(57)【要約】  本発明は、試料の画像を作成するコンピュータ実装方法に関し、該実装方法は、プロセッサにより、試料の第１断面の第１画像を受信し、前記第１画像は第１波長の不可視光を用いて作成されるステップと、前記プロセッサにより、前記試料の第２断面の第２画像を受信し、前記第２断面は前記第１断面に隣接し、前記第２画像は前記第１波長の不可視光を用いて作成されるステップと、前記プロセッサにより、前記第１画像および前記第２画像を位置合わせするステップと、前記プロセッサにより、次画像処理を用いて前記第１断面の単一平面画像を作成するステップと、を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の画像を作成するコンピュータ実装方法であって：
プロセッサにより、試料の第１断面の第１画像を受信するステップであって、前記第１画像は第１波長の不可視光を用いて作成されるステップと；
前記プロセッサにより、前記試料の第２断面の第２画像を受信するステップであって、前記第２断面は前記第１断面に隣接し、前記第２画像は前記第１波長の不可視光を用いて作成されるステップと；
前記プロセッサにより、前記第１画像および前記第２画像を位置合わせするステップと；
前記プロセッサにより、次画像処理を用いて前記第１断面の単一平面画像を作成するステップとを備える、方法。
【請求項２】
前記プロセッサにより、前記第１波長の不可視光を用いて作成された前記試料の第Ｎ断面の画像を受信するステップと；
前記プロセッサにより、隣接する試料断面の少なくとも３つの画像を用いて前記試料の３Ｄ画像を作成するステップとをさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記３Ｄ画像の前記作成ステップはぼけ補正プロセスを介して実行され、前記ぼけ補正プロセスは、表面下蛍光除去、カメラ光学系の収差、または物理的補正のうちの１つを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料は、これに限らないが、約２００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲の発光スペクトルを有し、第１蛍光体とは異なる第２蛍光体と接触させられる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記プロセッサにより、前記試料の前記第１断面の第３画像を受信するステップであって、前記第３画像は第２波長の不可視光を用いて作成されるステップと；
前記プロセッサにより、前記試料の第２断面の第４画像を受信するステップであって、前記第４画像は前記第２波長の不可視光を用いて作成されるステップと；
前記プロセッサにより、前記第３画像および前記第４画像を位置合わせするステップと；
前記プロセッサにより、次画像処理を用いて前記第１断面の単一平面画像を作成するステップとをさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記プロセッサにより、前記第１画像をぼけ補正するステップをさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
可視光画像を用いて組織型を決定するステップであって、前記ぼけ補正ステップは組織型に基づいて実行されるステップをさらに備える、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ぼけ補正ステップは、分析的解法、モンテカルロ・シミュレーション、点像分布関数法、およびデコンボリューション法のうちの１つを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記デコンボリューション法は、測定された点像分布関数カーネル、シミュレートされた点像分布関数カーネル、リチャードソン・ルーシー法、ウィーナ・フィルター・デコンボリューション、ヴァン・シッタート・デコンボリューション、ブラインド・デコンボリューション、および正規化デコンボリューション法のうちの１つを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料は、約２００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲の発光スペクトルを有する少なくとも１つの第１蛍光体と接触させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロセッサにより、可視光を用いて作成された前記試料の前記第１断面の画像を受信するステップと；
前記プロセッサにより、前記試料の前記第１断面の前記画像を位置合わせするステップとをさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
光源と；
画像キャプチャ装置と；
プロセッサであって；
試料の第１断面の、第１波長の不可視光を用いて作成された、第１画像を受信し；
前記試料の、前記第１断面に隣接する第２断面の、前記第１波長の不可視光を用いて作成された第２画像を受信し；
前記第１画像及び前記第２画像を位置合わせし；
次画像処理を用いて前記第１断面の単一平面画像を作成するように構成されたプロセッサとを備える、試料の画像を作成するシステム。
【請求項１３】
可視光源をさらに備える、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
フィルターをさらに備える、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１５】
前記プロセッサは：
前記第１波長の不可視光を用いて作成された前記試料の第Ｎ断面の画像を受信し；
