分子シーケンサー（HeliScope Single Molecule Sequencer）（HelicosBiosciences）、又はパシフィックバイオサイエンスリアルタイム単一分子塩基配列分析システム（PacificBiosciences Real Time Single Molecule Sequencing System）（Pacific BioSciences）又はポロネータージー塩基配列分析システム（PolonatorG Sequencing System）（Dover Systems）のような超並列的塩基配列分析プラットフォーム（massively parallel sequencing platform）を用いて同時に多項目の塩基配列を分析する段階、（c）特定配列と配列係数（sequence count）により混合物に存在するアプタマーを識別して定量化する段階を含む。
（免疫検定法を用いたバイオマーカー値の測定）
【０１０２】
免疫検定方法は、対応する標的又は分析物に対する抗体の反応に基づき、特定検定フォーマットに依存してサンプルから分析物を検出することができる。免疫-反応性に基づいて検定方法の特異度及び感度を向上させるために、単一クローン抗体が有する特異なエピトープを認識するために単一クローン抗体がよく使われる。多重クローン抗体は、単一クローン抗体に比べて標的に対して増加した親和力を有するため、多重クローン抗体も多様な免疫検定法においてよく用いられている。免疫検定法は、広範囲な生物学的サンプルマトリックスと共に使用するように設計された。免疫検定法のフォーマットは定性的、反定量的、更に定量的結果を提供するように設計された。
【０１０３】
定量的結果は公知の濃度を有する、検出される特定分析物を用いて生成された標準曲線により生成される。未知のサンプルから得られた反応又はシグナルを標準曲線をもって表し、未知のサンプルにおいて標的に対応する量又は値が確立する。  数多くの免疫検定フォーマットが設計されてきた。ＥＬＩＳＡ又はＥＩＡは分析物を定量的に検出することができる。この方法は、分析物又は抗体の何れかに対する標識の付着に依存し、前記標識成分は直接又は間接的に酵素を含む。ＥＬＩＳＡテストは分析物の直接、間接、競争的又はサンドウィッチ検出のためのフォーマットを備えることができる。他の方法は、例えば、放射性同位元素（radioisotope）（I１２５）又は蛍光発光のような標識に依存する。付加的な技術は、例えば、凝集（agglutination）、比濁法（nephelometry）、混濁法（turbidimetry）、ウェスタンブロッティング（Western blot）、免疫沈降法（immunoprecipitation）、免疫細胞化学法（immunocytochemistry）、免疫組織化学法（immunohistochemistry）、フローサイトメトリー（flowcytometry）、ルミネックス検定法（Luminex assay）及びその他のものを含む（ImmunoAssay:A Practical Guide, edited by Brain Law, published byTaylor＆Francis, Ltd., ２００５editionを参照）。
【０１０４】
例示的な検定フォーマットは、酵素-結合免疫吸着検定法（enzyme linked immunosorbentassay;ELISA）、放射性免疫検定法（radioimmunoassay）、蛍光（fluorescent）、化学発光（chemiluminescence）及び蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer;FRET）又は時分割蛍光共鳴エネルギー移動（time resolved-FRET;TR-FRET）の免疫検定法を含む。バイオマーカーの検出方法の例は、バイオマーカー免疫沈降法に加えてゲル電気泳動法（gel electrophoresis）、毛細管電気移動（capillaryelectrophoresis）、平面電気クロマトグラフィー（planarelectrochromatography）などのような、大きさ及びペプチドレベルの区別を可能にする定量的方法を含む。
【０１０５】
検出可能な標識又はシグナル発生物質を検出及び／又は定量化する方法は標識の特性に依存する。適切な酵素により触媒化された反応産物は（ここで検出可能な標識が酵素である場合、前記を参照）制限なしに蛍光性、発光性又は放射性であり得るか、それらは可視光線又は紫外線を吸収できる。このような検出可能な標識の検出に適した検出器の例は、制限なしにＸ線フィルム、放射能計測器、閃光計測器、分光光度計、比色計、蛍光計、発光計及び濃度測定計を含む。
【０１０６】
検出方法は製造、処理及び反応に対し、適切な分析が可能なフォーマットで行うことができる。これは、例えば、多重-ウェル検定プレート（例えば、９６ウェル又は３８４ウェル）や適切なアレイ又はマイクロアレイを用いることができる。多様な試薬のための保存溶液は手動で又は機械的に作ることができ、その後の全てのピペット操作、希釈、混合、分配、洗浄、培養、サンプルの判読、データの収集及び分析を常用分析ソフトウェア、ロボット工学及び検出可能な標識を検出できる検出機械を用いて機械的に完了することができる
（遺伝子発現プロフィーリングを用いたバイオマーカー値の測定）
【０１０７】
生物学的サンプルにおいてｍＲＮＡ測定は、前記生物学的サンプルで対応するタンパク質レベルの検出のためのサロゲートとして使用され得る。従って、本願に記載された任意のバイオマーカー又はバイオマーカーパネルもまた適切なＲＮＡ検出により検出され得る。
【０１０８】
ｍＲＮＡ発現レベルは、逆転写重合酵素連鎖反応（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction;RT-PCR）（ｑＰＣＲによるＲＴ−ＰＣＲ）により測定される。ＲＴ−ＰＣＲは、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを生成するのに用いられる。前記ｃＤＮＡはＤＮＡの増幅過程において、蛍光を生成するためにｑＰＣＲで使用され得る。標準曲線に比べ、ｑＰＣＲは細胞当たりｍＲＮＡ複製の数のような絶対測定値を生成することができる。毛細管電気移動と組み合わせられたノーザンブロッティング（Northern blots）、マイクロアレイ、インベーダー検定法（invader assay）及びＲＴ−ＰＣＲの何れもサンプルにおいてｍＲＮＡの発現レベルを測定する上で用いられている（Gene Expression Profiling:Method and Protocols, Richard A. Shimkets,editor, Humana Press, ２００４を参照）。
【０１０９】
ｍｉＲＮＡ分子は非暗号化されているが、遺伝子の発現をコントロールする小型ＲＮＡである。ｍＲＮＡ発現レベルの測定に適した方法も対応ｍｉＲＮＡに対して使用され得る。最近、多くの研究所で疾病に対するバイオマーカーとしてｍｉＲＮＡｓの使用について研究している。数多くの疾病が広範囲な転写調節（transcriptional regulation）を伴い、ｍｉＲＮＡがバイオマーカーとしての役割を果たすことは驚くべきことではない。ｍｉＲＮＡ濃度と疾病との連関性は、時にタンパク質レベルと疾病との連関性よりも明確ではないが、ｍｉＲＮＡバイオマーカーの値は実質的であり得る。もちろん、病気にかかっている間に異なって発現するＲＮＡの場合のように、試験管内での（in vitro）診断製品を開発する際に直面する問題には、ｍｉＲＮＡが異常細胞から生き残り、分析用として容易に抽出されたり、又はｍｉＲＮＡが測定され得るほど十分に長く生き残る血液あるいは他のマトリックス内へ放出される要件を含む。たとえ、多数の潜在的なバイオマーカーが病中に傍分泌方式（paracrine fashion）により病理及び機能部位に意図的に分泌されるとしても、タンパク質バイオマーカーも類似の要件を有する。数多くの潜在的なタンパク質バイオマーカーがタンパク質が合成される細胞の外側で機能するように設計される。
（生体内の分子映像技術を用いたバイオマーカーの検出）
【０１１０】
前述されたバイオマーカーは、分子画像テストにも使用され得る。例えば、イメージング剤は非小細胞肺癌の診断を補助するために、疾病の進行／快方又は転移、疾病の再発、又は他の用途で治療に対する反応を観察するために使用され得る前述したバイオマーカーと結合され得る。
【０１１１】
生体内の映像化技術は、個人の身体において特定疾病の状態を判断するための非浸潤的方法を提供する。例えば、身体の全ての部分又は全身を３次元画像で検査することができ、これにより、身体の形態や構造に関する非常に有益な情報が得られる。このような技術は個人の癌の状態、特に非小細胞肺癌の状態に関する情報を提供するために、本願に記載されたバイオマーカーの検出と組み合わせることができる。
【０１１２】
多様な技術の発展に伴い、生体内分子画像技術の使用が広がっている。このような技術の発展には、身体内で強力なシグナルを提供できる放射性標識及び／又は蛍光性標識のような新しい造影剤（contrast agent）の開発及び有用な情報を提供するために優れた感度と正確性を有する、身体の外部からこのようなシグナルを検出し、分析できる強力な新しいイメージング技術の開発が含まれる。前記造影剤は、適切な画像システムにより顕在化することができ、造影剤の位置する身体の部分の画像が提供される。前記造影剤は、アプタマー又は抗体のような捕捉試薬、例えば、ペプチド又はタンパク質又は（例えば、遺伝子発現の検出のための）オリゴヌクレオチド、又は１つ又はそれ以上の巨大分子（macromolecules）及び／又は他の微粒子形態（particulateforms）を有するものを含む複合体と結合することができる。
【０１１３】
また、前記造影剤は、画像化に有用な放射性元素の特徴を有することができる。適切な放射性元素は、シンチグラフィー（scintigraphic）の研究のためのテクネチウム-９９ｍ（technetium-９９m）又はヨード-１２３（iodine-１２３）を含む。その他、容易に検出可能な部分は、例えば、ヨード-１２３、ヨード-１３１（iodine-１３１）、インジウム-１１１（indium-１１１）、フッ素（fluorine-１９）、炭素-１３（carbon-１３）、窒素-１５（nitrogen-１５）、酸素-１７（oxygen-１７）、ガドリニウム（gadolinium）、マンガン（manganese）又は鉄（iron）のような磁気共鳴画像（ＭＲＩ）のためのスピン標識（spin label）を含む。このような標識は、当業界において周知されており、当業者らにより容易に選択され得る。
【０１１４】
