【手続補正書】
【提出日】平成25年11月15日(2013.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の配列の上流に該配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写調節因子をコードする遺伝子配列、
を導入したチミジンキナーゼ欠損細胞を使用し、
前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写抑制因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の非存在下でデオキシチミジン三リン酸(dTTP)のデノボ(de novo)合成経路の阻害剤を添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、若しくは、該遺伝子スイッチを活性化する物質の存在下で変異原性ヌクレオシドを添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、または
前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写活性化因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下でデオキシチミジン三リン酸(dTTP)のデノボ(de novo)合成経路の阻害剤を添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、若しくは、該遺伝子スイッチを活性化する物質の非存在下で変異原性ヌクレオシドを添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、
を含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項２】
下記工程(1)から(3)を含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法：
(1)下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の配列の上流に該配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写調節因子をコードする遺伝子配列、
を、チミジンキナーゼ欠損細胞に導入する工程、
(2)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写抑制因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する物質の存在下で上記細胞に変異原性ヌクレオシドを添加してインキュベーションする工程、または、前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写活性化因子である場合には、該遺伝子スイッチを活性化する物質の非存在下で上記細胞に変異原性ヌクレオシドを添加して該細胞をインキュベーションする工程、
および
(3)生細胞を回収する工程。
【請求項３】
前記工程(3)に続いて、下記工程(4)および(5)をさらに含む請求項2に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法：
(4)回収した生細胞を、前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写抑制因子である場合には、前記遺伝子スイッチを活性化する物質の非存在下でデオキシチミジン三リン酸(dTTP)のデノボ(de novo)合成経路の阻害剤を添加してインキュベーションする工程、または、前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写活性化因子である場合には、前記遺伝子スイッチを活性化する物質の存在下でdTTPのde novo合成経路の阻害剤を添加してインキュベーションする工程、
および
(5)生細胞を回収する工程。
【請求項４】
下記工程(6)から(8)を含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法：
(6)下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の配列の上流に該配列に作動可能に連結されたプロモータ配列、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動する転写調節因子をコードする遺伝子配列、
を、チミジンキナーゼ欠損細胞に導入する工程、
(7)前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写抑制因子である場合には、前記遺伝子スイッチを活性化する物質の非存在下で上記細胞にデオキシチミジン三リン酸(dTTP)のデノボ(de novo)合成経路の阻害剤を添加してインキュベーションする工程、または、前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写活性化因子である場合には、前記遺伝子スイッチを活性化する物質の存在下で上記細胞にdTTPのde novo合成経路の阻害剤を添加して該細胞をインキュベーションする工程、
および
(8)生細胞を回収する工程。
【請求項５】
前記工程(8)に続いて、下記工程(9)および(10)をさらに含む請求項4に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法：
(9)回収した生細胞を、前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写抑制因子である場合には前記遺伝子スイッチを活性化する物質の存在下で変異原性ヌクレオシドを添加してインキュベーションする工程、または、前記(f)の転写調節因子をコードする遺伝子配列が転写活性化因子である場合には前記遺伝子スイッチを活性化する物質の非存在下で変異原性ヌクレオシドを添加してインキュベーションする工程、
および
(10)生細胞を回収する工程。
【請求項６】
チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列が、ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列である、請求項1から5のいずれか1項に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項７】
チミジンキナーゼ欠損細胞が、大腸菌のチミジンキナーゼ欠損株である、請求項1から6のいずれか1項に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項８】
変異原性ヌクレオシドが、6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)である、請求項1から7のいずれか1項に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項９】
デオキシチミジン三リン酸(dTTP)のデノボ(de novo)合成経路の阻害剤が、5-フルオロ-2'-デオキシウリジン(5FdU)またはその誘導体である、請求項1から8のいずれか1項に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項１０】
下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の配列の上流に該配列に作動可能に連結されたプロモータ配列であってリプレッサータンパク質CIの作用を受けるプロモータ、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動するCIタンパク質をコードする遺伝子配列、
を導入したチミジンキナーゼ欠損大腸菌株を使用し、N-アシル-L-ホモセリンラクトン(AHL)の存在下で6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)を添加して該大腸菌株を5分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項１１】
