(57)【要約】  本発明は、流体試料の検体とバイオセンサのセンサ表面に固定化されたリガンドとの間の相互作用の評価のための方法に関し、各々が既知の濃度の検体を含む複数の流体試料を提供するステップ（１０１）と、複数の針および複数のセンサ表面または検出スポットを提供するステップ（１０２）であって、センサ表面または検出スポットの少なくとも一部は、既知の量の固定化されたリガンドを有し、各針は、流体試料をセンサ表面または検出スポットに注入するように構成されるステップ（１０２）と、前記複数の流体試料を少なくとも２つのグループに分割するステップ（１０３）と、前記グループの第１の流体試料を、針によってセンサ表面または検出スポットに注入して検体のリガンドへの会合を可能にするステップ（１０４）と、各センサ表面または検出スポットをモニタして結合データを収集するステップ（１０４）と、流体試料を注入し、検出スポットをモニタし、流体試料の各グループごとに結合データを収集するステップを繰り返すステップ（１０５）とを含み、上記のステップは、固定化されたリガンドの中間再生または更新を伴わずに連続的に行われる。本発明はまた、流体試料の検体とセンサ表面に固定化されたリガンドとの間の相互作用の評価のためのバイオセンサシステム、ならびに方法のステップを行うためのソフトウェアおよび前記ソフトウェアを記憶するためのコンピュータ可読媒体に関する。【選択図】図５
2018528431.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体試料の検体（４）とバイオセンサのセンサ表面に固定化されたリガンド（３）との間の相互作用の評価のための方法であって、
各々が既知の濃度の検体（４）を含む複数の流体試料を提供するステップ（１０１）と、
複数の針（１９）および複数のセンサ表面または検出スポットを提供するステップ（１０２）であって、前記センサ表面または検出スポットの少なくとも一部は、既知の量の固定化されたリガンド（３）を有し、各針（１９）は、流体試料をセンサ表面または検出スポットに注入するように構成されるステップ（１０２）と、
前記複数の流体試料を少なくとも２つのグループに分割するステップ（１０３）であって、各グループは、針（１９）の数に対応する多数の流体試料を有するステップ（１０３）と、
前記グループの第１の前記流体試料を、前記針（１９）によって前記センサ表面または検出スポットに注入して前記検体（４）の前記リガンド（３）への会合を可能にするステップ（１０４）と、
各センサ表面または検出スポットをモニタして結合データを収集するステップ（１０５）と、
流体試料を注入し、検出スポットをモニタし、流体試料の各グループごとに結合データを収集するステップを繰り返すステップとを含み、
上記のステップは、前記固定化されたリガンド（３）の中間再生または更新を伴わずに連続的に行われる、方法。
【請求項２】
前記複数の流体試料が、各試料が他のすべての試料とは異なる検体（４）の濃度を有する希釈系列を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の流体試料が、少なくとも２つの試料が同じ濃度の検体（４）を有する希釈系列を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
各センサ表面または検出スポットで収集された前記結合データが、結合曲線として共に記憶および／または表示される、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
結合曲線の質が、全応答または曲線全体にわたる応答の増加に対する所定の値に基づいて決定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
一部の試料結合曲線が、残りの試料結合曲線を共に表示することができるように除去され得る、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
一方のセンサ表面または検出スポットに固定化されたリガンド（３）の量が、他方のセンサ表面または検出スポットに固定化されたリガンド（３）の量とは異なる、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
流体試料の検体（４）とバイオセンサのセンサ表面に固定化されたリガンド（３）との間の相互作用の評価のためのバイオセンサシステムであって、前記バイオセンサシステムは、
少なくとも一部が固定化されたリガンド（３）を有する複数のセンサ表面または検出スポットと、