標準映像技術は、磁気共鳴画像、コンピュータ断層撮影（computed tomography scanning）、陽電子放射形コンピューター断層撮影（positron emission tomography;PET）、単一光子放射断層撮影（single photon emission computed tomography;SPECT）などを含むが、これに限定されない。診断的生体内の画像化のための、使用可能な検出器具の類型は標的（タンパク質、ｍＲＮＡなど）として用いられる、与えられた放射性核種（radionuclide）及び特定バイオマーカーのような、与えられた造影剤を選択する上で主な因子となる。一般に、選択された前記放射性核種は、器具の与えられた形態により検出可能な崩壊（decay）類型を有する。また、生体内の診断のための放射性核種を選択する際、半減期は標的組織により最大吸収（uptake）時間に検出され得るだけ十分に長くなければならないが、宿主に有害な放射能が最小限に止まるように十分に短くなければならない。
【０１１５】
映像技術の例は、放射性核種が個人に対して総合的（synthetically）又は局部的（locally）に投与される映像技術であるＰＥＴ及びＳＰＥＣＴを含むが、これに限定されない。その後、放射性核種の吸収は時間が経つにつれて測定され、標的化された組織及びバイオマーカーに関する情報を得るために使われる。用いられた特定同位元素の高エネルギー（ガンマ-レイ）の放出及びこれの検出に用いられる器具の敏感性と精巧性（sophistication）のため、放射性核種の２次元分布は身体外部で推論することができる。
【０１１６】
ＰＥＴにおいて一般に、用いられる陽電子放出核種（positron-emitting nuclides）は、例えば、炭素-１１（carbon-１１）、窒素-１３（nitrogen-１３）、酸素-１５（oxigen-１５）及びフッ素-１８（fluorine-１８）を含む。電子捕獲（electron capture）及び／又はガンマ線放出により崩壊される同位元素はＳＰＥＣＴに使われ、例えば、ヨード-１２３及びテクネチウム-９９ｍを含む。テクネチウム-９９ｍを用いてアミノ酸を標識するための例示的な方法は、テクネチウム-９９ｍ-化学走性ペプチド結合体（technetium-９９m-chemotactic peptide conjugate）を形成するために２つの機能を有するように変更された（bifunctionally modified）化学走性ペプチドの金属結合基と順次反応する不安定なテクネチウム-９９ｍ-前駆複合体（technetium-９９m-precursor complex）を形成するための、キレート性前駆体の存在のもとでの過テクネチウム酸塩（pertechnetate ion）の還元である。
【０１１７】
このような生体内の画像診断方法のために、抗体をよく用いる。生体内の診断のための抗体の製造及び使用は、当業界においてよく知られている。表２に示す任意のバイオマーカーに特異に結合する、標識された抗体は個人の疾病の状態を診断したり、又は評価するための目的で用いられた特定バイオマーカーによって検出可能な、特定類型の癌（例えば、非小細胞肺癌）を持っていると疑われる個人に注入され得る。用いられた標識は、上述したように、用いられる画像化手法によって選択されるはずである。標識の位置により癌の範囲を測定することができる。また、器官又は組織内での標識の量によりその器官又は組織での癌の有無を決定することができる。
【０１１８】
同様に、アプタマーは、このような生体内の画像診断方法に用いることができる。例えば、表２に記載の特定バイオマーカーの識別のために用いられるアプタマーは、（従って、前記特定バイオマーカーに特異に結合する）適切に標識されることができ、個人の非小細胞肺癌の状態を診断したり、又は判断するために、特定バイオマーカーにより検出可能な非小細胞肺癌を持っていると疑われる個人に注入される。用いられた標識は、上述したように、用いられた画像化手法に応じて選択される。標識の位置で癌の範囲を測定することができる。また、器官又は組織内での標識の量でその器官又は組織での癌の有無を決定することができる。アプタマー-誘導イメージング剤（aptamer-directed imaging agents）は他のイメージング剤に比べ、組織浸入（penetration）、組織分布（distribution）、動力学（kinetics）、除去（elimination）、効能（potency）及び敏感性に関連する固有の、有利な特性を有することができる。
【０１１９】
これらの技術は、また、例えば、逆配列（antisense）オリゴヌクレオチドを用いる画像化による遺伝子発現を検出するために、標識されたオリゴヌクレオチドを用いて選択的に行うことができる。これらの方法は、例えば、標識として蛍光性分子又は放射性核種を用いて、インサイチューハイブリダイゼーション（in situ hybridization）に用いられる。遺伝子発現を検出するための他の方法は、例えば、レポーター遺伝子（reporter gene）活性の検出を含む。
【０１２０】
その他の一般的な映像化技術は、被験者内部の蛍光シグナルが被験者外部にある光学器具により検出される光学画像化である。このシグナルは、実際の蛍光及び／又は生物発光（bioluminescence）に起因し得る。光学検出器具の感度の向上により、生体内の診断を検定するための光学画像化の有用性が増えた。
【０１２１】
例えば、新しい癌治療を試みる際に、臨床的な効果をより迅速に測定する臨床実験及び／又は多発性硬化症（multiple sclerosis）のようにプラシーボを用いる長期治療が倫理的に問題となり得る疾病において、プラシーボを用いた長期治療を避けるための臨床実験などにおいて、生体内分子バイオマーカーの画像化の使用が増えている。
【０１２２】
その他の技術をレビューする上で、n．Blow，Nature  Methods, 6,465-469,2009を参照することができる。
（組織学的／細胞学的方法を用いたバイオマーカー値の測定）
【０１２３】
非小細胞肺癌を評価するために、多様な組織サンプルを組織学的又は細胞学的な方法に用いることができる。サンプルは、主要腫瘍の位置及び転移部位によって選別する。例えば、末端気管支（endo-bronchial）及び経気管支（trans-bronchial）生検、細針吸引（fine needle aspirates）、切断針（cutting needles）及び中心部生検（core biopsy）は組織学に用いることができる。気管支洗浄液及びブラッシング（brushing）、肋膜吸引（pleural aspiration）及び喀痰（sputum）は細胞学に用いることができる。細胞学的分析は、依然として非小細胞肺癌の診断に用いられる反面、組織学的方法は癌の検出に更に高い感度を提供すると知られている。非小細胞肺癌にかかっている個人において上向き調整されると現れた、本願で確認された任意のバイオマーカーは疾病の標識（indicator）として組織学的サンプルの染色に用いることができる。
【０１２４】
一実施形態において、対応する（各）バイオマーカーに特異な１つ又はそれ以上の（各）捕捉試薬が肺組織細胞サンプルの細胞学的評価に用いられ、次の何れか１つ又はそれ以上を含むことができる：細胞サンプルの収集、細胞サンプルの固定（fixing）、脱水（dehydrating）、水洗い（clearing）、顕微鏡スライド上への細胞サンプルの固定化（immobilizing）、細胞サンプルの透過性の増進（permeabilizing）、分析物の復旧（analyte retrieval）のための処理（treating）、染色（staining）、脱色（destaining）、洗浄（washing）、遮断（blocking）及び緩衝溶液において１つ又はそれ以上の（各）捕捉試薬と反応させること。一実施形態において、前記細胞サンプルは細胞ブロック（block）から生成される。
【０１２５】
他の実施形態において、対応するバイオマーカーに特異な１つ又はそれ以上の（各）捕捉試薬が肺組織サンプルの組織学的な評価に用いられ、次の何れか１つ又はそれ以上を含むことができる:組織サンプルの収集、組織サンプルの固定、脱水、水洗い、顕微鏡スライド上への組織サンプルの固定化、組織サンプルの透過性の増進、分析物の復旧のための処理、染色、脱色、洗浄、遮断、再水和（rehydrating）及び緩衝溶液において（各）捕捉試薬との反応。一実施形態において、固定及び脱水は凍結（freezing）で代替される。
【０１２６】
他の実施形態において、対応する（各）バイオマーカーに特異な１つ又はそれ以上の（各）アプタマーは、組織又は細胞サンプルと反応させ、核酸の増幅方法において核酸標的として提供され得る。適した核酸の増幅方法は、例えば、ＰＣＲ、ｑ-ベータレプリカーゼ（q-beta replicase）、ローリングサークル増幅（rolling circle amplification）、鎖置換（stranddisplacement）、ヘリカーゼ依存増幅法（helicase dependentamplification）、ループ介在等温増幅（loop mediated isothermalamplification）、リガーゼ連鎖反応（ligase chain reaction）、及びローリングサークル増幅をサポートする制限（restriction）及び環状化（circularization）を含む。
【０１２７】
一実施形態において、組織学的又は細胞学的な評価に用いるために、対応するバイオマーカーに特異な１つ又はそれ以上の（各）捕捉試薬は任意の次のもの：遮断物質（blocking materials）、競合阻害物質（competitors）、洗剤（detergents）、安定化剤（stabilizers）、運搬核酸（carrier nucleic acid）、多価の陰イオン物質（polyanionicmaterials）などを含むことができる緩衝溶液に混合される。
【０１２８】
「細胞学プロトコル（cytology protocol）」は、一般に、サンプルの収集、サンプルの固定、サンプルの固定化及び染色を含む。「細胞製造（cell preparation）」は、製造された細胞の染色のための１つ又はそれ以上の遅いオフレートのアプタマーの使用を含む、サンプル収集後の複数の工程段階を含むことができる。
【０１２９】
サンプル収集は処理されていない運搬容器にサンプルを直接入れること、一定の類型の培地が入っている運搬容器にサンプルを入れること、又は任意の処理又は固定なしにスライド上へ直接サンプルを置くこと（固定化）を含むことができる。
【０１３０】
