(57)【要約】  本開示は、一般に、エンドリソソーム離脱剤と、核酸と、ポリマーとを含むナノ粒子に関する。他の態様は、そのようなナノ粒子を作製および使用する方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸および疎水性対イオン剤と、
約５０〜約９９．７５重量パーセントのジブロックポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーまたはジブロックポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーと
を含む、薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項２】
前記疎水性対イオン剤がエンドソームおよび／またはリソソーム破壊剤である、請求項１に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項３】
核酸分子が、アンチセンス化合物、ｍＲＮＡ、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏ−ＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、および短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を含む群から選択される、請求項１または２に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項４】
前記核酸分子が、オリゴヌクレオチド、アプタマー、ベクター、トレオース核酸、グリコール核酸（ＧＮＡ）、およびロックド核酸（ＬＮＡ）を含む群から選択される、請求項１から２のいずれか一項に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項５】
前記核酸が修飾を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項６】
前記修飾が、２’Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）修飾、２’フルオロ（２’Ｆ）修飾、２’メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）修飾、２’フルオロアラビノ（ＦＡＮＡ）修飾、２’−Ｈ修飾、２’−チオウラシル修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾、架橋型核酸（ＢＮＡ）修飾、エチレン架橋型核酸（ＥＮＡ）修飾、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）修飾、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）修飾、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）修飾、アンロックド核酸（ＵＮＡ）修飾、４’チオ（４’−Ｓ）修飾、チオール結合修飾、および３’逆位脱塩基末端キャップ修飾のうちの少なくとも１つである、請求項５に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項７】
前記疎水性対イオン剤が、エンドリソソーム破壊剤である、請求項１から５のいずれか一項に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項８】
リガンドで官能化されたポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項９】
少なくとも１つのリガンドが標的化リガンドである、請求項８に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの標的化リガンドが、核酸、抗体、低分子、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項９に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項１１】
前記抗体が、ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６）、ＩＧＦ−Ｒ、メソテリン、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原（ＣＤ１７４）、ＣａｎＡｇ（ＭＵＣ１、ＰＥＭ、ＣＡ２４２、ＣＤ２０５）、ＮＣＡＭ（ＣＤ５６）、Ｃｒｉｐｔｏ、メラノトランスフェリン（Ｐ９７）、糖タンパク質ＮＭＢ（ＣＧ５６９７２）、ＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド）、５Ｔ４（栄養芽細胞糖タンパク質）、ＣＤ５７、ＣＤ４４、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＧＤ２、ＣＤ４０、フィブロネクチンＥＤ−Ｂ、エンドグリン（ＣＤ１０５）、テネイシンＣ、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ＨＥＲ３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ＣＤ１３８、ＣＳ１（ＣＤ３１９、ＣＲＡＣＣ）、ＴＡＧ−７２、ＣＤ２、ＣＤ６４、ＲＯＢＯ４、ＤＬＬ４、Ｔｉｅ２、およびＢ７−Ｈ３からなる群から選択される標的を標的とする、請求項１０に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２、ｃ−Ｍｅｔ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ２、アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）、ＶＬＡ−４（α４β１インテグリン）、ＣＸＣＲ４、メラノコルチン受容体（ＭＣ１Ｒ）、ソマトスタチン受容体、コレシストキニン受容体、ＧｎＲＨ受容体、ＧＬＰ１受容体、Ｅ−セレクチン、ＩＬ−１１受容体、トロンボスポンジン−１受容体、エンドスタチン、ＣＤ７９、およびＣＤ７４からなる群から選択される標的を標的とする、請求項１０に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項１３】
前記標的化リガンドが、エンドサイトーシスのための受容体部位を標的とする、請求項９に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項１４】
前記疎水性対イオンが、クロルプロマジン、タモキシフェン、クロミフェン、ラロキシフェン、クエン酸タモキシフェン、トレミフェン、クエン酸クロミフェン、クエン酸塩トレミフェン、ベラパミル、ジリチアゼム、アムロジピン、ニフェドピン、ベラパミル塩酸塩、ニモジピン、フェロジピン、ニカルドピン、ニソルジピン  クレビジピン、イスラジピン、トランドラプリル／ベラパミル、デシプラミン、イミプラミン、アミトリプチリン、ノルチプチリン、クロミプラミン、ドキセピン、アモキサピン、トリミプラミン、プロトリプチリン、アミオダロン、リドカイン、ソタロール、ドロネダロン、フレカイニド、プロカインアミド、プロパフェノン、キニジン、ドフェチリド、メキシレチン、イブチリド、ジソピラミド、パロキセチン、フルオキセチン、セルトラリン、エスシタロプラム、シタロプラム、フルボキサミン、パロキセチン塩酸塩、ネファゾドン、シタロプラム臭化水素酸塩、シュウ酸エスシタロプラム、オランザピン／フルオキセチン、クロルシクリジン、アモジアキン、チオリダジン、クロロキン、キニーネ、アトバコン／プログアニル、アトバコン、フルオキセチン、メフロキン、プリマキン、キナクリン、キニジン、ハロファントリン、クロロキン、モネンシン、クロルシクリジン、アントラフェニン、アリピプラゾール、ビフェプルノクス、ブレクスピプラゾール、カリプラジン、シプロフロキサシン、ダピプラゾール、ドロプロピジン、エロピプラゾール、エトペリドン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、レボドロプロピジン、メピプラゾール、ミアンセリン、ナフトピジル、ネファゾドン、ニアプラジン、オキシペルチン、ポサコナゾール、トラゾドン、ウメスピロン、ウラピジル、ベスナリノン、ルバゾドン、アカプラジン、バトプラジン、ビフェプルノクス、ボルチオキセチン、ビラゾドン、トルピプラゾール、ソネピプラゾール、パルドプルノクス、ナフチルピペラジン、ナルゾタン、ロルピプラゾール、フレシノキサン、フルプラジン、フリバンセリン、エンサクリン、エンピプラゾール、エルトプラジン、エロピプラゾール、ＵＮＣ７９３８、スフィンゴシン、ドデシルイミダゾール、バフィロマイシンＡ１、キノロン、オメプラゾール、エスモプラゾール、パントプラゾール、ランソプラゾール、ラベプラゾール、デキシアンソプラゾール、ブレフェルジンＡ、ゴルギシド、ジアソル、Ｐｉｔｓｔｏｐ、アモジアキン、ＥＧＡ（４−ブロモベンズアルデヒドＮ−（２，６−ジメチルフェニル）セミカルバゾン）、フルオキセチン、パロキセチン、セルトラリン、チオリダジン、フェノチアジン、プロメタジン、プロクロルペルザイン、トリフルオペラジン、フルフェナジン、プロクロルペルジン、デカン酸フルフェナジン、プロメタジン塩酸塩、キニーネ、カルシマイシン、メフロキン、アプリンジン、ジソピラミド、フレカイニド、リドカイン、メキシレチン、ペンチソミド、プロパフェノン、シプロヘプタジン  アザタジン、ケトチフェン、ロラタジン、ピゾチフェン、アミトリプチリン、プロプラノロール、ルパタジン、デプトロピン、アミスルプリド、ノルトリプチリン、シクロベンザプリン、オクトリプチリン、ブトリプチリン、イプリンドール、トリミプラミン、フ��ボキセート、シンナリジン  クロミプラミン、フルオキセチン、プロマジン、イミプラミン、セルトラリン、カルバマゼピン、ａｙ９９４４、クロミプラミン、クロザピン、フレカイニド、ハロペリドール、ケトコナゾール、オフロキサシン、ペルヘキシリン、ソタロール、テモキシフェン、ジメリジン、シプロヘプタジン、トレミフェン、フルフェナジン、トリフルオペラジン、ピゾチリン、ＣＧＳ１２０６６Ｂ、プロクロルペラジン、ドキセピン、ケトチフェン、ラシジピン、ｓｂ２０５６０７、ロフェプラミン、ミフェプリストン、クロベンプロピット、サルメテロール、アゼラスチン、アゼラスチン、エピナスチン、デスロラタジン、ａｍ−２５１、インダトラリン、ネルフィナビル、ハロペリドール、ベンプロペリン、Ｍ−パロキセチン、カルベジロール、カルシポトリオール、ペルフェナジン、フェノチアジン、クロルプロチキセン、デシプラミン、テトラカイン、イフェンプロジル、Ｕ１８６６６Ａ、およびジフェンヒドラミンからなる群から選択される、請求項１から１３のいずれかに記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項１５】
前記疎水性対イオン剤が、約２以上であるｌｏｇＰを有する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項１６】
前記疎水性対イオン剤が、約２〜約３の間のｌｏｇＰを有する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項１７】
約５〜約２０重量パーセントの前記核酸を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項１８】
約５〜約２０重量パーセントの前記疎水性対イオン剤を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項１９】
前記ナノ粒子のゼータ電位が約−１０〜約１０ｍＶである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項２０】
前記核酸が、Ｄｎａｓｅアッセイにおいて実質的に安定している、請求項１から１９のいずれか一項に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項２１】
前記ポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーが、約１０ｋＤａ〜約３５ｋＤａの数平均分子量のポリ（乳酸）と、約４ｋＤａ〜約６ｋＤａの数平均分子量のポリ（エチレン）グリコールとを有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項２２】
存在するエンドリソソーム破壊剤の量が、核酸と疎水性対イオンを形成するのに少なくとも十分である、核酸およびエンドリソソーム破壊剤と、
約５０〜約９９．７５重量パーセントのジブロックポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーまたはジブロックポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーと
を含む、薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項２３】
核酸分子が、アンチセンス化合物、ｍＲＮＡ、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏ−ＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、および短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を含む群から選択される、請求項２２に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項２４】
前記核酸分子が、オリゴヌクレオチド、アプタマー、ベクター、トレオース核酸、グリコール核酸（ＧＮＡ）、およびロックド核酸（ＬＮＡ）を含む群から選択される、請求項２２から２３のいずれか一項に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項２５】
前記核酸が修飾を含む、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項２６】
前記修飾が、２’Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）修飾、２’フルオロ（２’Ｆ）修飾、２’メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）修飾、２’フルオロアラビノ（ＦＡＮＡ）修飾、２’−Ｈ修飾、２’−チオウラシル修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾、架橋型核酸（ＢＮＡ）修飾、エチレン架橋型核酸（ＥＮＡ）修飾、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）修飾、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）修飾、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）修飾、アンロックド核酸（ＵＮＡ）修飾、４’チオ（４’−Ｓ）修飾、チオール結合修飾、および３’逆位脱塩基末端キャップ修飾のうちの少なくとも１つである、請求項２５に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項２７】
リガンドで官能化されたポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーをさらに含む、請求項２２から２６のいずれか一項に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項２８】
少なくとも１つのリガンドが標的化リガンドである、請求項２７に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの標的化リガンドが、核酸、抗体、低分子、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項２８に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項３０】
前記抗体が、ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６）、ＩＧＦ−Ｒ、メソテリン、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原（ＣＤ１７４）、ＣａｎＡｇ（ＭＵＣ１、ＰＥＭ、ＣＡ２４２、ＣＤ２０５）、ＮＣＡＭ（ＣＤ５６）、Ｃｒｉｐｔｏ、メラノトランスフェリン（Ｐ９７）、糖タンパク質ＮＭＢ（ＣＧ５６９７２）、ＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド）、５Ｔ４（栄養芽細胞糖タンパク質）、ＣＤ５７、ＣＤ４４、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＧＤ２、ＣＤ４０、フィブロネクチンＥＤ−Ｂ、エンドグリン（ＣＤ１０５）、テネイシンＣ、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ＨＥＲ３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ＣＤ１３８、ＣＳ１（ＣＤ３１９、ＣＲＡＣＣ）、ＴＡＧ−７２、ＣＤ２、ＣＤ６４、ＲＯＢＯ４、ＤＬＬ４、Ｔｉｅ２、およびＢ７−Ｈ３からなる群から選択される標的を標的とする、請求項２９に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２、ｃ−Ｍｅｔ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ２、アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）、ＶＬＡ−４（α４β１インテグリン）、ＣＸＣＲ４、メラノコルチン受容体（ＭＣ１Ｒ）、ソマトスタチン受容体、コレシストキニン受容体、ＧｎＲＨ受容体、ＧＬＰ１受容体、Ｅ−セレクチン、ＩＬ−１１受容体、トロンボスポンジン−１受容体、エンドスタチン、ＣＤ７９、およびＣＤ７４からなる群から選択される標的を標的とする、請求項２９に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項３２】
前記標的化リガンドが、エンドサイトーシスのための受容体部位を標的とする、請求項２８に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項３３】
前記ナノ粒子のゼータ電位が約−１０〜約１０ｍＶである、請求項２２から３１のいずれか一項に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項３４】
前記核酸が、Ｄｎａｓｅアッセイにおいて実質的に安定している、請求項２２から３２のいずれか一項に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【請求項３５】
前記ポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーが、約１０ｋＤａ〜約３５ｋＤａの数平均分子量のポリ（乳酸）と、約４ｋＤａ〜約６ｋＤａの数平均分子量のポリ（エチレン）グリコールとを有する、請求項２２から３３のいずれか一項に記載の薬学的に許容できるナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、２０１５年８月２１日出願の米国仮出願第６２／２０８，３６１号、２０１５年１０月７日出願の米国仮出願第６２／２３８，４００号、２０１５年１０月１６日出願の米国仮出願第６２／２４２，５１５号、２０１６年１月１５日出願の米国仮出願第６２／２７９，２９５号、および２０１６年６月１３日出願の同第６２／３４９，３７７号の優先権および利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
患者へのある種の薬物を送達する（例えば、特定の組織もしくは細胞型を標的とするか、または正常組織ではなく特定の患部組織を標的とする）か、または薬物の放出を制御する系は、有益であると長い間認識されてきた。
【０００３】
例えば、活性薬物を含み、かつ例えば、特定の組織もしくは細胞型を標的とするか、または正常組織ではなく特定の患部組織を標的とする治療法は、標的とされていない体の組織における薬物の量を低減し得る。周囲の非がん組織を死滅させることなしに細胞毒性用量の薬物ががん細胞に送達されることが望ましい状態、例えば、がんを処置するときに、これは特に重要である。有効な薬物標的化は、抗がん療法においては一般的である、望ましくなく、時には生命を危うくする副作用を低減し得る。さらに、このような治療法は、薬物がその他の治療法では到達することができないある種の組織に到達することを可能にし得る。
【０００４】
制御放出および／または標的療法を実現する治療法はまた、有効量の薬物を送達できなければならないが、これは他のナノ粒子送達系において公知の制限である。例えば、ナノ粒子のサイズを、有利な送達特性を有するのに十分に小さく保つ一方で、各ナノ粒子と会合する適当な量の薬物を有するナノ粒子系を調製することは挑戦であり得る。
【０００５】
治療用ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはアンチセンスなどの核酸の治療送達には、効率的で非毒性の送達方法が必要である。しかし、例えば、ヌクレアーゼによる核酸の分解、および／または細胞もしくは核への有効な輸送の不備を含め、そうした送達にはかなりの難題が立ちはだかる。核酸を含むナノ粒子製剤にとっては、往々にして、望ましくない特性、例えば、破裂放出プロファイルや核酸の分解が支障となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ナノ粒子治療法、および核酸分子を細胞へ送達し、その間核酸分子の分解も防ぐことのできるナノ粒子を作製する方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書では、核酸と疎水性対イオンとを含む、治療用かつ／または薬学的に許容できるポリマーナノ粒子、ならびにそのようなナノ粒子を作製および使用する方法が記載される。例えば、本明細書では、核酸および疎水性対イオン剤と、約５０〜約９９．７５重量パーセントのジブロックポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーまたはジブロックポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーを含む薬学的に許容できるナノ粒子が提供される。疎水性対イオン剤は、例えば、エンドソームおよび／またはリソソーム破壊剤（例えば、エンドリソソーム破壊剤（ｅｎｄｏ−ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ））でよい。
【０００８】
企図されるナノ粒子は、アンチセンス化合物、ｍＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏ−ＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、および短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を含む群から選択されるものなどの核酸を含み得る。例えば、企図される核酸は、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンス）、アプタマー、ベクター、トレオース核酸、グリコール核酸（ＧＮＡ）、およびロックド核酸（ＬＮＡ）である場合がある。一部の実施形態では、ナノ粒子は、修飾されていない核酸を含む。
【０００９】
一部の態様では、核酸と、ｌｏｇＰが約２以上である、例えば、ｌｏｇＰが約２〜約３の間である疎水性対イオン剤とを含むナノ粒子が、本明細書において提供される。
【００１０】
ナノ粒子は、１個の核酸分子または複数の核酸分子を含む場合があると理解すべきである。複数の核酸分子は、１または複数のタイプまたは種類の核酸分子を含む場合もある。例えば、ナノ粒子は、ｍｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの両方を含む場合もある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】開示されているナノ粒子を形成するためのエマルジョンプロセスについてのフローチャートである。
【図２Ａ】開示されているエマルジョンプロセスについての流れ図である。
【図２Ａ】開示されているエマルジョンプロセスについての流れ図である。
【図３】（ｓｓＤＮＡなどの）核酸ヌクレアーゼ安定性アッセイについてのフローチャートである。
【図４】開示されているナノ粒子を形成するためのエマルジョンプロセスについてのフローチャートである。
【図５】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出アッセイについて、色素による定量とＨＰＬＣによる定量の比較を示すグラフである。
【図６】対イオンまたはエンドリソソーム剤としてジドデシルアンモニウムブロミドを表示された対イオン剤対オリゴヌクレオチド比で含有するナノ粒子について、オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出を経時的に示すグラフである。
【図７】対イオンまたはエンドリソソーム剤としてクロルプロマジンを表示された対イオン剤対オリゴヌクレオチド比で含有するナノ粒子について、オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出を経時的に示すグラフである。
