(57)【要約】本発明は、例えば血管新生および／または創傷治癒を、ｍｉＲ−１９阻害剤を単独でまたは他の薬剤と組み合わせて用いて促進するための、ｍｉＲ−１９調節物質およびその使用を提供する。本発明は、動脈および心臓の状態を、ｍｉＲ−１９阻害剤を用いて処置または予防する方法も提供する。ｍｉＲ−１９阻害剤である化学的モチーフを有するオリゴヌクレオチド、およびｍｉＲ−１９の機能または活性を阻害することを必要とする被験体においてｍｉＲ−１９の機能または活性を阻害するためのオリゴヌクレオチドの使用方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
創傷治癒を促進することを必要とする被験体における創傷治癒を促進するための方法であって、ｍｉＲ−１９と相補的な配列を含むｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項２】
前記ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤により、ｍｉＲ−１９の機能または活性が低下する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤が、表１から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
創傷治癒を促進するための追加的な薬剤を投与することをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記追加的な薬剤が、ｍｉＲ−９２と相補的な配列を含むｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与により、ｍｉＲ−９２の機能または活性が低下する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤が、表２から選択される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤および前記追加的な薬剤を逐次的に投与する、請求項４から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤および前記追加的な薬剤を同時に投与する、請求項４から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
増殖因子を追加することをさらに含む、請求項１から９に記載の方法。
【請求項１１】
前記増殖因子が、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および／または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記被験体がヒトである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記被験体が、糖尿病に罹患している、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記創傷治癒が、慢性創傷、糖尿病性足部潰瘍、静脈うっ血性下腿潰瘍または褥瘡に対するものである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与により、無処置と比較して、創傷治癒の間の再上皮化、肉芽形成、および／または新血管新生の速度が増大する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤および前記ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与により、無処置または前記ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤または前記ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤のいずれかを単独で用いた処置と比較して、創傷治癒の間の再上皮化、肉芽形成、および／または新血管新生の速度が増大する、請求項５から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ｍｉＲ−１９と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド阻害剤であって、該配列が、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドおよび１つまたは複数の非ロックドヌクレオチドをさらに含み、該非ロックドヌクレオチドの少なくとも１つが、化学修飾を含む、オリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項１８】
ｍｉＲ−１９ａと相補的である、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項１９】
ｍｉＲ−１９ｂと相補的である、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項２０】
前記ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドが、２’−４’メチレン架橋を有する、請求項１７から１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項２１】
前記化学修飾が、２’Ｏ−アルキル修飾または２’ハロ修飾である、請求項１７から２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項２２】
５’キャップ構造、３’キャップ構造、または５’および３’キャップ構造を有する、請求項１７から２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項２３】
ペンダント親油基をさらに含む、請求項１７から２２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項２４】
前記配列が表１から選択される、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項２５】
請求項１７から２４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤、または薬学的に許容されるその塩、および薬学的に許容されるキャリアもしくは希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項２６】
ｍｉＲ−９２と相補的な配列を含むｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤をさらに含む、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記配列が表２から選択される、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
請求項２６または２７に記載の医薬組成物であって、該組成物中の前記ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤の量と前記ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤の量のモル比が、約１：９９から約９９：１までである、医薬組成物。
【請求項２９】
前記ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤と前記ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤のモル比が約１：１である、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
創傷を処置することを必要とする被験体における創傷を処置する方法であって、該被験体に請求項２５から２９のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項３１】
前記創傷が、慢性創傷、糖尿病性足部潰瘍、静脈うっ血性下腿潰瘍または褥瘡である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
創傷治癒を調節するための治療薬の有効性を、該治療薬を受けた被験体において評価またはモニタリングするための方法であって、
ａ）被験体由来の試料から、ｍｉＲ−１９の標的である１つまたは複数の遺伝子の発現を測定すること；および
ｂ）ｍｉＲ−１９の標的である該１つまたは複数の遺伝子の発現を、所定の参照レベルまたは対照試料中のｍｉＲ−１９の標的である該１つまたは複数の遺伝子のレベルと比較し、該比較により該治療薬の有効性が示されることを含み、ここで、該治療薬が、表１から選択される配列を含むオリゴヌクレオチドである、方法。
【請求項３３】
ｍｉＲ−１９の標的である前記１つまたは複数の遺伝子が、ｆｒｉｚｚｌｅｄ−４（ＦＺＤ４）または低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記治療薬が、ｍｉＲ−１９の機能および／または活性を調節する、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記被験体が、虚血、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、末梢もしくは冠動脈閉塞、虚血性梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、冠動脈疾患、頸動脈疾患、糖尿病、慢性創傷（複数可）、末梢血管疾患または末梢動脈疾患に罹患している、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記被験体がヒトである、請求項３２から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
血管新生または創傷治癒を促進する薬剤の能力を評価するための方法であって、
ａ）細胞を、表１から選択される配列を含むオリゴヌクレオチド阻害剤である該薬剤と接触させること；
ｂ）該薬剤と接触させた該細胞における、ｍｉＲ−１９の標的である１つまたは複数の遺伝子の発現を測定すること；および
ｃ）ｍｉＲ−１９の標的である該１つまたは複数の遺伝子の発現を、所定の参照レベルまたは対照試料中のｍｉＲ−１９の標的である該１つまたは複数の遺伝子のレベルと比較し、ここで、該比較により血管新生または創傷治癒を促進する該薬剤の能力が示されること
を含む方法。
【請求項３８】
ｍｉＲ−１９の標的である前記１つまたは複数の遺伝子が、ＦＺＤ４またはＬＲＰ６である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記薬剤と接触させた前記細胞におけるｍｉＲ−１９の機能および／または活性を決定することをさらに含む、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項３７から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞が、心臓細胞、筋肉細胞、線維細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトまたは内皮細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにある、請求項３７から４１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年９月２２日に出願された米国仮出願第６２／２２２，０７９号の優先権の利益を主張し、その内容全体が本明細書に参照によって組み込まれる。
【０００２】
政府援助研究に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された補助金番号ＨＬ０９６６７０のもとの米国政府支援により行われた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
配列表に関する記述
本出願に付随する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、これによって参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称はＭＩＲＧ＿０４８＿０２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは、１７４ＫＢであり、２０１６年９月２２日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【０００４】
発明の分野
本発明は、一般に、ｍｉＲ−１９の機能および／または活性の調節物質、例えば、ｍｉＲ−１９阻害剤である化学的モチーフを有するオリゴヌクレオチド、ならびにその使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ）とは、特異的なメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ：ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ）をターゲティングし、それらの分解または翻訳の抑制を誘導することにより、遺伝子発現を負に調節することが可能な、小型で内因性の非コードＲＮＡのクラスである（Ａｍｂｒｏｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ４３１：３５０−３５５（２００４年）；Ｂａｒｔｅｌ、Ｃｅｌｌ  １３６：２１５−２３３（２００９年））。近年の研究は、ｍＲＮＡの分解を、ｍｉＲＮＡ：ｍＲＮＡ標的の主要な機構的効果と規定している（Ｇｕｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０年  ４６６：８３５−８４０）。
【０００６】
マイクロＲＮＡは、心機能の制御および維持、血管炎症および血管病態の発生を含めた、いくつもの生物学的プロセスに関係づけられている（Ｅｖａ  Ｖａｎ  ＲｏｏｉｊおよびＥｒｉｃ  Ｏｌｓｏｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１１７巻（９号）：２３６９〜２３７６頁（２００７年）；Ｃｈｉｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ、４４７巻：３８９〜３９０頁（２００７年）；ＫａｒｔｈａおよびＳｕｂｒａｍａｎｉａｎ、Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｒｅｓ．、３巻：２５６〜２７０頁（２０１０年）；Ｕｒｂｉｃｈら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．、７９巻：５８１〜５８８頁（２００８年）を参照されたい）。ｍｉＲＮＡはまた、生物体の発生に関与し（Ａｍｂｒｏｓ、Ｃｅｌｌ、１１３巻：６７３〜６７６頁（２００３年））、多数の組織において（Ｘｕら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、１３巻：７９０〜７９５頁（２００３年）；Ｌａｎｄｇｒａｆら、Ｃｅｌｌ、１２９巻：１４０１〜１４頁（２００７年））、ウイルス感染プロセスにおいて（Ｐｆｅｆｆｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０４巻：７３４〜７３６頁（２００４年））示差的に発現し、また、発がんに関連する（Ｃａｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１巻：２９９９〜３００４頁（２００４年）；Ｃａｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９巻（２４号）：１５５２４〜１５５２９頁（２００２年））ことも報告されている。
【０００７】
したがって、マイクロＲＮＡの機能および／または活性の調節は、種々の状態に対する有効な処置の開発における治療標的を示す。しかし、ｍｉＲＮＡをターゲティングするアンチセンスベースの治療剤の送達は、複数の難題を提起しうる。特異的なｍｉＲＮＡに対する結合アフィニティーおよび結合特異性、細胞内の取込みの効率、ならびにヌクレアーゼ耐性は全て、オリゴヌクレオチドベースの治療剤の送達および活性における因子であり得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、無傷細胞へと導入されると、典型的に、ヌクレアーゼにより攻撃および分解され、活性の喪失がもたらされることがあり得る。したがって、有用なアンチセンス治療剤は、細胞外および細胞内のヌクレアーゼに対する耐性が大きいほか、細胞膜を透過することも可能であるはずである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｍｂｒｏｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ４３１：３５０−３５５（２００４年）
【非特許文献２】Ｂａｒｔｅｌ、Ｃｅｌｌ  １３６：２１５−２３３（２００９年）
【非特許文献３】Ｇｕｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０年  ４６６：８３５−８４０
【非特許文献４】Ｅｖａ  Ｖａｎ  ＲｏｏｉｊおよびＥｒｉｃ  Ｏｌｓｏｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１１７巻（９号）：２３６９〜２３７６頁（２００７年）
【非特許文献５】Ｃｈｉｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ、４４７巻：３８９〜３９０頁（２００７年）
【非特許文献６】ＫａｒｔｈａおよびＳｕｂｒａｍａｎｉａｎ、Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｒｅｓ．、３巻：２５６〜２７０頁（２０１０年）
【非特許文献７】Ｕｒｂｉｃｈら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．、７９巻：５８１〜５８８頁（２００８年）
【非特許文献８】Ａｍｂｒｏｓ、Ｃｅｌｌ、１１３巻：６７３〜６７６頁（２００３年）
【非特許文献９】Ｘｕら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、１３巻：７９０〜７９５頁（２００３年）
【非特許文献１０】Ｌａｎｄｇｒａｆら、Ｃｅｌｌ、１２９巻：１４０１〜１４頁（２００７年）
【非特許文献１１】Ｐｆｅｆｆｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０４巻：７３４〜７３６頁（２００４年）
【非特許文献１２】Ｃａｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１巻：２９９９〜３００４頁（２００４年）
【非特許文献１３】Ｃａｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９巻（２４号）：１５５２４〜１５５２９頁（２００２年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、疾患に関連するｍｉＲＮＡを同定すること、ならびに疾患に関連するｍｉＲＮＡの活性を調節することによって疾患、傷害および／または状態を処置する方法が必要とされている。本発明は、これらの必要性を満たし、また、関連する利点も提供する。
本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、被験体に投与した際の効力、送達の効率、標的特異性、安定性、および／または毒性において利点を有し得る。
【００１０】
発明の概要
一態様では、創傷治癒を促進することを必要とする被験体における創傷治癒を促進するための方法であって、ｍｉＲ−１９と相補的な配列を含むｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤を投与することを含む方法が本明細書に提供される。一実施形態では、ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与により、ｍｉＲ−１９の機能または活性が低下する。一実施形態では、ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤は、表１から選択される。一実施形態では、方法は、創傷治癒を促進するための追加的な薬剤を投与することをさらに含む。一実施形態では、追加的な薬剤は、ｍｉＲ−９２と相補的な配列を含むｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤である。一実施形態では、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与により、ｍｉＲ−９２の機能または活性が低下する。一実施形態では、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤は、表２から選択される。一実施形態では、ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤および追加的な薬剤を逐次的に投与する。一実施形態では、ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤および追加的な薬剤を同時に投与する。一実施形態では、方法は、増殖因子を追加することをさらに含む。一実施形態では、増殖因子は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および／または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である。一実施形態では、被験体は、ヒトである。一実施形態では、被験体は、糖尿病に罹患している。一実施形態では、創傷治癒は、慢性創傷、糖尿病性足部潰瘍、静脈うっ血性下腿潰瘍または褥瘡に対するものである。一実施形態では、ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与により、無処置と比較して、創傷治癒の間の再上皮化、肉芽形成、および／または新血管新生の速度が増大する。一実施形態では、ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤およびｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤の投与により、無処置またはｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤またはｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤のいずれかを単独で用いた処置と比較して、創傷治癒の間の再上皮化、肉芽形成、および／または新血管新生の速度が増大する。
【００１１】
