(57)【要約】本開示は、概して、T細胞活性化および特異的標的細胞に対する方向付け直し(re-direction)のための、共通軽鎖を有する二重特異性抗原結合分子に関する。さらに、本開示は、そのような二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞に関する。さらに、本開示は、本開示の二重特異性抗原結合分子を産生するための方法、および疾患の治療においてこれらの二重特異性抗原結合分子を使用する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、第1の抗原結合部分が、第1の軽鎖を含みかつ活性化T細胞抗原に特異的に結合することができ、第2の抗原結合部分が、第2の軽鎖を含みかつ標的細胞抗原に特異的に結合することができ、第1の軽鎖および第2の軽鎖のアミノ酸配列が同一である、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２】
第1の抗原結合部分がFabである、請求項1記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３】
第2の抗原結合部分がFabである、請求項1または2記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる第3の抗原結合部分をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項５】
安定な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFcドメインをさらに含む、請求項1記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項６】
第1の軽鎖および第2の軽鎖が、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、およびSEQ ID NO:34の軽鎖CDRを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項７】
第1の軽鎖および第2の軽鎖がκ軽鎖定常ドメインを含む、請求項1〜6のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項８】
第1の軽鎖および第2の軽鎖がλ軽鎖定常ドメインを含む、請求項1〜6のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項９】
第1の軽鎖および第2の軽鎖がヒトλ軽鎖またはヒト化λ軽鎖である、請求項8記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０】
第1の軽鎖および第2の軽鎖がヒトλ7軽鎖またはヒト化λ7軽鎖である、請求項9記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１】
第1の軽鎖および第2の軽鎖がSEQ ID NO:31のアミノ酸配列を含む、請求項1〜6および8〜10のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２】
第1の軽鎖および第2の軽鎖がSEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含む、請求項11記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３】
活性化T細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合部分が、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、およびSEQ ID NO:39の重鎖CDRを含む重鎖を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４】
活性化T細胞抗原に特異的に結合することができる1以下の抗原結合部分を含む、請求項1〜13のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５】
第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分が、任意でペプチドリンカーを介して、互いに融合されている、請求項1〜13のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６】
第2の抗原結合部分のFab重鎖のC末端が第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている、請求項2〜13のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７】
第1の抗原結合部分のFab重鎖のC末端が第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている、請求項2〜13のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１８】
第2の抗原結合部分のFab重鎖のC末端が第1のFcドメインサブユニットまたは第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている、請求項2〜13および9のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１９】
第1の抗原結合部分のFab重鎖のC末端が第1のFcドメインサブユニットまたは第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている、請求項2〜13のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２０】
第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分それぞれのFab重鎖のC末端がFcドメインサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている、請求項2〜13のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２１】
第1の抗原結合部分、第2の抗原結合部分、および第3の抗原結合部分がそれぞれ、同一のVLCL軽鎖を含むFab分子である、請求項4記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２２】
第1の抗原結合部分、第2の抗原結合部分、および第3の抗原結合部分がそれぞれ、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、およびSEQ ID NO:34の軽鎖CDRを含むFab分子である、請求項4または21記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２３】
第1の抗原結合部分、第2の抗原結合部分、および第3の抗原結合部分がそれぞれ、SEQ ID NO:31のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むFab分子である、請求項4または21記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２４】
第3の抗原結合部分のFab重鎖のC末端が第1のFcドメインサブユニットまたは第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている、請求項4または21〜23のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２５】
第2の抗原結合部分および第3の抗原結合部分それぞれのFab重鎖のC末端がFcドメインサブユニットのうちの1つのN末端と融合され、第1の抗原結合部分のFab重鎖のC末端が第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている、請求項4または21〜23のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２６】
第2の抗原結合部分および第3の抗原結合部分ならびにFcドメインが免疫グロブリン分子の一部、特に、IgGクラス免疫グロブリンの一部である、請求項25記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２７】
第1の抗原結合部分および第3の抗原結合部分それぞれのFab重鎖のC末端がFcドメインサブユニットのうちの1つのN末端と融合され、第2の抗原結合部分のFab重鎖のC末端が第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている、請求項4または21〜23のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２８】
第1の抗原結合部分および第3の抗原結合部分ならびにFcドメインが免疫グロブリン分子の一部、特に、IgGクラス免疫グロブリンの一部である、請求項27記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２９】
Fcドメインが、IgG、特に、IgG1またはIgG4のFcドメインである、請求項5〜28のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３０】
FcドメインがヒトFcドメインである、請求項5〜25のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３１】
Fcドメインが、第1のFcドメインサブユニットおよび第2のFcドメインサブユニットの会合を促進する改変を含む、請求項5〜23のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３２】
Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにあるアミノ酸残基が、これより大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と交換され、それによって、第2のサブユニットのCH3ドメイン内の空洞に配置可能な突出部が、第1のサブユニットのCH3ドメイン内に生じ、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにあるアミノ酸残基が、これより小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と交換され、それによって、第1のサブユニットのCH3ドメイン内にある突出部を配置可能な空洞が、第2のサブユニットのCH3ドメイン内に生じる、請求項31記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３３】
Fcドメインが、天然のIgG1 Fcドメインと比較して、Fc受容体に対して低い結合親和性および/または低いエフェクター機能を示す、請求項5〜32のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３４】
Fcドメインが、Fc受容体に対する結合および/またはエフェクター機能を低減する1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項5〜32のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３５】
1つまたは複数のアミノ酸置換が、L234、L235、およびP329からなる群より選択される1つまたは複数の位置にある、請求項34記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３６】
Fcドメインの各サブユニットが、活性化Fc受容体に対する結合および/またはエフェクター機能を低減する3個のアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換がL234A、L235A、およびP329Gである、請求項34記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３７】
Fc受容体がFcγ受容体である、請求項33〜36のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３８】
エフェクター機能が抗体依存性細胞傷害(ADCC)である、請求項33〜37のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３９】
活性化T細胞抗原がCD3である、前記請求項のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４０】
標的細胞抗原が、葉酸受容体1(FolR1)、ムチン-1(MUC1)、およびB細胞成熟抗原(BCMA)からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４１】
第1の軽鎖および第2の軽鎖がヒト化軽鎖である、前記請求項のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４２】
異なる抗原特異性を有する2つを超える抗原結合部分において、第1の軽鎖および第2の軽鎖を使用することができる、前記請求項のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４３】
標的細胞抗原がBCMAでない、前記請求項のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４４】
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子において使用するための、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、およびSEQ ID NO:34のアミノ酸配列を含む軽鎖。
【請求項４５】
κ軽鎖定常ドメインを含む、請求項44記載の軽鎖。
【請求項４６】
λ軽鎖定常ドメインを含む、請求項44記載の軽鎖。
【請求項４７】
ヒトλ軽鎖またはヒト化λ軽鎖である、請求項46記載の軽鎖。
【請求項４８】
ヒトλ7軽鎖またはヒト化λ7軽鎖である、請求項46記載の軽鎖。
【請求項４９】
SEQ ID NO:31のアミノ酸配列を含む、請求項46〜48のいずれか一項記載の軽鎖。
【請求項５０】
SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含む、請求項49記載の軽鎖。
【請求項５１】
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を産生するためにライブラリーにおいて使用するための、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、およびSEQ ID NO:34のアミノ酸配列を含む軽鎖。
【請求項５２】
κ軽鎖定常ドメインを含む、請求項51記載の軽鎖。
【請求項５３】
λ軽鎖定常ドメインを含む、請求項51記載の軽鎖。
【請求項５４】
ヒトλ軽鎖またはヒト化λ軽鎖である、請求項53記載の軽鎖。
【請求項５５】
ヒトλ7軽鎖またはヒト化λ7軽鎖である、請求項54記載の軽鎖。
【請求項５６】
SEQ ID NO:31のアミノ酸配列を含む、請求項53〜55のいずれか一項記載の軽鎖。
【請求項５７】
SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含む、請求項56記載の軽鎖。
【請求項５８】
SEQ ID NO:31のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項５９】
SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項６０】
請求項1〜41のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子もしくはその断片、または請求項58もしくは59記載の単離されたポリペプチドもしくはその断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６１】
請求項60記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
【請求項６２】
請求項60記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター、特に、発現ベクター。
【請求項６３】
請求項60記載の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項62記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６４】
a)T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で請求項63記載の宿主細胞を培養する工程、および
b)T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程
を含む、請求項1〜43のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を産生する方法。
【請求項６５】
請求項64記載の方法によって産生されたT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項６６】
請求項1〜43のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項６７】
医薬として使用するための、請求項1〜43のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子または請求項66記載の薬学的組成物。
【請求項６８】
それを必要とする個体における疾患の治療において使用するための、請求項1〜43のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子または請求項66記載の薬学的組成物。
【請求項６９】
疾患ががんである、請求項66記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子または薬学的組成物。
【請求項７０】
それを必要とする個体において疾患を治療するための医薬を製造するための、請求項1〜43のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子または請求項44〜57のいずれか一項記載の軽鎖の使用。
【請求項７１】
個体において疾患を治療する方法であって、該個体に、請求項1〜43のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子または請求項44〜57のいずれか一項記載の軽鎖を薬学的に許容される形で含む治療的有効量の組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項７２】
疾患ががんである、請求項70記載の使用または請求項71記載の方法。
【請求項７３】
T細胞の存在下で、標的細胞を請求項1〜43のいずれか一項記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子と接触させる工程を含む、標的細胞の溶解を誘導するための方法。
【請求項７４】
T細胞活性化抗原および標的細胞抗原に特異的な二重特異性抗原結合分子において使用するための可変重鎖を特定するための方法であって、可変重鎖と、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、およびSEQ ID NO:34のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする工程を含む、方法。
【請求項７５】
軽鎖がκ軽鎖定常ドメインを含む、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
軽鎖がλ軽鎖定常ドメインを含む、請求項74記載の方法。
【請求項７７】
軽鎖がヒトλ軽鎖またはヒト化λ軽鎖である、請求項76記載の方法。
【請求項７８】
ヒトλ7軽鎖またはヒト化λ7軽鎖である、請求項77記載の軽鎖。
【請求項７９】
軽鎖がSEQ ID NO:31のアミノ酸配列を含む、請求項76〜78のいずれか一項記載の方法。
【請求項８０】
軽鎖がSEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含む、請求項79記載の方法。
【請求項８１】
前記の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本願は、ASCII形式で電子出願された配列表を含み、これが参照によりその全体が本明細書に援用される。2015年11月10日作成の当該ASCIIコピーはファイル名32398_SL.txtで、537,667バイトである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、T細胞を活性化するための二重特異性抗原結合分子に関する。さらに、本発明は、そのような二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞に関する。さらに、本発明は、本発明の二重特異性抗原結合分子を産生するための方法、および疾患の治療においてこれらの二重特異性抗原結合分子を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
様々な臨床の場において個々の細胞または特定の細胞タイプの選択的破壊がしばしば望まれる。例えば、健常な細胞および組織を無傷のまま傷つけずに腫瘍細胞を特異的に破壊することは、がん療法の主な目標の一つである。
【０００４】
これを実現する魅力的な手法の一つは、腫瘍に対する免疫応答を誘導することにより、ナチュラルキラー(NK)細胞または細胞傷害性Tリンパ球(CTL)などの免疫エフェクター細胞が腫瘍細胞を攻撃および破壊するようにする手法である。CTLは免疫系の中で最も強力なエフェクター細胞を構成するが、従来の治療抗体のFcドメインによって媒介されるエフェクター機構によっては活性化することができない。
【０００５】
この点に関して、近年、1本の「アーム(arm)」を用いて標的細胞上にある表面抗原に結合し、第2の「アーム」を用いてT細胞受容体(TCR)複合体の活性化インバリアント成分に結合するように設計された二重特異性抗体が関心対象となっている。このような抗体がその標的の両方と同時結合することによって標的細胞とT細胞との間の一時的相互作用が強制され、そして、細胞傷害性T細胞が活性化され、その結果、腫瘍細胞が溶解される。従って、免疫応答は標的細胞に方向付け直され(re-directed)、MHCによって制限される通常のCTL活性化に関連するように標的細胞によるペプチド抗原提示またはT細胞の特異性に依存しない。こういうわけで、二重特異性抗体が標的細胞およびCTLに結合する時にだけCTLが活性化されること、すなわち、免疫シナプスが模倣されることが重要である。効率的な標的細胞溶解の誘発のためにリンパ球プレコンディショニング(preconditioning)も共刺激も必要としない二重特異性抗体が特に望ましい。
【０００６】
いくつかの二重特異性抗体形式が開発されており、T細胞を介した免疫療法への適性が調べられている。これらの中から、いわゆるBiTE(二重特異性T細胞誘導)分子は非常によく特徴付けられており、臨床において、ある程度の有望性を既に示している(Nagorsen and Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)(非特許文献1)において概説されている)。BiTEは、2つのscFv分子がフレキシブルリンカーによって誘導されているタンデムscFv分子である。T細胞会合について評価されているさらなる二重特異性形式には、ダイアボディ(Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)(非特許文献2))およびそれらの誘導体、例えば、タンデムダイアボディ(Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66 (1999)(非特許文献3))が含まれる。つい最近の成果は、いわゆるDART(二重親和性再標的化(dual affinity retargeting))分子である。DARTはダイアボディ形式に基づいているが、さらなる安定化のためにC末端ジスルフィド架橋を特徴とする(Moore et al., Blood 117, 4542-51 (2011)(非特許文献4))。いわゆるトリオマブ(triomab)は全ハイブリッドマウス/ラットIgG分子であり、これも現在、臨床試験において評価されており、さらに大きなサイズの形式の代表例である(Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)(非特許文献5)において概説される)。
【０００７】
開発中の様々な形式が、免疫療法における、T細胞の方向付け直し(re-direction)および活性化に起因する大きな可能性を示している。しかしながら、これに適した二重特異性抗体を作製する作業は決して些細なことではなく、抗体の効力、毒性、適用可能性、および生産性(produceability)に関連して対処しなければならない多数の難題を伴う。
【０００８】
例えば、BiTE分子などの小さな構築物はエフェクター細胞と標的細胞とを効率的に架橋することができるが血清半減期は非常に短く、そのため、連続注入によって患者に投与する必要がある。他方で、IgG様形式は半減期が長いという大きな利点を持つが、IgG分子に固有の天然エフェクター機能に関連した毒性を欠点として持つ。それらの免疫原能力は、治療開発が成功するためには好ましくない、IgG様二重特異性抗体(特に、非ヒト形式)の別の特徴をなす。最後に、特異性の異なる抗体重鎖および軽鎖が、同時発現された時に誤対合することから、二重特異性抗体の全般的な開発における大きな課題は、臨床的に十分な量および純度で二重特異性抗体構築物を産生することであった。この誤対合のために、正しく組み立てられた構築物の収率が低下し、その結果、多くの機能しない副産物が生じる。この副産物から、望ましい二重特異性抗体を分離することは難しい場合がある。
【０００９】
T細胞を介した免疫療法用の現在利用可能な二重特異性抗体に関連した問題および欠点を考えると、このような分子の改善された新規の形式が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Nagorsen and Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)
【非特許文献２】Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)
【非特許文献３】Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66 (1999)
【非特許文献４】Moore et al., Blood 117, 4542-51 (2011)
【非特許文献５】Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)
【発明の概要】
【００１１】
第1の局面において、本発明は、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、第1の抗原結合部分が第1の軽鎖を含みかつ活性化T細胞抗原に特異的に結合することができ、第2の抗原結合部分が第2の軽鎖を含みかつ標的細胞抗原に特異的に結合することができ、第1の軽鎖および第2の軽鎖のアミノ酸配列が同一である、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。1つの態様において、第1の抗原結合部分はFabである。1つの態様において、第2の抗原結合部分はFabである。1つの態様において、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分はFabである。
【００１２】
1つの局面において、本発明は、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、抗原結合部分の一方が、活性化T細胞抗原に特異的に結合することができるFab分子であり、抗原結合部分の他方が、標的細胞抗原に特異的に結合することができるFab分子であり、第1のFab分子および第2のFab分子が、同一のVLCL軽鎖を有する、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００１３】
1つの態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFcドメインをさらに含む。
【００１４】
1つの態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、および SEQ ID NO:34の軽鎖CDRを含む軽鎖を含む。
【００１５】
1つの態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、SEQ ID NO:31を含む軽鎖を含む。
【００１６】
1つの態様において、活性化T細胞抗原に特異的に結合することができるFab分子は、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、およびSEQ ID NO:39の重鎖CDRを含む重鎖を含む。
【００１７】
特定の態様において、活性化T細胞抗原に特異的に結合することができる1以下の抗原結合部分が、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子に存在する(すなわち、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は活性化T細胞抗原との一価結合をもたらす)。
【００１８】
一部の態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分は、任意でペプチドリンカーを介して、互いに融合されている。1つのこのような態様において、第2の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は、第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている。別のこのような態様において、第1の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は、第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている。さらに別のこのような態様において、第2の抗原結合部分のFab軽鎖のC末端は、第1の抗原結合部分のFab軽鎖のN末端と融合されている。さらに別のこのような態様において、第1の抗原結合部分のFab軽鎖のC末端は、第2の抗原結合部分のFab軽鎖のN末端と融合されている。
【００１９】
1つの態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の第1の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は、第1のFcドメインサブユニットまたは第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている。
【００２０】
1つの態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の第2の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は、第1のFcドメインサブユニットまたは第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている。
【００２１】
別の態様において、第1の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は、第1のFcドメインサブユニットまたは第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている。
【００２２】
1つの態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分それぞれのFab重鎖のC末端は、Fcドメインサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている。
【００２３】
ある特定の態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合することができるFab分子である第3の抗原結合部分を含む。1つの態様において、第3の抗原結合部分は、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分と同一のVLCL軽鎖を含むFab分子である。
【００２４】
1つのこのような態様において、第1の抗原結合部分、第2の抗原結合部分、および第3の抗原結合部分はそれぞれ、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33 、および SEQ ID NO:34の軽鎖CDRを含むFab分子である。
【００２５】
1つのこのような態様において、第1の抗原結合部分、第2の抗原結合部分、および第3の抗原結合部分はそれぞれ、SEQ ID NO:31を含む軽鎖を含むFab分子である。
【００２６】
1つの態様において、第3の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は、第1のFcドメインサブユニットまたは第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている。特定の態様において、T細胞活性化抗原結合分子の第2の抗原結合部分および第3の抗原結合部分それぞれのFab重鎖のC末端はFcドメインサブユニットのうちの1つのN末端と融合され、第1の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている。別の特定の態様において、T細胞活性化抗原結合分子の第1の抗原結合部分および第3の抗原結合部分それぞれのFab重鎖のC末端はFcドメインサブユニットのうちの1つのN末端と融合され、第2の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は直接融合されてもよく、適切なペプチドリンカーを介して融合されてもよい。1つの態様において、第2の抗原結合部分および第3の抗原結合部分ならびにFcドメインは免疫グロブリン分子の一部である。1つの態様において、第1の抗原結合部分および第3の抗原結合部分ならびにFcドメインは免疫グロブリン分子の一部である。特定の態様において、免疫グロブリン分子はIgGクラス免疫グロブリンである。さらにより具体的な態様において、免疫グロブリンはIgG1サブクラス免疫グロブリンである。別の態様において、免疫グロブリンはIgG4サブクラス免疫グロブリンである。
【００２７】
特定の態様において、FcドメインはIgG Fcドメインである。特定の態様において、FcドメインはIgG1 Fcドメインである。別の具体的な態様において、FcドメインはIgG4 Fcドメインである。さらにより具体的な態様において、Fcドメインは、アミノ酸置換S228Pを含むIgG4 Fcドメインである。さらにより具体的な態様において、Fcドメインは、アミノ酸置換L235EおよびS228P(SPLE)を含むIgG4 Fcドメインである。特定の態様において、FcドメインはヒトFcドメインである。
【００２８】
特定の態様において、Fcドメインは、Fcドメインの第1のサブユニットおよび第2のサブユニットの会合を促進する改変を含む。このような特定の態様において、Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにあるアミノ酸残基が、これより大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と交換され、それによって、第2のサブユニットのCH3ドメイン内の空洞に配置可能な突出部が、第1のサブユニットのCH3ドメイン内に生じ、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにあるアミノ酸残基が、これより小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と交換され、それによって、第1のサブユニットのCH3ドメイン内にある突出部を配置可能な空洞が、第2のサブユニットのCH3ドメイン内に生じる。
【００２９】
特定の態様において、Fcドメインは、天然のIgG1 Fcドメインと比較してFc受容体に対する低い結合親和性および/または低いエフェクター機能を示す。ある特定の態様において、Fcドメインは、操作されていないFcドメインと比較して、Fc受容体に対する低い結合親和性および/または低いエフェクター機能を有するように操作されている。1つの態様において、Fcドメインは、Fc受容体に対する結合および/またはエフェクター機能を低減する1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。1つの態様において、Fc受容体に対する結合および/またはエフェクター機能を低減する、Fcドメイン中の1つまたは複数のアミノ酸置換は、L234、L235、およびP329(Kabatナンバリング)からなる群より選択される1つまたは複数の位置にある。特定の態様において、Fcドメインの各サブユニットは、Fc受容体に対する結合および/またはエフェクター機能を低減する3個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換はL234A、L235A、およびP329Gである。このような1つの態様において、Fcドメインは、IgG1 Fcドメイン、特に、ヒトIgG1 Fcドメインである。他の態様において、Fcドメインの各サブユニットは、Fc受容体に対する結合および/またはエフェクター機能を低減する2個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換はL235EおよびP329Gである。このような1つの態様において、Fcドメインは、IgG4 Fcドメイン、特に、ヒトIgG4 Fcドメインである。
【００３０】
1つの態様において、Fc受容体はFcγ受容体である。1つの態様において、Fc受容体はヒトFc受容体である。1つの態様において、Fc受容体は活性化Fc受容体である。特定の態様において、Fc受容体は、ヒトFcγRIIa、FcγRI、および/またはFcγRIIIaである。1つの態様において、エフェクター機能は抗体依存性細胞傷害(ADCC)である。
【００３１】
特定の態様において、二重特異性抗原結合分子が結合することができる活性化T細胞抗原はCD3である。他の態様において、二重特異性抗原結合分子が結合することができる標的細胞抗原は腫瘍細胞抗原である。1つの態様において、標的細胞抗原は、葉酸受容体1(FolR1)、ムチン-1(MUC1)、およびB細胞成熟抗原(BCMA)からなる群より選択される。1つの特定の態様において、標的細胞抗原はBCMAでない。
【００３２】
別の局面において、本発明は、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子において使用するための、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、および SEQ ID NO:34のアミノ酸配列を含む軽鎖を提供する。 1つの態様において、前記軽鎖はSEQ ID NO:31のアミノ酸配列を含む。1つの態様において、前記軽鎖はSEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含む。
【００３３】
別の局面において、本発明は、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を産生するためにライブラリーにおいて使用するための、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、および SEQ ID NO:34のアミノ酸配列を含む軽鎖を提供する。1つの態様において、前記軽鎖は、SEQ ID NO:31のアミノ酸配列を含む。1つの態様において、前記軽鎖は、SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含む。
【００３４】
別の局面において、本発明は、SEQ ID NO:31のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００３５】
別の局面において、本発明は、SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００３６】
本発明の別の局面によれば、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを包含する。さらに、本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および単離されたポリヌクレオチドまたは本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。一部の態様において、宿主細胞は、真核細胞、特に、哺乳動物細胞である。
【００３７】
別の局面において、a)T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、およびb)T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程を含む、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を産生する方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法によって産生されたT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を包含する。
【００３８】
さらに、本発明は、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。
【００３９】
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子および薬学的組成物を使用する方法も本発明に包含される。1つの局面において、本発明は、医薬として使用するための本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子または薬学的組成物を提供する。1つの局面において、それを必要とする個体における疾患の治療において使用するための本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子または薬学的組成物が提供される。特定の態様において、疾患はがんである。
【００４０】
それを必要とする個体における疾患を治療するための医薬を製造するための本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用;ならびに個体において疾患を治療する方法であって、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を薬学的に許容される形で含む治療的有効量の組成物を前記個体に投与する工程を含む方法も提供される。特定の態様において、疾患はがんである。任意の前記態様において、個体は、好ましくは、哺乳動物、特に、ヒトである。
【００４１】
本発明はまた、T細胞、特に、細胞傷害性T細胞の存在下で、標的細胞を本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子と接触させる工程を含む、標的細胞、特に、腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法も提供する。
【００４２】
別の局面において、本発明は、T細胞活性化抗原および標的細胞抗原に特異的な二重特異性抗原結合分子において使用するための可変重鎖を特定するための方法であって、可変重鎖と、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、およびSEQ ID NO:34のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする工程を含む、方法を提供する。1つの態様において、軽鎖はSEQ ID NO:31のアミノ酸配列を含む。1つの態様において、軽鎖はSEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１Ａ−Ｉ】本明細書において開示されたT細胞活性化二重特異性抗原結合分子(TCB)の例示的な構成を示す。(図1I)にあるκ-λ形式以外の全構築物がP329G LALA変異を有し、ノブイントゥホール(knob-into-hole)改変のあるノブイントゥホールFc断片を含む。(図1A)「FolR1 TCB 2+1 逆(inverted)(共通軽鎖)」の図。FolR1結合物質のFab重鎖のC末端は、ノブ改変を含む、Fcドメインの第1のサブユニットのN末端と融合されている。これらの構築物は交差しておらず、3倍の同じVLCL軽鎖を有する。(図1B)「FolR1 TCB 1+1 ヘッドトゥテール(共通軽鎖)」の図。これらの構築物は交差しておらず、2倍の同じVLCL軽鎖を有する。(図1C)「FolR1 TCB 1+1 古典的(共通軽鎖)」の図。これらの構築物は交差しておらず、2倍の同じVLCL軽鎖を有する。(図1D)「FolR1 TCB 2+1 古典的(共通軽鎖)」の図。CD3結合物質のFab重鎖のC末端は、ノブ改変を含む、Fcドメインの第1のサブユニットのN末端と融合されている。これらの構築物は交差しておらず、3倍の同じVLCL軽鎖を有する。(図1E)「FolR1 TCB 2+1 crossfab 古典的」の図。これらの構築物は、従来のCH1-VH鎖の代わりにCD3結合物質のCk-VH鎖を含む。CD3結合物質のFab重鎖のC末端は、ノブ改変を含む、Fcドメインの第1のサブユニットのN末端と融合されている。(図1F)「FolR1 TCB 2+1 crossfab 逆」の図。これらの構築物は、従来のCH1-VH鎖の代わりにCD3結合物質のCk-VH鎖を含む。FolR1結合物質のFab重鎖のC末端は、ノブ改変を含む、Fcドメインの第1のサブユニットのN末端と融合されている。(図1G)「FolR1 TCB 1+1 crossfab ヘッドトゥテール」の図。これらの構築物は、従来のCH1-VH鎖の代わりにCD3結合物質のCk-VH鎖を含む。(図1H)「FolR1 TCB 1+1 crossfab 古典的」の図。これらの構築物は、従来のCH1-VH鎖の代わりにCD3結合物質のCk-VH鎖を含む。図1Iは、CD3/FolR1κ-λ抗体形式を示す。これらの構築物は、交差した共通軽鎖VLCH1と、1つの交差した、CD3に特異的なVHCL鎖と、1つの交差した、FolR1に特異的なVHCL鎖を含む。
【図２Ａ−Ｃ】FoLR1 IgG結合物質とヒーラー細胞との結合をまとめたグラフを図示する。新たに作製したFolR1結合物質と、ヒーラー細胞上に発現しているFolR1との結合をフローサイトメトリーによって確かめた。結合した抗体は蛍光標識抗ヒト二次抗体を用いて検出された。
【図３Ａ−Ｂ】FolR1に対するFolR1結合物質の特異性をまとめたグラフを図示する。FolR1に特異的に結合するが、FolR2に特異的に結合しないクローンを特定するために、FolR1またはFolR2で一過的にトランスフェクトしたHEK細胞に対するFolR1 IgGの結合をフローサイトメトリーによって分析した。抗体を蛍光標識抗ヒト二次抗体で検出した。
【図４Ａ−Ｂ】cyFolR1に対するFolR1結合物質の交差反応性をまとめたグラフを図示する。cyFolR1で一過的にトランスフェクトしたHEK細胞において、フローサイトメトリーによって、カニクイザルFolR1に対するFolR1抗体の交差反応性に取り組んだ。抗体を蛍光標識抗ヒト二次抗体で検出した。
【図５】結合した後のFolR1 TCBの内部移行を示したグラフを図示する。FolR1と結合した後の4種類のFolR1 TCBの内部移行をヒーラー細胞において試験した。37℃での、示された時点のインキュベーション後に、表面に残っているFolR1 TCBを蛍光標識抗ヒト二次抗体で検出した。内部移行のパーセントを計算した。
【図６Ａ−Ｅ】FolR1 IgGと、FolR1発現レベルが異なる細胞との結合をまとめたグラフを図示する。9D11、16D5、およびMov19 IgGと、FolR1発現レベルが異なる腫瘍細胞との結合をフローサイトメトリーによって分析した。DP47 IgGをアイソタイプ対照として含め、MKN-45をFolR1陰性細胞株として含めた。抗体を蛍光標識抗ヒト二次抗体で検出した。
【図７Ａ−Ｌ】HT-29細胞およびSKOV3細胞のT細胞性死滅をまとめたグラフを図示する。FolR1 TCBを用いて、HT-29腫瘍細胞およびSKOV3腫瘍細胞のT細胞性死滅ならびに死滅の際のT細胞上にある活性化マーカーのアップレギュレーションを試験した。(図7A〜D)24時間後および48時間後に、9D11 FolR1 TCBおよび16D5 FolR1 TCBの存在下でのHT-29細胞およびSKOV3細胞のT細胞性死滅をLDH放出によって測定した。負の対照としてDP47 TCBを含めた。48時間インキュベートした後に、SKOV3腫瘍細胞(図7E〜H)またはHT-29腫瘍細胞(図7I〜L)が死滅する際のCD8 T細胞上およびCD4 T細胞上にある活性化マーカーCD25およびCD69のアップレギュレーションをフローサイトメトリーによって評価した。
【図８】抗FolR1が赤血球に結合しないことを示したグラフを図示する。赤血球をCD235a陽性集団としてゲーティングし、9D11 IgG、16D5 IgG、Mov19 IgG、および DP47 IgGと、この集団との結合をフローサイトメトリーによって確かめた。抗体を蛍光標識抗ヒト二次抗体で検出した。
【図９Ａ−Ｄ】全血中での活性化マーカーアップレギュレーションをまとめたグラフを図示する。9D11 FolR1 TCB、16D5 FolR1 TCB、Mov19 FolR1 TCB、およびDP47 TCBを添加して24時間後に、CD4 T細胞およびCD8 T細胞のCD25およびCD69活性化マーカーのアップレギュレーションをフローサイトメトリーによって分析した。
【図１０】9D11 TCB a-glyco 変種とヒーラー細胞との結合。9D11 FolR1 TCB a-glyco変種とヒーラー細胞との結合を、ヒーラー細胞上でのオリジナルの9D11 TCBの結合と比較した。抗体を蛍光標識抗ヒト二次抗体で検出し、結合をフローサイトメトリーによって確かめた。
【図１１Ａ−Ｆ】9D11 FolR1 TCB a-glyco変種を用いた、腫瘍細胞のT細胞性死滅をまとめたグラフを図示する。オリジナルの9D11 FolR1 TCBを用いた死滅と比較して、9D11 FolR1 TCB a-glyco変種を用いて、(図11A〜D)SKOV3、MKN-45(FolR1負の対照)、および(図11E〜F)HT-29腫瘍細胞のT細胞性死滅を試験した。読み取り値として、24時間後および48時間後のLDH放出を使用した。
【図１２Ａ−Ｘ】初代上皮細胞のT細胞性死滅をまとめたグラフを図示する。FolR1レベルが非常に低い初代上皮細胞を用いて、16D5 FolR1 TCBおよび9D11 FolR1 TCBを用いてT細胞性死滅を試験した。負の対照としてDP47 TCBを含め、正の対照としてHT29細胞を含めた。(図12A〜H)ヒト網膜色素細胞(HRP)、ヒト腎皮質細胞(HRC)、ヒト気管支細胞(HB)、およびHT29細胞のLDH放出を24時間後および48時間後に確かめた。(図12I〜L)HRP、(図12M〜P)HRC、(図12Q〜T)HB、および(図12U〜X)HT29が死滅する際の、CD4 T細胞上およびCD8 T細胞上でのCD25およびCD69活性化マーカーのアップレギュレーションを48時間後にフローサイトメトリーによって確かめた。
【図１３Ａ−Ｃ】16D5を含む様々なTCB形式の比較を示す。FolR1結合物質16D5を含有する4つの異なるTCB形式を比較した。図13Aでは、ヒーラー細胞との結合、図14Bでは、24時間後および48時間後のSKOV3細胞のT細胞性死滅、図14Cでは、死滅して48時間後のCD4 T細胞上およびCD8 T細胞上でのCD25およびCD69活性化マーカーのアップレギュレーション。
【図１４Ａ−Ｃ】9D11を含む様々なTCB形式の比較を図示する。FolR1結合物質9D11を含有する3つの異なるTCB形式を比較した。A)では、ヒーラー細胞との結合、B)では、24時間後および48時間後のSKOV3細胞のT細胞性死滅、C)では、死滅して48時間後のCD4 T細胞上およびCD8 T細胞上でのCD25およびCD69活性化マーカーのアップレギュレーション。
【図１５】NOGマウスにおける3つの異なる用量のFOLR1 TCBのPKプロファイルを図示する。
【図１６】FOLR1 TCBを用いた有効性研究のための実験プロトコールを示す。
【図１７Ａ−Ｂ】腫瘍成長曲線を図示する。(図17A)様々な治療群における腫瘍体積の平均値およびSEM。(図17B)全治療群における1匹のマウスの腫瘍成長。TGI(腫瘍成長阻害)は、ビヒクル群と比較した平均腫瘍体積のパーセントを示す。
【図１８】研究終了時の腫瘍重量を示す。
【図１９Ａ−Ｂ】研究32日目での腫瘍浸潤性T細胞のFACS分析を示す。(図19A)腫瘍シングル細胞懸濁液を抗ヒトCD3/CD4/CD8で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。(図19B)様々な治療群における腫瘍組織1mgあたりのT細胞数の平均値およびSEM。
【図２０Ａ−Ｂ】研究32日目でのT細胞活性化/脱顆粒およびサイトカイン分泌についてのFACS分析を示す。CD4+(図20A)およびCD8+(図20B)腫瘍浸潤性T細胞を、サイトカイン、活性化マーカーおよび脱顆粒マーカーについて染色した。様々な治療群における腫瘍組織1mgあたりのT細胞数の平均値およびSEMを示した。
【図２１Ａ−Ｂ】パーセント腫瘍溶解を示す。SKOV3細胞をPBMCとκλ FoLR1 TCBまたはDP47 TCBいずれかの存在下でインキュベートした。24時間後(図21A)および48時間後(図21B)に、LDH放出を測定することによって腫瘍細胞の死滅を確かめた。
【図２２Ａ−Ｄ】CD4 T細胞上でのCD25およびCD69のアップレギュレーションを示す。SKOV3細胞をPBMCとκλ FolR1 TCBまたはDP47 TCBいずれかの存在下でインキュベートした。48時間後に、CD4 T細胞上(図22A〜B)およびCD8 T細胞上(図22C〜D)でのCD25およびCD69のアップレギュレーションをフローサイトメトリーによって測定した。
【図２３Ａ−Ｂ】パーセント腫瘍溶解を示す。24時間(図23A)および48時間(図23B)インキュベートした後の(E:T=10:1、エフェクターヒトPBMC)、36F2 TCB、Mov19 TCB、および21A5 TCBによって誘導されたSKov-3細胞(中FolR1)のT細胞性死滅。
【図２４Ａ−Ｃ】36F2 TCB、16D5 TCB、16D5 TCB 古典的、16D5 TCB 1+1、および16D5 TCB HTによって誘導された、ヒーラー(高FolR1)(図24A)、Skov-3(中FolR1)(図24B)、およびHT-29(低FolR1)(図24C)ヒト腫瘍細胞のT細胞性死滅(E:T=10:1、エフェクターヒトPBMC、インキュベーション時間24時間)を示す。DP47 TCBを非結合対照として含めた。
