(57)【要約】分散勾配を準備するための方法、並びに競合分子の存在下で完全な化学反応速度論及び親和性分析を決定するためのＳＰＲ注入方法が開示される。このＳＰＲ注入は、２つ以上のサンプルの分散勾配をＳＰＲフローセル及び検出器に提供する。【選択図】  図１
2018528436.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不均一溶液内のモノマーの凝集体形態の存在を決定するための方法であって、
前記溶液内の少なくとも１つのモノマーを識別して、前記モノマーのＤｍを決定するステップと、
前記溶液内の合計分析物濃度（Ｃｔｏｔ）を決定するステップであり、前記合計分析物濃度が、前記溶液内に存在するモノマー濃度（Ｃｍ）及び任意の凝集体濃度（Ｃａ）の両方を含んでいる、ステップと、
パルス型注入手法を使用してテイラー分散条件下でサンプルを注入することによって、前記モノマー及び凝集体を含んでいる前記溶液の前記サンプルに対して表面プラズモン共鳴分析を実行するステップと、
テイラー分散条件下で表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線を決定するステップと、
最小二乗フィッティング手法を使用して、式＃１ａ
【数１】
2018528436.tif 000012
を前記サンプルの表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線にフィッティングするステップであり、
Ｃｍ＝モノマー濃度
Ｃａ＝凝集体濃度
Ｃｔｏｔ＝合計タンパク質濃度（モノマーと凝集体の合計）
（式＃１ｂ）Ｃｍ＝Ｃｔｏｔ−Ｃａ
ｄｎｄｃ＝前記分析物の屈折率増分（通常はｍＬ／ｍｇ＊ＲＵ）
Ｖｉ＝サンプル注入量（ｍ３）
ｄ＝管の直径（ｍ）
Ｔ＝分析物の平均滞留時間＝Ｌ／ｕ（ｓ）
Ｌ＝管の長さ（ｍ）
ｕ＝流体の平均速度（ｍ／ｓ）
ｋｍ＝モノマー種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数２】
2018528436.tif 000013
ｋａ＝凝集体種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数３】
2018528436.tif 000014
Ｄｍ＝モノマー種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
Ｄａ＝凝集体種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
であるステップと、
式＃１ａを前記バルク屈折率応答曲線にフィッティングした後に、以て近似的なＣａを提供するステップと、Ｄａを解くステップであり、ＤａがＤｍと同じではないときに、前記不均一溶液内の前記モノマーの凝集体形態が存在すると決定するステップとを含む、方法。
【請求項２】
Ｄｍ対Ｄａの比を使用して前記凝集体内のモノマーの数を推定するステップをさらに含み、ＤｍをＤａで割った値が、前記サンプル内で検出された前記凝集体形態でのモノマーの平均数に等しい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
不均一溶液内のモノマーの凝集体形態の濃度を決定するための方法であって、
前記溶液内の少なくとも１つのモノマーを識別して、前記モノマーのＤｍを決定するステップと、
前記溶液内の合計分析物濃度（Ｃｔｏｔ）を決定するステップであり、前記合計分析物濃度が、前記溶液内に存在するモノマー濃度（Ｃｍ）及び任意の凝集体濃度（Ｃａ）の両方を含んでいる、ステップと、
パルス型注入手法を使用してテイラー分散条件下でサンプルを注入することによって、前記モノマー及び凝集体を含んでいる前記溶液の前記サンプルに対して表面プラズモン共鳴分析を実行するステップと、
テイラー分散条件下で表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線を決定するステップと、
最小二乗フィッティング手法を使用して、式＃１ａ
【数４】
2018528436.tif 000015
を前記サンプルの表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線にフィッティングするステップであり、
Ｃｍ＝モノマー濃度
Ｃａ＝凝集体濃度
Ｃｔｏｔ＝合計タンパク質濃度（モノマーと凝集体の合計）
Ｃｍ＝Ｃｔｏｔ−Ｃａ（式＃１ｂ）
ｄｎｄｃ＝前記分析物の屈折率増分（通常はｍＬ／ｍｇ＊ＲＵ）
Ｖｉ＝サンプル注入量（ｍ３）
ｄ＝管の直径（ｍ）
Ｔ＝分析物の平均滞留時間＝Ｌ／ｕ（ｓ）
Ｌ＝管の長さ（ｍ）
ｕ＝流体の平均速度（ｍ／ｓ）
ｋｍ＝モノマー種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数５】
2018528436.tif 000016
ｋａ＝凝集体種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数６】
2018528436.tif 000017
Ｄｍ＝モノマー種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
Ｄａ＝凝集体種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
であるステップと、
式＃１ａを前記バルク屈折率応答曲線にフィッティングした後に、前記サンプル内の前記凝集体の前記Ｄａ及びＣａを計算するステップとを含む、方法。
【請求項４】
Ｄｍ対Ｄａの比を使用して前記凝集体内のモノマーの数を推定するステップをさらに含み、ＤｍをＤａで割った値が、前記サンプル内で検出された前記凝集体形態でのモノマーの平均数に等しい、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
不均一溶液内のモノマーの凝集体形態の存在を決定するための方法であって、
前記溶液内の少なくとも１つのモノマーを識別して、前記モノマーのＤｍを決定するステップと、
前記溶液内の合計分析物濃度（Ｃｔｏｔ）を決定するステップであり、前記合計分析物濃度が、前記溶液内に存在するモノマー濃度（Ｃｍ）及び任意の凝集体濃度（Ｃａ）の両方を含んでいる、ステップと、
パルス型注入手法を使用してテイラー分散条件下でサンプルを注入することによって、前記溶液の前記サンプルに対して表面プラズモン共鳴分析を実行するステップであり、前記サンプルが少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌの前記モノマー及び凝集体を合わせた濃度を有する、ステップと、
テイラー分散条件下で表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線を決定するステップと、
最小二乗フィッティング手法を使用して、
式＃１ａ
【数７】
2018528436.tif 000018
を前記サンプルの表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線にフィッティングするステップであり、
Ｃｍ＝モノマー濃度
Ｃａ＝凝集体濃度
Ｃｔｏｔ＝合計タンパク質濃度（モノマーと凝集体の合計）
（式＃１ｂ）Ｃｍ＝Ｃｔｏｔ−Ｃａ
ｄｎｄｃ＝前記分析物の屈折率増分（通常はｍＬ／ｍｇ＊ＲＵ）
Ｖｉ＝サンプル注入量（ｍ３）
ｄ＝管の直径（ｍ）
Ｔ＝分析物の平均滞留時間＝Ｌ／ｕ（ｓ）
Ｌ＝管の長さ（ｍ）
ｕ＝流体の平均速度（ｍ／ｓ）
ｋｍ＝モノマー種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数８】
2018528436.tif 000019
ｋａ＝凝集体種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数９】
2018528436.tif 000020
Ｄｍ＝モノマー種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
Ｄａ＝凝集体種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
であるステップと、
式＃１ａを前記バルク屈折率応答曲線にフィッティングした後に、以て近似的なＣａを提供するステップと、Ｄａを解くステップであり、ＤａがＤｍと同じではないときに、前記不均一溶液内の前記モノマーの凝集体形態が存在すると決定するステップとを含む、方法。
【請求項６】
Ｄｍ対Ｄａの比を使用して前記凝集体内のモノマーの数を推定するステップをさらに含み、ＤｍをＤａで割った値が、前記サンプル内で検出された前記凝集体形態でのモノマーの平均数に等しい、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
不均一溶液内のモノマーの凝集体形態の濃度を決定するための方法であって、
前記溶液内の少なくとも１つのモノマーを識別して、前記モノマーのＤｍを決定するステップと、
前記溶液内の合計分析物濃度（Ｃｔｏｔ）を決定するステップであり、前記合計分析物濃度が、前記溶液内に存在するモノマー濃度（Ｃｍ）及び任意の凝集体濃度（Ｃａ）の両方を含んでいる、ステップと、
パルス型注入手法を使用してテイラー分散条件下でサンプルを注入することによって、前記溶液の前記サンプルに対して表面プラズモン共鳴分析を実行するステップであり、前記サンプルが少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌの前記モノマー及び凝集体を合わせた濃度を有する、ステップと、
テイラー分散条件下で表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線を決定するステップと、
