(57)【要約】  腫瘍微小環境（TME）を改変するための遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法、および腫瘍微小環境（TME）を改変する方法を開示する。いくつかの実施形態において、前記方法は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを免疫細胞に送達することを含んでいてもよい。さらに、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制を調節する方法、腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑える方法、ならびに抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法の効率を向上させる方法が提供される。
2018528774.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍の腫瘍微小環境（TME）を改変するための遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法であって、
T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを免疫細胞に送達することを含む方法。
【請求項２】
第１のベクターがウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記レンチウイルスベクターが、Vpxタンパク質とともにパッケージングされている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質が、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質が、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質が、PD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質が、PD-L1タンパク質またはその活性断片であること、および該PD-L1タンパク質またはその活性断片とPD-1との結合が作動性シグナルを発生させないことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質がPD-1タンパク質の断片を含むこと、該PD-1タンパク質断片が、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、かつ該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合が作動性シグナルを発生させないことを特徴とする、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記PD-L1タンパク質断片が、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（KNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKI；配列番号７）を含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質が、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質が、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ケモカインが、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記免疫細胞が、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球およびヒト単球からなる群から選択された細胞である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記免疫細胞がT細胞である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫細胞がNK細胞である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記免疫細胞が遺伝子組換えNK細胞である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記T細胞が、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた遺伝子組換えT細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫細胞が骨髄系細胞である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記骨髄系細胞がマクロファージである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記骨髄系細胞が小膠細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記腫瘍が神経膠腫である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記腫瘍が膠芽腫である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクターを前記免疫細胞に送達すること；および
前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸を前記免疫細胞に送達すること
をさらに含み、
CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸が、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていてもよいことを特徴とする、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
第２のベクターがmRNAである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記Cas9が、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的遺伝子が、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである、請求項２５〜２７に記載の方法。
【請求項２９】
第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクターを前記免疫細胞に送達すること；ならびに
前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターを前記免疫細胞に送達すること
をさらに含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
第２のタンパク質が、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
第４のベクターがmRNAである、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記mRNAが、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの標的遺伝子が、内在性の炎症促進遺伝子である、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記炎症促進遺伝子が、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFをコードする、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
第１のベクターが、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記自殺遺伝子システムが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記タンパク質をコードする核酸が、調節因子によって制御される、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記調節因子が、薬物によって誘導可能なプロモーターである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記調節因子が、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記調節因子が、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記免疫細胞を分化誘導することをさらに含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、前記免疫細胞を炎症促進性の表現型に分化誘導する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、前記免疫細胞を抗炎症性の表現型に分化誘導する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
遺伝子組換え免疫細胞であって、
内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、T細胞の増殖の誘導、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含む細胞。
【請求項４５】
前記タンパク質が、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である、請求項４４に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項４６】
T細胞である、請求項４４または４５に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項４７】
遺伝子組換えT細胞である、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項４８】
キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた遺伝子組換え免疫細胞である、請求項４４〜４７のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項４９】
NK細胞である、請求項４４〜４８のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項５０】
遺伝子組換えNK細胞である、請求項４４〜４８のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項５１】
マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球および初代ヒト単球からなる群から選択された細胞である、請求項４４〜５０のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項５２】
骨髄系細胞である、請求項４４〜５１のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項５３】
前記骨髄系細胞がマクロファージである、請求項５２に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項５４】
前記骨髄系細胞が小膠細胞である、請求項５２に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項５５】
第１のベクターがウイルスベクターである、請求項４４〜５４のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項５６】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項５５に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項５７】
前記レンチウイルスベクターが、Vpxタンパク質とともにパッケージングされている、請求項５６に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項５８】
前記タンパク質が、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する、請求項４４〜５７のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項５９】
前記タンパク質が、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である、請求項４４〜５８のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項６０】
前記タンパク質が、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む、請求項４４〜５９のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項６１】
前記タンパク質が、PD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む、請求項４４〜６０のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項６２】
前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質が、PD-L1タンパク質またはその活性断片であること、および該PD-L1タンパク質またはその活性断片とPD-1との結合が作動性シグナルを発生させないことを特徴とする、請求項４４〜６１のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項６３】
前記タンパク質がPD-1タンパク質の断片を含むこと、該PD-1タンパク質が、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、かつ該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合が作動性シグナルを発生させないことを特徴とする、請求項４４〜６２のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項６４】
前記PD-L1タンパク質断片が、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（KNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKI；配列番号７）を含む、請求項４４〜６３のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項６５】
前記タンパク質が、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である、請求項４４〜６４のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項６６】
前記タンパク質が、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである、請求項４４〜６５のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項６７】
前記ケモカインが、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む、請求項６６に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項６８】
Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および
前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸
をさらに含み、
CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸が、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていてもよいことを特徴とする、請求項４４〜６７のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項６９】
第２のベクターがmRNAである、請求項６８に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項７０】
前記Cas9が、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項６８または６９に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項７１】
前記標的遺伝子が、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである、請求項６８または６９に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項７２】
第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに
前記免疫細胞中の少なくとも1つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクター
をさらに含む、請求項４４〜７１のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項７３】
第２のタンパク質が、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-αおよびIFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである、請求項７２に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項７４】
第４のベクターがmRNAである、請求項７２または７３に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項７５】
前記mRNAが、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項７４に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項７６】
前記少なくとも１つの標的遺伝子が、内在性の炎症促進遺伝子である、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項７７】
前記少なくとも１つの標的遺伝子が、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEをコードする、請求項７２〜７６のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項７８】
第１のベクターが、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む、請求項４４〜７７のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項７９】
前記自殺遺伝子システムが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである、請求項７８に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項８０】
前記タンパク質をコードする核酸が、調節因子によって制御される、請求項４４〜７９のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項８１】
前記調節因子が、薬物によって誘導可能なプロモーターである、請求項８０に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項８２】
前記調節因子が、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである、請求項８０または８１に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項８３】
前記調節因子が、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである、請求項８０〜８２のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項８４】
分化誘導された免疫細胞である、請求項４４〜８３のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項８５】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である、請求項８４に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項８６】
マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である、請求項８４に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【請求項８７】
請求項４４〜８６のいずれかに記載の遺伝子組換え免疫細胞の１種以上；および
キャリア、抗がん治療薬、抗感染症治療薬、抗菌治療薬、抗ウイルス治療薬または抗腫瘍治療薬
を含む組成物。
【請求項８８】
腫瘍微小環境における免疫応答の抑制の調節を必要とする対象において、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制を調節する方法であって、
請求項４４〜８６のいずれかに記載の遺伝子組換え免疫細胞の１種以上または請求項８７に記載の組成物を前記対象に投与すること、ならびに
任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および／または
任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象の腫瘍微小環境における免疫応答の抑制の調節を測定すること
を含む方法。
【請求項８９】
腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑えることを必要とする対象において、腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑える方法であって、
請求項４４〜８６のいずれかに記載の遺伝子組換え免疫細胞の１種以上または請求項８７に記載の組成物を前記対象に投与すること、ならびに
任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および／または
任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象における腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を測定すること
を含む方法。
【請求項９０】
抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法の効率の向上を必要とする対象において、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法の効率を向上させる方法であって、
請求項４４〜８６のいずれかに記載の遺伝子組換え免疫細胞の１種以上または請求項８７に記載の組成物を前記対象に投与すること、ならびに
任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および／または
任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象におけるがん、感染体、細菌、ウイルスまたは腫瘍の増殖を測定すること
を含む方法。
【請求項９１】
前記投与が養子細胞移入によって行われる、請求項８８〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記遺伝子組換え免疫細胞が、注射による腫瘍床への直接送達によって投与される、請求項８８〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記対象が、がんに罹患しているか、またはがんに罹患している対象が、抗がん療法を受けるべきであるとして選択される、請求項８８〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記がんが固形腫瘍である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記固形腫瘍が、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌からなる群から選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
請求項４４〜８６に記載の細胞の１種以上または請求項８７に記載の組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に細胞療法を行うことをさらに含む、請求項８８〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記細胞療法がCAR T細胞療法である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
請求項４４〜８６に記載の細胞の１種以上または請求項８７に記載の組成物を前記治療対象に導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、抗体、小分子、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体または腫瘍溶解性ポリオウイルスを前記対象に送達することをさらに含む、請求項８８〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
前記抗体が、α−フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（MAGE）、HER2、および／またはrasもしくはp53の異常生成物に特異的である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記対象にプロドラッグを投与することをさらに含む、請求項８８〜９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記プロドラッグが、アービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506または二量体化誘導化学物質である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
請求項４４〜８６に記載の細胞の１種以上または請求項８７に記載の組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に薬物を投与することをさらに含む、請求項８８〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記薬物が、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記対象が、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法を受けるべき対象として特定または選択された対象である、請求項８８〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
請求項４４〜８６に記載の細胞の１種以上または請求項８７に記載の組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤などのさらなる治療剤、または放射線療法および／もしくは外科手術などの補助療法を前記対象に導入、提供または投与することをさらに含む、請求項８８〜１０４の１項以上に記載の方法。
【請求項１０６】
前記さらなる治療剤が、ホルモン遮断療法、化学療法、小分子、モノクローナル抗体、および／または放射線照射を含む抗がん療法である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記モノクローナル抗体が、Her2、CD52、CD20、CD25、VEGFまたはEGRFに特異的である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ホルモン遮断療法が、タモキシフェン、アナストロゾール、および／またはレトロゾールの送達を含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
前記小分子が、チロシンキナーゼ阻害薬、小分子薬物複合体、セリンキナーゼ阻害薬、および／またはトレオニンキナーゼ阻害薬を含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１０】
医薬品として使用するための、請求項４４〜８６のいずれか１項に記載の遺伝子組換え免疫細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2015年9月9日に出願された米国仮出願第62/216,224号「免疫療法のためのマクロファージの遺伝子組換え」および2016年7月12日に出願された米国仮出願第62/361,348号「免疫療法のためのマクロファージの遺伝子組換え」の優先権を主張するものであり、これらの内容はその全体が本明細書の一部を構成するものとして援用される。
【０００２】
連邦政府の助成による研究開発に関する陳述
本発明は、Steven Higgins Brain Tumor Research FundおよびSarah M Hughes財団からの助成を一部受けてなされたものである。
【０００３】
配列表の参照
本願は電子形式の配列表とともに出願されたものである。この配列表は、Sequence SCRI.101WO.TXTのファイル名で2016年9月6日に作成された46kbのファイルとして提供されたものである。この電子形式の配列表に記載された情報は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００４】
本願は、腫瘍微小環境（TME）の改変を必要とする対象において、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制が調節され、かつ前記対象における腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖が最小限に抑えられるように腫瘍微小環境を改変する方法を開示する。さらに、がん療法の向上を必要とする対象においてがん療法を向上させる方法が提供される。これらの方法は、治療用量の遺伝子組換え免疫細胞または該遺伝子組換え免疫細胞の組成物を前記対象に投与することを含んでいてもよい。
【背景技術】
【０００５】
患者の免疫系を調節することによる免疫療法は、転移性悪性黒色腫や結腸直腸癌などの固形腫瘍および血液腫瘍において目覚ましい成功を収めている。このような成功とは対照的に、膠芽腫（GBM）などの固形腫瘍は免疫療法による効果が認められていない。この主な原因としては、多くの固形腫瘍および固形腫瘍によって形成される微小環境は、免疫抑制性が強く、腫瘍促進性が高いことから、腫瘍増殖が促進され、細胞傷害性免疫細胞の局在化およびその機能が抑制される。したがって、GBMや他の固形腫瘍の免疫療法を成功させるための第一歩として、腫瘍微小環境（TME）によって引き起こされる影響と、形質転換細胞を排除する役割を果たす浸潤免疫細胞が受ける影響とを解消するアプローチが必要とされている。
【０００６】
たとえば、小児白血病では、T細胞を用いた治療法に対して顕著な応答性が示されているが、固形腫瘍ではこれほどの治療成果は上げられていない。多くの固形腫瘍において免疫抑制性の微小環境は、腫瘍特異的抗原が存在しないことも相まって、CAR T細胞免疫療法を以てしてもこれまで克服できない障壁であった。小児がんの20％を占める脳腫瘍は、骨髄系細胞が高度に浸潤するため、細胞傷害性機能に対する腫瘍の抵抗性が高い。
【０００７】
したがって、GBMや他の固形腫瘍の免疫療法を成功させるための第一歩として、腫瘍微小環境（TME）によって引き起こされる影響と、形質転換細胞を排除する役割を果たす浸潤免疫細胞が受ける影響とを解消する方法が強く必要とされている。
【０００８】
膠芽腫（GBM）は、星細胞腫のWHO分類でグレードIVに分類され、成人および小児において最も進行の早い原発性脳腫瘍であり、５年生存率は成人で10％未満、小児で40％未満である（Omuro A, DeAngelis LM. Glioblastoma and other malignant gliomas: a clinical review. JAMA 2013;310:1842-1850；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。GBM患者の標準的な治療法としては、外科手術、テモゾロミドによる化学療法および放射線療法が挙げられるが、このような治療を行っても生存期間はわずかしか延長されない。患者の多くは治療に伴う副作用を経験するため、相応の生活の質を保つことが難しい。養子細胞免疫療法によって移入された細胞は、効率的に腫瘍部位に帰巣し、神経構造およびグリア構造に損傷を与えることなく腫瘍細胞を特異的な標的とすることができるため、GBM患者の関心を集めている（Choi BD, Pastan I, Bigner DD et al. A novel bispecific antibody recruits T cells to eradicate tumors in the "immunologically privileged" central nervous system. Oncoimmunology 2013;2:e23639; Grupp SA, Kalos M, Barrett D et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. N Engl J Med 2013;368:1509-1518; Miao H, Choi BD, Suryadevara CM et al. EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor T cells migrate to and kill tumor deposits infiltrating the brain parenchyma in an invasive xenograft model of glioblastoma. PLoS One 2014;9:e94281; Ransohoff RM, Engelhardt B. The anatomical and cellular basis of immune surveillance in the central nervous system. Nat Rev Immunol 2012;12:623-635；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）。様々な組織で見出される様々な種類の固形腫瘍と同様に、GBM腫瘍細胞は複雑な腫瘍微小環境（TME）を形成している。腫瘍微小環境には、制御性T細胞（Treg）、骨髄由来免疫抑制細胞（MDSC）、腫瘍関連マクロファージ（TAM）などの細胞が含まれ、これらの細胞は、内在性のT細胞およびナチュラルキラー（NK）細胞による免疫監視を回避し、抗原提示を低下させ、かつ養子移入された抗腫瘍性T細胞の活性を妨害する（Razavi SM, Lee KE, Jin BE et al. Immune Evasion Strategies of Glioblastoma. Front Surg 2016;3:11; Kostianovsky AM, Maier LM, Anderson RC et al. Astrocytic regulation of human monocytic/microglial activation. J Immunol 2008;181:5425-5432; Beavis PA, Slaney CY, Kershaw MH et al. Reprogramming the tumor microenvironment to enhance adoptive cellular therapy. Semin Immunol 2016;28:64-72；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）。このような免疫抑制環境を回避することができる新規の治療法としては、GBMまたは他の種類の固形腫瘍を有する患者体内の抗腫瘍応答を大幅に向上することができ、かつ抗体によるチェックポイント遮断、抗体による細胞傷害性の誘導、および遺伝子組換えT細胞療法などの免疫療法の有効性を高めることができるものが想定される。
【０００９】
前述したように、血液悪性腫瘍に対する免疫療法介入は成功を収めているにもかかわらず、膠芽腫（GBM）に対する免疫療法介入は成功にはほど遠い。これは、腫瘍の増殖を助長し、免疫系による破壊から腫瘍を保護する腫瘍微小環境の存在が一因となっている。したがって、腫瘍微小環境（TME）の改変を必要とする対象において腫瘍微小環境（TME）を改変するための新しいアプローチが必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
遺伝子組換えマクロファージを用いた免疫療法が本明細書において開示される。この免疫療法では、膠芽腫（GBM）の全切除後に遺伝子組換えマクロファージを脳に移植することによって、炎症促進性の自然免疫応答が促進され、かつ細胞傷害性T細胞およびNK細胞による腫瘍標的免疫活性が増強されることから、膠芽腫の腫瘍微小環境が中和される。形質導入された単球および単球由来マクロファージを製造するための新規レンチウイルス発現系が最近報告されており、この発現系の検証を行ったところ、インビトロおよびGBM異種移植片マウスモデルのいずれにおいても、導入遺伝子が数週間から数ヶ月間にわたって安定に発現されることが示された。さらに、遺伝子組換えマクロファージ（GEM）は、動物に疾患を引き起こすことがなく、腫瘍増殖を亢進することもなかった。GEMは、免疫抑制を低減させるタンパク質（可溶性TGFβRIIなど）を分泌するようにも、免疫細胞の活性化を促進するタンパク質を分泌する（IL-21を発現する）ようにも遺伝子操作できることが示されたことから、汎用性を備えるという際だった特徴を有することが明らかとなった。さらに、CRISPRシステムを利用して、細胞傷害性細胞の機能不全を引き起こす遺伝子（IL-10やPD-L1など）をノックアウトすることによって、GEMを原因とする免疫抑制を回避できることも本明細書において開示されている。以上の検証結果から、GEMは、腫瘍微小環境を転換し、抗腫瘍免疫を増強するための細胞種として理想的であることが実証された。特に重要な点として、これらの知見は、他の疾患では成功を収めている免疫療法では現在処置不能な微小環境を有する他の種類の腫瘍にも幅広く適用できると予想される。
【００１１】
したがって、遺伝子組換えされた初代マクロファージの医薬用途が本明細書において初めて開示され、たとえば医療処置用の遺伝子組換え初代マクロファージが開示される。本発明の態様は、がんの治療用医薬品として使用するための遺伝子組換え初代マクロファージをさらに含み、該がんとしては、膠芽腫（GBM）、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫または卵巣癌が挙げられる。
【００１２】
マクロファージは、養子免疫系と自然免疫系のクロストークにおいて中心的な役割を果たし、効率的に腫瘍に動員されて腫瘍内に保持され、炎症促進性の表現型に分極化した後でもTME内で生存を維持することから、免疫抑制性のTMEを再構成するための治療用細胞として理想的である（Long KB, Beatty GL. Harnessing the antitumor potential of macrophages for cancer immunotherapy. Oncoimmunology 2013;2:e26860; Peng J, Tsang JY, Li D et al. Inhibition of TGF-beta signaling in combination with TLR7 ligation re-programs a tumoricidal phenotype in tumor-associated macrophages. Cancer Lett 2013;331:239-249; Beatty GL, Chiorean EG, Fishman MP et al. CD40 agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreatic carcinoma in mice and humans. Science 2011;331:1612-1616; Pyonteck SM, Akkari L, Schuhmacher AJ et al. CSF-1R inhibition alters macrophage polarization and blocks glioma progression. Nat Med 2013;19:1264-1272；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）。さらに、遺伝子組換えマクロファージは、治療用T細胞受容体（TCR）やキメラ抗原受容体（CAR）T細胞の製造過程で廃棄される患者由来単球集団から製造することができる。本願は、遺伝子組換え初代マクロファージの治療目的での使用を初めて提案するものである。これまでにこのような使用が提案されなかった理由の１つとしては、マクロファージが、HIV1ベースのレンチウイルスなどの臨床承認されたベクターを使用して遺伝子操作することが困難であることが挙げられる。つまり、マクロファージは、逆転写反応に利用されるヌクレオチド三リン酸プールを減少させる制限因子SAMHD1を発現することから、通常、レンチウイルスで形質導入することができない（Lahouassa H, Daddacha W, Hofmann H et al. SAMHD1 restricts the replication of human immunodeficiency virus type 1 by depleting the intracellular pool of deoxynucleoside triphosphates. Nat Immunol 2012;13:223-228；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。しかしながら、最近になって、SAMHD1の分解を誘導するSIV／HIV2関連ウイルスタンパク質X（Vpx）を含むビリオンを産生可能なレンチウイルスパッケージングシステムが開発されたことから、初代ヒト骨髄系細胞に安定して遺伝子を送達することが可能となった（Bobadilla S, Sunseri N, Landau NR. Efficient transduction of myeloid cells by an HIV-1-derived lentiviral vector that packages the Vpx accessory protein. Gene Ther 2013;20:514-520；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【００１３】
遺伝子組換えマクロファージ（GEM）の使用を治療薬候補として評価するための、前記方法を利用したプラットフォームが本明細書において提供される。この評価方法によれば、（１）GEMがGBM異種移植動物モデルにおいて生存可能であり、その生存率に影響を及ぼさないこと、（２）腫瘍が分泌するシグナルによる再プログラム化に抵抗性を示すようにGEMを遺伝子操作できること、および（３）GEMが、内在性または養子移入されたNK細胞またはT細胞の生存持続および活性化を促進する因子を安定に発現できることを実証することができる。本発明の実施形態において、免疫抑制性のTMEを逆転させ、かつ既存または新規の免疫療法を補助することが可能な様々な因子を発現することができる送達細胞媒体としてのGEMの有用性を調査した結果について述べる。
【００１４】
遺伝子組換えマクロファージ（GEM）を用いた免疫療法を構築する方法が本明細書において開示され、この方法では、たとえば、膠芽腫（GBM）の全切除後に脳に移植された遺伝子組換えマクロファージが、炎症促進性免疫応答を刺激する因子を発現してGBMの微小環境を中和することによって、腫瘍を標的とする特定の免疫機能活性を発揮する。また、形質導入された単球由来マクロファージを製造するための、骨髄系細胞に特異的なレンチウイルス発現系の検証を行ったところ、インビトロおよび頭蓋内異種移植片マウスモデルのいずれにおいても、導入遺伝子が数週間から数ヶ月間にわたって安定に発現されることが示された。さらに、GEMは、動物に疾患を引き起こさず、腫瘍増殖を亢進することもない。GEMは、可溶性TGFβR、IL-7、IL-21などの因子を分泌するように遺伝子組換えすることができ、さらに、細胞傷害性細胞の機能不全を引き起こす遺伝子（IL-10やPD-L1など）のノックアウトを目的としてCRISPRシステムで正確に標的化することができることから、汎用性を有するという際だった特徴を有する。本明細書で開示した検証結果から、GEMは腫瘍微小環境を転換して、免疫監視および腫瘍破壊を向上させることが示された。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
第１の態様において、腫瘍の腫瘍微小環境（TME）を改変するための遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法が提供される。前記方法は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを免疫細胞に送達することを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、第１のベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質はPD-L1タンパク質の断片であり、該PD-L1タンパク質断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質断片は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（KNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKI（配列番号７））を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球およびヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えT細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記方法は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクターを前記免疫細胞に送達すること；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸を前記免疫細胞に送達することをさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸が、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていることを特徴とする。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、前記方法は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクターを前記免疫細胞に送達すること；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターを前記免疫細胞に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記炎症促進遺伝子は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記免疫細胞を分化誘導することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導する。いくつかの実施形態において、前記細胞をマクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導する。
【００１６】
第２の態様において、遺伝子組換え免疫細胞が提供される。前記遺伝子組換え免疫細胞は、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、T細胞の増殖の誘導、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球およびヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１のベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質は、PD-L1タンパク質またはその活性断片であり、該PD-L1タンパク質またはその活性断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実���形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球および初代ヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト単球である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。
【００１７】
第３の態様において、組成物が提供される。前記組成物は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上；およびキャリア、抗がん治療薬、抗感染症治療薬、抗菌治療薬、抗ウイルス治療薬または抗腫瘍治療薬を含んでいてもよい。前記遺伝子組換え免疫細胞は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および／もしくは活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球およびヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１のベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質は、PD-L1タンパク質またはその活性断片であり、該PD-L1タンパク質またはその活性断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク���と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球および初代ヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト単球である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。
【００１８】
第４の態様において、対象（たとえばヒト）の腫瘍微小環境における免疫応答の抑制を調節する方法が提供され、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物；およびキャリア、抗がん治療薬、抗感染症治療薬、抗菌治療薬、抗ウイルス治療薬または抗腫瘍治療薬を投与することを含んでいてもよい。前記遺伝子組換え免疫細胞は、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、T細胞の増殖の誘導、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球およびヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１のベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質は、PD-L1タンパク質またはその活性断片であり、該PD-L1タンパク質またはその活性断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136��目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていてもよい。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球および初代ヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト単球である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、注射による腫瘍床への直接送達によって投与される。いくつかの実施形態において、前記対象（たとえばヒト）は、がんに罹患しているか、またはがんに罹患している対象が、抗がん療法を受けるべきであるとして選択される。いくつかの実施形態において、前記がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記固形腫瘍は、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌からなる群から選択される。前記組成物は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上；およびキャリア、抗がん治療薬、抗感染症治療薬、抗菌治療薬、抗ウイルス治療薬または抗腫瘍治療薬を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に細胞療法を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞療法はCAR T細胞療法である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を前記治療対象に導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、抗体、小分子、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体または腫瘍溶解性ポリオウイルスを前記対象に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記抗体は、α−フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（MAGE）、HER2、および／またはrasもしくはp53の異常生成物に特異的である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記対象にプロドラッグを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロドラッグは、アービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506または二量体化誘導化学物質である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に薬物を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法を受けるべき対象として特定ま��は選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤などのさらなる治療剤、または放射線療法および／もしくは外科手術などの補助療法を前記対象に導入、提供または投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記さらなる治療剤は、ホルモン遮断療法、化学療法、小分子、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、および／または放射線照射を含む抗がん療法である。いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体は、Her2、CD52、CD20、CD25、VEGFまたはEGRFに特異的である。いくつかの実施形態において、前記ホルモン遮断療法は、タモキシフェン、アナストロゾール、および／またはレトロゾールの送達を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子は、チロシンキナーゼ阻害薬、小分子薬物複合体、セリンキナーゼ阻害薬、および／またはトレオニンキナーゼ阻害薬を含む。
【００１９】
第５の態様において、腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑えることを必要とする対象において、腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑える方法が提供される。前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上または組成物を前記対象に投与すること、ならびに任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および／または任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象における腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を測定することを含んでいてもよい。前記組成物は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上；およびキャリア、抗がん治療薬、抗感染症治療薬、抗菌治療薬、抗ウイルス治療薬または抗腫瘍治療薬を含んでいてもよい。前記遺伝子組換え免疫細胞は、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、T細胞の増殖の誘導、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球およびヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１のベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質は、PD-L1タンパク質またはその活性断片であり、該PD-L1タンパク質またはその活性断片とPD-1との結合は作動性シ���ナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球および初代ヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト単球である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、注射による腫瘍床への直接送達によって投与される。いくつかの実施形態において、前記対象（たとえばヒト）は、がんに罹患しているか、またはがんに罹患している対象が、抗がん療法を受けるべきであるとして選択される。いくつかの実施形態において、前記がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記固形腫瘍は、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に細胞療法を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞療法はCAR T細胞療法である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を前記治療対象に導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、抗体もしくはその結合断片、小分子、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体または腫瘍溶解性ポリオウイルスを前記対象に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその結合断片は、α−フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（MAGE）、HER2、および／またはrasもしくはp53の異常生成物に特異的である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記対象にプロドラッグを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロドラッグは、アービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506または二量体化誘導化学物質である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記��象に薬物を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法を受けるべき対象として特定または選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤などのさらなる治療剤、または放射線療法および／もしくは外科手術などの補助療法を前記対象に導入、提供または投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記さらなる治療剤は、ホルモン遮断療法、化学療法、小分子、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、および／または放射線照射を含む抗がん療法である。いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体は、Her2、CD52、CD20、CD25、VEGFまたはEGRFに特異的である。いくつかの実施形態において、前記ホルモン遮断療法は、タモキシフェン、アナストロゾール、および／またはレトロゾールの送達を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子は、チロシンキナーゼ阻害薬、小分子薬物複合体、セリンキナーゼ阻害薬、および／またはトレオニンキナーゼ阻害薬を含む。
【００２０】