隣接する試料断面の少なくとも３つの画像を用いて前記試料の３Ｄ画像を作成するようにさらに構成される、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１６】
前記３Ｄ画像の前記作成ステップは次画像処理を介して実行される、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
前記試料は、約２００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲で、第１蛍光体のスペクトルとは異なる発光スペクトルを有する第２蛍光体と接触させられる、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１８】
前記プロセッサは：
前記試料の前記第１断面の、第２波長の不可視光を用いて作成された、第３画像を受信し；
前記試料の第２断面の、前記第２波長の不可視光を用いて作成された第４画像を受信し；
前記第３画像及び前記第４画像を位置合わせし；
次画像処理を用いて前記第１断面の単一平面画像を作成するようにさらに構成される、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１９】
前記プロセッサは、前記第１画像をぼけ補正するようにさらに構成される、請求項１２に記載のシステム。
【請求項２０】
可視光画像を用いて組織型を決定するステップであって、前記ぼけ補正ステップは組織型に基づいて実行されるステップをさらに備える、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記ぼけ補正ステップは、光伝送に対する分析的解法、モンテカルロ・シミュレーション、点像分布関数法、およびデコンボリューション法のうちの１つを含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２２】
前記デコンボリューション法は、測定された点像分布関数カーネル、シミュレートされた点像分布関数カーネル、リチャードソン・ルーシー法、ウィーナ・フィルター・デコンボリューション、ヴァン・シッタート・デコンボリューション、ブラインド・デコンボリューション、および正規化デコンボリューション法のうちの１つを含む、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記試料は、約２００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲の発光スペクトルを有する少なくとも１つの第１蛍光体と接触させられる、請求項１２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記プロセッサは：
可視光を用いて作成された前記試料の前記第１断面の画像を受信し；
前記試料の前記第１断面の前記画像を位置合わせするようにさらに構成される、請求項１３に記載のシステム。
【請求項２５】
ディスプレイをさらに備える、請求項１２に記載のシステム。
【請求項２６】
試料の画像を作成するコンピュータ実装方法であって：
プロセッサにより、試料の第Ｎ断面の第ＮＸ画像を受信するステップであって、前記第ＮＸ画像は第１波長の光を用いて作成されるステップと；
前記プロセッサにより、前記試料の前記第Ｎ断面の第ＮＹ画像を受信するステップであって、前記第ＮＹ画像は第２波長の光を用いて作成され、ＹはＸ＋１に等しく、ＭはＮ＋１に等しく、第Ｍ断面は前記第Ｎ断面に隣接するステップと；
前記プロセッサにより、前記試料の前記第Ｎ断面の可視光画像を受信するステップであって、前記可視光画像は可視光を用いて作成されるステップと；
前記プロセッサにより、前記第ＮＸ画像、前記第ＮＹ画像、および前記可視光画像を位置合わせするステップと；
前記プロセッサにより、前記第ＮＸおよび前記第ＮＹ画像に対する次画像処理を用いて前記試料の３Ｄ画像を作成するステップとを備える、方法。
【請求項２７】
前記試料の前記第Ｎ断面の前記第ＮＸ画像の前記受信ステップと、
前記試料の前記第Ｎ断面の前記第ＮＹ画像の受信ステップと、
前記第ＮＸ画像、前記第ＮＹ画像、および前記可視光画像の前記位置合わせステップと、
前記３Ｄ画像の作成ステップとを反復するステップであって、ＮＸ＝ＮＸ＋１、ＮＹ＝ＮＹ＋１およびＭ＝Ｍ＋１であるステップをさらに備える、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
Ｎが整数の倍数である、前記第Ｎ断面の第Ｐ可視光画像を受信するステップをさらに備える、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料は、約２００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲の発光スペクトルを有する少なくとも１つの第１蛍光体と接触させられる、請求項２６、２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
試料の画像を作成するコンピュータ実装方法であって：
プロセッサにより、試料の第Ｎ断面の第Ｎ画像を受信するステップであって、前記第Ｎ画像は約６５０ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の第１波長の光を用いて作成されるステップと；
前記プロセッサにより、前記試料の前記第Ｎ断面の可視光画像を受信するステップであって、前記可視光画像は可視光を用いて作成されるステップと；
前記プロセッサにより、前記第Ｎ画像及び前記可視光画像を位置合わせするステップと；
前記プロセッサにより、前記第Ｎ画像に対する次画像処理を用いて前記試料の３Ｄ画像を作成するステップと；
反復するステップであって：