【図８】核酸および表示された対イオンまたはエンドリソソーム離脱剤が添加されたナノ粒子についてのゼータ電位を示すグラフである。
【図９】ナノ粒子にカプセル化されたｓｓＤＮＡのヌクレアーゼ分解に対する安定性を、むき出しのｓｓＤＮＡと比較して示すグラフである。
【図１０Ａ−１】エンドリソソーム破壊剤などの企図される疎水性対イオン剤を含む図である。
【図１０Ａ−２】エンドリソソーム破壊剤などの企図される疎水性対イオン剤を含む図である。
【図１０Ａ−３】エンドリソソーム破壊剤などの企図される疎水性対イオン剤を含む図である。
【図１０Ｂ−１】エンドリソソーム破壊剤などの企図される疎水性対イオン剤を含む図である。
【図１０Ｂ−２】エンドリソソーム破壊剤などの企図される疎水性対イオン剤を含む図である。
【図１０Ｂ−３】エンドリソソーム破壊剤などの企図される疎水性対イオン剤を含む図である。
【図１１】微細エマルジョン後に対イオンを加えてからオリゴを加える調製法を使用して調製したナノ粒子についての放出プロファイルを示すグラフである。
【図１２】対イオンとしてエチルラウロイルアルギネートを表示された対イオン剤対オリゴヌクレオチド比で含有するナノ粒子について、オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出を経時的に示すグラフである。
【図１３】対イオンとしてリールアミンを表示された対イオン剤対オリゴヌクレオチド比で含有するナノ粒子について、オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出を経時的に示すグラフである。
【図１４】ＡＳＯ−対イオンナノ粒子についての放出プロファイルを示すグラフである。
【図１５Ａ】ウエスタンブロット結果を示す図である。
【図１５Ｂ】ウエスタンブロット結果を示す図である。
【図１６Ａ】遊離ＡＳＯ対ナノ粒子製剤１、２、３、および４について、ナノ粒子からＡＳＯが放出されて２４時間後の用量応答プロファイルを示すグラフである。
【図１６Ｂ】遊離ＡＳＯ対ナノ粒子製剤１、２、３、および４について、ナノ粒子からＡＳＯが放出されて４８時間後の用量応答プロファイルを示すグラフである。
【図１６Ｃ】遊離ＡＳＯ対ナノ粒子製剤１、２、３、および４について、ナノ粒子からＡＳＯが放出されて７２時間後の用量応答プロファイルを示すグラフである。
【図１６Ｄ】３７℃で２４、４８、および７２時間インキュベート後にナノ粒子から放出されたＡＳＯの相対百分率を算出するために使用した、遊離ＡＳＯ処理群に対する各ナノ粒子製剤について算出したＩＣ５０値を示すグラフである。
【図１７Ａ】蛍光標識された、ホレートで標的化されたナノ粒子の内部移行および相対的な細胞内局在（矢印によって赤色で示される）、リソソーム（矢印によって緑色で示される）、および細胞核（矢印によって青色で示される）を示す、ＫＢ細胞（類表皮癌）の蛍光顕微鏡写真である。
【図１７Ｂ】０分、１５分、および６０分における、結合したホレート標的化ナノ粒子の内部移行パーセントを示すグラフである。
【図１８Ａ】細胞アッセイの結果を示すグラフである。図１８Ａは、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システムによって測定した相対ｅＧＦＰ蛍光の結果を示す。
【図１８Ｂ】細胞アッセイの結果を示すグラフである。図１８Ｂには、リアルタイムＰＣＲ転写結果を報告する。
【図１９Ａ】遊離ｓｉＲＮＡを用いて行った細胞アッセイの結果を示すグラフである。
【図１９Ｂ】ＰＴＮＰ−ｓｉＲＮＡを用いて行った細胞アッセイの結果を示すグラフである。
【図１９Ｃ】Ｂ８９０−ｓｉＲＮＡを用いて行った細胞アッセイの結果を示すグラフである。
【図２０Ａ】７８時間における種々のｓｉＲＮＡ製剤での細胞アッセイの結果を示すグラフである。
【図２０Ｂ】７８時間における種々のｓｉＲＮＡ製剤での細胞アッセイの結果を示すグラフである。
【図２０Ｃ】７８時間における種々のｓｉＲＮＡ製剤での細胞アッセイの結果を示すグラフである。
【図２０Ｄ】７８時間における種々のｓｉＲＮＡ製剤での細胞アッセイの結果を示すグラフである。
【図２１Ａ−Ｃ】細胞アッセイの結果、特に、細胞アッセイにおける、未処理細胞についての０および８８時間での蛍光を示す像である。
【図２２Ａ−Ｃ】細胞アッセイの結果、特に、細胞アッセイにおける、Ｂ８９０−ｓｉＲＮＡナノ粒子およびドキセピンについての０および８８時間での蛍光を示す像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書では、核酸を含むポリマーナノ粒子、ならびにそのような治療用ナノ粒子を作製および使用する方法が開示される。一部の実施形態では、開示されているナノ粒子は、核酸分子と、エンド−リソソーム破壊剤などの疎水性対イオンとを含むイオン対を含む。例えば、そのような開示されているナノ粒子は、有効なトランスフェクションを実現し得る。さらに、ある特定の実施形態では、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤を含む、かつ／またはその存在下で調製されたナノ粒子は、核酸分子完全性の向上を示し得る。例えば、核酸を含む開示されているナノ粒子は、例えば患者に投与されると、有効なトランスフェクションを実現することに加えて、核酸分解を実質的に防止し得る。
【００１３】
理論に束縛されるものではないが、少なくとも１種の核酸を含む開示されているナノ粒子は、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤とのイオン対の形成により、核酸完全性および／または核酸のトランスフェクションがかなり向上していると考えられる。用語「イオン対」は、１：１の比に限定されず、それよりも、互いに結びつく任意の比の、逆の電荷のイオンを指すと理解すべきである。例えば、８の負電荷を有する核酸分子は、正電荷を帯びた８個の分子と「対をなす」ことができる。したがって、本明細書で使用するとき、「イオン対」とは、クーロン引力によってまとまった、逆の電荷を帯びた一対のイオンである。本明細書で企図されるイオン対形成によって、例えば、薬物添加量が増加しているナノ粒子を得ることができる。例えば一部の実施形態では、水溶液への核酸の溶解性が低下するために、ナノ粒子からの核酸の放出をより緩徐にすることもできる。さらに、核酸を大きい疎水性対イオンと複合させることで、核酸のポリマーマトリックス内での拡散を緩やかにすることもできる。イオン対は、本明細書では、複合体と呼ぶ場合もあることを留意すべきである。有利なことに、イオン対形成は、疎水性基の治療剤への共有結合によるコンジュゲーションを必要とせずに起こる。
【００１４】
理論に束縛されるものではないが、イオン対の強度は、企図されるナノ粒子の薬物添加量および放出速度に影響すると考えられる。例えば、イオン対の強度は、以下でより詳細に論じるとおり、核酸のｐＫａとエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤のｐＫａの差の大きさを広げることにより高めることができる。また、理論に束縛されるものではないが、イオン対形成の条件も、企図されるナノ粒子の薬物添加量および放出速度に影響すると考えられる。
【００１５】
本明細書において開示されているナノ粒子は、１種、２種、３種またはそれ超の生体適合性および／または生分解性ポリマーを含み得る。例えば、企図されるナノ粒子は、約３５〜約９９．７５重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９９．７５重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９９．５重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９９重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９８重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９７重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９６重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９５重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９４重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９３重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９２重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９１重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約９０重量パーセント、一部の実施形態では、約５０〜約８５重量パーセント、一部の実施形態では、約６０〜約８５重量パーセント、一部の実施形態では、約６５〜約８５重量パーセント、および一部の実施形態では、約５０〜約８０重量パーセントの生分解性ポリマーおよびポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含む１種または複数のブロックコポリマー、ならびに約０〜約５０重量パーセントの生分解性ホモポリマーを含み得る。
【００１６】
開示されているナノ粒子は、核酸を含み得る。核酸という用語は、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているまたは組み込むことのできるいずれの化合物および／または物質も含み得る。開示されているナノ粒子に適合して使用される例示的な核酸としては、限定はしないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらのハイブリッド、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒性ＤＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、およびベクターの１種または複数が挙げられる。核酸は、一本鎖（センスまたはアンチセンス）でも、または二本鎖でもよい。ナノ粒子は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ  （ｓｎｏ−ＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、および短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子などの小さい核酸分子を含み得る。例示的な核酸としては、リボ核酸（ＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはこれらのハイブリッドが挙げられる。他の実施形態では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）がナノ粒子に組み込まれる場合もある。さらに、核酸は、アンタゴミル、ａｎｔｉｍｉｒ、またはＵ１アダプターでもよい。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含むアンチセンス、例えば、ヒトＳＴＡＴ３をコードする核酸に相補的な（例えば、核酸塩基３０１６−３０３１などの、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿１３９２７６．２のセグメントに相補的な）アンチセンス化合物）、および／または参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２０１４０７０８６８で開示されているものを含むナノ粒子が、本明細書において提供される。例えば、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を有し、各シトシンが５−メチルシトシンであり、ヌクレオシド１〜３および１４〜１６のそれぞれがｃＥｔ部分を含む、ＣＴＡＴＴＴＧＧＡＴＧＴＣＡＧＣを含む配列が本明細書において提供される。
【００１７】
開示されているナノ粒子の一部の実施形態は、修飾されていない核酸を含む。他の実施形態では、核酸は、修飾されている。修飾には、限定はしないが、リン酸ジエステル主鎖の修飾、リボース２’ＯＨ基における修飾、ならびにリボース環およびヌクレオシド塩基の修飾を含む、当技術分野において公知のいずれかの修飾を含めることができる。例えば、リン酸エステル主鎖の修飾として、架橋性でないリン酸酸素が硫黄で置き換えられている、ホスホロチオエート（ＰＳ）修飾を挙げることができる。加えて、他の修飾として、ホスホロジチオエートおよびホスホノアセテートが挙げられる。参照により組み込まれている米国特許第６，１４３，８８１号、第５，５８７，３６１号、および第５，５９９，７９７号を参照されたい。他の修飾として、２’Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）、２’フルオロ（２’Ｆ）、２’メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’フルオロアラビノ（ＦＡＮＡ）、２’−Ｈ、２’−チオウラシル、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋型核酸（ＢＮＡ）、エチレン架橋型核酸（ＥＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、４’チオ（４’−Ｓ）、および３’逆位脱塩基末端キャップが挙げられる。一部の実施形態では、核酸は、天然のリン酸ジエステル連結をボラノリン酸（ＰＢ）連結、ホスホノアセテート（Ｐａｃ）連結、またはチオホスホノアセテート主鎖連結で置換することにより修飾することができる。一部の実施形態では、核酸は、２つ以上の修飾を含む場合もある。一部の実施形態では、核酸は、３つ以上の修飾を含む場合もある。
【００１８】
一部の実施形態では、核酸は、一本鎖、二本鎖、または三本鎖核酸からなる群から選択することができる。生物活性を有する、例えば、遺伝子発現の変更をもたらす、一本鎖核酸分子の例としては、アンチセンス核酸分子、酵素性核酸分子またはリボザイム、および２−５−オリゴアデニレート核酸分子が挙げられる。遺伝子発現の変更をもたらす生物活性を有する三本鎖核酸の例としては、三重鎖形成性オリゴヌクレオチドが挙げられる。遺伝子発現の変更をもたらす生物活性を有する二本鎖核酸分子の例としては、ｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡが挙げられる。例えば、長い二本鎖ＲＮＡによって、タンパク質キナーゼＰＫＲの、インターフェロンを媒介とする誘導を、配列非特異的に活性化することができる（例えば、ＷｕおよびＫａｕｆｍａｎ、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、１９２１〜６を参照されたい）。この経路は、ＲＮａｓｅＬによってＲＮＡ切断をもたらすという点で、２，５−連結オリゴアデニレート（２−５Ａ）系と共通の特色を有し得る（例えば、Ｃｏｌｅら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、１９１８７〜９２を参照されたい）。
【００１９】
一部の実施形態では、企図される核酸は、核酸をベースとする化合物および／または組成物である場合もある。例えば、企図される核酸は、生物系（細胞、組織、または生物）における１つまたは複数の遺伝子の発現を調節する多機能短鎖干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）分子である場合がある。多機能短鎖干渉核酸または多機能ｓｉＮＡ分子は、同様に企図され、遺伝子発現の配列特異的な調節の強力なメディエーターとなり得る（多機能ｓｉＮＡ分子とは、多機能ｓｉＮＡ構築物における各鎖が、１種または複数の標的核酸分子における別個の核酸配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むように設計されているクラスのポリヌクレオチド分子を表す）。
【００２０】
一部の実施形態では、核酸は、別の化学種または生物学的種と（すなわち、結合またはリンカーを介して）関連している場合もあると理解すべきである。例えば、酵素、ヌクレアーゼ、タンパク質、ペプチド、別の核酸、分子、または化合物と関連している核酸が本明細書において企図される。例えば、一部の実施形態では、企図される核酸は、ガイドＲＮＡであり、酵素は、例えばＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９にあるようなＣａｓ９である。一部の実施形態では、核酸は、ＺＮＦ（亜鉛フィンガーヌクレアーゼ）またはＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）と関連することもあり得る。
【００２１】
一部の実施形態では、開示されているナノ粒子は、約０．２〜約３５重量パーセント、約０．２〜約２０重量パーセント、約０．２〜約１０重量パーセント、約０．２〜約５重量パーセント、約０．５〜約５重量パーセント、約０．７５〜約５重量パーセント、約１〜約５重量パーセント、約２〜約５重量パーセント、約３〜約５重量パーセント、約１〜約２０重量パーセント、約２〜約２０重量パーセント、約５〜約２０重量パーセント、約１〜約１５重量パーセント、約２〜約１５重量パーセント、約３〜約１５重量パーセント、約４〜約１５重量パーセント、約５〜約１５重量パーセント、約１〜約１０重量パーセント、約２〜約１０重量パーセント、約３〜約１０重量パーセント、約４〜約１０重量パーセント、約５〜約１０重量パーセント、約１０〜約３０重量パーセント、または約１５〜約２５重量パーセントの核酸を含み得る。
【００２２】
ある特定の態様では、開示されているナノ粒子は、経細胞／トランスサイトーシス、ポトサイトーシス、エンドサイトーシス、または生合成輸送機能において有効である疎水性対イオンを含む。トランスサイトーシスは、受容体を介したトランスサイトーシスを含み得ると理解すべきである。また、エンドサイトーシスも、いずれかのタイプの、受容体仲介エンドサイトーシスを含み得ると理解すべきである。例えば、エンドサイトーシスは、エンドサイトーシスを起こす潜在的可能性を有する形質膜の陥入である、カベオラを含み得る。エンドサイトーシスは、クラスリン仲介エンドサイトーシスも含み得る。開示されるナノ粒子の一部の実施形態では、疎水性対イオンは、エンドソームの膜を破ることのできるエンドリソソーム破壊剤である。
【００２３】
ある特定の実施形態では、開示されるナノ粒子は、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤を含み、かつ／またはエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤を含むプロセスによって調製される。このようなナノ粒子は、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤なしのナノ粒子より、核酸の完全性を保ちながら、効率のよいトランスフェクションを実現することができる。例えば、ナノ粒子なしでの核酸のトランスフェクションは、核酸が分解されるため、核酸は、治療に役立たなくなる結果となる。
【００２４】
ある特定の実施形態では、開示されるナノ粒子は、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオンと関連している。例えば、開示されるナノ粒子は、疎水性対イオンと共に溶液になっていることもあり得る。他の実施形態では、開示されるナノ粒子は、疎水性対イオンをさらに含む医薬組成物になっている。
【００２５】
エンドリソソーム破壊剤などの、適切ないかなる疎水性対イオン剤も、開示されるナノ粒子における使用が企図される。例えば、エンドリソソーム破壊剤は、細胞のエンドソームまたはリソソームのプロセスを、例えば実質的に回避および／または制限することのできる、いずれかの分子、イオン、または化合物でよい。本明細書で企図される、エンドサイトーシスとは、細胞への経路である。エンドサイトーシスのプロセスでは、エンドソームが形成される。エンドリソソーム剤は、エンドソームの膜を破ることができ、リソソームに輸送されて分解されるのを免れる。このような薬剤としては、エンドソームまたはリソソーム成熟、処理、および／または再循環に関連した作用機序を有する化合物を挙げることができる。エンドリソソーム破壊剤などの例示的な疎水性対イオン剤は、正電荷を帯びており、核酸とイオン対を形成することができる、かつ／またはｌｏｇＰが約１を越える、または約２を越える、例えば、約２〜約４以上であることが好ましい。例示的な疎水性対イオン剤（エンドリソソーム破壊剤でよい）としては、特に、テトランドリン、ノルトリプチリン、アステミゾール、テルフェナジン、ペルヘキシリン、メピラミン、ヒドロキシジン、アリメナジン（ａｌｉｍｅｎａｚｉｎｅ）、シアメマジン、ジブカイン、プロペリシアジン、チオプロペラジン、トリヘキシフェニジル、リールアミン（ｌｅｅｌａｍｉｎｅ）、エチルラウリルアルギナテクル（ｅｔｈｙｌ  ｌａｕｒｙｌ  ａｒｇｉｎａｔｅｃｈｌ）、プロマジン、タモキシフェン、クロミフェン、ラロキシフェン、クエン酸タモキシフェン、トレミフェン、クエン酸クロミフェン、クエン酸塩トレミフェン、ベラパミル、ジリチアゼム（ｄｉｌｉｔｉａｚｅｍ）、アムロジピン、ニフェドピン（ｎｉｆｅｄｐｉｎｅ）、ベラパミル塩酸塩、ニモジピン、フェロジピン、ニカルドピン（ｎｉｃａｒｄｐｉｎｅ）、ニソルジピン  クレビジピン、イスラジピン、トランドラプリル／ベラパミル、デシプラミン、イミプラミン、アミトリプチリン、ノルチプチリン（ｎｏｒｔｉｐｔｙｌｉｎｅ）、クロミプラミン、ドキセピン、アモキサピン、トリミプラミン、プロトリプチリン、アミオダロン、リドカイン、ソタロール、ドロネダロン、フレカイニド、プロカインアミド、プロパフェノン、キニジン、ドフェチリド、メキシレチン、イブチリド、ジソピラミド、パロキセチン、フルオキセチン、セルトラリン、エスシタロプラム、シタロプラム、フルボキサミン、パロキセチン塩酸塩、ネファゾドン、シタロプラム臭化水素酸塩、シュウ酸エスシタロプラム、オランザピン／フルオキセチン、クロルシクリジン、アモジアキン、チオリダジン、クロロキン、キニーネ、アトバコン／プログアニル、アトバコン、フルオキセチン、メフロキン、プリマキン、キナクリン、キニジン、ハロファントリン、クロロキン、モネンシン、クロルシクリジン、アントラフェニン、アリピプラゾール、ビフェプルノクス、ブレクスピプラゾール、カリプラジン、シプロフロキサシン、ダピプラゾール、ドロプロピジン、エロピプラゾール（Ｅｌｏｐｉｐｒａｚｏｌｅ）、エトペリドン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、レボドロプロピジン、メピプラゾール（Ｍｅｐｉｐｒａｚｏｌｅ）、ミアンセリン、ナフトピジル、ネファゾドン、ニアプラジン、オキシペルチン、ポサコナゾール、トラゾドン、ウメスピロン（Ｕｍｅｓｐｉｒｏｎｅ）、ウラピジル、ベスナリノン、ルバゾドン（Ｌｕｂａｚｏｄｏｎｅ）、アカプラジン（Ａｃａｐｒａｚｉｎｅ）、バトプラジン（Ｂａｔｏｐｒａｚｉｎｅ）、ビフェプルノクス、ボルチオキセチン、ビラゾドン、トルピプラゾール（Ｔｏｌｐｉｐｒａｚｏｌｅ）、ソネピプラゾール、パルドプルノクス（Ｐａｒｄｏｐｒｕｎｏｘ）、ナフチルピペラジン、ナルゾタン（Ｎａｌｕｚｏｔａｎ）、ロルピプラゾール（Ｌｏｒｐｉｐｒａｚｏｌｅ）、フレシノキサン、フルプラジン（Ｆｌｕｐｒａｚｉｎｅ）、フリバンセリン、エンサクリン（Ｅｎｓａｃｕｌｉｎ）、エンピプラゾール（Ｅｎｐｉｐｒａｚｏｌｅ）、エルトプラジン（Ｅｌｔｏｐｒａｚｉｎｅ）、エロピプラゾール（Ｅｌｏｐｉｐｒａｚｏｌｅ）、ＵＮＣ７９３８、スフィンゴシン、ドデシルイミダゾール、バフィロマイシンＡ１、キノロン、オメプラゾール、エスモプラゾール（Ｅｓｍｏｐｒａｚｏｌｅ）、パントプラゾール、ランソプラゾール、ラベプラゾール、デキシアンソプラゾール（ｄｅｘｉａｎｓｏｐｒａｚｏｌｅ）、ブレフェルジンＡ、ゴルギシド（Ｇｏｌｇｉｃｉｄｅ）、ジアソル（Ｄｙａｓｏｒｅ）、Ｐｉｔｓｔｏｐ、アモジアキン、ＥＧＡ（４−ブロモベンズアルデヒドＮ−（２，６−ジメチルフェニル）セミカルバゾン）、フルオキセチン、パロキセチン、セルトラリン、チオリダジン、フェノチアジン、プロメタジン、プロクロルペルザイン（ｐｒｏｃｈｌｏｒｐｅｒｚａｉｎｅ）、トリフルオペラジン、フルフェナジン、プロクロルペルジン（ｐｒｏｃｈｌｏｒｐｅｒｚｉｎｅ）、デカン酸フルフェナジン、プロメタジン塩酸塩、キニーネ、カルシマイシン、メフロキン、アプリンジン、ジソピラミド、フレカイニド、リドカイン、メキシレチン、ペンチソミド（ｐｅｎｔｉｓｏｍｉｄｅ）、プロパフェノン、シプロヘプタジン  アザタジン、ケトチフェン、ロラタジン、ピゾチフェン、アミトリプチリン、プロプラノロール、ルパタジン、デプトロピン、アミスルプリド、ノルトリプチリン、シクロベンザプリン、オクトリプチリン（ｏｃｔｒｉｐｔｙｌｉｎｅ）、ブトリプチリン、イプリンドール、トリミプラミン、フラボキセート、シンナリジン  クロミプラミン（ｃｈｌｏｍｉｐｒａｍｉｎｅ）、フルオキセチン、プロマジン、イミプラミン、セルトラリン、カルバマゼピン、ａｙ９９４４、クロミプラミン、クロザピン、フレカイニド、ハロペリドール、ケトコナゾール、オフロキサシン、ペルヘキシリン、ソタロール、テモキシフェン（ｔｅｍｏｘｉｐｈｅｎ）、ジメリジン、シプロヘプタジン、トレミフェン、フルフェナジン、トリフルオペラジン、ピゾチリン、ＣＧＳ  １２０６６Ｂ、プロクロルペラジン、ドキセピン、ケトチフェン、ラシジピン、ｓｂ  ２０５６０７、ロフェプラミン、ミフェプリストン、クロベンプロピット（ｃｌｏｂｅｎｐｒｏｐｉｔ）、サルメテロール、アゼラスチン、アゼラスチン、エピナスチン、デスロラタジン、ａｍ−２５１、インダトラリン、ネルフィナビル、ハロペリドール、ベンプロペリン、Ｍ−パロキセチン、カルベ���ロール、カルシポトリオール、ペルフェナジン、フェノチアジン、クロルプロチキセン、デシプラミン、テトラカイン、イフェンプロジル、Ｕ１８６６６Ａ、ジフェンヒドラミンが挙げられる。図１０Ａ−１、１０Ａ−２、１０Ａ−３、１０Ｂ−１、１０Ｂ−２、および１０Ｂ−３に、疎水性対イオン剤となり得るさらなる化合物を示す。
