(57)【要約】第１および第２分子を連結するらせん状コイルドコイル型構造のコネクタであって、該第１分子が、ペプチド性第１アルファらせんを含み、該第２分子が、ペプチド性第２アルファらせんを含み、その第２アルファらせんが、該第１アルファらせんに巻き付いており；ここで、該第１アルファらせんは、以下：ｉ）アミノ酸モチーフａ−ｘのリピートおよび該Ｃ末端モチーフａ−ｘ１−ｘ２からなるＣ末端領域；またはｉｉ）アミノ酸モチーフｘ１−ａのリピートおよび該Ｎ末端モチーフｘ２−ｘ１−ａからなるＮ末端領域；を含み；ここで、ａは、４〜８アミノ酸のモチーフ配列であり；ｘ１は、リジンであり；そしてｘ２は、該モチーフの拡張であり、ここで、該拡張は、１〜１０アミノ酸からなり、かつここで、該拡張は、前記のモチーフａ−ｘ１またはｘ１−ａ中に組み込まれている４個より多くの連続するアミノ酸を含まないコネクタ；ならびにそのようなコネクタにより互いに連結された少なくとも２個のポリペプチド鎖を含む多量体タンパク質であって、第１ポリペプチド鎖が、該第１アルファらせんを組み込んでおり、かつ該第２第１ポリペプチド鎖が、該第２アルファらせんを組み込んでおり、かつ該第１および第２ポリペプチド鎖が、該第１および第２アルファらせんのらせん状コイルドコイル型構造により連結されている多量体タンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１および第２分子を連結するらせん状コイルドコイル型構造のコネクタであって、該第１分子が、ペプチド性第１アルファらせんを含み、該第２分子が、ペプチド性第２アルファらせんを含み、その第２アルファらせんが、該第１アルファらせんに巻き付いており；
ここで、該第１アルファらせんは、以下：
ｉ）アミノ酸モチーフａ−ｘ１のリピートおよびＣ末端モチーフａ−ｘ１−ｘ２からなるＣ末端領域；または
ｉｉ）アミノ酸モチーフｘ１−ａのリピートおよびＮ末端モチーフｘ２−ｘ１−ａからなるＮ末端領域；
を含み、ここで
ａは、４〜８アミノ酸のモチーフ配列であり；
ｘ１は、リジンであり；そして
ｘ２は、モチーフの拡張であり、ここで、該拡張は、１〜１０アミノ酸からなり、かつここで、該拡張は、前記のモチーフａ−ｘ１またはｘ１−ａ中に組み込まれている４個より多くの連続するアミノ酸を含まない、上記コネクタ。
【請求項２】
拡張が、アラニン、グリシン、セリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、バリン、およびプロリンからなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸を含む、請求項１に記載のコネクタ。
【請求項３】
拡張が、アルファらせんを拡張する最初の１〜４アミノ酸内に前記の選択されたアミノ酸を含む、請求項２に記載のコネクタ。
【請求項４】
第１および第２アルファらせんのそれぞれが、２〜９個、好ましくは３〜５個の合致するアミノ酸モチーフのリピートを含み、好ましくは該リピートが、同一のモチーフの、または互いに少なくとも１アミノ酸異なるモチーフのリピートである、請求項１〜３のいずれかに記載のコネクタ。
【請求項５】
らせん状コイルドコイル型構造中に、合致するアミノ酸リピート配列を有する２〜７個のアルファらせんの束を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のコネクタ。
【請求項６】
第１および第２アルファらせんが、平行または逆平行アルファらせんであり、好ましくは第１および第２アルファらせんが、巻き付いてコイルドコイル２重らせんになっている、請求項１〜５のいずれかに記載のコネクタ。
【請求項７】
ヘテロ２量体性コイルドコイルを含み、第１アルファらせんが、第２アルファらせんと異なっている、請求項１〜６のいずれかに記載のコネクタ。
【請求項８】
ａ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  １、ＳＥＱ  ＩＤ  ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ５、およびＳＥＱ  ＩＤ  ７からなる群から選択され；または
ｂ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ４、ＳＥＱ  ＩＤ  ６、およびＳＥＱ  ＩＤ  ８からなる群から選択される、
請求項１〜７のいずれかに記載のコネクタ。
【請求項９】
ａ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  １であり、かつモチーフａ−ｘ１−ｘ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ６９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７１のいずれかであり、該モチーフａ−ｘ１−ｘ２が、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｂ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ３であり、かつモチーフａ−ｘ１−ｘ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ８５、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ８７のいずれかであり、該モチーフａ−ｘ１−ｘ２が、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｃ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ５であり、かつモチーフａ−ｘ１−ｘ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ４５、ＳＥＱ  ＩＤ  １０１、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １０３のいずれかであり、該モチーフａ−ｘ１−ｘ２が、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｄ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ７であり、かつモチーフａ−ｘ１−ｘ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ４７、ＳＥＱ  ＩＤ  １１７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１９のいずれかであり、該モチーフａ−ｘ１−ｘ２が、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｅ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ２であり、かつモチーフｘ２−ｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ７７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７９のいずれかであり、該モチーフｘ２−ｘ１−ａが、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｆ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４であり、かつモチーフｘ２−ｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ９３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ９５のいずれかであり、該モチーフｘ２−ｘ１−ａが、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｇ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ６であり、かつモチーフｘ２−ｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４６、ＳＥＱ  ＩＤ  １０９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１１のいずれかであり、該モチーフｘ２−ｘ１−ａが、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｈ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ８であり、かつモチーフｘ２−ｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４８、ＳＥＱ  ＩＤ  １２５、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １２７のいずれかであり、該モチーフｘ２−ｘ１−ａが、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されている、
請求項１〜８のいずれかに記載のコネクタ。
【請求項１０】
ａ）第１アルファらせんがモチーフａ−ｘ１を含み、かつ第２アルファらせんがモチーフｘ１−ａを含み；または
ｂ）第１アルファらせんがモチーフｘ１−ａを含み、かつ第２アルファらせんがモチーフａ−ｘ１を含み；
好ましくは、モチーフａ−ｘ１を含むアルファらせんがＣ末端モチーフａ−ｘ１−ｘ２をさらに含み、かつモチーフｘ１−ａを含むアルファらせんがＮ末端モチーフｘ２−ｘ１−ａをさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載のコネクタ。
【請求項１１】
ａ）
ｉ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  １であり；
ｉｉ）モチーフａ−ｘ１−ｘ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ６９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７１のいずれかであり；
ｉｉｉ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ２であり；そして
ｉｖ）モチーフｘ２−ｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ７７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７９のいずれかであり；
または
ｂ）
ｉ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ３であり；
ｉｉ）モチーフａ−ｘ１−ｘ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ８５、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ８７のいずれかであり；
ｉｉｉ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４であり；そして
ｉｖ）モチーフｘ２−ｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ９３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ９５のいずれかであり；
または
ｃ）
ｉ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ５であり；
ｉｉ）モチーフａ−ｘ１−ｘ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ４５、ＳＥＱ  ＩＤ  １０１、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １０３のいずれかであり；
ｉｉｉ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ６であり；そして
ｉｖ）モチーフｘ２−ｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４６、ＳＥＱ  ＩＤ  １０９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１１のいずれかであり；
または
ｄ）
ｉ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ７であり；
ｉｉ）モチーフａ−ｘ１−ｘ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ４７、ＳＥＱ  ＩＤ  １１７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１９のいずれかであり；
ｉｉｉ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ８であり；そして
ｉｖ）モチーフｘ２−ｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４８、ＳＥＱ  ＩＤ  １２５、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １２７のいずれかである、
請求項９に記載のコネクタ。
【請求項１２】
Ｘ２が、１個のアミノ酸、好ましくはアラニン、グリシン、またはセリンのいずれかからなる、請求項１〜１１のいずれかに記載のコネクタ。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載のコネクタにより互いに連結された少なくとも２個のポリペプチド鎖を含む多量体タンパク質であって、第１ポリペプチド鎖が第１アルファらせんを組み込んでおり、かつ第２ポリペプチド鎖が第２アルファらせんを組み込んでおり；かつ第１および第２ポリペプチド鎖が第１および第２アルファらせんのらせん状コイルドコイル型構造により連結されており、好ましくは該タンパク質が、以下：
ａ）ワクチン抗原およびアジュバントを含むワクチン構成要素；
ｂ）２個のポリペプチド鎖のそれぞれが少なくとも１個の抗体ドメインを組み込んでいる抗体または抗体形式；
ｃ）抗体および非抗体構成要素を含む抗体誘導体であって、ここで、該抗体の少なくとも１個のポリペプチド鎖が、該構成要素を組み込んでいる別のポリペプチド鎖に連結されており、好ましくは該構成要素が、有機および無機分子、特に標識、タグ、酵素、受容体、リガンド、毒素、脂質、炭水化物、または核酸のいずれかである；ならびに
ｄ）受容体またはリガンドが、キャリヤーに連結されている親和性物質；
からなる群から選択される、
上記多量体タンパク質。
【請求項１４】
ａ）第１アルファらせんを組み込んでいる第１ポリペプチド鎖が、アミノ酸モチーフａ−ｘ１のリピートおよびＣ末端モチーフａ−ｘ１−ｘ２からなるＣ末端領域を含み；かつ第２ポリペプチド鎖が、第２アルファらせんを平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはＣ末端領域中に組み込んでおり；または
ｂ）第１アルファらせんを組み込んでいる第１ポリペプチド鎖が、アミノ酸モチーフａ−ｘ１のリピートおよびＣ末端モチーフａ−ｘ１−ｘ２からなるＣ末端領域を含み；かつ第２ポリペプチド鎖が、第２アルファらせんを逆平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはＮ末端領域中に組み込んでおり、または
ｃ）第１アルファらせんを組み込んでいる第１ポリペプチド鎖が、アミノ酸モチーフｘ１−ａのリピートおよびＮ末端モチーフｘ２−ｘ１−ａからなるＮ末端領域を含み；かつ第２ポリペプチド鎖が、第２アルファらせんを平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはＮ末端領域中に組み込んでおり；または
ｄ）第１アルファらせんを組み込んでいる第１ポリペプチド鎖が、アミノ酸モチーフｘ１−ａのリピートおよびＮ末端モチーフｘ２−ｘ１−ａからなるＣ末端領域を含み；かつ第２ポリペプチド鎖が、第２アルファらせんを逆平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはＣ末端領域中に組み込んでいる、
請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載のタンパク質を生成する方法であって、以下の工程：
ａ）第１ポリペプチド鎖をコードする第１異種核酸を組み込んでいる第１宿主細胞を提供し；
ｂ）第２ポリペプチド鎖をコードする第２異種核酸を組み込んでいる第２宿主細胞を提供し；
ｃ）宿主細胞を、第１および第２ポリペプチド鎖を細胞培養において発現させるための条件下で培養し；そして
ｄ）第１および第２ポリペプチド鎖をらせん状コイルドコイル型構造により連結する；
を含み、好ましくは該第１および／または第２宿主細胞が、哺乳類または酵母宿主細胞である、上記方法。
【請求項１６】
請求項１３または１４に記載のタンパク質を生成する方法であって、以下の工程：
ａ）以下：
（ｉ）第１ポリペプチド鎖をコードする第１異種核酸；
および
（ｉｉ）第２ポリペプチド鎖をコードする第２異種核酸；
を組み込んでいる宿主細胞を提供し；
ｂ）宿主細胞を、第１および第２ポリペプチド鎖を細胞培養において発現させるための条件下で培養し；そして
ｃ）第１および第２ポリペプチド鎖をらせん状コイルドコイル型構造により連結する；
を含み、好ましくは該宿主細胞が、哺乳類または酵母宿主細胞である、上記方法。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の方法により得ることができるタンパク質の調製物であって、該タンパク質分子の少なくとも９０％が、第１および第２核酸によりコードされるポリペプチド鎖の正しいＣ末端およびＮ末端領域を含む、上記調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コイルドコイルを形成する少なくとも２つの合致するペプチド性アルファらせんを含むらせん状コイルドコイル型構造を有するコネクタに関し、前記のコネクタは、末端アミノ酸付加により向上している。
【背景技術】
【０００２】
コイルドコイルは、２〜７個のアルファらせんが縄の子縄のように一緒に巻き付いているタンパク質中の構造モチーフからなり；２量体および３量体が、最も一般的なタイプである。そのような構造は、複合体タンパク質分子の安定性および折り畳み構造を向上させることができる。コイルドコイルは、多量体タンパク質または例えば複合ワクチン免疫原もしくは抗体融合構築物を含む（１個以上のポリペプチド鎖および場合によりさらなる非ポリペプチド構成要素により特性付けられる）タンパク質性構築物の構成要素を連結するために用いられてきた。
【０００３】
コイルドコイルらせんは、Ｆｖ抗体フラグメントを安定化するために用いられており、それは結果としてヘテロ２量体状コイルドコイルドメインをもたらす（Arndt et al. 2001. Helix-stabilized Fv (hsFv) antibody fragments: substituting the constant domains of a Fab fragment for a heterodimeric coiled-coil domain. J Mol. Biol. 312:221-228）。
【０００４】
コイルドコイルの原理は、精製目的で（例えば、Chao et al 1998. Use of a heterodimeric coiled-coil system for biosensor application and affinity purification. J.Chromatogr.B Biomed.Sci.Appl. 715:307-329）、ならびに例えば成長因子受容体に関するリガンドとして試験されるべきタンパク質の係留（Boucher et al. 2009. Epidermal Growth Factor Tethered through Coiled-Coil Interactions Induces Cell Surface Receptor Phosphorylation. Bioconjug.Chem.1569-1577）のためにも用いられている。
【０００５】
国際公開第２０１４００９２０９Ａ２号は、免疫原およびアジュバントにより形成されるコイルドコイルを含むワクチンを開示しており、ここで、アジュバントは、少なくともＴＬＲ９リガンドおよび第１ペプチド性アルファらせんに連結された抗ＣＤ３２部分を含み、免疫原は、少なくとも１個のエピトープおよび第１アルファらせんに巻き付いた第２ペプチド性アルファらせんを含む。
【０００６】
