(57)【要約】  本開示の目的は、治療されている適応症の治療標的領域での薬物滞留時間が延長されることになる注射可能局所コラゲナーゼ製剤を提供することである。本開示のさらなる目的は、活性成分と適合性であり、その活性に悪影響を及ぼさないコラゲナーゼ遅延放出製剤を提供することである。また、本開示のさらなる目的は、治療に必要な用量を送達する能力と干渉する事前のゲル化を示すことなく、小さなサイズの針で患者に効果的に投与することができるコラゲナーゼ注射可能製剤を提供することである。また、本開示のさらなる目的は、他の局所的に使用される薬剤との適合性がより高く、より良好な結果を達成することになるコラゲナーゼ水性局所製剤を提供することである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン媒介性疾患を治療するための組成物であって、コラゲナーゼ、および前記コラーゲン媒介性疾患を治療するのに十分な量の前記コラゲナーゼの徐放を提供する担体を含む組成物。
【請求項２】
前記担体が、ゲル形成性ポリマーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリマーが、Ｎ−シオプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）に基づくトリブロックポリマーまたはコポリマーである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記トリブロックポリマーが、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリマーが、ＰＬＧＡおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から形成されるコポリマーを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＰＬＧＡおよびＰＥＧのコポリマーが、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡまたはＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧの反復で形成されている、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
注射可能であるか、挿入可能であるか、または局所適用される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
２８Ｇ１／２針を取り付けた注射器により、注射時に前記針内での事前のゲル化なしに投与することができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
注射針通過性または適合性が、製剤へのｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタンの添加により改変されている、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
中性から約８．５までのｐＨを提供するのに十分な量のｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１１】
約８．５のｐＨを提供するのに十分な量のｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＮＩＰＡＡｍに基づくポリマーが、Ｎ−シオプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）、ならびにポリアクチド−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡＰＬＡ）、アクリル酸（ＡＡｃ）、およびメタクリル化された超分岐ポリグリセロール（ＨＰＧ−ＭＡ）の一つまたは複数に基づくコポリマーである、請求項３に記載の組成物。
【請求項１３】
ポリ−ＮＩＰＡＡｍおよび超分岐ポリグリセロール（ＨＰＧ）のコポリマーを含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
１０〜３７℃の下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項１５】
約２５〜３２℃のＬＣＳＴを有する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
体温よりも低い温度では液体として存在し、体温ではゲルとして存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記コラゲナーゼが、クロストリジウム・ヒストリチクムから得られる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記コラゲナーゼが、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの混合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
コラーゲン媒介性疾患を罹患している対象を治療するための方法であって、前記コラーゲン媒介性疾患を治療するのに十分な量の請求項１に記載の組成物を、前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２０】
前記疾患が、デュピュイトラン拘縮、ペーロニー病、凍結肩、ヒト脂肪腫、イヌ脂肪腫、セルライト、子宮筋腫、慢性皮膚潰瘍、および重度火傷領域から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも一つの治療用量の請求項１に記載の製剤を提供するためのキットであって、単位包装中に、少なくとも一つの治療用量に十分な量の無菌熱感受性ヒドロゲル流体を含有する少なくとも一つの容器、凍結乾燥された粉末形態の有効量のコラゲナーゼを含有する少なくとも一つの第２の容器、および添付文書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
治療されている適応症の治療標的領域での薬物滞留時間が延長されることになる注射可能局所コラゲナーゼ無菌製剤、そのような製剤を使用するための方法、およびその調製プロセス。
【背景技術】
【０００２】
現在、クロストリジウム・ヒストリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）に由来するＡｕｘ  ＩおよびＡｕｘ  ＩＩコラゲナーゼの定比率混合物からなるコラゲナーゼは、米国ではＸｉａｆｌｅｘ（登録商標）という商標名で、欧州連合ではＸｉａｐｅｘ（登録商標）という商標名で、処方薬として使用が認可されている。現在認可されている適応症は、デュピュイトラン拘縮を罹患している成人の治療用、およびペーロニー病の成人男性用である。加えて、この製品は、凍結肩、ヒト脂肪腫、イヌ脂肪腫、セルライト、子宮筋腫、慢性皮膚潰瘍、および重度火傷領域等の、幾つかのコラーゲン病変に基づくヒト適用および獣医学的適用について、臨床および前臨床研究中である。
【０００３】
前述の非局所適用は全て、コラゲナーゼ製品の局所（病変部位）注射が必要である。最適な臨床利益を達成するには、コラゲナーゼが病変部位に長期間残留して、酵素が最大限に作用することを可能にすることが非常に望ましい。しかしながら、注射用コラゲナーゼの現行市販製剤は、凍結乾燥コラゲナーゼ粉末を注射用緩衝生理食塩水で再構成することにより調製される溶液である。薬物動態研究のデータによると、市販製剤では、かなりの量のコラゲナーゼが、注射３０分後には早くも患者尿中で検出されることが示されている。これは、投与されたコラゲナーゼが、病変の注射部位または他の治療標的領域から容易に洗い流されてしまう場合があることを示す。論理的に考えて、注射部位での滞留時間の長期化を提供する製剤は、コラゲナーゼ治療の治療効果を向上させることができる。局所適応症の場合、現在利用可能な局所コラゲナーゼは、ワセリン系軟膏である。水性製剤が望ましいが、コラゲナーゼは水中での長期安定性が低いため、開発するのが難しい。水性製剤は、様々な薬剤を変更または添加することに対して柔軟性が非常により大きい。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の目的は、治療されている適応症の治療標的領域での薬物滞留時間が延長されることになる注射可能コラゲナーゼ製剤を提供することである。本発明のさらなる目的は、活性成分と適合性があり、その活性に悪影響を及ぼさないコラゲナーゼ遅延放出製剤を提供することである。また、本発明のさらなる目的は、治療に必要な用量を送達する能力と干渉する事前のゲル化を示すことなく、小さなサイズの針で患者に効果的に投与することができるコラゲナーゼ注射可能製剤を提供することである。
