(57)【要約】      （修正有）【課題】天然由来の蛍光生体分子および固定剤からの不要なバックグラウンド蛍光から有用な信号を確実かつ正確に分離することができる撮像システムを提供する。【解決手段】標本を載置するための撮像ステージと、蛍光ダイヤモンドを励起するように構成され、かつ標本に指向される放射線源と、ダイヤモンドの蛍光を検出するように構成され、かつ標本からの蛍光を検出するように構成された蛍光検出器と、標本に時変磁場を印加するように構成された装置と、を備える。放射線源は、レーザおよびキセノンアークランプからなる群から選択され、蛍光ダイヤモンドは、蛍光ナノダイヤモンドであり、シリカ被覆蛍光ダイヤモンドまたは機能化シリカ被覆蛍光ダイヤモンド、または機能化シリカ被覆蛍光ナノダイヤモンドを含む、本撮像システムは、様々な磁場下で得られる標本の蛍光比較画像を提供する。【選択図】図１
0003215716.tif 000002
【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
標本を載置するための撮像ステージと、
蛍光ナノダイヤモンドの三重項励起状態を励起するように構成され、かつ標本に指向される放射線源と、
三重項‐三重項蛍光ナノダイヤモンドの蛍光を検出するように構成され、かつ前記標本からの蛍光を検出するように構成された蛍光検出器と、
前記標本に時変磁場を印加するように構成された装置と、
を備える撮像システム。
【請求項２】
前記撮像ステージに載置される標本を備える、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項３】
前記放射線源は、レーザおよびキセノンアークランプから選択される、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項４】
前記蛍光ナノダイヤモンドは、シリカ被覆蛍光ナノダイヤモンドを含む、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項５】
前記蛍光ナノダイヤモンドは、機能化シリカ被覆蛍光ナノダイヤモンドを含む、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項６】
時変磁場を印加するように構成された前記装置は、永久磁石を備える、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項７】
時変磁場を印加することは、前記標本に対して前記永久磁石を移動させることを含む、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項８】
時変磁場を印加するように構成された前記装置は、電磁石を備える、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項９】
前記標本は、患者、動物、組織および細胞から選択される、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項１０】
撮像処理ユニットを備える、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項１１】
前記画像処理ユニットは、第１の印加磁場下で得られた画像を、第２の印加磁場下で得られた蛍光画像と比較するように構成される、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項１２】
前記第１の磁場および前記第２の磁場は、異なる強度を有する、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項１３】
前記撮像システムは携帯用である、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項１４】
前記撮像システムは、１ｃｍ〜１０ｃｍの寸法を有する前記標本の一部分を撮像するように構成される、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項１５】
前記撮像システムは、少なくとも１ｃｍの寸法を有する前記標本の一部分を撮像するように構成される、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項１６】
前記撮像システムは、０．１ｃｍ未満の寸法を有する前記標本の一部分を撮像するように構成される、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項１７】
前記撮像システムは、０．０１ｃｍ〜０．１ｃｍの寸法を有する前記標本の一部分を撮像するように構成される、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項１８】
前記放射線源および前記検出器は、前記標本に対して移動するように構成される、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項１９】
前記放射線源、前記検出器、および時変磁場を印加するように構成された前記装置は、前記標本に対して移動するように構成される、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項２０】
前記検出器は、複数の検出器を含む、請求項１に記載の撮像システム。
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]本出願は、２０１５年４月９日に出願された米国仮特許出願第６２／１４５，４６６号の優先権を主張し、この全体はあらゆる目的のために本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
連邦政府の助成による研究および開発下で行われた発明に対する権利に関する陳述
[0002]米国政府の支援により本主題を行った。米国政府は、本主題において一定の権利を有する。本研究は、米国国立心肺血液研究所、米国国立衛生研究所からの交付番号第ＨＬ００６０８７−０２ＢＢＣ号の助成を受けたものである。
【考案の概要】
【考案が解決しようとする課題】
【０００３】
[0003]天然由来の蛍光生体分子および固定剤からの自家蛍光は重複発光スペクトルにより、不要な蛍光から有用な蛍光を分離することを困難にしている。したがって、自家蛍光は、組織および動物撮像能力を制限している。高性能のスペクトルアンミキシング法であっても、バックグラウンド蛍光から有用な信号を常に確実かつ正確に分離することができない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
[0004]本発明の一態様は、（ａ）蛍光ナノダイヤモンドを含浸した対象物の第１の蛍光画像を取得することと、（ｂ）蛍光ナノダイヤモンドの蛍光を減少させるために蛍光ナノダイヤモンドに磁場を印加することと、（ｃ）対象物の第２の蛍光画像を取得することと、（ｄ）第１の蛍光画像から第２の蛍光画像を減算して、結果として得られる画像を生成することとを含む撮像方法を提供する。
【０００５】
[0005]本態様は、様々な実施形態を有することができる。対象物は、生物標的であり得る。生物標的は、１つの細胞、複数の細胞、組織、器官、および有機体からなる群から選択することができる。
【０００６】
[0006]磁場は、永久磁石によって生成することができる。磁場は、電磁石によって生成することができる。
【０００７】
[0007]第２の蛍光画像は、磁場の印加中に取得することができる。
【０００８】
[0008]工程（ｄ）は、画素ごとに行うことができる。
【０００９】
[0009]本方法は、工程（ａ）〜（ｄ）を複数回繰り返し、かつ結果として得られた画像を平均化する追加の工程（ｅ）を更に含むことができる。複数回は、１０回を超え得る。
【００１０】
[0010]工程（ａ）および（ｃ）は、対象物に吸収波長を適用することができる。本発明の別の態様は、プロセッサによって実行可能なプログラム命令を含む非一時的なコンピュータ可読媒体を提供する。コンピュータ可読媒体は、（ａ）蛍光ナノダイヤモンドを含浸した対象物の第１の蛍光画像を取得するプログラム命令と、（ｂ）蛍光ナノダイヤモンドの蛍光を減少させるために蛍光ナノダイヤモンドに磁場を印加するプログラム命令と、（ｃ）対象物の第２の蛍光画像を取得するプログラム命令と、（ｄ）第１の蛍光画像から第２の蛍光画像を減算して、結果として得られる画像を生成するプログラム命令とを含む。
【００１１】
[0011]本態様は、様々な実施形態を有することができる。第２の蛍光画像は、磁場の印加中に取得することができる。
【００１２】
[0012]本発明の別の態様は、（ａ）蛍光ナノダイヤモンドを含浸した対象物に時変磁場を印加して、蛍光ナノダイヤモンドの蛍光を変調することと、（ｂ）対象物の複数の蛍光画像を取得することと、（ｃ）複数の蛍光画像内の対応する画素ごとに、ロックイン法を使用して蛍光強度を算出することとを含む撮像方法を提供する。
【００１３】
[0013]本態様は、様々な実施形態を有することができる。対象物は、生物標的であり得る。生物標的は、１つの細胞、複数の細胞、組織、器官、および有機体からなる群から選択することができる。
【００１４】
[0014]磁場は、永久磁石によって生成することができる。磁場は、電磁石によって生成することができる。
【００１５】
[0015]工程（ｂ）は、対象物に吸収波長を適用することを含むことができる。複数の蛍光画像は、広視野カメラによって取得することができる。複数の蛍光画像は、共焦点顕微鏡によって取得することができる。
【００１６】
[0016]本発明の別の態様は、プロセッサによって実行可能なプログラム命令を含む非一時的なコンピュータ可読媒体を提供する。コンピュータ可読媒体は、（ａ）蛍光ナノダイヤモンドを含浸した対象物に時変磁場を印加して、蛍光ナノダイヤモンドの蛍光を変調するプログラム命令と、（ｂ）対象物の複数の蛍光画像を取得するプログラム命令と、（ｃ）複数の蛍光画像内の対応する画素ごとに、ロックイン法を使用して蛍光強度を算出するプログラム命令とを含む。
【００１７】
[0017]本発明の別の態様は、（ａ）蛍光ナノダイヤモンドを含浸した対象物に吸収波長を適用することと、（ｂ）少なくとも約６ナノ秒の遅延後、対象物の蛍光画像を取得することとを含む撮像方法を提供する。
【００１８】
[0018]本態様は、様々な実施形態を有することができる。対象物は、生物標的であり得る。生物標的は、１つの細胞、複数の細胞、組織、器官、および有機体からなる群から選択することができる。
【００１９】
[0019]遅延は、約１０ナノ秒を超え得る。遅延は、約１０ナノ秒〜約２０ナノ秒を超え得る。
【００２０】
[0020]吸収波長は、パルスレーザによって発生することができる。吸収波長は、約４５０ｎｍ〜約６５０ｎｍ、または約９００ｎｍ〜約１３００ｎｍであってもよい。吸収波長は、約４５０ｎｍ〜約６５０ｎｍ、または約８５０ｎｍ〜約１３５０ｎｍであってもよい。
【００２１】
[0021]本発明の別の態様は、（ａ）蛍光ナノダイヤモンドを含浸した対象物に吸収波長を適用することと、（ｂ）少なくとも約４ナノ秒の遅延後、対象物の蛍光画像を取得することとを含む撮像方法を提供する。
【００２２】
[0022]本態様は、様々な実施形態を有することができる。対象物は、生物標的であり得る。生物標的は、１つの細胞、複数の細胞、組織、器官、および有機体からなる群から選択することができる。