第１アルファらせんは、典型的には第１モチーフの多価基（ｐｏｌｙａｄ）リピートで作られている（多価基リピートを含む、または多価基リピートからなる）。（カウンターモチーフの多価基リピートを含む、または多価基リピートからなる）合致する第２アルファらせんは、第１アルファらせんと自己集合し、そうしてコイルドコイルを形成し、アルファらせんのそれぞれに融合した部分を高い親和性で連結する。
【０００７】
米国特許出願公開第２０１５０１６６６１０Ａ１号および国際公開第２０１５０１８８０６Ａ１号は、Ｃ末端のコイルドコイルドメインにより安定化された免疫原性組成物を記載している。
【０００８】
国際公開第２０１５００６７３６Ａ２号は、免疫グロブリンがコイルドコイルにより療法剤に連結されている融合タンパク質を記載している。
国際公開第９４／２９３３３２Ａ１号は、分子内、逆平行、コイルドコイルステムループ配置で立体構造的に締め付けられているポリペプチドを記載している。ループ区分は、第１アルファらせん構造のカルボキシ末端および第２アルファらせん構造のアミノ末端の間にコネクタを含む。
【０００９】
Richardson et al. (Science 1988, 240:1648-1652)は、アルファらせんの末端における特定の位置に関するアミノ酸優先性を記載している。４５の異なる球状タンパク質構造からの２１５のアルファらせんの比較の結果は、ＣキャップまたはＮキャップの位置における特定のアミノ酸のある程度の優先性を示した。Serrano et al. (Journal of Molecular Biology 1992, 227(2):544-559)は、タンパク質におけるアルファらせんの安定性ならびにＮキャップ、Ｃキャップおよび内部の位置における変異の安定性への作用を記載している。
【００１０】
国際公開第２０１４１８７７４３Ａ１号は、２個の異なるアルファらせんのコイルドコイルを含むガストリンペプチド免疫原性組成物を記載している。
複合体タンパク質分子の安定性および折り畳み構造は、免疫原のような医薬を設計する際に非常に重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２０１４００９２０９Ａ２号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１５０１６６６１０Ａ１号
【特許文献３】国際公開第２０１５０１８８０６Ａ１号
【特許文献４】国際公開第２０１５００６７３６Ａ２号
【特許文献５】国際公開第９４／２９３３３２Ａ１号
【特許文献６】国際公開第２０１４１８７７４３Ａ１号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Arndt et al. 2001. Helix-stabilized Fv (hsFv) antibody fragments: substituting the constant domains of a Fab fragment for a heterodimeric coiled-coil domain. J Mol. Biol. 312:221-228
【非特許文献２】Chao et al 1998. Use of a heterodimeric coiled-coil system for biosensor application and affinity purification. J.Chromatogr.B Biomed.Sci.Appl. 715:307-329
【非特許文献３】Boucher et al. 2009. Epidermal Growth Factor Tethered through Coiled-Coil Interactions Induces Cell Surface Receptor Phosphorylation. Bioconjug.Chem.1569-1577
【非特許文献４】Richardson et al. (Science 1988, 240:1648-1652)
【非特許文献５】Serrano et al. (Journal of Molecular Biology 1992, 227(2):544-559)
【発明の概要】
【００１３】
複合ポリペプチドまたはタンパク質を設計するための構築ブロックとして用いられることができる向上した安定性および構造を有するコイルドコイルコネクタを提供することが、本発明の目的である。
【００１４】
目的は、特許請求される主題により解決される。
本発明によれば、第１および第２分子を含むらせん状コイルドコイル型構造のコネクタが提供され、特にここで、第１および第２分子のそれぞれは、ポリペプチド部分またはポリペプチド鎖を含むタンパク質性分子であり、ここで、第１分子は、ペプチド性第１アルファらせんを含み、かつ第２分子は、ペプチド性第２アルファらせんを含み、その第２アルファらせんは、第１アルファらせんに巻き付いており；
ここで、第１アルファらせんは、以下：
ｉ）アミノ酸モチーフａ−ｘ１のリピートおよびＣ末端モチーフａ−ｘ１−ｘ２からなるＣ末端領域；または
ｉｉ）アミノ酸モチーフｘ１−ａのリピートおよびＮ末端モチーフｘ２−ｘ１−ａからなるＮ末端領域；
を含み、ここで
ａは、４〜８アミノ酸のモチーフ配列であり；
ｘ１は、リジンであり；そして
ｘ２は、モチーフの拡張であり、ここで、拡張は、１〜１０アミノ酸からなり、かつここで、拡張は、前記のモチーフａ−ｘ１またはｘ１−ａ中に組み込まれている４個より多くの連続するアミノ酸を含まない。
【００１５】
具体的には、拡張のアミノ酸は、天然アミノ酸である。
具体的には、拡張は、アラニン、グリシン、セリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、バリン、およびプロリンからなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸を含む。
【００１６】
具体的には、拡張は、アルファらせん、特に（未拡張の）アルファらせんの末端またはキャップを拡張する最初の１〜４アミノ酸内に前記の選択されたアミノ酸を含む。
具体的には、モチーフ配列ａは、天然アミノ酸のいずれかの配列からなる。好ましくは、モチーフ配列は、モチーフリピートにおける疎水性残基の周期性およびアルファらせんの傾向を確実にするために少なくとも１個の疎水性アミノ酸を含む。
【００１７】
具体的には、コネクタは、コイル状アルファらせん（すなわち、アルファらせんの長軸方向の集合）を含むか、またはコイル状アルファらせんからなる。コネクタは、特に（例えば、ホモ２量体を得るために）同じ構造の２個の分子を、または（例えば、ヘテロ２量体を得るために）２個の異なる分子を連結するための構築ブロックとして用いられる。特に、分子の一方または両方は、タンパク質性であり、例えば、好ましくはポリペプチド鎖、特にコネクタのアルファらせん（連結部として用いられる）に融合しているポリペプチド鎖からなるポリペプチド部分を組み込んでいる。
【００１８】
具体的には、前記の第１および第２アルファらせんのそれぞれは、２〜９個、好ましくは３〜５個の合致するアミノ酸モチーフのリピートを含む。同じ数のリピートが、アルファらせんのそれぞれの上に存在することができるが、異なる数のリピートが存在することもできる。例えば、コイルのリピートの数は、ペプチド性アルファらせんのそれぞれにおいて３〜５、すなわち、組み合わせ３＋３、３＋４、３＋５、４＋４、４＋５、５＋５、４＋３、５＋３または５＋４のいずれであることもできる。
【００１９】
具体的には、リピートは、同一のモチーフまたは少なくとも１アミノ酸、典型的には１もしくは２アミノ酸において互いと異なるモチーフのリピートである。モチーフのバリアントが、そのようなバリアントモチーフが機能する限り、用いられることができ、すなわちここで、そのアルファらせんは、高い親和性で、例えば１０−７Ｍ未満のＫＤまたは１０−８Ｍ未満のＫＤで自己集合することができる。
【００２０】
ヘテロ２量体性コイルドコイルの場合、コイルリピートの典型的な数は、構造の望ましくないミスマッチを回避するため、具体的には５より多くない。ヘテロ２量体性コイルドコイルの場合、典型的には、少なくとも３リピートを有するペプチド配列の長さを用いることが望ましい。それにより、アルファらせんの互いへの結合は、典型的には１０−７Ｍ未満のＫＤまたは１０−８Ｍ未満、好ましくは１０−９Ｍもしくは１０−１０Ｍ未満のＫＤで達成される。しかし、より多くのリピートは親和性を増大させるが、これは、ホモ２量体化の増大という代償を伴い得る。
【００２１】
具体的には、前記の第１および第２アルファらせんのそれぞれは、６、７、８または９アミノ酸、好ましくは７アミノ酸からなるアミノ酸モチーフのリピートを含む。そのようなモチーフは、それが例えば６〜９アミノ酸の長さを有するある数の連続するアミノ酸からなるため、多価基とも名付けられている。７アミノ酸モチーフが、典型的には用いられ、本明細書において７つ組と呼ばれる。あるいは、６つ組（すなわち６アミノ酸）モチーフ、８つ組（すなわち８アミノ酸）モチーフ、または９つ組（すなわち９アミノ酸）モチーフが、用いられることができる。
【００２２】
具体的には、コネクタは、らせん状コイルドコイル型構造中に合致するアミノ酸リピート配列を有する２〜７個のアルファらせんの束を含む。
特定の態様によれば、第１および第２アルファらせんは、巻き付いてコイルドコイル（換言すると、集合した）二重らせんになっている。
【００２３】
互いに巻き付いているアルファらせん構造を有する２個のペプチド鎖は、本明細書において２量体と呼ばれる。特定の例は、２個以上のアルファらせんを含み、ここで、アルファらせんは、同一である（ホモマー、例えばホモ２量体）、または互いに異なる（ヘテロマー、例えばヘテロ２量体）可能性がある。３量体、４量体または５量体は、例えばそれぞれ３、４および５個のアルファらせんで構成されるオリゴマーである。
【００２４】
特定の側面によれば、コネクタは、第１アルファらせんが第２アルファらせんと異なるヘテロ２量体性コイルドコイルを含むか、またはヘテロ２量体性コイルドコイルからなる。
【００２５】
特定の態様によれば、
ａ）モチーフａ−ｘ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  １、ＳＥＱ  ＩＤ  ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ５、およびＳＥＱ  ＩＤ  ７からなる群から選択され；または
ｂ）モチーフｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ４、ＳＥＱ  ＩＤ  ６、およびＳＥＱ  ＩＤ  ８からなる群から選択される。
【００２６】
あるいは、特異的コイルドコイル型連結を生成する、Chao et al.（原文のまま）またはLitowsky et al.（2002. Designing heterodimeric two-stranded alpha-helical coiled-coils. Effects of hydrophobicity and alpha-helical propensity on protein folding, stability, and specificity. J. Biol. Chem. 277:37272-37279）により記載された配列または機能的バリアントのいずれが用いられることもできる：
特定の例によれば、
ａ）モチーフａ−ｘ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  １であり、モチーフａ−ｘ１−ｘ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ６９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７１のいずれかであり、そのモチーフａ−ｘ１−ｘ２は、場合により（例えばカルボキシル末端において）１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｂ）モチーフａ−ｘ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ３であり、モチーフａ−ｘ１−ｘ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ８５、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ８７のいずれかであり、そのモチーフａ−ｘ１−ｘ２は、場合により（例えばカルボキシル末端において）１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｃ）モチーフａ−ｘ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ５であり、モチーフａ−ｘ１−ｘ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ４５、ＳＥＱ  ＩＤ  １０１、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １０３のいずれかであり、そのモチーフａ−ｘ１−ｘ２は、場合により（例えばカルボキシル末端において）１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｄ）モチーフａ−ｘ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ７であり、モチーフａ−ｘ１−ｘ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ４７、ＳＥＱ  ＩＤ  １１７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１９のいずれかであり、そのモチーフａ−ｘ１−ｘ２は、場合により（例えばカルボキシル末端において）１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｅ）モチーフｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ２であり、モチーフｘ２−ｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ７７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７９のいずれかであり、そのモチーフｘ２−ｘ１−ａは、場合により（例えばアミノ末端において）１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｆ）モチーフｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ４であり、モチーフｘ２−ｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ９３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ９５のいずれかであり、そのモチーフｘ２−ｘ１−ａは、場合により（例えばアミノ末端において）１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｇ）モチーフｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ６であり、モチーフｘ２−ｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ４６、ＳＥＱ  ＩＤ  １０９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１１のいずれかであり、そのモチーフｘ２−ｘ１−ａは、場合により（例えばアミノ末端において）１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｈ）モチーフｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ８であり、モチーフｘ２−ｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ４８、ＳＥＱ  ＩＤ  １２５、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １２７のいずれかであり、そのモチーフｘ２−ｘ１−ａは、場合により（例えばアミノ末端において）１個以上のアミノ酸により拡張されている。
【００２７】
具体的には、
ａ）第１アルファらせんは、モチーフａ−ｘ１を含み、かつ第２アルファらせんは、モチーフｘ１−ａを含み；または
ｂ）第１アルファらせんは、モチーフｘ１−ａを含み、かつ第２アルファらせんは、モチーフａ−ｘ１を含み；
好ましくはここで、モチーフａ−ｘ１を含むアルファらせんは、さらにＣ末端モチーフａ−ｘ１−ｘ２を含み、かつモチーフｘ１−ａを含むアルファらせんは、さらにＮ末端モチーフｘ２−ｘ１−ａを含む。
【００２８】
特定のコネクタが提供され、ここで：
ａ）
ｉ）モチーフａ−ｘ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  １であり；
ｉｉ）モチーフａ−ｘ１−ｘ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ６９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７１のいずれかであり；
ｉｉｉ）モチーフｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ２であり；そして
ｉｖ）モチーフｘ２−ｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ７７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７９のいずれかであり；
または
ｂ）
ｉ）モチーフａ−ｘ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ３であり；
ｉｉ）モチーフａ−ｘ１−ｘ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ８５、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ８７のいずれかであり；
ｉｉｉ）モチーフｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ４であり；そして
ｉｖ）モチーフｘ２−ｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ９３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ９５のいずれかであり；
または
ｃ）
ｉ）モチーフａ−ｘ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ５であり；
ｉｉ）モチーフａ−ｘ１−ｘ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ４５、ＳＥＱ  ＩＤ  １０１、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １０３のいずれかであり；
ｉｉｉ）モチーフｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ６であり；そして
ｉｖ）モチーフｘ２−ｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ４６、ＳＥＱ  ＩＤ  １０９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１１のいずれかであり；
または
ｄ）
ｉ）モチーフａ−ｘ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ７であり；
ｉｉ）モチーフａ−ｘ１−ｘ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ４７、ＳＥＱ  ＩＤ  １１７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１９のいずれかであり；
ｉｉｉ）モチーフｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ８であり；そして
ｉｖ）モチーフｘ２−ｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ４８、ＳＥＱ  ＩＤ  １２５、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １２７のいずれかである。
【００２９】
具体的には、第１または第２アルファらせんは、以下のいずれかを含むか、または以下のいずれかからなる：
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  １０、ＳＥＱ  ＩＤ  ６８、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７０のいずれか；
ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  １２、ＳＥＱ  ＩＤ  ７２、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７３のいずれか；
ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ５３、ＳＥＱ  ＩＤ  ７４、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７５のいずれか；
ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  １４、ＳＥＱ  ＩＤ  ７６、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７８のいずれか；
ｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  １６、ＳＥＱ  ＩＤ  ８０、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ８１のいずれか；
ｖｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ８２、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ８３のいずれか；
ｖｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  １８、ＳＥＱ  ＩＤ  ８４、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ８６のいずれか；
ｖｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ８８、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ８９のいずれか；
ｉｘ）ＳＥＱ  ＩＤ  ５７、ＳＥＱ  ＩＤ  ９０、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ９１のいずれか；
ｘ）ＳＥＱ  ＩＤ  ２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ９２、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ９４のいずれか；
ｘｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ９６、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ９７のいずれか；
ｘｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ９８、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ９９のいずれか；
ｘｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ２６、ＳＥＱ  ＩＤ  １００、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １０２のいずれか；
ｘｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ２８、ＳＥＱ  ＩＤ  １０４、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １０５のいずれか；
ｘｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ６１、ＳＥＱ  ＩＤ  １０６、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １０７のいずれか；
ｘｖｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ３０、ＳＥＱ  ＩＤ  １０８、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１０のいずれか；
ｘｖｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ３２、ＳＥＱ  ＩＤ  １１２、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１３のいずれか；
ｘｖｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ６３、ＳＥＱ  ＩＤ  １１４、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１５のいずれか；
ｘｉｘ）ＳＥＱ  ＩＤ  ３４、ＳＥＱ  ＩＤ  １１６、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１８のいずれか；
ｘｘ）ＳＥＱ  ＩＤ  ３６、ＳＥＱ  ＩＤ  １２０、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １２１のいずれか；
ｘｘｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ６５、ＳＥＱ  ＩＤ  １２２、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １２３のいずれか；
ｘｘｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ３８、ＳＥＱ  ＩＤ  １２４、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １２６のいずれか；
ｘｘｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ４０、ＳＥＱ  ＩＤ  １２８、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １２９のいずれか；または
ｘｘｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ６７、ＳＥＱ  ＩＤ  １３０、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １３１のいずれか。
【００３０】
特定の態様は、以下のいずれかにより特性付けられる：
ｉ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  １０、ＳＥＱ  ＩＤ  ６８、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７０のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １０、ＳＥＱ  ＩＤ  ６８、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７０のいずれかからなり；かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ９を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ９からなり；
ｉｉ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  １２、ＳＥＱ  ＩＤ  ７２、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７３のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １２、ＳＥＱ  ＩＤ  ７２、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７３のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  １１を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１からなり；
ｉｉｉ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ５３、ＳＥＱ  ＩＤ  ７４、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７５のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ５３、ＳＥＱ  ＩＤ  ７４、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７５のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ５２を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ５２からなり；
ｉｖ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  １４、ＳＥＱ  ＩＤ  ７６、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７８のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １４、ＳＥＱ  ＩＤ  ７６、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７８のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  １３を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １３からなり；
ｖ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  １６、ＳＥＱ  ＩＤ  ８０、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ８１のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １６、ＳＥＱ  ＩＤ  ８０、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ８１のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  １５を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １５からなり；
ｖｉ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ８２、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ８３のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ８２、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ８３のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ５４を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ５４からなり；
ｖｉｉ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  １８、ＳＥＱ  ＩＤ  ８４、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ８６のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １８、ＳＥＱ  ＩＤ  ８４、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ８６のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  １７を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １７からなり；
ｖｉｉｉ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ８８、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ８９のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ８８、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ８９のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  １９を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １９からなり；
ｉｘ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ５７、ＳＥＱ  ＩＤ  ９０、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ９１のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ５７、ＳＥＱ  ＩＤ  ９０、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ９１のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ５６を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ５６からなり；
ｘ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ９２、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ９４のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ９２、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ９４のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ２１を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ２１からなり；
ｘｉ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ９６、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ９７のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ９６、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ９７のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ２３を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ２３からなり；
ｘｉｉ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ９８、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ９９のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ９８、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ９９のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ５８を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ５８からなり；
ｘｉｉｉ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ２６、ＳＥＱ  ＩＤ  １００、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １０２のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ２６、ＳＥＱ  ＩＤ  １００、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １０２のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ２５を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ２５からなり；
ｘｉｖ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ２８、ＳＥＱ  ＩＤ  １０４、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １０５のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ２８、ＳＥＱ  ＩＤ  １０４、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １０５のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ２７を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ２７からなり；
ｘｖ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ６１、ＳＥＱ  ＩＤ  １０６、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １０７のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ６１、ＳＥＱ  ＩＤ  １０６、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １０７のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ６０を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ６０からなり；
ｘｖｉ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ３０、ＳＥＱ  ＩＤ  １０８、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１０のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ３０、ＳＥＱ  ＩＤ  １０８、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１０のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ２９を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ２９からなり；
ｘｖｉｉ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ３２、ＳＥＱ  ＩＤ  １１２、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１３のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ３２、ＳＥＱ  ＩＤ  １１２、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１３のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ３１を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ３１からなり；
ｘｖｉｉｉ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ６３、ＳＥＱ  ＩＤ  １１４、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１５のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ６３、ＳＥＱ  ＩＤ  １１４、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１５のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ６２を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ６２からなり；
