(57)【要約】  本発明は、１種または複数のラムノリピドを含む組成物を得るための有機溶媒を使用しない方法ならびに前記方法から得ることができる組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種または複数のラムノリピドを含む組成物を得るための、有機溶媒を使用しない方法であって、
（ａ）  少なくとも１種のラムノリピド（ＲＬ）を含む水性培地を用意するステップと、
（ｂ）  （ａ）において用意した前記培地の非ろ過ベースの滅菌を行うステップと、
（ｃ）  （ｂ）の前記滅菌培地においてＲＬ含有相を不用物から分離して、前記組成物を得るステップと
を含み、場合により、
（１）ステップ（ａ）の後であってステップ（ｂ）の前に、ステップ（ａ）において用意した前記培地から固体不用物を除去するステップ、および／または
（２）滅菌ステップ（ｂ）の後であって分離ステップ（ｃ）の前に、ステップ（ａ）の前記滅菌培地を熟成させるステップ、および／または
（３）ステップ（ｃ）の後に、流体を、分離したＲＬ含有相から場合により除去して、固体組成物を得るステップ、および／または
（４）前記滅菌ステップの前および／または後に、用意した培地を脱色および／もしくは脱臭するステップ
をさらに含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）の後であってステップ（ｂ）の前、および／またはステップ（ｂ）の後であってステップ（ｃ）の前に、
（１）ステップ（ａ）において用意した前記培地を熟成させて、熟成されかつ滅菌された培地を得るステップをさらに含み、
ステップ（ａ）の後であって前記培地が（１）において熟成される前に、固体不用物がステップ（１）において用意した培地から場合により除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地が約０〜３０℃の間にて少なくとも約１日間、熟成される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記滅菌が、熱処理、化学処理および／または照射による、請求項１から３に記載の方法。
【請求項５】
前記化学処理が酸性化処理および／または過酸化物処理による、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）の前にステップ（ａ）で用意した前記培地を熟成させるステップと、
（ｂ）前記熟成された培地を滅菌するステップと、
（ｃ）前記滅菌された培地においてＲＬ含有相を不用物から分離するステップとを含み、場合により、
（ｃ）（１）前記ＲＬ含有相をさらに滅菌するステップと、
（ｃ）（２）前記滅菌したＲＬ含有相においてＲＬ含有相を不用物から分離して、前記組成物を得るステップと
をさらに含む、請求項１から５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）における前記滅菌ステップが、化学処理および／または照射処理によるものであり、ステップ（ｃ）（２）における前記滅菌ステップが熱処理によるものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
得られたラムノリピドを含む前記組成物が少なくとも約５重量％ラムノリピドを含む清澄なブロスである、請求項１から６に記載の方法。
【請求項９】
前記脱色および／または脱臭ステップが化学的処理および／または照射処理によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法において、前記方法が、
（ｉ）用意した前記培地を滅菌する前に、ステップ（ａ）において用意した前記培地から固体不用物を除去するステップをさらに含み；
前記方法において、ステップ（ａ）において用意した前記培地が、前記培地を酸処理することによってステップ（ｂ）において滅菌され、得られた前記酸性培地が固体相、液体相および油性相を含み、少なくとも液体相が除去され、ステップ（ｃ）の前に固体相および場合により油性相が中和されて中和溶液が得られ、
ここで、前記の固体相および油性相が別々に中和されて別々の溶液を得るか、または前記の固体相および油性相が合わされ、前記合わされた固体相および油性相が中和されて中和溶液が得られ、
ステップ（ｃ）において、不溶性不用物質が前記溶液から除去されてラムノリピドを含む前記組成物が得られ、前記ラムノリピドを含む組成物は少なくとも約３０重量％ラムノリピドを含む濃縮された清澄なブロスであり；
前記方法は、場合により、前記培地がステップ（ｂ）において酸で処理される前および／または後に追加の滅菌ステップをさらに含み；
前記方法は、場合により、
（１）前記追加の滅菌ステップの前および／または後に、不溶性不用物を前記溶液から除去するための追加の分離ステップ、および／または
（２）滅菌後に、前記滅菌して濃縮した清澄なブロスを脱色および／または脱臭するステップ、および／または
（３）ステップ（ｃ）において得られた前記溶液から流体を除去するステップ、および／または
（４）ステップ（ｃ）において得られた前記溶液から水を除去するステップ
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記追加の滅菌ステップの前および／または後に、用意した前記培地を熟成させるステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物がモノラムノリピドおよびジラムノリピドを含み、モノラムノリピド：ジラムノリピドの比が、約３５：６５から約５５：４５である、請求項１から１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１０から１２に記載の方法により得ることができる中和溶液を含む組成物。
【請求項１４】
請求項１から１２に記載の方法により得ることができる脱色および／または脱臭培地を含む組成物。
【請求項１５】