【０００５】
本明細書で使用される場合、用語「コラゲナーゼ」は、標準的コラゲナーゼアッセイでコラゲナーゼ活性を示す一つまたは複数のタンパク質、好ましくは、ヒストリチクムに由来するＡｕｘ  Ｉおよび／またはＡｕｘ  ＩＩコラゲナーゼ、最も好ましくは、そのようなＡｕｘ  ＩおよびＡｕｘ  ＩＩコラゲナーゼの１：１混合物を含むことが意図される。
【０００６】
治療標的部位でのコラゲナーゼの遅延放出を提供する適合性で注射可能の製剤は、特定の可逆的熱ゲル化ヒドロゲルを使用して調製することができることが、今や見出されており、本発明の基盤を形成している。そのようなヒドロゲルは、室温で流動性であるが、より高い椎体間温度ではゲルを形成する。このゲルは、体内の注射部位で相当量のコラゲナーゼを封入し、所望の位置で持続放出させることができる。
【０００７】
治療用薬物を送達するための熱ゲル化性ヒドロゲルは、依然としてかなり新しい技術であり、本発明の所望の目的を達成するためには、解決すべき課題が依然として数多く存在する。１つの課題は、注射性または注射針通過性である。これは臨床使用にとって重大な問題である。例えば、Ｔ．Ｒ．Ｈｏａｒｅ  ａｎｄ  Ｄ．Ｓ．Ｋｏｈａｎｅ，Ｐｏｌｙｍｅｒ’ｓ  ４９（２００８）１９９３−２００７を参照されたい。高粘性および針内部での早期ゲル化は、そのような注射性問題の２つの態様である。ヒドロゲルを含むポリマー溶液は、一般的に、約２４℃の室温では粘性が高い。「高粘性」溶液は、溶液を注射器から投与している臨床医にとって、やっかいな問題である。複数回の注射を含む医療行為の患者受容性を向上させるためには、小さなサイズの針を注射器に使用することが非常に望ましい。しかしながら、科学文献を調査すると、興味深いことには、ヒドロゲルを動物に注射したことが報告されている場合、大きなサイズの注射器および針が使用されたことを示す引用が非常に多いことが判明した。例えば、ＲｅＧｅｌ（登録商標）、トリブロックコポリマーは、２３Ｇ１／２サイズの針を使用して、薬物をヒトに注射している（Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，２００７，ｖｏｌ１８，Ｎｏ３）。
【０００８】
以前のヒドロゲル組成物の熱応答特性では、皮膚を貫通した後、注射器の内容物が放出される前に、針内部でゲル化が生じ、したがって針が塞がれてしまう場合がある。したがって、コラゲナーゼヒドロゲル製剤の許容される注射性を得るためには、（１）コラゲナーゼヒドロゲル溶液は、２８Ｇ１／２針が取り付けられた０．５ｍＬ注射器で室温にて快適に取り扱うことができ、（２）針が皮膚を貫通した後、合理的な時間にわたって針が事前のゲル化を示さないことが求められ、したがって、注射用コラゲナーゼによる通常の治療条件下で注射器の内容物が投与可能になる。
【０００９】
治療標的部位にて熱感受性ヒドロゲル／コラゲナーゼ製剤がｉｎ  ｓｉｔｕゲル化することにより、注射器中の原溶液に元々含有されていたコラゲナーゼ量の少なくとも約７０重量％、最も好ましくはそのようなコラゲナーゼの少なくとも８０重量％が封入されることになることが望ましい。現在認可されている適応症の場合、注射可能用量のコラゲナーゼの量は、約０．５８ｍｇであるが、今後認可される可能性のある他の適応症の場合、製剤は、より多くのまたはより少ないコラゲナーゼを含有するように調節することができる。投与されたコラゲナーゼの非封入部分は、標的コラーゲン病変の即時治療に利用可能であるが、封入コラゲナーゼは、ある期間にわたって放出され、１回の注射から長期治療が可能になるだろう。数週間またはさらに数か月間の放出時間を示すことができる全身療法薬物を持続放出するための従来のゲル製剤とは異なり、コラゲナーゼゲルの放出期間は、注射した時点から数日間、好ましくは約２日間を超過するべきでない。そのようなレジメンは、コラゲナーゼが正常組織と接触することに由来する望ましくない副作用のリスクを最小限に抑えつつ、病変の効果的な治療に必要な注射回数を減らし、したがってこの治療モダリティに対する患者受容性のレベルを上げることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明に従って使用するためのコラゲナーゼは、哺乳動物（例えば、ヒト、ブタ）、甲殻類（例えば、カニ、エビ）、真菌性、および細菌性（例えば、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、またはアクロモバクター・イオファグス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｉｏｐｈａｇｕｓ）の発酵による）を含む、任意の便利な供給源から得ることができる。コラゲナーゼは、天然供給源から単離してもよく、または遺伝子操作したもの／組換え体であってもよい。粗コラゲナーゼの一つの一般的な供給源は、細菌性発酵プロセス、特にクロストリジウム・ヒストリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の発酵に由来する。Ｃ．ヒストリチクムから得られる粗コラゲナーゼは、クロマトグラフィー法を含む、タンパク質精製の技術分野で公知の幾つかの技法のいずれかを使用して精製することができる。また、本発明に有用なコラゲナーゼ組成物は、任意の市販のまたは単離したコラゲナーゼ活性を使用して、またはそのような活性を混合することにより、調製することができる。例えば、精製コラゲナーゼは、Ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、リンブルック、ニューヨーク州により提供され得る。
【００１１】
本発明で使用される好ましいコラゲナーゼは、Ｃ．ヒストリチクムに由来し、つまりＩ型およびＩＩ型コラゲナーゼである。コラゲナーゼの産生にＣ．ヒストリチクムを使用することの実際上の利点は、Ｃ．ヒストリチクムは、単純液体培地で多量に培養することができ、常に多量のタンパク質分解酵素を産生し、それを培養培地に分泌することである。Ｃ．ヒストリチクム発酵の培地には、ウシ産物が使用されるが、それらには、伝染性海綿状脳症を引き起こす因子（ＴＳＥ；例えば、牛海綿状脳症または「狂牛病」に関連するプリオン）による夾雑のリスクがある。したがって、そのようなウシ産物を回避することが好ましい。無動物産物系が好ましい。クロストリジウム・ヒストリチクムのＨ４菌株は、もともとは１９５６年に開発されたものであるが、培養用細胞の供給源としての役目を果たすことができる。この菌株、およびＡＢＣクロストリジウム・ヒストリチクムマスター細胞バンク（ＡＴＣＣ  ２１０００として寄託）と名付けられているＨ４菌株由来の菌株は、動物産物を使用して開発されたが、本発明での使用に好適である。
【００１２】
米国特許第７，８１１，５６０号には、コラゲナーゼを産生する方法が開示されている。この文献に記載の方法では、大豆由来の発酵培地を使用して、高度に精製されたコラゲナーゼＩおよびＩＩが別々に生成された。また、この特許には、ブタ由来産物を含有する培養培地を使用して、高度に精製されたコラゲナーゼを産生する方法が開示されている。これらの方法はいずれも、本発明での使用に好適である。米国特許出願公開第２０１０／００８６９７１号には、大豆由来ペプトンを含む植物由来ペプトン、または植物由来ペプトンおよび魚ゼラチンに基づく多数の発酵レシピが開示されている。この刊行物に記載されている方法は、クロストリジウムの増殖およびコラゲナーゼ活性をもたらすのに好適である。また、これらの方法は、本発明での使用に好適であり、本発明での使用が企図されているが、コラゲナーゼ酵素活性を生成する技術分野で公知の任意の方法を使用することができる。
【００１３】
好ましい培養方法では、ペプトンは、大豆、ソラマメ、エンドウ、ジャガイモ、およびそれらの混合物からなる群から選択される植物供給源に由来する。ペプトンは、エンドウに由来するＯｘｏｉｄ  ＶＧ１００植物ペプトンＮｏ．１（ＶＧ１００）、エンドウに由来するＯｘｏｉｄ  ＶＧ２００植物ペプトンホスファートブロス（ＶＧ２００）、無動物性のＭｅｒｃｋ  ＴＳＢ  ＣＡＳＯ−Ｂｏｕｉｌｌｉｏｎ（ＴＳＢ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ大豆ペプトンＮｏ．１１０パパイン消化物（ＳＰ６）、Ｆｌｕｋａソラマメペプトン（ＢＰ）、ジャガイモ由来のＯｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ植物ペプトンＥ１（Ｅ１Ｐ）、ＢＢＬ  Ｐｈｙｔｏｎｅ（商標）ペプトン、およびＢＤ  Ｄｉｆｃｏ  Ｐｈｙｔｏｎｅ（商標）からなる群から選択することができる。
【００１４】