ｘｉｘ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ３４、ＳＥＱ  ＩＤ  １１６、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１８のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ３４、ＳＥＱ  ＩＤ  １１６、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１８のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ３３を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ３３からなり；
ｘｘ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ３６、ＳＥＱ  ＩＤ  １２０、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １２１のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ３６、ＳＥＱ  ＩＤ  １２０、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １２１のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ３５を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ３５からなり；
ｘｘｉ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ６５、ＳＥＱ  ＩＤ  １２２、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １２３のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ６５、ＳＥＱ  ＩＤ  １２２、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １２３のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ６４を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ６４からなり；
ｘｘｉｉ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ３８、ＳＥＱ  ＩＤ  １２４、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １２６のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ３８、ＳＥＱ  ＩＤ  １２４、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １２６のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ３７を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ３７からなり；
ｘｘｉｉｉ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ４０、ＳＥＱ  ＩＤ  １２８、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １２９のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ４０、ＳＥＱ  ＩＤ  １２８、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １２９のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ３９を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ３９からなり；または
ｘｘｉｖ）第１アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ６７、ＳＥＱ  ＩＤ  １３０、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １３１のいずれかを含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ６７、ＳＥＱ  ＩＤ  １３０、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １３１のいずれかからなり、かつ第２アルファらせんは、ＳＥＱ  ＩＤ  ６６を含み、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ６６からなる。
【００３１】
様々なモチーフが、表１においてさらに記載されている。
【００３２】
【表１−１】
2018528214.tif 000002
【００３３】
【表１−２】
2018528214.tif 000003
【００３４】
【表１−３】
2018528214.tif 000004
【００３５】
【表１−４】
2018528214.tif 000005
【００３６】
【表１−５】
2018528214.tif 000006
【００３７】
特定の態様によれば、第１および第２アルファらせんは、平行または逆平行アルファらせんのどちらかである。
特定の例によれば、平行集合体において、第１アルファらせんのＣ末端領域は、第２アルファらせんのＣ末端領域に集合しており；または、第１アルファらせんのＮ末端領域は、第２アルファらせんのＮ末端領域に集合している。連結している鎖がアミノ酸配列に融合している場合、両方の鎖は、アルファらせんをＣ末端ドメインとして含むことができ、または両方の鎖は、アルファらせんをＮ末端ドメインとして含むことができる。
【００３８】
あるいは、平行集合において、第１アルファらせんのＣ末端またはＮ末端領域は、第２アルファらせんに同方向（平行）方式で集合していることができるが、第２アルファらせんは、ポリペプチド鎖内に（すなわち末端を含まずに）位置していることができ、それは内部ドメインとしても理解されており、ここで、第２アルファらせんは、末端において別のポリペプチド配列に融合しているのではなく、それが好ましくはコネクタのコイルドコイルに干渉することができるであろうアルファらせん構造により特性付けられないいずれかの他のポリペプチド配列またはドメインによるＮ末端またはＣ末端拡張を含むように、アミノ酸配列内に組み込まれている。
【００３９】
逆平行集合において、第１アルファらせんのＣ末端領域は、第２アルファらせんのＮ末端領域に集合しており、または逆もまた同様である。あるいは、逆平行集合において、第１アルファらせんのＣ末端またはＮ末端領域は、第２アルファらせんに反対方向（逆平行）方式で集合していることができるが、第２アルファらせんは、ポリペプチド鎖内に（すなわち末端を含まずに）位置していることができ、それは内部ドメインとしても理解されており、ここで、第２アルファらせんは、末端において別のポリペプチド配列に融合しているのではなく、それが好ましくはコネクタのコイルドコイルに干渉することができるであろうアルファらせん構造により特性付けられないいずれかの他のポリペプチド配列またはドメインによるＮ末端またはＣ末端拡張を含むように、アミノ酸配列内に組み込まれている。
【００４０】
特定の態様によれば、Ｘ２は、１〜５個の連続するアミノ酸（本明細書において“拡張”とも呼ばれる）、好ましくは１〜４、または１〜３、または１〜２アミノ酸からなり、ここで、拡張は、アラニン、グリシン、セリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、バリン、およびプロリン、ならびに任意のさらなるアミノ酸（あらゆるタイプのアミノ酸、例えば２０種類の天然アミノ酸のいずれが用いられることもできる）からなる群から選択される好ましい拡張アミノ酸の少なくとも１個を含む。具体的には、ｘ２は、Ｎ末端において（Ｎ末端拡張）またはＣ末端において（Ｃ末端拡張）のどちらかでコイル配列を拡張する１アミノ酸のみからなる。好ましくは、アラニン、グリシンまたはセリンのいずれかが拡張のために用いられる。具体的には、ｘ２は、アラニン、グリシンもしくはセリンのいずれかのみ、またはアルファらせんの末端領域に続くアミノ酸がアラニン、グリシンもしくはセリンのいずれかであり、かつアルファらせんの末端がアラニン、グリシンもしくはセリンのいずれかもしくはあらゆる他のアミノ酸であることができるように場合により１、２、３、もしくは４個のさらなる連続するアミノ酸（あらゆるタイプのアミノ酸、例えば２０種類の天然アミノ酸のいずれが用いられることもできる）により拡張されているアラニン、グリシンもしくはセリンのいずれかからなる。
【００４１】
具体的には、拡張は、場合によりモチーフａ−ｘ１またはｘ１−ａ中に組み込まれている４個より多くの連続するアミノ酸を含まない。これは、コイルモチーフ（単数または複数）の拡張との非特異的相互作用または干渉を回避するためである。
【００４２】
特定の態様によれば、
ａ）拡張は、リジンを含まず、かつ／または
ｂ）アルファらせんの末端領域に続くアミノ酸は、リジンではなく、かつ／または
ｃ）Ｃ末端アミノ酸は、リジンではない。
【００４３】
好ましい態様によれば、前記の第１および第２アルファらせんは、１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満、もしくは１０−９Ｍ未満、もしくは１０−１０Ｍ未満、もしくは１０−１１Ｍ未満のＫＤで、またはさらにはピコモル濃度範囲のＫＤで互いに特異的に結合している。
【００４４】
本発明は、さらに本明細書で記載されたコネクタにより互いに連結された少なくとも２個のポリペプチド鎖を含む多量体または複合タンパク質を提供し、ここで、第１ポリペプチド鎖は、第１アルファらせんを組み込み、第２ポリペプチド鎖は、第２アルファらせんを組み込み；かつここで、第１および第２ポリペプチド鎖は、第１および第２アルファらせんのらせん状コイルドコイル型構造により連結されている。
【００４５】
具体的には、
ａ）第１アルファらせんを組み込んでいる第１ポリペプチド鎖は、アミノ酸モチーフａ−ｘ１のリピートおよびＣ末端モチーフａ−ｘ１−ｘ２からなるＣ末端領域を含み；かつ第２ポリペプチド鎖は、第２アルファらせんを平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはＣ末端領域中に組み込んでおり；または
ｂ）第１アルファらせんを組み込んでいる第１ポリペプチド鎖は、アミノ酸モチーフａ−ｘ１のリピートおよびＣ末端モチーフａ−ｘ１−ｘ２からなるＣ末端領域を含み；かつ第２ポリペプチド鎖は、第２アルファらせんを逆平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはＮ末端領域中に組み込んでおり、または
ｃ）第１アルファらせんを組み込んでいる第１ポリペプチド鎖は、アミノ酸モチーフｘ１−ａのリピートおよびＮ末端モチーフｘ２−ｘ１−ａからなるＮ末端領域を含み；かつ第２ポリペプチド鎖は、第２アルファらせんを平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはＮ末端領域中に組み込んでおり；または
ｄ）第１アルファらせんを組み込んでいる第１ポリペプチド鎖は、アミノ酸モチーフｘ１−ａのリピートおよびＮ末端モチーフｘ２−ｘ１−ａからなるＣ末端領域を含み；かつ第２ポリペプチド鎖は、第２アルファらせんを逆平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはＣ末端領域中に組み込んでいる。
【００４６】
具体的には、２個以上のポリペプチド鎖が、本明細書で記載されるコネクタにより集合していることができ、ここで、少なくとも２個のポリペプチド鎖（またはポリペプチド鎖のそれぞれ）は、アルファらせん構造により特性付けられるドメインを含む。
【００４７】
特定の側面によれば、タンパク質は、以下からなる群から選択され：
ａ）ワクチン抗原およびアジュバントを含むワクチン構成要素；
ｂ）２個のポリペプチド鎖のそれぞれが少なくとも１個の抗体ドメインを組み込んでいる抗体または抗体形式；
ｃ）抗体および非抗体構成要素を含む抗体誘導体、ここで、抗体の少なくとも１個のポリペプチド鎖は、構成要素を組み込んでいる別のポリペプチド鎖に連結されており、好ましくはここで、構成要素は、有機および無機分子、特に標識、タグ、酵素、受容体、リガンド、毒素、脂質、炭水化物、または核酸のいずれかである；ならびに
ｄ）親和性物質、ここで、受容体またはリガンドは、受容体特異的リガンドの精製のために、またはリガンドの異なるバリアントの親和性を試験するためにキャリヤー、例えば固相に連結されている。
【００４８】
本発明は、さらに、以下の工程：
ａ）第１ポリペプチド鎖をコードする第１異種核酸を組み込んでいる第１宿主細胞を提供し；
ｂ）第２ポリペプチド鎖をコードする第２異種核酸を組み込んでいる第２宿主細胞を提供し；
ｃ）前記の宿主細胞を前記の第１および第２ポリペプチド鎖を細胞培養において発現させるための条件下で培養し；そして
ｄ）前記の第１および第２ポリペプチド鎖をらせん状コイルドコイル型構造により連結する；
を含む、本明細書で記載されるタンパク質を生成する方法を提供し、好ましくはここで、第１および／または第２宿主細胞は、哺乳類または酵母宿主細胞である。
【００４９】
そのような連結は、好ましくは細胞培養中またはポリペプチド鎖の単離および任意の精製の際のポリペプチド鎖の自己集合による。
特定の側面によれば、方法は、以下の工程：
ａ）以下：
（ｉ）第１ポリペプチド鎖をコードする第１異種核酸；
および
（ｉｉ）第２ポリペプチド鎖をコードする第２異種核酸；
を組み込んでいる宿主細胞を提供し；
ｂ）前記の宿主細胞を、前記の第１および第２ポリペプチド鎖を細胞培養において発現させるための条件下で培養し；そして
ｃ）前記の第１および第２ポリペプチド鎖をらせん状コイルドコイル型構造により連結する；
を含み、好ましくはここで、宿主細胞は、哺乳類または酵母宿主細胞である。
【００５０】
具体的には、第１核酸を組み込んでおり、かつ場合によりさらに第２核酸を組み込んでいる宿主細胞は、哺乳類または酵母宿主細胞である。そのような宿主細胞は、あらゆるＣ末端リジンを切断する増大したリスクを有するであろう。本明細書で記載された拡張により、末端リジンは、覆い隠されると考えられ、驚くべきことに、コイルドコイル間の連結の親和性は、さらに向上する可能性がある。
【００５１】
本発明は、さらに、本明細書で記載される方法により得ることができるタンパク質の調製物を提供し、ここで、タンパク質分子の少なくとも９０％は、第１および第２核酸によりコードされるポリペプチド鎖の正しいＣ末端およびＮ末端領域を含む。具体的には、哺乳類または酵母宿主細胞のいずれかである宿主細胞を用いる場合、リジンをＮ末端またはＣ末端アミノ酸として含むアルファらせんは、末端から切断される多数の分子中に（例えば全分子の４０％に至るまでの中に）あるであろう。本明細書で記載される少なくとも１個のアミノ酸によるアルファらせんの拡張により、正しいアミノ酸末端、すなわちそれぞれの核酸配列によりコードされている末端により特性付けられる分子の百分率は、例えば質量分析により決定された場合に有意に、例えば９０％以上まで、例えば少なくとも９５％まで、または少なくとも９９％までさえも増大し得る。
【００５２】
少なくとも第１ポリペプチド鎖を発現させるための特に好ましい宿主細胞は、ヒト、ハムスター、またはマウス由来である哺乳類宿主細胞である。具体的には、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＳ０、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０およびＶＥＲＯ細胞のいずれが用いられることもできる。
【００５３】
あるいは、少なくとも第１ポリペプチド鎖を発現させるための特に好ましい宿主細胞は、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス、カンジダ、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、アークスラ（Ａｒｘｕｌａ）、ハンゼヌラ（Ｈｅｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、クルイウェロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、またはコマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属由来である酵母宿主細胞であり、好ましくはメチロトローフ性酵母である。具体的には、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、コマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｋ．ファフィー（Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ）、またはＫ．シュードパストリス（Ｋ．ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）、またはＳ．セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が、用いられることができる。
【００５４】
本発明は、さらに、本明細書で記載されるコネクタまたは多量体タンパク質を調製するための構成要素のキット、例えば構成要素を充填された１個以上の容器を含む医薬キットを提供する。アルファらせんのそれぞれまたは単一の（または１つのみの）アルファらせんを含むポリペプチド鎖は、別々の部分として、そしてコネクタまたは多量体タンパク質を調製する、例えばそのような複合構築物をその部分の混合および集合により新しく調製するための部分のキットとして一緒に提供されることができる。
【００５５】
特に、本明細書で記載されるコネクタまたは多量体タンパク質は、非天然存在であり、例えばコイルドコイルにより互いに連結されたポリペプチド鎖または他の構成要素を含む組成物（その組成物は天然に存在しない）として提供されることは、理解されている。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】典型的なｓｃＦｖ−ｃｏｉｌ１の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ４９）  下線：柔軟な連結配列により融合したＶＨおよびＶＬドメイン；ＶＨおよびＶＬドメイン配列は、ＣＤ３２ａを特異的に認識するモノクローナル抗体ＩＶ．３から得られる(Stuart et al. (1987) J. Exp. Med. 166: 1668)。  通常の字体のセット：柔軟なリンカー（あらゆるリンカーである可能性がある）；  斜体：ｐｅｐＥコイル：７つ組モチーフの５リピート、Ｃ末端リジン（斜体および太字）。
【図２】典型的なｓｃＦｖ−ｃｏｉｌ１ａｌａの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ５０）  下線：柔軟な連結配列により融合したＶＨおよびＶＬドメイン  通常の字体のセット：柔軟なリンカー（あらゆるリンカーである可能性がある）；  斜体：ｐｅｐＥコイル：７つ組モチーフの５リピート、Ｃ末端拡張としてのＣ末端アラニン（斜体および太字）。
【図３】ｐｅｐＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ５１）  斜体：ｐｅｐＫコイル：７つ組モチーフの５リピート、Ｎ末端リジン（斜体および太字）。
【図４−１】ＨＥＫ２９３細胞からのｓｃＦｖ−ｃｏｉｌ１の質量分析  図１の配列に基づく予想分子量（ＭＷ）は、３０７６４Ｄａである。  見付かったＭＷは、３０７５５．５Ｄａ（総材料の約６０％）および３０６３０Ｄａ（総材料の約４０％）であり、それは、予想ＭＷからＬｙｓ（２８９）を減算したものに相当する。  Ｂ：Ｓ２昆虫細胞からのｓｃＦｖ−ｃｏｉｌ１の質量分析  図１の配列に基づく予想分子量（ＭＷ）は、３０７６４Ｄａである。  見付かったＭＷは、３０７５５．５Ｄａであり、これは完全長タンパク質を示している。  Ｃ：ＨＥＫ２９３細胞からのｓｃＦｖ−ｃｏｉｌ１ａｌａの質量分析  図２の配列に基づく予想分子量（ＭＷ）は、３０８３５．４Ｄａである。  見付かったＭＷは、３０８３１．０Ｄａであり、これは完全長タンパク質を示している。