別の態様では、ｍｉＲ−１９と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド阻害剤であって、配列が、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドおよび１つまたは複数の非ロックドヌクレオチドをさらに含み、非ロックドヌクレオチドの少なくとも１つが、化学修飾を含む、オリゴヌクレオチド阻害剤が本明細書に提供される。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１９ａと相補的である。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１９ｂと相補的である。一実施形態では、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドは、２’−４’メチレン架橋を有する。一実施形態では、化学修飾は、２’Ｏ−アルキル修飾または２’ハロ修飾である。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、５’キャップ構造、３’キャップ構造、または５’および３’キャップ構造を有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ペンダント親油基をさらに含む。一実施形態では、配列は、表１から選択される。
【００１２】
別の態様では、ｍｉＲ−１９と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド阻害剤であって、配列が、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドおよび１つまたは複数の非ロックドヌクレオチドをさらに含み、非ロックドヌクレオチドの少なくとも１つが、化学修飾を含む、オリゴヌクレオチド阻害剤、または薬学的に許容されるその塩、および薬学的に許容されるキャリアもしくは希釈剤を含む医薬組成物が本明細書に提供される。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１９ａと相補的である。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１９ｂと相補的である。一実施形態では、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドは、２’−４’メチレン架橋を有する。一実施形態では、化学修飾は、２’Ｏ−アルキル修飾または２’ハロ修飾である。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、５’キャップ構造、３’キャップ構造、または５’および３’キャップ構造を有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、ペンダント親油基をさらに含む。一実施形態では、配列は、表１から選択される。一実施形態では、医薬組成物は、ｍｉＲ−９２と相補的な配列を含むｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤をさらに含む。一実施形態では、配列は、表２から選択される。一実施形態では、組成物中のｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤の量とｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤の量のモル比は、約１：９９から約９９：１までである。一実施形態では、ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤とｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤のモル比は、約１：１である。一実施形態では、医薬組成物は、創傷を処置することを必要とする被験体において創傷を処置する方法において使用され、該方法は、医薬組成物を被験体に投与することを含む。一実施形態では、創傷は、慢性創傷、糖尿病性足部潰瘍、静脈うっ血性下腿潰瘍または褥瘡である。
【００１３】
さらに別の態様では、創傷治癒を調節するための治療薬の有効性を、該治療薬を受けた被験体において評価またはモニタリングするための方法であって、ａ．）被験体由来の試料からの、ｍｉＲ−１９の標的である１つまたは複数の遺伝子の発現を測定すること；およびｂ．）ｍｉＲ−１９の標的である１つまたは複数の遺伝子の発現を、所定の参照レベルまたは対照試料中のｍｉＲ−１９の標的である１つまたは複数の遺伝子のレベルと比較し、比較により治療薬の有効性が示されることを含み、ここで、治療薬が、表１から選択される配列を含むオリゴヌクレオチドである、方法が本明細書に提供される。一実施形態では、ｍｉＲ−１９の標的である１つまたは複数の遺伝子は、ｆｒｉｚｚｌｅｄ−４（ＦＺＤ４）または低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）である。一実施形態では、治療薬は、ｍｉＲ−１９の機能および／または活性を調節する。一実施形態では、被験体は、虚血、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、末梢もしくは冠動脈閉塞、虚血性梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、冠動脈疾患、頸動脈疾患、糖尿病、慢性創傷（複数可）、末梢血管疾患または末梢動脈疾患に罹患している。一実施形態では、被験体は、ヒトである。別の態様では、血管新生または創傷治癒を促進する薬剤の能力を評価するための方法であって、ａ．）細胞を、表１から選択される配列を含むオリゴヌクレオチド阻害剤である薬剤と接触させること；ｂ．）薬剤と接触させた細胞における、ｍｉＲ−１９の標的である１つまたは複数の遺伝子の発現を測定すること；およびｃ．）ｍｉＲ−１９の標的である１つまたは複数の遺伝子の発現を、所定の参照レベルまたは対照試料中のｍｉＲ−１９の標的である１つまたは複数の遺伝子のレベルと比較し、比較により血管新生または創傷治癒を促進する薬剤の能力が示されることを含む方法が本明細書に提供される。一実施形態では、ｍｉＲ−１９の標的である１つまたは複数の遺伝子は、ＦＺＤ４またはＬＲＰ６である。一実施形態では、方法は、薬剤と接触させた細胞におけるｍｉＲ−１９の機能および／または活性を決定することをさらに含む。一実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一実施形態では、細胞は、心臓細胞、筋肉細胞、線維細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトまたは内皮細胞である。一実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにある。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１Ａは、外科手術前３日間にわたって毎日、その後、週に１回、対照または抗ｍｉＲ−１９を１２．５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下注射したマウスにおいて、深部透過レーザードップラープローブ（deep  penetrating  laser  doppler  probe）を使用して、外科手術の前および後の腓腹筋流（gastrochnemius  flow）を測定し、その後、週に１回測定することによって定量した灌流を例示するグラフである。図１Ａのデータは、群当たりｎ＝９のマウス、＊ｐ＜０．０５、二元配置ＡＮＯＶＡである。図１Ｂは、ＢＡＴ  ｇａｌマウスにおいて、ＬＮＡ−抗ｍｉＲ手法およびＨＬＩを使用して、虚血組織内の再生している筋線維の周囲の毛細血管ＥＣにおけるレポーター遺伝子発現が、抗ｍｉＲ−１９により増大したが、対照では増大しなかったことを例示する図である。
【００１５】
【図２】図２Ａ〜Ｃは、抗ｍｉＲ−１９を用いた処置により、抗ｍｉＲ−１９を実施例１に記載の通り投与したマウスの組織において、ｍｉＲ−１９レベルが低下し（図２Ａ）、ｍｉＲ−１９の直接標的であるＦＲＺＤ４（図２Ｂ）およびＬＲＰ６（図２Ｃ）のｍＲＮＡレベルが上方制御されたことを例示するグラフである。データは、群当たりｎ＝４のマウスからのものである；＊ｐ＜０．０５、二元配置ＡＮＯＶＡ。全てのデータは、平均＋／−ＳＥＭである。
【００１６】
【図３】図３Ａは、ＦＺＤ４の３’ＵＴＲ（配列番号１８８および１８９）およびＬＲＰ６（配列番号１９０）の３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−１９（配列番号１）予測結合性部位の配列の略図である。変異部位にはアスタリスク（＊）で印がつけられている。ｍｉＲ１９ａとｍｉＲ１９ｂの間の配列の差異には＿で印がつけられている。図３Ｂは、ルシフェラーゼアッセイにおいて、予測ｍｉＲ−１９標的部位の変異（図３Ａ中の＊）により、ＦＺＤ４およびＬＲＰ６の３’ＵＴＲ  ＬＵＣ活性のｍｉＲ−１９媒介性抑制が低減することを例示するグラフである。データは、３回の独立した実験からの平均＋／−ＳＥＭである。
【００１７】
【図４Ａ】図４Ａは、ｍｉＲ−１９模倣物または模倣物対照のいずれかをトランスフェクトしたマウス肺内皮細胞（ＭＬＥＣ）からの結果を例示するグラフである。４８時間後、細胞を、Ｗｎｔファミリーメンバー３Ａ（ＷＮＴ３ａ）を用いて処理した。ｍｉＲ−１９でトランスフェクトされた細胞では、ＷＮＴ３ａによる処理に応答して、Ａｘｉｎ２、Ｓｏｘ１７およびＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１を含めたいくつかのβ−カテニン依存性遺伝子の発現の低下がもたらされた。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＷＮＴ３ａによる刺激前４８時間にわたって対照または抗ｍｉＲ−１９（各６０ｎＭ）をトランスフェクトしたＭＬＥＣからの結果を例示する図である。細胞を４時間にわたって飢餓状態にさせ、次いで、上記の時点でＷＮＴ３ａ馴化培地を用いて処理した。溶解物を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、ｐ−ＪＮＫ、総ＪＮＫ、およびＨｓｐ９０について免疫ブロットした。
【００１８】
【図５ＡＢ】図５Ａ〜Ｄは、皮膚創傷の部位に対照、抗ｍｉＲ−９２（３０ｎｍｏｌおよび６０ｎｍｏｌの用量）、抗ｍｉＲ−１９（３０ｎｍｏｌおよび６０ｎｍｏｌの用量）または抗ｍｉＲ−９２と抗ｍｉＲ−１９の組合せ（各３０ｎｍｏｌ）を皮内注射した糖尿病マウスにおける皮膚創傷治癒パラメータを例示するグラフである。図５Ａは、パーセント再上皮化（｛１−［上皮の間隙を創傷の幅で割ったもの］｝×１００）を例示し、図５Ｂは、肉芽組織で充填された各創傷のパーセント（｛１−［肉芽組織の間隙を創傷の幅で割ったもの］｝×１００）を例示し、図５Ｃは、創傷内の肉芽組織面積を例示し、図５Ｄは、創傷内の肉芽組織の厚さの平均を例示する。データは、群当たりｎ＝１０匹のマウス、マウス当たり２つの創傷からのものである；＊ｐ＞０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、クラスカル・ワリス検定とダンの多重比較検定。全てのデータは、平均＋／−ＳＥＭである。
【図５ＣＤ】図５Ａ〜Ｄは、皮膚創傷の部位に対照、抗ｍｉＲ−９２（３０ｎｍｏｌおよび６０ｎｍｏｌの用量）、抗ｍｉＲ−１９（３０ｎｍｏｌおよび６０ｎｍｏｌの用量）または抗ｍｉＲ−９２と抗ｍｉＲ−１９の組合せ（各３０ｎｍｏｌ）を皮内注射した糖尿病マウスにおける皮膚創傷治癒パラメータを例示するグラフである。図５Ａは、パーセント再上皮化（｛１−［上皮の間隙を創傷の幅で割ったもの］｝×１００）を例示し、図５Ｂは、肉芽組織で充填された各創傷のパーセント（｛１−［肉芽組織の間隙を創傷の幅で割ったもの］｝×１００）を例示し、図５Ｃは、創傷内の肉芽組織面積を例示し、図５Ｄは、創傷内の肉芽組織の厚さの平均を例示する。データは、群当たりｎ＝１０匹のマウス、マウス当たり２つの創傷からのものである；＊ｐ＞０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、クラスカル・ワリス検定とダンの多重比較検定。全てのデータは、平均＋／−ＳＥＭである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
ｍｉＲ−１９は、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、およびｍｉＲ−９２−１からなるｍｉＲ−１７−９２クラスターに位置する（Venturiniら、Blood  １０９巻、１０号：４３９９〜４４０５頁（２００７年））。ｍｉＲ−１９のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列がプロセシングされて成熟配列（３ｐ）およびアスタリスク付きの（star）（すなわち副または５ｐ）配列になる。アスタリスク付きの配列は、幹ループ構造の他方の腕からプロセシングされる。ヒトおよびマウスのｍｉＲ−１９の成熟ｍｉＲＮＡ配列およびアスタリスク付きのｍｉＲＮＡ配列を提示する：
【化１】
2018528967.tif 000002
【００２０】
本発明は、ｍｉＲ−１９（例えば、ヒトｍｉＲ−１９）の活性または機能を低下させるまたは阻害するオリゴヌクレオチド阻害剤および組成物およびその使用を提供する。ｍｉＲ−１９模倣物などのｍｉＲ−１９アゴニストも本明細書に提供される。
【００２１】
「ｍｉＲ−１９」という用語は、本明細書で使用される場合、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１９、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐを含む。
【００２２】
一実施形態では、ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤は、本明細書に記載のｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１９ａ＊、ｍｉＲ−１９ｂ−１＊、ｍｉＲ−１９ｂ−２＊）の阻害剤である。別の実施形態では、ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−１９ａの阻害剤、ｍｉＲ−１９ｂの阻害剤、またはｍｉＲ−１９ａおよびｍｉＲ−１９ｂの両方の阻害剤である。さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤は、ｍｉＲ−１９ｂ阻害剤である。さらなる実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤は、ｍｉＲ−１９ａ阻害剤である。
【００２３】
本発明によるｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤の配列は、ｍｉＲ−１９と生理的条件下でハイブリダイズし、被験体の細胞（複数可）におけるｍｉＲ−１９の活性または機能を阻害することに関して、ｍｉＲ−１９の配列と十分に相補的である。例えば、一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、成熟ｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂ）配列と少なくとも部分的に相補的な配列、例えば、ｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂ）の成熟配列と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的な配列からなっても、それから本質的になっても、それを含んでもよい。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤（アンチセンスオリゴヌクレオチドとも称される）は、成熟ｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂ）配列と１００％相補的な配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含む。これに関連して、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、５’末端と３’末端のいずれかまたはその両方への任意選択のヌクレオチドの付加（例えば、１つまたは２つ）を、追加的なヌクレオチド（複数可）が、被験体内の細胞におけるｍｉＲ−１９活性のオリゴヌクレオチドによる阻害に、または本明細書に提供されるアッセイに実質的に影響を及ぼさない（ＩＣ５０の増大が２０％以下であることによって定義される）限りは含む。オリゴヌクレオチド阻害剤の配列は、オリゴヌクレオチド阻害剤配列が天然に存在するヌクレオチドの代わりに修飾されたヌクレオチドを含んでいたとしても、ｍｉＲ−１９と相補的であるとみなされることが理解される。例えば、ｍｉＲ−１９の成熟配列が特定の位置にグアノシンヌクレオチドを含む場合、オリゴヌクレオチド阻害剤は、対応する位置にロックドシチジンヌクレオチドまたは２’−フルオロ−シチジンなどの修飾されたシチジンヌクレオチドを含んでよい。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤を、完全に相補的な（成熟）ｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂ）配列と比較して１〜５つ（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つ）のミスマッチを含有する配列を有するように設計することができる。ある特定の実施形態では、そのようなアンチセンス配列は、例えば、ｓｈＲＮＡまたはステムループ部分を含有する他のＲＮＡ構造物に組み入れることができる。
【００２４】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤の配列全体は、ヒトｍｉＲ−１９ｂ−３ｐの成熟配列と完全に相補的である。種々の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の配列が部分的に、実質的に、または完全に相補的であるヒトｍｉＲ−１９ｂ−３ｐの成熟配列は、配列番号３の５’末端からヌクレオチド１〜２３またはヌクレオチド２〜１５を含む（to  includes）。一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の配列が部分的に、実質的に、または完全に相補的であるヒトｍｉＲ−１９ｂ−３ｐの成熟配列は、配列番号３の５’末端からヌクレオチド２〜１５を含む。
【００２５】
一実施形態では、本明細書で提供されるｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤を別のｍｉＲＮＡの阻害剤と一緒に投与する。両方の阻害剤は、単一の組成物（例えば、本明細書に提供される医薬組成物）中に存在してもよく、別々の組成物（例えば、本明細書に提供される医薬組成物）中に存在してもよい。一実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤をｍｉＲ−１７−９２クラスターに位置するｍｉＲＮＡの阻害剤と一緒に投与する。一実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤を、例えば、その内容全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６０２０８２５８に開示されているｍｉＲ−９２阻害剤などの、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤と一緒に投与する。
【００２６】
したがって、本発明は、ｍｉＲ−９２の活性または機能を低下させるまたは阻害するオリゴヌクレオチド阻害剤も提供する。
【００２７】
「ｍｉＲ−９２」という用語は、本明細書で使用される場合、ｐｒｉ−ｍｉＲ−９２、ｐｒｅ−ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−９２ｂ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐを含む。
【００２８】
ヒト、マウス、およびラットｍｉＲ−９２の成熟ｍｉＲＮＡ配列およびアスタリスク付きのｍｉＲＮＡ配列を提示する：
【化２】
2018528967.tif 000003
【化３】
2018528967.tif 000004
【００２９】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤は、ｍｉＲ−９２（例えば、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−１−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−２−５ｐ）の阻害剤である。一実施形態では、ｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤は、成熟ｍｉＲ−９２（例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ）の阻害剤である。
【００３０】
本発明によるｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤の配列は、ｍｉＲ−９２と生理的条件下でハイブリダイズし、被験体の細胞（複数可）におけるｍｉＲ−９２の活性または機能を阻害することに関して、ｍｉＲ−９２の配列と完全に相補的である。例えば、一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、成熟ｍｉＲ−９２配列と少なくとも部分的に相補的な配列、例えば、ｍｉＲ−９２の成熟配列と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的な配列からなっても、それから本質的になっても、それを含んでもよい。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤（アンチセンスオリゴヌクレオチドとも称される）は、成熟ｍｉＲ−９２配列と１００％相補的な配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含む。これに関連して、「から本質的になる」とは、５’末端と３’末端のいずれかまたはその両方への任意選択のヌクレオチドの付加（例えば、１つまたは２つ）を、追加的なヌクレオチド（複数可）が、被験体内の細胞におけるｍｉＲ−９２活性のオリゴヌクレオチドによる阻害に、または本明細書に提供されるアッセイに実質的に影響を及ぼさない（ＩＣ５０の増大が２０％以下であることによって定義される）限りは含む。オリゴヌクレオチド阻害剤の配列は、オリゴヌクレオチド阻害剤配列が天然に存在するヌクレオチドの代わりに修飾されたヌクレオチドを含んでいたとしても、ｍｉＲ−９２と相補的であるとみなされることが理解される。例えば、ｍｉＲ−９２の成熟配列が特定の位置にグアノシンヌクレオチドを含む場合、オリゴヌクレオチド阻害剤は、対応する位置にロックドシチジンヌクレオチドまたは２’−フルオロ−シチジンなどの修飾されたシチジンヌクレオチドを含んでよい。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤を、完全に相補的な（成熟）ｍｉＲ−９２配列と比較して１〜５つ（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つ）のミスマッチを含有する配列を有するように設計することができる。ある特定の実施形態では、そのようなアンチセンス配列は、例えば、ｓｈＲＮＡまたはステムループ部分を含有する他のＲＮＡ構造物に組み入れることができる。
