(57)【要約】本発明は、単一特異性抗体の混合物からの、イムノグロブリン分子のそれぞれの結合部位で異なる特異性を有する二重特異性抗体の精製に関する。二重特異性抗体は単一の重鎖と2種類の異なる軽鎖とから構成される。軽鎖の一方はκ定常ドメインを含み、もう一方はλ定常ドメインを含む。本発明は特に、2つのκ軽鎖またはその一部を有する単一特異性抗体および2つのλ軽鎖またはその一部を有する単一特異性抗体を含有する混合物からの、このような二重特異性抗体の単離に関する。本発明はまた、このような二重特異性抗体を効率的に精製する方法も提供する。2018510868.tif 000004
2018510868.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、抗体の混合物から二重特異性抗体を精製する方法：
(a)(i)それぞれの結合部位で異なる特異性を有し、かつ2コピーの単一の重鎖ポリペプチドとκ定常領域を有する第一の軽鎖とλ定常領域を有する第二の軽鎖とを有する、少なくとも1種類の二重特異性抗体(κλボディ)；
(ii)2つのλ軽鎖またはその一部を有する少なくとも1種類の単一特異性抗体(λ単一特異性抗体)；および
(iii)2つのκ軽鎖またはその一部を有する少なくとも1種類の単一特異性抗体(κ単一特異性抗体)
を含む混合抗体組成物を提供する段階；
(b)分離手段を提供する段階；
(c)κ単一特異性抗体およびλ単一特異性抗体と分離手段との結合と比べて、κλボディと分離手段との差次的な結合を可能にする条件下で、分離手段を混合抗体組成物と接触させる段階；ならびに
(d)分離手段からのκ単一特異性抗体およびλ単一特異性抗体の解離と比べて、分離手段からのκλボディの優先的な解離を可能にする条件下で、分離手段からκλボディ、κ単一特異性抗体、およびλ単一特異性抗体を溶出する段階。
【請求項２】
前記分離手段が、樹脂、メンブレン、磁気ビーズ、粒子、またはモノリスである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
結合の条件が、pHレベル、塩レベル、またはpHレベルおよび塩レベルの両方における変動を含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項４】
溶出の条件が、pHレベル、塩レベル、pHレベルおよび塩レベルの両方、ホフマイスターイオンレベル、pHレベルおよびホフマイスターイオンレベルの両方、バッファー濃度、バッファー組成、バッファー濃度およびバッファー組成の両方、ならびにそれらの組み合わせにおける段階的変動を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記分離手段がミックスモードクロマトグラフィー樹脂である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記分離手段がTOYOPEARL MX-Trp 650M樹脂である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記分離手段が疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記分離手段がTOYOPEARL Butyl 600M樹脂である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
段階(a)が、混合抗体組成物を提供するために、生物試料に対しアフィニティークロマトグラフィーを行うことを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物試料が細胞上清である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、1つのγ1重鎖cDNA配列、1つのκ軽鎖cDNA配列、および1つのλcDNA配列を含むκλ二重特異性発現ベクターでトランスフェクトされている、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記アフィニティークロマトグラフィーがプロテインAクロマトグラフィーである、請求項9に記載の方法。
【請求項１３】
前記アフィニティークロマトグラフィーがプロテインAクロマトグラフィーではない、請求項9に記載の方法。
【請求項１４】
前記分離手段が、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂とミックスモードクロマトグラフィー樹脂との組み合わせを含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１５】
前記分離手段が、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂の使用とその後に続くミックスモードクロマトグラフィー樹脂の使用を含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂がTOYOPEARL Butyl 600M樹脂を含み、かつ前記ミックスモードクロマトグラフィー樹脂がTOYOPEARL MX-Trp 650M樹脂を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記分離手段が、ミックスモードクロマトグラフィー樹脂の使用とその後に続く疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂の使用を含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１８】
前記ミックスモードクロマトグラフィー樹脂がTOYOPEARL MX-Trp 650M樹脂を含み、かつ前記疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂がTOYOPEARL Butyl 600M樹脂を含む、請求項17に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、その内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる2015年3月13日に出願された米国仮特許出願第62/132,782号の恩典を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、単一特異性抗体の混合物からの、イムノグロブリン分子のそれぞれの結合部位で異なる特異性を有する二重特異性抗体の精製に関する。二重特異性抗体は単一の重鎖と2種類の異なる軽鎖とから構成される。軽鎖の一方はκ定常ドメインを含み、もう一方はλ定常ドメインを含む。本発明は特に、2つのκ軽鎖またはその一部を有する単一特異性抗体および2つのλ軽鎖またはその一部を有する単一特異性抗体を含有する混合物からの、このような二重特異性抗体の単離に関する。本発明はまた、このような二重特異性抗体を効率的に精製する方法も提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
