(57)【要約】  本発明は、ヒトへの皮下投与時に改善されたバイオアベイラビリティを有する抗体を選択し、スクリーニングし、操作し、作製し、改変する方法に関する。ヒトへの皮下投与時に改善されたバイオアベイラビリティを有する抗体及び変異体抗体も記載される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体を選択する方法であって、
(a)同じ抗原に対する2つ以上の抗体を産生するステップ; 及び
(b)以下:
(i)+5により近い約pH7での正味電荷、又は8.8により近いpI、及び/又は
(ii)約pH7での0〜+12の正味電荷、又は8.4〜9.3のpI
を有する抗体配列を選択するステップ
を含み、選択された抗体はより高いバイオアベイラビリティを有する、方法。
【請求項２】
抗体を作製する方法であって、2つ以上のヒト生殖細胞系列フレームワーク配列、領域、又はアミノ酸を選択し、組み合わせて、約pH7で0〜+12の正味電荷、又は8.4〜9.3のpIを有する抗体配列を生成するステップを含み、生成された抗体はより高いバイオアベイラビリティを有する、方法。
【請求項３】
抗体配列ライブラリーを作製する方法であって、ライブラリーは、約pH7で0〜+12の正味電荷、又は8.4〜9.3のpIを有する抗体を含むように操作され、ライブラリーに由来する抗体は、少なくとも60％のバイオアベイラビリティを有する、方法。
【請求項４】
約pH7での正味電荷又はpIを用いて抗体のバイオアベイラビリティを予測する方法であって、改善されたバイオアベイラビリティは、約pH7で0〜+12の正味電荷、又は8.4〜9.3のpIと相関する、方法。
【請求項５】
抗体のバイオアベイラビリティを改善する方法であって、抗体のアミノ酸配列を改変して、約pH7で0〜+12の正味電荷、又は8.4〜9.3のpIをもたらすステップを含む、方法。
【請求項６】
抗体が、IgG1抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
正味電荷又はpIが、C末端リジンを含む抗体配列全体を用いて計算される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
約pH7での正味電荷が、+1〜+12、+1〜+10、又は+4〜+10であり、又はpIが、8.5〜9.3、8.6〜9.25、又は8.6〜9.2である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
改変が、1つ以上のアミノ酸置換を作製することを含む、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
改変が、異なるヒト生殖細胞系列フレームワーク配列、領域、又はアミノ酸から選択される、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
アミノ酸配列の改変又は組み合わせが、
(a)正のアミノ酸を中性又は負のアミノ酸へ変更する;
(b)負のアミノ酸を中性又は正のアミノ酸へ変更する; 又は
(c)中性アミノ酸を正又は負のアミノ酸へ変更する、請求項２及び５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
カバット残基H1、H6、H12、H13、H16、H19、H23、H43、H75、H81、H83、H85、L17、L18、L42、L74、L77、又はL79のいずれか1つ又は組み合わせにおいて、正若しくは負のアミノ酸又は中性アミノ酸がある、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
抗体が、ヒトへの皮下投与時に、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、又は少なくとも75％のバイオアベイラビリティを有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記バイオアベイラビリティが、予測されたバイオアベイラビリティである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法から生じる抗体。
【請求項１６】
親抗体配列の変異体であって、変異体は、2つ以上のヒト生殖細胞系列フレームワーク配列、領域、又はアミノ酸を組み合わせて、
(i)親抗体よりも、+5により近い約pH7での正味電荷、又は8.8により近いpI、及び/又は
(ii)親抗体と比較して、約pH7での0〜+12の正味電荷、又は8.4〜9.3のpI
を有する変異体抗体を生成することを含み、変異体抗体は、親抗体よりも高いバイオアベイラビリティを有する、変異体。
【請求項１７】
抗体配列が、
(a)変異体抗体において中性又は負のアミノ酸に変更される親抗体における正のアミノ酸;
(b)変異体抗体において中性又は正のアミノ酸に変更される親抗体における負のアミノ酸; 及び/又は
(c)変異体抗体において正又は負のアミノ酸に変更される親抗体における中性アミノ酸
を含む、請求項１６に記載の変異体。
【請求項１８】
親抗体配列が、カバット残基H1、H6、H12、H13、H16、H19、H23、H43、H75、H81、H83、H85、L17、L18、L42、L74、L77、又はL79のいずれか1つ又は組み合わせにおいて変更される、請求項１６又は１７に記載の変異体。
【請求項１９】
ヒトへの抗体の皮下投与方法であって、それを必要とする患者に、請求項１５に記載の抗体又は請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の変異体を投与するステップを含む、方法。
【請求項２０】
抗体配列ライブラリーであって、約pH7で0〜+12の正味電荷又は8.4〜9.3のpIを有する抗体を含むように操作される、ライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトへの皮下投与の際に改善されたバイオアベイラビリティを有する抗体を選択し、スクリーニングし、操作し、作製し及び改変する方法に関する。ヒトへの皮下投与の際のバイオアベイラビリティが改善された抗体及び変異体抗体もまた記載される。
【背景技術】
【０００２】
抗体薬物製品の皮下(SC)投与には、皮下の組織(皮下組織)の細胞外空間への投与が含まれる。SC投与は、自己投与、患者コンプライアンスの改善、及び医療費の削減など、多くの利点を有する。投与されると、抗体薬物製品は、様々な作用機序を使用する。SC投与経路の普及にもかかわらず、投与時の抗体のバイオアベイラビリティは依然としてほとんど理解されていない。バイオアベイラビリティ(BA)は、全身循環に到達する薬物の割合であり、前全身異化と全身吸収の相対的な比率によって影響を受ける。全身吸収のための経路には、リンパ管を介した血液への間接輸送、及び注射部位の周囲の血管への拡散を介した直接輸送が含まれる。皮下投与された抗体がピーク血漿濃度に達するには一般に2〜8日かかる。抗体のBAは、典型的には40〜85％の範囲である。
