(57)【要約】ＦＸＲおよびＴＧＲ５の両方を標的とする二重アゴニストは、様々な肝臓および代謝性疾患だけでなく、腎臓および胃腸障害の処置においても有用であり得る。本発明は、化合物またはその薬学的に許容可能な塩の調製において有用な方法および新規中間体に関する。本発明の目的は、胆汁酸誘導体および新規中間体を調製する方法を提供することである。本明細書に記載の方法および中間体の使用は、ＦＸＲおよびＴＧＲ５の両方を活性化する胆汁酸誘導体の合成に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ａ）
【化３４】
2018528230.tif 000035
（式中、Ｒ１は、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を調製する方法であって；
（ａ）式（Ｂ）の化合物のアルデヒドを還元剤で変換して、式（Ｃ）の化合物を調製するステップ
【化３５】
2018528230.tif 000036
（式中、Ｒ２は保護基である）；
（ｂ）式（Ｃ）の化合物を硫酸化試薬で変換して、式（Ｄ）
【化３６】
2018528230.tif 000037
の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を調製するステップ；
（ｃ）式（Ｄ）の化合物のＣ−３ヒドロキシルを脱保護するステップ
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、Ｒ１がＣ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｃ−７ヒドロキシルがアルファ−配向性である、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、Ｒ２が−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜Ｃ４アルキルである、方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の方法であって、前記式（Ａ）の化合物が薬学的に許容可能な塩として調製される、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記式（Ａ）の化合物が化合物７Ｂ：
【化３７】
2018528230.tif 000038
である、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、化合物７Ｂを化合物７Ｃ：
【化３８】
2018528230.tif 000039
に変換することをさらに含む、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、化合物７Ｃを化合物７：
【化３９】
2018528230.tif 000040
に変換することをさらに含む、方法。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載の方法であって、ステップ（ａ）中の前記還元試薬が、ＮａＢＨ４、ＮａＣＮＢＨ３、ＬｉＢＨ４、（ｉ−Ｂｕ２ＡｌＨ）２および有機ボランから選択される、方法。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載の方法であって、ステップ（ｂ）における前記硫酸化試薬が、三酸化硫黄ピリジン、三酸化硫黄トリメチルアミン、三酸化硫黄トリエチルアミン、三酸化硫黄Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ポリ（４−ビニルピリジン）三酸化硫黄、クロロスルホン酸、発煙硫酸またはスルファミン酸から選択される、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか１項に記載の方法であって、前記Ｒ２がアセチルであり、ステップ（ｃ）における前記脱保護が酸性条件下で行われる、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法であって、式（Ｅ）の化合物を変換して、式（Ｂ）の化合物を調製すること：
【化４０】
2018528230.tif 000041
をさらに含む、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、式（Ｆ）の化合物のＣ−３ヒドロキシルを保護して、式（Ｅ）の化合物を調製すること：
【化４１】
2018528230.tif 000042
をさらに含む、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、式（Ｇ）の化合物を変換して、式（Ｆ）の化合物を調製すること：
【化４２】
2018528230.tif 000043
をさらに含む、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、式（Ｈ）の化合物を変換して、式（Ｇ）の化合物を調製すること：
【化４３】
2018528230.tif 000044
（式中、Ｒ３はＣ１〜Ｃ６アルキルである）
をさらに含む、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、式（Ｉ）の化合物を変換して、式（Ｈ）の化合物を生成させること：
【化４４】
2018528230.tif 000045
（式中、Ｒ３はＣ１〜Ｃ６アルキルである）
をさらに含む、方法。
【請求項１６】
式（Ｂ）
【化４５】
2018528230.tif 000046
（式中、Ｒ１は、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；Ｒ２は保護基である）の化合物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の化合物であって、
【化４６】
2018528230.tif 000047
である、化合物。
【請求項１８】
式（Ａ）
【化４７】
2018528230.tif 000048
（式中、Ｒ１は、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）の化合物のナトリウム塩を調製する方法であって、
（ａ）式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を水溶液中で溶解させるステップ；
（ｂ）前記水溶液を陽イオン交換樹脂に通すステップ
を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、イオン交換カラムが２価陰イオン樹脂Ｎａ＋型である、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、式（Ａ）の化合物のナトリウム塩の凍結乾燥をさらに含む、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、逆相クロマトグラフィーによる式（Ａ）の化合物のナトリウム塩を精製することをさらに含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
胆汁酸（ＢＡ）は、脂溶性栄養分の可溶化および消化における役割がよく知られている。近年、ＢＡは、全身的な内分泌機能とともにシグナル伝達分子として浮上してきた。ＢＡおよびその誘導体は、いくつかの核ホルモン受容体、特にファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）を調整することが示されており、Ｇタンパク質共役受容体ＴＧＲ５に対するアゴニストである。ＦＸＲおよびＴＧＲ５を介したシグナル伝達は、いくつかの代謝経路を調整し、ＢＡ合成および腸肝再循環だけでなく、トリグリセリド、コレステロール、グルコースおよびエネルギーホメオスタシスも制御する（Ｔｈｏｍａｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２００８，７，６７８−６９３）。
【０００２】
６α−エチル−３α，７α，２３−トリヒドロキシ−２４−ノル−５β−コラン−２３−サルフェートナトリウム塩（本明細書中で「ＩＮＴ−７６７」と呼ぶ）は、ＦＸＲおよびＴＧＲ５の両方を標的とする二重アゴニストである。
