(57)【要約】  本発明は、（１）Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の高効率リアルタイムｑＰＣＲに使用可能な新規ＤＮＡプライマーセット、および（２）リアルタイムｑＰＣＲによる新規ＤＮＡプライマーのこのセットを用いた、細胞由来のＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの定量化のための新規ハイスループット法を提供する。本発明はまた、実験的に感染させた肝細胞におけるｃｃｃＤＮＡレベルを監視する際のこの方法の使用、およびＨＢＶに対する療法的効果の評価も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
極３’端に、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノム（配列番号１）のヌクレオチド配列内の少なくとも１６の連続配列を認識する配列を含む、逆方向プライマー。
【請求項２】
極３’端に、配列番号１の１９９６からヌクレオチド２２７８までのＨＢＶゲノムのヌクレオチド配列内の少なくとも１６の連続配列を認識する配列を含む、請求項１記載の逆方向プライマー。
【請求項３】
逆方向プライマーの長さが、１６〜２００ヌクレオチド、１７〜３５ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、２１〜３０ヌクレオチド、２４〜３０ヌクレオチドまたは２１〜２４ヌクレオチドである、請求項１または２記載の逆方向プライマー。
【請求項４】
逆方向プライマーが、５’から３’方向に：
【化１】
2018504891.tif 000009
より選択される配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の逆方向プライマー。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項の逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーからなるプライマー対であって、普遍的順方向プライマーの長さが、１６〜２００ヌクレオチド、１７〜３５ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、２１〜３０ヌクレオチド、２４〜３０ヌクレオチドまたは２１〜２４ヌクレオチドであり、そして普遍的順方向プライマーがＨＢＶゲノムのＤＲ２上流を認識する、前記プライマー対。
【請求項６】
普遍的順方向プライマーが、ヌクレオチド１５２８〜ヌクレオチド１５４８の配列番号５のヌクレオチド配列と、少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項５記載のプライマー対。
【請求項７】
普遍的順方向プライマーが、５’から３’方向に、配列番号５を含む、請求項５記載のプライマー対。
【請求項８】
プローブの長さが、１６〜２００ヌクレオチド、１７〜３５ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、２１〜３０ヌクレオチド、２４〜３０ヌクレオチドまたは２１〜２４ヌクレオチドである、抽出ＤＮＡまたは一工程ｑＰＣＲアッセイの溶解物を検出するためのプローブ。
【請求項９】
配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９より選択される配列の部分を含む配列と、少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項８記載のプローブ。
【請求項１０】
配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項８記載のプローブ。
【請求項１１】
５’から３’方向に、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９より選択される配列を有する、請求項８記載のプローブ。
【請求項１２】
プローブが、Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２またはＰ３であって、
Ｐ０が５’−色素＋配列番号６＋消光剤−３’であり；
Ｐ１が５’−色素＋配列番号７＋消光剤−３’であり；
Ｐ２が５’−色素＋配列番号８＋消光剤−３’であり；
Ｐ３が５’−色素＋配列番号９＋消光剤−３’である
請求項８〜１１のいずれか一項記載のプローブ。
【請求項１３】
逆方向プライマーが、Ｒ０、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１またはＲ４（３０ｂｐ）であり、そしてプローブがＰ０、Ｐ１、Ｐ２またはＰ３である、逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせ。
【請求項１４】
逆方向プライマーがＲ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ４（３０ｂｐ）であり、そしてプローブがＴＡＭＲＡ＋配列番号６＋ＢＨＱ２またはＴＡＭＲＡ＋配列番号８＋ＢＨＱ２である、請求項１３記載の組み合わせ。
【請求項１５】
テンプレートとしてＨＢＶゲノム（配列番号１）を用いるか、請求項５〜７のいずれか一項のプライマー対を用いるか、あるいは請求項１３または１４の組み合わせを用いることで構成される、ＰＣＲによってＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを検出するための方法。
【請求項１６】
ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
方法がハイスループット法である、請求項１５または１６記載の方法。
【請求項１８】
プレＤＮＡ抽出および精製を伴わないリアルタイムＰＣＲによる一工程ｃｃｃＤＮＡ検出法であって、以下の手順：
（１）試験しようとする化合物で細胞を処理し；
（２）処理後に細胞を採取し；
（３）溶解緩衝液を、採取した細胞に添加し；そして
（４）請求項１５〜１７のいずれか一項のリアルタイムＰＣＲを実行する
工程を含む、前記検出法。
【請求項１９】
溶解緩衝液がＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのものであり、そしてカタログ番号がＡＭ８７２３である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
細胞をオーブン中、５０℃〜７５℃の間の温度で３０分間〜２時間処理し、９６ウェルプレート中のウェルあたり、２０〜１００μＬの溶解緩衝液を添加し、そして次いで、０℃〜２５℃の温度でリアルタイムＰＣＲを行う、請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
請求項１５〜２０のいずれか一項の方法を用いる工程を含む、ＨＢＶに対する療法的効果を評価する際に用いる方法。
【請求項２２】
ＨＢＶに対する療法的効果を評価するための、請求項１〜４のいずれか一項の逆方向プライマー、請求項５〜７のいずれか一項のプライマー対、あるいは請求項１３または１４の組み合わせの使用。
【請求項２３】
ＨＢＶに対する療法的効果を評価するための検出剤の調製における、請求項１〜４のいずれか一項の逆方向プライマー、請求項５〜７のいずれか一項のプライマー対、あるいは請求項１３または１４の組み合わせの使用。
【請求項２４】
請求項１〜４のいずれか一項の逆方向プライマー、請求項５〜７のプライマー対、あるいは請求項１３または１４の組み合わせで構成される、ＨＢＶに対する療法的効果を評価するためのキット。
【請求項２５】
