(57)【要約】  本発明は、検体検出のための方法およびキットに関する。より正確には、本発明は、アプタマーおよびマイクロＲＮＡなどの短い一本鎖核酸（１０〜１００ｎｔ）を周囲温度で固体支持体上に保存する工程、およびその後の（１または複数の）検体検出のために前記核酸を増幅する工程を含む、検体を検出する方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１または複数の検体を検出する方法であって、低分子量一本鎖核酸（１０〜１００ｎｔ）を固体支持体上に保存する工程、ならびに前記核酸を増幅する工程を含む方法。
【請求項２】
前記低分子量核酸が、特異的ｓｓＤＮＡもしくはｓｓＲＮＡアプタマーまたはアプタマーのライブラリであり、１または複数の検体と、検体検出のための前記増幅されたアプタマーとの結合の工程、または検体検出前のアプタマーの選択の工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固体支持体が、セルロース系紙、人工または天然に存在するポリマー繊維を含む織物または不織の繊維性材料、ガラス繊維材料などの鉱物繊維系材料、または表面処理固体材料、例えば、レーザーエッチング表面を含む、すべてが、主にＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質分子を保持するための十分な粗さの表面粗さを備えた化学的または機械的に処理された材料、またはアルギン酸塩などのゲルを含み、これらすべてが場合により安定化試薬または試薬混合物で化学的に処理されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記試薬または試薬混合物が、弱塩基、抗酸化剤およびキレート剤、ならびに場合によりアニオン性界面活性剤を含むか、またはカオトロピック塩などのカオトロピック物質を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
保存されたアプタマーが提供された固体支持体、またはパンチなどのその一部を切り取り、既に増幅試薬が提供されているか、または提供されるであろう反応ウェルまたはチューブに入れる、請求項１乃至４の１または複数項に記載の方法。
【請求項６】
前記アプタマーを前記固体支持体から抽出し、溶液として前記次の増幅工程に添加する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
保存されたアプタマーを有する前記パンチを反応プレートの反応ウェルに入れ、前記ウェルに増幅試薬を提供し、前記保存したアプタマーを前記反応ウェル内で増幅させる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記増幅試薬が凍結乾燥物質として前記反応ウェルに存在する、請求項５、６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記反応プレートのウェルを一次アプタマーでコーティングし、前記パンチから増幅されたアプタマーを、検体の検出反応において二次アプタマーとして作用させる、請求項５、６、７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記固体支持体がセルロース系紙を含み、アプタマーの増幅がＲＣＡ、Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎによって行われる、請求項１乃至９の１または複数項に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅されたアプタマーに、蛍光色素、触媒アプタマー（リボザイムおよびＤＮＡｚｙｍｅ）などのレポーター分子が提供される、請求項１乃至１０の１または複数項に記載の方法。
【請求項１２】
固体支持体、好ましくはセルロース系紙上に保存されたアプタマーと、増幅試薬を含む反応ウェルを備えた反応プレートとを含むキット。
【請求項１３】
前記反応プレートのウェルが一次アプタマーでコーティングされている、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
低分子量核酸（１０〜１００ｎｔ）、好ましくは特異的アプタマーまたはアプタマーのライブラリを保存するための固体紙支持体の使用。
【請求項１５】
固体支持体に適用されたアプタマーが、ｉ）予めアプタマーについてスクリーニングされた結合親和性より高い結合親和性を有する特異的アプタマーを選択するために、またはｉｉ）特定の検体に対する新しいアプタマーを選択するために使用する、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記アプタマーがＲＮＡアプタマーであり、前記固体支持体が好ましくはＲＳＭである、請求項１４または１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体検出のための方法およびキットに関する。より正確には、本発明は、アプタマーおよびマイクロＲＮＡなどの短い一本鎖核酸（１０〜１００ｎｔ）を周囲温度で固体支持体上に保存する工程、およびその後の検体検出のために前記核酸を増幅する工程を含む、検体を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
保管試料は、検体検出、センシング、法医学および診断用途、ゲノム配列決定、全ゲノム増幅などのさまざまな用途に使用できるので、生体試料の保存および保管が望ましい。
【０００３】
紙基材上に試料を保管するために現在使用されている装置のいくつかが利用可能である。生体試料を保管するために、紙カードまたは膜などの多孔質または非多孔質基材が一般的に使用される。紙カードまたは膜の例としては、核酸試料の保管のための化学的に処理されたＦＴＡ（登録商標）およびＦＴＡ（登録商標）Ｅｌｕｔｅ紙（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ならびに血液試料の保管のためのＦＴＡ（登録商標）ＤＭＰＫカードおよび９０３（登録商標）カード（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が挙げられる。これらの基材は、基材上に配置された血液、口腔スワブまたは浸軟組織などの湿潤生体試料の吸収および乾燥方法に用いられた。