【０００３】
したがって、BAは、投与されることが要求される抗体薬物製品の総量に影響を及ぼし、したがって、商品のコストに影響を及ぼす。皮下に送達され得る限られた体積(1〜1.5ml)、及び粘度及び凝集傾向によって制限される濃度で、BAの改善は、投与される有効用量を増加させ得る。
【０００４】
しかし、現在のところ、ヒト臨床試験の前に抗体薬物製品のBAを正確に予測する方法はない。げっ歯類、カニクイザル、及びゲッティンゲンミニブタなどの前臨床動物モデルは、ヒトBAを常に確実に予測するとは限らない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、ヒト被験体における皮下投与の際の抗体薬物製品のバイオアベイラビリティを予測することが当技術分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明の第1の態様によれば、抗体を選択する方法であって、(a)同じ抗原に対する2つ以上の抗体を産生するステップ; 及び(b)以下:
(i)+5により近い約pH7での正味電荷、又は8.8により近いpI、及び/又は
(ii)約pH7での0〜+12の正味電荷、又は8.4〜9.3のpI
を有する抗体配列を選択するステップ
を含み、選択された抗体はより高いバイオアベイラビリティを有する、方法が提供される。
【０００７】
本発明のさらなる態様によれば、抗体を作製する方法であって、2つ以上のヒト生殖細胞系列フレームワークアミノ酸配列、領域、又はアミノ酸を選択及び組み合わせて、約pH7で0〜+12の正味電荷、又は8.4〜9.3のpIを有する抗体を生成するステップを含み、生成された抗体はより高いバイオアベイラビリティを有する、方法が提供される。
【０００８】
本発明のさらなる態様によれば、抗体のバイオアベイラビリティを改善する方法であって、抗体のアミノ酸配列を改変して、約pH7で0〜+12の正味電荷、又は8.4〜9.3のpIをもたらすステップを含む、方法が提供される。
【０００９】
本発明のさらなる態様によれば、約pH7での正味電荷又はpIを用いて抗体のバイオアベイラビリティを予測する方法であって、改善されたバイオアベイラビリティは、約pH7で0〜+12の正味電荷、又は8.4〜9.3のpIと相関する、方法が提供される。
【００１０】
本発明のさらなる態様によれば、抗体配列ライブラリーを作製する方法であって、ライブラリーは、約pH7で0〜+12の正味電荷、又は8.4〜9.3のpIを有する抗体を含むように操作され、ライブラリーに由来する抗体は、少なくとも60％のバイオアベイラビリティを有する、方法が提供される。
【００１１】
本発明のさらなる態様によれば、記載された方法のいずれか1つから生じる抗体が提供される。
【００１２】
本発明のさらなる態様によれば、親抗体配列の変異体であって、変異体は、2つ以上のヒト生殖細胞系列フレームワーク配列、領域、又はアミノ酸を組み合わせて、(i)親抗体よりも、+5により近い約pH7での正味電荷、又は8.8により近いpI、及び/又は
(ii)親抗体と比較して、約pH7で0〜+12の正味電荷、又は8.4〜9.3のpI
を有する変異体抗体を生成することを含み、変異体抗体は、親抗体よりも高いバイオアベイラビリティを有する、変異体が提供される。
【００１３】
本発明のさらなる態様によれば、ヒトへの抗体の皮下投与のための方法であって、本明細書に記載の抗体又は本明細書に記載の変異体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、方法が提供される。
【００１４】
本発明のさらなる態様によれば、抗体配列ライブラリーであって、ライブラリーは、約pH7で0〜+12の正味電荷、又は8.4〜9.3のpIを有する抗体を含むように操作される、抗体配列ライブラリーが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ヒト皮下バイオアベイラビリティと、pH7(図1A)、pH2(図1B)、pH5(図C)における正味電荷、又は表4に基づく、アバタセプト、エタネルセプト、リロナセプト、セルトリズマブ、デノスマブ、トラロキヌマブ、オマリズマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、mAb1、ベリムマブ、mAb2、mAb3、カナキヌマブ、アダリムマブ、ウステキヌマブ、トシリズマブ、mAb4、ゴリムマブ、及びエファリズマブについてGPMAW平均(図1D)又はiep(図1E)を用いて計算されたpIのいずれかとの間の関係。
【図２】IgG1と「その他」の違いを強調した、バイオアベイラビリティと、pH7(図2A)における正味電荷又はpI(iep)(図2B)のいずれかとの間の関係: IgG1は、mAb1、ベリムマブ、mAb2、mAb3、カナキヌマブ、アダリムマブ、ウステキヌマブ、トシリズマブ、mAb4、ゴリムマブ及びエファリズマブを含み; 「その他」は、アバタセプト、エタネルセプト、リロナセプト、セルトリズマブ、デノスマブ、トラロキヌマブ、オマリズマブ、リツキシマブ及びトラスツズマブを含む。
【図３】pH7での正味電荷と比較した、Actemra及び「IgG1」(mAb1、ベリムマブ、mAb2、mAb3、カナキヌマブ、アダリムマブ、ウステキヌマブ、トシリズマブ、mAb4、ゴリムマブ及びエファリズマブ)のBA値の関係。
【図４】カナキヌマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、ウステキヌマブの4つのIgG、及び「その他」エタネルセプト、リラノセプト、及びオマリズマブについての、pH7における正味電荷とのカニクイザルバイオアベイラビリティデータの関係。
【図５】GPMAW、pepstats及びiepを用いて計算した、セルトリズマブ、トラスツズマブ、トラロキヌマブ、アバタセプト、デノスマブ、ベリムマブ、エタネルセプト、リツキシマブ、カナキヌマブ、アダリムマブ、オマリズマブ、ウステキヌマブ、トシリズマブ、ゴリムマブ、エファリズマブ及びリロナセプトのpI値の比較。
【図６】表6に基づく、イン・ハウス(in-house)mAb 2、5〜23についてGPMAWによって計算された実験的pI値及び計算的pI値の比較。