本明細書で先に記述した発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（１）Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）共有閉鎖環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の高効率リアルタイムｑＰＣＲに使用可能な新規ＤＮＡプライマーセット、および（２）リアルタイムｑＰＣＲによる、当該新規ＤＮＡプライマーのセットを用いた細胞由来のＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの定量化のための新規ハイスループット法に関する。本発明はまた、実験的に感染させた肝細胞におけるｃｃｃＤＮＡレベルを監視する際のこの方法の使用、およびＨＢＶに対する療法的効果の評価にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ｃｃｃＤＮＡは、ＨＢＶ生物学において重要な役割を果たすため、ｃｃｃＤＮＡをターゲティングする潜在的な薬剤候補の研究のために、多くの実験系が確立されてきている。ｃｃｃＤＮＡの調節可能細胞モデルを提供するため、Ｌａｄｎｅｒら（Ｌａｄｎｅｒ，  Ｓ．Ｋ．，  Ｏｔｔｏ，  Ｍ．Ｊ．，  Ｂａｒｋｅｒ，  Ｃ．Ｓ．，  Ｚａｉｆｅｒｔ，  Ｋ．，  Ｗａｎｇ，  Ｇ．Ｈ．，  Ｇｕｏ，  Ｊ．Ｔ．，  Ｓｅｅｇｅｒ，  Ｃ．，  Ｋｉｎｇ，  Ｒ．Ｗ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  １９９７年８月；４１（８）：１７１５−２０）は、ｔｅｔプロモーター系の転写制御下で、ＨＢＶウイルスゲノムを挿入した。さらに、挿入物の長さは、ＨＢＶの全ゲノムの長さより長く、Ｎｔ（ヌクレオチド）１８０５−１９００に渡る配列重複を提供した（Ｃａｉら，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ２０１２年８月；  ５６（８）：  ４２７７−８８）。このスキームは、ｃｃｃＤＮＡレベルおよび機能の代理マーカーとして、ｅＡｇ産生の使用を可能にした。最後に、Ｇｕｏら（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ２００７，  ８１（２２）：１２４７２）は、上記遺伝的背景において、ｓＡｇ遺伝子をさらに突然変異させると、ＨｅｐＤＥＳ１９と称される細胞株において、ウイルスＤＮＡの形成は、成熟ウイルス粒子を形成するためには使用不能であり、したがって、核へとサイクリングされる経路にしたがって、ｃｃｃＤＮＡ形成のより多くの前駆体が提供されることを示唆した。これらの修飾は、ｃｃｃＤＮＡの調節された産生、ｃｃｃＤＮＡの代理測定および機能的ウイルス粒子の排除を生じたため、ＨｅｐＤＥＳ１９に基づく細胞モデルは、ｃｃｃＤＮＡの研究を非常に容易にし、そしてｃｃｃＤＮＡの代理マーカーとしてｅＡｇを用いるハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイの確立を生じた（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ２０１２年８月；  ５６（８）：  ４２７７−８８）。
【０００３】
しかし、ｃｃｃＤＮＡは、ＨＢＶ疾患治療の直接の関心対象ターゲットである。したがって、細胞株、特にＨｅｐＤＥＳ１９細胞におけるｃｃｃＤＮＡの直接測定は、ｃｃｃＤＮＡ産生および安定性に関する活性評価において重要である。
【０００４】
慣用的（従来型、conventional）技術、例えばサザンハイブリダイゼーションによるｃｃｃＤＮＡの測定は、感度またはスループットが低いため、ハイスループット法としては使用不能である。Ｈｅ（ＢＢＲＣ  ２９５  （２００２）  １１０２−１１０７、米国特許出願：２００４００５８３１４）、Ｓｈａｏら（ＣＮ  １０１５０３７４０  Ｂ）およびＬｕら（ＣＮ  １０１２８５１０５Ｂ）は、以前、ｑＰＣＲに基づくｃｃｃＤＮＡ定量化アッセイ法を報告してきている。詳細なｑＰＣＲ法は異なる可能性もあるが、すべての方法は、分析前にＨＢＶ  ＤＮＡの抽出を必要とする。ＤＮＡ抽出は複雑で、そしてｑＰＣＲに重要な系に必須の構成要素を除去する。したがって、こうしたＤＮＡ抽出が関与する場合、一般的に、等量の出発材料、例えば細胞数を用いることによって調節する。こうした調節は、結果を同等化することをどのように試みるかの示唆を提供するが、これらは、厳密に言って、実際の実験対照を含まない。
【０００５】
ＤＮＡ精製工程を含むため、ｑＰＣＲによるｃｃｃＤＮＡ直接測定は、ハイスループットスクリーニング形式にスケールアップすることが不可能である（Ｈｉｒｔ，  Ｂ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６７；  ２６，  ３６５−９）。すべての試料供給源、特にＨｅｐＤＥＳ１９細胞モデル系由来のものにおけるｃｃｃＤＮＡハイスループット測定を可能にしうる、より優れた方法を提供するため、新規のロバストなスクリーニングスキームが必要である。
【０００６】
多くの人々が、ＤＮＡのプレ精製を伴わない細胞溶解物試料において、ある核酸の特定の型を直接測定する方法を記載してきている（Ｙａｎｇ  Ｋ．ら，  Ｇｅｎｅ．  ２０１３年１２月１日，  ５３１（２）：１９９−２０４；  Ｋｕｍａｒ  ＪＳら，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ．  ２０１４年４月１３日；  Ｐａｎｇ  Ｚら，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１４年４月２１日，  ９（４）：  ｅ９５６３５．）。これらのアプローチは、アッセイ効率を有意に増加させた。しかし、これらのアプローチは、Ｈｅ、ＳｈａｏおよびＬｕによって記載されるｃｃｃＤＮＡ  ｑＰＣＲ法に適用不能である。彼らの引用される方法からのプライマー配列情報に基づいて、その逆方向プライマーはすべて、ｑ−ＰＣＲアッセイに容易に使用可能であるように、ＨＢＶ  Ｎｔ−１９９０上流の配列範囲内にある。このため、ＨｅｐＤＥＳ１９細胞において、これらのｑＰＣＲに基づく方法はすべて、１．１×  ＨＢＶゲノムの染色体挿入物からのＤＮＡシグナルを増幅し（Ｇｕｏら，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ２００７年１１月，  ８１（２２）：１２４７２−８４）、したがってｃｃｃＤＮＡを選択的に増幅することに失敗する。さらに、直接溶解後のｑＰＣＲは、ＨＢＶ  ＤＮＡの他の型、例えば弛緩環状ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）および細胞中に挿入されたＨＢＶゲノムからｃｃｃＤＮＡを区別することに関与するプライマーのより高い特異性を必要とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願：２００４００５８３１４
【特許文献２】ＣＮ  １０１５０３７４０  Ｂ
【特許文献３】ＣＮ  １０１２８５１０５Ｂ
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｌａｄｎｅｒ，  Ｓ．Ｋ．，  Ｏｔｔｏ，  Ｍ．Ｊ．，  Ｂａｒｋｅｒ，  Ｃ．Ｓ．，  Ｚａｉｆｅｒｔ，  Ｋ．，  Ｗａｎｇ，  Ｇ．Ｈ．，  Ｇｕｏ，  Ｊ．Ｔ．，  Ｓｅｅｇｅｒ，  Ｃ．，  Ｋｉｎｇ，  Ｒ．Ｗ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  １９９７年８月；４１（８）：１７１５−２０
【非特許文献２】Ｃａｉら，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ２０１２年８月；  ５６（８）：  ４２７７−８８
【非特許文献３】Ｇｕｏら（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ２００７，  ８１（２２）：１２４７２）
【非特許文献４】Ｈｅ（ＢＢＲＣ  ２９５  （２００２）  １１０２−１１０７）
【非特許文献５】Ｈｉｒｔ，  Ｂ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６７；  ２６，  ３６５−９
【非特許文献６】Ｙａｎｇ  Ｋ．ら，  Ｇｅｎｅ．  ２０１３年１２月１日，  ５３１（２）：１９９−２０４
【非特許文献７】Ｋｕｍａｒ  ＪＳら，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ．  ２０１４年４月１３日
【非特許文献８】Ｐａｎｇ  Ｚら，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１４年４月２１日，  ９（４）：  ｅ９５６３５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
要約すると、ＨＢＶ  ＤＮＡをあらかじめ抽出することなく、ＨＢＶ感染細胞、特にＨｅｐＤＥＳ１９において、ｃｃｃＤＮＡレベルを定量化するために利用可能な高感度および特異的ＨＴＳ直接アッセイはない。したがって、高感度、ハイスループットおよび高特異性をもって、ｃｃｃＤＮＡを定量化する方法が必要である。本発明の目的は、本明細書に示すように、これらの必要性を満たすことである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概略
本発明は、ＨＢＶ感染細胞、特にＨｅｐＤＥＳ１９細胞からの、事前のＤＮＡ抽出および精製を伴わない、直接リアルタイムＰＣＲによる、一工程ｃｃｃＤＮＡ定量的ＨＴＳ（ハイスループットスクリーニング）法を開発するためのものである。
【００１１】