【００２３】
[0023]遅延は、約１０ナノ秒を超え得る。遅延は、約１０ナノ秒〜約２０ナノ秒を超え得る。
【００２４】
[0024]吸収波長は、パルスレーザによって発生することができる。吸収波長は、約４５０ｎｍ〜約６５０ｎｍ、または約９００ｎｍ〜約１３００ｎｍであってもよい。吸収波長は、約４５０ｎｍ〜約６５０ｎｍ、または約８５０ｎｍ〜約１３５０ｎｍであってもよい。
【００２５】
[0025]本発明の別の態様は、プロセッサによって実行可能なプログラム命令を含む非一時的なコンピュータ可読媒体を提供する。コンピュータ可読媒体は、（ａ）蛍光ナノダイヤモンドを含浸した対象物に吸収波長を適用するプログラム命令と、（ｂ）少なくとも約６ナノ秒の遅延後、対象物の蛍光画像を取得するプログラム命令とを含む。
【００２６】
[0026]ある特定の態様では、標本を載置するための撮像ステージと、蛍光ナノダイヤモンドの三重項励起状態を励起するように構成され、かつ標本に指向される放射線源と、三重項‐三重項蛍光ナノダイヤモンドの蛍光を検出するように構成され、かつ標本からの蛍光を検出するように構成された蛍光検出器と、標本に時変磁場を印加するように構成された装置とを備える撮像システムが開示される。
【００２７】
[0027]本発明の性質および所望の対象物をより一層十分に理解するために、添付の図面と併せて以下の詳細な説明に言及し、同様の参照文字は以下の図を通して対応する部分を表すものとする。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ダイヤモンド窒素‐空孔中心の吸収（励起）スペクトルおよび発光スペクトルを示す。
【図２】本主題の一実施形態による撮像方法を示す。
【図３】本主題の一実施形態による第１の蛍光画像から第２の蛍光画像の画素ごとの減算の一例を示す。
【図４】本主題の別の実施形態による撮像方法を示す。
【図５】本主題の別の実施形態による撮像方法を示す。
【図６】本主題の一実施形態による撮像システムを示す。
【図７Ａ】負に帯電した窒素空孔（ＮＶ）中心のエネルギー準位図を示す。
【図７Ｂ】ＦＮＤを含む視野を示す。
【図７Ｃ】０．１Ｈｚの周波数および１００ガウスの振幅で変調磁場を印加する際の図７Ａに示したＦＮＤの強度変調を示す。
【図８Ａ】スライドの表面でのＦＮＤの走査型共焦点画像である。
【図８Ｂ】ＦＮＤの発光スペクトルと同程度の発光スペクトルを有する、約１μＭのＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７色素の添加後に同視野の同一撮像条件下で撮影された走査型共焦点画像である。高濃度のＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７色素からの蛍光は、ＦＮＤの蛍光を完全に不明瞭にする。
【図８Ｃ】高いＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７色素のバックグラウンドの存在下（図８Ｂと同様）で画像を処理した後の同視野のバックグラウンドのない画像である。磁場下および非磁場下で回収された画像の対の差分を算出し、これらの差分画像のうち１０００をともに平均化して処理済み画像を生成した。この処理によって、図８Ａに示したダイヤモンドの画像は、図８Ｂのような高バックグラウンドでの画像から回復される。
【図９Ａ】走査型共焦点顕微鏡によって撮影されたムービーのフレームである。
【図９Ｂ】ロックインアルゴリズムを使用して画素ごとにムービーを処理した後の広視野のバックグラウンドのない画像を示す。
【図９Ｃ】ＦＮＤに対応する明画素（図９Ａの画像の左上隅からの水平座標ｘ＝１０９および垂直座標ｙ＝１１１）へのロックインアルゴリズムの適用を示す。
【図９Ｄ】バックグラウンドに対応する暗画素（図９Ａの画像の左上隅からの水平座標ｘ＝１３７および垂直座標ｙ＝１０７）に適用された同じロックインアルゴリズムを示す。
【図１０Ａ】ＦＮＤ注入後のマウスの前四分体の従来のスペクトルアンミキシング法によって取得された蛍光画像を示す。この画像は、バックグラウンドチャネル（左上）とＦＮＤチャネル（右上）のオーバーレイである。ＦＮＤの注入部位は、合成で視認できるが、リンパ節は区別することができない。
【図１０Ｂ】ペアワイズ画像減算法で撮像された同じマウスを示す。リンパ節は、磁場をオンオフした蛍光画像（左上）のペアワイズ減算によって生成された処理済み画像（右上）で明確に視認できる。
【図１０Ｃ】広視野ロックイン法で得られた図１０Ｂと同じ画像を示す。
【図１０Ｄ】ペアワイズ減算のバックグラウンドのない検出で得られた切り開かれたマウス胸腔の画像を示す。リンパ節および最初の注入部位（白色矢印）は明確に視認できる。
【図１０Ｅ】広視野ロックインのバックグラウンドのない検出で得られた図１０Ｄと同じ画像を示す。
【図１０Ｆ】ＦＮＤ（１および３）ならびに２つのバックグラウンド部分（２および４）がある画像内の点に対する時間の関数としての強度を示す。４つの点の位置は、図１０Ｂおよび図１０Ｄにおける画像に示される。
【図１１Ａ】印加磁場下ではないシリカ被覆ＦＮＤを注入されたリンパ節（ＬＮ）の画像である。
【図１１Ｂ】約１００ガウスの磁場の印加中の同視野の画像である。
【図１１Ｃ】図１１Ａから図１１Ｂの２０の減算した画像の総和を示す。ＦＮＤは、他の暗視野内の輝点として観察される。
【図１１Ｄ】磁場が常にオフであったときのこのような２０の減算の総和を示す。
【図１１Ｅ】磁場が常にオンであったときのこのような２０の減算の総和を示す。
【図１２Ａ】図１１Ａ〜図１１Ｅに使用される同じＬＮの異なる領域の二光子ＦＬＩＭ画像である。より長い寿命（赤色で図示）がＦＮＤによると考えられ、これに対して報告された寿命は約１０〜２０ナノ秒に及ぶ。
【図１２Ｂ】非磁場下での画像および磁場下での画像を減算すること、かつこのような１０の減算を加算することによって得られた同視野のバックグラウンドのない画像である。
【図１３】ある特定の実施形態による交番磁場装置および全内部反射蛍光顕微鏡を含む撮像システムを示す。
【図１４】変調磁場蛍光撮像装置の一般的な構成要素を示す概略図である。
【図１５】ある特定の実施形態による変調磁場を印加するための様々な構成を示す。
【図１６】ある特定の実施形態による小動物撮像機器の構成要素を示す概略図である。
【図１７】ある特定の実施形態による磁場変調に変更された小動物撮像機器の構成要素を示す概略図である。
【図１８】ある特定の実施形態による磁場変調のための小動物撮像機器の構成要素を示す概略図である。
【図１９】ある特定の実施形態による変調磁場蛍光撮像装置を示す。
【図２０】ある特定の実施形態による変調磁場蛍光撮像装置を示す。
【図２１】ある特定の実施形態による変調磁場蛍光撮像装置を示す。
【図２２】ある特定の実施形態によるハンドヘルド変調磁場蛍光撮像装置の構成要素を示す概略図である。
【００２９】
定義
[0050]本主題は、以下の定義を参照して最も明確に理解される。
【００３０】
[0051]本明細書に使用されるとき、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、特に文脈から明らかな指示がない限り、複数のものを含むものとする。
【００３１】
[0052]特に記述されないか、または文脈から明白でない限り、本明細書に使用されるとき、「約」という用語は、例えば平均値の２標準偏差内など、当該技術分野における一般公差の範囲内として理解される。「約」は、規定値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％内として理解することができる。特に文脈から明らかでない限り、本明細書に提供されるすべての数値は、約という用語によって変更される。
【００３２】
[0053]本明細書に使用されるとき、「バックグラウンドのない画像」という用語は、蛍光ナノダイヤモンドの蛍光が内因性タンパク質などのバックグラウンド構成要素の蛍光と区別することができるように、十分に高い信号対雑音比（ＳＮＲ）を有する画像を指す。好適なＳＮＲとしては、約１：１、約１．５：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、および約１０：１を超えるものが挙げられる。
【００３３】
[0054]本明細書に使用されるとき、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法でそれらに起因する意味を有することができ、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができる。
【００３４】
[0055]本明細書に使用されるとき、「蛍光画像」という用語は、１つ以上の蛍光発光を表す画像を指す。例えば、蛍光発光は、約６２５ｎｍ〜約８２５ｎｍであり得る。蛍光画像は、対象物に吸収波長を適用すること、かつ同時にまたは遅延後、蛍光発光の画像を捕捉することによって、一般的に得られる。蛍光画像は、蛍光顕微鏡を含む様々なデバイスを使用して得ることができる。いくつかの実施形態では、蛍光画像は、複数の画素からなる二次元画像であってもよく、それぞれの画素が特定の位置での蛍光の強度の数値表現であり得る。
【００３５】
[0056]本明細書に使用されるとき、「蛍光ナノダイヤモンド」（「ＦＮＤ」と略す）という用語は、適切な吸収（励起）スペクトルにさらされるときに蛍光を示すナノダイヤモンドを指す。この蛍光は、窒素‐空孔（ＮＶ）中心の存在によって引き起こすことができ、そこで窒素原子がナノダイヤモンドの空孔に隣接する。約１００ｎｍの直径を有するシリカ被覆ＦＮＤの吸収（励起）スペクトルおよび発光スペクトルは、図１に示す。吸収（励起）スペクトルは一般に、約５６５ｎｍの励起ピークで約４５０ｎｍ〜約６００ｎｍにある。（ＦＮＤはまた、約９００ｎｍ〜約１３００ｎｍの波長域での二光子過程によって励起することができる。）発光スペクトルは一般に、約７００ｎｍの励起ピークで約６２５ｎｍ〜約７５０ｎｍにある。（本明細書に記載した実施例では、試料を５７５ｎｍで励起し、ＰＴＩ蛍光光度計を使用して励起スペクトルを得た。）
【００３６】
[0057]本明細書に使用されるとき、「ナノダイヤモンド」という用語は、約１００ｎｍ未満の最大寸法を有するダイヤモンドを指す。例えば、ナノダイヤモンドの最大寸法は、約１００ｎｍ、約９０ｎｍ、約８０ｎｍ、約７０ｎｍ、約６０ｎｍ、約５０ｎｍ、約４０ｎｍ、約３０ｎｍ、約２０ｎｍ、約２０ｎｍ、約１０ｎｍなど未満であってもよい。
【００３７】
[0058]本明細書に使用されるとき、「対象物」という用語は、蛍光画像が所望されるあらゆる物体を指す。対象物は、生物標的、例えば生体または有機体の試料であってもよい。対象物は、有機体、１つ以上の器官、１つ以上の組織、および／または１つ以上の細胞であってもよい。本明細書に記載した例は、主に生体撮像を対象にするが、本明細書に記載したＦＮＤおよび方法は、変調磁場が試料に印加され得るあらゆる撮像用途において雑音に対する信号を増大させるために使用することができる。例えば、本明細書に記載したＦＮＤおよびその方法は、高バックグラウンド環境での流れまたは形態を撮像および観察するために使用することができる。
【００３８】
[0059]特に記述されないか、または文脈から明白でない限り、本明細書に使用されるとき、「または」という用語は、包括的であると理解される。
【００３９】