【図７】両方とも、内部抗体及び文献抗体を試験セットとして用いてGPMAWを用いて計算した、pIとpH7での電荷の比較。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明者らは、ヒトへの皮下投与時のバイオアベイラビリティ(BA)と、約pH7での正味電荷又は抗体治療薬のpIとの間の予想外の相関を同定した。この相関は、ヒトにおける皮下投与時の抗体のBAを予測するものである。この予測相関を使用して、ヒトへの皮下投与の際に改善されたBAを有する抗体配列を作製し、スクリーニングし、選択し、改変し、操作することが可能である。
【００１７】
このようにBAを改善することで、医薬品有効成分(API)の商品原価(COG)を削減することができる。さらに、このようにBAを改善することはまた、用量が、注射の頻度又は容量が(例えば患者にとって又は競合分子と比較して)高すぎるようなものである、又は、粘度の問題のために製剤化のための濃度が難しい場合、抗体の商業化に影響を及ぼし得る。
【００１８】
本発明の方法は、改善されたBAを有する抗体をもたらすことができる。この改善は、改善された予測BAであり得る。改善されたBAは、実施例に提供される相関に基づいてもよい。本発明の方法は、60〜100％; 又は65〜100％; 又は70〜100％; 又は75〜100％のバイオアベイラビリティを有する抗体をもたらすことができる。
【００１９】
本明細書に記載の抗体は、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、又は少なくとも95％のBAを有し得る。BA値は、予測されたBA値であってもよい。BA値は、抗体のヒトへの皮下投与に基づいてもよい。
【００２０】
「バイオアベイラビリティ」(BA)は、本明細書において、全身循環に到達する薬物のパーセンテージとして定義される。バイオアベイラビリティは、集団PKモデリングに基づくか、又は皮下投薬研究に基づく推定値であってよい。バイオアベイラビリティは、静脈内投与後のもの(100％)と比較した所与の剤形の「絶対的バイオアベイラビリティ」(例えば、皮下、対、静脈内)並びに同じ若しくは別の非静脈内経路によって投与された別の形態と比較した「相対的バイオアベイラビリティ」(例えば、皮下の上腕、対、皮下の大腿部)にさらに区別され得る。例えば、本明細書に記載される改善されたBAは、実施例に提供される相関に基づく、改善された予測BAである。
【００２１】
量、分子量、持続時間などの測定可能な値を指すときに本明細書で使用する「約」は、指定された値からの±1％、±0.75％、±0.5％、±0.25％、±0.2％、及び±0.1％の変動を包含することを意味する。そのような変動は、記載される方法を実施するのに適切であるからである。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「抗体」は、IgG(IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4など)、IgM、IgA、IgD若しくはIgE抗体; 又はその断片(例えば、Fab、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、閉鎖型コンホメーション多重特異性抗体、ジスルフィド結合scFv、ダイアボディ)(天然に抗体を産生する任意の種に由来するものであれ、又は組換えDNA技術によって作製されたものであれ; 血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母又は細菌から単離されたものであれ)を指す。抗体は、モノクローナル、組換え、ポリクローナル、キメラ(例えば、異なる供給源由来(例えば、ヒト/マウスキメラ抗体)、若しくは異なる抗体型由来(例えば、IgG2/4抗体))、ヒト、ヒト化、多重特異性(二重特異性を含む)、又はヘテロコンジュゲート抗体であってもよい。
【００２３】
抗体は、IgG1抗体であってもよい。抗体は、全長IgG抗体であってもよい。抗体は、ヒト又はヒト化又はヒト様抗体であってもよい。抗体は、ヒト又はヒト化又はヒト様IgG1抗体であってもよい。抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。抗体は、組換え又は合成であってもよい。軽鎖は、κ軽鎖又はλ軽鎖であってよい。
【００２４】
抗体は、IgG1 Fc融合体又はIgG1 Fab断片でなくてもよい。抗体は、2つのIgG1鎖にわたって極度の電荷分布不均質性を有していなくてもよい。抗体は、ヒアルロニダーゼの存在下で製剤化されなくてもよい。
【００２５】
「CDR」は、抗体上の相補性決定領域として定義される。3つの重鎖CDR及び3つの軽鎖CDRがある。したがって、本明細書で使用する「CDR」は、3つ全ての重鎖CDR、3つ全ての軽鎖CDR、又は全ての重鎖CDR及び軽鎖CDRを指す。
【００２６】
本明細書を通して、抗体配列中のアミノ酸残基は、カバット(Kabat)番号付け規則に従って番号付けされる。
【００２７】
「正味電荷」は、本明細書において、アミノ酸配列から決定される抗体の全体的な(包括的な)電荷と定義される。抗体内の特定の領域、すなわち、Fc領域、Fv領域、CDR、軽鎖又は重鎖に対する主要な役割があるようではなく、したがって、正味電荷は、抗体の全配列の組み合わせである。正味電荷は、抗体の重鎖及び軽鎖の両方を用いて計算することができる。例えば、正味電荷は、C末端リジンを含む、抗体配列全体を用いて計算することができる。さらに、pIを、抗体の重鎖及び軽鎖の両方を用いて計算することができる。例えば、pIは、C末端リジンを含む、抗体配列全体を用いて計算することができる。C末端リジンは、投与前又は投与時に、抗体薬物製品の製造又は保存中に一般にクリッピング/除去される。C末端リジンが抗体配列から除外される場合(例えば、薬物製品が意図的にC末端リジンを含有しない場合)、正味電荷は「x」から2を引いたものとなる。
【００２８】
正味電荷は、次の式を使用して手動で計算することができる。
pH7.0での電荷=(1×Asp数)+(1×Glu数)-(1×Lys数)-(1×Arg数)-(0.05×His数)
【００２９】
正味電荷は、GPMAW(General Protein/Mass Analysis for Windows)を使用して計算することができる。あるいは、正味電荷は、EMBOSS(European Molecular Biology Open Software Suite)pepstats(K、R=+1.0; H=+0.5; D、E=-1.0)を用いて計算することができる。EMBOSS pepstatsは、GPMAWと同じ式を使用するが、His=0.5(デフォルトパラメータ)を設定する。His寄与を除外することにより(すなわち、His=0)、GPMAWによって生成された値により近い値が提供される。
