【手続補正書】
【提出日】平成26年1月24日(2014.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＨ−ローダミン−フルオレセインエネルギー転移染料ペアで標識されたオリゴヌクレオチドであって、以下：
（ａ）該オリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシルに非ヌクレオチド性試薬をカップリングさせて、ＮＨ−ローダミン標識されたオリゴヌクレオチドを得る工程であって、該試薬は、以下の構造式（ＩＸ．１）：
【化１】
2013048635.tif 000001
のものであり、ここで、
ＬＭは、標識部分を表し；
Ｒｅは、酸に不安定な保護基を表し；
ＰＥＰは、ホスホロアミダイト基、２−クロロフェニルリン酸基、２，５−ジクロロフェニルリン酸基またはＨ−ホスホネート基であるリン酸エステル前駆体基を表し；
−Ｚ−は、官能基Ｆｚによって寄与される結合の一部を表し、ここで、Ｆｚは相補的官能基Ｆｙと反応することが可能であり、そして、ＦｙまたはＦｚの一方が求核基を含み、ＦｙおよびＦｚの他方が求電子基を含み；
Ｓｐ１、Ｓｐ２およびＳｐ３は、同じであっても異なっていてもよく、それぞれ互いに独立して、１〜１０個の炭素原子を含むアルキレン鎖または−［ＣＨ２（ＣＨ２）ｅＯ］ｆ−ＣＨ２（ＣＨ２）−を表し、ここで、各ｅは、それぞれ独立して１〜４の範囲の整数を表し、そして、各ｆは、それぞれ独立して１〜１０の範囲の整数を表し；
Ｇは、ＣＨまたはＮを表し；そして
該標識部分は、Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分を含み、ここで、該Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分は、以下の構造式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）および（ＩＩＩｃ）：
【化２】
2013048635.tif 000002
から選択される構造を含み、ここで：
Ｒ’は、Ｒ３’および水素から選択され；
Ｒ”は、Ｒ６’および水素から選択され；
Ｒ９は、アシル保護基であり；
Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ２”、Ｒ４’、Ｒ４”、Ｒ５’、Ｒ５”、Ｒ７’、Ｒ７”、Ｒ８’、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、単独で占める場合、それぞれ互いに独立して、水素、低級アルキル、（Ｃ６−Ｃ１４）アリール、（Ｃ７−Ｃ２０）アリールアルキル、５員〜１４員のヘテロアリール、６員〜２０員のヘテロアリールアルキル、−Ｒｂおよび−（ＣＨ２）ｘ−Ｒｂから選択され、ここで、低級アルキルとは（Ｃ１−Ｃ８）アルキルを意味し、ｘは１〜１０の範囲の整数であり、Ｒｂは、−Ｘ、−ＯＨ、−ＯＲａ、−ＳＨ、−ＳＲａ、−ＮＨ２、−ＮＨＲａ、−ＮＲｃＲｃ、−Ｎ＋ＲｃＲｃＲｃ、ペルハロ低級アルキル、トリハロメチル、トリフルオロメチル、−Ｂ（ＯＨ）３、−Ｂ（ＯＲａ）３、−Ｂ（ＯＨ）Ｏ−、−Ｂ（ＯＲａ）２Ｏ−、−Ｂ（ＯＨ）（Ｏ−）２、−Ｂ（ＯＲａ）（Ｏ−）２、−Ｐ（ＯＨ）２、−Ｐ（ＯＨ）Ｏ−、−Ｐ（ＯＲａ）２、−Ｐ（ＯＲａ）Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲａ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲａ）Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＲａ）、−ＯＰ（ＯＨ）２、−ＯＰ（ＯＨ）Ｏ−、−ＯＰ（ＯＲａ）２、−ＯＰ（ＯＲａ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ）（Ｏ−）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲａ）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲａ）Ｏ−、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲａ）（ＯＨ）、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｓ）Ｘ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