(57)【要約】  改善された真菌株およびそれらの使用が提供され、ここで前記真菌株は、変化したレベルの関心対象のタンパク質、酵素、変異体および他の基質を生成することができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
親菌株と比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株であって、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子を含む組換え真菌株。
【請求項２】
親菌株と比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株であって、前記親菌株と比較して外部浸透圧に対する変化した感受性または耐性を誘発する突然変異を含む組換え真菌株。
【請求項３】
親菌株と比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株であって、前記親菌株と比較して殺真菌剤に対する変化した感受性または耐性を誘発する突然変異を含む組換え真菌株。
【請求項４】
前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、ハイブリッド型ヒスチジンキナーゼをコードする野生型ヒスチジンキナーゼ遺伝子の変異体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え真菌株。
【請求項５】
前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、第ＩＩＩ群ヒスチジンキナーゼをコードする野生型ヒスチジンキナーゼ遺伝子の変異体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え真菌株。
【請求項６】
前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、配列番号１の７４３位で突然変異を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、配列番号１と少なくとも６０％の同一性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え真菌株。
【請求項７】
前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、配列番号４３の７８６位で突然変異を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、配列番号４３と少なくとも６０％の同一性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え真菌株。
【請求項８】
７４３位での前記突然変異は、その位置の前記メチオニン残基をトレオニン残基と置換する突然変異、つまりＭ７４３Ｔである、請求項６に記載の組換え真菌株。
【請求項９】
７８６位での前記突然変異は、その位置の前記メチオニン残基をトレオニン残基と置換する突然変異、つまりＭ７８６Ｔである、請求項７に記載の組換え真菌株。
【請求項１０】
前記親菌株は、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）真菌株である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え真菌株。
【請求項１１】
前記親菌株は、糸状菌株である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え真菌株。
【請求項１２】
その親菌株と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％または少なくとも約１００％以上の関心対象のタンパク質を生成できる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え真菌株。
【請求項１３】
親菌株と比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる形質転換真菌株または誘導真菌株であって、前記親菌株と比較して、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子または外部浸透圧に対する変化した感受性または耐性を誘発する突然変異を含む形質転換真菌株または誘導真菌株。
【請求項１４】
前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、ハイブリッド型ヒスチジンキナーゼをコードする野生型ヒスチジンキナーゼ遺伝子の変異体である、請求項１３に記載の真菌株。
【請求項１５】
前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、第ＩＩＩ群ヒスチジンキナーゼをコードする野生型ヒスチジンキナーゼ遺伝子の変異体である、請求項１３または１４に記載の真菌株。
【請求項１６】
前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、配列番号１の７４３位で突然変異を含むポリペプチドをコードし、配列番号１と少なくとも６０％同一性であるアミノ酸配列を有する、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の真菌株。
【請求項１７】
７４３位での前記突然変異は、その位置でメチオニン残基をトレオニン残基と置換する突然変異、つまりＭ７４３Ｔである、請求項１６に記載の真菌株。
【請求項１８】
前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、配列番号４３の７８６位で突然変異を含むポリペプチドをコードし、配列番号４３と少なくとも６０％同一性であるアミノ酸配列を有する、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の真菌株。
【請求項１９】
７８６位での前記突然変異は、その位置で前記メチオニン残基をトレオニン残基と置換する突然変異、つまりＭ７８６Ｔである、請求項１８に記載の真菌株。
【請求項２０】
前記親菌株は、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）真菌株である、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の真菌株。
【請求項２１】
前記親菌株は、糸状菌株である、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の真菌株。
【請求項２２】
その親菌株と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％または少なくとも約１００％以上の関心対象のタンパク質を生成できる、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の真菌株。
【請求項２３】
タンパク質生成を改善するための方法であって、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子、または親菌株と比較して外部浸透圧に対する変化した感受性または耐性を誘発する突然変異を含む、組換え、形質転換または誘導真菌株を使用する工程を含む方法。
【請求項２４】
前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、ハイブリッド型ヒスチジンキナーゼをコードする野生型ヒスチジンキナーゼ遺伝子の変異体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、第ＩＩＩ群ヒスチジンキナーゼをコードする野生型ヒスチジンキナーゼ遺伝子の変異体である、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、配列番号１の７４３位で突然変異を含むポリペプチド、および配列番号１と少なくとも６０％同一性であるアミノ酸配列をコードする、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
７４３位での前記突然変異は、その位置で前記メチオニン残基をトレオニン残基と置換する突然変異、つまりＭ７４３Ｔである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、配列番号４３の７８６位で突然変異を含むポリペプチドおよび配列番号４３と少なくとも６０％同一性であるアミノ酸配列をコードする、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
７８６位での前記突然変異は、その位置で前記メチオニン残基をトレオニン残基と置換する突然変異、つまりＭ７８６Ｔである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記親菌株は、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）真菌株である、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記親菌株は、糸状菌株である、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記組換え、形質転換または誘導真菌株は、その親菌株と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％または少なくとも約１００％以上の関心対象のタンパク質を生成できる、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
関心対象のタンパク質を生成する方法であって、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組換え真菌株または請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の形質転換真菌株または誘導真菌株を発酵させる工程を含み、前記組換え、形質転換または誘導真菌株は、前記関心対象のタンパク質を分泌し、前記組換え、形質転換または誘導真菌株は、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子、または親菌株と比較して外部浸透圧に対する変化した感受性または耐性を誘発する突然変異を含む方法。
【請求項３４】
前記関心対象のタンパク質は、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、それらの機能的断片またはそれらの酵素および断片の１つ以上の混合物である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記関心対象のタンパク質は、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリサーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、それらの機能的断片またはそれらの１つ以上の混合物である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記関心対象のタンパク質は、ペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原、それらの機能的断片またはそれらの１つ以上の混合物である、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法を適用することによって生成される関心対象のタンパク質。
【請求項３８】
請求項３７に記載の関心対象のタンパク質を含む組成物。
【請求項３９】
バイオマス加水分解、クリーニング用途、穀粒加工、動物栄養、食品組成物または織物処理における請求項３８に記載の組成物を使用する方法。
【請求項４０】
親菌株に比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株を同定または選択するための方法であって、
（ａ）前記菌株を寒天プレートの表面上に浸透物質とともに接種する工程；および
（ｂ）前記親菌株より迅速または緩徐に増殖する前記菌株を選択する工程を含む方法。
【請求項４１】
親菌株と比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる前記組換え真菌株は、前記親菌株と比較して外部浸透圧に対する変化した感受性または耐性を誘発する突然変異を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記親菌株は、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）真菌株である、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記親菌株は、糸状菌株である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記組換え、形質転換または誘導真菌株は、その親菌株と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％または少なくとも約１００％以上の関心対象のタンパク質を生成できる、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記浸透物質は、糖、糖アルコールまたは塩のうちの１つ以上を含む、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記糖は、グルコース、スクロース、フルクトース、オリゴフルクトース、フルクト−オリゴ糖または転化糖であってよい、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記糖アルコールは、ソルビトール、キシリトールまたはガラクトシロソルビトール（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｏｓｏｒｂｉｔｏｌ）であってよい、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記塩は、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
液中培養中および／または固体寒天培地中での殺真菌剤耐性を使用して増加した比生産性を備える突然変異体をスクリーニングまたは選択する方法。
【請求項５０】
液中培養中および／または固体寒天培地中での殺真菌剤耐性を使用して浸透圧恒常性の調節に関係するヒスチジンキナーゼまたは他の遺伝子における改変を含む突然変異体をスクリーニングまたは選択する方法。
【請求項５１】
液中培養中および／または固体寒天培地中での殺真菌剤耐性を使用してｎｉｋ１遺伝子の改変を含む突然変異体をスクリーニングまたは選択する方法。
【請求項５２】
液中培養中および／または固体寒天培地中での浸透圧感受性および殺真菌剤耐性を同時または連続的に組み合わせて増加した比生産性を備える突然変異体をスクリーニングまたは選択する方法。
【請求項５３】
液中培養中および／または固体寒天培地中での浸透圧感受性および殺真菌剤耐性を同時または連続的に組み合わせて浸透圧恒常性の調節に関係するヒスチジンキナーゼまたは他の遺伝子における改変を含む突然変異体をスクリーニングまたは選択する方法。
【請求項５４】
液中培養中および／または固体寒天培地中での浸透圧感受性および殺真菌剤耐性を同時または連続的に組み合わせてｎｉｋ１遺伝子の改変を含む突然変異体をスクリーニングまたは選択する方法。
【請求項５５】
前記殺真菌剤は、ジカルボキシイミド系またはフェニルピロール系、例えばイプロジオンまたはフルジオキソニルである、請求項４９〜５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、現在係属中の２０１５年２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／１１３，９０５号明細書および２０１５年６月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／１７３，５１１号明細書に対する優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
本開示は、変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え、形質転換または誘導真菌株、および変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成する能力を有するように真菌株を遺伝子組換えする方法に関する。さらに、本開示は、この組換え、形質転換または誘導真菌株を発酵させる工程によって生成される関心対象のタンパク質およびこの関心対象のタンパク質を含む組成物に関する。さらに、本開示は、組換え、形質転換または誘導真菌株を使用して関心対象のタンパク質を生成する方法、ならびにこの関心対象のタンパク質を含む組成物を生成および使用する方法に関する。本明細書の関心対象のタンパク質は、内因性タンパク質または異種タンパク質であってよい。本開示はさらに、親菌株に比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株を同定または選択するための方法に関する。
【０００３】
配列表の参照
「４０７３３−ＰＣＴ−ＳＥＱ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」との名称が付けられた配列表のテキストファイルの電子的提出の内容は、２０１５年２月８日に作成され、サイズは３０ＫＢであり、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
生物学的材料の寄託についての言及
本出願は、その寄託が参照により本明細書に組み込まれる生物学的材料の寄託についての言及を含有する。詳細には、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）菌株ＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）であるＣＢＳ１４００２２は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約にしたがって、オランダ王立芸術科学アカデミー（ＫＮＡＷ）の機関であるＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａｌａａｎ  ８，３５８４  ＣＴ  Ｕｔｒｅｃｈｔ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に寄託された。
【背景技術】
【０００５】
真菌は、それらの内因性タンパク質のための工業製品として、および工業的に有用なタンパク質を生成するための発現宿主としての両方のそれらの商業的用途のために公知である。真菌の直接的工業使用の例では、糸状菌株、例えばトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）などは、セルロース性バイオマスに、そのような材料のセルロース成分およびセミセルロース成分を工業的に有用な物質にさらに加工できる小さなポリマー糖および／またはモノマー糖に分解するのに役立つように直接的に適用されてきた。しかしそのような直接使用は、これまでのところ、特に例えばセルロース性バイオマスなどの扱いにくい基質を分解するために必要とされるであろう高レベルの酵素活性によって相殺される場合、主としてこれらの生物によって生成される可能性がある全タンパク質／酵素の量には固有の限界があるために、経済的に高度に貴重であるとは証明されてこなかった。
【０００６】
他方、関心対象のタンパク質のための生成宿主としての真菌株の使用は、長年にわたり経済的に実行可能であると見なされてきて、しばらくの間は商業的環境において広範に使用されてきた。糸状菌が、三次元構造およびジスルフィド結合に正確に折り畳まれ、翻訳後に精密にタンパク質分解性でクリッピングされ、ｎ−結合およびｏ−結合グリコシル化反応を用いて相当に予想通りにグリコシル化されたそれらの複合タンパク質を分泌する能力は、これらの生物を分泌タンパク質を生成するための高度に魅力的な宿主にさせる（ＭａｃＫｅｎｚｉｅ，Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９３）１３９：２２９５−２３０７；Ｐｅｂｅｒｄｙ，Ｊ．Ｆ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２：５０−５７）。真菌は、バイオマス加水分解、食品および飼料添加物、織物用途、穀物加工、クリーニングおよびその他の工業的使用のために効率的な酵素生産菌であることが公知である。
【０００７】
工業プロセスのための真菌発現タンパク質の使用は広まっており、特に非石油再生可能材料または起源から燃料および化学物質を生成するための酵素を含む工業プロセスを使用することに関する現在の関心の高まりを前提に、着実に増加しつつある。当分野では、タンパク質の発現を改善する様々な技術が開発されてきた。それらの技術には、例えば、伝統的な菌株改善法、例えば菌株を複数回の突然変異誘発および高生産菌の選択、ゲノム内に挿入された高コピー数の関心対象の遺伝子を含む生産菌株の構築または遺伝子組換えが含まれる。これらの方法の多数は菌株の生産性を改善することに有効ではあるが、それらには、典型的には各個別生成物を作成するために必要とされる菌株構築精度の労働集約性を含む制限がある。このため、単一の関心対象のタンパク質、または一団の関心対象のタンパク質、または内因性タンパク質さえの増加したタンパク質生産が可能な改善された真菌株を入手することへの必要が依然として存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え、形質転換または誘導真菌株、および変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成する能力を有するように真菌株を遺伝子組換えする方法に関する。さらに、本開示は、この組換え、形質転換または誘導真菌株を発酵させる工程によって生成される関心対象のタンパク質およびこの関心対象のタンパク質を含む組成物に関する。さらに、本開示は、組換え、形質転換または誘導真菌株を使用して関心対象のタンパク質を生成する方法、ならびに関心対象のタンパク質を含む組成物を生成および使用する方法に関する。本開示はさらに、親菌株に比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株を同定または選択するための方法に関する。
【０００９】
第一態様では、本開示は、親菌株と比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株であって、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子を含む、および／または変異ヒスチジンキナーゼを発現する組換え真菌株を提供する。
【００１０】
一部の実施形態では、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、ハイブリッド型ヒスチジンキナーゼをコードする野生型ヒスチジンキナーゼ遺伝子の変異体である。一部の実施形態では、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、第ＩＩＩ群ヒスチジンキナーゼをコードする野生型遺伝子の変異体である。所定の実施形態では、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、外部浸透圧に反応するシグナル伝達経路の一部として機能するポリペプチドをコードする。ヒスチジンキナーゼにおける突然変異を含む菌株は、例えば、培地中のイプロジオンまたはフルジオキソニルなどの高レベルのジカルボキシイミド系殺真菌剤の存在下で、所定の抗真菌化合物に対する耐性または感受性についてスクリーニングすることによって同定できる。このシグナル伝達経路の他の成分における突然変異もまた有益な可能性があることも予測すべきである。これらの成分には、制限なく、浸透圧に反応して他の遺伝子の発現を調節するＭＡＰキナーゼタンパク質および転写因子が含まれる。この経路における突然変異を含む菌株は、例えば、培地中の高レベルのソルビトールまたは塩の存在下で、浸透圧ストレスに対する耐性または感受性についてスクリーニングすることによって同定できる。このため、これに関連して、本開示はさらに、工業的に有用な分子を生成するために有用な宿主生物として恵まれている、浸透圧ストレスに対して耐性または感受性を有する真菌株を同定する方法も提供する。
【００１１】
所定の実施形態では、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、配列番号１または配列番号４３と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはいっそうそれ以上の％）同一であるが、配列番号１または配列番号４３と１００％同一ではないアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。
【００１２】
所定の実施形態では、この態様の組換え真菌株の変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、配列番号１および配列番号１の７４３位での突然変異と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはいっそうそれ以上の％）同一であるアミノ酸配列をコードする。特定の実施形態では、配列番号１の７４３位での突然変異は、その位置でのメチオニン残基とトレオニン残基とを置換する突然変異、つまりＭ７４３Ｔである。
【００１３】
他の実施形態では、この態様の組換え真菌株の変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、配列番号４３および配列番号４３の７８６位での突然変異と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはいっそうそれ以上の％）同一であるアミノ酸配列をコードする。特定の実施形態では、配列番号１の７８６位での突然変異は、その位置でのメチオニン残基とトレオニン残基とを置換する突然変異、つまりＭ７８６Ｔである。
【００１４】
一部の実施形態では、この態様の組換え真菌株の親菌株は、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）真菌株である。特定の実施形態では、親菌株は、糸状菌株である。これに関連して、組換え真菌株は、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子によってコードされた変異ヒスチジンキナーゼであって、配列番号１および配列番号１の７４３位での突然変異または配列番号４３および配列番号４３の７８６位での突然変異と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはいっそうそれ以上の％）同一であるアミノ酸配列を含む変異ヒスチジンキナーゼを含む。
【００１５】
一部の実施形態では、この態様の組換え真菌株は、その親菌株と比較して、はるかに大量の関心対象のタンパク質を生成することができる。例えば、組換え真菌株は、その親菌株と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％またはいっそう少なくとも約１５０％多い量の関心対象のタンパク質を生成することができる。
【００１６】
第二態様では、本開示は、親菌株と比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる形質転換真菌株またはその誘導真菌株であって、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子を含む形質転換真菌株またはその誘導真菌株を提供する。
【００１７】