各々が流体試料を前記センサ表面または検出スポットの１つに注入するように配置される複数の針（１９）と、
各々が既知の濃度の検体（４）を含み、少なくとも２つのグループに分割され、各グループは、針（１９）の数に対応する多数の流体試料を有する複数の流体試料とを含み、
前記バイオセンサシステムは、前記グループの第１の前記流体試料を、前記針（１９）によって前記センサ表面または検出スポットに注入して前記検体（４）の前記リガンド（３）への会合を可能にし、各センサ表面または検出スポットをモニタして結合データを収集し、前記流体試料の注入、検出スポットのモニタ、および流体試料の各グループごとの結合データの収集を繰り返すように構成され、
前記バイオセンサシステムは、前記固定化されたリガンド（３）の中間再生または更新を伴わずに、連続的に前記注入を行うようにさらに構成される、バイオセンサシステム。
【請求項９】
各グループの前記流体試料が、前記バイオセンサシステムのプレート（１２）に行で配置される、請求項８に記載のバイオセンサシステム。
【請求項１０】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法を行うように構成されたソフトウェア。
【請求項１１】
請求項１１に記載のソフトウェアを記憶するように構成されたコンピュータ可読媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流体試料の検体とバイオセンサのセンサ表面に固定化されたリガンドとの間の相互作用の評価のための方法およびシステム、ならびに方法のステップを行うためのソフトウェアおよび前記ソフトウェアを記憶するためのコンピュータ可読媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子間、たとえば生体分子間の相互作用をリアルタイムでモニタすることができる分析用センサシステムに対する関心はますます高まっている。これらのシステムは、光学式バイオセンサに基づく場合が多く、通常、相互作用分析用センサまたは生体分子特異的相互作用分析用センサと呼ばれる。そのようなバイオセンサシステムの代表は、ＧＥヘルスケアの販売するＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）計測器であり、これは試料中の分子と検知表面に固定化された分子構造との間の相互作用を検出するために表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用する。試料がセンサ表面上を通過する時、結合の進行は、相互作用が起こる速度を直接反映する。試料の注入の後、バッファフローが続き、その間は検出器の応答が表面の複合体の解離速度を反映する。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムからの典型的な出力は、時間に対する分子相互作用の進行を表すグラフまたは曲線であり、これは会合フェーズの部分と解離フェーズの部分とを含む。通常、コンピュータ画面に表示されるこのグラフまたは曲線は、結合曲線または「センサグラム」と呼ばれることが多い。
【０００３】
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システム（および類似のセンサシステム）により、リガンドおよび検体として使用される分子の複数の相互作用パラメータを決定することが可能である。これらのパラメータには、分子相互作用における結合（会合）および解離の反応速度定数ならびに表面相互作用に対するアフィニティが含まれる。会合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）は、多数の異なる試料の検体濃度について得られた反応速度データを、微分方程式の形式で相互作用モデルの数学的表現にフィットさせることによって、得ることができる。（アフィニティ定数ＫＡまたは解離定数ＫＤとして表される）アフィニティは、会合および解離速度定数から計算することができる。
【０００４】
しかし、バイオセンサシステムを使用して相互作用を分析する前に、多くの場合は結果の質を高めるために分子の特性を決定することが必要である。これらの特性は、とりわけ、所望の結合曲線を達成するのに適した検体濃度の間隔およびセンサプレートに載置されるリガンドの量である。検体の濃度が低すぎたり高すぎたりすると、得られた結合曲線は分析が困難であり、相互作用パラメータの正確な決定をもたらさない可能性がある。同様に、リガンドの量が少なすぎると、センサの応答が悪くなり、リガンドの量が多すぎると、検体が意図した通りに結合するのが困難になることがある。これらの問題を克服するために、事前に計算および分析を行い、満足のいく結果をもたらす可能性が最も高い操作パラメータを決定するために数日または数週間かけることがある。１つの間隔内で検体の濃度が異なる流体試料を含む希釈系列を使用して、それらの少なくともいくつかを使用できることを期待して複数の結合曲線を作成するのが一般的である。