最小二乗フィッティング手法を使用して、式＃１ａ
【数１０】
2018528436.tif 000021
を前記サンプルの表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線にフィッティングするステップであり、
Ｃｍ＝モノマー濃度
Ｃａ＝凝集体濃度
Ｃｔｏｔ＝合計タンパク質濃度（モノマーと凝集体の合計）
Ｃｍ＝Ｃｔｏｔ−Ｃａ（式＃１ｂ）
ｄｎｄｃ＝前記分析物の屈折率増分（通常はｍＬ／ｍｇ＊ＲＵ）
Ｖｉ＝サンプル注入量（ｍ３）
ｄ＝管の直径（ｍ）
Ｔ＝分析物の平均滞留時間＝Ｌ／ｕ（ｓ）
Ｌ＝管の長さ（ｍ）
ｕ＝流体の平均速度（ｍ／ｓ）
ｋｍ＝モノマー種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数１１】
2018528436.tif 000022
ｋａ＝凝集体種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数１２】
2018528436.tif 000023
Ｄｍ＝モノマー種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
Ｄａ＝凝集体種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
であるステップと、
式＃１ａを前記バルク屈折率応答曲線にフィッティングした後に、前記サンプル内の前記凝集体の前記Ｄａ及びＣａを計算するステップとを含む、方法。
【請求項８】
Ｄｍ対Ｄａの比を使用して前記凝集体内のモノマーの数を推定するステップをさらに含み、ＤｍをＤａで割った値が、前記サンプル内で検出された前記凝集体形態でのモノマーの平均数に等しい、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
不均一溶液内のモノマーの凝集体形態の存在を決定するための方法であって、
前記溶液内の少なくとも１つのモノマーを識別して、前記モノマーのＤｍを決定するステップと、
前記溶液内の合計分析物濃度（Ｃｔｏｔ）を決定するステップであり、前記合計分析物濃度が、前記溶液内に存在するモノマー濃度（Ｃｍ）及び任意の凝集体濃度（Ｃａ）の両方を含んでいる、ステップと、
シグモイド型注入手法を使用してテイラー分散条件下でサンプルを注入することによって、前記モノマー及び凝集体を含んでいる前記溶液の前記サンプルに対して表面プラズモン共鳴分析を実行するステップと、
テイラー分散条件下で表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線を決定するステップと、
最小二乗フィッティング手法を使用して、式＃２ａ
【数１３】
2018528436.tif 000024
を前記サンプルの表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線にフィッティングするステップであり、
Ｃｍ＝モノマー濃度
Ｃａ＝凝集体濃度
Ｃｔｏｔ＝合計タンパク質濃度（モノマーと凝集体の合計）
（式＃１ｂ）Ｃｍ＝Ｃｔｏｔ−Ｃａ
ｄｎｄｃ＝前記分析物の屈折率増分（通常はｍＬ／ｍｇ＊ＲＵ）
ｅｒｆ＝ガウス誤差関数
ｄ＝管の直径（ｍ）
Ｔ＝分析物の平均滞留時間＝Ｌ／ｕ（ｓ）
Ｌ＝管の長さ（ｍ）
ｕ＝流体の平均速度（ｍ／ｓ）
ｋｍ＝モノマー種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数１４】
2018528436.tif 000025
ｋａ＝凝集体種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数１５】
2018528436.tif 000026
Ｄｍ＝モノマー種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
Ｄａ＝凝集体種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
であるステップと、
式＃２ａを前記バルク屈折率応答曲線にフィッティングした後に、以て近似的なＣａを提供するステップと、Ｄａを解くステップであり、ＤａがＤｍと同じではないときに、前記不均一溶液内の前記モノマーの凝集体形態が存在すると決定するステップとを含む、方法。
【請求項１０】
Ｄｍ対Ｄａの比を使用して前記凝集体内のモノマーの数を推定するステップをさらに含み、ＤｍをＤａで割った値が、前記サンプル内で検出された前記凝集体形態でのモノマーの平均数に等しい、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
不均一溶液内のモノマーの凝集体形態の濃度を決定するための方法であって、
前記溶液内の少なくとも１つのモノマーを識別して、前記モノマーのＤｍを決定するステップと、
前記溶液内の合計分析物濃度（Ｃｔｏｔ）を決定するステップであり、前記合計分析物濃度が、前記溶液内に存在するモノマー濃度（Ｃｍ）及び任意の凝集体濃度（Ｃａ）の両方を含んでいる、ステップと、
シグモイド型注入手法を使用してテイラー分散条件下でサンプルを注入することによって、前記モノマー及び凝集体を含んでいる前記溶液の前記サンプルに対して表面プラズモン共鳴分析を実行するステップと、
テイラー分散条件下で表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線を決定するステップと、
最小二乗フィッティング手法を使用して、式＃２ａ
【数１６】
2018528436.tif 000027
を前記サンプルの表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線にフィッティングするステップであり、
Ｃｍ＝モノマー濃度
Ｃａ＝凝集体濃度
Ｃｔｏｔ＝合計タンパク質濃度（モノマーと凝集体の合計）
Ｃｍ＝Ｃｔｏｔ−Ｃａ（式＃１ｂ）
ｄｎｄｃ＝前記分析物の屈折率増分（通常はｍＬ／ｍｇ＊ＲＵ）
ｅｒｆ＝ガウス誤差関数
ｄ＝管の直径（ｍ）
Ｔ＝分析物の平均滞留時間＝Ｌ／ｕ（ｓ）
Ｌ＝管の長さ（ｍ）
ｕ＝流体の平均速度（ｍ／ｓ）
ｋｍ＝モノマー種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数１７】
2018528436.tif 000028
ｋａ＝凝集体種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数１８】
2018528436.tif 000029
Ｄｍ＝モノマー種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
Ｄａ＝凝集体種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
であるステップと、
式＃２ａを前記バルク屈折率応答曲線にフィッティングした後に、前記サンプル内の前記凝集体の前記Ｄａ及びＣａを計算するステップとを含む、方法。
【請求項１２】
Ｄｍ対Ｄａの比を使用して前記凝集体内のモノマーの数を推定するステップをさらに含み、ＤｍをＤａで割った値が、前記サンプル内で検出された前記凝集体形態でのモノマーの平均数に等しい、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
不均一溶液内のモノマーの凝集体形態の存在を決定するための方法であって、
前記溶液内の少なくとも１つのモノマーを識別して、前記モノマーのＤｍを決定するステップと、
前記溶液内の合計分析物濃度（Ｃｔｏｔ）を決定するステップであり、前記合計分析物濃度が、前記溶液内に存在するモノマー濃度（Ｃｍ）及び任意の凝集体濃度（Ｃａ）の両方を含んでいる、ステップと、
シグモイド型注入手法を使用してテイラー分散条件下でサンプルを注入することによって、前記溶液の前記サンプルに対して表面プラズモン共鳴分析を実行するステップであり、前記サンプルが少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌの前記モノマー及び凝集体を合わせた濃度を有する、ステップと、
テイラー分散条件下で表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線を決定するステップと、
最小二乗フィッティング手法を使用して、
式＃２ａ
【数１９】
2018528436.tif 000030
を前記サンプルの表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線にフィッティングするステップであり、
Ｃｍ＝モノマー濃度
Ｃａ＝凝集体濃度
Ｃｔｏｔ＝合計タンパク質濃度（モノマーと凝集体の合計）
（式＃１ｂ）Ｃｍ＝Ｃｔｏｔ−Ｃａ
ｄｎｄｃ＝前記分析物の屈折率増分（通常はｍＬ／ｍｇ＊ＲＵ）
ｅｒｆ＝ガウス誤差関数
ｄ＝管の直径（ｍ）
Ｔ＝分析物の平均滞留時間＝Ｌ／ｕ（ｓ）
Ｌ＝管の長さ（ｍ）
ｕ＝流体の平均速度（ｍ／ｓ）
ｋｍ＝モノマー種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数２０】
2018528436.tif 000031
ｋａ＝凝集体種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数２１】
2018528436.tif 000032
Ｄｍ＝モノマー種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
Ｄａ＝凝集体種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
