(57)【要約】本開示は、ヘキソン、ペントン、ファイバー、及び非構造タンパク質をコードする遺伝子における変異の任意の組み合わせを有するＡｄ変異体（Ａｄ）であって、ヘキソン及びペントンの同時変異は、血管内ウイルス投与後の肝臓におけるＡｄの捕捉および毒性の減少をもたらす、Ａｄ変異体の生成および使用を説明する。そのような肝臓の非標的化Ａｄは、播種性転移性癌細胞を含む肝外組織および細胞への選択的かつ特異的な遺伝子送達のための有用なツールとなりうる。【選択図】図２６
2018504141.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペントンタンパク質のＲＧＤモチーフに変異を有する単離アデノウイルス（Ａｄ）であって、該変異は宿主細胞のβ３インテグリンの結合を減少させる、前記単離Ａｄ。
【請求項２】
変異は、挿入、欠失、または置換である請求項１のＡｄ。
【請求項３】
ペントンループのＲＧＤアミノ酸モチーフは、非ＲＧＤモチーフを含むペプチドと置き換えられ、非β３細胞インテグリンと結合できる、請求項１のＡｄ。
【請求項４】
ペントンループのＲＧＤアミノ酸モチーフは、非ＲＧＤモチーフを含むペプチドと置き換えられ、非インテグリンクラスの細胞膜受容体と結合できる、請求項１のＡｄ。
【請求項５】
宿主細胞は肝細胞である請求項１のＡｄ。
【請求項６】
ＡｄはＣ種Ａｄである請求項１のＡｄ。
【請求項７】
Ａｄは血清型５または２である請求項１のＡｄ。
【請求項８】
Ａｄは、ヘキソンタンパク質のＨＶＲ３、ＨＶＲ５、またはＨＶＲ７領域における変異をさらに含み、該変異はビタミンＫ依存性凝固因子の結合を減少させる、請求項１のＡｄ。
【請求項９】
ヘキソン変異は、挿入、欠失、または置換である請求項８のＡｄ。
【請求項１０】
ヘキソンＨＶＲ７領域変異は、ヒトＡｄ血清型５のＴＥＴアミノ酸モチーフにおける、トレオニン４２５のアラニンへの単一アミノ酸置換、Ｔ４２５Ａ、である請求項８のＡｄ。
【請求項１１】
凝固因子は第Ｘ因子である請求項８のＡｄ。
【請求項１２】
Ａｄはヘキソンタンパク質のＨＶＲ１領域における変異をさらに含み、該変異は肝臓におけるクッパー細胞とのウイルス相互作用を減少させる、請求項８のＡｄ。
【請求項１３】
ヘキソン変異は、挿入、欠失、または置換である請求項１２のＡｄ。
【請求項１４】
サイトカイン、細胞受容体、核内受容体、リガンド、凝固因子、ＣＦＴＲタンパク質、インスリン、ジストロフィン、成長ホルモン、真核生物または原核生物起源の、酵素の、免疫刺激または免疫抑制タンパク質、酵素阻害剤、抗がん効果を有するポリペプチド、細菌感染、寄生虫感染またはウイルス感染を抑制できるポリペプチド、抗体、毒、イムノトキシン、ｓｈＲＮＡ、ＬｎｃＲＮＡ、リボザイム、またはマーカーから選択された目的の遺伝子を含む、ことを特徴とする請求項８または請求項１２のＡｄ。
【請求項１５】
ペントンタンパク質のＲＧＤモチーフに変異を有するＡｄペントンタンパク質をコードしている単離核酸であって、該変異は、Ａｄで発現したとき、宿主細胞β３インテグリンタンパク質の結合を減少させる、前記単離核酸。
【請求項１６】
核酸はＡｄヘキソンタンパク質をさらにコードしており、ヘキソンタンパク質はヘキソンタンパク質のＨＶＲ３、ＨＶＲ５、またはＨＶＲ７領域に変異を含み、該変異は、Ａｄで発現したとき、ビタミンＫ依存性凝固因子の結合を減少させる、請求項１５の単離核酸。
【請求項１７】
核酸はＡｄヘキソンタンパク質をさらにコードしており、ヘキソンタンパク質はヘキソンタンパク質のＨＶＲ１領域に変異を含み、該変異は、Ａｄで発現したとき、クッパー細胞におけるウイルスの捕捉を減少させる、請求項１５または請求項１６の単離核酸。
【請求項１８】
薬学的に許容可能な担体と組み合わされた請求項１６または請求項１７に記載のＡｄを含む医薬組成物。
【請求項１９】
Ａｄは、複製欠損または複製弱化組み換えＡｄである請求項１８の医薬組成物。
【請求項２０】
Ａｄは、腫瘍細胞に於いて組み換えＡｄのみを複製するために、複製可能でありまたは複製制限される、請求項１８の医薬組成物。
【請求項２１】
宿主の肝臓におけるＡｄビリオンの隔離を回避するように、Ａｄを投与する方法であって、
ａ）ペントンタンパク質のＲＧＤモチーフに変異を有するＡｄを提供するステップであって、該変異は宿主正常肝臓細胞のβ３インテグリンの結合を減少させるステップ；
ｂ）宿主のビタミンＫ依存性凝固因子とのＡｄの結合を減少させるステップ；
および
ｃ）Ａｄのクッパー細胞への結合を減少させるステップ、
を含む、前記方法。
【請求項２２】
宿主のビタミンＫ依存性凝固因子とのＡｄの結合を減少させるステップは、
ヘキソンタンパク質のＨＶＲ３、ＨＶＲ５、またはＨＶＲ７領域に変異を有するＡｄを提供すること、を含み、
該変異はビタミンＫ依存性凝固因子の結合を減少させる、請求項２１の方法。
【請求項２３】
宿主のビタミンＫ依存性凝固因子とのＡｄの結合を減少させるステップは、
薬剤の存在によって宿主を処理すること、を含む請求項２１の方法。
【請求項２４】
薬剤の存在によって宿主を処理することによって、宿主のビタミンＫ依存性凝固因子とのＡｄの結合を減少させるステップは、
ワルファリンを投与すること、を含む請求項２１の方法。
【請求項２５】
クッパー細胞を少なくとも部分的に不活化する薬剤の介在によって宿主を処理するステップは、
クロドロネートリポソームを投与すること、を含む請求項２１の方法。
【請求項２６】
宿主のクッパー細胞とのＡｄの結合を減少させるステップは、
ヘキソンタンパク質のＨＶＲ１領域に変異を有するＡｄを提供すること、を含む請求項２１の方法。
【請求項２７】
ＡｄはＣ種Ａｄである請求項２１の方法。
【請求項２８】
Ａｄは血清型５または２である請求項２１の方法。
【請求項２９】
凝固因子は、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、およびにプロテインＣよって構成されるグループから選択される、請求項２１の方法。
【請求項３０】
肝臓以外の哺乳類細胞へ遺伝子を送達する方法であって、
ａ）ペントンタンパク質のＲＧＤモチーフに変異を有するＡｄを提供するステップであって、変異は正常肝臓細胞の宿主のβ３インテグリンの結合を減少させるステップ；
ｂ）ＨＶＲ１に変異を有するＡｄを提供するステップ；
ｃ）ＨＶＲ７に変異を有するＡｄを提供するステップ；
ｄ）Ａｄに宿主細胞を接触させるステップ、
を含む、前記方法。
【請求項３１】
肝臓以外の哺乳類細胞は哺乳動物の体内に含まれている、請求項３０の方法。
【請求項３２】
ａ）宿主のビタミンＫ依存性凝固因子とのＡｄの結合を減少させるステップ；および
ｂ）Ａｄのクッパー細胞への結合を減少させるステップ、
をさらに含む請求項３１の方法。
【請求項３３】
宿主のビタミンＫ依存性凝固因子とのＡｄの結合を減少させるステップは、
ヘキソンタンパク質のＨＶＲ３、ＨＶＲ５、またはＨＶＲ７領域に変異を有するＡｄを提供すること、を含み、
該変異はビタミンＫ依存性凝固因子の結合を減少させる、請求項３２の方法。
【請求項３４】
宿主のビタミンＫ依存性凝固因子とのＡｄの結合を減少させるステップは、
薬剤の存在によって宿主を処理すること、を含む請求項３２の方法。
【請求項３５】
薬剤の存在によって宿主を処理することによって、宿主のビタミンＫ依存性凝固因子とのＡｄの結合を減少させるステップは、
ワルファリンを投与すること、を含む請求項２６の方法。
【請求項３６】
宿主のクッパー細胞とのＡｄの結合を減少させるステップは、
ヘキソンタンパク質のＨＶＲ１領域に変異を有するＡｄを提供すること、を含む請求項３２の方法。
【請求項３７】
クッパー細胞を少なくとも部分的に不活化する薬剤の介在によって宿主を処理するステップは、
クロドロネートリポソームを投与すること、を含む請求項３２の方法。
【請求項３８】
ＡｄはＣ種Ａｄである請求項３２の方法。
【請求項３９】
Ａｄは血清型５または２である請求項３２の方法。
【請求項４０】
凝固因子は、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、およびにプロテインＣよって構成されるグループから選択される請求項３２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この国際出願は、ＰＣＴに基づいて出願され、その内容の全体が参照により本明細書に含まれる２０１５年１月２０日に米国に出願された米国仮出願第６２／１０５,２８４号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、受領機関としてワシントン大学に授与された米国国立衛生研究所からの助成金番号ＡＩ０６４８８２およびＡＩ０６５４２９の資金提供を受けてなされた。受領機関および米国政府は、２０１４年１０月２４日の発明者への手紙に記載されている発明者に対して、本発明に関する権利を放棄した。
【０００３】
この国際出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１６年１月１７日に作成された配列表ＡＳＣＩＩテキストファイル、ＰＣＴ３Ｍ配列表２．ｔｘｔを含む。ファイルサイズは４，５０８バイトである。
【０００４】
本発明は、遺伝子治療の分野に関し、より具体的には、血管内注入における炎症反応を弱め、且つ、物理的粒子レベルにて肝臓組織内への隔離を回避する新型のアデノウイルス（Ａｄ）ベクターに関する。これらのベクターは、造血および非造血性起源の器官を含む体内のあらゆる器官における、局在性および播種性の転移性がんの治療を含む遺伝子治療のために生体内で細胞を感染させるための安全かつ有用なツールとなりうる。
【背景技術】
【０００５】
アデノウイルス（Ａｄｓ）は、人体における治療介入のための有望なベクターである（Ｔｈｏｍａｓら、２００３）。生体外におけるＡｄと細胞との相互作用の生態に関する多大な知識にもかかわらず、生体内でのＡｄの感染力および生体内分布を支配する分子機構は、依然として不明なところが多いままである（Ｂａｋｅｒ,２００７；Ｋｈａｒｅら）。これはＡｄの血管内投与に重大なリスクをもたらし、生体内における特定の細胞および組織型に対する、安全で、選択的、および効率的なＡｄターゲッティングに大きな障害となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
血管内送達後のＡｄベクターの薬物動態学的研究は、投与されたウイルス量の大部分が肝臓によって循環から迅速に隔離されることを明らかにしている（ＡｌｅｍａｎｙおよびＣｕｒｉｅｌ、２００１；Ｄｉ Ｐａｏｌｏら、２００９ｂ；Ｋｈａｒｅら２０１１ａ）。総合的な生体内分析によって、肝臓組織によるＡｄ隔離を調整する全体的な分子機構は、重複して相乗的に作用することが見出されている（Ｄｉ Ｐａｏｌｏら、２００９ｂ）。具体的には、Ａｄ粒子は、３つの異なる細胞区画、すなわち、ｉ）肝実質細胞−肝細胞、ｉｉ）肝臓内マクロファージ、クッパー細胞、およびｉｉｉ）肝類洞内皮細胞、の間で肝臓組織内に分布していると現在考えられている。重要なことには、これらの細胞区分のうち１つのみとのＡｄ相互作用を除去しても、肝臓によるウイルス捕捉を防ぐことができず、２つの残りの細胞区画間のウイルスの代償的再分布が起こり、血液からのウイルスの定量的な除去を機能的に確実にする（Ｄｉ Ｐａｏｌｏら、２００９ｂ）。血管内ウイルス投与後、血液からＡｄ粒子を除去し、肝臓内でこれらを捕捉する働きをしうるこの機構の重複性の一般的な理解に関わらず、生体内の肝臓細胞とのＡｄ相互作用を誘導する正確な分子機構には、まだ議論の余地がある（Ｂａｋｅｒら、２０１３）。この議論および肝臓にＡｄ粒子を捕捉するように作用する機構の理解の欠如は、純粋にＡｄカプシドタンパク質の遺伝子（化学的ではない）修飾に基づいて、血管内ウイルス送達後に物理的粒子レベルにて肝臓内に隔離されることから逃れるＡｄｓの生成を可能にする、Ａｄベクター構造はこれまで報告されていない、という事実に究極的には明らかにされている。肝臓に隔離されたＡｄ粒子は破壊され、任意の肝臓外細胞への形質導入を達成するために大量のウイルス投与を必要とするので、肝臓におけるＡｄ捕捉は、遺伝子治療およびがん治療応用に有害である。静脈注射された高用量のＡｄは、致命的となりうる重度の全身炎症反応を活性化する（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ-Ｐｉｅｒｒｉら、２００４；Ｒａｐｅｒら、２００３；Ｒａｐｅｒら、２００２）。肝臓隔離および炎症活性を回避する新たなＡｄベクター及びこれを達成する方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、肝細胞、内皮細胞、及びクッパー細胞を含む肝臓細胞へのウイルスの結合を防ぎ、且つ、ウイルス粒子が血液中を循環した後、肝臓組織での捕捉および炎症反応が大幅に減少し又は完全に取り除かれるようにするために導入された、Ａｄペントン及びヘキソンタンパク質に同時に起こる遺伝子修飾を含む新型の改変されたＡｄベクターを提供する。
【０００８】
本発明の一つの実施形態は、ペントンタンパク質のＲＧＤモチーフに変異を有する単離Ａｄであって、変異は、マクロファージまたは内皮細胞などの生体内の宿主細胞のβ３インテグリンの結合を減少させ、且つ、生体内で血液中をウイルスが循環した後に炎症反応を大幅に低下させる。
【０００９】
本発明の好適な実施形態は、遺伝子治療用途に最も一般的に使用されるヒトＣ種血清型Ａｄ５ベースのベクターの一例において、１つの変異はＡｄペントンＲＧＤループにあり、２つの変異はＡｄヘキソン超可変ループ、特にループＨＶＲ１およびＨＶＲ７にある３つの同時変異が、生体内において肝臓細胞にウイルスが結合することを防ぐために必要であり十分である、新型のＡｄベクターを提供する。
【００１０】
また、本発明の実施形態の例は、ペントンタンパク質のＲＧＤモチーフに変異を含むＡｄペントンタンパク質をコードしている単離核酸であって、変異は、Ａｄで発現したとき、生体内の宿主細胞β３インテグリンタンパク質の結合を減少させる。
【００１１】
本発明は、Ａｄビリオンが生体内の宿主の肝臓での隔離を回避するように、Ａｄを投与する方法も提供する。この方法は、ａ）ペントンタンパク質のＲＧＤモチーフに変異を有するＡｄを提供するステップであって、変異は宿主正常肝臓細胞のβ３インテグリンの結合を減少させるステップ；ｂ）宿主のビタミンＫ依存性凝固因子とのＡｄの結合を減少させるステップ；およびｃ）Ａｄのクッパー細胞への結合を減少させるステップ、を含む。
【００１２】
本発明は、局在性および播種性の転移性がん細胞を含む、肝臓以外の哺乳類細胞へ遺伝子を送達する方法も提供する。この方法は、ａ）ペントンタンパク質のＲＧＤモチーフに変異を有するＡｄを提供するステップであって、変異は宿主の正常肝臓細胞のβ３インテグリンの結合を減少させるステップ；ｂ）Ａｄヘキソンタンパク質超可変領域１、ＨＶＲ１に変異を有するＡｄを提供するステップ；ｃ）Ａｄヘキソンタンパク質超可変領域７、ＨＶＲ７に変異を有するＡｄを提供するステップ；およびｃ）生体内においてＡｄに宿主細胞を接触させるステップ、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、記述と共にいくつかの実施形態を説明し、開示された組成物および方法を説明する。
【図１】図1は、静脈内ウイルス注射後における肝臓組織での血液由来Ａｄの隔離がファイバー構造に依存しないことを示す。静脈内Ａｄ注射の1時間後、肝臓をマウスから回収し、全ＤＮＡを本明細書に記載のように精製した。ＨｉｎｄＩＩＩ酵素で消化した全ＤＮＡの１０μgをアガロースゲルに負荷した。Ｎｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜に移した後、フィルターをマウスβ-グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）特異的プローブとハイブリダイズさせて等価な負荷を確認した。続いて、膜を剥がし、Ａｄ特異的プローブ（Ａｄ）で再ハイブリダイズさせた。Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＰＢＳのみを注射したマウスの肝臓から精製したＤＮＡ。
【図２】図２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃは、血液凝固因子へのウイルス結合とは無関係に生じる、静脈内ウイルス注射後における肝臓組織での血液由来Ａｄの隔離を示す。図２Ａは、模擬処理されたマウス（Ａｄ５レーン）又はワルファリンで前処理されたマウス（ワルファリンレーン）に、Ａｄ５ベクターを注射し、ウイルス注射の１時間後に肝臓を摘出し、図1に記載したようにサザンブロット法のために処理したことを示す。各レーンは、Ａｄ（生物学的複製物）を個々に注射したマウスから摘出した肝臓サンプルを表す。図２Ｂは、ワルファリン処理されたマウス又は模擬処理コントロールマウスのクッパー細胞（ＫＣｓ）とＡｄベクターとの関連を示す。Ａｄ５は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に注射された。１時間後、肝臓を回収し、ＯＣＴコンパウンド中で直ちに凍結させた。ＫＣｓを視覚化するために、固定された肝臓切片を抗Ｆ４／８０抗体（緑色）で染色した。肝臓切片をＣｙ３標識抗ヘキソンポリクローナルＡｂｓ（赤色）で染色した後、Ａｄ粒子を可視化した。代表的なフィールドの画像を赤および緑のフィルターで撮影し、重ね合わせ、ＡｄとＫＣｓとの関連を明らかにした（合わさると黄色）。クッパー細胞特異的染色とＡｄ特異的染色との重複は、矢印で示されている。図２Ｃは、静脈内ウイルス注射の１時間後に肝臓に存在する野生型ヒトＡｄのゲノムのサザンブロット分析を示す。示された血清型に対するＦＸ結合の親和性が示されている。Ｇｕｓ−マウスβ−グルクロニダーゼ遺伝子。Ｃｏｎｔｒｏｌ−ウイルス希釈緩衝液（ＰＢＳ）のみを注射したマウス由来の肝臓ＤＮＡ。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、血液凝固因子の不活性化が肝洞様内皮細胞のＡｄ形質導入をもたらすことを示す。図３Ａは、コントロール、模擬処理およびワルファリン処理マウスにおける全身性ベクター適用後のＡｄ５ＲＦＰによる肝細胞の生体内形質導入を示す。静脈内Ａｄ注射の２４時間後、肝臓を回収し、ホルマリン固定組織の連続切片を準備した。ＲＦＰ蛍光を可視化するために、紫外線下で切片の画像を撮影した。代表的なフィールドが示されている。倍率は、パネルの２つの左のセットで２００倍、右のパネルのセットでは４００倍である。ワルファリンによるマウスの処理は、肝細胞の形質導入を完全に排除することに留意されたい。しかしながら、シヌソイド内皮細胞は、ワルファリン処理マウスにおいてＲＦＰ（矢印で示されている）を発現する。２つの代表的なフィールドが示されている。図３Ｂは、フローサイトメトリーを用いたワルファリン処理マウスにおけるＲＦＰ発現細胞の表面マーカーの分析を示す。ＲＦＰ発現細胞は、内皮細胞マーカーであるＣＤ３１に対する抗体で陽性に染色されることに留意されたい。
【図４】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、及び４Ｄは、クッパー細胞の排除が、肝臓での血液由来Ａｄの隔離を妨げないことを示す。図４Ａは、野生型マウス（ＷＴ）又はスカベンジャー受容体Ａ遺伝子ノックアウトマウス（ＳＲ−Ａ−ＫＯ）のクッパー細胞とＡｄベクターとの関連を示す。静脈内ウイルス注射の１時間後、肝臓を回収し、ＯＣＴコンパウンド中で直ちに凍結させた。ＫＣｓを視覚化するために、固定された肝臓切片を抗Ｆ４／８０抗体（緑色）で染色した。肝臓切片をＣｙ３標識抗ヘキソンポリクローナルＡｂｓで染色した後、Ａｄ粒子を可視化した。代表的なフィールドの画像を赤および緑のフィルターで撮影し、重ね合わせ、ＡｄとＫＣｓとの関連を明らかにした。クッパー細胞特異的染色とＡｄ特異的染色との重複は、矢印で示されている。図４Ｂは、静脈内ウイルス注射の１時間後に野生型およびＳＲ−Ａ−ＫＯマウスの肝臓に関連するＡｄベクターゲノムのサザンブロット分析を示す。生物学的重複が示されている。Ｇｕｓ−マウスβ−グルクロニダーゼ遺伝子。Ｃｏｎｔｒｏｌ−ウイルス希釈緩衝液（ＰＢＳ）のみを注射したマウス由来の肝臓ＤＮＡ。図４Ｃは、本明細書に記載のクロドロネートリポソームで処理された野生型マウスを示す。静脈内ウイルス注射の１時間後、肝臓を回収し、ＯＣＴコンパウンド中で直ちに凍結させた。ＫＣｓを視覚化するために、固定された肝臓切片を抗Ｆ４／８０抗体で染色した。クロドロネートリポソームによるマウスの処理は、肝臓からクッパー細胞を完全に排除することに留意されたい。図４Ｄは、静脈内ウイルス注射の１時間後に野生型およびクロドロネートリポソームで処理されたマウスの肝臓に関連するＡｄベクターゲノムのサザンブロット分析を示す。Ｇｕｓ−マウスβ−グルクロニダーゼ遺伝子。Ｃｏｎｔｒｏｌ−ウイルス希釈緩衝液（ＰＢＳ）のみを注射したマウス由来の肝臓ＤＮＡ。
【図５】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ，及び５Ｄは、ワルファリン及びクロドロネートリポソームによるマウスの処理が、静脈内ウイルス投与後に肝臓によって隔離されたＡｄ ＤＮＡの量の部分的な減少を可能にすることを示す。図５Ａは、静脈内ウイルス注射の１時間後の野生型マウスの肝臓に関連するＡｄベクターゲノムのサザンブロット分析を示す。マウスは、ワルファリンのみで、又はワルファリンとクロドロネートリポソームとの組み合わせで、処理された。グループごとに重複したサンプルが示されている。Ｇｕｓ−マウスβ−グルクロニダーゼ遺伝子。Ｃｏｎｔｒｏｌ−ウイルス希釈緩衝液（ＰＢＳ）のみを注射したマウス由来の肝臓ＤＮＡ。図５Ｂは、対応するベクターのＧｕｓ遺伝子シグナル強度に対するＡｄ ＤＮＡシグナル強度を調整した後の（Ａ）に示すＡｄ特異的バンドのホスフォイメージャー分析によって決定された肝臓におけるＡｄ蓄積の定量的表示を示す。＊‐Ｐ＜０．０５。図５Ｃは、静脈内ウイルス注射の１時間後にワルファリンで又はワルファリンとクロドロネートリポソームとの組み合わせで処理したマウスの肝臓におけるＡｄ粒子の分布を示す。肝臓切片を抗Ｆ４／８０抗体で染色してクッパー細胞（緑色）を検出し、抗Ａｄヘキソン抗体でＡｄ粒子（赤色）を検出した。ワルファリン処理動物において多数のＡｄ粒子はクッパー細胞と共局在したが、両方の薬物で処理したマウスにおいてＡｄ粒子は肝洞様毛細血管と関連していたことに留意されたい。図５Ｄは、ワルファリン及びクロドロネートリポソームの両方で処理したマウスの肝臓の内皮細胞下ディッセ腔に局在するＡｄ粒子（矢印で示されている）を示す。電子顕微鏡分析は、静脈内ウイルス注射の１時間後に摘出した肝臓の超薄切片に対して行った。Ｓ−肝臓洞様毛細血管空間；Ｈ−肝細胞；Ｄ−ディッセ腔。倍率は２１，０００倍である。
【図６】図６Ａ、６Ｂは、静脈内ウイルス注射の１時間後の肝組織におけるＡｄ分布の可視化を示す。図６Ａは、ディッセ腔で肝類洞に存在するＡｄ粒子を示す；主画像の倍率：４，４００倍；拡大画像２１，０００倍。図６Ｂは、ディッセ腔における自由Ａｄ粒子の分布（矢印で示されている）を示す代表的な画像を示す。倍率は７，５００倍である。Ｓ−肝臓洞様毛細血管空間；Ｈ−肝細胞；Ｄ−ディッセ腔。
【図７】図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ，７Ｄは、ＡｄペントンＲＧＤモチーフが、肝臓における血液由来Ａｄの隔離を支持する役割を果たすことを示す。図７Ａは、ワルファリン及びリポソームの組み合わせで処理し、Ａｄ５ベクターを静脈注射した、野生型（ＷＴ）又はβ３−インテグリンノックアウトマウス（β３−ＫＯ）を示す。薬物処理に加えて、ＷＴマウスにもＡｄ５ΔＲＧＤベクターを注射した。ウイルス注射の１時間後、肝臓を摘出し、全肝臓ＤＮＡを精製し、次いで図１に記載のようにサザンブロット分析した。グループごとに重複したサンプルが示されている。Ｇｕｓ−マウスβ−グルクロニダーゼ遺伝子。Ｃｏｎｔｒｏｌ−ウイルス希釈緩衝液（ＰＢＳ）のみを注射したマウス由来の肝臓ＤＮＡ。図７Ｂは、対応するベクターのＧｕｓ遺伝子シグナル強度に対してＡｄ ＤＮＡシグナル強度を調整した後の（Ａ）に示すＡｄ特異的バンドのホスフォイメージャー分析によって決定された肝臓におけるＡｄ蓄積の定量的表示を示す。〜Ｐ＜０．０５。＊＊‐Ｐ＜０．０５。図７Ｃは、静脈内ウイルス注射１時間後の野生型またはβ３−ＫＯマウスの肝臓におけるＡｄ粒子の分布を示す。肝臓切片を抗Ｆ４／８０抗体で染色してクッパー細胞（緑色）を検出し、抗Ａｄヘキソン抗体でＡｄ粒子（赤色）を検出した。クッパー染色とＡｄ特異的染色の共局在は（合わされて）黄色で表示され、矢印で示されている。図７Ｄは、静脈内注射の１時間後にワルファリンとクロドロネートリポソームとの組み合わせで処理したマウスの肝臓におけるＡｄ及びＡｄ５ΔＲＧＤ粒子の分布を示す。肝臓切片を抗Ｆ４／８０抗体で染色してクロドロネートリポソーム（緑色）によるクッパー細胞の完全な排除を確認にし、ＤＡＰＩ（青色）及び抗Ａｄヘキソン抗体で染色してＡｄ粒子（赤色）を検出した。
