【手続補正書】
【提出日】平成26年4月18日(2014.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
交配親の一方にヒラタケ(P. ostreatus (Jacq.: Fr.) Kummer)を選択し、交配親の他方にネブロデンシス（P. nebrodensis (DC.:Fr.) Quel.）、バイリング（P. eryngii (DC.:Fr.) Quel. var. tuoliensis C.J.Mou）又はフェルラ（P. eryngii (DC.:Fr.) Quel. var. ferulae Lanzi）のいずれかを選択して、双方間で交配可能な一核菌糸間で交配させることを特徴とするヒラタケ属の種間雑種の育成方法。
【請求項２】
交配親の一方にヒラタケを選択し、交配親の他方にネブロデンシス、バイリング又はフェルラのいずれかを選択して、双方間で交配可能な一核菌糸間で交配させて得られたヒラタケ属の種間雑種。
【請求項３】
請求項２記載のヒラタケ属の種間雑種を交配親の一方に選択し、交配親の他方にエリンギ(P. eryngii (DC.:Fr.) Quel.)又はエレオセリニ（P. eryngii (DC.:Fr.) Quel. var. elaeoselini）のいずれかを選択して、双方間で交配可能な一核菌糸間で交配させることを特徴とするヒラタケ属の種間雑種の育成方法。
【請求項４】
請求項２記載のヒラタケ属の種間雑種を交配親の一方に選択し、交配親の他方にエリンギ又はエレオセリニのいずれかを選択して、双方間で交配可能な一核菌糸間で交配させて得られたヒラタケ属の種間雑種。
【請求項５】
ネブロデンシス、バイリング、フェルラ、エリンギ又はエレオセリニの中から、一方の親がネブロデンシス、バイリング又はフェルラになるように任意に２種を選択して交配株を得て、その交配株とヒラタケとの間で交配可能な一核菌糸間で交配させることを特徴とするヒラタケ属の種間雑種育成方法。
【請求項６】
ネブロデンシス、バイリング、フェルラ、エリンギ又はエレオセリニの中から、一方の親がネブロデンシス、バイリング又はフェルラになるように任意に２種を選択して交配株を得て、その交配株とヒラタケとの間で交配可能な一核菌糸間で交配させることで得られたヒラタケ属の種間雑種。
【請求項７】
ネブロデンシス、バイリング又はフェルラに換えてネブロデンシス、バイリング又はフェルラのうちの２種を親としてその２種間で交配可能な一核菌糸間で交配して得られた交配株を使用することを特徴とする請求項１、請求項３及び請求項５に記載されたヒラタケ属の種間雑種の育成方法。
【請求項８】
エリンギ又はエレオセリニに換えてエリンギとエレオセリニとの間で交配可能な一核菌糸間で交配させて得られた交配株を使用する請求項３、請求項５及び請求項７に記載されたヒラタケ属の種間雑種の育成方法。
【請求項９】
請求項７又は請求項８の方法で得られたヒラタケ属の種間雑種。
【請求項１０】
請求項２、請求項４，請求項６又は請求項９に記載されたヒラタケ属の種間雑種をきのこ栽培用の培地に接種してきのこを発生させることを特徴とするヒラタケ属の種間雑種の栽培方法。
【請求項１１】
ヒラタケ、ネブロデンシス、エリンギ及びエレオセリニを親として使用することで得た種間雑種Pleurotus sp.（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７８）又はPleurotus sp.（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７９）。
【請求項１２】
種間雑種Pleurotus sp.（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７８）又はPleurotus sp.（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７９）をきのこ栽培用培地に接種して発生させることを特徴とする、ヒラタケ属の種間雑種の栽培方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
請求項１１に記載の発明は、国内種のヒラタケと外国種との種間交配により得られた寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７８又はＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７９のヒラタケ属の新種である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
請求項１２に記載の発明は、国内種のヒラタケと外国種との種間交配により得られた寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７８又はＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７９のヒラタケ属の新種をきのこ栽培用の培地で栽培する方法である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