であるステップと、
式＃２ａを前記バルク屈折率応答曲線にフィッティングした後に、以て近似的なＣａを提供するステップと、Ｄａを解くステップであり、ＤａがＤｍと同じではないときに、前記不均一溶液内の前記モノマーの凝集体形態が存在すると決定するステップとを含む、方法。
【請求項１４】
Ｄｍ対Ｄａの比を使用して前記凝集体内のモノマーの数を推定するステップをさらに含み、ＤｍをＤａで割った値が、前記サンプル内で検出された前記凝集体形態でのモノマーの平均数に等しい、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
不均一溶液内のモノマーの凝集体形態の濃度を決定するための方法であって、
前記溶液内の少なくとも１つのモノマーを識別して、前記モノマーのＤｍを決定するステップと、
前記溶液内の合計分析物濃度（Ｃｔｏｔ）を決定するステップであり、前記合計分析物濃度が、前記溶液内に存在するモノマー濃度（Ｃｍ）及び任意の凝集体濃度（Ｃａ）の両方を含んでいる、ステップと、
シグモイド型注入手法を使用してテイラー分散条件下でサンプルを注入することによって、前記溶液の前記サンプルに対して表面プラズモン共鳴分析を実行するステップであり、前記サンプルが少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌの前記モノマー及び凝集体を合わせた濃度を有する、ステップと、
テイラー分散条件下で表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線を決定するステップと、
最小二乗フィッティング手法を使用して、
式＃２ａ
【数２２】
2018528436.tif 000033
を前記サンプルの表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線にフィッティングするステップであり、
Ｃｍ＝モノマー濃度
Ｃａ＝凝集体濃度
Ｃｔｏｔ＝合計タンパク質濃度（モノマーと凝集体の合計）
Ｃｍ＝Ｃｔｏｔ−Ｃａ（式＃１ｂ）
ｄｎｄｃ＝前記分析物の屈折率増分（通常はｍＬ／ｍｇ＊ＲＵ）
ｅｒｆ＝ガウス誤差関数
ｄ＝管の直径（ｍ）
Ｔ＝分析物の平均滞留時間＝Ｌ／ｕ（ｓ）
Ｌ＝管の長さ（ｍ）
ｕ＝流体の平均速度（ｍ／ｓ）
ｋｍ＝モノマー種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数２３】
2018528436.tif 000034
ｋａ＝凝集体種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数２４】
2018528436.tif 000035
Ｄｍ＝モノマー種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
Ｄａ＝凝集体種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
であるステップと、
式＃２ａを前記バルク屈折率応答曲線にフィッティングした後に、前記サンプル内の前記凝集体の前記Ｄａ及びＣａを計算するステップとを含む、方法。
【請求項１６】
Ｄｍ対Ｄａの比を使用して前記凝集体内のモノマーの数を推定するステップをさらに含み、ＤｍをＤａで割った値が、前記サンプル内で検出された前記凝集体形態でのモノマーの平均数に等しい、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願への相互参照］
[0001]本出願は、２０１５年９月２８日に出願された米国特許仮出願第６２／２３３６０５号の利益を請求する。
【０００２】
［背景］
[0002]大きい生体分子が２つ以上の分子の凝集体をいつどの程度形成するかを理解することは、治療法の開発及び分子の一般的理解にとって重要である。不均一溶液内の凝集体形態及び凝集率を推定するための現在の手法は、複数のステップを必要とする。１つの方法は、拡散係数の近似を使用して、溶液内の凝集率を決定する。図３に示されているように、拡散係数における変化が、不均一溶液内の凝集率の推定に適した較正曲線の生成に使用され得る。図３の傾きは、さまざまな程度の既知の凝集率を有するデキストラン溶液を使用して準備された。
【０００３】
[0003]残念ながら、タンパク質、ＤＮＡ、ペプチド、及びホルモンなどの、ただしこれらに限定されない多くの生体分子は、図３に示されたような較正表で使用するための既知の凝集体標準物質を簡単に準備することを可能にしない。したがって、そのような化合物の凝集体形態の存在及び割合を決定するための較正不要な方法は、それらの生体分子の研究にとって有益である。
【０００４】
［概要］
[0004]本明細書では、モノマーと凝集体の不均一な混合物内の凝集体の存在を定性的に決定するための方法が開示される。本明細書では、モノマーと凝集体の不均一な混合物内の凝集率を定量的に決定するための方法も開示される。モノマーと凝集体の不均一な混合物内の凝集体の構成要素を構成するモノマーの数を推定するための方法がさらに開示される。
【０００５】
[0005]本発明の方法は、パルス型注入又はシグモイド型注入のいずれかを使用して実行され、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）分析で使用するためのテイラー分散を生成することができる。
【０００６】
[0006]本明細書では、不均一溶液内のモノマーの凝集体形態の存在を決定するための方法が開示される。この方法は、
上記の溶液内の少なくとも１つのモノマーを識別して、このモノマーのＤｍを決定するステップと、
上記の溶液内の合計分析物濃度（Ｃｔｏｔ）を決定するステップであって、この合計分析物濃度が、上記の溶液内に存在するモノマー濃度（Ｃｍ）及び任意の凝集体濃度（Ｃａ）の両方を含んでいる、ステップと、
パルス型注入手法を使用してテイラー分散条件下でサンプルを注入することによって、上記のモノマー及び凝集体を含んでいる上記の溶液のこのサンプルに対してＳＰＲ分析を実行するステップと、
テイラー分散条件下でＳＰＲバルク屈折率応答曲線を決定するステップと、
最小二乗フィッティング手法を使用して、式＃１ａ
【数１】
2018528436.tif 000003
を上記のサンプルのＳＰＲバルク屈折率応答曲線にフィッティングするステップであって、
Ｃｍ＝モノマー濃度
Ｃａ＝凝集体濃度
Ｃｔｏｔ＝合計タンパク質濃度（モノマーと凝集体の合計）
Ｃｍ＝Ｃｔｏｔ−Ｃａ（式＃１ｂ）
ｄｎｄｃ＝分析物のＲＩＩ（通常はｍＬ／ｍｇ＊ＲＵ）
Ｖｉ＝サンプル注入量（ｍ３）
ｄ＝管の直径（ｍ）
Ｔ＝分析物の平均滞留時間＝Ｌ／ｕ（ｓ）
Ｌ＝管の長さ（ｍ）
ｕ＝流体の平均速度（ｍ／ｓ）
ｋｍ＝モノマー種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数２】
2018528436.tif 000004
ｋａ＝凝集体種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数３】
2018528436.tif 000005
Ｄｍ＝モノマー種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
Ｄａ＝凝集体種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
であるステップと、
式＃１ａをバルク屈折率応答曲線にフィッティングした後に、以て近似的なＣａを提供するステップと、Ｄａを解くステップであって、ＤａがＤｍと同じではないときに、上記の不均一溶液内のモノマーの凝集体形態が存在すると決定するステップとを含む。
【０００７】
[0007]前述の方法は、テイラー分散条件下でシグモイド型注入を使用して行われてもよい。シグモイド型注入を使用する場合は、式１ａの代わりに式２ａを使用する。式２ａは、
【数４】
2018528436.tif 000006
であり、
ｅｒｆ＝ガウス誤差関数
である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】一部の実施形態の流体供給システムを使用することができるＳＰＲ試験システムの図である。
【図２】本明細書で開示された方法を実践するのに適したシステムの１つの構成を概略的に示す図である。
【図３】デキストランの凝集率を決定するための較正表である。
【図４】デキストランモノマーの均一溶液（すなわち、１００％のモノマー）及びデキストランの凝集体の均一溶液（すなわち、実質的に１００％の凝集体）のＳＰＲ応答曲線を示す図である。
【図５】デキストランモノマーの均一溶液（すなわち、１００％のモノマー）並びにモノマー及び凝集体の不均一なデキストラン溶液のＳＰＲ応答曲線を示す図であり、この凝集体は重量で２２％である。
【図６】溶液内に実質的に凝集体が存在しないウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）のＳＰＲ応答曲線を示す図である。
【図７】ＢＳＡの凝集を開始するためにＢＳＡを一定期間加熱した後の、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＳＰＲ応答曲線を示す図である。
【図８】ＢＳＡの凝集を開始するためにＢＳＡを一定期間加熱した後の、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＳＰＲ応答曲線を示す図である。
【図９】ＢＳＡの凝集を開始するためにＢＳＡを一定期間加熱した後の、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＳＰＲ応答曲線を示す図である。