【００２６】
一実施形態では、疎水性対イオン剤（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｃｏｕｎｔｅｒ  ａｇｅｎｔ）は、例えば、ｓｉＲＮＡ送達を改善し得る、次式：
【００２７】
【化１】
2018528194.tif 000002
によって表される化合物でよい。
【００２８】
エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤によって、一部の実施形態では、エンドソームおよびリソソームプロセスが完全に回避される場合もあり、またはエンドソームもしくはリソソームプロセスの出現が低減する場合もある。本明細書で企図される、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤は、核酸とイオン対を形成する。エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤は、エンドソームおよび／またはリソソームプロセスからの核酸−エンドリソソーム離脱剤イオン対複合体の出現を低減させる。エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤の例として、デシプラミン、アミドアロン（ａｍｉｄｏａｒｏｎｅ）、フルオキセチン  クロルシクリジン、アモジアキン、パロキセチン、タモキシフェン、ベラパミル、チオリダジン、クロロキン、クロルプロマジン、モネンシン、スフィンゴシン、ドデシルイミダゾール、バフィロマイシンＡ１、ゴルギシド、ジアソル、Ｐｉｔｓｔｏｐ、ＥＧＡ（４−ブロモベンズアルデヒドＮ−（２，６−ジメチルフェニル）セミカルバゾン）、セルトラリン、カルシマイシン、メフロキン、プリマキン、キナクリン、ハロファントリン、キニーネ、ステアリルアミン、オレイルアミン、ジオレイルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミン、およびＮ，Ｎ−ジメチルオレイルアミン、ＤＯＤＡＣ（ジオレオイルジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウム）、ＤＭＡＢ（ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＳＤＭＡ（１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン）、ＤＯＤＭＡ（１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ−コレステロールＨＣｌ）、ＤＭＲＩＥ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、米国ニューヨーク州Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄから市販品として入手可能な、ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥとを含むカチオン性リポソーム）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから市販品として入手可能な、ＤＯＳＰＡとＤＯＰＥとを含むカチオン性リポソーム）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、米国ウィスコンシン州マディソンから市販品として入手可能な、ＤＯＧＳを含むカチオン性脂質）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（塩化物塩））、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレオイルオキシ−３−ジメチルアミノ−プロパン）、１−オレオイル−２−ヒドロキシ−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン、１，２−ジアシル−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン、１，２−ジデカノイル−１−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン２、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン���ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンまたはジリノレオイルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴシン、および追加の脂肪酸鎖またはアルキル基がペンダントヒドロキシル基のいずれかに結合かつ／またはアミノ官能基に結合しているスフィンゴシン誘導体、ポリアミン（プトレッシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミンなど）、ならびにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を挙げることもできる。疎水性対イオン剤は、薬学的に許容できる非毒性の有機塩基に由来する塩でよく、有機塩基には、第一級、第二級、および第三級アミン、自然に生じる置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、および塩基性イオン交換樹脂、例えば、アルギニン、ベタイン  カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ１−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン  トリプロピルアミン、トロメタミンなどが含まれると理解すべきである。塩基は、アンモニア、アニオン交換樹脂、例えばコレスチラミン樹脂、アルギニン、ベネタミン、ベンザチン、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、コリン、デアノール、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、エポールアミン（Ｅｅｐｏｌａｍｉｎｅ）、エチレンジアミン、ヒドラバミン、イミダゾール、リシン、モルホリン、４−（２−ヒドロキシエチル）、ピペラジン、ピロリジン、１−（２−ヒドロキシエチル）、トリエタノールアミン、およびトロメタミンでもよい。
【００２９】
一部の実施形態では、核酸と、本明細書では対イオンとも呼ぶエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤は、イオン対を形成する。一部の実施形態では、対イオンまたはエンドリソソーム離脱剤の数は、電荷を釣り合わせる、またはイオン対について約１０ｍＶ〜約−１０ｍＶの間（または例えば約２０ｍＶ〜約−２０ｍＶもしくは約５〜−５ｍＶ）のゼータ電位を実現するように、核酸分子と関連付けられる。エンドリソソーム離脱剤と不活性疎水性カチオンの組合せを使用して、必要に応じてＥＥ剤の用量を調整すると、所望の活性を実現することができる。例えば、核酸分子が２０の負電荷を有する場合、２０個の対イオンが単一核酸分子と会合し得る。この例では、核酸分子の対イオンに対する比は、１：２０である。この比は、核酸分子およびエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤上の電荷の数に応じて決まることになると理解すべきである。
【００３０】
一部の実施形態では、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤は、ｌｏｇＰが、約２〜約１５の間、一部の実施形態では、約１〜約２の間、一部の実施形態では、約５〜約１５の間、一部の実施形態では、約５〜約１０の間、一部の実施形態では、約２〜約８の間、一部の実施形態では、約４〜約８の間、一部の実施形態では、約２〜約７の間、または一部の実施形態では、約４〜約７の間となり得る。場合によって、疎水性の酸は、約２を越える、約４を越える、約５を越える、または６を越えるｌｏｇＰを有し得る。
【００３１】
場合によって、溶液（すなわち核酸溶液）中のエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤の濃度は、約１重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約２重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約３重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約４重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約５重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約６重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約８重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１０重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１２重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１４重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１６重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１重量パーセント〜約５重量パーセントの間、一部の実施形態では、約３重量パーセント〜約９重量パーセントの間、一部の実施形態では、約６重量パーセント〜約１２重量パーセントの間、一部の実施形態では、約９重量パーセント〜約１５重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１２重量パーセント〜約１８重量パーセントの間、および一部の実施形態では、約１５重量パーセント〜約２１重量パーセントの間でよい。ある特定の実施形態では、核酸溶液中の対イオンの濃度は、少なくとも約１重量パーセント、一部の実施形態では、少なくとも約２重量パーセント、一部の実施形態では、少なくとも約３重量パーセント、一部の実施形態では、少なくとも約５重量パーセント、一部の実施形態では、少なくとも約１０重量パーセント、一部の実施形態では、少なくとも約１５重量パーセント、および一部の実施形態では、少なくとも約２０重量パーセントでよい。
【００３２】
ある特定の実施形態では、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤の核酸に対する（例えば、ナノ粒子を製剤化する際の初期、および／またはナノ粒子中の）モル比は、約０．２５：１〜約６：１の間、一部の実施形態では、約０．２５：１〜約５：１の間、一部の実施形態では、約０．２５：１〜約４：１の間、一部の実施形態では、約０．２５：１〜約３：１の間、一部の実施形態では、約０．２５：１〜約２：１の間、一部の実施形態では、約０．２５：１〜約１．５：１の間、一部の実施形態では、約０．２５：１〜約１：１の間、一部の実施形態では、約０．２５：１〜約０．５：１の間、一部の実施形態では、約０．５：１〜約６：１の間、一部の実施形態では、約０．５：１〜約５：１の間、一部の実施形態では、約０．５：１〜約４：１の間、一部の実施形態では、約０．５：１〜約３：１の間、一部の実施形態では、約０．５：１〜約２：１の間、一部の実施形態では、約０．５：１〜約１．５：１の間、一部の実施形態では、約０．５：１〜約１：１の間、一部の実施形態では、約０．５：１〜約０．７５：１の間、一部の実施形態では、約０．７５：１〜約２：１の間、一部の実施形態では、約０．７５：１〜約１．５：１の間、一部の実施形態では、約０．７５：１〜約１．２５：１の間、一部の実施形態では、約０．９：１〜約１．１：１の間、一部の実施形態では、約０．９５：１〜約１．０５：１の間、一部の実施形態では、約１：１、一部の実施形態では、約０．７５：１〜約１：１の間、一部の実施形態では、約１：１〜約６：１の間、一部の実施形態では、約１：１〜約５：１の間、一部の実施形態では、約１：１〜約４：１の間、一部の実施形態では、約１：１〜約３：１の間、一部の実施形態では、約１：１〜約２：１の間、一部の実施形態では、約１：１〜約１．５：１の間、一部の実施形態では、約１．５：１〜約６：１の間、一部の実施形態では、約１．５：１〜約５：１の間、一部の実施形態では、約１．５：１〜約４：１の間、一部の実施形態では、約１．５：１〜約３：１の間、一部の実施形態では、約２：１〜約６：１の間、一部の実施形態では、約２：１〜約４：１の間、一部の実施形態では、約３：１〜約６：１の間、一部の実施形態では、約３：１〜約５：１の間、一部の実施形態では、約４：１〜約６：１の間でよい。
【００３３】
場合によって、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤の核酸に対する初期のモル比（すなわち、ナノ粒子を製剤化する際）は、ナノ粒子中での、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤の核酸に対するモル比（すなわち、カプセル化されていない、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤および核酸を除去した後）と異なることもある。他の場合では、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤の核酸に対する初期のモル比（すなわち、ナノ粒子を製剤化する際）が、ナノ粒子中での、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤の核酸に対するモル比（すなわち、カプセル化されていない、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤および核酸を除去した後）と本質的に同じであることもある。
【００３４】
場合によって、核酸を含有する溶液は、ポリマーを含有する溶液と別々に調製してもよく、次いで、２種の溶液を、ナノ粒子の製剤化前に合わせてもよい。例えば、一実施形態では、第１の溶液が、核酸とエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤とを含有し、第２の溶液が、ポリマーと、場合によりエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤とを含有する。第２の溶液がエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤を含有しない製剤は、例えば、プロセスにおけるエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤の使用量を最小限にする、または一部の場合では、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤と、例えば、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤の存在下で分解し得るポリマーとの接触時間を最小限にするのに有利となり得る。他の場合では、核酸と、ポリマーと、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤とを含有する単一溶液を調製することもある。
【００３５】
一部の実施形態では、核酸−エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤のイオン対を、ナノ粒子の製剤化前に形成させてよい。例えば、（例えば、適切な量の核酸とエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤とを含有する溶液を調製することによって、）イオン対を含有する溶液を、企図されるナノ粒子を製剤化する前に調製することができる。他の実施形態では、ナノ粒子を製剤化する間にイオン対を形成させてもよい。例えば、ナノ粒子を調製するプロセスステップの間（例えば、エマルジョン形成より前および／またはエマルジョン形成中）に、核酸を含有する第１の溶液と、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤を含有する第２の溶液とを合わせることができる。ある特定の実施形態では、核酸およびエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤が企図されるナノ粒子にカプセル化される前に、イオン対を形成させてもよい。他の実施形態では、例えば。核酸およびエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤がカプセル化された後に、ナノ粒子中でイオン対を形成させてもよい。
【００３６】
ある特定の実施形態では、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤は、２５℃で求められる溶解度が、水１００ｍＬあたり約２ｇ未満、一部の実施形態では、水１００ｍＬあたり約１ｇ未満、一部の実施形態では、水１００ｍＬあたり約１００ｍｇ未満、一部の実施形態では、水１００ｍＬあたり約１０ｍｇ未満、および一部の実施形態では、水１００ｍＬあたり約１ｍｇ未満となり得る。他の実施形態では、酸は、２５℃で求められる溶解度が、水１００ｍＬあたり約１ｍｇ〜水１００ｍＬあたり約２ｇの間、一部の実施形態では、水１００ｍＬあたり約１ｍｇ〜水１００ｍＬあたり約１ｇの間、一部の実施形態では、水１００ｍＬあたり約１ｍｇ〜水１００ｍＬあたり約５００ｍｇの間、および一部の実施形態では、水１００ｍＬあたり約１ｍｇ〜水１００ｍＬあたり約１００ｍｇの間となり得る。一部の実施形態では、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤は、２５℃において水に本質的に不溶性でよい。
【００３７】
一部の実施形態では、開示されるナノ粒子は、ナノ粒子を調製する際に、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤が本質的に使用されていなくてもよい。他の実施形態では、開示されるナノ粒子は、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤を含んでもよい。例えば、一部の実施形態では、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤の、開示されるナノ粒子中の含有量は、約０．０５重量パーセント〜約３５重量パーセントの間、一部の実施形態では、約０．０５重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約０．５重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約２重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約３重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約５重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約７重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１０重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１５重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約２０重量パーセント〜約３０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約０．０５重量パーセント〜約０．５重量パーセントの間、一部の実施形態では、約０．０５重量パーセント〜約５重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１重量パーセント〜約５重量パーセントの間、一部の実施形態では、約３重量パーセント〜約１０重量パーセントの間、一部の実施形態では、約５重量パーセント〜約１５重量パーセントの間、一部の実施形態では、約１０重量パーセント〜約２０重量パーセントの間でよい。
【００３８】
一部の実施形態では、開示されるナノ粒子は、例えば、室温（例えば２５℃）および／または３７℃のリン酸緩衝溶液に入れたとき、（例えば、約１分〜約３０分、約１分〜約２５分、約５分〜約３０分、約５分〜約１時間、約１時間、または約２４時間かけて、）約２％未満、約５％未満、約１０％未満、約１５％未満、約２０％未満、約２５％未満、約３０％未満、もしくは４０％未満の核酸または核酸−疎水性対イオン剤（エンドリソソーム破壊剤など）しか実質的に放出しない。ある特定の実施形態では、核酸を含むナノ粒子は、例えば２５℃および／または３７℃の水溶液（例えばリン酸緩衝溶液）に入れたとき、プロトン化可能な含窒素治療剤の約０．０１〜約５０％、一部の実施形態では約０．０１〜約２５％、一部の実施形態では約０．０１〜約１５％、一部の実施形態では約０．０１〜約１０％、一部の実施形態では約１〜約４０％、一部の実施形態では約５〜約４０％、および一部の実施形態では約１０〜約４０％が約１時間かけて放出されるのに実質的に相当する速度で、核酸または核酸−疎水性対イオンを放出し得る。一部の実施形態では、プロトン化可能な含窒素治療剤を含むナノ粒子は、水溶液（例えば、リン酸緩衝溶液）中に、例えば、２５℃にて、および／または３７℃にて置かれたとき、プロトン化可能な含窒素治療剤の約１０〜約７０％、一部の実施形態では、約１０〜約４５％、一部の実施形態では、約１０〜約３５％、または一部の実施形態では、約１０〜約２５％が約４時間にわたり放出されることに実質的に対応する速度で、プロトン化可能な含窒素治療剤を放出し得る。
【００３９】
一部の実施形態では、開示されているナノ粒子は、リン酸緩衝溶液中に３７℃にて置かれたとき、核酸を、例えば、少なくとも約１分間、少なくとも約１時間、またはそれ超の間実質的に保持し得る。
【００４０】
一実施形態では、開示されている治療用ナノ粒子は、標的化リガンド、例えば、低分子量リガンドを含み得る。ある特定の実施形態では、低分子量リガンドはポリマーにコンジュゲートしており、ナノ粒子は、特定の比のリガンドがコンジュゲートしたポリマー（例えば、ＰＬＡ−ＰＥＧ−リガンド）と非官能化ポリマー（例えば、ＰＬＡ−ＰＥＧまたはＰＬＧＡ−ＰＥＧ）とを含む。有効量のリガンドが、疾患または障害、例えば、がんの処置のためのナノ粒子と会合するように、ナノ粒子は、最適化された比のこれらの２種のポリマーを有することができる。例えば、リガンド密度の増加は、標的結合（細胞結合／標的取込み）を増加させ、ナノ粒子を「標的特異的」とし得る。代わりに、ナノ粒子における非官能化ポリマー（例えば、非官能化ＰＬＧＡ−ＰＥＧコポリマー）のある特定の濃度は、炎症および／または免疫原性（すなわち、免疫応答を誘発する能力）を制御し、かつナノ粒子が、疾患または障害の処置のために適した循環半減期を有することを可能とする。さらに、非官能化ポリマーは、一部の実施形態では、細網内皮系（ＲＥＳ）を介した循環器系からのクリアランスの速度を低下し得る。このように、非官能化ポリマーは、投与によって粒子が体内を移動することを可能とし得る特徴を有するナノ粒子を提供し得る。一部の実施形態では、非官能化ポリマーは、それ以外の場合では高濃度になってしまうリガンドを相殺することができる。リガンドが高濃度であったなら、対象によるクリアランスが加速され、標的細胞への送達が低下してしまっていた可能性がある。
【００４１】
一部の実施形態では、本明細書において開示されているナノ粒子は、ナノ粒子の全ポリマー組成物（すなわち、官能化＋非官能化ポリマー）の概ね０．１〜５０モルパーセント、例えば、０．１〜３０モルパーセント、例えば、０．１〜２０モルパーセント、例えば、０．１〜１０モルパーセントを構成する、リガンドにコンジュゲートした官能化ポリマーを含み得る。別の実施形態では、１種または複数の低分子量リガンドとコンジュゲート（例えば、共有結合（例えば、リンカー（例えば、アルキレンリンカー）を介した）または結合）したポリマーを含むナノ粒子が本明細書においてまた開示され、総ポリマーに対する低分子量リガンドの重量パーセントは、約０．００１〜５、例えば、約０．００１〜２、例えば、約０．００１〜１である。
【００４２】
一部の実施形態では、開示されているナノ粒子は、生物学的実体、例えば、特定の膜成分もしくは細胞表面受容体と効率的に結合するか、そうでなければ会合することができる場合がある。ペプチド、リガンド、タンパク質、抗体、またはナノボディを使用して、ナノ粒子を標的化することもできると理解すべきである。（例えば、特定の組織もしくは細胞型への、正常組織ではなく特定の患部組織などへの）治療剤または核酸の標的化は、組織特異的疾患、例えば、固形腫瘍がん（例えば、前立腺がん）の処置のために望ましい。例えば、細胞毒性抗がん剤の全身的送達と対照的に、本明細書において開示されているナノ粒子は、この薬剤が健康な細胞を死滅させることを実質的に防止し得る。さらに、開示されているナノ粒子は、（開示されているナノ粒子または製剤を伴わずに投与された有効量の薬剤と比較して）薬剤のより低い用量の投与を可能としてもよく、これは伝統的な化学療法と一般に関連する望ましくない副作用を低減し得る。
【００４３】
