(57)【要約】  本開示は、特に、特異的グリコシル化パターンを有する組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質に関する。本開示は、特に、ＣＨＯ細胞から作製される組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質に関する。本開示はまた、これらのタンパク質の使用方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．１ｍｍｏｌ／ｍｏｌ未満のＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）、
０．０２ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、
または
全グリカンの約９９％超である中性グリカンの割合、
の構造的特徴のうちの１つ以上を有する、組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質は、
検出可能なＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）を含まないこと、
検出可能なＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含まないこと、
または
全グリカンの約９９％超である中性グリカンの割合、
の構造的特徴のうちの１つ以上を有する、請求項１に記載の組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質。
【請求項３】
チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞でエクリズマブタンパク質またはエクリズマブ変異体タンパク質を発現させることが可能な発現ベクターを担持する前記ＣＨＯ細胞で産生される、組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質。
【請求項４】
前記発現ベクターは、前記ＣＨＯ細胞で前記エクリズマブタンパク質または前記エクリズマブ変異体タンパク質を発現させるために誘導的である、請求項３に記載の組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質。
【請求項５】
前記発現ベクターは、前記ＣＨＯ細胞で前記エクリズマブタンパク質または前記エクリズマブ変異体タンパク質を発現させるために構成的である、請求項３に記載の組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質。
【請求項６】
０．１ｍｍｏｌ／ｍｏｌ未満のグリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）、
０．０２ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、
または
全グリカンの約９９％超である中性グリカンの割合、
の構造的特徴のうちの１つ以上を有する、請求項３〜５のいずれか一項に記載の組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質。
【請求項７】
前記タンパク質は、
検出可能なＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）を含まないこと、
検出可能なＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含まないこと、
または
全グリカンの約９９％超である中性グリカンの割合、
の構造的特徴のうちの１つ以上を有する、請求項３〜６のいずれか一項に記載の組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質。
【請求項８】
前記ＣＨＯ細胞は、いずれの動物由来原料も含まない組織培養培地で培養される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質。
【請求項９】
チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞でエクリズマブタンパク質またはエクリズマブ変異体タンパク質を発現させることが可能な発現ベクターを担持する、前記ＣＨＯ細胞。
【請求項１０】
前記発現ベクターは、前記ＣＨＯ細胞で前記エクリズマブタンパク質または前記エクリズマブ変異体タンパク質を発現させるために誘導的である、請求項９に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項１１】
前記発現ベクターは、前記ＣＨＯ細胞で前記エクリズマブタンパク質または前記エクリズマブ変異体タンパク質を発現させるために構成的である、請求項９に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項１２】
前記ＣＨＯ細胞は、いずれの動物由来原料も含まない組織培養培地で培養される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項１３】
請求項１または請求項３に記載の組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、または腹腔内投与のために製剤化される、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記組換えエクリズマブタンパク質または前記組換えエクリズマブ変異体タンパク質の濃度は、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬであるが、１００ｍｇ／ｍＬ以下である、１３〜１４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
生体試料における末端補体の形成を阻害するための方法であって、前記方法は、生体試料を前記生体試料中で末端補体を阻害するのに効果的な量の治療薬と接触させることを含み、前記生体試料は、前記治療薬の非存在下で末端補体の産生が可能であり、前記治療薬は、請求項１または請求項３に記載の組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質である、方法。
【請求項１７】
エクリズマブまたはエクリズマブ変異体を用いた治療を必要とする患者を治療する方法であって、前記患者に請求項１または請求項３に記載の組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質を投与することを含む、方法。
【請求項１８】
前記患者は、補体関連疾患であると診断されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記患者は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（「ＰＮＨ」）、非典型溶血性尿毒症症候群（「ａＨＵＳ」）、または志賀毒素産生大腸菌による溶血性尿毒症症候群（「ＳＴＥＣ−ＨＵＳ」）であると診断されたことがある、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記補体関連疾患は、加齢黄斑変性、移植片拒絶、骨髄拒絶、腎移植片拒絶、皮膚移植片拒絶、心臓移植片拒絶、肺移植片拒絶、肝移植片拒絶、関節リウマチ、肺疾患、虚血再灌流障害、非典型溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、発作性夜間ヘモグロビン尿症、デンスデポジット病、加齢黄斑変性、自然胎児消失、微量免疫型血管炎、表皮水疱症、再発性胎児消失、多発性硬化症、外傷性脳損傷、重症筋無力症、寒冷凝集素症、皮膚筋炎、デゴス病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、Ｉ型糖尿病、乾癬、天疱瘡、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、多巣性運動ニューロパチー、視神経脊髄炎、抗リン脂質抗体症候群、敗血症、出血熱、および難治性抗リン脂質抗体症候群からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の組込み
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。該ＡＳＣＩＩコピーは、２０１６年９月６日に作成され、ＡＬＸＮ３０５ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、１６，１２０バイトの大きさである。
【０００２】
本出願は、免疫学およびバイオテクノロジーの分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
エクリズマブは、炎症促進性応答を誘発する可能性を低減するように、ヒトＩｇＧ２／ＩｇＧ４ハイブリッド定常領域を有するヒト化抗ヒトＣ５モノクローナル抗体（Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）である。エクリズマブは、Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）という商品名を有し、現在、発作性夜間ヘモグロビン尿症（「ＰＮＨ」）および非典型溶血性尿毒症症候群（「ａＨＵＳ」）を治療するために承認されている。また、エクリズマブは、志賀毒素産生大腸菌による溶血性尿毒症症候群（「ＳＴＥＣ−ＨＵＳ」）に罹患する患者に有効であることが最近の治験で示されている。２０１２年１１月３日土曜日のＡｌｅｘｉｏｎ社の報道発表「Ｎｅｗ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｄａｔａ  Ｓｈｏｗ  Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ  （Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標））ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＳＴＥＣ−ＨＵＳ」を参照されたい。
【０００４】
Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する培地でマウス骨髄腫細胞株であるＮＳ０細胞から作製される組換えタンパク質である。ＮＳ０細胞から作製される組換えエクリズマブは、タンパク質の機能に影響を及ぼし得る特異的グリコシル化パターンを有する。現在のプロセスは、動物性材料（ウシ血清アルブミン、またはＢＳＡ）を含有する培地とともに１０，０００および２０，０００Ｌの撹拌タンクバイオリアクターを使用する。ロットごとの変動性も見られる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示は、０．１ｍｍｏｌ／ｍｏｌ未満のグリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）、０．０２ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、または全グリカンの約９９％超である中性グリカンの割合、の構造的特徴のうちの１つ以上を有する組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質を提供する。
【０００６】
別の態様において、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞が提供される：この細胞は、そのＣＨＯ細胞でエクリズマブタンパク質またはエクリズマブ変異体タンパク質を発現させることが可能な（または発現させる）発現ベクターを担持する。
【０００７】
別の態様において、組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質が提供される：組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞でエクリズマブタンパク質またはエクリズマブ変異体タンパク質を発現させることが可能な（または発現させる）発現ベクターを担持するＣＨＯ細胞で産生される。
【０００８】
別の態様において、生体試料における末端補体の形成を阻害する方法が提供され、該方法は、生体試料を生体試料中で末端補体を阻害するのに効果的な量の治療薬と接触させることを含み、生体試料は、治療薬の非存在下で末端補体の産生が可能であり、治療薬は、本明細書に開示される組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質である。
【０００９】
別の態様において、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体を用いた治療を必要とする患者を治療する方法であって、前記患者に本明細書に開示される組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質を投与することを含む方法が提供される。
【００１０】
本開示のこれらおよび他の態様に従って多数の他の態様が提供される。本開示の他の特徴および態様は、詳細な説明および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
本明細書で使用される場合、名詞の前の「１つの（ａ）」または「複数の（ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）」という語は、１つ以上の特定の名詞を表す。例えば、「１つの哺乳動物細胞（ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ）」という表現は、「１つ以上の哺乳動物細胞」を表す。
【００１２】
用語「例えば」および「等」、ならびにそれらの文法的均等物には、明示的にそうではないという記載のない限り、「限定されない」という表現が続くものと理解されたい。本明細書で使用される場合、用語「約」は、実験誤差に起因する変動を考慮することが意図される。本明細書において報告される全ての測定値は、明示的にそうではないという記載のない限り、該用語が明示的に使用されているか否かにかかわらず、用語「約」によって修飾されるものと理解されたい。
【００１３】
用語「組換えタンパク質」は、当該技術分野で既知である。組換えタンパク質は、糖タンパク質であり得る。例えば、ＣＨＯ細胞で作製されるエクリズマブまたは組換えエクリズマブ変異体は、グリコシル化され、糖部分が共有結合によりタンパク質上に付着しており、糖タンパク質である。端的に述べると、用語「組換えタンパク質」は、細胞培養システムを使用して製造され得るタンパク質を指すことができる。細胞培養システム内の細胞は、例えば、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞、ＣＨＯ細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または細菌細胞に由来し得る。一般に、細胞培養中の細胞は、対象とする組換えタンパク質をコードする導入された核酸を含有する（核酸は、プラスミドベクター等のベクター上に担持され得る）。また、組換えタンパク質をコードする核酸は、タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された異種プロモーターも含有し得る。
【００１４】
用語「哺乳動物細胞」は、当該技術分野で既知であり、例えば、ヒト、ハムスター、マウス、ミドリザル、ラット、ブタ、ウシ、ハムスター、またはウサギを含む任意の哺乳動物からのまたはそれらに由来する任意の細胞を指すことができる。哺乳動物細胞は、不死化細胞、分化細胞、または未分化細胞であり得る。
【００１５】
用語「液体培養培地」は、当該技術分野で既知である。端的に述べると、これは、哺乳動物細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長または増殖させるのに十分な栄養素を含む流体を意味する。例えば、液体培養培地は、以下の１つ以上を含むことができる：アミノ酸（例えば、２０個のアミノ酸）、プリン（例えば、ヒポキサンチン）、ピリミジン（例えば、チミジン）、コリン、イノシトール、チアミン、葉酸、ビオチン、カルシウム、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チミジン、シアノコバラミン、ピルベート、リポ酸、マグネシウム、グルコース、ナトリウム、カリウム、鉄、銅、亜鉛、および重炭酸ナトリウム。いくつかの実施形態において、液体培養培地は、哺乳動物からの血清を含むことができる。いくつかの実施形態において、液体培養培地は、哺乳動物からの血清または別の抽出物を含まない（定義された液体培養培地）。いくつかの実施形態において、液体培養培地は、微量金属、哺乳類成長ホルモン、および／または哺乳類成長因子を含むことができる。液体培養培地の別の例として、最少培地（例えば、無機塩、炭素源、および水のみを含む培地）が挙げられる。液体培養培地の例は当該技術分野で既知であり、市販されている。液体培養培地は、任意の密度の哺乳動物細胞を含んでもよい。例えば、バイオリアクターから除去されるある体積の液体培養培地は、哺乳動物細胞を実質的に含まなくてもよい。