抗体は2つの重鎖および2つの軽鎖の4つのポリペプチドから構成される。抗体の抗原結合部分は軽鎖可変ドメイン(VL)および重鎖可変ドメイン(VH)から形成されている。これらのドメインの1つの末端において、6つのループが抗原結合部位を形成し、相補性決定領域(CDR)とも呼ばれる。3つのCDRがVHドメイン上に位置し(H1、H2、およびH3)、かつ別の3つがVLドメイン上に位置している(L1、L2、およびL3)。B細胞の発生の間に、ユニークなイムノグロブリン領域が、V(D)J再構成として公知の体細胞組換えによって形成される。イムノグロブリン重鎖または軽鎖の可変領域は異なる遺伝子セグメントによってコードされている。重鎖は可変(V)セグメント、多様性(D)セグメント、および連結(J)セグメントという3つのセグメントによりコードされているが、軽鎖可変はセグメントVとJの2つだけの再構成によって形成されている。数多くの抗体パラトープが、ゲノム中に存在するV、D、およびJセグメントの複数のコピーのうちの1つの間の再構成によって生成され得る。VセグメントはCDR1とCDR2とをコードするが、CDR3は再構成事象により生成される。免疫応答の過程の間に、体細胞高頻度突然変異(SHM)というプロセスによってさらなる多様性が抗原結合部位に導入される。このプロセスの間に、点突然変異が重鎖と軽鎖の可変遺伝子に、特にCDRをコードする領域に導入される。このような追加的な可変性により、同族抗原に対する親和性が増した抗体変種を発現するB細胞の選択および増殖が可能になる。
【０００４】
大多数のイムノグロブリンは、2つの同一の重鎖ポリペプチドと2つの同一の軽鎖ポリペプチドとから構成されるために両方のアーム上で同一の特異性を有する、二価でかつ単一特異性の分子である。しかしながら、ハイブリドーマ技術の開発中のごく初期に、2つのハイブリドーマ間の融合事象により混成ハイブリドーマが作製可能であることが認識されていた(Suresh MR et al., Methods Enzymol 1986; 121: 210-228(非特許文献1)) 。このような「クアドローマ」は2種類の異なる重鎖と2種類の異なる軽鎖とを発現しており、したがって、重鎖と軽鎖とのランダムな対合によってさまざまに異なる抗体種を産生する。このような種々の抗体種の中には、それぞれのアーム上に異なる特異性を有する二重特異性抗体(bsAb)が生成される。別の天然に存在する例外はIgG4アイソタイプのイムノグロブリンであり、このアイソタイプのヒンジ領域が媒介するあまり安定ではない二量体形成のために重鎖が交換され得る(van der Neut Kolfschoten M et al., Science. 2007 317(5844):1554-7(非特許文献2))。この交換はインビボで起こるようであるが、その生物学的意義については不明なままである。
【０００５】
単一特異性抗体は、ヒトの疾患のいくつかの領域への治療的介入に関して、奏効しかつ魅力的な分子クラスとして登場した。しかしながら、単一のタンパク質の標的化または中和は、特定の疾患において効力を発揮するには必ずしも十分ではないので、単一特異性抗体の治療的用途は限られてしまう。多くの適応症において、生物学的システムのうちの1つの構成要素を中和することは、効力を発揮するには不十分であることがますます明らかになってきている。この問題への1つの解決法はいくつかの単一特異性抗体を同時投与することである。しかしながら、このようなアプローチは、組み合わされる抗体が個々に事前に認可されていない場合は、規制面から困難なものとなる。さらに、製造の観点からしても組み合わせアプローチは費用がかさむ。したがって、単一の分子により複数の抗原を標的にできる、抗体および療法の需要が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Suresh MR et al., Methods Enzymol 1986; 121: 210-228
【非特許文献２】van der Neut Kolfschoten M et al., Science. 2007 317(5844):1554-7
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、配列において通常の抗体と区別できない二重特異性抗体の精製を可能にする。精製された抗体の改変されていない性質ゆえに、前記抗体には通常の単一特異性抗体と同様の製造上の好都合な特徴が提供される。
【０００８】
本明細書に提供される方法は、さまざまな二重特異性抗体、特に本明細書において「κλボディ」と呼ばれる二重特異性抗体を精製するのに有用である。「κλボディ」は、共通のIgG重鎖と2つの独立した標的への特異性をもたらす2種類の異なる軽鎖とを有し、軽鎖の一方はκ定常領域を有しかつもう一方はλ定常領域を有する。本明細書に提供される方法は、 2つのκ軽鎖またはその一部を有する単一特異性抗体(本明細書では「κ単一特異性抗体(κ monospecific antibody)」または「κ単一特異性抗体(κ mono-Ab)」とも呼ばれる)および2つのλ軽鎖またはその一部を有する単一特異性抗体(本明細書では「λ単一特異性抗体(λ monospecific antibody)」または「λ単一特異性抗体(λ mono-Ab)」とも呼ばれる)を含有する混合物から、このような二重特異性κλボディを精製することから有用である。
【０００９】
精製するその二重特異性抗体は、さまざまな方法のいずれを用いて生成されてもよい。例えば、二重特異性抗体は、(i)定まった重鎖を有する抗体ライブラリーまたは単一のVH遺伝子を含有するトランスジェニック動物を用いることなどにより、異なる特異性を有しかつ同一の可変重鎖ドメインを共有するが可変軽鎖は異なる2種類の抗体を単離すること；(ii)可変重鎖ドメインを重鎖定常領域と融合させること、一方の軽鎖可変ドメインをκ定常ドメインと融合させること、およびもう一方の可変軽鎖ドメインをλ定常ドメインと融合させること；ならびに(iii)宿主細胞または細胞系、例えば、哺乳動物細胞および／または哺乳動物細胞系で3種類の鎖を同時発現させることにより、3種類の抗体(2種類の単一特異性抗体、および2種類の異なる軽鎖を有する1種類の二重特異性抗体)の混合物が組み立てられ上清に分泌されることによって、生成され得る。本方法を用いて産生される抗体の一部においては、第一の軽鎖の少なくとも第一の部分がκ型であり、かつ第二の軽鎖の少なくとも一部がλ型である。本方法を用いて産生される抗体の一部においては、第一の軽鎖は少なくともκ定常領域を含む。本方法を用いて産生される抗体の一部においては、第一の軽鎖はκ可変領域をさらに含む。本方法を用いて産生される抗体の一部においては、第一の軽鎖はλ可変領域をさらに含む。本方法を用いて産生される抗体の一部においては、第二の軽鎖は少なくともλ定常領域を含む。本方法を用いる抗体の一部においては、第二の軽鎖はλ可変領域をさらに含む。本方法を用いる抗体の一部においては、第二の軽鎖はκ可変領域をさらに含む。本方法を用いて産生される抗体の一部においては、第一の軽鎖はκ定常領域およびκ可変領域を含み、かつ第二の軽鎖はλ定常領域およびλ可変領域を含む。本方法を用いて産生される抗体の一部においては、定常領域および可変フレームワーク領域の配列はヒトのものである。