【図１０】ＢＳＡの凝集を開始するためにＢＳＡを一定期間加熱した後の、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＳＰＲ応答曲線を示す図である。
【図１１】ＢＳＡの凝集を開始するためにＢＳＡを一定期間加熱した後の、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＳＰＲ応答曲線を示す図である。
【図１２】ＢＳＡの凝集を開始するためにＢＳＡを一定期間加熱した後の、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＳＰＲ応答曲線を示す図である。
【図１３】ＢＳＡの凝集を開始するためにＢＳＡを一定期間加熱した後の、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＳＰＲ応答曲線を示す図である。
【図１４】ＢＳＡの凝集を開始するためにＢＳＡを一定期間加熱した後の、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＳＰＲ応答曲線を示す図である。
【図１５】ＢＳＡの凝集を開始するためにＢＳＡを一定期間加熱した後の、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＳＰＲ応答曲線を示す図である。
【図１６】ＢＳＡの凝集を開始するためにＢＳＡを一定期間加熱した後の、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＳＰＲ応答曲線を示す図である。
【図１７】熱応力が加えられたＢＳＡのＳＰＲバルク屈折率曲線への式＃１ａのフィッティングを示す図である。
【０００９】
［発明を実施するための形態］
[0016]ＳＰＲ手法は当業者によく知られているため、本明細書では詳細に説明されない。以下の開示では、モノマーと凝集体の不均一な混合物内の凝集体の存在、濃度、及び推定された特性評価を評価するための方法に重点を置く。
【００１０】
[0017]分散勾配が、フローインジェクションベースの検出システムを使用して分析されてもよい。本開示の目的で、分散勾配の分析が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に関して説明される。通常は生体分子相互作用分析の応用に使用されるフローインジェクションベースの検出システムでは、少なくとも１つの分析物を含んでいるサンプルは、フローインジェクションを通じて表面高感度検出器を横断して流れる。この例では、サンプルは、ＳＰＲ検出面を収容するＳＰＲセルを通じて流れる。
【００１１】
[0018]本明細書で開示された方法を実践するのに適したＳＰＲ試験システムが、図１及び図２を参照して簡単に説明される。図１では、ＳＰＲシステム１００が示されている。ＳＰＲシステム１００は、流路、バルブ、ポンプ、及び／又は流体の実質的に一定の流れを複数の流体源からフローセル１０４へ提供するように構成されたその他の構成要素の複合体を含んでいるフローインジェクションシステム又は流体供給システム１０２を含んでいる。一実施形態によれば、フローセル１０４は、ＳＰＲ測定を実行するように構成された光インターフェイスアセンブリ１０６に動作可能なように連結されてもよい。ＳＰＲ光インターフェイスアセンブリは従来技術において知られており、薄膜光基板、プリズム、照明器、及び検出器を含むことができる。
【００１２】
[0019]通常、フローセルは、ＳＰＲ結合面と複数のアクティブな検出領域（図示されていない）の間の電気光学的関係を維持するように構成されてもよい。
【００１３】
[0020]光インターフェイスアセンブリ１０６は、薄膜光基板に光を当て、反射された光エネルギーの量における変動を検出するよう機能する。次に、反射された光エネルギーの量は、分析物からアクティブな検出領域への分子又は生体分子の結合（又は結合しないこと）による影響を受ける。アクティブな検出領域への分析物の結合が存在しない場合であっても、検出領域の表面の誘電特性を変化させるほど十分な濃度が存在する場合は、生体分子は、反射された光エネルギーの量に影響を与える。結合していない分析物の分析を実行する場合、アクティブなＳＰＲ領域は、通常、分析物の非特異的結合を防ぐ能力のために選択された化合物で覆われる。適切な被覆材の一例は、カルボキシメチルデキストランである。
【００１４】
[0021]前述したように、光インターフェイスアセンブリ１０６は、通常、薄膜光基板に光を当てるように構成された照明器を含む。この照明器は、照明器を作り出すよう機能する複数の個別の構成要素及び／又は統合された構成要素を含むことができる。通常、プリズムは、照明器から光を受信し、その光を薄膜光基板に連結するように位置合わせされる。光の光子の一部は、表面プラズモンに変換されることがある。一部のＳＰＲシステムでは、残りの光子が薄膜光基板から反射され、プリズムは、それらの光子を検出器に連結するように構成される。検出器は、薄膜光基板の表面から反射された光子の比率における変動を検出するよう機能する。その他のＳＰＲシステムは、ＳＰＲディップの最小値を追跡することによってプラズモンの放射角度におけるずれを検出する。
【００１５】
[0022]コントローラ１０８は、流体供給システム１０２及び光インターフェイスアセンブリ１０６に動作可能なように連結されてもよく、外部コンピューティングシステム又はネットワーク１１０へのインターフェイスを含んでもよい。或いは、外部コンピューティングシステム又はネットワーク１１０へのインターフェイスは省略されてもよく、装置１００は、スタンドアロンシステムとして動作してもよい。コントローラ１０８は、照明器の出力を制御することと、検出器によって取得された画像に対して画像処理を実行することと、データ分析を実行する、又は画像処理のために外部プロセッサ１１０へ画像データを送信することと、内部構成要素及び外部システムとの間で状態及びコマンドデータを送受信することと、キーボード、ディスプレイ、及び／又はその他の状態インジケータ（図示されていない）を介してヒューマンインターフェイスを提供することと、流体供給システム１０２を制御することとを実行するために使用されてもよい。特に、流体供給システムは、電気制御インターフェイスを備えるポンプ及びバルブを含んでもよく、コントローラ１０８は、流体供給システム１０２のポンプ、バルブなどを動作させるための信号を送信してもよい。必要に応じて、コントローラ１０８は、廃液システム１１２に動作可能なように連結されてもよい。
【００１６】
[0023]図２のシステムは、一部の実施形態に従う、流体供給システム１０２、フローセル１０４、及び廃液システム１１２の概略図である。流体供給システム１０２は、第１のマルチポートバルブ３００及び第２のマルチポートバルブ５００を介してフローセル１０４に流体を圧送するように構成された第１のポンプ２０２及び第２のポンプ２０４を含んでいる。第１及び第２のポンプ２０２、２０４はそれぞれ、Ｔｅｃａｎによって市販されているＣａｖｒｏ  ＸＬＰ６０００注射器ポンプ又はＣａｒｖｏ  Ｃｅｎｔｒｉｓ注射器ポンプのような注射器ポンプなどのポンプであってもよい。各ポンプ２０２、２０４は、４つの流線のうちの１つに圧送する、又は４つの流線のうちの１つから吸い込むように構成されるために、分配バルブ２０３、２０５を含んでいる。通常、分配バルブ２０３は、第１のポンプ２０２が、緩衝液を緩衝液貯蔵器２０６から流線２１４を通じてポンプの注射器に吸い込み、流線２１１、２１２、及び２１３のうちの１つに圧送するように設定され得る。したがって、分配バルブ２０３は、第１のマルチポートバルブ３００又は第２のマルチポートバルブ５００の１つのポートがいつでもポンプ２０２から流体を受け取るように構成される。緩衝液貯蔵器２０６からの緩衝液は、第１のポンプ２０２に導入される前に、脱ガス装置２０８を通過することができる。
【００１７】
[0024]同様に、分配バルブ２０５は通常、第２のポンプ２０４が、緩衝液を緩衝液貯蔵器２０６から流線２２４を通じてポンプの注射器に吸い込み、流線２２１、２２２、２２３のうちの１つに圧送するように設定され得る。したがって、分配バルブ２０５は、第１のマルチポートバルブ３００又は第２のマルチポートバルブ５００の１つのポートがいつでもポンプ２０４から流体を受け取るように構成される。やはり、緩衝液貯蔵器２０６からの緩衝液は、第２のポンプ２０４に導入される前に、脱ガス装置２０８を通過することができる。任意の適切な分配バルブが、分配バルブ２０３、２０５に利用され得る。
【００１８】
[0025]流線２１１及び２１２は、流体流連絡において第１のポンプ２０２を第１のマルチポートバルブ３００に接続する。流線２２１及び２２２は、流体流連絡において第２のポンプ２０４を第１のマルチポートバルブ３００に接続する。さらに、第１のマルチポートバルブ３００は、流線２３２及び２３４を介して合流点２３０に接続される。合流点２３０は、合流点２３０を合流点２４０と流体流連絡して配置する流線２３６にも接続される。合流点２４０は、サンプルラック２４６からサンプルを取得できるプローブ２４４に動作可能なように接続されるか、又は洗浄ステーション２７０と流体流連絡して配置され得る。さらに、合流点２４０は、流線２４２を介して第２のマルチポートバルブ５００と流体流連絡する。したがって、合流点２４０を横断する流体流は、動作中のポンプ２０２、２０４及び関連する分配バルブの設定に応じて、流線２４２を介してプローブ２４４と第２のマルチポートバルブ５００の間にあるか、又は流線２３６を介してプローブ２４４と合流点２３０の間にある。次に、合流点２３０を横断する流体流は、動作中のポンプ２０２、２０４及び関連する分配バルブの設定に応じて、流線２３２によって、又は流線２３４によって、プローブ２４４と第１のマルチポートバルブ３００の間にある。したがって、第１のマルチポートバルブ３００は、流線２３２を通じて、又は流線２３４を通じてプローブ２４４から流体（通常はサンプル）を受け取ることができる。さらに、プローブ２４４は、流体（通常は緩衝液）を、流線２３２を通じて、又は流線２３４を通じて、第１のマルチポートバルブ３００から受け取ることができる。最後に、第１のマルチポートバルブ３００は、線２４８を介してフローセル１０４と流体流連絡し、線２４８は、第１のマルチポートバルブ３００を廃液選択器２６０と連絡して配置する。