【００３１】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤の配列全体は、ヒトｍｉＲ−９２ａ−３ｐの成熟配列と完全に相補的である。種々の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の配列が部分的に、実質的に、または完全に相補的であるヒトｍｉＲ−９２ａ−３ｐの成熟配列は、配列番号１３の５’末端からヌクレオチド１〜２２またはヌクレオチド２〜１７を含む。一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の配列が部分的に、実質的に、または完全に相補的であるヒトｍｉＲ−９２ａ−３ｐの成熟配列は、配列番号１３の５’末端からヌクレオチド２〜１７を含む。
【００３２】
本発明に関しては、「オリゴヌクレオチド阻害剤」、「抗ｍｉＲ」、「アンタゴニスト」、「アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＡＳＯ」、「オリゴマー」、「抗マイクロＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはＡＭＯ」、または「ミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）」という用語は広範に使用され、標的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の活性または機能を、ｍｉＲＮＡと完全にまたは部分的にハイブリダイズし、それにより、標的ｍｉＲＮＡの機能または活性を抑制することによって阻害するリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾されたリボヌクレオチド、修飾されたデオキシリボヌクレオチドまたはこれらの組合せを含むオリゴマーを包含する。
【００３３】
「約」という用語は、本明細書で使用される場合、＋／−１０％、より好ましくは＋／−５％の変動を包含するものとし、そのような変動は本発明の実行に適するものである。
【００３４】
一般に、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｍｉＲ−１９またはｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤）の長さは、オリゴヌクレオチドにより標的ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１９またはｍｉＲ−９２）の活性または機能が低下するようなものであり得る。本明細書に提供されるｍｉＲ−１９および／またはｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤は、８〜２０ヌクレオチドの長さ、１５〜５０ヌクレオチドの長さ、１８〜５０ヌクレオチドの長さ、１０〜１８ヌクレオチドの長さ、または１１〜１６ヌクレオチドの長さであってよい。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１９またはｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤は、約８ヌクレオチド、約９ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１１ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１３ヌクレオチド、約１４ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１６ヌクレオチド、約１７ヌクレオチド、または約１８ヌクレオチドの長さであってよい。一実施形態では、本発明は、１１〜１６ヌクレオチドの長さを有するｍｉＲ−１９またはｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。種々の実施形態では、ｍｉＲ−１９またはｍｉＲ−９２を標的とするオリゴヌクレオチド阻害剤は、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、または１６ヌクレオチドの長さである。一実施形態では、ｍｉＲ−１９またはｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１９またはｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも１６ヌクレオチドの長さである。
【００３５】
本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｍｉＲ−１９および／またはｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤）は、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）残基、または「ロックドヌクレオチド」を含んでよい。本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）残基、または「ロックドヌクレオチド」を含有してよい。ＬＮＡは、例えば、全てが本明細書によってその全体が参照により組み込まれる米国特許第６，２６８，４９０号；同第６，３１６，１９８号；同第６，４０３，５６６号；同第６，７７０，７４８号；同第６，９９８，４８４号；同第６，６７０，４６１号；および同第７，０３４，１３３号に記載されている。ＬＮＡは、「ロックド」コンフォメーションをもたらすリボース糖部分の２’炭素と４’炭素との間の追加の架橋、および／または二環式構造を含有する修飾されたヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、下の構造Ａによって示される構造を有するＬＮＡを１つまたは複数含むか、または含有する。その代わりにまたはそれに加えて、オリゴヌクレオチドは、下の構造Ｂによって示される構造を有するＬＮＡを１つまたは複数含むか、または含有してよい。その代わりにまたはそれに加えて、オリゴヌクレオチドは、下の構造Ｃによって示される構造を有するＬＮＡを１つまたは複数含むか、または含有する。
【化４】
2018528967.tif 000005
【００３６】
本発明に関しては、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドの、その対応するロックドヌクレオチドによる置換について言及する場合、「対応するロックドヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ／ＲＮＡヌクレオチドが、それが置き換えられたＤＮＡ／ＲＮＡヌクレオチドと同じ天然に存在する窒素塩基または化学修飾された同じ窒素塩基を含有するロックドヌクレオチドによって置き換えられていることを意味するものとする。例えば、窒素塩基Ｃを含有するＤＮＡヌクレオチドの対応するロックドヌクレオチドは、同じ窒素塩基Ｃまたは化学修飾された同じ窒素塩基Ｃ、例えば５−メチルシトシンを含有してよい。
【００３７】
「非ロックドヌクレオチド」という用語は、ロックドヌクレオチドとは異なるヌクレオチドを指す、すなわち、「非ロックドヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ならびに、修飾がロックド修飾ではないことを除いては、塩基および／または糖が修飾されたものである、修飾されたヌクレオチドを含む。
【００３８】
本発明のオリゴヌクレオチドに組み入れることができる他の適切なロックドヌクレオチドとしては、どちらも本明細書によってその全体が参照により組み込まれる米国特許第６，４０３，５６６号および同第６，８３３，３６１号に記載されているものが挙げられる。
【００３９】
例示的な実施形態では、ロックドヌクレオチドは、例えば構造Ａに示されている２’−４’メチレン架橋を有する。他の実施形態では、架橋は、メチレン基またはエチレン基を含み、これは置換されていてもよく、そして２’位にエーテル結合を有しても有さなくてもよい。
【００４０】
本明細書に提供される本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｍｉＲ−１９および／またはｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤）は、一般に、少なくとも約１つ、少なくとも約２つ、少なくとも約３つ、少なくとも約４つ、少なくとも約５つ、少なくとも約７つ、または少なくとも約９つのＬＮＡを含有することができる。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｍｉＲ−１９および／またはｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤）は、ＬＮＡと非ロックドヌクレオチドとの混合物を含む。例えば、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｍｉＲ−１９および／またはｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤）は、少なくとも５つまたは少なくとも７つまたは少なくとも９つのロックドヌクレオチドと、少なくとも１つの非ロックドヌクレオチドとを含有してよい。一般に、ＬＮＡの数および位置は、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｍｉＲ−１９および／またはｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤）によりｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの機能または活性が低下するようなものである。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３つより多い連続したＬＮＡを有するひと続きのヌクレオチドを含有しない。例えば、オリゴヌクレオチドは、３つ以下の連続したＬＮＡを含む。これらまたは他の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｍｉＲ−１９および／またはｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤）は、ｍｉＲＮＡシード領域（すなわち、ｍｉＲ−１９シード領域またはｍｉＲ−９２シード領域）と実質的にまたは完全に相補的であって、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのロックドヌクレオチドを含む領域または配列を含んでよい。さらに別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｍｉＲ−１９および／またはｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤）は、配列の５’末端にＬＮＡを、配列の３’末端にＬＮＡを、または５’末端と３’末端の両方にＬＮＡを含んでよい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｍｉＲ−１９またはｍｉＲ−９２）はヌクレオチドの配列を含んでよく、その配列は、少なくとも５つのＬＮＡ、配列の５’末端にＬＮＡを、配列の３’末端にＬＮＡを、またはそれらの任意の組合せを含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤はヌクレオチドの配列を含み、少なくとも５つのＬＮＡ、配列の５’末端にＬＮＡを、配列の３’末端にＬＮＡを、またはそれらの任意の組合せを含み、ここで、ヌクレオチドの３つまたはそれ未満は連続したＬＮＡである。
【００４１】
ある特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｍｉＲ−１９および／またはｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤）は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのＤＮＡヌクレオチドを含有する。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも１つのＬＮＡを含み、オリゴヌクレオチド阻害剤内の各非ロックドヌクレオチドはＤＮＡヌクレオチドである。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも２つのＬＮＡを含み、オリゴヌクレオチド阻害剤内の各非ロックドヌクレオチドはＤＮＡヌクレオチドである。一実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも２番目のヌクレオチドはＤＮＡヌクレオチドである。一実施形態では、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのＤＮＡヌクレオチドが化学修飾された窒素塩基を含有する。一実施形態では、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から２番目のヌクレオチドは化学修飾された窒素塩基を含有する。化学修飾された窒素塩基は、５−メチルシトシンであってよい。一実施形態では、５’末端から２番目のヌクレオチドは、５−メチルシトシンである。一実施形態では、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド阻害剤は、シトシンである各ＬＮＡに５−メチルシトシンを含む。
【００４２】
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤中の非ロックドヌクレオチドに関して、ヌクレオチドは、２’ヒドロキシルに関して２’修飾を含有してよい。例えば、２’修飾は、２’デオキシであってよい。２’修飾されたヌクレオチドを本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み入れることにより、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼに対する抵抗性が増大し得る。２’修飾されたヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み入れることにより、相補的なＲＮＡとのそれらの熱安定性が増大し得る。２’修飾されたヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み入れることによりオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼに対する抵抗性および相補的なＲＮＡとのそれらの熱安定性の両方が増大し得る。２’位における種々の修飾は、独立に、ＲＮＡ標的との分子相互作用または細胞機構を損なうことなくヌクレアーゼ感受性の増大をもたらす修飾から選択される。そのような修飾は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの効力の増大に基づいて選択することができる。ｍｉＲ−１９および／またはｍｉＲ−９２の阻害に関する効力の増大（例えば、ＩＣ５０）を決定するための例示的な方法は、これだけに限定されないが、二重ルシフェラーゼアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｍｉＲＮＡの発現または標的抑制解除を含め、本明細書に記載されている。
【００４３】
一部の実施形態では、２’修飾は、独立に、Ｏ−アルキル（置換されていてもよい）、ハロ、およびデオキシ（Ｈ）から選択することができる。ある特定の実施形態では、非ロックドヌクレオチドの実質的に全てまたは全てのヌクレオチドの２’位を、例えば、独立に、Ｏ−アルキル（例えば、Ｏ−メチル）、ハロ（例えば、フルオロ）、デオキシ（Ｈ）、およびアミノから選択される通り修飾することができる。例えば、２’修飾は、各々独立に、Ｏ−メチル（ＯＭｅ）およびフルオロ（Ｆ）から選択することができる。例示的な実施形態では、プリンヌクレオチドは各々２’ＯＭｅを有し、ピリミジンヌクレオチドは各々２’−Ｆを有する。ある特定の実施形態では、１つ〜約５つの２’位、または約１つ〜約３つの２’位が修飾されていないままである（例えば、２’ヒドロキシルのように）。
【００４４】
本発明による２’修飾は、小さな炭化水素置換基も含み得る。炭化水素置換基としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアルコキシアルキルが挙げられ、アルキル（アルコキシのアルキル部分を含む）、アルケニルおよびアルキニルは置換されていても置換されていなくてもよい。アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル、アルケニルまたはアルキニル、例えば、Ｃ１、Ｃ２、またはＣ３などであってよい。炭化水素置換基は、１つまたは２つまたは３つの非炭素原子を含んでよく、これは、独立に、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、および／または硫黄（Ｓ）から選択することができる。２’修飾は、アルキル、アルケニル、およびアルキニルをＯ−アルキル、Ｏ−アルケニル、およびＯ−アルキニルとしてさらに含んでよい。
【００４５】
本発明による２’修飾の例としては、２’−Ｏ−アルキル（Ｃ１〜３アルキル、例えば、２’ＯＭｅまたは２’ＯＥｔなど）置換、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）置換、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）置換、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）置換、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）置換、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）置換、または２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）置換が挙げられ得る。
【００４６】
ある特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも１つの２’−ハロ修飾（例えば、２’ヒドロキシルの代わりに）、例えば、２’−フルオロ、２’−クロロ、２’−ブロモ、および２’−ヨードなどを含有する。一部の実施形態では、２’ハロ修飾はフルオロである。オリゴヌクレオチド阻害剤は、１つ〜約５つの２’−ハロ修飾（例えば、フルオロ）、または１つ〜約３つの２’−ハロ修飾（例えば、フルオロ）を含有してよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、全ての２’−フルオロヌクレオチドを非ロックド位に含有する、または全ての非ロックドピリミジンヌクレオチド上に２’−フルオロを含有する。ある特定の実施形態では、２’−フルオロ基は、独立に、ジメチル化されている、トリメチル化されている、またはメチル化されていない。
【００４７】
本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド阻害剤は、１つまたは複数の２’−デオキシ修飾（例えば、２’ヒドロキシルについてのＨ）を有してよく、一部の実施形態では、２〜約１０の２’−デオキシ修飾を非ロックド位に含有する、または、全ての非ロックド位に２’デオキシを含有する。
【００４８】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド阻害剤は、２’ＯＭｅに修飾された２’位を非ロックド位に含有する。あるいは、非ロックドプリンヌクレオチドは、２’位で２’ＯＭｅに修飾されていてよく、非ロックドピリミジンヌクレオチドは２’位で２’−フルオロに修飾されていてよい。
【００４９】
例示的な実施形態では、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド阻害剤は、２’ＯＭｅに修飾された２’位を非ロックド位に含有する。あるいは、非ロックドプリンヌクレオチドは、２’位で２’ＯＭｅに修飾されていてよく、非ロックドピリミジンヌクレオチドは２’位で２’−フルオロに修飾されていてよい。
【００５０】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも１つの末端修飾または「キャップ」をさらに含む。キャップは、５’および／または３’キャップ構造であってよい。「キャップ」または「末端キャップ」という用語は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端における化学修飾（末端リボヌクレオチドに関して）を含み、そして５’末端上の最後の２つのヌクレオチドと３’末端上の最後の２つのヌクレオチドの間の連結における修飾を含む。本明細書に記載のキャップ構造により、ｍｉＲＮＡ標的（すなわち、ｍｉＲ−１９）または細胞機構との分子相互作用を損なうことなくオリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼに対する抵抗性を増大させることができる。そのような修飾は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの効力の増大に基づいて選択することができる。キャップは５’末端に存在してもよく（５’キャップ）、３’末端に存在してもよく（３’キャップ）、両末端上に存在してもよい。ある特定の実施形態では、５’キャップおよび／または３’キャップは、独立に、ホスホロチオエートモノホスフェート、脱塩基残基（部分）、ホスホロチオエート結合、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、反転ヌクレオチド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）または反転脱塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ａｂａｓｉｃ）部分（２’−３’または３’−３’）、ホスホロジチオエートモノホスフェート、およびメチルホスホネート部分から選択される。ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合（複数可）は、キャップ構造の一部である場合、一般に、５’末端上の２つの末端ヌクレオチドと３’末端上の２つの末端ヌクレオチドの間に配置される。
【００５１】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも１つの末端ホスホロチオエートモノホスフェートを有する。ホスホロチオエートモノホスフェートは、エキソヌクレアーゼの作用を阻害することによってより高い効力を支持し得る。ホスホロチオエートモノホスフェートは、オリゴヌクレオチドの５’末端および／または３’末端にあってよい。ホスホロチオエートモノホスフェートは以下の構造によって定義され、式中、Ｂは塩基であり、Ｒは上記の２’修飾である：
【化５】
2018528967.tif 000006
【００５２】
キャップ構造によりロックドヌクレオチドの化学的性質を支持することができる場合、キャップ構造に本明細書に記載のＬＮＡを組み入れることができる。