【００１６】
用語「無血清液体培養培地」は、当該技術分野で既知である。端的に述べると、これは、哺乳動物の血清を含まない液体培養培地を意味する。
【００１７】
用語「血清含有液体培養培地」は、当該技術分野で既知である。端的に述べると、これは、哺乳動物の血清（ＢＳＡ等）を含む液体培養培地を意味する。
【００１８】
用語「化学的に定義された液体培養培地」は、専門用語であり、化学成分の全てが既知である液体培養培地を意味する。例えば、化学的に定義された液体培養培地は、ウシ胎仔血清、ウシ血清アルブミン、または血清アルブミンを含まないが、それは、これらの調製物が典型的にアルブミンと脂質との複雑な混合物を含むためである。
【００１９】
用語「無タンパク質液体培養培地」は、当該技術分野で既知であり、いずれのタンパク質も（例えば、いずれの検出可能なタンパク質も）含まない液体培養培地を意味する。
【００２０】
用語「連続プロセス」は、当該技術分野で既知であり、組換えタンパク質（例えば、本明細書に記載される組換えタンパク質のいずれか）を含有する培養培地から原薬（例えば、組換えタンパク質を含有する原薬）を生成するためのシステムの少なくとも一部を通して連続的に流体を供給するプロセスを意味する。例えば、組換え治療タンパク質（例えば、組換えヒトα−ガラクトシダーゼ−Ａタンパク質）を含む液体培養培地は、システムが作動している間は連続的にシステムに供給され、治療タンパク質原薬は、システムから送出される。連続プロセスを行うために使用することができるそのようなシステムの非限定的な例は、米国仮特許出願第６１／８５６，９３０号および同第６１／７７５，０６０号に記載されている。
【００２１】
用語「灌流培養」は、当該技術分野で既知であり、第１の液体培養培地において複数の細胞（例えば、哺乳動物細胞）を培養することを意味し、培養は、第１の液体培養培地を定期的または連続的に除去し、同時にまたはその直後に、実質的に同じ体積の第２の液体培養培地を容器（例えば、バイオリアクター）に添加することを含む。いくつかの例において、培養期間中の増分期間（例えば、約２４時間の期間、約１分〜約２４時間の期間、または２４時間を超える期間）にわたって除去または添加される第１の液体培養培地の体積（例えば、１日の培養培地再供給速度）に増分変化（例えば、増加または減少）が見られる。毎日除去され、置き換えられる培地の割合は、培養される特定の細胞、初期播種密度、および特定の時点における細胞密度に応じて変化し得る。「ＲＶ」または「リアクター体積」は、培養プロセスの初期に存在する培養培地の体積（例えば、播種後に存在する培養培地の全体積）を意味する。灌流培養を行うために使用することができるバイオリアクターは、当該技術分野で既知である。当業者は、バイオリアクターを灌流培養において使用するように適合させる（例えば、灌流バイオリアクターとして適合させる）ことができることを理解するであろう。
【００２２】
用語「フェドバッチ培養」は、専門用語であり、第１の液体培養培地において複数の細胞（例えば、哺乳動物細胞）を培養することを意味し、容器（例えば、バイオリアクター）内に存在する細胞の培養は、細胞培養から第１の液体培養培地または第２の液体培養培地を実質的にまたは有意に除去することなく、第１の液体培養培地に第２の液体培養培地が定期的または連続的に添加されることを含む。第２の液体培養培地は、第１の液体培養培地と同じであってもよい。フェドバッチ培養のいくつかの例において、第２の液体培養培地は、第１の液体培養培地の濃縮された形態である。フェドバッチ培養のいくつかの例において、第２の液体培養培地は、乾燥粉末として添加される。当業者は、バイオリアクターをフェドバッチ培養において使用するように適合させる（例えば、フェドバッチバイオリアクターとして適合させる）ことができることを理解するであろう。
【００２３】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載されるが、当該技術分野で既知の他の好適な方法および材料もまた使用され得る。材料、方法、および例は、説明的であるに過ぎず、限定的であることを意図するものではない。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、参照によりそれら全体が組み込まれる。矛盾がある場合、定義を含めて本明細書が優先する。
【００２４】
特定の態様において、組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質が提供される。タンパク質は、０．１ｍｍｏｌ／ｍｏｌ未満のグリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）、０．０２ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質未満のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、または全グリカンの約９９％超である中性グリカンの割合、の構造的特徴のうちの１つ以上を有する。特定の実施形態において、タンパク質は、検出可能なＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）を含まないこと、検出可能なＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含まないこと、または全グリカンの約９９％超である中性グリカンの割合、の構造的特徴のうちの１つ以上を有する。
【００２５】
他の態様において、組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質が提供される：該タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞でエクリズマブタンパク質またはエクリズマブ変異体タンパク質を発現させることが可能な（または発現させる）発現ベクターを担持する前記ＣＨＯ細胞で産生される。発現ベクターは、ＣＨＯ細胞でエクリズマブタンパク質またはエクリズマブ変異体タンパク質を発現させるために構成的または誘導的のいずれかであり得る。特定の実施形態において、組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質は、０．１ｍｍｏｌ／ｍｏｌ未満のグリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）、または全グリカンの約９９％超である中性グリカンの割合、の構造的特徴のうちの一方または両方を有する。
【００２６】
他の態様において、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞が提供され、該細胞は、前記ＣＨＯ細胞でエクリズマブタンパク質またはエクリズマブ変異体タンパク質を発現させることが可能な（または発現させる）発現ベクターを担持する。発現ベクターは、ＣＨＯ細胞でエクリズマブタンパク質またはエクリズマブ変異体タンパク質を発現させるために構成的または誘導的のいずれかであり得る。
【００２７】
他の態様において、薬学的組成物が提供され、該組成物は、本明細書に開示される組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む。薬学的組成物は、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、または腹腔内投与のために製剤化され得る。特定の実施形態において、薬学的組成物は、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬであるが、１００ｍｇ／ｍＬ以下である組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質を含む。特定の実施形態において、薬学的組成物は、１００ｍｇ／ｍＬを超える組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質を含む。
【００２８】
さらに他の態様において、生体試料における末端補体の形成を阻害するための方法が提供され、該方法は、生体試料を生体試料中で末端補体を阻害するのに効果的な量の治療薬と接触させることを含み、生体試料は、治療薬の非存在下で末端補体の産生が可能であり、治療薬は、本明細書に開示される組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質である。
【００２９】
エクリズマブまたはエクリズマブ変異体を用いた治療を必要とする患者を治療する方法であって、前記患者に本明細書に開示される組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質を投与することを含む方法。
【００３０】
ＣＨＯ細胞株は、当該技術分野で周知である。ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞株への言及は、任意のＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞株、およびＣＨＯ突然変異細胞、例えば、ＣＨＯグリコシル化突然変異を含む、ＣＨＯ細胞の任意の誘導体を指す。例えば、Ｊａｙａｐａｌ  Ｋ．Ｐ．，Ｗｌａｓｃｈｉｎ  Ｋ．Ｆ．，Ｙａｐ  Ｍ．Ｇ．Ｓ．，Ｈｕ  Ｗ−Ｓ．，（２００７），“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｒｏｍ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ  −  ２０  ｙｅａｒｓ  ａｎｄ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ．”Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｐｒｏｇ．１０３（１０）：４０−４７を参照されたく、またＮｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｖｏｌ．２８５，Ｎｏ．８，ｐｐ．５７５９−５７７５，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９，２０１０も参照されたい。
【００３１】
ＣＨＯ細胞は、任意の手段によって任意の培地で培養することができる。特定の実施形態において、ＣＨＯ細胞は、液体培養培地で培養される。特定の実施形態において、ＣＨＯ細胞は、例えばＢＳＡ等のいずれの動物由来原料も含まない液体培養培地で培養される。特定の実施形態において、ＣＨＯ細胞は、化学的に定義された液体培養培地または無タンパク質液体培養培地で培養される。特定の実施形態において、ＣＨＯ細胞は、連続プロセスによって培養される。特定の実施形態において、ＣＨＯ細胞は、フェドバッチ培養によってまたは灌流培養によって培養される。ＣＨＯ細胞は、単層培養および懸濁培養において培養され得る。
【００３２】
エクリズマブおよびその変異体はヒト化抗ヒト−Ｃ５抗体であるのに対し、ＣＨＯ細胞はハムスター細胞であるため、組換えエクリズマブタンパク質または組換えエクリズマブ変異体タンパク質は、ＣＨＯ細胞によって通常産生されるタンパク質ではない。
【００３３】
エクリズマブは、炎症促進性応答を誘発する可能性を低減するように、ヒトＩｇＧ２／ＩｇＧ４ハイブリッド定常領域を有するヒト化抗ヒトＣ５モノクローナル抗体（Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）である。エクリズマブは、Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）という商品名を有し、現在、発作性夜間ヘモグロビン尿症（「ＰＮＨ」）および非典型溶血性尿毒症症候群（「ａＨＵＳ」）を治療するために承認されている。発作性夜間ヘモグロビン尿症は、溶血性貧血の一形態であり、補体調節タンパク質ＣＤ５９およびＣＤ５５が存在しないことに起因して血管内溶血が顕著な特徴である。ＣＤ５９は、例えば、末端補体複合体の形成をブロックするように機能する。ＡＨＵＳは、慢性的に制御されない補体活性化に関与し、特に、血栓性微小血管症の抑制、全身の小血管における血栓形成、および急性腎不全をもたらす。エクリズマブは、ヒトＣ５タンパク質に特異的に結合し、強力な炎症促進性タンパク質Ｃ５ａの産生の形成をブロックする。エクリズマブは、末端補体複合体の形成をさらにブロックする。エクリズマブによる治療は、ＰＮＨに罹患する患者の血管内溶血を減少させ、ａＨＵＳにおける補体レベルを低下させる。例えば、Ｈｉｌｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００４；３５０：５５２−９、Ｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００７；２５（１１）：１２５６−１２６４、Ｈｉｌｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００６，３５５；１２，１２３３−１２４３、Ｚｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ８，６４３−６５７（２０１２）｜ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｎｅｐｈ．２０１２．２１４、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ２０１２／０２３７５１５、およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｕｍｂｅｒ６，３５５，２４５を参照されたい。また、エクリズマブは、志賀毒素産生大腸菌による溶血性尿毒症症候群（「ＳＴＥＣ−ＨＵＳ」）に罹患する患者に有効であることが最近の治験で示されている。２０１２年１１月３日土曜日のＡｌｅｘｉｏｎ社の報道発表「Ｎｅｗ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｄａｔａ  Ｓｈｏｗ  Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ  （Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標））  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＳＴＥＣ−ＨＵＳ」を参照されたい。ＳＴＥＣ−ＨＵＳは、全身性の補体媒介性血栓性微小血管症および急性重要臓器障害によって特徴付けられる。これらの患者に対するエクリズマブの投与は、血栓性微小血管症の迅速かつ持続的な改善、および全身臓器の合併症の改善をもたらした。明らかであるように、ＰＮＨ、ａＨＵＳ、およびＳＴＥＣ−ＨＵＳは全て、不適切な補体活性化に関連する疾患である。例えば、Ｎｏｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０１２  Ｎｏｖ；８（１１）：６２２−３３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｎｅｐｈ．２０１２．１９５．Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｓｅｐ  １８、Ｈｉｌｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００４；３５０：６，５５２−９、Ｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．���Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００７；２５（１１）：１２５６−１２６４、Ｈｉｌｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００６，３５５；１２，１２３３−１２４３、Ｚｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ８，６４３−６５７（２０１２）｜ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｎｅｐｈ．２０１２．２１４を参照されたい。
