(57)【要約】  本発明は、温度の関数において液状からゲル状に変化する、少なくとも一つのポロキサマーまたはポロキサマーの混合物、少なくとも一つのゲル化剤；および少なくとも一つの抗癌剤を含んでなるゲル化組成物に関する。当該組成物は、抗癌剤の局所投与に有利に使用される。当該組成物は、腫瘍を外科手術で除去する前に該腫瘍のサイズを縮小させるため、腫瘍を外科手術で除去した後に腫瘍再発を予防するため、および／または小さな腫瘍を治療するために有用である。したがって、それらは、癌、好ましくは消化器系の壁の癌または産婦人科系の癌の治療に有用である。また、本発明は、当該ゲル化組成物の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
−組成物の総重量に対して１２重量％〜３０重量％の、少なくとも一つのポロキサマーまたはポロキサマーの混合物、
−組成物の総重量に対して０．０１重量％〜１０重量％の、少なくとも一つのゲル化剤、および
−少なくとも一つの抗癌剤
を含んでなるゲル化組成物。
【請求項２】
前記組成物のゲル化温度が、２４℃〜３６℃の間などの２０℃〜４０℃の間である、請求項１に記載のゲル化組成物。
【請求項３】
前記ゲル化剤が、キトサンおよびその誘導体、カラギーナンおよびその誘導体、アルギネートおよびその誘導体、ペクチンおよびその誘導体、フィブリンおよびその誘導体、ポリアルケニルポリエーテルで架橋されたアクリル酸のホモポリマーおよびコポリマー、またはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１または２に記載のゲル化組成物。
【請求項４】
前記ゲル化剤が、キトサンおよびその誘導体、カラギーナンおよびその誘導体、アルギネートおよびその誘導体、ペクチンおよびその誘導体、フィブリンおよびその誘導体、ポリアルケニルポリエーテルで架橋されたアクリル酸のホモポリマーおよびコポリマー、またはそれらの混合物からなる群から選択され、好ましくはアルギネート、ペクチンおよびフィブリンまたはそれらの混合物からなる群から選択され、より好ましくはアルギネートおよび／またはペクチンからなる群から選択される、請求項３に記載のゲル化組成物。
【請求項５】
前記抗癌剤が、５−ＦＵ（フルオロウラシル）、オキサリプラチン、シスプラチン、フォリン酸、イリノテカン、メトホルミン、パクリタキセル、トポテカン、エトポシド、イホスファミド、アルトレタミン、ドキソルビシン、タモキシフェン、タモキシフェンクエン酸塩、ゲムシタビンおよびそれらの混合物からなる群から選択され、特に、５−ＦＵとシスプラチンの混合物、５−ＦＵとオキサリプラチンの混合物、５−ＦＵとフォリン酸の混合物、５−ＦＵ、フォリン酸およびオキサリプラチンの混合物、オキサリプラチンとパクリタキセルの混合物またはシスプラチンとパクリタキセルの混合物からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のゲル化組成物。
【請求項６】
前記組成物が、コロイドシリカなどの流動化剤をさらに含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のゲル化組成物。
【請求項７】
前記組成物が、スプレー、注射剤または展着可能な溶液の形態である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のゲル化組成物。
【請求項８】
前記組成物が、５−ＦＵ（フルオロウラシル）、オキサリプラチン、シスプラチン、フォリン酸、イリノテカン、メトホルミン、パクリタキセル、トポテカン、エトポシド、イホスファミド、アルトレタミン、ドキソルビシン、タモキシフェン、タモキシフェンクエン酸塩、ゲムシタビンおよびそれらの混合物からなる群から選択され、特に、５−ＦＵとシスプラチンの混合物、５−ＦＵとオキサリプラチンの混合物、５−ＦＵとフォリン酸の混合物、５−ＦＵ、フォリン酸およびオキサリプラチンの混合物、オキサリプラチンとパクリタキセルの混合物またはシスプラチンとパクリタキセルの混合物からなる群から選択される別の抗癌剤を少なくともさらに含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のゲル化組成物。
【請求項９】
薬剤、特に癌の治療のための薬剤として使用するための請求項１〜８のいずれか一項に記載のゲル化組成物。
【請求項１０】
薬剤、特に癌の治療のための薬剤として同時に、時間差で、または連続して使用するための、少なくとも以下を含んでなるキット：
−請求項１〜８のいずれかに記載のゲル化組成物を含んでなる第一組成物、および
−５−ＦＵ、オキサリプラチン、シスプラチン、フォリン酸、イリノテカン、メトホルミン、パクリタキセルおよびそれらの混合物などの別の抗癌剤を少なくとも含んでなる第二組成物。
【請求項１１】
前記薬剤が、癌、好ましくは婦人科系癌または結腸直腸癌などの消化器系の壁の癌の治療のための薬剤である、請求項９に記載の使用のための組成物あるいは請求項１０に記載の使用のためのキット。
【請求項１２】
腫瘍を外科手術で除去する前に、該腫瘍のサイズを縮小させるために使用する、請求項９または１１に記載の使用のための組成物あるいは請求項１０または１１に記載の使用のためのキット。
【請求項１３】
腫瘍を外科手術で除去した後の腫瘍の再発の予防、および／または小さな腫瘍の治療に使用する、請求項９〜１２に記載の使用のための組成物またはキット。
【請求項１４】
単独あるいはイオン化放射または非イオン化放射または温熱療法と組み合わせて、同時に、別々にまたは連続して使用する、請求項９〜１３に記載の使用のための組成物またはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、局所投与に有利な、抗癌剤を含んでなるゲル化組成物に関する。当該組成物は、腫瘍のサイズを、当該腫瘍を外科手術で除去する前に縮小させるため、および／または腫瘍を外科手術で除去した後に腫瘍再発を予防するため、および／または小さな腫瘍を治療するために有用であり、その結果有利には外科手術を回避することができる。したがって、それらは、癌、好ましくは消化器系の壁の癌または産婦人科系の癌の治療に有用である。また、本発明は、当該ゲル化組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在では、癌は主要な社会的な健康上の懸念である。癌の最も標準的な治療には、一次癒合治療または外科手術の補助療法としての化学療法が含まれる。しかしながら、化学療法は薬の全身投与により生じる（静脈内経路または経口経路のいずれかによって投与された場合）、副作用をしばしば伴う。そのような副作用は、患者にとって非常に苦痛である場合が多く、それ故に高用量での抗癌剤の使用が制限され、治療の全体的な効果に影響する場合がある。  
【０００３】
特に、フランスでは死亡率が２番目に高く、かつ罹患率が３番目に高い癌である結腸直腸癌（ＣＲＣ）については、外科手術が最もよく見られる治療の選択肢であるが、局所領域での外科手術後の再発は依然として主要な問題であり、結腸直腸癌患者の１１％に発生し（Sjoevall et al. Ann. Surg. Oncol. 14 (2007) 432-40; doi:10.1245/sl0434-006-9243-l）、これが理由で、残留する癌細胞を除去し、かつ再発性腫瘍の増殖を予防するために、通常、外科手術後に補助化学療法が用いられる。最もよく見られる併用化学療法は、オキサリプラチン、ロイコボリン（即ち、フォリン酸）と５−フルオロウラシル（5-Fluorouracil（５−ＦＵ））の静脈内投与を組み合わせたＦＯＬＦＯＸ４療法（N.C. Institute、結腸癌治療）である。現在、この用途のために試験を行った処方物はすべて全身に作用し、所望しない副作用をもたらす。
【０００４】
胃癌または食道癌などの消化器系の壁の癌あるいは子宮癌を含む卵巣癌または子宮癌などの婦人科系癌に罹患している患者も同様の問題に直面している。 
【０００５】
したがって、化学療法の一般的な効能を改善するために、化学療法の全身送達によって引き起こされる副作用に起因する患者の苦痛を制限することを示し、かつ改良されたバイオアベイラビリティを有する代替的な処方物が必要とされている。
【０００６】
近年では、副作用が低減され、かつ投与が容易である代替的な補助治療、特に、結腸直腸の腫瘍を外科手術で除去した後に腫瘍再発を予防することを目的とした治療を開発するための試みが行われてきた。
【０００７】
この目的のためには、局所投与用組成物が好ましく、その理由としては、病気の部位への直接送達を可能にし、これによって薬のバイオアベイラビリティが増加して、全身への循環が回避されるためである。そのような治療法は、副作用の低減をもたらすこと、および抗癌剤の部位への集中的な送達をより良く制御することを可能にすることが目的である。
【０００８】
例えば、Yangら（J. Control. Release. 135 (2009) 175-82. doi:10.1016/j.jconrel.2009.01.007）は、ドセタキセルの局所投与を含む、皮下の卵巣癌の治療のための、腫瘍内、腫瘍周囲および皮下の注射によって投与する抗癌剤としてドセタキセルを含んでなるポロキサマーに基づくｉｎ−ｓｉｔｕゲル化ヒドロゲルを報告した。当該ゲル化ヒドロゲルは、１５６時間後そのドセタキセル含有量の７０％を放出する。それにより組織を完全に覆うことができ、かつそれは針で、非侵襲的に注入し得る。しかしながら、このヒドロゲルは、生体接着性がないなど、限界が示されている。
【０００９】
また言及に値するものとして、Krupkaら（Invest. Radiol. 41 (2006) 890-7. doi:10.1097/01.rli.0000246102.56801.2f）によって開発された、ＰＬＧＡに基づく（ポリ（乳酸−共−グリコール酸）に基づく）ゲル化ヒドロゲルがあり、これは抗癌剤としてのカルボプラチンおよび化学療法増感剤（chemosensitizer）を含んでなる。このＰＬＧＡに基づくゲル化ヒドロゲルは皮下の結腸直腸癌を治療することを目的としている。その目標は、デポ製剤（depot of the formulation）を作ることであって、噴霧には向いていない高粘度な製剤であることを意味している。
【００１０】