一般に、「ナノ粒子」は、１０００ｎｍ未満、例えば、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍの直径を有する任意の粒子を指す。開示されている治療用ナノ粒子は、約６０〜約１２０ｎｍ、または約７０〜約１２０ｎｍ、または約８０〜約１２０ｎｍ、または約９０〜約１２０ｎｍ、または約１００〜約１２０ｎｍ、または約６０〜約１３０ｎｍ、または約７０〜約１３０ｎｍ、または約８０〜約１３０ｎｍ、または約９０〜約１３０ｎｍ、または約１００〜約１３０ｎｍ、または約１１０〜約１３０ｎｍ、または約６０〜約１４０ｎｍ、または約７０〜約１４０ｎｍ、または約８０〜約１４０ｎｍ、または約９０〜約１４０ｎｍ、または約１００〜約１４０ｎｍ、または約１１０〜約１４０ｎｍ、または約６０〜約１５０ｎｍ、または約７０〜約１５０ｎｍ、または約８０〜約１５０ｎｍ、または約９０〜約１５０ｎｍ、または約１００〜約１５０ｎｍ、または約１１０〜約１５０ｎｍ、または約１２０〜約１５０ｎｍの直径を有するナノ粒子を含み得る。開示されるナノ粒子は、特定のサイズで形成させることができ、これが、取込み経路、循環時間、標的化、内部移行、および／またはクリアランスを決定し得ると理解すべきである。
【００４４】
ポリマー
一部の実施形態では、ナノ粒子は、ポリマーのマトリックスと、上述のとおりの核酸などの治療剤とを、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤と一緒に含んでいてもよい。一部の実施形態では、治療剤および／または標的化部分（例えば、低分子量リガンド）は、ポリマーマトリックスの少なくとも一部と会合させることができる。例えば、一部の実施形態では、標的化部分（例えば、リガンド）は、ポリマーマトリックスの表面と共有結合的に会合させることができる。一部の実施形態では、共有結合的会合は、リンカーによって媒介される。治療剤は、ポリマーマトリックスの表面と会合するか、ポリマーマトリックス内にカプセル化されるか、ポリマーマトリックスによって囲まれるか、かつ／またはポリマーマトリックスにわたって分散し得る。
【００４５】
多種多様のポリマーおよびそこから粒子を形成する方法は、薬物送達の当技術分野において公知である。一部の実施形態では、本開示は、少なくとも２つの巨大分子を有するナノ粒子を対象とし、第１の巨大分子は、低分子量リガンド（例えば、標的化部分）に結合した第１のポリマーを含み、第２の巨大分子は、標的化部分に結合していない第２のポリマーを含む。ナノ粒子は、１種または複数のさらなる非官能化ポリマーを場合により含むことができる。
【００４６】
任意の適切なポリマーを、開示されているナノ粒子において使用することができる。ポリマーは、天然または非天然（合成）のポリマーでよい。ポリマーは、２種またはそれ超のモノマーを含むホモポリマーまたはコポリマーでよい。配列に関して、コポリマーは、ランダム、ブロックでよいか、またはランダムおよびブロック配列の組合せを含むことができる。典型的には、ポリマーは、有機ポリマーである。
【００４７】
用語「ポリマー」は、本明細書において使用する場合、当技術分野で使用されるようなその通常の意味を与えられ、すなわち、分子構造は、共有結合によって連結した１つまたは複数の繰り返し単位（モノマー）を含む。繰り返し単位は、全て同一であり得るか、または場合によって、ポリマー内に存在する２種以上のタイプの繰り返し単位があり得る。場合によって、ポリマーは、生物学的に由来するもの、例えば、生体ポリマーでよい。非限定的例には、ペプチドまたはタンパク質が含まれる。場合によって、さらなる部分、例えば、生物学的部分、例えば、下記に記載したものがまた、ポリマー中に存在し得る。２種以上のタイプの繰り返し単位がポリマー内に存在する場合、ポリマーは、「コポリマー」と言われる。ポリマーを用いる任意の実施形態では、用いられるポリマーは、場合によって、コポリマーであり得ることを理解すべきである。コポリマーを形成する繰り返し単位は、任意の様式で配置し得る。例えば、繰り返し単位は、ランダムな順序で、交互の順序で、またはブロックコポリマーとして配置してもよく、すなわち、それぞれが第１の繰り返し単位（例えば、第１のブロック）を含む１つまたは複数の領域、およびそれぞれが第２の繰り返し単位（例えば、第２のブロック）を含む１つまたは複数の領域などを含む。ブロックコポリマーは、２つ（ジブロックコポリマー）、３つ（トリブロックコポリマー）、またはそれ超の数の別個のブロックを有し得る。
【００４８】
開示されている粒子は、コポリマーを含むことができ、これは一部の実施形態では、通常、２種またはそれ超のポリマーが一緒の共有結合によって互いに会合している、２種またはそれ超のポリマー（例えば、本明細書に記載されているもの）を説明する。このように、コポリマーは、第１のポリマーおよび第２のポリマーを含んでいてもよく、これらは一緒にコンジュゲートされて、ブロックコポリマーを形成し、第１のポリマーは、ブロックコポリマーの第１のブロックでよく、第２のポリマーは、ブロックコポリマーの第２のブロックでよい。当然ながら、ブロックコポリマーは、場合によって、ポリマーの複数のブロックを含有してもよく、「ブロックコポリマー」は、本明細書において使用する場合、単一の第１のブロックおよび単一の第２のブロックのみを有するブロックコポリマーのみに限定されないことを当業者は理解する。例えば、ブロックコポリマーは、第１のポリマーを含む第１のブロック、第２のポリマーを含む第２のブロック、および第３のポリマーまたは第１のポリマーなどを含む第３のブロックを含み得る。場合によって、ブロックコポリマーは、任意の数の第１のポリマーの第１のブロック、および第２のポリマーの第２のブロック（およびある特定の場合では、第３のブロック、第４のブロックなど）を含有することができる。さらに、ブロックコポリマーはまた、場合によって、他のブロックコポリマーから形成することができることに留意すべきである。例えば、第１のブロックコポリマーは、別のポリマー（ホモポリマー、生体ポリマー、別のブロックコポリマーなどでよい）にコンジュゲートして複数のタイプのブロックを含有する新規なブロックコポリマーを形成し、かつ／または他の部分（例えば、非ポリマー部分）にコンジュゲートし得る。
【００４９】
一部の実施形態では、ポリマー（例えば、コポリマー、例えば、ブロックコポリマー）は、両親媒性でよく、すなわち、親水性部分および疎水性部分、または相対的に親水性部分および相対的に疎水性部分を有する。親水性ポリマーは、一般に水を引きつけるものでよく、疎水性ポリマーは、一般に水をはねかえすものでよい。親水性または疎水性ポリマーは、例えば、ポリマーの試料を調製し、水とのその接触角を測定する（典型的には、ポリマーは、６０°未満の接触角を有し、一方、疎水性ポリマーは、約６０°超の接触角を有する）ことによって同定することができる。場合によって、２種またはそれ超のポリマーの親水性は、互いに対して測定してもよく、すなわち、第１のポリマーは、第２のポリマーより親水性であり得る。例えば、第１のポリマーは、第２のポリマーより小さな接触角を有し得る。
【００５０】
一組の実施形態では、本明細書において企図されるポリマー（例えば、コポリマー、例えば、ブロックコポリマー）は、生体適合性ポリマー、すなわち、典型的には、生きている対象中に挿入または注射されたとき、例えば、Ｔ細胞応答によるかなりの炎症および／または免疫系によるポリマーの急性拒絶を伴わずに有害な応答を惹起しないポリマーを含む。したがって、本明細書において企図される治療用粒子は、非免疫原性であり得る。非免疫原性という用語は、本明細書において使用する場合、循環抗体、Ｔ細胞、もしくは反応性免疫細胞を通常引き起こさないか、または最小レベルのみを引き起こし、個体においてそれ自体に対する免疫応答を通常引き起こさない、その天然状態における内在性成長因子を指す。
【００５１】
生体適合性は典型的には、免疫系の少なくとも一部による材料の急性拒絶を指し、すなわち、対象中に植え込んだ非生体適合性材料が、対象において十分に重大であり得る免疫応答を誘発し、免疫系による材料の拒絶は、適当に制御することができず、材料を対象から除去しなくてはならないような程度であることが多い。生体適合性を決定するための１つの単純な試験は、ポリマーを細胞へとｉｎ  ｖｉｔｒｏで曝露させることでよい。生体適合性ポリマーは、典型的には中程度の濃度で、例えば、５０マイクログラム／１０６個の細胞の濃度でかなりの細胞死をもたらさないポリマーである。例えば、生体適合性ポリマーは、細胞、例えば、線維芽細胞または上皮細胞に曝露したとき、たとえこのような細胞によって貪食されるか、そうでなければ取り込まれるかしても、約２０％未満の細胞死をもたらし得る。様々な実施形態において有用であり得る生体適合性ポリマーの非限定的例には、ポリジオキサノン（ＰＤＯ）、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリヒドロキシブチレート、ポリ（グリセロールセバシン酸）、ポリグリコリド（すなわち、ポリ（グリコール）酸）（ＰＧＡ）、ポリラクチド（すなわち、ポリ（乳）酸（ＰＬＡ））、ポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン、またはこれらおよび／もしくは他のポリマーを含めたコポリマーまたは誘導体が含まれる。
【００５２】
ある特定の実施形態では、企図される生体適合性ポリマーは、生分解性でよく、すなわち、ポリマーは、生理学的環境内、例えば、体内で、化学的および／または生物学的に分解することができる。本明細書において使用する場合、「生分解性」ポリマーは、細胞中に導入されるとき、細胞の機構によって（生物学的に分解可能）、および／または化学プロセス、例えば、加水分解によって（化学的に分解可能）、細胞に対してかなりの毒性効果を伴わずに細胞が再使用または処分することができる成分へと分解されるものである。一実施形態では、生分解性ポリマーおよびこれらの分解副生成物は、生体適合性であり得る。
【００５３】
本明細書において開示されている粒子は、ＰＥＧを含有してもよいか、またはしなくてもよい。さらに、ある特定の実施形態は、ポリ（エステル−エーテル）を含有するコポリマー、例えば、エステル結合（例えば、Ｒ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ’結合）およびエーテル結合（例えば、Ｒ−Ｏ−Ｒ’結合）によって結合した繰り返し単位を有するポリマーを対象とすることができる。一部の実施形態では、生分解性ポリマー、例えば、カルボン酸基を含有する加水分解性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）繰り返し単位とコンジュゲートして、ポリ（エステル−エーテル）を形成し得る。ポリ（エチレングリコール）繰り返し単位を含有するポリマー（例えば、コポリマー、例えば、ブロックコポリマー）はまた、「ペグ化」ポリマーと称することができる。
【００５４】
例えば、企図されるポリマーは、（例えば、対象内で）水への曝露によって自発的に加水分解するものでよいか、またはポリマーは、（例えば、約３７℃の温度での）熱への曝露によって分解し得る。ポリマーの分解は、使用するポリマーまたはコポリマーによって様々な速度で起こり得る。例えば、ポリマーの半減期（ポリマーの５０％がモノマーおよび／または他の非ポリマー部分に分解することができる時間）は、ポリマーによって数日、数週間、数カ月、または数年程度であり得る。ポリマーは、例えば、酵素活性または細胞の機構によって、場合によって、例えば、リゾチーム（例えば、相対的に低ｐＨを有する）への曝露によって、生物学的に分解し得る。場合によって、ポリマーは、細胞に対して有意な毒性効果を伴わずに、細胞が再使用するか、または処分することができる、モノマーおよび／または他の非ポリマー部分に分解し得る（例えば、ポリラクチドは加水分解して、乳酸を形成し得、ポリグリコリドは加水分解して、グリコール酸などを形成し得る）。
【００５５】
一部の実施形態では、ポリマーは、本明細書において「ＰＬＧＡ」と集団的に称される、乳酸およびグリコール酸単位を含むコポリマー、例えば、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）；ならびに本明細書において「ＰＧＡ」と称される、グリコール酸単位、ならびに本明細書において「ＰＬＡ」と集団的に称される、乳酸単位、例えば、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリ−Ｄ−乳酸、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸、ポリ−Ｌ−ラクチド、ポリ−Ｄ−ラクチド、およびポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチドを含むホモポリマーを含めた、ポリエステルであり得る。一部の実施形態では、例示的なポリエステルには、例えば、ポリヒドロキシ酸；ラクチドおよびグリコリドのペグ化ポリマーおよびコポリマー（例えば、ペグ化ＰＬＡ、ペグ化ＰＧＡ、ペグ化ＰＬＧＡ、およびその誘導体）が含まれる。一部の実施形態では、ポリエステルは、例えば、ポリ無水物、ポリ（オルトエステル）ペグ化ポリ（オルトエステル）、ポリ（カプロラクトン）、ペグ化ポリ（カプロラクトン）、ポリリシン、ペグ化ポリリシン、ポリ（エチレンイミン）、ペグ化ポリ（エチレンイミン）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リシン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］、およびその誘導体を含む。
【００５６】
一部の実施形態では、ポリマーは、ＰＬＧＡであり得る。ＰＬＧＡは、乳酸およびグリコール酸の生体適合性および生分解性コポリマーであり、様々な形態のＰＬＧＡは、乳酸：グリコール酸の比によって特性決定することができる。乳酸は、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、またはＤ，Ｌ−乳酸でよい。ＰＬＧＡの分解速度は、乳酸−グリコール酸の比を変化させることによって調節することができる。一部の実施形態では、ＰＬＧＡは、概ね８５：１５、概ね７５：２５、概ね６０：４０、概ね５０：５０、概ね４０：６０、概ね２５：７５、または概ね１５：８５の乳酸：グリコール酸比によって特性決定することができる。一部の実施形態では、粒子のポリマー（例えば、ＰＬＧＡブロックコポリマーまたはＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマー）中の乳酸のグリコール酸モノマーに対する比を選択して、様々なパラメータ、例えば、水の取込み、治療剤の放出および／またはポリマー分解の反応速度について最適化し得る。
【００５７】
一部の実施形態では、ポリマーは、１種または複数のアクリルポリマーであり得る。ある特定の実施形態では、アクリルポリマーは、例えば、アクリル酸およびメタクリル酸コポリマー、メタクリル酸メチルコポリマー、メタクリル酸エトキシエチル、メタクリル酸シアノエチル、メタクリル酸アミノアルキルコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、メタクリル酸アルキルアミドコポリマー、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリアクリルアミド、メタクリル酸アミノアルキルコポリマー、メタクリル酸グリシジルコポリマー、ポリシアノアクリレート、および上記のポリマーの１つまたは複数を含む組合せを含む。アクリルポリマーは、低含量の第四級アンモニウム基を有するアクリル酸およびメタクリル酸エステルの完全に重合されたコポリマーを含み得る。
【００５８】
一部の実施形態では、ポリマーは、カチオン性ポリマーでよい。一般に、カチオン性ポリマーは、負に帯電している核酸鎖（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその誘導体）を凝縮および／または保護することができる。アミン含有ポリマー、例えば、ポリ（リシン）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、およびポリ（アミドアミン）デンドリマーは、一部の実施形態では、開示されている粒子における使用のために企図される。
【００５９】
一部の実施形態では、ポリマーは、カチオン性側鎖を担持する分解性ポリエステルでよい。これらのポリエステルの例には、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リシン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）が含まれる。
【００６０】
例えば、ＰＥＧがリガンドにコンジュゲートしていないとき、ＰＥＧは、終端しており、末端基を含んでいてもよいことが企図されている。例えば、ＰＥＧは、ヒドロキシル、メトキシもしくは他のアルコキシル基、メチルもしくは他のアルキル基、アリール基、カルボン酸、アミン、アミド、アセチル基、グアニジノ基、またはイミダゾールで終端し得る。他の企図される末端基には、アジド、アルキン、マレイミド、アルデヒド、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、アルコキシアミン、またはチオール部分が含まれる。
【００６１】
当業者は、例えば、開環重合技術（ＲＯＭＰ）などによって、ポリマーをアミンで終端しているＰＥＧ基に反応させるＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を使用することによって、ポリマーをペグ化するための方法および技術について知っている。
【００６２】
一実施形態では、ポリマーの分子量（または、例えば、コポリマーの異なるブロックの分子量の比）は、本明細書に開示されている有効な処置のために最適化することができる。例えば、ポリマーの分子量は、粒子分解速度（例えば、生分解性ポリマーの分子量を調節することができるとき）、溶解度、水の取込み、および薬物放出動態に影響を与えてもよい。例えば、ポリマーの分子量（または、例えば、コポリマーの異なるブロックの分子量の比）は、粒子が合理的な期間（数時間から１〜２週間、３〜４週間、５〜６週間、７〜８週間などの範囲）内で、処置される対象において生分解するように調節することができる。
【００６３】
開示されている粒子は、例えば、ＰＥＧおよびＰＬ（Ｇ）Ａのジブロックコポリマーを含むことができ、例えば、ＰＥＧ部分は、約１，０００〜２０，０００、例えば、約２，０００〜２０，０００、例えば、約２〜約１０，０００の数平均分子量を有してもよく、ＰＬ（Ｇ）Ａ部分は、約５，０００〜約２０，０００、または約５，０００〜１００，０００、例えば、約２０，０００〜７０，０００、例えば、約１５，０００〜５０，０００の数平均分子量を有してもよい。
【００６４】
例えば、約１０〜約９９重量パーセントのポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーまたはポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマー、または約２０〜約８０重量パーセント、約４０〜約８０重量パーセント、もしくは約３０〜約５０重量パーセント、もしくは約７０〜約９０重量パーセントのポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーまたはポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーを含む例示的な治療用ナノ粒子が本明細書において開示される。例示的なポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーは、約１０〜約２０ｋＤａ、約１５〜約２０ｋＤａ、または約１０〜約２５ｋＤａの数平均分子量のポリ（乳）酸および約４〜約６ｋＤａ、または約２ｋＤａ〜約１０ｋＤａの数平均分子量のポリ（エチレン）グリコールを含むことができる。
【００６５】
一部の実施形態では、ポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーは、約０．６〜約０．９５、一部の実施形態では、約０．７〜約０．９、一部の実施形態では、約０．６〜約０．８、一部の実施形態では、約０．７〜約０．８、一部の実施形態では、約０．７５〜約０．８５、一部の実施形態では、約０．８〜約０．９、および一部の実施形態では、約０．８５〜約０．９５の数平均分子量比率のポリ（乳）酸を有し得る。ポリ（乳）酸の数平均分子量比率は、コポリマーのポリ（乳）酸成分の数平均分子量を、ポリ（乳）酸成分の数平均分子量およびポリ（エチレン）グリコール成分の数平均分子量の合計で除することによって計算し得ることを理解すべきである。
【００６６】
開示されているナノ粒子は、約１〜約５０重量パーセントのポリ（乳）酸またはポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸（ＰＥＧを含まない）を場合により含んでいてもよいか、または約１〜約５０重量パーセント、もしくは約１０〜約５０重量パーセントもしくは約３０〜約５０重量パーセントのポリ（乳）酸もしくはポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸を場合により含んでいてもよい。例えば、ポリ（乳）酸またはポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸は、約５〜約１５ｋＤａ、または約５〜約１２ｋＤａの数平均分子量を有し得る。例示的なＰＬＡは、約５〜約１０ｋＤａの数平均分子量を有し得る。例示的なＰＬＧＡは、約８〜約１２ｋＤａの数平均分子量を有し得る。
【００６７】
治療用ナノ粒子は、一部の実施形態では、約１０〜約３０重量パーセント、一部の実施形態では、約１０〜約２５重量パーセント、一部の実施形態では、約１０〜約２０重量パーセント、一部の実施形態では、約１０〜約１５重量パーセント、一部の実施形態では、約１５〜約２０重量パーセント、一部の実施形態では、約１５〜約２５重量パーセント、一部の実施形態では、約２０〜約２５重量パーセント、一部の実施形態では、約２０〜約３０重量パーセント、または一部の実施形態では、約２５〜約３０重量パーセントのポリ（エチレン）グリコールを含有してもよく、ポリ（エチレン）グリコールは、ポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマー、ポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマー、またはポリ（エチレン）グリコールホモポリマーとして存在し得る。ある特定の実施形態では、ナノ粒子のポリマーは、脂質にコンジュゲートすることができる。ポリマーは、例えば、脂質末端ＰＥＧでよい。
【００６８】
標的化部分
一部の実施形態では、任意選択の標的化部分、すなわち、生物学的実体、例えば、膜成分、細胞表面受容体、抗原などに結合するか、そうでなければ会合することができる部分を含み得るナノ粒子が本明細書において提供される。粒子の表面上に存在する標的化部分は、粒子が特定の標的化部位、例えば、腫瘍、疾患部位、組織、器官、細胞のタイプなどにおいて局在化することを可能とし得る。したがって、ナノ粒子は、「標的特異的」であり得る。次いで、薬物または他の負荷物は、場合によって、粒子から放出され、特定の標的化部位と局所的に相互作用することを可能とし得る。
【００６９】
開示されるナノ粒子は、経細胞／トランスサイトーシス、ポトサイトーシス、エンドサイトーシス、または生合成輸送機能において有効である疎水性イオン対を含む場合がある。一部の実施形態では、標的化部分は、トランスサイトーシスまたはエンドサイトーシスの受容体部位に向けてナノ粒子を標的化することができる。例えば、標的化部分は、カベオリンタンパク質を介してエンドサイトーシスをなし得るカベオラに向けてナノ粒子を標的化することができる。他の実施形態では、巨大分子を取り込むための公知の効率的な経路であるクラスリン被覆ピットおよび小胞が標的とされる。受容体仲介エンドサイトーシスと呼ばれるこのプロセスにおいて、巨大分子は、相補的な膜貫通受容体タンパク質に結合し、被覆ピットに蓄積し、次いで、クラスリン被覆小胞中の受容体−巨大分子複合体として細胞に侵入する。２５種を越える種々の受容体が、異なるタイプの分子の受容体仲介エンドサイトーシスに関与しており、同じクラスリン被覆ピット経路を使用し得ることがわかっている（例えば、ＬＤＬ受容体、トランスフェリン受容体、ＥＧＦ（上皮成長因子）を結合する受容体）。したがって、企図される標的化分子は、受容体仲介エンドサイトーシスに関与することが公知の種々の受容体を標的とし得ると理解すべきである。
【００７０】
受容体−リガンド結合は、解離する場合があり、エンドソーム区画からの経路をたどる場合があると理解すべきである。例えば、エンドリソソーム離脱剤を含めることで、核酸−疎水性対イオン複合体は、異なる形質膜ドメインへと放出される場合がある。
【００７１】
一実施形態では、開示されているナノ粒子は、低分子量リガンドである標的化部分を含む。用語「結合」または「結合すること」は、本明細書において使用する場合、典型的には、これらに限定されないが、生化学的、生理的、および／または化学的相互作用を含めた特異的または非特異的な結合または相互作用による、相互親和性または結合能力を示す、対応する分子の対またはその部分の間の相互作用を指す。「生物学的結合」は、タンパク質、核酸、糖タンパク質、炭水化物、ホルモンなどを含めた分子の対の間に起こる相互作用のタイプを定義する。用語「結合パートナー」は、特定の分子と結合することができる分子を指す。「特異的結合」は、他の同様の生物学的実体に対してより実質的により高い程度まで結合パートナー（または限定された数の結合パートナー）に結合するか、認識することができる分子、例えば、ポリヌクレオチドを指す。一組の実施形態では、標的化部分は、約１マイクロモル未満、少なくとも約１０マイクロモル、または少なくとも約１００マイクロモルの親和性（解離定数によって測定すると）を有する。
【００７２】