一部の実施形態では、形質転換真菌株またはその誘導真菌株の変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、ハイブリッド型ヒスチジンキナーゼをコードする野生型ヒスチジンキナーゼ遺伝子の変異体である。一部の実施形態では、形質転換真菌株またはその誘導真菌株の変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、第ＩＩＩ群ヒスチジンキナーゼをコードする野生型ヒスチジンキナーゼ遺伝子の変異体である。所定の実施形態では、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、外部浸透圧に反応するシグナル伝達経路の一部として機能するポリペプチドをコードする。このヒスチジンキナーゼにおける突然変異を含む菌株は、例えば、培地中のイプロジオンまたはフルジオキソニルなどの高レベルのジカルボキシイミド系またはフェニルピロール系殺真菌剤の存在下で、所定の抗真菌化合物に対する耐性または感受性について選択またはスクリーニングすることによって同定できる。このシグナル伝達経路の他の成分における突然変異もまた有益な可能性があることも予測すべきである。これらの成分には、制限なく、浸透圧に反応して他の遺伝子の発現を調節するＭＡＰキナーゼタンパク質および転写因子が含まれる。この経路における突然変異を含む菌株は、例えば、培地中の高レベルのソルビトールまたは塩の存在下で、浸透圧ストレスに対する耐性または感受性についてスクリーニングすることによって同定できる。
【００１８】
所定の実施形態では、この態様の形質転換真菌株またはその誘導真菌株の変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、配列番号１または配列番号４３と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはいっそうそれ以上の％）同一であるが、配列番号１または配列番号４３と１００％同一ではないアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。例えば、所定の実施形態では、この態様の組換え真菌株の変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、配列番号１および配列番号１の７４３位での突然変異と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはいっそうそれ以上の％）同一であるアミノ酸配列をコードする。特定の実施形態では、配列番号１の７４３位での突然変異は、その位置でのメチオニン残基とトレオニン残基との置換、つまりＭ７４３Ｔである。他の実施形態では、この態様の組換え真菌株の変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、配列番号４３および配列番号４３の７８６位での突然変異と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはいっそうそれ以上の％）同一であるアミノ酸配列をコードする。特定の実施形態では、配列番号４３の７８６位での突然変異は、その位置でのメチオニン残基とトレオニン残基とを置換する突然変異、つまりＭ７８６Ｔである。
【００１９】
一部の実施形態では、この態様の組換え真菌株の親菌株は、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）真菌株である。特定の実施形態では、親菌株は、糸状菌株である。これに関連して、組換え真菌株は、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子によってコードされた変異ヒスチジンキナーゼであって、配列番号１および配列番号１の７４３位での突然変異または配列番号４３および配列番号４３の７８６位での突然変異と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはいっそうそれ以上の％）同一であるアミノ酸配列を含む変異ヒスチジンキナーゼを含む。
【００２０】
一部の実施形態では、この態様の形質転換真菌株または誘導真菌株は、その親菌株と比較して、はるかに大量の関心対象のタンパク質を生成することができる。例えば、この態様の形質転換真菌株または誘導真菌株は、その親菌株と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％またはいっそう少なくとも約１５０％多い量の関心対象のタンパク質を生成することができる。
【００２１】
第三態様では、本開示は、その親菌株と比較して、組換え、形質転換または誘導真菌株によるタンパク質生成を改善するための方法であって、その組換え、形質転換または誘導真菌株が変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子を含む方法を提供する。
【００２２】
一部の実施形態では、この態様の方法において使用される変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、ハイブリッド型ヒスチジンキナーゼをコードする野生型ヒスチジンキナーゼ遺伝子の変異体である。一部の実施形態では、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、第ＩＩＩ群ヒスチジンキナーゼをコードする野生型ヒスチジンキナーゼ遺伝子の変異体である。所定の実施形態では、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、外部浸透圧に反応するシグナル伝達経路の一部として機能するポリペプチドをコードする。このヒスチジンキナーゼにおける突然変異を含む菌株は、例えば、培地中のイプロジオンまたはフルジオキソニルなどの高レベルのジカルボキシイミド系またはフェニルピロール系殺真菌剤の存在下で、所定の抗真菌化合物に対する耐性または感受性について選択またはスクリーニングすることによって同定できる。このシグナル伝達経路の他の成分における突然変異もまた有益な可能性があることも予測すべきである。これらの成分には、制限なく、浸透圧に反応して他の遺伝子の発現を調節するＭＡＰキナーゼタンパク質および転写因子が含まれる。この経路における突然変異を含む菌株は、例えば、培地中の高レベルのソルビトールまたは塩の存在下で、浸透圧ストレスに対する耐性または感受性についてスクリーニングすることによって同定できる。
【００２３】
所定の実施形態では、この態様の方法において使用される変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、配列番号１または配列番号４３と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはいっそうそれ以上の％）同一であるが、配列番号１または配列番号４３と１００％同一ではないアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。例えば、この態様の方法において使用される変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、配列番号１および配列番号１の７４３位または配列番号４３および配列番号４３の７８６位での突然変異と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはいっそうそれ以上の％）同一であるアミノ酸配列をコードする。所定の特定の実施形態では、配列番号１の７４３位での突然変異は、その位置でのメチオニン残基とトレオニン残基とを置換する突然変異、つまりＭ７４３Ｔである。他の実施形態では、配列番号４３の７８６位での突然変異は、その位置でのメチオニン残基とトレオニン残基とを置換する突然変異、つまりＭ７８６Ｔである。
【００２４】
一部の実施形態では、この態様の方法において使用される組換え真菌株の親菌株は、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）真菌株である。特定の実施形態では、親菌株は、糸状菌株である。これに関連して、組換え真菌株は、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子によってコードされた変異ヒスチジンキナーゼであって、配列番号１および配列番号１の７４３位での突然変異または配列番号４３および配列番号４３の７８６位での突然変異と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはいっそうそれ以上の％）同一であるアミノ酸配列を含む変異ヒスチジンキナーゼを含む。
【００２５】
一部の実施形態では、この態様の方法において使用される組換え、形質転換または誘導真菌株は、その親菌株と比較して、はるかに大量の関心対象のタンパク質を生成することができる。例えば、組換え、形質転換または誘導真菌株は、その親菌株と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％またはいっそう少なくとも約１５０％多い量の関心対象のタンパク質を生成することができる。
【００２６】
また別の態様では、本開示は、本明細書に開示した組換え、形質転換または誘導真菌株を発酵させる工程を含む関心対象のタンパク質を生成する方法であって、その組換え、形質転換または誘導真菌株は、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子を含む、および／または変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子によってコードされたヒスチジンキナーゼを発現し、関心対象のタンパク質を分泌する方法を提供する。
【００２７】
さらにまた別の態様では、本開示は、本明細書に記載した真菌株などの組換え、形質転換または誘導真菌株を発酵させる工程によって生成される関心対象のタンパク質であって、組換え、形質転換または誘導真菌株は変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子を含む、および／または変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子によってコードされるヒスチジンキナーゼを発現する関心対象のタンパク質を提供する。
【００２８】
本発明の態様のいずれかの実施形態では、関心対象のタンパク質は、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マンナナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、それらの混合物、それらの機能的断片または１つ以上の酵素またはそれらの機能的断片の混合物であってよい。タンパク質の非限定的例は、さらに、デンプン代謝に含まれるタンパク質または酵素、グリコゲン代謝に含まれるタンパク質または酵素、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリサーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：０２−オキシドレダクターゼ、ＥＣ１．１．３．５）、それらの変異体、それらの機能的断片またはそれらの組み合わせを含むことができる。関心対象のタンパクは、さらにまたペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原（例えば、ＨＢＶ表面抗原、ＨＰＶ  Ｅ７など）、またはそれらの変異体、機能的断片または２つ以上の上記の物質の混合物であってよい。
【００２９】
所定の関連態様では、本開示は、本明細書に記載したいずれかの態様の関心対象のタンパク質を含む組成物を提供する。本開示はさらに、バイオマス加水分解、クリーニング用途、穀物加工、動物栄養、食品組成物、織物処理などにおいてそのような組成物を使用する方法を提供する。
【００３０】
また別の態様では、本開示は、親菌株に比較して（比べて）変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株を同定またはスクリーニングするための方法であって、
（ａ）菌株を寒天プレートの表面上に浸透物質および／またはジカルボキシイミド系殺真菌剤とともに接種する工程；および
（ｂ）親菌株より迅速または緩徐に増殖する菌株をスクリーニングまたは選択する工程を含む方法を提供する。
【００３１】
例えば、所定の実施形態では、浸透物質には、糖、糖アルコールおよび塩が含まれるがそれらに限定されない。所定の実施形態では、浸透物質は、グルコース、スクロース、フルクトース、オリゴフルクトース、フルクト−オリゴ糖、転化糖などを含むがそれらに限定されない糖である。所定の他の実施形態では、浸透物質は、ソルビトール、キシリトール、ガラクトシロソルビトール（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｏｓｏｒｂｉｔｏｌ）などを含むがそれらに限定されない糖アルコールである。さらに他の実施形態では、浸透物質は、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムを含むがそれらに限定されない塩である。別の実施形態では、殺真菌剤は、ジカルボキシイミドまたはフェニルピロールである。特定の実施形態では、殺真菌剤は、イプロジオンまたはフルジオキソニルである。
【００３２】
この態様の一部の実施形態では、親菌株と比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株は、親菌株と比較して外部浸透圧に対する変化した感受性または耐性を誘発する突然変異を含む。しかし理論によって拘束することを望まなくても、このシグナル伝達経路の他の成分における突然変異は、さらにそのような真菌株の生産性にとって個別的または集合的に有益であると予測することができる。このシグナル伝達経路の好適な他の成分には、制限なく、浸透圧に反応して他の遺伝子の発現を調節するＭＡＰキナーゼタンパク質および転写因子が含まれる。
【００３３】
この経路における突然変異を含む菌株は、例えば、培地中の高レベルのソルビトールまたは塩の存在下で、浸透圧ストレスに対する耐性または感受性についてスクリーニングすることによって同定できる。
【００３４】
一部の実施形態では、この態様の組換え真菌株の親菌株は、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）真菌株である。特定の実施形態では、親菌株は、糸状菌株である。
【００３５】
好適な浸透物質は、糖、糖アルコールまたは塩の１つまたは組み合わせを含むことができる。例えば、浸透物質は、グルコース、スクロース、フルクトース、オリゴフルクトース、フルクト−オリゴ糖、転化糖、ソルビトール、キシリトール、ガラクトシロソルビトール（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｏｓｏｒｂｉｔｏｌ）、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムの１つ以上であってよい。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＴｒＮｉｋ−１のドメイン構造の略図を示す図である。
【図２】ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ対立遺伝子を含有する遺伝子置換カセットを備えるｐＲＲＡＢ  ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔのマップを示す図である。
【図３】様々な培地上のＲＬＰ３７、ＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３ＴおよびＲＬＰ３７  ΔＮｉｋ１のコロニー表現型を比較する図である。図３Ａは、Ｖｏｇｅｌの最少培地上のＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔのコロニー表現型を示す。図３Ｂは、Ｖｏｇｅｌの最少培地上のＲＬＰ３７のコロニー表現型を示す。図３Ｃは、ソルビトールを含むＶｏｇｅｌの最少培地上のＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔのコロニー表現型を示す。図３Ｄは、ソルビトールを含むＶｏｇｅｌの最少培地上のＲＬＰ３７のコロニー表現型を示す。図３Ｅは、Ｖｏｇｅｌの最少培地上のＲＬＰ３７  ΔＮｉｋ１のコロニー表現型を示す。図３Ｆは、ソルビトールを含むＶｏｇｅｌの最少培地上のＲＬＰ３７  ΔＮｉｋ１のコロニー表現型を示す。
【図４Ａ】ＤＡＳＧＩＰの２Ｌスケール発酵でのＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔのタンパク質生成を比較する図である。図４Ａは、ＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの全タンパク質比生成率を示す。図４Ｂは、同一条件下で発酵中のＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの供給糖に対する比収率を示す。
【図４Ｂ】ＤＡＳＧＩＰの２Ｌスケール発酵でのＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔのタンパク質生成を比較する図である。図４Ａは、ＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの全タンパク質比生成率を示す。図４Ｂは、同一条件下で発酵中のＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの供給糖に対する比収率を示す。
【図５Ａ】１４Ｌスケールの標準真菌発酵でのＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔのタンパク質生成を比較する図である。図５Ａは、ＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの全タンパク質比生成率を示す。図５Ｂは、同一条件下で発酵中のＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの供給糖に対する比収率を示す。
【図５Ｂ】１４Ｌスケールの標準真菌発酵でのＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔのタンパク質生成を比較する図である。図５Ａは、ＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの全タンパク質比生成率を示す。図５Ｂは、同一条件下で発酵中のＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの供給糖に対する比収率を示す。
【図６】Δｎｉｋ１：：ｈｐｈ遺伝子欠失カセットを含有するｐＲＲＡＢ  Δｎｉｋ１のプラスミドマップを示す図である。
【図７Ａ】ＤＡＳＧＩＰの２Ｌスケール発酵中のＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Δｎｉｋ１のタンパク質生成を比較する図である。図７Ａは、ＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Δｎｉｋ１の全タンパク質比生成率を示す。図７Ｂは、同一条件下で発酵中のＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Δｎｉｋ１の供給糖に対する比収率を示す。
【図７Ｂ】ＤＡＳＧＩＰの２Ｌスケール発酵中のＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Δｎｉｋ１のタンパク質生成を比較する図である。図７Ａは、ＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Δｎｉｋ１の全タンパク質比生成率を示す。図７Ｂは、同一条件下で発酵中のＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Δｎｉｋ１の供給糖に対する比収率を示す。
【図８】様々な培地上の様々な菌株のコロニー表現型を比較する図である。図８Ａは、ウリジンを含むＶｏｇｅｌの最少培地上のＮｏＣｂｈ１  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔのコロニー表現型を示す。図８Ｂは、ウリジンを含むＶｏｇｅｌの最少培地上のＮｏＣｂｈ１のコロニー表現型を示す。図８Ｃは、ウリジンおよびソルビトールを含むＶｏｇｅｌの最少培地上のＮｏＣｂｈ１  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔのコロニー表現型を示す。図８Ｄは、ウリジンおよびソルビトールを含むＶｏｇｅｌの最少培地上のＮｏＣｂｈ１のコロニー表現型を示す。図８Ｅは、ウリジンを含むＶｏｇｅｌの最少培地上のＣｂｈ１  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔのコロニー表現型を示す。図８Ｆは、ウリジンを含むＶｏｇｅｌの最少培地上のＣｂｈ１のコロニー表現型を示す。図８Ｇは、ウリジンおよびソルビトールを含むＶｏｇｅｌの最少培地上のＣｂｈ１  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔのコロニー表現型を示す。図８Ｈは、ウリジンおよびソルビトールを含むＶｏｇｅｌの最少培地上のＣｂｈ１のコロニー表現型を示す。図８Ｉは、Ｖｏｇｅｌの最少培地上のＴＲ  Ｎｉｋ１ＷＴのコロニー表現型を示す。図８Ｊは、Ｖｏｇｅｌの最少培地上のＴＲ  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔのコロニー表現型を示す。図８Ｋは、ソルビトールを含むＶｏｇｅｌの最少培地上のＴＲ  Ｎｉｋ１ＷＴのコロニー表現型を示す。図８Ｌは、ソルビトールを含むＶｏｇｅｌの最少培地上のＴＲ  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔのコロニー表現型を示す。
【図９Ａ】ＤＡＳＧＩＰの２Ｌスケール発酵でのＣｂｈ１およびＣｂｈ１  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔのタンパク質生成を比較する図である。図９Ａは、Ｃｂｈ１およびＣｂｈ１  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの全タンパク質比生成率を示す。図９Ｂは、同一条件下で発酵中のＣｂｈ１およびＣｂｈ１  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの供給糖に対する比収率を示す。
【図９Ｂ】ＤＡＳＧＩＰの２Ｌスケール発酵でのＣｂｈ１およびＣｂｈ１  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔのタンパク質生成を比較する図である。図９Ａは、Ｃｂｈ１およびＣｂｈ１  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの全タンパク質比生成率を示す。図９Ｂは、同一条件下で発酵中のＣｂｈ１およびＣｂｈ１  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの供給糖に対する比収率を示す。
【図１０Ａ】１４Ｌスケールの標準真菌発酵でのＣｂｈ１およびＣｂｈ１  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔのタンパク質生成を比較する図である。図１０Ａは、Ｃｂｈ１およびＣｂｈ１  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの全タンパク質比生成率を示す。図１０Ｂは、同一条件下で発酵中のＣｂｈ１およびＣｂｈ１  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの供給糖に対する比収率を示す。
【図１０Ｂ】１４Ｌスケールの標準真菌発酵でのＣｂｈ１およびＣｂｈ１  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔのタンパク質生成を比較する図である。図１０Ａは、Ｃｂｈ１およびＣｂｈ１  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの全タンパク質比生成率を示す。図１０Ｂは、同一条件下で発酵中のＣｂｈ１およびＣｂｈ１  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの供給糖に対する比収率を示す。
【図１１】ｎｉｋ１ＷＴ対立遺伝子を含有する遺伝子置換カセットを備えるｐＲＲＡＢ  ｎｉｋ１ＷＴのマップを示す図である。
【図１２Ａ】ＤＡＳＧＩＰの２Ｌスケール発酵でのＴＲ  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔにとっての親菌株であるＲＬＰ３７、ＴＲ  Ｎｉｋ１Ｍ７４３ＴおよびＴＲ  Ｎｉｋ１ＷＴのタンパク質生成を比較する図である。図１２Ａは、ＲＬＰ３７、ＴＲ  Ｎｉｋ１Ｍ７４３ＴおよびＴＲ  Ｎｉｋ１ＷＴの全タンパク質比生成率を示す。図１２Ｂは、同一条件下で発酵中のＲＬＰ３７、ＴＲ  Ｎｉｋ１Ｍ７４３ＴおよびＴＲ  Ｎｉｋ１ＷＴの供給糖に対する比収率を示す。
【図１２Ｂ】ＤＡＳＧＩＰの２Ｌスケール発酵でのＴＲ  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔにとっての親菌株であるＲＬＰ３７、ＴＲ  Ｎｉｋ１Ｍ７４３ＴおよびＴＲ  Ｎｉｋ１ＷＴのタンパク質生成を比較する図である。図１２Ａは、ＲＬＰ３７、ＴＲ  Ｎｉｋ１Ｍ７４３ＴおよびＴＲ  Ｎｉｋ１ＷＴの全タンパク質比生成率を示す。図１２Ｂは、同一条件下で発酵中のＲＬＰ３７、ＴＲ  Ｎｉｋ１Ｍ７４３ＴおよびＴＲ  Ｎｉｋ１ＷＴの供給糖に対する比収率を示す。
【図１３】殺真菌剤を含む、または含まない培地上のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株であるＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの表現型を示す図である。図１３Ａは、Ｖｏｇｅｌの最少培地上のＲＬＰ３７、図１３Ｂは、Ｖｏｇｅｌの最少培地上のＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ、図１３Ｃは、０．１５％のＤＭＳＯを含むＶｏｇｅｌの最少培地上のＲＬＰ３７、図１３Ｄは、０．１５％のＤＭＳＯを含むＶｏｇｅｌの最少培地上のＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ、図１３Ｅは、４５μＭのイプロジオンを含むＶｏｇｅｌの最少培地上のＲＬＰ３７、図１３Ｆは、４５μＭのイプロジオンを含むＶｏｇｅｌの最少培地上のＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ。
【図１４】アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔ対立遺伝子を含有する遺伝子置換カセットを備えるｐＲＮｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔのマップを示す図である。
【図１５】振とうフラスコスケールで、野生型ｎｉｋ１対立遺伝子（コントロール）を含有する菌株ＧＩＣＣ２０７１ならびにｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔ対立遺伝子を含有するＧＩＣＣ２０７１  Ｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔ突然変異体菌株９９番、１１７番および１２１番のタンパク質生成を比較する図である。振とうフラスコからの上清はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で作業した。