下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の配列の上流に該配列に作動可能に連結されたプロモータ配列であってリプレッサータンパク質CIの作用を受けるプロモータ、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動するCIタンパク質をコードする遺伝子配列、
を導入したチミジンキナーゼ欠損大腸菌株を使用し、N-アシル-L-ホモセリンラクトン(AHL)の非存在下で5-フルオロ-2'-デオキシウリジン(5FdU)を添加して該大腸菌株を12時間から20時間インキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項１２】
下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の配列の上流に該配列に作動可能に連結されたプロモータ配列であってリプレッサータンパク質CIの作用を受けるプロモータ、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動するCIタンパク質をコードする遺伝子配列、
を導入したチミジンキナーゼ欠損大腸菌株を使用し、N-アシル-L-ホモセリンラクトン(AHL)の存在下で6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)を添加して該大腸菌株を5分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収し、次いで、AHLの非存在下で5-フルオロ-2'-デオキシウリジン(5FdU)を添加して該大腸菌株を12時間から20時間インキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項１３】
下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の配列の上流に該配列に作動可能に連結されたプロモータ配列であってリプレッサータンパク質CIの作用を受けるプロモータ、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動するCIタンパク質をコードする遺伝子配列、
を導入したチミジンキナーゼ欠損大腸菌株を使用し、N-アシル-L-ホモセリンラクトン(AHL)の非存在下で5-フルオロ-2'-デオキシウリジン(5FdU)を添加して該大腸菌株を12時間から20時間インキュベーションした後に生細胞を回収し、次いで、AHLの存在下で6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)を添加して該大腸菌株を5分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項１４】
下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の配列の上流に該配列に作動可能に連結されたプロモータ配列であってリプレッサータンパク質CIの作用を受けるプロモータ、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動するCIタンパク質をコードする遺伝子配列、
を導入したチミジンキナーゼ欠損大腸菌株を使用し、異なる濃度のN-アシル-L-ホモセリンラクトン(AHL)の存在下およびAHLの非存在下で5-フルオロ-2'-デオキシウリジン(5FdU)を添加して該大腸菌株を12時間から20時間インキュベーションした後に生細胞を回収し、次いで、前記濃度の1/10濃度のAHLの存在下で6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)を添加して該大腸菌株を5分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収することにより、AHLに対する感度の異なる遺伝子スイッチおよび遺伝子回路を取得することを特徴とする、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項１５】
下記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクター：
(a)ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、
(b)前記(a)の配列の上流に該配列に作動可能に連結されたプロモータ配列であってリプレッサータンパク質CIの作用を受けるプロモータ、
並びに、
下記配列(c)から(f)を少なくとも保持する発現ベクター：
(c)前記プロモータ配列とは異なるプロモータ配列であってその下流の遺伝子スイッチ発現配列に作動可能に連結されたプロモータ配列
(d)前記遺伝子スイッチ発現配列、
(e)前記遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチの標的配列、
(f)前記標的配列が作動可能に連結された遺伝子であって前記(a)のプロモータ配列に作動するCIタンパク質をコードする遺伝子配列、
を導入したチミジンキナーゼ欠損大腸菌株を使用し、異なる種類のN-アシル-L-ホモセリンラクトン(AHL)の存在下およびAHLの非存在下で5-フルオロ-2'-デオキシウリジン(5FdU)を添加して該大腸菌株を12時間から20時間インキュベーションした後に生細胞を回収し、次いで、前記種類とは異なるAHLの存在下で6-(β-D-2-デオキシリボ-フラノシル)-3,4-ジヒドロ-8H-ピリミド[4,5-c][1,2]オキザジン-7-オン(dP)を添加して該大腸菌株を5分間から60分間インキュベーションした後に生細胞を回収することにより、AHL特異性の異なる遺伝子スイッチおよび遺伝子回路を取得することを特徴とする、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項１６】
遺伝子スイッチ発現配列がLuxR変異体をコードする遺伝子配列である、請求項14または請求項15に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項１７】
前記配列(a)および(b)を少なくとも保持する発現ベクターが、該配列(a)および(b)に加えて蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列をさらに含む発現ベクターである、請求項1から16のいずれか1項に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法。
【請求項１８】
チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列とその上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列とを少なくとも含む発現ベクターであって、請求項1から17のいずれか1項に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に使用される発現ベクター。
【請求項１９】
チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列および蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列、並びにこれら遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモータ配列を少なくとも含む発現ベクターであって、請求項1から17のいずれか1項に記載の遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に使用される発現ベクター。
【請求項２０】
配列表の配列番号2または配列番号3に記載の塩基配列で表されるDNAからなる発現ベクター。