(57)【要約】  リガンドが固定化されている剛性の多孔質性マトリックス（２２）を備えるピペットチップ（２０）であって、リガンドは、クロマチンと関連するタンパク質に結合することが可能であり；剛性の多孔質性マトリックスは、使用において、ピペットチップを通過する液体サンプル中のクロマチンが、剛性の多孔質性マトリックスにより保持されるように、ピペットチップ内に配置される、ピペットチップが記載される。また、ピペットチップを用いて液体サンプルからクロマチンを単離する方法、および、クロマチン免疫沈降アッセイにおけるピペットチップの使用も記載される。
2018504089.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピペットチップであって、
ピペットに噛み合うように適合された開口上端；
開口下端；および、
前記上端および下端と流体連通した貫通通路；
を備え、
前記ピペットチップは、使用において、減圧の適用によって前記下端を通って吸引されること、および、上昇した圧力の適用によって前記下端の外に排出されることの両方により、液体サンプルが前記チップを通過することが可能であるように構成され；
前記ピペットチップは、リガンドが固定化された剛性の多孔質性マトリックスを備え、
前記リガンドは、クロマチンと関連するタンパク質に結合することが可能であり；
前記の剛性の多孔質性マトリックスは、使用において、前記ピペットチップを通過する液体サンプル中のクロマチンが、前記の剛性の多孔質性マトリックスにより保持されるように、前記ピペットチップ内に配置される、
ピペットチップ。
【請求項２】
請求項１に記載のピペットチップであって、
使用において、前記下端を通る多数の吸引および前記下端の外への多数の排出によって、前記液体サンプルが、前記チップを通って多数の通過が可能であるように、前記の剛性の多孔質性マトリックスが前記ピペットチップ内に配置される、
ピペットチップ。
【請求項３】
請求項１に記載のピペットチップであって、
使用において、前記の剛性の多孔質性マトリックスより下の前記チップ内の液体の比率が、前記チップ内の液体の全容量の５０％未満であるように、前記の剛性の多孔質性マトリックスが前記ピペットチップ内に配置される、
ピペットチップ。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかのピペットチップであって、
官能化された剛性の多孔質性マトリックスは、焼結された熱可塑性ポリマーを含む、
ピペットチップ。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかのピペットチップであって、
前記の剛性の多孔質性マトリックスは、フィルターディスクまたはフリットの形態である、
ピペットチップ。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかのピペットチップであって、
前記ピペットチップの断面積は、その下端に向かって狭くなっている、
ピペットチップ。
【請求項７】
請求項６に記載のピペットチップであって、
前記ピペットチップは、その下端に向かって先細になっている、
ピペットチップ。
【請求項８】
請求項７に記載のピペットチップであって、
円錐台またはピラミッド形状を有する、
ピペットチップ。
【請求項９】
請求項１から８に記載のチップとともに提供される、
ピペット。
【請求項１０】
請求項９に記載のピペットであって、
前記チップは、前記ピペットの不可欠部分である、
ピペット。
【請求項１１】
請求項９に記載のピペットであって、
前記チップは、前記ピペットとは別に製造されて、使用前に前記ピペットに取り付けられる、
ピペット。
【請求項１２】
請求項９から１１のいずれかに記載のピペットであって、
空気置換ピペット、容積式ピペット、マルチチャネルピペット、ピペッティングシリンジ、ガラスマイクロピペット、マイクロ流体ピペット、マイクロシリンジ、シリンジおよびカニューレからなる群より選択される、
ピペット。
【請求項１３】
液体サンプルからクロマチンを単離する方法であって、
前記クロマチンが、前記ピペットチップ内の前記の剛性の多孔質性マトリックス上に保持されるように、請求項１から８のいずれかに記載のピペットチップまたは請求項９から１２のいずれか一項に記載のピペットを通して前記液体サンプルを通過させるステップを含む、
方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
前記液体サンプルは、減圧の適用によって前記ピペットチップの下端を通って複数回吸引されて、上昇した圧力の適用によって前記ピペットチップの下端の外へ複数回排出される、
方法。
【請求項１５】
請求項１３または請求項１４に記載の方法であって、
前記ピペットチップの下端を通した前記液体サンプルの吸引は、前記の剛性の多孔質性マトリックスに空気が入らないような回数で終わる、
方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の方法であって、
前記リガンドは、抗体である、
方法。
【請求項１７】
請求項１３に記載の方法であって、
前記リガンドは、免疫グロブリン、プロテインＡまたはプロテインＧを含む、
方法。
【請求項１８】
クロマチン免疫沈降アッセイを行なう方法であって、
以下のステップ：
（ｉ）細胞からの、分析すべきクロマチンを含む液体サンプルの調製；
（ｉｉ）請求項１３から１７のいずれか一項に記載の方法による、リガンドが固定化された剛性の多孔質性マトリックス上への、前記液体サンプル中の前記クロマチンの免疫沈降；
（ｉｉｉ）前記の沈降したクロマチンからのＤＮＡ回収；および、
（ｉｖ）ＤＮＡ分析、
を含む、
方法。
【請求項１９】
クロマチン免疫沈降アッセイを行なう方法であって、以下のステップ：
（ｉ）細胞からの、分析すべきクロマチンを含む液体サンプルの調製；
（ｉｉ）請求項１から８のいずれかに記載のピペットチップまたは請求項９から１２のいずれか一項に記載のピペットを通して前記液体サンプルを通過させて、それにより、前記液体サンプルから前記クロマチンを分離するステップ；
（ｉｉｉ）前記の沈降したクロマチンからのＤＮＡ回収；および、
（ｉｖ）ＤＮＡ分析、
を含む、
方法。
【請求項２０】
請求項１から８のいずれかに定義されるピペットチップまたは請求項９から１２のいずれか一項に記載のピペット、および、クロマチン免疫沈降アッセイを行なうのに適切な１または複数のバッファー、溶液または試薬を含む、
キット。
【請求項２１】
請求項１から８のいずれかに定義されるピペットチップ、または請求項９から１２のいずれか一項に記載のピペットの使用であって、液体サンプルからクロマチンを単離するための、
使用。
【請求項２２】
請求項２０に記載の使用であって、
前記ピペットチップは、クロマチン免疫沈降アッセイにおいて用いられる、
使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピペットチップ、および、チップを用いた抽出方法（例えば、クロマチン免疫沈降アッセイ法）に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）は、ＤＮＡ／タンパク質相互作用の研究で用いられる重要な技術である。ＣｈＩＰの利点は、規定のゲノムの領域と、特定のタンパク質、またはそれらの改変アイソフォームの関連性を分析するのに用いることができる点である。既存のＣｈＩＰ技術の概説は、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）「Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ，ＮＣｈＩＰ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３１：７６−８２に提供される。ＣｈＩＰを用いて、転写因子および改変ヒストンのようなタンパク質が、生細胞または組織の内因性クロマチン上の特定の領域に結合するかどうかを判定し得る。
【０００３】
ＣｈＩＰアッセイでは、ＤＮＡ−タンパク質複合体のフラグメント（すなわちクロマチン）は、特定のＤＮＡ−タンパク質相互作用を保持するような方法で調製される。これらのクロマチンフラグメントは、それから、複合体中に存在するタンパク質に対する抗体を用いて免疫沈降され得る。それから、単離されたクロマチン画分を処理して、ＤＮＡおよびタンパク質成分を分離することができる。それから、特定のタンパク質（すなわち、免疫沈降に用いられた抗体が向かったタンパク質）に関連して単離されたＤＮＡフラグメントの一致性は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、マイクロアレイ上のハイブリダイゼーション、ダイレクトシーケンシング、または、所定配列のＤＮＡフラグメントの同定に用いられる他の技術によって、判定され得る。
【０００４】
それ故に、クロマチン免疫沈降アッセイは、典型的に、以下の５つの重要なステップ：（ｉ）細胞からの、分析すべきクロマチンの調製；（ｉｉ）抗体を用いた、クロマチンの免疫沈降；（ｉｉｉ）沈降したクロマチンフラグメントの単離；（ｉｖ）沈降産物からのＤＮＡ回収；および（ｖ）ＤＮＡ分析、を含む。
【０００５】
ＣｈＩＰ技術は、開始（投入）クロマチンの調製される方法が主に異なる、２つの主な変型を有する。第一の変型（ＮＣｈＩＰと呼ばれる）は、標準的な手順による細胞核の小球菌ヌクレアーゼ消化によって調製される、ネイティブのクロマチンを用いる。第二の変型（ＸＣｈＩＰと呼ばれる）は、通常は超音波処理によるクロマチンのフラグメント化の前に、増殖細胞へのホルムアルデヒドの添加により架橋されたクロマチンを用いる。一部の研究者は、穏やかなホルムアルデヒド架橋の後にヌクレアーゼ消化を用いていて、ＵＶ照射が、代替の架橋技術として成功して用いられている。
【０００６】
典型的に、クロマチンフラグメントの免疫沈降は、ＤＮＡに結合している目的のタンパク質に特異的な抗体を用いて行なわれる。抗体−結合クロマチンフラグメントは、固相を用いてサンプルから単離され得る。
【０００７】
ＷＯ２０１２／０７６８８２は、クロマチンを含む液体サンプルを保持するためのチャンバーを備える分離カラム、および、リガンドが固定化された剛性の多孔質性マトリックスを記載し、ここで、リガンドは、クロマチンと関連するタンパク質に結合することが可能である。使用において、液体サンプルは、例えばカラム内の上側開口を通して分離カラム内のチャンバーに最初に添加され得る。それから、液体サンプルは、典型的にカラムの下端の流出ポートの上に配置された剛性の多孔質性マトリックスを通過し得て、それにより、カラムを出る。このようにして、液体サンプル内に存在するクロマチンフラグメントは、マトリックスを通過しながらリガンドに結合することができる。それにより、クロマチンフラグメントは、その後捨てられ得る、液体サンプルから分離される。
