(57)【要約】  様々な実施形態では、白質卒中などの脳虚血傷害後の対象の回復を改善するための方法および組成物が提供される。様々な実施形態では、本方法は、幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞を対象の脳内の梗塞中心部内または梗塞中心部に直接隣接して投与することを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳虚血傷害後の対象の回復を改善する方法であって、治療有効量の幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞を、前記対象の脳の梗塞中心部内に、または梗塞中心部に直接隣接して投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記脳虚血傷害が皮質下白質卒中である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象がヒトである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞が、梗塞中心部に直接隣接して投与される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒト幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞が、梗塞中心部内に投与される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞が、虚血傷害の亜急性期中に投与される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒト幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞が、デポー送達系を使用して投与される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記デポー送達系がハイドロゲルを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ハイドロゲルがチオール化ヒアルロン酸を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ハイドロゲルがチオール化ゼラチンを含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ハイドロゲルが架橋結合剤を含む、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記前駆細胞が成体幹細胞由来である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記前駆細胞が誘導性多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）由来である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記前駆細胞が、胚または胎性組織から得られたものではない幹細胞由来である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記脳虚血傷害が卒中による、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記脳虚血傷害が頭部傷害による、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記脳虚血傷害が呼吸不全による、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
脳虚血傷害後の対象の運動または認知機能を改善するための方法であって、治療有効量の幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞を、前記対象の脳の梗塞中心部内に、または梗塞中心部に直接隣接して投与することを含む、方法。
【請求項１９】
前記脳虚血傷害が皮質下白質卒中である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象がヒトである、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞が、梗塞中心部に直接隣接して投与される、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞が、梗塞中心部内に投与される、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞が、虚血傷害の亜急性期中に投与される、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記前駆細胞が成体幹細胞由来である、請求項１８から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記前駆細胞が誘導性多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）由来である、請求項１８から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記前駆細胞が、胚または胎性組織から得られたものではない幹細胞由来である、請求項１８から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記脳虚血傷害が卒中による、請求項１８から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記脳虚血傷害が頭部傷害による、請求項１８から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記脳虚血傷害が呼吸不全による、請求項１８から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ヒト幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞を含む、皮質下白質卒中の治療のための医薬組成物。
【請求項３１】
デポー送達系をさらに含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記デポー送達系がハイドロゲルを含む、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記ハイドロゲルがヒアルロナンおよび／またはゼラチンを含む、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記ハイドロゲルがチオール化ヒアルロン酸を含む、請求項３２または３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記ハイドロゲルがチオール化ゼラチンを含む、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記ハイドロゲルが架橋結合剤を含む、請求項３２から３５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記前駆細胞が成体幹細胞由来である、請求項３０から３６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記前駆細胞が誘導性多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）由来である、請求項３０から３７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記前駆細胞が、胚または胎性組織から得られたものではない幹細胞由来である、請求項３０から３８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、その内容が本明細書に全体が組み込まれる、２０１５年８月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／２０５，７２３号の優先権を主張する。
【０００２】
様々な実施形態では、インビトロにおいて分化させたオリゴデンドロサイト前駆細胞、および脳虚血傷害の治療にそれを使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
米国では、皮質下白質卒中（ＷＭＳ）は、毎年新たに生じる卒中７９５，０００例の２５％をも占めており、認知症の第２の主要原因である。正常なヒトの老化過程において、脳の白質領域は明白であるが臨床症状を示さない虚血に関連する進行性の損傷を受ける。この種の虚血は、大脳動脈を閉塞することなく生じ、卒中損傷に典型的な臨床症状を伴わずに生じることがあるので、しばしば「小血管疾患」と呼ばれる（Ｇｏｒｅｌｉｃｋら（２０１１）Ｓｔｒｏｋｅ  ４２（９）：２６７２）。ＷＭＳの指標となる脳の白質病変は、卒中に罹患したことがない無症候性の個体の脳画像で検出され（ＤｅｂｅｔｔｅおよびＭａｒｋｕｓ（２０１０）Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３４１：ｃ３６６６）、年齢と共に蓄積するので８０歳を超える個体の事実上全てにおいて存在する（ｄｅ  Ｌｅｅｕｗら（２００１）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ７０：９）。白質傷害の程度は認知、平衡および歩調の異常と密接に相関し、死亡する危険性が増加する（Ｚｈｅｎｇら（２０１１）Ｓｔｒｏｋｅ  ４２（７）：２０８６；ＤｅｂｅｔｔｅおよびＭａｒｋｕｓ、（２０１０）Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３４１：ｃ３６６６）。この虚血性白質傷害の蓄積進行は、認知症の第２の主要原因で、アルツハイマー病と相互作用するとこの疾病は悪化し、ことによると加速する可能性もある（Ｇｏｒｅｌｉｃｋら（２０１１）Ｓｔｒｏｋｅ  ４２（９）：２６７２；ＤｅＣａｒｌｉら（２０１３）Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ．３３（Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ４１７）。現在のところ、ＷＭＳに利用可能な療法はない。
【０００４】