【図１６】振とうフラスコスケールで、野生型ｎｉｋ１対立遺伝子を含有する菌株ＧＩＣＣ２０７１ならびにｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔ対立遺伝子を含有するＧＩＣＣ２０７１  Ｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔ突然変異体菌株９９番、１１７番および１２１番間のＰＮＰＧに対する上清酵素活性を比較する図である。相対吸光度は、ＧＩＣＣ２０７１コントロールに比して標準化した。エラーバーは標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
Ｉ．概説
本菌株および本方法は、その野生型親糸状菌細胞から変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子を含むように、および／またはその変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子によってコードされる変異ヒスチジンキナーゼを発現するように遺伝子組換えされている変異または突然変異糸状菌細胞であって、その細胞のヒスチジンキナーゼ媒介性シグナル伝達機序が実質的に変更または排除されている変異または突然変異糸状菌細胞に関する。そのような菌株は、改善された生産性レベルで関心対象のタンパク質の大規模生産するために良好に適する。
【００３８】
ＩＩ．定義
本菌株、本組成物および本方法について記載する前に、下記の用語および語句について定義する。定義されていない用語は、当分野において使用されるそれらの通例の意味に一致するはずである。
【００３９】
ある範囲の数値が提供される場合、状況が明確に他のことを指示しない限り、その範囲の上限と下限の間にある下限値の単位の１０分の１までの各介在値、およびその範囲内の任意の他の記載された値または介在値は、本発明の組成物および方法の範囲内に含まれると理解されている。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さな範囲内に含まれてよく、同様に上記の範囲内の任意の限度が特別に除外されることを前提として、本発明の組成物および方法内に含まれる。上記の範囲が限度の一方または両方を含む場合、それらの含まれた限度のいずれかまたは両方を排除する範囲もまた、本発明の組成物および方法の中に含まれる。
【００４０】
所定の範囲は、用語「約」が先行する数値を用いて提示される。用語「約」は、本明細書では、それが先行する正確な数ならびにその用語が先行する数に近い、または近似する数についての文字による支持を提供するために使用される。ある数が特定した数に近いか否か、または略同じであるか否かの決定においては、その近いか略同じと記載されていない数が、それが示されている文脈において、その特定の数と実質的に等価なものを提供する数であり得る。例えば、数値に関連して、「約」という用語は、別段の定義がされていない限り、その数値の−１０％〜＋１０％の範囲を指す。別の例では、「約６のｐＨ値」という句は、ｐＨ値が別段特に定義されていない限り、５．４〜６．６のｐＨ値を指す。
【００４１】
本明細書に提供した見出しは、全体として本明細書を参照することによって得ることのできる本組成物および本方法の様々な態様または実施形態を制限するものではない。したがって、直下に定義した用語は、明細書全体を参照することにより、より十分に定義される。
【００４２】
本明細書は読みやすくするために数多くの項で構成されている。しかしながら、読者は１つの項での記載が他の項にも適用されることは認識していよう。このように、本開示の異なる項で使用されている見出しは、限定するものであると解釈すべきではない。
【００４３】
他に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明の組成物および方法が属する分野の当業者であれば一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に記載のものに類似しているかまたは同じである方法および材料もまた、本組成物および本方法の実施または試験に使用することができるが、代表的な事例的方法および材料を以下に記載する。
【００４４】
本明細書に引用されている全ての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が、具体的および個別に、参照により組み込まれ、それらの刊行物が関連して引用している方法および／または材料を開示し記載するよう指示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。あらゆる刊行物の引用は、出願日前の開示のためであり、先行発明のために、本組成物および本方法がその公開に先行する権利がないと認めたものであると解釈されるべきではない。さらに、示された公開日は、実際の公開日と異なる可能性があり、それらは独立して確認する必要があり得る。
【００４５】
この詳細な説明においては、以下の略語および定義が適用される。明らかに別段の記載がされていない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、複数の対象を包含することに留意されたい。したがって、例えば、「酵素（ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ）」との言及は、複数の酵素を含み、「用量（ｔｈｅ  ｄｏｓａｇｅ）」との言及は、１種以上の用量および当業者に知られたその同等物を含む。
【００４６】
さらに、特許請求の範囲が任意選択による要素を排除することを選択し得ることに留意されたい。したがって、この記述は、請求項の構成要素の列挙に関連した「唯一（ｓｏｌｅｌｙ）」、「ただ〜のみ（ｏｎｌｙ）」などの排他的用語を使用するための、または「負」の限定を使用するための先行文として機能することが意図されている。
【００４７】
さらに、本明細書で使用する用語「から本質的になる」は、この用語の後の成分が、全組成物の３０重量％未満の総量にあってこの成分の作用または活性に寄与しない、または妨害しない他の公知の成分の存在下で存在する組成物を意味することに留意されたい。
【００４８】
さらに、本明細書で使用する用語「含んでいる」は、それには限定されないその用語の後の成分を「含んでいる」ことを含むことを意味する。用語「含んでいる」の後の成分は、必要とされる、または必須であるが、これらの成分を含んでいる組成物は、さらに他の非必須または任意選択的成分を含むことができる。
【００４９】
さらに、本明細書で使用する用語「からなる」は、その用語の後の成分「からなる」ことを含むことを意味し、それに限定される。用語「からなる」の後の成分は、このため必要とされる、または必須であり、本組成物中には他の成分が全く存在しない。
【００５０】
当業者には本開示を読めば明白であるように、本明細書に記載および例示した個々の実施形態のそれぞれは、本明細書に記載した本発明の組成物および方法の範囲または精神から逸脱せずに他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴とは容易に分離することができる、または組み合わせることができる別個の成分および特徴を有する。任意の言及した方法は、言及した事象の順に、または論理的に可能である任意の他の順に実施することができる。
【００５１】
本明細書で使用する用語「関心対象のタンパク質」は、任意選択的に高レベルで、および商業化の目的で糸状菌内で発現させることが望ましいポリペプチドを意味する。そのようなタンパク質は、酵素、基質結合タンパク質、界面活性タンパク質、構造的タンパク質などであってよい。
【００５２】
本明細書で使用する用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを意味するために互換的に使用される。本明細書では、アミノ酸残基についての慣習的な１文字または３文字コードが使用される。ポリマーは、直鎖状または分岐鎖状であってよく、改変アミノ酸を含むことができ、非アミノ酸によって分断されてよい。これらの用語は、さらに、自然に、または、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または例えば標識化成分との共役結合などの任意の他の操作または改変などのインターベンションによって改変されているアミノ酸ポリマーも含んでいる。さらにこの定義の範囲内に含まれるのは、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１つ以上のアナログを含有するポリペプチド、ならびに当分野において公知の他の改変である。
【００５３】
本明細書で使用する用語「変異（体）」は、ポリペプチドと結び付けて使用される場合は、１つ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失によって、典型的には組換えＤＮＡ技術を適用することによって親（または参照）ポリペプチドから引き出されるポリペプチドを指す。変異ポリペプチドは、親ポリペプチドとは１つ以上、または数個（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上）のアミノ酸残基が異なる場合がある。変異ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較したアミノ酸の一次配列の相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）／同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）のレベルによって定義することができる。好ましくは、変異ポリペプチドは、親または参照ポリペプチドとの少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％またはいっそう少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。変異ポリペプチドは、典型的には、親／参照ポリペプチドのアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列を含んでいない。
【００５４】
用語「変異（体）」は、ポリヌクレオチドまたは遺伝子と結び付けて使用される場合は、親または参照ポリヌクレオチドまたは遺伝子と特定程度の相同性／同一性を有する、またはストリンジェント条件下で親または参照ポリヌクレオチドまたは遺伝子配列またはそれらの補体にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを指す。例えば、変異ポリヌクレオチドは、適切に、親ポリヌクレオチドとの少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％またはいっそう少なくとも約９９％のヌクレオチド配列同一性を有することができる。変異ポリヌクレオチドまたは遺伝子は、典型的には、親／参照ポリヌクレオチドまたは遺伝子のヌクレオチド配列と１００％同一であるヌクレオチド配列を含んでいない。
【００５５】
本明細書で使用する用語「ヒスチジンキナーゼ」は、ヒスチジンリン酸化を媒介する、細菌、酵母、糸状菌および植物中に存在するシグナル伝達因子を指す。ヒスチジンキナーゼは、大部分が膜貫通受容体であり、これらの実質的少数は、可溶性細胞質タンパク質である。いずれかの形態で、これらのキナーゼは、様々な感覚ドメインに連結した高度に保存された触媒伝達物質領域を含むモジュール式である。受容体ヒスチジンキナーゼは、膜貫通ドメインを通してその感覚ドメインを細胞質伝達物質領域に連結させる。伝達物質領域は、２つのドメイン：Ｎ末端ＤＨｐ（二量化およびヒスチジンリン酸転移）ドメインおよびＣ末端ＣＡ（触媒性およびＡＴＰ結合）ドメインからなる（Ｓｔｏｃｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）６９：１８３−２１５）。ヒスチジンキナーゼは、少数の例外を除いてホモ二量体として機能し、それらの二量体化は、４ヘリックスバンドルを形成するＤＨｐドメインによって媒介される（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．（２００９）２３：２４９−５９）。
【００５６】
本明細書で使用する用語「ハイブリッド型ヒスチジンキナーゼ」は、ヒスチジンキナーゼドメインと反応調節因子ドメインが同一タンパク質中に存在するヒスチジンキナーゼの１つの型である。酵母のサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、ゲノム内に１つのハイブリッド型ヒスチジンキナーゼ遺伝子（ＳＬＮ１）しか存在しない（Ｏｔａ，Ｉ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２６２，５６６−５６９）。酵母では、Ｓｌｎ１は高浸透圧反応に関係している。この反応は、細胞内の主要適合溶質としてのグリセロールの蓄積を含んでいる（Ｐｏｓａｓ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９６）８６，８６５−８７５）。植物のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）においては、ゲノム内に９つのハイブリッド型および３つの従来型ヒスチジンキナーゼ遺伝子が存在し、１２中２つのヒスチジンキナーゼ遺伝子は、酵母ｓｌｎ１突然変異体を補完することができる（Ｒｅｉｓｅｒ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００３）１６１，１０３５−１０４０）。アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）もまた、酵母ｓｌｎ１突然変異体を補完できるＳＬＮ１ホモログを有する（Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００２）６８，５３０４−５３１０）。糸状菌のニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）では、Ｓｌｎ１ホモログとは異なるハイブリッド型ヒスチジンキナーゼＯｓ−１／Ｎｉｋ−１がｏｓ（浸透圧感受性）シグナル伝達経路に関係しており、高浸透圧条件に順応するために必要とされている（Ａｌｅｘ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３，３４１６−３４２１）。
【００５７】
本明細書で使用する用語「第ＩＩＩ群ヒスチジンキナーゼ」は、ヒスチジンキナーゼ、アデニリルシクラーゼ、メチル基受容化学走性タンパク質およびホスファターゼを含むシグナル伝達関連タンパク質内で見いだされるＨＡＭＰドメイン反復配列からなる固有のＮ末端領域を有するヒスチジンキナーゼを指す（Ａｒａｖｉｎｄ  Ｌ，Ｐｏｎｔｉｎｇ  ＣＰ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ（１９９９）１７６：１１１−１１６）。例えば、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）Ｏｓ−１ｐ（Ｎｉｋ１ｐとしても公知）、Ｂ．フケリアナ（Ｂ．ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ）Ｄａｆ１ｐ（ＢｃＯｓ１ｐとしても公知）およびＣ．ヘテロストロフス（Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）Ｄｉｃ１ｐ（ＣｈＮｉｋ１ｐとしても公知）は、ＨＡＭＰドメイン反復配列からなる固有のＮ末端領域によって特徴付けられる（Ｃａｔｌｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ（２００３）２，１１５１−１１６１）。系統発生的分析は、真正子嚢菌（ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）（Ｃ．ヘテロストロフス（Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、Ｇ．モリニフォルミス（Ｇ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）およびＢ．フケリアナ（Ｂ．ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ））ヒスチジンキナーゼの１１の主要群を解明した。これらの群の多数は、糸状子嚢菌内で高度に保存されているヒスチジンキナーゼを含有する。他の群は、種内で拡大していて種間での明確なオルトログをほとんど有していない遺伝子ファミリーを含有していて、より相違する。これらの分類は、数種のヒスチジンキナーゼ遺伝子が大多数または全部の子嚢菌（ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）が共有する基本的機能（例えば、浸透圧感知）のために必要であるが、他の遺伝子は病原体の生活様式の特定態様に順応するために進化してきた可能性があることを示唆している。これらのドメインの正確な機能は知られていない。しかし、ＮＩＫ１  ＨＡＭＰ反復配列領域内の突然変異は、最も重度の浸透圧感受性およびジカルボキシイミド耐性表現型の原因となっている（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｔ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．（２００２）３５：１４７−１５５）。
【００５８】
本明細書で使用する用語「真菌」は、例えば酵母およびカビなどの微生物ならびにキノコを含む大きな群の真核生物の任意のメンバーを指す。これらの生物は、植物、動物、原生生物および細菌とは別個の独特な真菌界として分類される。１つの主要な相違は、真菌細胞が、セルロースを含有する植物および一部の原生生物の細胞壁とは異なり、および細菌の細胞壁とは異なり、キチンを含有する細胞壁を有することである。
【００５９】
本明細書で使用する用語「子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）真菌株」は、真菌界内の子嚢菌門（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）内の任意の生物を意味する。子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）真菌細胞の例には、例えば、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、ミセリオフトラ種（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐｐ）およびペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ）などのチャワンタケ亜門（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ  Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）内の糸状菌が含まれるがそれらに限定されない。
【００６０】
本明細書で使用する「糸状菌」は、真菌植物（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）亜門および卵菌類（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）亜門の全ての糸状菌形を指す。例えば、糸状菌には、制限なく、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、シタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種が含まれる。一部の実施形態では、糸状菌は、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）であってよい。一部の実施形態では、糸状菌は、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レティキュラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブチヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコセキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）またはフザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）である。一部の実施形態では、糸状菌は、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミーヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈ��ｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、シタリジウム・サーモフィラム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）またはチエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）である。一部の実施形態では、糸状菌は、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、例えばＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０（１９８４）ｐｐ．４６−５３；Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ  Ｂ．Ｓ．，Ｃａｎ．，１−２０，１９８７）、ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２６９２１）、ＮＲＲＬ  １５７０９、ＡＴＣＣ  １３６３１、５６７６４、５６４６６、５６７６７またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、例えばＡＴＣＣ  ３２０９８および３２０８６である。一部の実施形態では、糸状菌は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションからトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＡＴＣＣ  ５６７６５として入手できるトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＲｕｔＣ３０である。これに関連して、一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載した糸状菌のいずれか１つの全細胞ブロス調製物を提供する。
【００６１】
「異種」核酸構築物または核酸配列は、その中で発現する細胞にとって天然形ではない、または天然形で存在しない配列の一部分を有する。制御配列に関して「異種」は、それの発現を現在調節している同一遺伝子を調節するために自然には機能しない制御配列（すなわち、プロモーターまたはエンハンサー）に関する。一般に、異種核酸配列は、細胞またはそれらがその中に存在するゲノムの一部にとって内因性ではなく、感染、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどによって細胞に加えられている。「異種」核酸構築物は、天然細胞内で見いだされる制御配列／ＤＮＡコーディング配列の組み合わせと同一である、または異なる制御配列／ＤＮＡコーディング配列の組み合わせを含有することができる。
【００６２】
本明細書で使用する用語「宿主細胞」は、単細胞生物、多細胞生物に由来して組織培養中に配置された細胞または本発明による核酸構築物を用いた形質転換を受けやすい多細胞生物の一部として存在する細胞のいずれであろうと、好適には任意の真菌の細胞であってよい。例えば酵母および他の真菌細胞などの宿主細胞は、ＤＮＡを複製して、本発明において使用するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを生成するために使用できる。好適な細胞は、一般に糸状菌または酵母である。特に好ましいのは、糸状菌由来の細胞、好ましくは、例えばＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）およびＡ．ツビンゲンシス（Ａ．ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）などのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属由来の細胞である。他の好ましい生物には、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、ミセリオプトラ・サーモフィル（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、Ｔ．ビリジエ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）またはＴ．ロンギブラキアタム（Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）が含まれる。
【００６３】
本明細書で使用する用語「ベクター」は、異なる宿主細胞間の移入のために設計された核酸構築物を意味する。「発現ベクター」は、異種細胞内に異種ＤＮＡ断片を組み込んで発現させる能力を有するベクターを意味する。多数の原核生物および真核生物発現ベクターは、市販で入手できる。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内に含まれる。
【００６４】
本明細書で使用する用語「組換え真菌株」は、遺伝子組換えテクノロジーを使用して構築された真菌株を指す。
【００６５】
本明細書で使用する用語「親菌株」は、組換え菌株を生成するためにそのゲノムを１回、２回またはそれ以上突然変異させることのできる微生物菌株を指す。
【００６６】
本明細書で使用する用語「形質転換（された）」は、細胞が組換えＤＮＡ技術の使用によって形質転換されていることを意味する。形質転換は、典型的には細胞内への１つ以上のヌクレオチド配列の挿入によって発生する。挿入されたヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列であってよい、すなわち、例えば融合タンパク質などの形質転換されなければならない細胞にとって自然ではない配列である。
【００６７】
用語「誘導（された）」には、「に由来した」、「得られた」、「入手可能」および「作成された」が含まれ、一般には、１つの特定の材料がまた別の材料中にその起源が見いだされる、または他の特定の材料を参照して記載できる特徴を有する。
【００６８】
本明細書で使用する用語「遺伝子」は、コーディング領域に先行する、またはコーディング領域の次に来る領域を含んでいても含んでいなくてもよい、ポリペプチドを生成する際に含まれるＤＮＡのセグメント、例えば５’未翻訳（５’ＵＴＲ）または「リーダー」配列および３’ＵＴＲまたは「トレーラー」配列ならびに個別コーディングセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を意味する。所定の実施形態では、遺伝子は、商業的に重要な工業用タンパク質またはペプチド、例えば、酵素、例えばプロテアーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼまたはリパーゼなどをコードする。関心対象の遺伝子は、天然型遺伝子、突然変異遺伝子または合成遺伝子であってよい。
【００６９】
本明細書で使用する用語「突然変異」は、核酸配列内の任意の変更または変化を指す。点突然変異、フレームシフト突然変異およびスプライシング突然変異を含む数種のタイプの突然変異が存在する。突然変異は、特異的に（例えば、部位特異的突然変異誘発）または無作為に（例えば、化学薬品、修復マイナス細菌株の通過によって）実施することができる。
【００７０】
