(57)【要約】  本発明は、試料中の酸化性化学種の分析に使用できる方法であって、以下のステップ：試料を、フォトルミネセンス性の第１の試薬及び光学的に活性な第２の試薬と接触させるステップ（１２）であって、フォトルミネセンス性の第１の試薬が、希土類でドープされかつ酸化可能なナノ粒子を少なくとも含んでおり、フォトルミネセンス性の第１の試薬の発光が、少なくとも１つの第１の波長において、酸化性化学種の量と共に変化し、かつ光学的に活性な第２の試薬によって放出されるシグナルが、第１の波長とは異なる少なくとも１つの第２の波長において、一定であるか、或いは酸化性化学種の量と共に、フォトルミネセンス性の第１の試薬の発光とは逆方向に、変化するステップと、試料中のフォトルミネセンス性の第１の試薬及び光学活性な第２の試薬を励起するステップ（１６）と、少なくとも第１の波長及び少なくとも第２の波長において、試料の光度を測定するステップ（１８）と、前記測定された光度の解釈（２０）及び場合によって基準値の参照によって、酸化性化学種の存在及び／又は量を推定するステップとを含む方法に関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中、特に生物学的試料中、の酸化性化学種の分析に使用できる方法であって、以下のステップ：
ｉ）試料を、フォトルミネセンス性の第１の試薬及び光学的に活性な第２の試薬と接触させるステップ（１２）と、
ここで、該フォトルミネセンス性の第１の試薬が、希土類でドープされかつ酸化可能なナノ粒子を少なくとも含んでおり、
・フォトルミネセンス性の第１の試薬の発光が、少なくとも１つの第１の波長において、酸化性化学種の量と共に変化し、かつ
・光学的に活性な第２の試薬によって放出されるシグナルが、第１の波長とは異なる少なくとも１つの第２の波長において、酸化性化学種の量に対して一定であるか、或いは酸化性化学種の量と共に、フォトルミネセンス性の第１の試薬の発光とは逆方向に、変化する、
ｉｉ）試料中のフォトルミネセンス性の第１の試薬及び光学活性な第２の試薬を励起するステップ（１６）と、
ｉｉｉ）少なくとも第１の波長及び少なくとも第２の波長において、試料の光度を測定するステップ（１８）と、
ｉｖ）前記測定された光度の解釈（２０）によって及び場合によって基準値の参照によって、酸化性化学種の存在及び／又は量を推定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
ステップｉｖ）において、試料中の酸化性化学種の量が、ステップｉｉｉ）で測定された光度の対に対応する値を標準シート（３０）上で読み取る（２０）ことによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標準シートが、既知の量の酸化性化学種を有する試料で実施された測定によって予め確立されたシート（３０）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｉｉｉ）が、ステップｉｉ）の後ゼロでない待ち設定時間後に実施される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
フォトルミネセンス性の第１の試薬の発光の光度が酸化性化学種の量と共に増加する、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
光学的に活性な第２の試薬の発光の光度が、酸化性化学種の量に対してほぼ一定である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
光学的に活性な第２の試薬がフォトルミネセンス性であり、好ましくはＬａＰＯ４：Ｅｕ、ＬａＰＯ４：Ｅｒ、ＬａＰＯ４：Ｎｄ、ＬａＰＯ４：Ｔｂ、ＬａＦ３：ＲＥ、ＮａＹＦ４：Ｙｂ、ＮａＹＦ４：Ｅｒ、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＴｅ／ＺｎＳ、ＫＴＰ及び／又はＢａＴｉＯ３のナノ粒子を含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
光学的に活性な第２の試薬の発光の光度が酸化性化学種の量と共に減少する、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第１の波長がフォトルミネセンス性の第１の試薬の酸化型を代表し、第２の波長が光学的に活性で好ましくはフォトルミネセンス性の試薬の還元型を代表する、請求項１乃至請求項５及び請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
光学的に活性な第２の試薬がフォトルミネセンス性であり、好ましくはＹＡＧ：Ｃｅ、ＬａＰＯ４：Ｃｅのナノ粒子を含む、請求項１乃至請求項５及び請求項８又は請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
フォトルミネセンス性の第１の試薬が、ＡｘＥｕ１−ｘ（ＶＯ４）ｙ（ＰＯ４）（１−ｙ）、特にＡｘＥｕ１−ｘＶＯ４の少なくとも部分的に還元されたナノ粒子（式中、ＡはＹ、Ｇｄ及びＬａから選択される１種であり、０≦ｘ≦１、０≦ｙ≦１である。）である、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップｉ）の前に、フォトルミネセンス性の第１の試薬を得るためナノ粒子を還元（１４）することからなるステップａ）を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップａ）において、還元（１４）が還元剤を用いて化学的に実施され、ステップａ）が、好ましくは、化学的還元後に、過剰の還元剤を除去するため還元されたナノ粒子を洗浄することからなるサブステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
還元剤がＮａＢＨ４を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
試料（１０２）中、特に生物学的試料中の酸化性化学種の分析に使用できる方法であって、以下のステップ：
ｉ）ＡｘＥｕ１−ｘ（ＶＯ４）ｙ（ＰＯ４）（１−ｙ）（式中、ＡはＹ、Ｇｄ及びＬａから選択される１種であり、０≦ｘ≦１、０≦ｙ≦１である。）のフォトルミネセンス性のナノ粒子であって、特に還元剤を用いて化学的に、特にＮａＢＨ４によって、前もって還元されたナノ粒子を用意するステップと、
ｉｉ）アッセイ試料中に前記ナノ粒子を導入するステップと、
ｉｉｉ）前記ナノ粒子を励起するステップ（１６）と、
ｉｖ）前記ナノ粒子の酸化型又は還元型を代表する１以上の波長で前記試料によって放射された光度を測定するステップ（１８）と、
ｉｖ）前記測定の解釈によって、場合によって基準又は較正の参照によって、酸化性化学種の存在及び／又は量を推定するステップと
を含む方法。
【請求項１６】
前記粒子が、１種以上の官能化生体分子に並びに／又はターゲティング分子及びステルス剤から選択される公知の関心のある生体分子にさらにカップリングされている、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
試料が、
・生体、
・生物組織、
・生物細胞、
・溶液、特に生体分子を含有する溶液、
・ある容積のガス
から選択される１種である、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
診断、特に生理学的に許容されない１種以上の活性酸素種（ＲＯＳ）の発現に関連する生理学的障害（病理学的であるか否かを問わない）の診断のための、請求項１乃至請求項１７のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１９】
１種以上の活性酸素種（ＲＯＳ）の過剰発現に関連する障害（病理学的であるか否かを問わない）に関する活性物質の有効性のスクリーニングのための、請求項１乃至請求項１７のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項２０】
