(57)【要約】混合物中にある特定の分子実体を検出及び定量化するための、改良されたキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、アフィニティーキャピラリー電気泳動（ＡＣＥ）、及び部分充填ＡＣＥ（ＰＦ−ＡＣＥ）のシステム及び方法が提供される。ヘテロ二量体の二重特異性抗体は、製造中、ホモ二量体種と共に生成されることがしばしばあり、このことによって二重特異性抗体の定量化に混乱が生じ得る。二重特異性のヘテロ二量体及びホモ二量体の混合物中にある特定のホモ二量体を検出するキャピラリー電気泳動システム及び方法が開示される。二重特異性抗体のサブユニットのうちの１つに結合することができるリガンドは、混合物と接触して、電気泳動移動度が減少した複合体を形成し、これによって非結合のホモ二量体の検出が可能になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の他のタンパク質からの第１のタンパク質の純度を評価するために使用される、タンパク質の混合物を有する組成物であって、前記組成物が、第１のタンパク質；１つ以上の他のタンパク質；及び、前記１つ以上の他のタンパク質のうちの１つに結合することができる修飾リガンドであって、前記結合によって、前記修飾リガンドを伴わない前記１つ以上の他のタンパク質よりも低い電荷対質量比を有するタンパク質−リガンド複合体が形成される、修飾リガンドを含み、前記修飾リガンドが非修飾リガンドよりも等電点が低く、かつ前記修飾リガンドが前記第１のタンパク質には結合しない、前記組成物。
【請求項２】
前記修飾リガンドが、前記修飾リガンド上のリジン残基による共有結合的連結を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１のタンパク質がマルチサブユニットタンパク質であり、前記１つ以上の他のタンパク質がマルチサブユニットタンパク質を含み、前記第１のタンパク質及び第２のタンパク質が類似の電荷対質量比を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記第１のタンパク質が、２つの同一の第１のサブユニットを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記第１のタンパク質が単一特異性抗体であり、第２のタンパク質が二重特異性抗体である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記第１のタンパク質が単一特異性抗体であり、第２のタンパク質が単一特異性抗体である、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記修飾リガンドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
以下を備えるシステム：
ａ．タンパク質の混合物を有する組成物であって、
ｉ．第１のタンパク質；１つ以上の他のタンパク質；及び、前記１つ以上の他のタンパク質のうちの１つに結合することができる修飾リガンドであって、前記結合によって、前記修飾リガンドを伴わない前記１つ以上の他のタンパク質よりも低い電荷対質量比を有する１つ以上のタンパク質−リガンド複合体が形成される、修飾リガンドを含み、前記修飾リガンドが非修飾リガンドよりも等電点が低く、かつ前記修飾リガンドが前記第１のタンパク質には結合しない、前記組成物、
ｂ．キャピラリー、
ｃ．検出器、
ｄ．前記キャピラリーの一方の端部またはその付近にあるアノード、
ｅ．前記キャピラリーの他方の端部またはその付近にあるカソード、ならびに
ｆ．電源。
【請求項９】
前記修飾リガンドが、前記修飾リガンド上のリジン残基による共有結合的連結を含む、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記検出器が、前記キャピラリーの前記カソード側の端部の付近に配置され、前記タンパク質混合物が、前記キャピラリーにおいて前記キャピラリーの前記アノード側の端部に配置される、請求項８に記載のシステム。
【請求項１１】
前記検出器が、２００ｎｍ〜２８０ｎｍでの吸光度またはレーザー誘起蛍光を検出する、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記キャピラリーが、前記アノードと前記検出器との間に配置されたリガンドプラグを備え、前記リガンドプラグが前記修飾リガンドを含む、請求項８に記載のシステム。
【請求項１３】
前記修飾リガンドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のシステム。
【請求項１４】
実質的に類似した電荷対質量比を有するタンパク質の混合物中にある、第１のタンパク質の純度を評価するための方法であって、前記方法が
ａ．前記タンパク質の混合物を修飾リガンドに接触させて試料を形成させる工程、
ｂ．前記試料を、リガンドプラグを備えるキャピラリーにアプライする工程、
ｃ．前記キャピラリーに電圧を印加する工程、
ｄ．前記キャピラリーの中を、他のタンパク質よりも速い速度で前記第１のタンパク質を移動させる工程、及び
ｅ．前記第１のタンパク質を検出する工程
を含み、
（ｉ）前記修飾リガンドが酸性部分を含み、（ｉｉ）前記修飾リガンドが前記第１のタンパク質には結合せず、（ｉｉｉ）前記リガンドプラグが前記修飾リガンドを含む、前記方法。
【請求項１５】
前記修飾リガンドが、前記修飾リガンド上のリジン残基による共有結合的連結を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記キャピラリーが、カソード側の端部、アノード側の端部、及び前記カソード側の端部の付近に配置された検出器窓を備え、前記リガンドプラグが前記アノード側の端部の付近に配置される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１のタンパク質が、２００ｎｍ〜２８０ｎｍの範囲の波長における吸光度またはレーザー誘起蛍光を測定する検出器の前記検出器窓から検出される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記修飾リガンドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のタンパク質が第１の２価の単一特異性抗体であり、前記タンパク質の混合物が、二重特異性抗体及び第２の２価の単一特異性抗体を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記修飾リガンドにおける修飾がビオチンである、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（１９９８）に準拠する配列表のテキストファイルが、本明細書と同時に提出されている。このテキストファイルの内容は、参照によって本明細書に組み込まれている。配列表を含むテキストファイルは「１０１４１ＵＳ０１＿ＳＴ２５」という名称であり、２０１６年４月１１日に作成され、約１９，０２５バイトの情報を含んでいる。
【０００２】
分野
本発明は、概して、ポリペプチド及びポリペプチド複合体の複合混合物中にある１つ以上のポリペプチド種を検出するための、組成物、システム及び方法を対象にしている。具体的には、本発明は、二重特異性抗体を含む多量体の混合物中にあるホモ二量体を検出するための組成物、システム及び方法を含む。
【背景技術】
【０００３】
関連技術
モノクローナル抗体は、様々な疾患の治療法における重要なクラスに相当する。モノクローナル抗体の汎用性を増大させることについての関心が高まっており、その１つのアプローチは、二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）の設計及び産生である。２つの重鎖及び２つの軽鎖を使用した従来的なｂｓＡｂ発現を行うと、重鎖及び軽鎖のランダムな相互作用に起因して、複数の（１０個以下の）望ましくない多量体タンパク質生成物がもたらされることになる。２つのユニークな重鎖と１つの共通の軽鎖とを共発現させれば、副生成物の数を２つのホモ二量体種まで最小限化することになるが、この後、精製中にこれらを除去する必要があり得る。したがって、所望のヘテロ二量体（ｂｓＡｂ）からホモ二量体副生成物を検出し区別するための、有効かつ効率的な方法に対するニーズが存在する。２つのユニークな重鎖及び２つの同一の軽鎖からなるｂｓＡｂの純度を推定する試薬および方法が開示される。
【発明の概要】
【０００４】
概要
出願人らは、多量体生成物の混合物中のホモ二量体を検出するための試薬及びプロセスを開発した。この試薬は、ホモ二量体副生成物の特定のサブユニットに結合するリガンドを含む。このプロセスにはキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）の改変形態が含まれ、改変形態は、リガンドと多量体生成物の混合物とを組み合わせてから電気泳動を行うアフィニティーキャピラリー電気泳動（ＡＣＥ）、及びキャピラリーをリガンドで部分的に充填してから多量体生成物の混合物を電気泳動にかける部分充填アフィニティーキャピラリー電気泳動（ＰＦ−ＡＣＥ）と呼ばれる。多量体生成物には、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含有するヘテロ二量体、２つの第１のサブユニット（別名「ホモＢ」）を含有する第１のホモ二量体、ならびに２つの第２のサブユニット（別名「ホモＡ」）を含有する第２のホモ二量体が含まれる。リガンドは特定のサブユニットに結合し、一部の実施形態では第１のサブユニットに、他の実施形態では第２のサブユニットに結合する。
【０００５】
一実施形態では、多量体タンパク質の混合物は、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを発現する異種の核酸を含有する細胞によって生成される。特定の実施形態では、この細胞は、モノクローナル抗体のような生物療法用の分子を産業規模で生産する際に使用される、哺乳動物細胞である。細胞には、ＣＨＯ細胞ならびにその誘導体であるＣＨＯ−Ｋ１細胞及びＥＥＳＹＲ（登録商標）細胞が含まれる。
【０００６】
一実施形態では、ホモ二量体（第１のホモ二量体または第２のホモ二量体のいずれか）は、ヘテロ二量体及び他のホモ二量体の電荷／質量比を低下させることによって、キャピラリーゾーン電気泳動を介して検出される。電荷／質量比は、リガンドのうちの１つがサブユニットのうちの１つに結合して電荷／質量比が低い複合体形成がもたらされた場合に低下し、このことによってキャピラリー内での複合体の移動度が、非結合のサブユニット及びそのホモ二量体に比べて大きく遅延される。例えば、多量体の混合物が、第２のサブユニットに結合するリガンド（第２のリガンド）と組み合わされた場合、この第２のリガンドは、（第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含有する）ヘテロ二量体及び（２つの第２のサブユニットを含有する）第２のホモ二量体に結合することになる。第１のホモ二量体は結合しないままであり、そのためサイズに対する電荷比がより高く、それに伴いキャピラリー内の移動度も高い。したがって、電気泳動の実施中に、第１のホモ二量体のピークが最初に検出され、そのピークは、複合体を形成した第２のホモ二量体及びヘテロ二量体からは十分に分離されている。同様に、多量体の混合物が第１のリガンドと組み合わされた場合、複合体を形成した第１のホモ二量体及びヘテロ二量体の電気泳動移動度は低下し、これによって第２のホモ二量体が十分に分離されたピークとして検出されることが可能になる。この手順は、アフィニティーキャピラリー電気泳動（ＡＣＥ）と呼ばれる。