サンプルの固定化（immobilization）は、ポーリリシン（polylysine）、ゼラチン（gelatin）又はシラン（silane）で処理されたガラススライドに収集されたサンプルの一部分を貼り付けることで、改善することができる。スライドは、スライド全域に薄く、平坦な細胞層を塗抹（smearing）することで製造することができる。一般に、機械的変形（mechanicaldistortion）及び乾燥人工物（drying artifact）を最小限にとどめるように注意する。液状サンプルは細胞ブロック方法で処理することができる。又は、代案として、液状サンプルは常温で約１０分間、固定溶液と１:１で混合することができる。
【０１３１】
細胞ブロックは、残余滲出液（residual effusion）、喀痰（sputum）、尿沈渣（urine sediment）、胃腸液（gastrointestinal fluid）、肺液（pulmonary fluid）、細胞スクレイピング（cell scraping）又は細針吸引により生成することができる。細胞は、遠心分離又は膜ろ過により濃縮されるか、パッケージングされる。細胞ブロックを製造するための多くの方法が開発されている。代表的な方法として、沈殿物固定（fixed sediment）、細菌性寒天（bacterial agar）、又は膜ろ過方法が挙げられる。沈殿物の固定方法において、細胞沈殿物はブアン（Bouins）、ピクリン酸（picric acid）、又は緩衝ホルマリン （buffered formalin）のような固定液と混合された後、前記混合物は固定化された細胞をペレット化するために遠心分離される。できる限り、完全に細胞ペレットを乾燥して上層液を除去する。ペレットを収集してレンズペーパー（lens paper）で包んだ後、組織カセット（tissue cassette）に入れる。前記組織カセットを追加の固定液と共にボトルに入れ、組織サンプルと同様に処理する。寒天法（agar method）は非常に類似しているが、ペレットが除去され、ペーパータオル上で乾燥された後、半切にする。切り取った側をガラススライド上の溶解された寒天１滴に載せ、前記ペレットを寒天のなかで確実に泡が生成されないように寒天で覆う。前記寒天を固めた後、任意の余分の寒天を取りのける。これを組織カセットに入れれば、組織処理は完了する。代案として、前記ペレットは６５℃で２％寒天溶液に直接懸濁することができ、サンプルは遠心分離される。前記寒天細胞ペレットを４℃で１時間凝固させる。前記固体寒天は、遠心分離チューブから除去されることができ、折半に分離され得る。前記寒天をろ過ペーパーで覆い、組織カセットに入れる。この時点の前の処理は前記に記載された通りである。遠心分離は、膜ろ過と共に任意のこのような方法で代替することができる。任意のこのような方法は「細胞ブロックサンプル（cell block sample）」の製作に用いることができる。
【０１３２】
細胞ブロックは、ローウェクリル樹脂（Lowicryl resins）、ＬＲホワイト（LR White）、ＬＲゴールド（LR Gold）、ユニクリル（Unicryl）及びモノステップ（MonoStep）を含む特性化された樹脂を用いて製造することができる。これらの樹脂は低粘度を有し、低い温度で紫外線を用いて重合することができる。包埋処理（embedding process）は、脱水中にサンプルを漸進的に冷却させて、樹脂にサンプルを移し、最後に適切なＵＶ波長で低い温度でブロックを重合させることに依存する。
【０１３３】
細胞ブロックセクション（cell block sections）は、細胞形態学検査（cytomorphologicalexamination）のために、ヘマトキシリン-エオシンで染色することができ、同時に付加的な断片は特定マーカーに対する検査のために用いられる。
【０１３４】
前記工程が組織学的工程であるか、又は細胞学的工程であるかにかかわらず、前記サンプルはサンプルの分解を予防するために、付加的な処理を行う前に固定化することができる。この処理は「固定（fixation）」と呼ばれ、混用され得る広範囲な物質及び方法を説明する。サンプル固定プロトコル及び試薬は、検出される標的と分析される特定細胞／組織を基に経験的に選択する。サンプルの固定はエタノール（ethanol）、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol）、メタノール（methanol）、ホルマリン（formalin）又はイソプロパノール（isopropanol）のような試薬に依存する。前記サンプルは、できる限りスライドに収集及び添加された後、即時固定されなければならない。しかし、選別された固定液は後続検出を更に難しくする多様な分子標的に構造的変化をもたらすことができる。固定及び固定化処理及びこれらの順序は細胞の外形を変更させることができ、このような変化を細胞を検査する者が予想し、認識しなければならない。固定液は特定の細胞類型を収縮させることができ、細胞質が顆粒状（granular）又は網様（reticular）を呈するようにすることができる。数多くの固定液が細胞成分と架橋結合することで機能する。これは、特定のエピトープを損傷させたり、又は変更させ、新たなエピトープを生成することができる上、分子集合（molecular associations）をもたらし、膜透過性を減少させることがある。ホルマリンの固定は、最も一般的な細胞学的／組織学的な方法の１つである。ホルマリンは、タンパク質周辺又はタンパク質内においてメチルブリッジ（methyl bridge）を形成する。沈殿（precipitation）又は凝固（coagulation）も固定のために使われ、エタノールはこのような類型の固定によく用いられる。架橋結合（crosslinking）及び沈殿の組み合わせも固定のために用いることができる。強い固定処理は、形態学的な情報を保全する最善の方法である一方、弱い固定処理は分子標的の保存に最善の方法である。
【０１３５】
代表的な固定液は５０％無水エタノール、２ｍＭポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１.８５％ホルムアルデヒドである。この成分配合（formulation）上の変化はエタノール（５０％〜９５％）、メタノール（２０％-５０％）及びホルマリン（ホルムアルデヒド）単独を含む。他の一般的な固定液は２％ＰＥＧ１５００、５０％エタノール及び３％メタノールである。スライドは、常温で約１０〜１５分間固定液に放置した後、除去して乾燥する。一応、スライドが固定されると、ＰＢＳのような緩衝溶液で洗い落とすことができる。
【０１３６】
広範囲な染料が細胞、芽細胞及び組織の特徴又は形態学的な構造を差別的に強調して比較したり、又は「染色（stain）」に用いることができる。ヘマトキシリン（hematoxylin）は、核を青色又は黒色に染める際に用いられる。オレンジＧ-６（Orange G-６）及びエオシンアズール（eosin azure）、何れも細胞の細胞質を染色する。オレンジＧはケラチン（keratin）及びグリコーゲン（glycogen）含有細胞を黄色に染色する。エオシンＹは核小体（nucleoli）、繊毛（cilia）、赤血球（red blood cells）及び表在性扁平上皮細胞（superficial epithelial squamous cells）の染色に用いられる。ロマノフスキー染色（romanowsky stains）は自然乾燥された（air dried）スライドに用いられ、多形成を増加させ、細胞質内（intracytoplasmic）物質から細胞外物質を区別する上で有用である。
【０１３７】
染色過程は、染色に対する細胞の透過性を増加させるための処理を含むことができる。洗剤（detergent）を用いた細胞の処理は、透過性を増加させる上で使用され得る。細胞及び組織の透過性を増加させるために、固定されたサンプルは溶媒（solvents）、サポニン（saponins）又は非イオン性洗剤（non-ionic detergents）により更に処理され得る。酵素的分解（enzymaticdigestion）も組織サンプルにおいて特定標的への接近性を向上させることができる。
【０１３８】
染色の後、前記サンプルはアルコール濃度が増加する、連続的なアルコール洗いにより脱水される。最後の洗浄は、キシレン（xylene）又はスライドに用いられるカバースリップに近接した屈折率を有するシトラステルペン（citrus terpene）のようなキシレン代用物を用いて完了する。この最後の段階は水洗い（clearing）と呼ばれる。一応、サンプルが脱水、水洗いされると、封止剤（mountingmedium）を用いる。前記封止剤はガラスに近接した屈折率を有するものを選択し、スライドにカバースリップをくっつけることができる。これは、また細胞の付加的な乾燥、収縮又は衰退（fading）を抑制するはずである。
【０１３９】
用いられた染色又は処理と関係なく、肺細胞サンプルの最終評価は、形態の外観検査（visual inspection）及びマーカーの存否の決定を可能にする特定タイプの顕微鏡による観察で行われる。例示的な顕微鏡方法は、明視野（brightfield）、位相差（phase contrast）、蛍光（fluorescence）及び微分干渉観察（differentialinterference contrast）を含む。
【０１４０】
検査後のサンプル上に第２のテストが要求されると、カバースリップを除去することができ、スライドは脱色させる。脱色（destaining）は、もともと追加の染料なしに、本来の染色過程の逆順でスライドを染色する上で用いられたオリジナル溶媒システム（original solvent system）を用いることを含む。脱また、脱色は細胞が無色になるまで酸性アルコールにスライドを浸すことで完了することができる。一応、無色のスライドを水槽でよく洗い、第２の染色処理を適用する。
【０１４１】
また、特定分子の識別は、抗体又は核酸プローブ又はアプタマーのような特定分子試薬の使用による細胞形態学的分析と共に実施することができる。これは診断細胞学の精度を向上させる。顕微解体（micro-dissection）は、特に異常なクロモソーム（abnormalchromosomes）、遺伝子発現（gene expression）又は変異（mutations）に対する更なる評価のための細胞のサブセットの単離に用いることができる。
【０１４２】