【０００８】
しかしながら、ＷＯ２０１２／０７６８８２に記載の器具を、特にスピンカラムで用いた場合、剛性の多孔質性マトリックス上でのリガンドとクロマチンとの間の必要な接触を得てマトリックスに対するその保持を確保するために、クロマチンを含む液体サンプルは、完全にマトリックスにより吸収される容量で添加される必要があり、すなわち、液体サンプルは、マトリックスの内部空隙スペース内に保持されなければならない。マトリックスの空隙容量を超える、任意の容量の液体サンプルは、リガンド上の官能基に接触することができない。
【０００９】
ＷＯ２０１２／０７６８８２の公開日には、器具は、剛性の多孔質性マトリックスの内部空隙容量とほぼ等しい液体サンプルに対して操作可能であると考えられていた。しかしながら、ＷＯ２０１２／０７６８８２の公開後に、本発明者らは、実際には、スピンカラムで用いられた場合、液体サンプルの量は、十分なクロマチン回収を確保するためには、剛性の多孔質性マトリックスの空隙容量の約２〜３倍に制限されることを見いだした。例えば、空隙容量が約４０μｌである標準的なスピンカラムでは、器具は典型的に、最大で１００μｌのクロマチンを含有する液体サンプル容量に制限される。
【００１０】
ＷＯ２０１２／０７６８８２に記載の器具のさらなる欠点は、実際には、遠心分離によりマトリックスを通して液体サンプルを吸引することが一般に必要であり：多数の遠心分離プロセスが典型的に必要とされる点である。このことは、特にマルチウェルプレートが関与する分析に用いる場合に、ロボットアームのような複雑かつ高価な機械が、その方法を行なうのに必要とされることが頻繁である。
【００１１】
ピペットは、測定された容量の液体を移行させるために、しばしば培地ディスペンサーとして、多種多様の科学分野において一般に用いられる実験ツールである。典型的に、ピペットは、減圧が液体サンプルをピペット内へ吸引させるように液体保持チャンバーの上に部分的真空を作って、この真空を選択的に解除して（すなわち、圧力を上昇させて）液体を排出することにより作用する。
【００１２】
ＵＳ２００８／０１１９６３７は、ゲル樹脂の充填層からなるピペットチップカラムを記載し、ここで、ゲル樹脂の充填層は、アガロースまたはセファロースからなり、ゲル樹脂は、さらに、タンパク質分析物に関して親和性を有する親和性基からなり、前記ゲル樹脂は、残余イオン交換基を欠く。アガロースゲルは、チップ内の２つのフリット間に保持される。タンパク質分析物は、サンプル溶液を、ピペットチップカラムを通して通過させることにより抽出され得る。アガロースゲルは、ＤＮＡおよびタンパク質の非特異的な結合を生じやすく、生じるバックグラウンドシグナルを減らすために十分な洗浄ステップを提供することが難しい。これらの不利な点は、アガロースゲルがピペットチップにおける抽出システムの一部を形成する場合にも遭遇する。
【００１３】
ＵＳ２０１０／０００９８４５は、活性粒子でドープされた多孔質性有機モノリスを備えたピペットチップを記載する。チップは、固相抽出のための、特に、ペプチドおよびタンパク質のような生体分子を脱塩、単離および精製するための、ツールとして用いることができる。この文献に記載のプロセスによれば、重合はｉｎ  ｓｉｔｕで生じ得るので、産物は、各用途にカスタムメイドでなければならず、または、ユーザーによって作られなければならない。また、このプロセスを用いて、モノリス間で再現性を達成することも難しい。
【００１４】
液体サンプルを吸引するための減圧の適用および液体を排出するための圧力上昇の適用は、遠心分離の必要性を避けることができる。しかしながら、ＷＯ２０１２／０７６８８２に概して記載されるタイプの標準的なサイズのフリットを備える標準的なサイズ分離カラムにおいて、このプロセスが行われる場合、低下または上昇した圧力を用いてカラムを通して液体を動かすことは、気泡を生じさせ得る。この気泡は、汚染またはサンプルの損失をもたらし得て、さらなる液体通路をブロックし得る。
【００１５】
フリットのような濾過器具を中に備えるピペットチップは、一般に、当技術分野で知られている。しかしながら、公知のピペットチップには、濾過器具は、典型的に、チップがピペットの本体に噛み合う箇所の近くに、チップの上半分に配置される。そのような器具の機能は、一般に、液体内に存在するクロマチンのような分析物を捕捉するよりむしろ、液体を吸引するための吸引手段に液体が入るのを防いで、この装置を保護することである。
【００１６】
Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＺｉｐＴｉｐ（登録商標）のような一部の公知のピペットチップは、チップの下半分に配置された濾過または分析物捕捉手段を備える。しかしながら、これらは一般に、Ｃ８またはＣ１８改変シリカのような一般的な吸着剤を有する繊維状の材料を含む。クロマチン特異的な捕捉マトリックスを備えるピペットチップは、当技術分野でこれまでに開示されたことがない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、上記の課題の１つまたは複数を対処する、改善されたクロマチン免疫沈降アッセイ器具および方法に関する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の一態様では、
ピペットに噛み合うように適合された開口上端；
開口下端；および、
上端および下端と流体連通した貫通通路；
を備えるピペットチップが提供され、
ピペットチップは、使用において、減圧の適用によって下端を通って吸引されること、および、上昇した圧力の適用によって下端の外に排出されることの両方により、液体サンプルがチップを通過することが可能であるように構成され；
ピペットチップは、リガンドが固定化された剛性の多孔質性マトリックスを備え、リガンドは、クロマチンと関連するタンパク質に結合することが可能であり；
剛性の多孔質性マトリックスは、使用において、ピペットチップを通過する液体サンプル中のクロマチンが、剛性の多孔質性マトリックスにより保持されるように、ピペットチップ内に配置される。
【００１９】
別の態様では、本発明に係るチップとともに提供されるピペット（または他の抽出器具）が提供される。
【００２０】
さらなる態様では、液体サンプルからクロマチンを単離する方法が提供され、その方法は、ピペットチップ内の剛性の多孔質性マトリックス上にクロマチンが保持されるように、液体サンプルを、本発明に係るピペットチップまたは本発明に係るピペット（または他の抽出器具）を通して通過させるステップを含む。
【００２１】
また、さらなる態様では、以下のステップ：
（ｉ）細胞からの、分析すべきクロマチンを含む液体サンプルの調製；
（ｉｉ）本発明の方法による、リガンドが固定化された剛性の多孔質性マトリックス上への、液体サンプル中のクロマチンの免疫沈降、それにより、液体サンプルからクロマチンを分離するステップ；
（ｉｉｉ）沈降したクロマチンからのＤＮＡ回収；および、
（ｉｖ）ＤＮＡ分析、
を含むクロマチン免疫沈降アッセイを行なう方法が提供される。
【００２２】
また、さらなる態様では、以下のステップ：
（ｉ）細胞からの、分析すべきクロマチンを含む液体サンプルの調製；
（ｉｉ）本発明に係るピペットチップまたは本発明に係るピペットを通して液体サンプルを通過させて、それにより、液体サンプルからクロマチンを分離するステップ；
（ｉｉｉ）沈降したクロマチンからのＤＮＡ回収；および、
（ｉｖ）ＤＮＡ分析、
を含む、クロマチン免疫沈降アッセイを行なう方法が提供される。
【００２３】
また、さらなる態様では、本発明に係るピペットチップまたは本発明に係るピペット、および、クロマチン免疫沈降アッセイを行なうのに適切な１または複数のバッファー、溶液または試薬を含む、キットが提供される。
【００２４】
また、さらなる態様では、液体サンプルからクロマチンを単離するための、特にクロマチン免疫沈降アッセイでの、本発明のピペットチップ、または本発明に係るピペット（または他の抽出器具）の使用が提供される。
【００２５】
利点および驚くべき発見
本発明の器具および方法は、従来技術に勝る多くの利点を与える。特に、本発明の器具および方法は、バッファーおよび試薬を、剛性の多孔質性マトリックスを通して移動させるのに、遠心力の使用を必要とせず、それにより、より簡単な自動化（または手動操作でさえも）を可能にし、高価な自動化装置の必要性を避ける。
【００２６】
加えて、ＷＯ２０１２／０７６８８２に概して記載される器具および方法と比較した場合、本発明の器具および方法は、免疫沈降プロセスと関連するインキュベーション時間を著しく減らし、それを実施する時間を、時間から分に減らす。さらに、本発明の器具および方法は、免疫沈降プロセス中の洗浄ステップの有効性を著しく改善する。
【００２７】
本発明の器具および方法は、剛性の多孔質性マトリックス上へのクロマチンのローディングが、ＷＯ２０１２／０７６８８２に概して記載される器具および方法と比較した場合に、よりいっそう大量のクロマチン含有溶液から達成することができるという点で、さらなる利点を提供する。さらに、本発明の器具の剛性の多孔質性マトリックスと、クロマチンの、より密接な接触は、デバイスの感度を改善させ、競合デバイスと比較して、よりいっそう少ない量のクロマチンの使用を可能にさせる。本発明の方法によれば、フリットの細孔容積の何倍もの希釈クロマチン溶液は、器具の剛性の多孔質性マトリックスを前後に横切って吸引させることにより、溶液からのクロマチンの吸着を最大限にさせ得る。さらに、大量の希釈クロマチン溶液からクロマチンをロードして、それから、より少量の溶離液を用いてフリットからそれを取り出すことは、ＷＯ２０１２／０７６８８２に概して記載される方法と比較して、溶出液中のクロマチン濃度の有意な濃縮を可能にする。
【００２８】
特に、本発明の方法は、免疫沈降段階でのプロトコルが標準的なＣｈＩＰ方法よりもいっそう短くありながら、さまざまなクロマチン添加において良好なＣｈＩＰの結果を与える。予期しないことに、本発明の方法での、官能化された多孔質性マトリックスと溶解物の、よりいっそう短い接触時間は、剛性の多孔質性マトリックス上に固定化されたリガンドに対するクロマチンの結合効率に、悪い影響を与えず：驚くべきことに、このことは、ＷＯ２０１２／０７６８８２に概して記載される方法よりも良好な結果を与える。
【００２９】
理論に拘束されることを望まずに、本発明の方法における、剛性の多孔質性マトリックスを通した液体サンプルの多数の動きは、液体が動くときに、剛性の多孔質性マトリックスの内表面で利用可能なクロマチン／抗体を補給することにより、剛性の多孔質性マトリックスに対するクロマチンの結合を増進させ得ると考えられる。対照的に、ＷＯ２０１２／０７６８８２に概して記載される方法では、溶解物は、剛性の多孔質性マトリックスに添加されて細孔容積を単に満たし、拡散に頼って必要な接触を提供するだけである。
【００３０】