米国特許出願第２００２／１９２８９号は、癌の治療に有用な組成物を開示しているが、腫瘍血管を閉塞すること、より詳しくは血管形成を防止することを目的としている。前記組成物は光重合開始（photoinitiating）、電磁開始（electromagnetic initiation）または温度変化の後に架橋によってゲルを形成することができるポリマーを含む。架橋したゲルは、血液が血管内へ循環するのを防ぐため、その壊死を引き起こす。したがって、米国特許出願第２００２／１９２８９号の組成物は、組成物（ポロキサマーのゲル化剤との組み合わせは開示されていない）および目的の用途の点から著しく異なる。さらに、組成物の例示がない。 
【００１１】
米国特許出願第２００２／１９２２８９号では、抗癌剤などの治療剤を局所的に放出すること、および血管塞栓を生成することの両方を目的とした、癌の治療に有用な組成物が開示されている。米国特許出願第２００２／１９２２８９号の組成物は感熱性であり、体温でゲルを形成する。当該組成物は、特にＰＶＰと組み合わせたポロキサマーを含んでなり得る。しかしながら、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）はゲル化剤ではない。ＰＶＰ（Ｅ）２０１は、国際食品規格（世界保健機関（ＷＨＯ）および食糧農業機関（ＦＡＯ）の共通プログラム）では、安定剤（firming agent）、安定化剤（stabilizing agent）、および分散剤として列挙されている。また、当業者においては、ＰＶＰが、毛髪固定剤、バインダー、帯電防止剤、乳化剤等としての化粧用製品中に入れられるものとして知られている。確かに、ＰＶＰでは粘性（例えばＢＴＣｈｅｍｉｃａｌｓのウェブサイトを参照）の調節が可能であるが、それはゲル化剤ではない。したがって、米国特許出願第２００２／１９２２８９号はポロキサマーとゲル化剤の組み合わせの使用を教示していない。
【００１２】
米国特許出願第２０１１／３０１４５６号は、一切の抗癌剤も一切のゲル化剤も含まない組成物は開示していない(Application US 2011/301456 does not disclose compositions which neither comprise any anticancer agent nor any gelling agent)。
【００１３】
国際公開第２００６／０８６７７５号は、漏出の縮小を目的とした局所適用のための送達製剤に関係している。国際公開第２００６／０８６７７５号の組成物は、癌を治療するために特に有用である。しかしながら、治療剤は遺伝子療法に有用な活性ベクターである。加えて、国際公開第２００６／０８６７７５号の組成物は遮断薬を含有するため、当該組成物を投与すると遮断薬の粘度が少なくとも１００ｃＰに増加する結果となる。当該遮断薬はゲル「ボール」の形成を通じて得られる。したがって国際公開第２００６／０８６７７５号の組成物は、ゲル化された（gelified）粒子の分散物である。そのような不均一な組成物は、例えば噴霧によって投与することができなかった。最後に、国際公開第２００６／０８６７７５号はポロキサマーとゲル化剤の組み合わせの使用を教示していない。
【００１４】
また、出願では、ドセタキセルなどのいくつかの治療剤の水溶性を改善することを目的とした組成物が開示されている。しかしながら、当該組成物は、乾燥組成物として提供され、かつ全身投与のために経口で投与される。したがって、より効果的な癌治療、特に、外科手術前の腫瘍のサイズの縮小、および／または腫瘍を外科手術で除去した後の腫瘍再発の予防、および／または結果、癌の再発を引き起こすこともある外科手術を有利に回避する小さな腫瘍の治療のための必要性がある。当該治療は、先行技術の治療と比較して患者の平均余命を増加させるだけでなく、患者の快適さを改善するはずである。 
【００１５】
したがって、本発明は、局所経路を介して投与される、特に、外科手術で除去した後の腫瘍再発の治療で使用するため、および／または結果有利に外科手術を回避することが可能となる小さな腫瘍を治療するための組成物を提供することを目的としている。
【００１６】
また、本発明は、腫瘍のサイズを縮小するための外科手術前の治療に有用な局所経路を介して投与される組成物を提供することも目的としている。
【００１７】
この目的のために、少なくとも一つのポロキサマー、ゲル化剤および抗ガン剤を含んでなるゲル化組成物が提案する。したがって所望しない副作用が次の2つの理由で低減する:局所適用(少なくとも部分的)により薬の全身循環が回避される；他の投与経路（特に、全身経路）と比較して、抗癌剤のバイオアベイラビリティおよび部位への集中の制御も改善される。加えて、従来の全身治療と比較して、抗癌剤が標的とする作用部位で直接生体利用可能であるため、同一の治療効果に必要な用量を低減させ得る。
【００１８】
加えて、ゲル化組成物は液状である温度で調製、梱包および保管される。予備形成ゲルと比較して、粘性が低いため製造工程(滅菌、梱包、保管)が容易になる。また、それらは、噴霧、展布または注射などのいくつかの投与経路が可能である。最後に、それらの付着特性および浸食特性は、非常に容易に調整できる（Zeng et al, Int J Pharm. 2014 Jun 5;467(1- 2):70-83. doi: 10.1016/j.ijpharm.2014.03.055）。 
【発明の概要】
【００１９】
第一の側面では、本発明は、
‐少なくとも一つのポロキサマーまたはポロキサマーの混合物、
‐少なくとも一つのゲル化剤、および 
‐少なくとも一つの抗癌剤
を含んでなるゲル化組成物に関する。
【００２０】
別の側面では、本発明は、
‐少なくとも一つのポロキサマーまたはポロキサマーの混合物、
‐少なくとも一つのゲル化剤、
‐少なくとも一つの抗癌剤、および
‐5重量％超の水 
を含んでなる、本発明のゲル化組成物を即時形成するための固形組成物に関する。
【００２１】
さらなる側面では、本発明は、特に癌、好ましくは消化器系の壁の癌または婦人科系癌の治療のための薬剤として使用するための発明の組成物に関する。 
【００２２】
別の側面では、本発明は、特に癌、好ましくは消化器系の壁の癌または婦人科系癌の治療のための薬剤を製造するための本発明のゲル化組成物の使用に関する。
【００２３】
一層別の側面では、本発明は、癌、好ましくは消化器系の壁の癌または婦人科系癌の治療方法であって、それを必要とする患者に、治療上有効な量の本発明のゲル化組成物を、好ましくは局所投与を介して、投与することを含んでなる治療方法に関する。
【００２４】
別の側面によれば、本発明は、同時の使用、時間差での使用、または連続的な使用のための、薬剤として使用するための、特に癌、好ましくは消化器系の壁の癌または婦人科系癌の治療のための少なくとも以下を含んでなるキットに関する:
−本発明のゲル化組成物を含んでなる第一組成物、および、
−少なくとも別の抗癌剤、特に別の抗癌剤、血管阻害剤（anti-vascular agent）または血管新生阻害剤を含んでなる第二組成物。
【００２５】
別の側面によれば、本発明は本発明のゲル化組成物の製造方法に関する。
【００２６】
定義
本明細書で使用する場合、他の指示がない限り、百分率は組成物の総重量に対する重量パーセントを指す。ゲル化組成物に関しては、水の量は、成分と水の合計が組成物の総重量に対して１００重量％と等しくなるように加えられる。 
【００２７】
本明細書で使用する場合、「ｘｙ」または「ｘ〜ｙ」または「ｘとｙの間」という値の範囲は、限度のｘおよびｙ、ならびにこれらの限度の間の整数も含む。例えば、「１〜６」または「１と６の間」とは、整数１、２、３、４、５および６を意味する。好ましい実施態様には、数値範囲で個別に得られる各整数およびこれら整数の下位の組み合わせも含まれる。例えば、「１〜６」の好ましい値は整数１、２、３、４、５、６、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、２〜３、２〜４、２〜５および２〜６等を含み得る。 
【００２８】
本明細書で使用する場合、「ゲル化組成物」は、所与の温度で、特に消化器系（結腸、腸、胃または食道など）の壁の粘膜あるいは婦人科系範囲（卵巣粘膜、卵管、子宮粘膜、頚部粘膜および膣粘膜など）と接触してゲル化することができる組成物と理解される。本発明のゲル化組成物は、好ましくは「医薬組成物」であり、即ち、それらはヒト患者などの対象への治療的使用に好適である。本発明のゲル化組成物は有利には感熱性である。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「感熱性」または「温度感受性」とは、低温（約０℃〜約１０℃）で液体または低粘性溶液（即ち、剪断速度約０．１／秒、２５℃で粘度が５００ｃｐｓ未満）であるが、より高温（約３０℃〜約４０℃、例えば約３７℃）ではより粘性が高い（即ち、剪断速度約０．１／秒、２５℃で、粘度が１０，０００ｃｐｓ未満）ゲルである組成物を指す。 
【００３０】
組成物の「ゲル化温度」または「ゲル化の温度」（Ｔｇ）は、当技術分野において知られている。それは、組成物のゲル化が生じる温度に相当する。それは、一般に、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）を、単独で、または粘弾性剪断貯蔵弾性率(viscoelastic shear storage modulus) Ｇ’および損失弾性率Ｇ’’などのレオロジー・パラメーターの測定と組み合わせて測定する。
【００３１】
「投与」または「投与する」とは、対象に(医薬)組成物を適用する(即ち、投与する)工程を意味する。本明細書に開示された組成物は、例えば、腫瘍内または腫瘍付近への注射、あるいは腫瘍血管内または腫瘍を活性化する(irrigating)血管内への動脈内注射、あるいは腫瘍または切除部位へ直接組成物を噴霧または展着することによって非経口的に「局所投与」される。特に、治療剤の全身投与を回避して標的とする部位に注射による投与が適用される。本明細書で使用する場合、標的とする部位は、特に腫瘍(例えば、腫瘍サイズの縮小を目的として)、または腫瘍もしくは切除した腫瘍(特に腫瘍再発防止を目的として)のすぐ周辺の領域である。 
【００３２】
本発明では、「治療剤」とは、患者に投与した際に治療的な用途または有益性がある医薬品有効成分（active pharmaceutical ingredient（API））を意味する。治療剤は、例えば抗癌剤であってもよい。好ましくは、治療剤は化学薬剤、即ち、当技術分野において理解されるように、それは「小さな」分子である。特に、治療剤は遺伝子療法に有用なベクターではない。 
【００３３】