分析が容量分析試料について実施される、請求項１８又は請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
請求項１乃至請求項１４、請求項１６及び請求項１７のいずれか１項に記載の方法（１０）を実施するためのシステム（１００）であって、
・試料（１０２）中のフォトルミネセンス性の第１の試薬及び光学的に活性な第２の試薬を励起するための１又は２波長のレーザー照明装置（１０４）と、
・フォトルミネセンス性の第１の試薬及び光学的に活性な第２の試薬からの発光を異なる波長に応じてフィルタリングし、もって試料の２つの別個のフィルター処理画像を形成するためのスペクトルスプリッター（１２０）と、
・２つのフィルター処理画像の少なくとも２点の光度を決定するための手段と
を含むシステム。
【請求項２２】
光度を決定するための手段が、波長に応じてフィルタリングされた画像を記録するための手段を備えており、該記録手段が、好ましくは、スペクトルスプリッター（１２０）の出力に機能的に配置されかつカメラ（１３４）に記録された画像を記録するためのコンピュータに接続されたカメラ（１３４）、さらに好ましくはＥＭ−ＣＣＤ型のカメラを備える、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
光度を決定するための手段が、異なる波長での２つの光検出器、特に光電子増倍管又はフォトダイオード型のものを含む、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２４】
試料（１０２）とスペクトルスプリッター（１２０）との間に機能的に介在する顕微鏡をさらに備える、請求項２１乃至請求項２３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２５】
顕微鏡が、蛍光顕微鏡（好ましくは広視野型）、マクロスコープ及び実体顕微鏡から選択されるものである、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
試料（１０２）用のホルダー（１０３）、特に溶液の形態の試料のための容器をさらに備える、請求項２１乃至請求項２５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２７】
一方で照明装置（１０４）と試料（１０２）との間に、及び他方で試料（１０２）とスペクトルスプリッター（１２０）との間に、機能的に介在する分割プレート（１１４）をさらに備える、請求項２１乃至請求項２６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２８】
選択的に活性化できる、光度を決定するための手段の（特に機械的又は電子的）掩蔽のための装置をさらに備える、請求項２１乃至請求項２７のいずれか１項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化性化学種の分析に使用することができる方法及びこの方法の実施に適した酸化性化学種の検出システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中の酸化性化学種の存在を検出するための数多くの方法が既に提案されている。
【０００３】
さらに具体的に目標とされる酸化性化学種は、特に様々なシグナル伝達経路に関与する細胞メッセンジャーである。それらの調節は、免疫反応並びにある種の癌、循環器疾患及び神経変性疾患のような疾病において極めて重要である。従って、試験試料中、特に生物学的試料中の酸化性化学種の存在、その存在の定量化及びその濃度の経時的変化を測定するための有効な方法を有していると特に有利である。
【０００４】
ただし、酸化性化学種の検出は、他に数多くの用途をもつことに留意すべきである。例えばフランス出願公開第２９８０８４７号には、酸化性化学種の検出に基づく爆発物検出方法が提示されている。
【０００５】
公知の方法のいくつかは、試料中の酸化性化学種の存在によって発光が強まる有機蛍光試薬（又はフルオロフォア）の使用を提案する。ジクロロフルオレセインは、この種の有機蛍光試薬の一例であり、オキシダントの存在下でその蛍光が強まり、生環境下で使用することができる。
【０００６】
しかし、この種の有機蛍光試薬は強い光退色を起こし、周囲環境で自発的に酸化し易く、そのため実際には長期の定量測定ができなくなることが知られている。さらに、蛍光の増大に続いて不可逆的酸化反応が起こり、そのため時間分解測定を行うことができなくなる。
【０００７】
蛍光タンパク質を蛍光試薬として、特に遺伝子改変生物において使用することも知られている。ｃｐＹＦＰ、ＨｙＰｅｒ（１、２及び３）又はｒｏＧＦＰは、この種の蛍光タンパク質の公知の例である。しかしながら、これらの試薬は、特定の酸化性化学種だけに特異的であったり、応答時間が長かったり、或いは検出範囲が限られていたりすることがあり、例えば、Ｈｙｐｅｒタンパク質の中で最も性能の良いＨｙｐｅｒ３は５００ｎｍｏｌ／Ｌで飽和し、ある種の用途、特に生物学的用途には適合しない。しかし、Ｂｉｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ  ２０１３は、これらの蛍光タンパク質が生細胞中の酸化性化学種の検出に使用できるが、オキシダントの絶対濃度の測定値は得られないことを示している。
【０００８】
さらに、Ｄｉｄｉｅｒ  Ｃａｓａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ４，  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００９の「Ｓｉｎｇｌｅ  ｅｕｒｏｐｉｕｍ−ｄｏｐｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｓｉｄｅ  ｃｅｌｌｓ」という論文から、酸化状態ＩＩＩのユウロピウムをドープしたＹ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４のナノ粒子をフォトルミネセンス性試薬として用いる、酸化性化学種の定量的検出方法が知られている。従って、これらの粒子の使用には、それらを酸化可能にするため、事前にそれらを還元しておく必要がある。この還元は、ユウロピウム元素を酸化数ＩＩ、従って１種以上の酸化性化学種によって酸化できる形態にするため、レーザー照射下でその場で実施される。ここで、酸化可能なユーロピウム種を生成させるためのこの光還元は、時として同時に存在する細胞に有害であることが判明している。この光還元は、さらに、巨視的試料又はインビボでは達成するのが困難である。
【０００９】
さらに、試験試料中での酸化性化学種の濃度の経時的変化の測定には、この論文に記載された方法では、ナノ粒子の光度及びこの信号の時間微分を決定する必要がある。この導関数の決定には、光度のいくつかの連続した測定値が必要であり、そのためかかる方法の時間分解能が約３０秒に制限される。
【００１０】
最後に、かかる方法は、発光の絶対強度の測定に基づいており、従ってナノ粒子の個別化された態様での観察を仮定しており、巨視的な容積でのいかなる検出もできなくなる。
【００１１】
本発明の目的は、先行技術で公知の方法の短所をもたない酸化性化学種の検出方法を提案することである。特に、本発明は、バルク測定に適合し及び／又は時間分解能に優れる方法、好ましい変形例では、酸化可能な種のその場での生成を必要としない方法を提案することを目的とする。
【発明の概要】
【００１２】
この目的のため、本発明は、主に、試料中、特に生物学的試料中、の酸化性化学種の分析に使用できる方法であって、以下のステップ：
ｉ）試料を、フォトルミネセンス性の第１の試薬及び光学的に活性な第２の試薬と接触させるステップであって、フォトルミネセンス性の第１の試薬が、希土類でドープされかつ酸化可能なナノ粒子を少なくとも含んでおり、
・フォトルミネセンス性の第１の試薬の発光が、少なくとも１つの第１の波長において、酸化性化学種の量と共に変化し、かつ
・光学的に活性な第２の試薬によって放出されるシグナルが、第１の波長とは異なる少なくとも１つの第２の波長において、一定であるか、或いは酸化性化学種の量と共に、フォトルミネセンス性の第１の試薬の発光とは逆方向に、変化するステップと、
