(57)【要約】  本出願は、対象が前立腺癌に罹患するリスクを評価するための新しいin vitro方法に関する。当該方法は、患者からの尿サンプルにおいてhsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7e- 5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-1238-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-1260a, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-1972, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-320b, hsa-miR-320c, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-425-3p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-99a-5p, and hsa-miR-99b-5pからなるmiRの群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルを測定することを含む。少なくとも2つの選択されたmiRがhsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pである方法が好ましい。本出願は、in vitro方法を実施するためのキットの部品にも関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体が前立腺癌に罹患するリスクを評価するためのin vitro方法であって、前記被験体からの尿サンプルにおいて、hsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-1238-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-1260a, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-1972, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-320b, hsa-miR-320c, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-425-3p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-99a-5pおよびhsa-miR-99b-5pからなるmiRの群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルを測定することを含み、健康なドナーと比較して前記少なくとも2つのmiRの変化した発現レベルが、前記被験体が前立腺癌に罹患している確率が高いことを示す方法。
【請求項２】
前記少なくとも2つのmiRが、hsa-let-7a-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-1238-3p, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29c-3p , hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-93-5pおよびhsa-miR-99a-5pからなるmiRの群から選択される、請求項1に記載のin vitro方法。
【請求項３】
少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-93-5pおよびhsa-miR-99a-5pからなるmiRの群から選択される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-5pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-375およびhsa-miR-378a-3pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-375およびhsa-miR-378a-3pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-331-3pおよびhsa-miR-375からなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5pおよびhsa-miR-331-3pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-30c-5pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-24-3pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiRの群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも2つのmiRが3、4、5またはそれ以上のmiRである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも2つの選択されたmiRが、hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも2つの選択されたmiRが、hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pである、請求項１−１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも2つの選択されたmiRが、hsa-miR-30c-5pおよびhsa-miR-31-5pである、請求項１−１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
発現レベルが正規化された発現レベルである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
発現レベルは正規化された発現レベルであり、正規化は、hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-27b-3pおよびhsa-miR-23b-3pという5つのmiRsの平均正規化値を計算することによって行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
発現レベルは正規化された発現レベルであり、正規化はhsa-miR-200b-3p, hsa-miR-27b-3pおよびhsa-miR-30b-5pという3つのmiRsの平均正規化値を計算することによって行われる、請求項１−１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記miRの発現レベルは、前記尿サンプルから調製されたエキソソーム調製物中で測定される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前立腺癌のリスクを評価される被験体は、事前の標準的な前立腺特異抗原（PSA）測定による血清PSAレベルが10ng / mL未満であることによって特徴付けられる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
尿サンプルは、尿を採取する直前に前立腺マッサージを受けた被験体からのものである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
被験体が前立腺癌に罹患しているリスクの評価は、前記試料中の前記少なくとも2つのmiRのレベルを検出し、前記少なくとも2つのmiRの発現レベルデータを含むデータセットに基づく診断スコア（S）を算出することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記miRの発現レベルは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Q-PCR）の方法によって決定される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
診断スコアSは、hsa-miR-30c-5pの発現レベル対hsa-miR-31-5pの発現レベルの比として算出される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
診断スコアSは、hsa-miR-24-3pおよびhsa-miR-222-3pの発現レベル対hsa-miR-30a-5pの発現レベルの比として算出される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２８】
診断スコアSは、hsa-miR-24-3pおよびhsa-miR-222-3pの発現レベル対hsa-miR-30c-5pの発現レベルの比として算出される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２９】
診断スコアSが下記式により計算される:
【数１】
2018504915.tif 000045
（式中、「C」は閾値サイクル値（Ct）または交差点値（Cp）であり、XおよびYは線形回帰によって決定される係数である）
請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
診断スコアSが下記式により計算される:
【数２】
2018504915.tif 000046
（式中、「C」は、hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-30a-5pのそれぞれの定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）によって得られた閾値サイクル値（Ct）または交差点値（Cp）である）
請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
診断スコアSが下記式により計算される:
【数３】
2018504915.tif 000047
（式中、「C」は、hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-30c-5pのそれぞれの定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）によって得られた閾値サイクル値（Ct）または交差点値（Cp）である）
請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
診断スコアSが下記式により計算される:
【数４】
2018504915.tif 000048
（式中、X = (X1,…,Xp)は、各個々のサンプルについての正規化値から各個々のサンプルについての生データCq値を減算することによって得られた特定のmicroRNAアッセイのΔCq値であり、β0,…,βpは最尤法により推定された係数である）
請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項３３】
ΔCq値は、hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-27b-3pおよびhsa-miR-30b-5pのmicroRNAアッセイのCq値の平均のCq値に関して正規化された、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5pおよびhsa-miR-331-3pに対する特定のマイクロRNAアッセイの値である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ΔCq値は、hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-27b-3pおよびhsa-miR-30b-5pのmicroRNAアッセイのCq値の平均のCq値に関して正規化された、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-24-3pおよびhsa-miR-31-5pに対する特定のマイクロRNAアッセイの値である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前立腺癌治療を必要とする患者を治療する方法であって、患者が前立腺癌に罹患する確率が増加しているかどうかを判定するために、上記請求項いずれかに記載の診断テストを実行し、この情報に基づいて患者のための適切な治療法を選択することを含む方法。
【請求項３６】
被験体が前立腺癌に罹患するリスクをin vitroで評価するためのキットであって、前記験体からの尿サンプルにおいて、hsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-1238-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-1260a, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-1972, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-320b, hsa-miR-320c, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-425-3p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-99a-5pおよびhsa-miR-99b-5pからなるmiRの群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルの測定に必要な試薬のアリコートを含み、ここで、健康なドナーと比較して前記少なくとも2つのmiRの変化した発現レベルが、前記被験体が前立腺癌に罹患している確率が高いことを示す、キット。
【請求項３７】
miR群がhsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5pおよびhsa-miR-331-3pからなる、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
少なくとも２つのmiRがhsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5pおよびhsa-miR-331-3pから選択される、請求項３６または３７に記載のキット。
【請求項３９】
少なくとも２つのmiRがhsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pから選択される、請求項３６に記載のキット。
【請求項４０】
少なくとも２つのmiRがhsa-miR-30a-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pから選択される、請求項３６に記載のキット。
【請求項４１】
1つまたはそれ以上の健常コントロール(s)からのmiRNA発現データの少なくとも1つの参照セットをさらに含む、請求項３６−４０のいずれかに記載のキット。
【請求項４２】
尿サンプルのエキソソーム調製物を得るために必要な試薬をさらに含む、請求項３６−４１のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺癌における過剰診断の問題を軽減するための方法に関する。尿中のいくつかの特徴的なmicroRNAバイオマーカーのレベルを測定することにより、この方法は、さらなる侵襲的診断手順の利益を受ける前立腺癌患者を事前に選定することができる。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌（PC）は、前立腺に由来する悪性腫瘍であり、最も一般的に診断され治療された悪性腫瘍であり、西洋諸国の男性の癌関連死の主要な原因の1つである（1）。約6人に1人の男性が前立腺癌と診断され、多くの高齢男性が最終的にこの病気を発症する。
【０００３】
診断時に、大部分の男性は、予後良好な局所性の前立腺癌（前立腺に限局した癌）を有している。男性の約5％は、身体全体に広がっている進行癌または遠隔癌と診断される。そのような診断を受けた男性にとって、5年相対生存率は29％でしかない。しかし、非転移性PCに対してのみ治癒的治療が可能であるため、PCの早期発見は極めて重要である。
【０００４】
PCは、典型的には前立腺特異抗原（PSA）レベルの上昇に基づいて診断され、続いて針生検の組織病理学的検査が行われる。しかしながら、PC検出のためのPSAの使用は、かなりの偽陽性率が付随する。スクリーニングに4,0ng / mlのPSAカットオフを使用すると、65％の偽陽性率および20％の偽陰性率が存在する（2）。特に、中間範囲領域（2〜10ng / mL）におけるPSAレベルは、予測値が非常に低いグレーゾーン領域を示す。当然ながら、このような割合は、他のバイオマーカー、特に容易に入手可能なバイオフルイドに見出され、入手することが比較的安価なバイオマーカーの探索を促している。現在のところ、出願人の知る限り、この取り組みに成功した例はない。
【０００５】
したがって、PCの早期診断を改善し、不必要な生検に関連する男性の数を減らすことができる方法を開発するための、重大かつ、未だ対処されていないニーズがある。本研究ではそのような方法の一つを提示する。
【０００６】
前立腺癌の潜在的バイオマーカーの新たなクラスは、microRNAs（miRs）である。
【０００７】
MicroRNAは、哺乳動物を含む多様な生物において転写後レベルで遺伝子発現を制御する、内在性の小さな非コード調節RNA（〜22nt）のクラスを含む（3）。microRNAは、RNAポリメラーゼIIによる長い不完全な対になったステムループ一次microRNA転写物（pri-microRNA）として転写され、さらに核RNaseIIIエンドヌクレアーであるDroshaによってヘアピン前駆体microRNA（pre-microRNA）に加工される（4）。Exportin-5-Ran-GTPによる細胞質へのエクスポート後、別のRNaseIIIエンドヌクレアーゼであるDicerは、pre-microRNAを成熟-22nt microRNA二本鎖に切断する（4）。成熟microRNAは、microRNA誘導サイレンシング複合体（miRISC）に組み込まれて、それらの機能を媒介する。microRNAは、この複合体を完全/ほぼ完全な相補的な標的mRNAに導き、翻訳阻害またはmRNA分解をもたらす（5）。
【０００８】
MicroRNAは、遺伝子制御分子の中で最も豊富なクラスの1つであり、miRBase（バージョン21）の最新リリースは2588の成熟ヒトmicroRNA（1881前駆体）を含むhttp://www.mirbase.org/ (6)。全体としてmicroRNAは、すべてのヒトmRNAの3分の2までを調節すると推定されている。その結果、microRNAは、細胞の分化、細胞周期の進行およびアポトーシスなどの細胞内の多数のプロセスに影響を及ぼし、microRNAの制限解除は、癌を含むヒトの病態に関連することが多い（7）。さらに、いくつかのmicroRNAは細胞型特異的および疾患特異的であり、無秩序なmicroRNA発現は癌の発生および進行の両方に関連している（8）。このように、異常なmicroRNA発現は、早期癌診断のための新規なバイオマーカーの有望な潜在源として研究されている（8）。さらに、microRNAは、癌のためのmicroRNAベースの治療法の標的として使用される可能性がある（9）。いくつかのmicroRNAプロファイリング研究でも、PCの発症および/または進行において異常に発現したmicroRNAが報告されている（10）。しかしながら、これまでに発表されたPCのmicroRNAバイオマーカーの研究の大半は、被験体患者数が比較的少なく、また、同定されたmicroRNA候補のバイオマーカーとしてのポテンシャルを確かめるための厳密で独立した臨床での検証が欠けている場合が多い。
【０００９】
重要なことに、我々の知る限りでは、尿などの非侵襲的サンプルで検出されたmicroRNAバイオマーカーに基づく診断方法は出現していない。
【００１０】
そこで、750を超える最も豊富なmicroRNAについてmiRnomeプロファイリングを実施し、異なる疾患段階にわたり、無細胞尿中で検出可能な183個のmicroRNAを選択した（実施例1）。これらの183個のmicroRNAから、根治的前立腺切除術（RP）による前立腺除去の前に尿を採取されたPC患者に対して、良性前立腺肥大患者において著しく異常な制御を受けるmicroRNAを同定した（実施例2）。このデータセットから、非PC験体と比較してPCにおける有意に異なる発現をする少数のmiR群を同定した。さらに、コホート1において2つのmicroRNAのみからなる診断的分類指標を同定し、その診断精度を評価した。この2microRNA分類指標は、独立したコホート2において首尾よく有効性が確認された（実施例3）。堅牢性を調べるために、コホート1および2（実施例4）とはかなり異なる方法で標本をサンプリングし処理した独立コホート（コホート3）にアッセイを適用した。興味深いことに、前記の2microRNA分類指標は、このコホートでも首尾よく有効性が確認された。さらに、ディスカバリーコホートはコントロールの数に制限があるため、コホート1とコホート2を合わせて、合わせたデータに基づいてより強い統計的検定力を有する分類指標を確立することが有益であると思われた。このアプローチは実施例5において遂行され、僅かに異なる20-miR分類指標が同定されたが、驚くべきことに、そのAUCは0.99という高い値であり、特異性は95.5％、感度は93.6％であった。
【００１１】
2つのmiR診断分類指標（比計算を含む）は、試験されたすべての単一miRNAと比較して、向上した正確性を示した。興味深いことに、同定されたすべての分類指標は、全前立腺特異抗原（tPSA）試験と比較して有意に改善された精度を有することを示した。この試験のAUCは、0.59という低い値（11）、またはさらに低い値（12）であることが報告されている。
【００１２】
同定されたmicroRNAバイオマーカーの有効性を確認するために、更に205のPCサンプルのセットを追加し、コホート1およびコホート2からの非癌サンプルを2つのコホート間で均等かつ、無作為に分布させた2つの新しいコホート（それぞれコホート4およびコホート5）で分類指標の確立および検証を繰り返した。また、より厳しいデータフィルタリングパラメータを用いて、アッセイ選択および分類指標確立のための異なる統計的方法が適用された。
【００１３】
この研究から、3〜10個のmicroRNAからなる診断分類指標（以前の研究と有意な重複を有する）を同定し、コホート4において、それらの診断能力を評価した（実施例8）。分類指標は、独立したバリデーションコホート5で首尾よく有効性が確認された（実施例9）。驚くべきことに、この分類指標は、意図した用途のサブポピュレーション、即ち10ng / mL未満のPSAレベルを有する患者で検証した場合に、より優れた結果をを示した（実施例10）。
【００１４】
上述したように、比率に基づく分類指標は、正規化アッセイの必要性を回避し、それによって試験に含まれるアッセイの数を減らす能力があるため、魅力的である。ディスカバリーコホート4において高い診断能力を示した、このような比に基づく各々3つのアッセイからなる2つの分類指標を同定した（実施例11）。2つの比に基づく分類指標は、バリデーションコホート5において首尾よく有効性が確認された（実施例12）。最終的に、これらの比に基づく分類指標は、意図した用途ポピュレーションにおいて検証したところ、より正確であることが証明された。この場合も、3-10miR分類指標および2つの比に基づく分類器指標の両方が、試験されたすべての単一miRNAと比較して、向上した正確性を示した。興味深いことに、識別されたすべての分類指標は、全前立腺特異抗原（tPSA）検査と比較して有意に向上した正確性を有することを示した。実施例4の2 miR分類指標の場合と同様に、根本的に異なるコホート3における2つの3-miR比に基づく分類指標の診断上の堅牢性も試験した。この分析は、3-miR比に基づく分類指標の少なくとも1つがコホート3においてさえも堅牢かつ、有効であることを示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
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【非特許文献２１】Tom Mitchell, Machine Learning, McGraw Hill, 1997.