本明細書で使用する場合、「徐放性」とは、医薬および／またはゲル化組成物(ポロキサマーを含んでなるゲル化組成物など)に含まれる治療剤(即ち、抗癌剤および／または)が、数分〜約３か月の間の期間、好ましくは１時間〜１か月、例えば１時間〜１週間の期間にわたって医薬組成物から放出されることを意味する。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「ポロキサマー」という用語は、一方の側にポリオキシエチレン（ポリエチレングリコール、ＰＯＥとしても知られている）の鎖がグラフトしている中央のポリオキシプロピレン鎖（ポリプロピレングリコール、ＰＰＯとも呼ばれる）を含んでなる、またはそれからなるトリブロックコポリマーを指す。したがってポロキサマーは、ポリ（エチレンオキシド）の親水性鎖２本に囲まれたポリ（プロピレンオキシド）の中央の疎水性鎖を含んでなる（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯブロックコポリマー）。ポロキサマーは、一般に文字「Ｐ」（ポロキサマーのＰ）と後続の３つの数字によって示される：最初の２つの数に１００を掛けると、中核のポリオキシプロピレン（polyoxypropylene heart）の分子量が得られ、かつ最後の数字に１０を掛けるとポリオキシエチレン含量のパーセンテージが得られる。例えば、Ｐ４０７（Pluronic（商標）Ｆ１２７としても知られている）は、中核のポリオキシプロピレン分子量を４０００ｇ／ｍｏｌ含み、７０％のポリオキシエチレン含量を含むポロキサマーである。Ｐ４０７は、水溶液中で可溶化した際に、良好な可溶能力、低毒性を有し、かつ熱可逆的な特性を示す。理論に拘束されるものではないが、ポロキサマーの疎水性ＰＰＯブロックが脱水して、エントロピーの理由によりポリマーのミセル化が引き起こされると信じられている。ゲル化、したがって粘性の大幅な増加は、ミセルの規律正しい集合に起因する。ゲル化は冷却すると可逆的である。液体−固体の遷移温度は様々なパラメーターに依存する。さらに、ポロキサマーは、その両親媒性の特徴により、疎水性および親水性の化合物の両方を可溶化することができる。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「婦人科系癌(gynaecologic cancer)」という用語は、婦人科系範囲の癌、特に頸癌を含む子宮癌または卵巣癌として理解される。 
【００３６】
本明細書で使用する場合、「消化器系の壁の癌」という用語は、結腸、腸、胃または食道などの消化器系の壁に関係する任意の癌を含むと理解される。特に、「消化器系の壁の癌」は、結腸直腸癌、胃癌および食道癌からなる群から選択され、好ましくは結腸直腸癌である。 
【００３７】
本明細書で使用する場合、「切除部位」は、一旦切除した後の腫瘍の周辺(または近辺)の残りの組織に相当する。 
【００３８】
本明細書で使用する場合、「目的の領域」または「適用の領域」または、「治療の領域」は、外科手術後の治療の場合の切除部位に相当するか、あるいは外科手術前の腫瘍のサイズ縮小の場合には腫瘍に相当する。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「患者」または「対象」とは哺乳類、好ましくはヒトとして理解される。 
【００４０】
本明細書で使用する場合、組成物の「生体接着」は、生物学的組織、特に治療する領域の組織への前述の組成物の接着に相当する。本発明のゲル化組成物は良好な生体接着を示すことが好ましい。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「小さな腫瘍」とは、造影剤の使用を伴うか伴わないかにかかわらず、超音波検査、ＰＥＴイメージング、ＣＴまたはＭＲＩなどの通常技術によっては視認不能または検出不能である腫瘍、特に、術中イメージングを用いたとしても切除中に外科医が視認できない腫瘍である。典型的には、そのような小さな腫瘍の体積は１ｍｍ３未満である。実際に、これら癌の三次元検出の通常技術での最良な解像度は、身体のどの場所でもｌｍｍ３である(Frangioni J Clin Oncol 25(2008) 4012-4021)。 
【発明の具体的説明】
【００４２】
本発明は、
−少なくとも一つのポロキサマーまたはポロキサマーの混合物、
−少なくとも一つのゲル化剤、および 
−少なくとも一つの抗癌剤
を含んでなるゲル化組成物に関する。
【００４３】
典型的には、本発明のゲル化組成物は、水を５重量％超、一層より好ましくは水を１０重量％超、一層より好ましくは水を15重量％〜70重量％含んでなる。この水は好ましくは滅菌水(超純水または注射用水など)である。
【００４４】
そのような「水性」組成物は典型的に均質である。
【００４５】
本発明のゲル化組成物は有利には感熱性である。好ましくは、本発明のゲル化組成物のゲル化温度またはゲル化する温度は、２０℃〜４０℃の間、より好ましくは粘膜と接触して、特に２２℃〜３８度の温度の間、例えば、２４℃〜３６℃の間である。
【００４６】
本発明による有用なポロキサマーは温度感受性ポロキサマーであり、溶液中のそれらの濃度によって、室温、特に２℃〜２０℃の間で液状であり、ゲル化温度（Ｔｇ）以上の温度で、特に生理学的条件下で、特に２０℃〜４０℃の間で、ゲル状である。
【００４７】
ポロキサマーのゲル化温度（Ｔｇ）は、上で説明した従来の方法によって決定することができ、またはHandbook of Pharmaceutical Excipientsなどの参考資料で入手可能である。
【００４８】
ポロキサマー４０７、ポロキサマー１８８またはその混合物が特に好ましい。
【００４９】
より詳細には、これらのポロキサマーは、本発明の組成物中に十分な濃度で存在することで、特に生理学的条件下で、温度がそのゲル化温度（Ｔｇ）以上である場合に、ゲル化を可能にする。したがって典型的には、本出願の組成物は、ポロキサマーを組成物の総重量に対して１２重量％〜３０重量％、好ましくは１５重量％〜２８重量％含んでなる。
【００５０】
本発明のゲル化組成物はゲル化剤を含んでいる。当該ゲル化剤は、組成物の三次元構造を補強して、組成物の機械的特性、ゲル化特性、生体接着特性および放出特性を改善することを目的としている。例えば、ゲル化剤の含量はゲル化温度に影響を及ぼす。ゲル化剤の含量が組成物の徐放性プロフィールに影響を及ぼす場合もある。
【００５１】
好ましくは、ゲル化剤は、キトサンおよびその誘導体、例えば、キチン、カラギーナンおよびその誘導体、例えば硫酸塩を３０〜３２％の割合で有するカラギーナン、アルギネートおよびその誘導体、例えば主要な割合をマンヌロン酸とするアルギネートＭおよび主要な割合をグルロン酸とするアルギネートＧ、ペクチンおよびその誘導体、例えばエステル化度が３４〜６５％であるペクチン、フィブリンおよびその誘導体、ポリアルケニルポリエーテルで架橋されたアクリル酸のホモポリマーおよびコポリマーまたはそれらの混合物からなる群から選択される。
【００５２】
より好ましくは、ゲル化剤は、アルギネート、ペクチンおよびフィブリンまたはその混合物からなる群から選択される。
【００５３】
アルギネートの誘導体には、アルギン酸ナトリウムなどのアルギネートの塩が含まれる。好ましくは、アルギネートは、市販のkeltone（商標）または satialgine（商標）などの、粘度が２０〜１０００ｃＰの１％アルギネートである。
【００５４】
ペクチン誘導体は、好ましくは市販のＣＵ  ７０１およびＣＵ−Ｌ  ０２１／１５である。 
【００５５】
ゲル化剤の好ましい混合物には、アルギネートとペクチンの混合物が含まれる。一つの実施態様では、ゲル化剤はアルギネートおよび／またはペクチンである。 
【００５６】
本出願の組成物は、一般に、組成物の総重量に対してゲル化剤を０．０１重量％〜１０重量％、好ましくは０．０１重量％〜５重量％、一層より好ましくは０．０５重量％〜３重量％、一層より好ましくは、０．１重量％〜２重量％含んでなる。 
【００５７】
特定の実施態様では、ゲル化組成物は、組成物の総重量に対して
−ポロキサマーＰ４０７を１５重量％〜２１重量％、好ましくは１７重量％〜１９重量％、
−ポロキサマーＰ１８８を０重量％〜５重量％、好ましくは１重量％〜３重量％、
−アルギン酸ナトリウムなどのゲル化剤を０．０１重量％〜５重量％、好ましくは０．１重量％〜２重量％
含んでなる。
【００５８】
好ましい実施態様では、抗癌剤は、５−ＦＵ（フルオロウラシル）、オキサリプラチン、シスプラチン、フォリン酸、イリノテカン、メトホルミン、パクリタキセル、トポテカン、エトポシド、イホスファミド、アルトレタミン、ドキソルビシン、タモキシフェン、クエン酸タモキシフェン、ゲムシタビンおよびそれらの混合物からなる群から選択され、特に、５−ＦＵとシスプラチンの混合物、５−ＦＵとオキサリプラチンの混合物、５−ＦＵとフォリン酸の混合物、５−ＦＵ、フォリン酸およびオキサリプラチンの混合物、オキサリプラチンとパクリタキセルの混合物またはシスプラチンとパクリタキセルの混合物からなる群から選択される。結腸直腸癌の場合には、５−ＦＵが特に好ましい。
【００５９】
本発明の組成物は、一般に、組成物の総重量に対して抗癌剤を、０．１重量％〜１０重量％、好ましくは０．２５重量％〜５重量％、より好ましくは０．５重量％〜２．５重量％含んでなる。
【００６０】
本発明によるゲル化組成物は、流動化剤（rheofluidizing agent）、賦形剤、安定化剤、保存剤などの薬学的に許容可能な添加剤を、有利には組成物の総重量に対して、０．０１重量％〜５重量％の量でさらに含んでなり得る。本明細書で理解されるように、流動化剤は、組成物に剪断応力を加えた際に流動性を低減させる。流動化剤の例として、アエロジル（aerosil）、キトサン、カラギーナン（carraghenan）、アルギネートおよびペクチン(特に、エステル化度が３４％であるペクチンなどの低エステル化ペクチン）などのコロイドシリカが挙げられる。この特別な実施態様では、本発明の組成物は、組成物の総重量に対して流動化剤を０．１重量％〜１重量％含んでなる。 
【００６１】
薬学的に許容可能な賦形剤にはプロピレングリコールまたは塩化ナトリウムなどの塩、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロースまたは架橋したアクリル酸ポリマーなどの生体接着剤が含まれる。特に、本発明のゲル化組成物は、塩化ナトリウムをさらに含んでなり、特に組成物の総重量に対して塩化ナトリウムを０〜１重量％含んでなる。  