【００３４】
配列番号１は、エクリズマブの重鎖全体を示し、配列番号２は、エクリズマブの軽鎖全体を示し、配列番号５〜７は、それぞれ、エクリズマブの重鎖のＣＤＲ１〜３を示し、配列番号８〜１０は、それぞれ、エクリズマブの軽鎖のＣＤＲ１〜３を示し、配列番号１１は、エクリズマブの重鎖の可変領域を示し、配列番号１２は、エクリズマブの軽鎖の可変領域を示す。
【００３５】
特定の実施形態において、抗Ｃ５抗体は、エクリズマブに由来する変異体であり、エクリズマブと比較して１つ以上の改善された特性（例えば、改善された薬物動態特性）を有する。変異エクリズマブ抗体（エクリズマブ変異体、変異エクリズマブ等とも称される）またはそのＣ５結合断片は、（ａ）補体成分Ｃ５に結合し、（ｂ）Ｃ５ａの産生を阻害し、Ｃ５の断片Ｃ５ａおよびＣ５ｂへの切断をさらに阻害することができる。変異エクリズマブ抗体は、１０日を超える、または少なくとも１０日（例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４日を超える、または少なくともそれらの日数である）のヒトにおける血清半減期を有することができる。そのような変異エクリズマブ抗体は、米国特許第９，０７９，９４９号に記載されている。例えば、組換えＤＮＡ技術によってエクリズマブ変異体を作製する方法は、当該技術分野で周知である。
【００３６】
特定の実施形態において、エクリズマブ変異体抗体は、配列番号３（重鎖）および配列番号４（軽鎖）、またはその抗原結合断片に示される配列によって定義される抗体である。この抗体は、ヒトＣ５に結合して、Ｃ５ａの形成を阻害するだけではなく、Ｃ５の断片Ｃ５ａおよびＣ５ｂへの切断も阻害し、したがって末端補体複合体の形成を防止する。
【００３７】
用語「エクリズマブ」および「エクリズマブ変異体」は、全抗体ではないＣ５結合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ５結合ポリペプチドは、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体の一本鎖抗体型である。
【００３８】
用語「エクリズマブ」および「エクリズマブ変異体」は、配列番号１および配列番号２、または配列番号３および配列番号４、または上記のいずれかの抗原結合断片に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得るＣ５結合ポリペプチドを含む：ポリペプチドは、配列番号５〜１１に示されるアミノ酸配列のうちの１つ以上を含むことができる。
【００３９】
用語「エクリズマブ」および「エクリズマブ変異体」は、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体を含む融合タンパク質を含む。融合タンパク質は、融合タンパク質をコードする核酸から融合タンパク質が発現されるように遺伝子組み換えすることによって構築され得る。融合タンパク質は、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体とは異種である１つ以上のセグメントを含むことができる。異種配列は、任意の好適な配列、例えば、抗原性タグ（例えば、ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン、赤血球凝集素（「ＨＡ」）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）、またはマルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」））等であり得る。異種配列はまた、診断用マーカーまたは検出可能マーカーとして有用なタンパク質、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）であり得る。いくつかの実施形態において、異種配列は、Ｃ５結合セグメントに、対象とする細胞、組織、または微小環境を標的とさせる標的化部分であり得る。いくつかの実施形態において、標的化部分は、Ｃ３ｂまたはＣ３ｄに結合するヒト補体受容体（例えば、ヒト補体受容体２）または抗体（例えば、一本鎖抗体）の可溶型である。いくつかの実施形態において、標的化部分は、腎特異的抗原等の組織特異的抗原に結合する抗体である。組換えＤＮＡ技術等によってそのような融合タンパク質を構築する方法は、当該技術分野で周知である。
【００４０】
組換えＤＮＡ技術を含む、融合タンパク質（例えば、Ｃ５結合ポリペプチドおよびヒトＣＲ１またはヒトＣＲ２の可溶型を含有する融合タンパク質）を作製するための方法は当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第６，８９７，２９０号、米国特許出願公開第２００５／２６５９９５号、およびＳｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１（１２）：１８７５−１８８５に記載されている。
【００４１】
いくつかの実施形態において、用語「エクリズマブ」および「エクリズマブ変異体」は、二重特異性抗体であるＣ５結合ポリペプチドを含む。二重特異性抗体を産生させるための方法も当該技術分野で既知である。様々な二重特異性抗体の形態が抗体工学の分野で既知であり、二重特異性抗体を作製するための方法は、十分に当業者の認識範囲内である。例えば、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／２７０１１号、Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１、Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９２）１７５：２１７−２２５、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８（５）：１５４７−１５５３、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５２：５３６８、およびＴｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７：６０を参照されたい。任意の他の抗体が、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体を含む二重特異性抗体の一部であり得る。Ｃ３ｂ、Ｃ３ｄ、または肺特異的抗原、眼特異的抗原、および腎特異的抗原に対する抗体は、その例のほんの一部である。
【００４２】
二重特異性抗体はまた、架橋抗体またはヘテロコンジュゲート抗体も含む。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の都合のよい架橋方法を用いて作製されてもよい。好適な架橋方法は、当該技術分野で周知であり、多数の架橋技術とともに米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。米国特許第５，５３４，２５４号は、例えば、ペプチドカプラー、キレート化剤、または化学的もしくはジスルフィドカップリングによって一緒に連結された一本鎖Ｆｖ断片を含む、いくつかの異なる種類の二重特異性抗体について記載している。別の例において、Ｓｅｇａｌ  ａｎｄ  Ｂａｓｔ［（１９９５）Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｓｕｐｐｌ．１４：２．１３．１−２．１３．１６］が、２つの単一特異性抗体を化学的に架橋させることにより二重特異性抗体を形成する方法を記載している。
【００４３】
二重特異性抗体は、リンカー（例えば、ポリペプチドリンカー）によって共有結合的に一緒に繋ぎ止められた２つの異なるｓｃＦｖ断片を含有するタンデム一本鎖（ｓｃ）Ｆｖ断片であり得る。例えば、Ｒｅｎ−Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  １００：１０９５−１１０３およびＫｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ６：６４２−６５１を参照されたい。
【００４４】
いくつかの実施形態において、リンカーは、例えば、Ｇｒｏｓｓｅ−Ｈｏｖｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：６８５８−６８６３に記載されるように、ＣＨ１ドメイン等の重鎖ポリペプチド定常領域の全体または一部を含有することができるか、またはそれらであり得る。いくつかの実施形態において、２つの抗体断片は、例えば、米国特許第７，１１２，３２４号および同第５，５２５，４９１号にそれぞれ記載されるように、ポリグリシン−セリンリンカーまたはポリセリン−グリシンリンカーによって共有結合的に一緒に繋ぎ止めることができる。米国特許第５，２５８，４９８号も参照されたい二重特異性タンデムｓｃＦｖ抗体を産生させるための方法は、例えば、Ｍａｌｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９３：４０９−４１６、Ｈａｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｔｈｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １：３−１５、およびＨｏｎｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １８：６３６−６４４に記載されている。代替として、例えば、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２に記載されているように、抗体は、「直鎖抗体」であってもよい。端的に述べると、これらの抗体は、抗原結合領域の一部を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。
【００４５】
二重特異性抗体はまた、二特異性抗体であってもよい。例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８によって記載される二特異性抗体技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替の機構を提供している。断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つの断片のＶＨおよびＶＬドメインが、別の断片の相補的ＶＬおよびＶＨドメインと強制的に対合させられ、それによって２つの抗原結合部位を形成する。Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：１９２−１９６およびＨｅｌｆｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７６：２３２−２３９も参照されたい。二重特異性一本鎖抗体（「ｓｃＤｂ」）およびｓｃＤｂを産生させるための方法は、例えば、
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ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ４：１１５−１２３、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３：４１−５６、およびＮｅｔｔｌｅｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ３：８８２−８９１に記載されている。
【００４６】
Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５（１１）：１２９０−１２９７に記載されている四価の二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）分子等の、二重特異性抗体の変異形態もまた企図される。ＤＶＤ−Ｉｇ分子は、２つの異なる親抗体からの２つの異なる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、組換えＤＮＡ技術によってタンデムで直接的に連結されるか、または短いリンカーを介して連結され、その後に軽鎖定常ドメインが続くように設計される。２つの親抗体からＤＶＤ−Ｉｇ分子を作製するための方法は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ０８／０２４１８８号および同ＷＯ０７／０２４７１５号にさらに記載されている。また、例えば、米国特許出願公開第２００７／０００４９０９号に記載されている二重特異性形態も包含される。使用され得る別の二重特異性形態は、ＷＯ２０１２／１３５３４５に記載されている４つのドメイン抗体様分子を遺伝子操作するための形態である交差二重可変領域（ＣＯＤＶ−Ｉｇ）である。ＣＯＤＶ−Ｉｇは、Ｃ末端可変ドメイン（内側）における立体障害がＤＶＤ−Ｉｇの構築を妨げる可能性がある場合、二重特異性抗体様分子を遺伝子操作する際に有用であることが示された。
【００４７】
エクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、補体成分Ｃ５を阻害する。具体的には、それらは、Ｃ５ａアナフィラトキシンの産生、または補体成分Ｃ５タンパク質（例えば、ヒトＣ５タンパク質）のｃ５ａおよびＣ５ｂ活性断片の産生を阻害する。したがって、それらは、例えば、Ｃ５ａの炎症促進性効果を阻害し、細胞の表面におけるＣ５ｂ−９膜侵襲複合体（「ＭＡＣ」）の産生、およびそれに続く細胞溶解を阻害する。例えば、Ｍｏｏｎｇｋａｒｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ  １６２：３９７およびＭｏｏｎｇｋａｒｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ  １６５：３２３を参照されたい。
【００４８】
Ｃ５切断の阻害を測定するための好適な方法は、当該技術分野で既知である。例えば、体液中のＣ５ａおよび／またはＣ５ｂの濃度および／または生理活性は、当該技術分野で周知の方法によって測定することができる。Ｃ５ａの濃度または活性を測定するための方法は、例えば、化学走性アッセイ、ＲＩＡ、またはＥＬＩＳＡを含む（例えば、Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｚｖａｉｆｌｅｒ（１９７１）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ５０（３）：６０６−１６およびＷｕｒｚｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｉｎｆｌａｍｍ  ８：３２８−３４０を参照されたい）。Ｃ５ｂには、溶血アッセイ、または当該技術分野で既知の溶解性Ｃ５ｂ−９のためのアッセイを用いることができる。当該技術分野で既知の他のアッセイも用いられ得る。
【００４９】
補体成分Ｃ５の阻害は、対象の体液中における補体の細胞溶解能を低下させることができる。存在する補体の細胞溶解能のそのような低下は、当該技術分野で周知の方法によって、例えば、Ｋａｂａｔ  ａｎｄ  Ｍａｙｅｒ（ｅｄｓ），“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，”１３５−２４０，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＩＬ，ＣＣ  Ｔｈｏｍａｓ（１９６１），ｐａｇｅｓ１３５−１３９によって記載される溶血アッセイ等の従来の溶血アッセイによって、例えば、Ｈｉｌｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５０（６）：５５２に記載されるようなニワトリ赤血球溶血法等のアッセイの従来の変形例によって測定することができる。
【００５０】
発現構築物を含む組換えＣＨＯ細胞を作製する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体をコードする核酸は、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、転写ターミネーターシグナル、ポリアデニル化シグナル、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を含む、転写および翻訳調節配列を含有する発現ベクターに挿入することができる。調節配列は、プロモーター、ならびに転写開始および停止配列を含む。さらに、発現ベクターは、２つの異なる生物中で、例えば、発現のために哺乳動物または昆虫細胞中で、またクローニングおよび増幅のために原核宿主中で維持され得るように、１つより多くの複製系を含むことができる。調節配列は、ＣＨＯ細胞における組換えタンパク質の誘導的発現または構成的発現のいずれかを可能にすることができる。発現構築物は、次いで、当該技術分野で周知の方法、例えば、トランスフェクションおよび電気穿孔等によって、ＣＨＯ細胞に挿入される。