ＷＭＳの患者において神経機能を修復するために有望で実行可能な一つの療法は細胞移植である。ＷＭＳは、伝統的な卒中モデルで生じる細胞傷害とは非常に異なるパターンを有する。ＷＭＳで損傷を受けた神経要素は、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）、星状細胞および軸索を含む。ヒト胚性幹細胞由来オリゴデンドロサイト細胞（ｈＥＳＣ−ＯＰＣ）は、ＷＭＳ療法の魅力的な候補である。これらの細胞は、白質虚血において最も損傷を受けた細胞要素、オリゴデンドロサイト系列の細胞に一致する系列にあり、脳の白質領域のミエリン化細胞であるオリゴデンドロサイトの元となる（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら（２０１１）  Ｎｅｕｒｏｎ  ７０（４）：６６１）。さらに、ＷＭＳにおいて脳の白質病変は集密的かつ広範で、したがっていかなる細胞療法の候補も注射点から傷害部位に移動する必要がある。ＯＰＣは、ＣＮＳ傷害モデルにおいて広範囲に移動することが示されたことがある（Ｇｏｌｄｍａｎら（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３８（６１０６）：４９１；Ｓｕｎら（２０１３）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８（２）；ｅ５７５３４）。最後に、ＯＰＣは、虚血性白質に対して直接的に修復作用をもたらすことができる、ＢＤＮＦなどの分泌性神経栄養因子の源である。
【０００５】
ＡＳＴ−ＯＰＣ１は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から特異的な分化法を使用して産生されるオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の集団である（Ｎｉｓｔｏｒら（２００５）Ｇｌｉａ  ４９（３）：３８５）。ＡＳＴ−ＯＰＣ１は、ネスチン、ＰＤＧＲＦαおよびＮＧ２を含むオリゴデンドロサイト前駆体に関連するいくつかの分子の発現によって特徴付けられた。この細胞はさらに、ニューロン、星状細胞、内胚葉、中胚葉およびｈＥＳＣなどのその他の細胞種に存在することが知られているマーカーの発現が最小限であるか、または欠如していることが特徴である。インビトロにおいて、ＡＳＴ−ＯＰＣ１はまた、感覚ニューロンからの神経突起伸長を支持する拡散性因子を産生する（Ｚｈａｎｇら（２００６）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．１５（６）：９４３）。ＡＳＴ−ＯＰＣ１は、脊髄傷害モデルにおいて広範囲に移動することが示されたことがある（Ｋｅｉｒｓｔｅａｄら、（２００５）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２５（１９）：４６９４）。
【発明の概要】
【０００６】
ＷＭＳを含む脳の虚血傷害のための新規療法を開発することが必要である。さらに、ＷＭＳなどのミエリン修復および／または再ミエリン化を必要とする状態のための細胞治療で使用する高純度で臨床グレードのオリゴデンドロサイト前駆細胞が必要である。本明細書で記載した組成物および方法は、これらの必要性ならびにこの分野におけるその他の必要性を満たす。
【０００７】
本明細書で記載した様々な実施形態では、特に、脳虚血傷害後の対象を治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、脳虚血傷害は白質の皮質下卒中である。ある特定の実施形態では、対象はヒトである。様々な実施形態では、本方法は、一般的に、治療有効量の多能性幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞を、対象の脳内に投与することを含む。一部の実施形態では、オリゴデンドロサイト前駆細胞はヒト胚性幹細胞由来である。その他の実施形態では、オリゴデンドロサイト前駆細胞は、成体幹細胞、誘導性多能性幹細胞などのヒト胚性幹細胞以外の原料由来である。一部の実施形態では、本方法は、多能性幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞を梗塞中心部内に投与することを含む。その他の実施形態では、本方法は、多能性幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞を梗塞中心部に直接隣接して投与することを含む。
【０００８】
ある特定の実施形態では、多能性幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞は、虚血傷害後の亜急性期中に投与される。一部の実施形態では、多能性幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞は、虚血傷害後の亜急性期早期中に投与される。その他の実施形態では、多能性幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞は、亜急性期後期中に投与される。
【０００９】
ある特定の実施形態では、多能性幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞は、デポー送達系を使用して投与される。一部の実施形態では、デポー送達系はハイドロゲルを含む。一部の実施形態では、ハイドロゲルはヒアルロン酸を含む。その他の実施形態では、ハイドロゲルはチオール化ヒアルロン酸を含む。一部の実施形態では、ハイドロゲルはゼラチンを含む。さらにその他の実施形態では、ハイドロゲルはチオール化ゼラチンを含む。一部の実施形態では、ハイドロゲルはヒアルロン酸およびゼラチンを含む。その他の実施形態では、ハイドロゲルはチオール化ヒアルロン酸およびチオール化ゼラチンを含む。一部の実施形態では、ハイドロゲルは架橋結合剤を含む。その他の実施形態では、ハイドロゲルはチオール化ヒアルロン酸、チオール化ゼラチンおよび架橋結合剤を含む。
【００１０】
ある特定の実施形態では、脳虚血傷害後の対象の運動および／または認知機能および／または発話を改善するための方法であって、治療有効量の多能性幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞を、前記対象の脳の梗塞中心部内に、または梗塞中心部に直接隣接して投与することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、多能性幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞は、ヒト胚性幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞である。その他の実施形態では、オリゴデンドロサイト前駆細胞は、成体幹細胞、誘導性多能性幹細胞などのヒト胚性幹細胞以外の原料由来である。一部の実施形態では、脳虚血傷害は白質の皮質下卒中である。ある特定の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、本方法は、多能性幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞を梗塞中心部内に投与することを含む。その他の実施形態では、本方法は、多能性幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞を梗塞中心部に直接隣接して投与することを含む。
【００１１】
ある特定の実施形態では、本開示は、白質卒中の治療のための医薬組成物を含む容器を提供し、この医薬組成物は、多能性幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞を含む。ある特定の実施形態では、多能性幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞は、ヒト胚性幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞である。その他の実施形態では、オリゴデンドロサイト前駆細胞は、成体幹細胞、誘導性多能性幹細胞などのヒト胚性幹細胞以外の原料由来である。
【００１２】
さらに他の実施形態では、本開示は、多能性幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞を含む、皮質下白質卒中の治療のための医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、多能性幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞は、ヒト胚性幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞である。その他の実施形態では、オリゴデンドロサイト前駆細胞は、成体幹細胞、誘導性多能性幹細胞などのヒト胚性幹細胞以外の原料由来である。ある特定の実施形態では、医薬組成物はさらにデポー送達系を含む。一部の実施形態では、デポー送達系はハイドロゲルを含む。一部の実施形態では、ハイドロゲルはヒアルロン酸を含む。その他の実施形態では、ハイドロゲルはチオール化ヒアルロン酸を含む。一部の実施形態では、ハイドロゲルはゼラチンを含む。さらにその他の実施形態では、ハイドロゲルはチオール化ゼラチンを含む。一部の実施形態では、ハイドロゲルはヒアルロン酸およびゼラチンを含む。その他の実施形態では、ハイドロゲルはチオール化ヒアルロン酸およびチオール化ゼラチンを含む。一部の実施形態では、ハイドロゲルは架橋結合剤を含む。その他の実施形態では、ハイドロゲルはチオール化ヒアルロン酸、チオール化ゼラチンおよび架橋結合剤を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】左半球皮質下卒中の２日後に撮影したヒト白質卒中の代表的な核磁気共鳴画像である。矢印は、同じ患者の以前のスキャンと比較して新しい高強度の白質を示す（元々Ｓｏｚｍｅｎら（２００９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８０（２）：２６１において公表された）。
【図２】白質卒中のマウスモデルにおいてＡＳＴ−ＯＰＣ１を試験する試験１の実験予定表を示した図である。卒中の７日後のＡＳＴ−ＯＰＣ１移植および細胞移植の１５日後の組織処理を含む、実験計画の重要な時点を示す。ＡＳＴ−ＯＰＣ１用量＝１回の注射１μＬとして細胞１００，０００個／マウス。略語：Ｌ−ＮＩＯ＝Ｎ５−（１−イミノエチル）−Ｌ−オルニチン、２塩酸塩。
【図３】Ｌ−ＮＩＯの注射部位を示すマウス脳冠状切断を示した図である。青い矢印は、局所性虚血病変を誘導するために各マウス脳の脳梁内に直接３６°の角度で送達したＬ−ＮＩＯの３つの注射部位を示す。略語：Ｃｘ＝皮質；Ｓｔｒ＝線条体；ＷＭ＝白質。