例えば、標的化部は、粒子が、使用する標的化部分によって、対象の体内の腫瘍（例えば、固形腫瘍）、疾患の部位、組織、器官、あるタイプの細胞などへと局在化することをもたらし得る。例えば、低分子量リガンドは、固形腫瘍、例えば、乳房腫瘍もしくは前立腺腫瘍またはがん細胞に局在化し得る。対象は、ヒトまたはヒトではない動物であり得る。対象の例には、これらに限定されないが、哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ロバ、ウサギ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、霊長類、ヒトなどが含まれる。
【００７３】
企図される標的化部分は、低分子を含み得る。ある特定の実施形態では、用語「低分子」は、天然に生じたか、または人工的に創出した（例えば、化学合成による）、相対的に低分子量を有し、かつタンパク質、ポリペプチド、または核酸でない有機化合物を指す。低分子は典型的には、複数の炭素−炭素結合を有する。ある特定の実施形態では、低分子は、サイズが約２０００ｇ／ｍｏｌ未満である。一部の実施形態では、低分子は、約１５００ｇ／ｍｏｌ未満または約１０００ｇ／ｍｏｌ未満である。一部の実施形態では、低分子は、約８００ｇ／ｍｏｌ未満または約５００ｇ／ｍｏｌ未満、例えば、約１００ｇ／ｍｏｌ〜約６００ｇ／ｍｏｌ、または約２００ｇ／ｍｏｌ〜約５００ｇ／ｍｏｌである。
【００７４】
一部の実施形態では、低分子量リガンドは、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのもの：
【００７５】
【化２】
2018528194.tif 000003
およびエナンチオマー、立体異性体、回転異性体、互変異性体、ジアステレオマー、またはそのラセミ化合物であり、
式中、ｍおよびｎは、それぞれ独立に、０、１、２または３であり、ｐは、０または１であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、置換もしくは非置換アルキル（例えば、Ｃ１〜１０−アルキル、Ｃ１〜６−アルキル、またはＣ１〜４−アルキル）、置換もしくは非置換アリール（例えば、フェニルまたはピリジニル）、および任意のこれらの組合せからなる群から選択され、Ｒ３は、ＨまたはＣ１〜６−アルキル（例えば、ＣＨ３）である。
【００７６】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの化合物について、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４またはＲ５は、ナノ粒子への結合点、例えば、開示されているナノ粒子の一部を形成するポリマー、例えば、ＰＥＧへの結合点を含む。結合点は、共有結合、イオン結合、水素結合、化学的吸着および物理的吸着を含めた吸着によって形成される結合、ファンデルワールス結合によって形成される結合、または分散力によって形成し得る。例えば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、またはＲ５が、アニリンまたはＣ１〜６−アルキル−ＮＨ２基と定義されている場合、これらの官能基の任意の水素（例えば、アミノ水素）は、除去することができ、低分子量リガンドが、ナノ粒子のポリマーマトリックス（例えば、ポリマーマトリックスのＰＥＧ−ブロック）に共有結合している。本明細書において使用する場合、用語「共有結合」は、少なくとも一対の電子を共有することによって形成される２個の原子の間の結合を指す。
【００７７】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、Ｃ１〜６−アルキルもしくはフェニル、またはＣ１〜６−アルキルもしくはフェニルの任意の組合せであり、これらはＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、またはＣＯ２Ｈで１回または複数回独立に置換されており、アルキル基は、Ｎ（Ｈ）、Ｓ、またはＯによって中断し得る。別の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、ＣＨ２−Ｐｈ、（ＣＨ２）２−ＳＨ、ＣＨ２−ＳＨ、（ＣＨ２）２Ｃ（Ｈ）（ＮＨ２）ＣＯ２Ｈ、ＣＨ２Ｃ（Ｈ）（ＮＨ２）ＣＯ２Ｈ、ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、（ＣＨ２）２Ｃ（Ｈ）（ＳＨ）ＣＯ２Ｈ、ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−Ｐｈ、Ｏ−ＣＨ２−Ｐｈ、またはＯ−（ＣＨ２）２−Ｐｈであり、各Ｐｈは、独立に、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＯ２Ｈ、またはＳＨで１回または複数回置換し得る。これらの式について、ＮＨ２、ＯＨまたはＳＨ基は、ナノ粒子（例えば、−Ｎ（Ｈ）−ＰＥＧ、−Ｏ−ＰＥＧ、または−Ｓ−ＰＥＧ）への共有結合点としての役割を果たす。
【００７８】
例示的なリガンドは、
【００７９】
【化３】
2018528194.tif 000004
およびエナンチオマー、立体異性体、回転異性体、互変異性体、ジアステレオマー、またはそのラセミ化合物を含み、式中、ＮＨ２、ＯＨ、またはＳＨ基は、ナノ粒子（例えば、−Ｎ（Ｈ）−ＰＥＧ、−Ｏ−ＰＥＧ、もしくは−Ｓ−ＰＥＧ）への共有結合点としての役割を果たすか、または
【００８０】
【化４】
2018528194.tif 000005
は、ナノ粒子への結合点を示し、式中、ｎは、１、２、３、４、５、または６であり、Ｒは、ＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、もしくはＣＯ２Ｈで置換されているＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、ＣＯ２Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６−アルキル、およびＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、もしくはＣＯ２Ｈで置換されているフェニルからなる群から独立に選択され、Ｒは、ナノ粒子（例えば、−Ｎ（Ｈ）−ＰＥＧ、−Ｓ−ＰＥＧ、−Ｏ−ＰＥＧ、またはＣＯ２−ＰＥＧ）への共有結合点としての役割を果たす。これらの化合物は、ＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、もしくはＣＯ２Ｈで置換されているＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、ＣＯ２Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６−アルキル、またはＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、もしくはＣＯ２Ｈで置換されているフェニルでさらに置換されていてもよく、これらの官能基はまた、ナノ粒子への共有結合点としての役割を果たすことができる。
【００８１】
一部の実施形態では、固形腫瘍、例えば、前立腺または乳がん腫瘍と関連する細胞を標的とするために使用し得る低分子標的化部分は、ＰＳＭＡペプチダーゼ阻害剤、例えば、２−ＰＭＰＡ、ＧＰＩ５２３２、ＶＡ−０３３、フェニルアルキルホスホンアミデートならびに／またはその類似体および誘導体を含む。一部の実施形態では、前立腺がん腫瘍と関連する細胞を標的とするために使用し得る低分子標的化部分は、チオールおよびインドールチオール誘導体、例えば、２−ＭＰＰＡおよび３−（２−メルカプトエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボン酸誘導体を含む。一部の実施形態では、前立腺がん腫瘍と関連する細胞を標的とするために使用し得る低分子標的化部分は、ヒドロキサメート誘導体を含む。一部の実施形態では、前立腺がん腫瘍と関連する細胞を標的とするために使用し得る低分子標的化部分は、ＰＢＤＡおよび尿素をベースとする阻害剤、例えば、ＺＪ４３、ＺＪ１１、ＺＪ１７、ＺＪ３８ならびに／またはその類似体および誘導体、アンドロゲン受容体標的化剤（ＡＲＴＡ）、ポリアミン、例えば、プトレシン、スペルミン、およびスペルミジン、ＮＡＡＧペプチダーゼまたはＮＡＡＬＡＤアーゼとしてもまた公知である酵素グルタミン酸カルボキシラーゼＩＩ（ＧＣＰＩＩ）の阻害剤を含む。
【００８２】
一部の実施形態では、企図されるリガンドは、固形腫瘍を処置するために線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とし得る低分子ＤＰＰＩＶ阻害剤である場合もある。スルホンアミド（アセトゾールアミド（Ａｃｅｔｏｚｏｌａｍｉｄｅ）他）リガンドは、ｃｃＲＣＣ（明細胞腎細胞癌）および他の固形腫瘍を処置するためにＧ２５０抗原を標的とし得る。リガンドは、神経膠芽腫および固形腫瘍を処置するためにクロロトキシン受容体を標的とし得るクロロトキシンを含む場合もある。低分子は、白血病、リンパ腫、および血管新生の上方調節を処置するために、ＣＸＣＲ４およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を標的とする場合もある。
【００８３】
別の実施形態では、標的化部分は、葉酸受容体またはｔｏｌｌ受容体を標的とするリガンドでよい。別の実施形態では、標的化部分は、ホレート、葉酸、低分子、抗体、およびナノボディである。
【００８４】
標的化部分は、標的化抗体を含み得る。ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６）、ＩＧＦ−Ｒ、メソテリン、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原（ＣＤ１７４）、ＣａｎＡｇ（ＭＵＣ１、ＰＥＭ、ＣＡ２４２、ＣＤ２０５）、ＮＣＡＭ（ＣＤ５６）、Ｃｒｉｐｔｏ、メラノトランスフェリン（Ｐ９７）、糖タンパク質ＮＭＢ（ＣＧ５６９７２）、ＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド）、５Ｔ４（栄養芽細胞糖タンパク質）、ＣＤ５７、ＣＤ４４、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＧＤ２、ＣＤ４０、フィブロネクチンＥＤ−Ｂ、エンドグリン（ＣＤ１０５）、テネイシンＣ、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ＨＥＲ３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ＣＤ１３８、ＣＳ１（ＣＤ３１９、ＣＲＡＣＣ）、ＴＡＧ−７２、ＣＤ２、ＣＤ６４、ＲＯＢＯ４、ＤＬＬ４、Ｔｉｅ２、および／またはＢ７−Ｈ３を標的とする抗体が企図される。例えば、テネイシンＣ標的化抗体を用いてテネイシンＣを標的とすると、神経膠腫および癌腫を処置することができる。ヘレグリンまたはＨＥＲ３標的化抗体を用いてＨＥＲ３を標的とすると、固形腫瘍を処置することができる。ＣＤ３３抗体は、ＡＭＬ処置のためにＣＤ３３を標的とし得る。例えば、ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６）、ＩＧＦ−Ｒ、メソテリン、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原（ＣＤ１７４）、ＣａｎＡｇ（ＭＵＣ１、ＰＥＭ、ＣＡ２４２、ＣＤ２０５）、ＮＣＡＭ（ＣＤ５６）、およびＣｒｉｐｔｏを標的とする抗体は、固形腫瘍の処置に使用することができる。メラノトランスフェリン（Ｐ９７）を標的とする抗体は、原発性および転移性黒色腫の処置に使用することができる。ＣＤ３０は、抗体を用いて、ホジキンおよびＡＬＣリンパ腫の処置のための標的とすることができる。ＣＤ７４は、抗体を用いて、多発性骨髄腫、ＮＨＬ、またはＣＬＬの処置のための標的とすることができる。Ａｆｆｙｍａｘペプチドは、固形腫瘍の処置のために、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２を標的とすることができる。Ｄｙａｘ  Ｌｉｔｔなどのペプチドは、固形腫瘍の処置のために、ｃ−Ｍｅｔを標的とすることができる。他のペプチドおよび低分子リガンドは、固形腫瘍の処置のために、ＥｐｈＡ２およびＥｐｈＢ２を標的とすることができる。
【００８５】
例えば、企図される標的化部分は、核酸、アプタマー、ポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、または脂質を含み得る。例えば、標的化部分は、細胞型特異的マーカーに結合する核酸標的化部分（例えば、アプタマー、例えば、Ａ１０アプタマー）でよい。一般に、アプタマーは、特定の標的、例えば、ポリペプチドに結合するオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその類似体もしくは誘導体）である。一部の実施形態では、標的化部分は、細胞表面受容体のための天然または合成リガンド、例えば、成長因子、ホルモン、ＬＤＬ、トランスフェリンなどでよい。標的化部分は抗体でよく、この用語は抗体フラグメントを含むものとする。抗体の特徴的部分、単鎖標的化部分は、例えば、手順、例えば、ファージディスプレイを使用して同定することができる。
【００８６】
標的化部分は、約５０残基までの長さを有する標的化ペプチドまたは標的化ペプチド模倣物であり得る。例えば、標的化部分は、アミノ酸配列ＡＫＥＲＣ、ＣＲＥＫＡ、ＡＲＹＬＱＫＬＮ、またはＡＸＹＬＺＺＬＮを有してもよく、ＸおよびＺは、可変のアミノ酸、またはその保存的バリアントもしくはペプチド模倣物である。特定の実施形態では、標的化部分は、アミノ酸配列ＡＫＥＲＣ、ＣＲＥＫＡ、ＡＲＹＬＱＫＬＮ、またはＡＸＹＬＺＺＬＮを含むペプチドであり、ＸおよびＺは、可変のアミノ酸であり、２０個未満、５０個未満または１００個未満の残基の長さを有する。ＣＲＥＫＡ（Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｌａ）ペプチドもしくはそのペプチド模倣物、またはオクタペプチドＡＸＹＬＺＺＬＮはまた、コラーゲンＩＶに結合するか、もしくはコラーゲンＩＶと複合体を形成するか、または組織基底膜（例えば、血管の基底膜）を標的とする、標的化部分、およびペプチド、またはその保存的バリアントもしくはペプチド模倣物として企図される。例示的な標的化部分は、ＩＣＡＭ（細胞間接着分子、例えば、ＩＣＡＭ−１）を標的とするペプチドを含む。ペプチドをベースとする他の標的化部分は、Ａｆｆｙｍａｘ、Ｄｙａｘ  Ｌｉｔｔ、ＹＳＡ／ＳＷＬ、ＮＧＲペプチドおよびｂｅｓｔａｔｉｎ類似体、オクトレオチド、ＣＣＫおよびガストリン類似体、リュープロリドおよび類似体、ＧＬＰ１／エクセナチド、レクチン、ならびにＭｅｒｃａｔｏｒとなる場合がある。標的化リガンドは、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２、ｃ−Ｍｅｔ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ２、アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）、ＶＬＡ−４（α４β１インテグリン）、ＣＸＣＲ４、メラノコルチン受容体（ＭＣ１Ｒ）、ソマトスタチン受容体、コレシストキニン受容体、ＧｎＲＨ受容体、ＧＬＰ１受容体、Ｅ−セレクチン、ＩＬ−１１受容体、トロンボスポンジン−１受容体、エンドスタチン、ＣＤ７９、およびＣＤ７４を標的とし得ると理解すべきである。
【００８７】
本明細書において開示されている標的化部分は、一部の実施形態では、開示されているポリマーまたはコポリマー（例えば、ＰＬＡ−ＰＥＧ）にコンジュゲートすることができ、このようなポリマーコンジュゲートは、開示されているナノ粒子の一部を形成し得る。
【００８８】
一部の実施形態では、治療用ナノ粒子は、ポリマー−薬物コンジュゲートを含み得る。例えば、薬物は、開示されているポリマーまたはコポリマー（例えば、ＰＬＡ−ＰＥＧ）にコンジュゲートしていてもよく、このようなポリマー−薬物コンジュゲートは、開示されているナノ粒子の一部を形成し得る。例えば、開示されている治療用ナノ粒子は、約０．２〜約３０重量パーセントのＰＬＡ−ＰＥＧまたはＰＬＧＡ−ＰＥＧを場合により含んでいてもよく、ＰＥＧは、薬物（例えば、ＰＬＡ−ＰＥＧ−薬物）で官能化されている。
【００８９】
開示されているポリマーコンジュゲート（例えば、ポリマー−リガンドコンジュゲート）は、任意の適切なコンジュゲーション技術を使用して形成し得る。例えば、２種の化合物、例えば、標的化部分または薬物および生体適合性ポリマー（例えば、生体適合性ポリマーおよびポリ（エチレングリコール））は、ＥＤＣ−ＮＨＳ化学反応（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド）などの技術、またはチオール、アミン、または同様に官能化されたポリエーテルの１つの末端にコンジュゲートすることができるマレイミドもしくはカルボン酸が関与する反応を使用して一緒にコンジュゲートし得る。ポリマー−標的化部分コンジュゲートまたはポリマー−薬物コンジュゲートを形成させる標的化部分または薬物およびポリマーのコンジュゲーションは、これらに限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、アセトンなどなどの有機溶媒中で行うことができる。特定の反応条件は、単に通例の実験法を使用して当業者が決定することができる。
【００９０】
別の組の実施形態では、コンジュゲーション反応は、カルボン酸官能基（例えば、ポリ（エステル−エーテル）化合物）を含むポリマーと、アミンを含むポリマーまたは他の部分（例えば、標的化部分または薬物）とを反応させることによって行い得る。例えば、標的化部分、例えば、低分子量リガンド、または薬物、例えば、ダサチニブは、アミンと反応して、アミン含有部分を形成してもよく、これは次いで、ポリマーのカルボン酸にコンジュゲートすることができる。このような反応は、単一ステップの反応として起こり得、すなわち、コンジュゲーションは、中間体、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはマレイミドを使用することなく行われる。一部の実施形態では、薬物は、アミン含有リンカーと反応して、アミン含有薬物を形成してもよく、次いで、これは上記のようなポリマーのカルボン酸にコンジュゲートすることができる。アミン含有部分およびカルボン酸末端ポリマー（例えば、ポリ（エステル−エーテル）化合物）の間のコンジュゲーション反応は、一組の実施形態では、（これらに限定されないが）ジクロロメタン、アセトニトリル、クロロホルム、テトラヒドロフラン、アセトン、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ピリジン、ジオキサン、またはジメチルスルホキシドなどの有機溶媒に可溶化したアミン含有部分を、カルボン酸末端ポリマーを含有する溶液に加えることによって達成し得る。カルボン酸末端ポリマーは、これらに限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、またはアセトンなどの有機溶媒中に含有し得る。アミン含有部分およびカルボン酸末端ポリマーの間の反応は、場合によって、自発的に起こり得る。コンジュゲートしていない反応物は、このような反応の後に洗い流してもよく、ポリマーは、溶媒、例えば、エチルエーテル、ヘキサン、メタノール、またはエタノール中で沈殿し得る。ある特定の実施形態では、コンジュゲートは、ポリマーのアルコール含有部分およびカルボン酸官能基の間に形成してもよく、これはアミンおよびカルボン酸のコンジュゲートについて上で記載したのと同様に達成することができる。
【００９１】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、２種の異なるタイプのリガンドを含む場合があると理解すべきである。例えば、ナノ粒子は、低分子リガンドと核酸型リガンドとを含む場合がある。一部の実施形態では、ナノ粒子は、３種の異なるタイプのリガンドを含む場合もある。一部の実施形態では、ナノ粒子は、多種の異なるタイプのリガンドを含む場合もある。開示されるナノ粒子は、異なる幾種類のリガンドを含んでもよいと理解すべきである。
【００９２】
ナノ粒子の調製
本開示の別の態様は、開示されているナノ粒子を作製する系および方法を対象とする。異なる比の２種またはそれ超の異なるポリマー（例えば、コポリマー、例えば、ブロックコポリマー）を使用し、かつポリマー（例えば、コポリマー、例えば、ブロックコポリマー）から粒子を生成する一部の実施形態では、粒子の特性は制御される。例えば、１種のポリマー（例えば、コポリマー、例えば、ブロックコポリマー）は、低分子量リガンドを含んでいてもよく、一方、別のポリマー（例えば、コポリマー、例えば、ブロックコポリマー）は、その生体適合性および／または生成した粒子の免疫原性を制御するその能力のために選択し得る。
【００９３】
一部の実施形態では、ナノ粒子調製プロセス（例えば、以下で論じるとおりのナノ沈殿プロセスまたはナノエマルジョンプロセス）において使用する溶媒は、プロセスを使用して調製されたナノ粒子に有利な特性を付与し得る、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤を含んでいてもよい。上で論じたとおり、場合によって、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤は、薬物添加量を改善し、核酸の完全性を保ち、開示されるナノ粒子のトランスフェクションを達成し得る。さらに、場合によって、開示されるナノ粒子の制御放出特性も、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤の使用によって改善し得る。エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤は、場合によって、例えば、プロセスにおいて使用する有機溶液または水溶液中に含まれていてもよい。一実施形態では、薬物が、有機溶液およびエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤、ならびに１種または複数のポリマーと任意選択により合わせられる。薬物を溶解させるのに使用する溶液中のエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオンの濃度は、上で論じており、例えば、約１重量パーセント〜約３０重量パーセントの間などでよい。
【００９４】
一組の実施形態では、１種または複数のポリマーを含む溶液を提供し、この溶液をポリマー非溶媒と接触させ、粒子を生成させることによって、粒子が形成される。溶液は、ポリマー非溶媒と混和性または不混和性であり得る。例えば、水混和性液体、例えば、アセトニトリルは、ポリマーを含有してもよく、例えば、アセトニトリルを水中に制御された速度で注ぐことによって、アセトニトリルが水、ポリマー非溶媒と接触すると、粒子が形成される。溶液内に含有されるポリマーは、ポリマー非溶媒との接触によって、沈殿し、粒子、例えば、ナノ粒子を形成し得る。２種の液体は、周囲温度および周囲圧力で、一方が他方中で少なくとも１０重量％のレベルまで可溶性でないとき、互いに「不混和性」または混和性でないと言われる。典型的には、有機溶液（例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、クロロホルム、テトラヒドロフラン、アセトン、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ピリジン、ジオキサン、ジメチルスルホキシドなど）および水性液体（例えば、水、または溶解した塩もしくは他の種を含有する水、細胞もしくは生体媒体、エタノールなど）は、互いに関して不混和性である。例えば、第１の溶液を、第２の溶液中に注いでもよい（適切な速度またはスピードで）。場合によって、例えば、第１の溶液が、不混和性の第２の液体に接触するにつれ、粒子、例えば、ナノ粒子が形成し得、例えば、接触によるポリマーの沈殿は、第１の溶液が第２の液体中に注がれる間、ポリマーがナノ粒子の形成をもたらし、場合によって、例えば、導入の速度が相対的に遅い速度で注意深く制御および維持されるとき、ナノ粒子を形成し得る。このような粒子形成の制御は、通例の実験法のみを使用して当業者が容易に最適化することができる。
【００９５】
表面機能性、表面電荷、サイズ、ゼータ（ζ）電位、疎水性、免疫原性を制御する能力などの特性は、開示されているプロセスを使用して高度に制御し得る。例えば、粒子のライブラリーを合成、およびスクリーニングして、粒子が、粒子の表面上に存在する特定の密度の部分（例えば、低分子量リガンド）を有することを可能とする、特定の比のポリマーを有する粒子を同定し得る。これによって、過度の程度の労力を伴わずに、１つまたは複数の特定の特性、例えば、特定のサイズおよび特定の表面密度の部分を有する粒子を調製することを可能とする。したがって、ある特定の実施形態は、このようなライブラリーを使用したスクリーニング技術、およびこのようなライブラリーを使用して同定された任意の粒子を対象とする。さらに、同定は、任意の適切な方法によって行い得る。例えば、同定は直接的もしくは間接的でよいか、または定量的にもしくは定性的に進行し得る。
【００９６】
一部の実施形態では、既に形成されたナノ粒子は、リガンド−官能化ポリマーコンジュゲートを生成するために記載されたものと類似の手順を使用して、標的化部分で官能化される。例えば、第１のコポリマー（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）およびポリ（エチレングリコール））を核酸と混合して、粒子を形成させる。次いで、粒子を低分子量リガンドと会合させて、がんまたは他の障害の処置のために使用することができるナノ粒子を形成させる。粒子は、ナノ粒子のリガンド表面密度を制御し、それによってナノ粒子の治療の特徴を変化させるために、様々な量の低分子量リガンドと会合させることができる。さらに、例えば、パラメータ、例えば、分子量、ＰＥＧの分子量、およびナノ粒子の表面電荷を制御することによって、非常に正確に制御された粒子を得てもよい。