ｉｉ）試料中のフォトルミネセンス性の第１の試薬及び光学活性な第２の試薬を励起するステップと、
ｉｉｉ）少なくとも第１の波長及び少なくとも第２の波長において、試料の光度を測定するステップと、
ｉｖ）前記測定された光度の解釈及び場合によって基準値の参照によって、酸化性化学種の存在及び／又は量を推定するステップと
を含む方法を提案する。
【００１３】
本発明の意味するところでは、「酸化性化学種の分析」は、酸化性化学種の有無の検出又は定性的キャラクタリゼーションの態様並びに酸化性化学種のアッセイ又は定量的キャラクタリゼーションの態様を包含する。
【００１４】
本発明の意味するところでは、光学的に活性な試薬とは、光子による励起後に光子（おそらくは異なる波長のもの）を放出する試薬を意味する。
【００１５】
このように、提案した方法は、フォトルミネセンス性の第１の試薬及び光学的に活性な第２の試薬の発光強度の同時測定に基づいており、これら２種類の試薬の少なくとも一方の発光強度は、酸化性化学種の存在の関数として変化する。二重同時測定は、発光波長の異なる試薬の選択によって可能となる。本発明者らは、さらに、この二重測定によって、以下でさらに詳しく説明する通り、巨視的又は微視的試料での大量の測定を、向上した時間分解能で実施できるようになることを実証した。
【００１６】
さらに正確には、第１の波長は、フォトルミネセンス性の第１の試薬の酸化型又は還元型を代表する発光波長に対応する。
【００１７】
その部分に関しては、第２の波長は、光学的に活性な第２の試薬に特有の、かつ該当する場合にはその還元型又は酸化型を代表する、発光波長に対応する。
【００１８】
好ましい変形例によれば、第１の発光波長は、フォトルミネセンス性の第１の試薬の酸化型を代表する。従って、酸化性化学種の存在は、この波長での増大した光度の可視化によって確認される。
【００１９】
第１の変形例によれば、フォトルミネセンス性の第１の試薬は、酸化性化学種の濃度によって光度が変化しない光学的に活性な試薬との組合せで用いられる。この変形例では、光学的に活性な試薬に特有の光度は、フォトルミネセンス性の第１の試薬に特有の光度の増加の有無を確認するための基準値として直接使用することができ、いかなる増加も１種以上の酸化性化学種の存在を示す。
【００２０】
フォトルミネセンス性の第１の試薬と光学的に活性な第２の試薬との組合せに基づくこの実施形態は、巨視的容積における分析、特に非表面環境、例えば液体容積又は試料厚さにおける分析に特に有利である。
【００２１】
第２の変形例によれば、フォトルミネセンス性の第１の試薬は、光学的に活性な試薬であって、その第２の波長における光度も酸化性化学種の濃度の関数として変化するが、フォトルミネセンス性の第１の試薬の示すものとは逆方向に変化する光学的に活性な試薬との組合せで用いられる。２種類のナノ粒子が、例えば表面への堆積又は細胞内に内在化した後で、個別に観察される。従って、第１の発光波長がフォトルミネセンス性の第１の試薬の酸化型を代表する本発明の方法の好ましい変形例では、光学的に活性な試薬に特有の第２の波長はこの試薬の還元型を代表する。こうして、酸化性化学種の存在は、この第２の波長の光度の減少の可視化によって確認される。
【００２２】
この変形例では、２つの光度の測定値の解釈は、予め確立された基準値を参照することによって有利に実施される。
【００２３】
さらに正確には、試料中の酸化性化学種の量は、ステップｉｉｉ）で測定された光度の対に対応する値を標準シート上で読み取ることによって求めることができる。この標準シートは、既知の量の酸化性化学種を有する試料で、好ましくは試料の試験条件と同一の条件下で実施される測定によって予め確立されたシートであり、これら同一の条件は、特に溶媒、ｐＨ及び試験温度の１以上を含む。
【００２４】
フォトルミネセンス性の第１の試薬と光度の変化する光学的に活性な第２の試薬との組合せに基づくこの実施形態は、分析試料中の酸化性化学種の濃度の定量的値を、第１及び第２の試薬を代表する光度の対の１回の測定から、従って迅速に、記録装置の取得速度でしか制限されずに、しかも信頼性をもって、得ることができるという点で特に有利である。
【００２５】
ある実施形態によれば、本発明の方法は、フォトルミネセンス性の第１の試薬として、ＡｘＥｕ１−ｘ（ＶＯ４）ｙ（ＰＯ４）（１−ｙ）、特にＡｘＥｕ１−ｘＶＯ４のナノ粒子（式中、ＡはＹ、Ｇｄ及びＬａから選択される１種であり、０≦ｘ≦１、０≦ｙ≦１である。）であって、ユーロピウム元素が少なくとも部分的に還元された状態にあって、従って酸化数ＩＩを有するナノ粒子を用いる。
【００２６】
還元された酸化状態のユウロピウム元素の存在を考慮すると、対応するナノ粒子は、酸化状態ＩＩＩのＥｕ元素しか含んでいないので酸化物と呼ばれるＡｘＥｕ１−ｘ（ＶＯ４）ｙ（ＰＯ４）（１−ｙ）のナノ粒子とは対照的に、直接酸化可能である。
【００２７】
そこで、本発明の別の態様によれば、本発明は、試料中、特に生物学的試料中の酸化性化学種の分析に使用できる方法であって、以下のステップ：
ｉ）ＡｘＥｕ１−ｘ（ＶＯ４）ｙ（ＰＯ４）（１−ｙ）（式中、ＡはＹ、Ｇｄ及びＬａから選択される１種であり、０≦ｘ≦１、０≦ｙ≦１である。）のフォトルミネセンス性のナノ粒子であって、酸化数ＩＩのユーロピウム元素を含むナノ粒子を用意するステップと、
ｉｉ）アッセイ試料中に前記ナノ粒子を導入するステップと、
ｉｉｉ）前記ナノ粒子を励起するステップと、
ｉｖ）前記ナノ粒子の酸化型又は還元型を代表する１以上の波長で前記試料によって放射された光度を測定するステップと、
ｉｖ）前記測定の解釈及び場合によって基準又は較正の参照によって、酸化性化学種の存在及び／又は量を推定するステップと
を含む方法にも関する。
【００２８】
本発明の方法は、分析、特に試料中の酸化性化学種の検出及び／又はアッセイに特に有用である。
【００２９】
従って、本発明の方法は、工業的な洗浄及び漂白プロセスからのオキシダントの排出の生態学的影響を調べるために使用し得る。また、爆発物の検出のため気相での酸化性化学種の検出も可能になる。
【００３０】
ただし、本発明の方法は、ライフサイエンスの分野に関連する、活性酸素種（ＲＯＳ）のキャラクタリゼーションに関して特に関心がもたれる。
【００３１】
従って、別の態様によれば、本発明は、診断、特に生理学的に許容されない１種以上の活性酸素種の発現に関連する生理学的障害（病理学的であるか否かを問わない）の診断のための本発明の方法の使用に関する。
【００３２】
実際、活性酸素種は、数多くの生物学的機能、特にシグナル伝達、神経伝達、平滑筋の弛緩、血小板凝集、動脈圧の調節、免疫系の制御、細胞増殖の調節、幾多の生体分子の合成、炎症及び生体異物の代謝に必須であるとともに関与している。
【００３３】
生物学的試料中で分析し得る活性酸素種の代表例として、特に、スーパーオキシド（Ｏ２．−）、ヒドロペルオキシド（ＨＯ２．−）、ヒドロキシル（ＨＯ．）、ペルオキシド（ＲＯＯ．）、一酸化窒素（ＮＯ．）、二酸化窒素（ＮＯ２．）ラジカルのようなフリーラジカルだけでなく、例えば過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、一重項酸素（１Ｏ２）、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）、ペルオキシ亜硝酸アニオン（ＯＮＯＯ−）、ペルオキシ亜硝酸（ＯＮＯＯＨ）、ニトロソペルオキシカーボネートアニオン（ＯＮＯＯＣＯ２−）、ニトロニウムカチオン（ＮＯ２＋）、三酸化二窒素（Ｎ２Ｏ３）のような非ラジカル種も挙げることができる。
【００３４】
従って、これらの酸化性化学種が過剰に産生されるとき或いは逆にそれらの生理学的含有量が不十分なときは、例えばある種のタンパク質のような生体分子の酸化の形態の生理学的障害を招く。同様に、通常の生理学的レベルと一致しない量のキャラクタリゼーションは、例えば代謝障害の兆候又は炎症のような病理的状態の兆候であり得る。
【００３５】
そこで、本発明の方法によって、生物学的試料中の１種以上の酸化性化学種の量を効率的に決定するとともに、実施した測定に基づいて、これらの酸化性化学種の濃度が生理学的に許容されるか否かを確認することができる。