【図８】図８Ａ及び８Ｂは、ワルファリン及びクロドロネートリポソームの両方で処理したマウスにおいてのみ、肝臓における血液由来Ａｄ５ΔＲＧＤベクターの隔離が減少することを示す。図８Ａは、生理食塩水、ワルファリン、クロドロネートリポソーム、又はワルファリンとリポソームとの組み合わせで個々に処理され、Ａｄ５ΔＲＧＤベクターが静脈注射された野生型マウスを示す。ウイルス注射の１時間後、肝臓を摘出し、全肝臓ＤＮＡを精製し、次いで図１に記載のようにサザンブロット分析した。グループごとに重複したサンプルが示されている。Ｇｕｓ−マウス１３−グルクロニダーゼ遺伝子。Ｃｏｎｔｒｏｌ−ウイルス希釈緩衝液（ＰＢＳ）のみを注射したマウス由来の肝臓ＤＮＡ。図８Ｂは、対応するベクターのＧｕｓ遺伝子シグナル強度のＡｄ ＤＮＡシグナル強度を調整した後の（Ａ）に示すＡｄ特異的バンドのホスフォイメージャー分析によって決定された肝臓におけるＡｄ５ΔＲＧＤ蓄積の定量的表示を示す。＊Ｐ＜０．０５。
【図９】図９は、血液由来Ａｄの隔離を仲介する肝臓における細胞区画の概略図を示し、それらを不活性化するアプローチを示す。ＣＬ−クロドロネートリポソーム；ＰＩ−ポリイノシン酸；ＦＸ−ｂｐ−ＦＸ結合タンパク質。
【図１０Ａ】図１０は、ヘキソン（ｐＩＩ）およびペントンベース（ｐＩＩＩ）タンパク質の両方に同時に変異を有し、血管内注射後の肝臓でのウイルス捕捉を防ぐ、単一ＡｄゲノムＤＮＡ及びウイルス粒子カプシド、及び、ヘキソン及びペントン変異の機能的効果を説明する本発明の実施形態を示す。
【図１０Ｂ】同上
【図１１−１】図１１Ａ及び１１Ｂは、Ａｄ５及び他の代表的なヒトＡｄ血清型Ａｄ３、Ａｄ１６、Ａｄ１４およびＡｄ３５のアミノ酸配列アライメントを示し、Ａｄヘキソンタンパク質の溶媒露出表面局在化超可変ループのコンセンサス位置および多様性を示す。ヘキソンの超可変露出ループ１−９（ＨＶＲ１‐ＨＶＲ９）には下線が引かれている。ＨＶＲ３及びＨＶＲ７内の保存的凝固因子結合モチーフＴＤＴ及びＴＥＴの正確な部分は囲まれている。
【図１１−２】同上。
【図１１Ｂ】同上。
【図１２】図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、及び１２Ｄは、Ａｄ５ヘキソン上の推定の第Ｘ因子結合部位の決定を示す。図１２Ａは、最も強いＦＸ密度（赤色）とともにＡｄ５−ＦＸ複合体（青色）のＣｒｙｏＥＭ構造を示す。ＦＸ密度は、Ａｄ５−ＦＸ複合体のものからＡｄ５カプシドのｃｒｙｏＥＭ再構築を差し引くことによって提供された。最も強いＦＸ密度は、各ヘキソン三量体の中央くぼみ部に現れる。スケールバー、１００Å。図１２Ｂは、リボン表示および３０オームストロングの解像度（透明灰色）にフィルターされた密度マップで示されたＡｄ５ヘキソン（ＰＤＢ  １Ｐ３０）の結晶構造を示す。ヘキソンＨＶＲ７残基４２３−４２５（ＴＥＴ）は、黄色の空間充填表示で示されている。Ａｄ３、Ａｄ２１及びＡｄ５０ヘキソンに見られるＨＶＲ３ ＴＤＴ残基の位置は、対応するＡｄ５残基２１２−２１４によってシアンで示される。４５度の傾斜図および上面図の両方が示されている。図１２Ｃは、最も強いＦＸ密度（赤色）とともに示された（図１２Ｂ）におけるＡｄ５ヘキソントリマーの適合した結晶構造を有するヘキソン密度の平面図を示す。図１２Ｄは、ＦＸ結合について試験した１１種類のヒトＡｄ血清型に対するヘキソンＨＶＲ３及びＨＶＲ７領域のアミノ酸配列アライメントを示す（表１）。ＦＸ結合のために提案された２つの代替部位の位置はアステリスクで示されている。ＦＸ結合と関連する配列ＴＤＴ及びＴＥＴは、ＨＶＲ３内のシアン及びＨＶＲ７内の黄色で強調されている。ＦＸ結合親和性を除去または減少させることができる、陽性に帯電した近くのＡｒｇ残基は緑色で強調されている。赤い線は、ＦＸに結合するＡｄ血清型（線の上）を、ＦＸに結合しないもの（線の下）から区別する。
【図１３】図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ，１３Ｄ、１３Ｅ、及び１３Ｆは、分子動力学的フレキシブルフィッティング（ＭＤＦＦ）を用いたＦＸ−Ａｄ５複合体のＣｒｙｏ−ＥＭ構造およびＦＸ−ヘキソン界面のシミュレーションを示す。図１３Ａは、ＦＸと複合したＡｄ５のｃｒｙｏ−ＥＭ構造を示す。青色でヘキソンカプシド、金色でペントンベース、緑色でファイバー、及び赤色でＦＸ、の密度が示されている。スケールバー、１００Å。図１３Ｂは、ヘキソンカプシド上のＦＸ密度のネットワークを示す、ＦＸ−Ａｄ５複合体の拡大図を示す。図１３Ｃは、ＦＸｃｒｙｏ−ＥＭ密度（透明ピンク）内での酵素原ＦＸモデル（赤色リボン）の最良の剛体適合配向を示す。このＦＸ密度は、カプシドの正２０面体の３軸の近くのヘキソンの上から選択される。図１３Ｄは、ＦＸ−ＧＬＡ領域の残基Ｋ１０を取り囲むヘキソン残基Ｅ４２４及びＴ４２５を示す、ＭＤＦＦシミュレーションにおけるフレームからの座標を示す。これら３つの残基の側鎖は、空間充填表示で示され、要素によって着色されている。図１３Ｅは、ヘキソン三量体の中央くぼみ部におけるＦＸ−ＧＬＡ領域および関連Ｃａ２＋イオン（緑色）を示す。図１３Ｆは、ＦＸ−ＧＬＡ領域中の残基Ｋ１０がヘキソンのＥ４２４及びＴ４２５に十分接近していて、静電相互作用に関与することを示す（点線で示されている）。
【図１４−１】図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、１４Ｄ、１４Ｅ、１４Ｆ、１４Ｇ、１４Ｈは、単一のアミノ酸置換Ｔ４２５ＡがＡｄ５へのＦＸ結合を無効にすることを示す。図１４Ａは、Ｔ４２３−Ｅ４２４−Ｔ４２５アミノ酸および変異ヘキソンを有する個々のウイルスのこの領域に導入されたアミノ酸置換（赤で示されている）を示すＡｄ５ヘキソン超可変ループ７（ＨＶＲ７）の領域の概略図を示す。図１４Ｂは、表面プラズモン共鳴分析（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ピッツバーグ、ペンシルベニア州）を用いて得られた示された変異ウイルスへのＦＸ結合に対する動的応答データおよび解離定数（Ｋｄ）を示す。黒は実験的に得られたデータを示す。オレンジは、１：１  単一サイト相互作用モデルへのこれらのデータの全体的適合を示す。４つの独立した実験から得られた代表的なデータが示されている。図１４Ｃから１４Ｆは、ヘキソン変異ウイルスの生体外および生体内分析を示す。図１４Ｃは、ＦＸ（８μｇ  ｍｌ−１）の添加あり又はなしで示されたウイルスによるＣＨＯ−Ｋ１細胞の感染を示す。細胞を１細胞当たり２００ｖ．ｐ．の感染多重度で感染させた。ウイルスにコードされたＧＦＰ受容体タンパク質の平均蛍光強度を、ウイルス感染の２４時間後にフローサイトメトリーによって分析した。Ｎ＝６。＊Ｐ＜０．０１。ｎ．ｓ．−有意差なし。
【図１４−２】図１４Ｄは、マウスにＷＴ Ａｄ５（ＷＴ）または変異ウイルスを静脈内感染させた４８時間後のマウス肝細胞におけるウイルスコードＧＦＰ発現の組織学的分析を示す。代表的なフィールドが示されている（ｎ＝５生物学的複製物）。 ＧＦＰ発現は、固定された肝臓切片上で緑色蛍光として観察される。４´、６−ジアミジノ−２−フェニルインドールチャンネル（青、核特異的染色）の対応するフィールドが示されている。スケールバー、１００μｍ。図１４Ｅは、（図１４Ｄ）に示すマウスの肝臓におけるＧＦＰ発現のＧＦＰシグナル定量化（図１４Ｆ）およびウェスタンブロット分析を示す。各ウイルスの生物学的重複サンプルが示されている。図１４Ｇは、共焦点顕微鏡法により分析した示されたウイルスの感染から１時間後に観察された脾臓ＣＤ１６９＋及びＭＡＲＣＯ＋辺縁帯マクロファージ（緑色）とウイルス粒子（赤色）との共局在化を示す。図１４Ｈは、辺縁帯マクロファージと共局在したＡｄ粒子（赤色）の高倍率画像を示す。スケールバー、１００μｍ。代表的なフィールドが示されている。ｎ＝５生物学的複製物。
【図１５】図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｄ、１５Ｅ、１５Ｆは、ＦＸへのＡｄ５の結合が、生体内でＴＬＲ４−ＴＲＩＦ／ＭｙＤ８８−ＴＲＡＦ６シグナル伝達軸の下流にＮＦ−κＢ１依存性炎症性サイトカインおよびケモカインを誘導することを示す。図１５Ａは、プロテオームプロファイラー抗体アレイによって決定された、ＨＡｄｖ５またはＴＥＡ変異体での感染から１時間後のＷＴマウスの脾臓における炎症性サイトカインおよびケモカインの差異を示すマウスサイトカインアレイパネルを示す。４つの独立した実験からの代表的なブロットが示されている。Ｃ、生理食塩水を曝露したマウス。図１５Ｂは、示されたウイルス曝露から３０分後のＷＴマウスの脾臓におけるＩＬ−１βのｍＲＮＡ発現を示す。グラフは平均±ＳＤを示す。ｎ＝４生物学的複製物。＊＊Ｐ＜０．０１。ＡＵ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡに対するＩＬ−１β比を反映する任意の単位。図１５Ｃ及び１５Ｄは、ＨＡｄｖ５を曝露した３０分後における、ＷＴマウス及び示された遺伝子を欠損したマウスの脾臓におけるＩＬ−１βのｍＲＮＡ発現を示す。グラフは平均±ＳＤを示す。ｎ＝４生物学的複製物。＊＊Ｐ＜０．０１。ＡＵ、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対するＩＬ−１β比を反映する任意の単位。図１５Ｅは、プロテオームプロファイラー抗体アレイによって決定された、ＨＡｄｖ５曝露から１時間後のＷＴ及びＭｙｄ８８−／− 、Ｔｉｃａｍ１−／−、Ｔｌｒ４−／−、およびＭｄ２−／−マウスの脾臓における炎症性サイトカインおよびケモカインの差を示すマウスサイトカインアレイパネルを示す。４つの独立した実験からの代表的なブロットが示されている。Ｃ、生理食塩水を曝露したマウス。図１５Ｆは、プロテオームプロファイラー抗体アレイを用いて決定された、示された血清型のＷＴヒトＡｄ曝露から１時間後における、ＷＴマウスの脾臓における炎症性サイトカインおよびケモカインの差異を示すマウスサイトカインアレイパネルを示す。４つの独立した実験からの代表的なブロットが示されている。Ｃ、生理食塩水で擬似感染させたマウス。
【図１６−１】図１６は、異なるヒトＡｄ血清型由来のペントンベースタンパク質（ｐＩＩＩ）のアミノ酸配列アライメントを示す図である。大きな超可変露出ＲＧＤモチーフ含有ループは強調されている。
【図１６−２】同上。
【図１７】図１７は、Ａｄ５ペントンベースＲＧＤモチーフ含有ループに導入された変異の一例を示す。この変異は細胞インテグリンに対するペントン結合を除去する。ＲＧＤループからのＲＧＤトリ−アミノ酸モチーフの欠失の一例。
【図１８−１】図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｄ、１８Ｅ、１８Ｆは、Ａｄ５によるβ３インテグリンの関与が自然免疫応答の開始に関わることを示す。図１８Ａは、ウイルス注射から３０分後に、野生型マウス（ＷＴ）及びβ3、β5インテグリンノックアウトマウス、又は造血細胞におけるβ１インテグリン条件付きノックアウトマウス（β１−／−）、およびそのペントンタンパク質内のＲＧＤモチーフが欠損しているＡｄ変異体（Ａｄ５ΔＲＧＤ）が注射された野生型マウス、の脾臓におけるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＫＣ及びＭＴＰ−２のｍＲＮＡレベルを示す。Ｎ＝３。Ｃ−生理食塩水を注射された偽感染マウス。図１８Ｂは、ホスフォイメージャー分析後の（１８Ａ）に示されたゲルからのｍＲＮＡレベルの定量的表示を示す。Ｎ＝６。実験群と模擬注射コントロール［Ｃ］またはＡｄが注射されたＷＴとの間の統計的に有意な差は、星によって示されている。＊‐Ｐ＜０．０１。Ａｄ５ΔＲＧＤが注射されたＷＴマウスは矢印で示されている。ＡＵ−任意の単位。
【図１８−２】図１８Ｃは、（１８Ａ）に示されるマウスの肝臓におけるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、及びＭＩＰ−２ ｍＲＮＡレベルを示す。Ｎ＝３。図１８Ｄは、ホスフォイメージャー分析後の（１８Ｃ）に示されたゲルからのｍＲＮＡレベルの定量的表示を示す。Ｎ＝６。実験群とＡｄが注射されたＷＴマウスとの間の統計的に有意な差は、星によって示されている。＊‐Ｐ＜０．０１。
【図１８−３】図１８Ｅは、ウイルス注射から１時間後に、Ａｄ又はＡｄ５ΔＲＧＤが注射された、インテグリンβ1、β2、β3ノックアウトマウス若しくはＷＴマウスの脾臓におけるサイトカインおよびケモカインのタンパク質レベルを示す。Ｎ＝４。Ｐｏｓ−Ｃは、膜上の製造業者の内部陽性コントロールサンプルを示すドットである。Ｃｏｎｔｒｏｌ−生理食塩水が注射されたマウスの脾臓タンパク質サンプル。図１８Ｆは、Ａｄ注射の１時間後のマウスの脾臓におけるサイトカインおよびケモカインの量を示す。Ｎ＝４。Ｍｏｃｋ−生理食塩水が注射された陰性コントロールマウス。実験群とＡｄが注射されたＷＴマウスとの間の統計的に有意な差は、星によって示されている。＊‐Ｐ＜０．０１。
【図１９】図１９は、Ａｄが注射されたＷＴマウスおよびβ３インテグリンノックアウトマウス、又はＡｄΔＲＧＤ変異体が注射されたマウス、における辺縁帯マクロファージの核へのＩＬ−１α移行の共焦点顕微鏡法分析を示す。マウスに高用量の指示されたウイルス（マウス当たり１０１１個のウイルス粒子）を静脈注射し、３時間後に脾臓を摘出し、切片を調製し、ＣＤ１６９（緑色）またはＩＬ−１α（赤色）に特異的なＡｂｓと同様に、ＤＡＰＩ（青色）で染色して脾細胞の核を検出した。共焦点画像は、Ｚｅｉｓｓ５１０Ｍｅｔａ Ｃｏｎｆｏｃａｌ顕微鏡を用いて得られた。脾臓の胚中心の物理的境界は、点線で示されている。ＩＬ−１αを発現する辺縁帯マクロファージは矢印で示されている。代表的な画像が示されている。Ｎ＝４。
【図２０】図２０は、Ａｄ５ペントン改変ベクターおよびＡｄ５ペントンＲＧＤループに導入された大きな置換の具体例の設計の略図を示し、これには、ヒトラミニン１（５０アミノ酸長）又はラミニン３（５４アミノ酸長）とのアミノ酸配列に対する天然Ａｄ５ペントンアミノ酸配列の置換、得られたベクターの夫々Ｌａｍ１及びＬａｍ３として指定、が含まれる。ｄＲＧＤは、ペントンタンパク質に欠失したＲＧＤアミノ酸を含むＡｄ５ΔＲＧＤウイルスである。示されているアミノ酸の番号付けは、野生型Ａｄ５ペントンのアミノ酸番号付けに対応している。
【図２１】図２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃ、及び２１Ｄは、ペントンおよびヘキソンのＦＸ結合部位における同時変異の導入が、血管内投与後の肝臓におけるＡｄ隔離を妨げないことを示す。図２１Ａ及び２１Ｂは、ペントン（図２０に示すＬａｍ３置換変異）およびヘキソンＨＶＲ７Ｔ４２５Ａ置換の両方に変異を含むＡｄ５ベースベクターＡｄ−２Ｍの構造決定因子を示す。マウス当たり２×１０１０個のウイルス粒子の用量による示されたベクターの静脈内注射の１時間後、肝臓におけるＡｄゲノムＤＮＡの量の定量的ＰＣＲ分析が実施された。Ａｄ−ＷＴは、カプシドタンパク質に変異を含まないＡｄ５ベースベクターである。Ａｄ−ＴＥＡは、ヘキソンＨＶＲ７、Ｔ４２５Ａにおける単一のアミノ酸置換を含むベクターであり、血液凝固因子の結合を排除する。Ａｄ−Ｌａｍは、図２０に示されるように、ペントンＲＧＤループ内のＬａｍ３置換を含むＡｄベクターである。図２１Ｄは、静脈内ウイルス注射の１時間後に肝臓に於けるＦ−４／８０陽性クッパー細胞（緑色）とＡｄ−ＷＴおよびＡｄ−２Ｍとのビリオンの共局在化（矢印で示す）を示す。ウイルスを抗ヘキソンＡｂ（赤色）で染色した。クッパー細胞はＡｄ−ＷＴおよびＡｄ−２Ｍベクターの両方を効率的に蓄積することに留意されたい。
【図２２】図２２は、示された代表的なヒト血清型のヘキソン超可変ループ１（ＨＶＲ１）アミノ酸の配列および長さの自然変動、および天然アミノ酸配列の代わりにＡｄ５ヘキソンＨＶＲ１へ導入されアミノ酸１３６Ｄ及び１６５Ｔの間に位置するＨＶＲ１欠失／置換変異体のアミノ酸配列を示す。このＨＶＲ１変異は、ＨＶＲ７におけるＴ４２５Ａ変異およびペントンＬａｍ３変異／置換に加えて、Ａｄ５ベースベクターに導入され、新型のベクター、Ａｄ−３Ｍの生成をもたらす。この新型のベクターＡｄ−３Ｍは、３つの特異的かつ別個のカプシドタンパク質変異を同時に含み、本発明の好ましい実施形態を表す。
【図２３】図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃ、２３Ｄ、および２３Ｅは、カプシドタンパク質に３つの特異的かつ個別の変異を含む新型のＡｄ５ベースベクターＡｄ−３Ｍが、マウスにおける血管内注射後、肝臓における隔離を逃れ、炎症反応を大きく減弱させることを示す。図２３Ａは、ヒトラミニン−３由来の非ＲＧＤ含有アミノ酸配列とのペントンＲＧＤループの置換（図２０に示す）、ヘキソンＨＶＲ７点変異Ｔ４２５Ａ、およびＨＶＲ１欠失／置換（図２２に示す）、を含むＡｄ−３Ｍベクターのカプシドにおける変異の構造的局在を示す。図２３Ｂは、マウス当たり２×１０１０個のウイルス粒子の用量による示されたベクターの静脈内注射の１時間後、肝臓におけるＡｄゲノムＤＮＡの量の定量的ＰＣＲ分析を示す。Ａｄ−ＷＴは、カプシドタンパク質に変異を含まないＡｄ５ベースベクターである。Ａｄ−２Ｍは、血液凝固因子の結合を排除する、ヘキソンＨＶＲ７における単一のアミノ酸置換、Ｔ４２５Ａ、および図２０に示されるようにペントンＲＧＤループ内のＬａｍ３置換を含む。Ａｄ−３Ｍは、図２２に示すように、カプシドタンパク質における３つの同時変異−Ａｄ−２Ｍと同一の２つの変異及びＨＶＲ１欠失／置換を含む。静脈内ウイルス投与の１時間後の肝臓におけるＡｄ−３ＭゲノムＤＮＡの蓄積の有意な減少に注目されたい。図２３Ｃは、静脈内ウイルス注射の１時間後の肝臓における、Ａｄ−ＷＴのビリオンとＦ−４／８０−陽性クッパー細胞（緑色）との共局在化（矢印で示す）、およびＡｄ−３ＭビリオンとＦ−４／８０−陽性クッパー細胞（緑色）との共局在の欠如、を示す 。ウイルスを抗ヘキソンＡｂ（赤色）で染色した。クッパー細胞は、Ａｄ−ＷＴを効率的に蓄積するが、Ａｄ−３Ｍウイルス粒子は蓄積しないことに留意されたい。図２３Ｄは、示されたベクターの２×１０１０個のウイルス粒子の静脈注射の１時間後の脾臓のマウス炎症性抗体アレイプロファイリングによって決定された、コントロール非改変Ａｄ−ＷＴベクター及びカプシドに３つの変異を有するＡｄ−３Ｍベクターの生体内における炎症プロファイルを示す。Ｍｏｃｋ−生理食塩水が注射されたマウス。コントロール非改変Ａｄ−ＷＴ（Ａｄ５）ベクターが注射されたマウスと比較して、Ａｄ−３Ｍが注射されたマウスの脾臓において観察された全ての炎症促進性サイトカインおよびケモカインの量の大幅な減少に注目されたい。Ｎ＝３。図２３Ｅは、マウスへのＡｄ−３Ｍベクターの静脈内投与が肝臓におけるクッパー細胞の壊死を引き起こさないことを示す。赤核を有するヨウ化プロピジウム陽性（ＰＩ）細胞を矢印で示す。クッパー細胞を、抗ＣＤ６８マクロファージ特異的抗体（緑）で肝臓切片を染色することによって特定した。代表的なフィールドが示されている。スケールバーは５０μｍである。
【図２４】図２４は、血液由来Ａｄｓ捕捉における肝細胞の異なるタイプの等機能的役割、本発明の好ましい実施形態である、単一のウイルスのＡｄカプシドタンパク質への変異の導入を介して、特定の肝細胞とのウイルス相互作用を防止するための、関連するメカニズムおよび戦略、の概念を示す。
【図２５】図２５Ａ及び２５Ｂは、生体内での宿主細胞へのウイルスターゲッティング又は非ターゲッティングのために細胞インテグリンへのペントン結合を改変する、Ａｄ５ペントンベースＲＧＤモチーフ含有ループに導入された変異のさらなる例を示す。図２５Ａは、ＲＧＤモチーフ含有ループの欠失の例を示す。図２５Ｂは、非ＲＧＤモチーフ含有ペプチドとのＲＧＤモチーフの置換の例を示す。この置換は、選択的かつ等機能的に天然ＲＧＤ含有アミノ酸配列にすることができ、生体内での新型受容体とのペントン相互作用を促進する。この受容体には、腫瘍細胞上に存在するが、肝臓細胞上には豊富に発現されていない細胞インテグリンが含まれるが、これに限定されない。
【図２６】図２６は、血管内投与後、腫瘍細胞で特異的に複製すること、又は腫瘍若しくは他の細胞型に選択的に感染することができ、抗腫瘍若しくは免疫刺激活性を有する外来遺伝子を発現する、図１０に示したＡｄの変形例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
Ｖ．詳細な説明
本発明の化合物、組成物、論文、機器、および／または方法が開示され及び説明される前に、特に指定しない限り、特定の合成法もしくは特定の組み換えバイオテクノロジー方法に、又は特に指定しない限り特定の試薬に、限定されないことは理解されるだろう。なぜならば、これらは当然変化し得るからである。ここで使用される専門用語は、特定の実施態様のみを説明することを目的としており限定することを意図しているものではない、ことも理解されるだろう。
【００１５】
ａ．定義
他に定義されない限り、ここで使用されている全ての専門用語および科学用語は、本発明の属している技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を持っている。本発明の目的のため、以下の用語を以下に定義する。
【００１６】
明細書および添付の特許請求の範囲に使用されているように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈に他に明確な定めがない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「医薬担体」への言及は、２つ以上のそのような担体の混合物などを含む。
【００１７】
本明細書では、範囲は、「約」ある特定の値からおよび／または「約」他の特定の値までとして表されることができる。同様に、近似値として値が表される場合、先行する「約」の使用により、特定の値は別の実施形態となることは理解されるであろう。各範囲の端点は、他の端点に関して重要であり、他の端点とは無関係であることは更に理解されるであろう。本明細書には開示されている多数の値があり、各値は値そのものに加えて特定の値について「約」として開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」も開示されている。当業者に適切に理解されるように、「未満または同等の」値が開示されている場合、「超えるまたは同等の値」および値の間の可能な範囲も開示されていることも理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「１０未満または１０と同等」と同様に「１０を超えるまたは１０と同等」も開示されている。出願書類全体にわたって、複数の異なる形式でデータは提供され、このデータは、終点および始点と、データ点の任意の組み合わせの範囲と、を示すことも理解される。例えば、特定のデータ点「１０」および特定のデータ点１５が開示されている場合、１０から１５の間と同様に、超える、以上、未満、以下、および１０及び１５と同等、も開示されていると考えられることが理解される。２つの特定単位の間の各単位も開示されていることも理解される。例えば、１０および１５が開示されている場合、１１、１２、１３、および１４も開示されている。
【００１８】
本明細書および以下の特許請求の範囲において、以下の意味を有すると定義される複数の用語が参照される。
【００１９】
「任意の」または「任意に」は、後述の事象または状況が起きても又は起こらなくてもよいこと、および、説明が前記事象または状況が起こる場合と起こらない場合とを含むこと、を意味する。
【００２０】
本出願書類全体を通して、様々な刊行物が参照されている。これらの刊行物の全体における開示内容は、これに関連する最新技術をより完全に説明するために、参照により本明細書に取り込まれる。開示されている引用文献は、参照が信頼されている文章で論じられているそれらに含まれている題材について、参照により本明細書に個別にかつ具体的に取り込まれている。
【００２１】
ｂ．組成物
本明細書に開示されている方法に使用される組成物自体と同様に、開示されている組成物を準備するために使用される組成物が開示されている。これら及び他の物質は本明細書に開示されており、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示されている場合、これらの化合物の様々な個体および集団的組み合わせおよび変形の特定の参照は明確に開示されていないので、それぞれは本明細書で具体的に検討されており且つ説明されていることが理解される。
【００２２】
一つの態様において、本発明は新型の改変されたＡｄベクターを提供する。
【００２３】
ｉ．アデノウイルス
