(57)【要約】  アミン修飾デキストランは、マンノース分子及びスズ-117mで標識されている。このスズ-117m標識マンノース修飾デキストランは、CD206を発現する疾患、特に関節リウマチ並びにリンパ節に典型的に位置する癌の治療に有用である。これは、このような疾患のための全身治療を提供する。スズ-117mにより、それが結合している細胞を破壊し、また細胞を画像化することができる。更に、スズ-117mからの放射線の性質のため、近接する健康な細胞に大きな損傷は与えない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD206を発現する疾患を有する哺乳動物に、前記疾患を治療又は画像化するのに有効な線量のスズ-117m標識マンノース修飾デキストランを注射することによって、前記疾患を治療又は画像化する方法。
【請求項２】
前記スズ-117mが非担体添加の高比活性スズ-117mである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記疾患が関節リウマチである、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記疾患が癌である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記有効な線量が0.05mCi〜40mCiである、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記有効な線量がホルミシス線量である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物に非担体添加の高比活性スズ-117m標識マンノース修飾デキストランのホルミシス線量を投与することによって、リウマチ状態において細胞アポトーシスを誘導する方法。
【請求項８】
哺乳動物に非担体添加の高比活性スズ-117m標識マンノース修飾デキストランのホルミシス線量を投与することによって、前記哺乳動物の癌細胞における細胞アポトーシスを誘導する方法。
【請求項９】
複数のマンノース分子が結合し、更に複数のスズ-117m原子が結合したデキストラン鎖を含む、化合物。
【請求項１０】
前記デキストランが10〜30kDaの分子量を有する、請求項9に記載の化合物。
【請求項１１】
複数の荷電分子が前記デキストラン鎖に結合している、請求項9に記載の化合物。
【請求項１２】
前記複数のマンノース分子がアミンリーシュによって前記デキストラン鎖に結合している、請求項9に記載の化合物。
【請求項１３】
前記スズ-117mが、アミンリーシュによって前記デキストラン鎖に結合したアミノベンジル-DOTAに結合している、請求項9に記載の化合物。
【請求項１４】
前記スズ-117mが非担体添加の高比活性スズ-117mである、請求項13に記載の化合物。
【請求項１５】
前記デキストラン鎖に結合した親水性基を更に含む、請求項9に記載の化合物。
【請求項１６】
前記親水性基がDPTA又はDTPAの二無水物である、請求項15に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関節リウマチ及びある種の癌、特にリンパ節に位置する癌はともに、CD206陽性マクロファージと関連しているため、CD206を発現する。CD206に結合するように設計された放射性医薬品があるが、それらは関節炎又は癌細胞を画像化するのみで、治療上の利益をもたらさない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００２】
【特許文献１】米国特許第6,409,990号
【特許文献２】米国特許第8,257,681号
【特許文献３】米国特許第8,283,167号
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Veraら、(1985) J and UCL-. MED 26: 1157〜1167頁
【非特許文献２】Veraら、(1995) ACAD. RAD IOL. 2: 497〜596頁
【非特許文献３】the Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry: Volume 305、Issue 1 (2015)、99〜108頁(DOI: 10.1007/s10967-015-4031-7)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、関節リウマチ、並びに、癌細胞、特に、リンパ節に典型的に位置する癌細胞が、CD206陽性マクロファージと関連している又はCD206を発現する、ある種の癌を画像化及び治療する方法を提供する。適用は、ヒト及び動物の両方に存在する。
【０００５】