【００３６】
生物学的試料は、生体、又は生物組織、特に生体から単離されたもの（エクスビボ又は固定組織）、細胞、又は特に生体分子を含有する溶液であり得る。
【００３７】
この方法が容積スケールで有効であるという事実により、インビボでの生物学的標的のレベル或いは組織抽出物又は生物学的流体のレベルでの使用が可能となる。
【００３８】
従って、本発明の方法は、容積試料で有利に実施され、インビボ、エクスビボ及びインビトロでの使用に適合する。使用の例として、分析すべき試料を含む容器を用いて測定を行うことができる。２種類の試薬が溶液中でそこに添加され、特定の光源で励起され、各々に関連する光度を２つの光電子増倍管で収集する。組織の分析については、ナノ粒子の混合物の注入及びマクロスコープ上でのスペクトル分離による検出によって実施し得る。
【００３９】
特定の実施形態によれば、本発明の方法は、診断、特に生理学的に許容されない１種以上の活性酸素種の発現に関連する生理学的障害（病理学的であるか否かを問わない）の診断のためのエクスビボ用途に用いられる。
【００４０】
さらに別の態様によれば、本発明は、１種以上の活性酸素種（ＲＯＳ）の過剰発現に関連する障害（病理学的であるか否かを問わない）に関する活性物質の有効性のスクリーニングのための本発明の使用、特にエクスビボでの使用に関する。
【００４１】
従って、本発明の方法は、治療活性物質で処置された患者から得られる生物学的試料中の酸化性化学種の量を分析し、そうして得られた測定値を、基準値（例えば同じ患者の治療前の生物学的試料を代表するもの）との比較によって評価するために使用し得る。
【００４２】
このタイプのスクリーニングは、研究室での一群の潜在的有効物質の試験のために実験規模で実施することもでき、それらの有効性は、それらの存在下及び非存在下で評価される酸化性化学種のアッセイによって確認し得る。
【００４３】
別の態様によれば、本発明は、本発明の方法を実施するためのシステムであって、
・試料中のフォトルミネセンス性の第１の試薬及び光学的に活性な第２の試薬を励起するための１又は２波長でのレーザー照明用装置と、
・フォトルミネセンス性の第１の試薬及び光学的に活性な第２の試薬からの発光を異なる波長に応じてフィルタリングし、もって試料の２つの別個のフィルター処理画像を形成するためのスペクトルスプリッターと、
・２つのフィルター処理画像の少なくとも２点の光度を決定するための手段と
を含むシステムを提案する。
【００４４】
添付の図面を参照しながら、専ら例示を目的として示す非限定的な以下の説明を読むことによって本発明の理解を深めることができよう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、酸化性化学種の検出方法のブロック図を示す。
【図２】図２は、ＮａＢＨ４溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）で処理した後のＧｄ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４ナノ粒子の発光の光度レベルを表す。
【図３】図３は、既知濃度の過酸化水素を含む酸化性媒体中でのＧｄ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４の還元粒子及びＹＡＧ：Ｃｅの各々の発光の強度応答曲線を示す。
【図４】図４は、一対の測定光度の関数として試料中の過酸化水素の濃度を示すシートの例を示す。
【図５】図５は、図１の方法を実施するためのシステムの概略図。
【図６】図６は、培養中のマウス血管平滑筋細胞の実施例１に記載の試料の白色光下での観察例を示す。
【図７】図７は、図に示すナノ粒子が内在化されており、それらの発光を５５０ｎｍ及び６１７ｎｍの波長で検出した実施例１に記載の同じ試料の観察例を示す。
【図８】図８は、エンドセリン注入後の、実施例１に記載の図６と同じ試料に接触したフォトルミネセンス性試薬の光度の経時的変化を示す。
【図９】図９は、図４に示すシートから求めた、エンドセリン注入後の、実施例１に従って得られた図６の試料中の過酸化水素の濃度を示す。
【図１０】図１０は、２つの光電子増倍管で５５０ｎｍ及び６１７ｎｍで検出した、ＹＡＧ：Ｃｅ粒子とＧｄＶＯ４：Ｅｕ粒子の混合物を含む実施例２に記載の容器内の溶液の発光の、２ｍＭ過酸化水素の添加（ｔ＝０）後の変化を示す。
【図１１】培養中のマウス血管平滑筋細胞の実施例３に記載の試料の蛍光顕微鏡及びスペクトル分割によって得た写真を示す。
【図１２】図１２は、実施例３に従って、ＥＧＦＲ阻害と共に又はＥＧＦＲ阻害なしでＥＴ−１で刺激した後に得られた、ナノ粒子ＹＡＧ：Ｃｅ（１未満）及びＧＤＶＯ４：Ｅｕ（１超）の、それらの初期値により正規化した、フォトルミネセンスの変化を示す。
【図１３】図１３は、実施例３に従って求めた２つの細胞状態（正常又はＥＧＦＲ阻害）における過酸化水素の絶対濃度の経時的変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
酸化性化学種の検出方法１０は、試料を、フォトルミネセンス性の第１の試薬及び光学的に活性な第２の試薬と接触させる第１のステップ１２を含む。
【００４７】
上述の通り、光学的に活性な試薬は、光子による励起後に光子（おそらくは異なる波長のもの）を放出する試薬を意味する。従って、フォトルミネセンス性の試薬は、この種の光学的に活性な試薬である。第二高調波発生試薬も、本願でいう光学的に活性な試薬である。このような第二高調波発生試薬の例は、例えばＫＴＰ（リン酸チタニルカリウム（ＫＴｉＯＰＯ４）を表す。）の粒子である。これ以降の説明では、光学的に活性な第２の試薬は、フォトルミネセンス性の第２の試薬である。別途記載しない限り、フォトルミネセンス性の第２の試薬に関して記載したことは、この第２の試薬が光学的に活性である場合、特に第二高調波発生試薬である場合にも当てはまる。
【００４８】
フォトルミネセンス性の第１の試薬は、希土類でドープされたナノ粒子を含む。
【００４９】
ここで、「ナノ粒子」とは、直径がナノメートルの桁、特に１ｎｍ超及び／又は５００ｎｍ未満の粒子を意味する。ここで、「直径」とは、ナノ粒子の最大寸法を意味する。
【００５０】
好ましい実施形態では、フォトルミネセンス性の第２の試薬も、希土類でドープされたナノ粒子を含む。
【００５１】
フォトルミネセンス性の第１及び第２の試薬は、異なる発光波長を有する。換言すると、フォトルミネセンス性の第１の試薬によって放射される光だけを検出できる少なくとも１つの第１の波長と、第２の試薬によって放射される光だけを検出できる少なくとも１つの第２の波長であって第１の波長とは異なる第２の波長とが存在する。これらのフォトルミネセンス性の試薬は、好ましくは、スペクトル的に分離できるようにそれらのライン幅が十分に小さいものが選択される。これによって、フォトルミネセンス性の第１及び第２の試薬からの発光の検出が容易になる。この検出をさらに容易にするとともに精度を高めるため、フォトルミネセンス性の試薬はそれらの最大発光波長が異なるように選択され、検出はそれらの最大発光波長で行われる。
【００５２】
さらに、フォトルミネセンス性の第１の試薬は、検出波長で放射されるその発光（以下、その発光と略す。）の強度が、それと共存する酸化性化学種の量と共に変化するように選択される。以下、フォトルミネセンス性の第１の試薬の発光の光度が、それと共存する酸化性化学種の量と共に増加する場合について検討する。
【００５３】
フォトルミネッセンス性の試薬は、試料上又は試料中で低い表面密度が得られるように堆積し得、試料は例えばスライドガラス上に受けることができる。「低い表面密度」とは、１μｍ−２未満の表面密度を意味する。
【００５４】
ただし、本発明の方法で考慮されるフォトルミネッセンス性の試薬は、有利には、容積試料、例えば液体試料の容積又は試料のバルク中に直接導入し得る。
【００５５】
フォトルミネセンス性の第１の試薬
フォトルミネセンス性の第１の試薬は、有利には、ＡｘＥｕ１−ｘ（ＶＯ４）ｙ（ＰＯ４）（１−ｙ）（式中、ＡはＹ、Ｇｄ及びＬａから選択される１種であり、０≦ｘ≦１、０≦ｙ≦１である。）のナノ粒子を含む。
【００５６】