【０００５】
センサプレートの再生が試料間でしばしば必要となるため、これらの調製は時間がかかり、希釈系列のすべての試料について結合曲線を取得することが一般的である。有用な再生条件のスカウティングはそれ自体で、数時間または数週間かかるプロセスとなる可能性がある。
【０００６】
したがって、バイオセンサを使用する前に必要とされる調製とその後の実験の時間消費の両方に関して、本分野において改善が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０５８８７９号
【発明の概要】
【０００８】
本発明の目的は、流体試料の検体とバイオセンサのセンサ表面に固定化されたリガンドとの間の相互作用の評価のための新規な方法およびバイオセンサシステムを提供することであり、この方法およびバイオセンサシステムは、従来技術の１つまたは複数の欠点を克服する。これは、独立請求項に定義される方法およびバイオセンサシステムによって達成される。
【０００９】
本発明により、検体とリガンドとの間の多数の相互作用が観察され、記憶され、分析され、表示され、計算および実験を事前に必要とせずに良好な結果を得ることができる。さらに、固定化されたリガンドの中間再生または更新を伴わずに連続的に分析が行われるため、相互作用は従来の方法およびシステムより短時間で行われ、良好な結果を取得しながらさらなる時間および労力を節約する。
【００１０】
検体を含む流体試料は、各試料が行われる異なる相互作用の数を最大にするために他のすべての試料とは異なる検体の濃度を有する希釈系列であってもよく、あるいは、少なくとも２つの試料が同じ濃度を有する希釈系列であってもよく、結果の質をさらに高め、汚染、一時的な外乱または他の欠陥を排除するのを支援する。
【００１１】
得られた結合データは、組み合わせてバイオセンサシステムの各針について１つの結合曲線を形成することができ、好ましくは、結果の迅速な概観をユーザに提供し、さらなる分析に適さない結合曲線の特定を容易にするために、１つのグラフで共に表示される。そのような結合曲線は、視覚検査の後にユーザによって、または、とりわけ、全応答値または曲線全体にわたる応答の増加に対する所定の値などのいくつかの基準を使用するように構成されたソフトウェアによって除去することができる。そのような結合曲線の除去後、得られた結合曲線を好ましくは共に表示し、検体とリガンドとの間の相互作用に関する反応速度パラメータまたは他のデータを得るためのさらなる分析に使用する。
【００１２】
バイオセンサシステムのセンサ表面に固定化されたリガンドの量は、変化し得、立体効果および物質輸送特性の決定を可能にする。
【００１３】
本発明の多くの追加の利点は、以下の詳細な説明を考慮すれば、当業者には容易に明らかになるであろう。
【００１４】
本発明は、添付の図面を参照して、より詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＳＰＲに基づくバイオセンサシステムの概略側面図である。
【図２】結合曲線が視認可能な会合および解離フェーズを有する代表的なセンサグラムである。
【図３】異なる濃度の検体を含む複数の流体試料が再生せずに注入される単一のサイクル分析を示す図である。
【図４】本発明の好ましい実施形態による方法のステップを示す図である。
【図５】流体試料を保持するためのウェルを有するプレート、平行針を有するバイオセンサシステムの一部、およびリガンドと検体との間の相互作用を表す結果のグラフを示す図である。
【図６】本発明での使用に適した希釈系列を示す図である。
【図７】各コラムの固定化されたリガンドの濃度を変化させた希釈系列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
上述したように、本発明は、流体試料の検体とバイオセンサのセンサ表面に固定化されたリガンドとの間の相互作用の評価のための方法およびバイオセンサシステムに関する。
【００１７】
典型的には、実験的な結合データはセンサに基づく技術によって得られ、この技術は、分子相互作用を研究し、相互作用が進行する時にリアルタイムで結果を表示する。しかし、本発明をより詳細に説明する前に、本発明を使用しようとする一般的な状況について説明する。
【００１８】