第６の態様において、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法の効率の向上を必要とする対象において、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法の効率を向上させる方法が提供される。前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上または組成物を前記対象に投与すること、ならびに任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および／または任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象におけるがん、感染体、細菌、ウイルスまたは腫瘍の増殖を測定することを含んでいてもよい。前記組成物は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上；およびキャリア、抗がん治療薬、抗感染症治療薬、抗菌治療薬、抗ウイルス治療薬または抗腫瘍治療薬を含んでいてもよい。前記遺伝子組換え免疫細胞は、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、T細胞の増殖の誘導、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球およびヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１のベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質は、PD-L1タンパク質またはそ���活性断片であり、該PD-L1タンパク質またはその活性断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球および初代ヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト単球である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、注射による腫瘍床への直接送達によって投与される。いくつかの実施形態において、前記対象（たとえばヒト）は、がんに罹患しているか、またはがんに罹患している対象が、抗がん療法を受けるべきであるとして選択される。いくつかの実施形態において、前記がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記固形腫瘍は、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に細胞療法を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞療法はCAR T細胞療法である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を前記治療対象に導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、抗体もしくはその結合断片、小分子、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体または腫瘍溶解性ポリオウイルスを前記対象に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその結合断片は、α−フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（MAGE）、HER2、および／またはrasもしくはp53の異常生成物に特異的である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記対象にプロドラッグを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロドラッグは、アービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506または二量体化誘導化学物質である。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法を受けるべき対象として特定また��選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤などのさらなる治療剤、または放射線療法および／もしくは外科手術などの補助療法を前記対象に導入、提供または投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記さらなる治療剤は、ホルモン遮断療法、化学療法、小分子、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、および／または放射線照射を含む抗がん療法である。いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体は、Her2、CD52、CD20、CD25、VEGFまたはEGRFに特異的である。いくつかの実施形態において、前記ホルモン遮断療法は、タモキシフェン、アナストロゾール、および／またはレトロゾールの送達を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子は、チロシンキナーゼ阻害薬、小分子薬物複合体、セリンキナーゼ阻害薬、および／またはトレオニンキナーゼ阻害薬を含む。さらなる実施形態は、医薬品として使用するための前記遺伝子組換え免疫細胞の１種以上を用いた単独療法または併用療法に関する。
【００２１】
第７の態様において、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞は、医薬品として使用するためのものである。前記遺伝子組換え免疫細胞は、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、T細胞の増殖の誘導、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球およびヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１のベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質は、PD-L1タンパク質またはその活性断片であり、該PD-L1タンパク質またはその活性断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タ���パク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていてもよい。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球および初代ヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト単球である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】顕著なマクロファージの浸潤を示す高悪性度神経膠腫を示す。図１Ａは、マクロファージの細胞マーカーCD163で染色した代表的な組織切片（右）およびこの組織切片をNuance定量ソフトウェアで分析した１視野あたりの細胞数（左）（図１Ｂ）を示す。図１Ｃは、膠芽腫（GBM）患者において腫瘍を切除した直後に分析した、CD11bおよびHLA-DRの発現の検出による腫瘍浸潤マクロファージの代表的なフローサイトメトリー（左）を示す。分析した患者全員の結果をまとめたグラフを示す（MNG：n=13、GBM：n=17）（図１Ｄ）。
【００２３】
【図２】移植されたU87腫瘍に動員されたマウスマクロファージを示す。
【００２４】
【図３】VPX含有レンチウイルスによって形質導入が成功したHLA-DR+マクロファージを示す。
【００２５】
【図４】GFPおよびホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルスで形質導入した単球由来マクロファージ（MDM）は、膠芽腫（GBM）マウスモデルにおいて生存が持続することを示す。図４Ａ：GFPおよびルシフェラーゼをコードするレンチウイルスでMDMに形質導入し、GFPの発現を評価した結果を示す。図４Ｂ：2×105個の野生型U87細胞を頭蓋内注射したNSGマウスの画像を示す。図４Ｃ：縦方向のGEM（遺伝子組換えマクロファージ）の発光シグナルを示す。
【００２６】
【図５】代表的なレンチウイルスコンストラクトの模式図を示す。遺伝子調節因子を矢印で示す。遺伝子調節因子として、EF1αプロモーターと、エンハンサーであるWoodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element（WPRE）とを含む。各オープンリーディングフレームは、プロモーターを示す矢印の直後に示した導入される目的遺伝子、翻訳に共役したT2A切断部位、およびハーセプチンを結合させることによって感染細胞の検出が可能となる細胞表面エピトープタグHer2tまたはアービタックスを結合させることによって感染細胞の検出が可能となる細胞表面エピトープタグEGFRtを含む。
【００２７】
【図６】単球由来マクロファージ（MDM）におけるTGFβRIIの発現およびシグナル伝達の抑制を示す。図６Ａ（上パネル）は、GM-CSFを用いて初代単球から分化誘導したマクロファージを、抗HLA-DR-PE-Cy7抗体および抗TGFβRII-488抗体で染色し、FCMで分析した結果を示す。図６Ｃ（下パネル）は、HLA-DR+細胞（細胞集団の98%）のMFIを示す。図６Ｂは、SBE（SMAD binding element）−ルシフェラーゼレポーターおよび／またはdnTGFβRIIを発現する293T細胞を1ng/mLのTGFβ1で３時間処理した結果を示す。
【００２８】
【図７】形質導入されたH9細胞がPD-1/IFNα融合タンパク質（PIFP）を分泌することを示す。図７Ａは、H9親細胞またはPD1:IFNαを形質導入したH9細胞から回収した上清を濃縮し、電気泳動にかけ、IFNαタンパク質が有する2Aタグに対するモノクローナル抗体（左：1:5000）または抗PD1モノクローナル抗体（右：1:250）を用いてウエスタンブロットを行った結果を示す。図７Ｂは、H9親細胞またはPD1:IFNαを形質導入したH9細胞にブレフェルジンＡを添加して培養した後、各細胞を固定し、透徹し、蛍光色素結合抗体で細胞内染色した結果を示す。抗IFNα抗体（左）および抗PD1抗体（右）を使用したFCMで細胞を分析した。
【００２９】
【図８】293T細胞に複数のウイルスを同時にトランスフェクトし、得られたウイルスをCD14+単球または分化誘導したマクロファージに感染させた工程を示す。
【００３０】
【図９】遺伝子組換えマクロファージ（GEM）の機能を示す。遺伝子組換え骨髄単核細胞（MMC）から分化誘導されたGEMは、遺伝子組換え方法の種類によって様々な機能を備えていると見られ、たとえば、１）抗腫瘍免疫細胞の動員の促進およびその機能の強化、２）免疫応答抑制性の腫瘍微小環境の構成要素による機能的変化への対抗、または３）腫瘍増殖の直接的な抑制などの機能を備えていると考えられる。
【００３１】
【図１０】感染方法を図１０Ａおよび図１０Ｂに示す。
【００３２】
【図１１】GM-CSFによる分化誘導のプロットを図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。GM-CSFで分化誘導したマクロファージにレンチウイルスを感染させるには、レンチウイルスをVpxとともにパッケージングすることが必要である。
【００３３】
【図１２】M-CSFで分化誘導したマクロファージのプロットを図１２Ａおよび図１２Ｂに示す。M-CSFで分化誘導したマクロファージにレンチウイルスを感染させるには、レンチウイルスをVpxとともにパッケージングすることが必要である。
【００３４】
【図１３】マクロファージおよび単球にVpx+レンチウイルスを用量依存的に感染させることができることを示す。GM-CSF（図１３Ａ）またはM-CSF（図１３Ｂ）で単球からマクロファージに分化誘導し、分化７日目にGFPをコードするVpx含有レンチウイルス粒子（LP）をマクロファージ１個あたり20個、50個、100個、250個、500個、750個または1000個感染させ、あるいはVpxを含まないレンチウイルス粒子をマクロファージ１個あたり1000個感染させた。感染の７日後（単離の１４日後）、HLA-DRとGFPとがいずれも陽性の集団（４分割の右上）の頻度をフローサイトメトリーで定量した。３つの独立した反復実験の代表的なデータを示す。（図１３Ｃ）感染と同時に分化誘導し、単離／感染の１４日後に分析を行ったこと以外は図１３Ａと同様に実験を行った。（図１３Ｄ）250個／細胞のウイルス濃度のLPの存在下または非存在下で分化誘導したGM-CSF誘導マクロファージおよびM-CSF誘導マクロファージの収率を示す。使用したCD14+細胞数に対するパーセンテージを示し、エラーバーは３つの独立した反復実験の標準偏差を示す。（ｔ検定、*p<0.05、209×218mm（300×300DPI））。
【００３５】
【図１４】M-CSFによる分化誘導とレンチウイルス感染とを同時に行った場合、用量依存的にGFPが発現されるが、収率が低くなることを示す。単球をM-CSFで分化誘導すると同時に、GFPをコードするvpx含有LPを細胞１個あたり20個、50個、100個、250個、500個、750個または1000個感染させ、またはvpxを含まないLPを細胞１個あたり1000個感染させた。単離／感染の１４日後にフローサイトメトリーで細胞を分析した。HLA-DRおよびGFPがともに陽性の細胞のパーセンテージを４分割の右上に示す。
【００３６】
【図１５】GEMが一般的な骨髄系細胞表面マーカーを発現し、LPS/IFNγ刺激に応答することを示す。分化０日目に、GM-CSFまたはM-CSFを使用して単球から分化誘導したマクロファージに、mCherryをコードするレンチウイルスのウイルス粒子を250個／細胞の濃度で感染させた。６日目に新鮮培地またはLPS/IFNγで細胞を１８時間処理し、フローサイトメトリーで分析した。いずれの処理方法でもマクロファージの100%においてmCherry発現陽性を認めた（図１５Ａ）。ウイルス感染および／またはLPS/IFNγ刺激を行った後に、陽性細胞のパーセンテージ（図１５Ｂ）または平均蛍光強度（MFI）（図１５Ｃ〜１５Ｇ）を測定し、マクロファージ表面タンパク質の発現を示すオーバーレイヒストグラムを作成した。エラーバーは、３名の健常ドナーから得た単球を使用して実施した独立した実験の標準偏差を示す。一元配置分散分析を行った後に、Dunnetの多重比較検定を行った。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001。
【００３７】
【図１６】神経膠腫異種移植モデルにおいてGEMが生存を維持することを示す。（図１６Ａ）実験の概略：標識していないU87細胞を動物に注射し、６日後にGFP-ffluc発現GEMを同じ部位に注射した。（図１６Ｂ）ルシフェリンを皮下注射してから１５分後の生物発光画像を示す。（図１６Ｃ）U87腫瘍細胞とPBSのみとを注射した動物（丸）、U87腫瘍細胞とGM-CSFで分化誘導したGEMとを注射した動物（正方形）、およびU87腫瘍細胞とGM-CSFで分化誘導しLPS/IFNγで刺激したGEMとを注射した動物（三角形）をそれぞれルシフェリンで処理し、縦方向の生物発光分析を行った結果を示す。（図１６Ｄ）U87腫瘍細胞とPBSのみとを注射した動物、U87腫瘍細胞とGM-CSFで分化誘導したGEMとを注射した動物、およびU87腫瘍細胞とGM-CSFで分化誘導しLPS/IFNγで刺激したGEMとを注射した動物の生存曲線を示す（各群n＝4、Mantel-Cox：p=0.2542）。
【００３８】
【図１７】神経膠腫異種移植モデルにおいてGEMが腫瘍の増殖に影響を及ぼさないことを示す。（図１７Ａ）実験の概略：GFP-fflucを発現するU87細胞を動物に注射し、７日後に（生物発光標識をしていない）mCherry発現GEMを同じ部位に注射した。（図１７Ｂ）ルシフェリンを皮下注射してから１５分後の生物発光画像を示す。（図１７Ｃ）U87腫瘍細胞とPBSのみとを注射した動物（丸）、U87腫瘍細胞とGM-CSFで分化誘導したGEMとを注射した動物（正方形）、およびU87腫瘍細胞とGM-CSFで分化誘導しLPS/IFNγで刺激したGEMとを注射した動物（三角形）をそれぞれルシフェリンで処理し、縦方向の生物発光分析を行った結果を示す。（図１７Ｄ）U87腫瘍細胞とPBSのみとを注射した動物、U87腫瘍細胞とGM-CSFで分化誘導したGEMとを注射した動物、およびU87腫瘍細胞とGM-CSFで分化誘導しLPS/IFNγで刺激したGEMとを注射した動物の生存曲線を示す（各群n=5、Mantel-Cox：p=0.4491）。（図１７Ｅ〜１７Ｇ）腫瘍組織中のGEMを特定するため、全脳をホルマリン固定し、パラフィン包埋し、薄切し、抗ヒトCD45抗体で免疫染色した。腫瘍が存在する領域を*で示し、点線で境界を示す。
【００３９】
【図１８】図１８Ａ〜１８ＣＣは、サイトカインの放出がLPS/IFNγ刺激後２４〜４８時間のみ持続することを示す。野生型マクロファージおよびGM-CSFで分化誘導したマクロファージを24ウェルプレートに200,000個／ウェルの密度で播種し、培地500μL中においてLPS（100ng/mL）、IFNγ（20ng/mL）またはLPS+IFNγで１８時間刺激した。１８時間後（１日目）に馴化培地を回収し、サイトカインを添加していない新鮮培地で置換した。２４時間ごとに１０日間にわたって培地を回収した。Luminex Human 30-plexサイトカインキット（Life Tech）を使用してサイトカイン放出を検出した。大部分のサイトカインは、最初の２回で回収された培地でしか検出されず、１８時間後には急激に低下した。ただし、IL-10、IL-12、IL-17、IL-7、IP-10およびMIGは、LPS+IFNγ条件で２日目を過ぎても上昇したまま維持されたことに注意されたい。IFNγ単独では影響はほとんど見られないが、IFNγはLPSに対する応答をしばしば増強することが示された。
【００４０】
【図１９】免疫抑制性の腫瘍微小環境に抵抗性を示し、かつ抗腫瘍応答を補助するようにGEMを遺伝子組換えできることを示す。図１９Ａ）Cas9/IL-10gRNA発現ウイルスに感染させたGEMのゲノムから単離、増幅およびアニーリングして得たDNAはSurveyorエンドヌクレアーゼによって切断されるが、Cas9のみを含むコントロールウイルスに感染させたGEMから得たゲノムDNAはSurveyorエンドヌクレアーゼによって切断されないことを示す。図１９Ｂ、図１９Ｃ）LPS+IFNγ刺激に応答して産生されるIL-10の量が、Cas9およびIL-10gRNAを発現するGEMで少ないことを示す。図１９Ｄ）Cas9/PD-L1gRNA発現ウイルスに感染させたGEMのゲノムから単離、増幅およびアニーリングして得たDNAはSurveyorエンドヌクレアーゼによって切断されるが、Cas9のみを含むコントロールウイルスに感染させたGEMから得たゲノムDNAはSurveyorエンドヌクレアーゼによって切断されないことを示す。図１９Ｅ）Cas9/PD-L1gRNAを発現するGEMにおいてLPS+IFNγで誘導されたPD-L1の発現が、Cas9のみのコントロールよりも低いことを示す代表的なフローサイトメトリープロットである。図１９Ｆ）Cas9を利用してPD-L1遺伝子を破壊したことによって、PD-L1発現のMFIに差が出たことを示す。図１９Ｇ）GM-CSFで分化誘導したマクロファージを12ウェルプレートに１ウェルあたり500,000個播種し、sTGFβRIIをコードするレンチウイルスのウイルス粒子を250個／細胞または500個／細胞の濃度で感染させて形質導入を行った。２４時間馴化後、３日目、５日目、１２日目および１５日目に培地を回収し、タンパク質の分泌量をELISAで検出した。GEMはウイルスの用量に依存してsTGFβRIIを発現する。発現は形質導入後５日目前後でピークに達するが、少なくとも２週間は持続する。エラーバーは、３名の健常ドナーから得た単球を使用して実施した独立した実験の標準偏差を示す。図１９Ｈ）GM-CSFで分化誘導したマクロファージを24ウェルプレートに１ウェルあたり200,000個播種し、IL-21をコードするレンチウイルスのウイルス粒子を1000個／細胞の濃度で感染させて形質導入を行った。２４時間馴化後、６日目に培地を回収し、タンパク質の分泌量をBioplexアッセイで検出した。エラーバーは、２名の健常ドナーから得た単球を使用して実施した独立した実験の標準偏差を示す。図１９Ｉ）GM-CSFで分化誘導したマクロファージを12ウェルプレートに１ウェルあたり500,000個播種し、sTGFβRIIをコードするレンチウイルスのウイルス粒子を250個／細胞または500個／細胞の濃度で感染させて形質導入を行った。２４時間馴化後、３日目、５日目、１２日目および１５日目に培地を回収し、タンパク質の分泌量をELISAで検出した。GEMはウイルスの用量に依存してsTGFβRIIを発現する。発現は形質導入後５日目前後でピークに達するが、少なくとも２週間は発現が持続する。エラーバーは、３名の健常ドナーから得た単球を使用して実施した独立した実験の標準偏差を示す。
【００４１】
【図２０】脳から得た腫瘍細胞を分散させることによってGEMを回収可能であることを示す。安楽死させた動物から脳腫瘍内の異種移植片を採取し、そこからヒト細胞を単離し、染色してフローサイトメトリー分析を行った。シングレットの生細胞をゲーティングした後、mCherryの発現およびCD45の発現がいずれも陽性である細胞をGEMとして特定した。
【００４２】
【図２１】注射部位から遊走したヒトGEMが腫瘍組織に浸潤することを示す。GEMを注射した２５日後（U87細胞を注射した３０日後）に脳を摘出し、薄切し、DAPI（青色）染色およびヒトCD45染色を行った。CD45の発現は遺伝子組換えマクロファージのみに見られ、マウス骨髄系細胞との交差反応は見られなかった。図２１Ａ：U87細胞のみを注射し、次いで５日後にPBSをmockとして注射したマウスの代表的な切片を示す。図２１Ｂ：U87細胞を注射し、次いで５日後にCD45発現GEMを注射したマウスの代表的な切片を示す。
【００４３】
【図２２】GEMが一般的な骨髄系細胞表面マーカーを発現し、LPS/IFNγ刺激に応答することを示す。分化０日目に、GM-CSF（図２２Ａ）またはM-CSF（図２２Ｂ）で単球から分化誘導したマクロファージに、mCherryをコードするvpx含有レンチウイルスのウイルス粒子を250個／細胞の濃度で感染させた。７日目に細胞を分析したところ、処理方法に関係なく細胞の100%において発現陽性を認めた。さらに、これらの細胞において、一般的な骨髄系マーカーであるCD11b、CD16、CD80、HLADR、PD-L1およびCD163の表面発現を分析した（図２２Ｃ〜２２Ｈ）。
【００４４】
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｆは、（CD14細胞の単離の）０日目に、GM-CSFで分化誘導したマクロファージおよびM-CSFで分化誘導したマクロファージに形質導入を行い、７日目に骨髄系表面マーカーを染色して分析した結果を示す。
【００４５】
【図２４】GEMの機能分析に使用したコンストラクトを示す。Cas9を利用したゲノムDNA破壊を誘導する能力について、PD-L1をコードするgRNA配列（図２４Ａ）およびIL-10をコードするgRNA配列（図２４Ｂ）をSurveyorアッセイでスクリーニングした。ゲノムDNAの破壊を誘導できた配列と得られた分解産物を示す。使用したepHIV7.2レンチウイルスベクター（図２４Ｃ）およびLentiCRISPRv2レンチウイルスベクター（図２４Ｄ）の組み込み領域の構造を示す。（図２４Ｅ）図２４Ｃに示す構造を有するレンチウイルスを感染させた後、フローサイトメトリーで分析したCD19tエピトープタグの表面発現を示す。（図２４Ｆ）図２４Ｄに示す構造を有するレンチウイルスを感染させた後、フローサイトメトリーで分析したEGFRtエピトープタグの表面発現を示す。
【００４６】
【図２５】単球およびGM-CSFで分化誘導したマクロファージにVpx+レンチウイルスを用量依存的に感染させることができることを示す。（図２５Ａ）GM-CSFでの分化誘導を７日間行った後、GFP-fflucをコードするVpx含有レンチウイルス粒子（LP）をマクロファージ１個あたり20個、50個、100個、250個、500個、750個または1000個感染させ、あるいはVpxを含まないレンチウイルス粒子をマクロファージ１個あたり1000個感染させた。感染の７日後（単離の１４日後）、HLA-DRとGFPとがいずれも陽性の集団（４分割の右上）の頻度をフローサイトメトリーで定量した。３つの独立した反復実験の代表的なデータを示す。（図２５Ｂ）感染と同時に分化誘導し、１４日後に分析を行ったこと以外は図２５Ａと同様に実験を行った。回収された非感染細胞数に対する感染マクロファージ（図２５Ｃ）または感染単球（図２５Ｄ）の収率を示す。（図２５Ｅ）GM-CSFまたはM-CSFで分化誘導した後に回収されたマクロファージの収率を、最初に単離したCD14+単球の数に対するパーセンテージとして示す。エラーバーは、３名の健常ドナーから単離されたCD14+単球を使用して実施した独立した実験の標準偏差を示す。対応のないｔ検定、ns：p>0.05。ns：有意差なし。
【００４７】
【図２６】免疫抑制性の腫瘍微小環境に抵抗性を示し、かつ抗腫瘍応答を補助するようにGEMを遺伝子組換えすることができることを示す。（図２６Ａ）Cas9およびIL-10gRNAでGEMに形質導入し、LPS+IFNγ刺激に応答したIL-10の分泌をBioplexアッセイで評価した。各患者におけるIL-10の発現は、EGFRtコントロールベクターに対するパーセンテージとして示した。エラーバーは、３名の健常ドナーから単離されたCD14+単球を使用して実施した独立した実験の標準偏差を示す。対応のないｔ検定、***p<0.001。（図２６Ｂ）Cas9/PD-L1gRNA発現GEMにおいてLPS+IFNγで誘導したPD-L1の発現を、Cas9のみのコントロール（EGFRtベクター）に対してプロットした代表的なフローサイトメトリードットプロットである。（図２６Ｃ）Cas9を利用してPD-L1遺伝子を破壊した後のPD-L1表面発現の平均蛍光強度を示す。エラーバーは、３名の健常ドナーから単離されたCD14+単球を使用して実施した独立した実験の標準偏差を示す。各患者におけるPD-L1の発現は、EGFRtコントロールベクターに対するパーセンテージとして示した。対応のないｔ検定、****p<0.0001。（図２６Ｄ）GM-CSFでマクロファージに分化誘導し、７日目にCD19t-T2A-sTβRIIをコードするレンチウイルスまたはCD19tコントロールベクターのウイルス粒子を250個／細胞の濃度で感染させて形質導入を行った。２４時間馴化後、５日目、６日目および７日目の各時間点において培地を回収し、sTβRIIの分泌量をELISAで検出した。エラーバーは、３名の健常ドナーから得た単球を使用して実施した独立した実験の標準偏差を示す。一元配置分散分析を行った後に、Dunnetの多重比較検定を行った。p>0.05。ns：有意差なし。n/d：検出されず。（図２６Ｅ）GM-CSFでマクロファージに分化誘導し、IL-21-T2A-CD19tをコードするレンチウイルスまたはCD19tコントロールベクターのウイルス粒子を250個／細胞の濃度で感染させて形質導入を行った。６日目に培地を交換し、２４時間後に培地を回収し、Bioplexアッセイを使用して、分泌されたIL-21タンパク質を定量した。エラーバーは、３名の健常ドナーから得た単球を使用して実施した独立した実験の標準偏差を示す。n/d：検出されず。
【００４８】
【図２７】複数の機能を備えるようにGEMを遺伝子組換えすることができることを示す。（図２７Ａ）sTβRIIおよびPD-L1gRNAをコードするウイルスを感染させたGEMは、CD19tエピトープタグおよびEGFRtエピトープタグの共発現を指標として選択することができることを示す（Q2：EGFRt陽性かつCD19t陽性）。（図２７Ｂ）二重感染した細胞を選択するためにEGFRtの発現およびCD19tの発現をゲーティングして得た代表的なフローサイトメトリードットプロットにおいて、LPS+IFNγで誘導したPD-L1の発現が、Cas9のみのコントロールよりもCas9/PD-L1gRNA発現GEMで低いことを示す。（図２７Ｃ）Cas9を利用してPD-L1遺伝子を破壊し、EGFRtおよびCD19tを共発現する細胞を選択したところ、PD-L1発現のMFIに差が出たことを示す。エラーバーは、３名の健常ドナーから単離されたCD14+単球を使用して実施した独立した実験の標準偏差を示す。対応のないｔ検定、***p<0.001。（図２７Ｄ）２種のウイルスに感染させたGEMがsTβRIIを産生することを示す。上記と同様にして、二重形質導入した細胞から馴化培地を回収し、ELISAでsTβRIIの発現を分析した。エラーバーは、３名の健常ドナーから単離されたCD14+単球を使用して実施した独立した実験の標準偏差を示す。n/d：検出されず。（図２７Ｅ）IL-21およびCas9/IL-10gRNAをコードするウイルスに感染させたGEMを、非シグナル伝達型エピトープタグCD19tおよびEGFRtに特異的な抗体を用いて特定したことを示す（Q2：EGFRt陽性かつCD19t陽性）。上記と同様にして、二重形質導入した細胞から馴化培地を回収し、BioplexアッセイでIL-21の発現およびIL-10の発現を分析した。（図２７Ｆ）IL-21およびIL-10gRNAをコードするウイルスを感染させたGEMにおいて、LPS+IFNγに応答したIL-10の分泌量が低下することを示す。エラーバーは、３名の健常ドナーから単離されたCD14+単球を使用して実施した独立した実験の標準偏差を示す。一元配置分散分析を行った後に、Dunnetの多重比較検定を行った。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001。（図２７Ｇ）IL-21およびIL-10gRNAをコードするウイルスを感染させたGEMであっても、高濃度のIL-21が分泌されることを示す。エラーバーは、３名の健常ドナーから単離されたCD14+単球を使用して実施した独立した実験の標準偏差を示す。対応のないｔ検定、p>0.05。ns：有意差なし。n/d：検出されず。
【００４９】
【図２８】Vpxとともにパッケージングしたレンチウイルスが、より高効率的に樹状細胞およびマクロファージを形質導入できることを示す。分化３日目に、単球由来の樹状細胞（図２８Ａ）および単球由来のマクロファージ（図２８Ｂ）に、Vpxを除いてパッケージングしたGFP-ffluc含有レンチウイルスをMOI＝0、MOI＝1またはMOI＝15で感染させるか、あるいはVpxを含めてパッケージングしたGFP-fflucをコードするレンチウイルスをMOI＝1で感染させた。細胞染色によって生存率を調べ（左パネル）、「生細胞」としてゲーティングされた細胞のGFP発現を分析した（右）。
【００５０】
【図２９】単球およびM-CSFで分化誘導したマクロファージにVpx+レンチウイルスを用量依存的に感染させることができることを示す。（図２９Ａ）M-CSFでの分化誘導を７日間行った後、GFP-fflucをコードするVpx含有レンチウイルス粒子（LP）をマクロファージ１個あたり20個、50個、100個、250個、500個、750個または1000個感染させ、あるいはVpxを含まないレンチウイルス粒子をマクロファージ１個あたり1000個感染させた。感染の７日後（単離の１４日後）、HLA-DRとGFPとがいずれも陽性の集団（４分割の右上）の頻度をフローサイトメトリーで定量した。３つの独立した反復実験の代表的なデータを示す。（図２９Ｂ）感染と同時に分化誘導し、単離／感染の１４日後に分析を行ったこと以外は図２９Ａと同様に実験を行った。（図２９Ｃ）回収された非感染細胞数に対する感染単球の収率を示す。エラーバーは、３名の健常ドナーから単離されたCD14+単球を使用して実施した独立した実験の標準偏差を示す。対応のないｔ検定、*p<0.05。
【００５１】
【図３０】細胞１個あたりのレンチウイルスの組み込み事象を示す。GFP-fflucをコードするLPを100個／細胞または250個／細胞の濃度で感染させて、マクロファージ（７日目）（図３０Ａ）または単球（０日目）（図３０Ｂ）の形質導入を行った。形質導入の３日後にゲノムDNAを単離した。細胞１個あたりのベクターの組み込み部位の数を算出するため、qPCRによってWPREおよびアルブミン遺伝子を定量した。細胞１個あたりのレンチウイルスのコピー数は、WPREの量（pg）をアルブミンの量（pg）で除した比率に２を掛けて算出した。
【００５２】
【図３１】ウイルスを形質導入した後のサイトカインの産生を示す。野生型（WT）単球およびウイルスで形質導入した単球の馴化培地試料を形質導入の２４時間後または７日後に採取し、LuminexアッセイでIL12（p40/p70）（図３１Ａ）、TNF（図３１Ｂ）およびIFNα（図３１Ｃ）を分析した。分析した３種のサイトカインはいずれも処理方法に関係なく検出限界未満（点線）を示した。
【００５３】
【図３２−３３】増殖させ凍結保存した細胞から選択したCD4 T細胞およびCD8 T細胞を遺伝子組換えして、EGFRvIII 806CARと、IL2受容体（CD122）の細胞内シグナル伝達ドメインに融合させたキメラIL7受容体（CD127）細胞外ドメインとを発現させ、CD3/CD28で活性化し、凍結して行った実験の結果を示す。解凍したCD4 T細胞またはCD8 T細胞をCell Trace Violetで標識し、コントロールとしての組換えIL-7（500ng/ml）を加えて７日間培養するか、IL-7もしくはEGFRt（ベクターのみ）を発現するGEMから回収して一度凍結した馴化培地を加えて７日間培養するか、またはIL-7もしくはEGFRtを分泌する自家GEMと７日間共培養した。フローサイトメトリーでCellTrace Violetの希釈を分析することによって増殖を測定した。なお、CD4 T細胞およびCD8 T細胞はいずれも、CD3/CD28による再刺激は行わず、IL-7以外のサイトカインの添加も行わなかった。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
用語の定義
以下の説明では、様々な用語を広い意味で使用する。本発明の実施形態の理解を容易にするため、用語の定義を以下に記載する。
【００５５】
本明細書において「１つの」は、１つまたは１つ以上を意味していてもよい。
【００５６】
本明細書において「約」は、特定の値が、この値を決定するために用いられた方法に本質的に付随する誤差の変動または実験間での変動を含むことを示す。
【００５７】
本明細書において「腫瘍微小環境（TME）」は、腫瘍細胞と常に相互作用する周辺微小環境であり、腫瘍細胞とその周辺環境のクロストークを可能にする。腫瘍微小環境はがん免疫サイクルを破壊するという役割を果たし、がんの進行の様々な局面において重要な役割を果たす。たとえば、腫瘍微小環境は、薬物の移行を低下させることができ、生存細胞に増殖性およびアポトーシス耐性を付与することができ、遺伝的変異やエピジェネティックな変化を起こすことなく抵抗性を助長することができ、このような機能によって疾患の様相を変え、臨床指標を悪化させる。腫瘍微小環境には、腫瘍内細胞環境、周囲血管、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄由来の炎症性細胞、リンパ球、シグナル伝達分子および細胞外マトリックスが含まれうるが、腫瘍微小環境に含まれるものはこれらに限定されない。腫瘍環境に含まれる腫瘍細胞または悪性細胞は、腫瘍微小環境の支持や影響を受けることがあり、それによって増殖と生存が維持される。また、腫瘍微小環境は、リンパ球様細胞や骨髄系細胞などの腫瘍浸潤免疫細胞を含んでいることがあり、これらの腫瘍浸潤免疫細胞は、抗腫瘍免疫応答を刺激したり抑制したりすることができる。さらに、腫瘍微小環境には間質細胞が含まれていることもあり、これには、腫瘍の構造の統合性を担う腫瘍関連線維芽細胞や内皮細胞などが含まれる。間質細胞としては、さらに、組織構造（線維芽細胞）の統合性を担う内皮細胞や周皮細胞などの腫瘍関連血管を構成する細胞；腫瘍関連マクロファージ（TAM）；および単球、好中球（PMN）、樹状細胞（DC）、T細胞、B細胞、マスト細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞などの浸潤免疫細胞が挙げられるが、これらに限定されない。間質細胞が腫瘍を構成する細胞の大部分を占めるのに対し、固形腫瘍を支配している細胞種は腫瘍関連マクロファージである。
【００５８】
さらに腫瘍微小環境は小さなニッチを含みうる。ニッチは、血流も酸素も多く存在する場合と、血流が少なく低酸素状態である場合とがある。ニッチの血流が少なく低酸素状態である場合、低栄養・低酸素環境で生存可能な抵抗性腫瘍細胞がニッチ内で維持されることがあるため、宿主にとって特に危険な状態となる。
【００５９】
腫瘍は、細胞外シグナルの放出、VEGFのアップレギュレーションなどによる腫瘍血管新生の促進、および末梢免疫寛容の誘導によって、腫瘍の周辺環境を免疫抑制性に変化させることができる。
【００６０】
本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、腫瘍微小環境（TME）を改変するための遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法であって、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを免疫細胞に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制の調節を必要とする対象において、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制を調節する方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上を前記対象（たとえばヒト）に投与すること、ならびに任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および／または任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象の腫瘍微小環境における免疫応答の抑制の調節を測定することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑えることを必要とする対象において、腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑える方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上を前記対象（たとえばヒト）に投与すること、ならびに任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および／または任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象における腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を測定することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、増殖が誘導されるT細胞は、ヘルパーT細胞、メモリーT細胞、細胞傷害性T細胞、サプレッサーT細胞、ナチュラルキラーT細胞およびγδT細胞からなる群から選択される。図９に、抗腫瘍免疫を増強させるための、本明細書に記載の遺伝子組換え免疫細胞の使用を示す。
【００６１】
いくつかの実施形態において、PD-1の結合部位を塞ぐことを目的として、遺伝子設計された小さなタンパク質が使用されるが、この結合は作動性シグナルを送達しない。結合部位は、コンピュータプログラムや突然変異誘発などを利用して決定することができる。PD-L1の62番目〜136番目の残基はLinらによって報告されており（"The PD-1/PD-L1 complex resembles the antigen-binding Fv domains of antibodies and T-cell receptors," Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Feb 26; 105(8): 3011-3016；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）、本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、PD-1の結合部位を塞ぐためにこのPD-L1残基を使用することができる。また、PD-1に結合させた際の作動性機能を調べるため、複数のPD-1結合性分子を試験することができる。抑制性シグナルを送達しないPD-1結合性分子を使用して、PD-1/PD-L1複合体またはPD-1/PD-L2複合体のアゴニスト活性を抑制することができる。さらに、いくつかの実施形態において、PD-1のシグナル伝達を抑制するように構築されたモノクローナル抗体配列を使用して一本鎖抗体または抗体様タンパク質を作製し、これらを使用して複合体のアゴニスト活性を抑制することができる。具体例はUS8008449 B2に記載されている（この文献は引用によりその全体が明示的に本明細書に援用される）。
【００６２】
本明細書において「タンパク質」は、１つ以上のポリペプチド鎖を含む巨大分子を指す。したがって、タンパク質は複数のペプチドから構成されていてもよい。ペプチドとは、モノマーとしての１つ以上の任意のアミノ酸がペプチド（アミド）結合によって連結されたアミノ酸鎖である。タンパク質またはペプチドは２つ以上のアミノ酸を含んでいてもよく、タンパク質配列またはペプチド配列に含まれるアミノ酸の最大数に特に制限はない。前記アミノ酸としては、たとえば、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、シスチン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、ピロリシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、オルニチン、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびセレノシステインが挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質は、たとえば糖鎖などの非ペプチド成分をさらに含んでいてもよい。タンパク質への糖鎖やその他の非ペプチド性置換基の付加は、該タンパク質を産生する細胞によってなされてもよく、細胞種によっても左右される。本明細書においてタンパク質は、そのアミノ酸主鎖の構造で定義され、糖鎖などの置換基については特に規定されないが、このような置換基はタンパク質中に含まれていてもよい。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、腫瘍微小環境（TME）を改変するための遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法であって、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを免疫細胞に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子送達ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのタンパク質をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はT細胞の増殖を誘導または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインまたはケモカインの産生を誘導する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、増殖が誘導されるT細胞は、ヘルパーT細胞、メモリーT細胞、細胞傷害性T細胞、サプレッサーT細胞、ナチュラルキラーT細胞およびγδT細胞からなる群から選択される。
【００６３】
さらに、前記遺伝子組換え免疫細胞によって発現させることができるタンパク質も、半減期延長やプロテアーゼ耐性などの治療効果の増強を目的として遺伝子組換えすることができる。PAS、アルブミン、XTENなどのポリペプチドにタンパク質を融合させる方法は文献に記載されている（Schlapschy et al., Protein Eng Des Sel. 2013 Aug; 26(8): 489-501; Kontermann et al., Current Opinion in Biotechnology Volume 22, Issue 6, December 2011, 868-876; Schulte et al., Thrombosis Research Volume 122, Supplement 4, 2008, Pages S14-S19；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）。タンパク質の半減期を延長させる方法としては、遺伝子組換え技術によって、目的のタンパク質とアルブミンまたはその一部とを融合させて半減期を延長させる方法；遺伝子組換え技術によって、タンパク質とIgGのFc領域とを融合させて該タンパク質の半減期を延長させる方法；遺伝子組換え技術によって、目的のタンパク質と抗体のFcドメインとを融合させて半減期を延長させる方法；遺伝子組換え技術によって、目的のタンパク質と、864個のアミノ酸残基からなるポリペプチドXTENとを融合させて該タンパク質の半減期を延長させる方法；および遺伝子組換え技術によって、目的のタンパク質とPASポリペプチド（XL-protein GmbH）9)とを融合させて該タンパク質の半減期を延長させる方法が挙げられるが、これらに限定されない。Fcまたはヒト血清アルブミン（HSA）との遺伝子融合、および遺伝子設計されたポリペプチドXTENまたはPASとの融合は当業者によく知られており、これらのペプチドおよびタンパク質は、遺伝子組換え技術によって目的のタンパク質に融合させることができ、これによってタンパク質の半減期を延長したり、加水分解耐性を付与したりすることができる。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、腫瘍微小環境（TME）を改変するための遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法であって、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを免疫細胞に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、該タンパク質の半減期を延長させること、および／または該タンパク質の分解耐性を向上させることを目的として、遺伝子組換え技術によってポリペプチドに融合されている。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、抗体のFcドメインもしくはその一部、IgGのFcドメインもしくはその一部、XTENもしくはその一部、PASもしくはその一部、またはヒト血清アルブミンもしくはその一部を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態において、T細胞の増殖の誘導、および／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行う前記タンパク質をコードするベクターは、該タンパク質に翻訳されるRNAまたは該RNAをコードする核酸であってもよい。当技術分野でよく知られているように、前記RNAは、遺伝子操作によって、選択された宿主細胞（たとえばヒト細胞）における発現のために最適化されたコドンを含むように構築することができる。また、前記RNAは、宿主細胞における半減期が延長され、前記タンパク質の翻訳効率が向上するように構築することもできる。いくつかの実施形態において、RNAをポリアデニル化することによって、細胞における該RNAの安定性を向上させ、該RNAの半減期を延長することができる。いくつかの実施形態において、RNAの半減期の延長または細胞における翻訳量の増加を目的として、RNAの遺伝子組換えを行う。いくつかの実施形態において、前記RNAは、50個、100個、150個、200個、250個、300個、350個、400個、450個または500個のアデノシン残基が共有結合で連結されたポリ（Ａ）テールを含んでいてもよく、前記値のいずれか２つによって定義される範囲にある残基数のポリ（Ａ）テールを含んでいてもよい。
【００６５】
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。抗腫瘍活性を促進することができるタンパク質の具体例は過去に報告されており、たとえば、p53（腫瘍抑制因子）、リボソーム不活化タンパク質（RIP；タンパク質の合成を阻害し、抗腫瘍活性を発揮するタンパク質）およびサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、p53、リボソーム不活化タンパク質、サイトカインまたはケモカインである。サイトカインとしては、IL-2（NK細胞の増殖および発生を促すサイトカイン）、IL-1β（免疫細胞の細胞溶解活性を上昇させるサイトカイン）、IFNγ、IL-1、IL-7（T細胞の増殖／生存維持および細胞溶解性のエフェクター機能の発揮を促進するサイトカイン）、IL-15（T細胞の増殖／生存維持および細胞溶解性のエフェクター機能の発揮を促進するサイトカイン）、IL-12（T細胞の増殖／生存維持および細胞溶解性のエフェクター機能の発揮を促進するサイトカイン）、IL-18（CD8細胞およびTh1細胞のエフェクター機能を促進するサイトカイン）、IL-21（ウイルス感染細胞やがん性細胞を殺傷することができるナチュラルキラー（NK）細胞および細胞傷害性T細胞などの、免疫系の細胞を調節する作用を有するサイトカイン）またはIL-33（CD8細胞およびTh1細胞のエフェクター機能を促進するサイトカイン）が挙げられるが、これらに限定されない。前記免疫細胞によって発現されるタンパク質の実施形態のいくつかにおいて、前記タンパク質はサイトカインである。いくつかの実施形態において、前記サイトカインは、IL-2、IL-1β、IFNγ、IL-1、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21またはIL-33である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる（GCCACCATGGCACTTCCAGTCACAGCGCTTCTTCTGCCTTTGGCACTGCTTCTCCACGCAGCACGCCCAAACTGGGTCAATGTAATCAGCGACCTGAAGAAGATTGAAGACCTGATTCAATCAATGCACATAGACGCTACGTTGTACACCGAATCAGATGTTCATCCTAGCTGTAAAGTCACCGCAATGAAATGTTTTTTGCTGGAGCTTCAAGTTATATCCCTTGAGTCTGGGGACGCATCTATACATGACACAGTTGAGAATTTGATCATATTGGCAAACAATAGCTTGTCTTCCAACGGTAATGTCACAGAGTCCGGTTGTAAAGAGTGTGAGGAACTTGAAGAGAAAAACATTAAAGAATTTCTCCAGAGTTTCGTACATATTGTACAAATGTTCATAAATACTTCTATCTATATCTGGGCTCCTCTCGCCGGAACCTGTGGCGTTCTGCTGCTGTCTTTGGTGATTACAGGAAGTGGAGCCACAAATTTCAGTCTGCTTAAACAGGCAGGGGATGTGGAGGAGAACCCCGGCCCAATGCGAATTTCAAAACCACATCTTAGATCAATCAGCATACAGTGTTATCTTTGTCTGCTGCTCAACAGCCATTTCTTGACTGAAGCCAACTGGGTCAACGTAATTTCTGATCTTAAAAAAATCGAGGATCTGATCCAGAGTATGCACATAGACGCAACGCTTTACACCGAAAGTGATGTCCATCCGTCATGTAAAGTAACGGCGATGAAGTGTTTCCTTCTCGAGCTTCAGGTAATTTCATTGGAGTCTGGAGATGCCTCTATTCATGACACGGTAGAGAATTTGATCATTCTCGCTAACAATAGTCTTTCCAGTAACGGTAACGTTACAGAGAGCGGATGTAAAGAATGTGAGGAATTGGAGGAGAAGAACATTAAGGAATTCCTTCAGTCCTTTGTCCACATCGTTCAGATGTTTATTAACACGAGTTGA）。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。さらなる実施形態は、医薬品として使用するための、たとえば、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫、卵巣癌などのがんを治療または抑制するための医薬品として使用するための前記遺伝子組換え免疫細胞の１種以上を用いた単独療法または併用療法に関する。
【００６６】
「免疫応答を調節する」または「免疫応答の調節」とは、たとえば免疫増強、免疫抑制、免疫寛容誘導などが所望のレベルとなるように免疫応答を調節することを指す。本明細書に記載の実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、免疫を変化させることができるタンパク質を分泌させて、腫瘍微小環境を調節するために提供される。このようなタンパク質または免疫調節因子としては、インターロイキン、サイトカイン、免疫調節抗体およびケモカインが挙げられるが、これらに限定されない。前記免疫調節因子は、IL-2、G-CSF、イミキモド、CCL3、CCL26、CSCL7、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18、IL-21、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、PD-1チェックポイント結合性阻害物質、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL15のいずれであってもよいが、これらに限定されない。免疫調節因子は、免疫応答を増強するものであってもよく、免疫応答を抑制するものであってもよい。いくつかの実施形態において、前記免疫調節因子は免疫系の活性を増強して、疾患に対する生体の自然防御機構を増強することができる。さらに、免疫調節因子は免疫抑制を調節して、抗がん療法の有効性を向上することができる。腫瘍環境において、腫瘍は、免疫応答による抗腫瘍効果を阻害したり抑制したりすることができる。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、がんおよび／または
【００６７】
本明細書において「ケモカイン」は、小さなサイトカインのファミリー、すなわち細胞によって分泌されるシグナル伝達タンパク質である。ケモカインは、恒常性ケモカインであってもよく、炎症性ケモカインであってもよい。炎症性ケモカインは、IL-1、TNF-α、LPSなどの炎症性刺激やウイルスによって産生され、炎症部位に免疫細胞を誘引する炎症反応に関与する。炎症性ケモカインとしては、CXCL-8、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11またはCXCL10が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CXCL-8、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11またはCXCL10である。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL17、CCL22、CCL24またはCCL26を含む。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15である。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、EGF、エオタキシン、FGF-2、FLT-3L、フラクタルカイン、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-10、IL-12（p40）、IL-12（p70）、IL-13、IL-13、IL-15、IL-18A、IL-1RA、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、INF-α2、INF-γ、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1a、MIP-1b、PDGF-AA、PDGF-BB、RANTES、TGF-α、TGF-β、VEGF、sCD401、6CKINE、BCA-1、CTACK、ENA78、エオタキシン−２、エオタキシン−３、1309、IL-16、IL-20、IL-21、IL-23、IL-28a、IL-33、LIF、MCP-2、MCP-4、MIP-1d、SCF、SDF-1atb、TARC、TPO、TRAIL、TSLP、CCL1ra/HCC-1、CCL19/MIPβ、CCL20/MIPα、CXCL11/1-TAC、CXCL6/GCP2、CXCL7/NAP2、CXCL9/MIG、IL-11、IL-29/ING-γ、M-CSFおよびXCL1/リンホタクチンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる（GCCACCATGGCACTTCCAGTCACAGCGCTTCTTCTGCCTTTGGCACTGCTTCTCCACGCAGCACGCCCAAACTGGGTCAATGTAATCAGCGACCTGAAGAAGATTGAAGACCTGATTCAATCAATGCACATAGACGCTACGTTGTACACCGAATCAGATGTTCATCCTAGCTGTAAAGTCACCGCAATGAAATGTTTTTTGCTGGAGCTTCAAGTTATATCCCTTGAGTCTGGGGACGCATCTATACATGACACAGTTGAGAATTTGATCATATTGGCAAACAATAGCTTGTCTTCCAACGGTAATGTCACAGAGTCCGGTTGTAAAGAGTGTGAGGAACTTGAAGAGAAAAACATTAAAGAATTTCTCCAGAGTTTCGTACATATTGTACAAATGTTCATAAATACTTCTATCTATATCTGGGCTCCTCTCGCCGGAACCTGTGGCGTTCTGCTGCTGTCTTTGGTGATTACAGGAAGTGGAGCCACAAATTTCAGTCTGCTTAAACAGGCAGGGGATGTGGAGGAGAACCCCGGCCCAATGCGAATTTCAAAACCACATCTTAGATCAATCAGCATACAGTGTTATCTTTGTCTGCTGCTCAACAGCCATTTCTTGACTGAAGCCAACTGGGTCAACGTAATTTCTGATCTTAAAAAAATCGAGGATCTGATCCAGAGTATGCACATAGACGCAACGCTTTACACCGAAAGTGATGTCCATCCGTCATGTAAAGTAACGGCGATGAAGTGTTTCCTTCTCGAGCTTCAGGTAATTTCATTGGAGTCTGGAGATGCCTCTATTCATGACACGGTAGAGAATTTGATCATTCTCGCTAACAATAGTCTTTCCAGTAACGGTAACGTTACAGAGAGCGGATGTAAAGAATGTGAGGAATTGGAGGAGAAGAACATTAAGGAATTCCTTCAGTCCTTTGTCCACATCGTTCAGATGTTTATTAACACGAGTTGA）。
【００６８】
本明細書において「インターフェロン（IFN）」は、ウイルス、細菌、寄生虫、腫瘍細胞などの病原体の存在に応答して宿主細胞において合成され放出されるシグナル伝達タンパク質である。たとえば、ウイルスに感染した細胞は、インターフェロンを放出して、周辺の細胞の抗ウイルス防御を向上させる。Ｉ型IFNなどのインターフェロンは、動物において腫瘍増殖を抑制することが示されている。また、インターフェロンはp53活性を増強し、これによってがん細胞のアポトーシスを促進することができる。IFNとp53の組み合わせは、いくつかの種類のがんにおいて防御作用を発揮することが示されている。インターフェロンβ1a、インターフェロンβ1b、インターフェロンαおよびインターフェロンβは、いくつかの種類のがんの治療薬として使用されている。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記インターフェロンは、Ｉ型IFNである。いくつかの実施形態において、前記インターフェロンは、インターフェロンβ1a、インターフェロンβ1b、インターフェロンαまたはインターフェロンβである。
【００６９】
「プログラム細胞死タンパク質１」すなわちPD-1は、免疫チェックポイントとして機能するタンパク質であり、T細胞の活性化を抑制することによって免疫系をダウンレギュレートし、自己免疫を低下させ自己寛容を促進するという役割を果たしている。PD-1の抑制作用は、リンパ節中の抗原特異的T細胞のアポトーシスを誘導し、これと同時に制御性T細胞のアポトーシスを抑制することによって発揮される。一方、PD-1阻害物質は、免疫系を活性化して腫瘍を攻撃するために使用することができ、また、いくつかの種類のがんを治療するためにも使用することができる。PD-1のリガンドとして、PD-L1およびPD-L2の２種類が存在する。PD-1にPD-L1が結合すると、抑制性シグナルが伝達され、リンパ節中のCD8+T細胞の増殖が低下する。PD-L1は活性化T細胞、B細胞および骨髄系細胞に発現されたPD-1に結合することもでき、活性化または抑制を調節する。また、PD-L1がアップレギュレートされると、がんが宿主の免疫系を回避することが可能となる。したがって、PD-L1-PD-1複合体の形成を阻止するPD-L1阻害物質またはPD-1阻害物質は、いくつかの種類のがんの抑制にとって重要である。
【００７０】
いくつかの実施形態において、PD-1阻害物質が提供される。いくつかの実施形態において、前記PD-1阻害物質はscFvである。scFvの形態のPD1阻害物質（Nivolimumab）は配列番号３９に示されるアミノ酸配列を含む（QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSLGK）。このscFvの軽鎖は配列番号４０に示される配列を含む（EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC）。このscFvの重鎖可変領域は配列番号４１に示される配列を含む（QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS）。このscFvの軽鎖可変領域は配列番号４２に示される配列を含む（EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK）。
【００７１】
いくつかの実施形態において、前記重鎖および前記軽鎖は最適化されている。最適化された重鎖は、配列番号４３（MEFGLSWVFLVALFRGVQC）に示す配列を含み、この配列は、配列番号４４（ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTTAGAGGTGTCCAGTGT）に示す配列によってコードされる。最適化された軽鎖は、配列番号４５（MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARC）に示す配列を含み、この配列は、配列番号４６（ATGGACATGAGGGTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCTCAGGTGCCAGATGT）に示す配列によってコードされる。
【００７２】
本明細書において「PD-L2」は、T細胞の活性化を抑制する能力を有するPD-1の第２のリガンドである。したがって、PD1、PD-L1またはPD-L2に結合して、PD1-PD-L1複合体またはPD1-PD-L2複合体の形成を阻止する阻害物質は、いくつかの種類のがんを抑制することができる。本発明の方法の実施形態のいくつかにおいて、前記タンパク質は、PD1、PD-L1またはPD-L2に結合することによって、PD1-PD-L1複合体またはPD1-PD-L2複合体の形成を阻止することができる阻害物質である。
【００７３】
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質である。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント阻害物質は、PD1、PD-L1またはPD-L2に結合することによって、PD1-PD-L1複合体またはPD1-PD-L2複合体の形成または維持を阻止する。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質は、PD-L1タンパク質またはその活性断片であり、該PD-L1タンパク質またはその活性断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質断片は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。さらなる実施形態は、医薬品として使用するための、たとえば、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫、卵巣癌などのがんを抑制または治療するための医薬品として使用するための前記遺伝子組換え免疫細胞の１種以上を用いた単独療法または併用療法に関する。
【００７４】
本明細書において「核酸」または「核酸分子」は、ポリヌクレオチドを指し、たとえば、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により得られた断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより得られた断片などが挙げられる。核酸分子は、天然のヌクレオチドモノマー（DNA、RNAなど）、または天然のヌクレオチドの類似体（たとえば、天然のヌクレオチドのエナンチオマー）からなるモノマー、またはこれらの組み合わせから構成されていてもよい。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に修飾を有していてもよい。糖部分の修飾としては、たとえば、ハロゲン、アルキル基、アミンおよびアジド基による１つ以上のヒドロキシル基の置換が挙げられ、糖部分はエーテル化またはエステル化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、立体構造的に類似の構造や電子的に類似の構造と置換されていてもよく、このような構造として、たとえば、アザ糖および炭素環式糖類似体が挙げられる。修飾塩基部分としては、アルキル化プリン、アルキル化ピリミジン、アシル化プリン、アシル化ピリミジン、およびその他の公知の複素環置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはこれと似た結合により連結することができる。ホスホジエステル結合と似た結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロセレノエート結合、ホスホロジセレノエート結合、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）結合、ホスホロアニリデート（phosphoranilidate）結合、ホスホロアミデート結合などが挙げられる。「核酸分子」は、「ペプチド核酸」も包含し、これは、ポリアミド主鎖に付加された天然の核酸塩基または修飾核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。