【図４】卒中によって傷害を受けたマウス脳における星状細胞活性化および軸索損失の代表的な蛍光顕微鏡写真を示した図である。画像パネルは、傷害を受けていない対側半球（図４Ａ、対照）および卒中で傷害を受けた半球（図４Ｂ、白質卒中）における卒中傷害の３週間後の星状細胞（ＧＦＡＰ）および軸索（ＮＦ２００）の蛍光免疫染色を示す。図４Ａでは、左の列はＧＦＡＰ（緑）およびＮＦ２００（赤）の統合蛍光画像を示し、中央の列はＧＦＡＰ単独を示し、右の列はＮＦ２００単独を示す。図４Ｂでは、左の列はＮＦ２００単独を示し、中央の列はＧＦＡＰ単独を示し、右の列はＧＦＡＰ（緑）およびＮＦ２００（赤）の統合蛍光画像を示す。行は、病変領域（図４Ｂ）および対側（図４Ａ）の倍率レベルの増加を示す。上の列＝４０×、中央の列＝２００×、下の列＝６００×。白い四角は、下のパネルで拡大した領域を示す。図４Ａの白い点線は、脳梁のおよその境界を示す。アスタリスクは、側脳室を示す。略語：Ｃｘ＝皮質；ＧＦＡＰ＝グリア線維酸性タンパク質；ＮＦ２００＝神経フィラメント２００；Ｓｔｒ＝線条体；ＷＭ＝白質。
【図５】卒中傷害を受けたマウス脳において活性化したミクログリア／免疫細胞の代表的な蛍光顕微鏡写真を示した図である。図５Ａは、図５Ｂ〜５Ｄで示した領域を示すマウス脳冠状切断の図形である。Ｉｂａ１標識（紫）によって判定した卒中傷害の３週間後の相対的ミクログリア／免疫細胞活性化を、傷害を受けていない対側脳梁（図５Ｂ）および傷害を受けた同側脳梁（図５Ｃ〜５Ｅ）で示す。図５Ｄおよび図５Ｅは、図５Ｃで示した領域の高倍率画像を示す。図５Ｃの白い点線は、梗塞中心部と梗塞周辺組織の間のおよその境界を示す。倍率：図５Ｂおよび図５Ｃ＝６００×；図５Ｄおよび図５Ｅ＝１０００×。略語：Ｉｂａ１＝イオン化カルシウム結合アダプター分子１。
【図６】卒中傷害を受けたマウス脳におけるミエリン損失およびオリゴデンドロサイト応答の代表的な蛍光顕微鏡写真を示した図である。傷害を受けていない対側脳梁（図６Ａ、図６Ｂ）および傷害を受けた同側脳梁（図６Ｃおよび図６Ｄ）における卒中傷害３週間後の相対的ミエリン損失（ＭＢＰ、緑）およびオリゴデンドロサイトの存在（ＯＬＩＧ２、赤）。図６Ａおよび図６Ｃでは、左のパネルは、ＭＢＰおよびＯＬＩＧ２の統合画像を示し、中央のパネルはＭＢＰ単独を示し、右のパネルはＯＬＩＧ２単独を示す。図６Ｂおよび図６Ｄは、図６Ａおよび図６Ｃの統合画像の高倍率画像を示す。図６Ｅは、図６Ａ〜６Ｄで示した領域を示すマウス脳冠状切断の図形である。倍率：図６Ａおよび図６Ｃ＝６００×；図６Ｂおよび図６Ｄ＝１０００×。略語：ＭＢＰ＝ミエリン塩基性タンパク質。
【図７】卒中傷害を受けたマウス脳における内在性神経新生の代表的な蛍光顕微鏡写真を示した図である。卒中傷害の３週間後の病変した脳梁について、相対的神経新生（ＤＣＸ、白）、ミエリンの存在（ＭＢＰ、緑）、オリゴデンドロサイトの存在（ＯＬＩＧ２、赤）およびミクログリア／免疫細胞活性化（ＩＢＡ−１、青）を示す。上のパネル：図７Ａは上のパネル類の統合画像であり、図７ＢはＤＣＸ単独、図７ＣはＭＢＰ単独、図７ＤはＯＬＩＧ２単独である。下のパネル：図７Ｅは下のパネル類の統合画像であり、図７ＦはＩＢＡ−１単独、図７ＧはＤＣＸ単独、図７ＨはＯＬＩＧ２単独である。図７Ａの赤い四角は図７Ｅで拡大した領域である。図７Ｂの青い楕円は、ＤＣＸ陽性細胞を示す。倍率：図７Ａ〜７Ｄ＝２００×；図７Ｅ〜７Ｈ＝６００×。略語：ＤＣＸ＝ダブルコルチン、ＩＢＡ−１＝イオン化カルシウム結合アダプター分子１、ＭＢＰ＝ミエリン塩基性タンパク質。
【図８】傷害を受けていない脳梁内への細胞注射部位を示すマウス脳冠状切断を示した図形である。矢印は、傷害を受けていない脳梁内のおよその細胞注射部位を示す。略語：Ｃｘ＝皮質；Ｓｔｒ＝線条体；ＷＭ＝白質。
【図９】ＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の２週間後の傷害を受けていないマウス脳における星状細胞およびミクログリア／免疫細胞活性化の代表的な蛍光顕微鏡写真を示した図である。画像パネルは、傷害を受けていない脳梁内へのＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の２週間後の対側（図９Ａ、図９Ｃ）および同側（図９Ｂ、図９Ｄ）内の星状細胞（ＧＦＡＰ）および活性化したミクログリア／免疫細胞（Ｉｂａ１／ＩＢＡ−１）の蛍光免疫染色を示す。図９Ａおよび図９Ｃでは、左の列はＧＦＡＰ（緑）およびＩｂａ１（赤）の統合蛍光画像を示し、中央の列はＧＦＡＰ単独を示し、右の列はＩｂａ１単独を示す。図９Ｂおよび図９Ｄでは、左の列はＩｂａ１単独を示し、中央の列はＧＦＡＰ単独を示し、右の列はＧＦＡＰ（緑）およびＩｂａ１（赤）の統合蛍光画像を示す。図９Ａおよび図９Ｂの白い四角は、図９Ｃおよび図９Ｄで示した拡大領域を示す。倍率：図９Ａおよび図９Ｂ＝４０×；図９Ｃおよび図９Ｄ＝６００×。略語：Ｃｘ＝皮質；ＧＦＡＰ＝グリア線維酸性タンパク質；Ｉｂａ１／ＩＢＡ−１＝イオン化カルシウム結合アダプター分子１；Ｓｔｒ＝線条体。
【図１０】ＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の２週間後の傷害を受けていないマウス脳においてミエリン損失がなく、未成熟ニューロンの移動が最小限であることを示した代表的な蛍光顕微鏡写真を示した図である。画像パネルは、傷害を受けていない脳梁内へのＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の２週間後の対側（図１０Ａ、図１０Ｃ）および同側（図１０Ｂ、図１０Ｄ）内のミエリン（ＭＢＰ）および未成熟ニューロン（ＤＣＸ）の蛍光免疫染色を示す。図１０Ａおよび図１０Ｂでは、左の列はＭＢＰ（緑）およびＤＣＸ（赤）の統合蛍光画像を示し、中央の列はＭＢＰ単独を示し、右の列はＤＣＸ単独を示す。図１０Ｃおよび図１０Ｄでは、拡大した小領域においてＭＢＰ染色のみが示される。図１０Ｅは、蛍光顕微鏡で示した領域を示すマウス冠状脳切断の図形である。倍率：図１０Ａおよび図１０Ｂ＝４０×；図１０Ｃおよび図１０Ｄ＝６００×。略語：ＤＣＸ＝ダブルコルチン；ＭＢＰ＝ミエリン塩基性タンパク質。
【図１１】ＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の２週間後の傷害を受けていないマウス脳において増加したオリゴデンドロサイト応答を示した代表的な蛍光顕微鏡写真を示した図である。画像パネルは、傷害を受けていない脳梁内へのＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の２週間後の対側（図１１Ａ〜１１Ｂ）および同側（図１１Ｃ〜１１Ｄ）内のオリゴデンドロサイト（ＯＬＩＧ２）、ミエリン（ＭＢＰ）および活性化したミクログリア／免疫細胞（ＩＢＡ−１）の蛍光免疫染色を示す。図１１Ａでは、パネル１（一番左）は、ＭＢＰ（緑）およびＯＬＩＧ２（赤）およびＩＢＡ−１（青）の統合蛍光画像を示し、パネル２はＩＢＡ−１単独を示し、パネル３はＭＢＰ単独を示し、パネル４はＯＬＩＧ２単独を示す。図１１Ｂでは、図１１ＡのＩＢＡ−１およびＯＬＩＧ２の統合画像を示す。図１１Ｃでは、パネル１（一番左）はＯＬＩＧ２単独を示し、パネル２はＭＢＰ単独を示し、パネル３はＩＢＡ−１単独を示し、パネル４はＭＢＰ（緑）およびＯＬＩＧ２（赤）およびＩＢＡ−１（青）の統合蛍光画像を示す。図１１Ｄでは、図１１ＣのＩＢＡ−１およびＯＬＩＧ２の統合画像を示す。図１１Ａと図１１Ｃの間の図形は、蛍光顕微鏡で示した領域を示す。倍率＝２００×。略語：Ｉｂａ１／ＩＢＡ−１＝イオン化カルシウム結合アダプター分子；ＭＢＰ＝ミエリン塩基性タンパク質。
【図１２】卒中病変した脳梁内への細胞注射部位を示すマウス脳冠状切断の図形を示した図である。青い矢印は、卒中病変を誘導するためのＬ−ＮＩＯのおよその注射部位を示す。黒い矢印は、卒中病変中心部（赤い領域）内の細胞注射部位のおよその位置を示す。およその病変中心部は青で示す。略語：Ｃｘ＝皮質；Ｓｔｒ＝線条体；ＷＭ＝白質。
【図１３】卒中傷害および病変中心部内部のＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の後のマウス脳における星状細胞およびミクログリア／免疫細胞活性化の代表的な蛍光顕微鏡写真を示した図である。画像パネルは、卒中の３週間後およびＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の２週間後の傷害を受けていない対側半球（図１３Ａ〜１３Ｃ）および卒中傷害を受けた／ＡＳＴ−ＯＰＣ１移植した半球（図１３Ｄ〜１３Ｆ）における星状細胞（ＧＦＡＰ）および活性化したミクログリア／免疫細胞（ＩＢＡ−１）の蛍光免疫染色を示す。図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｄおよび図１３Ｅは、低倍率（図１３Ａ、図１３Ｄ）および高倍率（図１３Ｂ、図１３Ｅ）のＧＦＡＰ免疫染色を示す。図１３Ｃおよび図１３Ｆは、左パネルでＧＦＡＰ（緑）およびＩＢＡ−１（オレンジ）の統合画像、中央のパネルでＧＦＡＰ単独、右パネルでＩＢＡ−１単独を高倍率で示す。アスタリスクは、およその病変中心部を示す。倍率：図１３Ａおよび図１３Ｄ＝４０×；図１３Ｂおよび図１３Ｅ＝２００×；図１３Ｃおよび図１３Ｆ＝６００×。略語：Ｃｘ＝皮質；ＧＦＡＰ＝グリア線維酸性タンパク質；ＩＢＡ−１＝イオン化カルシウム結合アダプター分子；Ｓｔｒ＝線条体。
【図１４】卒中傷害および病変中心部内部のＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の後のマウス脳における星状細胞活性化および軸索損失の代表的な蛍光顕微鏡写真を示した図である。画像パネルは、卒中の３週間後およびＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の２週間後の卒中傷害を受けた／ＡＳＴ−ＯＰＣ１移植した半球における星状細胞（ＧＦＡＰ）および軸索（ＮＦ２００）の蛍光免疫染色を示す。図１４Ａは、卒中病変内のＧＦＡＰ（赤）およびＮＦ２００（青）の統合画像を示す。図１４Ｂは、ＮＦ２００染色単独を示し、図１４ＣはＧＦＡＰ染色単独を示す。図１４Ａ〜１４Ｃの白い点線は、脳梁のおよその境界を示す。図１４Ａ〜１４Ｃのアスタリスクは、卒中病変のおよその中心部を示す。図１４Ｄは、図１４Ａ〜１４Ｃで示した領域を示すマウス脳冠状切断の図形である。倍率＝２００×。略語：Ｃｘ＝皮質；ＧＦＡＰ＝グリア線維酸性タンパク質；Ｓｔｒ＝線条体。
【図１５】卒中傷害および病変中心部内部のＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の後のマウス脳におけるＡＳＴ−ＯＰＣ１位置、ミエリン損失および内在性神経新生の代表的な蛍光顕微鏡写真を示した図である。画像パネルは、卒中の３週間後およびＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の２週間後の卒中傷害を受けた／ＡＳＴ−ＯＰＣ１移植した半球におけるＡＳＴ−ＯＰＣ１（Ｈｎｕｃ）およびミエリン（ＭＢＰ）および未成熟ニューロン（ＤＣＸ）の蛍光免疫染色を示す。図１５Ａ〜１５Ｃのパネル１（一番左）は、卒中病変内のＨｎｕｃ（青）、ＭＢＰ（緑）およびＤＣＸ（赤）の統合画像を示す。図１５Ｄは、図１５Ａ〜１５Ｃで示した領域を示すマウス脳冠状切断の図形である。倍率：図１５Ａ＝２００×、図１５Ｂ＝１２００×、図１５Ｃ＝２０００×。略語：ＤＣＸ＝ダブルコルチン；Ｈｎｕｃ＝抗ヒト核；ＭＢＰ＝ミエリン塩基性タンパク質。