本発明者らは、ｃｃｃＤＮＡ特異的プライマーセットを設計した。プライマーのこの新規セットは、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡからＤＮＡ断片を増幅するが、ゲノムＤＮＡまたは染色体に挿入されたＨＢＶ  ＤＮＡからは増幅せず、ｃｃｃＤＮＡ特異的であることが立証されてきている。これらのプライマーのｃｃｃＤＮＡに対する特異性は、ＤＮＡ抽出およびｃｃｃＤＮＡ精製工程に対する必要性を排除し、そしてＨＴＳモードのマイクロタイタープレートアッセイ形式でｃｃｃＤＮＡを定量化することを可能にする。
【００１２】
本発明の１つの態様は、極３’端に、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノム（配列番号１）のヌクレオチド配列内の少なくとも１６の連続配列を認識する配列を含む、逆方向プライマーである。
【００１３】
本発明の別の態様は、上述のような有意性を有する逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーからなるプライマー対であって、普遍的順方向プライマーの長さが、１６〜２００ヌクレオチド、１７〜３５ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、２１〜３０ヌクレオチド、２４〜３０ヌクレオチドまたは２１〜２４ヌクレオチドであり、そしてＨＢＶゲノムのＤＲ２上流を認識する、前記プライマー対である。
【００１４】
本発明の別の態様は、プローブの長さが、１６〜２００ヌクレオチド、１７〜３５ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、２１〜３０ヌクレオチド、２４〜３０ヌクレオチドまたは２１〜２４ヌクレオチドである、抽出ＤＮＡまたは一工程ｑＰＣＲアッセイの溶解物を検出するためのプローブである。
【００１５】
本発明は、逆方向プライマーおよびプローブが上述のような有意性を有する、逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせに関する。
本発明は、テンプレートとしてＨＢＶゲノム（配列番号１）を用いるか、逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーのプライマー対を用いるか、または逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせを用いることで構成され、逆方向プライマー、普遍的順方向プライマーおよびプローブが上述のような有意性を有する、ＰＣＲによってＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを検出するための方法に関する。
【００１６】
本発明は、上述のような有意性を有する、ＨＢＶに対する療法的効果を評価する際に用いる方法に関する。
本発明は、ＨＢＶに対する療法的効果を評価するための、逆方向プライマー、逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーのプライマー対、または逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせの使用であって、逆方向プライマー、普遍的順方向プライマーおよびプローブが上述のような有意性を有する、前記使用に関する。
【００１７】
本発明は、ＨＢＶに対する療法的効果を評価するための検出剤調製における、逆方向プライマー、逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーのプライマー対、または逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせの使用であって、逆方向プライマー、普遍的順方向プライマーおよびプローブが上述のような有意性を有する、前記使用に関する。
【００１８】
本発明は、規準化対象としての内部参照遺伝子の使用に関する。これは、ｑＰＣＲ定量化対照としてのゲノムＤＮＡ上の遺伝子（単数または複数）に対するプライマーの使用を含む。
【００１９】
本発明におけるすべてのＤＮＡ構成要素の一部の保存は、こうした定量化対照を可能にする。
本発明は、逆方向プライマー、プライマー対、または組み合わせで構成され、逆方向プライマー、プライマー対、および組み合わせが上述のような有意性を有する、ＨＢＶに対する療法的効果を評価するためのキットに関する。
【００２０】
本発明はまた、ＨＢＶ  ＤＮＡに対するおよび参照遺伝子に対する、参照対照遺伝子プライマーおよびプローブ対と組み合わせた、逆方向プライマー、プライマー対で構成される、ＨＢＶに対する療法的効果を評価するための多重化キットであって、逆方向プライマーおよびプライマー対が、上述のような有意性を有する、前記キットにも関する。
【００２１】
定義
別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明が関連する技術分野の一般的な当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似の本質的に任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用可能であるが、例示的な方法および材料のみを記載する。本発明の目的のため、以下の用語を以下に定義する。
【００２２】
用語「ヌクレオチド」は、天然存在リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド単量体への言及に加えて、背景が明らかに別のものを示さない限り、関連するその構造変異体も指すと理解されるものとし、ヌクレオチドが使用される特定の背景（例えば相補的塩基へのハイブリダイゼーション）に関して機能的に同等である、誘導体および類似体が含まれる。
【００２３】
用語「同一性」は、２またはそれより多い核酸またはポリペプチド配列の背景において、同じである２またはそれより多い配列または下位配列を指す。配列は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いてまたは手動整列および視覚的検査によって測定した際、比較ウィンドウまたは指定される領域に渡って、最大対応のために比較し、そして整列させた際に、同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の明記される割合（例えば、明記される領域に渡る、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性）を有する場合、互いに「実質的に同一」である。これらの定義はまた、試験配列の相補体も指す。場合によって、同一性は、長さ少なくとも約５０ヌクレオチドである領域に渡って、あるいはより典型的には、長さ１００〜５００または１０００またはそれより多いヌクレオチドの領域に渡って存在する。
【００２４】
用語「ＰＣＲ」は、本明細書において、ポリメラーゼ連鎖反応を指す。
用語「ｑＰＣＲ」は、一般的に、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応、定量的ポリメラーゼ連鎖反応または動力学的ポリメラーゼ連鎖反応として知られるＰＣＲ技術を指す。この技術は、ＰＣＲを用いてターゲット核酸を増幅すると同時に定量化し、ここで、定量化は、ターゲット核酸にハイブリダイズした場合にしか検出可能でない蛍光レポーター分子を含有する、挿入蛍光色素または配列特異的プローブによる。
【００２５】
用語「プライマー」は、本明細書において、ｑＰＣＲ反応におけるＤＮＡ複製反応イニシエーターとして働くことが可能なオリゴヌクレオチドＤＮＡを指す。
用語「プローブ」は、本明細書において、反応中に存在する相補的ＤＮＡのレベルの増加と相関する蛍光強度変化を変化させることが可能な蛍光標識を伴うオリゴヌクレオチドを指す。
【００２６】
用語「Ｃｐ」は、投入ターゲット核酸の定量化を可能にする値を指す。Ｃｐ値は、二次導関数最大値法（Ｖａｎ  Ｌｕｕ−Ｔｈｅら，  「二次導関数計算および二重補正を用いたハイスループット測定のための改善リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法」  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｖｏｌ．  ３８，  Ｎｏ．  ２，  ２００５年２月，  ｐｐ．  ２８７−２９３）にしたがって決定可能である。二次導関数法において、Ｃｐは、二次導関数曲線の最初のピークに相当する。このピークは、対数線形相の始まりに相当する。二次導関数法は、リアルタイム蛍光強度曲線の二次導関数値を計算し、そして１つの値のみが得られる。元来のＣｐ法は、例えば多項式関数による強度値の局所定義微分近似に基づく。次いで、三次導関数を計算する。Ｃｐ値は、三次導関数の最小根である。Ｃｐはまた、対数線形領域において、閾値線の平行線の交差点によってＣｐを決定するフィットポイント法を用いても決定可能である（Ｖａｎ  Ｌｕｕ−Ｔｈｅら，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｖｏｌ．  ３８，  Ｎｏ．  ２，  ２００５年２月，  ｐｐ．  ２８７−２９３）。これらの計算は、いかなる当業者によっても容易に実行される。