【図２５Ａ−Ｃ】36F2 TCB、16D5 TCB、およびDP47 TCB(非結合対照)によって誘導されたヒーラー細胞(高FolR1)(図25A)、SKov-3細胞(中FolR1)(図25B)、およびHT-29細胞(低FolR1)(図25C)のT細胞性死滅(E:T=10:1、48時間インキュベーション)の後の、ヒトCD8+T細胞上(図25A、B)およびCD4+T細胞上(図25C)でのCD25およびCD69のアップレギュレーションを示す。
【図２６Ａ−Ｆ】24時間(図26A、C、E)および48時間(図26B、D、F)インキュベートした後の(E:T=10:1、エフェクターヒトPBMC)、36F2 TCB、16D5 TCB、およびDP47 TCBによって誘導された、ヒト腎皮質上皮細胞(図26A、B)、ヒト網膜色素上皮細胞(図26C、D)、およびHT-29細胞(図26E、F)細胞のT細胞性死滅を示す。
【図２７】様々な正常細胞株上およびがん細胞株上にあるFolR1結合部位の定量をまとめた表を図示する。
【図２８Ａ−Ｂ】16D5 TCBならびにその対応するCD3脱アミド変種16D5 TCB N100Aおよび16D5 TCB S100aA、ならびに9D11 TCBならびにその脱アミド(demidation)変種9D11 TCB N100Aおよび9D11 TCB S100aAと、ジャーカット細胞上に発現しているヒトCD3との結合を示す。
【図２９Ａ−Ｂ】16D5 TCBならびにその対応するCD3脱アミド変種16D5 TCB N100Aおよび16D5 TCB S100aA(図29A)、ならびに9D11 TCBならびにその脱アミド変種9D11 TCB N100Aおよび9D11 TCB S100aA(図29B)によって誘導されたSKov-3(中FolR1)ヒト腫瘍細胞のT細胞性死滅を示す(E:T=10:1、エフェクターヒトPBMC、インキュベーション時間24時間)。DP47 TCBを非結合対照として含めた。
【図３０Ａ−Ｂ】16D5 TCBならびにその対応するCD3脱アミド変種16D5 TCB N100Aおよび16D5 TCB S100aA(図30A)、ならびに9D11 TCBならびに脱アミド変種9D11 TCB N100Aおよび9D11 TCB S100aA(図30B)によって誘導されたHT-29(低FolR1)ヒト腫瘍細胞のT細胞性死滅を示す(E:T=10:1、エフェクターヒトPBMC、インキュベーション時間24時間)。DP47 TCBを非結合対照として含めた。
【図３１】特定された3種類のMUC1特異的結合物質のVHドメインの配列アラインメントを示す。3種類全てのクローンがIGHV3-23生殖系列(SEQ ID NO:136)の誘導体である。クローン58D6(SEQ ID NO:60)および110A5(SEQ ID NO:64)は、CDR3にだけ無作為されたライブラリーに由来するのに対して、クローン106D2(SEQ ID NO:62)は、3つ全てのCDRにおいて無作為化されたライブラリーから特定された。生殖系列配列から逸脱したCDR1およびCDR2の位置をイタリック体で印刷した。
【図３２Ａ−Ｂ】CLC結合物質の特徴付けの結果を示す。(図32A)SPR分析。MUC1に特異的に結合する3種類のクローンのSPRに基づく反応速度分析。滑らかな線は、データが1:1相互作用モデルに全体にフィットしたことを表している。(図32B)反応速度パラメータおよび熱力学パラメータをまとめたもの。
【図３３】作製したTCB構築物の模式図を図示する。CLC TCB構築物は、3つの異なる免疫グロブリン鎖:1)Fc部分に「ホール変異」があり、標的に特異的なVHドメインを含有するIgG重鎖;2)標的に特異的なVHドメインおよびCH1ドメインと、それに続く、CD3に特異的なVHドメインドメインおよびCH1ドメインと、それに続く、「ノブ」変異を含有するFc部分からなるIg鎖;ならびに3)MUC1特異的配列およびCD3特異的配列の両方にアニールする共通軽鎖からなる。
【図３４Ａ−Ｂ】産生したMUC1特異的TCBの精製および分析特徴付けを図示する(図34Aおよび図34B)。精製方法は、アフィニティ工程(プロテインA)に続いてサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200, GE Healthcare)を伴った。最終産物を分析し、分析用サイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200カラム)およびキャピラリー電気泳動によって特徴付けた。
【図３５】TCB形式のMUC1特異的結合物質のSPR分析を図示する。様々な濃度(本文を参照されたい)の2種類のMUC1特異的TCBと、MUC1または無関係の抗原との結合を示した。滑らかな線は、データが1:1相互作用モデルに全体にフィットしたことを表している。
【図３６Ａ−Ｇ】指定したように、Fc部分のある、またはFc部分の無いFab断片(CD3およびBCMAに特異的)しか含まない二重特異性二価抗体および二重特異性三価抗体を図示する。(A)Fab BCMA-Fc-Fab CD3;(B)Fab BCMA-Fc-Fab CD3-Fab BCMA;(C)Fab BCMA-Fc-Fab BCMA-Fab CD3;(D)Fc-Fab CD3-Fab BCMA;(E)Fc-Fab BCMA-Fab CD3;(F)Fab CD3-Fab BCMA-Fab BCMA;(G)Fab CD3-Fab BCMA。好ましくは、LC誤対合を避け、副産物を減らすために、Fab CD3およびFab BCMAのLCは同一(共通LC)である。Fab CD3およびFab BCMAは可動性リンカーによって互いに連結されている。
【図３７】表面プラズモン共鳴(SPR)によって検出された時に、BCMA IgG抗体とTACI受容体が結合しないことを図示する。曲線1は、参照チャンネルのシグナルに対応する。曲線2は、結合が起こるチャンネル(結合チャンネル)に対応する。曲線2-1は、差し引かれたシグナル(結合チャンネル-参照チャンネル)であり、これは、結合事象によるシグナルであることを意味する。SPR結合アッセイから、pSCHLI372 IgGはヒトTACI受容体に結合しないことがはっきりと証明された。
【図３８Ａ−Ｃ】BCMA-TCB CLCの産生および精製を示す。(A)pSCHLI333-TCB CLC、(B)pSCHLI372-TCB CLC、(C)pSCHLI373-TCB CLCに適用したプロテインA(PA)アフィニティクロマトグラフィー工程およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)精製工程の後の最終タンパク質調製物のCE-SDSグラフ(非還元(上)および還元(下))。3種類全ての分子が、図36Bに記載のような分子形式の分子である。
【図３９Ａ−Ｂ】フローサイトメトリーによって、BCMAhi陽性H929細胞上でのBCMA-TCB CLC抗体の結合を示す。BCMA-TCB CLC抗体の蛍光強度の中央値を抗体濃度(0.12〜500nM)の関数としてプロットした。(A)H929細胞上(A)およびMKN45細胞上(B)でのpSCHLI372-TCB CLCおよびpSCHLI373-TCB CLC。DP47-TCBは、100nM未満の濃度ではBCMAに結合しなかった負の対照TCBである(実施例7を参照されたい)。
【図４０Ａ−Ｂ】フローサイトメトリーによって測定された時の、CD3陽性ジャーカットT細胞上でのBCMA-TCB CLC抗体の結合を示す。BCMA-TCB CLC抗体(pSCHLI372-TCB CLCおよびpSCHLI373-TCB CLC)とジャーカットT細胞との結合の蛍光強度の中央値を抗体濃度の関数としてプロットした。100nM未満の濃度ではBCMA陰性CD3陰性MKN45細胞に結合しない。
【図４１】フローサイトメトリーによって検出された時の、H929細胞の存在下でBCMA-TCB CLC抗体によって媒介されたT細胞活性化を示す。48時間インキュベートした後のCD4+T細胞上およびCD8+T細胞上にある初期活性化マーカーCD69および後期活性化マーカーCD25の発現レベル。pSCHLI372-TCB CLCおよびpSCHLI373-TCB CLC抗体は、BCMA陽性標的細胞の存在下で、CD69およびCD25活性化マーカーのアップレギュレーションを濃度依存的かつ特異的に誘導した。E:T比を10 PBMC:1 H929細胞として使用した。細胞を48時間インキュベートした後に、CD69およびCD25のアップレギュレーションを測定した。負の対照TCBであるDP47-TCBはT細胞活性化を誘導しなかった。代表的な結果は2回の独立した実験からの結果である。
【図４２Ａ−Ｂ】比色LDH放出アッセイによって検出された時に、BCMA-TCB CLC抗体がBCMAhi陽性H929骨髄腫細胞のT細胞性強制指向(redirected)死滅を誘導することを示す。BCMA-TCB CLC抗体であるpSCHLI372-TCB CLC(A、B)およびpSCHLI373-TCB CLC(A)は、LDH放出によって測定された時に、BCMAhi陽性H929骨髄腫細胞の濃度依存的死滅を誘導した。BCMAに結合せず、CD3にだけ結合する、負の対照TCBであるDP47-TCBはH929細胞死滅を誘導しなかった。E:T比を10 PBMC:1 H929細胞として使用した。細胞を24時間インキュベートした後に、LDH放出を測定した。代表的な結果は3回の独立した実験からの結果である。
【図４３】比色LDH放出アッセイによって検出された時に、BCMA-TCB CLC抗体がBCMAmed/lo陽性U266骨髄腫細胞のT細胞性強制指向死滅を誘導することを示す。BCMA-TCB CLC抗体であるpSCHLI372-TCB CLCおよびpSCHLI373-TCB CLCは、LDH放出によって測定された時に、BCMAmed/lo陽性U266骨髄腫細胞の濃度依存的死滅を誘導した。BCMAに結合せず、CD3にだけ結合する、負の対照TCBであるDP47-TCBはH929細胞死滅を誘導しなかった。E:T比を10 PBMC:1 U266細胞として使用した。細胞を24時間インキュベートした後に、LDH放出を測定した。代表的な結果は2回の独立した実験からの結果である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
発明の詳細な説明
定義
以下において特に定めのない限り、当技術分野において一般的に用いられるように用語が本明細書において用いられる。
【００４５】
本明細書で使用する「抗原結合分子」という用語は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリンおよびその誘導体、例えば、その断片である。
【００４６】
「二重特異性」という用語は、抗原結合分子が少なくとも2種類の特異な抗原決定基に特異的に結合できることを意味する。典型的に、二重特異性抗原結合分子は2種類の抗原結合部位を含み、これらの抗原結合部位はそれぞれ異なる抗原決定基に特異的である。ある特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、2種類の抗原決定基、特に、2種類の別個の細胞上に発現している2種類の抗原決定基に同時に結合することができる。
【００４７】
本明細書で使用する「価」という用語は、特定の数の抗原結合部位が抗原結合分子に存在することを示す。従って、「抗原との一価結合」という用語は、抗原に特異的な1個(および1個以下の)抗原結合部位が抗原結合分子に存在することを示す。
【００４８】
「抗原結合部位」とは、抗原との相互作用をもたらす、抗原結合分子の部位、すなわち、1つまたは複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域(CDR)に由来するアミノ酸残基を含む。天然の免疫グロブリン分子は典型的に2個の抗原結合部位を有し、Fab分子は典型的に1個の抗原結合部位を有する。
【００４９】
本明細書で使用する「抗原結合部分」という用語は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。1つの態様において、抗原結合部分は、それが結合している実体(例えば、第2の抗原結合部分)を標的部位、例えば、抗原決定基を有する特定のタイプの腫瘍細胞または腫瘍間質に方向付けることができる。別の態様において、抗原結合部分は、その標的抗原、例えば、T細胞受容体複合抗原を介してシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分には、本明細書においてさらに定義される抗体およびその断片が含まれる。特定の抗原結合部分は、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む抗体の抗原結合ドメインを含む。ある特定の態様において、抗原結合部分は、本明細書においてさらに定義され、当技術分野において公知の抗体定常領域を含んでもよい。有用な重鎖定常領域には、5つのアイソタイプ:α、δ、ε、γ、またはμのいずれかが含まれる。有用な軽鎖定常領域には、2つのアイソタイプ:κおよびλのいずれかが含まれる。
【００５０】
本明細書で使用する「抗原決定基」という用語は「抗原」および「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合して抗原結合部分-抗原複合体を形成する、ポリペプチド高分子上の部位(例えば、アミノ酸の連続した領域、または連続していないアミノ酸の異なる領域で構成されるコンホメーション配置)を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面、ウイルス感染細胞の表面、他の疾患細胞の表面、免疫細胞の表面に、血清中に遊離して、および/または細胞外マトリックス(ECM)の中に見つけることができる。本明細書において抗原と呼ばれるタンパク質(例えば、MCSP、FAP、CEA、EGFR、CD33、CD3)は、特に定めのない限り、任意の天然形態でよく、霊長類(例えば、ヒト)ならびにげっ歯類(例えば、マウスおよびラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源に由来してもよい。特定の態様において、抗原はヒトタンパク質である。本明細書中の特定のタンパク質について言及された場合、この用語は、「完全長」、プロセシングされていないタンパク質、ならびに細胞内でのプロセシングに起因する任意の形態のタンパク質を包含する。この用語はまた、タンパク質の天然変種、例えば、スプライスバリアントまたは対立遺伝子変種を包含する。抗原として有用な例示的なヒトタンパク質には、葉酸受容体1(FolR1、葉酸受容体α(FRA);葉酸結合タンパク質(FBP);ヒトFolR1 Uniprot番号P15328;マウスFolR1 UniProt番号P35846;カニクイザルFolR1 UniProt番号G7PR14)、ムチン-1(MUC1)、およびB細胞成熟抗原(BCMA)、およびCD3、特に、CD3のεサブユニット(ヒト 配列の場合、UniProt番号P07766 (バージョン 130)、NCBI RefSeq番号NP_000724.1;またはカニクイザル[Macaca fascicularis]配列の場合、UniProt番号Q95LI5(バージョン49)、NCBI GenBank番号BAB71849.1を参照されたい)が含まれるが、これに限定されない。
【００５１】
ある特定の態様において、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、異なる種に由来する活性化T細胞抗原または標的抗原の間で保存されている、活性化T細胞抗原または標的細胞抗原のエピトープに結合する。
【００５２】
「特異的結合」とは、結合が抗原に選択的であり、望ましくない相互作用または非特異的な相互作用と区別できることを意味する。抗原結合部分が特定の抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫測定法(ELISA)、または当業者がよく知っている他の技法、例えば、表面プラズモン共鳴(SPR)法(BIAcore機器で分析される)(Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000))および従来の結合アッセイ(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))によって測定することができる。1つの態様において、抗原結合部分と無関係のタンパク質と結合の程度は、例えば、SPRによって測定された時、抗原結合部分と抗原との結合の約10％未満である。ある特定の態様において、抗原に結合する抗原結合部分、またはその抗原結合部分を含む抗原結合分子の解離定数(KD)は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、または≦0.001nM(例えば、10-8M以下、例えば、10-8M〜10-13M、例えば、10-9M〜10-13M)である。
【００５３】
「親和性」とは、分子(例えば、受容体)の1つの結合部位と、その結合パートナー(例えば、リガンド)との非共有結合相互作用の合計の強さを指す。特に定めのない限り、本明細書で使用する「結合親和性」とは、結合ペアのメンバー(例えば、抗原結合部分と抗原、または受容体とそのリガンド)との1:1相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。パートナーYに対する分子Xの親和性は、一般的に、解離定数(KD)で表すことができる。解離定数(KD)は解離速度定数および会合速度定数(それぞれ、koffおよびkon)の比である。従って、速度定数の比が同一のままである限り、同じ親和性が異なる速度定数から成り立っていることがある。親和性は、本明細書に記載の方法を含む、当技術分野において公知の十分に確立した方法によって測定することができる。親和性を測定するための特定の方法が表面プラズモン共鳴(SPR)である。
【００５４】
「低い結合」、例えば、Fc受容体に対する低い結合とは、例えば、SPRによって測定された時の、それぞれの相互作用に対する親和性の減少を指す。はっきりさせるために、この用語は、親和性が0まで(または分析法の検出限界未満に)低下すること、すなわち、相互作用が完全になくなることも含む。反対に、「高い結合」とは、それぞれの相互作用に対する親和性の増加を指す。
【００５５】
本明細書で使用する「活性化T細胞抗原」とは、抗原結合分子と相互作用した時にT細胞活性化を誘導することができる、Tリンパ球、特に、細胞傷害性Tリンパ球の表面に発現している抗原決定基を指す。具体的には、抗原結合分子と活性化T細胞抗原が相互作用すると、T細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードが誘発されることによってT細胞活性化が誘導され得る。特定の態様において、活性化T細胞抗原はCD3である。
【００５６】
本明細書で使用する「T細胞活性化」とは、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、および活性化マーカー発現より選択される、Tリンパ球、特に、細胞傷害性Tリンパ球の1つまたは複数の細胞応答を指す。本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子はT細胞活性化を誘導することができる。T細胞活性化を測定するのに適したアッセイは当技術分野において公知であり、本明細書において説明されている。
【００５７】
本明細書で使用する「標的細胞抗原」とは、標的細胞、例えば、腫瘍内の細胞、例えば、がん細胞または腫瘍間質細胞の表面に提示された抗原決定基を指す。
【００５８】
抗原結合部分などに関連して本明細書で使用する「第1の」および「第2の」という用語は、それぞれのタイプの部分が複数ある時に区別をよりしやすくするために用いられる。これらの用語の使用は、特に明確に述べられていない限り、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の順番または方向を付与することを目的としない。
【００５９】
本明細書で使用する「BCMA」という用語は、分化したプラズマ細胞において優先的に発現している腫瘍壊死受容体スーパーファミリーのメンバーである、BCMA; TR17_HUMAN、TNFRSF17(UniProt Q02223)とも知られるヒトB細胞成熟標的に関する。BCMAの細胞外ドメインはUniProtに従ってアミノ酸1〜54(または5〜51)からなる。本明細書で使用する「BCMAに対する抗体、抗BCMA抗体」という用語は、BCMAに特異的に結合する抗体に関する。
【００６０】
本明細書で使用する「CD3εまたはCD3」という用語は、UniProtP07766に記載されているヒトCD3ε(CD3E_HUMAN)に関する。「CD3に対する抗体、抗CD3抗体」という用語は、CD3εに結合する抗体に関する。
【００６１】
「Fab分子」は、免疫グロブリンの重鎖のVHおよびCH1ドメイン(「Fab重鎖」)と軽鎖のVLおよびCLドメイン(「Fab軽鎖」)からなるタンパク質を指す。本明細書で使用する「同一のVLCL軽鎖を有するFab分子」という用語は、1種類の軽鎖を共有するが、それでもなお別々の特異性を有する結合物質を指す。本発明のT細胞活性化二重特異性分子は、同一のVLCL軽鎖を有する少なくとも2種類のFab分子を含む。対応する重鎖は再構築され、それぞれ、T細胞活性化二重特異性抗原への特異的結合と、標的細胞抗原への特異的結合を付与する。
【００６２】
「融合される」とは、前記成分(例えば、Fab分子およびFcドメインサブユニット)がペプチド結合によって直接連結されるか、または1つもしくは複数のペプチドリンカーを介して連結されることを意味する。
【００６３】
本明細書で使用する「共通軽鎖」という用語は、二重特異性分子または多重特異性分子の中で、複数種の重鎖またはその断片と対になって、少なくとも、それぞれが異なる抗原に特異的な第1の抗原結合部位および第2の抗原結合部位、例えば、Fabを形成する軽鎖を指す。例えば、共通軽鎖は抗原結合分子の中で第1の重鎖またはその断片と対になって、腫瘍抗原に特異的な第1の結合部位を形成し、別のコピーの共通軽鎖は抗原結合分子の中で第2の重鎖またはその断片と対になって、T細胞活性化抗原、例えば、CD3に特異的な第2の結合部位を形成する。
【００６４】
「免疫グロブリン分子」という用語は、天然抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、IgGクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合した2本の軽鎖および2本の重鎖からなる約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端にかけて、それぞれの重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VH)に続いて、重鎖定常領域とも呼ばれる3つの定常ドメイン(CH1、CH2、およびCH3)を有する。同様に、N末端からC末端にかけて、それぞれの軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VL)に続いて、軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖(CL)ドメインを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)、またはμ(IgM)と呼ばれる5つのタイプの1つに割り当てられることがあり、これらのうちのいくつかはサブタイプ、例えば、γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)、およびα2(IgA2)にさらに分けられることがある。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる2つのタイプの1つに割り当てられることがある。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結した、2つのFab分子およびFcドメインから本質的になる。
【００６５】
本明細書において「抗体」という用語は最も広い意味で用いられ、望ましい抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗体断片を含むが、これに限定されない様々な抗体構造を包含する。
【００６６】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、ダイアボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子(例えば、scFv)、およびシングルドメイン抗体が含まれるが、これに限定されない。ある特定の抗体断片の総説については、Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)を参照されたい。scFv断片の総説については、例えば、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。WO93/16185;ならびに米国特許第5,571,894号および同第5,587,458号も参照されたい。サルベージ(salvage)受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が長い、FabおよびF(ab') 2断片の考察については、米国特許第5,869,046号を参照されたい。ダイアボディは、二価または二重特異性でもよい2つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、EP404,097; WO1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003);およびHollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディもHudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)に記載されている。シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む抗体断片である。ある特定の態様において、シングルドメイン抗体はヒトシングルドメイン抗体(Domantis, Inc., Waltham, MA;例えば、米国特許第6,248,516B1号を参照されたい)である。抗体断片は、本明細書に記載のようにインタクトな抗体のタンパク質分解消化ならびに組換え宿主細胞(例えば、大腸菌またはファージ)による産生を含むが、これに限定されない様々な技法によって作ることができる。
【００６７】
「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部または全てに特異的に結合し、抗原の一部または全てに相補的な領域を含む抗体部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、1つまたは複数の抗体可変ドメイン(抗体可変領域とも呼ばれる)によって提供されてもよい。特に、抗原結合ドメインは抗体軽鎖可変領域(VL)および抗体重鎖可変領域(VH)を含む。
【００６８】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体と抗原との結合に関与する抗体重鎖または抗体軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン(それぞれ、VHおよびVL)は、一般的に、類似した構造を有し、それぞれのドメインは4つの保存されたフレームワーク領域(FR)および3つの超可変領域(HVR)を含む。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照されたい。抗原結合特異性を付与するためにはVHシングルドメインまたはVLシングルドメインだけで十分な場合がある。
【００６９】
本明細書で使用する「超可変領域」または「HVR」という用語は、配列が高頻度で変わる、および/または構造が定義されたループ(「超可変ループ」)を形成する抗体可変ドメイン領域のそれぞれを指す。一般的に、天然の4本の鎖からなる抗体は、6個のHVR;VHに3個(H1、H2、H3)およびVLに3個(L1、L2、L3)を含む。HVRは、一般的に、超可変ループおよび/または相補性決定領域(CDR)に由来するアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性を持つ、および/または抗原認識に関与する。VHにあるCDR1を除いて、CDRは、一般的に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域(HVR)は「相補性決定領域」(CDR)とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域部分に関して本明細書において交換可能に用いられる。この特定の領域は、互いに比較された時に定義がアミノ酸残基の重複またはサブセットを含む、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983)およびChothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)に記載されている。それにもかかわらず、抗体またはその変種のCDRを指すために、いずれかの定義を適用することは、本明細書において定義および使用されるように用語の範囲内であることが意図される。前記で引用された参考文献のそれぞれによって定義されるようにCDRを構成する適切なアミノ酸残基が比較として以下の表Aに示される。ある特定のCDRを構成する正確な残基の数は、CDRの配列およびサイズに応じて変化する。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮すれば、どの残基が特定のCDRを構成するかを日常的に決定することができる。
【００７０】
（表Ａ）CDR定義1
2018504092.tif 000002
1表Aの中の全てのCDR定義のナンバリングは、Kabatらによって示されたナンバリング規則に従う(以下を参照されたい)。
2表Aに用いられた小文字「b」のある「AbM」は、Oxford Molecularの「AbM」抗体モデリングソフトウェアによって定義されたCDRを指す。
【００７１】
Kabatらは、全ての抗体に適用可能な可変領域配列のナンバリングシステムも定義した。当業者であれば、配列そのものの他に、いかなる実験データにも頼らず、この「Kabatナンバリング」システムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用する「Kabatナンバリング」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」(1983)に示されたナンバリングシステムを指す。他で特定しない限り、抗体可変領域にある特定のアミノ酸残基位置のナンバリングへの言及はKabatナンバリングシステムに従う。
【００７２】
配列表のポリペプチド配列の番号はKabatナンバリングシステムに従って付けられていない。しかしながら、配列表の配列のナンバリングをKabatナンバリングに変換することは十分に当業者の能力の範囲内にある。
【００７３】
「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域(HVR)残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、一般的に、4つのFRドメイン:FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。従って、HVRおよびFR配列は、一般的に、VH(またはVL)において以下の順序:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4で現れる。
【００７４】
抗体または免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には5種類の主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分けられることがある。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【００７５】
本明細書において「Fcドメイン」または「Fc領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然配列のFc領域および変種Fc領域を含む。IgG重鎖のFc領域の境界はわずかに異なる場合があるが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、重鎖のCys226またはPro230からカルボキシル末端にわたると定義される。しかしながら、Fc領域のC末端リジン(Lys447)は存在してもよく、存在しなくてもよい。本明細書において他で特定しない限り、Fc領域または定常領域にあるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載のようにEUインデックスとも呼ばれるEUナンバリングシステムに従う。本明細書で使用するFcドメインの「サブユニット」は、二量体Fcドメインを形成する2つのポリペプチドのうちの1つ、すなわち、安定した自己会合を可能にする免疫グロブリン重鎖のC末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、IgG FcドメインのサブユニットはIgG CH2定常ドメインおよびIgG CH3定常ドメインを含む。
【００７６】
「Fcドメインの第1のサブユニットおよび第2のサブユニットの会合を促進する改変」は、Fcドメインサブユニットを含むポリペプチドと同一のポリペプチドが会合してホモ二量体を形成するのを低減または阻止する、Fcドメインサブユニットのペプチドバックボーン操作または翻訳後改変である。本明細書で使用する、会合を促進する改変は、特に、会合することが望まれる、2つのFcドメインサブユニットのそれぞれ(すなわち、Fcドメインの第1のサブユニットおよび第2のサブユニット)に加えられる別々の改変を含む。ここで、改変は、2つのFcドメインサブユニットの会合を促進するように互いに補い合う。例えば、会合を促進する改変は、会合を立体的に好ましくするように一方または両方のFcドメインサブユニットの構造を変えてもよく、会合を静電気的に好ましくするように一方または両方のFcドメインサブユニットの電荷を変えてもよい。従って、第1のFcドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第2のFcドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で(ヘテロ)二量体化が生じる。第1のFcドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第2のFcドメインサブユニットを含むポリペプチドは、サブユニット(例えば、抗原結合部分)のそれぞれと融合されているさらなる成分が同一でないという意味で同一でなくてもよい。一部の態様において、会合を促進する改変は、Fcドメインにアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。特定の態様において、会合を促進する改変は、Fcドメインの2つのサブユニットのそれぞれにおいて別々のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。
【００７７】
「エフェクター機能」という用語は、抗体アイソタイプによって異なる抗体Fc領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、C1q結合および補体依存性細胞傷害(CDC)、Fc受容体結合、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性細胞食作用(ADCP)、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体を介した抗原取り込み、細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体)のダウンレギュレーション、およびB細胞活性化が含まれる。
【００７８】
本明細書で使用する「操作する(engineer)、操作された(engineered)、操作する(engineering)」という用語は、ペプチドバックボーンの任意の操作、または天然もしくは組換えのポリペプチドもしくはその断片の翻訳後修飾を含むとみなされる。操作するは、アミノ酸配列の改変、グリコシル化パターンの改変、または個々のアミノ酸の側鎖基の改変、ならびにこれらのアプローチの組み合わせを含む。
【００７９】
本明細書で使用する「アミノ酸変異」という用語は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、および改変を包含することが意図される。最終構築物が望ましい特徴、例えば、Fc受容体との低減した結合または別のペプチドとの向上した会合を有するのであれば、最終構築物に達するために、置換、欠失、挿入、および改変の任意の組み合わせを加えることができる。アミノ酸配列の欠失および挿入には、アミノ末端および/またはカルボキシ末端でのアミノ酸欠失およびアミノ酸挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えば、Fc領域の結合特性を変える目的では、非保存的アミノ酸置換、すなわち、あるアミノ酸と、異なる構造特性および/または化学特性を有する別のアミノ酸との交換が特に好ましい。アミノ酸置換には、非天然アミノ酸または20種類の標準的なアミノ酸の天然アミノ酸誘導体(例えば、4-ヒドロキシプロリン、3-メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、5-ヒドロキシリジン)による交換が含まれる。アミノ酸変異は当技術分野において周知の遺伝的方法または化学的方法を用いて作製することができる。遺伝的方法には、部位特異的変異誘発、PCR、遺伝子合成などが含まれ得る。化学修飾などの遺伝子工学以外の方法によるアミノ酸の側鎖基を変える方法も有用な場合があることが意図される。同じアミノ酸変異を示すために様々な名称が本明細書において用いられることがある。例えば、Fcドメインの位置329にあるプロリンからグリシンへの置換は、329G、G329、G329、P329G、またはPro329Glyと示すことができる。
【００８０】
本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、アミド結合(ペプチド結合とも知られる)によって直線的に連結された単量体(アミノ酸)からなる分子を指す。「ポリペプチド」という用語は2個以上のアミノ酸からなる任意の鎖を指し、産物の特定の長さを指さない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または2個以上のアミノ酸からなる鎖を指すために用いられる他の任意の用語は「ポリペプチド」の定義に含まれ、これらの用語の代わりに、またはこれらの用語と交換可能に「ポリペプチド」という用語が用いられることがある。「ポリペプチド」という用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、または非天然アミノ酸による改変を含むが、それに限定されるわけではないポリペプチドの発現後改変の産物を指すことが意図される。ポリペプチドは天然の生物学的供給源から得られてもよく、組換え技術によって産生されてもよいが、必ずしも、指定された核酸配列から翻訳されるとは限らない。化学合成を含む任意のやり方でポリペプチドを作製することができる。本発明のポリペプチドは、約3個以上、5個以上、10個以上、20個以上、25個以上、50個以上、75個以上、100個以上、200個以上、500個以上、1,000個以上、または2,000個以上のアミノ酸のサイズのポリペプチドでもよい。ポリペプチドは、規定された三次元構造を有することがあるが、必ずしも、このような構造を有するとは限らない。規定された三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれていると呼ばれ、規定された三次元構造を有さず、多数の異なるコンホメーションをとることができるポリペプチドは、折り畳まれていないと呼ばれる。
【００８１】
「単離された」ポリペプチドまたはその変種もしくは誘導体とは、天然環境にはないポリペプチドであることが意図される。特定の精製レベルは必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その自然環境または天然環境から取り出されてもよい。宿主細胞内で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は本発明の目的で単離されたとみなされ、同様に、任意の適切な技法によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製されている天然ポリペプチドまたは組換えポリペプチドも単離されたとみなされる。
【００８２】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列をアライメントし、配列同一性の部分としていかなる保存的置換も考慮に入れずに最大パーセント配列同一性を得るために必要に応じてギャップを導入した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一な候補配列中アミノ酸残基のパーセントと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性の決定を目的としたアラインメントは、当技術分野における技術の範囲内である様々なやり方で、例えば、公的に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、またはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアを用いて実現することができる。当業者であれば、比較されている配列の完全長にわたる最大アラインメントを得るのに必要な任意のアルゴリズムを含めて、配列アラインメントに適したパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて、％アミノ酸配列同一性値が作成される。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはGenentech, Inc.によって書かれ、ソースコードはユーザー文書と共に米国著作権庁(U.S. Copyright Office), Washington D.C., 20559に提出されており、米国著作権番号TXU510087で登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech, Inc., South San Francisco, Californiaから公的に利用可能であるか、ソースコードからコンパイルされてもよい。ALIGN-2プログラムは、デジタルUNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステムで使用する場合はコンパイルしなければならない。全ての配列比較パラメータはALIGN-2プログラムによって設定され、変更はない。アミノ酸配列比較のためにALIGN-2が用いられる場合、ある特定のアミノ酸配列Bに対する、ある特定のアミノ酸配列Bとの、またはある特定のアミノ酸配列Bと比較した、ある特定のアミノ酸配列Aの％アミノ酸配列同一性(あるいは、ある特定のアミノ酸配列Bに対する、ある特定のアミノ酸配列Bとの、またはある特定のアミノ酸配列Bと比較した、ある特定の％アミノ酸配列同一性を有する、またはある特定の％アミノ酸配列同一性を含む、ある特定のアミノ酸配列Aと表すことができる)は、以下:
100 x 分数X/Y
のように計算される。式中、Xは、配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、そのプログラムのAおよびBのアラインメントにおいて同一マッチとスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Yは、B中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、Bに対するAの％アミノ酸配列同一性はAに対するBの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが理解されるだろう。特に定めのない限り、本明細書において用いられる全ての％アミノ酸配列同一性の値は、ALIGN-2コンピュータプログラムを用いて直前の段落に記載のように得られる。
【００８３】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単離された核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)、ウイルス由来RNA、またはプラスミドDNA(pDNA)を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または従来にはない結合(例えば、ペプチド核酸(PNA)において見られるアミド結合)を含んでもよい。「核酸分子」という用語は、ポリヌクレオチドに存在する任意の1つまたは複数の核酸セグメント、例えば、DNA断片またはRNA断片を指す。
【００８４】
「単離された」核酸分子またはポリヌクレオチドとは、天然環境から取り出されている核酸分子DNAまたはRNAが意図される。例えば、ベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは本発明の目的で単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内で維持されている組換えポリヌクレオチド、または溶解状態にある、(部分的もしくは実質的に)精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含有している細胞内に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は染色体外に存在する、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。単離されたRNA分子には、本発明のインビボRNAまたはインビトロRNAならびに+鎖および-鎖および二本鎖型が含まれる。本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成により産生された、このような分子をさらに含む。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節エレメントでもよく、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節エレメントを含んでもよい。
【００８５】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、95％「同一の」ヌクレオチド配列を有する核酸またはポリヌクレオチドとは、前記ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列100ヌクレオチドにつき5個までの点変異を含んでもよいことを除けば、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であると意図される。言い換えると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中にあるヌクレオチドが5％まで欠失されてもよく、別のヌクレオチドで置換されてもよく、または、参照配列中にある全ヌクレオチドの5％までの数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこれらの変化は参照ヌクレオチド配列の5'末端位置もしくは3'末端位置で生じてもよく、末端位置間の任意の場所で生じてもよく、参照配列中の残基間に1つ1つ分散されてもよく、参照配列内に1つまたは複数の連続したグループとなって分散されてもよい。実際問題として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるかどうかは、従来法によって、公知のコンピュータプログラム、例えば、ポリペプチドについて前述されたコンピュータプログラム(例えば、ALIGN-2)を用いて確かめることができる。
【００８６】
「発現カセット」という用語は、標的細胞において特定の核酸の転写を可能にする一連の指定された核酸エレメントを有する、組換えまたは合成により作製されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアDNA、プラスチドDNA、ウイルス、または核酸断片に組み込むことができる。典型的に、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、配列の中でも特に、転写しようとする核酸配列およびプロモーターが含まれる。ある特定の態様において、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００８７】
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は「発現構築物」と同義であり、標的細胞内で機能的に結合している特定の遺伝子を導入し、その遺伝子の発現を誘導するのに用いられるDNA分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造であるベクター、ならびに導入されている宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは発現カセットを含む。発現ベクターは多量の安定なmRNAの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子またはタンパク質が細胞の転写機構および/または翻訳機構によって産生される。1つの態様において、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。
【００８８】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養」という用語は同義に用いられ、外因性核酸が導入されている細胞を指し、このような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、初代形質転換細胞および継代数に関係なく、初代形質転換細胞から得られた子孫を含む「形質転換体」および「形質転換細胞」を含む。子孫は、核酸内容物が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含有してもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択された時と同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫も本明細書に含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を作製するのに使用することができる任意のタイプの細胞系である。宿主細胞には、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、ほんの少し例を挙げると、CHO細胞、BHK細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、YOミエローマ細胞、P3X63マウスミエローマ細胞、PER細胞、PER.C6細胞またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および植物細胞が含まれるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、または植物培養組織もしくは動物培養組織の中にある細胞も含まれる。
【００８９】
「活性化Fc受容体」は、抗体のFcドメインが結合した後に、受容体を有する細胞を刺激してエフェクター機能を果たすシグナル伝達事象を誘発するFc受容体である。ヒト活性化Fc受容体には、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、およびFcαRI(CD89)が含まれる。
【００９０】
抗体依存性細胞傷害(ADCC)は、抗体でコーティングされた標的細胞を免疫エフェクター細胞が溶解する免疫機構である。標的細胞は、抗体またはFc領域を含むその誘導体が、一般的に、Fc領域のN末端側にあるタンパク質部分を介して特異的に結合する細胞である。本明細書で使用する「低減したADCC」という用語は、標的細胞を取り囲む培地に含まれる、ある特定の抗体濃度で、ある特定の時間で、前記で定義されたADCC機構によって溶解される標的細胞の数の低減、および/または、ある特定の時間で、ある特定の標的細胞数をADCC機構によって溶解するのに必要とされる、標的細胞を取り囲む培地に含まれる抗体濃度の増加と定義される。ADCCの低減は、(当業者に公知の)同じ標準的な産生方法、精製方法、処方方法、および保管方法を用いて同じタイプの宿主細胞によって産生されたが、操作されていない同じ抗体によって媒介されるADCCと比べられる。例えば、ADCCを低減させるアミノ酸置換をFcドメインに含む抗体によって媒介されるADCCの低減は、このアミノ酸置換がFcドメインにない同じ抗体によって媒介されるADCCと比べられる。ADCCを測定する適切なアッセイは当技術分野において周知である(例えば、PCT公報番号WO2006/082515またはPCT特許出願番号PCT/EP2012/055393を参照されたい)。
【００９１】
薬剤の「有効量」とは、投与された細胞または組織において生理学的変化をもたらすのに必要な量を指す。
【００９２】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、望ましい治療効果または予防結果を実現するために、必要な投与および期間において有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、例えば、疾患の副作用を排除する、減少させる、遅延する、最小化する、または阻止する。
【００９３】
「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物には、家畜化された動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ)、霊長類(例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類)、ウサギ、ならびにげっ歯類(例えば、マウスおよびラット)が含まれるが、これに限定されない。特に、個体または対象はヒトである。
【００９４】
「薬学的組成物」という用語は、薬学的組成物の中に含まれる活性成分の生物学的活性が有効になるような形をしており、かつ製剤が投与される対象に容認できないほど毒性のあるさらなる成分を含有しない調製物を指す。
【００９５】
「薬学的に許容される担体」とは、薬学的組成物の中にある、活性成分以外の、対象に無毒な成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、または防腐剤が含まれるが、これに限定されない。
【００９６】
本明細書で使用する「治療(treatment)」(およびその文法上の語尾変化、例えば、「治療する(treat)」または「治療している(treating)」)とは、治療を受けている個体における疾患の自然経過を変えようという臨床介入を指し、予防のために、または臨床病理の経過の間に行うことができる。望ましい治療効果には、疾患の発生または再発の阻止、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の阻止、疾患進行速度の減少、疾患状態の寛解または軽減、および軽快または予後の改善が含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、疾患の発症を遅延するために、または疾患進行を遅くするために用いられる。
【００９７】