【００１０】
本方法または当技術分野において公知の他の適切な方法のいずれかを用いて作られた二重特異性抗体は、抗体精製に用いられる通常のクロマトグラフィー技法を用いて精製される。本方法または当技術分野において公知の他の適切な方法のいずれかを用いて生成された二重特異性抗体は、例えば非限定的かつ非網羅的な例として、膜ろ過法およびタンパク質沈殿法などの、その他の分離技法を用いても精製可能である。好ましい態様において、二重特異性抗体は、ミックスモードクロマトグラフィーとしても公知のマルチモーダルクロマトグラフィーを用いて、または疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて、精製される。
【００１１】
本発明は、(a)それぞれの結合部位で異なる特異性を有し、かつ2コピーの単一の重鎖ポリペプチドとκ定常領域を有する第一の軽鎖とλ定常領域を有する第二の軽鎖とを有する、少なくとも1種類の二重特異性抗体(κλボディ)；ならびに(i)2つのλ軽鎖もしくはその一部を有する少なくとも1種類の単一特異性抗体(λ単一特異性抗体)、および／または(ii)2つのκ軽鎖もしくはその一部を有する少なくとも1種類の単一特異性抗体(κ単一特異性抗体)のうちの一種または複数種を含む、混合抗体組成物を提供する段階；(b)分離手段を提供する段階；(c)κ単一特異性抗体および／またはλ単一特異性抗体と分離手段との結合と比べて、κλボディと分離手段との差次的な結合を可能にする条件下で、分離手段を混合抗体組成物と接触させる段階；ならびに(d)分離手段からのκ単一特異性抗体および／またはλ単一特異性抗体の解離と比べて、分離手段からのκλボディの優先的な解離を可能にする条件下で、分離手段からκλボディ、κ単一特異性抗体、および／またはλ単一特異性抗体を溶出する段階により、抗体の混合物から二重特異性抗体を精製する方法を提供する。
【００１２】
いくつかの態様において、混合抗体組成物は少なくとも1種類のκλボディおよび少なくとも1種類のλ単一特異性抗体を含む。いくつかの態様において、混合抗体組成物は少なくとも1種類のκλボディおよびκ単一特異性抗体を含む。いくつかの態様において、混合抗体組成物は少なくとも以下のものを含む：(i)少なくとも1種類のκλボディ；(ii)少なくとも1種類のλ単一特異性抗体；および(iii)κ単一特異性抗体。
【００１３】
いくつかの態様において、本方法は、3つの抗体種のそれぞれに差次的に結合することによって、κ単一特異性抗体および／またはλ単一特異性抗体から二重特異性κλボディを分離するための、単一の分離手段を用いる。いくつかの態様において、本方法は、分離手段からの3つの抗体種のそれぞれの差次的な溶出によって、κ単一特異性抗体および／またはλ単一特異性抗体から二重特異性κλボディを分離するための、単一の分離手段を用いる。いくつかの態様において、本方法は、3つの抗体種のそれぞれに差次的に結合することによって、続いて分離手段からの3つの抗体種のそれぞれの差次的な溶出によって、κ単一特異性抗体および／またはλ単一特異性抗体から二重特異性κλボディを分離するための、単一の分離手段を用いる。
【００１４】
いくつかの態様において、κλボディの精製は、アフィニティークロマトグラフィーとその後に続く疎水性相互作用クロマトグラフィーへの連続的結合により行う。いくつかの態様において、κλボディの精製は、プロテインAクロマトグラフィーとその後に続く疎水性相互作用クロマトグラフィーへの連続的結合により行う。いくつかの態様において、アフィニティークロマトグラフィーはプロテインAクロマトグラフィーである。いくつかの態様において、アフィニティークロマトグラフィーは、例えば非限定的な例として、プロテインA模倣物またはその他の親和性タンパク質の使用に基づくクロマトグラフィー技法などの、プロテインAクロマトグラフィー以外の当技術分野において認められている任意のアフィニティークロマトグラフィー技法である。いくつかの態様において、アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインAクロマトグラフィーまたはプロテインAクロマトグラフィー以外の当技術分野において認められている任意のアフィニティークロマトグラフィー技法は、生物試料に対して行われる。いくつかの態様において、生物試料は細胞上清である。いくつかの態様において、前記細胞は、1つのγ1重鎖cDNA配列、1つのκ軽鎖cDNA配列、および1つのλcDNA配列を少なくとも含むκλ二重特異性発現ベクターでトランスフェクトされている。
【００１５】
いくつかの態様において、κλボディの精製は、アフィニティークロマトグラフィーとその後に続くミックスモードクロマトグラフィーとしても公知のマルチモーダルクロマトグラフィーへの連続的結合により行う。いくつかの態様において、κλボディの精製は、プロテインAクロマトグラフィーとその後に続くマルチモーダルクロマトグラフィーへの連続的結合により行う。いくつかの態様において、アフィニティークロマトグラフィーはプロテインAクロマトグラフィーである。いくつかの態様において、アフィニティークロマトグラフィーは、例えば非限定的な例として、プロテインA模倣物またはその他の親和性タンパク質の使用に基づくクロマトグラフィー技法などの、プロテインAクロマトグラフィー以外の当技術分野において認められている任意のアフィニティークロマトグラフィー技法である。いくつかの態様において、アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインAクロマトグラフィーまたはプロテインAクロマトグラフィー以外の当技術分野において認められている任意のアフィニティークロマトグラフィー技法は、生物試料に対して行われる。いくつかの態様において、生物試料は細胞上清である。いくつかの態様において、前記細胞は、1つのγ1重鎖cDNA配列、1つのκ軽鎖cDNA配列、および1つのλcDNA配列を少なくとも含むκλ二重特異性発現ベクターでトランスフェクトされている。
【００１６】
いくつかの態様において、κλボディの精製は、アフィニティークロマトグラフィーとその後に続く疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)とその後に続くマルチモーダル(ミックスモード)クロマトグラフィーへの連続的結合により行う。いくつかの態様において、アフィニティークロマトグラフィーはプロテインAクロマトグラフィーである。いくつかの態様において、アフィニティークロマトグラフィーは、例えば非限定的な例として、プロテインA模倣物またはその他の親和性タンパク質の使用に基づくクロマトグラフィー技法などの、プロテインAクロマトグラフィー以外の当技術分野において認められている任意のアフィニティークロマトグラフィー技法である。いくつかの態様において、アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインAクロマトグラフィーまたはプロテインAクロマトグラフィー以外の当技術分野において認められている任意のアフィニティークロマトグラフィー技法は、生物試料に対して行われる。いくつかの態様において、生物試料は細胞上清である。いくつかの態様において、前記細胞は、1つのγ1重鎖cDNA配列、1つのκ軽鎖cDNA配列、および1つのλcDNA配列を少なくとも含むκλ二重特異性発現ベクターでトランスフェクトされている。
