(57)【要約】本発明は、５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを発現する細胞と、フラン化合物輸送能力を有するポリペプチドを発現する細胞に関する。本発明はまた、本発明の細胞を２，５−フラン−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）のフラン前駆体の酸化に使用する、ＦＤＣＡを生産する方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＭＦＣＡの存在下で、好ましくは細胞によってＨＭＦＣＡの酸化を促進する条件下で、細胞をインキュベートするステップを含む、５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸（ＨＭＦＣＡ）を５−ホルミル−２−フロ酸（ＦＦＡ）に酸化させる方法であって、
前記細胞が、配列番号１〜１１のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも４５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含み、
前記発現構築物が前記細胞において発現可能であり、前記デヒドロゲナーゼの発現が、前記発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、ＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させる能力を前記細胞に付与する又は前記細胞において増大させる、
方法。
【請求項２】
１つ又は複数のＦＤＣＡのフラン前駆体を含む培地中で、好ましくは細胞によるＦＤＣＡのフラン前駆体のＦＤＣＡへの酸化を促進する条件下で、細胞をインキュベートするステップと、任意選択で、ＦＤＣＡを回収するステップとを含む、ＦＤＣＡを生産する方法であって、
前記細胞が、配列番号１〜１１のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも４５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含み、
前記発現構築物が前記細胞において発現可能であり、前記デヒドロゲナーゼの発現が、前記発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、ＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させる能力を前記細胞に付与する又は前記細胞において増大させ、
ＦＤＣＡの少なくとも１つのフラン前駆体が、ＨＭＦ、２，５−ジヒドロキシメチルフラン（ＤＨＦ）、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＡ及び２，５−ジホルミルフラン（ＤＦＦ）からなる群から選択されるのが好ましく、そのうちＨＭＦが最も好ましく、
ＦＤＣＡのフラン前駆体が、好ましくは酸触媒による脱水によって、１つ又は複数のヘキソース糖、好ましくはリグノセルロースバイオマスから得られる１つ又は複数のヘキソース糖から得られる、
ＦＤＣＡを生産する方法。
【請求項３】
前記ＦＤＣＡが、酸又は塩沈澱、続いて冷却結晶化及び／又は溶媒抽出を含む方法によって、培地から回収される、請求項２に記載のＦＤＣＡを生産する方法。
【請求項４】
ａ）請求項２又は３に記載の方法においてＦＤＣＡモノマーを調製するステップと；
ｂ）ａ）で得られたＦＤＣＡモノマーからポリマーを生産するステップと
を含む、１つ又は複数のＦＤＣＡモノマーからポリマーを生産する方法。
【請求項５】
１種又は複数のフラン前駆体をＦＤＣＡに生体内変換するための細胞の使用であって、
ＦＤＣＡの少なくとも１つのフラン前駆体がＨＭＦ、ＤＨＦ、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＡ及びＤＦＦからなる群から選択されるのが好ましく、そのうち、ＨＭＦが最も好ましく、
前記細胞が、配列番号１〜１１のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも４５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含み、
前記発現構築物が前記細胞において発現可能であり、前記デヒドロゲナーゼの発現が、前記発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、ＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させる能力を前記細胞に付与する又は前記細胞において増大させる、
細胞の使用。
【請求項６】
配列番号１〜１１のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも４５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含む細胞であって、
前記発現構築物が前記細胞において発現可能であり、前記デヒドロゲナーゼの発現が、前記発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、ＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させる能力を前記細胞に付与する又は前記細胞において増大させ、
前記細胞が、
ａ）フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性であって、前記細胞が、アミノ酸配列の配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９及び３０のうちのいずれか１つと少なくとも４５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための第２の発現構築物を含むのが好ましく、前記第２の発現構築物が前記細胞において発現可能であり、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼの発現が、前記第２の発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、ｉ）５−ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）をＨＭＦＣＡに酸化させる能力、ｉｉ）ＤＦＦをＦＦＡに酸化させる能力、及びｉｉｉ）ＦＦＡをＦＤＣＡに酸化させる能力のうちの少なくとも１つを前記細胞に付与する又は前記細胞において増大させる、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性と；
ｂ）フラン化合物を前記細胞内及び／又は細胞外に輸送する能力であって、前記細胞が、少なくともＨＭＦＣＡを細胞内に輸送する能力を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現するための第３の発現構築物を含むのが好ましく、前記ポリペプチドが、アミノ酸配列の配列番号１７、３１、３２、３３及び３４のうちのいずれか１つと少なくとも４５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第３の発現構築物が前記細胞において発現可能であり、前記ポリペプチドの発現が、前記第３の発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、少なくともＨＭＦＣＡを前記細胞内に輸送する能力を前記細胞に付与する又は前記細胞において増大させる、輸送する能力
のうちの少なくとも１つをさらに有する、
細胞。
【請求項７】
前記細胞が微生物細胞であり、前記細胞が、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ミセリオフトーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、クリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、パネロカエテ（Ｐａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、プロイロータス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からなる群の属から選択される酵母又は糸状菌細胞であるのが好ましく、クリベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ソジェ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、タラロミセス・エメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ミセリオフトーラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、及びペニシリウム・クリゾゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）からなる群の種から選択される酵母又は糸状菌細胞がより好ましく、或いは、
前記細胞が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アナベーナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、エアリバチルス（Ａｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、ブラジリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、コーロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、デスルホトマクルム（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）、デスルフリスポラ（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｓｐｏｒａ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ペロトマクルム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）（シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ））、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、及びストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）からなる群の属から選択される細菌細胞であるのが好ましく、エアリバチルス・パリダス（Ａ．ｐａｌｌｉｄｕｓ）、アネウリニバチルス・テラノベンシス（Ａ．ｔｅｒｒａｎｏｖｅｎｓｉｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・クリベンシス（Ｂ．ｋｒｉｂｂｅｎｓｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プンチス（Ｂ．ｐｕｎｔｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・サーモルーバー（Ｂ．ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒ）、バチルス・パナチフミ（Ｂ．ｐａｎａｃｉｈｕｍｉ）、カプリアビダス・バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）、デスルホトマクルム・クズネツォビイ（Ｄ．ｋｕｚｎｅｔｓｏｖｉｉ）、デスルフリスポラ・サーモフィラ（Ｄ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ゲオバチルス・カウストフィルス（Ｇ．ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）、コーロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）ＣＢ１５、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、ロドバクター・スフェロイデ��（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、シュードモナス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、シノリゾビウム・メリオティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｏｔｉ）、及びリゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）からなる群の種から選択される細菌細胞であるのがより好ましい、
請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８１．６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項９】
ａ）請求項８で定義したＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１２又は１３に示されているヌクレオチド配列；
ｃ）長さが１０、１５、２０、３０、５０又は１００ヌクレオチドである、（ａ）又は（ｂ）で定義したヌクレオチド配列の断片；
ｄ）遺伝コードの縮重によりｂ）又はｃ）のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列；及び、
ｅ）ａ）〜ｄ）で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列
のうちの少なくとも１つを含む核酸分子であって、
ベクターであるのが好ましい、
核酸分子。
【請求項１０】
請求項８で定義したポリペプチド、及び請求項９で定義した核酸分子のうちの少なくとも１つを含む細胞であって、
培養細胞であるのが好ましい、
細胞。
【請求項１１】
少なくともＨＭＦＣＡを細胞内に輸送する能力を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含む細胞であって、
前記ポリペプチドが、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８６．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記発現構築物が前記細胞において発現可能であり、前記ポリペプチドの発現が、前記発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、少なくともＨＭＦＣＡを前記細胞内に少なくとも輸送する能力を前記細胞に付与する又は前記細胞において増大させ、
前記細胞がＨＭＦをＦＤＣＡに変換するための酵素をさらに含み、
ＨＭＦをＦＤＣＡに変換するための前記酵素が、
ａ）ＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させるアルコールデヒドロゲナーゼ及びフランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性；並びに、
ｂ）ＨＭＦ、２，５−ジヒドロキシメチルフラン、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＡ及び２，５−ジホルミルフランのうちの１種又は複数をＦＤＣＡに酸化させるオキシドレダクターゼ、並びに任意選択で、フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性
のうちの少なくとも１つを含むのが好ましい、
細胞。
【請求項１２】
前記細胞が微生物細胞であり、前記細胞が、カンジダ、ハンゼヌラ、クリベロミセス、ピチア、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、ヤロウイア、アクレモニウム、アガリクス、アスペルギルス、アウレオバシディウム、ミセリオフトーラ、クリソスポリウム、コプリナス、クリプトコックス、フィリバシジウム、フザリウム、フミコラ、マグナポルテ、ムコール、ミセリオフトーラ、ネオカリマスティクス、ニューロスポラ、ペシロミセス、ペニシリウム、ピロミセス、パネロカエテ、プロイロータス、シゾフィラム、タラロミセス、サーモアスカス、チエラビア、トリポクラジウム、及びトリコデルマからなる群の属から選択される酵母又は糸状菌細胞であるのが好ましく、クリベロミセス・ラクチス、サッカロミセス・セルビシエ、ハンゼヌラ・ポリモルファ、ヤロウイア・リポリティカ、ピチア・パストリス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ソジェ、アスペルギルス・フミガーツス、タラロミセス・エメルソニ、アスペルギルス・オリゼ、ミセリオフトーラ・サーモフィラ、トリコデルマ・リーゼイ、及びペニシリウム・クリゾゲヌムからなる群の種から選択される酵母又は糸状菌細胞であるのがより好ましく；或いは、
前記細胞が、エシェリヒア、アナベーナ、エアリバチルス、アネウリニバチルス、バークホルデリア、ブラジリゾビウム、コーロバクター、カプリアビダス、デスルホトマクルム、デスルフリスポラ、グルコノバクター、ロドバクター、ペロトマクルム、シュードモナス、パラコッカス、バチルス、ゲオバチルス、ブレビバチルス、ブレビバクテリウム、コリネバクテリウム、リゾビウム（シノリゾビウム）、フラボバクテリウム、クレブシェラ、エンテロバクター、ラクトバチルス、ラクトコッカス、メチロバクテリウム、ラルストニア、ロドシュードモナス、スタフィロコッカス、及びストレプトミセスからなる群の属から選択される細菌細胞であるのが好ましく、エアリバチルス・パリダス、アネウリニバチルス・テラノベンシス、バチルス・スブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアグランス、バチルス・クリベンシス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・プンチス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ハロデュランス、バチルス・プミルス、バチルス・サーモルーバー、バチルス・パナチフミ、カプリアビダス・バシレンシス、デスルホトマクルム・クズネツォビイ、デスルフリスポラ・サーモフィラ、ゲオバチルス・カウストフィルス、グルコノバクター・オキシダンス、コーロバクター・クレセンタスＣＢ１５、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、ロドバクター・スフェロイデス、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム、シュードモナス・ゼアキサンチニファシエンス、シュードモナス・プチダ、パラコッカス・デニトリフィカンス、大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミクム、スタフィロコッカス・カルノーサス、ストレプトミセス・リビダンス、シノリゾビウム・メリオティ、及びリゾビウム・ラジオバクターからなる群の種から選択される細菌細胞であるのがより好ましい、
請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくともＨＭＦＣＡを細胞内に輸送する能力を有するポリペプチド。
【請求項１４】
ａ）請求項１３で定義した、少なくともＨＭＦＣＡを細胞内に輸送する能力を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１８に示されているヌクレオチド配列；
ｃ）長さが１０、１５、２０、３０、５０又は１００ヌクレオチドである（ａ）又は（ｂ）で定義したヌクレオチド配列の断片；
ｄ）遺伝コードの縮重によりｂ）又はｃ）のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列；及び、
ｅ）ａ）〜ｄ）で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列
のうちの少なくとも１つを含む核酸分子であって、
ベクターであるのが好ましい、
核酸分子。
【請求項１５】
請求項１３で定義したポリペプチド、及び請求項１４で定義した核酸分子のうちの少なくとも１つを含む細胞であって、
培養細胞であるのが好ましい、
細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素学、分子遺伝学、生体内変換及び発酵工学の分野に関する。特に、本発明は、５−（ヒドロキシメチル）−２−フロ酸を５−ホルミル−２−フロ酸に酸化するデヒドロゲナーゼ、及びこうしたデヒドロゲナーゼをコードしているポリヌクレオチド、及びヒドロキシメチルフルフラールの２，５−フランジカルボン酸への生体内変換におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