「添付文書」という用語は、適応症、用法、投与量、投与、併用療法、禁忌症についての情報、および/またはこのような治療製品の使用に関する警告を収めている、市販の治療製品パッケージに慣例に従って入れられている説明書を指すために用いられる。
【００９８】
態様の詳細な説明
本発明は、優れた有効性と生産性を組み合わせた、T細胞活性化および強制指向のために設計された二重特異性抗原結合分子、ならびに前記二重特異性抗原結合分子を作製および使用する方法を提供する。特に、本発明は二重特異性分子であって、少なくとも2種類の結合部分が、同一の軽鎖と、一部の態様では、対応する再構築された、T細胞活性化二重特異性抗原への特異的結合を付与する重鎖および標的細胞抗原への特異的結合を付与する重鎖を有する二重特異性分子に関する。この、いわゆる「共通軽鎖」原理を用いると、すなわち、1種類の軽鎖を共有するが、それでもなお別々の特異性を有する2種類の結合物質を組み合わせると軽鎖の誤対合が阻止される。従って、産生の間に副産物が少なくなるので、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を均一に調製することが容易になる。
【００９９】
本発明は、特に、抗原結合、ならびに異なる結合パートナー、例えば、重鎖およびその断片とのヘテロ多量体対形成に大きく寄与する予め定義された稀な軽鎖に関する。従って、この共通軽鎖は、新たな二重特異性抗原結合分子または多重特異性抗原結合分子を調製することができるライブラリーにおいて使用するのに適している。有利なことに、本明細書において開示された抗原結合分子および方法に関連して用いられる共通軽鎖は、T細胞活性化に有用な抗原結合分子を形成するのに使用することができる。当業者は、T細胞活性化抗原結合部分と標的抗原結合部分の両方で機能することができる、このような軽鎖をもつ有利な効率を認めることができる。これにより、T細胞活性化成分と標的抗原結合成分を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を効率的に産生することが可能になる。特定の態様において、共通軽鎖はλ軽鎖定常ドメインである。特定の態様において、共通軽鎖はヒトλ軽鎖またはヒト化λ軽鎖である。特定の態様において、共通軽鎖は、軽鎖の稀なヒトλ7ファミリーである。λ、特に、稀なλ7ファミリーの軽鎖を使用することは珍しいアプローチであり、様々な標的に特異的な抗原結合分子を作り出すのに適した重鎖結合パートナーを特定する可能性を小さくすると予想されただろう。従って、本明細書において開示された本発明者の研究より前には、様々な異なる無関係の標的抗原、例えば、FolR1、MUC1、およびBCMAに対して、適切な特性を有するλ7軽鎖を開発できることは公知でなかった。さらに、CD3特異性と標的抗原特異性を有するT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の産生を改善する目的で、安定した、機能的な、高親和性の結合物質を作製するためにλ軽鎖を開発できることは公知でなかった。この場合、標的抗原は無関係の抗原、例えば、FolR1、MUC1、およびBCMAである。1つの態様において、このような共通軽鎖は、下記で説明するように、特に、前記結合物質に寄与するCD3結合物質を作製するために、生殖系列抗体ではなく、特定のCD3結合物質に基づいた共通軽鎖(CLC)ライブラリーを構築するのに使用することができる。このアプローチの利点は、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の標的抗原結合部分のために新たな標的抗原結合物質を重鎖に基づいて特定することだけしなければならないように、以前に特定され、かつ検証されたCD3結合物質を維持できることである。これにより、同一の鎖または高度に相同な鎖を有する様々なT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を作製するモジュールアプローチが可能になる。ある特定のT細胞活性化抗原結合分子の中にある軽鎖は同一であるが、異なるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の軽鎖は同一でもよく、高度に相同であってもよい。「高度に相同な」とは、このモジュールアプローチによって産生された異なるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の軽鎖が少なくとも約95％、96％、97％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を含むことを意味する。好ましくは、本発明の高度に相同な軽鎖は同一の可変軽鎖領域を有し、定常領域でしか違いはない。例えば、一部の態様において、アミノ酸変化はリンカー領域に限定される。一部の態様において、共通軽鎖はκ軽鎖定常ドメインを含む。
【０１００】
前述の利点に加えて、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の抗原結合部分の中に用いられる軽鎖が同一であるので、このアプローチを用いた正しく対になったヘテロ多量体分子の収率は、前述で説明したように上昇する。別の言い方をすれば、共通軽鎖を用いると、軽鎖と、正しくない重鎖との誤対合が無くなるので、これらの分子の産生は容易になる。従って、高純度のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子種を単離することが容易になる。特定の態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は基本要素としてFabを用いる。他の形式と比較して、例えば、scFv断片を使用するのとは対照的に、基本要素としてFab断片を使用すると熱安定性が大きくなり、scFv凝集および分子間scFv形成が無くなる。
【０１０１】
本明細書に記載の本発明者らの研究より前には、二重特異性分子または多重特異性分子の中で共通軽鎖として役立つことができるだけでなく、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のT細胞活性化の機能特性も支持することができる共通軽鎖を作製できることは公知でなかった。さらに、本明細書に記載の本発明者らの研究より前には、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の中にある抗原結合部分の抗原結合特性に大きく寄与する共通軽鎖を作製できることは公知でなかった。十分に確立した戦略は、結合特性、例えば、強度および特異性の大部分に寄与する重鎖またはその断片を特定することである。本発明によれば、共通軽鎖は結合特性に大きく寄与する。従って、第1の局面において、本発明は、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、第1の抗原結合部分が第1の軽鎖を含み、活性化T細胞抗原に特異的に結合することができ、第2の抗原結合部分が第2の軽鎖を含み、標的細胞抗原に特異的に結合することができ、第1の軽鎖および第2の軽鎖のアミノ酸配列が同一である、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。1つの態様において、第1の抗原結合部分はFabである。1つの態様において、第2の抗原結合部分はFabである。1つの局面において、本発明は、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、抗原結合部分の一方が、活性化T細胞抗原に特異的に結合することができるFab分子であり、抗原結合部分の他方が、標的細胞抗原に特異的に結合することができるFab分子であり、第1のFab分子および第2のFab分子が、同一の軽鎖(可変軽鎖領域および定常軽鎖領域、VLCL)を有する、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。1つの態様において、軽鎖(VLCL)は、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、およびSEQ ID NO:34の軽鎖CDRを含む。1つの態様において、前記同一の軽鎖(VLCL)はSEQ ID NO.35を含む。
【０１０２】
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子形式
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は様々な構成で互いに融合することができる。例示的な構成には、図1A〜Dに図示した構成が含まれるが、これに限定されない。
【０１０３】
一部の態様において、前記T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFcドメインをさらに含む。Fcドメインを含む、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の例示的な態様が以下で説明される。これらのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は全て、同一の軽鎖(VLCL)と、異なる重鎖(VHCL)を有する少なくとも2種類のFab断片を含み、これにより、2つの異なる抗原に対する特異性が付与される。すなわち、一方のFab断片はT細胞活性化抗原に特異的に結合することができ、他方のFab断片は標的細胞抗原に特異的に結合することができる。
【０１０４】
一部の態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分は、任意でペプチドリンカーを介して、互いに融合されている。1つのこのような態様において、第2の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている。別のこのような態様において、第1の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている。さらに別のこのような態様において、第2の抗原結合部分のFab軽鎖のC末端は第1の抗原結合部分のFab軽鎖のN末端と融合されている。さらに別のこのような態様において、第1の抗原結合部分のFab軽鎖のC末端は第2の抗原結合部分のFab軽鎖のN末端と融合されている。1つの態様において、第2の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は第1のFcドメインサブユニットまたは第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている。
【０１０５】
このような特定の態様において、第1の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている。このような特定の態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、同一の(VLCL)軽鎖、第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFcドメイン、ならびに任意で1つまたは複数のペプチドリンカーを含む、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分から本質的になり、第1の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合され、第2の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は第1のFcドメインサブユニットまたは第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている。
【０１０６】
別のこのような態様において、第1の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は第1のFcドメインサブユニットまたは第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている。このような特定の態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、同一の(VLCL)軽鎖、第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFcドメイン、ならびに任意で1つまたは複数のペプチドリンカーを含む、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分から本質的になり、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分それぞれのFab重鎖のC末端はFcドメインサブユニットのうちの1つのN末端と融合されている。
【０１０７】
さらに別のこのような態様において、第2の抗原結合部分のFab軽鎖のC末端は第1の抗原結合部分のFab軽鎖のN末端と融合されている。このような特定の態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、同一の(VLCL)軽鎖、第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFcドメイン、ならびに任意で1つまたは複数のペプチドリンカーを含む、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分から本質的になり、第1の抗原結合部分のFab軽鎖のN末端は第2の抗原結合部分のFab軽鎖のC末端と融合され、第2の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は第1のFcドメインサブユニットまたは第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている。
【０１０８】
他の態様において、第1の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は第1のFcドメインサブユニットまたは第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている。このような特定の態様において、第2の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている。このような特定の態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、同一の(VLCL)軽鎖、第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFcドメイン、ならびに任意で1つまたは複数のペプチドリンカーを含む、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分から本質的になり、第2の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合され、第1の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は第1のFcドメインサブユニットまたは第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている。
【０１０９】
これらの態様の特定の態様において、第1の抗原結合部分は活性化T細胞抗原に特異的に結合することができる。他の態様において、第1の抗原結合部分は標的細胞抗原に特異的に結合することができる。
【０１１０】
抗原結合部分は、直接、または1つもしくは複数のアミノ酸、典型的には約2〜20アミノ酸を含むペプチドリンカーを介してFcドメインと融合されてもよく、互いに融合されてもよい。ペプチドリンカーは当技術分野において公知であり、本明細書において説明される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、(G4S)n(SEQ ID NO:41)、(SG4)n(SEQ ID NO:42)、(G4S)n(SEQ ID NO:41)、またはG4(SG4)n(SEQ ID NO:43)ペプチドリンカーが含まれる。「n」は、一般的には1〜10、典型的には2〜4の数である。第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のFab軽鎖を互いに融合するための特に適切なペプチドリンカーは(G4S)2(SEQ ID NO:44)である。さらに、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域(の一部)を含んでもよい。特に、抗原結合部分がFcドメインサブユニットのN末端と融合されている場合、さらなるペプチドリンカーを伴って、またはさらなるペプチドリンカーを伴わずに、免疫グロブリンヒンジ領域またはその一部を介して融合されていてもよい。
【０１１１】
標的細胞抗原に特異的に結合することができる1つの抗原結合部分を有するT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、特に、高親和性抗原結合部分が結合した後に標的細胞抗原の内部移行が予想される場合に有用である。このような場合、標的細胞抗原に特異的な複数の抗原結合部分が存在すると、標的細胞抗原の内部移行が強化され、それによって、その利用可能性が小さくなる可能性がある。
【０１１２】
しかしながら、他の多くの場合では、例えば、標的部位への標的化を最適化するために、または標的細胞抗原の架橋を可能にするためには、標的細胞抗原に特異的な2つ以上の抗原結合部分を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子があることが有利である。
【０１１３】
従って、ある特定の態様では、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合することができるFab分子である第3の抗原結合部分をさらに含む。1つの態様では、第3の抗原結合部分は、第1の抗原結合部分または第2の抗原結合部分と同じ標的細胞抗原に特異的に結合することができる。特定の態様では、第1の抗原結合部分は活性化T細胞抗原に特異的に結合することができ、第2の抗原結合部分および第3の抗原結合部分は標的細胞抗原に特異的に結合することができる。好ましい態様において、第1の抗原結合部分、第2の抗原結合部分、および第3の抗原結合部分は、同一の(VLCL)軽鎖を含む。
【０１１４】
1つの態様において、第3の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は第1のFcドメインサブユニットまたは第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている。
【０１１５】
1つの態様において、第1の抗原結合部分および第3の抗原結合部分それぞれのFab重鎖のC末端はFcドメインサブユニットのうちの1つのN末端と融合され、第2の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている。このような特定の態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第1の抗原結合部分、第2の抗原結合部分、および第3の抗原結合部分(Fab断片)と、第1のサブユニットおよび第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、任意で1つまたは複数のペプチドリンカーから本質的になり、第2の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合され、第1の抗原結合部分のFab重鎖のC末端はFcドメインの第1のサブユニットのN末端と融合され、第3の抗原結合部分のFab重鎖のC末端はFcドメインの第2のサブユニットのN末端と融合されている。好ましくは、前記態様において、第1の抗原結合部分は活性化T細胞抗原に特異的に結合することができ、第2の抗原結合部分および第3の抗原結合部分は標的細胞抗原に特異的に結合することができ、第1の抗原結合部分、第2の抗原結合部分、および第3の抗原結合部分は、同一の(VLCL)軽鎖を含むFab断片である。
【０１１６】
1つの態様において、第2の抗原結合部分および第3の抗原結合部分それぞれのFab重鎖のC末端はFcドメインサブユニットのうちの1つのN末端と融合され、第1の抗原結合部分のFab重鎖のC末端は第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端と融合されている。
【０１１７】
1つの態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、免疫グロブリン重鎖のうちの1つのN末端と、任意でペプチドリンカーを介して、融合された、標的細胞抗原に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子および活性化T細胞抗原に特異的に結合することができるFab分子から本質的になる。好ましくは、前記態様において、標的細胞抗原に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子および活性化T細胞抗原に特異的に結合することができるFab分子は、同一の(VLCL)軽鎖を含む。
【０１１８】
第1の抗原結合部分および第3の抗原結合部分(またはそれぞれ第2の抗原結合部分および第3の抗原結合部分)はFcドメインに直接融合されてもよく、ペプチドリンカーを介して融合されてもよい。特定の態様において、第1の抗原結合部分および第3の抗原結合部分(またはそれぞれ第2の抗原結合部分および第3の抗原結合部分)はそれぞれ、免疫グロブリンヒンジ領域を介してFcドメインに融合されている。
【０１１９】
特定の態様において、免疫グロブリンヒンジ領域はヒトIgG1ヒンジ領域である。1つの態様において、第1の抗原結合部分および第3の抗原結合部分(またはそれぞれ第2の抗原結合部分および第3の抗原結合部分)ならびにFcドメインは免疫グロブリン分子の一部である。特定の態様において、免疫グロブリン分子はIgGクラス免疫グロブリンである。さらにより具体的な態様において、免疫グロブリンはIgG1サブクラス免疫グロブリンである。別の態様において、免疫グロブリンはIgG4サブクラス免疫グロブリンである。さらに特定の態様において、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。他の態様において、免疫グロブリンはキメラ免疫グロブリンまたはヒト化免疫グロブリンである。
【０１２０】
Fcドメイン
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンG(IgG)分子のFcドメインは二量体であり、二量体の各サブユニットはCH2およびCH3 IgG重鎖定常ドメインを含む。2個のFcドメインサブユニットは互いに安定な会合が可能である。1つの態様において、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は1個以下のFcドメインを含む。
【０１２１】
本発明による1つの態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインはIgG Fcドメインである。特定の態様において、FcドメインはIgG1 Fcドメインである。別の態様において、FcドメインはIgG4 Fcドメインである。さらに具体的な態様において、Fcドメインは、位置S228(Kabatナンバリング)にアミノ酸置換、特に、アミノ酸置換 S228Pを含むIgG4 Fcドメインである。このアミノ酸置換はIgG4抗体のインビボFabアーム交換を低減する(Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)を参照されたい)。さらに特定の態様において、Fcドメインはヒトである。
【０１２２】
ヘテロ二量体化を促進するFcドメイン改変
本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、異なる抗原結合部分を含み、これらは、Fcドメインの2つのサブユニットの一方または他方と融合されており、従って、Fcドメインの2つのサブユニットは、典型的に、2本の非同一ポリペプチド鎖の中に含まれる。これらのポリペプチドの組換え同時発現およびその後の二量体化は、2つのポリペプチドのいくつかの可能性のある組み合わせをもたらす。従って、組換え産生におけるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率および純度を改善するために、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインに、望ましいポリペプチドの会合を促進する改変を導入することが有利であろう。
【０１２３】
従って、特定の態様において、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、Fcドメインの第1および第2のサブユニットの会合を促進する改変を含む。ヒトIgG Fcドメインの2つのサブユニット間にある最も大規模なタンパク質間相互作用の部位はFcドメインのCH3ドメインにある。従って、1つの態様において、前記改変はFcドメインのCH3ドメインにある。
【０１２４】
特定の態様において、前記改変は、Fcドメインの2つのサブユニットの一方に「ノブ」改変、Fcドメインの2つのサブユニットの他方に「ホール」改変を含む、いわゆる「ノブイントゥホール(knob-into-hole)」改変である。
【０１２５】
ノブイントゥホール技術は、例えば、US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)およびCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。一般的に、この方法は、突出部(「ノブ」)を空洞(「ホール」)の中に配置させてヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害できるように、第1のポリペプチドの境界面に突出部および第2のポリペプチドの境界面に対応する空洞を導入することを伴う。第1のポリペプチドの境界面に由来する小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖(例えば、チロシンまたはトリプトファン)と交換することによって突出部が構築される。大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖(例えば、アラニンまたはスレオニン)と交換することによって、突出部と同一または類似するサイズの埋め合わせとなる空洞が第2のポリペプチドの境界面に作り出される。
【０１２６】
従って、特定の態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基が、これより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と交換され、それによって、第2のFcドメインサブユニットのCH3ドメイン内の空洞に配置可能な突出部が、第1のサブユニットのCH3ドメイン内に生じ、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基が、これより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と交換され、それによって、第1のサブユニットのCH3ドメイン内にある突出部を配置可能な空洞が、第2のサブユニットのCH3ドメイン内に生じる。
【０１２７】
突出部および空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異誘発によって、またはペプチド合成によって作ることができる。
【０１２８】
特定の態様において、Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにある位置366のスレオニン残基がトリプトファン残基と交換され(T366W)、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにある位置407のチロシン残基がバリン残基と交換される(Y407V)。1つの態様において、Fcドメインの第2のサブユニットにおいて、さらに、位置366のスレオニン残基がセリン残基と交換され(T366S)、位置368のロイシン残基がアラニン残基と交換される(L368A)。
【０１２９】
なおさらなる態様において、Fcドメインの第1のサブユニットでは、さらに、位置354にあるセリン残基がシステイン残基と交換され(S354C)、Fcドメインの第2のサブユニットでは、さらに、位置349にあるチロシン残基がシステイン残基と交換される(Y349C)。これらの2つのシステイン残基が導入されると、Fcドメインの2つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、二量体がさらに安定化する(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。
【０１３０】
特定の態様において、活性化T細胞抗原に結合することができる抗原結合部分は、(任意で、標的細胞抗原に結合することができる抗原結合部分を介して)第1のFcドメインサブユニット(「ノブ」改変を含む)と融合されている。理論に拘束されるつもりはないが、活性化T細胞抗原に結合することができる抗原結合部分と、Fcドメインのノブ含有サブユニットが融合すると、活性化T細胞抗原に結合することができる2つの抗原結合部分を含む抗原結合分子の産生が(さらに)最小化する(2つのノブ含有ポリペプチドの立体衝突)。
【０１３１】
別の1つの態様において、Fcドメインの第1のサブユニットおよび第2のサブユニットの会合を促進する改変は、静電ステアリング効果を媒介する改変、例えば、PCT公報WO2009/089004に記載の改変を含む。一般的に、この方法は、ホモ二量体形成が静電気的に好ましくないが、ヘテロ二量体化が静電気的に好ましくなるように、2つのFcドメインサブユニットの境界面にある1つまたは複数のアミノ酸残基を荷電アミノ酸残基と交換することを伴う。
【０１３２】
Fc受容体結合および/またはエフェクター機能を低減するFcドメイン改変
Fcドメインは、標的組織における優れた蓄積に寄与する長い血清半減期および好ましい組織-血液分布比を含む好ましい薬物動態学的特性をT細胞活性化二重特異性抗原結合分子に付与する。しかしながら、同時に、Fcドメインは、抗原を有する好ましい細胞ではなくFc受容体発現細胞へのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の望ましくない標的化につながる場合がある。さらに、Fc受容体シグナル伝達経路が同時活性化されるとサイトカインが放出される場合がある。このサイトカイン放出は抗原結合分子のT細胞活性化特性および長い半減期と組み合わさって、サイトカイン受容体の過剰な活性化および全身投与時の重篤な副作用の原因となる。T細胞以外の(Fc受容体を有する)免疫細胞が活性化されると、T細胞が、例えば、NK細胞によって破壊される可能性があるために、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の効力がさらに低減する場合がある。
【０１３３】
従って、特定の態様において、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、天然のIgG1 Fcドメインと比較して、Fc受容体に対する低い結合親和性および/または低いエフェクター機能を示す。1つのこのような態様において、前記Fcドメイン(または前記Fcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子)は、天然のIgG1 Fcドメイン(もしくは天然のIgG1 Fcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子)と比較して50％未満、好ましくは20％未満、より好ましくは10％未満、最も好ましくは5％未満のFc受容体に対する結合親和性、および/または天然のIgG1 Fcドメインドメイン(もしくは天然のIgG1 Fcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子)と比較して50％未満、好ましくは20％未満、より好ましくは10％未満、最も好ましくは5％未満のエフェクター機能を示す。1つの態様において、前記Fcドメインドメイン(または前記Fcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子)はFc受容体に実質的に結合しない、および/またはエフェクター機能を実質的に誘導しない。特定の態様において、Fc受容体はFcγ受容体である。1つの態様において、Fc受容体はヒトFc受容体である。1つの態様において、Fc受容体は活性化Fc受容体である。特定の態様において、Fc受容体は活性化ヒトFcγ受容体、より具体的にはヒトFcγRIIIa、FcγRI、またはFcγRIIa、最も具体的にはヒトFcγRIIIaである。1つの態様において、エフェクター機能は、CDC、ADCC、ADCP、およびサイトカイン分泌からなる群より選択される1つまたは複数である。特定の態様において、エフェクター機能はADCCである。1つの態様において、Fcドメインドメインは、天然のIgG1 Fcドメインと比較して、胎児性Fc受容体(FcRn)に対する実質的に類似した結合親和性を示す。FcRnに対する実質的に類似した結合は、前記Fcドメイン(または前記Fcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子)が、FcRnに対して、天然のIgG1 Fcドメイン(または天然のIgG1 Fcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子)の結合親和性の約70％超、詳細には約80％超、より詳細には約90％超を示す時に達成される。
【０１３４】
ある特定の態様において、Fcドメインは、操作されていないFcドメインと比較して、Fc受容体に対する低い結合親和性および/または低いエフェクター機能を有するように操作されている。特定の態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性および/またはエフェクター機能を低減させる1つまたは複数のアミノ酸変異を含む。典型的に、Fcドメインの2つのサブユニットのそれぞれにおいて1つまたは複数の同じアミノ酸変異が存在する。1つの態様において、アミノ酸変異によって、Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性が低減する。1つの態様において、アミノ酸変異によって、Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性は少なくとも1/2、少なくとも1/5、または少なくとも1/10低減する。Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性を低減させるアミノ酸変異が複数ある態様では、これらのアミノ酸変異の組み合わせによって、Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性は少なくとも1/10、少なくとも1/20、またはさらに少なくとも1/50低減する場合がある。1つの態様において、操作されたFcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、操作されていないFcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子と比較して20％未満、詳細には10％未満、より詳細には5％未満のFc受容体に対する結合親和性を示す。特定の態様において、Fc受容体はFcγ受容体である。一部の態様において、Fc受容体はヒトFc受容体である。一部の態様において、Fc受容体は活性化Fc受容体である。特定の態様において、Fc受容体は活性化ヒトFcγ受容体、より具体的にはヒトFcγRIIIa、FcγRI、またはFcγRIIa、最も具体的にはヒトFcγRIIIaである。好ましくは、これらの各受容体との結合が低減する。一部の態様において、補体成分との結合親和性、具体的にはC1qとの結合親和性も低減する。1つの態様において、胎児性Fc受容体(FcRn)との結合親和性は低減しない。前記Fcドメイン(または前記Fcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子)が、FcRnに対して、非操作型Fcドメイン(または前記非操作型Fcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子)の結合親和性の約70％超を示す場合に、FcRnとの実質的に類似する結合、すなわち、前記受容体に対するFcドメインの結合親和性の保存が達成されている。Fcドメイン、または前記Fcドメインを含む本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、このような親和性の約80％超、さらには約90％超を示してもよい。ある特定の態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、操作されていないFcドメインと比較して低減したエフェクター機能を有するように操作されている。低減したエフェクター機能には、以下:低減した補体依存性細胞傷害(CDC)、低減した抗体依存性細胞傷害(ADCC)、低減した抗体依存性細胞食作用(ADCP)、低減したサイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体を介した低減した抗原取り込み、NK細胞との低減した結合、マクロファージとの低減した結合、単球との低減した結合、多核白血球との低減した結合、アポトーシスを誘導する低減した直接シグナル伝達、低減した標的結合抗体架橋結合、低減した樹状細胞成熟、または低減したT細胞プライミングの1つまたは複数が含まれ得るが、これに限定されない。1つの態様において、低減したエフェクター機能は、低減したCDC、低減したADCC、低減したADCP、および低減したサイトカイン分泌からなる群より選択される1つまたは複数である。特定の態様において、低減したエフェクター機能は、低減したADCCである。1つの態様において、低減したADCCは、操作されていないFcドメイン(または操作されていないFcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子)によって誘導されるADCCの20％未満である。
【０１３５】
1つの態様において、Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性および/またはエフェクター機能を低減させるアミノ酸変異はアミノ酸置換である。1つの態様において、Fcドメインは、E233、L234、L235、N297、P331、およびP329からなる群より選択される位置におけるアミノ酸置換を含む。さらに具体的な態様において、Fcドメインは、L234、L235、およびP329からなる群より選択される位置におけるアミノ酸置換を含む。一部の態様において、Fcドメインは、アミノ酸置換L234AおよびL235Aを含む。1つのこのような態様において、Fcドメインは、IgG1Fcドメイン、特にヒトIgG1Fcドメインである。1つの態様において、Fcドメインは、位置P329にアミノ酸置換を含む。さらに具体的な態様において、アミノ酸置換はP329AまたはP329G、特にP329Gである。1つの態様において、Fcドメインは、位置P329にアミノ酸置換を含み、E233、L234、L235、N297、およびP331より選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む。さらに具体的な態様において、さらなるアミノ酸置換は、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、またはP331Sである。特定の態様において、Fcドメインは、位置P329、L234、およびL235にアミノ酸置換を含む。さらに詳細な態様において、Fcドメインは、アミノ酸変異L234A、L235A、およびP329G(「P329G LALA」)を含む。1つのこのような態様において、Fcドメインは、IgG1Fcドメイン、特にヒトIgG1Fcドメインである。その全体が参照として本明細書に組み入れられるPCT特許出願番号PCT/EP2012/055393に記載のようにアミノ酸置換の「P329G LALA」組み合わせは、Fcγ受容体とヒトIgG1Fcドメインとの結合をほぼ完全になくす。PCT/EP2012/055393はまた、このような変異体Fcドメインを調製する方法、およびその特性、例えば、Fc受容体結合またはエフェクター機能を確かめるための方法について述べる。
【０１３６】
IgG4抗体は、IgG1抗体と比較してFc受容体に対する低減した結合親和性および低減したエフェクター機能を示す。従って、一部の態様において、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、IgG4Fcドメイン、特にヒトIgG4Fcドメインである。1つの態様において、IgG4Fcドメインは、位置S228にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換S228Pを含む。Fc受容体に対するその結合親和性および/またはそのエフェクター機能をさらに低減させるために、1つの態様では、IgG4Fcドメインは位置L235にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換L235Eを含む。別の態様において、IgG4Fcドメインは位置P329にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換P329Gを含む。特定の態様において、IgG4Fcドメインは、位置S228、L235、およびP329にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換S228P、L235E、およびP329Gを含む。このようなIgG4Fcドメイン変異体およびこれらのFcγ受容体結合特性は、その全体が参照として本明細書に組み入れられるPCT特許出願番号PCT/EP2012/055393に記載されている。
【０１３７】
特定の態様において、天然のIgG1Fcドメインと比較して、Fc受容体に対して低減した結合親和性および/または低減したエフェクター機能を示すFcドメインは、アミノ酸置換L234A、L235A、任意で、P329Gを含むヒトIgG1Fcドメイン、またはアミノ酸置換S228P、L235E、任意で、P329Gを含むヒトIgG4Fcドメインである。
【０１３８】
ある特定の態様において、FcドメインのN-グリコシル化が排除されている。1つのこのような態様において、Fcドメインは、位置N297にアミノ酸変異、特に、アスパラギンをアラニン(N297A)またはアスパラギン酸(N297D)と交換したアミノ酸置換を含む。
【０１３９】
前記およびPCT特許出願番号PCT/EP2012/055393に記載のFcドメインに加えて、Fc受容体結合および/またはエフェクター機能が低減したFcドメインは、Fcドメイン残基238、265、269、270、297、327、および329の1つまたは複数の置換を有するFcドメインも含む(米国特許第6,737,056号)。このようなFc変異体は、残基265および297がアラニンに置換された、いわゆる「DANA」Fc変異体(米国特許第7,332,581号)を含む、アミノ酸位置265、269、270、297、および327の2つ以上に置換を有するFc変異体を含む。
【０１４０】
変異体Fcドメインは、当技術分野において周知の遺伝的方法または化学的方法を用いたアミノ酸欠失、置換、挿入、または改変によって調製することができる。遺伝的方法には、コードDNA配列の部位特異的変異誘発、PCR、遺伝子合成などが含まれ得る。正しいヌクレオチド変化は、例えば、配列決定によって立証することができる。
【０１４１】
Fc受容体との結合は、例えば、ELISA、または表面プラズモン共鳴(SPR)によって、標準的な計測装置、例えば、BIAcore計器(GE Healthcare)を用いて容易に確かめることができる。Fc受容体は組換え発現によって得られてもよい。このような適切な結合アッセイは本明細書に記載されている。または、Fc受容体に対する、Fcドメイン、またはFcドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合親和性は、特定のFc受容体を発現することが分かっている細胞株、例えば、FcγIIIa受容体を発現するヒトNK細胞を用いて評価されてもよい。
【０１４２】
Fcドメイン、またはFcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は当技術分野において公知の方法によって測定することができる。ADCCを測定するのに適したアッセイは本明細書に記載されている。関心対象の分子のADCC活性を評価するインビトロアッセイの他の例は、米国特許第5,500,362号; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)、およびHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); 米国特許第5,821,337号; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361(1987)に記載されている。または、非放射性アッセイ法が用いられてもよい(例えば、フローサイトメトリー用のACTI(商標)非放射性細胞傷害アッセイ(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA);およびCytoTox96(登録商標)非放射性細胞傷害アッセイ(Promega, Madison, WI))を参照されたい)。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には末梢血単核球(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。または、もしくはそれに加えて、関心対象の分子のADCC活性がインビボで、動物モデル、例えば、Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)に開示される動物モデルにおいて評価されてもよい。
【０１４３】
一部の態様では、Fcドメインと補体成分、具体的にはC1qとの結合が低減する。従って、低いエフェクター機能を有するようにFcドメインが操作されている一部の態様において、前記低いエフェクター機能には、低減したCDCが含まれる。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子がC1qに結合することができ、従って、CDC活性を有するかどうか確かめるためにC1q結合アッセイが実施されてもよい。例えば、WO2006/029879およびWO2005/100402のC1qおよびC3c結合ELISAを参照されたい。補体活性化を評価するために、CDCアッセイが行われてもよい(例えば、Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003);およびCragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743(2004)を参照されたい)。
【０１４４】
抗原結合部分
本発明の抗原結合分子は二重特異性である、すなわち、2つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができる少なくとも2種類の抗原結合部分を含む。本発明の1つの態様によれば、抗原結合部分はFab分子(すなわち、それぞれが可変領域および定常領域を含む、重鎖および軽鎖で構成される抗原結合ドメイン)であり、少なくとも2種類のFab分子の軽鎖(VLCL)は、同一の配列を含む。1つの態様において、標的細胞抗原に特異的に結合することができるFab分子およびT細胞活性化抗原に特異的に結合することができるFab分子の前記VLCL軽鎖は、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、およびSEQ ID NO:34の軽鎖CDRを含む。
【０１４５】
1つの態様において、標的細胞抗原に特異的に結合することができるFab分子およびT細胞活性化抗原に特異的に結合することができるFab分子の前記VLCL軽鎖はSEQ ID NO:31を含む。
【０１４６】
1つの態様において、前記Fab分子はヒトである。別の態様において、前記Fab分子はヒト化されている。さらに別の態様において、前記Fab分子はヒト重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含む。
【０１４７】
本発明による特定の態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は標的細胞抗原、特に、腫瘍細胞抗原と活性化T細胞抗原に同時に結合することができる。1つの態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原と活性化T細胞抗原に同時に結合することによってT細胞と標的細胞とを架橋することができる。さらにより具体的な態様において、このように同時に結合すると、標的細胞、特に、腫瘍細胞が溶解される。1つの態様において、このように同時に結合するとT細胞が活性化される。他の態様において、このように同時に結合すると、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、および活性化マーカーの発現からなる群より選択される、Tリンパ球、特に、細胞傷害性Tリンパ球の細胞応答が生じる。1つの態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子が標的細胞抗原に同時に結合せずに活性化T細胞抗原に結合しても、T細胞は活性化されない。
【０１４８】
1つの態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、T細胞の細胞傷害活性を標的細胞に方向付け直すことができる。特定の態様において、前記の方向付け直しは、標的細胞によるMHCを介したペプチド抗原提示および/またはT細胞特異性に依存しない。
【０１４９】
特に、本発明の任意の態様によるT細胞は細胞傷害性T細胞である。一部の態様において、T細胞は、CD4+またはCD8+T細胞、特に、CD8+T細胞である。
【０１５０】
活性化T細胞抗原結合部分
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、活性化T細胞抗原に結合することができる少なくとも1つの抗原結合部分(本明細書において「活性化T細胞抗原結合部分」とも呼ばれる)を含む。特定の態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、活性化T細胞抗原に特異的に結合することができる1個以下の抗原結合部分を含む。1つの態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は活性化T細胞抗原との一価結合を提供する。活性化T細胞抗原結合部分はFab分子であり、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合部分と同じVLCL軽鎖を含む。
【０１５１】
特定の態様において、活性化T細胞抗原は、CD3、特にヒトCD3またはカニクイザルCD3、最も詳細にはヒトCD3である。特定の態様において、活性化T細胞抗原結合部分は、ヒトCD3およびカニクイザルCD3に対して交差反応性である(すなわち、ヒトCD3およびカニクイザルCD3に特異的に結合する)。一部の態様において、活性化T細胞抗原はCD3のεサブユニット(SEQ ID NO: 56)である。
【０１５２】
1つの態様において、活性化T細胞抗原結合部分は、CD3エピトープとの結合においてモノクローナル抗体H2C(PCT公報番号WO2008/119567に記載)と競合することができる。別の態様において、活性化T細胞抗原結合部分は、CD3エピトープとの結合においてモノクローナル抗体V9(Rodrigues et al., Int J Cancer Suppl 7, 45-50 (1992)および米国特許第6,054,297号に記載)と競合することができる。さらに別の態様において、活性化T細胞抗原結合部分は、CD3エピトープとの結合においてモノクローナル抗体FN18(Nooij et al., Eur J Immunol 19, 981-984 (1986)に記載)と競合することができる。特定の態様において、活性化T細胞抗原結合部分は、CD3エピトープとの結合においてモノクローナル抗体SP34(Pessano et al., EMBO J 4, 337-340 (1985)に記載)と競合することができる。1つの態様において、活性化T細胞抗原結合部分は、モノクローナル抗体SP34と同じCD3エピトープに結合する。
【０１５３】
1つの態様において、活性化T細胞抗原結合部分は、SEQ ID NO:14の重鎖CDR1、SEQ ID NO:15の重鎖CDR2、SEQ ID NO:16の重鎖CDR3、SEQ ID NO:32の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:33の軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO:34の軽鎖CDR3を含む。さらなる態様において、活性化T細胞抗原結合部分は、SEQ ID NO:36と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一の重鎖可変領域配列または機能を保持しているその変種を含む。
【０１５４】
さらなる態様において、活性化T細胞抗原結合部分は、SEQ ID NO:31と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一の軽鎖可変領域配列または機能を保持しているその変種を含む。
【０１５５】
1つの態様において、活性化T細胞抗原結合部分は、SEQ ID NO:36の配列を含む重鎖およびSEQ ID NO:31の配列を含む軽鎖を含む。
【０１５６】
1つの態様において、活性化T細胞抗原結合部分は、SEQ ID NO:40の重鎖およびSEQ ID NO:35を含む軽鎖を含む。
【０１５７】
標的細胞抗原結合部分
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に結合することができる少なくとも1つの抗原結合部分(本明細書において「標的細胞抗原結合部分」とも呼ばれる)を含む。ある特定の態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に結合することができる2つの抗原結合部分を含む。このような特定の態様において、これらの抗原結合部分はそれぞれ、同じ抗原決定基に特異的に結合する。1つの態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を含む。1つの態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に結合することができる、2以下の抗原結合部分を含む。標的細胞抗原結合部分は、一般的に、特定の抗原決定基に結合し、かつT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を標的部位、例えば、抗原決定基を有する特定のタイプの腫瘍細胞に向けることができるFab分子である。前記Fab分子は、T細胞活性化抗原に特異的に結合することができるFab分子と同一のVLCL軽鎖を有する。好ましい態様において、標的細胞抗原に特異的に結合することができるFab分子およびT細胞活性化抗原に特異的に結合することができるFab分子の前記VLCL軽鎖は、SEQ ID NO:32の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:33の軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO:34の軽鎖CDR3を含む。好ましい態様において、標的細胞抗原に特異的に結合することができるFab分子およびT細胞活性化抗原に特異的に結合することができるFab分子の前記VLCL軽鎖はSEQ ID NO.31のVLCL軽鎖を含む。