[0060]「特異的に結合する」ということは、標的（例えば、ポリペプチド、細胞、表面抗原など）に対する認識およびそれとの結合を意味するが、試料、例えば生体試料における他の分子を実質的に認識および結合しない。
【００４０】
[0061]本明細書に使用されるとき、「被写体」という用語は、本明細書に記載した方法によって撮像されるのに適したあらゆる有機体を指す。このような有機体としては、これらに限定されないが、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、モルモット、サル、鳥類、爬虫類、バクテリア、菌類、ウイルスなどが挙げられる。
【００４１】
[0062]本明細書に使用されるとき、「組織」という用語は、被写体の身体を指す。組織の非限定的な例としては、脳、心臓、肺、肝臓、胃、膵臓、結腸、直腸、腸、血管、動脈などの器官からの組織が挙げられる。
【００４２】
[0063]本明細書に提供される範囲は、範囲内の値のすべての省略表現であると理解される。例えば１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０（ならびに特に文脈から明らかな指示がない限り、これらの分数）からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むと理解される。
【考案を実施するための形態】
【００４３】
[0064]ナノダイヤモンドにおける窒素空孔中心は、光退色または点滅しない独自の蛍光源である。注目すべきことに、これらの蛍光ナノダイヤモンドの蛍光強度は、中強度の磁場（約０．０１Ｔ）によって変調することができる。さらに、ナノダイヤモンドの蛍光寿命（約１０〜２０ナノ秒）は、自家蛍光に寄与する大部分の蛍光体の寿命（＜５〜６ナノ秒）より長い。ナノダイヤモンドのこれらの両特性は、バックグラウンドのない撮像を達成するために使用することができる。印加磁場による蛍光強度の変調は、蛍光ナノダイヤモンドの独自の特徴であり、これはそれらの他の特徴と組み合わせて、複数の新規撮像用途を可能にする。バックグラウンドのない撮像は、これらの用途のうちの１つである。
【００４４】
[0065]この発見により、従来の撮像がバックグラウンド蛍光に起因して難しい組織試料内およびインビボで蛍光ナノダイヤモンドのバックグラウンドのない撮像を可能にする。我々は、蛍光ナノダイヤモンドの特性を利用することによってバックグラウンド蛍光を低減または除去するいくつかの技術を提示する。具体的には、蛍光強度の磁場変調は、様々な撮像技術、すなわち蛍光顕微鏡法、共焦点蛍光顕微鏡法、および広視野蛍光動物撮像においてバックグラウンドのない撮像を得る、単純、堅牢、かつ容易に適合可能な方法を提供する。
【００４５】
[0066]本主題の一実施形態では、磁場下で取得された画像を他の同一の条件下で回収された非磁場下での画像から減算することは、１つの画像において特異的に減少するダイヤモンド蛍光を目立たせながら、一定のバックグラウンド蛍光を除去する。
【００４６】
[0067]別の実施形態では、磁場は、画像が取得されながら正弦波的に変調される。次に、強度変調した位相敏感検波は、カメラベースの撮像のための後処理によって、または共焦点ベースの撮像でのロックイン技術によって達成することができる。この技術は、広視野および共焦点撮像システムでの使用に適合する可能性がある。重要なことに、この技術は、従来の連続波照明を利用している。
【００４７】
[0068]更に別の実施形態は、蛍光ナノダイヤモンドの長い励起状態寿命を利用して、より短い寿命のバックグラウンド蛍光を拒絶する。この技術は、パルスレーザおよび時間ゲートまたは寿命撮像に依存する。蛍光ナノダイヤモンドは、二光子手法で撮像することができ、これらの寿命ベースのバックグラウンド拒絶技術を容易にする。
【００４８】
[0069]ここで図２を参照すると、撮像方法２００が提供される。
【００４９】
[0070]工程Ｓ２０２では、蛍光ナノダイヤモンドを含浸した対象物の第１の蛍光画像が取得される。蛍光画像は、本明細書に記載するように従来の蛍光撮像デバイスを使用して取得することができる。
【００５０】
[0071]工程Ｓ２０４では、蛍光ナノダイヤモンドの蛍光を減少させるために蛍光ナノダイヤモンドに磁場が印加される。磁場は、例えば、永久磁石または電磁石で印加することができる。磁場は、蛍光ナノダイヤモンドの蛍光強度が第１の蛍光画像での蛍光強度未満であるように、蛍光ナノダイヤモンドの蛍光強度を変調する。
【００５１】
[0072]工程Ｓ２０６では、対象物の第２の蛍光画像が取得される。好ましくは、第２の蛍光画像は、磁場の印加の結果として蛍光ナノダイヤモンドの低下した蛍光強度以外の第１の蛍光画像と同一パラメータを有する。第２の蛍光画像は、磁場が印加した間に取得される。
【００５２】
[0073]工程Ｓ２０８では、第２の蛍光画像は、第１の蛍光画像から減算して、結果として得られる画像を生成する。減算は、画素ごとに行うことができる。例えば、図３に概念的に示すように、第２の１０×１０画素の蛍光画像は、第１の１０×１０画素の蛍光画像から減算して、結果として得られる画像を生成する。第１の蛍光画像と第２の蛍光画像との唯一の差分が蛍光ナノダイヤモンドの変調であるため、バックグラウンド蛍光（例えば、内因性タンパク質からのものなど）は、減算によって相殺されて、バックグラウンドのない蛍光画像を生成する。
【００５３】
[0074]画素ごとの減算は、手動で行うことができ、または自動化することができる。例えば、Ｎａｔｉｃｋ，ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓのＴｈｅ  ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＭＡＴＬＡＢ（登録商標）ソフトウェア、およびｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／の米国国立衛生研究所から入手可能なＩＭＡＧＥＪソフトウェアを含む様々な市販のコンピュータプログラムが画像減算を行うことができる。
【００５４】
[0075]工程Ｓ２１０では、工程Ｓ２０２〜工程Ｓ２０８が複数回（例えば１０回超）繰り返され、結果として得られた画像は、画質を改善するように画素ごとに平均化される。
【００５５】
[0076]ここで図４を参照すると、別の撮像方法４００が提供される。
【００５６】
[0077]工程Ｓ４０２では、時変磁場は、蛍光ナノダイヤモンドの蛍光を変調するように蛍光ナノダイヤモンドを含浸した対象物に印加される。時変磁場は、周期的に変化することができる。例えば、磁場の大きさは、正弦波的に変化することができる。磁場は、電磁石に印加した電流を変調することによって、または磁石（永久磁石または電磁石のいずれか）と対象物との間の距離を変調することによって変化することができる。
【００５７】
[0078]工程Ｓ４０４では、対象物の複数の蛍光画像が取得される。好ましくは、複数の蛍光画像は、周期内の複数の時点で捕捉される。試料抽出は、規則的または不規則な間隔で生じる可能性があり、必要ではないが、位相変更磁場の周波数に適合することができる。複数の蛍光画像は、共焦点顕微鏡などの単点撮像器を使用して画素ごとに、または広視野撮像器を使用して一度に複数の画素を取得することができる。
【００５８】
[0079]工程Ｓ４０６では、画素ごとの蛍光強度は、ロックイン技術を使用して算出される。ロックイン技術は、複数の蛍光画像の各画素の蛍光強度に各蛍光画像のそれぞれの時点での磁場の振幅を乗算し、その後、適切にフィルタリングしたまたは処理済みの結果として得られる生成物の強度を算出する。すべてのバックグラウンド蛍光は、すべての画像にわたる磁場変調と同調して変動せず、したがって平均してゼロになる。蛍光ナノダイヤモンドの蛍光強度は、磁力と同調して変化し、したがって平均して磁力の振幅の半分になる。
【００５９】
[0080]ロックイン技術は、Ｒｉｃｈａｒｄ  ＢｕｒｄｅｔｔによるＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄｅｓｉｇｎ（２００５）における  「Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  Ｓｉｇｎａｌｓ−Ｔｈｅ  Ｌｏｃｋ−ｉｎ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ」、およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｉｎｋｓｒｓ．ｃｏｍ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ＰＤＦｓ／ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＮｏｔｅｓ／ＡｂｏｕｔＬＩＡｓ．ｐｄｆで入手可能なＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．による「Ａｂｏｕｔ  Ｌｏｃｋ−Ｉｎ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｒｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｔｅ  ＃３」などの公表文献に記載されている。
一般的に言えば、単点検出器から得られた単一画素入力は、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．などの供給者から入手可能な従来のロックイン増幅器によって直接処理することができるが、アルゴリズムは、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）などのソフトウェアを使用して、一連の蛍光画像内の対応する画素の組ごとに通過し、かつ結果として得られるバックグラウンドのない画像を生成するロックイン技術を行うことで書き込むことができる。
【００６０】
[0081]蛍光画像が画素ごとに取得される場合、ロックイン技術は、別の画素を取得する前に、その特定の画素に適用することができる。広視野撮像器を使用して画像が取得される場合、ロックイン技術は、すべての画像が取得された後に画素ごとに適用することができる。
【００６１】
[0082]ここで図５を参照すると、別の撮像方法５００が提供される。
【００６２】
[0083]工程Ｓ５０２では、蛍光ナノダイヤモンドを含浸した対象物に吸収波長（例えば、５ナノ秒以下の短パルス）が適用される。この吸収波長は、ＦＮＤを励起するが、内因性タンパク質などの様々なバックグラウンド構成要素も励起する場合がある。
【００６３】
[0084]工程Ｓ５０４では、少なくとも約６ナノ秒の遅延後、対象物の蛍光画像を取得する。６ナノ秒後、大部分の（すべてではないとしても）バックグラウンド蛍光が消散しているが、ＦＮＤは光子を放出し続ける。したがって、上述した画像処理アルゴリズムを必要とすることなく、バックグラウンドのない画像が捕捉され得る。
【００６４】