また、器具および方法は、最終溶離液中のクロマチンを濃縮する利点も提供する。クロマチン免疫沈降アッセイにおいて用いられる場合、本発明に係る剛性の多孔質性マトリックスを組み込んだピペットチップにおいて、この方法を行なうことは、ユーザーが、アッセイのローディング段階において、より大量のクロマチンを含む溶液を扱うことを可能にする。ローディングの後に、最終の溶出段階において、より少量の溶離液が用いられる場合は、濃縮効果および増大した感度の両方を達成することが可能である。このことは、ロード容量の制限の問題が克服されるので、ＷＯ２０１２／０７６８８２に概して記載される標準的なスピンカラム法に勝る利点を提供する。
【００３１】
驚くべきことに、本発明の方法を、ＷＯ２０１２／０７６８８２に概して記載される方法と直接比較した場合（同一のバッチおよびサイズのフリットを使用する）、結果は、よりいっそう短いプロトコルで、より高い％で抗体の結果に改善した。ＵＳ２００８／０１１９６３７に概して記載される技術を用いるアガロースゲルチップ（Ｐｕｒｅｓｐｅｅｄ（商標）ＰｒｏＡ）は、この試験においてシグナルを示すことができなかった。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】従来技術に係るフリットとともに提供されるスピンカラムを示す。
【図１Ｂ】本発明に係るピペットチップを示す。
【図１Ｃ】図１Ｂの拡大図である。
【図２】本発明に係る２００μｌピペットチップ内の３．５ｍｍフリットを通して通過するクロマチン含有サンプルに関する、％Ａｂシグナルを示す。
【図３】本発明に係る２００μｌピペットチップ内の３．５ｍｍフリットを通して通過するクロマチン含有サンプルに関する、クロマチン希釈系列を示す。
【図４】同一のフリットサイズおよびタイプを用いた、本発明の方法およびＷＯ２０１２／０７６８８２に記載の方法を用いて達成された結果の間の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
ピペットチップ
本発明の器具の一態様は、ピペットチップを備える。チップは、ピペット（または、制限されないがシリンジを含む、以下に定義および例示されるもののような、他の同様の抽出器具）に噛み合うように適合された開口上端；開口下端；および、上端および下端と流体連通した貫通通路を備える。ピペットチップは、使用において、典型的に、減圧の適用によって（例えば、真空の適用によって）下端を通して吸引されて、上昇した圧力の適用によって下端の外に排出されることにより、液体サンプルが、チップを通って両方向に通過することが可能であるように構成される。ピペットチップは、以下により詳細に示される、官能化された、剛性の多孔質性マトリックスを備える。
【００３４】
典型的に、ピペットチップの断面積（特に、水平の横断面で見た場合）は、その上端から下端に向かって狭まっている。一実施態様では、ピペットチップは、その下端に向かって先細である。ピペットチップの特定の例は、円錐台またはピラミッド形状を有するものを含む。
【００３５】
ピペットチップは、ピペットまたは同様の抽出器具に噛み合うように適合された上端を有する。一実施態様では、チップは、ピペットの不可欠部分である。別の実施態様では、チップは、ピペットとは別に製造されて、ピペット使用前にピペットに取り付けられる。
【００３６】
ピペットは、その操作中、例えば、減圧の適用による下端を通した吸引および上昇した圧力の適用による下端の外への排出の両方によって、液体サンプルが両方向にチップを通って通過することが可能である限り、任意のピペットまたは当技術分野で知られている同様の抽出器具であってよい。ピペットおよび当業者によく知られる同様の抽出器具の例は、空気置換ピペット、容積式ピペット、ピペッティングシリンジ、ガラスマイクロピペット、マイクロ流体ピペット、マルチチャネルピペット、マイクロシリンジ、シリンジおよびカニューレを含む。使い捨てチップはプランジャーを備えるので、容積式ピペットが本発明に特に好ましい。このことは、プランジャーが液体を直接移すマイクロシリンジと同様にデバイスを操作することを本質的に可能にして、剛性の多孔質性マトリックスに空気が入らずにデバイスを操作する潜在能力を提供する。
【００３７】
ピペットチップの容量は、行なわれるアッセイ、備えている剛性の多孔質性マトリックス、および、それを通過することが意図される液体サンプルの量に応じて変化し得る。特定の一例では、ピペットチップは、１μｌ〜１０ｍｌ、例えば５μｌ〜１ｍｌ、例えば１０μｌ〜５００μｌ、例えば２０〜２００μｌ、例えば４０〜１００μｌの範囲の容量である。
【００３８】
ピペットチップは、ピペットチップ内に配置された剛性の多孔質性マトリックスを備える。剛性の多孔質性マトリックスは、器具の操作中に液体サンプル中の分析物（典型的には、クロマチンと関連するタンパク質）に結合するために官能化される。剛性の多孔質性マトリックスを、以下により詳細に記載する。
【００３９】
剛性の多孔質性マトリックスは、使用において、ピペットチップを通って通過する液体サンプル中の分析物（典型的にはクロマチン）が、剛性の多孔質性マトリックスにより保持されるように、ピペットチップ内に配置される（典型的には、クロマチンと関連するタンパク質への結合が可能なリガンドによるものであり、リガンドは、剛性の多孔質性マトリックス上に固定化されている）。典型的には、剛性の多孔質性マトリックスは、ピペットチップの断面積全体を実質的に覆うようにしてピペットチップ内に配置される。
【００４０】
剛性の多孔質性マトリックスは、使用において、下端を通した一回の吸引および下端の外への一回の排出によって、液体サンプルがチップを通って一回通過することが可能なようにピペットチップ内に配置され得る。しかしながら、本発明によれば、剛性の多孔質性マトリックスは、使用において、下端を通した多数の吸引および下端の外への多数の排出によって、液体サンプルが、チップを通した多数の通過が可能なように、ピペットチップ内に配置されることが好ましい。このことは、従来技術に勝る多くの利点を与える。分析物（典型的にはクロマチン）を含む液体サンプルを、剛性の多孔質性マトリックスを通して複数回、上下に吸引する能力は、剛性の多孔質性マトリックス上の官能化と分析物（典型的にはクロマチン）との間の潜在的な接触の量を増大させる。このことは、剛性の多孔質性マトリックス上の官能性の使用を最大限にさせて、それにより、ＷＯ２０１２／０７６８８２に概して記載される器具および方法と比較したサンプル容量の制限の問題を解決する。驚くべきことに、このことは、１時間から数分のオーダーまでインキュベーション期間の有意な減少にも寄与し、その時間のあいだ、よりいっそう大量の溶液中のクロマチンが、剛性の多孔質性マトリックス上に結合することができる。
【００４１】
一実施態様では、剛性の多孔質性マトリックスは、使用において、剛性の多孔質性マトリックスよりも下のチップ内の液体の比率が、チップ内の液体の全容量の５０％未満（例えば４０％未満、例えば３０％未満、例えば２０％未満、例えば１０％未満、例えば５％未満、例えば３％未満、例えば２％未満、例えば１％未満）であるように、ピペットチップ内に配置される。典型的に、これは、チップの下半分、好ましくは一番下の４分の１に剛性の多孔質性マトリックスを配置することによりなされる。一実施態様では、剛性の多孔質性マトリックスは、チップの下端またはその付近に配置される。使用において、剛性の多孔質性マトリックスよりも下の液体の比率を最小限にするように剛性の多孔質性マトリックスをピペットチップ内に配置することは、液体の各吸引および排出で剛性の多孔質性マトリックスを通して通過する液体含有量を最大限にして、各通過でリガンドがクロマチンに結合する能力を増大させるので、特に有利である。
【００４２】
剛性の多孔質性マトリックス
本発明のピペットチップは、剛性の多孔質性マトリックスを備える。本発明の方法では、場合により抗体により結合されたクロマチンを含む液体サンプルは、クロマチン、または抗体結合クロマチンが、剛性の多孔質性マトリックスにより保持されるようにして剛性の多孔質性マトリックスを通って通過する。
【００４３】
マトリックスは一般に多孔質性であり、すなわち、ポアまたはスペースがマトリックス内に存在し、それを通って液体が通過し得る。本発明のマトリックスは、シート、フィルター、メンブレン、シリンダー、繊維またはチューブのような任意の便利な物理的形態をとり得る。好ましい一実施態様では、マトリックスは、フィルター、ディスクまたはフリットを備える。マトリックスは典型的に、吸着剤として（すなわち、その表面上のリガンドのおかげで、クロマチンと関連するタンパク質に結合することにより）機能する。したがって、一部の実施態様では、マトリックスは、フィルターの物理的形状（例えばディスクまたはフリット）であってよいが、マトリックスは、典型的なフィルターとして機能する必要はない。一実施態様では、マトリックスは、吸着ディスクまたはフリットを備える。
【００４４】
ディスクまたはフリットのような剛性の多孔質性マトリックスは、ピペットチップ内に合うような寸法であり、典型的に、ピペットチップの断面積全体を占める。ディスクまたはフリットの正確な形状および寸法は、ピペットチップのものに依存する。しかしながら、一実施態様では、ディスクまたはフリットは、横断面が円形または多角形である。特定の一例では、ディスクまたはフリットは、０．０１ｍｍ〜２ｃｍ、例えば０．１ｍｍ〜２ｃｍ、例えば０．５ｍｍ〜１ｃｍ、例えば１〜８ｍｍ、例えば２〜５ｍｍまたは５〜８ｍｍの範囲の直径である。
【００４５】
ディスクまたはフリットのような剛性の多孔質性マトリックスの厚さは、例えば、サンプル中に存在するクロマチンなどの分析物に結合することが必要な、リガンドのような官能化された物質の量、および、中に合うピペットチップの寸法に応じて、変化し得る。特定の一例では、ディスクまたはフリットは、０．０１ｍｍ〜２ｃｍ、例えば０．１ｍｍ〜２ｃｍ、例えば０．５ｍｍ〜１ｃｍ、例えば１〜８ｍｍ、例えば１〜４ｍｍの範囲の厚さである。
【００４６】
特定の一例では、ＣｈＩＰアッセイは、２００μｌピペットチップ内に挿入された３．５ｍｍ直径×２ｍｍの厚さの小さなプロテインＡフリット、または、改変スピンカラム内に挿入された７．４ｍｍ直径×２ｍｍの厚さのプロテインＡフリットを用いて行なった。
【００４７】
一実施態様では、剛性の多孔質性マトリックスは、焼結された熱可塑性ポリマーを備える。適切なマトリックスの特定の例は、ＷＯ２００５／０１８８０３に記載されている。マトリックスは、化学的に反応性であり、または官能化される、修飾された表面を有してよく、例えば、場合によりリンカーを介してリガンドを付けるのに適切なペンダント官能基を提供する。本発明のマトリックスは、本質的に剛性である。
【００４８】