【図１６】卒中傷害および病変中心部内部のＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の後のマウス脳におけるミクログリア／免疫細胞活性化、ミエリン損失およびオリゴデンドロサイト応答の代表的な蛍光顕微鏡写真を示した図である。画像パネルは、卒中の３週間後およびＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の２週間後の卒中傷害を受けた／ＡＳＴ−ＯＰＣ１移植した半球（図１６Ａ、図１６Ｃ）および傷害を受けていない対側半球（図１６Ｂ、図１６Ｄ）における活性化ミクログリア／免疫細胞（Ｉｂａ１／ＩＢＡ−１）、ミエリン（ＭＢＰ）およびオリゴデンドロサイト（ＯＬＩＧ２）の蛍光免疫染色を示す。図１６Ａでは、パネル１（一番左）は卒中病変内のＩＢＡ−１（青）、ＭＢＰ（緑）およびＯＬＩＧ２（赤）の統合画像を示す。パネル２は、ＩＢＡ−１単独を示し、パネル３はＭＢＰ単独を示し、パネル４はＯＬＩＧ２単独を示す。図１６Ｂでは、パネル１（一番左）はＯＬＩＧ２単独を示し、パネル２はＭＢＰ単独を示し、パネル３はＩＢＡ−１単独を示し、パネル４は３つの染色全ての統合画像を示す。図１６Ｃおよび図１６Ｄは、ＩＢＡ−１（青）およびＯＬＩＧ２（赤）単独の統合画像を示す。図１６Ａと図１６Ｂの間の図形は、蛍光顕微鏡で示した領域を示す。倍率＝２００×。略語：ＩＢＡ−１＝イオン化カルシウム結合アダプター分子、ＭＢＰ＝ミエリン塩基性タンパク質。
【図１７】卒中病変に隣接した脳梁内の細胞注射部位を示すマウス脳冠状切断を示した図形である。青い矢印は、卒中病変を誘導するためのＬ−ＮＩＯのおよその注射部位を示す。黒い矢印は、卒中病変中心部（赤い領域）に隣接した細胞注射部位のおよその位置を示す。およその病変中心部は青で示す。略語：Ｃｘ＝皮質；Ｓｔｒ＝線条体；ＷＭ＝白質。
【図１８】卒中傷害および病変中心部に隣接したＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の後のマウス脳における星状細胞およびミクログリア／免疫細胞活性化の代表的な蛍光顕微鏡写真を示した図である。画像パネルは、卒中の３週間後およびＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の２週間後の傷害を受けていない対側半球（図１８Ａ〜１８Ｂ）および卒中傷害を受けた／ＡＳＴ−ＯＰＣ１移植した半球（図１８Ｃ〜１８Ｅ）における星状細胞（ＧＦＡＰ）および活性化したミクログリア／免疫細胞（ＩＢＡ−１）の蛍光免疫染色を示す。図１８Ａおよび図１８Ｂでは、左のパネルは、ＧＦＡＰ（緑）およびＩＢＡ−１（オレンジ）の統合画像を示し、中央のパネルはＧＦＡＰ単独を示し、右のパネルはＩＢＡ−１単独を示す。図１８Ａの白い四角は図１８Ｂで示した拡大領域を示す。図１８Ｃ〜１８Ｄでは、左のパネルは、ＩＢＡ−１単独を示し、中央のパネルはＧＦＡＰ単独を示し、右のパネルは統合画像を示す。図１８Ｅでは、左のパネルは、ＧＦＡＰ（緑）およびＩＢＡ−１（オレンジ）の統合画像を示し、中央のパネルはＧＦＡＰ単独を示し、右のパネルはＩＢＡ−１単独を示す。図１８Ｃおよび図１８Ｄの白い四角はそれぞれ、図１８Ｄおよび図１８Ｅで示した拡大領域を示す。図１８Ｄおよび図１８Ｅのアスタリスクは、画像パネル間共通の目印を示す。倍率：図１８Ａおよび図１８Ｃ＝４０×、図１８Ｂ＝６００×、図１８Ｄ＝１００×および図１８Ｅ＝１０００×。略語：Ｃｘ＝皮質；ＧＦＡＰ＝グリア線維酸性タンパク質；ＩＢＡ−１＝イオン化カルシウム結合アダプター分子；Ｓｔｒ＝線条体。
【図１９】卒中傷害および病変中心部に隣接したＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の後のマウス脳におけるＡＳＴ−ＯＰＣ１位置、反応性星状細胞および活性化したミクログリア／免疫細胞の代表的な蛍光顕微鏡写真を示した図である。画像パネルは、卒中の３週間後およびＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の２週間後の傷害を受けていない対側半球（図１９Ａ）および卒中傷害を受けた／ＡＳＴ−ＯＰＣ１移植した半球（図１９Ｂ）におけるＡＳＴ−ＯＰＣ１（Ｈｎｕｃ）および反応性星状細胞（ＧＦＡＰ）および活性化したミクログリア／免疫細胞（ＩＢＡ−１）の蛍光免疫染色を示す。図１９Ａおよび図１９Ｂでは、パネル１（一番左）は脳梁（図１９Ａおよび図１９Ｂの間の図形によって示した通り）内のＨｎｕｃ（青）、ＧＦＡＰ（緑）およびＩＢＡ−１（赤）の統合画像を示す。倍率＝６００×。略語：ＧＦＡＰ＝グリア線維酸性タンパク質；Ｈｎｕｃ＝抗ヒト核；ＩＢＡ−１＝イオン化カルシウム結合アダプター分子。
【図２０】卒中傷害および病変中心部に隣接したＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の後のマウス脳におけるＡＳＴ−ＯＰＣ１位置、ミエリン損失の低減および内在性神経新生の代表的な蛍光顕微鏡写真を示した図である。図２０Ａは、卒中の３週間後およびＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の２週間後の卒中傷害を受けた／ＡＳＴ−ＯＰＣ１移植した半球におけるＡＳＴ−ＯＰＣ１（Ｈｎｕｃ）およびミエリン（ＭＢＰ）および未成熟ニューロン（ＤＣＸ）の蛍光免疫染色を示す。一番左のパネルは、ＭＢＰ（緑）およびＤＣＸ（赤）（上および中央のパネル）またはＨｎｕｃ（青）およびＭＢＰ（緑）（下のパネル）の統合画像を示す。パネルの中央の列は、ＭＢＰまたはＨｎｕｃの単一染色を示し、右の列のパネルはＤＣＸまたはＭＢＰの単一染色を示す。図２０Ｂは、図２０Ａで示した領域を示す図形である。倍率：（上の行）＝２００×、（中央の行）＝６００×、（下の行）＝１０００×。略語：ＤＣＸ＝ダブルコルチン；Ｈｎｕｃ＝抗ヒト核；ＭＢＰ＝ミエリン塩基性タンパク質。
【図２１】卒中傷害および病変中心部に隣接したＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の後のマウス脳におけるミクログリア／免疫細胞活性化、ミエリン損失およびオリゴデンドロサイト応答の代表的な蛍光顕微鏡写真を示した図である。画像パネルは、卒中の３週間後およびＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の２週間後の傷害を受けていない対側半球（図２１Ａ、図２１Ｃ）および卒中傷害を受けた／ＡＳＴ−ＯＰＣ１移植した半球（図２１Ｂ、図２１Ｄ）における活性化ミクログリア／免疫細胞（ＩＢＡ−１）、ミエリン（ＭＢＰ）およびオリゴデンドロサイト（ＯＬＩＧ２）の蛍光免疫染色を示す。図２１Ａでは、パネル１（一番左）は対側脳梁内のＩＢＡ−１（青）、ＭＢＰ（緑）およびＯＬＩＧ２（赤）の統合画像を示す。パネル２は、ＩＢＡ−１単独を示し、パネル３はＭＢＰ単独を示し、パネル４はＯＬＩＧ２単独を示す。図２１Ｂでは、パネル１（一番左）はＯＬＩＧ２単独を示し、パネル２はＭＢＰ単独を示し、パネル３はＩＢＡ−１単独を示し、パネル４は３つの染色全ての統合画像を示す。図２１Ｃおよび図２１Ｄは、ＩＢＡ−１（青）およびＯＬＩＧ２（赤）単独の統合画像を示す。パネル図２１Ａと図２１Ｂの間の図形は、蛍光顕微鏡で示した領域を示す。倍率＝２００×。略語：ＩＢＡ−１＝イオン化カルシウム結合アダプター分子、ＭＢＰ＝ミエリン塩基性タンパク質。
【図２２】卒中傷害および病変中心部に隣接したＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の後のマウス脳におけるＡＳＴ−ＯＰＣ１位置の代表的な蛍光顕微鏡写真を示した図である。画像パネルは、卒中の３週間後およびＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の２週間後の傷害を受けていない対側半球（図２２Ａ、図２２Ｃ）および卒中傷害を受けた／ＡＳＴ−ＯＰＣ１移植した半球（図２２Ｂ、図２２Ｄ）におけるＡＳＴ−ＯＰＣ１（Ｈｎｕｃ、青）の蛍光免疫染色を示す。図の中央の図形は図２２Ａ〜２２Ｄで示した領域を示す。倍率＝２００×。略語：Ｈｎｕｃ＝抗ヒト核。
【図２３】卒中傷害およびＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の後のマウス脳における梗塞体積およびグリア性瘢痕体積の定量を示した図である。図２３Ａは、卒中（または偽手術）の３週間後およびＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の２週間後の各治療群の平均梗塞体積を示す。図２３Ｂは、卒中（または偽手術）３週間後およびＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の２週間後の各治療群の平均グリア性瘢痕体積を示す。治療群標識：ＷＭＳ＝白質卒中単独；ＯＰＣ＝偽手術およびＡＳＴ−ＯＰＣ１移植；ＷＭＳ＋ＯＰＣ  ｉｎｓ＝卒中および卒中病変内部へのＡＳＴ−ＯＰＣ１移植；ＷＭＳ＋ＯＰＣ  ｏｕｔ＝卒中および卒中病変に隣接したＡＳＴ−ＯＰＣ１移植。エラーバーは平均の標準誤差を示す。
【図２４】卒中傷害およびＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の後の脳梁病変内のミエリン塩基性タンパク質免疫反応性およびオリゴデンドロサイト応答の定量を示した図である。図２４Ａは、卒中（または偽手術）の３週間後およびＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の２週間後の各治療群の平均ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）免疫反応性を示す。図２４Ｂは、卒中（または偽手術）の３週間後およびＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の２週間後の各治療群のＯＬＩＧ２陽性細胞の平均数を示す。治療群標識：Ｎａｉｖｅ＝傷害を受けておらず、移植もしていない；ＷＭＳ＝白質卒中単独；ＯＰＣ＝偽手術およびＡＳＴ−ＯＰＣ１移植；ＷＭＳ＋ＯＰＣ  ｉｎｓ＝卒中および卒中病変内部へのＡＳＴ−ＯＰＣ１移植；ＷＭＳ＋ＯＰＣ  ｏｕｔ＝卒中および卒中病変に隣接したＡＳＴ−ＯＰＣ１移植。エラーバーは平均の標準誤差を示す。
【図２５】白質卒中のマウスモデルにおける機能回復および白質温存に対するＡＳＴ−ＯＰＣ１の効果を試験する試験２の実験予定表を示した図である。卒中７日後のＡＳＴ−ＯＰＣ１移植および毎月の行動試験を含む実験計画の重要な時点を示す。ＡＳＴ−ＯＰＣ１用量＝１回の注射１μＬとして細胞１００，０００個／マウス。