[0085]ここで図６を参照すると、本明細書に記載する方法は、ハードウェアおよび／またはソフトウェアで実装することができる。例えば、図６は、蛍光顕微鏡などの蛍光撮像デバイス６０２と、コンピュータ６０４とを含むシステム６００を示す。蛍光撮像デバイス６０２は、励起光源、画像センサ（例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）、相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）チップ、光電子増倍管（ＰＭＴ）、またはアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）など）、１つ以上のレンズ、および不要波長を遮蔽するように適合したフィルタを含むことができる。コンピュータ６０４は、パラレルポートまたはシリアルポート、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）、ＵＳＢ２．０、ファイアワイヤ、イーサネット（登録商標）、ギガビットイーサネット（登録商標）などの通信規格を介して蛍光撮像デバイス６０２と通信可能に結合することができる特殊用途または汎用コンピュータであってもよい。
【００６５】
[0086]当業者に理解されるように、コンピュータ６０４は、表示デバイス、プロセッサ、および／または記憶デバイスなどの様々な部品を含むことができる。
【００６６】
[0087]表示デバイスは、グラフィックスおよび／またはテキストを表示可能な任意のデバイスであってもよい。表示デバイスの例としては、陰極線管（ＣＲＴ）、プラズマディスプレイ、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、有機発光ダイオードディスプレイ（ＯＬＥＤ）、発光ダイオード（ＬＥＤ）ディスプレイ、エレクトロルミネセントディスプレイ（ＥＬＤ）、表面伝導型電子放出素子ディスプレイ（ＳＥＤ）、電界放出ディスプレイ（ＦＥＤ）、ナノ放射ディスプレイ（ＮＥＤ）、電気泳動ディスプレイ、バイクロマルボールディスプレイ、干渉変調器ディスプレイ、双安定ネマチック液晶ディスプレイなどが挙げられる。
【００６７】
[0088]プロセッサは、ハードウェアおよび／またはソフトウェアとして記憶された命令を実行可能な電子デバイス（中央処理装置またはマイクロプロセッサとしても知られている）である。好適なプロセッサは、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＩｎｔｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、またはＳｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（ＡＭＤ）などの製造者から入手可能である。
【００６８】
[0089]記憶デバイスとしては、磁気媒体（例えば、テープ、ディスク）、光媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＤＶＤ、ＨＤ  ＤＶＤ、ＢＬＵ−ＲＡＹ  ＤＩＳＫ（登録商標）、レーザディスク）、パンチカードなどの永続記憶デバイスが挙げられ得る。記憶デバイスとしは、メモリ（例えば、ランダムアクセスメモリ）として知られている一時記憶デバイスも挙げられ得る。
【００６９】
[0090]いくつかの実施形態では、カメラおよび／または被写体の運動を補正するように運動補正が適用される。例えば、運動補正は、サブピクセルレベルで面内運動を補正する画像の時系列に適用することができる。
【００７０】
[0091]一実施形態では、オプティカルフロー方法を使用して、各画像と共通の基準画像との間にペアワイズで非剛体変形マップが算出され、これは様々な分解能で局所相互相関画像サブセットを反復的に最大化する。初期時間枠は、順に外部磁場をオンおよびオフして取得された両画像系列に対する共通の基準として選択することができ、その結果、オンおよびオフ画像が共同登録される。サブピクセルスプラインベースの補間は、空間分解能の損失を最小限に抑えるために非剛体変形の適用に使用することができる。運動補正後、画像の時系列は、ノイズによる不規則変動を低下させるために平均化することができ、それによりオンおよびオフの平均画像を作成する。オンとオフの運動補正した平均の差分画像は、バックグラウンド組織の減算によるプローブ信号のコントラストを分析するために使用することができる。次に、ナノダイヤモンドからのこの信号は、開始画像に重ね合わせることができる。
【００７１】
[0092]本明細書に記載するように、本発明は、対象物を撮像する蛍光ナノダイヤモンドの使用に関する。本発明における使用に適した蛍光ナノダイヤモンド、およびこのような蛍光分子を作製するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｎａｎｏｄｉａｍｏｎｄｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｄ．Ｈｏ  ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ２００９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ（Ｒ．Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，２０１０）、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｈ．Ｆ．Ｔｉｂｂａｌｓ  ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ２０１０）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｂ．Ｖａｌｅｕｒ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  ２０１２）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｗｉｌｅｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｕｌｔｉ−Ｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）  （Ｐ．Ｎ．Ｐｒａｓａｄ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ  ２０１２）、ＹｕらによるＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１２７巻：１７６０４〜１７６０５頁（２００５）、ＭｏｃｈａｌｉｎらによるＮａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第７巻：１１〜２３頁（２０１２）、ＥｐｓｔｅｉｎらによるＮａｔｕｒｅ  Ｐｈｙｓｉｃｓ第１巻：９４〜９８頁（２００５）、ＣｈｏｗらによるＳｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．第３巻：７３ｒａ２１（２０１１）、ＡｗｓｃｈａｌｏｍらによるＳｃｉ．Ａｍ．第２９７巻：８４〜９１頁（２００７）、およびＷｉｌｓｏｎによるＰｈｙｓ．Ｔｏｄａｙ第６４巻：１７〜１８頁（２０１１）を参照されたい。
【００７２】
[0093]蛍光ナノダイヤモンドは、溶液、乳剤、懸濁液、ミクロスフェア、粒子、微粒子、ナノ粒子、リポソームなどとして提供することができる。
【００７３】
[0094]本発明の態様では、蛍光ナノダイヤモンドは、（例えば、蛍光ナノダイヤモンドをインビトロ、エクスビボ、原位置などで試料に含浸させるときに）試料と直接接触させられる。例えば、蛍光ナノダイヤモンドは、注入（例えば、マイクロインジェクション）または送達ビヒクルの使用によって試料に含浸させることができる。好適な送達ビヒクルは、当該技術分野において周知である。非限定的な例としては、脂質ベシクル、または他のポリマー担体材料、リポプレックス（例えば、米国特許出願公開第２００３／０２０３８６５号、およびＺｈａｎｇらによるＪ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，第１００巻：１６５〜１８０頁（２００４）参照）、ｐＨ感受性リポプレックス（例えば、米国特許出願公開第２００２／０１９２２７５号参照）、可逆的にマスクされたリポプレックス（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１８０９５０号参照）、カチオン性脂質ベース組成物（例えば、米国特許第６，７５６，０５４号および米国特許出願公開第２００５／０２３４２３２号参照）、カチオン性リポソーム（例えば、米国特許出願公開第２００３／０２２９０４０号、第２００２／０１６００３８号および第２００２／００１２９９８号、米国特許第５，９０８，６３５号、ならびに国際公開第０１／７２２８３号参照）、アニオン性リポソーム（例えば、米国特許出願公開第２００３／００２６８３１号参照）、ｐＨ感受性リポソーム（例えば、米国特許出願公開第２００２／０１９２２７４号、および豪州公開第２００３／２１０３０３号参照）、抗体で被覆されたリポソーム（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１０８５９７号、および国際公開第００／５０００８号参照）、細胞型特異的リポソーム（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１９８６６４号参照）、核酸およびペプチドを含むリポソーム（例えば、米国特許第６，２０７，４５６号参照）、放出性親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含むリポソーム（例えば、米国特許出願公開第２００３／００３１７０４号参照）、脂質封入分子（例えば、国際公開第０３／０５７１９０号および第０３／０５９３２２号参照）、脂質被包化分子（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１２９２２１号および米国特許第５，７５６，１２２号参照）、他のリポソーム組成物（例えば、米国特許出願公開第２００３／００３５８２９号および第２００３／００７２７９４号、ならびに米国特許第６，２００，５９９号参照）、リポソームと乳剤の安定化された混合物（例えば、欧州公開第１３０４１６０号参照）、乳剤組成物（例えば、米国特許第６，７４７，０１４号参照）、ならびにマイクロエマルション（例えば、米国特許出願公開第２００５／００３７０８６号参照）が挙げられる。
【００７４】
[0095]本発明のいくつかの態様では、蛍光ナノダイヤモンドは、被写体にインビボで投与される（例えば、これらに限定されないが、標的細胞、組織、器官、有機体、感染体、ウイルス、バクテリア、菌類、寄生体などを含む被写体内の対象物に蛍光ナノダイヤモンドを送達する）。被写体に投与されると、蛍光ナノダイヤモンドは、医薬的に許容される担体を含む医薬組成物として提供することができる。「医薬的に許容される」という用語は、規制機関によって承認され、または動物、より具体的にはヒトにおける使用のために、米国薬局方または他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬がともに投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような医薬担体は、水および油などの滅菌液であってもよく、これは、落花生油、大豆油、鉱油、ごま油、オリーブ油、ゲル（例えば、ヒドロゲル）などの石油、動物、植物または合成由来のものを含む。塩類は、医薬組成物が静脈内に投与されるときの典型的な担体である。塩水および水溶性ブドウ糖ならびにグリセリン溶液もまた、特に注射剤のための液体担体として利用することができる。