【０００７】
別の実施形態では、キャピラリーは、予めリガンドプラグをロードされる。多量体の混合物をロードし、キャピラリー内を電気泳動にかけると、各多量体種は、キャピラリー中にある「リガンドプラグ」に遭遇する。リガンドに結合するサブユニットを含有する任意の多量体は、リガンドに結合し、その電気泳動移動度は速度が抑えられることになる（すなわち、移動度シフト）。次に、非結合のホモ二量体は、リガンドと結合した多量体から分離されて自由にキャピラリー内を移動する。この手順は、部分充填アフィニティーキャピラリー電気泳動（ＰＦ−ＡＣＥ）と呼ばれる。
【０００８】
第１のホモ二量体及び第２のホモ二量体の両方を検出するために、少なくとも２つの別個の手順が実施され、１つは、第２のホモ二量体を検出するために第１のリガンドを使用し、１つは、第１のホモ二量体を検出するために第２のリガンドを使用する。任意選択により、標準的なＣＺＥ手順を実行してヘテロ二量体を検出してもよいが、両方のホモ二量体に類似した電荷／質量を有するヘテロ二量体は、これらのホモ二量体と同じ「ピーク」で検出されることになる。ヘテロ二量体の画分は、第１のＡＣＥまたはＰＦ−ＡＣＥ手順で検出される第１のホモ二量体を引き、第２の手順で検出される第２のホモ二量体を同様に引くことによって、定量化される。
【０００９】
一実施形態では、第１のサブユニットは、第１のサブユニットがプロテインＡに結合することを可能にする免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含有し、第２のサブユニットは、第２のサブユニットがプロテインＡに結合することを可能にしない変異した免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含有する。一実施形態では、各ホモ二量体は、個別の特異性を有する単一特異性抗体であり、ヘテロ二量体は、第１のホモ二量体の同族抗原及び第２のホモ二量体の同族抗原の両方に対して特異的な二重特異性抗体である。一実施形態では、３つの抗体の各々（例えば、ｂｓＡｂすなわちヘテロＡＢ、ホモＡ、ホモＢ）は同一の軽鎖を含有し、第１及び第２のサブユニットとは重鎖を指している。これらの抗体は、ホモ二量体及びヘテロ二量体と呼ばれているが、通常、実際にはこれらは四量体である。軽鎖は各多量体種とも同じものであるため、命名に関しては実質的に無視されている。特定の実施形態では、第１の重鎖はプロテインＡに結合することができ、第２の重鎖は、プロテインＡとの結合を不可能にする、ＣＨ３ドメインのＨ９５Ｒ及びＹ９６Ｆ置換を含有する（ＩＭＧＴに従ったナンバリング；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，（２００８）４０  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０１−１１１を参照）。
【００１０】
一実施形態では、リガンドは、サブユニットに結合する抗体である。第１のリガンドは、第１のサブユニットに結合するが第２のサブユニットには結合しない抗体であり、第２のリガンドは、第２のサブユニットに結合するが第１のサブユニットには結合しない抗体である。一実施形態では、リガンドのｐＩ（等電点）は、各多量体のｐＩと異なっているかまたは異なるように改変される（例えば、より酸性であるかまたはｐＩが低い）。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】二重特異性抗体（ヘテロＡＢ）及び、生成中に発現される生成物関連副生成物（ホモＡ及びホモＢ）を示す模式図である。プロテインＡに対する結合性を欠くＣＨ３ドメインのジペプチド置換は、塗りつぶされた六角星によって示されている。
【図２】還元条件下のＣＥ−ＳＤＳによって分析された、ホモＡ（ａ）、ホモＢ（ｂ）、ｂｓＡｂ１（ｃ）、ホモＡ、ホモＢ、及びｂｓＡｂ（ｄ）、ならびに分子量ラダー（ｅ）の電気泳動図を示している。
【図３】ＣＺＥを介して分離された、ｂｓＡｂ１（トレースａ）、ホモＢ ｍＡｂ（トレースｂ）、ホモＡ ｍＡｂ（トレースｃ）、及びホモＡ：ｂｓＡｂ１：ホモＢの１：２：１混合物（トレースｄ）の代表的な電気泳動図を示している。
【図４】ｂｓＡｂ２（トレースａ）、ホモＢ ｍＡｂ（トレースｂ）、及びホモＡ ｍＡｂ（トレースｃ）のＣＺＥ電気泳動図を示している。
【図５】ｂｓＡｂ３（トレースＡ）試料、抗Ａ ｍＡｂ親和性リガンド存在下でのｂｓＡｂ３（トレースＢ）、及び抗Ｂ ｍＡｂ親和性リガンド存在下でのｂｓＡｂ３（トレースＣ）の電気泳動図を示している。
【図６】鎖Ｂ特異的リガンドのｂｓＡｂ３に対する化学量論的結合を示すＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示している。トレースａはｂｓＡｂ３を示し、トレースｂは抗Ｂ抗体を示し、トレースｃはｂｓＡｂ３及び抗Ｂ抗体の組み合わせを示している。
【図７】ｂｓＡｂ３（トレースＡ）、抗−鎖Ｂリガンド存在下かつＡＣＥ条件下の場合（トレースＢ）及び、抗−鎖Ｂリガンド存在下かつＰＦ−ＡＣＥ条件下の場合（トレースＣ）の試料における電気泳動図を示している。
【図８】遊離ホモＢ ｍＡｂ（トレースＡ）、抗−鎖Ｂ ｍＡｂ存在下のホモＢ ｍＡｂ（トレースＢ）または抗−鎖Ａ ｍＡｂ存在下のホモＢ ｍＡｂ（トレースＣ）の電気泳動図を示している。遊離ホモＡ ｍＡｂ（トレースＤ）及び、抗−鎖Ａ ｍＡｂ存在下のホモＡ ｍＡｂ（トレースＥ）または抗−鎖Ｂ ｍＡｂ存在下のホモＡ ｍＡｂ（トレースＦ）の電気泳動図も示されている。
【図９】ｂｓＡｂ３（トレースａ）、５％のｍＡｂ不純物を添加したｂｓＡｂ３（トレースｂ）、さらに抗Ａ ｍＡｂ存在下の場合（トレースｃ）または抗Ｂ ｍＡｂ存在下の場合（トレースｄ）の電気泳動図を示している。
【図１０】ホモ二量体Ａ（ホモＡ）における、ホモＡの相対濃度（パーセント）に対する補正ピーク面積を示している。
【図１１】ホモ二量体Ｂ（ホモＢ）における、ホモＢの相対濃度（パーセント）に対する補正ピーク面積を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
本発明の説明の前に理解されたいことは、本発明が記載された特定の方法及び実験条件に限定されないことであり、それはこのような方法及び条件は変動し得るからである。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本明細書の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになるため、こうした用語が限定的であるようには意図されていないことも理解されたい。
【００１３】
本発明の実施または試験の際に、本明細書に記載の方法及び材料に類似したまたは同等の、任意の方法及び材料を使用することは可能であるが、これより好ましい方法及び材料について説明する。本明細書で引用される全ての刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれて記載される。別途定義されない限り、本明細書で使用される技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
【００１４】
本明細書で使用する「リガンド」という用語は、別の分子に結合する任意の分子を意味する。「リガンド」は、生化学分野では同族受容体に結合するアゴニストまたはアンタゴニストとしての従来的な意味を有する。本明細書で使用する「リガンド」には抗体抗原反応も含まれ、抗体がリガンドであり抗原が同族結合パートナーである場合も、その逆であるところの抗原がリガンドであり抗体（またはそのフラグメント）が同族結合パートナーである場合も含まれる。
【００１５】
リガンドは、「同族」の分子に結合する任意の分子とすることができ、抗体、抗体フラグメント、ＳｃＦｖ分子、ｔｒａｐ分子、受容体コンカテマー、１つ以上のＣＤＲを含有する組換え分子または合成分子、抗原、ハプテン、組換えエピトープ、古典的リガンド、受容体、可溶性受容体フラグメント、核内受容体、ステロイド、ペプチド、アプタマー、ＲＮＡ、ＤＮＡ、有機分子、小分子などが含まれる。
【００１６】
「リガンドプラグ」という用語は、キャピラリー内のリガンドに富んだ部位を指し、概してキャピラリーのローディング側の端部（例えば、アノード側の端部の付近）にある。キャピラリーに予めリガンドをロードしてもよく、このリガンドは、自らの同族結合パートナーがキャピラリーを移動する際にその同族結合パートナーと結合する（すなわち「捕捉する」）「プラグ」を形成し、そして移動度が変化した「複合体」を形成する。
【００１７】
「複合体」という用語は、小分子、金属、ポリペプチド、タンパク質、核酸、アプタマーまたは他の分子実体などの、少なくとも２つの分子実体を含む高次の分子実体を指し、かつそれらを含む。「複合体」という用語には、マルチサブユニットタンパク質も含まれる。例えば、ヘモグロビンは、２つのアルファグロビン鎖、２つのベータグロビン鎖、４つの鉄含有ヘム基、及びＣＯ２またはＯ２を含有する複合体である。例えば、自らの同族リガンドに結合している受容体は複合体であり、抗原に結合している抗体は複合体であり、基質に結合している酵素、または基質及び補酵素に結合している酵素は、複合体である。本明細書で開示の一部の実施形態で使用する「複合体」には、リガンドに結合しているホモ二量体またはヘテロ二量体が含まれる。複合体は、「分子実体」または「実体」とも呼ぶことができる。例えば、リガンドに結合しているホモ二量体またはヘテロ二量体は、複合体であり、それ自身を「実体」または「分子実体」と呼ぶことができる。
【００１８】