【００６２】
安定化剤の例として、界面活性剤、ポリマー、ポリオール、ポロキサマー、アルブミン、ゼラチン、トレハロース、タンパク質、糖類、ポリビニルピロリドン、Ｎ−アセチル−トリプトファン（「ＮＡＴ」）、カプリレート（即ち、カプリル酸ナトリウム）、ポリソルベート（即ち、Ｐ８０）、アミノ酸、および亜鉛などの二価金属カチオンが挙げられる。
【００６３】
防腐剤は、好ましくはベンジルアルコール、クレゾール、安息香酸、フェノール、パラベンおよびソルビン酸から選択される。 
【００６４】
より好ましくは、許容可能な添加剤はコロイドシリカなどの流動化剤である。  
【００６５】
特定の実施態様では、ゲル化組成物は、組成物の総重量に対して、
−ポロキサマーＰ４０７を１５重量％〜２１重量％、好ましくは１７重量％〜２１重量％、
−ポロキサマーＰ１８８を０重量％〜５重量％、好ましくは１重量％〜３重量％、
−アルギン酸ナトリウムなどのゲル化剤を０．０１重量％〜５重量％、好ましくは０．１重量％〜２重量％、
−ペクチンを０．１重量％〜０．４重量％、または
−ペクチンを０．１重量％〜０．４重量％およびアエロゾル（aerosol）を０．８重量％〜１．６重量％、または
−ペクチンを０．１重量％〜０．４重量％およびキトサンを０．１重量％〜０．５重量％、および
−抗癌剤、好ましくは５−ＦＵを０．１重量％〜１０重量％、好ましくは０．２５重量％〜５重量％含んでなり、
残りは水、特に超純水または注射用水などの滅菌水である。
【００６６】
本発明の組成物は、第一の抗癌剤に加えて、少なくとも別の治療剤、特に別の抗癌剤、血管阻害剤または血管新生阻害剤をさらに含んでなり得る。
【００６７】
血管阻害剤の例としては、コンブレスタチン（combretastatine）および類似体、オムブラブリン（ombrabuline）、ホスブレタブリン（fosbretabulin）、プリナブリン（plinabulin）、レキシブリン（lexibulin）、クリノブリン（crinobulin）、フラボンおよびフラボン・プロドラッグ、キサントン、バディメザン（vadimezan）、ミトフラキソン（mitoflaxone）などの血管破壊剤が挙げられる。好ましくは、血管阻害剤はコンブレスタチンおよび類似体から選択される。 
【００６８】
血管新生阻害剤の例としては、ベバシズマブ、ラムシズマブ（rmucizumab）などの抗ＶＥＧＦおよびラルムシズマブ（ralmucizumab）、スニチニブなどの抗ＶＥＧＦ受容体が挙げられる。好ましくは、血管新生阻害剤は、５−フルオロウラシルと関連し得るベバシズマブから選択される。
【００６９】
好ましくは、もう一方の治療剤は、第二抗癌剤であり、これは組成物の第一抗癌剤とは有利に異なるものであり、特に、５−ＦＵ（フルオロウラシル）、オキサリプラチン、シスプラチン、フォリン酸、イリノテカン、メトホルミン、パクリタキセル、トポテカン、エトポシド、イホスファミド、アルトレタミン、タモキシフェン、クエン酸タモキシフェンおよびそれらの混合物からなる群から選択され、特に、５−ＦＵとシスプラチンの混合物、５−ＦＵとオキサリプラチンの混合物、５−ＦＵとフォリン酸の混合物、５−ＦＵ、フォリン酸とオキサリプラチンの混合物、オキサリプラチンとパクリタキセルの混合物およびシスプラチンとパクリタキセルの混合物からなる群から選択される。結腸直腸癌の場合には、５−ＦＵが特に好ましい。より好ましくは、第二抗癌剤は、特に５−ＦＵ（フルオロウラシル）、オキサリプラチン、シスプラチン、フォリン酸、イリノテカン、メトホルミン、パクリタキセルおよびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００７０】
有利には、本発明によるゲル化組成物は無菌である。特定の実施態様では、ゲル化組成物は、溶液状であり、好適な噴霧器を用いてか、または注射器を備えてなるキット中で、バイアル中で、無菌条件下で調製および/または保管することができる。 
【００７１】
好ましくは、本出願によるゲル化組成物を適用領域上に噴霧または展着あるいは適用領域に注入することで即座に適用領域上または適用領域内にゲルが形成される。
【００７２】
したがって、有利には、組成物は、局所適用または注射に好適であることが好ましく、スプレーまたは展着可能な組成物(局所投与のため)の形態、あるいは注射可能な溶液の形態であってもよい。両方とも、組成物は当初(即ち、適用前)に液体であってもよく、身体に適用した際に体温に暖まることによってゲルを形成する。 
【００７３】
別の側面によれば、本発明は、
−少なくとも一つのポロキサマーまたはポロキサマーの混合物、
−少なくとも一つのゲル化剤、
−少なくとも一つの抗癌剤、および
−５重量％超の水
を含んでなる、本発明のゲル化組成物を即時形成する固形組成物に関する。
【００７４】
本発明の固形組成物は、好適な量の水溶液と混合した際に、本発明のゲル化組成物の即時形成をもたらす。当該水溶液は好ましくは生理食塩水または滅菌水（超純水または注射用水など）である。 
【００７５】
典型的には、本発明のゲル化組成物は、水を５重量％超、一層より好ましくは水を１０重量％超、一層より好ましくは水を１５重量％〜７０重量％含んでなる。  
【００７６】
ポロキサマー、ゲル化剤、抗癌剤および任意の添加剤は、本発明のゲル化組成物に関して上で記載した通りであることが好ましく、特にそれらの性質による。ポロキサマー、ゲル化剤、抗癌剤および任意の添加剤の好ましく、かつ特別な実施態様の任意の組み合わせは、本発明の固形組成物に包含されている。しかしながら、固形組成物中の異なる構成成分の重量比は、一度再構成されたゲル化組成物中で必要な重量比が得られるように適応させる。 
【００７７】
本発明の固形組成物は、好ましくは相当する本発明のゲル化組成物を凍結乾燥または真空乾燥することによって、または真空乾燥によって調製する。
【００７８】
あるいは、本発明は、
１）以下を含んでなる固形組成物を含んでなる第一区画：
−少なくとも一つのポロキサマーまたはポロキサマーの混合物；
−５重量％超の水；および
−少なくとも一つのゲル化剤および／または少なくとも一つの抗癌剤、ならびに
２）水溶液、好ましくは生理食塩水または滅菌水（超純水または注射用水など）ならびに場合により少なくとも一つのゲル化剤および／または少なくとも一つの抗癌剤を含んでなる第二区画
を含んでなる、本発明のゲル化組成物を即時形成するための二成分システムに関する。
【００７９】
典型的には、本発明のゲル化組成物は、水を５重量％超、一層より好ましくは水を１０重量％超、一層より好ましくは水を１５重量％〜７０重量％含んでなる。当該水は好ましくは滅菌水(超純水または注射用水など)である。
【００８０】
好ましくは、第一区画がゲル化剤を含んでならない場合、当該ゲル化剤は第二区画の水溶液中に存在する。第一区画が抗癌剤をふくんでならない場合、当該抗癌剤は第二区画の水溶液中に存在する。有利には、第一区画がゲル化剤と抗癌剤の両方を含んでなる場合、第二区画はゲル化剤と抗癌剤の水溶液を含んでなる。 
【００８１】
いかなる場合でも、第一区画の固形組成物は、第二区画の水溶液と混合した場合、本発明のゲル化組成物の即時形成をもたらす。
【００８２】
ポロキサマー、ゲル化剤、抗癌剤および任意の添加剤は、本発明のゲル化組成物に関して上で記載した通りであることが好ましく、特にそれらの性質による。ポロキサマー、ゲル化剤、抗癌剤および任意の添加剤の好ましく、かつ特定の実施態様の任意の組み合わせは、本発明の固形組成物に包含されている。しかしながら、固形組成物中の異なる構成成分の重量比は、一度再構成されたゲル化組成物中で必要な重量比が得られるように適応させる。
【００８３】
別の態様によれば、本発明は、同時に使用、時間差で使用するか、または連続して使用するための、少なくとも以下を含んでなるキットに関する：
−本発明のゲル化組成物を含んでなる第一組成物、および、
−少なくとも別の治療剤、特に、別の抗癌剤、血管阻害剤または血管新生阻害剤を含んでなる第二組成物、好ましくは、もう一つの治療剤は、５−ＦＵ、オキサリプラチン、シスプラチン、フォリン酸、イリノテカン、メトホルミン、パクリタキセルおよびそれらの混合物などの第二抗癌剤である。
【００８４】
特に、第二抗癌剤は、５−ＦＵとシスプラチンの混合物、５−ＦＵとオキサリプラチンの混合物、５−ＦＵとフォリン酸の混合物、５−ＦＵ、フォリン酸およびオキサリプラチンの混合物、オキサリプラチンとパクリタキセルの混合物およびシスプラチンとパクリタキセルの混合物である。結腸直腸癌の場合には、５−ＦＵが特に好ましい。 
【００８５】
当然、当業者であれば、別の治療剤を含んでなる第二組成物を選択し、特に、第二抗癌剤を、治療する腫瘍または癌の性質およびステージ、同様に、治療する患者の年齢、性別、体重および感受性を考慮して選択するだろう。 
【００８６】
本発明のキットは、単独で用いても、イオン化放射または非イオン化放射あるいは温熱療法と組み合わせて、同時、別々または連続して用いてもよい。 
【００８７】
本発明は、特に、癌、好ましくは消化器系の壁の癌または婦人科系癌の治療ために、薬剤として使用するための、上記の組成物またはキットに関する。 
【００８８】
一つの実施態様では、癌は、結腸直腸癌、食道癌または胃癌などの消化器系の壁の癌であり、好ましくは結腸直腸癌である。
【００８９】
別の実施態様では、癌は、婦人科系の癌、特に卵巣癌または子宮癌である。
【００９０】
好ましい実施態様では、癌は結腸直腸癌または子宮癌である。 
【００９１】
本発明の組成物は、結腸直腸癌を治療するための使用に特に好適である。
【００９２】
特定の実施態様では、本発明の組成物またはキットは、腫瘍のサイズを、当該腫瘍を外科手術で除去する前に縮小するために使用する。
【００９３】
別の特定の実施態様では、本発明の組成物またはキットは、腫瘍を外科手術で除去(切除)した後の腫瘍再発を予防するために使用される。
【００９４】
好ましくは、本発明のゲル化組成物は局所投与される。
【００９５】
特に、本発明のゲル化組成物を噴霧または展着によって投与することで、治療する領域が均一に覆われる。ゲル化組成物がスプレーまたは展着する溶液の形態である場合、それは外科手術中、腫瘍を切除した後に使用して切除領域に投与することが好ましい。
【００９６】
腫瘍切除部位に噴霧または展着した場合、本発明のゲル化組成物からの治療剤の浸透の深さは、高い間質性腫瘍圧力が不足しているために大きい。これにより病変実質の切除をより限定することができるため、残る機能的な組織の量が最大化され、結腸直腸癌の場合には、結腸切除（colorectomy）を代わりに経験しなければならないかもしれない患者の快適な生活を著しく改善する代替的な治療が提供される。