２，５−フランジカルボン酸（ＦＤＣＡ）は、極めて経済的影響のあるポリエステルの生産に適用し得るモノマー化合物である。この分野における非常に重要な化合物は、テレフタル酸（ＰＴＡ）及びエチレングリコールから生産されるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）である。ＦＤＣＡはポリエステルＰＥＴ中のＰＴＡに置き換えることができ、その場合には、ポリエチレンフランジカルボキシラート（ＰＥＦ）が得られる。ＰＥＦは、大きなポリエステル市場においてＰＥＴに代わる有効な可能性を有している。ＰＥＦは、ＰＥＴと比べた場合に優れた特性があるだけでなく、再生可能な供給原料から得ることができるからである。ＦＤＣＡは、糖から、化学的に（Ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２．Ｉｎ：  Ｂｉｏｂａｓｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒｓ，Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ；  Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．；  ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ；  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ：  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）、又は化学的−生物学的な併用経路（Ｗｉｅｒｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ  ２０１１．  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９２：１０９５−１１０５）のいずれかで生産することができる。後者の場合には、グルコース又はフルクトースなどのモノマー糖は、５−（ヒドロキシメチル）−２−フルアルデヒド（ＨＭＦ）に化学的に変換され、これは続いて酵素によってＦＤＣＡに酸化され得る。
【０００３】
ＦＤＣＡをＨＭＦから生産する生物学的経路は、カプリアビダス・バシレンシス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４のＨＭＦ分解株の単離に基づいて開発されている（Ｗｉｅｒｃｋｘ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：３３６−３４３）。カプリアビダス・バシレンシス  ＨＭＦ１４におけるＨＭＦ分解経路に関与する酵素をコードしている遺伝子のクラスターは同定され、関連遺伝子がシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）株において異種発現されており（Ｋｏｏｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０．ＰＮＡＳ  １０７：４９１９−４９２４）、それにより、ＨＭＦを代謝する能力を獲得された。分解経路の第１の酸化ステップは、５−（ヒドロキシメチル）−２−フロ酸（ＨＭＦＣＡ）の形成を含んでおり、これは、次いで、５−ホルミル−２−フロ酸（ＦＦＡ）、及びさらにＦＤＣＡに酸化された。その後の研究において（Ｋｏｏｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０．  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０１：６２９１−６２９６；及び国際公開第２０１１／０２６９１３号）、酵素ＨＭＦオキシドレダクターゼをコードするカプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４のｈｍｆＨ遺伝子のみがシュードモナス・プチダに導入された。オキシドレダクターゼは、主としてＨＭＦＣＡでオキシダーゼとして作用するが、ＨＭＦ又はＦＦＡも酸化させることができる。ｈｍｆＨ遺伝子のみの異種発現によって、シュードモナス・プチダはＨＭＦからＦＤＣＡを生産することができる。さらなる最適化の研究において（Ｗｉｅｒｃｋｘ  ｅｔ  ａｌ  ２０１１、前掲；及び国際公開第２０１２／０６４１９５号）、それぞれ未知の特性を有するＨＭＦＣＡトランスポーター及びアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、２種の追加の遺伝子がシュードモナス・プチダにおいて発現された。
【０００４】
しかし、ＦＤＣＡをＨＭＦから生産するためのオキシダーゼ触媒経路には、デヒドロゲナーゼ触媒経路と比べると、少なくとも毒性Ｈ２Ｏ２の生成、酸化ステップからのエネルギー獲得の不足、及びＯ２に対する親和性不足、及びシステムに関連する酸素の高需要などを含む、いくつかの固有の不都合な点がある。したがって、本発明は、ＨＭＦなどのフラン前駆体からＦＤＣＡを生産するための新規デヒドロゲナーゼ触媒経路に関する手段及び方法を提供することによって、並びに、このような方法において新規ＨＭＦＣＡトランスポーターを使用するための手段及び方法を提供することによって、これらの不都合な点に対処することを目的とする。
【発明の概要】
【０００５】
第１の態様において、本発明は、配列番号１〜１１のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも４５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含む細胞であって、上記発現構築物が上記細胞において発現可能であり、上記デヒドロゲナーゼの発現が、上記発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸（ＨＭＦＣＡ）を５−ホルミル−２−フロ酸（ＦＦＡ）に酸化させる能力を上記細胞に付与する又は上記細胞において増大させる、細胞に関する。上記細胞は、ａ）フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性であって、上記細胞が、アミノ酸配列の配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９及び３０のうちのいずれか１つと少なくとも４５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための第２の発現構築物を含むのが好ましく、第２の発現構築物が上記細胞において発現可能であり、上記アルデヒドデヒドロゲナーゼの発現が、第２の発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、ｉ）５−ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）をＨＭＦＣＡに酸化させる能力、ｉｉ）ＤＦＦをＦＦＡに酸化させる能力、及びｉｉｉ）ＦＦＡをＦＤＣＡに酸化させる能力のうちの少なくとも１つを上記細胞に付与する又は上記細胞において増大させる、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性と；ｂ）フラン化合物を細胞内及び／又は細胞外に輸送する能力であって、上記細胞が、少なくともＨＭＦＣＡを細胞内に輸送する能力を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現するための第３の発現構築物を含むのが好ましく、上記ポリペプチドが、アミノ酸配列の配列番号１７、３１、３２、３３及び３４のうちのいずれか１つと少なくとも４５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、上記第３の発現構築物が上記細胞において発現可能であり、上記ポリペプチドの発現が、第３の発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、少なくともＨＭＦＣＡを上記細胞内に輸送する能力を細胞に付与する又は細胞において増大させる、輸送する能力をさらに有するのが好ましい。
【０００６】
別の態様において、本発明は、少なくともＨＭＦＣＡを細胞内に輸送する能力を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含む細胞であって、上記ポリペプチドが、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８６．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、上記発現構築物が上記細胞において発現可能であり、上記ポリペプチドの発現が、発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、少なくともＨＭＦＣＡを細胞内に少なくとも輸送する能力を細胞に付与する又は細胞において増大させ、上記細胞がＨＭＦをＦＤＣＡに変換するための酵素をさらに含み、ＨＭＦをＦＤＣＡに変換するための上記酵素が、ａ）ＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させるアルコールデヒドロゲナーゼ及びフランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性；並びに、ｂ）ＨＭＦ、２，５−ジヒドロキシメチルフラン、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＡ及び２，５−ジホルミルフランのうちの１種又は複数をＦＤＣＡに酸化させるオキシドレダクターゼ、並びに任意選択で、フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、のうちの少なくとも１つを含むのが好ましい、細胞に関する。
【０００７】
本発明による細胞は、細菌、酵母又は糸状菌細胞などの微生物細胞であるのが好ましい。本発明の酵母又は糸状菌細胞は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ミセリオフトーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、クリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、パネロカエテ（Ｐａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、プロイロータス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からなる群の属から選択される酵母又は糸状菌細胞であるのが好ましく、クリベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ソジェ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、タラロミセス・エメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ミセリオフトーラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、及びペニシリウム・クリゾゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）からなる群の種から選択される酵母又は糸状菌細胞が最も好ましい。本発明の細菌細胞は、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アナベーナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、エ��リバチルス（Ａｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、ブラジリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、コーロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、デスルホトマクルム（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）、デスルフリスポラ（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｓｐｏｒａ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ペロトマクルム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）（シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ））、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、及びストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）からなる群の属から選択される細菌細胞であるのが好ましく、エアリバチルス・パリダス（Ａ．ｐａｌｌｉｄｕｓ）、アネウリニバチルス・テラノベンシス（Ａ．ｔｅｒｒａｎｏｖｅｎｓｉｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・クリベンシス（Ｂ．ｋｒｉｂｂｅｎｓｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プンチス（Ｂ．ｐｕｎｔｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、ブレビバチルス・サーモルーバー（Ｂ．ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒ）、ブレビバチルス・パナチフミ（Ｂ．ｐａｎａｃｉｈｕｍｉ）、カプリアビダス・バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）、デスルホトマクルム・クズネツォビイ（Ｄ．ｋｕｚｎｅｔｓｏｖｉｉ）、デスルフリスポラ・サーモフィラ（Ｄ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ゲオバチルス・カウストフィルス（Ｇ．ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）、コーロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）ＣＢ１５、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ペロトマクルム・サーモ��ロピオニカム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、シュードモナス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、シノリゾビウム・メリオティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｏｔｉ）、及びリゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）からなる群の種から選択される細菌細胞であるのがより好ましい。
【０００８】
さらなる態様において、本発明は、上記の態様で定義したＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを調製する方法、及び／又は上記の態様で定義したフラン化合物輸送能力を有するポリペプチドを調製する方法に関する。本方法は、ポリペプチド（複数可）の発現を促進する条件下で、上記態様で定義した細胞を培養するステップと、任意選択で、ポリペプチド（複数可）を回収するステップとを含むのが好ましい。
【０００９】
別の態様において、本発明は、ＨＭＦＣＡの存在下で、好ましくは、細胞によるＨＭＦＣＡの酸化を促進する条件下で、上記態様のうちのいずれか１つに従って細胞をインキュベートするステップを含む、ＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させる方法に関する。
【００１０】
さらに別の態様において、本発明は、１つ又は複数のＦＤＣＡのフラン前駆体を含む培地中で、好ましくは細胞によるＦＤＣＡのフラン前駆体のＦＤＣＡへの酸化を促進する条件下で、上記態様のうちのいずれか１つに従って細胞をインキュベートするステップと、任意選択でＦＤＣＡを回収するステップを含む、ＦＤＣＡを生産する方法であって、ＦＤＣＡの少なくとも１つのフラン前駆体がＨＭＦ、２，５−ジヒドロキシメチルフラン（ＤＨＦ、又はＨＭＦ−ＯＨ）、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＡ及び２，５−ジホルミルフラン（ＤＦＦ）からなる群から選択されるのが好ましく、そのうちＨＭＦが最も好ましく、ＦＤＣＡのフラン前駆体が、好ましくは酸触媒による脱水によって、１つ又は複数のヘキソース糖、好ましくはリグノセルロースバイオマスから得られる１つ又は複数のヘキソース糖から得られ、ＦＤＣＡが酸又は塩沈澱、続いて冷却結晶化及び／又は溶媒抽出を含む方法によって培地から回収されるのが好ましい、ＦＤＣＡを生産する方法に関する。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、ａ）上記態様に記載の方法においてＦＤＣＡモノマーを調製するステップと；ａ）で得られたＦＤＣＡモノマーからポリマーを生産するステップとを含む、１つ又は複数のＦＤＣＡモノマーからポリマーを生産する方法に関する。
【００１２】
本発明はまた、１種又は複数のフラン前駆体をＦＤＣＡに生体内変換するための上記態様のいずれかに記載の細胞の使用に関し、ＦＤＣＡの少なくとも１つのフラン前駆体はＨＭＦ、ＤＨＦ、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＡ及びＤＦＦからなる群から選択されるのが好ましく、そのうち、ＨＭＦが最も好ましい。
【００１３】
他の一態様において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８１．８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドに関する。この態様において、本発明はまた、ａ）ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８１．８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；ｂ）配列番号１２又は１３に示されているヌクレオチド配列；ｃ）長さが１０、１５、２０、３０、５０又は１００ヌクレオチドである、（ａ）又は（ｂ）で定義したヌクレオチド配列の断片；ｄ）遺伝コードの縮重によってｂ）又はｃ）のヌクレオチド配列の配列とは配列が異なるヌクレオチド配列；及び、ｅ）ａ）〜ｃ）で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列、のうちの少なくとも１つを含む核酸分子であって、ベクターであるのが好ましい、核酸分子に関する。この態様において、本発明は、さらに、この態様のポリペプチド及びこの態様の核酸分子のうちの少なくとも１つを含む細胞であって、培養細胞であるのが好ましい、細胞に関する。
【００１４】
最後の態様において、本発明は、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくともＨＭＦＣＡを細胞内に輸送する能力を有するポリペプチドに関する。この態様において、本発明はまた、ａ）配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくともＨＭＦＣＡを細胞内に輸送する能力を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；ｂ）配列番号１８に示されているヌクレオチド配列；ｃ）長さが１０、１５、２０、３０、５０又は１００ヌクレオチドである、（ａ）又は（ｂ）で定義したヌクレオチド配列の断片；ｄ）遺伝コードの縮重によってｂ）又はｃ）のヌクレオチド配列の配列とは配列が異なるヌクレオチド配列；及び、ｅ）ａ）〜ｄ）で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列、のうちの少なくとも１つを含む核酸分子であって、ベクターであるのが好ましい、核酸分子に関する。この態様において、本発明は、さらに、この態様のポリペプチド及びこの態様の核酸分子のうちの少なくとも１つを含む細胞であって、培養細胞であるのが好ましい、細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１ａ】シュードモナス・プチダＣＡ２０４６によるＨＭＦの生体内変換（シュードモナス・プチダ；白抜きの円：ＨＭＦ（５−ヒドロキシメチルフルフラール）；白抜きの正方形：ＨＭＦＣＡ（５−ヒドロキシメチルフロン酸）；塗潰しの菱形：ＦＤＣＡ（２，５−フランジカルボン酸）；塗潰しの灰色円：ＯＤ６００）。
【図１ｂ】シュードモナス・プチダＣＡ２１０１によるＨＭＦの生体内変換；白抜きの円：ＨＭＦ（５−ヒドロキシメチルフルフラール）；白抜きの正方形：ＨＭＦＣＡ（５−ヒドロキシメチルフロン酸）；塗潰しの菱形：ＦＤＣＡ（２，５−フランジカルボン酸）；塗潰しの灰色円：ＯＤ６００。
【図２】カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４由来のＡｌｄｈ及びＨｍｆＴ１をＹｉａＹと共発現する、シュードモナス・プチダＣＡ２１１１によるＨＭＦの生体内変換；白抜きの円：ＨＭＦ（５−ヒドロキシメチルフルフラール）；白抜きの正方形：ＨＭＦＣＡ（５−ヒドロキシメチルフロン酸）；塗潰しの菱形：ＦＤＣＡ（２，５−フランジカルボン酸）；塗潰しの灰色円：ＯＤ６００。重複培養の平均を示す。
【図３】カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４由来のＡｌｄｈ及びＨｍｆＴ１をＹｉａＹと共発現する、シュードモナス・プチダＣＡ２１１２によるＨＭＦの生体内変換；白抜きの円：ＨＭＦ（５−ヒドロキシメチルフルフラール）；白抜きの正方形：ＨＭＦＣＡ（５−ヒドロキシメチルフロン酸）；塗潰しの菱形：ＦＤＣＡ（２，５−フランジカルボン酸）；塗潰しの灰色円：ＯＤ６００。重複培養の平均を示す。
【図４】バチルス・クリベンシスＤＳＭ１７８７１由来のＹｉａＹとカプリアビダス・バシレンシス由来のＡｌｄｈ及びＨｍｆＴ１を共発現する、シュードモナス・プチダＣＡ２１７８０によるＨＭＦの生体内変換。ＨＭＦ−ＯＨは、本明細書において「ＤＢＦ」とも呼ばれる、ジヒドロキシメチルフランである。
【図５】アネウリニバチルス・テラノベンシスＤＳＭ１８９１９由来のＹｉａＹとカプリアビダス・バシレンシス由来のＡｌｄｈ及びＨｍｆＴ１を共発現する、シュードモナス・プチダＣＡ２１７８１によるＨＭＦの生体内変換。ＨＭＦ−ＯＨは、本明細書において「ＤＨＦ」とも呼ばれる、ジヒドロキシメチルフランである。
【図６】ブレビバチルス・パナチフミＷ２５由来のＹｉａＹとカプリアビダス・バシレンシス由来のＡｌｄｈ及びＨｍｆＴ１を共発現する、シュードモナス・プチダＣＡ２１７８３によるＨＭＦの生体内変換。ＨＭＦ−ＯＨは、本明細書において「ＤＨＦ」とも呼ばれる、ジヒドロキシメチルフランである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義