本明細書で使用する「多量体」という用語、そして「多量体タンパク質」というフレーズは、２つ以上の構成要素サブユニットから作られるタンパク質を示すために互換的に使用される。サブユニットは、共に結合して、あるいは相互作用して多量体を形成することができる。結合または相互作用は、共有結合及び非共有結合を含めた任意の１つ以上の分子間結合を介したものであり得る。「ホモ二量体」は、同じまたは機能的に同等な２つ以上のサブユニットを含む多量体である。本明細書で使用する場合、ホモ二量体は、同じまたは機能的に同等な少なくとも２つのポリペプチドを含むが、ホモ二量体はさらなるサブユニットも含んでよい。例えば、モノクローナル抗体は、２つの同一の重鎖を含有する。そのため、モノクローナル抗体は「ホモ二量体」であると考えることができる。ただし、完全に古典的なモノクローナル抗体は２つの軽鎖も含有するため、四量体と呼ぶこともできる。「ヘテロ二量体」は、同じではない、または機能的に同等ではない、２つ以上のサブユニットを含む多量体である。ヘテロ二量体は、２つの異なるサブユニットのほかにさらなるサブユニットを含有してもよい。例えば、二重特異性抗体は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含有し、抗体の半分（例えば、１つの重鎖及び１つの軽鎖）が１つのエピトープに結合し、抗体のもう半分（例えば、別の重鎖及び同じ軽鎖、同じ重鎖及び別の軽鎖、または別の軽鎖及び別の重鎖）は、別のエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体は四量体である。二重特異性という用語は、同じでないまたは機能的に同等でない重鎖に関するものであるため、場合によっては、二重特異性抗体は二量体である。
【００１９】
本明細書で使用する「サブユニット」または「構成要素サブユニット」または、多量体の構成要素、通常は（ただし常にではない）ポリペプチドを意味する。構成要素のポリペプチドは単鎖であり、その長さは３アミノ酸から数千アミノ酸までの任意のサイズをとり得る。
【００２０】
本明細書で使用する「結合する」または「結合している」という用語は、ある分子が非共有結合力によって別の分子と相互作用することを意味する。結合する、または結合しているということは、抗体とその抗原との間の力、またはリガンドとその受容体との間の力などの、比較的強い力（マイクロモルまたはＫｄ未満）を含意する。非共有結合力には、水素結合、イオン双極子及びイオン誘起双極子相互作用、イオン相互作用、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、ハロゲン結合、パイ−パイ相互作用、及びカチオンパイ−アニオンパイ相互作用が含まれる。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）３０  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２１１−２４３を参照されたい。
【００２１】
「付着する」、「架橋する」、「付着している」、または「架橋されている」という用語は、２つ以上のサブユニットがより複雑なタンパク質を形成するための共有結合的な相互作用を表すために使用される。
【００２２】
「ＣＨ３」、「ＣＨ３ドメイン」、及び「免疫グロブリンＣＨ３ドメイン」は互換的に使用され、おおよそ３４１番目（ＥＵナンバリングシステムによる）のアミノ酸からＣ末端に及ぶ免疫グロブリン重鎖の領域を示す（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９６９）６３（１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７８−８５）。ＣＨ３ドメインはプロテインＡとの結合に関係し、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４のＣＨ３ドメインはプロテインＡとの結合を調節し、ＩｇＧ３のＣＨ３ドメインはプロテインＡを調節しないようになっている（Ｖａｎ  Ｌｏｇｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ  ａｎｄ  ａｌｌｏｔｙｐｅｓ，１５（３）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７５−８（１９８２））。ＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸置換Ｈ９５Ｒ及びＹ９６Ｆ（ＩＭＧＴナンバリングによる；ＥＵナンバリングシステムではＨ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆとなる）は、プロテインＡとの結合を不可能にする（米国特許第８，５８６，７１３号（２０１３年１１月１９日発行））。
【００２３】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖（２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖）からなる免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨ）及び重鎖定常領域を有する。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含有する。各軽鎖は、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域にさらに再分割されることができ、この領域の間に保存的な領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と称される）が分散して存在する。各ＶＨ及びＶＬは３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向けてＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で配列されている。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスにおけるグリコシル化免疫グロブリン及び非グリコシル化免疫グロブリンの両方を指す。「抗体」という用語には、組換え手段によって調製、発現、創出または単離される抗体分子、例えば、抗体を発現するように遺伝子導入された宿主細胞から単離される抗体など、が含まれる。抗体の構造の概説については、Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＭＧＴ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｖ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ，２７（１）Ｄｅｖ．  Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５−７７（２００３）；及びＭ．Ｐｏｔｔｅｒ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，２（１）Ｓｕｒｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２７−４２（１９８３）を参照されたい。
【００２４】
抗体という用語には「二重特異性抗体」も含まれ、二重特異性抗体には、２つ以上の異なるエピトープに結合することができるヘテロ四量体の免疫グロブリンが含まれる。二重特異性抗体の半分（単一の重鎖及び単一の軽鎖を含み、６つのＣＤＲを含む）は、１つの抗原またはエピトープに結合し、抗体のもう半分は、異なる抗原またはエピトープに結合する。場合によっては、二重特異性抗体は、同じ抗原の、ただし異なるエピトープまたは重複しないエピトープに結合することがある。場合によっては、二重特異性抗体の両半分が同一の軽鎖を有しながらも、二重特異性を維持している。二重特異性抗体は、米国特許出願公開第２０１０／０３３１５２７号（２０１０年１２月３０日）でその概要が記載されている。
【００２５】
抗体の「抗原結合部分」（または「抗体フラグメント」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体における１つ以上のフラグメントを指す。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に含まれる結合フラグメントの例としては、以下のものが挙げられる：（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる１価のフラグメント）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメント）；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント（ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる）；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント（抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなる）、（ｖ）ｄＡｂフラグメント（ＶＨドメインからなる）（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ２４１：５４４−５４６）、（ｖｉ）単離されたＣＤＲ、及び（ｖｉｉ）ｓｃＦｖ（Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬ及びＶＨからなり、合成リンカーによってつなげられて単一のタンパク質鎖を形成し、ここではＶＬ及びＶＨ領域は対をなして１価の分子を形成する）。ダイアボディなどの他の形態の単鎖抗体も、「抗体」という用語の下に含まれる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）９０  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ６４４４−６４４８；及びＰｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）２  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １１２１−１１２３を参照）。
【００２６】
なおさらに、抗体またはその抗原結合部分は、抗体または抗体部分と、１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの、共有結合的または非共有結合的な相互作用によって形成される、より大きな免疫接着分子の一部であり得る。このような免疫接着分子の例としては、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）６  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ９３−１０１）、共有結合的ビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）３１  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０４７−１０５８）が挙げられる。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントなどの抗体部分は、全抗体のパパイン消化またはペプシン消化などの従来的な手法を使用して、全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分及び免疫接着分子は、当技術分野で知られている標準的な組換えＤＮＡ手法を使用して得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照）。