【００５１】
いくつかの可能性のあるベクター系（プラスミドベクター系等）は、当該技術分野で周知であり、ＣＨＯ細胞で核酸からエクリズマブまたはエクリズマブ変異体を発現させるために利用可能である。
【００５２】
発現ベクターは、それに続く核酸の発現に好適な様式で、当該技術分野で周知の方法によってＣＨＯ細胞に導入することができる。いくつかの実施形態において、ベクターおよび／または細胞は、当該技術分野で既知の方法（例えば、Ｓｃｈｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：５１７３−５１７６および米国特許第７，０５６，８９７号を参照されたい）によって、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体の構成的、誘導的、または抑制的な発現のために構成され得る。
【００５３】
エクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、タンパク質の発現を可能にするのに十分な条件下および期間の間、ポリペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換した宿主ＣＨＯ細胞を培養することによって、ＣＨＯ細胞から産生させることができる。そのような構成的または誘導的発現を含むタンパク質発現の条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変化し、日常的な実験を通して当業者によって容易に確認される。例えば、組換えＤＮＡ技術の包括的開示を有するＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  −−３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）を参照されたい。
【００５４】
発現後、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、当業者に既知の様々な様式で単離または精製することができる。
【００５５】
抗体が抗原に結合する（「特異的に結合する」を含む）かどうか、および／または抗原に対する抗体の親和性を決定するための方法は、当該技術分野で既知である。例えば、抗原に対する抗体の結合は、限定されないが、ウェスタンブロット、ドットブロット、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）等の様々な技術を使用して検出および／または定量化することができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｂｅｎｎｙ  Ｋ．Ｃ．Ｌｏ（２００４）“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（ＩＳＢＮ：１５８８２９０９２１）、Ｂｏｒｒｅｂａｅｋ（１９９２）“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，”Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ＮＹ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｋ（１９９５）“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｏｘｆｏｒｄ、Ｊｏｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  １６０：１９１−１９８、Ｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ  Ｂｉｏｌ  Ｃｌｉｎ  ５１：１９−２６、およびＪｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７を参照されたい。
【００５６】
エクリズマブまたはエクリズマブ変異体を作製、同定、精製、修飾等する方法は、当該技術分野で周知である。グリカン含有量およびシアル酸含有量を決定する方法もまた、当該技術分野で既知である。
【００５７】
特定の実施形態において、典型的な治療的処置は、一連の用量を含み、それは通常、所望の臨床結果を得るために必要に応じて調整される投薬レベルを含む臨床エンドポイントの監視と同時に投与される。特定の実施形態において、少なくとも数時間または数日にわたって複数回の投薬で治療が行われる。特定の実施形態において、治療は、少なくとも１週間にわたって複数回の投薬で行われる。特定の実施形態において、治療は、少なくとも１ヶ月にわたって複数回の投薬で行われる。特定の実施形態において、治療は、少なくとも１年にわたって複数回の投薬で行われる。特定の実施形態において、治療は、患者の残りの生涯にわたって複数回の投薬で行われる。
【００５８】
投与頻度も、種々のパラメータに応じて調整することができる。これらは、例えば、臨床応答、体液（例えば、血液、血漿、血清、または滑液）中のエクリズマブまたはエクリズマブ変異体の血漿半減期を含む。投与頻度の調整の指針とするために、治療過程の間、体液中のエクリズマブまたはエクリズマブ変異体のレベルを監視することができる。
【００５９】
特定の実施形態において、投薬（複数可）および投与頻度は、担当医の裁量で、患者の必要性に応じて決定される。
【００６０】
特定の実施形態において、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体の治療有効量は、患者の生存の可能性を向上させる量（または複数回投与の場合は種々の量）を含むことができる。特定の実施形態において、開示される方法は、少なくとも１日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも１８ヶ月、少なくとも２年、少なくとも３０ヶ月、もしくは少なくとも３年、または治療期間を含む任意の期間だけ患者の余命を延長する。
【００６１】
特定の実施形態において、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体の治療有効量は、治療される状態または疾患の症状を改善する量（または複数回投与の場合は種々の量）を含むことができる。エクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、補体関連疾患を治療または予防するように設計される。したがって、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、対象を苦しめている補体関連疾患を治療するのに十分な量で、それを必要とする対象（例えば、ヒト）に投与され得る。
【００６２】
補体関連疾患は、例えば、補体関連炎症性疾患、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、関節リウマチ（ＲＡ）、重症筋無力症（ＭＧ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、難治性抗リン脂質抗体症候群（ＣＡＰＳ）、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、ウイルス性出血熱（エボラ出血熱等）、または敗血症であり得る。いくつかの実施形態において、補体関連疾患は、補体関連肺疾患である。例えば、補体関連肺疾患は、例えば、喘息または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）であり得る。外の補体関連疾患もまた、治療または予防に適している。
【００６３】
エクリズマブまたはエクリズマブ変異体がＣ５切断を阻害するかどうかを決定するための方法は、当該技術分野で既知である。ＴＣＣの形成を阻害するために、ヒト補体成分Ｃ５の阻害により、対象の体液中における補体の細胞溶解能を低下させることができる。体液（複数可）に存在する補体の細胞溶解能のそのような低下は、当該技術分野で周知の方法によって、例えば、Ｋａｂａｔ  ａｎｄ  Ｍａｙｅｒ（ｅｄｓ．），“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，”１３５−２４０，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＩＬ，ＣＣ  Ｔｈｏｍａｓ（１９６１），ｐａｇｅｓ１３５−１３９によって記載される溶血アッセイ等の従来の溶血アッセイによって、例えば、Ｈｉｌｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５０（６）：５５２に記載されるようなニワトリ赤血球溶血法等のアッセイの従来の変形例によって測定することができる。化合物がヒトＣ５のＣ５ａおよびＣ５ｂ形態への切断を阻害するかどうかを決定するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｍｏｏｎｇｋａｒｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ  １６２：３９７、Ｍｏｏｎｇｋａｒｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ  １６５：３２３、Ｉｓｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２４（１）：３２６−３１、Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３３（１７−１８）：１３８９−４０１、およびＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２（１６）：１１８３−９５に記載されている。例えば、体液中のＣ５ａおよびＣ５ｂの濃度および／または生理活性は、当該技術分野で周知の方法によって測定することができる。Ｃ５ａの濃度または活性を測定するための方法は、例えば、化学走性アッセイ、ＲＩＡ、またはＥＬＩＳＡを含む（例えば、Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｚｖａｉｆｌｅｒ（１９７１）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ５０（３）：６０６−１６およびＷｕｒｚｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｉｎｆｌａｍｍ  ８：３２８−３４０を参照されたい）。Ｃ５ｂには、溶血アッセイ、または当該技術分野で既知の溶解性Ｃ５ｂ−９のためのアッセイを用いることができる。当該技術分野で既知の他のアッセイも用いられ得る。
【００６４】
抗Ｃ５抗体等のＣ５阻害剤がＣ５の生物学的に活性な産物への変換、例えば、Ｃ５ａの産生を阻害する能力を判定するために、限定されないがＥＬＩＳＡ等の免疫学的技術を使用して、Ｃ５および／またはその切断産物のタンパク質濃度を測定することができる。
【００６５】
エクリズマブまたはエクリズマブ変異体を含有する組成物は、治療のために対象に投与される薬学的組成物として製剤化することができる。任意の好適な薬学的組成物および製剤だけではなく、好適な製剤化のための方法、ならびに好適な投与経路および好適な投与部位も本発明の範囲内であり、当該技術分野で既知である。また、任意の好適な投薬（複数可）および投与頻度が企図される。
【００６６】
薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性のあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を指しかつそれらを含む。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ６６：１−１９を参照）を含むことができる。
【００６７】
特定の実施形態において、タンパク質組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、凍結乾燥（フリーズドライ）粉末、または高濃度での安定な保存に適した他の規則的な構造として安定化および製剤化することができる。無菌注射液は、必要な量の本発明に使用されるＣ５結合ポリペプチドを、必要に応じて、上に列挙した成分のうちの１つまたは成分の組み合わせと適切な溶媒中で併せ、続いて滅菌濾過することにより調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒と、上に列挙したものから必要とされる他の成分とを含有する無菌ビヒクル中に、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体を組み込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、調製の方法は真空乾燥およびフリーズドライ法を含み、以前に滅菌濾過したその溶液からＣ５阻害剤ポリペプチドおよび任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の場合は必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる試薬、例えば、一ステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。非タンパク質Ｃ５阻害剤は、同じかまたは同様の様式で製剤化され得る。
【００６８】
エクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、薬学的水溶液中の比較的高い濃度を含む任意の所望の濃度で製剤化することができる。例えば、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ（例えば、約９ｍｇ／ｍＬ〜約９０ｍｇ／ｍＬ、約９ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ〜約１１０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ〜約８０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約８５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、もしくは約２０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ）の濃度で、または任意の好適な濃度で、溶液中に製剤化することができる。エクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、約５ｍｇ／ｍＬよりも高い（または少なくともそれに等しい）（例えば、以下の数字のいずれかの概数よりも高い、または少なくともそれに等しい：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、約２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１２０、１３０、１４０、またはさらには１５０）濃度で溶液中に存在することができる。エクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、約２ｍｇ／ｍＬよりも高い（例えば、以下の数字のいずれかの概数よりも高い：２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５以上）が、約５５ｍｇ／ｍＬよりも低い（例えば、以下の数字のいずれかの概数よりも低い：５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または約５未満）濃度で製剤化することができる。したがって、いくつかの実施形態において、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、約５ｍｇ／ｍＬよりも高く約５５ｍｇ／ｍＬよりも低い濃度で水溶液中に製剤化することができる。エクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で水溶液中に製剤化することができる。任意の好適な濃度が企図される。タンパク質を水溶液中で製剤化するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第７，３９０，７８６号、ＭｃＮａｌｌｙ  ａｎｄ  Ｈａｓｔｅｄｔ（２００７），“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  １７５，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、およびＢａｎｇａ（１９９５），“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ，”ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【００６９】