栄養組成物中には、単一タイプのペプトンが存在し、ペプトンは、ＢＰ、Ｅ１Ｐ、大豆ペプトンＥ１１０、ＶＧ１００、およびＶＧ２００からなる群から選択され、組成物中のペプトン濃度は、約５重量／容積％であることが好ましい。より好ましくは、栄養組成物中には、単一タイプのペプトンが存在し、ペプトンは、ＢＢＬ  ｐｈｙｔｏｎｅペプトンまたはＤｉｆｃｏ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｈｙｔｏｎｅ（商標）  ＵＦであり、組成物中のペプトン濃度は、約１０〜１３重量／容積％である。
【００１５】
コラゲナーゼを単離する好ましい方法では、クロストリパイン等の望ましくない夾雑プロテアーゼは回避される。システインプロテアーゼであるクロストリパインは、コラゲナーゼ分解および不安定性の主な原因であると考えられており、クロストリジウム培養中に存在する。そのようなプロテアーゼが、粗コラゲナーゼ混合物中に存在する場合、プロテアーゼを中和するために特別な注意をはらわなければならず、それらには、ロイペプチン等のプロテアーゼ阻害剤を使用すること、および特別設計のコールドルームで冷却溶液を用いて全ての精製ステップを行い、プロテアーゼ活性を低減することが含まれる。したがって、好ましい分離方法では、クロストリパインを回避するために、精製法のできるだけ早い時点でクロストリパインを除去すること、または発酵段階でのクロストリパイン産生を低減することの２つの手法の一つを使用する。
【００１６】
好ましいコラゲナーゼ組成物は、動物性物質由来成分を含まない培養培地中でＣ．ヒストリチクムを発酵させることにより産生され、クロストリパインが実質的に含まれておらず、したがって高度に安定性である。「実質的に含まない」は、コラゲナーゼが、総コラゲナーゼ１ｍｇ当たり１０Ｕ未満の、より好ましくは５Ｕ／ｍｇ未満の、最も好ましくは約１Ｕ／ｍｇ以下のクロストリパインを含有し、かつ／または基準標準物と比較して、クロストリパインおよび／または分解コラゲナーゼを示す可視バンドが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに出現しないことを示す。
【００１７】
コラゲナーゼを精製するための好ましい方法は、Ｃ．ヒストリチクム培養に、本明細書に記載の「低グルコース」培地を使用することを含み、この培地は、約５ｇ／Ｌ未満の、より好ましくは約１ｇ／Ｌ未満の、更により好ましくは約０．５ｇ／Ｌ未満のグルコースを含有するか、またはグルコースを含有しない。増殖培地中の高塩濃度は、培養で産生されるクロストリパインの量を減少させることができ、したがって、Ｃ．ヒストリチクム培養用の好ましい培地は、約５ｇ／Ｌ（または０．５ｗ／ｖ％）を超える総塩量、より好ましくは約７．５ｇ／Ｌ（または７．５％）を超える総塩量、より好ましくは約９ｇ／Ｌ以上（または９％）以上を含む。微生物発酵培地で使用するに好適であることが知られている任意の塩を使用することができることが企図される。塩化物塩、リン酸塩、または硫酸塩を使用することができる。塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、第三リン酸ナトリウム、リン酸一カリウム、二リン酸カリウム、リン酸三カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、またはそれらの種々の組み合わせであってもよい。二リン酸カリウムは、約０．１〜０．３％であってもよく、リン酸カリウムは、約０．７５％〜０．１７５％であってもよく、リン酸ナトリウムは、約０．２〜０．５％であってもよく、および／または塩化ナトリウムは、約０．１５〜０．３５％であってもよい。好ましくは、培地は、硫酸マグネシウム、ならびにリボフラビン、ナイアシン、パントテン酸カルシウム、ピメリン酸、ピリドキシン、およびチアミンを含むビタミンを更に含む。
【００１８】
あるいは、栄養成分は、０．５〜５％の、より好ましくは約１〜４％の、最も好ましくは約１．５〜２．５％の酵母エキスを含有していてもよい。酵母エキスは、Ｃｏｌｅ  Ｐａｒｍｅｒ（バーノンヒル、イリノイ州）およびＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ピッツバーグ、ペンシルベニア州）を含む様々な供給業者から入手可能である。
【００１９】
培地のｐＨは、好ましくはｐＨ７〜ｐＨ８である。約ｐＨ７．２〜約ｐＨ７．７のｐＨが更により好ましく、最も好ましくは約ｐＨ７．４である。
【００２０】
本発明での使用に企図されるコラゲナーゼは、必要な条件下で活性である任意のコラゲナーゼであり得る。しかしながら、好ましい組成物は、所望のまたは更に最大の相乗効果をもたらすように修飾または最適化された、ある質量比のコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含有する。好ましくは、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩは、培養で産生された粗コラゲナーゼ混合物から別々に精製され、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩは、最適化された一定の質量比で再度合わせられる。好ましい実施形態は、約０．５対１．５、より好ましくは０．６対１．３、更により好ましくは０．８対１．２、最も好ましくは１対１のコラゲナーゼＩ対コラゲナーゼＩＩ質量比を含有するが、任意の組み合わせのまたは任意の単一のコラゲナーゼ活性を使用することができる。
【００２１】
本発明での使用に企図されるコラゲナーゼを産生する好ましい方法は、非哺乳動物または非動物培地中でＣ．ヒストリチクムを発酵させることを含み、培養液上清は、実質的にクロストリパインを含まない。このようにして産生されたコラゲナーゼを、単離し、精製し、および合わせて、クロストリパインを実質的に含まない、最適化された一定の質量比のコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの混合物を含む、本発明で使用される組成物が提供される。Ｃ．ヒストリチクムの発酵から得られる粗コラゲナーゼは、色素リガンド親和性クロマトグラフィー、ヘパリン親和性クロマトグラフィー、硫安沈澱、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および／または金属キレートクロマトグラフィーを含む、当業者に公知の様々な方法により精製することができる。加えて、コラゲナーゼの精製法は、例えば、米国特許第７，８１１，５６０号に記載のもの等が公知である。
【００２２】
コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩは両方とも、メタロプロテアーゼであり、強固に結合された亜鉛および緩やかに結合されたカルシウムをそれらのために必要とする。両コラゲナーゼは、全タイプのコラーゲンに対して幅広い特異性を有する。コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩは、生理学的条件下でコラーゲンの三重らせん領域を加水分解することにより、コラーゲンを消化する。各コラゲナーゼは、異なる特異性を示し（例えば、各々は、異なる好ましい切断標的アミノ配列を有する）、一緒になると、コラーゲンに対する相乗効果的活性を示す。コラゲナーゼＩＩは、ＩＩ型およびＩ型コラゲナーゼについて文献に報告されるように、あらゆる種類の合成ペプチド基質に対してコラゲナーゼＩよりも、より高い活性を示す。
【００２３】
好ましいコラゲナーゼは、コラゲナーゼＡＢＣ  ＩおよびコラゲナーゼＡＢＣ  ＩＩと呼ばれる、２つの微生物コラゲナーゼで構成される。用語「コラゲナーゼＩ」、「Ａｕｘ  Ｉ」、「ＡＢＣ  Ｉ」、および「コラゲナーゼＡＢＣ  Ｉ」は、同じものを意味し、同義的に使用することができる。同様に、用語「コラゲナーゼＩＩ」、「Ａｕｘ  ＩＩ」、「ＡＢＣ  ＩＩ」、および「コラゲナーゼＡＢＣ  ＩＩ」は、同じ酵素を指し、同義的に使用することができる。これらコラゲナーゼは、細菌細胞により分泌される。好ましくは、これらコラゲナーゼは、クロマトグラフィー法により、クロストリジウム・ヒストリチクム培養液上清から単離および精製される。両コラゲナーゼは、特殊なプロテアーゼであり、同じＥＣ番号（Ｅ．Ｃ３．４．２４．３）を共有する。しかしながら、コラゲナーゼ、または他の供給源に由来するコラゲナーゼの組み合わせが、本発明での使用に企図されている。コラゲナーゼＡＢＣ  Ｉは、１１５ｋＤａの分子量を有する、およそ１０００個のアミノ酸で構成される単一ポリペプチド鎖を有する。また、コラゲナーゼＡＢＣ  ＩＩは、１１０ｋＤａの分子量を有する、およそ１０００個のアミノ酸で構成される単一ポリペプチド鎖を有する。
【００２４】
コラゲナーゼは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ間のペプチド結合を加水分解することにより作用し、ここでＸは、プロリンまたはヒドロキシプロリンであることが多い。コラゲナーゼＩは、三重らせんドメインの末端の部位で作用するが、コラゲナーゼＩＩは内部で切断する。加水分解は、結合が全て切断されるまで、経時的に継続する。