【００２７】
用語「抽出」は、本明細書において、修飾Ｈｉｒｔ法（Ａｒａｄ  Ｕ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．  １９９８年５月；  ２４（５）：７６０−２；  Ｈｉｒｔ，  Ｂ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６７；  ２６，  ３６５−９）にしたがった、染色体外ＤＮＡの精製を指す。
【００２８】
用語「慣用的」(conventional)は、当該分野においてよく認められた公表参考文献に基づく実験法および材料を指す。曖昧さを回避するため、図中の「慣用群」および「慣用的」は異なる意味を有し、これは以下の略語部分に例示される。
【００２９】
用語「一工程ｑＰＣＲ」は、細胞材料を溶解し、そして直接ｑＰＣＲ分析に供する実験法を指す。
用語「Ｚ因子」は、アッセイの統計的再現性の測定値である。これは、ハイスループットスクリーニングにおいて、特定のアッセイにおける反応が、さらなる注目を保証するために十分に大きいかどうかを判断するためのハイスループットスクリーニングにおける使用のために提唱されてきている（この場合、Ｚプライムとしても知られ、そして一般的にＺ’と書かれる）。Ｚ因子は、４つのパラメータ：陽性（ｐ）および陰性（ｎ）対照両方の平均および標準偏差に関して定義される（μｐ、σｐ、μｎおよびσｎ）。これらの値を考慮して、Ｚ因子は：
【００３０】
【数１】
2018504891.tif 000002
【００３１】
と定義される。
用語「ＴＡＭＲＡ」は、色素としての５−カルボキシ−テトラメチルローダミンＮ−スクシニミジルエステルを指す。色素代替物を探す際、以下の基準が重要である：１）励起および検出波長が、装置光源および検出系と適合する。２）プローブに関しては、消光剤がレポーターの発光波長で光を有効に吸収する。３）消光係数がより高ければ色素はより明るく、これは高感度検出に寄与する。
【００３２】
用語「ＢＨＱ２」は、消光剤としての色素消光剤、ブラックホールクエンチャー−２を指す。消光剤：消光分子は、典型的には、単一分子プローブの３’に配置される。消光剤は蛍光（ＴＡＭＲＡＴＭ）または非蛍光分子（ＤＡＢＣＹＬ、ブラックホールクエンチャー（登録商標）（ＢＨＱ（登録商標）））であってもよい。最適な性能のため、消光剤吸光度スペクトルは、可能な限りレポーター発光スペクトルに近くマッチしているべきである。一般的に用いられる消光剤はＤＡＢＣＹＬおよびＴＡＭＲＡである。一般的に用いられるダーク消光剤には、ブラックホールクエンチャーＴＭ（ＢＨＱ）、アイオワブラックＴＭおよびブラックベリーＴＭクエンチャー６５０（ＢＢＱ−６５０）が含まれる。一般的に用いられる対は、色素６−ＦＡＭ／ＪＯＥ／ＴＥＴと消光剤ＢＨＱ−１／ＴＡＭＲＡ、色素ＴＡＭＲＡと消光剤ＢＨＱ−２である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ＨｅｐＤＥＳ１９安定細胞における組込みＨＢＶ  ＤＮＡおよび設計原理のスキームを示す。ＨｅｐＤＥＳ１９細胞における組込みＨＢＶ  ＤＮＡは、ヌクレオチド１８０５から始まり、ｔｅｔ  ＣＭＶプロモーターの下流に配置された１．１倍過剰長ＨＢＶゲノムで構成される。ＨＢＶ  Ｎｔ位は、Ｇａｌｉｂｅｒｔ命名法（Ｇａｌｉｂｅｒｔ，  Ｆら，  Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：６４６−６５０）にしたがう。図中に示すとおり、順方向プライマー（Ｆ）配列の位置は、二本鎖弛緩環状ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）の一本鎖部分内にある。このため、ｒｃＤＮＡ中の逆方向反応産物は、次の周期のＰＣＲにおいて、順方向プライマーによるテンプレートとしては使用不能である。さらに、ｑＰＣＲ設計におけるプローブは、ｒｃＤＮＡ中のニックの下流にある。物理的ブレークの存在は、順方向反応が、ｒｃＤＮＡ中のプローブ位内に移動することを妨げる。ｃｃｃＤＮＡにおいてはニック構造が存在せず、プローブがポリメラーゼによって切断されることが可能になり、蛍光増加が引き起こされる。これらの２つの要因が、ｒｃＤＮＡに勝るｃｃｃＤＮＡに対する選択性に関して、ｑＰＣＲスキームを説明する。しかし、ＨｅｐＤＥＳ１９細胞において、染色体１．１倍ＨＢＶゲノム挿入物も存在する。この１．１倍過剰長ＨＢＶゲノムの３’末端冗長性配列は、Ｎｔ１８０５から１９９０である。
【００３４】
本発明者らは最初に、逆方向プライマーを１９９０上流に設計すると、染色体ＨＢＶ  ＤＮＡ挿入物がｑＰＣＲアッセイにおいて増幅され、ｃｃｃＤＮＡ定量化のためにウイルスＤＮＡの抽出が必要となることを見出した。このことは、慣用的な逆方向プライマーを用いた際になぜウイルスＤＮＡの抽出が必要であるかを説明する（Ｔａｋｋｅｎｂｅｒｇら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．  ９０３，  ＤＯＩ  １０．１００７／９７８−１−６１７７９−９３７−２＿７）。本発明者らは、驚くべきことに、逆方向プライマーを１９９０の下流に設計することによって、新規逆方向プライマーが、図において、順方向プライマーの左側に位置し（互いに反対方向を指し）、ゲノムＨＢＶ  ＤＮＡ挿入物がｑＰＣＲアッセイにおいて増幅されず、そして新規逆方向プライマーは、なおｃｃｃＤＮＡ上では、順方向プライマーの方を指し、ｃｃｃＤＮＡの環状の性質のために、生産的なｑＰＣＲ反応を生じることを見出した。
【図２】図２は、抽出ウイルスゲノムＤＮＡに対して慣用的ｃｃｃＤＮＡプライマーを用いた、および一工程ｑＰＣＲアッセイを用いた、ｑＰＣＲアッセイを示す。
【図３】図３は、ＨｅｐＤＥＳ１９由来の抽出ＤＮＡ、または抽出を伴わない直接溶解物（一工程ｑＰＣＲアッセイ）を検出するための新規ｃｃｃＤＮＡプライマーの設計および試験を示す。
【図４】図４は、ＨｅｐＤＥＳ１９由来の抽出ＤＮＡ、または抽出を伴わない直接溶解物（一工程ｑＰＣＲアッセイ）を検出するための新規ｃｃｃＤＮＡプローブの設計および試験を示す。
【図５】図５は、ＤＮＡアガロースゲルによる、ｐＨＢＶ１．３陽性対照プラスミド（ｐＨＢＶ１．３陽性対照プラスミドに関しては、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ２００７年９月；  ８１（１８）：  １００７２−８０．  Ｅｐｕｂ  ２００７年７月３日を参照されたい）および一工程ｑＰＣＲアッセイ由来のＰＣＲ産物のサイズ比較を提供する。
【図６】図６は、ｑＰＣＲアッセイによる、ｐＨＢＶ１．３陽性プラスミドおよびＨＢＶ  ＤＮＡ対照を用いた、ｃｃｃＤＮＡプライマーの特異性の確認を提供する。
【図７】図７は、プラスミドセーフＡＴＰ依存性ＤＮアーゼ（ＰＳＡＤ、非環状ＤＮＡを切断不能、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、米国ウィスコンシン州マディソンより購入、カタログ番号：Ｅ３１０１Ｋ）前処理を伴いまたは伴わず、その後、ｑＰＣＲアッセイを行った、ｃｃｃＤＮＡプライマー対の特異性の確認を提供する。
【図８】図８は、ｑＰＣＲアッセイによる、ＨｅｐＧ２．２．１５、ＨｅｐＤＥ１９およびＨｅｐＤＥＳ１９細胞の上清を用いた、ｃｃｃＤＮＡプライマーの特異性の確認を提供する。
【図９】図９は、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３５９９）中のｃｃｃＤＮＡのレベルの試験を示す。
【図１０】図１０は、新規逆方向プライマーの設計およびＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ検出に関する能力の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、リアルタイムＰＣＲによる細胞溶解物からのＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの定量化のための新規ハイスループット法、ならびに感染肝細胞におけるｃｃｃＤＮＡレベルの監視およびＨＢＶに対する療法的効果の評価におけるその使用を提供する。
【００３６】
本発明の１つの態様は、（ｉ）極３’端に、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノム（配列番号１）のヌクレオチド配列内の少なくとも１６の連続配列を認識する配列を含む、逆方向プライマーである。
【００３７】
本発明のさらなる態様は、（ｉｉ）極３’端に、配列番号１の１９９６からヌクレオチド２２７８までのＨＢＶゲノムのヌクレオチド配列内の少なくとも１６の連続配列を認識する配列を含む、逆方向プライマーである。
【００３８】
