(57)【要約】  本発明は、デジタル的に再処理されて、引き続き解析される生体顕微鏡に接続されたカメラからとった画像の使用に基づく、内皮細胞の形態計測的解析のための方法および装置に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
角膜内皮の細胞の形態計測的解析のための方法であって、以下のステップ：
Ａ．デジタルカメラを装備した生体顕微鏡による角膜内皮細胞の少なくとも１つのリアルなデジタル画像を獲得するステップであって、前記リアルなデジタル画像は、複数の単独ピクセルから構成されている、ステップと、
Ｂ．前記画像の目的の少なくとも１つのエリア、好ましくは内皮細胞のみを含有するエリアを選択するステップと、
Ｃ．目的の前記エリアの各々のピクセルについて輝度値を検出するステップと、
Ｄ．その要素が単独ピクセルの輝度値を含む第一のマトリクスを生成するステップと、
Ｅ．同じ輝度値を実質的に有するピクセルの、各々のモデル細胞に対して、少なくともアサインメントによって影響される、前記内皮細胞の１つ以上のモデル細胞を再構築することによって前記エリアをモデリングするステップと、
Ｆ．各々のモデル細胞に関して、前記細胞が構成されるピクセルの共通重心および半径を算出するステップと、
Ｇ．第二のマトリクス３×Ｎを作成し、ここでＮが特定された細胞の数であるステップと、
Ｈ．関係式（ｄ＊Ｋ）≦（ｒｌ＋ｒ２）を満たす隣接のモデル細胞を、各々のモデル細胞に関して特定する前記マトリクス３×Ｎをスキャンするステップであって、ｒ１およびｒ２は、２つのモデル細胞の半径であり、ｄは、２つのモデル細胞の共通重心の間の距離であり、かつＫは形状因子であるステップと、
Ｉ．ステップＨの関係が検証された各々の対のモデル細胞に関して、前記対の２つのモデル細胞を接触とみなすステップと、
Ｊ．１ｍｍ２あたりのモデル細胞の数、および／または各モデル細胞の面積、および／または前記モデル細胞の平均面積、および／または前記平均面積に関する各々のモデル細胞の面積に対する標準偏差、および／または特定の細胞によって接触される細胞の数を算出するステップと、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記ステップＡが、複数の画像を獲得するステップと、その後の時間に得られた２つの連続画像のコントラストを測定することによって得られた相対変調伝達関数（ＭＴＦ）の算出によって獲得した複数の画像の間の好ましい画像を選択するステップとを包含する、方法。
【請求項３】
請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法であって、ステップＣが、ニセ情報を排除するために適切な、前記エリアのピクセルに対して画像解析フィルタを適応するステップと、細胞全体にわたって輝度値を均質化するステップとを包含する、方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記画像解析フィルタが、少なくともＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｌｕｃｙ、コントラスト増強フィルタ、モルフォロジーフィルタ（浸食、膨張）、色抽出切り離しフィルタである、方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の方法であって、ここで前記フィルタが：
ｉ）Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｌｕｃｙ、
ｉｉ）コントラスト増強フィルタ、
ｉｉｉ）モルフォロジーフィルタ（浸食、膨張）、
ｉｖ）色抽出切り離しフィルタであって、
前記フィルタは、上記の順序ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）で連続して適用されるフィルタ、
である、方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、ステップＨにおける前記形状因子Ｋが０．７〜１におよぶ、方法。
【請求項７】