請求項１から１２に記載の方法により得ることができる熟成された培地を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラムノリピドを含む組成物を得るための有機溶媒を使用しない方法ならびに前記組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ラムノリピド（ＲＬ）は、種々の細菌種によって産生される界面活性の糖脂質である。ＲＬは、１つのラムノースユニット（モノラムノシルリピド（monorhamnosyl lipid）またはモノ−ラムノリピド）または２つのラムノースユニット（ジラムノシルリピド（dirhamnosyl lipid）またはジ−ラムノリピド）および１つもしくは２つの（主に２つ）３−ヒドロキシ脂肪酸残基からなっている。ラムノリピドは、例えば、強力な発泡力などの特別な表面活性特性を有し、極めて広範な技術的用途にとって、特に界面活性剤として、興味深い（Randhawa et al. (2014) "Rhamnolipid biosurfactants-past, present, and future scenario of global market", Frontiers in Microbiology 5:1-7; Muller et al. (2012) "Rhamnolipids-Next generation surfactants?", J Biotechnol 162(4):366-80; Banat et al. (2010) "Microbial biosurfactants production, applications and future potential" Appl Microbiol Biotechnol 87:427-444にレビューされている）。潜在的用途の例としては、（１）ラムノリピドは汚染土壌から原油および重金属を効率的に除去し、かつそれらの乳化特性によるオイルスピルのバイオレメディエーションを促進することから、バイオレメディエーションおよび石油増進回収法（ＥＯＲ）；（２）例えば創傷治癒、熱傷、乾癬および皺向けの薬用化粧品を含む化粧品；（３）特に洗濯製品、それらの表面活性特性および乳化特性を付与されたシャンプーおよび石鹸のための洗剤および洗浄剤：ならびに（４）農業が挙げられる。ラムノリピドは、ＺＯＮＩＸ（商標）（Ｐｒｏｐｔｅｒａ  ＬＬＣ社）として市販されている農業用抗真菌製品で現在入手可能である。
【０００３】
ＲＬへの関心は、それらが再生可能な原料をベースとして発酵によって調製することができることから、高まっている。しかし、ラムノリピドは、下流処理方法が厄介であることなどから、市場では少量だけおよび高価でのみ入手可能であった。ラムノリピドを製造するために種々の方法が開示されてきた（例えば、Heyd et al. (2008) "Development and trends of biosurfactant analysis and purification using rhamnolipids as an example", Anal Bioanal Chem 391:1579-1590 and Smyth et al. (2010) "Isolation and Analysis of Low Molecular Weight Microbial Glycolipids", in Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, K. N. Timmis (ed.), Springer-Verlag, Berlin, pp. 3705-3724; Desai et al. (1997) "Microbial Production of Surfactants and Their Commercial Potential", Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61: 47-64にレビューされており、ならびにまた、たとえば、米国特許第５６５６７４７号明細書、米国特許第４６２８０３０号明細書、米国特許出願公開第２０１４０１４８５８８号明細書、中国特許第１０２７９６７８１号明細書、中国特許第１０２７６６１７２号明細書、中国特許第１０１７８７０５７号明細書、中国特許第１０１８４５４６８号明細書、中国特許第１０２４３２６４３号明細書、中国特許第１９０８１８０号明細書、韓国特許第１０２００６００１８７８３号公報にも開示されている）。
【０００４】
現在、ラムノリピドの最も一般的な単離手順には、発酵完了直後に発酵ブロスを高圧蒸気滅菌するステップと、それに続く、酸性化してラムノリピドを沈殿させるステップが含まれる。得られる固体ラムノリピドには、発酵において使用した生物由来の固体の細胞性物質が夾雑している。ＲＬは、酢酸エチルなどの有機溶媒に抽出することにより、そのような細胞性固形体から単離される。酢酸エチルを除去した後、濃縮された油状形態の生成物が得られる。しかし、溶媒抽出プロセスは、発酵プロセス由来の未消費のトリアシルグリセリド油および消泡剤を含む可能性のあるあらゆる疎水性不純物を生成物に同伴する。開示された他の方法の例としては、（１）発酵ブロスの硫酸アルミニウム沈殿と、それに続く、有機溶媒抽出；（２）連続限外ろ過；（３）沈殿ステップと組み合わせて行うことが可能である、吸着、イオン交換、逆相または順相カラムのいずれかを使用するカラムクロマトグラフィー（例えば、Lebron-Paler A (2008) "Solution and interfacial characterization of rhamnolipid biosurfactant from P. aeruginosa ATCC 9027" PhD Dissertation University of Arizona、中国特許第１０１７８７０５７号明細書、中国特許第１０１４０７８３１号明細書、中国特許第１９０８１８０号明細書を参照されたい）；（４）向流クロマトグラフィー（Zhang et al. "Separation and purification of six biosurfactant rhamnolipids by high-speed countercurrent chromatography utilizing novel solvent selection method", Separation Science and Technology, in press (posted Nov. 24, 2015)）；（５）選択的晶出と、それに続く、抽出、または（６）泡沫分離／吸着（例えば、米国特許出願公開第２０１５／００１１７４１号明細書；Sarachat et al., (2010) "Purification and concentration of a rhamnolipid biosurfactant produced by Pseudomonas aeruginosa SP4 using foam fractionation", Bioresource Technology 101: 324-330を参照されたい）が、挙げられる。しかし、これらの方法全ては、種々の欠点も有している（例えば、高価であり、スケール化が悪く、資源消費型であるなど）。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ラムノリピドを含む組成物を得るための有機溶媒を使用しない方法であって、