【０００４】
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、環状鋳型を介してｓｓＤＮＡを合成する、ＤＮＡポリメラーゼによって媒介される等温ＤＮＡ増幅法である。これは、超高感度ＤＮＡ検出アッセイにおけるシグナル増幅に使用される。ＲＣＡは、ＤＮＡアプタマーおよびＤＮＡ／ＲＮＡｚｙｍｅｓをコードする配列を増幅するように適合させられている。［Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏ−ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．Ｚｈａｏ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ  ２００８．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４７，６３３０−６３３７．］
アプタマーは、タンパク質、低分子量化合物、代謝産物、化合物などのさまざまな異なる化学的および生化学的部分に結合することができる一本鎖核酸（ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡ）分子である。この結合事象は、アプタマーおよび検体特異的であり、高い親和性で高度に特異的であるように操作することができる。したがって、アプタマーは、モノクローナル抗体と同等の多くの特性を共有しており、現在抗体が伝統的に使用されている多くのプロセスにおいて実行可能な選択肢と考えられている。
【０００５】
アプタマーは、同じ標的分子上の異なるエピトープに結合するように設計することができ、免疫学的ベースのＥＬＩＳＡに匹敵する検出システムの作製を容易にする。検出システムは、増幅したアプタマーに蛍光色素を組み込むことによって、またはアプタマーに基づくＤＮＡｚｙｍｅ（レポーター色素を変換する触媒酵素）およびリボザイムを生成することによって作製されている。異なる検体および重複しない検出試薬に結合するアプタマーの使用は、同じ反応容器中の異なる薬剤を検出するように設計されたマルチプレックスアッセイを支援する。
【０００６】
試験管内進化法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（ＳＥＬＥＸ）は、１または複数の標的リガンドに特異的に結合する一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡいずれかのオリゴヌクレオチドを産生するための、分子生物学におけるコンビナトリアル化学技術である。このプロセスは、プライマーとして機能する、定常５’および３’末端に隣接するランダムに生成された固定長の配列からなる、非常に大きなオリゴヌクレオチドライブラリの合成から始まる。長さｎのランダムに生成された領域について、ライブラリ内の配列候補の数は４ｎ（ｎ個の位置が、各位置において４つの候補（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）を有する）である。ライブラリ中の配列は、標的リガンド（タンパク質または低分子有機化合物であり得る）に暴露され、標的に結合しないリガンドは、通常、アフィニティークロマトグラフィーによって除去される。結合した配列は溶出され、後続の選択ラウンド用の調製のために核酸増幅によって濃縮され、選択ラウンドにおいて溶出条件のストリンジェンシーが高められて最密結合配列が同定される。
【０００７】
しかし、特異的アプタマーおよびアプタマーのライブラリのような短い核酸の使用には安定性の問題があり、ＳＥＬＥＸによる濃縮、選択および検出プロセスの前およびその間に、周囲温度におけるアプタマーの長期安定化を可能にする溶液を有することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１５／０９０８７９号
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ｓｓＤＮＡおよびｓｓＲＮＡアプタマーをコードする１０〜１００ヌクレオチド（ｎｔ）長の短い核酸配列のための、長期周囲温度保存媒体としての固体支持体の使用を提供することによって、アプタマーの安定性の問題を解決する。
【００１０】
支持体は、マトリックス、紙、繊維ウェブ、膜、または泡であってもよい。支持体は、繊維、例えばセルロースまたはガラス繊維、および場合により微粒子フィラー、湿潤強度添加剤または乾燥強度添加剤または保持剤などの他の成分を含むことができる。支持体は、好ましくは、ＦＴＡ（登録商標）またはＲＳＭなどの固体紙支持体である（ＲＮＡ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｘ；Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４；Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｏｌｉｄ  ｍａｔｒｉｘ  ｆｏｒ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｍｂｉｅｎｔ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｆｒｏｍ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ．ＢＭＣ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１４，２２；ｐｐ  １−９）。
【００１１】