【発明の概要】
【００１６】
前立腺特異抗原（PSA）法はかなりの偽陰性率を伴い、臨床的に無痛または侵略的な腫瘍を十分に区別しないので、単独でまたは既存のマーカーと組み合わせて使用できる新規の前立腺癌マーカーが必要とされている。本発明は、1組のマーカーと、それらをPC診断のための予備選択患者に適用する方法を提示する。
【００１７】
したがって、第1の態様において、本発明は、対象が前立腺癌に罹患するリスクを評価するためのin vitro方法であって、前記験体からの尿サンプルにおいてhsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7f- 5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR- 1238-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-1260a, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141 -3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR- 146a-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-151 a-3p, hsa-miR-151 a-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191 -5p, hsa-miR-1972, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-200b- 3p, hsa-miR-200b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR- 20a-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR- 29b-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa- miR-30e-5p, hsa-miR-31 -3p, hsa-miR-31 -5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-320b, hsa-miR-320c, hsa-miR- 331 -3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-378a-3p, hsa- miR-425-3p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-99a-5p,およびhsa-miR-99b-5p,からなるmiRの群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルを測定することを含み、ここで、健康なドナーと比較して前記の少なくとも2つのmiRの変化した発現レベルは、前記被験体が前立腺癌に罹患している確率が高いことを示す、方法に関する。
【００１８】
本発明の最も好ましい実施形態は、少なくとも2つの選択された25個のmiRがhsa-miR-24-3p、hsa-miR-222-3p、およびhsa-miR-30c-5pであるインビトロ法である。ほぼ等しく好ましい実施形態は、少なくとも2つの選択されたmiRがhsa-miR-24-3p、hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-30a-5pであるインビトロ法である。
【００１９】
本発明の重要な態様は、以前の30の標準前立腺特異抗原（PSA）測定が、その血清PSAレベルが10ng / mL未満であることを示した患者集団にこの方法を適用することである。
【００２０】
診断スコア（S）を計算することを含む生体外診断方法は、本発明の有用な態様である。
【００２１】
さらに、本発明の態様は、験体が前立腺癌に罹患しているリスクをin vitroで評価するためのキットであって、前記験体からの尿サンプルにおいてhsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa- let-7c-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR- 40 10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-1238-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-1260a, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR- 141 -3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-151 a-3p, hsa-miR-151 a-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191 -5p, hsa-miR-1972, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR- 5 204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR- 22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR- 27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31 -3p, hsa-miR-31 -5p, hsa-miR-320a, hsa- miR-320b, hsa-miR-320c, hsa-miR-331 -3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363-3p, hsa- 10 miR-375, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-425-3p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-99a-5p,およびhsa-miR-99b-5pからなるmiRの群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルを測定することを含み、ここで、健康なドナーと比較して前記の少なくとも2つのmiRの変化した発現レベルは、前記被験体が前立腺癌に罹患している確率が高いことを示す、キットに関する。
【００２２】
定義
表現「microRNA」、「miRNA」および「miR」は、内在性遺伝子由来の約18〜25ヌクレオチド（nt）長の非コードRNAを指すために同義語として使用される。microRNAは、pre-miRと呼ばれるより長い（約75nt）ヘアピン様前駆体からプロセシングされる。microRNAは、miRNPと呼ばれる複合体で集合し、アンチセンス相補性によってその標的を認識する。microRNAがその標的と100％一致する場合、すなわち相補性が完全である場合、標的mRNAは切断され、miRはsiRNAのように作用する。一致が不完全である場合、すなわち相補性が部分的である場合、標的mRNAの翻訳はブロックされる。一般に、mirRの命名は、miRBaseの命名法（バージョン21）に従う（表1参照）。
【００２３】
本明細書で使用する「発現」という用語は、細胞内または無細胞生物流体中のRNA分子の転写および/または蓄積を指す。
【００２４】
用語「Q-PCR」または「q-PCR」は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を指す。Q-PCRは、試験サンプル中の特定のDNA（およびRNA）種の量を定量するための高感度の方法である。PCR技術によるRNAの定量化は、RNAが逆転写されることを必要とするので、定量PCRが特定のRNAを定量するために使用されることを示すために、「qRT-PCR」または「RT-Q-PCR」と呼ばれることが多い。Q-PCRおよびqRT-PCR技術の完全な論文は、（13）に見出すことができる。明細書において、「Q-PCR」、「q-PCR」、「qRT-PCR」、「QRT-PCR」または「RT-Q-PCR」は、特異的RNA種（またはDNA）の量を定量する方法として同義的に使用することが出来る。
【００２５】
本明細書において、用語「miRの発現レベル」、「miR発現レベル」および「miRのレベル」は、サンプル中で検出される「特定のmiRの量」の尺度として、同義的に使用される。「特定のmiRの量」は、絶対的、相対的または正規化された尺度のいずれかで表すことができ、定量的および定性的方法の両方によって得られた値を指す。「特異的miRの量」の特に好ましい尺度の一つは、以下と実施例に記載されるリアルタイムRT-Q-PCR（qRT-PCR）によって得られる交差点（Cp）値であり、「量」はデジタルPCR、または様々な次世代配列決定法によって定量化することができる。特定の状況において、例えば、 miR発現レベルの比を用いて診断スコアを計算する場合、miRの絶対的に決定された発現レベルで十分である。しかしながら、miRの絶対発現レベルに基づいて決定を行う代わりに、miRの正規化された発現レベルに基づいて決定することができる。
【００２６】
発現レベルは、その発現を、構成的またはほぼ構成的に発現される遺伝子の発現と比較することによって、miRの絶対発現レベルを補正することによって正規化される。正規化にしばしば使用される適切な遺伝子には、アクチン遺伝子などのハウスキーピング遺伝子が含まれる。本研究では、正規化にmiRコレクションを使用する。典型的に、3または5のmiRNAのコレクションは平均正規化値を計算することことに使用することができる。好ましい3 miR-ノーマライザーは、hsa-miR-200b-3p、hsa-miR-27b-3p、およびhsa-miR-30b-5pである（実施例8参照）。好ましい5 miR-ノーマライザーは、hsa- miR-20a-5p、hsa-miR-30b-5p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-27b-3p、およびhsa-miR-23b-3pである（実施例5参照）。
【００２７】
「ROC曲線」はレシーバーの動作特性曲線の略である。（ROC）曲線は、診断検査を比較するために広く使用されている。
【００２８】
「健康な個体」、「健康なドナー」および「健康な対照」という表現は、前立腺癌患者と区別するのに対して、前立腺癌の明白な徴候が無い明らかに健康な個体を指すために同義語として使用される。
【００２９】
試料
サンプルは、デンマークのオーフス大学病院泌尿器科（1997〜2005年）または英国シェフィールドの医学部腫瘍学科で集められた。
【００３０】
miR分類指標に関連する用語「堅牢性」は、本明細書では、多少異なるサンプリングおよび定量法が使用されているにもかかわらず、PC患者と非PC患者とを区別することに関して相対的に類似の結果を提供する分類指標を表すのに使用される。
【００３１】
「UniRT」は、Exiqon A/Sによって市販されているQ-PCR方法である。方法およびその性能は、実施例1および7、デンマーク特許出願PA2009 00156、EP2391736、および Mestdagh et al. Nat Methods. 2014 Aug;1 1 (8):809-15に記載されている。
【００３２】
本明細書において「カットオフ値」は、miRsの発現量の存在レベルの計算値がその値を上回った（または下回った）場合に、テストサンプルが結腸癌由来であることを示す閾値である。
【００３３】
本発明の実施形態を以下に説明するが、これらはあくまでも例示目的に過ぎない。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の根底にある技術的問題は、対象が前立腺癌に罹患するリスクを評価するための改善されたin vitro方法の提供である。特に、非侵襲的手順をリレーし、結果としてスクリーニング目的のために有用な方法が、広範なPSA検査を補うことができるとの期待の下、斯かる方法を探索した。
【００３５】
バリデーションコホート（実施例3）のディスカバリーコホート（実施例2参照）および実施例5および8に提示されている代替分析の両方において、患者からの尿サンプル中のmiR群の発現レベルは前立腺癌（PC）の診断分類指標として使用可能であることを、出願人は一貫して確認した。miR群は合計76個のmiRからなる（表1参照）。
【００３６】
【表１−１】
2018504915.tif 000002
【表１−２】
2018504915.tif 000003
【表１−３】
2018504915.tif 000004
【００３７】
驚くべきことに、この76群のmiRから引き出されたわずか20,1,0,9,8,7,6,5,4,3または2つのmiRは、標準的なPSAテストで提供されているものをはるかに超える診断精度でPCを有する患者とBPHを有する患者との間を区別するために用いることが出来ることを発見した（実施例5、2、3、4、6、8、9、10、11、12および13参照）。
【００３８】
一般に、ROC曲線のAUC（Under Under Curve）は、診断テストの診断「力」を示す。
T.G.テープは診断のスコアを提供する。それは、
AUC: 0,90-1 = 優
AUC: 0,80-0,90 = 良
AUC: 0,70-0,80 = 並
AUC: 0,60-0,70 = 可
AUC: 0,50-0,60 = 不可
（参考文献：Tape、Thomas G.： "診断検査の解釈"、http://gim.unmc.edu/dxtests/Default.htm）このスコアによれば、本発明の診断分類指標（またはパネル）は良〜優である。
【００３９】
したがって、本発明の1つの態様は、対象が前立腺癌に罹患するリスクを評価するためのin vitro方法であって、前記験体からの尿サンプルにおいてhsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7e- 5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-1 0a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-1238-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-1260a, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-151 a-3p, hsa-miR-151 a-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-1972, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa- miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-320b, hsa-miR-320c, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-425-3p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-99a-5p,およびhsa-miR-99b-5p,からなるmiRの群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルを測定することを含み、ここで、健康なドナーと比較して前記の少なくとも2つのmiRの変化した発現レベルは、前記被験体が前立腺癌に罹患している確率が高いことを示す、方法である。