【図４−２】同上。
【図５】ｐｅｐＫおよびｓｃＦｖ−ｃｏｉｌ１またはｓｃＦｖ−ｃｏｉｌ１ａｌａの親和性分析。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本明細書全体を通して用いられている特定の用語は、以下の意味を有する。
用語“コイル”は、本明細書で用いられる際、ペプチド性アルファらせんの少なくとも一部であるアミノ酸配列および三次元構造からなるモチーフを意味するものとする。コイルリピートは、ペプチド性アルファらせんを構成することができる。そのようなコイルリピートは、同一のモチーフの、または異なる（例えばバリアント）モチーフのリピートを含むことができ、それは、合致するモチーフを認識して少なくとも２個のペプチド性アルファらせんを高い親和性で集合させることにより機能性である。
【００５８】
機能的に活性なバリアントは、例えば１個以上の点変異によるペプチド配列中の配列の変更により得られることができ、ここで、配列の変更は、未変更のペプチド配列の機能を実質的に保持する。そのような配列の変更または点変異は、（保存的）置換、付加、欠失、変異および挿入、例えば１、２、３、もしくは４アミノ酸の変更、または１〜数アミノ酸、例えば１、２、３、もしくは４アミノ酸の付加もしくは挿入による変更、または１〜数アミノ酸、例えば１、２、３、もしくは４アミノ酸の化学的誘導体化による変更またはそれらの組み合わせ、好ましくは隣接していない点変異による変更を含み得るが、それらに限定されない。アミノ酸残基における置換は、保存的置換、例えば１個の疎水性アミノ酸の代わりの疎水性アミノ酸に関する置換であることができる。
【００５９】
保存的置換は、それらの側鎖および化学的特性において関連しているアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。そのようなファミリーの例は、塩基性側鎖を有する、酸性側鎖を有する、非極性脂肪族側鎖を有する、非極性芳香族側鎖を有する、非荷電の極性側鎖を有する、小さい側鎖を有する、大きい側鎖を有する等のアミノ酸である。
【００６０】
好ましい点変異は、同じ極性および／または電荷のアミノ酸の交換を指す。これに関して、アミノ酸は、６４種の３つ組コドンによりコードされる２０種類の天然存在アミノ酸を指す。これらの２０種類のアミノ酸は、中性電荷、陽性電荷、および陰性電荷を有するアミノ酸に分けられることができる：
“中性”アミノ酸が、それらのそれぞれの３文字および１文字コードならびに極性と一緒に下記で示されている：
アラニン：(Ａｌａ、Ａ）非極性、中性；
アスパラギン：（Ａｓｎ、Ｎ）極性、中性；
システイン：（Ｃｙｓ、Ｃ）非極性、中性；
グルタミン：（Ｇｌｎ、Ｑ）極性、中性；
グリシン：（Ｇｌｙ、Ｇ）非極性、中性；
イソロイシン：（Ｉｌｅ、Ｉ）非極性、中性；
ロイシン：（Ｌｅｕ、Ｌ）非極性、中性；
メチオニン：（Ｍｅｔ、Ｍ）非極性、中性；
フェニルアラニン：（Ｐｈｅ、Ｆ）非極性、中性；
プロリン：（Ｐｒｏ、Ｐ）非極性、中性；
セリン：（Ｓｅｒ、Ｓ）極性、中性；
スレオニン：（Ｔｈｒ、Ｔ）極性、中性；
トリプトファン：（Ｔｒｐ、Ｗ）非極性、中性；
チロシン：（Ｔｙｒ、Ｙ）極性、中性；
バリン：（Ｖａｌ、Ｖ）非極性、中性；および
ヒスチジン：（Ｈｉｓ、Ｈ）極性、陽性（１０％）  中性（９０％）。
【００６１】
“正に”荷電したアミノ酸は、以下のアミノ酸である：
アルギニン：（Ａｒｇ、Ｒ）極性、陽性；および
リジン：（Ｌｙｓ、Ｋ）極性、陽性。
【００６２】
“負に”荷電したアミノ酸は、以下のアミノ酸である：
アスパラギン酸：（Ａｓｐ、Ｄ）極性、陰性；および
グルタミン酸：（Ｇｌｕ、Ｅ）極性、陰性。
【００６３】
具体的には、モチーフの機能的バリアントは、点変異、すなわち１または２アミノ酸の挿入、欠失または置換、特に保存的置換である置換を含むことができる。それにより、コイルドコイルの疎水性残基の周期性は、維持されることができる。
【００６４】
用語“ペプチド性アルファらせん”は、本明細書で用いられる際、本明細書においてコイルリピートと呼ばれるいくつかのモチーフのリピートを含むペプチド配列に基づくアルファらせん構造を意味するものとする。そのようなアルファらせんは、合致するアルファらせんとも呼ばれる１個以上のペプチド性の対応するアルファらせんに（合致するアルファらせんの長軸方向の集合または自己集合により）結合してコイルドコイルとも呼ばれる２量体、３量体またはさらなるオリゴマーを形成することができる。
【００６５】
コイルドコイルは、ポリペプチドまたはペプチドにおける構造モチーフであり、ここで、２〜７個のアルファらせんが、縄の子縄のように一緒に巻き付いている。ある態様において、コイルドコイルは、一緒に巻き付いている２個のアルファらせんを有するコイルドコイルである。そのようなアルファらせん領域は、コイルドコイル構造を形成すると思われ、適切なコイルドコイル相互作用結合アッセイにおいて測定された際に、コイルリピートのオリゴマー化に関わっている可能性がある。
【００６６】
具体的には、アルファらせんの２量体は、２個の単量体を、２アルファらせんコイルドコイルドメインでの相互作用により２量体が形成されるように接触させることにより形成されることができる。
【００６７】
特定の例によれば、コイルは、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７または８（コイルおよび逆コイル（ａｎｔｉ−ｃｏｉｌ））において示されているアミノ酸配列を有する７つ組ペプチドを含み、それは、ｎ回のリピートを含み、ここで、ｎ＝３〜５である。
【００６８】
２個の合致するペプチド性アルファらせんの集合は、“コイルドコイル”として理解されており、コイルドコイルで構成されるコネクタまたはコイルドコイルにより連結された少なくとも２個のポリペプチド鎖の集合は、らせん状コイルドコイル型構造を含むものとして理解されている。
【００６９】
アミノ酸配列に関する用語“末端領域”は、Ｃ末端領域、Ｎ末端領域、または両方を意味するものとする。ポリペプチド（その用語は、本明細書においてポリペプチドまたはタンパク質両方を指すものとして理解されている）配列の末端領域は、特に末端アミノ酸を含む連続するアミノ酸の領域として理解されており、そのような領域は、例えばポリペプチドのペプチド性アルファらせん部分を含む。典型的には、ペプチド性アルファらせんを含む、またはペプチド性アルファらせんからなる末端領域は、末端アミノ酸（すなわち末端）を含む少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０個の連続するアミノ酸、例えば好ましくは２０〜４５アミノ酸の範囲のいくつかのアミノ酸を含むか、または連続するアミノ酸からなる。例えば、７つ組モチーフの５リピートを含む末端領域に関して、末端領域は、末端アミノ酸を含む３５個の連続するアミノ酸を含む。
【００７０】
ペプチド性アルファらせんが非末端領域中に位置している場合、ポリペプチド配列は、ペプチド性アルファらせんをポリペプチド配列中に組み込まれた連続するアミノ酸配列として含むが、末端アミノ酸は含まず、特に少なくとも５、１０、１５、２０、２５、または３５アミノ酸の末端領域を含まない。
【００７１】
用語“多量体タンパク質”は、本明細書において複合タンパク質として理解されており、それは、少なくとも２個のポリペプチド鎖および場合によりペプチド性構造であることもそれ以外（例えば非ペプチド性または非ポリペプチド）であることもできる１個以上のさらなる構成要素で構成されている。具体的には、多量体タンパク質は、２個のペプチドもしくはポリペプチド（２量体、例えばホモ２量体またはヘテロ２量体）、または３個のペプチドもしくはポリペプチド（３量体、例えばホモ３量体またはヘテロ３量体）、または４個のペプチドもしくはポリペプチド（４量体、例えばホモ４量体またはヘテロ４量体）を含むタンパク質性構築物である。
【００７２】
本明細書において、用語“ポリペプチド”は、ポリペプチドおよびタンパク質両方を指すことが理解されており、用語“タンパク質”は、常にポリペプチドを含むものとする。用語“ペプチド”は、２〜５０アミノ酸、特に５〜４０アミノ酸の長さを有するアミノ酸配列を含むものとする。
【００７３】
多量体タンパク質は、少なくとも１個のワクチン抗原または免疫原（特にペプチド免疫原）およびアジュバントで構成されるワクチン構成要素であることができる。
用語“免疫原”は、本明細書において用いられる際、対象において免疫反応を誘発する１種類以上の抗原を意味するものとする。用語“抗原”は、本明細書において用いられる際、特に抗体の結合部位によりおそらく認識され得る、またはＨＬＡクラスＩもしくはクラスＩＩ分子のペプチド溝に結合することができ、それ自体が特定のＴ細胞に関する刺激因子の役目を果たすことができるあらゆる抗原決定基を指すものとする。標的抗原は、標的分子全体として認識されるか、または免疫学的に関連する、すなわちやはり天然もしくはモノクローナル抗体により認識可能であるそのような分子の断片、特に部分構造、例えば標的のポリペプチドもしくは炭水化物構造（一般に“エピトープ”、例えばＢ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープと呼ばれる）として認識されるかのどちらでもよい。本明細書において、Ｔ細胞エピトープの使用が、例えばアレルギーワクチンを提供するために好ましい。
【００７４】
用語“ペプチド免疫原”は、本明細書において用いられる際、ペプチド構造の抗原または免疫原、特に線状ペプチドまたは分枝状ペプチドのどちらかとして提供され、天然存在アミノ酸残基または改変されたアミノ酸残基、例えばリン酸化、メチル化、アセチル化、アミド化、ピロリドンカルボン酸の形成、異性化、ヒドロキシル化、硫酸化、フラビン結合、システインの酸化およびニトロシル化によるような修飾または化学的誘導体化により得られる誘導体を含む特定のアミノ酸配列のペプチドを含む、または特定のアミノ酸配列のペプチドからなる免疫原を意味するものとする。
【００７５】
ペプチド免疫原は、特に対象において免疫反応を誘発するように設計されており、特に抗体の結合部位によりおそらく認識され得る、またはＨＬＡクラスＩもしくはクラスＩＩ分子もしくは他の抗原提示分子、例えばＣＤ１のペプチド溝に結合することができ、それ自体が特定のＴ細胞に関する刺激因子の役目を果たすことができる１以上の抗原決定基を含む。標的抗原は、標的分子全体として認識されるか、または免疫学的に関連する、すなわちやはり天然もしくはモノクローナル抗体により認識可能であるそのような分子の断片、特に部分構造、例えば標的のポリペプチドもしくは炭水化物構造（一般に“エピトープ”、例えばＢ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープと呼ばれる）として認識されるかのどちらでもよい。本明細書において、Ｂ細胞エピトープの使用が、例えば腫瘍学ワクチンを提供するために好ましい。
【００７６】
用語“エピトープ”は、本明細書において用いられる際、特に本発明のモジュール式抗体の結合部位に対する特異的結合パートナーを完全に構成することができる、または特異的結合パートナーの一部であることができる分子構造を指す。エピトープという用語は、ハプテン類も指すことができる。化学的には、エピトープは、炭水化物、ペプチド、脂肪酸、有機、生化学もしくは無機物質またはそれらの誘導体およびそれらのあらゆる組み合わせのいずれで構成されることもできる。エピトープがポリペプチドである場合、それは、通常は少なくとも３アミノ酸、好ましくは少なくとも４、５、６、７、８、９、
１０、１１、１２または１３アミノ酸を含むであろう。ペプチドの長さに対する決定的な上限は存在せず、それは、タンパク質のポリペプチド配列のほぼ完全長を含むことができるであろう。エピトープは、線状エピトープであることも立体構造エピトープであることもできる。線状エピトープは、ポリペプチドまたは炭水化物鎖の一次配列の単一の区分で構成されている。線状エピトープは、連続している、または重複していることができる。立体構造エピトープは、ポリペプチドが折り畳まれて３次構造を形成することにより一緒になったアミノ酸または炭水化物で構成され、そのアミノ酸は、線状配列において必ずしも互いに隣接していない。具体的には、エピトープは、診断的に関連する分子の少なくとも一部であり、すなわち、試料中のエピトープの非存在または存在は、疾患に対して、または患者の健康状態に対して、または製造における進行状況に対して、または環境および食品の状態に対して定性的または定量的に相関している。エピトープは、療法的に関連する分子、すなわち疾患の過程を変化させる特異的結合ドメインにより標的とされることができる分子の少なくとも一部であることもできる。
【００７７】
癌疾患において、自己抗原に対する免疫反応が望ましい。用語“自己抗原”は、本明細書において用いられる際、それ自体は免疫反応を誘発しない正常な健康な対象により生成されるあらゆる抗原、特にポリペプチドまたはペプチドを意味する。これらの自己抗原は、癌疾患を含む（いわゆる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））特定の疾患状態において異常な、または高いレベルで生成され得る。自己免疫疾患と関係している自己抗原（Ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎｓ）は、本明細書において自己抗原（ａｕｔｏ−ａｎｔｉｇｅｎｓ）と呼ばれる。
【００７８】
自己抗原は、天然存在であることができ、組み換えにより、または合成により生成されることもできることは、理解されている。自己抗原は、天然に生成される抗原と同一である必要はなく、特定の配列の同一性、類似性または相同性を有するそれに対するバリエーションを含むことができることも、理解されている。
【００７９】
癌療法における使用のための自己抗原の選択は、癌疾患のタイプおよび病期に、そして特に例えば腫瘍または転移由来の癌細胞の発現パターンに依存する。本明細書において記載されるワクチンにおいて用いられる可能性がある選択された腫瘍関連抗原の特定の例は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ルイスＹ、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）および癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ−１等である。
【００８０】
自己免疫疾患の療法における使用のための自己抗原の選択は、自己免疫疾患のタイプに依存する。本明細書において記載されるワクチンにおいて用いられる可能性がある選択された自己免疫疾患関連抗原の特定の例は、Ｃ１ｑ、ＡＤＡＭＴＳ１３、デスモグレイン３、ケラチン、ガングリオシド類（例えばＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＱ１ｂ）、コラーゲンタイプＩＶ、ＩｇＭ、カルジオリピン、アネキシンＡ５等である。
【００８１】
ある態様において、免疫原は、１種類以上の特定のアレルゲンを含む。“アレルゲン”は、過敏の状態を開始し得る、または既にそのアレルゲンで感作された対象において即時の過敏反応を誘発し得る抗原である。アレルゲンは、一般にアレルゲン性である特性を有するタンパク質に結合したタンパク質または化学物質である。しかし、アレルゲンは、様々な合成的な、または天然の源、例えば植物材料、金属、化粧品または界面活性剤中の成分、ラテックス等に由来する有機または無機材料も含み得る。
【００８２】
抗アレルギー療法における使用のためのアレルゲンの選択は、アレルギーのタイプおよび重症度に依存する。本明細書において記載されるワクチンにおいて用いられる可能性がある選択されたアレルギー関連抗原の特定の例は、免疫原として従来用いられているあらゆるアレルゲン、特にチリダニアレルゲン（例えばＤｅｒ  ｐ１、Ｄｅｒ  ｐ２、Ｄｅｒ  ｐ３／−−−−−−Ｄｅｒ  ｐ２３、Ｄｅｒ  ｆ１、Ｄｅｒ  ｆ２、Ｄｅｒｆ３／−−−Ｄｅｒ  ｆ２３）、ネコのフケ、草または木の花粉、ゴキブリアレルゲン等である。
【００８３】
感染症の予防または療法における使用のための病原体に対する免疫反応を特異的に誘導する抗原の選択は、病原体のタイプ、例えば微生物性またはウイルス性感染因子に依存する。本明細書において記載されるワクチンにおいて用いられる可能性がある選択された病原体由来の抗原の特定の例は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、コレラ、ＨＩＶ、百日咳、インフルエンザ、腸チフス等である。
【００８４】
ワクチンアジュバントは、本明細書においてワクチン抗原に対する免疫反応を誘発するためのワクチンの有効性を高めることができるワクチン構成要素として理解されている。
高められたＴｈ１免疫反応は、Ｔｈ１免疫反応と関係するサイトカイン類の１種類以上（例えばＩＦＮγ）における増大および活性化されたマクロファージにおける増大を含み得る。
【００８５】
高められたＴｈ１免疫反応は、抗原特異的ＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１抗体における増大の１以上を含み得る。
例えば、免疫原性組成物、すなわちアジュバント構成要素、例えばＴＬＲ９リガンドおよび第１ペプチド性アルファらせんに連結された抗ＣＤ３２部分（例えばそれぞれが特異的にＣＤ３２を認識するペプチド、または抗体、抗体の抗原結合部位を含む抗体フラグメントもしくは構築物）、ならびに例えば第１アルファらせんに合致する第２ペプチド性アルファらせんに連結されたペプチド免疫原を含む免疫原構成要素を含むワクチンが、提供されることができる。そのような免疫原性組成物の特定の例が、国際公開第２０１４００９２０９Ａ２号において開示されている。
【００８６】
多量体タンパク質は、抗原結合分子、例えば抗体、またはそのフラグメントであることができる。
用語“抗体”は、本明細書において用いられる際、リンカー配列を有する、または有しない免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の定常および／または可変ドメインとして理解されている抗体ドメインからなる、または抗体ドメインを含むポリペプチドまたはタンパク質を指すものとする。ポリペプチドは、ループ配列により連結された抗体ドメイン構造の少なくとも２個のベータストランドからなるベータバレル構造を含む場合、抗体ドメインとして理解されている。抗体ドメインは、天然構造のものであることができ、または例えば抗原結合特性もしくはいずれかの他の特性、例えば安定性もしくは機能的特性、例えばＦｃ受容体ＦｃＲｎおよび／もしくはＦｃガンマ受容体への結合を改変するために変異誘発もしくは誘導体化により改変されていることもできる。
【００８７】
本明細書において用いられる抗体は、特に単一の可変抗体ドメイン、例えばＶＨ、ＶＬもしくはＶＨＨのＣＤＲ結合部位、または可変抗体ドメインの対、例えばＶＬ／ＶＨ対、ＶＬ／ＶＨドメイン対および定常抗体ドメインを含む抗体、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、もしくは完全長抗体の結合部位を含む、１以上の抗原またはそのような抗原の１以上のエピトープに結合するための特異的結合部位を有する。
【００８８】
用語“抗体”は、本明細書において用いられる際、特に、例えばＩｇＧ型（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４亜型）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体の単一の可変抗体ドメイン、例えばＶＨ、ＶＬもしくはＶＨＨ、または可変抗体ドメインの対、例えばＶＬ／ＶＨ対、ＶＬ／ＶＨドメイン対および定常抗体ドメインを含む、もしくはＶＬ／ＶＨドメイン対および定常抗体ドメインからなる抗体、例えば重鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆｖ、もしくは完全長抗体を含む、連結配列もしくはヒンジ領域を含む、もしくは含まない可変および／もしくは定常抗体ドメインの組み合わせを含む、またはそれらからなる抗体形式を指す。用語“完全長抗体”は、少なくともＦｃドメインおよび天然存在抗体単量体中に一般的に見られる他のドメインのほとんどを含むあらゆる抗体分子を指すために用いられることができる。この句は、本明細書において特定の抗体分子が抗体フラグメントではないことを強調するために用いられている。
【００８９】
用語“抗体”は、特に、例えばヒト、マウス、またはウサギを含む哺乳類のようなヒト種を含む動物由来の抗体に適用されるものとし、その用語は、動物由来の配列、例えばヒト配列に基づく組み換え抗体を含むものとする。
【００９０】
用語“抗体”は、さらに、異なる種由来の配列、例えばマウスおよびヒト由来の配列を有するキメラ抗体に適用される。