第１の態様において、本発明は、１または複数の検体を検出する方法であって、アプタマーおよびマイクロＲＮＡなどの低分子量一本鎖核酸（１０〜１００ｎｔ）を固体支持体上に保存する工程、ならびに前記核酸を増幅する工程を含む方法を提供する。核酸は、核酸を含む溶液を固体支持体上に沈着させ、該支持体上で前記溶液を乾燥させることによって固体支持体上に保存される。
【００１２】
本発明者らは、１０−１００ｎｔなどの低分子量一本鎖核酸が、保存およびその後の増幅反応の間の長期間、周囲温度で固体支持体上で安定化され得ることを発見した。低分子量核酸は、好ましくは特異的ｓｓＤＮＡもしくはｓｓＲＮＡアプタマーまたはアプタマーのライブラリであり、この方法は、１または複数の検体と、検体検出のための前記増幅されたアプタマーとの結合の工程、または検体検出前のアプタマーの選択の工程を含む。
【００１３】
前記固体支持体は、セルロース系紙、人工または天然に存在するポリマー繊維を含む織物または不織の繊維性材料、ガラス繊維材料などの鉱物繊維系材料、または表面処理固体材料、例えば、レーザーエッチング表面を含む、すべてが、主にＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質分子を保持するための十分な粗さの表面粗さを備えた化学的または機械的に処理された材料、またはアルギン酸塩などのゲルを含み、これらすべてが場合により安定化試薬または試薬混合物で化学的に処理されている。好ましい支持体は、セルロース系、ポリマー、繊維およびＲＳＭ、ＦＴＡ（商標）、ＦＴＡ  ｅｌｕｔｅ（商標）などの化学的コート紙、９０３（商標）３１−ＥＴＦセルロース紙などの非コート紙である。試薬または試薬混合物は、弱塩基、抗酸化剤およびキレート剤、ならびに場合によりアニオン性界面活性剤を含むか、またはカオトロピック塩などのカオトロピック物質を含む。例としては、ＳＤＳ、ＥＤＴＡ、酸化防止剤（尿酸、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフェート）、ＴＨＱ（トルヒドロキノン）、塩酸グアニジニン、チオシアン酸グアニジンである。
【００１４】
本方法の一実施形態において、保存されたアプタマーが提供された固体支持体、またはパンチなどのその一部を切り取り、既に増幅試薬が提供されているか、または提供されるであろう反応ウェルまたはチューブに入れる。場合により、切り取られた固体支持体は洗浄することができ、場合によりアプタマーを固体支持体から抽出し、溶液として次の増幅工程に添加する。
【００１５】
さらなる実施形態において、保存されたアプタマーを有する前記部分またはパンチを反応プレートの反応ウェルに入れ、前記ウェルに増幅試薬を提供し、保存したアプタマーを反応ウェル内で増幅させる。場合により、切り取られた固体支持体を洗浄する。
【００１６】
反応プレートのすべてのウェルには、好ましくは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのｒｅａｄｙ  ｔｏ  ｇｏフォーマット（ＲＴＧ）に例示される凍結乾燥フォーマットの増幅試薬が提供され、すべてのウェルにパンチを提供することができ、これらのパンチには同じか、または異なるアプタマーを提供することができる。
【００１７】
さらなる実施形態において、反応プレートのウェルを一次アプタマーでコーティングし、パンチから増幅されたアプタマーを、検体の検出反応において二次アプタマーとして作用させる。この反応において、一次アプタマーは、検体の第１のエピトープまたは結合部位に対して指向され、二次アプタマーは検体の第２のエピトープに対して指向される。この実施形態において、特異的アプタマーは、９６ウェルプレートなどの反応容器の特定の領域に共有結合される。これらの一次アプタマーは、従来の連結試薬、例えば、プロピオン酸Ｎ−スクシミジルを使用して固体支持体に繋がれている。生体試料を適用し、続いて、（上記のように作製された）安定化されたアプタマーを有するパンチを、二次アプタマーの増幅のための増幅試薬を含む反応容器に添加する。これらの繋がれた可溶性アプタマーは、同じ標的分子の異なるエピトープに結合するように設計され、それによって、ＥＬＩＳＡ型反応に類似した、アプタマーに基づく固体支持体系を容易にする。適切な核酸増幅試薬および検出システムは、ＲＴＧ（ｒｅａｄｙ  ｔｏ  ｇｏ）−フォーマットに組み込まれることが好ましい。
【００１８】
本発明で使用される増幅方法は、好ましくはＲＣＡ、ローリングサークル増幅である。これは好ましい増幅反応であるが、ＰＣＲのような他の増幅反応も使用することができる。ＰＣＲ、等温増幅、例えばヘリカーゼ依存性増幅、ＲＮＡ増幅；ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベース増幅−ＲＮＡを増幅するための１ステップ等温プロセス）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ。場合により、増幅はシクロデキストリンの存在下で行うことができる。シクロデキストリンは溶液から遊離ＳＤＳを隔離する。ＳＤＳはタンパク質変性剤であり、存在する場合、下流の酵素ベースの適用、例えばＰＣＲを阻害する。シクロデキストリンはＳＤＳに結合し、したがってそれを効果的に除去する。
【００１９】
検出のために、増幅されたアプタマーには、蛍光色素などのレポーター分子が提供される。アプタマーおよび検体結合アッセイとの適合性を示す任意の比色検出システムを使用することができる。これらは、蛍光色素を増幅アプタマーに組み込むことから、レポーター色素に作用して有色シグナルを生成する触媒酵素を模倣できるアプタマーベースのＤＮＡｚｙｍｅを生成することにまで及ぶ。本発明の方法およびキットは、インピーダンス測定を使用するマイクロ流体またはバイオセンサフォーマットで使用することもできる。
【００２０】
第２の態様において、本発明は、固体紙支持体上に保存されたアプタマーと、増幅試薬を含む反応ウェルを備えた反応プレートとを含むキットに関する。アプタマーを有する固体支持体は、反応プレートへの挿入の準備が整った紙シートまたはそのパンチ／一片として提供することができる。または、パンチは既に反応ウェルに挿入されていてもよい。好ましくは、反応ウェルにはｒｅａｄｙ  ｔｏ  ｇｏ（ＲＴＧ）増幅試薬が提供される。