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明に関連する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。また、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「この（ｔｈｅ）」は、別に記述されない限り、複数形への言及も含まれるものとする。
【００１９】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、その全体が参照により組み込まれる。
【００２０】
化学センサまたはバイオセンサは、典型的には、ラベルフリーの技術に基づき、センサ表面の特性、たとえば固定化された層の質量、屈折率、または厚さの変化を検出するものであるが、ある種の標識化に頼るセンサも存在する。典型的なセンサ検出技術としては、限定されるものではないが、質量検出法、たとえば光学的、熱光学的および圧電性の方法または音波法（たとえば、表面弾性波（ＳＡＷ）法および水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）法を含む）、ならびに電気化学的方法、たとえば電位差測定法、導電率測定法、電流測定法、および静電容量／インピーダンス法などが挙げられる。光学的な検出方法に関して、代表的な方法としては、質量表面濃度を検出する方法、たとえば外部および内部反射法の両方を含む反射光学的方法などが挙げられ、これらは角分解、波長分解、偏光分解または位相分解することができ、たとえば、エバネッセント波偏光解析法およびエバネッセント波分光法（ＥＷＳ、または内部反射分光法）（これらはいずれも表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるエバネッセント場の増強を含み得る）、ブリュースター角屈折率測定法、臨界角屈折率測定法、漏れ全反射（ＦＴＲ）、散乱内部全反射（ＳＴＩＲ）（散乱増強標識を含み得る）、光導波路センサ；外部反射撮像、および臨界角分解撮像、ブリュースター角分解撮像、ＳＰＲ角分解撮像などのエバネッセント波に基づく撮像などがある。さらに、測光および撮像／顕微鏡方法を挙げることができるが、これは「それ自体」または反射方法と組み合わせて、たとえば表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）、エバネッセント波蛍光（ＴＩＲＦ）および燐光に基づいており、また、導波路干渉計（たとえばＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）によって実現される生体層干渉法）、導波路漏洩モード分光法、反射干渉分光法（ＲＩｆＳ）、伝送干渉法、ホログラフィ分光法、および原子間力顕微鏡法（ＡＦＲ）を挙げることもできる。
【００２１】
市販されているバイオセンサは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社によって製造販売されている、上述したＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システム機器を含み、これは表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づいており、束縛されたリガンドと目的の検体との間の表面結合相互作用をリアルタイムでモニタすることを可能にする。この文脈では、「リガンド」は、所与の検体に対する既知または未知のアフィニティがあり、表面に固定化された任意の捕捉または捕獲する薬剤を含む分子であり、「検体」はそれに対する任意の特定の結合パートナーを含む。
【００２２】
以下の詳細な説明では、本発明は、ＳＰＲ分光法、特にＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムの文脈で例示しているが、本発明はこの検出方法に限定されるものではないことを理解されたい。そうではなく、検知表面における変化を測定することができ、それが検体の固定化されたリガンドへの結合を定量的に示すものであれば、検体が検知表面に固定化されたリガンドに結合する任意のアフィニティに基づく検出方法を用いることができる。
【００２３】