本発明の別の態様は（ｉｉｉ）逆方向プライマーの長さが、１６〜２００ヌクレオチド、１７〜３５ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、２１〜３０ヌクレオチド、２４〜３０ヌクレオチドまたは２１〜２４ヌクレオチドである、態様（ｉ）または（ｉｉ）に提供する有意性を有する逆方向プライマーである。
【００３９】
本発明の別の態様は、（ｉｖ）好ましくは極３’端ヌクレオチドにおいて、５’から３’方向に、以下の配列から選択される配列を含む、逆方向プライマーである：
【００４０】
【化１】
2018504891.tif 000003
【００４１】
本発明の別の態様は、（ｖ）逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーからなるプライマー対であって、逆方向プライマーが本明細書において前に定義するような有意性を有し、普遍的順方向プライマーの長さが、１６〜２００ヌクレオチド、１７〜３５ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、２１〜３０ヌクレオチド、２４〜３０ヌクレオチドまたは２１〜２４ヌクレオチドであり、そして普遍的順方向プライマーがＨＢＶゲノムのＤＲ２上流を認識する、前記プライマー対である。
【００４２】
本発明のさらなる態様は、（ｖｉ）逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーからなるプライマー対であって、逆方向プライマーが本明細書において前に定義するような有意性を有し；普遍的順方向プライマーの長さが、１６〜２００ヌクレオチド、１７〜３５ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、２１〜３０ヌクレオチド、２４〜３０ヌクレオチドまたは２１〜２４ヌクレオチドであり、そして普遍的順方向プライマーが、ヌクレオチド１５２８〜ヌクレオチド１５４８の配列番号５のヌクレオチド配列と、少なくとも８０％の配列同一性を有する、前記プライマー対である。
【００４３】
本発明のさらなる態様は、（ｖｉｉ）逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーからなるプライマー対であって、逆方向プライマーが本明細書において前に定義するような有意性を有し；普遍的順方向プライマーの長さが、１６〜２００ヌクレオチド、１７〜３５ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、２１〜３０ヌクレオチド、２４〜３０ヌクレオチドまたは２１〜２４ヌクレオチドであり、そして普遍的順方向プライマーがＨＢＶゲノムのＤＲ２上流を認識し、そして普遍的順方向プライマーが、ヌクレオチド１５２８〜ヌクレオチド１５４８の配列番号５のヌクレオチド配列と、少なくとも８０％の配列同一性を有する、前記プライマー対である。
【００４４】
本発明のさらなる態様は、（ｖｉｉｉ）逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーからなるプライマー対であって、逆方向プライマーが上に定義するような有意性を有し；普遍的順方向プライマーの長さが、１６〜２００ヌクレオチド、１７〜３５ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、２１〜３０ヌクレオチド、２４〜３０ヌクレオチドまたは２１〜２４ヌクレオチドであり、そして普遍的順方向プライマーが、５’から３’方向に、配列番号５を含む、前記プライマー対である。
【００４５】
本発明の別の態様は、（ｉｘ）プローブの長さが、１６〜２００ヌクレオチド、１７〜３５ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、２１〜３０ヌクレオチド、２４〜３０ヌクレオチドまたは２１〜２４ヌクレオチドである、抽出ＤＮＡまたは一工程ｑＰＣＲアッセイの溶解物を検出するためのプローブである。特に、本発明はまた、ＨｅｐＤＥＳ１９由来の抽出ＤＮＡまたは一工程ｑＰＣＲアッセイの溶解物を検出するためのプローブであって、プローブの長さが、１６〜２００ヌクレオチド、１７〜３５ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、２１〜３０ヌクレオチド、２４〜３０ヌクレオチドまたは２１〜２４ヌクレオチドである、前記プローブにも関する。
【００４６】
本発明のさらなる態様は、（ｘ）プローブが配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９より選択される配列の部分を含む配列と、少なくとも８０％の配列同一性を有する、抽出ＤＮＡまたは一工程ｑＰＣＲアッセイの溶解物を検出するためのプローブである。
【００４７】
本発明のさらなる態様は、（ｘｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９と、少なくとも８０％の配列同一性を有し、そして他の技術的特徴が上に定義するような有用性を有するプローブである。
【００４８】
本発明のさらなる態様は、（ｘｉｉ）５’から３’方向に、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９より選択される配列を有し、そして他の技術的特徴が上に定義するような有用性を有するプローブである。
【００４９】
本発明のさらなる態様は、（ｘｉｉｉ）Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２またはＰ３のプローブであって、
Ｐ０が５’−色素＋配列番号６＋消光剤−３’であり；
Ｐ１が５’−色素＋配列番号７＋消光剤−３’であり；
Ｐ２が５’−色素＋配列番号８＋消光剤−３’であり；
Ｐ３が５’−色素＋配列番号９＋消光剤−３’である
前記プローブである。
【００５０】
本発明のさらなる態様は、（ｘｉｖ）配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９より選択される配列の部分を含む配列と、少なくとも８０％の配列同一性を有し、色素が６−ＦＡＭ、ＪＯＥまたはＴＥＴであり、一方、消光剤がＢＨＱ−１またはＴＡＭＲＡであるか、あるいは色素がＴＡＭＲＡであり、一方、消光剤がＢＨＱ−２であるプローブである。
【００５１】
本発明の別の態様は、（ｘｖ）逆方向プライマーが、Ｒ０、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１またはＲ４（３０ｂｐ）であり；そしてプローブがＰ０、Ｐ１、Ｐ２またはＰ３である、逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせである。
【００５２】
本発明のさらなる態様は、（ｘｖｉ）逆方向プライマーがＲ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ４（３０ｂｐ）であり；そしてプローブがＴＡＭＲＡ＋配列番号６＋ＢＨＱ２またはＴＡＭＲＡ＋配列番号８＋ＢＨＱ２である、逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせである。
【００５３】
本発明の別の態様は、（ｘｖｉｉ）テンプレートとしてＨＢＶゲノム（配列番号１）を用い、そして逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーのプライマー対、または逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせを用いることで構成され；逆方向プライマー、普遍的順方向プライマーおよびプローブが上に定義するような有意性を有する、ＰＣＲによってＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを検出するための方法である。
【００５４】
本発明の別の態様は、（ｘｖｉｉｉ）テンプレートとしてＨＢＶゲノム（配列番号１）を用い、そして逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーのプライマー対、または逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせを用いる工程を含み；ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲであり；逆方向プライマー、普遍的順方向プライマーおよびプローブが上に定義するような有意性を有する、ＰＣＲによってＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを検出するための方法である。
【００５５】