【００２１】
キットでは、反応プレートのウェルを一次アプタマーでコーティングすることができる。この場合、固体支持体上のアプタマーは、ＥＬＩＳＡ反応の場合と同様に検体の検出のための反応において二次アプタマーとして作用する。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態において、安定化されたアプタマーを直接増幅して、増幅反応に直接添加された保存培地の単一のパンチから大量のアプタマーを生成する。安定化されたアプタマーとＲＣＡまたは他の増幅反応との組み合わせは、プロテオミクス、診断およびバイオセンシングにおいてさまざまな分子標的、例えば、タンパク質、代謝産物の検出のための結合アッセイを生み出す。
【００２３】
第３の態様において、本発明は、低分子量核酸（１０〜１００ｎｔ）、好ましくは特異的アプタマーまたはアプタマーのライブラリを保存するための固体紙支持体の使用に関する。この使用により、周囲温度で長時間アプタマーの簡便な保存が可能になる。固体紙支持体は上記と同じ種類のものであり、溶液中のアプタマーと比較して輸送に特に適している。
【００２４】
固体支持体に適用されたアプタマーは、ｉ）予めアプタマーについてスクリーニングされた結合親和性より高い結合親和性を有する特異的アプタマーを選択するために、またはｉｉ）特定の検体に対する新しいアプタマーを選択するために使用する。ＳＥＬＥＸは、標的分子に対するアプタマーを生成および選択するために使用される。これには、複数ラウンドのスクリーニングとそれに続く増幅が含まれる。固体支持体は、次の増幅および選択ラウンドの前の、核酸分子の簡便な周囲温度保存を可能にするマトリックスを提供する。好ましくはアプタマーはＲＮＡアプタマーであり、固体支持体は好ましくはＲＳＭである。
【００２５】
本発明によって提供される方法およびキットは、固相支持体が、ｉ）周囲温度でアプタマーを保存するが、抗体または他の結合剤が特殊冷蔵を必要とする、ｉｉ）関連する／適切な増幅ＲＴＧ（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｇｏ）試薬と組み合わせて、有意な量の特異的アプタマーを生成するために使用することができる、という点で現在使用されている方法を上回る有意な利点を有する。実施例に記載されるように、生体試料を含むパンチを反応混合物に適用することが、核酸増幅、免疫学的タンパク質結合または検出事象を阻害しないことを実証するデータが生成されている。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】特異的アプタマーの紙支持体上への保存および反応ウェルへの紙円のパンチングから、保存されたアプタマーと反応する特異的検体の増幅までのプロセスの概略図である。
【図２】ＱＲＴＰＣＲを使用したマイクロＲＮＡの発現検出の結果を示す。各バーについて、ｎ＝４であり、エラーバーは標準偏差を表す。
【図３】分析された各ｍｉＲＮＡについてＱＲＴＰＣＲによって決定されたＣｔ値を示す。全ＲＮＡを血液から抽出し、各固体支持体に適用し、３時間乾燥させ、その後Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＲＮＡｓｐｉｎキットを使用して抽出した。逆転写反応あたり０．４５ｎｇの全ＲＮＡを使用してマイクロＲＮＡ発現を検出した。各バーについて、ｎ＝４であり、エラーバーは標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下に発明を実施するための形態を示す。
【実施例１】
【００２８】
化学的にコーティングされたセルロース系固体支持体での低分子ＲＮＡの保存およびそこからの回収
この実施例は、化学的にコーティングされたセルロース系固体支持体マトリックス上にスポットされた生体試料が、ＲＮＡアプタマーおよびマイクロＲＮＡに例示されるような低分子量一本鎖ＲＮＡ分子（約２０ｎｔ長）の単離および精製の前に、周囲条件で保存可能であることを示す。
【００２９】
静脈穿刺によりＥＤＴＡ中に全血を採取してすぐに、４０μｌアリコートをセルロース系固体支持体上にスポットし、乾燥させた。続いて、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＲＮＡｓｐｉｎミニＲＮＡ単離キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＩｌｌｕｓｔｒａ  ＴｒｉｐｌｅＰｒｅｐキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、全ＲＮＡを固体支持体から単離した。低分子量マイクロＲＮＡの存在を、マイクロＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブを用いた２ステップ定量逆転写酵素ＰＣＲ（ＱＲＴＰＣＲ）を使用して検出および定量した。
【００３０】
ｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ製品（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、核酸増幅などの標準的な実験技術、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲなどにおいて堅牢で再現性のある性能を発揮するためのフォーマットで、予め配合され、予め分注された凍結乾燥試薬混合物である。Ｒｅａｄｙ−ｔｏ  Ｇｏフォーマットは、タンパク質、酵素、抗体などを安定化するために配合することもできる。Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＰｕＲｅＴａｑ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲビーズは、標準的なＰＣＲ増幅を行うために最適化された、予め混合され、予め分注された単回用量の反応用ビーズである。