アデノウイルス（本明細書では「Ａｄ」ともいう）は、呼吸器感染症、結膜炎、出血性膀胱炎、および消化器疾患を含む幅広いヒトの疾患を引き起こす、至る所に存在する病原体である（Ｓｈｅｎｋ，１９９６，２００１）。免疫正常患者において、Ａｄ感染は自己限定的であり、急性感染の治癒後、ウイルスはリンパ組織および腎組織に潜伏したままである。対照的に、免疫不全患者において、Ａｄは、生命を脅かすか、致死性劇症肝炎および他の組織の播種性感染を引き起こすことがある（Ｋｏｊａｏｇｈｌａｎｉａｎら、２００３）。
【００２４】
現在、ＡからＧまでの７つの種（正式には、サブグループ）に分類されている６０の特徴付けられたヒトＡｄ血清型が存在する（Ａｌｏｎｓｏ−Ｐａｄｉｌｌａら、２０１５）。８０％の小児患者は、５歳までに、多くのＡｄ血清型のうち少なくとも１つに対する抗体を作る（Ｂａｒｏｕｃｈら、２０１１；Ｂｒａｄｌｅｙら、２０１２；Ｒｏｂｅｒｔｓら、２００６）。これらの集団におけるヒトＡｄＣ種−特異的抗体の保有率は、５０から８０％に達している（Ａｌｏｎｓｏ−Ｐａｄｉｌｌａら、２０１５；Ｂａｒｏｕｃｈら、２０１１）。様々なＡｄ血清型は異なる感染ルートを経由して感染し始めるが、異なるウイルス付着受容体を利用することによる、生体内でのＡｄ感染の組織特異性を制御する宿主因子および細胞型は、依然として十分に理解されていないままである。
【００２５】
Ａｄゲノムは、ウイルスタンパク質をコードしている遺伝子を含む約３６キロベースの二本鎖直鎖状ＤＮＡ分子である。Ａｄゲノムの末端において、逆方向反復（逆方向末端反復またはＩＴＲｓとも呼ばれる）は、複製およびカプシド形成領域を含む。初期遺伝子は、Ａｄゲノムに分散した４つの領域（Ｅ１からＥ４と指定されている）に分布している。初期遺伝子は、６つの転写単位で発現される。後期遺伝子（Ｌ１からＬ５と指定されている）は、初期転写単位と部分的に重複しており、主要な後期プロモータ（ＭＬＰと呼ばれる）から一般的に転写される（Ｓｈｅｎｋ、２００１）。
【００２６】
Ａｄ感染サイクルは２段階で起こる。初期段階は、複製の開始に先行し、ウイルスＤＮＡの複製および転写を調節する初期タンパク質を生産することを可能にする。ゲノムの複製後に、ウイルス粒子を構成する構造タンパク質が合成される後期段階が続く。新たなビリオンの組み立ては、宿主細胞核で起こる。最初の段階において、ゲノムがカプシドで包まれる２０面体構造の空のカプシドを形成するように、ウイルスタンパク質が集合する。集合したウイルスは、ペントンベースおよびファイバーを含む。遊離したＡｄｓは、他の許容細胞へ感染できる。カプシドの表面に存在するファイバーおよびペントンベースは、ビリオンの細胞付着およびそれらの内部移行に関与する。
【００２７】
生体外での研究において、Ａｄ感染は細胞表面の高親和性一次付着受容体へのウイルスの結合から始まることが実証されている（Ｎｅｍｅｒｏｗ、２０００）。その末端ノブ領域が特定の細胞受容体に結合する場合、三量体Ａｄファイバータンパク質は、この相互作用を介在する。細胞への結合のために、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦ種ヒトＡｄは、コクサッキーウイルスおよびＡｄ受容体（ＣＡＲ）を利用できる（Ｒｏｅｌｖｉｎｋら、１９９８）。しかしながら、ヒトＢ種Ａｄの大部分は、高親和性細胞付着受容体としてＣＤ４６を利用する（Ｇａｇｇａｒら、２００３）。その際、可溶性Ａｄファイバーまたは抗ファイバー抗体は、Ａｄによる感染を阻害できる。ファイバーによって媒介される細胞へのＡｄの結合後に、細胞インテグリン（例えば、αγβ３およびαγβ５）へのウイルスペントンベースプロテインのＲＧＤモチーフによって媒介される結合が続く（ＮｅｍｅｒｏｗおよびＳｔｅｗａｒｔ、１９９９）。この相互作用は、インテグリン活性化および細胞内へのウイルス粒子の内部移行を促進する細胞骨格再構築を誘導する。この知識の一部に基づいて、先の開示は、生体外細胞培養系におけるインテグリンとのＡｄ相互作用を変化させるように設計されたＡｄベクターを提供した。例えば、参照により本明細書に取り込まれる米国特許第５、７１２、１３６号を参照されたい。しかしながら、上記の特許は、生体内の応用のために、血管内投与後に肝臓隔離を逃れ、炎症反応の低下をもたらすことができるＡｄｓを構築することを教示していない。重要なことには、変異ペントンタンパク質だけを含むＡｄｓベクターは、野生型ウイルスと同じレベルにおいて肝臓組織に捕捉され、その結果、肝細胞外の効率的な感染に使用することはできない。
【００２８】
Ａｄｓは、増加している遺伝子導入のための応用に使用されている。Ａｄｓは多くの動物種で確認されている。これらは、免疫が保たれているヒトにおいて低い病原性を示し、分裂細胞および静止細胞の両方において複製する。Ａｄｓは、広宿主域を一般的に示し、多くの細胞型のうち、例えば、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞、肝細胞、神経細胞、および滑膜細胞など非常に多くの細胞種に感染できる。
【００２９】
組み換えＡｄベクターはＡｄに由来し、感染細胞でのウイルス複製に必要なシス作用領域（例えば、ＩＴＲｓおよびカプシド形成配列）を通常含む。組み換えＡｄベクターは、遺伝子導入のための異種遺伝子の挿入を可能にするために、ウイルス遺伝子を除去または改変するように設計された実質的な内部欠損を含むこともできる。異種遺伝子の適合のために、遺伝子導入プロトコルに使用されるＡｄｓは、少なくともＥ１領域の削除によって複製を欠損させることができ、トランスにおける欠損されたウイルス機能を提供する相補性宿主細胞株で増殖する。一つの一般的に使用される宿主細胞株である２９３系統は、ヒト胚腎細胞から構築され、トランスにおけるＡｄＥ１機能を提供する。
【００３０】
ヒトＣ種Ａｄ血清型５（Ａｄ５）に基づく遺伝子導入システムは、がんを含むヒトの遺伝的および後天的疾患を治すことを目的とする臨床研究に最もよく使用されている。その血管内送達後の肝細胞感染に対するウイルスの極端な傾向は、Ａｄ５を、生体内での肝細胞において高いレベルの導入遺伝子の発現を必要とする適用のための最適なベクターとした。しかしながら、送達されたベクター投与量の９０％以上を隔離する肝細胞とＡｄ５との間の効率的な相互作用（ＡｌｅｍａｎｙおよびＣｕｒｉｅｌ、２００１；Ａｌｅｍａｎｙら２０００；Ｗｏｒｇａｌｌら１９９７）は、播種性転移性がん細胞および組織などの肝細胞および組織以外への遺伝子送達が必要とされる場合、重大な障害になる。生体外分析から、細胞表面上のＣＡＲへマイナーカプシドタンパク質、ファイバーが結合したときに、Ａｄ５感染は引き起こされることが見出された（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎら１９９７）。ＣＡＲおよびインテグリン結合の両方は生体外における細胞感染に重要ではあるが、これらの相互作用のどちらも、生体内での肝細胞へのＡｄ５の侵入に必須ではない（ＡｌｅｍａｎｙおよびＣｕｒｉｅｌ、２００１；Ｓｈａｙａｋｈｍｅｔｏｖら、２００４）。
【００３１】
肝臓内在マクロファージ、クッパー細胞（Ｌｉｅｂｅｒら、１９９７）、および脾臓などの体内の他の臓器に存在するマクロファージ（Ｄｉ Ｐａｏｌｏら、２００９ａ）におけるＡｄ隔離は、炎症性サイトカインおよびケモカインの活性化、炎症性型の細胞死の誘導（Ｍａｎｉｃｋａｎら、２００６）、骨髄から血液への多形核白血球の急速な放出（Ｄｉ Ｐａｏｌｏ ＮＣ、２０１４）および血液における前炎症性メディエータのレベルの上昇によって現れる全身毒性、全身補体活性化、その後、白血球減少をもたらす。Ａｄの静脈内投与と関連している急性全身炎症反応は、遺伝子導入応用または転移性腫瘍の形質導入における治療レベルまで、Ａｄ投与量を上昇させることに対して、極めて重要な障壁である。
【００３２】
血管内ウイルス注入後の肝組織における肝細胞の形質導入およびＡｄビリオンの隔離は、異なる分子機構によって制御されている。肝臓内在マクロファージ、クッパー細胞は、肝臓における血液由来のＡｄビリオンの隔離に寄与する要因の中で主要な役割を果たすと考えられている。実際、マウスの静脈内にＡｄが注入されると、クッパー細胞は多量のウイルス粒子を速やかに蓄積する（Ｄｉ Ｐａｏｌｏら、２００９ｂ）。さらに、エーテルクロドロネートリボソームまたは塩化ガドリニウムによってマウスを処理した後の肝臓からのクッパー細胞の排出は、肝細胞特異的なＡｄを介した遺伝子導入のレベルの顕著な増加をもたらし（Ｗｏｌｆｆら、１９９７；Ｗｏｒｇａｌｌら１９９７）、大量の感染性ウイルス粒子がクッパー細胞によって捕捉されうることを示唆している。
【００３３】
血液凝固因子ＸのＡｄ５ヘキソンへの結合は、効率的な肝細胞形質導入をもたらす（Ｋａｌｙｕｚｈｎｉｙら、２００８；Ｗａｄｄｉｎｇｔｏｎら、２００８）。しかしながら、凝固因子に結合することができず、肝細胞に形質導入できなかったＡｄ５ヘキソン変異体の肝臓における隔離は、コントロール未修正ベクターと比較して相対的に変わらなかった（Ｋａｌｙｕｚｈｎｉｙら、２００８）。
【００３４】
本発明は、生体内の宿主における肝臓細胞との特異的ウイルス相互作用を同時に構造的に及び機能的に減少または排除し、また、大幅に弱化された全身毒性および炎症を示す変異を含む、新型の遺伝子組み換えＡｄベクターを提供する。一つの例は、ビタミンＫ依存性血液凝固因子を含む血液因子とのＡｄ相互作用が排除されるように、ヘキソン遺伝子が変異させられている、カプシド修飾Ａｄベクターを含む。他の例において、カプシド修飾Ａｄベクターは、天然種類のＡｄ相互作用細胞インテグリンとの生体内のＡｄ相互作用が低下または減弱されるように、変異ペントン遺伝子を含む。他の例において、ヘキソン及びペントン変異は一つのベクターに組み込まれ、血管内投与に適しているベクターの産生をもたらし且つ大幅に弱化された全身毒性および炎症を示す。
【００３５】
本発明を実施するための最適な態様および新型のベクターの実施形態の最終的かつ好ましい例として、ペントンにおける及びヘキソン内の凝固因子結合部位における変異に加えて、クッパー細胞とのウイルス相互作用を除去するヘキソン表面露出超可変ループ１（ＨＶＲ１）に、第三の変異が取り入れられ、３つの変異を同時に含む大量のベクターが生成される。３つの変異（１つはペントンで、２つはヘキソン超可変ループで、凝固因子結合を除去し且つクッパー細胞におけるウイルス隔離を防止する）を同時に有するこの新型のベクターは、血管内投与後の肝組織における隔離を免れ且つ大幅に弱化された全身毒性を示す。
【００３６】
上記のようなヘキソンおよび／またはペントン遺伝子における変異に加えて、本明細書に記載されているＡｄベクターは、ファイバータンパク質、タンパク質ＩＸ、および／または他の構造タンパク質もしくは非構造タンパク質をコードする遺伝子における変異を含むことができる。
【００３７】
さらに、ヘキソンおよび／またはペントン変異は、宿主の肝臓におけるＡｄターゲティングおよび隔離をさらに抑える一つ以上の物質の投与と共に用いられることができる。一つの例において、ワルファリンは、血液細胞および血液凝固因子とＡｄベクターとの相互作用を抑えるために、使用されうる。他の例において、クッパー細胞が殺されて肝臓から除去されるように、宿主はクロドロネートリボソーム処理されうる。
【００３８】
加えて、本明細書に記載されているＡｄベクターは、例えば、腫瘍選択的なウイルス複製を可能にする、抗がんの、がん抑制の、および／または免疫促進の活性もしくは一つ以上の遺伝子変異を示す、一つ以上の導入遺伝子を持つことができる。さらに、本明細書に記載されている組み換えＡｄｓは、宿主タンパク質と因子との相互作用からウイルスが免れることを可能にし、それによって、血管内送達後の肝臓におけるウイルスの捕捉を回避する、機能的に異なり定義された一連の変異の新規のデザインを提供する。
【００３９】
非Ａｄ５ヒト血清型または動物血清型に基づくＡｄベクターは、血管内投与後、ビタミンＫ依存性凝固因子を含むがこれに限定されない因子と宿主タンパク質との相互作用に対して特異的な能力を示す（Ｋａｌｙｕｚｈｎｉｙら、２００８）。本開示および本明細書に記載されている分子機構および機能的相互作用は、血管内送達後の肝臓における隔離からそれらが免れることを許容するために、非ヒトＡｄ５ベースベクターの改変のための原理および方法を提供する。非ＡｄベースベクターがビタミンＫ依存性血液凝固因子と自然に相互に作用できない場合（例えば、ヒトＡｄ血清型Ａｄ９、 Ａｄ５０、 Ａｄ２６、 Ａｄ４８、 Ａｄ５１（表１）など）、その結果、血管内投与後の肝臓におけるこれらの捕捉は、ペントンおよび／またはクッパー細胞ターゲッティングヘキソン超可変ループ（ＨＶＲｓ）における変異を介して、防止されることができる。ヘキソンＨＶＲｓのアミノ酸配列における自然変異に起因して血液因子およびクッパー細胞の両方と非Ａｄ５ベースベクターが自然に相互に作用できない場合、ペントンのみにおける変異導入が血管内投与後に肝臓隔離からウイルスが逃れるのに十分である。
【００４０】
本明細書に記載されている改変されたＡｄベクターは、一つ以上の方法で用いられることができる。そのような方法の一つにおいて、一つ以上のＡｄベクターは、導入遺伝子を送達するための方法に、又は、標的細胞が宿主の体内に存在しうる非肝臓細胞もしくは両方を標的とする複製腫瘍溶解性ウイルスとしてデザインされるための方法に、用いられる。一つ以上のＡｄベクターは、宿主の肝臓における隔離をＡｄビリオンが回避するように、Ａｄを投与する方法に用いられることができる。そのような肝臓を標的としない複製または非複製Ａｄベクターは、宿主の体内の非肝細胞へ一つ以上の所定の導入遺伝子を送達する用途に有用となりうる。そこで、導入遺伝子は、宿主細胞や宿主体内における遺伝的、生化学的、若しくは生理的欠陥を修正するように作られ、又は、これらは、局在性もしくは転移性がんを除去するために、または  固形悪性腫瘍もしくは血液悪性腫瘍の両方を治療するために、用いられうる。
【００４１】
上述のように、本発明は、改変されたヘキソンおよび／またはペントンカプシドタンパク質を含むＡｄベクターの生成および使用のために、新型の改変されたＡｄベクターを提供し、改変は静脈内ウイルス投与後の肝臓におけるＡｄ捕捉を回避する。さらに、本明細書に記載されているＡｄベクターは、がん細胞特異的な感染およびウイルスの複製を可能にするために、ウイルスにコードされた構造および非構造タンパク質における遺伝子変異を含むことができる。
【００４２】
特に、本発明は、ヘキソン遺伝子および／またはペントン遺伝子に遺伝子変異を含む単一ウイルスゲノムＤＮＡ分子である、組み換え、二本鎖の、Ａｄベクターを提供する。第１タイプのヘキソン変異は、凝固因子（Ｆ）ＦＸ、ＦＩＸ、ＦＶＩＩ、プロテインＣ、およびプロテインＳを含む血液凝固因子とのウイルス相互作用を減少または除去するように構成されている。第２タイプのヘキソン変異は、ウイルスが血流に投与され又は血流に到達するとき、直接的あるいは間接的に、クッパー細胞とのウイルス相互作用を減少または除去するように構成されており、その結果、凝固因子以外の血液タンパク質との複合体の中に存在することができる。ペントン変異は、特にβ３クラスの細胞インテグリンとのＡｄ相互作用を減少または除去するように構成されている。ヘキソンおよびペントンの両方に記述した変異およびこれらの機能的意義を有する、組み換えＡｄベクターの一例の概要構成は、図１０及び図２３Ａに示されている。
【００４３】
上記特定された変異に加えて、本発明のＡｄｓは、付加的変異をさらに含む。血液凝固因子とのヘキソン相互作用を除去する特異的変異は、ヒトＡｄ５ヘキソン超可変領域（ＨＶＲ）７内のアミノ酸ＴＥＴの変異、欠失、又は置換を含む（図１１、１２）。ヒトＡｄ５血清型に関して、ヘキソンＨＶＲ７における単一アミノ酸置換Ｔ４２５Ａは、ウイルスと血液凝固因子Ｘ（図１３、１４）との相互作用を除去するのに十分である（Ｄｏｒｏｎｉｎら、２０１２）。他のヒト及び動物Ａｄ血清型に関して、凝固因子結合のための好ましいアミノ酸配列がどこに位置するかに応じて、凝固血液因子を除去する変異は、ＨＶＲ３又はＨＶＲ７（図１２）のいずれかに導入されることができる（Ｋａｌｙｕｚｈｎｉｙら、２００８）。Ａｄベクターヘキソン配列は、混合であってもよく、多様な起源の断片を含むことができる。特定の実施形態において、ヘキソン遺伝子は、例えば、血清型Ｃの、特に、タイプ２又は５Ａｄｓ（Ａｄ２又はＡｄ５）などのヒトＡｄに由来する。従って、例えば、本明細書に記載されているＡｄｓにおいて、Ａｄはヘキソンタンパク質のＨＶＲ３、ＨＶＲ５、又はＨＶＲ７領域に変異をさらに含み、変異はビタミンＫ依存性凝固因子の結合を低下させる。
【００４４】
クッパー細胞とのヘキソン相互作用を除去する特異的変異は、図２２に示すアミノ酸配列を含むがこれに限定されないＡｄ５ＨＶＲ１を含むアミノ酸の変異、欠失、又は置換を含む。例えば、本明細書に記載されている本発明のＡｄｓは、ヘキソンタンパク質のＨＶＲ１領域に変異をさらに含んでいるＡｄｓであり、変異は肝臓におけるクッパー細胞とのウイルス相互作用を低下させる。
【００４５】
上記のように、「変異」という用語は、Ａｄヘキソンタンパク質における一つ以上の残基残基の置換、欠失、および／または挿入を示す。血液因子タンパク質結合部位の変異は、約１０、約１００、約１０００、約１００００、若しくは約１０００００、若しくは約１００００００、若しくはそれ以上の倍率で血液因子タンパク質に対するヘキソンの親和性または結合性を削減できる。特定の実施形態において、血液因子タンパク質結合部位は除去され、生物学的に重要な血液因子タンパク質結合は維持されないことを意味している。
【００４６】
クッパー細胞とのウイルス相互作用を回避するヘキソン変異に関して、変異は、クッパー細胞におけるウイルス蓄積が低下または除去されるように、Ａｄヘキソンタンパク質における一つ以上の残基の置換、欠失、および／または挿入を含む。そのようなヘキソン変異が、単一ウイルスに於いて、血液凝固因子結合を除去する変異およびＲＧＤモチーフ結合インテグリンとのウイルス相互作用を防ぐペントン変異と組み合わされる場合、得られたウイルスは、血管内投与後の肝組織における隔離を逃れ、急性炎症反応をほとんど又は全く誘導しない（図２３）。Ａｄベクターヘキソン配列は、混合であってもよく、多様な起源の断片を含むことができ、自然発生的な又は非自然発生的な配列を含むことができる。特定の実施形態において、ヘキソン遺伝子は、例えば、血清型Ｃ、特にタイプ２又は５Ａｄｓ（Ａｄ２又はＡｄ５）などのヒトＡｄに由来する。
【００４７】
一つの態様において、本発明は、インテグリンのβ３およびβ５クラス結合に関わる領域において変異したＡｄペントンタンパク質を有するペントン改変Ａｄｓ提供する。そのような変異は、生体内の特にβ３およびβ５クラスの細胞インテグリンとのペントンタンパク質相互作用が低下または除去されるように、ペントンベースループを含むＲＧＤモチーフ（図１７、２０、２５）の欠失または置換を含むことができる。言い換えれば、本明細書に記載されている本発明の一つの実施形態は、ペントンタンパク質のＲＧＤモチーフに変異を有する単離されたＡｄであり、この変異は生体内の宿主細胞のβ３インテグリンの結合を低下させる。これに関連して、「変異」という用語は、Ａｄペントンタンパク質における一つ以上の残基の置換、欠失、および／または挿入を示す。インテグリン結合部位の変異は、約１０、約１００、約１０００、約１００００、若しくは約１０００００、若しくは約１００００００、若しくはそれ以上の倍率でインテグリンタンパク質に対するペントンの親和性または結合性を削減できる。特定の実施形態において、インテグリン結合部位は除去され、生物学的に重要な血液因子タンパク質結合は維持されないことを意味している。一つの態様では、本明細書に記載されているＡｄｓにおいて、ペントンループのＲＧＤアミノ酸モチーフは、非ＲＧＤモチーフを含むペプチドと置き換えられ、生体内の非β３細胞インテグリンと結合できる。ペントンループのＲＧＤアミノ酸モチーフは、非ＲＧＤモチーフを含むペプチドと置き換えられ、生体内の非インテグリンクラスの細胞膜受容体と結合できるＡｄｓも開示されている。Ａｄベクターペントン配列は、混合であってもよく、多様な起源の断片を含むことができ、自然発生的な又は非自然発生的な配列を含むことができる。特定の実施形態において、ペントン遺伝子は、例えば、血清型Ｃ、特にタイプ２又は５Ａｄｓ（Ａｄ２又はＡｄ５）などのヒトＡｄに由来する。従って、本明細書に記載されている１つの態様のＡｄｓにおいて、ＡｄはＣ種Ａｄであり、および／または、Ａｄ血清型はタイプ５若しくは２である。
【００４８】
上記のように、本明細書に記載されているＡｄベクターは、ヒトＡｄ血清型５（Ａｄ５）に基づくことができる。しかしながら、Ａｄベクターは、その他のヒト又は動物Ａｄ血清型に基づくことができる。例えば、非ヒトＡｄｓは、イヌ、鳥、マウス、羊、豚、又はサル起源を含むことができる。血管内投与後の遺伝子治療にＡｄ５血清型に代わるものが使用される場合、二つのタンパク質の一つのみ（ヘキソン又はペントンの何れか）の機能的不活性化変異は、凝固因子に結合し、クッパー細胞と相互に作用する非Ａｄ５ヘキソンの能力に応じて、又は非Ａｄ５は細胞インテグリンに結合する非Ａｄ５ペントンの能力に応じて、血管内注入後の肝臓におけるウイルス捕捉を防ぐために、必要であり十分である（図９、２３）。例えば、Ａｄ血清型９（Ａｄ９）ヘキソンは、そのヘキソンタンパク質におけるＦＸ結合モチーフの欠如を原因として、凝固因子と結合しない（表１）。従って、肝臓でのＡｄ９捕捉を除去するために、ＨＶＲ１におけるヘキソン変異およびインテグリンに対するその結合を除去するためのペントン変異の導入が実施されうる。Ａｄ血清型４１（Ａｄ４１）は、ＲＧＤモチーフの欠如を原因として、細胞インテグリンと相互作用するＲＧＤモチーフと結合しない（図１６）。従って、ヘキソンにおけるＦＸ結合モチーフ及びＨＶＲ１での変異の導入は、肝臓でのウイルス捕捉を防ぐために実施されうる。
【００４９】
さらに、本明細書に記載されているＡｄは、細胞型特異的ウイルスターゲッティングを可能にするために、ファイバーおよび／またはｐＩＸを含むがこれに限定されないそのマイナーカプシドタンパク質内に、付加的変異を含むことができる。本明細書に記載されているＡｄは、そのがん細胞特異的複製を可能にするために、ウイルスにコードされた非構造タンパク質に遺伝子変異をさらに含むことができる。単独Ａｄベクターがヘキソン、ペントン、ファイバー、ｐＩＸ、及び非構造タンパク質をコードする各遺伝子における一つ以上の変異を有するように（図２６に示されるように）、ファイバー／ｐＩＸおよび／または非構造タンパク質変異は、ヘキソンおよび／またはペントン変異と組み合わせられることができる。
【００５０】
「腫瘍特異的遺伝子発現」および「腫瘍特異的」は、腫瘍細胞におけるベクター遺伝子発現を含むことを意図しているが、正常細胞でのベクター遺伝子発現も、ごくわずかであり且つ目立たないものと考えられうる程の低レベルであるが、起こりうると理解されている。
【表１】
2018504141.tif 000003
【００５１】
本明細書に記載されているＡｄベクターは、肝臓にウイルスを捕捉する宿主メカニズムを少なくとも部分的に阻害するために、宿主の薬理調整後、哺乳動物の静脈内に投与されることができる。例えば、改変されたＡｄビリオンと肝洞様毛細血管との関連は、ワルファリン及びクロドロネートリボソーム処理された哺乳動物へのペントン変異Ａｄの注入後、検出の閾値未満に低下されうる（図７）。ワルファリンは、ヘキソンタンパク質と血液因子との相互作用を減少させることができ、クロドロネートリボソーム処理はクッパー細胞内のウイルス隔離を少なくとも部分的に阻害することができる。クッパー細胞内へのＡｄビリオン隔離は、血液凝固因子および／または細胞インテグリンと関係がないメカニズムを介して生じるかもしれない。いくつかの実施形態において、血液細胞のＡｄビリオン結合および形質導入を排除するために、ワルファリンなどの薬理学的介入を用いるよりも、一つ以上の所定のヘキソンタンパク質変異が使用されうる。
【００５２】
本明細書では、肝臓における血液由来Ａｄビリオンの隔離を媒介する既知のメカニズムの夫々の寄与は、系統的に分析された。データは、クロドロネートリボソームによるクッパー細胞の特異的除去またはワルファリンによる血液因子経路の不活化は、静脈内ウイルス注入後に肝臓に捕捉されたＡｄＤＮＡレベルの測定可能な低下を独立してもたらさない、ことを示している（図２Ａ、４Ｄ）。ワルファリンによるマウスの処理は、Ａｄ媒介肝細胞形質導入を完全に除去したが、Ａｄビリオンを捕捉するクッパー細胞の能力は影響を受けないままだった（図４Ｃ）。さらに、ワルファリン処理されたマウスにおいて、静脈内注入後にＡｄビリオンによって容易に形質導入されない細胞型である肝洞様毛細血管内皮細胞（図３）に、Ａｄは形質導入することが見出された。クッパー細胞の同時除去および血液因子経路の除去は、静脈内注入後に肝臓に捕捉されるＡｄＤＮＡの量の３５％のみ減少させた（図５Ａ、５Ｂ）。
【００５３】