【図２６】病変部位に隣接したＡＳＴ−ＯＰＣ１移植によって、グリッド歩行試験における卒中傷害マウスの能力が改善することを示した図である。グリッド歩行試験における平均能力（％フットフォールトで示す）は、時間（卒中後）の関数として各治療群について示す。卒中の１週間後は、ＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の前日に対応する。アスタリスクおよびハッシュタグは、２元配置ＡＮＯＶＡおよびテゥーキーＨＳＤポスト−ホック解析を使用して、傷害を受けていない対照群に対する有意性を示す（ｐ＜０．０５）。卒中の４カ月後、全卒中傷害群（＋／−ＡＳＴ−ＯＰＣ１）は、対照の傷害を受けていない動物とは有意に異なっており、持続的な欠損が示された。卒中の６カ月後に、卒中単独群および梗塞内部に高用量のＡＳＴ−ＯＰＣ１を投与した卒中群（卒中＋内部への高用量細胞）のみが対照の傷害を受けていない動物とは有意に異なっており、その他の卒中傷害を受けたＡＳＴ−ＯＰＣ１治療群においては正の回復が示された。治療群標識：対照＝傷害を受けておらず、移植もしていない；卒中＝卒中単独；卒中＋内部への高用量細胞＝卒中傷害＋卒中病変内部へ１００，０００個のＡＳＴ−ＯＰＣ１細胞を移植；卒中＋外部への高用量細胞＝卒中傷害＋卒中病変に隣接して１００，０００個のＡＳＴ−ＯＰＣ１細胞を移植；卒中＋外部への低用量細胞＝卒中傷害＋卒中病変に隣接して１０，０００個のＡＳＴ−ＯＰＣ１細胞を移植；高用量の細胞＝傷害を受けていない脳梁内に１００，０００個のＡＳＴ−ＯＰＣ１細胞を移植；低用量の細胞＝傷害を受けていない脳梁内に１０，０００個のＡＳＴ−ＯＰＣ１細胞を移植。
【図２７】病変部位に隣接したＡＳＴ−ＯＰＣ１移植によって、シリンダー試験における卒中傷害マウスの能力が改善することを示した図である。各治療群について、シリンダー試験における平均能力（傷害前ベースラインに対する運動障害として示す）を時間（卒中後）の関数として示す。卒中の１週間後は、ＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の前日に対応する。アスタリスクは、２元配置ＡＮＯＶＡおよびテゥーキーＨＳＤポスト−ホック解析を使用して、卒中単独群に対する有意性を示す（ｐ＜０．０５）。卒中の４カ月後、ＡＳＴ−ＯＰＣ１を投与された全卒中傷害群は卒中単独動物とは有意に異なっており、ＡＳＴ−ＯＰＣ１治療後の能力の改善が示された。治療群標識：対照＝傷害を受けておらず、移植もしていない；卒中＝卒中単独；卒中＋内部への高用量細胞＝卒中傷害＋卒中病変内部へ１００，０００個のＡＳＴ−ＯＰＣ１細胞を移植；卒中＋外部への高用量細胞＝卒中傷害＋卒中病変に隣接して１００，０００個のＡＳＴ−ＯＰＣ１細胞を移植；卒中＋外部への低用量細胞＝卒中傷害＋卒中病変に隣接して１０，０００個のＡＳＴ−ＯＰＣ１細胞を移植；高用量の細胞＝傷害を受けていない脳梁内に１００，０００個のＡＳＴ−ＯＰＣ１細胞を移植；低用量の細胞＝傷害を受けていない脳梁内に１０，０００個のＡＳＴ−ＯＰＣ１細胞を移植。
【図２８】白質卒中傷害およびＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の後のニッスル染色マウス脳の代表的な顕微鏡写真を示した図である。画像パネルは、各治療群の病変（左）および傷害を受けていない対側（右）半球における脳梁および側脳室の代表的なニッスル染色を示す。脳梁における組織温存の増加および同側の側脳室拡大の低減はＡＳＴ−ＯＰＣ１治療群において明らかで、病変部位に隣接して高用量のＡＳＴ−ＯＰＣ１を投与した卒中傷害群において最も著しい。治療群標識：対照＝傷害を受けておらず、移植もしていない；白質卒中＝卒中単独；卒中＋内部への高用量細胞＝卒中傷害＋卒中病変内部へ１００，０００個のＡＳＴ−ＯＰＣ１細胞を移植；卒中＋外部への高用量細胞＝卒中傷害＋卒中病変に隣接して１００，０００個のＡＳＴ−ＯＰＣ１細胞を移植；卒中＋外部への低用量細胞＝卒中傷害＋卒中病変に隣接して１０，０００個のＡＳＴ−ＯＰＣ１細胞を移植。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の組成物および方法を記載する前に、記載した特定の工程、組成物または方法は変動することがあるので、本明細書で開示した本発明はこれらに限定されないことを理解されたい。この記載で使用した用語は、特定の種類または実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。別段の規定がない限り、本明細書で使用した技術的および科学的用語は全て、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載したものと類似または同等のいかなる方法および材料も、本開示の実施形態の実行または試験において使用することができる。
【００１５】
様々な実施形態では、本明細書で記載した方法および組成物は、ＷＭＳのマウスモデルにおいて脳虚血傷害後にＡＳＴ−ＯＰＣ１を移植すると回復が増強するという発見に関する。亜急性時点（卒中の７日後）に病変中心部に直接隣接して、または内部にＡＳＴ−ＯＰＣ１を移植すると、ＡＳＴ−ＯＰＣ１は皮質下白質の全体にわたって広範な移動を生じ、損傷した白質内でのミエリン化の増加および反応性星状細胞増多症および炎症の測定値の低減を引き起こす。ＡＳＴ−ＯＰＣ１を病変中心部に直接隣接して移植した後の白質のＭＲＩ画像は、マウスモデルおよびヒトＷＭＳの両方において白質損傷の特徴である高強度の低減を示した。行動評価によって、２つの運動機能試験において改善が示された。これらの結果は、ＡＳＴ−ＯＰＣ１移植がＷＭＳにおける白質修復および回復を促進することを示す。
【００１６】
様々な実施形態では、白質卒中などの脳虚血傷害の治療におけるＡＳＴ−ＯＰＣ１の使用のための方法を提供する。白質卒中の細胞をベースにした臨床療法における使用に適した医薬組成物および製剤も本明細書で提供する。
【００１７】
本発明の細胞の使用
ヒト胚性幹細胞から高純度の特徴付けられたオリゴデンドロサイト前駆細胞を多数産生する方法は以前に記載されたことがある（例えば、米国特許仮出願第６２／１６２，７３９号および第６２／１４４，９２１号）。ヒト胚性幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を誘導することによって、脳の虚血傷害の治療を含む、いくつかの重要な治療、研究、開発および商用目的のためのＯＰＣの再生可能で大規模な原料がもたらされる。オリゴデンドロサイト前駆細胞はヒト胚性幹細胞以外の原料由来であってもよいことも認められている。このような原料としては、これらに限定されないが、成体幹細胞、誘導性多能性幹細胞ＩＰＳＣ、培養した幹細胞系などが挙げられる。
【００１８】
「ＡＳＴ−ＯＰＣ１」という用語は、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）および本明細書で開示した特異的な分化法によって未分化幹細胞から得られたその他の特徴付けられた細胞種の混合物を含有する、特異的で、特徴付けられた、インビトロにおいて分化させた細胞集団を意味する。
【００１９】
ＡＳＴ−ＯＰＣ１の免疫細胞化学（ＩＣＣ）、フローサイトメトリーおよび定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）による組成分析は、細胞集団は主にオリゴデンドロサイト表現型の神経系列細胞を含んでなることを示す。その他の神経系列細胞、すなわち、星状細胞およびニューロンは低頻度で存在する。集団中で唯一検出された非神経細胞は上皮細胞である。中胚葉、内胚葉系列細胞およびｕｈＥＳＣは、通常アッセイの定量または検出を下回っている。
【００２０】
本明細書では、「オリゴデンドロサイト前駆細胞」（ＯＰＣ）という用語は、オリゴデンドロサイトに分化することができる、中枢神経系に見いだされる細胞種の特徴を有する神経外胚葉／グリア系列の細胞を意味する。これらの細胞は典型的に、特徴的なマーカー、ネスチン、ＮＧ２およびＰＤＧＲ−Ｒαを発現する。
【００２１】
本明細書では「治療」、「治療する」、「治療した」または「治療している」という用語は、治療的療法または予防的もしくは防御的処置の両方を意味することができ、その目的は所望しない生理学的状態、症状、障害もしくは疾患を防御するか、または鈍化させる（減少させる）こと、または有益な、もしくは所望する臨床結果を得ることである。一部の実施形態では、この用語は治療および防御の両方を意味してもよい。本開示の目的において、有益な、または所望する臨床結果としては、これらに限定されないが、以下：症状の軽減；状態、障害または疾患の範囲の減少、状態、障害または疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、状態、障害または疾患の発症の遅延または進行の緩徐化、状態、障害もしくは疾患状態の緩解、および検出可能か検出不可能かにかかわらず、状態、障害または疾患の寛解（部分的または全体的）または増強または改善の１つまたは複数を挙げることができる。治療は、臨床的に重要な応答の惹起を含む。治療はまた、治療を受けなかった場合に予測される生存と比較して延長した生存も含む。ある特定の実施形態では、特に脳虚血の場合、治療には、運動制御の改善または復活、発話の改善または復活、平衡の改善または復活、認知の改善（例えば、様々な認知機能アッセイのいずれかによって測定したとき）などを含めることができる。
【００２２】
本明細書では、「対象」という用語は、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類ならびにネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウサギ、マウスおよびラットなどの齧歯類などの任意の動物を含む野生動物、飼育動物および家畜などの非ヒト脊椎動物を含む。一部の実施形態では、「対象」という用語は雄を意味する。一部の実施形態では、「対象」という用語は雌を意味する。
【００２３】
ＡＳＴ−ＯＰＣ１は、細胞療法の必要なヒト患者またはその他の対象におけるミエリン修復または再ミエリン化を促進する。以下は、ミエリン修復または再ミエリン化を必要とする状態、疾患および病態の非限定的例である：白質卒中、多発性硬化症、白質ジストロフィー、ギランバレー症候群、シャルコーマリートゥース神経障害、テイサックス病、ニーマンピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群および急性脊髄傷害などのミエリン化の損失を引き起こす外傷性疾患を含む脳虚血傷害。
【００２４】
ミエリン修復または再ミエリン化に加えて、ＡＳＴ−ＯＰＣ１は虚血組織に直接修復作用をもたらすことができる神経栄養因子、例えば、ＢＤＮＦを分泌する。
【００２５】