角膜内皮の細胞の形態計測的解析のための装置であって、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法を実現するという点で特徴付けられる、装置。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置であって、デジタルカメラ、電子的プロセッサおよびスクリーンに対して作動可能に連結された少なくとも１つの生体顕微鏡を備える、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、角膜内皮の細胞の形態計測的解析のための方法および関連の装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
「角膜内皮の細胞の形態計測的解析」という定義は、結果として、以下のパラメーター：
−選択されたエリアにおける内皮細胞の各々の細胞の面積の測定、
−細胞の数Ｐにおける内皮細胞の単位面積あたりの細胞の数、
−選択されたエリア中の内皮細胞の単位面積あたりの細胞の数、
−内皮細胞の特定における各々の細胞の形態の特定、
−内皮細胞の選択されたエリアにおける各々の細胞の形態の特定、
−前記細胞に関して可能な統計学的解析、
のうちの少なくともいくつかを提供するために適切な解析を指す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
内皮細胞の前記解析は、例えば、白内障手術の準備において、屈折矯正手術において、角膜疾患において、角膜移植において、およびコンタクトレンズ着用者の分野において、特に適用され得る。
【０００４】
内皮細胞は、角膜の透過性を保存するという主要な機能を有する；この組織の定性的解析および定量的解析の両方を達成することが特に重要である。なぜなら、この細胞は、再生能力を有さず、従って形態学的な変化に供されるからである。
【０００５】
この理由のために、当該分野の状況では、角膜内皮の形態計測的な解析は、特定の器具、いわゆる内皮細胞顕微鏡、すなわち、この組織の解析を専門的に達成するようになっている装置の使用によって行われる。
【０００６】
種々の種類の内皮細胞顕微鏡があり、これらの間で、最も広範に用いられるものの１つは、「非接触」または「反射鏡」型のものであり、それ自体当該分野の状況で公知であり、そのために、この点ではさらなる詳細は示さない。
【０００７】
内皮細胞顕微鏡の説明に入ることはないが、種類にかかわらずいくつかの共通する限界があることに注目すべきである。
【０００８】
まず第一に、内皮細胞顕微鏡は、主にそれらが構成される構成要素（すなわち、光源、種々の光学要素、検出器、機械的構成要素）に由来する、比較的高いコストを有し；このコストのせいで、それらは明白な結果を伴い、比較的一般的ではなくなる。
【０００９】
第二に、内皮細胞顕微鏡は、角膜の最も中心部分で内皮細胞の画像を得ることができるだけであり；さらに、操作者は、彼らが角膜に対するセンサーの配置を完全に制御しないので、どのエリアを検査するかを正確に選択する能力は有さない。
【００１０】
この装置の別の限界は、得られた画像が、操作者によって改変できない、入射光ビームの振幅に依存する、固定の大きさ（典型的には０．１ｍｍ２）を有するという事実に依拠する。
【００１１】
内皮細胞顕微鏡ではさらに、目的のエリアのリアルタイムの獲得は可能にならず、その結果として臨床評価は、検査の結果のいずれかの解析を進行する前に、器具の一部に対する完全な検査を要する。
【００１２】
一般には、当該分野の本発明の状況では、生体顕微鏡（スリットランプとしても示される）の使用によって、  −  経験した臨床家（通常は、眼科医または検眼医）にとって  −  非形態計測的（ただし、内皮細胞の定量的解析だけ）もまた達成され得ることに注目すべきである。
【００１３】
検査の間に臨床家によって可視化されるエリアに相当するリアルな写真画像を登録するための写真カメラを備える生体顕微鏡を装備することはまた、当該分野の状況で公知でもある。
【００１４】
生体顕微鏡（比較的低コストである）は、広範に用いられているが、ただし、この種の装置を用いて内皮細胞のデータを獲得するには限界がある。
【００１５】
当該分野の現在の状況では、実際に、上記で特定された意味では形態計測的解析は可能にならず、定性的解析のみである。なぜなら、角膜内皮から得られる画像は、公知のソフトウェアで解析するために適切な特徴を有さないからである。