【００３０】
異なるpHでの正味電荷は、異なるpHでのHis上及びAsp/Glu残基上の電荷を調節することによって決定することができる。例えば、正味電荷は、当業者によってpH2、pH5、pH6、及び/又はpH7で計算することができる。
【００３１】
抗体配列の正味電荷は、約pH7で計算することができる。本明細書で使用される場合、「約pH7」はおよその値を指し、したがって、6.6〜7.4、6.7〜7.3、6.8〜7.2、6.9〜7.1のpH範囲を意味し得ることが理解される。本発明者らは、このpH範囲での正味電荷が、BAと最もよく相関することを見出した。pH7はまた、SC環境において最も生理学的に関連し、これは約7.1〜7.4である。例えば、抗体配列の正味電荷は、コンピュータープログラムを用いてpH7で計算される。正味電荷を計算するために使用されるコンピューター方法は、GPMAWであってもよい。約pH7での正味電荷の使用は、pIの使用よりも、BAのより信頼できる予測因子であり得る。
【００３２】
荷電アミノ酸は、本明細書中で以下の表1に定義される。他の全ての天然アミノ酸は、中性であると分類される。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
「pI」は、タンパク質上の正味電荷がゼロであるpHである。これは、例えば実験的又はコンピューターによって、様々な方法によって計算することができる。例えば、pIは、荷電残基のpKa値を用いてタンパク質配列から計算することができる。「実験的pI」は、例えば等電点電気泳動を用いて、実験的に決定される。等電点電気泳動は、ゲルベースの方法を使用する、又はキャピラリーIEFを使用するなど、様々な方法で行うことができる。コンピューター法が使用される場合、pIは、Asp、Glu、Lys、Arg、及びHis残基、また、Cys及びTyr、並びにN及びC末端残基のpKa値を考慮に入れて計算することができる。pIの計算に利用可能ないくつかのプログラム、例えば、GPMAW、EMBOSS pepstats、及びEMBOSS iepがある。GPMAWは、3つの異なる方法を使用し、3つ全てからpI値を見積もる。3つのGPMAW pI値の平均を用いることができる。使用される正確な式及びpKa値は、3つのプログラムにわたって異なる。
【００３５】
pIを計算するために使用されるコンピューター法は、GPMAW、EMBOSS pepstats又はEMBOSS iepであってもよい。pIは、GPMAW(平均)又はiepを使用して計算することができる。例えば、GPMAW(平均)は、pIを計算するために使用される。pI値は、実験的pIと相関する任意のコンピューター法を使用して計算されてよい。
【００３６】
「pKa」は、酸解離定数(酸性定数又は酸イオン化定数としても知られる)の-log10又は酸の解離反応の平衡定数であり、これは、溶液中の分子の酸性強度の定量的尺度である。
【００３７】
本明細書に記載の方法は、バイオアベイラビリティを改善するために抗体の全体的な抗体電荷又はpIを調整することを可能にする。本発明者らは、驚くべきことに、本明細書に記載された値内に抗体の全体的な電荷又はpIを調整することが、バイオアベイラビリティの改善をもたらすことができることを見出した。本明細書に記載されるのは、IgG1を電荷調整する方法であって、IgGを選択し、スクリーニングし、操作し、作製し及び改変して、+5により近い約pH7での正味電荷; 及び/又は約pH7で計算された0〜+12の正味電荷をもたらすことを含む、方法である。
【００３８】
本明細書に記載の正味電荷及びpI値を使用して、抗体、変異体抗体又は抗体配列ライブラリーを選択し、作製し、又は改変して、改善されたBAを有する抗体をもたらすことができる。バイオアベイラビリティを改善するために、抗体のアミノ酸配列を選択し、組み合わせ、操作し、作製し、又は改変してもよい。
【００３９】
抗体の正味電荷は、ヒトへの皮下投与による十分なバイオアベイラビリティを確実にするために、約pH7で0〜+12であり得る。正味電荷は、0〜+10、又は0〜+8、又は0〜+5であってもよい。例えば、正味電荷は、+1〜+12、又は+1〜+10、又は+1〜+8、又は+1〜+5である。あるいは、抗体の正味電荷は、+4〜+12、又は+4〜+10、又は+4〜+8、又は+4〜+6である。本発明者らは、高いバイオアベイラビリティが、約+5の正味電荷を有する抗体に関連することを見出した。
【００４０】
抗体のpIは、ヒトへの皮下投与による十分なバイオアベイラビリティを確実にするために、8.4〜9.3であり得る。例えば、pIは8.5〜9.3、又は8.5〜9.25、又は8.5〜9.2である。あるいは、抗体のpIは、8.6〜9.3、又は8.6〜9.25、又は8.6〜9.2、又は8.6〜9.1、又は8.6〜9.0である。pIは、8.7〜9.1、又は8.7〜9.0、又は8.7〜8.9であってもよい。本発明者らは、高いバイオアベイラビリティが、約8.8のpIを有する抗体に関連することを見出した。
【００４１】
抗体を選択する方法であって、(a)同じ抗原に対する2つ以上の抗体を産生するステップ; 及び(b)以下:
(i)+5により近い約pH7での正味電荷、又は8.8により近いpI、及び/又は
(ii)約pH7で0〜+12の正味電荷、又は8.4〜9.3のpI
を有する抗体配列を選択するステップを含む方法が本明細書に記載される。選択された抗体は、抗体の正味電荷又はpIが本明細書に記載された値内にあるため、他の抗体から区別され、選択された抗体は、他の抗体よりも高いバイオアベイラビリティを有する。例えば、この方法は、ヒトへの皮下投与のための改善されたバイオアベイラビリティを有する抗体を選択することを含む。
【００４２】
抗体を作製する方法であって、2つ以上のヒト生殖細胞系列フレームワーク配列、領域、又はアミノ酸を選択し、組み合わせて、約pH7で0〜+12の正味電荷、又は8.4〜9.3のpIを有する抗体を生成することを含む方法が本明細書に記載される。
【００４３】
また、de novo抗体設計の方法であって、2つ以上のヒト生殖細胞系列フレームワーク配列、領域又はアミノ酸を組み合わせて、(i)約pH7で0〜+12の正味電荷、又は(ii)8.4〜9.3のpIを有するキメラ抗体を生成することを含む方法が記載される。
【００４４】
本明細書に記載される方法及び変異体抗体における2つ以上のヒト生殖細胞系列フレームワーク配列の組み合わせは、フレームワーク可変又は定常配列全体、フレームワーク領域又はフレームワークアミノ酸を含み得る。この組み合わせは、異なるヒト抗体生殖細胞系列配列に由来するアミノ酸(複数可)を含む。
【００４５】