組織学的評価のための組織サンプルの製造は、固定（fixation）、脱水（dehydration）、浸入（infiltration）、包埋（embedding）及び断片化（sectioning）を含む。組織学で用いられる固定試薬は、細胞学で用いられるものと非常に類似しているか、又は同一であり、個々のタンパク質のような分子特徴を犠牲にし、形態学的特徴を保存するといった同一の問題を有する。もし、組織サンプルが固定されず、脱水されたものの、その代りに凍結された後、凍結中に断片化されるならば、時間の節約が可能である。これは、もう少し緩やかな処理方法であり、より多くの個々のマーカーを保存することができる。しかし、凍結は氷晶の生成により芽細胞情報が失われるため、組織サンプルの長期間保存に適していない。凍結された組織サンプル内の氷は、更に非常に薄いスライスを生成する断片化工程を妨げる。ホルマリン固定だけでなく、四酸化オスミウム（osmium tetroxide）も固定に用いられ、燐脂質燐（膜）を染色する。
【０１４３】
組織はアルコールの濃度を増加させながら、連続的に洗浄、脱水される。水洗いはアルコール及び包埋物質と混ざる物質を用い、アルコール:水洗い促進剤（clearing agent）（キシレン又はキシレン代用品）の割合を５０:５０からスタートする段階的工程を含む。浸入（infiltration）は、まず組織を５０:５０の包埋試薬:水洗い促進剤において、さらに１００％包埋試薬において、液体形態の包埋試薬（ワームワックス（warm wax）、ニトロセルロース溶液（nitrocellulose solution））と共に培養するものを含む。包埋はモールド又はカセットに組織を位置させ、ワックス、寒天又はゼラチンのような溶解された包埋試薬を詰めることで完成する。前記包埋試薬を固める。固まった組織サンプルは、その後染色及び後続実験のために薄い断片に切断され得る。
【０１４４】
染色の前に、組織断片はワックスが除去され、再脱水される。キシレンは断片のワックスの除去に用いられ、１回又はそれ以上キシレンを取り替えることができ、組織は濃度を減らしたアルコールで連続的に洗浄することで、再脱水される。ワックスを除去する前に、組織断片は約２０分間約８０℃でガラススライドに熱固定化することができる。
【０１４５】
レーザー捕獲顕微解体（laser capture micro-dissection）は、組織断片から追加分析のための細胞のサブセット単離を可能にする。
【０１４６】
細胞学でと同じく、顕微鏡的特徴の顕在化を強化するために、組織断片又はスライスは多様な染色剤で染色することができる。多様な種類の常用染色剤が特異な特徴を強化させたり、又は識別するために使用され得る。
【０１４７】
細胞学的／組織学的サンプルと分子試薬の相互作用を一層増進するために、「分析物復旧（analyte retrieval）」に向けた多くの技術が開発された。まずこのような最初技術は、固定されたサンプルを高温で加熱する。また、この方法は、熱-誘導エピトープ復旧（heat-induced epitope retrieval）又はＨＩＥＲと称する。スチーム加熱（steam heating）、電子レンジ加熱（microwaving）、高圧殺菌（autoclaving）、恒温水槽（water bath）及び加圧蒸煮（pressure cooking）又はこれらの加熱方法の組み合わせを含む、多様な加熱技術が用いられてきた。分析物復旧溶液は、例えば、水、クエン酸塩（citrate）及び一般の食塩水緩衝液（saline buffers）を含む。分析物復旧の核心は高温での時間であるが、長期間にわたるより低い温度もよく用いられる。分析物を復旧する上でもう１つの核心は加熱溶液のｐＨである。低いｐＨは最適の免疫染色を提供すると知られているが、また、時には陰性対照群として第２組織断片の使用を要するバックグラウンドを生じさせる。（バックグラウンドを増加させることなく、免疫染色を増加させる）最も強力なメリットは、一般に、緩衝組成物にかかわらず、高いｐＨ溶液を用いて得られるということにある。特定標的のための前記分析物の復旧工程は、工程の最適化のためのパラメータとして、熱、時間、ｐＨ及び緩衝組成物を用いて経験的に最適化される。マイクロ波分析物の復旧方法を用いると、抗体試薬で互いに異なる標的に対する連続的な染色が可能である。しかし、染色段階において、抗体と酵素複合体の完成に要される時間は、また細胞膜の分析物を低下させることが分かった。マイクロ波の加熱方法は、インサイチューハイブリダイゼーション（in situ hybridization）方法においても改善される。
【０１４８】
分析物の復旧工程を開始するために、まず断片のワックスを除去して脱水させる。その後、スライドを皿やボトル中のｐＨ６.０の１０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファに浸ける。代表的な方法としては、１１００Ｗのマイクロ波を用いて、２分間１００％電力でスライドを電子レンジで加熱した後、溶液中で依然としてスライドカバーがされているかを確認した後、１８分間２０％電力を用いてスライドを電子レンジで加熱する。その後、スライドを、ふたのない容器で冷却させた後、蒸溜水で洗い落とした。免疫化学的試薬に対する標的の反応性を向上させるために、ＨＩＥＲを酵素分解と共に用いることができる。
【０１４９】
このような酵素分解プロトコルは、プロテアーゼＫ（proteinase K）を用いる。２０μｇ／ｍｌ濃度のプロテアーゼＫを５０ｍＭトリス塩、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０.５％トリトンＸ-１００、ｐＨ８.０のバッファとして製造する。前記工程はまず各５分ずつ、キシレンを２回置き換え、断片のワックスを除去することを含む。その後、サンプルをそれぞれ３分間１００％エタノール２回、それぞれ１分間９５％及び８０％エタノールで水和させ、蒸溜水で洗い落とす。断片をプロテアーゼＫ作用液（working solution）で覆い、湿ったチャンバーにおいて３７℃で１０〜２０分間培養する（最適の培養時間は組織形態及び固定化の程度に応じて変わることができる）。前記断片を１０分間常温で冷却させた後、２分間２回にわたってＰＢＳツイーン２０（PBS Tween ２０）で洗い落とす。もし、所望するならば、内在性化合物及び酵素からの潜在的な干渉を取り除くために、断片を遮断することができる。その後、前記断片を常温で１時間又は４℃で一晩中１次抗体希釈バッファに適切に希釈し、１次抗体と共に培養する。前記断片を２分間２回にわたってＰＢＳツイーン２０で洗い落とす。もし、特別な適用が必要であれば、付加的な遮断を行った後、２分間３回にわたってＰＢＳツイーン２０で追加的に洗い落とした後、最後に免疫染色プロトコルを完了する。
【０１５０】
常温での１％ＳＤＳを用いた簡単な処理も免疫組織学的染色を向上させることが分かった。分析物の復旧方法は、スライドで覆われた断片だけでなく、自由流動断片においても適用され得る。他の処理オプションにはｐＨ６.０のクエン酸０.１Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０を含む容器にスライドを漬かし、９５℃で加熱することがある。その後、ＰＢＳのような緩衝溶液で前記スライドを洗浄する。
【０１５１】
組織の免疫学的染色のために、血清又は脱脂粉乳（non-fat dry milk）のようなタンパク質溶液に断片を浸けることで、組織タンパク質と抗体との非特異結合を防ぐ上で有用である。
【０１５２】
遮断反応（blocking reaction）は、内在性ヌクレアーゼ（endogenous biotin）のレベルを低減させ、内因性の電荷効果（endogenous charge effects）を除去し、内在性のヌクレアーゼ（endogenousnucleases）を不活性化させ／させたり、ペルオキシダーゼ（peroxidase）及びアルカリホスファターゼ（alkaline phosphatase）のような内在性酵素を不活性化させる必要があり得る。内在性ヌクレアーゼは、プロテアーゼＫを用いた分解によって、熱処理によって、ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡのようなキレート剤を用い、運搬体ＤＮＡ又はＲＮＡの導入によって、ウレア（urea）、チオウレア（thiourea）、グアニジン塩酸塩（guanidine hydrochloride）、グアニジンチオシアン酸塩（guanidinethiocyanate）、過塩素酸リチウム（lithium perchlorate）など、又は二炭酸ジエチル（diethyl pyrocarbonate）のようなカオトロピック（chaotrope）で処理することで、不活性化することができる。アルカリホスファターゼは常温で５分間０.１Ｎ  ＨＣｌで処理するか、１ｍＭレバミゾール（levamisole）で処理することで、不活性化することができる。ペルオキシダーゼの活性度は０.０３％過酸化水素（hydrogen peroxide）で処理することで、除去することができる。内在性ビオチンは、スライド又は断片を常温で少なくとも１５分間アビジン（avidin）溶液（ストレプトアビジン（streptavidin）、ニュートラアビジン（neutravidin）をその代わりに使用することができる）に浸けることで、遮断することができる。その後、前記スライド又は断片をバッファで少なくとも１０分間洗浄する。洗浄は、少なくとも３回繰り返すことができる。その後、前記スライド又は断片を１０分間ビオチン溶液に浸ける。これは毎回新しいビオチン溶液を用いて少なくとも３回にわたって繰り返すことができる。バッファの洗浄方法を繰り返す。遮断プロトコルは、細胞又は組織構造、又は（各）関心標的の損傷を予防するために最小限に使われなければならないが、これらプロトコルの１つ又はそれ以上は、１つ又はそれ以上の遅いオフレートアプタマーと共に反応する前に、スライド又は断片を「遮断」するために組み合わせることができる（Basic Medical Histology:the Biology of Cells, Tissues and Organs,authored by Richard G. Kessel, Oxford University Press, １９９８を参照）。
（質量分析方法を用いたバイオマーカー値の測定）
【０１５３】