【００４０】
バリデーション研究で最も重要な20のmiRNAは特に魅力的である（表20）。したがって、本発明の一実施形態は、対象が前立腺癌に罹患するリスクを評価するためのin vitro方法であって、前記験体からの尿サンプルにおいてhsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31 -5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-93-5pおよびhsa-miR-99a-5pからなるmiRの群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルを測定することを含み、ここで、健康なドナーと比較して前記の少なくとも2つのmiRの変化した発現レベルは、前記被験体が前立腺癌に罹患している確率が高いことを示す、方法である。
【００４１】
76または20のmiRを測定することは、日常診療を目的とした診断検査では非実用的と思われ得る。実施例3の表3では、癌および非PCコントロール間の識別のための最も強力な診断可能性を有するmiRNAが示されている。したがって、本発明のさらなる一実施形態は、PCと非PCとの間の識別のためのin vitro方法であって、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222- 3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-5pおよびhsa-miR-31 -5pからなるmiRの群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルを測定することを含む、方法である。
【００４２】
同様に、本発明の実施形態としては、6つの最良ランクのmiR、すなわちhsa-miR-146a-5p, hsa-miR- 16-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-30c-5pおよびhsa-miR-31-5pからなる群から、少なくとも2つのmiRが選択される方法が考慮される。
【００４３】
例えば、コホート１において最も高いAUCを有する4つのmiRSである、hsa-miR-146-5p、hsa-miR-31-5p, hsa-miR-24-3pおよびhsa-miR-30c-5pからなる4miRグループ、hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3p、およびhsa-miR-24-3pからなる3miRグループ、およびhsa-miR-30a-5p, hsa-miR-222-3p,およびsa-miR-24-3pからなる3miRグループなどの他のmiRグループも、表3から導き出すことができる。
【００４４】
さらなる分析により、miRグループから導き出された5および4つのmiRもまた、スタンダード全前立腺特異抗原（PSA）試験と同等またはそれ以上の診断力（ROC曲線のAUC）を有する分類指標をもたらすことを示した。
【００４５】
したがって、本明細書では、被験体が前立腺癌に罹患しているリスクを評価するためのin vitroでの方法であって、前記験体からの尿サンプルにおいて、hsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa- miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-1238-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-1260a, hsa-miR-130a- 3p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa- miR-141 -3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-151 a-3p, hsa-miR-151 a- 5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-1972, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa- miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31 -5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-320b, hsa-miR-320c, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-425-3p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-99a-5p, およびhsa-miR-99b-5p, からなるmiRの群から選択される少なくとも2,3,4,5,6,7または10以上または20以上のmiRの発現レベルの測定を含む方法を提供する。
【００４６】
本発明のさらなる態様において、前記少なくとも2,3,4,5またはそれ以上、10またはそれ以上または20のmiRは、hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-140-3p, hsa- miR-141 -3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-151 a-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191 -5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205- 5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR- 24-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa- miR-30e-5p, hsa-miR-31 -3p, hsa-miR-31 -5p , hsa-miR-320a., hsa-miR-362-5p, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-93-5pおよびhsa-miR-99a-5pからなるmiRの群から選択され、またはhsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa- miR-151 a-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c- 5p, hsa-miR-31 -3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-93-5pおよびhsa-miR-99a-5pからなるmiRの群から選択される。
【００４７】
本発明者等も驚いた知見によれば、最良の分類指標の二つが、僅か3種類の選択されたmiR、即ち、1）hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3p, およびhsa-miR-24-3p、2）hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-222-3p, およびhsa-miR-24-3pのを含んでいた（実施例11,12および13を参照）。よってこれらの２つの特徴が、本発明の好ましい実施形態となる。
【００４８】
僅か２種類の選択されたmiR、即ちhsa-miR-30c-5pおよびhsa-miR-31-5pを含む分類指標も、有利であると思われる（実施例2,3および4参照）。この分類指標は、非常に高い特異性と感度でPCとコントロールを区別する能力を有することに加えて、非常に頑健であり、具体的なサンプリングの方法やmiRレベルの検出の方法に依存しないように見える。
【００４９】
本明細書において、用語「miRの発現レベル」、「miR発現レベル」および「miRのレベル」は、サンプル中で検出される「特定のmiRの量」の尺度として、相互に同義に使用される。「特定のmiRの量」は、絶対的、相対的または正規化された尺度のいずれかで表すことができ、定量的および定性的方法の両方によって得られた値を指す。しかしながら、miRの絶対発現レベルに基づいて決定を行う代わりに、miRの正規化された発現レベルに基づいて決定することもできる。発現レベルは、その発現を、恒常的またはほぼ恒常的に発現される遺伝子の発現と比較することによって、miRの絶対発現レベルを補正することによって正規化される。正規化にしばしば使用される適切な遺伝子には、アクチン遺伝子などのハウスキーピング遺伝子が含まれる。
【００５０】
したがって、本発明の一実施形態において、発現レベルは正規化された発現レベルである。本研究では、正規化のためにmiRのコレクションを使用する。好ましくは、Normfinderからのトップ3またはトップ5の最も安定なmiRNAを用いて、各サンプルの平均正規化値を算出する。したがって、正規化は、3つのmiR、すなわちhsa-miR-200b-3p, hsa-miR-27b-3p, およびhsa-miR-30b-5p、または５つのmiR、すなわちhsa-miR-20a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-23b-3pの平均正規化値を計算することによって行われる。3つのmiR-ノルマライザーが好ましい。
【００５１】
標準的な全前立腺特異抗原（tPSA）検査がスクリーニング目的のために非常に普及している理由の1つは、それが最小限の侵襲的手順（血液検査）に基づいていることである。tPSAは血液検査のみを必要とするが、検査者が血液サンプルを採取できる病院、診療所、または医療従事者へ訪問する必要がある。これと比較して、尿検査は有利と思われる。しかしながら、尿にはわずかな量のmiRしか含まれていない。本発明において、この課題は、1）尿試料から調製されたエキソソーム調製物中の前記miRの発現レベルを測定すること、2）Q-PCRのExiqons感受性法 - UniRT法によるmiRの発現レベルの測定によって克服された（実施例1および7を参照）。したがって、UniRT法はQ-PCRの好ましい方法である。
【００５２】
標準的な尿試料がスクリーニングの視点から好ましいが、前立腺マッサージ後に得られた尿試料が有利であり得る例が提供される（（19）参照）。実施例4は、前立腺マッサージ後に得られた尿試料で実施される。実施例4において、2-miR分類指標（miR-30c、miR-31-5p）は、標準全前立腺特異抗原（tPSA）検査の診断能力をはるかに超える診断力を有することが示されている。2-miR分類指標は、コホート1で設定されたカットオフ値を用い、0.79のROC曲線下面積（CI：0.69 ~ 0.90、p <<0.0001）および72.9％感度、および84.8%の特異性、で驚くほど良好に機能した。
【００５３】
したがって、本発明の一実施形態において、尿試料は、尿を採取する直前に前立腺マッサージを受けた対象からのものである。
【００５４】
診断アッセイを実際に適用する場合、診断値を用いて、診断スコア（S）を計算し、診断スコアに基づいて、カットオフ値を定義し、癌サンプルと非癌サンプルとを区別することが有利である。したがって、本発明の１実施形態は、験体が前立腺癌に罹患しているリスクの評価が前記サンプルにおいて少なくとも２つの前記miRのレベルを検出すること、および少なくとも２つの前記miRの発現レベルのデータを構成する診断スコアを計算することを含む方法である。
【００５５】
miRのレベルは、定量的リアルタイム逆転写酵素媒介性ポリメラーゼ連鎖反応法、RT-QPCR（13）によって簡便に定量することができる。
【００５６】
「特異的miRの量」の1つの特に好ましい尺度は、リアルタイムqRT-PCRによって得られる交差点（Cp）値である。「特定のmiRの量」の別の好ましい尺度は、実施例に記載されるようにリアルタイムqRT-PCRによって同様に得られる「閾値サイクル値（Ct）」値である。「特定のmiRの量」のCpおよびCt尺度は、ほぼ同様の尺度を提供する（（13）を参照）。CpまたはCtを選択するかどうかは主にマシンの選択の問題であり、アッセイは結び付けて実行した。Roche LCソフトウェアを使用するLightCycler（登録商標）480 Real-Time PCR Systemで増幅を実行すると、特定のmiRの量はCpで表されます。増幅が、付属のソフトウェアを用いてApplied Biosystems ABI Prism 7900HT 384ウェル機器で実施される場合、特異的miRの量はCtで表される。以下はCp値を参照するが、Ct値および「定量サイクル」（Cq）値にも適用される。
【００５７】
Cp値は例えば特定のmiRの発現に関連し、その関係は式:
【数１】
2018504915.tif 000005
によって表される。式中、Cp（miRx）は、miRxと呼ばれる特定のmiRを特異的に検出するリアルタイムQPCR装置からのCp-読み出しを示す。
実施例2は、そのようなアッセイを詳細に記載する。
【００５８】
従って、Cp値をmiRレベルの定量指数として使用する場合、例えば、
【数２】
2018504915.tif 000006
上記式は
【数３】
2018504915.tif 000007
と等値となり、同様に
【数４】
2018504915.tif 000008
上記式は
【数５】
2018504915.tif 000009
と等値となる。
【００５９】
したがって、4-miR分類指標（hsa-miR-31-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-30c-5pおよびhsa-miR-24- 3p）のための有用な推定の診断スコア（S)は線形回帰モデルである。例えば:
【数６】
2018504915.tif 000010
（式中、係数X、Y、ZおよびWは、特定の設定に従って回帰分析によって決定される）
である。
【００６０】
同様に、2-miR分類指標に対する推定子-診断スコア（S）は
【数７】
2018504915.tif 000011
（式中、係数XおよびYは、回帰分析によって決定される）
である。線形および他のタイプの両方の回帰が考えられる。
【００６１】
したがって、本発明の一実施形態では、診断診断スコア（S）は以下のように計算される:
【数８】
2018504915.tif 000012
（式中、「C」は閾値サイクル値（Ct）または交差点値（Cp）であり、XおよびYは、線形または別のタイプの回帰によって決定される係数である）
【００６２】