エクリズマブまたはエクリズマブ変異体の投薬レベルは、任意の好適なレベルであり得る。特定の実施形態において、ヒト対象に対するエクリズマブまたはエクリズマブ変異体の投薬レベルは、一般的に、治療当たり、患者の体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜約１００ｍｇであってもよく、治療当たり、患者の体重１ｋｇ当たり約５ｍｇ〜約５０ｍｇであってもよい。
【００７０】
患者におけるエクリズマブまたはエクリズマブ変異体の血漿中濃度は、達成される最高レベルであろうとまたは維持されるレベルであろうと、任意の所望のまたは好適な濃度であり得る。そのような血漿中濃度は、当該技術分野で既知の方法によって測定することができる。特定の実施形態において、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体の患者（ヒト患者等）の血漿中濃度は、約２５μｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬ（例えば、約３５μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ等）の範囲である。そのような患者における抗Ｃ５抗体の血漿中濃度は、抗Ｃ５抗体を投与した後に達成される最高濃度であり得るか、または治療を通して維持される患者における抗Ｃ５抗体の濃度であり得る。しかしながら、極端な症例ではより多くの量（濃度）が必要になる場合があり、より軽度の症例ではより少ない量で十分な場合があり、量は、治療中の異なる時期で変化し得る。特定の実施形態において、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体の血漿中濃度は、治療中、約３５μｇ／ｍＬ以上に維持され得る。いくつかの実施形態において、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体の血漿中濃度の血漿中濃度は、治療中、約５０μｇ／ｍＬ以上に維持され得る。
【００７１】
いくつかの実施形態において、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体の血漿中濃度は、約２００ｎＭ以上、または治療中、約２８０ｎＭ〜２８５ｎＭ以上に維持され得る。
【００７２】
他の治療シナリオにおいて、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体の血漿中濃度は、治療中、約７５μｇ／ｍＬ以上に維持され得る。最も重度の治療シナリオにおいて、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体の血漿中濃度は、治療中、約１００μｇ／ｍＬ以上に維持され得る。
【００７３】
特定の実施形態において、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体の血漿中濃度は、治療中、約２００ｎＭ〜約４３０ｎＭ以上、または約５７０ｎＭ〜約５８０ｎＭ以上に維持され得る。
【００７４】
特定の実施形態において、薬学的組成物は単一単位剤形である。特定の実施形態において、単一単位剤形は、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体の約３００ｍｇ〜約１２００ｍｇの単位剤形（約３００ｍｇ、約９００ｍｇ、および約１２００ｍｇ等）である。特定の実施形態において、薬学的組成物は凍結乾燥される。特定の実施形態において、薬学的組成物は無菌溶液である。特定の実施形態において、薬学的組成物は、防腐剤不含製剤である。特定の実施形態において、薬学的組成物は、１０ｍｇ／ｍｌの無菌の防腐剤不含溶液３０ｍｌの３００ｍｇ単回使用製剤を含む。
【００７５】
特定の実施形態において、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、以下のプロトコルに従って投与される：最初の４週間は７＋／−２日ごとに２５〜４５分の静脈内注入により６００ｍｇ、その後、７±２日後に第５の用量として９００ｍｇ、次いで、それ以降は１４±２日ごとに９００ｍｇ。抗体は、２５〜４５分にわたって静脈内注入により投与することができる。別の実施形態において、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、以下のプロトコルに従って投与される：最初の４週間は７＋／−２日ごとに２５〜４５分の静脈内注入により９００ｍｇ、その後、７±２日後に第５の用量として１２００ｍｇ、次いで、それ以降は１４±２日ごとに１２００ｍｇ。抗体は、２５〜４５分にわたって静脈内注入により投与することができる。例えば、全長エクリズマブ抗体または全長エクリズマブ変異体抗体の、体重と関連付けた例示的な小児投与量を表１に示す。
【表１】
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【００７６】
特定の他の実施形態において、全長抗体ではなく、全長抗体よりも小さいエクリズマブまたはエクリズマブ変異体が、全長抗体の投薬と同じモル濃度に対応する投薬量で投与され得ることに留意されたい。
【００７７】
水溶液は、中性のｐＨ、例えば、例えば、約６．５〜約８（例えば、７〜８（両方の値を含む））のｐＨを有することができる。水溶液は、以下の数字のいずれかの概数のｐＨを有することができる：６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０。いくつかの実施形態において、水溶液は、約６よりも高い（またはそれに等しい）（例えば、以下の数字のいずれかの概数以上である：６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、または７．９）が、約ｐＨ８よりも低いｐＨを有する。
【００７８】
いくつかの実施形態において、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、静脈内注射または静脈内注入等によって対象（用語「対象」は、本明細書において用語「患者」と同義に使用される）に静脈内投与される。いくつかの実施形態において、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、静脈内注入等によって対象に静脈内投与される。いくつかの実施形態において、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、対象の肺に投与される。いくつかの実施形態において、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、皮下注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態において、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、動脈内注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態において、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、硝子体腔内または眼球内注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態において、エクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、肺送達、例えば、（特に、肺敗血症の場合）肺内注射によって対象に投与される。追加の好適な投与経路も企図される。
【００７９】
エクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、単剤治療として対象に投与され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、１つ以上の追加の治療、例えば、１つ以上の追加の治療薬を対象に投与することを含むことができる。
【００８０】
追加の治療は、補体関連疾患の実験的治療、または補体関連疾患の症状の治療を含む任意の追加の治療であり得る。他の治療は、患者の健康を改善するまたは安定させる任意の治療、任意の治療薬であり得る。追加の治療薬（複数可）は、静脈内輸液、例えば、水および／または生理食塩水、アセトアミノフェン、ヘパリン、１つ以上の凝固因子、抗生物質等を含む。１つ以上の追加の治療薬は、エクリズマブもしくはエクリズマブ変異体と一緒にまたは別個の治療組成物として投与され得るか、あるいは、１つの治療組成物は、（ｉ）１つ以上のエクリズマブおよびエクリズマブ変異体、ならびに（ｉｉ）１つ以上の追加の治療薬の両方を含むように製剤化され得る。追加の治療薬は、Ｃ５結合ポリペプチドの投与の前に、それと同時に、またはその後に投与され得る。追加の薬剤は、同じ送達方法もしくは経路を使用して、または異なる送達方法もしくは経路を使用して投与され得る。追加の治療薬は、別のＣ５阻害剤を含む別の補体阻害剤であってもよい。
【００８１】
エクリズマブまたはエクリズマブ変異体が第２の活性薬剤と組み合わせて使用される場合、その薬剤は、別個にまたは一緒に製剤化され得る。例えば、それぞれの薬学的組成物が、例えば、投与の直前に混合されて一緒に投与されてもよいか、または、例えば、同じ時間にもしくは異なる時間に、同じ経路もしくは異なる経路によって、別個に投与されてもよい。
【００８２】
いくつかの実施形態において、組成物は、組成物が全体として補体関連疾患の治療に治療的に有効であるように、治療量以下の量のエクリズマブまたはエクリズマブ変異体と、治療量以下の量の１つ以上の追加の活性薬剤とを含むように製剤化され得る。治療抗体等の薬剤の治療有効用量を決定するための方法は、当該技術分野で既知である。
【００８３】
組成物は、投与経路に一部依存する様々な方法を用いて、対象、例えば、ヒト対象に投与され得る。経路は、例えば、静脈内（「ＩＶ」）注射もしくは注入、皮下（「ＳＣ」）注射、腹腔内（「ＩＰ」）注射、例えば、（特に、肺敗血症の場合）肺内注射等による肺送達、眼球内注射、関節内注射、または筋肉内（「ＩＭ」）注射であってもよい。
【００８４】
本明細書に開示されるエクリズマブまたはエクリズマブ変異体の好適な用量は、例えば、治療を受ける対象の年齢、性別、および体重、ならびに使用される特定の阻害剤化合物を含む様々な要因に依存し得る。対象に投与される用量に影響を与える他の要因は、例えば、疾患の種類または重症度を含む。他の要因は、例えば、対象に同時に影響を与えているかまたは以前に影響を与えていた他の医学的疾患、対象の総体的な健康、対象の遺伝的素因、食生活、投与期間、排泄速度、薬物の組み合わせ、および対象に投与される任意の他の追加の治療剤を含むことができる。また、いずれか特定の対象のための特定の投薬および治療計画は、担当の医療従事者（例えば、医師または看護師）の判断に依存することも理解されたい。
【００８５】
本明細書に開示されるエクリズマブまたはエクリズマブ変異体は、固定用量として、または１キログラムあたりのミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）の用量で投与され得る。いくつかの実施形態において、用量は、組成物中の活性抗体のうちの１つ以上に対する抗体の産生または他の宿主免疫応答を低下させるまたは回避するように選択することもできる。
【００８６】
薬学的組成物は、治療有効量の本明細書に開示されるエクリズマブまたはエクリズマブ変異体を含むことができる。そのような有効量は、当業者によって容易に決定され得る。
【００８７】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるエクリズマブまたはその変異体の投与量は以下の通りであり得る：（１）最初の３週間は、毎週、約９００ミリグラム（ｍｇ）のエクリズマブもしくはその変異体、または（２）最初の３週間は、毎週、１２００ミリグラム（ｍｇ）のエクリズマブもしくはその変異体を患者に投与し、（３）その後、４、６、および８週目に約１２００ｍｇの用量を投与する。最初の８週間のエクリズマブまたはその変異体による治療期間後、担当の医療従事者（医師等）は、任意選択的に、約１２００ｍｇのエクリズマブまたはその変異体を用いた治療を隔週でさらに８週間要求する（かつ施す）ことができる。次いで、エクリズマブまたはその変異体による治療後２８週間、患者を観察することができる。
【００８８】
決して限定的であることを意図するものではないが、一本鎖抗Ｃ５抗体（Ｃ５の切断を阻害する）等の一本鎖抗体の例示的な投与方法は、例えば、Ｇｒａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８：１１８４、Ｈａｖｅｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ  ８２：４８６−４９２、およびＴｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  １３６（４）：８８４−８９３に記載されている。
【００８９】
本明細書で使用される用語「治療有効量」もしくは「治療有効用量」、または同様の用語は、所望の生物学的応答または医学的応答を誘発する本明細書に開示されるエクリズマブまたはエクリズマブ変異体の量を意味することを意図する。
【００９０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物は、組成物が全体として治療的に有効であるように、本明細書に開示される治療有効量のエクリズマブまたはエクリズマブ変異体と、１つ以上（例えば、１、２、３，４，５，６，７，８，９、１０、もしくは１１個またはそれ以上）の追加の治療薬とを含有する。例えば、組成物は、本明細書に記載されるＣ５結合ポリペプチドおよび免疫抑制剤を含有することができ、ポリペプチドおよび薬剤は、それぞれ、組み合わせたときに対象における補体関連疾患を治療または予防するのに治療的に有効な濃度である。
【００９１】
本開示中、本明細書に開示される方法におけるエクリズマブまたはエクリズマブ変異体、ならびにエクリズマブまたはエクリズマブを使用する治療および予防に対する言及は、本明細書に開示されるエクリズマブおよび本明細書に開示されるエクリズマブ変異体に対する言及である。
【００９２】
「対象」は、本明細書で使用される場合、ヒトであってもよい。「患者」は、本明細書において「対象」と同義に使用される。特定の実施形態において、患者（または対象）は、ヒト患者（またはヒト対象）である。
【実施例】
【００９３】
本発明をよりよく理解するために、以下の例を記載する。これらの例は、説明のみを目的としており、決して本発明の範囲を限定するものであると解釈されるべきではない。
【００９４】
例１．エクリズマブによる治療
治療当たり、患者の体重１ｋｇ当たり１ｍｇ〜１００ｍｇの本明細書に開示されるエクリズマブを含む製剤が、補体障害であると診断されたヒト患者に静脈内注入によって投与される。これらの患者全員が、病態の初期にエクリズマブを始めて投与される。種々の日数の経過後、当該技術分野で既知の方法により疾患レベルを判定する。
【００９５】
本明細書に開示されるエクリズマブを含む製剤を投与される患者の余命は、少なくとも１日延長される。
【００９６】
例２．臨床試験
臨床試験には、補体障害に罹患する１００人の患者を組み入れる。試験中の患者は、試験の１日目に１２００ミリグラム（ｍｇ）の本明細書に開示されるエクリズマブを投与され、その後、次の２週間は毎週１２００ｍｇ、その後、４、６、および８週目には１２００ｍｇの用量を投与される。最初の８週間のエクリズマブによる治療期間後、治験責任医師は、任意選択的に、１２００ｍｇの本明細書に開示されるエクリズマブを用いた治療を隔週でさらに８週間要求することができる。本明細書に開示されるエクリズマブの患者への投与は、静脈内注入によって行われる。
【００９７】
本明細書に開示されるエクリズマブを投与される患者の余命は、少なくとも１日延長される。
【００９８】
例３．水溶液中のエクリズマブまたはエクリズマブ変異体の単糖組成を決定するための手順
機器および材料
