(57)【要約】本発明は、抗原CLL1に対して特異的であるようにした、多鎖CARと呼ばれる新世代のキメラ抗原受容体（CAR）に関する。そのようなCARは、免疫細胞の特異性および反応性を、腫瘍抗原CLL1を発現する悪性細胞に向け直すことを目的としている。これらのCARを構成するアルファポリペプチド、ベータポリペプチド、およびガンマポリペプチドは、膜近傍位置で集合して、最適なシグナル伝達を付与する天然受容体に近い柔軟なアーキテクチャを形成するように設計されている。本発明は、該多鎖CARをコードするポリヌクレオチド、ベクター、およびそれらをその表面に発現する単離された細胞、特に免疫療法において使用するためのものを包含する。本発明は、がんを処置するための、特に白血病を処置するための、効率的な養子免疫療法戦略への道を切り開く。2018504144.tif 000043
2018504144.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面CLL1抗原に結合する少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメインを含む、第1膜貫通ポリペプチド、および
少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含む第2ポリペプチド
を少なくとも含む、CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）であって、
該多鎖キメラ抗原受容体のシグナル伝達ドメインが、細胞外リガンド結合ドメインを保持するポリペプチドとは別個のポリペプチド上に存在する、
CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）。
【請求項２】
シグナル伝達ドメイン含有ポリペプチドが膜貫通ポリペプチドである、請求項1記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項３】
少なくとも1つの膜貫通ポリペプチドがFc受容体の一部を含む、請求項1または請求項2記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項４】
Fc受容体の一部が、（a）FcεRIアルファ鎖、（b）FcεRIベータ鎖、および（c）FcεRIガンマ鎖からなる群より選択される、請求項3記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項５】
高アフィニティーIgE受容体（FcεRI）のアルファ鎖からの膜貫通ポリペプチドが、細胞外CLL1リガンド結合ドメインに融合されている、請求項3または4記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項６】
シグナル伝達ドメインに融合されたFcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖からの第2膜貫通ポリペプチド
をさらに含む、請求項3〜5のいずれか一項記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）。
【請求項７】
共刺激ドメインを含むFcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖からの第3膜貫通ポリペプチド
をさらに含む、請求項3〜6のいずれか一項記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）。
【請求項８】
FcεRIのアルファ鎖に融合されたCLL1リガンド結合ドメインが、CLL1に対する特異性を付与する重（VH）鎖および軽（VL）鎖を含む一本鎖可変フラグメント（scFv）である、請求項1〜7のいずれか一項記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項９】
VHが、SEQ ID NO：13、14、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、および35から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも90％の同一性を呈するポリペプチド配列を含む、請求項8記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１０】
VLが、SEQ ID NO：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、および36から選択されるポリペプチドに対して少なくとも90％の同一性を呈するポリペプチドを含む、請求項8記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１１】
FcεRIのアルファ鎖が、CD8α、IgG1、またはFcRIIIαタンパク質からのヒンジによって細胞外リガンド結合ドメインに融合されている、請求項4〜10のいずれか一項記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１２】
ヒンジが、SEQ ID NO：2に対して少なくとも90％の同一性を呈するポリペプチド配列を含む、請求項11記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１３】
FcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖に融合されたシグナル伝達ドメインが、TCRゼータ鎖、FCεRβ鎖、FcεRIγ鎖に由来するか、または免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含む、請求項3〜12のいずれか一項記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１４】
シグナル伝達ドメインがCD3ゼータに由来する、請求項13記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１５】
シグナル伝達ドメインが、SEQ ID NO：10に対して少なくとも90％の同一性を呈するポリペプチド配列を含む、請求項14記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１６】
第2または第3ポリペプチドが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、CD8、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンド、およびそれらの任意の組み合わせから選択される共刺激分子の細胞質ドメインからの共刺激ドメインを含む、請求項1〜15のいずれか一項記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１７】
共刺激ドメインが4-1BBに由来し、SEQ ID NO：6に対して少なくとも90％の同一性を呈するポリペプチド配列を含む、請求項16記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１８】
共刺激ドメインがCD28に由来し、SEQ ID NO：7に対して少なくとも90％の同一性を呈するポリペプチド配列を含む、請求項16記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項１９】
少なくとも1つのエピトープが、CARの細胞外ドメインのうちの少なくとも1つに挿入されている、請求項1〜18のいずれか一項記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項２０】
少なくとも1つのエピトープが、CARの1つの細胞外リガンド結合ドメインに挿入されている、請求項19記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項２１】
少なくとも1つのエピトープが、CLL1に結合するCARの細胞外ドメインに挿入されている、請求項20記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項２２】
細胞外結合ドメインが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のmAb特異的エピトープを含む、請求項19〜21のいずれか一項記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項２３】
細胞外結合ドメインが、1、2、3、または4個のmAb特異的エピトープを含む、請求項22記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項２４】
細胞外結合ドメインが、2、3、または4個のmAb特異的エピトープを含む、請求項23記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項２５】
細胞外結合ドメインが、以下の配列:
V1-L1-V2-（L）x-エピトープ1-（L）x-、
V1-L1-V2-（L）x-エピトープ1-（L）x-エピトープ2-（L）x-、
V1-L1-V2-（L）x-エピトープ1-（L）x-エピトープ2-（L）x-エピトープ3-（L）x-、
（L）x-エピトープ1-（L）x--V1-L1-V2、
（L）x-エピトープ1-（L）x-エピトープ2-（L）x-V1-L1-V2、
エピトープ1-（L）x-エピトープ2-（L）x-エピトープ3-（L）x-V1-L1-V2、
（L）x-エピトープ1-（L）x-V1-L1-V2-（L）x-エピトープ2-（L）x、
（L）x-エピトープ1-（L）x-V1-L1-V2-（L）x-エピトープ2-（L）x-エピトープ3-（L）x-、
（L）x-エピトープ1-（L）x-V1-L1-V2-（L）x-エピトープ2-（L）x-エピトープ3-（L）x-エピトープ4-（L）x-、
（L）x-エピトープ1-（L）x-エピトープ2-（L）x-V1-L1-V2-（L）x-エピトープ3-（L）x-、
（L）x-エピトープ1-（L）x-エピトープ2-（L）x-V1-L1-V2-（L）x-エピトープ3-（L）x-エピトープ4-（L）x-、
V1-（L）x-エピトープ1-（L）x-V2、
V1-（L）x-エピトープ1-（L）x-V2-（L）x-エピトープ2-（L）x、
V1-（L）x-エピトープ1-（L）x-V2-（L）x-エピトープ2-（L）x-エピトープ3-（L）x、
V1-（L）x-エピトープ1-（L）x-V2-（L）x-エピトープ2-（L）x-エピトープ3-（L）x-エピトープ4-（L）x、
（L）x-エピトープ1-（L）x-V1-（L）x-エピトープ2-（L）x-V2;または
（L）x-エピトープ1-（L）x-V1-（L）x-エピトープ2-（L）x-V2-（L）x-エピトープ3-（L）x
のうちの1つを含み、
V1はVLでありかつV2はVHであるか、またはV1はVHでありかつV2はVLであり、
L1は、VH鎖をVL鎖に連結するのに適したリンカーであり、
Lは、グリシン残基およびセリン残基を含むリンカーであり、細胞外結合ドメインにおけるLの各存在は、同じ細胞外結合ドメインにおけるLの他の存在と同一であってもよくまたは相違してもよく、
xは0または1であり、xの各存在は他のものとは独立して選択され、
エピトープ1、エピトープ2、およびエピトープ3はmAb特異的エピトープであり、同一であってもよくまたは相違してもよい、
請求項23記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項２６】
細胞外結合ドメインが、以下の配列:
V1-L1-V2-L-エピトープ1; V1-L1-V2-L-エピトープ1-L; V1-L1-V2-L-エピトープ1-L-エピトープ2; V1-L1-V2-L-エピトープ1-L-エピトープ2-L; V1-L1-V2-L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3; V1-L1-V2-L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-L; V1-L1-V2-エピトープ1; V1-L1-V2-エピトープ1-L; V1-L1-V2-エピトープ1-L-エピトープ2; V1-L1-V2-エピトープ1-L-エピトープ2-L; V1-L1-V2-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3; V1-L1-V2-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-L; エピトープ1-V1-L1-V2; エピトープ1-L-V1-L1-V2; L-エピトープ1-V1-L1-V2; L-エピトープ1-L-V1-L1-V2; エピトープ1-L-エピトープ2-V1-L1-V2; エピトープ1-L-エピトープ2-L-V1-L1-V2; L-エピトープ1-L-エピトープ2-V1-L1-V2; L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-V1-L1-V2; エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-V1-L1-V2; エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-L-V1-L1-V2; L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-V1-L1-V2; L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-L-V1-L1-V2; V1-L-エピトープ1-L-V2; L-エピトープ1-L-V1-L-エピトープ2-L-V2; V1-L-エピトープ1-L-V2-L-エピトープ2-L; V1-L-エピトープ1-L-V2-L-エピトープ2-L-エピトープ3; V1-L-エピトープ1-L-V2-L-エピトープ2-エピトープ3; V1-L-エピトープ1-L-V2-L-エピトープ2-L-エピトープ3-エピトープ4; L-エピトープ1-L-V1-L-エピトープ2-L-V2-L-エピトープ3-L; エピトープ1-L-V1-L-エピトープ2-L-V2-L-エピトープ3-L; L-エピトープ1-L-V1-L-エピトープ2-L-V2- L-エピトープ3; L-エピトープ1-L-V1-L1-V2-L-エピトープ2-L; L-エピトープ1-L-V1-L1-V2-L-エピトープ2-L-エピトープ3; L-エピトープ1-L-V1-L1-V2-L-エピトープ2-エピトープ3、またはエピトープ1-L-V1-L1-V2-L-エピトープ2-L-エピトープ3-エピトープ4
を含み、
V1はVLでありかつV2はVHであるか、またはV1はVHでありかつV2はVLであり、
L1は、VH鎖をVL鎖に連結するのに適した任意のリンカーであり、
Lは、グリシン残基およびセリン残基を含むリンカーであり、細胞外結合ドメインにおけるLの各存在は、同じ細胞外結合ドメインにおけるLの他の存在と同一であってもよくまたは相違してもよく、
エピトープ1、エピトープ2、およびエピトープ3はmAb特異的エピトープであり、同一であってもよくまたは相違してもよい、
請求項22記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項２７】
L1がグリシンおよび/またはセリンを含むリンカーである、請求項25または26記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項２８】
L1が、アミノ酸配列（Gly-Gly-Gly-Ser）nまたは（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）nを含むリンカーであり、ここで、nは1、2、3、4、または5である、請求項27記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項２９】
L1が、アミノ酸配列（Gly4Ser）4または（Gly4Ser）3を含むリンカーである、請求項27記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項３０】
Lが、
2018504144.tif 000042
から選択されるアミノ酸配列を有するリンカーである、請求項27記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項３１】
Lが、SGGGG、GGGGS、またはSGGGGSである、請求項30記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項３２】
mAb特異的エピトープが、イブリツモマブ、チウキセタン、ムロモナブ-CD3、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、QBEND-10、アレムツズマブ、またはウステキヌマブによって特異的に認識される、請求項22記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項３３】
mAb特異的エピトープが、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、およびSEQ ID NO：116から選択されるアミノ酸配列を含むものである、請求項22記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項３４】
エピトープ1が、SEQ ID NO：109のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープである、請求項25または26記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項３５】
エピトープ2が、SEQ ID NO：109のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープである、請求項25または26記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項３６】
エピトープ3が、SEQ ID NO：109またはSEQ ID NO：117またはSEQ ID NO：118のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープである、請求項25または26記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項３７】
エピトープ4が、SEQ ID NO：109のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープである、請求項25または26記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項３８】
表6に示す抗CLL1 SC02-357、抗CLL1 SC02-378、抗CLL1 SC02-161、抗CLL1 M26、抗CLL1 M31、抗CLL1 G4、抗CLL1 M22、抗CLL1 M29、抗CLL1 M2、抗CLL1 M5、抗CLL1 G12、抗CLL1 21.26、および抗CLL1 1075.7の全長アミノ酸配列に対して少なくとも80％の同一性を呈するポリペプチド配列を含む、請求項1〜37のいずれか一項記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
【請求項３９】
請求項1〜38のいずれか一項記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項４０】
請求項39記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項４１】
請求項1〜38のいずれか一項記載の抗CLL1 mcCARを細胞表面膜に発現する、操作された免疫細胞。
【請求項４２】
炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球から誘導される、請求項41記載の操作された免疫細胞。
【請求項４３】
治療において使用するための、請求項41または42のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項４４】
患者がヒトである、治療において使用するための請求項412〜43のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項４５】
状態が、CLL1発現細胞を特徴とする前悪性または悪性がん状態である、請求項41〜44のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項４６】
状態が、CLL1発現細胞の過剰を特徴とする状態である、治療において使用するための請求項41〜45のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項４７】
状態が血液がん状態である、治療において使用するための請求項41〜46のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項４８】
血液がん状態が白血病である、治療において使用するための請求項41〜47のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項４９】
白血病が急性骨髄性白血病（AML）である、治療において使用するための請求項41〜48のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項５０】
前記免疫細胞においてTCRの発現が抑制されている、請求項41〜49のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項５１】
前記免疫細胞において少なくとも1つのMHCタンパク質、好ましくはβ2mまたはHLAの発現が抑制されている、請求項41〜50のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項５２】
少なくとも1つの免疫抑制薬または化学療法薬に対する耐性を付与するために変異が導入されている、請求項41〜51のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項５３】
血液がん細胞の損傷を引き起こすのに有効な量の請求項41〜52のいずれか一項記載の操作された細胞と、血液がん細胞を接触させる工程を含む、血液がん細胞を損傷させる方法。
【請求項５４】
（c）免疫細胞を用意する工程、
（d）請求項1〜38のいずれか一項記載の少なくとも1つの多鎖キメラ抗原受容体を該細胞の表面に発現させる工程
を含む、免疫細胞を操作する方法。
【請求項５５】
（d）免疫細胞を用意する工程、
（e）請求項1〜38のいずれか一項記載の少なくとも1つの多鎖キメラ抗原受容体を構成するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを、該細胞に導入する工程、
（f）該ポリヌクレオチドを該細胞中に発現させる工程
を含む、請求項54記載の免疫細胞を操作する方法。
【請求項５６】
（c）免疫細胞を用意する工程、
（d）異なる細胞外リガンド結合ドメインをそれぞれが含む請求項1〜38のいずれか一項記載の多鎖キメラ抗原受容体の集団を、該細胞の表面に発現させる工程
を含む、請求項36記載の免疫細胞を操作する方法。
【請求項５７】
（d）免疫細胞を用意する工程、
（e）異なる細胞外リガンド結合ドメインをそれぞれが含む請求項1〜38のいずれか一項記載の多鎖キメラ抗原受容体の集団を構成するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを、該細胞に導入する工程、
（f）該ポリヌクレオチドを該細胞中に発現させる工程
を含む、請求項56記載の免疫細胞を操作する方法。
【請求項５８】
請求項54〜57のいずれか一項記載の方法から得ることができる、単離された免疫細胞。
【請求項５９】
請求項1〜38のいずれか一項記載の少なくとも1つの多鎖キメラ抗原受容体を含む、単離された免疫細胞。
【請求項６０】
医薬として使用するための、請求項58または59記載の単離された免疫細胞。
【請求項６１】
NK細胞、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球から誘導される、請求項58〜60のいずれか一項記載の単離された細胞。
【請求項６２】
請求項58〜61のいずれか一項記載の単離された免疫細胞を含む、治療組成物。
【請求項６３】
必要としている患者を処置するための方法であって、
c）請求項54〜57のいずれか一項記載の方法によって得ることができる免疫細胞を用意する工程、
d）該T細胞を該患者に投与する工程
を含む、方法。
【請求項６４】
該免疫細胞がドナーから採取される、請求項63記載の患者を処置するための方法。
【請求項６５】
該免疫細胞が患者から採取される、請求項63記載の患者を処置するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗原CLL1に対して特異的であるようにした、多鎖CARと呼ばれる新世代のキメラ抗原受容体（CAR）に関する。そのようなCARは、免疫細胞の特異性および反応性を、腫瘍抗原CLL1を発現する悪性細胞に向け直すことを目指している。これらのCARを構成するポリペプチドは、膜近傍位置で集合して、調整可能なシグナル伝達を付与する天然受容体に近い柔軟なアーキテクチャを形成するように設計されている。本発明は、前記多鎖CARをコードするポリヌクレオチド、ベクター、およびそれらを免疫細胞中で異種発現させることによってもたらされる単離された細胞、特に免疫療法において使用するためのものを包含する。本発明は、がんを処置するための、特に急性骨髄性白血病（AML）を処置するための、効率的な養子免疫療法戦略への道を切り開く。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