本明細書において用いられる用語「ポリマー」は、一般に、制限されないが、ホモポリマー、コポリマー、例えば、ブロック、移植片、ランダムおよび交互のコポリマー、ターポリマーなど、および、それらのブレンドおよび改変を含む。加えて、別段に明確に制限されない限り、用語「ポリマー」は、分子の全てのあり得る幾何学的形状も含む。これらの形状は、とりわけ、イソタクチック、シンジオタクチック、アタクチックおよびランダムシンメトリーを含む。
【００４９】
本発明のプロセスおよび材料で用いられるポリマーは、典型的に熱可塑性ポリマーである。熱可塑性物質は、熱軟化性のプラスチックとしても知られ、特定の温度よりも上で柔軟または成形性になり、冷却時に固形状態に戻るポリマーである。
【００５０】
本発明のプロセスおよび材料で用いられるポリマーは、典型的に有機ポリマーである。数多くの有機ポリマーが、当技術分野で知られている。本発明による使用に適切な特定のクラスの有機ポリマーの例は、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ポリエーテルスルホン、およびそれらの混合物または誘導体を含む。
【００５１】
一実施態様では、有機ポリマーは、エチレン性不飽和モノマー（すなわちＣ＝Ｃ結合を有する化合物）の重合化により形成されるポリマーである。一実施態様では、エチレン性不飽和モノマーは、オレフィン：換言すれば、非置換、不飽和炭化水素（例えば、エチレン、プロピレン、１−ブテン、１−ヘキセン、４−メチル−１−ペンテンまたはスチレン）であってよい。本明細書では、そのようなモノマーの重合化により形成されるポリマーは、「ポリオレフィン」と呼ばれる。別の実施態様では、エチレン性不飽和モノマーは、１つまたは複数のハロゲン原子、特に１つまたは複数のフッ素原子で置換されたエチレン性不飽和炭化水素（例えば、フッ化ビニリデンまたはテトラフルオロエチレン）、または、別の置換基で置換されたエチレン性不飽和炭化水素であり、それは、重合化の後に、吸着物質に対して不活性である。本明細書では、そのようなモノマーを重合化することにより形成されるポリマーは、「置換ポリオレフィン」と呼ばれる。
【００５２】
一実施態様では、熱可塑性有機ポリマーは、ポリオレフィンおよび置換ポリオレフィンからなる群より選択される。適切なポリオレフィンの例は、限定されないが：ポリエチレン；ポリプロピレン；ポリ（１−ブテン）；ポリ（１−ペンテン）；ポリ（１−ヘキセン）；ポリ（メチルペンテン）；ポリスチレン；およびそれらの混合物を含む。適切な置換ポリオレフィンの例は、限定されないが：ポリ（フッ化ビニリデン）；ポリ（テトラフルオロエチレン）（ＰＴＦＥ−Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））；ポリ（メチルメタクリレート）；およびそれらの混合物を含む。好ましくは、熱可塑性有機ポリマーは、ポリエチレンおよびポリプロピレンからなる群より選択される。
【００５３】
一実施態様では、ポリオレフィンは、ポリエチレンである。ポリエチレンは典型的に、その密度および直線性により特徴付けられる。超低密度ポリエチレン（ＶＬＤＰＥ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、線形低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）および高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）および超高分子量ポリエチレン（ＵＨＭＷＰＥ）は全て、本発明で用いられ得る。ＵＨＭＷＰＥは、数百万、通常は３１０万〜５６７万の数の分子量を有するポリエチレンである。それは典型的に、０．９３０〜０．９３５ｇ／ｃｍ３の密度を有する。ＨＤＰＥは、０．９４１ｇ／ｃｍ３以上の密度により定義される。ＭＤＰＥは、０．９２６〜０．９４０ｇ／ｃｍ３の範囲の密度により定義される。ＬＬＤＰＥは、０．９１５〜０．９２５ｇ／ｃｍ３の範囲の密度により定義される。ＬＬＤＰＥは、かなりの数の短い枝を有する実質的に直線状のポリマーであり、一般に、短鎖α−オレフィン（例えば、１−ブテン、１−ヘキセンおよび１−オクテン）とエチレンの共重合化により作られる。ＬＤＰＥは、０．９１０〜０．９４０ｇ／ｃｍ３の範囲の密度により定義される。ＶＬＤＰＥは、０．８８０〜０．９１５ｇ／ｃｍ３の範囲の密度により定義される。ＶＬＤＰＥは、高いレベルの短鎖の枝を有する実質的に直線状のポリマーであり、一般に、短鎖α−オレフィン（例えば、１−ブテン、１−ヘキセンおよび１−オクテン）とエチレンの共重合化により作られる。上記のポリエチレンの全ての形態は、当業者によく知られた標準的な技術により調製され得る。
【００５４】
一実施態様では、ポリオレフィンは、ポリプロピレンである。ポリプロピレンは、立体規則性（イソタクチックまたはシンジオタクチック）、アタクチックのポリプロピレン、またはそれらの混合であってよい。上記のポリプロピレンの全ての形態は、当業者によく知られた標準的な技術により調製され得る。
【００５５】
一実施態様では、熱可塑性ポリマーは、ポリエチレン；または共重合体またはブレンドであり、ポリエチレンを、好ましくは少なくとも８０％ポリエチレン、特に好ましくは少なくとも９０％ポリエチレン、最も好ましくは少なくとも９５％ポリエチレンを含む。
【００５６】
使用可能なポリエチレンの例は、Ｐｏｒｖａｉｒ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ，ＵＫにより用いられるように、商標ＶＹＯＮ（登録商標）またはＢＩＯＶＹＯＮ（登録商標）の下でのその産物の製品中に、高密度ポリエチレンおよび超高分子量ポリエチレンを含む。また、熱可塑性ポリマーは、当技術分野で通例の流動改善剤、添加剤などを含んでもよい。
【００５７】
焼結されてマトリックスを形成する熱可塑性ポリマー粒子は、一般に、マトリックスの最終的な使用に適切な範囲内のサイズを有する。粒子は、球状であってよく、一般に球状であり、または、任意の他の適切な規則的または不規則の形状であってよい。マトリックスを通る流体通路の速度は、少なくとも部分的に、マトリックスを含む粒子のサイズおよびこれらの粒子が焼結される条件によって判定されることを、当業者は理解するであろう。この点について考慮される他の変数は、マトリックスに結合される任意の材料の分子サイズおよび他の特性を含む。
【００５８】
本明細書において用いられる用語「焼結された熱可塑性ポリマー」は、一般に、実際のところポリマーを液化せずに、熱および振動の影響下で単一ユニットに合体されている、多くの熱可塑性ポリマー粒子を指す。したがって、マトリックスは、流体の適用時に維持される規定構造を有する複数の融合熱可塑性ポリマー粒子を含む。また、「焼結された熱可塑性ポリマー」は、一般に、成分粒子の融合性質に起因して、本質的に剛性であり、すなわち、本質的に非圧縮性であり、水溶液中で収縮または膨張しない。しかしながら、本発明のマトリックスを含むシートまたはメンブレンなどの本発明の一部の実施態様は、柔軟であり得る。
【００５９】
焼結熱可塑性物質の方法は、当技術分野でよく知られている。これらは、例えばＵＳ２００２／００６４４１３およびＧＢ２３６９７９６に開示される方法を含む。
【００６０】
焼結後のマトリックスのポアサイズは、その製造中に、所望の使用に適切であるように事前に決定され得る。一般に、マトリックス内のポアのサイズは、１〜１０００μｍ、例えば１〜５００μｍ、例えば５００〜１０００μｍ、例えば２００〜７００μｍ、例えば５〜１００μｍ、例えば５〜２０μｍ、例えば２０〜４０μｍまたは４０〜８０μｍであってよい。
【００６１】
焼結後に、マトリックスは、化学反応性の表面、例えば、官能化された表面、好ましくは不規則な表面を提供するために修飾される。この修飾は、マトリックスの表面積を増大させる。また、表面上の官能基も提供して、リガンドの付着を促進する。換言すれば、化学反応性表面は、場合によりリンカーを介して、表面にリガンドを付けるのに適切なペンダント官能基を提供する修飾表面である。
【００６２】
熱可塑性ポリマーの表面修飾に関して、多くの技術が知られている。この点について利用可能な３つの好ましい技術は、ＷＯ２００５／０１８８０３に記載の、ガスプラズマアミノ化、γ照射および化学的酸化である。
【００６３】
好ましくは、マトリックスは、化学的酸化により製造された修飾表面を有する。化学的酸化技術は、熱可塑性物質内の炭素結合の切断を介して、中間体の不規則な反応性官能基を作成する。好ましくは、マトリックスの表面は、１つまたは複数の酸化性酸、例えば、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、過マンガン酸カリウムおよび硫酸、三酸化クロムおよび硫酸からなる群より選択される酸によって；場合によりＫ２Ｃｒ２Ｏ７のような重クロム酸塩の存在下で、処理されることにより修飾される。
【００６４】
多くのストラテジーが、一般に熱可塑性物質の化学的酸化に用いられている。熱可塑性物質の表面のみの修飾が所望である場合は、これは、Ｈ２ＳＯ４中でＫ２Ｃｒ２Ｏ７のようなクロム酸または二クロム酸の塩および酸を用いて、表面の物理的構造に重大な損傷を引き起こさずに、相対的に穏やかな化学的酸化により達成することができる。熱可塑性物質の物理的浸食（プラスチック材料の表面の修飾前に、その結合能力を増大させるプラスチック材料の内側のトンネルおよびホール）は、プラスチックを、より高い濃度およびより高い温度で添加されるトリフルオロ酢酸または過マンガン酸カリウム、硫酸およびトリフルオロ酢酸のような、より侵襲性の酸または酸性混合物で処理することにより、達成することができる。
【００６５】
マトリックスの表面上に存在する官能基のタイプは、それらを生産するのに用いられる反応のタイプに依存する。ほとんどの場合、カルボキシル基またはヒドロキシル基が生産される。アルデヒドおよびケト基もまた、反応の副産物として生産され得る。カルボキシルまたはヒドロキシル官能基は、より安定でおよび潜在的に反応性の官能基、例えばアミンにより置換され得る。アミノ基は、熱可塑性物質の表面上に直接、化学的に導入され得て、または、スペーサー分子（リンカー）を介して付く。
【００６６】
マトリックスの表面が官能化された後、表面は、１つまたは複数のリンカーまたはスペーサーと反応され得る。そのような物質の機能は、（ｉ）マトリックスの表面に対する、所望のリガンドの付着を促進すること、および／または、（ｉｉ）必要に応じて、マトリックスの表面から特定の距離を置いてリガンドが配置されるのを可能にすることである。
【００６７】
有利に、修飾された表面は、化学的に不活性のままであり、したがって、非特異的なバックグラウンド結合を著しく減少させる。リンカー技術は、任意の固定化タンパク質、および、そのようなマトリクス上で精製される任意のタンパク質についても、生来の構造をかなりの程度で保つのを助ける。マトリックス上の切断不可能なリンカーの利用は、マトリックスに対するタンパク質の永久的な共有結合を可能にし、したがって、マトリックスからの任意の固定化分子の浸出を根本的に減少させる。
【００６８】