用語「相同性」、「配列同一性」などは、本明細書では同義的に使用される。配列同一性は、本明細書において、配列を比較することにより決定する場合、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド若しくはタンパク質）配列又は２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の関係として定義される。当技術分野において、「同一性」はまた、場合によっては、こうした配列のストリング間のマッチによって決定する場合、アミノ酸配列又は核酸配列間の配列相関性の程度を意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法によって容易に計算することができる。
【００１７】
「配列同一性」及び「配列類似性」は、グローバルアラインメントアルゴリズム又はローカルアラインメントアルゴリズムを使用し、２つの配列の長さに基づいて、２つのペプチド配列又は２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定することができる。類似の長さの配列は、全長にわたって配列を最適に配列比較する、グローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈ）を使用し配列比較するのが好ましいが、実質的に異なる長さの配列は、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用し配列決定するのが好ましい。次いで、配列が（例えば、デフォルトパラメーターを使用してプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって最適に配列比較した場合）、配列同一性（下記で定義したとおりである）の少なくともある特定の最小パーセンテージを共有する場合、配列は、「実質的に同一の」又は「本質的に類似した」と称することができる。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して２つの配列をそれらの全長（完全長）にわたって配列比較し、マッチの数を最大限にし、ギャップの数を最小限にする。グローバルアラインメントは、２つの配列が類似の長さを有する場合の配列同一性を決定するために適切に使用される。一般に、ＧＡＰデフォルトパラメーターは、ギャップ生成ペナルティー＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）、及びギャップ伸長ペナルティー＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）で使用される。ヌクレオチドの場合、使用されるデフォルトスコアマトリックスはｎｗｓｇａｐｄｎａであり、またタンパク質の場合、デフォルトスコアマトリックスはＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，ＰＮＡＳ  ８９，９１５−９１９）。配列同一性パーセントに関する配列アラインメント及びスコアは、例えば、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  ９２１２１−３７５２  ＵＳＡから入手可能な、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３コンピュータプログラムを使用し、又はオープンソースのソフトウェア、例えば、ＥｍｂｏｓｓＷＩＮバージョン２．１０．０においてプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用）又は「ｗａｔｅｒ」（ローカルＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用）を使用し、上記ＧＡＰと同じパラメーターを使用し、或いはデフォルト設定（「ｎｅｅｄｌｅ」及び「ｗａｔｅｒ」の両方、並びにタンパク質アラインメント及びＤＮＡアラインメントの両方について、デフォルトＧａｐ開始ペナルティーは１０．０であり、デフォルトｇａｐ伸長ペナルティーは０．５である；デフォルトスコアリングマトリックスは、タンパク質についてはＢｌｏｓｓｕｍ６２であり、ＤＮＡについてはＤＮＡＦｕｌｌである）を使用することにより決定することができる。配列が実質的に異なる全長を有する場合、ローカルアラインメント、例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するのが好ましい。
【００１８】
或いは、類似性又は相同性パーセンテージは、アルゴリズム、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどを使用し、公的データベースに対して検索することにより決定することができる。したがって、本発明の核酸配列及びタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバー又は関連の配列を同定するための公的データベースに対して検索を実施する「照会配列」としてさらに使用することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明のオキシドレダクターゼ核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３により実施することができる。比較目的でギャップアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：  ３３８９−３４０２に開示されているようにして、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラム及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／の米国バイオテクノロジー情報センターのホームページを参照されたい。
【００１９】
任意選択で、アミノ酸類似性の程度を決定する際に、当業者はまた、当業者には明らかな、いわゆる「保存的」アミノ酸置換も考慮に入れることができる。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の基は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の基は、セリン及びスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の基は、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の基は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の基は、リジン、アルギニン及びヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の基は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書に開示されているアミノ酸配列の置換変異体は、開示されている配列の少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されたものである。アミノ酸変化は保存的であるのが好ましい。それぞれの天然のアミノ酸に対する好ましい保存的置換は以下のとおりである：Ａｌａからｓｅｒ；Ａｒｇからｌｙｓ；Ａｓｎからｇｌｎ又はｈｉｓ；Ａｓｐからｇｌｕ；Ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａ；Ｇｌｎからａｓｎ；Ｇｌｕからａｓｐ；Ｇｌｙからｐｒｏ；Ｈｉｓからａｓｎ又はｇｌｎ；Ｉｌｅからｌｅｕ又はｖａｌ；Ｌｅｕからｉｌｅ又はｖａｌ；Ｌｙｓからａｒｇ；ｇｌｎ又はｇｌｕ；Ｍｅｔからｌｅｕ又はｉｌｅ；Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕ又はｔｙｒ；Ｓｅｒからｔｈｒ；Ｔｈｒからｓｅｒ；Ｔｒｐからｔｙｒ；Ｔｙｒからｔｒｐ又はｐｈｅ；及びＶａｌからｉｌｅ又はｌｅｕ。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「選択的にハイブリダイズする（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」、「選択的にハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ）」及び同類の用語は、相互に少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、よりさらに好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％相同であるヌクレオチド配列が、相互にハイブリダイズされた状態を典型的に維持するハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を記載することを意図している。言い換えると、このようなハイブリダイズする配列は、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、よりさらに好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有し得る。
【００２１】
こうしたハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定例では、約４５℃で、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でハイブリダイゼーションを行い、続いて約５０℃、好ましくは約５５℃、好ましくは約６０℃、さらにより好ましくは約６５℃で、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回又は複数回洗浄する。
【００２２】
高ストリンジェント条件としては、例えば、約６８℃で、５×ＳＳＣ／５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液／１．０％ＳＤＳ中でハイブリダイズし、室温で、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で洗浄することが含まれる。或いは、洗浄は４２℃で実施することができる。
【００２３】
当業者は、ストリンジェント条件及び高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件に関してどのような条件を適用するべきかがわかっている。こうした条件に関するさらなる手引きは、当技術分野においては容易に入手可能であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  （２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．）がある。
【００２４】
もちろん、ポリＡ配列（ｍＲＮＡの３’末端ポリ（Ａ）トラクトなど）又はＴ（若しくはＵ）残基の相補的ストレッチに対してのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチ又はその相補体（例えば、実際には任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含有する任意の核酸分子にもハイブリダイズするため、本発明の核酸の一部に特異的にハイブリダイズさせるために使用される本発明のポリヌクレオチドには含まれない。
【００２５】
「核酸構築物」又は「核酸ベクター」は、本明細書においては、組換えＤＮＡ技術を使用することによって得られる人工の核酸分子を意味すると理解されたい。したがって、用語「核酸構築物」は、天然の核酸分子を含まないが、核酸構築物は、天然の核酸分子（の一部）を含み得る。用語「発現ベクター」又は「発現構築物」とは、こうした配列と適合する宿主細胞又は宿主生物中の遺伝子の発現を達成することができるヌクレオチド配列を意味する。これらの発現ベクターは、典型的には、少なくとも適切な転写制御配列を含み、任意選択で、３’転写終止シグナルを含む。発現の達成に必要な、又は有用であるさらなる因子、例えば、発現エンハンサーエレメントなども存在し得る。発現ベクターは適切な宿主細胞に導入され、宿主細胞のインビトロ細胞培養においてコード配列の発現を達成することができる。発現ベクターは、本発明の宿主細胞又は生物における複製に適している。
【００２６】
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」又は「転写制御配列」とは、１つ又は複数のコード配列の転写を制御するように機能し、コード配列の転写開始部位の転写の方向に関して上流に位置している核酸断片を意味し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに関する結合部位、転写開始部位、並びに限定するものではないが、転写因子結合部位、抑制因子及びアクチベータータンパク質結合部位を含む別の任意のＤＮＡ配列、並びに、プロモーターからの転写量を制御するために直接的又は間接的に作用することが当業者に知られているヌクレオチドの別の任意の配列の存在によって構造的に同定される。「構成性」プロモーターは、ほとんどの生理学的及び発生的条件下で、ほとんどの組織において活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、例えば、化学誘導物質を適用することによって、生理学的又は発生的に制御されるプロモーターである。
【００２７】
用語「選択可能マーカー」は、当業者によく知られている用語であり、本明細書においては、発現された場合に、選択可能マーカーを含有している１個又は複数の細胞を選択するために使用することができる、任意の遺伝子実体を記載するために使用されている。用語「リポーター」とは、可視マーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などを意味するために主として使用されるが、マーカーと同義的に使用され得る。選択可能マーカーは、優性又は劣性又は双方向であってよい。
【００２８】
本明細書において使用する場合、用語「作動可能に連結されている」とは、機能的関係におけるポリヌクレオチドエレメントの連結を意味する。核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結されている」。例えば、転写制御配列は、コード配列の転写に作用する場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されているとは、連結しているＤＮＡ配列が典型的には連続的であり、必要な場合、２つのタンパク質コード領域に、連続的にリーディングフレーム内で結合されていることを意味する。
【００２９】
用語「タンパク質」又は「ポリペプチド」は同義的に使用され、特定の作用機序、サイズ、３次元構造又は起源に関係なく、アミノ酸鎖からなる分子を意味する。
【００３０】
用語「遺伝子」は、適切な制御領域（例えばプロモーター）に作動可能に連結されている、細胞においてＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）を含むＤＮＡ断片を意味する。遺伝子は、通常、数種類の作動可能に連結されている断片、例えば、プロモーター、５’リーダー配列、コード領域及びポリアデニル化部位を含む３’−非翻訳配列（３’−末端）を含む。「遺伝子の発現」とは、適切な制御領域、特にプロモーターに作動可能に連結されているＤＮＡ領域が、生物学的に活性である、すなわち、生物学的に活性であるタンパク質又はペプチドに翻訳され得る、ＲＮＡに転写されるプロセスを意味する。用語「相同体」とは、所定の（組換え）核酸又はポリペプチド分子と所定の宿主生物又は宿主細胞との間の関係を示すために使用される場合、本質的に、核酸又はポリペプチド分子が宿主細胞又は同種の生物、好ましくは同一系統又は同一株の生物によって産生されることを意味するものと理解されたい。宿主細胞に対して相同体である場合、ポリペプチドをコードしている核酸配列は、典型的には（しかし必須ではない）、別の（異種性）プロモーター配列に作動可能に連結され、適用可能な場合、その天然環境の場合よりも別の（異種性）分泌シグナル配列及び／又はターミネーター配列に連結される。制御配列、シグナル配列、ターミネーター配列などもまた、宿主細胞に対して相同体であり得ることを理解されたい。これに関連して、「相同体」配列エレメントのみの使用は、「自己クローン化」遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）を構築することができる（自己クローニングは、本明細書においてはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ９８／８１／ＥＣ  Ａｎｎｅｘ  ＩＩ）のとおり定義する）。２つの核酸配列の相関性を示すために使用する場合、用語「相同体」とは、１つの一本鎖核酸配列が相補的な一本鎖核酸配列にハイブリダイズし得ることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、配列間の同一性の量、並びにハイブリダイゼーション条件、例えば、後で論じるような温度及び塩濃度などを含む多数の要因に依存し得る。
【００３１】
用語「異種性」及び「外因性」とは、核酸（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）又はタンパク質に関して使用する場合、存在する生物、細胞、ゲノム又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列の一部として天然には生じない核酸又はタンパク質を意味するか、或いは、細胞又はゲノム若しくはＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列における１つ又は複数の位置で天然に確認されるものとは異なることが確認される核酸又はタンパク質を意味する。異種性及び外因性の核酸又はタンパク質は、導入される細胞に対して内因性ではないが、別の細胞から取得されたか、又は合成的に若しくは組換えにより産生された。一般的には、必ずしもそうではないが、こうした核酸は、通常、ＤＮＡが転写又は発現される細胞によって産生されないタンパク質、すなわち、外因性タンパク質をコードする。同様に、外因性ＲＮＡは、外因性ＲＮＡが存在する細胞において通常発現されないタンパク質をコードする。異種性／外因性の核酸及びタンパク質はまた、外来核酸又はタンパク質と呼ぶこともできる。発現される細胞に対して外来性として当業者が認識する任意の核酸又はタンパク質は、異種性又は外因性の核酸又はタンパク質という用語によって本明細書に包含される。異種性及び外因性という用語はまた、核酸配列又はアミノ酸配列の非天然の組合せ、すなわち、少なくとも２つの組み合わせた配列が相互に外来である組合せにも適用される。
【００３２】
酵素の「比活性」とは、本明細書では、通常、全宿主細胞タンパク質のｍｇ当たりの酵素単位活性で表される、全宿主細胞タンパク質の量当たりの特定酵素の活性量を意味するものと理解されたい。本発明の関連において、特定酵素の比活性は、（さもなければ同一の）野性型宿主細胞におけるその酵素の比活性と比べ、増加又は低減され得る。
【００３３】
「フラン化合物」とは、本明細書では、２，５−フラン−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）、並びに、ＦＤＣＡに酸化され得るフラン基を有する任意の化合物であると理解するものとし、後者は、本明細書において、「ＦＤＣＡの前駆体」又は「ＦＤＣＡのフラン前駆体」として言及されている。ＦＤＣＡの前駆体としては、少なくとも、５−ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）、２，５−ジヒドロキシメチルフラン（ＤＨＦ若しくはＨＭＦ−ＯＨ）又は２，５−ビス（ヒドロキシメチル）フラン（ＢＨＦ）、５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸、又は５−ヒドロキシメチル−２−フロ酸又は（ＨＭＦＣＡ）、５−ホルミル−２−フロ酸（ＦＦＡ）、及び２，５−ジホルミルフラン（ＤＦＦ）が挙げられる。「フラン化合物」において、フラン環又は任意の若しくはその置換可能な側鎖基は、任意の利用可能な位置のフラン環において、例えば、環状基を含む、ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、アルキル、アリル、アリール又はＲＯ−エーテル部分で置換され得ることをさらに理解されたい。
【００３４】
本明細書における公開配列データベースにアクセス可能なヌクレオチド又はアミノ酸配列へのいかなる言及も、この文書の出願日に入手可能な配列のエントリーバージョンを意味する。
【００３５】
ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼを発現する細胞
第１の態様において、本発明は、５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸（ＨＭＦＣＡ）を５−ホルミルフロ酸（ＦＦＡ）に酸化させる能力を有する細胞に関する。ＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させる能力は、ＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させる能力を有するデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を含む核酸構築物で細胞を形質転換することによって細胞に付与する又は細胞において増大させるのが好ましい。デヒドロゲナーゼは、アルコールデヒドロゲナーゼであるのが好ましい（すなわち、ＥＣ１．１活性を有する）。したがって、細胞は、ＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させる能力を有するデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含む細胞であるのが好ましい。本発明の好ましい細胞において、発現構築物は細胞において発現可能であり、デヒドロゲナーゼの発現は、発現構築物を欠損している対応する細胞、例えば野性型細胞と比べ、ＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させる能力を細胞に付与する又は細胞において増大させるのが好ましい。ＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させる酵素の比活性は、発現構築物を欠損している対応する細胞と比べ、少なくとも１．０５、１．１、１．２、１．５、２．０、５．０、１０、２０、５０又は１００倍、細胞において増大させるのが好ましい。