「機械学習」は、経験を通して自動的に改善するコンピュータアルゴリズムを利用するプロセスを指し、このアルゴリズムを改善するこのプロセスは、しばしば「トレーニング」と呼ばれる。機械学習は、大きなデータセットにおける一般的な規則を発見するために使用することができ、前立腺の癌試料および非癌試料におけるmiR発現を含むデータセットから臨床情報データを抽出するために用いることができる。機械学習の概念の一般的な論文は、（21）に見出すことができ、これらは援用により本明細書に組み込まれる。したがって、本発明の一実施形態では、診断スコア（S）を計算するアルゴリズムは、機械学習を適用することにより達成される。
【００６３】
驚くべきことに、実施例に示されるように、
【数９】
2018504915.tif 000013
【数１０】
2018504915.tif 000014
または
【数１１】
2018504915.tif 000015
のような比に基づく単純な推定法でさえ、標準全前立腺特異抗原（tPSA）試験の診断力をはるかに超えており、さらにアッセイをさらに単純化することで正規化を不要にするアドバンテージを持つ。
【００６４】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、診断スコアSがmiRの発現レベルの比として計算されることを含む方法である。例えばhsa-miR-24-3pおよびhsa-miR-222-3pの発現レベル対hsa-miR-30a-5pの発現レベルの比率、hsa-miR-24-3pおよびhsa-miR-222-3pの発現レベル対hsa-miR-30c-5pの発現レベルの比率、またはhsa-miR-30c-5pの発現レベル対hsa-miR-31-5pの比率等である。
【００６５】
hsa-miR-31-5pとhsa-miR-30c-5pの比で議論したように、ディスカバリーコホートでは89.9％のAUCで驚くほど良好に機能する（実施例5）。実施例11,12および13に示すように、hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3pを超えるhsa-miR-30a-5p、およびhsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3pを超えるhsa-miR-30c-5pの2種の3つのmiR比に基づく分類指標は妥当性確認において0.9に近いかそれ以上のAUCを示し、さらに良好に機能した。
【００６６】
したがって、本発明のさらなる実施形態では、診断スコア（S）は、
【数１２】
2018504915.tif 000016
（式中、「C」はhsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-30a-5pのそれぞれに対する定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）によって得られた閾値サイクル値（Ct）または交差点値(Cp)である）
として計算される。または：
【数１３】
2018504915.tif 000017
（式中、「C」はhsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-30c-5pのそれぞれに対する定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）によって得られた閾値サイクル値（Ct）または交差点値(Cp)である）
である。
【００６７】
それにもかかわらず、実施例5では、多数の他の驚くほど良好に実施される2のmiR比が言及されている。実施例5の表7を参照。これらの比に基づくバイオマーカーも、本発明の実施形態として考えられる。
【００６８】
本発明の特に興味深い実施形態は、事前の標準的な前立腺特異抗原（PSA）測定の結果、その血清PSAレベルが10ng / mL未満であることによって特徴付けられた患者グループに関連する。
【００６９】
このグループは、そのPSAテストの結果によれば、さらに侵襲的なテストに関しては「グレイゾーン」に分類されてしまうため、おそらく最も興味深いものである。従って、これらの患者は、PSA試験を補うことができる試験から大きな利益を得ると思われる。
【００７０】
驚くべきことに、2つの3-mir分類指標は、10ng / mL未満のPSAレベルを有する患者のサブポピュレーションで検証した場合、さらに良好であった（実施例10）。
【００７１】
特に、hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pの分類指標は、バリデーションコホートで実施された場合、AUC = 0.91で注目に値する（実施例13参照）。
【００７２】
したがって、hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3p分類指標は
【数１４】
2018504915.tif 000018
（式中、「C」は、miRに特異的な定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）によって得られた閾値サイクル値（Ct）または交差点値（Cp）である）
の診断スコア(S)を有し、本発明の好ましい実施形態である。
【００７３】
さらに、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-222-3p、およびhsa-miR-24-3p分類指標は、卓越した堅牢性を示す。3-miR分類指標の堅牢性を調べるために、検体をコホート5および6とはかなり異なる方法でサンプリングおよび処理した独立コホート（コホート3）にアッセイを適用した（実施例14）。興味深いことに、hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3p分類指標もまたこのコフォートで首尾よく有効性が確認された（実施例14）。
【００７４】
一態様では、本発明は、前立腺癌治療を必要とする患者を治療する方法であって、患者が前立腺癌に罹患する確率が増加しているかどうかを判定し、この情報に基づいて患者に適切な治療法を選択するために、請求項のいずれか一項に記載の診断検査を行うことを含む方法に関する。
【００７５】
本発明のさらなる態様は、対象が前立腺癌に罹患しているリスクをin vitroで評価するための複数部品のキットであって、前記験体からの尿サンプルにおいてhsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-1238-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-1260a, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-132-3p, hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-1972, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-320b, hsa-miR-320c, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-363-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-425-3p, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-660-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-99a-5pおよびhsa-miR-99b-5pから成るmiR群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルを測定するために必要な試薬のアリコートを含むと共に、健康なドナーと比較して少なくとも2つの前記miRの変化した発現レベルは、前記被験体が前立腺癌に罹患している確率が高いことを示す、キットである。
【００７６】
本発明のさらなる実施形態は、少なくとも2つのmiRがhsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a., hsa-miR-93-5pおよびhsa-miR-99a-5pmiRから成るmiR群から選択され、または、少なくとも2つのmiRが、hsa-miR-141-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-5pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiR群から選択され、または、少なくとも2つのmiRがhsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5pおよびhsa-miR-331-3pからなるmiR群から選択され、または、少なくとも2つのmiRがhsa-miR-146a-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-30c-5pおよびhsa-miR-31-5pからなるmiR群から選択されるキットである。
【００７７】
特に少なくとも2つの選択されたmiRがhsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pであることが好ましい。
【００７８】
おそらくRNaseに起因して、標準尿サンプルのような生体流体中の豊富な遊離（すなわち、細胞またはパーティクルにない）マイクロRNAは非常に乏しい。しかしながら、マイクロRNAは、種々のタンパク質複合体およびエキソソームまたはマイクロベシクルのような膜状の粒子への包含によって、安定化され、RNase分解から保護されることが示されている。
【００７９】
したがって、本発明の好ましい実施形態において、miRは、尿試料のエキソソーム調製物から抽出される。
【００８０】
したがって、本発明による好ましいキットは、尿サンプルのエキソソーム調製物を得るために必要な試薬を含む。
【００８１】
本発明を以下の非限定的な実施例および図面にさらに例示する。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】miR-31-5p対miR-30cの比からなる2miR分類指標のROC曲線。図1Aは、コホート（ディスカバリーコホート）のROC曲線であり、図1Bは、コホート2（バリデーションコホート、実施例3）のROC曲線であり、図1Cは、コホート3（バリデーションコホート、実施例4）のROC曲線である。
【図２】実施例5、表5に提示された20のmiRNAのROC曲線は、感度および特異性が曲線の下に示されている。
【図３】膀胱癌対コントロール（miR31-5pーmiR30c-5p）に適用されたPC診断のための2mlR分類指標。
【図４】UniRTメソッド。
【図５】ディスカバリーおよびバリデーションコホート（コホート4および5）における3miRパネル分類指標のROC曲線。
【図６】ディスカバリーおよびバリデーションコホート（コホート4および5）における７miRパネル分類指標 (hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5pおよびhsa-miR-331-3p) のROC曲線。
【図７ａ】ディスカバリーコホート、コホート4における3miR_1比に基づく分類指標(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5p)のROC曲線。
【図７ｂ】ディスカバリーコホート、コホート4における3miR_2比に基づく分類指標(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5p)のROC曲線。
【図８ａ】バリデーションコホート（コホート5）におけるバイオマーカーシグネチャー比に基づく3miR_1 (hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5p)のROC曲線。
【図８ｂ】バリデーションコホート（コホート5）における分類指標比に基づく3miR_2(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5p)のROC曲線。
【図９ａ】バリデーションコホート5(< 10ng/mL)のサブセットにおけるバイオマーカーシグネチャーに基づく3miR_1比のROC曲線。
【図９ｂ】バリデーションコホート5のサブセットにおけるバイオマーカーシグネチャーに基づく3miR_2比のROC曲線。
【図１０】「デンマーク」コホートの概要。
【図１１】コホート3における分類指標検証に基づく3miR_2(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30c-5p)比のROC曲線。
【実施例１】
【００８３】
タイトル: 試験的研究-エキソソーム分画した無細胞尿中のマイクロRNAプロファイリング
【００８４】
研究目的
健康な個体および前立腺癌患者（異なる病気のステージにわたり）からの無細胞尿サンプル中に存在する豊富なマイクロRNAを同定すること。
【００８５】
試料
すべてのサンプルは、デンマークオーフス大学病院泌尿器科で収集した（1997〜2005年）。サンプルセットは、前立腺肥大症（BPH)からの12の非悪性サンプル、組織学的に確認された臨床的に局所化されたPC（RP）の治癒を意図した根治的前立腺切除術（RP）の前に33人の患者から採集したサンプル、および去勢抵抗性PC（CRPC）を有する8人の患者の繰り返しから成る。これらのうち３４のサンプルは、コホート1（実施例2）に属する。
【００８６】
方法
サンプル調製
尿試料を沈降させ、4,5mlの上清を5mLのCRYOチューブに移し、使用するまで-80℃で保存した。エキソソーム由来のRNAをmiRCURY（商標） RNA Isolation Kit (カタログ番号300102) - Exosome Isolation in combination with miRCURY（商標） RNA Isolation Kits - Cell & Plant (カタログ番号300110)、両方ともExiqon社より、を使用して製造元の説明書きに従い、尿上清3mlから抽出した。精製したRNAを使用するまで-80℃で保存した。
【００８７】
MicroRNA発現プロファイリング
プロファイリングは、Exiqon社のmiRCURY LNA（商標）Universal RT microRNA PCRプラットフォームを2連（2つの別個の逆転写反応）で行った。すべての定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）実験およびデータ品質管理は、Exiqon Services、Vedbaek、Denmarkにより実施した。簡単に、miRCURY LNA（商標）マイクロRNA PCR、ユニバーサルcDNA合成キットII（カタログ番号203301）を使用して、2μlのRNAを10μlの反応で逆転写（RT）した。cDNAを100倍に希釈し、2μlを10μlのPCR反応のための投入量として使用した。相対microRNAレベルを384ウェルPCRプレート中で752の異なるmicroRNAをアッセイできるmicroRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I+II, V3,Rを用い解析した。以前にmiRBase（バージョン19）の命名法に関連して「hsa-miR-210」と呼ばれていたものは、miRBAse（バージョン21）の命名法を採用するために「hsa-miR-210-3p」と呼ばれるべきであることを考慮する。同じ問題が「hsa-let-7c」と「hsa-let-7c-5p」およびhsa-miR-203aとhsa-miR-203a-3pにも適応される。本発明のmiRの概要およびそれらの配列を表11に示す。すべての分析について、ExiLENT SYBR（登録商標）Greenマスターミックス（カタログ番号203421）を使用した。逆転写反応からRNA鋳型を除いたネガティブコントロールを行い、平行してプロファイリングした。増幅は、LightCycler（登録商標）480 Real-Time PCR System（Roche）で行った。増幅曲線は、Roche LCソフトウェアを用いて、定量サイクル（Cp）値の決定および融解曲線分析の両方について分析した。