エクスビボで作製した抗原特異的T細胞の移入を伴う養子免疫療法は、ウイルス感染症およびがんを処置するための有望な戦略である。養子免疫療法に使用されるT細胞は、抗原特異的T細胞の増加または遺伝子工学によるT細胞のリダイレクションによって作製することができる（Park, Rosenberg et al.（2011）Treating Cancer with Genetically Engineered T Cells. Trends Biotechnol. 29（11）:550-557）。ウイルス抗原特異的T細胞の移入は、移植関連ウイルス感染症および希少なウイルス関連悪性疾患の処置に使用される十分に確立された手法である。同様に、腫瘍特異的T細胞の単離および移入は、黒色腫の処置に奏功することが示されている。
【０００３】
T細胞に新規な特異性を生じさせることは、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体（CAR）の遺伝子導入によって成功している（Jena, Dotti et al.（2010）Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor. Blood. 116（7）:1035-1044）。CARは、1つまたは複数のシグナリングドメインを伴って一本鎖融合分子を形成しているターゲティング部分からなる、合成受容体である。しかしこのアプローチは、今のところ、抗原CD19を保有する悪性B細胞を標的とすることによる有効性が、急性リンパ芽球性白血病（ALL）患者に関して証明されているに過ぎない（Porter, D.L. et al.（2011）Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. N. Engl. J. Med. 365:725-733）。
【０００４】
急性骨髄性白血病（AML）の寛解導入処置は50年近くにわたってほとんど何も変わっておらず、AMLは今なお予後が不良な疾患である。急性骨髄性白血病（AML）は、骨髄における未成熟な骨髄性細胞の迅速な増殖が造血機能障害をもたらすことを特徴とする疾患である。標準的な寛解導入化学療法が完全寛解を誘導する場合もあるが、多くの患者が結局は再発を起こして、この疾患に屈することから、AMLのための新規な治療薬の開発が必要とされている。
【０００５】
一方、急性骨髄性白血病（AML）の寛解導入処置は50年近くにわたってほとんど何も変わっておらず、AMLは今なお予後が不良な疾患である。AMLは、骨髄における未成熟な骨髄性細胞の迅速な増殖が造血機能障害をもたらすことを特徴とする疾患である。標準的な寛解導入化学療法が完全寛解を誘導する場合もあるが、多くの患者が結局は再発を起こして、この疾患に屈することから、AMLのための新規な治療薬の開発が必要とされている。AMLの免疫表現型検査における最近の進歩により、将来の治療法の標的となりうる数種類のAML関連細胞表面抗原が明らかになっている。
【０００６】
なかでも、CLL1（C型レクチン様分子1）は、分析されたAML患者の85〜92％の白血病性芽球が診断時にこれを発現しているので、興味深い腫瘍抗原標的であると思われる。これは、V群C型レクチン様受容体分子ファミリーの75kDaメンバーである。V群分子は非糖リガンドに結合するレクチン様ドメインを有する。CLL1は、200AAの細胞外ドメインを含有する265アミノ酸のII型膜貫通糖タンパク質である（「Entrez Gene」データベースの遺伝子番号160364がコードするヒトタンパク質については、Uniprotデータベース:Q5QGZ9）。CLL1は、文献およびデータベースでは、MICL、CLEC12およびKLRL1とも呼ばれている。
【０００７】
Bakker et al, 2004は、CLL1抗原がAML幹細胞と関連することを示した。他のいくつかの抗原（CD33など）と同様に、CLL1は、大半の悪性リンパ系幹細胞（AML LSC）に特異的に発現し、正常HSCには発現していない細胞表面タンパク質である（Van Rhenen et al, 2007）。一方、CLL1は、AMLにおける診断マーカーであることも明らかにされている（Larsen et al, 2012）。抗CLL-1抗体は、診断時にも寛解中にも、悪性細胞と正常幹細胞とを識別するものとして、AML特異的幹細胞の検出と、おそらくは抗原ターゲティングとを、どちらも可能にする（van Rhenen et al, 2007）。しかし、治療用抗体として臨床治験で試験されていると現在までに報告されたものは、これらの抗体にはない。
【０００８】
モノクローナル抗体は、リンパ腫を処置するためにしばしば使用されてきたが、白血病におけるそれらの使用は、それより限定されたものであった。ゲムツズマブオゾガミシン（Mylotarg（登録商標））は、細胞毒が取り付けられているモノクローナル抗体である。これは、以前に、高齢患者におけるAMLの処置に関して承認されたが、この製品に関連する多少の毒性が研究によって見つかった後に、市場から撤退した（PMLIVEにおける2010年11月10日のプレスリリース「ASH: Pfizer eyes re-launch of Mylotarg」）。過去10年間に他のモノクローナル治療用抗体も有害作用を示している（Klastersky, J.（2006）「Adverse effects of the humanized antibodies used as cancer therapeutics」Current Opinion in Oncology. 18（4）:316-320）。
【０００９】
Zhang et al（2011）の刊行物には、標的薬物送達（ダウノルビシン）のために、共有結合によりCLL1ターゲティングペプチドで飾られたミセル状ナノ粒子が記載されている。これらの「ターゲティングナノミセル」は、インビトロで、CLL1を発現する細胞の内部に、そして臨床検体から単離されたLSCに、積み荷である薬物を輸送する。CLL1ターゲティングナノミセルは白血病幹細胞への標的薬物送達に使用されうることが示された。しかし、CCL-1ターゲティングペプチドそのものに起因すると考えることができる治療効果はない。
【００１０】
上記に鑑み、本発明者らは、免疫細胞の特異性をCLL1陽性細胞に向け直す、抗CLL1モノクローナル抗体に基づく特異的キメラ抗原受容体を賦与された免疫細胞を使って、CCL1を標的とするための新しいアプローチを追究した。
【００１１】
悪性細胞または感染細胞を標的とすることができる治療薬グレードの操作された免疫細胞を開発する中で、本発明者らは、任意の細胞外単一特異性または多重特異性リガンド結合ドメインを使って、天然物との類似性が向上していて相応に挙動する可能性が高い改良されたCARアーキテクチャを探求した。WO2014039523において、本発明者らは、「多鎖CAR」と呼ばれる、本発明の分離したポリペプチドサブユニットを伴う新世代のCARを記載した。このアーキテクチャでは、シグナリングドメインと共刺激ドメインとが、異なるペプチド鎖上に置かれる。そのような多鎖CARは、FcεRIアルファ鎖の高アフィニティーIgE結合ドメインをscFvなどの細胞外リガンド結合ドメインで置き換えることによって、FcεRI（図1参照）から誘導することができ、その一方で、FcεRIベータ鎖および/またはガンマ鎖のN末および/またはC末テールは、それぞれ、シグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインに融合される。細胞外リガンド結合ドメインは、T細胞の特異性を細胞標的に向け直す役割を有し、一方、シグナル伝達ドメインは免疫細胞応答を活性化する。FcεRIのアルファ、ベータおよびガンマポリペプチドから誘導される異なるポリペプチドが膜近傍に位置する膜貫通ポリペプチドであるという事実は、より柔軟なアーキテクチャをCARに与え、標的分子に対する特異性を改良すると共に、免疫細胞のバックグラウンド活性化を低減する。
【００１２】
本発明者らは、マーカーとしてCLL1を保有する悪性細胞を標的とするのにとりわけ適した、CLL1に結合するscFv細胞外ドメインを保有する多鎖CARを、ここに設計した。白血病、特にAMLを処置または防止するために、CLL1陽性細胞に対して効率よく作用すると記載された抗体は、今までほとんどなかったが、これを達成した。
【００１３】
本発明の目的のために、本発明者らは、抗CLL1多鎖CARを発現するT細胞を、ここに用意した。これら新しい抗CLL1 CARのデザインおよびアーキテクチャゆえに、そして操作された免疫細胞の特性ゆえに、操作された免疫細胞の作用および活性の動態（kinetic）は予想外に修飾されて、エスケープしうる腫瘍細胞が減少すると共に、GVHDおよび副作用が低減して長期的効果が観察されるようになる。
【００１４】
これらの独創的CARは、CLL1陽性T細胞に、特に、AML中に発生する悪性CLL1陽性細胞に、特異的に結合してその生存に影響を及ぼし、それら悪性細胞の生存能を選択的に改変することから、これらのCARが呈するサイトカイン放出などの中毒性副作用は少ないと予想される。さらにまた本発明は、「既製の（off-the-shelf）」同種異系治療用製品として使用しうる操作された同種異系免疫細胞を提供する。本発明のさらに別の利点として、CAR陽性の操作された細胞は、化学療法または免疫枯渇処置と適合するように（すなわち耐性となるように）することができ、それにより、化学療法と免疫療法との相乗効果を可能にする。
【発明の概要】
【００１５】
本発明者らは、さまざまなデザインを有し、抗CLL1特異的抗体から誘導されるさまざまなscFVを含む、CLL1特異的多鎖（mcCAR）を作製した。該多鎖CARは、好ましくは、本明細書において詳述するように、FcεRIのアルファ、ベータおよびガンマポリペプチドに基づく。
【００１６】
特に本発明者らは、SC02-357、SC02-378、SC02-161、M26、M31、G4、M22、M29、M2、M5、G12、21.26および1075.7抗体から誘導されるVL鎖およびVL鎖を含み、さまざまなアーキテクチャを持つ、抗CLL1特異的多鎖CAR（mcCAR）を開発し、CLL1発現細胞に結合してCLL1発現がん細胞を選択的に破壊する、高度に特異的で極めて選択的なmcCAR構築物を同定した。
【００１７】
ドナーからの初代T細胞を、インビトロでの（例えば抗CD3/CD28被覆ビーズおよび組換えIL2による）非特異的活性化後に、ウイルス形質導入法を使って、これらのmcCARを発現するポリヌクレオチドで形質転換した。一定の例では、アロ反応性が低下したT細胞または非アロ反応性のT細胞を作製するために、より具体的には移植片対宿主反応を防止するためにTCR（αβ-T細胞受容体）のコンポーネントを破壊することによって、T細胞をさらに操作した。
【００１８】
本発明のCLL1特異的CARを賦与された免疫細胞をさらに操作して抗がん薬に耐性なT細胞を作製し、それを該古典的抗がん薬と併用するか、逐次的に使用することができる。
【００１９】
結果として得られた操作されたT細胞は、インビトロでCLL1陽性細胞に対する反応性をさまざまな程度に呈して、本発明のmcCARが、前記T細胞の抗原依存的活性化の一因となり、その増殖の一因にもなることを示した。これは、これらの操作されたT細胞を免疫療法にとって有用なものにする。
【００２０】
結果として得られた操作されたT細胞は、インビボでCLL1陽性細胞に対する反応性を呈し、インビボでがん細胞の数を有意に低減した。
【００２１】
本発明の操作されたT細胞は、CLL1陽性細胞に対してインビボ反応性を呈するように設計されており、抗がん薬と併用することができ、忍容性が高い。ある特定態様において、本発明の操作されたT細胞は数回の投与後でさえ依然として有効であり、このことが、本発明の操作されたT細胞を、第1処置（導入）としての免疫療法、強化処置としての免疫療法、古典的抗がん化学療法との併用処置としての免疫療法にとって有用なものにする。本発明のCARのポリペプチド配列および本発明のCARをコードするポリヌクレオチド配列を、本明細書において詳述する。
【００２２】
さらに別の局面によれば、本発明のCLL1特異的CARは、CD20ミモトープなどの少なくとも1つのエピトープタギング配列を含むことで、CAR陽性細胞の免疫応答（すなわち、免疫療法にそれらを使用している時のサイトカインストームなどの有害作用の発生）を調整するために、そのようなエピトープに対する抗体の使用による該免疫細胞の枯渇を可能にする。好ましくは、前記少なくとも1つのエピトープは、CARの細胞外リガンド結合ドメイン中に挿入され、より好ましくは本明細書において例示する多鎖CARのアルファ鎖上に挿入される。
【００２３】
本発明の操作された免疫細胞は、急性骨髄腫白血病（AML）処置などの治療的応用にとって、とりわけ有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の多鎖CARアーキテクチャの元となったネイティブFcεRIの模式図。
【図２】本発明のCLL1多鎖CARをコードするポリシストロニックコンストラクトの一般構造。
【図３】本発明のCLL1特異的多鎖CARのさまざまなアーキテクチャ。左から右に、ポリペプチドガンマ（CD3ゼータのITAMに融合されている）、ポリペプチドアルファ（ScFvに融合されている）、ポリペプチドベータ（CD28または41BBのどちらか一方からの共刺激ドメインに融合されている）。AおよびB:ポリペプチドベータが41BBからの共刺激ドメインに融合されており、VLフラグメントとVHフラグメントの順序が逆である。CおよびD:ポリペプチドベータがCD28からの共刺激ドメインに融合されており、VLフラグメントとVHフラグメントの順序が逆である。  図3Cおよび図4では、VLフラグメントとVHフラグメントの順序が、図3Dの構築物と比較して逆である。図3Cおよび図4では、細胞外CLL1リガンド結合ドメインのVLフラグメントが、高アフィニティーIgE受容体（FcεRI）のアルファ鎖からの膜貫通ポリペプチドに、より正確にはCD8フラグメントと高アフィニティーIgE受容体（FcεRI）のアルファ鎖のフラグメントとを含むペプチドに、融合されている。
【図４】アルファフラグメントが、CD8フラグメントを含むポリペプチドとVHフラグメントとに連結しているVLフラグメントを含み、ベータ鎖が、ベータ鎖のC末に位置する共刺激ドメインを含み、該共刺激ドメインが41BB（mcCLL1-41BB）またはCD28（mcCLL1-CD28）に由来する、本発明のCLL1特異的多鎖CARの2つのアーキテクチャ（mcCLL1-41BBおよびmcCLL1-CD28）。
【図５Ａ】CAR陽性細胞注射に関連して起こりうる副作用を緩和するために計画されるT細胞枯渇のために例えばCD20ミモトープを使用する、mAbエピトープタギングに基づくさまざまな戦略の模式図。V1およびv2はそれぞれVH鎖またはVL鎖のどちらか一方を表す。TM:膜貫通ドメイン。L:リンカー。  （A）細胞を選別するためまたは枯渇させるためのエピトープタギング配列を含まない、本発明の多鎖アーキテクチャの細胞外抗CLL1リガンド結合ドメイン部分。V1:抗CLL1モノクローナル抗体VH;L:GSリンカー;V2:抗CLL1モノクローナル抗体VH;ヒンジ:好ましくはCD8ヒンジ;TM:好ましくはFcεRIγ-TM-IC。  （B）CARの細胞外リガンド結合ドメインに挿入された少なくとも1つのエピトープを含む、本発明の多鎖アーキテクチャの細胞外抗CLL1ドメイン。ここで、エピトープはVH鎖とVL鎖との間に挿入されており、エピトープは異なるリンカーと接している。  （C）ここに提示されているアーキテクチャはどちらも、2つのエピトープがCARの細胞外リガンド結合ドメインに挿入されていて、一つはCARのN末端とVH鎖との間に挿入され、該エピトープは少なくとも1つまたは2つのリンカーと接しており、第2エピトープはVH鎖とVL鎖との間に挿入されていて、該第2エピトープも少なくとも1つまたは2つのリンカーと接している例に相当する。ここに図解するアーキテクチャは、第2エピトープに境界をつけるために使用されるリンカーが異なる。  （D）ここに提示されているアーキテクチャはどちらも、2つのエピトープがCARの細胞外リガンド結合ドメインに挿入されていて、一つはVH鎖とVL鎖との間に挿入され、他方のエピトープはVL鎖とヒンジとの間に挿入されており、また各エピトープは、少なくとも1つまたは2つのリンカーと接している例に相当する。ここに図解するアーキテクチャは、第1エピトープに境界をつけるために使用されるリンカーが異なる。  （E）2つのエピトープがCARの細胞外ドメインに挿入されていて、一つはCARのN末端とVH鎖との間に挿入され、該エピトープは少なくとも1つまたは2つのリンカーと接しており、第2エピトープはVL鎖とヒンジとの間に挿入され、第2エピトープもそのようなリンカーと接している、1つのアーキテクチャが提示されている。
【図５Ｂ】CAR陽性細胞注射に関連して起こりうる副作用を緩和するために計画されるT細胞枯渇のために例えばCD20ミモトープを使用する、mAbエピトープタギングに基づくさまざまな戦略の模式図。V1およびv2はそれぞれVH鎖またはVL鎖のどちらか一方を表す。TM:膜貫通ドメイン。L:リンカー。  （F）ここに提示されているアーキテクチャはどちらも、3つのエピトープがCARの細胞外ドメインに挿入されていて、一つはCARのN末端とVH鎖との間に挿入され、該エピトープは少なくとも1つまたは2つのリンカーと接しており、第2エピトープはVH鎖とVL鎖との間に挿入され、該エピトープもそのようなリンカーと接しており、第3エピトープはVL鎖とヒンジとの間に挿入されている例に相当する。これら2つのアーキテクチャは第2エピトープに境界をつけるために使用されるリンカーが異なる。  （G）少なくとも2つのエピトープ（好ましくはCD20エピトープ）が細胞外リガンド結合ドメインにおいてヒンジと抗CLL1 VH鎖およびVL鎖との間に挿入されている、本発明の多鎖アーキテクチャの細胞外抗CLL1ドメイン。3つ目の例示的アーキテクチャでは、1つのCD34エピトープが2つのCD20エピトープの間に含まれている。さらに、他の前記CD20エピトープのいずれかがCD34で置きかわっているアーキテクチャも考えることができる。  （H）少なくとも2つのエピトープが細胞外リガンド結合ドメインの先端に挿入されている、本発明の多鎖アーキテクチャの細胞外抗CLL1ドメイン。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（表１）CLL1多鎖CARのアルファポリペプチドコンポーネントの例示的配列
2018504144.tif 000003
【００２６】
（表２）CLL1多鎖CARのベータポリペプチドコンポーネントの例示的配列
2018504144.tif 000004
【００２７】
（表３）CLL1多鎖CARのガンマポリペプチドコンポーネントの例示的配列
2018504144.tif 000005
【００２８】
（表４）多サブユニットCARを形成するポリペプチドを連結するスキップペプチド
2018504144.tif 000006
【００２９】
（表５）例示的な抗CLL1 VH鎖およびVL鎖の可変領域ならびにそれらの各CDRの配列
2018504144.tif 000007
2018504144.tif 000008
2018504144.tif 000009
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【００３０】
（表６）抗CLL1多鎖CARを形成する例示的ポリペプチド
2018504144.tif 000011
2018504144.tif 000012
2018504144.tif 000013
【００３１】
本明細書において特に定義する場合を除き、使用される技術用語および科学用語はいずれも、遺伝子治療、生化学、遺伝学、および分子生物学の分野の当業者が一般に理解している意味と同じ意味を有する。
【００３２】
本発明の実施または試験では、本明細書に記載するものと類似する方法および材料と類似するまたは等価なすべての方法および材料を使用することができ、本明細書には適切な方法および材料を記載する。本明細書において言及する刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。矛盾が生じた場合は、定義を含めて本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は、例示にすぎず、別段の指定がある場合を除き、限定を意図していない。
【００３３】
本発明の実施では、別段の表示がある場合を除き、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の通常の技法が使用され、それらは当技術分野の技能の範囲内である。そのような技法については文献に完全な説明がある。例えばCurrent Protocols in Molecular Biology（Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA）; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition,（Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press）; Oligonucleotide Synthesis（M. J. Gait ed., 1984）; Mullisらの米国特許第第4,683,195号; Nucleic Acid Hybridization（B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984）; Transcription And Translation（B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984）; Culture Of Animal Cells（R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987）; Immobilized Cells And Enzymes（IRL Press, 1986）; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning（1984）;「Methods In ENZYMOLOGY」シリーズ（編集主幹:J. Abelsonおよび M. Simon, Academic Press, Inc., New York）、特にVol.154およびVol.155（Wu et al. eds.）ならびにVol.185,「Gene Expression Technology」（D. Goeddel, ed.）; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells（J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory）; Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology（Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987）; Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV（D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986）;およびManipulating the Mouse Embryo,（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986）を参照されたい。
【００３４】
本発明は以下に関する。
１）
細胞表面CLL1抗原に結合する少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメインを含む、第1膜貫通ポリペプチド、および
少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含む第2ポリペプチド
を少なくとも含む、CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）であって、
該多鎖キメラ抗原受容体のシグナル伝達ドメインが、細胞外リガンド結合ドメインを保持するポリペプチドとは別個のポリペプチド上に存在する、
CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）。
２）
シグナル伝達ドメイン含有ポリペプチドが膜貫通ポリペプチドである、態様1記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
３）
少なくとも1つの膜貫通ポリペプチドがFc受容体の一部を含む、態様1または態様2記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
４）
Fc受容体の一部が、（a）FcεRIアルファ鎖、（b）FcεRIベータ鎖、および（c）FcεRIガンマ鎖からなる群より選択される、態様3記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
５）
高アフィニティーIgE受容体（FcεRI）のアルファ鎖からの膜貫通ポリペプチドが、細胞外CLL1リガンド結合ドメインに融合されている、態様3または4記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