ＳＰＲの現象はよく知られており、屈折率の異なる２つの媒体の界面において特定の条件の下で光が反射する場合にＳＰＲが発生し、界面は金属膜、典型的には、銀または金で被覆されていると言えば十分であろう。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）機器では、媒体は、試料およびセンサチップのガラスであって、そのガラスはマイクロ流体フローシステムにより試料に接触する。金属膜は、チップ表面の金の薄い層である。ＳＰＲは、特定の反射角で反射光の強度を低下させる。反射光強度が最小になるこの角度は、反射光の反対側、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムでは試料側の表面に近い屈折率に応じて変化する。
【００２４】
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムの概略図を、図１に示す。センサチップ１は、流路５を通る検体４、たとえば抗原を有する試料の流れにさらされた捕捉分子（リガンド）３、たとえば抗体を支持する金膜２を有する。光源７（ＬＥＤ）からの単色のｐ偏光６は、プリズム８によってガラス／金属界面９に結合され、そこで光は全反射される。反射光ビーム１０の強度は、光検出ユニット１１（光検出器アレイ）によって検出される。
【００２５】
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）機器の技術的側面およびＳＰＲの現象の詳細な説明は、米国特許第５，３１３，２６４号に見出すことができる。バイオセンサ検知表面のマトリックス皮膜についてのより詳細な情報は、たとえば、米国特許第５，２４２，８２８号および第５，４３６，１６１号に記載されている。さらに、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）機器に関連して使用されるバイオセンサチップの技術的側面の詳細な説明は、米国特許第５，４９２，８４０号に見出すことができる。
【００２６】
試料中の分子がセンサチップ表面の捕捉分子に結合すると、濃度、したがって表面の屈折率が変化して、ＳＰＲ応答が検出される。相互作用の過程の時間に対する応答をプロットすることにより、相互作用の進行の定量的な測定を提供する。このようなプロット、または反応速度もしくは曲線（結合等温線）は、通常、結合曲線またはセンサグラムと呼ばれ、また当技術分野では時には「アフィニティトレース」または「アフィノグラム」とも呼ばれる。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムでは、ＳＰＲ応答値は、共鳴単位（ＲＵ）で表される。１ＲＵは、最小反射光強度の角度の０．０００１°の変化を表しており、これは、大部分のタンパク質および他の生体分子についてセンサ表面の約１ｐｇ／ｍｍ２の濃度変化に対応する。検体を含む試料がセンサ表面に接触すると、センサ表面に結合した捕捉分子（リガンド）が、「会合」と呼ばれるステップで検体と相互作用する。  このステップは、試料が最初にセンサ表面に接触される際のＲＵの増加によって結合曲線で示される。逆に、試料の流れが、たとえばバッファフローに置換された場合には、「解離」が通常発生する。このステップは、検体が表面結合リガンドから解離する際の経時的なＲＵの低下により結合曲線で示される。センサチップ表面での可逆的相互作用についての代表的な結合曲線（センサグラム）を図２に示しており、検知表面は、固定化された捕捉分子すなわちリガンド、たとえば抗体を有し、試料中の結合パートナー、したがって、すなわち検体と相互作用する。上述した他の検出原理に基づくバイオセンサシステムによって生成される結合曲線は、同様の外観を有する。縦軸（ｙ軸）は応答（ここでは共鳴単位ＲＵ）を示し、横軸（ｘ軸）は時間（ここでは秒）を示す。横軸の下には、結合曲線を取得するための取得サイクルが、センサ表面が異なる流体に接触する異なる時間区間に分割されて模式的に開示されている。最初に、ｔ２から、バッファ（Ｂ）が検知表面上を通過し、結合曲線のベースライン応答Ｉを与える。次に、ｔ２からｔ３までの間、センサ表面が濃度Ｃｉで検体を含む試料と接触し、検体の結合に起因して信号の増加が観察される。結合曲線のこの部分ＩＩは、通常、「会合フェーズ」と呼ばれる。最終的に、会合フェーズの終了時またはその近くで定常状態条件に到達し、共鳴信号はＩＩＩで平坦になる（しかし、この状態は常に達成されなくてもよい）。本明細書中で用語「定常状態」は、用語「平衡」と同義的に使用されることに注意すべきである（たとえシステムが平衡状態にない場合でも実際には結合は経時的に一定であり得るので、他の文脈で用語「平衡」は、理想的な相互作用モデルを説明するために留保されていることがある）。会合フェーズの終了時のｔ３では、試料はしばしばバッファ（Ｂ）の連続的な流れに置き換えられ、信号の減少は表面からの検体の解離、すなわち解放を反映している。