【００９７】
別の実施形態では、ナノエマルジョンプロセス、例えば、図１、２Ａ、および／または２Ｂにおいて表すプロセスを提供する。例えば、核酸、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤、第１のポリマー（例えば、どちらもリガンドに場合により結合し得るＰＬＡ−ＰＥＧまたはＰＬＧＡ−ＰＥＧなどのジブロックコポリマー）、および任意選択の第２のポリマー（例えば、（ＰＬ（Ｇ）Ａ−ＰＥＧまたはＰＬＡ）を、有機溶液と合わせて、第１の有機相を形成することができる。他のプロセスでは、核酸および／または疎水性対イオン剤を、水相に加える。このような第１の相は、約１〜約５０重量％の固体、約５〜約５０重量％の固体、約５〜約４０重量％の固体、約１〜約１５重量％の固体、または約１０〜約３０重量％の固体を含み得る。第１の有機相は、第１の水溶液と合わせて、第２の相を形成し得る。有機溶液は、例えば、トルエン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、イソプロピルアルコール、酢酸イソプロピル、ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、ベンジルアルコール、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｓｐａｎ８０など、およびこれらの組合せを含むことができる。ある実施形態では、有機相は、ベンジルアルコール、酢酸エチル、およびこれらの組合せを含み得る。第２の相は、約０．１〜５０重量％、約１〜５０重量％、約５〜４０重量％、または約１〜１５重量％の固体でよい。水溶液は、コール酸ナトリウム、酢酸エチル、ポリ酢酸ビニルおよびベンジルアルコールの１つまたは複数と組み合わせてもよい水であり得る。一部のプロセスでは、この水相に、核酸および／または疎水性対イオン剤が加えられる。一部の実施形態では、水相のｐＨは、核酸のｐＫａおよび／またはエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤のｐＫａに基づいて選択することができる。例えば、ある特定の実施形態では、核酸は、第１のｐＫａを有する場合があり、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤は、第２のｐＫａを有する場合があり、水相は、第１のｐＫａと第２のｐＫａとの間のｐＫａ単位に等しいｐＨを有する場合がある。特定の実施形態では、水相のｐＨは、第１のｐＫａおよび第２のｐＫａの間の約等距離であるｐＫａ単位と等しくてもよい。
【００９８】
例えば、油または有機相は、非溶媒（水）と部分的にのみ混和性である溶媒を使用し得る。したがって、十分に低い比で混合したとき、および／または有機溶媒で事前飽和された水を使用するとき、油相は液体のままである。例えば、高エネルギー分散システム、例えば、ホモジナイザーまたはソニケーターを使用して、油相を、水溶液に乳化し、液滴として、ナノ粒子に剪断し得る。エマルジョンの水性部分は、場合によっては「水相」としても公知であるが、これはコール酸ナトリウムからなり、酢酸エチルおよびベンジルアルコールで事前飽和されている界面活性剤溶液でよい。場合によって、有機相（例えば、第１の有機相）は、核酸を含むことがある。加えて、ある特定の実施形態では、水溶液（たとえば、第１の水溶液）が、エンドリソソーム破壊剤などの、実質的に疎水性の対イオン剤を含むこともある。他の実施形態では、核酸と、エンドリソソーム破壊剤などの実質的に疎水性の対イオン剤の両方を、有機相に溶解させることができる。他の実施形態では、核酸と、エンドリソソーム破壊剤などの実質的に疎水性の対イオン剤の両方を、水相に溶解させることができる。
【００９９】
第２の相を乳化して、例えば、１つまたは２つの乳化ステップにおいてエマルジョン相を形成することを行い得る。例えば、一次エマルジョンを調製し、次いで、乳化して、微細エマルジョンを形成し得る。例えば、単純な混合、高圧ホモジナイザー、プローブソニケーター、撹拌棒、またはローターステーターホモジナイザーを使用して、一次エマルジョンを形成することができる。例えば、プローブソニケーターまたは高圧ホモジナイザーの使用によって、例えば、ホモジナイザーを通す１、２、３、またはそれ超のパスを使用することによって、一次エマルジョンを微細エマルジョンに形成し得る。例えば、高圧ホモジナイザーが使用されるとき、使用される圧力は、約３０〜約６０ｐｓｉ、約４０〜約５０ｐｓｉ、約１０００〜約８０００ｐｓｉ、約２０００〜約４０００ｐｓｉ、約４０００〜約８０００ｐｓｉ、または約４０００〜約５０００ｐｓｉ、例えば、約２０００、２５００、４０００または５０００ｐｓｉであり得る。
【０１００】
場合によって、エマルジョンにおける液滴の表面対体積比が非常に高いことを特徴とし得る微細エマルジョン条件を選択して、核酸剤およびエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤の溶解度を最大にしてもよい。ある特定の実施形態では、微細エマルジョン条件下で、溶解した成分の平衡が、非常に迅速に、すなわち、ナノ粒子の凝固より急速に起こり得る。したがって、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤を、例えば、核酸剤とエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤との間のｐＫａ差に基づいて選択する、または微細エマルジョンのｐＨおよび／またはクエンチ溶液のｐＨなどの他のパラメータを調節することで、例えば、ナノ粒子の外では核酸剤および／またはエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤が拡散するのとは対照的に、ナノ粒子中では核酸−疎水性対イオン複合体の形成が決定づけられることにより、ナノ粒子の薬物添加量および放出特性に有意な影響を及ぼすことができる。
【０１０１】
一部の実施形態では、核酸と、エンドリソソーム破壊剤などの実質的に疎水性の対イオン剤は、第２の相を乳化する前に、第２の相において合わせることができる。場合によって、第２の相を乳化する前に、核酸と、エンドリソソーム破壊剤などの実質的に疎水性の対イオン剤が、核酸−疎水性対イオン複合体を形成することもある。他の実施形態では、核酸と、エンドリソソーム破壊剤などの実質的に疎水性の対イオン剤は、第２の相を乳化している間に核酸−疎水性対イオン複合体を形成し得る。例えば、核酸剤と、エンドリソソーム破壊剤などの実質的に疎水性の対イオン剤は、第２の相を乳化するのと実質的に同時に、第２の相において合わせることができ、例えば、核酸剤と、エンドリソソーム破壊剤などの実質的に疎水性の対イオン剤を、別個の溶液（例えば、２種の実質的に不混和性の溶液）に溶解させ、次いでこれを、乳化の際に合わせることができる。別の例では、核酸、およびエンドリソソーム破壊剤などの実質的に疎水性の対イオン剤を、別個の不混和性の溶液に溶解させ、次いでこれを、乳化の際に、第２の相に送ることができる。
【０１０２】
溶媒の抽出を完了し、粒子を凝固するために、溶媒蒸発または希釈を必要とし得る。抽出の反応速度およびよりスケーラブルなプロセスのより良好な制御のために、水性クエンチによる溶媒希釈を使用し得る。例えば、エマルジョンは、有機溶媒の全てを溶解するのに十分な濃度まで冷水に希釈して、クエンチされた相を形成することができる。一部の実施形態では、クエンチを約５℃またはそれ未満の温度で少なくとも部分的に行い得る。例えば、クエンチにおいて使用される水は、室温未満（例えば、約０〜約１０℃、または約０〜約５℃）である温度であり得る。ある特定の実施形態では、エマルジョン相をクエンチするのに有利なｐＨを有するクエンチは、例えば、ナノ粒子の特性、例えば、放出プロファイルを改善するか、またはナノ粒子のパラメータ、例えば、薬物添加量を改善することによって選択し得る。クエンチのｐＨは、例えば、酸もしくは塩基滴定によって、または緩衝液の適当な選択によって調節し得る。一部の実施形態では、クエンチのｐＨは、核酸のｐＫａおよび／またはエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤のｐＫａに基づいて選択することができる。例えば、ある特定の実施形態では、核酸は、第１のｐＫａを有する場合があり、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤は、第２のｐＫａを有する場合があり、エマルジョン相は、第１のｐＫａと第２のｐＫａとの間のｐＫａ単位に等しいｐＨを有する水溶液でクエンチすることができる。一部の実施形態では、得られるクエンチされた相も、第１のｐＫａおよび第２のｐＫａとの間のｐＫａ単位と等しいｐＨを有することがある。特定の実施形態では、ｐＨは、第１のｐＫａと第２のｐＫａとの間の約等距離にあるｐＫａ単位と等しい場合もある。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、乳化の間または後に、例えば、微細エマルジョンにおける平衡条件の結果として、核酸−疎水性対イオン複合体が生じる場合がある。理論に束縛されるものではないが、有機物に可溶性の対イオン（すなわち、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤）は、核酸−疎水性対イオン複合体の結果として、親水性治療剤（核酸）の、ナノ粒子、有機相、またはエマルジョン液滴への拡散を促進し得ると考えられる。理論に束縛されるものではないが、核酸−疎水性対イオン複合体のナノ粒子への溶解度は、核酸−疎水性対イオン複合体の、エマルジョンおよび／またはクエンチへの溶解度より高いため、核酸−疎水性対イオン複合体は、ナノ粒子が凝固する前に、ナノ粒子、有機相、または液滴中にとどまることができる。例えば、クエンチするのに、核酸のｐＫａとエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤のｐＫａとの間にあるｐＨを選択することにより、核酸−疎水性対イオン複合体の形成を最適化することができる。しかし、高すぎるｐＨを選択すると、エンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤をナノ粒子の外に拡散させる結果につながりかねず、一方、低すぎるｐＨを選択すると、治療剤（核酸）をナノ粒子の外に拡散させる結果につながりかねない。
【０１０４】
一部の実施形態では、ナノ粒子形成プロセスにおいて使用する水溶液（例えば、限定はしないが、水相、エマルジョン相、クエンチ、およびクエンチされた相を含める）のｐＨは、独立に選択することができ、約１〜約３の間、一部の実施形態では、約２〜約４の間、一部の実施形態では、約３〜約５の間、一部の実施形態では、約４〜約６の間、一部の実施形態では、約５〜約７の間、一部の実施形態では、約６〜約８の間、一部の実施形態では、約７〜約９の間、および一部の実施形態では、約８〜約１０の間でよい。ある特定の実施形態では、ナノ粒子形成プロセスにおいて使用する水溶液のｐＨは、約３〜約４の間、一部の実施形態では、約４〜約５の間、一部の実施形態では、約５〜約６の間、一部の実施形態では、約６〜約７の間、一部の実施形態では、約７〜約８の間、一部の実施形態では、約８〜約９の間でよい。
【０１０５】
一部の実施形態では、この段階において核酸の全ては粒子中にカプセル化されておらず、薬物可溶化剤をクエンチされた相に加え、可溶化した相を形成させる。薬物可溶化剤は、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ポリビニルピロリドン、シクロデキストラン、ドデシル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、ジエチルニトロサミン、酢酸ナトリウム、尿素、グリセリン、プロピレングリコール、グリコフロール、ポリ（エチレン）グリコール、ビス（ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル、安息香酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、またはこれらの組合せであり得る。例えば、Ｔｗｅｅｎ−８０をクエンチしたナノ粒子懸濁液に加えて、遊離薬物を可溶化し、薬物結晶の形成を防止し得る。一部の実施形態では、薬物可溶化剤の核酸に対する比は、約２００：１〜約１０：１であり、または一部の実施形態では、約１００：１〜約１０：１である。
【０１０６】
可溶化した相を濾過して、ナノ粒子を回収し得る。例えば、限外濾過膜を使用して、ナノ粒子懸濁液を濃縮し、有機溶媒、遊離薬物（すなわち、カプセル化されていない核酸）、薬物可溶化剤、および他の処理助剤（界面活性剤）を実質的に排除し得る。例示的な濾過は、タンジェンシャルフロー濾過系を使用して行い得る。例えば、溶質、ミセル、および有機溶媒が通過することを可能とする一方で、ナノ粒子を保持するのに適切な孔径を有する膜を使用することによって、ナノ粒子は、選択的に分離することができる。約３００〜５００ｋＤａ（約５〜２５ｎｍ）の分画分子量を有する例示的な膜を使用し得る。
【０１０７】
一定容量アプローチを使用してダイアフィルトレーションを行ってもよく、これは濾液が懸濁液から除去されるのと同じ速度で、ダイア濾液（冷たい脱イオン水、例えば、約０〜約５℃、または０〜約１０℃）を、供給懸濁液に加えてもよいことを意味する。一部の実施形態では、フィルタリングは、約０〜約５℃、または０〜約１０℃の第１の温度、および約２０〜約３０℃、または１５〜約３５℃の第２の温度を使用した第１のフィルタリングを含み得る。一部の実施形態では、フィルタリングは、約１〜約３０、場合によって、約１〜約１５、または場合によって、１〜約６ダイア容量を処理することを含み得る。例えば、フィルタリングは、約０〜約５℃にて、約１〜約３０、または場合によって、約１〜約６ダイア容量を処理し、約２０〜約３０℃にて、少なくとも１ダイア容量（例えば、約１〜約１５、約１〜約３、または約１〜約２ダイア容量）を処理することを含み得る。一部の実施形態では、フィルタリングは、異なる別個の温度にて異なるダイア容量を処理することを含む。
【０１０８】
ナノ粒子懸濁液を精製および濃縮した後、粒子は、例えば、約０．２μｍのデプスプレフィルターを使用した、１つ、２つまたはそれ超の無菌化および／またはデプスフィルターを通して通過させ得る。例えば、除菌濾過ステップは、制御された速度で濾過トレインを使用して治療用ナノ粒子をフィルタリングすることを含み得る。一部の実施形態では、濾過トレインは、デプスフィルターおよび無菌フィルターを含み得る。
【０１０９】
ナノ粒子を調製する別の実施形態では、核酸とポリマー（例えば、コポリマー、場合により、リガンドを有するコポリマー）の混合物から構成される有機相が形成される。この有機相を、界面活性剤およびいくらかの溶解した溶媒から構成される水相と、概ね１：５の比（油相：水相）で混合する。一次エマルジョンは、単純に混合しながら、またはローターステーターホモジナイザーの使用によって、２つの相の組合せによって形成される。次いで、一次エマルジョンを、高圧ホモジナイザーの使用によって、微細エマルジョンに形成する。次いで、混合しながら脱イオン水を加えて、微細エマルジョンをクエンチする。一部の実施形態では、クエンチ：エマルジョン比は、約２：１〜約４０：１、または一部の実施形態では、約５：１〜約１５：１でよい。一部の実施形態では、クエンチ：エマルジョン比は、概ね８．５：１である。次いで、クエンチにＴｗｅｅｎ（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０）の溶液を加えて、Ｔｗｅｅｎを全体で概ね２％を達成する。これは、カプセル化されていない遊離の核酸を溶解させるのに役立つ。次いで、遠心分離または限外濾過／ダイアフィルトレーションのいずれかによってナノ粒子を単離する。
【０１１０】
製剤の調製において使用されるポリマー、核酸、およびエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤の量は、最終製剤と異なる場合もあると理解される。例えば、核酸のいくらかは、ナノ粒子に完全には組み込まれず、そのような遊離核酸は、例えば、濾別される場合もある。例えば、一実施形態では、約９％の第１のエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤を含有する第１の有機溶液中に約１１重量パーセント理論添加量の核酸を含有する第１の有機溶液、約８９重量パーセントのポリマー（例えば、ポリマーは、ポリマーにコンジュゲートされた約２．５モルパーセントの標的化部分と、約９７．５モルパーセントのＰＬＡ−ＰＥＧとを含む場合がある）を含有する第２の有機溶液、および約０．１２％の第２のエンドリソソーム破壊剤などの疎水性対イオン剤を含有する水溶液を、例えば、約２重量パーセントの核酸と、約９７．５重量パーセントのポリマー（ポリマーは、ポリマーにコンジュゲートされた約１．２５モルパーセントの標的化部分と、約９８．７５モルパーセントのＰＬＡ−ＰＥＧ％とを含む場合がある）と、約０．５％〜約３の総エンドリソソーム離脱剤とを含む最終ナノ粒子となる製剤の調製において使用することができる。このようなプロセスは、約１〜約２０重量パーセントの治療剤、例えば、約１、約２、約３、約４、約５、約８、約１０、または約１５重量パーセントの核酸を含む、患者への投与に適する最終ナノ粒子を提供することができる。
【０１１１】
医薬製剤
本明細書において開示されているナノ粒子は、別の態様によって、薬学的に許容できる担体と合わさり、医薬組成物を形成し得る。当業者が理解するように、担体は、下記のような投与経路、標的組織の場所、送達される薬物、薬物の送達の時間経過などに基づいて選択し得る。
【０１１２】
医薬組成物は、経口および非経口経路を含めた当技術分野において公知の任意の手段によって患者に投与することができる。用語「患者」は、本明細書において使用する場合、ヒト、ならびに例えば、哺乳動物、鳥、爬虫類、両生類、および魚を含めた非ヒトを指す。例えば、非ヒトは、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、霊長類、またはブタ）であり得る。ある特定の実施形態では、非経口経路が、消化管において見出される消化酵素との接触を回避するために望ましい。このような実施形態によると、組成物は、注射（例えば、静脈内、皮下または筋内、腹腔内注射）、直腸、経膣的、局所的（散剤、クリーム剤、軟膏剤、もしくは点眼剤によるなど）によって、または吸入（スプレーによるなど）によって投与し得る。
【０１１３】
特定の実施形態では、ナノ粒子は、それを必要とする対象に全身的に、例えば、ＩＶ注入または注射によって投与される。
【０１１４】
注射可能な調製物、例えば、無菌の注射可能な水性または油性懸濁液は、適切な分散化剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して公知技術によって製剤化し得る。無菌の注射可能な調製物はまた、無毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な溶液、懸濁液、またはエマルジョン、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液でよい。用いることができる許容できるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張食塩液がある。さらに、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒として従来用いられる。この目的のために、合成のモノまたはジグリセリドを含めた任意の刺激の少ない不揮発性油を用いることができる。さらに、脂肪酸、例えば、オレイン酸は、注射剤の調製において使用される。一実施形態では、コンジュゲートを、１％（ｗ／ｖ）のカルボキシメチルセルロースナトリウムおよび０．１％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（商標）８０を含む担体液に懸濁させる。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通す濾過によって、または使用前に滅菌水もしくは他の無菌の注射可能な媒体に溶解もしくは分散させることができる無菌の固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって、無菌化することができる。
【０１１５】
経口投与のための固体剤形は、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤を含む。このような固体剤形において、カプセル化されたか、またはカプセル化されていないコンジュゲートを、少なくとも１種の不活性な薬学的に許容できる添加剤または担体、例えば、クエン酸ナトリウムまたは第二リン酸カルシウム、ならびに／または（ａ）充填剤もしくは増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸、（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシア、（ｃ）保湿剤、例えば、グリセロール、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のシリケート、および炭酸ナトリウム、（ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール、（ｈ）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイトクレイ、ならびに（ｉ）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物と混合する。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、剤形はまた、緩衝剤を含む。
【０１１６】
核酸剤を含有するナノ粒子の正確な投与量は、処置される患者を考慮して個々の医師によって選択され、一般に、投与量および投与は、有効量の核酸剤ナノ粒子を処置される患者に提供するように調節されることを認識されたい。本明細書において使用する場合、核酸剤を含有するナノ粒子の「有効量」は、所望の生物学的応答を引き出すのに必要な量を指す。当業者が理解するように、核酸剤を含有するナノ粒子の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達される薬物、標的組織、投与経路などの要因によって変わり得る。例えば、核酸剤を含有するナノ粒子の有効量は、所望の期間にわたり所望の量の腫瘍サイズの低減をもたらす量であり得る。考慮し得るさらなる要因は、病態の重症度；処置される患者の年齢、体重および性別；食事、投与の時間および頻度；薬物の組合せ；反応感受性；ならびに治療に対する耐性／応答を含む。
【０１１７】
ナノ粒子は、投与の容易さおよび投与量の均一性のために投与量単位形態で製剤化し得る。「投与量単位形態」という表現は、本明細書において使用する場合、処置される患者に適当なナノ粒子の物理的個別単位を指す。しかし、組成物の一日の総使用量は、正しい医学的判断の範囲内で主治医によって決められることが理解される。任意のナノ粒子について、治療有効用量は、細胞培養アッセイにおいて、または動物モデル、通常、マウス、ウサギ、イヌ、もしくはブタにおいて最初に推定することができる。動物モデルをまた使用して、望ましい濃度範囲および投与経路を達成する。次いで、このような情報を使用して、ヒトにおける投与のための有用な用量および経路を決定することができる。ナノ粒子の治療有効性および毒性、例えば、ＥＤ５０（用量は集団の５０％において治療的に有効である）およびＬＤ５０（用量は集団の５０％まで致死的である）は、細胞培養物または実験動物において標準的な医薬手順によって決定することができる。毒性効果の治療効果に対する用量比は治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物は、一部の実施形態では有用であり得る。細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータは、ヒト使用のための投与量範囲の配合において使用することができる。
【０１１８】
ある実施形態では、本明細書において開示されている組成物は、約１０ｐｐｍ未満のパラジウム、または約８ｐｐｍ未満、または約６ｐｐｍ未満のパラジウムを含み得る。例えば、ポリマーコンジュゲートを有するナノ粒子を含む組成物が本明細書において提供され、組成物は、約１０ｐｐｍ未満のパラジウムを有する。
【０１１９】
一部の実施形態では、本明細書において開示されているナノ粒子を含む冷凍に適した組成物が企図され、冷凍に適した溶液、例えば、糖、例えば、単糖類、二糖類、もしくは多糖類、例えば、スクロースおよび／もしくはトレハロース、ならびに／または塩および／もしくはシクロデキストリン溶液を、ナノ粒子懸濁液に加える。糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）は、例えば、粒子が冷凍によって凝集することを防止する凍結防止剤として作用し得る。例えば、複数の開示されているナノ粒子、スクロース、イオン性ハロゲン化物、および水を含むナノ粒子製剤であり、ナノ粒子／スクロース／水／イオン性ハロゲン化物は、約３〜４０％／１０〜４０％／２０〜９５％／０．１〜１０％（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）または約５〜１０％／１０〜１５％／８０〜９０％／１〜１０％（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）が本明細書において提供される。例えば、このような溶液は、本明細書に開示されているナノ粒子、約５重量％〜約２０重量％のスクロースおよび約１０〜１００ｍＭの濃度のイオン性ハロゲン化物、例えば、塩化ナトリウムを含み得る。別の例では、複数の開示されているナノ粒子、トレハロース、シクロデキストリン、および水を含むナノ粒子製剤が本明細書において提供され、ナノ粒子／トレハロース／水／シクロデキストリンは、約３〜４０％／１〜２５％／２０〜９５％／１〜２５％（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）または約５〜１０％／１〜２５％／８０〜９０％／１０〜１５％（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）である。