【００２７】
「Ｆｃ融合タンパク質」は、２つ以上のタンパク質の一部または全てを含み、このうちの１つが免疫グロブリン分子のＦｃ部分であり、これらのタンパク質は本来、別の方法で一緒に見出されることはない。抗体由来のポリペプチドの様々な部分（Ｆｃドメインを含む）と融合したいくつかの異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製については、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）８８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５３５；Ｂｙｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）３４４  Ｎａｔｕｒｅ  ６７７；及びＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ  １０．１９．１−１０．１９．１１）で説明されている。「受容体Ｆｃ融合タンパク質」は、Ｆｃ部分にカップリングした受容体の１つ以上の細胞外ドメインを含み、Ｆｃ部分は、一部の実施形態では免疫グロブリンのヒンジ領域およびそれに続くＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、１つ以上のリガンドに結合する２つ以上の別々の受容体鎖を含有する。例えば、Ｆｃ融合タンパク質はｔｒａｐであり、例えば、ＩＬ−１  ｔｒａｐ（例えば、リロナセプト（ｈＩｇＧ１のＦｃと融合したＩＬ−１Ｒ１細胞外領域と融合したＩＬ−１ＲＡｃＰリガンド結合領域を含有する）；米国特許第６，９２７，００４号を参照）、またはＶＥＧＦ  ｔｒａｐ（例えば、アフリベルセプト（ｈＩｇＧ１のＦｃと融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３と融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含有する）；米国特許第７，０８７，４１１号（２００６年８月８日発行）及び同第７，２７９，１５９号（２００７年１０月９日発行）を参照）などである。
【００２８】
本明細書で使用する「プロテインＡ」という用語は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のＦｃドメインに結合し、ＩｇＧ３には結合しない、４２ｋＤａのＳｔａｐｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ細胞壁プロテインＡの天然形態、組換え形態、改変形態、遺伝子操作形態及び誘導体を意味する（Ｄｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）１３（８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６０５−１４）。遺伝子操作プロテインＡは、例えば、Ｚ−ドメイン四量体、Ｙ−ドメイン四量体、またはＤドメイン及びＥドメインを欠いた遺伝子操作プロテインＡである。これら遺伝子操作されたプロテインＡの典型例は、免疫グロブリンのＶＨ３ドメインに結合することができない（または親和性があったとしても極めて低い親和性で結合する）が、それでもＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のＣＨ３ドメインには結合することができる。遺伝子操作プロテインＡは、Ｍｉｎａｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）２２（９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１２３０−８で論じられている。市販のプロテインとしては、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、Ｐｒｏｓｅｐ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、及びＰｏｒｏｓ  Ａ（登録商標）（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）が挙げられる。
【００２９】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、プロテインＡのＦｃドメインに対する親和性を利用してＦｃ含有タンパク質を精製する。実際には、プロテインＡクロマトグラフィーは、固体支持体に固定されたプロテインＡの使用を伴う。Ｇａｇｎｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍｏｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  １５５−１９８（１９９６）を参照されたい。固体支持体は非水溶性マトリックスであり、これにプロテインＡが接着する。このような支持体としては、アガロース、セファロース、ガラス、シリカ、ポリスチレン、ニトロセルロース、チャコール、砂、セルロース及び任意の他の好適な材料が挙げられる。タンパク質を好適な固体支持体に固定するための方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、Ｏｓｔｒｏｖｅ，（１９９０）（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８２：３５７−３７１）を参照されたい。このような固体支持体は、プロテインＡの固定を伴うものも伴わないものも、多くの商業的供給元、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ），Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆ．），ＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ），Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの一部門，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ），Ｐａｌｌ（Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）及びＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）などから容易に利用可能である。多孔質ガラスマトリックスに固定されたプロテインＡは、ＰＲＯＳＥＰ（登録商標）−Ａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）として市販されている。また、固相はアガロースベースのマトリックスであってもよい。アガロースマトリックスに固定されたプロテインＡは、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）として市販されている。
【００３０】
「キャピラリー」という用語は、基体であって、該基体の中または上を通って１つ以上の分子実体が移動する、基体を指し、場合によっては、この１つ以上の分子実体は分離を可能にするために異なる速度で移動する。キャピラリーは、ガラスまたはポリマーなどの任意の材料で作られてよい。例えば、下に例示する一部の実験では、裸溶融シリカキャピラリー（４０μｍまたは５０μｍ）を使用した（Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺから入手可能）。キャピラリーは、自らの直径よりも大きい長さの中空チューブとすることができる。概してキャピラリーは、生体分子または他の分子実体を、実体の質量及び／または電荷に基づいて分離するために使用される。例えば、ある等電点がキャピラリー全体に適用された場合、分子実体は、自らの電荷対質量比によって決まる速度でキャピラリー内を移動する。等電点を提供するために、キャピラリーの一方の端部はカソード（負荷電）に連結され（「キャピラリーのカソード側の端部」）、キャピラリーの他方の端部はアノード（正荷電）に連結される（「キャピラリーのアノード側の端部」）。正電荷を帯びた実体は、カソードに向かって移動することになる。
【００３１】
「検出器」または「検出器窓」は、キャピラリーの長軸に沿ったある点で提供され、分子実体が通過する際にそれを検出するための窓としての役割を果たす。分子実体は、分子検出の技術分野で知られている方法のうちの任意の１つ以上の方法によって検出することができる。例えば、タンパク質は、２２０ｎｍまたは２８０ｎｍ（ＤＮＡは２６０ｎｍ）における電磁放射の吸光度によって検出することができる（「ＵＶ吸光度検出」）。Ｃ．Ｓｔｏｓｃｈｅｃｋ，（１９９０）１８２  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ５０−６９を参照されたい。レーザー誘起蛍光（ＣＥ−ＬＩＦ）を用いて、固有蛍光によって（固有蛍光を有する分子の場合）、または標識実体の検出によって、分子実体を検出することもできる。例えば、２８０ｎｍまたは２９５ｎｍのレーザーは、タンパク質のチロシン、トリプトファン及びフェニルアラニンの固有蛍光を誘起させるために使用することができ、発光が検出される（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＰＡ  ８００タンパク質キャラクタリゼーションシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ））。また分子実体は、ＬＩＦによって検出することもでき、実体を蛍光体タグで誘導体化し、誘導体化された実体をレーザー（例えば、４８８ｎｍの光を照射するアルゴンイオンレーザー、４４２ｎｍの光を照射するＨｅＣｄレーザー、または４７３ｎｍ、４１０ｎｍ、４０５ｎｍ、もしくは４２５ｎｍの光を照射するダイオードレーザー）で励起させ、そして発光波長を検出することによって行われる。こういったタグとしては、とりわけ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）、６−オキシ−（Ｎ−スクシンイミジルアセテート）−９−（２−メトキシカルボニル）（ＳＡＭＦ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルフルオレセイン−Ｏ−アセテート（ＳＩＦＡ）、４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾオキシジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）、３−（２−フロイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド（ＦＱ）、５−（４，６−ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）及び３−（４−カルボキシベンゾイル）−２−キノリンカルボキシアルデヒド（ＣＢＱＣＡ）が挙げられる。Ｅ．Ｓｚｏｋｏ＆Ｔ．Ｔａｂｉ，（２０１０）５３（５）Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  １１８０−１１９２を参照されたい。