【００１９】
[0026]流線２１３は、第１のポンプ２０２を合流点２５４と流体流連絡して接続し、合流点２５４は、流線２５６を介して第２のマルチポートバルブ５００と流体流連絡する。同様に、流線２２３は、第２のポンプ２０２を合流点２５４と流体流連絡して接続し、したがって、流線２５６を介して第２のマルチポートバルブ５００に接続する。したがって、合流点２５４を横断する流体流は、どのポンプ（複数可）が動作中か、及びその関連するバルブの設定に応じて、流線２１３及び流線２５６を介して第１のポンプ２０２と第２のマルチポートバルブ５００の間にあるか、又は流線２２３及び流線２５６を介して第２のポンプ２０４と第２のマルチポートバルブ５００の間にあるか、或いはポンプ２０２、２０４の両方とマルチポートバルブ５００の間にある。
【００２０】
[0027]前述したように、第２のマルチポートバルブ５００は、流線２４２を介してプローブ２４４と流体流連絡することができる。さらに、第２のマルチポートバルブ５００は、流線２５０を介して第１のマルチポートバルブ３００と流体流連絡し、流線２５２を介してフローセル１０４と流体流連絡している。流線２５０は、分散ループ２５１を含むことができる。流線２５２を通じてフローセル１０４に入る流体は、光インターフェイスアセンブリ１０６の薄膜光基板と相互作用する。廃液ポートの選択に応じて、流線２４８を通じてフローセル１０４に入る流体も光インターフェイスと相互作用できることに留意されたい。
【００２１】
[0028]フローセル１０４は、流線２６２、２６４、２６６、及び２６８を介して廃液選択器２６０と流体流連絡して接続される。したがって、流線２４８又は流線２５２を通じて入る流体は、廃液選択器２６０に供給される。次に、廃液選択器２６０は、流線２７２を介して洗浄ステーション２７０と流体流連絡する。洗浄ステーション２７０は、流線２７６を介して廃液貯蔵器２７４とも流体流連絡する。
【００２２】
[0029]当業者は、前述したＳＰＲシステムの使用について熟知しているであろう。したがって、本開示の残りの部分では、モノマーと凝集体の不均一な混合物内の凝集体の存在を決定することと、モノマーと凝集体の不均一な混合物内の凝集体の割合を決定することと、モノマーと凝集体の不均一な混合物内の凝集体の構成要素を構成しているモノマーの数を推定することとに関する新しい方法に重点を置く。ＳＰＲシステムの前述の説明は、以下で説明される方法の実践に適したＳＰＲシステムの１つの実施形態のみを提供する。以下の方法の実践に適した別のシステムは、米国特許出願公開第２０１３／０２７３５６４号において開示されているシステムを含むが、これに限定されない。
【００２３】
[0030]本明細書で開示された方法の実践は、初期較正ステップを必要としない。１つの態様では、本明細書で開示された方法は、不均一溶液内の凝集体の存在を決定することを可能にする。前述したように、本明細書で開示された方法は、タンパク質、ＤＮＡ、ペプチド、炭水化物、小分子化合物、及びホルモンなどの、ただしこれらに限定されない、生体分子（「分析物」とも呼ばれる）の分析に適用できる。以下の説明の目的で、「モノマー」という用語は、生体分子の非凝集形態を指すために使用され、「凝集体」という用語は、２つ以上の生体分子の組み合わせを指している。さらに、「テイラー分散条件下」という用語は、分散の展開、及びサンプルのパルス型注入又はシグモイド型注入によって展開された少なくとも実質的にすべてのテイラー分散がＳＰＲ検出領域を通過することによる、その後のバルク屈折率又は結合応答曲線を指している。当業者に知られているように、テイラー分散注入は、ＳＰＲシステム内の流線内の緩衝液にサンプルを注入することによって、分散を生成する。
【００２４】
[0031]モノマーの凝集体形態の存在を決定するための定性的方法が、各図を参照して説明される。最初に図４を参照すると、テイラー分散を生成するために、モノマーとして４０ｋＤａデキストランを含んでいるサンプルが準備され、パルス手法を使用して注入されている。実線は、このサンプルの時間経過に伴うＳＰＲバルク屈折率応答を反映している。モノマーサンプルと凝集体サンプルの間のＳＰＲバルク屈折率応答における違いを示すために、凝集体として５００ｋＤａデキストランを含んでいる溶液が準備された。破線は、凝集体形態のＳＰＲバルク屈折率応答を反映している。
【００２５】
[0032]図５は、実質的にモノマーを含んでいる溶液のＳＰＲバルク屈折率曲線と重量で２２％のモノマーを含んでいる溶液のＳＰＲバルク屈折率曲線を区別できることを示している。図５では、線１は、テイラー分散を生成するためにパルス型注入を使用して注入されたデキストランモノマーのサンプルのＳＰＲバルク屈折率応答を表している。このサンプルは、２０ｍｇ／ｍｌのデキストランを含んでいる。線２は、デキストラン及びデキストランの凝集体を含んでいる不均一溶液を表しており、このデキストランの凝集体は重量で２２％だった。これらの曲線の分析は、各曲線の下の合計面積が実質的に同一であることを示している。したがって、下で説明される方法に従う不均一溶液の曲線のみの分析は、不均一溶液内の凝集体の近似的拡散係数の決定に有益であり、不均一溶液内の凝集率の決定にも有益である。
【００２６】
[0033]同様に、図６〜１６は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が熱にさらされたときの、時間経過に伴うＢＳＡのＳＰＲバルク屈折率における変化を示している。ＢＳＡは、雌牛から抽出された血清アルブミンタンパク質であり、実験においてタンパク質濃度基準として一般的に使用される。ＢＳＡは、加熱されると、可溶性凝集体を形成する。図６は、加熱される前のＢＳＡのテイラー分散注入のＳＰＲバルク屈折率を示している。したがって、図６のＳＰＲバルク屈折率曲線は、実質的に凝集体を含まないＢＳＡの溶液を反映している。図７〜１６は、ＢＳＡが、７０℃の温度にさらされたときのＳＰＲバルク屈折率曲線における変化を反映しており、図ごとに、さらされる時間が次第に長くなっている。具体的には、図７は３分間の加熱期間を反映しており、その後の各図の加熱時間は３分ずつ長くなっている。
【００２７】
[0034]ＳＰＲバルク屈折率によって、モノマーの均一溶液と、モノマー及び凝集体を含んでいる不均一溶液とを区別できることが示されたため、本明細書で開示された方法は、不均一溶液内の凝集体の濃度だけでなく、凝集体の拡散係数を決定することもできる。
【００２８】
[0035]凝集体濃度及び拡散係数を決定するための方法は、パルス型テイラー分散注入及びシグモイド型テイラー分散注入で、同様に有効である。通常、テイラー分散の準備に使用される溶液は、少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌのモノマー及び凝集体を合わせた濃度を有する。ただし、この溶液は、飽和溶液の濃度以下の、モノマー及び凝集体のより高い濃度を有してもよい。本明細書で開示された方法は、任意の分子量のモノマーを使用して行われてもよい。ただし、１０ｋＤａよりも大きい分子量を持つモノマー及びそのようなモノマーに基づく凝集体は、一般に、より正確な屈折率増分（ＲＩＩ：Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔ）の推定値をもたらす。当業者に知られているように、テイラー分散注入は、ＳＰＲ検出領域につながっている流線に指示されたサンプルを注入する。通常、供給線は、テイラー分散の生成に適した緩衝液を含む。一般的に使用される緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液、及びトリス緩衝液を含むが、これらに限定されない。
【００２９】
[0036]テイラー分散の形成においてパルス型注入を実行する場合、次の式が使用される。
【数５】
2018528436.tif 000007
Ｃｍ＝モノマー濃度
Ｃａ＝凝集体濃度
Ｃｔｏｔ＝合計タンパク質濃度（Ｃｍ＋Ｃａ）
Ｃｍ＝Ｃｔｏｔ−Ｃａ（式＃１ｂ）
ｄｎｄｃ＝分析物のＲＩＩ（通常はｍＬ／ｍｇ＊ＲＵ）
Ｖｉ＝サンプル注入量（ｍ３）
ｄ＝管の直径（ｍ）
Ｔ＝分析物の平均滞留時間＝Ｌ／ｕ（ｓ）
Ｌ＝管の長さ（ｍ）
ｕ＝流体の平均速度（ｍ／ｓ）
ｋｍ＝モノマー種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数６】
2018528436.tif 000008
ｋａ＝凝集体種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数７】
2018528436.tif 000009
Ｄｍ＝モノマー種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
Ｄａ＝凝集体種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