６）
シグナル伝達ドメインに融合されたFcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖からの第2膜貫通ポリペプチド
をさらに含む、態様3〜5のいずれか一つに記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）。
７）
共刺激ドメインを含むFcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖からの第3膜貫通ポリペプチド
をさらに含む、態様3〜6のいずれか一つに記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）。
８）
FcεRIのアルファ鎖に融合されたCLL1リガンド結合ドメインが、CLL1に対する特異性を付与する重（VH）鎖および軽（VL）鎖を含む一本鎖可変フラグメント（scFv）である、態様1〜7のいずれか一つに記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
９）
VHが、SEQ ID NO：13、14、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、および35から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも90％の同一性を呈するポリペプチド配列を含む、態様8記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
１０）
VLが、SEQ ID NO：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、および36から選択されるポリペプチドに対して少なくとも90％の同一性を呈するポリペプチドを含む、態様8記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
１１）
FcεRIのアルファ鎖が、CD8α、IgG1、またはFcRIIIαタンパク質からのヒンジによって細胞外リガンド結合ドメインに融合されている、態様4〜10のいずれか一つに記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
１２）
ヒンジが、SEQ ID NO：2に対して少なくとも90％の同一性を呈するポリペプチド配列を含む、態様11記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
１３）
FcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖に融合されたシグナル伝達ドメインが、TCRゼータ鎖、FCεRβ鎖、FcεRIγ鎖に由来するか、または免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含む、態様3〜12のいずれか一つに記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
１４）
シグナル伝達ドメインがCD3ゼータに由来する、態様13記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
１５）
シグナル伝達ドメインが、SEQ ID NO：10に対して少なくとも90％の同一性を呈するポリペプチド配列を含む、態様14記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
１６）
第2または第3ポリペプチドが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、CD8、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンド、およびそれらの任意の組み合わせから選択される共刺激分子の細胞質ドメインからの共刺激ドメインを含む、態様1〜15のいずれか一つに記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
１７）
共刺激ドメインが4-1BBに由来し、SEQ ID NO：6に対して少なくとも90％の同一性を呈するポリペプチド配列を含む、態様16記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
１８）
共刺激ドメインがCD28に由来し、SEQ ID NO：7に対して少なくとも90％の同一性を呈するポリペプチド配列を含む、態様16記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
１９）
少なくとも1つのエピトープが、CARの細胞外ドメインのうちの少なくとも1つに挿入されている、態様1〜18のいずれか一つに記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
２０）
少なくとも1つのエピトープが、CARの1つの細胞外リガンド結合ドメインに挿入されている、態様19記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
２１）
少なくとも1つのエピトープが、CLL1に結合するCARの細胞外ドメインに挿入されている、態様20記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
２２）
細胞外結合ドメインが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のmAb特異的エピトープを含む、態様19〜21のいずれか一つに記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
２３）
細胞外結合ドメインが、1、2、3、または4個のmAb特異的エピトープを含む、態様22記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
２４）
細胞外結合ドメインが、2、3、または4個のmAb特異的エピトープを含む、態様23記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
２５）
細胞外結合ドメインが、以下の配列:
V1-L1-V2-（L）x-エピトープ1-（L）x-、
V1-L1-V2-（L）x-エピトープ1-（L）x-エピトープ2-（L）x-、
V1-L1-V2-（L）x-エピトープ1-（L）x-エピトープ2-（L）x-エピトープ3-（L）x-、
（L）x-エピトープ1-（L）x--V1-L1-V2、
（L）x-エピトープ1-（L）x-エピトープ2-（L）x-V1-L1-V2、
エピトープ1-（L）x-エピトープ2-（L）x-エピトープ3-（L）x-V1-L1-V2、
（L）x-エピトープ1-（L）x-V1-L1-V2-（L）x-エピトープ2-（L）x、
（L）x-エピトープ1-（L）x-V1-L1-V2-（L）x-エピトープ2-（L）x-エピトープ3-（L）x-、
（L）x-エピトープ1-（L）x-V1-L1-V2-（L）x-エピトープ2-（L）x-エピトープ3-（L）x-エピトープ4-（L）x-、
（L）x-エピトープ1-（L）x-エピトープ2-（L）x-V1-L1-V2-（L）x-エピトープ3-（L）x-、
（L）x-エピトープ1-（L）x-エピトープ2-（L）x-V1-L1-V2-（L）x-エピトープ3-（L）x-エピトープ4-（L）x-、
V1-（L）x-エピトープ1-（L）x-V2、
V1-（L）x-エピトープ1-（L）x-V2-（L）x-エピトープ2-（L）x、
V1-（L）x-エピトープ1-（L）x-V2-（L）x-エピトープ2-（L）x-エピトープ3-（L）x、
V1-（L）x-エピトープ1-（L）x-V2-（L）x-エピトープ2-（L）x-エピトープ3-（L）x-エピトープ4-（L）x、
（L）x-エピトープ1-（L）x-V1-（L）x-エピトープ2-（L）x-V2;または
（L）x-エピトープ1-（L）x-V1-（L）x-エピトープ2-（L）x-V2-（L）x-エピトープ3-（L）x
のうちの1つを含み、
V1はVLでありかつV2はVHであるか、またはV1はVHでありかつV2はVLであり、
L1は、VH鎖をVL鎖に連結するのに適したリンカーであり、
Lは、グリシン残基およびセリン残基を含むリンカーであり、細胞外結合ドメインにおけるLの各存在は、同じ細胞外結合ドメインにおけるLの他の存在と同一であってもよくまたは相違してもよく、
xは0または1であり、xの各存在は他のものとは独立して選択され、
エピトープ1、エピトープ2、およびエピトープ3はmAb特異的エピトープであり、同一であってもよくまたは相違してもよい、
態様23記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
２６）
細胞外結合ドメインが、以下の配列:
V1-L1-V2-L-エピトープ1; V1-L1-V2-L-エピトープ1-L; V1-L1-V2-L-エピトープ1-L-エピトープ2; V1-L1-V2-L-エピトープ1-L-エピトープ2-L; V1-L1-V2-L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3; V1-L1-V2-L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-L; V1-L1-V2-エピトープ1; V1-L1-V2-エピトープ1-L; V1-L1-V2-エピトープ1-L-エピトープ2; V1-L1-V2-エピトープ1-L-エピトープ2-L; V1-L1-V2-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3; V1-L1-V2-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-L; エピトープ1-V1-L1-V2; エピトープ1-L-V1-L1-V2; L-エピトープ1-V1-L1-V2; L-エピトープ1-L-V1-L1-V2; エピトープ1-L-エピトープ2-V1-L1-V2; エピトープ1-L-エピトープ2-L-V1-L1-V2; L-エピトープ1-L-エピトープ2-V1-L1-V2; L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-V1-L1-V2; エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-V1-L1-V2; エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-L-V1-L1-V2; L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-V1-L1-V2; L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-L-V1-L1-V2; V1-L-エピトープ1-L-V2; L-エピトープ1-L-V1-L-エピトープ2-L-V2; V1-L-エピトープ1-L-V2-L-エピトープ2-L; V1-L-エピトープ1-L-V2-L-エピトープ2-L-エピトープ3; V1-L-エピトープ1-L-V2-L-エピトープ2-エピトープ3; V1-L-エピトープ1-L-V2-L-エピトープ2-L-エピトープ3-エピトープ4; L-エピトープ1-L-V1-L-エピトープ2-L-V2-L-エピトープ3-L; エピトープ1-L-V1-L-エピトープ2-L-V2-L-エピトープ3-L; L-エピトープ1-L-V1-L-エピトープ2-L-V2- L-エピトープ3; L-エピトープ1-L-V1-L1-V2-L-エピトープ2-L; L-エピトープ1-L-V1-L1-V2-L-エピトープ2-L-エピトープ3; L-エピトープ1-L-V1-L1-V2-L-エピトープ2-エピトープ3、またはエピトープ1-L-V1-L1-V2-L-エピトープ2-L-エピトープ3-エピトープ4
を含み、
V1はVLでありかつV2はVHであるか、またはV1はVHでありかつV2はVLであり、
L1は、VH鎖をVL鎖に連結するのに適した任意のリンカーであり、
Lは、グリシン残基およびセリン残基を含むリンカーであり、細胞外結合ドメインにおけるLの各存在は、同じ細胞外結合ドメインにおけるLの他の存在と同一であってもよくまたは相違してもよく、
エピトープ1、エピトープ2、およびエピトープ3はmAb特異的エピトープであり、同一であってもよくまたは相違してもよい、
態様22記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
２７）
L1がグリシンおよび/またはセリンを含むリンカーである、態様25または26記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
２８）
L1が、アミノ酸配列（Gly-Gly-Gly-Ser）nまたは（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）nを含むリンカーであり、ここで、nは1、2、3、4、または5である、態様27記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
２９）
L1が、アミノ酸配列（Gly4Ser）4または（Gly4Ser）3を含むリンカーである、態様27記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
３０）
Lが、
2018504144.tif 000014
から選択されるアミノ酸配列を有するリンカーである、態様27記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
３１）
Lが、SGGGG、GGGGS、またはSGGGGSである、態様30記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
３２）
mAb特異的エピトープが、イブリツモマブ、チウキセタン、ムロモナブ-CD3、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、QBEND-10、アレムツズマブ、またはウステキヌマブによって特異的に認識される、態様22記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
３３）
mAb特異的エピトープが、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、およびSEQ ID NO：116から選択されるアミノ酸配列を含むものである、態様22記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
３４）
エピトープ1が、SEQ ID NO：109のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープである、態様25または26記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
３５）
エピトープ2が、SEQ ID NO：109のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープである、態様25または26記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
３６）
エピトープ3が、SEQ ID NO：109またはSEQ ID NO：117またはSEQ ID NO：118のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープである、態様25または26記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
３７）
エピトープ4が、SEQ ID NO：109のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープである、態様25または26記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
３８）
表6に示す抗CLL1 SC02-357、抗CLL1 SC02-378、抗CLL1 SC02-161、抗CLL1 M26、抗CLL1 M31、抗CLL1 G4、抗CLL1 M22、抗CLL1 M29、抗CLL1 M2、抗CLL1 M5、抗CLL1 G12、抗CLL1 21.26、および抗CLL1 1075.7の全長アミノ酸配列に対して少なくとも80％の同一性を呈するポリペプチド配列を含む、態様1〜37のいずれか一つに記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体。
３９）
態様1〜38のいずれか一つに記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
４０）
態様39記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
４１）
態様1〜38のいずれか一つに記載の抗CLL1 mcCARを細胞表面膜に発現する、操作された免疫細胞。
４２）
炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球から誘導される、態様41記載の操作された免疫細胞。
４３）
治療において使用するための、態様41または42のいずれか一つに記載の操作された細胞。
４４）
患者がヒトである、治療において使用するための態様412〜43のいずれか一つに記載の操作された細胞。
４５）
状態が、CLL1発現細胞を特徴とする前悪性または悪性がん状態である、態様41〜44のいずれか一つに記載の操作された細胞。
４６）
状態が、CLL1発現細胞の過剰を特徴とする状態である、治療において使用するための態様41〜45のいずれか一つに記載の操作された細胞。
４７）
状態が血液がん状態である、治療において使用するための態様41〜46のいずれか一つに記載の操作された細胞。
４８）
血液がん状態が白血病である、治療において使用するための態様41〜47のいずれか一つに記載の操作された細胞。
４９）
白血病が急性骨髄性白血病（AML）である、治療において使用するための態様41〜48のいずれか一つに記載の操作された細胞。
５０）
前記免疫細胞においてTCRの発現が抑制されている、態様41〜49のいずれか一つに記載の操作された細胞。
５１）
前記免疫細胞において少なくとも1つのMHCタンパク質、好ましくはβ2mまたはHLAの発現が抑制されている、態様41〜50のいずれか一つに記載の操作された細胞。
５２）
少なくとも1つの免疫抑制薬または化学療法薬に対する耐性を付与するために変異が導入されている、態様41〜51のいずれか一つに記載の操作された細胞。
５３）
血液がん細胞の損傷を引き起こすのに有効な量の態様41〜52のいずれか一つに記載の操作された細胞と、血液がん細胞を接触させる工程を含む、血液がん細胞を損傷させる方法。
５４）
（a）免疫細胞を用意する工程、
（b）態様1〜38のいずれか一つに記載の少なくとも1つの多鎖キメラ抗原受容体を該細胞の表面に発現させる工程
を含む、免疫細胞を操作する方法。
５５）
（a）免疫細胞を用意する工程、
（b）態様1〜38のいずれか一つに記載の少なくとも1つの多鎖キメラ抗原受容体を構成するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを、該細胞に導入する工程、
（c）該ポリヌクレオチドを該細胞中に発現させる工程
を含む、態様54記載の免疫細胞を操作する方法。
５６）
（a）免疫細胞を用意する工程、
（b）異なる細胞外リガンド結合ドメインをそれぞれが含む態様1〜38のいずれか一つに記載の多鎖キメラ抗原受容体の集団を、該細胞の表面に発現させる工程
を含む、態様36記載の免疫細胞を操作する方法。
５７）
（a）免疫細胞を用意する工程、
（b）異なる細胞外リガンド結合ドメインをそれぞれが含む態様1〜38のいずれか一つに記載の多鎖キメラ抗原受容体の集団を構成するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを、該細胞に導入する工程、
（c）該ポリヌクレオチドを該細胞中に発現させる工程
を含む、態様56記載の免疫細胞を操作する方法。
５８）
態様54〜57のいずれか一つに記載の方法から得ることができる、単離された免疫細胞。
５９）
態様1〜38のいずれか一つに記載の少なくとも1つの多鎖キメラ抗原受容体を含む、単離された免疫細胞。
６０）
医薬として使用するための、態様58または59記載の単離された免疫細胞。
６１）
NK細胞、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球から誘導される、態様58〜60のいずれか一つに記載の単離された細胞。
６２）
態様58〜61のいずれか一つに記載の単離された免疫細胞を含む、治療組成物。
６３）
必要としている患者を処置するための方法であって、
a）態様54〜57のいずれか一つに記載の方法によって得ることができる免疫細胞を用意する工程、
b）該T細胞を該患者に投与する工程
を含む、方法。
６４）
該免疫細胞がドナーから採取される、態様63記載の患者を処置するための方法。
該免疫細胞が患者から採取される、態様63記載の患者を処置するための方法。
【００３５】
予備定義
本明細書において使用する用語「細胞外リガンド結合ドメイン」は、リガンドに結合する能力を有するオリゴペプチドまたはポリペプチドと定義される。好ましくは、本ドメインは、細胞表面分子と相互作用する能力を有するであろう。より好ましくは、該ドメインはCLL1細胞表面分子と相互作用する能力を有するであろう。
【００３６】
用語「から誘導される」は、Fcε受容体の配列の1つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、Fcε受容体のアミノ酸配列と等価なアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。そのようなアミノ酸修飾は、アミノ酸の置換、欠失、付加、またはそれらの修飾のいずれかの組み合わせを含むことができ、Fc結合領域の生物学的活性をFc受容体と比較して改変しうる。他方、特定のFc受容体から誘導されるFc結合領域は、Fc受容体と比較してFc結合領域の生物学的活性を実質的に改変しない1つまたは複数のアミノ酸修飾を含みうる。この種のアミノ酸修飾は、典型的には、保存的アミノ酸置換を含むであろう。
【００３７】
「同一性」という用語は、2つの核酸分子間または2つのポリペプチド間の配列同一性を指す。同一性は、比較のために整列されうる各配列中の位置を比較することによって、決定することができる。比較した配列中のある位置が同じ塩基で占められている場合、それらの分子はその位置において同一である。核酸配列間またはアミノ酸配列間の類似性および同一性の程度は、それらの核酸配列が共有する位置における同一ヌクレオチドまたは合致ヌクレオチドの数の関数である。2つの配列間の同一性を算出するには、GCG配列解析パッケージ（ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン）の一部として利用することができるFASTAまたはBLASTを含むさまざまな整列アルゴリズムおよび/またはプログラムを使用することができ、それらは例えばデフォルト設定で使用することができる。例えば、本明細書に記載する具体的ポリペプチドに対して少なくとも70％、85％、90％、95％、98％または99％の同一性を有し、好ましくは実質的に同じ機能を呈するポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが考えられる。別段の表示がある場合を除き、類似性スコアはBLOSUM62の使用に基づくであろう。BLASTPを使用する場合、パーセント類似性はBLASTPポジティブスコア（positive score）に基づき、パーセント配列同一性はBLASTPアイデンティティスコア（identities score）に基づく。BLASTP「アイデンティティ（Identities）」は、高スコア配列ペア（high scoring sequence pair）中の同一である全残基の数および分率を示し、BLASTP「ポジティブ（Positives）」は、アラインメントスコアが正の値を有し互いに類似している残基の数および分率を示す。本明細書に開示するアミノ酸配列に対して、これらの同一度または類似度を有するか任意の中間的同一度または類似度を有するアミノ酸配列が考えられ、それらはこの開示に包含される。類似するポリペプチドのポリヌクレオチド配列は遺伝暗号を使って推定され、通常の手段によって、特に、遺伝暗号を使ってそのアミノ酸配列を逆翻訳することによって、得ることができる。
【００３８】
本発明の抗CLL1多鎖CAR
本発明は、免疫療法において使用される免疫細胞にとりわけ適した、多鎖キメラ抗原受容体（CAR）に関する。
【００３９】
特に本発明は、
少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメインを含み、該少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメインが細胞表面CLL1抗原に結合する、第1膜貫通ポリペプチド;および
少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含む第2ポリペプチド
を含むCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）であって、多鎖キメラ抗原受容体のシグナル伝達ドメインが、細胞外リガンド結合ドメインを保持するポリペプチドとは別個のポリペプチド上に存在する、CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）を提供する。