本発明の別の態様は、（ｘｉｘ）テンプレートとしてＨＢＶゲノム（配列番号１）を用い、そして逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーのプライマー対、または逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせを用いることで構成され；方法がハイスループット法であり；逆方向プライマー、普遍的順方向プライマーおよびプローブが上に定義するような有意性を有する、ＰＣＲによってＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを検出するための方法である。
【００５６】
本発明の別の態様は、（ｘｘ）プレＤＮＡ抽出および精製を伴わないリアルタイムＰＣＲによる一工程ｃｃｃＤＮＡ検出法であって、以下の手順：
（１）試験しようとする化合物で細胞を処理し；
（２）処理後に細胞を採取し；
（３）溶解緩衝液を、採取した細胞に添加し；そして
（４）上に定義するような有用性を有するリアルタイムＰＣＲを実行する
工程を含む、前記検出法である。
【００５７】
本発明のさらなる態様は、（ｘｘｉ）態様（ｘｘ）記載のプレＤＮＡ抽出および精製を伴わないリアルタイムＰＣＲによる一工程ｃｃｃＤＮＡ検出法であって、溶解緩衝液が、商業的に入手可能な溶解緩衝液、例えばＲＩＰＡ緩衝液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡ；ＮＰ−４０緩衝液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０置換物および５ｍＭ  ＥＤＴＡ；ならびにＤＳＰ緩衝液：４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸および５０ｍＭ  ＮａＦであり；そして他の技術的特徴が上に定義するような有用性を有する、前記検出法に関する。
【００５８】
本発明のさらなる態様は、（ｘｘｉｉ）態様（ｘｘ）記載のプレＤＮＡ抽出および精製を伴わないリアルタイムＰＣＲによる一工程ｃｃｃＤＮＡ検出法であって、溶解緩衝液がＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのものであり、そしてカタログ番号がＡＭ８７２３であり；そして他の技術的特徴が上に定義するような有用性を有する、前記検出法に関する。
【００５９】
本発明のさらなる態様は、（ｘｘｉｉｉ）態様（ｘｘ）記載のプレＤＮＡ抽出および精製を伴わないリアルタイムＰＣＲによる一工程ｃｃｃＤＮＡ検出法であって、細胞をオーブン中、５０℃〜７５℃の間の温度で３０分間〜２時間処理し、９６ウェルプレート中のウェルあたり、２０〜１００μＬの溶解緩衝液を添加し、そして次いで、０℃〜２５℃の間の温度でリアルタイムＰＣＲを行い；そして他の技術的特徴が上に定義するような有用性を有する、前記検出法に関する。
【００６０】
本発明の別の態様は、（ｘｘｉｖ）上に定義するような有用性を有する方法を用いる工程を含む、ＨＢＶに対する療法的効果を評価する際に用いる方法である。
本発明の別の態様は、（ｘｘｖ）ＨＢＶに対する療法的効果を評価するための、逆方向プライマー、逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーのプライマー対、または逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせの使用であって、逆方向プライマー、普遍的順方向プライマーおよびプローブが上に定義するような有用性を有する、前記使用である。
【００６１】
本発明の別の態様は、（ｘｘｖｉ）ＨＢＶに対する療法的効果を評価するための検出剤調製における、逆方向プライマー、逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーのプライマー対、または逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせの使用であって、逆方向プライマー、普遍的順方向プライマーおよびプローブが上に定義するような有用性を有する、前記使用である。
【００６２】
本発明の別の態様は、（ｘｘｖｉｉ）逆方向プライマー、逆方向プライマーおよび普遍的順方向プライマーのプライマー対、または逆方向プライマーおよびプローブで構成される組み合わせで構成される、ＨＢＶに対する療法的効果を評価するためのキットであって、逆方向プライマー、普遍的順方向プライマーおよびプローブが上に定義するような有用性を有する、前記キットである。
【００６３】
本発明の別の態様は、（ｘｘｖｉｉｉ）リアルタイムＰＣＲによってＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを検出するための新規プライマーおよびプローブの原理であって；選択プライマーおよびｑＰＣＲ設計の一般的な原理が図１に示されるとおりである、前記原理である。１．１ｘＨＢＶ組込みゲノムの戦略的位置にｑＰＣＲプライマーを注意深く設計することによって、ＰＣＲ  ＤＮＡ供給源としてｃｃｃＤＮＡを用いた際に特定のサイズのｑＰＣＲ産物が生成可能となる一方、組込みゲノムＨＢＶ  ＤＮＡをＰＣＲ供給源として用いた場合には、生産的ＰＣＲ産物は生じないであろうことが可能となる。このプライマー対は、ｑＰＣＲ分析の供給源として、精製ウイルスＤＮＡ調製を用いることを必要としない、十分な特異性および選択性を提供する。
【００６４】
材料および方法
細胞培養
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｔｅｔ系認可ＦＢＳ、カタログ番号６３１１０６）および３００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０１３１−０２７）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０５６５−０１８）中、３７℃で培養した。
【００６５】
ＨｅｐＤＥ１９およびＨｅｐＤＥＳ１９細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、３００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８、および１μｇ／ｍＬテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ０６０００００）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、３７℃で培養した。ＨＢＶウイルスＤＮＡを得るため、ＨｅｐＤＥＳ１９細胞を６０ｍｍ培養プレート中、テトラサイクリンを含まず、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、３００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に植え付けた。
【００６６】
ＤＮＡ抽出法（修飾Ｈｉｒｔ  ＤＮＡ抽出、１９９８，  ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：７６０−７６２）
５０μｇ／ｍＬ  ＲＮアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｒ６１４８）を含むまたは含まない２５０μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ７．５および１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に細胞を再懸濁した。次いで、試料をボルテックスによって２５０μＬの１．２％ＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号７４２５５）と混合し、そして次いで５分間放置した。３５０μＬの３Ｍ  ＣｓＣｌ、１Ｍ酢酸カリウムおよび０．６７Ｍ酢酸を添加することによって、細胞破片および染色体ＤＮＡを沈殿させた。混合物を１．５ｍＬ試験管に移し、そして次いで、ピペットで直ちにしかし穏やかに試験管を混合し、そして氷上に１５分間置いた。試料を１４０００ｇ（ｒｃｆ）、４℃で１５分間遠心分離し、上清をカラム（ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡミニキットのＱｉａｇｅｎスピンカラム；Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、ドイツ・ヒルデン、カタログ番号５１３０６）上に装填した。１４０００ｇ（ｒｃｆ）、４℃で遠心分離することによって、カラムを７５０μＬの洗浄緩衝液（８０ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、４０μＭ  ＥＤＴＡおよび６０％エタノールＶ／Ｖ）で洗浄した。次いで、１４０００ｇ（ｒｃｆ）、４℃で遠心分離することによって、５０μＬの水またはＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）でＤＮＡを溶出した。