組換えＰｕＲｅＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび他の高純度試薬を使用することにより、エンドポイントおよびリアルタイム蛍光ベースのＰＣＲ増幅の両方で信頼性の高い堅牢な性能が保証される。ｐｕＲｅＴａｑ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲ試薬は、反応間の再現性を高め、ピペッティングステップを最小限に抑え、ピペッティングエラーやコンタミネーションの可能性を減らすために予め配合されている。必要な試薬は、水、プライマー、および鋳型ＤＮＡのみである。Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ製品は室温で安定しており、シングルチューブの１ステップ逆転写ＰＣＲを行うために設計されている。それぞれの室温安定性製品には、Ｍ−ＭｕＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、バッファー、ヌクレオチド、およびＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅが含まれている。必要な試薬は水、鋳型ＲＮＡ、プライマーのみである。これらの試薬は、７．５ｋｂ超の完全長ｃＤＮＡの合成およびＰＣＲからの最適感度のために最適化される。
【００３１】
固体支持体マトリックスおよびＩｌｌｕｓｔｒａ  ＲＮＡｓｐｉｎ  ｍｉｎｉ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキットの使用
１．ＥＤＴＡ中に採取した後、４０μｌアリコートの血液を紙系固体支持体マトリックスに適用し、室温で最低３時間乾燥させた。
【００３２】
２．滅菌Ｈａｒｒｉｓの５ｍｍ使い捨てマイクロパンチ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とパンチマットとを使用して、乾燥させた試料スポットの中心からディスクを切り抜き、清潔なＲＮａｓｅ非含有の１．５  ｍｌ微小遠心管に入れた。
【００３３】
３．Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＡ１（３５０μｌ、Ｉｌｌｕｓｔｒａキットから）を各管に添加し、続いて３．５μｌのβ−メルカプトエタノールを添加し、次いで各ディスクを２０ゲージの針を使用して均質化した。
【００３４】
４．ホモジネートを、Ｉｌｌｕｓｔｒａキットにより供給されるフィルターカラムに移し、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＲＮＡｓｐｉｎ  ｍｉｎｉ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔにより供給されたプロトコルに従った。５０μｌのＲＮａｓｅ非含有水中でＲＮＡの溶出を行った。
【００３５】
固体支持体マトリックスおよびＩｌｌｕｓｔｒａ  ＴｒｉｐｌｅＰｒｅｐキットの使用
１．ＥＤＴＡ中に採取した後、４０μｌアリコートの血液をセルロース系固体支持体マトリックス（支持体１はＦＴＡ（登録商標）であり、支持体２はＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ（登録商標）である）に適用し、室温で最低３時間乾燥させた。
【００３６】
２．Ｈａｒｒｉｓの５ｍｍ使い捨てマイクロパンチとパンチマットとを使用して、乾燥させた試料スポットの中心からディスクを切り抜き、清潔なＲＮａｓｅ非含有の１．５ｍｌ微小遠心管に入れた。
【００３７】
３．Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＡ１（３５０μｌ、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＴｒｉｐｌｅＰｒｅｐキットから）を各管に添加し、続いて３．５μｌのβ−メルカプトエタノールを添加し、各ディスクを２０ゲージの針を使用して均質化した。
【００３８】
４．ホモジネートを、ＴｒｉｐｌｅＰｒｅｐキットにより供給されるＤＮＡミニカラムに移した。次いで、これらを１１，０００×ｇで１分間遠心分離した。ＤＮＡカラムを破棄し、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＴｒｉｐｌｅＰｒｅｐ  キットに記載されたプロトコルに従った。５０μｌのＲＮａｓｅ非含有水中でＲＮＡの溶出を行った。
【００３９】
Ｔｒｉｚｏｌを使用した全血からの全ＲＮＡの単離
１．ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（１ｍｌ）を、１．５ｍｌの微量遠心管内の５００μｌの全血に添加し、短時間ボルテックスした。
【００４０】
２．均質化した試料を３０℃で５分間インキュベートした。
【００４１】
３．クロロホルム（０．２ｍｌ／Ｔｒｉｚｏｌ  １ｍｌ）を添加した。試料の管をしっかり閉め、手で１５秒間激しく振盪した後、３０℃で２〜３分間インキュベートした。
【００４２】
４．試料を１２，０００×ｇで１５分間、８℃において遠心分離した。注：遠心分離後、混合物は、下相の赤色のフェノール−クロロホルム相、中間相および無色のＲＮＡ含有上部水相に分離する。
【００４３】
５．水相を新しい１．５ｍｌ管に移した。最初の均質化に使用したＴｒｉｚｏｌ  １ｍｌあたり０．５ｍｌのイソプロピルアルコールと混合し、その後試料を３０℃で１０分間インキュベートすることによって、ＲＮＡを水相から沈殿させた。沈殿したＲＮＡを、１２，０００×ｇで１０分間、８℃において遠心分離することによりペレット化した。
【００４４】
６．上清を除去し、ＲＮＡペレットを１ｍｌの７５％エタノールと一緒にボルテックスすることによって１回洗浄し、次に７，５００×ｇで５分間、２〜８℃において遠心分離した。
【００４５】
７．ペレットを風乾し、次いで５０μｌのＲＮａｓｅ非含有水に再懸濁した。セルロース系固体支持体マトリックスに保存された血液との比較のために、Ｔｒｉｚｏｌ抽出のための血液のアリコートを４℃で保存し、次いで室温で１時間揺動し、１日または２日後に単離した。
【００４６】