【００４０】
「細胞外リガンド結合ドメインを保持するポリペプチドとは別個のポリペプチド」とは、それら2つのポリペプチド間にペプチド結合がないことを意味する。
【００４１】
本発明は、図2、図3、または図4に図解する構造を有する、請求項1、2および/または3に記載の抗CLL1多鎖キメラ抗原受容体（CAR）（CLL1 mcCAR 抗CLL1 mc）を提供し、該構造は、モノクローナル抗CLL1抗体からの細胞外リガンド結合ドメインVHおよびVLまたはCDR配列を含む。
【００４２】
好ましい一態様において、少なくとも1つのシグナル伝達ドメイン含有ポリペプチドを含む該第2ポリペプチドは、膜貫通ポリペプチドである。
【００４３】
別の好ましい一態様において、該少なくとも1つの膜貫通ポリペプチドは、Fc受容体の一部を含む。より好ましくは、該Fc受容体の一部は、（a）FcεRIアルファ鎖、（b）FcεRIベータ鎖、および（c）FcεRIガンマ鎖からなる群より選択される。
【００４４】
ある態様によれば、該第1膜貫通ポリペプチドは、高アフィニティーIgE受容体（FcεRI）のアルファ鎖に由来し、それが、細胞外CLL1リガンド結合ドメインに融合されている。
【００４５】
ある態様によれば、本発明は、
シグナル伝達ドメインに融合された、FcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖からの該第2膜貫通ポリペプチド
をさらに含む、上記CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）を提供する。
【００４６】
別の一態様によれば、本発明は、
共刺激ドメインを含む、FcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖からの第3膜貫通ポリペプチド
をさらに含む、上記CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）を提供する。
【００４７】
本発明は、好ましくは、
CLL1に対する特異性を付与する重（VH）鎖および軽（VL）鎖を含む一本鎖可変フラグメント（scFv）を含むCLL1に特異的に結合する細胞外リガンド結合ドメインに融合された、高アフィニティーIgE受容体（FcεRI）のアルファ鎖からの第1膜貫通ポリペプチド、
シグナル伝達ドメインに融合された、FcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖からの第2膜貫通ポリペプチド;および
共刺激ドメインを含む、FcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖からの第3膜貫通ポリペプチド
を含む、CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）を提供する。
【００４８】
より好ましい一態様において、該抗CLL1 CARは、これらの配列を使って構築され、図4に図解する構築物に対応する。
【００４９】
より具体的な態様において、該多鎖CARは、FcεRIアルファ鎖の一部およびFcεRIベータ鎖の一部またはそれらの変異体を含んで、該FcεRI鎖が互いに自発的に二量体化して二量体型キメラ抗原受容体を形成するようになっていてもよい。別の一態様において、多鎖キメラ抗原は、FcεRIアルファ鎖の一部およびFcεRIガンマ鎖の一部またはそれらの変異体を含んで、該FcεRI鎖が互いに自発的に三量体化して三量体型キメラ抗原受容体を形成するようになっていてもよく、また別の一態様において、多鎖キメラ抗原受容体は、FcεRIアルファ鎖の一部、FcεRIベータ鎖の一部、およびFcεRIガンマ鎖の一部、またはそれらの変異体を含んで、該FcεRI鎖が互いに自発的に四量体化して四量体型キメラ抗原受容体を形成するようになっていてもよい。
【００５０】
非限定的な例として、多鎖CARのさまざまなバージョン（アーキテクチャ）を図3に図解する。好ましい一態様において、多鎖CARの2つのバージョン（アーキテクチャ）を図4に図解する。より好ましい一態様において、本発明の多鎖CARは、表6に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。別の好ましい一態様において、多鎖CARは、前述のアミノ酸配列に対して、または多鎖ポリペプチド構造を構成する前記ポリペプチドのうちの1つ、2つ、または3つをコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を持つポリペプチドを含む。
【００５１】
本発明は、表6において言及する抗CLL1 SC02-357、SC02-378、SC02-161、M26、M31、G4、M22、M29、M2、M5、G12、21.26、および1075.7の全アミノ酸配列に対して少なくとも80％の同一性を呈するポリペプチド配列を含む、上記CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドを提供する。
【００５２】
細胞外結合ドメイン、ヒンジ、および膜貫通ドメイン
適当な膜貫通ポリペプチドの際立った特徴には、免疫細胞、特にリンパ球細胞またはナチュラルキラー（NK）細胞の表面に発現されうること、および免疫細胞の細胞応答を予め定められた標的細胞に向かわせるために互いに相互作用できることが含まれる。細胞外リガンド結合ドメインおよび/またはシグナル伝達ドメインを含む本発明の多鎖CARの異なる膜貫通ポリペプチドは、互いに相互作用することで、標的リガンドとの結合に続くシグナル伝達に関与し、免疫応答を誘発する。膜貫通ドメインは天然供給源または合成供給源のいずれか一方から誘導することができる。膜貫通ドメインは任意の膜結合型タンパク質または任意の膜貫通型タンパク質から誘導することができる。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、α、β、γまたは？などのT細胞受容体サブユニット、CD3複合体を構成するポリペプチド、IL2受容体p55（α鎖）、p75（β鎖）またはγ鎖、Fc受容体、特にFcγ受容体IIIのサブユニット鎖、またはCDタンパク質であってもよい。あるいは、膜貫通ドメインは合成物であってよく、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含むことができる。
【００５３】
本発明は、FcεRIのアルファ鎖に融合されたCLL1リガンド結合ドメインが、CLL1に対する特異性を付与する重（VH）鎖および軽（VL）鎖を含む一本鎖可変フラグメント（scFv）である、上記のいずれか一つによるCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００５４】
好ましい一態様において、細胞外リガンド結合ドメインは、柔軟なリンカーによって接合された、CLL1に対して特異的な標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖（VL）および重鎖（VH）可変フラグメントを含む、一本鎖抗体フラグメント（scFv）である。好ましい一態様において、該scFvは、抗CLL1 scFV、好ましくは表5にSEQ ID NO：13〜36として掲載するものである。リンパ球の予め定められたターゲティングには、scFv以外の、CLL1に対して特異的な結合ドメイン、例えば非限定的な例として、ラクダ類またはサメ類（VNAR）の単一ドメイン抗体フラグメント、または血管内皮成長因子ポリペプチドのような受容体リガンド、インテグリン結合ペプチド、ヘレグリンまたはIL-13ムテイン、抗体結合ドメイン、抗体超可変ループ、またはCDRなども使用することができる。
【００５５】
本発明は、VHが、SEQ ID NO：13、14、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、および35から選択されるポリペプチド配列の一つに対して少なくとも80％〜少なくとも90％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、上記CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００５６】
本発明は、VLが、SEQ ID NO：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、および36から選択されるポリペプチド配列の一つに対して少なくとも80％〜少なくとも90％の同一性を有するポリペプチドを含む、上記CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００５７】
より好ましい一態様において、本発明は、細胞外リガンド結合ドメインが、以下のCDR配列:
2018504144.tif 000015
のうちの少なくとも1つを含有するモノクローナル抗CLL1抗体からのVHを含み、かつ以下のCDR配列:
2018504144.tif 000016
のうちの少なくとも1つを含有するモノクローナル抗CLL1抗体からのVLを含む、CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mcAR）を提供する。
【００５８】
本発明は、FcεRIのアルファ鎖が、CD8a、IgG1またはFcRIIIαタンパク質からのヒンジによって細胞外リガンド結合ドメインに融合されている、上記CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００５９】
本発明は、ヒンジが、SEQ ID NO：2に対して少なくとも90％の同一性を呈するポリペプチド配列を含む、上記CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を提供する。好ましい一態様において、ヒンジはSEQ ID NO：2のポリペプチドを含む。
【００６０】
好ましい一態様において、第1膜貫通ポリペプチドは細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にストーク（stalk）領域をさらに含む。本明細書において使用する用語「ストーク領域」は、一般に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結する機能を果たす任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。特に、ストーク領域は、細胞外リガンド結合ドメインの柔軟性および接近可能性を高めるために使用される。ストーク領域は、最大300アミノ酸、好ましくは10〜100アミノ酸、最も好ましくは25〜50アミノ酸を含みうる。ストーク領域は、天然分子の全部または一部から、例えばCD8、CD4またはCD28の細胞外領域の全部または一部から、または抗体定常領域の全部または一部から、誘導することができる。あるいは、ストーク領域は、天然のストーク配列に対応する合成配列であってもよく、または全くの合成ストーク配列であってもよい。好ましい一態様において、ストーク領域は、ヒトCD8アルファ鎖（例えばNP_001139345.1）（SEQ ID NO:2）の一部である。したがって、免疫細胞における多鎖CARの発現は、所定の標的、例えば限定するわけではないが、それぞれの腫瘍関連表面抗原を保持する悪性細胞、またはウイルス特異的表面抗原を保持するウイルス感染細胞、または系譜特異的もしくは組織特異的表面抗原を保持する標的細胞などを選択的に排除する修飾された細胞をもたらす。
【００６１】
本発明は、FcεRIのアルファ鎖が、CD8α、IgG1またはFcRIIIαタンパク質からのヒンジによって細胞外リガンド結合ドメインに融合されている、上記CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００６２】
本発明は、ヒンジが、SEQ ID NO：2に対して少なくとも90％の同一性を呈するポリペプチド配列を含む、上記CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００６３】
がん細胞には、抗原喪失エスケープ変異体を作り出す標的抗原のダウンレギュレーションまたは突然変異が、よく観察される。そこで、腫瘍エスケープを相殺し、標的に対する免疫細胞の特異性を高めるために、多鎖CARは、標的中の異なる要素に同時に結合し、それによって免疫細胞の活性化および機能を増強するように、数種類の細胞外リガンド結合ドメインを含むことができる。一態様では、それらの細胞外リガンド結合ドメインを同じ膜貫通ポリペプチド上に直列に置くことができ、任意で、それらの細胞外リガンド結合ドメインをリンカーによって分離することができる。
【００６４】
別の一態様では、異なる細胞外リガンド結合ドメインを、多鎖CARを構成する異なる膜貫通ポリペプチド上に置くことができる。
【００６５】
別の一態様において、本発明は、それぞれが1つの異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む、多鎖CARの集団に関する。特定の一態様において、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を用意する工程、および該細胞の表面に、異なる細胞外リガンド結合ドメインをそれぞれが含む多鎖CARの集団を発現させる工程を含む方法に関する。別の一特定態様において、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を用意する工程、および該細胞中に異なる細胞外リガンド結合ドメインをそれぞれが含む多鎖CARの集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する工程を含む方法に関する。特定の一態様において、免疫細胞を操作する方法は、細胞の表面に、シグナル伝達ドメインに融合されたFcεRIベータ鎖および/またはガンマ鎖の少なくとも一部、ならびに異なる細胞外リガンド結合ドメインに融合された数個のFcεRIアルファ鎖部分を発現させる工程を含む。より具体的な一態様において、該方法は、該細胞中に、シグナル伝達ドメインに融合されたFcεRIベータ鎖および/またはガンマ鎖の一部ならびに異なる細胞外リガンド結合ドメインに融合された数個のFcεRIアルファ鎖をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを導入する工程を含む。多鎖CARの集団とは、異なる細胞外リガンド結合ドメインをそれぞれが含む、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つまたはそれ以上の多鎖CARを意味する。本発明の異なる細胞外リガンド結合ドメインは、好ましくは、標的療法において異なる要素に同時に結合することができ、それによって免疫細胞の活性化および機能を増強する。
【００６６】
伝達シグナリングドメイン
本発明の多鎖CARのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、標的への細胞外リガンド結合ドメインの結合に続く細胞内シグナリングを担っており、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす。言い換えると、シグナル伝達ドメインは、多鎖CARを発現する免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも1つの活性化を担っている。例えばT細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞傷害活性またはヘルパー活性であることができる。したがって、用語「シグナル伝達ドメイン」は、タンパク質のうち、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、細胞に専門機能を行うように指示する部分を指す。
【００６７】
本発明は、FcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖に融合されたシグナル伝達ドメインがTCRゼータ鎖、FCεRβ鎖、FcεRIγ鎖に由来するか、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含む、上記態様のいずれか一つに記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を提供し、シグナル伝達ドメインは好ましくはCD3ゼータ（より好ましくはSEQ ID NO：10のポリペプチド配列を含むもの）に由来する。
【００６８】
本発明は、FcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖に融合されたシグナル伝達ドメインが、TCRゼータ鎖、FCεRβ鎖、FcεRIγ鎖に由来するか、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含む、上記態様のいずれか一つに記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００６９】
本発明は、FcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖に融合されたシグナル伝達ドメインがTCRゼータ鎖に由来する、上記態様のいずれか一つに記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００７０】
本発明は、FcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖に融合されたシグナル伝達ドメインがFCεRβ鎖に由来する、上記態様のいずれか一つに記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００７１】
本発明は、FcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖に融合されたシグナル伝達ドメインがFcεRIγ鎖に由来する、上記態様のいずれか一つに記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００７２】
本発明は、FcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖に融合されたシグナル伝達ドメインが免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含む、上記態様のいずれか一つに記載のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００７３】
本発明は、シグナル伝達ドメインがCD3ゼータに由来する、上記CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を提供し、好ましくは本発明は、シグナル伝達ドメインが、SEQ ID NO：10に対して少なくとも90％の同一性を呈するポリペプチド配列を含む、上記CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を提供する。一態様において、シグナル伝達ドメインはSEQ ID NO：10のポリペプチド配列を含む。
【００７４】
多鎖CARにおいて使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例として、抗原受容体会合に続いてシグナル伝達を開始するように協奏的に作用するFc受容体またはT細胞受容体および補助受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変異体、および同じ機能的能力を有する合成配列を挙げることができる。シグナル伝達ドメインは、抗原依存的一次活性化を開始するものと、抗原非依存的に作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルを与えるものという、2種類の異なる細胞質シグナリング配列を含む。一次細胞質シグナリング配列は、免疫受容体チロシン活性化モチーフ、すなわちITAMとして知られているシグナリングモチーフを含むことができる。ITAMは、さまざまな受容体の細胞質内テール中に見いだされる明確に定義されたシグナリングモチーフであり、syk/zap70クラスのチロシンキナーゼの結合部位として役立つ。本発明において使用されるITAMの例には、非限定的な例として、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、FcRイプシロン、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dから誘導されるものを含めることができる。好ましい一態様において、多鎖CARのシグナリング伝達ドメインは、CD3ゼータシグナリングドメイン、またはFcεRIベータ鎖またはガンマ鎖の細胞質内ドメインを含むことができる。
【００７５】
本発明は、FcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖に融合されたシグナル伝達ドメインが、TCRゼータ鎖、FCεRβ鎖、FcεRIγ鎖に由来するか、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含む、上記のいずれか一つによるCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００７６】
本発明は、シグナル伝達ドメインがCD3ゼータに由来する、上記CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００７７】
本発明は、シグナル伝達ドメインが、SEQ ID NO：10に対して少なくとも90％の同一性を呈するポリペプチド配列を含む、上記CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００７８】
別の一特定態様において、シグナル伝達ドメインはTNFR関連因子2（TRAF2）結合モチーフ、共刺激TNFRメンバーファミリーの細胞質内テールである。共刺激TNFRファミリーメンバーの細胞質テールは、メジャー保存モチーフ（P/S/A）X（Q/E）E）またはマイナーモチーフ（PXQXXD）からなるTRAF2結合モチーフを含有し、ここで、Xは任意のアミノ酸である。TRAFタンパク質は、受容体三量体化に応答して、多くのTNFRの細胞内テールに動員される。
【００７９】
好ましい一態様において、本発明の多鎖CARのシグナル伝達ドメインは、4-1BB（GenBank:AAA53133.）およびCD28（NP_006130.1）からなる群より選択される共刺激シグナル分子の一部を含む。
【００８０】
共刺激ドメイン
特定の態様において、本発明の多鎖CARのシグナル伝達ドメインは共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子とは、有効な免疫応答に必要とされる抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。
【００８１】
「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって細胞による共刺激応答、例えば限定するわけではないが増殖などを媒介する、T細胞上のコグネイト結合パートナーをいう。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLAまたはTollリガンド受容体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００８２】
本発明は、第2または第3ポリペプチドが、CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（ICOS-L）、細胞間接着分子（ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンフォトキシンベータ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、Tollリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3と特異的に結合するリガンドから選択される共刺激分子の細胞質ドメインからの共刺激ドメインを含む、上記態様のいずれかであるCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体に関する。共刺激リガンドには、なかんずく、T細胞上の共刺激分子、例えば限定するわけではないがCD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンドと特異的に結合する抗体も包含される。
【００８３】
好ましい一態様において、本発明は、第2または第3ポリペプチドが、CD28からの共刺激分子の細胞質ドメインからの共刺激ドメインを含む、上記態様のいずれかであるCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体に関する。
【００８４】
好ましい一態様において、本発明は、第2または第3ポリペプチドが、4-1BBからの共刺激分子の細胞質ドメインからの共刺激ドメインを含む、上記態様のいずれかであるCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体に関する。
【００８５】