シグモイド型注入を使用してテイラー分散を準備する場合、式＃１ａが以下で提供される式＃２ａに置き換えられる。パルス型の式の残りの定義された項及び式は、同じである。
【数８】
2018528436.tif 000010
ｅｒｆ＝ガウス誤差関数
【００３０】
[0037]上の式＃１ａ及び＃２ａは、項ｄｎｄｃを使用する。項ｄｎｄｃは、特定の分析物の屈折率増分（ＲＩＩ）に等しい。ほとんどの場合、ＲＩＩは特定の分析物の既知の値である。さらに、モノマーに凝集体を加えた合計濃度は、吸光測定又はその他の適切な標準的手法によって決定される既知の値である。したがって、凝集率及びモノマーの割合は、未知の値である。最後に、ほとんどの場合、特定の分析物の拡散係数は既知の値である。したがって、本明細書で開示された方法は、２つのテイラー分散事象（モノマー及び凝集体）の合計としてＹを測定し、合計分析物濃度（モノマーと凝集体の合計）は既知であり、モノマーの拡散係数は既知であり、且つモノマーのＲＩＩは既知である。
【００３１】
[0038]この方法は、最小二乗フィッティング手法を使用して、式＃１ａ（パルス型注入）又は式＃２ａ（シグモイド型注入）のいずれかを、分析物溶液のテイラー分散によって生成されたＳＰＲバルク屈折率応答曲線にフィッティングし、式内の未知の値の最良適合値を決定する。
【００３２】
[0039]１つの方法によれば、式＃１ａ又は＃２ａのいずれかが、モノマーを含む溶液内の凝集体の存在を定性的に決定するために使用されてもよい。この方法は、モノマーを含んでいる溶液を準備し、溶液内の少なくとも１つのモノマーを識別し、モノマーの拡散係数（Ｄｍ）を決定することから開始する。さらに、この方法は、溶液内の合計分析物濃度（Ｃｔｏｔ）を決定することを提唱し、Ｃｔｏｔは、上記の溶液内に存在するモノマー濃度（Ｃｍ）及び任意の凝集体濃度（Ｃａ）の両方を含んでいる。ただし、Ｃｍ及びＣａの個々の値は未知であることがある。その後、分析物のテイラー分散のバルク屈折率曲線を決定するためのＳＰＲ分析が実行される。テイラー分散の分析に使用されるサンプルは、少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌの分析物濃度（モノマーと凝集体の両方）を有するべきである。ただし、飽和溶液までの溶液が許容される。テイラー分散条件下でのサンプルの注入（パルス型注入又はシグモイド型注入）に続いて、ＳＰＲバルク屈折率応答曲線が生成される。テイラー分散条件下でのＳＰＲバルク屈折率応答曲線の生成に続いて、当業者は、最小二乗フィッティング手法などの手法を使用して、生成されたＳＰＲバルク屈折率応答曲線に式＃１ａ又は＃２ａのいずれかをフィッティングする。当業者に知られているように、そのようなフィッティングプロセスは、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔなどの高度な反復的アルゴリズムを使用して、２つ以上の未知の値を解くことができる。さらに、当業者は、式＃１ａ及び＃２ａを調べるときに、ＣｍをＣｔｏｔ−Ｃａ（式＃１ｂ）に置き換えることで、１つの未知の値（Ｃｍ）がフィッティングプロセスから消去されることに気付くであろう。
【００３３】
[0040]Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムは、当業者によく知られている。
Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔを表す１つの方法は、非線形関数の二乗和である次の関数Ｆ（ｘ）の最小値を見つけるガウス−ニュートン法のよく知られた代替法として存在している。
【数９】
2018528436.tif 000011
ｆｉ（ｘ）の関数行列式（Ｊａｃｏｂｉａｎ）をＪｉ（ｘ）と示すことにすると、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法は、式
（ＪｋＴＪｋ＋λｋＩ）ｐｋ＝−ＪｋＴｆｋ
に対する解ｐによって与えられる方向に検索する。
ここで、λｋは非負のスカラーであり、Ｉは単位行列である。
【００３４】
[0041]定性的分析を実行して溶液内の凝集体の存在を決定するときに、フィッティングプロセスは、Ｃａの近似を提供し、当業者がＤａを解くことができるようにする。Ｄｍが既知の値であるため、当業者は、ＤａがＤｍに等しいのか、それとも等しくないのかを決定できる。ＤａがＤｍに等しくない場合、バルク屈折率は、溶液内の凝集体の存在を反映する。例えば、図５を参照すること。
【００３５】
[0042]別の方法では、当業者は、ＳＰＲ分析によって生成されたＳＰＲバルク屈折率及び式＃１ａ又は＃２ａのいずれかを、テイラー分散注入のタイプに応じて使用して、ＤａとＣａの両方について定量的に解くことができる。この方法は、モノマーを含んでいる溶液を準備し、溶液内の少なくとも１つのモノマーを識別し、モノマーの拡散係数（Ｄｍ）を決定することから開始する。さらに、この方法は、溶液内の合計分析物濃度（Ｃｔｏｔ）を決定することを提唱し、Ｃｔｏｔは、上記の溶液内に存在するモノマー濃度（Ｃｍ）及び任意の凝集体濃度（Ｃａ）の両方を含んでいる。ただし、Ｃｍ及びＣａの個々の値は未知であることがある。その後、分析物のテイラー分散のバルク屈折率曲線を決定するためのＳＰＲ分析が実行される。バルク屈折率信号が検出されるためには、テイラー分散の分析に使用されるサンプルが、少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌの分析物濃度（モノマーと凝集体の両方）を有するべきである。ただし、飽和溶液までの溶液が許容される。テイラー分散条件下でのサンプルの注入（パルス型注入又はシグモイド型注入）に続いて、ＳＰＲバルク屈折率応答曲線が生成される。テイラー分散条件下でのＳＰＲバルク屈折率応答曲線の生成に続いて、当業者は、最小二乗フィッティング手法などの手法を使用して、生成されたＳＰＲバルク屈折率応答曲線に式＃１ａ又は＃２ａのいずれかをフィッティングし、Ｄａ及びＣａについて解く。
【００３６】
[0043]最小二乗フィッティング手法を使用することによって、注入方法のタイプによって決定される式＃１ａ又は＃２ａが、生成されたＳＰＲバルク屈折率曲線にフィッティングされる。ＳＰＲバルク屈折率曲線への式＃１ａ又は＃２ａの好ましい適合に達したときに、当業者は、不均一溶液内の凝集体に関して、Ｄａ及びＣａを決定できる。
【００３７】
[0044]図１７は、Ｄｍ及びＣａを定量的に決定するための方法の例を示している。ＳＰＲバルク屈折率曲線は、６６℃で２０分間加熱されたＢＳＡの注入を使用して準備された。１０ｍｇ／ｍｌの熱処理されたＢＳＡを含んでいるサンプルがパルス条件下で注入されて、テイラー分散を生成し、図に示されているＳＰＲバルク屈折率曲線を生成した。その後、式＃１ａが、最小二乗フィッティング手法を使用してＳＰＲデータにフィッティングされた。図１７に示されているように、フィッティングプロセスによって、実質的にＳＰＲバルク屈折率曲線に等しい曲線が得られる。Ｄａ及びＣａは、式＃１ａをＳＰＲバルク屈折率曲線にフィッティングし、フィッティングプロセスにおいて次の既知の値を使用することによって計算された。Ｄｍ＝６．０３×１０−１１ｍ２／ｓ、ｄｎｄｃ（すなわち１８５ｍｌ／ｍｇ＊ＲＵのＲＩＩ）、及びＣｔｏｔ＝１０ｍｇ／ｍｌ。その結果、Ｄａは１．７７６×１０−１１ｍ２／ｓと計算され、Ｃａは４．５５ｍｇ／ｍｌ（サンプル溶液の４５．５％）と計算された。Ｄａ及びＣａを決定できることを示すことに加えて、ＤａとＤｍの間の差は、事前の較正を必要とせずに、不均一溶液内の凝集体の存在を決定できることを示している。
【００３８】
[0045]本発明のその他の実施形態が、当業者にとって明らかである。そのため、前述の説明は、本発明の一般的な使用及び方法を可能にし、説明しているにすぎない。したがって、以下の特許請求の範囲が、本発明の真の範囲を定める。
【図１】
2018528436.tif 000036
【図２】
2018528436.tif 000037
【図３】
2018528436.tif 000038
【図４】
2018528436.tif 000039
【図５】
2018528436.tif 000040
【図６】
2018528436.tif 000041
【図７】
2018528436.tif 000042
【図８】
2018528436.tif 000043
【図９】
2018528436.tif 000044
【図１０】
2018528436.tif 000045
【図１１】
2018528436.tif 000046
【図１２】
2018528436.tif 000047
【図１３】
2018528436.tif 000048
【図１４】
2018528436.tif 000049
【図１５】
2018528436.tif 000050
【図１６】
2018528436.tif 000051
【図１７】
2018528436.tif 000052
【手続補正書】
【提出日】平成30年5月22日(2018.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不均一溶液内のモノマーの凝集体形態の存在を決定するための方法であって、
前記溶液内の少なくとも１つのモノマーを識別して、前記モノマーのＤｍを決定するステップと、
前記溶液内の合計分析物濃度（Ｃｔｏｔ）を決定するステップであり、前記合計分析物濃度が、前記溶液内に存在するモノマー濃度（Ｃｍ）及び任意の凝集体濃度（Ｃａ）の両方を含んでいる、ステップと、
パルス型注入手法を使用してテイラー分散条件下でサンプルを注入することによって、前記モノマー及び凝集体を含んでいる前記溶液の前記サンプルに対して表面プラズモン共鳴分析を実行するステップと、