用語“キメラ”は、抗体に関して用いられる際、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの一部分が特定の種由来の、または特定のクラスに属する抗体中の対応する配列に相同性であり、一方で鎖の残りの区分が別の種またはクラスにおける対応する配列に相同性である抗体を指す。典型的には、軽鎖および重鎖両方の可変領域は、哺乳類のある種由来の抗体の可変領域を真似ており、一方で定常部分は、別の種由来の抗体の配列に相同性である。例えば、可変領域は、例えばヒト細胞調製物由来の定常領域との組み合わせで、非ヒト宿主生物からの容易に入手可能なＢ細胞またはハイブリドーマを用いて現在既知の種に由来することができる。
【００９１】
用語“抗体”は、さらにヒト化抗体に適用されることができる。
用語“ヒト化”は、抗体に関して用いられる際、実質的に非ヒト種からの免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を有する分子であって、その分子の残りの免疫グロブリン構造がヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づいている分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメイン上に融合した完全な可変ドメインを含むか、または可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域上に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含むかのどちらであることもできる。抗原結合部位は、野生型であることができ、または例えば１個以上のアミノ酸置換により改変されている、好ましくはヒト免疫グロブリンにより近く似るように改変されていることもできる。ヒト化抗体の一部の形態は、全てのＣＤＲ配列を保持している（例えばマウス抗体からの６個のＣＤＲ全部を含有するヒト化マウス抗体）。他の形態は、元の抗体に関して変更されている１個以上のＣＤＲを有する。
【００９２】
用語“抗体”は、さらにヒト抗体に適用される。
用語“ヒト”は、抗体に関して用いられる際、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する抗体を含むことが理解されている。本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲ中にヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされていないアミノ酸残基を含むことができる（例えばインビトロでランダムもしくは部位特異的変異誘発により、またはインビボで体細胞突然変異により導入された変異）。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１種類以上のヒト免疫グロブリンに関してトランスジェニックである動物から単離された抗体を含む。
【００９３】
用語“抗体”は、特にあらゆるクラスまたは下位クラスの抗体に適用される。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体は、抗体の主なクラスであるＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに割り当てられることができ、これらのいくつかは、さらに下位クラス（イソ型）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に細分されることができる。
【００９４】
その用語は、さらに、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、特に組み換え抗体に適用され、その用語は、組み換え的手段により調製、発現、作製または単離された全ての抗体および抗体構造物、例えば異なる由来からの遺伝子または配列を含む動物、例えばヒトを含む哺乳類に由来する抗体、例えばマウス、キメラ、ヒト化抗体、またはハイブリドーマ由来の抗体を含む。さらなる例は、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、または抗体もしくは抗体ドメインの組み換えコンビナトリアルライブラリーから単離された抗体、または抗体遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含むあらゆる他の手段により調製、発現、作製もしくは単離された抗体に関する。
【００９５】
用語“抗体”は、抗体の誘導体、特に機能的に活性な誘導体も指すことは、理解されている。抗体誘導体は、１個以上の抗体ドメインもしくは抗体のあらゆる組み合わせおよび／または融合タンパク質として理解されており、ここで、抗体のあらゆるドメインは、１個以上の他のタンパク質、例えば他の抗体、例えばＣＤＲループを含む結合構造、受容体ポリペプチドだけでなくリガンド、骨格タンパク質、酵素、毒素等のあらゆる位置において融合しているか、または他の方法で連結されていることができる。抗体の誘導体は、（例えば本明細書で記載されるコネクタによる）会合または様々な化学的技法、例えば共有結合性カップリング、静電相互作用、ジスルフィド結合等による他の物質への結合により得られることができる。抗体に結合している他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機および無機分子またはそれらのあらゆる組み合わせ（例えばＰＥＧ、プロドラッグまたは薬物）であることができる。特定の態様において、抗体は、生物学的に許容可能な化合物との特異的相互作用を可能にする追加のタグを含む誘導体である。本発明において使用可能なタグに関する特定の制限は、それが抗体のその標的への結合に対する負の影響を有しない、または許容可能な負の影響を有する限り、存在しない。適切なタグの例は、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、カルモジュリンタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、およびＳタグを含む。別の特定の態様において、抗体は、標識を含む誘導体である。用語“標識”は、本明細書で用いられる際、“標識された”抗体を生成するために抗体に直接または間接的にコンジュゲートされている検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能であることができ（例えば放射性同位体標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合、検出可能である基質化合物もしくは組成物の化学変化を触媒することができる。
【００９６】
特定の例によれば、多量体タンパク質は、本明細書で記載されるコネクタにより互いに連結されている少なくとも２個のポリペプチド鎖で構成されている抗体構築物である。特定の例は、少なくとも１個の抗体ドメイン（単一のドメインまたは２、３、もしくは４個の抗体ドメインの鎖のどちらでもよい）が別の抗体ドメイン（単一のドメインまたは２、３、もしくは４個の抗体ドメインの鎖のどちらでもよい）に連結されている構築物、例えばリンカーが本明細書で記載されるコネクタにより置き換えられている単鎖抗体構築物、または本明細書で記載されるコネクタにより連結された抗体重鎖および軽鎖を含む構築物を含む。
【００９７】
本明細書で記載されるコネクタもしくは多量体タンパク質の構成要素、またはコイルリピートを含む、もしくは含まないその一部は、当該技術で既知の様々な方法により、例えば細胞培養、組み換え技術からの精製もしくは単離により、または化学合成により得られることができる。
【００９８】
本明細書で用いられる際、用語“組み換え”は、宿主細胞中に天然に存在しない分子または構築物を指す。ある態様において、組み換え核酸分子は、天然に存在しない方式で一緒に連結されている２個以上の天然存在配列を含有する。組み換えタンパク質は、組み換え核酸によりコードおよび／または発現されるタンパク質を指す。ある態様において、“組み換え細胞”は、故意の人の介入により細胞の天然（すなわち非組み換え）形態内では同一の形態で見付からない遺伝子を発現している、かつ／または天然遺伝子を発現しており、それが、他の方式で異常に過剰発現されている、低く発現されている、かつ／もしくは全く発現されていない。組み換え細胞は、少なくとも１種類の組み換えポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含有する。“組み換え”、“組み替えている”、および“組み替えられた”核酸を生成することは、一般に少なくとも２個の核酸断片の組み立てを包含する。特定の態様において、組み換えタンパク質および組み換え核酸は、宿主細胞中で機能性であるままであり、すなわち、それらの活性を保持しているか、または高められた活性を示す。
【００９９】
従って、本発明は、さらにコネクタもしくはコネクタを含む多量体タンパク質、またはそれらの構成要素（例えばポリペプチド鎖のいずれか、特に第１アルファらせんまたは第１アルファらせんを含む第１ポリペプチド鎖）の生成、およびそれぞれのアミノ酸配列をコードしている核酸、発現されるべきアミノ酸配列をコードしている核酸を含む発現カセット、ベクターまたはプラスミドを含むそのような生成のための組み換え手段、ならびにあらゆるそのような手段を含む宿主細胞に関する。適切な標準的組み換えＤＮＡ技法は、当該技術で既知であり、特にSambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (1989), 第２版 (Cold Spring Harbor Laboratory press)において記載されている。
【０１００】
本明細書で記載される多量体タンパク質は、特に少なくとも１個の異種組み換えポリペプチド鎖で構成されており、真核細胞、好ましくは本明細書で記載される哺乳類または酵母細胞のいずれかにおいて好ましくは分泌型タンパク質として生成される。
【０１０１】
用語“異種”は、本明細書でヌクレオチドもしくはアミノ酸配列またはタンパク質に関して用いられる際、所与の宿主細胞に対して外来、すなわち“外因性”である、例えば天然に存在しない化合物；または所与の宿主細胞中に天然に存在するが、例えば異種核酸を用いる異種コンストラクトの状況において例えば“内因性”である化合物を指す。内因性に存在する場合の異種ヌクレオチド配列は、細胞中で不自然な、例えば予想されるよりも多い量で、または天然に存在するよりも多い量で生成される可能性もある。異種ヌクレオチド配列、または異種ヌクレオチド配列を含む核酸は、内因性ヌクレオチド配列と配列が異なるが内因性に存在するタンパク質と同じタンパク質をコードしている可能性がある。具体的には、異種ヌクレオチド配列は、天然における宿主細胞との関係と同じ関係にないヌクレオチド配列である。あらゆる組み換えまたは人工ヌクレオチド配列は、異種であると理解されている。異種ポリヌクレオチドの例は、例えばハイブリッドプロモーターを得るために発現コンストラクトにおいて用いられている、または本明細書で記載されるコード配列に作動可能に連結されているプロモーターと天然に関係していないヌクレオチド配列である。結果として、ハイブリッドまたはキメラポリヌクレオチドが、得られることができる。異種化合物のさらなる例は、内因性の天然存在タンパク質をコードしている配列が正常に作動可能に連結されていない転写制御要素、例えば外因性プロモーターに作動可能に連結されたタンパク質をコードしているポリヌクレオチドである。
【０１０２】
用語“宿主細胞”は、本明細書で用いられる際、特定の組み換えタンパク質、例えば本明細書で記載される多量体タンパク質またはあらゆるそのような多量体タンパク質の１個以上のポリペプチド鎖を生成するように形質転換された一次対象細胞、ならびにそのあらゆる子孫を指すものとする。（故意の、もしくは意図されない変異または環境における違いにより）全ての子孫が親細胞と正確に同一であるわけではないが、そのような変化した子孫は、子孫が最初に形質転換された細胞の機能性と同じ機能性を保持している限り、これらの用語に含まれることは、理解されるべきである。用語“宿主細胞株”は、組み換えポリペプチド、例えば組み換え抗体を生成するための組み換え遺伝子を発現させるために用いられる宿主細胞の細胞株を指す。用語“細胞株”は、本明細書で用いられる際、長期間にわたって増殖する能力を獲得している特定の細胞型の確立されたクローンを指す。そのような宿主細胞または宿主細胞株は、細胞培養において維持されることができ、かつ／または組み換えポリペプチドを生成するように培養されることができる。
【０１０３】
特定の側面によれば、組み換えコンストラクトは、関連する遺伝子をベクター中にライゲーションすることにより得られる。これらの遺伝子は、そのようなベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより、宿主細胞ゲノム中に安定して組み込まれることができる。遺伝子によりコードされるポリペプチドは、組み換え宿主細胞株を用いて、形質転換体を培養することにより生成されることができ、そうして適切な培地中に得られ、発現されたタンパク質を培養物から単離し、そしてそれを発現された生成物に適した方法により精製し、特にタンパク質を混入しているタンパク質から分離する。
【０１０４】
組み換え技術に関して、単離された核酸が、提供されることができる。
本明細書で記載される核酸に関して、用語“単離された核酸”が、時々用いられる。この用語は、ＤＮＡに適用される場合、それが由来する生物の天然存在ゲノム中ですぐ近くに隣接している配列から分離されているＤＮＡ分子を指す。例えば、“単離された核酸”は、ベクター、例えばプラスミドもしくはウイルスベクター中に挿入された、または原核もしくは真核細胞もしくは宿主生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれたＤＮＡ分子を含むことができる。ＲＮＡに適用される場合、用語“単離された核酸”は、主に上記で定義された単離されたＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ分子を指す。あるいは、その用語は、それがその天然の状態において（すなわち細胞または組織中で）会合しているであろう他の核酸から十分に分離されているＲＮＡ分子を指すことができる。“単離された核酸”（ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらでもよい）は、さらに生物学的または合成的手段により直接生成され、その生成の間に存在する他の構成要素から分離された分子を表すことができる。
【０１０５】
ポリペプチドまたはタンパク質に関して、用語“単離された”は、特にそれらが天然に会合している物質、例えばそれらがそれらの天然の環境、またはそのような調製がインビトロもしくはインビボで実行される組み換えＤＮＡ技術による場合にそれらが調製される環境（例えば細胞培養）において一緒に存在する他の化合物を含まない、または実質的に含まない化合物を指すものとする。単離された化合物は、希釈剤またはアジュバントと共に配合されてなお実質上単離されていることができる−例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、診断または療法において用いられる際、薬学的に許容可能なキャリヤーまたは賦形剤と混合されることができる。
【０１０６】
組み換えポリペプチドまたはタンパク質生成物を得るための単離および精製法として、溶解度における差を利用する方法、例えば塩析および溶媒沈殿、分子量における差を利用する方法、例えば限外濾過およびゲル電気泳動、電荷における差を利用する方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、特異的親和性を利用する方法、例えば親和性クロマトグラフィー、疎水性における差を利用する方法、例えば逆相高性能液体クロマトグラフィー、および等電点における差を利用する方法、例えば等電点分画法のような方法が、用いられることができる。
【０１０７】
高度に精製された生成物は、本質的に混入タンパク質を含まず、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、またはさらには少なくとも９８％、１００％に至るまでの純度を有する。精製された生成物は、細胞培養上清の精製により、またはそうでなければ細胞破砕片から得られることができる。
【０１０８】
単離および精製法として、以下の標準的な方法が、好ましい：細胞破砕（タンパク質が細胞内に得られる場合）、細胞（破砕片）分離および微量濾過または接線流フィルター（ＴＦＦ）または遠心分離による洗浄、沈殿または熱処理によるタンパク質精製、酵素消化によるタンパク質活性化、クロマトグラフィー、例えばイオン交換（ＩＥＸ）によるタンパク質精製、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除（ＳＥＣ）またはＨＰＬＣクロマトグラフィー、濃縮のタンパク質沈殿および限外濾過工程による洗浄。
【０１０９】
単離および精製されたタンパク質は、従来の方法、例えばウェスタンブロット、ＨＰＬＣ、活性アッセイ、またはＥＬＩＳＡにより同定されることができる。
従って、本発明は、特に向上したコネクタドメインおよびポリペプチド鎖がそのような向上したコネクタを用いて互いに連結されている向上した多量体タンパク質を提供する。
【０１１０】
特定の例によれば、哺乳類細胞において生成されたタンパク質におけるＣ末端Ｌｙｓの喪失は、回避されることができ、正しいＣ末端（Ｌｙｓ拡張、例えばＣ末端Ｌｙｓの後の追加のＡｌａ、ＧｌｙまたはＳｅｒ）が、得られた。そのような正しい末端は、驚くべきことに、安定化されたコイルドコイル構造によりタンパク質構築物を安定化しただけでなく、コイルを対コイルに接続する親和性も高めた。
【０１１１】
前記の記載は、以下の実施例への参照により、より完全に理解されるであろう。しかし、そのような実施例は、単に本発明の１以上の態様を実施する方法の代表的なものでしかなく、本発明の範囲を限定するものとして読み取られるべきではない。
【実施例】
【０１１２】
実施例１：向上したＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１
免疫原性組成物は、国際公開第２０１４００９２０９Ａ２号に従って調製される。従って、ＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１が、弾頭の調製のための基礎である。ＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１分子を弾頭分子に変換するため、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＴＬＲ９結合剤）が、ＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１タンパク質骨格中の“Ｌｙｓ”アミノ酸にカップリングされる。
【０１１３】
先行技術によれば、ＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１は、哺乳類細胞、例えばＣＡＰ−Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３およびＣＨＯ細胞中で生成されたが、昆虫細胞、例えばＳ２細胞中および酵母細胞（ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））中でも生成された。
【０１１４】
典型的なＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１として、ＳＥＱ  ＩＤ  ４９（図１）として同定されるアミノ酸配列により特性付けられるポリペプチドが、用いられてきた。
しかし、質量分析での分析は、哺乳類細胞中で生成されたＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１分子の約４０％においてＬｙｓ（２８９）が切断されたことを示しており（図４ａ）、これは、以前にHarris (1995. Processing of C-terminal lysine and arginine residues of proteins isolated from mammalian cell culture. J.Chromatogr.A 705:129-134)により記載されている現象である。しかし、昆虫細胞中で生成されたＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１は、分子の１００％がＬｙｓ（２８９）を含有していたため、この現象を示さなかった（図４ｂ）。ＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１中のＬｙｓ分子は、ＣｐＧ分子のカップリングに関する標的であり、従って免疫原性構築物におけるＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１の完全な機能性に関して重要である。
【０１１５】
この問題に対する解決策として、以下のものが構築された：