クロドロネートリボソーム及びワルファリンの両方で処理した後にＡｄ投与されたマウスの肝臓切片の評価は、多量のＡｄビリオンが遊離粒子として肝洞様毛細血管に局在されることを明らかにした。ワルファリン及びクロドロネートリボソームで処理されたＰ３インテグリンノックアウトマウスへのＡｄ５の投与は、肝臓によって隔離されたＡｄＤＮＡのレベルをさらに低下させる（図７）。Ａｄビリオンと肝洞様毛細血管との顕微鏡で検出可能な関係は、ワルファリンの注入後、およびクロドロネートリボソーム処理したマウスへのペントンベースタンパク質内のＲＧＤモチーフ欠失を持つＡｄ５ΔＲＧＤベクターを用いて、完全に除去されうる（図７Ｄ）。これらのマウスにおける静脈内ウイルス注入後に肝臓に捕捉されるＡｄ５ΔＲＧＤ ＤＮＡのレベルは、各薬品で個々に処理された動物または処理されていないコントロールにおいて観測されたレベルの２０％以下だった（図８）。このデータは、肝臓組織における血液由来Ａｄビリオンの隔離を制御する分子経路の冗長性および相乗作用の証拠を提供する。
【００５４】
血液中の循環後、肝臓において大幅に減少した隔離を示す本発明の新型のＡｄベクターを提供するために、一連の変異体Ａｄ５ベースベクターは、構築され、生体内の細胞β３インテグリンとのウイルス相互作用を阻害する個々の変異を含んでいる（例えば、Ａｄ５ΔＲＧＤ（図１７）、Ａｄ−Ｌａｍ１（図２０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３）、およびＡｄ−Ｌａｍ３（図２０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４）、血液凝固因子（Ａｄ−ＴＥＡ、ＨＶＲ７  Ｔ４２５Ａ変異体、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：２、図１３、１４）、ペントンＲＧＤループ及びヘキソンＨＶＲ７ループに複合変異を含むウイルスＡｄ−２Ｍ（図２１）、および三つの同時変異−１）ペントンＲＧＤループ変異（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４）；２）ヘキソンＨＶＲ７  Ｔ４２５Ａ変異（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：２）；及び新型のヘキソンＨＶＲ１変異（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：５、図２２、２３）を含むウイルスＡｄ−３Ｍ）。これらのウイルスの全てをマウスに静脈内注入した後、Ａｄ−３Ｍウイルスのみが肝臓での隔離を免れたが、他のウイルス変異体は全て、改変のないカプシドに相当する野生型ウイルス、Ａｄ−ＷＴ、で観測されたものと同量、肝臓で捕捉された（図２１Ｃ、２３Ｂ）。血管内ウイルス送達後に生体内の肝臓クッパー細胞とのＡｄ相互作用の除去を許容する、ＡｄヘキソンＨＶＲ１ループの遺伝子変異の特性は、報告されておらず、本発明の不可欠な部分および本発明の革新的で有利な部位面を示す。
【００５５】
肝臓組織に隔離されることを免れることに加えて、Ａｄ−３Ｍベクターは、物理的粒子レベルでクッパー細胞に蓄積せず（図２３Ｃ）、それらの壊死をもたらさず（図２３Ｅ）、脾臓での炎症性サイトカイン及びケモカインを活性化することができず（図２３Ｄ）、ペントンにおける個々の変異またはペントン及びヘキソンＨＶＲ７変異のみを含む、改変されていないコントロールＡｄ−ＷＴウイルス（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１）、又はＡｄ−Ｌａｍ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３）、Ａｄ−Ｌａｍ３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４）、及びＡｄ−２Ｍベクターなどと比較して、血管内投与後に大幅に減少した毒性を示す。Ａｄ−３Ｍのこれらの特性は、ヒト遺伝子治療応用に有用となることができ、治療の安全性を損なうことなくベクター投与量の増加を可能にする。
【００５６】
他の態様において、変異体Ａｄヘキソン、ペントン、ファイバー、および／または非構造タンパク質をコードしているＤＮＡ断片、およびそのようなＤＮＡ断片を発現させるためのベクターが提供される。必要な転写および翻訳シグナルも、天然Ａｄ核酸および／またはその隣接領域によって供給されうるか、異種でありうる。ＤＮＡ断片は、例えば、発現カセットでありうる。そのような発現カセットは、変異体ＡｄヘキソンをコードしているＤＮＡ断片に動作可能なように結合している異種プロモーターを任意に含むことができる。ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス、統合型またはその他、でありうる。
【００５７】
ＤＮＡ断片、発現カセットおよび／またはベクターは、断片、カセットまたはベクターのトランスフェクション効率性および／または安定性を向上させることができる一つ以上の物質と、組み合わせることもできる。そのような物質は、例えば、ポリマー、脂質（例えば、陽イオン性脂質）、リポソーム、核タンパク質、および中性脂肪を含む。
【００５８】
特定の実施形態において、Ａｄは、組み換え及び複製欠損の（すなわち、宿主細胞にて自律的に複製する能力がない）Ａｄでありうる。そのような複製欠損のＡｄは、例えば、Ｅ１領域および／またはＥ３領域の全部または一部などの一つ以上のウイルス領域の変異または欠失を含むことができる。Ａｄのゲノムは、例えば、配列をコードしているウイルスの完全欠失および非ＡｄＤＮＡによる置換を含むＥ２、Ｅ４および／またはＬ１−Ｌ５領域などの他の領域に影響を与える追加的な欠失または変異を、任意に含むことができる（いわゆる「ヘルパー依存性の」ベクター）。
【００５９】
Ａｄベクターは、任意に組み換えＡｄｓであってもよく、Ａｄベクターに導入される核酸断片に含まれている一つ以上の目的の遺伝子を含む。目的の遺伝子は、宿主細胞におけるこれらの発現に必要な要素の制御下に置かれることができる。目的の遺伝子は、一般的に、ヒトまたは非ヒト異種遺伝子（すなわち、非Ａｄ遺伝子）である。目的の遺伝子は、例えば、ゲノム、ｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）、雑種遺伝子もしくはキメラ遺伝子（例えば、一つ以上のイントロンが欠けているミニ遺伝子）、または同様なものでありうる。それは、例えば、従来型の分子生物学手法によって、および／または化学合成によって、得ることができる。目的の遺伝子は、例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡ、リボザイム若しくは目的のポリペプチドに翻訳されうるｍＲＮＡをコードできる。目的のポリペプチドは、例えば、核、細胞質、膜、分泌タンパク質または他のタイプのタンパク質でありうる。さらに、目的のポリペプチドは、例えば、天然に見出されるポリペプチド、多様な起源の配列の融合から得られるキメラポリペプチド、天然配列と比較して変異した改良および／または改変された生物学的特性を有するポリペプチド、でありうる。
【００６０】
特定の実施形態において、核酸断片は、所定の機能または結果を得るように構成された所定の目的遺伝子を含むことができる。目的の遺伝子は、例えば、以下のポリペプチドの一つをコードできるが、これに限定されない：サイトカイン又はリンホカイン（α‐、β‐又はγ‐インターフェロン、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒ、およびＩＬ−２４）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、又は同様のもの））；細胞または核内受容体（例えば、病原体によって識別されるこれら（例えば、ウイルス、バクテリア又は寄生生物））；原核生物又は真核生物起源（例えば、バクテリアフラジェリン）の自然免疫シグナル伝達の活性化に関わるタンパク質；遺伝病の誘発に関わるタンパク質（例えば、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、ジストロフィン又はミニジストロフィン、インスリン、ＧＦＴＲタンパク質（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子））；成長ホルモン（例えば、インスリン、ｈＧＨ又は同様のもの）；酵素（例えば、ウレアーゼ、レニン、トロンビン、又は同様のもの）；酵素阻害物質（例えば、α１‐アンチトリプシン、抗トロンビンＩＩＩ、ウイルスプロテアーゼ阻害物質、又は同様のもの）；（例えば、腫瘍またはがんの始まりや進行を少なくとも部分的に抑制することができる）抗腫瘍効果を有するポリペプチド、例えば抗体、細胞分裂または形質導入シグナルに作用する阻害物質、腫瘍抑制遺伝子の発現産物（具体的には、ｐ５３又はｐＲｂであるがこれに限定されない）、免疫システムを刺激するタンパク質、又は同様のもの；クラス１若しくは２主要組織適合遺伝子複合体のタンパク質、または対応遺伝子の発現に作用する調節タンパク質；ウイルス、バクテリア若しくは寄生生物による感染、又はその進行を阻害できるポリペプチド（例えば、免疫特性を有する抗原ポリペプチド、抗原エピトープ、抗体、競争により天然タンパクの作用を阻害できるトランスドミナント変異体）；毒素（例えば、単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−１−ＴＫ）、リシン、コレラ毒素、ジフテリア毒素、又は同様のもの）又はイムノトキシン；マーカー（１３−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、又は同様のもの）；アポトーシスへの影響を有するポリペプチド（例えば、アポトーシス誘導因子：Ｂａｘ、又は同様のもの、アポトーシス誘導因子Ｂｃｌ２、Ｂｃｌｘ、又は同様のもの）；細胞増殖抑制物質（例えば、ｐ２１、ｐ１６、Ｒｂ、又は同様のもの）；アポリポタンパク質（例えば、ａｐｏＥ、又は同様のもの）；活性酸素分解酵素、カタラーゼ、酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）；成長因子（例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦｓ）、インスリン、又は同様のもの）、又は治療的もしくは研究的関係のある他の遺伝子。このリストは限定するものではなく、他の遺伝子も使用されうることは、留意されるべきである。特定の実施形態において、目的のポリペプチドはマーカー（例えば、β‐ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、又は同様のもの）ではな��。
【００６１】
Ａｄは、感染細胞の選択または識別を可能にする選択可能な遺伝子を任意に含むことができる。適切な選択可能な遺伝子は、例えば、Ｎｅｏ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードしている）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）、ＰＡＣ（ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）、ＧＰＴ（キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、又は同様のものを含む。
【００６２】
特定の実施形態において、目的の遺伝子は、宿主細胞における遺伝子発現に必要な要素を任意に含むことができる。そのような要素は、例えば、遺伝子のＲＮＡへの転写および／またはｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を促進する要素を含む。適切なプロモーターは、例えば、真核生物またはウイルス起源のものを含む。適切なプロモーターは、構成的または調節可能（例えば、誘導可能）でありうる。プロモーターは、プロモーター活性を高め、転写抑制領域を抑制し、構成的プロモーターを調節可能にし、制限酵素認識部位を導入する、などするように改変されうる。適切なプロモーターの例は、例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）ウイルスプロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）ウイルスプロモーター、ＨＳＶ‐１ウイルスＴＫ遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーター、Ａｄ  ＭＬＰプロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＭＴ（メタロチオネイン）、（肝臓特異的な）α１‐アンチトリプシンおよびアルブミン、（リンパ球に特異的な）免疫グロブリン、腫瘍特異的なプロモーター（例えば、α‐フェトプロテインＡＦＰ（例えば、Ｉｄｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ５５ ：３１０５−０９ （１９９５）を参照））；ＭＬＪＣ‐１；前立腺特異抗原（ＰＳＡ）（例えば、Ｌｅｅら、Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ.２７１ ：４５６１−６８ （１９９６）を参照）；および内皮細胞特異的ｆｌｔ１（例えば、Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ. ２７０：２７９４８−５３ （１９９５））を含む。
【００６３】
目的の遺伝子は、発現のため（例えば、イントロン配列、シグナル配列、核局在配列、転写終結配列、ＩＲＥＳタイプ翻訳の開始部位など）、宿主細胞におけるそのメンテナンスなどのため、追加の要素も含むことができる。
【００６４】
また、本開示によるヒト又は非ヒトＡｄベクターを調製する方法も提供される。そのような方法は、例えば、（変異体Ａｄヘキソンタンパク質をコードしている）Ａｄのゲノムを適切な細胞株にトランスフェクトすること、およびＡｄの産生を可能にするための適切な条件下においてトランスフェクトされた細胞株を培養すること、を含むことができる。Ａｄは、培養物から随意に回収されることができる。特定の実施形態において、例えば、遺伝子治療またはがん治療のため、Ａｄは十分に精製される。
【００６５】
細胞株は、適用できる場合、Ａｄにおける欠損機能に従って、選択されうる。欠損機能をトランスで提供できる相補性宿主細胞株が、用いられることができる。特定の実施形態において、２９３系は、Ｅ１機能を補うために、使用される（例えば、Ｇｒａｈａｍら、ｉ Ｇｅｎ. Ｖｉｒｏｌ. ３６：５９−７２ （１９７７）（Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３）を参照）。相補性宿主細胞株は、例えば、Ｅ１およびＥ２、またはＥ４の欠損など、複数のＡｄ遺伝的欠損を補うことができる。特定の実施形態において、ヘルパーウイルスは、宿主細胞における欠損Ａｄを補うために用いられることができる。欠損Ａｄｓを増やす方法は、当技術分野で知られている（例えば、ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（編集、Ｅ. Ｊ. Ｍｕｒｅｙ、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ）、ｖｏｌ. ７, ｐ. １９０−１２８ （１９９７）を参照）。Ａｄゲノムは、連結反応および／または相同的組み換えによって、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などにおいて、体外で、再構成されることができる。
【００６６】
本明細書でさらに提供されるものは、本開示に従ったＡｄに感染した又は本発明に従った方法によって得られることができる宿主細胞である。感染した宿主細胞は、例えば、ヒト細胞などの哺乳類細胞、または非ヒト、動物細胞でありうる。感染した宿主細胞は、例えば、一次または腫瘍細胞、および、例えば、造血の（例えば、全能性幹細胞、白血球、リンパ球、単球もしくはマクロファージ、又は同様のもの）、筋肉（例えば、衛星細胞、ミオサイト、筋芽細胞、平滑筋細胞）、心臓の、鼻の、肺の、気管の、肝臓の、上皮の、又は線維芽細胞起源など、任意の適した起源のもの、でもありうる。
【００６７】
ＡｄｓおよびＡｄベクターの実施形態の例に加えて、本明細書で提供されるものは、Ａｄペントンタンパク質をコードしている単離された核酸であって、該ペントンタンパク質はそのＲＧＤモチーフに変異を含むペントンタンパク質であり、Ａｄで発現した場合、変異は生体内における宿主細胞β３インテグリンの結合を減少させる。さらなる態様において、本明細書で提供されものは、単離された核酸であり、該核酸は、Ａｄヘキソンタンパク質であって、ヘキソンタンパク質のＨＶＲ３、ＨＶＲ５、又はＨＶＲ７領域に変異を含むヘキソンタンパク質、をさらにコードしており、Ａｄで発現した場合、変異は生体内におけるビタミンＫ依存性凝固因子の結合を減少させる。
【００６８】
ｉｉ．核酸
提供される核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド代替物から構成されている。これら及び他の分子の限定されない例は、本明細書で論じられる。例えば、細胞においてベクターが発現された場合、発現されたｍＲＮＡは、典型的には、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵから構成されるであろうことは、理解されている。同様に、例えば、アンチセンス分子が例えば外因性送達によって細胞または細胞環境に導入される場合、アンチセンス分子は、細胞環境におけるアンチセンス分子の分解を抑制するヌクレオチド類似体から構成されることが有利である、ことも理解されている。
【００６９】
ヌクレオチドは、塩基部分、糖成分およびリン酸部分を含む分子である。ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合を作るこれらのリン酸部分および糖部分によって結合されうる。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン‐９‐ｙ１（Ａ）、シトシン‐１‐ｙ１（Ｃ）、ウラシル‐１‐ｙ１（Ｕ）、及びチミン‐１‐ｙ１（Ｔ）でありうる。ヌクレオチドの糖成分は、リボース又はデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、５価リン酸である。ヌクレオチドの非限定的な例は、３´‐ＡＭＰ（３´‐アデノシン一リン酸）又は５´‐ＧＭＰ（５´‐グアノシン一リン酸）である。
【００７０】
ヌクレオチド類似体は、単一の修飾のみを含むことが必要であるが、部分の一つ又は異なる部分の間に複数の修飾を含むことができる、ことは理解される。
【００７１】
ｉｉｉ．発現系
細胞に届けられる核酸は、発現制御系を典型的に含む。例えば、ウイルス及びレトロウイルス系に挿入された遺伝子は、所望の遺伝子産物の発現を制御することを助けるために、プロモーターおよび／またはエンハンサーを通常は含む。プロモーターは、通常、転写開始部位に対して比較的固定した位置にあるときに機能する配列またはＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子との基本的な相互作用に必要なコア要素を含み、上流要素および応答要素を含んでいてもよい。
【００７２】
１．ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳類の宿主細胞におけるベクターからの転写を制御する好適なプロモーターは、例えばポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、Ａｄ、レトロウイルス、B型肝炎ウイルスおよび望ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスのゲノムなど様々なものから、または例えばβ‐アクチンプロモーターなど異種哺乳類プロモーターから、得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限断片として、好都合に得られる（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ,２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、ＨｍｄＩＩＩ Ｅ制限断片として、好都合に得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ, ｐ.Ｊ.ら、Ｇｅｎｅ １８： ３５５−３６０ （１９８２））。当然、本明細書において、宿主細胞または近縁種からのプロモーターも有用である。
【００７３】
エンハンサーは、転写開始部位から固定されていない距離にて機能するＤＮＡの配列を通常指し、転写単位に対して、５´（Ｌａｉｍｉｎｓ, Ｌ.ら、Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ７８： ９９３ （１９８１））または３´（Ｌｕｓｋｙ, Ｍ.Ｌ.,ら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．  ３  ：  １  １０８  （１９８３））になりうる。さらに、エンハンサーは、イントロンおよびコード配列自体内にありうる。それらは、通常、１０から３００ｂｐの長さであり、シスで機能する。エンハンサーは、近隣のプロモーターからの転写を増加させるように、機能する。エンハンサーは、転写調節を仲介する応答要素をしばしば含む。プロモーターも、転写調節を仲介する応答要素を含むことができる。エンハンサーは、遺伝子発現の調節をしばしば決定する。哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテインおよびインスリン）から多くのエンハンサー配列が現在知られているが、典型的に、一般的な発現のために、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーの一つが使用されるであろう。好ましい例は、複製起点の後期部位（ｂｐ１００−２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期部位のポリオーマエンハンサー、およびＡｄエンハンサーである。
【００７４】
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、それらの機能をもたらす光若しくは特定の化学的事象によって、特異的に活性化されてもよい。システムは、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬によって調節されうる。ガンマ線照射などの照射に対する曝露、又はアルキル化化学療法剤、によって、ウイルスベクター遺伝子発現を増強する方法もある。
【００７５】
特定の実施形態において、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーとして機能でき、転写される転写ユニットの領域の発現を最大にできる。特定の構成において、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、たとえ、ある特定の時に特定タイプの細胞においてのみ発現されたとしても、全ての真核細胞タイプに活性がある。このタイプの好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０ベース）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（完全長プロモーター）、及びレトロウイルスベクターＬＴＲである。
【００７６】
全ての特異的調節要素は、メラノーマ細胞などの特定の細胞タイプに選択的に発現される発現ベクターを構成するために、クローン化され且つ用いられることができる、ことは示されている。グリア細胞ファイバー性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは、グリア由来の細胞における遺伝子を選択的に発現させるために、使用されている。
【００７７】
真核宿主細胞（酵母、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞）に用いられる発現ベクターは、ｍＲＮＡ発現に影響を与えうる転写の終了のために必要な配列も含みうる。これらの領域は、ポリアデニル化された部分として、組織因子タンパク質をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分に転写される。３´非翻訳領域は、転写終結部位も含む。転写ユニットもポリアデニル化領域を含むことが好ましい。この領域の一つの利点は、ｍＲＮＡのように転写ユニットが処理され且つ運ばれる可能性を高めることである。発現構成におけるポリアデニル化信号の同定および使用は、十分に確立されている。相同するポリアデニル化信号が導入遺伝子構成にて用いられることが好ましい。特定の転写ユニットにおいて、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化信号に由来し、約４００塩基からなる。転写ユニットが、単独でまたは上記配列と組み合わせて他の標準の配列を含むこと、構成からの発現または構成の安定性を向上させること、も好ましい。