【０１５８】
さらなる態様において、標的細胞抗原結合部分は、SEQ ID NO:31と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一の軽鎖可変領域配列または機能を保持しているその変種を含む。
【０１５９】
さらなる態様において、標的細胞抗原結合部分は、SEQ ID NO:35と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一の軽鎖配列または機能を保持しているその変種を含む。
【０１６０】
ある特定の態様において、標的細胞抗原結合部分は、病理学的状態に関連する抗原、例えば、腫瘍細胞上またはウイルス感染細胞上に提示される抗原に向けられる。適切な抗原は細胞表面抗原、例えば、細胞表面受容体であるが、これに限定されない。特定の態様において、抗原はヒト抗原である。特定の態様において、標的細胞抗原は、葉酸受容体1(FolR1)、ムチン-1(MUC1)、およびB細胞成熟抗原(BCMA)の群より選択される。
【０１６１】
特定の態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:263、SEQ ID NO:264、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:267、およびSEQ ID NO:272の群より選択される配列と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％同一のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を、その機能的断片または変種を含めて含む。
【０１６２】
ポリヌクレオチド
さらに、本発明は、本明細書に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドまたはその断片を提供する。
【０１６３】
本発明のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:263、SEQ ID NO:264、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:267、およびSEQ ID NO:272に示した配列と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一のポリヌクレオチドを、その機能断片または変種を含めて含む。
【０１６４】
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドは、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の全体をコードする1種類のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、同時発現される複数種の(例えば、2種類以上の)ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。同時発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合または他の手段を介して会合して、機能的なT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を形成してもよい。例えば、抗原結合部分の軽鎖部分は、抗原結合部分の重鎖部分、Fcドメインサブユニット、および、任意で、別の抗原結合部分(の一部)を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現された時に、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して抗原結合部分を形成する。別の例では、2つのFcドメインサブユニットの一方を含み、任意で、1つまたは複数の抗原結合部分(の一部)を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子部分は、2つのFcドメインサブユニットの他方を含み、任意で、抗原結合部分(の一部)を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現された時に、Fcドメインサブユニットは会合してFcドメインを形成する。
【０１６５】
ある特定の態様において、ポリヌクレオチドまたは核酸はDNAである。他の態様において、本発明のポリヌクレオチドは、RNA、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)の形をしたRNAである。本発明のRNAは一本鎖または二本鎖でもよい。
【０１６６】
組換え方法
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成(例えば、Merrifield固相合成)または組換え産生によって入手することができる。組換え産生の場合、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド、例えば、前記のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび/または発現のために1つまたは複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは従来の手順を用いて容易に単離および配列決定することができる。1つの態様において、本発明のポリヌクレオチドの1つまたは複数を含むベクター、好ましくは、発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を用いて、適切な転写/翻訳制御シグナルと共にT細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)のコード配列を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えDNA法、合成法、およびインビボ組換え/遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989);およびAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載の技法を参照されたい。発現ベクターはプラスミド、ウイルスの一部でもよく、核酸断片でもよい。発現ベクターには、プロモーターおよび/または他の転写制御エレメントもしくは翻訳制御エレメントと機能的に会合して、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)をコードするポリヌクレオチド(すなわち、コード領域)がクローニングされている発現カセットが含まれる。本明細書で使用する「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸部分である。「停止コドン」(TAG、TGA、またはTAA)はアミノ酸に翻訳されないが、存在するのであればコード領域の一部とみなされることがある。だが、いかなる隣接配列も、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5'非翻訳領域および3'非翻訳領域などはコード領域の一部でない。2種類以上のコード領域が1つのポリヌクレオチド構築物、例えば、1つのベクターに存在してもよく、別々のポリヌクレオチド構築物に、例えば、別々の(異なる)ベクターに存在してもよい。さらに、任意のベクターが1つのコード領域を含有してもよく、2種類以上のコード領域を含有してもよい。例えば、本発明のベクターは1種類または複数種のポリペプチドをコードしてもよく、1種類または複数種のポリペプチドは翻訳後または翻訳と同時にタンパク質切断を介して最終タンパク質に分離される。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)またはその変種もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドと融合された状態で、または融合されていない状態で異種コード領域をコードしてもよい。異種コード領域には、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインなどの特殊なエレメントまたはモチーフが含まれるが、それに限定されるわけではない。機能的な結合とは、遺伝子産物の発現を調節配列の影響下または制御下に置くように遺伝子産物、例えば、ポリペプチドのコード領域が1つまたは複数の調節配列と結合している時の結合である。プロモーター機能が誘導されることで、望ましい遺伝子産物をコードするmRNAが転写されるのであれば、および2つのDNA断片間の連結の内容が、発現調節配列が遺伝子産物の発現を誘導する能力を妨げない、またはDNA鋳型が転写される能力を妨げないのであれば、2つのDNA断片(例えば、ポリペプチドコード領域およびそれと結合しているプロモーター)は「機能的に結合している」。従って、プロモーターが、ポリペプチドをコードする核酸を転写することができれば、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と機能的に結合している。プロモーターは、予め決められた細胞でのみ大幅なDNA転写を誘導する細胞特異的プロモーターでもよい。細胞特異的転写を誘導するように、プロモーターに加えて他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルをポリヌクレオチドと機能的に結合することができる。適切なプロモーターおよび他の転写制御領域が本明細書において開示される。様々な転写制御領域が当業者に公知である。これらには、サイトメガロウイルスに由来するプロモーターおよびエンハンサーセグメント(例えば、最初期プロモーターとイントロン-A)、シミアンウイルス40(例えば、初期プロモーター)、ならびにレトロウイルス(例えば、ラウス肉腫ウイルス)などがあるが、それに限定されない、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域が含まれるが、それに限定されるわけではない。他の転写制御領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギα-グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来する転写制御領域、ならびに真核細胞において遺伝子発現を制御することができる他の配列が含まれる。さらなる適切な転写制御領域には、組織特異的なプロモーターおよびエンハンサーならびに誘導性プロモーター(例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン)が含まれる。同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に公知である。これらの翻訳制御エレメントには、リボソーム結合部位、翻訳開始コドンおよび翻訳終結コドン、ならびにウイルス系に由来するエレメント(特に、内部リボソーム挿入部位すなわちIRES。CITE配列とも呼ばれる)が含まれるが、これに限定されない。発現カセットはまた、他の特徴、例えば、複製起点、および/または染色体組み込みエレメント、例えば、レトロウイルス末端反復配列(LTR)、またはアデノ随伴ウイルス(AAV)逆位末端配列(ITR)も含んでよい。
【０１６７】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を誘導する分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードする、さらなるコード領域と結合してもよい。例えば、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の分泌が望ましい場合、シグナル配列をコードするDNAは本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードする核酸の上流に配置されることがある。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質にはシグナルペプチド配列または分泌リーダー配列があり、粗面小胞体を通る成長タンパク質鎖の輸送が開始したらシグナルペプチド配列または分泌リーダー配列は成熟タンパク質から切断される。当業者であれば、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは、一般的に、ポリペプチドのN末端にシグナルペプチドが融合しており、シグナルペプチドは翻訳されたポリペプチドから切断されて、分泌型または「成熟」型のポリペプチドとなることを知っている。ある特定の態様において、天然シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖シグナルペプチドもしくは軽鎖シグナルペプチド、または機能的に結合しているポリペプチドの分泌を誘導する能力を保持している、その配列の機能誘導体が用いられる。または、異種哺乳動物シグナルペプチドまたはその機能誘導体が用いられてもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノゲンアクチベーター(TPA)またはマウスβ-グルクロニダーゼのリーダー配列と置換されてもよい。
【０１６８】
後の精製を容易にするために使用することができる短いタンパク質配列(例えば、ヒスチジンタグ)またはT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の標識を助けるために使用することができる短いタンパク質配列をコードするDNAが、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)をコードするポリヌクレオチドの中に、またはT細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)をコードするポリヌクレオチドの末端に含まれてもよい。
【０１６９】
さらなる態様において、本発明の1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。ある特定の態様において、本発明の1つまたは複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。前記ポリヌクレオチドおよびベクターは、それぞれ、ポリヌクレオチドおよびベクターに関して本明細書において説明される任意の特徴を単独で、または組み合わせて組み込んでもよい。1つのこのような態様において、宿主細胞は、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子(の一部)をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む(例えば、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子(の一部)をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換またはトランスフェクトされている)。本明細書で使用する「宿主細胞」という用語は、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子またはその断片を生じるように操作することができる任意の種類の細胞系を指す。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の複製および発現の支援に適した宿主細胞は当技術分野において周知である。このような細胞は、適宜、特定の発現ベクターでトランスフェクトまたは形質導入されてもよく、ラージスケールファーメンターに播種して、臨床用途に十分な量のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を得るために多量のベクター含有細胞を増殖させることができる。適切な宿主細胞には、原核生物微生物、例えば、大腸菌、または様々な真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、昆虫細胞などが含まれる。例えば、特に、グリコシル化が必要とされない場合、ポリペプチドが細菌内で産生されてもよい。発現後、ポリペプチドは、可溶性画分にある細菌細胞ペーストから単離されてもよく、さらに精製することができる。原核生物に加えて糸状菌または酵母などの真核微生物が、ポリペプチドをコードするベクターに適したクローニング宿主または発現宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、その結果、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドが産生される菌類および酵母株を含む。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)およびLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照されたい。(グリコシル化) ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた多細胞生物(無脊椎動物および脊椎動物)に由来する。無脊椎動物細胞の例には植物細胞および昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と一緒に使用することができる、特に、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞をトランスフェクトするために使用することができる非常に多くのバキュロウイルス株が特定されている。植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号、同第6,040,498号、同第6,420,548号、同第7,125,978号、および同第6,417,429号(トランスジェニック植物において抗体を産生するためのPLANTIBODIES(商標)技術について説明している)を参照されたい。脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7)、ヒト胚腎臓株(例えば、Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59(1977)に記載の293細胞または293T細胞)、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK)、マウスセルトリ細胞(例えば、Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980)に記載のTM4細胞)、サル腎臓細胞(CV1)、アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76)、ヒト子宮頸がん細胞(HELA)、イヌ腎臓細胞(MDCK)、バッファローラット(buffalo rat)肝臓細胞(BRL 3A)、ヒト肺細胞(W138)、ヒト肝臓細胞(Hep G2)、マウス乳房腫瘍細胞(MMT060562)、TRI細胞(例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44-68 (1982)に記載)、MRC5細胞、およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、dhfr- CHO細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞;ならびにミエローマ細胞株、例えば、YO、NS0、P3X63、およびSp2/0が含まれる。タンパク質産生に適した、ある特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照されたい。宿主細胞は、培養細胞、例えば、ほんの少し例を挙げると哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞、および植物細胞を含むが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、または植物培養組織もしくは動物培養組織の中に含まれる細胞も含む。1つの態様において、宿主細胞は、真核細胞、好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胚腎臓(HEK)細胞、またはリンパ系細胞(例えば、Y0、NSO、Sp20細胞)である。
【０１７０】
これらの系において外来遺伝子を発現するための標準的な技術が当技術分野において公知である。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖または軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発現する細胞は、発現産物が重鎖および軽鎖を両方とも有する抗体になるように抗体鎖の他方も発現するように操作されてもよい。
【０１７１】
1つの態様において、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を産生する方法であって、本明細書において提供されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程、および宿主細胞(または宿主細胞培地)からT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程を含む方法が提供される。
【０１７２】
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は遺伝子的に互いに融合されている。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、その成分が互いに直接、またはリンカー配列を介して間接的に融合されるように設計することができる。リンカーの組成および長さは当技術分野において周知の方法に従って決定することができ、効力について試験することができる。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の異なる成分間のリンカー配列の例は、本明細書において提供される配列において見出される。所望であれば、融合の個々の成分を分離するための切断部位、例えば、エンドペプチダーゼ認識配列を組み込むように、さらなる配列も含まれてよい。
【０１７３】
ある特定の態様において、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の1つまたは複数の抗原結合部分は、少なくとも、抗原決定基に結合することができる抗体可変領域を含む。可変領域は、天然または非天然の抗体およびその断片の一部でもよく、天然または非天然の抗体およびその断片の一部に由来してもよい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生するための方法は当技術分野において周知である(例えば、Harlow and Lane, 「Antibodies, a laboratory manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照されたい)。非天然抗体は固相ペプチド合成を用いて構築されてもよく、組換えにより産生されてもよく(例えば、米国特許第4,186,567号に記載)、例えば、可変重鎖および可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって入手されてもよい(例えば、McCaffertyへの米国特許第5,969,108号を参照されたい)。
【０１７４】
任意の動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン、または可変領域を本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子において使用することができる。本発明において有用な非限定的な抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン、または可変領域は、マウス、霊長類、またはヒトに由来してもよい。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子がヒトでの使用を目的とする場合、抗体の定常領域がヒトに由来するキメラ型の抗体が用いられることがある。ヒト化型または完全ヒト型の抗体も当技術分野において周知の方法(例えば、Winterへの米国特許第5,565,332号を参照されたい)に従って調製することができる。ヒト化は、(a)非ヒト(例えば、ドナー抗体)CDRを、極めて重要なフレームワーク残基(例えば、良好な抗原結合親和性もしくは抗体機能の保持に重要なフレームワーク残基)を保持している、もしくは保持していないヒト(例えば、レシピエント抗体)フレームワークおよび定常領域に接ぎ合わせる工程、(b)非ヒト特異性決定領域(SDRもしくはa-CDR;抗体-抗原相互作用に極めて重要な残基)のみをヒトフレームワークおよび定常領域に接ぎ合わせる工程、または(c)非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の交換によってヒト様部分で「覆い隠す(cloaking)」工程を含むが、これに限定されない様々な方法によって実現することができる。ヒト化抗体およびヒト化抗体を作る方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)において概説され、例えば、Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); 米国特許第5,821,337号、同第7,527,791号、同第6,982,321号、および同第7,087,409号; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al, Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (SDR (a-CDR)の接ぎ合わせについて説明している); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (リサーフェシング(resurfacing)について説明している); Dall'Acqua et al, Methods 36, 43-60 (2005) (「FR シャッフリング」について説明している);ならびにOsbourn et al, Methods 36, 61-68 (2005)およびKlimka et al, Br J Cancer 83, 252-260 (2000)(FRシャッフリングする「ガイディッドセレクション(guided selection)」法について説明している)においてさらに説明される。ヒト抗体およびヒト可変領域は当技術分野において公知の様々な技法を用いて産生することができる。ヒト抗体は、van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001)およびLonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)において大まかに説明されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ方法によって作られたヒトモノクローナル抗体の一部を形成してもよく、ハイブリドーマ方法によって作られたヒトモノクローナル抗体に由来してもよい(例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照されたい)。ヒト抗体およびヒト可変領域はまた、抗原曝露に応答してインタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されているトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製されてもよい(例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照されたい)。ヒト抗体およびヒト可変領域はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーより選択されるFvクローン可変領域配列を単離することによって作製されてもよい(例えば、Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001);およびMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)を参照されたい)。ファージは、典型的に、抗体断片を単鎖Fv(scFv)断片またはFab断片としてディスプレイする。
【０１７５】
ある特定の態様において、本発明において有用な抗原結合部分は、例えば、その全内容が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2004/0132066号に開示される方法に従って高い結合親和性を有するように操作されている。本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子が特定の抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫測定法(ELISA)、または当業者がよく知っている他の技法、例えば、表面プラズモン共鳴法(BIACORE T100システムで分析される)(Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000))および従来の結合アッセイ(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))を介して測定することができる。ある特定の抗原との結合において参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン、または可変ドメイン、例えば、CD3への結合においてV9抗体と競合する抗体を特定するために競合アッセイが用いられてもよい。ある特定の態様において、このような競合抗体は、参照抗体が結合する同じエピトープ(例えば、直鎖エピトープまたはコンホメーションエピトープ)に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Morris (1996)「Epitope Mapping Protocols」, Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供される。例示的な競合アッセイでは、固定化された抗原(例えば、CD3)は、抗原(例えば、V9抗原)に結合する第1の標識抗体、および抗原との結合において第1の抗体と競合する能力について試験されている第2の非標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第2の抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化された抗原は、第1の標識抗体を含むが、第2の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。第1の抗体と抗原との結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な非結合抗体が除去され、固定化された抗原と結び付いた標識の量が測定される。固定化された抗原と結び付いた標識の量が対照試料と比べて試験試料においてかなり減少していれば、このことから、第2の抗体は抗原との結合において第1の抗体と競合していることが分かる。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照されたい。
【０１７６】
本明細書に記載のように調製されたT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、当技術分野において公知の技法、例えば、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製することができる。特定のタンパク質を精製するのに用いられる実際の条件は、部分的に、実効電荷、疎水性、親水性などの要因に左右され、当業者に明らかであろう。アフィニティクロマトグラフィー精製の場合、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体、または抗原を使用することができる。例えば、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のアフィニティクロマトグラフィー精製の場合、プロテインAまたはプロテインGを含むマトリックスが用いられてもよい。本質的に実施例に記載のように、連続したプロテインAアフィニティクロマトグラフィーまたはプロテインGアフィニティクロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を分離することができる。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む任意の様々な周知の分析方法によって求めることができる。例えば、実施例に記載のように発現された重鎖融合タンパク質は、還元SDS-PAGEによって証明されたようにインタクトであり、適切に組み立てられていることが示された。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の軽鎖の予測分子量に対応する約Mr25,000、重鎖の予測分子量に対応するMr50,000、および重鎖/軽鎖融合タンパク質の予測分子量に対応するMr75,000の3つのバンドが分離された。
【０１７７】
アッセイ
本明細書において提供されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の物理的/化学的特性および/または生物学的活性を、当技術分野において公知の様々なアッセイによって特定、スクリーニング、または特徴付けすることができる。
【０１７８】
親和性アッセイ
Fc受容体または標的抗原に対するT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の親和性は、実施例に示された方法に従って、BIAcore装置(GE Healthcare)などの標準的な計器を用いた表面プラズモン共鳴(SPR)によって求めることができる。受容体または標的タンパク質は組換え発現によって入手されてもよい。または、異なる受容体または標的抗原に対するT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合は、特定の受容体または標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えば、フローサイトメトリー(FACS)によって評価されてもよい。結合親和性を測定するための実例となる、かつ例示的な具体的な態様が、以下において、および下記の実施例において説明される。
【０１７９】
1つの態様によれば、表面プラズモン共鳴によって、25℃でBIACORE(登録商標)T100装置(GE Healthcare)を用いてKDが測定される。
【０１８０】
Fc部分とFc受容体との相互作用を分析するために、CM5チップ上に固定化した抗Penta His抗体(Qiagen)(「Penta His」はSEQ ID NO:45に開示)によってHisタグ化組換えFc受容体を捕捉する。二重特異性構築物を分析物として使用する。簡単に述べると、供給業者の説明書に従って、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, GE Healthcare)をN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)およびN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化する。抗Penta-His抗体(「Penta His」はSEQ ID NO:45に開示)を10mM酢酸ナトリウム, pH5.0で40μg/mlで希釈した後に、約6500応答単位(response unit)(RU)の結合タンパク質となるように5μl/分の流速で注入する。リガンドを注入した後に、反応しなかった基をブロックするために、1Mエタノールアミンを注入する。その後に、Fc受容体を4nMまたは10nMで60秒間、捕捉する。反応速度測定のために、HBS-EP(GE Healthcare、10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％Surfactant P20、 pH7.4)に溶解した二重特異性構築物の4倍段階希釈液(500nM〜4000nMの範囲)を30μl/分の流速、25℃で120秒間、注入する。
【０１８１】
標的抗原に対する親和性を求めるために、抗Penta-His抗体(「Penta His」はSEQ ID NO:45に開示)について述べたように活性化CM5-センサーチップ表面に固定化した抗ヒトFab特異的抗体(GE Healthcare)によって二重特異性構築物を捕捉する。結合タンパク質の最終量は約12000RUである。二重特異性構築物を300nMで90秒間、捕捉する。標的抗原をフローセルに250〜1000nMの濃度範囲、30μl/分の流速で180秒間、通す。解離を180秒間、モニタリングする。
【０１８２】
参照フローセルで得られた応答を差し引くことによって体積屈折率(bulk refractive index)差を補正する。ラングミュア結合等温線の非線形曲線フィッティングによって解離定数KDを得るために定常状態での応答を使用した。会合速度(kon)および解離速度(koff)は、単純1：1ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model)(BIACORE(登録商標)T100 Evaluation Softwareバージョン1.1.1)を用いて会合センサーグラムおよび解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによって計算される。平衡解離定数(KD)は比koff/konとして計算される。例えば、 Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999)を参照されたい。
【０１８３】
活性アッセイ
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の生物学的活性は、実施例に記載されるような様々なアッセイによって測定することができる。生物学的活性には、例えば、T細胞増殖の誘導、T細胞におけるシグナル伝達の誘導、T細胞における活性化マーカー発現の誘導、T細胞によるサイトカイン分泌の誘導、標的細胞、例えば、腫瘍細胞の溶解の誘導、ならびに腫瘍退縮の誘導および/または生存の改善が含まれ得る。
【０１８４】
組成物、製剤、および投与経路
さらなる局面において、本発明は、例えば、以下の任意の治療方法において使用するための、本明細書において提供される任意のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物を提供する。1つの態様において、薬学的組成物は、本明細書において提供される任意のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む。別の態様において、薬学的組成物は、本明細書において提供される任意のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子および少なくとも1種類のさらなる治療剤、例えば、下記の治療剤を含む。
【０１８５】
さらに、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子をインビボ投与に適した形で産生する方法であって、(a)本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を入手する工程、および(b)少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と共にT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を処方する工程であって、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の調製物がインビボ投与のために処方される工程を含む方法が提供される。
【０１８６】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体に溶解または分散された治療的有効量の1種類または複数種のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む。「薬学的または薬理学的に許容される」という句は、適宜、動物、例えば、ヒトに投与された時に、使用された投与量および濃度でレシピエントに概して無毒の分子的実体および組成物、すなわち、有害な、アレルギー性の、または他の不都合な反応を生じない分子的実体および組成物を指す。少なくとも1種類のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含有し、任意で、さらなる活性成分を含有する薬学的組成物の調製は、参照として本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990により例示されるように、本開示を考慮すれば当業者に公知であろう。さらに、動物(例えば、ヒト)への投与の場合、調製物は、FDA生物基準局(Office of Biological Standards)または他の国の対応機関の基準により求められるような無菌性、発熱性、一般的安全性、および純度の基準を満たさなければならない。好ましい組成物は凍結乾燥製剤または水溶液である。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」は、任意のおよび全ての溶媒、緩衝液、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤(例えば、抗菌剤、抗真菌剤)、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、酸化防止剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合物質、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、着香剤、色素、当業者に公知のこのような同様の材料およびその組み合わせを含む(例えば、参照として本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照されたい)。従来の担体が活性成分と適合しない場合を除いて、治療薬または薬学的組成物に用いられることが意図される。
【０１８７】
組成物は、固体、液体、またはエアロゾルの形で投与されるかどうかに応じて、および注射などその投与経路のために無菌である必要があるかどうかに応じて、異なるタイプの担体を含んでもよい。本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子(および任意のさらなる治療剤)は、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、脾臓内に、腎臓内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、眼内に、経口的に、局部に、局所に、吸入(例えば、エアロゾル吸入)、注射、注入、連続注入、標的細胞を直接浸す局所灌流によって、カテーテルを介して、洗浄によって、クリームに入れて、脂質組成物(例えば、リポソーム)に入れて、または当業者に公知の他の方法もしくは前述の任意の組み合わせ(例えば、参照として本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990を参照されたい)によって投与することができる。本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子などのポリペプチド分子を投与するために非経口投与、特に、静脈内注射が最も一般的に用いられる。
【０１８８】
非経口組成物には、注射、例えば、皮下注射、皮内注射、病巣内注射、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、くも膜下腔内注射、または腹腔内注射による投与のために設計された非経口組成物が含まれる。注射の場合、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、水溶液、好ましくは、生理学的に適合する緩衝液、例えば、ハンクス液、リンガー液、または生理食塩水緩衝液に溶解して処方されてもよい。溶液は、懸濁剤、安定剤、および/または分散剤などの処方用の剤(formulatory agent)を含有してもよい。または、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、使用前に適切なビヒクル、例えば、発熱物質を含まない滅菌水を用いて構成するために粉末の形をとってもよい。滅菌注射液は、必要とされる量の本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を、必要に応じて以下に列挙された他の成分のいくつかを含む適切な溶媒の中に組み込むことによって調製される。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜で濾過することによって容易に達成することができる。一般的に、分散液は、様々な滅菌活性成分を、基本分散媒および/または他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌した注射液、懸濁液、またはエマルジョンを調製するための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は、予め濾過滅菌したその液体媒体から活性成分+任意のさらなる望ましい成分の散剤を生じさせる真空乾燥法および凍結乾燥法である。液体媒体は必要に応じて安定して緩衝されていなければならない。最初に、液体希釈剤が十分な食塩水またはグルコースで注射前に等張にされる。組成物は製造および保管の条件下で安定していなければならず、細菌および菌類などの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。エンドトキシン汚染は、安定なレベル、例えば、0.5ng/mgタンパク質未満に最小限に保たれなければならないことが理解されるだろう。適切な薬学的に許容される担体は、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルパラベンもしくはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール;塩形成対イオン、例えば、ナトリウム;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);ならびに/または非イオン界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)を含むが、これに限定されない。注射用水性懸濁液は、懸濁液の粘度を高める化合物、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストランな���を含有してもよい。任意で、懸濁液はまた、高濃度溶液の調製を可能にする、化合物の溶解度を高める適切な安定剤または薬剤も含有してよい。さらに、適切な注射用油性懸濁液として活性化合物の懸濁液が調製されてもよい。適切な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油、例えば、ゴマ油、あるいは合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチル(ethyl cleats)もしくはトリグリセリド、またはリポソームが含まれる。
【０１８９】
活性成分は、調製されたマイクロカプセル、例えば、コアセルベーション法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル)に、またはマクロエマルジョンに封入されてもよい。このような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed. Mack Printing Company, 1990)に開示される。持効性調製物が調製されてもよい。持効性調製物の適切な例には、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれる。このマトリックスは、成型品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形をとる。特定の態様では、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、またはその組み合わせの組成物中に使用することによって注射用組成物の長期吸収を生じることができる。
【０１９０】
前記の組成物に加えて、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子はまたデポー調製物として処方されてもよい。このような長時間作用型製剤は、移植によって(例えば、皮下もしくは筋肉内に)投与されてもよく、筋肉内注射によって投与されてもよい。従って、例えば、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料(例えば、許容される油に溶解したエマルジョンとして)またはイオン交換樹脂として処方されてもよく、やや溶けにくい誘導体、例えば、やや溶けにくい塩として処方されてもよい。
【０１９１】
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、または凍結プロセスによって製造されてもよい。薬学的組成物は、1種類または複数種の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはタンパク質を、薬学的に使用することができる調製物に調製するのを容易にする補助剤を用いて従来のやり方で処方されてもよい。適切な製剤は、選択された投与経路によって決まる。
【０１９２】
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、遊離酸または遊離塩基、中性または塩の形で組成物に処方されてもよい。薬学的に許容される塩は、遊離酸または遊離塩基の生物学的活性を実質的に保持している塩である。これらには、酸添加塩、例えば、タンパク質組成物の遊離アミノ基と形成された酸添加塩、あるいは無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、もしくはマンデル酸のような有機酸と形成された酸添加塩が含まれる。遊離カルボキシル基と形成された塩はまた、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは水酸化第二鉄;またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、もしくはプロカインのような有機塩基からも得ることができる。薬学的塩は、水性溶媒および他のプロトン性溶媒中では、対応する遊離塩基型より溶解度が高くなる傾向がある。
【０１９３】
治療方法および組成物
本明細書において提供される任意のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を治療方法において使用することができる。本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を、例えば、がん治療において使用することができる。
【０１９４】
治療方法において使用する場合、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、好適な医療行為と一致するやり方で処方、投薬、および投与される。この文脈で考慮すべき要因には、治療されている特定の障害、治療されている特定の哺乳動物、患者1人1人の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画、および医師が知っている他の要因が含まれる。
【０１９５】
1つの局面において、医薬として使用するための本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。さらなる局面において、疾患の治療において使用するための本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。ある特定の態様において、治療方法において使用するための本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。1つの態様において、本発明は、それを必要とする個体における疾患の治療において使用するための本明細書に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。ある特定の態様において、本発明は、治療的有効量のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を個体に投与する工程を含む、疾患を有する個体を治療する方法において使用するためのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。ある特定の態様において、治療される疾患は増殖性障害である。特定の態様において、疾患はがんである。ある特定の態様において、前記方法は、治療される疾患ががんであれば、治療的有効量の少なくとも1種類のさらなる治療剤、例えば、抗がん剤を個体に投与する工程をさらに含む。さらなる態様において、本発明は、標的細胞、特に、腫瘍細胞の溶解の誘導において使用するための本明細書に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。ある特定の態様において、本発明は、個体において標的細胞、特に、腫瘍細胞の溶解を誘導する方法であって、有効量のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を個体に投与して標的細胞の溶解を誘導する工程を含む方法において使用するためのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。前記態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくは、ヒトである。
【０１９６】
さらなる局面において、本発明は、医薬の製造または調製における本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。1つの態様において、医薬は、それを必要とする個体において疾患を治療するためのものである。さらなる態様において、医薬は、疾患を有する個体に治療的有効量の医薬を投与する工程を含む、疾患を治療する方法において使用するためのものである。ある特定の態様において、治療される疾患は増殖性障害である。特定の態様において、疾患はがんである。1つの態様において、前記方法は、治療的有効量の少なくとも1種類のさらなる治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤を個体に投与する工程をさらに含む。さらなる態様において、医薬は、標的細胞、特に、腫瘍細胞の溶解を誘導するためのものである。なおさらなる態様において、医薬は、個体において標的細胞、特に、腫瘍細胞の溶解を誘導する方法であって、有効量の医薬を個体に投与して標的細胞の溶解を誘導する工程を含む方法において使用するためのものである。前記態様のいずれかによる「個体」は哺乳動物、好ましくは、ヒトでもよい。
