(57)【要約】  本発明の実施形態は、限定的ではないがマイクロ流体チップなどの流体装置を提供し、比較的高い温度で、及び／又は、ＦＴＶシステムを備える従来のマイクロ流体装置よりも高速で凍結させるように確実に作用できる一つ以上の氷核形成剤（ＩＮＡ）を採用する一つ以上の凍結融解バルブ（ＦＴＶ）が設けられる。【選択図】  図２Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体分析装置であって、
少なくとも一つの凍結融解バルブと少なくとも一つの氷核形成剤（ＩＮＡ）とを包含する少なくとも一つの流体通路であって、前記少なくとも一つのＩＮＡが炭素含有ＩＮＡである、少なくとも一つの流体通路、
を包含する流体分析装置。
【請求項２】
前記少なくとも一つのＩＮＡが、氷核形成タンパク質及び／又は氷核形成タンパク質の機能的断片、氷核形成核酸、氷核形成脂質、及び／又は、氷核形成炭水化物を包含する、請求項１に記載の流体分析装置。
【請求項３】
前記少なくとも一つのＩＮＡが有機体から抽出されるか有機体に由来する、請求項１に記載の流体分析装置。
【請求項４】
前記少なくとも一つのＩＮＡが氷核形成タンパク質（ＩＮＰ）及び／又は氷核形成タンパク質の機能的断片を包含する、請求項１に記載の流体分析装置。
【請求項５】
前記ＩＮＰ又は前記ＩＮＰの機能的断片が、ｉｃｅＥ，ｉｃｅＨ，ｉｎａＡ，ｉｎａＥ，ｉｎａＦ，ｉｎａＫ，ｉｎａＰｂ，ｉｎａＱ，ｉｎａＵ，ｉｎａＶ，ｉｎａＷ，ｉｎａＸ，ｉｎａＺで構成されるグループから選択される遺伝子により符号化され、前記遺伝子が、シュードモナス・シリンゲ、シュードモナス・フルオレセンスＫＵＩＮ−１、エルウィニア・ヘルビコラ、エルウィニア・ウレドヴォラ、パントエア・アナナチス、ザントモナス・カンペストリス、エルウィニア・カロトボーラ、シュードモナス・アンタークチカ、シュードモナス・アエルギノーサ、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・ヴィリディフラヴァ、パントエア・アグロメランス、エルウィニア・アナナス、及び／又は、シュードモナス・ボレアリスで構成されるグループから選択される有機体で発見されるか前記有機体から採取される、請求項４に記載の流体分析装置。
【請求項６】
合体されて流体分析装置としてのマイクロ流体チップを画定する第１及び第２基板をさらに包含し、前記少なくとも一つの流体輸送通路と、前記少なくとも一つの流体輸送通路に沿った前記少なくとも一つの凍結融解バルブとしての複数の離間した凍結融解バルブとが設けられる、請求項１に記載の流体分析装置。
【請求項７】
前記少なくとも一つのＩＮＡを包含する液体緩衝液との流体連通状態で、前記少なくとも一つのＩＮＡが流体分析装置の流体ポートへ流動導入される、請求項１に記載の流体分析装置。
【請求項８】
前記少なくとも一つの凍結融解バルブが複数の離間した凍結融解バルブであって、各々が、前記少なくとも一つの流体通路の規定領域との熱連通状態にある熱電冷却器を包含し、前記少なくとも一つの流体通路が、マイクロ流体又はナノ流体通路のサイズである少なくとも一つの区画を有する、請求項１に記載の流体分析装置。
【請求項９】
前記少なくとも一つの流体通路が主輸送通路と少なくとも一つの試薬通路とを包含し、すべてが前記主輸送通路との流体連通状態にある試料インプットと緩衝液インプットとビードウェルアレイとを包含する流体分析装置であって、前記少なくとも一つの凍結融解バルブが、前記主輸送通路及び／又は少なくとも一つの試薬通路との流体連通状態にある複数の離間した凍結融解バルブを包含する、請求項１に記載の流体分析装置。
【請求項１０】
前記少なくとも一つの流体通路が、前記少なくとも一つのＩＮＡが表面に接合及び／又はコーティングされた少なくとも一つの流体通路を包含する、請求項１に記載の流体分析装置。
【請求項１１】
ビード貯蔵／試料培養室と廃棄物容器と試料計量ループとをさらに包含して、前記試料計量ループが前記ビード貯蔵／培養室と前記試料インプットとの間に所在し、前記試料計量ループが、約１μＬと約１ｍＬの間の容積を有して、前記試料計量ループの各端部分の第１及び第２凍結融解バルブとの流体連通状態にある、請求項９に記載の流体分析装置。
【請求項１２】
前記少なくとも一つのＩＮＡが、氷に似た構造、及び／又は、水分子を氷状の格子に配列する構造を包含しうる、請求項１から１１のいずれか一つに記載の流体分析装置。
【請求項１３】
標的分析物を分析する方法であって、
少なくとも一つの凍結融解バルブとの流体連通状態にある少なくとも一つの流体通路を備える流体分析装置を用意することと、
少なくとも一つの氷核形成剤（ＩＮＡ）を前記少なくとも一つの流体通路へ導入することであって、前記少なくとも一つのＩＮＡが炭素原子を含有することと、
前記少なくとも一つの凍結融解バルブを電子選択的に冷却し、前記少なくとも一つのＩＮＡを使用して前記少なくとも一つの凍結融解バルブを凍結させることと、
を包含する方法。
【請求項１４】
前記少なくとも一つの凍結融解バルブが複数の離間した凍結融解バルブであり、前記少なくとも一つの流体通路と熱連通している冷却器を−１００℃と−１℃の間の温度に設定して前記凍結融解バルブを凍結させることを包含する方法である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記流体装置が、０．１ｍｍと１０ｍｍの間の厚さを持つ流体マイクロチップであり、前記少なくとも一つの凍結融解バルブが複数の離間した凍結融解バルブであり、前記凍結融解バルブの少なくとも幾つかが、３分以内に行われる凍結操作の為に約−１００℃と約−１℃の間に設定される熱電冷却器を有し、前記電子選択的冷却が各試料について複数回実行される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記装置が流体マイクロチップであって、前記分析物が、有機分子、元素化合物、無機化合物、薬剤、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、グリカン、あるいは他の生体又は合成高分子である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも一つのＩＮＡが、氷核形成タンパク質及び／又は氷核形成タンパク質の機能的断片、氷核形成核酸、氷核形成脂質、及び／又は、氷核形成炭水化物を包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも一つのＩＮＡが有機体から抽出されるか有機体に由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも一つのＩＮＡが、氷核形成タンパク質（ＩＮＰ）及び／又は氷核形成タンパク質の機能的断片を包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＩＮＰ又は前記ＩＮＰの機能的断片が、ｉｃｅＥ，ｉｃｅＨ，ｉｎａＡ，ｉｎａＥ，ｉｎａＦ，ｉｎａＫ，ｉｎａＰｂ，ｉｎａＱ，ｉｎａＵ，ｉｎａＶ，ｉｎａＷ，ｉｎａＸ，ｉｎａＺで構成されるグループから選択される遺伝子により符号化され、前記遺伝子が、シュードモナス・シリンゲ、シュードモナス・フルオレセンスＫＵＩＮ−１、エルウィニア・ヘルビコラ、エルウィニア・ウレドヴォラ、パントエア・アナナチス、ザントモナス・カンペストリス、エルウィニア・カロトボーラ、シュードモナス・アンタークチカ、シュードモナス・アエルギノーサ、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・ヴィリディフラヴァ、パントエア・アグロメランス、エルウィニア・アナナス、及び／又は、シュードモナス・ボレアリスで構成されるグループから選択される有機体で発見されるか前記有機体から採取される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも一つのＩＮＡが前記少なくとも一つの流体通路へ液体として流動導入される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記液体が緩衝液であり、前記少なくとも一つのＩＮＡが前記緩衝液で希釈される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも一つのＩＮＡのコーティングを包含する表面から前記少なくとも一つのＩＮＡが導入される、及び／又は、前記少なくとも一つのＩＮＡが前記少なくとも一つの流体流路の表面に吸着される、及び／又は化学的に接合される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも一つのＩＮＡが固形支持体に固定又は結合される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも一つのＩＮＡが、氷に似た構造、及び／又は、水分子を氷状の格子に配列する構造を包含する、請求項１３から２４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも一つの氷核形成剤（ＩＮＡ）を包含するＤＮＡ処理用の液体緩衝液であって、前記少なくとも一つのＩＮＡが炭素原子を含有し、任意で前記少なくとも一つのＩＮＡが、１分子／μＬと１００億分子／μＬの間の量で、及び／又は、約１ｎＭから約１ｍＭの濃度で前記液体緩衝液に存在する、液体緩衝液。
【請求項２７】
前記少なくとも一つのＩＮＡが有機体から抽出されるか有機体に由来する、請求項２６に記載の液体緩衝液。
【請求項２８】
前記少なくとも一つのＩＮＡが氷核形成タンパク質（ＩＮＰ）及び／又は氷核形成タンパク質の機能的断片を包含する、請求項２６に記載の液体緩衝液。
【請求項２９】
前記ＩＮＰ及び／又は前記ＩＮＰの機能的断片が、ｉｃｅＥ，ｉｃｅＨ，ｉｎａＡ，ｉｎａＥ，ｉｎａＦ，ｉｎａＫ，ｉｎａＰｂ，ｉｎａＱ，ｉｎａＵ，ｉｎａＶ，ｉｎａＷ，ｉｎａＸ，ｉｎａＺで構成されるグループから選択される遺伝子により符号化され、前記遺伝子が、シュードモナス・シリンゲ、シュードモナス・フルオレセンス、エルウィニア・ヘルビコラ、エルウィニア・ウレドヴォラ、パントエア・アナナチス、及びザントモナス・カンペストリスで構成されるグループから選択される有機体で発見されるか有機体から採取される、請求項２８に記載の液体緩衝液。
【請求項３０】
前記少なくとも一つのＩＮＡが一つ以上のアプタマーを包含する、請求項２６に記載の液体緩衝液。
【請求項３１】
前記少なくとも一つのＩＮＡが氷核形成タンパク質及び／又は氷核形成タンパク質の機能的断片、氷核形成核酸、氷核形成脂質、及び／又は、氷核形成炭水化物を包含する、請求項２６に記載の液体緩衝液。
【請求項３２】
前記少なくとも一つのＩＮＡが、氷に似た構造、及び／又は、水分子を氷状の格子に配列する構造を包含する、請求項２６から３１のいずれか一つに記載の液体緩衝液。
【請求項３３】
試料を調製する方法であって、
試料計量ループと少なくとも一つの流体通路とを包含する流体分析装置を用意することであって、前記試料計量ループと前記少なくとも一つの流体通路とが少なくとも一つの凍結融解バルブとの流体連通状態にあることと、
前記試料計量ループへ試料を導入することであって、前記試料が、炭素原子を含有する少なくとも一つの氷核形成剤（ＩＮＡ）を包含することと、
前記少なくとも一つの凍結融解バルブを使用して前記試料計量ループを電子選択的に冷却して、前記少なくとも一つの凍結融解バルブ及び／又は前記試料計量ループの前記試料の少なくとも一部分を凍結させることと、