【化１】
2018528230.tif 000002
【０００３】
ＩＮＴ−７６７は、脂肪細胞によるＦＸＲ依存性の脂質取り込みを誘導し、腸内分泌細胞によるＧＬＰ−１のＴＧＲ５依存性分泌を増加させる。糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスおよびストレプトゾトシン投与により糖尿病を発症させたマウスにおけるコレステロールおよびトリグリセリドレベルの低下により、ＩＮＴ−７６７処置のインビボでの有効性が示される（Ａｄｏｒｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１０，７８，６１７−６３０）。ＦＸＲおよびＴＧＲ５の両方を標的とする二重アゴニストは、様々な肝臓および代謝性疾患だけでなく、腎臓および胃腸障害の処置においても有用であり得る。
【０００４】
ＩＮＴ−７６７を合成する様々な方法が、例えば国際公開第２００８／００２５７３号パンフレットおよびより最近の国際公開第２０１４／０６６８１９号パンフレットに記載されている。しかし、少ないステップ数で、高収率で、より高純度でＩＮＴ−７６７を調製可能である方法が現在も必要とされている。本願はこれらの要求に対処する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００８／００２５７３号
【特許文献２】国際公開第２０１４／０６６８１９号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｈｏｍａｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２００８，７，６７８−６９３
【非特許文献２】Ａｄｏｒｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１０，７８，６１７−６３０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的は、胆汁酸誘導体および新規中間体を調製する方法を提供することである。本明細書中に記載の方法および中間体の使用は、ＦＸＲおよびＴＧＲ５の両方を活性化する胆汁酸誘導体の合成に関する。
【０００８】
一態様において、本発明は、式（Ａ）：
【化２】
2018528230.tif 000003
（式中、Ｒ１はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を調製する方法であって、
（ａ）式（Ｂ）の化合物のアルデヒドを還元剤で変換して、式（Ｃ）の化合物を調製するステップ
【化３】
2018528230.tif 000004
（式中、Ｒ２は保護基である）；
（ｂ）式（Ｃ）の化合物を硫酸化試薬で変換して、式（Ｄ）
【化４】
2018528230.tif 000005
の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を調製するステップ；
（ｃ）式（Ｄ）の化合物のＣ−３ヒドロキシルを脱保護するステップ
を含む方法に関する。
【０００９】
本発明の別の目的は、本明細書中に記載の方法において中間体として使用される新規化合物を提供することである。
【００１０】
一態様において、中間体は、式（Ｂ）：
【化５】
2018528230.tif 000006
（式中、Ｒ１は、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；Ｒ２は保護基である）
の化合物である。
【００１１】
本発明の別の目的は、式（Ａ）：
【化６】
2018528230.tif 000007
（式中、Ｒ１は、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）の化合物のナトリウム塩を調製する方法であって、
（ａ）式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を水溶液中で溶解させるステップ；
（ｂ）水溶液を陽イオン交換樹脂に通すステップ
を含む方法を提供することである。
【００１２】
別段の定めがない限り、本明細書中で使用される全ての技術および科学用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載のものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用し得るが、適切な方法および材料を以下に記載する。材料、方法および例は、単なる例示であり、限定するものではない。
【００１３】
本発明の他の特徴および長所が続く詳細な記載から明らかとなろう。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
定義
本明細書および特許請求の範囲で使用されるある一定の用語をここで集める。
【００１５】
「Ｃ１〜Ｃ６アルキル」という用語は、本明細書中で使用される場合、１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有する直鎖または分岐状炭化水素部分を指す。Ｃ１〜Ｃ６アルキル部分の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチルおよびｎ−ヘキシルが挙げられるが限定されない。「Ｃ１〜Ｃ４アルキル」は、１、２、３または４個の炭素原子を有する直鎖または分岐状炭化水素部分を指す。
【００１６】
「ＤＣＭ」という用語は、本明細書中で使用される場合、ジクロロメタンを指す。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「ＭＴＢＥ」という用語は、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを指す。
【００１８】
「ＴＨＦ」という用語は、本明細書中で使用される場合、テトラヒドロフランを指す。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「ＥｔＯＡｃ」という用語は、酢酸エチルを指す。
【００２０】
「Ｈｅｘ」という用語は、本明細書中で使用される場合、ヘキサンを指す。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「ＷＦＩ」という用語は、注射用の水を指す。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「ＴＬＣ」という用語は、薄層クロマトグラフィーを指す。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「ＨＰＬＣ」という用語は、高速液体クロマトグラフィーを指す。
【００２４】
「Ｐｙｒ」という用語は、本明細書中で使用される場合、ピリジンを指す。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「還元試薬」という用語は、例えばアルデヒドをアルコールに変換する試薬を指す。
【００２６】
「硫酸化試薬」という用語は、例えばアルコールを硫酸エステルに変換する試薬を指す。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「保護基」という用語は、例えば反応条件下で安定／非反応性である（例えば、反応において使用される薬剤と非反応性）、ヒドロキシル官能基を遮蔽するための適切な部分を指す。当業者は、別の官能基、例えばカルボン酸の代わりにヒドロキシル基を保護するために使用される特定の部分を認識するであろう。
【００２８】