ＯＰＣは、企図する組織部位に存在させ、融合させ、および／または移動させる方法で投与される。細胞の対象への投与は、当業界で公知の任意の方法によって実現することができる。例えば、細胞は、細胞移植を必要とする器官または組織に外科的に直接投与することができる。あるいは、非侵襲的な手法を使用して細胞を対象に投与することができる。非侵襲的送達方法の例は、細胞療法を必要とする器官または組織に細胞を送達するためのシリンジおよび／またはカテーテルおよび／またはカニューレの使用を含む。
【００２６】
ある特定の実施形態では、ＯＰＣは、梗塞中心部内に投与される。その他の実施形態では、ＯＰＣは、梗塞中心部に直接隣接して投与される。本明細書では「直接隣接して」とは、場合によっては部分的卒中損傷の領域を表す梗塞中心部の外側の領域を意味し、その他の場合では、「直接隣接して」とは梗塞領域の外側の健康な組織を意味する。一部の実施形態では、ＯＰＣは、梗塞中心部から０．０１ｍｍから１０ｍｍに投与される。一部の実施形態では、ＯＰＣは、梗塞中心部から０．０５ｍｍから３ｍｍに投与される。一部の実施形態では、ＯＰＣは、梗塞中心部から０．１ｍｍから２ｍｍに投与される。一部の実施形態では、ＯＰＣは、梗塞中心部から０．５ｍｍから１ｍｍに投与される。一部の実施形態では、ＯＰＣは、梗塞中心部から０．３ｍｍから０．６ｍｍに投与される。
【００２７】
ある特定の実施形態では、ＯＰＣは、亜急性期中に対象に投与される。本明細書では「亜急性」とは、卒中傷害による初期の損傷および細胞死が終了する急性期と慢性期の間の期間を意味する。本明細書では、ヒト対象における「亜急性早期」とは卒中後１カ月までを意味し、「亜急性後期」とは卒中後１〜３カ月の期間を意味する。
【００２８】
ある特定の実施形態では、本発明のＯＰＣを投与されている対象は、移植した細胞の免疫拒絶を低減させるために治療することができる。検討した方法としては、これらに限定されないが、タクロリムス、シクロスポリンＡのような伝統的な免疫抑制薬の投与（Ｄｕｎｎら、Ｄｒｕｇｓ  ６１：１９５７、２００１）または多能性幹由来細胞の一致した集団を使用した免疫寛容の誘導（国際公開第０２／４４３４３号パンフレット；米国特許第６，２８０，７１８号；国際公開第０３／０５０２５１号パンフレット）が挙げられる。ある特定の実施形態では、抗炎症薬（プレドニゾンなど）および免疫抑制薬の組み合わせを使用してもよい。ある特定の実施形態では、ＯＰＣは、ヒトに投与するために十分滅菌した条件下で調製した等張賦形剤を含む、医薬組成物の形態で供給することができる。
【００２９】
医薬製剤の一般的な原理については、読者は「Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ＬａｚａｒｕｓおよびＬａｕｇｈｌｉｎ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ  ＬＬＣ  ２０１０」および「Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｅ．Ｄ．Ｂａｌｌ、Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ  ＆  Ｐ．Ｌａｗ、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、２０００」を参照すること。細胞賦形剤および組成物に付随する任意の要素の選択は、投与するために使用する経路および装置に従って適応させる。組成物はまた、増殖させた標的細胞の生着または機能動員を容易にする１つまたは複数のその他の成分を含むかまたは伴っていてもよい。適切な成分には、標的細胞種の接着を支持もしくは促進する、または移植した組織の血管新生を促進するマトリックスタンパク質を含めることができる。
【００３０】
本発明の医薬組成物
オリゴデンドロサイト前駆細胞はそれ自体を、療法を必要とする対象に投与することができる。あるいは、細胞は、適切な担体と混合した医薬組成物で、および／またはデポー送達系を使用して、療法を必要とする対象に投与することができる。
【００３１】
本明細書では、「医薬組成物」という用語は、生理学的に適切な担体および賦形剤などのその他の成分と組み合わせて治療剤または治療剤類を含む調製物を意味する。
【００３２】
本明細書では、「治療剤」という用語は、対象において生物学的効果を及ぼす本発明の細胞を意味する。本発明の実施形態によって、「治療剤」は本発明のオリゴデンドロサイト前駆細胞を意味することができる。さらに、または代わりに、「治療剤」は、神経修復を助ける役割を有する本発明のオリゴデンドロサイト前駆細胞によって分泌される１つまたは複数の因子を意味してもよい。
【００３３】
本明細書では、「治療有効量」という用語は、所望する結果を生じるために十分な用量、投薬レジメンまたは量を意味する。
【００３４】
本明細書では、「担体」「生理学的に許容される担体」および「生物学的に許容される担体」という用語は同義に使用することができ、対象において重大な有害作用または刺激作用を引き起こさず、治療剤の生物学的活性または効果を実質的に阻害しない希釈剤または担体物質を意味する。「賦形剤」という用語は、治療剤の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加した物質を意味する。
【００３５】
本発明の組成物は、注射、例えば、ボーラス注入または連続注入による非経口投与のために製剤化することができる。組成物は、約１５分間から約２４時間にわたって皮下に連続注入することによって投与することができる。注射用の製剤は、単位投与形態、例えば、アンプルまたは複数投与容器に入れて、保存剤を添加して調製することができる。組成物は、懸濁液、溶液または油性もしくは水性媒体中のエマルジョンのような形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含有することができる。
【００３６】
本明細書で記載した治療剤は、２０１４年５月１２日に出願された米国特許出願第１４／２７５，７９５号および米国特許第８，３２４，１８４号および第７，９２８，０６９号に記載されたものなどのハイドロゲルの成分として投与することができる。ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）およびポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）などの合成ポリマーを含む、および／またはコラーゲン、ヒアルロン酸（ＨＡ）、フィブリン、アルギン酸塩、アガロースおよびキトサンなどの天然由来の材料を含むハイドロゲルは当業界では公知である（Ｐｅｐｐａｓら（２００６）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  １８：１３４５；Ｌｅｅら（２００１）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０１：１８６９）。様々な化学修飾によって形成された共有的に架橋結合したハイドロゲルはまた以前に記載されたことがある（Ｖｅｒｃｒｕｙｓｓｅら（１９９７）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．８：６８６；Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈら（１９９８）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５３：９３；Ｂｕｒｄｉｃｋら（２００５）Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ６：３８６；Ｇａｍｉｎｉら（２００２）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２３：１１６１；米国特許第７，９２８，０６９号；米国特許第７，９８１，８７１号）。
【００３７】
ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）（商標名ＨｙＳｔｅｍ（登録商標））と架橋結合したヒアルロン酸（ＨＡ）およびブタゼラチンのチオール修飾誘導体をベースにしたハイドロゲルは、細胞培養、薬物送達などを含む多くの適用に適応させる特有の化学的、生物学的および物理学的特質を有する（Ｓｈｕら（２００４）Ｊ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔ  Ｒｅｓ  Ｐａｒｔ  Ａ  ６８：３６５；Ｓｈｕら（２００２）Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ３：１３０４；Ｖａｎｄｅｒｈｏｏｆｔら（２００９）Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉ  ９：２０）。ＨｙＳｔｅｍ（登録商標）を含む架橋結合したＨＡハイドロゲルは、角膜上皮創傷治癒（Ｙａｎｇら（２０１０）Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｏｐｔｈａｌ  １３：１４４）、角膜組織工学（Ｅｓｐａｎｄａｒら（２０１２）Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｏｐｔｈａｍｏｌ  １３０：２０２）、および網膜修復（Ｌｉｕら（２０１３）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ  １９：１３５）の動物モデルにおける使用に成功したことがある。
【００３８】
生理活性を維持し、生物製剤の放出を遅延させるためにハイドロゲルを前臨床で使用することは記載されたことがある（Ｃａｉら（２００５）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２６：６０５４；Ｚｈａｎｇ（２０１１）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３２：９４１５；Ｏｖｅｒｍａｎら（２０１２）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０９：Ｅ２２３０；Ｇａｒｂｅｒｎら（２０１１）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３２：２４０７；Ｋｏｕｔｓｏｐｏｕｌｏｓら（２００９）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０６：４６２３）。さらに、細胞送達におけるこれらの使用は、細胞生存能および移植後の局在化を改善することが示されたことがある（Ｌａｆｌａｍｍｅら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５：１０１５；Ｚｈｏｎｇら（２０１０）Ｎｅｕｒｏｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｒｅｐａｉｒ  ２４：６３６；Ｃｏｍｐｔｅら（２００９）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２７：７５３）。いくつかの異なるハイドロゲルは、ＦＤＡ承認の眼用低分子治療薬において、眼表面での滞留時間を延長させるための賦形剤として使用されたことがある（Ｋｏｍｐｅｌｌａら（２０１０）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  １：４３５）。