Ａｌａを配列のＣ’末端に追加することにより（ＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１ａｌａ、図２）、Ｌｙｓ（２８９）が効果的に保護された。ＨＥＫ２９３細胞中またはＣＨＯ細胞中で生成されたＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１ａｌａの質量分析は、１００％完全長のＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１ａｌａを示した（図４ｃ）。同じことが、ＧｌｙまたはＳｅｒがＣ’末端に追加された場合にも当てはまった（データは示されていない）。
【０１１６】
この実施例によれば、ＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１（弾頭に関する基礎）は、５×７つ組リピート構造（ｐｅｐＥ、図１および２中の斜体）を含有し、それは、免疫原構成要素の一部であるｐｅｐＫと呼ばれる類似の５×７つ組リピート構造（図３）とコイルドコイル相互作用を形成する。免疫原および弾頭が混合された際、コイルドコイルが形成され、そうして弾頭および免疫原を高い親和性でカップリングさせ、アレルギー、腫瘍学、感染症および／または自己免疫疾患における使用のためのワクチン構築物を生成するために用いられるべき安定な複合体を形成する。免疫原構成要素は、さらに、あらゆるそのような疾患を処置するために必要に応じて有効な免疫反応を誘発するために１個以上の関連するエピトープを含む必要があるであろう。
【０１１７】
ＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１およびＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１ａｌａがＯｃｔｅｔ分析においてｐｅｐＥおよびｐｅｐＫの間の親和性に関して比較された際、ｐｅｐＫおよびＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１の間の親和性は、ｐｅｐＫおよびＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１ａｌａの間の親和性よりも低く、一方でＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１の部分的に切り詰められたバージョンを用いて得られたＫＤ値は、（より低い親和性を反映して）完全長のＫＤ値よりも高かった（図５）。親和性は、同様にＣ’末端におけるＧｌｙまたはＳｅｒにより増大した（データは示されていない）。
【０１１８】
実施例２：ＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１バリアントの質量分析。
精製されたＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１バリアントは、質量分布に関してＷａｔｅｒｓ  ３１００質量検出器上で製造業者の指示に従って分析された。質量スペクトルは、陽イオンモードで作動するエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ−ＭＳ）により獲得された。質量スペクトルは、プログラムＭａｘＥｎｔ  ｖ．４．１（Ｗａｔｅｒｓ）によりデコンボリューションされた。
【０１１９】
図１の配列に基づく予想分子量（ＭＷ）は、３０７６４  Ｄａである。
図４Ａにおいて示されているように、組み換えＨＥＫ２９３細胞中で生成されたｓｃＦＶ−ｃｏｉｌ１に関して、見付かったＭＷは３０７５５．５  Ｄａ（総物質の約６０％）および３０６３０  Ｄａ（総物質の約４０％）であり、それは予想ＭＷからＬｙｓ（２８９）を減算したものに相当する。
【０１２０】
図４Ｂにおいて示されているように、組み換えＳ２昆虫細胞中で生成されたｓｃＦＶ−ｃｏｉｌ１に関して、見付かったＭＷは３０７５５．５  Ｄａであり、これは完全長タンパク質を示している。
【０１２１】
図２の配列に基づく予想分子量（ＭＷ）は、３０８３５．４  Ｄａである。
図４Ｃにおいて示されているように、組み換えＨＥＫ２９３細胞中で生成された（実施例１に従って得られた）ｓｃＦＶ−ｃｏｉｌ１ａｌａに関して、見付かったＭＷは３０８３１．０  Ｄａであり、これは完全長タンパク質を示している。
【０１２２】
実施例３：ｐｅｐＫおよびｓｃＦＶ−ｃｏｉｌ１またはＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１ａｌａの親和性分析
ｐｅｐＫに関するＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１の異なるバージョンのＣ末端に対する大腸菌の親和性が、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ機器上でバイオレイヤー干渉法により決定された。この目的に関して、ストレプトアビジンバイオセンサーにビオチン化されたｐｅｐＫが装填され、非特異的結合に関する表面のブロッキング後、会合および解離速度が、ＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１タンパク質に関して測定された。異なるタンパク質濃度により得られた結合曲線から、親和性が計算された。明確にするため、１つの濃度のみがグラフ中に示されている。組み換えＨＥＫ細胞から得られた（実施例１に従って得られた）ＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１ａｌａに関して８．７ｐＭ、組み換えＳ２昆虫細胞から得られたＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１に関して１５．８ｐＭ、および組み換えＨＥＫ細胞中から得られたＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１に関して３２．５ｐＭのＫＤ値が、計算された。最低の親和性は、分子の約４０％におけるＬｙｓ  ２８９の欠失を示している（図４Ａ）ＨＥＫ細胞由来のＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１に関して見出される。完全な本来の配列を含有する昆虫細胞からの物質（図４Ｂ）は、中程度の親和性を示し、一方でＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１ａｌａ（図４Ｃ）は、意外にも最高の親和性を示している（図５参照）。
【図１】
2018528214.tif 000007
【図２】
2018528214.tif 000008
【図３】
2018528214.tif 000009
【図４−１】
2018528214.tif 000010
【図４−２】
2018528214.tif 000011
【図５】
2018528214.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成30年5月7日(2018.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド性第１アルファらせんおよび該第１アルファらせんに巻き付いているペプチド性第２アルファらせんを含むらせん状コイルドコイル型構造のコネクタであって、
ここで、該第１アルファらせんは、以下：
ｉ）アミノ酸モチーフａ−ｘ１のリピートおよびＣ末端モチーフａ−ｘ１−ｘ２からなるＣ末端領域；または
ｉｉ）アミノ酸モチーフｘ１−ａのリピートおよびＮ末端モチーフｘ２−ｘ１−ａからなるＮ末端領域；
を含み、ここで
ａは、４〜８アミノ酸のモチーフ配列であり；
ｘ１は、リジンであり；そして
ｘ２は、モチーフの拡張であり、ここで、該拡張は、１〜１０アミノ酸からなり、かつここで、該拡張は、前記のモチーフａ−ｘ１またはｘ１−ａ中に組み込まれている４個より多くの連続するアミノ酸を含まず、かつ
ａ）モチーフａ−ｘ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  １であり、かつモチーフａ−ｘ１−ｘ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ６９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７１のいずれかであり、該モチーフａ−ｘ１−ｘ２は、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｂ）モチーフａ−ｘ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ３であり、かつモチーフａ−ｘ１−ｘ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ８５、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ８７のいずれかであり、該モチーフａ−ｘ１−ｘ２は、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｃ）モチーフａ−ｘ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ５であり、かつモチーフａ−ｘ１−ｘ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ４５、ＳＥＱ  ＩＤ  １０１、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １０３のいずれかであり、該モチーフａ−ｘ１−ｘ２は、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｄ）モチーフａ−ｘ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ７であり、かつモチーフａ−ｘ１−ｘ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ４７、ＳＥＱ  ＩＤ  １１７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１９のいずれかであり、該モチーフａ−ｘ１−ｘ２は、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｅ）モチーフｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ２であり、かつモチーフｘ２−ｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ７７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７９のいずれかであり、該モチーフｘ２−ｘ１−ａは、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｆ）モチーフｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ４であり、かつモチーフｘ２−ｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ９３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ９５のいずれかであり、該モチーフｘ２−ｘ１−ａは、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｇ）モチーフｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ６であり、かつモチーフｘ２−ｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ４６、ＳＥＱ  ＩＤ  １０９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１１のいずれかであり、該モチーフｘ２−ｘ１−ａは、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｈ）モチーフｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ８であり、かつモチーフｘ２−ｘ１−ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ４８、ＳＥＱ  ＩＤ  １２５、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １２７のいずれかであり、該モチーフｘ２−ｘ１−ａは、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されている、
上記コネクタ。
【請求項２】
拡張が、アラニン、グリシン、セリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、バリン、およびプロリンからなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸を含む、請求項１に記載のコネクタ。
【請求項３】
拡張が、アルファらせんを拡張する最初の１〜４アミノ酸内に前記の選択されたアミノ酸を含む、請求項２に記載のコネクタ。
【請求項４】
第１および第２アルファらせんのそれぞれが、２〜９個、好ましくは３〜５個の合致するアミノ酸モチーフのリピートを含み、好ましくは該リピートが、同一のモチーフの、または互いに少なくとも１アミノ酸異なるモチーフのリピートである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコネクタ。
【請求項５】
らせん状コイルドコイル型構造中に、合致するアミノ酸リピート配列を有する２〜７個のアルファらせんの束を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のコネクタ。
【請求項６】
第１および第２アルファらせんが、平行または逆平行アルファらせんであり、好ましくは第１および第２アルファらせんが、巻き付いてコイルドコイル２重らせんになっている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコネクタ。
【請求項７】
ヘテロ２量体性コイルドコイルを含み、第１アルファらせんが、第２アルファらせんと異なっている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のコネクタ。
【請求項８】
ａ）第１アルファらせんがモチーフａ−ｘ１を含み、かつ第２アルファらせんがモチーフｘ１−ａを含み；または
ｂ）第１アルファらせんがモチーフｘ１−ａを含み、かつ第２アルファらせんがモチーフａ−ｘ１を含み；
好ましくは、モチーフａ−ｘ１を含むアルファらせんがＣ末端モチーフａ−ｘ１−ｘ２をさらに含み、かつモチーフｘ１−ａを含むアルファらせんがＮ末端モチーフｘ２−ｘ１−ａをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のコネクタ。
【請求項９】
ａ）
ｉ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  １であり；
ｉｉ）モチーフａ−ｘ１−ｘ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ６９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７１のいずれかであり；
ｉｉｉ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ２であり；そして
ｉｖ）モチーフｘ２−ｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ７７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７９のいずれかであり；
または
ｂ）
ｉ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ３であり；
ｉｉ）モチーフａ−ｘ１−ｘ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ８５、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ８７のいずれかであり；
ｉｉｉ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４であり；そして
ｉｖ）モチーフｘ２−ｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ９３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ９５のいずれかであり；
または
ｃ）
ｉ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ５であり；
ｉｉ）モチーフａ−ｘ１−ｘ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ４５、ＳＥＱ  ＩＤ  １０１、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １０３のいずれかであり；
ｉｉｉ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ６であり；そして
ｉｖ）モチーフｘ２−ｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４６、ＳＥＱ  ＩＤ  １０９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１１のいずれかであり；
または
ｄ）
ｉ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ７であり；
ｉｉ）モチーフａ−ｘ１−ｘ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ４７、ＳＥＱ  ＩＤ  １１７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１９のいずれかであり；
ｉｉｉ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ８であり；そして
ｉｖ）モチーフｘ２−ｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４８、ＳＥＱ  ＩＤ  １２５、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １２７のいずれかである、
請求項１〜８のいずれか１項に記載のコネクタ。
【請求項１０】
Ｘ２が、１個のアミノ酸、好ましくはアラニン、グリシン、またはセリンのいずれかからなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載のコネクタ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のコネクタにより互いに連結された少なくとも２個のポリペプチド鎖を含む多量体タンパク質であって、第１ポリペプチド鎖が第１アルファらせんを組み込んでおり、かつ第２ポリペプチド鎖が第２アルファらせんを組み込んでおり；かつ第１および第２ポリペプチド鎖が第１および第２アルファらせんのらせん状コイルドコイル型構造により連結されており、好ましくは該タンパク質が、以下：
ａ）ワクチン抗原およびアジュバントを含むワクチン構成要素；
ｂ）２個のポリペプチド鎖のそれぞれが少なくとも１個の抗体ドメインを組み込んでいる抗体または抗体形式；
ｃ）抗体および非抗体構成要素を含む抗体誘導体であって、ここで、該抗体の少なくとも１個のポリペプチド鎖が、該構成要素を組み込んでいる別のポリペプチド鎖に連結されており、好ましくは該構成要素が、有機および無機分子、特に標識、タグ、酵素、受容体、リガンド、毒素、脂質、炭水化物、または核酸のいずれかである；ならびに
ｄ）受容体またはリガンドが、キャリヤーに連結されている親和性物質；
からなる群から選択される、
上記多量体タンパク質。
【請求項１２】
ａ）第１アルファらせんを組み込んでいる第１ポリペプチド鎖が、アミノ酸モチーフａ−ｘ１のリピートおよびＣ末端モチーフａ−ｘ１−ｘ２からなるＣ末端領域を含み；かつ第２ポリペプチド鎖が、第２アルファらせんを平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはＣ末端領域中に組み込んでおり；または
ｂ）第１アルファらせんを組み込んでいる第１ポリペプチド鎖が、アミノ酸モチーフａ−ｘ１のリピートおよびＣ末端モチーフａ−ｘ１−ｘ２からなるＣ末端領域を含み；かつ第２ポリペプチド鎖が、第２アルファらせんを逆平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはＮ末端領域中に組み込んでおり、または