を包含する方法。
【請求項３４】
前記少なくとも一つの流体通路が主輸送通路と少なくとも一つの試薬通路とを包含し、前記流体分析装置が、すべて前記主輸送通路との流体連通状態にある試料インプットと緩衝液インプットとビードウェルアレイとを包含し、前記少なくとも一つの凍結融解バルブが、前記主輸送通路及び／又は少なくとも一つの試薬通路との連通状態にある複数の離間した凍結融解バルブである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記流体分析装置がさらに、ビード貯蔵／試料培養室と廃棄物容器とを包含し、前記試料計量ループが前記ビード貯蔵／培養室と前記試料インプットとの間に所在する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料計量ループが、約１μＬと約１ｍＬの間の容積を有して、前記試料計量ループの各端部分の第１及び第２凍結融解バルブとの流体連通状態にある、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも一つのＩＮＡが、氷核形成タンパク質及び／又は氷核形成タンパク質の機能的断片、氷核形成核酸、氷核形成脂質、及び／又は、氷核形成炭水化物を包含する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも一つのＩＮＡが有機体から抽出されるか有機体に由来する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも一つのＩＮＡが氷核形成タンパク質（ＩＮＰ）及び／又は氷核形成タンパク質の機能的断片を包含する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＩＮＰ及び／又はＩＮＰの機能的断片が、ｉｃｅＥ，ｉｃｅＨ，ｉｎａＡ，ｉｎａＥ，ｉｎａＦ，ｉｎａＫ，ｉｎａＰｂ，ｉｎａＱ，ｉｎａＵ，ｉｎａＶ，ｉｎａＷ，ｉｎａＸ，ｉｎａＺで構成されるグループから選択される遺伝子により符号化され、前記遺伝子が、シュードモナス・シリンゲ、シュードモナス・フルオレセンスＫＵＩＮ−１、エルウィニア・ヘルビコラ、エルウィニア・ウレドヴォラ、パントエア・アナナチス、ザントモナス・カンペストリス、エルウィニア・カロトボーラ、シュードモナス・アンタークチカ、シュードモナス・アエルギノーサ、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・ヴィリディフラヴァ、パントエア・アグロメランス、エルウィニア・アナナス、及び／又は、シュードモナス・ボレアリスで構成されるグループから選択される有機体で発見されるか有機体から採取される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記試料が複数の細胞を包含し、前記少なくとも一つの凍結融解バルブを使用して前記試料計量ループを電子選択的に冷却して前記少なくとも一つの凍結融解バルブ及び／又は前記試料計量ループで前記試料の少なくとも一部分を凍結させると、前記複数の細胞の少なくとも一部分が溶解する、請求項３３から４０のいずれか一つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年７月２２日に出願された米国仮出願第６２／１９５，６５２号の利益及び優先権を主張し、その内容は参照によりここに完全に記載されているかのように援用される。
【０００２】
連邦政府援助の記載
本発明は、ＤＯＤ国防高等研究計画局（ＤＡＲＰＡ）により付与された許可第ＨＲ００１１−１２−２−０００１号に基づく政府援助により行われた。連邦政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
著作権の留保
本特許書類の開示の一部分は、著作権保護の対象となるものを含む。著作権所有者であるノースカロライナ州チャペルヒル（Chapel Hill）のノースカロライナ大学（The University of North Carolina）は、米国特許商標庁の特許包袋又は記録に記載されるものなので特許書類又は特許開示を何者かが再掲することに異議を唱えないが、それ以外はいかなる著作権もすべて留保する。
【０００４】
本発明は、分析の為に分析物を処理する流体装置に関する。
【背景技術】
【０００５】
マイクロ流体装置又はチップは、少量の液体を処理及び研究することが可能なので大きな注目を集めている。非特許文献１を参照すること。クロマトグラフィ及び電気泳動による分離、細胞培養、臨床現場即時医療診断を含めて、これらの装置についての様々な応用が実証されている。多くの液体又は試薬を利用するマイクロ流体システムでは、流体の流れを調整するのにバルブが有用又は必要であることが多い。凍結融解バルブ（ＦＴＶ）は、熱電冷却器（ＴＥＣ）のような外部冷却源を利用して通路内で流体のプラグを凍結させ、こうして流体チップの所望の領域で流体の流れを停止させる。それから、融解するまでプラグを温めることにより通路が開放される。しかしながら、マイクロ流体スケールで氷晶の核を形成するのに必要とされる低温により、ＦＴＶの実現は阻止されている。
【０００６】
液体水は、その融点を下回ると必ずしも凍結するわけではなく即座に凍結するわけではない。液体水の温度が０℃よりも低下すると、略固相の小さな凝集体（「エンブリオ」）が液相の中に存在する準安定性の熱力学状態（過冷却）に入る。これらのエンブリオは液相との平衡状態で崩壊又は成長し、その平均サイズは過冷却の程度に比例する。準安定性の液相が安定した固相（氷相／凍結相）へ移行するには、エンブリオの成長が崩壊よりもエネルギー的に好ましく起こりやすいものであるべきである。これは「核形成」として知られるプロセスにおいて発生し、これには二つのタイプがある。純液体では、エンブリオが臨界サイズに達すると核形成が均質に発生し、固相の成長継続を誘発する。過冷却相の温度が低下すると、均質な核形成の確率が高くなる。およそ−３５℃では、連続して１℃低下するたびにこの確率は５０倍ずつ上昇し始め、およそ−４０℃では、均質な核形成の確率は１００％に近づくか達する。この温度範囲より上では、鉱物、埃、花粉などの異物とともに、水が不均質に核形成されうる。これらの核形成不純物は豊富にあるので、マクロスケールでは激しい過冷却はあまり観察されない。
【０００７】
マイクロ流体装置は一般的に、凹凸のない通路壁と非常に小さい容積とを有して、核形成部位は稀である。大部分のマイクロ流体装置で水を凍結させるには、たいていは−２０℃より下の温度までの高度の過冷却が一般的に必要とされる。これは、ヒートポンプと一方では出力についてのシステムの要件を高める。マイクロ流体装置と冷却要素との間の強力な熱接触も、重要な設計上の課題である。通路からのヒートポンプを増大又は最大化するには、Ｄ２６３ガラスのような薄い材料がたいてい使用される。これらの薄板ガラス材料は脆弱である。付加的に、核形成部位が存在しないと、良好なバルブ作用事象の再現性は、高い相対的標準偏差パーセント（％ＲＳＤ）を有する。温暖な温度で氷核を形成することが可能であるが水不溶性ゆえにマイクロ流体装置での応用がたいていは制限される薬剤、及び／又は、多くの生体プロセスを阻止して、生体緩衝液で使用される多くの塩の沈殿を引き起こす成分の使用により、これらの問題が回避されうる。また、多くの核剤は乾燥時に最も良好に機能し、水中に懸濁されると効果のほとんどを失うことがある。これらの懸念が、マイクロ流体装置でのＦＴＶの実現を制限している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ホワイトサイズ（Whitesides）Ｇ．Ｍ．著「マイクロ流体の原点及び将来（The Origins and the Future of Microfluidics）」ネイチャー２００６年（Nature 2006）pp.442, 368-373
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の実施形態は、比較的高い温度で、及び／又は、ＦＴＶシステムを備える従来のマイクロ流体装置よりも高速で凍結させるように確実に作用しうる一つ以上の氷核形成剤（ＩＮＡ）（例えば、一つ以上の氷核形成タンパク質“ＩＮＰ”及び／又はその機能的断片、及び／又はこれを包含する微生物）を採用する一つ以上のＦＴＶを備えるマイクロ流体チップを提供する。
【００１０】
本発明の実施形態は、水溶液中で確実に機能して乾燥の必要がなく、それぞれのマイクロ流体装置での多数のバルブ作動を許容しうるＩＮＡを提供する。
【００１１】
本発明の実施形態は、例えば、ポリマー、ガラス、シリコン、金属、ＦＴＶを備えるマイクロ流体チップに適した他の基板のような基板を採用しうる。
【００１２】
本発明の実施形態は、少なくとも一つの凍結融解バルブを備える少なくとも一つの流体通路と少なくとも一つの氷核形成剤（ＩＮＡ）とを含む流体分析装置に関する。
【００１３】
少なくとも一つのＩＮＡは、氷核形成タンパク質、氷核形成核酸、氷核形成脂質、及び／又は、氷核形成炭水化物のうち一つ以上を含みうる。
【００１４】
少なくとも一つのＩＮＡは、有機体から抽出される、及び／又は、有機体に由来する。
【００１５】
少なくとも一つのＩＮＡは、氷核形成タンパク質（ＩＮＰ）及び／又はその機能的断片を含みうる。任意で、ＩＮＰ及び／又はその機能的断片は、シュードモナス・シリンゲの膜から抽出されうる。
【００１６】
以下の有機体、すなわちシュードモナス・シリンゲ、シュードモナス・フルオレセンスＫＵＩＮ−１、エルウィニア・ヘルビコラ、エルウィニア・ウレドヴォラ、パントエア・アナナチス、ザントモナス・カンペストリスのうち一つ以上に発見される、及び／又はこれらから採取される以下の遺伝子、すなわちｉｃｅＥ，ｉｃｅＨ，ｉｎａＡ，ｉｎａＥ，ｉｎａＦ，ｉｎａＫ，ｉｎａＰｂ，ｉｎａＱ，ｉｎａＵ，ｉｎａＶ，ｉｎａＷ，ｉｎａＸ，ｉｎａＺのうち一つ以上により、ＩＮＰが符号化されうる。他の遺伝子及び／又は有機体が使用されてもよい。
【００１７】
流体分析装置は、合体されて、少なくとも一つの流体輸送通路を備えるマイクロ流体チップを画定する第１及び第２基板を有し、流体輸送通路は、複数の離間した凍結融解バルブを備える。
【００１８】
流体分析装置は、少なくとも一つのＩＮＡを包含する液体緩衝液との流体連通状態にある。少なくとも一つのＩＮＡは、流体分析装置の流体ポートへ流動導入されうる。
【００１９】
少なくとも一つの凍結融解バルブは、複数の離間した凍結融解バルブであって、少なくとも一つの流体通路の画定領域との熱連通状態にある熱電冷却器を各々が含む。
【００２０】
少なくとも一つの流体通路は、マイクロ流体又はナノ流体通路となるサイズである少なくとも一つの区画を有しうる。
【００２１】
少なくとも一つの流体通路は、主輸送通路と少なくとも一つの試薬通路とを有しうる。
【００２２】
流体分析装置は、すべて主輸送通路との流体連通状態にある試料インプットと緩衝液インプットとビードウェルアレイとを有しうる。少なくとも一つの凍結融解バルブは、主輸送通路及び／又は少なくとも一つの試薬通路との流体連通状態にある複数の離間した凍結融解バルブでありうる。
【００２３】
少なくとも一つの流体通路は、少なくとも一つのＩＮＡが表面に接合及び／又はコーティングされた少なくとも一つの流体通路を含みうる。
【００２４】