（Ｓ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ２、−Ｃ（ＮＨ）ＮＨＲａおよび−Ｃ（ＮＨ）ＮＲｃＲｃから選択され、ここで、Ｘはハロであり、各Ｒａは互いに独立して、低級アルキル、（Ｃ６−Ｃ１４）アリール、（Ｃ７−Ｃ２０）アリールアルキル、５員〜１４員のヘテロアリールおよび６員〜２０員のヘテロアリールアルキルから選択され、そして、各Ｒｃは互いに独立してＲａであるか、あるいは、同じ窒素原子に結合した２つのＲｃはその窒素原子と一緒になって５員〜８員の飽和または不飽和環を形成し得、該環は任意に、通常Ｏ、ＮおよびＳから選択される同じかまたは異なる環ヘテロ原子を１つ以上含み得るか、あるいは、
Ｒ１’とＲ２’またはＲ７’とＲ８’が、それらが結合する炭素原子と一緒になって、任意に置換される（Ｃ６−Ｃ１４）アリール架橋を形成し；および／または、Ｒ４’とＲ４”および／またはＲ５’とＲ５”が、それらが結合する炭素原子と一緒になって、ベンゾ基を形成し；そして、
Ｒ３’およびＲ６’は、単独で占める場合、それぞれ互いに独立して、低級アルキル、（Ｃ６−Ｃ１４）アリール、（Ｃ７−Ｃ２０）アリールアルキル、５員〜１４員のヘテロアリールおよび６員〜２０員のヘテロアリールアルキルから選択されるか、あるいは、
構造式（ＩＩＩａ）の化合物におけるＲ３’とＲ２’もしくはＲ４’、および／または、Ｒ６’とＲ５’もしくはＲ７’、構造式（ＩＩＩｂ）の化合物におけるＲ３’とＲ２’もしくはＲ４’、および／または、Ｒ６’とＲ５’もしくはＲ７”、または、構造式（ＩＩＩｃ）の化合物におけるＲ３’とＲ２”もしくはＲ４’、および／または、Ｒ６’とＲ５’もしくはＲ７”が、それらが結合する原子と一緒になって、１つ以上の同じかまたは異なる低級アルキル、ベンゾもしくはピリド基で任意に置換される５員または６員の飽和または不飽和環を形成し、
但し、構造式（ＩＩＩａ）の化合物におけるＲ２’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ７’、Ｒ５またはＲ６のうち少なくとも１つ、構造式（ＩＩＩｂ）の化合物におけるＲ２’、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ７”、Ｒ５またはＲ６のうち少なくとも１つ、および、構造式（ＩＩＩｃ）の化合物におけるＲ２”、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｒ７”、Ｒ５またはＲ６のうち少なくとも１つは、式−Ｙ−の基であり、ここで、Ｙは、官能基Ｆｙによって寄与される共有結合の一部を表し、ここで、Ｆｙは相補的官能基Ｆｚと反応して共有結合を形成することが可能であり、そして、ＦｙまたはＦｚの一方が求核基を含み、ＦｙおよびＦｚの他方が求電子基を含む、工程；
（ｂ）該酸に不安定な保護基Ｒｅを該ＮＨ−ローダミン標識されたオリゴヌクレオチドから除去する工程；
（ｃ）Ｏ−保護フルオレセインホスホロアミダイトとカップリングさせて、標識され、支持体に結合したオリゴヌクレオチドを得る工程；ならびに
（ｄ）該標識され、支持体に結合したオリゴヌクレオチドを脱保護および切断して、ＮＨ−ローダミン−フルオレセインエネルギー転移染料ペアで標識されたオリゴヌクレオチドを得る工程
を包含する段階的な様式で、支持体に結合したオリゴヌクレオチドを該染料ペアの各メンバーで標識することによって得られる、標識されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記構造式（ＩＸ．１）の試薬におけるリン酸エステル前駆体基が、ホスホロアミダイト基またはＨ−ホスホネート基である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記構造式（ＩＸ．１）の試薬におけるリン酸エステル前駆体基が、以下の式（Ｐ．１）：
【化３】
2013048635.tif 000003
のホスホロアミダイトであり、ここで：
Ｒ２０は、１〜１０個の炭素原子を含む、直鎖、分枝または環状の、飽和または不飽和アルキル、２−シアノエチル、６〜１０個の環炭素原子を含むアリール、および、６〜１０個の環炭素原子および１〜１０個のアルキレン炭素原子を含むアリールアルキルから選択され；かつ
Ｒ２１およびＲ２２は、それぞれ互いに独立して、１〜１０個の炭素原子を含む、直鎖、分枝または環状の、飽和または不飽和アルキル、６〜１０個の環炭素原子を含むアリール、および、６〜１０個の環炭素原子および１〜１０個のアルキレン炭素原子を含むアリールアルキルから選択されるか、あるいは、