【００２５】
好ましくは、コラゲナーゼ産物は、少なくとも９５％純粋のコラゲナーゼであり、いかなる狭雑プロテアーゼも実質的に含まれていない。より好ましくは、コラゲナーゼ産物は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）；高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）；逆相ＨＰＬＣ；または酵素アッセイの一つまたは複数により決定して、９７％純粋であり、最も好ましくは９８％以上純粋である。好ましいコラゲナーゼ産物は、クロストリパインを本質的に含んでおらず、精製は、好ましくは、ロイペプチンの非存在下で実施される。本発明での使用に好ましいコラゲナーゼ産物は、下記の表１から選択される少なくとも一つの仕様を有する。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
本明細書での使用に記載されているコラゲナーゼ産物は、子宮類線維腫、デュピュイトラン病；ペーロニー病；凍結肩（癒着性関節嚢炎）、ケロイド；テニス肘（外側上顆炎）；瘢痕腱；緑内障；椎間板ヘルニア；硝子体切除術の補助物（ａｄｊｕｎｃｔ  ｔｏ  ｖｉｔｒｅｃｔｏｍｙ）；過形成性瘢痕；炎症性ざ瘡から生じるもの等の圧迫瘢痕；手術後の癒着；尋常性ざ瘡；脂肪腫、ならびにしわ、セルライト形成、および新生物線維症等の外観を損なう状態を含むコラーゲン媒介性疾患の治療に有用である。
【００２８】
特定のコラーゲン媒介性疾患の治療に使用することに加えて、本発明の組成物は、組織を個々の細胞および細胞集団に解離させるためにも有用であり、幅広く多様な検査、診断、および治療応用にも有用である。これら応用は、小径合成血管グラフト播種用の微小血管内皮細胞、遺伝子治療用の肝細胞、薬物毒性スクリーニングおよび体外肝臓補助デバイス、軟骨再生用の軟骨細胞、およびインスリン依存性糖尿病治療用のランゲルハンス島を含む、種々の用途用の多数のタイプの細胞を単離することを含む。酵素治療は、断片細胞外マトリックスタンパク質、および細胞間接触を維持するタンパク質に有効である。一般的に、本発明の組成物は、細胞の除去または細胞外マトリックスの修飾が所望であるあらゆる応用に有用である。
【００２９】
本発明によるコラゲナーゼ組成物は、治療上有効量の記載されているコラゲナーゼ組成物、または治療上有効量の記載されている医薬コラゲナーゼ製剤を、その必要性のある患者に投与するためのものである。化合物、組成物、または製剤の「治療上有効量」は、任意の医学的治療に適用可能な合理的ベネフィット／リスク比で、治療対象に治療効果を付与する化合物の量である。
【００３０】
治療効果は、客観的であってもよく（つまり、ある試験またはマーカーにより測定可能）、または主観的であってもよく（つまり、対象が、効果の指標を示すか、または効果を感じる）、臨床医または患者により決定されてもよい。また、有効用量は、投与経路、ならびに他の作用剤と併用の可能性に応じて、様々であろう。しかしながら、本発明の組成物の合計１日用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決定されることになることが理解されるだろう。任意の特定の患者の特定の治療上有効用量レベルは、治療されている障害、および障害の重症度；使用される特定の化合物の活性；使用される特定の組成物；患者の年齢、体重、全体的健康、および食事；使用される特定の化合物の投与時間、投与経路、および排泄速度；治療期間；使用される特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；および医学分野において周知の類似要因を含む様々な要因に依存するだろう。
【００３１】
用語「患者」または「必要とする患者」は、コラーゲン媒介性疾患またはその症状を有するあらゆる哺乳動物を包含する。そのような「患者」または「必要とする患者」には、ウマおよびブタ等の家畜、イヌおよびネコなどの伴侶動物、ならびにマウス、ラット、およびウサギ等の実験動物を含む、ヒトまたは任意の哺乳動物が含まれる。
【００３２】
ナノ担体は、薬物治療剤（例えば、タンパク質など）を送達および分解から保護するためのものである。また、ナノ担体製剤は、この方法が、注射した類線維腫から薬物が拡散および分布して遠ざかるのを妨げ、放出を長期化し、不活化を遅延させ、したがって、反復注射の頻度を低減するため、好ましい。当技術分野で公知の任意のそのようなナノ担体を、本発明で使用することできる。これらナノ担体の幾つかは、熱応答性送達系とも呼ばれる。
【００３３】
Ａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は、生体適合性の水混和性有機溶媒（例えば、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ＮＭＰ）に溶解されている不水溶性生分解性ポリマー（例えば、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＬＧＡ）を含む。使用時に、コラゲナーゼを添加して、溶液または懸濁液を形成する。ＰＬＧＡの分子量およびラクチド−グリコリドのモル比（Ｌ：Ｇ比）は両方とも、薬物送達を左右する。５０：５０〜８５：１５のＬ：Ｇ比、および３４〜５０％のポリマー濃度を使用した臨床研究では、デポ製剤が３か月間を超えて維持されたことが実証されている。
【００３４】
ＲｅＧｅｌ（登録商標）は、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡまたはＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧが反復されている、ＰＬＧＡおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ、１０００Ｄａまたは１４５０Ｄａ）から形成された４０００Ｄａのトリブロックコポリマーである。ＲｅＧｅｌ（登録商標）は、水性媒体中で２３重量％のコポリマー溶液として製剤化されている。薬物を溶液に添加し、温度を３７℃に上昇させると、系全体がゲル化する。ＲｅＧｅｌ（登録商標）の、乳酸、グリコール酸、およびＰＥＧの最終産物への分解は、コポリマーのモル組成に応じて、１〜６週間にわたって生じる。ブタ成長ホルモンおよびグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）のような化学的に異なる薬物を、一つ毎に組み込み、ＲｅＧｅｌ（登録商標）から放出させることができる。
【００３５】
ＬｉｑｕｏＧｅｌ（商標）は、機械的に独立した薬物送達経路、捕捉および共有結合により作用することができる。この担体を使用して、２つ以上の薬物を腫瘍部位に送達することができる。ＬｉｑｕｏＧｅｌ（商標）は、熱ゲル化性Ｎ−イソプロピルアクリルアミド；ポリ（乳酸）および２−ヒドロキシエチルメタクリラートの生分解性マクロマー；親水性アクリル酸（分解産物の溶解性を維持するため）；および薬物に共有結合で結合される多官能性超分岐ポリグリセロールの四量体コポリマーである。ＬｉｑｕｏＧｅｌ（商標）は、水性媒体中で１６．９重量％のコポリマー溶液として製剤化されている。この溶液は、生理学的条件下でゲル化し、１〜６日以内に分解して薬物内容物を放出する。
【００３６】
上記の担体はいずれも、本発明でのナノ担体として使用することができる。しかしながら、好ましいナノ担体は、多くの望ましい特徴を有する超分岐ポリグリセロール（ＨＰＧ）を含有する。ＨＰＧは、分岐ユニットの不完全生成により成長し、便利な１段階反応で生産される。それらを生産する際に分子量の多分散性が大きいという以前の問題は、克服されている。その結果生じるポリマーは、多数の修飾可能な表面官能基、ならびに薬物が相互作用するための内部空洞を含有する。他のポリマー手法は、合成ステップの数、および結果的にはコストを著しく増加させずに、これら特性を容易に提供することはできない。ＨＰＧポリマーは、グリセロールに基づくものであり、ポリエチレングリコールと構造が類似しているため、生体適合性である。
【００３７】