【００３９】
さらに、２つの新規ハイドロゲル製剤は、治療用細胞の送達において有望性を示すことが報告されたことがある（Ｂａｌｌｉｏｓら（２０１０）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３１：２５５５；Ｃａｉｃｃｏら（２０１２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｔ  Ａ  １０１：１４７２；Ｙａｎｇら（２０１０）Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  １３：１４４；Ｍａｚｕｍｄｅｒら（２０１２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｔ  Ａ  １００：１８７７）。
【００４０】
材料および方法
動物対象。使用した手法は全て、有資格の獣医師によって承認され、米国国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針に従って実施された。ＮＳＧマウス（Ｓｈｕｌｔｚら（２００７）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（２０：１１８；ｊａｘｍｉｃｅ．ｊａｘ．ｏｒｇ／ｎｏｄ−ｓｃｉｄ−ｇａｍｍａ）は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から入手した。動物対象は全て、明暗１２時間周期の標準的条件下で飼育し、食物および水は自由に与えた。
【００４１】
Ｌ−Ｎｉｏを使用した局所的虚血病変の誘導。中等度から進行型のヒト白質虚血または血管性認知症で認められる大きな白質病変を模倣した、以前に確立された皮質下白質卒中のマウスモデル（Ｓｏｚｍｅｎら（２００９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８０（２）：２６１；Ｈｉｎｍａｎら（２０１３）Ｓｔｒｏｋｅ  ４４（１）：１８２）を使用した。簡単に説明すると、局所性虚血病変を誘導するために、図３に例示したように、Ｎ５−（１−イミノエチル）−Ｌ−オルニチン２塩酸塩（Ｌ−Ｎｉｏ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を各マウス脳の脳梁に３次元定位座標で直接注射した。
【００４２】
ｈＥＳＣからのＡＳＴ−ＯＰＣ１の分化。ＷＡ０１（Ｈ１）ｈＥＳＣ系列は、フィーダーを含まない条件下で増殖させた。ｈＥＳＣコロニーは、コラゲナーゼおよび手作業で擦過して採取し、次に超低接着面フラスコ内で肺葉体形成を刺激するために塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）４ｎｇ／ｍＬおよび上皮成長因子（ＥＧＦ）２０ｎｇ／ｍＬを含有する５０％ｈＥＳＣ増殖培地および５０％グリア前駆細胞培地（ＧＰＭ）に接種した（０日目）。１日目に、培地をＥＧＦ２０ｎｇ／ｍＬおよびオールトランス型レチノイン酸（ＲＡ）１０μΜを含有する５０％ｈＥＳＣ増殖培地／５０％ＧＰＭと交換した。２〜８日目に、培地をＥＧＦ２０ｎｇ／ｍＬおよびＲＡ１０μＭを含有する１００％ＧＰＭと毎日交換した。９〜２６日目に、ＲＡを含まないＧＰＭ／ＥＧＦ培地で肺葉体を維持し、培地は２日毎に交換した。２８日目に、マトリゲルをコーティングしたフラスコに肺葉体を播種し、ＧＰＭ／ＥＧＦ培地で２日毎に培地を交換しながら７日間培養した。３４日目に、細胞をトリプシンで収集し、マトリゲルをコーティングしたフラスコに再播種し、ＧＰＭ／ＥＧＦ培地で２日毎に培地を交換しながらさらに７日間培養した。４１日目に、細胞をトリプシンで収集し、残存する細胞凝集物を除去するために濾過し、液体窒素中で凍結保存した。
【００４３】
分化したＡＳＴ−ＯＰＣ１のフローサイトメトリーによる分析。分化したＡＳＴ−ＯＰＣ１試料の表面および細胞内マーカーの存在を標準的なフローサイトメトリーを使用してアッセイした。表面マーカー染色のために、４１日目にＡＳＴ−ＯＰＣ１試料を１０％熱不活性化ヤギ血清（ＨＩ  ＦＢＳ）でブロックし、次いで１次抗体および／またはアイソタイプ対照（０．５μｇ／細胞５×ｌ０５個、ＮＧ２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃３７−２３００；マウスＩｇＧ１  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃５５４１２）で２〜８℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、次いで２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧｌ−Ａ４８８  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ２１１２１  ０．２５μｇ／細胞５×ｌ０５個）で２〜８℃で３０分間インキュベートした。生育不能な細胞を排除するために、取得直前にヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ  Ｐ４８６４  １μｇ／ｍＬ）を染色した試料に添加した。次に、試料は全て取得し、データはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）血球計数機システムで、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェアを使用して分析した。
【００４４】
細胞内マーカー染色のために、４１日目に死細胞識別のためにＡＳＴ−ＯＰＣ１試料をエチジウムモノアジド（Ｓｉｇｍａ  Ｅ２０２８  ５μｇ／ｍＬ）でタグ付けし、次いで２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を使用して固定し、次に９０％冷メタノールで透過化した。細胞を５％  ＨＩ  ＦＢＳ（Ｏｃｔ４用）または１０％熱不活性化ヤギ血清（ネスチン用）でブロックし、次いで１次抗体および／またはアイソタイプ対照（ヤギ抗Ｏｃｔ４  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＳＣ８６２９、正常なヤギＩｇＧ  ＳＣ２０２８  ０．１５〜０．５μｇ／細胞５×ｌ０５個；ネスチン  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢ５３２６；ＭｏＩｇＧ１  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５４１２１  ０．５μｇ／細胞５×ｌ０５個）で２〜８℃で３０分間インキュベートし、染色緩衝液で洗浄し、２次抗体（ロバ抗ヤギＩｇＧ−Ａ４８８  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ１１０５５またはヤギ抗マウスＩｇＧ１−Ａ４８８  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ２１１２１  ０．２５μｇ／細胞５×ｌ０５個）で２〜８℃で３０分間インキュベートした。次に、試料は全て取得し、データはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）血球計数機システムで、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェアを使用して分析した。
【００４５】
ＮＳＧマウスにおけるＡＳＴ−ＯＰＣ１移植。ＡＳＴ−ＯＰＣ−１細胞は、Ａｓｔｅｒｉａｓ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃからドライアイスに入れて受け取り、「ＡＳＴ−ＯＰＣ１  Ｄｏｓｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ」（ＡＳＴ−ＧＥＮ−００２１バージョン０．２）法に従った。動物の５つの異なる群にＡＳＴ−ＯＰＣ１を投与した。卒中の７日後に細胞を定位的に移植した。マウスの体温をモニターし、直腸内プローブおよび温熱パッドを使用して３６．５〜３７．５℃に維持した。ハミルトンシリンジにＡＳＴ−ＯＰＣ１を充填し、定位固定アームに固定し、圧力ポンプに連結した。表１に示した座標に、３６°の角度で切開を形成し、細胞を２回注射して投与した。高用量群には１μＬ中全部で約１００，０００個の細胞を投与し、低用量群には１μＬ中全部で約１０，０００個の細胞を投与した。針は１回目の注射後２分間、２回目の注射後は４分間生体位に留置した。
【００４６】
【表１】
2018528265.tif 000003
【００４７】
免疫蛍光法のための脳組織処理。手術後生存期間（１５日間）の後、各マウスにイソフルランを過剰投与し、０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水、次いで４％パラホルムアルデヒドで経心的に灌流した。脳を取り出し、４％パラホルムアルデヒドで一晩後固定（ｐｏｓｔｆｉｘ）し、３０％スクロースで２日間凍結保護した。その後、脳を取り出して凍結した。脳組織をクリオスタット（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ  ０５３０）を使用して２００μｍ間隔で４０μｍ切片に切断した。
【００４８】
ヒト核抗原（ＨｕＮｕ）、ミクログリア／マクロファージマーカーＩＢＡ−１、ニューロンマーカーＮＦ２００、星状細胞マーカーＧＦＡＰ、汎オリゴデンドロサイトマーカーＯｌｉｇ２、成熟オリゴデンドロサイトマーカーＭＢＰおよび未成熟ニューロンマーカーＤＣｘの免疫染色は、正常なロバ血清５％で室温で１時間ブロックし、１次抗体でセ氏４度で一晩インキュベートし、２次抗体で室温で１時間インキュベートし、切片をコーティングスライド（ｓｕｂｂｅｄ  ｓｌｉｄｅｓ）にマウントし、空気乾燥することによって行った。次にアルコールおよびキシレンの濃度を上昇させてマウントした切片を脱水し、ＤＰＸと共にカバーガラスをかけた。１次抗体は、マウス抗ＨｕＮｕ（１：１５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ウサギ抗Ｉｂａ−１（１：５００、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ウサギ抗ＮＦ２００（１：５００、Ｓｉｇｍａ）、ラット抗ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、１：５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ウサギ抗Ｏｌｉｇ２（１：５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ラット抗ＧＦＡＰ（１：５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ヤギ抗ダブルコルチン（１：５００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびマウスモノクローナルｈＮｕｃ（１：１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）であった。２次抗体は全て、Ｃｙ２（青色）またはＣｙ３（黄色）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）色素にコンジュゲートしたロバＦ（ａｂ’）２断片で、１：１０００の希釈で使用した。