バイオアベイラビリティを改善するために、抗体のアミノ酸配列を組み合わせ、操作し、又は改変してもよい。アミノ酸は、別のヒト抗体配列、例えば、別のヒト生殖細胞系列配列に由来する天然に存在するアミノ酸であってもよい。したがって、ヒトへの投与時の免疫原性応答のリスクは減少し得る。
【００４６】
特に、フレームワーク領域又は定常領域を組み合わせ、操作し、又は改変することが記載される。例えば、相補性決定領域(CDR)は変更されない。したがって、いずれかの抗体配列変化は、抗原結合に影響を与えないか、又はほとんど与えない。例えば、抗体は、その抗原結合活性を保持する。
【００４７】
ヒトへ皮下投与される抗体のバイオアベイラビリティを改善する方法であって、抗体のアミノ酸配列を改変して、約pH7で0〜+12の正味電荷、又は8.4〜9.3のpIをもたらすことを含む方法が、本明細書に記載される。
【００４８】
改変は、1つ以上のアミノ酸置換、又は少なくとも1つのアミノ酸置換を作製することを含み得る。置換は、Fc又はFv領域から選択される領域内にあってよい。置換は、Fv領域内にあってもよい。例えば、置換は、フレームワーク1、フレームワーク2、フレームワーク3、及び/又はフレームワーク4にある。特に、置換はCDR内にはない。
【００４９】
例えば、置換は重鎖上にある。あるいは、置換は軽鎖上にある。あるいは、同じ鎖(重鎖又は軽鎖)又は異なる鎖(重鎖及び軽鎖)上にあってもよい、少なくとも2つのアミノ酸置換が存在する。
【００５０】
抗体1つあたり少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸置換が存在し得る。
【００５１】
置換は、異なるアミノ酸へのものであってもよく、別のヒト抗体生殖細胞系列配列から選択されてもよい。
【００５２】
親抗体配列の変異体である変異体抗体であって、該変異体は、2つ以上のヒト生殖細胞系列フレームワーク配列、領域、又はアミノ酸を組み合わせることを含む、変異体抗体が本明細書に記載される。抗体の正味電荷又はpIが本明細書に記載された値内にあるので、変異体は親から区別される。変異体は、親抗体よりも高いバイオアベイラビリティを有する。
【００５３】
本明細書に記載の方法によって選択される抗体又は本明細書に記載の変異体抗体は、他の抗体配列と比較した場合、1〜20、例えば、1〜19、1〜18、1〜17、1〜16、1〜15、1〜14、1〜13、1〜12、1〜11、1〜10、1〜9、1〜8、1〜7、1〜6、1〜5、1〜4、1〜3又は1〜2の正味電荷差を有する。あるいは、抗体は、他の抗体配列と比較した場合、1〜4、例えば1〜2の正味電荷差を有する。抗体は、他の抗体配列と比較した場合、1の正味電荷差(例えば、正から中性、又は負から中性、又はその逆)を有し得る。作製されたアミノ酸置換に依存して、正味電荷差が、全体的な正又は負の電荷差(すなわち、+1又は-1、+2又は-2、+3又は-3、+4又は-4など)を有してよいことが当業者に理解される。
【００５４】
異なるヒト生殖細胞系列配列に由来するアミノ酸は、残基に基づいて選択され、操作され、組み合され、改変され又は置換されてもよく、ここで、
(a)正のアミノ酸は中性又は負のアミノ酸に変更され;
(b)負のアミノ酸は中性又は正のアミノ酸に変更され;又は
(c)中性アミノ酸は正又は負のアミノ酸に変更される。
【００５５】
選択され、操作され、組み合わされ、改変され又は置換されるアミノ酸は、H1、H6、H12、H13、H16、H19、H23、H43、H75、H81、H83、H85、L17、L18、L42、L74、L77、又はL79から選択されるカバット残基のいずれか1つ又は組み合わせにおけるものであってよい。アミノ酸置換は、H6、H12、H13、H16、H19、H23、H43、H75、H81、H83、H85、L17、L18、L42、L74、L77又はL79から選択されるカバット残基のいずれか1つ又は組み合わせにおけるものであってもよい。アミノ酸置換は、H6、H12、H13、H16、H19、H23、H43、H75、H85、L17、L18、L42、L74、L77又はL79から選択されるカバット残基のいずれか1つ又は組み合わせにおけるものであってもよい。アミノ酸置換は、H12、H16、H19、H43、H75、L17、L18、L74、又はL79から選択されるカバット残基のいずれか1つ又は組み合わせにおけるものであってもよい。アミノ酸置換は、H12、H16、H43、H75、L17、L18、又はL74から選択されるカバット残基のいずれか1つ又は組み合わせにおけるものであってもよい。
【００５６】
選択され、組み合わされ、改変され又は置換されるアミノ酸は、H1、H6、H12、H19、H75、L17、L42、L74、L77又はL79から選択されるカバット残基のいずれか1つ又は組み合わせにおけるものであってもよい。アミノ酸置換は、H6、H12、H75、L42、L74、L77、又はL79から選択されるカバット残基のいずれか1つ又は組み合わせにおけるものであってもよい。アミノ酸置換は、H12、H75、L74、又はL79から選択されるカバット残基のいずれか1つ又は組み合わせにおけるものであってもよい。
【００５７】
選択され、組み合わされ、改変され又は置換されるアミノ酸は、
(a)H1、H6、H85又はL17における中性又は負のアミノ酸;
(b)H12、H19、H23、H75、H83、L18、L42、L74又はL77における中性又は正のアミノ酸; 又は
(c)H13、H16、H43、H81又はL79における中性又は負若しくは正のアミノ酸
であってもよい。
【００５８】
アミノ酸置換は:
(a)H1、H6又はL17における中性又は負のアミノ酸;
(b)H12、H19、H75、L42、L74又はL77における中性又は正のアミノ酸; 又は
(c)L79における中性又は負若しくは正のアミノ酸
であってもよい。
【００５９】
特定のカバット残基における可能なアミノ酸変化の例を以下の表2にまとめる。上記及び表2で論じられるアミノ酸変化のいずれか1つ又は組み合せが、抗体、変異体、ライブラリーに対して、又は本発明に包含される方法において作製され得ることは、当業者に理解される。
【００６０】
【表２】
2018528937.tif 000003
2018528937.tif 000004
【００６１】
例えば、以下の置換のいずれか1つ又は組み合わせを単一の抗体において作製することができる:
H12：VからKへ(中性から正へ=+1電荷)
H16：A/G/SからEへ(中性から負へ=-1電荷)
H19：RからSへ(正から中性へ=-1電荷)
H43：KからQへ(正から中性へ=-1電荷)
H75：KからTへ(正から中性へ=-1電荷)又はTからKへ(中性から正へ=+1電荷)
L17：E/DからQへ(負から中性へ=+1電荷)
L18：RからP/Sへ(正から中性へ=-1電荷)