前記試料の前記第Ｎ断面の前記第Ｎ画像の前記受信ステップと、
前記試料の前記第Ｎ断面の前記可視光画像の前記受信ステップと、
前記第Ｎ画像、および前記可視光画像の前記位置合わせステップと、
前記３Ｄ画像の作成ステップとを反復し、Ｎ＝Ｎ＋１であるステップと；
Ｎが整数の倍数である、前記第Ｎ断面の第Ｐ可視光画像を受信するステップとを備え、前記試料は、約２００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲の発光スペクトルを有する少なくとも１つの第１蛍光体と接触させられる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年５月２１日に出願された「マルチスペクトル３次元イメージングシステムおよび方法」という名称の米国仮特許出願第６２／１６４，８００号の利益を主張するものであり、その開示全体が参照することにより本明細書に援用される。
【０００２】
本発明概念はイメージングに関し、より詳細には、異なる波長の光を用いたイメージングに関する。
【背景技術】
【０００３】
以前は、マルチスペクトル蛍光凍結切片イメージングは、独立型または改造型凍結切片撮像装置［１，２］において生体外で薬物分布を測定するために用いられていた。単一のイメージングシステムのそのような特異性により、スキャンごとのコストが高くなる可能性がある。高スループットおよび低コストのために、導入済みの一般的な凍結切断機器と同時に動作することができる対応するソフトウェアパッケージを備えた蛍光撮像装置を構成することが役立つであろう。そのために、本明細書で概説した方法は、既存の凍結切断機器への汎用可搬アドオンの凍結蛍光イメージング技術のワークフローを示す。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明概念の態様は、試料の画像を作成するコンピュータ実装方法であって、プロセッサにより、試料の第１断面の第１画像を受信するステップであって、第１画像は第１波長の不可視光を用いて作成されるステップと、プロセッサにより、試料の第２断面の第２画像を受信するステップであって、第２断面は第１断面に隣接し、第２画像は第１波長の不可視光を用いて作成されるステップと、第１画像および第２画像を位置合わせするステップと、プロセッサにより、次画像処理を用いて第１断面の単一平面画像を作成するステップとを備える方法を含む。
【０００５】
本方法は、プロセッサにより、第１波長の不可視光を用いて作成された試料の第Ｎ断面の画像を受信するステップと、プロセッサにより、次画像処理を用いて作成することができる、隣接する試料断面の少なくとも３つの画像を用いて試料の３Ｄ画像を作成するステップとを備えてもよい。
【０００６】
本方法は、プロセッサにより、試料の第１断面の第３画像を受信するステップであって、第３画像は第２波長の不可視光を用いて作成されるステップと、プロセッサにより、試料の第２断面の第４画像を受信するステップであって、第４画像は第２波長の不可視光を用いて作成されるステップと、プロセッサにより、第１画像および第２画像を位置合わせするステップとをさらに備えてもよい。
【０００７】
本方法は、プロセッサにより、第１画像をぼけ補正するステップと、可視光画像を用いて組織型を決定するステップとをまたさらに備えてもよく、ぼけ補正ステップは、例えば、記憶された履歴またはライブラリに基づいた分類アルゴリズムを用いたプロセッサにより、組織型に基づいて実行してもよい。本態様によれば、ぼけ補正ステップは、モンテカルロ・シミュレーション、点像分布関数法、およびデコンボリューション法のうちの１つを含んでもよい。さらに本態様によれば、デコンボリューション法は、測定された点像分布関数カーネル、シミュレートされた点像分布関数カーネル、リチャードソン・ルーシー法、ウィーナ・フィルター・デコンボリューション、ヴァン・シッタート・デコンボリューション、ブラインド・デコンボリューション、および正規化デコンボリューション法のうちの１つを含んでもよい。
【０００８】
本態様によれば、試料は、約２００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲の発光スペクトルを有する少なくとも１つの第１蛍光体と接触させてもよい。さらに本態様によれば、試料は、約２００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲の発光スペクトルを有し、第１蛍光体とは異なる第２蛍光体と接触させてもよい。
【０００９】
本発明によれば、本方法は、プロセッサにより、可視光を用いて作成された試料の第１断面の画像を受信するステップと、プロセッサにより、試料の第１断面の画像を位置合わせするステップとをさらに備えてもよい。
【００１０】
本発明概念の別の態様は、光源と、画像キャプチャ装置と、プロセッサとを備える、試料の画像を作成するシステムである。光源は、可視光源および／または不可視光源を含んでもよい。さらに本態様によれば、本システムは、本発明概念のシステムおよび方法を用いて作成された画像を含むデータを出力するためのディスプレイおよび／または出力手段を備えてもよい。
【００１１】
別の態様は、本発明概念に従った試料の画像を作成する方法を実施するための非一時的なプログラム製品を含む。
【００１２】
本発明概念のまたさらなる態様は、試料の画像を作成するコンピュータ実装方法を含んでおり、本方法は、プロセッサにより、試料の第Ｎ断面の第ＮＸ画像を受信するステップであって、第ＮＸ画像は第１波長の光を用いて作成されるステップと、プロセッサにより、試料の第Ｎ断面の第ＮＹ画像を受信するステップであって、第ＮＹ画像は第２波長の光を用いて作成され、ＹはＸ＋１に等しく、ＭはＮ＋１に等しく、第Ｍ断面は第Ｎ断面に隣接するステップと、プロセッサにより、試料の第Ｎ断面の可視光画像を受信するステップであって、可視光画像は可視光を用いて作成されるステップと、プロセッサにより、第ＮＸ画像、第ＮＹ画像、および可視光画像を位置合わせするステップと、プロセッサにより、第ＮＸおよび第ＮＹ画像に対する次画像処理を用いて試料の３Ｄ画像を作成するステップとを備える。