【００１７】
いくつかの態様において、κλボディの精製は、プロテインAクロマトグラフィーとその後に続くマルチモーダル(ミックスモード)クロマトグラフィーとその後に続く疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)への連続的結合により行う。いくつかの態様において、アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインAクロマトグラフィーまたはプロテインAクロマトグラフィー以外の当技術分野において認められている任意のアフィニティークロマトグラフィー技法は、生物試料に対して行われる。いくつかの態様において、生物試料は細胞上清である。いくつかの態様において、前記細胞は、1つのγ1重鎖cDNA配列、1つのκ軽鎖cDNA配列、および1つのλcDNA配列を少なくとも含むκλ二重特異性発現ベクターでトランスフェクトされている。
【００１８】
いくつかの態様において、分離手段は、樹脂、メンブレン、磁気ビーズ、粒子、またはモノリスである。
【００１９】
いくつかの態様において、分離手段は、ミックスモードクロマトグラフィーとしても公知のマルチモーダルクロマトグラフィーである。いくつかの態様において、分離手段は疎水性相互作用クロマトグラフィーである。
【００２０】
いくつかの態様において、分離手段はミックスモードクロマトグラフィー樹脂である。いくつかの態様において、ミックスモードクロマトグラフィー樹脂はTOYOPEARL MX-Trp 650M樹脂(Tosoh Bioscience LLC)である。TOYOPEARL MX-Trp 650Mは、TOYOPEARL媒体のメタクリルポリマー骨格に基づき、かつ活性リガンドとしてトリプトファンを用いる。
【００２１】
いくつかの態様において、分離手段は疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂である。いくつかの態様において、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂はTOYOPEARL Butyl 600M樹脂(Tosoh Bioscience LLC)である。TOYOPEARL Butyl 600M樹脂は、TOYOPEARL媒体のメタクリルポリマー骨格に基づき、かつブチルリガンドを含む。
【００２２】
いくつかの態様において、分離手段は、少なくとも2種類の樹脂の組み合わせである。いくつかの態様において、分離手段は、少なくとも2種類のミックスモードクロマトグラフィー樹脂の組み合わせである。いくつかの態様において、分離手段は、3種類以上のミックスモードクロマトグラフィー樹脂の、例えば3種類もしくはそれ以上の、4種類もしくはそれ以上の、および／または5種類もしくはそれ以上のミックスモードクロマトグラフィー樹脂の組み合わせである。いくつかの態様において、分離手段は、少なくとも2種類の疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂の組み合わせである。いくつかの態様において、分離手段は、3種類以上の疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂の、例えば3種類もしくはそれ以上の、4種類もしくはそれ以上の、および／または5種類もしくはそれ以上の疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂の組み合わせである。いくつかの態様において、分離手段は、少なくとも1種類のミックスモードクロマトグラフィー樹脂および少なくとも1種類の疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂の組み合わせである。
【００２３】
いくつかの態様において、分離手段は、ミックスモードクロマトグラフィー樹脂の使用とその後に続く疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂の使用を含む。いくつかの態様において、分離手段は、TOYOPEARL MX-Trp 650M樹脂(Tosoh Bioscience LLC)の使用とその後に続くTOYOPEARL Butyl 600M樹脂(Tosoh Bioscience LLC)の使用を含む。
【００２４】
いくつかの態様において、分離手段は、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂の使用とその後に続くミックスモードクロマトグラフィー樹脂の使用を含む。いくつかの態様において、分離手段は、TOYOPEARL Butyl 600M樹脂(Tosoh Bioscience LLC)の使用とその後に続くTOYOPEARL MX-Trp 650M樹脂(Tosoh Bioscience LLC)の使用を含む。
【００２５】
いくつかの態様において、結合の条件および／または溶出の条件は、pHレベルの段階的変動および／または塩濃度の変動に対応する導電度の段階的変動を含む。いくつかの態様において、結合の条件および／または溶出の条件は、無機塩の濃度、例えば塩化ナトリウム(NaCl)濃度またはその他の無機塩、例えば非限定的かつ非網羅的な例としては、ホフマイスターシリーズのイオン、例えば硫酸塩、からの無機塩の組み合わせなどの濃度の段階的変動を含む。いくつかの態様において、本方法は、結合および／または溶出のために、硫酸アンモニウムの濃度を変動させる段階を含む。いくつかの態様において、本方法は、溶出された画分における、二重特異性抗体、κ単一特異性抗体、および／またはλ単一特異性抗体の純度および比率を決定する、さらなる段階を含む。この段階は、当技術分野において認められているさまざまな技法のいずれか、例えば非限定的かつ非網羅的な例としては、疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー(HIC-HPLC)、イオン交換高速液体クロマトグラフィー(IEX-HPLC)、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー(CEX-HPLC)、または逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)などを用いて達成される。
【００２６】