【００８８】
結果
平均Cp値が36未満であり、少なくとも2つの試料で検出された全てのアッセイを、さらなる分析のために含めて考えた。ディスカバリー研究のために183のmicroRNAを選択した（実施例2）。
【実施例２】
【００８９】
タイトル: 健常コントロールとPC症例を区別する診断分類指標の同定
【００９０】
目的
前立腺癌患者（PC）および健常コントロールからの尿試料中の診断バイオマーカーポテンシャルを有するmicroRNAを同定すること。
【００９１】
試料
すべての尿サンプルは、デンマークオーフス大学病院泌尿器科で収集した（1997〜2005年）。トレーニングコホート（コホート1）は、BPH患者（コントロール）由来の8つの非悪性サンプル（NM）、組織学的に確認され、臨床的に位置が特定されたされたPCの治癒のために前立腺摘除（RP）を受けた患者由来の122のサンプル、及び、5つの去勢抵抗性前立腺癌（CRPC）のサンプルから構成される。コホートのサンプル構成の概要については、表2を参照。
【００９２】
【表２】
2018504915.tif 000019
【００９３】
表2: コホート1および2の患者構成
【００９４】
方法
サンプル調製
尿試料を沈降させ、4,5mlの上清を5mLのCRYOチューブに移し、使用するまで-80℃で保存した。エキソソーム由来のRNAをmiRCURY（商標） RNA Isolation Kit (カタログ番号300102) - Exosome Isolation in combination with miRCURY（商標） RNA Isolation Kits - Cell & Plant (カタログ番号300110)、両方ともExiqon社より、を使用して製造元の説明書きに従い、尿上清3mlから抽出した。精製したRNAを使用するまで-80℃で保存した。
【００９５】
MicroRNA発現プロファイリング
プロファイリングは、Exiqon社のmiRCURY LNA（商標）Universal RT microRNA PCRプラットフォームを2連（2つの別個の逆転写反応）で行った。すべての定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）実験およびデータ品質管理は、Exiqon Services、Vedbaek、Denmarkにより実施した。簡単に、miRCURY LNA（商標）マイクロRNA PCR、ユニバーサルcDNA合成キットII（カタログ番号203301）を使用して、2μlのRNAを10μlの反応で逆転写（RT）した。cDNAを100倍に希釈し、2μlを10μlのPCR反応のための投入量として使用した。コホート1について、相対マイクロRNAレベルは183の選択されたmicroRNAアッセイ（実施例1）および4つのspike-inコントロールから成るmicroRNA Ready-Use PCR、Pick-and-Mix microRNA PCRパネル（カスタムメイド、品番20381）を使用し解析した。すべての分析について、ExiLENTSYBR（登録商標）Greenマスターミックス（カタログ番号203421）を用いた。逆転写反応からRNA鋳型を除いたネガティブコントロールを実施し、並行してプロファイリングした。増幅は、LightCycler（登録商標）480 Real-Time PCR System（Roche）で行った。増幅曲線は、Roche LCソフトウェアを用いて、定量サイクル（Cp）値の決定および融解曲線分析の両方について分析した。全てのサンプルにおいて全てのCp値が37を超えるmicroRNAを、さらなる解析から除外した。低品質サンプルを排除するために、検出数が100未満のmiRNAを有する任意のサンプルを除去した。
【００９６】
データのフィルタリングとデータの正規化
増幅効率は、LinRegソフトウェアと同様のアルゴリズムを用いて算出した。すべてのアッセイを明確な融解曲線について検査し、Tmをアッセイの既知の仕様内にあると確認した。さらに、ネガティブコントロールよりも3 Cps低く、データ分析にCp <37を含むアッセイを検出しなければならない。これらの基準を満たさなかったデータは、今後の分析から除外された。 Cpは2次導関数として計算された。低品質サンプルを排除するために、検出数が100未満のmiRNAを有する任意のサンプルを除去した。NormFinderを用いて、最良のノーマライザーは、すべてのサンプルにおいて検出されたアッセイの平均であることが見出された。すべてのデータは、すべてのサンプル（N = 23）（平均-アッセイCp）で検出されたアッセイの平均に対して正規化され、それは多数のアッセイを含むqRT-PCR研究のための最良の標準化であることが示された堅牢な方法である（13）。23のアッセイはhsa-let-7a-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-1260a, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-99a-5pおよびhsa-miR-99b-5pである。
【００９７】
統計分析
発現解析: すべての分析について、P値<0.05が統計的に有意であると考えられた。Shapiro Wilkテストを使用して、データが正常に配布されたかどうかを評価した。いくつかのmicroRNAは異なったため、ノンパラメトリック統計Wilcoxon signed-rank検定を、異なる群の間のmicroRNA発現のペアワイズ比較のために使用した。miRNA発現の診断ポテンシャルは、受信者操作特性（ROC）曲線分析によって評価した。
【００９８】
結果
発現データ:
いくつかのmicroRNAが、Wilcoxon rank検定に基づいて有意に制御されることが見出され（P <0.01）、トップ20はhsa-miR-135b-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-5pおよびhsa-miR-362-5pである。
【００９９】
microRNA発現の診断性能および診断用microRNA分類指標の開発
miRNAの診断可能性は、性能の尺度として曲線下面積（AUC）を用いて、受信者操作特性（ROC）によって評価することができる。これに関して、miRNA-31-5pは、ディスカバリーコホートにおいてAUCが0,92である最も高い可能性を示す。
【０１００】
検出差を増やし、標準化の必要性を回避し、アッセイの堅牢性を高めるために、最も有意に上方制御されたmiRNA対、最も強力で有意に下方制御されたmiRNAの比を計算した。miRNA-31-5pとmiR-30cの比がmiRNA-31-5pよりも高いAUC値を示すことを見出した（表3）。
【０１０１】
結論
122症例（RP）に対してわずか8コントロール（BPH）でのカテゴリーの不均一な分布にもかかわらず、85,7％の特異性および92,2％の感度を有するROC曲線下面積(AUC=0.92)によって決定されるように、優れた診断精度を有する強力な2 miR分類指標としてのmiR-31-5p対miR-30cの比を同定することができた。
【実施例３】
【０１０２】
タイトル: 2つのmiR（Cp（miR-31-5p）-Cp（miR-30c））分類指標の診断性能のバリデーション
【０１０３】
目的
PC患者からの尿サンプルのmiRNA発現パターンをコントロールと比較して確かめるため、および実施例2で同定された２つのmiR(Cp(miR- 31-5p)- Cp(miR-30c ))分類指標を検証するため。
【０１０４】
試料（コホート2）
すべての尿サンプルは泌尿器科で採取され、デンマークオーフス大学病院研究所から入手した（1997〜2005年）。すべての個体について、H＆E染色ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料の切片を、訓練された病理学者によって評価した。バリデーションコホート（コホート2）は、47の非悪性サンプル（コントロール：BPH患者）、組織学的に確認され臨床的に位置を突き止められたPCの治癒のための前立腺摘除（RP）を受けた患者由来の98のサンプル、および去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)の3つのサンプルから構成される。コホートのサンプル構成の概要については、表2を参照のこと。
【０１０５】
方法
サンプル調製
１例として、
【０１０６】
MicroRNA発現プロファイリング
プロファイリングは実施例2と全く同じように行った。
【０１０７】
データのフィルタリングとデータの正規化
データのフィルタリングおよび正規化は、実施例2と全く同じように行った。すべてのデータを、すべてのサンプル（N = 23）で検出されたアッセイの平均に対して正規化した。それは多数のアッセイを含むqRT-PCR研究のための最良の標準化であることが示された堅牢な方法である（14）。
【０１０８】
統計解析
発現解析: すべての分析について、P値<0.05が統計的に有意であると考えられた。Shapiro Wilkテストを使用して、データが正常に分布されたかどうかを評価した。いくつかのmicroRNAは異なったので、ノンパラメトリック統計Wilcoxon signed-rank検定を、異なる群の間のmicroRNA発現のペアワイズ比較のために使用した。Benjamini-Hochberg法（15）を用いて複数の検定のためにP値を補正した。miRNA発現の診断可能性は、受信者操作特性（ROC）によって評価された。
【０１０９】
結果
複数の検定（Benjamin Hochberg（BH）法）のために調整されたWilcoxon rank検定に基づいて、いくつかのmicroRNAが有意に調節されることが見出された(P<0,01)、トップ20は: hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-93-5pおよびhsa-miR-99a-5pである。
【０１１０】
これらの上位20の著しく調節されたmiRNAの間には、コホート1と2との間に10個の著しく制御されたmiRNAの重複があった（表3）。
【０１１１】
表3に見られるように、癌とコントロールとの間の識別のための最も強力な診断可能性を有するmiRNAは、miR-31-5pおよびmiR-146である。しかしながら、miR-31-5pは試料の96％で検出されたのに対し、miR-146は試料の60％においてのみ検出されたため適切な候補ではない(AUC= 0,85)。
【０１１２】
【表３】
2018504915.tif 000020
【０１１３】
表3: コホート1およびコホート2の両方において有意に制御されたmiRNA、MiRは、Benjamin Hochberg（BH）法による複数の検定のための調整後、バリデーションコホートにおけるWilcoxon rank検定に基づくp値に従ってランク付けされる。「Fold change」は、コントロール（BPH）と症例（RP）との間のmiR発現の相対的差異であり、「-」は、特定のmiRが癌において下方制御されることを示す。「AUC」はROC曲線下面積を示す。「95％CI」は95％信頼区間（CI）を示す。
【０１１４】
コホート1において確立されたカットオフを有する2-miR（miR-31-5p/miR30c）分類指標の診断可能性は、コホート2において、ROC分析を用いて0,86 (95% CI: 0,79 to 1,00, p<0,0001)ROC曲線下面積によって定義された高い診断精度で検証され、72.5%の感受性、84.1%の特異性が見出された。
【０１１５】
結論
miR-31-5p（正規化済）および2 miRNA（比）分類指標（miR-31-5p / miR-30c）の診断可能性は、コホート1において確立された同様のカットオフ値を用いて独立したバリデーションコホートにおいて首尾よく有効性が確認された。診断用の2 miRNA（miR-31-5p/miR-30c）分類指標の精度は高く（AUC = 0.86）、感受性は72.5％、特異性は84.1％であった。
【実施例４】
【０１１６】
タイトル: 独立したコホート3における分類指標の堅牢性のテスト
【０１１７】
マーカーとして目的
2-miR分類指標の堅牢性、すなわち、かなり異なる方法論に従ってサンプリング、処理されたコホートであってもサンプルを癌症例およびコントロールに正確に分類するための診断ポテンシャルを試験するため。コホート3の試料は、コホート1および2と以下のパラメーターに関して異なる: 1)国籍（イギリス）、2)サンプリング（サンプリング前に前立腺をマッサージした）、3)RNA抽出技術（エキソソームの濃縮を伴わない全細胞フリーの尿からの抽出−異なるキットを使用した）。したがって、2つのmiRNAの実施例1および2に対する重複が有意に上方/下方制御されることは、堅牢性の証拠となる。
【０１１８】
試料
尿サンプルは、英国シェフィールドのオンコロジー医科学科によって提供された。バリデーションコホートは34の非悪性コントロールサンプル、限局性前立腺癌患者からの36サンプル、進行したPC患者からの20サンプルから構成される。Ambion、Life TechnologyのmirVana（商標）miRNA分離キット（カタログ番号：AM1560）を使用して、製造元の説明書に従い、細胞フリー尿画分（上清）からRNAを直接抽出した。精製したRNAを使用するまで-80℃で保存した。
【０１１９】
方法
プロファイリングは実施例3のように行った。コホート3について、相対microRNAレベルは48の選択されたmicroRNAアッセイと4-spike-inコントロールから成るカスタムメイドmicroRNA Ready-to-Use PCRを用いて解析された。測定された50％未満の48のmiRNAがサンプルセットから除去されたサンプル。コホート1およびコホート3の両方についてNormFinderアルゴリズム（40）を使用し、正規化遺伝子hsa-miR-103a-3pとして最も安定に発現されたmiRNAを両方のセットにおいて選択し、コホート3の標準化を行った。
【０１２０】
結果
２つのmiR分類指標(miR31-5p, 30c)はコホート1で確立されたカットオフ値と0,79 (CI: 0,69 to 0,90, p< <0,0001)のROC曲線下面積を用いることで感受性72.9%と特異性84.4%と共にコントロールから分類された。タブ4および図1c参照。
【０１２１】
【表４】
2018504915.tif 000021
【０１２２】
表4: ３つのコホートにおいてmiR-31-5p/miR-30c のためのROC曲線をプロットし、ROC曲線は計算された。95％信頼区間（CI）を表に示す。
【０１２３】
結論