特に、以降では、フォトルミネセンス性の第１の試薬がＧｄ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４のナノ粒子によって形成されている特定の場合について検討する。
【００５７】
好ましい実施形態では、これらのナノ粒子は、分析すべき試料と接触させる前に還元される。
【００５８】
この種のフォトルミネセンス性の第１の試薬の還元されたナノ粒子は、特に、フォトルミネセンス性の第１の試薬を得るためナノ粒子を還元することからなる予備ステップ１４から得ることができる。
【００５９】
以下で詳しく説明する通り、還元は、
・物理的に、特に例えばレーザー、電子又はガンマ線照射によって、或いは
・化学的に、化学的還元剤の使用によって、
実施し得る。
【００６０】
第１の実施形態によれば、分析試料と接触させる前に、ＡｘＥｕ１−ｘ（ＶＯ４）ｙ（ＰＯ４）（１−ｙ）のナノ粒子を物理的に、特にレーザー励起によって還元する。
【００６１】
この実施形態に関して、ナノ粒子は、それらを分析試料と接触させるときには、Ｅｕ２＋の形態のユウロピウムを既に含んでいる。例えば、Ｇｄ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４の粒子を使用する場合、この粒子のＥｕ３＋イオン粒子は本発明の方法のステップ１４においてＥｕ２＋イオンに可逆的に還元し得る。
【００６２】
ＡｘＥｕ１−ｘ（ＶＯ４）ｙ（ＰＯ４）（１−ｙ）のナノ粒子のこのような還元された種は、その場で、つまりアッセイ試料中で、例えばＥｕ種が基本的にＥｕ３＋の形態であるＡｘＥｕ１−ｘ（ＶＯ４）ｙ（ＰＯ４）（１−ｙ）のナノ粒子の光還元によってでも、生成し得ると理解される。このアプローチは、特にＣａｓａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ（２００９）に記載されている。
【００６３】
しかし、出発反応体として、還元型のＥｕを既に導入したナノ粒子（例えばＧｄ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４）を用いることからなる実施形態が、その効率及び簡単さのために好ましい。さらに、この変形例は、アッセイ試料中に存在する生物細胞の完全性に影響を与えない。
【００６４】
別の実施形態によれば、分析試料と接触させる前に、ＡｘＥｕ１−ｘ（ＶＯ４）ｙ（ＰＯ４）（１−ｙ）のナノ粒子を還元剤を用いて化学的に還元する。
【００６５】
化学的に還元するこのサブステップに続いて、過剰の還元剤を除去するため、還元ナノ粒子を洗浄することからなるサブステップを行ってもよい。例えば、粒子を、還元剤を含有する溶液中に希釈し、次いで遠心分離し、次いで還元剤の存在しない新鮮な溶液（例えば純水）中に再度分散させ、こうして連続的洗浄作業が可能になる。
【００６６】
使用される還元剤は、特にＮａＢＨ４であり得る。その場合、最終ステップは、過剰の還元剤を除去するため還元ナノ粒子を洗浄することからなり得る。
【００６７】
例えば、Ｇｄ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４のナノ粒子は、ステップ１４において水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）で可逆的に還元し得る。
【００６８】
図２は、１ＭのＮａＢＨ４による処理前、処理直後、７時間後及び２日後の、波長４６６ｎｍのレーザー照明下でのＧｄ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４のナノ粒子の溶液の発光レベルの比較を示す。
【００６９】
本発明者らは、今回、還元剤による還元後に得られる粒子が、酸化性化学種、例えばＨ２Ｏ２を、レーザー励起によってＥｕ３＋イオンが予めＥｕ２＋に還元された粒子によるＨ２Ｏ２の検出と同様に、検出できることを示す。
【００７０】
従って、本発明の別の目的によれば、本発明は、試料中、特に生物学的試料中の酸化性化学種の分析に使用できる方法であって、以下のステップ：
ｉ）ＡｘＥｕ１−ｘ（ＶＯ４）ｙ（ＰＯ４）（１−ｙ）（式中、ＡはＹ、Ｇｄ及びＬａから選択される１種であり、０≦ｘ≦１、０≦ｙ≦１である。）のフォトルミネセンス性のナノ粒子であって、特に還元剤を用いて化学的に、特にＮａＢＨ４によって、前もって還元されたナノ粒子を用意するステップと、
ｉｉ）アッセイ試料中に前記ナノ粒子を導入するステップと、
ｉｉｉ）前記ナノ粒子を励起するステップと、
ｉｖ）前記ナノ粒子の酸化型又は還元型を代表する１以上の波長で前記試料によって放射された光度を測定するステップと、
ｉｖ）前記測定の解釈によって、場合によって基準又は較正の参照によって、酸化性化学種の存在及び／又は量を推定するステップと
を含む方法に関する。
【００７１】
化学薬品（例えばＮａＢＨ４）でのＡｘＥｕ１−ｘ（ＶＯ４）ｙ（ＰＯ４）（１−ｙ）粒子の還元が、酸化性化学種（例えばＨ２Ｏ２）を検出することのできる酸化可能なナノ粒子をもたらし得ることは決して自明ではなかった。
【００７２】
理論に束縛されることは望まないが、本発明者らは、今回、還元のメカニズムが、２つの場合で同じではないことを示す。
【００７３】
レーザー励起による還元の場合、Ｅｕ３＋イオンの電子遷移と共鳴するレーザー励起の結果はＥｕ２＋イオンの出現であり、これは粒子を酸化可能にするとともに酸化性化学種を検出できるようにする。しかしながら、化学薬品によるナノ粒子の還元の場合、Ｅｕ３＋イオンの数に持続的な有意の変化はなく、化学薬品での還元は、おそらくはＥｕ３＋イオンの発光に作用する消光現象に関与し、粒子の再酸化によりルミネセンスの回復が可能になる。
【００７４】
光学的に活性な第２の試薬
光学的に活性で好ましくはフォトルミネセンス性の第２の試薬は、その発光（又はその発光の光度）が一定でであるか、或いは、好ましくは、酸化性化学種の量と共に変化するように、選択される。
【００７５】
従って、上述した酸化性化学種の検出方法１０の第１の変形例によれば、光学的に活性な特にフォトルミネセンス性の第２の試薬の発光の強度は、酸化性化学種の存在下でほぼ一定である。
【００７６】
「ほぼ一定」とは、光度の変動が±１０％、好ましくは±５％の範囲内であることを意味する。この場合、光学的に活性な第２の試薬は、特に、ＬａＰＯ４：Ｅｕ、ＬａＰＯ４：Ｅｒ、ＬａＰＯ４：Ｎｄ、ＬａＰＯ４：Ｔｂ、ＬａＦ３：ＲＥ（ＲＥ＝希土類）、ＮａＹＦ４：Ｙｂ、ＮａＹＦ４：Ｅｒ、ＹＡＧ：Ｅｕのナノ粒子、蛍光性半導体ナノ結晶ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＴｅ／ＺｎＳ、或いはＫＴＰ及び／又はＢａＴｉＯ３のような第二高調波発生による発光特性を有する粒子を含み得る又はからなり得る。この方法の変形例も、試験試料中の酸化性化学種の存在を検出できるようになる。
【００７７】
上述した酸化性化学種の検出方法１０の第２の好ましい変形例によれば、光学的に活性な第２の試薬の発光の強度は、酸化性化学種の量の関数として、フォトルミネセンス性の第１の試薬の第１の波長で観察される発光の変化とは逆方向に、変化する。
【００７８】
従って、これ以降の説明では、フォトルミネセンス性の第２の試薬の発光は、それと共存する酸化性化学種の量と共に減少すると想定する。例えば、フォトルミネセンス性の第２の試薬は、ＹＡＧ：Ｃｅ及び／又はＬａＰＯ４：Ｃｅのナノ粒子を含有する溶液からなり得る。これ以降の説明では、フォトルミネセンス性の第２の試薬は、ＹＡＧ：Ｃｅのナノ粒子によって形成されると想定する。
【００７９】
図３は、濃度０μΜ、５μΜ、１０μΜ及び５０μΜの既知濃度の過酸化水素を含む酸化性媒体中でのＧｄ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４の還元粒子及びＹＡＧ：Ｃｅのそれぞれの発光強度応答曲線５０〜５６及び５８〜６４を示す。曲線５０〜６４の各々は、個別に検出された約１０個のナノ粒子のモニタリングからの平均値である。
【００８０】
本発明に従って酸化性化学種の有無を決定する