【０１９７】
さらなる局面において、本発明は、疾患を治療するための方法を提供する。1つの態様において、前記方法は、このような疾患を有する個体に治療的有効量の本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を投与する工程を含む。1つの態様において、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を薬学的に許容される形で含む組成物が前記個体に投与される。ある特定の態様において、治療される疾患は増殖性障害である。特定の態様において、疾患はがんである。ある特定の態様において、前記方法は、治療的有効量の少なくとも1種類のさらなる治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤を個体に投与する工程をさらに含む。前記態様のいずれかによる「個体」は哺乳動物、好ましくは、ヒトでもよい。
【０１９８】
さらなる局面において、本発明は、標的細胞、特に、腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法を提供する。1つの態様において、前記方法は、T細胞、特に、細胞傷害性T細胞の存在下で、標的細胞を本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子と接触させる工程を含む。さらなる局面において、個体において標的細胞、特に、腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法が提供される。このような1つの態様において、前記方法は、有効量のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を個体に投与して標的細胞の溶解を誘導する工程を含む。1つの態様において、「個体」はヒトである。
【０１９９】
ある特定の態様において、治療される疾患は、増殖性障害、特にがんである。がんの非限定的な例には、膀胱がん、脳がん、頭頚部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮がん、骨がん、および腎臓がんが含まれる。本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を用いて治療することができる他の細胞増殖障害には、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺(副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺)、眼、頭頚部、神経系(中枢および末梢)、リンパ系、骨盤、皮膚、軟部組織、脾臓、胸部領域、ならびに泌尿生殖器系に位置している新生物が含まれるが、これに限定されない。前がん状態または病変部およびがん転移も含まれる。ある特定の態様において、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、および頭頚部がんからなる群より選択される。当業者であれば、多くの場合、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は治癒をもたらさない場合があり、部分的利益しかもたらさない場合があることを容易に認める。一部の態様において、いくらかの利益のある生理学的変化が治療上有益であるとみなされる。従って、一部の態様において、生理学的変化をもたらすT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の量は「有効量」または「治療的有効量」とみなされる。治療を必要とする対象、患者、または個体は典型的に哺乳動物であり、より具体的にはヒトである。
【０２００】
一部の態様において、有効量の本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子が細胞に投与される。他の態様において、疾患を治療するために、治療的有効量の本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子が個体に投与される。
【０２０１】
疾患を予防または治療する場合、(単独でまたは1種類もしくは複数種の他のさらなる治療剤と組み合わせて用いられる場合)本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の適切な投与量は、治療しようとする疾患のタイプ、投与経路、患者の体重、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のタイプ、疾患の重篤度および経過、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子が予防目的または治療目的に投与されるかどうか、以前の治療介入または同時の治療介入、患者の病歴、ならびにT細胞活性化二重特異性抗原結合分子に対する応答、ならびに主治医の裁量に左右される。投与を担当する医師は、どのような場合でも、組成物に含まれる活性成分の濃度および対象1人1人に合った適切な用量を決定するだろう。1回の投与または様々な時点にわたる複数回の投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むが、これに限定されない様々な投与計画が本明細書において意図される。
【０２０２】
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、一度に、または一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾患のタイプおよび重篤度に応じて、例えば、1回もしくは複数回の別々の投与でも、または連続注入でも、約1μg/kg〜15mg/kg(例えば、0.1mg/kg〜10mg/kg)のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、患者に投与するための初回候補投与量になり得る。前述の要因に応じて、代表的な一日量は約1μg/kg〜100mg/kg以上になるかもしれない。数日間またはそれより長い反復投与のために、状態に応じて、一般的に、疾患の症状の望ましい抑制が生じるまで治療は維持される。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の例示的な投与量の1つは約0.005mg/kg〜約10mg/kgの範囲になるだろう。他の非限定的な例において、用量は、1回の投与につき約1マイクログラム/kg体重、約5マイクログラム/kg体重、約10マイクログラム/kg体重、約50マイクログラム/kg体重、約100マイクログラム/kg体重、約200マイクログラム/kg体重、約350マイクログラム/kg体重、約500マイクログラム/kg体重、約1ミリグラム/kg体重、約5ミリグラム/kg体重、約10ミリグラム/kg体重、約50ミリグラム/kg体重、約100ミリグラム/kg体重、約200ミリグラム/kg体重、約350ミリグラム/kg体重、約500ミリグラム/kg体重〜約1000mg/kg体重以上、およびこれらから導き出せる任意の範囲を含んでもよい。本明細書において列挙された数字から導き出せる範囲の非限定的な例では、前記の数字に基づいて、約5mg/kg体重〜約100mg/kg体重、約5マイクログラム/kg体重〜約500ミリグラム/kg体重などの範囲を投与することができる。従って、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg、または10mg/kg(またはその任意の組み合わせ)の1つまたは複数の用量が患者に投与されてもよい。このような用量は、(例えば、約2〜約20用量、または、例えば、約6用量のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子が患者に与えられるように)断続的に、例えば、毎週または3週間ごとに投与されてもよい。高い初回負荷量の後に1つまたは複数の低い用量が投与されることがある。しかしながら、他の投与計画が有用な場合がある。この療法の進行は従来の技法およびアッセイによって容易にモニタリングされる。
【０２０３】
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、一般的に、意図された目的を達成するのに有効な量で用いられる。疾患状態を治療または予防するための使用の場合、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子またはその薬学的組成物は治療的有効量で投与または適用される。治療的有効量の決定は、特に、本明細書中で提供される詳細な開示を考慮すれば、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【０２０４】
全身投与の場合、最初に、治療に有効な用量をインビトロアッセイ、例えば、細胞培養アッセイから見積もることができる。次いで、動物モデルにおいて、細胞培養において求められたIC50を含む循環濃度範囲に達するように用量を処方することができる。このような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に求めることができる。
【０２０５】
当技術分野において周知の技法を用いてインビボデータ、例えば、動物モデルからも初回投与量を見積もることができる。当業者であれば、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化することができるだろう。
【０２０６】
治療効果を維持するのに十分なT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の血漿中濃度をもたらすように、投与量および間隔を個々に調節することができる。注射による投与のための通常の患者投与量は、約0.1〜50mg/kg/日、典型的には、約0.5〜1mg/kg/日である。治療に有効な血漿中濃度は、毎日、複数の用量を投与することによって達成されてもよい。血漿中濃度は、例えば、HPLCによって測定されてもよい。
【０２０７】
局所投与または選択的取り込みの場合、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効局所濃度は血漿中濃度と関連しない場合がある。当業者であれば、過度の実験なく、治療に有効な局所投与量を最適化することができるだろう。
【０２０８】
本明細書に記載の治療に有効な用量のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、一般的に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療利益を提供する。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって求めることができる。細胞培養アッセイおよび動物試験を用いて、LD50 (集団の50％を死に致らしめる用量)およびED50 (集団の50％において治療に有効な用量)を求めることができる。毒性作用と治療効果との用量比が治療指数であり、比LD50/ED50で表すことができる。高い治療指数を示すT細胞活性化二重特異性抗原結合分子が好ましい。1つの態様において、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は高い治療指数を示す。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトでの使用に適した範囲の投与量の処方において使用することができる。投与量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くなく、ED50を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、様々な要因、例えば、使用される剤形、利用される投与経路、対象の状態などに応じて、この範囲内で変動してもよい。個々の医師が、患者の状態を考慮して、正確な製剤、投与経路、および投与量を選択することができる(例えば、その全体が参照として本明細書に組み入れられる、Fingl et al., 1975, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1, p.1を参照されたい)。
【０２０９】
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子による治療を受けている患者の主治医であれば、毒性、臓器機能不全などにより、投与を止める方法、中断する方法、もしくは調節する方法、または投与を止める時、中断する時、もしくは調節する時を知っているだろう。逆に、主治医であれば、臨床応答が十分でなければ治療を高い水準まで調節することも知っているだろう(毒性は除外する)。関心対象の障害の管理における投与される用量の大きさは、治療される状態の重篤度、投与経路などによって異なる。状態の重篤度は、例えば、部分的に、標準的な予後評価方法によって評価されることがある。さらに、用量、もしかすると投与頻度も、患者1人1人の年齢、体重、および応答によって異なる。
【０２１０】
他の薬剤および治療
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、療法において1種類または複数種の他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は少なくとも1種類のさらなる治療剤と同時投与されてもよい。「治療剤」という用語は、このような治療を必要とする個体において症状または疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。このようなさらなる治療剤は、治療されている特定の適応症に適した任意の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する活性成分を含んでもよい。ある特定の態様において、さらなる治療剤は、免疫調節剤、細胞分裂阻害剤、細胞接着阻害剤、細胞傷害薬剤、細胞アポトーシスアクチベーター、またはアポトーシス誘導物質に対する細胞の感受性を高める薬剤である。特定の態様において、さらなる治療剤は、抗がん剤、例えば、微小管阻害剤、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、DNAインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスアクチベーター、または血管新生阻害剤である。
【０２１１】
このような他の薬剤は、意図された目的に有効な量で組み合わされて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の量、障害または治療のタイプ、および前記で議論された他の要因によって決まる。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、一般的に、本明細書に記載のものと同じ投与量および投与経路で、または本明細書に記載の投与量の約1〜99％、または経験的に/臨床的に適切であると確かめられた任意の投与量および任意の経路で用いられる。
【０２１２】
前記のこのような併用療法は、併用投与(2種類以上の治療剤が同じ組成物または別々の組成物に含まれる場合)および別々の投与を包含する。別々の投与の場合、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の投与は、さらなる治療剤および/もしくはアジュバントの投与の前に、さらなる治療剤および/もしくはアジュバントの投与と同時に、ならびに/またはさらなる治療剤および/もしくはアジュバントの投与の後に行うことができる。本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は放射線療法と併用することもできる。
【０２１３】
製造物品
本発明の別の局面において、前記の障害の治療、予防、および/または診断に有用な材料を含有する製造物品が提供される。製造物品は、容器および容器に貼られている、または容器に関連するラベルまたは添付文書を備える。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、注射器、IV溶液バック(IV solution bag)などが含まれる。容器はガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。容器は、状態の治療、予防、および/もしくは診断に有効な別の組成物と組み合わされた組成物、または単独の組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してもよい(例えば、容器は、静脈内溶液バックまたは皮下注射針で穴を開けることができるストッパーを有するバイアルでもよい)。組成物中の少なくとも1種類の活性薬剤は本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択された状態を治療するのに用いられることを示す。さらに、製造物品は、(a)本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物が中に入れられている第1の容器;および(b)さらなる細胞傷害剤または他の治療剤を含む組成物が中に入れられている第2の容器を備えてもよい。本発明のこの態様における製造物品は、ある特定の状態を治療するために組成物を使用することができることを示す添付文書をさらに備えてもよい。または、もしくはさらに、製造物品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、無菌注射用水(BWFI)、リン酸緩衝食塩水、リンガー液、およびデキストロース液を含む第2の(または第3の)容器をさらに備えてもよい。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、および注射器を含む、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに備えてもよい。
【０２１４】
スクリーニング方法
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を構築する目的で適切な重鎖可変領域を特定する方法のために、1種類の軽鎖またはその高度に相同な変種を用いる有利な効率が本明細書において説明される。これらの結合物質を構築するために、この軽鎖は、特異性の異なる結合部分を産生するために様々な重鎖と対になることができなければならないだけでなく、結合物質が結合するT細胞を活性化できる結合部分を形成する能力を保持することができなければならない。
【０２１５】
本明細書に記載の軽鎖は、適切な重鎖可変領域を特定するための、例えば、重鎖可変領域ライブラリーをスクリーニングすることによって特定するための共通軽鎖(CLC)として使用することができる。これは、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の標的抗原結合部分用の新たな標的抗原結合物質を特定することだけしなければならないように、以前に特定され、かつ検証されたCD3結合物質を維持することを可能にする。
【０２１６】
従って、別の局面において、本発明は、T細胞活性化抗原および標的細胞抗原に特異的な二重特異性抗原結合分子において使用するための可変重鎖を特定するための方法であって、可変重鎖と、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、およびSEQ ID NO:34のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする工程を含む、方法を提供する。1つの態様において、前記軽鎖は、SEQ ID NO:31のアミノ酸配列を含む。1つの態様において、前記軽鎖は、SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含む。この方法は、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子、例えば、CD3特異性と標的抗原特異性を有するT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の産生を改善するために、安定した、機能的な、高親和性の結合物質を開発するのに使用することができる。この場合、標的抗原は無関係の抗原、例えば、FolR1、MUC1、およびBCMAである。
【実施例】
【０２１７】
以下は本発明の方法および組成物の例である。前記で概要が示されていれば、様々な他の態様が実施され得ることが理解される。
【０２１８】
一般的方法
組換えDNA法
Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載のように、DNAを操作するために標準的な方法を使用した。分子生物学用試薬を製造業者の説明書に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91-3242に示されている。
【０２１９】
DNA配列決定
Synergene(Schlieren)の標準的な二本鎖配列決定によってDNA配列を決定した。
【０２２０】
遺伝子合成
必要に応じて、望ましい遺伝子セグメントが、適切なテンプレートを用いてPCRによって作製されたか、またはGeneart AG(Regensburg, Germany)によって自動遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチドおよびPCR産物から合成された。正確な遺伝子配列を入手できなかった場合、オリゴヌクレオチドプライマーを、最も近いホモログからの配列に基づいて設計した。遺伝子を、適切な組織に由来するRNAからRT-PCRによって単離した。独特の制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接する遺伝子セグメントを標準的なクローニング/配列決定ベクターにクローニングした。形質転換された細菌からプラスミドDNAを精製し、濃度をUV分光法によって求めた。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列をDNA配列決定によって確認した。遺伝子セグメントを、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にする適切な制限部位が備わった設計にした。全ての構築物を、真核細胞においてタンパク質を分泌するように向けるリーダーペプチドをコードする5'末端DNA配列が備わった設計にした。
【０２２１】
PBMCからの初代ヒトpanT細胞の単離
地元の血液バンクから入手した濃縮リンパ球調製物(バフィーコート)または健常ヒトドナーに由来する新鮮な血液から末梢血単核球(PBMC)をHistopaque密度遠心分離によって調製した。簡単に述べると、血液を滅菌PBSで希釈し、注意深くHistopaque 勾配(Sigma, H8889)の上に層状に積み重ねた。450xgで室温で30分間、遠心分離した後に(ブレーキのスイッチをオフにした)、中間期(interphase)を含有するPBMCの上にある血漿の一部を捨てた。PBMCを新たな50ml Falconチューブに移し、チューブをPBSで総体積50mlまで満たした。混合物を400xg、室温で10分間、遠心分離した(ブレーキのスイッチをオンにした)。上清を捨て、PBMCペレットを滅菌PBSで2回洗浄した(350xg、4℃で10分間の遠心分離工程)。結果として生じたPBMC集団を自動計数し(ViCell)、10％FCSおよび1％L-アラニル-L-グルタミン(Biochrom, K0302)を含有するRPMI1640培地に溶解し、アッセイ開始までインキュベーターに入れて37℃、5％CO2で保管した。
【０２２２】
PBMCからのT細胞濃縮は、Pan T Cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotec #130-091-156)を用いて製造業者の説明書に従って行った。簡単に述べると、細胞ペレットを、1x107細胞あたり40μlの冷緩衝液 (0.5％BSA、2mM EDTAを含むPBS。濾過滅菌済み)で希釈し、1x107細胞あたり10μlのビオチン-抗体カクテルと4℃で10分間インキュベートした。1x107細胞あたり30μlの冷緩衝液および20μlの抗ビオチン磁気ビーズを添加し、混合物をさらに15分間、4℃でインキュベートした。現体積の10〜20xを添加することによって細胞を洗浄し、その後に、300xgで10分間、遠心分離工程を行った。1x108個までの細胞を500μlの緩衝液に再懸濁した。非標識ヒトpanT細胞の磁気分離を、LSカラム(Miltenyi Biotec #130-042-401)を用いて製造業者の説明書に従って行った。結果として生じたT細胞集団を自動計数し(ViCell)、AIM-V培地に溶解し、アッセイ開始までインキュベーターに入れて37℃、5％CO2で保管した(24時間未満)。
【０２２３】
PBMCからの初代ヒトナイーブT細胞の単離
地元の血液バンクから入手した濃縮リンパ球調製物(バフィーコート)または健常ヒトドナーに由来する新鮮な血液から末梢血単核球(PBMC)をHistopaque密度遠心分離によって調製した。PBMCからのT細胞濃縮は、Miltenyi BiotecのNaive CD8+ T cell isolation Kit(#130-093-244)を用いて製造業者の説明書に従って行ったが、CD8+T細胞の最後の単離工程を省いた(初代ヒトpanT細胞の単離についての説明も参照されたい)。
【０２２４】
脾細胞からのマウスpanT細胞の単離
脾臓をC57BL/6マウスから分離し、MACS緩衝液(PBS+0.5％BSA+2mM EDTA)を含有するGentleMACS C-チューブ(Miltenyi Biotech #130-093-237)に移し、製造業者の説明書に従ってGentleMACS Dissociatorで解離してシングル細胞懸濁液を得た。残存している解離しなかった組織粒子を除去するために、細胞懸濁液をプレセパレーション(pre-separation)フィルターに通した。400xg、4℃で4分間、遠心分離した後に、赤血球を溶解するためにACK溶解緩衝液を添加した(室温で5分間のインキュベーション)。残存している細胞をMACS緩衝液で2回洗浄し、計数し、マウスpanT細胞の単離に使用した。負の(磁気)選択を、Miltenyi BiotecのPanT Cell Isolation Kit(#130-090-861)を用いて製造業者の説明書に従って行った。結果として生じたT細胞集団を自動計数し(ViCell)、すぐに、さらなるアッセイに使用した。
【０２２５】
ヘパリン添加血液からの初代カニクイザルPBMCの単離
以下の通りに、健常なカニクイザルドナーに由来する新鮮な血液から末梢血単核球(PBMC)を密度遠心分離によって調製した。ヘパリン添加血液を滅菌PBSで1:3に希釈し、Lymphoprep培地(Axon Lab #1114545)を滅菌PBSで90％まで希釈した。2体積の希釈血液を1体積の希釈密度勾配の上に層状に積み重ねた。ブレーキなしで、PBMC画分を520xg、室温で30分間、遠心分離によって分離した。PBMCバンドを新しい50ml Falconチューブに移し、遠心分離によって滅菌PBSで400xg、4℃で10分間、洗浄した。血小板を除去するために低速遠心分離(150xg、4℃で15分間)を1回、行い、結果として生じたPBMC集団を自動計数し(ViCell)、さらなるアッセイのために、すぐに使用した。
【０２２６】
例示的な抗原作製
抗原は2つの異なるバージョンで発現される。非Fc含有構築物の場合、細胞外ドメインを、そのC末端に取り付けたavi-Hisタグと融合する。Fc含有抗原の場合、Fc二量体1つにつき関心対象のタンパク質分子が1つしかないように、ノブイントゥホール技術を用いて、ヘテロ二量体Fc部分のN末端とのFc融合を適用する(Merchant et al.)。これは、関心対象のタンパク質のあらゆる人工二量体構造の形成を回避するために行われる。この場合、aviタグをFcのC末端に取り付ける。これらのタンパク質は、HEKまたはCHOのような哺乳動物細胞において容易に一過性発現させ、プロテインAクロマトグラフィーを介して精製し、ビオチン化することができ、ファージ選択のために、標準的な方法に従ってビオチン化aviタグを介してストレプトアビジンビーズに取り付けることができる。
【０２２７】
親和性成熟
CLC-ライブラリーから生じたFab断片の親和性成熟は、CD3e結合親和性が保たれるように軽鎖を変えずに保つために、重鎖だけに限定されなければならない。本発明者らの初回ライブラリーは重鎖CDR3にしか無作為化されないので、本発明者らは、成熟工程についてはCDR1および2に焦点を合わせる。このために、本発明者らは、それぞれのフレームワークについて、CDR1およびCDR2の中に別々に無作為化を導入するPCRプライマーを設計する。それぞれのプライマーは、6つの重鎖フレームワークの1つに結合するように設計され、その特定のファージライブラリーから生じた、それぞれの抗体クローンに対して、包括的なやり方で使用することができる。成熟プロセスは、KnappikまたはSteidl(Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86). S. Steidl et al.; Molecular Immunology 46 (2008) 135-144)に記載のように行われる。ファージパニングは、可溶性抗原の濃度が2x10^-8Mで用いられ、2x10^-10Mの最終濃度まで低下した点で異なるが、前記のように行われる。
【０２２８】
CLC TCBのクローニング、産生、精製、および生化学的特徴付け
結果として生じた、重鎖DNA配列および軽鎖DNA配列の可変領域を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入した定常重鎖または定常軽鎖とインフレームでサブクローニングする。MPSVプロモーターによって抗体を発現させる。合成ポリAシグナル配列はCDSの3’末端に位置する。さらに、各ベクターは、HEK293-EBNA細胞における一過的性発現のためにEBV OriP配列を含有する。抗体アイソタイプとしてIgG1 P329G LALAまたはIgG4 SPLE PGを使用する。
【０２２９】
CLC TCBを、ポリエチレンイミンを用いてHEK293-EBNA細胞を哺乳動物発現ベクターでコトランスフェクトすることによって産生する。前記細胞を、1:1:3比(「ベクター重鎖Fc(ホール)」:「ベクター重鎖Fc(ノブ)-FabCrossfab」):「ベクター共通軽鎖」の対応する発現ベクターでトランスフェクトする。
【０２３０】
トランスフェクションのために、HEK293 EBNA細胞を無血清CD CHO培養培地中で懸濁培養する。500ml振盪フラスコ中で産生するために、トランスフェクションの24時間前に、4億個のHEK293 EBNA細胞を播種する。トランスフェクションのために、細胞を210xgで5分間、遠心分離し、上清を、予め温めた20mlのCD CHO培地と交換する。発現ベクターを200gのDNAの最終量まで20mlのCD CHO培地中で混合する。540μlのPEIを添加した後に、溶液を15秒間混合し、その後に、室温で10分間インキュベートする。その後、細胞をDNA/PEI溶液と混合し、500ml振盪フラスコに移し、5％CO2雰囲気のインキュベーターに入れて37℃で3時間インキュベートする。インキュベーション期間の後、160mlのF17培地を添加し、細胞を24時間、培養する。トランスフェクションの1日後に、1mMバルプロ酸および7％Feed1を添加する。7日間、培養した後、精製のために210xgで15分間、遠心分離することによって上清を収集する。溶液を濾過滅菌(0.22μmフィルター)し、最終濃度0.01％w/vのアジ化ナトリウムを添加し、4℃に保つ。
【０２３１】
プロテインAを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって、細胞培養上清から分泌タンパク質を精製する。上清を、40mlの20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、pH7.5で平衡化したHiTrap ProteinA HPカラム(CV=5mL, GE Healthcare)にロードする。少なくとも10カラム体積の20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、pH7.5で洗浄することによって、結合しなかったタンパク質を除去する。20カラム体積の20mMクエン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、pH7.5から20mMクエン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、pH2.5にわたる勾配の間に、標的タンパク質を溶出させる。1/10の0.5Mリン酸ナトリウム、pH8を添加することによって、タンパク質溶液を中和する。標的タンパク質を濃縮および濾過した後に、pH6.0の20mMヒスチジン、140mM塩化ナトリウム溶液で平衡化したHiLoad Superdex 200カラム(GE Healthcare)にロードする。
【０２３２】
精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光率を用いて280nmでの光学密度(OD)を測定することによって求める。
【０２３３】
分子の純度および分子量は、還元剤の存在下および非存在下でのCE-SDS分析によって分析する。Caliper LabChip GXIIシステム(Caliper lifescience)を製造業者の説明書に従って使用する。分析のために2ugの試料を使用する。
【０２３４】
抗体試料の凝集物含有率は、25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-アルギニン一塩酸塩、0.02％(w/v)NaN3、pH6.7のランニングバッファーに溶解してTSKgel G3000 SW XL分析用サイズ排除カラム(Tosoh)を用いて25℃で分析する。
【０２３５】
細胞に基づくアッセイにおけるCLC TCBの特徴付け
CLC TCBとECD腫瘍抗原発現細胞およびCD3発現細胞との結合
関心対象の抗原Xを発現する腫瘍細胞と、CD3e発現不死化Tリンパ球株(ジャーカット)を用いて、CLC TCBの結合を試験する。簡単に述べると、細胞を回収し、計数し、生存率について調べ、FACS緩衝液(100μl PBS 0.1％BSA)に2x106細胞/mlで再懸濁する。100μlの細胞懸濁液(0.2x106細胞を含有する)を丸底96ウェルプレートに入れて、漸増濃度のCLC TCB(3pM〜200nM)と4℃で30分間インキュベートし、冷PBS 0.1％BSAで2回洗浄し、PE結合AffiniPure F(ab')2断片ヤギ抗ヒトIgG Fcg断片特異的二次抗体(Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170)と4℃でもう30分間、再インキュベートし、冷PBS 0.1％BSAで2回洗浄し、すぐに、DAPI陰性生細胞をゲーティングすることによって、FACS CantoII(Software FACS Diva)を用いたFACSによって分析する。GraphPadPrism5を用いて結合曲線を得る。
【０２３６】
実施例1
ビオチン化葉酸受容体-Fc融合の精製
ヒトFolR1に対する新たな抗体を作製するために、以下の抗原およびスクリーニングツールを一価Fc融合タンパク質(Fc-ホール分子と同時発現させた、Fc-ノブのヒンジ領域に連結した抗原の細胞外ドメイン)として作製した。GenBankまたはSwissProtから入手した配列に基づいて抗原遺伝子を合成し(Geneart, Regensburg, Germany)、発現ベクターに挿入して、インビボビオチン化用またはインビトロビオチン化用のC末端Aviタグを有するFc-ノブとの融合タンパク質を作製した。産生中に、細菌ビオチンリガーゼをコードする細菌birA遺伝子を同時発現させることによって、インビボビオチン化を成し遂げた。全遺伝子の発現は、EBNAを含有する細胞株においてプラスミドを安定して維持するためのoriPエレメントを含有するプラスミド上でキメラMPSVプロモーターの制御下にあった。
【０２３７】
ビオチン化単量体抗原/Fc融合分子を調製するために、指数関数的に増殖している懸濁HEK293 EBNA細胞を、融合タンパク質の2つの成分(ノブ鎖およびホール鎖)ならびにビオチン化反応に必要な酵素であるBirAをコードする3つのベクターでコトランスフェクトした。対応するベクターを9.5:9.5:1の比(「抗原ECD-Fcノブ-aviタグ」:「Fcホール」:「BirA」)で使用した。
【０２３８】
500ml振盪フラスコ中でタンパク質を産生するためにトランスフェクションの24時間前に、4億個のHEK293 EBNA細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を210gで5分間、遠心分離し、上清を、予め温めたCD CHO培地と交換した。発現ベクターを200μgのベクターDNAを含有するCD CHO培地20mLに再懸濁した。540μlのポリエチレンイミン(PEI)を添加した後に、溶液を15秒間混合し、室温で10分間インキュベートした。その後、細胞をDNA/PEI溶液と混合し、500ml振盪フラスコに移し、5％CO2雰囲気のインキュベーターに入れて37℃で3時間インキュベートした。インキュベーション後、160mlのF17培地を添加し、細胞を24時間、培養した。トランスフェクションの1日後に、1mMバルプロ酸および7％Feed1(Lonza)を培養物に添加した。産生培地に100μMビオチンも加えた。7日間、培養した後、細胞を210gで15分間、遠心沈殿することによって細胞上清を収集した。溶液を濾過滅菌(0.22μmフィルター)し、最終濃度0.01％(w/v)までアジ化ナトリウムを加え、4℃に保った。
【０２３９】
プロテインAを用いたアフィニティクロマトグラフィーに続いてサイズ排除クロマトグラフィーを行うことによって、細胞培養上清から分泌タンパク質を精製した。アフィニティクロマトグラフィーの場合、上清を、40mLの20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム、pH7.5で平衡化したHiTrap ProteinA HPカラム(CV=5mL, GE Healthcare)にロードした。少なくとも10カラム体積の20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウムpH7.5で洗浄することによって、結合しなかったタンパク質を除去した。20カラム体積の20mMクエン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウム、100mMグリシン、pH3.0にわたって作り出した直線pH勾配を用いて、結合したタンパク質を溶出させた。次いで、10カラム体積の20mMクエン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウム、100mMグリシン、pH3.0を用いて、カラムを洗浄した。
【０２４０】
収集した画分のpHを、1/10(v/v)の0.5Mリン酸ナトリウム、pH8.0を添加することによって調整した。タンパク質を濃縮および濾過した後に、20mMヒスチジン、140mM塩化ナトリウム、pH6.0で平衡化したHiLoad Superdex 200カラム(GE Healthcare)にロードした。
【０２４１】
タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光率を用いて280nmでの光学密度(OD)を測定することによって求めた。FolR1-Fc融合の純度および分子量は、製造業者の説明書(instrument Caliper LabChipGX, Perkin Elmer)に従って、還元剤の存在下および非存在下でのSDSキャピラリー電気泳動によって分析した。試料の凝集物含有率は、25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-アルギニン一塩酸塩、0.02％(w/v)NaN3、pH6.7のランニングバッファーで平衡化したTSKgel G3000 SW XL分析用サイズ排除カラム(Tosoh)を用いて25℃で分析した。
【０２４２】
抗原の正しい、かつ天然のコンホメーションを確かめるために、精製した抗原-Fc融合タンパク質を、市販の抗体を用いた表面プラズモン共鳴アッセイによって分析した(データは示さず)。
【０２４３】
(表１)ヒトFolR1抗体を単離、選択、およびカウンターセレクションするために産生した抗原
2018504092.tif 000003
【０２４４】
(表２)FolR-Fc融合の収率および最終単量体含有率の概要
2018504092.tif 000004
【０２４５】
実施例2
CD3ε特異性をもつ共通軽鎖の作製
本明細書に記載のT細胞活性化二重特異性分子は少なくとも1つのCD3結合部分を含む。この部分は、実験動物を免疫し、ファージライブラリーをスクリーニングするか、または公知の抗CD3抗体を用いることによって作製することができる。マウス親抗CD3ε抗体(CH2527)の軽鎖をヒト化することによって、CD3ε特異性をもつ共通軽鎖を作製した。非ヒト起源の抗体をヒト化する場合、非ヒト抗体(ドナー)に由来するCDR残基をヒト(アクセプター)抗体のフレームワークに移植しなければならない。一般的に、ドナーと、可能性のあるアクセプター配列の収集物をそろえ、ドナーに対して妥当な相同性をもつか、または構造および活性に重要ないくつかの一部において類似のアミノ酸を示すものを選択することによって、アクセプターフレームワーク配列を選択する。この場合、親抗体のマウスVL-ドメイン配列とヒト生殖系列配列の収集物をそろえ、高い配列同一性を示したヒト配列を選択することによって、抗体アクセプターフレームワークを検索した。驚いたことに、フレームワーク配列相同性の点での良好な一致は、λタイプのV-ドメインファミリー7に属するかなり珍しいヒト軽鎖、もっと正確に言うと、hVL_7_46(IMGT命名法、GenBank Acc No.Z73674)において見出された。その後に、CH2527軽鎖をヒト化するためのアクセプターフレームワークとして、この珍しいヒト軽鎖を選択した。このアクセプターフレームワークに、マウス軽鎖可変ドメインの3つの相補性決定領域(CDR)をつないだ。フレームワーク4領域は生殖系列V遺伝子の可変領域の一部ではないので、この領域(J-エレメント)のアラインメントを個別に行った。従って、この軽鎖をヒト化するためにIGLJ3-02配列を選択した。13種類のヒト化変種を作製した(CH2527-VL7_46-1〜VL7_46-10、VL7_46-12〜VL7_46-14)。これらは、マウスV-ドメイン配列に復帰突然変異したフレームワーク残基(およびその組み合わせ)の点で、またはヒト生殖系列配列と同一に保つことができたCDR残基(Kabat定義)の点で異なる。最終ヒト化VL-ドメイン変種VL7_46-13(列挙したマウス残基)では、CDRの外側にある以下のフレームワーク残基をマウス残基:それぞれ、V36、E38、F44、G46、G49、およびG57に復帰突然変異させた。ヒトJ-エレメントIGLJ3-02はマウス親抗体のJ-エレメントと100％同一であった。
【０２４６】
実施例3
CD3ε特異性をもつヒト化変種のSPR評価
ヒト化VL変種を2+1古典的形式でキメラとして評価した(図1D)。すなわち、ヒト化軽鎖V-ドメインをマウス重鎖V-ドメインと対にした。ProteOn XPR36計器(Bio-Rad)を用いてSPR評価を行った。もっと正確に言うと、抗Fab誘導体化GLMセンサーチップ(ヤギ抗ヒトIgG、F(ab')2断片特異的, Jackson ImmunoResearch)上に、垂直方向に、培養上清から直接、変種を捕捉した。その後に、ヒトCD3εおよびカニクイザルCD3εとの結合を評価するために、以下の分析物: それぞれ、3μMのhu CD3ε(-1-26)-Fc(ノブ)-avi(ID807)および2.5μMのcy CD3ε-(-1-26)-Fc(ノブ)-Avi-Fc(ホール)(ID873)を1種類の濃縮物として水平に注入した。結合応答をマウス対照構築物の結合と定性的に比較し、+(同等の結合が観察された)、+/-(結合低下が観察された)、および-(結合が観察されなかった)と段階評価した。リガンド捕捉および分析物結合のサイクルが終わるたびに捕捉用抗体を再生し、捕捉表面の活性を確かめるために、研究の終わりにマウス構築物を再注入した。結果を表3にまとめた。
【０２４７】
(表３)CH2527のマウス重鎖と組み合わせたヒト化軽鎖変種のSPRに基づく定性結合評価。太字で強調した、最終的に選択されたヒト化軽鎖変種、CH2527-VL7_46-13だけがヒトCD3εおよびカニクイザルCD3εと同等の結合を示した。
2018504092.tif 000005
【０２４８】
実施例4
CD3ε特異性をもつヒト化共通軽鎖の特性
ヒト化リード分子用に選択した軽鎖V-ドメイン変種はVL7_46-13である。ヒト化(humanness)の程度、すなわち、ヒト生殖系列V-ドメイン配列に対するヒト化V-ドメインの配列相同性を求めた。VL_7_46-13の場合、最も近いヒト生殖系列ホモログとの全配列同一性はヒト化前には65％であり、ヒト化後では80％である。CDR領域を省くと、最も近いヒト生殖系列ホモログに対する配列同一性は92％である。表3から分かるように、VL7_46-13は、1パネル13種類の変種のうち、親マウス抗体に対して同等の結合を示し、カニクイザルCD3εとの交差反応性も保持していた唯一のヒト化VL変種である。この結果から、CD3εに対する結合親和性を失うことなくマウスVL-ドメインをヒト化することは些細なことではなかったことが分かる。CDR1にG24を保持しながら、マウスフレームワーク残基(特にG46)に対する、いくつかの復帰突然変異が必要だったことが分かる。さらに、この結果から、VL-ドメインは標的認識に重要な役割を果たしていることが分かる。重要なことに、λタイプのV-ドメインファミリー7に属する珍しいヒト生殖系列に基づいており、かつCD3εに対する親和性および特異性を保持しているヒト化VL-ドメインVL7_46-13はまた、Fab形式のファージディスプレイ抗体ライブラリーにおいて共通軽鎖として用いられるのに適しており、CD3εと、例えば、腫瘍標的に結合し、同じ「共通」軽鎖を共有する二重特異性分子の作製および産生をかなり楽にする、新規の特異性の首尾良い選択を可能にする。
【０２４９】
実施例5
HVK1-39に由来するヒト生殖細胞系列共通軽鎖を用いたファージディスプレイ抗体ライブラリーの作製
完全長ヒトIgGに似た二重特異性抗体を作製する、いくつかのアプローチでは、2つの別個の重鎖のヘテロ二量体化を誘導するFc領域改変を利用する。このような例には、ノブイントゥホール(Merchant et al., Nat Biotechnol. 1998 Jul;16(7):677-81)、SEED (Davis et al., Protein Eng Des Sel. 2010 Apr;23(4): 195-202)、および静電ステアリング(electrostatic steering)技術(Gunasekaran et al., J Biol Chem. 2010 Jun 18;285(25):19637-46)が含まれる。これらのアプローチは2つの別個の重鎖を効果的にヘテロ二量体化することができるが、コグネイト軽鎖および重鎖を適切に対にすることは、依然として問題である。共通軽鎖(LC)の使用は、この問題を解決することができる(Merchant, et al. Nat Biotech 16, 677-681(1998))。
【０２５０】
ここでは、本発明者らは、M13ファージ上にディスプレイするための抗体ライブラリーの作製を説明する。本質的に、本発明者らは、1種類の定常(または「共通」)軽鎖をもつ重鎖のマルチフレームワークライブラリーを設計した。このライブラリーは、軽鎖の誤対合を避けるために高度な技術を用いる必要なく、多重特異性抗体を作製するために設計されている。
【０２５１】
共通軽鎖を用いることによって、誤対合がこれ以上起こらず、高純度の二重特異性抗体の単離が容易になるので、これらの分子の産生を容易にすることができる。他の形式と比較して、例えば、scFv断片を使用するのとは対照的に、基本要素としてFab断片を使用すると熱安定性が大きくなり、scFv凝集および分子間scFv形成が無くなる。
【０２５２】
ライブラリー作製
以下では、M13ファージ上にディスプレイするための抗体ライブラリーの作製を説明する。本質的に、本発明者らは、1種類の定常(または「共通」)軽鎖をもつ重鎖のマルチフレームワークライブラリーを設計した。
【０２５３】
本発明者らは、ライブラリーの中で、これらの重鎖(括弧内にGenBankアクセッション番号):
IGHV1-46＊01(X92343),(SEQ ID NO:104)
IGHV1-69＊06(L22583),(SEQ ID NO:105)
IGHV3-15＊01(X92216),(SEQ ID NO:106)
IGHV3-23＊01(M99660),(SEQ ID NO:107)
IGHV4-59＊01(AB019438),(SEQ ID NO:108)
IGHV5-51＊01(M99686),(SEQ ID NO:109)
を使用した。
【０２５４】
IGHJ6配列を用いるIGHV1-69*06を除く全重鎖が、J-エレメントとしてIGHJ2を使用する。無作為化の設計には、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含めた。CDR-H1およびCDR-H2については、「ソフトな(soft)」無作為化戦略を選択した。無作為化オリゴヌクレオチドは、生殖細胞系列配列のアミノ酸のコドンが50％存在するようなオリゴヌクレオチドであった。システインを除く他の全てのアミノ酸は合計すると、残りの50％になる。遺伝子D-エレメントが存在するために生殖細胞系列アミノ酸が存在しないCDR-H3では、V-エレメントとJ-エレメントとの間に長さが4〜9アミノ酸の無作為化インサートの使用を可能にするオリゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチドを無作為化部分に含めた。3アミノ酸G/Y/Sはそれぞれ15％まで存在し、アミノ酸A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/Eはそれぞれ4,6％まで存在する。
【０２５５】
抗体ライブラリーを作製するための例示的な方法は、Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-13; Lee et., al J. Mol. Biol.(2004) 340, 1073-1093に記載されている。
【０２５６】
軽鎖はヒト配列hVK1-39に由来し、改変せず、無作為化することなく使用する。これにより、これ以上改変することなく、他のプロジェクトに同じ軽鎖を使用できることが確かなものになる。
【０２５７】
例示的なライブラリー選択:
全ての親和性成熟ライブラリーを用いた選択を、以下の手順に従って、標的抗原Xの単量体の、かつビオチン化された細胞外ドメインを用いて溶解状態で行う。
1. 各ライブラリーの10^12個のファージミド 粒子を100nM ビオチン化可溶性抗原に総体積1mlで0.5時間、結合させる。2.ビオチン化抗原を捕捉し、約5x10^7個のストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを10分間、添加することによって、特異的に結合したファージ粒子を単離する。3.5〜10x1mlのPBS/Tween20および5〜10x1mlのPBSを用いてビーズを洗浄する。4.1mlの100mM TEA(トリエチルアミン)を添加することによってファージ粒子を10分間、溶出させ、500ulの1M Tris/HCl pH7.4を添加することによって中和する。5.指数関数的に増殖している大腸菌TG1細菌への再感染、ヘルパーファージVCSM13の感染、その後の、ファージミド粒子のPEG/NaCl沈殿を後の選択回において適用する。選択は、一定の、または漸減(10^-7M〜2x10^-9M)抗原濃度のいずれかを用いて3〜5回以上行う。2回目には、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレートを用いて抗原:ファージ複合体を捕捉する。抗体とプラスチック支持体との単なる粘着性の結合から生じた望ましくないクローンにおいて競合するために、全ての結合反応物に100nMウシ血清アルブミンまたは脱脂粉乳を加える。
【０２５８】
選択は、100nMから始まって、最後の選択回では5nMまで低下する漸減抗原濃度の抗原を用いて3回または4回以上行う。特異的結合物質は、バックグラウンドより約5倍大きいシグナルと定義され、ELISAによって特定される。以下の通りに、ELISAによって特異的結合物質を特定する。1ウェルあたり100μlの10nMビオチン化抗原をニュートラアビジンプレート上にコーティングする。Fab含有細菌上清を添加し、抗Flag/HRP二次抗体を用いることによってFlagタグを介して、結合しているFabを検出する。ELISA陽性クローンを96ウェル形式で可溶性Fab断片として細菌により発現させ、ProteOn XPR36(BioRad)を用いたSPR分析によって上清を反応速度スクリーニング実験に供する。親和定数が最も高いFabを発現するクローンを特定し、対応するファージミドを配列決定する。さらに特徴付けるために、Fab配列をファージミドからPCR増幅し、哺乳動物産生のために適切な制限部位を介してヒトIgG1発現ベクターに入れてクローニングする。
【０２５９】
ヒト化CD3ε特異的共通軽鎖を用いたファージディスプレイ抗体ライブラリーの作製
ここでは、M13ファージ上にディスプレイするための抗体ライブラリーの作製を説明する。本質的に、本発明者らは、1種類の定常(または「共通」)軽鎖をもつ重鎖のマルチフレームワークライブラリーを設計した。このライブラリーは、IgG1 P329G LALAまたはIgG4 SPLE PGアイソタイプの、Fcを含有するが、FcgR結合に不活性なT細胞二重特異性抗体を作製するために設計された。このT細胞二重特異性抗体の中にある1つまたは2つのFabは、腫瘍細胞上に発現している腫瘍表面抗原を認識するのに対して、抗体の残りのFabアームは、T細胞上にあるCD3eを認識する。
【０２６０】
ライブラリー作製
以下では、M13ファージ上にディスプレイするための抗体ライブラリーの作製を説明する。本質的に、本発明者らは、1種類の定常(または「共通」)軽鎖をもつ重鎖のマルチフレームワークライブラリーを設計した。このライブラリーは、IgG1 P329G LALAまたはIgG4 SPLE PGアイソタイプの、Fcを含有するが、FcgR結合に不活性なT細胞二重特異性抗体を作製するためだけに設計された。
【０２６１】
無作為化オリゴヌクレオチドを介して、様々な重鎖のCDR3にだけ多様性を導入した。抗体ライブラリーを作製するための方法は当技術分野において周知であり、(Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-13またはLee et., al J. Mol. Biol. (2004) 340, 1073-1093)に記載されている。
【０２６２】
本発明者らは、ライブラリーの中で、これらの重鎖:
IGHV1-46＊01(X92343),(SEQ ID NO:104)
IGHV1-69＊06(L22583),(SEQ ID NO:105)
IGHV3-15＊01(X92216),(SEQ ID NO:106)
IGHV3-23＊01(M99660),(SEQ ID NO:107)