流体分析装置は、ビード貯蔵／試料培養室と廃棄物容器と試料計量ループとを有しうる。試料計量ループは、ビード貯蔵／培養室と試料インプットとの間に所在しうる。
【００２５】
試料計量ループは、約１μLと約１ｍＬの間の容積を有して、試料計量ループのそれぞれの端部分の第１及び第２凍結融解バルブとの流体連通状態にある。ＩＮＡは、細胞溶解を限定的にではなく含む試料分離の一部としての試料計量ループでの試料の凍結を改良するのに使用されうる。
【００２６】
少なくとも一つのＩＮＡは、氷に似た構造、及び／又は、水分子を氷状の格子に配列する構造を包含しうる。
【００２７】
他の実施形態は、標的分析物を分析する方法に関する。この方法は、少なくとも一つの凍結融解バルブとの流体連通状態にある少なくとも一つの流体通路を備える流体分析装置を用意することと、少なくとも一つの氷核形成剤（ＩＮＡ）を少なくとも一つの流体通路へ導入することと、少なくとも一つの凍結融解バルブを電子選択的に冷却し、少なくとも一つのＩＮＡを使用して少なくとも一つの凍結融解バルブを凍結させることとを含む。
【００２８】
少なくとも一つの凍結融解バルブは、複数の離間した凍結融解バルブでありうる。この方法は、少なくとも一つの流体通路と熱的に連通している冷却器を、一般的には−１００℃から−１℃、より一般的には−５０℃と−２℃の間の範囲の温度に（電子的に）設定して、凍結融解バルブを凍結させることを含みうる。
【００２９】
流体装置は、０．０１ｍｍと１０ｍｍの間の厚さを持つ流体マイクロチップでありうる。
【００３０】
凍結融解バルブの少なくとも幾つかは、３分以内に発生する凍結作用の為、例えば約−５０℃と約−２℃の間など所望の温度範囲に設定される熱電冷却器を有し、それぞれの流体装置、分析物、及び／又は、分析について、電子選択的冷却が複数回実行されうる。
【００３１】
装置は流体マイクロチップでありうる。
【００３２】
分析物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、グリカン、医薬品、あるいは他の生体又は合成高分子か元素又は無機化合物の分子であるか、かかる分子を含みうる。
【００３３】
少なくとも一つのＩＮＡは、氷核形成タンパク質、氷核形成核酸、氷核形成脂質、及び／又は、氷核形成炭水化物を含みうる。
【００３４】
少なくとも一つのＩＮＡは、有機体から抽出されるか有機体に由来する。
【００３５】
少なくとも一つのＩＮＡは、氷核形成タンパク質（ＩＮＰ）及び／又はその機能的断片を含みうる。
【００３６】
任意で、ＩＮＰ及び／又はその機能的断片は、シュードモナス・シリンゲの膜から抽出される。
【００３７】
以下の有機体、すなわちシュードモナス・シリンゲ、シュードモナス・フルオレセンスＫＵＩＮ−１、エルウィニア・ヘルビコラ、エルウィニア・ウレドヴォラ、パントエア・アナナチス、ザントモナス・カンペストリスのうち一つ以上に発見される、及び／又はこれらから採取される以下の遺伝子、すなわちｉｃｅＥ，ｉｃｅＨ，ｉｎａＡ，ｉｎａＥ，ｉｎａＦ，ｉｎａＫ，ｉｎａＰｂ，ｉｎａＱ，ｉｎａＵ，ｉｎａＶ，ｉｎａＷ，ｉｎａＸ，ｉｎａＺのうち一つ以上により、ＩＮＰが符号化されうる。他の遺伝子及び／又は有機体が使用されてもよい。
【００３８】
液体中の少なくとも一つのＩＮＡは、少なくとも一つの流体通路へ流動導入される。
【００３９】
液体は緩衝液でありうる。少なくとも一つのＩＮＡは緩衝液中で希釈されうる。
【００４０】
少なくとも一つのＩＮＡのコーティングを包含する表面から少なくとも一つのＩＮＡが導入される、及び／又は、少なくとも一つの流体流路の表面に少なくとも一つのＩＮＡが吸着される、及び／又は、化学的に接合される。
【００４１】
少なくとも一つのＩＮＡは、氷に似た構造、及び／又は、水分子を氷状の格子に配列する構造を有しうる。
【００４２】
また他の実施形態は、ＤＮＡ処理の為の液体緩衝液に関する。
【００４３】
液体緩衝液は、１分子／μＬと１００億分子／μＬの間まで任意で希釈される少なくとも一つの氷核形成剤（ＩＮＡ）を含みうる。ＩＮＡの濃度は、１００億分子／μＬを超えてもよく、ナノモル、マイクロモル、及び／又は、ミリモルの濃度範囲にわたる。
【００４４】
少なくとも一つのＩＮＡは、有機体から抽出されるか有機体に由来する。
【００４５】
少なくとも一つのＩＮＡは、氷核形成タンパク質（ＩＮＰ）及び／又はその機能的断片を含みうる。任意で、ＩＮＰ及び／又はその機能的断片は、シュードモナス・シリンゲの膜から抽出されうる。
【００４６】
以下の有機体、すなわちシュードモナス・シリンゲ、シュードモナス・フルオレセンスＫＵＩＮ−１、エルウィニア・ヘルビコラ、エルウィニア・ウレドヴォラ、パントエア・アナナチス、ザントモナス・カンペストリスのうち一つ以上に発見される、及び／又はこれらから採取される以下の遺伝子、すなわちｉｃｅＥ，ｉｃｅＨ，ｉｎａＡ，ｉｎａＥ，ｉｎａＦ，ｉｎａＫ，ｉｎａＰｂ，ｉｎａＱ，ｉｎａＵ，ｉｎａＶ，ｉｎａＷ，ｉｎａＸ，ｉｎａＺのうち一つ以上により、ＩＮＰが符号化されうる。他の遺伝子及び／又は有機体が使用されてもよい。
【００４７】
少なくとも一つのＩＮＡは、一つ以上のアプタマーを含みうる。
【００４８】
少なくとも一つのＩＮＡは、氷核形成タンパク質、氷核形成核酸、氷核形成脂質、及び／又は、氷核形成炭水化物のうち一つ以上を含みうる。
【００４９】
少なくとも一つのＩＮＡは、氷に似た構造、及び／又は、水分子を氷状の格子に配列する構造を有しうる。
【００５０】
一つの実施形態に関して説明された発明の態様は、それについて明記されていなくても異なる実施形態に取り入れられうることに注意していただきたい。すなわち、すべての実施形態及び／又は実施形態の特徴がいかなる手法及び／又は組み合わせで組み合わされてもよいのである。出願人は、そのように原出願時に請求されていなくても、他の単数又は複数の請求項に従属する及び／又はその特徴を取り入れるように原出願時の請求項を補正できる権利を含めて、原出願時の請求項を変更する、及び／又は、それに応じて新たな請求項を出願する権利を留保する。本発明の以上及び他の目的及び／又は態様は、以下に提示される明細書で詳しく説明される。本発明のさらなる特徴と利点と詳細とは、図と以下に続く好適な実施形態についての詳細な説明との解釈により当業者に認識され、このような説明は本発明を例示するものに過ぎない。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１Ａ】本発明の実施形態による、輸送通路に近接して配置される少なくとも一つの熱電冷却器を備えるマイクロ流体チップの概略端部断面図である。
【図１Ｂ】本発明の実施形態による、輸送通路の少なくとも一部を保持する基板の下の熱電冷却器を図示する、図１Ａに示された装置の概略上面図である。
【図２Ａ】本発明の実施形態による、例示的なマイクロ流体チップの拡大上面図である。
【図２Ｂ】本発明の実施形態による、図２Ａに示された例示的なマイクロ流体チップの拡大上面図であり、さらに、例示的な凍結融解バルブのフットプリントを含む付加的な構成要素／特徴を図示している。
【図２Ｃ】本発明の幾つかの実施形態によるバルブ番号を表す注記を含む、図２Ｂに示されたマイクロ流体チップの拡大上面図である。
【図３Ａ】本発明の実施形態による例示的なマイクロ流体チップの拡大上面図である。
【図３Ｂ】本発明の実施形態による、図３Ａに示された例示的なマイクロ流体チップの拡大上面図であり、さらに例示的な凍結融解バルブのフットプリントを含む付加的な構成要素／特徴を図示している。
【図３Ｃ】本発明の幾つかの実施形態によるバルブ番号を表す注記を含む、図３Ｂに示されたマイクロ流体チップの拡大上面図である。
【図４Ａ】本発明の実施形態による二重基板マイクロ流体チップのデジタル写真である。
【図４Ｂ】本発明の他の実施形態による二重基板マイクロ流体チップのデジタル写真である。
【図５Ａ】本発明の実施形態による、チップの規定領域にわたるＰＴＦＥ空気専用膜の設置を図示する二重基板マイクロ流体チップのデジタル写真である。
【図５Ｂ】本発明の実施形態による、図５Ａに示されたマイクロ流体チップの拡大区画のデジタル写真であるが、ＰＴＦＥ空気専用膜はビード貯蔵／試料培養室の上の位置にはない。
【図６】本発明の実施形態により実行されうる分析物を処理及び／又は分析する方法の例示的動作のフローチャートである。
【図７】本発明の実施形態による、分析の為一つ以上のマイクロ流体チップと解除可能に係合する自動検査システムの一部分の側方前方斜視図である。
【図８】本発明の実施形態による、流体制御の為の凍結融解バルブを備える例示的システムの概略図である。
【図９】本発明の実施形態による、凍結融解バルブのオン／オフ及び／又は温度作用を制御する為の例示的なグラフィックユーザインタフェースである。
【図１０】本発明の実施形態による、マイクロ流体チップを保持する為のＴＥＣ台部を備える例示的な実装アセンブリの分解図である。
【図１１】本発明の実施形態による、各温度でＩＮＰなし（「ＩＮＰ非含有」）が最も左のバーとして示されている緩衝液についてとトリス緩衝液での多様なＩＮＰ抽出希釈についての凍結時間（秒）と温度のグラフである。ＩＮＰ非含有緩衝液は、−２０℃では割り当て時間内に凍結しなかった。エラーバーは、各方向に一つずつの標準偏差を示している。
【図１２】本発明の実施形態による、トリス緩衝液での五つの異なるＩＮＰ抽出希釈の為に試料を凍結させるのに使用される融解時間（秒）と温度のグラフである。各バーセットの最も左のバーは、ＩＮＰなし（ＩＮＰ非含有）緩衝液についてのものである。ＩＮＰ非含有緩衝液は−２０℃の凍結温度では凍結しない為、この緩衝液についてこの温度では融解時間は適用できない。エラーバーは、各方向に一つずつの標準偏差を示している。
【図１３】本発明の実施形態による、異なるチップ厚さと異なるＩＮＰ抽出希釈について試料を凍結させるのに使用される凍結時間（秒）と温度のグラフである。−２０℃の凍結温度では試料は凍結しない為、標準的な厚さと薄い厚さのマイクロ流体チップではＩＮＰ非含有緩衝液についてこの温度では融解時間は適用できない。エラーバーは、各方向に一つずつの標準偏差を示している。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
さて以下では、発明の実施形態が示されている添付の図を参照して本発明がより詳しく説明される。しかしながらこの開示は、多様な形で具体化されてもよく、ここに提示される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。同様の数字は、全体を通して同様の要素を指している。図では、ある種の層、構成要素、又は特徴は明瞭化の為に誇張され、破線は他に明記されなければ任意の特徴又は操作を示している。加えて、操作（又はステップ）のシーケンスは、他に明記されなければ、図及び／又は請求項に挙げられた順序に限定されない。図面では、線の太さ、層、特徴、構成要素、及び／又は領域が明瞭化の為に誇張され、破線は他に明記されなければ任意の特徴又は操作を示す。“Ｆｉｇｕｒｅ”の語に代わる“ＦＩＧ．”及び“Ｆｉｇ．”の略語は、文中及び図中で互換的に使用されうる。
【００５３】