多様な構成の質量分析器がバイオマーカー値を検出するのに使用され得る。多様な類型の質量分析器が使用可能であるが、多様な構成を有するように生産され得る。一般に、質量分析器は次のような主要構成要素を有する:サンプル流入口（inlet）、イオン供給源（ion source）、質量分析器（mass analyzer）、検出器（detector）、真空システム（vacuum system）及び器具-制御システム（instrument-control system）及びデータシステム（data system）。一般に、サンプル流入口、イオン供給源及び質量分析器の差が器具の形態と特性を定義する。例えば、前記流入口は、毛管カラム液体クロマトグラフィー供給源（capillary-column liquid chromatography source）や、マトリックス支援レーザー脱離（matrix-assisted laser desorption）に用いられるのと同一の直接プローブ（direct probe）又はステージ（stage）であり得る。通常のイオン供給源は例えば、ナノスプレー（nanospray）及びマイクロスプレー（microspray）を含むエレクトロスプレー（electrospray）又はマトリックス支援レーザー脱離である。通常の質量分析器は、四重極型質量フィルタ（quadrupole mass filter）;イオントラップ質量分析器（ion trap mass analyzer）及び飛行時間型質量分析器（time-of-flightmass analyzer）を含む。追加的な質量分析方法は当業界においてよく知られている（Burlingameet al., Anal. Chem. ７０:６４７ R-７１６R（１９９８）;Kinter and Sherman, New York（２０００）を参照）。
【０１５４】
タンパク質バイオマーカー及びバイオマーカー値は、任意の下記:電子スプレーイオン化質量分析法（electrospray ionizationmass spectrometry, ESI-MS）、ＥＳＩ-ＭＳ／ＭＳ, ＥＳＩ-ＭＳ／（ＭＳ）ｎ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight massspectrometry, MALDI-TOF-MS）、表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（surface-enhancedlaser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS）、シリコン上での脱離／イオン化（desorption/ionization on silicon, DIOS）、二次イオン質量分析（secondary ion mass spectroscopy, SIMS）、四重極型飛行時間（quadrupole time-of-flight;Q-TOF）、ウルトラフレックス（ultraflex）III TOF/TOFと呼ばれるタンデム型飛行時間（tandemtime-of-flight）（TOF/TOF）技術、大気圧化学イオン化質量分析法（atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry;APCI-MS）、ＡＰＣＩ-ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ-（ＭＳ）Ｎ、大気圧光イオン化質量分析法（atmospheric pressure photoionization mass spectrometry;APPI-MS）、ＡＰＰＩ-ＭＳ／ＭＳ及びＡＰＰＩ-（ＭＳ）Ｎ、四重極型質量分析法（quadrupole mass spectrometry）、フーリエ変換質量分析法（Fouriertransform mass spectrometry;FTMS）、定量的質量分析法（quantitativemass spectrometry）及びイオントラップ質量分析法（ion trap massspectrometry）によって検出されて測定され得る。
【０１５５】
サンプル製造戦略は、タンパク質バイオマーカーの質量分析的特性化及びバイオマーカー値の検出前にサンプルを標識し、量を増やすのに用いられる。標識方法は、相対的、かつ絶対的な定量のための等圧タグ（isobaric tag）（isobaric tag for relative andabsolute quantitation;iTRAQ）及び細胞培養におけるアミノ酸を用いた安定した同位元素標識（stable isotope labeling with amino acid in cell culture;SILAC）を含むが、これに限定されない。質量分析的分析の前に、候補バイオマーカータンパク質のためのサンプルを選択的に強化するために用いられる捕捉試薬はアプタマー、抗体、核酸プローブ、キメラ、小分子、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体フラグメント（singlechain antibody fragment）、Ｆｖフラグメント（Fv fragment）、一本鎖Ｆｖフラグメント（single chain Fv fragment）、核酸（nucleic acid）、レクチン（lectin）、リガンド結合受容体（ligand-binding receptor）、アフィボディ（affybodies）、ナノボディ（nanobodies）、アンキリン（ankyrins）、ドメイン抗体（domain antibodies）、オルタナティブ抗体スキャフォールド（alternative antibody scaffolds）（例えば、ダイアボディ（diabodies）など）、刷込高分子（imprinted polymer）、アヴィメール（avimers）、ペプチド模倣体（peptidomimetics）、ペプトイド（peptoids）、ペプチド核酸（peptide nucleic acid）、トレオース核酸（threosenucleic acid）、ホルモン受容体（hormone receptor）、サイトカイン受容体（cytokine receptor）、及び合成受容体（syntheticreceptors）及びこれらの変更及びフラグメントを含むが、これに限定されない。
（近接結合検定法を用いたバイオマーカー値の測定）
【０１５６】
近接結合検定法（proximity ligation assay）は、バイオマーカー値の測定に用いられることができる。簡単に言えば、試料は一対の抗体又は一対のアプタマーであり得る一対のアフィニティープローブ（affinity probe）と接触し、前記対の各構成成分はオリゴヌクレオチドに延長される。一対のアフィニティープローブに対する標的は、１つのタンパク質上の２つの区別される決定因子であるか、ホモ多量体の（homomultimeric）又はヘテロ多量体の（heteromultimeric）複合体として存在し得る２つの互いに異なるタンパク質それぞれの１つの決定因子であり得る。プローブが標的決定因子に結合するとき、オリゴヌクレオチド拡張子（oligonucleotide extension）の遊離端（free end）は互いに混成化されるのに十分な程度に隣接するように移動する。オリゴヌクレオチド拡張子が十分に近接するように位置したとき、これらの架橋としての役割を果たす共通連結オリゴヌクレオチド（common connector oligonucleotide）により、オリゴヌクレオチド拡張子が容易に混成化される。一応、プローブのオリゴヌクレオチド拡張子が混成化されると、拡張子の末端は酵素ＤＮＡ結合により互いに結合される。
【０１５７】
オリゴヌクレオチド拡張子のそれぞれは、ＰＣＲ増幅のためのプライマー部位を含む。一応、前記オリゴヌクレオチド拡張子が互いに結合されると、前記オリゴヌクレオチドはＰＣＲ増幅によって標的タンパク質のアイデンティティ（identity）及び量（amount）に関する情報だけでなく、標的決定因子が２つの相異するタンパク質上にある場合、タンパク質-タンパク質の相互作用に関する情報を示す連続的なＤＮＡ配列を形成する。近接結合は、リアルタイムＰＣＲを通じてリアルタイムタンパク質の濃度及び相互作用の情報のための高い感度及び特異度を有する検定法を提供できる。関心決定要素と結合しないプローブは対応するオリゴヌクレオチド拡張子を近接移動させず、如何なる結合やＰＣＲ増幅も行われることができず、その結果、如何なるシグナルも生成されない。
【０１５８】
前記検定法により、非小細胞肺癌の診断法に有用に用いられることができるバイオマーカー値の検出が可能になり、前記方法は、個人の生物学的サンプルで表２に提供されるバイオマーカーからなる群より選択されたバイオマーカーにそれぞれ対応する少なくともＮ個のバイオマーカー値を検出する段階を含む。以下に説明するように、バイオマーカー値を用いた分類は、前記個人が非小細胞肺癌を患っているか否かを表す。記載された非小細胞肺癌バイオマーカーのうち特定のバイオマーカーは、単独で非小細胞肺癌を検出して診断するのに有用ではあるものの、それぞれ３つ又はそれ以上のバイオマーカーを含むパネルとして有用な多重非小細胞肺癌バイオマーカーサブセットを定める方法を本願に説明する。従って、本発明の多様な実施形態においては、Ｎ個のバイオマーカーを含む組み合わせを提供し、ここでＮは少なくとも３つのバイオマーカーである。他の実施形態において、Ｎは２〜５９個のバイオマーカーのうち任意に選択される。Ｎは、前記記載された範囲で任意に選択され得るだけでなく、類似しているが、より高次の範囲を含むように選択され得る。本願に記載された方法によって、バイオマーカー値は個別に検出されて分類されることができ、又は、例えば、多重検定フォーマットのように、集合的に検出されて分類され得る。
【０１５９】
他の様相によれば、非小細胞肺癌の不在を検出する方法を提供する。前記方法は、個人の生物学的サンプルで表２に提供されるバイオマーカーの群から選択されるバイオマーカーにそれぞれ対応する少なくともＮ個のバイオマーカー値を検出する段階を含む。以下に詳細に説明するように、バイオマーカー値を用いた分類は、前記個人において非小細胞肺癌が不在であることを表す。記載された非小細胞肺癌バイオマーカーのうち特定のバイオマーカーは、非小細胞肺癌の不在を検出して診断するのに単独で有用ではあるものの、３つ又はそれ以上のバイオマーカーのパネルとしてそれぞれ有用な非小細胞肺癌バイオマーカーの多重サブセットの分類のための方法を本願に説明する。従って、本発明の多様な実施形態は、Ｎ個のバイオマーカーを含む組み合わせを提供し、ここでＮは少なくとも３つのバイオマーカーである。他の実施形態において、Ｎは２〜５９個のバイオマーカーのうち任意に選択される。Ｎは、前記記載された範囲で任意に選択され得るだけでなく、類似しているが、より高次の範囲を含むように選択され得る。本願に記載された方法によって、バイオマーカー値は個別に検出されて分類されることができ、又は、例えば、多重検定フォーマットのように、集合的に検出されて分類され得る。
（バイオマーカーの分類及び疾病スコアの計算）
【０１６０】