好ましくは、リンカーは、マトリックスの表面に結合される。最も好ましくは、リンカーは、表面が修飾された直後に、マトリックスの表面に結合される。適切なリンカーの選択は、マトリックスの表面官能化、および、マトリックスに結合されることが意図されるリガンドに依存する。非常に多くのそのようなリンカーが、当技術分野で知られている。特に、ポリペプチドまたはＤＮＡ／ＲＮＡ分子を、特定のリンカーに、または固体支持体に直接、結合するために用いられ得る反応は、当技術分野でよく知られている。好適に、官能基は、その化学合成中に、リガンド中に取り込むことができる。潜在的な官能基は、エーテル、エステル、チオール、ジアルキルアミド、ヒドラジド、ジアミンおよび多くの他のものを含む。適切なリンカーは、前述の官能基の１つまたは複数と反応することが可能な基を含むものである。例えば、リガンドとリンカーとの間のチオエーテル結合の形成を利用するリンカーは、一方（リガンド）の末端上にチオール基、および、他方（リンカー）上にブロムアセチル基を有し得る。
【００６９】
典型的に、マトリックス上に固定化されるリガンドは、生物学的分子であり、一般に、タンパク質（例えば、抗体、プロテインＡまたはプロテインＧ）である。マトリックスにそれが結合した時点で、生物学的分子の活性を保つことが重要である。このことは、タンパク質をリンカーに結合させるのに、非変性（すなわち生理学的またはマイルド）の条件を用いなければならないので、リンカーストラテジーの選択を制限する。そのような条件下では、全てのリンカーを用いることができるのではない。タンパク質の生物学的活性は、特定の官能基の（基質に対する）接近可能性に依存し得て；したがって、そのような基は、タンパク質をマトリックスに結合するのに用いてはいけない。さらに、潜在的な官能基の多くは、（例えば、リン酸化、アセチル化などによって）翻訳後に修飾され得て、したがって、結合反応に利用できない。
【００７０】
生物学的に活性の分子およびリンカーの結合に好ましい反応は、以下を含む：
【００７１】
１）アミノ結合、または、リンカーの末端でのエステル作用およびタンパク質の一次および／または二次アミンの間の反応を介した、リンカーとリガンド（例えばタンパク質）との間のアミド結合の形成。そのような反応は、一般に信頼でき、固定化タンパク質の活性は、影響を受けることがごく稀である。さらに、反応は、（一次アミンについては）中性ｐＨで行なうことができ、（二次アミンについては）ｐＨ８．３付近までリンスする。さらに、反応は、反応混合物中のフリーのアミンを必要としない。
【００７２】
２）チオ結合、または、マトリックス上に存在するチオールと、タンパク質由来の別のチオールとの間の共有結合の形成。この反応では、結合反応は可逆的であり、すなわち、リガンドは、２−メルカプトエタノールまたはＤＴＴを用いた還元後に、流体相中へ元に移すことができる。このことは、例えば、タンパク質間の相互作用を試験するのに非常に便利であり得る。反応は、結合のための一部の特別な条件、すなわち、溶液中の二価金属の不存在を必要とし；タンパク質は、結合前に、ＳＨ−基が還元されなければならない。
【００７３】
３）カルボキシ結合、または、マトリックス上の官能基とタンパク質のカルボキシ末端との間の共有結合の形成。このタイプの反応は、多くのタンパク質が、天然に修飾されている（すなわちブロックされている）Ｃ末端を有するので、効率および信頼性がより低い。
【００７４】
一実施態様では、クロマチンと関連するタンパク質に結合するリガンドは、マトリックスの表面上に固定化される。この実施態様では、焼結後に、マトリックスは、非アミノ化または本質的に非アミノ化の表面で提供される。この方法では、酸化後（好ましくは酸化の直後）に、スペーサーが、マトリックス上のカルボキシル官能基と６−アミノヘキサン酸との間の反応で生産される。この反応は、アンカリングカルボキシ官能基（ｔｈｅ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を有するリンカーを産生する。重要なことに、この方法は、表面上の未結合アミンの生成を伴わず、それは、修飾された表面に対する非特異的なバックグラウンド結合を著しく減少させる。
【００７５】
リンカーは、好ましくは、支持体と、リガンドに結合するタンパク質との間の、任意の立体障害を防止するのに十分長いものである。また、リンカーは、リガンド付着部位の間に大きな十分な距離を作るように導入され得て、したがって、試薬に対する、リガンドの無制限の接近を提供し、ポリマーの表面上のリガンドの凝集も防止する。
【００７６】
生物学的に活性の分子との結合において、リンカーの長さは、リガンドと固体支持体との間の距離を決定する。この長さは、リンカーを介して付着された生物学的分子の機能活性に著しく影響し得ることが示されている。好ましくは、リンカーは、３〜１１個の炭素原子、最も好ましくは、３、４、５、６、７または８個の炭素原子を含む。リンカーは、切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーのいずれかであってよい。用語「切断可能なリンカー」は、リンカーを介してマトリックスに結合されるリガンドの活性に影響を及ぼさない条件下で切断可能なリンカーを意味することを意図する。
【００７７】
場合によりリンカーを介してマトリックスに付着するリガンドは、クロマチンと関連するタンパク質に結合する任意の試薬であってよい。典型的に、リガンドは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、抗体またはそれらのフラグメント（例えばモノクローナル、ポリクローナル、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）である。好ましくは、リガンドは、抗体に結合する試薬、例えば、抗−免疫グロブリン（例えば抗−ＩｇＧ）抗体、プロテインＡまたはプロテインＧを含む。あるいは、リガンドは、目的のタンパク質に結合する抗体を含んでよく、例えば、リガンドは、抗−ヒストン抗体であってよい。
【００７８】
一実施態様では、リガンドは、プロテインＡである。プロテインＡは、元は細菌黄色ブドウ球菌の細胞壁に見いだされた、４２ｋＤａの表面タンパク質である。それはｓｐａ遺伝子によりコードされ、その調整は、ＤＮＡトポロジー、細胞のモル浸透圧濃度、および、ＡｒｌＳ−ＡｒｌＲと呼ばれる二成分系により制御される。プロテインＡ、および、免疫グロブリンに結合するその能力は、当業者によく知られている。
【００７９】
一実施態様では、リガンドは、プロテインＧである。当業者に知られるように、プロテインＧは、プロテインＡと全く同様に、グループＣおよびＧの連鎖球菌性の細菌で発現される免疫グロブリン−結合タンパク質であるが、特異性が異なる。それは、ＦａｂおよびＦｃ領域に対するその結合を通した抗体の精製において適用が見いだされた、６５−ｋＤａ（Ｇ１４８プロテインＧ）および５８ｋＤａ（Ｃ４０プロテインＧ）の細胞表面タンパク質である。
【００８０】
一態様では、本発明は、サンプルからクロマチンを単離する方法に関する。「クロマチンを単離する」とは、典型的に、クロマチンが、例えば、液体サンプルから好適にそれが分離され得るようにマトリックスに結合するようになることを意味する。
【００８１】
クロマチン
クロマチンは、ＤＮＡおよびタンパク質（主にヒストン）の複合体からなり、真核生物細胞に見られる染色体を構成する。クロマチンは、２つの状態、ユークロマチンおよびヘテロクロマチンで生じ、異なる染色特性を有し、細胞分裂中にらせん状に巻いて折り畳まれて、中期染色体を形成する。クロマチンは、本明細書において、核酸（典型的にＤＮＡ）および関係があるタンパク質の任意のそのような複合体を指すために用いられ、染色体の断片化により生じるクロマチンフラグメントまたは他のクロマチン調製物を含む。
【００８２】
クロマチン免疫沈降
典型的に、当該方法は、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイの一部として行なわれる。用語「クロマチン免疫沈降アッセイ」は、当業者によく知られていて、好ましくは、少なくとも以下のステップを含む：
（ｉ）細胞からの、分析すべきクロマチンを含む液体サンプルの調製；
（ｉｉ）抗体を用いた、マトリックス上への、液体サンプル中のクロマチンの免疫沈降；
（ｉｉｉ）沈降したクロマチンからのＤＮＡ回収；
（ｉｖ）ＤＮＡ分析。
【００８３】
ＣｈＩＰアッセイは、上述のＮＣｈＩＰまたはＸＣｈＩＰであってよい。
【００８４】
サンプル
液体サンプルは、細胞を含む任意の調製物のような、分析物（典型的にはクロマチン）を含む任意の生物学的ソースから調製され得る。細胞は、組織サンプルから、または培養で増殖した細胞から得てよい。好ましくは、細胞は、哺乳類の細胞、好ましくはヒトまたはマウス細胞を含む。
【００８５】
典型的に、当該方法は、１０３〜１０９の細胞、例えば好ましくは１０７未満の細胞、１０６未満の細胞または１０５未満の細胞、好ましくは約１０４〜１０６の細胞由来のクロマチンを含むサンプルに対して行なわれ得る。１つの細胞は、典型的に、細胞あたり約６ｐｇ（６×１０−１２ｇ）のＤＮＡ、および、クロマチン中に同等量のＤＮＡおよびタンパク質を含む。一実施態様では、当該方法は、１００μｇ未満、例えば５０μｇ未満、例えば２０μｇ未満、例えば１０μｇ未満、例えば５μｇ未満、例えば２μｇ未満、例えば１μｇ未満、例えば５００ｎｇ未満、例えば２００ｎｇ未満、例えば１００ｎｇ未満、例えば５ｎｇ未満、例えば２０ｎｇ未満、例えば１０ｎｇ未満のクロマチンを含むサンプルに対して行なわれ得る。したがって、当該方法は、例えば、約０．６μｇのＤＮＡ、または１．２μｇのクロマチン（これは、約１００，０００細胞中のＤＮＡまたはクロマチンの質量と等しい）を含むサンプルに対して、行なわれ得る。
【００８６】
クロマチン調製物
本発明の実施態様では、細胞を含む調製物が、クロマチン免疫沈降アッセイ（ＣｈＩＰ）に供される。典型的に、クロマチンは、調製物から最初に抽出されて、クロマチンフラグメントを含む液体サンプルが調製される。
【００８７】
一実施態様では、細胞は、標準的な技術を用いて調製物から最初に回収されて、そこから核を得てよい。例えば、細胞は、（例えば、細胞溶解バッファーまたは超音波処理を用いて）粉砕され得て、核がそこから放出される。核の放出の後に、当該方法は、好ましくは、例えば小球菌のヌクレアーゼまたはさらなる超音波処理を用いて、クロマチンを放出するために核を消化するステップを含む。
【００８８】
別の実施態様では、当該方法は、クロマチンを架橋するステップを含んでよい。このことは、例えば、ホルムアルデヒドのような適切な架橋剤を、好ましくはクロマチンの断片化の前に添加することにより、任意の適切な手段に関して達成され得る。断片化は、超音波処理によって行われ得る。しかしながら、ホルムアルデヒドを断片化の後に添加してよく、それから、ヌクレアーゼ消化を続ける。
【００８９】