【００７５】
「ベクター」または「コンストラクト」は、様々な調節因子を含みうる細胞中に異種核酸を導入して、該細胞において該異種核酸を発現させるために使用される核酸である。ベクターとしては、プラスミド、ミニサークル、酵母、およびウイルスゲノムが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、プラスミド、ミニサークル、ウイルスベクター、DNAまたはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクターである。
【００７６】
本明細書において「Vpx」は、HIV2型およびいくつかのサル免疫不全ウイルス株にコードされているビリオン関連タンパク質である。Vpxは、ヒトにおいてHIV-2の複製を増強することができる。Vpxタンパク質とともにパッケージングされたレンチウイルスベクターをトランスフェクションに使用すると、骨髄系細胞の感染率を上昇させることができる。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。
【００７７】
本明細書において「Vpr」タンパク質はViral Protein Rを指す。Vprは14kDaのタンパク質であり、HIV-1の組込み前複合体の核移行の制御において重要な役割を果たしており、非分裂細胞におけるウイルス複製に必要とされる。非分裂細胞としては、たとえば、マクロファージが挙げられる。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、前記レンチウイルスベクターは、Vprタンパク質またはその一部とともにパッケージングすることができる。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターは、ウイルスのアクセサリータンパク質とともにパッケージングされる。いくつかの実施形態において、前記ウイルスアクセサリータンパク質は、Vif、Vpx、Vpu、Nef およびVprからなる群から選択される。このようなvif、Vpx、vpu、nefなどのアクセサリータンパク質は、細胞内リガンドと相互作用してアダプター分子として機能し、宿主因子の正常な機能をウイルス自身の目的のために利用することを可能にする。HIVアクセサリータンパク質はStrebelらよって報告されている（"HIV Accessory Proteins versus Host Restriction Factors, Curr Opin Virol. 2013 Dec; 3(6): 10.1016/j.coviro.2013.08.004；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【００７８】
本明細書において、CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）は、短い反復塩基配列を含む原核生物由来DNAセグメントである。過去に遭遇した細菌ウイルスやプラスミドから獲得した「スペーサーDNA」と呼ばれる短いセグメントが各反復配列の後ろに挿入されている。CRISPR/Casシステムは、原核生物の免疫系であり、プラスミドやファージなどの外来遺伝因子に対する耐性を付与し、後天性免疫として機能する。CRISPRスペーサーは、真核生物で見られるRNAiとよく似た方法で、これらの外来遺伝因子を認識し切断する。CRISPR/Casシステムは、あらゆる生命において遺伝子編集（特定の遺伝子配列の付加、破壊または変更）や遺伝子調節に使われてきた。Cas9タンパク質と適切なガイドRNAとを細胞に送達することによって、生物のゲノムを所望とする任意の位置で切断することができる。CRISPRを利用して、特定の集団全体のゲノムを改変することが可能なRNA誘導型遺伝子編集ツールを構築することが可能である。いくつかの実施形態において、細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子を編集するシステムが提供される。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、腫瘍微小環境（TME）を改変するための遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法であって、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および／もしくは活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを免疫細胞に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記方法は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクターを前記細胞に送達すること；および前記細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸を前記細胞に送達することをさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記細胞中の標的遺伝子はTGF-βまたはIL-10をコードする。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βおよび／またはPGEである。
【００７９】
CRISPR/Casシステムは、様々な生物種において遺伝子編集（たとえば、特定の遺伝子配列の付加、破壊または変更）や遺伝子調節に使われてきた。本明細書において「Cas9」は、細菌のCRISPR獲得免疫系と関連したRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ酵素である。Cas9タンパク質と適切なガイドRNAとを細胞に送達することによって、生物のゲノムを所望とする任意の位置で切断することができる。CRISPR/Cas9システムの基本的なコンポーネントは、標的遺伝子、ガイドRNAおよびCas9エンドヌクレアーゼまたはその誘導体もしくは断片を含む。CRISPR/Cas9を使用して遺伝子編集を行う際の重要な点の１つとして、様々な細胞種にガイドRNAを効率よく送達できるシステムが必要であることが挙げられる。このようなシステムは、たとえば、核酸としてインビトロで作製されたガイドRNA（インビトロ転写または化学合成により作製されたガイドRNA）を送達することを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ガイドRNAをコードする核酸は、２’Ｏ−メチル塩基などの修飾塩基を付加することによってヌクレアーゼ耐性が付与されている。さらに、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを使用することによって広範囲な初代細胞において形質導入を行うことができるため、本明細書において、ガイドRNAを発現するための重要なシステムではAAVベクターを使用している。AAVベクターは感染症を引き起こすことがなく、ゲノムに組み込まれることもないことが知られている。したがって、AAVベクターは、安全かつ効果的に使用できるという利点がある。いくつかの実施形態において、前記ベクターはAAVベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターはレンチウイルスベクターである。
【００８０】
CRISPR/Cas9システムは、転写活性化因子と組み合わせて使用することによって、遺伝子を活性化させるためのエフェクタータンパク質動員モジュールシステムとしても使用することができる。Cas9は、遺伝子的組換え技術を利用することによって、転写活性化因子のドメインを含む融合タンパク質として作製することもできる。活性化ドメインは、たとえば、転写活性化因子VP16もしくはVP64に由来する単一または複数のドメイン、またはp65活性化ドメインを含んでいてもよいが、これらに限定されない。したがって、Cas9融合タンパク質は、任意のタンパク質を任意のDNA配列にターゲティングするためのRNA誘導型DNA結合性タンパク質として使用することができ、タンパク質をDNAにターゲティングするための汎用プラットフォームを提供することができる。また、Cas9融合タンパク質は、エンハンサー、イントロンおよびその他の非コード因子にターゲティングさせることによって、転写におけるこれらの因子の制御機能を解明するために利用することもできる。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、腫瘍微小環境（TME）を改変するための遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法であって、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを免疫細胞に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記方法は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するために、転写活性化ドメインに融合されたCas9タンパク質をコードする第４のベクターを前記細胞に送達すること；ならびに前記細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターを前記細胞に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記転写活性化ドメインは、VP16、VP64、またはp65活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクターを前記細胞に送達すること；ならびに前記細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターを前記細胞に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記炎症促進遺伝子はIFN-γ、IL-12および／またはIL-18である。いくつかの実施形態において、IL-12は配列番号２７に示される配列によってコードされる（ATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGTGTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTGCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCCTAA）。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記炎症促進遺伝子は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFをコードする。
【００８１】
タンパク質を最大限に分泌させるための別の因子として、転写産物を生じる遺伝子のコドンを宿主（たとえばヒト）の標準的なコドンの使用頻度に適合させることが挙げられる。この態様では、タンパク質の発現レベルが増加するように様々な合成遺伝子を設計することができる。コドン最適化の設計プロセスでは、まれにしか使用されないコドンを、タンパク質の発現効率を最大限まで上昇させることが知られているコドンに変更することができる。いくつかの実施形態においてコドンの選択が述べられており、アルゴリズムを使用してコドンを選択することによって、タンパク質の収率が上昇するように最適化された合成遺伝子転写産物を作製することができる。コドン最適化のためのアルゴリズムを含むプログラムが利用可能であり、たとえばOptimumGeneTMやGeneGPS（登録商標）などが挙げられる。本明細書で提供される方法の実施形態のいくつかにおいて、前記方法で使用するために提供される前記ベクターは、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている。
【００８２】
「遺伝子組換え免疫細胞」または「遺伝子組換え細胞」は、遺伝子工学と呼ばれる方法によって作製された細胞であり、遺伝子工学技術には、細胞自体のゲノムを操作することや、細胞に新しい核酸を挿入することが含まれるが、これらの操作に限定されない。いくつかの実施形態において、遺伝子組換え免疫細胞はマクロファージであってもよく、これを遺伝子組換えマクロファージ（GEM）とも呼ぶ。このような技術を使用して細胞の遺伝子構成を変化させることができ、この技術の具体例としては、目的遺伝子をコードするベクターの細胞への挿入；およびRNAiシステム、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPRを使用したゲノム編集が挙げられる。目的遺伝子をコードする前記ベクターは、ウイルスベクター、DNAまたはmRNAであってもよいが、これらに限定されない。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、遺伝子組換え免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、たとえば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、CRISPR/VP64-Cas9システム、CRISPR/CAS9システムなどの、ゲノム編集タンパク質またはゲノム編集システムを使用して作製される。いくつかの実施形態において、ベクターを使用して前記遺伝子組換え免疫細胞を作製する場合、該ベクターはウイルスベクター、DNAまたはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記T細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は、キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えT細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされている。さらなる実施形態は、医薬品として使用するための、たとえば、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫、卵巣癌などのがんを治療または抑制するための医薬品として使用するための前記遺伝子組換え免疫細胞の１種以上を用いた単独療法または併用療法に関する。
【００８３】
本明細書において「キメラ受容体」は、前記疾患または障害に関連する分子と結合する抗体配列やその他のタンパク質配列のリガンド結合ドメインを含む合成設計された受容体を指し、該リガンド結合ドメインは、スペーサードメインを介して、T細胞受容体またはその他の受容体に由来する１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（たとえば共刺激ドメイン）に連結されている。キメラ受容体は、人工T細胞受容体、キメラT細胞受容体、キメラ免疫受容体、およびキメラ抗原受容体（CAR）とも呼ぶことができる。レトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターなどのベクターを使用してキメラ受容体のコード配列をT細胞に導入することによって、モノクローナル抗体またはその結合断片の特異性をT細胞に移植することができる。CARは、特定の細胞表面抗原を発現する標的細胞への標的指向性をT細胞に付与するために設計された遺伝子組換えT細胞受容体である。養子細胞移入と呼ばれる方法によって、まず対象からT細胞を得た後、抗原に対して特異性を発揮することができる受容体を発現できるようにT細胞を遺伝子操作する。次いで、このT細胞を患者に再導入する。導入されたT細胞は抗原を認識し、これを標的とすることができる。このようなCARは、免疫受容体を発現する細胞に任意の特異性を移植することができる遺伝子組換え受容体である。研究者によっては、キメラ受容体（CAR）は、抗体または抗体断片、スペーサー、シグナル伝達ドメインおよび膜貫通領域を含むものであると理解されている。本明細書に記載のCARは、様々な構成要素すなわちドメイン（たとえばエピトープ結合領域（たとえば抗体断片、scFvまたはそれらの一部）、スペーサー、膜貫通ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインなど）が遺伝子組換えされており、この遺伝子組換えによって驚くべき効果が得られたことから、各構成要素に注目した場合、本明細書全体ではCARの構成要素はそれぞれ別個のものとして明確に区別できることが多い。CARに含まれる様々な構成要素は様々なバリエーションを有することから、たとえば、特定のエピトープや抗原に対する結合親和性が増強されていることがある。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるCARはT2A切断配列を含む。この切断配列は、配列番号１３（Ggcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctagg）に示される配列によってコードされる。
【００８４】
「T細胞受容体」すなわちTcrは、主要組織適合遺伝子複合体分子に結合する抗原を認識し、これに結合する機能を有するTリンパ球表面上分子である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えT細胞はTcrを発現する。
【００８５】
本明細書において「自殺遺伝子療法」、「自殺遺伝子」および「自殺遺伝子システム」は、アポトーシスにより細胞を破壊する方法を指してもよく、この方法では、細胞にアポトーシスを起こして自殺させる自殺遺伝子が必要とされる。腫瘍環境の治療または改変のために遺伝子組換え免疫細胞の使用を必要とする患者の安全性への懸念から、有害事象を予防または軽減するための様々な戦略が開発されつつある。前処置工程として遺伝子組換え免疫細胞を対象に移植する際に見られうる有害作用としては、移入されたT細胞が血流にサイトカインを放出することによって起こる「サイトカインストーム（サイトカイン放出症候群）」が挙げられ、この疾患では生命に危険が及ぶほどの高熱や血圧の急降下を招く恐れがある。
【００８６】
本明細書において「プロドラッグ」は、生体内で代謝されて薬理学的に活性な薬物に変換される化合物、製剤または医薬品である。プロドラッグは、インビボで酵素的修飾および／または化学的修飾を受けることによって、所望の薬理学的効果を発揮する活性な親薬物を放出することができる薬物分子誘導体である。したがって、不活性なプロドラッグが代謝されることによって、活性化形態に変換される。プロドラッグは、薬物の吸収、分配、代謝および／もしくは排泄の向上、薬物のバイオアベイラビリティの向上、または薬物が本来標的とはしない細胞もしくはプロセスと相互作用する際の選択性の向上を目的として使用することができるが、使用目的はこれらに限定されない。
【００８７】
プロドラッグは、生体内で活性型の最終薬物形態に変換される方法に応じて、さらにいくつかの種類に分類される。TypeＩプロドラッグは細胞内で生体活性化され、TypeIIプロドラッグは細胞外で生体活性化される。いずれのタイプも、生体活性化が起こる細胞内部位と治療効果が発揮される部位とが同じであるかどうか、生体活性化が消化液中で起こるのか、それとも循環系で起こるのかというような要因に基づいてサブタイプにさらに分類することができる。
【００８８】
がん療法においてプロドラッグを使用することも本明細書において開示される。がん療法における最も大きな課題は、健常な宿主細胞を破壊することなく、がん細胞と悪性腫瘍または腫瘍細胞とを破壊することである。これは、たとえば、自殺遺伝子を使用することによって達成することができる。自殺遺伝子を使用して細胞にアポトーシスを誘導し、自殺させることができる。自殺遺伝子を使用した方法として、遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法およびウイルス指向性酵素プロドラッグ療法の２つが挙げられる。
【００８９】
遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法では、がん細胞から遺伝子を取り出し、別の遺伝子で組換えることによって、健常細胞に無害な酵素を形成させる。この異種酵素は次いで腫瘍細胞に挿入され、健常細胞には無害であるが、がん細胞に対しては有害なプロドラッグを腫瘍細胞から放出させることができる。遺伝子組換え自殺遺伝子は、無毒なプロドラッグを細胞毒性物質に変換することができる。
【００９０】
ウイルス指向性酵素プロドラッグ療法では、キャリアを利用してがん細胞に組換え遺伝子を送達することができる。キャリアとしては、ヘルペスウイルスなどのウイルスや、組換え遺伝子を送達することができるベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
自殺遺伝子療法を利用することによって、遺伝子組換え免疫細胞の安全性を高め、遺伝子組換え免疫細胞の注入によって起こりうる有害事象を抑制することができる。悪性細胞のみに対して細胞傷害作用を発揮させるためには、薬理療法、自殺遺伝子または新規戦略が必要である。自殺遺伝子療法を実施する方法として、いくつかの方法が知られており、たとえば、遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法やウイルス指向性酵素プロドラッグ療法が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法（GDEPT）では、がん細胞から遺伝子を取り出し、別の遺伝子で組換えることによって、健常細胞に無害な酵素を形成させる。この異種酵素は腫瘍細胞に挿入され、正常細胞に無害であるが、がん細胞に対しては有害な小分子プロドラッグがこの腫瘍細胞から放出される。遺伝子組換え自殺遺伝子は、無毒なプロドラッグを細胞毒性物質に変換する。ウイルス指向性酵素プロドラッグ療法では、キャリアとしての単純ヘルペスウイルスや感冒ウイルスなどのウイルス、またはベクターを使用して、組換えた遺伝子をがん細胞に送達する。自殺遺伝子療法を実施したとしても、がん性腫瘍に対する化学療法や放射線療法の必要性が必ずしも完全に排除されるとは限らない。しかしながら、自殺遺伝子療法によって腫瘍細胞に損傷を与えることができるため、化学療法や放射線療法に対する腫瘍細胞の感受性を高めることができる。このようなアプローチは、前立腺癌および膀胱癌に対して有効であることが既に立証されている。自殺遺伝子療法は、他の種類のがんにも適用が拡大されつつある。がん患者は免疫系が抑制されていることが多いため、送達キャリアとして使用されるウイルスによって副作用が起こる可能性がある。遺伝子組換え免疫細胞の有害作用は、プロモーターの制御下で遺伝子組換え免疫細胞を発現させることによって抑制することができる。過去のレビュー論文のいくつかで報告されているように、遺伝子組換え免疫細胞は、エクスビボにおいて自殺遺伝子を用いてさらに遺伝子組換えすることができる。自殺遺伝子は、細胞レベルで非毒性プロドラッグを毒性化合物に変換することができる因子をコードする遺伝子であってもよいが、このような遺伝子に限定されない。養子細胞移入による遺伝子組換え免疫細胞の注入によって有害作用が起こった場合、有害作用を発症した対象に前記プロドラッグを投与することができ、投与されたプロドラッグは、非遺伝子組換えT細胞による免疫再構成を妨害することなく、自殺遺伝子で遺伝子操作された遺伝子組換え免疫細胞を選択的に排除することができる。また、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（Hsv-tk）／ガンシクロビル（GCV）自殺システムを使用した自殺システムが報告されている（Casucci et al. 2011, Journal of Cancer 2011, 2；この文献は引用によりその全体が明示的に本明細書に援用される）。いくつかの実施形態において、腫瘍微小環境（TME）を改変する方法であって、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質を��ードする核酸を含む第１のベクターを免疫細胞に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。
【００９２】
いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムはEGFRt自殺遺伝子システムであり、プロドラッグとしてアービタックスを患者に投与する。いくつかの実施形態において、前記対象に投与するアービタックスの用量は、１日当たり0.04mg/cm2である。いくつかの実施形態において、アービタックスを前記プロドラッグとして使用する場合、初回量を0.04mg/cm2とすることができ、いくつかの実施形態においては、この初回量を投与した後に、0.025mg/cm2の用量でアービタックスを毎週投与する。いくつかの実施形態において、患者が発疹を発症した場合、週当たりの用量を、0.03mg/cm2、0.02mg/cm2、0.01mg/cm2、またはこれらの量のいずれか２つの間の用量まで低減することができる。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、Her2tG自殺遺伝子システムであり、プロドラッグとしてハーセプチンを患者に投与する。いくつかの実施形態において、前記対象に投与するハーセプチンの用量は、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、またはこれらの量のいずれか２つの間の用量である。
【００９３】
本明細書において「調節因子」は、調節配列を指してもよく、調節配列とは、プロモーターやオペレーターなどの、遺伝子発現の調節を担う任意のDNA配列である。調節因子は、生物体内において特定の遺伝子の発現を増加または低減させることが可能な核酸分子のセグメントであってもよい。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、前記タンパク質は調節因子によって制御される。
【００９４】
「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を誘導するヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、プロモーターは遺伝子の５’末端の非コード領域に存在し、構造遺伝子の転写開始点の近傍に位置する。転写を開始させるプロモーター配列のエレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴付けられることが多い。プロモーター配列のエレメントとしては、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的エレメント（DSE；McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)；参照によりその全体が明示的に本明細書に援用される）、環状AMP応答エレメント（CRE）、血清応答エレメント（SRE；Treisman et al., Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990)；参照によりその全体が援用される）、グルココルチコイド応答エレメント（GRE）、および他の転写因子結合部位が挙げられ、たとえば、CRE/ATF（O’Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)；参照によりその全体が援用される）、AP2（Ye et al., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994)；参照によりその全体が援用される）、SP1、cAMP応答エレメント結合タンパク質（CREB；Loeken et al., Gene Expr. 3:253 (1993)； 参照によりその全体が明示的に本明細書に援用される）および８量体因子（概要は、Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed.（The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987；参照によりその全体が援用される）およびLemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)（参照によりその全体が援用される）を参照されたい）を挙げることができるが、これらに限定されない。本明細書において、プロモーターは、構成的に活性なプロモーター、抑制可能なプロモーター、誘導可能なプロモーターのいずれであってもよい。プロモーターが誘導可能なプロモーターである場合、転写率は誘導剤に応答して上昇する。これに対して、プロモーターが構成的プロモーターである場合、転写率は誘導剤による調節を受けない。抑制可能なプロモーターも公知である。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、腫瘍微小環境（TME）を改変するための遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法であって、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを免疫細胞に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。
【００９５】
いくつかの実施形態において、本発明で使用されるプロモーターは、誘導可能なプロモーターであってもよく、構成的プロモーターであってもよい。誘導可能なプロモーターとしては、たとえば、タモキシフェン誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、およびドキシサイクリン誘導性プロモーター（たとえば、treプロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。構成的プロモーターとしては、たとえば、SV40、CMV、UBC、EF1α、PGKおよびCAGGを挙げることができる。いくつかの実施形態において、前記調節因子はプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、タモキシフェン誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、またはドキシサイクリン誘導性プロモーター（たとえば、treプロモーター）である。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、タンパク質の発現は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導される。タモキシフェンの代謝産物として、4-ヒドロキシタモキシフェン（アフィモキシフェン）やN-デスメチル-4-ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）などの活性代謝産物が挙げられ、これらは、エストロゲン受容体に対してタモキシフェンの30〜100倍の親和性を発揮することができる。いくつかの実施形態において、タモキシフェンの代謝産物は、4-ヒドロキシタモキシフェン（アフィモキシフェン）および／またはN-デスメチル-4-ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）である。
【００９６】
本明細書において「免疫細胞」は、感染性疾患からの防御やがん細胞からの防御に関与する免疫系細胞である。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、腫瘍微小環境（TME）を改変するための遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法であって、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを免疫細胞に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。
【００９７】
がんは、制御不能な細胞増殖や調節異常を起こした細胞増殖を伴う。がんは、異常な細胞増殖を有する悪性腫瘍や悪性新生物として見られることがあり、このような悪性腫瘍は、生体内の他の部分に浸潤して広がることがある。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制の調節を必要とする対象（たとえばヒト）において、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制を調節する方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上を前記対象（たとえばヒト）に投与すること、ならびに任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および／または任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象の腫瘍微小環境における免疫応答の抑制の調節を測定することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記腫瘍環境内に存在する腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は肺腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は前立腺腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は胃腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は乳房腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は結腸直腸腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は脳腫瘍である。
【００９８】
「ナチュラルキラー細胞」すなわちNK細胞は、自然免疫系において重要な機能を果たす細胞傷害性リンパ球の一種である。NK細胞は、脊椎動物の適応免疫応答において細胞傷害性T細胞とよく似た役割を果たしている。また、NK細胞は、ウイルス感染細胞に素早く応答し、また、腫瘍形成に応答性を示す。さらに、NK細胞は、免疫監視として知られているプロセスによって新たな腫瘍増殖を予防するという重要な機能を発揮する（Dunn et al., Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol 3, 991-998 (2002); Langers et al., Natural killer cells: role in local tumor growth and metastasis. Biologics: targets & therapy 6, 73-82 (2012)；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【００９９】
「骨髄系細胞」は、骨髄または脊髄に見られる顆粒球前駆細胞または単球前駆細胞や、骨髄または脊髄に見られるこれらと類似した細胞を指す。骨髄系細胞系列には、末梢血中を循環する単球、およびこれらの単球から成熟、分化および／または活性化した細胞集団が含まれる。このような細胞集団には、終末分化していない骨髄系細胞、骨髄由来免疫抑制細胞、および分化したマクロファージが含まれる。分化したマクロファージには、分極化していないマクロファージ、分極化マクロファージ、休止状態のマクロファージ、および活性化マクロファージが含まれる。骨髄系細胞系列には、さらに、顆粒球前駆細胞、多形核球由来免疫抑制細胞、分化した多形核白血球、好中球、顆粒球、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージ、ミクログリア、骨髄由来免疫抑制細胞、樹状細胞および赤血球が含まれるが、骨髄系細胞系列に含まれる細胞はこれらに限定されない。ミクログリアは、たとえば骨髄系前駆細胞から分化することができる。
【０１００】
本明細書において「小膠細胞」は、脳および脊髄に見られるグリア細胞のうち、マクロファージを指す。したがって、この細胞は、中枢神経系（CNS）において第一線で中心となって活発な免疫防御を行う。
【０１０１】
本明細書において「併用療法」とは、２種以上の薬剤または治療法を使用して治療を行うことを指す。また、併用療法は、たとえば、単一の疾患を治療するために複数の治療法を使用することも指し、この目的で組み合わせ医薬製剤が使用されることが多い。さらに、併用療法は、別々の薬物を処方および投与して２種以上の有効成分を投与することも含む。いくつかの実施形態において、併用療法が提供される。いくつかの実施形態において、前記併用療法は、腫瘍微小環境を改変するための遺伝子組換え免疫細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記併用療法は、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制を調節するための遺伝子組換え免疫細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記併用療法は、腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑えるための遺伝子組換え免疫細胞を、これを必要とする対象（たとえばヒト）に投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記併用療法は、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法の効率を向上させるための遺伝子組換え免疫細胞を、これを必要とする対象（たとえばヒト）に投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記併用療法は、阻害物質を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記阻害物質は酵素阻害物質ではない。いくつかの実施形態において、前記阻害物質は酵素阻害物質である。いくつかの実施形態において、前記併用療法は、阻害物質または抗体もしくはその結合断片の治療用量を投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその結合断片はヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態において、前記併用療法は、CARを有するT細胞を、これを必要とする対象（たとえばヒト）に投与することをさらに含む。
【０１０２】
「化学療法薬」は、標準化された化学療法レジメンの一部として投与することが可能な化学物質など（たとえば抗がん薬（化学療法剤））を含んでいてもよい抗がん医薬類である。化学療法薬は、治癒を目的として投与される場合と、生存期間の延長または症状の緩和を目的として投与される場合（緩和的化学療法）とがある。化学療法は、腫瘍内科の主要なカテゴリーの１つであるホルモン療法および標的療法をさらに含んでいてもよい（がん薬物療法）。これらの化学療法は、放射線療法、外科手術、および／または温熱治療などの別のがん療法としばしば併用される。ごくわずかな症例においては、外科手術によってがんが拡散することが知られている。いくつかの実施形態において、外科的処置の前またはその後に、遺伝子組換え免疫細胞を腫瘍部位に投与する。
【０１０３】
最近になって新たに開発された抗がん薬（たとえば様々なモノクローナル抗体、そのヒト化抗体およびそれらの結合断片）のいくつかは、無差別に細胞傷害性を発揮するわけではなく、正確には、がん細胞において異常発現され、がん細胞の増殖にとって必須であるタンパク質を標的としている。このような治療法は、（古典的化学療法と区別して）標的療法と呼ばれることが多く、抗腫瘍療法レジメンで使用される従来の化学療法剤と併用されることが多い。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、このような標的抗がん療法（たとえば様々なモノクローナル抗体、そのヒト化抗体およびそれらの結合断片）の１種以上を投与することをさらに含んでいてもよい。
【０１０４】
化学療法では、化学療法薬が投与されるが、化学療法において１種類の薬物を使用してもよく（単剤化学療法）、あるいは複数の薬物を同時に使用してもよい（併用化学療法または多剤併用化学療法）。放射線療法を併用した化学療法は、化学放射線療法と呼ばれる。光線に曝露させると細胞傷害活性を発揮する物質に変換される薬物を使用した化学療法は、光化学療法または光線力学療法と呼ばれる。本発明の遺伝子組換え免疫細胞を投与することを含む実施形態のいくつかにおいて、前記方法は、がんを有する対象に本発明の遺伝子組換え免疫細胞または遺伝子組換えマクロファージ（GEM）を投与した後、光化学療法または光線力学療法を実施することをさらに含んでいてもよい。
【０１０５】
化学療法薬としては、抗体−薬物複合体（たとえば、リンカーを介して薬物に結合された抗体）、ナノ粒子（たとえば、腫瘍選択性を向上させ、低溶解性薬物の送達を補助する1〜1000nmのサイズのナノ粒子であってもよい）、電気化学療法、アルキル化薬、代謝拮抗薬（たとえば、５−フルオロウラシル（5-FU）、６−メルカプトプリン（6-MP）、カペシタビン（ゼローダ（登録商標））、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン（Ara-C（登録商標））、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、ペメトレキセド（アリムタ（登録商標））、ペントスタチンおよびチオグアニン）、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害薬、分裂阻害薬、コルチコステロイド類、DNAインターカレーター、またはチェックポイント阻害物質（たとえば、チェックポイントキナーゼCHK1またはCHK2）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法の実施形態のいくつかにおいて、前記遺伝子組換え免疫細胞、または前記遺伝子組換え免疫細胞を含む組成物は、前記化合物または治療法の１種以上などの、１種以上の抗がん薬と併用投与される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞と共投与または併用投与される前記１種以上の抗がん薬は、抗体−薬物複合体、ナノ粒子、電気化学療法、アルキル化薬、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害薬、分裂阻害薬、コルチコステロイド類、DNAインターカレーターまたはチェックポイント阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記代謝拮抗薬は、５−フルオロウラシル（5-FU）、６−メルカプトプリン（6-MP）、カペシタビン（ゼローダ（登録商標））、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン（Ara-C（登録商標））、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、ペメトレキセド（アリムタ（登録商標））、ペントスタチンまたはチオグアニンを含む。
【０１０６】
「チェックポイント遮断薬」とは免疫療法の一形態であり、患者自身の免疫系ががんと戦うのを助けることを目的としている。チェックポイント遮断薬は、モノクローナル抗体またはその結合断片などの物質を使用することができ、モノクローナル抗体またはその結合断片は、細胞表面上に極めて特異的に発現される分子を標的とするように設計することができる。たとえば、浸潤しつつあるがん細胞に対して惹起される自然免疫系の攻撃を停止させる反応が、前記モノクローナル抗体よって解除される。別の例として、リガンドと受容体の間の相互作用ががん療法の標的として研究されており、たとえば、膜貫通型プログラム細胞死タンパク質１（PDCD1またはPD-1とも呼ばれ、CD279としても知られている）とそのリガンドであるPD-1リガンド1（PD-L1、CD274）との間の相互作用が研究されている。通常の生理状態において、細胞表面上のPD-L1は、免疫細胞の表面上のPD1に結合し、免疫細胞の活性を抑制する。これに対して、がん細胞表面でPD-L1がアップレギュレートされると、通常は腫瘍細胞を攻撃する能力を発揮するT細胞が抑制され、その結果、がん細胞が宿主免疫系を回避することが可能となると考えられる。したがって、PD-1またはPD-L1に結合し、これによってPD-1とPD-L1の相互作用を遮断する抗体を使用することによって、T細胞が腫瘍を攻撃することが可能となる。いくつかの実施形態において、チェックポイント遮断薬は、抗PD-1抗体またはその結合断片（たとえばモノクローナル抗体、そのヒト化抗体またはそれらの結合断片）を含む。いくつかの実施形態において、チェックポイント遮断薬はPD-L1を含む。いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子組換え免疫細胞または遺伝子組換えマクロファージ（GEM）と共投与または併用投与される１種以上の抗がん薬は、上述のようなチェックポイント遮断薬を１種以上含む。
【０１０７】
本明細書において「小分子阻害薬」は、目的のタンパク質を標的とすることができる小さな阻害分子を指す。目的のタンパク質は、腫瘍細胞によって分泌されるタンパク質であってもよく、細胞ストレスによって分泌されるタンパク質であってもよい。小分子阻害薬としては、キナーゼ阻害薬、がん療法のためのBcl-2ファミリータンパク質阻害薬、MCl-1阻害薬、およびチロシンキナーゼ阻害薬が挙げられるが、これらに限定されない。チロシンキナーゼ阻害薬としては、イマチニブメシル酸塩（慢性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍などのがんの治療薬として承認されている）、ゲフィチニブ（イレッサ、ZD1839の名称でも知られている）；上皮成長因子受容体（EGFR）チロシンキナーゼを標的とする、エルロチニブ（タルセバとして市販されている）、ソラフェニブ、スニチニブ（スーテント）、ダサチニブ（Srycel）、ラパチニブ（タイケルブ）、ニロチニブ（タシグナ）、ボルテゾミブ（ベルケイド）、ヤヌスキナーゼ阻害薬、ALK阻害薬、クリゾチニブ、Bcl-2阻害薬、オバトクラックス、ナビトクラックス、ゴシポール、PARP阻害薬、イニパリブ、オラパリブ、PI3K阻害薬、ペリホシン、アパチニブ、VEGF受容体2阻害薬、AN-152、Braf阻害薬、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、LGX818、MEK阻害薬、トラメチニブ、MEK162、CDK阻害薬、PD-0332991、Hsp90阻害薬、およびサリノマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子組換え免疫細胞または遺伝子組換えマクロファージ（GEM）と共投与または併用投与される１種以上の抗がん薬は、上述のような小分子阻害薬を１種以上含む。いくつかの実施形態において、併用される小分子阻害薬はキナーゼ阻害薬を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はBcl-2ファミリータンパク質阻害薬を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はMCl-1阻害薬を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はチロシンキナーゼ阻害薬を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はイマチニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はメシル酸塩である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はゲフィチニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はエルロチニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はソラフェニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はスニチニブ（スーテント）である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はダサチニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はラパチニブ（タイケルブ）である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はニロチニブ（タシグナ）である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はボルテゾミブ（ベルケイド）である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はヤヌスキナーゼ阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はALK阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はクリゾチニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はBcl-2阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はオバトクラックスである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はナビトクラックスである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はゴシポールである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はPARP阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はイニパリブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はオラパリブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はPI3K阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はペリホシンである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はアパチニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はVEGF受容体2チロシンキナーゼ阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はAN-152である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はBraf阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はベムラフェニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はダブラフェニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はLGX818である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はMEK 阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はトラメチニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はMEK162である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はCDK 阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はPD-0332991である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はHsp90阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はサリノマイシンである。
【０１０８】
本発明の方法の実施形態のいくつかにおいて、前記方法は、前記遺伝子組換え免疫細胞または前記遺伝子組換えマクロファージ（GEM）と、免疫細胞を調節する免疫療法とを併用投与または共投与することをさらに含み、該免疫療法は、チェックポイント遮断薬、小分子阻害薬および／または養子細胞療法の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞を調節する前記免疫療法は、チェックポイント遮断薬、小分子阻害薬および／または養子細胞療法の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、前記チェックポイント遮断薬は、抗PD-1抗体またはその結合断片を含む。いくつかの実施形態において、チェックポイント遮断薬はPD-L1を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、養子細胞療法と組み合わせてもよい。いくつかの実施形態において、養子細胞療法は、キメラ抗原受容体を含むT細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記養子細胞療法は、キメラ抗原受容体を含むT細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記キメラ抗原受容体は腫瘍上のエピトープを標的とする。いくつかの実施形態において、前記養子細胞療法は、特異的Tcrを含むT細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はキナーゼ阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はChk1阻害薬およびChk2阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はBcl-2ファミリータンパク質阻害薬を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はMCl-1阻害薬を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はチロシンキナーゼ阻害薬を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はイマチニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はメシル酸塩である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はゲフィチニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はエルロチニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はソラフェニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はスニチニブ（スーテント）である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はダサチニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はラパチニブ（タイケルブ）である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はニロチニブ（タシグナ）である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はボルテゾミブ（ベルケイド）である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はヤヌスキナーゼ阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はALK阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はクリゾチニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はBcl-2阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はオバトクラックスである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はナビトクラックスである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はゴシポールである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はPARP阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はイニパリブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はオラパリブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はPI3K阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はペリホシンである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はアパチニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はVEGF受容体2チロシンキナーゼ阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はAN-152である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はBraf阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はベムラフェニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はダブラフェニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はLGX818である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はMEK 阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はトラメチニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はMEK162である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はCDK 阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はPD-0332991である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はHsp90阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はサリノマイシンである。
【０１０９】
小分子阻害薬として、さらにセリン／トレオニンキナーゼ阻害薬が挙げられる。セリン／トレオニンキナーゼ阻害薬としては、テムシロリムス（トーリセル）、エベロリムス（アフィニトール）、ベムラフェニブ（ゼルボラフ）、トラメチニブ（メキニスト）またはダブラフェニブ（タフィンラー）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はテムシロリムス（トーリセル）である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はエベロリムス（アフィニトール）である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はベムラフェニブ（ゼルボラフ）である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はトラメチニブ（メキニスト）である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はダブラフェニブ（タフィンラー）である。
【０１１０】