（ａ）  少なくとも１種のラムノリピド（ＲＬ）を含む水性培地を用意するステップと、
（ｂ）  （ａ）において用意した前記培地の非ろ過ベースの滅菌を行うステップと、
（ｃ）  （ｂ）の前記滅菌培地においてＲＬ含有相を不用物から分離して、前記組成物を得るステップと
を含む、方法を提供する。
【０００６】
上記の方法を使用する最終生成物は、天然のプロセスに由来し、化学的に修飾されておらず、かつ石油をベースとしたなんらの有機溶媒とも接触していない。上記のプロセスまたは方法は、水性培地（例えば、発酵培地またはブロス）からラムノリピドを抽出するための石油由来の化学溶媒の使用を排除し、したがって、これは製造コストを大幅に低減させる。さらに、最終的なラムノリピド溶液は天然由来である。
【０００７】
ある特定の一実施形態では、ラムノリピドを含む組成物は少なくとも約５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、または１０重量％のラムノリピドを含む清澄なブロスであり、ここで、前記方法は、ステップ（ａ）の後であってステップ（ｂ）の前に、（１）ステップ（ａ）において用意した前記培地を熟成させて、熟成されかつ滅菌された培地を得るステップをさらに含む。上記プロセスから得ることができる前記熟成されかつ滅菌された培地を含む組成物も提供される。本方法は、ステップ（ａ）の後であってステップ（ｂ）の前に、ステップ（ａ）において用意した前記培地から固体不用物を除去するステップをさらに含むことができる。上の特定の実施形態での組成物は約５％から約１０％の間のＲＬを含むことができる。
【０００８】
また別の実施形態では、方法は、滅菌ステップ（ｂ）の後であって分離ステップ（ｃ）の前に、ステップ（ａ）の前記滅菌培地を熟成させるステップをさらに含むことができる。また別の実施形態では、ステップ（ａ）の後および前記培地が（１）において熟成される前に、固体不用物を用意した培地から除去してもよい。
【０００９】
また別の実施形態では、方法は、２つの熟成ステップを含み、かつ以下のステップ：
（ａ）  少なくとも１種のラムノリピドを含む水性培地（例えば、発酵培地）を用意するステップと、
（ｂ）  用意した前記水性培地（例えば、発酵培地）を熟成させるステップと、
（ｃ）  （ｂ）において用意した前記培地の非ろ過ベースの滅菌を行うステップと、
（ｄ）  （ｃ）の前記滅菌培地を熟成させるステップと、
（ｅ）  （ｄ）の前記熟成させおよび滅菌された培地においてＲＬ含有液体相を不用物から分離して、前記組成物を得るステップと
を含むことができる。
【００１０】
またさらに別の実施形態では、ラムノリピドを含む組成物は、少なくとも約５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、または１０重量％のラムノリピドを含む清澄なブロスとすることができる。特定の一実施形態では、ＲＬを含む組成物、特に清澄なブロスを得るための方法は、ステップ（ｂ）の前に、ステップ（ａ）において用意した前記培地を熟成させるステップと、次に続いて（ｂ）前記熟成された培地を化学的処理により、特に過酸化物処理（例えば過酸化水素、および過酸化ベンゾイルおよびペルオキシ酢酸などの有機過酸化物および過酸化リチウム、過酸化ナトリウム、過酸化バリウムなどの無機過酸化物）により、および／または紫外光照射処理により滅菌するステップと、（ｃ）前記滅菌された培地においてＲＬ含有相を固体不用物から分離するステップとを含むことができ、場合により、（ｃ）（１）前記ＲＬ含有相をさらに滅菌するステップと、（ｃ）（２）前記滅菌したＲＬ含有相においてＲＬ含有相を固体不用物から分離して、前記清澄なブロスを得るステップとをさらに含む。特定の一実施形態では、ステップ（ｂ）における前記滅菌ステップは、化学処理および／または紫外線照射処理によるものとし、ステップ（ｃ）（２）における前記滅菌ステップは熱処理によるものとする。
【００１１】
前記熟成された培地を滅菌するステップの後に得ることができる組成物も提供される。上記のステップ（ｂ）および／またはステップ（ｃ）（１）を使用して得ることができる滅菌組成物もさらに提供される。
【００１２】
上記の方法は、脱色および／または脱臭ステップをさらに含むことができる。脱色および／または脱臭処理は滅菌ステップの前および／または後に行うことができる。上記方法を使用して得ることができる脱色および／または脱臭培地を含む組成物も提供される。
【００１３】
さらにまた別の実施形態では、ステップ（ｃ）の後に、分離したＲＬ含有相から流体または液体を除去して、例えば蒸発によって固体組成物を得ることができる。特定の一実施形態では、前記組成物は、例えば粉末形態または顆粒形態である。
【００１４】
さらにまた別の実施形態では、ラムノリピドを含む前記組成物は、少なくとも約３０重量％、少なくとも約３５重量％、少なくとも約４０重量％、少なくとも約４５重量％、少なくとも約５０重量％または少なくとも約６０重量％のラムノリピドを含む濃縮された清澄なブロスである。またより特定の一実施形態では、前記濃縮された清澄なブロスは、約３０から６０重量％の間のＲＬ、約３０から４０重量％の間のＲＬまたは約５０から６０重量％の間のＲＬを含むことができる。
【００１５】
特定の一実施形態では、上記方法におけるステップ（ａ）において用意した前記培地は、前記培地を酸で処理することによってステップ（ｂ）において滅菌され、得られた前記酸性培地は固体相、液体相および油性相を含み、少なくとも液体相は除去され、ステップ（ｃ）の前に固体相および場合により油性相は中和されて一溶液が得られ、ステップ（ｃ）において不溶性不用物質が前記溶液から除去されて、上記の前記濃縮された清澄なブロスを含む前記組成物が得られる。したがって、濃縮された清澄なブロスを得るための方法は、
（ａ）  ラムノリピド（ＲＬ）を含む水性培地（例えば、発酵培地）を用意するステップと、
（ｂ）  （ａ）において用意した前記発酵または培養培地を酸処理により滅菌して酸性化した液体相、油性相および固体相を得るステップと、
（ｃ）  （ｂ）において得られた前記液体相を除去してかつ前記固体相および場合により油性相を塩基で処理して、中和溶液を得るステップと、
（ｄ）  （ｃ）において得られた前記溶液から不溶性物質を除去して、１種または複数のラムノリピドを含む濃縮された清澄なブロスを含む組成物を得るステップと
を、含むことができる。
【００１６】