本発明は、共刺激ドメインが4-1BBに由来し、SEQ ID NO：6に対して少なくとも90％の同一性を呈するペプチド配列を含む、CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を提供する。一態様において、共刺激ドメインは4-1BBに由来し、SEQ ID NO：6のポリペプチド配列を含む。
【００８６】
本発明は、共刺激ドメインがCD28に由来し、SEQ ID NO：7に対して少なくとも90％の同一性を呈するポリペプチド配列を含む、上記CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を提供する。
【００８７】
例示的CLL1多鎖CAR
一態様において、本発明は、
細胞外CLL1リガンド結合ドメインに融合された高アフィニティーIgE受容体（FcεRI）のアルファ鎖からの膜貫通ポリペプチド、
シグナル伝達ドメインに融合されたFcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖からの第2膜貫通ポリペプチド、および
共刺激ドメインを含むFcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖からの第3膜貫通ポリペプチド
を含み、
細胞外リガンド結合ドメインが、以下のCDR配列:
2018504144.tif 000017
のうちの少なくとも1つを含有するモノクローナル抗CLL1抗体からのVHを含み、かつ以下のCDR配列:
2018504144.tif 000018
のうちの少なくとも1つを含有するモノクローナル抗CLL1抗体からのVLを含む、
CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）を提供する。
【００８８】
一態様において、本発明は、
細胞外CLL1リガンド結合ドメインに融合された高アフィニティーIgE受容体（FcεRI）のアルファ鎖からの第1膜貫通ポリペプチド、
シグナル伝達ドメインに融合されたFcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖からの第2膜貫通ポリペプチド、および
共刺激ドメインを含むFcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖からの第3膜貫通ポリペプチド
を含み、
細胞外リガンド結合ドメインは、以下のCDR配列:
2018504144.tif 000019
のうちの少なくとも1つを含有するモノクローナル抗CLL1抗体からのVH、および以下のCDR配列:
2018504144.tif 000020
のうちの少なくとも1つを含有するモノクローナル抗CLL1抗体からのVL、およびVHとVLの間のヒンジを含み（アルファ鎖）、
シグナル伝達ドメイン（または細胞質膜貫通ドメイン）はCD3ゼータシグナリングドメインを含み（ガンマ鎖）、かつ
共刺激ドメインは、4-1BBまたはCD28からの共刺激膜貫通ドメインを含む（ベータ鎖）、
CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（CLL1 mc CAR）を提供する。
【００８９】
本発明は、以下のとおり表6に従ってペプチド配列を含み、ポリペプチド配列が、以下のペプチド配列:
2018504144.tif 000021
2018504144.tif 000022
2018504144.tif 000023
2018504144.tif 000024
に対して少なくとも80％の同一性を有する、上記の態様のいずれかであるCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（CLL1 mc CAR）を提供する。
【００９０】
好ましい一態様において、本発明は、ポリペプチド配列が前記ペプチド配列に対して少なくとも90％の同一性を有する、CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（CLL1 mc CAR）を提供する。
【００９１】
より好ましい一態様において、本発明は、ポリペプチド配列が前記ペプチド配列に対して少なくとも95％の同一性を有する、CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（CLL1 mc CAR）を提供する。
【００９２】
最も好ましい態様において、本発明は、ポリペプチド配列が前記ペプチド配列に対して少なくとも99％の同一性を有する、CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（CLL1 mc CAR）を提供する。
【００９３】
上記の態様のすべてにおいて、CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（CLL1 mc CAR）は、CLL1発現細胞に結合し、かつ/またはCLL1発現がん細胞の生存に影響を及ぼすというそれらの特性を、持続的にまたは一時的に保つ。
【００９４】
抗CLL1多鎖CARの細胞外ドメインにおける少なくとも1つのエピトープの挿入
本発明の抗CLL1 mcCARは、少なくとも、該CARの1つの細胞外ドメインにおける、好ましくは図に図解するようにCLL1に結合する細胞外ドメインにおける、少なくとも1つのエピトープの挿入を含みうる。これは、CARを賦与された免疫細胞が後にインビボでサイトカインストームなどの有害作用を引き起こした場合に、それらを枯渇させることを目的としている。さらにまた、そのようなエピトープの挿入、すなわち「エピトープタギング」は、操作された免疫細胞を精製のためにインビトロで選別するのにも役立ちうる。例えばこれは、少なくとも1コピーの、好ましくは2コピーのCD20ミモトープ、好ましくは配列CPYSNPSLCS（SEQ ID NO：110）を持つものを、CARポリペプチド配列に挿入することなどによって得られる。前記少なくとも1つのCD20ミモトープのさまざまな位置を図5に図式化する。
【００９５】
以後、簡略化のために、scFvの順序は、N末端からC末端に向かって、VH鎖、そして次にVL鎖というように表す。しかし、この順序を逆にして、VL鎖、そして次にVL鎖とすることは、本発明の範囲内で想定することができる。
【００９６】
一態様では、少なくとも1つのエピトープが、抗CLL1.1 CARのVH鎖とVL鎖との間に挿入され、任意で、VH鎖およびVL鎖に、1つのリンカーによって連結される。
【００９７】
別の一態様では、少なくとも1つのエピトープが、CARのN末端に（したがってscFvの前方に）挿入され、任意で、VH鎖およびCARのN末端に、1つのリンカーによって連結される。
【００９８】
別の一態様では、少なくとも1つのエピトープが、CARのscFvとヒンジとの間に挿入され、任意で、VL鎖およびヒンジに、1つのリンカーによって連結される。
【００９９】
好ましい一態様では、少なくとも2つのエピトープが抗CLL1 CARの細胞外ドメインに挿入される。
【０１００】
ある態様によれば、2つのエピトープが、それらの間にVHが位置するような形で挿入され、これらのコンポーネントはすべて、任意で、少なくとも1つのリンカーが中間に介在する。
【０１０１】
別の一態様によれば、2つのエピトープが、それらの間にVLが位置するような形で挿入され、これらのコンポーネントはすべて、任意で、少なくとも1つのリンカーが中間に介在する。
【０１０２】
別の一態様によれば、2つのエピトープが、それらの間にVH鎖とVL鎖とが位置するような形で挿入され、これらのコンポーネントはすべて、任意で、少なくとも1つのリンカーが中間に介在する。
【０１０３】
別の一態様によれば、3つのエピトープが、それらの間にVH鎖とVL鎖とが位置するような形で挿入され、これらのコンポーネントはすべて、任意で、少なくとも1つのリンカーが中間に介在する。
【０１０４】
該リンカーは、SEQ ID NO：10のGSリンカーなどでありうる。
【０１０５】
該少なくとも1つのエピトープは、そのペプチドを認識する特異的抗体が結合するのに十分な免疫原性を持つ、任意の抗原ペプチドでありうる。
【０１０６】
好ましい一態様において、キメラscFv内に導入されるエピトープはCD20抗原（SEQ ID NO：110）であり、選別目的および/または枯渇目的でそれを標的とするために使用されている注入mAb（infused mAb）は、リツキシマブである。
【０１０７】
別の一態様によれば、エピトープはミモトープである。エピトープの構造を模倣する高分子（多くの場合、ペプチド）として、ミモトープは従来のエピトープより小さいという利点を有し、それゆえに非コンフォメーショナル配列にとって有益であり、CARなどの長いポリペプチド中に再現するのが容易でありうる。ミモトープは、セツキシマブ用の2つの10アミノ酸ペプチド（Riemer et al., 2005）またはパリビズマブ用の24aa（Arbiza et al, 1992）など、医薬として承認された数種類のmAbについて公知である。これらのミモトープはファージディスプレイ法によって同定することができるので、同じmAbについてscFvを乱さない配列を得るために、それらのうちのいくつかを試すことが可能である。さらにまた、それらの使用は、補体依存性細胞傷害性（CDC）を強化することができる。
【０１０８】
そのようなエピトープおよびミモトープのいくつかの例を、それぞれに対応する結合性mAbと共に、以下の表7に掲載する。
【０１０９】
（表７）ミモトープおよびエピトープとそれらに対応するmAb
2018504144.tif 000025
【０１１０】
2コピーのCD20ミモトープは互いに、そしてVLにも、リンカーによって連結することができる。それらは、随意のリンカーを使って、抗CLL1 scFvとヒンジ（例えばCD8アルファ）との間に挿入することもできる。CD20ミモトープはリツキシマブなどの抗CD20抗体によって結合されうる（McLaughlin P, et al. 1998）。したがって、本発明の抗CLL1 CARは、CLL1細胞表面抗原に結合することができるVH鎖およびVL鎖（任意で、ヒト化されたもの）、リンカーL、自殺ドメイン、ヒンジまたはその一部、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および刺激ドメインを含みうる。本発明の好ましい一態様によれば、キメラscFv内に導入されるエピトープはSEQ ID NO：109のCD20ミモトープであり、CAR陽性細胞を枯渇させるために患者に使用される対応する抗体はリツキシマブである。
【０１１１】
一般に、scFvとの関連において使用される用語「リンカー」は、可変重鎖領域および可変軽鎖領域を一つに連結するために、単独で、または組み合わせて使用される、グリシン残基および/またはセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。一態様において、柔軟なポリペプチドリンカーはグリシン/セリンリンカーであり、アミノ酸配列（Gly-Gly-Gly-Ser）nまたは（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）nを含む。ここで、nは、1以上の正の整数である。例えばn＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5、n＝6、n＝7、n＝8、n＝9、およびn＝10である。一態様において、柔軟なポリペプチドリンカーには、（Gly4Ser）4または（Gly4Ser）3が含まれるが、それらに限定されるわけではない。別の一態様において、リンカーは、（GlyxSer）nの多重リピート（ここで、x＝1、2、3、4、または5であり、nは1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である）、例えば（GlySer）、（Gly2Ser）または（Gly5Ser）の多重リピートを含む。本発明の範囲には、参照により本明細書に組み入れられるWO2012/138475に記載のリンカーも含まれる。
【０１１２】
ある態様によれば、本発明は、少なくとも
少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメインを含み、該少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメインが細胞表面CLL1抗原に結合し、かつ少なくとも1つのエピトープを含む、第1膜貫通ポリペプチド、および
少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含む第2ポリペプチド
を含むCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）であって、前記多鎖キメラ抗原受容体のシグナル伝達ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインを保持するポリペプチドとは別個のポリペプチド上に存在する、CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）に関する。
【０１１３】
好ましい一態様において、抗CLL1 mcCARは、膜貫通ポリペプチドであるシグナル伝達ドメイン含有ポリペプチドを含有し、少なくとも1つの膜貫通ポリペプチドが、Fc受容体の一部を含む。
【０１１４】
好ましい一態様において、本発明は、少なくとも（a）FcεRIアルファ鎖、（b）FcεRIベータ鎖、および（c）FcεRIガンマ鎖を含むCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）であって、
高アフィニティーIgE受容体（FcεRI）のアルファ鎖からの膜貫通ポリペプチドは、細胞外CLL1リガンド結合ドメインに融合されており、
細胞外CLL1リガンド結合ドメインは、少なくとも1つのエピトープを含有する、
CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）に関する。
【０１１５】
別の好ましい一態様において、本発明は、少なくとも（a）FcεRIアルファ鎖、（b）FcεRIベータ鎖、および（c）FcεRIガンマ鎖を含むCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）であって、
高アフィニティーIgE受容体（FcεRI）のアルファ鎖からの膜貫通ポリペプチドは、細胞外CLL1リガンド結合ドメインに融合されており、
FcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖からの第2膜貫通ポリペプチドは、シグナル伝達ドメイン、好ましくはCD3 ITAMに融合されており、
FcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖からの第3膜貫通ポリペプチドは、共刺激ドメイン、好ましくは4-1BB共刺激ドメインを含み、
FcεRIのアルファ鎖に融合されているCLL1リガンド結合ドメインは、CLL1に対する特異性を付与する重（VH）鎖および軽（VL）鎖を含む一本鎖可変フラグメント（scFv）であり、
細胞外CLL1リガンド結合ドメインは、少なくとも1つのエピトープを含有する、
CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）に関する。
【０１１６】
一態様において、前述のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）は、1つのエピトープがその細胞外ドメイン中の2つのscFvの間に挿入されているFcεRIアルファ鎖を含み、該エピトープは任意で1つのリンカーと接している。
【０１１７】
別の好ましい一態様において、本発明は、少なくとも（a）FcεRIアルファ鎖、（b）FcεRIベータ鎖、および（c）FcεRIガンマ鎖を含むCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）であって、
高アフィニティーIgE受容体（FcεRI）のアルファ鎖からの膜貫通ポリペプチドは、細胞外CLL1リガンド結合ドメインに融合されており、
FcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖からの第2膜貫通ポリペプチドは、シグナル伝達ドメインに融合されており、
FcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖からの第3膜貫通ポリペプチドは、共刺激ドメインを含み、
FcεRIのアルファ鎖に融合されているCLL1リガンド結合ドメインは、CLL1に対する特異性を付与する重（VH）鎖および軽（VL）鎖を含む一本鎖可変フラグメント（scFv）であり、
scFvは、ヒンジ、好ましくはIgG1、CD8アルファまたはFcγRIIIαヒンジによって、FcεRIアルファ鎖の膜貫通（TM）ドメインに連結されており、
細胞外CLL1リガンド結合ドメインは2つのエピトープを含有する、
CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）に関する。
【０１１８】
一態様において、前述のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）は、2つのエピトープがCARの細胞外ドメインに挿入されていて、一つはCARのN末端とVH鎖との間に挿入され、該エピトープは任意で2つのリンカーと接しており、第2エピトープは2つのscFvの間に挿入され、該第2エピトープは任意で2つのリンカーと接している、FcεRIアルファ鎖を含む。
【０１１９】
別の一態様において、CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）は、2つのエピトープがCARの細胞外ドメインに挿入されていて、一方は2つのscFvの間に挿入され、他方のエピトープはVL鎖とヒンジの間に挿入され、各エピトープは任意で2つのリンカーと接している、FcεRIアルファ鎖を含む。
【０１２０】
別の一態様において、CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）は、2つのエピトープがCARの細胞外ドメインに挿入されていて、一つはCARのN末端とVH鎖の間に挿入され、該エピトープは任意で2つのリンカーと接しており、第2エピトープはVL鎖とヒンジの間に挿入され、該第2エピトープは任意で2つのリンカーと接している、FcεRIアルファ鎖を含む。
【０１２１】
別の好ましい一態様において、本発明は、少なくとも（a）FcεRIアルファ鎖、（b）FcεRIベータ鎖、および（c）FcεRIガンマ鎖を含むCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）であって、
高アフィニティーIgE受容体（FcεRI）のアルファ鎖からの膜貫通ポリペプチドは、細胞外CLL1リガンド結合ドメインに融合されており、
FcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖からの第2膜貫通ポリペプチドは、シグナル伝達ドメインに融合されており、
FcεRIのガンマ鎖またはベータ鎖からの第3膜貫通ポリペプチドは共刺激ドメインを含み、
FcεRIのアルファ鎖に融合されているCLL1リガンド結合ドメインは、CLL1に対する特異性を付与する重（VH）鎖および軽（VL）鎖を含む一本鎖可変フラグメント（scFv）であり、
細胞外CLL1リガンド結合ドメインは3つのエピトープを含有する、
CLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）に関する。
【０１２２】
別の一態様において、前述のCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体（mc CAR）は、3つのエピトープがCARの細胞外ドメインに挿入されていて、第1のエピトープはCARのN末端とVH鎖の間に挿入され、該エピトープは任意で2つのリンカーと接しており、第2エピトープは2つのscFvの間に挿入され、該エピトープは任意で2つのリンカーと接しており、第3のエピトープはVL鎖とヒンジの間に挿入されている、FcεRIアルファ鎖を含む。
【０１２３】
前記少なくとも1つのエピトープは、好ましくは、対応するモノクローナル抗体が存在し、各国の保健機関（FDAなど）によって承認されているものの中から選択することができる。例えば、該エピトープは、SEQ ID NO：109〜SEQ ID NO：116の中から選択することができる。選択しうる別のエピトープはCD34エピトープ、例えばSEQ ID N0.117または118のものである。
【０１２４】
特定の一態様において、上記抗CLL1 mcCARは、少なくとも、モノクローナル抗CLL1抗体のVHドメインとVLドメインとを含む細胞外リガンド結合ドメインを含む。
【０１２５】
本発明は、必要であれば、すなわちサイトカインストームなどの有害作用を回避するために、CLL1特異的mcCAR、例えば本願に開示するものと、少なくとも1つのエピトープとを発現する操作されたリンパ系免疫細胞を、該エピトープに特異的な抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を患者に投与することによって、該患者中で枯渇させるための方法にも関係する。
【０１２６】
好ましい一態様では、CLL1特異的mcCARの細胞外ドメインに挿入された少なくとも1つのCD20抗原に特異的なモノクローナル抗体リツキシマブが、操作された免疫細胞を枯渇させるために、患者に投与される。
【０１２７】
より具体的には、エピトープは、本発明のCARの細胞外ドメインに、以下のように含めることができる。
【０１２８】
一部の態様において、細胞外結合ドメインは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のmAb特異的エピトープを含む。
【０１２９】
一部の態様において、細胞外結合ドメインは、少なくとも1、2、または3個のmAb特異的エピトープを含む。
【０１３０】
一部の態様において、細胞外結合ドメインが数個のmAb特異的エピトープを含む場合に、それらのmAb特異的エピトープはすべて同一である。
【０１３１】
一部の態様において、細胞外結合ドメインが数個のmAb特異的エピトープを含む場合に、それらのmAb特異的エピトープは同一ではない。例えば、細胞外結合ドメインは3つのmAb特異的エピトープを含み、そのうちの2つは同一であり、3つ目は異なることができる。
【０１３２】
一部の態様において、細胞外結合ドメインは、VH、VL、1つまたは複数のmAb特異的エピトープ、好ましくは1、2、または3個、より好ましくは2個または3個のmAb特異的エピトープを含む。
【０１３３】
一部の態様において、細胞外結合ドメインは以下の配列を含む（N末を左側に置く）:
V1-L1-V2-（L）x-エピトープ1-（L）x、
V1-L1-V2-（L）x-エピトープ1-（L）x-エピトープ2-（L）x、
V1-L1-V2-（L）x-エピトープ1-（L）x-エピトープ2-（L）x-エピトープ3-（L）x、
（L）x-エピトープ1-（L）x-V1-L1-V2、
（L）x-エピトープ1-（L）x-エピトープ2-（L）x-V1-L1-V2、
エピトープ1-（L）x-エピトープ2-（L）x-エピトープ3-（L）x-V1-L1-V2、
（L）x-エピトープ1-（L）x-V1-L1-V2-（L）x-エピトープ2-（L）x、
（L）x-エピトープ1-（L）x-V1-L1-V2-（L）x-エピトープ2-（L）x-エピトープ3-（L）x、
（L）x-エピトープ1-（L）x-V1-L1-V2-（L）x-エピトープ2-（L）x-エピトープ3-（L）x-エピトープ4-（L）x、
（L）x-エピトープ1-（L）x-エピトープ2-（L）x-V1-L1-V2-（L）x-エピトープ3-（L）x、
（L）x-エピトープ1-（L）x-エピトープ2-（L）x-V1-L1-V2-（L）x-エピトープ3-（L）x-エピトープ4-（L）x、
V1-（L）x-エピトープ1-（L）x-V2、
V1-（L）x-エピトープ1-（L）x-V2-（L）x-エピトープ2-（L）x、
V1-（L）x-エピトープ1-（L）x-V2-（L）x-エピトープ2-（L）x-エピトープ3-（L）x、
V1-（L）x-エピトープ1-（L）x-V2-（L）x-エピトープ2-（L）x-エピトープ3-（L）x-エピトープ4-（L）x、
（L）x-エピトープ1-（L）x-V1-（L）x-エピトープ2-（L）x-V2、
（L）x-エピトープ1-（L）x-V1-（L）x-エピトープ2-（L）x-V2-（L）x-エピトープ3-（L）x、
V1-L1-V2-L-エピトープ1、
V1-L1-V2-L-エピトープ1-L、
V1-L1-V2-L-エピトープ1-L-エピトープ2、
V1-L1-V2-L-エピトープ1-L-エピトープ2-L、
V1-L1-V2-L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3、
V1-L1-V2-L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-L、
V1-L1-V2-エピトープ1、
V1-L1-V2-エピトープ1-L、
V1-L1-V2-エピトープ1-L-エピトープ2、
V1-L1-V2-エピトープ1-L-エピトープ2-L、
V1-L1-V2-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3、
V1-L1-V2-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-L、
エピトープ1-V1-L1-V2、
エピトープ1-L-V1-L1-V2、
L-エピトープ1-V1-L1-V2、
L-エピトープ1-L-V1-L1-V2、
エピトープ1-L-エピトープ2-V1-L1-V2、
エピトープ1-L-エピトープ2-L-V1-L1-V2、