【００３６】
ＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させる能力を有するデヒドロゲナーゼは、したがって、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するアルコールデヒドロゲナーゼである。ポリペプチドがＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するか否かについては、ＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させることができない適切な宿主細胞中でポリペプチドを発現させ、ポリペプチドの発現がＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させる能力を細胞に付与するか否かを検出することによってアッセイすることができる。ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性は、本明細書の実施例ＩＶに記載しているようにアッセイされるのが好ましく、それによって、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイされるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列がｐＢＴ’ｈｍｆＨ−ａｄｈのカプリアビダス・バシレンシスｈｍｆＨ遺伝子（国際公開第２０１２／０６４１９５号に開示されている）と置き換わり、その後、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイされるポリペプチドのコード配列を含むプラスミドが、ｐＪＮＮｈｍｆＴ１（ｔ）を含有するシュードモナス・プチダＫＴ２４４０Δｇｃｄ（国際公開第２０１２０６４１９５号に開示されている）に導入される。ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイされるポリペプチドを発現するシュードモナス・プチダ形質転換体をＨＭＦとインキュベートし、ＦＤＣＡを分析するため試料を一定間隔で得る。ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性（及びｈｍｆＨ遺伝子）についてアッセイされるポリペプチドを欠損している対応するシュードモナス・プチダ形質転換体と比べた場合のＦＤＣＡ生産の増加は、ポリペプチドがＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有することを示唆しているものと考えられる。
【００３７】
本発明の細胞において発現されるＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼは、アデニンジヌクレオチドから選択される補因子に依存するデヒドロゲナーゼ、例えば、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、及びピロロキノリンキノロン（ＰＱＱ）などであるのが好ましい。
【００３８】
本発明の細胞において発現されるＦＥＶＩＦＣＡデヒドロゲナーゼは、別のフランアルコール、好ましくは２位にヒドロキシ基を有するフランアルコールを対応するアルデヒドに酸化させる能力を（さらにまた）有するアルコールデヒドロゲナーゼであるのがさらに好ましい。したがって、ＦＥＶＩＦＣＡデヒドロゲナーゼは、５−ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）を２，５−ジホルミルフラン（ＤＦＦ）に酸化させる能力を有するのが好ましい。
【００３９】
一実施形態において、ＦＥＶＩＦＣＡをＦＦＡに酸化させる能力を有するデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列は、
（ａ）ポリペプチドが配列番号１（エアリバチルス・パリダス）、配列番号２（バチルス・クリベンシス）、配列番号３（ゲオバチルス・カウストフィルス）、配列番号４（アネウリニバチルス・テラノベンシス）、配列番号５（ブレビバチルス・サーモルーバー）、配列番号６（ブレビバチルス・パナチフミ）、配列番号７（バチルス属の種ＦＪＡＴ−１４５７８）、配列番号８（デスルホトマクルム・クズネツォビイ）、配列番号９（デスルフリスポラ・サーモフィラ）、配列番号１０（バチルス属の種．Ｌ１（２０１２））、及び配列番号１１（ペロトマクルム・サーモプロピオニカム）のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８１．６５、８１．７、８１．８、８１．８５、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＦＥＶＩＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；
（ｂ）その相補鎖が（ａ）のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列；並びに、
（ｃ）その配列が遺伝コードの縮重により（ｂ）のヌクレオチド配列の配列とは異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択される。
【００４０】
したがって、本発明の好ましいヌクレオチド配列は、バチラス目（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）又はクロストリジア目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）の細菌から得ることができる（又は天然の）ＦＥＶＩＦＣＡデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するＦＥＶＩＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードしている。好ましい一実施形態において、細菌は、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）の細菌であり、細菌がエアリバチルス属、ゲオバチルス属及びバチルス属の細菌であるのがより好ましく、そのうち、エアリバチルス・パリダス、バチルス・クリベンシス、ゲオバチルス・カウストフィルス、アネウリニバチルス・テラノベンシス、バチルス属の種ＦＪＡＴ−１４５７８、及びバチルス属の種Ｌ１（２０１２）が最も好ましい。別の好ましい実施形態において、細菌は、パエニバチルス科（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）の細菌であり、アネウリニバチルス及びブレビバクテリウム属の細菌がより好ましく、そのうち、アネウリニバチルス・テラノベンシス、ブレビバチルス・サーモルーバー、及びブレビバチルス・パナチフミの種が最も好ましい。さらに別の好ましい実施形態において、細菌は、ペプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）の細菌であり、細菌がデスルホトマクルム、デスルフリスポラ及びペロトマクルム属であるのがより好ましく、そのうち、デスルホトマクルム・クズネツォビイ、デスルフリスポラ・サーモフィラ、及びペロトマクルム・サーモプロピオニカムの種が最も好ましい。
【００４１】
一実施形態において、本発明の好ましいヌクレオチド配列は、中温細菌、すなわち、適温において、典型的には２０〜４５℃の間で最も増殖する細菌由来のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードする。本発明のヌクレオチド配列は、２０〜４５℃の範囲において最適な活性及び安定性を有する中温性ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードするのが好ましい。このような中温性デヒドロゲナーゼの例は、例えば、バチルス・クリベンシス（３０℃）、アネウリニバチルス・テラノベンシス（４０℃）、ブレビバチルス・サーモルーバー（４５℃）、ブレビバチルス・パナチフミ（３０℃）、バチルス属の種ＦＪＡＴ−１４５７８（３０℃）、及びバチルス属の種Ｌ１（２０１２）（３０〜５０℃）由来のデヒドロゲナーゼ、並びにこれに関連するデヒドロゲナーゼである。
【００４２】
一実施形態において、本発明の好ましいヌクレオチド配列は、高温細菌、すなわち、比較的高温において、典型的には４５℃と１２２℃の間の高い温度で最も増殖する細菌由来のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードする。したがって、本発明のヌクレオチド配列は、４５℃と１２２℃の間の高い温度の範囲において最適な活性及び安定性を有する好熱性ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードするのが好ましい。このような好熱性デヒドロゲナーゼの例は、例えば、エアリバチルス・パリダス（５５℃）、ゲオバチルス・カウストフィルス（５５℃）、デスルホトマクルム・クズネツォビイ（６０℃）、デスルフリスポラ・サーモフィラ（５０℃）、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム（５５℃）、及びバチルス属の種Ｌ１（２０１２）（３０〜５０℃）由来のデヒドロゲナーゼ、並びにこれに関連するデヒドロゲナーゼである。
【００４３】
一実施形態において、本ヌクレオチド配列は、天然に存在するような、例えば、野性型供給源生物から単離され得るような、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。或いは、本ヌクレオチド配列は、上記で定義したＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼのいずれかの操作された形態をコードし、対応する天然のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼと比べて１つ又は複数のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含むが、本明細書において定義した相同性又は類似性の範囲内にあり得る。したがって、一実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードし、そのアミノ酸配列がそれぞれの不変位置（表２において「＊」で示される）に、不変位置に存在するアミノ酸を少なくとも含む。アミノ酸配列はまた、高度に保存された位置（表２において「：」で示される）に、強度に保存された位置に存在するアミノ酸のうちの１つを含むのが好ましい。アミノ酸配列はさらにまた、それほど高度に保存されていない位置（表２において「．」で示される）に、それほど高度に保存されていない位置に存在するアミノ酸のうちの１つを含むのがより好ましい。これらの不変位置及び保存位置の外側のアミノ酸置換は、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性に影響する可能性は低い。
【００４４】
ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている本発明のヌクレオチド配列は、当技術分野でそれ自体が周知であるヌクレオチド配列の単離方法を利用して、真菌、酵母又は細菌のゲノム及び／又はｃＤＮＡ、例えば、上述の供給源生物と同じ門、クラス又は属に属するものから得ることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。本発明のヌクレオチド配列は、例えば、ａ）（保存アミノ酸配列に基づいて設計された）縮重ＰＣＲプライマーを適切な生物のゲノム及び／又はｃＤＮＡに使用して、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の一部を含むＰＣＲ断片を生成する；ｂ）ａ）で得られたＰＣＲ断片をプローブとして使用し、生物のｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーをスクリーニングする；並びに、ｃ）ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを産生する、方法で得ることができる。
【００４５】
本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼが本発明の形質転換細胞において十分なレベルで、活性形態で発現される可能性を高めるために、これらの酵素をコードしているヌクレオチド配列、並びに本発明の他の酵素（下記を参照）は、それらのコドン使用を当該宿主細胞の使用に最適化するように構成されるのが好ましい。ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の宿主細胞のコドン使用に対する適応構成性（ａｄａｐｔｉｖｅｎｅｓｓ）は、コドン適応構成指数（ＣＡＩ（ｃｏｄｏｎ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ））として表すことができる。コドン適応構成指数は、本明細書において、特定の宿主細胞又は生物における高度発現遺伝子のコドン使用に対する遺伝子のコドン使用の相対的な適応構成性の測定値として定義される。それぞれのコドンの相対的適応構成性（ｗ）は、同じアミノ酸に関する最も豊富なコドンの使用に対する、それぞれのコドンの使用比率である。ＣＡＩ指数は、これらの相対的な適応構成性値の幾何平均として定義される。非同義コドン及び終止コドン（遺伝コードに依存する）は除外される。ＣＡＩ値は０〜１の範囲であり、高い値は最も豊富なコドンが高い割合であることを示す（Ｓｈａｒｐ  ａｎｄ  Ｌｉ，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：１２８１−１２９５を参照；また、Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（８）：２２４２−５１も参照）。適応構成されたヌクレオチド配列は、少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８又は０．９のＣＡＩを有するのが好ましい。シュードモナス・プチダ細胞における発現に対して最適化されたコドンであった、配列番号１３又は１４に記載されている配列が最も好ましい。
【００４６】
本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための核酸構築物で形質転換される宿主細胞は、原則として、本ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ発明が、好ましくは機能的に、すなわち活性型で適切に発現され得る、任意の宿主細胞であり得る。本発明の宿主細胞は、フラン化合物の細胞内及び細胞外への能動輸送又は受動輸送が可能な宿主であるのが好ましい。本発明の好ましい宿主細胞は、カルボキシル化されたフラン化合物、例えば、特にＨＭＦＣＡ、ＦＦＡ及びＦＤＣＡを脱カルボキシル化する検出可能な活性を欠損しているか、有していない。このような宿主細胞は、カルボキシル化されたフラン化合物を脱カルボキシル化する能力を自然に欠損しているのが好ましい。
【００４７】
宿主細胞は、培養細胞、例えば、発酵プロセスにおいて、好ましくは液中発酵において培養することができる細胞であるのが好ましい。
【００４８】
一実施形態によれば、本発明に記載の宿主細胞は、真核宿主細胞である。真核細胞は、哺乳動物、昆虫、植物、真菌又は藻類の細胞であるのが好ましい。好ましい哺乳動物細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＰｅｒＣ６細胞、及びハイブリドーマが挙げられる。好ましい昆虫細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞及びＳｆ２１細胞、並びにそれらの誘導体が挙げられる。
【００４９】
しかし、宿主細胞は微生物細胞であるのが好ましい。細胞は、真核微生物細胞、好ましくは真菌細胞、例えば、酵母又は糸状菌細胞であり得る。好ましい酵母宿主細胞としては、例えば、カンジダ、ハンゼヌラ、クリベロミセス、ピチア、サッカロマイセス、シゾサッカロミセス及びヤロウイアなどの属の酵母細胞が挙げられる。クリベロミセス・ラクチス、サッカロミセス・セルビシエ、ハンゼヌラ・ポリモルファ、ヤロウイア・リポリティカ及びピチア・パストリスなどの種の酵母がより好ましい。好ましい糸状菌細胞としては、例えば、アクレモニウム、アガリクス、アスペルギルス、アウレオバシディウム、ミセリオフトーラ、クリソスポリウム、コプリナス、クリプトコックス、フィリバシジウム、フザリウム、フミコラ、マグナポルテ、ムコール、ミセリオフトーラ、ネオカリマスティクス、ニューロスポラ、ペシロミセス、ペニシリウム、ピロミセス、パネロカエテ、プロイロータス、シゾフィラム、タラロミセス、サーモアスカス、チエラビア、トリポクラジウム属、及びトリコデルマ属などの属の糸状真菌細胞が挙げられる。アスペルギルス、ミセリオフトーラ、ペニシリウム、ミセリオフトーラ、タラロミセス又はトリコデルマの属の種に属する糸状真菌細胞が好ましく、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ソジェ、アスペルギルス・フミガーツス、タラロミセス・エメルソニ、アスペルギルス・オリゼ、ミセリオフトーラ・サーモフィラ、トリコデルマ・リーゼイ及びペニシリウム・クリゾゲヌムから選択される種であるのが最も好ましい。
【００５０】
また微生物宿主細胞は原核細胞であってよく、細菌細胞が好ましい。用語「細菌細胞」には、グラム陰性微生物及びグラム陽性微生物の両方が含まれる。適切な細菌は、エシェリヒア、アナベーナ、エアリバチルス、アネウリニバチルス、バークホルデリア、ブラジリゾビウム、コーロバクター、カプリアビダス、デスルホトマクルム、デスルフリスポラ、グルコノバクター、ロドバクター、ペロトマクルム、シュードモナス、パラコッカス、バチルス、ゲオバチルス、ブレビバチルス、ブレビバクテリウム、コリネバクテリウム、リゾビウム（シノリゾビウム）、フラボバクテリウム、クレブシェラ、エンテロバクター、ラクトバチルス、ラクトコッカス、メチロバクテリウム、ラルストニア、ロドシュードモナス、スタフィロコッカス、及びストレプトミセスの属から選択することができる。細菌細胞は、エアリバチルス・パリダス、アネウリニバチルス・テラノベンシス、バチルス・スブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアグランス、バチルス・クリベンシス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・プンチス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ハロデュランス、バチルス・プミルス、バチルス・サーモルーバー、バチルス・パナチフミ、カプリアビダス・バシレンシス、デスルホトマクルム・クズネツォビイ、デスルフリスポラ・サーモフィラ、ゲオバチルス・カウストフィルス、グルコノバクター・オキシダンス、コーロバクター・クレセンタスＣＢ１５、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、ロドバクター・スフェロイデス、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム、シュードモナス・ゼアキサンチニファシエンス、シュードモナス・プチダ、パラコッカス・デニトリフィカンス、大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミクム、スタフィロコッカス・カルノーサス、ストレプトミセス・リビダンス、シノリゾビウム・メリオティ、及びリゾビウム・ラジオバクターからなる群の種から選択されるのが好ましい。シュードモナス・プチダ種のうち、シュードモナス・プチダＳ１２株及びシュードモナス・プチダＫＴ２４４０株が好ましい。
【００５１】
本発明による宿主細胞において生産される化合物の特定の使用において、宿主細胞の選択はこうした使用に従って行われ得る。例えば、本発明による宿主細胞において産生される化合物が食品用途において使用される場合、宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエなどの食品等級生物から選択することができる。特定の使用としては、限定するものではないが、食品、（動物用）飼料、医薬品、作物防除など農業、及び／又はパーソナルケアでの使用が挙げられる。
【００５２】
本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物は、構築物で形質転換された宿主細胞に対して異種性又は外因性である発現構築物であるのが好ましい。構築物は、本明細書においては、構築物が宿主細胞中に天然に存在しない少なくとも１つの配列又は配列エレメントを含む場合、及び／又は構築物が組合せにおいて少なくとも２つの配列エレメントを含む場合、及び／又はエレメントがそれ自体宿主細胞中に天然に存在していても、宿主細胞中で天然に存在しない生じない命令を含む場合に、構築物を含む宿主細胞に対して異種性又は外因性であると理解されたい。
【００５３】
適切な宿主細胞における本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するためのベクター及び発現構築物は、以下の本明細書において、より詳細に記載する。
【００５４】