更なる成分を、このポリマーに、したがって修飾ＨＰＧポリマーおよびＨＰＧのコポリマーに随意に付加することができることが企図される。これら更なる成分またはモノマーには、例えば、架橋部分、生分解性部分、および熱応答性部分が含まれ得る。例えば、熱に応答するヒドロゲルは、必要な流体容積を、体温未満に維持された注射器から注射することが可能であり、暖まると、機械的特性が増加し、それにより注射部位に物質が拘束されるため、注射療法には魅力的である。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ポリ−ＮＩＰＡＡｍ）は、およそ３２℃の下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を有する、熱に応答するポリマーである。したがって、ＨＰＧとＮＩＰＡＡｍとのコポリマーは、本発明で使用するために企図されており、好ましい。このナノ担体は、可変性のメッシュサイズを有し、小型薬物分子、大型タンパク質、または成分の混合物を捕捉するようにカスタマイズすることができ、体温でゲル化して、ナノ担体が生分解すると共に遅延放出を可能にする。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、製剤は、体温未満の温度では液体として存在し、体温ではゲルとして存在する。液体からゲルへの遷移が生じる温度は、ＬＣＳＴと呼ばれること場合があり、特定の温度ではなくて、狭い温度範囲であってもよい。ＬＣＳＴを有する物質は、ＬＣＳＴ物質と呼ばれる。本発明の実施での典型的なＬＣＳＴは、例えば、１０〜３７℃の範囲である。その結果、ＬＣＳＴ未満で注射された製剤は、体内でＬＣＳＴ以上の温度に温められ、それにより液体からゲルへの遷移を起こす。
【００３９】
本発明で使用するための好適なＬＣＳＴ物質には、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン（ＰＥＯ−ＰＰＯ）ブロックコポリマーが含まれる。２つの許容される化合物は、プルロニック酸Ｆ１２７およびＦ１０８であり、それらは、それぞれ１２，６００および１４，６００の分子量を有するＰＥＯ−ＰＰＯブロックコポリマーである。これら化合物の各々は、ＢＡＳＦ（マウントオリーブ、ニュージャージー州）から入手可能である。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の２０〜２８％濃度のプルロニック酸Ｆ１０８は、好適なＬＣＳＴ物質の例である。有益な一つの調製物は、ＰＢＳ中の２２．５％プルロニック酸Ｆ１０８である。ＰＢＳ中の２２％プルロニック酸Ｆ１０８の調製物は、３７℃のＬＣＳＴを有する。ＰＢＳ中の２０〜３５％濃度のプルロニック酸Ｆ１２７は、好適なＬＣＳＴ物質の別の例である。ＰＢＳ中の２０％プルロニック酸Ｆ１２７の調製物は、３７℃のＬＣＳＴを有する。典型的な分子量は、５，０００〜２５，０００であり、上記で特定した２つの特定の化合物の場合は、１２，６００および１４，６００である。また、より一般的には、他のＰＥＯ−ＰＰＯブロックコポリマーを含む、生分解性であり、体温ではゲルとして存在し、体温未満では液体として存在する物質を、本発明により使用することができる。ＬＣＳＴ物質に関する更なる情報は、米国特許第６，５６５，５３０（Ｂ２）号および第６，５４４，２２７（Ｂ２）号に見出すことができる。
【００４０】
コラゲナーゼ組成物用の多数の熱感受性ヒドロゲルが、当技術分野で公知であり、市販されている。本発明の製剤で使用される好ましい熱感受性ヒドロゲルは、構造ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡのトリブロックポリマーであり、式中、ＰＬＧＡは、ポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）であり、ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）である。（ＰＬＧＡ：ＰＥＧ：ＰＬＧＡ、ＬＡ／ＧＡ＝３．１、ＰＥＧ１０００〜１５００、Ｍｎ＝３５００〜５５００）を有する、これら物質の市販トリブロックポリマーは、中国済南のＤａｉｇａｎｇ  Ｂｉｏならびにウェストラファイエット、インディアナ州  ４７９０６、米国のＡｋｉｎａ，Ｉｎｃ．から取得可能である。本発明の製剤で使用される別の好ましい熱感受性ヒドロゲルは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ポリ−ＮＩＰＡＡｍ）である。
【００４１】
本発明のコラゲナーゼ化合物の医薬製剤は、一つまたは複数の薬学的に許容される媒体または賦形剤と共に製剤化されたコラゲナーゼ組成物を含む。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体または賦形剤」は、無毒性、不活性、固体、半固体、または液体の、任意のタイプの充填材、希釈剤、カプセル化材料、媒体、溶媒、または製剤助剤を意味し、個々の剤形でまたはバルクで使用可能することができる。活性化合物のデポ製剤を生成するための他の剤形も、本発明での使用に企図される。本発明での使用に好適なコラゲナーゼの剤形には、これらに限定されないが、注射前に再構成するための、複数用量または単一用量の凍結乾燥または他の乾燥粉末、注射の準備ができている個々の用量単位（好ましくは一つまたは複数の保存剤も含む）、凍結単位剤形、または当技術分野で公知の任意の様式の調製物が含まれる。また、製剤は、キットの形態で提供されていてもよく、キットは、固体形態のコラゲナーゼ、再構成および注射用の液体または溶媒、ならびに注射器および針、特に患部に投与するための専用注射器および／または針等の、投与に必要な任意の装置を含んでいてもよい。好ましくは、製剤は無菌である。製品は、細菌保持フィルターでろ過することによる等、当技術分野で公知の任意の方法により滅菌されていてもよく、または無菌条件下で生産される。他の方法には、製剤またはその成分を、熱、放射、またはエチレンオキシドガスに暴露させることが含まれる。
【００４２】
薬学的に許容される担体としての役目を果たすことができる物質の幾つかの例は、当技術分野で公知であるような注射用溶媒である。例には、これらに限定されないが、滅菌水、緩衝液、生理食塩水またはリンゲル液等の生理食塩溶液、発熱性物質除去水、エチルアルコール、および無毒性油等、または本発明で使用するための本明細書に記載の注射もしくは他の投与形態と適合性のある任意の溶媒が含まれる。
【００４３】
加えて、当技術分野で公知の任意の固体賦形剤は、例えば、媒体または充填材として、本発明と共に医薬品に使用することできる。ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；コーンスターチおよびジャガイモデンプン等のデンプン；セルロース、ならびに微結晶性セルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース等の、その誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；ゴム；タルク；プロピレングリコール等のグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル等のエステル；ならびに寒天等を使用することができる。水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム、クエン酸、およびリン酸塩または炭酸塩等の酸化合物またはアルカリ化合物を含む、活性化合物および使用法と適合性のある緩衝剤が、使用に企図される。また、潤滑剤、乳化剤、湿潤剤、懸濁化剤、結合剤、崩壊剤、保存剤または抗菌剤、酸化防止剤、徐放性賦形剤、およびコーティング剤等の無毒性適合性賦形剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）、ならびに着色剤、香料、粘性増強剤、および生体接着剤等を、製剤専門家の判断に従って使用することができる。
【００４４】
例えば、一つまたは複数の生分解性結合剤が、典型的には、固体特徴を有する剤形に関する本発明の製剤に含まれていてもよい。使用される場合、広範な生分解性結合剤の濃度は、他の考慮すべきことの中でも、例えば、その結果生じる剤形の所望の物理的特徴に基づき、および選択されている治療剤の特徴（例えば、希釈度、放出遅延等、つまり、所望の／許容される）に基づき、様々な量で使用することができる。生分解性結合剤の濃度範囲は、典型的には、生分解性結合剤の約１〜８０重量％、より典型的には、約５〜５０重量％である。「生分解性」物質は、患部組織に配置されると、溶解、分解、再吸収、および／または他の分解プロセスを起こすものである。そのような物質が含まれている場合、本発明による製剤は、組織に７日間存在した後で、典型的には少なくとも１０％の重量低下を起こし、より典型的には組織に４日間存在した後で５０〜１００％の重量低下を起こすだろう。本発明との関連で使用するのに好適な生分解性結合剤には、これらに限定されないが、グリセリン等の生分解性有機化合物、および生分解性ポリマー、または薬剤学の技術分野で公知の任意の公知な崩壊剤化合物が含まれる。
【００４５】