【００７５】
[0096]好適な医薬用賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、サッカロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。所望される場合、組成物もまた、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性製剤など形を取ることができる。経口製剤は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの医薬品グレードなどの標準担体を含むことができる。好適な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載され、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものである。
【００７６】
[0097]実施形態では、造影剤は、これらに限定されないが、経口、非経口、口腔および舌下、直腸、エアロゾル、鼻、筋肉内、皮下、皮内、ならびに局所を含む様々な経路を通って投与されてもよい。本明細書に使用されるとき、非経口という用語は、例えば、眼内、皮下、腹腔内、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、および頭蓋内注射、または他の注入技術を含む。製剤が投与方法に適合しなければならないことを当業者は容易に理解するであろう。
【００７７】
[0098]投与に適した製剤としては、意図された受容者の血液によって製剤を等張性にする酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤および溶質を含み得る含水および非水滅菌溶液、ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る含水および非水滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、例えば、封止されたアンプルおよびバイアルなど、単位用量または多用量容器で提示することができ、使用直前に滅菌液体担体、例えば、水を加えることのみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管することができる。即時溶液および懸濁液は、当業者によく使用される滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
【００７８】
[0099]錠剤またはカプセルの形態での経口投与のために、蛍光ナノダイヤモンドは、ラクトース、デンプン、サッカロース、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸ニカルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトールなど、経口、非毒性、医薬的に許容される、不活性担体と組み合わせることができる。液状での経口投与のために、蛍光ナノダイヤモンドは、エタノール、グリセロール、水など、任意の経口、非毒性、医薬的に許容される、不活性担体と組み合わせることができる。さらに、所望されるか、または必要であれば、好適な結合剤、潤滑剤、崩壊剤および着色剤もまた、混合物に取り込むことができる。好適な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、グルコースまたはβ‐ラクトースなどの天然糖、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガカントなどの天然および合成ガム、またはアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどが挙げられる。これらの投薬形態で使用される潤滑剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。崩壊剤としては、これらに限定されないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどが挙げられる。
【００７９】
[0100]本発明の方法に使用される蛍光ナノダイヤモンドはまた、リポソーム送達系の形態で投与することができる。このような送達系は、当該技術分野において周知であり、これらに限定されないが、単層ベシクル、大単層ベシクル、および多層ベシクルを含む。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンなどの様々なリン脂質から形成することができる。
【００８０】
[0101]被写体への蛍光ナノダイヤモンドの投与は、一般または局所投与経路によってであってもよい。例えば、蛍光ナノダイヤモンドは、全身に送達されるように被写体に投与することができる。あるいは、蛍光ナノダイヤモンドは、対象とする特定の器官または組織に投与することができる。
【００８１】
[0102]蛍光ナノダイヤモンドは、確実な診断を確保するのに十分な発光を有しなければならない。検出を提供するために試料と接触させられ、または被写体に導入される蛍光ナノダイヤモンドの量は、当業者が容易に決定することができる。例えば、ますます多くの量の蛍光ナノダイヤモンドは、蛍光ナノダイヤモンドが最適な検出方法によって検出されるまで被写体に適用または投与することができる。加えて、当業者もまた、蛍光ナノダイヤモンドが対象物と関連付けられるようになる十分な時間量を決定することに精通している。必要な時間量は、検出可能な量の蛍光ナノダイヤモンドを被写体に導入し、その後、投与後に様々な時間で蛍光ナノダイヤモンドを検出することによって容易に決定することができる。
【００８２】
[0103]いくつかの態様では、蛍光ナノダイヤモンドは、対象物に優先的に結合する分子と会合することができる。このような分子は、当該技術分野において周知であり、これらに限定されないが、標的分子に対する標的結合剤（および蛍光ナノダイヤモンド）の選択的結合のための１つ以上の標的認識部分を有する標的結合剤を含む。標的認識部分は、特定の細胞、組織、器官、受容体、表面抗原、有機体／感染体などの標的分子に特異的に結合するように構成される。
【００８３】
[0104]標的認識部分の例としては、これらに限定されないが、抗原、リガンド、受容体、特異的結合対の一成員、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、オリゴ糖、多糖、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）またはＬＤＬのアポタンパク質、ステロイド、ステロイド誘導体、ホルモン、ホルモン模倣物、レクチン、薬物、抗生剤、アプタマー、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、抗体、抗体関連ポリペプチドなどが挙げられる。実施形態では、標的部分は、ポリペプチド、炭水化物、または脂質である。標的部分はまた、抗体、抗体断片、またはナノボディであってもよい。他の実施形態では、標的認識部分は、特定の組織、受容体、有機体／感染体などに優先的に会合または結合する分子または高分子構造（例えば、リポソーム、ミセル、脂質ベシクルなど）であってもよい。
【００８４】
[0105]本明細書に企図する蛍光ナノダイヤモンド複合体を作製する方法を当業者は容易に理解するであろう。例えば、蛍光ナノダイヤモンドは、標的結合剤／部分と共有的または非共有的に会合することができる。ＶａｉｊａｙａｎｔｈｉｍａｌａｌらによるＮａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ第４巻：４７〜５５頁（２００９）、ＶａｉｊａｙａｎｔｈｉｍａｌａｌらによるＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ第３３巻：７７９４〜７８０２頁（２０１２）、ＨａｒｔｍａｎｎらによるＣｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  第１８巻：第２１号６４８５〜６４９２頁（２０１２）、ＭｏｃｈａｌｉｎらによるＮａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第７巻：１１〜２３頁（２０１２）、ＷｅｎｇらによるＤｉａｍｏｎｄ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ第２２巻：９６〜１０４頁（２０１２）、ＡｌｈａｄｄａｄらによるＳｍａｌｌ第７巻：３０８７〜３０９５頁（２０１１）、Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｊ  Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．第２１巻：１２５７１〜１２５７８頁（２０１１）、およびＬｉｕらによるＮａｎｏｓｃａｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｅｔｔｅｒｓ第５巻：１０４５〜１０５０頁（２０１０）、ＲｕｒａｃｋによるＳｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｍｅｅｔｓ  Ｈｙｂｒｉｄ  （Ｎａｎｏ）Ｍａｔｅｒｉａｌｓ：Ａ  Ｂｒｉｅｆ  Ｌｏｏｋ  Ａｈｅａｄ，Ｔｈｅ  Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ−Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓの６８９〜７００頁（Ｗｉｌｅｙ，２０１０）を参照されたい。
【００８５】
[0106]いくつかの実施形態では、ＦＮＤは、シリカ被覆ＦＮＤである。シリカ被覆ナノダイヤモンドを作製するための方法は、Ａ．Ｂｕｍｂらによる「Ｓｉｌｉｃａ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｎａｎｏｄｉａｍｏｎｄｓ  ｆｏｒ  ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｆａｃｉｌｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ」、１３５  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ７８１５〜１８頁（２０１３）に記載されている。
【００８６】
第１の実施例  ＦＮＤ発光の磁気変調
[0107]図７Ａは、スピン三重項（ｍｓ＝０およびｍｓ＝±１）基底状態および励起状態ならびに一重項準安定状態を示すダイヤモンド内のＮＶ−中心のエネルギー準位図を示す。ＮＶ−中心は、幅広い波長（４５０〜６５０ｎｍ）（緑色矢印）にわたって光学的に励起することができる。励起状態のｍｓ＝±１副準位でのＮＶ−中心は、準安定状態（灰色破線矢印）によって崩壊する確率が基底状態のｍｓ＝±１副準位より高い。準安定状態から、ＮＶ−中心は、可視光を発することなく基底状態のｍｓ＝０副準位に主に移行する。したがって、磁場の不在下では、ＮＶ−中心は、励起されるときに基底状態のｍｓ＝０副準位に迅速に入れられる。これは、定常状態に達するときに蛍光発光強度の初期増加をもたらす。磁場の存在下では、ｍｓ＝０およびｍｓ＝±１の状態が混合され、準安定一重項状態を通る崩壊経路を到達しやすいものにし、ひいては蛍光発光強度を低下させる。