IGHV4-59＊01(AB019438),(SEQ ID NO:108)
IGHV5-51＊01(M99686),(SEQ ID NO:109)
を使用した。
【０２６３】
本発明者らは、ライブラリーにある、ヒトおよびカニクイザルのCD3εに特異的なヒト化された抗体CH2527に由来する軽鎖:(VL7_46-13; SEQ ID NO:112)を使用した。様々な二重特異性結合物質との適合性を確かなものにするために、この軽鎖を無作為化せず、これ以上改変することなく使用した。
【０２６４】
IGHJ6配列を用いるIGHV1-69*06を除く全ての重鎖がJ-エレメントとしてIGHJ2を使用する。無作為化の設計はCDR-H3にのみ焦点を合わせた。V-エレメントとJ-エレメントとの間に長さが4〜9アミノ酸の無作為化インサートの使用を可能にするPCRオリゴヌクレオチドを設計した。
【０２６５】
実施例6
FolR1に対する共通軽鎖ライブラリー(CD3ε特異性をもつ軽鎖を含む)からの抗体断片の選択
CD3ε特異性をもつ共通軽鎖VL7_46-13を含む、抗体16A3、15A1、18D3、19E5、19A4、15H7、15B6、16D5、15E12、21D1、16F12、21A5、21G8、19H3、20G6、および20H7を、様々な種(ヒト、カニクイザル、およびマウス)のFolR1に対するファージディスプレイ選択によって得た。クローン16A3、15A1、18D3、19E5、19A4、15H7、15B6、21D1、16F12、19H3、20G6、および20H7は、共通軽鎖が、ヒト生殖系列VH1_46に基づく重鎖レパートリーと対になったサブライブラリーから選択された。このサブライブラリーの中にあるVH1_46のCDR3は6つの異なるCDR3長に基づいて無作為化されている。クローン16D5、15E12、21A5、および21G8は、共通軽鎖が、ヒト生殖系列VH3_15に基づく重鎖レパートリーと対になったサブライブラリーから選択された。このサブライブラリーの中にあるVH3_15のCDR3は6つの異なるCDR3長に基づいて無作為化されている。種交差反応性(またはマウスFolR1反応性)抗体を得るためには、3回のバイオパニングにわたって、異なる種のFolR1を異なるやり方で交互に入れ替えた(または一体に保った):16A3および15A1(ヒト-カニクイザル-ヒトFolR1);18D3(カニクイザル-ヒト-マウスFolR1);19E5および19A4(マウスFolR1に対して3回);15H7、15B6、16D5、15E12、21D1、16F12、21A5、21G8(ヒト-カニクイザル-ヒトFolR1);19H3、20G6、および20H7(マウスFolR1に対して3回)。
【０２６６】
ファージディスプレイ選択用ならびにELISAおよびSPRに基づくスクリーニング用の抗原として、ヒトFolR1、マウスFolR1、およびカニクイザルFolR1をHEK EBNA細胞においてN末端単量体Fc融合として一過性発現させ、受容体鎖を運ぶFc部分(Fcノブ鎖)のC末端に位置するaviタグ認識配列において、BirAビオチンリガーゼの同時発現を介してインビボで部位特異的にビオチン化した。FolR1に対する特異性を評価するために、2つの関連受容体であるヒトFolR2およびFolR3を同じやり方で作製した。
【０２６７】
選択回(バイオパニング)を以下のパターンに従って溶解状態で行った。
1.抗原のFc部分を認識する抗体ライブラリーを枯渇させるために、10ug/mlの無関係のヒトIgGでコーティングしたmaxisorpプレート上で約1012個のファージミド粒子をプレクリア(pre-clear)する。
2.Fc結合物質をさらに枯渇させるために、100nMの無関係の非ビオチン化Fcノブイントゥホール構築物の存在下で、Fcに結合しなかったファージミド粒子を100nMのビオチン化ヒトFolR1、ビオチン化カニクイザルFolR1、またはビオチン化マウスFolR1と総体積1mlで0.5時間インキュベートする。
3.ニュートラアビジンでプレコーティングしたマイクロタイタープレートの4個のウェルに移すことによって、ビオチン化FolR1と、取り付けられた特異的に結合しているファージを10分間、捕捉する(1回目および3回目)。
4.5xPBS/Tween20および5xPBSを用いて、それぞれのウェルを洗浄する。
5. 1ウェルあたり250ulの100mM TEA(トリエチルアミン)を添加することによってファージ粒子を10分間、溶出させ、4個のウェルからプールした溶出液に500ulの1M Tris/HCl pH7.4を添加することによって中和する。
6.Fc結合物質および非特異的結合物質を最終除去するために、ニュートラアビジンでプレコーティングしたマイクロタイタープレート上で、ビオチンで捕捉された100nMのFolR2またはFolR3とインキュベートすることによって、中和された溶出液をポストクリアする。
7.対数期大腸菌TG1細胞に、溶出されたファージ粒子の上清を再感染させ、ヘルパーファージVCSM13を感染させ、シェーカーに載せて30℃で一晩インキュベートし、その後に、次の選択回において使用するファージミド粒子をPEG/NaCl沈殿する。
【０２６８】
選択は、100nMの一定の抗原濃度を用いて3回以上行った。2回目では、ニュートラアビジンに対する結合物質の濃縮を回避するために、5.4x107個のストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを添加することによって抗原:ファージ複合体を捕捉した。以下の通りに、ELISAによって特異的結合物質を特定した。100ulの25nMビオチン化ヒトFolR1、ビオチン化カニクイザルFolR1、またはビオチン化マウスFolR1をニュートラアビジンプレート上にコーティングし、10ug/mlヒトIgGをmaxisorpプレート上にコーティングした。Fab含有細菌上清を添加し、抗Flag/HRP二次抗体を用いてFlagタグを介して、結合しているFabを検出した。ヒトFolR1にはシグナルを示し、ヒトIgGには陰性であったクローンを、さらなる分析のために最終候補リストに載せ、残りの2種のFolR1に対しても同様に試験した。これらを0.5リットル培養体積で細菌により発現させ、アフィニティ精製し、BioRadのProteOn XPR36バイオセンサーを用いたSPR分析によって、さらに特徴付けた。
【０２６９】
選択されたクローンの親和性(KD)は、ProteOn XPR36計器(Biorad)と、ニュートラアビジン捕捉によってNLCチップに固定化したビオチン化したヒトFolR1、カニクイザルFolR1、およびマウスFolR1ならびにヒトFolR2およびFolR3(負の対照)を用いて表面プラズモン共鳴(SPR)によって25℃で測定した。抗原(リガンド)の固定化:組換え抗原をPBST(10mMリン酸、150mM塩化ナトリウムpH7.4、0.005％Tween20)で10μg/mlまで希釈し、次いで、垂直方向に30μl/分で注入した。分析物の注入:「one-shot kinetics」測定の場合、注入方向を水平方向に変え、2倍希釈系列の精製Fab(様々な濃度範囲)を別々のチャンネル1〜5に沿って同時に注入した。会合時間は200sであり、解離時間は600sであった。緩衝液(PBST)を、参照用の「インライン(in-line)」ブランクとなるように6番目のチャンネルに沿って注入した。会合速度定数(kon)および解離速度定数(koff)は、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアの中にある単純1：1ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model)を用いて会合センサーグラムおよび解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによって計算した。平衡解離定数(KD)は比koff/konとして計算した。表4は、選択されたFolR1特異的クローンの平衡解離定数(KD)を列挙する。
【０２７０】
(表４)CD3εに特異的なヒト化軽鎖であるVL7_46-13を含む共通軽鎖サブライブラリーからのファージディスプレイによって選択された抗FolR1抗体(Fab形式)の平衡解離定数(KD)。KDをnMで表した。
2018504092.tif 000006
【０２７１】
実施例7
FolR1に対する汎用マルチフレームワークライブラリーからの抗体断片の選択
抗体11F8、36F2、9D11、5D9、6B6、および14E4を、様々な種(ヒト、カニクイザル、およびマウス)のFolR1に対する汎用マルチフレームワークサブライブラリーに基づくファージディスプレイ選択によって得た。これらのマルチフレームワークサブライブラリーでは、無作為化CDR3(3つの異なる長さ)のある異なるVL-ドメインが、無作為化CDR3(6つの異なる長さ)のある異なるVH-ドメインと対になっている。選択されたクローンは、以下のVL/VH対:11F8(Vk_1_5/VH_1_69)、36F2(Vk_3_20/VH_1_46)、9D11(Vk2D_28/VH1_46)、5D9(Vk3_20/VH1_46)、6B6(Vk3_20/VH1_46)、および14E4(Vk3_20/VH3_23)のクローンである。種交差反応性(またはマウスFolR1反応性)抗体を得るために、3回または4回のバイオパニングにわたって異なる種のFolR1を異なるやり方で交互に入れ替えた(または一体に保った):11F8(カニクイザル-マウス-ヒトFolR1);36F2(ヒト-マウス-カニクイザル-マウスFolR1);9D11(カニクイザル-ヒト-カニクイザルFolR1);5D9(ヒト-カニクイザル-ヒトFolR1);6B6(ヒト-カニクイザル-ヒトFolR1)、および14E4(マウスFolR1に対して3回)。
【０２７２】
ファージディスプレイ選択用ならびにELISAおよびSPRに基づくスクリーニング用の抗原としてヒトFolR1、マウスFolR1、およびカニクイザルFolR1を、HEK EBNA細胞においてN末端単量体Fc融合として一過性発現させ、受容体鎖を運ぶFc部分(Fcノブ鎖)のC末端に位置するaviタグ認識配列において、BirAビオチンリガーゼの同時発現を介してインビボで部位特異的にビオチン化した。FolR1に対する特異性を評価するために、2つの関連受容体であるヒトFolR2およびFolR3を同じやり方で作製した。
【０２７３】
選択回(バイオパニング)を以下のパターンに従って溶解状態で行った。
1.抗原のFc部分を認識する抗体ライブラリーを枯渇させるために、10ug/mlの無関係のヒトIgGでコーティングしたmaxisorpプレート上で約1012個のファージミド粒子をプレクリアする。
2.Fc結合物質をさらに枯渇させるために、100nMの無関係の非ビオチン化Fcノブイントゥホール構築物の存在下で、Fcに結合しなかったファージミド粒子を100nMのビオチン化ヒトFolR1、ビオチン化カニクイザルFolR1、またはビオチン化マウスFolR1と総体積1mlで0.5時間インキュベートする。
3.ニュートラアビジンでプレコーティングしたマイクロタイタープレートの4個のウェルに移すことによって、ビオチン化FolR1と、取り付けられた特異的に結合しているファージを10分間捕捉する(1回目および3回目)。
4.5xPBS/Tween20および5xPBSを用いて、それぞれのウェルを洗浄する。
5.1ウェルあたり250ulの100mM TEA(トリエチルアミン)を添加することによってファージ粒子を10分間、溶出させ、4個のウェルからプールした溶出液に500ulの1M Tris/HCl pH7.4を添加することによって中和する。
6.Fc結合物質および非特異的結合物質を最終除去するために、ニュートラアビジンでプレコーティングしたマイクロタイタープレート上で、ビオチンで捕捉された100nMのFolR2またはFolR3とインキュベートすることによって、中和された溶出液をポストクリアする。
7.対数期大腸菌TG1細胞に、溶出されたファージ粒子の上清を再感染させ、ヘルパーファージVCSM13を感染させ、シェーカーに載せて30℃で一晩インキュベートし、その後に、次の選択回において使用するファージミド粒子をPEG/NaCl沈殿する。
【０２７４】
選択は、100nMの一定の抗原濃度を用いて3回以上行った。2回目および4回目では、ニュートラアビジンに対する結合物質の濃縮を回避するために、5.4x107個のストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを添加することによって抗原:ファージ複合体を捕捉した。以下の通りに、ELISAによって特異的結合物質を特定した。100ulの25nMビオチン化ヒトFolR1、ビオチン化カニクイザルFolR1、またはビオチン化マウスFolR1をニュートラアビジンプレート上にコーティングし、10ug/mlヒトIgGをmaxisorpプレート上にコーティングした。Fab含有細菌上清を添加し、抗Flag/HRP二次抗体を用いてFlagタグを介して、結合しているFabを検出した。ヒトFolR1にはシグナルを示し、ヒトIgGには陰性であったクローンを、さらなる分析のために最終候補リストに載せ、残りの2種のFolR1に対しても同様に試験した。これらを0.5リットル培養体積で細菌により発現させ、アフィニティ精製し、BioRadのProteOn XPR36バイオセンサーを用いたSPR分析によって、さらに特徴付けた。
【０２７５】
選択されたクローンの親和性(KD)は、ProteOn XPR36計器(Biorad)と、ニュートラアビジン捕捉によってNLCチップに固定化したビオチン化したヒトFolR1、カニクイザルFolR1、およびマウスFolR1、ならびにヒトFolR2およびFolR3(負の対照)を用いて表面プラズモン共鳴(SPR)によって25℃で測定した。抗原(リガンド)の固定化:組換え抗原をPBST(10mMリン酸、150mM塩化ナトリウムpH7.4、0.005％Tween20)で10μg/mlまで希釈し、次いで、垂直方向に30μl/分で注入した。分析物の注入:「one-shot kinetics」測定のために、注入方向を水平方向に変え、2倍希釈系列の精製Fab(様々な濃度範囲)を別々のチャンネル1〜5に沿って同時に注入した。会合時間はそれぞれ150sまたは200sであり、解離時間はそれぞれ200sまたは600sであった。緩衝液(PBST)を、参照用の「インライン」ブランクとなるように6番目のチャンネルに沿って注入した。会合速度定数(kon)および解離速度定数(koff)は、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアの中にある単純1：1ラングミュア結合モデルを用いて会合センサーグラムおよび解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによって計算した。平衡解離定数(KD)は比koff/konとして計算した。表5は、選択されたFolR1特異的クローンの平衡解離定数(KD)を列挙する。
【０２７６】
(表５)汎用マルチフレームワークサブライブラリーからのファージディスプレイによって選択された抗FolR1抗体(Fab形式)の平衡解離定数(KD)。KDをnMで表した。
2018504092.tif 000007
【０２７７】
実施例8
IgG形式およびT細胞二重特異性形式の新規のFolR1結合物質の産生および精製
選択された標的細胞のT細胞依存性死滅を誘導することができるFolR1結合物質を特定するために、共通軽鎖ライブラリーまたはFabライブラリーから単離した抗体を、対応するヒトIgG1形式に変換した。手短に述べると、ファージディスプレイに由来する、他に同じものがないFolR1結合物質の可変重鎖および可変軽鎖を、テンプレートとしてFabクローンを用いる標準的なPCR反応によって増幅した。PCR産物を精製し、PCR産物が適切なヒト定常重鎖またはヒト定常軽鎖と融合される適切な発現ベクターに(制限エンドヌクレアーゼとリガーゼに基づくクローニングによって、またはInvitrogenのInFusion kitを用いた「再結合(recombineering)」によって)挿入した。これらのベクターの中にある発現カセットはキメラMPSVプロモーターおよび合成ポリアデニル化部位からなる。さらに、このプラスミドは、EBV核抗原(EBNA)を有するHEK293細胞においてプラスミドを安定に維持するために、エプスタイン-バーウイルスに由来するoriP領域を含有する。PEIを介してトランスフェクトした後に、抗体をHEK293 EBNA細胞において一過的に産生させ、説明するように標準的なプロテインAアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、この後にサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
【０２７８】
一過的トランスフェクションおよび産生
下記のように、必要とされるベクター用のPEIを介したトランスフェクション手順を用いて、本明細書において使用する(二重特異性)抗体を全て(商業的供給業者から得られていなければ)HEK293 EBNA細胞中で一過的に産生した。HEK293 EBNA細胞を無血清CD CHO培養培地中で懸濁培養する。500ml振盪フラスコ中で産生するために、トランスフェクションの24時間前に、4億個のHEK293 EBNA細胞を播種する(別のスケールについては、それに合うように全ての量を調整した)。トランスフェクションのために細胞を210xgで5分間、遠心分離し、上清を、20mlの予め温めたCD CHO培地と交換する。発現ベクターを200μgのDNAの最終量まで20mlのCD CHO培地中で混合する。540μlのPEIを添加した後に、溶液を15秒間ボルテックスし、その後に室温で10分間インキュベートする。その後、細胞をDNA/PEI溶液と混合し、500ml振盪フラスコに移し、5％CO2雰囲気のインキュベーターに入れて37℃で3時間インキュベートする。インキュベーション期間の後、160mlのF17培地を添加し、細胞を24時間、培養する。トランスフェクションの1日後に、1mMバルプロ酸および7％Feed1を添加する。7日間、培養した後、精製のために210xgで15分間、遠心分離することによって上清を収集する。溶液を濾過滅菌(0.22μmフィルター)し、最終濃度0.01％w/vのアジ化ナトリウムを添加し、4℃に保つ。産生後、上清を回収し、抗体を含有する上清を0.22μm滅菌フィルターで濾過し、精製まで4℃で保管した。
【０２７９】
抗体精製
プロテインAアフィニティ精製(Akta Explorer)およびサイズ排除クロマトグラフィーなどの標準的な手順を用いて2段階で全分子を精製した。一過的産生から入手した上清を(2M TRIS pH8.0を用いて)pH8.0に調整し、8カラム体積(cv)のバッファーA(20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム、pH7.5)で平衡化したHiTrap PA FF(GE Healthcare、カラム体積(cv)=5ml)に適用した。10cvのバッファーAで洗浄した後に、12cvにわたるバッファーB(20mMクエン酸ナトリウムpH3、100mM NaCl、100mMグリシン)へのpH勾配を用いてタンパク質を溶出させた。関心対象のタンパク質を含有する画分をプールし、溶液のpHを(0.5M Na2HPO4 pH8.0を用いて)pH6.0に穏やかに調整した。試料をウルトラコンセントレーター(ultra-concentrator)(Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius)を用いて2mlまで濃縮し、その後に、20mMヒスチジン、pH6.0、140mM NaCl、0.01％Tween-20で平衡化したHiLoad(商標)16/60 Superdex(商標)200調製グレード(GE Healthcare)に適用した。溶出した画分の凝集物含有率を分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。従って、30μlの各画分を、25mM K2HP04、125mM NaCl、200mM L-アルギニン一塩酸塩、0.02％(w/v)NaN3、pH6.7のランニングバッファーで平衡化したTSKgel G3000 SW XL分析用サイズ排除カラム(Tosoh)に25℃で適用した。2％未満のオリゴマーを含有する画分をプールし、ウルトラコンセントレーター(Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius)を用いて最終濃度1〜1.5mg/mlまで濃縮した。タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光率を用いて280nmでの光学密度(OD)を測定することによって求めた。構築物の純度および分子量は、製造業者の説明書(instrument Caliper LabChipGX, Perkin Elmer)に従って、還元剤の存在下および非存在下でのSDSキャピラリー電気泳動によって分析した。精製されたタンパク質を液体N2中で凍結させ、-80℃で保管した。インビトロ特徴付け結果に基づいて、選択された結合物質をT細胞二重特異性形式に変換した。これらの分子では、FolR1:CD3結合部分は2:1の順序で並べられ、FolR1 FabはN末端に位置する。標準的なFabライブラリーから単離したクローンについては、CD3結合部分をCrossFab(CH1Cκ交差)として作製したのに対して、共通軽鎖ライブラリーからのクローンについては交差は必要でなかった。これらの二重特異性分子をIgGと同様に産生および精製した。
【０２８０】
(表６)IgG形式およびTCB形式の新規のFolR1結合物質の収率および単量体含有率
2018504092.tif 000008
CLC:共通軽鎖
【０２８１】
実施例9
2+1 T細胞二重特異性形式および1+1 T細胞二重特異性形式
インビトロでの死滅特性を比較するために、1種類の共通軽鎖結合物質(16D5)については4つの異なるT細胞二重特異性形式を調製し、Fabライブラリーに由来する1種類の結合物質(9D11)については3つの形式を調製した。
【０２８２】
標準的な形式は、既に説明したように2+1逆形式である(FolR1:CD3結合部分は2:1の順序で並べられ、FolR1 FabはN末端に位置する)。2+1古典的形式では、FolR1:CD3結合部分は2:1の順序で並べられ、CD3 FabはN末端に位置する。2種類の一価形式も調製した。1+1ヘッドトゥテールには、分子の同じアームに1:1の順序で並べられたFolR1:CD3結合部分があり、FolR1 FabはN末端に位置する。1+1古典的形式では、FolR1:CD3結合部分は1度、存在し、それぞれが分子の1本のアームにある。標準的なFabライブラリーから単離した9D11クローンについては、CD3結合部分をCrossFab(CH1Cκ交差)として作製したのに対して、共通軽鎖ライブラリーからの16D5については交差は必要でなかった。これらの二重特異性分子を、標準的な逆T細胞二重特異性形式と同様に産生および精製した。
【０２８３】
(表７)様々なT細胞二重特異性形式の収率および最終単量体含有率の概要
2018504092.tif 000009
【０２８４】
実施例10
表面プラズモン共鳴によるFolR1結合物質の生化学的特徴付け
IgGであるか、またはT細胞二重特異性形式のFolR1結合物質と、様々な組換え葉酸受容体(ヒトFolR1、2、および3、マウスFolR1ならびにカニクイザルFolR1; 全てFc融合)との結合を表面プラズモン共鳴(SPR)によって評価した。全SPR実験を、Biacore T200において、ランニングバッファーとしてHBS-EP(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％ Surfactant P20, Biacore, Freiburg/Germany)を用いて25℃で行った。
【０２８５】
単回注入
最初に、抗FolR1 IgGの(ヒトFolR1、マウスFolR1、およびカニクイザルFolR1に対する)交差反応性ならびに(ヒトFolR1、ヒトFolR2、ヒトFolR3に対する)特異性を特徴付けるために、抗FolR1 IgGを単回注入によって分析した(表1)。ヒト、カニクイザル、およびマウス葉酸受容体1の組換えビオチン化単量体のFc融合(FolR1-Fc)またはヒト葉酸受容体2および3の組換えビオチン化単量体のFc融合(FolR2-Fc、FolR3-Fc)を、標準的なカップリング説明書(Biacore, Freiburg/Germany)を用いてSAチップ上に直接カップリングした。固定化レベルは約300〜400RUであった。500nMの濃度のIgGを60秒間注入した。IgGとhuFolR2およびhuFolR3との結合は特異性が無いために排除された。結合物質のほとんどは、ヒトFolR1とカニクイザルFolR1との間にしか交差反応性がない。ほとんどの場合、マウスFolR1に対するさらなる交差反応性と特異性の欠如は関連して起こった。
【０２８６】
(表８)25種類の新たな葉酸受容体1結合物質(IgG)ならびに2種類の対照IgG(Mov19およびファーレツズマブ)の交差反応性および特異性。+は、結合があることを意味し、-は、結合が無いことを意味し、+/-は、結合が弱いことを意味する。
2018504092.tif 000010
【０２８７】
葉酸受容体1に対するアビディティ
抗FolR1 IgGまたはT細胞二重特異性と組換え葉酸受容体との相互作用のアビディティを下記のように求めた(表9)。
【０２８８】
ヒト、カニクイザル、およびマウス葉酸受容体1の組換えビオチン化単量体Fc融合(FolR1-Fc)を、標準的なカップリング説明書(Biacore, Freiburg/Germany)を用いてSAチップ上に直接カップリングした。固定化レベルは約300〜400RUであった。2.1〜500nMの濃度範囲の抗FolR1 IgGまたはT細胞二重特異性を180秒にわたって30μL/分の流れでフローセルに通した。解離を600秒間モニタリングした。組換えビオチン化IL2受容体Fc融合を固定化した参照フローセル上で得られた応答を差し引くことによってバルク屈折率差(bulk refractive index difference)を補正した。19H3 IgGとマウス葉酸受容体1の相互作用を分析するために、2.3μMの濃度の葉酸(Sigma F7876)をHBS-EPランニングバッファーに添加した。IgGまたはT細胞二重特異性の二価結合に起因する結合曲線を1:1ラングミュア結合に近づけ、(正しくはないが、アビディティを知る)そのモデルを用いてフィッティングした。Bia Evaluationソフトウェア(GE Healthcare)を用いて、相互作用のみかけのアビディティ定数をフィッティングの速度定数から導き出した。
【０２８９】
(表９)ヒトFolR1およびカニクイザルFolR1に対する、IgGまたはT細胞二重特異性(TCB)である選択されたFolR1結合物質の二価結合(みかけのKDをもつアビディティ)
2018504092.tif 000011
【０２９０】
1.葉酸受容体1に対する親和性
抗FolR1 IgGまたはT細胞二重特異性と組換え葉酸受容体との間の相互作用の親和性を下記のように求めた(表10)。
【０２９１】
親和性を測定するために、約6000〜7000共鳴単位(RU)の抗ヒトFab特異的抗体の直接カップリング(Fab capture kit, GE Healthcare)を、標準的なアミンカップリングキット(GE Healthcare)を用いてCM5チップ上でpH5.0で行った。20nMの抗FolR1 IgGまたはT細胞二重特異性を10μl/minの流速で20秒間または40秒間、捕捉した。参照フローセルには捕捉を行わなかった。ヒトまたはカニクイザル葉酸受容体1 Fc融合の希釈系列(6.17〜500nMまたは12.35〜3000nM)を30μl/minで120秒間または240秒間、全フローセル上に通して、会合期を記録した。解離期を240秒間モニタリングし、試料溶液をHBS-EPに切り替えることによって誘発した。サイクルが終わるたびに、60秒の10mMグリシン-HCl pH2.1またはpH1.5の2回注射を用いてチップ表面を再生した。参照フローセル1上で得られた応答を差し引くことによってバルク屈折率差を補正した。Bia Evaluationソフトウェア(GE Healthcare)を用いて1:1ラングミュア結合にフィッティングさせることによって、相互作用の親和定数を速度定数から導き出した。
【０２９２】
(表１０)ヒトFolR1およびカニクイザルFolR1に対する、IgGまたはT細胞二重特異性(TCB)である選択されたFolR1結合物質の一価結合(親和性)
2018504092.tif 000012
【０２９３】
2.CD3に対する親和性
抗FolR1 T細胞二重特異性と組換えヒトCD3εδ-Fcとの間の相互作用の親和性を下記のように求めた(表11)。
【０２９４】
親和性を測定するために、約9000共鳴単位(RU)の抗ヒトFab特異的抗体の直接カップリング(Fab capture kit, GE Healthcare)を、標準的なアミンカップリングキット(GE Healthcare)を用いてCM5チップ上でpH5.0で行った。20nMの抗FolR1 T細胞二重特異性を10μl/minの流速で40秒間、捕捉した。参照フローセルには捕捉を行わなかった。ヒトCD3εδ-Fc融合の希釈系列(6.17〜500nM)を30μl/minで240秒間、全フローセル上に通して、会合期を記録した。解離期を240秒間モニタリングし、試料溶液をHBS-EPに切り替えることによって誘発した。サイクルが終わるたびに、60秒の10mMグリシン-HCl pH2.1の2回注射を用いてチップ表面を再生した。参照フローセル1上で得られた応答を差し引くことによってバルク屈折率差を補正した。Bia Evaluationソフトウェア(GE Healthcare)を用いて1:1ラングミュア結合にフィッティングさせることによって、相互作用の親和定数を速度定数から導き出した。
【０２９５】
(表１１)ヒトCD3-Fcに対する、選択されたFolR1 T細胞二重特異性(TCB)の一価結合(親和性)
2018504092.tif 000013
【０２９６】
CD3結合部分は全構築物について同一であり、測定されたT細胞二重特異性の親和性は似ている(KDは60〜90nMである)。
【０２９７】
実施例11
T細胞二重特異性を葉酸受容体1とCD3に同時結合させる
抗FolR1 T細胞二重特異性が組換え葉酸受容体1と組換えヒトCD3εδ-Fcに同時結合することを、下記のように表面プラズモン共鳴によって確かめた。ヒト、カニクイザル、およびマウス葉酸受容体1の組換えビオチン化単量体Fc融合(FolR1-Fc)を、標準的なカップリング説明書(Biacore, Freiburg/Germany)を用いてSAチップ上に直接カップリングした。固定化レベルは約300〜400RUであった。500nMの抗FolR1 T細胞二重特異性を30μl/分の流れで60秒間注入してフローセルに通した後に、500nMのhu CD3εδ-Fcを60秒間注入した。組換えビオチン化IL2受容体Fc融合を固定化した参照フローセル上で得られた応答を差し引くことによってバルク屈折率差を補正した。試験した4種類のT細胞二重特異性(16D5 TCB、21A5 TCB、51C7 TCB、および45D2 TCB)は、予想した通り、葉酸受容体1とヒトCD3に同時に結合することができた。
【０２９８】
実施例12
エピトープビニング
エピトープビニングのために、抗FolR1 IgGまたはT細胞二重特異性を、標準的なアミンカップリングキット(GE Healthcare)を用いて、pH5.0で、CM5チップ上に直接固定化した。最終応答は約700RUであった。次いで、500nMのhuFolR1-Fcを60秒間、捕捉した後に、500nMの異なる結合物質を30秒間、捕捉した。それぞれ30秒の10mMグリシンpH2を2回注射することによって表面を再生した。固定化された結合物質に捕捉されたhuFolR1に、異なる結合物質が結合できるかどうかを評価した(表12)。
【０２９９】
(表１２)ヒトFolR1に対する、IgGまたはT細胞二重特異性(TCB)である選択されたFolR1結合物質のエピトープ特徴付け。+は、結合があることを意味し、-は、結合が無いことを意味し、+/-は、結合が弱いことを意味する。
2018504092.tif 000014
【０３００】
これらの結果と、固定化huFolR1に対する同時結合を用いたさらなるデータに基づいて、結合物質は3つのグループに分けられた。9D11は、他の全ての結合物質に取って代わるので別個のエピトープを有するかどうかは明らかでない。16D5と21A5は同じグループにあり、Mov19、ファーレツズマブは同じグループにあり(Coney et al., Cancer Res. 1991 Nov 15;51(22):6125-32; Kalli et al., Curr Opin Investig Drugs. 2007 Dec;8(12):1067-73)、36F2は別のグループにあるように思われる(表13)。しかしながら、36F2はヒトFolR1、カニクイザルFolR1、およびマウスFolR1に結合する時に、Mov19およびファーレツズマブとは異なるエピトープに結合する。
【０３０１】
(表１３)ヒトFolR1に対する、IgGまたはT細胞二重特異性(TCB)である選択されたFolR1結合物質のエピトープグループ化
2018504092.tif 000015
【０３０２】
実施例13
結合物質の選択
最良の候補を選択するために、IgG形式のFolR1結合物質を、表面プラズモン共鳴(SPR)および細胞に対するインビトロアッセイによってスクリーニングした。
【０３０３】
抗FolR1 IgGの(ヒトFolR1、マウスFolR1、およびカニクイザルFolR1に対する)交差反応性ならびに(ヒトFolR1、ヒトFolR2、ヒトFolR3に対する)特異性を特徴付けるために、抗FolR1 IgGをSPRによって分析した。ヒトFolR2およびFolR3と非特異的に結合することは除外因子とみなした。ヒトFolR1との結合およびヒトFolR1に対する特異性を細胞上で確認した。一部の結合物質は、SPRにおいて組換えヒトFolR1を認識したが、FolR1を発現する細胞に結合しなかった。
【０３０４】
凝集温度が確かめられたが、除外因子ではなかった。なぜなら、選択された結合物質は全て安定していたからである。非特異的結合をチェックするために、選択された結合物質を多反応性ELISA(polyreactivity ELISA)において試験した。これにより4種類の結合物質が除外された。このプロセスによって、3種類の結合物質:36F2(Fabライブラリー)、9D11(Fabライブラリー)、および16D5(共通軽鎖)が最初に選択された。36F2はhuFolR1から急速に解離し、従って、最初に、好まれなかった。
【０３０５】
実施例14
新たに作製したFolR1結合物質とヒトFolR1陽性腫瘍細胞との特異的結合
新たなFolR1結合物質を、FabライブラリーまたはCD3軽鎖を用いた共通軽鎖ライブラリーを用いたファージディスプレイを介して作製した。特定された結合物質をヒトIgG1形式に変換し、FolR1高発現ヒーラー細胞との結合に取り組んだ。参照分子として、ヒトFolR1結合物質Mov19を含めた。このアッセイで試験した結合物質のほとんどはFolR1に対して中程度から良好な結合を示し、一部のクローンはMov19と同じくらい良く結合した(図2を参照されたい)。クローン16A3、18D3、15H7、15B6、21D1、14E4、および16F12は、細胞上にあるFolR1との結合をフローサイトメトリーによって確認できなかったので除外した。次の工程では、近縁関係にあるヒトFolR2との結合を除外することによって、ヒトFolR1に対する選択されたクローンの特異性を試験した。特異性に取り組むために、HEK細胞をヒトFolR1またはヒトFolR2で一過的にトランスフェクトした。Fabライブラリーに由来するクローン36F2および9D11ならびにCLCライブラリーに由来するクローン16D5および21A5はヒトFolR1に特異的に結合するが、ヒトFolR2に特異的に結合しない(図3A〜Bを参照されたい)。他の試験したクローンは全てヒトFolR2と少なくともいくらかの結合を示した(図3A〜Bを参照されたい)。従って、これらのクローンを、さらなる特徴付けから除外した。同時に、カニクイザルFolR1で一過的にトランスフェクトしたHEK細胞に対する結合研究を行うことによって、FolR1クローンとカニクイザルFolR1との交差反応性に取り組んだ。試験したクローンは全てカニクイザルFolR1に結合することができ、4種類の選択されたヒトFoLR1特異的クローン36F2、9D11、16D5、および21A5はヒトFoLR1およびカニクイザルFoLR1に同程度に良好に結合する(図4)。その後に、3種類のヒトFoLR1特異的カニクイザル交差反応性結合物質をTCB形式に変換し、T細胞性死滅およびT細胞活性化の誘導について試験した。これらのクローンは、Fabライブラリーに由来する9D11、CLCライブラリーに由来する16D5および21A5であった。参照分子として、Mov19 FolR1 TCBを全研究に含めた。次いで、これらのFolR1 TCBを用いて、ヒーラー細胞上にあるFolR1に結合した後の内部移行の誘導を比較した。試験した3種類全てのクローンが、Mov19 FoLR1 TCBに結合した際に内部に取り入れられるのと同じ程度に、FolR1に結合した際に内部に取り入れられた(図5)。21A5 FolR1 TCBは多反応性の兆しが現れたために打ち切られた。
【０３０６】
実施例15
FolR1 TCB抗体によって誘導されたFolR1発現腫瘍標的細胞のT細胞性死滅
FolR1 TCBを用いて、FolR1発現腫瘍細胞のT細胞性死滅を確かめた。可能性のある1パネルの標的細胞株を用いて、Qifikit分析によってFolR1結合部位を確かめた。
【０３０７】
使用した腫瘍細胞パネルは、FolR1高発現腫瘍細胞、FolR1中発現腫瘍細胞、およびFolR1低発現腫瘍細胞と、FolR1陰性細胞株を含む。
【０３０８】
(表１４)腫瘍細胞上にあるFolR1結合部位
2018504092.tif 000016
【０３０９】
3つの異なるFoLR1 TCB(9D11、16D5、およびMov19結合物質を含有する)と、この腫瘍細胞株パネルが結合することが確かめられた。このことから、FolR1 TCBはFolR1発現腫瘍細胞に特異的に結合し、FoLR1陰性腫瘍細胞株には特異的に結合しないことが分かった。結合する構築物の量はFolR1発現レベルに比例し、構築物と、検出可能なFolR1低細胞株HT-29は依然として良好に結合する。さらに、負の対照DP47 TCBは、使用した、どの細胞株とも結合しない(図6A〜E)。
【０３１０】
さらに、中発現細胞株SKOV3および低発現細胞株HT-29を用いて、16D5 TCBおよび9D11 TCBを用いてT細胞性死滅およびT細胞活性化を試験した。負の対照としてDP47 TCBを含めた。両細胞株とも、既に非常に低いレベルの16D5 TCBおよび9D11 TCBの存在下では死滅し、9D11 TCBは16D5 TCBより強力にFolR1に結合するが、両TCB間の活性に違いは無かった。SKOV3細胞の全体的な死滅はHT-29と比べて多かった。このことは、SKOV3細胞上でのFolR1の発現レベルがHT-29より多いことを反映している(図7A〜D)。これに合致して、CD4+T細胞上およびCD8+T細胞上での活性化マーカーCD25およびCD69の強力なアップレギュレーションが検出された。T細胞活性化はSKOV3細胞およびHT-29細胞の存在下では非常によく似ている。負の対照DP47 TCBは、使用した濃度では死滅を全く誘導せず、T細胞上でCD25およびCD69は有意にアップレギュレートされなかった。
【０３１１】
(表１５)SKOV3細胞を用いた腫瘍細胞死滅およびT細胞活性化のEC50値
2018504092.tif 000017
【０３１２】
(表１６)HT-29細胞を用いた腫瘍細胞死滅およびT細胞活性化のEC50値
2018504092.tif 000018
【０３１３】
実施例16
赤血球との結合および全血中でのT細胞活性化
FolR1発現腫瘍細胞の非存在下では自発的活性化が無いことを証明するために、本発明者らは、潜在的にFolR1を発現している可能性がある赤血球にFolR1クローンが結合するかどうかを試験した。本発明者らは、9D11 IgG、16D5 IgG、およびMov19 IgGと赤血球との特異的結合を全く観察できなかった。負の対照としてDP47 IgGを含めた(図8)。
【０３１４】
血球とのさらなる非特異的結合、またはFolR1 TCBを介した非特異的活性化を除外するために、9D11 TCB、16D5 TCB、およびMov19 TCBを全血に添加し、CD4+T細胞上およびCD8+T細胞上でのCD25およびCD69のアップレギュレーションをフローサイトメトリーによって分析した。負の対照としてDP47 TCBを含めた。CD4+T細胞上およびCD8+T細胞上でのCD25およびCD69のアップレギュレーションを分析することによって、試験したどの構築物を用いてもT細胞活性化は観察できなかった(図9)。
【０３１５】
実施例17
9D11軽鎖の中にあるN-グリコシル化部位の除去
クローン9D11のCDR L3の末端にある、可能性のある配列ホットスポットを特定するために様々なFolR1結合物質を分析している間に、推定N-グリコシル化部位を特定した。通常、N-グリコシル化のためのコンセンサスモチーフはN-X-S/T-X(XはPでない)と定義される。CDR L3の配列(MOASIMNRT(SEO ID NO:46))は、配列N-R-Tを有する、このコンセンサスモチーフと完全に一致する。産生バッチごとにグリコシル化を完全に再現できないかもしれないので、CDR L3におけるグリコシル化が抗原結合に寄与するのであれば、これはFolR1結合に影響を及ぼす可能性がある。このN-グリコシル化部位がFolR1結合に重要かどうか、または結合を損なうことなく取り替えることができるかどうか評価するために、部位特異的変異誘発によってN-グリコシル化部位を交換した様々な9D11軽鎖変種を作製した。
【０３１６】
1.一過的トランスフェクションおよび産生
下記のように、必要とされるベクター用のPEIを介したトランスフェクション手順を用いて、4種類のT細胞二重特異性をHEK293 EBNA細胞中で一過的に産生した。HEK293 EBNA細胞を無血清CD CHO培養培地中で懸濁培養した。500ml振盪フラスコ中で産生するために、トランスフェクションの24時間前に、4億個のHEK293 EBNA細胞を播種した(別のスケールについては、それに合うように全ての量を調整した)。トランスフェクションのために細胞を210xgで5分間、遠心分離し、上清を、20mlの予め温めたCD CHO培地と交換した。発現ベクターを200μgのDNAの最終量まで20mlのCD CHO培地中で混合した。540μlのPEIを添加した後に、溶液を15秒間ボルテックスし、その後に室温で10分間インキュベートした。その後、細胞をDNA/PEI溶液と混合し、500ml振盪フラスコに移し、5％CO2雰囲気のインキュベーターに入れて37℃で3時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、160mlのF17培地を添加し、細胞を24時間、培養した。トランスフェクションの1日後に、1mMバルプロ酸および7％Feed1を添加した。7日間、培養した後、精製のために210xgで15分間、遠心分離することによって上清を収集した。溶液を濾過滅菌(0.22μmフィルター)し、最終濃度0.01％w/vのアジ化ナトリウムを添加し、4℃に保った。産生後、上清を回収し、抗体を含有する上清を0.22μm滅菌フィルターで濾過し、精製まで4℃で保管した。
【０３１７】
2.抗体精製
プロテインAアフィニティ精製(Akta Explorer)およびサイズ排除クロマトグラフィーなどの標準的な手順を用いて2段階で全分子を精製した。一過的産生から入手した上清を(2M TRIS pH8.0を用いて)pH8.0に調整し、8カラム体積(cv)のバッファーA(20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム、0.5M NaCl、0.01％Tween-20、pH7.5)で平衡化したHiTrap PA HP(GE Healthcare、カラム体積(cv)=5ml)に適用した。10cvのバッファーAで洗浄した後に、20cvにわたるバッファーB(20mMクエン酸ナトリウムpH2.5、0.5M NaCl、0.01％Tween-20)へのpH勾配を用いて、タンパク質を溶出させた。関心対象のタンパク質を含有する画分をプールし、溶液のpHを(2M TRIS pH8.0を用いて)pH6.0に穏やかに調整した。試料を、ウルトラコンセントレーター(Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius)を用いて1mlまで濃縮し、その後に、20mMヒスチジン、pH6.0、140mM NaCl、0.01％Tween-20で平衡化したSuperdex(商標)200 10/300 GL(GE Healthcare)に適用した。溶出した画分の凝集物含有率を分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。従って、30μlの各画分を、25mM K2HP04、125mM NaCl、200mM L-アルギニン一塩酸塩、0.02％(w/v)NaN3、pH6.7のランニングバッファーで平衡化したTSKgel G3000 SW XL分析用サイズ排除カラム(Tosoh)に25℃で適用した。2％未満のオリゴマーを含有する画分をプールし、ウルトラコンセントレーター(Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius)を用いて最終濃度1〜1.5mg/mlまで濃縮した。タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光率を用いて280nmでの光学密度(OD)を測定することによって求めた。構築物の純度および分子量は、製造業者の説明書(instrument Caliper LabChipGX, Perkin Elmer)に従って、還元剤の存在下および非存在下でのSDSキャピラリー電気泳動によって分析した。精製されたタンパク質を液体N2中で凍結させ、-80℃で保管した。
【０３１８】
3.凝集温度
4種類の構築物の安定性を、Optim1000(Avacta, PALL Corporation)において0.1℃/minで25°から80°の勾配加熱によって試験した。凝集開始時の温度を記録した。
【０３１９】
(表３４)2+1逆T細胞二重特異性形式の9D11結合物質の4種類のN-グリコシル化部位ノックアウト変異体の収率、単量体含有率、および凝集温度。4種類全ての変異体は野生型9D11結合物質と同じようにふるまった。
2018504092.tif 000019
【０３２０】
以下の変種:N100S(N95S);N100Q(N95Q)、T102A(T97A)、およびT102N(T97N)(Kabatナンバリングを括弧内に示した)を作製し、T細胞二重特異性形式に変換した。HEK293 EBNA細胞における一過性産生と精製の後に、オリジナルの9D11クローンと比較して様々な変種の標的結合および細胞死滅活性を分析した。
【０３２１】
(表１７)9D11のCDR L3にあるN-グリコシル化部位を除去するのに使用したプライマー(配列は以下を参照されたい)
2018504092.tif 000020
【０３２２】
実施例18
9D11 a-glyco変種を用いた結合およびT細胞性死滅
CDRのグリコシル化部位のために、グリコシル化部位を取り除いた変異をもつ4つの異なる9D11変種を産生した(実施例17)。オリジナルの9D11と比較して、ヒーラー細胞上にあるFolR1との結合(図10)ならびにSKOV3およびHT-29における腫瘍細胞死滅の誘導(図11A〜B、E〜F)について、これらの4つの変種を試験した。変種はどれも結合にも腫瘍細胞死滅の誘導にも相違を示さなかった。同時に、FolR1陰性細胞株MKN-45の非特異的死滅に取り組んだ(図11C〜D)。これもまた、変種とオリジナルの結合物質との間に相違を観察することができなかった。これらの構築物はどれもFolR1陰性腫瘍細胞において非特異的死滅を誘導しなかった。
【０３２３】
実施例19
初代上皮細胞上でのFolR1発現
FolR1は初代上皮細胞上では低レベルで発現している。ここで、本発明者らは、これらのレベルがFolR1 TCBの存在下でT細胞性死滅を誘導するのに十分であるかどうかを試験したかった。これを試験するために、本発明者らは、初代ヒト気管支上皮細胞、初代ヒト脈絡叢上皮細胞、初代ヒト腎皮質上皮細胞、および初代ヒト網膜色素上皮細胞を使用した。正の対照として、FolR1陽性SKOV3細胞またはHT-29細胞のいずれかを含めた。最初に、本発明者らは、使用した初代細胞上でFolR1が発現することを検証し、これらの細胞上にあるFolR1結合部位の量を求めた。気管支上皮細胞、腎皮質上皮細胞、および網膜色素上皮細胞は、腫瘍細胞上に発現しているレベルと比較して非常に少ないが、有意なレベルのFolR1を発現する。脈絡叢上皮細胞は有意なレベルのFolR1を発現しない。
【０３２４】
(表１８)初代上皮細胞上にあるFolR1結合部位
2018504092.tif 000021
【０３２５】
表面にFolR1 発現を示した初代上皮細胞を用いて、FoLR1 TCBの存在下で、T細胞がこれらの細胞を死滅できるかどうかという問題に取り組んだ。有意な死滅レベルを測定することができなかったが、網膜色素上皮細胞、気管支上皮細胞、および腎皮質細胞の存在下では、CD25およびCD69のアップレギュレーションをもたらすT細胞活性化の誘導が検出された。網膜色素上皮細胞を用いた場合には、CD4+T細胞上およびCD8+T細胞上でのCD25およびCD69のアップレギュレーションをもたらす最も強い活性化が見られた。気管支上皮細胞の存在下では弱いT細胞活性化が誘導され、CD69はCD4+T細胞上およびCD8+T細胞上でアップレギュレートされたが、CD25はCD4+T細胞上でのみ非常に弱くアップレギュレートされ、CD8+T細胞上ではアップレギュレートされなかった。腎臓上皮細胞の存在下では最も弱いT細胞活性化が得られ、CD25はCD4+T細胞上およびCD8+T細胞上でアップレギュレートされず、CD69はCD8+T細胞上でのみアップレギュレートされた(図12A〜X)。
【０３２６】
実施例20
16D5結合物質または9D11結合物質のいずれかを含有する様々なTCB形式の比較
TCB 2+1 逆形式が、選択されたFolR1結合物質を用いた最も活性のある形式であるかどうかを確かめるために、16D5または9D11のいずれかを含有する様々な形式を産生し、標的細胞結合、T細胞性死滅、およびT細胞活性化の点で比較した。16D5結合物質を、TCB 2+1 逆(図1A)、TCB 2+1 古典的(図1D)、TCB 1+1 古典的(図1C)、およびTCB 1+1 ヘッドトゥテール(図1B)形式で試験した。9D11結合物質を、TCB 2+1 逆(図1A)、TCB 1+1 古典的(図1C)、およびTCB 1+1ヘッドトゥテール(図1B)形式で試験した。
【０３２７】
全構築物を、ヒーラー細胞上にあるFolR1との結合について試験した。FolR1との結合が二価の分子は、アビディティのために一価構築物と比較して強く結合する。二価構築物と一価構築物との差異は16D5の方が顕著であった。この理由は、16D5の低親和性のために、この結合物質のアビディティ効果が強くなるということであるかもしれない。2種類の1+1 TCB間で結合に有意差はないが、2種類の2+1構築物間には差がある。逆2+1構築物は古典的 2+1構築物より強くFolR1に結合する。このことから、古典的 2+1構築物では、FoLR1との結合はCD3 Fabの存在の影響を受けるのに対して、逆構築物では結合はあまり影響を受けないことが分かる。
【０３２８】
これらの構築物を用いたT細胞性死滅を試験することによって、本発明者らは、2+1 古典的TCBと比較して強い2+1逆TCBの結合が強い腫瘍細胞死滅およびT細胞活性化に変わったことを示すことができた。16D5 FolR1 TCB 2+1 古典的は、それぞれの1+1ヘッドトゥテール構築物よりも少しだけ活性が高い。1+1ヘッドトゥテール構築物は1+1 古典的構築物よりも活性がかなり高い。このことは、結合において見られる状況を反映しておらず、ヘッドトゥテール構築物との良好な架橋によるものかもしれない。全体的な腫瘍細胞死滅およびT細胞活性化は、試験した全構築物で同等であり、差異を伴って見られた効力の差異はEC50値の点だけである。一般的に、使用した結合物質に関係なく、FolR1 TCB 2+1逆はT細胞性腫瘍細胞死滅およびT細胞活性化を誘導するのに好ましい形式であると結論づけることができる(図13A〜Cおよび図14A〜Cを参照されたい)。
【０３２９】
(表１９)様々なTCB形式を用いた標的細胞結合およびT細胞性死滅のEC50値
2018504092.tif 000022
【０３３０】
(表２０)様々なTCB形式を用いた、SKOV3細胞の存在下でのT細胞活性化のEC50値
2018504092.tif 000023
【０３３１】
実施例21
腫瘍細胞株および初代細胞
ヒーラー細胞(CCL-2)をATCCから入手し、10％FCSおよび2mMグルタミンを含むDMEM中で培養した。SKOV3(HTB-77)をATCCから入手し、10％FCSおよび2mMグルタミンを含むRPMI中で培養した。OVCAR5をNCIから入手し、10％FCSおよび2mMグルタミンを含むRPMI中で培養した。HT-29(ACC-299)をDSMZから入手し、10％FCSおよび2mMグルタミンを含むMcCoy 5A培地中で培養した。MKN-45(ACC-409)をDSMZから入手し、10％FCSおよび2mMグルタミンを含むRPMIで培養した。
【０３３２】
試験した初代上皮細胞は全てScienCell Research Laboratoriesから入手した。ヒト気管支上皮細胞(HBEpiC、カタログ番号3210)を気管支上皮細胞培地(BEpiCM, カタログ番号3211, ScienCell)中で培養した。ヒト結腸上皮細胞(HCoEpiC)、カタログ番号2950を結腸上皮細胞培地(CoEpiCM, カタログ番号2951, ScienCell)中で培養した。ヒト網膜色素上皮細胞(HRPEpiC)、カタログ番号6540を上皮細胞培地(EpiCM, カタログ番号4101, ScienCell)中で培養した。ヒト腎皮質上皮細胞(HRCEpiC)、カタログ番号4110を上皮細胞培地(EpiCM, カタログ番号4101, ScienCell)中で培養した。ヒト脈絡叢上皮細胞(HCPEpiC)、カタログ番号1310を上皮細胞培地(EpiCM、カタログ番号4101, ScienCell)中で培養した。
【０３３３】
実施例22
フローサイトメトリーによる標的結合
示されたような標的細胞をCell Dissociation Bufferを用いて回収し、PBSで洗浄し、FACS緩衝液に再懸濁した。抗体染色を96ウェル丸底プレートの中で行った。従って、1ウェルあたり200'000個の細胞を播種した。プレートを400gで4分間、遠心分離し、上清を除去した。試験抗体をFACS緩衝液で希釈し、細胞に20μlの抗体溶液を4℃で30分間、添加した。結合しなかった抗体を除去するために、細胞をFACS緩衝液で2回洗浄した後に、希釈した二次抗体(FITC結合AffiniPure F(ab')2断片ヤギ抗ヒトIgG, Fcg断片, Jackson ImmunoResearch #109-096-098またはPE結合AffiniPure F(ab')2断片ヤギ抗ヒトIgG Fcg断片特異的, Jackson ImmunoResearch #109-116-170を添加した。4℃で30分間インキュベートした後に、結合しなかった二次抗体を洗い流した。測定の前に、細胞を200μlのFACS緩衝液に再懸濁し、BD Canto IIまたはBD Fortessaを用いてフローサイトメトリーによって分析した。
【０３３４】
実施例23
内部移行