本明細書に提供される実施例は、TOYOPEARL MX-Trp-650Mミックスモードクロマトグラフィー樹脂または疎水性相互作用樹脂のTOYOPEARL Butyl 600M樹脂から、二重特異性抗体をκ単一特異性抗体および／またはλ単一特異性抗体より優先的に溶出するために、塩濃度を上げる段階的溶出または塩濃度を下げる段階的溶出を用いることの実施可能性、加えて、ミックスモードクロマトグラフィーと疎水性相互作用クロマトグラフィーとの組み合わせを用いることの実施可能性を実証している。例えば、塩濃度を下げる段階的溶出、例えば硫酸アンモニウムの濃度を下げることが、疎水性相互作用樹脂のTOYOPEARL Butyl 600M樹脂から、二重特異性抗体をκ単一特異性抗体および／またはλ単一特異性抗体より優先的に溶出するために用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図1A、1B、および1Cは、2コピーの唯一の重鎖ポリペプチドと2種類の異なる軽鎖ポリペプチドとから構成される、さまざまなκλボディ二重特異性抗体の構造の、一連の図式表現である。図1Aは、κ定常ドメインに融合されたκ可変ドメインおよびλ定常ドメインに融合されたλ可変ドメインを図示する。図1Bは、κ定常ドメインに融合されたκ可変ドメインおよびλ定常ドメインに融合されたκ可変ドメインを図示する。図1Cは、κ定常ドメインに融合されたλ可変ドメインおよびλ定常ドメインに融合されたλ可変ドメインを図示する。
【図２】CHO細胞中での3シストロン性発現ベクターの発現により、理論比において25:50:25で3種類の抗体産物が生じることを図示する図解である。
【図３Ａ】バッファー段階的勾配溶出を用いてのTOYOPEARL Butyl 600Mの代表的なUV吸光度トレースプロファイルを図示するグラフである。
【図３Ｂ】CEX-HPLCを用いてのTOYOPEARL Butyl 600Mの溶出画分分析の実例を図示するグラフである。
【図３Ｃ】NaCl段階的勾配溶出を用いてのTOYOPEARL MX-Trp 650Mの代表的なUV吸光度トレースプロファイルを図示するグラフである。
【図３Ｄ】TOYOPEARL MX-Trp 650M画分の非還元的SDS-PAGEおよび還元的SDS-PAGE分析を図示する図解である。
【図３Ｅ】TOYOPEARL MX-Trp 650M画分のHIC-HPLC分析を図示するグラフである。
【図４】図4Aは、より大きなカラムスケールで得られた、NaCl段階的勾配溶出を用いてのTOYOPEARL MX-Trp 650Mの代表的なUV吸光度トレースプロファイルを図示するグラフである。図4Bは、CEX-HPLCを用いてのTOYOPEARL MX-Trp 650Mの溶出画分分析の実例を図示するグラフである。
【図５】図5Aは、より大きなカラムスケールでの、NaCl段階的勾配溶出を用いてのTOYOPEARL Butyl 600Mの代表的なUV吸光度トレースプロファイルを図示するグラフである。図5Bは、CEX-HPLCを用いてのTOYOPEARL Butyl 600Mの溶出画分分析の実例を図示するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
本発明は、ヒトのイムノグロブリンと構造上同一な二重特異性抗体を精製する方法を提供する。この種の分子は、2コピーの唯一の重鎖ポリペプチド、定常κドメインに融合された第一の軽鎖可変領域、および定常λドメインに融合された第二の軽鎖可変領域からなる。結合部位はそれぞれ、重鎖と軽鎖の両方が寄与する異なる抗原特異性を示す。軽鎖可変領域は、λまたはκファミリーのものであってよく、好ましくはλおよびκ定常ドメインにそれぞれ融合される。こちらの方が、非天然型のポリペプチド接合部の生成を避けるために好ましい。しかしながら、第一の特異性のためにκ軽鎖可変ドメインを定常λドメインと融合させかつ第二の特異性のためにλ軽鎖可変ドメインを定常κドメインに融合させることにより、本発明の二重特異性抗体を得ることも可能である（図1A〜1C）。本明細書に記載される二重特異性抗体は、完全にヒトの二重特異性IgGフォーマットで、IgGκλ抗体または「κλボディ」とも称される。このκλボディフォーマットゆえに、通常の単一特異性抗体、例えば通常のIgG分子と区別できない二重特異性抗体の親和性精製が可能であり、したがって従前のフォーマットと比較して好都合である。
【００２９】
これらの図に示されているκ軽鎖およびλ軽鎖（またはそれらの一部）の位置および／または配置について限定する意図はない。当業者は、図1A〜1Cに示されている二重特異性抗体の鏡像を産生するように、κ軽鎖およびλ軽鎖（またはそれらの一部）が配置されてもよいことを理解すると考えられる。当業者は、図1A〜1Cに完全IgGフォーマットで示されている二重特異性抗体が、その他のイムノグロブリンアイソタイプを用いて、またはF(ab’)2などのその他のイムノグロブリンフォーマットで生成されてもよいことも理解すると考えられる。
【００３０】
κλボディは、同一の重鎖可変ドメインを共有する、異なる抗原特異性を有する2つの抗体Fv領域(それぞれ可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインとから構成される)を同定することにより生成される。
【００３１】
本発明の方法を用いて精製されるκλボディは、抗体を生成するさまざまな方法のいずれかを用いて生成される。抗体またはその断片を生成するための数多くの方法が記載されてきた(例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照されたい)。完全ヒト抗体とは、CDR1および2を含む軽鎖と重鎖の両方の配列がヒト遺伝子に由来する抗体分子である。CDR3領域はヒト起源であっても合成手段によって設計してもよい。そのような抗体を本明細書では「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と呼ぶ。ヒトの単一特異性抗体は、トリオーマ法、ヒトB細胞ハイブリドーマ法(Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照されたい)、およびヒトモノクローナル抗体を産生するEBVハイブリドーマ法(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照されたい)を用いて調製してもよい。ヒト抗体を利用してもよく、ヒト抗体は、ヒトハイブリドーマを用いて(Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030を参照されたい)またはインビトロでエプスタインバーウイルスによりヒトB細胞を形質転換して(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照されたい)産生してもよい。
【００３２】