結合曲線のこの部分ＩＶは、通常、「解離フェーズ」と呼ばれる。分析は、必要に応じて、ｔ４における再生ステップにより終了し、（理想的には）リガンドの活性を維持しつつ、結合した検体を表面（Ｒ）から除去することができる溶液をセンサ表面に注入する。これは、センサグラムの部分Ｖで示されてい��。バッファ（Ｂ）の注入がベースラインＩを回復させ、ここで表面は新たな分析のための準備が整う。いくつかの状況では、再生ステップＶを省略して、再生せずに新しい注入サイクルを開始することが便利であり得る。そのような状況の例としては、同一検体の濃度系列、本質的に完全な解離を可能にする十分に高い解離速度を有する検体のスクリーニングなどが挙げられる。
【００２７】
固定化されたリガンドの中間再生または更新を伴わずに、１回および同じ実験サイクルで複数の注入を連続的に実施することができ、米国特許出願公開第２０１３／００６５２５１号により詳細に記載されている。異なる濃度の検体を含む複数の流体試料が再生せずに注入される一例も、図３に示されている。
【００２８】
会合および解離フェーズＩＩおよびＩＶそれぞれのプロファイルから、結合および解離反応速度に関する情報が得られ、ＩＩＩの結合曲線の高さは、アフィニティ（表面の質量濃度の変化に関連する相互作用に起因する応答）を表す。
【００２９】
たとえば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）４０００などのいくつかのバイオセンサシステムを使用して、複数の検出スポットを各々含む複数の独立したフローセルが、複数の分析を同時に行うように構成される。各フローセルは、それ自体の針を有し、各フローセルへの平行注入を可能にし、各々がそれ自体の検体を有する複数のリガンドまたは実際には異なる濃度の検体を含む複数の試料を有する１つのリガンドの組み合わせを可能にする。この種の分析は、一般に、平行分析と呼ばれる。
【００３０】
上述したように、本発明は、流体試料の検体とバイオセンサのセンサ表面に固定化されたリガンドとの間の相互作用の評価のための方法およびバイオセンサシステムに関する。バイオセンサは、検知表面の変化を測定することができ、それが検体の固定化されたリガンドへの結合を定量的に示すものであれば、検体が検知表面に固定化されたリガンドに結合する任意の種類の相互作用に基づく検出方法に基づいてもよい。
【００３１】
図４は、本発明の好ましい実施形態による、流体試料の検体とバイオセンサのセンサ表面に固定化されたリガンドとの間の相互作用の評価のための方法のステップを開示する。第１のステップ１０１では、各々が既知の濃度の検体を含む複数の流体試料が提供される。流体試料は、以下でさらに説明するように、より小さい試料に分割され、所定の希釈スケジュールに従って希釈される所与の濃度の検体を含む流体に基づいてもよい。
【００３２】
第２のステップ１０２では、複数の針および複数のセンサ表面または検出スポットが提供され、センサ表面または検出スポットの少なくとも一部は、既知の量の固定化されたリガンドを有し、各針は、流体試料をセンサ表面または検出スポットに注入するように構成される。この好ましい実施形態では、並列に配置された複数のフローセルを有するバイオセンサシステムが、多数の流体試料の同時分析を可能にするために使用される。別の実施形態では、センサ表面は１つのみだが、前記センサ表面に複数の検出スポットを有するバイオセンサシステムを使用することが可能である。
【００３３】
第３のステップ１０３では、複数の流体試料を少なくとも２つのグループに分割し、各グループは、針の数に対応する多数の流体試料を有する。流体試料は、図５に示すようにプレートのウェルに配置され、１つのグループの試料が図の横軸に沿って分布するようにすることができる。したがって、グループの試料の数は、バイオセンサシステムの針の数に対応するように選択され、グループのすべての流体試料が同時に注入されることを可能にする。
【００３４】
第４のステップ１０４では、前記グループの第１の流体試料は、針によってセンサ表面または検出スポットに注入されて検体のリガンドへの会合を可能にし、第５のステップでは、各センサ表面または検出スポットがモニタされ、結合データが収集される。検体を含む流体試料が注入された後、次の検体の注入のためにバッファ溶液が加えられてセンサ表面を調製するが、再生は行われない。
【００３５】