【００１３】
本方法は、試料の第Ｎ断面の第ＮＸ画像の受信ステップと、試料の第Ｎ断面の第ＮＹ画像の受信ステップと、第ＮＸ画像、第ＮＹ画像、および可視画像の位置合わせステップと、３Ｄ画像の作成ステップとを反復するステップであって、ＮＸ＝ＮＸ＋１、ＮＹ＝ＮＹ＋１およびＭ＝Ｍ＋１であるステップをさらに備えてもよい。本方法は、Ｎが整数の倍数である場合の第Ｎ断面の第Ｐ光画像を受信するステップをさらに備えてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明概念に従った工程を示すフローチャートである。
【図２】図２は、本発明概念に従った環境における装置を示す。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、本発明概念の一態様を用いて作成された画像を示す。
【図４】図４は、本発明概念に従ってキャプチャされた例示的な一連の連続断面画像である。
【図５】図５Ａ、図５Ｂおよび図５Ｃは、本態様に従った例示的な断面画像である。
【図６】図６は、本発明の態様に従った環境における装置を示す。
【図７】図７は、本発明の態様に従った環境における装置を示す。
【図８】図８は、本発明の態様に従った環境における装置を示す。
【図９】図９は、本発明の態様に従った環境における装置を示す。
【図１０】図１０は、本発明の態様に従った環境における装置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
動物、臓器、または組織内の様々な物質の蛍光分布を撮像する能力は、創薬開発に役立つことがわかっている。生体内での蛍光イメージングは、組織内の光学光の高散乱によって、特に深部の標的では、難しい問題になることがわかっている。生体内でのバルク蛍光イメージングは、落射および透過照明方式と同様に、断層撮影再生を用いて実行されている。しかしながら、これらのイメージング形式を用いた蛍光回復は、肝臓のような深部に位置し、吸収力の高い臓器に対しては精度が悪いことが示されている。さらに、生体内での蛍光回復の解像限界は、蛍光回復問題の不良設定性質により、せいぜい数ミリメートルに制限されていると広く信じられている。この解像限界により、被験体の表面から約数百ミクロンの深度を超えた関連する（例えば、血管の）特性長さスケールに関する有意義な蛍光情報を提供する能力が減少する。薬品開発が進歩するにつれて、広範囲の血管および標的の蛍光造影剤が存在する場合、蛍光分布のバルク特性を調べるだけでは十分ではなくなる。高い解像度で蛍光イメージングを実行するために、蛍光落射照明イメージングと連携して連続切断を実行してもよい。薬物分布イメージングは放射線透過法によって実行することができることが前もって実証されているが、蛍光凍結切片イメージングは電離放射線を用いずに実行することができる。さらに、多くの薬剤は常温保存可能で無毒性である。また、マルチスペクトルイメージング技術を用いて同時に複数の薬剤を撮像することも可能である。
【００１６】
本発明概念の態様は、多くの研究室で利用可能な一般的な類の機器である凍結切片撮像装置に対する独立型（だが携帯型）のアドオンの単純なワークフローおよびソフトウェアを提供する。しかしながら、本発明概念の態様に従った蛍光イメージングシステムは輸送用に構成することができるので、蛍光イメージングを単一の連続切断機器と組み合わせる必要はない。本発明概念に従った機器使用および処理方式の汎用性は、１つにはその輸送可能性にある。例えば、全身イメージング用に設計された１つの連続切断機器を用いたイメージングの後、蛍光機器を高解像度の単一臓器イメージング用に構成された別の凍結切断機に移動させることも可能である場合がある。
【００１７】
蛍光イメージングを含む既存の凍結切片ワークフローの拡張により、分子プローブの刃先の使用の機会が与えられる。本発明の態様は、分子プローブ（単独または併用）によって、本発明概念のイメージング方式を用いながら、様々な供給方法を介して（例えば、髄腔内、経口、静脈・皮下経路、吸入等によって）投与された薬剤分布および／または分子プローブの測定および可視化を可能にする。本発明の態様は、対象領域のイメージング、画像の位置合わせ、および同時に複数の蛍光体のレンダリングを可能にする。また、例えば、１つ以上の蛍光体の異なる特性および分布を活用することによって、相対強度定量化を実行してもよい。３次元画像を作成して表示することができることにより、対象領域を通るプローブ輸送の詳細分析が可能になる。本発明概念の態様は、インドシアニングリーンを含む、蛍光ガイド下手術において一般的に用いられる蛍光体と共に使用するために最適化されたＫフレアシステムを利用するが、本発明概念の方法およびシステムを用いて、多くの他の蛍光体を撮像してもよい。例えば、表１に一覧を示したプローブを参照のこと。最終的に、ｘ線ＣＴおよびＭＲＩのような付加的なモダリティによる光学データのレジストレーションにより、ハイブリッド剤のマルチモダリティ・バリデーションを可能にすることができる。
【００１８】