【００３２】
「細胞」という用語は、原核細胞または真核細胞を指す。細胞は、とりわけ試薬または治療薬として有用なポリペプチドまたはタンパク質を発現することが可能である（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ａｎｄ  Ｌｉｔｔｌｅ，（１９９９）１２  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７３−２０１）。発現されたポリペプチドまたはタンパク質は、細胞内に局在する場合もあれば、細胞膜または細胞壁に局在する場合もあれば、細胞から分泌される場合もある。原核細胞には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどの細菌細胞が含まれる（Ｓｐａｄｕｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）３２（１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５４−６０）。真核細胞には、タバコ、シロイヌナズナ、ジャガイモ、トウモロコシ、ニンジン、及びベニバナが含まれる（Ｙｕｓｉｂｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）７：３  Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ３１３−３２１；Ｋ．Ｋｏ，（２０１４）３３（３）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  １９２−１９８）。真核細胞には、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの酵母細胞（Ｓｐａｄｕｉｔ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）３（５）ＭＡｂｓ  ４５３−６０）が含まれる。真核細胞には、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞が含まれる（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）２６（２Ａ）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０５７−６３）。真核生物細胞としては、以下のような哺乳動物細胞：ＢＳＣ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ−ＭＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ−１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ−ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ−２１細胞、「ＣＨＯ細胞」、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＥＥＳＹＲ（登録商標）細胞、ＮＳ−１細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、及びニワトリ胚細胞が挙げられる。「チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株」または、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株などのいくつかの特定のＣＨＯ細胞変異体のうちの１つ以上は、大規模なタンパク質生産（例えば、抗体生産）用に最適化される。ＥＥＳＹＲ（登録商標）細胞株は、対象タンパク質の生産強化に最適化された特殊なＣＨＯ細胞株である。ＥＥＳＹＲ（登録商標）細胞の詳細な説明については、米国特許第７，７７１，９９７号（２０１０年８月１０日発行）を参照されたい。
【００３３】
「移動度」という用語は、媒体を通る分子実体（複合体を含む）の移動を指す。媒体は、ゲル、フィルム、空気または他の気体、水性緩衝液または他の液体、キャピラリー、薄膜、ふるい粒子などであり得る。分子実体は、特に電場、磁場、重力場の中を、単純な拡散によって、または分子ふるいを介して移動し得る。概して、移動度は、分子実体の体積、質量、または電荷に関連する。拡散については、質量が大きい分子実体は、質量が小さい実体または複合体よりも移動度が低い。電場における分子実体の移動度（すなわち、「電気泳動移動度」）は、実体の電荷対質量比に依存する。実体の電荷は、実体の３次元構造、等電点、変性状態または未変性状態、溶媒和状態及び水和状態、緩衝液ならびに媒体のｐＨに部分的に依存する。Ｂａｒｒｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）８５４  Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  １６９−１７７を参照されたい。分子実体の電荷対サイズ比が大きいほど、電気泳動移動度も高くなる（すなわち、媒体を通る速度が高くなる）。
【００３４】
リガンド
一態様において、本発明は、マルチサブユニットタンパク質の第１のサブユニットに結合し、かつマルチサブユニットタンパク質の第２のサブユニットには結合しないリガンドを提供する。リガンドは、第１のサブユニットを含有するこうした分子を同定するために、直接的に、またはサブトラクションによって間接的に、使用される。代替の実施形態では、リガンドは、第２のサブユニットに結合し、かつ第１のサブユニットには結合しない。概して、リガンドは、ヘテロ二量体の一方のサブユニットに結合するが、ヘテロ二量体の他方のサブユニットには結合しない。
【００３５】
場合によっては、第１のサブユニット及び第２のサブユニットの各々が、免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含有する。免疫グロブリン重鎖はＣＨ３ドメインを含有することから、各サブユニットは免疫グロブリン重鎖であり得る。そのため、マルチサブユニットタンパク質は、場合によっては２つの別々の重鎖を含有する抗体である。このような抗体は、二重エピトープ特異性を有する二重特異性抗体であり得る。
【００３６】
二重特異性抗体（または他のヘテロ多量体）を生成するためのいくつかのプロトコールによれば、一方のサブユニットのＣＨ３ドメインはプロテインＡに結合することが可能であり（ＣＨ３）、他方のサブユニットのＣＨ３はプロテインＡには結合しないかまたは非常に低い親和性で結合する（ＣＨ３＊）。そのため、二重特異性抗体は、プロテインＡとの結合能力が低いまたはゼロの２つのＣＨ３ドメイン（すなわち、ＣＨ３＊）を有する抗体よりは良好にプロテインＡに結合するが、２つのプロテインＡ結合性のＣＨ３ドメインを有する抗体ほど良好に結合するわけではない。このプロテインＡに対する結合性の差は、存在する任意のホモ二量体から二重特異性抗体を分離するために使用することができる。一実施形態では、ＣＨ３＊は、プロテインＡとの結合を低下させるかまたは不可能にするアミノ酸置換Ｈ９５Ｒ及びＹ９６Ｆ（ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムによるナンバリング）を含む。
【００３７】
例えば、二重特異性抗体は、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＥＥＳＹＲ（登録商標）などのＣＨＯ細胞派生物）の中で、第１のエピトープに対して特異的な第１の重鎖と、第２のエピトープに対して特異的な第２の重鎖との両方を発現させることによって、生成することができる。抗体は２つの重鎖を含有するため、２つの同一の第１の重鎖を有し、第１のエピトープに対して特異的なホモ二量体（別名ホモＢ）；２つの同一の第２の重鎖を有し、第２のエピトープに対して特異的なホモ二量体（別名ホモＡ）；ならびに第１及び第２の重鎖両方を有し、両方のエピトープに対して特異的なヘテロ二量体（別名ヘテロＡＢ）の少なくとも３つの形態の抗体が形成されると考えられる。精製スキームによっては、プロテインＡ結合性のホモ二量体（ホモＢ）及びプロテインＡ結合性のヘテロ二量体（ヘテロＡＢ）の分離は完璧ではなく、得られるヘテロ二量体（例えば、二重特異性抗体）にはホモ二量体が混入している。
【００３８】
本発明における１つの特定の目的は、細胞によって生成され、プロテインＡクロマトグラフィーによりヘテロ二量体からホモ二量体を識別して精製された、ヘテロ二量体の純度を決定することである。場合によっては、ホモ二量体及びヘテロ二量体（Ａｂ）の生物物理学的属性（例えば、質量、等電点、アミノ酸含有量など）はかなり類似しており、各々の種に対する具体的な同定および定量化を困難にしている。そのため、リガンド（Ｌ）を使用して、ホモ二量体の一方及びヘテロ二量体に選択的に結合させ、かつ他方のホモ二量体に結合させないようにする。このような結合は、生物物理学的属性が変化しかつ際立った特徴を備える複合体（別名Ａｂ・Ｌ）を形成し、当業者はこれにより、結合しているホモ二量体及び結合しているヘテロ二量体から非結合のホモ二量体を識別することができるようになる。場合によっては、この複合体は電気泳動移動度が変化し、リガンドを伴う複合体から、複合体を形成しないホモ二量体をより顕著に分離するまたは分けることが可能になる。
【００３９】
リガンドは、サブユニットのうちの１つ（例えば、第１のサブユニットまたは第２のサブユニット。ただし両方ではない）に特異的に結合する抗体、抗体フラグメント、または他の抗原結合タンパク質とすることができる。一実施形態、すなわち（ａ）ヘテロ二量体が二重特異性抗体であり、（ｂ）第１のサブユニットが、プロテインＡに結合するＣＨ３ドメインを含有する免疫グロブリン重鎖であり、（ｃ）第２のサブユニットが、プロテインＡには結合しないＣＨ３ドメイン（例えば、Ｈ９５Ｒ及びＹ９６Ｆアミノ酸置換を含有するＣＨ３＊）を有する免疫グロブリン重鎖であり、（ｄ）リガンドが、第１のサブユニットに結合する抗体である、実施形態では、リガンドは、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３にそれぞれ記載の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、２及び３、ならびに／または配列番号４、配列番号５、及び配列番号６にそれぞれ記載の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、２及び３を含む（例えば、抗Ｂ抗体）。