流体試料を注入し、各センサ表面または検出スポットでの相互作用をモニタし、結合データを収集するステップは、すべての試料が使用されるまで流体試料の各後続のグループごとに繰り返される。これを容易にするために、各グループの流体試料は、列と行に配置された複数のウェルを含むプレートに一列に配置されてもよい。別のグループが使用される場合、バイオセンサシステムの針およびプレートは、互いに対して移動するように配置され、針が次のグループの流体試料を含むウェルの上に配置されるようにしてもよい。
【００３６】
各センサ表面または検出スポットでの相互作用のための結合データを組み合わせて結合曲線を形成し、その特定の表面またはスポットに注入されたすべての流体試料を表示することができる。８つの針を有するシステムの場合、実験の結果は、図５に示されて以下に説明されるように、８つのグラフまたは曲線となり、これらの結合曲線から、反応速度パラメータが決定され得る。
【００３７】
方法のステップは、検体を含む流体試料の各注入の間に再生を有するマルチサイクルプロセスと比較して、分析の時間が大幅に短縮された単一のサイクルプロセスを可能にするため、リガンドを保持するセンサ表面の再生またはリガンド自体の更新を伴わずに行われるという点で特に有利である。いくつかの実施形態では、センサ表面または検出スポットの１つまたは複数は、リガンドがなくてもよく、参照を提供してもよい。
【００３８】
すべての流体試料が使用された後、取得された試料結合曲線を記憶、分析および／または表示することができ、システムのユーザは異なる濃度でリガンドと分析物との間の相互作用の概要を知ることができる。試料結合曲線はまた、好ましくは、コンピュータ可読媒体に記憶される。本明細書で使用するコンピュータ可読媒体という用語は、ＲＡＭ、メモリスティック、コンパクトディスクなどのコンピュータまたは同様のツールによるアクセスのためのデータを記憶するのに適した任意の媒体として理解されるべきである。試料結合曲線を表示する場合、ユーザが曲線の形状を比較し、相互作用の質が低いか濃度範囲外であると考えられるものを除去することができるように、すべての曲線を１つのグラフに示すことが有利である。
【００３９】
図５は、針１９が第１の行１４にアクセスできるように複数のウェル１３が行で配置されたプレート１２の上に載置された複数の針１９を開示する。流体試料を含む検体の希釈系列は、第１の行１４の一方の端部１７で最も濃度が高く、行に沿って減少する濃度が分布している流体試料を用いて所定のパターンに従って分布させることができる。同様に、次の行１５において、最も高い濃度を有する流体試料は、一方の端部１７に位置し、最も低い濃度を有する流体試料、または検体を全く含まないブランク試料は、他方の端部１８とすることができる。このようにして、希釈系列を簡単かつ効率的に作成することができる。本発明による方法の第４および第５のステップ１０４、１０５の間に、各グループまたは行１４、１５、１６の流体試料は、針１９の使用によってウェルから除去され、１つまたは複数のセンサ表面に注入されて検体とリガンドとの間の相互作用を表示する試料結合曲線を取得する。
【００４０】
１つまたは複数のセンサ表面のリガンドと流体試料の検体との間の相互作用からの試料結合曲線を、図５のグラフ２０に示す。ここでは、各センサ表面または検出スポットで収集された結合データが組み合わされて結合曲線を形成する。注入された流体試料が低濃度から高濃度の検体に進行すると有利である。示されたバイオセンサシステムは、８つの針を有し、第１のグループまたは行１４で８つの流体試料を可能にし、したがって各針は、各行１４、１５、１６に対して１つのウェルを有する１つの列に沿って移動する。１つの行の流体試料のリガンドと検体との間の相互作用から得られたグラフは、数字２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８で図５に開示されている。各流体試料中の検体の濃度に応じて、得られたグラフが示すセンサ応答は小さすぎたり大きすぎたりする可能性があり、その結果、ユーザの目的は、リガンドと検体との間の相互作用の反応速度特性に関する情報を得るためのさらなる分析に適したグラフを特定することである。
【００４１】
図５において、第１のグラフ２１は、リガンドと検体を含まないブランク試料との間の相互作用を示し、結果を改善するために基準減算を可能にする本質的に水平な線を表示している。第２および第３のグラフ２２、２３は、使用するには小さすぎる応答を示し、第４、第５および第６のグラフ２４、２５、２６は、分析に適した曲線を示す。第７のグラフ２７は、高すぎて分析には適さない限界に近づくセンサ応答を有する。最後に、第８のグラフ２８は、大きすぎて分析には適さないセンサ応答を有する。これらのグラフに直面したユーザに対しては、最良の結果を示すもののみが残され、グローバルグラフ２０と共に表示され得るように、３つを除くすべてが除去されてもよい。さらなる分析に適したグラフのこの判定は、ユーザ、またはいくつかの除外基準を使用してどの応答が予想される結果に適合するかを決定するソフトウェアによって行われ得ることに留意されたい。センサグラムの質を決定するための基準は、とりわけ、全応答または曲線全体にわたる応答の増加に対する所定の値であってもよい。