粘性調節剤が用いられる場合、粘性調節剤は、典型的には、例えば、製剤に高度な粘性を付与することにより、所望の粘性を有する製剤を提供するのに有効な量で、例えば、約５，０００〜２００，０００ｃｐｓ、より典型的には約１０，０００〜１００，０００ｃｐｓ、更により典型的には約２０，０００〜４０，０００ｃｐｓの粘性を提供するのに有効な量で存在する。これら範囲内の粘性を有する製剤を提供することにより、製剤は、従来の注射装置（例えば注射器）を使用して、組織に注射することができる。しかしながら、製剤は、粘性が高いため、注射部位の組織内での保持が向上されている。使用される粘性調節剤の濃度は、幅広く様々であってもよい。一般的に、粘性調節剤の総濃度は、約１〜２０重量％である。多くの実施形態では、粘性調節剤は、天然由来または合成由来であってもよい、典型的には生体内崩壊性であるポリマーである。また、ポリマーは、典型的には水溶性および／または親水性である。しかしながら、幾つかの実施形態では、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の有機溶媒が液体成分として使用されている場合、粘性調節剤は、比較的疎水性であってもよい。ポリマー粘性調節剤には、ホモポリマー、コポリマー、およびポリマーブレンドが含まれる。
【００４６】
本発明を実施するための粘性調節剤の例には、これらに限定されないが、セルロースポリマーおよびコポリマー、例えば、セルロースエーテル、例えば、メチルセルロース（ＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルヒドロキシエチルセルロース（ＭＨＥＣ）、メチルヒドロキシプロピルセルロース（ＭＨＰＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）および例えばナトリウム塩を含むその種々の塩、ヒドロキシエチルカルボキシメチルセルロース（ＨＥＣＭＣ）およびその種々の塩、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース（ＣＭＨＥＣ）およびその種々の塩、他のポリサッカライドおよびポリサッカライド誘導体、例えば、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、デキストラン、デキストラン誘導体、キトサン、およびアルギン酸、およびその種々の塩、カラゲナン、キサンタンゴム、グアーゴム、アラビアゴム、カラヤゴム、ガッディゴム、コンニャク、およびトラガカントゴムを含む種々のゴム、グリコサミノグリカン、およびプロテオグリカン、例えば、ヒアルロン酸、およびその塩、ヘパリン、ヘパリン硫酸、デルマタン硫酸、タンパク質、例えば、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、およびフィブリン、他のポリマー、例えば、カルボキシビニルポリマー、およびそれらの塩（例えば、カルボマー）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアクリル酸およびその塩、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸／アクリルアミドコポリマー、ポリアルキレンオキシド、例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、およびポリ（エチレンオキシド−プロピレンオキシド）（例えば、プルロニック酸）、ポリオキシエチレン（ポリエチレングリコール）、ポリエチレンアミン、およびポリピリジン、ポリメタホスファート（クロール塩）、ポリビニルアルコール、上記に特に示されているもの以外の更なる塩およびコポリマー、ならびに先述のもののブレンド（同じモノマーを含有するが、異なる分子量を有するポリマーの混合物を含む）等が含まれる。また、これらの種の多くは、結合剤として有用である。
【００４７】
本発明の他の実施形態では、製剤または担体は、使用前またはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで架橋される。架橋は、例えば、製剤保持を向上させるように作用する点で（例えば、より硬質の／粘性の物質を提供することにより、および／またはポリマーを特定の環境により不溶性にすることにより）、有利である。製剤がｉｎ  ｖｉｖｏで架橋される場合、架橋剤は、一般的に、本発明により製剤を注射または挿入する前またはした後のいずれかで組織に注射される。製剤および架橋剤の性質に応じて、製剤は、例えば、固体に、半固体に、または高粘性流体に変換されてもよい。
【００４８】
本発明で使用するのに好適な架橋剤には、イオン性および共有結合性架橋剤を含む、任意の無毒性架橋剤が含まれる。例えば、幾つかの実施形態では、本発明の製剤内には、例えば多価金属イオンとイオン的に架橋されるポリマーが含まれる。好適な架橋イオンには、カルシウム陽イオン、マグネシウム陽イオン、バリウム陽イオン、ストロンチウム陽イオン、ホウ素陽イオン、ベリリウム陽イオン、アルミニウム陽イオン、鉄陽イオン、銅陽イオン、コバルト陽イオン、鉛陽イオン、および銀陽イオンからなる群から選択される多価陽イオンが含まれる。多価陰イオンには、リン酸陰イオン、クエン酸陰イオン、ホウ酸陰イオン、コハク酸陰イオン、マレイン酸陰イオン、アジピン酸陰イオン、およびシュウ酸陰イオンが含まれる。より幅広くは、架橋陰イオンは、一般的に、多塩基性の有機酸または無機酸に由来する。イオン性架橋は、例えば、イオン的に架橋可能なポリマーを、溶解されているイオンを含有する水溶液と接触させることにより、当技術分野で公知の方法で実施することができる。
【００４９】
幾つかの実施形態では、例えば、ポリマー構造体中の官能基と反応性である多官能性架橋剤を使用して、共有結合で架橋可能であるポリマーが含まれている。多官能性架橋剤は、ポリマー中の官能基と反応する少なくとも２つの官能基を有する任意の化合物であってもよい。本明細書中に記載の種々のポリマーは、共有結合的およびイオン的の両方で架橋されていてもよい。
【００５０】
イオン性および／または共有結合性架橋に好適なポリマーは、例えば、ポリアクリラート；ポリ（アクリル酸）；ポリ（メタクリル酸）；ポリアクリルアミド；ポリ（Ｎ−アルキルアクリルアミド）；ポリアルキレンオキシド；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（プロピレンオキシド）；ポリ（ビニルアルコール）；ポリ（ビニル芳香族）；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチレンイミン）；ポリ（エチレンアミン）；ポリアクリロニトリル；ポリ（ビニルスルホン酸）；ポリアミド；ポリ（Ｌ−リジン）；親水性ポリウレタン；無水マレイン酸ポリマー；タンパク質；コラーゲン；セルロースポリマー；メチルセルロース；カルボキシメチルセルロース；デキストラン；カルボキシメチルデキストラン；修飾デキストラン；アルギン酸塩；アルギン酸；ペクチニン酸；ヒアルロン酸；キチン；プルラン；ゼラチン；ジェラン；キサンタン；カルボキシメチルデンプン；ヒドロキシエチルデンプン；コンドロイチン硫酸；グアー；デンプン；ならびにそれらの塩、コポリマー、混合物、および誘導体の非限定的リストから選択される。
【００５１】
本発明で使用するための好ましいコラゲナーゼ組成物は、少なくとも１０００ＳＲＣ単位／ｍｇ、より好ましくは少なくとも約１５００ＳＲＣ単位／ｍｇ等の、少なくとも約７００ＳＲＣ単位／ｍｇの比活性を有するコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの混合物を含む。１ＳＲＣ単位は、ラット尾部コラーゲンを、２５℃、ｐＨ７．４で１分間当たり１ナノモルのロイシンと等価なニンヒドリン反応物質に可溶化させるだろう。コラゲナーゼは、同様にＡＢＣ単位で記載されている。コラゲナーゼのこの効力アッセイは、ｐＨ７．２および３７℃で、２０〜２４時間の未変性コラーゲン（ウシ腱に由来する）の消化に基づく。切断したペプチド結合の数は、ニンヒドリンとの反応により測定した。トリプシン消化対照により放出されたアミノ基を差し引く。コラーゲンの１正味ＡＢＣ単位は、１分間当たり１．０９ナノモルのロイシンと等価なニンヒドリン反応物質を可溶化させるだろう。１ＳＲＣ単位は、およそ６．３ＡＢＣ単位または１８．５ＧＰＡ単位と等しい。一つの実施形態では、注射用コラゲナーゼは、１ミリグラム当たりおよそ２８００ＳＲＣ単位を含有するだろう。
【００５２】
患部組織への直接注射により投与するために企図される用量は、治療される組織のサイズ、および治療する医師の判断に応じて様々であろう。しかしながら、用量は、一般的に、治療される組織の１ｃｍ３当たり約０．０６ｍｇコラゲナーゼ〜約１ｍｇコラゲナーゼ、または治療される組織の１ｃｍ３当たり約０．１ｍｇコラゲナーゼ〜約０．８ｍｇコラゲナーゼ、または治療される組織の１ｃｍ３当たり約０．２ｍｇコラゲナーゼ〜約０．６ｍｇのコラゲナーゼである。
【００５３】