本明細書で使用する用語「タンパク質生成を改善する工程」は、それによりその工程から生成されるタンパク質量が増加するタンパク質生成工程を指す。このように生成されたタンパク質は、培養培地内または宿主細胞内で生成できるが、しかし、前者が好ましい。増加した生成は、例えば親宿主生物と比較して、生成されるセルラーゼまたはヘミセルラーゼ活性などのタンパク質または酵素活性または全細胞外タンパク質のより高い最高レベルとして検出することができる。
【００７１】
本明細書で使用する用語「比生産性」は、所定の期間にわたって単位細胞当たり、単位時間当たり生成されるタンパク質の総量を指す。
【００７２】
本明細書で使用する用語「同一性率（％）」は、用語「相同性率（％）」と互換的に使用され、どちらも配列アラインメントプログラムを使用して整列させた場合に、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のいずれか１つをコードする核酸配列間の核酸配列またはアミノ酸配列の同一性のレベルを意味する。
【００７３】
ＩＩＩ．改善されたタンパク質生成を有する組換え真菌株
本開示は、第一態様では、変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え、形質転換または誘導真菌株に関し、および第二態様では、変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成する能力を有するように真菌株を遺伝子組換えする方法に関する。さらに、本開示は、そのような組換え、形質転換または誘導真菌株を発酵させる工程によって生成される関心対象のタンパク質、およびさらにこうして生成された関心対象のタンパク質を含む組成物に関する。さらに、本開示は、組換え、形質転換または誘導真菌株を使用して関心対象のタンパク質を生成する方法、ならびに関心対象のタンパク質を含む組成物を生成および使用する方法に関する。本開示はさらに、親菌株に比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株を同定または選択するための方法に関する。
【００７４】
第一態様では、本開示は、親菌株と比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株であって、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子を含む、および／または変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子を発現することができる組換え真菌株を提供する。一部の実施形態では、本開示は、その親菌株と比較して、有意に大量の関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株を提供する。例えば、組換え真菌株は、その親菌株と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％またはいっそう少なくとも約１５０％多い量の関心対象のタンパク質を生成することができる。
【００７５】
第二態様では、本開示は、親菌株と比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる形質転換真菌株またはその誘導真菌株であって、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子を含む、および／または変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子を発現することができる形質転換真菌株またはその誘導真菌株を提供する。
【００７６】
第三態様では、本開示は、その天然型、非組換え、非形質転換または非誘導親菌株と比較して、組換え、形質転換または誘導真菌株によるタンパク質生成を改善するための方法であって、組換え、形質転換または誘導真菌株を使用する工程を含み、その組換え、形質転換または誘導真菌株が変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子を含む、および／または変異ヒスチジンキナーゼを発現することができる方法を提供する。
【００７７】
本明細書に提示した態様のいずれかでは、変異ヒスチジンキナーゼは、野生型ヒスチジンキナーゼの変異体である。一部の実施形態では、変異ヒスチジンキナーゼは、配列番号１と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはいっそうそれ以上の％）同一であるが、配列番号１と１００％同一ではないポリペプチドまたはアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、変異ヒスチジンキナーゼは、配列番号４３と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはいっそうそれ以上の％）同一であるが、配列番号４３と１００％同一ではないポリペプチドまたはアミノ酸配列を含む。例えば、変異ヒスチジンキナーゼは、適切には変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子によってコードされた変異ヒスチジンキナーゼであって、変異ヒスチジンキナーゼは、配列番号１および配列番号１の７４３位での突然変異または配列番号４３および配列番号４３の７８６位での突然変異と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはいっそうそれ以上の％）同一であるアミノ酸配列を含む。
【００７８】
Ａ．ヒスチジンキナーゼ
ヒスチジンキナーゼは、外部シグナルを検出して外部シグナルを形質導入可能な細胞事象に形質変換させることのできるセンサータンパク質である。外部刺激の検出および適切に反応するために細胞内のこれらのシグナルの伝達は、生物にとって生物のライフサイクル中の様々な環境条件に順応するために極めて重要である。シグナル伝達機序は、より複雑な生物では二成分系またはリン酸リレー系として全ての生細胞において見いだされる。そのような系は、ホスホリル基の頻回に膜結合したヒスチジンキナーゼから反応調節因子タンパク質へのシグナル伝達を付与し、したがって様々な生理学的反応を始動させる。リン酸化は、オリゴマー化（Ｗｅｉｓｓ，Ｖ．，Ｆ．Ｃｌａｖｅｒｉｅ−Ｍａｒｔｉｎ，ａｎｄ  Ｂ．Ｍａｇａｓａｎｉｋ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：５０８８−５０９２；Ｗｅｂｂｅｒ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ  Ｒ．Ｊ．Ｋａｄｎｅｒ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９７）２４：１０３９−１０４８）、二量体化（Ｃｏｂｂ，Ｍ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｅ．Ｊ．Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（２０００）２５：７−９）、他のタンパク質との相互作用（Ｂｌａｔ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｍ．Ｅｉｓｅｎｂａｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９４）３３：９０２−９０６；Ｎｅｗｔｏｎ，Ａ．Ｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．（２００１）１０１：２３５３−２３６４）、ＤＮＡとの相互作用（Ａｉｂａ，Ｈ．，Ｆ．Ｎａｋａｓａｉ，Ｓ．Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍｉｚｕｎｏ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８９）１０６：５−７）またはこれらの機序の組み合わせ（Ｈａｒｌｏｃｋｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｌ．Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，ａｎｄ  Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）２７０：２６８４９−２６８５６）を促進できる。リン酸リレー系は、病原性および非病原性細菌および真菌における分化工程、走化性、二次代謝産物産生ならびに毒性関連工程の原因に関連付けられてきた（Ｇｒｅｂｅ，Ｔ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｊ．Ｂ．Ｓｔｏｃｋ．Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９９）４１：１３９−２２７；Ｗｏｌａｎｉｎ，Ｐ．Ｍ．，Ｐ．Ａ．Ｔｈｏｍａｓｏｎ，ａｎｄ  Ｊ．Ｂ．Ｓｔｏｃｋ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．（２００２）３：Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３０１３）。
【００７９】
塩基性シグナル伝達因子としての２つの成分：自己リン酸化ヒスチジンキナーゼおよびそれからリン酸を受容して情報を下流領域に送る反応調節因子からなるリン酸リレーシグナル伝達系であるハイブリッド型ヒスチジンキナーゼは、植物、粘菌、真菌および細菌における数種のシグナル伝達経路に含まれるが動物においては含まれない（Ｃａｔｌｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ（２００３）２，１１５１−１１６１）。それらは、環境刺激に対する反応において極めて重要な役割を果たし、植物および動物病原体における毒性を含む様々な工程を調節する（Ｗｏｌａｎｉｎ，Ｐ．Ｍ．，Ｐ．Ａ．Ｔｈｏｍａｓｏｎ，ａｎｄ  Ｊ．Ｂ．Ｓｔｏｃｋ．２００２．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．（２００２）３：Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３０１３）。
【００８０】
真菌においては、ヒスチジンキナーゼは、第１１群に分類される（Ｃａｔｌｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ（２００３）２，１１５１−１１６１）。典型的には、ハイブリッド型ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、ＨｉｓＫＡドメインに加えて、ＲＥＣ（シグナル受信体）ドメイン（ＰＦ０００７２）、ＨＡＴＰａｓｅ（ヒスチジン様ＡＴＰａｓｅ；ＰＦ０２５１８）ドメインおよび様々なシグナル伝達ドメイン、例えば、ＨＡＭＰ−（ヒスチジンキナーゼ、アデニリルシクラーゼ、メチル基受容タンパク質およびホスファターゼ；ＰＦ００６７２）およびＡＴＰａｓｅドメイン（ＰＦ１３１９１）を含有する。第ＩＩＩ群ヒスチジンキナーゼは、ＨＫｓ、アデニリルシクラーゼ、メチル基受容化学走性タンパク質およびホスファターゼを含むシグナル伝達関連タンパク質において見いだされるＨＡＭＰドメイン反復配列からなる固有のＮ末端領域を有する（Ａｒａｖｉｎｄ  Ｌ，Ｐｏｎｔｉｎｇ  ＣＰ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ（１９９９）１７６：１１１−１１６）。
【００８１】
第ＩＩＩ群ヒスチジンキナーゼは、環境ストレス反応、病原性、菌糸発達および胞子形成の媒介因子として公知であった（Ｌｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９８）１７：６９５２−６９６２．；Ｈｏｈｍａｎｎ，Ｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００２）６６：３００−３７２．；Ｎｅｍｅｃｅｋ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００６）３１２：５８３−５８８．；Ｖｉａｕｄ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．（２００６）１９：１０４２−１０５０；Ｉｓｌａｓ−Ｆｌｏｒｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ａｓｉａｎ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０１１）６：１−１４）。これらのヒスチジンキナーゼ遺伝子の突然変異は、フェニルピロール系およびジカルボキシイミド系殺真菌剤に対する耐性ならびにさらに浸透圧感受性の増加も生じさせた（Ｃｕｉ，Ｗ．；Ｂｅｅｖｅｒ，Ｒ．Ｅ．，Ｐａｒｋｅｓ，Ｓ．Ｌ．，Ｗｅｅｄｓ，Ｐ．Ｌ．＆  Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，Ｍ．Ｄ．Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．（２００２），３６，１８７−１９８；Ｏｃｈｉａｉ，Ｎ．；Ｆｕｊｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｍｏｔｏｙａｍａ，Ｔ．，Ｉｃｈｉｉｓｈｉ，Ａ．，Ｕｓａｍｉ，Ｒ．，Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ，Ｋ．＆  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｉ．Ｐｅｓｔ．Ｍａｎａｇ．Ｓｃｉ．，（２００１）５７，４３７−４４２）。Ｃ．ヘトロストロフス（Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）では、ｄｉｃ１に対するヌル突然変異体およびＨＡＭＰドメイン反復配列内の欠失または点突然変異を含む突然変異体は、浸透圧ストレスに対して高度に感受性であり、以前に挙げた殺真菌剤に対して高度に耐性であった（Ｙｏｓｈｉｍｉ  Ａ，Ｔｓｕｄａ  Ｍ，Ｔａｎａｋａ  Ｃ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｎｏｍｉｃｓ（２００４）２７１：２２８−２３６）。突然変異の結果として生じる類似の効果は、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）ｏｓ−１およびＢ．フケリアナ（Ｂ．ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ）ｄａｆ１において観察された（Ｃｕｉ，Ｗ．；Ｂｅｅｖｅｒ，Ｒ．Ｅ．，Ｐａｒｋｅｓ，Ｓ．Ｌ．，Ｗｅｅｄｓ，Ｐ．Ｌ．＆  Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，Ｍ．Ｄ．Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．（２００２），３６，１８７−１９８；Ｏｃｈｉａｉ，Ｎ．；Ｆｕｊｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｍｏｔｏｙａｍａ，Ｔ．，Ｉｃｈｉｉｓｈｉ，Ａ．，Ｕｓａｍｉ，Ｒ．，Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ，Ｋ．＆  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｉ．Ｐｅｓｔ．Ｍａｎａｇ．Ｓｃｉ．，（２００１）５７，４３７−４４２）。Ｃ．ヘテロストロフス（Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）ｄｉｃ１のキナーゼドメインまたは調節因子ドメイン内の単一アミノ酸変化は、浸透圧ストレスに対する感受性を変化させ、殺真菌剤に対する中等度の耐性を付与した。したがって、第ＩＩＩ群ヒスチジンキナーゼは、推定浸透圧センサーであると考えられる（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ（１９９７）３４，３４０−３４７）。さらに、第ＩＩＩ群ヒスチジンキナーゼのメンバーは、例えばフルジオキソニル、イプロジオンなどの市販の殺虫剤および抗真菌性天然産物であるアンブルチシンの標的であると考えられる（Ｍｏｔｏｙａｍａ，Ｔ．；Ｏｈｉｒａ，Ｔ．，Ｋａｄｏｋｕｒａ，Ｋ．，Ｉ���ｈｉｉｓｈｉ，Ａ．，Ｆｕｊｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｉ．＆  Ｋｕｂｏ，Ｔ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，（２００５ｂ）４７，２９８−３０６；Ｄｏｎｇｏ  Ａ，Ｂａｔａｉｌｌｅ−Ｓｉｍｏｎｅａｕ  Ｎ，Ｃａｍｐｉｏｎ  Ｃ，Ｇｕｉｌｌｅｍｅｔｔｅ  Ｔ，Ｈａｍｏｎ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００９）７５：１２７−１３４）。
【００８２】
１つの例では、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ヒスチジンキナーゼ遺伝子（ＴｒＮｉｋ−１）のドメイン構造は、本開示においてはバイオインフォマティクスによって分析し、ＴｒＮｉｋ−１が５つのＨＡＭＰ機能的ドメイン、１つのＨｉｓＫＡ機能的ドメイン、１つのＨＡＴＰａｓｅドメインおよび１つのＲＥＣ機能的ドメインを含有することが証明された（図１）。ドメイン構造によると、ＴｒＮｉｋ−１は、第ＩＩＩ群ヒスチジンキナーゼに属する。トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ヒスチジンキナーゼのアミノ酸またはポリペプチド配列は、本明細書では下記に配列番号１として提示した：
【化１】
2018504936.tif 000003
【００８３】
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ヒスチジンキナーゼ（ＡｎＮｉｋ１）のアミノ酸またはポリペプチド配列は、本明細書では下記に配列番号４３として提示した：
【化２】
2018504936.tif 000004
【００８４】
Ｂ．突然変異またはノックアウトヒスチジンキナーゼを含む組換え真菌株
１つの実施形態では、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）天然ｎｉｋ１ヒスチジンキナーゼ対立遺伝子の改変は、分泌タンパク質の量の増加を誘発することができる。ｎｉｋ１改変は、Ｎｉｋ１タンパク質の７４３位のアミノ酸をＭｅｔ（ＡＴＧ）からＴｈｒ（ＡＣＧ）へ変化させるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号１）内の単一ヌクレオチドＴからＣへの置換であった。
【００８５】
改変ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔヒスチジンキナーゼ対立遺伝子を含有する菌株とｎｉｋ１野生型（天然）対立遺伝子を含有する宿主菌株とのタンパク質生成の比較は実施されており、ＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの全タンパク質比生成率および供給糖に対する収率はＲＬＰ３７に比した有意な改善を示すことが見いだされた（図４）。これは、宿主Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株内への改変ｎｉｋ１ヒスチジンキナーゼの導入がタンパク質生成の増加を誘発することを示した。
【００８６】
他の実施形態では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）天然ｎｉｋ１ヒスチジンキナーゼ対立遺伝子の改変は、分泌タンパク質の量の増加を誘発することができる。ｎｉｋ１改変は、Ｎｉｋ１タンパク質の７８６位のアミノ酸をＭｅｔ（ＡＴＧ）からＴｈｒ（ＡＣＧ）へ変化させるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号４３）内の単一ヌクレオチドＴからＣへの置換であった。
【００８７】
改変ｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔヒスチジンキナーゼ対立遺伝子を含有する菌株とｎｉｋ１野生型（天然）対立遺伝子を含有する宿主菌株とのタンパク質生成の比較は実施されており、ＧＩＣＣ２０７１  Ｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔのタンパク質生成およびｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＰＮＰＧ）基質に対する酵素活性は、野生型親ＧＩＣＣ２０７１に比して改善を示すことが見いだされた（図１５および１６）。これは、宿主Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）菌株内への改変ｎｉｋ１ヒスチジンキナーゼの導入がタンパク質生成の増加を誘発することを示した。
【００８８】
一部の実施形態では、変異ヒスチジンキナーゼは、任意の種類の突然変異、例えば、単一および多重（例えば、少数、つまり１、２、３、４、５、６、７、８、９またはいっそう１０以上さえの）突然変異、例えば、置換、挿入、欠失、転位、終結（終止コドンが導入される）および点突然変異を含むという点で、天然ヒスチジンキナーゼの変異体である。所定の例では、それにより単一ヌクレオチド塩基が同一位置で異なるヌクレオチド塩基と置換される単一塩基対置換が、ＤＮＡの他方の鎖上の相補的塩基の対応する置換を伴って発生する可能性がある。任意のそのような単一塩基対置換は、本明細書では本発明の１つの実施形態として企図されており、したがって、変異ヒスチジンキナーゼは、野生型の親ヒスチジンキナーゼ遺伝子と比較して単一塩基対置換を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる可能性がある。変異ポリヌクレオチドの突然変異は、タンパク質コーディング領域内またはリボソームまたはトランスファーＲＮＡをコードする領域内で出現する可能性がある。
【００８９】
突然変異は、当分野において公知の任意の突然変異誘発手法、例えば部位特異的突然変異誘発法、合成遺伝子構築法、半合成遺伝子組換え法、ランダム突然変異誘発法、シャッフリング法などを使用して調製できる。
【００９０】
部位特異的突然変異誘発法は、１つ以上（例えば、数個）の突然変異が親をコードするポリヌクレオチド内の１つ以上の規定部位で導入される技術である。部位特異的突然変異誘発法は、所望の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーの使用を含むＰＣＲによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施することができる。部位特異的突然変異誘発法は、さらにｉｎ  ｖｉｔｒｏで、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド内の１つの部位での制限酵素による切断およびその後にポリヌクレオチド内の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドのライゲーションを含むカセット突然変異誘発法によって実施することもできる。通常は、プラスミドおよびオリゴヌクレオチドを消化する制限酵素は同一であり、プラスミドおよびインサートの付着末端が相互にライゲートすることを許容する。例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：４９４９−４９５５；およびＢａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８：７３４９−４９６６を参照されたい。部位特異的突然変異誘発法はさらに、当分野において公知の方法によってｉｎ  ｖｉｖｏで実施することもできる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号明細書；Ｓｔｏｒｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００１）１９：７７３−７７６；Ｋｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（１９９８）４：２８５−２９０；およびＣａｌｉｓｓａｎｏ  ａｎｄ  Ｍａｃｉｎｏ，Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．（１９９６）４３：１５−１６を参照されたい。本発明では、任意の部位特異的突然変異誘発手技を使用することができる。変異体を調製するために使用できる、多数の市販のキットが存在する。
【００９１】
ランダム突然変異誘発法は、様々な手段の１つを通して実施できる。１つの方法は、例えば、特に２−アミノプリン（２ＡＰ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）またはエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）などの突然変異誘発試薬の存在下での成果による化学的突然変異誘発法である（Ｆｏｓｔｅｒ，Ｐ．Ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９１）２０４：１１４−１２５．）。化学的突然変異誘発のための方法は、当分野において周知であり、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．（Ａ  ｓｈｏｒｔ  ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ａｎｄ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．１９９２）によって詳細に記載されている。突然変異誘発は、さらにまたＳｅｌｉｆｏｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．（２００１）ｌ６７：３６４５−３６４９）によって記載されたように、プラスミドのｍｕｔＤ５  ｏｆｆなどの突然変異誘発遺伝子を発現させることによっても実施できる。細胞ゲノムは、さらにまたトランスポゾン突然変異誘発、ゲノムシャッフリング、プラスミド由来の遺伝子の過剰発現または他の細胞工学技術を通して操作することもできる（Ｋｌｅｃｋｎｅｒ，Ｎ．，Ｂｅｎｄｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９１）２０４：１３９−１８０；Ｐａｔｎａｉｋ，Ｒ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（２００８）２４：３８−４７）。突然変異細胞は、さらにまたＭｉｒｏｕｘ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒの方法（米国特許第６，３６１，９６６号明細書）におけるように、細胞を単純により大きく増殖させ、複製エラーを自然に発生させることによっても生成できる。さらにより優れた突然変異体を得るためには、２ラウンド以上の突然変異誘発が実施することができ、各ラウンドは、同一または異なる突然変異誘発法を使用することができる。
【００９２】
所定の実施形態では、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、変異第ＩＩＩ群ヒスチジンキナーゼであり、配列番号１または配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％またはいっそう少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するＴｒＮｉｋ−１またはＡｎＮｉｋ−１の天然型変異体であってよいが、この変異ヒスチジンキナーゼは、配列番号１または配列番号４３と１００％同一の配列を有していない。
【００９３】