ｍｉＲＮＡ分析−Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＲＮＡｓｐｉｎキット、ＴｒｉｐｌｅＰｒｅｐキット、またはトリアゾール抽出物を使用して溶出した試料を、ｍｉＲＮＡ分析前に全ＲＮＡ含量について分析した。後続のマイクロＲＮＡ定量化反応に使用される鋳型ＲＮＡの量を正規化できるように、溶出された全ＲＮＡの定量を、７９００ＨＴサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＱＲＴＰＣＲにより行った。ＴａｑＭａｎ  ＥＺ−ＲＴ  ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＧＡＰＤＨコントロール試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して反応をセットアップした。ＲＮＡ定量のための標準曲線を、キットにより供給される対照ＲＮＡの５ｎｇ／μｌから０．５ｐｇ／μｌまでの５点連続希釈を使用して調製した。ＲＮＡ分析のためのＴａｑＭａｎ  ＥＺ−ＲＴ  ＰＣＲキットに含まれるプライマーは、ｃＤＮＡのみが増幅可能であることを確保するために、イントロンをまたぐように設計されている。
【００４７】
溶出液中のマイクロＲＮＡの存在は、７９００ＨＴサーマルサイクラーを使用してＱＲＴＰＣＲによって決定した。
【００４８】
２ステップＴａｑＭａｎプロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して反応をセットアップした。ＴａｑＭａｎ  ＲＴマイクロＲＮＡ試薬キット（＃４３６６５９６）を使用し、マイクロＲＮＡのｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１９１およびｍｉＲ−２６ａに特異的なプライマーを用いて、以下のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅｍｓキット、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３（カタログ番号４３９５２０９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１（カタログ番号４３９５４１０）およびｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−１（カタログ番号４３９５１６６）を使用して、５μｌの全ＲＮＡからｃＤＮＡを転写して、その後ＴａｑＭａｎ  ＱＰＣＲを実施した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅｍｓのマニュアルに記載のプロトコルに従った。マニュアルからの唯一の逸脱は、９６ウェルブロックの使用であった。
【００４９】
結果−最初の実験では、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＲＮＡｓｐｉｎおよびＴｒｉｐｌｅＰｒｅｐキットを使用して、セルロース系固体支持体からマイクロＲＮＡを単離できるかどうかに焦点を当てた。加えて、実験により、マトリックス上に２４時間および４８時間保存された血液を使用して、マトリックス上のマイクロＲＮＡの安定性をさらに評価した。対照として、トリアゾール抽出によって全血から全ＲＮＡを単離した。
【００５０】
結果（図２）は、マイクロＲＮＡなどの低分子量ＲＮＡ分子を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  のＩｌｌｕｓｔｒａ  ＲＮＡｓｐｉｎおよびＴｒｉｐｌｅＰｒｅｐのキット両方を使用して化学的にコーティングされたセルロース系固体支持体に保存し、そこからの単離に成功できたことを示している。
【００５１】
検出された固体支持体由来のマイクロＲＮＡの量は、試験された時間枠、すなわち３、２４および４８時間にわたって同等であり、マイクロＲＮＡが試験した両方の固体支持体上で安定であることが示された。全ＲＮＡの定量により、ＴｒｉｐｌｅＰｒｅｐキットを使用して両方のマトリックスから溶出した収率が、ＲＮＡｓｐｉｎキットを使用して得られた収率の約１／１０であることが示された。しかし、前者はＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を単離するように設計されているが、後者はＲＮＡ特異的であるため、このことは驚くべきことではない。
【００５２】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅｍｓのｍｉｃｒｏＲＮＡ  ＴａｑＭａｎアッセイに使用するために推奨される全ＲＮＡの最小量は、各反応に１ｎｇ／５μｌの全ＲＮＡの使用であることに留意するべきである。これらの実験において、反応あたり１６ｐｇ／５μｌの全ＲＮＡ中のマイクロＲＮＡを定量することができた。
【００５３】
マイクロＲＮＡ標準がなければ、個々の被験マイクロＲＮＡの確実な定量は不可能であった。しかし、ＱＲＴＰＣＲによって得られたＣｔ値は、相対発現レベルの貴重な指標を提供する。Ｃｔ値が低いほど発現が高いことを示し、Ｃｔ値が高いほど発現レベルが低いことを示すことに留意されたい。個々のマイクロＲＮＡの発現レベル間の比は、使用した固体支持体、抽出キットまたは保存時間のいずれによっても変化しなかった。
【００５４】
予備精製された全ＲＮＡ中に存在するマイクロＲＮＡ画分がセルロース系固体支持体上で安定しているかどうかを理解するために、全血からＴｒｉｚｏｌ抽出法を使用して全ＲＮＡを単離した。次いで、単離された全ＲＮＡ試料を固体支持体に適用し、３時間乾燥させ、その後Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＲＮＡｓｐｉｎキットを使用して抽出した。Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用して血液から抽出した全ＲＮＡを対照として使用した。その後の分析は上記のように行った。固体支持体から抽出した、および血液から直接Ｔｒｉｚｏｌ抽出した全ＲＮＡを、ＧＡＰＤＨ  ＱＲＴＰＣＲを使用して定量し、０．４５ｎｇの全ＲＮＡをマイクロＲＮＡ  ＱＰＣＲに使用した。