試薬：グルコサミン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ４８７５）；ガラクトサミン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ０５００）グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ７５２８）；ガラクトース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ６４０４）マンノース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ６０２０）；フコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ２２５２）；氷酢酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、３２００９９）；酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓ７５４５）；ホウ酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂ７６６０）；メタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、４３９１９３）；アントラニル酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ８９８５５）；シアノ水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、１５６１５９）；ブチルアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、４７１３０５）；リン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、６９５０１７）；テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、４９４４６１）；脱イオン水（ｄｉＨ２Ｏ）；アセトニトリル、ＨＰＬＣグレード（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、３６０４５７）
【００９９】
ＨＰＬＣ移動相：移動相Ａ：０．２％ブチルアミン、ｄｉＨ２Ｏ中の０．５％リン酸および１％ＴＨＦ；移動相Ｂ：５０％アセトニトリル中の５０％移動相Ａ；移動相Ｃ：ｄｉＨ２Ｏ中の４０％メタノール
【０１００】
機器：温度制御モジュール（ＴＣＭ）またはカラムオーブンおよび２４７５モデル多波長蛍光検出器を備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５ＨＰＬＣシステム；Ｗａｔｅｒｓ  Ｅｍｐｏｗｅｒクロマトグラフィーソフトウェア；Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ−１８カラム、１５０×４．６ｍｍ、粒径５μｍ（ＷＡＴ０４５９０５）；Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ５００フィルタ、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  ＰＥＳ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ−Ｓｔｅｄｉｍ  番号ＶＳ０１０２；エッペンドルフ微量遠心機、Ｏリングシール付きスクリューキャップを有する２．０ｍＬ微量遠心管、ＢｉｏＳｔｏｒ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；２〜１０００μＬピペット、Ｒａｉｎｉｎ；真空遠心濃縮器；乾燥加熱ブロック；キャップ付き注射用スクリューネックバイアル、Ｗａｔｅｒｓ
【０１０１】
手順
溶媒および試薬の調製
１．０ｍＭ単糖標準原液：グルコサミン塩酸塩およびガラクトサミン塩酸塩をそれぞれ４３ｍｇ計量する。ガラクトース、マンノース、およびグルコースをそれぞれ３６ｍｇ計量する。３３ｍｇのフコースを計量する。単糖を合わせ、ｄｉＨ２Ｏを加えて最終体積を２００ｍＬとする。溶解するまで混合し、１ｍＬバイアルに分取する。−２０℃で保存する。有効期限は５年である。
【０１０２】
単糖標準較正溶液（０．０４ｍＭ）：１．０ｍＭ単糖標準原液のアリコートを室温まで解凍する。４０μＬの１．０ｍＭ標準原液を９６０μＬのｄｉＨ２Ｏに加え、十分に混合する。新しく調製する。
【０１０３】
０．０５％核酸：５０μＬの氷酢酸を１００ｍＬのｄｉＨ２０に加える。室温で保存する。有効期限は１年である。
【０１０４】
１％酢酸ナトリウム：１ｇの酢酸ナトリウムを１００ｍＬのｄｉＨ２０に溶解する。室温で保存する。有効期限は１年である。
【０１０５】
４％酢酸ナトリウム、２％ホウ酸、メタノール溶液：４ｇの酢酸ナトリウムおよび２ｇのホウ酸を１００ｍＬのメタノールに溶解する。室温で保存する。有効期限は１年である。
【０１０６】
３０ｍｇ／ｍＬアントラニル酸および２０ｍｇ／ｍＬシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（ＡＡ溶液）：２００ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを１０ｍＬの酢酸ナトリウム／ホウ酸／メタノール溶液に溶解し（上の６．２．５を参照されたい）、その後、３００ｍｇのアントラニル酸を加える。十分に混合する。新しく調製する。
【０１０７】
ＨＰＬＣ移動相Ａ：４ｍＬのブチルアミン、１０ｍＬのリン酸、および２０ｍＬのＴＨＦを１．８ＬのｄｉＨ２Ｏに混合する。適量のＨ２Ｏを加えて２Ｌにし、十分に混合する。室温で保存する。有効期限は６ヶ月である。
【０１０８】
ＨＰＬＣ移動相Ｂ：５００ｍＬの移動相Ａを５００ｍＬのアセトニトリルに加える。十分に混合する。室温で保存する。有効期限は６ヶ月である。
【０１０９】
ＨＰＬＣ移動相Ｃ：４００ｍＬのメタノールを６００ｍＬのＨ２Ｏに加える。十分に混合する。室温で保存する。有効期限は６ヶ月である。
【０１１０】
試料の加水分解：５００μＬの水をスピンフィルタに加える。すすぎのために１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。濾液を廃棄する。４ｍｇの試料（１０ｍｇ／ｍＬで４００μＬ）をすすいだフィルタに入れる。適量の０．０５％ＡｃＯＨ溶液を加えて５００μＬにする。１２０００ｒｐｍで８〜１０分間遠心分離する。濾液を廃棄し、適量の０．０５％ＡｃＯＨ溶液を加えて５００μＬにし、１２０００ｒｐｍで８〜１０分間遠心分離する。合計２回の洗浄ステップを繰り返す。０．０５％ＡｃＯＨ溶液を用いて最終体積を約２５０μＬに調整する。ボルテックスし、微量遠心管に移す。必要に応じて複製物をプールする。５０μＬのタンパク質を４５０μＬの０．０５％ＡｃＯＨ溶液に加えることにより、紫外線による濃度決定のための１：１０希釈液を作製する。０．０５％ＡｃＯＨ溶液を用いて紫外線検出器のブランク測定を行う。各１：１０希釈タンパク質試料の２８０ｎｍでの吸光度を測定する。Ａ２８０に、希釈係数１０、およびセル光路長に関連するタンパク質に特異的な吸光度係数を乗じることにより、タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）を決定する。試料は、加水分解を続けるまで４℃で保存され得る。
【０１１１】
最終濃度が約０．５ｍｇ／ｍＬになるまで０．０５％ＡｃＯＨ中にタンパク質溶液を希釈する。ＢｉｏＳｔｏｒ試験管に、０．１ｍＬの０．５ｍｇ／ｍＬタンパク質溶液、０．３ｍＬのｄｉＨ２Ｏ、および０．１ｍＬのＴＦＡを混合する。試験管のキャップをきつく締め、十分に混合し、１００℃で６時間インキュベートする。試験管が室温まで冷却した後、真空濃縮機で熱を加えずに内容物を乾燥させる。試料は、タグ付けの前に４℃で保存され得る。
【０１１２】
標準曲線の調製：０．０４ｍＭ単糖標準較正溶液を使用して、表２の希釈系列により試験管内で標準曲線を調製する。
【表２】
2018528218.tif 000004
【０１１３】
試料のタグ付け：ボルテックスおよび超音波処理により乾燥試料を１００μＬの１％酢酸ナトリウムに溶解する。各５０μＬの単糖標準希釈液を別個のスクリューキャップ付きプラスチックバイアルに入れる。ステップ６．５．１からの加水分解されたタンパク質の体積を２つの５０μＬアリコートに分割し、別個のスクリューキャップ付きプラスチックバイアルに入れる。１００μＬの上記ＡＡ溶液を各バイアルに加え、加熱ブロック内で１時間８０℃でインキュベートする。反応後、内容物を室温まで冷却させ、８５０μＬのＨＰＬＣ溶媒Ａを加える。十分に混合し、内容物をオートサンプラーバイアルに移す。
【０１１４】
注入試料：１．０ｍＬ／分で３０分間、５％のＢでカラムを平衡化する。運転条件は次の通りである：ＴＣＭまたはカラムオーブン：２０±℃；試料トレー温度：５±２℃；脱気装置：正常；サンプラー間隔：１．０秒；波長：３６０ｎｍ励起、４２０ｎｍ放射；流速：１．０／分；運転時間：８５分。処理を「運転のみ」に設定する。
【表３】
2018528218.tif 000005
【０１１５】
各５０μＬの溶媒Ａブランク、標準曲線、および試験試料を注入する。
【表４】
2018528218.tif 000006
【０１１６】
システムを停止する前に、溶媒Ｃで１５分間カラムを洗浄し、１００％溶媒Ｂ中に保存する。
【０１１７】
データ処理および分析：必要であれば前回の較正曲線を消去して、標準曲線を較正し、次いで試料を処理する。標準レベルのための処理方法の量は次の通りである。
【表５】
2018528218.tif 000007
【０１１８】
処理パラメータは次の通りである：閾値：２０μｖ／秒；ピーク幅：１５０秒；積分抑制：０．０〜６．０分、１０〜２２分、および４０．０〜８５．０分。
【０１１９】
標識ピークは次の通りである：表６
【表６】
2018528218.tif 000008
【０１２０】
滞留時間は変化する場合があり、また必要であれば、処理パラメータが調整されてもよい。
【０１２１】
計算：重み付けした理論モル比の計算。参照物質のオリゴ糖アッセイの結果を用いて、各オリゴ糖の相対的なパーセント面積の平均値を計算する。各単糖種ごとに重み付けした理論モル比は、平均化した各オリゴ糖のパーセント面積にオリゴ糖種当たりの単糖の分子数を乗じた積和を、次いで１００で除したものである。各単糖ごとに３つのマンノース分子に対して正規化した重み付けした理論モル比は、単糖の重み付けした理論モル比を３で乗じた積を、次いで、マンノースの重み付けした理論モル比で除したものである。例えば、表７を参照されたい。
【表７】
2018528218.tif 000009
【０１２２】
単糖の計算：較正された各標準曲線を基にして、試験試料の単糖量をｐｍｏｌで計算する。複製試料の平均ピーク面積を計算する。タンパク質（ｍｇ）当たりの単糖の比（ｎｍｏｌ）を報告する。例えば、表８を参照されたい。計算は、必要に応じて調整されてもよく、実験ノートに記入されてもよいことに留意されたい。グルコースは、最終的な合計グリコシル化％には含まれない。
【表８】
2018528218.tif 000010
【０１２３】
合計グリコシル化パーセント
【数１】
2018528218.tif 000011
【表９】
2018528218.tif 000012
【０１２４】
計算は、必要に応じて調整されてもよく、実験ノートに記入されてもよい。グルコースは、最終的な合計グリコシル化％には含まれない。
【０１２５】
均等な機器および材料が使用されてもよい。また、必要に応じて手順が調整されてもよい。
【０１２６】
例４：ＨＰＬＣによる２−ＡＡの標識化を用いたＮ結合型オリゴ糖プロファイリングの手順
この手順は、水溶液中のエクリズマブまたはエクリズマブ変異体等のタンパク質の特徴付けに適用される。
【０１２７】
機器および材料
機器：２４７５モデル多波長蛍光検出器を備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５／２７９５ＨＰＬＣシステム；Ｗａｔｅｒｓ  Ｅｍｐｏｗｅｒクロマトグラフィーソフトウェア；Ｓｈｏｗａ  ＤｅｎｋｏのＡｓａｈｉｐａｋアミノカラム、２５０×４．６ｍｍ、粒径５μｍ、ＮＨ２Ｐ−５０４Ｅ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＣＨＯ−２６２８）；遠心機、エッペンドルフモデル５４１５Ｃまたは均等物；乾燥加熱ブロック（３７℃、８０℃、および１００℃）；ボルテックスミキサー；ポリプロピレンラック（ＶＷＲ  ６０９８５−５４５）
【０１２８】
材料：参照標準または対照；脱イオン水（ｄｉＨ２Ｏ）；アセトニトリル、ＨＰＬＣグレード（Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ  ０１４−４）；ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｎ−グリカナーゼ、ＧＫＥ−５００６ＢまたはＧＫＥ−５００６Ｄ；水酸化アンモニウム（Ｂａｋｅｒ  ９７２１−０２）；アントラニル酸（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ａ８９８５−５）；氷酢酸（Ｂａｋｅｒ  ９５２６−０３）；ホウ酸（Ａｌｄｒｉｃｈ  ２０２８７−８）；Ｍａｎ９  ２−ＡＡ（１００ｐｍｏｌ）（Ｐｒｏｚｙｍｅ  ＧＫＳＡ−１０７）；酢酸ナトリウム（Ｆｌｕｋａ  ７１１７９）；シアノ水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  １５６１５９）；β−メルカプトエタノール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  １６１−０７１０）；メタノール、ＨＰＬＣグレード（Ｂａｋｅｒ  ９０７０−３）；エタノール、ＨＰＬＣグレード（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｅ１０２８）；Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａ  Ｉ−３０２１）；ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤＳ（Ｂａｋｅｒ  ４０９５−０２）；テトラヒドロフラン、阻害ＴＨＦ（Ｓｉｇｍａ  ３６０５８９）；トリエチルアミン、ＴＥＡ（Ｓｉｇｍａ  ４７１２８３）；Ｏリングシール付きスクリューキャップを有する２．０ｍＬ微量遠心管（Ｂｉｏｓｔｏｒ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＶＷＲ  ６６００６−８１２）；１．５ｍＬ微量遠心管；０．４５μｍ、２５ｍｍ  ナイロンアクロディスクフィルタ（Ｐａｌｌ  ＰＮ  ＡＰ−４４３８Ｔ）；全回収ガラスＨＰＬＣバイアル（Ｗａｔｅｒｓ  １８６０００３８４ｃ）；５ｍＬシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ３０９６０３）
【０１２９】
手順
溶媒、試薬、および移動相の調製
１：１００水酸化アンモニウム溶液：５０μＬの水酸化アンモニウムを４．９５ｍＬの水に加え、十分に混合する。２〜８℃で保存する。有効期限は１ヶ月である。
【０１３０】
１０％ＳＤＳ溶液（化学ヒュームフード内で調製）：１０ｇのＳＤＳを８０ｍＬの水に加える。適量の水を加えて１００ｍＬにし、十分に混合する。室温で保存する。有効期限は１年である。
【０１３１】
変性溶液：４．７５ｍＬの１：１００水酸化アンモニウム溶液を１５ｍＬポリプロピレン試験管に加える。２５０μＬの１０％ＳＤＳを加える。５０μＬのβ−メルカプトエタノールを加え、十分に混合する。２〜８℃で保存する。有効期限は１ヶ月である。
【０１３２】
５％Ｉｇｅｐａｌ：５ｇのＩｇｅｐａｌを８０ｍＬの水に加える。適量の水を加えて１００ｍＬにし、十分に混合する。室温で保存する。有効期限は１年である。
【０１３３】
メタノール溶液：４ｇの酢酸ナトリウムおよび２ｇのホウ酸を９０ｍＬのメタノールに加える。適量のメタノールを加えて１００ｍＬにし、十分に混合する。室温で保存する。有効期限は１年である。
【０１３４】
ＡＡ溶液（新しく調製する）：１０ｍＬのメタノール溶液を１５ｍＬポリプロピレン試験管に入れる。２００ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを溶液に加え、溶解するまで混合する。３００ｍｇのアントラニル酸を溶液に加え、溶解するまで混合する。２〜８℃で保存する。使用前に沈殿物が形成した場合は廃棄する。
【０１３５】
洗浄溶媒：５ｍＬの水を９５ｍＬのアセトニトリルに加え、十分に混合する。室温で保存する。有効期限は６ヶ月である。