【００５３】
本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド阻害剤のいくつかの実施形態では、ホスホロチオエート結合は、例えば、５’末端および３’末端上の最後の２つのヌクレオチド間に存在してもよく（例えば、キャップ構造の一部として）、ホスホジエステル結合と交互に存在してもよい。これらのまたは他の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤は、５’末端と３’末端のいずれかまたはその両方に少なくとも１つの末端脱塩基残基を含有してよい。脱塩基部分は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンなどの一般に認識されているプリンヌクレオチド塩基またはピリミジンヌクレオチド塩基を含有しない。したがって、そのような脱塩基部分はヌクレオチド塩基を欠く、または１’位にヌクレオチド塩基ではない他の化学基を有する。例えば、脱塩基ヌクレオチドは、例えば、逆脱塩基（ｒｅｖｅｒｓｅ  ａｂａｓｉｃ）ホスホルアミダイトが５’アミダイト（３’アミダイトの代わりに）を介してカップリングし、それにより５’−５’リン酸結合が生じた、逆脱塩基ヌクレオチドであってよい。ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端の逆脱塩基ヌクレオシドの構造が下に示されている。
【化６】
2018528967.tif 000007
【００５４】
本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド阻害剤は、１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含有してよい。ホスホロチオエート結合は、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼによる切断に対してより抵抗性にするために使用されて得る。例えば、ポリヌクレオチドは部分的にホスホロチオエート結合していてよく、例えば、ホスホロチオエート結合とホスホジエステル結合が交互になっていてよい。しかし、ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは完全にホスホロチオエート結合している。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは１つ〜５つまたは１つ〜３つのリン酸結合を有する。
【００５５】
一部の実施形態では、ヌクレオチドは、本明細書によって参照により組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１１／５９５８８に記載されている１つまたは複数のカルボキシアミド修飾塩基を、そこに複素環置換基と共に開示されている例示的なピリミジンカルボキシアミド修飾の全てに関しても含めて有する。
【００５６】
修飾されたポリヌクレオチドを含めたオリゴヌクレオチドの固相合成による合成は周知であり、Caruthersら、Nucleic  Acids  Symp.  Ser.、７巻：２１５〜２３頁（１９８０年）に概説されている。
【００５７】
本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、塩基修飾または置換を有する修飾されたヌクレオチドを含んでよい。ＲＮＡ内の天然のまたは修飾されていない塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）（ＤＮＡはチミン（Ｔ）を有する）である。修飾された塩基は、複素環式塩基部分とも称され、それらとして、他の合成および天然の核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ（５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシンを含む）、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−１９またはｍｉＲ−９２を標的とするオリゴヌクレオチド阻害剤は、１つまたは複数のＢＳＮ修飾（すなわち、ＬＮＡ）を塩基修飾（例えば、５−メチルシチジン）と組み合わせて含む。
【００５８】
本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、修飾された糖部分を有するヌクレオチドを含んでよい。代表的な修飾された糖としては、炭素環式または非環式糖、それらの２’位、３’位または４’位の１つまたは複数に置換基群を有する糖、および、糖の１つまたは複数の水素原子の代わりに置換基を有する糖が挙げられる。ある特定の実施形態では、糖は、２’位に置換基群を有することによって修飾されている。追加的な実施形態では、糖は、３’位に置換基群を有することによって修飾されている。他の実施形態では、糖は、４’位に置換基群を有することによって修飾されている。糖がこれらの位置の１つ超に修飾を有してよいこと、またはオリゴヌクレオチド阻害剤が１つの位置に糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドならびに異なる位置にも糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドを有してよいことも意図されている。
【００５９】
オリゴヌクレオチド阻害剤に対する、安定性を増強し、有効性を改善するための他の修飾、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８３８，２８３号に記載されている修飾が当技術分野で公知であり、本発明の方法における使用に適している。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける送達および安定性を容易にするために、オリゴヌクレオチド阻害剤に、その３’末端においてコレステロール部分などのステロイド、ビタミン、脂肪酸、炭水化物もしくは配糖体、ペプチド、または他の小分子リガンドを連結することができる。
【００６０】
一実施形態では、本発明のｍｉＲ−１９阻害剤は、表１から選択される配列または本明細書に提供されるｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａおよび／もしくはｍｉＲ−１９ｂ）と少なくとも部分的にもしくは完全に相補的な配列を含む。ｍｉＲ−１９阻害剤は、２’−デオキシ、２’Ｏ−アルキルまたは２’ハロ修飾された少なくとも１つの非ロックドヌクレオチドを含んでよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’−４’メチレン架橋を有する少なくとも１つのＬＮＡを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’キャップ構造、３’キャップ構造、または５’および３’キャップ構造を有する。さらに他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ペンダント親油基を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤は、１６ヌクレオチドの配列を含むオリゴヌクレオチドであり、ここで、配列は、ｍｉＲ−１９と相補的であり、３つ以下の連続したＬＮＡを含み、配列の５’末端から３’末端までの、１位、５位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１５位および１６位がＬＮＡである。一実施形態では、配列は、５’末端から３’末端までの、２番目のヌクレオチド位にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドをさらに含む。さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、完全にホスホロチオエート結合している。
【００６１】
別の実施形態では、本発明のｍｉＲ−９２阻害剤は、表２から選択される配列、または本明細書に提供されるｍｉＲ−９２と少なくとも部分的にまたは完全に相補的な配列を含む。ｍｉＲ−９２阻害剤は、２’−デオキシ、２’Ｏ−アルキルまたは２’ハロ修飾された少なくとも１つの非ロックドヌクレオチドを含んでよい。一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２阻害剤は、２’−４’メチレン架橋を有する少なくとも１つのＬＮＡを含む。一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２阻害剤は、５’キャップ構造、３’キャップ構造、または５’および３’キャップ構造を有する。さらに他の実施形態では、ｍｉＲ−９２阻害剤は、ペンダント親油基を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２阻害剤は、１６ヌクレオチドの配列を含むオリゴヌクレオチドであり、配列は、ｍｉＲ−９２と相補的であり、３つ以下の連続したＬＮＡを含み、ここで、配列の５’末端から３’末端までの、１位、６位、１０位、１１位、１３位および１６位はＬＮＡである。一部の実施形態では、１６ヌクレオチドの配列を含むオリゴヌクレオチドの５’末端から２位は、５−メチルシトシンであるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２阻害剤は、１６ヌクレオチドの配列を含むオリゴヌクレオチドであり、ここで、配列は、ｍｉＲ−９２と相補的であり、３つ以下の連続したＬＮＡを含み、５’末端から３’末端までの、配列の１位、３位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１４位および１６位はＬＮＡである。一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２阻害剤は、１６ヌクレオチドの配列を含むオリゴヌクレオチドであり、配列は、ｍｉＲ−９２と相補的であり、３つ以下の連続したＬＮＡを含み、配列の５’末端から３’末端までの、１位、５位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１５位および１６位がＬＮＡである。一部の実施形態では、ｍｉＲ−９２阻害剤は、１６ヌクレオチドの配列を含むオリゴヌクレオチドであり、ここで、配列は、ｍｉＲ−９２と相補的であり、３つ以下の連続したＬＮＡを含み、ここで、配列の５’末端から３’末端までの、１位、３位、６位、９位、１０位、１１位、１３位、１４位および１６位はＬＮＡである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、完全にホスホロチオエート結合している。
【００６２】
本明細書に提供される通り、本発明のｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤は、単独でまたはｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤と組み合わせて使用することができる。一実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤は、表１から選択され、一方、ｍｉＲ−９２阻害剤は、表２から選択される。表１および２において、「＋」または「ｌ」は、ヌクレオチドがＬＮＡであることを示し、「ｄ」は、ヌクレオチドがＤＮＡであることを示し、「ｓ」は、２つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を示し、「ｍｄＣ」は、ヌクレオチドが５−メチルシトシンＤＮＡであることを示す：
【００６３】
【表１】
2018528967.tif 000008
【００６４】
【表２−１】
2018528967.tif 000009
【表２−２】
2018528967.tif 000010
【表２−３】
2018528967.tif 000011
【表２−４】
2018528967.tif 000012
【表２−５】
2018528967.tif 000013
【表２−６】
2018528967.tif 000014
【表２−７】
2018528967.tif 000015
【表２−８】
2018528967.tif 000016
【表２−９】
2018528967.tif 000017
【表２−１０】
2018528967.tif 000018
【表２−１１】
2018528967.tif 000019
【表２−１２】
2018528967.tif 000020
【００６５】
本明細書に記載の通り、本発明の標的ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１９またはｍｉＲ−９２）のオリゴヌクレオチド阻害剤を被験体に投与することにより、被験体の細胞における標的ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１９またはｍｉＲ−９２）の活性または機能が低下するまたは阻害される。一部の実施形態では、細胞は、心臓細胞または筋肉細胞である。一部の実施形態では、細胞は、線維細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトまたは内皮細胞である。さらに他の実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにある。一部の実施形態では、本発明の標的ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１９またはｍｉＲ−９２）のある特定のオリゴヌクレオチド阻害剤は、標的ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１９またはｍｉＲ−９２）の他のｍｉＲＮＡ阻害剤と比較して、細胞における標的ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１９またはｍｉＲ−９２）の活性または機能のより大きな阻害を示し得る。「他のｍｉＲＮＡ阻害剤」という用語は、標的ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１９またはｍｉＲ−９２）の機能または活性を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗ｍｉＲ、アンタゴｍｉＲ、ミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）、ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）、アプタマー、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ、または低分子ヘアピン型ＲＮＡ；抗体もしくはその抗原結合性断片；および／または薬物などの核酸阻害剤を含み得る。本発明の標的ｍｉＲＮＡの特定のオリゴヌクレオチド阻害剤は、本発明の標的ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１９またはｍｉＲ−９２）の他のオリゴヌクレオチド阻害剤と比較して、細胞（例えば、筋肉細胞、心臓細胞、内皮細胞、線維細胞、線維芽細胞、またはケラチノサイト）における標的ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１９またはｍｉＲ−９２）のより大きな阻害を示し得る可能性がある。「より大きな」という用語は、本明細書で使用される場合、定量的により多いことまたは統計的に有意により多いことを指す。例えば、本発明のｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤の１つは、ｆｒｉｚｚｌｅｄ−４（ＦＺＤ４）または低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）などの、ｍｉＲ−１９の標的の抑制解除の量によって測定される通り、別のｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤と比較してより高い有効性を示し得る。
【００６６】
標的ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１９またはｍｉＲ−９２）の機能または活性の低下における本発明の標的ｍｉＲＮＡのオリゴヌクレオチド阻害剤の活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで決定することができる。例えば、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１９またはｍｉＲ９２）活性の阻害をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定する場合、活性は、二重ルシフェラーゼアッセイを使用して決定することができる。二重ルシフェラーゼアッセイは、当技術分野で公知の任意の二重ルシフェラーゼアッセイであってよい。二重ルシフェラーゼアッセイは、市販の二重ルシフェラーゼアッセイであってよい。二重ルシフェラーゼアッセイは、市販されている製品であるＰｓｉＣＨＥＣＫ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって例示される通り、検出可能なタンパク質（例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ）の遺伝子の３’ＵＴＲにｍｉＲ認識部位を配置させることを伴い得る。例えば、ｍｉＲ−１９阻害剤活性を評価するために、構築物をｍｉＲ−１９と共発現させ、それによって、阻害剤活性をシグナルの変化によって決定することができる。検出可能なタンパク質（例えば、ホタルルシフェラーゼ）をコードする第２の遺伝子を同じプラスミド上に含め、シグナルの比を候補オリゴヌクレオチドの抗ｍｉＲ（例えば、抗ｍｉＲ−１９）活性の指標として決定することができる。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、二重ルシフェラーゼ活性によって決定して、約５０ｎＭもしくはそれ未満、または他の実施形態では、４０ｎＭもしくはそれ未満、２０ｎＭもしくはそれ未満、または１０ｎＭもしくはそれ未満の濃度で、そのような活性を有意に阻害する。例えば、ｍｉＲ−１９に関しては、ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤は、二重ルシフェラーゼアッセイにおいて決定して、ｍｉＲ−１９活性の阻害に関して、約５０ｎＭもしくはそれ未満、４０ｎＭもしくはそれ未満、３０ｎＭもしくはそれ未満、または２０ｎＭもしくはそれ未満のＩＣ５０を有し得る。
【００６７】
その代わりに、またはそれに加えて、標的ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１９またはｍｉＲ−９２）の機能または活性の低下における本発明の標的ｍｉＲＮＡのオリゴヌクレオチド阻害剤の活性は、適切な動物モデルにおいて決定することができる。この場合、オリゴヌクレオチド阻害剤の用量、例えば、５０ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、２５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、１０ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満または５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満の用量における標的ｍｉＲＮＡ機能の阻害（例えば、少なくとも５０％の阻害）を観察することができる。動物モデルは、げっ歯類モデル（例えば、マウスモデルまたはラットモデル）であってよい。一部の実施形態では、その記載が本明細書によって参照により組み込まれるＷＯ２００８／０１６９２４に記載されているものなどの動物モデルにおいてオリゴヌクレオチドの活性を決定する。例えば、オリゴヌクレオチド阻害剤は、例えば、５０ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満、２５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満など、例えば１０ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満または５ｍｇ／ｋｇもしくはそれ未満の用量で、少なくとも５０％の標的ｍｉＲＮＡの阻害を示し得る。そのような実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤をマウスの静脈内または皮下に投薬、送達または投与することも、筋肉への局部注射など、局部に送達することもでき、また、オリゴヌクレオチドは、食塩水中で製剤化されていてよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤（複数可）を、マウスに、例えば創傷（例えば、創傷縁または創傷床）に、局所的にまたは皮内に（すなわち、皮内注射）投薬することができる。
【００６８】
一実施形態では、動物モデルは、糖尿病の適切なマウスモデルまたはラットモデルである。一実施形態では、マウスモデルは、ｄｂ／ｄｂマウスなどの遺伝的ＩＩ型糖尿病マウスである（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｃａｔ番号０００６４２  ＢＫＳ．Ｃｇ  Ｄｏｃｋ（Ｈｏｍ）７ｍ＋／＋Ｌｅｐｒｄｂ／ｊ）。一実施形態では、モデルに全層皮膚切除パンチ生検（full  thickness  cutaneous  excisional  punch  biopsy）を使用する。他の実施形態では、モデルに切開、熱傷または火傷を利用する。そのような実施形態では、オリゴヌクレオチド阻害剤（複数可）は、マウスの静脈内にまたは皮下に投薬することも、創傷（例えば、創傷縁または創傷床）への局部注射または局所的適用など、局部に送達することもできる。
【００６９】
これらまたは他の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、投与後に安定であり得、投与後少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、または少なくとも６週間、またはそれよりも長い間、循環中および／または標的器官において検出可能である。したがって、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｍｉＲ−１９またはｍｉＲ−９２）により、本明細書に記載の標的ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１９またはｍｉＲ−９２）の他のｍｉＲＮＡ阻害剤と比較して、より頻度の低い投与、より低い用量、および／またはより長い治療効果の持続時間がもたらされ得る。
【００７０】