【０１２０】
例えば、企図される溶液は、本明細書に開示されているナノ粒子、約１重量％〜約２５重量％の二糖類、例えば、トレハロースもしくはスクロース（例えば、約５重量％〜約２５重量％のトレハロースもしくはスクロース、例えば、約１０重量％のトレハロースもしくはスクロース、または約１５重量％のトレハロースもしくはスクロース、例えば、約５重量％のスクロース）、および約１重量％〜約２５重量％の濃度のシクロデキストリン、例えば、β−シクロデキストリン（例えば、約５重量％〜約２０重量％、例えば、１０重量％もしくは約２０重量％、または約１５重量％〜約２０重量％のシクロデキストリン）を含み得る。企図される製剤は、複数の開示されているナノ粒子（例えば、ＰＬＡ−ＰＥＧおよび活性剤を有するナノ粒子）、および約２重量％〜約１５重量％（または約４重量％〜約６重量％、例えば、約５重量％）のスクロースおよび約５重量％〜約２０重量％（例えば、約７重量パーセント〜約１２重量％、例えば、約１０重量％）のシクロデキストリン、例えば、ＨＰｂＣＤを含み得る。
【０１２１】
本開示は、復元されたとき、最小量の大きな凝集体を有する凍結乾燥した医薬組成物に部分的に関する。このような大きな凝集体は、約０．５μｍ超、約１μｍ超、または約１０μｍ超のサイズを有してもよく、復元された溶液中で望ましくないことがあり得る。凝集体サイズは、参照により本明細書に組み込まれている米国薬局方の３２＜７８８＞において示されるものを含めた種々の技術を使用して測定することができる。ＵＳＰ３２＜７８８＞において概略が述べられている試験は、光遮蔽粒子計数試験、顕微鏡粒子計数試験、レーザー回折、および単一粒子光学検知を含む。一実施形態では、所与の試料中の粒径は、レーザー回折および／または単一粒子光学検知を使用して測定される。
【０１２２】
光遮蔽粒子計数試験によるＵＳＰ３２＜７８８＞は、懸濁液中の粒径のサンプリングのためのガイドラインを規定する。１００ｍＬと等しい、またはこれ未満を有する溶液について、存在する粒子の平均数が、容器毎に≧１０μｍである６０００個および容器毎に≧２５μｍである６００個を超えない場合、調製は試験に準拠する。
【０１２３】
ＵＳＰ３２＜７８８＞において概略が述べられているように、顕微鏡粒子計数試験は、接眼マイクロメーターを有する１００±１０×の拡大率に調節した双眼顕微鏡を使用して粒子量を決定するためのガイドラインを規定する。接眼マイクロメーターは、１００×の拡大率で見たとき、１０μｍおよび２５μｍを表す黒の基準円を有する象限に分割された円からなる円形直径グラティキュールである。直線状スケールは、グラティキュールの下に提供される。１０μｍおよび２５μｍに関する粒子の数を視覚的に符合させる。１００ｍＬと等しい、またはこれ未満を有する溶液について、存在する粒子の平均数が、容器毎に≧１０μｍである３０００個、および容器毎に≧２５μｍである３００個を超えない場合、調製は試験に準拠する。
【０１２４】
一部の実施形態では、開示されている組成物の復元による１０ｍＬの水性試料は、１ｍｌ毎に６００個未満の１０ミクロンと等しい、もしくはこれ超のサイズを有する粒子；および／または１ｍｌ毎に６０個未満の２５ミクロンと等しい、もしくはこれ超のサイズを有する粒子を含む。
【０１２５】
動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、粒径を測定し得るが、これはブラウン運動に依存し、そのためこの技術は、いくつかのより大きな粒子を検出し得ない。レーザー回折は、粒子および懸濁培地の間の屈折率における差異に依存する。この技術は、サブミクロンからミリメートル範囲にて粒子を検出することができる。相対的に少（例えば、約１〜５重量％）量のより大きな粒子を、ナノ粒子懸濁液中で決定することができる。単一粒子光学検知（ＳＰＯＳ）は、約０．５μｍの個々の粒子を計数する希薄な懸濁液の光遮蔽を使用する。測定した試料の粒子濃度を知ることによって、凝集体の重量パーセントまたは凝集体濃度（粒子／ｍＬ）を計算することができる。
【０１２６】
凝集体の形成は、粒子の表面の脱水によって凍結乾燥の間に起こり得る。この脱水は、凍結乾燥の前に懸濁液中で凍結保護剤、例えば、二糖類を使用することによって回避することができる。適切な二糖類は、スクロース、ラクツロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、またはセロビオース、および／またはこれらの混合物を含む。他の企図される二糖類は、コウジビオース、ニゲロース、イソマルトース、β，β−トレハロース、α，β−トレハロース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチオビオース、ツラノース、マルツロース、パラチノーゼ、ゲンチオビオース、マンノビオース、メリビオース、メリビウオース（ｍｅｌｉｂｉｕｌｏｓｅ）、ルチノース、ルチヌノース（ｒｕｔｉｎｕｌｏｓｅ）、およびキシロビオースを含む。復元は、開始懸濁液と比較したときの等しいＤＬＳサイズ分布を示す。しかし、レーザー回折は、いくらかの復元された溶液中でサイズが＞１０μｍの粒子を検出することができる。さらに、ＳＰＯＳはまた、ＦＤＡガイドラインの濃度超の濃度（＞１０μｍの粒子について１０４〜１０５個の粒子／ｍＬ）で＞１０μｍサイズの粒子を検出し得る。
【０１２７】
一部の実施形態では、１種または複数のイオン性ハロゲン化塩は、糖、例えば、スクロース、トレハロースまたはこれらの混合物に対するさらなる凍結保護剤として使用し得る。糖は、二糖類、単糖類、三糖類、および／または多糖類を含んでいてもよく、かつ他の添加剤、例えば、グリセロールおよび／または界面活性剤を含んでいてもよい。場合により、シクロデキストリンを、さらなる凍結保護剤として含んでいてもよい。シクロデキストリンは、イオン性ハロゲン化塩の代わりに加え得る。代わりに、シクロデキストリンを、イオン性ハロゲン化塩に加え得る。
【０１２８】
適切なイオン性ハロゲン化塩は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛、またはこれらの混合物を含み得る。さらなる適切なイオン性ハロゲン化塩は、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化アンモニウム、臭化ナトリウム、臭化カルシウム、臭化亜鉛、臭化カリウム、臭化マグネシウム、臭化アンモニウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カルシウム、ヨウ化亜鉛、ヨウ化カリウム、ヨウ化マグネシウム、またはヨウ化アンモニウム、および／またはこれらの混合物を含む。一実施形態では、約１〜約１５重量パーセントのスクロースを、イオン性ハロゲン化塩と共に使用し得る。一実施形態では、凍結乾燥した医薬組成物は、約１０〜約１００ｍＭの塩化ナトリウムを含み得る。別の実施形態では、凍結乾燥した医薬組成物は、約１００〜約５００ｍＭの二価のイオン性塩化物塩、例えば、塩化カルシウムまたは塩化亜鉛を含み得る。さらに別の実施形態では、凍結乾燥される懸濁液は、シクロデキストリンをさらに含み得、例えば、約１〜約２５重量パーセントのシクロデキストリンを使用し得る。
【０１２９】
適切なシクロデキストリンは、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、またはこれらの混合物を含み得る。本明細書において開示されている組成物における使用のために企図される例示的なシクロデキストリンには、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰｂＣＤ）、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチルエチル−β−シクロデキストリン、ジエチル−β−シクロデキストリン、トリ−Ｏ−アルキル−β−シクロデキストリン、グルコシル−β−シクロデキストリン、およびマルトシル−β−シクロデキストリンが含まれる。一実施形態では、約１〜約２５重量パーセントのトレハロース（例えば、約１０重量％〜約１５重量％、例えば、５〜約２０重量％）を、シクロデキストリンと共に使用し得る。一実施形態では、凍結乾燥した医薬組成物は、約１〜約２５重量パーセントのβ−シクロデキストリンを含み得る。例示的な組成物は、ＰＬＡ−ＰＥＧ、活性／治療剤、約４％〜約６％（例えば、約５重量パーセント）のスクロース、および約８〜約１２重量パーセント（例えば、約１０重量％）のＨＰｂＣＤを含むナノ粒子を含み得る。
【０１３０】
一態様では、開示されているナノ粒子を含む凍結乾燥した医薬組成物を提供し、１００ｍＬ未満または約１００ｍＬの水性媒体中で約５０ｍｇ／ｍＬのナノ粒子濃度での凍結乾燥した医薬組成物の復元によって、非経口投与に適した復元された組成物は、６０００個未満、例えば、３０００個未満の１０ミクロンと等しい、もしくはこれ超の微粒子；および／または６００個未満、例えば、３００個未満の２５ミクロンと等しい、もしくはこれ超の微粒子を含む。
【０１３１】
微粒子の数は、例えば、光遮蔽粒子計数試験によるＵＳＰ３２＜７８８＞、顕微鏡粒子計数試験によるＵＳＰ３２＜７８８＞、レーザー回折、および単一粒子光学検知などの手段によって決定することができる。
【０１３２】
ある態様では、それぞれが疎水性ポリマーセグメントおよび親水性ポリマーセグメント；活性剤；糖；ならびにシクロデキストリンを有するコポリマーを含む複数種の治療用粒子を含む、復元による非経口使用に適した医薬組成物を提供する。
【０１３３】
例えば、コポリマーは、ポリ（乳）酸−ブロック−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーであり得る。復元によって、１００ｍＬの水性試料は、６０００個未満の１０ミクロンと等しい、もしくはこれ超のサイズを有する粒子；および６００個未満の２５ミクロンと等しい、もしくはこれ超のサイズを有する粒子を含み得る。
【０１３４】
二糖類およびイオン性ハロゲン化塩を加えるステップは、約５〜約１５重量パーセントのスクロースまたは約５〜約２０重量パーセントのトレハロース（例えば、約１０〜約２０重量パーセントのトレハロース）、および約１０〜約５００ｍＭのイオン性ハロゲン化塩を加えることを含み得る。イオン性ハロゲン化塩は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、および塩化亜鉛、またはこれらの混合物から選択し得る。ある実施形態では、約１〜約２５重量パーセントのシクロデキストリンをまた加える。
【０１３５】
別の実施形態では、二糖類およびシクロデキストリンを加えるステップは、約５〜約１５重量パーセントのスクロースまたは約５〜約２０重量パーセントのトレハロース（例えば、約１０〜約２０重量パーセントのトレハロース）、および約１〜約２５重量パーセントのシクロデキストリンを加えることを含み得る。ある実施形態では、約１０〜約１５重量パーセントのシクロデキストリンを加える。シクロデキストリンは、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、またはこれらの混合物から選択し得る。
【０１３６】
別の態様では、糖および塩を凍結乾燥した製剤に加え、復元によるナノ粒子の凝集を防止することを含む、医薬ナノ粒子組成物中で粒子の実質的な凝集を防止する方法を提供する。ある実施形態では、シクロデキストリンをまた、凍結乾燥した製剤に加える。さらに別の態様では、糖およびシクロデキストリンを凍結乾燥した製剤に加えて、復元によるナノ粒子の凝集を防止することを含む、医薬ナノ粒子組成物中の粒子の実質的な凝集を防止する方法を提供する。
【０１３７】
企図される凍結乾燥した組成物は、約４０ｍｇ／ｍＬ超の治療用粒子濃度を有し得る。非経口投与に適した製剤は、１０ｍＬの用量中に１０ミクロン超のサイズを有する約６００個未満の粒子を有し得る。凍結乾燥は、組成物を約−４０℃超、または例えば、約−３０℃未満の温度で冷凍し、冷凍した組成物を形成させ、冷凍した組成物を乾燥させ、凍結乾燥した組成物を形成することを含み得る。乾燥のステップは、約５０ｍＴｏｒｒで約−２５〜約−３４℃、または約−３０〜約−３４℃の温度にて起こり得る。
【０１３８】
処置方法
一部の実施形態では、開示されるナノ粒子は、疾患、障害、および／または状態を処置し、緩和し、回復させ、軽減し、その発生を遅延させ、その進行を阻害し、その重症度を低減し、かつ／またはその１つもしくは複数の症状または特色の発生率を低減するのに使用することができる。一部の実施形態では、開示されるナノ粒子は、固形腫瘍、例えば、がんおよび／またはがん細胞を処置するのに使用することができる。一部の実施形態では、ＥＧＦＲを発現する細胞が処置される。一部の実施形態では、ＥＧＦＲを発現する他のがん細胞の固形腫瘍が処置される。ある特定の実施形態では、開示されるナノ粒子を使用して、任意のがんを処置してもよく、ＰＳＭＡは、がん細胞の表面上に、またはそれを必要とする対象における前立腺もしくは非前立腺固形腫瘍の血管新生を含めた腫瘍血管新生において発現している。ＰＳＭＡが関連する徴候の例には、これらに限定されないが、前立腺がん、乳がん、非小細胞肺がん、結腸直腸癌、および神経膠芽腫が含まれる。例えば、開示されるナノ粒子は、腎細胞癌の処置に使用することができる。別の実施形態では、開示されるナノ粒子は、腎臓がん、多形性神経膠芽腫、マントル細胞リンパ腫、または皮膚カポジ肉腫の処置に使用することができる。
【０１３９】
開示されるナノ粒子は、がんの処置に使用することができる。用語「がん」は、前悪性および悪性のがんを含む。がんには、これらに限定はしないが、血液（例えば、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、フィラデルフィア染色体陽性の急性リンパ芽球性白血病、マントル細胞リンパ腫）、前立腺、胃がん、中咽頭がん、子宮頸がん、肛門がん、胆嚢がん、胆管がん、腸のがん、結腸直腸がん、皮膚がん、例えば、黒色腫または基底細胞癌、肺がん（例えば、小細胞肺がんまたは非小細胞肺がん（例えば、腺癌、扁平上皮癌））、乳がん、頭頸部のがん、気管支がん、膵臓がん、膀胱がん、脳または中枢神経系がん、扁桃腺がん、末梢神経系がん、食道がん、口腔または咽頭のがん、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、腎臓がん（例えば、腎細胞癌）、睾丸がん、胆道がん、小腸または虫垂がん、胃腸間質腫瘍、唾液腺がん、甲状腺がん（例えば、濾胞性甲状腺がんおよび未分化甲状腺がん）、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液系組織のがん、ＫＲａｓ変異を有するがんの処置、治療抵抗性がんの処置などが含まれる。「がん細胞」は、腫瘍（すなわち、固形腫瘍）の形態であるか、対象内で単独で存在する（例えば、白血病細胞）か、またはがんに由来する細胞株であり得る。
【０１４０】
がんは、種々の身体症状と関連し得る。がんの症状は一般に、腫瘍のタイプおよび場所によって決まる。例えば、肺がんは、咳嗽、息切れ、および胸痛をもたらすことが多く、一方、結腸がんは、下痢、便秘、および血便をもたらす。しかし、数例のみを挙げると、下記の症状は一般に、多くのがんと関連することが多い。発熱、悪寒、寝汗、咳、呼吸困難、体重減少、食欲不振、食欲不振症、悪心、嘔吐、下痢、貧血、黄疸、肝腫大、喀血、疲労、倦怠感、認知機能障害、うつ、ホルモンの障害、好中球減少、疼痛、非治癒性の痛み、腫大したリンパ節、末梢性ニューロパシー、および性的機能障害。開示されるナノ粒子は、がんの身体症状の処置に使用することができる。
【０１４１】
一態様では、がん（例えば、白血病）を処置する方法が提供される。感染症、炎症、胃腸障害などの他の処置方法は、本明細書で開示するとおりに実現することができると理解すべきである。一部の実施形態では、がんの処置は、それを必要とする対象に、所望の結果を実現するのに必要となるような量で、そのような時間をかけて、治療有効量の開示ナノ粒子を投与することを含む。ある特定の実施形態では、開示されるナノ粒子の「治療有効量」とは、がんを処置し、緩和し、回復させ、軽減し、その発生を遅延させ、その進行を阻害し、その重症度を低減し、かつ／またはその１つもしくは複数の症状または特色の発生率を低減するのに有効な量である。
【０１４２】
一態様では、がん（例えば、白血病）に罹患している対象に組成物を投与する方法が提供される。一部の実施形態では、所望の結果（すなわち、がんの処置）を実現するのに必要となるような量で、そのような時間をかけて、対象に粒子を投与することができる。ある特定の実施形態では、開示されているナノ粒子の「治療有効量」とは、がんを処置し、緩和し、回復させ、軽減し、その発生を遅延させ、その進行を阻害し、その重症度を低減し、かつ／またはその１つもしくは複数の症状または特色の発生率を低減するのに有効な量である。
【０１４３】
ここでは、臓器移植を受けたことのある患者を、開示されるナノ粒子を投与することにより処置する方法も企図される。ここで企図される他の方法には、結節性硬化症および／または自閉症を有する患者を、有効量の開示ナノ粒子を投与することにより処置する方法が含まれる。
【０１４４】
本明細書で企図される方法として、例えば、患者、例えば、血管の病変にベアメタルステントが留置されている患者の血管において新生内膜過形成を予防または阻止する方法であって、開示されるナノ粒子を含む組成物を投与することを含む方法が挙げられる。本明細書では、（例えば、ステントが留置されている患者において）再狭窄を処置または予防する方法であって、開示されるナノ粒子を投与することを含む方法も企図される。
【０１４５】
企図される方法は、クローン病、潰瘍性大腸炎、コラーゲン性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置性大腸炎（ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、ベーチェット病、または分類不能大腸炎などの炎症性腸疾患であり得る炎症性疾患を処置することを含む。他の実施形態では、それを必要とする患者において過敏性大腸症候群を処置する方法が提供される。この方法は、患者に治療有効量のナノ粒子を投与することを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、治療剤を含有する場合がある。例えば、ある特定の実施形態では、治療剤は、上述のものなどの抗炎症剤である場合がある。
【０１４６】
治療プロトコルは、健康な個体（すなわち、がんのいずれの症状も示していない、かつ／またはがんと診断されたことがない対象）に、治療有効量の開示されるナノ粒子を投与することを含む。例えば、健康な個体は、がんの発病および／またはがんの症状の発症より前に、開示されるナノ粒子で「免疫化」することもでき、リスクのある個体（例えば、がんの家族歴を有する患者、がんの発病と関連する１つまたは複数の遺伝子変異を有する患者、がんの発病と関連する遺伝的多型を有する患者、がんの発病と関連するウイルスに感染した患者、がんの発病と関連する習慣および／または生活様式を有する患者など）は、がんの症状の発症と実質的に同時（例えば、その４８時間以内、２４時間以内、または１２時間以内）に処置することができる。当然のことながら、がんを有することがわかっている個体は、いつでも処置を受けることができる。
【０１４７】
他の実施形態では、開示されるナノ粒子を使用して、がん細胞、例えば、骨髄性白血病、がん細胞の成長を阻害することができる。本明細書において使用する場合、「がん細胞の成長を阻害する」または「がん細胞の成長を阻害すること」という用語は、がん細胞成長の速度が、未処置対照がん細胞の観察または予想された成長速度と比べて低減されるような、がん細胞増殖および／もしくは遊走の速度のいずれかの緩慢化、がん細胞増殖および／もしくは遊走の抑止、またはがん細胞の死滅を指す。「増殖を阻害する」という用語は、がん細胞または腫瘍のサイズの縮小または消失、ならびにその転移の可能性の低減も指す場合がある。細胞レベルでのこのような阻害が、患者において、がんのサイズを縮小し、その成長を阻止し、その侵襲性を低減し、またはその転移を予防もしくは阻害し得ることが好ましい。がん細胞成長が阻害されているかどうかは、適切な様々な徴候のいずれかによって、当業者が容易に判定することができる。
【０１４８】
がん細胞成長の阻害は、例えば、がん細胞の細胞周期の特定の期における停止、例えば、細胞周期のＧ２／Ｍ期における停止によって証明することができる。がん細胞成長の阻害は、がん細胞または腫瘍サイズの直接的または間接的測定によって証明することもできる。ヒトがん患者では、このような測定は、一般に、磁気共鳴画像診断、コンピュータ体軸断層撮影、Ｘ線などの、周知の画像診断法を使用してなされる。がん細胞成長は、循環している癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、またはがん細胞成長と互いに関係付けられる他のがん特異的抗原のレベルを決定することなどにより、間接的に判定することもできる。がん成長の阻害は、一般に、対象の生存期間の延長および／または健康および幸福の増進とも互いに関係付けられる。
【０１４９】
本明細書では、活性剤を含む、本明細書で開示するナノ粒子を患者に投与する方法であって、患者への投与の際、このようなナノ粒子が、薬剤単独の投与（すなわち、開示されるナノ粒子としてでない）に比べて、分布体積を実質的に縮小し、かつ／または遊離Ｃｍａｘを実質的に低減する方法も提供される。
【０１５０】
「Ｄｒｕｇ  Ｌｏａｄｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓａｍｅ」と題された２０１２年６月２６日発行の米国特許第８，２０６，７４７号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【実施例】
【０１５１】
開示されるナノ粒子について、ここまでは大まかに述べており、以下の実施例を参照することで、これについてより容易に理解されるところとなるが、実施例は、開示されるナノ粒子のある特定の態様および実施形態を説明する目的で含めているにすぎず、開示されるナノ粒子を一切限定するものでない。
【０１５２】
（実施例１）
ＰＬＡ−ＰＥＧの調製
合成は、以下に示すとおり、ｄ，ｌ−ラクチドの、マクロ開始剤としてのα−ヒドロキシ−ω−メトキシポリ（エチレングリコール）との開環重合によって遂行し、２−エチルヘキサン酸スズ（ＩＩ）を触媒として使用して高温で実施する（ＰＥＧ  Ｍｎ≒５，０００Ｄａ、ＰＬＡ  Ｍｎ≒１６，０００Ｄａ、ＰＥＧ−ＰＬＡ  Ｍｎ≒２１，０００Ｄａ）。
【０１５３】
【化５】
2018528194.tif 000006
【０１５４】
ポリマーは、ポリマーをジクロロメタンに溶解させ、それをヘキサンとジエチルエーテルの混合物中で沈殿させることにより精製する。このステップから回収されたポリマーを、オーブンで乾燥させる。
【０１５５】
（実施例２）
エマルジョンプロセス
このプロセスの全体的なフローチャートを図４に示す。乳化された油相の溶媒含有量を減らすことにより、ナノ粒子の硬化時にクエンチ流体へと損なわれる薬物は、より少なくなる。薬物を溶液中に高濃度に保つために、適切な溶媒和力を有する溶媒系を選択する。共溶媒系（通常は７９：２１の酢酸エチル：ベンジルアルコール）の使用により、８０：２０のポリマー：対イオン配合で、連続溶液に５０％までの固体（通常は２０〜３０％または２０〜２５％）が見込まれる。
【０１５６】
対イオンとポリマー（コポリマー、場合により、リガンドを有するコポリマー）の混合物から構成される有機相を形成する。有機相を、核酸、界面活性剤、およびいくらかの溶解した溶媒から構成される水相と、概ね１：５の比（油相：水相）で混合する。高い薬物添加量を実現するために、有機相中の約３０％の固体を使用する。
【０１５７】
有機相は、核酸、任意選択の界面活性剤、およびいくらかの溶解した溶媒を含む水相と、概ね１：５の比（油相：水相）で混合される。一次エマルジョンは、単純に混合しながら、またはローターステーターホモジナイザーの使用によって、２つの相の組合せによって形成される。次いで、一次エマルジョンを、高圧ホモジナイザーの使用によって微細エマルジョンに形成する。次いで、微細エマルジョンを、脱イオン水もしくは緩衝液または塩溶液に、（表に示す）所与の温度にて混合しながら加えることによって、クエンチする。クエンチ：エマルジョン比は、概ね８：１である。次いで、２５％（ｗｔ％）のＴｗｅｅｎ８０の溶液をクエンチに加え、全体的に概ね２％のＴｗｅｅｎ８０を達成する。これは、カプセル化されていない遊離の薬物を溶解させるのに役立ち、またこれによって、ナノ粒子単離プロセスが実施可能になる。次いで、遠心分離または限外濾過／ダイアフィルトレーションのいずれかによってナノ粒子を単離する。
【０１５８】
（実施例３）
ナノ粒子調製−エマルジョンプロセス２
対イオン（一部の実施形態では、カチオン性対イオンとオリゴヌクレオチドの電荷会合（ｃｈａｒｇｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）によって形成された核酸の疎水性塩）とポリマー（コポリマー、場合により、リガンドを有するコポリマー）の混合物から構成される有機相を形成する。有機相を、核酸、界面活性剤、およびいくらかの溶解した溶媒から構成される水相と、概ね１：５の比（油相：水相）で混合する。高い核酸および対イオン添加量を実現するために、有機相中の約３０％の固体を使用する。