【００４２】
不適切なグラフを除去した後、残りの曲線は、したがって、その後の分析がリガンドと検体との間の相互作用をより詳細に表す会合速度定数、解離速度定数などの反応速度パラメータを決定することを可能にする。満足のいく結合曲線を与える列の流体試料に使用される検体の濃度に応じて、相互作用を研究するのに適した濃度範囲をより厳密に決定することも可能である。したがって、実験または問題の濃度範囲を確立するために煩雑な計算を行うのではなく、以前に可能であったよりも短時間かつより少ない労力で所望の情報を得るために１回の実験サイクルを行うことができる。
【００４３】
図６は、本発明の方法およびシステムでの使用に適した検体を含む流体試料の希釈系列の一例を示す。各列は、１つの針（番号１〜８）に対応し、希釈係数は、３つの行を有するプレートの各ウェルに対して与えられる。１つの針については、ブランクの系列が使用され、他の針については、行に沿った各ステップごとに５つの希釈係数および各列に沿った２つの希釈係数が、広範囲の濃度を提供するために使用される。広い範囲が使用されることにより、より小さい濃度範囲が一般的に確立され、ほんの少数の試料の希釈系列が使用される以前の方法を使用する機会と比較して、満足のいく結果が１回の実験から得られる確率が高い。
【００４４】
図７は、リガンドの固定化レベルが、各針または列に対応するバイオセンサのセンサプレートで変化する本発明の別の実施形態を示す。それにより、とりわけ、立体効果および物質輸送特性を決定および処理することができる。満足のいくグラフを得るために十分な応答レベルを有する結合曲線を生成する機会を増加させるために、検体の最高濃度に対応するように最低レベルの固定化されたリガンドを選択することが有利である。この実施形態を、好ましくは上述の好ましい実施形態と組み合わせて使用することによって、検体の適切な濃度間隔と同様に、事前評価または煩雑な計算を伴うことなく、適切な固定化レベルを決定することができる。
【００４５】
本明細書で使用される針という語は、過度に限定することを意図しない。ここで、「針」とは、好ましくは皮下注射器として使用されるのと同様のサイズの流体経路を形成する中空要素を意味することを意図し、０．８ｍｍ角（１ｍｍ径）以下の流体経路を有するが、必ずしもその大きさではない。表面張力下で流体を適所に保持するのに十分に小さい末端を有する流体経路を有する中空部材は、本発明のための「針」として十分である。
【００４６】
本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、当業者であれば容易に理解できる通り、添付の特許請求の範囲の技術的範囲において変更が可能である。たとえば、針および流路の数を変更することができ、検出スポットまたはフローセルを使用することができ、中間フローセル参照構成を使用することができ、各針のために１つのブランク検出スポットを使用してもよく、プレートフォーマットを変更してもよく、異なる希釈係数および濃度レベルを使用することができ、希釈系列以外のランダム濃度変動または他の濃度を使用することができる。
【符号の説明】
【００４７】
１  センサチップ
２  金膜
３  捕捉分子（リガンド）
４  検体
５  流路
６  ｐ偏光
７  光源
８  プリズム
９  ガラス／金属界面
１０  反射光ビーム
１１  光検出ユニット
１２  プレート
１３  ウェル
１４  行
１５  行
１６  行
１７  一方の端部
１８  他方の端部
１９  針
２０  グローバルグラフ
２１  第１のグラフ
２２  第２のグラフ
２３  第３のグラフ
２４  第４のグラフ
２５  第５のグラフ
２６  第６のグラフ
２７  第７のグラフ
２８  第８のグラフ
【図１】
2018528431.tif 000003
【図２】
2018528431.tif 000004
【図３】
2018528431.tif 000005
【図４】
2018528431.tif 000006
【図５】
2018528431.tif 000007
【図６】
2018528431.tif 000008
【図７】
2018528431.tif 000009
【国際調査報告】
2018528431.tif 000010
2018528431.tif 000011