コホート３は異なる試料、採集、処理および標準化手順等でコホート１および２とは根本的に異なるのにもかかわらず、miR31の診断ポテンシャルが確認された。コホート1とコホート2で確立されたカットオフ値と同じものを使用して、この独立コホート（コホート3）で2 miR分類指標が首尾よく有効性が確認された。診断分類指標の精度は高く（AUC = 0,79）、感受性は72,9％、特異性は84,8％であった。
【実施例５】
【０１２４】
タイトル: 診断ポテンシャルを有する改善された分類指標に基づくmiRNAバイオマーカーの発見
【０１２５】
目的
単一のmiRNAの発現レベル上で上下変動しない分類指標であるmiRNAのパネルを使用することが有利であり得る。診断ポテンシャルを有するmiRNAの同定検出力を高めるために、コホート1およびコホート2を1つの大きなディスカバリーコホートに併合する。併合されたデータセットは、分類指標を構築するための統計的アプローチに十分な力を有する。
【０１２６】
試料（コホート1およびコホート2）
併合されたコホート（実施例1のコホート1および実施例2のコホート2）は48の非悪性サンプル(NM; BPH患者から(コントロール)、組織学的に確認され臨床的に位置を突き止められたPCの治癒のための前立腺摘除を受けている患者からの205サンプル、去勢抵抗性前立腺癌（CRPC）の8サンプルから構成される。
【０１２７】
方法
データフィルタリングおよび正規化
ノーマライザの数を減らすために、バックグラウンドでフィルタリングされたデータ（すべてのサンプルで測定値が取得される）がNormfinderアルゴリズムに解析された（14）。Normfinderからの上位5種の最も安定なmiRNA（hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-23b-3p）は、各サンプルの平均正規化値を計算するために使用される。個々のサンプルの平均正規化値は、ΔCp値を得るために各個々のサンプルの生データCp値から減算される。2つの正規化手順（トップ5のmiRNAおよび全域平均正規化）は、差次的に発現されるmicroRNAの上位ならびにmicroRNAの全体的なランキングに関して非常に類似した結果をもたらし、その後の検証研究で正規化遺伝子として5 microRNAの妥当性を支持している。5 miR正規化法は、その後のすべての分析に使用される。
【０１２８】
分類指標の構築
各miRNA分類指標は、モンテカルロサンプリングによって構築され、2つのグループ間の最も重要なmiRNAのトップ100からランダムに2〜20のmiRNAを抽出した（Benjamini-Hochbergに基づく調整されたWilcoxon test p-value）(17)。これを100万回実施し、ROC AUCまたはlog-rank検定p値をそれぞれ診断および予後分類器のスコアとして用いて、各分類指標の性能を試験した。次いで、分類指標は、分類指標を減らすために、leave-one-outクロスバリデーション（LOOCV）最尤分類器アプローチによって削減された（18）。
【０１２９】
分類指標を用いたスコアリング
分類指標に基づく患者スコアは、以下のように計算した: RにおけるpROCパッケージによって決定されたROC曲線から最良の閾値(Youden's J statistic (Youden, 1950)) (17)に基づいて、所定のmiRNAについてカットオフ値（ΔCp値）を選択した。次に、各患者について、所与のmiRNAのΔCp値を調べ、患者ΔCp値がカットオフより大きい場合、ΔCp値がカットオフ未満であれば、miRNAは+1または-1のスコアを与えた。miRNAがアップレギュレートされているかダウンレギュレートされているかに応じて、操作上のサインをそれに応じて変更した。最後に、所定のmiRNAが検出限界内で発現されないことが判明した場合、スコアに0を割り当てた。この手順を各miRNAについて行い、結果を合計して各患者の総合的な分類スコアを得た。
【０１３０】
結果
この大きな併合サンプルセットにおいてBenjamin Hochbergによる複数の検査のために調整した後、表5に示すように、BPHとRPの間で有意に脱調節されることが見出されたトップ20のmiRNAは実施例3で検証された20個のmiRNAのうち15個が全てこのセットに含まれている。表6は、実施例5で見出された、BPHとRPとの間の全ての有意に脱調節されたmiRNAを示す。
【０１３１】
【表５】
2018504915.tif 000022
【０１３２】
表5、コントロール（BPH）と症例（RP）の間で有意に調節されたmiRNAを有する上位20個のmiRNA。
「ΔΔCq」は、2-ΔΔCt法によって決定された対照（BPH）および症例（RP）間の遺伝子発現の相対的差の尺度である、(20)参照。
「Fold」は、コントロール（BPH）と症例（RP）との間の遺伝子発現の相対的差異であり、「-」は、miRが癌において下方制御されることを示す。
「Expressed」とは、測定可能な量のmiRを発現するサンプルのパーセンテージを示す。
【０１３３】
【表６−１】
2018504915.tif 000023
【表６−２】
2018504915.tif 000024
【０１３４】
表６、BPHとRPとの間の有意に脱調節されたmiRNA。MiRは、AUCと発現の積に従ってランク付けされる
【０１３５】
実施例5で分析した組合わせセットでは、2miR分類指標（miR-31-5p/miR-30c）はROC曲線分析（0.9（AUC））に基づく診断精度を示した。
【０１３６】
単一のmiRNAまたは比に基づくバイオマーカーが良好に機能する一方で、miRNAのパネルを使用することで分類指標の堅牢性を高めることがある。
【０１３７】
モンテカルロシミュレーションを使用して、20-miRNA診断分類指標を上記のように構築し、図2に示すようなROC曲線を得た。分析は、95,5％の特異性および93,6％の感受性を有するAUC = 0.99を示した。20のmiRNA分類指標は: hsa-miR-132-3p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-187-3p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-363-3p, hsa-miR-495-3p, hsa-miR-548c-5p, hsa-miR-96-5p, hsa-miR-135a-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-20a-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320aから構成される。
【０１３８】
比率に基づくバイオマーカー
miRNAの診断ポテンシャルは、性能の尺度として曲線下面積（AUC）を用いて、受信機動作特性（ROC）によって評価することができる。これに関して、miRNA-31-5pはディスカバリーコホートにおいて89.9％のAUCを有する最も高いポテンシャルを示す。
【０１３９】
潜在的に、いくつかのmiRNAが診断テストでお互いを補うことができ、それによってどちらかのmiRNAより優れた性能を発揮する。コホート内のmiRNA-31-5pと他のmiRNAとの比を計算することにより、miRNA-31-5pと組み合わせた場合、それら自身より、他の12個のmiRNAがより高いAUCスコアを示すことが発見された（表7参照）。
【０１４０】
表7に見られるように、ROC曲線のAUCで判断される最良の実行比は
【数１５】
2018504915.tif 000025
である。しかしながら、hsa-miR-1238-3pは、サンプルの3％でしか発現せず、その結果、実用的価値はほとんどない。比率が代わりにAUCの産物に従ってランク付けされる場合、発現比:
【数１６】
2018504915.tif 000026
が最も高いランキング比に基づくバイオマーカーとして示され
【数１７】
2018504915.tif 000027
【数１８】
2018504915.tif 000028
【数１９】
2018504915.tif 000029
等が続く。
【０１４１】
【表７】
2018504915.tif 000030
【０１４２】
表7、miRNA-31-5pと一緒にうまく機能するmiRNAのリスト。「Expressed」とは、そのmiRNAが発現されることが見出されたサンプル数のパーセントの尺度である。
【０１４３】
結論
この実施例は、コントロールおよび限局性前立腺癌（RP患者）を有する患者の間の識別のポテンシャルを有するmiRNAを発見するための異なるアプローチを提示した。この分析により、20のmiRNAのリストが明らかとなり、ここで5つのmiRNAが実施例2および3で発見および検証された。診断スコアに最も大きな影響を与えるmiRNAは、miR-320およびmiR-31-5pであり、続いてmiR16-5pであった。
【実施例６】
【０１４４】
タイトル: 前立腺癌の特異性
【０１４５】
目的:
同定されたシグネチャーが前立腺癌に特異的であることを確認するため。
【０１４６】
試料
膀胱癌患者からの25サンプルおよび8つの個々の非膀胱癌患者コントロールサンプルからの尿サンプルのセット、実施例１、２および３に用いられた同じプロトコルに従ってサンプリングし処理した。
【０１４７】
方法
用いた方法は、実施例1,2および3で使用した方法と同一である。
【０１４８】
結果
コントロールと比較して膀胱癌において顕著に異常な発現を有する上位20のランキングマイクロRNAのうち、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-320aおよびhsa-miR-10b-5pの3つのマイクロRNAのみがPCで同定されたものと重複している。強力なPC診断2-miR分類指標（miR-31-5p、miR-30c）のROCプロットは、膀胱癌対コントロールの図3に示されており、非常に低い識別値を示す。
【実施例７】
【０１４９】
タイトル: UniRTメソッド
【０１５０】
目的:
この実施例では、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）技術を使用して、小さな非コードRNA分子を増幅および定量するためのUniRT法を簡単に説明する。さらなる説明は、EP2391736に見られる。
【０１５１】
要約すると、図4を参照、UniRTプロトコルは2ステッププロトコルである。STEP 1では、サンプル中に存在するmiRは、RNA分子の3'-末端にアデニン残基を付加するポリ（A）ポリメラーゼを用いて最初にポリAテイル化される。第2に、ポリ-T-コアヌクレオチド配列、3'-末端VN-縮重モチーフおよび5'-末端テールを有する伸長プライマーは、伸長プライマーのVN-ポリ-T配列とのハイブリダイゼーションによりポリAテイル化されたmiRにアニールされる。続いて、鋳型としてmiRを用いて伸長プライマーを逆転写反応で伸長させる。得られた一次伸長産物は、伸長プライマーと、サンプル中のmiRに相補的な新たに合成されたcDNAとから構成される。
【０１５２】
次のステップ2では、miR特異的PCRが行われる。新たに合成されたcDNAの3 '末端にmiR特異的フォワードプライマーをアニーリングし、鋳型としての一次伸長産物を用いてDNA重合反応においてフォワードプライマーを伸長させることにより、上鎖の合成を行う。次に、miR特異的3'-末端配列、ポリ-T-ストレッチおよび5'-末端尾部からなるmiR特異的リバースプライマーを上鎖にハイブリダイズさせ、下鎖はリバースプレイマーの伸長によって合成される。
【０１５３】
STEP1およびSTEP2の両方において、LNAは、プライマーのそれぞれの標的への特異的かつ効率的なアニーリングを確実にするために役立つ。
【０１５４】
ExiqonのUniRT法（miRCURY LNA（商標）ユニバーサルRT microRNA PCR）は、比類のない感度と特異性をもたらす（Mestdagh et al. Nat Methods. 2014 Aug;11(8):809-15参照）。
【実施例８】
【０１５５】
タイトル: エキソソーム分画した細胞フリー尿中の改善されたmicroRNA分類指標の発見
【０１５６】
研究の目的
良性の状態と癌の状態を区別する診断能力を有するmicroRNAを同定すること。
【０１５７】
試料
すべての尿サンプルは、泌尿器科で採取され、デンマークオーフス大学病院研究所から入手した（1997〜2005年）。H＆E染色ホルマリン固定パラフィン包埋組織標本のすべての個体について、訓練された病理学者によって評価した。トレーニングコホート（コホート4-（V））は、22の非悪性試料（NM; BPH患者（コントロール）由来）であり、組織学的に確認された臨床的に突き止められたPCaの治癒のための前立腺摘除を行った患者から200サンプルであった。
【０１５８】
コホート組成の概要については、表8および図10を参照。
【０１５９】
【表８】
2018504915.tif 000031
【０１６０】
方法
サンプル調製およびマイクロRNA発現プロファイリングを、実施例1に記載のように実施した。
【０１６１】
データのフィルタリングと正規化
全てのサンプルにおいて全てのCq値が37を超えたmicroRNAは、さらなる解析から除外した。低品質サンプルを排除するために、発現されたmiRNAの総数が潜在的最大値の50％を下回るサンプルを除去した。強く発現されたアッセイのみを選択するために、サンプルの80％未満で発現されるmicroRNAアッセイを除去し、35を上回る平均Cq値でのアッセイも同様に除去した。
【０１６２】
コホート4の標準化は、NormFinderアルゴリズム(40)によって同定されたトップ3（hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-30b-5p）の最も安定に発現されたアッセイの平均正規化値を計算することによって行った
【０１６３】
分類指標の構築-複数のロジック回帰
2つのカテゴリー（良性および癌）が与えられた場合、ロジスティック回帰を使用して、所与の患者が特定のカテゴリーに属する確率をモデル化することが可能である。マルチブルロジスティック回帰モデルを用いることにより、一つ以上の予測因子を含めることができる（microRNAアッセイ測定）。
【０１６４】
説明変数の値が与えられたときの特性が存在する確率（p（X））、単一のカテゴリ変数(p (X) = (Y = 1|X = x)の場合において、即ち推定されたCp値を所与された癌を持つ患者は、以下のモデルで表すことができる：
【数２０】
2018504915.tif 000032
（式中、X=(X1,…,Xp)は説明上の変数のセットであり、この場合は特定のmicroRNAアッセイのΔCq値であり、β0,…,βpは係数である。microRNAアッセイは、LASSO（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator）回帰によって選択され、係数は最尤法により推定される。）
【０１６５】
microRNAパネルの選択
最適な診断ポテンシャルを有するmicroRNAパネルを同定するための統計的方法としてLasso回帰を用いた。十分なシグナル対ノイズ比を有するmicroRNAから選択するために、正常およびPCa被験体の間のディスカバリーセットにおいて少なくとも1,75倍の変化を示すmiRNAのみを含めた。ロジスティック回帰は完全なデータセットを必要とするため、欠損値を埋めるために複数の帰属法を使用した。補完はRパッケージの「mice」を用いて行った。