また、更なる活性作用剤または薬剤を含有する製剤が企図される。随伴性投与、同時投与、または個別投与用の製剤に含むことができる随意の更なる作用剤には、例えば、コラーゲン媒介性疾患またはそれらの症状を縮小、治療、または除去するための、または現在の治療方法の実施を支援するための、当技術分野で公知の任意の医薬品が含まれる。例えば、アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール、アナストロゾール、およびエキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｄｅ））、プロゲステロン受容体アゴニストおよび修飾因子（例えば、プロゲステロン、プロゲスチン、ミフェプリストン、レボノルゲストレル（ｌｅｖｏｎｏｅｒｇｅｓｔｒｅｌ）、ノルゲストレル、アソプリスニル、ウリプリスタル、および酢酸ウリプリスタル、テラプリストン（ｔｅｌｅｐｒｉｓｔｏｎｅ））、選択的エストロゲン受容体修飾因子（ＳＥＲＭ）（例えば、ベンゾピラン、ベンゾチオフェン、クロマン、インドール、ナフタレン、トリ−フェニルエチレン化合物、アルゾキシフェン、ＥＭ−６５２、ＣＰ３３６，１５６、ラロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、およびタモキシフェン）、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体（ＧｎＲＨａ）（例えば、６位がＤ−アミノ酸に変更されている、および／またはカルボキシル末端Ｇｌｙ１０−アミドがエチルアミドに置換されているＧｎＲＨアゴニストペプチドまたは類似体、例えば、トリプトレリン、またはセトロレリクス、ガニレリクス、デガレリクス、およびオザレリクス等のＧｎＲＨアンタゴニスト）、増殖因子修飾因子（例えば、ＴＧＦｂ中和抗体）、酢酸ロイプロリド、非ステロイド系抗炎症薬、ｍＴＯＲ径路の阻害剤、ＷＮＴシグナル径路の阻害剤、ビタミンＤ、ビタミンＤ代謝産物、ビタミンＤ修飾因子、および／または更なる抗線維症化合物（例えば、ピルフェニドンおよびハロフジノン）等の一つまたは複数の類線維腫治療剤を、同じまたは別々の投与で、コラゲナーゼと同時投与してもよい。
【００５４】
また、化学的アブレーション剤が、本発明の製剤に含まれていてもよい。そのような化合物は、有効な量だと、暴露時に組織壊死または縮小を引き起こす。任意の公知のアブレーション剤を、コラゲナーゼの不活化は回避されるが状態に適切な濃度で、本技術に従って使用することができる。使用される量は、当業者により容易に決定される。典型的な濃度範囲は、アブレーション剤の約１〜９５重量％、より典型的には、約５〜８０重量％である。本発明で使用するのに好適なアブレーション剤には、これらに限定されないが、浸透圧ストレス発生剤（例えば、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム等の塩）、有機化合物（例えば、エタノール）、塩基性作用剤（例えば、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウム）、酸性作用剤（例えば、酢酸およびギ酸）、酵素（例えば、ヒアルロニダーゼ、プロナーゼ、およびパパイン）、フリーラジカル発生剤（例えば、過酸化水素および過酸化カリウム）、酸化剤（例えば、次亜塩素酸ナトリウム、過酸化水素、および過酸化カリウム）、組織固定剤（例えば、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、またはグルタルアルデヒド）、および／または血液凝固剤（例えば、ゲングピン（ｇｅｎｇｐｉｎ））が含まれる。これら作用剤は、コラゲナーゼの酵素活性に悪影響を及ぼさない限り、同じ製剤にコラゲナーゼと共に混合してもよく、または、同じ時点でまたは異なる時点で、別々に投与してもよい。
【００５５】
本発明による方法は、コラーゲン媒介性疾患、例えばＮＳＡＩＤにより引き起こされる症状を制御するための任意の公知の治療と共に使用してもよく、疼痛を軽減するために、他の鎮痛剤を使用してもよい。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態では、粘性であるためまたはｐＨが酸性であるため注射性または適合性の要件を満たさない、当技術分野で公知の熱感受性ヒドロゲル物質を、それらの溶液に、粘性調節量またはｐＨ調節量の化合物ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタンを添加することにより溶液中で処理して、それらの特性を改変することができる。このようにすると、そのようなヒドロゲル特性は、目詰まりさせずに２８Ｇ１／２針で注射することが可能になるように改変され、中性またはわずかに塩基性のｐＨにおいて、コラゲナーゼと適合性を示すことになる。
【００５７】
好適なコラゲナーゼ製剤は、１ｍｇのコラゲナーゼ、およびｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタンを添加することにより、中性〜８．５のｐＨに、好ましくは約８．５のｐＨに調節されたＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ等の、０．５ｍｌの１３％〜１５％トリブロックヒドロゲル溶液中のラクトース等の、１．７ｍｇのポリサッカライド担体物質を溶解させることにより調製することができる。このようにして得られる溶液は、２８Ｇ１／２針からインスリン用注射器に容易に導入することができる。ｐＨが塩基性であることが、許容される注射性を得るために重要であることを見出した。コラゲナーゼは、この調製法で形成したゲル中で維持すると、３７℃で少なくとも４８時間保持しても安定であることを見出した。加えて、そのようなゲルからの放出および封入コラゲナーゼは、未処理コラゲナーゼと同じ生物活性を有することを見出した。ヒドロゲルが塩基性条件に感受性を示すある実施形態では、あらゆる分解リスクを最小限に抑えるために、コラゲナーゼ粉末と混合する前に、ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタンをヒドロゲル溶液に添加することが好ましい。
【００５８】
注射に好適な製剤を提供するため、ヒドロゲル溶液を滅菌しなければならない。高温またはヒドロゲルの完全性に影響を及ぼし得る物質の使用を伴わない任意の方法を使用することができる。好ましい滅菌方法は、ヒドロゲル溶液を、例えば、約０．２２μｍの細孔を有するフィルター等の小細孔フィルターで、無菌の密閉可能容器へとろ過することを含む。得られた無菌溶液は、使用前に凍結保存溶液として適宜保存することができる。この保存溶液は、必要時に解凍し、注射前に凍結乾燥コラゲナーゼを溶解するための希釈剤として使用することができる。
【００５９】
本発明のさらなる実施形態では、対象の標的適応症の治療を達成するために必要な成分を、キットの形態で医療従事者に適宜提供することができる。そのようなキットは、１回または複数回の注射を提供するのに十分な量の熱感受性ヒドロゲル保存溶液を含有する無菌バイアル、各々が標的適応症のための治療用量のコラゲナーゼを凍結乾燥粉末として含有する一つまたは複数のバイアル、および任意選択でキットが患者の治療に使用される管轄地での医薬品規制当局により承認された添付文書を含むだろう。ヒドロゲルが塩基性条件との長期接触に感受性である実施形態では、ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン溶液を、別々のバイアルで提供することが好ましい。最も好ましくは、バイアルは、使用前は、冷蔵庫でまたは凍結条件下で保管されるだろう。
【００６０】
本発明の製剤の調製および使用は、以下の実施例を参照することによりさらに例示される。本発明の範囲および性質は、本出願の特許請求の範囲により規定されるべきものであり、いかなる点でも、このような実施例に限定されるべきでないことが理解されるべきである。
【実施例】
【００６１】
［実施例１］
ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−コラゲナーゼポリマー溶液：調製およびキャラクタリゼーション
ポリマー保存溶液の調製
トリブロックポリマー、ポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）（Ｍｎ＝１６００−１５００−１６００）を、中国済南のＤａｉｇａｎｇ  Ｂｉｏから取得した。１５％（ｗ／ｖ）のポリマー溶液を、乾燥ポリマーおよび水を２〜８℃で混合することにより調製した。この溶解には、穏やかに撹拌しながら数日間かかる場合がある。その後、溶液を０．２２μｍフィルターでろ過した。滅菌した溶液を等分し、−２０℃で保管する。凍結溶液は、コラゲナーゼ−ヒドロゲル溶液を調製する前に、好ましくは冷蔵庫温度で一晩静置する。