【００７８】
２．マーカー
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードしている核酸配列を含むことができる。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に送達されたか、一度送達されたことが発現されたか、を決定するために使用される。好ましいマーカー遺伝子は、β‐ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードしている大腸菌ｌａｃＺ遺伝子である。
【００７９】
いくつかの実施形態において、マーカーは、選択可能なマーカーであってもよい。哺乳類細胞に適した選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似物Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびピューロマイシンである。そのような選択可能なマーカーが哺乳類宿主細胞にうまく移入された場合、形質転換された哺乳類宿主細胞は、選択圧下におかれても生存できる。選択的なレジームの二つの広く使用されている異なるカテゴリーがある。第一カテゴリーは、細胞の代謝に基づいており、添加培地から独立して増殖する能力を欠く変異細胞株の使用である。二つの例は：ＣＨＯ ＤＨＦＲ‐細胞およびマウスＬＴＫ‐細胞である。これらの細胞は、チミジン又はヒポキサンチンなどの栄養素の添加なしで増殖する能力が欠けている。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路のために必要な特定の遺伝子が欠けているので、それらは、添加培地に不足しているヌクレオチドが供給されない限り、生存できない。培地を補充することに代わるものは、それぞれの遺伝子が欠損している細胞に損なわれていないＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子を導入して、それらの増殖要求を変更することである。ＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、無添加培地において生存する能力がない。
【００８０】
第二カテゴリーは、任意の細胞型に使用される選択スキームを指し、変異細胞株の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、宿主細胞の増殖を阻む薬剤を典型的に使用する。新型の遺伝子を有するそれらの細胞は、薬剤耐性を伝えるタンパク質を発現し、選択を生き残るだろう。そのような優先選択の例は、薬剤ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ＰおよびＢｅｒｇ,Ｐ.,Ｊ、Ｍｏｌｅｃ. Ａｐｐｌ. Ｇｅｎｅｔ.１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ,Ｒ.ＣおよびＢｅｒｇ,Ｐ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２０９：１４２２（１９８０））、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ,Ｂら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ.５：４１０−４１３（１９８５））を使用する。三つの例は、適切な薬剤Ｇ４１８若しくはネオマイシン（ジェネテシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）又はハイグロマイシンに対する耐性を伝えるために、真核生物のコントロール下の細菌遺伝子をそれぞれ用いる。その他は、ネオマイシン類似物Ｇ４１８およびピューロマイシンを含む。
【００８１】
ｉｖ．配列類似性
本明細書で論じられるように、相同性および同一性という用語の使用は、類似性と同じことを意味することが理解される。したがって、例えば、相同性という単語の使用が二つの非天然配列間で用いられる場合、これは必ずしもこれらの二つの配列の進化的関係を示すものではなく、むしろそれらの核酸配列間の類似性または関連性に注目するものである、ことは理解される。二つの進化的関連分子間の相同性を判断するための多くの方法は、それらが進化的に関わっているか否かに関わらず、配列相同性を評価する目的で、任意の二つ以上の核酸またはタンパク質に、通常、適用される。
【００８２】
一般に、本明細書に開示されている遺伝子およびタンパク質の任意の既知の変異体および派生物または生じうるものを定義する一つの方法は、特定の既知の配列との相同性に関して変異体および派生物を定義することであることは理解される。本明細書に開示されている特定の配列のこの同一性は、本明細書の他の部分でも議論される。一般に、本明細書に開示されている遺伝子およびタンパク質の変異体は、示された配列または天然配列に対して、少なくとも、約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の相同性を典型的に有する。当業者は、遺伝子など、二つのタンパク質または核酸の相同性をどのように決定するかを容易に理解する。例えば、相同性がその最高レベルになるように、二つの配列を調整した後に相同性は計算されることができる。
【００８３】
相同性を計算する他の方法は、公表されたアルゴリズムによって、実行されうる。比較のための配列の最適アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：  ４８２  （１９８１）のローカル相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．  ４８：  ４４３  （１９７０）の相同性配列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：  ２４４４  （１９８８）の同一性方法のための検索によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実施（ＧＡＰ，  ＢＥＳＴＦＩＴ，  ＦＡＳＴＡ，  ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ, Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ., Ｍａｄｉｓｏｎ, ＷＩ）によって、または検査によって、実施されうる。
【００８４】
方法のうちのいずれかは典型的に用いられ、場合によってはこれらの様々な方法の結果は異なるかもしれないが、これらの方法の少なくとも一つに同一性が見出された場合、配列は示された同一性を有するものと言われ、本明細書に開示されうることは理解される。
【００８５】
例えば、本明細書で使用される場合、他の配列に対して特定割合の相同性を有するとして列挙される配列は、上記の計算方法のいずれか一つ以上によって計算される列挙された相同性を有する配列を示す。例えば、第二の配列に対して第一の配列が８０％の相同性を有するとＺｕｋｅｒ計算方法を用いて計算された場合、第一の配列が他のいずれかの計算方法によって計算された第二の配列に対する８０％の相同性を有さなくても、第一の配列は第二の配列に対して本明細書で定義されるような８０％の相同性を有する。別の例として、Ｚｕｋｅｒ計算方法とＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ計算方法との両方を用いて、第二の配列に対して第一の配列が８０％の相同性を有すると計算された場合、第一の配列がＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ計算方法、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ計算方法、Ｊａｅｇｅｒ計算方法、又は他のいずれかの計算方法によって計算された第二の配列に対する８０％の相同性を有さなくても、第一の配列は、第二の配列に対して本明細書で定義されるような８０％の相同性を有する。さらに別の例として、各計算方法を用いて第二の配列に対して第一の配列が８０％の相同性を有すると計算された場合、第一の配列は第二の配列に対して本明細書で定義されるような８０％の相同性を有する（しかし、実際には、異なる計算方法は、異なる算出相同性割合をしばしばもたらしうる）。
【００８６】
ｖ．医薬担体／医薬品の投与
一つの態様において、本発明の新型のＡｄｓおよび核酸は、治療または予防目的のための医薬組成物の成分として、用いられうることは理解され且つ本明細書で考慮される。一つの態様において、本明細書は、本明細書に開示されるＡｄｓ、Ａｄベクター、および核酸のいずれかを含む医薬組成物を提供する。当技術分野において周知の理由により、複製欠損の又は複製弱化組み換えＡｄをいずれかの医薬組成物が含むことが有利になりうることは理解され且つ本明細書で考慮される。一つの態様において、医薬組成物は、Ａｄを含むことができ、Ａｄは、複製可能であり、または、腫瘍細胞においてのみ組み換えＡｄを複製するように複製が制限されている。
【００８７】
薬学的に許容可能な担体と組み合わせて、治療もしくは予防薬、宿主細胞、またはＡｄを含む医薬組成物も提供される。特定の実施形態において、組成物は、遺伝的疾患（例えば、血友病、嚢胞性線維症、糖尿病、デュシェーヌ筋疾患もしくはベッカー筋疾患など）、がん遺伝子またはウイルスによって引き起こされたものを含む、固形または血液由来の局在性または播種性の転移性がん、ＢまたはＣ型肝炎およびＡＩＤＳ（ＨＩＶ感染による後天性免疫不全症候群）などのウイルス性疾患、ヘルペスウイルスによって引き起こされるウイルス感染などの再発性ウイルス疾患および再狭窄を含む心臓血管疾患など、の予防および／または治療に使用されることができる。
【００８８】
適宜に、組成物は、薬学的に許容可能な担体に生体内で投与されうる。「薬学的に許容可能な」とは、生物学的または他の望ましくないものではない物質を意味する。言い換えれば、物質は、望ましくない生物学的作用をもたらすことなく、または、それが含まれている医薬組成物の任意の他の成分と有害な方法で相互作用することなく、核酸またはベクターと共に、対象に投与されうる。当業者に周知なように、担体は、活性成分のあらゆる分解を最小限にし、且つ、対象に対するあらゆる副作用を最小限にするように、当然選択される。
【００８９】
組成物は、経口、非経口（例えば、静脈内）、筋肉注射、腹腔内注射、経皮的、体外的、局所鼻腔内投与または吸入による投与を含む局所的、又は同様のものによって、投与されうる。本明細書で使用される「局所鼻腔内投与」は、鼻孔の一方もしくは両方に通じる鼻および鼻腔への組成物の送達を意味し、噴霧機構もしくは液滴機構、または核酸もしくはベクターのエアロゾル化、による送達を含むことができる。吸入による組成物の投与は、噴霧もしくは液滴機構による送達を介して、鼻または口を通じて行うことができる。送達は、挿管を介して、呼吸器系の任意の領域（例えば、肺）に直接行うこともできる。必要とされる組成物の正確な量は、対象の種、年齢、体重および一般的な状態、治療されるアレルギー性疾患の重症度、用いられる特定の核酸もしくはベクター、その投与方法などに応じて、対象ごとに異なる。従って、全ての組成物に正確な量を指定することはできない。しかしながら、適切な量は、本明細書の内容に鑑みて、所定の実験のみを用いて当業者によって決定されうる。
【００９０】
組成物の非経口投与は、使用される場合、一般的に注射を特徴とする。注入物質は、溶液もしくは懸濁液の何れかの従来の形態、注入前の液体中の懸濁液の溶液に適した固形形態、または乳濁液として、調整されうる。非経口投与のためのより最近の修正された方法は、一定の投与量が維持されるように、徐放または持続放出製剤の使用を含む。例えば、参照することにより本明細書に取り込まれる米国特許第３，６１０，７９５号を参照。
【００９１】
材料は、溶液、懸濁液中にあってもよい（例えば、微粒子、リポソーム、または細胞に取り込まれている）。これらは、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して、特定の細胞型を標的とすることができる。以下の参照文献は、腫瘍組織に特定のタンパク質を向けるこの技術の使用例である（Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ, Ｋ.Ｄ、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，  ５８：７００−７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；ＰｉｅｔｅｒｓｚおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，  １２９：５７−８０，（１９９２）；およびＲｏｆｆｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５，（１９９１））。「ステルス」および他の抗体結合リポソーム（結腸がんに対してターゲッティングする脂質媒介薬剤を含む）、細胞特異的リガンドを介したＤＮＡの受容体媒介ターゲッティング、腫瘍ターゲッティングに向けられたリンパ球、および生体内におけるマウスグリオーマ細胞をターゲッティングする特異性の高い治療レトロウイルスなどの媒体。以下の参照文献は、腫瘍組織に特定のタンパク質をターゲッティングさせるこの技術の使用例である（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ,４９：６２１４−６２２０,（１９８９）；ＬｉｔｚｉｎｇｅｒおよびＨｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１  １０４：１７９−１８７，（１９９２））。一般に、受容体は、構成的またはリガンド誘導のいずれかのエンドサイトーシスの経路に関わる。これらの受容体は、クラスリン被覆ピットに集合し、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、受容体が分類される酸性エンドソームを通過し、それから、細胞表面に再循環するか、細胞内に蓄えられるか、またはリソソームで分解される。内部移行経路は、例えば、栄養摂取、活性タンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見的侵入、リガンドの解離および分解、および受容体レベル調整など、様々な機能を果たす。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの種類、リガンド結合価、およびリガンド濃度に応じて、複数の細胞内経路を進む。受容体媒介エンドサイトーシスの分子および細胞機構は、概説されている（Ｂｒｏｗｎ  およびＧｒｅｅｎｅ、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１０：６，３９９−４０９（１９９１））。
【００９２】
１．薬学的に許容可能な担体
抗体を含む組成物は、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて治療的に用いられることができる。
【００９３】
最適な担体およびそれらの形成は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎに記述されている：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ.Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ１９９５。典型的に、薬学的に許容可能な塩の適切な量は、製剤において使用され、製剤を等張する。薬学的に許容可能な担体の例は、生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含むが、これに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは約５から約８、より好ましくは約７から約７．５である。さらに、担体は、例えば、抗体を含む固体疎水性高分子の半透性マトリクスなどの持続放出製剤を含み、マトリクスは例えばフィルム、リポソームまたは微粒子などの形成品の形態である。例えば投与される組成物の投与経路および濃度に応じて、特定の担体がより好ましいことは、当業者には明らかであろう。
【００９４】
医薬担体は当業者に公知である。これらは、最も典型的には、ヒトへの薬剤の投与のための標準的な担体であり、生理的ｐＨでの、滅菌水、生理食塩水、および緩衝液などの溶液を含む。組成物は、筋肉内で又は皮下に、投与されうる。他の化合物は、当業者によって使用される標準的な手順に従って、投与される。
【００９５】
医薬組成物は、選択された分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤、界面活性剤などを含むことができる。医薬組成物は、例えば、抗菌剤、抗炎症薬、麻酔剤など、一つ以上の活性成分も含むことができる。
【００９６】
医薬組成物は、局所または全身治療が望まれるか及び治療される領域に応じて、多くの方法で投与されうる。投与は、局所的（眼、膣内、直腸内、鼻腔内を含む）、経口、吸入により、または例えば点滴によるなど非経口、皮下、腹腔内もしくは筋肉注射によって行われる。開示されている抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮的に投与されうる。
【００９７】
非経口投与のための製剤は、滅菌水性または非水の溶液、懸濁液、および乳濁液を含む。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレン・グリコール、オリーブオイルなどの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルである。水性担体は、水、アルコール性／水性溶液、乳濁液または生理食塩水および緩衝媒体を含む懸濁液を、含む。非経口媒体は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油を含む。静脈媒体は、液体および栄養補充液、電解質補充液（例えばリンゲルブドウ糖に基づくもの）などを含む。防腐剤および他の添加剤は、例えば、抗菌剤、抗酸化物質、キレート剤、および不活性ガスなどのように、存在もしうる。
【００９８】
局所投与のための剤形は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴剤、坐薬、噴霧剤、液体および粉末剤を含むことができる。従来型の医薬担体、水性、粉末もしくは油性基剤、増粘剤などは、必要または望ましくなることがある。
【００９９】
経口投与のための組成物は、粉末もしくは顆粒、水もしくは非水媒体中の懸濁剤か液剤、カプセル、小袋、または錠剤を含む。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましい場合がある。
【０１００】
組成物のいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、及びリン酸などの無機酸、およびギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、及びフマル酸などの有機酸との反応によって、または、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、およびモノ‐、ジ‐、トリ‐及びアリールアミン及び置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応によって、生成される、薬学的に許容可能な酸または塩基付加塩として投与される可能性がある。
【０１０１】
２．治療的使用
一つの態様において、本明細書に開示されている治療方法は、本明細書の説明に従ったＡｄおよび宿主細胞の治療効果のある量を、そのような治療を必要とする患者に投与する方法である。そのような方法は、Ａｄに感染する前または後のいずれかに、一つ以上の薬剤実在物によって宿主を治療することを含むことができる。
【０１０２】
組成物を投与するための有効な投与量およびスケジュールは実験的に決定でき、そのような決定をすることは当技術分野の技術範囲内である。組成物の投与のための投与量範囲は、疾患の症状が影響を受ける所望の効果を生じるのに十分な量である。投与量は、望まない交差反応、アナフィラキシー反応などの有害な副作用を生じさせるほど多くすべきでない。一般に、投与量は、患者の年齢、状態、性別、および疾患の程度、投与経路、他の薬剤が養生法に含まれるかどうかによって変わり、当業者によって決定されうる。投与量は、何らかの禁忌の場合、個々の医師によって調節されうる。投与量は変動してもよく、一日または数日間、毎日一回もしくは複数回の用量投与によって投与されることができる。指針は、所与の種類の医薬品のための適切な投与量に関する文献中に見つけることができる。例えば、抗体の適切な投与量の選択における指針は、抗体の治療的使用に関する文献、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｆｅｒｒｏｎｅら、編集、Ｎｏｇｅｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ, Ｐａｒｋ Ｒｉｄｇｅ, Ｎ.Ｊ., （１９８５）２２章、３０３−３５７頁；Ｓｍｉｔｈら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｈａｂｅｒら、編集、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７７）３６５−３８９頁に見つけることができる。単独で使用される抗体の典型的な一日投与量は、上記要因に応じて、一日当たり、約１μｇ／ｋｇ体重から１００ ｍｇ／ｋｇ体重またはそれ以上の範囲であってもよい。
【０１０３】
ｃ．組成物の使用方法
ｉ．肝臓におけるＡｄの隔離を回避する方法
一つの態様において、本発明のＡｄは、宿主の肝臓におけるＡｄの隔離の問題を回避するために考案されることは理解され且つ本明細書で考慮される。従って、本明細書で開示されるのは、宿主の肝臓におけるＡｄビリオンの隔離を回避するように、Ａｄを投与する方法である。この方法は、ａ）ペントンタンパク質のＲＧＤモチーフに変異を有するＡｄを提供するステップであって、該変異は生体内の宿主正常肝臓細胞のβ３インテグリンの結合を減少させるステップ；ｂ）宿主のビタミンＫ依存性凝固因子（例えば、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、およびにプロテインＣなど）とのＡｄの結合を減少させるステップ；およびｃ）Ａｄのクッパー細胞への結合を減少させるステップ、を含む。
【０１０４】
宿主のビタミンＫ依存性凝固因子とのＡｄの結合を減少させるステップは、ヘキソンタンパク質のＨＶＲ３、ＨＶＲ５、またはＨＶＲ７領域に変異を有するＡｄを提供すること、を含むことができ、変異はビタミンＫ依存性凝固因子の結合を減少させる、ことは理解され且つ本明細書で考慮される。一つの態様において、ビタミンＫ依存性凝固因子とのＡｄの結合を減少させるステップは、例えば、ワルファリンなどの薬剤存在物の投与、または、例えばクロドロネートリポソームを投与することを含む、クッパー細胞を少なくとも部分的に不活化する薬剤によって宿主を処理すること、を含むことができる。
【０１０５】
さらに、クッパー細胞とのＡｄの結合を防止するステップは、ヘキソンタンパク質のＨＶＲ１領域に変異を有するＡｄを提供すること、および／または、クロドロネートリポソームを投与することを含むクッパー細胞を少なくとも部分的に不活化する薬剤の介在によって宿主を処理すること、を含むことができることは理解される。
【０１０６】
ｉｉ．がんを治療する方法
開示されているＡｄ組成物は、がんなどの無制御細胞増殖が生じる任意の疾患を治療するために使用されうる。異なる種類のがんの非限定的なリストは以下の通りである：リンパ腫（ホジキン又は非ホジキン）、白血病、上皮性悪性腫瘍、固形組織がん、扁平上皮細胞がん、腺がん、肉腫、神経膠腫、高悪性度神経膠腫、芽細胞腫、神経芽細胞腫、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、低酸素腫瘍、骨髄腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫もしくは肉腫、転移性がん、または一般がん。