本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、種々の高分子集合体または組成物に単独でまたは組み合わせて組み入れることができる。そのような送達用の複合体としては、患者に送達するために製剤化された種々のリポソーム、ナノ粒子、およびミセルを挙げることができる。複合体は、細胞膜透過を開始させるための１つまたは複数の融合性分子または親油性分子を含んでよい。そのような分子は、例えば、本明細書によってそれらの全体が参照により組み込まれる米国特許第７，４０４，９６９号および米国特許第７，２０２，２２７号に記載されている。あるいは、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、細胞への送達を補助するためのペンダント親油基、例えば、本明細書によって参照により組み込まれるＷＯ２０１０／１２９６７２に記載されているものをさらに含んでよい。
【００７１】
本明細書において前記の通り、本発明の組成物には、本明細書に記載されている少なくとも１つを含めた複数の治療用オリゴヌクレオチドを使用するまたは含めることができる。例えば、組成物または製剤には、本明細書に記載のｍｉＲ−１９阻害剤１つまたは全てを、本明細書に記載のｍｉＲ−９２阻害剤の１つまたは複数と組み合わせて使用するまたは含めることができる。本発明の別の実施形態では、本発明の組成物には、複数の治療用オリゴヌクレオチドを１つまたは複数の他の治療様式と組み合わせて含めることができる。この実施形態に加えて、複数の治療用オリゴヌクレオチドは、本明細書に提供されるｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチドと本明細書に提供されるｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤の組合せであってよい。他の治療様式は、血管新生促進性因子または増殖因子であってよい。増殖因子は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および／または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）であってよい。併用療法の例としては、前述のもののいずれかを挙げることができる。
【００７２】
本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド阻害剤および／または他の治療様式の組合せは、各薬剤を含む単一の組成物または薬理学的製剤を用いて実現することもでき、それぞれが少なくとも１つの薬剤を含有する別個の組成物または製剤を用いて実現することもできる。別個の組成物または製剤は、同時に投与することができる。あるいは、別個の組成物または製剤は、逐次的に投与することができ、これは、ある間隔を空けたものであってよい。例えば、ｍｉＲ−１９阻害剤を使用した組成物を、他の薬剤（複数可）の投与に、ある間隔で先行させることも後に続けることもできる。間隔は、数秒間、数分間、数時間、数日間、数週間から、数カ月までにわたってよい。一部の実施形態では、本明細書に提供されるｍｉＲ−１９阻害剤および別の薬剤（例えば、ｍｉＲ−９２阻害剤および／またはＶＥＧＦまたはＰＤＧＦなどの増殖因子）を、細胞に、他の薬剤（例えば、ｍｉＲ−９２阻害剤および／またはＶＥＧＦまたはＰＤＧＦなどの増殖因子）とｍｉＲ−１９阻害剤が細胞に対して併用効果を発揮することが可能になるように設定された時間枠または間隔で別々に適用する。併用効果は有利であり得る。併用効果は、単独の他の薬剤（例えば、ｍｉＲ−９２および／またはＶＥＧＦまたはＰＤＧＦなどの増殖因子）またはｍｉＲ−１９阻害剤によって引き起こされる効果よりも有利であり得る。ｍｉＲ−１９阻害剤は、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドであってよい。そのような例では、一般には、細胞を、薬剤に、互いから約１２〜２４時間以内に、互いから約６〜１２時間以内に、または約１２時間だけの遅延時間を伴って、接触させることができることが意図されている。しかし、一部の状況では、それぞれの投与間に数日（２日、３日、４日、５日、６日または７日）〜数週間（１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間または８週間）が経過する場合には、処置期間を有意に延長することが望ましい場合がある。
【００７３】
一実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤または他の薬剤（複数可）（例えば、本明細書に提供されるｍｉＲ−９２阻害剤またはＶＥＧＦまたはＰＤＧＦなどの増殖因子）を２回以上投与することが望ましい場合がある。この点について、種々の組合せを使用することができる。例示として、ｍｉＲ−１９阻害剤が「Ａ」であり他の薬剤が「Ｂ」である場合、例として、全部で３回および４回の投与に基づく以下の順列を提供することができる：Ａ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ａ、Ａ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ａ／Ａ、Ａ／Ｂ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ、Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ、Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ、Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ、Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ、Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ、Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ、Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ、Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ、Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ。他の組合せも同様に意図されている。他の薬剤および療法の特定の例は本明細書に提供される。一部の実施形態では、他の薬剤は、本明細書に提供されるｍｉＲ−９２阻害剤（例えば、表２に列挙されているｍｉＲ−９２阻害剤）である。
【００７４】
一実施形態では、組成物中のまたは本明細書に提供される方法において組み合わせて投与される、本明細書に提供されるｍｉＲ−１９阻害剤の量と別の薬剤（例えば、本明細書に提供されるｍｉＲ−９２阻害剤）の量の比は、約９９：１、９０：１、８０：１、７０：１、６０：１、５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１０：１、５：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０または１：９９である。一実施形態では、組成物中のまたは本明細書に提供される方法において組み合わせて投与される、本明細書に提供されるｍｉＲ−１９阻害剤の量と別の薬剤（例えば、本明細書に提供されるｍｉＲ−９２阻害剤）の量の比は、１：１である。比は、モル比（ｍｏｌｅ  ｒａｔｉｏ）またはモル比（ｍｏｌａｒ  ｒａｔｉｏ）であってよい。
【００７５】
一実施形態では、組成物中のまたは本明細書に提供される方法において投与される、本明細書に提供されるｍｉＲ−１９阻害剤の量は、前記組成物中のまたは前記方法において組み合わせて投与される別の薬剤（例えば、本明細書に提供されるｍｉＲ−９２阻害剤）の量の１００倍、７５倍、５０倍、２５倍、１０倍、５倍、３倍、もしくは２倍または１００分の１、７５分の１、５０分の１、２５分の１、１０分の１、５分の１、３分の１、もしくは２分の１である。一実施形態では、本明細書で提供されるｍｉＲ−１９阻害剤を他の薬剤（例えば、本明細書に提供されるｍｉＲ−９２阻害剤）と等量で投与する。
【００７６】
ｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂ）のアゴニストも本明細書に提供される。一実施形態では、ｍｉＲ−１９のアゴニストは、ｍｉＲ−１９の機能を増大させる、補う、または置き換えるように作用する、ｍｉＲ−１９とは別個の薬剤であってよい。ｍｉＲ−１９のアゴニストは、成熟ｍｉＲ−１９配列を含むオリゴヌクレオチドであってよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１９のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列の配列を含む。成熟ｍｉＲ−１９、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１９、またはｐｒｉ−ｍｉＲ−１９配列を含むオリゴヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。一実施形態では、ｍｉＲ−１９アゴニストは、約１５〜約５０ヌクレオチドの長さ、約１８〜約３０ヌクレオチドの長さ、約２０〜約２５ヌクレオチドの長さ、または約１０〜約１４ヌクレオチドの長さであってよい。ｍｉＲ−１９アゴニストは、ｍｉＲ−１９の成熟配列、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってよい。オリゴヌクレオチドであるｍｉＲ−１９アゴニストは、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−フルオロ、および４’チオ修飾などの糖修飾、ならびに１つまたは複数のホスホロチオエート、モルホリノ、またはホスホノカルボン酸結合などの骨格修飾などの、１つまたは複数の化学修飾を含有してよい。一実施形態では、ｍｉＲ−１９アゴニストであるオリゴヌクレオチドは、コレステロールとコンジュゲートしたｍｉＲ−１９配列を含む。ｍｉＲ−１９アゴニストであるオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂまたはｍｉＲ−１９ａ／ｂ模倣物であってよい。一実施形態では、ｍｉＲ−１９アゴニストは、ｍｉＲ−１９ｂ模倣物である。一実施形態では、ｍｉＲ−１９ｂ模倣物は、配列：
第２の／センス／パッセンジャー鎖５’ｍＵｍＣｒＡｒＧｍＵｍＵｍＵｒＡｒＧｍＣｍＵｍＵｒＧｒＧｒＡｍＵｍＵｍＵｒＧｒＧｒＡｍＣｒＡＣｈｏｌ６−３’（配列番号１８０）および
第１の／アンチセンス／ガイド鎖５’ｒＵｒＧｆＵｒＧｆＣｒＡｒＡｒＡｆＵｆＣｆＣｒＡｆＵｒＧｆＣｒＡｒＡｒＡｒＡｆＣｆＵｒＧｒＡｓｒＵｓｒＵ−３’（配列番号１８１）（略語は表３において定義されている）
を含む。
【表３】
2018528967.tif 000021
【００７７】
本発明によるマイクロＲＮＡ模倣（ｍｉｍｅｔｉｃ）または模倣（ｍｉｍｉｃ）化合物は、第１の鎖および第２の鎖を含み、第１の鎖は、成熟マイクロＲＮＡ配列を含み、第２の鎖は、第１の鎖と実質的に相補的な配列を含み、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する。本開示全体を通して、「マイクロＲＮＡ模倣化合物」という用語は、「ｐｒｏ  ｍｉＲ−１９」、「ｍｉＲ−１９アゴニスト」、「ｍｉＲ−１９」、「マイクロＲＮＡアゴニスト」、「マイクロＲＮＡ模倣物」、「ｍｉＲＮＡ模倣物」または「ｍｉＲ−１９模倣物」という用語と互換的に使用することができ、「第１の鎖」という用語は、「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」という用語と互換的に使用することができ、「第２の鎖」という用語は、「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語と互換的に使用することができる。模倣物（mimic）および／または阻害剤の配列は、リボ核酸配列またはデオキシリボ核酸配列またはその２つの組合せ（すなわち、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの両方を含む核酸）のいずれであってもよい。本明細書に記載の配列のいずれか１つを含む核酸は、ＤＮＡ配列についてはウリジン塩基の代わりにチミジン塩基を有し、ＲＮＡ配列についてはチミジン塩基の代わりにウリジン塩基を有することが理解される。
【００７８】
本発明は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ｍｉＲ−１９および／またはｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤）を含む医薬組成物もさらに提供する。臨床適用が想定される場合、医薬組成物は、意図される適用に適する形態で調製され得る。一般に、これは、発熱物質のほか、ヒトまたは動物に有害でありうる他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴い得る。
【００７９】
一実施形態では、医薬組成物は、有効用量のｍｉＲ−１９阻害剤または有効用量のｍｉＲ−１９阻害剤および有効用量のｍｉＲ−９２阻害剤ならびに薬学的に許容されるキャリアを含む。ｍｉＲ−１９阻害剤は、表１から選択される配列を有してよいオリゴヌクレオチドであってよい。ｍｉＲ−９２阻害剤は、表２から選択される配列を有してよいオリゴヌクレオチドであってよい。
【００８０】
一部の実施形態では、「有効用量」は、有益なまたは所望の臨床結果に影響を及ぼすために十分な量である。「有効用量」は、疾患および／または状態の症状（１つまたは複数）を実質的に低下させる、排除するまたは好転させるために十分なまたは必要な量であり得る。これは、無処置の被験体に対して相対的なものであってよい。「有効用量」は、被験体における病態を遅らせる、安定化する、予防する、またはその重症度を低下させるために十分なまたは必要な量であり得る。これは、無処置の被験体に対して相対的なものであってよい。本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドの有効用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇでありうる。一部の実施形態では、有効用量は、創傷エリアに適用されるオリゴヌクレオチドの量である。一部の実施形態では、有効用量は、創傷エリア１ｃｍ２当たり約０．０１ｍｇ〜創傷エリア１ｃｍ２当たり約５０ｍｇ  創傷エリア１ｃｍ２当たりｍｇ、創傷エリア１ｃｍ２当たり約０．０２ｍｇ〜創傷エリア１ｃｍ２当たり約２０ｍｇ、創傷エリア１ｃｍ２当たり約０．１ｍｇ〜創傷エリア１ｃｍ２当たり約１０ｍｇ、創傷エリア１ｃｍ２当たり約１ｍｇ〜創傷エリア１ｃｍ２当たり約１０ｍｇ、創傷エリア１ｃｍ２当たり約２．５ｍｇ〜創傷エリア１ｃｍ２当たり約５０ｍｇ、または創傷エリア１ｃｍ２当たり約５ｍｇ〜創傷エリア１ｃｍ２当たり約２５ｍｇ、または約０．０５〜創傷エリア１ｃｍ２当たり約２５ｍｇである。有効用量と考えられる量の正確な決定は、患者の体格、年齢、を含む、各患者に個別の因子と、オリゴヌクレオチドの性質（例えば、溶融温度、ＬＮＡ含量など）とに基づきうる。したがって、当業者は、投与量を、本開示および当技術分野における知見から、たやすく確認することができる。
【００８１】
一部の実施形態では、方法は、有効用量の医薬組成物を１日に１回、２回、３回、４回、５回、または６回投与することを含む。一部の実施形態では、投与は、１週間に１回、２回、３回、４回、または５回である。他の実施形態では、投与は、２週間に１回または月に１回である。臨床的適用が意図されている場合、医薬組成物は、意図された適用のために適した形態に調製する。一般に、これは、発熱物質ならびにヒトまたは動物に対して有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴う。
【００８２】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｍｉＲ−１９阻害剤単独またはｍｉＲ−９２阻害剤との組合せ）を含む組成物は、創傷縁または創傷床への投与などの局所的適用に適したものである。一部の実施形態では、組成物は、水、食塩水、ＰＢＳまたは他の水溶液を含む。一部の実施形態では、組成物は、ローション、クリーム、軟膏、ゲルまたはハイドロゲルの形態である。一部の実施形態では、局所的適用に適した組成物は、高分子の複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、または脂質ベースの系（例えば、水中油エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソーム）を送達ビヒクルとして含む。さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤（単独でまたは例えばｍｉＲ−９２阻害剤と組み合わせて）は、乾燥粉末の形態であるか、または創傷被覆材に組み入れられている。
【００８３】
コロイド分散系、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含めた脂質ベースの系を、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤の送達ビヒクルとして使用することができる。本発明の核酸を心臓組織および骨格筋組織に送達するために適した市販の脂肪エマルションとして、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ、および他の同様の脂質エマルションが挙げられる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける送達ビヒクルとして使用するのに好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。そのような系の調製および使用は当技術分野において周知である。例示的な製剤は、全てが本明細書によってその全体が参照により組み込まれる、米国特許第５，９８１，５０５号；同第６，２１７，９００号；同第６，３８３，５１２号；同第５，７８３，５６５号；同第７，２０２，２２７号；同第６，３７９，９６５号；同第６，１２７，１７０号；同第５，８３７，５３３号；同第６，７４７，０１４号；およびＷＯ０３／０９３４４９にも開示されている。
【００８４】
ある特定の実施形態では、送達のために使用されるリポソームは、米国付与前公開第２０１１００７６３２２号に詳しく記載されているＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）のような両性リポソームである。ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）上の表面電荷は、完全に可逆的であり、それにより、核酸の送達に特に適したものになっている。ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）は、注射によって送達することができ、安定なままであり、凝集せず、かつ、細胞膜を渡って核酸を送達する。
【００８５】
本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ｍｉＲ−１９のオリゴヌクレオチド阻害剤、ｍｉＲ−１９アゴニスト、またはｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤）は、当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載されている通り、ベクターから、および／またはプロモーターに作動可能に連結して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて発現させることができる。例えば、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｍｉＲ−１９阻害剤および／またはｍｉＲ−９２阻害剤）はいずれも、標的細胞に、細胞に本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｍｉＲ−１９阻害剤および／またはｍｉＲ−９２阻害剤）をコードする発現ベクターを送達することにより、送達することができる。「ベクター」は、目的の核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物である。ベクターは、当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載されている任意のベクターであってよい。これだけに限定されないが、直鎖ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に会合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含めた多数のベクターが当技術分野で公知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律複製性プラスミドまたはウイルスを含む。ウイルスベクターの例としては、これだけに限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。特定の一実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである。発現構築物は、生細胞において複製することもでき、合成により作製することもできる。本出願の目的に関しては、「発現構築物」、「発現ベクター」および「ベクター」という用語は、一般的な例示的な意味で本発明の適用を示すために互換的に使用され、本発明を限定するものではない。
【００８６】
一実施形態では、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｍｉＲ−１９阻害剤および／またはｍｉＲ−９２阻害剤）を発現させるための発現ベクターは、オリゴヌクレオチド阻害剤をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターを含む。「作動可能に連結した」または「転写制御下」という句は、本明細書で使用される場合、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために、ポリヌクレオチドとの関連で妥当な位置および配向にあることを意味する。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」とは、遺伝子の特異的な転写を開始するために必要な細胞の合成機構、または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。適切なプロモーターとしては、これだけに限定されないが、ＲＮＡ  ｐｏｌ  Ｉ、ｐｏｌ  ＩＩ、ｐｏｌ  ＩＩＩ、およびウイルスプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、およびラウス肉腫ウイルスの長い末端反復）が挙げられる。一部の場合では、プロモーターは、誘導性プロモーターであってよい。誘導性プロモーターは、当技術分野で公知であり、それらとして、これだけに限定されないが、テトラサイクリンプロモーター、メタロチオネインＩＩＡプロモーター、熱ショックプロモーター、ステロイド／甲状腺ホルモン／レチノイン酸応答エレメント、アデノウイルス後期プロモーター、および誘導性マウス乳房腫瘍ウイルスＬＴＲが挙げられる。
【００８８】