いくつかの態様において、精製されるκλボディは、例えば、重鎖可変ドメインが全てのライブラリーメンバーで同一であり、ゆえに多様性は軽鎖可変ドメインに限られている、抗体ライブラリーを用いて生成される。そのようなライブラリーは、例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる、PCT公開番号WO 2010/135558およびPCT公開番号WO 2011/084255に記載されている。しかしながら、軽鎖可変ドメインは重鎖可変ドメインと共に発現されているので、両方のドメインが抗原結合に寄与し得る。このプロセスをさらに容易にするために、同一の重鎖可変ドメインと多様なλ可変軽鎖または多様なκ可変軽鎖のいずれかとを含有する抗体ライブラリーを、異なる抗原に対する抗体のインビトロセレクションのために並行して用い得る。このアプローチにより、共通の重鎖を有するが一方はλ軽鎖可変ドメインをもう一方はκ軽鎖可変ドメインを有する2つの抗体を同定することが可能となり、それらは本発明の完全イムノグロブリンフォーマットの二重特異性抗体を生成するための基礎的要素として用いることができる。本発明の方法を用いて精製される二重特異性抗体は異なるアイソタイプであってもよく、そのFc部分は、異なるFc受容体に対する結合特性を変えるために、かつ斯くして抗体のエフェクター機能とその薬物動態特性を改変するために、改変され得る。Fc部分の改変方法は数多く記載されており、本発明の抗体にも適用可能である(例えば、Strohl, WR, “Optimization of Fc-mediated Effector Functions of Monoclonal Antibodies,” Curr. Opin. Biotechnol., 2009 (6):685-91；米国特許番号第6,528,624号；米国特許出願公開番号第2009/0191199号を参照されたい)。本発明の方法は、二重特異性抗体およびFc部分を欠いたF(ab’)2フォーマットの抗体混合物を精製するためにも用いることができる。
【００３３】
好ましくは、精製されるκλボディは、本発明の二重特異性抗体を組み立てることが可能なように、共通の重鎖と2種類の異なる軽鎖とを単一の細胞で同時発現するのに最適化されている。全てのポリペプチドが同レベルで発現され、かつ全てのポリペプチドが同様な効率で組み立てられてイムノグロブリン分子を形成する場合、単一特異性(同一の軽鎖)および二重特異性(2種類の異なる軽鎖)の割合は50%となるはずである。しかしながら、異なる軽鎖は異なるレベルで発現され、かつ／または同じ効率では組み立てられないようである。さらに、インタクトなIgG分子への組み立てを免れた軽鎖は、「遊離軽鎖」として細胞培養物上清に分泌され得る。異なるポリペプチドの相対的発現を調整して、それらの内因的な発現特徴または共通の重鎖と組み立てられる際の異なる傾向を補償する手段としては、非限定的な例として、さまざまな強度のプロモーターの使用、異なる効率を備える配列内リボソーム進入部位(IRES)の使用、またはmRNAの安定性に作用するだけではなく転写もしくは翻訳のレベルで作用し得る他のタイプの調節要素が挙げられる。発現の調整は、一方またはもう一方の軽鎖を発現する個々の遺伝子のコピー数を増すように細胞を複数回連続的にトランスフェクトして、その結果、相対的発現を改変することによっても達成される。
【００３４】
重鎖と2種類の軽鎖との同時発現により、細胞培養物上清に分泌される3種類の異なる抗体(2種類の単一特異性二価抗体および1種類の二重特異性二価抗体)の混合物が生成される。関心対象のκλボディを得るために、後者を混合物から精製する必要がある。マルチモーダルクロマトグラフィーすなわちミックスモードクロマトグラフィーは、さまざまな相互作用メカニズム、例えば非限定的な例として、イオン交換特徴および疎水性特徴などによって、κλボディの精製を容易にする。イオン交換特徴および疎水性特徴は、高度な結合能力を与え、かつκλボディの精製を含む二重特異性抗体の効率的な精製を可能にする。マルチモーダルクロマトグラフィー方法すなわちミックスモードクロマトグラフィー方法は、複数のモードのクロマトグラフィーが同時に利用されるため効率的である。疎水性クロマトグラフィーは、特異性抗体の効率的な精製を可能にする疎水性特徴によって、κλボディの精製を容易にする。マルチモーダルクロマトグラフィーすなわちミックスモードクロマトグラフィーとその後に続く疎水性クロマトグラフィーとの組み合わせは、連続的に適用される複数の相互作用メカニズムによって、その結果、いずれかのメカニズム単独と比較してさらにより効率的な二重特異性抗体の精製を可能にして、κλボディの精製を容易にする。
【００３５】
3種類の鎖の同時発現により、3種類の異なる抗体(2種類の単一特異性抗体および1種類の二重特異性抗体)が組み立てられた。発現レベルおよび組み立て率が両方の軽鎖で同様である場合、抗体の理論的な相対的割合は1:1:2となるはずである。二重特異性抗体は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー手順とその後に続くマルチモーダルクロマトグラフィーもしくは疎水性クロマトグラフィーのいずれか、またはプロテインAアフィニティークロマトグラフィーとその後に続くマルチモーダルクロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーを用いて、精製された。
【００３６】
さまざまな抗体工学アプローチを用いて等質的な二重特異性分子を産生させようとする、二重特異性抗体フォーマットの産生および精製の従前のアプローチは、生産性、スケーラビリティ、および産物の安定性を犠牲にして行われた。本明細書に記載される方法は、二重特異性抗体を精製するための効率的な手段を提供する。
【００３７】
二重特異性抗体フォーマットの産生および精製の従前のアプローチとは対照的に、本明細書に提供される方法は、3つの抗体種それぞれと差次的に結合することまたは分離手段からの3つの抗体種それぞれの差次的な溶出を介するかのいずれかによりκ単一特異性抗体および／またはλ単一特異性抗体から二重特異性κλボディを分離する、単一の分離手段を用いる。
【００３８】
本明細書に提供される方法は、ミックスモードクロマトグラフィーおよび／または疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび／またはこれらのクロマトグラフィー方法両方の組み合わせなどのプロセスを用いて、2つのκ軽鎖またはその一部を有する単一特異性抗体および2つのλ軽鎖またはその一部を有する単一特異性抗体から、一方はκ定常ドメインおよびもう一方はλ定常ドメインを含有する2種類の異なる軽鎖を有する二重特異性抗体を分離する初めてのものである。対照的に、例えばPCT公開番号WO 2013/088259に記載されているものなどの従前のアプローチは、図2に示された遊離軽鎖のようなインタクトでない抗体から、インタクトな全長二重特異性抗体を取り出すよう設計されていた。このように、本明細書に提供される方法は従前のアプローチより有利である。
【実施例】
【００３９】
実施例1：疎水性相互作用クロマトグラフィーを利用しての二重特異性抗体の精製
κλボディは、共通のIgG1重鎖と2つの独立した標的への特異性をもたらす2種類の異なる軽鎖とを含む、新規の二重特異性IgGフォーマットである。大規模な工業プロセスに適用可能な効率的な精製プロトコールを可能にするため、前記フォーマットは、一方の軽鎖がκ定常領域を含有しもう一方はλ定常領域を含有する必要がある(図1A〜1Cを参照されたい)。