図１は、試料の画像を作成するコンピュータ実装方法１００の工程を示すフローチャートであり、その方法はプロセッサによって実行される工程を備える。図示の方法に従った第１工程は、プロセッサにより、試料の第１断面の第１画像を受信するステップ１０２であって、第１画像は第１波長の不可視光を用いて作成されるステップを含む。不可視光によって、近赤外（ＮＩＲ）または赤外（ＩＲ）スペクトルの波長の電磁エネルギーは、Ｘ線（蛍光Ｘ線など）のような電磁エネルギーと同様に含まれ得ると理解されている。加えて、現在知られているかまたは後に開発される超音波、ＭＲＩおよびその他のモダリティは、解剖学的指針に用いてもよい。さらにまた、不可視光は紫外線を含んでもよい。不可視光は、あらゆる現在知られているかまたは後に開発される蛍光体が蛍光を発する波長をさらに含んでもよい。
【００１９】
本方法の別の工程は、試料の第２断面の第２画像を受信するステップ１０４であって、第２断面は第１断面に隣接し、第２画像は第１波長の不可視光を用いて作成されるステップを含む。試料の一連だが不連続の断面を撮像することができ、例えば、本発明概念の態様に従って、１つおきの断面、２つおきの断面、または連続および不連続の断面の組み合わせを撮像して加工処理することができると考えられる。実行することになる次の工程は、第１画像および第２画像を位置合わせするステップ１０６を含む。そして、本発明概念の態様に従った最終工程は、次画像処理を用いて第１断面の単一平面画像を作成するステップ１０８を含む。
【００２０】
上記の工程と連携して実行してもよい任意の工程は、第１波長の不可視光を用いて作成された試料の第Ｎ断面の画像を受信するステップ１１０を含む。さらなる任意の工程は、隣接する試料断面の少なくとも３つの画像を用いて試料の３Ｄ画像を作成するステップ（図３）を含む。これらの任意の工程は、試料（またはその一部）の完全な（または不完全な）３Ｄレンダリングを作成するために、複数の断面に対してＮ回繰り返して実行してもよい。３Ｄ画像の作成は、次画像処理を介して実行してもよい。そのような方法は、以下のように、試料の第Ｎ断面の第ＮＸ画像を受信するステップであって、第ＮＸ画像は第１波長の光を用いて作成されるステップと、試料の第Ｎ断面の第ＮＹ画像を受信するステップであって、第ＮＹ画像は第２波長の光を用いて作成され、ＹはＸ＋１に等しく、ＭはＮ＋１に等しく、第Ｍ断面は第Ｎ断面に隣接するステップと、試料の第Ｎ断面の可視光画像を受信するステップであって、可視光画像は可視光を用いて作成されるステップと、プロセッサにより、第ＮＸ画像、第ＮＹ画像、および可視光画像を位置合わせするステップと、第ＮＸおよび第ＮＹ画像に対する次画像処理を用いて試料の３Ｄ画像を作成するステップとを備えると説明することができる。本発明概念に従った方法は、以下の、試料の第Ｎ断面の第ＮＸ画像の受信ステップと、試料の第Ｎ断面の第ＮＹ画像の受信ステップと、第ＮＸ画像、第ＮＹ画像、および可視画像の位置合わせステップと、３Ｄ画像の作成ステップの各々を反復するステップであって、ＮＸ＝ＮＸ＋１、ＮＹ＝ＮＹ＋１およびＭ＝Ｍ＋１であるステップを備えてもよい。
【００２１】
さらに、本発明概念に従った方法は、Ｎが整数の倍数である場合の第Ｎ断面の第Ｐ光画像を受信するステップを備えてもよい。光画像を用いた位置合わせは、画像データの適切な配置の決定および組織型の決定に役立つことになる。同じ断面のすべての可視光画像によるすべての蛍光画像の位置合わせはおそらく不必要であり、各第５、第１０、またはその他の整数倍数（第Ｐ）の可視光画像は、その第Ｐ不可視光画像による位置合わせに使用することができる。
【００２２】
異なる波長の光を撮像することができるように、様々な蛍光体を使用することが考えられる。様々な蛍光体は、特異的結合と連携して使用して、試料と関連する様々なタンパク質や構造を発見し照射することができる。したがって、本発明の態様に従って実行してもよいさらなる任意の工程は、試料の第１断面の第３画像を受信するステップ１１４であって、第３画像は第２波長の不可視光を用いて作成されるステップを含む。次の任意の工程は、試料の第２断面の第４画像を受信するステップ１１６であって、第４画像は第２波長の不可視光を用いて作成されるステップを含む。次の工程は、第３画像および第４画像を位置合わせするステップ１１８を含む。位置合わせを実行して、様々な断面内の同一構造が画像において適切に整列することを確実にすることができる。
【００２３】
本発明概念の態様によれば、試料と接触するために用いられる蛍光体は、約２００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲の発光スペクトルを示し、上記のように、複数の蛍光体を単一の試料に使用してもよく、各蛍光体は他とは異なる発光スペクトルを有する。蛍光体としては、限定はされないが、表１に詳述したものが挙げられる。
【００２４】
実行してもよい別の任意の工程は、第１画像および／またはその他の画像をぼけ補正するステップを含む。ぼけ補正は、白色光を用いて組織型を決定した後に組織型に基づいて実行してもよい。ぼけ補正は、モンテカルロ・シミュレーション、点像分布関数法、およびデコンボリューション法を含むがこれに限らない、任意の適切な方法を用いて実行してもよい。さらに、用いられるデコンボリューション法は、測定された点像分布関数カーネル、シミュレートされた点像分布関数カーネル、リチャードソン・ルーシー法、ウィーナ・フィルター・デコンボリューション、ヴァン・シッタート・デコンボリューション、ブラインド・デコンボリューション、および正規化デコンボリューション法を含むが、これに限定されるものではない。本発明の別の態様では、構造画像処理は、構造画像における均一性の縁および領域が結果として生じる蛍光／機能画像に保持される制約を用いて、画像から既知の点像分布関数を確率的に解析するデコンボリューション工程を含むことができる。
【００２５】
別の任意の工程は、画像回復、ぼけ補正および再構成のために白色光の代替物を使用するステップを含む。あらゆる種類の位置合わせされた構造イメージングモダリティ（例えば、ｘ線ＣＴ、超音波、ＭＲＩ等）を情報に基づくデコンボリューションに使用することができる。
【００２６】