ここで使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、発明を限定することは意図されていない。ここで使用される際に、単数形“ａ”、“ａｎ”、“ｔｈｅ”は、文脈上明らかに他を指していない限り、複数形も含むことが意図されている。さらに、“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”、“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”（包含する）、“ｉｎｃｌｕｄｅｓ”、及び／又は“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ”（含む）の語は、本明細書で使用される時に、記載の特徴、領域、ステップ、操作、要素、及び／又は、構成要素の存在を明記するものであるが、一つ以上の他の特徴、領域、ステップ、操作、要素、構成要素、及び／又は、これらのグループの存在又は追加を除外しないことが理解されるだろう。ここで使用される際に、“ａｎｄ／ｏｒ”（及び／又は）の語は、関連して挙げられた項目のうち一つ以上のいかなる、またすべての組み合わせも含む。ここで使用される際に、“ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｘ  ａｎｄ  Ｙ”（ＸとＹとの間）と“ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｂｏｕｔ  Ｘ  ａｎｄ  Ｙ”（約ＸとＹの間）のような語句は、ＸとＹとを含むものと解釈されるべきである。ここで使用される際に、“ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｂｏｕｔ  Ｘ  ａｎｄ  Ｙ”（約ＸとＹとの間）のような語句は、“ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｂｏｕｔ  Ｘ  ａｎｄ  ａｂｏｕｔ  Ｙ”（約Ｘと約Ｙとの間）を意味する。ここで使用される際に、“ｆｒｏｍ  ａｂｏｕｔ  Ｘ  ｔｏ  Ｙ”（約ＸからＹまで）のような語句は、“ｆｒｏｍ  ａｂｏｕｔ  Ｘ  ｔｏ  ａｂｏｕｔ  Ｙ”（約Ｘから約Ｙまで）を意味する。
【００５４】
層、領域、又は基板のような特徴が別の特徴又は要素の「上に」あると言及される時には、他の特徴又は要素のすぐ上にあっても、介在する特徴及び／又は要素が存在してもよいことが理解されるだろう。対照的に、ある要素が別の特徴又は要素の「すぐ上」にあると言及される時には、介在する要素は存在しない。特徴又は要素が別の特徴又は要素に「接続」、「装着」、「結合」されると言及される時には、これは他の要素に直接的に接続、装着、又は結合されても、介在の要素が存在してもよいことも理解されるだろう。対照的に、ある特徴又は要素が別の要素に「直接的に接続」、「直接的に装着」、又は「直接的に結合」されると言及される時には、介在の要素は存在しない。一つの実施形態に関して説明及び図示されたが、説明又は図示された特徴は他の実施形態に適用されうる。
【００５５】
他に定義されなければ、（技術的及び科学的な語を含めて）ここで使用されるすべての語は、本開示が属する技術分野の通常の技量を有する者に通常理解されるのと同じ意味を有する。さらに、通常使用されている辞書に定義されているような語は、本出願及び関連技術における意味と一致する意味を有するものと解釈されるべきであり、またここにはっきりと定義されない限り、理想化されるか過度に形式的な意味で解釈されるべきではないことが理解されるだろう。周知の機能又は構造は、簡潔性及び／又は明瞭性の為、詳細に説明されない。
【００５６】
“ｕｎｄｅｒ”（下に）、“ｂｅｌｏｗ”（下方に）、“ｌｏｗｅｒ”（下方の）、“ｏｖｅｒ”（上方に）、“ｕｐｐｅｒ”（上方の）、その他のような空間的相対語は、図に示されている一つの要素又は特徴と別の要素又は特徴の関係を表す説明を容易にする為にここで使用されうる。空間的相対語は、図に描かれた配向に加えて、使用又は操作時の装置の多様な配向を包含する意図があることが理解されるだろう。例えば、図の装置が逆転された場合、他の要素又は特徴の「下に」又は「下方に」あると記載される要素は、他の要素又は特徴の「上方に」配向されることになるだろう。こうして、例示的な語である「下に」は、上方と下方の両方の配向を包含しうる。装置は、他の配向を持ち（９０度回転されるか他の配向であり）、ここで使用される空間的相対記述子はそれに従って解釈される。同様に、“ｕｐｗａｒｄｌｙ”（上向きに）、“ｄｏｗｎｗａｒｄｌｙ”（下向きに）、“ｖｅｒｔｉｃａｌ”（垂直の）、“ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ”（水平の）、その他の語は、他に明記されない限り説明のみを目的としてここで使用される。
【００５７】
第１、第２等の語はここでは様々な要素、構成要素、領域、層、及び／又は区分を説明するのに使用されるが、これらの要素、構成要素、領域、層、及び／又は区分はこれらの語により限定されるべきではないことが理解されるだろう。これらの語は一つの要素、構成要素、領域、層、又は区分を別の領域、層、又は区分と区別する為にのみ使用されている。ゆえに、以下に記される第１の要素、構成要素、領域、層、又は区分が、本発明の教示を逸脱することなく、第２の要素、構成要素、領域、層、又は区分と呼ばれることもある。
【００５８】
引用文献（特許、特許出願、論文）のすべては、参照により、ここに完全に記載されているかのように援用される。
【００５９】
「マイクロチップ」及び「マイクロ流体チップ」の語は互換的に使用され、実質的に平面状の薄型装置を指している。マイクロ流体チップは、剛性、半剛性、又は可撓性である。「薄型」の語は、１０ｍｍと０．０１ｍｍの間のように１０ｍｍ以下であって、約３ｍｍ、約２．５ｍｍ、約２ｍｍ、約１．５ｍｍ、約１ｍｍ、約０．５ｍｍ、約０．１ｍｍ、約０．０１ｍｍである厚さ寸法を指す。マイクロチップは一般的に、約６インチ未満、より一般的には約１インチと６インチの間の幅及び長さを有する。マイクロチップは、長さ寸法より小さい幅寸法を有する。マイクロ流体チップは、幾つかの実施形態では、約２．１３インチ（５４ｍｍ）である幅寸法と、約３．４インチ（８５．５ｍｍ）である長さ寸法とを有する。マイクロチップは、マイクロサイズ及び／又はナノサイズの流体通路を含みうる。
【００６０】
「主寸法」の語は、流体通路の幅及び／又は奥行寸法を指す。
【００６１】
流体通路に関する「マイクロサイズ」及び「マイクロ流体」の語は、ミリメートル、サブミリメートル、又はそれより小さいサイズの幅及び／又は奥行を有する流体流路を指し（例えば、この語は、ミリメートル、マイクロメートル、及びナノメートルサイズの通路を含み）、数百ミクロン以下、一般的には９００ミクロンより小さく１ｎｍより大きいサイズ範囲の幅及び／又は奥行を有する区画を少なくとも備える通路を含む。
【００６２】
幾つかの実施形態において、主輸送通路は、１ｎｍと約５００μｍの間である少なくとも一つの主寸法を持つ、主な長さを有するマイクロ流体通路でありうる。主輸送通路は例えば、約２５０μｍ／２５０μｍ（幅／奥行つまり幅／高さ）の主寸法を有する。「主流体輸送通路」の語は、一般的には、分析物が分析の為に流動するマイクロサイズの通路又はナノ通路である、副次的な長さを少なくとも包含する流体通路を指す。
【００６３】
「ナノ通路」の語は、ナノメートルスケールである臨界寸法を有する通路又は溝部を指す。ナノ通路の（「臨界」として知られる）主寸法はともに、一般的に、約１〜７０ｎｍの間を含む約１００ｎｍ未満である。幾つかの実施形態において、少なくとも一つの主寸法は（平均又は最大で）約５ｎｍ以下でありうる。
【００６４】
流体通路は、側壁と床部とを有する。一つ以上の流体輸送通路は、側壁が間に延在する開放上面と密閉底面とを有するように固体基板に形成されうる。流体通路及び／又は関連のポートの上面を密封、被覆、又は他の方法で密閉するのに、一つ以上の上基板、膜、又はカバーが使用されうる。
【００６５】
「約」の語は、＋／−１０％のように、＋／−２０％以下の間で変化しうるパラメータを指す。
【００６６】
「横」通路の語は、それぞれの流体輸送通路と交差する流体通路を指す。流体装置は、主輸送通路に各々が合流する複数の横通路を含みうる。
【００６７】
試料中の分析物は、例えば、合成及び生体高分子、ナノ粒子、小分子、ＤＮＡ、核酸／ポリ核酸、ペプチド、タンパク質、グリカン、医薬品、元素化合物、無機化合物、有機化合物、及び／又はその他を含む様々な混合物を含む試料からの対象分析物である。分析物は一つ以上の単一分析物分子でありうる。試料又は試料の分析物は、アミノ酸又は荷電分子、分子、ペプチド、及びタンパク質など、一つ以上の極性代謝物質を含みうる。試料及び／又は分析物はまた、あるいは代替的に、生物流体、血液、血清、尿素、乾燥血液、細胞増殖培地、溶解細胞、飲料、又は、食品から抽出される分子を含みうる。試料はまた、又は代替的に、水、空気、又は土壌のような環境試料を含みうる。
【００６８】
輸送通路での輸送は、界面動電性、濃度分極、及び／又は、油圧又は空気圧（強制的圧力又は圧力勾配）、毛管力、又は重力のうち一つ以上を使用して実行されうる。
【００６９】
ここで使用される「氷核形成剤」、「ＩＮＡ」、又はその文法的変形は、氷晶形成に触媒作用を及ぼす、及び／又は、氷晶形成を開始することが可能である、及び／又は、その能力を有する薬剤を指す。ゆえにＩＮＡは、氷核を形成できる、及び／又は、その能力を有する。ＩＮＡは、所与の温度でのＦＴＶ作動時間を短縮しうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＡは炭素含有ＩＮＡである（つまり、少なくとも一つの炭素原子を含有する）。幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、氷核形成タンパク質（単数形では“ＩＮＰ”，複数形では“ＩＮＰｓ”）及び／又はその機能的断片、氷核形成核酸、氷核形成脂質、及び／又は、氷核形成炭水化物を含む、及び／又は、これらである。幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、例えばヨウ化銀及び／又は銀を含有するナノ粒子のような銀含有薬剤ではない。幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、それが存在する流体中で塩の沈殿を引き起こす、及び／又は、行うことはない。幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、生体プロセス、及び／又は、マイクロ流体装置を使用して研究及び／又は実行される分析でのプロセスに干渉しない。幾つかの実施形態において、ＩＮＡはそれが存在する流体中の構成要素に干渉しない。
【００７０】