【００６７】
一工程ｑＰＣＲアッセイ：
９６ウェルプレート中のウェルあたり４０，０００細胞を３７℃で６日間インキュベーションした後、細胞をＣａ２＋およびＭｇ２＋不含リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、そして５０μＬの特別溶解緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＡＭ８７２３）によって溶解した。生じた試料をオーブン中、７５℃で２時間インキュベーションした。リアルタイムＰＣＲを行うまで、溶解物を４℃で維持した。ｑＰＣＲを実行するため、２μＬの溶解物を分析に用いた。異なる試料に関して、各反応を、各７５０ｎＭプライマー、４００ｎＭプローブおよび１０μＬのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０プローブマスター（ＲＤ０４８８７３０１００１−０１、Ｒｏｃｈｅ）を含有する最終体積２０μＬ中、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ＩＩ装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，  ＩＮＣ）によって実行した。ＰＣＲサイクリングプログラムを以下のように実行した：５０℃で２分間開始、次いで、９５℃の温度で１０分間変性、その後、９５℃の温度で１０秒間の変性、５８℃の温度で５秒間のアニーリング、６３℃１０秒間、および７２℃の温度で４０秒間の伸長の４５周期の増幅、そして次いで７２℃１０分間の最終伸長。ＰＣＲサイクリングプログラムの完了後、Ｃｐ値を得て、投入ターゲット核酸の定量化を決定した。
【００６８】
実施例
以下の実施例は、請求する発明を例示するよう提供されるが、限定するためではない。
本明細書に用いる略語は以下の通りである：
慣用群：慣用的逆方向プライマー（配列番号４）および慣用的プローブ（５’−ＴＡＭＲＡ＋配列番号２＋ＢＨＱ２−３’）と対形成する慣用的順方向プライマー（配列番号３）を意味し、「慣用群」（Conventional Group）は、すべての図において「慣用的」(Conventional)と略される。
【００６９】
ＨＢＶ  ＤＮＡ群：ＨＢＶ−Ｒ（配列番号２６）およびＨＢＶ  ＤＮＡプローブ（５’−ＴＡＭＲＡ＋配列番号２７＋ＢＨＱ２−３’）と対形成するＨＢＶ−Ｆ（配列番号２５）を意味する。
【００７０】
【化２】
2018504891.tif 000004
【実施例１】
【００７１】
実施例1：抽出ウイルスゲノムＤＮＡのための慣用的ｃｃｃＤＮＡプライマー対を用いた、および一工程ｑＰＣＲアッセイを用いた、ｑＰＣＲアッセイの比較
細胞材料の供給源は、ｃｃｃＤＮＡ誘導を伴わない（１μｇ／ｍＬテトラサイクリンの存在によるバックグラウンド）または誘導を伴う（テトラサイクリンが存在しないことによるｃｃｃＤＮＡ発現）、培養６日後のＨｅｐＤＥＳ１９由来であった。慣用群を試験した。ＤＮＡ抽出法および一工程ｑＰＣＲアッセイを上述の方法にしたがって行った。
【００７２】
図２に示す結果は、Ｔｅｔオン（バックグラウンド）条件由来のＤＮＡおよびＴｅｔオフ（ｃｃｃＤＮＡ発現）条件由来のＤＮＡの間の範囲を示した。抽出ＤＮＡ法に関して、慣用群は、ｑＰＣＲアッセイにおいて１１．３倍の相違を示した。一工程ｑＰＣＲアッセイに関しては、１．３倍しか相違がなかった。抽出ＤＮＡ法および一工程ｑＰＣＲアッセイの結果を比較することによって、慣用群は、一工程ｃｃｃＤＮＡ定量化アッセイを確立するために使用することができなかった。
【実施例２】
【００７３】
実施例２：ＨｅｐＤＥＳ１９由来の抽出ＤＮＡまたは抽出を伴わない直接溶解物（一工程ｑＰＣＲアッセイ）を検出するための新規ｃｃｃＤＮＡプライマーの試験
細胞材料の供給源は、ｃｃｃＤＮＡ誘導を伴わない（１μｇ／ｍＬテトラサイクリンの存在によるバックグラウンド）または誘導を伴う（テトラサイクリンが存在しないことによるｃｃｃＤＮＡ発現）、培養６日後のＨｅｐＤＥＳ１９由来であった。本実施例では、以下の材料を用いた：慣用群、ＰＡＩＲ０−Ｐ０、ＰＡＩＲ１−Ｐ０、ＰＡＩＲ２−Ｐ０、ＰＡＩＲ３−Ｐ０、およびＰＡＩＲ４−Ｐ０。Ｐ０中で用いた色素はＴＡＭＲＡであり、そしてＰ０中で用いた消光剤はＢＨＱ２であった。一工程ｑＰＣＲアッセイを、上述のような以下の方法で行った。
【００７４】
図３ａに示す結果は、ＨｅｐＤＥＳ１９細胞におけるバックグラウンド由来の抽出ＤＮＡおよびｃｃｃＤＮＡ発現由来の抽出ＤＮＡの間の範囲が、ＰＡＩＲ０−Ｐ０、ＰＡＩＲ１−Ｐ０、ＰＡＩＲ２−Ｐ０、ＰＡＩＲ３−Ｐ０、およびＰＡＩＲ４−Ｐ０において、慣用群における１１．３倍から、５０〜８０倍に改善されたことを示した。これは、新規プライマー対およびプローブ、すなわちＰＡＩＲ０−Ｐ０、ＰＡＩＲ１−Ｐ０、ＰＡＩＲ２−Ｐ０、ＰＡＩＲ３−Ｐ０、およびＰＡＩＲ４−Ｐ０が、低いバックグラウンドで、ｃｃｃＤＮＡの検出に関してより優れた感度を有することを示した。図３ｂに示す結果は、一工程ｑＰＣＲアッセイに関して、バックグラウンドおよびｃｃｃＤＮＡ発現の間にほぼ６．８倍の相違があることを示した。慣用群とは異なり、新規ｃｃｃＤＮＡプライマー対およびプローブ、すなわちＰＡＩＲ０−Ｐ０、ＰＡＩＲ１−Ｐ０、ＰＡＩＲ２−Ｐ０、ＰＡＩＲ３−Ｐ０、およびＰＡＩＲ４−Ｐ０は、ＨｅｐＤＥＳ１９細胞中のＨＢＶゲノムＤＮＡを検出することは不能であり、そして一工程ｑＰＣＲアッセイに有用であることに注目することは価値あることであった。これは、新規プライマー対およびプローブと関連する改善を説明した。
【実施例３】
【００７５】
実施例３：ＨｅｐＤＥＳ１９由来の抽出ＤＮＡまたは抽出を伴わない一工程ｑＰＣＲアッセイの直接溶解物（一工程ｑＰＣＲアッセイ）を検出するための新規ｃｃｃＤＮＡプローブの試験
細胞材料の供給源は、ｃｃｃＤＮＡ誘導を伴わない（１μｇ／ｍＬテトラサイクリンの存在によるバックグラウンド）または誘導を伴う（テトラサイクリンが存在しないことによるｃｃｃＤＮＡ発現）、培養６日後のＨｅｐＤＥＳ１９由来であった。
【００７６】
ＤＮＡ抽出研究に関して、用いたプローブはＰ０、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３であり、各プローブにおいて、用いた色素はＴＡＭＲＡであり、そして用いた消光剤はＢＨＱ２であった。すべての反応に用いたプライマーは、ＰＡＩＲ４であった。
【００７７】
一工程ｑＰＣＲアッセイに関して、用いたプローブはＰ２であり、そしてＰ２で用いた色素はＴＡＭＲＡであり、そしてＰ２で用いた消光剤はＢＨＱ２であった。用いたプライマーは、それぞれ、ＰＡＩＲ１およびＰＡＩＲ４であった。慣用群もまた、対照として用いた。
【００７８】
図４ａに示す結果は、新規プローブの設計、および抽出されたウイルスＤＮＡにおいてＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを検出する能力の比較を示した。ｑＰＣＲアッセイにおいて、ＰＡＩＲ４に固定し、Ｐ０およびＰ２は優れた効率を示し、そしてバックグラウンドおよびｃｃｃＤＮＡ発現の間の相違はほぼ９０倍であった。一工程ｑＰＣＲアッセイに関しては、図４ｂに示す結果は、ＰＡＩＲ１−Ｐ２およびＰＡＩＲ４−Ｐ２が８倍より多い相違を有する一方、慣用群に関しては１．３倍の相違しかないことを示した。この結果から、新規プライマーおよびプローブ対は、ハイスループットアッセイの開発に有用であると結論づけられた。
【実施例４】
【００７９】
実施例４：ＤＮＡアガロースゲルによる、ｐＨＢＶ１．３陽性対照プラスミドおよび一工程ｑＰＣＲアッセイ由来のＰＣＲ産物のサイズ比較
細胞材料の供給源は、誘導を伴う（テトラサイクリンを含まないｃｃｃＤＮＡ発現）、培養６日後のＨｅｐＤＥＳ１９由来であった。
【００８０】
ＰＡＩＲ１−Ｐ２、ＰＡＩＲ４−Ｐ２および慣用群を、ＤＮＡ抽出および一工程ｑＰＣＲアッセイで用いた。ＨＢＶ  ＤＮＡ群および慣用群を対照として用いた。用いたＰ２中の色素はＴＡＭＲＡであり、そして用いたＰ２中の消光剤はＢＨＱ２であった。
【００８１】
図５の左部分は、テンプレートとしてｐＨＢＶ１．３を用いたｑＰＣＲ由来の反応産物の１％アガロースゲル電気泳動結果であった。図５の右部分は、同じプライマーおよびプローブ表示を用いた一工程ｑＰＣＲアッセイの結果を提供した。
【００８２】
図５に示す結果は、ｐＨＢＶ１．３陽性対照プラスミド由来および一工程ｑＰＣＲアッセイ由来のＰＣＲ産物のサイズが同じであることを示し、これは、一工程由来のＰＣＲ産物が正しい産物であることと一致した。ＰＡＩＲ４−Ｐ２由来の一工程ｑＰＣＲ産物は、慣用的プライマー対由来のＰＣＲ産物よりもより特異的なバンドを有した。
【実施例５】
【００８３】
実施例５：ｃｃｃＤＮＡプライマーおよびプローブの特異性の確認