【００４０】
別の実施形態、すなわち（ａ）ヘテロ二量体が二重特異性抗体であり、（ｂ）第１のサブユニットが、プロテインＡに結合するＣＨ３ドメインを含有する免疫グロブリン重鎖であり、（ｃ）第２のサブユニットが、プロテインＡには結合しないＣＨ３ドメイン（例えば、Ｈ９５Ｒ及びＹ９６Ｆアミノ酸置換を含有するＣＨ３＊）を有する免疫グロブリン重鎖であり、（ｄ）リガンドが、第２のサブユニットに結合する抗体である、実施形態では、リガンドは、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９にそれぞれ記載の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、２及び３、ならびに／または配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２にそれぞれ記載の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、２及び３を含む（例えば、抗Ｂ抗体）。
【００４１】
二重特異性抗体を検出または定量化するためのシステム
二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）は、２つの別々の結合特異性を備え、がん治療を含めた広範囲の臨床適用例がある（Ｋｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）２２（５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３８−４４及びＬａｍｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｓ１０４０−８４２８（１４）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１４，００１３５−８）。ｂｓＡｂは、従来の併用薬物療法または単剤療法を介して他の方法で活性化させることが難しいヘテロ二量体受容体に対し、架橋して活性化させることができる（Ｊ．Ｒ．Ｃｏｃｈｒａｎ，（２０１０）２（１７）Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．１７ｐｓ５）。
【００４２】
商用規模でのｂｓＡｂ製造は難しい。治療用途に好適である実現可能なｂｓＡｂを産生するために、複数のアプローチが採用された（Ｒ．Ｅ．  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２０１２）４：２  ＭＡｂｓ  １８２−９７）。このようなアプローチの１つは、２つのユニークな重鎖（鎖Ａ及び鎖Ｂ）に共有結合的に連結する共通の軽鎖の使用を伴う（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１０１５１７９２号，２０１０年１２月２９日；２０１１；Ｂａｂｂ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１３１８４７６１号，２０１３年１２月１２日）。第１の重鎖（別名「第１のサブユニット」または「鎖Ｂ」）、第２の重鎖（別名「第２のサブユニット」または「鎖Ａ」）及び共通の軽鎖を生成中に共発現させ、次に、これらを組み合わせてホモＡ、ホモＢ及びヘテロＡＢの３つの生成物にする。ホモ二量体（ホモＡまたはホモＢ）は、２つの同一の重鎖（ＡＡまたはＢＢ）及び２つの同一の軽鎖からなる。ｂｓＡｂ生成物（ヘテロＡＢ）は、２つのユニークな重鎖（鎖Ａ及び鎖Ｂ）及び２つの同一の軽鎖からなる。理論的には、これら３つの生成物は、１：２：１（ホモＡ、ヘテロＡＢ及びホモＢ）の比で発現されるはずである（図１）。重鎖の一方である鎖ＡはプロテインＡへの結合を不可能にし、またプロテインＡに対する鎖Ａの結合親和性が、単一特異性ＡｂであるホモＢの緊密な結合またはホモＡの弱い結合と比較して中程度であることにより、ｂｓＡｂ（ヘテロＡＢ）の選択的精製が可能になる。
【００４３】
ｂｓＡｂの製造におけるこういった進歩にもかかわらず、精製されたｂｓＡｂ薬物中に少量のホモ二量体（ホモＡ及びホモＢ）が依然として存在する可能性がある。標的抗原によっては、例え少量のホモ二量体であっても、可能性として、異なる作用様式または異なる分解経路を示し、よってｂｓＡｂ生成物の効力及び免疫原性に影響を及ぼす恐れが考えられる（Ｗｏｏｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）５  ｍＡｂｓ  ７１１−７２２）。そのため、ｂｓＡｂの純度を評価するための分析方法の開発は極めて重要である。
【００４４】
ホモ二量体生成物とヘテロ二量体との間の構造的類似性及び生物物理学的類似性は、分離及び定量化を極めて困難にしている。ゲル電気泳動法及びサイズ排除クロマトグラフィーなどの従来的な分離ベースの純度アッセイは、ホモ二量体不純物からｂｓＡｂを識別するための分離能を欠いている。最近では、ｂｓＡｂの純度を推定するためのＬＣ−ＭＳベースのアプローチが報告されている（同上）。ｂｓＡｂの純度の特性決定には質量分析がごく普通に適用されているが、ホモ二量体に優先してｂｓＡｂを定量化するために質量分析を適用するには、脱グリコシル化などの修飾を伴う。イオン化速度から生じる異種性及びＣ末端リジンの切断により、ｂｓＡｂの純度評価のための質量分析の適用は更に限定される。
【００４５】
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、抗体を特性決定するために使用される（Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）７２  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１１１−１２８）。ＣＥの形態には、キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ−ＳＤＳ）、キャピラリー等電点集束（ｃＩＥＦ）及びキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）が含まれる。ＣＺＥの分離メカニズムは、電荷対サイズ比に基づく。ＣＺＥは、コーティングされていないキャピラリーを使用した一部の抗体アッセイで用いられる（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）８２（８）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３２２２−３０）。また、部分充填アフィニティーキャピラリー電気泳動（ＰＦ−ＡＣＥ）と組み合わせたＣＺＥも、特定の分子種の同一性を決定するために使用されてきた（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）５４０  Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ４０３−４１０）。ＰＦ−ＡＣＥは、その鎖特異的リガンドに対する選択的親和性による分析物（例えば、ｂｓＡｂ、ホモＡ及びホモＢ）の移動度のシフトを利用している。ＰＦ−ＡＣＥは、既存のＬＣ−ＭＳベースのアプローチとは独立して用いることができる（Ｗｏｏｄｓ，２０１３）。
【００４６】
別の態様では、本発明は、リガンド、第１のホモ二量体、第２のホモ二量体、ヘテロ二量体、キャピラリー、検出器、キャピラリーの一方の端部またはその付近にあるアノード、キャピラリーの他方の端部またはその付近にあるカソード、及び電源を備えるシステム（例えばＣＺＥシステム）を提供する。一実施形態では、第１のホモ二量体は、少なくとも２つの同一の第１のサブユニット（例えば、プロテインＡに結合することが可能な免疫グロブリン重鎖）を含み、第２のホモ二量体は、少なくとも２つの同一の第２のサブユニット（例えば、プロテインＡに結合することが不可能な免疫グロブリン重鎖）を含み、ヘテロ二量体は、１つの第１のサブユニット及び１つの第２のサブユニットを含む。検出器は、キャピラリーに沿った任意の箇所に配置してもよい。概して、分子実体は全体として正電荷を有し、そのため電場下ではカソードに向かって移動することになる。そのため、一部の実施形態では、検出器はキャピラリーのカソード側の端部の付近に配置される。検出器は、タンパク質を検出することができ、とりわけ２１０ｎｍまたは２８０ｎｍにおける吸光度を測定するＵＶ検出法、または自然蛍光もしくは蛍光標識を検出するレーザー誘起蛍光を用いることができる。
【００４７】
一実施形態では、リガンド（第１のサブユニットまたは第２のサブユニットのいずれかに対して特異的だが、両方に対してではない）、第１のホモ二量体、第２のホモ二量体、及びヘテロ二量体がキャピラリーのアノード側の端部またはその付近にロードされる。場合によっては、この混合物は、カソード側の端部の付近にロードされてもよいし、キャピラリーに沿った任意の位置でロードされてもよい。リガンドはその同族サブユニットに結合し、ヘテロ二量体と、及びホモ二量体のうちの一方と複合体を形成するが、他方のホモ二量体とは複合体を形成しない。したがって、リガンドが第１のサブユニットに結合すると、第１のホモ二量体及びリガンドを含む複合体（第１の複合体）、ならびにヘテロ二量体及びリガンドを含む複合体（第２の複合体）が形成される。代替的に、リガンドが第２のサブユニットに結合すると、第２のホモ二量体及びリガンドを含む複合体（第３の複合体）、ならびにヘテロ二量体及びリガンドを含む複合体（第４の複合体）が形成される。各場合において、複合体は、結合しない（複合体を形成しない）ホモ二量体よりも、電気泳動移動度が低い。一部の実施形態では、すなわち、ヘテロ二量体が二重特異性抗体である場合、第１のサブユニットは、プロテインＡに結合することが可能な免疫グロブリン重鎖であり、第２のサブユニットは、プロテインＡに結合することが不可能な免疫グロブリン重鎖である（すなわち、Ｈ９５Ｒ及びＹ９６Ｆに置換されたＣＨ３＊ドメインを含有する）。
【００４８】
本システム及び方法によれば、キャピラリー内を進む間、複合体は速度が抑えられ、複合体を形成しないホモ二量体と同時に検出器窓を通過することはない。そのため、複合体を形成しないホモ二量体は、ヘテロ二量体及び他のホモ二量体により妨害されることなく検出及び定量化される。二重特異性抗体の場合において、一つのＡＣＥアッセイでは、非置換ＣＨ３重鎖に結合するリガンドが使用され、この場合、ＣＨ３＊：ＣＨ３＊（ホモＡ）２量体は複合体を形成しないままである。このＣＨ３＊：ＣＨ３＊（ホモＡ）ホモ二量体が検出及び定量化される。（最初のＡＣＥアッセイとは別個にかつ／または並行して実行することができる）他の独立したＡＣＥアッセイでは、Ｈ９５Ｒ及びＹ９６Ｆに置換されたＣＨ３＊ドメインに結合するリガンドが使用される。この場合、ＣＨ３：ＣＨ３（ホモＢ）２量体は複合体を形成しないままであり、検出及び定量化される。両方のＡＣＥアッセイを実行する実施形態では、両方のホモ二量体を定量化することができる。この場合、二重特異性抗体のヘテロ二量体は、いかなるリガンドも伴わないＣＺＥアッセイで決定するか、または添加されたホモＡ及び／またはホモＢ試料について生成された標準曲線を使用して決定する、二量体の総量（ＣＨ３：ＣＨ３ ＋ ＣＨ３：ＣＨ３＊ ＋ ＣＨ３＊：ＣＨ３＊）（ホモＢ ＋ ヘテロＡＢ ＋ ホモＡ）から、独立したＡＣＥアッセイによって決定する各ホモ二量体の量を引くことによって、定量化することができる。