所定の実施形態では、変異ヒスチジンキナーゼは、例えば、培地中のイプロジオンまたはフルジオキソニルなどの高レベルのジカルボキシイミド系またはフェニルピロール系殺真菌剤の存在下で、所定の抗真菌化合物に対する耐性または感受性についてスクリーニングすることによって同定できる。
【００９４】
一部の実施形態では、変異ヒスチジンキナーゼは、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ではない真菌株から入手することができ、変異ヒスチジンキナーゼは、配列番号１または配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％またはいっそう少なくとも約９９％同一であるポリペプチド配列を含むが、この変異ヒスチジンキナーゼは、配列番号１または配列番号４３と１００％同一ではない。
【００９５】
一部の実施形態では、ヒスチジンキナーゼは、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）、特にトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（ロンギブラキアタム（ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ））由来である。ヒスチジンキナーゼは、さらに例えば、アブシディア種（Ａｂｓｉｄｉａ  ｓｐｐ．）；アクレモニウム種（Ａｃｒｅｍｏｎｉυｍ  ｓｐｐ．）；アガンカス種（Ａｇａｎｃｕｓ  ｓｐｐ．）、アナエロミセス種（Ａｎａｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）；Ａ．アウクレアタス（Ａ．ａｕｃｕｌｅａｔｕｓ）、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、Ａ．フラバス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）、Ａ．フォエティダス（Ａ．ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、Ａ．フマリカス（Ａ．ｆｕｍａｒｉｃｕｓ）、Ａ．フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ａ．テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）およびＡ．バーシカラー（Ａ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）を含むアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）；オイロバシジウム種（Ａｅｕｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）；セファロスポラム種（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｕｍ  ｓｐｐ．）；カエトミウム種（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｓｐｐ．）；クリソスポリウム種）Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）；コプリヌス種（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｓｐｐ．）；ダクチルム種（Ｄａｃｔｙｌｌｕｍ  ｓｐｐ．）；Ｆ．コングロメランス（Ｆ．ｃｏｎｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、Ｆ．デセムセルラレ（Ｆ．ｄｅｃｅｍｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｆ．ジャバニカム（Ｆ．ｊａｖａｎｉｃｕｍ）、Ｆ．リム（Ｆ．ｌｉｍ）、Ｆ．オキシスポラム（Ｆｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）およびＦ．ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）を含むフザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）；グリオクラジウム種（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）；Ｈ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）およびＨ．ラヌギノサ（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）を含むフミコラ種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｓｐｐ．）；ムコール種（Ｍｕｃｏｒ  ｓｐｐ．）；Ｍ．サーモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）を含むミセリオフトラ種（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐｐ．）；Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）およびＮ．シトフィラ（Ｎ．ｓｉｔｏｐｈｉｌａ）を含むニューロスポラ種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．）；ネオカリマスティックス種（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ  ｓｐｐ．）；オルピノミセス種（Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）；ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）；ファネロケーテ種（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｓｐｐ．）；フレビア種（Ｐｈｌｅｂｉａ  ｓｐｐ．）；ピロミセス種（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）；シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）；リゾプス種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｐ．）；シゾフィラム種（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｓｐｐ．）；トラメテス種（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｓｐｐ．）；Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ（ロンギブラキアタム（ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ））およびＴ．ビンデ（Ｔ．ｖｉｎｄｅ）を含むトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）；またはジゴリンクス種（Ｚｙｇｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｓｐｐ．）などの他の真菌に由来してよい。同様に、ヒスチジンキナーゼは、例えば、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、セルロモナス種（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）；クロストリジウム種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ミセリオフトラ種（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐｐ．）；サーモモノスポラ種（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐｐ．）；ストレプトミセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、Ｓ．オリボクロモゲネス（Ｓ．ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）；フィブロバクター・スクシノゲネス（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）などの細菌およびカンジダ・トレスン（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｏｒｒｅｓｎ）、Ｃ．パラシロシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｌｌｏｓｉｓ）；Ｃ．サケ（Ｃ．ｓａｋｅ）；Ｃ．ゼイラノイデス（Ｃ．ｚｅｙｌａｎｏｉｄｅｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）；ロードトルーラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）；Ｒ．ムチラギノーザ（Ｒ．ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）またはスポロボロミセス・ロゼウス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｕｓ）を含む酵母の中に見いだすことができる。
【００９６】
１つの例では、ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ対立遺伝子が機能獲得または機能消失を生じさせるかどうかを決定するために、Ｎｉｋ１欠失菌株（ＲＬＰ３７  ΔＮｉｋ１）が構築された。ＲＬＰ３７  ΔＮｉｋ１菌株と野生型対立遺伝子を含有するＲＬＰ３７宿主菌株とのタンパク質生成および他の特徴についての比較は、ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ対立遺伝子が機能獲得表現型を生じさせる機能獲得対立遺伝子であることを証明した（図１２）。
【００９７】
所定の実施形態では、変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子は、外部浸透圧に反応するシグナル伝達経路の一部として機能するポリペプチドをコードする。このシグナル伝達経路の他の成分における突然変異もまた有益な可能性があると予測することができる。これらの成分には、制限なく、浸透圧に反応して他の遺伝子の発現を調節するＭＡＰキナーゼタンパク質および転写因子が含まれる。この経路における突然変異を含む菌株は、例えば、培地中の高レベルのソルビトールまたは塩の存在下で、浸透圧ストレスに対する耐性または感受性についてスクリーニングすることによって同定できる。
【００９８】
本発明のためには、用語「浸透圧」は、糸状菌の細胞膜を横断する正味の水の流れを停止させるために必要とされる静水圧を指す。例えば、真菌細胞に曝露させられる浸透圧は、真菌細胞が培養される増殖培地中の塩またはソルビトールなどの成分の（例えば、１．２Ｍと高い）濃度によって変動する可能性がある。細胞が高浸透圧に抵抗する能力は有益であり、細胞がより大量の関心対象のタンパク質を生成する能力と結び付けることができる。この考え方に沿うと、本発明の組換え真菌株または誘導真菌株は、それらの親菌株と比較して改善された浸透圧に抵抗する能力を有する。
【００９９】
Ｃ．タンパク質生成の検出
組換え真菌株が改善されたレベルの関心対象のタンパク質を生成する能力を有することを確証するために、様々なスクリーニング法を実施することができる。発現ベクターは、検出可能な標識として機能する標的タンパク質へのポリペプチド融合をコードできる、または標的タンパク質自体が選択可能またはスクリーニング可能なマーカーとして機能できる可能性がある。標識タンパク質は、ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング（ウェブサイトのＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓから入手できる方法）、ＥＬＩＳＡ、または標識がＧＦＰである場合は、全細胞蛍光法またはＦＡＣＳによって検出することができる。例えば、６−ヒスチジンタグは標的タンパク質への融合体として含まれ、このタグがウェスタンブロッティングによって検出されるであろう。標的タンパク質が十分に高いレベルで発現すると、野生型に比した突然変異体発現の増加を検出するためには、クマシー／銀染色と組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施することができ、その場合には標識が必要とされない。さらに、関心対象のタンパク質の改善されたレベルを確証するためには、培養または発酵がより長期間にわたり効率的に持続することを可能にする、例えば細胞毎のタンパク質活性または量、培地１ｍＬ当たりのタンパク質活性または量の増加の検出などの他の方法、またはこれらの方法の組み合わせを使用できる。
【０１００】
比生産性の検出は、タンパク質生成を評価するためのまた別の方法である。比生産性（Ｑｐ）は、下記の方程式：
Ｑｐ＝ｇＰ／ｇＤＣＷ・ｈｒ
（式中、「ｇＰ」はタンク内で生成されたタンパク質のグラム数であり、「ｇＤＣＷ」はタンク内の乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のグラム数であり、「ｈｒ」は、生成時間ならびに増殖時間を含む接種時点からの発酵時間（時間）である）によって決定できる。
【０１０１】
一部の実施形態では、組換え、形質転換または誘導真菌株は、その親菌株と比較して、少なくとも約０．５％、例えば、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．７％、少なくとも約１％、少なくとも約１．５％、少なくとも約２．０％、少なくとも約２．５％またはいっそう少なくとも約３％以上多い関心対象のタンパク質を生成することができる。
【０１０２】
Ｄ．関心対象のタンパク質を生成するために組換え、形質転換または誘導真菌株を使用する
１つの態様では、本開示は、組換え、形質転換または誘導真菌株を発酵させる工程を含む関心対象のタンパク質を生成する方法であって、組換え、形質転換または誘導真菌株が関心対象のタンパク質を分泌し、組換え、形質転換または誘導真菌株がそのヒスチジンキナーゼ遺伝子内に突然変異を含む方法を提供する。
【０１０３】
真菌を形質転換させてその真菌を培養するための標準技術は、当分野において周知であり、組換えタンパク質を生成するために本発明の改善された宿主を形質転換させるために使用できる。宿主細胞内へのＤＮＡ構築物またはベクターの導入には、例えば、形質転換法；エレクトロポレーション法；核マイクロインジェクション法；形質導入法；トランスフェクション法、例えば、リポフェクション媒介性およびＤＥＡＥ−デキストリン媒介性トランスフェクション法；リン酸カルシウムＤＮＡ沈降物とのインキュベーション法；ＤＮＡ被覆微粒子弾丸を用いた高速衝撃法；遺伝子銃またはバイオリスティック形質転換法およびプロトプラスト融合法などの技術が含まれる。一般的形質転換技術は、当分野において公知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），ｓｕｐｒａ，ｃｈａｐｔｅｒ  ９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），ｓｕｐｒａ；およびＣａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９）１６：５３−５６を参照されたい。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の異種タンパク質の発現は、例えば、米国特許第６，０２２，７２５号明細書；同第６，２６８，３２８号明細書；Ｈａｒｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）１３：２２７−２３３；Ｈａｒｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．（１９８９）７：５９６−６０３；欧州特許第２４４，２３４号明細書および同第２１５，５９４号明細書に記載されている。さらに、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌株の形質転換については、さらにＣａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）９：９９１−１００１も参照されたい。
【０１０４】
通常、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）の形質転換は、典型的には１０５〜１０７／ｍＬ、特に２×１０６／ｍＬの密度での透過性処理を受けているプロトプラストまたは細胞が使用される。適切な溶液（例えば、１．２Ｍのソルビトールおよび５０ｍＭのＣａＣｌ２）中の体積１００μＬのこれらのプロトプラストまたは細胞が所望のＤＮＡと混合される。一般には、高濃度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が取込み溶液に加えられる。例えば、ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウムなどの添加物もまた、形質転換を促進するために取込み溶液に加えられてよい。他の真菌宿主細胞に対しても類似の手技を利用できる。例えば、どちらも参照により組み込まれる米国特許第６，０２２，７２５号明細書および同第６，２６８，３２８号明細書を参照されたい。
【０１０５】
一部の実施形態では、本発明は、組換え真菌株または形質転換真菌株および誘導真菌株を発酵させる工程を含む関心対象のタンパク質を生成する方法であって、組換えまたは形質転換および誘導真菌株が関心対象のタンパク質を分泌する方法を提供する。当分野において周知の発酵方法は、組換えまたは形質転換または誘導真菌株を発酵させるために使用できる。一部の実施形態では、真菌細胞は、バッチまたは連続発酵条件下で増殖させられる。伝統的なバッチ発酵は、培地の組成が発酵の開始時に設定されて発酵中には変更されない閉鎖系である。発酵の開始時に、培地には所望の生物が接種される。この方法では、発酵は、この系に任意の成分を添加せずに発酵が許容される。典型的には、バッチ発酵は、炭素源の添加に関して「バッチ」であると見なされ、例えばｐＨおよび酸素濃度などの因子を制御する試みが頻回に企てられる。バッチ系の代謝産物およびバイオマス組成は、発酵が停止する時点まで常に変化する。バッチ培養内では、細胞は静的誘導期を経由して高増殖対数期へ進行し、最終的には増殖率が減少または停止する静止期に進む。未処理のまま放置すると、静止期にある細胞は最終的には死滅する。一般に、対数期にある細胞は、生成物の大量生産に寄与する。
【０１０６】
標準バッチ系に関する好適な変形形態は、「フェドバッチ発酵」系である。典型的なバッチ系のこの変形形態では、基質が発酵の進行につれて徐々に加えられる。フェドバッチ系は、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を抑制する可能性が高い場合、および培地中で限定量の基質を有することが所望である場合に有用である。フェドバッチ系内での実際の基質濃度の測定は困難であるので、このため例えばｐＨ、溶存酸素およびＣＯ２などの排気ガスの部分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチおよびフェドバッチ発酵は、当分野において一般的で周知である。
【０１０７】
連続発酵は、定義された発酵培地がバイオリアクターに連続的に加えられ、加工処理のために等量の馴化培地が同時に除去される開放系である。連続発酵は、一般に、細胞が主として対数期増殖にある一定の高密度で培養を維持する。連続発酵は、細胞増殖および／または生成物濃度に影響を及ぼす１つ以上の因子の調節を許容する。例えば、１つの実施形態では、炭素源または窒素源などの制限的栄養物質は、一定比率に維持することができ、他の全てのパラメーターは調節することが許容される。他の系では、増殖に影響を及ぼす多数の因子を連続的に変化させることができ、その間に培地濁度によって測定される細胞濃度は一定に維持される。連続系は、定常状態増殖条件を維持しようと努力する。したがって、除去される培地に起因する細胞消失は、発酵中の細胞増殖率に対してバランスが取られなければならない。連続発酵工程のための栄養分および増殖因子を調節する方法ならびに生成物形成速度を最大化するための技術は、工業微生物学の分野において周知である。
【０１０８】
Ｅ．組換え、形質転換または誘導菌株によって生成される関心対象のタンパク質
所定の態様では、本開示は、組換え、形質転換または誘導真菌株を発酵させる工程によって生成される関心対象のタンパク質であって、組換え、形質転換または誘導真菌株が変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子を含む、および／または変異ヒスチジンキナーゼを発現できる関心対象のタンパク質を提供する。
【０１０９】
関心対象のタンパク質は、任意の内因性および異種タンパク質であってよい。そのタンパク質は、１つ以上のジスルフィド架橋を含有することができる、またはその機能的形態がモノマーまたはマルチマーであるタンパク質である。すなわち、そのタンパク質は四次構造を有し、複数の同一（同種）または非同一（異種）サブユニットから構成され、このとき関心対象のタンパク質は、好ましくは関心対象の特性を備えるタンパク質である。関心対象のタンパク質または関心対象の変異タンパク質は、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マンナナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、これらの酵素の２つ以上の混合物、それらの酵素のいずれかの機能的断片またはこれらの酵素およびそれらの機能的断片のいずれかの混合物であってよい。関心対象のタンパク質または変異タンパク質の非限定的例は、さらに、デンプン代謝に含まれるタンパク質または酵素、グリコゲン代謝に含まれるタンパク質または酵素、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリサーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ａ−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：０２−オキシドレダクターゼ、ＥＣ１．１．３．５）、それらの変異体、それらの機能的断片またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１１０】
関心対象のタンパクは、さらにまた好適には、ペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原（例えば、ＨＢＶ表面抗原、ＨＰＶ  Ｅ７など）、またはそれらの変異体、それらの機能的断片またはこれらの上記の物質のいずれかの混合物であってよい。
【０１１１】
他のタイプの関心対象のタンパク質または変異体は、食品または作物に栄養価を提供できるタンパク質または変異体を含むことができる。非限定的例には、栄養分吸収阻止因子の形成を阻害できる植物性タンパク質およびより望ましいアミノ酸組成物（例えば、非トランスジェニック植物より高いリシン含量）を有する植物性タンパク質が含まれる。
【０１１２】
Ｆ．このように作成された組成物の使用
所定の態様では、本開示は、組換え真菌細胞によって生成された関心対象のタンパク質を含む組成物であって、組換え真菌細胞が変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子を含む、および／または変異ヒスチジンキナーゼを発現できる組成物を提供する。この組成物は、好適には、本明細書に提供した方法を使用して生成される。本組成物は、本明細書に記載した方法を使用して発現させた、関心対象の遺伝子によってコードされた関心対象のタンパク質を含む。本組成物は、例えばバイオマス加水分解、クリーニング用途、穀物加工、動物栄養、食品組成物、織物処理などの様々な有用な工業用途において使用することができる。
【０１１３】
例えば、本開示の組換え宿主細胞によって、および／または本明細書に提供した方法または工程を使用して生成された組成物は、リグノセルロース系バイオマス加水分解において使用できる。世界最大の再生可能なバイオマス源であるリグノセルロースは、主として、リグニン、セルロースおよびその大部分がキシランであるヘミセルロースから構成される。リグノセルロース系供給原料からエタノールへの変換は、大量の供給原料の容易な入手可能性、材料の燃焼または埋立処分を回避できるという望ましさおよびエタノール燃料の清浄度という長所を有する。木材、農業残留物、草本作物および都市固形廃棄物は、エタノール製造のための供給原料であると見なされてきた。リグノセルロースがいったん発酵性糖、例えばグルコースに転換されると、発酵性糖は、酵母によって容易にエタノールに発酵させられる。セルロースは、β−１，４−結合によって共有結合された単糖であるグルコースのポリマーである。多数の微生物は、β結合グルカンを加水分解する酵素を生成する。これらの酵素には、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼおよびβ−グルコシダーゼが含まれる。キシランは、１，４−β−グルコシド結合Ｄ−キシロピラノースから形成された多糖である。キシラン（例えば、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、ＥＣ３．２．１．８）は、キシラン内の内部β−１，４−キシロシド結合を加水分解して、より低分子量のキシロースおよびキシロ−オリゴマーを生成する。本開示は、そのようなリグノセルロース系バイオマス使用にとっての関心対象の工業用酵素、変異体および混合物の生産菌として好適および有利である、改善されたタンパク質生成を証明した形質転換真菌細胞を提供する。
【０１１４】
また別の例では、本開示の組換え宿主細胞によって、および／または本明細書に提供した方法または工程を使用して生成された組成物は、クリーニング用途に使用できる。酵素的クリーニング成分は、それらが、さもなければ従来型の化学的洗剤によっては容易には除去されない汚れ、染みおよび他の砕片を分解する能力のために人気が高い。クリーニングのために有用な周知の酵素には、例えば、それぞれが一連の様々な機能性を提供するリパーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、さらに所定のセルラーゼさえなどの他の酵素とともに、プロテアーゼおよびアミラーゼが含まれる。プロテアーゼは、タンパク質をベースとする染みに有効である；アミラーゼは炭水化物やデンプンに働く；およびリパーゼは、例えば、脂質または脂肪を分解する。本開示は、クリーニング用途におけるそのような使用にとっての関心対象の工業用酵素、変異体および混合物の生産菌として好適および有利である、改善されたタンパク質生成を証明した形質転換真菌細胞を提供する。
【０１１５】
また別の例では、本開示の組換え宿主細胞によって、および／または本明細書に提供した方法または工程を使用して生成された組成物は、穀物加工において使用できる。デンプンは、植物自体ならびに微生物および高等生物によって使用される、植物における最も一般的な貯蔵炭水化物である。極めて様々な酵素がデンプン加水分解を触媒することができる。全ての植物源からのデンプンは穀物の形態で発生するが、植物源の種に依存して、デンプンは顕著に様々なサイズおよび物理的特徴で存在する。デンプンの酸加水分解は以前には広範に使用されていたが、この工程は、現在では、耐蝕性材料やその他の利点を必要とすることが少なく、加熱のために必要とするエネルギーが少なく、酸性工程よりも制御するのが相当に容易であることが知られている酵素的工程に取って代わられている。本開示は、例えばデンプン分解および穀粒加工におけるそのような使用にとっての関心対象の工業用酵素、変異体および混合物の生産菌として好適および有利である、改善されたタンパク質生成を証明した形質転換真菌細胞を提供する。