【０１０７】
開示されている組成物が治療に用いられうるがんの代表的であるが非限定的なリストは以下の通りである：リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱がん、脳腫瘍、神経系がん、頭部および頸部がん、頭部および頸部の扁平上皮細胞がん、腎がん、小細胞肺がん及び非小細胞肺がん等の肺がん、神経芽細胞腫／膠芽細胞腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、肝がん、黒色腫、口腔、咽喉、喉頭、及び肺の扁平上皮細胞がん、乳がん、及び上皮がん、腎がん、泌尿生殖器がん、肺がん、食道がん、頭部および頸部がん、大腸がん、造血がん；精巣がん；結腸および直腸がん、前立腺がん、または膵がん。
【０１０８】
本明細書に開示されている組成物は、頸部および肛門異形成、他の異形成、高度の異形成、過形成、異型過形成、及び新生組織形成などの前がん症状の治療にも使用されうる。
【０１０９】
ｄ．実施例
以下の実施例は、当業者に、この特許請求の範囲に係る化合物、組成物、論文、機器、および／または方法がどのようなになされ且つ評価されるかについて、完全な開示および説明を提供するために提示されており、単なる例示であり且つ本開示を限定することを意図されていない。数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証する取り組みがなされているが、いくらかの誤差および偏差は説明されるべきである。他に指示がない限り、部は重量部、温度は℃または周囲温度であり、及び圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
【０１１０】
ｉ．実施例１：血液由来Ａｄビリオンは、ウイルスファイバー構造またはＲＧＤモチーフを介したインテグリンへのペントンの結合と関係なく、肝臓に効率的に隔離される。
肝臓における血液由来ウイルス粒子の隔離の媒介における、Ａｄファイバー構造またはＲＧＤモチーフを介した細胞インテグリンへのペントンの結合の潜在的役割を評価するために、ペントンベース内の変異ファイバーまたはＲＧＤ欠失を有する予め構成されたＡｄ５ベースベクターのセットが利用された。Ａｄ５およびＡｄ５ΔＲＧＤベクターは、一次ウイルス付着受容体としてＣＡＲに結合できた。Ａｄ５／３５Ｌ、Ａｄ５／３５ＬΔＲＧＤ、Ａｄ５＊ＦおよびＡｄ５＊ＦΔＲＧＤはファイバーノブ領域を有していたが、当該ファイバーノブ領域は、そのＣＡＲとの結合を排除するＡｄ５ファイバーノブ内における単一点変異のため（Ａｄ５＊ＦおよびＡｄ５＊ＦΔＲＧＤ）、又は、Ａｄ５ファイバーノブ領域の全体の、一次付着受容体としてのヒトＣＤ４６に結合するＡｄ３５由来のファイバーノブ領域との置換のため（Ａｄ５／３５ＬおよびＡｄ５／３５ＬΔＲＧＤ）、ＣＡＲに結合できない。Ａｄ５／３５Ｓベクターは、Ａｄ３５由来のファイバーシャフトおよびノブ領域を除き、野生型Ａｄ５カプシド有している。これらの全てのベクターはＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスに静脈内注射され、1時間後、肝臓が摘出され、各ベクターの肝臓に捕捉されたＡｄＤＮＡの量は、サザンブロット法を用いて分析された。この分析は、ファイバーの改変またはペントンベースのＲＧＤモチーフ欠失とは無関係に、全てのベクターが肝臓に同程度で蓄積したことを明らかにした（図１）。この実施例は、生体内での血管内投与後に肝臓での隔離を逃れる本発明のＡｄの構築を、米国特許第５，７１２，１３６号に開示された先行技術が教示していないか又は可能にしていない、という直接的な証拠を提供する。
【０１１１】
ｉｉ．実施例２：肝細胞形質導入の血液因子経路の不活性化は、肝臓における血液由来Ａｄビリオンの隔離またはクッパー細胞におけるウイルス蓄積を防ぐことができない。
静脈内にＡｄ５が注射されると、ウイルスヘキソンタンパク質は凝固因子Ｘととても高い親和性で結合し、この相互作用は、生体内における肝細胞への効率的なウイルス侵入および肝細胞形質導入をもたらす。この生体内における肝細胞へのＡｄビリオンの侵入経路の不活化が、静脈内ウイルス注射後に肝臓に隔離されるＡｄ粒子量の減少をもたらすかどうかをよりよく理解するために、コントロール非処理マウス、および全てのビタミン独立血液凝固因子を不活性化するワルファリンで処理されたマウスに、非改変Ａｄウイルスが投与された。静脈内ウイルス注射から１時間後に肝臓に捕捉されたＡｄ  ＤＮＡの分析は、この時点において、ワルファリン処理が、肝臓でのＡｄビリオン隔離の有意な減少をもたらさないことを示した（図２Ａ）。
【０１１２】
静脈注射後、大量のＡｄビリオンは、肝臓に存在するマクロファージ、クッパー細胞に捕捉されることが知られている。ワルファリンで処理されたマウスにおいて、血液由来Ａｄ粒子を捕捉するクッパー細胞の能力が変化するかどうかを評価するために、Ａｄ５を静脈内に投与し、１時間後、免疫染色および蛍光顕微鏡検査法によって、クッパー細胞とウイルス粒子の共局在化を分析した。この分析は、コントロールおよびワルファリン処理マウスにおいて、肝臓にクッパー細胞が存在することを明らかにした（図２Ｂ）。重要なことには、Ａｄ５ヘキソン特異的抗体およびＦ４／８０抗体でマウスの肝臓切片を共染色した場合、クッパー細胞にＡｄヘキソン特異的染色の明確な共局在が観察され（図２Ｂ）、血液由来Ａｄを捕捉するクッパー細胞の能力をマウスのワルファリン処理が除去しないことが示された。
【０１１３】
異なる野生型ヒトＡｄ血清型は、それらのカプシドへのＦＸ結合の解離定数（Ｋｄｓ）において、高い変動性を示す。ヘキソンの露出領域のアミノ酸組成およびＦＸ結合のＫｄｓの変動が、肝臓におけるＡｄビリオン隔離の効果に影響を与えうるかどうかをさらに評価するために、マウスに野生型ヒトＡｄ血清型Ａｄ３、Ａｄ１４、Ａｄ１６、およびＡｄ３５が静脈注射された。ここで、Ａｄ１６はＦＸ結合の１．６７ ｎＭ Ｋｄを有し、Ａｄ３は３０００ ｎＭと同等のＦＸ結合のＫｄを有するが、Ａｄ３５はＦＸ結合を全く明示しない、ことが示されている。静脈内投与後の肝臓におけるこれらのウイルス隔離の評価は、Ａｄ３およびＡｄ１６の間で差異を示さず、およびＡｄ３５ＤＮＡのより高いレベルを示し（図２Ｃ）、ＦＸへのウイルス結合は、肝臓における血液由来Ａｄビリオンの隔離を媒介する唯一の重要な経路ではないことを示した。
【０１１４】
ワルファリンによるマウスの処理がＡｄ媒介肝細胞形質導入に何らかの影響を有するかどうかを分析するために、コントロールマウス及びワルファリン処理されたマウスに、未改変野生型Ａｄ５カプシドを有するがＣＭＶプロモーターの制御下で赤色蛍光タンパク質を発現するＡｄ５ＲＦＰ、が投与された。ＲＦＰ発現のための肝臓切片の組織学的評価は、コントロール擬似処理マウスにおいて、Ａｄ５ＲＦＰが肝細胞に非常に高い効率で形質導入したことを示した（図３Ａ上方のパネル）。また、ワルファリンによるマウスの処理は、Ａｄ５媒介肝細胞形質導入を完全に抑制した。驚くべきことに、肝臓切片の詳細な評価もまた、ワルファリン処置群において、Ａｄ５ＲＦＰは類洞内皮細胞をも形質導入したことを明らかにした（図３Ａ、下パネル、及び３Ｂ）。これらの細胞におけるＲＦＰ発現のレベルは非常に低かったが、ＲＦＰ発現は分析した細胞の１０．８％で検出された。ＣＤ３１／ＲＦＰ二重陽性細胞は、全てのＣＤ３１陽性内皮細胞の１７％を示した。対照的に、ＲＦＰ発現は、循環および滞留性（residential）の単球およびマクロファージを含む造血起源のβ２インテグリン陽性細胞では観察されなかった（図３Ｂ）。まとめると、データは、肝細胞感染の血液因子経路のワルファリン仲介不活性化がＡｄビリオン肝細胞の形質導入を完全に排除するが、静脈内ウイルス注射後の肝臓におけるＡｄビリオン隔離にはほとんど影響しない、ことを示す。さらに、ＦＸ結合のＫｄｓにおいて劇的に変化する野生型ヒトＡｄ血清型は、静脈内ウイルス投与後に同等のレベルで肝臓に蓄積する。ワルファリンによるマウスの処理は、クッパー細胞におけるＡｄ蓄積を妨げなかった; しかし、それは肝細胞から類洞内皮細胞へのＡｄ感染の再方向づけを可能にした。
【０１１５】
ｉｉｉ．実施例３：クッパー細胞の減少は、肝臓におけるＡｄ隔離に影響しない。
クッパー細胞は静脈内ウイルス投与直後に大量のＡｄ粒子を蓄積することが知られている。Ａｄ注射前のマウスへのポリイノシン酸、ポリ（Ｉ）、投与は、生体内における血液由来Ａｄを捕捉するクッパー細胞の能力を大幅に低下させる。このデータは、ポリ（Ｉ）特異的受容体、スカベンジャー受容体Ａが、その静脈内注射後に血液からのＡｄビリオン隔離に関与しうることを示唆する。この可能性を評価するために、野生型またはスカベンジャー受容体Ａノックアウトマウス（ＳＲ−Ａ−ＫＯ）にＡｄ５ベースベクターを投与し、サザンブロット法によって肝臓におけるウイルスＤＮＡ沈着を分析し、及び蛍光顕微鏡によってクッパー細胞におけるウイルス捕捉を分析した。これらの分析は、コントロール野生型マウス及びＳＲ−Ａ−ＫＯマウスの両方において、静脈内ウイルス投与後、Ａｄ粒子を蓄積する能力をクッパー細胞が保持したことを示した（図４Ａ）。静脈内ウイルス注射後に肝臓から回収されうるＡｄベクターＤＮＡの量は、野生型およびＳＲ−Ａ−ＫＯマウスにおいて実質的に同一であることが見出され（図４Ｂ）、ＳＲ−Ａは、生体内において血液由来Ａｄを捕捉するクッパー細胞の能力の原因となる唯一の受容体ではなく、又、少なくとも、唯一の受容体ではあり得ないがことが示された。
【０１１６】
次に、これらの食細胞の減少が血液由来Ａｄを隔離する肝臓の能力を低下させることができるかどうかが分析された。クッパー細胞を激減させるために、単回投与クロドロネートリポソーム注射によるマクロファージの除去が使用された。マウスへのクロドロネートリポソームの静脈内投与は、肝臓からのクッパー細胞の完全な排除をもたらした（図４Ｃ）。しかしながら、クロドロネートリポソームで処理したマウス又はＰＢＳのみで処理したコントロールマウスの肝臓におけるＡｄ ＤＮＡ量のサザンブロット分析は、肝実質におけるクッパー細胞の存在とは無関係に、肝臓に捕捉されたＡｄの量に差異を示さなかった（図４Ｄ）。
【０１１７】
ｉｖ．実施例４：ワルファリン及びクロドロネートリポソームによるマウスの同時処理は、血液由来Ａｄを隔離する肝臓能力の部分的な低下のみをもたらす。
血液因子経路の不活性化またはクッパー細胞の減少が、静脈内ウイルス投与後に肝臓に捕捉されたＡｄ ＤＮＡ量の測定可能な減少をもたらさないという知見は、大量のＡｄ粒子がクッパー細胞に蓄積し且つＡｄ ＤＮＡは形質導入された肝細胞において長期間持続するため、むしろ予期せぬことであった。このデータは、生体内において、クッパー細胞と肝細胞とによるＡｄ隔離のメカニズムの間に動釣り合いが存在しうることを示している。このデータは、血液由来Ａｄの隔離のメカニズムが冗長的かつ相乗的に働きうることも示している。この可能性を評価するために、Ａｄ投与前にワルファリン及びクロドロネートリポソームの両方で処理したマウスの肝臓におけるＡｄ ＤＮＡの隔離が分析された。この分析は、ワルファリンのみで処理したマウスと比較して、ワルファリン及びクロドロネートリポソームの両方で処理したマウスにおいて、静脈内Ａｄ注射から１時間後に摘出した場合、肝臓に捕捉されたウイルスＤＮＡの量が３５％低かったことを明らかにした（図５Ａ、５Ｂ）。これら２つの実験群の差は統計的に有意であったが、それは劇的ではなかった。ワルファリン及びクロドロネートリポソームで処理したマウスの肝臓におけるＡｄ分布の綿密な評価は、肝洞様毛細血管に局在するたくさんの点状のＡｄ特異的染色を示した（図５Ｃ）。ワルファリン又はクロドロネートリポソームのどちらか単独で処理されたマウスの肝臓におけるＡｄ分布のこのタイプは観察されなかったので、このデータは、クッパー細胞および血液因子経路の両方が不活性化された場合にＡｄ隔離のさらに別のメカニズムが関与することを示している。Ａｄ粒子は血小板に蓄積する可能性があるため、肝臓切片は血小板特異的抗ＣＤ４１抗体で染色された。このアプローチを用いて、Ａｄヘキソン特異的染色は非常にわずかな領域でＣＤ４１特異的染色と共局在することが見出されたが、点状Ａｄヘキソン特異的染色の大部分はＣＤ４１染色と重複しなかった。
【０１１８】
ワルファリン及びクロドロネートリポソームで処理したマウスの肝洞様毛細血管におけるＡｄ粒子の局在をより明確にするために、透過型電子顕微鏡が用いられた。ウイルス注射の１時間後、肝臓組織は摘出され、固定され、超薄切片処理された。電子顕微鏡分析は、ワルファリン処理したマウスでは肝細胞の細胞質構成が非常にゆがんでいることを明らかにし、肝細胞に対するこの薬物の主要な細胞毒性効果が示された。Ａｄ粒子は、薄い切片上で容易に同定され、洞様内皮細胞と肝細胞表面との間および下部の解剖学的領域であるディッセ腔に局在した（図５Ｄ及び６）。予想通り、Ａｄ粒子は、自由粒子として肝洞様毛細血管に存在していた（図６）。
【０１１９】
まとめると、このデータは、クッパー細胞によって仲介される隔離メカニズムおよび血液凝固因子が機能しない条件下で、肝洞様毛細血管内皮細胞と肝細胞との間のディッセ腔におけるＡｄ捕捉が、肝臓における大量の血液由来Ａｄを捕捉する原因となる主要なメカニズムとなりうる、ことを示している。
【０１２０】
ｖ．実施例５：他のウイルスクリアランス機構が不活性化された場合、ＲＧＤモチーフ媒介Ａｄ相互作用は肝臓における血液由来Ａｄを隔離するのに主要な役割を果たす。
細胞へのＡｄ内部移行は、ペントンベースＲＧＤモチーフを介した細胞インテグリンへの結合によって促進される。多くのＲＧＤモチーフ相互作用インテグリンは、異なる種類の細胞へのＡｄ内部移行を促進することができる機能的共受容体として機能することが示された。さらに、インテグリンとのＡｄ相互作用は、細胞へのウイルス付着および内部移行の両方を媒介できることが示された。ＲＧＤモチーフ相互作用性β３−インテグリンは、内皮細胞上に発現されるαγβ３インテグリンサブユニットであるため、β３−インテグリン遺伝子がノックアウトされたマウスでは、肝臓における血液由来Ａｄの隔離が低減されうる。これをさらに評価するために、β３−ＫＯマウスに、ワルファリン及びクロドロネートリポソームによる処理を伴い又は伴わずＡｄ５が投与され、サザンブロット法によって肝臓におけるウイルスＤＮＡ沈着が分析された。この分析は、野生型コントロール及びβ３−ＫＯマウスの肝臓におけるＡｄ５の蓄積は同等であったが、ワルファリン及びクロドロネートリポソームによるβ３−ＫＯマウスの処理は、野生型動物と比較して、静脈内ウイルス注射後に肝臓に捕捉されたＡｄのレベルを有意に低下させることを明らかにした（図７Ａ−７Ｂ）。静脈内ウイルス投与後のクッパー細胞におけるＡｄ捕捉の分析は、両方のマウス種において、クッパー細胞が血液由来Ａｄを捕捉することができたことを示し（図７）、βインテグリンが血液由来Ａｄ粒子を捕捉するクッパー細胞の能力に有意に寄与する可能性が低いことを示した。
【０１２１】
ＡｄペントンＲＧＤモチーフ媒介相互作用がディッセ腔におけるＡｄ保持に関与するかどうかをさらに評価するために、野生型マウスにペントンベースに３アミノ酸欠失を有するＡｄ５ΔＲＧＤベクターが注射された。サザンブロット法を用いて、Ａｄ５ΔＲＧＤベクターを注射した野生型マウスであってワルファリン及びクロドロネートリポソームで処理した野生型マウスの肝臓から回収されたＡｄ ＤＮＡのレベルの大幅な低下が観察された（図７Ａ）。肝臓に関連するＡｄ５ΔＲＧＤ ＤＮＡのレベルは、ワルファリン及びクロドロネートリポソームの両方で処理したマウスのＡｄ５ ＤＮＡのレベルと比較して３０％であり、模擬処理したコントロール群のＡｄ５ ＤＮＡレベルと比較して１８％であった（図７Ｂ）。蛍光顕微鏡を用いたワルファリン及びクロドロネートリポソームで処理したマウスの肝臓におけるＡｄ５ΔＲＧＤ分布の分析は、Ａｄ特異的染色の完全な欠如を示した（図７Ｄ）。
【０１２２】
肝臓における血液由来Ａｄの捕捉を媒介する際のＡｄペントンＲＧＤモチーフの役割をさらに検証し、このプロセスを支配する経路の関与順序を評価するために、ワルファリン又はクロドロネートリポソーム単独で処理したマウスにＡｄ５ΔＲＧＤが投与された。これらのマウスの肝臓におけるＡｄ ＤＮＡ沈着の分析は、コントロール非改変Ａｄ５を注射したマウスと同様に、ワルファリン又はクロドロネートリポソーム単独での処理は、静脈注射後に肝臓に捕捉されたベクターＤＮＡの測定可能な減少をもたらさなかったことを示した（図８）。しかしながら、ワルファリン及びクロドロネートリポソームによる同時のマウスの薬理学的処理と、ＲＧＤモチーフ媒介相互作用の除去と、の組み合わせは、肝臓組織に関連するベクターＤＮＡの量に大幅な減少をもたらし、肝臓で作動し、静脈内Ａｄ注射後に、血液からのＡｄの定量的な除去および肝組織における捕捉を可能にする、分子機構の冗長性および相乗作用の証拠を提供する（図９）。
【０１２３】
ｖｉ．実施例６：血液凝固因子への結合に対して除去されるヘキソン修飾Ａｄｓ。
血液凝固因子へのＡｄ５ヘキソン結合を除去することができるヘキソン修飾は、ＨＶＲ７におけるＴＥＴアミノ酸配列の欠失（図１１Ａ）、またはこれに限定されないがＮＡＡ（ＦＸに結合しないＡｄ５１由来ＨＶＲ7配列、図１２Ｄ）を含むアミノ酸への置換、または凝固因子結合を機能的に不活性化する他の方法でのヘキソンの変異、を含む。凝固因子結合を除去することができる修飾の別の例は、ＨＶＲ７又はＨＶＲ３への正荷電アミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）の挿入であり、したがって、ＨＶＲ３におけるに標準的なＦＸ結合ＴＤＴ配列を有するが、ＦＸに効率的に結合しない、Ａｄ３及びＡｄ５におけるアミノ酸の自然な幾何学的配置を模倣する（図１２；表１）。
【０１２４】
ＦＸ及びＦＶＩＩに限定されないがこれらを含む凝固因子とのＡｄ相互作用の完全な除去を可能にするＡｄヘキソンの特異的な最小変異は、トレオニン（４２５）のアラニンへの単一アミノ酸置換である（Ｔ４２５Ａ、図１３及び１４Ａ、Ｂ）。この変異は、効率的な肝細胞形質導入と、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＭＩＰ１αを含むＮＦ−ＫＢ依存性炎症性サイトカインとケモカインとの選択サブセットの誘導と、を含む宿主とのＡｄのＦＸ依存性相互作用を全て排除するのに十分である（図１５）。しかしながら、この変異だけでは、静脈内ウイルス投与後の、クッパー細胞（図２２Ｄ）、脾臓周辺帯マクロファージ（図１４Ｇ、１４Ｈ、Ａｄ−ＴＥＡ変異体）を含む組織マクロファージにおけるＡｄの捕捉または肝臓におけるウイルス隔離（図２２Ｃ）、を妨げない。
【０１２５】
ｖｉｉ．実施例７：細胞β３及びβ５インテグリンへの結合に対して除去されるペントン修飾Ａｄｓ。
Ａｄ５ΔＲＧＤウイルスは、ＲＧＤモチーフを介してＡｄ５とインテグリンとの相互作用を除去させるフレキシブルＡｄ５ペントンループ内での３アミノ酸欠失を有する（図１７）。
【０１２６】
インテグリンとのＡｄ５相互作用を除去できるペントン修飾は、Ａｄ５ペントンのインテグリン相互作用性ＲＧＤモチーフ含有ループ全体の欠失、３つのアミノ酸Ｒ−Ｇ−Ｄのみの欠失または置換（図１６、１７）、または何らかの方法でβ３及びβ５インテグリンとの機能的ペントン相互作用を防止するペントンの変異、を含むことができる。
【０１２７】
マクロファージに対するβ３インテグリンクラスとのＡｄ相互作用は、ＩＬ−１α−ＩＬ−１ＲＩシグナル伝達によって誘導される自然免疫の独特なシグナル伝達経路を活性化する（図１８）。ＲＧＤアミノ酸モチーフの欠失を有し、したがって、ＲＧＤ相互作用インテグリンへの結合に対して除去されたＡｄ５ΔＲＧＤウイルスは、ＩＬ−１α依存性炎症促進性シグナル伝達を機能的に活性化することができず（図１８、１９）、非改変Ａｄ−ＷＴウイルスと比較して、血管内ウイルス投与後の肝臓および脾臓における炎症性サイトカインおよびケモカイン活性化のレベルの低下または無視できるほどのレベルをもたらす（図１８Ｅ）。β３インテグリン欠損マウスへの野生型非改変Ａｄの投与は、炎症性サイトカイン活性化をほとんど又は全く引き起こさなかったので、Ａｄに対するマクロファージのこの炎症促進性応答は、ウイルスペントンＲＧＤモチーフとβ３クラスインテグリンとの特異的相互作用によって引き起こされる（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ―６、ＴＮＦ−α、図１８）。この知見は、ＲＧＤモチーフ含有ペントンを有するＡｄ変異体と比較して、有意に低い炎症レベル、したがって、改善された毒性プロファールを示す修飾ペントンを有するＡｄ変異体の構築の基礎を表す。
【０１２８】
ＲＧＤモチーフを介したインテグリンとのペントン相互作用を除去できる修飾の別の例は、ＲＧＤモチーフを含まず且つインテグリンの特定のサブセット又は他の受容体をＡｄの選択的な標的にできるアミノ酸配列（複数の配列を含む）へのＡｄ５のＲＧＤモチーフ含有フレキシブルループの置換である。前記特定のサブセット又は受容体は、生体内において、肝細胞上で効率的に発現されないが、腫瘍細胞上で発現されうる。これらのタイプの受容体には、生体内において、腫瘍細胞では高度に発現されるが、肝細胞では発現されないα３β１、α６β４、又はα６β１インテグリンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２９】
ＲＧＤループの代わりにＡｄ５ペントンに挿入された非ＲＧＤモチーフ含有ペプチドを介して、非天然クラスのインテグリンをＡｄの標的とするために、Ａｄ−Ｌａｍ１及びＡｄ−Ｌａｍ３ベクターが構築された（図２０）。Ａｄ５−Ｌａｍ１ベクターは、ヒトＬａｍｉｎｉｎ−１由来のＳＩＫＶＡＶアミノ酸モチーフを囲む５０個のアミノ酸を含む（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.： ３）。Ａｄ５−Ｌａｍ３ベクターは、ヒトＬａｍｉｎｉｎ−３由来のＳＫＶＡＶアミノ酸配列を取り囲む５４個のアミノ酸を含む（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.：４）。これらのラミニン由来配列はいずれもＲ−Ｇ−Ｄアミノ酸モチーフを含まず、２９３細胞上のＳＩＫＶＡＶ又はＳＫＶＡＶモチーフを介してα６β１インテグリンに結合することができ、ウイルスの侵入および増殖を可能にする。
【０１３０】
非β３インテグリンへのウイルスターゲッティングを可能にするための非ＲＧＤモチーフ含有ペプチドによる同機能Ａｄ５ＲＧＤループ置換の他の例は、図２５に示されている（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ.：９, １０）。
【０１３１】
ｖｉｉｉ．実施例８：ヘキソン及びペントンに変異を有し、血管内投与後、物理的粒子レベルで肝臓における捕捉をウイルス粒子が回避することを可能にする、Ａｄベクター。
実施例６に記載のヘキソン変異体Ｔ４２５Ａ及び実施例７に記載のペントン変異体を有するＡｄ５ウイルス粒子（図２１、Ａｄ−２Ｍ）は、マウスに静脈注射され、ウイルス投与から１時間後に肝臓に捕捉されたウイルスが分析された。コントロール非改変Ａｄ−ＷＴウイルス、又は、ヘキソン（Ｈ４２５Ａ、Ａｄ−ＴＥＡ）若しくはペントン（Ａｄ−Ｌａｍ３、Ａｄ−Ｌａｍ、図２１Ｃ）のいずれかに個々の変異を含むウイルスと比較した場合、肝臓に捕捉されたＡｄ−２Ｍウイルスの量に有意差はなかった。肝臓のクッパー細胞は、Ａｄ−ＷＴ粒子と同程度に効率的にＡｄ−２Ｍウイルス粒子を捕捉した（図２１Ｄ）。このデータは、（血液凝固因子を不活性化する）ワルファリンで薬理学的に調節されたマウス及びＡｄ５ΔＲＧＤを注射されたマウスからの所見と一致し、非改変ウイルス又は生理食塩水で調節されたマウスと比較して、肝臓に隔離されたウイルス粒子のレベルの低下を示さなかった（図８Ａ）。
【０１３２】
Ａｄ２−Ｍウイルスは、プラットフォームとして使用され、ヘキソンＨＶＲ１ループ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.：５）に追加的な新規欠失が導入され、血管内ウイルス投与後クッパー細胞における捕捉をウイルスが回避することを可能にすることが実験的に見出された（図２２）。得られたウイルス、Ａｄ−３Ｍは、ヒトＡｄ血清型５に基づいており、同時に３つの変異、即ちヘキソンに２つの変異とペントンに１つの変異、を同時に含む、本発明の好ましい実施形態の1つを表す（図２３Ａ）。静脈注射した場合、Ａｄ−ＷＴ、カプシドタンパク質に改変を含まない野生型ウイルスを含む他のベクターと比較して、Ａｄ−３Ｍウイルスは、物理的粒子レベルで、クッパー細胞を含む肝臓における蓄積の有意な減少を示した（図２３Ｂ、Ｃ、Ｅ）。
【０１３３】