【００９７】
注射（有利には、腹腔内または動脈内または静脈内の注射）による投与は、好ましくは、腫瘍のサイズを、当該腫瘍を外科手術で除去する前に縮小させるために使用される。 
【００９８】
腫瘍のサイズを、当該腫瘍を外科手術で除去する前に縮小させるためには、腫瘍が、直腸の腫瘍または結腸内の腫瘍のように、注射を使用する必要なしに、容易にアクセス可能である身体部に位置している場合には、局所適用を想定してもよい。この場合、組成物は、例えば手動で、あるいは内視鏡または結腸内視鏡などの装置を通じて局所適用してもよい。
【００９９】
別の特定の実施態様では、本発明の組成物またはキットは、腫瘍を外科手術で除去した後に腫瘍再発を予防するため、および／または小さな腫瘍を治療するために使用される。
【０１００】
特に好ましい実施態様では、本発明の組成物またはキットは、結腸直腸の腫瘍を外科手術で除去(切除)した後の腫瘍再発を予防するため、および／または小さな結腸直腸の腫瘍を治療するために使用される。小さな腫瘍は、特に、術中イメージングを用いたとしても切除中に外科医が視認できないものである。 
【０１０１】
別の側面によれば、本発明は、上記の癌の治療方法に関するものであって、それを必要とする患者に、有効量の本発明の組成物を、好ましくは局所投与によって、具体的には、手術中に非経口的または局所的な経路を介して(例えば、または切除部位上に組成物を展着することによって)投与することを含んでなる、癌の治療方法に関する。本発明の組成物の有効量は、例えば、投与経路、治療する個体の体重、年齢、性別、治療する病変状態および感受性などの多くのパラメーターに依存する。 
【０１０２】
別の態様では、本発明は、併用療法に関するものであって、それを必要とする患者に、放射線療法または手術と供に、同時に使用、時間差で使用するか、または連続して使用するための本発明の組成物またはキットを投与することを含んでなる併用療法に関する。
【０１０３】
また、本発明は、以下の工程を含んでなる、本発明のゲル化組成物の製造方法に関する： 
ａ）寒冷法(cold method)を用いて、第一ポロキサマー溶液を調製する工程；
ｂ）ゲル化剤と場合により添加剤との水性混合物を含有している第二溶液を調製する工程； 
ｃ）工程ａ）およびｂ）で得られた溶液を、１５℃〜２５℃の間の温度、好ましくは２０℃で混合する工程；
ｄ）抗癌剤を、工程ｃ）で得られた混合溶液に添加し、透明な溶液が得られるまで撹拌する工程；
ｅ）得られた透明な溶液を均質化する工程；
ｆ）場合により、工程ｅ）で得られた透明な溶液の容積を、水（好ましくは無菌）を加えることによって所定の最終容積に調節する工程；
ｇ）場合により溶液を殺菌する工程。 
【０１０４】
ポロキサマー、ゲル化剤、抗癌剤および任意の添加剤は、本発明のゲル化組成物に関して上で記載した通りであることが好ましく、特にそれらの性質または組成物中の割合による。ポロキサマー、ゲル化剤、抗癌剤および任意の添加剤の好ましく、かつ特別な実施態様の任意の組み合わせは、本発明の方法に包含されている。 
【０１０５】
本発明によれば、寒冷法は以下の連続的工程を含んでなるか、またはそれらからなるものである： 
ａ１）ポロキサマーまたはポロキサマーの混合物を、所定の容積の水（好ましくは滅菌水（特に、超純水または注射用水）にゆっくりと添加して不明瞭なポロキサマー溶液を得る工程；
ａ２）得られた不明瞭なポロキサマー溶液を、溶液が透明になるまで０〜５℃、好ましくは４℃の温度で放置する工程；
ａ３）得られた透明なポロキサマー溶液を均質化する工程； 
ａ４）場合により、得られた透明なポロキサマー溶液の容積を、水（好ましくは無菌）を加えることによって所定の最終容積に調節する工程。 
【０１０６】
好ましくは、本発明のゲル化組成物の製造方法の工程ａ）は、工程ａｌ）〜ａ４）を含んでなる。
【０１０７】
好ましくは、本発明のゲル化組成物の製造方法の工程ｂ）は、以下の連続的工程を含んでなるか、またはそれらからなるものである：
ｂｌ）ゲル化剤、場合により添加剤を水（好ましくは滅菌水）中に分散させる工程；
ｂ２）完全に溶解するまで撹拌する工程；
ｂ３）場合により工程ｂ２）で得られた溶液を、１５℃〜２５℃、好ましくは２０℃の温度に加熱する工程。 
【０１０８】
工程ｂ２）は、ゲル化剤および場合により添加剤の溶解を促進させるために加熱しながら実施してもよい。例えば、工程ｂ２）は、６０℃〜９０℃、好ましくは８０℃の温度で実施してもよい。
【０１０９】
殺菌工程ｇ）は殺菌濾過または放射線殺菌により実施してもよい。特定の実施態様では、工程のすべて（即ち、工程ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）および任意の工程ｆ））は、無菌的に行なわれ、その結果、工程ｅ）またはｆ）の終わりで得られた溶液は無菌である。この実施態様では、殺菌工程ｇ）は必要ではない。
【０１１０】
また、本発明は、本発明の固形組成物を好適な量の水溶液、好ましくは生理食塩水または滅菌水（超純水または注射用水など）と混合する工程を含んでなる、本発明のゲル化組成物の即時調製方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１は、Ｐ４０７／Ｐ１８８（２０／２）を含有している本発明のサーモゲル（thermogel）中１％アルギネートを添加したことによる、ミセル化および次のプログラム：１０分間で５℃の平衡、その後５℃／分で５から４０℃、を用いて示差走査熱量測定法（Mettler Toledo、SSC7）によって得られたゲル化温度への影響を示す図である。
【図２】図２は、Ｐ４０７／Ｐ１８８／アルギネート（２０／２／１）を含有している本発明のサーモゲル中０．５％ＦＵを添加したことによる、ミセル化および次のプログラム：１０分間で５℃の平衡、その後５℃／分で５から４０℃、を用いて示差走査熱量測定法（Mettler Toledo、SSC7）によって得られた種々のゲル組成物のゲル化温度への影響を示す図である。
【図３】図３は、Ｐ４０７／Ｐ１８８／アルギネート（２０／２／１）を含有している本発明のサーモゲル中０．５％ＦＵを添加したことによる、ミセル化および次のプログラム：１０分間で５℃の平衡、その後５℃／分で５から４０℃、を用いて示差走査熱量測定法（Mettler Toledo、SSC7）によって得られた種々のゲル組成物のゲル化温度への影響を示す図である。
【図４】図４は、Ｐ４０７を１８重量％含有しているゲルのゲル化温度におけるペクチンの挿入による影響を示す図である。Ｆｌは、様々な重量濃度でのペクチン７０１を含有している製剤を表す。Ｆ２は、様々な重量濃度でのペクチンＣＵ−Ｌを含有している製剤を表す。ＦＯはペクチンを含んでいない。ゲル化温度はレオロジー研究によって得られた。
【図５】図５は、ＣＴ２６細胞株を６時間インキュベートした後の、本発明の成分であるＰ４０７、Ｐ４０８およびアルギネートを異なる量で含有するゲル３００μｌの細胞毒性を示す図である。
【図６】図６は、Ｐ４０７／Sataxiane／５−ＦＵを２１重量％／０．１％重量％／０．５重量％含んでなる本発明の組成物を使用した、異なる細胞株への５−ＦＵ含有ゲルの細胞毒性を表す。これらの実験は、次の様々な細胞タイプで実現された：Ｂ１６−Ｆ０（ＡＴＣＣ（商標）ＣＬ−６３２２ＴＭ）：マウス皮膚メラノーマ、ＮＩＨ  ３Ｔ３（ＡＴＣＣ（商標）ＣＲＬ−１６５８ＴＭ）：マウス線維芽細胞、ＢＷＴＧ３：マウス肝癌細胞株、３ＬＬ（ＡＴＣＣ（商標）ＣＲＬ−１６４２ＴＭ）：マウス、ルイス肺癌およびＣＴ２６（ＡＴＣＣ（商標）ＣＲＬ−２６３８ＴＭ）：マウス結腸癌。
【図７】図７は、１４日目にＣＴ２６ルシフェラーゼ陽性腫瘍を切除し、抗癌剤として、Ｐ４０７／Ｐ１８８／アルギネート／５−ＦＵ：２０重量％／２重量％／１重量％／０．５重量％を含んでなる本発明の組成物またはＰ４０７を２０重量％、Ｐ１８８を２重量％、アルギネートを１重量％含んでなり、かつ治療剤を含まない（２０／２／１／０）対照ゲルを使用して治療した後のマウス内の腫瘍再発を示す、経時的な腫瘍増殖の体積を表す。横軸は日数での時間を表し、一方で縦軸は、ルシフェリンを光子／秒で腹腔内注射した後の発光強度を表している。
【図８】図８は、ＣＴ２６腫瘍を切除し、抗癌剤として、Ｐ４０７を２０重量％、Ｐ１８８を２重量％、アルギネートを１重量％、５−ＦＵを０．５重量％（２０／２／１／０．５）含んでなる本発明の組成物またはＰ４０７を２０重量％、Ｐ１８８を２重量％、アルギネートを１重量％含んでなり、かつ治療剤を含まない（２０／２／１／０）対照ゲルを使用した局所治療を行った後のマウスの生存率を示す図である。横軸は日数での時間を表し、一方で縦軸は、マウスの生存率のパーセンテージを表す。落下（drop out）しているところは、マウスの死を示す。
【図９】図９は、サーモゲルの腫瘍内注射から４〜２０日後の経時的な腫瘍増殖の体積を表す図である。マウスは、８日目に、抗癌剤として、Ｐ４０７を２１重量％、Satiaxaneを０．１％および５−ＦＵを０．５重量％含有している本発明の組成物またはＰ４０７を２１重量％、Satiaxaneを０．１％含んでなり、治療剤を含まない対照ゲルを使用した局所治療（ゲル６０μｌを腫瘍内注射）を受けた。横軸は日数での時間を表し、一方で縦軸は、カリパスを用いて外部測定したことで得られたｍｍ３での腫瘍体積を表す。データをＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ試験後統計分析での２元ＡＮＯＶＡに提出した。
【図１０】図１０は、抗癌剤として、Ｐ４０７を２１重量％、Satiaxaneを０．１％および５−ＦＵを０．５重量％含有している本発明の組成物またはＰ４０７を２１重量％、Satiaxaneを０．１％含んでなり、治療剤を含まない対照ゲル（ゲルＫ）を用いたサーモゲルを腫瘍内注射した後のマウス内の平均腫瘍増殖を表す図である。横軸は日数での時間を表し、一方で縦軸は、腫瘍体積をｍｍ３で表す。時間遅延、メジアン径および比などのデータは、図の下の表（表２）に示されている。この比が４２％未満である場合、化合物は活性であると考えられる。
【図１１】図１１は、サーモゲルを腫瘍内注射した４〜２０日後のマウスの経時的な体重を表す図である。