【０１６６】
次に、Rパッケージglmnetを使用して、どの予測変数を使用するかを判定するため、Lasso回帰を実行した。簡単に説明すると、Lasso回帰は、λが増加すると係数をゼロに縮小するペナルティ（λ）を導入する。予測因子（マイクロRNAアッセイ）がモデルに寄与するほど、β値がゼロになる前にλ値が大きくなければならない(参照、http://www-bcf.usc.edu/~gareth/ISL/ page 219 ラッセル回帰の完全な説明のために)。3つまたは7つの予測因子（microRNA）を用いることが最適であることが示されたcv.glmnetを用いた交差検証においてλおよび異常を増加の結果として、係数は縮小した。
【０１６７】
microRNAパネルの診断ポテンシャルは、ロジスティック回帰モデルからのp値を用いたROC分析によって評価した。
【０１６８】
結果
上位10位のmicroRNAを表9に示す。LASSO回帰は、3または7個の予測因子（microRNA）を用いることが最適であることを示した。
【０１６９】
【表９ａ】
2018504915.tif 000033
【０１７０】
【表９ｂ】
2018504915.tif 000034
【０１７１】
最高の診断精度を有する単一のmicroRNAアッセイは、AUCが0,92であるhsa-miR-31-5pである。
「PSA≦10」は、先の標準的な前立腺特異抗原（PSA）測定が、個々の患者（または対象）において血清PSAレベルが10ng / mLまたはそれ以下であることを示す。
【０１７２】
その後の2つのmicroRNA（ランク2および3）は両方とも、0.95のAUC（カットオフ0.94）を達成する分類指標（hsa-miR-31-5p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-24-3p）に有意な精度を付加した。
【０１７３】
最も高い診断精度を有するマイクロRNAパネルは、0.96のROC曲線下面積(AUC)を持つ7 miR分類指標であった: hsa-miR-31-5p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-331-3p。より多くのアッセイを追加しても、識別力はさらに増加しなかった。
【０１７４】
結論
良性状態および癌性状態を非常に高精度（AUC> 0.95）で区別するいくつかの新規診断バイオマーカーmicroRNAパネルを同定することができた。
【実施例９】
【０１７５】
タイトル: 同定されたmicroRNAバイオマーカーパネルの診断性能の検証
【０１７６】
目的
実施例8で同定された10個のmiRバイオマーカーパネル（バイオマーカー分類器またはmiRシグネチャとも呼ばれる）の診断能力を検証するため。
【０１７７】
試料
サンプルは実施例8に記載したように収集、処理された。バリデーションコホートは22の非悪性サンプル（NM; BPH患者（コントロール）由来）、組織学的に確認され臨床的に位置を突き止められたPC（RP）の治癒のための前立腺摘除受けている患者からの205サンプルから構成される。
【０１７８】
方法
microRNA発現プロファイリング、標準化およびデータフィルタリング
実施例8と同様に、microRNA Ready-Use PCRの異なる生産ロットを使用する以外は、Pick-and-Mix microRNA PCRパネル（カスタムメイド;品番号174845）を使用する以外は実施例8と全く同様にした。
【０１７９】
結果
コホート4で定義されたパネル（または分類指標）の診断ポテンシャルは、コホート5でROC分析を用いて検証された。結果を表9bに示す（実施例8参照）。
【０１８０】
1つのマイクロRNA分類指標（hsa-miR-31-5p）は、バリデーションコホートにおいて0.81の診断精度を示したが、2つのその次のマイクロRNA（hsa-miR-141-3pおよびhsa-miR-24-3 ）は、AUCが0.86に達し、診断精度に無視できない増加を追加した（図5も参照）。ディスカバリーセットにおける良性状態および癌性状態を識別する際に診断精度が最も高いマイクロRNAパネル; 7-miR分類指標は、AUCが0.88であることが確認された（図6）。
【０１８１】
結論
コホート4で確立されたカットオフ値を用いて、独立した検証コホートにおいて、診断miR分類指標1〜10（診断miRシグネチャー、または診断バイオマーカーパネル番号1〜10）が首尾よく有効性が確認された。microRNAパネルのいくつかは、診断精度が0.86を超える生検検査の陽性転帰を予測することができた。最も適したmicroRNAバイオマーカーパネルは7-miR分類指標であった。診断検査の場合、診断検査の価格および複雑さのために、少数の検査が好ましい。したがって7miR分類指標とは別に、3miR(hsa-miR-31-5p, hsa-miR-141-3p,およびhsa-miR-24-3p)および４miR(hsa-miR-31-5p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-24-3p,およびhsa-miR-31-3p)分類指標は有望なバイオマーカーの候補である。
【実施例１０】
【０１８２】
タイトル: サブポピュレーションでの使用目的における同定されたmicroRNAバイオマーカーパネルの検証
【０１８３】
研究の目的
生検を行うか否かにかかわらず、先のPSA検査結果が「グレーゾーン領域」で10ng / mL未満の患者では、バイオマーカーパネルが、臨床決定を支持するために使用されることが意図されている。この試験の目的は、同定されたバイオマーカーパネルが、10ng / mL未満のPSAレベルを有する患者のサブポピュレーションに適用され得ることができ、さらに高い診断精度で良性および癌性状態を識別することができるかどうかを検証することであった。
【０１８４】
試料
コホートはバリデーションコホートのサブセットであった。19の非悪性サンプル（NM; BPH患者から（コントロール））、およびPSAレベルが10 ng/mLより低い、または同等(表8)の組織学的に確認され臨床的に突き止められた治癒のために前立腺摘除を受けた患者からの83サンプルから構成される。
【０１８５】
方法
microRNA発現プロファイリング、標準化およびデータフィルタリング
実施例9を参照。
【０１８６】
結果
コホート4で定義された分類指標の診断ポテンシャルは、ROC分析を使用して（PSA<10）コホート5のサブポピュレーションで検証された。結果は表9に示す。
【０１８７】
1つのmicroRNA分類指標（hsa-miR-31-5p）は、検証コホートでは0.82の診断精度を示したが、一方、3つのmicroRNA（3-miR）分類子は、実施例8のディスカバリー研究に沿って、AUCが0.88に相当する診断精度においてかなりの増加を示した。ディスカバリーコホートにおける正常状態と癌状態の区別において最高の診断精度を示した7-miR microRNAパネルも、AUCが0.89であるバリデーションコホートにおいて最も高い識別力を有することが判明した。ディスカバリーコホートで観察されたように、パネルにさらに多くのマイクロRNAを加えることは、バイオマーカーパネルを改善しなかった。
【０１８８】
結論
10ng / mL未満のPSAレベルを有する患者で意図した用途ポピュレーションから構成される独立コホートにおいて、いくつかのmicroRNAパネルの診断バイオマーカーの可能性を検証した。いくつかのmicroRNAパネルは、診断精度が0.88以上の生検検査の良好な結果を予測することができた。
【実施例１１】
【０１８９】
タイトル: 診断のための比率ベースのバイオマーカー
【０１９０】
研究目的
比率に基づくmicroRNAバイオマーカーシグネチャーは、正規化の必要性を回避することによって検出差を増加させる重要な利点を有し、それにより診断精度を得るために必要とされるアッセイの数を減少させる。この研究の目的は、良性状態よび癌性状態を識別するための診断ポテンシャルを有する比に基づく分類指標を発見することであった。
【０１９１】
試料
実施例8と同様（ディスカバリーコホート）。
【０１９２】
方法
microRNA発現プロファイリングおよびデータフィルタリング
実施例8からのデータ-標準化無し。
【０１９３】
分類指標構築-比率分類指標
簡単に説明すると、92のプールからのすべての可能なmiRNA対が作成された（n = 4186）。次いで、全試料の少なくとも95％において発現されなかった対を除去し、残りの対（n = 823）の間の比についてAUCを計算した。上位10個のmicroRNA比の対から、可能なすべての3-miR比が作成された。
【０１９４】
結果
2-miR比に基づく分類指標を上回る診断力を追加した唯一の3-miR比に基づく分類指標は、感受性と特異性の両方がAUC0.96（感受性および特異性> 0,9、カットオフ2および感度88、特異性95、カットオフ> 6）を有する、hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5p and hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30c-5p（表10参照）（図7）である。
【０１９５】
【表１０】
2018504915.tif 000035
【０１９６】
3-miR比分類指標のスコアリングアルゴリズムは、次のように表すことができる:
【数２１】
2018504915.tif 000036
（式中、X1〜X3は、3つの異なるmiRの発現レベルに関する実験的に決定された値（測定値）のセットである。好ましい場合には、分類指標における特定のmicroRNAアッセイのCq値を発現レベルの尺度として用いる）。
【０１９７】
Cq値は対数スケールであるため、スコアは次のように書くこともできる:
【数２２】
2018504915.tif 000037
（式中、Cq1-Cq3は、3つの異なるmiRについて観察されたCq値である）。
【０１９８】
選択された比率ベースの分類指標は、正規化の必要性を回避がない:
【数２３】
2018504915.tif 000038
（式中、XはmicroRNA測定のCq値であり、Nは（共通選択された）正規化因子である）。
【０１９９】
結論
良好な政権結果の予測において有望な診断ポテンシャルを有する2つの比率に基づくmicroRNA分類指標が同定された。
【実施例１２】
【０２００】
タイトル: 全データセットにおける3miR分類指標のバリデーション
【０２０１】
研究の目的
独立した患者コホートにおける2つの同定された3miR比に基づく分類指標のバイオマーカーポテンシャルの検証。
【０２０２】
試料
実施例9と同様（すなわちコホート5, 表8）
【０２０３】
方法
microRNA発現プロファイリングおよびデータフィルタリング
実施例9からのデータ-正規化無し。
【０２０４】
結果
コホート1において確立されたカットオフを有するhsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5pおよびhsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30c-5pからの2つの3-miR比率に基づく分類指標の診断ポテンシャルはコホート2において、ROC分析を用いて検証された。2つの分類器のROC曲線下面積で定義された診断精度は、それぞれ、0,87（感受性0,89、特異性0,76、カットオフ> 2）および0,89（感受性0,78、特異性0,95 、カットオフ> 6）である（図8）。
【０２０５】
診断スコアSが以下式として計算される場合:
【数２４】
2018504915.tif 000039
1％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 0,5は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
【０２０６】
2％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 0.9は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
【０２０７】
5％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 1.8は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
【０２０８】
同様に診断スコアSが下記の様に計算される場合:
【数２５】
2018504915.tif 000040
1％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 5は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
【０２０９】
2％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 5.1は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
【０２１０】
5％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 5.8は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
【０２１１】
結論
2つの同定された比率に基づくmicroRNA分類指標の診断能力は、ディスカバリーコホートにおいて確立された同様のカットオフ値を用いて、独立したバリデーションコホートにおいて首尾よく有効性が確認された。診断3 miR分類指標の精度は、AUCが0.87以上で高くなった。
さらに、3miR分類指標について診断スコアSを計算し、患者のさらなる治療を決定するために使用することができると結論付けている。
【実施例１３】
【０２１２】
タイトル: 意図した用途サブポピュレーションにおける比率に基づく分類指標の検証
【０２１３】
研究の目的
この研究の目的は、識別された比率に基づく分類指標が10ng / mL以下のPSAレベルを有する患者意図した用途サブポピュレーションに適用できるかどうかを検証することであり、診断精度の高い良性および癌性の被験体を区別する。
【０２１４】
試料
コホート5からのデータ。
【０２１５】
方法
microRNA発現プロファイリングおよびデータフィルタリング
実施例9からのデータ-正規化無し。
【０２１６】
3miR分類指標(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5p and hsa-miR-30a-5p and hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30c-5p)は（AUC）0.88（感受性0.79、特異性0.88）および0.91（感受性0.88、特異性0.95）それぞれの診断正確性を有するサブポピュレーションにおいて検証された（図9）。
【０２１７】
PSA≦10ng / mLの患者の診断スコアSは、以下のように計算される。
【数２６】
2018504915.tif 000041
1％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 0.7は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