一実施形態では、単一の発現ベクターがｍｉＲ−１９阻害剤およびｍｉＲ−９２阻害剤をコードしていてよい。この場合、ｍｉＲ−１９阻害剤を第１のプロモーターによって駆動することができ、ｍｉＲ−９２阻害剤を第２のプロモーターによって駆動することができる、または、発現ベクターが両方のｍｉＲＮＡ阻害剤を制御するための単一のプロモーターを含んでもよい。別の実施形態では、第１の発現ベクターは、ｍｉＲ−１９阻害剤をコードするものであってよく、ここで、ｍｉＲ−１９阻害剤は第１のプロモーターに作動可能に連結しており、第２の発現ベクターは、ｍｉＲ−９２阻害剤をコードするものであってよく、ここで、ｍｉＲ−９２阻害剤は、第２のプロモーターに作動可能に連結している。上記の実施形態のいずれにおいても、プロモーターは、本明細書に提供される誘導性プロモーターであってよい。ｍｉＲ−１９阻害剤およびｍｉＲ−９２阻害剤の発現を制御するための誘導性プロモーターと構成的プロモーターの他の組合せも意図されている。例えば、ｍｉＲ−１９阻害剤を、構成的プロモーターを使用してベクターから発現させることができ、同時に、ｍｉＲ−９２阻害剤を、誘導性プロモーターを使用してベクターから発現させることができる。
【００８９】
本発明の別の実施形態では、単一の核酸分子を使用してｍｉＲ−１９およびｍｉＲ−９２の両方を同時に阻害することができる。例えば、単一の核酸は、成熟ｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂ）配列（例えば、配列番号３）と実質的に、部分的にまたは完全に相補的な配列、および、成熟ｍｉＲ−９２配列（例えば、配列番号１３）と実質的に、部分的にまたは完全に相補的な配列を含有してよい。単一の核酸分子は、ｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂ）ターゲティング配列とｍｉＲ−９２ターゲティング配列の間にリンカーをさらに含んでよい。例えば、単一の核酸分子は、ｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂ）ターゲティング配列とｍｉＲ−９２ターゲティング配列の間に約１〜約２００ヌクレオチド、より好ましくは約５〜約１００ヌクレオチド、最も好ましくは約１０〜約５０ヌクレオチドで構成されるリンカーを含有してよい。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１９配列とｍｉＲ−９２配列の間のリンカーは、切断可能なリンカーであってよい。切断可能なリンカーは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３０４０４２９に開示されている切断可能なリンカーであってよい。
【００９０】
この実施形態では、切断可能なリンカーは、ヌクレアーゼにより切断可能なオリゴヌクレオチドリンカーである。一部の実施形態では、ヌクレアーゼにより切断可能なリンカーは、オリゴヌクレオチド骨格内に１つまたは複数のホスホジエステル結合を含有する。例えば、リンカーは、単一のホスホジエステル架橋または２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたはそれよりも多いホスホジエステル結合を、例えば、一連の１〜１０デオキシヌクレオチド、例えばｄＴ、またはＲＮＡリンカーの場合ではリボヌクレオチド、例えばｒＵとして含有してよい。リンカー内のｄＴまたは他のＤＮＡヌクレオチドｄＮの場合では、ある特定の実施形態では、切断可能なリンカーは、１つまたは複数のホスホジエステル結合を含有する。他の実施形態では、ｒＵまたは他のＲＮＡヌクレオチドｒＮの場合では、切断可能なリンカーは、ホスホロチオエート結合のみからなってよい。ヌクレアーゼによってゆっくりとしか切断されないホスホロチオエート結合デオキシヌクレオチド（したがって、「切断不可能」と称される）とは対照的に、ホスホロチオエート結合ｒＵは、リボヌクレアーゼによる比較的迅速な切断を受け、したがって、本明細書では切断可能であると考えられる。リンカー領域内にｄＮとｒＮを組み合わせて、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合により接続することも可能である。他の実施形態では、リンカーは、ヌクレアーゼによってなお切断可能な化学修飾されたヌクレオチド、例えば、２’−０修飾された類似体なども含有してよい。特に、２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロヌクレオチドを互いとまたはｄＮもしくはｒＮヌクレオチドと組み合わせることができる。一般に、ヌクレオチドリンカーの場合では、リンカーは、通常は標的と相補的でない多量体の一部であるが、そうでなくてもよい。これは、リンカーが、一般に、ターゲティングオリゴヌクレオチドが標的に対して作用する前に切断され、したがって、標的に対してリンカーの同一性は重要でないからである。したがって、一部の実施形態では、リンカーは、標的に対してターゲティングオリゴヌクレオチド（例えば、ｍｉＲ−１９およびｍｉＲ−９２ターゲティング配列）を設計するその標的のいずれに対しても相補的でない（オリゴ）ヌクレオチドリンカーである。切断可能なリンカーは、化学的または酵素的な切断反応を受けるように設計することができる。化学反応は、例えば、酸性環境（例えば、エンドソーム）における切断、還元的切断（例えば、サイトゾルでの切断）または酸化的切断（例えば、肝臓ミクロソームにおけるもの）を伴う。切断反応は、転位反応によって開始させることもできる。酵素反応としては、ヌクレアーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、オキシダーゼ、レダクターゼなどによって媒介される反応を挙げることができる。例えば、リンカーは、ｐＨ感受性であっても、カテプシン感受性であっても、主にエンドソームおよび／またはサイトゾルにおいて切断されるものであってもよい。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、器官特異的または組織特異的なもの、例えば、肝臓特異的なもの、腎臓特異的なもの、腸特異的なものなどである。
【００９１】
発現構築物および核酸を細胞に送達する方法は、当技術分野で公知であり、それらとして、例えば、リン酸カルシウム共沈澱、電気穿孔、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクション、ポリアミントランスフェクション試薬を用いるトランスフェクション、細胞超音波処理、高速微粒子銃を使用した遺伝子銃撃、および受容体媒介性トランスフェクションを挙げることができる。
【００９２】
一般に、送達ビヒクルを安定なものにし、標的細胞による取り込みを可能にするために、適切な塩およびバッファを用いることが望まれる。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容されるキャリアまたは水性媒体に溶解または分散させた阻害剤ポリヌクレオチド（例えば、リポソーム、もしくは他の複合体、まあは発現ベクター）を含む送達ビヒクルを有効量で含み得る。「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という句は、動物またはヒトに投与した際に有害な反応、アレルギー性反応、または他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容されるキャリア」は、ヒトに投与するために適した医薬品などの医薬品の製剤化において使用するために許容される溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は当該技術分野において周知である。任意の従来の媒質または薬剤が、本発明の有効成分に不適合である場合を除き、治療用組成物中のその使用が想定される。また、補助的有効成分も、それらが組成物のオリゴヌクレオチドを不活化しない限りにおいて、組成物へと組み込むことができる。
【００９３】
本発明の活性化合物を含む組成物は、当技術分野で公知の古典的な医薬調製物を含んでよい。本発明によるこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路によって利用可能である限りは任意の一般的経路によるものであってよい。これは、経口、経鼻、または頬側を含む。あるいは、投与は局所的なものであってもよく、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、動脈内注射、または静脈内注射によるものであってもよい。一部の実施形態では、医薬組成物を肺または心臓組織に直接注射する。別の実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤（例えば、ｍｉＲ−１９および／またはｍｉＲ−９２のオリゴヌクレオチド阻害剤）を含む組成物は、クリーム剤、軟膏剤、ペースト剤、ローション剤、またはゲル剤などの、局所的適用に適した形態に製剤化することができる。一部の実施形態では、医薬組成物を創傷エリアに直接注射する。一部の実施形態では、医薬組成物を創傷エリアに局所的に適用する。
【００９４】
本明細書に記載のオリゴヌクレオチド阻害剤を含む医薬組成物は、カテーテルシステムまたは治療剤を心臓および肺に送達するために冠循環／肺循環を隔離するシステムによって投与することもできる。治療剤を心臓および冠血管系に送達するための種々のカテーテルシステムが当該技術分野で公知である。本発明において使用するために適したカテーテルに基づく送達方法または冠血管の隔離方法のいくつかの非限定的な例は、全て本明細書によってその全体が参照により組み込まれる米国特許第６，４１６，５１０号；同第６，７１６，１９６号；および同第６，９５３，４６６号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０８２４４０号および同第ＷＯ２００６／０８９３４０号；および米国特許公開第２００７／０２０３４４５号、同第２００６／０１４８７４２号、および同第２００７／００６０９０７号に開示されている。そのような組成物は、本明細書に記載の薬学的に許容される組成物として投与することができる。
【００９５】
活性化合物はまた、非経口的にまたは腹腔内に投与することもできる。例示として、遊離塩基または薬理学的に許容される塩として活性化合物の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性物質と適切に混合されている水中で調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、ならびにそれらの混合物中、および油中で分散液を調製することもできる。保管および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、一般に、微生物の成長を予防するために防腐剤を含有する。
【００９６】
注射用の使用、カテーテルによる送達、または吸入による送達に適する薬学的形態は、例えば、滅菌水溶液または滅菌水性分散液および滅菌注射用溶液または滅菌注射用分散液（例えば、エアゾール溶液、ネブライザー溶液）の即席調製のための滅菌粉末を含んでもよい。一般に、これらの調製物は、容易な注射可能性またはエアゾール化／噴霧化がなされる程度に滅菌であり、かつ、流体であり得る。調製物は製造および保管の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護されるべきである。適切な溶媒または分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有してよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することによって、分散液の場合では必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性物質を使用することによって維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらすことができる。
【００９７】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤またはｍｉＲ−１９阻害剤とｍｉＲ−９２阻害剤を含む組成物は、創傷縁または創傷床への投与などの局所的適用に適したものである。一部の実施形態では、組成物は、水、食塩水、ＰＢＳまたは他の水溶液を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤またはｍｉＲ−１９阻害剤およびｍｉＲ−９２阻害剤は、ローション、クリーム、軟膏、ゲルまたはハイドロゲルの状態である。一部の実施形態では、局所的適用に適した組成物は、高分子の複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、または脂質ベースの系（例えば、水中油エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソーム）を送達ビヒクルとして含む。さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤またはｍｉＲ−１９阻害剤およびｍｉＲ−９２阻害剤は、乾燥粉末の形態であるか、または創傷被覆材に組み入れられている。
【００９８】
滅菌注射用溶液は、所望の通り、適量の活性化合物を任意の他の成分（例えば、上に列挙されているもの）と一緒に溶媒中に組み入れ、その後、濾過滅菌することによって調製することができる。適切な量は、調製中の活性化合物の減損または分解をもたらすために、最終的な調製物中の所望の量を上回る量であってよい。所望の量は、本明細書に提供される用量であってよい。用量は、有効用量またはその一部分であってよい。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒および所望の他の成分、例えば、上に列挙されているものを含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製することができる。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法として、活性成分（複数可）と任意の追加的な所望の成分の粉末を予め滅菌濾過したその溶液から得る真空乾燥技法および凍結乾燥技法が挙げられる。一部の実施形態では、例えば、吹き入れ器または吸入デバイスを通じて滅菌粉末を被験体に直接投与することができる（すなわち、希釈剤中での再構成を伴わない）。
【００９９】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤の単独でのまたはｍｉＲ−９２阻害剤と組み合わせた投与は、例えば、創傷（例えば、慢性創傷、糖尿病性足部潰瘍、静脈うっ血性下腿潰瘍または褥瘡）へのものなど、皮下注射または皮内注射によるものである。投与は、創傷縁または創傷床へのものなど、創傷の部位におけるものであってよい。
【０１００】
本発明の組成物は一般に、中性形態または塩形態で製剤化することができる。薬学的に許容可能な塩は、例えば、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）に由来する酸添加塩（タンパク質の遊離アミノ基により形成される）を含む。また、タンパク質の遊離カルボキシル基により形成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄）に由来する場合もあり、有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）に由来する場合もある。
【０１０１】
製剤化されたら、溶液は、好ましくは投薬製剤と適合する様式で、かつ治療的に有効な量で投与され得る。製剤は、注射用溶液、薬物放出カプセル剤、単一用量吸入器などの種々の剤形で容易に投与することができる。水溶液中で非経口投与するためには、例えば、一般に、溶液を適切に緩衝し、液体希釈剤を、まず、例えば、十分な食塩水またはグルコースを用いて等張性にする。そのような水溶液は、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、動脈内投与および腹腔内投与のために使用することができる。好ましくは、滅菌水性媒体は、当業者に公知の通り、特に本開示に照らして使用され得る。例示として、単一用量を等張性ＮａＣｌ溶液１ｍｌに溶解させ、皮下注入用液１０００ｍｌに添加するか、または提案される注入部位に注射することができる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照されたい）。治療されている被験体の状態に応じて投与量のいくらかの変動が必ず生じる。投与を担当する人は、いかなる場合においても、個々の被験体に適した用量を決定することができる。さらに、ヒトに投与するためには、調製物は、必要に応じてＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄｓによる滅菌、発熱性、ならびに一般的な安全性および純度の基準に適合するべきである。
【０１０２】
被験体における状態の進行を処置する、好転させる、または予防するための方法であって、本明細書に開示されている阻害剤または阻害剤の組合せを含む医薬組成物を投与することを含む方法も本明細書に提供される。方法は、一般に、阻害剤またはそれを含む組成物を被験体に投与することを含む。「被験体」または「患者」という用語は、これだけに限定することなく、ヒトおよび他の霊長類（例えば、チンパンジーおよび他の類人猿およびサル種）、農場動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）、家庭哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、およびモルモットなどのげっ歯類）、ならびに鳥類（例えば、飼育鳥、野鳥および猟鳥、例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他のキジ類の鳥、アヒル、およびガチョウなど）を含めた任意の脊椎動物を指す。一部の実施形態では、被験体は哺乳動物である。他の実施形態では、被験体は、ヒトである。被験体は、ｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａおよび／またはｍｉＲ−１９ｂ）、またはｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａおよび／またはｍｉＲ−１９ｂ）およびｍｉＲ−９２の発現に関連する、それによって媒介される、またはそれによって生じる状態を有してよい。
【０１０３】
一実施形態では、被験体における血管新生を促進する方法は、被験体にｍｉＲ−１９阻害剤を単独でまたはｍｉＲ−９２阻害剤と組み合わせて投与することを含む。一実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤は、例えば表１から選択される、オリゴヌクレオチドである。一実施形態では、ｍｉＲ−９２阻害剤は、例えば表２から選択される、オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、被験体は、虚血、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、末梢もしくは冠動脈閉塞、虚血性梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、冠動脈疾患、頸動脈疾患、糖尿病、慢性創傷（複数可）、または末梢動脈疾患に罹患している。
【０１０４】
別の実施形態では、被験体における虚血、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、末梢もしくは冠動脈閉塞、虚血性梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、冠動脈疾患、頸動脈疾患、または末梢動脈疾患を処置または予防する方法は、被験体にｍｉＲ−１９阻害剤を単独でまたはｍｉＲ−９２阻害剤と組み合わせて投与することを含む。一実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤は、例えば表１から選択される、オリゴヌクレオチドである。一実施形態では、ｍｉＲ−９２阻害剤は、例えば表２から選択される、オリゴヌクレオチドである。
【０１０５】
本発明の一実施形態では、血管新生を促進することを必要とする被験体において血管新生を促進する方法は、被験体に、本明細書に記載のｍｉＲ−１９阻害剤などのｍｉＲ−１９阻害剤および血管新生を促進する別の薬剤を投与することを含む。本発明の一実施形態では、末梢動脈疾患を処置または予防することを必要とする被験体における末梢動脈疾患を処置または予防する方法は、被験体に、本明細書に記載のｍｉＲ−１９阻害剤などのｍｉＲ−１９阻害剤を投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、別の薬剤をｍｉＲ−１９阻害剤と一緒に投与することをさらに含む。他の薬剤は、ｍｉＲ−９２の阻害剤（例えば、表２に列挙されているｍｉＲ−９２阻害剤）であってよい。一部の実施形態では、他の薬剤は、血管新生を促進し得るものである、またはアテローム性動脈硬化症もしくは末梢動脈疾患を処置するために使用される薬剤であってよい。他の薬剤は、ホスホジエステラーゼ（phophodiesterase）３型阻害剤（シロスタゾールなど）、スタチン、抗血小板薬、Ｌ−カルニチン、プロピオニル−Ｌ−カルニチン、ペントキシフィリン、またはナフチドロフリルであってよい。末梢動脈疾患を処置または予防することを必要とする被験体における末梢動脈疾患を処置または予防する方法は、被験体に抗ｍｉＲ−１９を投与することも含んでよく、被験体はまた、遺伝子療法（ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＩＦ−１α、ＨＧＦ、またはＤｅｌ−１などの血管新生促進性因子を用いたもの）、細胞療法、および／または抗血小板療法も受けているかまたは受ける予定である。一部の実施形態では、方法は、被験体にｍｉＲ−１９阻害剤および抗菌薬を投与することを含む。
【０１０６】
一実施形態では、創傷治癒を促進することを必要とする被験体において創傷治癒を促進する方法は、被験体に本明細書に記載の抗ｍｉＲ−１９（例えば、表１に列挙されているｍｉＲ−１９阻害剤）などのｍｉＲ−１９阻害剤を投与することを含む。一実施形態では、被験体は糖尿病を有する。一部の実施形態では、被験体は、慢性創傷、糖尿病性足部潰瘍、静脈うっ血性下腿潰瘍または褥瘡を有する。一部の実施形態では、慢性創傷、糖尿病性足部潰瘍、静脈うっ血性下腿潰瘍または褥瘡の治癒は、ｍｉＲ−１９阻害剤の投与により促進される。別の実施形態では、被験体は、末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）を有する。一部の実施形態では、方法は、別の薬剤を抗ｍｉＲ−１９と一緒に投与することをさらに含む。他の薬剤は、例えば上記の、末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）を処置するために使用される薬剤であってよい。一部の実施形態では、他の薬剤は、創傷治癒を促進する、または糖尿病を処置するために使用される。他の薬剤は、血管新生促進性因子であってよい。一部の実施形態では、他の薬剤は、ＶＥＧＦまたはＰＤＧＦなどの増殖因子である。一部の実施形態では、他の薬剤は、ＶＥＧＦの発現もしくは活性またはＰＤＧＦの発現もしくは活性を促進する。一部の実施形態では、他の薬剤は、同種異系皮膚代替物または生体包帯、（例えば、Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、Ｃａｎｔｏｎ、ＭＡから入手可能なＤｅｒｍａｇｒａｆｔ（登録商標）またはＡｐｌｉｇｒａｆ（登録商標））、または、ベカプレルミン（Buchbergerら、Experimental  and  Clinical  Endocrinology  and  Diabetes、１１９巻：４７２〜４７９頁（２０１１年））などの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）ゲルである。一部の実施形態では、他の薬剤は、デブリードマン用薬剤または抗菌剤である。一部の実施形態では、他の薬剤は、ｍｉＲ−１７−９２クラスターに位置するｍｉＲＮＡの阻害剤を含む。一実施形態では、他の薬剤は、ｍｉＲ−９２の阻害剤（例えば、表２に列挙されているｍｉＲ−９２阻害剤）である。