本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼを発現する形質転換細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する（すなわち、ＥＣ１．２活性を有する）のがさらに好ましい。アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、フランアルデヒドを変換することができることが好ましい。アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させることができることがより好ましい。より詳細には、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させること、ｉｉ）２，５−ジホルミルフラン（ＤＦＦ）を５−ホルミル−２−フロ酸（ＦＦＡ）に酸化すること、及びｉｉｉ）ＦＦＡをＦＤＣＡに酸化すること、のうちの少なくとも１つを可能にし得ることが好ましい。こうしたフランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、細胞の内因性活性であってもよく、又は細胞へ付与される外因性活性であってもよい。フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、第２の発現構築物で細胞を形質転換することによって、細胞に付与する又は細胞において増大させるのが好ましい。本発明の好ましい細胞において、第２の発現構築物は細胞において発現可能であり、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現は、発現構築物を欠損する対応する細胞、例えば野性型細胞と比べ、ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させること、ｉｉ）ＤＦＦをＦＦＡに酸化させること、及びｉｉｉ）ＦＦＡをＦＤＣＡに酸化させること、のうちの少なくとも１つの酸化させる能力を細胞に付与する又は細胞において増大させるのが好ましい。フランアルデヒドデヒドロゲナーゼの比活性は、発現構築物を欠損する対応する細胞と比べ、少なくとも１．０５、１．１、１．２、１．５、２．０、５．０、１０、２０、５０又は１００倍、細胞において増大させるのが好ましい。第２の発現構築物は、
ａ）ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させること、ｉｉ）ＤＦＦをＦＦＡに酸化させること、及びｉｉｉ）ＦＦＡをＦＤＣＡに酸化させること、のうちの少なくとも１つの能力を有し、
ｂ）配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９及び３０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むのが好ましい。
【００５５】
ｉ）ＨＭＦからＨＭＦＣＡ、ｉｉ）ＤＦＦからＦＦＡ、及びｉｉｉ）ＦＦＡからＦＤＣＡのうちの少なくとも１つを酸化させるポリペプチドの能力は、例えば、国際公開第２０１２／０６４１９５号の実施例ＩＶに記載されているようにして、シュードモナス・プチダ宿主細胞、好ましくはシュードモナス・プチダＫＴ２４４０宿主細胞において、ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を、カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４由来のＨｍｆＨ及びＨｍｆＴ１遺伝子と一緒に共発現させ、１０ｍＭのＨＭＦ中でシュードモナス・プチダ細胞をインキュベートし、ポリペプチドを発現しない対応するシュードモナス・プチダ細胞と比較し、蓄積ＦＤＣＡの増大を検出することによってアッセイすることができる。ポリペプチドがＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化させる能力はまた、Ｋｏｏｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０，  ＰＮＡＳ（前掲）によってアッセイすることもできる。カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４由来のＨｍｆＴ１遺伝子を発現する株は、本明細書においては、配列番号３１のアミノ酸配列を有する遺伝子産物を発現すると理解されたい。
【００５６】
本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼを発現する形質転換細胞は、フラン化合物を細胞内及び／又は細胞外に輸送する能力を有するのがさらに好ましい。細胞は、ＦＤＣＡの前駆体であるフラン化合物を細胞内に輸送する能力を有しているのが好ましく、ＦＤＣＡを細胞外に輸送する能力を有しているのが好ましい。こうしたフラン化合物の輸送能力は、細胞の内因性能力であり得、及び／又は細胞に付与される外因性能力であり得る。したがって、本発明の好ましい細胞は、フラン化合物輸送能力を有するポリペプチドを発現する。細胞は、ＨＭＦＣＡ輸送能力を有するポリペプチドを発現するのがより好ましい。ＨＭＦＣＡ輸送能力は、ＨＭＦＣＡを細胞内に輸送する能力を少なくとも含むものと理解されたい。ＨＭＦＣＡ輸送能力を有するポリペプチドの発現は、ＨＭＦＣＡの細胞内への輸送を増大させ、これはＦＤＣＡへの細胞内変換の利用可能性を増大させる。したがって、ＨＭＦＣＡ生物変換が改善され得る。
【００５７】
フラン化合物を細胞内及び／又は細胞外に輸送する能力は、第３の発現構築物で細胞を形質転換することによって、細胞に付与する又は細胞において増大させるのが好ましい。本発明の好ましい細胞において、第３の発現構築物は細胞において発現可能であり、フラン化合物トランスポーターの発現は、発現構築物を欠損する対応する細胞、例えば野性型細胞と比べ、少なくともＨＭＦＣＡを細胞内へ輸送する能力を細胞に付与する又は細胞において増大させるのが好ましい。第３の発現構築物は、
ａ）少なくともＨＭＦＣＡ輸送能力を有し；
ｂ）配列番号１７、３１、３２、３３及び３４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むのが好ましい。
【００５８】
ポリペプチドがフラン化合物、特にＨＭＦＣＡを細胞内に輸送する能力は、例えば、国際公開第２０１２／０６４１９５号の実施例ＩＶに記載されているようにして、トランスポーターポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を、シュードモナス・プチダ宿主細胞、好ましくはシュードモナス・プチダＫＴ２４４０宿主細胞において、カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４由来のＨｍｆＨ遺伝子、及び（国際公開第２０１２／０６４１９５号の配列番号１９のアミノ酸配列を有する）カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４由来のＨＭＦ分解オペロンに関連するフランアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子と一緒に共発現させ、１０ｍＭのＨＭＦ中でシュードモナス・プチダ細胞をインキュベートし、トランスポーターポリペプチドを発現しない対応するシュードモナス・プチダ細胞と比較し、蓄積ＦＤＣＡの増大を検出することによってアッセイすることができる。
【００５９】
一実施形態において、ヌクレオチド配列は、天然に存在する場合、例えば、野性型供給源生物から単離され得る場合、ＨＭＦＣＡ輸送能力を有するポリペプチドをコードしている。或いは、ヌクレオチド配列は、ＨＭＦＣＡ輸送能力を有する対応する天然のポリペプチドと比較して、１つ又は複数のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含むが、それが本明細書で定義した同一性又は類似性の範囲内である、上記で定義したようなＨＭＦＣＡ輸送能力を有するポリペプチドのいずれかの操作された形態をコードすることができる。したがって、一実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、ＨＭＦＣＡ輸送能力を有するポリペプチドをコードしており、そのアミノ酸配列はそれぞれの不変位置（表３において「＊」で示されている）に少なくとも含まれ、アミノ酸は不変位置に存在する。アミノ酸配列はまた、高度に保存された位置（表３において「：」で示されている）にも含まれ、アミノ酸のうちの１つが高度に保存された位置に存在するのが好ましい。さらにまた、アミノ酸配列はそれほど高度に保存されていない位置（表３において「．」で示されている）に含まれ、アミノ酸のうちの１つがそれほど高度に保存されていない位置に存在するのがより好ましい。これらの不変位置及び保存位置以外のアミノ酸置換は、ＨＭＦＣＡ輸送能力に影響する可能性は低い。
【００６０】
ＨＭＦＣＡ輸送能力を有するポリペプチドをコードしている本発明のヌクレオチド配列は、当技術分野でそれ自体は周知であるヌクレオチド配列を単離するための方法を使用し、本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列に関して上述したのと同様の方法で、真菌、酵母又は細菌、例えば、上記の供給源生物と同じ門、クラス又は属に属するもののゲノム及び／又はｃＤＮＡから取得することができる。
【００６１】
フラン化合物のトランスポーターを発現する細胞
第２の態様において、本発明は、フラン化合物輸送能力を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現する細胞に関する。本細胞は、フラン化合物輸送能力を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物で形質転換されるのが好ましい。フラン化合物輸送能力を有するポリペプチドは、ＨＭＦＣＡを細胞内に輸送する能力を少なくとも含む、ＨＭＦＣＡ輸送能力を有するポリペプチドであるのが好ましい。本細胞は、ポリペプチドが配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８６．５、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくともＨＭＦＣＡを細胞内に輸送する能力を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含むのが好ましく、発現構築物は細胞において発現可能であり、ポリペプチドの発現は、発現構築物を欠損している対応する野生型細胞と比べ、少なくともＨＭＦＣＡを細胞内に輸送する能力を細胞に付与する又は細胞において増大させる。ポリペプチドがフラン化合物、特にＨＭＦＣＡを細胞内に輸送する能力は、上述のようにアッセイすることができる。
【００６２】
本発明のこの態様のフラン化合物のトランスポーターを発現する形質転換細胞は、ＨＭＦをＦＤＣＡに変換するための活性が、
ａ）ＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させるアルコールデヒドロゲナーゼ及びフランアルデヒドを対応するフランカルボン酸へ酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性；
ｂ）ＨＭＦ、２，５−ジヒドロキシメチルフラン、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＡ及び２，５−ジホルミルフランのうちの１種又は複数をＦＤＣＡに酸化させるオキシドレダクターゼ、好ましくはオキシダーゼ、並びに任意選択で、フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸へ酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、
のうちの少なくとも１つを好ましくは含む、ＨＭＦをＦＤＣＡに変換するための酵素活性をさらに含むのが好ましい。
【００６３】
ＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させるアルコールデヒドロゲナーゼ、及びフランアルデヒドを酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、本明細書において上記で定義したとおりであるのが好ましい。ＨＭＦ、２，５−ジヒドロキシメチルフラン、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＡ及び２，５−ジホルミルフランのうちの１種又は複数をＦＤＣＡに酸化させるオキシドレダクターゼは、国際公開第２０１１／０２６９１３号に開示されているように、ＥＣ１．１活性及びＥＣ１．２活性の両方を有するオキシドレダクターゼであるのが好ましい。
【００６４】
別段の定めがない限り、本発明のこの態様のフラン化合物のトランスポーターを発現する形質転換細胞は、上記で定義した本発明の第１の態様のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼを発現する細胞の特徴をさらに有し得る。
【００６５】
ベクター及び構築物及び本発明のポリペプチドを発現するための方法
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチド、例えば、本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ若しくはトランスポーターをコードしているヌクレオチド配列、又はそれらの機能性均等物を含む、核酸構築物、例えば、クローニングベクター及び発現ベクターを含むベクター、並びに、例えば、本発明のポリペプチドの発現が生じる条件下で、適切な宿主細胞においてこのようなベクターを増殖、形質転換又はトランスフェクトする方法に関する。本明細書で使用する場合、用語「ベクター」及び「構築物」は同義的に使用され、本発明のポリヌクレオチドを含む、好ましくは輸送することができる、構築された核酸分子を意味する。
【００６６】
本発明のポリヌクレオチドは、複製可能な組換えベクター、例えばクローニングベクター又は発現ベクターに組み込むことができる。ベクターは、適合する宿主細胞において核酸を複製するために使用することができる。したがって、さらなる実施形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入し、適合する宿主細胞にベクターを導入し、ベクターの複製を生じさせる条件下で宿主細胞を増殖させることによって、本発明のポリヌクレオチドを調製する方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収することができる。適切な宿主細胞は上記に記載されている。
【００６７】
本発明の発現カセット又はポリヌクレオチドが挿入されるベクターは、組換えＤＮＡ手順に都合よく提供され得る任意のベクターであってよく、ベクターの選択は、導入しようとする宿主細胞に多くの場合依存する。
【００６８】
本発明に記載のベクターは、自律複製ベクター、すなわち染色体外の実体として存在するベクターであってもよく、その複製は、染色体複製、例えばプラスミドから独立している。或いは、ベクターは、宿主細胞に導入される場合、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と共に複製されるものであってもよい。
【００６９】
１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメントが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループを意味する。別のタイプのベクターはウイルス系ベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、導入される宿主細胞（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）において自律複製が可能である。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入される際、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定ベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。こうしたベクターは、本明細書においては「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用性のある発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。用語「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用されている形態であることから、本明細書においては同義的に使用することができる。しかし、本発明は、例えば、コスミド、ウイルス系ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）、並びに同等の機能を果たすファージベクターなどの発現ベクターのこうした他の形態を含むものとする。
【００７０】
本発明に記載のベクターは、例えば、ＲＮＡを産生するためにインビトロで使用され得るか、又は宿主細胞をトランスフェクト若しくは形質転換するために使用され得る。
【００７１】
本発明のベクターは、例えば、過剰発現させるために。２つ以上の、例えば３、４又は５つの本発明のポリヌクレオチドを含み得る。
【００７２】
本発明の組換え型発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含み、組換え発現ベクターが、発現させる核酸配列に作動可能に連結されている、発現で使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ又は複数の制御配列を含むことを意味する。コード配列に「作動可能に連結されている」制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー又は別の発現制御シグナルは、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるように配置されているか、又は、配列は意図した目的に対して共同して機能するように配置されており、例えば、転写がプロモーターで開始され、ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を介して進行する。用語「制御配列」又は「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を含むものとする。こうした制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に開示されている。用語の制御配列又は調節配列は、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するそれらの配列、及び特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示する配列（例えば、組織特異的制御配列）を含む。
【００７３】
したがって、所定の宿主細胞に関するベクター又は発現構築物は、第１の発明のポリペプチドをコードしている配列のコード鎖に対して５’末端から３’末端への連続した順序で互いに作動可能に連結されている以下のエレメント：（１）所与の宿主細胞におけるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の転写を指示することが可能なプロモーター配列；（２）真核生物のコザックコンセンサス配列又は原核生物のリボソーム結合部位／シャイン−ダルガルノ配列などの翻訳開始配列、（３）任意選択で、所与の宿主細胞から培地へのポリペプチドの分泌を指示することが可能なシグナル配列；（４）本発明のポリペプチドの成熟化、好ましくは活性型をコードしている本発明のＤＮＡ配列；及び好ましくはまた、（５）ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列に下流の転写を終結させることが可能な転写終結反応領域（ターミネーター）、を含み得る。
【００７４】
本発明に記載のヌクレオチド配列の下流には、１つ又は複数の転写終結部位を含有する３’非翻訳領域（例えばターミネーター）が存在し得る。ターミネーターの起源はそれほど重要ではない。ターミネーターは、例えば、ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列に天然であり得る。しかし、酵母ターミネーターは酵母宿主細胞において使用されるのが好ましく、糸状菌ターミネーターは糸状菌宿主細胞において使用されるのが好ましい。ターミネーターは宿主細胞（ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が発現される）に対し内因性であるのがより好ましい。転写された領域には、翻訳に関するリボソーム結合部位が存在し得る。構築物によって発現される成熟転写産物のコード部分は、最初に翻訳を開始するＡＵＧを含み、翻訳されるポリペプチドの末端に適切に配置されている終止コドンを含む。
【００７５】
本発明のポリヌクレオチドの発現の強化はまた、発現宿主から目的のタンパク質の発現を増大させ、所望により分泌レベルを増加させること、及び／又は、本発明のポリペプチドの発現の誘導性調節を提供することに役立ち得る、異種制御領域、例えば、プロモーター、分泌リーダー領域及び／又はターミネーター領域の選択によっても達成することができる。
【００７６】
発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に依存し得ることは、当業者には理解されよう。本発明のベクター、例えば、発現ベクターを宿主細胞に導入し、それにより本明細書に記載されているような核酸によってコードされているタンパク質又はペプチド（例えば、本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ又はトランスポーター、それらの変異型、それらの断片、変異体又は機能性均等物、融合タンパク質など）を産生することができる。
【００７７】