【図１】国内種、外国種及び本願発明により得られた寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７８とＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７９についての系統関係をＵＰＧＭＡ方法によって示す図である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
また、ヒラタケ、ネブロデンシス、エリンギ及びエレオセリニを使用して数回にわたり交配を繰り返すことで得られた比較的短期間で栽培できる菌株例として２菌株を独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託した。それぞれ、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７８、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７９として寄託されている。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）にＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７８及びＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７９として寄託されている菌株は、ヒラタケ、ネブロデンシス、エリンギ、エレオセリニを使用して、任意に選択した親品種から単胞子分離を行って得られた一核菌糸の対峙培養による交配を繰り返し得た菌株である。具体的には次の通りである。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
ヒラタケとネブロデンシスとを交配し交配株を得て、形態などを検定して１品種を選抜した（交配株１とする）。一方、エリンギとエレオセリニとを交配し交配株を得て、形態などを検定して１品種を選抜した（交配株２とする）。次に交配株１と交配株２とを交配し交配株を得て、形態などを検定して１品種を選抜した（交配株３とする）。交配株３とヒラタケとを交配し交配株を得て、形態などを検定して１品種を選抜した（交配株４とする）。交配株４とエリンギとを交配し交配株を得て、形態などを検定して１品種を選抜した（交配株５とする）。交配株５とヒラタケとを交配し交配株を得て、形態などを検定して１品種を選抜した（交配株６とする）。交配株５と交配株６とを交配し交配株を得て、形態などを検定して、その交配株のなかから２菌株を選抜して独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託し、寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７８及びＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７９とされた。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７８と寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７９とをそれぞれポテトデキストロース寒天培地で前培養し、コルクボーラーで直径５．０mmに打ち抜き、下記の各培地に接種して暗培養した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７８の結果
（１）麦芽エキス寒天培地での生育状態（２５℃）
６日目のコロニー直径は２３．５mm，菌叢の色は白色だった。菌叢の密度は極めて希薄であり、エリンギ及びヒラタケ比較して同程度であった。気中菌糸の量は少なく、エリンギと比較するとやや少なく、ヒラタケと比較すると同程度であった。
（２）ポテトデキストロース寒天培地での生育状態（２５℃）
６日目のコロニー直径は４２．５mm，菌叢の色は白色だった。菌叢の密度は密であり、エリンギ及びヒラタケと比較して同程度であった。気中菌糸の量は多く、エリンギ及びヒラタケと比較してやや多かった。
（３）サブロー寒天培地での生育状態（２５℃）
６日目のコロニー直径は２２．３mm，菌叢の色は白色だった。菌叢の密度は密であり、エリンギ及びヒラタケと比較して同程度であった。気中菌糸の量は多く、エリンギと比較して同程度であり、ヒラタケと比較してやや多かった。
（４）合成ムコール寒天培地での生育状態（２５℃）
６日目のコロニー直径は１７．１mm，菌叢の色は白色だった。菌叢の密度は密であり、エリンギと比較して同等で、ヒラタケと比較してより密であった。気中菌糸の量は少なく、エリンギと比較して同程度であり、ヒラタケと比較するとやや多かった。
（５）ＹｐＳｓ寒天培地での生育状態（２５℃）
６日目のコロニー直径は４９．４mm，菌叢の色は白色だった。菌叢の密度は密であり、エリンギ及びヒラタケと比較して同程度であった。気中菌糸の量は中程度で、エリンギと比較して同程度でありヒラタケと比較すると少なかった。