また別の実施形態では、濃縮された清澄なブロスを含む組成物を得るための方法は、追加の滅菌ステップと場合により、前記溶液から不溶性不用物を除去するためのさらなる分離ステップをさらに含むことができる。さらに、前記方法は、滅菌後に、前記滅菌した濃縮された清澄なブロスを脱色および／または脱臭するステップをさらに含むことができる。方法はまた、固体組成物を得るために、ステップ（ｃ）において得られた前記溶液から蒸発によって液体または流体を除去するステップをさらに含むこともできる。培地は、追加の滅菌ステップの前または後のいずれかに、酸で処理し次いで中和することができる。
【００１７】
上記方法では、前記固体相と油性相とは別々に中和して、別々の溶液を得てもよい。あるいは、前記の固体相と油性相とが合わされ、そして前記合わされた固体相と油性相とが中和されて、中和溶液が得られる。さらに、また別の実施形態では、固体相のみが中和される。
【００１８】
上記方法は、前記組成物を脱色および／または脱臭するステップをさらに含むことができる。さらに、前記組成物は乾燥することができる。
【００１９】
別の実施形態では、ラムノリピドを含む組成物を、これは少なくとも約３０重量％、少なくとも約３５重量％、少なくとも約４０重量％、少なくとも約４５重量％、少なくとも約５０重量％または少なくとも約６０重量％のラムノリピドを含む濃縮された清澄なブロスであるが、得るための方法は、前記追加の滅菌ステップの前および／または後に用意した前記培地を熟成させるステップをさらに含むことができる。
【００２０】
具体的には、前記方法は、
（ａ）  １種または複数のラムノリピドを含む水性（例えば、発酵）培地を用意するステップと、
（ｂ）  場合により、用意した前記培地から不溶性不用物を除去するステップと、
（ｃ）  用意した前記培地を滅菌するステップと、
（ｄ）  （ｃ）の前記滅菌された培地を熟成させるステップと、
（ｅ）  前記熟成させかつ滅菌された培地から不用物を除去するステップと、
（ｆ）  （ｅ）で得られた培地を酸で処理するステップであって、得られた前記酸性化培地が固体相、液体相および油性相を含み、少なくとも液体相が除去され、固体相および場合により油性相が中和されて中和溶液が得られるステップと、
（ｇ）  （ｆ）の前記中和溶液から固体不用物を除去して前記濃縮された清澄なブロスを含む前記組成物を得るステップと
を含む。
【００２１】
上記の方法により得ることができる中和溶液を含む組成物も提供される。上記方法を使用してまたはそれから得ることができる少なくとも約３０％ＲＬを含む脱色および／または脱臭組成物もさらに提供される。
【００２２】
得られた組成物は、ハンドソープ、ボディーウォッシュ、フェイシャルクレンザー、歯磨きペースト、シャンプー、コンディショナー、コンディショナーシャンプー、化粧品、食器用洗剤、洗濯洗剤、洗濯前処理スプレー、硬質表面クリーナー、多孔性表面クリーナー、床クリーナー、自動車クリーナー、油分回収の増強、創傷包帯、農業用抗菌剤、抗腐食処理剤、バイオレメディエーション、アンチスティックフィルム、抗生物付着剤、消火剤、抗ウイルス剤、抗カビ剤、および抗鞭毛菌剤において界面活性剤として使用することができる。一実施形態では、ある特定の陰イオン性界面活性剤は一部の用途向けに約３０％の濃度で販売されていることが多いことを考慮し、上記の方法を使用して得られたより高いＲＬの量（３０％ｗｔ／ｖｏｌ超）、より詳細には約５０％ｗｔ／ｖｏｌ超を含有する組成物を使用して、パーソナルケアおよび家庭用クリーナー市場におけるラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）などの陰イオン性界面活性剤に取って代わることが可能なラムノリピドをベースとした製品を作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ラムノリピドに富んだ清澄なブロス（ＣＢ）を得るための有機溶媒を使用しない方法を示す概略図である。
【図２】ＣＢが酸／塩基処理によって濃縮されて、濃縮された清澄なブロス（ＣＣＢ）が得られることを示す概略図である。
【図３】過酸化水素処理したＣＢからＣＣＢが得られることを示す概略図である。
【図４】過酸化水素処理した滅菌発酵培地からＣＣＢが得られることを示す概略図である。
【図５】プロセスにおいて、発酵ブロスについて分離ステップをまず行いそして後に滅菌ステップを行うことによってＣＣＢが得られることを示す概略図である。
【図６】分離ステップ、滅菌ステップ、熟成ステップそして酸性化ステップを行うことによってＣＣＢを得るための方法を示す概略図である。
【００２４】
定義
数値範囲が与えられる場合、文脈上別途明確に指示がない限り下限単位の１０分の１まで、その範囲の上限値と下限値の間の各介在値、および、記載された範囲内の他のいずれの記載値または介在値は、本発明の範囲に包含されることは理解されよう。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は、そのより小さい範囲に独立に含めることができ、それらもまた本発明の範囲内にあり、記載された範囲中で具体的に排除されたあらゆる限界値も対象となる。記載された範囲が１つまたは両方の限界値を含む場合は、これらの含められた限界値の片方または両方を排除する範囲もまた、本発明に含まれる。
【００２５】
別途定義されない限り、本明細書で使用の全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書で説明されたものと類似するか同等の方法および材料も本発明の実施または試験に使用可能であるが、好ましい方法および材料を以下に説明する。
【００２６】
本開示に引用した全ての刊行物および特許は、参照によりその全体が組み込まれる。本発明が先行発明を理由としてかかる開示に先行しないことを認めるものと解釈されるべきではない。参照により組み込まれた資料が、本明細書に矛盾するかまたは一致しない限り、本明細書はこのようなあらゆる資料に優先する。
【００２７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別途明瞭に指示がない限り、複数の参照を含むことに留意しなければならない。
【００２８】