組成物は、スズ-117m標識マンノース結合デキストランアミンである。特に、スズ-117m-イソチオシアナト-ベンジル-DOTAはマンノース結合デキストランアミンに結合することができる。スズ-117mは、ガンマ放射体であり、内部転換電子放出体でもある。ガンマ粒子は、画像化することができる。この内部転換電子は関節リウマチに起因する炎症を低減するのに有効であり、約300ミクロンの距離内にある癌細胞に、これらの細胞に致命的でありうる放射線量を送達する。低線量(すなわち、下記の放射線壊死線量又は非DNA及び非RNA破壊線量(fracturing dose)の10分の1〜100の1)では、これらの内部転換電子による細胞アポトーシスホルミシス効果が認められており、リウマチ及び癌の状態に適用可能である。本発明は、以下の詳細な説明によって更に理解されよう。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明の組成物は、マンノース及びデキストランの種々のアミン基に結合したスズ-117mの両方を有する、アミン修飾デキストラン鎖である。アミン修飾デキストランは、より詳細には、米国特許第6,409,990号に開示されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。これはまた、MANOCEPT(登録商標)の商標で市販されている。デキストランは細菌由来の天然産物である。デキストランは高分子量形態で単離され、制御しながら加水分解及び精製することによって、例えば1000;10,000;40,000;70,000;110,000;150,000及び500,000等の種々のより小さい分子量にすることができる。列挙された各分子量種は、本発明で使用することができ、それぞれは、所与の適用に多かれ少なかれ適切な効果を有し得る。腫瘍の画像化及び治療のためには、アミンリーシュ(leash)のコンジュゲーション後に、50〜70キロダルトンの最終分子量を有すると思われるサイズのデキストランを選択するであろう。関節リウマチ及び癌の治療に使用するのに適した他の分子量としては、10kDa;15kDa;20kDa;30kDa;40kDa;50kDa及びそれ以上が挙げられる。ある特定の範囲は10kDa〜30kDaである。市販のアミン修飾デキストランは、約14kDaの分子量を有する。
【０００７】
デキストラン分子は、多数の利用可能なヒドロキシル基を有する。デキストランのサイズにもよるが、数百になることもある。アミン基は、例えば臭化アリルによる活性化によって、デキストランのヒドロキシル基に結合される。次いで、米国特許第6,409,990号に更に記載されているように、アリル基をアミノエタンチオール及びDMSOと反応させて、アミン末端を有するリーシュを生成する。次いで、この化合物を、スズ-117m及びマンノースと合わせて、本発明で使用するための組成物を形成することができる。
【０００８】
スズ-117mは、担体添加の又は非担体添加のスズ-117mであり得る。更に、それは、高比活性スズ-117m及び低比活性スズ-117mであり得る。高比活性のスズ-117mは、一般に少なくとも1グラムあたり100Ci、好ましくは1グラムあたり少なくとも1000Ci又は1グラムあたり10,000Ci又は1グラムあたり15,000Ci又は1グラムあたり20,000Ci又はそれ以上の活性を有するスズ-117mである。以下に記載するように、一般に高比活性非担体添加スズ-117mが本発明において利用されるが、特定の適用においては、担体添加の低比活性スズ-117mを使用することができる。
【０００９】
非担体添加スズ-117mは、高エネルギー陽子入射核反応によってアンチモンを非担体添加スズ-117mに変換することにより、サイクロトロンのような加速器中で調製することが可能である。米国特許第8,257,681号に記載されているように、カドミウム116をアルファ粒子ビームに曝露することによっても、非担体添加スズ-117mを得ることができ、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。これにより、好ましくは1グラム当たり100〜1000キュリー又はそれ以上を有する高比活性のスズ-117mの形成が可能になる。現在の方法は20,000Ci/gを提供する。
【００１０】
このスズ標識デキストランは、最初にマンノース分子をデキストラン鎖に結合させることによって形成される。次に、アミノベンジル-DOTAを高比活性スズ-117mと合わせる。スズ-117m錯化アミノベンジル-DOTAをマンノース修飾デキストラン鎖と反応させて、本発明の画像化/治療剤を形成する。
【００１１】