したがって、幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、例えば、ＩＮＰ及び／又はその機能的断片、氷核形成核酸、氷核形成脂質、及び／又は、氷核形成炭水化物を含む、及び／又は発現させる、無脊椎動物（例えば多細胞無脊椎動物）、細菌、菌類、及び／又は、地衣類のような有機体でありうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＰ及び／又はその機能的断片、氷核形成核酸、氷核形成脂質、及び／又は、氷核形成炭水化物を含む、及び／又は、（例えばタンパク質工学により）発現させる細菌及び／又は酵母菌のような有機体から、ＩＮＡが採取されうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、例えば、ＩＮＰ及び／又はその断片、氷核形成核酸、氷核形成脂質、及び／又は、氷核形成炭水化物が存在する有機体の細胞及び／又は細胞構成要素（例えば細胞膜）のような有機体（例えば脊椎動物及び／又は微生物）の構成要素及び／又は由来物でありうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＰ及び／又はその機能的断片が細胞膜に残存する、及び／又は、他の膜構成要素（例えば他の細胞膜タンパク質又は脂質）との相互作用が可能である時に、核形成の有効性が最大化されうる。幾つかの実施形態において、氷核形成脂質は、細胞膜のすべて又は一部分を包含するか、合成脂質膜のすべて又は一部分を包含しうる。氷核形成脂質は、他の氷核形成剤の作用を高めうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、ＩＮＰ及び／又はその機能的断片でありうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、例えば、氷核を形成できる合成核酸、合成脂質、及び／又は、合成炭水化物のような、氷核形成核酸、氷核形成脂質、及び／又は、氷核形成炭水化物でありうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、自然発生による、合成による、又は選択的進化による核酸配列でありうる。
【００７１】
二つ以上（例えば３，４，５，６、又はそれ以上）の異なるＩＮＡが、本発明の装置、流体通路、及び／又は、ＦＴＶに存在しうる。例えば、本発明の装置は複数のＦＴＶを包含し、複数のＦＴＶのうち一つのＦＴＶは、複数のＦＴＶのうち別のＦＴＶと同じＩＮＡ、同じＩＮＡ組み合わせ、異なるＩＮＡ，及び／又は異なるＩＮＡ組み合わせを含みうる。ＩＮＡは、本発明の装置、流体通路、及び／又はＦＴＶに、適当な濃度で存在しうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、１μＬ当たり約１分子又は有機体から１μＬ当たり約１００億分子又は有機体の範囲、あるいは１μＬ当たり約１，０００分子又は有機体から１μＬ当たり約３００万分子又は有機体のような範囲及び／又はその中の個々の値の濃度で、装置、流体通路、及び／又は、ＦＴＶに存在しうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＡの濃度は、例えば、約１ｎＭから約１ｍＭのように、ナノモルからミリモルの濃度範囲に及ぶ。幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、１００億分子／μＬより高い濃度で、装置、流体通路、及び／又は、ＦＴＶに存在しうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、ナノモル、マイクロモル、及び／又は、ミリモルの濃度範囲に及ぶ範囲の濃度で、装置、流体通路、及び／又はＦＴＶに存在しうる。
【００７２】
幾つかの実施形態において、ＩＮＡ（例えばＩＮＰ、氷核形成核酸、氷核形成脂質、及び／又は、氷核形成炭水化物）は、氷核を形成することのできる構造（例えば二次、三次、四次構造又はその一部分）を包含する。幾つかの実施形態において、ＩＮＡ（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はペプチドアプタマーなどのアプタマー）は、氷に似た構造を包含する、及び／又は、水分子を氷状の格子に配列しうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、効率的に氷核を形成しうる（つまり、ＩＮＡは氷状の花粉及び／又は埃粒子の核をランダムに形成するのではない）。幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、平均すると、ＩＮＡが不在の状態で水及び／又は溶液が凍結する平均時間よりも少ない時間内に所与の温度で水及び／又は溶液を凍結させることにより、効率的に氷核を形成しうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＡが不在の状態で水及び／又は溶液が凍結融解バルブで凍結する時間と比較すると、１０回の試験を使用して評価されうる連続的凍結操作にわたって、５０秒未満（例えば４５，４０，３５，３０，２５，２０，１５，１０，５，４，３，２，１秒）の標準偏差を含む短い時間内に所与の温度でマイクロ流体装置のそれぞれの凍結融解バルブで水及び／又は溶液を凍結させることにより、ＩＮＡは効率的に氷核を形成しうる。
【００７３】
ＩＮＡの例は、米国特許第４，２００，２２８号、第４，７０６，４６３号、第４，９７８，５４０号、第５，２３３，４１２号、第５，４８９，５２１号、第５，５３２，１６０号、第５，５５４，３６８号、第５，６２０，７２９号、第５，８４３，５０６号、第５，９７２，６８６号、第６，３６１，９３４号、第７，６２４，６９８号と、欧州特許出願第８８１１４１２０．４号に記載されているものを限定的にではなく含み、各々の一部分は、本段落に関連する教示の為に参照によりその全体が援用される。
【００７４】
ここで使用される際に、「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」の語は、アミノ酸残基の重合体を指す。これらの語は、一つ以上のアミノ酸残基が対応の自然発生のアミノ酸とともに自然発生のアミノ酸重合体の人工的な化学類似体である、アミノ酸重合体を含む。
【００７５】
「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド配列」及び「ポリヌクレオチド」の語は互換的に使用され、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、合成（例えば化学的に合成された）ＤＮＡ又はＲＮＡ、そしてＲＮＡ及びＤＮＡのキメラを含むＲＮＡとＤＮＡの両方を包含する。ポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列、又は核酸の語は、鎖の長さに関係なくヌクレオチドの鎖を指す。核酸は、自然発生ヌクレオチドに類似した塩基対であってもなくてもよい、一つ以上の非自然発生ヌクレオチド（例えば自然発生ヌクレオチドの人工的な化学的類似体）を包含しうる。幾つかの実施形態において、核酸は、通常は自然発生せず、必ずしも自然発生ヌクレオチドと同じような塩基対でなくてもよい一つ以上の塩基を包含しうる。核酸は二本鎖又は一本鎖である。「核酸」の語は、他に限定されなければ、自然発生ヌクレオチド（例えばペプチド核酸）に類似した一本鎖核酸となるように交雑されるという点で、自然ヌクレオチド配列の本質的性質を有する類似体を含む。
【００７６】
幾つかの実施形態において、ＩＮＰ及び／又はその機能的断片、氷核形成核酸、氷核形成脂質、及び／又は、氷核形成炭水化物は、それが存在する、及び／又は、発現する有機体及び／又は細胞に、氷核活性（Ｉｃｅ＋）表現型を与える。ここで使用される際のＩｃｅ＋表現型は、０℃より低く−２０℃より高い温度、及び／又は、その中の何らかの範囲及び／又は個々の値のような比較的高温で氷晶形成に触媒作用を及ぼす、及び／又は、氷晶形成を開始させる、有機体及び／又は細胞の能力を指す。ゆえにＩｃｅ＋表現型は、−２０℃から０℃の範囲の温度で氷核を生成する能力を有機体及び／又は細胞に付与する。当業者であれば認識するように、ＩＮＰ及び／又はその機能的断片（例えば、それが発現される有機体から採取される及び／又は抽出されるＩＮＰ及び／又はその機能的断片）、氷核形成核酸、氷核形成脂質、及び／又は、氷核形成炭水化物そのものが、氷晶形成に触媒作用を及ぼす、及び／又は、これを開始させる能力を有している。
【００７７】
幾つかの実施形態において、ＩＮＰは、例えば外側細胞膜タンパク質などの細胞膜タンパク質でありうる。ＩＮＰは、例えば脊椎動物、無脊椎動物（例えば多細胞無脊椎動物）、細菌、菌類、及び／又は、地衣類のような有機体により自然発現する、及び／又は有機体に存在しうる。幾つかの実施形態では、ＩＮＰは組み換えにより有機体に発現しうる。
【００７８】
ＩＮＰを自然発現させる細菌の例は、シュードモナス・シリンゲ、シュードモナス・アンタークチカ、シュードモナス・ヴィリディフラヴァ、シュードモナス・フルオレセンス、エルウィニア・ヘルビコラ、エルウィニア・アナナス、ザントモナス・カンペストリスを限定的にではなく含む。幾つかの実施形態において、ＩＮＰは、ＩＮＰを発現させる有機体（例えば細菌）の外側膜に存在しうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＰは、例えばシュードモナス・シリンゲのようなＩＮＰを発現させる細菌の膜から採取及び／又は抽出されうる。
【００７９】
ポリペプチドに関してここで使用される際に、「断片」の語は、参照ポリペプチド（例えば自然発生ＩＮＰのような完全長ＩＮＰ）に対して長さが短く、参照ポリペプチドの対応部分と同一又はほぼ同一（例えば９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％同一）である連続アミノ酸のアミノ酸配列を包含する、このアミノ酸配列で本質的に構成される、及び／又は構成されるポリペプチドを指す。このようなポリペプチド断片は、適宜、それが構成要素である大きなポリペプチドに含まれうる。幾つかの実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも約２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０，５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９，６０，６１，６２，６３，６４，６５，６６，６７，６８，６９，７０，７１，７２，７３，７４，７５，７６，７７，７８，７９，８０，８１，８２，８３，８４，８５，８６，８６，８７，８８，８９，９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９，１００，１２５，１５０，１７５，２００，２２５，２５０，３００，３５０，３５０，４００，４５０，５００又はそれ以上の連続アミノ酸を包含するか、これらで本質的に構成されるか、これらで構成される。幾つかの実施形態において、ポリペプチド断片は、約１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０，８５，９０，９５，１００，１２５，１５０，１７５，２００，２２５，２５０，３００，３５０，４００，４５０，５００より少ない連続アミノ酸を包含するか、これらで本質的に構成されるか、これらで構成される。
【００８０】
ポリペプチドに関してここで使用される際に、「機能的断片」の語は、完全長ポリペプチドの少なくとも一つの生物活性（例えば、氷核形成に触媒作用を及ぼす、及び／又は、氷核活性（Ｉｃｅ＋）表現型を付与する能力）を、少なくとも約５％，１０％，１５％，２０％，２５％，３０％、３５％，４０％，４５％，５０％，５５％，６０％，６５％，７０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％，９９．５％、又はそれ以上保持するポリペプチド断片を指す。幾つかの実施形態において、機能的断片は、完全長ポリペプチドの少なくとも一つの生物活性を高レベルで有しうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＰの機能的断片を含有する有機体（例えばＩＮＰ機能的断片を含有する細菌）は、完全長ポリペプチドの少なくとも一つの生物活性を高レベルで有する。