別段の指示がない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」とは、当該一連の全ての要素を指すと理解される。当業者であれば、ただの通常の実験を使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多数の均等物を認識しまたは確認することができるであろう。このような均等物は本発明に包含されることを意図するものである。本明細書および以下の特許請求の範囲を通して、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、語「含む（comprise）」ならびに「含む（comprises）」および含んでいる「（comprising）」などの変化形は、記載された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の組み込みを意味するが、あらゆる他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を排除するものではないと理解される。したがって、用語「含む（comprising）」「含む（including）」「含有する（containing）」「有する（having）」などは、発展的にまたは制限なくおよび限定されずに読まれるものとする。本明細書で使用される場合、用語「含む（comprising）」は、用語「含有している（containing）」で置き換えられることができ、場合により、本明細書で使用される場合用語「有している（having）」で置き換えられることができる。
【００２９】
本明細書で規定の、「ラムノリピド」とは、１つまたは複数の、典型的には直鎖の、飽和または不飽和のβ−ヒドロキシカルボン酸部分を含む脂質部とラムノースの１つまたは複数のユニットの糖類部とを有する糖脂質をいう。
【００３０】
糖部と脂質部とが、糖部のラムノース部分の１−ＯＨ基と脂質部のβ−ヒドロキシ−カルボン酸の３−ＯＨ基の間のβ−グリコシド結合を介して連結している。したがって、一カルボン酸部分のカルボキシル基が、ラムノリピドの末端を形成している。２個以上のラムノース部分がラムノリピドに含まれている場合、脂質部に連結していないラムノース部分のそれぞれが１，４β−グリコシド結合を介して別のラムノース部分に連結している。２個以上のβ−ヒドロキシカルボン酸がラムノリピドに存在する実施形態では、β−ヒドロキシカルボン酸部分はそれぞれ独立して選択される。それぞれ複数のβ−ヒドロキシカルボン酸部分のβ−ヒドロキシカルボン酸部分は、一部の実施形態では、同一の場合もある。一部の実施形態では、それらはそれぞれ異なっている。
【００３１】
本明細書で規定の、用語「水性培地」とは、少なくとも約５重量％のラムノリピドまたはラムノリピドの塩を水中に含む組成物である。特定の一実施形態では、これは、当技術で公知の発酵条件下で、少なくとも１種の炭素源から１種または複数のラムノリピドを製造する能力を有する発酵の生成物を含む。
【００３２】
用語「発酵ブロス」および「発酵培地」とは同義であり、同じ意味で使用することができる。
【００３３】
１種または複数のラムノリピドを含む組成物を得るための、有機溶媒を使用しない方法が、本明細書で提供される。特定の一実施形態では、ラムノリピドは、構造（Ｉ）
【００３４】
【化１】
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を有することができる。
【００３５】
本式中、Ｒ９は水素原子（Ｈ）または脂肪族基であり、脂肪族基は、例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個または２８個を含めて、１〜約４２個、１〜約４０個、１〜約３８個、１〜約３６個、１〜約３４個、１〜約３０個、１〜約２８個などの、１個〜約４６個の炭素原子の主鎖と、２個を含めて１〜約３個の酸素原子とを有する。一部の実施形態では、それぞれの脂肪族の主鎖は、末端カルボン酸基および／または内部エステル基を有する。この点に関して例示的一例として、Ｒ９は式−ＣＨ（Ｒ５）−ＣＨ２−ＣＯＯＲ６とすることができる。これらの例示的部分では、Ｒ５は、例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個または１２個を含めて、１個から約１７個、１個から約１５個、１個から約１３個、約２個から約１３個、約３個から約１３個または約４個から約１３個などの１個から約１９個の炭素原子の長さを有する主鎖を持つ脂肪族部分とすることができる。式（Ｉ）のＲ４は水素原子（Ｈ）、またはラムノピラノシル部分である。Ｒ６は水素原子である。
【００３６】
用語「脂肪族」とは、別段明記しない限り、直鎖状または分枝状炭化水素鎖を意味し、これは飽和でも単価不飽和もしくは多価不飽和でもよく、ヘテロ原子を含んでよい。本明細書で使用する用語「ヘテロ原子」とは、炭素または水素以外のあらゆる元素の原子を意味する。本明細書では、不飽和脂肪族基は、１個または複数の二重結合（アルケニル部分）を含有する。炭化水素鎖の分枝は、直鎖ならびに非芳香族環要素を含んでよい。炭化水素鎖は、別段明記しない限り、任意の長さとすることができ、任意の数の分枝を含有してもよい。典型的には、炭化水素（主）鎖は、１〜約５個まで、約１０個まで、約１５個までまたは約２０個までの炭素原子を含む。アルケニル部分の例は、１個または複数の二重結合を含有する、直鎖または分枝炭化水素部分である。アルケニル部分は一般に、約２〜約２０個の炭素原子と１個または複数（例えば２個）の二重結合、例えば約２〜約１０個の炭素原子と１個の二重結合を含む。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルがあり、これら基のノルマル異性体、イソプロピル、イソブチル、イソペンチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル、３，３−ジメチルブチルがある。主鎖ならびに分枝鎖の両方は、例えばＮ、Ｏ、Ｓ、ＳｅもしくはＳｉのようなヘテロ原子をさらに含んでよく、または一炭素原子がこれらヘテロ原子の１つによって置きかえられていてもよい。脂肪族部分は、１個または複数の官能基で置換されていてもよく無置換であってもよい。置換基は、例えば、それらに限定されないが、アミノ、アミド、カルボニル、カルボキシル、ヒドロキシル、ニトロ、チオおよびスルホニルのような任意の官能基とすることができる。
【００３７】
より特定の一実施形態では、前記構造のラムノリピドまたはラムノリピド塩は構造（ＩＩ）
【００３８】
【化２】
2018504140.tif 000003
［式中、ｘは１または２であり、ｙは４、６または８であり、およびＭはＨ、またはアルカリ金属Ｌｉ、Ｎａ、もしくはＫ、アルカリ土類金属ＭｇもしくはＣａ、または遷移金属Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｕ、もしくはＺｎなどの金属である］