【０２１８】
2％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 1.5は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
【０２１９】
5％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 2は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
【０２２０】
同様に、診断スコアSが以下のように計算される場合:
【数２７】
2018504915.tif 000042
1％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 5は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
【０２２１】
2％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 5.5は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
【０２２２】
5％の偽陰性を受け入れると、診断スコア（S）> 6は、患者は生検を受けるべきであることを示唆する。
【０２２３】
結論
2つの3miR比に基づく分類指標の診断バイオマーカーのポテンシャルは、コホート2の意図した用途サブポピュレーション（PSA≦10ng / mL）において、それぞれ0.88および0.91という高い診断精度で首尾よく有効性が確認された。臨床検体に適用される診断カットオフ値は、0.5から2（ダイナミックレンジ：[-3, +6]最初の3miR分類指標(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5pおよびhsa-miR-30a-5p)）の間であり、4から6.5（ダイナミックレンジ：[1, 10]2番目の3miR分類指標(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30c-5p)）の間である。
【０２２４】
さらに、3つのmiR分類子について診断スコアSを計算し、患者のさらなる治療を決定するために使用することができると結論付けている。
【実施例１４】
【０２２５】
タイトル: 独立コホート（実施例4のコホート3）における比に基づく分類指標の堅牢性の試験
【０２２６】
目的
2つの3-mir比に基づく分類器のロバスト性をテストするため、すなわち、実施例4に記載した根本的に異なる方法論に従ってサンプリングし処理したコホートであっても、サンプルを良性状態および癌性状態に正確に分離するそれらの診断ポテンシャルをテストするため。
【０２２７】
試料
実施例4を参照。
【０２２８】
方法
実施例4を参照。
【０２２９】
結果
3-miR分類指標(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30c-5p)の一つは0.79（CI：0,68-0,87、p <<0,0001、感受性64％および特異性84％）の正確度（ROC曲線下面積）を有し癌状態から良性状態を分類した、図11参照。他の比率に基づく3miR分類指標（hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30a-5p）の診断ポテンシャルは確認できなかった（0.66のAUC）。
【０２３０】
結論
コホート3とディスカバリーコホート（コホート4）の間の根本的な違いに基づいて予想されることはないが; 試料の採取と処理の違いにより、比率に基づく分類指標の1つの診断ポテンシャルが確認された。この分類指標(hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-30c-5p)は良性状態と癌状態の区別において0.79の診断正確性（AUC)を有しコホート３において首尾よく有効性が確認された。
【０２３１】
【表１１−１】
2018504915.tif 000043
【表１１−２】
2018504915.tif 000044
【図１】
2018504915.tif 000049
【図２】
2018504915.tif 000050
【図３】
2018504915.tif 000051
【図４】
2018504915.tif 000052
【図５】
2018504915.tif 000053
【図６】
2018504915.tif 000054
【図７ａ】
2018504915.tif 000055
【図７ｂ】
2018504915.tif 000056
【図８ａ】
2018504915.tif 000057
【図８ｂ】
2018504915.tif 000058
【図９ａ】
2018504915.tif 000059
【図９ｂ】
2018504915.tif 000060
【図１０】
2018504915.tif 000061
【図１１】
2018504915.tif 000062
【手続補正書】
【提出日】平成28年12月9日(2016.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体が前立腺癌に罹患するリスクを評価するためのin vitro方法であって、前記被験体からの尿サンプルにおいて、hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-30a-5pおよびhsa-miR-30c-5pからなるmiRの群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルを測定することを含み、健康なドナーと比較して前記少なくとも2つのmiRの変化した発現レベルが、前記被験体が前立腺癌に罹患している確率が高いことを示す方法。
【請求項２】
hsa-let-7a-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-1238-3p, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29c-3p , hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-99a-5pおよびhsa-miR99b-5pからなるmiRの群から選択されるmiRの発現レベルを測定することを更に含む、請求項1に記載のin vitro方法。
【請求項３】
少なくとも2つのmiRが3、4、5またはそれ以上のmiRである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも2つの選択されたmiRが、hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも2つの選択されたmiRが、hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
発現レベルが正規化された発現レベルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
発現レベルは正規化された発現レベルであり、正規化は、hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-27b-3pおよびhsa-miR-23b-3pという5つのmiRsの平均正規化値を計算することによって行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
発現レベルは正規化された発現レベルであり、正規化はhsa-miR-200b-3p, hsa-miR-27b-3pおよびhsa-miR-30b-5pという3つのmiRsの平均正規化値を計算することによって行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記miRの発現レベルは、前記尿サンプルから調製されたエキソソーム調製物中で測定される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前立腺癌のリスクを評価される被験体は、事前の標準的な前立腺特異抗原（PSA）測定による血清PSAレベルが10ng / mL未満であることによって特徴付けられる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
尿サンプルは、尿を採取する直前に前立腺マッサージを受けた被験体からのものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
被験体が前立腺癌に罹患しているリスクの評価は、前記試料中の前記少なくとも2つのmiRのレベルを検出し、前記少なくとも2つのmiRの発現レベルデータを含むデータセットに基づく診断スコア（S）を算出することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記miRの発現レベルは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Q-PCR）の方法によって決定される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
診断スコアSは、hsa-miR-30c-5pの発現レベル対hsa-miR-31-5pの発現レベルの比として算出される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
診断スコアSは、hsa-miR-24-3pおよびhsa-miR-222-3pの発現レベル対hsa-miR-30a-5pの発現レベルの比として算出される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１６】
診断スコアSは、hsa-miR-24-3pおよびhsa-miR-222-3pの発現レベル対hsa-miR-30c-5pの発現レベルの比として算出される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１７】
診断スコアSが下記式により計算される:
【数１】
2018504915.tif 000063
（式中、「C」は閾値サイクル値（Ct）または交差点値（Cp）であり、XおよびYは線形回帰によって決定される係数である）
請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
診断スコアSが下記式により計算される:
【数２】
2018504915.tif 000064
（式中、「C」は、hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-30a-5pのそれぞれの定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）によって得られた閾値サイクル値（Ct）または交差点値（Cp）である）
請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
診断スコアSが下記式により計算される:
【数３】
2018504915.tif 000065
（式中、「C」は、hsa-miR-24-3p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-30c-5pのそれぞれの定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）によって得られた閾値サイクル値（Ct）または交差点値（Cp）である）
請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
診断スコアSが下記式により計算される:
【数４】
2018504915.tif 000066
（式中、X = (X1,…,Xp)は、各個々のサンプルについての正規化値から各個々のサンプルについての生データCq値を減算することによって得られた特定のmicroRNAアッセイのΔCq値であり、β0,…,βpは最尤法により推定された係数である）
請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項２１】
前立腺癌治療を必要とする患者を治療する方法であって、患者が前立腺癌に罹患する確率が増加しているかどうかを判定するために、上記請求項いずれかに記載の診断テストを実行し、この情報に基づいて患者のための適切な治療法を選択することを含む方法。
【請求項２２】
被験体が前立腺癌に罹患するリスクをin vitroで評価するためのキットであって、前記験体からの尿サンプルにおいて、hsa-miR-222-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-30a-5pおよびhsa-miR-30c-5pからなるmiRの群から選択される少なくとも2つのmiRの発現レベルの測定に必要な試薬のアリコートを含み、ここで、健康なドナーと比較して前記少なくとも2つのmiRの変化した発現レベルが、前記被験体が前立腺癌に罹患している確率が高いことを示す、キット。
【請求項２３】
hsa-let-7a-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-1238-3p, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-203a, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-223-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29c-3p , hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-31-3p, hsa-miR-31-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-99a-5pおよびhsa-miR99b-5pからなる群から選択されるmiRの発現レベルの測定に必要な試薬のアリコートを更に含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
少なくとも２つのmiRがhsa-miR-30c-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pから選択される、請求項２２または２３に記載のキット。
【請求項２５】
少なくとも２つのmiRがhsa-miR-30a-5p, hsa-miR-222-3pおよびhsa-miR-24-3pから選択される、請求項２２または２３に記載のキット。
【請求項２６】
1つまたはそれ以上の健常コントロール(s)からのmiRNA発現データの少なくとも1つの参照セットをさらに含む、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２７】
尿サンプルのエキソソーム調製物を得るために必要な試薬をさらに含む、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載のキット。
【国際調査報告】
2018504915.tif 000067
2018504915.tif 000068
2018504915.tif 000069