上述のように、用語「調節配列」又は「制御配列」は、本明細書において、ポリペプチドの発現に必要及び／又は有利であり得る少なくとも任意の成分を含めるものと定義される。任意の調節配列は、ポリペプチドをコードしている本発明の核酸配列に対して天然又は外来であり得る。このような調節配列としては、限定するものではないが、プロモーター配列、リーダー配列、最適翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋ，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０に開示されている）、又は原核生物シャイン−デルガルノ配列、分泌シグナル配列、プロペプチド配列、ポリアデニル化配列、転写ターミネーターが挙げられる。最低限、調節配列は、典型的には、プロモーター、翻訳開始及び停止シグナルを含む。
【００７８】
安定的に形質転換された微生物は、導入された分子が増殖培養において維持、複製及び分離されるように導入された１つ又は複数のＤＮＡ断片を有しているものである。安定した形質転換は、複数又は単一の染色体組み込み（複数可）によるか、又はプラスミドベクター（複数可）などの染色体外エレメント（複数可）によるものであり得る。プラスミドベクターは、特定のＤＮＡ断片によってコードされているポリペプチドの発現を指示することが可能である。
【００７９】
発現は、特定のポリペプチドをコードしている機能的に関連するＤＮＡ断片の高レベルの転写を可能にする誘導性（又は抑制性）プロモーターによって構成又は調節され得る。
【００８０】
本発明のポリペプチドの発現に利用される正確な機序にかかわらず、このような発現は、当技術分野で公知の方法によって、これらのポリペプチドをコードしている遺伝子を別の宿主細胞に導入することによって、移入することができると思われる。本明細書で定義されている遺伝子エレメントは、関連するポリペプチドの発現を発現又は制御する、産物、例えばタンパク質、特に酵素、アポタンパク質又はアンチセンスＲＮＡについての発現可能なコード配列を有している核酸（一般的にはＤＮＡ又はＲＮＡ）を含んでいる。発現されたタンパク質は、酵素として機能するか、又は酵素活性を抑制若しくは脱抑制するか、酵素の発現若しくは化合物、例えば代謝産物のトランスポーターとしての機能を調節することができる。これらの発現可能な配列をコードしている組換えＤＮＡは、染色体（例えば、相同組換えによって宿主細胞染色体に組み込まれている）又は染色体外（例えば、１つ若しくは複数のプラスミド、コスミド及び自己複製可能な他のベクター）のいずれかであり得る。本発明に従って宿主細胞を形質転換するために利用される組換えＤＮＡとしては、構造遺伝子及び転写因子に加えて、タンパク質、アポタンパク質又はアンチセンスＲＮＡに関するコード配列の発現又は脱抑制を調節するように作用するプロモーター、抑制因子及びエンハンサーを含む発現調節配列を挙げることができることを理解されたい。例えば、このような調節配列は、宿主細胞ゲノムにおいて既にコードされている選択されたポリペプチドの過剰発現を促進するために野生型宿主細胞に挿入することができるか、或いは、染色体外でコードされているポリペプチドの合成を調節するために使用することができる。
【００８１】
組換えＤＮＡは、限定するものではないが、プラスミド、コスミド、ファージ、酵母人工染色体又は宿主細胞への遺伝子エレメントの移入を介在する別のベクターを含む、任意の手段によって宿主細胞に導入することができる。これらのベクターは、ベクターの複製及びベクターによって運ばれる遺伝子エレメントを調節するシス作用調節エレメントに加えて、複製開始点を含むことができる。選択可能マーカーは、遺伝子エレメントが導入された宿主細胞の同定を補助するためベクター上に存在し得る。
【００８２】
宿主細胞に遺伝子エレメントを導入する手段（例えばクローニング）は、当業者に周知である。本発明に従って遺伝子エレメントを挿入するために染色体外マルチコピープラスミドベクターを利用することができる。宿主細胞への遺伝子エレメントのプラスミド担持導入は、制限酵素によるプラスミドベクターの最初の切断、続いて本発明に従って標的酵素種をコードしている遺伝子エレメントとプラスミドとの連結を含む。連結された組換えプラスミドを再環状化する際、感染（例えばλファージへのパッケージング）、又はプラスミド移入するための別のメカニズム（例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクションなど）を利用して、プラスミドを宿主細胞に移入する。遺伝子エレメントの宿主細胞への挿入に適したプラスミドは、当業者には周知である。
【００８３】
他の遺伝子クローニング方法としては、限定するものではないが、染色体への遺伝物質の直接組み込みなどが挙げられる。これは、宿主染色体の相同ＤＮＡ配列に隣接している非複製プラスミドに本明細書に記載の遺伝子エレメントをクローニングすること；前記組換えプラスミドを宿主に形質転換する際、遺伝子エレメントをＤＮＡ組換えによって染色体に導入することができることを含む、様々な手段によって生じ得る。このような組換え株は、組み込んでいるＤＮＡ断片が抗生物質耐性などの選択可能なマーカーを含有する場合、回収することができる。或いは、遺伝子エレメントは、非複製プラスミドを使用することなく、宿主細胞の染色体に直接導入することができる。これは、宿主染色体の相同ＤＮＡ配列をも含有している、本発明に従って遺伝子エレメントのＤＮＡ断片を合成的に産生することにより行うことができる。さらに、これらの合成ＤＮＡ断片が選択可能なマーカーも含有する場合、遺伝子エレメントは宿主染色体に挿入することができる。
【００８４】
本発明はさらに、ポリペプチドの発現の促進する条件下で、本発明に記載の細胞を培養するステップと、任意選択で、発現されたポリペプチドを回収するステップとを含む、本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド及び／又は本発明のフラン化合物輸送能力を有するポリペプチドを調製する方法、並びに、こうした方法によって得られるポリペプチドに関する。
【００８５】
フラン化合物を酸化させる方法
さらなる態様において、本発明は、フラン化合物を酸化させる方法に関する。特に、本発明は、ＦＤＣＡのフラン前駆体を酸化させる方法に関する。本発明の方法は、生成物が得られる単一の酸化反応ステップ（例えば、ＨＭＦＣＡのＦＦＡへの酸化）を含み得る。或いは、本発明の方法は、複数の酸化反応ステップを含むことができ、それぞれのステップは中間体を生じ、最後の中間体は最終生成物である。ＨＭＦが連続する酸化ステップでＦＤＣＡに酸化される、このような一連のステップの例としては、例えば：１）ＨＭＦをまずＨＭＦＣＡに酸化させ、これを第２のステップでＦＦＡに酸化させ、次いで、これを最終的にＦＤＣＡに酸化させるか、或いは、Ｄｉｊｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．５３（２０１４）６５１５−８）によって記載されているとおりである、２）ＨＭＦをまずＤＦＦに酸化させ、これを第２のステップでＦＦＡに酸化させ、次いで、これを最終的にＦＤＣＡに酸化させる、ステップが挙げられる。したがって、本発明の好ましい方法において、ＦＤＣＡの１つ又は複数のフラン前駆体は、一連のステップで最終的にＦＤＣＡに酸化される。
【００８６】
一実施形態において、本発明は、少なくともＨＭＦＣＡのＦＦＡへの酸化を含む方法に関する。本方法は、細胞をＨＭＦＣＡの存在下でインキュベートするステップを含む、ＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させる方法であって、上記細胞は、本明細書において上記で定義したＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼを発現する細胞であるか、又はフラン化合物輸送能力を有するポリペプチドを発現し、本明細書において上記で定義したＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ又はオキシダーゼ活性をさらに含む細胞である、方法であるのが好ましい。上記細胞は、例えば、下記に明示しているように、細胞によるＨＭＦＣＡの酸化の促進する条件下にて、ＨＭＦＣＡの存在下でインキュベートされるのが好ましい。
【００８７】
別の実施形態において、本発明はＦＤＣＡを産生する方法に関する。ＦＤＣＡを産生する方法は、細胞をＦＤＣＡの１つ又は複数のフラン前駆体を含む培地でインキュベートするステップを含み、上記細胞が本明細書において上記で定義したＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼを発現する細胞であるか、又はフラン化合物輸送能力を有し、本明細書において上記で定義したＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ又はオキシダーゼ活性をさらに含むポリペプチドを発現する細胞である、方法であるのが好ましい。上記細胞は、例えば、下記に明示しているように、細胞によるＦＤＣＡフラン前駆体のＦＤＣＡへの酸化を促進する条件下にて、ＨＭＦＣＡの存在下でインキュベートするのが好ましい。
【００８８】
本方法において、ＦＤＣＡの少なくとも１つのフラン前駆体は、ＨＭＦ、ＤＨＦ、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＡ及びＤＦＦからなる群から選択されるのが好ましく、そのうち、ＨＭＦが最も好ましい。ＦＤＣＡのフラン前駆体は、従来の方法において、好ましくは酸触媒脱水によって、例えば、酸の存在下で加熱することによって、１つ又は複数のヘキソース糖から得られるのが好ましい。フルクトースからＨＭＦを生成する技術は十分に確立されており、堅実である（例えば、ｖａｎ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１１３，１４９９−１５９７を参照）。グルコース高含有の供給原料も利用することができるが、ＨＭＦの熱化学的形成は、フルクトースからより効率的に生じる。したがって、追加の酵素的ステップは、グルコースイソメラーゼを使用して、グルコースをフルクトースに変換するために含めることができる。後者の方法は、例えば、加水分解デンプンからの高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）の生産に対し、食品産業において十分に確立されている。グルコースはまた、例えば、ｖａｎ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３、前掲）に開示されているように、触媒及び溶媒の組合せを使用して、化学的にフルクトースに異性化することができる。
【００８９】
ヘキソース糖は、通常、バイオマスから得られる。用語「バイオマス」とは、農業（作物残留物などの植物物質及び動物物質を含む）、林業（木材資源など）並びに漁業及び水産養殖を含む関連産業などの生物学的起源由来の生物分解性画分の生成物、廃棄物及び残留物、並びに産業廃棄物及び自治体廃棄物、例えば、自治体ゴミ又は古紙などの生物分解性画分を意味するものと理解されたい。好ましい実施形態において、バイオマスは植物バイオマスであり、（発酵性）ヘキソース／グルコース／糖高含有バイオマス、例えば、サトウキビ、デンプン含有バイオマス、例えばコムギ穀粒若しくはトウモロコシ藁、又は穀類、例えばトウモロコシ、コムギ、オオムギ、又はそれらの混合物がより好ましい。フルクタンを天然に高含有する農業作物（例えばキクイモ又はチコリの根）が好ましい。
【００９０】
ヘキソース糖は、このようなバイオマスの加水分解によって得ることができる。バイオマスを加水分解する方法は、それ自体は当技術分野において公知であり、例えば、蒸気及び／又はグルコアミラーゼなどのカルボヒドラーゼの使用を含む。
【００９１】
本発明の方法において使用するための好ましいタイプのバイオマスは、いわゆる「第２世代」のリグノセルロース系供給原料であって、多量のＦＤＣＡをより持続可能な方法で生産しようとする場合に好ましい。リグノセルロース系供給原料は、例えば、耕作地周辺部で栽培される専用エネルギー作物から得ることができ、したがって、食用作物とは直接競合しない。又は、リグノセルロースの供給原料は、副生成物、例えば、自治体ゴミ、古紙、木材残留物（製材工場及び製紙工場の廃棄物を含む）として得ることができ、また作物残留物を考慮することができる。作物残留物の例としては、サトウキビからのバガス及び数種類のトウモロコシ及びコムギの廃棄物が挙げられる。トウモロコシ副生成物の場合、３つの廃棄物は繊維、穂軸及び茎葉である。さらに、林業バイオマスを供給原料として使用することができる。第二世代の供給原料を本発明の発酵産物に変換するには、単糖類としてセルロース及びヘミセルロースを遊離させる必要がある。ここには、熱化学的アプローチ（通常、前処理と呼ばれる）、酵素的アプローチのいずれか、又は２つの方法論の組合せが適用される。前処理は糖を完全に遊離させるために、又は高分子化合物をその後の酵素作用に対しより利用可能にするために役立ち得る。様々なタイプの前処理としては、液体温水、水蒸気爆発、酸前処理、アルカリ前処理及びイオン性液体前処理が挙げられる。様々な化合物の相対量は、使用される供給原料及び使用される前処理の両方に依存する。このようなリグノセルロース供給原料から単糖類の糖を遊離させるには、例えば、アラビナーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼなどを含む、適切なカルボヒドラーゼが使用される。
【００９２】
本発明の方法は、ＦＤＣＡ又はＨＭＦＣＡなどの本方法で生産された酸化生成物（複数可）を回収するステップを含むのがさらに好ましい。酸化生成物は、酸化ステップを行なう細胞をインキュベートする培地から回収されるのが好ましい。ＦＤＣＡ、ＨＭＦＣＡなどの酸化生成物は、例えば、（酸又は塩）沈殿、その後の冷却結晶化、及び結晶化した酸化生成物、例えば、結晶化ＦＤＣＡの分離によって、反応混合物又は培地から回収され得る。しかし、他の回収方法、例えば、当技術分野で知られている、酸又は塩沈澱及び溶媒抽出も適切である。ＦＤＣＡを回収するための塩沈澱は、例えば、二価の（金属）カチオン、例えばＭｇ２＋を使用して実施することができる。
【００９３】
酸化反応は、細胞に最も適した温度で行なわれるのが好ましく、含まれるオキシドレダクターゼ酵素は細胞である。したがって、好熱性細胞及び酵素の場合には、温度が、４５℃以上、例えば４５〜１２２℃の範囲、例えば５０、５５、６０又は６５℃よりも高温であるのが好ましい。しかし、好中温性生物由来の酵素を含有する中温性細胞の場合には、酸化反応は、比較的マイルドな温度、例えば１０〜８０℃、より好ましくは２０〜４５℃、最も好ましくは約２５〜４０℃で行なわれるのが好ましい。
【００９４】
酸化反応は、ＦＤＣＡが中性の形態又は完全に解離された形態である場合、塩形成が制御され得るようなｐＨで行なわれるのが好ましい。ＦＤＣＡ内の２つの酸成分が存在することを考えると、２つの個別の好ましいｐＨ領域が存在する。反応中のｐＨは、ｐＨ１〜６、好ましくはｐＨ１〜４、最も好ましくはｐＨ１〜３であり得る。或いは、反応中のｐＨは、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ５〜８、最も好ましくはｐＨ５〜７であり得る。宿主細胞の要件が本方法に適したｐＨ値の選択にも影響を及ぼすことは、当業者には理解されよう。特定の宿主細胞に適切なｐＨ値の選択は当業者の範囲内であり、標準的なテキストブックから得ることができる。例えば、シュードモナス・プチダＳ１２株又はＫＴ２４４０株を含むシュードモナス・プチダに関しては、好ましいｐＨ領域はｐＨ５〜７の範囲である。
【００９５】
反応時間は６〜１５０時間であってよく、６〜１８時間であるのがより好ましい。酸素は、酸素源、例えば純酸素として、若しくは空気中の分子酸素、又は水、或いはフラン酸化酵素の要件に依存する異なる酸素源から反応培地中の細胞に供給されるのが好ましい。空気は、分子酸素の供給源として都合よく使用することができる。
【００９６】
リアクターは、任意の適切な（通気型）バイオリアクターであり得る。リアクターは、連続的にバッチで操作することができ、供給型バッチで操作することができるのが好ましい。
【００９７】
フラン化合物を酸化させる本発明の方法は、供給原料からフラン化合物を除去するために有利に適用することができるが、この場合、フラン化合物は、例えば、バイオ燃料及びバイオケミカルズの生産用の発酵用供給原料に対して不都合であると考えられる。フラン化合物を酸化させる方法は、ＦＤＣＡがポリエステルＰＥＴのＰＴＡに置き換えられ、その場合、ベイオベースのポリエチレンフランジカルボキシラート（ＰＥＦ）を得ることができる、ポリエステル（プラスチック）を生産するためのモノマー前駆体としてＦＤＣＡのバイオ生産に適用されるのがより好ましい。ＦＤＣＡはまた、例えば、コハク酸の生産用の基質として、２，５−ビス（アミノメチル）−テトラヒドロフラン、２，５−ジヒドロキシメチル−テトラヒドロフラン、２，５−ジヒドロキシメチルフラン及び２，５−フランジカルバルデヒドを含む、基質として有用な様々な化合物に使用することができる。ＦＤＣＡは、コーティングの生産において、例えば、アルキド樹脂及び熱可塑性コーティングにおいて使用することができる。またこれは、バイオ燃料におけるキシレン等価物として、及び溶媒として使用することができる。ＦＤＣＡはエステル化されていてもよく、エステルは可塑剤として使用することができる。ＦＤＣＡは、ＰＥＴ様ポリエステル及びポリウレタンに使用され得るそのジオールに変換され得る。さらに、ＦＤＣＡはそのジアミンに変換させることができ、ジアミンは鎖延長剤として使用することができ、またジアミンは、ポリウレタンの生産に使用することができるジイソシアネートに変換させることができる。
【００９８】
したがって、さらなる態様において、本発明は、ａ）ＦＤＣＡモノマーを上述のような本発明の酸化方法において調製するステップと；ｂ）ａ）で得られたＦＤＣＡモノマーからポリマーを生産するステップとを含む、１つ又は複数のＦＤＣＡモノマーからポリマーを生産する方法に関する。ポリマーは、ポリエチレンフランジカルボキシラート（ＰＥＦ）であるのが好ましい。
【００９９】
さらに別の態様において、本発明は、１種又は複数のフラン前駆体をＦＤＣＡに生体内変換するための本発明の細胞の使用であって、前記細胞が、本明細書において上記で定義したＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼを発現する細胞であるか、又はフラン化合物輸送能力を有し、本明細書において上記で定義したＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性若しくはオキシダーゼ活性をさらに含むポリペプチドを発現する細胞である、使用に関する。ＦＤＣＡに生体内変化されるＦＤＣＡの少なくとも１つのフラン前駆体は、ＨＭＦ、ＤＨＦ、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＡ及びＤＦＦからなる群から選択されるのが好ましく、そのうちＨＭＦが最も好ましい。
【０１００】
ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼポリペプチド及びＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードしている核酸
さらなる態様において、本発明は、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドに関する。ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１（エアリバチルス・パリダス）のアミノ酸配列と少なくとも８１．６５、８１．７、８１．８、８１．８５、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するが、それ以外は本明細書において上記で定義したとおりである、アミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸からなる。ポリペプチドは、単離されたポリペプチドであるのが好ましい。
【０１０１】
本発明は、さらに、
ａ）ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８１．６５、８１．７、８１．８、８１．８５、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなる、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１２又は１３に示されているヌクレオチド配列
；ｃ）長さが１０、１５、２０、３０、５０又は１００ヌクレオチドである（ａ）又は（ｂ）で定義したヌクレオチド配列の断片；
ｄ）遺伝コードの縮重によりｂ）又はｃ）のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列；及び、
ｅ）ａ）〜ｄ）で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列、
のうちの少なくとも１つを含む、核酸分子に関する。
【０１０２】
本発明の別の態様は、本セクションにおいて上記のａ）〜ｅ）で定義したヌクレオチド配列を含む、クローニングベクター及び発現ベクターを含むベクターに関し、さもなければ、それらのベクターは、本明細書において上述したとおりである。
【０１０３】
さらに別の態様において、本発明は、ｉ）本セクションにおいて上記で定義したＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、及びｉｉ）本セクションにおいて上記に定義した核酸分子、の少なくとも１つを含む細胞に関する。上記細胞は、本セクションにおいて上記のａ）〜ｅ）で定義したヌクレオチド配列を含む細胞、又は当該ヌクレオチド配列で形質転換された細胞、又はこのようなヌクレオチド配列を含むベクターであるのが好ましい。細胞は、単離細胞又は培養細胞であるのが好ましく、さもなければ、細胞は、本明細書において上記で記載したとおりであるのが好ましく、本細胞は、本明細書において上記で記載した１つ又は複数の遺伝的修飾を含むのが好ましい。本細胞は、上記で記載した方法、過程及び使用のいずれかにおいて適用することができる。
【０１０４】
フラン化合物トランスポーターポリペプチド及びこのようなトランスポーターポリペプチドをコードしている核酸