【００５５】
３種すべてのマイクロＲＮＡの個別の存在を、固体支持体に適用された全ＲＮＡにおいて検出した（図３）。固体支持体に適用した試料によるＣｔ値から推定されるマイクロＲＮＡの相対収率と、Ｔｒｉｚｏｌを使用した全血由来の相対収率の比較（図３）は、セルロース系固体支持体の乾燥または処理中に一部のマイクロＲＮＡが失われる可能性があることを示している。全ＲＮＡ量をＱＲＴＰＣＲの前に正規化したが、Ｔｒｉｚｏｌ試料について得られたＣｔ値のほうが低いことは、本方法を用いて抽出した試料がより多量のマイクロＲＮＡを含んだことを示している。
【００５６】
結論として、化学的にコーティングされた固体支持体は、この実施例で使用された３種のマイクロＲＮＡによって例示される低分子量ＲＮＡ分子の保存、精製および検出を容易にする。記載されたシステムを使用して、個々のマイクロＲＮＡの検出限界は反応あたり１６ｐｇと低かった。この実験は、低分子量ＲＮＡ分子が、化学的にコーティングされたセルロース系固体支持体上に長期間保存できることを明らかに示している。
【実施例２】
【００５７】
化学的にコーティングされたＲＳＭ固体支持体に適用された生体試料由来のｍＲＮＡ分子の抽出および分析。
【００５８】
ラットの血液採取および乾燥させた血液スポットの抽出−雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１８０−２５０ｇ）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。麻酔したラットの尾静脈に配置した２６ゲージのカテーテルから直接、ピペットで全血を採取した。５０マイクロリットルのアリコートを抗凝固剤なしで移し、化学的に処理した濾紙および未処理の濾紙にスポットした。血液スポットを乾燥させ、デシケータキャビネット（相対湿度約２０％）において周囲の実験室温度で１１日間維持した。２種の試料ディスクを、７ｍｍ  Ｈａｒｒｉｓ  Ｕｎｉ−Ｃｏｒｅパンチ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して各乾燥血液スポットから打ち抜き、１５μｌのＰＫ溶液（４ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ＋０．５％ＳＤＳ）／パンチで処理した。試料ディスクを、３５０μｌの抽出溶液（１％β−メルカプトエタノールを含むＲＬＴバッファー、Ｑｉａｇｅｎ）を含有する１．５ｍｌの微小遠心管に移し、４０℃で２０分間、７００ｒｐｍのＴｈｅｒｍｏ−ｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）上でインキュベートした。インキュベーション後、ＱＩＡａｍｐ  ＲＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて溶出液３５０μｌからＲＮＡを精製し、４０μｌのヌクレアーゼ非含有水で溶出した。
【００５９】
ヒトの血液採取およびＲＳＭ紙への適用−静脈血試料を瀉血によりＥＤＴＡまたはヘパリンコーティング血液管（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に採取した。採血および混合の直後に、５０μｌの血液を血液チューブからピペットで採取し、スポットした円内に円運動で分注することにより１片のＲＳＭ紙に適用した。試料を室温で約２時間乾燥させ、次いで新鮮な乾燥剤を入れた元のマイラー（Ｍｙｌａｒ）袋に戻し、３種の異なる条件、室温（約２５℃）で一晩（１８時間）、室温で６日間、または３７℃で一晩（１８時間）保存した。
【００６０】
ＲＳＭ紙からのＲＮＡ抽出−４〜５個の６ｍｍの試料ディスクを、６ｍｍのＨａｒｒｉｓ  Ｕｎｉ−Ｃｏｒｅパンチ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、各乾燥血液スポットから調製した。試料ディスクをパラフィルム上に置き、１５μｌのＰＫ溶液（４ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ＋０．５％ＳＤＳ）を各ディスク上に加え、室温で１５分間インキュベートした。２つの血液スポット由来のディスクを８００μｌの抽出溶液（１％β−メルカプトエタノールを含むＲＬＴバッファー、Ｑｉａｇｅｎ）を含有する１．５ｍｌの微小遠心管に入れ、６００ｒｐｍのＴｈｅｒｍｏ−ｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）上で３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、７００μｌの溶出液を新しい微小遠心管に移し、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＲＮＡｄｖａｎｃｅ  Ｂｌｏｏｄキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）からの４００μｌのイソプロパノールおよび１０μｌのＳＰＲＩビーズと混合した。次に、製造業者の指示書に従ってＲＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡの除去をＡｍｂｉｏｎ  ＤＮａｓｅ  Ｉキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて３７℃で１０分間行った。
【００６１】
ＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡ血液採取およびＲＮＡ抽出。
【００６２】