【００８１】
幾つかの実施形態において、ＩＮＰ及び／又はその機能的断片は、例えば、８，１６，及び／又は４８個のアミノ酸配列のリピートのように、２個以上の連続アミノ酸の少なくとも一つのリピートを包含する。幾つかの実施形態において、２個以上の連続アミノ酸（例えば８，１６，及び／又は４８個のアミノ酸配列）は、ＩＮＰ及び／又は機能的断片で１，２，３，４，５，６，７，８，９、又はそれ以上の回数、リピートされうる。２個以上の連続アミノ酸（例えば８，１６，及び／又は４８個のアミノ酸配列）は、ＩＮＰ及び／又は機能的断片で１，２，３，４，５，６，７，８，９、又はそれ以上の回数、連続的にリピートされうる。幾つかの実施形態において、リピート配列は、不完全である、及び／又は、自然変異を呈する。アミノ酸配列の例は、グリーン（Green）及びウォーレン（Warren）著のネイチャー１９８５年（Nature 1985）の３１７巻pp. 645-648に記載されたものを限定でなく含み、その内容は、本段落に関係する部分について参照により援用される。幾つかの実施形態において、ＩＮＰ及び／又はその機能的断片は、ＩＮＰの内部領域に存在しうる縦リピートの８，１６，及び／又は４８個のアミノ酸配列を包含しうる。
【００８２】
幾つかの実施形態において、例えば、限定的ではないが、ｉｃｅＥ，ｉｃｅＨ，ｉｎａＡ，ｉｎａＥ，ｉｎａＦ，ｉｎａＫ，ｉｎａＰｂ，ｉｎａＱ，ｉｎａＵ，ｉｎａＶ，ｉｎａＷ，ｉｎａＸ，及び／又はｉｎａＺのような一つ以上の遺伝子により、ＩＮＰが符号化されうる。ＩＮＰは、例えば、限定的ではないが、シュードモナス・シリンゲ、シュードモナス・フルオレセンスＫＵＩＮ−１、エルウィニア・ヘルビコラ、エルウィニア・ウレドヴォラ、パントエア・アナナチス、ザントモナス・カンペストリス、エルウィニア・カロトボーラ、シュードモナス・アンタークチカ、シュードモナス・アエルギノーサ、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・ヴィリディフラヴァ、パントエア・アグロメランス、エルウィニア・アナナス、及び／又は、シュードモナス・ボレアリスのような有機体に存在する、これらに発見される、及び／又は、これらから採取されうる。幾つかの実施形態において、表１に示されているような有機体に存在する、発見される、及び／又は、これらから採取される遺伝子により、ＩＮＰが符号化されうる。例えば、ＩＮＰは、エルウィニア・ヘルビコラに発見されるか存在する、及び／又はこれから採取されるｉｃｅＥ遺伝子により符号化されるポリペプチドでありうる。
【００８３】
表１：氷核形成遺伝子／タンパク質と、これらが発見されるか存在する、及び／又は採取される種の例
【表１】
2018528409.tif 000003
【００８４】
幾つかの実施形態において、ＩＮＰ及び／又はその機能的断片は、受け入れ番号第Ｐ０６６２０号（ＩＣＥＮ＿ＰＳＥＳＹ）に記載されているポリペプチドのような、ｉｎａＺ遺伝子により符号化されたポリペプチドでありうる。ＩＮＰの中心領域（例えばｉｎａＺ）はオクタペプチドの１２２回の不完全なリピートを包含し、氷の構造に類似した構造を有しうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＰ及び／又はその機能的断片は、水分子を氷状の格子に配列しうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＰ及び／又はその機能的断片は、少なくとも一つのベータヘアピン（例えば１，２，３，４，５かそれ以上）を包含する構造を有し、任意で少なくとも一つのベータヘアピンは１，２かそれ以上のオクタペプチドリピートを包含しうる。幾つかの実施形態において、氷核形成核酸、氷核形成脂質、及び／又は、氷核形成炭水化物は、ＩＮＰの構造の少なくとも一部に類似した構造を有しうる。
【００８５】
幾つかの実施形態において、ＩＮＰ及び／又はその機能的断片は、自然に、合成により、及び／又は、組み換えにより得られる、及び／又は生成されうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＰ及び／又はその機能的断片は、それが自然に、及び／又は、組み換えにより発現される有機体から、隔離、取得、採取、及び／又は、抽出されうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＰ及び／又はその機能的断片は、有機体かマイクロ有機体（例えば、細菌、菌類等）から隔離、取得、採取、及び／又は抽出されて、ＩＮＡとして使用されうる。
【００８６】
幾つかの実施形態において、ＩＮＰ及び／又はその機能的断片は、組み換え技術を通して得られ、自然及び／又は合成ＤＮＡからのプラスミドに基づきうる。組み換えＩＮＰ及び／又はその機能的断片は、細菌（例えば大腸菌（エシェリキア・コリ））及び／又は酵母菌（例えば出芽酵母（サッカロマイシス・セリヴィシエ））のような有機体で発現されうる。同様に、ＩＮＰ薬剤は、植物や動物のような他の適当な有機体で発現されうる。組み換えＩＮＰ及び／又はその機能的断片は、ＩＮＰ及び／又は機能的断片の発現、精製、改変、及び／又は、安定化を補助するように改変されうる。例えば、組み換えＩＮＰ及び／又はその機能的断片は、それが発現される有機体からのポリペプチドの精製を促進するポリヒスチジンタグを含むように改変されうる、及び／又は、例えば、温度、ｐＨレベル、イオン強度、及び溶媒強度の範囲のように異なる条件下での変性に対する耐性の向上のようなより好ましい特性を有するように改変されうる。組み換えＩＮＰ及び／又はその機能的断片は、表面や別の分子への付着の為の官能基を含むように改変されうる。幾つかの実施形態において、組み換えＩＮＰ及び／又はその機能的断片は、氷核形成を改良するように改変されうる。例えば、組み換えＩＮＰ及び／又はその機能的断片は、二つ以上のＩＮＰ／機能領域を一緒にリンクするか若しくはＰＴＭ中にリン脂質をリンクする為の配列のリピートを含むか、又はＩＮＰ領域の間の距離を最適化するスペーサを含むように改変されうる。幾つかの実施形態において、組み換えＩＮＰ及び／又はその機能的断片は、二つ以上のＩＮＰ及び／又はその機能的断片を一緒にまとめるように改変されうる。
【００８７】
幾つかの実施形態において、ＩＮＰ及び／又はその機能的断片、氷核形成核酸、氷核形成脂質、及び／又は氷核形成炭水化物は、隔離されたものでありうる。ポリペプチド、核酸、脂質、及び／又は炭化水素に関してここで使用される際に、「隔離された」の語は、人の手によって自然環境とは別に存在してそれゆえ自然の産物ではないポリペプチド、核酸、脂質、及び／又は、炭化水素を指す。幾つかの実施形態において、氷核形成ポリペプチド、氷核形成核酸、氷核形成脂質、及び／又は、氷核形成炭水化物は、細胞物質、ウィルス性物質、培地（組み換えＤＮＡ技術により生成される時）、あるいは化学的前駆体か他の化学物質（化学的に合成される時）を実質的に含まない、精製された形で存在する。「隔離断片」は、自然では断片としてかなりの濃度で発生することがなく、自然状態では微量レベルより上で発見されることのないポリペプチド、核酸、脂質、及び／又は、炭水化物の断片である。「隔離された」は、前処理が技術的に純粋（均質）であることを意味するのではなく、むしろ、想定される目的に使用可能な形で氷核形成ポリペプチド、氷核形成核酸、氷核形成脂質、及び／又は、氷核形成炭水化物を提供するのに充分なほど純粋であることを意味している。ある実施形態において、氷核形成ポリペプチド、氷核形成核酸、氷核形成脂質、及び／又は、氷核形成炭水化物を包含する組成物は、少なくとも約５０％，５５％，６０％，６５％，７０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％、又はそれ以上に純粋である。
【００８８】
幾つかの実施形態において、ＩＮＡは氷晶の核をマイクロ流体スケールで形成しうる。ゆえに、上述したＩＮＡは、例えばマイクロ流体チップのようにマイクロ流体スケールで水及び／又は溶液（例えば水溶液）中の氷晶形成に触媒作用を及ぼす、及び／又は、氷晶形成を開始させることにより、水及び／又は溶液を凍結させる。マイクロ流体チップ（例えば流体通路及び／又はＦＴＶ）で凍結しうる流体（例えば水）の容積は、約１フェムトリットルから約１００マイクロリットルの範囲、及び／又は、その中の何らかの範囲及び／又は個々の値でありうる。幾つかの実施形態において、約１ミリリットル又は複数ミリリットルのように、一つ以上の凍結融解バルブで凍結しうる大きな流体容積が使用されうる。ここで使用される際に「凍結させる」は、熱電冷却器のような外部冷却源と関連するマイクロ流体装置のＦＴＶに存在する流体の流れを阻止する、及び／又は、停止させるのに充分な量での固相の形成を指す。ゆえに、凍結後に、マイクロ流体チップでの（例えば流体通路及び／又はＦＴＶでの）固相は、凍結前の流体の容積よりも大きな容積を有しうる。
【００８９】
幾つかの実施形態において、マイクロ流体チップでのＩＮＡの使用は、平均すると、ＩＮＡが不在の時に水及び／又は溶液が凍結する温度及び／又は時間より高い温度、及び／又は、短い時間で、水及び／又は溶液を凍結させうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＡが不在の際に所与の時間量で水及び／又は溶液が凍結しうる温度よりも少なくとも５℃高い（例えば６，７，８，９，１０℃かそれ以上の）温度で、ＩＮＡは水及び／又は溶液を凍結させうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、結晶化が発生する前に水及び／又は溶液がその融点（例えば水については０℃）より下に保たれる平均時間を短縮しうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、結晶化が発生する前に水及び／又は溶液がその融点（例えば水については０℃）より下に保たれる平均時間を、例えば少なくとも１０％，１５％，２０％，２５％，５０％かそれ以上のように、少なくとも約５％以上は短縮しうる。
【００９０】
ＩＮＡは、例えば、約−１℃から約−２０℃、約−６℃から約−１４℃、約−２℃から約−１２℃、約−１℃から約−３０℃、約−２℃から約−８℃、約−２℃から約−５０℃、又は約−５℃から約−２５℃のように、０℃より低く−５０℃より高い温度、及び／又は、その中の何らかの範囲及び／又は個々の値で、水及び／又は溶液（例えば水溶液）中での氷晶形成に触媒作用を及ぼす、及び／又は、氷晶形成を開始しうる。ある実施形態において、ＩＮＡは、約０，−１，−２，−３，−４，−５，−６，−７，−８，−９，−１０，−１１，−１２，−１３，−１４，−１５，−１６，−１７，−１８，−１９，−２０，−２１，−２２，−２３，−２４，−２５，−２６，−２７，−２８，−２９，−３０，−３１，−３２，−３３，−３４，−３５，−３６，−３７，−３８，−３９，−４０，−４１，−４２，−４３，−４４，−４５，−４６，−４７，−４８，−４９，−５０℃の温度、及び／又は、その中の何らかの範囲及び／又は個々の値で、水及び／又は溶液中での氷晶形成に触媒作用を及ぼす、及び／又は氷晶形成を開始しうる。凍結／融解温度は、ＩＮＡを含む溶液を所望の凍結融解領域に保持するマイクロ流体輸送通路で測定されうる。凍結及び／又は融解インプットとなる熱電供給源の実際の温度（設定）は一般的に凍結／融解領域での輸送通路の温度と異なっており、例えば、−４５℃から−２０℃のような凍結温度設定は結果的に、この設定より上、一般的にはこの設定より約５から２５℃上である輸送通路でのＩＮＡ含有物質の凍結温度となる。