L74：KからTへ(正から中性へ=-1電荷)
L79：QからEへ(中性から負へ=-1電荷)。
【００６２】
本明細書中で示唆されたアミノ酸変化が抗体になされた場合、アミノ酸変化が抗体分子の重鎖又は軽鎖の両方で行われるので、全電荷変化が倍になることは当業者に理解され、例えば、VからKへの位置H12における変化(すなわち、中性から正へ=+1電荷)は、この変化が両方の重鎖でなされるため、全体の抗体電荷に対して+2の電荷変化をもたらす。
【００６３】
抗体配列ライブラリーを作製する方法が本明細書に記載され、ここで、ライブラリーは、約pH7で0〜+12の正味電荷、又は8.4〜9.3のpIを有する抗体を含むように操作される。また、抗体配列ライブラリーから抗体を単離することを含む、抗体を作製する方法も記載される。
【００６４】
ライブラリーに由来する抗体が本明細書に記載される正味電荷及び/又はpI値を有することを確実にするために、抗体配列ライブラリーを作製する方法は、アミノ酸フレームワーク残基を含み得ることが理解される。例えば、ライブラリーは、本明細書中上に論じたような固定されたアミノ酸位置を有してもよい(例えば、上記の表2で論じた変化を参照のこと)。
【００６５】
以下のフレームワーク配列は、抗体配列ライブラリーにおいて、約pH7.0で0〜+12の正味電荷、又は8.4〜9.3のpIを達成し得る：
(a)H1、H6、H85、L3又はL17における中性又は負のアミノ酸;
(b)H12、H19、H23、H75、H83、L18、L42、L74又はL77における中性又は正のアミノ酸;又は
(c)H13、H16、H43、H81又はL79における中性又は負若しくは正のアミノ酸。
【００６６】
用語「ライブラリー」は、異種ポリペプチド又は核酸の混合物を指す。ライブラリーは、それぞれが単一のポリペプチド又は核酸配列を有するメンバーで構成される。この程度まで、「ライブラリー」は「レパートリー」と同義である。ライブラリーメンバー間の配列の相違により、ライブラリーに存在する多様性が生じる。ライブラリーは、ポリペプチド又は核酸の単純な混合物の形態をとってよく、又は核酸のライブラリーで形質転換した、生物又は細胞、例えば、細菌、ウイルス、動物又は植物細胞、の形態であってもよい。1つの例では、個々の生物又は細胞のそれぞれは、1つ又は限られた数のライブラリーメンバーのみを含有する。核酸によってコードされるポリペプチドの発現を可能にするために、核酸を発現ベクターに組み込んでもよい。ライブラリーは、宿主生物の集団の形態をとってもよく、それぞれの生物は、対応するポリペプチドメンバーを産生するために発現され得る核酸形態のライブラリーの単一メンバーを含有する発現ベクターの1つ以上のコピーを含有する。したがって、宿主生物の集団は、多様なポリペプチドの大きなレパートリーをコードする可能性を有する。ライブラリーは、ファージ(例えば、バクテリオファージ)、酵母又はリボソームライブラリーであり得る。
【００６７】
親ヒト抗体配列の変異体が本明細書に記載され、ここで、変異体は、2つ以上のヒト生殖細胞系列フレームワーク配列、領域又はアミノ酸を組み合わせ、(i)親抗体配列より、+5に近い約pH7.0での正味電荷、若しくは8.8に近いpI、及び/又は(ii)親抗体配列と比較した、約pH7で0〜+12の正味電荷、若しくは8.4〜9.3のpIを有する変異体抗体を作製することを含む。
【００６８】
親抗体は、親抗体配列の変異体を産生するために、本明細書中上に記載したのと同じように改変されてもよい。例えば、アミノ酸置換は、Fv領域内にある。アミノ酸置換は、相補性決定領域(CDR)内にはなくてもよい。変異体は、親抗体配列と比較した場合、1〜4の正味電荷差を有し得る。アミノ酸置換は、(a)正のアミノ酸を中性又は負のアミノ酸に変化させ; (b)負のアミノ酸を中性又は正のアミノ酸に変化させ; 又は(c)中性アミノ酸を正又は負のアミノ酸に変化させてもよい。一実施形態において、アミノ酸置換は、H1、H6、H12、H13、H16、H19、H23、H43、H75、H81、H83、H85、L17、L18、L42、L74、L77、又はL79から選択されるカバット残基のいずれか1つ又は組み合わせにおけるものである。アミノ酸置換は、H12、H16、H19、H43、H75、L17、L18、L74、又はL79から選択されるカバット残基のいずれか1つ又は組み合わせにおけるものであり得る。
【００６９】
変異体抗体の正味電荷は、ヒトへの皮下投与による十分なバイオアベイラビリティを確実にするために、約pH7で0〜+12であり得る。正味電荷は、0〜+10、又は0〜+8、又は0〜+5であり得る。例えば、正味電荷は+1〜+12、又は+1〜+10、又は+1〜+8、又は+1〜+5である。あるいは、抗体の正味電荷は、+4〜+12、又は+4〜+10、又は+4〜+8、又は+4〜+6である。本発明者らは、高いバイオアベイラビリティが、約+5の正味電荷を有する抗体に関連することを見出した。
【００７０】
変異体抗体のpIは、ヒトへの皮下投与による十分なバイオアベイラビリティを確実にするために、8.4〜9.3であり得る。例えば、pIは、8.5〜9.3、又は8.5〜9.25、又は8.5〜9.2である。あるいは、抗体のpIは、8.6〜9.3、又は8.6〜9.25、又は8.6〜9.2、又は8.6〜9.1、又は8.6〜9.0である。pIは、8.7〜9.1、又は8.7〜9.0、又は8.7〜8.9であってもよい。本発明者らは、高いバイオアベイラビリティが、約8.8のpIを有する抗体に関連することを見出した。
【００７１】
正味電荷は、C末端リジンを含む、抗体配列全体を用いて計算することができる。例えば、変異体は、その抗原結合活性を保持する。変異体は、IgG1抗体であってもよい。
【００７２】
本明細書に記載の抗体(方法から作製された、選択された、改変された、改変体、方法から生じた)は、改善されたBA、例えば実施例に提供される相関に基づく予測されたBAを有する。抗体は、60〜100％、又は65〜100％、又は70〜100％、又は75〜100％のバイオアベイラビリティを有していてもよい。抗体は、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、又は少なくとも95％のBAを有してもよい。
【実施例】
【００７３】
本発明を以下の実施例を参照してより詳細に説明する。
【００７４】
以下の実施例は、ヒトへの皮下送達時の電荷又はpIとバイオアベイラビリティとの間の相関を実証するために含まれ、抗体の予測バイオアベイラビリティを増加させる方法のサポートを提供する。
【００７５】
実施例1-ヒトのバイオアベイラビリティ値