細胞を回収し、生存率を求めた。細胞を新鮮な冷培地に1mlあたり2個のMio細胞で再懸濁した。細胞懸濁液を、それぞれの抗体について15mlのfalconチューブに移した。内部移行について試験しなければならない抗体を最終濃度20μg/mlで細胞に添加した。チューブを低温室内でシェーカーに載せて45分間インキュベートした。インキュベーション後に、結合しなかった抗体を除去するために、細胞を冷PBSで3回洗浄した。時点0で、1ウェルあたり0.2個のMio細胞をFACSプレートに移した。標識された細胞を温かい培地に再懸濁し、37℃でインキュベートした。示された時点で、1ウェルあたり0.2個のMio細胞を冷PBS中に移し、FACSプレート上にプレートして洗浄した。表面に残っている構築物を検出するために、細胞をPE標識抗ヒトFc二次抗体で染色した。従って、1ウェルあたり20μlの希釈した抗体を添加し、プレートを4℃で30分間インキュベートした。次いで、結合しなかった抗体を除去するために細胞を2回洗浄し、次いで、これ以上、内部移行しないようにするために1％PFAで固定した。蛍光をBD FACS CantoIIを用いて測定した。
【０３３５】
実施例24
QIFIKIT(登録商標)分析
QIFIKIT(登録商標)は、異なるが、詳細に明らかにされている量のマウスMab分子(高親和性抗ヒトCD5、クローンCRIS-1、アイソタイプIgG2a)でコーティングされた、直径10μmの一連のビーズを収めている。これらのビーズは、一次マウスMab、アイソタイプIgGで標識されている、抗原密度が異なる細胞を模倣する。簡単に述べると、関心対象の抗原に対して作られた一次マウスモノクローナル抗体で細胞を標識した。別の試験ウェルの中では、無関係のマウスモノクローナル抗体(アイソタイプ対照)で細胞を標識した。次いで、細胞、セットアップ(Set-Up)ビーズ、および較正(Calibration)ビーズを、キットの中に入っているフルオレセイン結合抗マウス二次抗体で標識した。細胞の標識に使用した一次抗体は飽和濃度で使用しなければならない。一次抗体はどのマウスIgGアイソタイプのものでもよい。これらの条件下で、結合した一次抗体分子の数は、細胞表面に存在する抗原性部位の数と一致する。二次抗体も飽和濃度で使用する。その結果、蛍光は、細胞上にある結合した一次抗体分子およびビーズ上にある結合した一次抗体分子の数と相関関係にある。
【０３３６】
実施例25
T細胞性腫瘍細胞死滅およびT細胞活性化
標的細胞をトリプシン/EDTAを用いて回収し、計数し、生存率をチェックした。細胞を、最終濃度300'000細胞/mlで、それぞれの培地に再懸濁した。次いで、100μlの標的細胞懸濁液を96平底プレートの各ウェルに移した。細胞がプレートに付着するように、プレートをインキュベーターに入れて37℃で一晩インキュベートした。翌日、PBMCを健常ドナーの全血から単離した。血液をPBSで2:1に希釈し、Leucosepチューブの中にある15mlのHistopaque-1077(#10771, Sigma-Aldrich)の上にかぶせ、450gで30分間、間断なく遠心分離した。遠心分離後に、細胞を含有するバンドを10mlピペットで収集し、50mlチューブに移した。チューブをPBSで50mlまで満たし、遠心分離した(400g、10分、室温)。上清を除去し、ペレットをPBSに再懸濁した。遠心分離(300g、10分、室温)の後に、上清を捨て、2本のチューブをプールし、洗浄工程を繰り返した(今回は、遠心分離350xg、10分、室温)。その後、細胞を再懸濁し、細胞を計数するためにペレットを50mlのPBSに溶解してプールした。計数した後に、細胞を遠心分離し(350g、10分、室温)、2％FCSおよび2nMグルタミンを含むRPMIに溶解して1mlあたり6個のMio細胞で再懸濁した。プレートした標的細胞から培地を除去し、2％FCSおよび2nMグルタミンを含むRPMIで希釈した試験抗体を添加した。300'000個の細胞のエフェクター細胞溶液を各ウェルに移して、E:T比を10:1にした。最大放出を確かめるために、標的細胞をTriton X-100で溶解した。24時間後および48時間後に、LDH放出を、Cytotoxicity Detection Kit(#1644793, Roche Applied Science)を用いて確かめた。腫瘍細胞死滅後のT細胞上での活性化マーカーのアップレギュレーションをフローサイトメトリーによって測定した。簡単に述べると、PBMCを回収し、96ウェル丸底プレートに移し、FACS緩衝液で希釈したCD4 PE-Cy7(#3557852, BD Bioscience)、CD8 FITC(#555634, BD Bioscience)、CD25 APC(#555434, BD Bioscience)、CD69 PE(#310906, BioLegend)抗体で染色した。4℃で30分間インキュベートした後に、細胞をFACS緩衝液で2回洗浄した。BD Canto IIを用いて蛍光を測定する前に、細胞を200μlのFACS緩衝液に再懸濁した。
【０３３７】
実施例26
全血中でのT細胞活性化
280μlの新鮮血を96ウェルコニカルディープ(conical deep)ウェルプレートに添加した。次いで、20μlの希釈したTCBを血液に添加し、プレートを振盪することによってよく混合した。インキュベーターに入れて37℃で24時間インキュベートした後に、血液を混合し、35μlを96ウェル丸底プレートに移した。次いで、CD4 PE-Cy7(#3557852, BD Bioscience)、CD8 FITC(#555634, BD Bioscience)、CD25 APC(#555434, BD Bioscience)、CD69 PE(#310906, BioLegend)、およびCD45 V500(#560777, BD Horizon)からなる抗体染色ミックス20μlを添加し、暗所、室温で15分間インキュベートした。測定する前に、新鮮に調製されたBD FACS lysing solution(#349202、BD FCAS)200μlを血液に添加した。室温で15分間インキュベートした後に、細胞をBD Fortessaで測定した。
【０３３８】
実施例27
免疫不全NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull(NOG)マウスにおけるヒト化FOLR1 TCB(クローン16D5)のSDPK(単回投与薬物動態)研究
実験開始時に6〜7週齢の雌NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull(NOG)マウス(Taconic, Denmarkで飼育)を、書き留められたガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従って、特定の病原体が存在しない条件下で12時間明/12時間暗の1日サイクルで維持した。実験研究プロトコールは地方政府によって詳細に調べられ、認可された(P 2011/128)。到着後、新しい環境に慣れるように、また観察のために動物を1週間維持した。継続的な健康モニタリングを定期的に行った。
【０３３９】
マウスに10/1/0.1μg/マウスのFOLR1 TCBをi.v.注射した。これに対して、1つの群および1つの時点につき3匹のマウスを採血した。全マウスに総体積200μlの適切な溶液を注射した。200μlにつき適量のFOLR1 TCBを得るために、必要に応じて原液をPBSで希釈した。療法注射の5分後、1時間後、3時間後、8時間後、24時間後、48時間後、72時間後、96時間後、および168時間後に血清試料を収集した。
【０３４０】
図15から、16D5 FOLR1 TCBは、NOGマウスにおいて、ゆっくりとしたクリアランスで、典型的な、かつ用量に比例するIgG様PK特性を示すことが分かる。
【０３４１】
（表２１）
2018504092.tif 000024
【０３４２】
実施例28
Skov3を有するNOGマウスにおけるヒトPBMC移入後のFOLR1 TCB(クローン16D5)のインビボ有効性
PBMCを移植したNOGマウスにs.c.注射したヒト卵巣がん細胞株Skov3において、FOLR1 TCBを試験した。
【０３４３】
Skov3卵巣がん細胞をATCC(HTB-77)から入手した。腫瘍細胞株を、10％FCS(Gibco)を含有するRPMI中で、5％CO2の水飽和雰囲気において37℃で培養した。移植には、生存率>95％の継代35を使用した。動物1匹につき5x106個の細胞を合計100μlのRPMI細胞培養培地(Gibco)に溶解して動物の右側腹部にs.c.注射した。
【０３４４】
実験開始時に6〜7週齢の雌NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull(NOG)マウス(Taconic, Denmarkで飼育)を、書き留められたガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従って、特定の病原体が存在しない条件下で12時間明/12時間暗の1日サイクルで維持した。実験研究プロトコールは地方政府によって詳細に調べられ、認可された(P 2011/128)。到着後、新しい環境に慣れるように、また観察のために動物を1週間維持した。継続的な健康モニタリングを定期的に行った。
【０３４５】
プロトコール(図16)に従って、研究0日目に、マウスに5x106個のSkov3をs.c.注射した。研究21日目に、健常ドナーのヒトPBMCをFicoll法を介して単離し、10x106個の細胞を担がんマウスにi.p.注射した。2日後に、マウスを無作為化し、5つの治療群に等しく分配した後に(n=12)、10/1/0.1μg/マウスのFOLR1 TCBまたは10μg/マウスのDP47対照TCBを3週間にわたって週1回、i.v.注射した。全マウスに200μlの適切な溶液をi.v.注射した。ビヒクル群のマウスにはPBSを注射した。200μlにつき適量のTCBを得るために、必要に応じて原液をPBSで希釈した。腫瘍成長を、カリパスを用いて週1回、測定し(図17)、腫瘍体積を以下の通りに計算した。
Tv:(W2/2)xL(W:幅、L:長さ)
【０３４６】
FOLR1 TCBを週1回、注射することによって、用量依存的な抗腫瘍効果が得られた。10μg/マウスおよび1μg/マウスの用量は腫瘍縮小を誘導したのに対して、0.1μg/マウスは腫瘍静止を誘導した(図17、表22)。非標的化対照DP47 TCBと比較して10μg/マウスの用量で腫瘍は最大に縮小した。
【０３４７】
（表２２）
2018504092.tif 000025
【０３４８】
PD読み取りのために、研究32日目に1治療群につき3匹のマウスを屠殺した。腫瘍を取り出し、後のFACS分析のためにシングル細胞懸濁液を、コラゲナーゼV、ディスパーゼII、およびDNアーゼを用いた酵素消化によって調製した(図19および図20)。シングル細胞を、細胞外抗原および活性化マーカーの染色に直接使用したか、または通常の培養培地に溶解して、タンパク質輸送阻害剤モネンシンの存在下で5ng/ml PMAおよび500ng/mlイオノマイシンを用いて5時間、再刺激した。再刺激後に、細胞を表面抗原について染色した後に、固定および透過処理工程を行った。次いで、固定試料を、TNF-α、IFN-γ、IL-10、およびIL-2について細胞内で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。細胞を脱顆粒するために同じ手順を使用したが、再刺激期間の間に抗CD107a抗体を加え、固定試料を細胞内パーフォリンおよびグランザイム-B内容物について染色した。FACS分析から、ビヒクルおよび非標的化対照TCBと比較してFOLR1 TCBで処置すると、統計学的に多い数の浸潤性のCD4+T細胞およびCD8+T細胞が腫瘍組織にあることが明らかになった。さらに、FOLR1 TCBで処置した腫瘍では、多数のTNF-□、IFN-□、およびIL-2を産生し、かつパーフォリン+/グランジム(granzym)-B+のCD4+T細胞およびCD8+T細胞が検出された。FOLR1 TCBで処置した腫瘍浸潤性T細胞はまた対照群と比較して高い脱顆粒率も示した。
【０３４９】
研究終了38日目に、全動物を屠殺した。腫瘍を取り出し、秤量した(図18)。10μg/マウスおよび1μg/マウスのFOLR1 TCBで処置した腫瘍の重量は対照群と比較して統計的に有意な差を示した。
【０３５０】
（表２３）
2018504092.tif 000026
【０３５１】
実施例29
二重特異性FolR1/CD3-κ-λ抗体の作製
ヘテロ二量体化アプローチ(例えば、ノブイントゥホール技術)を全く用いることなく、ヒトCD3とヒト葉酸受容体α(FolR1)に同時に結合することができる二重特異性抗体(各抗原について一価)を作製するために、共通軽鎖ライブラリーと、いわゆるCrossMab技術の組み合わせを適用した。すなわち、ヒト化CD3結合物質(CH2527_VL7_46/13)の可変領域を標準的なヒトIgG1抗体のCH1ドメインと融合させて、両特異性に共通の(Fcと融合した)VLVH交差分子を形成した。交差した対応物(VHCL)を作製するために、CD3特異的可変重鎖ドメイン(CH2527_VH_23/12)を定常ヒトλ軽鎖と融合させたのに対して、ヒトFolR1に特異的な可変重鎖ドメイン(共通軽鎖ライブラリーから単離したクローン16D5)を定常ヒトκ軽鎖に融合させた。これは、KappaSelectおよびLambdaFabSelectカラム(GE Healthcare)を用いた後の精製工程を適用して、望ましくないホモ二量体抗体を除去することによって、望ましい二重特異性抗体の精製を可能にする。
【０３５２】
抗体発現ベクターは全て、Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載のように標準的な組換えDNA技術を用いて作製した。分子生物学試薬を製造業者の推奨に従って使用した。遺伝子または遺伝子断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅したか、またはGeneart AG(Regensburg, Germany)において自動遺伝子合成によって合成オリゴヌクレオチドから作製した。PCR増幅したか、またはサブクローニングしたDNA断片をDNA配列決定(Synergene GmbH, Switzerland)によって確認した。標準的なMaxiprepキット(Qiagen)を用いてトランスフェクショングレードのプラスミドDNAを作製するために、プラスミドDNAを形質転換によって適切な大腸菌宿主株に導入し、この中で増幅した。二重特異性分子を産生するために、標準的なポリエチレンイミン(polyethlenimine)(PEI)に基づく方法を用いて、HEK293 EBNA細胞を、それぞれの遺伝子をコードするプラスミドでトランスフェクトした。3種類の発現ベクターの使用したプラスミド比は1:1:1であった。トランスフェクトした細胞を7日間、培養した後に、精製のために上清を回収した。以下のように二重特異性FolR1/CD3-κ-λ抗体を産生および精製した。
【０３５３】
1.一過的トランスフェクションおよび産生
下記のように、必要とされるベクター用のPEIを介したトランスフェクション手順を用いて、κ-λ二重特異性抗体をHEK293 EBNA細胞中で一過的に産生した。HEK293 EBNA細胞を無血清CD CHO培養培地中で懸濁培養した。500ml振盪フラスコ中で産生するために、トランスフェクションの24時間前に、4億個のHEK293  EBNA細胞を播種した(別のスケールについては、それに合うように全ての量を調整した)。トランスフェクションのために細胞を210xgで5分間、遠心分離し、上清を、20mlの予め温めたCD CHO培地と交換した。発現ベクターを200μgのDNAの最終量まで20mlのCD CHO培地中で混合した。540μlのPEIを添加した後に、溶液を15秒間ボルテックスし、その後に室温で10分間インキュベートした。その後、細胞をDNA/PEI溶液と混合し、500ml振盪フラスコに移し、5％CO2雰囲気のインキュベーターに入れて37℃で3時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、160mlのF17培地を添加し、細胞を24時間、培養した。トランスフェクションの1日後に、1mMバルプロ酸および7％Feed1を添加した。7日間、培養した後、精製のために210xgで15分間、遠心分離することによって上清を収集した。溶液を濾過滅菌(0.22μmフィルター)し、最終濃度0.01％w/vのアジ化ナトリウムを添加し、4℃に保った。
【０３５４】
2.精製
κ軽鎖に特異的なアフィニティ工程と、その後に、λ軽鎖に特異的なアフィニティ工程と、最後に、凝集物を除去するためのサイズ排除クロマトグラフィー工程を用いて3段階でκ-λ二重特異性抗体を精製した。一過的産生から入手した上清を(2M TRIS pH8.0を用いて)pH8.0に調整し、5カラム体積(cv)のバッファーA(50mM Tris、100mMグリシン、150mM NaCl、pH8.0)で平衡化したCapture Select kappa affinity matrixまたはHiTrap KappaSelect, GE Healthcare, カラム体積(cv)=1mlに適用した。15cvのバッファーAで洗浄した後に、25cvにわたるバッファーB(50mM Tris、100mMグリシン、150mM NaCl、pH2.0)へのpH勾配を用いて、タンパク質を溶出させた。関心対象のタンパク質を含有する画分をプールし、溶液のpHを(2M TRIS pH8.0を用いて)pH8.0に調整した。中和したプール画分を5カラム体積(cv)のバッファーA(50mM Tris、100mMグリシン、150mM NaCl、pH8.0)で平衡化したCapture Select lamda affinity matrix(現在はHiTrap LambdaFabSelect, GE Healthcare, カラム体積(cv)=1ml)に適用した。15cvのバッファーAで洗浄した後に、25cvにわたるバッファーB(50mM Tris、100mMグリシン、150mM NaCl、pH2.0)へのpH勾配を用いて、タンパク質を溶出させた。関心対象のタンパク質を含有する画分をプールし、溶液のpHを(2M TRIS pH 8.0を用いて)pH8.0に調整した。この溶液を、ウルトラコンセントレーター(Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius)を用いて濃縮し、その後に、20mMヒスチジン、pH6.0、140mM NaCl、0.01％Tween-20で平衡化したSuperdex(商標)200 10/300 GL(GE Healthcare)に適用した。サイズ排除後に、プール画分をウルトラコンセントレーター(Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius)を用いて再濃縮した。
【０３５５】
タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光率を用いて280nmでの光学密度(OD)を測定することによって求めた。構築物の純度および分子量は、製造業者の説明書(instrument Caliper LabChipGX, Perkin Elmer)に従って、還元剤の存在下および非存在下でのSDSキャピラリー電気泳動によって分析した。少量のタンパク質しか精製することができず、最終収率は0.17mg/Lであった。
【０３５６】
実施例30
二重特異性FolR1/CD3-κ-λ抗体を用いたT細胞性死滅
SKOV3細胞に対するκλ FolR1 TCBの活性を、新鮮に単離されたPBMCの存在下で試験した。負の対照としてDP47 TCBを含めた。24時間後および48時間後に、LDH放出によってSKOV3細胞のT細胞性死滅を確かめた。48時間後に、T細胞を回収し、CD4 T細胞上およびCD8 T細胞上でのCD69およびCD25アップレギュレーションをフローサイトメトリーによって測定した。
【０３５７】
κλ FolR1構築物は、CD4 T細胞上およびCD8 T細胞上でのCD69およびCD25アップレギュレーションを伴ってSKOV3細胞の死滅を濃度依存的に誘導する。
【０３５８】
κλ FolR1 TCBまたはDP47 TCBのいずれかの存在下でSKOV3細胞をPBMCとインキュベートした。24時間後および48時間後に、LDH放出を測定することによって腫瘍細胞の死滅を確かめた(図21)。κλ FolR1 TCBまたはDP47 TCBのいずれかの存在下でSKOV3細胞をPBMCとインキュベートした。48時間後に、CD4 T細胞上およびCD8 T細胞上でのCD25およびCD69アップレギュレーションをフローサイトメトリーによって測定した(図22)。
【０３５９】
実施例31
表面プラズモン共鳴による16D5および36F2 FolR1結合物質の生化学的特徴付け
様々な一価T細胞二重特異性形式または二価T細胞二重特異性形式の抗FolR1 16D5およびIgGまたはT細胞二重特異性の抗FolR1 36F2と、組換えヒト、カニクイザル、およびマウス葉酸受容体1(全てFc融合)との結合を表面プラズモン共鳴(SPR)によって評価した。全SPR実験をBiacore T200においてランニングバッファー(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％Surfactant P20, Biacore, GE Healthcare)としてHBS-EPを用いて25℃で行った。
【０３６０】
1.試験した分子
親和性およびアビディティの決定に使用した分子を表24に記載した。
【０３６１】
(表２４)SPR分析に使用した6種類の構築物の名前および説明
2018504092.tif 000027
【０３６２】
2.葉酸受容体1に対するアビディティ
抗FolR1 IgGまたはT細胞二重特異性と組換え葉酸受容体との相互作用のアビディティを下記のように求めた(表25)。
【０３６３】
ヒト、カニクイザル、およびマウス葉酸受容体1(FolR1-Fc)の組換えビオチン化単量体Fc融合を、標準的なカップリング説明書(Biacore, GE Healthcare)を用いてSAチップ上に直接カップリングした。固定化レベルは約300〜400 RUであった。3.7〜900nMの濃度範囲の抗FolR1 IgGまたはT細胞二重特異性を30μL/分の流れで180秒間にわたってフローセルに通した。解離を240秒間または600秒間モニタリングした。サイクルが終わるたびに、30秒の10mMグリシン-HCl pH2の2回注射を用いてチップ表面を再生した。組換えビオチン化マウスCD134 Fc融合を固定化した参照フローセル上で得られた応答を差し引くことによって、バルク屈折率差を補正した。IgGまたはT細胞二重特異性の二価結合に起因する結合曲線を(1:2結合であるが)1:1ラングミュア結合に近づけ、そのモデルを用いてフィッティングして、二価結合のアビディティを表す、みかけのKDを得た。Bia Evaluationソフトウェア(GE Healthcare)を用いて、相互作用のみかけのアビディティ定数をフィッティングの速度定数から導き出した。1+1 T細胞二重特異性形式の場合、相互作用は真の1:1であり、この構築物には1つしかFolR1結合物質がないので、KDは親和性を表す。
【０３６４】
(表２５)ヒトFolR1、カニクイザルFolR1、およびマウスFolR1における、IgGまたはT細胞二重特異性(TCB)である抗FolR1 16D5および36F2の二価結合(みかけのKDをもつアビディティ)
2018504092.tif 000028
【０３６５】
3.葉酸受容体1に対する親和性
抗FolR1 IgGまたはT細胞二重特異性と組換え葉酸受容体との相互作用の親和性を下記のように求めた(表26)。
【０３６６】
親和性を測定するために、約12000共鳴単位(RU)の抗ヒトFab特異的抗体の直接カップリング(Fab capture kit, GE Healthcare)を、標準的なアミンカップリングキット(GE Healthcare)を用いてCM5チップ上でpH5.0で行った。20nMの抗FolR1 IgGまたはT細胞二重特異性を10μl/minの流速で40秒間、捕捉した。参照フローセルには捕捉を行わなかった。ヒト、カニクイザル、またはマウス葉酸受容体1 Fc融合の希釈系列(12.3〜3000nM)を30μl/minで240秒間、全フローセル上に通して、会合期を記録した。解離期を300秒間モニタリングし、試料溶液をHBS-EPに切り替えることによって誘発した。サイクルが終わるたびに、60秒の10mMグリシン-HCl pH1.5の2回注射を用いてチップ表面を再生した。参照フローセル1上で得られた応答を差し引くことによってバルク屈折率差を補正した。Bia Evaluationソフトウェア(GE Healthcare)を用いて1:1ラングミュア結合にフィッティングさせることによって、相互作用の親和定数を速度定数から導き出した。
【０３６７】
(表２６)ヒトFolR1、カニクイザルFolR1、およびマウスFolR1に対する、IgGまたはT細胞二重特異性(TCB)である抗FolR1 16D5および36F2の一価結合(親和性)
2018504092.tif 000029
【０３６８】
ヒトFolR1-FcおよびカニクイザルFolR1-Fcに対する36F2 TCBの親和性(一価結合)は似ており、両方とも約1000nMであるのに対して、マウスFolR1-Fcに対する親和性はわずかに良く、約300nMである。36F2はマウスモデルおよび霊長類モデルにおいて使用することができ、代理は必要とされない。
【０３６９】
ヒトFolR1に対する36F2 TCBのアビディティ(みかけのKD)は、ヒトFolR1に対する16D5 TCBの親和性の約1/30である。二価形式では、36F2 TCBは低ナノモル範囲であるのに対して、16D5 TCBは低ピコモル範囲である(1000倍の差)。FolR1は腫瘍細胞上に発現しており、卵巣がん、乳がん、腎臓がん、結腸直腸がん、肺がん、および他の固形がんを含む一連の上皮悪性腫瘍のがん細胞表面に中間(intermittent)レベルおよび高レベルで過剰発現しており、正常組織にある極性化した上皮細胞の限られたサブセットの頂端表面にも発現している。これらの非腫瘍性の正常細胞は低レベルでしかFolR1を発現せず、例えば、肺胞表面にある気管支上皮細胞、尿細管細胞の腎皮質管腔境界、網膜色素上皮(側底膜)、および脈絡叢を含む。
【０３７０】
16D5 TCBは、少量のFolR1を発現する正常組織細胞に結合し、その結果として、正常組織細胞のT細胞性死滅をもたらす。これは、少なくとも部分的には、カニクイザルにおいて10μg/kgで観察された、限られた耐性を説明するのかもしれない。本発明者らは、T細胞二重特異性分子の親和性の低下が、標的密度が大きい組織と標的密度が小さい組織との区別を大きくし、それによって、二価結合およびアビディティを利用することで毒性を小さくできるかどうかを確かめたかった。低親和性は効力および有効性が小さいことと関連することが多いので、普通、低親和性結合物質は、さらなる分析のための適切な候補として選択されない。それにもかかわらず、低親和性FolR1結合物質36F2をいくつかの形式で開発し、その生物学的特性について特徴付けた。二価T細胞二重特異性形式で使用した36F2の場合、アビディティ効果(一価結合と二価結合との差)は約250倍(1000nM対4nM)である。標的密度が小さい時には、親和性は相互作用を決定し、1000nMではTCBの小さな効力につながった。しかしながら、標的密度が大きな時には、分子のアビディティが働き始め、4nMでは、TCBの大きな活性につながった(実施例32を参照されたい)。
【０３７１】
別のアプローチでは、本発明者らは、16D5の一価形式と、二価形式の16D5の低親和性変種(約10〜40nMの親和性)を作製した。一価形式(1+1)で使用した16D5結合物質の親和性は約50nMである。アビディティ効果を利用することで、標的密度が大きい組織と標的密度が小さい組織を良好に区別することができる。
【０３７２】
実施例32
36F2 TCB、Mov19 TCB、および21A5 TCBによって誘導されたSKov-3細胞のT細胞性死滅
SKov-3細胞(中FolR1)において、36F2 TCB、Mov19 TCB、および21A5 TCBによって媒介されたT細胞性死滅を評価した。ヒトPBMCをエフェクターとして使用し、二重特異性抗体と24時間および48時間インキュベートした時に死滅が検出された。簡単に述べると、標的細胞をトリプシン/EDTAを用いて回収し、洗浄し、平底96ウェルプレートを用いて25000細胞/ウェルの密度でプレートした。細胞を一晩、付着させた。健常ヒトドナーから入手した濃縮リンパ球調製物(バフィーコート)のHistopaque密度遠心分離によって末梢血単核球(PBMC)を調製した。新鮮血を滅菌PBSで希釈し、Histopaque勾配(Sigma, #H8889)の上にかぶせた。遠心分離(450xg、30分、室温)した後に、PBMCを含有する中間層(interphase)の上にある血漿を捨て、PBMCを新たなfalconチューブに移し、その後に、チューブを50mlのPBSで満たした。混合物を遠心分離(400xg、10分、室温)し、上清を捨て、PBMCペレットを滅菌PBSで2回洗浄した(遠心分離工程350xg、10分)。結果として生じたPBMC集団を自動計数し(ViCell)、10％FCSおよび1％L-アラニル-L-グルタミン(Biochrom, K0302)を含有するRPMI1640培地に溶解し、さらに使用するまで(24時間以下)細胞インキュベーターに入れて37℃、5％CO2で保管した。死滅アッセイのために、抗体を、示された濃度(0.005pM〜5nMの範囲、3回繰り返した)で添加した。PBMCを標的細胞に10:1の最終E:T比で添加した。37℃、5％CO2で24時間および48時間インキュベートした後に、アポトーシス/壊死細胞が細胞上清に放出したLDHを定量することによって標的細胞死滅を評価した(LDH検出キット、Roche Applied Science, #11 644 793 001)。標的細胞の最大溶解(=100％)は、標的細胞を1％TritonX-100とインキュベートすることによって達成した。最小溶解(=0％)とは、エフェクター細胞とコインキュベートされたが、二重特異性構築物とコインキュベートされていない標的細胞を指す。
【０３７３】
結果から、36F2によって誘導された死滅はMov19 TCBおよび21A5 TCBと比較して強く低下したことが分かる(図23A〜B)。GraphPadPrism6を用いて計算した、死滅アッセイに関連するEC50値を表27にまとめた。
【０３７４】
(表２７)36F2 TCB、Mov19 TCB、および21A5 TCBによって誘導されたFolR1発現SKov-3細胞のT細胞性死滅のEC50値(pM)
2018504092.tif 000030
*曲線は飽和に達しなかった。値は仮定の値である。
【０３７５】
実施例33
様々な一価T細胞二重特異性形式および二価T細胞二重特異性形式の36F2 TCBおよび16D5 TCBによって誘導されたT細胞性死滅
36F2 TCB、16D5 TCB、16D5 TCB 古典的、16D5 TCB 1+1、および16D5 TCB HT抗体によって媒介された、ヒーラー(高FolR1、約200万コピー、表14、図27)、Skov-3(中FolR1、約70000〜90000コピー、表14、図27)、およびHT-29(低FolR1、約10000、表14、図27)ヒト腫瘍細胞のT細胞性死滅を評価した。負の対照としてDP47 TCB抗体を含めた。ヒトPBMCをエフェクターとして使用し、二重特異性抗体と24時間インキュベートした時に死滅が検出された。簡単に述べると、標的細胞をトリプシン/EDTAを用いて回収し、洗浄し、平底96ウェルプレートを用いて25000細胞/ウェルの密度でプレートした。細胞を一晩、付着させた。健常ヒトドナーから入手した濃縮リンパ球調製物(バフィーコート)のHistopaque密度遠心分離によって末梢血単核球(PBMC)を調製した。新鮮血を滅菌PBSで希釈し、Histopaque勾配(Sigma, #H8889)の上にかぶせた。遠心分離(450xg、30分、室温)した後に、PBMCを含有する中間層の上にある血漿を捨て、PBMCを新たなfalconチューブに移し、その後に、チューブを50mlのPBSで満たした。混合物を遠心分離(400xg、10分、室温)し、上清を捨て、PBMCペレットを滅菌PBSで2回洗浄した(遠心分離工程350xg、10分)。結果として生じたPBMC集団を自動計数し(ViCell)、10％FCSおよび1％L-アラニル-L-グルタミン(Biochrom, K0302)を含有するRPMI1640培地に溶解し、さらに使用するまで(24時間以下)細胞インキュベーターに入れて37℃、5％CO2で保管した。死滅アッセイのために、抗体を、示された濃度(0.01pM〜100nMの範囲、3回繰り返した)で添加した。PBMCを標的細胞に10:1の最終E:T比で添加した。37℃、5％CO2で24時間インキュベートした後に、アポトーシス/壊死細胞が細胞上清に放出したLDHを定量することによって標的細胞死滅を評価した(LDH検出キット、Roche Applied Science, #11 644 793 001)。標的細胞の最大溶解(=100％)は、標的細胞を1％TritonX-100とインキュベートすることによって達成した。最小溶解(=0％)とは、エフェクター細胞とコインキュベートされたが、二重特異性構築物とコインキュベートされていない標的細胞を指す。
【０３７６】
結果から、36F2 TCBによって誘導された3種類全てのFolR1+標的細胞株の標的特異的死滅は、16D5 TCBによって誘導された死滅と比較してかなり弱いことが分かる(図24A〜C、表29)。一価16D5 TCB(16D5 HTおよび16D51+1)によって誘導された標的特異的死滅は二価16D5 TCB(16D5 TCBおよび16D5 TCB古典的)と比較して悪い。GraphPadPrism6を用いて計算した、死滅アッセイに関連するEC50値を表28にまとめた。重要なことに、このデータから、二価2+1 TCB形式の36F2 FolR1結合物質を用いると、16D5 FOLR1 TCBと比較して治療可能時間域(therapeutic window)が広がることが分かる(図24A〜C)。16D5と36F2 FOLR1 TCBとの間の効力低下は、ヒーラー細胞(FOLR1高発現。表28を参照されたい: 16D5 TCB=0.8対36F2 TCB 36.0)については約45倍、Skov3細胞(FOLR1中発現。表28を参照されたい: 16D5 TCB=0.6対36F2 TCB 178.4)については約297倍であるが、この低下は、FOLR1発現が少ないHT29については、ほぼ7000倍である(表28を参照されたい: 16D5 TCB=5.7対36F2 TCB 39573)。従って、36F2 FOLR1 TCBは高発現細胞と低発現細胞を区別し、いくつかの正常な非腫瘍組織の細胞が非常に低いレベルのFolR1(細胞1個あたり約1000コピー未満)を発現するので、このことは毒性を小さくするのに特に重要である。この観察と一致して、下記の実施例35において述べる結果から、36F2 TCBは初代細胞のT細胞性死滅を誘導しないが(図26A〜D)、16D5 TCBについては48時間のインキュベーション後に、HRCEpiC細胞およびHRPEpiC細胞において、いくらかの死滅を観察できることが分かる(図26BおよびC)。36F2 TCBのこの重要な特徴は、FOLR1発現が多いか、または中程度の腫瘍組織の強力な死滅を媒介するが、発現が少ない(部分的に極性化した)正常組織の強力な死滅を媒介しないようにFolR1陽性腫瘍を処置するための投薬を可能にする。特に、この特徴は、同じ低親和性36F2結合物質を有する1+1一価形式を用いた時に観察されなかったので、二価2+1逆形式の36F2 TCBのアビディティによって媒介されるように思われる。別の言い方をすれば、二価2+1形式の36F2 TCBは比較的低い親和性のFolR1結合部分を含むが、FolR1高発現細胞とFolR1低発現細胞の区別を可能にするアビディティ効果をもつ。腫瘍細胞はFolR1を高レベルまたは中間レベルで発現するので、このTCBは腫瘍細胞に選択的に結合し、FolR1を低レベルで発現するか、全く発現しない正常な非がん細胞には結合しない。
【０３７７】
上記の有利な特徴に加えて、二価2+1逆形式の36F2 TCBには、化学的架橋結合も他のハイブリッドアプローチも必要としないという利点もある。このために、二価2+1逆形式の36F2 TCBは、患者、例えば、FolR1陽性がん腫瘍を有する患者を治療するための医薬を製造するのに適している。二価2+1逆形式の36F2 TCBは、標準的なCHOプロセスを用いて、少ない凝集物で産生することができる。さらに、二価2+1の36F2 TCBはヒト配列およびヒト化配列を含み、このために、ヒトに投与された時に、免疫原性が高いラットポリペプチドおよびマウスポリペプチドを用いた分子よりも優れている。さらに、FcgR結合が無くなるように二価2+1形式の36F2 TCBを操作した。従って、二価2+1形式の36F2 TCBはFcgR架橋および注入反応を引き起こさないので、患者に投与された時の安全性が高い。
【０３７８】
前記の結果によって証明されたように、二価2+1 逆形式の36F2 TCBは、そのヘッドトゥテール形状のために、完全な標的細胞死滅を誘導する非常に強力な分子となっている。その二価性はアビディティおよび効力を高めるが、高発現細胞と低発現細胞との区別も可能になる。アビディティ効果のために、標的を高発現する細胞または中発現する細胞が好まれるので、FolR1を低レベルで発現する正常細胞のT細胞性死滅に起因する毒性は小さくなる。
【０３７９】
二価2+1形式の36F2 TCBおよび本明細書において開示された他の態様のさらなる利点は、ヒトFolR1、カニクイザルFolR1、およびマウスFolR1に結合するので、これらの臨床開発には代理分子(surrogate molecule)の使用が必要とされないことである。従って、本明細書において開示された分子は、3つ全ての種に由来するFolR1を認識しない、以前に述べられたFolR1に対する抗体とは異なるエピトープを認識する。
【０３８０】
(表２８)24時間インキュベートした後の、様々な一価T細胞二重特異性形式および二価T細胞二重特異性形式の36F2 TCBおよび16D5 TCBによって誘導されたFolR1発現腫瘍細胞のT細胞性死滅のEC50値(pM)
2018504092.tif 000031
*曲線は飽和に達せず、仮定の値にすぎない。
【０３８１】
表29は、試験した様々なT細胞株に対する16D5 TCBおよび36F2 TCBのEC50値の比較を示す。得られたEC50値から、Δ(16D5 TCBのEC50-36F2 TCBのEC50)およびx倍の差(16D5 TCBのEC50/36F2 TCBのEC50)を計算した。
【０３８２】
(表２９)16D5 TCBおよび36F2 TCBのEC50値の比較
2018504092.tif 000032
*曲線は飽和に達せず、仮定の値にすぎない。
【０３８３】
EC50の計算値から、標的細胞上のFolR1発現が少ないほど、36F2 TCBと16D5 TCBとの差異が大きくなることがはっきりと分かる。
【０３８４】
16D5 TCB および 36F2 TCBのEC50値を比較するために行った計算と同じ計算を、16D5 TCB と2種類の一価16D5 TCB(16D5 TCB HTおよび16D5 1+1)についても行った。表30および表31は、16D5 TCBのEC50値と16D5 TCB HTのEC50値(表30)および16D5 TCBのEC50値と16D5 TCB 1+1のEC50値(表31)の比較、ならびに対応するΔ(16D5 TCBのEC50-16D5 TCB HT/1+1のEC50)およびx倍の差(16D5 TCBのEC50/16D5 TCB HT/1+1のEC50)を示す。
【０３８５】
(表３０)16D5 TCB(2+1 逆)および16D5 TCB HTのEC50値の比較
2018504092.tif 000033
【０３８６】
(表３１)16D5 TCBおよび16D5 TCB 1+1のEC50値の比較
2018504092.tif 000034
*曲線は飽和に達せず、仮定の値にすぎない。
【０３８７】
16D5 TCBのEC50値と36F2 TCBのEC50値の比較(表29)から、標的細胞上のFolR1発現が少ないほど、EC50値の差異が大きくなることが分かる。この効果は、16D5 TCBと一価16D5 TCBの比較では見られない(表29および表30)。16D5 TCB 1+1(表31)の場合も、FolR1発現が減少するにつれて、16D5 TCBのEC50と16D5 TCB 1+1のEC50との差異がわずかに増加するが、16D5 TCBと36F2 TCBとの比較で見られるほど顕著ではない。
【０３８８】
実施例34
36F2 TCB抗体および16D5 TCB抗体によって誘導されたFolR1発現腫瘍細胞のT細胞性死滅後の、CD8+エフェクター細胞上およびCD4+エフェクター細胞上でのCD25およびCD69のアップレギュレーション
36F2 TCBおよび16D5 TCBによって媒介された、FolR1を発現するヒーラー、SKov-3、およびHT-29腫瘍細胞のT細胞性死滅後のCD8+T細胞およびCD4+T細胞の活性化を、T細胞活性化マーカーCD25(後期活性化マーカー)およびCD69(初期活性化マーカー)を認識する抗体を用いたFACS分析によって評価した。DP47 TCBを非結合対照として含めた。抗体および死滅アッセイ条件は、本質的に前記(実施例32)のとおりであり、同じ抗体濃度範囲(0.01pM〜100nM、3回繰り返した)、E:T比10:1、および48時間のインキュベーション時間を用いた。
【０３８９】
インキュベーション後に、PBMCを丸底96ウェルプレートに移し、400xgで4分間、遠心分離し、0.1％BSA含有PBSで2回洗浄した。CD8(PE抗ヒトCD8, BD #555635)、CD4(Brilliant Violet 421(商標)抗ヒトCD4, Biolegend #300532)、CD69(FITC抗ヒトCD69, BD #555530)、およびCD25(APC抗ヒトCD25 BD #555434)の表面染色を製造業者の説明書に従って行った。細胞を150μl/ウェルの0.1％BSA含有PBSで2回洗浄した。遠心分離後に、FACS測定のために、試料を200μl/ウェルのPBS 0.1％に再懸濁した。試料をBD FACS Canto IIで分析した。
【０３９０】
36F2 TCBは、ヒーラー(図25A)およびSKov-3(図25B)細胞を死滅した後に、CD8+T細胞およびCD4+T細胞上にある活性化マーカー(CD25、CD69)の標的特異的アップレギュレーションを誘導した。16D5 TCBと比較すると、36F2によって誘導されたCD8+T細胞およびCD4+T細胞上にあるCD25およびCD69のアップレギュレーションはかなり弱い。
【０３９１】
HT-29(低FolR1)では、最も高い濃度の36F2 TCBでしか活性化マーカーのアップレギュレーションを見ることができない。対照的に、16D5 TCBを用いると、既にかなり低い抗体濃度でCD25およびCD69のアップレギュレーションを見ることができる(図25C)。
【０３９２】
腫瘍溶解実験でも見られるように、死滅後の、T細胞(CD4+およびCD8+)上にある活性化マーカー(CD25およびCD69)の分析から、標的細胞上のFolR1発現レベルが少ないほど、16D5 TCBと36F2 TCBとの差異が大きくなることがはっきりと分かる。
【０３９３】
実施例35
36F2 TCBおよび16D5 TCBによって誘導された初代細胞のT細胞性死滅
初代細胞(ヒト腎皮質上皮細胞(HRCEpiC)(ScienCell Research Laboratories; カタログ番号4110)およびヒト網膜色素上皮細胞(HRPEpiC)(ScienCell Research Laboratories; カタログ番号6540))において、36F2 TCBおよび16D5 TCBによって媒介されたT細胞性死滅を評価した。HT-29細胞(低FolR1)を対照細胞株として含めた。DP47 TCBは非結合対照として役立った。ヒトPBMCをエフェクターとして使用し、二重特異性抗体と24時間および48時間インキュベートした時に死滅が検出された。簡単に述べると、標的細胞をトリプシン/EDTAを用いて回収し、洗浄し、平底96ウェルプレートを用いて25000細胞/ウェルの密度でプレートした。細胞を一晩、付着させた。健常ヒトドナーから入手した濃縮リンパ球調製物(バフィーコート)のHistopaque密度遠心分離によって末梢血単核球(PBMC)を調製した。新鮮血を滅菌PBSで希釈し、Histopaque勾配(Sigma, #H8889)の上にかぶせた。遠心分離(450xg、30分、室温)した後に、PBMCを含有する中間層の上にある血漿を捨て、PBMCを新たなfalconチューブに移し、その後に、チューブを50mlのPBSで満たした。混合物を遠心分離(400xg、10分、室温)し、上清を捨て、PBMCペレットを滅菌PBSで2回洗浄した(遠心分離工程350xg、10分)。結果として生じたPBMC集団を自動計数し(ViCell)、10％FCSおよび1％L-アラニル-L-グルタミン(Biochrom, K0302)を含有するRPMI1640培地に溶解し、さらに使用するまで(24時間以下)細胞インキュベーターに入れて37℃、5％CO2で保管した。死滅アッセイのために、抗体を、示された濃度(0.01pM〜10nMの範囲、3回繰り返した)で添加した。PBMCを標的細胞に10:1の最終E:T比で添加した。37℃、5％CO2で24時間および48時間インキュベートした後に、アポトーシス/壊死細胞が細胞上清に放出したLDHを定量することによって標的細胞死滅を評価した(LDH検出キット、Roche Applied Science, #11 644 793 001)。標的細胞の最大溶解(=100％)は、標的細胞を1％TritonX-100とインキュベートすることによって達成した。最小溶解(=0％)とは、エフェクター細胞とコインキュベートされたが、二重特異性構築物とコインキュベートされていない標的細胞を指す。
【０３９４】
結果から、36F2 TCBは初代細胞のT細胞性死滅を誘導しないが(図26A〜D)、16D5 TCBについてはHRCEpiC細胞およびHRPEpiC細胞において48時間のインキュベーション後に、ある程度の死滅を観察できる(図26BおよびD)ことが分かる。前記のように、16D5 TCBと36F2 TCBとの間で、HT-29細胞間のT細胞性死滅の大きな差異が観察された(図26E、F)。
【０３９５】
実施例36
DP47 GS TCB(2+1 Crossfab-IgG P329G LALA逆=「非標的化TCB」)の調製
前記の実験では対照として「非標的化TCB」を使用した。この二重特異性抗体はCD3eに結合するが、他のいかなる抗原とも結合せず、従って、T細胞を、いかなる標的細胞とも架橋することができない(その後に、死滅を誘導することができない)。従って、このアッセイでは、非特異的なT細胞活性化をモニタリングするために負の対照として「非標的化TCB」を使用した。この非標的化 TCBをWO2014/131712に記載のように調製した。手短に述べると、重鎖DNA配列および軽鎖DNA配列の可変領域は、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入した定常重鎖または定常軽鎖とインフレームでサブクローニングされている。MPSVプロモーターによって抗体を発現させた。合成ポリAシグナル配列はCDSの3’末端に位置する。さらに、各ベクターはEBV OriP配列を含有する。
【０３９６】
ポリエチレンイミンを用いて、HEK293-EBNA細胞を哺乳動物発現ベクターでコトランスフェクトすることによって前記分子を産生した。前記細胞を1:2:1:1比(「ベクター重鎖Fc(ホール)」:「ベクター軽鎖」:「ベクター軽鎖Crossfab」:「ベクター重鎖Fc(ノブ)-FabCrossfab」)の対応する発現ベクターでトランスフェクトした。
【０３９７】
トランスフェクションのために、HEK293 EBNA細胞を無血清CD CHO培養培地中で懸濁培養した。500ml振盪フラスコ中で産生するために、トランスフェクションの24時間前に、4億個のHEK293 EBNA細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を210xgで5分間、遠心分離し、上清を20mlの予め温めたCD CHO培地と交換した。発現ベクターを200gのDNAの最終量まで20mlのCD CHO培地中で混合した。540μlのPEIを添加した後に、溶液を15秒間ボルテックスし、その後に室温で10分間インキュベートした。その後、細胞をDNA/PEI溶液と混合し、500ml振盪フラスコに移し、5％CO2雰囲気のインキュベーターに入れて37℃で3時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、160mlのF17培地を添加し、細胞を24時間、培養した。トランスフェクションの1日後に、1mMバルプロ酸および7％Feed1を添加した。7日間、培養した後、精製のために210xgで15分間、遠心分離することによって上清を収集した。溶液を濾過滅菌(0.22・mフィルター)し、最終濃度0.01％w/vのアジ化ナトリウムを添加し、4℃に保った。
【０３９８】
プロテインAを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって、細胞培養上清から分泌タンパク質を精製した。上清を、40mlの20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、pH7.5で平衡化したHiTrap ProteinA HPカラム(CV=5mL, GE Healthcare)にロードした。少なくとも10カラム体積の20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、pH7.5で洗浄することによって、結合しなかったタンパク質を除去した。20mMクエン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、pH7.5から20mMクエン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、pH2.5の20カラム体積にわたる勾配の間に標的タンパク質を溶出させた。1/10の0.5Mリン酸ナトリウム、pH8を添加することによって、タンパク質溶液を中和した。標的タンパク質を濃縮および濾過した後に、pH6.0の20mMヒスチジン、140mM塩化ナトリウム溶液で平衡化したHiLoad Superdex 200カラム(GE Healthcare)にロードした。
【０３９９】
精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光率を用いて280nmでの光学密度(OD)を測定することによって求めた。
【０４００】
分子の純度および分子量は、還元剤の存在下および非存在下でのCE-SDS分析によって分析した。Caliper LabChip GXIIシステム(Caliper lifescience)を製造業者の説明書に従って使用した。分析のために2ug試料を使用する。
【０４０１】
抗体試料の凝集物含有率は、25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-アルギニン一塩酸塩、0.02％(w/v)NaN3、pH6.7のランニングバッファーに溶解してTSKgel G3000 SW XL分析用サイズ排除カラム(Tosoh)を用いて25℃で分析した。
【０４０２】
(表３２)DP47 GS TCBの産生および精製の概要
2018504092.tif 000035
【０４０３】
(表３３)DP47 GS TCBのCE-SDS分析
2018504092.tif 000036
【０４０４】
実施例37
16D5 TCBおよび9D11 TCBならびにその対応するCD3脱アミド変種N100AおよびS100aAとCD3発現ジャーカット細胞との結合
CD3発現不死化Tリンパ球株(ジャーカット)において、16D5 TCBならびに対応するCD3脱アミド変種16D5 TCB N100Aおよび16D5 TCB S100aA、ならびに9D11 TCBならびに脱アミド変種9D11 TCB N100Aおよび9D11 TCB S100aAとヒトCD3との結合を評価した。簡単に述べると、細胞を回収し、計数し、生存率について調べ、FACS緩衝液(100μl PBS 0.1％BSA)に2x106細胞/mlで再懸濁した。100μlの細胞懸濁液(0.2x106個の細胞を含有する)を丸底96ウェルプレートに入れて、様々な濃度の二重特異性抗体(686pM〜500nM)と4℃で30分間インキュベートした。冷PBS0.1％BSAを用いた2回の洗浄工程後に、試料を、PE結合AffiniPure F(ab')2断片ヤギ抗ヒトIgG Fcg断片特異的二次抗体(Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170)と4℃でさらに30分間、再インキュベートした。洗浄後に、試料を冷PBS 0.1％BSAで2回洗浄した後に、すぐFACS CantoII(Software FACS Diva)を用いたFACSによって分析した。GraphPadPrism6を用いて結合曲線を得た(図28A〜B)。
【０４０５】
結果から、脱アミド変種N100AおよびS100aAとCD3との結合は親抗体16D5 TCB(図28A)および9D11 TCB(図28B)と比較して低下したことが分かる。
【０４０６】
実施例38
16D5 TCBおよび9D11 TCBならびにそのCD3脱アミド変種N100AおよびS100aAによって誘導されたSKov-3細胞およびHT-29細胞のT細胞性死滅
Kov-3(中FolR1)およびHT-29(低FolR1)細胞において、16D5 TCBならびに対応するCD3脱アミド変種16D5 TCB N100Aおよび16D5 TCB S100aA、ならびに9D11 TCBならびに脱アミド変種9D11 TCB N100Aおよび9D11 TCB S100aAによって媒介されたT細胞性死滅を評価した。ヒトPBMCをエフェクターとして使用し、二重特異性抗体と24時間インキュベートした時に死滅が検出された。簡単に述べると、標的細胞をトリプシン/EDTAを用いて回収し、洗浄し、平底96ウェルプレートを用いて25000細胞/ウェルの密度でプレートした。細胞を一晩、付着させた。健常ヒトドナーから入手した濃縮リンパ球調製物(バフィーコート)のHistopaque密度遠心分離によって末梢血単核球(PBMC)を調製した。新鮮血を滅菌PBSで希釈し、Histopaque勾配(Sigma, #H8889)の上にかぶせた。遠心分離(450xg、30分、室温)した後に、PBMCを含有する中間層の上にある血漿を捨て、PBMCを新たなfalconチューブに移し、その後に、チューブを50mlのPBSで満たした。混合物を遠心分離(400xg、10分、室温)し、上清を捨て、PBMCペレットを滅菌PBSで2回洗浄した(遠心分離工程350xg、10分)。結果として生じたPBMC集団を自動計数し(ViCell)、10％FCSおよび1％L-アラニル-L-グルタミン(Biochrom, K0302)を含有するRPMI1640培地に溶解し、さらに使用するまで(24時間以下)細胞インキュベーターに入れて37℃、5％CO2で保管した。死滅アッセイのために、抗体を、示された濃度(0.01pM〜10nMの範囲、3回繰り返した)で添加した。PBMCを標的細胞に10:1の最終E:T比で添加した。37℃、5％CO2で24時間インキュベートした後に、アポトーシス/壊死細胞が細胞上清に放出したLDHを定量することによって標的細胞死滅を評価した(LDH検出キット、Roche Applied Science, #11 644 793 001)。標的細胞の最大溶解(=100％)は、標的細胞を1％TritonX-100とインキュベートすることによって達成した。最小溶解(=0％)とは、エフェクター細胞とコインキュベートされたが、二重特異性構築物とコインキュベートされていない標的細胞を指す。
【０４０７】