【００４９】
高解像度共焦点画像をＺ−スタックで取得した（Ｎｉｋｏｎ  Ｃ２共焦点システム）。梗塞中心部、ＩＢＡ−１、ＧＦＡＰ、ＨｕＮｕ、ＤＣＸおよびＯｌｉｇ２陽性細胞の領域測定は、光学分流装置プローブおよび神経解剖学的定量ソフトウェア（Ｓｔｅｒｅｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ、ＭＢＦ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して立体解析学的に定量した。ＮＦ２００およびＭＢＰで染色した白質軸索投影は、強度プロファイル（ＩｍａｇｅＪ、ＮＩＨ）で定量した。
【００５０】
ニッスル染色。ニッスル染色は、組織学的検査およびニューロン損失の測定のために使用した。４０μｍ脳切片のスライドは段階的エタノール（５０％、７０％、９５％および１００％）で脱水し、５０％エタノール−５０％クロロホルムで１時間洗浄し、段階的エタノール（１００％、９５％、７０％、５０％）で再脱水した。切片はクレシルバイオレット溶液で４５秒間染色し、蒸留水で濯ぎ、数滴の氷酢酸を含有する７０％エタノールで洗浄し、段階的エタノール（７０％、９５％および１００％）で再脱水し、キシレン中に入れ、封入剤を使用してカバーガラスをかけた。染色した切片は、Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ＬＢ蛍光顕微鏡で可視化した。
【００５１】
核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）。マウスを麻酔し、Ｂｒｕｋｅｒ  ７Ｔ小動物用ＭＲＩ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に設置した。ＭＲＩ画像法は、卒中後０、７日目および６カ月後に実施した。呼吸数は、手法全体にわたってモニターし、体温は３７±０．５℃に維持した。一連のＴ２強調画像を取得した：迅速取得緩和促進因子（ｒａｐｉｄ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ）８、反復時間５３００ｍｓ、エコー時間１５．００ｍｓ、面内解像度０．０１５６＿０．０１５６＿０．５０ｍｍ、１３枚の連続スライス。
【００５２】
トラクトグラフィー。スピンエコーシングルショットエコープラナー法（ＥＰＩ）パルスシークエンスで、以下のパラメータ：ＴＲ／ＴＥ：５０００／３５ｍｓ；シグナル平均１０、拡散強調ｂ＝１０００ｓ／ｍｍ２およびｂ＝０ｓ／ｍｍ２での３０ノンコリニア拡散勾配スキームおよび視野３．５×３．５ｃｍを使用して、処置して０、７日後および６カ月後にトラクトグラフィー、拡散テンソルデータ（ＤＴＩ）を取得した。データは、９６×９６マトリクスによるシングルショットＥＰＩシークエンスで３０方向を使用して取得し、ｋ空間にゼロ充填して１２８×１２８画像マトリクスを構築した。画像はｍｅｄｌｎｒｉａ、マルチプラットフォーム医学用画像処理および可視化ソフトウェアを使用して得た。ＤＴＩトラクトグラフィーデータは、１群当たり動物ｎ＝６を使用して病変領域で実施した。ＤＴＩトラクトグラフィー画像の拡大病変部位の３次元図は、Ｐａｒａ  Ｖｉｅｗ４．１．０ソフトウェアを使用して表した。
【実施例】
【００５３】
以下の実施例は、本発明者が本発明とみなすものの範囲を限定するものではなく、以下の実験が実施した全実験または唯一の実験であることを表すものでもない。
【実施例１】
【００５４】
ＡＳＴ−ＯＰＣ１の誘導および特徴付け
ＡＳＴ−ＯＰＣ１（以前はＧＲＮＯＰＣ１として知られていた）は、材料および方法で記載したようにマスター細胞バンク（ＭＣＢ）からＷＡ０１（ＨＩ）ｈＥＳＣを分化させることによって生成した。ＡＳＴ−ＯＰＣ１を産生するための分化工程は４１日を要し、ｈＥＳＣを未分化細胞コロニーから胚様体に移行させて、収穫され、凍結保存される接着性の分散した細胞集団となる必要がある。
【００５５】
４１日目の分化したＡＳＴ−ＯＰＣ１のフローサイトメトリーおよび免疫細胞化学（ＩＣＣ）による分析は以前に記載されたことがある（米国特許仮出願第６２／１６２，７３９号および第６２／１４４，９２１号）。ＩＣＣおよびフローサイトメトリーの結果は、細胞集団が早期オリゴデンドロサイト前駆細胞表現型の神経系列細胞のほとんどを含んでなることを示した。フローサイトメトリーによって、細胞の９０％超がネスチン陽性で、＞５０％がＮＧ２、オリゴデンドロサイト前駆細胞によって発現された神経／グリアプロテオグリカンが陽性であった。さらに、多能性幹細胞マーカー、Ｏｃｔ４のレベルは、定量レベルを下回り（＜０．２％）、残存ｈＥＳＣが欠如していることを示した。代替的なハイコンテンツ画像分析アッセイを使用して、ＡＳＴ−ＯＰＣ１におけるＯｃｔ４＋細胞の頻度が０．０５％未満であることをさらに判定した。定義されたＡＳＴ−ＯＰＣ１分化工程を使用して、ＡＳＴ−ＯＰＣ１を７５ロット超産生し、集団の組成を評価し、所望しない細胞種の可能性を検出するために、４１日目に外胚葉、中胚葉、内胚葉および多能性細胞種の複数のマーカーの存在をＩＣＣによってさらに特徴付けた。フローサイトメトリーの結果と一致して、ＩＣＣによるプロファイルは、細胞集団が主に早期オリゴデンドロサイト前駆細胞から構成され、成熟したニューロンも星状細胞もほとんどないことを示した。内胚葉、中胚葉または多能性細胞種の存在は、分化したＡＳＴ−ＯＰＣ１細胞集団の＜１％まで検出されなかった。
【実施例２】
【００５６】
試験１−白質卒中のＮＳＧマウスモデルにおけるＡＳＴ−ＯＰＣ１移植
ＡＳＴ−ＯＰＣ１異種移植の完全な試験を可能にするために、中等度から進行型のヒト白質虚血または血管性認知症において認められる大きな白質病変を模倣した、以前に確立された皮質下白質卒中のマウスモデル（Ｓｏｚｍｅｎら（２００９）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８０（２）：２６１；Ｈｉｎｍａｎら（２０１３）Ｓｔｒｏｋｅ  ４４（１）：１８２）を免疫不全ＮＳＧマウスに適応させた（Ｓｈｕｌｔｚら（２００７）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（２０：１１８；ｊａｘｍｉｃｅ．ｊａｘ．ｏｒｇ／ｎｏｄ−ｓｃｉｄ−ｇａｍｍａ）。簡単に説明すると、局所性虚血病変を誘導するために、図３に例示したように、Ｎ５−（１−イミノエチル）−Ｌ−オルニチン２塩酸塩（Ｌ−Ｎｉｏ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を各マウス脳の脳梁に、３次元定位座標で直接注射した。実験の予定表を図２に例示する。研究の目標およびパラメータは表２に詳細に記載する。脳組織は、卒中誘導して１５日後（すなわち、ＡＳＴ−ＯＰＣ１または偽注射の２週間後）に処理し、ミエリン化の範囲、軸索損失、星状細胞活性化、ミクログリア／マクロファージ応答およびオリゴデンドロサイト応答を判定するために蛍光免疫染色を実施した。代表的な結果を図１〜２４に示す。
【００５７】
【表２】
2018528265.tif 000004
【実施例３】
【００５８】
試験２−行動回復のためのＡＳＴ−ＯＰＣ１の有効性試験
実施例２で記載したようなＷＭＳのＮＳＧマウスモデルを使用して、行動回復に対するＡＳＴ−ＯＰＣ１移植の効果ならびにＭＲＩおよびエキソビボ組織化学染色に基づいてＡＳＴ−ＯＰＣ１移植が白質保存を改善するかどうかを評価した。実験の予定表を図２５に例示する。試験の目標およびパラメータは表３に詳細に記載する。行動試験（シリンダー試験およびグリッド歩行）は以下に詳細に記載する。代表的な結果を図２６〜２８に示す。
【００５９】
【表３】
2018528265.tif 000005
【００６０】
シリンダー試験。マウスの探索行動によって、空間および運動行動に基づいて神経を調査することが可能で、脳機能のアッセイとして使用することができる。シリンダー試験は、齧歯類の自発的な前肢使用を評価する方法で、卒中のいくつかの運動系傷害モデルで使用されたことがある。前肢障害を評価するために、動物を透明なプレキシガラス製シリンダーに入れ、観察する。マウスは後肢で棒立ちになることによって垂直な表面を活発に探索し、前肢および感覚毛で表面を探索する。シリンダー中において行動を評価する場合、自主的に右前肢、左前肢および両前肢を同時に壁に配置する回数を観察して記録した。一側性脳損傷を有する動物は、垂直探索中の前肢の使用が非対称となる。
【００６１】
シリンダー課題は客観的で、使用および採点が容易で、その他のものでは検出できない慢性障害に感受性があり、評価者間信頼性が高いことが見いだされた。
【００６２】
グリッド歩行試験。しばしばフットフォールト課題と呼ばれるグリッド歩行課題は、齧歯類の四肢機能の運動欠陥（最も一般的には後肢であるが、前肢も評価されたことがある）および移動運動中の配置障害を評価する比較的簡単な方法である。この課題は、卒中後の運動協調障害およびリハビリテーション効果を客観的に示すことが見いだされた。動物を開口部を有する高い平らなグリッドに配置した。脳損傷を有さない動物は典型的に足を正確にワイヤの枠に配置して、グリッドに沿って移動する間自分自身を保持する。足が開いたグリッドからすべる度に、「フットフォールト」を記録する。各四肢の対側および同側フォールト両方の数を歩行数全体と比較し、次にフットフォールト係数を使用して採点する。無処置の動物は全体的にフットフォールトをほとんど示さないかまたは全く示さず、フォールトが生じた場合、非対称である。虚血動物は典型的に無処置の動物よりも有意に多くの対側フットフォールトを示す。フットフォールト試験は、齧歯類における虚血後の感覚運動機能の欠陥を検出するための敏感な指標であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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