酸化性化学種の存在を決定する方法１０は、試料中のフォトルミネセンス性の第１及び第２の試薬を励起することからなるステップ１６に続く。この目的のため、試料を二重発光励起（特にレーザーによるもの）に付してもよい。本明細書で想定するフォトルミネセンス性試薬の例の場合、試料のこの二重励起は、例えば３９６ｎｍ（Ｇｄ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４に対して）及び４８８ｎｍ（ＹＡＧ：Ｃｅに対して）の波長において、それぞれレーザーダイオード及びアルゴンレーザーによって実施し得る。
【００８１】
酸化性化学種の検出方法１０は、次いでフォトルミネセンス性の第１の試薬の発光波長に対応する少なくとも１つの第１の波長及びフォトルミネセンス性の第２の試薬の発光波長に対応する少なくとも１つの第２の波長において、試料によって放射される光度を測定するステップ１８に続く。ここで、第１の波長と第２の波長は異なる。ここで想定する例では、試料によって放射される光度は、Ｅｕ３＋及びＣｅ３＋の２つの発光波長、すなわちそれぞれ６１７ｎｍ及び５５０ｎｍで測定される。
【００８２】
実際、試料中の酸化性化学種の存在は、Ｅｕ２＋及びＣｅ３＋イオンからそれぞれＥｕ３＋及びＣｅ４＋イオンへの酸化を引き起こす。これは、波長５５０ｎｍでのセリウム系粒子の発光の光度の低下及び波長６１７ｎｍでのユーロピウム系粒子の光度の増加に反映される。
【００８３】
分析すべき酸化性化学種の濃度とは無関係に第２の試薬が一定の発光を有する実施形態では、その発光シグナルを基準尺度として直接使用し得る。そこで、このシグナルによって、フォトルミネセンス性の第１の試薬の酸化型又は還元型を代表する波長又は複数の波長の１つの光度に変化があるか、或いはこの光度に変動がないかを証明できるようになる。光度の変化は、酸化性化学種の存在を表す。逆に、光度の変動がないことは、分析すべき試料中に酸化性化学種が存在しないことを示す。
【００８４】
別の実施形態において、本方法は、試験した試料中の酸化性化学種の量を決定するため、標準値に対してフォトルミネセンス性試薬の各々の発光の、個々のナノ粒子のスケールでの、測定光度を比較するステップ２０を含む。このステップは、特に、フォトルミネセンス性の第２の試薬の光度も分析試料中の酸化性化学種の量と共に変化する場合に必要である。酸化性化学種の量は、特に、試験した試料中の酸化性化学種の濃度であり得る。
【００８５】
ここで、基準値は、図４に示すようなシート３０から決定し得る。このシートは、以下の３つに対応する点の組を表す。
・ユーロピウム系粒子を含むフォトルミネセンス性試薬の発光の光度、
・セリウム系粒子を含むフォトルミネセンス性試薬の発光の光度、及び
・酸化性化学種（図３に示す例の場合、Ｈ２Ｏ２）の濃度。
【００８６】
このシート３０は、特に、図３の曲線５０〜６４から少なくとも部分的に得ることができる。この場合、実際に、２種類のフォトルミネセンス性試薬は、酸化性化学種の量の関数として逆方向の発光応答を有するので、酸化性化学種の１つの同一の濃度に対応する曲線５０〜６４の各対によってシート３０の１点を決定することができる。変形例として、正規化された光度の対が酸化性化学種の濃度に一義的に対応する場合には、シート３０は、曲線５０〜６４のデータセットに基づいて補間することができる。
【００８７】
従って、有利には、オキシダント濃度に対して２種類の試薬の発光が異なる単調な依存性を示す場合には、２種類の試薬の瞬時発光に基づいてオキシダントの濃度を一義的に定めるシートを構築することができる。２種類の試薬に関していくつかのタイプの発光応答を想定し得る。ただし、好ましい変形例は、オキシダントに対する応答が逆方向の発光の変化を有する２種類の試薬の使用である。
【００８８】
このシート３０の変形例として、基準値は、テーブル又はソフトウェアから得ることもでき、測定された強度の対の測定点から、酸化性化学種の濃度を補間してもよい。
【００８９】
いずれの場合も、基準値に対する測定光度の対のこの比較によって、Ｃａｓａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈ（２００９）に記載された方法で必要とされる光度の導関数の測定はなくすことができる。本方法は、従って優れた時間分解能をもたらす。
【００９０】
Ｅｕ３＋及びＣｅ３＋イオンの発光波長で測定される光度によって、試験した試料中に存在する酸化性化学種の濃度に一義的に対応するシート３０の点を決定することができる。この濃度の一義性は、フォトルミネセンス性試薬の発光強度が、それらと共に存在する酸化性化学種の量の関数としての異なる単調な変化をすることによって確保される。
【００９１】
従って、本発明の酸化性化学種の検出方法は、光度の二重測定から試料中の酸化性化学種の量を迅速かつ比較的簡単に決定するのに特に有利である。
【００９２】
本方法は、レシオメトリック測定が可能となる。特に、フォトルミネセンス性の第１の試薬の発光が酸化性化学種の量の関数として変化するが、光学的に活性な第２の試薬によって放射される光度が酸化性化学種の濃度とは無関係にほぼ一定である場合、酸化性化学種の濃度を決定するために第１の試薬と第２の試薬の発光強度の比を使用するのが有利であり得る。
【００９３】
本方法は、さらに、活性酸素種（すなわちＲＯＳ）のバルクでの検出に特に適している。実際、かかる検出は、フォトルミネセンス性試薬の濃度にも、試験すべき試料の容積にも依存しない。本方法は、特に生体組織（エクスビボ又はインビボで採取）における酸化性化学種の産生のモニタリングに使用することができる。
【００９４】
ＲＯＳがある種の癌、神経変性疾患及び循環器疾患のような疾病において異常に産生されることが知られていることがここで想起される。ここに記載された方法は、従って、この分野で実施された多くの研究を補完し、これらの疾患によってもたらされる公衆衛生上の課題に答えることに資することができる。
【００９５】
提案される方法は、また、特にフォトルミネセンス性試薬の励起の光度を変化させることによって、酸化性化学種の変動する濃度に有利に適応可能である。本方法を用いて検出することができる酸化性化学種には、Ｈ２Ｏ２、ＮＯ及びＣｌＯが含まれるが、これらに限定されない。本方法は、試料中の酸化性化学種の絶対濃度を決定することができる。本方法は、公知の方法よりも優れた空間及び時間分解能を提供する。本方法は、いかなる副反応も引き起こさないし、生体適合性である。本方法は、細胞又は生物学的組織における酸化性化学種のアッセイに使用し得るだけでなく、生体分子の溶液中の酸化性化学種の検出及び／又はアッセイにも使用し得る。
【００９６】
上述の方法１０は、特に図５に示すような酸化性化学種の存在を決定するためのシステム１００によって実施することができる。図５において、試料１０２中の酸化性化学種の存在を検出するためのシステムは、まず、ここでは２つの異なるレーザー源１０６，１０８から形成され、かつ異なる波長のビームを放射するように構成されたレーザー照明装置１０４を備える。フォトルミネセンス性試薬がＧｄ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４及びＹＡＧ：Ｃｅである上記で想定した例において、第１のレーザー源１０６は波長４８８ｎｍの第１のレーザービーム１１０を放射するように構成され、第２のレーザー源１０８は波長３９６ｎｍの第２のレーザー光１１２を放射する。
【００９７】
システム１００は、次いで、第１及び第２のレーザービーム１１０，１１２を結合し、ビーム１１０，１１２を試験試料１０２のゾーンに集束させるための光学レンズ１１６にそれらを導くダイクロイックミラー１１４を備える。このゾーンは例えば数ｍｍ２の表面積に相当し得る。試料１０２は、試料ホルダー１０３上又は試料ホルダー１０３内に配置し得ることに留意すべきである。特に、試料がガスである場合、この試料ホルダ１０３は、試験試料１０２の分散を防ぐため、閉鎖空間の形態を取る。試料ホルダ１０３は、特に試料１０２が溶液の形態である場合、セル又はキュベットの形態も取り得る。
【００９８】
試験試料は、フォトルミネセンス性の第１の試薬及び光学的に活性な第２の試薬（この例ではフォトルミネセンス性）と接触させる。既に想定した例のように、この例のフォトルミネセンス性試薬は、以下の２つの異なる種類の粒子の形態：