【００８７】
[0108]図７Ａは、ＦＮＤを含む視野を示す。図７Ｂは、周波数０．１Ｈｚおよび振幅１００ガウスで変調磁場を印加した時点での図７Ａに示したＦＮＤの強度変調を示す。
【００８８】
[0109]ＦＮＤ発光の磁気変調を示すために、ＦＮＤを用いてカバースリップを調製した。ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ中の１ｍｇ／ｍｌのポリ‐Ｌ‐リジン（ＰＬＬ）の５００μｌをシリカ被覆ＦＮＤと混合し、第１のカバースリップに堆積し、一晩培養した。両面テープを使用してフローセルを作製し、カバースリップをスライドガラスに取り付けた。
【００８９】
[0110]ＣＡＲＬ  ＺＥＩＳＳ（登録商標）ＬＳＭ５  ＬＩＶＥ顕微鏡を使用してムービーを得た。ムービーの各フレームは、２５０ミリ秒の時間分解能による走査型共焦点画像であった。０．３ＮＡ（ＥＣ  Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ）を備えた１０Ｘ  ＺＥＩＳＳ（登録商標）対物レンズを使用して、ＦＮＤを刺激し、かつＦＮＤ発光を回収する励起光を導入した。試料を５３２ｎｍで励起し、ロングパスフィルタＬＰ６５０を使用して発光をフィルタリングし、光電子増倍管（ＰＭＴ）を使用して検出した。
【００９０】
[0111]電磁石（ＡＰＷ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｔｅｍ＃ＥＭ４００−１２−２１２，４．０”Ｄｉａｍｅｔｅｒ  Ｒｏｕｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔ）を０または１２Ｖの振幅およびゼロオフセットでの方形波電圧信号で駆動した。試料を磁石の表面から約１３ｍｍ離して配置し、そこで磁場強度は約１００ガウスだった。
【００９１】
第２の実施例  磁場下および非磁場下でのフレームのペアワイズ減算によるバックグラウンドのない撮像
[0112]図８Ａは、約４０ｎｍのＦＮＤが図７Ｂのように約１５ＮＶ撮像したものを含む視野の画像である。図８Ｂは、約１μＭのＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７色素溶液をフローセルに導入した後の同視野の画像である。この色素は、ＦＮＤと類似の発光特性を有するため、ＦＮＤからの蛍光は高濃度のＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７色素のバックグラウンド蛍光によってマスクされる。図８Ｃは、高いＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７色素バックグラウンド（図８Ｂのように）の存在下で画像を処理した後の同じ視野の画像である。磁場下および非磁場下で回収された画像の対の差分を算出し、これらの差分画像のうちの１０００をともに平均化して処理済み画像を生成した。この処理によって、図８Ａに示したダイヤモンドでの画像を、図８Ｂのような高バックグラウンドの画像から回復する。
【００９２】
第３の実施例  広視野ロックイン検出を使用したバックグラウンドのない撮像
[0113]図９Ａは、走査型共焦点顕微鏡によって撮影されたムービーのフレーム（時間分解能０．２５秒で１０００フレーム）を示す。撮像の詳細は、上の図７Ｂのものと同一である。周波数０．１Ｈｚおよび振幅１００ガウスでの変調磁場をムービーの取得中に印加した。
【００９３】
[0114]図９Ｂは、ロックインアルゴリズムを使用して画素ごとにムービーを処理した後の広視野のバックグラウンドのない画像を示す。
【００９４】
[0115]図９Ｃは、ＦＮＤに対応する明画素（図９Ａの画像の左上隅からの水平座標ｘ＝１０９および垂直座標ｙ＝１１１）へのロックインアルゴリズムの適用を示す。図９Ｃの左上パネルは、時間の関数として画素値を図示する。図９Ｃの右上パネルは、周波数の関数として高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を図示する。図９Ｃの中段左パネルは、基準正弦波１＋ｓｉｎ（２π×０．１×ｔ）を乗算した左上パネルからの画素値を示す。図９Ｃの中段右パネルは、対応するＦＦＴを示す。図９Ｃの左下パネルは、基準余弦波１＋ｃｏｓ（２π×０．１×ｔ）を乗算した画素値を示す。図９Ｃの右下パネルは、対応するＦＦＴを示す。
【００９５】
[0116]図９Ｄは、バックグラウンドに対応する暗画素（図９Ａの画像の左上隅からの水平座標ｘ＝１３７および垂直座標ｙ＝１０７）に適用された同じロックインアルゴリズムを図示する。
【００９６】
[0117]図９Ｃおよび図９Ｄの両図を参照すると、０．２Ｈｚでの縦方向の破線は、基準周波数の２倍の周波数での値を示す指標である。正弦および余弦ＦＦＴにおける約０．２Ｈｚの３つの点の平均を画素ごとに算出した。図９Ｂにおけるバックグラウンドのない画像は、求積法、すなわち、ｉ＝ｓｑｒｔ（ｉｃｏｓ２＋ｉｓｉｎ２）で加算された正弦および余弦平均に対応し、式中、ｉは平均強度であり、ｉｃｏｓおよびｉｓｉｎは余弦関数および正弦関数をそれぞれ乗算した信号のＦＦＴから算出した平均に対応する。１０００フレームにわたる画素値の平均は、約１０の信号対雑音比を付与するロックインアルゴリズムを適用する前に（１０９、１１１）および（１３７、１０７）での画素に対して１７３および１８だった。約０．２Ｈｚの３つの点に対するＦＦＴ振幅の平均は、約７７の信号対雑音比を付与するロックインアルゴリズムを適用した後に（１０９、１１１）および（１３７、１０７）での画素に対して２１．４２および０．２８である。したがって、ロックインアルゴリズムは、信号対雑音比を約８倍に高めた。ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）のソフトウェアで計算を実行した。
【００９７】
第４の実施例  広視野のペアワイズ画像減算およびロックイン検出を使用したインビボでのセンチネルリンパ節のバックグラウンドのない撮像
[0118]図１０Ａは、バックグラウンド蛍光（左上の挿入画像、オーバーレイでの白色）からＦＮＤの発光（右上の挿入画像、オーバーレイでの赤色）を分離する従来のスペクトルアンミキシング法を使用して得られたマウスの前四分体の画像を示す。流入領域腋窩リンパ節における皮膚を通じてＦＮＤを検出しなかった。図１０Ｂは、磁場下および非磁場下での４７５のペアワイズ減算画像を平均化することによって得られた同じマウスの画像を示す。処理済み画像（右上の挿入画像、オーバーレイでの赤色）を、磁場オフで得られた未処理画像（左上の挿入画像、オーバーレイでの白色）に重ね合わせた。白色矢印は、足蹠における注入部位、および腋窩（センチネル）リンパ節の部位を指し示す。リンパ節でのＦＮＤからの信号を明確に検出する。図１０Ｃは、磁場オフで得られた未処理画像（左上の挿入画像、オーバーレイでの白色）に重ね合わされた図９に記載したアルゴリズムを使用して図１０Ｂを生成するために使用された同じ画像（右上の挿入画像、オーバーレイでの赤色）からＦＮＤからの発光のロックイン検出によって得られた画像を示す。図１０Ｄは、磁場下および非磁場下でのペアワイズ減算画像によって得られた画像の平均化による同じマウスの開胸腔の画像を示す。処理済み画像（下段の挿入画像、オーバーレイでの赤色）を、磁場オフで得られた未処理画像（上段の挿入画像、オーバーレイでの白色）に重ね合わせた。白色矢印は、前方足蹠における注入部位、および腋窩リンパ節の部位を指し示す。図１０Ｅは、磁場オフで得られた未処理画像（上段の挿入画像、オーバーレイでの白色）に重ね合わされた図１０Ｄを生成するために使用した同じ画像（下段の挿入画像、オーバーレイでの赤色）からＦＮＤからの発光のロックイン検出から得られた画像を示す。部分的に切開したマウスでは、リンパ節へのＦＮＤの位置特定を明確に見ることができる。図１０Ｆは、図１０Ｂおよび図１０Ｄにおける選択された点に対応する時間の関数としての画素値を示す。選択された画素は、（１）腋窩リンパ節および（２）図１０Ｂにおける皮膚に対する負の制御、ならびに（３）腋窩リンパ節および（４）図１０Ｄにおける肋骨に対する負の制御に関するものだった。印加した磁場の結果としての信号変調は、胸腔が切り開かれたときと同様に、皮膚を通じてリンパ節で明確に視認できる。その一方で、皮膚および肋骨は、負の制御に期待されるように不規則信号を示した。
【００９８】
[0119]雌の無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）マウスを、生後４〜６週間でＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、特定病原体未感染の米国実験動物管理協会認可施設内に収容した。米国国立がん研究所の動物福祉委員会によってすべての実験を承認した。Ｏ２中の１．５〜２．５％のイソフルランの気体混合物を使用して、注入手順中に約３０ｂｐｍの呼吸速度を維持し、マウスに麻酔をかけた。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の約８０ｍｇ／ｍＬシリカ被覆ナノダイヤモンド（約１００ｎｍ）溶液の１０μＬの体積を、各マウスの前方足蹠に皮内注入した。この注入部位からの一次流入領域ＬＮは腋窩および外側胸ＬＮであることを先行研究が示している。
【００９９】
[0120]２４時間の注入後、マウスを犠牲にして、ＭＡＥＳＴＲＯ（商標）ＣＲｉ分光光学カメラ（励起フィルタ５２３ｎｍ、発光フィルタ６７５ｎｍロングパス）を使用して光学撮像を行った。ＢＩＯＬＩＴＥ（登録商標）ＭｕｌｔｉＳｐｅｃｔｒａｌ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（励起フィルタ５２５ｎｍ、発光フィルタ６５０ｎｍロングパス）を備えたＵＶＰ（登録商標）ＢＩＯＳＰＥＣＴＲＵＭ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて磁気変調により画像も撮影し、緑色レーザ（Ｚ−Ｂｏｌｔ（登録商標）＃ＤＰＳＳ−１００）によって追加の照明を提供し、約１ｍＷ／ｃｍ２の強度を達成した。非磁性ステージ上の機器において各マウスを撮像し、その下で永久磁石（Ｃａｔａｌｏｇ＃ＤＺ０８−Ｎ５２，Ｋ＆Ｊ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）を摺動して出し入れすることができた。磁場オフおよびオンで連続して画像を捕捉し、ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊで入手可能なＩｍａｇｅＪソフトウェアにおいてムービーをまとめた。
【０１００】
[0121]図１１Ａは、印加磁場下ではないシリカ被覆ＦＮＤを注入されたリンパ節（ＬＮ）の画像である。図１１Ｂは、約１００ガウスの磁場の印加中の同視野の画像である。次に、図１１Ａから図１１Ｂを減算した。図１１Ｃは、このような２０の減算画像の総和を示す。ＦＮＤは、他の暗視野内の輝点として観察される。図１１Ｄおよび図１１Ｅは、磁場が常にオフおよびオンであったときのこのような２０の減算の総和をそれぞれ示す。