「陽イオン交換」という用語は、液相中の陽イオンが、負に荷電した固形ポリマーの対イオンとして存在する別の陽イオンと交換される工程を指す。陽イオン交換は、陽イオンを分離するためにクロマトグラフィーで使用され得る。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「陽イオン交換樹脂」という用語は、通過する溶液中の陽イオンとポリマー内の特定のイオンを交換可能であるポリマーを指す。陽イオン交換樹脂は、樹脂中の陽イオンと比較して、溶液中の陽イオンに対する親和性がより高い。陽イオン交換樹脂はポリスチレンスルホン酸塩に基づき得る。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容可能な塩」という用語は、ナトリウム、リチウムもしくはカリウム塩から選択されるアルカリ金属塩またはカルシウムもしくはマグネシウムから選択されるアルカリ土類金属塩を含むが限定されない塩基付加塩を指す。塩基付加塩は、アンモニウム、メチルアンモニウム、エチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニン、Ｎ−メチルグルカミンおよびコリンを含むが限定されない無機および有機アミン塩をさらに含む。
【００３１】
「薬学的に許容可能な担体」という句は、当技術分野で認められおり、何らかの対象組成物をある器官または身体の一部分から別の器官または身体の一部分へと運ぶかまたは輸送することに関与する、例えば薬学的に許容可能な材料、組成物またはビヒクル、例えば液体もしくは固形充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル封入材料などを含む。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容可能な賦形剤」という用語は、一般に安全で無毒性で、生物学的にも他の面でも望ましくないものではない医薬組成物を調製することにおいて有用である賦形剤を指し、獣医学での使用ならびにヒトの医薬での使用に対して許容可能な賦形剤を含む。
【００３３】
「溶媒和物」は、本明細書中で使用される場合、化学量論的または非化学量論的量の何れかの溶媒を含有する式（Ａ）の化合物の溶媒付加形態を指す。一部の化合物は、結晶性固相において固定されたモル比の溶媒分子を捕捉する傾向を有し、したがって溶媒和物を形成する。溶媒が水である場合、形成される溶媒和物は水和物であり、溶媒がアルコールである場合、形成される溶媒和物はアルコラートである。水和物は、１個以上の水分子と、水がＨ２Ｏとしてその分子状態を保持する物質のうちの１つとの組み合わせにより形成され、このような組み合わせは１つ以上の水和物を形成可能である。
【００３４】
「医薬組成物」は、式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含有する処方物である。一実施形態において、本医薬組成物はバルクまたは単位剤型である。単位剤型は、例えばカプセル、ＩＶバッグ、錠剤、エアロゾル吸入器の単ポンプまたはバイアルを含む様々な形態の何れかである。組成物の単位用量中の活性成分（例えば、本発明の化合物またはその塩の処方物）の量は有効量であり、関与する特定の処置に従い変動する。当業者にとって当然のことながら、例えば患者の年齢および状態に依存して、投与量に対して従来的な変更を行うことが必要であり得る。投与量は投与経路にも依存する。経口、眼内、眼、肺、直腸、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内などを含め、様々な経路が企図される。本願の化合物の局所または経皮投与のための剤型としては、粉剤、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、液剤、パッチおよび吸入薬が挙げられる。別の実施形態において、活性化合物は、薬学的に許容可能な担体と、必要とされる何らかの保存剤、緩衝剤または噴霧剤と滅菌条件下で混合される。
【００３５】
本明細書中で定義される場合、「代謝産物」という用語は、式（Ａ）の化合物のグルクロン酸抱合および硫酸化誘導体を指し、１つ以上のグルクロン酸または硫酸部分が化合物に連結される。グルクロン酸部分は、化合物のヒドロキシル基（例えば、３−ヒドロキシルおよび／または７−ヒドロキシル）とのグリコシド結合を通じて化合物と連結され得る。本化合物の硫酸化誘導体は、ヒドロキシル基（すなわち、３−ヒドロキシルまたは７−ヒドロキシル）の硫酸化を通じて形成され得る。代謝産物の例としては、式（Ａ）の化合物の、３−Ｏ−グルクロニド、７−Ｏ−グルクロニドおよび３−Ｏ−７−Ｏ−グルクロニドおよび式（Ａ）の化合物の、３−硫酸塩、７−硫酸塩および３，７−重硫酸塩誘導体が挙げられるが限定されない。
【００３６】
「処置すること」という用語は、本明細書中で使用される場合、疾患状態または状態を、緩和する、和らげる、軽減する、排除する、調節する、または改善する、すなわち疾患状態または状態の退行を引き起こすことを指す。
【００３７】
「予防すること」という用語は、本明細書中で使用される場合、特に患者または対象が疾患状態もしくは状態を発症し易いかまたは疾患状態もしくは状態に罹患するリスクがある場合に、完全にまたはほぼ完全に、患者または対象において疾患状態または状態の発症を阻止することを指す。予防はまた、例えば疾患状態または状態が既に存在し得る場合、疾患状態または状態の発症を阻害すること、すなわち疾患状態または状態の発症を抑止すること、および疾患状態または状態を緩和または改善すること、すなわち疾患状態または状態の退行を引き起こすことも含み得る。
【００３８】
「リスクを低下させる」という句は、本明細書中で使用される場合、特に対象が中枢神経系疾患、炎症性疾患および／または代謝性疾患を発症し易い場合、患者において中枢神経系疾患、炎症性疾患および／または代謝性疾患が起こる可能性または確率を低下させることを指す。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「約」または「およそ」などの用語は、数値と一緒に使用される場合、その用語が指すかまたは関連する数値よりも大きいかもしくは小さい数値の範囲を含み得る。例えば、この範囲は、その用語が指すかまたは関連する数値よりも、５％小さい〜５％大きい、４％小さい〜４％大きい、３％小さい〜３％大きい、２％小さい〜２％大きい、または１％小さい〜１％大きい、数値を含み得る。例えば、「約５」は、４．５〜５．５、４．５５〜５．４５、４．６〜５．４、４．６５〜５．３５、４．７〜５．３、４．７５〜５．２５、４．８〜５．２、４．８５〜５．１５、４．９〜５．１または４．９５〜５．０５の数値を含み得る。
【００４０】
本発明の方法
一態様において、本発明は、式（Ａ）：
【化７】
2018528230.tif 000008
（式中、Ｒ１は、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を調製する方法であって、
（ａ）式（Ｂ）の化合物のアルデヒドを還元試薬で変換して、式（Ｃ）の化合物を調製するステップ
【化８】
2018528230.tif 000009
（式中、Ｒ２は保護基である）；
（ｂ）式（Ｃ）の化合物を硫酸化試薬で変換して、式（Ｄ）
【化９】
2018528230.tif 000010
の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を調製するステップ；
（ｃ）式（Ｄ）の化合物のＣ−３ヒドロキシルを脱保護するステップ
を含む方法に関する。
【００４１】
一実施形態において、本発明の方法により調製される化合物は、式（Ａ）の化合物（式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ４アルキルである）である。別の実施形態において、Ｒ１は、メチル、エチルまたはプロピルである。また別の実施形態において、Ｒ１はエチルである。
【００４２】
一実施形態において、本発明の方法により調製される化合物は、式（Ａ）の化合物（式中、Ｃ−７ヒドロキシルはアルファ−配向性である）である。一実施形態において、Ｃ−７ヒドロキシルはベータ−配向性である。
【００４３】
また別の実施形態において、本発明の方法により調製される化合物は、式（Ａ）の化合物（式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｃ−７ヒドロキシルはアルファ−配向性である）である。一実施形態において、Ｒ１はエチルであり、Ｃ−７ヒドロキシルはアルファ−配向性である。
【００４４】