テイラー分散条件下で表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線を決定するステップと、
最小二乗フィッティング手法を使用して、式＃１ａ
【数１】
2018528436.tif 000053
を前記サンプルの表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線にフィッティングするステップであり、
Ｃｍ＝モノマー濃度
Ｃａ＝凝集体濃度
Ｃｔｏｔ＝合計タンパク質濃度（モノマーと凝集体の合計）
（式＃１ｂ）Ｃｍ＝Ｃｔｏｔ−Ｃａ
ｄｎｄｃ＝前記分析物の屈折率増分（通常はｍＬ／ｍｇ＊ＲＵ）
Ｖｉ＝サンプル注入量（ｍ３）
ｄ＝管の直径（ｍ）
Ｔ＝分析物の平均滞留時間＝Ｌ／ｕ（ｓ）
Ｌ＝管の長さ（ｍ）
ｕ＝流体の平均速度（ｍ／ｓ）
ｋｍ＝モノマー種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数２】
2018528436.tif 000054
ｋａ＝凝集体種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数３】
2018528436.tif 000055
Ｄｍ＝モノマー種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
Ｄａ＝凝集体種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
であるステップと、
式＃１ａを前記バルク屈折率応答曲線にフィッティングした後に、以て近似的なＣａを提供するステップと、Ｄａを解くステップであり、ＤａがＤｍと同じではないときに、前記不均一溶液内の前記モノマーの凝集体形態が存在すると決定するステップとを含む、方法。
【請求項２】
不均一溶液内のモノマーの凝集体形態の濃度を決定するための方法であって、
前記溶液内の少なくとも１つのモノマーを識別して、前記モノマーのＤｍを決定するステップと、
前記溶液内の合計分析物濃度（Ｃｔｏｔ）を決定するステップであり、前記合計分析物濃度が、前記溶液内に存在するモノマー濃度（Ｃｍ）及び任意の凝集体濃度（Ｃａ）の両方を含んでいる、ステップと、
パルス型注入手法を使用してテイラー分散条件下でサンプルを注入することによって、前記モノマー及び凝集体を含んでいる前記溶液の前記サンプルに対して表面プラズモン共鳴分析を実行するステップと、
テイラー分散条件下で表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線を決定するステップと、
最小二乗フィッティング手法を使用して、式＃１ａ
【数４】
2018528436.tif 000056
を前記サンプルの表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線にフィッティングするステップであり、
Ｃｍ＝モノマー濃度
Ｃａ＝凝集体濃度
Ｃｔｏｔ＝合計タンパク質濃度（モノマーと凝集体の合計）
Ｃｍ＝Ｃｔｏｔ−Ｃａ（式＃１ｂ）
ｄｎｄｃ＝前記分析物の屈折率増分（通常はｍＬ／ｍｇ＊ＲＵ）
Ｖｉ＝サンプル注入量（ｍ３）
ｄ＝管の直径（ｍ）
Ｔ＝分析物の平均滞留時間＝Ｌ／ｕ（ｓ）
Ｌ＝管の長さ（ｍ）
ｕ＝流体の平均速度（ｍ／ｓ）
ｋｍ＝モノマー種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数５】
2018528436.tif 000057
ｋａ＝凝集体種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数６】
2018528436.tif 000058
Ｄｍ＝モノマー種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
Ｄａ＝凝集体種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
であるステップと、
式＃１ａを前記バルク屈折率応答曲線にフィッティングした後に、前記サンプル内の前記凝集体の前記Ｄａ及びＣａを計算するステップとを含む、方法。
【請求項３】
不均一溶液内のモノマーの凝集体形態の存在を決定するための方法であって、
前記溶液内の少なくとも１つのモノマーを識別して、前記モノマーのＤｍを決定するステップと、
前記溶液内の合計分析物濃度（Ｃｔｏｔ）を決定するステップであり、前記合計分析物濃度が、前記溶液内に存在するモノマー濃度（Ｃｍ）及び任意の凝集体濃度（Ｃａ）の両方を含んでいる、ステップと、
パルス型注入手法を使用してテイラー分散条件下でサンプルを注入することによって、前記溶液の前記サンプルに対して表面プラズモン共鳴分析を実行するステップであり、前記サンプルが少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌの前記モノマー及び凝集体を合わせた濃度を有する、ステップと、
テイラー分散条件下で表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線を決定するステップと、
最小二乗フィッティング手法を使用して、
式＃１ａ
【数７】
2018528436.tif 000059
を前記サンプルの表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線にフィッティングするステップであり、
Ｃｍ＝モノマー濃度
Ｃａ＝凝集体濃度
Ｃｔｏｔ＝合計タンパク質濃度（モノマーと凝集体の合計）
（式＃１ｂ）Ｃｍ＝Ｃｔｏｔ−Ｃａ
ｄｎｄｃ＝前記分析物の屈折率増分（通常はｍＬ／ｍｇ＊ＲＵ）
Ｖｉ＝サンプル注入量（ｍ３）
ｄ＝管の直径（ｍ）
Ｔ＝分析物の平均滞留時間＝Ｌ／ｕ（ｓ）
Ｌ＝管の長さ（ｍ）
ｕ＝流体の平均速度（ｍ／ｓ）
ｋｍ＝モノマー種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数８】
2018528436.tif 000060
ｋａ＝凝集体種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数９】
2018528436.tif 000061
Ｄｍ＝モノマー種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
Ｄａ＝凝集体種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
であるステップと、
式＃１ａを前記バルク屈折率応答曲線にフィッティングした後に、以て近似的なＣａを提供するステップと、Ｄａを解くステップであり、ＤａがＤｍと同じではないときに、前記不均一溶液内の前記モノマーの凝集体形態が存在すると決定するステップとを含む、方法。
【請求項４】
不均一溶液内のモノマーの凝集体形態の濃度を決定するための方法であって、
前記溶液内の少なくとも１つのモノマーを識別して、前記モノマーのＤｍを決定するステップと、
前記溶液内の合計分析物濃度（Ｃｔｏｔ）を決定するステップであり、前記合計分析物濃度が、前記溶液内に存在するモノマー濃度（Ｃｍ）及び任意の凝集体濃度（Ｃａ）の両方を含んでいる、ステップと、
パルス型注入手法を使用してテイラー分散条件下でサンプルを注入することによって、前記溶液の前記サンプルに対して表面プラズモン共鳴分析を実行するステップであり、前記サンプルが少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌの前記モノマー及び凝集体を合わせた濃度を有する、ステップと、
テイラー分散条件下で表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線を決定するステップと、
最小二乗フィッティング手法を使用して、式＃１ａ
【数１０】
2018528436.tif 000062
を前記サンプルの表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線にフィッティングするステップであり、
Ｃｍ＝モノマー濃度
Ｃａ＝凝集体濃度
Ｃｔｏｔ＝合計タンパク質濃度（モノマーと凝集体の合計）
Ｃｍ＝Ｃｔｏｔ−Ｃａ（式＃１ｂ）
ｄｎｄｃ＝前記分析物の屈折率増分（通常はｍＬ／ｍｇ＊ＲＵ）
Ｖｉ＝サンプル注入量（ｍ３）
ｄ＝管の直径（ｍ）
Ｔ＝分析物の平均滞留時間＝Ｌ／ｕ（ｓ）
Ｌ＝管の長さ（ｍ）
ｕ＝流体の平均速度（ｍ／ｓ）
ｋｍ＝モノマー種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数１１】
2018528436.tif 000063
ｋａ＝凝集体種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数１２】
2018528436.tif 000064
Ｄｍ＝モノマー種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
Ｄａ＝凝集体種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
であるステップと、
式＃１ａを前記バルク屈折率応答曲線にフィッティングした後に、前記サンプル内の前記凝集体の前記Ｄａ及びＣａを計算するステップとを含む、方法。
【請求項５】
不均一溶液内のモノマーの凝集体形態の存在を決定するための方法であって、
前記溶液内の少なくとも１つのモノマーを識別して、前記モノマーのＤｍを決定するステップと、
前記溶液内の合計分析物濃度（Ｃｔｏｔ）を決定するステップであり、前記合計分析物濃度が、前記溶液内に存在するモノマー濃度（Ｃｍ）及び任意の凝集体濃度（Ｃａ）の両方を含んでいる、ステップと、