さらに、画像は、最初に人間または自動分類法によって、その後各領域に定められた点像分布関数に基づいたデブラーによって、ぼけ補正することができる。
【００２７】
ぼけ補正ステップは、第１画像および／またはその他の画像に実行してもよい。ぼけ補正は、画像の鮮明性を損なう画像アーチファクトを除去する工程を含んでもよい。ぼけ補正を受ける画像アーチファクトは、表面下蛍光、カメラ光学収差、および器具の振動等のその他の環境影響の結果である可能性がある。
【００２８】
ぼけ補正は、組織型が白色光画像を用いて決定された後、組織に基づいて実行してもよい。ぼけ補正は、モンテカルロ・シミュレーション、点像分布関数法、およびデコンボリューション法を含むがこれに限らない、任意の適切な方法を用いて実行してもよい。
【００２９】
点像分布関数は、画像における単一点または複数店の組み合わせを取り出し、結果として画像上のぼけになる画像アーチファクトを補正する手段を含むと解釈される。点像分布関数は、ぼけが表面下蛍光の結果である場合に画像をぼけ補正するための好適な方法である。
【００３０】
用いられるデコンボリューション法は、測定された点像分布関数カーネル、シミュレートされた点像分布関数カーネル、リチャードソン・ルーシー法、ウィーナ・フィルター・デコンボリューション、ヴァン・シッタート・デコンボリューション、ブラインド・デコンボリューション、および正規化デコンボリューション法を含むが、これに限定されるものではない。本発明の別の態様では、構造画像処理は、構造画像における均一性の縁および領域が結果として生じる蛍光／機能画像に保持される制約を用いて、画像から既知の点像分布関数を確率的に解析するデコンボリューション工程を含むことができる。
【００３１】
上記した方法は本明細書で定義されたように不可視光を用いたイメージングについて述べたが、本発明概念の態様に従って可視光を用いた画像を使用することもできる。その他の工程と連携して使用してもよい任意の工程は、可視光を用いて作成された試料の第１断面の画像を受信するステップと、試料の第１断面の画像を位置合わせするステップとを含む。
【００３２】
試料の画像を作成するためのシステムもまた企図される。本態様に従った例示的システム２００が図２に示され、光源２０２を含んでいる。光源２０２は、光の任意の波長または波長の組み合わせを発するように構成することができる。すなわち、光源２０２は、蛍光体が蛍光を発する波長だけでなく、可視光も発することができる。光源２０２は、特定波長を単独でまたは他の波長と一緒に同時に発するように構成してもよい。光源２０２は、物理的フィルター２０３と連携して使用してもよい。また、フィルタリングをデジタル処理で実行し、画像データを操作してデジタル処理で修正された画像を生成してもよい。画像キャプチャ装置２０４も図示されている。画像キャプチャ装置２０４は、デジタルカメラ、デジタルビデオキャプチャ装置、電荷結合素子（ＣＣＤ）、増強電荷結合素子（ｉＣＣＤ）、フィルム、シンチレータ、光コヒーレンス断層撮影法、ｘ線のような解剖学的指針のための付加的な光および医用画像モダリティを含んでもよい。システム２００は、特に本発明概念に従った方法を実行するようにプログラムされたプロセッサ２０６を含む。プロセッサ２０６は、単一ユニットに、あるいは接続・非接続を問わない複合ユニットに組み入れてもよい。例えば、第１工程はある場所のプロセッサにより実行し、次の工程は異なるプロセッサにより実行し、一方のプロセッサから他方へ送信されるデータに関してその工程の組み合わせが実行されるようにしてもよい。ディスプレイ２０８が図示されている。ディスプレイ２０８は、本発明概念に従った方法を用いて作成された再構成画像を示すように構成することができる。ディスプレイ２０８は、現在知られているかまたは後に開発される任意の適切なディスプレイであってよい。
【００３３】
本発明概念の代替実施形態によれば、様々な種類（すなわち、蛍光のオンオフ、低解像度と高解像度の白色光）の画像を位置合わせする必要を減らすことができる、比較的高解像度のカメラを使用してもよい。本態様によれば、高解像度の本質的に位置合わせされた白色光および蛍光画像を同時に収集して記憶することができる。本態様に従って用いられる場合がある高解像度の例としては、１０２４×１０２４ピクセル、３６４９８×２４３２ピクセル、またはその他の適切な解像度が挙げられる。
【００３４】
そのような態様によれば、蛍光再構成は以下のように実行することができる。露出したブロック面の白色光および蛍光画像が各画像スライスに対してキャプチャされる。基準参照マーカーは白色画像で見ることができ、一般的にブロックにあけられたインク充填孔である。この孔がまっすぐに構成されることにより、１つの白色光画像を次のものと整列させるためにこの孔を使用することが可能になる（すなわち、連続断面の画像を互いに整列させることができる）。各スライスに対して、白色光及び蛍光画像が自然に位置合わせされる、つまり、白色光画像が整列していると、それらの整列規則を用いて蛍光画像を整列させることができるということである。このようにして、白色光および蛍光情報の完全に整列した３Ｄ分布を集めることができる。
【００３５】
本発明の別の態様によれば、高解像度カメラを用いて集められた蛍光画像がなお表面下蛍光が出現しやすい場合、表面下蛍光の影響はデコンボリューション法または次画像処理方法を用いることによって除去することができる。これらの補正に要求されるパラメータは、発見的または経験的に決定することができる。これらのパラメータは、おそらく各組織型で異なる。
【００３６】