【０１３６】
溶出溶媒：２０ｍＬのアセトニトリルを８０ｍＬの水に加える。十分に混合する。室温で保存する。有効期限は６ヶ月である。
【０１３７】
移動相Ａ：４０ｍＬの核酸および２０ｍＬのＴＨＦを１６００ｍＬのアセトニトリルに加える。適量のアセトニトリルを加えて２Ｌにし、十分に混合する。室温で保存する。有効期限は６ヶ月である。
【０１３８】
移動相Ｂ：１００ｍＬの核酸、２０ｍＬのＴＨＦ、および６０ｍＬのＴＥＡを１６００ｍＬの水に加える。適量の水を加えて２Ｌにし、十分に混合する。室温で保存する。有効期限は６ヶ月である。
【０１３９】
カラム洗浄：４００ｍＬのエタノールを１５００ｍＬの水に加える。適量の水を加えて２Ｌにし、十分に混合する。室温で保存する。有効期限は６ヶ月である。
【０１４０】
試料、参照物質、および陰性対照の調製：２５μｇの各試料および参照物質を２ｍＬスクリューキャップ付き試験管にピペットで入れる。（より低い強度プロファイルを示す試料、または低レベルのグリコシル化を示す試料の場合、初期試料の量を増加してもよい。）陰性対照として５μＬの水を使用する。３０μＬの変性溶液を各試験管に加え、ボルテックスする。１００℃で２分間インキュベートする。注意：熱い試験管を開けないこと。室温で５分間冷却する。１０μＬのＩｇｅｐａｌ溶液を各試験管に加え、ボルテックスする。２μＬのＮ−グリカナーゼ酵素を加え、ボルテックスし、遠心分離して試験管の底に沈殿させる。３７℃で１６〜２２インキュベートする。新しいＡＡ溶液を調製する。１００μＬのＡＡ溶液を各試験管に加え、ボルテックスする。８０℃で１時間インキュベートする。各試料ごとに、アクロディスクフィルタを５ｍＬシリンジにとりつけ、ポリプロピレンラック上に配置する。シリンジプランジャーを廃棄する。反応混合物を室温で５分間冷却する。１ｍＬの洗浄溶媒を各フィルタに適用する。重力駆動型抽出の間、フィルタを乾燥させないようにする。１ｍＬの洗浄溶媒を各試料に加え、ボルテックスする。全体積をフィルタに適用し、排出させる。２ｍＬの洗浄溶媒をフィルタに適用し、排出させる。１ｍＬの溶出溶媒を用いて１．５ｍＬ微量遠心管内に直接溶出する。試料、参照物質、および陰性対照をＨＰＬＣバイアルに移す。残りの試料、参照物質、および陰性対照を−２０℃以下で保存する。
【０１４１】
システム適合性の調製：１００μＬの水を１００ｐｍｏｌ  Ｍａｎ−９  ＡＡを含む試験管に加え、ボルテックスする。溶液の濃度は１ｐｍｏｌ／μＬである。−２０℃以下で保存する。有効期限は１年である。４０μＬのＭａｎ−９溶液を３６０μＬの溶出溶液に加え、ボルテックスする。ＨＰＬＣバイアルに移す。
【０１４２】
ＨＰＬＣシステムの設定：１．０ｍＬ／分で３０分間、７０％Ａ／３０％Ｂでカラムを平衡化する。以下の条件に設定する：ＴＣＭまたはカラムオーブン：５０℃±５℃；試料トレー温度：５℃±２℃；脱気装置：正常；サンプラー間隔：１．０秒。波長：３６０ｎｍ励起、４２０ｎｍ放射；粒子：１；時定数：０．３；検出器出力装置：放出；運転時間：１１０分。
【表１０】
2018528218.tif 000013
【０１４３】
試料セットを次の通りに構成する：表１１
【表１１】
2018528218.tif 000014
【０１４４】
注入試料：複数のシステム適合性試料が加えられてもよい。処理を「運転のみ」に設定する。運転終了時に、システムを停止する前にＣｏｌｕｍｎ  Ｗａｓｈで１５分間カラムを洗浄する。
【０１４５】
処理：
処理パラメータを次の通りに設定する：Ａｐｅｘ  Ｔｒａｃｋを起動する：開始：１６、終了：５５。
最小面積：５０００μＶ＊秒；最小高さ：５００μＶ；リフトオフ：０．５；タッチダウン：０．５；閾値：１００μＶ／秒；ピーク幅：２０秒；積分抑制：０．０〜１９．５分および＞６０分。
【０１４６】
標識ピークは次の通りである：表１２
【表１２】
2018528218.tif 000015
【０１４７】
ある程度の手動積分が必要な場合がある。滞留時間は調整されてもよい。ピークの中には、全ての試料に検出されないものもある。
【０１４８】
必要に応じて各ピークの相対的なパーセント面積を計算する。
【０１４９】
均等な機器および材料が使用されてもよい。また、必要に応じて手順が調整されてもよい。
【０１５０】
例５：水溶液中のエクリズマブまたはエクリズマブ変異体のシアル酸含有量を決定するための手順
機器および材料
試薬：氷酢酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、３２００９９）；脱イオン水（ｄｉＨ２Ｏ）；硫酸水素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、７１６５７）；Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＮＡＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ２３８８）；Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＧＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ９７９３）；Ｏ−フェニレンジアミン２ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ１５２６）；ブチルアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、４７１３０５）；リン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、６９５０１７）；テトラヒドロフラン、阻害ＴＨＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、４９４４６１）；アセトニトリル、ＨＰＬＣグレード（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、３６０４５７）；メタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、４３９１９３）。
【０１５１】
ＨＰＬＣ移動相：移動相Ａ：０．２％ブチルアミン、水中の０．５％リン酸および１％ＴＨＦ；移動相Ｂ：５０％アセトニトリル中の５０％移動相Ａ；移動相Ｃ：水中の４０％メタノール
ｉ．機器：温度制御モジュール（ＴＣＭ）またはカラムオーブンおよび２４７５モデル多波長蛍光検出器を備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５ＨＰＬＣシステム；Ｗａｔｅｒｓ  Ｅｍｐｏｗｅｒクロマトグラフィーソフトウェア；Ｃ１８  Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳ逆相カラム、４．６×１５０ｍｍ、５μｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ２３５３３０）；Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ５００フィルタ濃度、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  ＰＥＳ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ−Ｓｔｅｄｉｍ  ＶＳ０１０２）；２．０ｍＬ微量遠心管（低タンパク質結合）；２〜１０００μＬピペット（Ｒａｉｎｉｎ）；乾燥加熱ブロック；キャップ付き注射用スクリューネックバイアル（Ｗａｔｅｒｓ）；エッペンドルフ遠心機；ボルテックスミキサー；紫外線分光光度計；２ｍｍキュベット；および一般的な実験用品
【０１５２】
手順
移動相および試薬の調製
０．０５％核酸（ＡｃＯＨ）溶液：５０μＬの氷酢酸を８０ｍＬの水に加える。適量の水を加えて１００ｍＬにする。十分に混合する。室温で保存する。有効期限は３ヶ月である。
【０１５３】
０．５Ｍ硫酸水素ナトリウム溶液：６．９ｇの硫酸水素ナトリウムを１００ｍＬの水に溶解する。新しく調製する。
【０１５４】
０．２５Ｍ硫酸水素ナトリウム溶液：５０ｍＬの０．５Ｍ溶液を５０ｍＬの水に加える。十分に混合する。新しく調製する。
【０１５５】
１．０ｍＭシアル酸原液：７．７５ｍｇのＮＡＮＡおよび８．１６ｍｇのＮＧＮＡを２５ｍＬの０．０５％ＡｃＯＨ溶液に溶解する。−２０℃にて１ｍＬアリコートで保存する。有効期限は２年である。
【０１５６】
シアル酸標準溶液：シアル酸原液のアリコートを解凍する。１００μＬを４．９ｍＬの０．２５Ｍ硫酸水素ナトリウムに加える。標準溶液は、１ｍＬ当たり２０ｎｍｏｌのシアル酸を含有する。新しく調製する。
【０１５７】
Ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）誘導体化溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）：４０ｍｇのＯＰＤをＢｉｏｓｔｏｒ試験管に加える。適量の０．２５Ｍ硫酸水素ナトリウムを加えて２ｍＬにし、十分に混合する。約１９回の調製に十分である。新しく調製する。
【０１５８】
ＨＰＬＣ移動相Ａ：４．０ｍＬの１−ブチルアミン、１０ｍＬのリン酸、および２０ｍＬのＴＨＦを、ガラス瓶内の１．８Ｌの水に加える。適量の水を加えて２Ｌにし、十分に混合する。室温で保存する。有効期限は６ヶ月である。
【０１５９】
ＨＰＬＣ移動相Ｂ：０．５ＬのＨＰＬＣ移動相Ａおよび０．５Ｌのアセトニトリルをガラス瓶内で混合し、最終体積を１Ｌとする。十分に混合する。室温で保存する。有効期限は６ヶ月である。
【０１６０】
ＨＰＬＣ移動相Ｃ：４００ｍＬのメタノールを６００ｍＬの水に加える。十分に混合する。室温で保存する。有効期限は６ヶ月である。
【０１６１】
試料の加水分解：５００μＬの水をスピンフィルタに加える。すすぎのために１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。濾液を廃棄する。４ｍｇの試料（１０ｍｇ／ｍＬで４００μＬ）をすすいだフィルタに入れる。適量の０．０５％ＡｃＯＨ溶液を加えて５００μＬにする。１２０００ｒｐｍで８〜１０分間遠心分離する。濾液を廃棄し、適量の０．０５％ＡｃＯＨ溶液を加えて５００μＬにし、１２０００ｒｐｍで８〜１０分間遠心分離する。合計２回の洗浄ステップを繰り返す。０．０５％ＡｃＯＨ溶液を用いて最終体積を約２５０μＬに調整する。ボルテックスし、微量遠心管に移す。必要に応じて複製物をプールする（これは「未希釈のタンパク質」である）。５０μＬのタンパク質を４５０μＬの０．０５％ＡｃＯＨ溶液に加えることにより、紫外線による濃度決定のための１：１０希釈液を作製する。０．０５％ＡｃＯＨ溶液を用いて紫外線検出器のブランク測定を行う。各１：１０希釈タンパク質試料の２８０ｎｍでの吸光度を測定する。Ａ２８０に、希釈係数１０、およびセル光路長に関連するタンパク質に特異的な吸光度係数を乗じることにより、タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）を決定する。試料は、加水分解を続けるまで４℃で保存され得る。２５０μｇの未希釈のタンパク質を二通り微量遠心管に入れる。適量の０．５Ｍ硫酸水素ナトリウムを加えて１００μＬにする。５０μＬの０．０５％ＡｃＯＨ溶液および５０μＬの０．５Ｍ硫酸水素ナトリウムを、陰性対照として試験管に入れる。試験管のキャップをきつく締め、十分に混合し、８０℃の加熱ブロック内で２０分間インキュベートする。試験管を室温まで冷却させる。
【０１６２】
２０ｎｍｏｌ／ｍＬシアル酸標準溶液（「シアル酸標準」）を使用して、表１３の希釈系列により試験管内で標準曲線を調製する。
【表１３】
2018528218.tif 000016
【０１６３】
１００μＬの各シアル酸標準（１０、１５、２０、２５、および３０ｐｍｏｌ）を試験管に加える。
【０１６４】
１００μＬのＯＰＤ溶液を標準、試料、および陰性対照の各々に加える。試験管のキャップをきつく締め、混合し、８０℃の加熱ブロック内に４０分間入れる。冷却させ、０．８ｍＬのＨＰＬＣ移動相Ａを各試験管に加える。十分に混合し、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ペレットを破壊しないようにしてオートサンプラーバイアルに移す。
【０１６５】
ＨＰＬＣ．１．０ｍＬ／分で３０分間、１０％のＢでカラムを平衡化する。運転条件は次の通りである：
【表１４】
2018528218.tif 000017
【表１５】
2018528218.tif 000018
【０１６６】
処理を「運転のみ」に設定する。移動相Ａブランク、陰性対照、標準曲線レベルおよび試験試料の各々を１００μＬ注入する。
【表１６】
2018528218.tif 000019
【０１６７】
運転終了時に、システムを停止する前に、移動相Ｃで１５分間カラムを洗浄し、１００％移動相Ｂ中に保存する。
【０１６８】
データ処理および分析
必要であれば前回の較正曲線を消去して、標準曲線を較正し、次いで試料を処理する。標準レベルのための処理方法の量は次の通りである。
【表１７】
2018528218.tif 000020
【０１６９】
処理パラメータは次の通りである：
【表１８】
2018528218.tif 000021
【０１７０】
標識ピークは次の通りである：
【表１９】
2018528218.tif 000022
【０１７１】
滞留時間は変化する場合がある。必要であれば、処理パラメータが調整されてもよい。
【０１７２】
計算：較正した各標準曲線に基づいて、試験試料シアル酸の量をｐｍｏｌで計算する。較正範囲内に存在する各シアル酸について、タンパク質（ｍｇ）当たりのシアル酸（ｐｍｏｌ）の量を報告する。結果は、タンパク質のｍｏｌ当たりのシアル酸のｍｍｏｌに変換され得る。最も低い較正標準値である１０ｐｍｏｌ未満の値については、結果を「ＬＯＱ未満」として報告する。
【０１７３】
計算は、必要に応じて調整されてもよい。均等な機器および材料が使用されてもよい。また、必要に応じて手順が調整されてもよい。
【０１７４】
例６．ＮＳ０細胞で培養されるエクリズマブとＣＨＯ細胞で培養されるエクリズマブ変異体との間のグリコシル化パターンの比較
配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列からなるエクリズマブ変異体を含むベクターを担持するＣＨＯ細胞を、２００Ｌバイオリアクターによる培養で成長させる。エクリズマブ変異体タンパク質を標準的な方法により精製し、標準的な方法により１０ｍｇ／ｍｌで試験する。タンパク質上にはＮＧＮＡは検出されない。中性オリゴ糖は、タンパク質の全オリゴ糖含有量の約９９．９９％を占める。
【０１７５】
配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列からなるエクリズマブを含むベクターを担持するＮＳ０細胞を、２００Ｌバイオリアクターによる培養で成長させる。エクリズマブタンパク質を標準的な方法により精製し、標準的な方法により１０ｍｇ／ｍｌで試験する。０．１ｍｍｏｌ／ｍｏｌ〜９．６ｍｍｏｌ／ｍｏｌのＮＧＮＡ含有量がタンパク質上で検出される。中性オリゴ糖（グリカン）は、タンパク質の全オリゴ糖含有量の約８９％を占める。
【０１７６】
例７．ＣＨＯ細胞で培養されるエクリズマブおよびエクリズマブ変異体
エクリズマブを含むベクターを担持するＣＨＯ細胞と、配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列からなるエクリズマブ変異体を担持するＣＨＯ細胞とを、２００Ｌバイオリアクターによる培養で成長させる。タンパク質を標準的な方法により精製する。これらのタンパク質は、正しい分子量、正しいＮ末端配列、ヒトＣ５に対する結合特異性を有するが、その他の点ではエクリズマブまたはエクリズマブ変異体のように挙動する。これらのタンパク質は、いずれのＮＧＮＡも有さず、いずれのＧａｌＮｃも有さず、各タンパク質の全オリゴ糖含有量の約９９％以上の中性オリゴ糖含有量を有する。
【０１７７】
例８．ＮＳ０細胞で培養したエクリズマブ
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，ＵＳ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用して３つのバッチのエクリズマブ（バッチＡ）を製造し、ＭＰ  ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌのＬｏｗ  ＩｇＧ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ，ＮＺ）を使用して３つのバッチのエクリズマブを産生させた（バッチＢ）。
【０１７８】