シグモイド型注入手法を使用してテイラー分散条件下でサンプルを注入することによって、前記モノマー及び凝集体を含んでいる前記溶液の前記サンプルに対して表面プラズモン共鳴分析を実行するステップと、
テイラー分散条件下で表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線を決定するステップと、
最小二乗フィッティング手法を使用して、式＃２ａ
【数１３】
2018528436.tif 000065
を前記サンプルの表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線にフィッティングするステップであり、
Ｃｍ＝モノマー濃度
Ｃａ＝凝集体濃度
Ｃｔｏｔ＝合計タンパク質濃度（モノマーと凝集体の合計）
（式＃１ｂ）Ｃｍ＝Ｃｔｏｔ−Ｃａ
ｄｎｄｃ＝前記分析物の屈折率増分（通常はｍＬ／ｍｇ＊ＲＵ）
ｅｒｆ＝ガウス誤差関数
ｄ＝管の直径（ｍ）
Ｔ＝分析物の平均滞留時間＝Ｌ／ｕ（ｓ）
Ｌ＝管の長さ（ｍ）
ｕ＝流体の平均速度（ｍ／ｓ）
ｋｍ＝モノマー種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数１４】
2018528436.tif 000066
ｋａ＝凝集体種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数１５】
2018528436.tif 000067
Ｄｍ＝モノマー種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
Ｄａ＝凝集体種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
であるステップと、
式＃２ａを前記バルク屈折率応答曲線にフィッティングした後に、以て近似的なＣａを提供するステップと、Ｄａを解くステップであり、ＤａがＤｍと同じではないときに、前記不均一溶液内の前記モノマーの凝集体形態が存在すると決定するステップとを含む、方法。
【請求項６】
不均一溶液内のモノマーの凝集体形態の濃度を決定するための方法であって、
前記溶液内の少なくとも１つのモノマーを識別して、前記モノマーのＤｍを決定するステップと、
前記溶液内の合計分析物濃度（Ｃｔｏｔ）を決定するステップであり、前記合計分析物濃度が、前記溶液内に存在するモノマー濃度（Ｃｍ）及び任意の凝集体濃度（Ｃａ）の両方を含んでいる、ステップと、
シグモイド型注入手法を使用してテイラー分散条件下でサンプルを注入することによって、前記モノマー及び凝集体を含んでいる前記溶液の前記サンプルに対して表面プラズモン共鳴分析を実行するステップと、
テイラー分散条件下で表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線を決定するステップと、
最小二乗フィッティング手法を使用して、式＃２ａ
【数１６】
2018528436.tif 000068
を前記サンプルの表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線にフィッティングするステップであり、
Ｃｍ＝モノマー濃度
Ｃａ＝凝集体濃度
Ｃｔｏｔ＝合計タンパク質濃度（モノマーと凝集体の合計）
Ｃｍ＝Ｃｔｏｔ−Ｃａ（式＃１ｂ）
ｄｎｄｃ＝前記分析物の屈折率増分（通常はｍＬ／ｍｇ＊ＲＵ）
ｅｒｆ＝ガウス誤差関数
ｄ＝管の直径（ｍ）
Ｔ＝分析物の平均滞留時間＝Ｌ／ｕ（ｓ）
Ｌ＝管の長さ（ｍ）
ｕ＝流体の平均速度（ｍ／ｓ）
ｋｍ＝モノマー種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数１７】
2018528436.tif 000069
ｋａ＝凝集体種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数１８】
2018528436.tif 000070
Ｄｍ＝モノマー種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
Ｄａ＝凝集体種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
であるステップと、
式＃２ａを前記バルク屈折率応答曲線にフィッティングした後に、前記サンプル内の前記凝集体の前記Ｄａ及びＣａを計算するステップとを含む、方法。
【請求項７】
不均一溶液内のモノマーの凝集体形態の存在を決定するための方法であって、
前記溶液内の少なくとも１つのモノマーを識別して、前記モノマーのＤｍを決定するステップと、
前記溶液内の合計分析物濃度（Ｃｔｏｔ）を決定するステップであり、前記合計分析物濃度が、前記溶液内に存在するモノマー濃度（Ｃｍ）及び任意の凝集体濃度（Ｃａ）の両方を含んでいる、ステップと、
シグモイド型注入手法を使用してテイラー分散条件下でサンプルを注入することによって、前記溶液の前記サンプルに対して表面プラズモン共鳴分析を実行するステップであり、前記サンプルが少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌの前記モノマー及び凝集体を合わせた濃度を有する、ステップと、
テイラー分散条件下で表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線を決定するステップと、
最小二乗フィッティング手法を使用して、
式＃２ａ
【数１９】
2018528436.tif 000071
を前記サンプルの表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線にフィッティングするステップであり、
Ｃｍ＝モノマー濃度
Ｃａ＝凝集体濃度
Ｃｔｏｔ＝合計タンパク質濃度（モノマーと凝集体の合計）
（式＃１ｂ）Ｃｍ＝Ｃｔｏｔ−Ｃａ
ｄｎｄｃ＝前記分析物の屈折率増分（通常はｍＬ／ｍｇ＊ＲＵ）
ｅｒｆ＝ガウス誤差関数
ｄ＝管の直径（ｍ）
Ｔ＝分析物の平均滞留時間＝Ｌ／ｕ（ｓ）
Ｌ＝管の長さ（ｍ）
ｕ＝流体の平均速度（ｍ／ｓ）
ｋｍ＝モノマー種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数２０】
2018528436.tif 000072
ｋａ＝凝集体種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数２１】
2018528436.tif 000073
Ｄｍ＝モノマー種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
Ｄａ＝凝集体種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
であるステップと、
式＃２ａを前記バルク屈折率応答曲線にフィッティングした後に、以て近似的なＣａを提供するステップと、Ｄａを解くステップであり、ＤａがＤｍと同じではないときに、前記不均一溶液内の前記モノマーの凝集体形態が存在すると決定するステップとを含む、方法。
【請求項８】
不均一溶液内のモノマーの凝集体形態の濃度を決定するための方法であって、
前記溶液内の少なくとも１つのモノマーを識別して、前記モノマーのＤｍを決定するステップと、
前記溶液内の合計分析物濃度（Ｃｔｏｔ）を決定するステップであり、前記合計分析物濃度が、前記溶液内に存在するモノマー濃度（Ｃｍ）及び任意の凝集体濃度（Ｃａ）の両方を含んでいる、ステップと、
シグモイド型注入手法を使用してテイラー分散条件下でサンプルを注入することによって、前記溶液の前記サンプルに対して表面プラズモン共鳴分析を実行するステップであり、前記サンプルが少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌの前記モノマー及び凝集体を合わせた濃度を有する、ステップと、
テイラー分散条件下で表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線を決定するステップと、
最小二乗フィッティング手法を使用して、
式＃２ａ
【数２２】
2018528436.tif 000074
を前記サンプルの表面プラズモン共鳴バルク屈折率応答曲線にフィッティングするステップであり、
Ｃｍ＝モノマー濃度
Ｃａ＝凝集体濃度
Ｃｔｏｔ＝合計タンパク質濃度（モノマーと凝集体の合計）
Ｃｍ＝Ｃｔｏｔ−Ｃａ（式＃１ｂ）
ｄｎｄｃ＝前記分析物の屈折率増分（通常はｍＬ／ｍｇ＊ＲＵ）
ｅｒｆ＝ガウス誤差関数
ｄ＝管の直径（ｍ）
Ｔ＝分析物の平均滞留時間＝Ｌ／ｕ（ｓ）
Ｌ＝管の長さ（ｍ）
ｕ＝流体の平均速度（ｍ／ｓ）
ｋｍ＝モノマー種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数２３】
2018528436.tif 000075
ｋａ＝凝集体種のテイラー−アリス分散係数（ｍ２／ｓ）
【数２４】
2018528436.tif 000076
Ｄｍ＝モノマー種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
Ｄａ＝凝集体種の分析物の拡散係数（ｍ２／ｓ）
であるステップと、
式＃２ａを前記バルク屈折率応答曲線にフィッティングした後に、前記サンプル内の前記凝集体の前記Ｄａ及びＣａを計算するステップとを含む、方法。
【請求項９】
Ｄｍ対Ｄａの比を使用して前記凝集体内のモノマーの数を推定するステップをさらに含み、ＤｍをＤａで割った値が、前記サンプル内で検出された前記凝集体形態でのモノマーの平均数に等しい、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
2018528436.tif 000077