文献から、又はイン・ハウス・ポートフォリオから、皮下注射によって投与されるものとして20個の抗体が同定された。これらを表3に列挙する。これらの抗体のバイオアベイラビリティは43〜87％の範囲である。
【００７６】
【表３】
2018528937.tif 000005
2018528937.tif 000006
【００７７】
実施例2：ヒトのバイオアベイラビリティ相関
分子量及び用量に関する予備分析は、BAの広範囲の値を説明するための明白な相関を示さなかった。GeneDocソフトウェアを用いてV領域及びC領域を配列アラインメントすることにより、全長抗体の14個を調べた。バイオアベイラビリティの変動の原因となるものとして、明らかな配列特徴は同定できなかった。
【００７８】
次いで、さらなる配列特性を評価した。正味電荷は、GPMAWを用いて(pH2.0、5.0及び7.0にて、すなわち異なるpHでHis上及びAsp/Glu上の電荷を調節することで)計算した。pIは、EMBOSS iep及びGPMAWを用いて計算した。iep及びGPMAWはいずれも、還元(-SH)及び非還元(-SS)状態のタンパク質のpIを計算することができる。GPMAWはまた、3つの異なる方法を使用してpIを計算し、したがって、方法にわたって平均を生成した。
【００７９】
次いで、これらの特性値を、表4及び図1に示すように、バイオアベイラビリティ値に対して相関させた。
【００８０】
【表４】
2018528937.tif 000007
2018528937.tif 000008
【００８１】
抗体の全てが分析に含まれていれば、pH2.0及び5.0でのGPMAW正味電荷計算で相関が観察される(「ピアソン(全て)」参照)。グラフから、他のパラメータで見られる低い相関は、低い正味電荷値を有するデータポイントに主に起因する(図1参照)。検査すると、これらは主に非IgG1抗体で構成されているようである。
【００８２】
IgG1抗体に焦点を当て、分子全体に極度の電荷分布不均一性を有するIgG1及びヒアルロニダーゼ(独立にBAを改善する)の存在下で製剤化されたIgG1を除外するために、分子フォーマットによってデータを区別すると、皮下バイオアベイラビリティとの強い相関があることが明らかになり(図2参照)、表4「ピアソン(その他を除く)」におけるピアソン相関は-0.93である。
【００８３】
図2「IgG1」は、mAb1、ベリムマブ、mAb2、mAb3、カナキヌマブ、アダリムマブ、ウステキヌマブ、トシリズマブ、mAb4、ゴリムマブ及びエファリズマブを含む。「その他」は、非完全長IgG1：Fc融合体(アバタセプト、エタネルセプト、リロナセプト)、Fab断片(セルトリズマブ); IgG2(デノスマブ); IgG4(トラロキヌマブ); オマリズマブ(IgG1であるが、分子全体に極度の電荷分布不均一性を有する点で異例である)(また、Xolairに対する抗原はIgEであり、したがって、標的結合はバイオアベイラビリティに影響を与え得る)、及びリツキシマブ及びトラスツズマブ(ヒアルロニダーゼの存在下で製剤化される)(EMAウェブサイト及びShpilberg and Jackisch (2013) Br. J. Cancer, 109(6), 1556-1561に記載されているRituximab(商標)及びHerceptin(商標)についての情報を参照のこと)で構成される。
【００８４】
「ピアソン相関」は、2つの変数XとYとの間の線形依存性の尺度を指す、当該技術分野において周知の用語であることに留意されたく、+1以下-1以上の値(ここで、+1は完全な正の相関であり、0は無相関であり、-1は完全な負の相関である)を与える。
【００８５】
Actemra(商標)/トシリズマブに対する欧州医薬品庁(EMA)報告は80％のBAを提供し、これは、集団PKモデリング(Actemra(商標)/RoActemra(商標)のEMA評価を参照)に基づく推定値であり、以前に報告された単回投与試験(Zhang et al. (2013) Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. 51(6), p. 443-55参照)で観察された48.8％及び56.5％より大幅に高いことに留意されたい。より低い値の平均値(53％)は、推定値よりも相関の線上に密接にフィットする(図3参照)。平均値は表3、4並びに図1及び2に提供される。
【００８６】
データは、pH7が、電荷を計算するのに最適なpHであることを示す。このpHより下では、ピアソン相関は減少する。最大バイオアベイラビリティのための、pH7での最適な電荷は、約+5、又は0〜+12であるようである。図2aの「その他」のため、+5未満の7での電荷の効果を予測することは困難である。最適な電荷は、実際には0〜+5、又は+1〜+5であり得る。
【００８７】
データはまた、最大バイオアベイラビリティのための最適なpIが、約8.8、又は8.4〜9.3であるようであることを示す。図2bの「その他」のため、8.8未満のpIの効果を予測することは困難である。最適なpIは、実際には8.4〜8.8であり得る。
【００８８】
電荷とpIデータを比較すると、両者とも相関関係を示しているが、pH7データでの電荷の方が相関が良いことが示唆される。これは、同じデータセットに対してR2値を使用する場合に強められ、これは、pH7における電荷について0.89の相関及びpIについて0.73の相関を示す(GPMAWで計算)。「R2」は、2つの変数間の相関度の尺度である相関係数の2乗を指す。
【００８９】
ヒトのバイオアベイラビリティデータと正味電荷又はpIとの間に観察される強い相関関係は、非ヒトモデルに変換されない。表3に列挙される、4つのIgG: カナキヌマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、ウステキヌマブ; 及び「その他」(非IgGエタネルセプト及びリラノセプト並びにIgG1オマリズマブ(極度の電荷不均一性を有する)を含む)についてのカニクイザルデータ(Richter et al. (2012) AAPS J. 14(3), 559-570から取得)を、pH7におけるそれらの正味電荷に対してプロットすると、明らかな相関は生じない(図4参照)。対照的に、これらの4つのIgGについて、ヒトBAと正味電荷又はpIについて明確な相関がある。
【００９０】
実施例3-pIと電荷の関係の分析
本発明者らは、驚くべきことに、約pH7での正味電荷及び/又はpIを使用することが、皮下送達時のヒトのバイオアベイラビリティの良好な予測因子であることを見出した。これを以下により詳しく説明する。
【００９１】
正味電荷及びpIの両方は、タンパク質の配列から計算することができる。「正味電荷」は、特定のpHで荷電した残基からの寄与を合計することに基づくタンパク質の全電荷である。したがって、電荷はpHに依存して変化する。