付与された診断テストのためのバイオマーカー「シグネチャー（signature）」は一連のマーカーを含み、各マーカーは関心集団で互いに異なるレベルを有する。ここで、互いに異なるレベルとは、２つ又はそれ以上の群の個人に対する相異するマーカーレベルの平均、或いは２つ又はそれ以上の群の相異する変化、又はこれら２つの両方の組み合わせを指すことができる。最も単純な形態の診断テストのために、２つの群の何れかである正常群又は疾病群に個人の未知サンプルを割り当てる際にこれらマーカーを用いることができる。２つ又はそれ以上の群の何れかにサンプルを割り当てることを分類といい、このようなサンプル割当のために用いられる方法を分類器（classifier）又は分類方法（classification method）という。この他に分類方法はスコアリング方法（scoring method）ともいう。多くの分類方法が一連のバイオマーカー値から診断分類器（diagnostic classifier）を構成するために利用され得る。一般に、区別しようとする２つの（又は複数の分類状態のためにはそれ以上のデータセット）互いに異なる群内で個人から得られたサンプルを用いてデータセットを収集する教師あり学習技術（supervised learning techniques）を利用すれば、分類方法が最も容易に遂行される。各サンプルの属するクラス（群又は集団）は予め知られているため、前記の分類方法は所望する分類反応を与えられるようにトレーニングすることができる。診断分類器を生産するために、教師なし学習技術（unsupervised learning techniques）を利用することもまた可能である。
【０１６１】
診断分類器の開発に向けた通常の接近法は、決定木（decisiontree）と、バギング（bagging）＋ブースティング（boosting）+フォレスト（forests）と、学習基盤規則推論と、パルツェン窓（Parzen Window）と、線形モデル（linear models）と、記号論理学（logistic）と、神経回路網（neural network）方法と、クラスタリング（unsupervised clustering）と、Ｋ-平均（K-means）と、階層的上昇/下降（hierarchicalascending/descending）と、半教師あり学習（semi-supervisedlearning）と、プロトタイプ方法（prototype methods）と、最近傍（nearest neighbor）と、カーネル密度推定（kernel densityestimation）と、サポートベクトルマシン（support vector machines）と、隠れマルコフモデル（hidden Markov models）と、ボルツマン学習（BoltzmannLearning）とを含み、分類器は単純結合したり、特定の目的関数（objective function）を最小化する方式で結合され得る。Pattern Classification, R.O. Duda, et al., editors, John Wiley＆Sons, 2nd edition, ２００１及びThe Elements ofStatistical Learning-Data Mining, Inference, and Prediction, T. Hastie, et al.,editors, Springer Science+Business Media, LLC, 2nd edition, ２００９を参照できれば、これらのそれぞれは全体が参照統合される。
【０１６２】
教師あり学習技術を用いて分類器を生成するために、トレーニングデータと呼ばれる一連のサンプルを獲得する。診断テストにおいて、トレーニングデータは、後から未知のサンプルが割り当てられる、互いに区分される群（分類）からのサンプルを含む。例えば、対照群の個人と特定の疾病群の個人より収集されたサンプルは、未知のサンプル（又は、より詳しくは、サンプルが得られた個人）を疾病の存否により分類できる分類器の開発のために用いられるトレーニングデータを構成することができる。トレーニングデータから分類器を開発することを分類器をトレーニングするという。分類器トレーニングに対する特異的な細部事項は、教師あり学習技術の特性に関わっている。説明のために、トレーニング単純ベイズ分類器（naive Bayesian classifier）の例を以下に説明する（例えば、PatternClassification, R.O. Duda, et al., editors, John Wiley ＆ Sons, 2nd edition, ２００１を参照;また、The Elements of Statistical Learning-Data Mining, Inference, andprediction, T. Hastie, et al., editors, Springer Science+Business Media, LLC,2nd edition, ２００９を参照）。
【０１６３】
通常、トレーニングセットのサンプルよりも更に多くの潜在的バイオマーカー値が存在するため、オーバーフィッティング（over-fitting）を避けるよう注意を傾けなければならない。統計学的モデルが底辺の関係の代りにランダムエラーやノイズを記述する場合、オーバーフィッティングが生じる。オーバーフィッティングは、例えば、分類器の開発に用いられるマーカーの数を制限し、マーカーの反応が互いに独立していると仮定した上、その使用された基礎統計学的モデルの複雑性を制限し、そして基礎統計学的モデルがデータに基づくものであることを保障するなどの様々な方法で避けることができる。
【０１６４】
一連のバイオマーカーを用いた診断テスト開発の例は、単純ベイズ分類器、バイオマーカーを厳格に独立して処理するとともに、ベイズ原理に基づいた単純確率分類器の適用を含む。それぞれのバイオマーカーは、各クラスで測定されたＲＦＵ値又はログＲＦＵ値（相対的蛍光単位）に対するクラス-依存性確率密度関数（probability density function;pdf）により記述される。１つのクラスで一連のマーカーに対するジョイントｐｄｆ（joint pdfs）は、各バイオマーカーに対する個人クラス-依存性ｐｄｆの産物と仮定する。これに関連し、単純ベイズ分類器をトレーニングすることは、前記クラス-依存性ｐｄｆを特性化するためのパラメーターを選定すること（「パラメーター化（parameterization）」）に該当する。クラス-依存性ｐｄｆに対する基礎モデルが使用され得るが、前記モデルは一般にトレーニングセットで観察されたデータに合わなければならない。
【０１６５】
具体的に、疾病クラスのバイオマーカーｉに対する値ｘｉを測定するクラス-依存性確率は
2018528441.tif 000003
と記載され、
2018528441.tif 000004
値を持つｎ個のマーカーを観察できる総単純ベイズ確率は
2018528441.tif 000005
と記載され、ここで個人ｘｉはＲＦＵ又はログＲＦＵで測定されたバイオマーカーレベルである。未知に対する分類指定は、同一の測定値に対して疾病を患わない可能性（対照群）
2018528441.tif 000006
と比較し、測定値
2018528441.tif 000007
のある疾病を患う可能性
2018528441.tif 000008
【０１６６】
を計算することによって容易になる。これらの可能性などの比率は、ベイズ原理を適用してクラス-依存性ｐｄｆから計算されることができ、ここでｐ（ｄ）はテストに適切な集団における疾病の罹病率である。前記比率の両方の対数を取り、前記の単純ベイズクラス-依存性確率を代入すれば、下記の通りである。
【０１６７】
この形態は、対数尤度比（loglikelihood ratio）と知られており、単に疾病の存在と疾病の不在に対する対数尤度（loglikelihood）をいい、一次的にｎ個のバイオマーカーそれぞれの対数尤度比の和からなる。これに対する最も単純な形態において、未知のサンプル（又はより詳しくは、前記サンプルが得られた個人）は前記比率が０よりも大きければ疾病がないものと分類され、前記比率が０よりも小さければ疾病を持つものと分類される。
【０１６８】
例示的な一実施形態において、クラス-依存性バイオマーカーｐｄｆｓ
2018528441.tif 000009
及び
2018528441.tif 000010
は、測定されたＲＦＵ値ｘｉ、即ちμｄ及びσｄを用いたｐ(xi｜d)に対して類似の式を有するＲＦＵ値で正規又はログ-正規分布と仮定される。前記モデルのパラメーター化のためには、トレーニングデータから各クラス-依存性ｐｄｆに対する２つのパラメーター、平均μ及び分散σ２推定を行う必要がある。これは、例えば、最大尤度推定、最小自乗及び当業者に公知となった任意の方法を含む多数の方法で達成され得る。μとσに対する正規分布を前記に定義された対数尤度比に代入すれば、下記の通りである。
【０１６９】
まず、一連のμとσ２がトレーニングデータと集団の疾病罹病率から各クラスの各ｐｄｆに対して定義されると、前記ベイズ分類器が完全に決定され、これを測定値{tilde over（x）}を用いて未知のサンプルを分類する上で利用することができる。
【０１７０】
単純ベイズ分類器の性能は分類器を構成し、トレーニングに用いられたバイオマーカーの数と特性による。単一バイオマーカーは、下記の例３に定義されているように、前記バイオマーカーのＫＳ-距離（Kolmogorov-Smirnov）によって作動するはずである。万が一、分類器性能指標（classifier performance metric）が受信者操作特性曲線下の面積（ＡＵＣ）で定義されれば、完壁な分類器は１のスコアになるはずであり、ランダム分類器は平均的に０.５のスコアになるはずである。サイズｎとｍの２つのセットＡとＢとのＫＳ-距離は
2018528441.tif 000011
の値で定義され、これら２つの経験累積分布関数（empiricalcumulative distribution function, cdf）間の最大の差である。ｎ番の観察ＸｉセットＡに対する経験的累積分布関数は次の通りに定義され、ここでＩＸｉｘはＸｉ＜ｘである場合、１と同一であり、そうでなければ０と同一の表示関数（indicator function）である。その意味上、この値は０と１との間にあり、ここでＫＳ-距離１は経験的分布が重複しないことを表す。
【０１７１】
優れたＫＳ距離（例えば、>０.３）を持つ後続マーカーを添加する場合、前記添加されたマーカーが第１マーカーに対して独立していれば、一般に分類性能が向上する。分類器スコアとして受信者操作特性曲線下の面積（ＡＵＣ）を使用すれば、貪欲アルゴリズム（greedy algorithm）の変化を伴う多くの高得点分類器を生成し易い。（貪欲アルゴリズムは、全域最適化（global optimum）を発見する可能性のある各段階で局部的な最適の選択を行うメタヒューリスティクス（metaheuristic）方法を解決する問題を遂行する任意のアルゴリズムである。）
【０１７２】