【０１０１】
[0122]雌の無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）マウスを、生後４〜６週間でＷｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓのＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、特定病原体未感染の米国実験動物管理協会認可施設内に収容した。動物を生後６〜８週間使用し、米国国立がん研究所の動物福祉委員会によって実験を承認した。マウスの腋窩および外側胸リンパ節（ＬＮ）のリンパ節切除を行った。切除したＬＮにシリカ被覆ＦＮＤを注入した。次に、ＬＮを３日間、１０％のホルマリン中に固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＥＲＭＯＵＮＴ（登録商標）溶媒（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手）を使用してカバースリップを付着して、ＳＵＰＥＲＦＲＯＳＴ  ＰＬＵＳ（登録商標）スライド（ＶＷＲから入手）に載置した。
【０１０２】
[0123]ネオジム永久磁石（Ｋ＆Ｊ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｊａｍｉｓｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａから入手）を使用してバックグラウンドのない画像を得た。ＣＡＲＬ  ＺＥＩＳＳ（登録商標）ＬＳＭ５  ＬＩＶＥ顕微鏡を使用してムービーを得た。ムービーの各フレームは、１秒の時間分解能による走査型共焦点画像であった。０．３ＮＡ（ＥＣ  Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ）を備えた１０Ｘ  ＺＥＩＳＳ（登録商標）対物レンズを使用して、ＦＮＤを励起し、ＦＮＤ発光を回収した。試料を５３２ｎｍで励起した。ロングパスフィルタ（５６０〜６７５ｎｍのバンドパス）を使用して発光をフィルタリングし、ＰＭＴを使用して検出した。
【０１０３】
第５の実施例  蛍光寿命撮像（ＦＬＩＭ）を使用したバックグラウンドのない撮像
[0124]図１２Ａは、図１１Ａ〜図１１Ｅに使用される同じＬＮの異なる領域の二光子ＦＬＩＭ画像である。より長い寿命（赤色で示す）がＦＮＤによると考えられ、これに対して報告された寿命は約１０から２０ナノ秒に及ぶ。図１２Ｂは、非磁場下での画像および磁場下での画像を減算すること、かつこのような１０の減算を加算することによって得られた同視野のバックグラウンドのない画像である。
【０１０４】
[0125]ＬＥＩＣＡ（登録商標）ＴＣＳ  ＳＰ５走査型共焦点システムをカスタマイズして、蛍光寿命撮像顕微鏡法（ＦＬＩＭ）画像（図１２Ａ）、およびネオジム永久磁石を使用して磁場（約１００ガウス）を印加したバックグラウンドのない共焦点画像（図１２Ｂ）の両方を得た。図１２Ｂでは、磁場下での画像および非磁場下での画像の１０の減算を加えて、最終画像を得た。油浸対物レンズ（ＬＥＩＣＡ（登録商標）ＨＣＸ  ＰＬ  ＡＰＯ  ＣＳ  ４０．０Ｘ  １．２５  ＮＡ  Ｏｉｌ  ＵＶ）を使用して、発光を励起かつ回収した。ＦＬＩＭ画像では、ＳＰＥＣＴＲＡ−ＰＨＹＳＩＣＳ（登録商標）ＭＡＩ  ＴＡＩ（登録商標）レーザを使用して試料を９３０ｎｍで励起した。ＦＬＩＭ撮像では、バンドパスフィルタ（ＢＰ６０７〜６８３ｎｍ）を使用してＬＮ内のＦＮＤからの発光をフィルタリングし、単一光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ）を装着したＰＩＣＯＱＵＡＮＴ（商標）ＰＩＣＯＨＡＲＰ（商標）３００Ｔｉｍｅ−Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ（ＴＣＳＰＣ）システムを使用して検出した。同視野（ＦＯＶ）の走査型共焦点画像（４００Ｈｚの走査速度）では、試料を５６１ｎｍで励起し、バンドパスフィルタ（６００〜７８９ｎｍ）を使用して発光をフィルタリングし、ＰＭＴを使用して検出した。
【０１０５】
[0126]本主題は、試料と接触することなく既存の顕微鏡または動物撮像システムと容易に組み合わせることができる独自の簡潔な方法を提供する。複雑かつエラーが生じやすいスペクトルアンミキシングは必要ではない。一般に使用される染色剤および標識の蛍光は、磁場を使用して選択的に変調することができない。一般に使用されるＧＦＰなどの標識および色素の化学的または光学的改質が可能であるが、これらの改質は実施するのが難しく、侵襲的であり、不要な変化を引き起こす可能性がある。
【０１０６】
[0127]本主題は上記の実施形態を参照して記載したが、本主題の範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、均等物をこれらの構成要素の代わりに用いることができることが当業者に理解されるであろう。加えて、本主題の必須の範囲から逸脱することなく、特定の状況または材料を本主題の教示に適合させるように多くの修正を行うことができる。したがって、本主題は、本主題を実行するために企図される最良の形態として開示される特定の実施形態に限定されないが、本主題は添付の特許請求の範囲に入るすべての実施形態を含むことを意図している。
【０１０７】
[0128]代替的実施形態では、いくつかの構成要素の機能は、より少ない構成要素または単一の構成要素で実施することができる。同様に、いくつかの実施形態では、あらゆる機能的構成要素は、例示した実施形態に関して記載した操作より少ない操作またはそれとは異なる操作を行うことができる。それにまた、例示のために別個のものとして示した機能的構成要素（例えば、モジュール、データベース、コンピュータなど）は、他の機能的構成要素内に組み込まれ、異なるハードウェアに分離され、または特定の実装で分配されてもよい。
【０１０８】
[0129]図１３は、変調磁場蛍光撮像システムの構成要素を示す。ＡＦＭステージ１１に対象の生体試料が載置される。ＡＦＭステージの上方に変調磁場を印加するための装置が取り付けられる。磁場アプリケータは、ＡＦＭコンピュータ１３によって制御されるＡＦＭコントローラ１０によって制御される。磁場の位置は、ＸＹＺ閉ループスキャナ９を使用して監視される。ＡＦＭステージの上方にコンデンサおよびトランスイルミネータが取り付けられ、生体試料を照明する。
【０１０９】
[0130]ＡＦＭステージ１１の下に全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）撮像装置が取り付けられる。ＴＩＲＦ照明は、フィルタ１６、望遠鏡１５、光ファイバ１８、およびＴＩＲＦ照明器１９に光学的に結合されたＡｒ／Ｋｒレーザ２３によって提供することができる。ＴＩＲＦ照明器１９からの放射線は、ビームスプリッタに入射し、これはレンズを通してＡｒ／Ｋｒレーザ照射を指向して、生体試料に焦点を合わせる。Ａｒ／Ｋｒレーザ２３は、水冷システム２４で冷却される。
【０１１０】
[0131]あるいは、試料には、Ｌａｍｂｄａ  ＬＳ照明器（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．）などのキセノンアークランプを照射することができる。キセノンアーク２５からの放射線は、Ｅｐｉ−ＩＲＭ照明器１２を使用してコリメートし、ビームスプリッタに指向し、生体試料に焦点を合わすことができる。
【０１１１】
[0132]共焦点顕微鏡または他の好適な撮像システムによって蛍光が回収され、この蛍光はＣＣＤカメラ１４およびビデオカメラ２２を使用して検出される。撮像光学系は制御され、撮像データは顕微鏡コンピュータ８を使用して取得される。
【０１１２】
[0133]図１３に図示した変調磁場蛍光撮像システムは、好適な撮像システムの一般的な構成要素を例示する。一般に、このシステムは、時間変調磁場が生体試料に印加されるように構成される。磁場は、生体試料全体または生体試料の一部分に印加することができる。このシステムは、生体試料全体または生体試料の一部分に照射して、生体試料を蛍光発光させるように構成される。このシステムは、蛍光を回収するように更に構成される。
【０１１３】
[0134]ある特定の実施形態では、蛍光ナノダイヤモンドは、生体試料を撮像するために使用される。生体試料は、機能化蛍光ナノダイヤモンドで標識することができる。時変磁場は、高磁場強度で＋／−１および０の三重項状態を混合するのに十分な磁気強度で印加される。
【０１１４】
[0135]図１４は、変調磁場蛍光撮像システムの構成要素を要約した概略図であり、変調磁場装置、撮像機器、生体試料などの標本、およびソフトウェア分析モジュールを含む。変調磁場は、永久磁石または電磁石を使用して印加することができる。ある特定の実施形態では、永久磁石は、標本に対して移動して、時変磁場を提供することができる。ある特定の実施形態では、電磁石は、異なる波形で時変磁場を印加するために使用される。
【０１１５】
[0136]図１４で言及する撮像機器は、共焦点顕微鏡法、光学顕微鏡法、ＴＩＲＦ顕微鏡法、およびＦＬＦ顕微鏡法などの好適な顕微鏡撮像光学系、または透照スキャナもしくは反射スキャナなどの動物撮像システムを含むことができる。必要に応じて、撮像機器は、例えば、光学フィルタ、レンズ、コリメータ、およびビームスプリッタを含むことができる。撮像機器はまた、蛍光を検出し、かつ試料を光学的に撮像するためのデバイスを含むことができる。試料に照射して蛍光を誘起するための光学系、ならびに磁石、光学系、放射線源、および／または撮像部品を移動させるための平行移動ステージもまた含まれる。
【０１１６】
[0137]様々な部品は、ソフトウェアによって制御することができる。画像処理は、試料に印加された磁場内で得られた画像と非磁場下で得られた画像との比較を含み、または低磁場強度で得られた蛍光と高磁場強度で得られた蛍光との比較を含むことができる。
【０１１７】
[0138]図１５は、試料ステージに対する磁石の様々な構成を示す。例えば、ある特定の実施形態では、電磁石は、試料ステージの上方、その下、かつ／またはその側面に取り付けることができる。電磁石は、時変磁場を印加するために使用することができる。別の構成では、永久磁石は、試料ステージの上方、その下、かつ／またはその側面に取り付け、試料ステージに向かってかつそれから離れて物理的に移動して、試料に印加した磁場の強度を変更することができる。第３の方式で示すように、永久磁石は、試料を中心にして磁石を回転させて時変磁場を提供するように構成された装置に取り付けることができる。ある特定の実施形態では、永久磁石は定置式であってもよく、磁気シールドは、時変磁場を提供するように磁石と試料との間に配設することができる。
【０１１８】
[0139]図１６は、小動物光学撮像機器の一般的な構成要素を示す概略図である。撮像機器は、光源、生体試料などの標本、検出器、光源および検出器（複数を含む）を制御するためのソフトウェア、ならびにユーザインターフェースを含む。光源は、励起照射の波長範囲を制御するための複数の励起フィルタを含むことができ、検出器は、蛍光発光の波長範囲を選択するための複数のフィルタを含むことができる。
【０１１９】