【０１１６】
また別の例では、本開示の組換え宿主細胞によって、および／または本明細書に提供した方法または工程を使用して生成された組成物は、食品用途において使用できる。細菌、酵母およびカビによって生成された酵素は、何千年にもわたり、例えばパン、チーズ、ビールおよびワインなどの食品を製造するために食品用途において使用されてきた。現在、酵素は、パン製造、チーズ製造、デンプン加工および果汁や他の飲料の製造において使用され、そのような改善された質感、外観および栄養価を提供し、所望の香味および芳香などを生成する。食品用酵素は、典型的には、動物および植物（例えば、デンプン消化酵素、アミラーゼは、発芽大麦種子から入手できる）ならびにある範囲の有益な微生物を起源とする。酵素は、多数の工程における合成化学物質に取って代わって、伝統的な化学物質に基づく技術にとっての実行可能で所望である代替品であると思われる。酵素は、エネルギー消費を減少させて、廃棄物または副生成物の生分解性を改善する、食品製造加工の環境的性能を改善することに役立つことができる。酵素は、それらの作用において合成化学物質よりも特異的である傾向があり、したがって、酵素的加工はより少ない副反応および廃棄物または副生成物を生じさせ、結果としてより高品質の生成物を生成して、汚染の可能性を減少させる傾向がある。酵素的加工は、唯一の可能な加工であることも多い。これの１つの例は、酵素であるペクチナーゼの使用に依存する透明リンゴ果汁濃縮液の製造にある。食品用酵素の大多数は、微生物、例えばバチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属またはクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属から生成される。本開示は、食品用途におけるそのような使用にとっての関心対象の工業用酵素、変異体および混合物の生産菌として好適および有利である、改善されたタンパク質生成を証明した形質転換真菌細胞を提供する。
【０１１７】
また別の例では、例えば、本開示の組換え宿主細胞によって、および／または本明細書に提供した方法または工程を使用して生成された組成物は、動物飼料添加物において使用できる。セルラーゼ、キシラナーゼ、β−グルカナーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、フィターゼおよび他のカルボヒドラーゼは、動物飼料工業において広範に使用されてきた。多数の植物をベースとする供給原料は動物の成長を低下させる栄養阻害因子を含む物質を含有するので、そのような供給原料に加えられる酵素は、繊維、タンパク質、デンプンおよびフィチン酸塩を分解し、それらを動物がより消化し易くし、肉、卵またはミルク生産性を最大化しながら、より安価で頻回に地元で製造される供給原料の使用を可能にすることによってこれらの栄養阻害因子の消化性を改善する。同時に、そのような供給原料に加えられる酵素は、さらに腸の健康および動物の性能強化を支持する利点を提供することもできる。本開示は、動物飼料用途におけるそのような使用にとっての関心対象の工業用酵素、変異体および混合物の生産菌として好適および有利である、改善されたタンパク質生成を証明した形質転換真菌細胞を提供する。
【０１１８】
さらになお別の例では、本開示の組換え宿主細胞によって、および／または本明細書に提供した方法または工程を使用して生成された組成物は、織物用途において使用できる。酵素は、織物加工の不可欠な部分になっている。織物工業においては、２つの明確に確立された酵素用途がある。第一に、例えばアミラーゼなどの酵素は、一般に湯通しのための予備仕上げ領域において使用される。第二に、例えばセルラーゼなどの酵素は、一般に、柔軟化、バイオストーン加工および綿製品のピリング傾向を低下させるための仕上げ領域で使用される。例えば、ペクチナーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼなどの他の酵素もまた織物加工において使用される。さらに、デニムや非デニムのフェーディング、バイオスカーリング、バイオポリッシング、ウール仕上げ、過酸化物除去、染料の脱色などに含まれた酵素を必要とする様々な用途がある（Ｃａｖａｃｏ−Ｐａｕｌｏ  Ａ  ａｎｄ  Ｇｕｅｂｉｔｚ  ＧＭ．Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，２００３，１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｃｈｅｌｉｋａｎｉ  Ｐ，Ｆｉｔａ  Ｉ，Ｌｏｅｗｅｎ  ＰＣ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．（２００４）６１：１９２−２０８；  Ｎａｌａｎｋｉｌｌｉ．Ｇ．，Ｃｏｌｏｕｒａｇｅ，１９９８，ＸＬＶ（１０），１７−１９；Ｓｈｅｎａｉ，Ｖ．Ａ．ａｎｄ  Ｓａｒａｆ，Ｎ．Ｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ，（１９９０），Ｖｏｌ．Ｘ．ＩＩ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）。本開示は、織物用途におけるそのような使用にとってのおよび関心対象の工業用酵素、変異体混合物の生産菌として好適および有利である、改善されたタンパク質生成を証明した形質転換真菌細胞を提供する。
【０１１９】
Ｇ．変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる真菌株を同定するためのスクリーニング法
また別の態様では、本開示は、親菌株に比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株を同定または選択するための方法であって、
（ａ）菌株を寒天プレートの表面上に浸透物質および／またはジカルボキシイミド系またはフェニルピロール系殺真菌剤とともに接種する工程；および
（ｂ）親菌株より迅速または緩徐に増殖する菌株を選択またはスクリーニングする工程を含む方法を提供する。
【０１２０】
一部の実施形態では、親（未変化）菌株と比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株は、親菌株と比較して外部浸透圧に対する変化した感受性または耐性を誘発する突然変異を含む。
【０１２１】
一部の実施形態では、親（未変化）菌株と比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株は、親菌株と比較してジカルボキシイミド系またはフェニルピロール系殺真菌剤に対する変化した感受性または耐性を誘発する突然変異を含む。
【０１２２】
一部の実施形態では、親（未変化）菌株と比較して変化したレベルの関心対象のタンパク質を生成できる組換え真菌株は、親菌株と比較して浸透圧に対する変化した感受性または耐性およびジカルボキシイミド系またはフェニルピロール系殺真菌剤に対する変化した感受性または耐性を誘発する突然変異を含む。
【０１２３】
このシグナル伝達経路の他の成分における突然変異もまた真菌株の生産性にとって有益な可能性があろうと考えられる。これらの成分には、制限なく、浸透圧に反応して他の遺伝子の発現を調節するＭＡＰキナーゼタンパク質および転写因子が含まれる。
【０１２４】
この経路における突然変異を含む菌株は、例えば、培地中の高レベルの浸透物質の存在下で、浸透圧ストレスに対する耐性または感受性についてスクリーニングすることによって同定できる。一般に、菌株は、例えば１つ以上の糖、糖アルコールまたは塩（例えば、グルコース、スクロース、フルクトース、オリゴフルクトース、フルクト−オリゴ糖、転化糖、ソルビトール、キシリトール、ガラクトシロソルビトール（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｏｓｏｒｂｉｔｏｌ）、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）のうちの１つまたは組み合わせであってよい様々なレベルの浸透物質とともに、個別コロニーが発生し、培養後には識別可能となるように、栄養寒天プレートの表面上に接種させられる。突然変異体の増殖は、有意に損傷した；突然変異体は、超分岐して膨潤した不規則な形状の菌糸の小集団を形成する傾向があった。これらの結果は、突然変異体が高浸透圧の条件下では輪郭のはっきりした菌糸体を形成できないことを示した。
【０１２５】
変化した感受性は、高浸透圧の条件下での親の非突然変異細胞（すなわち、高浸透圧に対して耐性）より速く増殖する能力として、または高浸透圧の条件下での親の非突然変異細胞（すなわち、高浸透圧に対して感受性）に比較して低下した増殖率として現れる可能性がある。
【０１２６】
親のタイプより迅速または緩徐に増殖する個別コロニーは、液中（液体培地）での同一条件下での増殖によるさらなる評価のために選別し、それらの全分泌タンパク質比生成率および供給糖に対する収率を比較した。この方法で、親菌株と比較して浸透圧に対する変化した感受性および増加した分泌タンパク質生成率を有する突然変異真菌株が同定される。
【実施例】
【０１２７】
本発明の菌株、組成物および方法の態様は、限定するものと見なすべきではない下記の実施例を考慮に入れると、より明確に理解することができる。材料および方法の改変は、当業者には明白であろう。
【０１２８】
実施例１
ｎｉｋ１遺伝子内に１つの突然変異を含む組換え真菌株を創出する
１．１．ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ遺伝子置換カセットの生成
遺伝子置換構築物は、ｎｉｋ１遺伝子座の上流の５’領域を含有する１つのＤＮＡ断片、ｌｏｘＰ−隣接ハイグロマイシンＢ耐性マーカーカセットならびにプロモーターおよびｎｉｋ１遺伝子を含有する２つのＤＮＡ断片（７４３位のアミノ酸をメチオニンからトレオニンに変化させるＴからＣへの置換を含む）を、２μの骨格含有酵母ベクターｐＲＳ４２６（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のｐＲＳ４２６ファージミド（ＡＴＣＣ（登録商標）７７１０７（商標））由来）を用いて融合させることによって作成した（図２）。
【０１２９】
下記のプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）によって調製された。
ＲＲａｂ８８（フォワード）−
５’−
ＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＧＣＣＴＡＧＧＴＧＧＣＴＴＴＧＡＧＣＧＧＴＧＴＴＧＡＴＧＴＧＴＡ−３’（配列番号２）、プラスミドｐＲＲａｂｎｉｋ１Ｍ７４３ＴのためのＡｖｒＩＩ制限部位およびベクター骨格末端突出部を備えるｎｉｋ１の上流のＤＮＡ配列（５’隣接）を増幅させるために使用された。
ＲＲａｂ８９（リバース）−５’−
ＴＡＣＡＣＡＴＣＡＡＣＡＣＣＧＣＴＣＡＡＡＧＣＣＡＣＣＴＡＧＧＣＣＣＴＧＧＣＧＴＴＡＣＣＣＡＡＣＴＴＡＡＴＣＧ−３’（配列番号３）、プラスミドｐＲＲａｂｎｉｋ１Ｍ７４３ＴのためのＡｖｒＩＩ制限部位および５’隣接末端突出部を備えるベクター骨格を増幅させるために使用された。
ＲＲａｂ９０（フォワード）−５’−
【化３】
2018504936.tif 000005
、プラスミドｐＲＲａｂｎｉｋ１Ｍ７４３ＴのためのＡｖｒＩＩ制限部位および３’隣接断片２末端突出部を備えるベクター骨格を増幅させるために使用された。
ＲＲａｂ９１（リバース）−５’−ＧＣＣＡＡＧＣＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＣＣＴＡＧＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＧＧＴＴＣＴＴＣＴＣＧＡＧＣＡＧ−３’（配列番号５）、プラスミドｐＲＲａｂｎｉｋ１Ｍ７４３ＴのためのＡｖｒＩＩ制限部位およびベクター骨格末端突出部を備えるｎｉｋ１  ＤＮＡ配列（３’隣接、断片２）を増幅させるために使用された。
ＲＲａｂ９２（フォワード）−５’−
【化４】
2018504936.tif 000006
、プラスミドｐＲＲａｂｎｉｋ１Ｍ７４３ＴのためのＳｗａＩ制限部位および５’隣接末端突出部と一緒にｌｏｘＰ部位を備えるハイグロマイシン耐性マーカーを増幅させるために使用された。
ＲＲａｂ９３（リバース）−５’−
【化５】
2018504936.tif 000007
、プラスミドｐＲＲａｂｎｉｋ１Ｍ７４３ＴのためのＳｗａＩ制限部位およびｈｐｈ＋ｌｏｘＰ部位末端突出部を備えるｎｉｋ１の上流のＤＮＡ配列（５’隣接）を増幅させるために使用された。
ＲＲａｂ９４（フォワード）−５’−
【化６】
2018504936.tif 000008
、プラスミドｐＲＲａｂｎｉｋ１Ｍ７４３ＴのためのＮｏｔＩ制限部位およびｈｐｈ＋ｌｏｘＰ部位末端突出部を備えるｎｉｋ１遺伝子（３’隣接断片１）を増幅させるために使用された。
ＲＲａｂ９５（リバース）−５’−
【化７】
2018504936.tif 000009
、プラスミドｐＲＲａｂｎｉｋ１Ｍ７４３ＴのためのＮｏｔＩ制限部位および３’隣接断片１末端突出部と一緒にｌｏｘＰ部位を備えるハイグロマイシン耐性マーカーを増幅させるために使用された。
ＲＲａｂ１１０（フォワード）−５’−ＧＡＡＡＴＴＧＣＣＴＣＣＧＴＣＡＣＡＡＣＡＧＣＣＧＴＣＧＣＴＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡ−３’（配列番号１０）、プラスミドｐＲＲａｂｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔのための３’隣接断片１突出部を備えるｎｉｋ１  ＤＮＡ配列（３’隣接断片２）を増幅させるために使用された。
ＲＲａｂ１１１（リバース）−５’−ＴＴＣＴＴＴＧＴＣＡＧＡＴＣＧＣＣＧＴＧＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＡＣＧＧＡＧＧＣＡＡＴＴＴＣ−３’（配列番号１１）、プラスミドｐＲＲａｂｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔのための３’隣接断片２突出部を備えるｎｉｋ１遺伝子（３’隣接断片１）を増幅させるために使用された。
【０１３０】
ＰＣＲ増幅は、ＰｆｕＵｌｔｒａＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＴｅｔｒａｄ  ２サーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して実施した。ＰＣＲ産物は、ＥＸゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）上で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して正確な長さの断片を精製した。４つのＤＮＡ断片のそれぞれは、組換えのために十分な長さの相同配列を提供するために隣接ＤＮＡ断片に相補的である５’プライマー伸長を有しており、全部が酵母の天然組換え機構を使用してサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株ＹＰＨ４９９（ＡＴＣＣ  ７６６２５）における最終構築物に組み換えられた。酵母形質転換のためには、Ｆｒｏｚｅｎ  ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。ウリジン栄養素要求性の相補性を選択するために、形質転換体をＳＤ−Ｕプレート上で平板培養した。Ｚｙｍｏｐｒｅｐ（商標）Ｙｅａｓｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してプラスミドＤＮＡを抽出するために、形質転換プレートからの個別コロニーを選択した。各Ｍｉｎｉｐｒｅｐから１μＬをＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学的コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）内に直接的に形質転換させ、カルベニシリンを含むＬＢプレート上で平板培養した。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してプラスミドＤＮＡを抽出するために形質転換プレートから個別コロニーを選択した。この方法で得られたＤＮＡは、Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）でシーケンシングされ、正確な配列を含むプラスミドがＤＮＡ増幅のために選択された。遺伝子置換カセットは、下記のプライマー：
ＲＲａｂ１５６（５’−ＴＧＧＣＴＴＴＧＡＧＣＧＧＴＧＴＴＧＡＴＧＴＧＴＡ−３’）（配列番号１２）；および
ＲＲａｂ１５７（５’−ＣＴＣＧＣＴＣＡＣＧＧＴＴＣＴＴＣＴＣＧＡＧＣＡＧ−３’）（配列番号１３）を使用してＰＣＲにより増幅させた。
【０１３１】
ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して精製および濃縮した。
【０１３２】
１．２．ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ対立遺伝子含有遺伝子置換カセットを用いたＲＬＰ３７宿主菌株の形質転換、候補選択、検証および特性解析
精製濃縮遺伝子置換カセットは、ＰＥＧ媒介性形質転換法（Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，６１（２）：１５５−６４（１９８７））を使用してＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主菌株ＲＬＰ３７内に形質転換させた（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６−５３（１９８４）によって記載された）。形質転換体は、１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含有するＶｏｇｅｌの培地（Ｖｏｇｅｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｕｌｌ．１３：４２−４３（１９５６）；Ｖｏｇｅｌ，Ａｍ．Ｎａｔ．９８：４３５−４４６（１９６４））上でオーバーレイ方式で平板培養し、２８℃でインキュベートした。ハイグロマイシンＢに耐性の安定性形質転換体由来のゲノムＤＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＰｌａｎｔＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用して抽出した。次に、天然ｎｉｋ１遺伝子座での遺伝子置換の相同組換えを確証するためにこのゲノムＤＮＡを診断的ＰＣＲのための鋳型として使用した。診断的ＰＣＲのために使用されたプライマー対ＲＲａｂ１１７およびＲＲａｂ１６７を下記に明記する。
ＲＲａｂ１１７（５’−ＣＧＡＡＣＴＧＴＧＡＣＣＴＴＴＣＡＡＧＴ−３’）（配列番号１４）；および
ＲＲａｂ１６７（５’−ＧＣＡＣＡＣＡＣＡＴＣＴＣＧＧＣＣＴＴＡ−３’）（配列番号１５）。
【０１３３】
ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ含有遺伝子置換カセットの検証された相同的組込みを含む菌株である標識ＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔを選択し、芽胞精製した。芽胞精製は、水中でのＰＤＡプレート培養上で生成された成熟気中分生子を収穫し、分生子懸濁液の１０倍連続希釈液を作成し、ＰＤＡプレート上で懸濁液の連続希釈液を平板培養し、それらを２８℃で一晩インキュベートすることによって実施した。選択した芽胞精製菌株は、タンパク質生成に遺伝子置換が及ぼす効果を決定するため、および残りの実験のために使用した。ＰＤＡプレート上のＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ菌株の表現型は、宿主ＲＬＰ３７菌株と比較して、より緩徐な増殖およびより低い分生子の収率から構成された（図３Ａおよび３Ｂ）。ソルビトールをＶｏｇｅｌの最少培地に加えた場合、この菌株のコロニー増殖はＲＬＰ３７と比較して制限されたが、これはソルビトールに対する感受性が浸透圧ストレスに対する反応を調節する能力がないことに起因する可能性が最も高いことを示した（図３Ｃおよび３Ｄ）。
【０１３４】
１．３．全タンパク質生成を評価するためのＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの発酵
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）菌株ＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３ＴおよびＲＬＰ３７を液中（液体培地）の同一条件下で増殖させ、それらの全タンパク質比生成率および供給糖に対する収率を２Ｌ（ＤＡＳＧＩＰ）および１４Ｌの発酵槽内で比較した。
【０１３５】
種培養を創出するために、２５０ｍＬフラスコ内の５０ｍＬのクエン酸最少培地に各菌株の芽胞を個別に加えた。この培養を振とう培養器内の３０℃および１７０ｒｐｍで４８時間にわたり増殖させた。４８時間後、１４５．６ｍＬの５０％グルコースおよびｐＨ３．５に調整した０．６ｇ／ｋｇのＣａＣｌ２に種培養を接種した。その後、温度を３０℃およびｐＨを３．５で維持した。その後にグルコース−ソホロース供給材料を導入すると、温度は２５℃に低下し、ｐＨは４．８に上昇した。
【０１３６】
乾燥細胞重量、全タンパク質濃度およびその他のパラメーターを計測し、全タンパク質比生成率および供給糖に対する収率を計算した。天然遺伝子座でｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ対立遺伝子を含有するＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ菌株は、天然ｎｉｋ１対立遺伝子を含有するＲＬＰ３７宿主に比較して、全タンパク質比生成率（図４Ａ）および供給糖に対する収率（図４Ｂ）の改善を示した。
【０１３７】
１４Ｌの発酵のためには、菌株ＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３ＴおよびＲＬＰ３７を液中（液体培地）の同一条件下で増殖させ、それらの全タンパク質生成率およびタンパク質比生成率もまた比較した。発酵作業は、同様に調製した種培養を使用して１４Ｌ発酵槽内で実施した。発酵後、全タンパク質生成率およびタンパク質比生成率を比較した。
【０１３８】
ＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ菌株は、全タンパク質比生成率の１０１％増加（図５Ａ）、および供給糖に対する収率における４６％改善（図５Ｂ）を証明したが、これは宿主Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株内へ改変ｎｉｋ１ヒスチジンキナーゼを導入する工程がタンパク質生成の増加を誘発することを示している。
【０１３９】
実施例２
ｎｉｋ１遺伝子欠失を含む真菌株を創出する
２．１．Δｎｉｋ１：：ｈｐｈ欠失カセットの設計および創出
遺伝子置換構築物は、ｎｉｋ１遺伝子の５’隣接を含有する１つのＤＮＡ断片、ｌｏｘＰ−隣接ハイグロマイシンＢ耐性マーカーカセットおよびｎｉｋ１遺伝子の３’隣接を含有する１つのＤＮＡ断片を、２μの骨格含有酵母ベクターｐＲＳ４２６（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のｐＲＳ４２６ファージミド（ＡＴＣＣ（登録商標）７７１０７（商標））由来）を用いて融合させることによって作成した（図６）。下記のプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）によって作成された。
ＲＲａｂ２６６（フォワード）−５’−
【化８】
2018504936.tif 000010
、プラスミドｐＲＲａｂΔｎｉｋ１のためのＳａｃＩ制限部位および５’隣接末端突出部と一緒にｌｏｘＰ部位を備えるハイグロマイシン耐性マーカーを増幅させるために使用された。
ＲＲａｂ２６７（リバース）−５’−
【化９】
2018504936.tif 000011
、プラスミドｐＲＲａｂΔｎｉｋ１のためのＳｅｘＡＩ制限部位および３’隣接末端突出部と一緒にｌｏｘＰ部位を備えるハイグロマイシン耐性マーカーを増幅させるために使用された。
ＲＲａｂ２６８（フォワード）−５’−
【化１０】
2018504936.tif 000012
、プラスミドｐＲＲａｂΔｎｉｋ１のためのＳｅｘＡＩ制限部位およびｈｐｈ＋ｌｏｘＰ部位末端突出部を備えるｎｉｋ１の下流のＤＮＡ配列（３’隣接）を増幅させるために使用された。
ＲＲａｂ２６９（リバース）−５’−
【化１１】
2018504936.tif 000013
、プラスミドｐＲＲａｂΔｎｉｋ１のためのＳｆｉＩ制限部位およびベクター骨格末端突出部を備えるｎｉｋ１の下流のＤＮＡ配列（３’隣接）を増幅させるために使用された。
ＲＲａｂ２７０（フォワード）−５’−
【化１２】
2018504936.tif 000014
、プラスミドｐＲＲａｂΔｎｉｋ１のためのＳｆｉＩ制限部位および３’隣接末端突出部を備えるベクター骨格を増幅させるために使用された。
ＲＲａｂ２７１（リバース）−５’−
【化１３】
2018504936.tif 000015
、プラスミドｐＲＲａｂΔｎｉｋ１のためのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位およびベクター骨格末端突出部を備えるｎｉｋ１の上流のＤＮＡ配列（５’隣接）を増幅させるために使用された。
ＲＲａｂ２７２（フォワード）−５’−
【化１４】
2018504936.tif 000016
、プラスミドｐＲＲａｂΔｎｉｋ１のためのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位およびベクター骨格末端突出部を備えるｎｉｋ１の上流のＤＮＡ配列（５’隣接）を増幅させるために使用された。
ＲＲａｂ２７３（リバース）−５’−
【化１５】
2018504936.tif 000017
、プラスミドｐＲＲａｂＤｅｌｔａ  ｎｉｋ１のためにＳａｃＩ制限部位およびｈｐｈ＋ｌｏｘＰ部位末端突出部を備えるｎｉｋ１の上流のＤＮＡ配列（５’隣接）を増幅させるために使用された。
【０１４０】
ＰＣＲ増幅は、ＰｆｕＵｌｔｒａＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＴｅｔｒａｄ  ２サーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して実施した。ＰＣＲ産物は、ＥＸゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）上で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して正確な長さの断片を精製した。４つのＤＮＡ断片のそれぞれは、組換えのために十分な長さの相同配列を提供するために隣接ＤＮＡ断片に相補的である５’プライマー伸長を有しており、全部が酵母の天然組換え機構を使用してサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株ＹＰＨ４９９（ＡＴＣＣ  ７６６２５）における最終構築物に組み換えられた。酵母形質転換のためには、Ｆｒｏｚｅｎ  ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。ウリジン栄養素要求性の相補性を選択するために、形質転換体をＳＤ−Ｕプレート上で平板培養した。Ｚｙｍｏｐｒｅｐ（商標）Ｙｅａｓｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してプラスミドＤＮＡを抽出するために、形質転換プレートからの個別コロニーを選択した。各Ｍｉｎｉｐｒｅｐから１μＬをＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学的コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）内に直接的に形質転換させ、カルベニシリンを含むＬＢプレート上で平板培養した。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してプラスミドＤＮＡを抽出するために形質転換プレートから個別コロニーを選択した。この方法で得られたＤＮＡは、Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）でシーケンシングし、ＤＮＡ増幅のために正確な配列を含むプラスミドを選択した。遺伝子欠失カセットは、プライマーＲＲａｂ  ２９６およびＲＲａｂ２９７を使用して増幅させた。