ｃ）第１アルファらせんを組み込んでいる第１ポリペプチド鎖が、アミノ酸モチーフｘ１−ａのリピートおよびＮ末端モチーフｘ２−ｘ１−ａからなるＮ末端領域を含み；かつ第２ポリペプチド鎖が、第２アルファらせんを平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはＮ末端領域中に組み込んでおり；または
ｄ）第１アルファらせんを組み込んでいる第１ポリペプチド鎖が、アミノ酸モチーフｘ１−ａのリピートおよびＮ末端モチーフｘ２−ｘ１−ａからなるＣ末端領域を含み；かつ第２ポリペプチド鎖が、第２アルファらせんを逆平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはＣ末端領域中に組み込んでいる、
請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載のタンパク質を生成する方法であって、以下の工程：
ａ）第１ポリペプチド鎖をコードする第１異種核酸を組み込んでいる第１宿主細胞を提供し；
ｂ）第２ポリペプチド鎖をコードする第２異種核酸を組み込んでいる第２宿主細胞を提供し；
ｃ）宿主細胞を、第１および第２ポリペプチド鎖を細胞培養において発現させるための条件下で培養し；そして
ｄ）第１および第２ポリペプチド鎖をらせん状コイルドコイル型構造により連結する；
を含み、好ましくは該第１および／または第２宿主細胞が、哺乳類または酵母宿主細胞である、上記方法。
【請求項１４】
請求項１１または１２に記載のタンパク質を生成する方法であって、以下の工程：
ａ）以下：
（ｉ）第１ポリペプチド鎖をコードする第１異種核酸；
および
（ｉｉ）第２ポリペプチド鎖をコードする第２異種核酸；
を組み込んでいる宿主細胞を提供し；
ｂ）宿主細胞を、第１および第２ポリペプチド鎖を細胞培養において発現させるための条件下で培養し；そして
ｃ）第１および第２ポリペプチド鎖をらせん状コイルドコイル型構造により連結する；
を含み、好ましくは該宿主細胞が、哺乳類または酵母宿主細胞である、上記方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の方法により得ることができるタンパク質の調製物であって、該タンパク質分子の少なくとも９０％が、第１および第２核酸によりコードされるポリペプチド鎖の正しいＣ末端およびＮ末端領域を含む、上記調製物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
実施例３：ｐｅｐＫおよびｓｃＦＶ−ｃｏｉｌ１またはＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１ａｌａの親和性分析
ｐｅｐＫに関するＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１の異なるバージョンのＣ末端に対する大腸菌の親和性が、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ機器上でバイオレイヤー干渉法により決定された。この目的に関して、ストレプトアビジンバイオセンサーにビオチン化されたｐｅｐＫが装填され、非特異的結合に関する表面のブロッキング後、会合および解離速度が、ＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１タンパク質に関して測定された。異なるタンパク質濃度により得られた結合曲線から、親和性が計算された。明確にするため、１つの濃度のみがグラフ中に示されている。組み換えＨＥＫ細胞から得られた（実施例１に従って得られた）ＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１ａｌａに関して８．７ｐＭ、組み換えＳ２昆虫細胞から得られたＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１に関して１５．８ｐＭ、および組み換えＨＥＫ細胞中から得られたＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１に関して３２．５ｐＭのＫＤ値が、計算された。最低の親和性は、分子の約４０％におけるＬｙｓ  ２８９の欠失を示している（図４Ａ）ＨＥＫ細胞由来のＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１に関して見出される。完全な本来の配列を含有する昆虫細胞からの物質（図４Ｂ）は、中程度の親和性を示し、一方でＳｃＦＶ−ｃｏｉｌ１ａｌａ（図４Ｃ）は、意外にも最高の親和性を示している（図５参照）。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］第１および第２分子を連結するらせん状コイルドコイル型構造のコネクタであって、該第１分子が、ペプチド性第１アルファらせんを含み、該第２分子が、ペプチド性第２アルファらせんを含み、その第２アルファらせんが、該第１アルファらせんに巻き付いており；
ここで、該第１アルファらせんは、以下：
ｉ）アミノ酸モチーフａ−ｘ１のリピートおよびＣ末端モチーフａ−ｘ１−ｘ２からなるＣ末端領域；または
ｉｉ）アミノ酸モチーフｘ１−ａのリピートおよびＮ末端モチーフｘ２−ｘ１−ａからなるＮ末端領域；
を含み、ここで
ａは、４〜８アミノ酸のモチーフ配列であり；
ｘ１は、リジンであり；そして
ｘ２は、モチーフの拡張であり、ここで、該拡張は、１〜１０アミノ酸からなり、かつここで、該拡張は、前記のモチーフａ−ｘ１またはｘ１−ａ中に組み込まれている４個より多くの連続するアミノ酸を含まない、上記コネクタ。
［態様２］拡張が、アラニン、グリシン、セリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、バリン、およびプロリンからなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸を含む、態様１に記載のコネクタ。
［態様３］拡張が、アルファらせんを拡張する最初の１〜４アミノ酸内に前記の選択されたアミノ酸を含む、態様２に記載のコネクタ。
［態様４］第１および第２アルファらせんのそれぞれが、２〜９個、好ましくは３〜５個の合致するアミノ酸モチーフのリピートを含み、好ましくは該リピートが、同一のモチーフの、または互いに少なくとも１アミノ酸異なるモチーフのリピートである、態様１〜３のいずれかに記載のコネクタ。
［態様５］らせん状コイルドコイル型構造中に、合致するアミノ酸リピート配列を有する２〜７個のアルファらせんの束を含む、態様１〜４のいずれかに記載のコネクタ。
［態様６］第１および第２アルファらせんが、平行または逆平行アルファらせんであり、好ましくは第１および第２アルファらせんが、巻き付いてコイルドコイル２重らせんになっている、態様１〜５のいずれかに記載のコネクタ。
［態様７］ヘテロ２量体性コイルドコイルを含み、第１アルファらせんが、第２アルファらせんと異なっている、態様１〜６のいずれかに記載のコネクタ。
［態様８］ａ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  １、ＳＥＱ  ＩＤ  ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ５、およびＳＥＱ  ＩＤ  ７からなる群から選択され；または
ｂ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ４、ＳＥＱ  ＩＤ  ６、およびＳＥＱ  ＩＤ  ８からなる群から選択される、
態様１〜７のいずれかに記載のコネクタ。
［態様９］ａ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  １であり、かつモチーフａ−ｘ１−ｘ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ６９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７１のいずれかであり、該モチーフａ−ｘ１−ｘ２が、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｂ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ３であり、かつモチーフａ−ｘ１−ｘ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ８５、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ８７のいずれかであり、該モチーフａ−ｘ１−ｘ２が、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｃ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ５であり、かつモチーフａ−ｘ１−ｘ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ４５、ＳＥＱ  ＩＤ  １０１、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １０３のいずれかであり、該モチーフａ−ｘ１−ｘ２が、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｄ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ７であり、かつモチーフａ−ｘ１−ｘ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ４７、ＳＥＱ  ＩＤ  １１７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１９のいずれかであり、該モチーフａ−ｘ１−ｘ２が、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｅ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ２であり、かつモチーフｘ２−ｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ７７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７９のいずれかであり、該モチーフｘ２−ｘ１−ａが、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｆ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４であり、かつモチーフｘ２−ｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ９３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ９５のいずれかであり、該モチーフｘ２−ｘ１−ａが、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｇ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ６であり、かつモチーフｘ２−ｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４６、ＳＥＱ  ＩＤ  １０９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１１のいずれかであり、該モチーフｘ２−ｘ１−ａが、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されており；または
ｈ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ８であり、かつモチーフｘ２−ｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４８、ＳＥＱ  ＩＤ  １２５、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １２７のいずれかであり、該モチーフｘ２−ｘ１−ａが、場合により１個以上のアミノ酸により拡張されている、
態様１〜８のいずれかに記載のコネクタ。
［態様１０］ａ）第１アルファらせんがモチーフａ−ｘ１を含み、かつ第２アルファらせんがモチーフｘ１−ａを含み；または
ｂ）第１アルファらせんがモチーフｘ１−ａを含み、かつ第２アルファらせんがモチーフａ−ｘ１を含み；
好ましくは、モチーフａ−ｘ１を含むアルファらせんがＣ末端モチーフａ−ｘ１−ｘ２をさらに含み、かつモチーフｘ１−ａを含むアルファらせんがＮ末端モチーフｘ２−ｘ１−ａをさらに含む、態様１〜９のいずれかに記載のコネクタ。
［態様１１］ａ）
ｉ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  １であり；
ｉｉ）モチーフａ−ｘ１−ｘ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ６９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７１のいずれかであり；
ｉｉｉ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ２であり；そして
ｉｖ）モチーフｘ２−ｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ７７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ７９のいずれかであり；
または
ｂ）
ｉ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ３であり；
ｉｉ）モチーフａ−ｘ１−ｘ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ８５、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ８７のいずれかであり；
ｉｉｉ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４であり；そして
ｉｖ）モチーフｘ２−ｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ９３、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ９５のいずれかであり；
または
ｃ）
ｉ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ５であり；
ｉｉ）モチーフａ−ｘ１−ｘ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ４５、ＳＥＱ  ＩＤ  １０１、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １０３のいずれかであり；
ｉｉｉ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ６であり；そして
ｉｖ）モチーフｘ２−ｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４６、ＳＥＱ  ＩＤ  １０９、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１１のいずれかであり；
または
ｄ）
ｉ）モチーフａ−ｘ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ７であり；
ｉｉ）モチーフａ−ｘ１−ｘ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ４７、ＳＥＱ  ＩＤ  １１７、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １１９のいずれかであり；
ｉｉｉ）モチーフｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ８であり；そして
ｉｖ）モチーフｘ２−ｘ１−ａが、ＳＥＱ  ＩＤ  ４８、ＳＥＱ  ＩＤ  １２５、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  １２７のいずれかである、
態様９に記載のコネクタ。
［態様１２］Ｘ２が、１個のアミノ酸、好ましくはアラニン、グリシン、またはセリンのいずれかからなる、態様１〜１１のいずれかに記載のコネクタ。
［態様１３］態様１〜１２のいずれかに記載のコネクタにより互いに連結された少なくとも２個のポリペプチド鎖を含む多量体タンパク質であって、第１ポリペプチド鎖が第１アルファらせんを組み込んでおり、かつ第２ポリペプチド鎖が第２アルファらせんを組み込んでおり；かつ第１および第２ポリペプチド鎖が第１および第２アルファらせんのらせん状コイルドコイル型構造により連結されており、好ましくは該タンパク質が、以下：
ａ）ワクチン抗原およびアジュバントを含むワクチン構成要素；
ｂ）２個のポリペプチド鎖のそれぞれが少なくとも１個の抗体ドメインを組み込んでいる抗体または抗体形式；
ｃ）抗体および非抗体構成要素を含む抗体誘導体であって、ここで、該抗体の少なくとも１個のポリペプチド鎖が、該構成要素を組み込んでいる別のポリペプチド鎖に連結されており、好ましくは該構成要素が、有機および無機分子、特に標識、タグ、酵素、受容体、リガンド、毒素、脂質、炭水化物、または核酸のいずれかである；ならびに
ｄ）受容体またはリガンドが、キャリヤーに連結されている親和性物質；
からなる群から選択される、
上記多量体タンパク質。
［態様１４］ａ）第１アルファらせんを組み込んでいる第１ポリペプチド鎖が、アミノ酸モチーフａ−ｘ１のリピートおよびＣ末端モチーフａ−ｘ１−ｘ２からなるＣ末端領域を含み；かつ第２ポリペプチド鎖が、第２アルファらせんを平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはＣ末端領域中に組み込んでおり；または
ｂ）第１アルファらせんを組み込んでいる第１ポリペプチド鎖が、アミノ酸モチーフａ−ｘ１のリピートおよびＣ末端モチーフａ−ｘ１−ｘ２からなるＣ末端領域を含み；かつ第２ポリペプチド鎖が、第２アルファらせんを逆平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはＮ末端領域中に組み込んでおり、または
ｃ）第１アルファらせんを組み込んでいる第１ポリペプチド鎖が、アミノ酸モチーフｘ１−ａのリピートおよびＮ末端モチーフｘ２−ｘ１−ａからなるＮ末端領域を含み；かつ第２ポリペプチド鎖が、第２アルファらせんを平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはＮ末端領域中に組み込んでおり；または
ｄ）第１アルファらせんを組み込んでいる第１ポリペプチド鎖が、アミノ酸モチーフｘ１−ａのリピートおよびＮ末端モチーフｘ２−ｘ１−ａからなるＣ末端領域を含み；かつ第２ポリペプチド鎖が、第２アルファらせんを逆平行アルファらせんとして非末端領域内もしくはＣ末端領域中に組み込んでいる、
態様１３に記載のタンパク質。
［態様１５］態様１３または１４に記載のタンパク質を生成する方法であって、以下の工程：
ａ）第１ポリペプチド鎖をコードする第１異種核酸を組み込んでいる第１宿主細胞を提供し；
ｂ）第２ポリペプチド鎖をコードする第２異種核酸を組み込んでいる第２宿主細胞を提供し；
ｃ）宿主細胞を、第１および第２ポリペプチド鎖を細胞培養において発現させるための条件下で培養し；そして
ｄ）第１および第２ポリペプチド鎖をらせん状コイルドコイル型構造により連結する；
を含み、好ましくは該第１および／または第２宿主細胞が、哺乳類または酵母宿主細胞である、上記方法。
［態様１６］態様１３または１４に記載のタンパク質を生成する方法であって、以下の工程：
ａ）以下：
（ｉ）第１ポリペプチド鎖をコードする第１異種核酸；
および
（ｉｉ）第２ポリペプチド鎖をコードする第２異種核酸；
を組み込んでいる宿主細胞を提供し；
ｂ）宿主細胞を、第１および第２ポリペプチド鎖を細胞培養において発現させるための条件下で培養し；そして
ｃ）第１および第２ポリペプチド鎖をらせん状コイルドコイル型構造により連結する；
を含み、好ましくは該宿主細胞が、哺乳類または酵母宿主細胞である、上記方法。
［態様１７］態様１５または１６に記載の方法により得ることができるタンパク質の調製物であって、該タンパク質分子の少なくとも９０％が、第１および第２核酸によりコードされるポリペプチド鎖の正しいＣ末端およびＮ末端領域を含む、上記調製物。
【国際調査報告】
2018528214.tif 000013
2018528214.tif 000014
2018528214.tif 000015