一実施態様では、細胞または組織フラグメントは、ホルムアルデヒドで最初に固定されて、タンパク質−ＤＮＡ複合体を架橋する。細胞は、室温または３７℃で、５〜２０分、好ましくは１０分間、穏やかに振動させて、ホルムアルデヒドとともにインキュベートすることができる。組織フラグメントは、ホルムアルデヒドとの、より長いインキュベーション時間、例えば１０〜３０分、例えば１５分を必要とし得る。ホルムアルデヒドの濃度は、０．５〜１０％、例えば１％（ｖ／ｖ）であり得る。
【００９０】
架橋反応が完了した時点で、架橋剤の阻害剤、例えば、架橋剤と等しいモル濃度のグリシンを用いて、架橋反応を止めることができる。架橋反応を止めるのに適切な時間は、室温で、２〜１０分、好ましくは約５分の範囲であり得る。それから細胞を集めて、ナトリウム塩、ＥＤＴＡ、およびＳＤＳのような洗浄剤を含む溶解バッファーで溶解することができる。組織フラグメントは、溶解前にホモジナイズされ得る。
【００９１】
細胞またはホモジナイズされた組織混合物は、それから、機械的または酵素的にせん断して、適切な長さのＤＮＡフラグメントを生じることができる。通常、２００〜１０００塩基対のせん断されたクロマチンまたはＤＮＡが、ＣｈＩＰアッセイに必要とされる。ＤＮＡの機械的せん断は、噴霧または超音波処理、好ましくは超音波処理によって行なうことができる。ＤＮＡの酵素的せん断は、Ｍｎ塩の存在下でＤＮＡｓｅＩを用いることにより、または、Ｍｇ塩の存在下で小球菌のヌクレアーゼを用いることにより行なうことができ、ランダムＤＮＡフラグメントを生じる。架橋したＤＮＡのせん断の条件は、細胞、およびソニケーター機器または消化酵素濃度に基づいて最適化することができる。
【００９２】
一実施態様では、ＤＮＡのせん断が完了した時点で、細胞デブリを遠心分離により取り除くことができ、ＤＮＡ−タンパク質複合体を含む上清が回収される。結果物は、タンパク質がＤＮＡ上に固定化されているクロマチンフラグメントを含む液体サンプルであり（例えば、ＤＮＡおよびタンパク質は架橋されている）、当該方法で使用することができる。代替の実施態様では、遠心分離ステップを省いてよく、すなわち、以下のステップは、ＤＮＡせん断の直後に行なわれる。
【００９３】
免疫沈降
タンパク質がクロマチン上に固定化された時点で、タンパク質−ＤＮＡ複合体は、それから、免疫沈降され得る。それ故に、クロマチンを含むサンプルが調製された時点で、当該方法は、好ましくは、クロマチンを免疫沈降するステップを含む。好ましくは、免疫沈降は、クロマチン中に存在し得る目的のタンパク質に対する適切な抗体の添加により行なわれる。
【００９４】
一実施態様では、抗体は、剛性の多孔質性マトリックス上に固定化されてよく、すなわち、抗体は、クロマチンと関連するタンパク質に結合するリガンドである。この実施態様では、クロマチンと関連するタンパク質は目的のタンパク質であり、例えば、クロマチン中のＤＮＡに結合している。
【００９５】
代替の実施態様では、溶液中でフリーの抗体がクロマチン−含有サンプルに最初にアプライされる。それから、抗体−結合クロマチンフラグメントは、抗体に結合する薬剤を用いて単離され得て、その薬剤は、剛性の多孔質性マトリックスに結合される。この実施態様では、剛性の多孔質性マトリックスに結合されるリガンドは、抗体に結合する任意の薬剤、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、または、抗−免疫グロブリン（例えば抗−ＩｇＧ）抗体であってよい。クロマチンと関連するタンパク質は、目的のタンパク質に特異的な抗体である。
【００９６】
抗体は、クロマチンと関連する任意のタンパク質に結合し得る。一実施態様では、抗体は、転写因子などの非ヒストンタンパク質、または他のＤＮＡ−結合タンパク質に免疫特異性である。あるいは、抗体は、ヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４およびそれらの様々な翻訳後修飾アイソフォームおよび変異体のいずれかに免疫特異性であってよい。あるいは、抗体は、クロマチンの修飾に関与する酵素、例えばヒストンアセチラーゼまたはデアセチラーゼ、またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼに免疫特異性であってよい。さらに、ヒストンは、所定の酵素によって、例えば、所定のアミノ酸残基のアセチル化、メチル化、リン酸化、ＡＤＰ−リボシル化、ＳＵＭＯ化およびユビキチン化によって、翻訳後にインビボで修飾され得ることが理解されよう。それ故に、抗体は、これらの翻訳後修飾のいずれかに免疫特異性であってよい。
【００９７】
使用方法
また、本発明は、剛性の多孔質性マトリックス上に、分析物（典型的にはクロマチン）を結合させるための本発明の器具の使用にも関する。クロマチンは、それから、後に続く分析のために、剛性の多孔質性マトリックスから溶出することができる。
【００９８】
したがって、本発明は、液体サンプルからクロマチンを単離する方法も含み、クロマチンがピペットチップ内の剛性の多孔質性マトリックス上に保持されるように、本発明に係るピペットチップを通して液体サンプルを通過させるステップを含む。当該方法は、ピペットチップを通して通過するときにクロマチンを液体サンプルから分離させる。
【００９９】
本発明によれば、液体は、両方向にチップを通って通過することが可能であり；典型的に、減圧の適用は、剛性の多孔質性マトリックスを通して一方向に液体サンプルを通過させて、上昇した圧力の適用は、剛性の多孔質性マトリックスを通して反対方向に液体サンプルを通過させる。したがって、クロマチンは、ピペットチップを通って両方向に通過するときに液体サンプルから分離され得る。
【０１００】
本発明の方法の一実施態様では、液体サンプルは、剛性の多孔質性マトリックスを通して１サイクル受けて、すなわち、液体サンプルは、減圧の適用によってピペットチップの下端を通って一回吸引されて、上昇した圧力の適用によってピペットチップの下端の外に一回排出される。本発明の方法によれば、液体サンプルは、剛性の多孔質性マトリックスを通して多数のサイクル受けることが好ましく、すなわち、液体サンプルは、減圧の適用によってピペットシップの下端を通して複数回吸引されて、上昇した圧力の適用によってピペットチップの下端の外に複数回排出されることが好ましい。従来技術の方法と対照的に、剛性の多孔質性マトリックスを通した多数サイクルの液体サンプルは、剛性の多孔質性マトリックス上に固定化されたリガンドに対する多数の結合機会を提供し、それにより、より大量のクロマチンが剛性の多孔質性マトリックス上にロードされるのを可能にする。このようにして、剛性の多孔質性マトリックスの細孔容積の何倍もの希釈クロマチン溶液は、剛性の多孔質性マトリックスを前後に横切って吸引させることにより、溶液からのクロマチンの吸着を最大限にさせ得る。
【０１０１】
この方法は、より少量の溶離液で剛性の多孔質性マトリックスからクロマチンが溶出され得て、それにより、より濃縮されたクロマチン溶液を器具から溶出するのを可能にするという点で、さらに利点を提供する。このようにして、剛性の多孔質性マトリックスの細孔容積と容量が同じ溶出バッファーを、剛性の多孔質性マトリックスの中に引き上げることができ、その結果、そこから分配して溶出バッファー中のクロマチンの濃度を最大限にする。
【０１０２】
試薬およびバッファーが剛性の多孔質性マトリックスを通って複数回前後に吸引されるのを可能にするので、免疫沈降プロセスの感度および有効性を改善する。
【０１０３】
一実施態様では、液体サンプルは、空気が剛性の多孔質性マトリックスに入らない様式で、ピペットチップの下端を通して吸引される。一実施態様では、液体サンプルは、空気が剛性の多孔質性マトリックスに入らないような速度で、ピペットチップの下端を通して吸引される。一実施態様では、ピペットチップの下端を通した液体サンプルの吸引は、空気が剛性の多孔質性マトリックスに入らない回数で終わる。
【０１０４】
ピペットチップを用いること、および、空気がフリットに入らないようにして前後に吸引することは、気泡の問題を取り除き、したがって、遠心分離を用いずにプロセスが行なわれるのを可能にする。このことは、自動化ハイスループットプロセスのための本発明の有用性をかなり改善する。
【０１０５】
圧力を増減させる任意の適切な手段が、マトリックスを通した液体サンプルの通過に用いられ得る。好ましくは、液体サンプルは、部分的真空または減圧によって、マトリックスを通して吸入され得る。その結果、液体サンプルは、上昇した圧力下でマトリックスから排出され得る。本発明の方法が実施され得る圧力に対して特定の制限はない。しかしながら、駆動力（排出ステップのための上昇した圧力または吸入ステップのための減圧）は、空気が剛性の多孔質性マトリックスを通って押し進められ得る前に、取り除かれることが好ましい。使い捨てチップを用いた大部分の一般的な実験ピペットにおいて用いられるピストン作動型空気置換システムは、この方法に関してうまく作用する。しかしながら、使い捨てチップは、プランジャーを備え、プランジャーが液体を直接移すマイクロシリンジとしてデバイスを操作することを本質的に可能にして、それにより、剛性の多孔質性マトリックスに空気が入らずにデバイスを使用する潜在性を提供するので、容積式ピペットは、この方法に関してさらにいっそううまく作用し得る。
【０１０６】
一部の実施態様では、液体サンプルは、適切な期間、例えば、サンプルをカラムに添加した後、および、サンプルをカラムから吸引する前に、マトリックスとともにインキュベートされる。本発明によれば、リガンドは、ＷＯ２０１２／０７６８８２に概して記載されるプロセスよりもずっと短い期間、液体サンプルがマトリックスとともにインキュベートされた後に、クロマチンに結合することができる。これは、ＷＯ２０１２／０７６８８２に記載の方法では、インキュベーションは静的であり；サンプルの液体は、剛性の多孔質性マトリックスのポア構造内に、または、拡散が分析物（特にクロマチン）を剛性の多孔質性マトリックス中に動かすのを可能にするのに十分にその近くに、留まるからである。対照的に、本発明において好ましい方法では、サンプルの液体は、剛性の多孔質性マトリックスを通して前後に継続的に吸引される点において、インキュベーションは動的であり：ＷＯ２０１２／０７６８８２に記載の方法と比較してインキュベーション時間を著しく減少させるのは、この動的インキュベーションである。インキュベーション時間の例は、１秒〜１時間の範囲、例えば、２秒〜２０分、５秒〜１０分、１０秒から５分、または２０秒〜２分または約１分である。このインキュベーションの長さは、この反応のカイネティクスに応じて、リガンドがクロマチンに結合するのに十分な時間を可能にするために変化し得る。
【０１０７】
液体サンプルの容量は、カラム内のチャンバーの容量およびマトリックス（例えばフリット）の寸法に応じて変化し得る。マトリックスは多孔質性であり、典型的には約０．５の多孔性であり得て、すなわちマトリックスの全容量の約５０％が内部空隙スペースである。