本明細書に記載の方法の実施形態のいくつかにおいて、特に、本発明の方法を、免疫細胞の活性化に基づいた処置または治療法と併用する場合、前記遺伝子組換え免疫細胞または前記遺伝子組換えマクロファージ（GEM）は、チェックポイント遮断薬、小分子阻害薬および／または養子細胞療法と組み合わせて投与することができ、具体的には、抗CTLA-4抗体またはその結合断片、抗PD1抗体またはその結合断片、抗PD-L1抗体またはその結合断片、Chk1阻害物質、Chk2阻害物質、CARまたはTCRと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はテムシロリムス（トーリセル）である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はエベロリムス（アフィニトール）である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はベムラフェニブ（ゼルボラフ）である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はトラメチニブ（メキニスト）である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はダブラフェニブ（タフィンラー）である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はキナーゼ阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はChk1阻害薬およびChk2阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はBcl-2ファミリータンパク質阻害薬を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はMCl-1阻害薬を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はチロシンキナーゼ阻害薬を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はイマチニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はメシル酸塩である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はゲフィチニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はエルロチニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はソラフェニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はスニチニブ（スーテント）である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はダサチニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はラパチニブ（タイケルブ）である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はニロチニブ（タシグナ）である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はボルテゾミブ（ベルケイド）である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はヤヌスキナーゼ阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はALK阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はクリゾチニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はBcl-2阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はオバトクラックスである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はナビトクラックスである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はゴシポールである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はPARP阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はイニパリブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はオラパリブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はPI3K阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はペリホシンで���る。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はアパチニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はVEGF受容体2チロシンキナーゼ阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はAN-152である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はBraf阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はベムラフェニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はダブラフェニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はLGX818である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はMEK 阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はトラメチニブである。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はMEK162である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はCDK 阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はPD-0332991である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はHsp90阻害薬である。いくつかの実施形態において、前記小分子阻害薬はサリノマイシンである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、養子細胞療法をさらに含み、該養子細胞療法は、キメラ抗原受容体（CAR）を含むT細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記CARは、腫瘍細胞上のエピトープに結合するように遺伝子組換えされている。
【０１１１】
本明細書に記載した様々な具体的態様および実施形態において本発明を説明するが、個々の実施形態に記載した様々な特徴、態様および機能は、それらが記載された特定の実施形態における適用に限定されない。また、具体的な実施形態が記載されているかどうか、具体的な特徴が本発明の実施形態の一部として提示されているかどうかにかかわらず、個々の実施形態に記載した様々な特徴、態様および機能は単独で使用してもよく、本発明の別の実施形態の１つ以上と様々に組み合わせて使用してもよい。本発明の範囲は、本明細書に記載または提示された具体的な実施形態によって限定されない。
【０１１２】
本発明の態様は、腫瘍環境を改変する方法ならびに腫瘍環境を改変するための遺伝子組換え免疫細胞および組成物に関する。具体的には、腫瘍環境を改変する方法ならびに腫瘍環境を改変するための遺伝子組換え免疫細胞および組成物は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする免疫細胞を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。
【０１１３】
がんにおける免疫応答は、腫瘍を特定し、それを排除するという重要な役割を果たしている。たとえば、腫瘍の形質転換細胞は、正常細胞には見られない抗原を発現していることがある。免疫系にとってこのような抗原は異物と認識され、この抗原が存在することで、免疫細胞は形質転換された腫瘍細胞への攻撃を開始する。腫瘍に発現される抗原は様々な供給源に由来しており、たとえば、子宮頸がんを引き起こすことがあるヒトパピローマウイルスのような腫瘍ウイルスに由来する腫瘍抗原があるのに対し、正常細胞では発現量の少ない生物自身のタンパク質が、腫瘍細胞では高レベルに発現されたものもある。一例として、チロシナーゼと呼ばれる酵素があり、高レベルで発現された場合、特定の皮膚細胞（たとえばメラノサイト）を悪性黒色腫と呼ばれる腫瘍に形質転換する。３つ目に考えられる腫瘍抗原の供給源としては、通常は細胞の増殖および生存の調節に重要な役割を果たしているタンパク質が挙げられ、がん遺伝子と呼ばれるがん誘導分子に変異することがよくある。
【０１１４】
腫瘍に対する免疫系の応答は、主にキラーT細胞が異常細胞を破壊することによって行われ、時としてヘルパーT細胞の助けを借りて異常細胞が破壊される。腫瘍抗原は、ウイルス抗原の提示と同様の方法でMHCクラスＩ分子上に提示される。これによって、キラーT細胞が腫瘍細胞を異常なものとして認識することができる。NK細胞もこれと似た方法で腫瘍細胞を殺傷するが、特に、腫瘍細胞が細胞表面上に通常よりも少数のMHCクラスＩ分子を発現している場合に殺傷能力を発揮する。MHCクラスＩ分子の発現低下は腫瘍においてよく見られる。時として、腫瘍細胞に対する抗体が産生されることもあり、これによって補体系による腫瘍細胞の破壊が可能となる。
【０１１５】
本明細書に記載の実施形態では、脳内への同種移植に使用される炎症促進性マクロファージを遺伝子操作するための様々な新規アプローチについて述べている。移植されたマクロファージは腫瘍微小環境（TME）を形質転換し、たとえば、免疫抑制性骨髄系細胞の表現型を元に戻すことができる。このような遺伝子組換えマクロファージ（GEM）は細胞傷害性の免疫機能を補助し、脳腫瘍や他の固形腫瘍において効果を発揮するCAR T細胞免疫療法を補助すると予想される。
【０１１６】
また、本明細書に記載の実施形態では、新規の遺伝子組換えマクロファージ（GEM）技術を利用することによって、固形腫瘍を有する患者の抗腫瘍免疫応答の抑制を調節もしくは阻害し、かつ／または抗腫瘍応答を促進もしくは向上することができる広く適用可能な治療法を構築している。この治療法は、転移性疾患、外科手術不能な疾患、慢性ウイルス感染症または自己免疫疾患の患者にも適用することができ、新規用途および１つ以上の新規製剤を包含するものである。これらの実施形態は、単独療法または補助療法として使用してもよく、あるいは局所的な免疫抑制を改変および調節し、かつさらなる応答の誘導や付加療法の実施を容易とする「プレコンディショニング工程」としても使用可能であると予想される。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、対象が自己免疫疾患に罹患している場合、遺伝子組換え骨髄系細胞を使用して免疫応答を調節することによって、自己免疫反応を低減または抑制することができる。
【０１１８】
本明細書に記載の実施形態は、T細胞の増殖および機能を向上させる因子を発現するように、かつ／または腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑えることができるように遺伝子組換えされたマクロファージを養子移入することによってTMEを改変する新規方法を包含する。初代ヒト単球およびマクロファージは遺伝子組換えが難しいことがよく知られている。しかし、骨髄系細胞に特異的なレンチウイルスパッケージングシステムを使用することによって、末梢血から単離された初代ヒト単球および単球由来マクロファージに感染させることができる。本明細書に記載の実施形態では、これらのベクターから遺伝子を安定に組み込むことができ、遺伝子を安定かつ強力に発現できることが実証された。さらに、本明細書に記載の実施形態において、GEMはTME内で生存を維持した。
【０１１９】
本発明の方法ではレンチウイルスベクターを使用してGEMを製造しているが、mRNAの直接送達などの様々な遺伝子導入方法を使用して、様々なタイプのGEMを製造することもできる。さらに、本発明の方法は膠芽腫（GBM）に使用されているが、GBMや他の特定のがんに限定されるものではなく、免疫応答の調節が治療の妨げになっている疾患に有益だと考えられる。
【０１２０】
膠芽腫（GBM）患者の治療選択肢は他のがんよりもはるかに遅れを取っており、有効性を示す薬物はほとんど存在せず、標準的な治療方法（外科的切除の実施後、放射線療法およびテモゾロミドによる化学療法を行う）はこの数十年間でほとんど変化していない。このことから、GBM患者の新たな治療方法が早急に必要とされている。これまでに実施されてきたGBMの細胞免疫療法は効果が見られなかったことが多く、これは、免疫抑制性を示すTMEによるところが大きいと見られる。GBMやその他の高悪性度神経膠腫の明確な特徴の１つとして、腫瘍促進性および抗炎症性の表現型を示す制御性骨髄系細胞の大量浸潤が挙げられる。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、TMEにおける局所的な免疫抑制を解消するGEMが提供される。骨髄系細胞に感染させることが可能なレンチウイルスが最近になって開発されたことから、これを利用した独自の遺伝子組換え技術により、コンストラクトを安定に組み込むことが可能となり、安定かつ強力にタンパク質を発現するGEMを得ることできた。本明細書に記載の実施形態では、このようなGEMにおける遺伝子発現を改良するためにいくつかの方法を使用している。１つの方法では、NK細胞およびT細胞の増殖および機能を向上させる小分子やタンパク質の供給源を局所的に提供することを目的としてGEMの遺伝子組換えを行う。このような小分子およびタンパク質としては、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-21、Ｉ型インターフェロン（αおよびβ）、PD-1チェックポイント遮断薬、TLRを介したHMGB1 B boxドメインよる活性化に応答して産生される様々なサイトカインやケモカイン、または構成的に活性な内在性MyD88シグナル（Medzhitov MTA）が挙げられる。別の方法では、Cas9/CRISPRによる遺伝子編集を利用して、TGF-βやIL-10などの免疫抑制遺伝子を欠失させることによって、注射後の生体内における分極化に対して抵抗性を示すGEMを作製する。さらに、この方法と同様にCas9/CRISPRシステムを利用して、内在性の炎症促進遺伝子が構成的発現あるいは誘導発現されるように遺伝子編集を行い、マクロファージ、NK細胞およびT細胞の機能を補助し、かつ／または腫瘍細胞の増殖を抑制する。標的遺伝子としてはIFNγ、IL-12およびIL-18が挙げられ、VP64で転写を活性化したCas9/CRISPRベクターを使用してこれらを標的とする。
【０１２２】
本明細書に記載の実施形態を使用して、細胞を適宜調節することが可能なGEMを構築するための様々なベクターを開発することができる。本明細書に記載の実施形態において、約10種類のベクターをこれまでに開発したが、本明細書に記載の方法を利用することによってさらに多くのベクターを開発することができる。
【０１２３】
本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、本発明のGEMが頭蓋内膠芽腫（GBM）モデルの腫瘍に浸潤し、生存を維持し、導入遺伝子を安定に産生することを示すデータが得られた。さらに、いくつかの実施形態において、遺伝子操作された本発明のGEMは安定な炎症促進性サイトカインプロファイルを示すことが示されたことから、TEMを再構成し、抗腫瘍免疫応答を補助する手段としてGEMが理想的であることが実証された。
【０１２４】
本明細書に記載の実施形態は、単独療法として、あるいはその他のがん療法または免疫療法の補助療法として、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制を調節するために利用することができる。したがって、これらの実施形態は、様々な細胞免疫療法と併用することができ、このような細胞免疫療法として、CAR T細胞療法、抗体またはその結合断片、小分子、破傷風毒素、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体、および腫瘍溶解性ポリオウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、本発明の治療法は自家細胞を使用し、これを腫瘍床に直接注射する。しかし、別の実施形態において、同種異系細胞を使用して、これを静脈注射投与することもできる。本明細書において、腫瘍床とは、がん性腫瘍を取り囲む血管組織および間質組織を指し、腫瘍に酸素、増殖因子および栄養素を供給するものである。したがって、本発明の実施形態は、腫瘍およびその他の免疫抑制性状態の非外科的処置に有用であり、本明細書に記載の態様は、個々の条件に適したすぐに投与可能な既製品としての同種異系マクロファージ製剤を提供し、このマクロファージ製剤は他の形態の免疫療法を補助することができる。本発明の方法の実施形態のいくつかにおいて、本発明の遺伝子組換え細胞または組成物は腫瘍床に直接注射される。いくつかの実施形態において、1×105〜2×107個の遺伝子組換え細胞を腫瘍床に注射する。いくつかの実施形態において、1×105個、2×105個、3×105個、4×105個、5×105個、6×105個、7×105個、8×105個、9×105個、1×106個、2×106個、3×106個、4×106個、5×106個、6×106個、7×106個、8×106個、9×106個、1×107個、2×107個、3×107個、4×107個、5×107個、6×107個、もしくは7×107個の遺伝子組換え細胞、またはこれらの値のいずれか２つの間の任意の数の遺伝子組換え細胞を腫瘍床に注射する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞または組成物は、腫瘍床の半径1mm以内、2mm以内、5mm以内、10mm以内、20mm以内、30mm以内、40mm以内、50mm以内、60mm以内、70mm以内、80mm以内、90mm以内、100mm以内、110mm以内、120mm以内、130mm以内、140mm以内、150mm以内、160mm以内、170mm以内、180mm以内、190mm以内もしくは200mm以内、またはこれらの値のいずれか２つの間の任意の半径以内に注射される。
【０１２６】
本発明の実施形態に記載のGEMを使用することによって、T細胞またはNK細胞の細胞傷害性およびサイトカイン産生、腫瘍微小環境における骨髄系細胞の機能、腫瘍細胞の増殖、腫瘍微小環境の改変などの極めて重要な免疫機能が回復され、これによって大きな治療ベネフィットが得られる。単独療法あるいは他の免疫療法の補助療法としての遺伝子組換えマクロファージで患者を処置することによって、全生存期間を延長することができ、このような実施形態は本明細書に記載されている。
【０１２７】
腫瘍の腫瘍微小環境（TME）を改変するための遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法
腫瘍微小環境（TME）を改変するための遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法が開示される。腫瘍微小環境は腫瘍を含んでいてもよい。前記方法は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および／もしくは活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを免疫細胞に送達することを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、第１のベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質は、PD-L1タンパク質またはその活性断片であり、該PD-L1タンパク質またはその活性断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質断片は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（KNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKI（配列番号７））を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞および単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記方法は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクターを前記免疫細胞に送達すること；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸を前記免疫細胞に送達することをさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸が、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていてもよいことを特徴とする。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、前記方法は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクターを前記免疫細胞に送達すること；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターを前記免疫細胞に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記炎症促進遺伝子は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記免疫細胞を分化誘導することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞を��粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導する。いくつかの実施形態において、前記細胞をマクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導する。
【０１２８】
T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質を発現する細胞
好ましい実施形態のいくつかによれば、遺伝子組換え免疫細胞であって、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む細胞が提供される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、第１のベクターを含む遺伝子組換え免疫細胞が提供される。第１のベクターは、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、腫瘍微小環境（TME）を改変するための前記遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記方法は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを免疫細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球および初代ヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト単球である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、第１のベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる（GCCACCATGGCACTTCCAGTCACAGCGCTTCTTCTGCCTTTGGCACTGCTTCTCCACGCAGCACGCCCAAACTGGGTCAATGTAATCAGCGACCTGAAGAAGATTGAAGACCTGATTCAATCAATGCACATAGACGCTACGTTGTACACCGAATCAGATGTTCATCCTAGCTGTAAAGTCACCGCAATGAAATGTTTTTTGCTGGAGCTTCAAGTTATATCCCTTGAGTCTGGGGACGCATCTATACATGACACAGTTGAGAATTTGATCATATTGGCAAACAATAGCTTGTCTTCCAACGGTAATGTCACAGAGTCCGGTTGTAAAGAGTGTGAGGAACTTGAAGAGAAAAACATTAAAGAATTTCTCCAGAGTTTCGTACATATTGTACAAATGTTCATAAATACTTCTATCTATATCTGGGCTCCTCTCGCCGGAACCTGTGGCGTTCTGCTGCTGTCTTTGGTGATTACAGGAAGTGGAGCCACAAATTTCAGTCTGCTTAAACAGGCAGGGGATGTGGAGGAGAACCCCGGCCCAATGCGAATTTCAAAACCACATCTTAGATCAATCAGCATACAGTGTTATCTTTGTCTGCTGCTCAACAGCCATTTCTTGACTGAAGCCAACTGGGTCAACGTAATTTCTGATCTTAAAAAAATCGAGGATCTGATCCAGAGTATGCACATAGACGCAACGCTTTACACCGAAAGTGATGTCCATCCGTCATGTAAAGTAACGGCGATGAAGTGTTTCCTTCTCGAGCTTCAGGTAATTTCATTGGAGTCTGGAGATGCCTCTATTCATGACACGGTAGAGAATTTGATCATTCTCGCTAACAATAGTCTTTCCAGTAACGGTAACGTTACAGAGAGCGGATGTAAAGAATGTGAGGAATTGGAGGAGAAGAACATTAAGGAATTCCTTCAGTCCTTTGTCCACATCGTTCAGATGTTTATTAACACGAGTTGA）。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質は、PD-L1タンパク質またはその活性断片であり、該PD-L1タンパク質またはその活性断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質���、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激��子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、第１のベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、Vpxタンパク質とともにパッケージングされた前記レンチウイルスベクターは、骨髄系細胞を効率的にトランスフェクションするために使用される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL17、CCL22、CCL24またはCCL26を含む。いくつかの実施形態において、前記T細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えT細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記方法は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクターを前記免疫細胞に送達すること；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸を前記免疫細胞に送達することをさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸が、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていることを特徴とする。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子はTGF-βまたはIL-10である。いくつかの実施形態において、前記方法は、Cas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクターを前記免疫細胞に送達すること；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターを前記免疫細胞に送達することをさらに含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記炎症促進遺伝子はIFN-γ、IL-12および／またはIL-18である。いくつかの実施形態において、IL-12は配列番号２７に示される配列によってコードされる（ATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGTGTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTGCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCCTAA）。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞および単球からなる群から選択される。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、前記方法は、前記免疫細胞を分化誘導することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導する。いくつかの実施形態において、前記細胞をマクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導する。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、遺伝子組換え免疫細胞であって、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含む細胞が提供される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされたT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子はTGF-βまたはIL-10である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記炎症促進遺伝子はIFN-γ、IL-12および／またはIL-18である。いくつかの実施形態において、IL-12は配列番号２７に示される配列によってコードされる（ATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGTGTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTGCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCCTAA）。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞および単���からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞および単球からなる群から選択される。
【０１３４】
GEMにおいて骨髄系細胞表面マーカーを発現させる方法
好ましい実施形態のいくつかによれば、遺伝子組換え免疫細胞であって、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む細胞が提供される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、第１のベクターを含む遺伝子組換え免疫細胞が提供される。第１のベクターは、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および／もしくは活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、腫瘍微小環境（TME）を改変するための前記遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記方法は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および／もしくは活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを免疫細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球および初代ヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト単球である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、第１のベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質は、PD-L1タンパク質またはその活性断片であり、該PD-L1タンパク質またはその活性断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコード��る前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、第１のベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、Vpxタンパク質とともにパッケージングされた前記レンチウイルスベクターは、骨髄系細胞を効率的にトランスフェクションするために使用される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL17、CCL22、CCL24またはCCL26を含む。いくつかの実施形態において、前記T細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えT細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記方法は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクターを前記免疫細胞に送達すること；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸を前記免疫細胞に送達することをさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸が、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていることを特徴とする。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子はTGF-βまたはIL-10である。いくつかの実施形態において、前記方法は、Cas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクターを前記免疫細胞に送達すること；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターを前記免疫細胞に送達することをさらに含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記炎症促進遺伝子はIFN-γ、IL-12および／またはIL-18である。いくつかの実施形態において、IL-12は配列番号２７に示される配列によってコードされる（ATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGTGTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTGCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCCTAA）。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞および単球からなる群から選択される。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、前記方法は、前記免疫細胞を分化誘導することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導する。いくつかの実施形態において、前記細胞をマクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導する。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、遺伝子組換え免疫細胞であって、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含む細胞が提供される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされたT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる（GCCACCATGGCACTTCCAGTCACAGCGCTTCTTCTGCCTTTGGCACTGCTTCTCCACGCAGCACGCCCAAACTGGGTCAATGTAATCAGCGACCTGAAGAAGATTGAAGACCTGATTCAATCAATGCACATAGACGCTACGTTGTACACCGAATCAGATGTTCATCCTAGCTGTAAAGTCACCGCAATGAAATGTTTTTTGCTGGAGCTTCAAGTTATATCCCTTGAGTCTGGGGACGCATCTATACATGACACAGTTGAGAATTTGATCATATTGGCAAACAATAGCTTGTCTTCCAACGGTAATGTCACAGAGTCCGGTTGTAAAGAGTGTGAGGAACTTGAAGAGAAAAACATTAAAGAATTTCTCCAGAGTTTCGTACATATTGTACAAATGTTCATAAATACTTCTATCTATATCTGGGCTCCTCTCGCCGGAACCTGTGGCGTTCTGCTGCTGTCTTTGGTGATTACAGGAAGTGGAGCCACAAATTTCAGTCTGCTTAAACAGGCAGGGGATGTGGAGGAGAACCCCGGCCCAATGCGAATTTCAAAACCACATCTTAGATCAATCAGCATACAGTGTTATCTTTGTCTGCTGCTCAACAGCCATTTCTTGACTGAAGCCAACTGGGTCAACGTAATTTCTGATCTTAAAAAAATCGAGGATCTGATCCAGAGTATGCACATAGACGCAACGCTTTACACCGAAAGTGATGTCCATCCGTCATGTAAAGTAACGGCGATGAAGTGTTTCCTTCTCGAGCTTCAGGTAATTTCATTGGAGTCTGGAGATGCCTCTATTCATGACACGGTAGAGAATTTGATCATTCTCGCTAACAATAGTCTTTCCAGTAACGGTAACGTTACAGAGAGCGGATGTAAAGAATGTGAGGAATTGGAGGAGAAGAACATTAAGGAATTCCTTCAGTCCTTTGTCCACATCGTTCAGATGTTTATTAACACGAGTTGA）。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子はTGF-βまたはIL-10である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記炎症促進遺伝子はIFN-γ、IL-12および／またはIL-18である。いくつかの実施形態において、IL-12は配列番号２７に示される配列によってコードされる（ATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGTGTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTGCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCCTAA）。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システム���コードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞および単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、前記ベクターを使用した誘導を行っていない免疫細胞と比較して、CD11bの発現が低下している。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞および単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、抗炎症性マクロファージマーカーの発現が増加している。いくつかの実施形態において、前記抗炎症性マクロファージマーカーはCD163およびCD80である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、前記ベクターを使用した形質導入を行っていない免疫細胞と比較して、発現された抗炎症性マクロファージマーカーの濃度が高い。
【０１４０】
組成物
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法および組成物は、がん、疾患または感染症に罹患している対象（たとえばヒト）において腫瘍環境を改変するために使用される。本明細書で提供される方法および組成物の実施形態のいくつかにおいて、腫瘍環境の改変を必要とする患者は、不応性再発神経芽腫に罹患している小児年齢の患者である。いくつかの実施形態において、前記がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記固形腫瘍は、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌からなる群から選択される。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、前記対象に提供される前記組成物は、該対象の腫瘍環境を改変するために使用される。いくつかの実施形態において、前記組成物は、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制を必要とする対象において、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制を調節するために使用され、該対象は、たとえば乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌などのがんを有している。いくつかの実施形態において、前記組成物は、腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑えることを必要とする対象において、腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑えるために使用され、該対象は、たとえば乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌などのがんを有している。いくつかの実施形態において、前記組成物は、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法の効率の向上を必要とする対象において、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法の効率を向上させるために使用され、該対象は、たとえば乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌などのがんを有している。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、前記組成物は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによって製造された遺伝子組換え免疫細胞の１種以上；およびキャリア、抗がん治療薬、抗感染症治療薬、抗菌治療薬、抗ウイルス治療薬または抗腫瘍治療薬を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物中に含まれる前記遺伝子組換え免疫細胞は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および／もしくは活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞を製造する前記方法は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを免疫細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、Vpxタンパク質とともにパッケージングされた前記レンチウイルスベクターは、骨髄系細胞を効率的にトランスフェクションするために使用される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL17、CCL22、CCL24またはCCL26を含む。いくつかの実施形態において、前記T細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えT細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記方法は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクターを前記免疫細胞に送達すること；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸を前記免疫細胞に送達することをさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸が、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていることを特徴とする。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子はTGF-βまたはIL-10である。いくつかの実施形態において、前記方法は、Cas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクターを前記免疫細胞に送達すること；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターを前記免疫細胞に送達することをさらに含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記炎症促進遺伝子はIFN-γ、IL-12および／またはIL-18である。いくつかの実施形態において、IL-12は配列番号２７に示される配列によってコードされる（ATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGTGTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTGCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCCTAA）。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞および単球からなる群から選択される。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、前記方法は、前記免疫細胞を分化誘導することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導する。いくつかの実施形態において、前記細胞をマクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導する。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされたT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる（GCCACCATGGCACTTCCAGTCACAGCGCTTCTTCTGCCTTTGGCACTGCTTCTCCACGCAGCACGCCCAAACTGGGTCAATGTAATCAGCGACCTGAAGAAGATTGAAGACCTGATTCAATCAATGCACATAGACGCTACGTTGTACACCGAATCAGATGTTCATCCTAGCTGTAAAGTCACCGCAATGAAATGTTTTTTGCTGGAGCTTCAAGTTATATCCCTTGAGTCTGGGGACGCATCTATACATGACACAGTTGAGAATTTGATCATATTGGCAAACAATAGCTTGTCTTCCAACGGTAATGTCACAGAGTCCGGTTGTAAAGAGTGTGAGGAACTTGAAGAGAAAAACATTAAAGAATTTCTCCAGAGTTTCGTACATATTGTACAAATGTTCATAAATACTTCTATCTATATCTGGGCTCCTCTCGCCGGAACCTGTGGCGTTCTGCTGCTGTCTTTGGTGATTACAGGAAGTGGAGCCACAAATTTCAGTCTGCTTAAACAGGCAGGGGATGTGGAGGAGAACCCCGGCCCAATGCGAATTTCAAAACCACATCTTAGATCAATCAGCATACAGTGTTATCTTTGTCTGCTGCTCAACAGCCATTTCTTGACTGAAGCCAACTGGGTCAACGTAATTTCTGATCTTAAAAAAATCGAGGATCTGATCCAGAGTATGCACATAGACGCAACGCTTTACACCGAAAGTGATGTCCATCCGTCATGTAAAGTAACGGCGATGAAGTGTTTCCTTCTCGAGCTTCAGGTAATTTCATTGGAGTCTGGAGATGCCTCTATTCATGACACGGTAGAGAATTTGATCATTCTCGCTAACAATAGTCTTTCCAGTAACGGTAACGTTACAGAGAGCGGATGTAAAGAATGTGAGGAATTGGAGGAGAAGAACATTAAGGAATTCCTTCAGTCCTTTGTCCACATCGTTCAGATGTTTATTAACACGAGTTGA）。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていてもよい。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子はTGF-βまたはIL-10である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記炎症促進遺伝子はIFN-γ、IL-12および／またはIL-18である。いくつかの実施形態において、IL-12は配列番号２７に示される配列によってコードされる（ATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGTGTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTGCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCCTAA）。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞および単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。
【０１４８】
前記組成物は、医薬担体または医薬添加物をさらに含んでいてもよい。本明細書において「医薬添加物」または「医薬担体」は、処置または治療を目的とした薬学的に活性な物質またはT細胞を処方および／または投与するための溶媒として使用されるキャリアまたは不活性媒体を指してもよい。担体としては、高分子ミセル、リポソーム、リポタンパク質ベースのキャリア、ナノ粒子キャリア、デンドリマーおよび／またはその他の担体が挙げられる。
【０１４９】
本明細書において「担体」は、投与と目的とした活性な医薬または細胞を送達するために使用される治療効果のない物質を指してもよい。本明細書において「医薬担体」は、薬学的に活性な物質を処方および／または投与するための溶媒として使用されるキャリアまたは不活性媒体を指してもよい。理想的な担体としては、毒性がなく、生体適合性、非免疫原性および生分解性を有し、宿主の防御機構によって認識されないものが挙げられる。いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子組換え免疫細胞の完全性を向上、強化または保持するための担体または添加物を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、前記担体は医薬担体である。いくつかの実施形態において、前記医薬担体は医薬組成物を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる少なくとも１つの遺伝子組換え免疫細胞集団と医薬添加物とをさらに含む。
【０１５０】
腫瘍微小環境における免疫応答の抑制の調節を必要とする対象において、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制を調節する方法
いくつかの実施形態において、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制の調節を必要とする対象（たとえばヒト）において、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制を調節する方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物の１種以上を前記対象に投与すること、ならびに任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および／または任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象の腫瘍微小環境における免疫応答の抑制の調節を測定することを含む方法が提供される。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされたT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL17、CCL22、CCL24またはCCL26を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標���遺伝子はTGF-βまたはIL-10である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記炎症促進遺伝子はIFN-γ、IL-12および／またはIL-18である。いくつかの実施形態において、IL-12は配列番号２７に示される配列によってコードされる（ATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGTGTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTGCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCCTAA）。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞および単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である��いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、前記組成物は、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制を調節することを目的として使用される。前記組成物中に含まれる遺伝子組換え細胞の実施形態のいくつかにおいて、前記遺伝子組換え細胞は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および／もしくは活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされたT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子はTGF-βまたはIL-10である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記炎症促進遺伝子はIFN-γ、IL-12および／またはIL-18である。いくつかの実施形態において、IL-12は配列番号２７に示される配列によってコードされる（ATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGTGTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTGCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCCTAA）。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモータ��である。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞および単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。
【０１５３】
本発明の方法の実施形態のいくつかにおいて、投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、注射による腫瘍床への直接送達によって投与される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞の投与を必要とする対象はがんに罹患している。いくつかの実施形態において、前記がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記固形腫瘍は、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌からなる群から選択される。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象（たとえばヒト）に細胞療法を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞療法はCAR T細胞療法である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を前記治療対象に導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、抗体もしくはその結合断片、小分子、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体または腫瘍溶解性ポリオウイルスを前記対象に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその結合断片は、α−フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（MAGE）、HER2、および／またはrasもしくはp53の異常生成物に特異的である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記対象にプロドラッグを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロドラッグは、アービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506または二量体化誘導化学物質である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に薬物を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記薬物は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物である。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法を受けるべき対象として特定または選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤などのさらなる治療剤、または放射線療法および／もしくは外科手術などの補助療法を前記対象に導入、提供または投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記さらなる治療剤は、ホルモン遮断療法、化学療法、小分子、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、および／または放射線照射を含む抗がん療法である。いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体またはその結合断片は、Her2、CD52、CD20、CD25、VEGFまたはEGRFに特異的であり、該抗体またはその結合断片はヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態において、前記ホルモン遮断療法は、タモキシフェン、アナストロゾール、および／またはレトロゾールの送達を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子は、チロシンキナーゼ阻害薬、小分子薬物複合体、セリンキナーゼ阻害薬、および／またはトレオニンキナーゼ阻害薬を含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記対象の生存率に悪影響を及ぼさない。いくつかの実施形態において、前記方法は、有害な副作用を起こさない。
【０１５５】
腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑える方法
いくつかの実施形態において、腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑えることを必要とする対象（たとえばヒト）において、腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑える方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物の１種以上を前記対象に投与すること、ならびに任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および／または任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象における腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を測定することを含む方法が提供される。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされたT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL17、CCL22、CCL24またはCCL26を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていてもよい。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、���記標的遺伝子はTGF-βまたはIL-10である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記炎症促進遺伝子はIFN-γ、IL-12および／またはIL-18である。いくつかの実施形態において、IL-12は配列番号２７に示される配列によってコードされる（ATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGTGTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTGCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCCTAA）。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞および単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞��ある。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、前記組成物は、腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑えることを必要とする対象において、腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑えることを目的として使用される。前記組成物中に含まれる遺伝子組換え細胞の実施形態のいくつかにおいて、前記遺伝子組換え細胞は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および／もしくは活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされたT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL17、CCL22、CCL24またはCCL26である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていてもよい。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子はTGF-βまたはIL-10である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記炎症促進遺伝子はIFN-γ、IL-12および／またはIL-18である。いくつかの実施形態において、IL-12は配列番号２７に示される配列によってコードされる（ATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGTGTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTGCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCCTAA）。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンお��び／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞および単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。前記組成物は、担体または医薬担体をさらに含んでいてもよい。
【０１５８】