【００１６】
要するに、従って、角膜内皮を検討するための当該分野の状況では２つのアプローチがある：内皮細胞顕微鏡（真の形態計測的な解析を可能にするが、費用がかさみ、従って広くは用いられておらず、さらに他の問題もある）の使用、および生体顕微鏡（他の種の評価のための眼科学的かつ視力測定的な臨床診療に広く用いられるが、いずれにしても角膜内皮の定性的解析しかできない）の使用。
【００１７】
内皮細胞顕微鏡が採用する解析技術が、生体顕微鏡によって獲得される画像で用いられるべきであった場合でさえ、生体顕微鏡で見られる低いコントラストのせいで、内皮細胞を認識することはできなかった。
【発明の効果】
【００１８】
従って、本発明の一般的な目的は、比較的低コストであって、当該分野の状況で公知の解決法の限界を克服する角膜内皮の形態計測的解析のための方法および関連の装置を提供することである。
【００１９】
上記の目的は、本発明によって、それぞれの開示された独立した請求項による方法および関連の装置によって達成される。
【００２０】
本発明の基礎的な原理は、従来ではない技術（角膜内皮細胞の端部の優れた強調を可能にする）を用いて、生体顕微鏡によって得られる画像を処理するための革新的な方法にある。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
この一般的概念は、要するに以下のステップを含む方法に関する：
（ｉ）細胞のデジタル画像を獲得するために着想された特異的かつ単純な手順を用いる（一般的な）生体顕微鏡によって角膜内皮細胞のリアルな写真画像を獲得して登録するステップ。これによって、入射光ビームの大きさを変更することが可能になり、これによって、内皮細胞顕微鏡で典型的には得られたものに関して少なくとも２〜３倍大きい多数の認識された細胞を有するように面積の振幅が検査されて、入射光ビームの大きさ（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）を、従って、（共通の）角膜内皮を用いて角膜内皮細胞の振幅を変更することが可能になり；さらに、角膜のどの部分が観察されたかを選択または登録して、これを適切なエリアに分ける可能性がもたらされる；
（ｉｉ）目的のエリアの形態計測的解析。
【００２２】
この方法では、これによって、上記の制限の全てが克服される；解析装置の一部としての生体顕微鏡の使用によって、その器具の全体的なコストを低下することが可能になり、またこのような解析をより簡易に行うことも可能になり；さらに、内皮細胞の一般的解析における主観的要素から解放されることが可能になり、これによって、真の形態計測的解析を果たすことが可能になり；同時に、これを角膜の特定の一部に対して参照することによって解析の目的のエリアを正確に位置決めすることも可能になる。
【００２３】
本発明の構造的および機能的な特徴、ならびに公知の技術に対するその利点は、本発明自体の革新的な原理による本発明の可能な実施形態に関する以下の説明からさらに明らかになるであろう。
【００２４】
本発明の方法をさらによく理解することができるように、前記方法を好ましいが非限定的な実施形態で行う装置を最初に簡略に記載することが都合がよい。
【００２５】
この実施形態では、角膜内皮細胞の形態計測的な解析のための本発明の装置は、生体顕微鏡、デジタルカメラ、電子的プロセッサおよびモニターを備える。
【００２６】
これらの構成要素は、お互いに対して作動可能に接続されており、デジタルカメラによって獲得された画像、およびプロセッサによって達成された計算操作のその後のグラフ表示を、リアルタイムでスクリーン（またはモニター）上に示す。
【００２７】
モニターなのは、コンピューターであり、例えば、この方法は、コンピューター記憶ユニットにロードされ、その上で実行され得る特異的なソフトウェアによって達成される。
【００２８】
生体顕微鏡はまた、「スリットランプ」とも呼ばれ：これは、そのままで公知であるデバイスであり、本明細書ではなんらさらなる説明は必要としない。
【００２９】
このデジタルカメラはまた、周知のデバイスであり、本出願については、少なくとも５百万ピクセルおよび少なくとも５ｆｐｓのフレームレートを有するＣＣＤまたはＣｍｏｓセンサーを備えた種類のものであることが好ましいことに注意すべきであることを除いて、本明細書では技術的説明を必要としない。