またさらなる態様において、本発明は、フラン化合物輸送能力を有するポリペプチドに関する。本ポリペプチドは、ＨＭＦＣＡを細胞に輸送する能力を少なくとも有しているのが好ましい。本ポリペプチドは、配列番号１７（エアリバチルス・パリダス）のアミノ酸配列と少なくとも８６．５、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するが、それ以外は本明細書において上記で定義したとおりである、アミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸からなるのが好ましい。本ポリペプチドは、単離ポリペプチドであるのが好ましい。
【０１０５】
本発明は、さらに、
ａ）ポリペプチドが、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８６．５、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなる、少なくともＨＭＦＣＡを細胞内に輸送する能力を有しているポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１８に示されているヌクレオチド配列；
ｃ）長さが１０、１５、２０、３０、５０又は１００ヌクレオチドである、（ａ）又は（ｂ）で定義したヌクレオチド配列の断片；
ｄ）遺伝コードの縮重によりｂ）又はｃ）のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列；及び、
ｅ）ａ）〜ｄ）で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列、
の少なくとも１つを含む、核酸分子に関する。
【０１０６】
本発明の別の態様は、本セクションにおいて上記のａ）〜ｅ）で定義したヌクレオチド配列を含む、クローニングベクター及び発現ベクターを含むベクターに関し、さもなければ、それらのベクターは、本明細書において上述したとおりである。
【０１０７】
さらに別の態様において、本発明は、ｉ）本セクションにおいて上記で定義したフラン化合物輸送能力を有するポリペプチド、及びｉｉ）本セクションにおいて上記に定義した核酸分子、の少なくとも１つを含む細胞に関する。本細胞は、本セクションにおいて上記のａ）〜ｅ）で定義したヌクレオチド配列を含む細胞、又は当該ヌクレオチド配列で形質転換された細胞、又はこのようなヌクレオチド配列を含むベクターであるのが好ましい。本細胞は、単離細胞又は培養細胞であるのが好ましく、さもなければ、本細胞は、本明細書において上記で記載したとおりであるのが好ましく、本細胞は、本明細書において上記で記載した１つ又は複数の遺伝的修飾を含むのが好ましい。本細胞は、上記で記載した方法、過程及び使用のいずれかにおいて適用することができる。
【０１０８】
本明細書及びその特許請求の範囲において、動詞の「含む（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその動詞の活用形は、その単語に続く項目が含まれるが、特に言及されていない項目も除外されないことを意味する、非限定的な意味で使用される。さらに、不定冠詞「１つの（「ａ」又は「ａｎ」）」の構成要素への言及は、構成要素の１つ、及び１つだけが存在することを状況が明白に要求しない限り、複数の構成要素が存在する可能性を排除するものではない。したがって、不定冠詞の「１つの（「ａ」）」又は「１つの（ａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【０１０９】
本明細書に引用されているすべての特許及び文献参照は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるものとする。
【０１１０】
以下の実施例は、単なる例示目的として提供されており、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１１１】
一般的方法論
株及びプラスミド
シュードモナス−プチダＳ１２Δｇｃｄ若しくはシュードモナス・プチダＫＴ２４４０Δｇｃｄ（それぞれ、シュードモナス・プチダＳ１２（ＡＴＣＣ  ７００８０１）、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０（ＤＳＭ６１２５）のグルコースデヒドロゲナーゼ欠損変異株））、又は野性型シュードモナス・プチダＳ１２を、エアリバチルス・パリダスＣＡ１８２８株由来のｙｉａＹ遺伝子を発現するための宿主として使用した（下記を参照）。大腸菌ＴＧ９０株を一般的なクローニングの目的で使用した。
エアリバチルス・パリダス遺伝子のエピソームの発現については、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−由来ｐＢＴ’ｍｃｓ（Ｋｏｏｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０ａ，Ｂｉｏｒｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  １０１：６２９１−６１９６）を使用した。ｐＢＴ’ｍｃｓにおいて、標的遺伝子の発現は、構成性ｔａｃプロモーターから作動される。
【０１１２】
培地及び培養条件
好中温性菌ミネラル塩培地（ＭＭＭ）は、指定どおりに炭素源を補充して、下記を含有していた（脱イオン水１リットル当たり）：１５．５２ｇのＫ２ＨＰＯ４、６．５２ｇのＮａＨ２ＰＯ４、２．０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２０、１０ｍｇのＥＤＴＡ、２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２０、１ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２０、５ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２０、０．２ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２０、０．２ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２０、０．４ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２０、及び１ｍｇのＭｎＣｌ２・２Ｈ２０。
【０１１３】
好熱性菌ミネラル塩培地（ＴＭＭ）は、下記を含有していた（脱イオン水１リットル当たり）：１０ｇのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、１０ｍＭのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４ｍＭのトリシン、１．３２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、９．５３ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、０．２ｇの酵母抽出物、５ｇのＮａＣｌ、１．４７ｇのＮａ２ＳＯ４、０．０８ｇのＮａＨＣＯ３、０．２５ｇのＫＣｌ、１．８７ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．４１ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００８ｇのＳｒＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．００８ｇのＨ３ＢＯ３、０．９０ｇのＮａＮＯ３、及び１ｍｌのビタミン溶液（チアミン、０．１ｇ／Ｌ；リボフラビン、０．１ｇ／Ｌ；ニコチン酸、０．５ｇ／Ｌ、パントテン酸、０．１ｇ／Ｌ；ピリドキサミン−ＨＣｌ、０．５ｇ／Ｌ；ピリドキサール−ＨＣｌ、０．５ｇ／Ｌ；Ｄ−ビオチン、０．１ｇ／Ｌ；葉酸、０．１ｇ／Ｌ；ｐ−アミノ安息香酸、０．１ｇ／Ｌ；コバラミン、０．１ｇ／Ｌ）。炭素源は、指定どおりに補充した。
【０１１４】
好中温性菌の増殖用完全培地としては、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロスを使用した：１０ｇ／ｌのＢａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／ｌの酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｇ／ｌのＮａＣｌ。プレート培養のため、ＬＢは１．５％（ｗ／ｖ）の寒天（Ｄｉｆｃｏ）を用いて固化した。ｐＢＴ’ｍｃｓ由来プラスミドを担持する大腸菌、シュードモナス・プチダＳ１２又はシュードモナス・プチダＫＴ２４４０形質転換体のいずれかを選択するため、カナマイシン（Ｋｍ）５０μｇ／ｍｌを培地に添加した。抗生物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。シュードモナス・プチダは３０℃で培養した。大腸菌は３７℃で培養した。
【０１１５】
好熱性菌の増殖用完全培地としては、ＴＧＰブロスを使用した：１７ｇ／Ｌのトリプトン、３ｇ／Ｌのダイズペプトン、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、２．５ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、４ｇ／Ｌのグリセロール及び４ｇ／ＬのＮａ−ピルビン酸（ｐＨ７）。プレート培養のため、ＴＧＰは１．５％（ｗ／ｖ）の寒天（Ｄｉｆｃｏ）を用いて固化した。エアリバチルス・パリダスは６０℃で培養した。
【０１１６】
アッセイ及び分析方法
細胞乾燥重量（ＣＤＷ）測定：
細菌培養のＣＤＷ含量は、Ｂｉｏｗａｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｍｅｔｅｒ（ＷＰＡ  Ｌｔｄ）又はμＱｕａｎｔ  ＭＱＸ２００ユニバーサルマイクロプレート分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用し、平底９６ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を用いて、６００ｎｍ（ＯＤ６００）で光学密度を測定することにより決定した。１．０のＯＤ６００は、シュードモナス・プチダに関しては、０．５６ｇのＣＤＷ／Ｌ（Ｂｉｏｗａｖｅ）又は１．４ｇのＣＤＷ／Ｌ（μＱｕａｎｔ）に対応する。
【０１１７】
ＨＰＬＣ分析：
フラン化合物（ＦＤＣＡ、ＨＭＦ、ＨＭＦ−アルコール、ＨＭＦＣＡ及びＦＦＡ）は、Ｋｏｏｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０ａ，Ｂｉｏｒｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  １０１：６２９１−６１９６）によって開示されているＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。
【０１１８】
化学物質
５−ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）は、Ｅｕｒｏｌａｂｓ  Ｌｔｄ  （Ｐｏｙｎｔｏｎ，  ＵＫ）から購入した。ＦＤＣＡ及び５−ヒドロキシメチル−フロ酸（ＨＭＦＣＡ）の分析標準は、Ｉｍｍｕｎｏｓｏｕｒｃｅ  Ｂ．Ｖ．（Ｈａｌｌｅ−Ｚｏｅｒｓｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  ＳＣ，ＵＳＡ）からそれぞれ購入した。他のすべての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂ．Ｖ．（Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。
【０１１９】
分子及び遺伝学的技術：
ゲノムＤＮＡは、マスターピュア（ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ）（商標）のグラム陽性のＤＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用してエアリバチルス・パリダスＣＡ１８２８から単離した。プラスミドＤＮＡは、ＪＥＴＳＴＡＲ  Ｍａｘｉプラスミド精製キット（ＧＥＮＯＭＥＤ，ＩＴＫ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて単離した。アガロース捕捉ＤＮＡ断片は、ＤＮＡクリーン＆コンセントレーター（ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）（商標）（Ｚｙｍｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて単離した。ＰＣＲ反応は、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｆｌａｓｈ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、メーカーの使用説明書に従って実施した。オリゴヌクレオチドプライマー（実施例において特定したもの）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈによって合成された。プラスミドＤＮＡは、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒエレクトロポレーション装置（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、エレクトロコンピテント細胞に導入した。他の標準の分子生物学技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１、前掲）に従って実施した。
【０１２０】
実施例Ｉ：ＨＭＦを代謝するエアリバチルス・パリダス株の単離
コンポスト（１５ｇ）を０．９％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌ溶液１５ｍｌと混合し、７５０ｒｐｍ及び８０℃で４０分間インキュベートした。得られたコンポストスラリーを、振盪フラスコに０．６５ｇ／ＬのＨＭＦを補充したＴＭＭ中で、３日間、６０℃及び１８０ｒｐｍでインキュベートした。この培養物を一定間隔で新鮮なＴＭＭ−ＨＭＦに移し、固体ＴＭＭ−ＨＭＦ上にプレーティングした。単一のコロニーをＴＭＭ−ＨＭＦプレート及びＴＧＰプレート上で再度平板画線し、ＨＭＦ及びまたＦＤＣＡを代謝するそれらの能力について再評価した。ＨＭＦ及びＦＤＣＡの両方を代謝した２種の単離物（ＣＡ１８０９株及びＣＡ１８２８株）は、１６Ｓ  ｒＤＮＡを配列決定することによりエアリバチルス・パリダスであると確認され、さらなる試験について選択した。
【０１２１】
実施例ＩＩ：ＨＭＦ分解性エアリバチルス・パリダス単離株おける新規なデヒドロゲナーゼ触媒によるＨＭＦ異化代謝経路の同定
エアリバチルス・パリダスＣＡ１８０９株及びＣＡ１８２８株のゲノムは、ＰａｃＢｉｏシークエンシングによって配列決定し、自動ＯＲＦ呼び出し及び注釈付けを実施した。注釈付けされたゲノムにおいて、フロ酸分解クラスターを構成する、カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４株のｈｍｆＡＢＣＤＥ遺伝子の相同体が同定された（Ｋｏｏｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７：４９１９−４９２４）。
【０１２２】
ＨＭＦに加えてＦＤＣＡを代謝するＣＡ１８０９株及びＣＡ１８２８株の能力を考慮すると、ＨＭＦがカプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４株の場合のようにＦＤＣＡを介して代謝されることが強く示唆された。しかし、予想外に、ＦＤＣＡを介したＨＭＦからフロ酸への分解経路を構成する、カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４株のｈｍｆＦＧＨクラスターの相同体は確認されなかった。この結果から、ＨＭＦをＦＤＣＡに酸化する代替経路、またおそらくは、その後のフロ酸への脱カルボキシル化がエアリバチルス・パリダス単離株に存在することが示唆された。酸化活性及び脱カルボキシル活性の両方をコードしている遺伝子を含んだ遺伝子クラスターのゲノムを採取することにより、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ及び２種のデカルボキシラーゼをコードしている遺伝子を含む推定上のＨＭＦ分解クラスターが同定された（表１Ａ及び表１Ｂ）。まとめると、これらの遺伝子は、カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４株のように、ヒドロキシメチルフロン酸（ＨＭＦＣＡ）を介するが、オキシダーゼ活性ではなく、ＨＭＦＣＡのホルミルフロ酸（ＦＦＡ）への酸化に関するアルコールデヒドロゲナーゼ活性が関与する、ＨＭＦからＦＤＣＡへの酸化の推定上の経路をコードしている。
【０１２３】
【表１】
2018504904.tif 000002
【０１２４】
【表２】
2018504904.tif 000003
【０１２５】
実施例ＩＩＩ：シュードモナス・プチダＳ１２におけるエアリバチルス・パリダス由来のＹｉａＹ発現は、ＨＭＦをＦＤＣＡに酸化させる能力を付与する
ｙｉａＹ遺伝子は、プラスミドｐＫＷ００７を産生するｐＢＴ’ｍｃｓにおいて、バチルス・コアグランスＤＳＭ１由来のＰｌｄｈＬ１プロモーター領域を含む、１９８８ｂｐの合成ＸｂａＩ−ＳａｌＩ断片（配列番号１５）としてクローニングされた。プラスミドｐＫＷ００７をシュードモナス・プチダＫＴ２４４０Δｇｃｄ（ＣＡ１８７７）に導入し、シュードモナス・プチダＣＡ２１０１を得た。ｐＢＴ’ｍｃｓを担持するシュードモナス・プチダＫＴ２４４０Δｇｃｄ（ＣＡ２０４６株）を空ベクターの対照として試験した。
【０１２６】
シュードモナス・プチダＣＡ２１０１株及びＣＡ２０４６株は、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを補充した１０ｍｌのＭＭ＋８０ｍＭグリセロール及び２ｍＭグルコースを含有する１００ｍｌの振盪フラスコ内で増殖させた。細胞は、対数期の終わり（ＯＤ６００で約４）に回収し、洗浄し、１９．４ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、８．１５ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４、８０ｍＭのグリセロール及び５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを補充したＭＭ中に再懸濁した。洗浄した細胞懸濁液（ＯＤ６００で１〜２）のアリコート（１０ｍｌ）を、１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中のＨＭＦと共にインキュベートし、試料をＦＤＣＡ解析用に一定間隔で採取した。図１ａは、ＨＭＦが空のベクター対照でヒドロキシメチルフロ酸（ＨＭＦＣＡ）に速やかに酸化されるが、ＦＤＣＡ形成は全く存在しないことを示している。ＹｉａＹが発現される場合（図１ｂ）、蓄積されたＨＭＦＣＡはゆっくりとＦＤＣＡに酸化され、これにより、ＨＭＦＣＡを酸化するデヒドロゲナーゼとしてのＹｉａＹの機能が実証された。
【０１２７】
実施例ＩＶ：エアリバチルス・パリダス由来のＹｉａＹ並びに、カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４由来のＡｌｄｈ及びＨｍｆＴ１の共発現によるＨＭＦのＦＤＣＡへの最適酸化
エアリバチルス・パリダスＣＡ１８２８のｙｉａＹ遺伝子は、リボソーム結合部位ＴＡＧＧＡＡＡＧＧＡＡＧＡＴＴＡＡＣＣＣ（配列番号２１）を含め合成した。ｙｉａＹ断片（配列番号１６）をＫｐｎＩ及びＸｂａＩで消化し、ｐＢＴ’ｈｍｆＨ−ａｄｈ（国際公開第２０１２０６４１９５号）のｈｍｆＨ遺伝子で置き換え、プラスミドｐＫＷ０１０を得た。プラスミドｐＫＷ０１０を、ｐＪＮＮｈｍｆＴ１（ｔ）（国際公開第２０１２０６４１９５号）を保有するシュードモナス・プチダＳ１２Δｇｃｄに導入し、シュードモナス・プチダＣＡ２１１１を取得し、またシュードモナス・プチダＫＴ２４４０Δｇｃｄ（ｐＪＮＮｈｍｆＴ１（ｔ）も保有する）に導入し、シュードモナス・プチダＣＡ２１１２を得た。したがって、ｙｉａＹによってコードされているＨＭＦＣＡ酸化アルコールデヒドロゲナーゼは、カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４由来のＨＭＦデヒドロゲナーゼ及びＨＭＦＣＡトランスポーターを共発現させることができ、ＨＭＦＣＡ及びＨＭＦＣＡの取込みに対するＨＭＦ酸化の障害を排除することができた。
【０１２８】
シュードモナス・プチダＣＡ２１１１及びＣＡ２１１２を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、３０ｍｇ／Ｌのゲンタミシン及び１００μＭのサリチル酸を補充した、１０ｍｌのＭＭ＋８０ｍＭグリセロール及び２ｍＭのグルコースを入れた１００ｍｌの振盪フラスコ中で増殖させた。細胞を対数期の終わり（ＯＤ６００で約４）に回収し、洗浄し、ＭＭ５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、３０ｍｇ／Ｌのゲンタミシン及び１０μＭのサリチル酸に再懸濁した。洗浄した細胞懸濁液（ＯＤ６００で１〜２）のアリコート（１０ｍｌ）を、１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中のＨＭＦと共にインキュベートし、試料をＦＤＣＡ解析用に一定間隔で採取した。図２及び図３は、ＨＭＦがＨＭＦＣＡに速やかに酸化され、それがＦＤＣＡにさらに酸化されることを示している。ＹｉａＹとＡｌｄｈ及びＨｍｆＴ１の共発現は、ＨＭＦのＦＤＣＡへの酸化を顕著に促進することが明らかである。
【０１２９】
実施例Ｖ：カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４由来の中温性ＨＭＦＣＡアルコールデヒドロゲナーゼ並びにＡｌｄｈ及びＨｍｆＴ１の共発現による、ＨＭＦをＦＤＣＡに酸化する最適化株の構築
バチルス・クリベンシスＤＳＭ１７８７１、ブレビバチルス・サーモルーバー４２３、バチルス属の種ＦＪＡＴ−１４５７８、及びバチルス属の種Ｌ１（２０１２）のｙｉａＹ相同体は、リボソーム結合部位含有スペーサーＴＡＧＧＡＡＡＧＧＡＡＧＡＴＴＡＡＣＣＣ（配列番号２１）、並びに、クローニング用の制限酵素（それぞれ、ＫｐｎＩ、ＮｈｅＩ；ＸｂａＩと適合可能）認識部位（配列番号：１９、３６、３８及び３９）を含めて合成された。