【図１２】図１２は、Ｐ４０７／Ｐ１８８（２０／２）を含有している本発明のサーモゲル中アルギネート（０．５および１％）を添加したことによる、細胞の接着への影響を表す。接着細胞の百分率は、対照（プラスチック製プレートに直接接着する細胞）の関数として計算された。
【図１３】図１３は、５−ＦＵ、オキサリプラチンまたは５−ＦＵとオキサリプラチンの組み合わせを含有しているゲルの、卵巣細胞株Ａ２７８０に対する細胞毒性を表す図である。図１３Ａは、それぞれ、細胞培養培地（１）、対照ヒドロゲルＰ４０７／Ｐ１８８／アルギネート  ２０／２／１（２）、５−ＦＵ・ヒドロゲルＰ４０７／Ｐ１８８／アルギネート／  ２０／２／１／０．５（３）、オキサリプラチン・ヒドロゲルＰ４０７／Ｐ１８８／アルギネート／ＯＸ  ２０／２／１／０．３（４）、および５−ＦＵ・オキサリプラチン・ヒドロゲルＰ４０７／Ｐ１８８／アルギネート／５ＦＵ／ＯＸ  ２０／２／１／０．５／０．３（５）で２４時間インキュベートした後の細胞の写真を表す図である。図１３Ｂは、Ａ２７８０卵巣細胞株を２４時間インキュベートした後の、５−ＦＵ、オキサリプラチンまたは５−ＦＵとオキサリプラチンの組み合わせを含有している異なるヒドロゲルの細胞毒性を表す図である。生存率は、ＭＴＴテスト（当技術分野において知られている、３（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドを使用するＭＴＴ細胞増殖分析）によって評価し、即ち、対照ウェルの吸収度の百分率で推定した。
【図１４】図１４は、結腸直腸腹膜癌腫症ＣＴ２６に対する、ヒドロゲルＰ４０７／Ｐ１８８／アルギネート／５ＦＵ／ＯＸ  ２０／２／１／０．５／０．３を含有している５−ＦＵ・オキサリプラチンのｉｎ  ｖｉｖｏ効果の評価を表す図である。図１４Ａは、マウス内への腫瘍移植から４〜１８日後の経時的な腫瘍増殖の体積を表す図である。マウスは、６日目に、抗癌剤としてＰ４０７／Ｐ１８８／アルギネート／５ＦＵ／ＯＸ（２０／２／１／０．５／０．３）含有している本発明の組成物またはＰ４０７／Ｐ１８８／アルギネート（２０／２／１／０／０）を含んでなり、治療剤を含まない対照ゲルを使用した局所治療（ゲル２００μｌを腫瘍内注射）を受けた。横軸は日数での時間を表し、一方で縦軸は、ルシフェリン（平均ｎ＝５）を腹腔内注射した後の光子／ステラジアン／秒／ｃｍ２での発光強度を表す。図１４Ｂは、６日目に、抗癌剤としてＰ４０７／Ｐ１８８／アルギネート／５ＦＵ／ＯＸ（２０／２／１／０．５／０．３）を含んでなる本発明の組成物（４Ｂ  １）またはＰ４０７／Ｐ１８８／アルギネート（２０／２／１／０／０）を含んでなり、治療剤を含まない対照ゲル（４Ｂ  ２）を使用した局所治療を受けたマウスを１８日目に屠殺した後の腸の写真を表す図である。
【実施例】
【０１１２】
以下の例は本発明を説明することを意図し、いかなる方法においてもその範囲を制限することを意図していない。
【０１１３】
実施例１
１．材料および方法
１．サーモゲルの調製
ガラスビーカー中で、必要な量のポロキサマー  ４０７およびポロキサマー１８８（Ｐ１８８）を、目標としている溶液量のおよそ３分の２の水（ミリポア（Millipore）、０．２２［ｉｍ、抵抗性＝１８．３  ＭＨ／ｃｍ）と混合した。氷浴中に横たえながら磁気撹拌機を用いて数時間溶液を撹拌し、次に、４℃で一晩放置した。通常、混合物は翌日に溶解し、水で調節して容積を所望の容積（メスシリンダーを用いて）にした。所望量のアルギネート（Manucol DH、FMC BioPolymer、9005-38-3）またはペクチン（Herbstreith & Fox）またはキトサン（TM3728、Primex）またはSatiaxane、または／および抗癌剤５−ＦＵを、その後、原液に添加した。すべての成分が溶解するまでゲル化組成物を混合し、その後４℃で保管した。 
【０１１４】
ゲル組成物は以下の実験区分では次のように表される：（ｗ／ｖ）％  ポロキサマー  ４０７／％（ｗ／ｖ）ポロキサマー  １８８／％（ｗ／ｖ）アルギネート／％（ｗ／ｖ）（またはSatiaxane、またはペクチン）抗癌剤（５−ＦＵ）。  
【０１１５】
２．ゲル化温度の測定
ゲル化温度（Ｔｇｅｌ）を示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）およびレオロジーによって測定した。
【０１１６】
ＤＳＣにより：溶液２０〜３５ｍｇをアルミニウム・パンの中に密閉し、ＤＳＣ機器（ＤＳＣ１、Mettler Toledo）に置いた。空のアルミニウム・パン（サイズ：  ４０μＬ）を参考サンプルとして用いた。走査開始の前に、機器を７分間５℃で平衡にした。その後、サンプルを加熱速度５℃／分で４０℃に加熱した。機器に事前インストールしてあったソフトウェア（ＳＴＡＲｅソフトウェア）でデータ分析を行なった。ゲル化温度は、他の研究で既に行われていたように(Nie et al, Int. J. Nanomedicine. 6 (2011) 151-166. doi:10.2147/IJN.S15057)、ポロキサマーのミセル化によって引き起こされた大きな吸熱ピークを上回る約１０〜１２℃付近で視認可能なエンタルピーの小変化として決定された。  
【０１１７】
レオロジーにより：角度を１°とし、直径を５０ｍｍとし、ギャップを０．１ｍｍとし、コーン／プレート  モバイル（cone/plan mobile）で、固定周波数１Ｈｚで、ひずみを適用し、０．０１〜１００％で変化させた。時間の室温でサンプルを放置し、その後、およそ７５０μＬをペルチェ・プレート（pelletier plan）に搭載して温度を上昇させた。粘弾性係数Ｇ’およびＧ’’を測定した。ゲル化温度は曲線の交差点に相当する。 
【０１１８】
３．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性試験
３．１細胞培養
ＣＴ２６細胞株（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection：ＡＴＣＣ）、LGC Standards、モルスアイム、フランス））をｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験に使用した。ＣＴ２６細胞は、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレタン［９４］によって化学的に誘発された未分化の結腸癌から元々得られたものであり、これを後にクローニングして安定したＣＴ２６細胞株を得た。この細胞株をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの評価に使用した。
【０１１９】
細胞毒性の評価のために、我々はさらに他のタイプの癌細胞（Ｂ１６  Ｆ０マウス皮膚メラノーマ（ＡＴＣＣ（商標）ＣＲＬ−６３２２ＴＭ）、ＢＷＴＧ３：  マウス肝癌細胞株、３ＬＬ（ＡＴＣＣ（商標）ＣＲＬ−１６４２ＴＭ）：マウスルイス肺癌）も使用して、文献では非癌細胞（ＮＩＨ  ３Ｔ３マウス繊維芽細胞（ＡＴＣＣ（商標）ＣＲＬ−１６５８ＴＭ）と通常見なされる１つの細胞株を試験した。
【０１２０】
これら腫瘍細胞をすべて、３７℃にて、5%C02で加湿した雰因気中で、ウシ胎児血清 (FBS、Gibco Life technoligies)  を１０％、ストレプトマイシンを１００μΜおよびペニシリンを１００Ｕ／ｍＬ含有している、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）（ＤＭＥＭ、Gibco)中で培養した。他の方法で言及されていない場合、この混合物は細胞培養培地として単純化されるだろう。 
【０１２１】
マウス繊維芽細胞を同一条件で培養したが、ウシ胎児血清 (子牛血清、Gibco Life technoligies) を１０％、ストレプトマイシンを１００μΜおよびペニシリンを１００Ｕ／ｍＬ含有している、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Gibco)が必要であった。
【０１２２】
３．２  細胞毒性評価
２４−ウェルプレート（TPP Techno Plastic Products、92024)中で１ｍＬあたり細胞２００  ０００個（１ウェルあたり培地０．１ｍＬ）をインキュベーター（３７℃）内で一晩培養した。翌日、培地を取り除き、ゲル３００μｌを細胞上においた（deposed）。生細胞数は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT、Sigma Aldrich、298-93-1）比色アッセイによって決定した。６時間インキュベートを行った後にＭＴＴ溶液１００μＬ（細胞培養培地中ＭＴＴ４ｍｇ／ｍＬ）を細胞に添加した。溶液を取り除き、ＤＭＳＯ  １００μＬで置き換え、プレートを１０分間振盪させた。その後吸収を５６２ｎｍで測定した。
【０１２３】
９６−ウェルプレート（TPP Techno Plastic Products、92024)中で、１ｍＬあたり細胞２００  ０００個（１ウェルあたり培地０．１ｍＬ）をインキュベーター（３７℃）内で一晩培養した。翌日、培地を取り除き、本発明のサーモゲル（Ｐ407／Satiaxane／5ＦＵ）を異なる量で細胞上においた（deposed）。生細胞数は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT、Sigma Aldrich、298-93-1）比色アッセイによって決定した。７２時間インキュベートを行った後にＭＴＴ溶液１００μＬ（細胞培養培地中ＭＴＴ４ｍｇ／ｍＬ）を細胞に添加した。溶液を取り除き、ＤＭＳＯ  １００μＬで置き換え、プレートを１０分間振盪させた。その後吸収を５６２ｎｍで測定した。 
【０１２４】
４．ｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
４．１マウス
６〜７週齢のＢａｌｂ／ＣＪＲＪ雌マウス(Janvier、St Genest de Lisle、フランス)で実験を行った。動物実験は欧州指針および国内指針に従い行い、倫理委員会によって承認された。 
【０１２５】
４．２マウスへの腫瘍移植  
腫瘍モデルとして、ＣＴ２６細胞株の修飾細胞株であるＣＴ２６＿ｌｕｃ細胞株を使用した。培地中のＣＴ２６＿ｌｕｃ細胞をマウスの右と左の脇腹へ皮下注射した（異所的に）。移植から１５日後に、腫瘍を有するマウスを屠殺し、その腫瘍を切除し、無菌のＰＢＳに入れた。その後、腫瘍を２０〜３０ｍｍ３の断片に切断し、１２のゲージの套管針（３８ｍｍ）を用いて、前もってアルコールで消毒していたマウスの右脇腹に皮下挿入した。同じことをマウスの左脇腹にも行った。