・ＹＡＧ：Ｃｅの粒子（図５では「＊」と示す。）、及び
・Ｇｄ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４の還元粒子（図５では「ｏ」と示す。）
を取る。
【００９９】
第１及び第２のレーザービーム１１０，１１２は、試料１０２中のフォトルミネセンス性の第１及び第２の試薬を励起する。異なる種類のフォトルミネセンス性試薬は、２つのレーザービームのうちの一方の励起に応答し、好ましくは、２つの異なる波長範囲で発光することにより選択的に（すなわち、一方のみに）応答する。「２つの異なる波長範囲」とは、２つの波長範囲が、他の波長範囲に含まれない１以上の波長を含むことを意味する。例えば、ＹＡＧ：Ｃｅ粒子は、４８８ｎｍの第１のレーザービームの励起に対して５５０ｎｍの第１の波長で発光することにより応答する。Ｇｄ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４の還元粒子は、３９６ｎｍの第２のレーザービームの励起に対して６１７ｎｍの第２の波長で発光することにより応答する。
【０１００】
対物レンズ１１６は、フォトルミネセンス性試薬の２つの応答波長を含む２種類のフォトルミネセンス性試薬１１８の発光を、任意的には発光が透過するダイクロイックミラー１１４を介して、スペクトルスプリッター１２０に集束させることができるようにする。すると、ダイクロイックフィルター１１４は、レーザー源を反射し、フォトルミネセンス性試薬の発光に透明であることによって、一方ではレーザー源１０６，１０８と試料１０２との間、及び他方では試料１０２とスペクトルスプリッター１２０との間に機能的に介在する分割プレートとしての役割を果たす。
【０１０１】
変形例として、対物レンズは、試料１０２とスペクトルスプリッター１２０との間に機能的に介在する光学装置、特に顕微鏡に組み込まれる。この顕微鏡は、特に蛍光顕微鏡（好ましくは広視野）、マクロスコープ又は実体顕微鏡であり得る。
【０１０２】
スペクトルスプリッター１２０によって、単一の入射ビーム１１８から、２つの異なる波長（ここでは試料１０２と接触するフォトルミネッセンス性試薬の応答波長）でフィルタリングされた２つの出力画像１２２，１２４を得ることができる。換言すると、スペクトルスプリッター１２０は、フォトルミネセンス性試薬の発光を異なる波長でフィルタリングし、もって試験試料１０２の２つの別個のフィルター処理画像を形成することを可能にする。
【０１０３】
この目的のため、この例におけるスペクトルスプリッター１２０は、ダイクロイックミラー１２６を含む。フォトルミネセンス性試薬の応答波長にそれぞれ対応する波長の第１のフィルター１３０及び第２のフィルター１３２は、それぞれ、ダイクロイックミラー１２６によって反射されるビーム１２２の経路及びダイクロイックミラー１２６を通過するビーム１２４の経路に配置される。これにより、異なる波長のビームを、２つの別個のセンサで又は単一のセンサ（例えばカメラ１３４）の２つの異なる領域で検出するために空間的に分離することができる。
【０１０４】
システム１００は、２つのフィルター処理画像に付随する光度を決定するための手段をさらに備える。ここで、こうした手段は、カメラ１３４、例えば２種類のフォトルミネセンス性試薬の各々の応答に対応する２つのフィルター処理画像をそれぞれの領域１３６，１３８の各々で検出するためのレコーダー（例えばコンピュータ）に接続されたＥＭＣＣＤカメラ（ＥＭＣＣＤ：「電子増倍電荷結合素子」）を備える。
【０１０５】
或いは、光度を決定するために用いられる手段は、異なる波長での２つの光検出器、特に光電子増倍管又はフォトダイオード型のものを含む。これらの光検出器は、照明試料全体から届く全光度の測定を空間分解能なしで可能にする。
【０１０６】
ここで、システム１００は、各々のタイプの粒子を同時にかつ個別に検出することができることに留意すべきである。カメラ１３４のような全視野装置を使用する場合、試料の低い表面密度のため、粒子をさらに個別に検出し、空間的に局在化することができる。従って、これら２つのルミネッセンス発光及びそれらの変化の各単一粒子のスケールでのモニタリングは、試料中の酸化性化学種の定量的、局所的（特に４０ｎｍの位置精度）及び１００ｍｓのオーダー（特に３３ｍｓ）の取得速度での時間分解測定が可能となる。測定の時間分解能は、実際に、カメラ１３４の取得速度によって与えられる。
【０１０７】
励起レーザーのパワーは、さらに、検出される酸化性化学種の濃度の範囲を変更するために調節し得る。従って、酸化性化学種を検出するための方法及びシステムは、炎症又はある種の腫瘍におけるＲＯＳの検出のような数多くの用途に使用し得る。
【実施例】
【０１０８】
例１
タンパク質による刺激後に哺乳動物細胞で産生される酸化性化学種を検出するために行った実験例について以下で詳しく説明する。
【０１０９】
最初に、哺乳動物細胞を調製した。この目的のため、マウス血管平滑筋細胞（初代培養）を、１０％ウシ胎児血清及び抗生物質（本例ではペニシリン及びストレプトマイシン）を含むＲＰＭＩ（「ロズウェルパーク記念研究所」培地）で培養した。コンフルエンスが８０％に達したときに、細胞を採取し、スライドガラス上に付着させる。この特定の例では、典型的には１．５×１０４個の細胞がスライドガラス上に配置される。次いで、細胞をスライドガラス上で完全培地中で４８時間培養し、次いで血清なしの培地中で２４時間培養する。
【０１１０】
さらに、ほぼ１ｍＭに等しい濃度のＧｄ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４の安定コロイド溶液を調製する。溶液を次いで加速度５０００×ｇで５分間遠心分離して粒子を沈殿させる。上清を除去し、ペレットを濃度１Ｍの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）の水溶液中に再懸濁する。ＮａＢＨ４と粒子及び水との反応は、泡の形態の水素分子Ｈ２を生じる。従って、反応混合物を閉じ込めないように注意を払うべきである。数分後に、溶液を加速度５０００×ｇで５分間再度遠心分離する。上清を除去し、ペレットを蒸留水に再懸濁する。洗浄操作を２回繰り返して残留還元性イオンを除去する。
【０１１１】
約１ｍＭのＹＡＧ：Ｃｅ（４％）の安定溶液を、水を主溶媒として調製する。これらの粒子は、グリコサーマル法によってエタノール中の分散液の形態で合成される。洗浄サイクルが行われる：必要な遠心分離を加速度５０００×ｇで５分間行い、次いで粒子を測定用に選択した溶媒（ここで説明する例では水）に再懸濁させる。
【０１１２】
さらに、ＹＡＧ：Ｃｅの懸濁液１０μＬと、還元しかつ洗浄したＧｄ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４粒子の懸濁液１５μＬとを、高張培地の市販溶液（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で混合する。細胞をこの溶液で１０分間、次いで７０％のＲＰＭＩ及び３０％の滅菌蒸留水を含む低張液中で２分間インキュベートする。細胞は次いでそれらの完全培地中で３０〜６０分間培養する。
【０１１３】
次いで、ナノ粒子がロードされた細胞を含むスライドを試料ホルダーに配置し、１ｍＬの緩衝生理学的培地（ＨＢＳＳ／１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）を添加する。次いで、スライドを、個々の粒子の観察のための落射蛍光顕微鏡（オリンパスＩＸ７１、対物×６３、ＮＡ＝１．４）に装着する。次いで、細胞を、図６に示すように白色光透過、及び図７に示すように二重照明下（４８８ｎｍ及び３９６ｎｍのレーザー源）で観察する。適切な形態を有する細胞、すなわち付着性の生細胞を選択する。５０秒間観察した後に、最初の培地を２７０ｎＭのエンドセリン−１（ＥＴ−１）を含有する生理学的培地で交換し、全視野センサー（ＩｍａｇｅＥＭ  ＥＭ−ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス））で個々のナノ粒子の発光を数分間観察する。図８は、Ｅｕ系及びＣｅ系の粒子にそれぞれ対応する応答曲線２００，２０２を示す。Ｅｕ系粒子の光度の増加とＣｅ系粒子の光度の低下が観察される。