一実施形態において、本発明の方法により調製される化合物は、式（Ａ）の化合物（式中、Ｒ２保護基は、Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、任意選択により置換されるアリールオキシカルボニル、ベンゾイル、ベンジル、ピバロイル、テトラヒドロピラニルエーテル、テトラヒドロフラニル、２−メトキシエトキシメチルエーテル、メトキシメチルエーテル、エトキシエチルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、メチルチオメチルエーテル、トリフェニルメチル、ジメトキシトリチル、メトキシトリチルおよびシリルエーテルから選択される）である。一実施形態において、シリルエーテルは、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテルおよびｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルエーテルから選択される。一実施形態において、Ｒ２保護基は、ベンゾイルまたはアセチルである。一実施形態において、Ｒ２保護基は、Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜Ｃ４アルキルである。一実施形態において、Ｒ２保護基はアセチルである。
【００４５】
一実施形態において、ステップ（ａ）中の還元試薬は、ＮａＢＨ４、ＮａＣＮＢＨ３、ＬｉＢＨ４、（ｉ−Ｂｕ２ＡｌＨ）２または有機ボランである。一実施形態において、還元試薬はＮａＢＨ４である。一実施形態において、還元試薬のモル比は、約３当量〜約２当量である。別の実施形態において、モル比は約２．２当量である。
【００４６】
ステップ（ａ）における還元は、適切な溶媒を使用することにより行われる。一実施形態において、還元はアルコール性溶媒中で行われる。一実施形態において、アルコール性溶媒はメタノールである。一実施形態において、アルコール性溶媒はイソプロパノールである。一実施形態において、アルコール性溶媒はエタノールである。
【００４７】
一実施形態において、ステップ（ａ）における還元は、約２時間〜約４８時間の時間で、例えば、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間ならびにその中間のあらゆる時間増分で行われる。
【００４８】
一実施形態において、ステップ（ａ）における還元は、約−１０℃〜約１５℃の温度、例えば−１０℃、−５℃、０℃、３℃、５℃、７℃および１０℃ならびにその中間のあらゆる温度増分で行われる。一実施形態において、還元は約５℃で行われる。
【００４９】
別の実施形態において、ステップ（ｂ）の硫酸化試薬は、三酸化硫黄ピリジン、三酸化硫黄トリメチルアミン、三酸化硫黄トリエチルアミン、三酸化硫黄Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、三酸化硫黄ピリジンポリマー結合（すなわち、ポリ（４−ビニルピリジン）三酸化硫黄）、クロロスルホン酸、発煙硫酸またはスルファミン酸から選択される。一実施形態において、硫酸化試薬は三酸化硫黄トリメチルアミンである。一実施形態において、硫酸化試薬は、三酸化硫黄トリエチルアミンである。一実施形態において、硫酸化試薬は三酸化硫黄Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドである。一実施形態において、硫酸化試薬は、硫黄ピリジン錯体ポリマー結合（すなわち、ポリ（４−ビニルピリジン）三酸化硫黄）である。一実施形態において、硫酸化試薬は発煙硫酸である。一実施形態において、硫酸化試薬は三酸化硫黄ピリジンである。ある実施形態において、硫酸化試薬のモル比は、約１．３当量〜約１．０当量である。別の実施形態において、モル比は約１．０５当量である。
【００５０】
一実施形態において、ステップ（ｂ）の変換は、約３０分間〜約３時間の時間で、例えば、３０分間、４５分間、１時間、１．５時間、２時間、３時間ならびにその中間のあらゆる時間増分で行われる。
【００５１】
一実施形態において、ステップ（ｃ）の脱保護は、塩酸を使用して酸性条件下で行われる。一実施形態において、脱保護は、アンバーリストＨ＋樹脂を用いて行われる。一実施形態において、アンバーリストＨ＋樹脂の比率は、式（Ｄ）の化合物の量に関して、約１．０ｗｔ．／ｗｔ．％〜約０．３ｗｔ．／ｗｔ．％である。別の実施形態において、比率は約０．５ｗｔ．／ｗｔ．％である。
【００５２】
一実施形態において、本発明の方法により調製される化合物は化合物７Ｂ：
【化１０】
2018528230.tif 000011
である。
【００５３】
一実施形態において、本方法は、化合物７Ｂを化合物７Ｃ：
【化１１】
2018528230.tif 000012
に変換することをさらに含む。
【００５４】
一実施形態において、化合物７Ｃへの変換は、アンモニウムを含有する塩基性水溶液中で化合物７Ｂを溶解させることによって調製される。一実施形態において、塩基性溶液は水酸化アンモニウム水溶液である。一実施形態において、塩基性溶液は約２８％水酸化アンモニウム水溶液である。一実施形態において、水酸化アンモニウム水溶液は、変換中、＞８のｐＨを維持する。
【００５５】
一実施形態において、本方法は、化合物７Ｃを化合物７：
【化１２】
2018528230.tif 000013
に変換することをさらに含む。
【００５６】
一実施形態において、化合物７への変換は、
（ａ）水溶液中で化合物７Ｃを溶解させるステップ；
（ｂ）水溶液を陽イオン交換樹脂に通すステップ
を含む。
【００５７】
別の態様において、本方法は、式（Ｅ）の化合物を変換して、式（Ｂ）の化合物を調製すること：
【化１３】
2018528230.tif 000014
をさらに含む。
【００５８】
一実施形態において、式（Ｅ）の化合物をオゾンで処理し、続いてトリフェニルホスフィンまたはジメチルスルフィドを添加する。別の実施形態において、オゾンは酸素を含有する。一実施形態において、ジメチルスルフィドを使用する。別の実施形態において、トリフェニルホスフィンを使用する。一実施形態において、トリフェニルホスフィンまたはジメチルスルフィドのモル比は、約１．３当量〜約１当量である。別の実施形態において、モル比は約１．１２当量である。一実施形態において、変換はアルコール性溶媒中で行われる。一実施形態において、アルコール性溶媒はメタノールである。一実施形態において、変換は、約−７０℃〜約−５０℃の温度、例えば−７０℃、−６５℃、−６０℃、−５５℃および−５０℃ならびにその中間のあらゆる温度増分で行われる。
【００５９】
別の態様において、本方法は、式（Ｆ）の化合物のＣ−３ヒドロキシルを保護して、式（Ｅ）の化合物を調製すること：
【化１４】
2018528230.tif 000015
をさらに含む。
【００６０】
一実施形態において、式（Ｆ）の化合物を無水酢酸で処理する。一実施形態において、無水酢酸のモル比は、約２．０当量〜約１当量である。別の実施形態において、モル比は約１．６６当量である。一実施形態において、変換はジメチルアミノピリジにより触媒される。別の実施形態において、変換においてピリジンが使用される。別の実施形態において、変換はジエチルエーテルまたはテトラヒドロフラン中で行われる。一実施形態において、変換は３０℃を下回る温度で行われる。
【００６１】
一態様において、本方法は、式（Ｇ）の化合物を変換して、式（Ｆ）の化合物を調製すること：
【化１５】
2018528230.tif 000016
をさらに含む。
【００６２】
一実施形態において、式（Ｇ）の化合物をｐ−トルエンスルホン酸で処理する。一実施形態において、ｐ−トルエンスルホン酸のモル比は、約０．１当量〜約０．０２当量である。別の実施形態において、モル比は約０．０５当量である。一実施形態において、変換はアルコール性溶媒中で行われる。一実施形態において、アルコール性溶媒はエタノールである。一実施形態において、変換は、約５０℃〜約９０℃の温度、例えば、５０℃、６０℃、７０℃、７５℃、８０℃および９０℃ならびにその中間のあらゆる温度増分で行われる。
【００６３】
別の態様において、本方法は、式（Ｈ）の化合物を変換して、式（Ｇ）の化合物を調製すること：
【化１６】
2018528230.tif 000017
をさらに含む。
【００６４】