【００９１】
当該のＦＴＶ２２の一つ、一般的にはすべては、３分未満、一般的には約４５秒未満、より一般的には２秒と３３秒の間の凍結時間で作用しうる。一つ以上のＦＴＶ２２の融解時間は、対応の凍結時間より短く、１〜１５秒の間のように一般的には１〜３０秒でありうる。
【００９２】
ＩＮＡは、水及び／又は水溶液などの溶液で機能するように設計され、乾燥している必要はない。ＩＮＡは幾つかの手法で用意されうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＡが希釈されて、マイクロ流体チップの中及び／又は上へのインプットの為の緩衝液となる。幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、緩衝液、あるいは免疫検定法での使用に適した他の液体中（例えばトリス系かリン酸系の緩衝液）に設けられうる。ＩＮＰの他の処方／送達メカニズムについては後述する。
【００９３】
「回路」の語は、完全にハードウェアの実施形態か、ソフトウェアとハードウェアを組み合わせた実施形態を指す。
【００９４】
「均質核形成」の語は、固形状の相（エンブリオ）の小さな凝集体が液相全体に存在する時に、エンブリオが臨界サイズに達して、エンブリオが固相の成長継続を引き起こすことを指す。均質核形成は概して、水については−３７℃以下で発生する。
【００９５】
「不均質核形成」の語は、液相中の異物（例えばＩＮＡ）の存在による、準安定の過冷却状態から安定した固体状態までの相転移を指す。不均質核形成は一般的に液体表面の核形成部位で発生し、水については、概して約０℃と約−４０℃の範囲の温度で発生する。幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、それが存在する溶液及び／又は液体について不均質な核形成を行いうる。
【００９６】
「オリゴヌクレオチド」の語は、約５個のヌクレオチドから約５００個のヌクレオチド（例えば、５，６，７，８，９，１０，１２，１５，１８，２０，２１，２２，２５，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０，８５，９０，１００，１２５，１５０，１７５，２００，２５０，３００，３５０，４００，４５０、又は５００個のヌクレオチド）の核酸配列を指している。幾つかの実施形態において、例えば、約１５個のヌクレオチドから約４０個のヌクレオチド、又は約２０個のヌクレオチドから約２５個、又は約３０個のヌクレオチドから、オリゴヌクレオチドが得られ、これは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅試験でのプライマとして、及び／又は、交雑試験やマイクロアレイでのプローブとして使用されうる。処理の為のオリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、改変主鎖等、天然又は合成のものであるか、当該技術で周知であるようなこれらの何らかの組み合わせでありうる。
【００９７】
増幅及び／又は検出のいずれかの為のものを含むプローブ及びプライマは、適当な長さのオリゴヌクレオチド（ＤＮＡのような自然発生オリゴヌクレオチドと合成及び／又は改変オリゴヌクレオチドとを含む）であるが、一般的には長さがヌクレオチド５，６，８個分から長さがヌクレオチド４０，５０，６０個分又はそれ以上である。このようなプローブ及び又はプライマは、ビード、チップ、ピン、又はマイクロタイタープレートウェルなどの固形支持体に固定されるか結合されうる、及び／又は、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性元素、又は酵素などの検出可能なグループに結合されるか、その標識が付けられうる。
【００９８】
幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、例えば粒子やビードのような固形支持体に固定、付着、又は結合されうる。ＩＮＡは、流体分析装置へ導入される前に固形支持体に固定、付着、又は結合されうる。固形支持体に固定、付着、又は結合されたＩＮＡは、流体分析装置の少なくとも一つの流体通路へ導入される、及び／又は、流体分析装置の少なくとも一つの凍結融解バルブを凍結及び融解するのに使用されうる。
【００９９】
幾つかの特定実施形態において、凍結融解バルブを備えてＩＮＡ（例えばＩＮＰ及び／又はその機能的断片、及び／又はこれを包含する微生物）を包含する流体装置は、周知の技術によるＰＣＲを実行できる。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号、第４，９６５，１８８号を参照すること。概して、ＰＣＲは、最初に、各核酸ストランドに対して相補的である各プライマの伸長生成物が合成されるように、交雑条件で検出される固有配列の各ストランドに一つずつのオリゴヌクレオチドプライマを含む核酸試料を（例えば熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で）処理して、各プライマから合成される伸長生成物がその補体から分離された時に他のプライマの伸長生成物の合成テンプレートとして機能するように交雑に充分なほどプライマが固有配列の各ストランドに相補的であることと、それから、変性条件下で試料を処理して、検出される単数又は複数の配列が存在する場合にプライマ伸長生成物をそのテンプレートから分離することを伴う。これらのステップは、所望の程度の増幅が得られるまで周期的に反復されうる。増幅配列の検出は、反応生成物への交雑が可能なオリゴヌクレオチドプローブ（例えば本発明のオリゴヌクレオチドプローブ）を反応生成物に添加することにより検出可能な標識がプローブに付けられることと、それから、周知の技術に従って、あるいはゲルでの直接可視化により標識を検出することとにより、実行されうる。増幅配列は、反応混合物に染料を挿入して蛍光信号強度を監視することによっても検出され、この強度は二本鎖ＤＮＡの総質量に比例する。本発明による実施形態はＰＣＲ反応に関して説明されるが、ローリングサークル増幅又はループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）のような等温増幅技術を含む逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）のように、他の核酸増幅方法が使用されうることが理解されるべきである。
【０１００】
上記のようなＤＮＡ増幅技術は、対象の多型や突然変異を含有するＤＮＡに特異的に結合するが同じ交雑条件で対象の多型を含有しないＤＮＡには結合せず、増幅反応ではＤＮＡやその一部分の増幅の為の単数又は複数のプライマとしての役割を果たすプローブ、一対のプローブ、又は二対のプローブの使用を伴う。このようなプローブは時にして、増幅プローブ又はプライマと称される。
【０１０１】
「試薬」の語は、化学反応を引き起こす為にシステムに添加されるか、反応が発生するかどうかを確認する為に添加されるプライマ、核酸テンプレート、及び／又は、増幅酵素を含む何らかの物質又は化合物を指す。増幅試薬又は試薬は、プライマと核酸テンプレートと増幅酵素とを除き、概して増幅に使用されるこれらの試薬（デオキシリボヌクレオチド３リン酸、緩衝液等）を指す。一般的に、増幅試薬は、他の反応化合物とともに、反応容器（試験管、マイクロウェル等）に設置又は含有される。
【０１０２】
ここで使用される際に「磁気」の語は、強磁性、常磁性、超常磁性の特性を含む。
【０１０３】
幾つかの実施形態において、本発明の実施形態により検討される流体装置は、対象の多型又は突然変異を含有するＤＮＡを検出するのに使用されて、この突然変異や多型を符号化するＤＮＡに結合するが同じ交雑条件で突然変異や多型を含有しないＤＮＡには結合しないオリゴヌクレオチドプローブであるオリゴヌクレオチドプローブを採用しうる。オリゴヌクレオチドプローブは、下に挙げるような適当な検出可能基の標識が付けられる。このようなプローブは時にして、検出プローブ又はプライマと称される。
【０１０４】
本発明による実施形態はＰＣＲ反応に関して記載されたが、ここに記載されるマイクロ流体装置と方法は、他の様々なプロセス、例えば反応に使用されうることが理解されるべきである。例えば、ＰＣＲ反応、リアルタイムＰＣＲ反応（ｒｔ−ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、ＲＮＡからｃＤＮＡ（ＲＴ）への逆転写、先行ＲＴステップからのｃＤＮＡのＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイム又はデジタル定量化を使用するＲＴ−ＰＣＲ、免疫ＰＣＲ（ｉＰＣＲ）とその変形、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル複製、及び／又は、非酵素核酸増幅方法（例えば「ＤＮＡ回路」）を限定的にではなく含めて、核酸転写及び／又は増幅に関係する反応は、本発明の範囲に含まれる。合成又は交雑に基づく方法による配列を含む次世代配列方法を含む核酸配列の方法も、発明の範囲に含まれる。本発明の範囲に含まれる他の反応は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、単分子アレイ（ＳｉＭｏＡ）又はデジタルＥＬＩＳＡ、コンビナトリアル化学の為の異なる試薬を送達するのに多数のビードが使用される反応、ビードが触媒試薬を送達する反応、及び／又は、確率的ビード装填により決定される化学量で「クリック」ケミストリー試薬が送達される反応を含むが、これらに限定されるわけではない。例えば、開裂試薬を使用するプロセスの例としての米国特許第１４／４０２，５６５号を参照すること。その内容はここに完全に記載されているかのように参照により援用される。
【０１０５】
さて、単なる例示としての図を参照すると、本発明の実施形態により検討される流体装置の一例は、図１Ａ及び１Ｂに示されているようなマイクロ流体チップ１０を含みうる。マイクロ流体チップ１０は、少なくとも一つの流体輸送通路２０を有する。幾つかの実施形態は、複数の輸送通路を包含しうる。それぞれの輸送通路２０は、凍結融解「バルブ」２２を備える少なくとも一つの規定の流域２０ｒを有する。凍結融解バルブ２２は少なくとも一つの冷却器２５との熱連通状態にある。一般的に、流体装置は複数の凍結融解バルブ２２を包含し、その各々が、輸送通路２０のそれぞれの規定領域で液体を凍結及び融解するのに使用されうるそれぞれの冷却器２５、任意で一つ以上の熱電冷却器（ＴＥＣ）２５ｔを備えている。少なくとも一つの熱電冷却器２５ｔは、例えばペルティエ冷却器でありうる。
【０１０６】
幾つかの実施形態において、ＦＴＶ２２のうち一つ以上は、凍結作用を高める、つまり凍結時間を短縮しうる複数の冷却器２５を、それぞれのＦＴＶ２２と関連する対応の通路区画２０ｒの上に一つと下に一つのように含みうる。