【０１０７】
一実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤の投与により、ｍｉＲ−１９阻害剤の投与またはいかなる処置もしていない創傷と比較して、創傷の再上皮化または創傷閉鎖の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の改善がもたらされる。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤の投与により、ｍｉＲ−１９阻害剤の投与またはいかなる処置もしていない創傷と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％多い肉芽組織形成または新生血管形成がもたらされる。一実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤とｍｉＲ−９２阻害剤の併用投与により、ｍｉＲ−１９阻害剤をｍｉＲ−９２阻害剤の投与またはいかなる処置と併用していない創傷と比較して、創傷の再上皮化または創傷閉鎖の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の改善がもたらされる。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤とｍｉＲ−９２阻害剤の併用投与により、ｍｉＲ−１９阻害剤をｍｉＲ−９２阻害剤の投与またはいかなる処置と併用していない創傷と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％多い肉芽組織形成または新生血管形成がもたらされる。
【０１０８】
一実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤の投与により、創傷を処置するための当技術分野で公知の薬剤を投与した創傷と比較して、創傷の再上皮化または創傷閉鎖の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の改善がもたらされる。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤の投与により、創傷を処置するための当技術分野で公知の薬剤を投与した創傷と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％多い肉芽組織形成または新生血管形成がもたらされる。一実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤とｍｉＲ−９２阻害剤の併用投与により、創傷を処置するための当技術分野で公知の薬剤を投与した創傷と比較して、創傷の再上皮化または創傷閉鎖の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の改善がもたらされる。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤とｍｉＲ−９２阻害剤の併用投与により、創傷を処置するための当技術分野で公知の薬剤を投与した創傷と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％多い肉芽組織形成または新生血管形成がもたらされる。薬剤は、例えば血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および／または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの増殖因子であってよい。
【０１０９】
一実施形態では、本明細書に提供されるｍｉＲ−１９阻害剤と本明細書に提供されるｍｉＲ−９２阻害剤の併用投与により、いずれかの阻害剤を単独で投与した創傷と比較して、創傷の再上皮化または創傷閉鎖の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の改善がもたらされる。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１９阻害剤とｍｉＲ−９２阻害剤の併用投与により、いずれかの阻害剤を単独で投与した創傷と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％多い肉芽組織形成または新生血管形成がもたらされる。
【０１１０】
本発明はまた、一部において、ｍｉＲ−１９によって有意に制御される遺伝子の発見にも基づく。したがって、本発明の別の態様は、血管新生または創傷治癒を調節するための治療薬の有効性を、治療薬を受けた被験体において評価またはモニタリングするための方法であって、被験体から試料を得ること；試料中の、ｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂ）の標的である１つまたは複数の遺伝子の発現を測定すること；およびｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂ）の標的である１つまたは複数の遺伝子の発現を、所定の参照レベルまたは対照試料中のｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａもしくはｍｉＲ−１９ｂ）の標的である１つもしくは複数の遺伝子のレベルと比較し、比較により治療薬の有効性が示されることを含む方法である。ｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂ）の標的である１つまたは複数の遺伝子は、予測ｍｉＲ−１９結合性部位を含んでよい。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂ）の標的である１つまたは複数の遺伝子は、ＦＺＤ４またはＬＲＰ６である。一部の実施形態では、治療薬は、ｍｉＲ−１９の機能および／または活性を調節する。治療薬は、表１から選択されるｍｉＲ−１９阻害剤などのｍｉＲ−１９アンタゴニストであってよい。他の実施形態では、治療薬は、ｍｉＲ−１９模倣物などのｍｉＲ−１９アゴニストである。一部の実施形態では、治療薬は、さらに、ｍｉＲ−１７−２クラスターに位置する別のｍｉＲＮＡの機能および／または活性を調節する。一部の実施形態では、治療薬は、さらに、ｍｉＲ−９２の機能および／または活性を調節する。この実施形態では、治療薬は、表２から選択されるｍｉＲ−９２阻害剤などのｍｉＲ−９２アンタゴニストをさらに含んでよい。一部の実施形態では、被験体は、虚血、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、末梢もしくは冠動脈閉塞、虚血性梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、冠動脈疾患、頸動脈疾患、または末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）に罹患しており、治療薬は、本明細書に提供されるｍｉＲ−１９アンタゴニストであり、単独でまたは別の薬剤（例えば、本明細書に提供されるｍｉＲ−９２アンタゴニスト）と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、被験体は、糖尿病、慢性創傷、糖尿病性足部潰瘍、静脈うっ血性下腿潰瘍または褥瘡に罹患しており、治療薬は、本明細書に提供されるｍｉＲ−１９アンタゴニストであり、単独でまたは別の薬剤（例えば、本明細書に提供されるｍｉＲ−９２アンタゴニスト）と組み合わせて使用される。ｍｉＲ−９２アンタゴニストを利用する実施形態では、方法は、ｍｉＲ−９２の１つまたは複数の標的の発現を測定し、ｍｉＲ−９２の標的である１つまたは複数の遺伝子の発現または活性を所定の参照レベルまたは対照試料中のｍｉＲ−９２の標的である１つもしくは複数の遺伝子のレベルと比較し、比較により治療薬（複数可）の有効性が示されることをさらに含んでよい。ｍｉＲ−９２の１つまたは複数の標的は、その内容全体が本明細書によって参照により組み込まれるＵＳ２０１６０２０８２５８に開示されている標的の１つまたは複数であってよい。
【０１１１】
一部の実施形態では、血管新生または創傷治癒を調節するための治療薬の有効性を、治療薬を受けている被験体において評価またはモニタリングする方法は、被験体における血管新生を評価する、別の診断アッセイまたは試験を実施することをさらに含む。一部の実施形態では、血管新生を調節するための治療薬の有効性を評価またはモニタリングするための追加の診断アッセイまたは試験は、被験体に対する歩行時間試験、足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）、動脈造影もしくは血管造影、またはＳＰＥＣＴ分析である。
【０１１２】
本発明の別の態様は、ｍｉＲ−１９の機能および／または活性を調節する治療薬を用いた処置のために被験体を選択するための方法であって、被験体から試料を得ること；試料中の、ｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂ）の標的である１つまたは複数の遺伝子の発現を測定すること；およびｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂ）の標的である１つまたは複数の遺伝子の発現または活性を所定の参照レベルまたは対照試料中のｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａもしくはｍｉＲ−１９ｂ）の標的である１つもしくは複数の遺伝子のレベルと比較し、比較により被験体が治療薬を用いた処置のために選択されるべきかどうかが示されることを含む方法である。ｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂ）の標的である１つまたは複数の遺伝子は、予測ｍｉＲ−１９結合性部位を含んでよい。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂ）の標的である１つまたは複数の遺伝子は、ＦＺＤ４またはＬＲＰ６である。治療薬は、表１から選択されるｍｉＲ−１９阻害剤などのｍｉＲ−１９アンタゴニストであってよい。他の実施形態では、治療薬は、ｍｉＲ−１９模倣物などのｍｉＲ−１９アゴニストである。一部の実施形態では、治療薬は、さらに、ｍｉＲ−１７−２クラスターに位置する別のｍｉＲＮＡの機能および／または活性を調節する。一部の実施形態では、治療薬は、さらに、ｍｉＲ−９２の機能および／または活性を調節する。この実施形態では、治療薬は、表２から選択されるｍｉＲ−９２阻害剤などのｍｉＲ−９２アンタゴニストをさらに含んでよい。一部の実施形態では、被験体は、虚血、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患、末梢もしくは冠動脈閉塞、虚血性梗塞、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、冠動脈疾患、頸動脈疾患、または末梢血管疾患（例えば、末梢動脈疾患）に罹患しており、治療薬は、本明細書に提供されるｍｉＲ−１９アンタゴニストであり、単独でまたは別の薬剤（例えば、本明細書に提供されるｍｉＲ−９２アンタゴニスト）と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、被験体は、糖尿病、慢性創傷、糖尿病性足部潰瘍、静脈うっ血性下腿潰瘍または褥瘡に罹患しており、治療薬は、本明細書に提供されるｍｉＲ−１９アンタゴニストであり、単独でまたは別の薬剤（例えば、本明細書に提供されるｍｉＲ−９２アンタゴニスト）と組み合わせて使用される。ｍｉＲ−９２アンタゴニストを利用する実施形態では、方法は、ｍｉＲ−９２の１つまたは複数の標的の発現を測定し、ｍｉＲ−９２の標的である１つまたは複数の遺伝子の発現または活性を所定の参照レベルまたは対照試料中のｍｉＲ−９２の標的である１つもしくは複数の遺伝子のレベルと比較し、比較により被験体が治療薬（複数可）を用いた処置のために選択されるべきかどうかが示されることをさらに含んでよい。ｍｉＲ−９２の１つまたは複数の標的は、その内容全体が本明細書によって参照により組み込まれるＵＳ２０１６０２０８２５８に開示されている標的の１つまたは複数であってよい。
【０１１３】
一部の実施形態では、ｍｉＲ−１９の機能および／または活性を調節する治療薬を用いた処置のために被験体を選択するための方法は、治療薬を用いて処置した被験体から試料を得ることを含む。一部の実施形態では、被験体は治療薬を用いて処置せず、試料を治療薬で処理する。一部の実施形態では、被験体を、治療薬を用いて処置し、かつ試料を治療薬で処理する。一部の実施形態では、方法は、被験体における血管新生または創傷治癒を評価する、別の診断アッセイまたは試験を実施することをさらに含む。一部の実施形態では、血管新生を評価するための追加の診断アッセイまたは試験は、被験体に対する歩行時間試験、足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）、動脈造影もしくは血管造影、またはＳＰＥＣＴ分析である。
【０１１４】
歩行試験は、療法に応答した、最大または無痛の歩行時間の変化を測定するための非侵襲的トレッドミル試験であってよい。足関節上腕血圧比（ＡＢＩ）は、超音波によって測定されるものなどの、上腕および足首で行う血圧測定であってよい。次いで、指数を上腕での血圧に対する足首での血圧の比として表すことができる。動脈造影は、動脈または静脈を通る血流を測定するための造影剤（contrast  dye）法であってよい。ＳＰＥＣＴ（単一光子放射型コンピュータ断層撮影法）分析は、毛細血管を通る血流を測定するために放射線を使用する３−Ｄイメージングシステムを用いて実施することができる。
【０１１５】
血管新生または創傷治癒を促進する薬剤の能力を評価するための方法であって、細胞を薬剤に接触させること；薬剤と接触させた細胞における、ｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂ）の標的である１つまたは複数の遺伝子の発現または活性を測定すること；および１つまたは複数の遺伝子の発現または活性を、所定の参照レベルまたは対照試料中の１つもしくは複数の遺伝子のレベルと比較し、比較により血管新生を促進する薬剤の能力が示されることを含む方法も本明細書に提供される。一部の実施形態では、方法は、薬剤と接触させた細胞におけるｍｉＲ−１９の機能および／または活性を決定することをさらに含む。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、心臓細胞または筋肉細胞である。一部の実施形態では、細胞は、創傷治癒に関与するものである。一部の実施形態では、細胞は、線維細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトまたは内皮細胞である。さらに他の実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにある。薬剤は、ｍｉＲ−１７−２クラスターに位置するｍｉＲＮＡの阻害剤を含んでよい。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１７−２クラスターに位置するｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１９である。一部の実施形態では、ｍｉＲ−１７−２クラスターに位置するｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１９およびｍｉＲ−９２の両方である。一部の実施形態では、薬剤は、ｍｉＲ−１９の阻害剤（例えば、表１から選択されるｍｉＲ−１９阻害剤）を単独でまたはｍｉＲ−９２の阻害剤（例えば、表２から選択されるｍｉＲ−９２阻害剤）と組み合わせて含む。ｍｉＲ−９２の阻害剤を利用する実施形態では、方法は、ｍｉＲ−９２の１つまたは複数の標的の発現を測定し、ｍｉＲ−９２の標的である１つまたは複数の遺伝子の発現または活性を所定の参照レベルまたは対照試料中のｍｉＲ−９２の標的である１つもしくは複数の遺伝子のレベルと比較し、比較により血管新生を促進する薬剤の能力が示されることをさらに含んでよい。ｍｉＲ−９２の１つまたは複数の標的は、その内容全体が本明細書によって参照により組み込まれるＵＳ２０１６０２０８２５８に開示されている標的の１つまたは複数であってよい。
【０１１６】
遺伝子の発現の測定または検出は、当業者に公知の任意の様式で実施することができ、遺伝子のレベルを測定または検出するためのそのような技法は周知であり、容易に用いることができる。遺伝子発現レベルは、遺伝子のｍＲＮＡレベルまたは遺伝子によりコードされるタンパク質のタンパク質レベルを測定することによって決定することができる（may  be  determined  measuring）。遺伝子発現を検出するための種々の方法が記載されており、それらとして、ウエスタンブロッティング、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学、免疫組織化学、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ、電気化学的方法、生物発光、生物発光タンパク質再集合、ＢＲＥＴに基づくもの（ＢＲＥＴ：生物発光共鳴エネルギー移動）、ＲＴ−ＰＣＲ、蛍光相関分光法および表面増強ラマン分光法が挙げられる。市販のキットも使用することができる。遺伝子発現を検出するための方法は、ハイブリダイゼーションに基づく技術プラットフォームおよび複数の遺伝子を同時に検出することを可能にする大規模並列処理次世代配列決定（massively-parallel  next  generation  sequencing）を含み得る。
【０１１７】
一部の実施形態では、被験体において状態（例えば、末梢動脈疾患または創傷）を処置するための治療薬の治療有効性を決定するための方法は、治療薬（例えば、ｍｉＲ−１９阻害剤単独もしくはｍｉＲ−９２阻害剤との組合せ）を用いた処置のために被験体を選択すること、治療薬（例えば、ｍｉＲ−１９阻害剤単独もしくはｍｉＲ−９２阻害剤との組合せ）を用いた処置のために被験体を選択すること、または血管新生もしくは創傷治癒を促進する薬剤の能力を評価することを含み、ＦＺＤ４またはＬＲＰ６などの、ｍｉＲ−１９（例えば、ｍｉＲ−１９ａまたはｍｉＲ−１９ｂ）の標的である１つまたは複数の遺伝子の発現レベルおよび／または活性を決定する。
【０１１８】
試料（例えば、治療薬を投与されている被験体由来の試料、または被験体もしくは細胞培養物由来の、治療薬で処理された試料）中の遺伝子発現または活性を、それぞれを参照レベルと称することができる、状態を有する被験体由来の試料中または健康な集団に存在する遺伝子の標準の量または活性と比較することができる。他の実施形態では、遺伝子発現レベルまたは活性を、対照試料（状態を有する被験体に由来するものではない試料）中のレベルと比較する、または処理されていない試料（例えば、治療薬を用いた処置前に被験体から取得した試料、もしくは無処置の被験体から取得した試料、もしくは治療薬で処理されていない細胞培養試料）中の遺伝子発現レベルまたは活性と比較する。遺伝子の標準のレベルは、正常な、健康な対照の被験体から得た十分に多くの試料中の遺伝子発現レベルを決定して所定の参照値または閾値を得ることによって決定することができる。本明細書で使用される場合、「参照値」とは、公知の試料から確認された遺伝子発現レベルまたは活性の所定の値を指す。
【０１１９】
発現または活性の標準のレベルは、治療薬を用いた処理前の試料中の遺伝子発現レベルまたは活性を決定することによって決定することもできる。さらに、標準のレベル情報および標準のレベルを決定するための方法は、公的に利用可能なデータベース、ならびに他の供給源から得ることができる。一部の実施形態では、通常は試料中に存在しない、既知量の別の遺伝子を試料に添加し（すなわち、試料を既知量の外因性ｍＲＮＡまたはタンパク質を用いてスパイクし）、１つまたは複数の目的の遺伝子のレベルを、スパイクされたｍＲＮＡまたはタンパク質の既知量に基づいて算出する。１つまたは複数の遺伝子の測定されたレベルと、対照試料中の遺伝子の１つまたは複数の参照量またはレベルの比較は、当業者に公知の任意の方法によって行うことができる。
【０１２０】
本発明に従って、一部の実施形態では、対照試料（例えば、処置を受ける前の患者または無処置の患者における試料）中の遺伝子のレベルまたは所定の参照値と比較した、測定された遺伝子の発現または活性のレベルの差異（上昇または低下）により、治療薬の治療有効性、治療薬を用いた処置のための被験体の選択、または血管新生を促進もしくは阻害する薬剤の能力が示される。
【０１２１】
試料採取方法は当業者に周知であり、任意の型の生体試料を得るための任意の適用可能な技法が意図されており、それを本発明の方法で用いることができる（例えば、Clinical  Proteolytics:  Methods  and  Protocols、Methods  in  Molecular  Biology、４２８巻、Antonia  Vlahou編、（２００８年）を参照されたい）。試料としては、ｍＲＮＡまたはタンパク質を単離することが可能な任意の生体試料を挙げることができる。そのような試料としては、血清、血液、血漿、全血およびそれらの誘導体、心臓組織、筋肉、皮膚、毛髪、毛包、唾液、口腔粘液、膣粘液、汗、涙、上皮組織、尿、精液（semen）、精液（seminal  fluid）、精漿、前立腺液、尿道球腺液（カウパー腺液）、排泄物、生検材料、腹水、脳脊髄液、リンパ、心臓組織、ならびに他の組織抽出試料または生検材料を挙げることができ、一部の実施形態では、生体試料は、血漿または血清である。
【０１２２】
開示されている方法において使用するための生体試料は、治療薬の投与開始後の任意の時点で被験体から得ることができる。一部の実施形態では、試料は、治療介入開始の少なくとも１カ月、２カ月、３カ月、または６カ月後に得る。一部の実施形態では、試料は、治療介入開始の少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、６週間または８週間後に得る。一部の実施形態では、試料は、治療介入開始の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日後に得る。一部の実施形態では、試料は、治療介入開始の少なくとも１時間、６時間、１２時間、１８時間または２４時間後に得る。他の実施形態では、試料は、治療介入開始の少なくとも１週間後に得る。
【０１２３】
本発明の方法は、治療薬の処置レジメンを変更するための方法も含み得る。処置レジメンの変更は、これだけに限定されないが、治療介入の型、治療介入を投与するときの投与量、治療介入の投与の頻度、治療介入の投与経路、ならびに変化および／または改変が医師に周知である任意の他のパラメータを変化させることおよび／または改変することを含んでよい。