【００４０】
κλボディを産生するため、共通の重鎖と2種類の軽鎖とが、3遺伝子発現ベクターを用いてCHO細胞で発現される。このようなベクターフォーマットにより、単一特異性κ抗体(κ単一特異性抗体)、二重特異性κλボディ、および単一特異性λ抗体(λ単一特異性抗体)の3種類の産物の構築が可能となる。理論的な産物比は25:50:25である(図2を参照されたい)。
【００４１】
これらの研究において、このκλボディフォーマットの精製は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーとその後に続く疎水性相互作用樹脂TOYOPEARL Butyl 600Mへの連続的結合により行われる。
【００４２】
本明細書に提供される研究により、バッファー段階的溶出クロマトグラフィーを用いての単一特異性λ抗体および単一特異性κ抗体(単一特異性抗体)からのκλボディの成功裏の分離が実証される。
【００４３】
出発材料：κλ二重特異性発現ベクター(1つのγ1重鎖cDNA、1つのκ軽鎖cDNA、および1つのλ軽鎖cDNAを含有する)でトランスフェクトされたCHO細胞の清澄化された25Lウェーブバッグ(wave bag)発酵上清を、プロテインAクロマトグラフィーとその後に続く疎水性相互作用クロマトグラフィーの出発材料として用いた。
【００４４】
段階：疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)媒体(Tosoh Bioscience)を用いてκλボディ二重特異性IgG抗体を精製した。100mMリン酸ナトリウム、1M硫酸アンモニウム、pH7.0のバッファー(平衡バッファー)中に試料を1:1で希釈した後、カラムに10mg/mLでロードした。平衡バッファー(5カラム容量)を用いた洗浄段階の後、10mMリン酸ナトリウム、pH7.0のバッファー(2つの連続的段階において60%と75%)を用いて段階的溶出を行った(図3A)。溶出画分を収集し、かつ産物回収率を決定するために280nmでのUV吸光度測定(NanoDrop UV-Vis spectrophotometer, Thermo Scientificを使用)により分析した。2種類の単一特異性抗体副産物からκλボディ二重特異性IgGを分離する精製プロセスの能力を決定するために、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー(CEX-HPLC)を行った(図3B)。
【００４５】
実施例2：マルチモーダルミックスモードクロマトグラフィーを利用した二重特異性抗体の精製
実施例1に記載されているように、κλボディは、共通のIgG1重鎖と2つの独立した標的への特異性をもたらす2種類の異なる軽鎖とを含む、新規の二重特異性IgGフォーマットである。大規模な工業プロセスに適用可能な効率的な精製プロトコールを可能にするため、前記フォーマットは、一方の軽鎖がκ定常領域を含有しもう一方はλ定常領域を含有する必要がある(図1A〜1Cを参照されたい)。
【００４６】
κλボディを産生するため、共通の重鎖と2種類の軽鎖とが、3遺伝子発現ベクターを用いてCHO細胞で発現される。このようなベクターフォーマットにより、単一特異性κ抗体(κ単一特異性抗体)、二重特異性κλボディ、および単一特異性λ抗体(λ単一特異性抗体)の3種類の産物の構築が可能となる。理論的な産物比は25:50:25である(図2を参照されたい)。
【００４７】
これらの研究において、κλボディフォーマットの精製は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーとその後に続くミックスモードクロマトグラフィー樹脂TOYOPEARL MX-Trp 650Mへの連続的結合により行われる。
【００４８】
本明細書に提供される研究により、NaCl段階的溶出クロマトグラフィーを用いての単一特異性λ抗体および単一特異性κ抗体(単一特異性抗体)からのκλボディの成功裏の分離が実証される。
【００４９】
出発材料：κλ二重特異性発現ベクター(1つのγ1重鎖cDNA、1つのκ軽鎖cDNA、および1つのλ軽鎖cDNAを含有する)でトランスフェクトされたCHO細胞の清澄化された25Lウェーブバッグ発酵上清を、プロテインAクロマトグラフィーとその後に続くマルチモーダル(ミックスモード)相互作用クロマトグラフィーの出発材料として用いた。
【００５０】
段階：マルチモーダル(ミックスモード)クロマトグラフィー媒体(Tosoh Bioscience)を用いてκλボディ二重特異性IgG抗体を精製した。25mg/mLでのカラムローディングおよび100mMリン酸ナトリウム、pH6.0 (5カラム容量)を用いた洗浄段階の後、100mMリン酸ナトリウム、pH6.0のバッファー(2つの連続的段階において15%と100%の500mM NaClバッファー)を用いてNaCl段階的溶出を行った(図3C)。フロースルーおよび溶出画分を収集し、そして、産物回収率を決定するために280nmでの吸光度測定(NanoDrop UV-Vis spectrophotometer, Thermo Scientificを使用)により、試料の純度および組成を決定するために還元的SDS-PAGEおよび非還元的SDS-PAGE(製造者のガイドラインに従ってInvitrogen Novex NuPAGE 12ウェル4〜20%勾配ゲルを使用)により(図3D)、ならびに2種類の単一特異性抗体副産物からκλボディ二重特異性IgGを分離する精製プロセスの能力を決定するために疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー(HIC-HPLC)(図3E)により、分析した。
【００５１】
図3CにUV吸光度トレース(赤)により示されているように、TOYOPEARL MX-Trp 650Mクロマトグラフィーミックスモード樹脂に適用された段階的溶出により、3つの画分の連続的な分離が可能であった。図3Dに示された、ミックスモード精製の間に収集された画分の還元的SDS-PAGEおよび非還元的SDS-PAGE分析により、κλボディを含有する15%NaClでの溶出画分(第2のピーク)が高純度であることが明らかとなった。一方、単一特異性のλ単一特異性抗体およびκ単一特異性抗体のIgGを、λλについては非保持画分(第1のピーク)中に、およびκκについては100%NaCl段階的画分(第3のピーク)中にそれぞれ分離しかつ収集した。3つの画分はさらに、HIC-HPLC分析およびその後のHIC-HPLCクロマトグラムのピーク領域の積分により特徴づけられた(図3E)。表1に要約されている結果は、SDS-PAGE分析と一致しており、15%NaClでの第2の溶出画分中でκλボディが高純度(96%)であることが実証された。
【００５２】
（表１）TOYOPEARL MX Trp-650Mから収集された結合画分のHIC-HPLC分析のUVピーク積分
2018510868.tif 000003
【００５３】