Ｒ２１およびＲ２２は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、５〜６個の環原子を含む、飽和または不飽和環を形成し、該環原子のうちの１つまたは２つは、示された窒素原子に加えて、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択されるヘテロ原子であってもよく、
任意に、Ｒ２０がβ−シアノエチルであり、かつ、Ｒ２１およびＲ２２がそれぞれイソプロピルである、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記構造式（ＩＸ．１）の試薬におけるＲｅが、４’，４”−ジメトキシトリチルである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分が、以下の構造式（ＩＩＩａ．１）、（ＩＩＩａ．２）、（ＩＩＩｂ．１）、（ＩＩＩｂ．２）、（ＩＩＩｃ．１）および（ＩＩＩｃ．２）：
【化４】
2013048635.tif 000004
から選択される構造を含み、ここで、
Ｒ’、Ｒ”、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ２”、Ｒ３’、Ｒ４’、Ｒ４”、Ｒ５’、Ｒ５”、Ｒ６’、Ｒ７’、Ｒ７”、Ｒ８’、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９およびＹは、請求項１において前に定義されたとおりである、
請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記Ｎ−保護ＮＨ−ローダミン部分が、以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）：
（ｉ）Ｙが、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−および−ＮＨ−から選択される；
（ｉｉ）Ｒ４およびＲ７がそれぞれクロロである；
（ｉｉｉ）Ｒ１’およびＲ８’がそれぞれ水素である；
（ｉｖ）Ｒ１’とＲ２’またはＲ７’とＲ８’が一緒になってベンゾ基を形成する；
（ｖ）Ｒ２’およびＲ７’がそれぞれ水素または低級アルキルである；
（ｖｉ）Ｒ’がＲ３’であり、かつ、Ｒ”がＲ６’である；および
（ｖｉｉ）Ｒ’がＲ３’であり、Ｒ”がＲ６’であり、かつ、Ｒ３’とＲ６’が、隣接炭素原子における置換基と一緒になって、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−および
【化５】
2013048635.tif 000005
から選択される基を形成する；
から選択される１つ以上の適用可能な特徴を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
Ｒ９が、式−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０のアリール基であり、ここで、Ｒ１０は、水素、低級アルキル、メチル、−ＣＸ３、−ＣＨＸ２、−ＣＨ２Ｘ、−ＣＨ２−ＯＲｄ、および、低級アルキル、メチル、−Ｘ、−ＯＲｄ、シアノもしくはニトロ基で任意に一置換されるフェニルから選択され、ここで、Ｒｄは、低級アルキル、フェニルおよびピリジルから選択され、そして、各Ｘはハロ基、通常はフルオロもしくはクロロであり、任意に、Ｒ１０がメチルおよびトリフルオロメチルから選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記Ｏ−保護フルオレセインホスホロアミダイト試薬が、Ｏ−保護ＦＡＭホスホロアミダイト試薬である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記ＮＨ−ローダミン標識されたオリゴヌクレオチドからの前記酸に不安定な保護基Ｒｅの除去の後でかつ、前記Ｏ−保護フルオレセインホスホロアミダイトとのカップリングの前に、リンカーホスホロアミダイトがカップリングされ、該リンカーホスホロアミダイトが、以下の構造：
【化６】
2013048635.tif 000006
を有し、ここで、Ｓｐは、Ｓｐ１、Ｓｐ２およびＳｐ３について請求項１において定義されたとおりのスペーサー部分である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。