本発明の方法の実施形態のいくつかにおいて、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、注射による腫瘍床への直接送達によって投与される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞の投与を必要とする対象はがんに罹患している。いくつかの実施形態において、前記がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記固形腫瘍は、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌からなる群から選択される。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に細胞療法を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞療法はCAR T細胞療法である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を前記治療対象に導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、抗体もしくはその結合断片、小分子、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体または腫瘍溶解性ポリオウイルスを前記対象に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその結合断片は、α−フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（MAGE）、HER2、および／またはrasもしくはp53の異常生成物に特異的である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記対象にプロドラッグを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロドラッグは、アービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506または二量体化誘導化学物質である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に薬物を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記薬物は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物である。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法を受けるべき対象として特定または選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤などのさらなる治療剤、または放射線療法および／もしくは外科手術などの補助療法を前記対象に導入、提供または投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記さらなる治療剤は、ホルモン遮断療法、化学療法、小分子、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、および／または放射線照射を含む抗がん療法であり、前記モノクローナル抗体もしくはその結合断片はヒト化されていてもよい。いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体、その結合断片またはそれらのヒト化バリアントは、Her2、CD52、CD20、CD25、VEGFまたはEGRFに特異的である。いくつかの実施形態において、前記ホルモン遮断療法は、タモキシフェン、アナストロゾール、および／またはレトロゾールの送達を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子は、チロシンキナーゼ阻害薬、小分子薬物複合体、セリンキナーゼ阻害薬、および／またはトレオニンキナーゼ阻害薬を含む。
【０１６０】
対象において、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法の効率を向上させる方法
いくつかの実施形態において、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法の効率の向上を必要とする対象（たとえばヒト）において、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法の効率を向上させる方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を前記対象（たとえばヒト）に投与すること、ならびに任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および／または任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象におけるがん、感染体、細菌、ウイルスまたは腫瘍の増殖を測定することを含む方法が提供される。
【０１６１】
前記対象において抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法の効率を向上させるために使用される遺伝子組換え免疫細胞の実施形態のいくつかにおいて、前記遺伝子組換え免疫細胞は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および／もしくは活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞はT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされたT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３の��クターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子はTGF-βまたはIL-10である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記炎症促進遺伝子はIFN-γ、IL-12および／またはIL-18である。いくつかの実施形態において、IL-12は配列番号２７に示される配列によってコードされる（ATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGTGTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTGCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCCTAA）。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって���導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞および単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、前記組成物は、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法の改善またはその効率の向上を必要とする対象（たとえばヒト）において、これらの療法の改善またはその効率の向上を目的として使用される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および／もしくは活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞はT細胞である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされたT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていてもよい。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子はTGF-βまたはIL-10である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記炎症促進遺伝子はIFN-γ、IL-12および／またはIL-18である。いくつかの実施形態において、IL-12は配列番号２７に示される配列によってコードされる（ATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGTGTTCCTGGAGTAGGGGTACCTGGGGTGGGCGCCAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTGCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCCTAA）。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターで��る。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞および単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。前記組成物は、医薬担体または医薬添加物をさらに含んでいてもよい。担体としては、高分子ミセル、リポソーム、リポタンパク質ベースのキャリア、ナノ粒子キャリア、デンドリマーおよび／またはT細胞用の当業者に公知の他の担体が挙げられる。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、注射による腫瘍床への直接送達によって投与される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞の投与を必要とする対象はがんに罹患している。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、前記がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記固形腫瘍は、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象（たとえばヒト）に細胞療法を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞療法はCAR T細胞療法である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を前記治療対象（たとえばヒト）に導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、抗体もしくはその結合断片、小分子、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体または腫瘍溶解性ポリオウイルスを前記対象に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその結合断片は、α−フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（MAGE）、HER2、および／またはrasもしくはp53の異常生成物に特異的である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記対象にプロドラッグを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロドラッグは、アービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506または二量体化誘導化学物質である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に薬物を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記薬物は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物である。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法を受けるべき対象として特定または選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤などのさらなる治療剤、または放射線療法および／もしくは外科手術などの補助療法を前記対象に導入、提供または投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記さらなる治療剤は、ホルモン遮断療法、化学療法、小分子、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、および／または放射線照射を含む抗がん療法である。いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体またはその結合断片は、Her2、CD52、CD20、CD25、VEGFまたはEGRFに特異的である。いくつかの実施形態において、前記ホルモン遮断療法は、タモキシフェン、アナストロゾール、および／またはレトロゾールの送達を含む。
【実施例】
【０１６４】
遺伝子組換えマクロファージ（GEM）を投与後のマウスにおける頭蓋内腫瘍の成長
実施したいくつかの実験において、ドナーのPBMCからCD14+単球を単離し、M1様マクロファージに分化させ、次いで骨髄系細胞に特異的なレンチウイルスを感染させた。感染させたマクロファージをqPCR、Bioplexアッセイおよびフローサイトメトリーで試験し、IL12、TNFαおよび／またはＩ型インターフェロンなどの炎症促進性サイトカインの発現のアップレギュレーションについて調べた。また、CAR T細胞の存在下および非存在下において、この遺伝子組換えマクロファージ（GEM）が膠芽腫マウスモデルの頭蓋内腫瘍の成長を遅延させることができるかどうかを試験した。
【０１６５】
マクロファージは、外来遺伝物質を検出したり排除したりする免疫学的機能を有することから、導入された外来遺伝子を発現するように遺伝子操作することが大変困難であることが知られている。しかし、最近になって、骨髄系細胞に感染させることが可能なレンチウイルスが開発されたことから、マクロファージを遺伝子操作することによって脳腫瘍の微小環境（TME）を形質転換するという方法のいくつかが利用可能となった。第１の方法では、マクロファージを遺伝子操作して、TLRアゴニストであるhigh mobility group box 1（HMGB1）を過剰発現させて分泌させ、炎症促進性因子を持続的に発現させるオートクリンシグナルとして作用させるとともに、腫瘍微小環境（TME）内の免疫抑制性骨髄系細胞に対するパラクリンシグナルとして作用させる。定量PCRでは、HMGBで処理したマクロファージにおいて、IL1βおよびTNFαの発現がアップレギュレートされることが示唆されている。第２の方法は、新たに開発されたPD1結合性タンパク質を発現させることを含み、移植された遺伝子組換えマクロファージ（GEM）からPD1結合性タンパク質が分泌されると、このPD1結合性タンパク質が、PD1とその天然のリガンドとの間の相互作用を遮断し、CAR T細胞の疲弊が緩和される。第３の方法では、Cas9-CRISPRシステムを用いて抗炎症性サイトカイン遺伝子をノックアウトすることによって、移植されたGEMがTMEの影響を受けにくくする。インビボ実験のデータからは、サイトカインや増殖因子をさらに送達せずとも、マウスの脳腫瘍に移植されたマクロファージが生存を維持し、マウスの生存を延長することを目的として導入された遺伝子を発現することが示されている。
【０１６６】
TLRアゴニストであるEntolomidは、配列番号３８に示される配列によってコードされる（CTGGGGATCGGCCTCTTCATGGGGTCCGGTGCCACCAACTTTTCTCTCCTGAAGCAGGCGGGCGATGTCGAAGAGAACCCAGGGCCTATGCTCCTGCTCGTAACCTCTCTCCTTTTGTGCGAATTGCCCCACCCTGCATTCTTGCTTATACCAATGCGCGGCAGTCACCATCATCATCACCACGGTATGGCGAGTATGACTGGCGGCCAGCAGATGGGCCGGGACCTGTATGATGACGATGACAAAGACCCGATGGCTCAGGTCATCAATACTAATAGCCTGTCACTGCTCACCCAGAACAACCTGGTTAAATCACAGTCATCCTTGTCATCAGCGATAGAGAGGTTGTCTTCTGGACTCCGCATCAACTCTGCTAAGGATGATGCAGCTGGTCAAGCAATAGCAAACCGATTCACCTCCAATATCAAAGGACTTACGCAGGCCAGTAGGAATGCGAATGATGGAATAAGCATCGCACAGACTACGGAAGGAGCGCTGAACGAAATCAACAATAACCTCCAGCGCGTTCGCGAACTCTCTGTCCAGGCGACAACGGGCACGAATTCTGATAGCGATCTTAAATCAATACAAGACGAGATACAGCAGCGCTTGGAAGAGATTGATAGGGTAAGCGGACAAACGCAATTCAATGGCGTTAAAGTGCTTTCCCAGGACAATCAGATGAAGATACAAGTCGGCGCAAACGACGGGGAGACGATTACAATCGACTTGCAAAAAATAGATGTGAAAAGCCTCGGGTTGGATGGGTTTAACGTCAATAGTCCTGGCATTAGTGGTGGCGGCGGTGGGATTTTGGACAGCATGGGTACTCTTATTAATGAAGATGCCGCAGCAGCTAAAAAAAGTACTGCTAACCCGCTGGCATCCATCGATTCAGCGTTGAGTAAAGTTGACGCAGTCCGCAGCAGTCTGGGCGCGATACAAAACAGATTTGATTCCGCCATTACCAACCTCGGCAATACCGTCACCAATTTGAATTCAGCGAGATCTCGGATTGAGGACGCCGATTACGCAACAGAAGTGTCTAACATGTCTAAAGCTCAAATCTTGCAACAGGCCGGCACCTCCGTACTGGCTCAGGCCAATCAAGTTCCACAGAATGTGCTGAGTCTGCTTCGA TAA GCTCTAGACCCGGGCTGCA）。
【０１６７】
マクロファージの浸潤
マクロファージの浸潤を調べるため、マウスの高悪性度神経膠腫を使用して実験を行った。図１Ａは、正常細胞、グレード１の神経膠腫、グレード２の神経膠腫、グレード３の神経膠腫、グレード４の神経膠腫、および髄膜腫を示す。図１Ａ〜１Ｄに示すように、高悪性度の神経膠腫は、顕著なマクロファージ浸潤を示す。
【０１６８】
U87腫瘍に動員されたマウスマクロファージ
200,000個のU87腫瘍細胞を８週齢のNSGマウスに頭蓋内注射した。２８日後に脳を摘出し、冠状方向に切断した組織をパラフィン包埋固定した。組織を5μmに薄切し、1:100に希釈したラット抗F4/80（シグマ）で染色した後、ヤギ抗ラットHRP（Life technologies）で染色し、Alexa488を組み合わせたチラミドシグナル増幅法を用いて検出した。ニコンEclipse Ciを用いてスライドを撮影し、タイリング法によって10×1720の画像を得た。移植したU87腫瘍に動員されたマウスマクロファージを示す染色スライドを図２に示す。
【０１６９】
VPX含有レンチウイルスによって形質導入が成功したHLA-DR+マクロファージ
正常ヒトPBMCからCD14+細胞を単離し、25nM/mlのM-CSFで６日間処理した。得られた単球由来マクロファージ（MDM）に、Vpx含有GFPレポーターレンチウイルス（pLenti-CMV-eGFP）粒子をマクロファージ１個あたり0個、88個、220個または308個感染させることによって形質導入した。１３日目にトリプシン処理を行ってMDMを回収し、抗HLA-DR-PE Cy7で染色し、フローサイトメトリーでGFPの発現を分析した。MDM１個あたり0個、88個、220個または308個のLV粒子を有するMDMを分析したフローサイトメトリーの結果を図３に示す。
【０１７０】
GFPおよびホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルスで形質導入された単球由来マクロファージ（MDM）は、膠芽腫（GBM）マウスモデルにおいて生存が持続する
GFPおよびルシフェラーゼをコードするレンチウイルスを用いてMDMに形質導入し、３０日後にフローサイトメトリーを実施してGFPの発現を評価した（図４Ａ）。０日目に2×105個の野生型U87細胞を頭蓋内注射したNSGマウスの画像を図４Ｂに示す。発光バックグラウンドは６日目に測定した。U87細胞を注射した７日目に、1.44×105個のルシフェラーゼ発現GEM（パネルAにおいて65.5％を占めたGFP+マクロファージ）を注射し、週２回画像を撮影した。図４Ｂおよび図４Ｃは縦方向のGEMの発光シグナルを示す。
【０１７１】
他の実験で使用したレンチウイルスコンストラクトを図５に示す。
【０１７２】
単球由来マクロファージ（MDM）におけるTGFβRIIの発現およびシグナル伝達の抑制
MDMにおいてTGFβRIIを発現させるための図５に示すベクターを用いて、免疫細胞をトランスフェクトした。GM-CSFを用いて初代単球から分化誘導したマクロファージを、抗HLA-DR-PE-Cy7抗体および抗TGFβRII-488抗体で染色し、FCMで分析した。その結果を図６Ａ（上パネル）に示す。HLA-DR+細胞（細胞集団の98%）のMFIを図６Ｃ（下パネル）に示す。SBE（SMAD binding element）−ルシフェラーゼレポーターおよび／またはdnTGFβRIIを発現する293T細胞を1ng/mLのTGFβ1で３時間処理した結果を図６Ｂに示す。
【０１７３】
遺伝子組換え免疫細胞におけるPD-1/IFNα融合タンパク質の発現
単球由来マクロファージ（MDM）においてPD-1/IFNα融合タンパク質を発現させるための図５に示すベクターを用いて、免疫細胞をトランスフェクトした。図７Ａに示すように、形質導入されたH9細胞は、PD-1/IFNα融合タンパク質（PIFP）を分泌する。H9親細胞またはPD1:IFNαを形質導入したH9細胞から回収した上清を濃縮し、電気泳動にかけ、IFNαタンパク質が有する2Aタグに対するモノクローナル抗体（左：1:5000）または抗PD1モノクローナル抗体（右：1:250）を用いてウエスタンブロットを行った。また、H9親細胞またはPD1:IFNαを形質導入したH9細胞にブレフェルジンＡを添加して培養した後、各細胞を固定し、透徹し、蛍光色素結合抗体で細胞内染色した結果を図７Ｂに示す。抗IFNα抗体（左）および抗PD1抗体（右）を使用したFCMで細胞を分析した。
【０１７４】
VPXウイルスの製造
図８に示すように、レンチウイルスパッケージング成分（gag-pol、vsv-gおよびrev）をコードするプラスミド、導入される目的遺伝子（ピンク色）をepHIV7レンチウイルス骨格中にコードするプラスミド、および骨髄系細胞への形質導入を可能にするための因子Vpxをコードするプラスミドを293T細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、Vpxタンパク質を含めてパッケージングしたビリオンを293T細胞の上清から精製した。このVpx含有ウイルスを骨髄単核細胞（MMC）（初代ヒト単球またはインビトロで分化誘導したマクロファージ）に感染させた。過去に報告されているように、MMCによって発現される制限因子SAMHD1がVpxによって分解されることによって、ウイルスの逆転写酵素が不活性化され、安定した遺伝子の組み込みと発現が可能となる。Vpxタンパク質とともにパッケージングしたレンチウイルスベクターを使用することによって、骨髄系細胞の安定したトランスフェクションが可能となる。
【０１７５】
感染方法
初代ヒト末梢血単球や単球由来マクロファージなどの骨髄単核細胞（MMC）は、レンチウイルスを感染させることができる。図１０Ａに示したように、第１のプロトコルでは、磁気分離によって末梢血単球（PBMC）からCD14+単球を単離し、10ng/mLの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を添加して培養することによって炎症促進性の表現型へと分化させるか、あるいは25ng/mLのマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）を添加して培養することによって抗炎症性の表現型へと分化させる。分化の７日後に、Vpx含有レンチウイルスをマクロファージに感染させ、１週間後に導入遺伝子が安定して発現された後、実験に使用した。感染の７日後（CD14+単球を単離した１４日後）までには、導入遺伝子を発現するマクロファージの割合は95％を超える。図１０Ｂに示したように、PBMCからCD14+単球を単離し、これと同じ日にVpx含有レンチウイルスに感染させ、次いでGM-CSFまたはM-CSFを用いて７日間培養することによって分化誘導する。この場合も７日間培養した後には、導入遺伝子を発現するマクロファージの割合は95％を超える。
【０１７６】
GM-CSFによる分化誘導
GM-CSFで分化誘導したマクロファージにレンチウイルスを感染させるには、レンチウイルスをVpxとともにパッケージングすることが必要である。マクロファージまたは単球にウイルスを感染させなかったもの、Vpxを除いてパッケージングしたGFP-レンチウイルスを感染させたもの、またはVpxを含めてパッケージングしたGFP-レンチウイルスを感染させたものをフローサイトメトリーで分析し、プロットの右側に示した時間点におけるGFPおよびHLA-DRの共発現（図１１Ａ）またはGFPおよびCD11bの共発現（図１１Ｂ）を調べた。プロットの右側に示した時間点は、MMCのうち単球（感染０日目）およびマクロファージ（感染７日目）の感染を示す。
【０１７７】
M-CSFで分化誘導したマクロファージのプロット
M-CSFで分化誘導したマクロファージにレンチウイルスを感染させるには、レンチウイルスをVpxとともにパッケージングすることが必要である。CD14+細胞を単離し、７日目のマクロファージにウイルスを感染させなかったもの、Vpxを除いてパッケージングしたGFP-レンチウイルスを感染させたもの、またはVpxを含めてパッケージングしたGFP-レンチウイルスを感染させたものを準備し、２１日目にフローサイトメトリーを使用してGFPおよびHLA-DRの共発現（図１２Ａ）またはGFPおよびCD11bの共発現（図１２Ｂ）を分析した。
【０１７８】
末梢血単球（PBMC）からのCD14+単球の単離
Bloodworks Northwestから健常ドナーの全血および成分分離血液製剤を得た（Seattle Children’s Research Institute IRB# 14412）。標準プロトコルを使用して、Ficoll-Paque密度勾配（GEヘルスケア）によってPBMCを単離した15。メーカーのプロトコルに従ってEasySep Human CD14 Positive Selection Kit（Stemcell Technologies）を使用して、PBMCからCD14+単球を精製した（Noble PB, Cutts JH. Separation of blood leukocytes by Ficoll gradient. Can Vet J 1967;8:110-111；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【０１７９】
マクロファージの分化誘導
単離したCD14+単球は、250,000個／cm2の密度を超えないように、25ng/mLのM-CSFまたは10ng/mLのGM-CSF（R&Dシステムズ）の存在下において、組織培養処理プラスチックディッシュ（コーニング）中のマクロファージ培地（10%FBS（Hyclone）を添加したRPMI1640培地（Gibco））に37℃、5%CO2で播種した。播種の７２時間後、培地の半量を、最終濃度25ng/mlのM-CSFまたは10ng/mlのGM-CSFを添加した新鮮なマクロファージ培地と交換した。単離の６日後には単球がマクロファージに完全に分化したと見なした。必要に応じて0.25%トリプシン（Gibco）を加え、穏やかに掻き取って細胞を剥がし、再播種することができた。
【０１８０】
樹状細胞の分化誘導
単離したCD14+単球を、Spadaroらのプロトコルに従って樹状細胞（DC）に分化誘導した（Spadaro M, Montone M, Arigoni M et al. Recombinant human lactoferrin induces human and mouse dendritic cell maturation via Toll-like receptors 2 and 4. FASEB J 2014;28:416-429；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。具体的には、10%FBS、100ng/mL GM-CSFおよび50ng/mL IL-4（R&Dシステムズ）を添加したRPMI-1640にCD14+細胞を播種した。７２時間後に培地を交換し、新鮮なサイトカインを加えた。
【０１８１】
レンチウイルスベクター
特に記載がない限り、コンストラクトはいずれも、Michael Jensen博士（Seattle Children’s Research Institute）から供与されたepHIV7レンチウイルス骨格またはepHIV7.2レンチウイルス骨格を使用して作製した。epHIV7において、pHIV7のCMVプロモーター（Yam PY, Li S, Wu J et al. Design of HIV vectors for efficient gene delivery into human hematopoietic cells. Mol Ther 2002;5:479-484；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）をEF1αプロモーターと置換した。epHIV7.2は、EF1αプロモーターを最小EF1αプロモーター（HTLV-1ドメインを持たない）と置換し、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子と置換した。緑色蛍光タンパク質−ホタルルシフェラーゼ（GFP-ffluc）融合タンパク質は過去に報告されている（Brown CE, Starr R, Martinez C et al. Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells. Cancer Res 2009;69:8886-8893；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。epHIV7骨格中に含まれるGFP-fflucは、Michael Jensen博士から供与された。緑色蛍光タンパク質−ホタルルシフェラーゼ（GFP-ffluc）融合タンパク質は、配列番号２９に示される配列によってコードされる（atggaggatgccaagaatattaagaaaggccctgccccattctaccctctggaagatggcactgctggtgagcaactgcacaaggccatgaagaggtatgccctggtccctggcaccattgccttcactgatgctcacattgaggtggacatcacctatgctgaatactttgagatgtctgtgaggctggcagaagccatgaaaagatatggactgaacaccaaccacaggattgtggtgtgctctgagaactctctccagttcttcatgcctgtgttaggagccctgttcattggagtggctgtggcccctgccaatgacatctacaatgagagagagctcctgaacagcatgggcatcagccagccaactgtggtctttgtgagcaagaagggcctgcaaaagatcctgaatgtgcagaagaagctgcccatcatccagaagatcatcatcatggacagcaagactgactaccagggcttccagagcatgtatacctttgtgaccagccacttaccccctggcttcaatgagtatgactttgtgcctgagagctttgacagggacaagaccattgctctgattatgaacagctctggctccactggactgcccaaaggtgtggctctgccccacagaactgcttgtgtgagattcagccatgccagagaccccatctttggcaaccagatcatccctgacactgccatcctgtctgtggttccattccatcatggctttggcatgttcacaacactggggtacctgatctgtggcttcagagtggtgctgatgtataggtttgaggaggagctgtttctgaggagcctacaagactacaagatccagtctgccctgctggtgcccactctgttcagcttctttgccaagagcaccctcattgacaagtatgacctgagcaacctgcatgagattgcctctggaggagcacccctgagcaaggaggtgggtgaggctgtggcaaagaggttccatctcccaggaatcagacagggctatggcctgactgagaccacctctgccatcctcatcacccctgaaggagatgacaagcctggtgctgtgggcaaggtggttcccttttttgaggccaaggtggtggacctggacactggcaagaccctgggagtgaaccagaggggtgagctgtgtgtgaggggtcccatgatcatgtctggctatgtgaacaaccctgaggccaccaatgccctgattgacaaggatggctggctgcactctggtgacattgcctactgggatgaggatgagcactttttcattgtggacaggctgaagagcctcatcaagtacaaaggctaccaagtggcacctgctgagctagagagcatcctgctccagcaccccaacatctttgatgctggtgtggctggcctgcctgatgatgatgctggagagctgcctgctgctgttgtggttctggagcatggaaagaccatgactgagaaggagattgtggactatgtggccagtcaggtgaccactgccaagaagctgaggggaggtgtggtgtttgtggatgaggtgccaaagggtctgactggcaagctggatgccagaaagatcagagagatcctgatcaaggccaagaagggtggcaaa）。EGFP:ffluc-T2A-CD19tは、配列番号３４に示される配列によってコードされる（atggaggatgccaagaatattaagaaaggccctgccccattctaccctctggaagatggcactgctggtgagcaactgcacaaggccatgaagaggtatgccctggtccctggcaccattgccttcactgatgctcacattgaggtggacatcacctatgctgaatactttgagatgtctgtgaggctggcagaagccatgaaaagatatggactgaacaccaaccacaggattgtggtgtgctctgagaactctctccagttcttcatgcctgtgttaggagccctgttcattggagtggctgtggcccctgccaatgacatctacaatgagagagagctcctgaacagcatgggcatcagccagccaactgtggtctttgtgagcaagaagggcctgcaaaagatcctgaatgtgcagaagaagctgcccatcatccagaagatcatcatcatggacagcaagactgactaccagggcttccagagcatgtatacctttgtgaccagccacttaccccctggcttcaatgagtatgactttgtgcctgagagctttgacagggacaagaccattgctctgattatgaacagctctggctccactggactgcccaaaggtgtggctctgccccacagaactgcttgtgtgagattcagccatgccagagaccccatctttggcaaccagatcatccctgacactgccatcctgtctgtggttccattccatcatggctttggcatgttcacaacactggggtacctgatctgtggcttcagagtggtgctgatgtataggtttgaggaggagctgtttctgaggagcctacaagactacaagatccagtctgccctgctggtgcccactctgttcagcttctttgccaagagcaccctcattgacaagtatgacctgagcaacctgcatgagattgcctctggaggagcacccctgagcaaggaggtgggtgaggctgtggcaaagaggttccatctcccaggaatcagacagggctatggcctgactgagaccacctctgccatcctcatcacccctgaaggagatgacaagcctggtgctgtgggcaaggtggttcccttttttgaggccaaggtggtggacctggacactggcaagaccctgggagtgaaccagaggggtgagctgtgtgtgaggggtcccatgatcatgtctggctatgtgaacaaccctgaggccaccaatgccctgattgacaaggatggctggctgcactctggtgacattgcctactgggatgaggatgagcactttttcattgtggacaggctgaagagcctcatcaagtacaaaggctaccaagtggcacctgctgagctagagagcatcctgctccagcaccccaacatctttgatgctggtgtggctggcctgcctgatgatgatgctggagagctgcctgctgctgttgtggttctggagcatggaaagaccatgactgagaaggagattgtggactatgtggccagtcaggtgaccactgccaagaagctgaggggaggtgtggtgtttgtggatgaggtgccaaagggtctgactggcaagctggatgccagaaagatcagagagatcctgatcaaggccaagaagggtggcaaaGgcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctaggatgccacctcctcgcctcctcttcttcctcctcttcctcacccccatggaagtcaggcccgaggaacctctagtggtgaaggtggaagagggagataacgctgtgctgcagtgcctcaaggggacctcagatggccccactcagcagctgacctggtctcgggagtccccgcttaaacccttcttaaaactcagcctggggctgccaggcctgggaatccacatgaggcccctggccatctggcttttcatcttcaacgtctctcaacagatggggggcttct）。epHIV7.2レンチウイルスベクターおよびepHIV7:GFP-ffluc、ならびにdnTGFBRII-t2a-Her2tgおよびsTGFBRII-t2a-Her2tgは、Michael Jensen博士の厚意により供与された。T2A-sTGFBRIIは、配列番号３２に示される配列によってコードされる（Ggcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctaggatgggtcgggggctgctcaggggcctgtggccgctgcacatcgtcctgtggacgcgtatcgccagcacgatcccaccgcacgttcagaagtcggttaataacgacatgatagtcactgacaacaacggtgcagtcaagtttccacaactgtgtaaattttgtgatgtgagattttccacctgtgacaaccagaaatcctgcatgagcaactgcagcatcacctccatctgtgagaagccacaggaagtctgtgtggctgtatggagaaagaatgacgagaacataacactagagacagtttgccatgaccccaagctcccctaccatgactttattctggaagatgctgcttctccaaagtgcattatgaaggagaagaaaaagcctggtgagactttcttcatgtgttcctgtagctctgatgagtgcaatgacaacatcatcttctcagaagaatataacaccagcaatcctgacttgttgctagtcatatttcaatga）。mCherryコンストラクトは、ギブソンクローニングによってHIV7.2のNheI/NotIに挿入することによって作製した。過去に報告されている可溶性トランスフォーミング増殖因子β受容体II（sTβRII）コンストラクトを作製するため（Rowland-Goldsmith MA, Maruyama H, Kusama T et al. Soluble type II transforming growth factor-beta (TGF-beta) receptor inhibits TGF-beta signaling in COLO-357 pancreatic cancer cells in vitro and attenuates tumor formation. Clin Cancer Res 2001;7:2931-2940.；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）、ヒトTGFβRIIアイソフォームAの細胞外部分（aa 1-159；NCBI accession # NP_001020018.1）を、epHIV7.2のNheI/NotI部位にクローニングした。末端切断型CD19（CD19t）（Sato S, Miller AS, Howard MC et al. Regulation of B lymphocyte development and activation by the CD19/CD21/CD81/Leu 13 complex requires the cytoplasmic domain of CD19. J Immunol 1997;159:3278-3287；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）は、ギブソンクローニングによってsTβRII遺伝子の上流に挿入し、CD19tとsTβRII遺伝子の間にT2A配列を配置した。IL-21プラスミドは、オリジーン社から購入し（NCBI RefSeq NM_021803に示されるコード配列を含むプラスミドRC215235）、epHIV7.2のNheI/NotIにクローニングした。CD19t（Sato S, Miller AS, Howard MC et al. Regulation of B lymphocyte development and activation by the CD19/CD21/CD81/Leu 13 complex requires the cytoplasmic domain of CD19. J Immunol 1997;159:3278-3287；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）は、ギブソンクローニングによってIL-21遺伝子の下流に挿入し、CD19tとIL-21遺伝子の間にT2A配列を配置した。このIL-21-T2A配列（配列番号１６；Gccaccatgagatccagtcctggcaacatggagaggattgtcatctgtctgatggtcatcttcttggggacactggtccacaaatcaagctcccaaggtcaagatcgccacatgattagaatgcgtcaacttatagatattgttgatcagctgaaaaattatgtgaatgacttggtccctgaatttctgccagctccagaagatgtagagacaaactgtgagtggtcagctttttcctgctttcagaaggcccaactaaagtcagcaaatacaggaaacaatgaaaggataatcaatgtatcaattaaaaagctgaagaggaaaccaccttccacaaatgcagggagaagacagaaacacagactaacatgcccttcatgtgattcttatgagaaaaaaccacccaaagaattcctagaaagattcaaatcacttctccaaaagatgattcatcagcatctgtcctctagaacacacggaagtgaagattcc）のギャップは、フォワードプライマー（配列番号１４；ccgccagaacacagctggctagcgccaccatgagatccagtcctggcaac）およびリバースプライマー（配列番号１５；tgtcaccaggagaagcatcctagggccgggattctc）を使用して埋めた。また、EGFRt-P2A-可溶性VEGF受容体（配列番号２８に示される配列によってコードされる）を発現する細胞を製造することもできる。LentiCRISPRv2ベクターはFeng Zhang氏（Addgeneプラスミド#52961）から供与されたものであり、IL-10を標的とするガイド配列（TGTTGCCTGGTCCTCCTGAC（配列番号１））およびPD-L1を標的とするガイド配列（TCCAGATGACTTCGGCCTTG（配列番号２））は、標準的なプロトコルを使用してBsmB1部位に挿入した（Sanjana NE, Shalem O, Zhang F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods 2014;11:783-784およびShalem O, Sanjana NE, Hartenian E et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science 2014;343:84-87；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）。末端切断型上皮成長因子受容体（EGFRt）（Wang X, Chang WC, Wong CW et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood 2011;118:1255-1263；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）エピトープタグを挿入して、ピューロマイシン耐性配列と置換した。可溶性TGFβRII（sTGFβRII）コンストラクトを作製するため、ヒトTGFβRIIアイソフォームAの細胞外部分（aa 1-166；NCBI accession # NP_001020018.1）をGen9社から購入し、epHIV7.2のNheI/NotI部位にクローニングした。IL-21プラスミドは、オリジーン社から購入し（NCBI RefSeq NM_021803に示されるコード配列を含むプラスミドRC215235）、epHIV7.2のNheI/NotIにクローニングした。
【０１８２】
レンチウイルスの製造
ウイルスの製造はいずれもBSL-2ラミナーフローフード内で行った。pcVpxおよびpMDL-Xは、Landau labの厚意により供与された（Bobadilla, Gene Therapy 2013）（Bobadilla S, Sunseri N, Landau NR. Efficient transduction of myeloid cells by an HIV-1-derived lentiviral vector that packages the Vpx accessory protein. Gene Ther 2013;20:514-520；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。RSV-RevはAddgene社（プラスミド# 12253）から購入した。pCMV-GはMichael Jensen博士から供与された（Yee JK, Miyanohara A, LaPorte P et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 1994;91:9564-9568；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。293T細胞をATCC（CRL-3216）から購入し、継代数20回未満で使用した。293T細胞は、15cmディッシュ１枚あたり107個の密度で293T培地（10mM HEPES、1%Glutamax（Gibco）および10%FBSを添加したDMEM）に播種した。一晩培養した後、CalPhos哺乳動物用トランスフェクションキット（クロンテック）を使用して、各プレートに、pcVpx（4.6μg）、pMDL-X（13.5μg）、RSV-Rev（6.8μg）、pCMV-G（9.5μg）および外来遺伝子導入ベクター（37.8μg）をそれぞれトランスフェクトした。１６時間後、培地を新鮮な293T培地に交換した。４８時間後、ウイルスを含む上清を回収し、0.45μmフィルターで濾過して残渣を除去し、SW-28ローターを備えたベックマン・コールター社のOptima L-90K超遠心分離機を使用して、4℃、108,000×gで９０分間超遠心分離した。ウイルスペレットを無血清DMEMに再懸濁し、レンチウイルス構成タンパク質p24測定用ELISAキットであるQuick Titer Lentivirus titer kit（Cell Biolabs）を使用して、インタクトなレンチウイルス粒子（LP）の濃度を測定した。
【０１８３】
部分的に分化誘導されたマクロファージ集団およびDC集団の高MOIでの形質導入
Vpxを含めてパッケージングしたレンチウイルスまたはVpxを除いてパッケージングしたレンチウイルス１mLあたりの力価（TU）を測定するため、GFP-fflucをコードするウイルスを様々な濃度で使用してH9細胞に形質導入し、フローサイトメトリーで分析した。TU／mL＝（形質導入時のH9細胞の数）×（GFP陽性細胞の割合）／（添加したウイルスの量（mL））。この式で算出された値を使用して、分化３日目の樹状細胞またはマクロファージに感染させる際のMOIを決定した（Breckpot K, Dullaers M, Bonehill A et al. Lentivirally transduced dendritic cells as a tool for cancer immunotherapy. J Gene Med 2003;5:654-667；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。上記と同様にして、新鮮培地およびサイトカインとともにウイルスを加えた。Vpxを除いてパッケージングしたレンチウイルスの形質導入効率を向上させるため、硫酸プロタミン（100μg/mL）を加えた。
【０１８４】
単球またはマクロファージのレンチウイルス感染
マクロファージ培地において、新鮮単離した単球または分化誘導したマクロファージに20〜1000個／細胞の濃度でLPを感染させた（感染と同時に単球の分化が進むように、M-CSFまたはGM-CSFを適宜培地に添加した）。培地は３日ごとに新たなものに交換した。
【０１８５】
U87細胞の培養
野生型のU87神経膠腫細胞株はATCC（HTB-14）から購入した。epHIV7:GFP-fflucで安定に形質導入されたU87細胞はMichael Jensen博士の研究所から供与された。U87細胞はいずれも、1%Glutamaxおよび10%FBSを添加したDMEM中で37℃、5%CO2で培養した後、継代培養してから、ニューロスフェアを形成させた。継代数が５回を超えたGFP-ffluc発現U87細胞は使用しなかった。実験に使用する前に蛍光顕微鏡下でGFPの発現を確認した。
【０１８６】
レンチウイルスのコピー数アッセイ
細胞１個あたりのレンチウイルスの組み込み数を測定するため、分化０日目または10ng/mL GM-CSFで分化誘導後７日目に、GFP-fflucをコードするLPを100個／細胞または250個／細胞の濃度でCD14+細胞に感染させて形質導入を行った。分化１０日目に、Qiagen DNA Mini Kitを使用してゲノムDNAを単離した。2×Power SYBR Green Master Mix（サーモフィッシャー）を使用して、BioRad CFX96リアルタイムシステムにおいてqPCRを行い、WPREおよびアルブミン遺伝子を定量した。濃度が既知のプラスミドDNAから作製した標準曲線のCq値と、レンチウイルス（WPRE）およびゲノムDNA（アルブミン）のCq値とを比較することによって、レンチウイルス（WPRE）の量およびゲノムDNA（アルブミン）の量をピコグラム単位で求めた。細胞１個あたりのウイルスの組み込み数＝２×（WPRE（pg））／（ALB（pg））。
【０１８７】
WPRE-QF：ACTGTGTTTGCTGACGCAACCC（配列番号８）
【０１８８】
WPRE-QR：CAACACCACGGAATTGTCAGTGCC（配列番号９）
【０１８９】
ALB-QF：TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT（配列番号１０）
【０１９０】
ALB-QR：CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT（配列番号１１）
【０１９１】
フローサイトメトリー
遺伝子組換えマクロファージ（GEM）をVersene（Gibco）で処理し、穏やかに剥がして回収し、フローサイトメトリーに使用した。回収した細胞をFc Block（BDバイオサイエンス）で処理して非特異的な抗体の結合を防ぎ、蛍光色素標識抗体で染色し、2%パラホルムアルデヒドで固定し、FACS DIVAソフトウェアを使用してBD LSR Fortessaフローサイトメーターによる測定を行った。Mac用のFlowJo v10（Treestar）を使用して分析を行った。抗ヒト抗体として、CD16-V500、CD163-Alexa647およびCD80-BV786（BDバイオサイエンス）；ならびにCD11b-APC-Cy7、CD19-APC、HLA-DR-BV605またはHLA-DR-APC、CD45-BV785、およびPD-L1-PECy7（Biolegend）を使用し、また、Live/Dead fixable blue stain（サーモフィッシャー）を使用した。EZ-link biotinylation kit（サーモサイエンティフィック）を使用してアービタックス（ブリストル・マイヤーズ スクイブ）をビオチン標識し、ストレプトアビジン-FITC（Biolegend）と組み合わせて使用した。
【０１９２】
免疫組織化学分析の結果を図２１に示す。図２１Ａは、U87細胞のみを注射し、次いで５日後にPBSをmockとして注射したマウスの代表的な切片を示す。図２１Ｂは、U87細胞を注射し、次いで５日後にCD45発現GEMを注射したマウスの代表的な切片を示す。
【０１９３】
ウイルスの誘導によるサイトカインの産生
健常ドナーPBMCからCD14+単球を単離し、mCherry Vpx+レンチウイルスのウイルス粒子を0個／細胞または250個／細胞の濃度で感染させて形質導入を行い、GM-CSFを添加して７日間分化誘導した。２４時間馴化後、形質導入から２４時間後および７日後に細胞500,000個につき培地１mLを回収した。培地試料を希釈せずに使用して、IL-12（p40/p70）、TNF、IFNαなどの測定が可能なLuminexキット（ライフテクノロジーズ）で測定した。
【０１９４】
Surveyorアッセイ
GM-CSFでマクロファージに分化誘導し、コントロール（gRNA非含有）、IL-10 gRNAまたはPD-L1 gRNAを含むVpx+LentiCRISPRv2ウイルスのウイルス粒子を1000個／細胞の濃度で感染させた。５日間培養した後、メーカーのプロトコルに従ってDNeasyキット（キアゲン）を使用してゲノムDNAを単離した。Cas9の切断部位周辺のゲノム領域を、以下に示すプライマーセットでPCR増幅し、メーカーのプロトコルに従ってSurveyorアッセイ（Integrated DNA Technologies）を実施した。
【０１９５】
IL-10 PCRプライマーを以下に示す。
【０１９６】
F：5’-AGAGAGGTAGCCCATCCTAAAAATAGCTG（配列番号３）
【０１９７】
R：5’-GCAGGTTTCCTGCACATTTACTGTATCA（配列番号４）
【０１９８】
PD-L1 PCRプライマーを以下に示す。
【０１９９】
F：5’-TTGAATTGAATTGAGGCAGAGCTAGCAG（配列番号５）
【０２００】
R：5’-ATATGGTTTGGATGAATGGAGGTGAGGA（配列番号６）
【０２０１】
PD-L1発現のダウンレギュレーションの確認
GM-CSFでマクロファージに分化誘導し、コントロール（gRNA非含有）またはPD-L1 gRNAを含むVpx+LentiCRISPRv2-EGFRtウイルスのウイルス粒子を1000個／細胞の濃度で感染させた。６日間培養した後、100ng/mLリポ多糖（LPS）および20ng/mLインターフェロンγ（IFNγ）で遺伝子組換えマクロファージ（GEM）を２４時間刺激し、抗PD-L1抗体およびアービタックスでGEMを染色してフローサイトメトリーを行い、エピトープタグEGFRtの発現に基づいて形質導入効率を求めた。
【０２０２】
IL-10発現のダウンレギュレーションの確認
GM-CSFでマクロファージに分化誘導し、コントロール（gRNA非含有）またはIL-10 gRNAを含むVpx+LentiCRISPRv2:EGFRtウイルスのウイルス粒子を1000個／細胞の濃度で感染させた。６日間培養した後、500,000個／mLの遺伝子組換えマクロファージ（GEM）を100ng/mL LPSおよび20ng/mL IFNγで２４時間刺激した。回収した馴化培地を希釈せずに使用して、Bio-Plex 200機器でバイオ・ラッド社のIL-10 BioPlex Proアッセイを行った。アービタックスで細胞を染色してフローサイトメトリーを行い、エピトープタグEGFRtの発現に基づいて形質導入効率を求めた。
【０２０３】
可溶性TGFβRII発現の確認
sTβRIIの発現を確認するため、GM-CSFでマクロファージに分化誘導し、７日目にCD19t-T2A-sTβRIIをコードするレンチウイルスまたはCD19tコントロールベクターのウイルス粒子を250個／細胞の濃度で感染させて形質導入を行った（CD19t-T2A-sTβRII：配列番号３３；AtgccacctcctcgcctcctcttcttcctcctcttcctcacccccatggaagtcaggcccgaggaacctctagtggtgaaggtggaagagggagataacgctgtgctgcagtgcctcaaggggacctcagatggccccactcagcagctgacctggtctcgggagtccccgcttaaacccttcttaaaactcagcctggggctgccaggcctgggaatccacatgaggcccctggccatctggcttttcatcttcaacgtctctcaacagatggggggcttctacctgtgccagccggggcccccctctgagaaggcctggcagcctggctggacagtcaatgtggagggcagcggggagctgttccggtggaatgtttcggacctaggtggcctgggctgtggcctgaagaacaggtcctcagagggccccagctccccttccgggaagctcatgagccccaagctgtatgtgtgggccaaagaccgccctgagatctgggagggagagcctccgtgtgtcccaccgagggacagcctgaaccagagcctcagccaggacctcaccatggcccctggctccacactctggctgtcctgtggggtacccCctgactctgtgtccaggggccccctctcctggacccatgtgcaccccaaggggcctaagtcattgctgagcctagagctgaaggacgatcgcccggccagagatatgtgggtaatggagacgggtctgttgttgccccgggccacagctcaagacgctggaaagtattattgtcaccgtggcaacctgaccatgtcattccacctggagatcactgctcggccagtactatggcactggctgctgaggactggtggctggaaggtctcagctgtgactttggcttatctgatcttctgcctgtgttcccttgtgggcattcttcatcttcaaagagccctggtcctgaggaggaaaagataaGgcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctaggatgggtcgggggctgctcaggggcctgtggccgctgcacatcgtcctgtggacgcgtatcgccagcacgatcccaccgcacgttcagaagtcggttaataacgacatgatagtcactgacaacaacggtgcagtcaagtttccacaactgtgtaaattttgtgatgtgagattttccacctgtgacaaccagaaatcctgcatgagcaactgcagcatcacctccatctgtgagaagccacaggaagtctgtgtggctgtatggagaaagaatgacgagaacataacactagagacagtttgccatgaccccaagctcccctaccatgactttattctggaagatgctgcttctccaaagtgcattatgaaggagaagaaaaagcctggtgagactttcttcatgtgttcctgtagctctgatgagtgcaatgacaacatcatcttctcagaagaatataacaccagcaatcctgacttgttgctagtcatatttcaatga）。500,000個／mLの密度で２４時間馴化し、形質導入後５日目、６日目および７日目に培地を回収した。ヒトTGFβRII DuoSet ELISA（R&Dシステムズ）を使用して、分泌されたタンパク質を検出した。T2A-CD19tは、配列番号３０に示される配列によってコードされる（Ggcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctaggatgccacctcctcgcctcctcttcttcctcctcttcctcacccccatggaagtcaggcccgaggaacctctagtggtgaaggtggaagagggagataacgctgtgctgcagtgcctcaaggggacctcagatggccccactcagcagctgacctggtctcgggagtccccgcttaaacccttcttaaaactcagcctggggctgccaggcctgggaatccacatgaggcccctggccatctggcttttcatcttcaacgtctctcaacagatggggggcttctacctgtgccagccggggcccccctctgagaaggcctggcagcctggctggacagtcaatgtggagggcagcggggagctgttccggtggaatgtttcggacctaggtggcctgggctgtggcctgaagaacaggtcctcagagggccccagctccccttccgggaagctcatgagccccaagctgtatgtgtgggccaaagaccgccctgagatctgggagggagagcctccgtgtgtcccaccgagggacagcctgaaccagagcctcagccaggacctcaccatggcccctggctccacactctggctgtcctgtggggtaccccctgactctgtgtccaggggccccctctcctggacccatgtgcaccccaaggggcctaagtcattgctgagcctagagctgaaggacgatcgcccggccagagatatgtgggtaatggagacgggtctgttgttgccccgggccacagctcaagacgctggaaagtattattgtcaccgtggcaacctgaccatgtcattccacctggagatcactgctcggccagtactatggcactggctgctgaggactggtggctggaaggtctcagctgtgactttggcttatctgatcttctgcctgtgttcccttgtgggcattcttcatcttcaaagagccctggtcctgaggaggaaaagataa）。CD19tエピトープタグは、配列番号３１に示される配列によってコードされる（Atgccacctcctcgcctcctcttcttcctcctcttcctcacccccatggaagtcaggcccgaggaacctctagtggtgaaggtggaagagggagataacgctgtgctgcagtgcctcaaggggacctcagatggccccactcagcagctgacctggtctcgggagtccccgcttaaacccttcttaaaactcagcctggggctgccaggcctgggaatccacatgaggcccctggccatctggcttttcatcttcaacgtctctcaacagatggggggcttctacctgtgccagccggggcccccctctgagaaggcctggcagcctggctggacagtcaatgtggagggcagcggggagctgttccggtggaatgtttcggacctaggtggcctgggctgtggcctgaagaacaggtcctcagagggccccagctccccttccgggaagctcatgagccccaagctgtatgtgtgggccaaagaccgccctgagatctgggagggagagcctccgtgtgtcccaccgagggacagcctgaaccagagcctcagccaggacctcaccatggcccctggctccacactctggctgtcctgtggggtaccccctgactctgtgtccaggggccccctctcctggacccatgtgcaccccaaggggcctaagtcattgctgagcctagagctgaaggacgatcgcccggccagagatatgtgggtaatggagacgggtctgttgttgccccgggccacagctcaagacgctggaaagtattattgtcaccgtggcaacctgaccatgtcattccacctggagatcactgctcggccagtactatggcactggctgctgaggactggtggctggaaggtctcagctgtgactttggcttatctgatcttctgcctgtgttcccttgtgggcattcttcatcttcaaagagccctggtcctgaggaggaaaagataa）。