【００４９】
別の実施形態におけるシステム及び方法は、ローディングポートと検出器との間の、キャピラリーのアノード側（ローディング側）の端部の付近に入れられたリガンドプラグを使用する（ＰＦ−ＡＣＥ）。この場合、（第１のホモ二量体、第２のホモ二量体、及びヘテロ二量体を含む）多量体混合物が、キャピラリーのリガンドプラグ手前にロードされる。多量体がキャピラリー内を移動する際に、構成成分である分子実体がリガンドプラグに遭遇し、その地点でリガンド−多量体複合体が形成され、それにより、リガンドには結合しないホモ二量体以外の全ての種における電気泳動移動度が低下する。リガンドが第１のサブユニットに結合する場合、２つの第２のサブユニットを含む（かつ第１のサブユニットを含まない）ホモ二量体は結合しないままであり、電気泳動移動度の影響を受けない。
【００５０】
ヘテロ二量体が二重特異性抗体である一部の実施形態によれば、第１のサブユニットは、プロテインＡに結合することが可能な免疫グロブリン重鎖（別名サブユニットＢ）であり、第２のサブユニットは、Ｈ９５Ｒ及びＹ９６Ｆに置換されたＣＨ３ドメイン（すなわち、ＣＨ３＊）を含有する免疫グロブリン重鎖（別名サブユニットＡ）であり、第１のサブユニットに結合するリガンドは、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、２及び３（これらはそれぞれ、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む）を含み、かつ軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、２及び３（これらはそれぞれ、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む）を含む、抗体である。この場合、第２のサブユニットに結合するリガンドは、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、２及び３（これらはそれぞれ、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む）を含み、かつ軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、２及び３（これらはそれぞれ、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む）を含む、抗体である。
【実施例】
【００５１】
実施例１：キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）による純度
二重特異性抗体（「ｂｓＡｂ」）の純度を評価するため、ＣＥ−ＳＤＳを還元条件下で実施した。ｂｓＡｂ（ヘテロ二量体）試料、ホモＡ（第２のホモ二量体）試料及びホモＢ（第１のホモ二量体）試料について還元条件下で得られたＣＥ−ＳＤＳ結果（図２、トレースａ〜ｃ）から、軽鎖（図２、ピーク１）、非グリコシル化重鎖（図２、ピーク２）及び重鎖（図２、ピーク３）に対応する３つのピークが明らかになった。ホモＡ及びホモＢを精製ｂｓＡｂ１に添加することによって調製したホモＡ：ｂｓＡｂ１：ホモＢ（１：２：１モル比）の共混合物試料からも、類似した移動時間を伴った３つのピークがもたらされた（図２、トレースｄ）。ｂｓＡｂ、ホモ二量体及びこれらの共混合物の電気泳動図は識別することができず、このサイズに基づいた分離方法の限界を示している（図２）。非還元条件下のＣＥ−ＳＤＳについても、類似した結果が観測された。試験を行った抗体の分子量が非常に類似しているため、これらの結果は驚くべきものではない。適度な分離選択性は、ｂｓＡｂからこれらのホモ二量体構成要素を分離する上で極めて重要である。
【００５２】
ＣＺＥは、密接に関連したｍＡｂを分離するための強力なツールであることが証明されている（Ｈｅ，２０１０）。ｂｓＡｂ１の純度を、分析物を電荷対サイズ比に基づいて分離する方法であるＣＺＥによって評価した。電荷対サイズ比が大きい分析物ほどキャピラリー内を高速で移動する。純粋なｂｓＡｂ１試料（図３、トレースａ）に比べて、ホモＡは電荷対サイズ比がより大きく、キャピラリー内をより高速で移動する（図３、トレースｂ）。ホモＢは電荷対サイズ比がより小さく、キャピラリー内をより低速で移動する（図３、トレースｃ）。ｂｓＡｂは、ホモＡ（鎖Ａ）からの重鎖である一方のアームとホモＢ（鎖Ｂ）からのものである他方のアームとを含有し、かつ対応するｐＩ（８．０１）を有するため、ｂｓＡｂの電気泳動移動度は、ホモＡとホモＢとの間にある（図３、トレースａ）。主なピークグループ２、３及び４は、それぞれホモＡ、ｂｓＡｂ、及びホモＢに対応する。電気泳動図で観察される小さいピークは、抗体における電荷バリアントまたはサイズバリアントのいずれかに起因する。ホモＡ及びホモＢを精製ｂｓＡｂに添加することによって、ホモＡ、ｂｓＡｂ、及びホモＢの混合物（１：２：１の比）を作製した。次に、混合物をＣＺＥによって分析した。混合物のＣＺＥトレースには４セットのピークが含まれ、これらはホモＡ（ピークグループ２）、ｂｓＡｂ（ピークグループ３）、及びホモＢ（ピークグループ４）に相当する（図３、トレースｄ）。ホモＢのピークで観察される低いピーク強度は、低速な電気泳動移動度と、電気泳動図全体に分布するホモＢ種における複数の電荷バリアントとの組み合わせによるものである可能性が考えられる。ＣＥ−ＳＤＳ（図２）で分離されなかったホモＡ：ｂｓＡｂ１：ホモＢの共混合物は、ＣＺＥにおいては期待できる結果が示された。ｂｓＡｂ１のＣＺＥプロファイル（図３）が十分に分離されているため、同定および純度の定量化が期待できる。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上でＡｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２３０キットを使用して、ＣＥ−ＳＤＳ分離を実施した。
【００５３】
実施例２：部分充填アフィニティーキャピラリー電気泳動による純度
ＣＺＥは、電荷対サイズ比が多様な実体を含有する試料に限定される。常にこれが該当するわけではないため、ＣＺＥは、多くのｂｓＡｂ候補に適用することはできない。例えば、ｂｓＡｂ２及び関連のホモ二量体はｐＩ及びサイズが類似するため、非常に類似したＣＺＥプロファイルを共有する（図４、トレースａ〜ｃ）。様々な分子実体が分離されないことから、個々の構成要素分子種の同定は現実的でなかった。
【００５４】
純度を定量化するための別の実現可能なアプローチは、アフィニティーキャピラリー電気泳動（ＡＣＥ）である。ＡＣＥでは、抗体（Ａｂ）及びリガンド（Ｌ）の混合物（これらは、抗体−リガンド複合体（Ａｂ・Ｌ）を形成する）を用意する（式１を参照）。次に、この混合物をキャピラリーに注入し、電気泳動にかけた。ＡＣＥは、Ａｂ、Ｌ及びＡｂ・Ｌ間の電気泳動移動度の相違に基づいている。抗原または鎖特異的抗体のいずれかがリガンドとして使用される場合、ホモ二量体の定量化は、様々な種間のベースライン分離能に依存しない。個々の種の選択的な移動度シフトは、任意の残りのホモ二量体の量を推定するために使用することができる。
2018528389.tif 000002
【００５５】
ＡＣＥでは、抗原を同族抗体用のリガンドとして使用することができる。代替的に、鎖特異的抗体（抗Ａまたは抗Ｂ）を同族抗体用のリガンドとして使用することができる。抗Ａ抗体（別名「第２のリガンド」）は、鎖Ａを含有する抗体（ホモＡ及びｂｓＡｂ）に対して特異的に結合する。同様に、抗Ｂ抗体（別名「第１のリガンド」）は、鎖Ｂを含有する抗体（ホモＢ及びｂｓＡｂ）に対して結合する。
【００５６】
一実施形態では、抗Ａ抗体は、配列番号７〜１２のアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖のＣＤＲを含む。一実施形態では、抗Ａ抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗Ａ抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む。
【００５７】
一実施形態では、抗Ｂ抗体は、配列番号１〜６のアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖のＣＤＲを含む。一実施形態では、抗Ｂ抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗Ａ抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む。
【００５８】
一実施形態では、鎖Ａ特異的抗体及び鎖Ｂ特異的抗体における理論上の等電点（ｐＩ）は、それぞれ６．５５及び６．６４である。ｐＩ及びサイズが類似した分析物（ｂｓＡｂまたはホモ二量体）から生じるピークは、鎖特異的ｍＡｂと共に移動し、同定および定量化を妨害する可能性が考えられる。この妨害の可能性を避けるため、鎖特異的抗体の電気泳動移動度をビオチン化によって改変する。ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎキット及び手順（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して抗Ａ抗体及び抗Ｂ抗体をビオチン化した（Ｄａｎｉｅｌｓ  ａｎｄ  Ａｍａｒａ，（１９９８）２９６  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０７−１８；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ：ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎ，Ｄｏｃ．Ｎｏ．１８５０．３，ｈｔｔｐｓ：／／ｔｏｏｌｓ．ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ＭＡＮ００１１５８０＿ＥＺ＿Ｓｕｌｆｏ＿ＮＨＳ＿Ｂｉｏｔｉｎ＿ＵＧ．ｐｄｆ，Ａｐｒｉｌ  ２９，２０１５で入手可能）。様々な性質及びスペーサーアーム長を有するいくつかの異なるビオチンのＮＨＳエステルが利用可能である。簡潔に述べると、ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル（例えば、水溶性のスルホ−ＮＨＳ−ビオチン）を、リジンの一級アミノ基（−ＮＨ２）及び各ポリペプチドのＮ末端で利用可能な一級アミノ基とｐＨ７〜９の緩衝液中で反応させた。