【０１０８】
クロマチンがマトリックス上に保持されるようにして剛性の多孔質性マトリックスを通して液体サンプルが通過した後、クロマチンは、任意の適切な手段によってマトリックスから取り除かれ得る。一実施態様では、クロマチンは、溶出によってマトリックスから取り除かれ得る。マトリックスからクロマチンを溶出する適切な溶媒は、当業者によく知られている。
【０１０９】
洗浄
マトリックスを通して液体サンプルを通過させた後、一実施態様では、カラムを洗浄してマトリックスに対する非特異的な結合を減らす。典型的に、洗浄溶液をカラムに加えて、マトリックスを通して洗浄溶液を通過させることにより、１または複数の洗浄ステップが用いられ得る。
【０１１０】
例えば、マトリックスは、高ストリンジェンシーバッファーを用いて洗浄して、非共有の相互作用を除去し得る。高ストリンジェンシーバッファーは、例えば、２０〜５０ｍＭ  ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１〜５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．１〜０．５％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５〜１Ｍ  ＮａＣｌ、および、０．５〜１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含んでよい。あるいは、洗浄バッファーは、０．５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０；Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標））を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム、および、Ｔｗｅｅｎ−２０または２−（４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシ）エタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標））のような洗浄剤を含んでよい。典型的に、洗浄ステップは、様々なストリンジェンシーを有する一連のバッファー、例えば、相対的に低い塩濃度を含む低ストリンジェンシーバッファー、および、より高い塩濃度を有する高ストリンジェンシーバッファーを含んでよい。
【０１１１】
好ましくは、洗浄バッファーは、少なくとも０．１％  ＳＤＳ、より好ましくは約０．２％  ＳＤＳを含む。一実施態様では、当該方法は、１、２または３回の洗浄ステップ、好ましくは３回の洗浄ステップを含む。好ましくは、洗浄バッファーはＮａＣｌを含み、ＬｉＣｌがより少ないことが好ましい。
【０１１２】
架橋の反転
サンプルが架橋したＤＮＡ−タンパク質複合体を含んだ実施態様では、架橋は、洗浄後に反転することができる。架橋反転のためのバッファーを最適化して、架橋の反転を最大限にして、化学的、生化学的および熱力学作用から生じるＤＮＡ分解を最小限にすることができる。
【０１１３】
例えば、一実施態様では、架橋の反転のためのバッファーは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＳＤＳ、およびプロテイナーゼＫを含み、ＤＮＡと複合化したタンパク質を効率的に分解し、ＤＮＡｓｅ  ＩなどのヌクレアーゼによるＤＮＡの分解を防ぐ。また、高濃度のナトリウムおよびカリウム塩、例えば、１Ｍの塩化ナトリウムまたは０．５Ｍの塩化カリウムを含む、さらなるバッファーを用いてもよい。そのようなバッファーは、化学的および熱力学作用からのＤＮＡ分解を効率的に減少させて（Ｍａｒｇｕｅｔ，Ｅ．Ｆｏｒｔｕｒｒｅ，Ｐ，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ，２：１１５−１２２，１９９８）、ホルムアルデヒド架橋の反転速度を増大させることが示されている。典型的に、架橋の反転は、上昇した温度、例えば５０〜８５℃で５分〜４時間、好ましくは、６５〜７５℃で０．５〜１．５時間で生じる。
【０１１４】
好ましくは、マトリックスに結合したクロマチンは、架橋の反転前に、ピペットチップから最初に溶出される。本発明の一部の実施態様では、架橋の反転ステップは、ピペットチップ内で生じ得る。あるいは、剛性の多孔質性マトリックス（例えば、フィルターまたはフリットの形態）は、架橋の反転が異なる容器内で生じるように、（例えば、洗浄の前または後に）ピペットチップから取り除かれ得る。
【０１１５】
一実施態様では、反転架橋は、陰圧を用いてカラムを通して液体を一方向に吸引して、上昇した圧力を用いて剛性の多孔質性マトリックスを通して液体を逆方向に促して、カラムを通して液体を継続的に前後に吸引することにより、動的インキュベーション法を用いて、カラム上で生じる。理論により拘束されることを望まずに、そのような動的インキュベーション法の使用は、反転架橋のためのインキュベーション時間も減らし得ると考えられる。
【０１１６】
ＤＮＡの捕捉および分析
架橋されたＤＮＡ−タンパク質複合体の反転が完了した時点で、ＤＮＡは捕捉および洗浄され得る。これは、フェノール−クロロホルム抽出の標準的な技術によって、または、さらなる固相（例えば、高濃度の非カオトロピック塩の存在下での、シリカまたはニトロセルロース）上にＤＮＡを捕捉することによって、達成され得る。
【０１１７】
精製ステップに続いて、それから、単離されたＤＮＡフラグメントが分析され得て、それらの同一性が判定され得る。これは、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって達成される。例えば、分析ステップは、適切なプライマーの使用を含んでよく、それはＰＣＲの間、核酸の長さの増幅をもたらす。用語「ＰＣＲ」は、当業者に一般に知られる技術の全ての変型を含み、対立遺伝子−特異的なＰＣＲ、ダイヤルアウトＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、逆ＰＣＲ、ライゲーション仲介ＰＣＲ、メチル化−特異的ＰＣＲ、ミニプライマーＰＣＲ、多重ＰＣＲ、ナノＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ、固相ＰＣＲ、およびタッチダウンＰＣＲを含む。当業者は、特異的なＰＣＲプライマーが調製され得る遺伝子またはゲノムの任意の領域を検出するためにその方法が用いられ得ることを理解する。ＰＣＲの結果は、例えば、電気泳動ゲル上に見られ得る。ｑＰＣＲは、存在するＤＮＡの定量分析を提供して、この方法のためのＰＣＲの好ましい形態である。用いることのできる他の技術は、ＤＮＡフラグメントのダイレクトシーケンシングまたはマイクロアレイハイブリダイゼーションである。
【０１１８】
適用
当該方法は、ＣｈＩＰ分析が現在のところ用いられる任意のものを含む、多くの適用を有し得て、多種多様の生物学的サンプルタイプに適用され得る。例えば、当該方法は、ＤＮＡ／タンパク質相互作用を特徴付けるための様々な研究用途で用いられ得る。変動、例えばヒストンタンパク質修飾、非ヒストンタンパク質修飾、および／または、ＤＮＡメチル化は、遺伝子発現の重要なレギュレーターであり、それらの変更は、変更された細胞機能または機能障害、したがって疾患と関連する。ＣｈＩＰアッセイを用いて、そのようなエピジェネティックマーカーにおける変動を調べることができるので、当該方法は、診断および予後適用において、適切な治療レジメンに対するガイドとして用いられ得る。
【０１１９】
したがって、一態様では、当該方法は、疾患状態の診断または予後に用いられ得る。当該方法は、例えば、前立腺、子宮頸癌、またはホジキンリンパ腫などの癌、および、関節リウマチなどの自己免疫疾患の、診断または予後において用いられ得る。好ましくは、診断方法は、インビトロで行なわれる。
【０１２０】
一実施態様では、当該方法は、第一および第二のサンプルを取るステップ、および、各サンプルについて当該方法に従ってＣｈＩＰアッセイを行なうステップを含んでよい。例えば、第一のサンプルは、正常（コントロール）細胞を含んでよく、第二のサンプルは、病的である疑いのある細胞を含んでよい。そのような分析の結果を比較することにより、当該方法を用いて、サンプルを病的または非病的として分類することができる。
【０１２１】
キット
当該方法で用いるための構成要素は、場合により、当該方法を行なうための説明書とともにパッケージされた、キットの形態で提供され得る。そのようなキットは、例えば、上述の分離カラム、および場合により、クロマチン免疫沈降アッセイを行なうための１または複数のさらなる試薬を含んでよい。キットに含まれる典型的な試薬は、液体サンプルを調製するため、クロマチンを架橋するため、マトリックスを洗浄するため、架橋の反転のため、および／または、ＤＮＡ精製のための、１または複数のバッファーまたは溶液を含む。
【０１２２】
図１Ａは、従来技術に係るスピンカラム１０を概して示す。カラムは、フリット１２とともに提供されて；液体１４は、フリット内に保持され得て、遠心分離により動かされる１回の下への通過で、それを通って流れることができる。
【０１２３】
図１Ｂは、本発明に係るピペットチップ２０を概して示し；図１Ｃは、拡大図を提供する。チップは、典型的に、フリット２２とともに、その下半分（特にその一番下の４分の１）に提供されて、剛性の多孔質性マトリックスで形成されて、それを通って液体２４ａ、２４ｂが通過し得る。使用において、液体は、フリット内に保持され得て、または、減圧が用いられてチップを通って液体を一方向に吸引することによりフリットを通って通過し；上昇した圧力が用いられてフリットを通して液体を他の方向に排出して、いずれかの方向にそれを通って吸引される。
【０１２４】
ここで本発明は、以下の非限定的な例に関して説明される。
【実施例】
【０１２５】
ポリエチレン焼結されたフリットが、プロテインＡまたはプロテインＧのいずれかにより化学的酸化および官能化されている、ＷＯ２０１２／０７６８８２に概して記載されるＣｈＩＰアッセイに、スピンカラムフォーマットを利用した。そのカラムで用いたフリットサイズは、およそ７．４ｍｍの直径および２ｍｍの厚さである。これらのフリットの細孔容積は、およそ４０μｌである。
【０１２６】
その後の実験において、ピペットチップまたは改変スピンカラム内の官能化されたフリットを用いて、ＣｈＩＰアッセイ（ピペットを用いてフリットを通って液体を上下に押し進める）を行なった：結果を、ＷＯ２０１２／０７６８８２に概して記載されるＣｈＩＰアッセイ（遠心分離機を用いて、フリットを通して液体を下に押し進める）と比較した。また、比較のために、（ＵＳ２００８／０１１９６３７に概して記載されるデザインの）ピペットチップ内でフォーマットされた産物も、同様のＣｈＩＰアッセイにおいて用いた。