一実施形態において、式（Ｈ）の化合物をフェニルマグネシウムブロミドで処理する。別の実施形態において、フェニルマグネシウムブロミドのモル比は、約２当量〜約６当量である。別の実施形態において、モル比は約５当量である。一実施形態において、変換は、非プロトン溶媒中で行われる。一実施形態において、非プロトン溶媒はテトラヒドロフランである。一実施形態において、変換は、約２５℃〜約７０℃の温度、例えば２５℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃および７０℃ならびにその中間のあらゆる温度増分で行われる。
【００６５】
一態様において、本方法は、式（Ｉ）の化合物を変換して、式（Ｈ）の化合物を生成させること：
【化１７】
2018528230.tif 000018
をさらに含む。
【００６６】
一実施形態において、Ｃ１〜Ｃ６アルコールを用いて式（Ｉ）の化合物をエステル化する。一実施形態において、Ｃ１〜Ｃ６アルコールは、メタノールまたはエタノールである。一実施形態において、Ｃ１〜Ｃ６アルコールはメタノールである。別の実施形態において、変換は酸で触媒される。別の実施形態において、Ｈ＋Ｄｏｗｅｘ樹脂によって酸が送達される。一実施形態において、変換は、約５５℃〜約８５℃の温度、例えば５５℃、６５℃、７５℃および８５℃ならびにその中間のあらゆる温度増分で行われる。
【００６７】
本発明の別の目的は、本明細書中に記載の方法において中間体として使用される新規化合物を提供することである。一態様において、中間体は式（Ｂ）：
【化１８】
2018528230.tif 000019
（式中、Ｒ１は、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；Ｒ２は保護基である）の化合物である。
【００６８】
一実施形態において、中間体は、式（Ｂ）の化合物（式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ４アルキルである）である。別の実施形態において、Ｒ１はメチル、エチルまたはプロピルである。また別の実施形態において、Ｒ１はエチルである。一実施形態において、Ｃ−７ヒドロキシルはアルファ−配向性である。一実施形態において、Ｃ−７ヒドロキシルはベータ−配向性である。一実施形態において、Ｒ２保護基は、Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、任意選択により置換されるアリールオキシカルボニル、ベンゾイル、ベンジル、ピバロイル、テトラヒドロピラニルエーテル、テトラヒドロフラニル、２−メトキシエトキシメチルエーテル、メトキシメチルエーテル、エトキシエチルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、メチルチオメチルエーテル、トリフェニルメチル、ジメトキシトリチル、メトキシトリチルおよびシリルエーテルから選択される。一実施形態において、シリルエーテルは、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテルおよびｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルエーテルから選択される。一実施形態において、Ｒ２保護基はベンゾイルまたはアセチルである。一実施形態において、Ｒ２保護基はＣ（Ｏ）Ｃ１〜Ｃ４アルキルである。一実施形態において、Ｒ２保護基はアセチルである。
【００６９】
一実施形態において、式（Ｂ）の化合物は、
【化１９】
2018528230.tif 000020
である。
【００７０】
本発明の別の目的は、式（Ａ）：
【化２０】
2018528230.tif 000021
（式中、Ｒ１は、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）の化合物のナトリウム塩を調製する方法であって、
（ａ）式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を水溶液中で溶解させるステップ；
（ｂ）その水溶液を陽イオン交換樹脂に通すステップ
を含む方法に関する。
【００７１】
一実施形態において、式（Ａ）の化合物のナトリウム塩は、遊離塩基から調製される。一実施形態において、式（Ａ）の化合物のナトリウム塩は、アンモニウム塩から調製される。一実施形態において、式（Ａ）の化合物のナトリウム塩は、ピリジニウム塩から調製される。別の実施形態において、陽イオン交換樹脂は、Ｄｉａｉｏｎ樹脂Ｎａ＋型である。一実施形態において、陽イオン交換樹脂に通す前に、ステップ（ａ）の水溶液をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／２−メチル−テトラヒドロフランの混合物で洗浄する。別の実施形態において、陽イオン交換樹脂に通す水溶液を凍結乾燥させる。別の実施形態において、凍結乾燥生成物を研磨ろ過して（ｐｏｌｉｓｈ  ｆｉｌｔｅｒｅｄ）、硫酸ナトリウムを除去する。一実施形態において、逆相クロマトグラフィーによって式（Ａ）の化合物のナトリウム塩をさらに精製する。
【００７２】
一態様において、本願の方法は、実質的に純粋な式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を生成させる。「純度」という用語は、本明細書中で使用される場合、当技術分野で一般的に使用される分析方法（例えば、ＨＰＬＣ）に基づく、式（Ａ）の化合物の量を指す。純度は、化合物の「有機的」純度に基づき、水、溶媒、金属、無機塩などの何らかの量の尺度を含まない。一実施形態において、ＨＰＬＣにおけるピーク下面積を比較することによって、式（Ａ）の化合物の純度を参照標準物質の純度と比較する。一実施形態において、式（Ａ）の化合物の純度は約９６％を超える。一実施形態において、式（Ａ）の化合物の純度は約９８％を超える。例えば合成される式（Ａ）の化合物の純度は、９６．０％、９６．１％、９６．２％、９６．３％、９６．４％、９６．５％、９６．６％、９６．７％、９６．８％、９６．９％、９７．０％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．５％、９７．６％、９７．７％、９７．８％、９７．９％、９８．０％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％である。例えば合成される式（Ａ）の化合物の純度は、９８．０％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％である。例えば合成される式（Ａ）の化合物の純度は、９８．０％、９８．５％、９９．０％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％である。例えば合成される式（Ａ）の化合物の純度は、９８．５％、９９．０％または９９．５％である。一実施形態において、純度はＨＰＬＣにより決定される。
【００７３】
本願は、安全であり、大規模に式（Ａ）の化合物を産生させる高純度の式（Ａ）の化合物の合成のための方法を提供する。一実施形態において、本願の方法は、高収率および純度（＞９８％）である式（Ａ）の化合物を生成させる。
【００７４】
医薬組成物
本願は、経口投与のための式（Ａ）の化合物をさらに提供する。一実施形態において、本処方は、ＦＸＲおよび／またはＴＧＲ５介在性疾患および状態の予防および処置のための経口投与である。
【００７５】
経口投与に適切な処方物は、それぞれ所定量の１つ以上の式（Ａ）の化合物を含有する、錠剤、カプセル、カシェー（薬物を与えるために薬剤師により使用されるウエハカプセル）、薬用キャンディーなどの不連続単位として；粉剤または顆粒剤として；水性または非水性液体中の液剤または懸濁液として；または水中油または油中水エマルションとして提供され得る。
【００７６】
本願の処方物は、必要とされる割合で、何らかの適切な方法によって、一般的には１つ以上の式（Ａ）の化合物を液体または微粉化固形担体またはその両方と均一で密に混合し、次いで必要に応じて得られた混合物を所望の形態に成形することによって、調製され得る。
【００７７】