ヒトの全血試料を、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｕｂｅｓ中に製造業者の説明書（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ）に従って採取した。ＲＮＡは、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＲＮＡｄｖａｎｃｅ  Ｂｌｏｏｄキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）の改変版およびＨａｍｉｌｔｏｎ  ＳＴＡＲ自動液体ハンドラー（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を使用して、磁気ビーズに基づくアプローチを用いて単離した。１ウェルあたり４００μｌの全血を含む９６ウェルプレートで抽出を実施し、ゲノムＤＮＡの除去を、Ａｍｂｉｏｎ  ＤＮａｓｅ  Ｉキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して３７℃で１０分間行った。
【００６３】
内部ＰＡＸプール血液コントロール−約２．５ｍＬの血液を、合意したドナーからＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  Ｔｕｂｅｓに採取した（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＩＲＢ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ＃２００９０３６２）。ドナー管由来の血液／ＰＡＸｇｅｎｅ試薬混合物を一緒にプールした。プールおよび混合後、各プールを１．５ｍｌのアリコートに分配し、−２０℃で保存した。
【００６４】
ＲＮＡ分析−精製ＲＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ８０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して２６０ｎｍにおける吸光度によって定量した。ＲＮＡ完全性は、Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ６０００  Ｐｉｃｏ  Ａｓｓａｙキットを使用してＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによって、製造業者の説明書（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）に従って評価した。ＲＮＡ完全性数（ＲＩＮ）は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して計算した（最も低いＲＮＡ品質ＲＩＮ＝１から最も高いＲＮＡ品質ＲＩＮ＝１０）。
【００６５】
逆転写−ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。ＰＡＸｇｅｎｅチューブから抽出したＲＮＡを６ｎｇ／μｌに調整し、ｃＤＮＡ試料を下流処理用に１ｎｇ／μｌのＲＮＡ等量に希釈した。ＲＳＭペーパーから抽出された利用可能なすべてのＲＮＡ（推定約２００ｎｇ）を、質量正規化を行わずにｃＤＮＡ反応に使用した。
【００６６】
ＲＴ−ｑＰＣＲ反応を、２μｌのｃＤＮＡ試料をＧＥＳプレート上に添加することによって行った。すべてのＲＴ−ｑＰＣＲ反応は、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、５０℃２分、９５℃１０分および４５サイクルの９５℃１５秒および６０℃１分というサイクル条件を使用して行った。個々の交差点（Ｃｐ）値を、ＬＣ４８０  ＩＩソフトウェア（Ｒｏｃｈｅ）を使用して計算した。ゲノムＤＮＡ汚染は、スプライス部位スパニングおよび遺伝子間ＴＦＣＰ２アッセイの発現値を比較することによって評価した。
【００６７】
結果−この研究のベースライン群は、２５人の健康な被験者を利用し、ＲＳＭおよび３１−ＥＴＦの紙にスポットされたか、またはＰＡＸｇｅｎｅチューブに採取された、室温で１８時間保存された全血試料からなった（ベースライン条件、ＲＴ；約２５℃）。ＰＡＸｇｅｎｅチューブから得られたＲＮＡのＲＩＮスコアは、ＲＳＭから得られたものよりわずかに高かった（平均ＲＩＮ±９５％ＣＩ：７．９８±０．５４対６．９２±０．２４、ｐ＜０．００１；平均収率はＰＡＸｇｅｎｅ由来のものがより高く（それぞれ６．５８ｎｇ／μｌ対４．７９ｎｇ／μｌ全血、ｐ＜０．００１）、未処理の３１−ＥＴＦ紙から単離されたＲＮＡは、有意な分解（２．８７±０．１１）を示した
ＲＴ−ｑＰＣＲ−機能検査を用いてさまざまな条件下で単離したＲＮＡを評価するために、臨床的に検証された、閉塞性冠動脈疾患の遺伝子発現に基づく診断試験で使用された２３の遺伝子をＲＴ−ｑＰＣＲによりアッセイした。全体的に、ベースライン群と比較して３７℃または６日間保存されたＲＳＭ紙からは遺伝子発現レベルのわずかな変化しか観察されず、両方の比較で０．１５のメジアンデルタ交差点（Ｃｐ）が観察された。試験した２３の遺伝子のうちの１５の遺伝子は、３群の間の発現レベル（Ｃｐ値）に有意差を示さなかった。２つの遺伝子（ＣＤ３Ｄ、ＴＬＲ４）は３７℃の群においてＣｐ値の有意なシフトを示したが、７種の遺伝子（ＣＤ３Ｄ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＫＬＲＣ４、ＮＣＦ４、ＲＰＬ２８、ＴＮＦＡＩＰ６、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）は６日間の分群において有意なシフトを示し、ＣＤ３Ｄだけが両法の群において有意に影響を受けた。比較して、ベースライン群と３７℃との間のメジアンデルタＣｐは、ＲＳＭと比較してＰＡＸｇｅｎｅ試料でわずかに大きかった（それぞれ０．５３対０．１５Ｃｐ；および６日間の群と比較してＰＡＸｇｅｎｅで顕著に大きかった（１．９７対０．１５Ｃｐ；）。したがって、分析された２３種の遺伝子について、ＲＳＭ紙からの平均遺伝子発現は、ＰＡＸｇｅｎｅ安定化ＲＮＡと比較して、高温または長時間の保存に対して感受性が低かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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