【０１２７】
材料
Ｃｈｒｏｍａｔｒａｐ（登録商標）ＣｈＩＰキット−ＣＨＩＰ１００１００−Ｐｏｒｖａｉｒ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄから入手可能
Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏから入手可能なＲａｉｎｉｎ  ２００μｌピペッター
Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏから入手可能なＲａｉｎｉｎ  １０００μｌピペッター
Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏから入手可能なＰｕｒｅｓｐｅｅｄチップのための、Ｒａｉｎｉｎ  １０００μｌピペッター
微量遠心機−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｃｃｕｓｐｉｎ  ｍｉｃｒｏ  １７Ｒ
ｑＰＣＲ機−ＢＩＯＲＡＤ  ＣＦＸ  Ｃｏｎｎｅｃｔ
ＨｅｐＧ２クロマチン（活性モチーフ、５３０１９）
Ｈ３抗体（活性モチーフ、６１２７７）
ネガティブ抗体−ウサギＩｇＧ、Ｓｉｇｍａ  Ｉ５００６
ＧＡＰＤＨプライマー（ヒトプロモーター領域）−Ｓｉｇｍａ
Ｐｕｒｅｓｐｅｅｄ  Ｐｒｏ  Ａチップ、Ｒａｉｎｉｎ  ＰＴ−１０−Ａ２０
Ｐｕｒｅｓｐｅｅｄ  ＩＰ希釈溶液：１６．７ｍＭ  ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１．１％  ２−（４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシ）エタノール（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）、１．２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１６７ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）
Ｐｕｒｅｓｐｅｅｄ平衡バッファー（４４．４ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０４％  ＳＤＳ、０．７３％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１１１ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）
Ｐｕｒｅｓｐｅｅｄ洗浄バッファー１（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１ｍＭ  ＰＭＳＦ）
Ｐｕｒｅｓｐｅｅｄ洗浄バッファー２（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５００ｍＭ  ＬｉＣｌ、１％  ＮＰ４０、１％デオキシコール酸ナトリウムおよび１ｍＭ  ＰＭＳＦ）
Ｐｕｒｅｓｐｅｅｄ溶出バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３および１％  ＳＤＳ）
【０１２８】
方法
コンパレータ―ＣｈＩＰアッセイは、スピンカラムフォーマットを利用する、ＷＯ２０１２／０７６８８２に概して記載されるキットを用いて行ない、このキットによるプロトコルに従った。
【０１２９】
本発明に係るＣｈＩＰアッセイは、２００μｌピペットチップ内に挿入された小さなプロテインＡフリット（３．５ｍｍ直径×２ｍｍ厚さ）、または、改変スピンカラム内に挿入されたプロテインＡフリット（７．４ｍｍ直径×２ｍｍ厚さ）を用いて行なった。フリットがピペットチップの末端にできるだけ近くなるように、チップの末端を切断した。液体を、ピペットチップ内をゆっくり上下に吸引して（手動操作）、フリットに空気が入らないことを確認した（１サイクル）。プロトコルの各段階は、ウェル内の新鮮な溶液に関連し、用いた溶液およびサイクル数は以下のとおりであった：
【０１３０】
２００μｌピペットチップ：
１．１５０μｌ蒸留水×３サイクル
２．１５０μｌカラム調整バッファー×３サイクル
３．１５０μｌカラム調整バッファー×３サイクル
４．１５０μｌ水×３サイクル
５．１５０μｌ水×３サイクル
６．１００μｌ溶解物×２０サイクル
７．１５０μｌ洗浄バッファー１×５サイクル
８．１５０μｌ洗浄バッファー２×５サイクル
９．１５０μｌ洗浄バッファー３×５サイクル
１０．１５０μｌ水×６サイクル
１１．１５０μｌ水×６サイクル
１２．１００μｌ溶出バッファー×２０サイクル、それから、気泡がピペットチップで形成されるまで、エッペンドルフ中に戻して液体を排出する。
【０１３１】
改変スピンカラム
１．３００μｌ蒸留水×３サイクル
２．３００μｌカラム調整バッファー×３サイクル
３．３００μｌカラム調整バッファー×３サイクル
４．３００μｌ水×３サイクル
５．３００μｌ水×３サイクル
６．１００μｌ溶解物×２０サイクル
７．３００μｌ洗浄バッファー１×５サイクル
８．３００μｌ洗浄バッファー２×５サイクル
９．３００μｌ洗浄バッファー３×５サイクル
１０．３００μｌ水×６サイクル
１１．３００μｌ水×６サイクル
１２．１００μｌ溶出バッファー×２０サイクル、それから、気泡がピペットチップで形成されるまで、エッペンドルフ中に戻して液体を排出する。
【０１３２】
抗体：各実験におけるクロマチン比は２：１であった。ＷＯ２０１２／０７６８８２に概して記載されるプロトコルに従って、溶出溶液を反転架橋に供した。全てのサンプルを反転架橋して、ＧＡＰＤＨプライマーを用いてｑＰＣＲにより分析した。
【０１３３】
結果
ピペッティング段階は、完了するのにおよそ８〜１０分かかった。このプロセスの短い期間に起因して、フリットを用いた、クロマチン／抗体混合物を含む溶解物の、ＷＯ２０１２／０７６８８２に概して記載されるプロセスよりも少ないインキュベーション時間が存在し：遠心分離を必要とするＷＯ２０１２／０７６８８２に概して記載されるプロセスでの１時間と比較して、ピペットチップ法のためのフリットと接触する溶解物では１分未満である。
【０１３４】
実験１（２００μｌピペットチップ、３．５ｍｍ直径フリット）
本発明の方法に係る、５００ｎｇクロマチン／１０００ｎｇ抗体。結果を図２に示す。３回の合理的なレプリケートは、良好な％Ａｂシグナルを達成した。Ｒ２のバックグラウンドはわずかにより高くて、より低い免疫沈降（％）をもたらした。
【０１３５】
実験２（２００μｌピペットチップ、３．５ｍｍ直径フリット）
クロマチンの希釈系列、５００ｎｇ、２５０ｎｇ、１２５ｎｇ、６２．５ｎｇ（抗体ローディングはそれぞれ１０００ｎｇ、５００ｎｇ、２５０ｎｇ、１２５ｎｇ）を、本発明の方法に従って処理した。結果を図３に示す。良好なＣｈＩＰの結果が得られた：２５０ｎｇクロマチンのみが、わずかにより高いバックグラウンドを有し、免疫沈降（％）の結果を低くした。
【０１３６】
実験３
実験は、７．４ｍｍ直径フリットを備える改変スピンカラム（上述）内で行なった。改変された「チップ」内であるが、これは、ＷＯ２０１２／０７６８８２に概して記載される方法において用いられるフリットのサイズおよびタイプにできる限り近く再現するために行なった。それは、１０００ｎｇクロマチンおよび２０００ｎｇ抗体を用いて行なった。また、比較として、遠心分離機を用いたＷＯ２０１２／０７６８８２に概して記載される方法で用いられる標準的なスピンカラムにおいても、同一のアッセイを行なった。
【０１３７】
結果を図４に示す。見ることができるように、ピペッターを用いた、改変スピンカラム内での７．４ｍｍチップの処理は、スピンカラムにおける標準的な遠心分離機方法よりも良好な結果を与えた。
【０１３８】
実験４：Ｐｕｒｅｓｐｅｅｄ  Ｐｒｏ  Ａチップ
Ｐｕｒｅｓｐｅｅｄ  Ｐｒｏ  Ａチップ（ＵＳ２００８／０１１９６３７に記載の全般的なデザイン）を、ピペッターおよび１０００ｎｇのクロマチンおよび２０００ｎｇの抗体を含むＰｕｒｅｓｐｅｅｄバッファー内で、プログラムされた方法を用いて、Ｒａｉｎｉｎプロトコルに従って実行した。これは、ＷＯ２０１２／０７６８８２に概して記載される方法および本発明の方法に対する比較をするために行なった。
【０１３９】
ポジティブまたはネガティブ抗体のいずれかに関するｑＰＣＲ段階において、ＤＮＡの複製は生じなかった。
【０１４０】
結果は、本発明の方法は、免疫沈降段階において、標準的なＣｈＩＰ方法よりもいっそう短いプロトコルを有し、それでもなお、さまざまなクロマチン添加において良好なＣｈＩＰの結果を与えることを示す。本発明の方法における、官能化されたフリットと溶解物の、よりいっそう短い接触時間は、プロテインＡフリットに対するクロマチン／抗体の結合効率に負の影響を与えず、驚くべきことに、標準的な方法よりも良好な結果を与える。これは、ＢｉｏＶｙｏｎ上のリガンドとクロマチン／抗体の、より密接な接触が達成されることに起因し得る。加えて、本発明の方法において生じる、フリットを何度も通る液体の動きは、液体が移動するときにフリットの内表面で利用可能なクロマチン／抗体を補充することにより、結合を強め得ると考えられる。ＷＯ２０１２／０７６８８２に概して記載される標準的な方法では、溶解物がフリットに添加されて細孔容積を満たすだけであり、拡散のみに頼って必要な接触を与える。標準的な方法と直接比較すると（同一のバッチおよびサイズのフリットを用いる）、結果は、よりいっそう短いプロトコルで、より高い％の抗体の結果で改善した：これは驚くべき結果である。競合製品（Ｐｕｒｅｓｐｅｅｄ  Ｐｒｏ  Ａ）は、シグナルを示すことができなかった。
【０１４１】
上記明細書で言及された全ての刊行物は、参照により本明細書中に援用される。本発明の記載された方法およびシステムの様々な改変および変型は、本発明の範囲および主旨を逸脱せずに当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい実施態様に関して記載されているが、特許請求の範囲に記載される本発明は、そのような特定の実施態様に過度に制限されるべきでないことが理解されるべきである。実際に、本発明を実施するための、記載されたモードの、化学、生化学、生物学、材料科学または関連分野における当業者に明らかである様々な改変は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。
【図１】
2018504089.tif 000003
【図２】
2018504089.tif 000004
【図３】
2018504089.tif 000005
【図４】
2018504089.tif 000006
【国際調査報告】
2018504089.tif 000007
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2018504089.tif 000009