【００３０】
この方法は最初に、本明細書において以降で、その一般的な実施形態で、次いでさらに詳細に記載されている。
【００３１】
角膜内皮細胞のリアルな画像は、生体顕微鏡ならびに、これにおよびパーソナルコンピューターに接続されたデジタルカメラによって獲得されて、解像度は引き続く処理に十分である。
【００３２】
この目的のために、細胞は好ましくは、約６０／７０ピクセルで示されることに注意すべきであるが、理論的には、最小数のピクセルで作動することも可能にすべきである。
【００３３】
最も適切な画像を選択するために好ましくは用いられる技術は、２つのフレームから開始して最大で任意の数「ｎ」までの可変フレーム数を獲得するステップ、およびこれらの各々に関して相対的ＭＴＦ（変調伝達関数）を算出するステップ、ならびにソフトウェアの必要性に基づいて、引き続く処理のための最も適切な値でそれを選択するステップからなる。
【００３４】
ＭＴＦ関数は（一般には）２つのコトラストの間の比によって与えられるＣ１／Ｃ０であり、ここで、Ｃ１は、デジタルカメラ（例えば、ＣＣＤ）のセンサーによって獲得される画像のコントラストであり、Ｃ０は、獲得プロセスの前の画像のコトラストであることを念頭においておくべきである。
【００３５】
本発明の場合、相対的なＭＴＦは、再度獲得プロセス後に、ｔ０時点のコントラストＣ０、およびｔ１時点のコトラストＣ１を測定することによって算出される。
【００３６】
この方法では、２つの異なるモーメントで得られる２つのフレームの間の相対的なＭＴＦ測定がある（１つはモーメントｔ０で、他はモーメントｔ１で）。
【００３７】
各々の獲得についての相対的ＭＴＦ測定を繰り返すことによって（ｔ０、ｔ１、ｔ２．．ｔｎ）、ＭＴＦ中のモーメントごとの変動、従って、画像の最高品質のエリア中の生体顕微鏡の位置を評価することが可能である。
【００３８】
この目的のために、最も適切なＭＴＦ（変調伝達関数）値で決定される装置（例えば、サウンドフィードバック）を制御する、操作者に向けられた警告またはフィードバックシグナルの生成が予測される。
【００３９】
獲得を支持するために、目的の内皮細胞のエリアが操作者によって特定された後に、センタリングステップが予測され得、これは、スクリーンまたはモニター（ここにディスプレイされる）の中心に目的の内皮細胞の部分を維持する相を備える。
【００４０】
獲得後に、解析すべきエリアを、例えば、スクリーン上での選択によって、あるフレームで、選択してもよく、この情報を、記憶してもよい。
【００４１】
この処理は、固定順序で画像の適切な処理手順による、リアル画像の予備的なモデリングを含む。
【００４２】
画像は、目的のパラメーター、すなわち、各々の単一細胞の面積および最初の隣接細胞の数が推論される、ある配列の関数ｆ（ｘ，ｙ）が適用されるデカルト座標位置（ｘ，ｙ）のマトリクスで示される。
【００４３】
データを最終的に処理して、画像の統計学的説明、すなわち、角膜内皮細胞の形態計測的解析のパラメーターのうち少なくともいくつかを得る。
【００４４】
さらに具体的には、角膜内皮細胞の形態計測的解析のための方法は、以下のステップ：
Ａ．デジタルカメラを装備した生体顕微鏡によって特定のエリア内で角膜内皮細胞のリアルなデジタル画像を獲得するステップであって、前記リアルなデジタル画像は、複数の単独ピクセルから構成されるステップと、
Ｂ．目的の前記画像の少なくとも１つのエリア、好ましくは内皮細胞のみを含むエリアを選択するステップと、
Ｃ．目的の前記エリアの各々のピクセルについて輝度値を検出するステップと、
Ｄ．要素が、単独ピクセルの輝度値を含む第一のマトリクスを生成するステップと、
Ｅ．同じ輝度値を実質的に有するピクセルの、各々のモデル細胞に対するアサインメントによって少なくとも達成される、内皮細胞の１つ以上のモデル細胞を再構築することによって、前記エリアをモデリングするステップと、
Ｆ．各々のモデル細胞に関して、前記細胞が構成されるピクセルの共通重心および半径を算出するステップと、
Ｇ．第二マトリクス３×Ｎ（ここでＮは、特定された細胞の数である）を生成するステップと、