【０１２６】
４．３腫瘍切除およびサーモゲル挿入
腫瘍挿入から１４日後に、マウスに麻酔（ケタミン８０ｍｇ／ｋｇ、キシラジンｌ０ｍｇ／ｋｇ  ３００μＬ腹腔内）を行い、２つの腫瘍の周辺領域を削り、消毒した。麻酔中に、マウスを生理学的温度で維持した。腫瘍付近で１〜２ｃｍ切開し、続けて腫瘍を肉眼で見て残留物を残さずに切除した。注射器を用いて、残った空洞に、ヒドロゲル製剤Ｐ４０７／Ｐ１８８／アルギネート／５Ｆｕ  ２０／２／１／０．５を１００μＬ挿入した。傷は絹糸５．０で閉じた。
【０１２７】
４．４ゲル注入後の腫瘍増殖の阻害
腫瘍挿入から８日後にマウスに麻酔（ケタミン８０ｍｇ／ｋｇ、キシラジンｌ０ｍｇ／ｋｇ  ３００μＬ腹腔内）をかけ、２つの腫瘍の周辺領域を削り、消毒した。この時点で、本発明のサーモゲルＰ４０７／Satiaxane／５Ｆｕ  ２１／０．１／０．５を６０μｌ、または５ＦＵなしの対照サーモゲルを腫瘍内に注入した。 
【０１２８】
４．４  腫瘍追跡検査
腫瘍のサイズは主に光学的イメージングによって測定した。したがって、イメージングを行う２０分前に、マウスには、ルシフェリン２ｍｇ（２００μｌ、ｌ０ｍｇ／ｍｌ）（ＤルシフェリンＫ塩、INTERCHIM)を腹腔内注射した。ルシフェラーゼと反応することによって、カメラ（PhotonlMAGERTM Biospace Lab）によって検出することができる光子信号が発生する。このように、マウスにイソフルランで麻酔をかけている間に１０分間イメージングを行った。画像分析はBiospace Labが開発したM3Visionソフトウェアで行なった。
【０１２９】
さらに、カリパスを用いていくつかの時点で腫瘍体積を測定した。体積は次のように推定した：（長さ×幅２）／２。
【０１３０】
これによってマウスを屠殺する時点を決定することも可能であった：マウスは腫瘍体積が一度１０００ｍｍ３を超過するや否や屠殺した。続けて腫瘍を切除し計量した。
【０１３１】
ＩＩ．結果
ポロキサマーに基づき、かつ接着および／または強度を改善するための添加剤成分を含有しているゲルが得られた。第一のアプローチとして、ＤＳＣとレオロジーによって得られたゲル化温度によりゲルの特性がもたらされた（図１および２）。製剤Ｐ４０７／Ｐ１８８中に１％アルギネートを添加することでゲル化温度が１〜２℃下がった。細胞毒性薬の局所送達に使用されるこれらのゲルの目的として、細胞毒性５−ＦＵをゲル内に取り込み、そのゲル化の維持を試験した（図２）。０．５％５−ＦＵを添加することでゲル化温度が２℃上昇したことが見出された。５ＦＵをＰ４０７／Satiaxane２１／０．１に取り込んだ場合に、同様の結果が得られた（図３）。ペクチンを含有している別の組成物のゲル化能を試験した。また、Ｐ４０７を含有しているゲル中のペクチンを様々なパーセンテージで添加すると、レオロジーによって得られたように、ゲル化温度が上昇したことも示された（図４）。
【０１３２】
サーモゲル内の５−ＦＵの細胞毒性効果は、本発明の製剤Ｐ４０７／Ｐ１８８／アルギネートでは腫瘍結腸ＣＴ２６に対して維持され（図５）、同様に、混合物Ｐ４０７／Satiaxane（２１／０．１／０．５）では様々な細胞株に対して維持されていた（図６）ことが見出された。５−ＦＵ誘導体の細胞毒性は、ゲルに取り込まれた際に維持された。興味深いことに、サーモゲルは、恐らく繊維芽細胞の倍増時間が最も遅いことに起因して、非癌細胞ＮＩＨ  ３Ｔ３と比較して、癌細胞に対してより有毒であることが見出された。
【０１３３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験をＢａｌＢＣマウスの脇腹に異種移植片したルシフェラーゼ陽性結腸ＣＴ２６に対して行った。異なる２つの実験を行なった。第一に、腫瘍を１１日目に除去し、マウスには切除領域への本発明のサーモゲルでの局所治療を行った。第二に、腫瘍を残し、移植から１１日後に本発明のサーモゲルを腫瘍内に直接注射した。切除後にＰ４０７／Ｐ１８８／アルギネート／５ＦＵ（２０／２／１／０．５）を含有しているゲルで局所治療を行ったところ、治療から１５日後に、細胞毒性を一切含まないゲル（ｐ＜０．０５）と比較して腫瘍増殖が有意に遅延していることが示された（図７）。さらに、治療していないマウスと比較して、マウスの生存率は局所治療の結果増加した（図８）。  
【０１３４】
腫瘍内での腫瘍内注射からなる第二治療では、一層より驚くべき結果が示された。組成物Ｐ４０７／Satiaxane／５ＦＵ（２１／０．２／０．５）は、ゲル無し（free gel）または治療していないマウスと比較して、腫瘍増殖の縮小を示した（図９）。平均データから、腫瘍遅延は４．２日であり、Ｔ／Ｃは３３％であった。Ｔ／Ｃ＜４２％は化合物が活性と見なされるための最低比であるため、我々は、ここで５ＦＵが当初からゲル内に投与された場合に活性であることを示し、これは、それがその細胞毒性の役割を果たすために、ゲルを通って拡散することを意味している（図１０）。 
【０１３５】
より顕著なのは、全身的な毒作用がないことであり、これは動物の体重減少を追跡することで観察することができる。腫瘍増殖を受ける動物の体重とは反対に、５ＦＵを局所送達することで一切の全身性細胞毒性も誘発することなく、腫瘍増殖を遅延させることができる（図１１）。
【０１３６】
実施例２
１．材料および方法
材料
ヒドロゲルは全て、Lavoisier France (パリ、フランス)からの注射用水を使用して調製した。BASF（フランス）から医薬品用途グレードのKolliphor（商標）P407およびKolliphor（商標）P188を得た。Protanal（商標）LF 10/60 FT(アルギネート)をFMC Biopolymer laboratories (ノルウェー)から得た。Protasan（商標）CL 113(キトサン)をNovamatrix(ノルウェー)から得た。Satiaxane（商標）UCX930(キサンタンガム)をCargill France (サン・ジェルマン−アン−レー、フランス)から得た。Carbopol（商標）971P NFおよびCarbopol（商標）974P NF(ルブリゾル、フランス)。Aerosil（商標）A200をAgeps laboratories(パリ、フランス)から得た。 
【０１３７】
製剤の調製
ヒドロゲルは容積単位で調製した。ここで報告したすべての成分の濃度は重量／容積百分率（％ｗ／ｖ）として表現される。ポロキサマー溶液は寒冷法（Schmolka、１９７２年）を使用して調製した。Ｐ１８８（１％−２％−５％）と合わせたＰ４０７（１７％−２０％）を一定量の注射用水にゆっくりと添加し、その後、透明な溶液を得るまで、調製物を４℃で放置した。その後、その調製物を磁気撹拌機で優しく均質化した。その後、多量の注射用水を、合計容積を調節するために添加した。  
【０１３８】
ポロキサマー/Satiaxane、ポロキサマー／アルギネート、ポロキサマー／キトサンのブレンド物を調製するために、第一に、Satiaxane（０．０５％および０．１％）、アルギネート（０．２５％、０．５％および１％）およびキトサン（０．２５％、０．５％および１％）の溶液を、必要な量を一定量の注射用水に分散させて、完全に溶解するまで連続的に撹拌することで調製した。その後、必要量のＰ４０７およびＰ１８８を既に膨潤（swollen）溶液に添加した。調製物を、前述の調節容積になるまで磁気撹拌機で優しく均質化した。
【０１３９】
カルボマー（０．２％）で作成したヒドロゲルは、一定の容積に必要量のカルボマーを分散させることにより調製した。その後、ポロキサマーを添加し、透明な溶液を得るまで溶解させた。その後、透明かつ均質な溶液のｐＨを１Ｍ水酸化ナトリウムで５．０〜５．５の間に調節して、化学的安定性を得た。
【０１４０】
ポロキサマー/Aerosil（１％および２％）のブレンド物の製剤には、注射用水中aerosil粉末を事前に分散させることが必要であり、Ultra-Turraxを用いて１５０００ｒｐｍで少なくとも８分間分散させた。その後、多量のaerosil分散物を、4℃で、磁気撹拌しながら、膨潤Ｐ４０７／Ｐ１８８ヒドロゲルにゆっくり添加した。調製した製剤の組成を表１に示す。 
【０１４１】
レオロジー分析によるポロキサマー製剤の熱分析および粘弾性のパラメーター  （表１）
表１では、様々なパーセンテージ（０．０５〜１）でアルギネート、キトサンおよびcarbopolなどの生体接着コポリマーを含有しているポロキサマー（１７／１および２０／１）の様々な混合物のゲル化温度および粘弾性のパラメーターを提供する表である。
表１：３７℃での各製剤のゲル化温度およびレオロジー測定結果
Ｔｇ＝ゲル化温度−Ｇ’’＝粘性係数−Ｇ’＝の弾性係数−ｔａｎδ＝Ｇ’’／Ｇ＝損失因子
【０１４２】
【表１】
2018528970.tif 000002
2018528970.tif 000003
2018528970.tif 000004
【０１４３】
レオロジー分析はAnton Parr MCR102レオメーター（フランス）を使用して行なった。測定システムは、コーン・プレートの組み合わせ（直径＝５０ｍｍ；角度＝  １°）であった。１Ｈｚでの非破壊振動測定から、弾性係数（Ｇ’）、粘性係数（Ｇ’’）および位相角（ｔａｎδ＝Ｇ’’／Ｇ）を得ることができた。プレートを速度ｌ℃／分で２０℃〜５０℃に加熱した。第一に、粘性係数（Ｇ’’）は弾性係数（Ｇ’）より高い。ゾル−ゲル遷移温度は２つの係数が交差する場所に定義し、弾性係数（Ｇ’）を粘性係数（Ｇ’’）より高くした。測定はすべて３回行ない、結果は平均±標準偏差として表現した。
【０１４４】
レオロジー分析によるポロキサマー製剤の流動化（Rheofluidification）試験（表２）
様々な製剤でのaerosilのずり流動化を決定するために、２０℃で、剪断速度γ０．１〜１００００ｓ−１にわたり、ｍＰａｓで粘度ηを測定することにより流動化試験を行った。測定はすべて３回行なった。平均と標準偏差を計算し、方程式ｙ＝ａｘ＋ｂから得られた直線キャリブレーショングラフをプロットするために報告した。ずり流動化は、傾斜（ａ）を比較し、同様に交差点（ｂ）を比較することにより決定され、これらは各製剤の粘度をもたらす。
【０１４５】
表２:レオロジー測定によって決定されたAerosil（商標）200のずり流動化効果および粘度（剪断速度０〜１０ｓ−１）。
【表２】
2018528970.tif 000005
【０１４６】