【００６２】
（８３／７／１／９）の比率の超分岐ポリグリセロール（ＨＰＧ）ポリマー、ポリ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＨＥＭＡＰＬＡ−ｃｏ−ＡＡｃ−ｃｏ−ＨＰＧ−ＭＡ）コポリマーは、ＮＣＣＵにより製作された。２０％（ｗ／ｖ）ポリマー溶液を、乾燥ポリマーおよび水を２〜８℃で混合することにより調製する。この溶解には、穏やかに撹拌しながら数日間かかる場合がある。その後、溶液を０．２２μｍフィルターでろ過する。滅菌した溶液は、等分し、−２０℃で保管してもよい。凍結溶液は、コラゲナーゼ−ヒドロゲル溶液を調製する前に、好ましくは冷蔵庫温度で一晩静置する。
【００６３】
ポリマー希釈の方法
ポリマー溶液は、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡは水で１３％に、ＨＰＧポリマー、ポリ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＨＥＭＡＰＬＡ−ｃｏ−ＡＡｃ−ｃｏ−ＨＰＧ−ＭＡ）コポリマーは１７％にさらに希釈する。この溶液のｐＨは４である。この溶液は、３７℃で軟質ゲルを形成することが可能である。酸性条件ではコラゲナーゼの変性が引き起こされることに加えて、１３％または１７％のポリマー溶液は、室温で粘性であることも見出された。
【００６４】
多くの公開されている結果は、実際、通常は４℃である冷蔵ポリマー溶液を使用して得られたものである。４℃という温度は、臨床作業条件としては理想的とは言えず、通常は、周囲温度であることが好ましい。このように粘性であると、注射器で使用することが不可能である。その後、ｐＨ７．５のＴｒｉｓ緩衝液を使用して、ポリマー溶液を希釈した。コラゲナーゼはこの時点で安全であるが、ポリマー溶液は、依然として粘性が高過ぎて、室温では注射器で取り扱うことができなかった。ｐＨ８．５に調節すると、室温でのポリマー溶液の粘性が大幅に低減されることを見出した。ｐＨ８．５ポリマー溶液は、透明の流動性溶液であり、２８Ｇ１／２針を有する注射器で取り扱うことができる。
【００６５】
コラゲナーゼ／ヒドロゲル溶液の調製
コラゲナーゼ／ヒドロゲル溶液は、以下のように調製することができる。（Ａ）計算した容積の無菌０．７５Ｍ  ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を、無菌ポリマー溶液（実施例１）に添加し、（Ｂ）必要容積のポリマー溶液を、凍結乾燥コラゲナーゼ粉末に添加する。ポリマーの終濃度は、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡが１３％（ｗ／ｖ）であり、ＨＰＧポリマー、ポリ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＨＥＭＡＰＬＡ−ｃｏ−ＡＡｃ−ｃｏ−ＨＰＧ−ＭＡ）コポリマーが１７％（ｗ／ｖ）である。溶解したコラゲナーゼは、好ましくは、注射前に３０分間冷蔵庫に静置して、気泡を除去する。
【００６６】
［実施例２］
室温での注射器試験−体温での針試験
多くの熱感受性ヒドロゲル溶液は粘性であり、特に小さなサイズの注射器および針が必要とされる場合、室温では注射器に入れて使用して吸引や空気排出を行うのは難しい。注射器試験は、小さなサイズの注射器および２８Ｇ１／２針を使用して実施する。許容されるポリマー溶液は、室温で小さなサイズの注射器および２８Ｇ１／２針での取り扱いが容易でなければならない。コラゲナーゼ溶液の現行注射様式は、病変内注射によるものであり、臨床医は、プランジャーを押す前に、針を適所に配置するための時間が必要である。針が既に体内に進入しているため、注射器の内容物を放出する前にゲル化が生じる場合がある。針試験は、プランジャーを押してヒドロゲル溶液を放出する前に、３７℃に加温された緩衝液に最大４０秒間にわたって針を浸漬させることにより実施する。
【００６７】
注射器試験は、コラゲナーゼ−ヒドロゲル溶液（０．２５ｍＬ）を、コラゲナーゼ−生理食塩水溶液のように取り扱うことができることを示す。針試験は、体温にてコラゲナーゼ／ヒドロゲルを容易に放出することができることを示す。
【００６８】
［実施例３］
滅菌方法
ポリマー溶液は、４℃にて０．２２μｍフィルターでろ過することにより滅菌することができる。
【００６９】
［実施例４］
ＳＲＣアッセイによる適合性、初期封入、およびコラゲナーゼ放出試験
コラゲナーゼ活性は、生物学的力価試験法−ＳＲＣアッセイにより測定することができる。この方法では、可溶性ラットテイル腱（ｔｒａｉｌ  ｔｅｎｄｏｎ）コラーゲンを基質として使用する。このアッセイは、Ｍａｌｌｙａ（Ｍａｌｌｙａ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５８：３３４−３４５）により最初に開発された方法に基づく。分解したコラーゲン（小ペプチド断片）の量によりコラゲナーゼ活性を測定する。分解したコラーゲンの量は、ニンヒドリン反応により定量化する。反応溶液（紫色ニンヒドリン）の５７０ｎｍでの光学濃度を分光計で測定し、既知量のロイシンを使用したニンヒドリン反応（標準曲線）と比較する。加水分解したｎｍｏｌペプチドを、ｎｍｏｌロイシン等量に計算する。コラゲナーゼ活性の単位は、ｎｍｏｌ  ｌｅｕ当量／分として表した。
【００７０】
２００μｌのコラゲナーゼ／ヒドロゲル溶液を、３７℃に予め加温した１ｍＬ  Ｔｒｉｓ緩衝液（２０ｎＭ  Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン／４ｍＭ酢酸カルシウム  ｐＨ７．４）を有する試験チューブに入れた。ゲル化が即座に生じた。試験チューブを、種々の時間にわたって最大４８時間インキュベートした。上清およびゲルのコラゲナーゼ力価をＳＲＣアッセイで測定した。表Ｉの結果は、コラゲナーゼが、ポリマーおよびゲル化プロセスと適合性であることを示す。こうした結果は、初期に、８０％を超えるコラゲナーゼが、ゲルに封入されることを示す。また、こうした結果は、ほとんどのコラゲナーゼが４８時間でゲルから放出されることを示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験は、同様の封入率および放出パターンを示した。ほとんどの遅延放出ヒドロゲルとは対照的に、本製剤の放出は非常に迅速である。臨床使用には、この相対的に「迅速」な遅延放出がより望ましい。
【００７１】
【表２】
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【００７２】
［実施例５］
ＧＰＡアッセイによる適合性試験
また、ヒドロゲルの適合性を、第２の生物学的力価試験で、つまり合成ペプチド基材に基づくアッセイであるＧＰＡアッセイで確認する。カルボベンゾキシ−グリシル−Ｌ−プロリル−グリシル−グリシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アラニン（ｚＧＰＧＧＰＡ）は、クロストリジウムコラゲナーゼの合成基質である。この基材は、Ａｕｘ  ＩＩコラゲナーゼ（コラゲナーゼＡＢＣ  ＩＩ）により、カルボベンゾルキシ（ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｌｘｙ）−グリシル−Ｌ−プロリル−グリシン（ｚＧＰＧ）およびグリシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アラニン（ＧＰＡ）という２つのペプチドへと直ちに切断される。放出されたＧＰＡの遊離アミノ基を、ニンヒドリン試薬と反応させる。紫色ニンヒドリン反応溶液の５７０ｎｍでの光学濃度を分光計で測定し、コラゲナーゼ参照標準試料とのニンヒドリン反応と比較する。コラゲナーゼ活性の単位は、ｎｍｏｌ  ｌｅｕ当量／分として表した。このアッセイ手順は、Ｗ．Ａｐｐｅｌ［Ｈ．Ｕ．Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ／Ｖｅｒｌａｇ  Ｃｈｅｍｉｅ，１９７４］により最初に開発されたものである。
【００７３】
合計０．３５３ｍｇのコラゲナーゼを、０．３ｍＬの１３．２％トリブロックヒドロゲル溶液、ｐＨ８．５と混合した。０．２ｍＬのコラゲナーゼヒドロゲル溶液を、試験チューブ中の３７℃のｔｒｉｓ緩衝液１ｍＬに添加した。ゲル化が即座に生じた。試験チューブを、３７℃で１時間揺動器に配置した。ゲル化プロセスを経たコラゲナーゼを、ＧＰＡアッセイを使用して対照コラゲナーゼと比較した。対照コラゲナーゼが５１４７３単位／ｍｇであり、およびゲル中のコラゲナーゼが５１１８２単位／ｍｇであったという結果は、コラゲナーゼがポリマーと適合性であったことを示す。
【国際調査報告】
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