ＲＲａｂ２９６  （フォワード）５’−ＣＡＣＡＧＴＴＣＧＡＴＣＴＡＣＣＴＴＡＣＣＴＡＣＡ−３’（配列番号２４）
ＲＲａｂ２９７  （リバース）５’−ＧＣＴＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＣＴＧＴＡＡＡＧＴＡＣ−３’（配列番号２５）
【０１４１】
ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して精製および濃縮した。
【０１４２】
２．２．Δｎｉｋ１：：ｈｐｈ欠失カセットを用いたＲＬＰ３７宿主菌株の形質転換、候補選択、検証および特性解析
精製濃縮Δｎｉｋ１：：ｈｐｈカセットは、ＰＥＧ媒介性形質転換法を使用してＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主菌株ＲＬＰ３７内に形質転換させた（Ｐｅｎｔｔｉｌａ，Ｍ．，Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ，Ｈ．，Ｒａｔｔｏ，Ｍ．，Ｓａｌｍｉｎｅｎ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｊ．Ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｕｓ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ．Ｇｅｎｅ（１９８７）６１：１５５−１６４．）。形質転換体は、１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含有するＶｏｇｅｌの最少培地上でオーバーレイ方式で平板培養し、２８℃でインキュベートした。ハイグロマイシンＢに耐性の安定性形質転換体由来のゲノムＤＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＰｌａｎｔＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用して抽出した。次に、天然ｎｉｋ１遺伝子座での欠失カセットの相同組換えを確証するために、このゲノムＤＮＡを診断的ＰＣＲのための鋳型として使用した。
【０１４３】
Δｎｉｋ１：：ｈｐｈ欠失カセットの検証された相同的組込みを含む菌株である標識ＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔを選択し、芽胞精製した。芽胞精製は、水中でのＰＤＡプレート培養上で生成された成熟気中分生子を収穫し、分生子懸濁液の１０倍連続希釈液を作成し、ＰＤＡプレート上で懸濁液の連続希釈液を平板培養し、それらを２８℃で一晩インキュベートすることによって実施した。選択した芽胞精製菌株は、タンパク質生成に遺伝子置換が及ぼす効果を決定するため、および残りの実験のために使用した。ＰＤＡプレート上のＲＬＰ３７ΔＮｉｋ１菌株の表現型は、宿主ＲＬＰ３７菌株と比較して、より緩徐な増殖およびより低い分生子の収率から構成された（図３Ｂおよび３Ｅ）。ソルビトールをＶｏｇｅｌの最少培地に加えた場合、この菌株のコロニー増殖は菌株ＲＬＰ３７と比較して制限されたが、これはソルビトールに対する感受性が浸透圧ストレスに対する反応を調節する能力がないことに起因する可能性が高いことを示した（図３Ｄおよび３Ｆ）。
【０１４４】
２．３．全タンパク質生成を評価するためのＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＲＬＰ３７Δｎｉｋ１の発酵
ＲＬＰ３７宿主菌株およびＲＬＰ３７ΔＮｉｋ１菌株を全タンパク質生成率および供給糖に対する収率について２ＬのＤＡＳＧＩＰ発酵槽内で試験した。種培養および発酵手技は、上記の実施例１に記載した同一方法にしたがって実施した。
【０１４５】
乾燥細胞重量、全タンパク質濃度およびその他のパラメーターを計測し、全タンパク質比生成率および供給糖に対する収率を計算した。ＲＬＰ３７コントロール菌株と比較して、菌株ＲＬＰ３７ΔＮｉｋ１の全タンパク質生成率は８５％、供給糖に対する収率は３９％減少した。これは、ｎｉｋ１遺伝子の欠失が全タンパク質生成にとって有害であることを示しており、天然ｎｉｋ１対立遺伝子とｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ対立遺伝子との置換と同一の効果を有していないことを示している。これはさらに、ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ対立遺伝子が機能獲得表現型を生じさせる機能獲得対立遺伝子であることを示している（図７）。
【０１４６】
実施例３
関心対象のセルラーゼの発現宿主としての組換え真菌株
３．１．ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ対立遺伝子含有遺伝子置換カセットを用いたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主菌株の形質転換、候補選択、検証および特性解析
実施例１．１に記載した精製濃縮遺伝子置換カセットは、ＰＥＧ媒介性形質転換法を使用して、ＣＢＨ１を過剰発現するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主菌株内に形質転換させた（Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，６１（２）：１５５−６４（１９８７））。形質転換体は、３０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含有するＶｏｇｅｌの最少培地上でオーバーレイ方式で平板培養し、２８℃でインキュベートした。１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢに耐性の安定性形質転換体由来のゲノムＤＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＰｌａｎｔＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用して抽出した。次に、天然ｎｉｋ１遺伝子座での遺伝子置換の相同組換えを確証するために、このゲノムＤＮＡを診断的ＰＣＲのための鋳型として使用した。プライマー対ＲＲａｂ１１７（配列番号１４）およびＲＲａｂ１６７（配列番号１５）を診断的ＰＣＲのために使用した。
【０１４７】
ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ含有遺伝子置換カセットの検証された相同的組込みを備える菌株である標識ＣｂｈＩ  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔを選択し、芽胞精製した。芽胞精製は、水中でのＰＤＡプレート培養上で生成された成熟気中分生子を収穫し、分生子懸濁液の１０倍連続希釈液を作成し、ＰＤＡプレート上で懸濁液の連続希釈液を平板培養し、それらを２８℃で一晩インキュベートすることによって実施した。選択した芽胞精製菌株は、タンパク質生成に遺伝子置換が及ぼす効果を決定するため、および残りの実験のために使用した。
【０１４８】
ソルビトールをＶｏｇｅｌの最少培地に加えた場合、ＣｂｈＩ  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ菌株のコロニー増殖は制限されたが、これはソルビトールに対する感受性が浸透圧ストレスに対する反応を調節する能力がないことに起因する可能性が高いことを示した（図８Ｅ〜８Ｈ）。天然ｎｉｋ１ＷＴは、ＣＢＨ１セルラーゼ（ＮｏＣｂｈ１）を過剰発現しないＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株内のｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ対立遺伝子と置換された。これはソルビトールに対する同一反応を示し、ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔがこの反応の原因であることを確証した（図８Ａ〜８Ｄ）。
【０１４９】
３．２．全タンパク質生成を評価するためのＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｃｂｈ１  ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの発酵
上述のトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１過剰発現菌株およびトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｃｂｈ１  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔは、液中（液体）培地中の同一条件下で増殖させた。各全タンパク質比生成率および供給糖に対する収率を、２Ｌ（ＤＡＳＧＩＰ）および１４Ｌスケールの発酵槽内で比較した。
【０１５０】
種培養を創出するために、２５０ｍＬフラスコ内の５０ｍＬのクエン酸最少培地に各菌株の芽胞を個別に加えた。この培養を振とう培養器内の３０℃および１７０ｒｐｍで４８時間にわたり増殖させた。４８時間後、１４５．６ｍＬの５０％グルコースおよびｐＨ３．５に調整した０．６ｇ／ｋｇのＣａＣｌ２に種培養を接種した。その後、温度を３２℃、およびｐＨを３．５で維持した。その後にグルコース−ソホロース供給材料を導入すると、温度は２８℃に低下し、ｐＨは４．５に上昇した。
【０１５１】
乾燥細胞重量、全タンパク質濃度およびその他のパラメーターを計測し、全タンパク質比生成率および供給糖類に対する収率を計算した。Ｃｂｈ１  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ菌株は、菌株Ｃｂｈ１に比して、全タンパク質比生成率における１９％の改善および供給糖に対する収率の４６％の改善を証明した（図９）。
【０１５２】
１４Ｌの発酵のためには、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｃｂｈ１菌株およびトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｃｂｈ１  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔを液中（液体培地）の同一条件下で増殖させ、それらの全タンパク質生成率およびタンパク質比生成率を比較した。発酵作業は、同様に調製した種培養を使用して１４Ｌ発酵槽内で実施した。発酵後、全タンパク質生成率およびタンパク質比生成率を比較した。
【０１５３】
Ｃｂｈ１  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ菌株は、Ｃｂｈ１菌株に比して、全タンパク質比生成率の３０％の増加（図１０Ａ）、および供給糖に対する収率における２０％の改善（図１０Ｂ）を証明したが、これは宿主Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１過剰発現菌株内へ改変ｎｉｋ１ヒスチジンキナーゼを導入する工程がタンパク質生成の増加を誘発することを示している。
【０１５４】
実施例４
Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主内のｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ対立遺伝子のｎｉｋ１ｗｔ対立遺伝子との置換による機能獲得表現型の復帰
４．１．ｎｉｋ１ＷＴ遺伝子置換カセットの設計および創出
遺伝子置換構築物は、ｎｉｋ１遺伝子座の上流の５’領域を含有する１つのＤＮＡ断片、ｌｏｘＰ−隣接ハイグロマイシンＢ耐性マーカーカセットならびにプロモーターおよびｎｉｋ１野生型遺伝子を含有する１つのＤＮＡ断片を、２μの骨格含有酵母ベクターｐＲＳ４２６（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のｐＲＳ４２６ファージミド（ＡＴＣＣ（登録商標）７７１０７（商標））由来）を用いて融合させることによって作成した（図１１）。
【０１５５】
プライマー対ＲＲａｂ８８（配列番号２）およびＲＲａｂ８９（配列番号３）；ＲＲａｂ９０（配列番号４）およびＲＲａｂ９１（配列番号５）；ＲＲａｂ９２（配列番号６）およびＲＲａｂ９３（配列番号７）；ＲＲａｂ９４（配列番号８）およびＲＲａｂ９５（配列番号９）；ＲＲａｂ１１０（配列番号１０）およびＲＲａｂ１１１（配列番号１１）を使用して、（上記の実施例１．１に記載した）ＤＮＡ断片を増幅させた。
【０１５６】
ＰＣＲ増幅は、ＰｆｕＵｌｔｒａＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＴｅｔｒａｄ  ２サーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して実施した。ＰＣＲ産物は、ＥＸゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）上で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して正確な長さの断片を精製した。４つのＤＮＡ断片のそれぞれは、組換えのために十分な長さの相同配列を提供するために隣接ＤＮＡ断片に相補的である５’プライマー伸長を有しており、全部が酵母の天然組換え機構を使用してサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株ＹＰＨ４９９（ＡＴＣＣ  ７６６２５）における最終構築物に組み換えられた。酵母形質転換のためには、Ｆｒｏｚｅｎ  ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。ウリジン栄養素要求性の相補性を選択するために、形質転換体をＳＤ−Ｕプレート上で平板培養した。Ｚｙｍｏｐｒｅｐ（商標）Ｙｅａｓｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してプラスミドＤＮＡを抽出するために、形質転換プレートからの個別コロニーを選択した。
【０１５７】
各Ｍｉｎｉｐｒｅｐから１μＬをＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学的コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）内に直接的に形質転換させ、カルベニシリンを含むＬＢプレート上で平板培養した。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してプラスミドＤＮＡを抽出するために、形質転換プレートから個別コロニーを選択した。この方法で得られたＤＮＡは、Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）でシーケンシングし、ＤＮＡ増幅のために正確な配列を含むプラスミドを選択した。遺伝子置換カセットは、プライマーＲＲａ１５６（配列番号１２）およびＲＲａｂ１５７（配列番号１３）を使用して増幅させ、ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して精製および濃縮した。
【０１５８】
４．２．ｎｉｋ１ＷＴ対立遺伝子含有遺伝子置換カセットを用いたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株ＴＲ  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの形質転換、候補選択、検証および特性解析
精製濃縮ｎｉｋ１ＷＴ含有遺伝子置換カセットは、ＰＥＧ媒介性形質転換法を使用して、天然ｎｉｋ１遺伝子座でｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔを含有するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＴＲ  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ宿主菌株内に形質転換させた（Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，６１（２）：１５５−６４（１９８７））。ＴＲ  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ宿主菌株は、菌株ＲＬＰ３７に由来した。形質転換体は、３０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含有するＶｏｇｅｌの最少培地（Ｖｏｇｅｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｕｌｌ．１３：４２−４３（１９５６）；Ｖｏｇｅｌ，Ａｍ．Ｎａｔ．９８：４３５−４４６（１９６４））上でオーバーレイ方式で平板培養し、２８℃でインキュベートした。１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢに耐性の安定性形質転換体由来のゲノムＤＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＰｌａｎｔＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用して抽出した。次に、天然ｎｉｋ１遺伝子座での遺伝子置換の相同組換えを確証するために、このゲノムＤＮＡを診断的ＰＣＲのための鋳型として使用した。プライマー対ＲＲａｂ１１７（配列番号１４）およびＲＲａｂ１６７（配列番号１５）を診断的ＰＣＲのために使用した。
【０１５９】
天然ｎｉｋ１遺伝子座でのｎｉｋ１ＷＴ含有遺伝子置換カセットの検証された相同的組込みを含む菌株である標識ＴＲ  Ｎｉｋ１ＷＴを選択し、芽胞精製した。芽胞精製は、水中でのＰＤＡプレート培養上で生成された成熟気中分生子を収穫し、分生子懸濁液の１０倍連続希釈液を作成し、ＰＤＡプレート上で懸濁液の連続希釈液を平板培養し、それらを２８℃で一晩インキュベートすることによって実施した。選択した芽胞精製菌株は、タンパク質生成に遺伝子置換が及ぼす効果を決定するため、および残りの実験のために使用した。Ｖｏｇｅｌの最少培地プレート上のＴＲ  Ｎｉｋ１ＷＴ菌株の表現型は、ＴＲ  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ菌株と比較して、より迅速な増殖およびより高い分生子の収率から構成された（図８Ｉおよび８Ｊ）。
【０１６０】
ソルビトールをＶｏｇｅｌの最少培地に加えた場合、この菌株のコロニー増殖はＴＲ  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔと比較して制限されなかったが、これはソルビトールに対する感受性が浸透圧ストレスに対する反応を調節する能力がないことに起因する可能性があることを示した（図８Ｋおよび８Ｌ）。
【０１６１】
４．３．全タンパク質生成を評価するためのＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｎｉｋ１ＷＴの発酵
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）菌株ＴＲ  Ｎｉｋ１ＷＴおよびＴＲ  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔを液中（液体）培地の同一条件下で増殖させ、それらの全タンパク質比生成率および供給糖に対する収率を２Ｌ（ＤＡＳＧＩＰ）の発酵槽内で比較した。
【０１６２】
種培養を創出するために、２５０ｍＬフラスコ内の５０ｍＬのクエン酸最少培地に各菌株の芽胞を個別に加えた。この培養を振とう培養器内の３０℃および１７０ｒｐｍで４８時間にわたり増殖させた。４８時間後、１４５．６ｍＬの５０％グルコースおよびｐＨ３．５に調整した０．６ｇ／ｋｇのＣａＣｌ２に種培養を接種した。その後、温度を３０℃およびｐＨを３．５で維持した。その後にグルコース−ソホロース供給材料を導入すると、温度は２５℃に低下し、ｐＨは４．８に上昇した。
【０１６３】
乾燥細胞重量、全タンパク質濃度およびその他のパラメーターを計測し、全タンパク質比生成率および供給糖の収率を計算した。天然ｎｉｋ１遺伝子座でｎｉｋ１ＷＴ対立遺伝子を含有するＴＲ  Ｎｉｋ１ＷＴ菌株は、ｎｉｋ１遺伝子座でｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ対立遺伝子を含有するＴＲ  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ菌株に比較して、全タンパク質比生成率の３６％減少および供給糖に対する収率の２９％減少を示した（図１２）。これは、ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ対立遺伝子と天然ｎｉｋ１ＷＴ対立遺伝子との置換が機能獲得表現型を野生型表現型に復帰させることを証明し、ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ対立遺伝子単独が改善された全タンパク質生成率および供給糖に対する収率の原因であることを確証した。
【０１６４】
実施例５
浸透圧感受性または耐性についてのスクリーニングおよび改善された分泌タンパク質生産性
１集団のトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）突然変異細胞を創出するためには任意の方法を使用できる。例えば、分生子は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の菌株から入手して、ＵＶ照射、Ｘ線照射、γ線照射または例えばＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）またはＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）などの突然変異誘発剤を用いる化学的突然変異誘発法を用いる処理にかけた（Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｈ．ａｎｄ  Ｄｅ  Ｓｅｒｒｅｓ，Ｆ．Ｊ．（１９７０）Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ．Ｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ１７Ａ．Ｅｄｓ．Ｔａｂｏｒ，Ｈ．ａｎｄ  Ｔａｂｏｒ，Ｃ．Ｗ．ｐｐ７９−１４３）。または、自然突然変異に依存することができる。さらに、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換による挿入突然変異誘発法などの突然変異誘発の分子生物学的方法を使用することができる（Ｓｕｇｕｉ，Ｊ．Ａ．，Ｃｈａｎｇ，Ｙ．Ｃ．ａｎｄ  Ｋｗｏｎ−Ｃｈｕｎｇ，Ｋ．Ｊ．（２００５）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：１７９８−１７８０２）。
【０１６５】
突然変異細胞の集団は、高浸透圧に対する変化した感受性を備える突然変異細胞を同定するためのスクリーニングにかける。変化した感受性は、高浸透圧の条件下で親の非突然変異細胞より迅速に増殖する能力（すなわち、高浸透圧に対する耐性）または高浸透圧の条件下で親の非突然変異細胞に比較して減少した増殖率（すなわち、高浸透圧に対する感受性）として現れる可能性がある。
【０１６６】
高浸透圧に対する変化した感受性についてスクリーニングするために、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞は、個別コロニーが発生し、培養後に識別できるように、様々なレベルの添加された糖、糖アルコールまたは塩を含む栄養寒天プレートの表面に接種する。栄養寒天は、グルコースを含むＶｏｇｅｌの最少培地である（Ｖｏｇｅｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｕｌｌ．１３：４２−４３（１９５６）；Ｖｏｇｅｌ，Ａｍ．Ｎａｔ．９８：４３５−４４６（１９６４））。この培地に、１Ｍ〜１．２Ｍのソルビトール、または０．７Ｍ〜１．４Ｍの塩化ナトリウム、または０．５Ｍ〜１．４Ｍの塩化カリウムが補給されている。親のタイプより迅速または緩徐に増殖する個別コロニーは、液中（液体培地）での同一条件下での増殖ならびに比較したそれらの全分泌タンパク質比生成率および供給糖に対する収率によるさらなる評価のために選別した。この方法で、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の突然変異菌株は、親菌株と比較して浸透圧に対する変化した感受性および増加した分泌タンパク質生成率を有すると同定される。
【０１６７】
実施例６
殺真菌剤に対する耐性および改善された分泌タンパク質生産性についてのスクリーニングまたは選択
１集団のトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）突然変異細胞を創出するためには任意の方法を使用できる。例えば、分生子は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の菌株から入手して、ＵＶ照射、Ｘ線照射、γ線照射または例えばＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）またはＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）などの突然変異誘発剤を用いる化学的突然変異誘発法を用いる処理にかけた（Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｈ．ａｎｄ  Ｄｅ  Ｓｅｒｒｅｓ，Ｆ．Ｊ．（１９７０）Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ．Ｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ１７Ａ．Ｅｄｓ．Ｔａｂｏｒ，Ｈ．ａｎｄ  Ｔａｂｏｒ，Ｃ．Ｗ．ｐｐ７９−１４３）。または、自然突然変異に依存することができる。さらに、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換による挿入突然変異誘発法などの突然変異誘発の分子生物学的方法を使用することができる（Ｓｕｇｕｉ，Ｊ．Ａ．，Ｃｈａｎｇ，Ｙ．Ｃ．ａｎｄ  Ｋｗｏｎ−Ｃｈｕｎｇ，Ｋ．Ｊ．（２００５）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：１７９８−１７８０２）。
【０１６８】
突然変異細胞の集団は、さらに、培地中の例えばイプロジオンまたはフルジオキソニルなどのジカルボキシイミド系およびフェニルピロール系殺真菌剤に対する変化した感受性を備える突然変異細胞を同定するためのスクリーニングにかけることもできる。変化した感受性は、殺真菌剤の存在下で親の非突然変異細胞より迅速に増殖する能力（すなわち、殺真菌剤に対する耐性）または殺真菌剤の存在下で親の非突然変異細胞に比較して減少した増殖率（すなわち、殺真菌剤に対する感受性）として現れる可能性がある。
【０１６９】