例えば、錠剤は、１つ以上の式（Ａ）の化合物の粉剤または顆粒剤および１つ以上の任意の成分、例えば結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤または界面活性分散剤を含む密接な混合物を圧縮することによって、または粉末化活性成分および不活性液体希釈剤の密接な混合物を鋳型成形することによって調製され得る。
【００７８】
例えば、対象の体重、例えば約５０ｋｇ〜約１００ｋｇのヒト、に基づき標的用量レベルに到達するために、１個以上の錠剤を投与し得る。
【００７９】
上記で具体的に述べられる成分に加えて、本願の経口処方物は、問題となる処方のタイプを考慮して、薬学分野の技術者にとって既知の他の物質を含み得る。経口処方物は適切に香味剤を含み得る。
【００８０】
一実施形態において、本願は、１つ以上の式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくはアミノ酸抱合体の製剤処方に関し、１つ以上の式（Ａ）の化合物は本願の工程により作製される。別の実施形態において、本処方物は経口投与される。
【００８１】
一実施形態において、本処方物は錠剤形態である。別の実施形態において、本処方物は、１つ以上の式（Ａ）の化合物および微結晶セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、コーティング材料またはコロイド状二酸化ケイ素から選択される１つ以上の成分を含む。一実施形態において、コーティング材料はＯｐａｄｒｙ（登録商標）コーティング材料である。
【００８２】
本明細書中で使用される全てのパーセンテージおよび比率は、別段の指示がない限り、重量に基づく。パーセント二量体不純物は、一般的に分析的ＨＰＬＣにより定量される場合、面積パーセントに基づく。
【００８３】
治療方法
式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、様々な医学的目的に有用である。式（Ａ）の化合物は、ＦＸＲおよび／またはＴＧＲ５介在性疾患および状態の予防または処置のための方法において使用し得る。一実施形態において、疾患または状態は、胆道閉鎖、胆汁うっ滞性肝臓疾患、慢性肝臓疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、Ｃ型肝炎感染、アルコール性肝臓疾患、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、進行性の線維症による肝損傷、肝線維症およびアテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、高コレステロール血症および高脂血症を含む心血管系疾患から選択される。一実施形態において、式（Ａ）の化合物は、トリグリセリド低下および／またはＨＤＬ上昇のための方法において使用され得る。式（Ａ）の化合物の他の効果としては、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ビリルビン、ＡＬＴ、ＡＳＴおよびＧＧＴを低下させることが挙げられる。一実施形態において、本願は、１つ以上の式（Ａ）の化合物および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物に関し、ここで１つ以上の式（Ａ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物もしくはアミノ酸抱合体は本願の方法により作製される。
【００８４】
一実施形態において、本化合物または医薬組成物は、経口、非経口または局所投与される。一実施形態において、本化合物または医薬組成物は経口投与される。
【００８５】
一実施形態において、本願は、胆汁うっ滞性状態に罹患している対象において線維症を阻害するための方法であって、有効量の１つ以上の式（Ａ）の化合物またはその医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法に関し、ここで１つ以上の式（Ａ）の化合物は本願の方法により作製される。一実施形態において、本願は、胆汁うっ滞性状態に罹患していない対象において線維症を阻害するための方法であって、対象に有効量の１つ以上の式（Ａ）の化合物またはその医薬組成物を投与するステップを含む方法に関し、ここで１つ以上の式（Ａ）の化合物は本願の方法により作製される。一実施形態において、阻害しようとする線維症は、ＦＸＲが発現される器官で生じる。
【００８６】
一実施形態において、胆汁うっ滞性状態は、アルカリホスファターゼ、７−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）および５’ヌクレオチダーゼの血清レベルの異常な上昇を有するものとして定義される。別の実施形態において、胆汁うっ滞性状態は、少なくとも１つの臨床症状とともに現れるものとしてさらに定義される。別の実施形態において、症状はかゆみ（そう痒）である。別の実施形態において、線維症は、肝線維症、腎臓線維症および腸線維症からなる群から選択される。別の実施形態において、胆汁うっ滞性状態は、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、薬物誘導性胆汁うっ滞、遺伝性胆汁うっ滞および妊娠の肝内胆汁うっ滞からなる群から選択される。別の実施形態において、対象は、原発性肝臓および胆道癌、転移性癌、敗血症、長期にわたる完全静脈栄養、嚢胞性線維症および肉芽腫性肝臓疾患からなる群から選択される疾患または状態を伴う胆汁うっ滞性状態に罹患していない。
【００８７】
一実施形態において、対象は、Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；肝寄生虫症；移植後細菌、ウイルスおよび真菌感染；アルコール性肝臓疾患（ＡＬＤ）；非アルコール性脂肪肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）；非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）；メトトレキサート、イソニアジド、オキシフェニスタチン、メチルドパ、クロルプロマジン、トルブタミドまたはアミオダロンにより誘発される肝臓疾患；自己免疫肝炎；サルコイドーシス；ウィルソン病；ヘモクロマトーシス；ゴーシェ病；ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩ、ＩＸおよびＸ型糖原病；α１−アンチトリプシン欠乏；ツェルウェーガー症候群；チロシン血症；フルクトース血症；ガラクトース血症；バッド・キアリ症候群、静脈閉塞性疾患または門脈血栓症を伴う血管撹乱；および先天性肝線維症からなる群から選択される疾患を伴う肝線維症を有する。
【００８８】
一実施形態において、対象は、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線照射後大腸炎および顕微鏡的大腸炎からなる群から選択される疾患を伴う腸線維症を有する。
【００８９】
一実施形態において、対象は、糖尿病性腎症、高血圧性腎硬化症、慢性糸球体腎炎、慢性移植糸球体症、慢性間質性腎炎および多発性嚢胞腎からなる群から選択される疾患を伴う腎臓線維症を有する。
【実施例】
【００９０】
次の実施例は、本発明のある一定の実施形態を説明するものであるが、本発明の全範囲を例示するものではない。
【００９１】
実施例１．式（Ｉ）
【化２１】
2018528230.tif 000022
（式中、Ｒ１は、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである）の化合物の合成：
式（Ｉ）の化合物は当業者により容易に調製され得る。特に、本発明の化合物は、米国特許第号７，７８６，１０２号明細書および同第７，９９４，３５２号明細書で公開されている手順に従い調製され得る。
【００９２】
実施例２．化合物１の合成
【化２２】
2018528230.tif 000023
化合物１は、国際公開第２０１３／１９２０９７号パンフレットで公開される手順に従い調製され得る。この手順において、３α−ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸（ＫＣＬＡ）を市販の出発材料として使用した。