細胞材料の供給源は、誘導を伴う（テトラサイクリンを含まないｃｃｃＤＮＡ発現）、培養６日後のＨｅｐＤＥＳ１９由来であった。ｐＨＢＶ１．３プラスミドを陽性対照として用い、そしてＨＢＶ  ＤＮＡをＤＮＡ抽出法によって抽出した。ＨＢＶ  ＤＮＡ群、ＰＡＩＲ１−Ｐ２およびＰＡＩＲ４−Ｐ２をこの研究で用いた。Ｐ２に関して、用いた色素はＴＡＭＲＡであり、そして用いた消光剤はＢＨＱ２であった。陽性対照ｐＨＢＶ１．３プラスミドを用いて、多様なＤＮＡプライマー対のレベルを較正した。較正後、プライマー対は、等量のＰＣＲ産物（白いバー）を生じた。しかし、同じ量のプライマー対をＨｅｐＤＥＳ１９抽出ＤＮＡに適用した際、ｑＰＣＲ産物の異なるＣｐ値が検出された。図６に示すように、ＨｅｐＤＥＳ１９細胞において、ＨＢＶ  ＤＮＡ群を用いた実験で検出されるＨＢＶ  ＤＮＡのレベルは、ＰＡＩＲ１−Ｐ２およびＰＡＩＲ４−Ｐ２を用いた実験において検出されるｃｃｃＤＮＡレベルよりも２０倍高かった。
【実施例６】
【００８４】
実施例６：ｃｃｃＤＮＡプライマー対の特異性の確認
ＤＮＡ抽出法の手順にしたがって、本研究において、ＨＢＶ  ＤＮＡ群、ＰＡＩＲ１−Ｐ２およびＰＡＩＲ４−Ｐ２を用いた。反応混合物は、６．８μＬの抽出ＤＮＡ、４Ｕ  ＰＳＡＤ、１ｍＭ  ＡＴＰおよび２μＬの反応緩衝液と、最終体積２０μＬまでの水を含有した。消化を３０℃で１６時間行った。細胞材料の供給源は、ｃｃｃＤＮＡの誘導を伴わない（１μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むバックグラウンド）または誘導を伴う（テトラサイクリンを含まないｃｃｃＤＮＡ発現）、培養６日後のＨｅｐＤＥＳ１９由来であった。供給源ＤＮＡは、ＨｅｐＤＥＳ１９細胞由来の抽出ＤＮＡであった。ＰＳＡＤは、二本鎖弛緩環状ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）を含む非環状ＨＢＶ  ＤＮＡを切断可能である。結果を図７に示した。一般的ＨＢＶ  ＤＮＡ群を用いて、ＰＳＡＤ処理を伴う、および伴わないＤＮＡ試料間で、２．４倍の相違があった。しかし、ＰＡＩＲ１−Ｐ２およびＰＡＩＲ４−Ｐ２を用いると相違はなく、ＰＡＩＲ１−Ｐ２およびＰＡＩＲ４−Ｐ２のｑＰＣＲテンプレートは、ＤＮＡの環状供給源（ｃｃｃＤＮＡ）であることが示された。
【実施例７】
【００８５】
実施例７：ｑＰＣＲアッセイによる、ＨｅｐＧ２．２．１５、ＨｅｐＤＥ１９およびＨｅｐＤＥＳ１９細胞の上清を用いた、ｃｃｃＤＮＡプライマーの特異性の確認
本実施例ではＰＡＩＲ４−Ｐ２を用いた。陽性対照プラスミドｐＨＢＶ１．３を用いて、ＨＢＶ  ＤＮＡプライマーおよびｃｃｃＤＮＡプライマーの効率を較正した。ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清および３００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、３７℃で培養した。ＨｅｐＤＥ１９およびＨｅｐＤＥＳ１９細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、３００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８、および１μｇ／ｍＬテトラサイクリンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、３７℃で培養した。ｃｃｃＤＮＡは、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞（ＨＢＶウイルスを連続して発現する安定細胞株）の上清中では検出されなかった。ＨｅｐＤＥ１９細胞（テトラサイクリンをオフにした６日後）およびＨｅｐＤＥＳ１９（テトラサイクリンをオフにした６日後）細胞の上清において、ｃｃｃＤＮＡはバックグラウンドレベルでしか検出されなかったが、ｒｃＤＮＡはこれらの細胞株において検出された。細胞を６日間インキュベーションした後、ｑＰＣＲを実行するため、２μＬの上清を分析に用いた。異なる試料に関して、各反応を、各７５０ｎＭプライマー、４００ｎＭプローブおよび１０μＬのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０プローブマスター（ＲＤ０４８８７３０１００１−０１、Ｒｏｃｈｅ）を含有する最終体積２０μＬ中、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ＩＩ装置（Ｒｏｃｈｅ）を用いることによって実行した。ＰＣＲサイクリングプログラムを以下のように実行した：５０℃で２分間開始、次いで、９５℃の温度で１０分間変性、その後、９５℃の温度で１０秒間の変性、５８℃の温度で５秒間のアニーリング、６３℃１０秒間、および７２℃の温度で４０秒間の伸長の４５周期の増幅、そして次いで７２℃の温度で１０分間の最終伸長。結果を図８に示す。
【実施例８】
【００８６】
実施例８：リアルタイムＰＣＲによってＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを検出するためのアッセイ開発
一工程ｑＰＣＲアッセイにおいて、ＰＡＩＲ４−Ｐ２をこの実施例で用いた。ウェルあたり４０，０００細胞を植え付けた。細胞材料の供給源は、ｃｃｃＤＮＡ誘導を伴わない（１μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むバックグラウンド）または誘導を伴う（テトラサイクリンを含まないｃｃｃＤＮＡ発現）、培養６日後のＨｅｐＤＥＳ１９由来であった。ウェル１からウェル４８の試料はｃｃｃＤＮＡ発現であり、そして４９〜９６の試料はバックグラウンドであった。
【００８７】
図９に示す結果は、最適化条件を示した。細胞を含む溶解の最適なインキュベーションは、約３０分から１時間であった。９６マイクロタイタープレート上のｃｃｃＤＮＡ発現に対する細胞数は、ウェルあたり４０，０００細胞であった。Ｃｐ差は、Ｔｅｔオン（ｃｃｃＤＮＡ発現）に比較した際、Ｔｅｔオフ（バックグラウンド）後、約３．０周期であり、そしてＺ因子は約０．５３であり、これは、ハイスループットスクリーニング、または感染生存細胞において、ｃｃｃＤＮＡの集積をブロックする化合物をスクリーニングするためのハイスループットスクリーニングに適していた。
【実施例９】
【００８８】
実施例９：一工程ｑＰＣＲアッセイによるＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの検出のための新規逆方向プライマーの能力の比較
一工程ｑＰＣＲアッセイによって、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３５９９）において、ｃｃｃＤＮＡのレベルを試験した。すべての場合で、新規順方向ｃｃｃＤＮＡプライマー（配列番号５）およびＰ２に固定し、ここで、用いるＰ２中の色素はＴＡＭＲＡであり、そして用いるＰ２中の消光剤はＢＨＱ２であった。試験した複数の逆方向プライマーもまたあり、ここで、逆方向プライマーは、Ｒ５（配列番号１５）；Ｒ６（配列番号１６）；Ｒ７（配列番号１７）；Ｒ８（配列番号１８）；Ｒ９（配列番号１９）；Ｒ１０（配列番号２０）；Ｒ１１（配列番号２１）；またはＲ４（３０ｂｐ）（配列番号２４）である。ウェルあたり４０，０００細胞を植え付けた。細胞材料の供給源は、ｃｃｃＤＮＡ誘導を伴わない（１μｇ／ｍＬを含むバックグラウンド）または誘導を伴う（テトラサイクリンを含まないｃｃｃＤＮＡ発現）、培養６日後のＨｅｐＤＥＳ１９由来であった。ウェル１からウェル４８の試料はｃｃｃＤＮＡ発現であり、そして４９〜９６の試料はバックグラウンドであった。このアッセイにおいて、ＰＡＩＲ４−Ｐ２を用いた。
【００８９】
結果を図１０に示した。逆方向プライマーＲ５〜Ｒ１０は、優れた効率を示し、そしてこれらは、バックグラウンドおよびｃｃｃＤＮＡ発現間で、ほぼ８倍の相違を有した。Ｒ４（３０ｂｐ）（配列番号２４）もまた試験した。図１０の結果は、Ｒ４（３０ｂｐ）（配列番号２４）がＲ４（配列番号１４）に比較して、同様に有効であることを示した。
【００９０】
本明細書記載の実施例および態様は、例示目的のみのためであり、そしてこれを考慮して、多様な修飾または変更が当業者には示唆されることが理解される。
非公式配列表
【００９１】
【化３−１】
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【００９２】
【化３−２】
2018504891.tif 000006
【００９３】
【化３−３】
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【００９４】
【化３−４】
2018504891.tif 000008
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018504891.tif 000021
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