イプロジオンまたはフルジオキソニルに対する耐性を選択するために、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞は、個別コロニーが発生し、培養後に識別できるように、様々なレベルのこれらの殺真菌剤を含む栄養寒天プレートの表面に接種する。栄養寒天は、グルコースを含むＶｏｇｅｌの最少培地である（Ｖｏｇｅｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｕｌｌ．１３：４２−４３（１９５６）；Ｖｏｇｅｌ，Ａｍ．Ｎａｔ．９８：４３５−４４６（１９６４））。親のタイプより迅速に増殖する個別コロニーは、液中（液体培地）での同一条件下での増殖によるさらなる評価のために選別し、それらの全分泌タンパク質比生成率および供給糖に対する収率を比較した。この方法で、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の突然変異菌株は、イプロジオンもしくはフルジオキソニルに対して耐性であり、親菌株と比較して増加した分泌タンパク質生成率を有すると同定される。
【０１７０】
液体培地殺真菌剤スクリーンにおいて使用するために、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株ＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ由来の分生子を収穫し、１０，０００／ｍＬの濃度に希釈した。同等数の芽胞を０、１１．２５、２２．５、４５もしくは９０μＭのイプロジオンもしくはフルジオキソニルを含有する液体ＹＥＧ培地（５ｇ／Ｌの酵母抽出物、２２ｇ／Ｌのグルコース、Ｈ２Ｏ）内に接種し、２８℃で一晩発芽させた。ＲＬＰ３７分生子は、イプロジオンもしくはフルジオキソニルを含有しない培地中で発芽して伸長した菌糸を生成した。１１．２５μＭのイプロジオンもしくはフルジオキソニルでは、この菌株の発芽は明白であったが、菌糸成長については明白な阻害が見られた。イプロジオンまたはフルジオキソニルの上記の１１．２５μＭの濃度では、菌株ＲＬＰ３７を用いた発芽および増殖の完全な阻害が生じた。これとは対照的に、ＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ分生子は、試験したイプロジオンまたはフルジオキソニルの全濃度で発芽して伸長した菌糸を生成した。これは明白に、Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ突然変異が殺真菌剤イプロジオンおよびフルジオキソニルに対する耐性を付与することを証明した。さらに、ＲＬＰ３７の感受性およびＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔの耐性は、接種培養が芽胞１０７個／ｍＬまで拡大された場合に持続した。
【０１７１】
寒天（固体）培地中の殺真菌剤スクリーニングまたは選択に使用するために、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株ＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ由来の分生子を収穫し、グルコースを含む栄養寒天Ｖｏｇｅｌの最少培地を含有する１０ｃｍプレート当たりに公知の数の芽胞を平板培養するような濃度に希釈した（Ｖｏｇｅｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｕｌｌ．１３：４２−４３（１９５６）；Ｖｏｇｅｌ，Ａｍ．Ｎａｔ．９８：４３５−４４６（１９６４））。各菌株の同等数の芽胞は、０、１１．２５、２２．５、４５または９０μＭのイプロジオンを含有する栄養寒天プレートの表面上に塗り広げ、３２℃で３日間にわたり増殖させた。１１．２５および２２．５μＭでは、ＲＬＰ３７コロニーはピン先のサイズより大きく増殖することはできなかった。４５μＭ以上では、ＲＬＰ３７コロニーは全く増殖できなかった。これとは対照的に、ＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔコロニーは、イプロジオンを含まない栄養寒天プレートの表面上で増殖するコロニーと同様に増殖した。これは明白に、ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ突然変異が固体寒天培地中でイプロジオンに対する耐性を付与することを証明した（図１３）。野生型ｎｉｋ１を含有する細胞の大集団においては余り発生しないｎｉｋ１突然変異体を選択する際のイプロジオンの感受性を確立するために、公知の数のＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ芽胞（芽胞５個まで減らして）を公知の、はるかに多数（１０５〜１０８）のＲＬＰ３７に混合した。この混合集団の芽胞を４５μＭのイプロジオンを含有するＶｏｇｅｌの最少培地上に塗り広げ、３２℃で３日間増殖させた。コロニーを計数し、ＰＣＲおよびシーケンシング（Ｓｅｑｕｅｎｔｅｃｈ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）によってｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ突然変異の存在について、下記のプライマー：
ＲＲａｂ１２６（フォワード）５’−ＣＧＧＣＡＴＧＧＣＣＡＴＧＡＡＣＣＴＣＡ−３’（配列番号４０）
ＲＲａｂ１６１（リバース）５’−ＧＣＡＣＴＧＡＡＧＣＣＧＧＴＴＡＧＴＴＣ−３’（配列番号４１）
ＲＲａｂ１２８（フォワード）５’−ＣＴＧＴＣＣＡＧＣＴＴＣＴＧＣＴＡＣＧＡ−３’（配列番号４２）を使用して評価した。
【０１７２】
４５μＭのイプロジオン上の選択的平板培養は、野生型芽胞１０６個中５個という少数の突然変異体を検出するために十分感受性である。１０ｃｍプレート当たり１０６個より多い芽胞を平板培養すると、高い偽陽性率が発生する。
【０１７３】
ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ突然変異はソルビトール感受性ならびにイプロジオン耐性を付与するので、非ソルビトール感受性芽胞の欠失は、所望の特徴を備えるｎｉｋ１突然変異体を富化する可能性がある。ＲＬＰ３７およびＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔは、１．２Ｍのソルビトールを含有するＹＥＧ中において２８℃で一晩増殖させ、その後に４層のＭｉｒａｃｌｏｔｈ（ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）に通して濾過し、その後に４５μＭのイプロジオンを含有するＶｏｇｅｌの最少培地寒天上で公知の数の芽胞を平板培養した。Ｍｉｒａｃｌｏｔｈによる濾過は、未濾過ＲＬＰ３７と比較してＲＬＰ３７コロニー数の９８％減少を生じさせた。これとは対照的に、濾過後ＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔについては２〜８％の減少しか観察されなかった。しかし、＞９０％のＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ芽胞はＭｉｒａｃｌｏｔｈフィルターを通過したが、プレート上で回収することができたのは濾過されたＲＬＰ３７  Ｎｉｋ１Ｍ７４３Ｔ芽胞のたった１〜２％に過ぎなかった。ｎｉｋ１における自然突然変異の頻度に依存して、この欠失法は、イプロジオンを含有する寒天プレート上での選択前に利点を付与することができる。十分な突然変異体が蓄積すると、ソルビトール欠失が大多数の突然変異体を排除する可能性はあるが、ソルビトール下で発芽する野生型胞子の濾過から擬陽性の減少も生じるので、このため潜在的スループットが増加する。ソルビトール感受性およびジカルボキシイミド系殺真菌剤耐性はどちらもタンパク質生産性における所望の結果に関連する特徴であるので、ソルビトール欠失法を殺真菌剤プレート上の選択と組み合わせることによって、スループットの潜在的増加は所望の比生産性を備える自然突然変異体を同定する機会を改善することができる。
【０１７４】
殺真菌剤耐性を有する自然突然変異した細胞を選択するために、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株ＲＬＰ３７由来の分生子を収穫し、４５μＭのイプロジオンを含有する各栄養寒天プレートの表面上に１０６個の芽胞を塗り広げた。栄養寒天は、グルコースを含むＶｏｇｅｌの最少培地である（Ｖｏｇｅｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｕｌｌ．１３：４２−４３（１９５６）；Ｖｏｇｅｌ，Ａｍ．Ｎａｔ．９８：４３５−４４６（１９６４））。増殖した個別コロニーは、ｎｉｋ１遺伝子座のシーケンシングによって詳細に評価するために選定した。殺真菌剤に耐性のコロニーは、ｎｉｋ１のコーディング領域内に少なくとも１つの突然変異を含有していた。この方法によって、ｎｉｋ１内に突然変異を含有するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のイプロジオン耐性突然変異菌株を入手した。
【０１７５】
実施例７
ｎｉｋ１遺伝子内に１つの突然変異を含む組換えアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）菌株を創出する
７．１．ｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔ遺伝子置換カセットの生成
遺伝子置換構築物は、ｎｉｋ１遺伝子座の上流の５’領域を含有する１つのＤＮＡ断片、ｐｙｒＧマーカーカセットならびにプロモーターおよびｎｉｋ１遺伝子を含有する３つのＤＮＡ断片（７８６位のアミノ酸をメチオニンからトレオニンに変化させるＴからＣへの置換を含む）を、２μの骨格含有酵母ベクターｐＲＳ４２６（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のｐＲＳ４２６ファージミド（ＡＴＣＣ（登録商標）７７１０７（商標））由来）を用いて融合させることによって作成した（図１４）。
【０１７６】
下記のプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）によって調製された：
ＲＮ０２８６（フォワード）−５’−ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＧＡＣＴＴＧＧＧＧＴＴＧ−３’（配列番号２６）、プラスミドｐＲＮｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔのためのｎｉｋ１の上流のＤＮＡ断片（５’隣接）を増幅させるために使用され、ベクター骨格末端突出部を含有する。
ＲＮ０５０８（リバース）−５’−ＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＧＣＣＣＡＧＴＡＣＴＡＧＡＴＡＧＡＴＡＣＣＴＧ−３’（配列番号２７）、プラスミドｐＲＮｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔのためのｎｉｋ１の上流のＤＮＡ断片（５’断片）を増幅させるために使用され、ｐｙｒＧマーカーカセット末端突出部を含有する。
ＲＮ０４２８（フォワード）−５’−ＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＣＣ−３’（配列番号２８）、プラスミドｐＲＮｎｉｋ１Ｍ７８６ＴのためのｐｙｒＧマーカーカセットを増幅させるために使用された。
ＲＮ０１７２（リバース）−５’−ＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴ−３’（配列番号２９）、プラスミドｐＲＮｎｉｋ１Ｍ７８６ＴのためのｐｙｒＧマーカーカセットを増幅させるために使用された。
ＲＮ０５０９（フォワード）−５’−ＧＡＴＡＡＧＧＧＡＣＧＧＴＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＧＧＡＴＴＴＧＣＴＧＣＣＡＧＣＴＴＴＡＣ−３’（配列番号３０）、プラスミドｐＲＮｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔのためのｎｉｋ１およびｎｉｋ１の５’末端の上流のＤＮＡ配列（３’断片１）を増幅させるために使用され、ｐｙｒＧカセット末端突出部を含有する。
ＲＮ４８９（リバース）−５’−ＣＴＴＣＡＡＣＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＣＴＣＣ−３’（配列番号３１）、プラスミドｐＲＮｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔのためのｎｉｋ１およびｎｉｋ１の５’末端の上流のＤＮＡ配列（３’断片１）を増幅させるために使用された。
ＲＮ０４９５（フォワード）−５’−ＣＡＣＧＧＴＴＡＣＣＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧ−３’（配列番号３２）、プラスミドｐＲＮｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔのためのｎｉｋ１（３’断片２）を増幅させるために使用された。
ＲＮ０４９８（リバース）−５’−ＣＣＡＡＴＧＡＴＡＣＣＧＴＴＣＧＴＧＧＧＣＧＴＣＣＧＧＡＴＣＴＣＧ−３’（配列番号３３）、プラスミドｐＲＮｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔのためのｎｉｋ１（３’断片２）を増幅させ、Ｍ７８６Ｔ突然変異を組み込むために使用された。
ＲＮ０１６１（フォワード）−５’−ＣＣＧＧＡＣＧＣＣＣＡＣＧＡＡＣＧＧＴＡＴＣＡＴＴＧＧＴＡＴＧＡＣＧＣＡＧＴＴＧＡＣ−３’（配列番号３４）、プラスミドｐＲＮｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔのためのｎｉｋ１（３’断片３）を増幅させ、Ｍ７８６Ｔ突然変異を組み込むために使用された。
ＲＮ０１８２（リバース）−５’−ＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＧＴＧＣＡＴＴＴＣＡＣＣＡＣＴＡＣＴＴＧＡＧ−３’（配列番号３５）、プラスミドｐＲＮｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔのためのｎｉｋ１（３’断片３）を増幅させるために使用され、ベクター骨格突出部を含有する。
【０１７７】
ＰＣＲ増幅は、ＰｆｕＵｌｔｒａＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＴｅｔｒａｄ  ２サーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して実施した。ＰＣＲ産物は、Ｅ−ｇｅｌｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）上で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎキットまたはＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して正確な長さの断片を精製した。ベクター骨格はＢａｍＨＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いる消化により線形化し、その後にアルカリホスファターゼによる脱リン酸化（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）およびＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを使用する精製を実施した。
【０１７８】
５つのＤＮＡ断片のそれぞれは、組換えのために十分な長さの相同配列を提供するために隣接ＤＮＡ断片に重複する両端上に配列を含有しており、全部が酵母の天然組換え機構を使用してサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株ＹＰＨ４９９（ＡＴＣＣ  ７６６２５）における最終構築物に組み換えられた。酵母形質転換のためには、Ｆｒｏｚｅｎ  ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。ウリジン栄養素要求性の相補性を選択するために、形質転換体をＳＤ−Ｕプレート上で平板培養した。形質転換プレートからの個別コロニーは、Ｚｙｍｏｐｒｅｐ（商標）Ｙｅａｓｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＩＩキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してプラスミドＤＮＡを抽出するために選択した。各Ｍｉｎｉｐｒｅｐから１μＬをＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学的コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）内に直接的に形質転換させ、カルベニシリンを含むＬＢプレート上で平板培養した。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してプラスミドＤＮＡを抽出するために形質転換プレートから個別コロニーを選択した。この方法で得られたＤＮＡは、Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）でシーケンシングし、正確な配列は、ＳｎａＢＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いた制限消化により線形化し、その後にアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）による脱リン酸化を実施した。生じた遺伝子置換カセットは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）またはエタノール沈降法を使用して精製した。
【０１７９】
７．２．ｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔ対立遺伝子含有遺伝子置換カセットを用いたＧＩＣＣ２０７１宿主菌株の形質転換、候補選択、検証および特性解析
精製濃縮遺伝子置換カセットは、ＰＥＧ媒介性形質転換法を使用して、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主菌株ＧＩＣＣ２０７１（それ自体はアスペルギルス・ニガー変種アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉ）ＮＲＲＬ３１１２に由来するグルコアミラーゼ過剰生成突然変異体ＵＶＫ１４３ｆに由来する、不活性ｐｙｒＧ遺伝子を有する非組換え菌株）内に形質転換させた（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｎｉａＤ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｎｉｔｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ”，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：５３−５６，１９８９）。形質転換体は、ウリジンを含まない最少培地上でオーバーレイ方式で平板培養し、３２℃でインキュベートした。形質転換体由来のゲノムＤＮＡは、ＣｅｌＬｙｔｉｃ（商標）Ｙ細胞溶解試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を使用して抽出した。次に、天然ｎｉｋ１遺伝子座での遺伝子置換の相同組換えを確証するために、このゲノムＤＮＡを診断的ＰＣＲのための鋳型として使用した。診断的ＰＣＲのために使用したプライマー対は下記に明記した。
ＲＮ０５９１（５’−ＧＡＣＧＴＧＡＡＴＡＣＧＡＴＧＧＣＣＧＡ−３’）（配列番号３６）；および
ＲＮ０５９２（５’−ＡＡＣＧＴＴＴＧＧＧＣＴＴＧＣＧＡＧＧ−３’）（配列番号３７）。
ＲＮ０５７７（５’−ＡＧＧＴＣＧＡＣＴＡＴＣＣＧＧＴＴＡＧＡＣ−３’）（配列番号３８）；および
ＲＮ０５８３（５’−ＧＣＧＡＣＴＣＣＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＣ−３’）（配列番号３９）。
【０１８０】
ｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔ突然変異の組込みは、シーケンシングによって確証された（Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）。
【０１８１】
ｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔ含有遺伝子置換カセットの検証された相同的組込みを含む菌株である標識ＧＩＣＣ２０７１  Ｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔ突然変異体９９番、１１７番および１２１番を選択した。選択した菌株を使用して、タンパク質生成に遺伝子置換が及ぼす効果を決定した。
【０１８２】
７．３．全タンパク質生成を評価するためのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＧＩＣＣ２０７１  Ｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔの発酵
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）コントロール菌株ＧＩＣＣ２０７１およびＧＩＣＣ２０７１  ＮｉｋＭ７８６Ｔ突然変異体９９番、１１７番および１２１番は、５０ｍＬの液中（液体）培養中の同一条件下で増殖させ、それらの全タンパク質生成を振とうフラスコ内で比較した。
【０１８３】
種培養を創出するために、２５０ｍＬフラスコ内の５０ｍＬのＹＥＧ（５ｇ／Ｌの酵母抽出物、２２ｇ／Ｌのグルコース、Ｈ２Ｏ）に各菌株の芽胞を個別に加えた。培養は、振とう培養器内で２４時間にわたり３７℃および２００ｒｐｍで増殖させた。２４時間後、タンパク質生成のために、５ｍＬの種培養を２５０ｍＬの４バッフル付き振とうフラスコ内で４５ｍＬのＰｒｏｍｏｓｏｙ特殊培地（Ｗａｒｄ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：２５６７−２５７６）に３回ずつ加えた。フラスコは、４日間にわたり２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃でインキュベートした。分泌タンパク質は、培養をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８０４Ｒ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）内で４，０００ｒｐｍで２５分間にわたり遠沈させ、上清を収集することによって収穫した。
【０１８４】
全タンパク質生成は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）によって、およびタンパク質をトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて沈降させ、その後にＢＣＡタンパク質アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を実施することによって評価した。ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を基質としてして使用する、例えばグルコアミラーゼなどのタンパク質の活性を同様に評価した。
【０１８５】
野生型ｎｉｋ１対立遺伝子を含有するコントロール菌株ＧＩＣＣ２０７１ならびにＧＩＣＣ２０７１  Ｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔ突然変異体９９番、１１７番および１２１番のそれぞれからの体積４μＬの上清を製造業者が提供したプロトコールに基づいて４〜１２％のＮｕＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）上で作業した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＧＩＣＣ  Ｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔ突然変異体菌株９９番がＧＩＣＣ２０７１コントロールより低いレベルでタンパク質を生成するが、他方ＧＩＣＣ  Ｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔ突然変異体１１７番および１２１番は、天然ｎｉｋ１対立遺伝子を含有するＧＩＣＣ２０７１コントロールに比した全タンパク質の改善を示すことを明らかにした（図１５）。
【０１８６】
ＢＣＡタンパク質アッセイのためには、コントロール菌株ＧＩＣＣ２０７１、ＧＩＣＣ２０７１  Ｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔ突然変異体９９番、１１７番および１２１番由来の上清をトリクロロ酢酸中で沈降させ、０．１Ｎの水酸化ナトリウム中に再懸濁させ、その後にＢＣＡタンパク質アッセイにかけた。ＢＣＡタンパク質アッセイは、製造業者のプロトコールにしたがって実施した。ＧＩＣＣ  Ｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔ突然変異体９９番および１２１番は、天然ｎｉｋ１対立遺伝子を含有するＧＩＣＣコントロールに比較して減少した全タンパク質を示し、突然変異体１１７番はＧＩＣＣ２０７１コントロールに比較して同等の全タンパク質を有した。
【０１８７】
ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド−ＰＮＰＧ基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）上の上清酵素の活性を評価した。コントロール菌株ＧＩＣＣ２０７１ならびにＧＩＣＣ２０７１  Ｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔ突然変異体９９番、１１７番および１２１番由来の上清を９６ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）のウエル内に等分し、その後に８分４５秒間にわたりＰＮＰＧとともにインキュベートした。酵素反応は、０．１Ｍのホウ酸塩溶液（ｐＨ９．２）を添加して停止させ、吸光度を４００ｎｍで読み取った。ＧＩＣＣ  Ｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔ突然変異体９９番は、野生型ｎｉｋ１対立遺伝子を含有するＧＩＣＣ２０７１と比較してＰＮＰＧ基質上の減少した上清酵素活性を示したが、他方ＧＩＣＣ  Ｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔ突然変異体１１７番および１２１番はＧＩＣＣ２０７１コントロールと比較してＰＮＰＧ基質上のより高い上清酵素活性を示した（図１６）。
【０１８８】
ＧＩＣＣ２０７１  Ｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔ突然変異体１１７番は、ＳＤＳゲル上で見られたように、ＧＩＣＣ２０７１コントロールより高いタンパク質生成（図１５）ならびにより高いＰＮＰＧ活性（図１６）を示したが、これは、突然変異ｎｉｋ１Ｍ７８６Ｔヒスチジンキナーゼ遺伝子対立遺伝子をアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）へ導入する工程がタンパク質生成の増加を誘発できることを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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