【００９３】
実施例３．化合物７（ＩＮＴ−７６７）の合成
【化２３】
2018528230.tif 000024
出発材料として化合物１を使用した。大まかには、化合物１の側鎖酸を炭素１個、短縮した。得られたアルコールを硫酸エステルに変換し、さらにはナトリウム塩に変換した。具体的には、化合物１をエステル化し、続いてグリニャール反応を行う（それぞれステップ１および２）ことによって、カルビノール化合物３が得られた。脱水（ステップ３）および酢酸保護（ステップ４）後、得られた化合物４をオゾン処理し（ステップ５Ａ）、還元し（ステップ５Ｂ）、カラムクロマトグラフィーによって精製（ステップ５Ｃ）した。ステップ６を３ステップ：ステップ６Ａ（スルホン化）、ステップ６Ｂ（脱保護および塩の切り換え）およびステップ６Ｃ（Ｎａ＋塩への変換、凍結乾燥、Ｎａ２ＳＯ４除去および再凍結乾燥）に分離した。
【００９４】
ステップ１．化合物２の合成
【化２４】
2018528230.tif 000025
反応容器に化合物１（１．０６４ｋｇ、１ｅｑ．）、Ｈ＋Ｄｏｗｅｘ（化合物１に対して１０重量％）およびメタノール、（１２．５ｖｏｌ．）を入れた。１９〜２０時間にわたり内容物を穏やかな還流温度（約６５℃）で撹拌し、ＴＬＣ［６：４酢酸エチル：ヘキサン（ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ）、リンモリブデン酸（ＰＭＡ）染色］ならびにＨＰＬＣ分析によって反応が完了したとみなされた。約２５℃に冷却したら、内容物をろ過し、ろ紙を２体積のメタノール（ＭｅＯＨ）で洗浄した。速度が顕著に低下するまでろ液を濃縮した。次に、残留メタノールを除去するために、濃縮物をＤＣＭ（４ｖｏｌ．）中で再溶解させ、留出速度が顕著に低下するまで濃縮した。ＤＣＭ溶媒交換／濃縮を繰り返した。濃縮液を１０ｖｏｌ．のＤＣＭで希釈した後、２１％炭酸ナトリウム（２ｖｏｌ．）を添加し、内容物を４５分間撹拌した。有機層を分離し、再び反応容器に入れ、塩化ナトリウム飽和溶液（ブライン）で抽出した。相カット（ｐｈａｓｅ  ｃｕｔ）後、有機溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、再び反応容器に入れた。濃縮後、留出速度が顕著に低下するまで、無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２ｖｏｌ．）を用いて濃縮液の溶媒交換を行い、留出速度が顕著に低下するまで濃縮した。溶媒交換を３〜４回繰り返すか、または濃縮試料ＩＰＣが≦５００ｐｐｍ  ＭｅＯＨおよび≦１２５０ｐｐｍ  ＤＣＭであることが明らかになるまで繰り返した。濃縮液を約２ｖｏｌ．の無水ＴＨＦで希釈し、ドラムに滴下し、重量を測定し、ｗｔ．％を決定してステップ２に対する当量を計算した。
【００９５】
ステップ２．化合物３の合成
【化２５】
2018528230.tif 000026
反応容器＃１に前のステップからのＴＨＦ中の化合物２を入れた。ｗｔ．％を考慮して、溶液を無水ＴＨＦで希釈して、全部で約１７体積の無水ＴＨＦとした。反応容器＃２に、フェニルマグネシウムブロミド（ＴＨＦ中１．０Ｍ）（５ｅｑ．）を入れ、ラインを最小で約１ｖｏｌ．の無水ＴＨＦですすいだ。温度を＜６５℃に維持しながら、発熱反応が起こり、反応容器温度が約６０℃にゆっくりと変化するような速度で反応容器＃１の内容物（すなわち、基質）をゆっくりと＃２中のグリニャール溶液に入れた。添加（および最小の無水ＴＨＦでのラインのすすぎ）が完了したら、反応混合物を１時間撹拌し、ＴＬＣ（６：４  ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ、ＰＭＡ染色ならびにＨＰＬＣ分析によって完了したとみなされた。反応容器＃３に約１２．５ｖｏｌ．の３Ｎ  ＨＣｌ溶液を入れ、２〜５℃に冷却した。内部温度を≦１５℃に維持するような速度で、＃３中のＨＣｌ溶液に、＃２からの反応混合物をゆっくりと逆不活性化（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｄ）した。反応停止させた反応混合物を約１５℃で４５分間撹拌し続けた。撹拌を停止させ、層を分離し、相カット（ｐｈａｓｅ  ｃｕｔ）を行った。水相に約１０ｖｏｌ．のメチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）を入れ、約２０分間にわたり混合物を激しく撹拌した。撹拌停止後、相を分離し、水相を再びＭＴＢＥ（約７．５ｖｏｌ．）で抽出した。有機相を合わせ、ブライン（約７．５ｖｏｌ．）で抽出し、相カット（ｐｈａｓｅ  ｃｕｔ）を行い、有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。留出速度が顕著に低下するまで、ろ過した溶液を濃縮した。無水エタノール（４ｖｏｌ．）を添加し、留出速度が顕著に低下するまで濃縮した。エタノール溶媒交換を繰り返し、濃縮液を約４ｖｏｌ．の無水エタノールで希釈し、ドラムに滴下し、重量を測定し、ｗｔ．％を決定してステップ３に対する当量を計算した。
【００９６】
ステップ３．化合物３Ａの合成
【化２６】
2018528230.tif 000027
反応容器に前ステップからの無水エタノール中の化合物３を入れた。ｗｔ．％を考慮して、９〜１０体積に等しい総量の無水エタノールを得るために、溶液を無水エタノールで希釈した。ｐ−トルエンスルホン酸（０．０５ｅｑ）を添加し、反応物を７５℃に１６時間加熱した。ＴＬＣ（４：６  ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ、ＰＭＡ染色）ならびにＨＰＬＣ分析によって、反応完了を判定した。内容物を＜２０℃に冷却した後、重炭酸ナトリウム飽和水溶液（０．１ｅｑ．）を入れた。反応混合物をその元の体積の約１／４に濃縮し、ＤＣＭ（７ｖｏｌ．）で希釈した。次に、重炭酸ナトリウム飽和水溶液（７ｖｏｌ．）を添加し、混合物を激しく撹拌し、相を分離し、相カット（ｐｈａｓｅ  ｃｕｔ）を行った。有機層にブライン（３ｖｏｌ．）を入れた。混合物を激しく撹拌し、相を分離し、相カット（ｐｈａｓｅ  ｃｕｔ）を行った。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、留出速度が顕著に低下するまで濃縮した。無水ＴＨＦ（４ｖｏｌ．）を添加し、希釈した溶液を留出速度が顕著に低下するまで濃縮した。無水ＴＨＦ溶媒交換／濃縮を繰り返した。濃縮液を無水ＴＨＦ（４ｖｏｌ．）中で希釈し、ドラムに滴下し、重量を測定し、ｗｔ．％を決定してステップ４に対する当量を計算した。
【００９７】
ステップ４．化合物４の合成
【化２７】
2018528230.tif 000028
反応容器に前ステップからの無水ＴＨＦ中の化合物３Ａを入れた。ｗｔ．％を考慮して、約６体積に等しい総量のＴＨＦを得るために、溶液をさらなるＴＨＦで希釈した。ピリジン（１．６６ｅｑ．）および無水酢酸（１．６６ｅｑ．）を添加した。ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．０７ｅｑ．）を個別の容器中で１０ｖｏｌ．ＴＨＦ（ＤＭＡＰに対する）中で溶解させ、反応温度≦３０℃に維持しながら反応混合物にゆっくりと入れた。反応物を１６時間にわたり２５℃で保持した。ＴＬＣ（４：６  ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ、ＰＭＡ染色）ならびにＨＰＬＣ分析によって、反応完了を判定した。完了時に、反応物を０〜５℃に冷却し、クエンチ温度≦２５℃に維持しながら、水（２ｖｏｌ．）でゆっくりと反応停止させた。撹拌を停止し、層を分離した。相カット（ｐｈａｓｅ  ｃｕｔ）後、水層をＤＣＭで２回（それぞれ２ｖｏｌ．および１ｖｏｌ．）抽出し、合わせた有機層を１Ｎ  ＨＣｌ（４ｖｏｌ．）、９％重炭酸ナトリウム水溶液（２ｖｏｌ．）およびブライン（２ｖｏｌ．）の順に抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、濃縮乾固させた。
【００９８】