【０２０４】
IL-10発現の確認
GM-CSFでマクロファージに分化誘導し、コントロール（gRNA非含有）またはIL-10 gRNAを含むVpx+LentiCRISPRv2ウイルスのウイルス粒子を1000個／細胞の濃度で感染させた。また、単球にも1000個／細胞の濃度でLPを感染させて、これと同時にGM-CSFで分化誘導した。６日間培養した後、それぞれから遺伝子組換えマクロファージ（GEM）を回収し、細胞数をそろえて再播種し（24ウェルプレートの１ウェルあたり100,000〜200,000個）、100ng/mL LPSおよび20ng/mL IFNγで４８時間刺激した。回収した馴化培地を希釈せずに使用して、Bio-Plex 200機器でバイオ・ラッド社のIL-10 BioPlex Proアッセイを行った。
【０２０５】
IL-10 Bioplexアッセイ
GM-CSFでマクロファージに分化誘導し、コントロール（gRNA非含有）またはIL-10 gRNAを含むVpx+LentiCRISPRv2ウイルスのウイルス粒子を1000個／細胞の濃度で感染させた。また、単球にも1000個／細胞の濃度でLPを感染させ、これと同時に分化誘導した。６日間培養した後、それぞれから遺伝子組換えマクロファージ（GEM）を回収し、細胞数をそろえて再播種し（24ウェルプレートの１ウェルあたり100,000〜200,000個）、100ng/mL LPSおよび20ng/mL IFNγで４８時間刺激した。回収した馴化培地を希釈せずに使用して、Bio-Plex 200機器でバイオ・ラッド社のIL-10 BioPlex Proアッセイを行った。
【０２０６】
sTGFβRII発現の確認
過去に報告されているHIV7.2骨格にTGFβBRIIコンストラクトおよびIL-21プラスミドをクローニングした。２４時間ごとにGEMの馴化培地を回収し、TGFβR duoset kit DY241（R&D）およびIL-21 Bioplex pro kit（バイオ・ラッド）を使用して可溶性TGFβ受容体の発現およびIL-21の発現をそれぞれ検出した。これらのアッセイでは、GM-CSFで分化誘導したマクロファージは、分化７日目に形質導入した。
【０２０７】
可溶性TGFβ受容体の発現を確認するため、GM-CSFでマクロファージに分化誘導し、６日目に１ウェルあたり700μLの培地を入れた12ウェルプレートに500,000個／ウェルの密度でマクロファージを播種した。７日目にsTGFβRIIをコードするレンチウイルスのウイルス粒子を250個／細胞または500個／細胞の濃度で感染させて形質導入を行った。２４時間馴化し、形質導入後２日目、５日目、１２日目および１５日目に培地を回収した。ヒトTGFβRII DuoSet ELISA（R&D）を使用して、分泌されたタンパク質を検出した。
【０２０８】
IL-21発現の確認
いくつかの実験において、IL-21の発現を確認するため、GM-CSFでマクロファージに分化誘導し、７日目にIL-21-T2A-CD19tをコードするレンチウイルスまたはCD19tコントロールベクターのウイルス粒子を250個／細胞の濃度で感染させて形質導入を行った。500,000個／mLの密度で細胞を２４時間馴化し、形質導入の７日後（分化１４日目）に培地を回収した。BioPlex Proアッセイ（バイオ・ラッド社）を使用して、IL-21の分泌を検出した。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、IL-21の発現を確認するため、単離した後にGM-CSFでマクロファージに分化誘導し、６日目に１ウェルあたり500μLのマクロファージ培地を入れた24ウェルプレートに200,000個／ウェルの密度でマクロファージを播種した。７日目にIL-21をコードするレンチウイルスのウイルス粒子を1000個／細胞の濃度で感染させて形質導入を行い、２４時間馴化し、形質導入の６日後（分化１３日目）に培地を回収した。BioPlex Proアッセイ（バイオ・ラッド社）を使用して、IL-21の分泌を検出した。
【０２１０】
epHIV7.2およびLentiCRISPRv2 Vpx+レンチウイルスの同時感染
GM-CSFでマクロファージに分化誘導し、epHIV7.2:CD19tコントロールベクター（配列番号１２）、CD19t-T2A-sTβRIIウイルスまたはIL-21-T2A-CD19tウイルスのウイルス粒子を250個／細胞の濃度で感染させ、これと同時に、lentiCRISPRv2:EGFRtコントロールベクター、PD-L1gRNA-EGFRtウイルスまたはIL-10gRNA-EGFRtウイルスのウイルス粒子を1000個／細胞の濃度で感染させた。各エピトープタグをフローサイトメトリーで検出することによって、ダブルポジティブ細胞の割合（％）を測定し、上記と同様にして各因子の分析を行った。
【０２１１】
LPS/IFNγによって誘導された因子の検出
リポ多糖／インターフェロン−γ（LPS/IFNγ）刺激によって誘導されたインターロイキン、サイトカイン、ケモカインおよび増殖因子の長期的な発現を測定するため、GM-CSFでマクロファージに分化誘導し、６日目に24ウェルプレートの１ウェルあたり200,000個のマクロファージを播種した。７日目に500μLの培地中でマクロファージを100ng/mL LPS、20ng/mL IFNγ、またはLPS+IFNγで１８時間刺激した。１８時間後（１日目）に馴化培地を回収し、サイトカインを添加していない新鮮培地で置換した。２４時間ごとに１０日間にわたって培地を回収した。Luminex Human 30-plexサイトカインキット（Life Tech）を使用してサイトカインの放出を検出した。
【０２１２】
動物研究
マウス研究はいずれもSeattle Children’s Research InstituteのIACUC（プロトコル#15181）の監督下で行なわれ、研究所の方針に従って動物の使用を最小限にするよう尽力した。悪液質、嗜眠、後肢麻痺などの腫瘍移植に伴う症状の発症が見られたり、マウスの体重が元の体重の80%に低下した場合には、マウスを安楽死させた。８週齢のNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）雄性マウスをJackson Laboratoryから購入した。ケタミン／キシラジンで麻酔したマウスを定位固定装置（Stoelting）に固定し、頭蓋を覆っている皮膚を0.5cm切開し、ブレグマから2mm外側、0.5mm前方にドリルで穴を空けて穿頭孔を作製した。野生型U87細胞またはGFP-ffluc発現U87細胞200,000個を、1μL／分の速度で、硬膜下2.5mmおよび2.25mmに、各部位につき1μLずつ、合計2μL注射した。縫合後、体液の補充のために乳酸リンゲル液をマウスに投与し、鎮痛薬としてブプレノルフィンを投与した。GEMを注射するための外科手術は、150,000個のGEMを３回に分けて硬膜下2.5mm、2.35mmおよび2.25mmに合計3μL注射したこと以外は、U87細胞の注射のための外科手術と同様に行った。GEMまたはffluc発現U87細胞の生物発光イメージングを週３回行った。イソフルランでマウスに麻酔をかけ、28.57mg/mLのD−ルシフェリン（パーキンエルマー）溶液150μLを腹腔内注射または首の付け根に皮下注射した。Xenogen IVIS Spectrum Imaging System（パーキンエルマー）およびLiving Image Software（パーキンエルマー）を使用して生物発光画像を撮影し、データを分析した。
【０２１３】
異種移植脳腫瘍におけるヒトCD45+細胞の免疫組織化学分析（IHC）
（上述した）既定の実験エンドポイントに達したマウスに4%イソフルランで深く麻酔をかけ、開胸し、心臓および血管を通してPBS15mLを灌流し、次いで10%中性緩衝ホルマリン（NBF）15mLを灌流させた。マウスの脳を摘出し、標準的なプロトコルを使用して、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した。腫瘍異種移植片内の注射されたGEMを特定するため、1:100に希釈した抗ヒトCD45抗体（クローンHI30、BioLegend）で脳切片を免疫染色し、Ventana Ultra自動プラットフォームでiVIEW DAB検出キットを用いて検出した。DS-Ri1カラーカメラと20×PlanApo対物レンズ（NA：0.75）を備えたニコンEclipse Ciで写真を撮影した。ニコンElementsソフトウェアを使用して、タイリング法でスキャンした画像を統合した。
【０２１４】
脳異種移植片からのヒト細胞の単離およびフローサイトメトリー
（上述した）既定の実験エンドポイントに達したマウスに4%イソフルランで深く麻酔をかけ、開胸し、心臓および血管を通してPBS15mLを灌流させた。脳および腫瘍を、これらを取り囲む正常組織を1mm残したまま切り出した。メーカーのプロトコルを使用して、ヒトTumor Dissociation Kit（ミルテニー）で脳腫瘍細胞を分散させ、Mouse Cellディプリーションキット（ミルテニー）でマウス細胞を除去した。上記と同様にして、ヒト細胞の単一細胞懸濁液を染色し、フローサイトメトリーで分析した。
【０２１５】
統計および再現性
特に記載がない限り、実験はいずれも様々なドナーから単離したマクロファージを使用して少なくとも３回行った。Prismソフトウェア（GraphPad）で結果を分析し、適切な検定（対応のあるｔ検定または分散分析）を行った。統計的有意差（p<0.05）はアスタリスクで示す。
【０２１６】
単球由来マクロファージはレンチウイルスにコードされた遺伝子を安定に発現することができる
近年、レンチウイルスを使用してT細胞に安定に形質導入し、これを用いてがん免疫療法を行うことは日常的に実施されている。しかしながら、骨髄系細胞に感染させるための標準的なシステムは存在しない。最近の研究では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）およびIL-4を使用して単球から分化誘導した樹状細胞（DC）や、GM-CSFのみを使用して分化誘導した炎症促進性マクロファージは、Vpxとともにパッケージングしたレンチウイルス粒子を使用することによって高効率に形質導入することができることが実証されている（Bobadilla S, Sunseri N, Landau NR. Efficient transduction of myeloid cells by an HIV-1-derived lentiviral vector that packages the Vpx accessory protein. Gene Ther 2013;20:514-520およびSunseri N, O'Brien M, Bhardwaj N et al. Human immunodeficiency virus type 1 modified to package Simian immunodeficiency virus Vpx efficiently infects macrophages and dendritic cells. J Virol 2011;85:6263-6274；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）。また、過去の研究では、DCの分化初期段階において高い感染多重度（MOI）でウイルスを感染させた場合、Vpxを使用することなく形質導入できることが報告されている（Breckpot K, Dullaers M, Bonehill A et al. Lentivirally transduced dendritic cells as a tool for cancer immunotherapy. J Gene Med 2003;5:654-667およびChinnasamy N, Chinnasamy D, Toso JF et al. Efficient gene transfer to human peripheral blood monocyte-derived dendritic cells using human immunodeficiency virus type 1-based lentiviral vectors. Hum Gene Ther 2000;11:1901-1909；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）。単球由来のマクロファージの形質導入にVpxが必要かどうかを決定するため、標準的なレンチウイルス製造プロトコルを使用して、現在臨床試験中（NCT01683279、NCT02311621）のレンチウイルス骨格であるepHIV7:GFP-fflucを、Vpxを含めてあるいはVpxを除いてパッケージングした。健常ドナーPBMCからCD14+細胞を単離し、GM-CSFおよびIL-4を使用してDCに分化誘導するか、あるいはGM-CSFのみを使用してマクロファージに分化誘導した。単離および分化開始の３日後に細胞をカウントし、Vpxを含めてあるいはVpxを除いてパッケージングしたGFP-fflucをコードするレンチウイルスとサイトカインとを含む新鮮培地に再播種した。Vpxを含まないウイルスに感染させた細胞は、ウイルスの侵入を促すため、100μg/mL硫酸プロタミンをさらに添加した。インビトロでの分化誘導を６日間行った後、フローサイトメトリーで細胞を分析した。MOI＝15で感染させたところ、100μg/mLの硫酸プロタミンを添加したDC25において、DCの20%およびマクロファージの60%が、レンチウイルスにコードされたGFPを発現したことが示された（図２８Ａおよび図２８Ｂ）。しかしながら、ウイルス用量を高くし、かつ硫酸プロタミンの濃度を高くすると、マクロファージの生存率が大幅に低下し、死細胞または死につつある細胞を染色する色素に陽性を示した細胞は30%を超えていた（図２８Ｂ）。このような影響はDCでは観察されなかった（図２８Ａ）。これに対して、Vpxを含めてパッケージングしたレンチウイルスでは、MOI＝1で３日目のマクロファージをほぼ100%感染させることができ、さらに生存率の低下も見られなかった。これらを踏まえ、Vpx+レンチウイルスについての研究を進めることにした。
【０２１７】
以下の実験では、様々なウイルスペイロードでGEMにおける発現を評価したが、従来のフローサイトメトリーを用いた力価測定によって標準化することができないウイルス用量であったため、ウイルス構成タンパク質p24の量に基づいてウイルス用量を標準化した。１ngのp24は1.25×107個のレンチウイルス粒子（LP）に相当する。導入遺伝子を確実に高発現させるために必要なVpx含有ウイルスの最小用量を決定するため、分化７日目に、マクロファージ１個あたりに感染させるレンチウイルス粒子の数（個／細胞）を様々に変えて、GM-CSFで分化誘導した炎症促進性マクロファージ（図２５Ａ、３つの独立した実験の代表データ）およびM-CSFで分化誘導した抗炎症性マクロファージ（図２９Ａ）それぞれに形質導入した。形質導入後、さらに７日間培養してからGFPの発現を評価した（図２５Ａ、図２９Ａ）。Vpx含有ビリオンを感染させたこれら２種の表現型は、いずれの試験用量でも同等の形質導入効率を示し、細胞１個あたり250個のLPという低濃度でほぼ100%の形質導入効率が得られることがわかった。特に重要な点として、GM-CSFで分化誘導した後に細胞１個あたり250個のLPを感染させても、生存率に有意な影響は見られなかった（図２５Ｃ）。Vpxを除いてパッケージングしたビリオンでは、最も高い試験濃度（LP1000個／細胞）においていずれの表現型でも形質導入効率が非常に低く、GM-CSFで分化誘導したマクロファージでは5.09%であり、M-CSFで分化誘導したマクロファージでは14.6%であった（図２５Ａ、図２９Ａ）。
【０２１８】
再発性疾患の患者を治療するにあたっての課題の１つとしては、成分分離血を得てから治療用自家細胞を送達するまでに時間がかかることが挙げられ、CAR T細胞製剤の場合、数日から数週間かかることがある（Kaiser AD, Assenmacher M, Schroder B et al. Towards a commercial process for the manufacture of genetically modified T cells for therapy. Cancer Gene Ther 2015;22:72-78；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。患者に投与するための単球由来の臨床用細胞製剤を開発するのにかかる時間とコストを削減できるかどうかを判断するため、CD14+単球を新鮮単離して、形質導入と分化誘導を同時に実施可能かどうかを試験した。GM-CSFまたはM-CSFによる選択および分化誘導（０日目）と同時に単球に形質導入を行うと、分化に次いで形質導入を行った場合と同様の割合で用量依存的にGFP+マクロファージが得られることがわかった（図２５Ｂ、図２９Ｂ）。しかしながら、この方法ではマクロファージの生存率が大きく影響を受けた。GM-CSFまたはM-CSFで分化誘導し、ウイルスを感染させなかった場合の収率は、最初のCD14+細胞数の約20〜30％であったが（図２５Ｅ）、分化誘導と同時に細胞１個あたり250個のLPを感染させた場合の収率は、GM-CSFで分化誘導したマクロファージにおいてさらに49.7％低下し、M-CSFで分化誘導したマクロファージにおいて67.4％低下した（図２５Ｄおよび図２９Ｃにそれぞれ示す）。
【０２１９】
ウイルスで形質導入した養子細胞療法の臨床開発を成功させるには、有効性と安全性のバランスが適切でなければならない。導入された遺伝子の発現量が高く、かつ形質導入効率が高ければ、宿主細胞のゲノムへのレンチウイルスの組み込み率も高くなることが多い。ベクターのコピー数が増加すれば、挿入突然変異が起こる可能性が高くなったり、導入遺伝子の合成による毒性が高くなるため、組み込み率を制御することは重要である。細胞１個あたりのレンチウイルスのコピー数を測定するため、分化０日目または７日間分化誘導した後に、GFP-fflucをコードするVpx含有レンチウイルスで形質導入したマクロファージからゲノムDNAを単離した。代表的な実験において、250個／細胞の濃度のLPで形質導入した場合、マクロファージ１個あたりのレンチウイルスのコピー数は３４コピーであり、100個／細胞の濃度のLPで形質導入した場合のマクロファージ１個あたりのレンチウイルスのコピー数は２２コピーであった（図３０Ａ）。これに対して、250個／細胞の濃度のLPで形質導入した場合、単球１個あたりのレンチウイルスのコピー数は１８コピーであり、100個／細胞の濃度のLPで形質導入した場合の単球１個あたりのレンチウイルスのコピー数は１０コピーであった（図３０Ｂ）。
【０２２０】
単球由来マクロファージはレンチウイルスにコードされた遺伝子を安定に発現することができる
過去の研究では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）およびIL-4を使用して単球から分化誘導した樹状細胞、またはGM-CSFのみを使用して分化誘導した炎症促進性マクロファージは、Vpxとともにパッケージングしたレンチウイルス粒子を使用することによって、高効率に形質導入することができることが実証されている。このシステムが、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）を使用して単球から分化させた抗炎症性集団に適用可能であるかどうかを決定するため、標準的なレンチウイルス製造プロトコルを使用して、現在臨床試験中（NCT01683279、NCT02311621）のレンチウイルス骨格であるepHIV7:GFP-fflucを、Vpxとともにパッケージングした。GM-CSFまたはM-CSFの存在下で７日間培養して単球由来マクロファージを得た後、マクロファージ１個あたりに感染させるレンチウイルス粒子（LP）の数を様々に変えて形質導入を行い、形質導入後さらに７日間培養してからGFPの発現を評価した（図１３Ａ、図１３Ｂ）。Vpx含有ビリオンを感染させたこれら２種の表現型は、いずれの試験用量でも同等の形質導入効率を示し、細胞１個あたり250個のLPという低濃度でほぼ100%の形質導入効率を示すことがわかった。これに対して、Vpxを除いてパッケージングしたビリオンは、細胞１個あたり1000個のLPを感染させた場合であっても、いずれの表現型でも形質導入効率が非常に低く、GM-CSFで分化誘導したマクロファージでは5.09%であり、M-CSFで分化誘導したマクロファージでは14.6%であった。
【０２２１】
再発性疾患の患者を治療するにあたっての課題の１つとしては、成分分離血を得てから治療用自家細胞を送達するまでに時間がかかることが挙げられ、CAR T細胞製剤の場合、数日から数週間かかることがある。患者に投与するための臨床製剤を開発するのにかかる時間とコストを削減できるかどうかを判断するため、新鮮単離したCD14+単球の感染と分化誘導を同時に実施可能かどうか検討した。０日目の選択およびGM-CSFまたはM-CSFによる分化誘導と同時に単球の形質導入を行うと、分化に次いで感染を行った場合と同様の割合で用量依存的にGFP+マクロファージが得られることがわかった（図１３Ｃおよび図１４）。
【０２２２】
GEMは骨髄系細胞表面マーカーを発現し、LPS/IFNγ刺激に応答する
この一連の実験では、ウイルスによる感染が、単球から炎症促進性または抗炎症性のマクロファージへの分化に影響を及ぼすかどうかを確認した。GM-CSFで分化誘導したGEM（図１３Ａ）およびM-CSFで分化誘導したGEM（図１３Ｂ）の表現型を調べるため、赤色蛍光タンパク質mCherryをコードするepHIV7.2レンチウイルスのウイルス粒子を250個／細胞のウイルス濃度で単球に感染させて形質導入を行い、これと同時にGM-CSFまたはM-CSFで単球を分化させた。７日後にGEMにおけるmCherryの発現をフローサイトメトリーで分析したところ、分化条件に関係なく100%陽性であった（図１５Ａ）。さらに、一般的な骨髄系マーカーの表面発現を調べるため、フローサイトメトリーでGEMを分析した。骨髄系マーカーとして、CD163（スカベンジャー受容体）、HLA-DR（取り込まれた抗原をT細胞に提示する受容体）、CD80（T細胞に共刺激シグナルを伝える分子）、PD-L1（T細胞を抑制するタンパク質）、CD11b（細胞接着を担うインテグリン）、およびCD16（Fc受容体）（図１５Ｂ〜Ｇ）；ならびにCD80（T細胞に共刺激シグナルを送達する分子）、主要組織適合遺伝子複合体II（HLADR）（取り込まれた抗原をT細胞に提示する分子）、PD-L1（免疫抑制タンパク質）、およびCD163（スカベンジャー受容体）（図２２Ｃ、図２３Ａ〜２３Ｆ）を使用した。予想されたとおり、抗炎症性マクロファージの古典的マーカーCD163を発現したマクロファージの割合は、GM-CSFマクロファージよりもM-CSFマクロファージの方が高かった（90%対5%）（図１５Ｂ）。特に重要な点として、過去の報告と一致して、抗原提示の増強に関連するタンパク質であるHLA-DRおよびCD80、ならびにPD-L1がGEMにおいてアップレギュレートされたことが示されたことから（図１５Ｃ〜Ｅ）、強力なtoll様受容体4（TLR4）アゴニストであるLPSと炎症促進性サイトカインであるIFNγによる刺激に対してGEMが応答性を示すことがわかった。Vpx含有ウイルスで形質導入を行っても、前記マーカーの多くにおいて発現に大きな影響は見られず、特にCD16はいずれの処理でも発現に影響は見られなかった（図１５Ｇ）。しかし、興味深いことに、M-CSFで分化誘導したGEMにウイルスで形質導入を行った場合、CD11bの発現が60%低下し（図１５Ｆ）、GM-CSFで分化誘導したGEMに刺激を与えなかった場合は、CD80の発現が３倍に上昇したことがわかった（図１５Ｄ）。CD80の発現上昇による抗原提示への影響は、近いうちに調査がなされるであろう。TLR4シグナル伝達のためのEF1α-Her2tGタンパク質は、配列番号２６に示される配列によってコードされる（GGCATTGANNGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGGGCTAGCATGTTGCTCCTCGTAACCTCCCTTTTGTTGTGTGAGCTCCCTCACCCAGCTTTTCTGCTGATCCCGTGCCACCCTGAGTGTCAACCACAGAATGGTAGCGTTACCTGCTTTGGGCCTGAAGCTGATCAGTGCGTTGCATGTGCTCACTATAAGGATCCGCCATTTTGCGTGGCGCGGTGCCCTTCGGGCGTGAAACCTGATCTAAGCTATATGCCGATCTGGAAGTTTCCCGATGAGGAGGGGGCTTGCCAGCCATGTCCCATCAATTGTACACATAGCTGCGTCGACTTAGATGACAAGGGGTGCCCGGCGGAACAACGCGCCTCGCCCCTTACTGGAGGCGGATCGGGAGGCGGCTCAATAATATCAGCGGTAGTTGGTATACTGCTGGTGGTGGTTCTCGGAGTAGTATTTGGGATATTGATAGGCGGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGGATGTGCCGAGCCATCTCTCTTANGCGCTTGCTGCTGCTGCTGCTGCAGCTGTCACAACTCCTAGCTGTCACTCAAGGGAAGACGCTGGTGCTGGGGAAGGAAGGGGAATCAGCAGAACTGCCCTGCGAGAGTTCCCAGAAGAAGATCACAGTCTTCACCTGNAAGTTCTCTGACCAGANGAAGATTCTGGGGCAGCATGGNAAAGTGTATTAATTAGAGGAGGTTCGCCTTCGCAGTTTGATCGTTTTGATTCCAAAAAAGGGCATGGGANNAAAGGATCGTTTCCNNTCATCATCAATAAACTTNAGATGGAAGANTCTCAGACTTANNNNNTGTGAGCTG）。
【０２２３】
TLR3やTLR7などのパターン認識受容体はウイルスRNAを認識し、これに応答してサイトカインおよびケモカインをアップレギュレートすることによって免疫応答を惹起する（Xagorari A, Chlichlia K. Toll-like receptors and viruses: induction of innate antiviral immune responses. Open Microbiol J 2008;2:49-59；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。このことから、ウイルス感染によってGEMが古典的炎症促進性サイトカインを分泌したかどうかを調査することにした。これを評価するため、０日目の単球に、mCherry Vpx+レンチウイルスのウイルス粒子を単球１個あたり0個または250個感染させ、GM-CSFで分化誘導した。形質導入の２４時間後および７日後に培地を回収し、腫瘍壊死因子α（TNFα）、IL-12およびＩ型インターフェロンのLuminex分析を行った（図３１）。分析したこれら３種のサイトカインはいずれもアッセイの検出限界未満を示した。このことから、レンチウイルスによる形質導入によって炎症促進性サイトカインの分泌は誘導されないことが示唆された。
【０２２４】
遺伝子組換えマクロファージはマウス神経膠腫モデルにおいて生存を維持する
本研究は、初代ヒト単球から分化誘導したマクロファージをレンチウイルスで遺伝子組換えし、この遺伝子組換えマクロファージを使用した養子移入療法の治療有効性を評価した初めての試験である。炎症促進性マクロファージの抗腫瘍効果は、マウスを用いたいくつかの研究で実証されており、これらの研究では、TLRアゴニストを局所投与または全身投与することによって、腫瘍関連マクロファージ（TAM）の腫瘍支持プログラムを逆転させ、免疫監視を回復させることに成功している。炎症促進性マクロファージの抗腫瘍効果は、マウスを用いたいくつかの研究で実証されており、これらの研究では、TLRアゴニストを局所投与または全身投与することによって、腫瘍関連マクロファージ（TAM）の腫瘍支持プログラムを逆転させ、免疫監視を回復させることに成功している（Peng J, Tsang JY, Li D et al. Inhibition of TGF-beta signaling in combination with TLR7 ligation re-programs a tumoricidal phenotype in tumor-associated macrophages. Cancer Lett 2013;331:239-249; Huang Z, Gan J, Long Z et al. Targeted delivery of let-7b to reprogramme tumor-associated macrophages and tumor infiltrating dendritic cells for tumor rejection. Biomaterials 2016;90:72-84; Chang LS, Leng CH, Yeh YC et al. Toll-like receptor 9 agonist enhances anti-tumor immunity and inhibits tumor-associated immunosuppressive cells numbers in a mouse cervical cancer model following recombinant lipoprotein therapy. Mol Cancer 2014;13:60; Yu Q, Nie SP, Wang JQ et al. Toll-like receptor 4 mediates the antitumor host response induced by Ganoderma atrum polysaccharide. J Agric Food Chem 2015;63:517-525；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）。理想的なGEMとは、古典的なLPS/IFNγによる活性化によって誘導される因子（IL-12など）を持続的に放出し、かつ自然免疫系および獲得免疫系の両方を刺激するように遺伝子組換えされたものである（図１８Ａ〜１８ＣＣを参照されたい）（Hao NB, Lu MH, Fan YH et al. Macrophages in tumor microenvironments and the progression of tumors. Clin Dev Immunol 2012;2012:948098；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。GM-CSFで分化誘導したGEMがLPS/IFNγに対して応答性を示すことが実証されたことから、活性化マクロファージを、脳に直接注入される治療用細胞製剤として使用することが可能かどうかを試験することにした。具体的には、刺激したGEMまたは刺激しなかったGEMが、TMEにおいて生存可能であるかどうか、疾患に効果を及ぼすかどうか、腫瘍の増殖を促進するかどうかを評価することにした。他の免疫細胞の作用を混乱させることなくGEMの挙動を直接評価するため、細胞免疫療法の前臨床評価に使用されることが多い頭蓋内神経膠腫異種移植モデルを利用して、Ｔリンパ球およびＢリンパ球を欠損したNOD SCID-γ（NSG）マウスにおけるGEMを評価した（Miao H, Choi BD, Suryadevara CM et al. EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor T cells migrate to and kill tumor deposits infiltrating the brain parenchyma in an invasive xenograft model of glioblastoma. PLoS One 2014;9:e94281; Kahlon KS, Brown C, Cooper LJ et al. Specific recognition and killing of glioblastoma multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells. Cancer Res 2004;64:9160-9166; Krenciute G, Krebs S, Torres D et al. Characterization and Functional Analysis of scFv-based Chimeric Antigen Receptors to Redirect T Cells to IL13Ralpha2-positive Glioma. Mol Ther 2016;24:354-363; Shiina S, Ohno M, Ohka F et al. CAR T Cells Targeting Podoplanin Reduce Orthotopic Glioblastomas in Mouse Brains. Cancer Immunol Res 2016;4:259-268; KK, Naik S, Kakarla S et al. T cells redirected to EphA2 for the immunotherapy of glioblastoma. Mol Ther 2013;21:629-637; Hegde M, Corder A, Chow KK et al. Combinational targeting offsets antigen escape and enhances effector functions of adoptively transferred T cells in glioblastoma. Mol Ther 2013;21:2087-2101；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）。これらの実験では、200,000個のU87細胞を頭蓋内注射し、６日間または７日間かけて腫瘍を樹立させた（図１６Ａ、図１７Ａ）。最初の実験では、新鮮単離した単球にepHIV7:GFP-fflucをコードするレンチウイルスのウイルス粒子を250個／細胞の濃度で形質導入し、６日間かけてGM-CSFで炎症促進性の表現型に分化誘導した（図１６Ａ）。分化および形質導入を行った５日目に、GEMの半数をLPS/IFNγで１８時間刺激した。150,000個の刺激したGEMまたは刺激しなかったGEMを樹立腫瘍に注入し、生物発光を週３回測定した。
【０２２５】
GEMの移植後にイメージングデータを取得したところ、GM-CSFで分化誘導したGEM、およびGM-CSFで分化誘導した後LPS/IFNγで刺激したGEMはいずれも、マウスの寿命を通してルシフェリンシグナルを安定に発現することがわかった（図１６Ｂおよび図１６Ｃ）。特に重要な点として、GEMはマウスの生存に有害な影響を及ぼさず、生存率は群間で有意差はなく（図１６Ｄ、図１７Ｄ）、マウスが苦痛を感じているような外的徴候も示されなかったことから、LPS/IFNγで刺激を与えたGEMであっても忍容性が高いことが示唆された。また、GEMは、ffluc発現U87腫瘍の増殖を増強せず（図１７Ｂ、図１７Ｃ）、細胞数の少ない細胞集団であるにもかかわらず、腫瘍組織を酵素処理で分散させることによって回収することができる（図２０）。さらに、細胞数の少ない細胞集団であるにもかかわらず、ヒトCD45を免疫染色することによって腫瘤内のGEMを検出することができ（図１７Ｅ〜図１７Ｇ）、腫瘍組織を酵素処理で分散させることによって回収することができる（図２０）。これらのデータを考え合わせると、GEMはインビボにおいて導入遺伝子を長期発現することができ、腫瘍増殖を促進せず、腫瘍担持動物の生存率を低下させることもないことが示唆された。このGEMは活性化シグナルを構成的に発現するものであるが、このGEMが内在性の抗腫瘍応答を補助するかどうか、あるいはこのGEMが他の免疫細胞と相互作用する際に安全性の懸念が生じるかどうかは、近いうちに実験的に評価がなされるであろう。
【０２２６】
イメージングデータから、強力なTLR4アゴニストであるLPSと炎症促進性サイトカインであるIFNγによる刺激とは関係なく、GM-CSFで分化誘導したGEMがマウスの寿命を通してルシフェリンシグナルを安定に発現することがわかった（図１６Ａ、図１６Ｂ）。図示したように、GEMはマウスの生存率に悪影響を与えることはない（図１６Ｃおよび図１７Ｃ）。さらに、GEMは、ffluc発現U87腫瘍の増殖を増強しない（図１７Ａ、図１７Ｂ）。これらのデータから、GEMはインビボにおいて導入遺伝子を長期発現することができ、腫瘍増殖を促進せず、腫瘍担持動物の生存率を低下させることもないことが示唆された。
【０２２７】
TMEの免疫抑制作用を打ち消すようにGEMを遺伝子操作することができる
頭蓋内神経膠腫モデルは不完全な免疫系しか持たない動物モデルであり、上記GEMは抗腫瘍因子を産生しないことから、腫瘍担持動物の腫瘍増殖や全生存期間に影響が見られるとは予想していなかった。一方、IFNγおよび／またはLPSで刺激したマクロファージを評価することを目的として1990年代から実施されたヒト臨床試験では、LPS/IFNγで刺激することによって抗体依存性細胞傷害（ADCC）を高め、かつIFNγで１８時間刺激することによってインビトロでの腫瘍壊死因子（TNF）の分泌を増加させたにもかかわらず、マクロファージに有効性が見られなかったことが示されている（Andreesen，1998）。このような評価条件においてマクロファージが生存期間を延長できなかった原因としては、腫瘍細胞によってマクロファージが腫瘍促進性の表現型すなわち抗炎症性の表現型に転換されたこと、他の細胞傷害性免疫細胞が存在しないか、あるいは無能力化されていること、またはインビトロ実験で観察されたように（図１８Ａ〜図１８ＣＣ）、LPS/IFNγによって誘導される炎症性シグナルが持続しないことが一因として考えられる。実際、LPSのような強力なTLR4アゴニストを使用すると、IL-10の分泌（図１８Ｊ）などの抗炎症応答や、PD-L1の表面発現の上昇（図１５Ｂ）が意図せずに起こる可能性がある。IL-10の分泌およびPD-L1の表面発現の上昇は、腫瘍に対して効果的な免疫応答を抑制することが知られている（参考文献を参照されたい）。したがって、腫瘍による抗炎症表現型への分極化に抵抗性を示すことができるGEMを製造すると同時に、細胞傷害性免疫細胞の有効性を向上させることを目的として以下の実験を行った。
【０２２８】
腫瘍免疫回避に寄与するTAM関連因子の発現をGEMにおいて抑制することが可能であることが実証された。IL-10およびPD-L1は、効果的な抗腫瘍応答が抑制される腫瘍微小環境において腫瘍関連マクロファージから発現される因子であることから、CRISPR/Cas9システムを使用して欠失させる遺伝子としてIL-10遺伝子およびPD-L1遺伝子を選択した（Sica, Antonio, et al. Autocrine production of IL-10 mediates defective IL-12 production and NF-kappa B activation in tumor-associated macrophages. J Immunol. 2000 Jan 15; 164(2):762-7; Bloch et al., Gliomas promote immunosuppression through induction of B7-H1 expression in tumor-associated macrophages; Clin Cancer Res. 2013 Jun 15;19(12):3165-75；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【０２２９】
Cas9および特異的ガイドRNAをコードするレンチウイルスベクター（Sanjana Nat，2014に記載の方法）を使用して、IL-10座位およびPD-L1座位にゲノム破壊を導入した（図１９Ａおよび図１９Ｄ）。単球またはGM-CSFで分化誘導したマクロファージにこれらのゲノム破壊を導入したところ、LPS/IFNγの誘導によるIL-10の分泌（図１９Ａ、図１９Ｂおよび図１９Ｃ）およびPD-L1の表面発現（図１９Ｄ、図１９Ｅおよび図１９Ｆ）が低下した。
【０２３０】
さらに、TMEの免疫抑制環境に抵抗してこれを逆転させ、かつ無能力化された細胞傷害性免疫細胞の活性化、増殖および／または生存を支援するようにGEMをプログラムすることができる。たとえば、腫瘍増殖因子β（TGFβ）は、細胞傷害性免疫応答を様々な方法で阻害する腫瘍由来因子として過去に多くの報告がなされている。本研究では、TGFβのシグナル伝達およびSMADの活性を抑制するデコイ受容体として機能する可溶性TGFβ受容体II（sTGFβRII）を分泌するようにGEMを遺伝子組換えできることが実証されている（図１９Ｇおよび図１９Ｉ）。さらに、NK細胞およびT細胞を活性化するとともにADCCを補助するサイトカイン（IL-21（25961061）など）を分泌させることを目的としてGEMを利用することもできる（図１９Ｈ）。IL-21は、現在、がんの単独療法として、または治療用抗体との併用療法として、複数の臨床試験で評価されているシグナル伝達分子である。IL-21は、主にCD4ヘルパーT細胞によって産生される分子であり、T細胞やナチュラルキラー細胞などの細胞傷害性リンパ球に強力な増殖シグナルおよび活性化シグナルを送達する。実験データから、高濃度のIL-21を発現してこれを分泌するようにマクロファージを遺伝子組換えすることができることが示され、このことから、細胞傷害性免疫細胞の機能低下がGEMによって回復できる可能性が示唆された。以上のデータから、GEMを遺伝子操作することによって、抗炎症性タンパク質の発現を低下させたり、あるいは免疫抑制タンパク質のシグナル伝達を妨害する可溶性因子または炎症促進性タンパク質の産生を促進する可溶性因子を産生させることができることが実証された。本発明のGEMの実施形態のいくつかにおいて、本発明のGEMは、本明細書に記載の実施形態によるレンチウイルスベクターで形質導入していない場合のタンパク質の発現量と比較して、抗炎症性タンパク質の発現が低減されていたり、あるいは免疫抑制タンパク質のシグナル伝達を妨害する可溶性因子または炎症促進性タンパク質の産生を促進する可溶性因子をより多く産生することができる。いくつかの実施形態において、発現されるタンパク質または発現が低減される抗炎症性タンパク質はIL-21である。本発明の実施形態のいくつかにおいて、本発明の遺伝子組換えGEMは、抗炎症性タンパク質の発現が低減されていたり、あるいは免疫抑制タンパク質のシグナル伝達を妨害する可溶性因子または炎症促進性タンパク質の産生を促進する可溶性因子を野生型の免疫細胞よりも高い発現量で産生することができる。
【０２３１】
CRISPRを利用したTAM関連免疫抑制遺伝子のGEMにおける標的化
頭蓋内膠芽腫モデルは不完全な免疫系しか持たず、GEMが機能性ペイロードを持っていないか、あるいは検出可能な量の炎症性サイトカインを発現しないことから（図３１Ａ〜図３１Ｃ）、異種移植片を移植した動物の腫瘍増殖や全生存期間に影響が見られるとは予想していなかった。一方、エクスビボにおいてIFNγおよび／またはLPSで刺激されたマクロファージを固形腫瘍患者の治療に使用することを目的として評価が行われた1980年代および1990年代のヒト臨床試験でも、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を誘導し、かつIFNγで１８時間刺激することによってインビトロにおける腫瘍壊死因子α（TNFα）の分泌を増加させたにもかかわらず、生存期間は延長されなかったことが示されている（Andreesen R, Hennemann B, Krause SW. Adoptive immunotherapy of cancer using monocyte-derived macrophages: rationale, current status, and perspectives. J Leukoc Biol 1998;64:419-426；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。完全な免疫系を利用したこのような条件においてマクロファージが生存期間を延長できなかった原因としては、１）腫瘍細胞によってマクロファージが腫瘍促進性の表現型すなわち抗炎症性の表現型に転換されたこと、２）他の細胞傷害性免疫細胞が存在しないか、あるいは無能力化されていること、または３）１８時間刺激した後にインビトロで観察されたように（図１９）、LPS/IFNγによって誘導される炎症性サイトカインの放出が持続しないことが考えられる。実際、LPSのような強力なTLR4アゴニストを使用すると、IL-10の持続的な分泌（図１９）などの抗炎症応答や、PD-L1の表面発現の上昇（図１５Ｅ）が意図せずに起こる可能性がある。IL-10およびPD-L1は、腫瘍から分泌されるシグナルの誘導によってTAMに発現される因子としても知られている（Bloch O, Crane CA, Kaur R et al. Gliomas promote immunosuppression through induction of B7-H1 expression in tumor-associated macrophages. Clin Cancer Res 2013;19:3165-3175；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。これらを踏まえて、CRISPR/Cas9を利用して遺伝子を編集することによって、免疫回避に寄与するこれらの因子のGEMにおける発現を防ぐことが試みられた（Sanjana NE, Shalem O, Zhang F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods 2014;11:783-784; Shalem O, Sanjana NE, Hartenian E et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science 2014;343:84-87；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）。Cas9および特異的ガイドRNA19をコードするレンチウイルスベクターを使用して、IL-10およびPD-L1のゲノム座位を破壊した。これらのゲノム領域を増幅し、再アニーリングし、ミスマッチ塩基対を切断するSurveyorエンドヌクレアーゼとインキュベートしたところ、分解産物が生成されたことから、IL-10座位およびPD-L1座位が破壊されたことが示された（図１９Ａ、図１９Ｄおよび図２４ＡならびにBarrows）（Qiu P, Shandilya H, D'Alessio JM et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques 2004;36:702-707；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。単球またはGM-CSFで分化誘導したマクロファージにIL-10のゲノム破壊を導入したところ、IL-10座位を破壊したことによって、LPS/IFNγで誘導したIL-10の分泌が60%低下した（図２６Ｂおよび図２６Ｃ）。また、GM-CSFで分化誘導したマクロファージに、Cas9およびPD-L1��イドRNAをコードするウイルスを感染させると、LPS/IFNγ刺激で誘導したPD-L1の表面発現が40%低下した（図２６Ｂおよび図２６Ｃ）。この結果は、CRISPRシステムを利用した場合、１つのアレルのみしか組換えが起こらないことがしばしばあるという他の研究者らによる知見と一致している（Ran FA, Hsu PD, Wright J et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc 2013;8:2281-2308; McComb S, Aguade-Gorgorio J, Harder L et al. Activation of concurrent apoptosis and necroptosis by SMAC mimetics for the treatment of refractory and relapsed ALL. Sci Transl Med 2016;8:339ra370；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【０２３２】
GEMによる抗炎症因子遮断物質または活性化作用を有するサイトカインの分泌
TMEの免疫抑制環境に抵抗性を示し、かつ細胞傷害性抗腫瘍免疫細胞の活性化、増殖および生存を支援するようにGEMをプログラムすることができるどうかを評価した。たとえば、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）は、細胞傷害性免疫応答を様々な方法で阻害する腫瘍由来因子として過去に多くの報告がなされている（Crane CA, Han SJ, Barry JJ et al. TGF-beta downregulates the activating receptor NKG2D on NK cells and CD8+ T cells in glioma patients. Neuro Oncol 2010;12:7-13; Smyth MJ, Strobl SL, Young HA et al. Regulation of lymphokine-activated killer activity and pore-forming protein gene expression in human peripheral blood CD8+ T lymphocytes. Inhibition by transforming growth factor-beta. J Immunol 1991;146:3289-3297; Bright JJ, Sriram S. TGF-beta inhibits IL-12-induced activation of Jak-STAT pathway in T lymphocytes. J Immunol 1998;161:1772-1777; Peng Y, Laouar Y, Li MO et al. TGF-beta regulates in vivo expansion of Foxp3-expressing CD4+CD25+ regulatory T cells responsible for protection against diabetes. Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101:4572-4577; Gorelik L, Flavell RA. Immune-mediated eradication of tumors through the blockade of transforming growth factor-beta signaling in T cells. Nat Med 2001;7:1118-1122；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）。過去に報告されているように、可溶性TGFβ受容体II（sTGFβRII）を分泌するようにGEMを遺伝子組換えすることができ（図１９Ｇおよび図２６Ｄ）、こうして分泌されたsTGFβRIIは、TGFβのデコイ受容体として機能し、TGFβのシグナル伝達を低下させることができることが実証された（Rowland-Goldsmith MA, Maruyama H, Kusama T et al. Soluble type II transforming growth factor-beta (TGF-beta) receptor inhibits TGF-beta signaling in COLO-357 pancreatic cancer cells in vitro and attenuates tumor formation. Clin Cancer Res 2001;7:2931-2940；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。さらに、GEMは、通常はCD4+T細胞によって発現されるサイトカインであるIL-21を分泌するように遺伝子組換えすることができ（図１９Ｈおよび図２６Ｅ）、こうして分泌されたIL-21は、NK細胞およびT細胞を活性化させるとともにADCCを補助し44、TAMをM1表現型へと分極化させる（Qiu P, Shandilya H, D'Alessio JM et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques 2004;36:702-707; Croce M, Rigo V, Ferrini S. IL-21: a pleiotropic cytokine with potential applications in oncology. J Immunol Res 2015;2015:696578; Skak K, Frederiksen KS, Lundsgaard D. Interleukin-21 activates human natural killer cells and modulates their surface receptor expression. Immunology 2008;123:575-583; Xu M, Liu M, Du X et al. Intratumoral Delivery of IL-21 Overcomes Anti-Her2/Neu Resistance through Shifting Tumor-Associated Macrophages from M2 to M1 Phenotype. J Immunol 2015;194:4997-5006；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）。組換えIL-21は、がんの単独療法として、またはチロシンキナーゼ阻害薬または治療用抗体との併用療法として、現在複数の臨床試験で評価されている（Croce M, Rigo V, Ferrini S. IL-21: a pleiotropic cytokine with potential applications in oncology. J Immunol Res 2015;2015:696578; Spolski R, Leonard WJ. Interleukin-21: a double-edged sword with therapeutic potential. Nat Rev Drug Discov 2014;13:379-395；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）。実験結果から、高濃度のIL-21を分泌するようにマクロファージを遺伝子組換えすることができることが示され、このことから、IL-21発現GEMによって細胞傷害性免疫細胞の機能低下を回復できることが実証された。以上のデータから、GEMを遺伝子操作することによって、GEMにおける抗炎症性タンパク質の発現量を低下させたり、あるいは免疫抑制シグナル伝達を妨害する可溶性因子または抗腫瘍免疫応答を促進する可溶性因子をGEMに産生させることができることが実証された。
【０２３３】
GEMは複数のウイルスに由来する遺伝子を発現することができる
TMEの免疫抑制環境によって生じる様々な課題を克服するため、CRISPRを利用した遺伝子破壊によって腫瘍微小環境に抵抗性を示し、かつsTβRIIおよびIL-21を分泌するマクロファージの遺伝子組換え技術による製造を試みた。このようなマクロファージを製造するため、末端切断型CD19配列（CD19t）をepHIV7.2ベクターに挿入し（図２４Ｃ）、lentiCRISPRv2ベクターのピューロマイシン配列をエピトープタグEGFRtと置換した（図２４Ｄ）。CD19tエピトープタグおよびEGFRtエピトープタグはいずれも、各配列をコードするレンチウイルスに感染させたマクロファージにおいて検出可能であることが確認された（図２４Ｅおよび図２４Ｆ）。これら２種のウイルスを同時にGEMに感染させ、フローサイトメトリーで分析したところ、30〜45％の細胞が二重陽性を示した（図２７Ａおよび図２７Ｅ）。さらに、CD19tおよびEGFRtの両方を発現する細胞においてPD-L1の発現を評価したところ、PD-L1の発現が70％低下し（図２７Ｃ）、また、sTβRIIは低減されることなく発現された（図２７Ｄ）。興味深いことに、IL-21を発現させたことによって、LPSで誘導されたIL-10の発現が抑制されたと見られる。IL-21をコードするGEM単独では、IL-10の発現が76.4%低下し、IL-21の発現とIL-10gRNAとを組み合わせた場合では、IL-10の発現が87.3%低下する。これらのIL-10の発現は、IL-10gRNA+CD19tコントロールベクターと比べて有意に低く、38.5%低かった（図２７Ｆ）。IL-10の発現を標的化しても、IL-21の発現はその影響を受けなかった（図２７Ｇ）。
【０２３４】
注射部位から遊走したヒトGEMは腫瘍組織に浸潤する
単離したCD14+単球は、250,000個／cm2の密度を超えないように、10ng/mLのGM-CSF（R&Dシステムズ）の存在下において組織培養処理プラスチックディッシュ（コーニング）中のマクロファージ培地（10%FBS（Hyclone）を添加したRPMI1640培地（Gibco））に37℃、5%CO2で播種した。播種の７２時間後、培地の半量を、20ng/mLのGM-CSFを添加した新鮮なマクロファージ培地と交換した。epHIV7において、pHIV7のCMVプロモーターをEF1プロモーターと置換した。epHIV7.2は、EF1プロモーターを最小EF1プロモーター（HTLV-1ドメインを持たない）と置換し、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子と置換した。mCherryコンストラクトは、クローニングによってmCherry遺伝子をHIV7.2に挿入することによって作製した。８週齢のNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）雄性マウスをJackson Laboratoryから購入した。ケタミン／キシラジンで麻酔したマウスを定位固定装置（Stoelting）に固定し、頭蓋を覆っている皮膚を0.5cm切開し、ブレグマから2mm外側、0.5mm前方にドリルで穴を空けて穿頭孔を作製した。野生型U87細胞またはGFP-ffluc発現U87細胞200,000個を、1μL／分の速度で、硬膜下2.5mmおよび2.25mmに、各部位につき1μLずつ、合計2μL注射した。縫合後、体液の補充のために乳酸リンゲル液をマウスに投与し、鎮痛薬としてブプレノルフィンを投与した。GEMを注射するための外科手術は、150,000個のGEMを３回に分けて硬膜下2.5mm、2.35mmおよび2.25mmに合計3μL注射したこと以外は、U87細胞の注射のための外科手術と同様に行った。GEMまたはffluc発現U87細胞の生物発光イメージングを週３回行った。イソフルランでマウスに麻酔をかけ、28.57mg/mLのD-ルシフェリン（パーキンエルマー）溶液150μLを腹腔内注射または首の付け根に皮下注射した。Xenogen IVIS Spectrum Imaging System（パーキンエルマー）およびLiving Image Software（パーキンエルマー）を使用して生物発光画像を撮影し、データを分析した。GEMの注射の２１日後にマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出し、腫瘍細胞を分散させた。単一細胞懸濁液をCD45染色し、フローサイトメトリーによって、生細胞およびシングレットをゲーティングし、mCherryの発現およびCD45の発現を評価した。図２１Ａおよび図２１Ｂを参照されたい。
【０２３５】
本研究では、レンチウイルスを利用して初代ヒト単球およびマクロファージの遺伝子組換えを行う方法の検証を行っており、固形腫瘍のための新規免疫療法を開発することを最終目的としている。過去の研究では、500,000個の細胞あたり600ngのp24を使用してDCに形質導入すると80％の感染率が得られることが報告されている（Firat H, Zennou V, Garcia-Pons F et al. Use of a lentiviral flap vector for induction of CTL immunity against melanoma. Perspectives for immunotherapy. J Gene Med 2002;4:38-45；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。上述したように、Vpxとともにパッケージングしたレンチウイルス粒子を250個／細胞の濃度で感染させると、ほぼ100％の効率で感染させることができ、これは、500,000個の細胞あたり10ngのp24を使用したことに相当し、ウイルスの使用量は60分の1になっている。この方法で観察されるゲノム組込み事象の数は、臨床で使用されている遺伝子組換えT細胞で観察されるものよりも多い。それにもかかわらず、本発明のGEMは、インビボ研究で観察されるような分裂を起こさず、GEM自体が増殖することがないため、挿入突然変異によって臨床製剤の安全性が損なわれるとは考えにくい。さらに、生体機能が影響を受けることが判明した場合や、挿入率が米国食品医薬品局（FDA）の規制を超えることが判明した場合は、中央部分の遺伝子発現領域を選定することによってベクターのコピー数を減少させることができる。
【０２３６】
本発明の方法は柔軟性を備えた方法であることから、CRISPRを利用した遺伝子破壊によって、免疫抑制因子として重要なIL-10およびPD-L1の発現を阻害することが可能であるとともに、内在性の抑制シグナルを遮断し、かつNK細胞および細胞傷害性T細胞の抗腫瘍機能を支持する分泌タンパク質であるsTβRIIおよびIL-21を過剰発現させることもできる。興味深いことに、２種のウイルスベクターを使用して共発現させると、これらのウイルスのエピトープタグを両方とも発現するGEMの割合が大幅に高くなり、GEMがIL-21をさらに発現する場合は、CRISPRによるIL-10の発現低下が有意に増強されることがわかった。
【０２３７】
初代ヒトマクロファージをレンチウイルスで遺伝子組換えする本発明の方法は、新たな種類の細胞免疫療法として利用することができ、本発明の遺伝子組換えマクロファージは、臨床承認されたレンチウイルス骨格を用いて、患者の血液を元にわずか７日間で製造することができる。GEMは、治療用TCRまたはCAR T細胞の製造過程において現在廃棄されている患者由来の単球集団から製造してもよく、これによって、臨床製剤を製造するための新規施設の構築に伴う時間とコストを削減することができる。臨床では、外科的腫瘍切除の直後にGEMを直接腫瘍部位に移植することが想定される。この方法は、点滴静注や過去の臨床試験で使用されてきた非特異的な全身投与よりも利点があり、GEMを最大限に腫瘍細胞と相互作用させることができ、また、末梢循環の細い毛細血管床にGEMが停留しうるという懸念も緩和されている。
【０２３８】