を有する。アルカリ土類金属および遷移金属の場合、ラムノリピド塩の多数部分が各金属と会合することができる。特定の一実施形態では、組成物はモノラムノリピド（式中ｘ＝１）およびジラムノリピド（式中ｘ＝２）の混合物を含むが、ここで、ｙおよびｚは６であり、ＭはＨまたはＮａである。モノラムノリピドは、式Ｃ２６Ｈ４８Ｏ９を持つ、Ｒｈａ−Ｃ１０−Ｃ１０とよぶことができる。ＩＵＰＡＣ名は、３−［３−［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−メチルオキサン−２−イル］オキシデカノイルオキシ］デカン酸である。ジラムノリピドは、式Ｃ３２Ｈ５８Ｏ１３を持つ、ＲｈａＲｈａ−Ｃ１０−Ｃ１０とよぶことができる。ＩＵＰＡＣ名は、３−［３−［４，５−ジヒドロキシ−６−メチル−３−（３，４，５−トリヒドロキシ−６−メチルオキサン−２−イル）オキシオキサン−２−イル］オキシデカノイルオキシ］デカン酸である。より特定の一実施形態では、モノラムノリピドは、総ラムノリピドの約３０％から総ラムノリピドの約５０％の量で存在することができ、ジラムノリピドは、総ラムノリピドの約５０％から約７０％ジラムノリピドの量で存在することができる。別の実施形態における組成物は、モノラムノリピド：ジラムノリピドの比が約３５：６５から約５５：４５である、モノラムノリピドおよびジラムノリピドを含んでいる。
【００３９】
最も特異的な一実施形態では、組成物は、表１に記載の化合物を含む。
【００４０】
【表１】
2018504140.tif 000004
【００４１】
上記のように、方法は、（ａ）  少なくとも１種のラムノリピド（ＲＬ）を含む水性培地を用意するステップと、（ｂ）  （ａ）において用意した前記培地の非機械的滅菌を行うステップと、（ｃ）  （ｂ）の滅菌培地中のＲＬ含有相を不用物から分離して、前記組成物を得るステップとを含む。さらに、特定の実施形態では、熟成、酸性化、中和、乾燥、脱色および／または脱臭のステップも使用し得る。
【００４２】
培地源
１種または複数のラムノリピドを含んでいる用意した水性培地は、当技術分野で公知の方法を使用するラムノリピドを産生する組換え宿主細胞由来の発酵ブロスから得ることができ、特にこの組換え宿主細胞の成果とすることができるが、あるいはラムノリピド産生微生物由来の発酵ブロスから得ることができる。ラムノリピドを産生する組換え宿主細胞は、ＲｈｌＡ遺伝子もしくはそのオルソログおよび／またはＲｈｌＢ遺伝子もしくはそのオルソログ、および／またはＲｈｌＣ遺伝子もしくはそのオルソログ、および／またはＲｈｌＲ遺伝子もしくはそのオルソログ、および／またはＲｈｌＩ遺伝子もしくはそのオルソログ、および／またはＲｈｌＧ遺伝子またはそのオルソログ等などを発現する細菌細胞などの、宿主細胞とすることができる。
【００４３】
本明細書で使用する用語「ラムノリピド産生微生物」とは、適切な条件下でラムノリピドを合成／産生する能力を有する細菌などの任意の微生物を指し、限定されるものではないが、これとしては、アクチノバクテリア門（Actinobacteria）、フィルミクテス門（Fimicutes）およびプロテオバクテリア門（Proteobacteria）の細菌が挙げられる。特定の一実施形態では、ラムノリピド産生微生物は、ガンマプロテオバクテリア（Gammaproteobacteria）綱の細菌である。さらなる一実施形態では、ラムノリピド産生微生物はシュードモナダレス（Pseudomonadales）目の細菌である。また別のさらなる実施形態では、ラムノリピド産生微生物は、シュードモナスダカエ（Pseudomonadacae）科の細菌である。さらなる一実施形態では、ラムノリピド産生微生物は、シュードモナス（Pseudomonas）属の細菌、例えば、Ｐ．アルカリゲネス（P.alcaligenes）、緑膿菌（P.aeruginosa）、Ｐ．クロロラフィス（P.chlororaphis）、Ｐ．クレマンソー（P.clemancea）、Ｐ．コリエレア（P. collierea）、蛍光菌（P.fluorescens）、Ｐ．ルテオラ（P.luteola）、Ｐ．プチダ（P. putida）、Ｐ．シュトツェリ（P. stutzeri）およびＰ．ティーズサイド（P. teessidea）である。さらなる一実施形態では、ラムノリピド産生微生物は緑膿菌（P. aeruginosa）である。
【００４４】
宿主細胞は、ＲＬ産生を可能とする条件下で培養される。種々の炭素源、例えば、単糖、例えばグルコース、二糖、例えばスクロース、アルコール、例えばグリセロール、アルカン、例えばｎ−ヘキサデカン、カプリル酸（オクタノン酸とも呼ばれる）などの脂肪酸、植物油（精製油または廃油、例えば大豆油）もしくはこれらの混合物、有機酸（例えば乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸）、アルコール（例えば、エタノール、グリセリン）、およびそれらの混合物；窒素源、例えば、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、およびコーンスティープリカー；ならびに他の栄養源、例えば、ミネラル塩およびビタミンを使用できる。細菌宿主細胞は一般には発酵プロセスに晒されることになる。細菌宿主細胞は、例えば、対数増殖期であっても静止期であってもよい。
【００４５】
滅菌
用意した水性（例えば発酵）培地は滅菌される。具体的には、上記の方法における培地は、当技術で公知の方法を使用して非ろ過法によって滅菌することができる。これらの方法は、熱ベース、化学ベースまたは紫外光照射ベースのいずれかとすることができる。特定の一実施形態では、熱ベース処理とは、湿熱滅菌、特に高圧蒸気滅菌によることができる。
【００４６】
あるいは、発酵培地は化学的に処理することができる。特定の一実施形態では、化学処理とは、下記の手順を使用して酸性化、固体不用物の除去および中和によることができる。
【００４７】
特定の別の実施形態では、水性（例えば発酵）培地は、過酸化水素、過酸化リチウム、過酸化ナトリウム、過酸化バリウム、ペルオキシ酢酸、過酸化ベンゾイル、特に当業界で公知のかつ下記の方法を使用して過酸化水素などの過酸化物で処理することができる。
【００４８】
また別の実施形態では、水性培地は、例えば、紫外光照射で照射することができる。
【００４９】
一実施形態では、水性培地（例えば、発酵培地またはブロス）は上の手順の１つによって滅菌することができる。別の実施形態では、発酵培地は、上記の複数の手順によって滅菌することができ、それらの滅菌は任意の順序とすることができる。
【００５０】
不用生成物の分離／除去（固体／液体（Ｓ／Ｌ）分離）
本明細書に記載の培地を使用して得られた組成物および／または培地由来の不用物は、当技術で公知の分離手順を使用して組成物から除去または分離することができる。これらの手順としては、限定されるものではないが、沈降バッチまたは連続遠心分離または超遠心分離が挙げられるが、これに続いて、当技術で公知の手順を使用するデカンテーションまたはろ過を行うことができる。不用物は、分離がプロセスのどこで行われるかに応じて、固体相または液体相のいずれかとすることができる。