【０１３０】
アネウリニバチルス・テラノベンシスＤＳＭ１８９１９及びブレビバチルス・パナチフミＷ２５のｙｉａＹ相同体は、リボソーム結合部位含有スペーサーＧＡＡＴＴＣＣＡＣＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＧＡＧＡＣＣＧＣ（配列番号４０）、並びにクローニング用の制限酵素（それぞれ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ）認識部位（配列番号３５及び３７）を含めて合成された。バチルス・クリベンシス酵素（配列番号１９）、ブレビバチルス・サーモルーバー酵素（配列番号３６）及び、両バチルス属の種の酵素（配列番号３８及び３９）に関するコードヌクレオチド配列は、アミノ酸配列（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｍｓ２／ｒｅｖ＿ｔｒａｎｓ．ｈｔｍｌ）の逆翻訳を介し、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／のシュードモナス・プチダのコドン使用表を使用して得た。アネウリニバチルス・テラノベンシス及びブレビバチルス・パナチフミ酵素に関するコードヌクレオチド配列は、アミノ酸配列の逆翻訳を介し、ＧｅｎｅＡｒｔの大腸菌配列最適化ツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｎｌ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｃｌｏｎｉｎｇ／ｇｅｎｅ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ／ｇｅｎｅａｒｔ−ｇｅｎｅ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ／ｇｅｎｅｏｐｔｉｍｉｚｅｒ．ｈｔｍｌ）を使用して得た。
【０１３１】
バチルス・クリベンシス、ブレビバチルス・サーモルーバー、バチルス属の種ＦＪＡＴ−１４５７８及びバチルス属の種Ｌ１（２０１２）のｙｉａＹ−相同体断片は、ＫｐｎＩ及びＮｈｅＩで消化し（ｐＢＴ’ｈｍｆＨ−ａｄｈ中のＸｂａＩと適合可能）、ｐＢＴ’ｈｍｆＨ−ａｄｈ中のｈｍｆＨ遺伝子と置き換え（国際公開第２０１２０６４１９５号）、プラスミドｐＫＷ２２１０、ｐＫＷ２２１２、ｐＫＷ２２１４及びｐＫＷ２２１５を得た。アネウリニバチルス・テラノベンシス及びブレビバチルス・パナチフミのｙｉａＹ−相同体断片は、ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで消化し、ｐＢＴ’ｈｍｆＨ−ａｄｈの中のｈｍｆＨ遺伝子と置き換え（国際公開第２０１２０６４１９５号）、プラスミドｐＫＷ２２１１及びｐＫＷ２２１３を得た。
【０１３２】
プラスミドｐＫＷ２２１０、ｐＫＷ２２１１、ｐＫＷ２２１２、ｐＫＷ２２１３、ｐＫＷ２２１４及びｐＫＷ２２１５をシュードモナス・プチダＫＴ２４４０Δｇｃｄ＿ｐＪＮＮｈｍｆＴ１（ＣＡ１９６５）に導入し、ａｌｄｈ及びｈｍｆＴ１を含む、最適化された宿主バックグラウンドにおいてＹｉａＹ相同体を発現させるためのシュードモナス・プチダＣＡ２１７８０、ＣＡ２１７８１、ＣＡ２１７８２、ＣＡ２１７８３、ＣＡ２１７８４及びＣＡ２１７８５がそれぞれ得られた。性能を評価するため、シュードモナス・プチダのＣＡ２１７８０、ＣＡ２１７８１、ＣＡ２１７８２、ＣＡ２１７８３、ＣＡ２１７８４及びＣＡ２１７８５株を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、３０ｍｇ／Ｌのゲンタミシン及び１００μＭのサリチル酸を補充し、１０ｍｌのＭＭ＋８０ｍＭグリセロール及び２ｍＭのグルコースを入れた１００ｍｌの振盪フラスコ内で増殖させた。細胞を対数期の終わり（ＯＤ６００で約４）に回収し、洗浄し、ＭＭ５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、３０ｍｇ／Ｌのゲンタミシン及び１０μＭのサリチル酸に再懸濁した。洗浄した細胞懸濁液（ＯＤ６００で１〜２）のアリコート（１０ｍｌ）を、１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中のＨＭＦと共にインキュベートし、試料をＦＤＣＡ解析用に一定間隔で採取した。シュードモナス・プチダＣＡ２１７８０、ＣＡ２１７８１及びＣＡ２１７８３に関する結果をそれぞれ、図４、図５及び図６に示す。３つのすべての形質転換株がＨＭＦからＦＤＣＡを産生した。しかし、各種の株は、ＨＭＦＣＡの一過性蓄積及びＨＭＦのジヒドロキシメチルフラン（ＨＭＦ−ＯＨ又はＤＨＦ）への部分的還元において顕著な差を示した。シュードモナス・プチダＣＡ２１７８２、ＣＡ２１７８４及びＣＡ２１７８５株では、ＨＭＦからＦＤＣＡが産生されることが確認され、ＨＭＦＣＡ酸化酵素としての６つのすべてのアルコールデヒドロゲナーゼ機能性を示した。
【０１３３】
実施例ＶＩ：ＨＭＦＣＡトランスポーターをコードしているエアリバチルス・パリダスｐｒｏＰを発現するシュードモナス・プチダ株の構築
ｐｒｏＰ遺伝子（配列番号１８）は、プライマーｐｒｏＰ（ｆ）（ｇｃｃｇａａｔｔｃＡＴＧＡＡＧＡＡＴＡＴＣＧＣＴＡＡＴＡＣＧ；配列番号２２）及びｐｒｏＰ（ｒ）（ｇｃｃｇｃｔａｇｃＴＴＡＴＴＴＧＡＧＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣ；配列番号２３）を使用し、ＰＣＲによって、エアリバチルス・パリダスＣＡ１８２８のゲノムＤＮＡから増幅させた。ＰＣＲ産物を、ｐＪＮＮｍｃｓ（ｔ）に１３５０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩ断片（配列番号２０）として導入し、ｐＪＮＮｐｒｏＰ（ｔ）を得た。プラスミドｐＢＴ’ｈｍｆＨ＿ａｌｄｈ及びｐＪＮＮｐｒｏＰ（ｔ）を、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０Δｇｃｄ（ＣＡ１８７７）に連続的に導入し、シュードモナス・プチダＣＡ２１７８３を得た。シュードモナス・プチダＣＡ２１７８３は、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、３０ｍｇ／Ｌのゲンタミシン及び１００μＭのサリチル酸を補充し、１０ｍｌのＭＭ＋８０ｍＭグリセロール及び２ｍＭのグルコースを入れた１００ｍｌの振盪フラスコ内で培養した。細胞を対数期の終わり（ＯＤ６００で約４）に回収し、洗浄し、ＭＭ５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、３０ｍｇ／Ｌのゲンタミシン及び１０μＭのサリチル酸に再懸濁した。洗浄した細胞懸濁液（ＯＤ６００で１〜２）のアリコート（１０ｍｌ）を、１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中のＨＭＦと共にインキュベートし、試料をＦＤＣＡ解析用に一定間隔で採取した。ＨＭＦＣＡトランスポーターをコードしているｐｒｏＰの発現は、ｐｒｏＰを発現しない対応する対照株と比べ、ＨＭＦのＦＤＣＡへの酸化を顕著に促進することが明白である。
【０１３４】
【表３】
2018504904.tif 000004
2018504904.tif 000005
2018504904.tif 000006
【０１３５】
【表４】
2018504904.tif 000007
2018504904.tif 000008
2018504904.tif 000009
2018504904.tif 000010
【図１ａ】
2018504904.tif 000011
【図１ｂ】
2018504904.tif 000012
【図２】
2018504904.tif 000013
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2018504904.tif 000017
【配列表】
2018504904000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年9月21日(2017.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＭＦＣＡの存在下で、好ましくは細胞によってＨＭＦＣＡの酸化を促進する条件下で、細胞をインキュベートするステップを含む、５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸（ＨＭＦＣＡ）を５−ホルミル−２−フロ酸（ＦＦＡ）に酸化させる方法であって、
前記細胞が、配列番号１〜１１のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも４５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含み、
前記発現構築物が前記細胞において発現可能であり、前記ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼの発現が、前記発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、ＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させる能力を前記細胞に付与する又は前記細胞において増大させる、
方法。
【請求項２】
１つ又は複数のＦＤＣＡのフラン前駆体を含む培地中で、好ましくは細胞によるＦＤＣＡのフラン前駆体のＦＤＣＡへの酸化を促進する条件下で、細胞をインキュベートするステップと、任意選択で、ＦＤＣＡを回収するステップとを含む、ＦＤＣＡを生産する方法であって、
前記細胞が、配列番号１〜１１のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも４５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含み、
前記発現構築物が前記細胞において発現可能であり、前記ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼの発現が、前記発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、ＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させる能力を前記細胞に付与する又は前記細胞において増大させ、
ＦＤＣＡの少なくとも１つのフラン前駆体が、ＨＭＦ、２，５−ジヒドロキシメチルフラン（ＤＨＦ）、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＡ及び２，５−ジホルミルフラン（ＤＦＦ）からなる群から選択されるのが好ましく、そのうちＨＭＦが最も好ましく、
ＦＤＣＡのフラン前駆体が、好ましくは酸触媒による脱水によって、１つ又は複数のヘキソース糖、好ましくはリグノセルロースバイオマスから得られる１つ又は複数のヘキソース糖から得られる、
ＦＤＣＡを生産する方法。
【請求項３】
前記ＦＤＣＡが、酸又は塩沈澱、続いて冷却結晶化及び／又は溶媒抽出を含む方法によって、培地から回収される、請求項２に記載のＦＤＣＡを生産する方法。
【請求項４】
ａ）請求項２又は３に記載の方法においてＦＤＣＡモノマーを調製するステップと；
ｂ）ａ）で得られたＦＤＣＡモノマーからポリマーを生産するステップと
を含む、１つ又は複数のＦＤＣＡモノマーからポリマーを生産する方法。
【請求項５】
１種又は複数のフラン前駆体をＦＤＣＡに生体内変換するための細胞の使用であって、
ＦＤＣＡの少なくとも１つのフラン前駆体がＨＭＦ、ＤＨＦ、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＡ及びＤＦＦからなる群から選択されるのが好ましく、そのうち、ＨＭＦが最も好ましく、
前記細胞が、配列番号１〜１１のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも４５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含み、
前記発現構築物が前記細胞において発現可能であり、前記ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼの発現が、前記発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、ＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させる能力を前記細胞に付与する又は前記細胞において増大させる、
細胞の使用。
【請求項６】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８１．６５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含む細胞であって、
前記発現構築物が前記細胞において発現可能であり、前記ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼの発現が、前記発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、ＨＭＦＣＡをＦＦＡに酸化させる能力を前記細胞に付与する又は前記細胞において増大させる、細胞。
【請求項７】
前記細胞が、
ａ）フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性であって、前記細胞が、アミノ酸配列の配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９及び３０のうちのいずれか１つと少なくとも４５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための第２の発現構築物を含むのが好ましく、前記第２の発現構築物が前記細胞において発現可能であり、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼの発現が、前記第２の発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、ｉ）５−ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）をＨＭＦＣＡに酸化させる能力、ｉｉ）ＤＦＦをＦＦＡに酸化させる能力、及びｉｉｉ）ＦＦＡをＦＤＣＡに酸化させる能力のうちの少なくとも１つを前記細胞に付与する又は前記細胞において増大させる、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性と；
ｂ）フラン化合物を前記細胞内及び／又は細胞外に輸送する能力であって、前記細胞が、少なくともＨＭＦＣＡを細胞内に輸送する能力を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現するための第３の発現構築物を含むのが好ましく、前記ポリペプチドが、アミノ酸配列の配列番号１７、３１、３２、３３及び３４のうちのいずれか１つと少なくとも４５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第３の発現構築物が前記細胞において発現可能であり、前記ポリペプチドの発現が、前記第３の発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、少なくともＨＭＦＣＡを前記細胞内に輸送する能力を前記細胞に付与する又は前記細胞において増大させる、輸送する能力
のうちの少なくとも１つをさらに有する、
請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
前記細胞が微生物細胞であり、前記細胞が、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ミセリオフトーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、クリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、パネロカエテ（Ｐａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、プロイロータス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からなる群の属から選択される酵母又は糸状菌細胞であるのが好ましく、クリベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ソジェ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、タラロミセス・エメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ミセリオフトーラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、及びペニシリウム・クリゾゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）からなる群の種から選択される酵母又は糸状菌細胞がより好ましく、或いは、
前記細胞が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アナベーナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、エアリバチルス（Ａｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、ブラジリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、コーロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、デスルホトマクルム（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）、デスルフリスポラ（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｓｐｏｒａ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ペロトマクルム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）（シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ））、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、及びストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）からなる群の属から選択される細菌細胞であるのが好ましく、エアリバチルス・パリダス（Ａ．ｐａｌｌｉｄｕｓ）、アネウリニバチルス・テラノベンシス（Ａ．ｔｅｒｒａｎｏｖｅｎｓｉｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・クリベンシス（Ｂ．ｋｒｉｂｂｅｎｓｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プンチス（Ｂ．ｐｕｎｔｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・サーモルーバー（Ｂ．ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒ）、バチルス・パナチフミ（Ｂ．ｐａｎａｃｉｈｕｍｉ）、カプリアビダス・バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）、デスルホトマクルム・クズネツォビイ（Ｄ．ｋｕｚｎｅｔｓｏｖｉｉ）、デスルフリスポラ・サーモフィラ（Ｄ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ゲオバチルス・カウストフィルス（Ｇ．ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）、コーロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）ＣＢ１５、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、ロドバクター・スフェロイデ��（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、シュードモナス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、シノリゾビウム・メリオティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｏｔｉ）、及びリゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）からなる群の種から選択される細菌細胞であるのがより好ましい、
請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８１．６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項１０】
ａ）請求項９に記載のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１２又は１３に示されているヌクレオチド配列；
ｃ）遺伝コードの縮重によりｂ）のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列；及び、
ｄ）ａ）〜ｃ）で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列
のうちの少なくとも１つを含む核酸分子であって、
ベクターであるのが好ましい、
核酸分子。
【国際調査報告】
2018504904.tif 000018
2018504904.tif 000019
2018504904.tif 000020
2018504904.tif 000021