ステップ５Ａ．化合物５の合成
【化２８】
2018528230.tif 000029
ＤＣＭ（５．７ｖｏｌ．）およびメタノール（１．５ｖｏｌ．）を用いて、反応容器に化合物４を入れた。撹拌し、均一になったら、反応混合物を−６５〜７０℃に冷却した。溶液が緑色／青色に変色するまで、温度を≦−６０℃に維持しながらオゾン（オゾン生成装置を介する）を溶液に泡立てて通気した。少量をトリフェニルホスフィン（ＴＰＰ）で反応停止させ、ＴＬＣ（２：８、ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ）およびＨＰＬＣにより分析することによって、反応完了を確認する。添加中、クエンチ温度≦−５０℃に維持しながら、ＤＣＭ（基質に対して０．７ｖｏｌ．）中で予め溶解させたトリフェニルホスフィン（１．１２ｅｑ．）の溶液で、得られた中間体オゾニドを非常にゆっくりと反応停止させた。反応混合物の温度を０±５℃までゆっくりと上昇させた（約６時間にわたる）。内部温度＜５℃に維持しながら水（４．８ｖｏｌ．）をゆっくりと添加した。混合物を分離容器に移し、有機層を分離した。水層をＤＣＭ（２ｖｏｌ．）で逆抽出し、相カット（ｐｈａｓｅ  ｃｕｔ）を行い、合わせた有機層をブライン（１．１ｖｏｌ．）で洗浄し、相カット（ｐｈａｓｅ  ｃｕｔ）を行い、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、その後、真空下で濃縮乾固させた。
【００９９】
ステップ５Ｂおよび５Ｃ．化合物６の合成
【化２９】
2018528230.tif 000030
２００プルーフのエタノール（２ｖｏｌ．）を使用して反応容器に化合物５を入れた。撹拌して均一になったら、反応混合物を０±５℃に冷却した。反応温度≦５℃を維持するような速度で、混合物に水素化ホウ素ナトリウム（２．２ｅｑ．）を少量ずつ入れた。反応物を１５±５℃に温めた後、ＴＬＣ（４：６、ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ）およびＨＰＬＣによって分析して反応が完了したと判断した。反応混合物を０±５℃に冷却した後、温度≦５℃に維持しながら、１Ｎ  ＨＣｌ（約４．５〜５ｖｏｌ．）を滴下により添加することによって反応を停止させた（反応停止の終了までｐＨを監視；所望のｐＨ＝２）。内容物を分離容器に移し、ＤＣＭ（２．７ｖｏｌ．）を添加した。有機層を分離し、水層をＤＣＭ（２ｖｏｌ．）で逆抽出し、相カット（ｐｈａｓｅ  ｃｕｔ）を行い；合わせた有機層をブライン（１．３ｖｏｌ．）で洗浄し、相カット（ｐｈａｓｅ  ｃｕｔ）を行い、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、その後、真空下で濃縮乾固させた。ＥｔＯＡｃおよびＨｅｘでの勾配溶出によるカラムクロマトグラフィーによって残渣を精製し、純粋な分画を濃縮して、純粋な化合物６を提供した（約７０％全体収率）。
【０１００】
ステップ６．化合物７Ａの合成
【化３０】
2018528230.tif 000031
ＤＣＭ（５．５ｖｏｌ．）を使用して反応容器に化合物６（２５０．８ｇ、１ｅｑ．）を入れた。撹拌して均一になったら、三酸化硫黄ピリジン錯体（１．０５ｅｑ．）を１回で入れた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、ＨＰＬＣにより分析して完了したと判断した。反応内容物をロータリーエバポレーター（ｒｏｔｏｖａｐ）に移し、ほぼ乾固するまで濃縮した。メタノール（ＭｅＯＨ）（０．４ｖｏｌ．）を添加した後、得られた溶液を濃縮乾固させた。泡状の固形物をＭｅＯＨ（０．４ｖｏｌ．）で再希釈し、シリカプラグに通してＭｅＯＨを用いて溶出した（化合物６に対して約８／１ｗｔ．／ｗｔ．％）。ＴＬＣにより判定された生成物を含有する全分画（９：１、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ）を真空下で濃縮乾固させ、シリカゲルカラムを介して精製して、９３％収率；９８％純度で３２９．８ｇの純粋な化合物７Ａを得た。
【０１０１】
ステップ６Ｂ．化合物７Ｂの合成
【化３１】
2018528230.tif 000032
無水変性ＥｔＯＨ（１１．９ｖｏｌ．）を使用して、反応容器に化合物７Ａを入れた。水（２．８体積当量）およびアンバーリストＨ＋樹脂（化合物７Ａに対して０．５ｗｔ．／ｗｔ．％）を添加した後、反応混合物を４０±５℃で６０〜７０時間にわたり撹拌した。ＨＰＬＣ分析によって反応が完了したと判断した。反応内容物を室温に冷却し、（樹脂を除去するために）ろ過し、ロータリーエバポレーターに移し、ほぼ濃縮乾固させた。
【０１０２】
残留酢酸の除去：各ロトバップフラスコに水（約３．２／１、ｗｔ．／ｗｔ．％水／フラスコの内容量の質量）を入れた。内容物をほぼ濃縮乾固させた。前に入れた量と同量の水を入れ、濃縮乾固させることによって、この操作を繰り返した。１Ｈ  ＮＭＲ相対積分（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）、ｗｔ．／ｗｔ．％によって残留酢酸を調べた。
【０１０３】
ステップ６Ｃ．化合物７Ｃの合成
【化３２】
2018528230.tif 000033
各ロトバップフラスコに水（各フラスコに前に入れた量と同量）を入れた後、各フラスコにｐＨ＝１０になるまで２８％水酸化アンモニウムを入れた。各ロトバップフラスコの内容物をほぼ濃縮乾固させた。再び、同量の水を各フラスコに入れ、ｐＨ＝１０になるまで２８％水酸化アンモニウムも入れた。濃縮乾固後（または観察される蒸留水が最小量となるまで）、使用した各ロトバップフラスコの試料を残留ピリジン（ＧＣ）に対して供した。
【０１０４】
ステップＣ．化合物７の合成
【化３３】
2018528230.tif 000034
水（６．４ｖｏｌ．）を使用して、分離容器に化合物７Ｃを入れた。ＭＴＢＥ／２−メチルテトラヒドロフランの混合物を４／１体積（全部で４．９ｖｏｌ．）添加し、１分間撹拌した後、相を分離した。水相にＭＴＢＥ（２．５ｖｏｌ．）を添加し、混合物を１分間撹拌し、その後相カット（ｐｈａｓｅ  ｃｕｔ）した。ロータリーエバポレーターを介して水相を濃縮し、水（含まれる各フラスコに対して約３〜４ｖｏｌ．）で希釈し、再濃縮した。水溶媒交換／濃縮を繰り返し、残渣を水（約３ｖｏｌ．）中で再溶解し、イオン交換カラム（Ｄｉａｉｏｎ樹脂Ｎａ＋型、８．１／１、ｗｔ．／ｗｔ．樹脂／化合物７Ｃ）にゆっくりと通した。色（褐色〜淡褐色）を含有する分画を濃縮乾固（またはほぼ濃縮乾固）させ、水（４．３５ｖｏｌ．）で希釈し、凍結乾燥させた。凍結乾燥機サイクル完了（およびＫＦ≦５％）後、軽いスラリーが観察されるまで、無水エタノール（３．８〜４．０ｖｏｌ．）を含有する反応容器に得られた綿毛状の固形物を添加した。溶液を研磨ろ過して（ｐｏｌｉｓｈ  ｆｉｌｔｅｒｅｄ）、微量の硫酸ナトリウム副産物を除去した。濃縮乾固後、残渣を水（４ｖｏｌ．）で希釈し、濃縮乾固させた（残留ＥｔＯＨを除去）。水（４．３５ｖｏｌ．）で残渣を希釈した後、溶液を再び凍結乾燥に供した。高解像度エレクトロスプレーイオン化質量分析によって化合物７（Ｃ２５Ｈ４３Ｏ６Ｓ）の陰イオンの分子量を確認したところ、４７１．２８ｍ／ｅであった。この工程によって、ＨＰＬＣ（ＥＬＳＤ）により、９９％純度の、３１６．１ｇの化合物７が得られた。同じ工程により調製した化合物７の他のバッチでは、ＨＰＬＣにより約７２％収率および９９．２％の純度で化合物７が得られた。
【０１０５】
化合物７をまた逆相クロマトグラフィーによってさらに精製した。本手順は、ＷＦＩ（１０．１ｖｏｌ．）中で化合物７を溶解させることを伴い、半径方向圧縮型のＢｉｏｔａｇｅ  Ｆｌａｓｈ  ４００Ｌ逆相カラム装置上に載せた。ＷＦＩに対するＨＰＬＣグレードアセトニトリル（ＡＣＮ）比の勾配をゆっくりと上昇させ、ＨＰＬＣによって分画を分析して、所望の純粋な分画（＞９０〜１００％純度）を判定した。次いで、凍結乾燥機に入れるのに合理的な体積まで純粋な分画を濃縮した（そのままでのＨＰＬＣアッセイ（ｗｔ／ｗｔ％）は１０３．５％であった）。
【国際調査報告】
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