【００９２】
約pH7(SC薬剤が注入される間質空間に最も近く)において、正味電荷はGPMAWによって以下の式を使用して計算される:
pH7.0における電荷=(1×Asp数)+(1×Glu数)-(1×Lys数)-(1×Arg数)-(0.05×His数)
【００９３】
EMBOSS pepstatsは、同じ式を使用するが、His=0.5(デフォルトパラメータ)を設定する。His寄与を除外することにより(すなわち、His=0)、GPMAWによって生成された値により近い値が提供される。
【００９４】
「pI」は、タンパク質上の正味電荷がゼロであるpHである。これは、荷電残基のpKa値を用いて、タンパク質配列から様々な方法によって計算することができる。pIは、Asp、Glu、Lys、Arg、及びHis残基、また、Cys及びTyr並びにN及びC末端残基のpKa値も考慮に入れることによって計算することができる。
【００９５】
本発明者らは、pIを計算するために3つの異なるプログラム、GPMAW、EMBOSS pepstats及びEMBOSS iepを使用した。EMBOSS iep及びGPMAWの両方が、分子のジスルフィド結合状態を説明する。使用される正確な式及びpKa値は、3つのプログラムにわたって異なる。GPMAWは3つの異なる方法を使用し、3つ全てからpI値を見積もる。用いるpKa値における変動を表5にまとめる。
【００９６】
【表５】
2018528937.tif 000009
【００９７】
残基pKa値における差異は、文献からの16個の抗体(セルトリズマブ、トラスツズマブ、トラロキヌマブ、アバタセプト、デノスマブ、ベリムマブ、エタネルセプト、リツキシマブ、カナキヌマブ、アダリムマブ、オマリズマブ、ウステキヌマブ、トシリズマブ、ゴリムマブ、エファリズマブ、及びリロナセプト)について図5によって示されるように、3つのプログラムを用いて計算されたpI値におけるいくらかの変動をもたらす。
【００９８】
いくつかのコンピューター方法は、他のコンピューター方法よりも、実験データとより密接に相関する。本発明者らは、GPMAW及びEMBOSS iepからのpI計算が、イン・ハウスmAb 2、5〜23のイン・ハウス実験データと密接に相関することを観察した(図6及び表6参照)。しかし、実験的pIと対応するpIを計算することができる任意の適切なコンピューター方法が使用され得ることが理解される。
【００９９】
【表６】
2018528937.tif 000010
【０１００】
GPMAWを使用して、pIと電荷の関係は直線状ではないことが観察されている(図7参照)。試験セットとして内部又は市販Abを使用し、+5の電荷を超えて、pIは大きく変化しない(+5及び+17の電荷の間の<1pI単位)。しかし、電荷とSCバイオアベイラビリティとの間に最良の相関を本発明者らが見出すのは、この領域においてである。+5の電荷未満で、pIは電荷の減少に伴って急速に減少する。
【０１０１】
したがって、約pH7における正味電荷の使用は、BAのより信頼できる予測因子であり得る。
【０１０２】
実施例4：置換部位の同定
抗体の配列は、ヒトへの皮下投与の際にBAを改善するように改変することができる。GeneDocソフトウェアを用いてV領域及びC領域を配列アラインメントすることにより、15個の抗体を調べた。
【０１０３】
正味電荷は、特定の領域(CDR、フレームワーク又は鎖)に起因するものではなかったが、両方の鎖にわたって組み合わせた配列に起因することが判明した。
【０１０４】
V領域に加えて、C領域も、トラロキヌマブ及びmAb1によって証明されるように、観察されたSCバイオアベイラビリティに影響を及ぼすことが分かった。これら2つの抗体は、V領域にわたって同様の正味電荷を有する。しかし、トラロキヌマブはヒトIgG4ラムダ2抗体であり、一方、mAb1はヒトIgG1カッパであり、C領域の正味電荷は異なり、IgG1は、IgG4について中性であるのと対照的に、正に荷電している(データは示さず)。
【０１０５】
Fc又はFv領域は、この相関において主な役割を果たすようには見えず、全体的な電荷が重要である。
【０１０６】
In silico配列解析を実施して、生殖細胞系列-生殖細胞系列突然変異で電荷を改変することができる、保存されたフレームワーク領域内の潜在的な位置を同定した。
【０１０７】
表7に示すように、抗体の電荷を調整するために使用できる特定の残基を選択した。
【０１０８】
【表７】
2018528937.tif 000011
表7に示される突然変異を、ヒト生殖細胞系列配列のセットにわたって個別に作製し、潜在的な免疫原性リスクを、TEpredictを用いてMHCクラスII T細胞エピトープを予測することによってin silicoで計算した。
【０１０９】
実施例5-改変された正味電荷の突然変異体の生成
本発明者らは、突然変異が「良性」(すなわち、分子に、例えば結合、力価、生成物の品質、免疫原性などに負の影響を与えない)かどうかを実験的に評価することができる。
【０１１０】
イン・ハウス抗体配列を整列させて、突然変異を評価するための適切なフレームワークを同定した。各突然変異を、2つの異なる抗体において作製した。
【０１１１】
【表８】
2018528937.tif 000012
【０１１２】
各アミノ酸変異について、総電荷変化が2倍になることに留意されたい。アミノ酸変化が、抗体分子の両重鎖及び/又は両軽鎖で行われるためである。例えば、VからKへの位置H12での変化(すなわち、中性から正へ=+1電荷)は、この変化が両方の重鎖でなされるため、全体の抗体電荷に対して+2の電荷変化をもたらす。
【０１１３】
これらの利用可能な置換部位は、ヒト皮下BAを改善するために抗体をベニア化(veneer)又は改変するための創薬中のツールボックスの一部であり得る。あるいは、これらの異なる残基は、ライブラリーに由来する抗体について正味電荷が最大になることを確実にするために、抗体配列ライブラリーの一部であってもよい。
【０１１４】
参考文献
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【図１】
2018528937.tif 000014
【図２】
2018528937.tif 000015
【図３】
2018528937.tif 000016
【図４】
2018528937.tif 000017
【図５】
2018528937.tif 000018
【図６】
2018528937.tif 000019
【図７】
2018528937.tif 000020
【国際調査報告】
2018528937.tif 000021
2018528937.tif 000022
2018528937.tif 000023