【００５１】
熟成
培養または発酵培地は、約０〜３０℃の間にて少なくとも約１日間および約２４〜７２時間の間、インキュベートすることによって熟成させることができる。この熟成ステップは、上記の１回のまたは複数の滅菌ステップの前および／または後に行うことができる。
【００５２】
酸性化／中和
水性（例えば、発酵）培地は、酸で処理し、液体不用物を除去し、次いで残留固体相または層をおよび場合により油性相または層を中和することによって、濃縮するまたは滅菌することができる。特定の一実施形態では、水性培地は酸で処理することができ、したがって、培養培地は約１．５〜２．５、好ましくは約２．０５〜約２．１５の間のｐＨに調整される。酸は、酢酸などの有機酸でも鉱酸であってもよい。好ましい一実施形態では、酸は鉱酸、例えばＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３またはＨ３ＣｌＯ４である。その結果、液体相、油性相および固体相が生成する。液体相は、当技術で公知の手順を使用して、および特定の一実施形態では上記の方法を使用して除去される（例えば、ろ過、またはデカンテーションと組み合わせた遠心分離もしくは沈降）。
【００５３】
固体相および場合により油性相は、約５．５超のｐＨ、好ましくは約６．５〜７．５の間のｐＨ、より好ましくは約６．９〜７．１の間のｐＨに中和される。特定の一実施形態では、固体相および場合により油性相は、固体の乾燥鉱物塩基（例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮａＨＣＯ３）で処理する。固体相と油性相の両方を中和する場合、これらの相を合わせて中和してもよく、あるいは別々に中和してもよい。中和後、固体不用物は、限定されないが、ろ過、沈降または遠心分離およびデカンテーションを含めて、上記の方法によって除去される。中和された材料はまた、上記のようにさらなる滅菌工程に供することもできる。
【００５４】
脱色／脱臭
水性培地（例えば、発酵培地またはブロス）は、当技術で公知の手順を使用して脱色および／または脱臭することができる。特定の一実施形態では、化学的処理および／または紫外照射処理もしくは可視照射処理が使用される。
【００５５】
特定の一実施形態では、前記脱色および／または脱臭ステップは、過酸化水素または有機過酸化物（例えば、過酸化ベンゾイルまたはペルオキシ酢酸）もしくは無機過酸化物（例えば過酸化リチウム、過酸化ナトリウム、過酸化バリウム）のいずれかを使用して過酸化物処理によって行うことができる。特定の一実施形態では、水性培地（例えば、発酵培地またはブロス）を過酸化物で、特に過酸化水素で、約１〜５％ｖ／ｖの濃度で、約４８〜１２０時間、より詳細には約３〜４％ｖ／ｖの間で約７２〜９６時間、処理することができる。
【００５６】
あるいは、水性培地は、３５０〜５５０ｎｍ、好ましくは４００〜４５０ｎｍの紫外照射または可視照射によって脱色および／または脱臭することができる。照射線量は少なくとも約１００Ｊ／ラムノリピド１ｇ、優先的には少なくとも約１ｋＪ／ラムノリピド１ｇ、より優先的には少なくとも約１０ｋＪ／ラムノリピド１ｇである必要がある。
【００５７】
この水性培地は、滅菌の前および／または後、および上記の酸性化および中和プロセスの前または後に、脱色および／または脱臭することができる
【００５８】
液体除去
別の実施形態では、過酸化物処理による脱色および／または脱臭をフォローしないことを条件として、液体は、当技術で公知の方法を使用して固体不用物を除去した後に除去することができる。これらには、それらに限定されないが、熱、蒸発、フリーズドライ（凍結乾燥）、ドラム乾燥が挙げられる。
［実施例］
【実施例１】
【００５９】
発酵ブロスから、ラムノリピド（ＲＬ）に富んだ溶液（清澄なブロス）を回収するための、有機溶媒を使用しない方法
ジラムノリピドおよびモノラムノリピドの混合物少なくとも５０ｇ／Ｌを含有する希薄溶液中の発酵ブロスからラムノリピドを、有機溶媒を使用せずに回収する方法が、本明細書で提供される。使用されている一般スキームを図１に示す。
【００６０】
本方法は、室温での熟成ステップと、これに続く高圧蒸気滅菌ステップと、標準的な固体／液体分離技法とを利用して、細菌細胞物質から少なくとも５０ｇ／Ｌを含有した清澄でラムノリピドに富んだ溶液を分離する。具体的には、ラムノリピド含有ブロスは、ｐＨ６．２〜６．５の３７℃での４８〜７２時間の緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）による発酵から、大豆油を原料として用いて生成される。熟成前の発酵ブロスの最終ｐＨは６．４〜６．５の範囲である。室温で約４８時間熟成後、発酵ブロスを蒸気加熱または高圧蒸気滅菌により滅菌する。固体／液体分離後、ラムノリピド溶液は透明であり、すぐに使用することができる。ラムノリピド溶液の暗褐色は、過酸化水素を２〜３％ｖ／ｖにて室温で７２〜９６時間かけて添加することで減少させることができる。有機過酸化物（例えば、過酸化ベンゾイルまたはペルオキシ酢酸）または無機過酸化物（例えば、過酸化リチウム、過酸化ナトリウム、過酸化バリウム）を含めて、他の過酸化物をこのステップで使用することもできる。ラムノリピドに富んだ溶液（活性５％超）が得られる。
【００６１】
清澄でラムノリピドに富んだ溶液はまた、過酸化物で処理しない場合、凍結乾燥して、薄く着色した粉末を製造することができる。ラムノリピドに富んだ粉末（活性７５％超）が得られる。
【実施例２】
【００６２】
清澄な発酵ブロスからの沈殿と塩基中での再溶解とによるラムノリピドの水溶液の単離および本方法から得られる組成物
本方法は、実施例１で得られた清澄なブロスから出発し、図２に概略的に示されている。実施例１に記載のように、清澄なブロスは、ｐＨ６．０〜６．５で終わる発酵ブロスを周囲条件下で約２日間熟成させることで、作製される。バイオマスは、この熟成方法に使用した容器の底に沈降し、透明な上清は、除去後、清澄なブロスである。方法の次のステップは、ｐＨが約２．１になるまで、濃硫酸などの酸を添加することである。ラムノリピドは溶液から沈殿し、このステップに使用された容器の底に固体相および油状液体相を形成する。固体相および油状液体相の分離は、遠心分離によって迅速化できる。固体相および油状液体相は、廃棄してもリサイクルしてもよい水性上相または水性上層から分離される。次いで、ｐＨが約７．０に達するまで、合わせた固体および油状液体のラムノリピド含有相を、水酸化ナトリウムなどの固体塩基で処理する。これによって、約２５〜３０％の濃度を持つラムノリピドの粘性水溶液が製造される。最終ステップは、２５〜３０％ラムノリピド溶液を遠心分離することと、残留固形体から形成されたペレットから液体最終生成物をデカントすることである。この液体を凍結乾燥（フリーズドライ）して、乾燥固体製品を製造することができる。