【０１１４】
次に、観察された粒子（Ｃｅ又はＥｕがドープされたもの）の強度の経時的な変化を、画像処理又は計算ソフトウェア（例えば、Ｍａｔｌａｂ）を用いて決定する。得られる各曲線を、最初の測定値を対照として正規化する。過酸化水素の濃度は、図４のシート３０から得られる。こうして図９に示す曲線２０４及び対応する平滑化曲線２０６が得られ、これは試験した試料中のＨ２Ｏ２の変動を時間の関数として示す。
【０１１５】
例２
図１０は、本発明の方法の別の使用例を示し、分析すべき試料が容器内に収容されている。ＹＡＧ：ＣｅとＧｄＶＯ４：Ｅｕの２種類の試薬を溶液中で容器に入れる。それらは特定の源で励起される。２ｍＭの過酸化水素を添加（ｔ＝０）した後、５５０ｎｍ及び６１７ｎｍで検出される各試薬のルミネセンスを２つの光電子増倍管で収集して、それぞれ２つの曲線２０８，２１０を形成する。
【０１１６】
例３
血管平滑筋細胞は血管の壁を覆う。エンドセリン−１（ＥＴ−１）のような強力な血管収縮剤による刺激は、それらの収縮を引き起こし、動脈圧の上昇を誘発する。この応答を担う細胞シグナル伝達プロセスは、過酸化水素（酸化性化学種）の産生を誘導することが知られている。さらに、膜受容体ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）もこのプロセスに関与することが知られている。ただし、それらの寄与、特にそれらのオキシダント生成に対する影響は依然として不明である。これは、この現象のキャラクタリゼーションのための十分迅速な定量的検出方法がないためである。
【０１１７】
この例では、血管収縮剤ＥＴ−１に対する応答におけるＥＧＦＲ受容体のトランス活性化を、本発明の方法によって研究した。
【０１１８】
そのため、例１と同じプロトコール、すなわち血管平滑筋細胞の培養、ＹＡＧ：Ｃｅ及びＧｄ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４還元粒子の懸濁液の調製、及び懸濁液での培養細胞のインキュベーションを行った。
【０１１９】
これらの粒子の存在は、例１（図１１）に示した通り、蛍光顕微鏡法及びスペクトル分解によって観察した。スライドガラス（１７０μｍ）上に付着させた血管平滑筋細胞にナノ粒子の混合物（事前に化学的に還元したＧｄＶＯ４：ＥｕとＹＡＧ：Ｃｅ）を内在化させ、このスライドを個々の粒子の観察のため落射蛍光顕微鏡（オリンパスＩＸ７１、対物×６３、ＮＡ＝１．４）に取り付けたが、この落射蛍光顕微鏡には分光スプリッターが備え付けられていて、各タイプの粒子のフォトルミネセンスを超高感度カメラ（ＥＭ−ＣＣＤ、Ｅｖｏｌｖｅ  ５１２（Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社））の２つの異なる領域に投影できるようになっていた。
【０１２０】
正常細胞及び薬剤ＡＧ１４７８（刺激の３０分前に適用し、顕微鏡での観察のため培地に添加）の存在によってＥＧＦＲが特異的に阻害された細胞の刺激を、２７０ｎＭの濃度のエンドセリン−１で行った。刺激後すぐに、細胞内の異なる粒子によって放射された発光シグナルを収集した。こうして、図１２は、ＥＴ−１による刺激（ＥＧＦＲの阻害の存在下又は非存在下）後に得られたナノ粒子ＹＡＧ：Ｃｅ（１未満）及びＧｄＶＯ４：Ｅｕ（１超）の光ルミネセンスをそれらの初期値で正規化したものを示す。
【０１２１】
次に、上述の較正により、２通りの細胞状態（正常又はＥＧＦＲ阻害）の下での過酸化水素の絶対濃度の経時的変動を推定した（図１３）。このステップによって、シグナル伝達プロセス全体へのＥＧＦＲチャネルの寄与を定量化することができるようになる。阻害細胞で産生される過酸化水素の量が正常細胞の半分であるので、この寄与は５０％に達する。また、過酸化水素の生成キネティクスに対するこの阻害の効果を定量化することもできるようになり、例えばＢｏｕｚｉｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ２０１４；  ２１：６４７−５６とは対照的に、ＥＧＲのトランス活性化は１秒未満で起こり、上記の生成キネティクスを＜１分に制御することが判明した。
【０１２２】
無論、本発明は上述の例に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲内で数多くの変形例が当業者によって想起し得る。
【０１２３】
従って、例えば、光学的に活性な第２の試薬は、例えば半導体ナノ結晶のようなあらゆるタイプの光安定な試薬からなることができる。
【０１２４】
さらに、粒子は、特に細胞レベルでの測定の場合の特定の細胞区画或いは組織又はインビボ（生体）レベルでの測定の場合の特定の細胞タイプ（例えば癌細胞）のいずれかをターゲティングするため、官能化しかつ関心のある１以上の生体分子にカップリングしてもよい。
【０１２５】
さらに正確には、生物活性分子は、ターゲティング分子、すなわち器官、体液（例えば血液）、細胞タイプ（例えば血小板、リンパ球、単球、腫瘍細胞など）又は細胞区画への本発明の粒子の特異的ターゲティングを可能にする分子である。従って、この特異的ターゲティングは、モノクローナル又はポリクローナル抗体、或いは細胞受容体のタンパク質又はポリペプチドリガンドを用いて達成することができる。非限定的な例として、以下の受容体／リガンド対：ＴＧＦ／ＴＧＦＲ、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ、ＴＮＦα／ＴＮＦＲ、インターフェロン／インターフェロン受容体、インターロイキン／インターロイキン受容体、ＧＭＣＳＦ／ＧＭＣＳＦ受容体、ＭＳＣＦ／ＭＳＣＦ受容体及びＧＣＳＦ／ＧＣＳＦ受容体を挙げることができる。リガンドとしてトキシン断片又は解毒トキシン及びそれらの細胞受容体を挙げることもできる。抗体に関しては、その抗体が対象とする１以上の抗原の機能によって選択される。
【０１２６】
別の実施形態では、１以上の生物活性分子は、体内でのステルス性を粒子に付与し、それによって血液中でのそれらの循環時間を増加させるための、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はデキストランのようなステルス剤である。
【０１２７】
特定の実施形態では、本発明の粒子は、上記で定義したターゲティング分子及びステルス分子によって官能化し得る。
【０１２８】
実施形態にかかわらず、生物活性分子は、粒子の表面又は適宜調製層に、共有結合又は非共有結合によって、直接又は官能基を有する層を介して結合させることができる。これらの生物活性分子の結合は、生物活性分子との、粒子の表面、調製層及び／又は官能基を有する層の酸化、ハロゲン化、アルキル化、アシル化、付加、置換又はアミド化の従来技術によって達成される。
【０１２９】
調製層は、共有結合又は吸収のいずれかによって粒子に直接施用される。この調製層は、親水性又は疎水性であり得る。特定の実施形態では、この調製層は非晶質である。
【０１３０】
粒子と生体分子との間のカップリングは、例えば国際公開第２０１２／０１０８１１号に記載されている。さらに、国際公開第２０１３／１２３１９７号は、生体分子とカップリングした粒子をもたらすことができる粒子のコーティングを記載している。
【０１３１】
さらに、信号雑音比を向上させるため、ほとんどの蛍光体と比較して長い励起状態の寿命を有するユーロピウムドープ粒子によって放出される信号の遅延検出を使用することもできる。選択的に活性化できる、光度検出手段の（特に機械的又は電子的）掩蔽（ｏｃｃｕｌｔａｔｉｏｎ）のための装置の助けを借りて、このアプローチは、第１及び第２の試薬の励起用のレーザーパルスの後、設定時間後に放出された光子のみを検出することからなる。この設定時間は、他の発光体から入射する光子（例えば自発蛍光によるもの）を検出せずに、ＹＶＯ４：Ｅｕナノ粒子によって放射される光子のみを検出するように選択し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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