【００５９】
一級アミンのカップリング及びリジン側鎖修飾を介したビオチン化によって、鎖特異的抗体の電荷が酸性方向に改変され、そのため鎖特異的抗体の電気泳動速度が低下して、結果的に実験の実行時間内に検出可能な信号が喪失した。鎖特異的抗体からのいかなる検出可能なピークも存在しないことにより、対象分子種の同定および定量化が容易になった。
【００６０】
ＡＣＥ分析に関しては、抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体をリガンドとして使用した。ｂｓＡｂ３と抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体とを１：２のモル比で混合することによって調製したｂｓＡｂ−リガンド複合体を使用して、ＡＣＥを実施した。複合体が形成されると、ｂｓＡｂ３の電気泳動移動度は変化することが予想され、そして遊離ｂｓＡｂ３の残留シグナルは残存しないことが予測された。しかし、ｂｓＡｂ３−抗Ａ複合体及びｂｓＡｂ３−抗Ｂ複合体について、遊離ｂｓＡｂ３の移動時間に類似した移動時間において大量の残留物のピークが検出された（図５、トレースｂ及びｃ）。様々な比のｂｓＡｂ及び抗Ｂの複合体（１：０．５、１：１及び１：３）について得られたＡＣＥデータから、過剰な抗Ｂリガンドの存在下であっても残留物のピークが見られることが実証された。ｂｓＡｂ３−抗Ｂ複合体の調製物中に残留非結合ｂｓＡｂ３が存在するかをさらに調べるため、ＳＥ−ＨＰＬＣ実験を実施したところ、ｂｓＡｂ３（図６、トレースａ；ピーク４）及び抗Ｂ（図６、トレースｂ；ピーク３）が良好に分かれることが示された。ＳＥ−ＨＰＬＣの結果は、ｂｓＡｂ３−抗Ｂ複合体（図６、トレースｃ；ピーク１及び２）及び過剰な抗Ｂ（図６、トレースｃ；ピーク３）の存在を示している。しかし、非結合ｂｓＡｂ３の存在を証明するものはほとんどなかった。これらの結果から、高レベルでの残留物のピークの存在は、ＣＺＥ実験（図５）中に印加された高電圧で分析物−リガンドが解離したこと（例えば、ｂｓＡｂ・Ｌ→ｂｓＡｂ＋Ｌ）によるものであり得ることが示唆される。分析物−リガンド複合体の解離は、ＣＥなどの親和性ベースの分離方法において過去に報告されている（Ｓ．Ｋｒｙｌｏｖ，（２００６）１１（２）Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  １１５−１２２）。ｓｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡ結合タンパク質を含有する平衡混合物をキャピラリー内で分離する過去の試みからは、連続的な解離を経てピーク及び指数関数的「スミアー」がもたらされることが見出された。リガンド及び標的の両方が、電気泳動の間中、解離を続けた（同上）。一部のｂｓＡｂについては、ＡＣＥ分析で観察される残留物のピーク及び「スミアー」の存在が、純度分析の妨害となる。
【００６１】
解離の影響を回避するために、部分充填アフィニティーキャピラリー電気泳動（ＰＦ−ＡＣＥ）が開発され利用された（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，５４０  Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ４０３−４１０（２００５））。ＰＦ−ＡＣＥは、キャピラリーにリガンドを部分的に充填してから試料を注入することによって実施される。分析物が親和性リガンドゾーンを移動する際にリガンド−分析物複合体が形成され、複合体の移動度が遊離分析物に対してシフトする。親和性リガンドには結合しない残留分析物の移動度は、いずれも変化しない。そのため、ＰＦ−ＡＣＥは、ｂｓＡｂ中に存在する任意の残留分析物の相対的存在量を正確に推定することができる。
【００６２】
ＡＣＥ及びＰＦ−ＡＣＥ条件下で実験を行い、ｂｓＡｂ３−抗Ｂ複合体のデータを収集した。分析物−リガンド複合体の解離によりＡＣＥ条件下で観察された残留ｂｓＡｂ３のピークは、ＰＦ−ＡＣＥ条件では検出されなかった（図７）。ＡＣＥ条件下では、分析物は、ひとたび分析物−リガンド複合体から解離すると、再び複合体を形成しない可能性がある。ＰＦ−ＡＣＥ条件下では、分析物がリガンドプラグ内を移動することにより、分析物は、早期に解離した場合であっても分析物−リガンド複合体を形成することができる。親和性リガンドゾーンの非存在下で観察されたホモＢのピークは、抗Ｂ ｍＡｂを用いてＰＦ−ＡＣＥを実施した場合には、シフトして信号の喪失として示された（図８、トレースＡ及びトレースＢ）。この効果は、ホモＢ−抗Ｂ ｍＡｂ複合体の形成によるものである。これとは対照的に、ホモＢ ｍＡｂが抗Ａ ｍＡｂで部分的に充填されたキャピラリー内を移動した場合は親和性リガンドゾーンを含有しないトレースに比べて変化がないが、これはホモＢ ｍＡｂが抗Ａ ｍＡｂには結合しないためである（図８、トレースＡ、トレースＣ）。同様に、移動度シフトは、特異的結合（すなわち、ホモＡ＋抗ＡまたはホモＢ＋抗Ｂ）についてのみ観察され、他のリガンドによるものでは観察されなかった（図８、トレースＤ及びトレースＦ）。これらの結果は、ＰＦ−ＡＣＥアッセイが、鎖特異性リガンドに基づく移動度シフトに高度に特化していることを示すものである。
【００６３】
実施例３：二重特異性試料中にあるホモ二量体ｍＡｂの検出及び定量化
ＰＦ−ＡＣＥアッセイを介してｂｓＡｂ純度を評価するため、少量（５％）のホモＡ及びホモＢをｂｓＡｂ３試料に添加してホモ二量体「不純物」の役割をさせた。得られたＣＺＥ及びＰＦ−ＡＣＥトレースは、図９に示されている。トレース『ａ』は、ｂｓＡｂ３の電気泳動図を示している。トレース『ｂ』は、５％のホモＡ及びホモＢの不純物を添加したｂｓＡｂ３の電気泳動図を示している。ホモＡ及びホモＢをｂｓＡｂ３に添加したことにより、２つのピーク強度が増加する結果がもたらされた（トレースａ及びトレースｂ、ピーク２及びピーク４を比較）。精製ホモ二量体の電気泳動移動度に基づいて、これらの２つのピークをそれぞれホモＡ及びホモＢとして暫定的に同定した。これらの同定を、ＰＦ−ＡＣＥ実験でトレースｃ及びトレースｄにおいて確認した。トレースｄは、残留物のピークであればホモＡ種を表すことになるｂｓＡｂ３−抗Ｂ  ＰＦ−ＡＣＥを示している。ｄにおいて観察される残留物のピークは、トレースｂにおけるピーク２に類似した移動時間を有し、したがって添加された試料におけるピークの同定を立証する。類似した結果が、ｂｓＡｂ３−抗Ａ  ＰＦ−ＡＣＥについても観察された（図９、トレースｃ、ホモＢ）。図９で観察された少量の残留物のピーク、トレースｃは、ｂｓＡｂ３で観察された混入物に対応し、添加された試料に由来するものではないため、トレースｃを定量化から除外した。ＰＦ−ＡＣＥに基づいて、添加された試料中に存在するホモＡ及びホモＢの量がそれぞれ５．２％及び５．２％と推定された。これらの値は、添加量の５％と良好に一致しており、実験誤差の範囲内である。
【００６４】
検出限界（ＬＯＤ）及び定量限界（ＬＯＱ）を評価するため、様々な量のホモＡ及びホモＢを精製ｂｓＡｂ３に加えてスパイクリカバリーを実施した。広範囲のホモＡ及びホモＢ ｍＡｂ（濃度０．１％〜５％）を含有する９つのｂｓＡｂ３試料を調製して、これらの添加された試料中に存在するホモ二量体のレベルを調べた。親和性リガンドの非存在下でホモＡ及びホモＢを含有するｂｓＡｂ３のＰＦ−ＡＣＥトレースは、結果的にｂｓＡｂ３、ホモＡ及びホモＢに対応するピークを含む電気泳動図となった。この電気泳動図は、それぞれの添加されたｂｓＡｂ３試料中にホモ二量体ｍＡｂが存在することを示すものである。添加されたｂｓＡｂ３試料中の濃度増加に伴う優れた線形応答（Ｒ２＝０．９９９）が、ホモＡ（図１０）及びホモＢ（図１１）について観察された。全体として、ホモ二量体のＬＯＱは０．１％の値を有することが実験的に判定された。
【００６５】
実施例４：タンパク質分析の方法論
ダイオードアレイ検出器を搭載したＢｅｃｋｍａｎ  ＰＡ８００  ｐｌｕｓ装置を使用して、ＣＺＥ実験を実施した。３２Ｋａｒａｔ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ）をデータ分析に使用した。簡潔に述べると、抗体試料（１ｍｇ／ｍＬ）を水で希釈して約１ｍｇ／ｍＬの濃度にして、裸溶融シリカキャピラリー（全長６０．２ｃｍ、実効長５０ｃｍ、ｉ．ｄ．４０μｍ）を備えたＢｅｃｋｍａｎ  ＰＡ８００  Ｐｌｕｓを使用して０．５ｐｓｉで４５秒間注入した。同じ条件下で１：２モル比のｂｓＡｂ対リガンドを使用してＡＣＥを実施した。ＰＦ−ＡＣＥ分析用については、リガンドプラグ（１Ｘリン酸緩衝食塩水中２ｍｇ／ｍＬの修飾リガンド）を１ｐｓｉで９０秒間注入してから、分析物または分析物−リガンド複合体の注入を行った。分離を２８ｋＶで実施し、分離中はキャピラリー温度を２２℃に維持した。試料を１０℃で保管した。ε−アミノカプロン酸−酢酸６００ｍＭ、０．１％のＨＰＭＣを含有するｐＨ５．７の緩衝液をバックグラウンド電解液として使用し、１ｍＭのヒスチジンを内部標準として添加した。
【００６６】
ｂｓＡｂ、ホモＡ及びホモＢの試料を、ＣＥ−ＳＤＳにより還元条件下で分析した。ｂｓＡｂ及びホモ二量体を単一バッチから共発現させ、精製した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで分離を実施し、試料調製は、Ｐｒｏｔｅｉｎ２３０キット用の製造業者のプロトコールに概ね従った。
【００６７】
抗体、リガンド及び抗体−リガンド複合体の試料も、自然の条件下でサイズに基づいて分析し、これは０．３ｍＬ／分の流量のＳＥＣ緩衝液（リン酸ナトリウム２００ｍＭ、ｐＨ７．１）中で平衡化されたＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨカラムを搭載したＷＡＴＥＲＳ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）に注入することによって行った。
【図１】
2018528389.tif 000003
【図２】
2018528389.tif 000004
【図３】
2018528389.tif 000005
【図４】
2018528389.tif 000006
【図５】
2018528389.tif 000007
【図６】
2018528389.tif 000008
【図７】
2018528389.tif 000009
【図８】
2018528389.tif 000010
【図９】
2018528389.tif 000011
【図１０】
2018528389.tif 000012
【図１１】
2018528389.tif 000013
【配列表】
2018528389000001.app
【国際調査報告】
2018528389.tif 000014
2018528389.tif 000015
2018528389.tif 000016
2018528389.tif 000017
2018528389.tif 000018