マンノースのアミノデキストランへの化学的結合は、いくつかの異なる方法、例えば、ヒト血清アルブミンへの結合について記載されている方法(Veraら、(1985) J and UCL-. MED 26: 1157〜1167頁)、及び2つのポリリシンへの結合について記載されている方法(Veraら、(1995) ACAD. RAD IOL. 2: 497〜596頁)によって、達成することができる。スズ標識デキストランへのマンノースの結合の具体例は、下記の実施例に開示されている。一般に、このような反応では、利用可能なアミンリーシュのうちのすべてより少ないものがマンノース基に連結され、他の未反応のアミンリーシュは、スズ錯体及び他の化合物に結合するために利用可能なままである。
【００１２】
スズ-117m錯化アミノベンジル-DOTAの形成は、Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry: Volume 305、Issue 1 (2015)、99〜108頁(DOI: 10.1007/s10967-015-4031-7)並びにその開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第8,283,167号に、更に開示されている。示されているように、スズは、担体添加又は非担体添加、高比活性又は低比活性であり得るが、以下に開示されるように、米国特許第8,257,681号に記載された方法によって形成された高比活性非担体添加スズ-117mが本発明では使用される。
【００１３】
ある種の実施形態において、スズマンノース結合デキストランを、肝臓への取り込みを減少させる電荷含有基と更に反応させる。放射性医薬品に使用するのに適した任意の荷電分子を、本発明に用いることができる。特に、例えばジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)等の酸又はエステルを含有する組成物が特に適している。DTPA修飾デキストランは、最初にDTPAをイソブチルクロロホルメートで活性化することによって形成することができる。これは、-30℃で、アセトニトリル中で実施する。活性化したDTPAを約4℃で重炭酸塩溶液とともにアミノ末端デキストランにゆっくりと添加する。この溶液を室温で一晩撹拌する。5倍の交換体積の重炭酸塩緩衝液、続いて5倍の交換体積の脱イオン水で生成物の広域ダイアフィルトレーションを行った後、保持液を濃縮し、凍結乾燥させる。電荷含有分子(DTPA)は、デキストラン分子上の未反応のアミンリーシュに結合する。或いは、DTPAの二無水物も同様の方法で使用することができる。更に、最終構築物の血液中の残存率を高めるために、ポリマー中のアミン基の一部をポリエチレングリコール等のポリエーテルで誘導体化することを用いて、親水性を高めることができるであろう。
【００１４】
本発明の化合物は、食塩水等の適切な担体に担持された本発明の化合物を哺乳動物に注射することにより、CD206を発現する関節炎又は癌を治療するために利用される。スズ-117mには、2つの可能な線量レジメンがある。第1は、DNA細胞を破壊してアポトーシスを引き起こすことを意図した線量である。一般に、そのような線量は、約0.05ミリキュリー〜40mCi、一般には1mCi〜10mCiである。これは静脈内、関節内、皮下、リンパ内及び髄腔内に注射することができ、必要に応じて定期的に繰り返すことができる。この組成物は、必要に応じて約1ヶ月間隔で再注射することができる。
【００１５】
更に、本発明の化合物は、ホルミシス線量で投与することができる。ホルミシス線量は、哺乳動物の免疫応答を活性化して、影響を受ける細胞のアポトーシスに影響を与えるのに十分低い線量となるように設計される。一般に、ホルミシス線量は、通常の線量の1/10〜1/100であり、一般に、約0.0005マイクロキュリー〜約2mCi又は1mCi未満、より典型的には約0.005mCi〜約4mCi(投与方式に依存して)である。本発明は、慢性関節炎の連続治療のために投与することもできる。これは静脈内、関節内、皮下、リンパ内及び髄腔内に投与することができる。本発明は、以下の詳細な実施例によって更に理解されよう。
【００１６】
試薬:
すべての水溶液は、社内の脱イオン水を利用して調製した。重炭酸ナトリウムは、Sigma Aldrich社製の純度99.0〜100.5%のものであった。使用した重炭酸ナトリウムは、Sigma Aldrich社製のACSレベル≧99.5%の試薬であった。1分子あたり31個のNH2基を有する分子量14kDaのデキストラン-アミンは、Reliable Pharmaceutical社から入手した。シアノメチル-2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-1-チオ-β-D-マンノース(CNM-チオマンノース)は、Reliable Pharmaceutical社から入手した。使用したメタノールは、Fisher Scientific社製のACS認定  99.9%純度のものであり、Acros Organics社製の4オングストローム、8〜12メッシュモレキュラーシーブとともに貯蔵した。使用したナトリウムメトキシドは、Acros Organics社製の、メタノール溶液中0.5Mの純度滴定液グレードであった。グリシンは、Sigma Life Science社製の純度99%のReagent Plusであった。グリシン標準溶液は、脱イオン水から調製し、完全性を維持するために使用と使用との間には凍結させた。メタノール溶液中の2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBSA)5%w/vは、Thermo Scientific社から入手した。