【０１５９】
一次粗エマルジョンは、単純な混合をしながら、またはローターステーターホモジナイザーの使用によって、２つの相の組合せによって形成される。
【０１６０】
次いで、一次エマルジョンを、高圧ホモジナイザーの使用によって微細エマルジョンに形成する。
【０１６１】
次いで、微細エマルジョンを、所与の温度にて混合しながら脱イオン水に加えることによってクエンチする。クエンチユニットの操作において、エマルジョンを、撹拌下の冷たい水性クエンチに加える。これは油相溶媒の大部分を抽出し、下流の濾過のためにナノ粒子を効果的に硬化させる役割を果たす。クエンチ：エマルジョン比は、概ね５：１である。
【０１６２】
３５％（ｗｔ％）のＴｗｅｅｎ８０の溶液をクエンチに加え、全体的に概ね２％のＴｗｅｅｎ８０を達成することができる。エマルジョンがクエンチされた後、Ｔｗｅｅｎ−８０の溶液を加えることができる。
【０１６３】
上で概略を述べたものなどの標準手順を使用して、以下に示すとおり、ポリマー分子量が様々であるナノ粒子を、１００％のカプセル化効率で調製した。核酸は、ｓｓＤＮＡ：５’ＣＧＧ  ＣＡＡ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＧＴＴとした。
【０１６４】
【表１】
2018528194.tif 000007
【０１６５】
（実施例４）
ナノ粒子調製−エマルジョンプロセス３
対イオンとポリマー（コポリマー、および場合により、リガンドを有するコポリマー）の混合物から構成される有機相を形成する。有機相を、界面活性剤およびいくらかの溶解した溶媒から構成される水相と、概ね１：５の比（油相：水相）で混合する。高い核酸および対イオン添加量を実現するために、有機相中の約３０％の固体を使用する。
【０１６６】
一次粗エマルジョンは、単純に混合しながら、またはローターステーターホモジナイザーの使用によって、２つの相の組合せによって形成される。
【０１６７】
次いで、一次エマルジョンを、高圧ホモジナイザーの使用によって微細エマルジョンに形成する。
【０１６８】
次いで、微細エマルジョンにオリゴヌクレオチドの水溶液を加え、一定期間おいて、オリゴヌクレオチドをエマルジョン全体に分散させる。
【０１６９】
次いで、微細エマルジョンを、所与の温度にて混合しながら脱イオン水に加えることによってクエンチする。クエンチ単位操作において、エマルジョンを、撹拌下の冷たい水性クエンチに加える。これは油相溶媒の大部分を抽出し、下流の濾過のためにナノ粒子を効果的に硬化させる役割を果たす。クエンチ：エマルジョン比は、概ね５：１である。
【０１７０】
３５％（ｗｔ％）のＴｗｅｅｎ８０の溶液をクエンチに加え、全体的に概ね２％のＴｗｅｅｎ８０を達成することができる。エマルジョンがクエンチされた後、Ｔｗｅｅｎ−８０の溶液を加えることができる。
【０１７１】
（実施例５）
ナノ粒子調製−微細エマルジョン後（ＣＩの添加およびそれに続くオリゴの添加）
有機溶媒に溶解させたポリマー（コポリマー、場合により、リガンドを有するコポリマー）から構成される有機相を形成する。有機相を、界面活性剤およびいくらかの溶解した溶媒から構成される水相と、概ね１：５の比（油相：水相）で混合する。有機相中の約１５％の固体を使用する。
【０１７２】
一次粗エマルジョンは、単純に混合しながら、またはローターステーターホモジナイザーの使用によって、２つの相の組合せによって形成される。
【０１７３】
次いで、一次エマルジョンを高圧ホモジナイザーの使用によって、微細エマルジョンに形成する。
【０１７４】
微細エマルジョンに、対イオンを粉末として加える。溶液を概ね１０分間撹拌する。撹拌されている微細エマルジョンに、オリゴ（粉末）を加え、概ねもう１０分間撹拌する。
【０１７５】
次いで、微細エマルジョンを、所与の温度にて混合しながら脱イオン水に加えることによってクエンチする。クエンチ単位操作において、エマルジョンを、撹拌下の冷たい水性クエンチに加える。これは油相溶媒の大部分を抽出して、下流の濾過のためにナノ粒子を効果的に硬化させる役割を果たす。クエンチ：エマルジョン比は、概ね５：１である。
【０１７６】
３５％（ｗｔ％）のＴｗｅｅｎ８０の溶液をクエンチに加え、全体的に概ね２％のＴｗｅｅｎ８０を達成する。エマルジョンがクエンチされた後、Ｔｗｅｅｎ−８０の溶液を加える。
【０１７７】
上で概略を述べた標準手順を使用して、ナノ粒子を調製した。以下は、この手法で作製したバッチについてのＮＰサイズ、薬物添加量、およびＩＶＲデータである。図１１も参照されたい。核酸は、ｓｓＤＮＡ：５’ＣＧＧ  ＣＡＡ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＧＴＴとした。
【０１７８】
【表２】
2018528194.tif 000008
【０１７９】
（実施例６）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出法を使用して、周囲条件および３７℃条件でのナノ粒子からの初期破裂相放出を決定する。シンク条件を維持し、ナノ粒子が放出試料に入り込まないようにするために、透析システムを設計した。１００ｎｍの粒子をペレット化し得る超遠心を実現した後、透析膜を取り除き、遠心分離を使用して、放出された薬物を、カプセル化された薬物から分離した。
【０１８０】
透析システムは、次のとおりである。脱イオン水中のオリゴヌクレオチドナノ粒子（２．５ｍｇ／ｍＬの固体濃度に相当する、概ね２５０μｇ／ｍＬの核酸／ＰＬＡナノ粒子）のスラリー３ｍＬを、ピペット操作によって、３００ｋＤａ  ＭＷＣＯダイアライザーの内部チューブに入れる。脱イオン水に代えて、ＮａＣｌなどの塩溶液、または緩衝液を使用してもよい。一部の実施形態では、０．５Ｍ  ＮａＣｌの塩溶液を使用する。この媒体中では、ナノ粒子は、懸濁液である。ダイアライザーを、１３０ｍｌの放出媒体（ＰＢＳ中２．５％のヒドロキシルベータシクロデキストリン）を含有するガラス瓶に入れ、これを、振盪機を使用して１５０ｒｐｍで継続的に撹拌して、膜／外部溶液界面において望ましくない水層が形成するのを防ぐ。
【０１８１】
予め決められた時点で、外部溶液（透析液）から試料の一定分量（１ｍＬ）を採取し、オリゴヌクレオチド濃度について、色素法（Ｏｌｉｇｒｅｅｎ）を使用して分析した。色素による定量を、ＨＰＬＣによって確認した。図５は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出に使用した色素およびＨＰＬＣによる定量法の比較を示す。
【０１８２】
この遠心分離システムを、より少ない懸濁液体積で、透析バッグを用いず、同様の条件を使用して実施する。試料を６０，０００ｇで３０分間遠心分離し、薬物含有量について上清をアッセイして、放出された薬物を測定する。
【０１８３】
（実施例７）
対イオンスクリーニング
送達を強化するために、すべての核酸含有ナノ粒子に、対イオンを含めた。試験した対イオンには、クロルプロマジン、ジドデシルジメチルアンモニウム、セチルピリジニウム、およびヒドラバミンが含まれ、これらは、カプセル化および制御の可能性ならびにイオン対として働く能力に基づき選択した。様々な対イオン：核酸比で作製したナノ粒子を、粒径、ゼータ電位、添加量、カプセル化効率、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出に基づきスクリーニングした。
【０１８４】
以下に示すのは、様々な比のジドデシルアンモニウムブロミドおよびクロルプロマジン（エンドソームおよびリソソームを破壊する分子の多くと構造が非常に似通っている）を含む核酸含有ナノ粒子の完全な特徴付けである。
【０１８５】
【表３】
2018528194.tif 000009
図６および７は、それぞれ、様々な比のジドデシルアンモニウムブロミドおよびクロルプロマジンを含む核酸含有ナノ粒子についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出結果を示す。
【０１８６】
図８は、表示された対イオンを用いた核酸含有粒子のゼータ電位を示す。粒子特性はすべて、中性〜わずかにマイナスの所望の電荷と一致すると思われる。図３に示すとおり、遊離ｓｓＤＮＡ（例えば、ナノ粒子中にない、いずれかのタイプのＤＮＡ）およびナノ粒子に添加されたｓｓＤＮＡを、Ｄｎａｓｅ  Ｉで処理した後、Ｄｎａｓｅ  Ｉを不活性化する。ナノ粒子内のＤＮＡは分解から保護されるが、遊離ナノ粒子は分解される（図９に示すとおり）。
【０１８７】
（実施例８）
カプセル化された材料のヌクレアーゼ安定性
カプセル化された核酸のヌクレアーゼ分解に対する安定性を、ＤＮａｓｅＩによる切断からの保護によって評価した。むき出しのｓｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡが添加されたナノ粒子をＤＮａｓｅＩで処理し、ＤＮａｓｅの不活性化およびＤＮＡ抽出後、ＨＰＬＣを使用してＤＮＡを定量化した。図９は、ｓｓＤＮＡが、表示されたナノ粒子に組み込まれたとき、タンパク質分解切断から完全に保護されたことを示す。
【０１８８】
（実施例９）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出および添加量または理論添加量
オリゴヌクレオチドおよび対イオンを（２：１の対イオン：オリゴ比で）含有するナノ粒子を、代用ｓｓＤＮＡを使用して調査して、放出プロファイルを決定した。方法については、上記の実施例６を参照されたい。いずれの代用ＤＮＡまたはｓｓＤＮＡも使用し得た（例えば、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ））。粒子は、サイズが９５〜１００ｎｍの範囲であった。エチルラウロイルアルギネートおよびリールアミンの２種の対イオンについての放出プロファイルを３７℃で調査した。
【０１８９】
図１２は、エチルラウロイルアルギネートを対イオンとして含有するナノ粒子に関するオリゴヌクレオチドの経時的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出プロファイルを、種々の理論添加量について示す。
【０１９０】
図１３は、リールアミン（エンドソーム離脱剤）を対イオンとして含有するナノ粒子に関するオリゴヌクレオチドの経時的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出を、種々の理論添加量について示す。
【０１９１】
図１２および１３において示されるとおり、添加量（または理論添加量）は、他の属性にマイナスに影響することなく、ＩＶＲに影響を与えることが観察された。
【０１９２】
（実施例１０）
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）
アンチセンスオリゴヌクレオチド（５ヌクレオチドの２’Ｏ−Ｍｅ修飾領域と隣接する１０ヌクレオチドのＲＮａｓｅ  Ｈドメイン）を対イオン（クロルプロマジン）と共に含有するナノ粒子を調査して、放出プロファイルを決定した。製剤は、ｓｓＤＮＡについて以前に評価したのと同じものとした。
【０１９３】
図１４は、ＡＳＯと対イオン（クロルプロマジン）とを表示された対イオン：オリゴ比で含むナノ粒子についての放出プロファイルを示す。
【０１９４】
（実施例１１）
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）および
エンドソーム離脱剤と組み合わされた、ＳＴＡＴ３（シグナル伝達性転写因子３）アンチセンスオリゴヌクレオチド（本明細書では、ＳＴＡＴ３  ＡＳＯと呼ぶ）を含有するナノ粒子を細胞内で調査して、ＳＴＡＴ３発現を決定。ＳＴＡＴ３は、ＳＴＡＴ３遺伝子によってコードされる転写因子である。ＳＴＡＴ３  ＡＳＯをいかなる送達剤なしにインキュベートすると、ＳＴＡＴ３発現の測定可能な低減は認められない結果となる。対照的に、脂質をベースとする送達剤を加えると、ＡＳＯ取込みおよび後続のＳＴＡＴ３ノックダウンが促進される。これは、このタイプのＡＳＯが、細胞膜を越え、タンパク質発現を阻害することができないという、当技術分野において公知のことと一致する。
【０１９５】
０日目に、Ｃ４−２細胞（ＰＳＭＡ発現について陽性）を、ウェルあたり１．５×１０５細胞で播いた。Ｃ４−２細胞は、市販品として入手可能であり、細胞をインキュベートし、成長させ、維持することは、当技術分野において周知の技術であると理解すべきである。同様に、ウエスタンブロット分析も、周知の分析技術である。１日目に、細胞を、成長培地において、処理しないままとするか、または２．５μＭのＳＴＡＴ３  ＡＳＯ（遊離）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（脂質）中の２００ｎＭのＳＴＡＴ３  ＡＳＯ、もしくは２．５μＭのＳＴＡＴ３  ＡＳＯをエンドソーム離脱剤（例えば、クロルプロマジン、フルオキセチン、プロメタジン、またはリールアミン）と共に含有するナノ粒子で処理した。細胞を３７℃で７２時間インキュベートし、７２時間で、それを溶解緩衝液に集め、ＳＴＡＴ３発現について、ウエスタンブロットによって分析した。細胞を溶解用緩衝液に溶解させることは、当技術分野に周知の技術であると理解すべきである。この実験では、アクチンを対照とした。結果は、図１５Ａに示す。ＳＴＡＴ３  ＡＳＯと、２．５μＭまたは１０μＭの、クロルプロマジン、エチルラウロイルアルギネート、またはリールアミンのいずれかを含有するナノ粒子で７２時間細胞を処理したことを除き、同じ実験を繰り返した。結果は、図１５Ｂに示す（ＵＴＣ（未処理細胞）、ＡＳＯ（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、ＣＰＺ（クロルプロマジン）、ＥＬＡ（エチルラウロイルアルギネート）、脂質（ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ））。
【０１９６】
図１５Ａのウエスタンブロットプロファイルに示されるとおり、細胞をＳＴＡＴ３  ＡＳＯとリールアミン対イオン（２．５μＭ）とを含有するナノ粒子で処理すると、ＳＴＡＴ３発現の測定可能なノックダウンが認められる。図１５Ｂにおいて示されるとおり、より高濃度のリールアミン（１０ｍＭ）およびＣＰＺも、ＡＳＯ送達を促進し得る。
【０１９７】
図１５Ａおよび１５Ｂから、ＰＳＭＡを標的とするナノ粒子に、リールアミンをＳＴＡＴ３アンチセンスＡＳＯと共にカプセル化すると、２．５および１０μＭの濃度でＡＳＯの送達が促進されて、ＳＴＡＴ３タンパク質発現のノックダウンが生じる結果となることが実証される。１０μＭの濃度のＡＳＯでは、クロルプロマジン−ＡＳＯでも同様の効果が認められる。
【０１９８】
（実施例１２）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞アッセイ
ナノ粒子の種々の製剤をｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞アッセイで調査して、ナノ粒子から放出され、細胞において検出される治療剤の量を決定した。
【０１９９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞アッセイ（細胞ＩＶＲ）は、９６ウェルプレートに播かれたＡ４３１細胞（類表皮癌細胞）からなった。細胞を播種し、ＣＯ２制御下のインキュベーターにおいて細胞培地と共に終夜インキュベートした。検量線を定めるために、遊離ＡＳＯを細胞培地に３倍連続希釈し、細胞と共に２４時間インキュベートした。引き続いて細胞を溶解させ、ｃＤＮＡ合成およびそれに続くｍＲＮＡレベルについてのｑＰＣＲのために加工した。カプセル化されたＡＳＯのナノ粒子の放出を評価するために、以下のステップを遂行した。カプセル化されたＡＳＯのナノ粒子含有量をＨＰＬＣ分析によって決定した。９６ウェルプレートにおいて、公知のＡＳＯ含有量の粒子を細胞培地に３倍連続希釈し、３７℃で２４、４８、または７２時間インキュベートした。各時点で、細胞培地中の粒子を、３倍連続希釈された遊離ＡＳＯ（検量線）と並行して、Ａ４３１細胞を含有する９６ウェルプレートに移した。３７℃でさらに２４時間インキュベートした後、細胞を溶解させ、ｃＤＮＡ合成、およびｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ読み出し用に加工した。ナノ粒子からのＡＳＯの全体的な放出パーセントを確立するために、各ナノ粒子処理群についてＩＣ５０値を算出し、遊離ＡＳＯについての値と比較した。
【０２００】
図１６Ａ〜１６Ｃは、遊離ＡＳＯ対ナノ粒子製剤１、２、３、および４について、ナノ粒子からＡＳＯが放出されて２４、４８、または７２時間後の用量応答プロファイルを示す。ｓｓＤＮＡ製剤は、陽性対照として、非活性オリゴヌクレオチドペイロードを含有する。製剤番号１は、１０％ｗ／ｗのＡＳＯペイロードを含有する、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とする製剤である。製剤番号２は、５％ｗ／ｗのＡＳＯペイロードを含有する、標的をもたない製剤である。製剤番号３は、１０％ｗ／ｗのＡＳＯペイロードを含有する、標的をもたない製剤である。製剤番号４は、１０％ｗ／ｗのＡＳＯペイロードを、疎水性添加剤（ヘプタキス２，３，６−トリオベンゾイルシクロデキストリン）と共に含有する、標的をもたない製剤である。図１６Ｄは、３７℃で２４、４８、および７２時間インキュベート後にナノ粒子から放出されたＡＳＯの相対百分率を算出するために使用した、遊離ＡＳＯ処理群に対する各ナノ粒子製剤について算出したＩＣ５０値を示す。
【０２０１】
図１７Ａは、蛍光標識された、ホレートで標的化されたナノ粒子の内部移行および相対的な細胞内局在（矢印によって赤色で示される）、リソソーム（矢印によって緑色で示される）、および細胞核（矢印によって青色で示される）を示す、ＫＢ細胞（類表皮癌）の蛍光顕微鏡写真を示す。実験の３日前に、ＧＦＰでタグ付けされたリソソームマーカーを発現するバキュロウイルスで細胞を感染させた。２日後、感染したＫＢ細胞をカバーガラスに播き、無葉酸培地中で終夜接着させた。翌日、細胞培地を、ホレートで標的化されたナノ粒子を含有する新たな無葉酸培地に取り替え、これを細胞の上で３７℃で６０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、固定し、透過処理し、ＤＡＰＩ  ＤＮＡ染色剤で染色し、カバーガラスに載せた。像を１００倍の倍率で撮影した。図１７Ｂは、０分、１５分、および６０分における、結合したホレート標的化ナノ粒子の内部移行パーセントを示す。ＫＢ細胞を集め、ホレートで標的化された蛍光ナノ粒子を含有する無葉酸培地に懸濁させ、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄して、結合していないナノ粒子を除去し、無葉酸培地に再び送り込み、３７℃で０、１５、または６０分間インキュベートした。各時点において、細胞を集め、２つのプールに分けた。第１のプールは、ＰＢＳに懸濁させ、フローサイトメトリーによって、ナノ粒子蛍光について評価した（これは、総ナノ粒子含有量（内部移行したものと表面に結合したものの両方）に相当した）。第２のプールは、酸洗浄液（０．２Ｍの酢酸、０．５ＭのＮａＣｌ）に再懸濁し、室温で５分間インキュベートし、ＰＢＳ中で洗浄し、フローサイトメトリーによって評価した。酸洗浄によって、表面に結合したナノ粒子が剥ぎ取られるので、この蛍光の読みは、内部移行したナノ粒子だけの尺度である。酸で洗浄された蛍光を総蛍光で割ることにより、内部移行パーセントを決定する。
【０２０２】
（実施例１３）
ｓｉＲＮＡ−ＧＦＰノックアウトｉｎ  ｎｉｔｒｏ細胞アッセイ
エンドソーム離脱剤と組み合わされたｓｉＲＮＡを含有するナノ粒子を細胞内で調査して、ｅＧＦＰ発現に対する影響を決定した。Ａ４３１細胞アッセイにおいて、ｓｉＲＮＡ標的指向性ｅＧＦＰの種々の製剤をナノ粒子にカプセル化した。ｓｉＲＮＡペイロードが順調に送達されるか検定するために、Ｃ末端ＰＥＳＴドメインを含んでいる短命型のｅＧＦＰ（ｅＧＦＰ−ＰＥＳＴ）を安定して発現するＡ４３１細胞を、処理の前日、９６ウェル組織培養プレートにウェルあたり５０００細胞で播き、３７℃、湿度５％でインキュベートした。翌日、培地を除去し、２．５、０．６３、または０．１６μＭのｓｉＲＮＡ濃度の種々のｓｉＲＮＡ製剤を、単独で、または予め決められた毒性水準下用量の溶液中の推定上のエンドソーム離脱剤（６．７μＭのアミオダロン、１６．７μＭのアミトリプチリン、５０μＭのドキセピン、０．５μＭのＵＮＣ−７９３８、７５μＭのＥＬＡ）の存在下で含有する、１００ｕｌの新鮮な培地と交換した。すべての試験群を二通りに設定した。次いで、細胞をＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞画像処理システムにおいてインキュベートし、そこで、細胞を数日間にわたり３時間毎に１０倍の倍率で画像処理した。積算されたｅＧＦＰ蛍光を視野毎に平均し、細胞集密度パーセントで割って、細胞密度のばらつきについて正規化した。次いで、この値を、１００％に設定された未処理細胞の値に対して正規化した。
【０２０３】
図１８Ａおよび図１８Ｂは、細胞アッセイの結果、特に、相対的な蛍光を示す。図１８Ａは、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システムによって測定した相対ｅＧＦＰ蛍光の結果を示す。図１８Ｂは、リアルタイムＰＣＲ転写結果を報告する。図１８Ａおよび１８Ｂにおいて示されるとおり、蛍光レベルと転写物レベルは、概ね一致する。結果において、ｓｉＲＮＡ−Ｂ８９０ナノ粒子に曝された細胞における蛍光が、未処理の細胞に比べて減少したことを認めることができる。同様に、ドキセピンおよびアミトリプチリンを加えたｓｉＲＮＡ−Ｂ８９０ナノ粒子では、相対的な蛍光が最も少なくなった。
【０２０４】
図１９Ａ、１９Ｂ、および１９Ｃは、遊離ｓｉＲＮＡ（図１９Ａ）、ＰＴＮＰ−ｓｉＲＮＡ（図１９Ｂ）、およびＢ８９０−ｓｉＲＮＡ（図１９Ｃ）を用いて行った、上述のとおりの細胞アッセイの結果を示す。ＰＴＮＰは、官能化されていないナノ粒子であることを意味する。図１９Ａ、１９Ｂ、および１９Ｃから見てとれるように、Ｂ８９０−ｓｉＲＮＡナノ粒子では、特に２．５ｕＭの濃度で、相対的な蛍光が最も少なくなった。
【０２０５】
図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、および２０Ｄは、７８時間での種々のｓｉＲＮＡ製剤での細胞アッセイの結果を示すものである。図２０Ａは、７８時間でのＰＴＮＰ−ｓｉＲＮＡについての相対ＧＦＰ蛍光を示す。図２０Ｂは、７８時間での５％Ｂ８９０−ｓｉＲＮＡについての相対ＧＦＰ蛍光を示す。図２０Ｃは、７８時間での１０％Ｂ８９０−ｓｉＲＮＡについての相対ＧＦＰ蛍光を示す。図２０Ｃは、７８時間での２０％Ｂ８９０−ｓｉＲＮＡについての相対ＧＦＰ蛍光を示す。
【０２０６】
図２１Ａ〜２１Ｃは、細胞アッセイの結果、特に、細胞アッセイにおける、未処理細胞についての０および８８時間での蛍光を示すものであり、図２２Ａ〜２２Ｃは、細胞アッセイにおける、Ｂ８９０−ｓｉＲＮＡナノ粒子およびドキセピンについての０および８８時間での蛍光を示すものである。
【０２０７】
均等物
当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載されている開示されるナノ粒子の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、確認することができる。このような均等物は、下記の特許請求の範囲によって包含されるものとする。
【０２０８】
参照による組込み
本明細書において引用した全ての特許、公開された特許出願、ウェブサイト、および他の参照文献の全内容は、参照によりその全体が明確に本明細書において組み込まれている。
【図１】
2018528194.tif 000010
【図２−１】
2018528194.tif 000011
【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2018528194.tif 000018
【図９】
2018528194.tif 000019
【図１０−１】
2018528194.tif 000020
【図１０−２】
2018528194.tif 000021
【図１０−３】
2018528194.tif 000022
【図１０−４】
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【図１０−５】
2018528194.tif 000024
【図１０−６】
2018528194.tif 000025
【図１１】
2018528194.tif 000026
【図１２】
2018528194.tif 000027
【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
2018528194.tif 000030
【図１５−２】
2018528194.tif 000031
【図１６−１】
2018528194.tif 000032
【図１６−２】
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【図１７】
2018528194.tif 000034
【図１８−１】
2018528194.tif 000035
【図１８−２】
2018528194.tif 000036
【図１９−１】
2018528194.tif 000037
【図１９−２】
2018528194.tif 000038
【図１９−３】
2018528194.tif 000039
【図２０−１】
2018528194.tif 000040
【図２０−２】
2018528194.tif 000041
【図２０−３】
2018528194.tif 000042
【図２０−４】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
2018528194.tif 000046
2018528194.tif 000047