[0140]図１７は、時間変調磁場蛍光画像を得るための小動物撮像機器の一般的な構成要素を示す概略図である。図１７に示した機器は、光源、生体試料などの標本、検出器（複数を含む）、光源および検出器（複数を含む）を制御するためのソフトウェア、ユーザインターフェース、ならびに標本に磁場を印加するための磁場アプリケータを制御するためのソフトウェアインターフェースを含む。光源は、励起照射の波長範囲を制御するための複数の励起フィルタを含むことができ、検出器は、蛍光発光の波長範囲を選択するための複数のフィルタを含むことができる。ある特定の実施形態では、励起波長範囲および検出波長範囲は、磁場改質ＮＶ中心ナノダイヤモンド蛍光のコントラストを最適化するように選択される。磁場アプリケータは、標本に時変磁場を印加するように構成された永久磁石または電磁石を含むことができる。ソフトウェアの追加は、標本の磁場依存画像を標本の光学像と相関させ、かつ画像処理を行って標本の画像を提供するために使用することができる。磁場下および非磁場下またはより低い強度の磁場で得られた標本もしくは標本の一部分の磁場改質ＮＶ中心ナノダイヤモンド蛍光画像に基づいた撮像の場合に比較して、ＮＶ中心蛍光ナノダイヤモンドから生じないバックグラウンド蛍光を低減または除去することができる。
【０１２０】
[0141]図１８は、磁場変調のための小動物撮像機器の別の実施形態を示し、この機器は、光源、標本、検出器、磁場アプリケータ、光源、検出器および磁場アプリケータを制御するためのソフトウェア、ならびにユーザインターフェースを含む。この実施形態では、光源は、ＮＶ中心蛍光ナノダイヤモンド三重項状態の励起を最適化するように構成されるソースおよび／または光学系、ならびにＮＶ中心蛍光ナノダイヤモンドの蛍光の検出を最適化するように選択される検出器および例えばフィルタなどの光学素子を含む。
【０１２１】
[0142]図１９〜図２１は、光源、標本、検出器、および磁場アプリケータの様々な構成を示す。図１９は、磁場を回転ステージの下から印加する線形構成における光源、標本、および検出器を示す。図２０は、励起光源および検出器（複数を含む）が標本の同じ側にあり、かつ磁場アプリケータが標本の反対側にある、共焦点構成における光源、標本、および検出器を示す。図２１は、検出器が標本の周囲に位置し、かつ単一光源が磁場アプリケータである撮像機器装備を示す。ある特定の実施形態では、検出器、光源および磁場アプリケータは、試料の周囲を回転することができる。図２１に図示したある特定の実施形態では、複数の光源および磁場アプリケータがあり得る。
【０１２２】
[0143]変調磁場蛍光撮像装置は、標本または生体試料がステージに載置される定置式システムであってもよく、撮像機器装備は、スタンドアロンシステムである。ある特定の実施形態では、本開示によって提供される撮像装置は、ハンドヘルドスキャナなどの携帯用デバイスであってもよい。図示するように、例えば、図２２では、臨床ハンドヘルドスキャナは、光源、磁場アプリケータ、カメラまたは検出器、患者の変調磁場蛍光画像を得るように構成されたソフトウェア、および臨床医とソフトウェアとの間のインターフェースを含むことができる。ある特定の実施形態では、スキャナの構成要素は、磁場改質ＮＶ中心ナノダイヤモンド蛍光の画像を得るように最適化される。
【０１２３】
[0144]ある特定の実施形態では、蛍光ナノダイヤモンドは、シリカ被覆である。シリカ被覆ナノダイヤモンドおよびシリカ被覆ナノダイヤモンドを調製する方法は、例えば、国際特許第２０１４／０１４９７０号（Ａ１）に開示され、これはその全体が参照により組み込まれるものである。蛍光ナノダイヤモンドをシリカ被覆するために類似の方法を使用することができる。
【０１２４】
[0145]シリカ被覆蛍光ナノダイヤモンドは、プローブ、親和性分子、または生体試料の特定の標的に結合することができる他の構成要素で機能化することができる。これらの機能化シリカ被覆蛍光ナノダイヤモンドは、標本を機能化ナノダイヤモンドで染色するように組織試料または細胞などの生体標本に適用することができる。他の実施形態では、機能化ナノダイヤモンドは、インビボで投与することができ、機能化シリカ被覆ナノダイヤモンドの磁気改質した蛍光は、患者の皮膚を通して測定することができる。ある特定の実施形態では、被写体への機能化ナノダイヤモンドのインビボの投与後、組織または生体液は、被写体から除去し、機能化ナノダイヤモンドの存在を評価することができる。機能化シリカ被覆ナノダイヤモンドは、蛍光プローブが使用される方法と同様に標的を探るために使用することができる。
【０１２５】
[0146]本主題によるある特定の実施形態を記載しているが、本主題は、単に記載した実施形態に限定されない。本主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、記載した実施形態のいずれかに様々な変更および／または修正を行うことができる。それにまた、記載した実施形態の構成要素、工程、特徴および／または態様の様々な組み合わせが可能であり、このような組み合わせが本明細書に明示的に特定されない場合であっても企図されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月9日(2018.1.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】実用新案登録請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
標本を載置するための撮像ステージと、
蛍光ダイヤモンドを励起するように構成され、かつ前記標本に指向される放射線源と、
ダイヤモンドの蛍光を検出するように構成され、かつ前記標本からの蛍光を検出するように構成された蛍光検出器と、
前記標本に時変磁場を印加するように構成された装置と、
を備える撮像システム。
【請求項２】
前記撮像ステージに載置された前記ダイヤモンドを含む前記標本を備える、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項３】
前記放射線源は、レーザおよびキセノンアークランプからなる群から選択される、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項４】
前記蛍光ダイヤモンドは、蛍光ナノダイヤモンドであり、シリカ被覆蛍光ダイヤモンドまたは機能化シリカ被覆蛍光ダイヤモンドを含む、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項５】
前記蛍光ダイヤモンドは、蛍光ナノダイヤモンドであり、機能化シリカ被覆蛍光ナノダイヤモンドを含む、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項６】
時変磁場を印加するように構成された前記装置は、前記標本に対して回転する永久磁石を備える、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項７】
時変磁場を印加するように構成された前記装置は、前記標本に対して移動するように構成され、かつ前記標本の上方、その下、またはそれに隣接して位置決めされる永久磁石を備える、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項８】
時変磁場を印加するように構成された前記装置は、電磁石を備える、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項９】
前記標本は、患者、動物、スライド、組織、または細胞から選択される、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項１０】
前記蛍光検出器からのデータから画像を処理するための撮像処理ユニットを備える、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項１１】
前記画像処理ユニットは、前記装置によって前記標本に提供される第１の印加磁場下で得られた画像を、前記装置によって前記標本に提供される第２の印加磁場下で得られた蛍光画像と比較するように構成される、請求項１０に記載の撮像システム。
【請求項１２】
前記第１の磁場および前記第２の磁場は、異なる強度を有する、請求項１１に記載の撮像システム。
【請求項１３】
前記撮像システムは携帯用である、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項１４】
前記撮像システムは、１ｃｍ〜１０ｃｍの寸法を有する前記標本の一部分を撮像するように構成される、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項１５】
前記撮像システムは、少なくとも１ｃｍの寸法を有する前記標本の一部分を撮像するように構成される、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項１６】
前記撮像システムは、０．１ｃｍ未満の寸法を有する前記標本の一部分を撮像するように構成される、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項１７】
前記撮像システムは、０．０１ｃｍ〜０．１ｃｍの寸法を有する前記標本の一部分を撮像するように構成される、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項１８】
前記放射線源および前記蛍光検出器は、前記標本に対して移動するように構成される、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項１９】
前記放射線源、前記蛍光検出器、および時変磁場を印加するように構成された前記装置は、前記標本に対して移動するように構成される、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項２０】
前記システムは、前記蛍光検出器を含む複数の検出器を備える、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項２１】
前記システムは、前記標本の周囲に配置された複数の蛍光検出器を備え、前記複数の蛍光検出器は、前記標本の周囲を回転し、かつ前記標本からの蛍光信号を受信するように構成される、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項２２】
前記システムは、複数の蛍光検出器を備え、前記複数の蛍光検出器、前記放射線源、および前記装置は、前記標本の周囲に配置され、前記システムが動作中であるとき、前記標本の周囲を回転するように構成される、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項２３】
前記ダイヤモンドは、ナノダイヤモンドである、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項２４】
前記標本に時変磁場を印加するように構成された前記装置はまた、同時に前記ダイヤモンドに前記時変磁場を印加し、前記ダイヤモンドは、ナノダイヤモンドである、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項２５】
前記蛍光ダイヤモンドは、蛍光ナノダイヤモンドであり、機能化蛍光ナノダイヤモンドを含む、請求項１に記載の撮像システム。
【請求項２６】
前記標本に時変磁場を印加するように構成された複数の装置を更に備える、請求項１に記載の撮像システム。