図２２に記載のＡｄ５ヘキソンＨＶＲ１ループ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.：５）における特異的変異およびＡｄ−３Ｍウイルスにおけるその形態は、代替の改変のための制限なく一例として提供される。ＨＶＲ１における変異の他の例は、アミノ酸Ｄ１３６及びＫ１６５間のＨＶＲ１ループのＧＧＳＧグリシンリンカーとの置換を含むことができるが、これに限定されず、得られたベクターにおける新たなＨＶＲ１拡張欠失の配列全体は１３６−ＤＥＡＡＴ−ＧＧＳＧ−ＱＱＫ−１６５（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.：６）と示される。Ａｄ５ＨＶＲ１ループの別の改変は、Ａｄ５のＨＶＲ１（図２２）の代わりにＡｄ４１（天然の短鎖）及びＡｄ５１（天然の中間体）等の任意の他のヒトまたは動物Ａｄ血清型からのＨＶＲ１ループの移植も含むことができ、Ａｄ４１ １３５−Ｗ−ＫＤＮＮ−Ｋ−１６５（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.：７）；及びＡｄ５１ １３５−Ｗ−ＥＱＫＫＴＴＧＧＧＮＤＭＥ−ＴＨ−１６７（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.：８）からキメラＨＶＲ１配列のベクターを生成する。
【０１３４】
Ａｄ−３Ｍウイルスの静脈内投与はまた、脾臓における炎症性サイトカイン活性化をほとんど引き起こさず、Ａｄ−ＷＴウイルスが注射されたマウスとは対照的に、ウイルス注射から１時間後にＡｄ−３Ｍベクターが注射されたマウスにおいてクッパー細胞死は観察されなかった（図２３Ｅ）。このデータは、血管内投与後の肝臓におけるＡｄ捕捉を可能にする３つの異なる肝細胞区画の等機能的役割を示し、ウイルス肝細胞相互作用を媒介する際の特定の分子機構を暗示する（図２４）。このモデルは、本発明の好ましい実施形態のＡｄ−３Ｍベクター（図２３）に例示されるように、血管内投与後にウイルスが肝臓による隔離を回避することを可能にするために、Ａｄ５ベースベクターへの３つの特異的変異の導入を必要とする。
【０１３５】
肝臓における肝外細胞（腫瘍細胞および他の器官における転移）又は非肝細胞（肝臓における腫瘍転移）を、ファイバー修飾を介して若しくは他の手段によってターゲッティングすると（図２６）、非改変ウイルス変異体と比較して、記載されたペントン及びヘキソン変異ベクターに対する治療上のウイルス投与量ははるかに少なく、且つ、そのようなウイルスの急性全身毒性が低いため、ウイルス安全性ははるかに高くなりうる。
【０１３６】
ｉｘ．実施例９：考察
Ａｄは、二本鎖直鎖ＤＮＡゲノムを有する非エンベロープウイルスである（Ｓｈｅｎｋ、２００１）。体外でのウイルス感染に対する細胞の感受性は、少なくとも部分的に、細胞表面上の特異的付着受容体への効率的なＡｄファイバー結合に起因する（Ｎｅｍｅｒｏｗ、２０００）。ヒトＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦ種Ａｄ血清型について、ＣＡＲは、ファイバーノブドメインに結合し、体外での細胞への効率的なウイルス侵入を媒介することが示された（Ｒｏｅｌｖｉｎｋら、１９９８）。ヒトＢ種血清型の大部分について、ＣＤ４６は、高親和性ウイルス付着受容体として同定された（Ｇａｇｇａｒら、２００３）。ウイルス付着受容体へのファイバー結合に、ペントンベースタンパク質と細胞インテグリンとのＲＧＤモチーフ依存性相互作用がまもなく続く（Ｗｉｃｋｈａｍら、１９９３）。この相互作用は、細胞内へのＡｄ粒子の内部移行を促進し、ウイルスカプシド分解プログラムを開始する。異なるＡｄ血清型は、高効率で生体外および生体内における様々な細胞に感染する。このＡｄの性質に基づいて、遺伝子導入およびワクチン接種の研究のために、多数のＡｄベースベクターが開発されている（Ｔｈｏｍａｓら、２００３）。しかしながら、Ａｄベクターが高用量で又は自然Ａｄ感染に関連しない経路を介して送達された場合、感染性および組織生体分布は、ファイバー付着受容体のレベルと相関しなかった（Ａｌｅｍａｎｙ及びＣｕｒｉｅｌ、２００１）。具体的には、ヒトＡｄ５ベースベクターの静脈内注射後、送達されたベクター用量の９９％が肝臓に急速に隔離される（Ｋｈａｒｅら、２０１１ａ）。さらに、Ａｄファイバーとペントンタンパク質との変異によるＣＡＲとインテグリンとの相互作用の除去は、肝臓におけるウイルス蓄積および効率的な肝細胞形質導入を防ぐことができなかった（Ｓｈａｙａｋｈｍｅｔｏｖら、２００４）。Ａｄと肝臓細胞との間の効率的な相互作用は、臨床的に有意な肝毒性を引き起こし、播種性転移性腫瘍など肝臓外の細胞および組織への遺伝子送達が必要な場合に大きな障害となる。
【０１３７】
肝臓内のマクロファージ、クッパー細胞は、肝臓における血液由来Ａｄの迅速な隔離に寄与する最も研究された因子の1つである（Ｄｉ Ｐａｏｌｏら、２０１３； Ｄｉ Ｐａｏｌｏら、２００９ｂ； Ｋｈａｒｅら、２０１１ｂ；Ｌｉｅｂｅｒら、１９９７；Ｍａｎｉｃｋａｎら、２００６；Ｗｏｌｆｆら、１９９７；Ｗｏｒｇａｌｌら、１９９７）。静脈内ウイルス注射後、クッパー細胞は大量のウイルス粒子を捕捉する。クッパー細胞におけるこのＡｄ粒子の蓄積は、肝細胞へのＡｄベクター媒介導入遺伝子送達のための非線形用量応答を引き起こす。クッパー細胞とのＡｄ相互作用は、炎症応答の活性化を誘導する。最近のデータは、高用量の静脈内Ａｄ投与が炎症促進性宿主応答の活性化にも関与するかもしれない急速なクッパー細胞死を誘導しうることを示唆している（Ｄｉ Ｐａｏｌｏら、２０１３）。一方、静脈内Ａｄ投与前のクッパー細胞の不活性化は、循環ウイルスのレベル及び肝細胞および肝外細胞の形質導入を有意に増加させることが示された（Ｋｈａｒｅら、２０１３；Ｋｈａｒｅら、２０１１ｂ；Ｗｏｌｆｆら、１９９７）。クッパー細胞は大量の血液由来Ａｄを蓄積することができるが、クッパー細胞へのウイルス侵入は生体内でのそれらの形質導入を導かず、クッパー細胞がＡｄ増殖のためには適応不足であることを示している。その代わりに、クッパー細胞は壊死型の細胞死によって急速に死亡する（Ｄｉ Ｐａｏｌｏら、２０１３；Ｍａｎｉｃｋａｎら、２００６）。まとめると、これらのデータは、クッパー細胞によるＡｄ捕捉は、肝臓における血液由来Ａｄの隔離を媒介する潜在的機序に沿った最初のものであることを強く示した。
【０１３８】
しかしながら、この研究で得られたデータは、クッパー細胞によるＡｄ捕捉が、肝臓における血液由来Ａｄの隔離に関与する唯一のメカニズムではないことを示している。驚いたことに、クロドロネートリポソーム投与後の肝実質からのクッパー細胞の完全な排除は、静脈内ウイルス注射後に肝臓に隔離されたＡｄ ＤＮＡの減少をもたらさなかった（図４）。このデータは、塩化ガドリニウムを用いたクッパー細胞の機能的不活性化も、静脈内ウイルス注射直後に肝臓に捕捉されたＡｄ ＤＮＡの量を減少させることができなかったことを示している。クッパー細胞の排除は、Ａｄ媒介肝細胞形質導入のレベルの顕著な増加をもたらすので、このデータは、クッパー細胞による隔離を回避したベクター粒子が、肝細胞に効率的に進入し、導入遺伝子発現レベルが大幅に上昇することを示している。
【０１３９】
先行データは、Ａｄ５の肝細胞への侵入が血液因子によって媒介され、ＣＡＲ又はインテグリンとのウイルス相互作用に依存しないことを示唆した（Ｋａｌｙｕｚｈｎｉｙら、２００８；Ｗａｄｄｉｎｇｔｏｎら、２００８）。最近の研究は、凝固因子Ｘへの高親和性Ａｄ５ヘキソン結合が、生体内でのＡｄ５ベクターによる肝細胞形質導入を媒介するのに十分であることを明らかに示した。Ｐａｒｋｅｒらは、全てのビタミンＫ血液凝固因子を不活性化する薬物ワルファリンによるマウスの処理が、静脈注射されたＡｄ５ベクターによる肝細胞形質導入を除去することを示した（Ｐａｒｋｅｒら、２００６）。本研究において、マウスのワルファリン処理はＡｄ５ベクターによる肝細胞形質導入を完全に無効にしたが（図３）、肝臓で隔離されたＡｄ ＤＮＡの量は、ワルファリン処理マウスおよびコントロールマウスにおいて同等であることが見出された（図２）。先行の研究は、肝組織が無血液状態でそのままＡｄ５でかん流されると、クッパー細胞は血液因子（ＦｌＸ）依存的にＡｄ粒子を蓄積しうることを示した（Ｓｈａｙａｋｈｍｅｔｏｖら、２００５）。
【０１４０】
ここで、ワルファリン処理マウスにおいて、クッパー細胞は血液由来Ａｄを捕捉する能力を保持することが見出されており、クッパー細胞内へのＡｄ侵入の血液因子媒介経路はＡｄクッパー細胞相互作用をコントロールする唯一のものではないことが示されている 。ＳＲ−Ａ特異的リガンドポリ（Ｉ）を用いたマウスの予備注射は、静脈内ウイルス注射後のクッパー細胞におけるＡｄ蓄積を劇的に減少させたので、この観察は、クッパー細胞がＳＲ−Ａを介してＡｄに結合することができることを示した（Ｈａｉｓｍａら、２００８）。ＳＲ−Ａ−ＫＯマウスを用いた肝臓におけるＡｄ蓄積の定量分析およびクッパー細胞におけるＡｄ捕捉の定性的評価は、Ａｄ ＤＮＡの量およびクッパー細胞のＡｄ粒子を蓄積する能力の両方が、ＳＲ−Ａ−ＫＯおよびコントロールマウスにおいて類似していることを示した（図４）。ここに提示されたデータは、ＳＲ−Ａ依存性機構がクッパー細胞とのＡｄ相互作用の媒介において主要な役割を果たすとは考えにくいことを強く示している。クッパー細胞におけるＡｄ捕捉に対するポリ（I）の効果は、ＳＲ−Ａの下流のシグナル伝達は、そのポリ（I）への結合によって、クッパー細胞の食細胞機能またはエンドソーム形成を遮断または妨害することができるという別の間接的機構によって、説明することができる。
【０１４１】
クッパー細胞欠失マウス又はワルファリン処理マウスの肝臓に隔離されたＡｄ ＤＮＡの量がコントロール動物と比較して有意に減少していないことは、肝臓における血液由来Ａｄの隔離をコントロールする異なる機構間にこれまでは未知の冗長性および相乗作用が存在することを示している。これをさらに評価するために、ワルファリン及びクロドロネートリポソームの両方でマウスを処理し、静脈内ウイルス注射後に肝臓におけるＡｄ隔離を分析した。この研究は、予想外に、薬物の組み合わせで処理したマウスの肝臓中に隔離されたＡｄ ＤＮＡの量のわずかな減少しか示さなかった。ワルファリン及びクロドロネートリポソームの両方で処理されたマウスの肝臓で３５％少ないＡｄ ＤＮＡが捕捉されたが、Ａｄ ＤＮＡの６５％は、クッパー細胞を欠損し且つ血液中に凝固因子を持たないマウスの肝臓に捕捉されたままであった（図５）。このデータは、血液由来Ａｄの循環からの効率的なクリアランスを確実にするために、Ａｄ隔離機構が、これらの機構の関与の未知の順序で、冗長かつ相乗的に作動する可能性が高いことを示している。蛍光顕微鏡および電子顕微鏡を用いた肝実質におけるＡｄ粒子分布の詳細な分析は、肝洞様毛細血管に局在する豊富に分布したＡｄ粒子を示した（図７）。このタイプのウイルス分布は、各薬剤単独で処理されたマウス又は模擬処理動物の肝臓では観察されなかったため、このデータは、他の隔離メカニズムが不活性化された条件下でのみＡｄと肝細胞との新しい相互作用が活性化されることを示す 。
【０１４２】
この研究において、ＡｄペントンＲＧＤモチーフが、肝細胞から肝洞様毛細血管内皮細胞を分離するディッセ腔におけるウイルス捕捉に寄与することが実証された。β３−インテグリンノックアウトマウスの肝臓におけるＡｄ沈着の分析は、β３−インテグリンがこの相互作用に寄与していることを示している。αγβ３インテグリンは、内皮細胞上に発現するため、肝細胞へＡｄ粒子が入ることができない場合、ＲＧＤ相互作用インテグリンとβ3インテグリンサブユニットとを類洞内皮に結合させることができ、従って、ディッセ腔に保持されるので、内皮細胞または肝細胞への最終的な内部移行および循環からのウイルスクリアランスをもたらす。ワルファリンで処理されたマウスにおいて、Ａｄを用いた低レベル類洞内皮細胞形質導入を示すデータは、この考えを支持する（図３）。
【０１４３】
データは、肝臓における血液由来Ａｄの隔離を媒介するメカニズムにおいて、これまで知られていなかった冗長性および相乗作用を明らかにした。肝臓における血液由来Ａｄの隔離のためのモデルが提案された（図９）。この概念モデルは、循環からの血液由来Ａｄのクリアランスを確実にするために、特定の分子機構の定義されたセットが、冗長な、相乗的な、および規則的な方法で、関わることを示している。血液中に少量のＡｄ粒子が現れると、クッパー細胞によるウイルスの捕捉が第一の支配的メカニズムとして働き、肝臓におけるＡｄの隔離を媒介する。Ａｄ用量がクッパー細胞のウイルスを捕捉する能力を超えると、肝細胞は血液因子に依存して血液由来Ａｄ粒子を吸収し、血液由来Ａｄの隔離を媒介する第二の支配的メカニズムとなる。しかしながら、Ａｄ用量が多く、クッパー細胞および血液因子経路の両方が不活性化された場合、類洞内皮細胞および肝洞様毛細血管の解剖学的構造は、ＲＧＤモチーフ依存的にＡｄ粒子を隔離する第三の防御線となる。
【０１４４】
このモデルを試験し、血管内送達後にＡｄ変異体が肝臓での隔離を回避できることを実施するために、変異Ａｄ５ベースベクターのセットが開発され、肝臓におけるＡｄ捕捉を媒介する経路のいくつか又は全てに対して、肝細胞との相互作用を除去する特定の変異が導入された（図２４）。肝臓でのウイルス捕捉を媒介するメカニズムの１つ又は２つのみを除去する個々の変異を有するＡｄ５ベースベクターの例示的な状況において、血管内ウイルス投与後の肝臓におけるＡｄ粒子の隔離が防止できないことに注意することが重要である 。実際、Ａｄベクターは、Ｔ４２５Ａヘキソン変異（Ａｄ−ＴＥＡ）に起因する血液凝固因子への結合を除去したか、又は、ヒトラミニン由来ペプチド（Ａｄ−Ｌａｍ）とのＲＧＤペントンループの置換に起因するＲＧＤ特異的細胞インテグリンとの相互作用、若しくは、これらの変異の両方を同時に含む単一のＡｄ−２Ｍウイルスにおけるそれらの組み合わせ、を除去し、これらのベクターの全ては、静脈内ウイルス注射から１時間後に、非改変野生型Ａｄ５ウイルス、Ａｄ−ＷＴ（図２１Ｃ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.：１）と同じくらい効率的に肝臓組織に捕捉された。しかしながら、本発明を実施する最良の方法は、Ｔ４２５Ａヘキソン及びＬａｍペントン変異に加えて、一つの及び同じベクター、Ａｄ−３ＭへのヘキソンＨＶＲ１における第３および新規変異の組み込みであり、これは得られた三重変異体ウイルスのその血管内注射後に肝臓隔離を回避できたという顕著な特性を明らかにした。（図２３Ｂ）。
【０１４５】
肝臓組織におけるその減少した隔離に加えて、三重変異Ａｄ−３Ｍベクターの静脈内注射は、非改変Ａｄ−ＷＴウイルスと比較して、脾臓における炎症性サイトカインおよびケモカイン活性化の顕著な低下を示した。非改変Ａｄ−ＷＴベクターとは異なり、Ａｄ−３Ｍウイルスは、Ａｄ５−ＷＴと比較して、肝マクロファージ、クッパー細胞の急速な壊死を誘発せず、大幅に改善された安全性プロファイルの直接的証拠を提供する（図２３Ｄ及び２３Ｅ）。ウイルスのこれらの特性は、細胞インテグリンとの相互作用を無効にするＡｄ５ペントンへ（図１８）、及び、凝固因子ＦＸとのウイルス相互作用を除去するヘキソンに（図１５）、導入された変異から生じる。
【０１４６】
この研究は、肝臓における血液由来Ａｄの隔離プロセスをコントロールする定義された一連のメカニズムの特定の遺伝子不活性化に基づいて、肝臓における血液由来Ａｄの隔離を除去するためのＡｄベクター設計の最初の実証である。単一のベクターに同時に導入される変異の実施形態および具体的な実施例は、ベクター送達の血管内経路による播種性転移性腫瘍の治療に有効である腫瘍を標的とした腫瘍溶解性ウイルスの開発のためのプラットフォームとして、肝臓回避特性を有するベクターを使用する根拠を提供する。
【０１４７】
ｘ．実施例１０：細胞およびウイルス。
Ａｄ増殖のための２９３（ヒト胎児腎臓、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ、トロント、カナダ）細胞が、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１ｘペニシリン/ストレプトマイシン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養された。野生型ヒトＡｄ血清型Ａｄ３（ＧＢ株、ＶＲ３）；Ａｄ１４（ｄｅ Ｗｉｔ、ＶＲ１Ｓ）、Ａｄ１６（Ｃｈ．７９、ＶＲ１７）、及びＡｄ３５（Ｈｏｌｄｅｎ株、ＶＲ−７１８）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入された。無傷野生型Ａｄ５カプシドを有するヒトＡｄ５は以前に構築され、Ａｄ５ＧＦＰとして詳細に説明されている。Ａｄ３５由来ファイバーシャフトおよびノブドメインを有するＡｄ５ベースベクターＡｄ５／３５Ｓは、以前に構築され、Ａｄ５ＧＦＰ／Ｆ３５として説明されている。Ａｄ３５由来ファイバーノブドメインを有するＡｄ５／３５Ｌは以前に構築され、説明されている。Ａｄ５ΔＲＧＤ及びＡｄ５／３５ΔＲＧＤは、Ａｄ５及びＡｄ５／３５Ｌと同一であるが、ペントンベースタンパク質にＲＧＤモチーフ欠失を有する。これらのベクターは以前に構築され、説明されている。Ａｄ５＊Ｆ及びＡｄ５＊ＦΔＲＧＤは、Ｒａｍｏｎ Ａｌｅｍａｎｙ博士（バルセロナ、スペイン）から親切に提供された。これらのＡｄ５ベースベクターの両方は、ＣＡＲへのウイルス結合を排除するファイバーノブドメイン内の単一点Ｙ４７７Ａアミノ酸変異を有する。Ａｄ５＊ＦΔＲＧＤは、そのペントンベースタンパク質内にＲＧＤモチーフの欠失を有する。赤色蛍光タンパク質を発現するＡｄ５ベクターは、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂａｒｒｙ博士（ロチェスター、ミネソタ州）から親切に提供された。全てのウイルスは、交差汚染を防止する条件下で２９３細胞において増幅された。ウイルスは、塩化セシウム勾配でバンド化され； ウイルスバンドは、別の個所に記載されているように、集められ、透析され、分注された。Ａｄ粒子濃度は、野生型Ａｄ５に対する吸光係数、Ａ２６０＝ ９．０９×１０１１ＯＤ ｍｌｃｍビリオン−１を用いて、２６０ｎｍの光学密度（ＯＤ ２６０）で測定することによって分光光度法で決定された。
【０１４８】
ｘｉ．実施例１１：生体内におけるＡｄ感染。
動物を含む全ての実験手順は、ワシントン大学によって定められた施設ガイドラインに従って実施された。Ｃ５７Ｂ１／６マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（ウィルミントン、マサチューセッツ州）から購入された。β３インテグリンノックアウトマウス、β３−ΚΟ（ストック＃４６６９）及びスカベンジャー受容体Ａノックアウトマウス（Ｍｓｒ１、ストック＃６０９６）は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バーハーバー、メイン州）から購入された。全てのマウスは、特定の病原体を含まない施設に収容された。全ての野生型ウイルス又はＡｄベクターは、２００μlのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に１０１１個のＡｄ粒子（２９３細胞で決定したＡｄ５ベクターの５×１０９ＰＦＵに相当）の用量でマウスの尾静脈に注射された。生体内での形質導入研究のために、ウイルス注入から１又は４８時間後にマウスを屠殺し、肝臓を組織学的分析のために処理した。尾静脈へのＡｄベクター投与の１時間後および２４時間後の肝臓組織におけるＡｄゲノム蓄積の解析のために、心臓生理食塩水かん流によって肝臓から血液を流し、肝臓を摘出し、全ＤＮＡを精製した。ビタミンＫ依存性血液凝固因子を不活性化するために、マウスにワルファリンを、Ａｄ投与の７２時間前および２４時間前の二回注射した。ワーファリンを落花生油に再懸濁し、注射あたりマウス1匹あたり１５０μｇのワルファリンを別の場所で記載したように使用した。肝臓からクッパー細胞を排除するために、マウスに、ウイルス投与の４８時間前に２００μｌのクロドロネートリポソーム（Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．ｏｒｇ）を注射した。Ｃｌ２ＭＤＰ（又はクロドロネート）は、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ（マンハイム、ドイツ）の贈答品であった。フローサイトメトリーによるＡｄ肝臓細胞形質導入を分析するために、肝細胞を、コラゲナーゼかん流で精製し、静脈内ウイルス注射の２４時間後にＰｒｉｍａｒｉａ６ウェルプレート上に配置した。翌日、細胞を、２ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いてプレートから剥がし、抗ＣＤ３１（内皮細胞）、抗β３-インテグリン（クッパー細胞および循環単球を含む造血起源の細胞）、又はアイソタイプコントロール抗体で染色した。細胞の陽性染色は、フローサイトメトリーによって分析された。
【０１４９】
ｘｉｉ．実施例１２：生体内におけるＡｄクッパー細胞相互作用の分析。
クッパー細胞とのＡｄ相互作用を分析するために、１０１０個のウイルス粒子を尾静脈に注入し、６０分後、肝臓を心臓かん流により生理食塩水で洗い流し、摘出し、ＯＣＴコンパウンド中で直ちに凍結させた。凍結肝臓切片を固定し、ラット抗マウスＦ４／８０一次抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州）で染色してクッパー細胞を検出した。一次抗体の特異的結合を抗ラット-Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ４８８二次抗体（緑色）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ、ユージーン、オレゴン州）で可視化した。Ａｄ粒子を検出するために、肝臓切片を抗ヘキソンポリクローナル抗体（Ａｂｅａｍ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）で染色した。ビオチン化抗ヘキソン一次抗体による染色は、赤色で現れる二次Ｃｙ３標識ストレプトアビジンを用いて行った。肝臓切片上の血小板および内皮細胞を検出するために、ＣＤ４１（血小板、クローンＭＷＲｅｇ３０）又はＣＤ３１−ＦＩＴＣ（内皮細胞、クローンＭＥＣ１３．３（いずれもＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製））に対する抗体を使用した。細胞核を１μｇ／ｍｌの４´、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）で対比染色した。
【０１５０】
ｘｉｉｉ．実施例１３：サザンブロット解析
マウス肝臓におけるＡｄゲノムＤＮＡ沈着および残存の分析のために、全肝臓ＤＮＡの単離およびサザン分析を、他の箇所に記載されているように実施した。簡潔には、示された時点で肝臓を摘出し、ＤＮＡ塩析プロトコル、次いでフェノール/クロロホルムおよびクロロホルムイソアミルアルコール精製によって、肝臓の全ＤＮＡを単離した。次に、１０μｇの精製全肝臓ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレアーゼで一晩消化し、１％アガロースゲルに負荷した。ＤＮＡ断片の電気泳動分離が完了した後、Ｈｙｂｏｎｄ−ＸＬメンブレン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にトランスフェクトし、メンブレンを３２Ｐ標識マウスβ−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）遺伝子特異的プローブとハイブリダイズさせて均等のＤＮＡ負荷を確認した。Ｇｕｓ特異的ハイブリダイゼーションの画像は、膜をホスフォイメージャースクリーン及びＸ線フィルムの両方に曝露することによって、得られた。次に、膜をＧｕｓ特異的プローブから剥ぎ取り、Ａｄ特異的３２Ｐ標識プローブ（ＡｄゲノムのＥ２領域に対応する８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−Ａ断片）と再ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション反応の画像は、膜をホスフォイメージャースクリーン（phosphoimager screen）及びＸ線フィルムに曝露することによって、得られた。ホスフォイメージャー収集画像におけるＧｕｓ及びＡｄ特異的シグナルの強度を、製造業者のソフトウェアを用いて分析した。
【０１５１】
ｘｉｖ．実施例１４：プロテオームプロファイラー抗体アレイ。
製造者の使用説明書に従って、「Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｒｒａｙ：Ｍｏｕｓｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｒｒａｙ Ｐａｎｅｌ Ａ」（＃ＡＲＹ００６、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用した。各脾臓を２ｍｌのサンプル溶液中でホモジナイズし、１ｍｌ（１／２の脾臓）を用いて揺動プラットフォーム上の各膜とともに一晩インキュベートした。メンブレンをＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ ＨＲＰ−基質（Ｂｉｏ Ｒａｄ、＃１７０５０４１）で発色させた。