Ｈ．各々のモデル細胞に関して、関係式（ｄ＊Ｋ）≦（ｒ１＋ｒ２）を満たす隣接のモデル細胞を特定する前記マトリクス３×Ｎをスキャンするステップであって、ｒ１およびｒ２は、２つのモデル細胞の半径であり、ｄは、２つのモデル細胞の共通重心の間の距離であり、Ｋは形状因子であり、（ｄ＊Ｋ）ｅは、各々のモデル細胞での、２つのモデル細胞の共通重心の間の同じ距離および形状因子Ｋを実質的に有するピクセルであるステップと、
Ｉ．ステップＨの関係を検証したモデル細胞の各々の対に関して、２つのモデル細胞の対が接触しているとみなすステップと、
１ｍｍ２あたりのモデル細胞の数、および／または各々のモデル細胞の面積、および／またはモデル細胞の平均面積、および／または平均面積に関する各々のモデル細胞の面積に対する標準偏差、および／または特定の細胞に接触される細胞の数を算出するステップと、
を包含する。
【００４５】
この方法では、要するに、形態計測的解析は、生体顕微鏡およびカメラによって獲得されるデータに基づいて達成され得、それによって、当該分野の状況に関連する限界が克服される。
【００４６】
この方法では、形態計測的解析が正確に達成される角膜部分を選択することも可能である。
【００４７】
任意のかつ有利な改善によれば、ステップＣ）は、ニセ情報を排除して、細胞まるごとにわたる輝度値を均一化するために適切な前記エリアのピクセルに対して画像解析フィルタを適用するステップを包含する。
【００４８】
この種のフィルタは、文献では公知であり；具体的には、以下のフィルタのうち少なくとも１つ、好ましくは全てが適用される。
【００４９】
・Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｌｕｃｙ：
これは、Ｂａｙｅｓ’  ｔｈｅｏｒｅｍに基づくアルゴリズムであり、これによって、画像のデコンボリューションが、反復プロセスによって達成されることが可能になる。一般には、Ｙ（ｉ）が、潜伏性の「非混同（ｎｏｎ−ｃｏｎｆｕｓｅｄ）」画像であり、Ｘ（ｉ）が獲得された画像であり、かつＰ（ｉ｜ｊ）が点像分布関数である場合、Ｘ（ｉ）＝Σ  Ｐ（ｉ｜Ｊ）Ｙ（ｊ）であると言え、ここでｊは、実際のピクセルであり、かつＩは、ピクセルである。Ｙ（ｊ）は、Ｐ（ｉ｜ｊ）ＰＳＦが、既知であることを仮定し、かつ光子の分布がポアソン分布であることを仮定する、反復プロセスによって得ることが可能であることが実証され得る。
【００５０】
・コントラスト増強フィルタ：
画像のコントラストにおける改善を得るためのアルゴリズムは、輝度値のヒストグラムの同等化に基づく。
【００５１】
・形態学フィルタ（浸食、膨張）：
これは、形態解析に基づく画像処理のアルゴリズムである。これは、解析すべき画像とコンボルートされた構造化要素の使用に基づく。このコンボリューションから生じるピクセルは、近いピクセル値に依存する値を有する。浸食（ＥＲＯＳＩＯＮ）および膨張（ＤＩＬＡＴＩＯＮ）と呼ばれる２つの基本的操作が一般に用いられる。膨張操作において、画像物体の輪郭上のピクセルを、合計する。浸食では、操作ピクセルは、画像中の物体の輪郭から除外する。
【００５２】
・色抽出切り離しフィルタ：
このアルゴリズムは、Ｌｕｃ  ＶｉｎｃｅｎｔおよびＰｉｅｒｒｅ  Ｓｏｉｌｌｅによって導入され、浸漬概念に基づく。各々の極小は、表面の穴とみなされる。この表面によって限られるベイスンの充填を、クレストのみが可視になるまでシミュレートする。
【００５３】
上記のフィルタは、文献では公知であり、そのために、さらなる詳細は必要ない。
【００５４】
これらのフィルタの全てが、好ましくは適用され、正確な順序（時間、連続）は上記で規定される。
【００５５】
ステップＨ）による形状因子Ｋに関して、これは、各々の単一細胞の形態が、完全に球状ではないという事実を考慮する；形状因子Ｋは、好ましくは、要するに、最大３０％までの偏差を受け入れるように、０．７〜１におよぶ。
【００５６】
従って、上記で提唱された目的は達成された。
【００５７】
本発明の保護の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。
【国際調査報告】
2018504198.tif 000002
2018504198.tif 000003
2018504198.tif 000004