【実施例１】
【００１７】
合成:
マンノースコンジュゲーション。イミデートカップリングを利用して、デキストラン-アミンをマンノースとコンジュゲートさせた。この反応の準備のために、0.0772gのCNM-チオマンノースを、20時間、窒素雰囲気下室温(約22℃)で乾燥メタノール10ml中のナトリウムメトキシド(0.5M)0.4mlで脱アセチル化した。この脱アセチル化は、撹拌のために適度な速度で回転するBuchi Rotavapor R-200において50ml丸底フラスコ中で行った。脱アセチル化完了後、イミデートカップリング工程の直前に、メタノールを真空除去した。次いで、0.05M炭酸ナトリウム/重炭酸ナトリウム緩衝液6mlに溶解した0.0480gのデキストラン-アミンを添加することによって、カップリング反応を直ちに開始した。この混合物を室温(約22℃)で22時間反応させ、再びRotavaporにおいて回転させて撹拌した。完了時に、生成物の72%をAmicon(登録商標)Ultra-15遠心フィルター装置(10,000NMWL)に移し、5mlの交換体積の脱イオン水を用いて5000rpmで50分間透析した。これを更に2回繰り返した。濃縮物を脱イオン水で戻し、総質量1.9936gとし、標準としてグリシンを使用する2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBSA)アッセイによってアミン密度について分析し、マンノースカップリングの程度を決定した。更に、比較目的のために、元のデキストラン-アミンコンジュゲートのサンプルをアミン密度について分析した。
【００１８】
マンノースコンジュゲーション分析。マンノースコンジュゲーションのレベルを決定するために、反応の前後にデキストラン-アミンポリマーの遊離アミン基の数を測定した。グリシンを用いて、TNBSA1を利用した比色法による校正を行った。5つの異なるグリシン濃度サンプル及びブランクを使用して、R2=0.9957の相関係数を有する検量線を得た。非カップリングデキストランアミン及びマンノースカップリングデキストランアミン材料の分析は、アミン部位の平均48.4%がマンノースとコンジュゲートされていることを示した。Table 1(表1)は、このデータをまとめたものである。
【００１９】
【表１】
2018528235.tif 000002
【実施例２】
【００２０】
放射線標識:
高比活性Sn-117mを二官能性キレート剤アミノベンジル-DOTAでキレート化した。最初に、4MのHCl中のSn-117m(約1〜2mCi)の溶液をマイクロ波管に入れ、管に目に見える体積がなくなるまで窒素でパージしながら加熱した。キレート化は、20モル過剰のアミノベンジルDOTAをSnに添加することによって達成された。管を密閉し、次いで140℃で15分間加熱した。冷却後、形成されたSn-117m-ABDを、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって精製した。生成物のピークを集めて処理し、体積を約0.5MLまで減少させた。これを0.2μLの純粋な(neat)チオホスゲンで処理し、1分後にジメチルエーテルで4回抽出して、未反応のチオホスゲンを除去した。同じHPLC法を使用して、アミンのイソチオシアネートへの転換を示した。放射性ピークの保持時間は4分から17分にシフトした。
【００２１】
マンノース結合デキストランアミンを、Sn-117mキレートに対して5:1モル過剰で合わせ、pHを9から9.2に調整した。溶液を37℃で90分間静置した。重力落下型6,000分子量サイズ排除カラムを用いて精製を行った。早期に溶出する生成物のピークと、カラムによってより多く保持された低分子量不純物とのベースライン分離があった。このプロセスを用いた収率は、典型的には30〜60%の範囲であった。
【実施例３】
【００２２】
生体内分布:
生体内分布の準備。イソフルラン麻酔下の8匹の雄性BALB/cマウスの右後肢の腓腹筋に、1/3ccインスリン注射器を用いてそれぞれ20μLのテレビン油を注射した。マウスは、注射した脚に印をつけて、群飼育で保持した。24時間後、マウスをオープンシリンダー中に拘束し、1/3ccインスリン注射器を用いて、上記で調製したSn-117m組成物20μLを外側尾静脈にそれぞれ注射した。マウスを、ワイヤーメッシュ底部の下に吸収紙を有するケージに、個別に収容した。
【００２３】