L-エピトープ1-L-エピトープ2-V1-L1-V2、
L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-V1-L1-V2、
エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-V1-L1-V2、
エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-L-V1-L1-V2、
L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-V1-L1-V2、
L-エピトープ1-L-エピトープ2-L-エピトープ3-L-V1-L1-V2、
V1-L-エピトープ1-L-V2、
L-エピトープ1-L-V1-L-エピトープ2-L-V2、
V1-L-エピトープ1-L-V2-L-エピトープ2-L、
V1-L-エピトープ1-L-V2-L-エピトープ2-L-エピトープ3、
V1-L-エピトープ1-L-V2-L-エピトープ2-エピトープ3、
V1-L-エピトープ1-L-V2-L-エピトープ2-L-エピトープ3-エピトープ4、
L-エピトープ1-L-V1-L-エピトープ2-L-V2-L-エピトープ3-L、
エピトープ1-L-V1-L-エピトープ2-L-V2-L-エピトープ3-L、
L-エピトープ1-L-V1-L-エピトープ2-L-V2-L-エピトープ3、
L-エピトープ1-L-V1-L1-V2-L-エピトープ2-L、
L-エピトープ1-L-V1-L1-V2-L-エピトープ2-L-エピトープ3、
L-エピトープ1-L-V1-L1-V2-L-エピトープ2-エピトープ3、または
エピトープ1-L-V1-L1-V2-L-エピトープ2-L-エピトープ3-エピトープ4。
ここで、
V1およびV2は、ScFvのVHおよびVLであり（すなわち、V1がVLでありかつV2がVHであるか、V1がVHでありかつV2がVLであり）、
L1は、ScFv中でVH鎖をVL鎖に連結するのに適した任意のリンカーであり、
Lはリンカー、好ましくはグリシン残基とセリン残基とを含むものであり、細胞外結合ドメインにおけるLの各存在は、同じ細胞外結合ドメインにおけるLの他の存在と同一であってもよくまたは異なってもよく、
xは0または1であって、xの各存在は、他のものとは独立しており、
エピトープ1、エピトープ2、およびエピトープ3はmAb特異的エピトープであって、同一であってもよくまたは異なってもよい。
【０１３４】
一部の態様において、細胞外結合ドメインは以下の配列を含む（N末を左側に置く）:
VH-L1-VL-L-エピトープ1-L-エピトープ2-L、
L-エピトープ1-L-VH-L-エピトープ2-L-VL-L-エピトープ3-L、
VL-L1-VH-L-エピトープ1-L-エピトープ2-L;または
L-エピトープ1-L-VL-L-エピトープ2-L-VH-L-エピトープ3-L。
ここで、L、L1、エピトープ1、エピトープ2、およびエピトープ3は上に定義したとおりである。
【０１３５】
一部の態様において、L1は、グリシンおよび/またはセリンを含むリンカーである。一部の態様において、L1は、アミノ酸配列（Gly-Gly-Gly-Ser）nまたは（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）nを含むリンカーであり、ここで、nは1、2、3、4、または5である。一部の態様において、L1は（Gly4Ser）4または（Gly4Ser）3である。
【０１３６】
一部の態様において、Lは柔軟なリンカー、好ましくはグリシンおよび/またはセリンを含むものである。一部の態様において、Lは、
2018504144.tif 000026
から選択されるアミノ酸配列を有する。一部の態様において、細胞外結合ドメインが数個のLの存在を含む場合に、それらのLはすべて同一である。一部の態様において、細胞外結合ドメインが数個のLの存在を含む場合に、それらのLはすべてが同一であるわけではない。一部の態様において、LはSGGGGSである。一部の態様において、細胞外結合ドメインは数個のLの存在を含み、それらのLはすべてSGGGGSである。
【０１３７】
一部の態様において、エピトープ1、エピトープ2、およびエピトープ3は同一であるか、または相違し、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、またはSEQ ID NO：116のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープから選択される。
【０１３８】
一部の態様において、エピトープ1、エピトープ2、およびエピトープ3は同一であるか、または相違し、イブリツモマブ、チウキセタン、ムロモナブ-CD3、トシツモマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベドリズマブ、アダリムマブ、ベリムマブ、カナキヌマブ、デノスマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、QBEND-10、アレムツズマブ、またはウステキヌマブによって特異的に認識されるmAb特異的エピトープから選択される。
【０１３９】
一部の態様において、エピトープ1は、SEQ ID NO：109のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープである。
【０１４０】
一部の態様において、エピトープ2は、SEQ ID NO：109のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープである。
【０１４１】
一部の態様において、エピトープ3は、SEQ ID NO：109のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープである。
【０１４２】
一部の態様において、エピトープ4は、SEQ ID NO：109のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープである。
【０１４３】
一部の態様において、エピトープ2は、SEQ ID NO：109のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープであり、エピトープ3は、SEQ ID NO：117のアミノ酸配列を有するmAb特異的エピトープである。
【０１４４】
一部の態様において、エピトープ1、エピトープ2、エピトープ3、およびエピトープ4のうちの1つはCD34エピトープ、好ましくはSEQ ID NO：117またはSEQ ID NO：118のエピトープである。一部の態様において、エピトープ1、エピトープ2、エピトープ3、およびエピトープ4のうちの1つはCD34エピトープ、好ましくはSEQ ID NO：117またはSEQ ID NO：118のエピトープであり、他のmAb特異的エピトープはCD20ミモトープ、好ましくはSEQ ID NO：109のミモトープである。
【０１４５】
CAR発現免疫細胞を枯渇させるための方法
本発明のCLL1特異的CARを発現する免疫細胞は、その細胞外ドメインに上述のようなエピトープを含みうるので、有害なまたは激烈すぎる免疫応答（例えばサイトカインストーム）が起こった場合には、該エピトープに特異的な抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を患者に投与することによって、患者中の前記免疫細胞を枯渇させることができる。
【０１４６】
「インビボ枯渇」とは、本発明においては、阻害または排除によってCAR発現免疫細胞の増殖を停止させることを目的とする哺乳類生物への処置の施行を意味する。
【０１４７】
本発明の一局面は、前述のm-Ab特異的エピトープを含むCARを発現する操作された免疫細胞をインビボ枯渇させるための方法であって、該操作された免疫細胞、すなわち該CAR発現免疫細胞を、少なくとも1つのエピトープ特異的mAbと接触させる工程を含む方法に関する。本発明の別の局面は、上記キメラscFv（mAb特異的エピトープの挿入によって形成されたもの）を含む免疫CAR発現免疫細胞をインビボ枯渇させるための方法であって、該操作された免疫細胞をエピトープ特異的抗体と接触させることによる方法に関する。
【０１４８】
好ましくは、該免疫細胞はT細胞であり、かつ/または抗体はモノクローナルである。
【０１４９】
ある態様によれば、操作された免疫細胞のインビボ枯渇は、本発明のインビトロ法を使って先に選別された、操作された免疫細胞に対して行われる。その場合、これは、同じ注入mAbを使って行われるであろう。
【０１５０】
好ましい一態様によれば、mAb特異的抗原はCD20抗原であり、エピトープ特異的mAbはリツキシマブである。
【０１５１】
一部の態様において、本発明は、前述のmAb特異的エピトープを含むCARを発現する操作された免疫細胞（CAR発現免疫細胞）を患者においてインビボ枯渇させるための方法であって、該CAR発現免疫細胞を少なくとも1つのエピトープ特異的mAbと接触させる工程を含む方法に関する。
【０１５２】
一部の態様において、mAb特異的エピトープはCD20エピトープまたはCD20ミモトープ、好ましくはSEQ ID NO：35であり、エピトープ特異的mAbはリツキシマブである。
【０１５３】
一部の態様において、操作された免疫細胞、すなわちCAR発現免疫細胞を少なくとも1つのエピトープ特異的mAbと接触させる工程は、エピトープ特異的mAb、好ましくはリツキシマブを患者に注入する工程を含む。
【０１５４】
一部の態様において、mAb特異的エピトープを含むCARを発現する免疫細胞（CAR発現免疫細胞）を、CDCアッセイにおいて、エピトープ特異的mAbを使って枯渇させる場合には、生存可能なCAR発現免疫細胞の量が、好ましくは、少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％減少する。好ましくは、CDCアッセイは、実施例3、実施例4、または実施例7.4に開示するアッセイである。一部の態様において、mAb特異的エピトープはCD20エピトープまたはCD20ミモトープ、好ましくはSEQ ID NO：35であり、エピトープ特異的mAbはリツキシマブである。
【０１５５】
CARの細胞外ドメインに挿入されたエピトープは、本発明の免疫細胞をインビボ枯渇させることが可能であるだけでなく、該CARを発現する免疫細胞を生産するための方法の一部として、それらの免疫細胞を選別または精製する工程にも役立ちうる。
【０１５６】
抗CLL1 CARをコードするポリヌクレオチドおよびベクター
本発明は、上述した本発明の多鎖CARをコードするポリヌクレオチド、ベクターにも関係する。本発明は、多鎖CARに含まれうる本明細書に開示の膜貫通ポリペプチドをコードするDNA分子およびRNA分子を含むポリヌクレオチドを提供する。特に本発明は、上述の多鎖CARを構成する少なくとも1つの膜貫通ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。より具体的には、本発明は、上述の多鎖CARを構成する膜貫通ポリペプチドをコードする2つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【０１５７】
本ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば細菌宿主細胞に導入するためのプラスミド、昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、または哺乳類宿主細胞のトランスフェクションのためのプラスミドもしくはレンチウイルスなどのウイルスベクター）中に存在しうる。
【０１５８】
特定の一態様では、2Aペプチドをコードする配列などのリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含む1つのポリヌクレオチドまたはベクターに、異なる核酸配列を含めることができる。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された2Aペプチドは、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こし、それらのコドンによってコードされる2つのアミノ酸の間にペプチド結合を形成しない（Donnelly et al., J. of General Virology 82: 1013-1025（2001）; Donnelly et al., J. of Gen. Virology 78:13-21（1997）; Doronina et al., Mol. And. Cell. Biology 28（13）:4227-4239（2008）; Atkins et al., RNA 13: 803-810（2007）参照）。「コドン」とは、リボソームによって1つのアミノ酸残基に翻訳されるmRNA上（またはDNA分子のセンス鎖上の）3つのヌクレオチドを意味する。したがって、ポリペプチドをインフレームの2Aオリゴペプチド配列で分離すれば、mRNA内の単一の連続オープンリーディングフレームから、2つのポリペプチドを合成させることができる。そのようなリボソームスキップ機序は当技術分野において周知であり、単一のメッセンジャーRNAによってコードされる数個のタンパク質の発現に、いくつかのベクターによって使用されていることが知られている。非限定的な例として、本発明では、2Aペプチドを使って、多鎖CARの異なるポリペプチドを細胞中に発現させた。
【０１５９】
FcεRなどの膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向かわせるために、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列には、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても公知である）が設けられる。分泌シグナル配列はFcεRのものでもよく、別の分泌タンパク質（例えばt-PA）から誘導するか、新規に合成してもよい。分泌シグナル配列は膜貫通核酸配列に機能的に連結される。すなわち、それら2つの配列は正しい読み枠で接合され、新しく合成されるポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向かわせるように配置される。分泌シグナル配列は一般的には関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列に対して5'側に配置されるが、一定の分泌シグナル配列は、関心対象の核酸配列中のどこか他の場所に配置することもできる（例えばWelchらの米国特許第5,037,743号; Hollandらの米国特許第5,143,830号参照）。好ましい一態様において、シグナルペプチドはFcεRIアルファ鎖（NP_001992.1）の残基1〜25を含み、アミノ酸配列SEQ ID NO:5を有する。
【０１６０】
遺伝暗号の縮重を考えると、これらのポリヌクレオチド分子の間にかなりの配列多様性が可能であることは、当業者にはわかるであろう。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現用に、好ましくはヒト細胞における発現用に、コドン最適化される。コドン最適化とは、関心対象の配列において、所与の種の高発現遺伝子では一般に希少であるコドンを、そのような種の高発現遺伝子において一般に高頻度であって、かつ交換しようとしているコドンと同じアミノ酸をコードするコドンに交換することをいう。
【０１６１】
本発明は、上記の態様のいずれか一つのCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【０１６２】
本発明は、以下のペプチド配列を含むCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
2018504144.tif 000027
2018504144.tif 000028
2018504144.tif 000029
【０１６３】
本発明は、上記のポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは以下のペプチド配列を含むCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体をコードするベクターを提供する。
2018504144.tif 000030
2018504144.tif 000031
2018504144.tif 000032
2018504144.tif 000033
【０１６４】
免疫細胞を操作するための方法
本発明は、上記のように免疫細胞を操作する方法であって、以下の工程を含む方法も提供する:
（a）免疫細胞を用意する工程、
（b）異なる細胞外リガンド結合ドメインをそれぞれが含む上記多鎖キメラ抗原受容体の集団を、該細胞の表面に発現させる工程。
【０１６５】
本発明は、上記のように免疫細胞を操作する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する:
（a）免疫細胞を用意する工程、
（b）異なる細胞外リガンド結合ドメインをそれぞれが含む上記多鎖キメラ抗原受容体の集団を構成するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを、該細胞に導入する工程、
（c）該ポリヌクレオチドを該細胞中に発現させる工程。
【０１６６】
免疫細胞を操作して、上記態様のいずれか一つのCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を賦与する方法は、本発明の一部であり、免疫細胞を操作するこの方法は、以下の工程を含んでいる:
（a）免疫細胞を用意する工程、
（b）少なくとも1つの上記態様のいずれか一つのCLL1多鎖キメラ抗原受容体を、該細胞の表面に発現させる工程。
【０１６７】
一態様において、本発明は、免疫細胞を操作して、上記態様のいずれか一つのCLL1特異的多鎖キメラ抗原受容体を賦与する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。
（a）免疫細胞を用意する工程、
（b）上記いずれか一つのCLL1多鎖キメラ抗原受容体を構成するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、好ましくは以下のペプチド配列をコードするものを、該細胞に導入する工程:
2018504144.tif 000034
2018504144.tif 000035
2018504144.tif 000036
（c）該ポリヌクレオチドを該細胞中に発現させる工程。
【０１６８】
好ましい一態様において、免疫細胞を操作する方法は、以下の工程を含んでいる:
（a）免疫細胞を用意する工程、
（b）異なる細胞外リガンド結合ドメインをそれぞれが含む上記態様のいずれか一つのCLL1多鎖キメラ抗原受容体の集団を、該細胞の表面に発現させる工程。
【０１６９】
好ましい一態様において、免疫細胞を操作する方法は、以下の工程をさらに含む:
（a）免疫細胞を用意する工程、
（b）異なる細胞外リガンド結合ドメインをそれぞれが含む上記態様のいずれか一つのCLL1多鎖キメラ抗原受容体の集団を構成するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを該細胞に導入する工程、
（c）該ポリヌクレオチドを該細胞中に発現させる工程。
【０１７０】
単離された免疫細胞
別の一局面によれば、本発明は、上記態様のいずれか一つの方法によって得ることができる単離された免疫細胞、好ましくは以下のペプチド配列を含むCLL1多鎖キメラ抗原受容体を発現する単離された免疫細胞を提供する。
2018504144.tif 000037
2018504144.tif 000038
2018504144.tif 000039
2018504144.tif 000040
【０１７１】
本発明は、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球またはヘルパーTリンパ球からなる群より選択される単離された細胞であって、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）をさらに含むものを提供する。
【０１７２】
好ましい一態様において、本発明において提供される単離された細胞は単離された免疫T細胞であり、該単離された免疫T細胞は少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を発現する。
【０１７３】
別の好ましい一態様において、単離された免疫細胞は単離された免疫T細胞であり、該単離された免疫T細胞は少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を発現する。
【０１７４】
一態様において、単離された免疫細胞はさらに操作されており、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を含む、操作され単離された初代免疫細胞である。
【０１７５】
好ましい一態様において、操作され単離された初代免疫細胞は、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を含む。
【０１７６】
別の好ましい一態様において、操作され単離された初代免疫細胞は、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を含む少なくとも1つの抗CLL1多鎖（CAR）を含む。
【０１７７】
薬学的組成物
一局面において、本発明は、上述の薬学的組成物を提供する。
【０１７８】
本発明は、少なくとも1つの薬学的に許容される媒体と、少なくとも1つの抗CLL1多鎖（CAR）を賦与された少なくとも1つの初代細胞とを含む薬学的組成物を提供する。
【０１７９】
ある態様において、薬学的組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容される媒体と、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を賦与された少なくとも1つの初代細胞とを含む。
【０１８０】
ある態様において、薬学的組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容される媒体と少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）とを含む。
【０１８１】
免疫細胞を操作する方法
包含される特定の態様において、本発明は、免疫療法用の免疫細胞を調製する方法であって、前記多鎖CARを構成するポリペプチドを該免疫細胞に導入する工程、および該細胞を増加させる工程を含む方法に関する。特定の態様において、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、細胞を用意する工程および少なくとも1つの上述の多鎖CARを該細胞の表面に発現させる工程を含む方法に関する。特定の態様において、本方法は、少なくとも1つの上述の多鎖CARを構成するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドで細胞を形質転換する工程、および該ポリヌクレオチドを該細胞中に発現させる工程を含む。
【０１８２】
別の一態様において、本発明は、免疫療法用の免疫細胞を調製する方法であって、多鎖CARを構成する異なるポリペプチドを該細胞に導入する工程、および該細胞を増加させる工程を含む方法に関する。
【０１８３】
好ましい一態様では、細胞中で安定に発現されることを見込んで、該ポリヌクレオチドをレンチウイルスベクターに含める。
【０１８４】
本発明は、免疫療法用の初代免疫細胞を調製する方法であって、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を構成するポリペプチドを該初代免疫細胞に導入する工程を含む方法に関する。
【０１８５】
別の一態様において、本発明は、免疫療法用の初代免疫細胞を調製する方法であって、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）をコードするポリヌクレオチドを、該免疫細胞に導入する工程を含む方法を提供する。
【０１８６】
送達方法
上述のさまざまな方法は、多鎖CAR、pTアルファまたはその機能的変異体、レアカットエンドヌクレアーゼ、TALEヌクレアーゼ、CARを、任意でDNA端プロセシング酵素または外因性核酸と共に、細胞中に導入する工程を伴う。
【０１８７】
非限定的な例として、多鎖CARは、1つのプラスミドベクターによってコードされた導入遺伝子として、または異なるプラスミドベクターとして、導入することができる。異なる導入遺伝子を、リボソームスキップ配列をコードする核酸配列（例えば2Aペプチドをコードする配列）を含む1つのベクターに含めることができる。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された2Aペプチドは、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こし、それらのコドンによってコードされる2つのアミノ酸の間にペプチド結合を形成しない（Donnelly et al., J. of General Virology 82:1013-1025（2001）; Donnelly et al., J. of Gen. Virology 78:13-21（1997）; Doronina et al., Mol. And. Cell. Biology 28（13）:4227-4239（2008）; Atkins et al., RNA 13:803-810（2007）参照）。「コドン」とは、リボソームによって1つのアミノ酸残基に翻訳されるmRNA上（またはDNA分子のセンス鎖上の）3つのヌクレオチドを意味する。したがって、ポリペプチドをインフレームの2Aオリゴペプチド配列で分離すれば、mRNA内の単一の連続オープンリーディングフレームから、2つのポリペプチドを合成させることができる。そのようなリボソームスキップ機序は当技術分野において周知であり、単一のメッセンジャーRNAによってコードされる数個のタンパク質の発現に、いくつかのベクターによって使用されていることが知られている。非限定的な例として、本発明では、2Aペプチドを使って、レアカットエンドヌクレアーゼおよびDNA端プロセシング酵素または多鎖CARの異なるポリペプチドを細胞中に発現させた。