全ての単一分析物分類器は、潜在的なバイオマーカーの表から生成され、リストに添加される。次に、可能な限り、全ての第２分析物をそれぞれの保存された単一分析物分類器に添加し、新しいリスト上に所定個数の最上得点ペア（pair）、いわゆる、例えば１０００を保存する。最上の２-マーカー分類器に対する前記新しいリストを用いて、全ての可能な３つのマーカー分類器を調べ、改めてこれらのうち最上の１０００を保存する。前記スコアが安定状態（plateau）に達するか、又は付加的なマーカーの添加によって低下し始めるまでこの過程を続ける。意図する用途に対する好ましい性能のために、収斂後に残っている高得点分類器を評価することができる。例えば、一診断的適用において、高い感度と適当な特異度を有する分類器は、適当な感度と高い特異度を有することよりも好ましくなり得る。他の診断的適用において、高い特異度と適当な感度を有する分類器がより好ましくなり得る。一般に、理想的な性能レベルは、特定の診断に適用する際に許容され得る偽陽性の数と偽陰性の数との間に存在しなければならないトレードオフ（trade-off）に基づいて選択される。このようなトレードオフは誤診、一般に偽陽性又は偽陰性の何れかの医学的結果に依存する。
【０１７３】
その他、様々な技術が当業界で知られており、単純ベイズ分類器を用いるバイオマーカーのリストから多くの潜在的分類器を生成する上で利用され得る。一実施形態において、いわゆる遺伝アルゴリズム（genetic algorithms）が前記に定義された適正スコアを用いて互いに異なるマーカーを組み合わせるのに利用され得る。遺伝アルゴリズムは、特に、非常に大きく、様々な集団の潜在的分類器を見つける上でかなり適している。他の実施形態において、いわゆる蟻コロニー最適化（ant colony optimization）が一連の分類器を生成する上で使用され得る。例えば、他の進化的な方法に限らず、模擬アニーリング（simulated annealing）及び他の確率的探索法（stochasticsearch methods）を含む当業界で公知となった他の方法も用いられることができる。メタヒューリスティクス方法、例えばハーモニー探索法（harmony search）もまた用いられることができる。
（臨床サンプルの獲得）
【０１７４】
バイオマーカーを選択するために、患者群及び対照群を図１と表１に記載された研究デザインによって収集した。患者群は、病期が１期〜４期の非小細胞肺癌を患うアジア人である。対照群は、健常者と非悪性肺結節を患う患者からなる。各サンプルは、静脈穿刺によって抽出し、血清は一般的なプロトコルによって獲得した。それぞれの血清は、零下８０℃以下で凍結して保存した。
（候補バイオマーカーの測定）
【０１７５】
候補マーカーの測定のために、アプタマー基盤の重検定法を図２に示すように実施した。光で切断可能なリンカーを通じてビオチン・フラグメントを各アプタマーに連結する。簡単に言えば、修正アプタマー混合体を希釈の血清と混合し、３時間３７℃で培養して平衡結合を行う。その後、前記混合液は、ストレプトアビジン（streptavidin）でコーディングされたプレートに移送され、ビオチン・タグを通じてアプタマータンパク質複合体をアプタマー上に捕獲するために３０分間培養した。一連の洗浄段階を行い、サンプルから非結合タンパク質を除去した。その後、ビオチンを捕獲されたタンパク質にタギングするために、アミン反応性のビオチン試薬を培養した。その後、紫外線を照射してプタマータンパク質複合体を光切断反応によって解除した。上澄液は、ストレプトアビジン（streptavidin）でコーディングされた新たなプレートに移送され、ビオチン・フラグメントによって複合体をタンパク質上に捕獲するために培養した。一連の洗浄段階を行って非結合アプタマーを除去した。その後、捕獲されたアプタマーを溶出緩衝液で高ｐＨにより解除して中性化した。溶出液は、検出プローブとルミネックス-ビード結合捕獲ブローブと脱水反応を起こす。ルミネックス-ビード混合体は洗浄され、ルミネックス２００器具を用いて測定され、データはルミネックス３.１ソフトウェアを用いて分析された。
（バイオマーカー値の調整（calibration））
【０１７６】
検定変化を最小化するために、３点ＱＣサンプルをサンプルと共に測定した。３点は、検定法の検出範囲でタンパク質濃度の高レベル、中レベル及び低レベルを示す。ＱＣサンプルは、血清とスパイクタンパク質（spiked protein）からなり、従来テストを行った名目値を確認した。各検定時にＱＣサンプルのテストを行い、ＱＣサンプルで測定されたタンパク質の値を名目値と比較し、各タンパク質に対して調整因子を生成した。その後、検定の結果を調整因子を利用して調整した。
（非小細胞肺癌のためのバイオマーカーの選定）
【０１７７】
非小細胞肺癌のための小規模のバイオマーカーセットを選択するために、患者群と対照群の調整されたＭＦＩ値を比較し、累積分布グラフと各アプタマーに対するＲＯＣ曲線を導出した（図４Ａ〜図４Ｎ）。各マーカーは、曲線下領域をテストして比較した。
（単純ベイズ分類器の確立）
【０１７８】
多数の変化量を単一のスコアとするために、単純ベイズ分類器を生成した。非小細胞肺癌のためのバイオマーカーリストから、７つのマーカーを選択して単純ベイズ分類器を構成した。単一タンパク質の測定のための単純ベイズ分類器を以下に説明する。タンパク質の測定値がｘである場合、疾病を患う確率はＰ（ｄ｜ｘ）である。そして、タンパク質の測定値がｘである場合、疾病を患わない確率はＰ（ｃ｜ｘ）である。Ｐ（ｄ｜ｘ）＞Ｐ（ｃ｜ｘ）である場合、タンパク質レベルｘは疾病に分類できる。
【０１７９】
ベイズ整理によって、
事後確率（posterior）=尤度（likelihood）×事前確率（prior）/証拠（evidence）
【０１８０】
クラス-依存性確率密度関数、ｐ（ｘｉ｜ｃ）及びｐ（ｘｉ｜ｄ）は、平均ｕと偏差ｓ２により規定されるログ-ノーマル分布関数でモデリングされ、ここでｘｉはバイオマーカーｉに対する調整ＭＦＩ値のログ値である。前記７つのバイオマーカーのｐｄｆのための変数は表３に記載されており、正規ｐｄｆに適合したモデルと共に未加工データの一例は図３に示す。このようなモデルのための単純ベイズ分類は、次式で表され、ここでｐ（ｄ）は集団の疾病罹病率である。
【０１８１】
（数式１）
尤度比率（likelihood ratio）＝Ｐ（ｄ｜ｘ）／Ｐ（ｃ｜ｘ）＝ｐ（ｄ）／（１−ｐ（ｄ）ｘＰｉ（ｐ（ｘ｜ｄ）／ｐ（ｘ｜ｃ））
対数尤度比は、疾病の状態を区分するための単一スコアで用いられる。
［実施形態］
【０１８２】
下記例は、単なる例示的目的のために提供されており、添付の請求の範囲により定義される本願の範囲を制限しない。本願に記載されている全ての例は、当業者に周知された標準技術を利用して実施されている。下記例に示した一般的な分子生物学技術は、Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,（２００１）といった標準実験室マニュアルに記載されているように実施され得る。
（実施形態１：サンプルの製造）
【０１８３】
サンプルを製造するために、全血をレッドトップチューブ（red top tube）に保管しなければならない。全血を採取した後、血液が３０分間凝固するようテストチューブを常温で正常に培養する。その後、冷蔵遠心分離器で１０分間１,０００〜２,０００ｘｇで遠心分離を行い、血清と血栓を分離することができる。遠心分離後、上層部の血清を直ちに清潔なチューブに移動させなければならない。サンプルは、処理過程で２〜８℃の温度で維持しなければならない。血清が現場で分析されなければ、前記血清を直ちに少量のアリコート（aliquot）で分注して零下２０℃以下で保存しなければならない。冷凍-解凍の周期は、多くの血清成分に致命的であるため、避けることが重要となる。溶血性、黄疸性、又は高脂血症のサンプルは、特定のテストを無効化することができる。
（実施形態２：多重アプタマー検定法によるサンプルの分析）
【０１８４】
本実施形態は、表２に記載されている非小細胞肺癌バイオマーカーの識別のためのサンプルを分析するために用いられる多重のアプタマー検定法を記述する。これらの方法では、溶液を添加する度にピペットチップを交換した。
【０１８５】
更に、他の記載がない限り、大半の溶液の移動と洗浄液の添加は、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬ  ４０６洗浄器とディスペンサを用いた。他の記載がない限り、手作業でピペットする段階では８−チャンネルＰ２００  Ｐｉｐｅｔｔｅｍａｎ（Rainin Instruments, LLC, Oakland, Calif.）を用いた。ＳＢ１７と呼ばれるカスタマイズバッファは内部で製作し、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０１ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣＬ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及びｐＨ７.５の１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる。他の記載がない限り、全ての段階は常温で実施された。
【０１８６】
１.アプタマーストック溶液（aptamer stock solution）の製造
２％、０.１％及び０.０１％血清のためのカスタマイズ・ストックアプタマー溶液を１ｘＳＢ１７、０.０５％ツイン-２０で２ｘ濃度で製造した。
【０１８７】
これらの溶液を使用するまで、零下２０℃で保管した。検定する日、各アプタマー混合液は１０分間３７℃で解凍し、１０分間沸騰する水槽に置いて２０分間２５℃に冷やし、各段階の間で活発な混合が起きた。加熱-冷却後、それぞれの２ｘアプタマー混合液５５ｕｌを手作業で９６-ウェルＰＣＲプレートにピペッティングし、プレートをホイールで密封した。
【０１８８】
２.検定サンプルの製造
零下８０℃で保管された凍結１００％の血清アリコートを５分間、２５℃の水槽に入れた。解凍したサンプルを氷上に載置し、ゆっくりと渦流が起きるようにしておき、その後、再び氷上に載置した。
【０１８９】
２０ｕｌ  ８-チャンネルピペットを用いて、３ｕｌサンプルを９６-ウェルＰＣＲプレートに移動させることにより、各ウェルには４℃で適正なサンプル希釈液７２ｕｌ（１ｘＳＢ１７、０.０２％ツイン-２０）を入れ、４％サンプル液（最終２ｘ）を準備した。数回ピペッティングしてサンプルを混合した後、４％サンプル溶液４ｕｌを移動させて適正なサンプル希釈液７６ｕｌと混合し、０.２％サンプル液（最終２ｘ）が得られた。最後に、０.２％サンプル液６ｕｌを移動させてサンプル希釈液５４ｕｌと混合し、０.０２％サンプル液（最終２ｘ）が得られた。サンプル希釈液を準備した後、各サンプル５５ｕｌを平衡結合のために新しいＰＣＲプレートに移動させた。