エクリズマブのバッチＢの分析超遠心によって決定されたモノマーレベル（％）は、バッチＡと同程度であり、全ての値が９８．３％〜９９．９％の範囲内であった。超遠心で決定されたモノマー％は、エクリズマブのバッチＢが平均９９．１％、エクリズマブの３つのバッチＡが平均９９．５％であった。超遠心データは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅｓ  ＣｅｎｔｅｒのＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙを利用して取得した。この方法により、モノマーＩｇＧを二量体またはそれ以上の種からなる凝集体と区別する。この方法により、連続的な沈降係数の分布を測定し、モノマー％を決定する。
【０１７９】
エクリズマブの平均分子量を、ＮＩＳＴの分子量および同位体の割合を用いて軽鎖および重鎖の主要アミノ酸配列から計算する。ジスルフィドが形成されると、３６個のシステインからの３６個の遊離チオール基が１８個のジスルフィド結合を形成する。両方の重鎖Ｎ末端のピログルタミン化、両方の重鎖Ｃ末端リジン残基の切断、およびＡｓｎ２９８における２つのＧ０Ｆグリカン残基によるグリコシル化を推定することにより、理論上のエクリズマブ抗体の主要成分の平均分子量は１４７，８６９．７０Ｄａであると計算される。
【０１８０】
エクリズマブのバッチＡおよびＢならび計算された主要成分について決定されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる平均分子量値は、外部較正されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの１％質量精度以内である。エクリズマブのバッチＡについて決定されたインタクトな分子量は１４８，６５４Ｄａの平均値を有し、バッチＢは１４８，５３１Ｄａの平均値を有する。エクリズマブのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータは、ＷＰＤ−ＰＡ−００６を使用して取得した。この方法により、インタクトな分子量に基づいて分子を同定する。試験試料は、抽出された固相であり、シナピン酸マトリックス溶液と混合され、ＭＡＬＤＩ標的上に共沈させた。この乾燥試料をレーザーでイオン化してＴＯＦ質量分析計に導入し、ｍ／ｚスペクトルを収集し、インタクトなｍＡｂのｍ／ｚを分子量に変換した。試料を３回試験し、インタクトな平均分子量を決定した。
【０１８１】
エクリズマブのバッチＢの主要ピークについて決定されたＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるインタクトな分子量値は、エクリズマブのバッチＡと同程度であり、計算された主要成分は、外部較正されたＥＳＩ−ＴｏＦ−ＭＳの１００ｐｐｍ質量精度以内である。バッチＡは１４７，８７２．０３Ｄａのインタクトな平均分子量を有し、バッチＢは１４７，８７１．９８Ｄａの平均を有していた。この値は、１４７，８６９．７０Ｄａというエクリズマブの計算された主要成分の分子量値と一致する。１４７，０００〜１４９，５００Ｄａの範囲を超える主要ピークは観察されなかった。エクリズマブのＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳデータを取得した。この方法により、インタクトな分子量に基づいて分子を同定する。試験試料をＣ４  ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に注入し、水性：有機溶媒勾配により溶出した。次いで、溶出液をＴｏＦ質量分析計内にエレクトロスプレーし、クロマトグラフピークの上半分からのスペクトルをデコンボリューションしてインタクトな分子量を得た。
【０１８２】
２つのエクリズマブバッチの重鎖および軽鎖の決定されたＮ末端配列は、既知のアミノ酸配列とエクリズマブの最初の１５個の残基が一致する。予想されたように、重鎖はＰｙｒｏＱでブロックされていることが分かり、ピログルタミン酸アミノペプチダーゼ（ＰＧＡＰ）で非ブロック化した。逐次エドマン分解およびＨＰＬＣ分析によってポリペプチド鎖のＮ末端におけるタンパク質の主要配列を決定することにより、Ｎ末端配列データを取得した。
【０１８３】
観察されたＮ結合型オリゴ糖またはグリカン分子量は、２つのエクリズマブバッチの間と同程度であり、理論上のグリカン分子量と一致する。
【０１８４】
２つのバッチについて決定された単糖の割合は同程度である。
【０１８５】
シアル酸に関して、いずれのバッチにもＮＡＮＡは検出されなかった。薬物分子に関連するシアル酸の種類および相対量を決定することによってグリコシル化パターンを評価することにより、シアル酸データを取得した。硫酸水素ナトリウムとともにインキュベーションすることによりシアル酸を抗体から化学的に切断し、次いでＯ−フェニレンジアミンでタグ付けした。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃ１８  Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅカラムを用いてＲＰ−ＨＰＬＣシステム上に試料を注入し、蛍光検出器（２３０ｎｍ励起；４２５ｎｍ放射）を用いてタグ付けされたシアル酸を検出した。試料を２回試験し、２つの結果の平均を報告した。バッチＡでは、ＮＧＮＡ含有量は、９．６、９．０、８．３、８．９ｍｍｏｌ／ｍｏｌであり、バッチＢでは、ＮＧＮＡ含有量は、６．６、６．４、６．４、６．５ｍｍｏｌ／ｍｏｌであった。
【０１８６】
例８．ＣＨＯ細胞で培養したエクリズマブ変異体
配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列からなるエクリズマブ変異体を含むベクターを担持するＣＨＯ細胞を、２００Ｌバイオリアクターによる培養で成長させる。抗体を標準的な方法により９９％超の純度まで精製し、約１０ｍｇ／ｍｌで製剤化した。いくつかのそのようなバッチを生成した。
【０１８７】
この変異体の平均分子量を、ＮＩＳＴの分子量および同位体の割合を用いて軽鎖および重鎖の主要アミノ酸配列から計算する。ジスルフィドが形成されると、３６個のシステインからの３６個の遊離チオール基が１８個のジスルフィド結合を形成する。両方の重鎖Ｎ末端のピログルタミン化、両方の重鎖Ｃ末端リジン残基の切断、およびＡｓｎ２９８における２つのＧ０Ｆグリカン残基によるグリコシル化を推定することにより、理論上の抗体の主要成分の平均分子量は１４７，８２７．６２Ｄａであると計算される。
【０１８８】
このエクリズマブ変異体の２つのバッチならびに計算された主要成分について決定されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる平均分子量値は、外部較正されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの１％質量精度以内である（１４８，４８４Ｄａおよび１４８，５２２Ｄａ）。この方法により、インタクトな分子量に基づいて分子を同定する。試験試料は、抽出された固相であり、シナピン酸マトリックス溶液と混合され、ＭＡＬＤＩ標的上に共沈させた。この乾燥試料をＮ２レーザーでイオン化ＴＯＦ質量分析計に導入し、ｍ／ｚスペクトルを収集し、インタクトなｍＡｂのｍ／ｚを分子量に変換した。試料を３回試験し、インタクトな平均分子量を決定した。
【０１８９】
２つのバッチについてインタクトな分子量を決定した。この値は、１４７，８２７．６２Ｄａという計算された主要成分の分子量値と一致しており、外部較正されたＥＳＩ−ＴｏＦ−ＭＳの１００ｐｐｍ質量精度以内である。１４７，０００〜１４９，５００Ｄａの範囲を超える主要ピークは観察されなかった。ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法は、インタクトな分子量に基づいて分子を同定する。試験試料をＣ４  ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に注入し、水性：有機溶媒勾配により溶出した。次いで、溶出液をＴｏＦ質量分析計内にエレクトロスプレーし、クロマトグラフピークの上半分からのスペクトルをデコンボリューションしてインタクトな分子量を得た。
【０１９０】
重鎖および軽鎖の決定されたＮ末端配列は、２つのバッチのアミノ酸配列と一致する。予想されたように、重鎖はＰｙｒｏＱでブロックされていることが分かり、ピログルタミン酸アミノペプチダーゼ（ＰＧＡＰ）で非ブロック化した。Ｎ末端シーケンス法は、逐次エドマン分解およびＨＰＬＣ分析によってポリペプチド鎖のＮ末端におけるタンパク質の主要配列を決定する。
【０１９１】
種々の種類のＮ結合型オリゴ糖の合計を計算する：（合計Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ）、酸性、高マンノース、中性、モノシアリル化、およびジシアリル化。酵素的に解離し、蛍光でタグ付けしたオリゴ糖の滞留時間に基づいて薬物分子に関連するＮ結合型オリゴ糖を同定することによってグリコシル化パターンを評価する方法を用いて、オリゴ糖データを取得した。この方法により、各オリゴ糖種の相対存在量を提供する。オリゴ糖は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆにより抗体から酵素的に切断し、アントラニル酸でタグ付けした。過剰なアントラニル酸は、ＨＩＬＩＣ濾過ステップを用いて除去した。Ｓｈｏｗａ  ＤｅｎｋｏのＡｓａｈｉｐａｋアミノカラムを用いてＷＡＸ−ＨＰＬＣシステム上に試料を注入し、蛍光検出器（３６０ｎｍ励起；４２０ｎｍ放射）を用いてタグ付けされたオリゴ糖を検出した。
【０１９２】
エクリズマブ変異体の２つのバッチについて単糖の割合を決定する。決定した単糖の割合は、５つの単糖（ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、フコース）についてであった。蛍光でタグ付けした単糖の滞留時間に基づいて薬物分子に関連する単糖を決定することによってグリコシル化パターンを特徴付けるアッセイを用いて、単糖データを取得した。酸加水分解によりタンパク質からオリゴ糖を除去し、その構成要素である単糖にした。次いで、還元的アミノ化によりアントラニル酸（ＡＡ）で遊離単糖にタグ付けした。次いで、Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ（登録商標）Ｃ−１８カラムを用いてＲＰ−ＨＰＬＣシステム上に試料を注入し、蛍光検出器（３６０ｎｍ励起、４２０ｎｍ放射）を用いてＡＡでタグ付けしたタンパク質を検出した。試料を２回試験し、報告された値は２つの結果の平均であった。
【０１９３】
２つのエクリズマブ抗体変異体バッチの決定されたＮＡＮＡおよびＮＧＮＡシアル酸含有量は、定量化の限界未満であった（＜６ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）。ＣＨＯ細胞で産生されたいずれのバッチにもＮＧＮＡは観察されなかった。薬物分子に関連するシアル酸の種類および相対量を決定することによってグリコシル化パターンを評価する方法を用いてシアル酸データを取得した。硫酸水素ナトリウムとともにインキュベーションすることによりシアル酸を抗体から化学的に切断し、次いでＯ−フェニレンジアミンでタグ付けした。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃ１８  Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅカラムを用いてＲＰ−ＨＰＬＣシステム上に試料を注入し、蛍光検出器（２３０ｎｍ励起；４２５ｎｍ放射）を用いてタグ付けされたシアル酸を検出した。試料を２回試験し、２つの結果の平均を報告した。
【０１９４】
表１８は、このエクリズマブ変異体の２つのバッチの糖含有量のデータをまとめたものである。
【表２０】
2018528218.tif 000023
【０１９５】
他の実施形態
上記記載は、例示的な実施形態のみを開示している。
【０１９６】
本発明を、その詳細な説明と併せて記載してきたが、上記記載は、例示を目的とするものであって、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および修正は、添付の特許請求の範囲内である。したがって、本発明の特定の特徴のみが例示および記載されてきたが、当業者は多くの修正および変更を想到するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の主旨に属するそのような全ての修正および変更を包含することを意図すると理解されたい。
表１９：核酸およびアミノ酸配列
配列番号１
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＩＦＳＮＹＷＩＱＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＥＹＴＥＮＦＫＤＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＦＦＧＳＳＰＮＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号２
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＧＡＳＥＮＩＹＧＡＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＴＮＬＡＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＮＶＬＮＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号３
重鎖（ｇ２／４）（４４８アミノ酸）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＨＩＦＳＮＹＷＩＱＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥＩＬＰＧＳＧＨＴＥＹＴＥＮＦＫＤＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＦＦＧＳＳＰＮＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＳＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号４
軽鎖：（κ）（２１４アミノ酸）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＧＡＳＥＮＩＹＧＡＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＴＮＬＡＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＮＶＬＮＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号５
ＧＹＩＦＳＮＹＷＩＱ
配列番号６
ＥＩＬＰＧＳＧＳＴＥＹＴＥＮＦＫＤ
配列番号７
ＹＦＦＧＳＳＰＮＷＹＦＤＶ
配列番号８
ＧＡＳＥＮＩＹＧＡＬＮ
配列番号９
ＧＡＴＮＬＡＤ
配列番号１０
ＱＮＶＬＮＴＰＬＴ
配列番号１１
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＩＦＳＮＹＷＩＱＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＥＹＴＥＮＦＫＤＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＦＦＧＳＳＰＮＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１２
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＧＡＳＥＮＩＹＧＡＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＴＮＬＡＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＮＶＬＮＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【配列表フリーテキスト】
【０１９７】
配列番号：１〜１２＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
【配列表】
2018528218000001.app
【国際調査報告】
2018528218.tif 000024
2018528218.tif 000025
2018528218.tif 000026