（６）ツァペック・ドックス寒天培地での生育状態（２５℃）
６日目のコロニー直径は３２．９mm，菌叢の色は白色だった。菌叢の密度は極めて希薄であり、エリンギと比較して密、ヒラタケと比較すると同程度であった。気中菌糸の量は少なく、エリンギ及びヒラタケと比較して同程度であった。
（７）オートミール寒天培地での生育状態（２５℃）
６日目のコロニー直径は５９．２mm，菌叢の色は白色だった。菌叢の密度は密であり、エリンギ及びヒラタケと比較して同程度であった。気中菌糸の量は中程度で、エリンギと比較して同程度でありヒラタケと比較して少なかった。
（８）フェノールオキシダーゼ検定培地での生育状態（２５℃）
０．５％タンニン酸添加ポテトデキストロース培地おいて、培養６日目で菌糸は生長せず、かつ不活着症状を示すとともに接種源の周辺培地がわずかに褐変化した。エリンギ、ヒラタケも同様の結果であった。
０．５％没食子酸添加ポテトデキストロース培地において、培養６日目では菌糸は生長せず、接種源の周辺培地が褐変化した。引き続き培養を継続したところ菌糸が活着し、接種後９日目でコロニーの直径は２４．２mmになった。菌叢の色は白色だった。菌叢の密度は密であり、エリンギと比較して同程度であった。気中菌糸の量は少なく、エリンギと比較して同程度であった。一方、ヒラタケでは菌糸の活着及び生長が見られず、接種源の周辺培地の褐変化のみが見られた。
（９）最適生長温度：ポテトデキストロース寒天培地に直径５mmの菌糸片を接種し、２５℃で２日間前培養した後、各温度でそれぞれ培養した。６日後に生長したコロニー半径を測定したところ、最適生長温度は２８℃付近だった。また、５℃ではほとんど菌糸が生長せず、３４℃では生長が著しく悪かった。
（10）最適生長ｐＨ：ＰＤ液体培地２５ｍｌを滅菌後、塩酸又は水酸化カリウムでｐＨを無菌的にｐＨ３．０〜１０．０の範囲で０．５毎に調整した。その後直径５mmの菌糸片を接種して、１５日間静置培養した後、各乾燥重量を測定したところ、最適生長ｐＨは６．０付近であった。また、本菌株の生長はｐＨ４．５〜９．０の範囲で良好だった。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７９の結果
（１）麦芽エキス寒天培地での生育状態（２５℃）
６日目のコロニー直径は４９．０mm，菌叢の色は白色だった。菌叢の密度は極めて希薄であり、エリンギ及びヒラタケと同程度であった。気中菌糸の量は少なく、エリンギと比較してやや少なく、ヒラタケと比較して同程度であった。
（２）ポテトデキストロース寒天培地での生育状態（２５℃）
６日目のコロニー直径は６１．２mm，菌叢の色は白色だった。菌叢の密度は密であり、エリンギ及びヒラタケと比較して同程度であった。気中菌糸の量は多く、エリンギ及びヒラタケと比較してやや多かった。
（３）サブロー寒天培地での生育状態（２５℃）
６日目のコロニー直径は３９．８mm，菌叢の色は白色だった。菌叢の密度は密であり、エリンギ及びヒラタケと比較して同程度であった。気中菌糸の量は多く、エリンギと比較して同程度でありヒラタケと比較してやや多かった。
（４）合成ムコール寒天培地での生育状態（２５℃）
６日目のコロニー直径は１９．５mm，菌叢の色は白色だった。菌叢の密度は希薄で、エリンギと比較して希薄、ヒラタケと比較して同等であった。気中菌糸の量は中程度で、エリンギと比較して多く、ヒラタケと比較してやや少なかった。 
（５）ＹｐＳｓ寒天培地での生育状態（２５℃）
６日目のコロニー直径は６３．５mm，菌叢の色は白色だった。菌叢の密度は密であり、エリンギ及びヒラタケと同程度であった。気中菌糸の量は中程度で、エリンギと比較して同程度であり、ヒラタケと比較して少なかった。
（６）ツァペック・ドックス寒天培地での生育状態（２５℃）
６日目のコロニー直径は６０．４mm，菌叢の色は白色だった。菌叢の密度は極めて希薄であり、エリンギと比較して密で、ヒラタケと比較して同程度であった。気中菌糸の量は少なく、エリンギ及びヒラタケと比較して同程度であった。
（７）オートミール寒天培地での生育状態（２５℃）
６日目のコロニー直径は７５．６mm，菌叢の色は白色だった。菌叢の密度は密であり、エリンギ及びヒラタケと同程度であった。気中菌糸の量は中程度で、エリンギと比較して同程度でありヒラタケと比較して少なかった。
（８）フェノールオキシダーゼ検定培地での生育状態（２５℃）
０．５％タンニン酸添加ポテトデキストロース培地おいて、培養６日目で菌糸は生長せず、かつ不活着症状を示すとともに接種源の周辺培地がわずかに褐変化した。エリンギ、ヒラタケも同様の結果であった。
０．５％没食子酸添加ポテトデキストロース培地において、培養６日目では菌糸は生長せず、接種源の周辺培地が褐変化した。引き続き培養を継続したところ菌糸が活着し、接種後９日目でコロニーの直径は８．０mmになった。菌叢の色は白色だった。菌叢の密度は密であり、エリンギと比較して同程度であった。また、気中菌糸の量は少なく、エリンギと比較して同程度であった。一方、ヒラタケでは菌糸の活着及び生長が見られず、接種源の周辺培地の褐変化のみが見られた。