腫瘍微小環境は複数の重複機構を介して免疫応答を回避している（Razavi SM, Lee KE, Jin BE et al. Immune Evasion Strategies of Glioblastoma. Front Surg 2016;3:11; Beavis PA, Slaney CY, Kershaw MH et al. Reprogramming the tumor microenvironment to enhance adoptive cellular therapy. Semin Immunol 2016;28:64-72；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）。また、免疫抑制の調節は、単一の標的に対して設計された小分子、抗体または細胞療法よりも有効に抗腫瘍活性を誘導できると考えられている。CAR T細胞などの他の細胞療法と併用する場合、頭蓋内異種移植モデルを使用することによってGEMのアジュバント特性を評価することができ、次いで、免疫コンピテントモデルで評価を行って、複雑なTMEにおいてGEMが発揮する機能を確認することができる。
【０２３９】
抗腫瘍療法を目的としてマクロファージを利用するという概念は1974年に初めて提唱され、同年、Fidlerらによって、エキソビボで刺激したマクロファージを使用してB16黒色腫モデルの肺転移を抑制できることが実証された（Fidler IJ. Inhibition of pulmonary metastasis by intravenous injection of specifically activated macrophages. Cancer Res 1974;34:1074-1078；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。その後の研究によりこれらの知見が検証され、これに基づいて、卵巣癌、結腸直腸癌、腎癌など様々ながん患者の治療を目的とした養子移入マクロファージの安全性および有効性がいくつかの臨床試験において評価された（Andreesen R, Hennemann B, Krause SW. Adoptive immunotherapy of cancer using monocyte-derived macrophages: rationale, current status, and perspectives. J Leukoc Biol 1998;64:419-426；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。注入前にIFNγまたはLPS/IFNγで活性化された自家マクロファージの用量漸増試験では、この治療法が安全であり、インフルエンザ様の症状しか誘導されないことが示されたが、臨床的有用性は認められなかった（Andreesen R, Hennemann B, Krause SW. Adoptive immunotherapy of cancer using monocyte-derived macrophages: rationale, current status, and perspectives. J Leukoc Biol 1998;64:419-426；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。患者の転帰の改善が見られなかった原因としては、エフェクター細胞の細胞傷害機能を補助するIL-12、TNFαまたはIL-6などのLPS/IFNγ誘導性因子が限定的にしか発現されなかったことが考えられる（Hao NB, Lu MH, Fan YH et al. Macrophages in tumor microenvironments and the progression of tumors. Clin Dev Immunol 2012;2012:948098；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。さらに、TGFβ、M-CSF、IL-4、IL-10などの腫瘍由来因子は、養子移入されたマクロファージを別の表現型に分極化させ、これによって、マクロファージからのサイトカインの産生を変化させてTregの機能を促進するとともに、腫瘍特異的T細胞の応答を抑制すると考えられる（Glass R, Synowitz M. CNS macrophages and peripheral myeloid cells in brain tumours. Acta Neuropathol 2014;128:347-362；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【０２４０】
特定の表現型に分極化されたまま維持されるマクロファージの有効性は、最近の動物実験で裏付けられており、この実験では、NFκBを介した代替的活性化（M2）が抑制されるように、あるいはIFNαを過剰発現するように遺伝子組換えされた養子移入マクロファージまたは腫瘍浸潤マクロファージが、免疫抑制性のTMEを逆転させ、腫瘍増殖を抑制したことが示されている（Hagemann T, Lawrence T, McNeish I et al. "Re-educating" tumor-associated macrophages by targeting NF-kappaB. J Exp Med 2008;205:1261-1268; Escobar G, Gentner B, Naldini L et al. Engineered tumor-infiltrating macrophages as gene delivery vehicles for interferon-alpha activates immunity and inhibits breast cancer progression. Oncoimmunology 2014;3:e28696；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）。さらに、様々な抗体や作用物質を使用して内在性マクロファージの抗炎症表現型を転換させることによって、腫瘍を支持する挙動を抑制し、かつ抗腫瘍免疫応答を回復させることができ、ひいては腫瘍の進行を抑えることができる。このような抗体や作用物質としては、Ang2／VEGF二重特異性抗体（Kloepper J, Riedemann L, Amoozgar Z et al. Ang-2/VEGF bispecific antibody reprograms macrophages and resident microglia to anti-tumor phenotype and prolongs glioblastoma survival. Proc Natl Acad Sci U S A 2016;113:4476-4481；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）、M-CSFのアンタゴニスト（Pyonteck SM, Akkari L, Schuhmacher AJ et al. CSF-1R inhibition alters macrophage polarization and blocks glioma progression. Nat Med 2013;19:1264-1272; Ries CH, Cannarile MA, Hoves S et al. Targeting tumor-associated macrophages with anti-CSF-1R antibody reveals a strategy for cancer therapy. Cancer Cell 2014;25:846-859；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）、CD40のアゴニスト（Beatty GL, Chiorean EG, Fishman MP et al. CD40 agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreatic carcinoma in mice and humans. Science 2011;331:1612-1616；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）、またはTLR経路（Peng J, Tsang JY, Li D et al. Inhibition of TGF-beta signaling in combination with TLR7 ligation re-programs a tumoricidal phenotype in tumor-associated macrophages. Cancer Lett 2013;331:239-249; Huang Z, Gan J, Long Z et al. Targeted delivery of let-7b to reprogramme tumor-associated macrophages and tumor infiltrating dendritic cells for tumor rejection. Biomaterials 2016;90:72-84; Yu Q, Nie SP, Wang JQ et al. Toll-like receptor 4 mediates the antitumor host response induced by Ganoderma atrum polysaccharide. J Agric Food Chem 2015;63:517-525; El Andaloussi A, Sonabend AM, Han Y et al. Stimulation of TLR9 with CpG ODN enhances apoptosis of glioma and prolongs the survival of mice with experimental brain tumors. Glia 2006;54:526-535；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）が挙げられる。特に、これらの抗腫瘍機構は直接的であってもよく、たとえば、マクロファージ自体による殺腫瘍活性の誘導によるものであってもよく（Peng J, Tsang JY, Li D et al. Inhibition of TGF-beta signaling in combination with TLR7 ligation re-programs a tumoricidal phenotype in tumor-associated macrophages. Cancer Lett 2013;331:239-249; Beatty GL, Chiorean EG, Fishman MP et al. CD40 agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreatic carcinoma in mice and humans. Science 2011;331:1612-1616; Hagemann T, Lawrence T, McNeish I et al. "Re-educating" tumor-associated macrophages by targeting NF-kappaB. J Exp Med 2008;205:1261-1268；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）、あるいは間接的であってもよく、たとえば、NK細胞を補助することによるものであってもよく（Yu Q, Nie SP, Wang JQ et al. Toll-like receptor 4 mediates the antitumor host response induced by Ganoderma atrum polysaccharide. J Agric Food Chem 2015;63:517-525; Hagemann T, Lawrence T, McNeish I et al. "Re-educating" tumor-associated macrophages by targeting NF-kappaB. J Exp Med 2008;205:1261-1268；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）、T細胞を介した細胞傷害性によるものであってもよく（Yu Q, Nie SP, Wang JQ et al. Toll-like receptor 4 mediates the antitumor host response induced by Ganoderma atrum polysaccharide. J Agric Food Chem 2015;63:517-525; El Andaloussi A, Sonabend AM, Han Y et al. Stimulation of TLR9 with CpG ODN enhances apoptosis of glioma and prolongs the survival of mice with experimental brain tumors. Glia 2006;54:526-535；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）、DCの活性化によるものであってもよい（Van der Jeught K, Bialkowski L, Daszkiewicz L et al. Targeting the tumor microenvironment to enhance antitumor immune responses. Oncotarget 2015;6:1359-1381；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。さらに、膠芽腫（GBM）患者から得た腫瘍由来骨髄系細胞を、TLR3を介して再分極化させた研究では、骨髄系細胞が本質的に備える可塑性によって、局所免疫の活性化が惹起されることが示唆されている（Kees T, Lohr J, Noack J et al. Microglia isolated from patients with glioma gain antitumor activities on poly (I:C) stimulation. Neuro Oncol 2012;14:64-78；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。したがって、マクロファージは、免疫系が腫瘍に応答できるように多面的な変化を誘導することができると考えられており、このことから、マクロファージ集団を利用してTMEを再構成することの重要性がわかる。
【０２４１】
この概念を支持するものとして、TMEにおける自然免疫細胞の活性化の効果を評価したいくつかの研究では、自然免疫細胞の活性化が固形腫瘍患者における臨床的有効性にとって重要な要素の１つであることが示されている。たとえば、DCを用いた細胞療法は、去勢抵抗性前立腺癌患者の抗腫瘍免疫応答がDCによって誘導されるという効果に基づいて、米国食品医薬品局（FDA）により初めて承認された細胞療法である（Kantoff PW, Higano CS, Shore ND et al. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med 2010;363:411-422；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。他の実験的研究において、免疫を増強させるために使用が試みられたものとしては、アジュバント（Crane CA, Han SJ, Ahn B et al. Individual patient-specific immunity against high-grade glioma after vaccination with autologous tumor derived peptides bound to the 96 KD chaperone protein. Clin Cancer Res 2013;19:205-214；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）、生きている腫瘍溶解性ウイルス（Suryadevara CM, Riccione KA, Sampson JH. Immunotherapy gone viral: Bortezomib and oHSV enhance antitumor NK cell activity. Clin Cancer Res 2016；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）、腫瘍内に存在する抗原提示細胞（APC）に特異的に感染するように遺伝子組換えされたウイルス（Goyvaerts C, De Groeve K, Dingemans J et al. Development of the Nanobody display technology to target lentiviral vectors to antigen-presenting cells. Gene Ther 2012;19:1133-1140; Cire S, Da Rocha S, Yao R et al. Immunization of mice with lentiviral vectors targeted to MHC class II+ cells is due to preferential transduction of dendritic cells in vivo. PLoS One 2014;9:e101644；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に援用される）などが挙げられる。これらの方法では、自然免疫細胞が大幅に活性化されると考えられ、たとえば、自然免疫細胞による炎症促進性メディエーターの産生や、腫瘍内における細胞傷害性免疫細胞の機能が補助されると見られる。また、これらの方法では、自然免疫細胞と養子移入免疫細胞のクロストークが活発化し、臨床的有効性が高まることが実証されているが、腫瘍微小環境および抗腫瘍免疫に対する多面的効果の根底にある機構は明確には解明されていない。動物研究や臨床試験においてマクロファージを用いた免疫療法を上記の方法と併用することによって、免疫抑制性および抗炎症性を示すTMEの克服に極めて重要なメカニズムを容易に見出すことができると予想される。
【０２４２】
脳腫瘍異種移植片に直接注射されたGEMは、レンチウイルスにコードされたホタルルシフェラーゼを安定に産生し、また、自己増殖したり動物の生存率を低下させたりすることなく、長期間にわたって生存し続けることができる。本発明の方法は柔軟性を備えた方法であることから、CRISPRを利用した遺伝子破壊によって、免疫抑制因子として重要なIL-10およびPD-L1の発現を阻害することが可能であるとともに、内在性の抑制シグナルを遮断し、かつNK細胞およびT細胞の抗腫瘍機能を支持する分泌タンパク質であるsTGFRβIIおよびIL-21を過剰発現させることもできる。
【０２４３】
抗腫瘍療法を目的としてマクロファージを利用するという概念は1974年に初めて提唱され、同年、Fidlerらによって、エキソビボで刺激したマクロファージを使用してB16黒色腫モデルの肺転移を抑制できることが実証された。その後の研究によりこれらの知見が検証され、これに基づいて、卵巣癌、結腸直腸癌、腎癌など様々ながん患者の治療を目的とした養子移入マクロファージの安全性および有効性がいくつかの臨床試験において評価された。注入前にIFNγまたはLPS/IFNγで活性化された自家マクロファージの用量漸増試験では、この治療法が安全であり、インフルエンザ様の症状しか誘導されないことが示されたが、臨床的有用性は認められなかった。患者の転帰の改善が見られなかった原因としては、エフェクター細胞の細胞傷害機能を補助するIL-12、TNFαまたはIL-6などのLPS/IFNγ誘導性因子が限定的にしか発現されなかったことが考えられる。さらに、TGFβ、M-CSF、IL-4、IL-10などの腫瘍由来因子は、養子移入されたマクロファージを別の表現型に分極化させ、これによって、マクロファージからのサイトカインの産生を変化させてTregの機能を促進するとともに、腫瘍特異的T細胞の応答を抑制すると考えられる。
【０２４４】
特定の表現型に分極化されたまま維持されるマクロファージの有効性は、最近の動物実験で裏付けられており、この実験では、NFκBを介した代替的活性化（M2）が抑制されるように、あるいはIFNαを過剰発現するように遺伝子組換えされた養子移入マクロファージまたは腫瘍浸潤マクロファージが、免疫抑制性のTMEを逆転させ、腫瘍増殖を抑制したことが示されている。さらに、様々な抗体や作用物質を使用して内在性マクロファージの抗炎症表現型を転換させることによって、腫瘍を支持する挙動を抑制し、かつ抗腫瘍免疫応答を回復させることができ、ひいては腫瘍の進行を抑えることができる。このような抗体や作用物質としては、Ang2/VEGF二重特異性抗体、M-CSFのアンタゴニスト、CD40のアゴニスト、またはTLR経路が挙げられる。特に、これらの抗腫瘍機構は直接的であってもよく、たとえば、マクロファージ自体による殺腫瘍活性の誘導によるものであってもよく、あるいは間接的であってもよく、たとえば、NK細胞を補助することによるものであってもよく、T細胞を介した細胞傷害性によるものであってもよい。さらに、膠芽腫（GBM）患者から得た腫瘍由来骨髄系細胞を、TLR3を介して再分極化させた研究では、骨髄系細胞が本質的に備える可塑性によって、局所免疫の活性化が惹起されることが示唆されている。したがって、マクロファージはそれ自体単独で、免疫系が腫瘍に応答できるように多面的な変化を誘導することができると考えられており、このことから、TMEを再構成するためのツールとしてマクロファージ集団を利用することの重要性がわかる。
【０２４５】
臨床承認されたレンチウイルス骨格を使用して患者血液からマクロファージを７日間で製造することができ、このマクロファージを用いた新規免疫療法を提供できることが初めて実証された。GEMは、治療用TCRまたはCAR T細胞の製造過程において廃棄されている患者由来の単球集団から製造してもよく、これによって、臨床製剤を製造するための新規施設の構築に伴う時間とコストを削減することができる。臨床では、外科的腫瘍切除を行う際にGEMを直接腫瘍に移植することが想定される。本発明の方法は、GEMを最大限に腫瘍細胞と相互作用させることができ、また、末梢循環の細い毛細血管床にGEMが停留しうるという懸念も緩和されていることから、過去の臨床試験で使用されてきた点滴静注よりも利点がある。
【０２４６】
腫瘍微小環境は複数の重複機構を介して免疫応答を回避している。したがって、免疫抑制の調節は、単一の標的に対して設計された小分子、抗体または細胞療法よりも有効に抗腫瘍活性を誘導できると考えられる。
【０２４７】
EGFRvIII 806CARおよびキメラIL7受容体を発現するCD4 T細胞およびCD8 T細胞
増殖させ凍結保存した細胞から選択したCD4 T細胞およびCD8 T細胞を遺伝子組換えして、EGFRvIII 806CARと、IL2受容体（CD122）の細胞内シグナル伝達ドメインに融合させたキメラIL7受容体（CD127）細胞外ドメインとを発現させ、CD3/CD28で活性化し、凍結した。解凍したCD4 T細胞またはCD8 T細胞をCell Trace Violetで標識し、コントロールとしての組換えIL-7（500ng/ml）を加えて７日間培養するか、IL-7もしくはEGFRt（ベクターのみ）を発現するGEMから回収して一度凍結した馴化培地を加えて７日間培養するか、またはIL-7もしくはEGFRtを分泌する自家GEMと７日間共培養した。フローサイトメトリーでCellTrace Violetの希釈を分析することによって増殖を測定した。なお、CD4 T細胞およびCD8 T細胞はいずれも、CD3/CD28による再刺激は行わず、IL-7以外のサイトカインの添加も行わなかった。（図３２および図３３を参照されたい。）
【０２４８】
IL-7の配列（配列番号１９；Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaaccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaataaatctttaaaggaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaacttgttggaataaaattttgatgggcactaaagaacacctcgagtga）は、配列番号１７（atgcttctcctggtgacaagc）に示されるフォワードプライマーと、配列番号１８（gcagcccgggtctagagcggccgctcactcgaggtgttctttagtgccc）に示されるリバースプライマーを使用して増幅した。
【０２４９】
本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、腫瘍微小環境（TME）を改変するための遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法であって、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および／もしくは活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを免疫細胞に送達することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質はPD-L1タンパク質の断片であり、該PD-L1タンパク質断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質断片は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記T細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えT細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態にお���て、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記方法は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクターを前記免疫細胞に送達すること；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸を前記免疫細胞に送達することをさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸が、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていてもよいことを特徴とする。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、CRISPRを利用してPDL1を欠失させるための短鎖ガイドRNA用プライマーは、配列番号２０（CACCGGTCCAGATGACTTCGGCCTT）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２１（AAACAAGGCCGAAGTCATCTGGACC）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、PD-L1を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２２（TCCAGATGACTTCGGCCTTG）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列用プライマーは、配列番号２３（AGGAACACGCGAATGAGAACCC）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２４（TGCAAGGCATGGGGAGCATCTT）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２５（GGCTGGCCCTCACCCCAGT）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクターを前記免疫細胞に送達すること；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターを前記免疫細胞に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記炎症促進遺伝子は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFをコードする。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞および単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記免疫細胞を分化誘導することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導する。いくつかの実施形態において、前記細胞をマクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導する。いくつかの実施形態において、増殖が誘導されるT細胞は、ヘルパーT細胞、メモリーT細胞、細胞傷害性T細胞、サプレッサーT細胞、ナチュラルキラーT細胞およびγδT細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、遺伝子設計された小さなタンパク質を使用してPD-1の結合部位を塞ぐが、この結合は作動性シグナルを送達しない。さらに、いくつかの実施形態において、PD-1のシグナル伝達を抑制するように開発されたモノクローナル抗体の配列を使用して一本鎖抗体様タンパク質を作製し、この一本鎖抗体様タンパク質を使用して複合体のアゴニスト活性を抑制することができ、このような方法は、US8008449 B2に記載されている（この文献は引用によりその全体が本明細書に援用される）。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15である。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、EGF、エオタキシン、FGF-2、FLT-3L、フラクタルカイン、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-10、IL-12（p40）、IL-12（p70）、IL-13、IL-13、IL-15、IL-18A、IL-1RA、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、INF-α2、INF-γ、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1a、MIP-1b、PDGF-AA、PDGF-BB、RANTES、TGF-α、TGF-β、VEGF、sCD401、6CKINE、BCA-1、CTACK、ENA78、エオタキシン−２、エオタキシン−３、1309、IL-16、IL-20、IL-21、IL-23、IL-28a、IL-33、LIF、MCP-2、MCP-4、MIP-1d、SCF、SDF-1atb、TARC、TPO、TRAIL、TSLP、CCL1ra/HCC-1、CCL19/MIPβ、CCL20/MIPα、CXCL11/1-TAC、CXCL6/GCP2、CXCL7/NAP2、CXCL9/MIG、IL-11、IL-29/ING-γ、M-CSFおよびXCL1/リンホタクチンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質はPD-L1タンパク質の断片であり、該PD-L1タンパク質断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質断片は、腫瘍細胞��よび／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。
いくつかの実施形態において、前記方法は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクターを前記細胞に送達すること；および前記細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸を前記細胞に送達することをさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸が、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていることを特徴とする。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記細胞中の標的遺伝子はTGF-βまたはIL-10をコードする。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、前記方法は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するために、転写活性化ドメインに融合されたCas9タンパク質をコードする第４のベクターを前記細胞に送達すること；ならびに前記細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターを前記細胞に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記転写活性化ドメインは、VP16もしくはVP64またはp65活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記炎症促進遺伝子は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFをコードする。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、コドンの最適化は、OptimumGeneTM、GeneGPS（登録商標）アルゴリズムおよび当業者に公知の他のプログラムによって行われる。
【０２５０】
いくつかの実施形態において、遺伝子組換え免疫細胞であって、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および／もしくは活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88もしくはサイトカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含む細胞が提供される。いくつかの実施形態において、前記T細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされたT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質はPD-L1タンパク質の断片であり、該PD-L1タンパク質断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質断片は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコ��ドする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていてもよい。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、CRISPRを利用してPDL1を欠失させるための短鎖ガイドRNA用プライマーは、配列番号２０（CACCGGTCCAGATGACTTCGGCCTT）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２１（AAACAAGGCCGAAGTCATCTGGACC）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、PD-L1を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２２（TCCAGATGACTTCGGCCTTG）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列用プライマーは、配列番号２３（AGGAACACGCGAATGAGAACCC）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２４（TGCAAGGCATGGGGAGCATCTT）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２５（GGCTGGCCCTCACCCCAGT）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球および初代ヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト単球である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子設計された小さなタンパク質を使用してPD-1の結合部位を塞ぐが、この結合は作動性シグナルを送達しない。いくつかの実施形態において、62番目〜136番目の残基を含むPD-L1タンパク質は、結合を遮断するために使用される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記サイトカインは、IL-2、IL-1β、IFNγ、IL-1、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21またはIL-33である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15である。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、EGF、エオタキシン、FGF-2、FLT-3L、フラクタルカイン、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-10、IL-12（p40）、IL-12（p70）、IL-13、IL-13、IL-15、IL-18A、IL-1RA、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、INF-α2、INF-γ、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1a、MIP-1b、PDGF-AA、PDGF-BB、RANTES、TGF-α、TGF-β、VEGF、sCD401、6CKINE、BCA-1、CTACK、ENA78、エオタキシン−２、エオタキシン−３、1309、IL-16、IL-20、IL-21、IL-23、IL-28a、IL-33、LIF、MCP-2、MCP-4、MIP-1d、SCF、SDF-1atb、TARC、TPO、TRAIL、TSLP、CCL1ra/HCC-1、CCL19/MIPβ、CCL20/MIPα、CXCL11/1-TAC、CXCL6/GCP2、CXCL7/NAP2、CXCL9/MIG、IL-11、IL-29/ING-γ、M-CSFおよびXCL1/リンホタクチンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質はPD-L1タンパク質の断片であり、該PD-L1タンパク質断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質断片は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態に��いて、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記細胞中の標的遺伝子はTGF-βまたはIL-10をコードする。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するための、転写活性化ドメインに融合されたCas9タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記転写活性化ドメインは、VP16もしくはVP64またはp65活性化ドメインを含む。さらなる実施形態は、医薬品として使用するための、たとえば、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫、卵巣癌などのがんを治療または抑制するための医薬品として使用するための前記遺伝子組換え免疫細胞の１種以上を用いた単独療法または併用療法に関する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、EGFRvIII 806 CARと、CD122に融合されたキメラIL7受容体とを発現する。
【０２５１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上；およびキャリア、抗がん治療薬、抗感染症治療薬、抗菌治療薬、抗ウイルス治療薬または抗腫瘍治療薬を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、増殖が誘導されるT細胞は、ヘルパーT細胞、メモリーT細胞、細胞傷害性T細胞、サプレッサーT細胞、ナチュラルキラーT細胞およびγδT細胞からなる群から選択される。
【０２５２】
いくつかの実施形態において組成物が提供される。前記組成物は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上；およびキャリア、抗がん治療薬、抗感染症治療薬、抗菌治療薬、抗ウイルス治療薬または抗腫瘍治療薬を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88もしくはサイトカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記T細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされたT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質はPD-L1タンパク質の断片であり、該PD-L1タンパク質断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質断片は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていてもよい。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、CRISPRを利用してPDL1を欠失させるための短鎖ガイドRNA用プライマーは、配列番号２０（CACCGGTCCAGATGACTTCGGCCTT）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２１（AAACAAGGCCGAAGTCATCTGGACC）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、PD-L1を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２２（TCCAGATGACTTCGGCCTTG）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列用プライマーは、配列番号２３（AGGAACACGCGAATGAGAACCC）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２４（TGCAAGGCATGGGGAGCATCTT）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２５（GGCTGGCCCTCACCCCAGT）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球および初代ヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト単球である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子設計された小さなタンパク質を使用してPD-1の結合部位を塞ぐが、この結合は作動性シグナルを送達しない。いくつかの実施形態において、62番目〜136番目の残基を含むPD-L1タンパク質は、結合を遮断するために使用される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記サイトカインは、IL-2、IL-1β、IFNγ、IL-1、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21またはIL-33である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、EGF、エオタキシン、FGF-2、FLT-3L、フラクタルカイン、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-10、IL-12（p40）、IL-12（p70）、IL-13、IL-13、IL-15、IL-18A、IL-1RA、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、INF-α2、INF-γ、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1a、MIP-1b、PDGF-AA、PDGF-BB、RANTES、TGF-α、TGF-β、VEGF、sCD401、6CKINE、BCA-1、CTACK、ENA78、エオタキシン−２、エオタキシン−３、1309、IL-16、IL-20、IL-21、IL-23、IL-28a、IL-33、LIF、MCP-2、MCP-4、MIP-1d、SCF、SDF-1atb、TARC、TPO、TRAIL、TSLP、CCL1ra/HCC-1、CCL19/MIPβ、CCL20/MIPα、CXCL11/1-TAC、CXCL6/GCP2、CXCL7/NAP2、CXCL9/MIG、IL-11、IL-29/ING-γ、M-CSFおよびXCL1/リンホタクチンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質はPD-L1タンパク質の断片であり、該PD-L1タンパク質断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質断片は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記細胞中の標的遺伝子はTGF-βまたはIL-10をコードする。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するための、転写活性化ドメインに融合されたCas9タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記転写活性化ドメインは、VP16もしくはVP64またはp65活性化ドメインを含む。
【０２５３】
いくつかの実施形態において、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制の調節を必要とする対象（たとえばヒト）において、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制を調節する方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物の１種以上を対象に投与すること、ならびに任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および／または任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象の腫瘍微小環境における免疫応答の抑制の調節を測定することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88もしくはサイトカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされたT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質はPD-L1タンパク質の断片であり、該PD-L1タンパク質断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質断片は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タ��パク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていてもよい。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、CRISPRを利用してPDL1を欠失させるための短鎖ガイドRNA用プライマーは、配列番号２０（CACCGGTCCAGATGACTTCGGCCTT）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２１（AAACAAGGCCGAAGTCATCTGGACC）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、PD-L1を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２２（TCCAGATGACTTCGGCCTTG）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列用プライマーは、配列番号２３（AGGAACACGCGAATGAGAACCC）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２４（TGCAAGGCATGGGGAGCATCTT）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２５（GGCTGGCCCTCACCCCAGT）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球および初代ヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト単球である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子設計された小さなタンパク質を使用してPD-1の結合部位を塞ぐが、この結合は作動性シグナルを送達しない。いくつかの実施形態において、62番目〜136番目の残基を含むPD-L1タンパク質は、結合を遮断するために使用される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記サイトカインは、IL-2、IL-1β、IFNγ、IL-1、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21またはIL-33である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、EGF、エオタキシン、FGF-2、FLT-3L、フラクタルカイン、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-10、IL-12（p40）、IL-12（p70）、IL-13、IL-13、IL-15、IL-18A、IL-1RA、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、INF-α2、INF-γ、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1a、MIP-1b、PDGF-AA、PDGF-BB、RANTES、TGF-α、TGF-β、VEGF、sCD401、6CKINE、BCA-1、CTACK、ENA78、エオタキシン−２、エオタキシン−３、1309、IL-16、IL-20、IL-21、IL-23、IL-28a、IL-33、LIF、MCP-2、MCP-4、MIP-1d、SCF、SDF-1atb、TARC、TPO、TRAIL、TSLP、CCL1ra/HCC-1、CCL19/MIPβ、CCL20/MIPα、CXCL11/1-TAC、CXCL6/GCP2、CXCL7/NAP2、CXCL9/MIG、IL-11、IL-29/ING-γ、M-CSFおよびXCL1/リンホタクチンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質はPD-L1タンパク質の断片であり、該PD-L1タンパク質断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質断片は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記細胞中の標的遺伝子はTGF-βまたはIL-10をコードする。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。
いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するための、転写活性化ドメインに融合されたCas9タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記転写活性化ドメインは、VP16もしくはVP64またはp65活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、注射による腫瘍床への直接送達によって投与される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞の投与を必要とする対象はがんに罹患している。いくつかの実施形態において、前記がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記固形腫瘍は、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、EGFRvIII 806 CARと、CD122に融合されたキメラIL7受容体とを発現する。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に細胞療法を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞療法はCAR T細胞療法である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を前記治療対象に導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、抗体もしくはその結合断片、小分子、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体または腫瘍溶解性ポリオウイルスを前記対象に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその結合断片は、α−フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（MAGE）、HER2、および／またはrasもしくはp53の異常生成物に特異的である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記対象にプロドラッグを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロドラッグは、アービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506または二量体化誘導化学物質である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に薬物を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記薬物は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物である。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法を受けるべき対象として特定または選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤などのさらなる治療剤、または放射線療法および／もしくは外科手術などの補助療法を前記対象に導入、提供または��与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記さらなる治療剤は、ホルモン遮断療法、化学療法、小分子、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、および／または放射線照射を含む抗がん療法である。いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体またはその結合断片は、Her2、CD52、CD20、CD25、VEGFまたはEGRFに特異的である。いくつかの実施形態において、前記ホルモン遮断療法は、タモキシフェン、アナストロゾール、および／またはレトロゾールの送達を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子は、チロシンキナーゼ阻害薬、小分子薬物複合体、セリンキナーゼ阻害薬、および／またはトレオニンキナーゼ阻害薬を含む。
【０２５４】
いくつかの実施形態において、腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑えることを必要とする対象において、腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑える方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物の１種以上を対象に投与すること、ならびに任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および／または任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象における腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を測定することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88もしくはサイトカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされたT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質はPD-L1タンパク質の断片であり、該PD-L1タンパク質断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質断片は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていてもよい。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、CRISPRを利用してPDL1を欠失させるための短鎖ガイドRNA用プライマーは、配列番号２０（CACCGGTCCAGATGACTTCGGCCTT）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２１（AAACAAGGCCGAAGTCATCTGGACC）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、PD-L1を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２２（TCCAGATGACTTCGGCCTTG）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列用プライマーは、配列番号２３（AGGAACACGCGAATGAGAACCC）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２４（TGCAAGGCATGGGGAGCATCTT）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２５（GGCTGGCCCTCACCCCAGT）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206���IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球および初代ヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト単球である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子設計された小さなタンパク質を使用してPD-1の結合部位を塞ぐが、この結合は作動性シグナルを送達しない。いくつかの実施形態において、62番目〜136番目の残基を含むPD-L1タンパク質は、結合を遮断するために使用される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記サイトカインは、IL-2、IL-1β、IFNγ、IL-1、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21またはIL-33である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、EGF、エオタキシン、FGF-2、FLT-3L、フラクタルカイン、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-10、IL-12（p40）、IL-12（p70）、IL-13、IL-13、IL-15、IL-18A、IL-1RA、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、INF-α2、INF-γ、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1a、MIP-1b、PDGF-AA、PDGF-BB、RANTES、TGF-α、TGF-β、VEGF、sCD401、6CKINE、BCA-1、CTACK、ENA78、エオタキシン−２、エオタキシン−３、1309、IL-16、IL-20、IL-21、IL-23、IL-28a、IL-33、LIF、MCP-2、MCP-4、MIP-1d、SCF、SDF-1atb、TARC、TPO、TRAIL、TSLP、CCL1ra/HCC-1、CCL19/MIPβ、CCL20/MIPα、CXCL11/1-TAC、CXCL6/GCP2、CXCL7/NAP2、CXCL9/MIG、IL-11、IL-29/ING-γ、M-CSFおよびXCL1/リンホタクチンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質はPD-L1タンパク質の断片であり、該PD-L1タンパク質断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質断片は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記細胞中の標的遺伝子はTGF-βまたはIL-10をコードする。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。
いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するための、転写活性化ドメインに融合されたCas9タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記転写活性化ドメインは、VP16もしくはVP64またはp65活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記組成物は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上；およびキャリア、抗がん治療薬、抗感染症治療薬、抗菌治療薬、抗ウイルス治療薬または抗腫瘍治療薬を含む。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、注射による腫瘍床への直接送達によって投与される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞の投与を必要とする対象はがんに罹患している。いくつかの実施形態において、前記がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記固形腫瘍は、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、EGFRvIII 806 CARと、CD122に融合されたキメラIL7受容体とを発現する。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に細胞療法を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞療法はCAR T細胞療法である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を前記治療対象に導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、抗体もしくはその結合断片、小分子、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体または腫瘍溶解性ポリオウイルスを前記対象に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその結合断片は、α−フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（MAGE）、HER2、および／またはrasもしくはp53の異常生成物に特異的である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記対象にプロドラッグを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロドラッグは、アービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506または二量体化誘導化学物質である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に薬物を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記薬物は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物である。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法を受けるべき対象として特定または選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれか��よる細胞の１種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤などのさらなる治療剤、または放射線療法および／もしくは外科手術などの補助療法を前記対象に導入、提供または投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記さらなる治療剤は、ホルモン遮断療法、化学療法、小分子、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、および／または放射線照射を含む抗がん療法である。いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体は、Her2、CD52、CD20、CD25、VEGFまたはEGRFに特異的である。いくつかの実施形態において、前記ホルモン遮断療法は、タモキシフェン、アナストロゾール、および／またはレトロゾールの送達を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子は、チロシンキナーゼ阻害薬、小分子薬物複合体、セリンキナーゼ阻害薬、および／またはトレオニンキナーゼ阻害薬を含む。
【０２５５】
いくつかの実施形態において、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法の効率の向上を必要とする対象（たとえばヒト）において、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法の効率を向上させる方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物の１種以上を前記対象に投与すること、ならびに任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および／または任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象におけるがん、感染体、細菌、ウイルスまたは腫瘍の増殖を測定することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88もしくはサイトカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされたT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質はPD-L1タンパク質の断片であり、該PD-L1タンパク質断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質断片は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていてもよい。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、CRISPRを利用してPDL1を欠失させるための短鎖ガイドRNA用プライマーは、配列番号２０（CACCGGTCCAGATGACTTCGGCCTT）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２１（AAACAAGGCCGAAGTCATCTGGACC）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、PD-L1を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２２（TCCAGATGACTTCGGCCTTG）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列用プライマーは、配列番号２３（AGGAACACGCGAATGAGAACCC）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２４（TGCAAGGCATGGGGAGCATCTT）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２５（GGCTGGCCCTCACCCCAGT）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつか���実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球および初代ヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト単球である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子設計された小さなタンパク質を使用してPD-1の結合部位を塞ぐが、この結合は作動性シグナルを送達しない。いくつかの実施形態において、62番目〜136番目の残基を含むPD-L1タンパク質は、結合を遮断するために使用される。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記サイトカインは、IL-2、IL-1β、IFNγ、IL-1、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21またはIL-33である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、EGF、エオタキシン、FGF-2、FLT-3L、フラクタルカイン、G-CSF、GM-CSF、GRO、IL-10、IL-12（p40）、IL-12（p70）、IL-13、IL-13、IL-15、IL-18A、IL-1RA、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、INF-α2、INF-γ、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1a、MIP-1b、PDGF-AA、PDGF-BB、RANTES、TGF-α、TGF-β、VEGF、sCD401、6CKINE、BCA-1、CTACK、ENA78、エオタキシン−２、エオタキシン−３、1309、IL-16、IL-20、IL-21、IL-23、IL-28a、IL-33、LIF、MCP-2、MCP-4、MIP-1d、SCF、SDF-1atb、TARC、TPO、TRAIL、TSLP、CCL1ra/HCC-1、CCL19/MIPβ、CCL20/MIPα、CXCL11/1-TAC、CXCL6/GCP2、CXCL7/NAP2、CXCL9/MIG、IL-11、IL-29/ING-γ、M-CSFおよびXCL1/リンホタクチンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質はPD-L1タンパク質の断片であり、該PD-L1タンパク質断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質断片は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記細胞中の標的遺伝子はTGF-βまたはIL-10をコードする。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。
いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するための、転写活性化ドメインに融合されたCas9タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記転写活性化ドメインは、VP16もしくはVP64またはp65活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記組成物は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上；およびキャリア、抗がん治療薬、抗感染症治療薬、抗菌治療薬、抗ウイルス治療薬または抗腫瘍治療薬を含む。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、注射による腫瘍床への直接送達によって投与される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞の投与を必要とする対象はがんに罹患している。いくつかの実施形態において、前記がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記固形腫瘍は、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、EGFRvIII 806 CARと、CD122に融合されたキメラIL7受容体とを発現する。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に細胞療法を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞療法はCAR T細胞療法である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を前記治療対象に導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、抗体もしくはその結合断片、小分子、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体または腫瘍溶解性ポリオウイルスを前記対象に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその結合断片は、α−フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（MAGE）、HER2、および／またはrasもしくはp53の異常生成物に特異的である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記対象にプロドラッグを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロドラッグは、アービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506または二量体化誘導化学物質である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に薬物を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記薬物は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物である。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法を受けるべき対象として特定または選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれか��よる細胞の１種以上を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤などのさらなる治療剤、または放射線療法および／もしくは外科手術などの補助療法を前記対象に導入、提供または投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記さらなる治療剤は、ホルモン遮断療法、化学療法、小分子、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、および／または放射線照射を含む抗がん療法である。いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体またはその結合断片は、Her2、CD52、CD20、CD25、VEGFまたはEGRFに特異的である。いくつかの実施形態において、前記ホルモン遮断療法は、タモキシフェン、アナストロゾール、および／またはレトロゾールの送達を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子は、チロシンキナーゼ阻害薬、小分子薬物複合体、セリンキナーゼ阻害薬、および／またはトレオニンキナーゼ阻害薬を含む。
【０２５６】
いくつかの実施形態において、腫瘍の腫瘍微小環境（TME）を改変するための遺伝子組換え免疫細胞を製造する方法が提供される。前記方法は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを免疫細胞に送達することを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、第１のベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質はPD-L1タンパク質の断片であり、該PD-L1タンパク質断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質断片は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（KNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKI（配列番号７））を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球およびヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記T細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えT細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は神経膠腫である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は膠芽腫である。いくつかの実施形態において、前記方法は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクターを前記免疫細胞に送達すること；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸を前記免疫細胞に送達することをさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸が、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていてもよいことを特徴とする。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、CRISPRを利用してPDL1を欠失させるための短鎖ガイドRNA用プライマーは、配列番号２０（CACCGGTCCAGATGACTTCGGCCTT）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２１（AAACAAGGCCGAAGTCATCTGGACC）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、PD-L1を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２２（TCCAGATGACTTCGGCCTTG）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列用プライマーは、配列番号２３（AGGAACACGCGAATGAGAACCC）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２４（TGCAAGGCATGGGGAGCATCTT）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２５（GGCTGGCCCTCACCCCAGT）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクターを前記免疫細胞に送達すること；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターを前記免疫細胞に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記炎症促進遺伝子は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFをコードする。い���つかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記免疫細胞を分化誘導することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導する。いくつかの実施形態において、前記細胞をマクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導する。いくつかの実施形態において、前記組成物は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上；およびキャリア、抗がん治療薬、抗感染症治療薬、抗菌治療薬、抗ウイルス治療薬または抗腫瘍治療薬を含む。
【０２５７】
いくつかの実施形態において、医薬品として使用することを目的として遺伝子組換え免疫細胞が提供される。前記遺伝子組換え免疫細胞は、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、T細胞の増殖の誘導、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球およびヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１のベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質は、PD-L1タンパク質またはその活性断片であり、該PD-L1タンパク質またはその活性断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγと��融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていてもよい。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、CRISPRを利用してPDL1を欠失させるための短鎖ガイドRNA用プライマーは、配列番号２０（CACCGGTCCAGATGACTTCGGCCTT）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２１（AAACAAGGCCGAAGTCATCTGGACC）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、PD-L1を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２２（TCCAGATGACTTCGGCCTTG）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列用プライマーは、配列番号２３（AGGAACACGCGAATGAGAACCC）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２４（TGCAAGGCATGGGGAGCATCTT）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２５（GGCTGGCCCTCACCCCAGT）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイル��チミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球および初代ヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト単球である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。
【０２５８】
いくつかの実施形態において組成物が提供される。前記組成物は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上；およびキャリア、抗がん治療薬、抗感染症治療薬、抗菌治療薬、抗ウイルス治療薬または抗腫瘍治療薬を含んでいてもよい。前記遺伝子組換え免疫細胞は、T細胞の増殖の誘導、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球およびヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１のベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質は、PD-L1タンパク質またはその活性断片であり、該PD-L1タンパク質またはその活性断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、CRISPRを利用してPDL1を欠失させるための短鎖ガイドRNA用プライマーは、配列番号２０（CACCGGTCCAGATGACTTCGGCCTT）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２１（AAACAAGGCCGAAGTCATCTGGACC）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、PD-L1を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２２（TCCAGATGACTTCGGCCTTG）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列用プライマーは、配列番号２３（AGGAACACGCGAATGAGAACCC）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２４（TGCAAGGCATGGGGAGCATCTT）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２５（GGCTGGCCCTCACCCCAGT）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施���態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球および初代ヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト単球である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。
【０２５９】
いくつかの実施形態において、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制の調節を必要とする対象（たとえばヒト）において、腫瘍微小環境における免疫応答の抑制を調節する方法が提供され、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物；およびキャリア、抗がん治療薬、抗感染症治療薬、抗菌治療薬、抗ウイルス治療薬または抗腫瘍治療薬を投与することを含んでいてもよい。前記遺伝子組換え免疫細胞は、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、T細胞の増殖の誘導、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球およびヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１のベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質は、PD-L1タンパク質またはその活性断片であり、該PD-L1タンパク質またはその活性断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と��合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていてもよい。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、CRISPRを利用してPDL1を欠失させるための短鎖ガイドRNA用プライマーは、配列番号２０（CACCGGTCCAGATGACTTCGGCCTT）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２１（AAACAAGGCCGAAGTCATCTGGACC）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、PD-L1を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２２（TCCAGATGACTTCGGCCTTG）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列用プライマーは、配列番号２３（AGGAACACGCGAATGAGAACCC）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２４（TGCAAGGCATGGGGAGCATCTT）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２５（GGCTGGCCCTCACCCCAGT）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は、TGF-β、IL-10、アルギナ��ゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球および初代ヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト単球である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記組成物は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上；およびキャリア、抗がん治療薬、抗感染症治療薬、抗菌治療薬、抗ウイルス治療薬または抗腫瘍治療薬を含む。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、注射による腫瘍床への直接送達によって投与される。いくつかの実施形態において、前記対象は、がんに罹患しているか、またはがんに罹患している対象が、抗がん療法を受けるべきであるとして選択される。いくつかの実施形態において、前記がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記固形腫瘍は、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、EGFRvIII 806 CARと、CD122に融合されたキメラIL7受容体とを発現する。
いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に細胞療法を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞療法はCAR T細胞療法である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を前記治療対象に導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、抗体もしくはその結合断片、小分子、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体または腫瘍溶解性ポリオウイルスを前記対象に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその結合断片は、α−フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（MAGE）、HER2、および／またはrasもしくはp53の異常生成物に特異的である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記対象にプロドラッグを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロドラッグは、アービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506または二量体化誘導化学物質である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に薬物を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法を受けるべき対象として特定または選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤などのさらなる治療剤、または放射線療法および／もしくは外科手術などの補助療法を前記対象に導入、提供または投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記さらなる治療剤は、ホルモン遮断療法、化学療法、小分子、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、および／または放射線照射を含む抗がん療法である。いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体またはその結合断片は、Her2、CD52、CD20、CD25、VEGFまたはEGRFに特異的である。いくつかの実施形態において、前記ホルモン遮断療法は、タモキシフェン、アナストロゾール、および／またはレトロゾールの送達を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子は、チロシンキナーゼ阻害薬、小分子薬物複合体、セリンキナーゼ阻害薬、および／またはトレオニンキナーゼ阻害薬を含む。
【０２６０】
いくつかの実施形態において、腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑えることを必要とする対象において、腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を最小限に抑える方法が提供される。前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上または組成物を前記対象に投与すること、ならびに任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および／または任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象における腫瘍細胞および免疫抑制細胞の増殖を測定することを含んでいてもよい。前記遺伝子組換え免疫細胞は、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、T細胞の増殖の誘導、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球およびヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１のベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質は、PD-L1タンパク質またはその活性断片であり、該PD-L1タンパク質またはその活性断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていてもよい。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、CRISPRを利用してPDL1を欠失させるための短鎖ガイドRNA用プライマーは、配列番号２０（CACCGGTCCAGATGACTTCGGCCTT）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２１（AAACAAGGCCGAAGTCATCTGGACC）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、PD-L1を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２２（TCCAGATGACTTCGGCCTTG）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列用プライマーは、配列番号２３（AGGAACACGCGAATGAGAACCC）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２４（TGCAAGGCATGGGGAGCATCTT）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２５（GGCTGGCCCTCACCCCAGT）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの��施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球および初代ヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト単球である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記組成物は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上；およびキャリア、抗がん治療薬、抗感染症治療薬、抗菌治療薬、抗ウイルス治療薬または抗腫瘍治療薬を含む。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、注射による腫瘍床への直接送達によって投与される。いくつかの実施形態において、前記対象は、がんに罹患しているか、またはがんに罹患している対象が、抗がん療法を受けるべきであるとして選択される。いくつかの実施形態において、前記がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記固形腫瘍は、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、EGFRvIII 806 CARと、CD122に融合されたキメラIL7受容体とを発現する。
いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に細胞療法を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞療法はCAR T細胞療法である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を前記治療対象に導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、抗体もしくはその結合断片、小分子、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体または腫瘍溶解性ポリオウイルスを前記対象に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその結合断片は、α−フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（MAGE）、HER2、および／またはrasもしくはp53の異常生成物に特異的である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記対象にプロドラッグを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロドラッグは、アービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506または二量体化誘導化学物質である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に薬物を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法を受けるべき対象として特定または選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤などのさらなる治療剤、または放射線療法および／もしくは外科手術などの補助療法を前記対象に導入、提供または投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記さらなる治療剤は、ホルモン遮断療法、化学療法、小分子、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、および／または放射線照射を含む抗がん療法である。いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体またはその結合断片は、Her2、CD52、CD20、CD25、VEGFまたはEGRFに特異的である。いくつかの実施形態において、前記ホルモン遮断療法は、タモキシフェン、アナストロゾール、および／またはレトロゾールの送達を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子は、チロシンキナーゼ阻害薬、小分子薬物複合体、セリンキナーゼ阻害薬、および／またはトレオニンキナーゼ阻害薬を含む。
【０２６１】
いくつかの実施形態において、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法の効率の向上を必要とする対象において、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法の効率を向上させる方法が提供される。前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上または組成物を前記対象に投与すること、ならびに任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞を投与すべき対象を選択または特定すること、および／または任意で、前記遺伝子組換え免疫細胞の投与後に、前記対象におけるがん、感染体、細菌、ウイルスまたは腫瘍の増殖を測定することを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記組成物は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞の１種以上；およびキャリア、抗がん治療薬、抗感染症治療薬、抗菌治療薬、抗ウイルス治療薬または抗腫瘍治療薬を含む。前記遺伝子組換え免疫細胞は、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、T細胞の増殖の誘導、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球およびヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１のベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性��害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質は、PD-L1タンパク質またはその活性断片であり、該PD-L1タンパク質またはその活性断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていてもよい。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、CRISPRを利用してPDL1を欠失させるための短鎖ガイドRNA用プライマーは、配列番号２０（CACCGGTCCAGATGACTTCGGCCTT）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２１（AAACAAGGCCGAAGTCATCTGGACC）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、PD-L1を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２２（TCCAGATGACTTCGGCCTTG）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列用プライマーは、配列番号２３（AGGAACACGCGAATGAGAACCC）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２４（TGCAAGGCATGGGGAGCATCTT）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２５（GGCTGGCCCTCACCCCAGT）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球および初代ヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト単球である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、注射による腫瘍床への直接送達によって投与される。いくつかの実施形態において、前記対象は、がんに罹患しているか、またはがんに罹患している対象が、抗がん療法を受けるべきであるとして選択される。いくつかの実施形態において、前記がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記固形腫瘍は、乳癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、皮膚癌、頭部癌、頸部癌、肉腫、神経芽腫および卵巣癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、EGFRvIII 806 CARと、CD122に融合されたキメラIL7受容体とを発現する。
いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、前記対象に細胞療法を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記細胞療法はCAR T細胞療法である。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を前記治療対象に導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、抗体もしくはその結合断片、小分子、熱ショックタンパク質−ペプチド複合体または腫瘍溶解性ポリオウイルスを前記対象に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその結合断片は、α−フェトプロテイン、癌胎児抗原、CA-125、MUC-1、上皮性腫瘍抗原、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（MAGE）、HER2、および／またはrasもしくはp53の異常生成物に特異的である。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記対象にプロドラッグを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロドラッグは、アービタックス、ハーセプチン、ガンシクロビル、FK506または二量体化誘導化学物質である。いくつかの実施形態において、前記対象は、抗がん療法、抗感染症療法、抗菌療法、抗ウイルス療法または抗腫瘍療法を受けるべき対象として特定または選択される。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる細胞の１種以上、または本明細書に記載の実施形態のいずれかによる組成物を導入、提供または投与する前、その後、またはそれと同時に、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗菌剤などのさらなる治療剤、または放射線療法および／もしくは外科手術などの補助療法を前記対象に導入、提供または投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記さらなる治療剤は、ホルモン遮断療法、化学療法、小分子、モノクローナル抗体もしくはその結合断片、および／または放射線照射を含む抗がん療法である。いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体またはその結合断片は、Her2、CD52、CD20、CD25、VEGFまたはEGRFに特異的である。いくつかの実施形態において、前記ホルモン遮断療法は、タモキシフェン、アナストロゾール、および／またはレトロゾールの送達を含む。いくつかの実施形態において、前記小分子は、チロシンキナーゼ阻害薬、小分子薬物複合体、セリンキナーゼ阻害薬、および／またはトレオニンキナーゼ阻害薬を含む。さらなる実施形態は、医薬品として使用するための前記遺伝子組換え免疫細胞の１種以上を用いた単独療法または併用療法に関する。
【０２６２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる遺伝子組換え免疫細胞は、医薬品として使用するためのものであり、たとえばがんを治療または抑制するための医薬品として使用するためのものである。前記遺伝子組換え免疫細胞は、内在性もしくは養子移入されたNK細胞もしくはT細胞の生存維持および活性化の促進、T細胞の増殖の誘導、ならびに／またはインターロイキン、インターフェロン、PD-1チェックポイント結合性タンパク質、HMGB1、MyD88、サイトカインもしくはケモカインの産生の誘導を行うタンパク質をコードする核酸を含む第１のベクターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えT細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（Tcr）を発現するように遺伝子組換えされた免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞はNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は遺伝子組換えNK細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞はマクロファージである。いくつかの実施形態において、前記骨髄系細胞は小膠細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球およびヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１のベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記レンチウイルスベクターはVpxタンパク質とともにパッケージングされている。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞および／またはNK細胞の抗腫瘍活性を補助または促進する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、TGFβRII、IL-1、IL-6、IL-7、IL-15、IL-2、IL-12、IL-18またはIL-21である。いくつかの実施形態において、IL-15は配列番号３５に示される配列によってコードされる。IL-15は、配列番号３６に示される配列を含むクローニング用フォワードプライマー、および配列番号３７に示される配列を含むクローニング用リバースプライマーを使用して増幅することができる。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγを含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1チェックポイント結合性阻害物質を含む。いくつかの実施形態において、前記PD-1チェックポイント結合性阻害物質は、PD-L1タンパク質またはその活性断片であり、該PD-L1タンパク質またはその活性断片とPD-1との結合は作動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記タンパク質はPD-1タンパク質の断片を含み、該PD-1タンパク質は、腫瘍細胞および／または腫瘍関連マクロファージによって発現されるPD-L1またはPD-L2と結合し、該PD-1タンパク質断片とPD-L1またはPD-L2との結合は���動性シグナルを発生させない。いくつかの実施形態において、前記PD-L1タンパク質断片は、PD-L1の62番目〜136番目のアミノ酸配列（配列番号７）を含む。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、PD-1チェックポイント結合性タンパク質と、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、T細胞ケモカインまたはNK細胞ケモカインである。いくつかの実施形態において、前記ケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCR4、CCL5、CCL7、CCL8/MCP-2、CCL11、CCL13/MCP-4、HCC-1/CCL14、CTAC/CCL17、CCL19、CCL22、CCL23、CCL24、CCL26、CCL27、VEGF、PDGF、リンホタクチン（XCL1）、エオタキシン、FGF、EGF、IP-10、TRAIL、GCP-2/CXCL6、NAP-2/CXCL7、CXCL8、CXCL10、ITAC/CXCL11、CXCL12、CXCL13またはCXCL15を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、Cas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む第２のベクター；および前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAをコードする核酸をさらに含み、CRISPRガイドRNAをコードする前記核酸は、第２のベクターまたは第３のベクターに組み込まれていてもよい。いくつかの実施形態において、第２のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記Cas9は、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記標的遺伝子は、PD-L1、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEである。いくつかの実施形態において、CRISPRを利用してPDL1を欠失させるための短鎖ガイドRNA用プライマーは、配列番号２０（CACCGGTCCAGATGACTTCGGCCTT）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２１（AAACAAGGCCGAAGTCATCTGGACC）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、PD-L1を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２２（TCCAGATGACTTCGGCCTTG）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列用プライマーは、配列番号２３（AGGAACACGCGAATGAGAACCC）に示される配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２４（TGCAAGGCATGGGGAGCATCTT）に示される配列を含むリバースプライマーとを含む。いくつかの実施形態において、IL-10を標的とする短鎖ガイドRNA配列は、配列番号２５（GGCTGGCCCTCACCCCAGT）に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え免疫細胞は、第２のタンパク質の転写および翻訳を活性化するCas9-VP64融合タンパク質をコードする第４のベクター；ならびに前記免疫細胞中の少なくとも１つの標的遺伝子に相補的なCRISPRガイドRNAを含む第５のベクターをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、IL-12p40、IL-15、IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-α/β/γ、IL-12、IL-18、IL-23またはGM-CSFである。いくつかの実施形態において、第４のベクターはmRNAである。いくつかの実施形態において、前記mRNAは、ヒト細胞などの真核細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は内在性の炎症促進遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的遺伝子は、TGF-β、IL-10、アルギナーゼ、HIF-1α、RAGE、CD206、IL-4、CCL22、CCL17、VEGF、EGF、WNT7βまたはPGEをコードする。いくつかの実施形態において、第１のベクターは、自殺遺伝子システムをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記自殺遺伝子システムは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSVTK）／ガンシクロビル（GCV）自殺遺伝子システムまたは誘導型カスパーゼ自殺遺伝子システムである。いくつかの実施形態において、前記タンパク質をコードする前記核酸は調節因子によって制御される。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、薬物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、エストロゲン受容体のリガンドなどのステロイドによって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記調節因子は、タモキシフェンおよび／またはその代謝産物によって誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記細胞は、マクロファージ、同種異系細胞、骨髄系細胞、単球および初代ヒト単球からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト単球である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、炎症促進性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前記免疫細胞は、マクロファージコロニー刺激因子とともに培養することによって、抗炎症性の表現型に分化誘導された免疫細胞である。
【０２６３】
当業者であれば、通常、本明細書に記載の用語、特に、添付の請求項（たとえば、添付の請求項の本体部）において使用されている用語は「オープンエンドな」用語であることを理解するであろう（たとえば、「含んでいる（including）」という用語は、「含んでいるが、これらに限定されない」と解釈されるべきであり、「有する（having）」という用語は、「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含む（include）」という用語は「含むが、これらに限定されない」と解釈されるべきである）。さらに、当業者であれば、特定の数について請求項に記載する場合、その記載の意図も請求項に明確に記載すべきであり、特定の数が記載されていない場合はその意図を記載する必要はないことを理解するであろう。分かりやすく説明をすれば、たとえば、後述の特許請求の範囲では、請求項を記載するために、「少なくとも１つ」や「１つ以上」といった前置きが記載されている場合がある。しかしながら、このような前置きが使用されているからといって、不定冠詞「１つ（aまたはan）」で記載された特定の請求項を、１つのみの要素を含む実施形態に限定すべきではなく、たとえ同じ請求項内に「１つ以上」または「少なくとも１つ」といった前置きと「１つ（aまたはan）」といった不定冠詞とが含まれていたとしても、１つのみの要素を含む実施形態に限定すべきではない（たとえば、「１つ（aおよび／またはan）」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味すると解釈されるべきである）。これは、請求項の記載において定冠詞が使用されている場合でも同じである。さらに、請求項に特定の数が明確に記載されていたとしても、当業者であれば、「少なくとも」記載されたその数であるということを理解するであろう（たとえば、修飾語を伴わない「２つ」という記載は、「少なくとも２つ」または「２つ以上」を意味する）。さらに、たとえば「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つ」などの頻用される語句が使用されている場合、通常、そのような文構造は、当業者がその語句を通常理解する意味で記載されている（たとえば、「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢを有するシステム、ＡとＣを有するシステム、ＢとＣを有するシステム、ならびに／またはＡ、ＢおよびＣを有するシステムなどを包含するが、これらに限定されない）。また、たとえば、「Ａ、ＢまたはＣのうちの少なくとも１つ」などの頻用される語句が使用されている場合、通常、そのような文構造は、当業者がその語句を通常理解する意味で記載されている（たとえば、「Ａ、ＢまたはＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢを有するシステム、ＡとＣを有するシステム、ＢとＣを有するシステム、ならびに／またはＡ、ＢおよびＣを有するシステムなどを包含するが、これらに限定されない）。さらに、当業者であれば、２つ以上の選択肢を表すための選言的用語および／または選言的語句は、ほぼすべて、明細書、特許請求の範囲または図面のいずれにおいても、列記された用語のうちの１つ、列記された用語の��ずれか、または列記された用語の両方を含む場合があると理解するであろう。たとえば、「ＡまたはＢ」という表現は、「ＡまたはＢ」または「ＡおよびＢ」を含む場合がある。
【０２６４】
さらに、本開示の構成要素または態様がマーカッシュ形式で記載されている場合、当業者であれば、マーカッシュ形式で記載された個々のメンバーまたはメンバーのサブグループについても記載されていると理解するであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ−Ｇ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１８Ｈ】
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【図１８Ｉ】
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【図１８Ｊ】
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【図１８Ｋ】
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【図１８Ｌ】
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【図１８Ｍ】
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【図１８Ｎ】
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【図１８Ｏ】
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【図１８Ｐ】
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【図１８Ｑ】
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【図１８Ｒ】
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【図１８Ｓ】
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【図１８Ｔ】
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【図１８Ｕ】
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【図１８Ｖ】
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【図１８Ｗ】
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【図１８Ｘ】
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【図１８Ｙ】
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【図１８Ｚ】
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【図１８ＡＡ】
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【図１８ＢＢ】
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【図１８ＣＣ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図１９Ｈ】
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【図１９Ｉ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２２Ｇ】
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【図２２Ｈ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２４Ａ−Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２７Ｆ】
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【図２７Ｇ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３２】
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【図３３】
2018528774.tif 000134
【配列表】
2018528774000001.app
【国際調査報告】
2018528774.tif 000135
2018528774.tif 000136
2018528774.tif 000137