薬物を組み込んでいる製剤の熱分析およびエネルギー遷移（表３）
これらの実験にシステムDSC METTLER TOLEDO DSC 1 Star Systemと４０μＬのアルミニウムるつぼを使用した。サンプルをるつぼ内で計量して、次いでシステムに搭載した。プログラムは５分間５℃でサンプルを一貫して維持し、１℃／分の傾斜で進行し、平均データのエラーが１０％を超過しなくなるまで実験を３〜６回繰り返した。
【０１４７】
表３：示差走査熱量測定で測定した５Ｆｕ、オキサリプラチンのいずれかまたは両方の組み合わせの薬物を組み込んでいる製剤のミセル化温度（Ｔｍ）および遷移のエンタルピー（ｍＷ）結果
【表３】
2018528970.tif 000006
【０１４８】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ細胞毒性試験
細胞培養
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験にはＣＴ２６細胞株（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、ＣＬ−２６３８、LGC Standards、モルスアイム、フランス)を使用した。ＣＴ２６細胞は、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレタンによって化学的に誘発された未分化の結腸癌から元々得られたものであり、これを後にクローニングして安定したＣＴ２６細胞株を得た。この細胞株をｉｎ  ｖｉｖｏの評価に使用した。
【０１４９】
細胞毒性の評価のために、我々は別のタイプの癌細胞であるＥＣＡＣＣ  （９３１１２５１９  ＳＩＧＭＡ、ヒト細胞株）によって提供されたＡ２７８０卵巣癌細胞株を使用した。
【０１５０】
これら腫瘍細胞の全てを５％ＣＯ２で加湿した雰因気で、３７℃にてインキュベートした。ＣＴ２６細胞株にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、  Gibco)を使用し、Ａ２７８０  細胞株には重炭酸ナトリウムと２ｍＭのグルタミンを有するＲＰＭＩ−１６４０培地(RPMI, Gibco)を使用した。これら培地に１０％ウシ胎児血清 (FBS、Gibco Life technoligies)、ストレプトマイシン１００μΜおよびペニシリンｌ００Ｕ／ｍＬを補充した。別の言及がない限り、この混合物を細胞培養培地として単純化する。
【０１５１】
細胞接着評価
異なるヒドロゲル（３００μｌ）を４℃で、１０分の間に２４ウェルプレートに入れた。プレートを３７℃で３０分間インキュベートしてゲル化プロセスを確実にした。細胞の懸濁液をヒドロゲル（Ａ２７８０：細胞８００  ０００個／ｍｌ）に播種し、ヒドロゲルと接触した細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。この一晩のインキュベート後に細胞の写真を撮影した。次いで、トリプシン０．０５％で接着細胞を単離し、細胞懸濁液をKOVA（商標）GLASSTIC（商標）スライドで測定した。接着細胞の百分率を対照（プラスチック製プレートに直接接着した細胞）の関数として計算した。
【０１５２】
細胞毒性評価
細胞を３７℃で２４時間FalconＴＭセル・カルチャー・インサート（Cell Culture Inserts） (Cyclopore（商標）Falcon（商標）353095) に播種した（培地５００μｌ中１インサートあたり細胞４００  ０００個）。２日目に、頂端培地（apical medium）を除去し、ヒドロゲル２００μＬまたは対照溶液をインサートに載せた。３日目にヒドロゲルまたは対照溶液でのインキュベートを２４時間行った後に写真撮影を行った。プレートを１０分の間に４℃でインキュベートしてゲルを液化し、培養培地でウェルを２回洗浄し、死細胞およびヒドロゲル残渣を除去した。培養培地中の３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド (MTT、Sigma Aldrich、２９８−９３−１；０．５ｍｇ／ｍｌ）を細胞で４時間中インキュベートした。溶液を除去し、１００μＬのジメチルスルホキシドＤＭＳＯで置き換え、プレートを１０分間振盪させた。続けて、吸収を５６２ｎｍで測定した。９６−ウェルプレート(TPP Techno Plastic Products、92024)。対照ウェルの吸収の百分率で生存率を推測した。
【０１５３】
Ｉｎ  Ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
マウスモデル：６〜７週齢のＢａｌｂ／ＣＪＪ雌マウス (Janvier、St Genest de Lisle、フランス) で実験を行った。動物実験は欧州指針および国内指針に従い行い、倫理委員会によって承認された。
マウスへの腫瘍移植：結腸直腸癌腹膜癌腫症ＣＲＰＣモデル
【０１５４】
腫瘍モデルとして、ＣＴ２６細胞株の修飾細胞株であるＣＴ２６−ｌｕｃ細胞株を使用した。培養培地中のＣＴ２６−ｌｕｃ細胞を腹腔内注射した（マウス１個体あたり、１ｍｌ中ＣＴ２６−ｌｕｃ細胞５×１０５個）。
【０１５５】
サーモゲル挿入：腫瘍注射から６日後にマウスに麻酔（イソフラン２．０％）をかけ、皮膚および筋肉面内に１〜２ｃｍの小さな切り込みをした。麻酔中に、マウスを生理学的温度で維持した。ヒドロゲル製剤Ｐ４０７／Ｐ１８８／アルギネート／５Ｆｕ／オキサリプラチン  ２０／２／１／０．５／０．３またはＰ４０７／Ｐ１８８／アルギネート溶液を１ｍｌ注射器で注射した。傷口を絹糸５．０で閉じた。
【０１５６】
腫瘍追跡調査：腹膜空洞中の腫瘍の拡散を光学イメージングによって測定した。したがって、イメージングを行う２０分前に、マウスには、ルシフェリン２ｍｇ（２００μｌ、ｌ０ｍｇ／ｍｌ）（ＤルシフェリンＫ塩、INTERCHIM)を腹腔内注射した。ルシフェラーゼと反応することによって、カメラ（PhotonlMAGERTM Biospace Lab）によって検出することができる光子信号が発生する。このように、マウスにイソフルランで麻酔をかけている間に１０分間イメージングを行った。画像分析はBiospace Labが開発したM3Visionソフトウェアで行なった。
【０１５７】
ＩＩ結果
実施例２では、アルギネート、キサンタンガム、carbopol、キトサンなどの種々のゲル化剤が添加された例Ｐ４０７／Ｐ１８８  １７／１、２０／１および２０／５と、製剤範囲が拡大した。
【０１５８】
目標のゲル化温度（Ｔｇ  ）である２６〜３７℃を得るために製剤を設計した。コポリマーＰ４０７／Ｐ１８８およびゲル化剤の両方を含有している全ての試験された製剤は固定の目標温度に応答するサーモゲルである。ゲルの機械抵抗はゲル弾性Ｇ’のレオロジー測定を介して得た。活性物質の放出動力学は、ゲルの弾性Ｇ’および粘度の両方のレオロジー測定、続く、値がゼロに傾く際のより遅い放出を反映するｔａｎδの計算によって得た。一般的な特徴として、我々はゲル化剤の濃度を増加させることで機械抵抗などのゲルの期待特性を改善し、かつゲル内での活性物質の滞留が増加したことを観察した。
【０１５９】
実施例２は、aerosilを組み込むことでずり流動化サーモゲルが得られ得ることを示した。
【０１６０】
粘度はaerosilを製剤に添加した場合に増加し、１７％のＰ４０７および１％のＰ１８８に基づく製剤については２％のaerosilが添加された場合に８５．７８ｍＰａｓから９５．１２ｍＰａｓに増加し、２０％のＰ４０７および２％のＰ１８８に基づく製剤については２％のａerosilが製剤に添加された場合に１２２ｍＰａｓから、１５６．５４ｍＰａｓに増加した（表２）。コポリマーＰ４０７／Ｐ１８８の種々の製剤へのaerosilの挿入の効果は、ずり流動化の増加を示す機械的強度を維持しながらＧ”を低減させたことを明確に示し、これはヒドロゲルの注入および粉状化に好ましいだろう。剪断速度０〜１０ｓ−１の平均曲線を研究すると、aerosil濃度に伴ってずり流動化が増加することが示される（表２）。
【０１６１】
また、Ｐ４０７／Ｐ１８８  ２０／２内にアルギネートの量を増やして取り込むことで接着性ヒドロゲルが得られ得ることも示された。
【０１６２】
製剤の接着効果は、標準プレートまたは０．５または１％のアルギネートとＰ４０７／Ｐ１８８  ２０／２を含有しているゲルで被覆したプレートに細胞をロードすることで示された。細胞が特にアルギネートの百分率を増加した場合にゲル上に接着して増殖することができたために、接着性の百分率はアルギネートが接着性硬化を有することを示す（図１２）。
【０１６３】
実施例２では、適用した抗癌剤は５−フルオロウラシル、オキサリプラチンおよびそれらの組み合わせである。さらに、実施例２は、抗癌剤がゲルの結合を変更しなかったことを示すＤＳＣ測定、抗癌剤がゲル内に当初に取り込まれた場合であっても依然として活性であることを示す卵巣癌株に対するin vitro毒性研究、および腹腔内転移を有するマウス内の転移のin vivo治療後縮小を提供する。
【０１６４】
ＤＳＣによる熱分析から薬物がゲルの形成を損なわなかったことが示された。コポリマーの初期の混合に依存してゲルの安定化を得ることができる。
【０１６５】
５フルオロウラシル（０．５  ｍｇ）、オキサリプラチン（０．１ｍｇ）または５フルオロウラシル（０．５  ｍｇ）とオキサリプラチン（０．１ｍｇ）の両方を含むゲルＰ４０７／Ｐ１８８／アルギネート  ２０／２／１は、卵巣細胞Ａ２７８０が、ゲル内に取り込まれた個々の薬物または抗癌剤の組み合わせに感受性であり、かつ抗癌剤の溶液として類似の細胞毒性のレベルに達することを示した（図１３）。
【０１６６】
５−フルオロウラシルとオキサリプラチン（それぞれ５ｍｇ、３ｍｇ）の混合物を含有しているゲルＰ４０７／Ｐ１８８／アルギネートのｉｎ  ｖｉｖｏ転移への効果を評価するために腹腔内癌腫症のモデルを設定した。マウス１個体に対する追跡検査を示す：生物発光（ルシフェラーゼ活性）により観察した転移増殖は、抗がん剤の組み合わせを含有しているゲルで治療したマウスについてのみ腫瘍の減少よりも増加を示した。検死後の転移を観察すると、５−フルオロウラシルとオキサリプラチンを含有しているゲルで治療したマウスの腸内には転移数が著しく低減していることが示された（図１４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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