【０１５２】
ｘｖ．実施例１５：リボヌクレアーゼ保護分析。
「ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−Ｍｉｄｉ ｋｉｔ」（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ、オースティン、テキサス州）を用いて、組織から全ＲＮＡを抽出した。１０μｇのＲＮＡを、３２Ｐ標識ＲＮＡプローブの混合物とハイブリダイズさせた。３２Ｐ標識ＲＮＡプローブ混合物は、「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ」、ＣＫ−３を用いたインビトロ転写によって調製され、及びカスタムテンプレートセットは、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（サンディエゴ、カリフォルニア州）によって提供された。ハイブリダイズしたＲＮＡを「ＲＮＡｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ」（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＲＮＡｓｅで処理し、沈殿させ、保護された断片を垂直シークエンシング（１０％アクリルアミド）ゲルで分離した。電気泳動後、ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ−Ｘ−Ｏｍａｔ）及びホスフォイメージャースクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、サニーベール、カリフォルニア州）に曝露した。スクリーン上のシグナルを、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ Ｉｍａｇｅ−Ｑｕａｎｔソフトウェアによって分析した。リボヌクレアーゼ保護アッセイは、各ウイルスあたり少なくとも３〜５個体のマウスのＲＮＡサンプルを用いて行った。少なくとも２つの独立して調製されたウイルスストックを、ＲＮＡレベル分析に使用した。
【０１５３】
ｘｖｉ．実施例１６：免疫組織化学および免疫蛍光染色。
マウスに麻酔をかけ、脾臓および肝臓を摘出し、Ｏ.Ｃ.Ｔ.コンパウンド中で凍結し、処理するまで−８０℃で保存した。６から８ミクロンの切片を切断し、風乾し、−２０℃でアセトン中に１０分間固定し、少なくとも４時間風乾し、ＴＢＳ中で１時間再水和し、２％Ｎ．Ｓ．で１時間ブロックし、抗原に応じて０．１％サポニンを含むか含まない状態で、一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。次に、切片をＨＲＰ標識二次抗体とともに１時間インキュベートした。スライドは、ＩｍｍＰａｃｔ ＤＡＢ又はＮｏｖａＲｅｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で発色され、風乾され、マウントされ、ライカ顕微鏡で分析された。免疫蛍光染色のために、二次抗体を洗浄した後、スライドを直ちに装着した。共焦点画像解析は、Ｚｅｉｓｓ ５１０ Ｍｅｔａ Ｃｏｎｆｏｃａｌ顕微鏡で行った。
【０１５４】
ｘｖｉｉ．実施例１７：統計分析
全ての統計分析は、Ｉｎｓｔａｔソフトウェアの独立両側スチューデントｔ検定を用いて行われた。データは、平均÷／‐標準偏差で表される。個々の条件ごとに実験で使用した動物の数は、３から５匹であった。
【０１５５】
ｅ．引用文献
米国特許文献
5,712,136    Wickham et al.,    01/1998    435/456
【０１５６】
その他の出版物
Alemany, R., and Curiel, D.T. (2001). CAR-binding ablation does not change biodistribution and toxicity of adenoviral vectors. Gene Ther 8, 1347-1353.
Alemany, R., Suzuki, K., and Curiel, D.T. (2000). Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice. The Journal of general virology 81, 2605-2609.
Alonso-Padilla, J., Papp, T., Kajan, G.L., Benko, M., Havenga, M., Lemckert, A., Harrach, B., and Baker, A.H. (2015). Development of Novel Adenoviral Vectors to Overcome Challenges Observed With HAdV-5-based Constructs. Mol Ther.
Baker, A., McVey, JH, Waddington, SN, Di Paolo, NC, Shayakhmetov, DM. (2007). The influence of blood on in vivo adenovirus bio-distribution and transduction. Mol Ther, epub (ahead of print).
Baker, A.H., Nicklin, S.A., and Shayakhmetov, D.M. (2013). FX and Host Defense Evasion Tactics by Adenovirus. Molecular Therapy 21, 1109-1111.
Barouch, D.H., Kik, S.V., Weverling, G.J., Dilan, R., King, S.L., Maxfield, L.F., Clark, S., Ng'ang'a, D., Brandariz, K.L., Abbink, P., et al. (2011). International seroepidemiology of adenovirus serotypes 5, 26, 35, and 48 in pediatric and adult populations. Vaccine 29, 5203-5209.
Bergelson, J.M., Cunningham, J.A., Droguett, G., Kurt-Jones, E.A., Krithivas, A., Hong, J.S., Horwitz, M.S., Crowell, R.L., and Finberg, R.W. (1997). Isolation of a common receptor for Coxsackie B viruses and adenoviruses 2 and 5. Science 275, 1320-1323.
Bradley, R.R., Lynch, D.M., Iampietro, M.J., Borducchi, E.N., and Barouch, D.H. (2012). Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection. J Virol 86, 625-629.
Brunetti-Pierri, N., Palmer, D.J., Beaudet, A.L., Carey, K.D., Finegold, M., and Ng, P. (2004). Acute toxicity after high-dose systemic injection of helper-dependent adenoviral vectors into nonhuman primates. Hum Gene Ther 15, 35-46.
Di Paolo NC, B.L., Irons EE, Papayannopoulou T, Tomlinson S, Shayakhmetov DM (2014). IL-1a and complement cooperate in triggering local neutrophilic inflammation in response to adenovirus and eliminating virus-containing cells. PLoS Pathogens DOI: 10.1371/journal.ppat.1004035.
Di Paolo, N.C., Doronin, K., Baldwin, L.K., Papayannopoulou, T., and Shayakhmetov, D.M. (2013). The Transcription Factor IRF3 Triggers "Defensive Suicide" Necrosis in Response to Viral and Bacterial Pathogens. Cell Reports 3, 1840-1846.
Di Paolo, N.C., Miao, E.A., Iwakura, Y., Murali-Krishna, K., Aderem, A., Flavell, R.A., Papayannopoulou, T., and Shayakhmetov, D.M. (2009a). Virus binding to a plasma membrane receptor triggers interleukin-1 alpha-mediated proinflammatory macrophage response in vivo. Immunity 31, 110-121.
Di Paolo, N.C., van Rooijen, N., and Shayakhmetov, D.M. (2009b). Redundant and Synergistic Mechanisms Control the Sequestration of Blood-born Adenovirus in the Liver. Molecular Therapy 17, 675-684.
Doronin, K., Flatt, J.W., Di Paolo, N.C., Khare, R., Kalyuzhniy, O., Acchione, M., Sumida, J.P., Ohto, U., Shimizu, T., Akashi-Takamura, S., et al. (2012). Coagulation factor X activates innate immunity to human species C adenovirus. Science 338, 795-798.
Gaggar, A., Shayakhmetov, D., and Lieber, A. (2003). CD46 is a cellular receptor for group B adenoviruses. Nature Medicine 9, 1408-1412.
Graham, F.L., and van der Eb, A.J. (1973). A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 52, 456-467.
Haisma, H.J., Kamps, J.A., Kamps, G.K., Plantinga, J.A., Rots, M.G., and Bellu, A.R. (2008). Polyinosinic acid enhances delivery of adenovirus vectors in vivo by preventing sequestration in liver macrophages. The Journal of general virology 89, 1097-1105.
Kalyuzhniy, O., Di Paolo, N.C., Silvestry, M., Hofherr, S.E., Barry, M.A., Stewart, P.L., and Shayakhmetov, D.M. (2008). Adenovirus serotype 5 hexon is critical for virus infection of heptocytes in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 5483-5488.
Khare, R., Chen, C.Y., Weaver, E.A., and Barry, M.A. (2011a). Advances and future challenges in adenoviral vector pharmacology and targeting. Curr Gene Ther 11, 241-258.
Khare, R., Hillestad, M.L., Xu, Z., Byrnes, A.P., and Barry, M.A. (2013). Circulating antibodies and macrophages as modulators of adenovirus pharmacology. J Virol 87, 3678-3686.
Khare, R., May, S.M., Vetrini, F., Weaver, E.A., Palmer, D., Rosewell, A., Grove, N., Ng, P., and Barry, M.A. (2011b). Generation of a Kupffer cell-evading adenovirus for systemic and liver-directed gene transfer. Mol Ther 19, 1254-1262.
Kojaoghlanian, T., Flomenberg, P., and Horwitz, M.S. (2003). The impact of adenovirus infection on the immunocompromised host. Rev Med Virol 13, 155-171.
Lieber, A., He, C.Y., Meuse, L., Schowalter, D., Kirillova, I., Winther, B., and Kay, M.A. (1997). The role of Kupffer cell activation and viral gene expression in early liver toxicity after infusion of recombinant adenovirus vectors. J Virol 71, 8798-8807.
Manickan, E., Smith, J.S., Tian, J., Eggerman, T.L., Lozier, J.N., Muller, J., and Byrnes, A.P. (2006). Rapid Kupffer cell death after intravenous injection of adenovirus vectors. Molecular Therapy 13, 108-117.
Nemerow, G.R. (2000). Cell receptors involved in adenovirus entry. Virology 274, 1-4.
Nemerow, G.R., and Stewart, P.L. (1999). Role of alpha(v) integrins in adenovirus cell entry and gene delivery. Microbiol Mol Biol Rev 63, 725-734.
Parker, A.L., Waddington, S.N., Nicol, C.G., Shayakhmetov, D.M., Buckley, S.M., Denby, L., Kemball-Cook, G., Ni, S.H., Lieber, A., McVey, J.H., et al. (2006). Multiple vitamin K-dependent coagulation zymogens promote adenovirus-mediated gene delivery to hepatocytes. Blood 108, 2554-2561.
Raper, S.E., Chirmule, N., Lee, F.S., Wivel, N.A., Bagg, A., Gao, G.P., Wilson, J.M., and Batshaw, M.L. (2003). Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer. Mol Genet Metab 80, 148-158.
Raper, S.E., Yudkoff, M., Chirmule, N., Gao, G.P., Nunes, F., Haskal, Z.J., Furth, E.E., Propert, K.J., Robinson, M.B., Magosin, S., et al. (2002). A pilot study of in vivo liver-directed gene transfer with an adenoviral vector in partial ornithine transcarbamylase deficiency. Hum Gene Ther 13, 163-175.
Roberts, D.M., Nanda, A., Havenga, M.J.E., Abbink, P., Lynch, D.M., Ewald, B.A., Liu, J., Thorner, A.R., Swanson, P.E., Gorgone, D.A., et al. (2006). Hexon-chimaeric adenovirus serotype 5 vectors circumvent pre-existing anti-vector immunity. Nature 441, 239-243.
Roelvink, P.W., Lizonova, A., Lee, J.G., Li, Y., Bergelson, J.M., Finberg, R.W., Brough, D.E., Kovesdi, I., and Wickham, T.J. (1998). The coxsackievirus-adenovirus receptor protein can function as a cellular attachment protein for adenovirus serotypes from subgroups A, C, D, E, and F. J Virol 72, 7909-7915.
Shayakhmetov, D.M., Gaggar, A., Ni, S.H., Li, Z.Y., and Lieber, A. (2005). Adenovirus binding to blood factors results in liver cell infection and hepatotoxicity. Journal of Virology 79, 7478-7491.
Shayakhmetov, D.M., Li, Z.Y., Ni, S., and Lieber, A. (2004). Analysis of adenovirus sequestration in the liver, transduction of hepatic cells, and innate toxicity after injection of fiber-modified vectors. J Virol 78, 5368-5381.
Shenk, T. (1996). Adenoviridea. In Fields Virology, B.N. Fields, Knipe, D.M., Howley, P.M., ed. (Philadelphia: Lippincott-Raven Publisher), pp. 2111-2148.
Shenk, T. (2001). Adenoviridae. in Field's Virology (D.M. Nipe and P.M. Howley, Eds.), 2265-2328.
Thomas, C.E., Ehrhardt, A., and Kay, M.A. (2003). Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nature Reviews Genetics 4, 346-358.
Waddington, S.N., Mcvey, J.H., Bhella, D., Parker, A.L., Barker, K., Atoda, H., Pink, R., Buckley, S.M.K., Greig, J.A., Denby, L., et al. (2008). Adenovirus serotype 5 hexon mediates liver gene transfer. Cell 132, 397-409.
Wickham, T.J., Mathias, P., Cheresh, D.A., and Nemerow, G.R. (1993). Integrins alpha v beta 3 and alpha v beta 5 promote adenovirus internalization but not virus attachment. Cell 73, 309-319.
Wolff, G., Worgall, S., van Rooijen, N., Song, W.R., Harvey, B.G., and Crystal, R.G. (1997). Enhancement of in vivo adenovirus-mediated gene transfer and expression by prior depletion of tissue macrophages in the target organ. J Virol 71, 624-629.
Worgall, S., Wolff, G., Falck-Pedersen, E., and Crystal, R.G. (1997). Innate immune mechanisms dominate elimination of adenoviral vectors following in vivo administration. Hum Gene Ther 8, 37-44.
【図１】
2018504141.tif 000004
【図２】
2018504141.tif 000005
【図３】
2018504141.tif 000006
【図４】
2018504141.tif 000007
【図５】
2018504141.tif 000008
【図６】
2018504141.tif 000009
【図７】
2018504141.tif 000010
【図８】
2018504141.tif 000011
【図９】
2018504141.tif 000012
【図１０Ａ】
2018504141.tif 000013
【図１０Ｂ】
2018504141.tif 000014
【図１１−１】
2018504141.tif 000015
【図１１−２】
2018504141.tif 000016
【図１１Ｂ】
2018504141.tif 000017
【図１２】
2018504141.tif 000018
【図１３】
2018504141.tif 000019
【図１４−１】
2018504141.tif 000020
【図１４−２】
2018504141.tif 000021
【図１５】
2018504141.tif 000022
【図１６−１】
2018504141.tif 000023
【図１６−２】
2018504141.tif 000024
【図１７】
2018504141.tif 000025
【図１８−１】
2018504141.tif 000026
【図１８−２】
2018504141.tif 000027
【図１８−３】
2018504141.tif 000028
【図１９】
2018504141.tif 000029
【図２０】
2018504141.tif 000030
【図２１】
2018504141.tif 000031
【図２２】
2018504141.tif 000032
【図２３】
2018504141.tif 000033
【図２４】
2018504141.tif 000034
【図２５】
2018504141.tif 000035
【図２６】
2018504141.tif 000036
【国際調査報告】
2018504141.tif 000037
2018504141.tif 000038