結果から、SKov-3細胞において、CD3脱アミド変種16D5 TCB N100Aおよび16D5 S100aAによって誘導された死滅は、16D5 TCBによって誘導された死滅と同等であることが分かる(図29A)。同じことが9D11 TCBならびにその変種9D11 TCB N100Aおよび9D11 TCB S100aAにも当てはまる(図29B)。FolR1低発現HT-29細胞では、S100aA変種は、16D5 TCB(図30A)ならびに9D11 TCB(図30B)の場合である死滅効率の低下を示す。GraphPadPrism6を用いて計算した死滅アッセイに関連するEC50値を表35に示した。
【０４０８】
(表３５)16D5 TCBおよび9D11 TCBならびにその脱アミド変種N100AおよびA100aAによって誘導された、FolR1を発現するSKov-3細胞およびHT-29細胞のT細胞性死滅のEC50値(pM)
2018504092.tif 000037
*確認できず
【０４０９】
実施例39
共通軽鎖を含有するムチン-1 T細胞二重特異性構築物の作製
遺伝子合成
Geneart AG(Regensburg, Germany)において、自動遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチドおよびPCR産物から望ましい遺伝子セグメントを合成した。
【０４１０】
MUC1抗原の産生および精製
ヒトムチン-1(MUC1)の「sea urchin sperm protein, enterokinase and agrin」(SEA)ドメインに対する共通軽鎖(CLC)抗体を作製するために、SEAドメインをコードするDNA断片を合成した(Uniprot P15941、アミノ酸1041-1151)。Ligtenber et al. (1992). Cell-associated episialin is a complex containing two proteins derived from a common precursor. J Biol Chem 267, 6171-7. Parry et al., Identification of MUC1 Proteolytic Cleavage Sites in Vivo. Biochem Biophys Res Commun 283, 715-20に以前に述べられたプロセスである、位置G1097とS1098との間でのSEAの自己タンパク分解を阻止するために、G1097とS1098との間に4つのさらなるグリシン残基を挿入した。この挿入によってコンホメーションストレスが軽減し、タンパク質は無傷のまま保たれる。DNA断片を誘導性細菌発現ベクターであるpETXXに挿入した。結果として生じたプラスミドは、C末端aviタグとHis6タグをもつSEAドメイン(SEQ ID NO:47)を発現する。aviタグを、BirAを介したインビボビオチン化に使用したのに対して、His6タグ(SEQ ID NO:47)を精製に使用した。
【０４１１】
500mlの培養物に細菌株BL21 D3を接種し、対応するプラスミドおよびBirAを発現するプラスミドで形質転換し、OD600 0.8で、1mM IPTGで誘導した。その後、培養物を25℃で一晩インキュベートし、遠心分離によって回収した。細菌ペレットを25mlのBugBuster(登録商標)Protein Extraction Reagent(Millipore)に再懸濁し、プロトコールに記載のように室温で20分間インキュベートした。16000xgで20分間、遠心分離した後に、上清を濾過し、IMACカラム(His gravitrap, GE Healthcare)にロードした。カラムを40mlのウォッシングバッファー(500mM NaCl、20mMイミダゾール、20mM NaH2PO4 pH7.4)で洗浄した。カラムから溶出させた後に(500mM NaCl、500mMイミダゾール、20mM NaH2PO4 pH7.4)、PD10カラム(GE Healthcare)を用いて溶出液を再緩衝化した。
【０４１２】
CLC Fabライブラリーからの抗ヒトMUC1 SEAドメイン結合物質の選択
ヒトMUC1のSEAドメインに対する選択を、大腸菌(E.coli)に由来し、インビボでビオチン化したMUC1を用いて行った。ビオチンリガーゼBirAを同時発現させることによって、抗原をC末端aviタグを介して酵素によりビオチン化した。パニング回を以下のパターンに従って溶解状態で行った。1.CLCライブラリーのファージミド粒子を、100nMビオチン化抗原タンパク質に総体積1mlで0.5時間、結合させる。2.5.4x107個のストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを添加することによって、ビオチン化抗原と、取り付けられた特異的に結合しているファージを10分間、捕捉する。3.5x1mlのPBS/Tween20および5x1mlのPBSを用いてビーズを洗浄する。4.1mlの100mMトリエチルアミン(TEA)を添加することによってファージ粒子を10分間、溶出させ、500ulの1M Tris/HCl pH7.4を添加することによって中和する。5.対数期大腸菌TG1細胞に、上清中のファージ粒子を再感染させ、ヘルパーファージVCSM13を感染させ、その後に、後の選択回において使用するファージミド粒子をPEG/NaCl沈殿する。選択は、一定の、または漸減(10-7M〜2x10-9M)抗原濃度のいずれかを用いて3回以上行った。2回目には、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレートを用いて抗原:ファージ複合体を捕捉した。以下の通りに、ELISAによって特異的結合物質を特定した。1ウェルあたり100ulの50nMビオチン化抗原をニュートラアビジンプレート上にコーティングした。Fab含有細菌上清を添加し、抗Flag/HRP二次抗体を用いてFlagタグを介して、結合しているFabを検出した。配列決定(58D6 VH、106D2 VH、110A5 VH)およびさらなる分析のために、バックグラウンドより大きなシグナルを示すクローンのVHドメインを最終候補リストに載せた。全クローンがIGHV3-23生殖系列配列に由来する(図31)。注目すべきことに、クローン58D6および110A5は、CDR3にしか無作為化されなかったライブラリーから生じたのに対して、クローン106D2は、3つ全てのCDRにおいて無作為化されたライブラリーから特定された。生殖系列配列から逸脱したCDR1およびCDR2の位置をイタリック体で印刷した。VH変種を全て、同じ共通軽鎖(共通軽鎖VL)と組み合わせて発現させた。
【０４１３】
Fabの精製
反応速度パラメータを正確に分析するために、細菌培養物からFab(58D6 VH、106D2 VH、110A5 VHの可変重鎖ドメインのタンパク質配列。全クローンが、SEQ ID NO:31に列挙した同じCLC可変ドメインを発現した)を精製した。各クローンについて、500ml培養物に、対応するファージミドを有する細菌を接種し、OD600 0.9で、1mM IPTGで誘導した。その後、培養物を25℃で一晩インキュベートし、遠心分離で回収した。再懸濁したペレットを、25mlのPPB緩衝液(30mM Tris-HCl pH8、1mM EDTA、20％スクロース)中で20分間インキュベートした後に、細菌を再遠心分離し、上清を回収した。このインキュベーション工程を、25mlの5mM MgSO4溶液を用いて1回繰り返した。両インキュベーション工程の上清をプールし、濾過し、IMACカラム(His gravitrap, GE Healthcare)にロードした。その後に、カラムを40mlのウォッシングバッファー(500mM NaCl、20mMイミダゾール、20mM NaH2PO4 pH7.4)で洗浄した。溶出させた後に(500mM NaCl、500mMイミダゾール、20mM NaH2PO4 pH7.4)、PD10カラム(GE Healthcare)を用いて溶出液を再緩衝化した。次いで、精製されたFabの反応速度パラメータを、100nM〜6.25nMの希釈系列(row)中でSPR分析(Proteon XPR36, Biorad)によって研究した。
【０４１４】
BioRadのProteOn XPR36バイオセンサーを用いたSPRによる親和性の決定
選択されたFabクローンの親和性(KD)は、ProteOn XPR36計器(Biorad)と、ニュートラアビジン捕捉によってNLCチップに固定化したビオチン化MUC1抗原を用いて表面プラズモン共鳴によって25℃で測定した。組換え抗原(リガンド)の固定化:抗原をPBST(10mMリン酸、150mM塩化ナトリウムpH7.4、0.005％Tween20)で10μg/mlまで希釈し、次いで、約200応答ユニット(RU)の固定化レベルとなるように様々な接触時間で垂直方向に30μl/分で注入した。分析物の注入:one-shot kinetics測定の場合、注入方向を水平方向に変え、2倍希釈系列の精製Fab(100〜6.25nMの様々な濃度範囲)を50μl/minで別々のチャンネル1〜5に沿って同時に注入した。会合時間は250sまたは300sであり、解離時間は300sであった。緩衝液(PBST)を、参照用の「インライン」ブランクとなるように6番目のチャンネルに沿って注入した。会合速度定数(kon)および解離速度定数(koff)は、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアの中にある単純1：1ラングミュア結合モデルを用いて会合センサーグラムおよび解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによって計算した。平衡解離定数(KD)は比koff/konとして計算した。再生を10mMグリシン、pH1.5を用いて30秒の接触時間にわたって100ul/minの流速で水平方向に行った。3種類のクローンがMUC1に特異的に結合したが(図32A)、「インライン」ブランクには特異的に結合しなかった。このことは、これらの結合物質の特異性を証明している。全測定の反応速度データおよび熱力学データを図32Bにまとめた。
【０４１５】
MUC1ベースのクローニング、発現、および特徴付け
SPRによってMUC1に特異的に結合することを証明したFabを全てT細胞二重特異性(TCB)形式に変換した。このために、重鎖VH-ドメインおよび軽鎖VH-ドメインのPCR増幅DNA断片を、TCBの作製に必要な両Fc含有Ig鎖にインフレームで挿入した(図33)。MPSVプロモーターによって抗体鎖を発現させ、CDSの下流に位置する合成ポリAシグナル配列によって転写を終結させる。発現カセットに加えて、それぞれのベクターは、EBV-EBNA発現細胞株において自律複製するためにEBV oriP配列を含む。結果として生じたDNA構築物をCLC(クローン58D6; クローン110A5)と組み合わせて同時発現させ、哺乳動物由来細胞培養上清(クローン58D6: クローン110A5)から精製した。2種類の二重特異性抗体の分析データをまとめたものを図34Aおよび図34Bに示した。
【０４１６】
BioRadのProteOn XPR36バイオセンサーを用いたMUC1特異的TCBの結合分析
産生されたMUC1特異的TCBの結合を、ProteOn XPR36計器(Biorad)を用いて表面プラズモン共鳴によって25℃で測定した。ビオチン化MUC1抗原および無関係のビオチン化抗原を、ニュートラアビジン捕捉によってNLCチップに固定化した。以前に説明したように抗原の固定化を行った。one-shot kinetics測定の場合、注入方向を水平方向に変え、2倍希釈系列の精製構築物(30〜1.88nMまたは100〜6.25nMの様々な濃度範囲)を50μl/minで別々のチャンネル1〜5に沿って同時に注入した。会合時間は120sであり、解離時間は600sまでであった。緩衝液(PBST)を、参照用の「インライン」ブランクとなるように6番目のチャンネルに沿って注入した。
【０４１７】
再生を10mMグリシン、pH1.5を用いて30秒の接触時間にわたって100ul/minの流速で水平方向に行った。3種類のクローンがMUC1に特異的に結合したが(図35)、「インライン」ブランクには特異的結合しなかった。このことは、これらの結合物質の特異性を証明している。二価TCB形式のアビディティ効果のために、MUC1と非常に強く結合することが観察された。対照的に、無関係の抗原との結合は検出されなかった。このことは、TCB構築物が特異的に結合することを示している。
【０４１８】
実施例40
抗BCMA抗体の作製
1.1:抗原およびツール試薬の産生
1.1.1:組換え可溶性ヒトBCMA細胞外ドメイン
ファージディスプレイ選択用の抗原として使用したヒトBCMA、カニクイザルBCMA、およびマウスBCMAの細胞外ドメインをHEK EBNA細胞においてN末端単量体Fc融合として一過性発現させ、BirAビオチンリガーゼの同時発現を介して、受容体鎖を運ぶFc部分(Fcノブ鎖)のC末端に位置するaviタグ認識配列においてインビボで部位特異的にビオチン化した。ヒトBCMA、カニクイザルBCMA、およびマウスBCMAの細胞外ドメインは、それぞれ、メチオニン4〜アスパラギン53、メチオニン4〜アスパラギン52、およびアラニン2〜スレオニン49を含んだ。これらのN末端はヒトIgG1のヒンジに融合されるので、ノブイントゥホール技術によって、融合していないヒトIgG1 Fc部分(ホール鎖)とのヘテロ二量体化が可能になる。
【０４１９】
BCMAの細胞外ドメインを回収するために、以下のプライマーを使用した:
BamH1部位を組み込んでいる(太字、下線)
2018504092.tif 000038
、および
リバースプライマー
2018504092.tif 000039
プライマー
2018504092.tif 000040
およびリバースプライマー
2018504092.tif 000041
HindIII制限部位(太字、下線)およびKozakコンセンサス配列を含む
2018504092.tif 000042
、および
リバースプライマー
2018504092.tif 000043
【０４２０】
BCMAの細胞外ドメインを得るために、遺伝子合成も使用することができる。
【０４２１】
1.2:ツールとしてのBCMA発現細胞
1.2.1:表面にBCMAを発現するヒト骨髄腫細胞株
4種類のヒト骨髄腫細胞株(NCI-H929、RPMI-8226、U266B1、およびL-363)におけるBCMA発現をフローサイトメトリーによって評価した。NCI-H929細胞((H929)ATCC(登録商標)CRL-9068(商標))を、10〜20％熱失活FCSを含む80〜90％RPMI1640中で培養した。これは、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、および50μMメルカプトエタノールを含有してもよい。RPMI-8226細胞((RPMI)ATCC(登録商標)CCL-155(商標))を、90％RPMI1640および10％熱失活FCSを含有する培地中で培養した。U266B1((U266)ATCC(登録商標)TIB-196(商標))細胞を、2mM L-グルタミン、10mM HEPES、1mMピルビン酸ナトリウム、4500mg/Lグルコース、および1500mg/L重炭酸ナトリウム、および15％熱失活FCSを含有するように改変したRPMI-1640培地中で培養した。L-363細胞株(Leibniz Institute DSMZ - German collection of microorganisms and cell cultures; DSMZ No. ACC 49)を85％RPMI1640および15％熱失活FCSの中で培養した。簡単に述べると、細胞を回収し、洗浄し、生存率について計数し、96ウェル丸底プレートの1ウェルあたり50,000細胞で再懸濁し、(内部移行を阻止するために)10μg/mlの抗ヒトBCMA抗体(Abcam, #ab54834, マウスIgG1)と4℃で30分間インキュベートした。マウスIgG1をアイソタイプ対照(BD Biosciences, #554121)として使用した。次いで、細胞を遠心分離し(350xgで5分)、2回洗浄し、FITC結合抗マウス二次抗体と4℃で30分間インキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、細胞を遠心分離し(350xgで5分)、FACS緩衝液で2回洗浄し、100ulのFACS緩衝液に再懸濁し、FACS Diva ソフトウェアを実行するCantoII装置で分析した。H929、U266B1、RPMI-8226、およびL-363骨髄腫細胞株の表面膜にあるBCMA受容体の相対量をQIFIKIT分析(Dako, #K0078、製造業者の説明書に従う)によって評価した。H929細胞はヒトBCMAを最も高い密度で他の骨髄腫細胞株の3.8〜27倍まで発現した。BCMAmed/lo発現骨髄腫細胞であるU266ならびにBCMAlo発現骨髄腫細胞であるRPMI-8226およびL363と比較すると、H929はBCMAhi発現骨髄腫細胞株とみなされる。表36は、ヒト多発性骨髄腫細胞株の細胞表面にあるBCMA受容体の相対数をまとめたものである。
【０４２２】
(表３６)NCI-H929、U266B1、RPMI-8226、およびL-363ヒト骨髄腫細胞株の細胞表面にあるBCMA受容体数の定量
2018504092.tif 000044
【０４２３】
1.3:インビトロ組換えライブラリーからBCMA結合物質を得る
1.3.1:共通軽鎖Fabライブラリーの構築
ヒト化抗CD3抗体軽鎖に基づいて構築したFab形式の抗体ライブラリーを作製した。重鎖にだけ多様性を導入した。6つの異なる重鎖フレームワーク:VH1-46、VH1-69、VH3-15、VH3-23、VH4-59、およびVH5-1を使用した。CDR1、2、および3を無作為化し、各重鎖ライブラリーを非無作為化軽鎖と組み合わせた。Nissim et al EMBO J. 1994 Feb 1;13(3):692-8およびSilacci et al. Proteomics. 2005 Jun;5(9):2340-50に記載のようにライブラリーを作製した。
【０４２４】
1.3.2:抗BCMA Fabクローンの選択
抗BCMA Fabを、1種類の定常(constant)VLと6つの異なるヒトVH配列からなる合成Fabライブラリーからファージディスプレイによって確立した。
【０４２５】
(表３７)抗BCMAクローンおよびそれぞれのVL/VH対形成
2018504092.tif 000045
【０４２６】
選択回(バイオパニング)を以下のパターンに従って溶解状態で行った。
1)抗原のFc部分を認識する抗体ライブラリーを枯渇させるために、10ug/mlの無関係のヒトIgGでコーティングしたイムノチューブ(immunotube)の中で、1ライブラリープールあたり約1012個のファージミド粒子をプレクリアする;2)Fc結合物質をさらに枯渇させるために、100nMの無関係の非ビオチン化Fcノブイントゥホール構築物の存在下で、Fcに結合しなかったファージミド粒子を100nMビオチン化BCMAと総体積2mlで0.5時間インキュベートする;3)パニング反応を、ニュートラアビジンまたはストレプトアビジンでプレコーティングしたマイクロタイタープレートにある16個のウェルに分割し、移すことによって、ビオチン化BCMAと、特異的に結合しているファージをシェーカーに載せて20分間、捕捉する;4)プレートウォッシャーを用いて、それぞれのウェルをPBS/Tween20で10〜30回洗浄し、PBSで10〜30回洗浄する;5)任意で、230nMマウスAPRILを添加して、天然リガンドの結合部位を認識するFabクローンを追い出すことによって、従って、APRIL非競合ファージ抗体を選択することによって競合的洗浄工程を行う;6)1ウェルあたり125ulの100mM TEA(トリエチルアミン)を添加することによってファージ粒子を5〜10分間、溶出させ、等量の1M Tris/HCl pH7.4を添加することによって中和する;7)対数期大腸菌TG1細胞に、溶出されたファージ粒子を再感染させ、ヘルパーファージVCSM13を感染させ、シェーカーに載せて30℃で一晩インキュベートし、その後に、次の選択回において使用するファージミド粒子をPEG/NaCl沈殿する。
【０４２７】
選択は、100nMの一定の抗原濃度を用いて3〜5回以上行った。抗原としてヒトBCMAしか使用しなかった選択キャンペーンを除いて、交差反応性抗体を選択するために、ヒトBCMAと交互に入れ替えてカニクイザルBCMAまたはマウスBCMAも使用するさらなる選択キャンペーンを行った。さらに、ストレプトアビジンプレートに基づく捕捉に代わるものとして、5.4x107個のストレプトアビジンコーティング磁気ビーズをパニング反応に添加し、その後に、前記の条件下で、それぞれの磁石を用いて洗浄工程を行うことによって抗原:ファージ複合体を捕捉した。
【０４２８】
BioRadのProteOn XPR36バイオセンサーを用いた、Fabを含有する細菌培養上清の表面プラズモン共鳴スクリーニングによって特異的結合物質を特定した。手短に述べると、対数期大腸菌TG1細胞に、溶出されたファージ粒子を感染させた後に、シングルコロニー形成単位(cfu)をプレートし、96ディープウェルプレートに1ml発現培養物を接種するためにつついた。8.000〜10.000RUのヤギ抗ヒトIgG, F(ab')2断片特異的ポリクローナル抗体(Jackson ImmunoResearch、#109-005-006)で誘導体化したProteOn GLMチップ上に垂直方向に、上清からFabを捕捉した。その後に、分析物としてヒトBCMA、カニクイザルBCMA、およびマウスBCMAならびに無関係のFcノブイントゥホール構築物を水平方向に注入した。BCMAに対して有意な結合応答を示し、抗原のFc部分に結合しなかったクローンを0.5リットル培養体積で細菌により発現させ、アフィニティ精製し、BioRadのProteOn XPR36バイオセンサーでのone-shot kineticsプロトコールを用いたSPR分析によって、反応速度をさらに特徴付けた。
【０４２９】
実施例41
BCMA結合アッセイ:表面プラズモン共鳴
以下のように、抗BCMA抗体と組換えBCMAとの結合を表面プラズモン共鳴(SPR)によって評価した。全SPR実験を、Biacore T200において、ランニングバッファーとしてHBS-EP(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％Surfactant P20, Biacore, Freiburg/Germany)を用いて25℃で行った。抗BCMA抗体と組換えBCMA Fc(kih)(ヒト、カニクイザル、およびマウス)との相互作用のアビディティを求めた(表38〜40)。ビオチン化した組換えヒト、カニクイザル、およびマウスBCMA Fc(kih)を説明書(Biacore, Freiburg/Germany)に従ってSAチップ上に直接カップリングした。固定化レベルは80〜120RUであった。4倍濃度範囲(1.95〜500nM)の抗BCMA抗体を120秒にわたって30uL/分の流れでフローセルに通した。解離を180秒間モニタリングした。参照フローセル上で得られた応答を差し引くことによってバルク屈折率差を補正した。ここでは、標準的なアミンカップリングキットに説明されているように、予め活性化および不活性化された空の表面に抗BCMA抗体を流した。比較のために、相互作用が二価性であるのにもかかわらず、Biacore T200 Evaluation Software(v1.0, Biacore AB, Uppsala/Sweden)を用いて、数値積分法によって1:1ラングミュア結合に反応速度式をフィッティングさせるように、みかけの速度定数を導き出した。
【０４３０】
(表３８)比較のためだけのアビディティ値(実験1)
2018504092.tif 000046
(表３９)比較のためだけのアビディティ値(実験2)
2018504092.tif 000047
【０４３１】
(表４０)比較のためだけのアビディティ値(実験3)
2018504092.tif 000048
【０４３２】
抗BCMA抗体またはBCMA-TCB CLC抗体と組換えヒトBCMA Fc(kih)との相互作用の親和性も求めた。抗ヒトFab抗体(GE Healthcare)を、標準的なアミンカップリングキット(Biacore, Freiburg/Germany)を用いてpH5.0でCM5チップ上に直接カップリングした。固定化レベルは約6500RUであった。抗BCMA抗体またはBCMA-TCB CLC抗体を25nMで90秒間、捕捉した。4倍濃度範囲(1.95〜500nM)の組換えヒトBCMA Fc(kih)を120秒または180秒にわたって30μL/分の流れでフローセルに通した。解離を120秒間または400秒間モニタリングした。参照フローセル上で得られた応答を差し引くことによってバルク屈折率差を補正した。ここでは、抗ヒトFab抗体が固定化されているが、抗BCMA抗体でもBCMA-TCB CLC抗体でもなくHBS-EPが注入されている表面に組換えBCMAを流した。Biacore T200 Evaluation Software(v1.0, Biacore AB, Uppsala/Sweden)を用いて、数値積分法によって1:1ラングミュア結合に反応速度式をフィッティングさせるように速度定数を導き出した(表41)。
【０４３３】
(表４１)1:1ラングミュア結合に反応速度式をフィッティングさせることによって求めた親和定数
2018504092.tif 000049
【０４３４】
実施例42
共通軽鎖を有する二価抗BCMA IgG抗体の作製
共通軽鎖の使用を、どのBCMA抗体にも適用することができるという仮説を検証するために、WO/2014/122143に以前に述べられた二価BCMA抗体83A10の天然軽鎖を共通軽鎖(CD3 LC(CLC))で置換することによって、83A10-CLC二価BCMA抗体を作製した。材料および一般的な方法のセクションに記載した二価IgG抗体を作製するための一般的な技法を用いて、83A10の2本の重鎖と2本の共通軽鎖を含む抗BCMA抗体を産生した。ヒトBCMAに対する83A10-CLC IgG抗体の親和性を、実施例41に記載の方法に似た方法を用いてSPRによって測定した。表42は、組換えヒトBCMA Fc(kih)と83A10-CLC BCMA IgG抗体との結合を図示する。
【０４３５】
(表４２)1:1ラングミュア結合に反応速度式をフィッティングさせることによって求めた親和定数:組換えBCMA Fc(kih)と83A10-CLC抗BCMA抗体との結合
2018504092.tif 000050
【０４３６】
実施例43
huTACI-RおよびhuBAFF-Rに対する抗BCMA IgG抗体の特異性試験
TNF-TNF-RスーパーファミリーのメンバーとしてTACI受容体およびBAFF受容体はBCMA受容体と関係があり、細胞外ドメインでの相同性はそれぞれ22％および18.5％である。従って、抗BCMA IgG抗体の特異性を調べるために、表面プラズモン共鳴(SPR)結合実験を行った。全SPR実験をBiacore T200(GE Healthcare)においてランニングバッファーとしてHBS-EP(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％Surfactant P20)を用いて25℃で行った。Fcに融合したhuBCMA、huBAFF-R、およびhuTACI-Rを、標準的なアミンカップリングキット(GE Healthcare)を用いて、pH5.0で、Biacore CM5センサーチップの異なるフローチャンネル上に高い固定化レベル(約5000RU)で化学的に固定化した。最初に、結合が起こるかどうかをチェックするために、正の対照として抗BCMA IgG pSCHLI372ならびにa-huTACI-R IgGまたはa-huBAFF-R IgGの高濃縮溶液(3μM、HBS-EPに溶解)を注入した(会合時間:80s、解離時間:600s、流速:30μl/min)。a-huTACI-R IgGとhuTACI-R、ならびにa-huBAFF-R IgGとhuBAFF-R、および抗BCMA IgG抗体とhuBCMAとの結合事象が陽性であったことから、固定化後に全受容体は依然として認識されることが分かった。抗BCMA IgG抗体がhuBAFF-Rおよび/またはhuTACI-Rと速い反応速度定数で結合する場合、反応速度パラメータを新しいCM5センサーチップ上で低い固定化レベル(300RU)で注意深く調べた。濃度が3000〜93.75nM(HBS-EPで2倍希釈)の抗BCMA IgG抗体希釈液を注入し(会合時間:80s、解離時間:300s、流速:30μl/min)、試料を2回繰り返して試験した。該当する場合には、すなわち、速く完全に解離しない場合には再生も行った。データを、大量輸送(mass transport)の項を含む1:1相互作用モデル(Biacore T200 evaluationバージョン1.0)に全体にフィットさせることによって、抗BCMA IgG抗体とhuBAFF-RまたはhuTACI-Rとの相互作用の反応速度評価を行った。定常状態分析も行った。図37に図示したように、曲線1は、参照チャンネルのシグナルに対応する。曲線2は、結合が起こるチャンネル(結合チャンネル)に対応する。曲線2-1は、差し引かれたシグナル(結合チャンネル-参照チャンネル)であり、これは、結合事象によるシグナルであることを意味する。図37に示したように、SPR結合アッセイから、pSCHLI372 IgGはヒトTACI受容体に結合しないことがはっきりと証明された。結合の正の対照として、TACI受容体にわずかに結合するが、非常に速いオンレートおよびオフレートで結合することが分かっている別のBCMA IgGを使用した(データは示さず)。
【０４３７】
実施例44
BCMA-TCB CLC Fc含有(2+1)抗体の産生および精製
二重特異性抗体を産生するために、懸濁培養したHEK293-EBNA細胞を、それぞれの哺乳動物発現ベクターでポリマーに基づいて一過的にコトランスフェクトすることによって、二重特異性抗体を発現させた。トランスフェクトする1日前に、HEK293-EBNA細胞を、6mMのL-グルタミンを加えたEx-Cell培地に1mLあたり1.5個のMio生細胞で播種した。最終産生体積1mLごとに2.0個のMio生細胞を遠心分離した(210xgで5分)。上清を吸引し、細胞を100μLのCD CHO培地に再懸濁した。1μgのDNA(二重特異性抗体産生の比:重鎖:改変された重鎖:軽鎖:改変された軽鎖=1:1:2:1;標準的な抗体の比:重鎖:軽鎖=1:1)を100μLのCD CHO培地に入れて混合することによって最終産生体積1mLごとにDNAを調製した。0.27μLのPEI溶液(1mg/mL)を添加した後に、混合物を15秒間ボルテックスし、10分間、室温で放置した。10分後に、再懸濁した細胞およびDNA/PEI混合物を一緒にし、次いで、適切な容器に移し、容器を振盪装置(37℃、5％CO2)に入れた。3時間のインキュベーション期間後に、最終産生体積1mLごとに、6mM L-グルタミン、1.25mMバルプロ酸、および12.5％Pepsoy(50g/L)を加えたEx-Cell Medium 800μlを添加した。24時間後に、最終産生体積1mLごとに70μLの供給溶液を添加した。7日後、または細胞生存率が70％以下になった時に、上清から細胞を遠心分離および滅菌濾過によって分離した。抗体を、アフィニティ工程と、磨きをかける一工程であるサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
【０４３８】
アフィニティ工程のために、上清を、6CVの20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム、pH7.5で平衡化したプロテインAカラム(HiTrap Protein A FF, 5mL, GE Healthcare)にロードした。同じ緩衝液を用いた洗浄工程後に、20mMリン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウム、100mMグリシン、pH3.0を用いた溶出工程によって抗体をカラムから溶出させた。望ましい抗体を含む画分を、0.5Mリン酸ナトリウム、pH8.0(1:10)ですぐに中和し、プールし、遠心分離によって濃縮した。濃縮物を滅菌濾過し、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに処理した。
【０４３９】
サイズ排除工程のために、濃縮タンパク質を、フォーミュレーションバッファー(formulation buffer)として、Tween20を含む、またはTween20を含まない20mMヒスチジン、140mM塩化ナトリウム、pH6.0を用いてXK 16/60 HiLoad Superdex 200カラム(GE Healthcare)に注入した。単量体を含有する画分をプールし、遠心分離によって濃縮し、滅菌濾過して滅菌バイアルに入れた。
【０４４０】
抗体濃度は、抗体の0.1％溶液の吸光度の理論値を用いて、280nmでの吸光度を測定することによって求めた。この値はアミノ酸配列に基づき、GPMAWソフトウェア(Lighthouseデータ)によって計算した。最終タンパク質調製物の純度および単量体含有率は、それぞれ、CE-SDS(Caliper LabChip GXIIシステム(Caliper Life Sciences))、および25mMリン酸カリウム、125mM塩化ナトリウム、200mM L-アルギニン一塩酸塩、0.02％(w/v)アジ化ナトリウム、pH6.7緩衝液中でのHPLC(TSKgel G3000 SW XL分析用サイズ排除カラム(Tosoh))によって求めた。図38A〜Cは、プロテインA(PA)アフィニティクロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)精製工程後の最終タンパク質調製物のCE-SDSグラフ(非還元(上パネル)および還元(下パネル))を図示する。(図38A)pSCHLI333-TCB CLC、(図38B)pSCHLI372-TCB CLC、(図38C)pSCHLI373-TCB CLC。pSCHLI333-TCB CLC抗体に適用したPAアフィニティクロマトグラフィーおよびSEC精製工程から、89.2％の純度と、100％の単量体含有率が得られ(図38A)、pSCHLI372-TCB CLC抗体については88.5％の純度と、100％の単量体含有率が得られ(図38B)、pSCHLI372-TCB CLC抗体については91.8％の純度と、100％の単量体含有率が得られた(図38C)。表43は、PAアフィニティクロマトグラフィーおよびSEC精製工程後のpSCHLI333-TCB CLC、pSCHLI372-TCB CLC、およびpSCHLI373-TCB CLC抗体の特性をまとめたものである。全BCMA-TCB CLC抗体において、一貫して、>88％の純度と100％に単量体含有率に達した。結果全体から、TCB抗体に対する共通軽鎖(CLC)を用いることで産生/精製特徴における優位性を達成することができ、非常に優れた開発可能性がある、既に高品質のタンパク質調製物を実現するのに2つの精製工程(すなわち、PAアフィニティクロマトグラフィーとSEC)しか必要とされないことがはっきりと証明された。
【０４４１】
(表４３)プロテインAアフィニティクロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー精製工程後のBCMA-TCB CLC抗体の産生/精製プロファイル
2018504092.tif 000051
【０４４２】
実施例44
BCMA-TCB CLC抗体とBCMA陽性多発性骨髄腫細胞株との結合
BCMA-TCB CLC抗体(pSCHLI333、pSCHLI372、pSCHLI373)がBCMAhi発現H929細胞上にあるヒトBCMAに結合するかどうかをフローサイトメトリーによって分析した。負の対照としてMKN45(BCMAを発現しないヒト胃腺がん細胞株)を使用した。簡単に述べると、培養細胞を回収し、計数し、細胞生存率をViCellを用いて評価した。次いで、生細胞を、BSAを含有するFACS Stain Buffer(BD Biosciences)に溶解して2x106細胞/mlになるように調整した。さらに、この細胞懸濁液を1ウェルあたり100μl分取して丸底96ウェルプレートに入れ、30μlのBCMA-TCB CLC抗体または対応するTCB対照と4℃で30分間インキュベートした。BCMA-TCB CLC抗体(およびTCB対照)を全て滴定し、0.12〜500nMの最終濃度範囲で分析した。次いで、細胞を遠心分離し(5分、350xg)、120μl/ウェルのFACS Stain Buffer(BD Biosciences)で洗浄し、再懸濁し、蛍光色素結合PE結合AffiniPure F(ab')2断片ヤギ抗ヒトIgG Fc断片特異的(Jackson Immuno Research Lab; 109-116-170)と、4℃でもう30分間インキュベートした。次いで、細胞をStain Buffer(BD Biosciences)で2回洗浄し、1ウェルあたり100ulのBD Fixation buffer(#BD Biosciences、554655)で4℃で20分間、固定し、120μlのFACS緩衝液に再懸濁し、BD FACS CantoIIを用いて分析した。図39A〜Bに図示したように、BCMA-TCB CLC抗体の平均蛍光強度を抗体濃度の関数としてプロットした。(図39A)H929細胞上でのpSCHLI372-TCB CLCおよびpSCHLI373-TCB CLC。(図39B)MKN45細胞上でのpSCHLI372-TCB CLCおよびpSCHLI373-TCB CLC。BCMA-TCB CLC抗体(pSCHLI333、pSCHLI372、pSCHLI373)抗体は100nM未満の濃度ではBCMA陰性CD3陰性MKN45細胞に結合しなかった。該当する場合には、EC50を、Prism GraphPad(LaJolla, CA, USA)を用いて計算した。抗BCMA/抗CD3 TCB抗体とH929細胞との結合について最大結合の50％に達するのに必要な抗体濃度を表すEC50値を表44にまとめた。
【０４４３】
(表４４)BCMA-TCB CLC抗体とH929細胞との結合のEC50値
2018504092.tif 000052
【０４４４】
実施例45
BCMA-TCB CLC抗体とCD3陽性ジャーカットT細胞株との結合(フローサイトメトリー)
BCMA-TCB CLC抗体(pSCHLI333、pSCHLI372、pSCHLI373)と、ヒト白血病T細胞ジャーカット(ATCC TIB-152)上に発現しているヒトCD3との結合特性もフローサイトメトリーによって分析した。ジャーカットT細胞を、10％熱失活FCSを加えたRPMI中で培養した。簡単に述べると、培養細胞を回収し、計数し、細胞生存率をViCellを用いて評価した。次いで、生細胞を、0.1％BSAを含有するFACS Stain Buffer(BD Biosciences)に溶解して2x106細胞/mlになるように調整した。さらに、この細胞懸濁液を1ウェルあたり100μl分取して丸底96ウェルプレートに入れた。最終濃度が0.12nM〜500nMとなるように30μlのBCMA-TCB CLC抗体または対応するTCB対照を、細胞を含有するウェルに添加した。BCMA-TCB CLC抗体および対照IgGを同じモル濃度で使用した。4℃で30分間インキュベートした後に、細胞を遠心分離し(5分、350xg)、150μl/ウェルのBSA含有FACS Stain Buffer(BD Biosciences)で2回洗浄し、次いで、1ウェルあたり100ulのBD Fixation buffer(#BD Biosciences, 554655)を用いて4℃で20分間、固定し、120μlのFACS緩衝液に再懸濁し、BD FACS CantoIIを用いて分析した。BCMA-TCB CLC抗体とT細胞との結合を評価し、蛍光強度の中央値をCD3発現ジャーカットT細胞にゲーティングして求め、ヒストグラムまたはドットプロットでプロットした。図40A〜Bは、抗体濃度の関数としてプロットした、BCMA-TCB CLC抗体(pSCHLI333、pSCHLI372、pSCHLI373)とジャーカットT細胞(図40A)またはMKN45細胞(図40B)との結合についての蛍光強度の中央値を示す。抗BCMA/抗CD3 TCB抗体とCD3陽性ジャーカットT細胞とのEC50値および最大結合に達しなかった。アイソタイプ対照抗体はジャーカットT細胞に結合せず、BCMA-TCB CLC抗体(pSCHLI333、pSCHLI372、pSCHLI373)抗体は100nM未満の濃度ではBCMA陰性CD3陰性MKN45細胞に結合しなかった。
【０４４５】
実施例46
BCMA-TCB CLC抗体とCD3陽性T細胞およびBCMA陽性多発性骨髄腫細胞株が結合した時のヒトT細胞活性化
CD4+T細胞上およびCD8+T細胞上での初期活性化マーカーCD69または後期活性化マーカーCD25の表面発現をヒトBCMA発現MM細胞の存在下または非存在下での評価することによって、BCMA-TCB CLC抗体(pSCHLI372、pSCHLI373)がT細胞活性化を誘導する能力をフローサイトメトリーによって分析した。簡単に述べると、BCMA陽性H929細胞をCell Dissociation Bufferを用いて回収し、計数し、生存率をチェックした。細胞を、改変RPMI-1640培地に溶解して1mlあたり0.3x106個の(生)細胞になるように調整し、この細胞懸濁液を1ウェルあたり100μlピペットで取って、(示されたように)丸底96ウェルプレートに入れた。最終濃度が0.012pM〜100nMになるように50μlの(希釈した)BCMA-TCB CLC抗体を、細胞を含有するウェルに添加した。ヒトPBMCエフェクター細胞を健常ドナーの新鮮血から単離し、改変RPMI-1640培地に溶解して1mlあたり6x106個の(生)細胞になるように調整した。PBMC:骨髄腫腫瘍細胞の最終E:T比が10:1となるように、この細胞懸濁液をアッセイプレートの1ウェルあたり50μl添加した。BCMA-TCB CLC抗体が、ヒトBCMAを発現する標的細胞の存在下でT細胞を特異的に活性化できるかどうか分析するために、3〜10nMのそれぞれのBCMA-TCB CLC抗体分子とPBMCを含むが、標的細胞を含まないウェルを含めた。37℃、5％CO2で48時間インキュベートした後に、細胞を遠心分離し(5分、350xg)、150μl/ウェルの0.1％BSA含有PBSで2回洗浄した。CD4(マウスIgG1,K; クローンRPA-T4)、CD8(マウスIgG1,K; クローンHIT8a; BD #555635)、CD69(マウスIgG1; クローンL78; BD #340560)、およびCD25(マウスIgG1,K; クローンM-A251; BD #555434)の表面染色を供給業者の提案に従って4℃で30分間、行った。細胞を、150μl/ウェルの0.1％BSA含有PBSで2回洗浄し、100μl/ウェルのfixation buffer(BD #554655)を用いて4℃で15分間、固定した。遠心分離後、試料を200μl/ウェルの0.1％BSA含有PBSに再懸濁し、FACS CantoII装置(Software FACS, Diva)を用いて分析した。図41は、48時間インキュベートした後のCD4+T細胞上およびCD8+T細胞上にある初期活性化マーカーCD69および後期活性化マーカーCD25の発現レベルを図示する(2回の独立した実験からの代表的な結果)。pSCHLI372-TCB CLCおよびpSCHLI373-TCB CLC抗体はBCMA陽性標的細胞の存在下でCD69およびCD25活性化マーカーのアップレギュレーションを濃度依存的かつ特異的に誘導した。ヒトPBMCをDP47-TCB対照抗体で処理した時に、CD4+T細胞およびCD8+T細胞の活性化は観察されなかった。このことから、T細胞上にあるCD3に結合しても、TCB抗体がBCMA陽性標的細胞に結合しない時には、T細胞活性化は起こらないことが示唆される。
【０４４６】
実施例47
抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異性抗体によって誘導されたBCMAhi発現H929骨髄腫細胞の強制指向T細胞性細胞傷害(比色LDH放出アッセイ)
BCMA-TCB CLC抗体(pSCHLI372、pSCHLI373)が抗原結合部分の結合を介してBCMA高発現MM細胞上にあるBCMAと架橋した時に、この構築物が、この細胞においてT細胞を介したアポトーシスを誘導する能力も分析した。簡単に述べると、ヒトBCMA発現H929多発性骨髄腫標的細胞をCell Dissociation Bufferを用いて回収し、洗浄し、10％胎仔ウシ血清(Invitrogen)を加えたRPMIに再懸濁した。1ウェルあたり約30,000個の細胞を丸底96ウェルプレートに入れてプレートし、構築物の各希釈液を、望ましい最終濃度になるように添加した(3回繰り返した)。最終濃度は0.12pM〜100nMであった。適切に比較するために、TCB構築物および対照を全て同じモル濃度になるように調整した。5:1の最終E:T比となるように、ヒト全T細胞(エフェクター)をウェルに添加した。ヒトPBMCをエフェクター細胞として使用した時には、10:1の最終E:T比を使用した。負の対照のグループはエフェクターのみまたは標的細胞のみで表された。ヒトpan T細胞の活性化の正の対照として、1μg/ml PHA-M(Sigma #L8902)を使用した。基準化のために、H929 MM標的細胞の最大溶解(=100％)は、標的細胞を最終濃度1％のTritonX-100とインキュベートし、細胞死を誘導することによって求めた。最小溶解(=0％)は、エフェクター細胞のみと、すなわち、T細胞二重特異性抗体なしでコインキュベートした標的細胞によって表された。次いで、37℃、5％CO2で20〜24時間または48時間インキュベートした後に、アポトーシス/壊死MM標的細胞から上清へのLDH放出を、LDH検出キット(Roche Applied Science)を用いて製造業者の説明書に従って測定した。LDH放出のパーセントを濃度-応答曲線においてBCMA-TCB CLC抗体の濃度に対してプロットした。EC50値をPrismソフトウェア(GraphPad)を用いて測定し、最大LDH放出の50％をもたらすTCB抗体濃度として求めた。図42A〜Bに示したように、BCMA-TCB CLC抗体であるpSCHLI372-TCB CLC(図42A、B)およびpSCHLI373-TCB CLC(図42B)は、LDH放出によって測定した時にBCMA陽性H929骨髄腫細胞の濃度依存的死滅を誘導した。DP47-TCB対照抗体が100nMという試験した最も高い濃度でさえBCMA陽性標的細胞に結合せず、LDH放出を誘導しなかったので、H929細胞の死滅は特異的であった。表45は、BCMA-TCB CLC抗体によって誘導されたBCMA陽性H929細胞の強制指向T細胞性死滅のEC50値をまとめたものである。
【０４４７】
(表４５)BCMA-TCB CLC抗体によって誘導されたH929細胞の強制指向T細胞性死滅のEC50値
2018504092.tif 000053
【０４４８】
実施例48
BCMA-TCB CLC抗体によって誘導されたBCMAmed/lo発現U266骨髄腫細胞の強制指向T細胞性細胞傷害(LDH放出アッセイ)
BCMA-TCB CLC抗体(pSCHLI372、pSCHLI373)が抗原結合部分の結合を介してBCMAmed/lo発現MM細胞上にあるBCMAと架橋した時に、この構築物が、この細胞においてT細胞を介してアポトーシスを誘導する能力を分析した。簡単に述べると、ヒトBCMAmed/lo発現U266多発性骨髄腫標的細胞をCell Dissociation Bufferを用いて回収し、洗浄し、10％胎仔ウシ血清(Invitrogen)を加えたRPMIに再懸濁した。1ウェルあたり約30,000個の細胞を丸底96ウェルプレートに入れてプレートし、構築物の各希釈液を、望ましい最終濃度になるように添加した(3回繰り返した)。最終濃度は0.12pM〜100nMであった。適切に比較するために、TCB構築物および対照を全て同じモル濃度になるように調整した。5:1の最終E:T比となるように、ヒト全T細胞(エフェクター)をウェルに添加した。ヒトPBMCをエフェクター細胞として使用した時には、10:1の最終E:T比を使用した。負の対照のグループはエフェクターのみまたは標的細胞のみで表された。ヒトT細胞の活性化の正の対照として、1μg/ml PHA-M(Sigma #L8902)を使用した。基準化のために、MM標的細胞の最大溶解(=100％)は、標的細胞を最終濃度1％のTritonX-100とインキュベートし、細胞死を誘導することによって求めた。最小溶解(=0％)は、エフェクター細胞のみと、すなわち、T細胞二重特異性抗体なしでコインキュベートした標的細胞によって表された。次いで、37℃、5％CO2で20〜24時間インキュベートした後に、アポトーシス/壊死MM標的細胞から上清へのLDH放出を、LDH検出キット(Roche Applied Science)を用いて製造業者の説明書に従って測定した。LDH放出のパーセントを濃度-応答曲線においてBCMA-TCB CLC抗体の濃度に対してプロットした。EC50値をPrismソフトウェア(GraphPad)を用いて測定し、最大LDH放出の50％をもたらすTCB抗体濃度として求めた。表46は、BCMA-TCB CLC抗体によって誘導されたBCMA陽性U266細胞の強制指向T細胞性死滅のEC50値をまとめたものである。
【０４４９】
(表４６)BCMA-TCB CLC抗体によって誘導された、U266細胞の強制指向T細胞性死滅のEC50値
2018504092.tif 000054
【０４５０】
例示的な態様のアミノ酸配列
1)共通軽鎖形式、可変重鎖において有用なFolR結合物質
2018504092.tif 000055
2018504092.tif 000056
2018504092.tif 000057
【０４５１】
2)CD3結合物質共通軽鎖(CLC)
2018504092.tif 000058
【０４５２】
3)CD3結合物質、重鎖
2018504092.tif 000059
【０４５３】
4)共通軽鎖形式、可変重鎖において有用なMUC1結合物質
2018504092.tif 000060
2018504092.tif 000061
2018504092.tif 000062
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2018504092.tif 000065
2018504092.tif 000066
【０４５４】
5)共通軽鎖形式、可変重鎖において有用なBCMA結合物質
2018504092.tif 000067
2018504092.tif 000068
2018504092.tif 000069
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2018504092.tif 000071
2018504092.tif 000072
【０４５５】
6)非標的化DP47
2018504092.tif 000073
【０４５６】
7)例示的な標的配列
2018504092.tif 000074
8)例示的な態様のヌクレオチド配列
2018504092.tif 000075
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2018504092.tif 000077
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2018504092.tif 000098
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【０４５７】
9)さらなる共通軽鎖タンパク質およびヌクレオチド配列
2018504092.tif 000100
【０４５８】
10)DNA配列ヒト化CD3CH2527 (CDR/VH/VL)
2018504092.tif 000101
2018504092.tif 000102
2018504092.tif 000103
【０４５９】
前述の発明は、はっきりと理解できるようにするために例示および実施例によっていくらか詳細に説明されたが、説明および実施例が本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。本明細書において引用された全ての特許および科学文献の開示は、その全体が参照によりはっきりと組み入れられる。
【図１Ａ】
2018504092.tif 000104
【図１Ｂ】
2018504092.tif 000105
【図１Ｃ】
2018504092.tif 000106
【図１Ｄ】
2018504092.tif 000107
【図１Ｅ】
2018504092.tif 000108
【図１Ｆ】
2018504092.tif 000109
【図１Ｇ】
2018504092.tif 000110
【図１Ｈ】
2018504092.tif 000111
【図１Ｉ】
2018504092.tif 000112
【図２】
2018504092.tif 000113
【図３】
2018504092.tif 000114
【図４】
2018504092.tif 000115
【図５】
2018504092.tif 000116
【図６Ａ】
2018504092.tif 000117
【図６Ｂ】
2018504092.tif 000118
【図６Ｃ】
2018504092.tif 000119
【図６Ｄ】
2018504092.tif 000120
【図６Ｅ】
2018504092.tif 000121
【図７−１】
2018504092.tif 000122
【図７−２】
2018504092.tif 000123
【図７−３】
2018504092.tif 000124
【図８】
2018504092.tif 000125
【図９】
2018504092.tif 000126
【図１０】
2018504092.tif 000127
【図１１−１】
2018504092.tif 000128
【図１１−２】
2018504092.tif 000129
【図１２−１】
2018504092.tif 000130
【図１２−２】
2018504092.tif 000131
【図１２−３】
2018504092.tif 000132
【図１２−４】
2018504092.tif 000133
【図１２−５】
2018504092.tif 000134
【図１２−６】
2018504092.tif 000135
【図１２−７】
2018504092.tif 000136
【図１２−８】
2018504092.tif 000137
【図１３Ａ】
2018504092.tif 000138
【図１３Ｂ】
2018504092.tif 000139
【図１３Ｃ】
2018504092.tif 000140
【図１４Ａ】
2018504092.tif 000141
【図１４Ｂ】
2018504092.tif 000142
【図１４Ｃ】
2018504092.tif 000143
【図１５】
2018504092.tif 000144
【図１６】
2018504092.tif 000145
【図１７Ａ】
2018504092.tif 000146
【図１７Ｂ】
2018504092.tif 000147
【図１８】
2018504092.tif 000148
【図１９Ａ】
2018504092.tif 000149
【図１９Ｂ】
2018504092.tif 000150
【図２０Ａ】
2018504092.tif 000151
【図２０Ｂ】
2018504092.tif 000152
【図２１】
2018504092.tif 000153
【図２２】
2018504092.tif 000154
【図２３】
2018504092.tif 000155
【図２４】
2018504092.tif 000156
【図２５Ａ】
2018504092.tif 000157
【図２５Ｂ】
2018504092.tif 000158
【図２５Ｃ】
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【図２６】
2018504092.tif 000160
【図２７】
2018504092.tif 000161
【図２８】
2018504092.tif 000162
【図２９】
2018504092.tif 000163
【図３０】
2018504092.tif 000164
【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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