【０１８８】
プラスミドベクターは、該ベクターを受け取った細胞の同定および/または選択に備えて、選択マーカーも含有することができる。
【０１８９】
ポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが細胞中に導入された結果として、細胞においてインサイチューで合成されうる。あるいは、ポリペプチドを細胞外で生産してから、そこに導入することもできるであろう。動物細胞中にポリヌクレオチドコンストラクトを導入するための方法は当技術分野において公知であり、これには、非限定的な例として、ポリヌクレオチドコンストラクトが細胞のゲノムに組み込まれる安定形質転換法、ポリヌクレオチドコンストラクトが細胞のゲノムに組み込まれない一過性形質転換法、およびウイルスによる方法が含まれる。ポリヌクレオチドは、例えば組換えウイルスベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどによって、細胞中に導入されうる。例えば、一過性形質転換法には、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたはパーティクルボンバードメントなどがある。ポリヌクレオチドは、細胞中で発現されることを見込んで、ベクター中に、より具体的にはプラスミド中またはウイルス中に含めることができる
【０１９０】
エレクトロポレーション
本発明の特定の態様において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えばエレクトロポレーションなどによって細胞中に直接導入されるmRNAであることができる。本発明者らは、T細胞におけるmRNAエレクトロポレーションの最適条件を決定した。
【０１９１】
本発明者は、細胞中に物質を送達するために生細胞を一時的に透過性にすることをパルス電場を使って可能にするcytoPulse技術を使用した。PulseAgile（Cellectisの所有）エレクトロポレーション波形の使用に基づくこの技術では、パルス持続時間、強度、およびパルス間の間隔の正確な制御がかなう（米国特許第6,010,613号および国際PCT出願WO2004083379）。高いトランスフェクション効率と最低限の死亡率にとって最善の条件に到達するために、これらすべてのパラメータを変更することができる。基本的に、最初の高電場パルスではポア形成が可能になるのに対し、後続の低電場パルスでは、細胞内へのポリヌクレオチドの移動が可能になる。本発明の一局面において、本発明者は、＞95％という、T細胞におけるmRNAのトランスフェクション効率の達成につながる工程と、T細胞においてさまざまな種類のタンパク質を一過性に発現させるためのエレクトロポレーションプロトコールの使用とを記載する。特に本発明は、T細胞を形質転換する方法であって、T細胞をRNAと接触させる工程、およびT細胞に、
（a）電圧範囲が2250〜3000V/センチメートル、パルス幅が0.1ms、そして工程（a）と工程（b）の電気パルス間のパルス間隔が0.2〜10msである、1回の電気パルス、
（b）電圧範囲が2250〜3000V、パルス幅が100ms、そして工程（b）の電気パルスと工程（c）の第1電気パルスとの間のパルス間隔が100msである、1回の電気パルス、および
（c）電圧が325V、パルス幅が0.2ms、そして4回の電気パルスのそれぞれの間のパルス間隔が2msである、4回の電気パルス
からなる素早いパルスシーケンスを印加する工程を含む方法に関する。
【０１９２】
特定の態様において、T細胞を形質転換する方法は、T細胞をRNAと接触させる工程、および
（a）電圧が2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900、または3000V/センチメートル、パルス幅が0.1ms、および工程（a）と工程（b）の電気パルス間のパルス間隔が0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10msである、1回の電気パルス、
（b）電圧範囲が2250から、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900、または3000Vであり、パルス幅が100msであり、工程（b）の電気パルスと工程（c）の第1電気パルスとの間のパルス間隔が100msである、1回の電気パルス、および
（c）電圧が325V、パルス幅が0.2ms、そして4回の電気パルスのそれぞれの間のパルス間隔が2msである、4回の電気パルス
からなる素早いパルスシーケンスをT細胞に印加する工程を含む。
【０１９３】
上述の値域に含まれる値はいずれも本願において開示されている。エレクトロポレーション培地は、当技術分野において公知の任意の適切な培地であってよい。好ましくは、エレクトロポレーション培地は、0.01〜1.0ミリジーメンスの範囲の導電率を有する。
【０１９４】
特定の態様において、非限定的な例として、RNAは、レアカットエンドヌクレアーゼ、レアカットエンドヌクレアーゼの1単量体、例えば半TALEヌクレアーゼ、キメラ抗原受容体、多鎖キメラ抗原受容体の少なくとも1つのコンポーネント、pTアルファまたはその変異体、外因性核酸、1つの追加触媒ドメインをコードする。
【０１９５】
操作された免疫細胞
本発明は、細胞を操作するための前記方法によって得ることができる単離された細胞または細胞株にも関係する。特に、単離された細胞は、少なくとも1つの上記多鎖CARを含む。別の一態様において、単離された細胞は、異なる細胞外リガンド結合ドメインをそれぞれが含む多鎖CARの集団を含む。特に、単離された細胞は、少なくとも1つの多鎖CARを構成するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を含む。
【０１９６】
本発明の範囲には、前述の方法のいずれか1つに従って得られる単離された免疫細胞、好ましくはT細胞も包含される。
【０１９７】
免疫細胞とは、自然免疫応答および/または適応免疫応答の開始および/または遂行に機能的に関与する造血系由来の細胞を指す。本発明の免疫細胞は幹細胞から誘導することができる。幹細胞は、成人幹細胞、胚性幹細胞、より具体的には非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞であってもよい。代表的なヒト細胞はCD34+細胞である。
【０１９８】
好ましい一態様において、単離された細胞は、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を含む単離されたCD34+幹細胞である。
【０１９９】
別の好ましい一態様において、単離された細胞は、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を含む単離されたCD34+幹細胞である。
【０２００】
単離された細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、NK細胞、B細胞、または炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球もしくはヘルパーTリンパ球からなる群より選択されるT細胞であってもよい。
【０２０１】
別の一態様において、該細胞は、CD4+ Tリンパ球およびCD8+ Tリンパ球からなる群より誘導することができる。
【０２０２】
本発明の細胞の増加および遺伝子修飾に先だって、細胞の供給源を、さまざまな非限定的方法によって対象から得ることができる。細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍などといったいくつかの非限定的供給源から得ることができる。本発明の一定の態様では、当業者に公知であり利用可能である多くのT細胞株を使用することができる。別の一態様では、健常ドナーから、またはがんと診断された患者から、または感染症と診断された患者から、細胞を誘導することができる。別の一態様において、細胞は、異なる表現型特徴を提示する混合細胞集団の一部である。本発明の範囲には、形質転換T細胞から前述の方法に従って得られる細胞株も包含される。免疫抑制処置に対して耐性であって、前述の方法によって得ることができる修飾された細胞は、本発明の範囲に包含される。前述のとおり、そのような細胞は、例えばCD52、GR、TCRアルファ、TCRベータ、HLA遺伝子、PD1およびCTLA-4などの免疫チェックポイント遺伝子からなる群より選択される1種類または数種類の遺伝子が不活化されるように遺伝子操作することもでき、またはpTアルファ導入遺伝子を発現することもできる。
【０２０３】
別の一態様では、TCRアルファ遺伝子および/またはTCRベータ遺伝子を不活化することによって、TCRを、本発明の細胞では非機能的にする。より具体的には、GvHDを回避するために、上記の戦略が使用される。本発明の一特定局面には、個体から誘導される修飾された細胞を得るための方法であって、該細胞は、主要組織適合遺伝子複合体シグナリング経路には依存せずに増殖することができる方法が含まれる。該方法は以下の工程を含む:
（a）個体から細胞を回収する工程、
（b）TCRアルファ遺伝子および/またはTCRベータ遺伝子を不活化することによって、該細胞をエクスビボで遺伝子修飾する工程、
（c）遺伝子修飾されたT細胞を適当な条件でインビトロ培養することで、該細胞を増幅する工程。
【０２０４】
本発明は、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を含む操作された初代T細胞を提供する。
【０２０５】
本発明は、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を含む操作された初代T細胞を提供する。
【０２０６】
主要組織適合遺伝子複合体シグナリング経路に依存せずに増殖することができ、本方法によって得ることができる修飾された細胞は、本発明の範囲に包含される。修飾された細胞は、本発明の一特定局面において、処置を必要とする患者に宿主対移植片（HvG）拒絶および移植片対宿主病（GvHD）の処置を行うために使用することができる。それゆえに、処置を必要とする患者に宿主対移植片（HvG）拒絶および移植片対宿主病（GvHD）の処置を行う方法であって、不活化されたTCRアルファ遺伝子および/またはTCRベータ遺伝子を含む修飾された細胞の有効量を患者に投与することによって患者を処置する工程を含む方法は、本発明の範囲内にある。
【０２０７】
より好ましい一態様において、該方法は、以下の工程を含む:
（a）T細胞、好ましくは細胞培養からのT細胞、または血液試料からのT細胞を、用意する工程、
（b）T細胞受容体（TCR）のコンポーネントをコードする少なくとも1つの遺伝子を、DNA切断によって、好ましくは二本鎖切断によって、選択的に不活化することができるレアカットエンドヌクレアーゼをコードする核酸で、該T細胞を形質転換する工程、
（c）該レアカットエンドヌクレアーゼを該T細胞中に発現させる工程、
（d）それぞれの細胞表面にTCRを発現しない形質転換T細胞を選別する工程、
（e）該細胞を増加させる工程。
【０２０８】
別の一態様において、レアカットエンドヌクレアーゼはメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはTALEヌクレアーゼである。好ましい一態様において、レアカットエンドヌクレアーゼはTALEヌクレアーゼであってもよい。好ましい方法および関連するTALEヌクレアーゼはWO2013176915に記載されている。
【０２０９】
本発明は、宿主対移植片（HvG）拒絶を誘発する率が、操作されていない初代T細胞より50％〜100％少ない、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を含む操作された初代T細胞を提供する。
【０２１０】
本発明は、宿主対移植片（HvG）拒絶を誘発する率が、操作されていない初代T細胞より50％〜100％少ない、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を含む操作された初代T細胞を提供する。
【０２１１】
化学療法に対して耐性にした抗CLL1免疫細胞
本発明の好ましい一態様では、養子免疫療法と化学療法とを併用するために、抗CLL1多鎖CARを賦与された免疫細胞を、化学療法薬、特にプリンヌクレオチド類似体（PNA）に対して耐性になるように操作することで、それらをがん処置に適したものにする。プリンヌクレオチド類似体は、多くのがん処置要の化学療法組成物、特に白血病用の化学療法組成物に取り入れられている。特にこれはAMLの標準治療薬として使用されている。最も広く使用されているPNAは、クロファラビン、フルダラビン、シタラビン、およびデシタビン（Dacogen）の単独使用または併用である。PNAは、デオキシシチジンキナーゼ（dCK）活性を有する酵素［EC 2.7.1.74］によって、PNA一リン酸、PNA二リン酸、およびPNA三リン酸に代謝される。それらの三リン酸型、特にクロロファラビン（clorofarabine）三リン酸は、DNA合成に関してATPと競合して、アポトーシス促進剤として作用し、トリヌクレオチド生産に関与するリボヌクレオチドレダクターゼ（RNR）の強力な阻害剤である。
【０２１２】
したがって本発明は、プリン類似体薬に対して耐性であってCLL1陽性悪性細胞を標的とすることができる免疫細胞、好ましくはT細胞を、エクスビボで生産する方法を包含する。該方法は以下の工程のうちの1工程または数工程を含む:
（a）患者（自家処置）からの免疫細胞またはドナーからの免疫細胞を用意する工程、
（b）デオキシシチジンキナーゼ活性を有する酵素（dcK-EC 2.7.1.74）を発現する遺伝子、特にヒトデオキシシチジンキナーゼ遺伝子（NCBI Gene ID:1633）を特異的標的とするレアカットエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を、該免疫細胞にトランスフェクトする工程、
（c）該dck遺伝子の標的不活化が得られるように、該エンドヌクレアーゼを該免疫細胞中に発現させる工程、
（d）工程c）で得た操作された免疫細胞を、任意で該プリン類似体薬の存在下で、増加させる工程、および
（e）該免疫細胞に前述の抗CLL1多鎖CARを導入する工程。
【０２１３】
本発明者らは、細胞におけるdcK遺伝子発現の不活化を、TALヌクレアーゼを使って媒介することにより、プリンヌクレオチド類似体、より具体的にはクロロファラビンおよび/またはフルダラビンに対して耐性である抗CLL1 T細胞を作製することに成功した。cdk遺伝子を指向する特異的TALヌクレアーゼをコードするmRNAを使った、好ましくはWO2013176915に記載のエレクトロポレーションによる、T細胞のトランスフェクションは、CLL1保有細胞に対するT細胞の細胞傷害性を維持しつつ、薬物に対する著しい耐性を誘導した。
【０２１４】
こうして本願は、白血病の処置のために、デオキシシチジンキナーゼの発現が抑制または不活化された抗CLL1 T細胞を提供する。
【０２１５】
本発明は、白血病の処置、好ましくはAMLの処置のために、デオキシシチジンキナーゼの発現が抑制または不活化された、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を含む操作された初代T細胞を提供する。
【０２１６】
本発明は、白血病の処置、好ましくはAMLの処置のために、デオキシシチジンキナーゼの発現が抑制または不活化された、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を含む操作された初代T細胞を提供する。
【０２１７】
T細胞の活性化および増加
T細胞の遺伝子修飾の前でも後でも、T細胞は通常、例えば米国特許第6,352,694号、同第6,534,055号、同第6,905,680号、同第6,692,964号、同第5,858,358号、同第6,887,466号、同第6,905,681号、同第7,144,575号、同第7,067,318号、同第7,172,869号、同第7,232,566号、同第7,175,843号、同第5,883,223号、同第6,905,874号、同第6,797,514号、同第6,867,041号、および米国特許出願公開第20060121005号に記載の方法を使って、活性化し、増加させることができる。T細胞はインビトロまたはインビボで増加させることができる。
【０２１８】
本発明のT細胞は概して、T細胞にとっての活性化シグナルを生成させるための、T細胞表面での、CD3 TCR複合体を刺激する作用物質および共刺激分子との接触によって、増加する。
【０２１９】
例えば、カルシウムイオノフォアA23187、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）、またはフィトヘマグルチニン（PHA）のような分裂誘発性レクチンなどの化学薬品を使って、T細胞にとっての活性化シグナルを生成させることができる。
【０２２０】
非限定的な例として、表面上に固定化された抗CD3抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは抗CD2抗体との接触によって、あるいはプロテインキナーゼC活性化因子（例えばブリオスタチン）をカルシウムイオノフォアと一緒に接触させることによって、T細胞集団をインビトロで刺激することができる。T細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えばT細胞の集団を、T細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。CD4+ T細胞またはCD8+ T細胞のどちらかの増殖を刺激するために、抗CD3抗体および抗CD28抗体。例えば、各シグナルを与える作用物質は、溶解状態にあってもよいし、表面にカップリングしていてもよい。当業者にはすぐに理解できるであろうが、細胞に対する粒子の比は、標的細胞と比較した粒径に依存しうる。本発明のさらなる態様では、T細胞などの細胞を作用物質被覆ビーズと合わせ、次にビーズと細胞とを分離してから、細胞を培養する。代替的一態様では、培養前に作用物質被覆ビーズと細胞とを分離せずに、一緒に培養する。T細胞培養に適した条件には、増殖と生存能にとって必要な因子、例えば血清（例えばウシ胎児血清またはヒト血清）、インターロイキン-2（IL-2）、インスリン、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFp、およびTNF-、または当業者に公知である細胞成長用の他の任意の添加物などを含有しうる適当な培地（例えば最小必須培地、またはRPMI培地1640、またはX-vivo5（Lonza））が含まれる。細胞成長用の他の添加剤には、界面活性剤、プラスマネート、ならびにN-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールなどの還元剤があるが、それらに限定されるわけではない。培地としては、無血清の、または適量の血清（もしくは血漿）もしくはホルモンの所定のセット、および/もしくはT細胞の成長および増加にとって十分な量のサイトカインが補足された、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加されている、RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo1、およびX-Vivo20、Optimizerを挙げることができる。抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養物だけに含まれ、対象に注入される予定の細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、成長を支えるのに必要な条件下で、例えば適当な温度（例えば37℃）および雰囲気（例えば空気＋5％CO2）で維持される。異なる刺激時間に曝露されたT細胞は、異なる特徴を呈しうる。
【０２２１】
別の一特定態様において、細胞は、組織または細胞との共培養によって増加させることができる。細胞は、インビボで、例えば対象の血中で、対象への該細胞の投与後に、増加させることもできる。
【０２２２】
医薬
AMLを防止または処置するための医薬として使用するための本発明の薬学的組成物は、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を含む操作された免疫細胞、好ましくは初代免疫T細胞を、少なくとも1つの薬学的に許容される媒体と共に含む。
【０２２３】
本発明は、上記の態様による単離された免疫細胞を、好ましくは本発明のCLL1 mc CARを賦与された、単離された免疫T細胞を、医薬としてのその使用のために提供する。
【０２２４】
ある態様において、本願は、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を賦与された、単離された免疫T細胞を、難治性/再発性AMLを防止または処置するための医薬としてのその使用のために提供する。
【０２２５】
本発明は、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を持つ単離された炎症性Tリンパ球を、AMLを防止または処置するための医薬としてのその使用のために提供する。
【０２２６】
本発明は、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を賦与された、単離された細胞傷害性Tリンパ球を、AMLを防止または処置するための医薬としてのその使用のために提供する。
【０２２７】
本発明は、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を賦与された、単離された制御性Tリンパ球を、AMLを防止または処置するための医薬としてのその使用のために提供する。
【０２２８】
本発明は、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を賦与された、単離されたヘルパーTリンパ球を、AMLを防止または処置するための医薬としてのその使用のために提供する。
【０２２９】
本発明は、少なくとも1つの本発明の抗CLL1多鎖（CAR）を賦与された、単離された免疫NK細胞を、AMLを防止または処置するための医薬としてのその使用のために提供する。
【０２３０】
別の一局面において本発明は、病理学的状態、例えばがん、特に造血細胞のがん、より具体的にはAMLを防止または処置するための医薬として使用するための薬学的組成物を提供する。
【０２３１】
治療的適応症
好ましくは、本発明は、処置を必要とする患者を処置するための方法であって、
a）上記態様のいずれか一つの方法によって得ることができる単離された免疫T細胞を用意する工程、
b）該T細胞を該患者に投与する工程、
を含み、該患者が、AMLから選択されるがん、より好ましくは難治性/再発性AMLから選択されるがんを患っている方法を提供する。
【０２３２】
本発明は、患者を処置するための上記方法であって、該免疫細胞がドナーから回収される方法を提供する。
【０２３３】
本発明は、患者を処置するための上記方法であって、該免疫細胞が、該方法によって処置される予定の患者から、好ましくは患者そのものから、回収される方法を提供する。
【０２３４】
本願において、患者または対象とは非ヒト霊長類またはヒトを意味する。
【０２３５】
ドナーとは、健常個体または疾患を患っている個体を意味する。
【０２３６】
白血病/AML
「血液悪性疾患」または「血液がん」という用語は、身体の血液（骨髄および/またはリンパ組織）のがんを指す。血液悪性疾患の例には、特に白血病、例えば急性骨髄性白血病（AML）が含まれる。
【０２３７】
「白血病」という用語は、血液形成組織の悪性新生物を指し、特に急性骨髄性白血病（AML）を含む。
【０２３８】
「再発した」という用語は、治療後にがんが寛解していた対象に、がん細胞が復帰している状況を指す。
【０２３９】
「難治性または耐性」とは、対象または哺乳動物が、集中的処置後でさえ、その体内に残存がん細胞を有する状況を指す。本発明の抗CLL1多鎖CARを含むT細胞は、CLL1発現細胞を特徴とする、特にCLL1発現細胞の過剰を特徴とする、前悪性または悪性がん状態と診断された患者における処置として提供される。そのような状態は、白血病、特に急性骨髄性白血病（AML）などの血液がんに見いだされる。
【０２４０】
AMLサブタイプ/マーカー