【０１９０】
３.平衡結合
３つの加熱-冷却アプタマー溶液を体積５５ｕｌの適正なサンプル希釈液に移動させた。サンプルとアプタマー溶液をピペッティングして混合し、ホイールカバーを覆った。その後、前記プレートを３時間、３７℃の培養器に置いた。
【０１９１】
４.キャッチ１（Catch １）
平衡結合段階の後、アプタマー-サンプル混合液１００ｕｌをストレプトアビジンでコーティングされた新しいプレートに移し、該プレートをサーモミキサ（thermomixer）に置いて、３０分間（８００ｒｐｍで）混合しながら３７℃で培養した。光を避けるために、前記プレートをキャッチ１段階の間、覆っておいた。
【０１９２】
５.自動化段階１：洗浄、タギング
キャッチ１段階の後、前記プレートをＥＬ４０６洗浄器とディスペンサに置いた。前記ＥＬ４０６洗浄器とディスペンサは、次の段階を実施するようにプログラム化されている：吸収されない物質は吸引によって除去し、ウェルは１ｍＭのデキストラン硫酸と５００ｕＭのビオチンを補充した３００ｕｌの緩衝液ＰＢ１で４回洗浄した。その後、ウェルを３００ｕｌの緩衝液ＰＢ１で更に３回洗浄した。
【０１９３】
緩衝液ＰＢ１で新たに準備した１ｍＭ  ＮＨＳ-ＰＥＧ４-ビオチン溶液１５０ｕＬをウェルに添加して５分間振りながら培養した。液体は吸引され、ウェルは１０ｍＭのグリセリンが補充された３００ｕｌの緩衝液ＰＢ１で８回洗浄した。１ｍＭのデキストラン硫酸を補充した１００ｕｌの緩衝液ＰＢ１を添加した。
【０１９４】
６.動的誘発（kinetic challenge）、光切断及びキャッチ２
プレートをＥＬ４０６洗浄器とディスペンサから取り出して２０分間５ｃｍ離れた紫外線光源（ＬＥＤ紫外線光源）の下に配置されたサーモミキサに載置した。前記サーモミキサは、８００ｒｐｍ及びＲＴにセッティングされた。５分間照射した後、サンプルを洗浄した新たなストレプトアビジン・コーティングプレートに手作業で移した。キャッチ２段階は１０分間、８００ｒｐｍ及び常温のサーモミキサで行われた。
【０１９５】
７.自動化段階２：洗浄、溶出
キャッチ２段階の後、前記プレートをＥＬ４０６洗浄器とディスペンサに載置した。前記ＥＬ４０６洗浄器とディスペンサは、次の段階を実施するようにプログラムされている:液体を吸引し、２５％のプロフィレン・グリコールを補充した３００ｕｌの緩衝液ＰＢ１で８回洗浄した。ウェルを３００ｕｌの緩衝液ＰＢ１で５回洗浄し、最終洗浄液を吸引した。１００ｕｌのＣＡＰＳＯ溶出緩衝液を添加し、アプタマーを５分間振りながら溶出した。
【０１９６】
８．溶出及び中性化
これらの自動化段階の後、前記のプレートをプレート洗浄器のデッキから取り出し、９０ｕｌのサンプルアリコートを手作業で１０ｕＬの中性化緩衝液を含んでいるＰＣＲプレートのウェルに移した。
【０１９７】
９．ルミネックスの読み出し
微小球体（microsphere）を浮遊させるために、６０秒間微小球体のストック溶液に渦流を起こして超音波処理を施した。浮遊する微小球体は、１.５ｘＴＭＡＣ混成化溶液で毎反応当たり２０００個の微小球体に希釈され、渦流及び超音波処理を施して混合された。毎反応当たり３３ｕＬのビード混合液を９６-ウェルＰＣＲプレートに移した。１ｘＴＥ緩衝液で１５ｎＭビオチン化された検出オリゴヌクレオチド・ストック７ｕｌを毎反応ごとに添加して混合した。中性化された検定サンプル１０ｕｌを添加し、前記プレートをシリコンキャップマットシールで封じた。前記プレートをまず５分間９６Cで培養し、遺伝子増幅器で一晩の間に攪拌せずに５０Cで培養した。フィルタープレートを０.５％ＢＳＡが補充された０.００５ｘＴＭＡＣ混成化溶液で予め浸しておいた。前記の混成化反応によりサンプル全体をフィルタープレートに移した。前記混成化プレートは０.５％ＢＳＡが補充された０.００５ｘＴＭＡＣ混成化溶液７５ｕｌで洗浄し、残存の物質はフィルタープレートに移した。サンプルを緩い真空下でフィルターリングした。前記フィルタープレートは、０.５％ＢＳＡが補充された０.００５ｘ ＴＭＡＣ混成化溶液７５ｕｌで１回洗浄し、フィルタープレートにある微小球体はサンプル緩衝液で更に１回浮遊処理を施した。フィルタープレートは遮光して１０００ｒｐｍで５分間サーモミキサで培養した。その後、フィルタープレートを０.５％ＢＳＡを含む０.００５ｘＴＭＡＣ溶液で洗浄した。０.５％ＢＳＡを含む０.００５ｘＴＭＡＣ溶液で１０ｕｇ／ｍｌ ＳＡＰＥ ０７５ｕｌを各反応ごとに添加し、１時間１０００ｒｐｍで２５℃のサーモミキサで培養した。フィルタープレートを０.５％ＢＳＡを含む０.００５ｘＴＭＡＣ溶液で２回洗浄し、フィルタープレートにある微小球体は０.５％ＢＳＡを含む０.００５ｘＴＭＡＣ混成化溶液７５ｕｌで更に１回浮遊処理を施し、ＸＰｏｎｅｎｔ３.０ソフトウェアを稼動するルミネックス２００器具上で分析した。７５００〜１８０００の高ＰＭＴ調整及びダブレット判別器のセッティング下で、ビード類型当たりに少なくとも１００個の微小球体を計数した。
（実施形態３：バイオマーカーの識別）
【０１９８】
検定変化を最小化するために、３点のＱＣサンプルをサンプルと共に測定した。３点は、検定法の検出範囲でタンパク質濃度の高レベル、中レベル及び低レベルを示す。ＱＣサンプルは、血清とスパイクタンパク質（spiked protein）からなり、従来テストを行った名目値を確認した。各検定時にＱＣサンプルのテストを行い、ＱＣサンプルで測定されたタンパク質の値を名目値と比較し、各タンパク質に対して調整因子を生成した。調整因子を名目値／テスト値と称することができる。その後、検定の結果を調整因子を利用して調整した。
【０１９９】
非小細胞肺癌のための小規模のバイオマーカーセットを選択するために、患者群と対照群の調整されたＭＦＩ値を比較し、各アプタマーに対するＲＯＣ曲線を導出した（図４Ａ〜図４Ｎ）。各マーカーは、曲線下領域のテストを行って比較した。
（実施形態４：非小細胞肺癌のための単純ベイズ分類器トレーニング）
【０２００】
多数の変化量を単一スコアとするために、単純ベイズ分類器を生成した。非小細胞肺癌のためのバイオマーカーリストから、７つのマーカーを選択して単純ベイズ分類器を構成した。単一のタンパク質の測定のための単純ベイズ分類器を以下に説明する。タンパク質の測定値がｘであれば、疾病を患う確率はＰ（ｄ｜ｘ）である。そして、タンパク質の測定値がｘである場合、疾病を患わない確率はＰ（ｃ｜ｘ）である。Ｐ（ｄ｜ｘ）＞Ｐ（ｃ｜ｘ）であれば、タンパク質レベルｘは疾病に分類され得る。ベイズ整理によって、
事後確率（posterior）=尤度（likelihood）×事前確率（prior）/証拠（evidence）
【０２０１】
クラス-依存性確率密度関数、ｐ（ｘｉ｜ｃ）及びｐ（ｘｉ｜ｄ）は、平均ｕと偏差ｓ２により規定されるログ-ノーマル分布関数でモデリングされ、ここでｘｉはバイオマーカーｉに対する調整ＭＦＩ値のログ値である。前記７つのバイオマーカーのｐｄｆのための変数は表３に記載されており、正規ｐｄｆに適したモデルと共に未加工データの一例は図５Ａ〜図５Ｃに示す。このようなモデルのための単純ベイズ分類は、次式で表され、ここでｐ（ｄ）は集団の疾病罹病率である。疾病の尤度Ｐ（ｄ｜ｘ）／Ｐ（ｃ｜ｘ）は、下記のように表され得る。
【０２０２】
（数式１）
Ｐ（ｄ｜ｘ）／Ｐ（ｃ｜ｘ）＝ｐ（ｄ）／（１−ｐ（ｄ）×Ｐｉ（ｐ（ｘ｜ｄ）／ｐ（ｘ｜ｃ））
対数尤度比（Ｐ（ｄ｜ｘ）／Ｐ（ｃ｜ｘ））は、疾病の状態を区分するための単一スコアで用いられる。
【０２０３】
７-マーカー分類器のための変数は、表４に記載されているように算出された。更に、トレーニングされた分類器は、図５Ａ〜図５Ｃ及び図７に示すように、疾病区分性能を示した。
（実施形態５）
【０２０４】
診断性能が損なわれることなく、パネルに要求されるバイオマーカーの最小の個数を最適化するために、貪欲後方消去アルゴリズム（greedy backward elimination algorithm）を用いた。簡単に言えば、７つの６-マーカー分類器を構成したものの、前記７-マーカーモデルに比べて性能が劣った（図６Ａ〜図６Ｇ及び表６）。肺癌診断のためのパネルを単純化するために、最小個数のタンパク質により最適の性能を示すように最終７-マーカーモデルを選択した。
（実施形態６：７-マーカー分類器の検証）
【０２０５】
分類器の疾病区別性能を検証するために、テストを行わないサンプルをアプタマー基盤の多重検定法で測定した。７つのマーカーの測定値を７-マーカー分類器に適用し、これらはトレーニングセットのある類似するＲＯＣ曲線を示した（図５Ａ〜図５Ｃ及び図７、表５）。
（実施形態７：従来の血液テストと性能比較、Ｃｙｆｒａ  ２１−１）
【０２０６】
７-マーカー分類器の性能を比較するために、サンプル全部をＣｙｆｒａ２１-１ Ｅｌｉｓａキットを用いてテストを行った。酵素-テストＣｙｆｒａ２１-１（DRG Instruments GmbH, Germany）は、一般のサンドウィッチプロトコルに沿って酵素免疫検定技術に基づく。Ｃｙｆｒａ２１-１の濃度は、標準曲線から算出した。検定法の感度は、０.１５ｎｇ/ｍＬであった。Ｃｙｆｒａ ２１-１のＲＯＣ曲線を描いて７-マーカー分類器のＲＯＣ曲線と比較した（図７Ａ及び図７Ｂ）。
【０２０７】
前記分類器のＡＵＣは、全ての非小細胞肺癌ケースで０.８８、初期肺癌患者（１期及び２期）で０.８３が観察された一方、Ｃｙｆｒａ ２１-１は全てのケースに対して０.７２のＡＵＣ、初期肺癌患者には０.６３のＡＵＣが確認された（図７Ａ及び図７Ｂ）。
【０２０８】
【表１】
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【０２０９】
【表２】
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【０２１０】
【表３】
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【０２１１】
【表４】
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【０２１２】
【表５】
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【０２１３】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図４Ｍ】
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【図４Ｎ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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