本発明のさらなる態様によれば、組織同定は、ｘ線ＣＴ、ＭＲＩまたは人間の介入、あるいはそれらの組み合わせ等の付加的なイメージングモダリティを用いることなく、カラーマッチング、アトラスレジストレーション、またはハイブリッド技術を用いた白色光画像を用いて実行することができる。組織が同定されると、ルックアップテーブルを用いて表面下蛍光除去のための適切なパラメータを取り出すことができる。それから、回復のための適切なパラメータによって各組織を処理することができる。これにより、補正された光子数によって測定された蛍光の分布になる。
【００３７】
そのような場合、システムが十分に特徴づけられている（すなわち、すべてのカメラおよびファイバーの効率および安定特性がわかっている）とすると、この分布は蛍光の定量的分布に変換することができる。あるいは、注入された蛍光体の総分子数がわかっていて、全身が撮像されているとすると、レシオメトリック技術を用いて蛍光分布を回復することが可能である。あるいは、蛍光基準が視野内でも見ることができる場合、蛍光を基準の光子数に基づいた濃度で計ることも可能となる。
【００３８】
これらの態様に従ったワークフローは、３Ｄ蛍光及び白色光画像をデータベースにインデックスすることができるように、画像にメタ情報を追加することができる。メタ情報の非限定的な例としては、被験体名、撮像日、情報入手に用いたモダリティ、他の番号、プロジェクトまたは研究固有情報、ピクセルサイズまたはボクセルサイズ等と組み合わせた識別番号が挙げられる。これは、世界中のどこでもクラウドを通して画像にアクセスすることができるようになることを意味する。
【００３９】
本発明概念に従った方法は、非一時的コンピュータプログラム製品として具現化することができる。１つ以上のコンピュータ可読記憶装置またはコンピュータ可読媒体の任意の組み合わせを利用してもよい。コンピュータ可読媒体は、コンピュータ可読記憶媒体であってよい。コンピュータ可読記憶装置は、例えば、電子、磁気、光学、電磁、または半導体システム、装置、またはデバイス、あるいは前述のものの任意の適切な組み合わせであってよいが、これに限定されるものではない。コンピュータ可読記憶装置のより具体的な例（非限定的リスト）には以下のもの：ポータブルコンピュータディスケット、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、消去可能プログラマブルリードオンリーメモリ（ＥＰＲＯＭまたはフラッシュメモリ）、光ファイバー、ポータブルコンパクトディスクリードオンリーメモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）、光学記憶装置、磁気記憶装置、または前述のものの任意の適切な組み合わせが含まれる。本書の文脈において、コンピュータ可読記憶装置は、命令実行システム、装置、またはデバイスによって、またはそれらと接続して使用されるプログラムを記憶することができる任意の有形のデバイスまたは媒体であってよい。用語「コンピュータ可読記憶装置」またはその変化形は、銅ケーブル、光ファイバーまたは無線伝送媒体等の信号伝搬媒体を包含するものではない。
【００４０】
コンピュータ可読記憶装置またはコンピュータ可読媒体上で具現化されるプログラムコードは、無線、ワイヤライン、光ファイバーケーブル、ＲＦ等、または前述のものの任意の適切な組み合わせを含むがこれに限定されない、任意の適切な媒体を用いて送信することができる。
【００４１】
本発明の態様の動作を実行するためのコンピュータプログラムコードは、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｓｍａｌｌｔａｌｋ、Ｃ＋＋または同様のもの等のオブジェクト指向プログラミング言語、および「Ｃ」プログラミング言語または同様のプログラミング言語等の従来の手続き型プログラミング言語を含む、１つ以上のプログラミング言語の任意の組み合わせで書かれてもよい。プログラムコードは、全体的にユーザのコンピュータ上で、部分的にユーザのコンピュータ上で、独立型ソフトウェアパッケージとして、部分的にユーザのコンピュータ上かつ部分的にリモートコンピュータ上で、あるいは全体的にリモートコンピュータまたはサーバ上で実行してもよい。後者のシナリオでは、リモートコンピュータは、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）またはワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）を含む任意のタイプのネットワークを通してユーザのコンピュータに接続してもよく、接続は外部コンピュータに対して（例えば、インターネットサービスプロバイダを用いたインターネットを通して）行ってもよい。
【００４２】
本発明の態様は、本発明の実施形態に従った方法、装置（システム）およびコンピュータプログラム製品のフローチャート図および／またはブロック図を参照して本明細書で説明する。フローチャート図および／またはブロック図の各ブロック、ならびにフローチャート図および／またはブロック図のブロックの組み合わせは、コンピュータプログラム命令によって実装され得ることが理解されるであろう。これらのコンピュータプログラム命令は、汎用コンピュータ、専用コンピュータ、または他のプログラム可能データ処理装置の１つ以上のプロセッサに提供されて、コンピュータまたは他のプログラム可能データ処理装置の１つ以上のプロセッサを介して実行される命令が、フローチャートおよび／またはブロック図のブロックまたはブロック群に指定された機能／行為を実装するための手段を作成するようにマシンを生成することができる。
【００４３】
これらのコンピュータプログラム命令はまた、１つ以上のコンピュータ、１つ以上の他のプログラム可能データ処理装置、または１つ以上の他のデバイスに特定の方法で機能するよう指示し得る１つ以上のコンピュータ可読記憶装置またはコンピュータ可読媒体に記憶されることができ、それにより、１つ以上のコンピュータ可読記憶装置またはコンピュータ可読媒体に記憶される命令が、フローチャートおよび／またはブロック図のブロックまたはブロック群に指定された機能／行為を実装する命令を含む製品を生成する。