【０１２４】
一部の実施形態では、処置の有効性は、治療介入を継続するかどうかを決定するために使用することができる。一部の実施形態では、処置の有効性は、治療介入を中止するかどうかを決定するために使用することができる。一部の実施形態では、処置の有効性は、治療介入を改変するかどうかを決定するために使用することができる。一部の実施形態では、処置の有効性は、治療介入の投与量を増やすか減らすかを決定するために使用することができる。一部の実施形態では、処置の有効性は、治療介入の投薬頻度を変更するかどうかを決定するために使用することができる。一部の実施形態では、処置の有効性は、治療介入の投与の数または頻度を変更するかどうかを決定するために使用することができる。一部の実施形態では、処置の有効性は、１日当たり、１週間当たりの用量の数、１日当たりの回数を変更するかどうかを決定するために使用することができる。一部の実施形態では、処置の有効性は、投薬量を変更するかどうかを決定するために使用することができる。
【０１２５】
本発明を、限定的とみなされるべきではない、以下のさらなる例によりさらに例示する。当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態に多くの変化を施すことができ、本発明の精神および範囲から逸脱しない限りにおいて、やはり同様または類似の結果を得うることを察知する。
【０１２６】
本開示全体を通して参照される特許および非特許文献は全て、その全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１２７】
（実施例１）
ＭｉＲ−１９拮抗作用により、側副依存性血流および虚血からの回復が促進される
ｍｉＲ１７−９２クラスターは、動脈形成および血管新生のために重要であり、ｍｉＲ−１９は重大な制御因子である。Ｃ５７／Ｂｌ６Ｊマウス（６カ月齢）に、ＬＮＡ修飾された抗ｍｉＲ−１９または対照抗ｍｉＲを１２．５ｍｇ／ｋｇの用量で、外科手術前３日間にわたって皮下注射し、その後、週に１回、皮下注射した。抗ｍｉＲ−１９は、どちらもその全体が本明細書によって参照により組み込まれる、Elmen  J.ら（２００８年）、「Antagonism  of  microRNA-122  in  mice  by  systemically  administered  LNA-antimiR  leads  to  up-regulation  of  a  large  set  of  predicted  target  mRNAs  in  liver」、Nucleic  acids  research、３６巻（４号）：１１５３〜１１６２頁およびMontgomeryら、（２０１１年）、「Therapeutic  inhibition  of  miR-208a  improves  cardiac  function  and  survival  during  heart  failure」、Circulation、１２４巻（１４号）：１５３７〜１５４７頁に記載されている通り、古典的なＬＮＡ含有オリゴヌクレオチド薬物動態プロファイルを有するオリゴヌクレオチドのクラスに属する。マウスに連続３日間注射し、次いで、後肢虚血に供し、その後、実験全体を通して、週に１回、維持注射を行った。簡単に述べると、皮下投与後、これらの抗ｍｉＲの血漿中濃度は、一般には、投与後３０分から１時間の間にピーク濃度に達する。血漿クリアランスは、短い最初の分布相と、その後の、より長い消失相の二相性である。オリゴヌクレオチドの蓄積は、腎臓および肝臓において最も高く、脾臓、骨髄および遠位の皮膚（注射部位から離れた）においても有意な蓄積が観察される。終末消失半減期は数週間であり、およそ３〜６週間にわたる。
【０１２８】
ＨＬＩ後に完全に回復する能力が低いので、６カ月齢の雄マウスを全ての実験に使用した。ＨＬＩを、どちらもその全体が本明細書によって参照により組み込まれるYu,  Jら、（２００５年）、「Endothelial  nitric  oxide  synthase  is  critical  for  ischemic  remodeling,  mural  cell  recruitment,  and  blood  flow  reserve」、PNAS、１０２巻（３１号）：１０９９９〜１１００４頁、およびAckah  Eら、（２００５年）、「Akt1/protein  kinase  Balpha  is  critical  for  ischemic  and  VEGF-mediated  angiogenesis」、J  Clin  Invest、１１５巻（８号）：２１１９〜２１２７頁に記載されている通り実施した。
【０１２９】
灌流を、Yu,  Jら、（２００５年）、「Endothelial  nitric  oxide  synthase  is  critical  for  ischemic  remodeling,  mural  cell  recruitment,  and  blood  flow  reserve」、PNAS、１０２巻（３１号）：１０９９９〜１１００４頁に記載されている通り、深部透過レーザードップラープローブを使用して、外科手術の前および後の腓腹筋流を測定し、その後、週に１回、測定することによって定量した。
【０１３０】
図１Ａおよび図２Ａ〜Ｃに示されているｍｉＲＮＡの検出および標的ｍＲＮＡ（例えば、ＦＺＤ４およびＬＲＰ６）の分析のために、本明細書に記載の通り抗ｍｉＲ−１９または対照を注射したマウスから、市販のＲＮＡ抽出キット（例えば、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して大腿筋組織由来の全ＲＮＡを抽出した。
【０１３１】
ｍｉＲＮＡの検出（図１Ａに示されている通り）のために、抽出されたＲＮＡを、ＲＴ２  ｍｉＲＮＡ  Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して逆転写し（retro-transcribed）、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｑＰＣＲを実施した。Ｓｎｏｒｄ６６を内部正規化対照として使用した。Ｐｒｉ  ｍｉＲＮＡを検出するために、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ  ｔｏ  ｃＤＮＡ  ｋｉｔ（ＡＢ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＲＮＡを逆転写し（reverse  transcribed）、Ｔａｑｍａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してリアルタイムＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨを内部正規化対照として使用した。ＲＮＡを３〜５回の生物学的反復実験から抽出した。リアルタイムＰＣＲ増幅反応をｉＱ５  ＢｉｏＲａｄで実施し、比較ＣＴ法（デルタデルタ法）を使用してデータを解析した。
【０１３２】
図２Ａ〜Ｃの標的ｍＲＮＡ（例えば、ＦＺＤ４およびＬＲＰ６）を分析するために、ｉＳｃｒｉｐｔ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＢｉｏＲａｄ）を使用してｃＤＮＡを合成し、その後、ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して定量的分析を行った。プライマーの配列は、
【化７】
2018528967.tif 000022
を含んだ。ＧＡＰＤＨを内部正規化対照として使用した。
【０１３３】
さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｍｉＲ−１９の生理的役割を、ＢＡＴ  ｇａｌマウスにおいて、ＬＮＡ−抗ｍｉＲ手法およびＨＬＩを使用して評価した。最初に、高齢のＢＡＴ  ｇａｌマウスを上記の通りＨＬＩに供し、ＬＮＡ−抗ｍｉＲ−１９の皮下注射（外科手術の３日前および２日後）での処置を行った。その後、組織におけるｂ−ガラクトシダーゼの発現を調査した。図１Ｂに見られるように、虚血組織内の再生している筋線維の周囲の毛細血管ＥＣにおけるレポーター遺伝子発現が、抗ｍｉＲ−１９により増大したが、対照では増大しなかった。
【０１３４】
抗ｍｉＲ−１９の投与により、末梢動脈疾患、血管リモデリングおよび虚血のモデルである後肢虚血マウスモデルにおける血流の回復が、対照抗ｍｉＲと比較して改善された（図１Ａ）。抗ｍｉＲ−１９を用いた処置により、マウスの組織におけるｍｉＲ−１９レベルが低下し（図２Ａ）、同定されたｍｉＲ−１９の直接の標的であるＦＲＺＤ４およびＬＲＰ６が上方制御された（図２Ｂおよび２Ｃ）。より詳細には、大腿筋組織の定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析から、ＬＮＡで修飾された抗ｍｉＲ−１９を用いて処置した動物におけるｍｉＲ−１９の抑制が確認された（図１）。試料分析により、ＬＮＡ  ｍｉＲ−１９を用いて処置したマウスにおいて、対照ＬＮＡ−ｍｉＲで処置したマウスと比較して、ＦＺＤ４およびＬＲＰ６  ｍＲＮＡの発現レベルの全体的な有意な上昇が示された（図２Ｂ〜Ｃ）。したがって、抗ｍｉＲ−１９は、側副血液供給が筋肉機能の重要な決定因子である可能性がある末梢動脈疾患または心筋虚血に対する有用な療法であり得る。
【０１３５】
（実施例２）
ＭｉＲ−１９はＦＺＤ４およびＬＲＰ６を直接標的とする
本実施例では、ＦＺＤ４およびＬＲＰ６の３’ＵＴＲにおける推定ｍｉＲ−１９予測結合性部位の存在に基づいて（図３Ａ）、ｍｉＲ−１９がＦＺＤ４およびＬＲＰ６を直接標的とするかどうかという疑問を調査した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、バイシストロン性ウミシイタケ／ホタルルシフェラーゼレポーターベクターにクローニングしたＦＺＤ４またはＬＲＰ６の全長３’ＵＴＲをトランスフェクトし、ｍｉＲ−１９模倣物または陰性対照模倣物を共トランスフェクトし、ルシフェラーゼレポーターアッセイを実施した。簡単に述べると、マウスＦＺＤ４  ３’ＵＴＲの１ｋｂ断片またはマウスＬＲＰ６  ３’ＵＴＲの４００ｂｐ断片をＰＣＲによって生成し、ｐｓｉ−ＣＨＥＣＫ−２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの２４時間前に、２４ウェルプレートにウェル当たり細胞９×１０４個でプレーティングした。クローニングされた３’ＵＴＲまたはその変異体を含有するｐｓｉ−ＣＨＥＣＫ−２レポータープラスミド５０ｎｇおよび６０ｎＭのｍｉＲＮＡ模倣物（ｍｉＲ−１９；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を、それぞれリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびオリゴフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、３連のウェルで共トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してルシフェラーゼアッセイを実施した。
【０１３６】
図３Ｂに示されている通り、ｍｉＲ−１９模倣物により、ＦＺＤ４  ３’ＵＴＲレポーターおよびＬＲＰ６  ３’ＵＴＲレポーターのレベルが低下し、これにより、これらの受容体がどちらもｍｉＲ−１９の標的であることが実証される。図３Ａに示されている通り、予測ｍｉＲ−１９結合性部位のシード配列の変異誘発により、ルシフェラーゼ発現が回復し、したがって、ｍｉＲ−１９とＦＺＤ４  ３’ＵＴＲおよびＬＲＰ６  ３’ＵＴＲとの間の相互作用の特異性が確認された。ｍｉＲ−１９により、３’ＵＴＲ構築物のルシフェラーゼ活性は配列特異的に低下したが、ＬＲＰ６  ｍＲＮＡレベルは直接低下しなかったので、ｍｉＲ−１９は、ＬＲＰ６の翻訳効率を制御する可能性があり得る。
【０１３７】
（実施例３）
ＭｉＲ−１９により、内皮細胞（ＥＣ）におけるＷＮＴ／βカテニン媒介性遺伝子発現がもたらされる
マウス肺内皮細胞（ＭＬＥＣ）を、その全体が参照により本明細書に組み込まれるLanahan  AAら（２０１０年）、「VEGF  reporter  2  endocytic  trafficking  regulates  arterial  morphogenesis」、Dev  Cell、１８巻（５号）：７１３〜７２４頁に記載されている通り、マウスから単離した。簡単に述べると、安楽死させたマウスから肺を切除し、マウス５匹から抜き取り、細かく切り、新しく調製した、ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ中、４℃で４５分にわたって消化した。ホモジナイズした消化物を１４ゲージの針に複数回通し、７０μｍのセルストレーナーで濾過した。細胞ホモジネートを、抗マウスＰＥＣＡＭ−１抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でコンジュゲートしたＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ  ＵＳＡ）と一緒にインキュベートし、その後、磁気細胞分離器を使用して細胞選別を行った。細胞を０．１％ゼラチンでコーティングしたディッシュ上にプレーティングした。細胞が７０％集密度に達したら、第２の免疫選択を実施し、細胞をプレーティングし、これを継代０と称した。細胞を、ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、ゲンタマイシンおよびアンホテリシンＢ、ペニシリン  ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、内皮マイトジェン（Ｂｉｏｍｅｄ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）およびＤＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ  １２−７０９Ｆ）中ヘパリン１００μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）を補充した２０％ＦＢＳ中で繁殖させた。その後、継代０〜３の間の細胞を使用して、一次ＥＣ培養物を使用した内皮細胞（ＥＣ）を伴うｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験（すなわち、図４Ａおよび４Ｂ）を行った。
【０１３８】
図４Ａにおいて、ＷＮＴ３ａにより転写制御される遺伝子のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＭＬＥＣに、ｍｉＲ−１９模倣物（３０ｎＭ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）または模倣物対照（３０ｎＭ）のいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ＭＬＥＣを、０．５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で３時間にわたって血清を飢餓状態にし、対照馴化培地（ＣＭ）または１０％ＷＮＴ３ａ  ＣＭを用いて２〜６時間にわたって刺激した。ＷＮＴ３ａ馴化培地および対照馴化培地を調製し、Ｌ  ＷＮＴ３ａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６４７）および対照Ｌ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６４８）を使用して、その全体が参照により本明細書に組み込まれるWilbert  Jら（２００２年）、「A  transcriptional  response  to  Wnt  protein  in  human  embryonic  carcinoma  cells」、BMC  Dev  Biol  ２巻:８頁において以前に記載されている通り試験した。
【０１３９】
図４Ａにおいて見ることができるように、ｍｉＲ−１９でトランスフェクトされた細胞では、ＷＮＴ３ａによる処理に応答して、Ａｘｉｎ２、Ｓｏｘ１７およびＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１を含めたいくつかのβ−カテニン依存性遺伝子の発現の低下がもたらされた。
【０１４０】
さらに、ＦＺＤ４はカノニカル（β−カテニン）経路および非カノニカル（平面内細胞極性、ＰＣＰ）経路のどちらの構成成分でもあるので、ｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２−末端キナーゼ（ＪＮＫ）とカップリングしたＦＺＤ４を調査した。ＭＬＥＣを上記の通りプレーティングし、その後、上記の通り、ＷＮＴ３ａによる刺激前４８時間にわたって対照または抗ｍｉＲ−１９（各６０ｎＭ）を用いてトランスフェクトした。ＭＬＥＣを４時間にわたって飢餓状態にさせ、次いで、ＷＮＴ３ａ馴化培地を用いて０分、１５分、または４５分にわたって処理した。馴化培地を上記の通り調製した。溶解物を当技術分野において以前に記載されている通り調製し、収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、ｐ−ＪＮＫ、総ＪＮＫ、およびＨＳＰ９０について免疫ブロットした。使用した抗体には、ＨＳＰ９０（ＢＤ  ６１０４１９）が含まれた。
【０１４１】
図４Ｂに示されている通り、ＭＬＥＣを抗ｍｉＲ−１９で処理することにより、ｐ−ＪＮＫのＷＮＴ３ａによる刺激が増強され、これは、ｍｉＲ−１９がＰＣＰシグナル伝達を負に制御し得ることも意味する。
【０１４２】
まとめると、これらのデータから、ｍｉＲ−１９によりＷＮＴシグナル伝達が負に制御され、それにより今度は、動脈発生の局面が制御されることが示される。
【０１４３】
（実施例４）
ｍｉＲ−９２拮抗作用により、糖尿病創傷モデルにおける創傷治癒が促進され、ｍｉＲ−９２拮抗作用とｍｉＲ−１９拮抗作用の組合せがｍｉＲ−９２拮抗作用単独よりも良好である
ｍｉＲ−９２アンタゴニスト（配列番号２２）およびｍｉＲ−１９アンタゴニスト（配列番号１１）をｉｎ  ｖｉｖｏ慢性創傷モデルにおいて創傷治癒の加速について試験した。ｄｂ／ｄｂ（ＢＫＳ．Ｃｇ  Ｄｏｃｋ（Ｈｏｍ）７ｍ＋／＋Ｌｅｐｒｄｂ／ｊ）マウスは、６週齢までに２型糖尿病および創傷治癒不良を発症する。年齢および性別をマッチさせた成体マウスに麻酔を行い、背側を脱毛した。マウスの肩部と臀部から等距離の背中のところで脊柱のいずれかの側面に直径６ｍｍの切除によるパンチ創傷を２つ作出し、両方の創傷を半密封包帯で覆った。
【０１４４】
外科手術の時点、および手術後２日目、４日目および８日目に、化合物を創傷縁の周囲の複数の部位へ皮内注射することによって適用した。ビヒクル対照を投与したマウスを陰性対照として使用した。
【０１４５】
外科手術後１０日目に動物を屠殺した。再上皮化の割合、肉芽組織内方成長の割合、ならびに新しい上皮および肉芽組織の厚さおよび横断面積を評価するために組織学的分析を実施した。組織学的分析は、標準のプロトコールに従い、各皮膚創傷の半分を１０％中性緩衝ホルマリン中に２４時間固定し、パラフィン包埋することによって実施した。４μｍの組織切片を脱パラフィンし、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。Ａｐｅｒｉｏ  ＡＴ２スキャナーを使用して２０×倍率で完全なスライドスキャンを実施し、画像を、Ａｐｅｒｉｏ  ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅを使用して％再上皮化、％肉芽組織内方成長、ならびに新しい上皮および肉芽組織の厚さおよび横断面積について分析した。
【０１４６】
この試験からのデータを図５Ａ〜Ｄに示す。図５Ａのデータは、抗ｍｉＲ−９２ならびに抗ｍｉＲ−９２プラス抗ｍｉＲ−１９により、創傷の再上皮化が対照創傷と比較して増大したことを例示した。抗ｍｉＲ−９２と抗ｍｉＲ−１９の組合せでの処置による変化の大きさは、高用量（６０ｎｍｏｌ）の抗ｍｉＲ−９２単独と同等であった。図５Ｂのデータは、抗ｍｉＲ−９２および抗ｍｉＲ−１９のどちらによっても皮膚創傷内への肉芽組織の内方成長が増大したことを例示した。図５Ｃおよび図５Ｄのデータは、抗ｍｉＲ−９２により、肉芽組織の面積および厚さが、それぞれ用量依存的に増大したこと、抗ｍｉＲ−１９単独で肉芽組織の面積および厚さに対する効果があったこと、および抗ｍｉＲ−９２と抗ｍｉＲ−１９の組合せでの処置の効果が高用量（６０ｎｍｏｌ）の抗ｍｉＲ−９２よりも大きかったことを例示する。
【０１４７】
この試験から、ｍｉＲ−９２アンタゴニストにより、再上皮化、肉芽組織の内方成長、肉芽組織面積および肉芽組織の厚さの増大によって測定される通り、創傷治癒が用量依存的に増大することが実証された。これらの結果は、その内容全体が本明細書によって参照により組み込まれるＵＳ２０１６０２０８２５８に示されている結果と一致する。ｍｉＲ−１９アンタゴニストを用いた処置では、３０ｎｍｏｌ用量での肉芽組織の内方成長を含め、対照創傷と比較して、全てのパラメータの改善が示された。オリゴヌクレオチド単独、３０ｎｍｏｌのｍｉＲ−９２阻害剤と３０ｎｍｏｌのｍｉＲ−１９阻害剤の組合せのいずれと比較しても、創傷治癒の実質的な改善が示された。これらの結果により、創傷治癒の改善に対するｍｉＲ−９２拮抗作用とｍｉＲ−１９拮抗作用のコンビナトリアル効果が例示される。
【０１４８】
適用可能である全ての実施例において、Ｐｒｉｓｍ  ５  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて統計解析を実施した。有意性は、両側の対応のないスチューデントのｔ検定、または多重比較に関しては適切な場合にはボンフェローニ補正を伴う二元配置ＡＮＯＶＡによって検定した。全ての値が平均±ＳＥＭとして表されている。
【０１４９】
本明細書で論じられ、引用された、全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。開示された発明は、それらは変化しうるので、記載された特定の方法、プロトコール、および材料に限定されないことが理解される。また、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を記載することだけを目的とするものであり、付属の特許請求の範囲だけにより限定される、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解される。
【０１５０】
当業者は、単に日常的な実験のみを使用して、本明細書で記載される本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識または確認することが可能である。このような均等物は、以下の特許請求の範囲により包摂されることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５ＡＢ】
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【図５ＣＤ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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