本発明の抗CLL1多鎖CAR発現細胞を使って処置しうるAMLまたはAMLサブタイプとしては、CLL1陽性悪性細胞が関与するかどうかを問わず、特に、急性骨髄芽球性白血病、最未分化型急性骨髄芽球性白血病（minimally differentiated acute myeloblastic leukemia）、未分化型急性骨髄芽球性白血病（acute myeloblastic leukemia without maturation）、分化型急性骨髄芽球性白血病（acute myeloblastic leukemia with granulocytic maturation）、前骨髄球性または急性前骨髄球性白血病（APL）、急性骨髄性単球性白血病、骨髄好酸球増加を伴う骨髄単球性（myelomonocytic together with bone marrow eosinophilia）、急性単芽球性白血病（M5a）または急性単球性白血病（M5b）、赤白血病（M6a）および極めて稀な未分化型赤白血病（very rare pure erythroid leukemia）（M6b）を含む急性赤白血病、急性巨核芽球性白血病、急性好塩基球性白血病、骨髄線維症を伴う急性汎骨髄症を挙げることができる。
【０２４１】
AMLのサブタイプには、ヘアリー細胞白血病、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病も含まれる。
【０２４２】
本発明の抗CLL1多鎖CAR発現細胞を使って処置しうるAMLまたはAMLサブタイプとして、特異的遺伝子異常を伴うAMLを挙げることができる。分類は、導入療法に対する応答、再発リスク、生存率を予測する核型の能力に基づく。
【０２４３】
したがって、本発明の抗CLL1多鎖CAR発現細胞を使って処置しうるAMLとしては、染色体8と染色体21の間の転座を伴うAML、染色体16における転座または逆位を伴うAML、染色体9と染色体11の間の転座を伴うAML、染色体15と染色体17の間の転座を伴うAPL（M3）、染色体6と染色体9の間の転座を伴うAML、染色体3における転座または逆位を伴うAML、染色体1と染色体22の間の転座を伴うAML（巨核芽球性）を挙げることができる。
【０２４４】
本発明は、これらの特定の細胞遺伝学的マーカーと関連するAMLの処置に、とりわけ有用である。
【０２４５】
本発明は、AMLの特定の細胞遺伝学的サブセットを持つ患者、例えば全トランス型レチノイン酸（ATRA）16-19を使って同定されるt（15;17）（q22;q21）を持つ患者を処置するための、および高用量シタラビンの反復投与を使って同定されるt（8;21）（q22;q22）またはinv（16）（p13q22）/t（16;16）（p13;q22）を持つ患者を処置するための、抗CLL1多鎖CAR発現細胞も提供する。
【０２４６】
好ましくは、本発明は、完全寛解率および生存率が低いことが示されている、-5/del（5q）、-7、3qの異常、または複合的核型（complex karyotype）などといった異形を持つAML罹患患者を処置するための、抗CLL1多鎖CAR発現細胞を提供する。
【０２４７】
別の一態様において、前述の、さまざまな方法によって得られる単離された細胞、または該単離された細胞から誘導される細胞株は、医薬として使用することができる。
【０２４８】
別の一態様において、該医薬は、CLL1陽性細胞に関連付けられる病変と診断された患者におけるがんまたは感染症を処置するために使用することができる。別の一態様において、本発明の単離された細胞または該単離された細胞から誘導される細胞株は、がん、特にAMLを処置するための医薬の製造において使用することができる。
【０２４９】
別の局面において、本発明は、処置を必要とする患者を処置するための方法であって、以下の工程のうちの少なくとも1つを含む方法に依拠する:
（a）前述の方法のいずれか一つによって得ることができる免疫細胞を用意する工程、
（b）該患者に該形質転換免疫細胞を投与する工程。
【０２５０】
一態様において、本発明のT細胞はロバストなインビボT細胞増加を起こすことができ、長期間にわたって存続することができる。
【０２５１】
該処置は、改善的処置、治療的処置または予防的処置であってもよい。これは、自家免疫療法処置の一部または同種異系免疫療法処置の一部のどちらかでありうる。自家とは、患者の処置に使用される細胞、細胞株または細胞集団が、当該患者またはヒト白血球抗原（HLA）適合ドナーに起源を有することを意味する。同種異系とは、患者の処置に使用される細胞または細胞集団が、当該患者に起源を有するのではなく、ドナーに起源を有することを意味する。
【０２５２】
本発明は、T細胞（典型的にはドナーから得られたもの）の非アロ反応性細胞への形質転換を可能にするという点で、同種異系免疫療法には特に適している。これは、標準的プロトコールで行うことができ、何度でも必要なだけ再現することができる。結果として得られる修飾されたT細胞はプールして、1人または数人の患者に投与しうることから、「既製の」治療用製品としての利用が可能になる。
【０２５３】
ここに開示する方法で使用することができる細胞は、前述のセクションに記載されている。処置は、がん、ウイルス感染、自己免疫障害または移植片対宿主病（GvHD）と診断された患者を処置するために使用することができる。処置しうるがんには、脈管形成した腫瘍の他、脈管形成していないか、まだ実質的には脈管形成していない腫瘍が含まれる。がんは、非固形腫瘍（血液腫瘍など、例えば白血病およびリンパ腫）を含むか、固形腫瘍を含みうる。本発明の多鎖CARで処置されるがんのタイプには、癌、芽細胞腫、および肉腫、ならびに一定の白血病またはリンパ系悪性疾患、良性および悪性腫瘍、ならびに悪性疾患、例えば肉腫、癌、および黒色腫が含まれるが、それらに限定されるわけではない。成人腫瘍/がんおよび小児腫瘍/がんも含まれる。
【０２５４】
投与:経路/薬量
本発明の好ましい一態様によれば、処置は、免疫抑制処置を受けている患者に施行される。事実、本発明は、好ましくは、少なくとも1つの免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活化によってそのような免疫抑制剤に対して耐性にした、細胞または細胞集団に依拠する。この局面において、免疫抑制処置は、患者内での本発明のT細胞の選択および増加を助けるはずである。本発明の細胞または細胞集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、埋植または移植によるなど、任意の好都合な方法で実行しうる。本明細書に記載する組成物は、患者の皮下、皮内、腫瘍内、節内（intranodally）、髄内、筋肉内に投与するか、静脈内注射またはリンパ管内注射によって投与するか、腹腔内に投与することができる。一態様において、本発明の細胞組成物は好ましくは静脈内注射によって投与される。
【０２５５】
別の一態様において、有効量の細胞、またはそれらの細胞を含む組成物は、非経口投与される。投与は静脈内投与であってもよい。投与は腫瘍内への注射によって直接的に行うことができる。
【０２５６】
細胞または細胞集団の投与は、体重1kgあたり104〜109細胞、好ましくは105〜106細胞/kg体重（これらの範囲内にある整数値の細胞数をすべて含む）の投与からなることができる。細胞または細胞集団は、1回または複数回、投与することができる。別の一態様において、有効量の細胞は、単回投与として投与される。別の一態様において、有効量の細胞は、ある期間にわたって2回以上の投薬として投与される。投与のタイミングは、管理する医師の判断により、患者の臨床状態に依存する。細胞または細胞集団は、血液バンクまたはドナーなど、任意の供給源から得ることができる。個々のニーズはさまざまであるが、特定の疾患または状態に関する所与の細胞タイプの有効量の至適範囲の決定は、当技術分野の技能の範囲内である。有効量とは、治療上または予防上の利益を与える量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、併用処置があればその種類、処置の頻度、および所望する効果の性質に依存するであろう。
【０２５７】
他の処置との併用
これは、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法および放射線療法の群から選択される1つまたは複数の抗がん療法との併用処置であってもよい。
【０２５８】
本発明の一定の態様において、細胞は、多くの関連処置モダリティ、例えば限定するわけではないが、抗ウイルス療法薬シドフォビルおよびインターロイキン2などの作用物質による処置、MS患者のためのシタラビン（ARA-Cとしても知られている）またはナタリズマブ処置、乾癬患者のためのエファリズマブ処置、またはPML患者のための他の処置と一緒に（例えば事前に、同時に、または事後に）、患者に投与される。さらなる態様において、本発明のT細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノラート、およびFK506などの免疫抑制剤、抗体、または他の免疫アブレーション剤、例えばCAM PATH、抗CD3抗体または他の抗体療法、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、および放射線照射と併用することができる。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼであるカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびFK506）、増殖因子が誘発するシグナリングにとって重要なp70S6キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Liu et al., Cell 66:807-815, 11; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Citrr. Opin. mm n. 5:763-773, 93）。さらに別の態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植と一緒に、あるいはフルダラビンなどの化学療法剤、体外放射線療法（XRT）、シクロホスファミド、またはOKT3もしくはCAMPATHなどの抗体を使用するT細胞アブレーション療法と一緒に（例えば事前に、同時に、または事後に）、患者に投与される。別の一態様において、本発明の細胞組成物は、CD20と反応する作用物質、例えばリツキサンなどのB細胞アブレーション療法後に投与される。例えば、一態様において、対象は、高用量化学療法とそれに続く末梢血幹細胞移植による標準的処置を受けうる。一定の態様では、移植後に、本発明の増加させた免疫細胞を対象に輸注する。さらなる一態様では、外科手術の前または後に、増加させた細胞を投与する。本明細書に記載する方法のいずれか一つによって得られる修飾された細胞は、本発明の特定の一局面において、処置を必要とする患者を宿主対移植片（HvG）拒絶および移植片対宿主病（GvHD）について処置するために使用することができる。したがって、処置を必要とする患者を、有効量の、不活化されたTCRアルファ遺伝子および/またはTCRベータ遺伝子を含む修飾（操作）された細胞を患者に投与することによって、宿主対移植片（HvG）拒絶および移植片対宿主病（GvHD）について処置する方法は、本発明の範囲内にある。
【実施例】
【０２５９】
文献PCT/EP2015/055848に開示されている方法はすべて参照により本明細書に組み入れられる。
【０２６０】
実施例1:多鎖CARの設計
IgEに対する高アフィニティー受容体（FcεRI）に基づいて、図2〜図4に図示するような、CLL1抗原を標的とする多鎖CARを設計した。肥満細胞および好塩基球上に発現したFcεRIはアレルギー反応をトリガーする。これは、単一のαサブユニット、単一のβサブユニット、およびジスルフィド連結した2つのγサブユニットで構成される四量体型複合体である。αサブユニットはIgE結合ドメインを含有している。βサブユニットとγサブユニットは、シグナル伝達を媒介するITAMを含有している。すべての多鎖CARにおいて、FcRα鎖の細胞外ドメインを除去して、それぞれ表5において言及した各scFvおよびCD8αヒンジ（SEQ ID NO:2）で置き換え、FcRβ鎖および/またはFcRγ鎖のITAMを除去した。結果として得られた構築物は表6に詳述する構造を有していた。
【０２６１】
実施例2:ヒトT細胞における抗CLL1 mcCARの発現
初代T細胞培養
EFS（Etablissement Francais du Sang（フランス血液機構）、フランス国パリ）によって提供されたバフィーコート試料から、Ficoll密度勾配媒体（Ficoll Paque PLUS/GE Healthcare Life Sciences）を使って、T細胞を精製した。PBMC層を回収し、市販のT細胞濃縮キット（Stem Cell Technologies）を使って、T細胞を精製した。20ng/mLヒトIL-2（Miltenyi Biotech）、5％ヒト血清（Sera Laboratories）、およびビーズ:細胞比が1:1のDynabeads Human T activator CD3/CD28（Life Technologies）を補足したX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）中で、精製T細胞を活性化した。活性化後は、20ng/mLヒトIL-2（Miltenyi Biotec）および5％ヒト血清（Sera Laboratories）を補足したX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）中で、細胞を成長させ、維持した。
【０２６２】
AMLおよびクロロファラビン、フルダラビンまたはシタラビン耐性AMLのモデル
元々、MOLM13細胞株などのAML陽性細胞株は、急性骨髄性白血病AML FAB M5aを持つ20歳男性の末梢血から、最初の骨髄異形成症候群（MDS、芽球増加型不応性貧血、RAEB）後の1995年における再発時に樹立されたものである。
【０２６３】
MOLM13-Luc細胞株およびdckノックアウトMOLM13-Luc細胞株（クロロファラビン、フルダラビンまたはシタラビン耐性MOLM13-Luc細胞株）を樹立するために、デオキシシチジンキナーゼ活性を有する酵素（dcK-EC 2.7.1.74）を発現する遺伝子、すなわちヒトデオキシシチジンキナーゼ遺伝子（NCBI Gene ID:1633）を特異的標的とするレアカットエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列、ならびにGFPおよびホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルス（amsbio LVP438-PBS）を、MOLM13細胞（DSMZ ACC 554）にトランスフェクトした。
【０２６４】
GFP陽性細胞をネオマイシン（ref 10131-027、Gibco、Life Technologies、フランス国サントーバン）で選択した。クロロファラビン、フルダラビンまたはシタラビンの存在下で、cdk KO MOLM13-Luc細胞のクロロファラビン、フルダラビンまたはシタラビンに対する耐性を試験した。
【０２６５】
T細胞における一過性発現
ポリシストロニックmRNAを使って操作された生T細胞は、その表面に多鎖CARを発現した。多鎖CARは、ポリシストロニックmRNAのエレクトロポレーション後に、ヒトT細胞中で発現させることができる。mMESSAGE mMACHINEキットを使用し、線状化プラスミドをテンプレートとして作製したキャップ化およびポリアデニル化されたポリシストロニックmRNAを、T細胞にエレクトロポレートした。テンプレートとして使用したプラスミドは、T7 RNAポリメラーゼプロモーターを含有し、さまざまなCAR変異体をコードするポリシストロニックDNA配列がそれに続いていた。
【０２６６】
ヒトT細胞へのポリシストロニックmRNAのエレクトロポレーションは、CytoLVT-Sデバイス（Cellectis）を使用し、以下のプロトコールに従って行った。抗CD3/CD28被覆ビーズおよびIL2で数日（3〜5日）にわたって事前に活性化しておいた5×106個のT細胞を、サイトポレーション（cytoporation）バッファーTに再懸濁し、0.4cmキュベット中で45μgのmRNAをエレクトロポレートした。
【０２６７】
エレクトロポレーションの24時間後に、多鎖CARをコードするポリシストロニックmRNAを使って操作されたヒトT細胞を、固定可能な生存率解析色素（fixable viability dye）eFluor-780およびPEコンジュゲートヤギ抗マウスIgG F（ab'）2フラグメント特異的で標識し、フローサイトメトリーで分析した。
【０２６８】
多鎖CARをコードするポリシストロニックmRNAを使って操作されたヒトT細胞を、標的（Daudi）細胞またはAML細胞株対照細胞と共に24時間にわたって共培養した。次に上清を収集し、TH1/TH2サイトカインサイトメトリービーズアレイキットを使って分析して、T細胞によって生産されたサイトカインを定量した。このアッセイの目的は、多鎖CARを発現するヒトT細胞がCLL1発現標的細胞との共培養ではIFNγ、IL8およびIL5を生産するが、対照細胞との共培養ではそうでないことを示すことにある。
【０２６９】
T細胞形質導入およびCAR検出
T細胞の精製/活性化の3日後に、mcCARの発現に加えて、組換えレンチウイルスベクターによるT細胞の形質導入を実行した。レンチウイルスベクターは、HEK-293細胞へのゲノムプラスミドおよびヘルパープラスミドのトランスフェクションにより、Vectalys SA（フランス国トゥールーズ）によって作製された。形質導入は、形質導入1回あたり106個の細胞を使って、感染多重度5で行った。T細胞表面におけるCAR検出は、ヒトCLL1タンパク質の細胞外ドメインとマウスIgG1 Fcフラグメントとの融合物（LakePharmaが作製したもの）からなる組換えタンパク質を使って行った。CAR分子へのこのタンパク質の結合は、タンパク質のマウスFc部分を標的とするPEコンジュゲート二次抗体（Jackson Immunoresearch）で検出し、フローサイトメトリーで分析した。
【０２７０】
実施例3:抗CLL1 mcCARを一過性に発現するT細胞の、標的細胞との共培養に続く脱顆粒
エレクトロポレーションの24時間後に、多鎖CARをコードするポリシストロニックmRNAを使って操作されたヒトT細胞を、標的（Daudi）細胞またはAML細胞株対照細胞と共に、6時間にわたって共培養した。次に、CD8+ T細胞を、その表面における脱顆粒マーカーCD107aの発現を検出するために、フローサイトメトリーで分析した。この実験の目的は、CLL1多鎖CARを発現するヒトCD8+ T細胞がCLL1発現標的細胞との共培養では脱顆粒するが、対照細胞との共培養では脱顆粒しないことを調べることにある。
【０２７１】
脱顆粒アッセイ（CD107a動員）
T細胞を、等量のCLL1タンパク質を発現する細胞またはCLL1タンパク質を発現しない細胞と一緒に、96ウェルプレートにおいてインキュベートした（40,000細胞/ウェル）。共培養を、最終体積100μlのX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）中に、37℃、5％CO2で、6時間維持した。共培養の開始時に蛍光抗CD107a抗体（APCコンジュゲート、Miltenyi Biotec製）を1μg/mlの抗CD49d（BD Pharmingen）、1μg/mlの抗CD28（Miltenyi Biotec）、および1×モネンシン溶液（eBioscience）と一緒に添加することにより、細胞刺激中にCD107a染色を行った。6時間のインキュベーション期間後に、細胞を固定可能な生存率解析色素（eFluor 780、eBioscience製）および蛍光色素コンジュゲート抗CD8（PEコンジュゲート、Miltenyi Biotec）で染色し、フローサイトメトリーで分析した。
【０２７２】
脱顆粒活性は、CD8+/CD107a+細胞の％として、CD8+細胞の中でCD107a染色に関する平均蛍光強度シグナル（MFI）を決定することによって決定した。脱顆粒アッセイは、mcCARによるT細胞形質導入の8〜10日後に実行した。
【０２７３】
実施例4:抗CLL1 mcCARを一過性に発現するT細胞による標的細胞の溶解
エレクトロポレーションの24時間後に、多鎖CARをコードするポリシストロニックmRNAを使って操作されたヒトT細胞を、4時間にわたって標的（Daudi）細胞またはAML細胞株対照細胞と共培養した。次に標的細胞を、その生存率を分析するために、フローサイトメトリーで分析した。このアッセイの目的は、CLL1多鎖CARを発現するさまざまな細胞が、CLL1発現標的細胞を溶解するが、対照細胞を溶解しないことを示すことにある。
【０２７４】
細胞毒性アッセイ
T細胞を、96ウェルプレートにおいて、同じウェル中で10,000個の標的細胞（さまざまなレベルのCLL1を発現するもの）および10,000個の対照（CLL1neg）細胞と共にインキュベートした（100,000細胞/ウェル）。標的細胞および対照細胞をCAR+ T細胞（mcCAR+ T細胞またはmcCAR+ T細胞）と共培養する前に、それらを蛍光細胞内色素（CFSEまたはCell Trace Violet、Life Technologies製）で標識した。共培養物を37℃、5％CO2で4時間インキュベートした。このインキュベーション期間後に、固定可能な生存率解析色素（eFluor 780、eBioscience）で細胞を標識し、フローサイトメトリーで分析した。各細胞集団（標的細胞またはCLL1neg対照細胞）の生存率を決定し、特異的細胞溶解の％を算出した。細胞毒性アッセイはmRNAトランスフェクションの48時間後に実行した。
【０２７５】
実施例5:抗腫瘍マウスモデル
動物の飼育および実験手順は、フランスおよび欧州の規則ならびにNRCの実験動物の管理と使用に関する指針に従って、Oncodesign（フランス国ディジョン; http://www.oncodesign.com/）によって実行された。6〜8週齢の免疫不全メスNOG（NOG）マウス（NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtm1Sug/JicTac）マウス（NODはnon-obese diabetic（非肥満糖尿病）を表す）をTaconic（デンマーク国リュー）から入手した。実験の一方のアームでは、マウスにクロロファラビンまたはフルダラビンを与えた。MOLM13-ルシフェラーゼ細胞またはクロロファラビン耐性MOLM13-ルシフェラーゼ細胞を、それぞれAMLマウスモデルおよびクロロファラビン耐性AMLマウスモデルとして、マウスに静脈内（iv）注射した。次に、用量の異なるmcCAR+ T細胞（104〜5×106）またはCARレンチウイルスベクターによる形質導入が何もなされていないT細胞を、（腫瘍細胞株の注射の7日後に）マウスにiv注射した。
【０２７６】
異なる動物における腫瘍進行を追跡するために、T細胞注射の前日（D-1）ならびにT細胞注射後のD7およびD14に生物発光シグナルを決定した。
【０２７７】
実施例6:CLL1-mcCARを発現するTCRアルファ不活化細胞の増殖
T細胞受容体アルファ定常鎖領域（TRAC）遺伝子内の15bpのスペーサーによって隔てられた2つの17bp長配列（半標的という）を標的とするヘテロ二量体型TALEヌクレアーゼを設計し、作製した。各半標的は表8に示す半TALEヌクレアーゼのリピートによって認識される。
【０２７８】
（表８）TCRアルファ遺伝子を標的とするTALヌクレアーゼ
2018504144.tif 000041
【０２７９】
各TALEヌクレアーゼコンストラクトを、制限酵素消化を使って、哺乳類発現ベクター中、T7プロモーターの制御下に、サブクローニングした。TRACゲノム配列を切断するTALEヌクレアーゼをコードするmRNAは、T7プロモーターから下流にコード配列を保持するプラスミドから合成された。
【０２８０】
抗CD3/CD28被覆ビーズで72時間にわたって事前に活性化しておいた精製T細胞に、両方の半TRAC_T01 TALEヌクレアーゼをコードする2つのmRNAのそれぞれをトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、同じドナーからのT細胞の異なる群を、それぞれ、前述の抗CLL1 mcCAR（SEQ ID NO:18〜37）の一つをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。形質導入の2日後に、抗CD3磁気ビーズを使ってCD3NEG細胞を精製し、形質導入の5日後に、可溶性抗CD28（5μg/ml）を使って細胞を再活性化した。
【０２８１】
1.週に2回細胞をカウントすることにより、再活性化後最大30日にわたって、細胞増殖を追跡した。CLL1 mcCARを発現するTCRアルファ不活化細胞では、非形質導入細胞と比較して増加した増殖が、特に抗CD28で再活性化した場合に観察された。
【０２８２】
CLL1-mcCARを発現するヒトT細胞が活性化された状態を呈するかどうかを調べるために、活性化マーカーCD25の発現を形質導入の7日後に、FACSによって分析する。CLL1 mcCARをコードするレンチウイルスベクターで形質導入された精製細胞を、非形質導入細胞と比較してその活性化を評価するために、その表面におけるCD25発現についてアッセイする。CD28再活性化条件でも非再活性化条件でもCD25発現の増加が予想される。
【図１】
2018504144.tif 000044
【図２】
2018504144.tif 000045
【図３】
2018504144.tif 000046
【図４】
2018504144.tif 000047
【図５Ａ】
2018504144.tif 000048
【図５Ｂ】
2018504144.tif 000049
【配列表】
2018504144000001.app
【国際調査報告】
2018504144.tif 000050
2018504144.tif 000051
2018504144.tif 000052
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