マウスを4つの群に分けた。第1群は、注射の2時間後に、他の群は、注射の24時間後に屠殺した。蓄積した糞便と尿を含む収集されたすべての吸収紙とともに、収集された組織及びサンプルは、血液、心臓、肺、左大腿部(left femur)、左大腿筋(left thigh muscle)、肝臓、脾臓、腎臓、小腸、大腸、胃、尾、膿瘍、死骸の残部及び膀胱であった。死骸の残部は、筋骨格構造、生殖器官、皮膚、頭部及び四肢からなる。次いで、サンプルをNaI結晶中で1分間計数した。
【００２４】
別の8匹の雄のBALB/cマウスを用いて、第2の実験を行った。これらのマウスをイソフルラン麻酔下に置き、それぞれ、1/3ccのインスリン注射器を用いて右後肢の腓腹筋に20μLのテレビン油を注射した。マウスは、注射した脚に印をつけて、群飼育で保持した。24時間後、マウスをオープンシリンダー中に拘束し、それぞれ、1/3ccインスリン注射器を用いて、20μLのTc-99m標識マンノース修飾デキストランを外側尾静脈に注射した。マウスを、ワイヤーメッシュ底部の下に吸収紙を有するケージに、個別に収容した。
【００２５】
マウスを4つの群に分けた。第1群は、注射の2時間後に、他の群は、注射の24時間後に屠殺した。蓄積した糞便と尿を含む収集されたすべての吸収紙とともに、収集された組織及びサンプルは、血液、心臓、肺、左大腿部(left femur)、左大腿筋(left thigh muscle)、肝臓、脾臓、腎臓、小腸、大腸、胃、尾、膿瘍、死骸の残部及び膀胱であった。死骸の残部は、筋骨格構造、生殖器官、皮膚、頭部及び四肢からなる。次いで、サンプルをNaI結晶中で1分間計数した。
【００２６】
【表２】
2018528235.tif 000003
【００２７】
【表３】
2018528235.tif 000004
【００２８】
【表４】
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【００２９】
【表５】
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【００３０】
Sn-117m標識マンノース修飾デキストランの生体内分布を、Tc-99m標識マンノース修飾デキストランの生体分布と比較した。両方の場合において、膿瘍対正常筋肉比はほぼ同じであり、両方の構築物が類似の生物活性を有することを示した。Sn標識物質は、肝臓に、Tc構築物よりも有意に多く取り込まれていた。Sn標識物質には、結合したキレート剤がより少なく、すべてのキレーターが、それらを中性に帯電させるSn(IV)を有していた。Tc生成物の場合、おそらくTcに過剰のDTPAが存在し、分子の負電荷に添加する、4個のカルボン酸基を有する有意により多くのキレーター(DTPA)をもたらす。したがって、Sn構築物は分子上の電荷がより少なく、おそらくこのことによりキレーターが肝臓によって血液から排除される。肝臓が浄化する速度をコントロールするために、これに限定されるものではないが、DTPA等の荷電分子を、ポリマーに単に添加することによって、生成物を修飾することができる。ポリマーにDTPA官能基(又は別の荷電基)を添加することによって、生物学的特性は、Tc構築物により近いものに改変するはずである。或いは、ポリマー中のいくつかのアミン基をポリエチレングリコール等のポリエーテルで誘導体化すれば、親水性を高め、最終構築物の血液中の残存率を高めることができるであろう。
【００３１】
上記に基づいて、スズ-117m標識マンノース修飾デキストランは、CD206タンパク質を発現する細胞の位置を特定することは明らかである。したがって、一度そのような細胞に結合すると、スズ-117mは、関節炎又は癌(又はその両方)を画像化するために使用することができるだけでなく、炎症を低減し、実際には、関節炎及び/又は癌を治療するように作用する。スズ-117mは約300μm移動する内部転換電子を放出する。したがって、強力なアルファ放射体のような他の放射性化合物とは異なり、標的細胞だけを破壊し、近接する健康な細胞には影響を与えない。非常に低い線量のスズ-117m化合物を投与することができる。これは、疾患の治療に有効であるが、おそらく体内の免疫系を高めることにより、関節炎又は癌細胞への攻撃を促進する、ホルミシス線量である。より高い線量は細胞を直接破壊する。しかし、スズ-117mは14日半減期を有するので、数週間後には、より高いスズ-117mの線量は、ホルミシス線量まで減衰する。このように、単一の治療が、細胞を直接破壊し、かつホルミシスを開始させるという両方のやりかたで、疾患を治療するように作用することができる。
【００３２】
これは、本発明を実施する好ましい方法とともに、本発明の説明であった。しかしながら、本発明自体は添付の特許請求の範囲によってのみ規定されるべきである。
【国際調査報告】
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