実施例3：マルチモーダルミックスモードクロマトグラフィーとその後に続く疎水性クロマトグラフィーを利用した二重特異性抗体の精製
実施例1に記載されているように、κλボディは、共通のIgG1重鎖と2つの独立した標的への特異性をもたらす2種類の異なる軽鎖とを含む、新規の二重特異性IgGフォーマットである。大規模な工業プロセスに適用可能な効率的な精製プロトコールを可能にするため、前記フォーマットは、一方の軽鎖がκ定常領域を含有しもう一方はλ定常領域を含有する必要がある(図1A〜1Cを参照されたい)。
【００５４】
κλボディを産生するため、共通の重鎖と2種類の軽鎖とが、3遺伝子発現ベクターを用いてCHO細胞で発現される。このようなベクターフォーマットにより、単一特異性κ抗体(κ単一特異性抗体)、二重特異性κλボディ、および単一特異性λ抗体(λ単一特異性抗体)の3種類の産物の構築が可能となる。理論的な産物比は25:50:25である(図2を参照されたい)。
【００５５】
この実施例において、このκλボディフォーマットの精製は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーと、その後に続くTOYOPEARL MX-Trp 650Mミックスモード樹脂によるマルチモーダル(ミックスモード)クロマトグラフィーと、その後に続くTOYOPEARL Butyl 600M樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーへの連続的結合により行われる。
【００５６】
段階：κλボディ二重特異性IgG抗体を含有するプロテインA親和性溶出液を、ミックスモードクロマトグラフィー媒体(Tosoh Bioscience)とその後に続く疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)媒体(Tosoh Bioscience)を用いて精製した。TOYOPEARL Butyl 600Mカラムにミックスモードカラムで精製され、100mMリン酸ナトリウム、1M硫酸アンモニウム、pH7.0バッファー中に1:1に希釈された溶出試料(図4Aの画分2に対応)をロードした。洗浄段階の後、硫酸アンモニウムのレベルを低減するためにバッファー段階的溶出を行った(図5A)。溶出画分を収集し、産物回収率を決定するために280nmでのUV吸光度測定(NanoDrop UV-Vis spectrophotometer, Thermo Scientificを使用)により分析した。2種類の単一特異性抗体副産物からκλボディ二重特異性IgGを分離する精製プロセスの能力を決定するために、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー(CEX-HPLC)を行った(図5B)。
【００５７】
図4AにUV吸光度トレース(赤)により示されているように、TOYOPEARL MX-Trp 650Mミックスモードクロマトグラフィー樹脂に適用された段階的溶出により、3つの画分の連続的な分離が可能であった。ミックスモード精製の間に収集された画分のCEX-HPLC分析により、溶出されたκλボディが高純度であることが確認された(図4B)。アセテート、pH6.0のバッファー中、20%NaClで溶出された主要画分(プール2)をさらに、TOYOPEARL Butyl 600M疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂上にロードした。結果を図5Aに図示する。
【００５８】
図5AにUV吸光度トレース(赤)により示されているように、TOYOPEARL Butyl 600M疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に適用された段階的溶出により、2つの画分の連続的な分離が可能であった。画分のCEX-HPLC(図5B)分析により、10mMリン酸ナトリウム、pH7.0のバッファー(75%)を用いて行われた段階的溶出の第2の画分中に溶出されたκλボディおよび10mMリン酸ナトリウム、pH7.0のバッファー(54%)を用いて行われた段階的溶出の第1の画分中に溶出された残りのκκ単一特異性の分離および純度を確認した。κλボディに対応する高純度の主要画分(プール2)は、>95%であると測定された。
【００５９】
これらの作業実施例に提示されるデータから、マルチモーダル(ミックスモード)クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはマルチモーダル(ミックスモード)クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーの組み合わせを用いて、κλボディを含むIgG混合物から二重特異性抗体を精製することの実施可能性が実証された。
【００６０】
HIC-HPLC方法：試料混合物中のλ単一特異性抗体、κ単一特異性抗体、およびκλボディの相対的比率を決定するために、Dionex ProPac HIC-10カラムを用いるHIC-HPLC (疎水性相互作用クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー)アッセイを用いた。前記の3つの種を高分解能で溶出させるために、試料をローディングした後のカラム上に、85%から25%の下降勾配の硫酸アンモニウムをアプライした。κ単一特異性抗体が最初に溶出し、続いてκλボディ、そして最後にλ単一特異性抗体が溶出した。それぞれの種の量を決定するために、280nmでモニターされたUVトレースのピーク領域積分を行った。
【００６１】
CEX-HPLC方法：この陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー(CEX-HPLC)方法を用いて、精製された試料中の単一特異性抗体および二重特異性抗体の比率を決定した。CEX-HPLC方法により、タンパク質変種をその電荷分布に従って分離することが可能である。異なる抗体産物を分離するため、試料を調製してBioMab NP5-SSカラム(Agilent)上に50μgロードし、直線勾配の10mMリン酸ナトリウム、500mM NaCl、pH6.5(0%から100%のNaCl濃度)を0.8mL/分の流速でアプライした。214nmでのUV検出を用いて試料の溶出をモニターした。3つの集団が(参照標準に従って)同定され、それらの相対的面積パーセントに従って分析された。それぞれのアイソフォームのパーセントを、総ピーク面積に対する各構成要素のピーク面積を計算することにより決定した。
【００６２】
その他の態様
本発明をその詳細な説明に関連して説明したが、前記詳細な説明は、例を示すことを意図したものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図したものではない。その他の局面、利点および改変が、添付の特許請求の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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