（９）最適生長温度：ポテトデキストロース寒天培地に直径５mmの菌糸片を接種し、２５℃で２日間前培養した後、各温度でそれぞれ培養した。６日後に生長したコロニー半径を測定したところ、最適生長温度は２８℃付近だった。また、５℃ではほとんど菌糸が生長せず、３４℃では生長が著しく悪かった。
(10) 最適生長ｐＨ：ＰＤ液体培地２５ｍｌを滅菌後、塩酸又は水酸化カリウムでｐＨを無菌的にｐＨ３．０〜１０．０の範囲で０．５毎に調整した。その後直径５mmの菌糸片を接種して、１５日間静置培養して後、各乾燥重量を測定したところ、最適生長ｐＨは６．５付近であった。また、本菌株の生長はｐＨ４．５〜９．０の範囲で良好だった。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７８と寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７９とを実施例２のきのこ栽培方法と同様の方法によりきのこを発生させた。その栽培結果について、栽培的特性や形態的特性等について表５に示した。傘の色や茎の形状などはエリンギよりもヒラタケの形状に近似していた。なお、色についてはＲＨＳcolour chartを参考にした。
【表５】
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【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
ヒラタケ、ネブロデンシス、エリンギ、エレオセリニ、種間雑種寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７８及び種間雑種寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７９のそれぞれについてＩＴＳ領域の塩基配列を調査して比較した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
(1)ITS領域の塩基配列の決定
ＰＤＡ平板培地で培養したヒラタケ、エリンギ、エレオセリニ、ネブロデンシス、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７８及びＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７９の6菌株の菌糸体をそれぞれ集菌し、凍結乾燥したものからDNA抽出キット「Plant Geno-DNA-Template（TaKaRa社）」を用いてDNAをそれぞれ抽出した。抽出したそれぞれのDNAを鋳型として、ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG）及びITS４（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC）のプライマー対により、リボソームDNAの内部転写スペーサー領域（以下、ITS領域とする）をPCR（polymerase chain reaction）法により増幅し、得られたPCR産物を精製し、シーケンシングをして塩基配列を決定した。シーケンシングは株式会社ベックスに依頼し、ABI Prism 3130 Genetic Analyzer(Applied Biosystems Japan)を用いたダイターミネーター法により行った。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
この結果に基づき、本実施例で使用したきのこの最終同定を行ったところ、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７８はヒラタケ属のきのこ「P. eryngii」の配列と相同性が最も高く、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７９は「P. eryngii」と「P. ostreatus」の2つの配列と相同性が高いという結果になった。このことから、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７９は、ヒラタケとエリンギの両方の遺伝子を併せもつことが明確となった。一方、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７８は、ITS領域においては、エリンギに近似しているものの、実施例７の結果からきのこの形状はエリンギよりもヒラタケに近似しており、総合的に考察するとヒラタケとエリンギの形質が混在していると判断できた。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
ＭＨ００６４０３  ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７８
ＭＨ００６４０４  ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３７９
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2014027881.tif 000002