【００４４】
コンピュータプログラム命令はまた、１つ以上のコンピュータ、１つ以上の他のプログラム可能データ処理装置、または１つ以上の他のデバイスにロードされて、一連の動作ステップが、１つ以上のコンピュータ、１つ以上の他のプログラム可能データ処理装置、または１つ以上の他のデバイス上で実施されるようにさせ、それにより、１つ以上のコンピュータ、１つ以上の他のプログラム可能データ処理装置、または１つ以上の他のデバイス上で実行される命令が、フローチャートおよび／またはブロック図のブロックまたはブロック群に指定された機能／行為を実装するためのプロセスを提供するようにコンピュータ実装プロセスを生成することができる。
【００４５】
本明細書において用いられる専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のためだけのものであって、本発明の限定を意図するものではない。本明細書で使用するとき、単数形「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数形も含むことが意図される。用語「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および／または「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書で使用されるとき、述べる特徴、整数、ステップ、動作、要素、および／またはコンポーネントの存在を指定するが、１つ以上の他の特徴、整数、ステップ、動作、要素、コンポーネント、および／またはそのグループの存在または付加を排除しないことがさらに理解されるであろう。
【００４６】
特許請求の範囲における、すべてのミーンズまたはステップ・プラス・ファンクション要素の対応する構造、材料、行為、および均等物は、具体的に特許請求されるような他の特許請求される要素と組み合わせて機能を実行するための任意の構造、材料、または行為を含むことが意図されている。本発明の記載は、例示および説明を目的として提示されたが、開示された形態において網羅的であること、または本発明を限定することは意図されていない。多くの変更形態および変形形態が本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者には明らかであろう。実施形態は、本発明の原理および実際の適用について最善の説明を行うために、および考えられる特定の使用に適するような様々な変更形態と共に様々な実施形態について当業者の他の人が本発明を理解することができるように選ばれ記載された。
【００４７】
一般的方法：測定のため、被験体は最初に適切な方法によって研究の前処理をされる（すなわち、所定量の造影剤を注入され、一般的に適当な時間が経ってから解剖される）。対象サンプルは、最適切断温度材料（Ｏ．Ｃ．Ｔ）で凍結される。Ｏ．Ｃ．Ｔ．ブロックは凍結切断機で連続的にスライスされ、そこで各切片または断面の蛍光画像と同時に高解像度白色光画像が撮られる。適切なフィルタリングによって、複数の蛍光体を同時に撮像することができる。断面画像は、解剖学的基準マーカーに基づいて切り取られて整列される。複数のカメラが使用される（すなわち、対象被写体が白色光および蛍光カメラによって異なる角度から見られるように白色光カメラが位置づけられる）場合、凍結切片画像処理において行われる標準の剛性位置合わせと共に１２パラメータ・アフィンレジストレーションが実行される。そして、蛍光画像は、Ｓｔｅｙｅｒら［３］で提示された方法の変更形態を用いて処理されて、白色画像スタックに位置合わせされる３Ｄ蛍光分布回復になる。
【実施例】
【００４８】
未処置のオスのＳＤラットに、１００μＭの濃度で７０μＬのＺＷ８００−１［４］を髄腔内に注入した。被験体を解剖して脳を切除する前に、造影剤を９０分間行き渡らせることができた。脳はＯ．Ｃ．Ｔ．で凍結させてから、ライカ３０５０クリオスタット（ライカカメラＡＧ、ヴェッツラー、ドイツ）、高解像度キャノンＥＯＳ（登録商標）７００白色光カメラ（キャノン、メルヴィル、ニューヨーク州、米国）、およびＫフレア手術用蛍光イメージングシステム（Ｃｕｒａｄｅｌ  ＬＬＣ、ウースター、マサチューセッツ州、米国）を用いて撮像された。
【００４９】
図４は、連続断面で撮られた一連の画像を示す。図５Ａ〜図５Ｃは、本発明概念の態様に従って撮像された断面を示す。具体的には、本発明概念の態様に従って前処理して撮像されたラットの脳の、図５Ａは矢状断面を示し、図５Ｂは冠状断面を示し、図５Ｃは横断面を示す。
【００５０】
蛍光トレーサの測定分布は、先の研究に基づく予想分布に合致する。本方法論は、汎用蛍光イメージング技術が既定の凍結切断機器と同時に独立型蛍光イメージングシステムを用いて実行することができることを実証した。
参考文献：
［１］Ｒｏｙら、Ａｎａｔ  Ｒｅｃ（２００９年）。
［２］Ｓａｒａｎｔｏｐｏｕｌｏｓら、Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｂｉｏｌ（２０１１年）。
［３］Ｓｔｅｙｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．（２００９年）。
［４］Ｃｈｏｉら、Ａｎｇｅｒ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ（２０１１年）。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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