【実施例３】
【００６３】
ｐＨシフトを使用する、３５〜４０％ラムノリピド溶液を製造するための有機溶媒を使用しない濃縮方法
実施例１に記載の「低減された色および臭気を有する清澄なブロス」または「低減された色および臭気を有する滅菌発酵ブロス」を開始とする、ｐＨシフトを使用する、３０〜４０％ラムノリピド溶液を製造する方法が提供されるが、図３および図４に概略的に示されている。
【００６４】
「低減された色および臭気を有する清澄なブロス」および「低減された色および臭気を有する滅菌発酵ブロス」は、清澄なブロスまたは滅菌した発酵ブロスそれぞれに３〜５％ｖ／ｖの過酸化水素を添加することによって得ることができる。室温で７２〜９６時間後、清澄なラムノリピドに富んだ溶液の色はわずかに黄色であるが、ラムノリピドの損失を伴わず、臭気は低減されている。その後、低減された色および臭気を有する清澄なブロスは、クロスフローろ過によって１ミクロンにてろ過されるか、または固形体が遠心分離によって、またこれに続くデカントによって除去される。硫酸などの濃酸をｐＨが約２．１になるまで、濾液（透過液）または上清中に添加する。次いで、この混合物を、固体相と油状液体相から構成されているラムノリピドに富んだ層へと容器の底部に分離させる。次いで、合わせた固体および油状液体のラムノリピド含有相は、水性の上部層から分離され、ｐＨが約７．０に達するまで、水酸化ナトリウムなどの固体塩基で処理される。これによって、ラムノリピドの粘性水溶液が製造される。
【００６５】
最終ステップは、生成するラムノリピド溶液を遠心分離することと、残留固形体から形成されたペレットから液体最終生成物を取り出すことである。最終液体生成物は３０〜４０％のラムノリピドである。
【実施例４】
【００６６】
方法の最終段階での滅菌を伴う、発酵ブロスからのラムノリピドの単離方法および本方法で製造された物質
本方法は、図５に概略的に示されているが、ラムノリピドを産生する生体がなお含有されている発酵ブロスの遠心分離またはろ過などの固体／液体分離プロセスを行うことによって開始される。次いで、清澄な液体生成物は、濃硫酸、または別の濃い、強い鉱酸を使用してｐＨ２．１に酸性化される。沈降または遠心分離の後、油状層と固体層である密度の高い生成物から水層をデカントする。この油状および／または固体層は、水酸化ナトリウムなどの固体塩基でｐＨ７に中和し、溶液が得られる。最終的な固体／液体分離工程を行って、あらゆる残留不溶性不純物を除去する。次いで、液体は、例えば、高圧蒸気滅菌により滅菌する。
【実施例５】
【００６７】
ｐＨシフトを使用する、５０〜６０％ラムノリピド溶液を製造するための有機溶媒を使用しない濃縮方法
５０〜６０％ラムノリピド溶液を製造するために、実施例３、「ｐＨシフトを使用する、３０〜４０％ラムノリピド溶液を製造するための有機溶媒を使用しない濃縮方法」で開示されている方法の変更形態が提供される。
【００６８】
清澄なブロスの調製および濃硫酸（９５〜９８ｗｔ％）によるｐＨ２．１への清澄なブロスの酸沈殿は、実施例３に開示されているのと変更なしである。ｐＨ２．１になるまで清澄なブロスに９５〜９８ｗｔ％の硫酸を加えた後、次いで、この混合物を、固体相と油状液体相から構成されているラムノリピドに富んだ層へと容器の底部に分離させる。しかし、５０〜６０％ラムノリピド溶液を得るために、油状物質と固体を、例えば遠心分離を使用して分離する。遠心分離後、固体が底に得られ、油状物質は中間にあって、一方、水性上部層は容器の上部にある。次いで、固形体を、油状液体のラムノリピド含有相から分離し、その生成物が溶解するｐＨ約７．０に達するまで水酸化ナトリウムなどの固体塩基で処理する。
【００６９】
最終ステップは、生成するラムノリピド溶液を遠心分離することと、あらゆる残留固形体から形成されたペレットから液体最終生成物を取り出すことである。最終の液体生成物は５０〜６０％のラムノリピドであり、本発明の一部である。この液体は、凍結乾燥（フリーズドライ）して乾燥固体製品を製造することができ、これも本発明の一部である。
【実施例６】
【００７０】
溶媒抽出をせずにラムノリピド高濃縮物を得るための、滅菌前に発酵ブロスからラムノリピドを単離する方法
この方法は、５０〜６０％ラムノリピド溶液を製造するための実施例５、「ｐＨシフトを使用する、５０〜６０％ラムノリピド溶液を製造するための有機溶媒を使用しない濃縮方法」に記載の方法の変更形態であるが、溶液は酸沈殿後に得られる油状層を含み、したがってラムノリピドの回収が高められることから、より高い収率にある。
【００７１】
図６にこの方法が記載されている。これは、ラムノリピドを産生した細胞、優先的には緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来のラムノリピドおよびバイオマスを含有する発酵ブロスを開始とする。まず、遠心分離を少なくとも７５００ｇで少なくとも５分間行う。次いで、清澄なブロス（ＣＢ）を微生物細胞（固体）から分離し、蒸気オートクレーブにより滅菌する。次いで、ＣＢは、遠心分離またはろ過に先立ち好ましくは一晩沈降させ、沈降中に沈殿した追加のあらゆる固形体を除去する。
【００７２】
次いで、このさらに清澄なＣＢを、濃硫酸、または別の濃い、強い鉱酸を使用してｐＨ２．１に酸性化する。この酸性化した清澄なブロスは本発明の一部である。沈降または遠心分離の後、水層を固体層からデカントする。次いで、ｐＨが約７．０に達するまで、固体を水酸化ナトリウムなどの固体塩基で処理する。その結果、５０〜６０％のラムノリピドを有する液体が生じる。この液体を、凍結乾燥（フリーズドライ）して、乾燥固体製品を製造することができる。
【００７３】
発酵が停止された直後に遠心分離し、次いで実施例１に記載のように生成物を熟成させることにより、さらに処理することができる清澄なブロス（ＣＢ）を製造する。このことによって、発酵ブロスの固体／液体分離が困難になるおそれがあるという問題が解決される。
【００７４】
全体的な方法により、高濃度のラムノリピドバイオサーファクタントである製品が、当初の発酵ブロスにおけるラムノリピドの約８０％超の回収率を有して、費用効果的に製造される。このことによって、ラムノリピド発酵から生成物を単離することは高価すぎて商業的に実現不可能であると認識されている問題が、解決される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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