【０１０７】
幾つかの特定実施形態において、熱電冷却器２５ｔは、電気絶縁性だが熱伝導性である材料の薄型シートの間に挟まれるｎ及びｐ型の半導体から成るソリッドステート装置として構成されうる。ｎ及びｐ型要素のアレイに直流が印加されると、装置の片側がペルティエ効果により冷却され、周囲環境から熱を吸収する。熱は装置を経て反対側へ伝えられて放出され、ＴＥＣの両側に温度勾配を生じる。例えば、スグロその他（Sgro et al.）著「マイクロ流体装置における水滴の熱電処理（Thermoelectric Manipulation of Aqueous Droplets in Microfluidic Devices）」分析化学２００７年（Anal Chem. 2007）79(13):pp.4845-4851を参照すること。その内容は、ここに完全に記載されているように参照により援用される。マイクロスケール以上のＴＥＣは、ナノリットル及び／又はマイクロリットルサイズの容積の局所的冷却の為に、マイクロ流体チップ１０に埋め込まれる、一体的に装着される、及び／又は、直接的又は間接的に着脱可能に装着されうる。熱電冷却器の他の例については、例えば、マルテゾスその他（Maltezos et al.）著「マイクロペルティエ接点を使用するマイクロ流体での熱管理（Thermal management in microfluidics using micro-Peltier junctions）」応用物理雑誌（Applied Phys.Lett）87,154105（２００５年）を参照すること。その内容は、ここに完全に記載されているように参照により援用される。
【０１０８】
冷却器２５は、輸送通路２０に向かう、及び／又は、輸送通路に沿った流動方向に測定される長さＬを有するマイクロ流体チップ１０との熱連通状態にある熱的フットプリント“Ｆ”を有し、ＦＴＶ領域２２の幾つかのフットプリントＦは、他のもの（例えば図２Ｂ，２Ｃ，３Ｂ，３Ｃ）よりも（幅及び／又は長さが）大きい。幾つかの特定実施形態において、フットプリントＦはそれぞれのＴＥＣ２５ｔのサイズにより規定されうる。例えば、ＦＴＶ領域２２の少なくとも幾つかについて、ＴＥＣ２５ｔは、約１６ｍｍ２の表面積を有し、例えば、約４ｍｍ×４ｍｍの幅及び長さ寸法を有する。
【０１０９】
図２Ａ〜２Ｃ及び３Ａ〜３Ｃは、それぞれの冷却器２５との熱接触状態にある複数の凍結融解バルブ２２と、ビードウェルアレイ４０と、試料インプット４５と、ビード貯蔵／試料培養室５０と、廃棄物容器５５とを各々が備えるマイクロ流体チップ１０の例を図示している。試料計量ループ４７は、ビード貯蔵／培養室５０と試料インプット４５との間に所在しうる。試料計量ループ４７は任意で、図のように蛇行形状を有しうる。幾つかの実施形態において、試料計量ループ４７は、約１０．７５μＭと２９μＬの間のように、約１μＬから約１ｍＬの間、より一般的には１と５００μＬの間の容積を有しうる。ループ４７は、主流体輸送通路２０に合流する両側開口端部を有しうる。
【０１１０】
例えば図２Ａ及び３Ａに示されているように、凍結融解バルブ２２と関連する流体通路区画の幾つかは、冷却器により冷却される容積を増大させて凍結作用を促進するようなサイズ及び構成を持つ曲線エルボ２２ｂを有する。
【０１１１】
ビードウェルアレイ４０は、全長にわたって、又は実質的に全長にわたって、ウェルアレイ４０の下又は上に所在し、その入口／出口のネックに隣接して、その前又は後に終端を持つことが可能な温度制御部材１２５を有しうる。
【０１１２】
マイクロ流体チップ１０及び／又はチップ１０の一つの層は、流体入口／出口領域の為の規定箇所でチップ１０の片側又は両側に延在する貫通孔（つまりアクセス開口及び／又はポート）及び／又は流体路を有する。
【０１１３】
図２Ａ及び３Ａに示されているように、試料インプット４５は、アクセス開口又はビア４５ａの試料インプットを含みうる。ビード貯蔵／試料培養室５０はアクセスビア又は開口５０ａを含みうる。ビード洗浄・二次試薬培養室５２はアクセス開口又はビア５２ａを含みうる。緩衝液インプット６０はアクセスビア又は開口６０ａ（図３Ａ）を含みうる。封止剤インプット６６はアクセス開口又はビア６６ａを含みうる。検出基板（及び／又はＰＣＲマスターミックス）７０はアクセス開口又はビア７０ａを含みうる。廃棄物容器５５は、片側の貫通孔又はビア５５ａを含みうる。二次試薬インプット６３はアクセス開口又はビア６３ａを含みうる。
【０１１４】
図３Ａは、マイクロ流体チップ１０が、貫通孔又はビア６８ａを備えるアレイ前処理試薬室６８と、貫通孔又はビア６９ａを備えるアレイ洗浄・オイルパージ廃棄物室６９とを含みうることを図示している。
【０１１５】
図２Ａ〜２Ｃは冷却器２５を備える１５個の凍結融解バルブ２２を図示し、図３Ａ〜３Ｃは冷却器２５（例えばＴＥＣ部材／要素２５ｔ）を備える１４個の凍結融解バルブ２２を図示しており、幾つかはマイクロ流体チップ１０の上面１０ｔ（図４）に、複数個はマイクロ流体チップ１０の底部１０ｂにある。
【０１１６】
図２Ｃに示されているように、凍結融解バルブ２２の為の冷却器２５（例えばＴＥＣ部材２５ｔ）は、例えばバルブ７，８のようにビードウェルアレイ４０に通じる通路区画２０ｓの各側に配置され、ビード貯蔵／培養室５０の上流でこれに隣接するバルブ７は流体チップ１０の上側に所在し、残りはマイクロ流体チップ１０の下に所在する。図３Ｃに示されているように、凍結融解バルブ８，９の為の冷却器２５はマイクロ流体チップ１０の上に所在し、一方はビード貯蔵／培養室５０の上流でこれに隣接し、一方はビードウェルアレイ４０に通じる通路区画２０ｓの内側にある。
【０１１７】
凍結融解バルブ２２（つまり図２Ｃのバルブ７／８、図３Ｃのバルブ８／９）の為の上側冷却器２５は、薄い領域、例えば上基板１０ｔの厚さの約３０〜９５％である領域、及び／又は、チップそのものの本体に所在し、このエリア／容積の外側の１〜２ｍｍの間の公称又は平均厚さを有する基板の上部の厚い領域では約９００μｍである。すなわち、マイクロ流体チップ１０は、成形されて例えば流体通路２０，６３ｉ，２０ｓを保持する上基板１０ｔ（図４Ａ，４Ｂ）を有する。薄い領域２２ｔは、上部に実装された冷却器２５ｔを保持する、及び／又は、これとの熱連通状態にあるようなサイズ及び構成を持ちうる。
【０１１８】
マイクロ流体チップ１０は、緩衝液インプット６０と複数の試薬インプット６３（例えば図７の流体容器６３ｆ）とを含みうる。図２Ａ〜２Ｃは３個の二次試薬インプット６３を図示しているのに対して、図３Ａ〜３Ｃは２個の二次試薬インプット６３を図示している。試薬インプット６３の各々は、冷却器２５を備える対応の凍結融解バルブ２２を有するインプット通路６３ｉと関連している。
【０１１９】
マイクロ流体チップ１０は、二次試薬インプット６３の一つ又はすべてとの流体連通状態にあるビード洗浄／二次培養室５２を含みうる。
【０１２０】
マイクロ流体チップ１０は、検出基板領域及び／又はＰＣＲマスターミックス領域７０を含みうる。使用の場合、ＰＣＲマスターミックスは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰとＭｇＣｌ２と反応緩衝液とを例えばＰＣＲによるＤＮＡテンプレートの効率的な増幅に最適な濃度で含有する、予混合された使用状態の溶液を包含しうる。
【０１２１】
マイクロ流体チップ１０は、封止剤インプット６６を含みうる。封止剤は、鉱物、シリコン、炭化水素、フルオロカーボン系、このような油の混合物、多官能基合成油、及び／又は、ワックスを包含しうる。
【０１２２】
図２Ｂ，２Ｃ，３Ｂ，３Ｃは、それぞれ規定された流体通路の局所的領域の周囲に描かれた閉鎖外周により図示されている、冷却器２５と関連する凍結融解バルブ２２の例示的フットプリントＦを図示している。これらの図は、空気透過膜３５，１３５も図示している。図２Ｂ及び２Ｃは、試薬インプット６３、ビード洗浄・二次試薬培養室５２の上にある１枚の膜３５と、ビード貯蔵試料培養室５０の上の別の膜１３５とを図示している。図３Ｂ及び３Ｃは、廃棄物容器５５と試薬インプット６３とをそれぞれ覆う２枚の別々の離間した膜３５を図示している。別の空気透過膜１３５は、ビード貯蔵／培養室５０と隣接の検出基板及び／又はＰＣＲマスターミックス７０とアレイ前処理試薬６８との上に所在している。
【０１２３】
図４Ａ及び４Ｂを参照すると、マイクロ流体チップ１０は複数の積層、一般的には合体される第１及び第２基板層を包含しうる。図４Ａは、上基板１０ｔと底基板１０ｂの両方が視覚的に透過性であり、一般的には透明又は半透明であることを図示している。図４Ｂは、底基板１０ｂが不透明（例えば不透明な黒色）であるのに対して上部１０ｔが視覚的に透過性であることを図示している。
【０１２４】
上基板層１０ｔは、少なくとも一つの流体輸送通路２０の少なくとも一部分を保持できる。輸送通路２０と他の流体通路とは内部通路である（上基板１０ｔに包囲されている）か、基板１０ｔの開放上面として形成されうる。後者の場合、オーバーレイ又はカバーが上層１０ｔの上面に装着されて輸送通路２０を密閉するか、輸送通路２０がその長さ又はその一部分にわたって大気に開放されている。底基板層１０ｂはビードウェルアレイ４０を保持しうる。上記のように、ビア及び／又は流体入口／出口通路は、容器又は室を外部流体供給源及び／又は排水設備のうち一つ以上と接続するために使用されうる。
【０１２５】
図４Ａ及び４Ｂに示されているように、試料入口４５、ビード貯蔵部５０、二次試薬培養室５２、廃棄物容器５５、二次試薬インプット６３、検出基板及び／又はＰＣＲマスターミックス７０を含めて、室又は容器の幾つかは、大気／環境条件に開放されうる。単数又は複数の空気透過膜３５，１３５は、これらの特徴／構成要素の上に所在しうる。
【０１２６】
上基板１０ｔ及び／又は底基板１０ｂは適当な材料を包含し、剛性、半可撓性、又は可撓性でありうる。底層及び上層１０ｔ，１０ｂの基板は、同じか異なる材料でありうる。上層及び／又は底層１０ｔ，１０ｂは、シリコン、ガラス、硬質プラスチック、硬質ポリマー材料、可撓性ポリマー材料、又はこのような材料の混成物か複合物でありうる。凍結融解バルブ２２のマイクロ流体チップで流体の流れを調整するのに、凍結が使用されうる。マイクロ流体チップ１０は、弾性／可撓性（例えばポリジメチルシロキサン）である基板において、及び／又は、非弾性／非可撓性（例えばガラスと硬質プラスチック）である基板において、一つ以上の主輸送通路及び二次流体緩衝液及び／又は試薬通路を保持しうる。
【０１２７】
図５は、空気透過膜３５，１３５を備えるマイクロ流体チップ１０を図示している。膜３５は、幾つかの実施形態において、廃棄物容器５５と二次試薬インプット６３と検出基板及び／又はＰＣＲマスターミックス７０との上に所在している。膜３５，１３５は、ＰＴＦＥ又は他の適当な材料を包含し、「空気専用」膜でありうる。「空気専用」の語は、気体は膜から放出されるか膜を横断できるのに対して、液体又は粒子状物質はゼロから少なくとも１ｐｓｉ（又は２，３，４，５ｐｓｉのようにさらに高い）印加圧力差では通過できないことを意味している。
【０１２８】
図５Ｂは、ビード貯蔵／試料培養室５０で乾燥されたビードを図示しており、室５０の上の位置の空気透過膜１３５は含んでいない。
【０１２９】
幾つかの特定実施形態において、上基板１０ｔは、流体通路２０及び他の流体通路とともに射出成形されうる。輸送通路２０は例えば、幅２５０μｍで奥行２５０μｍの通路を包含しうる。試料計量通路４７の幅はさらに広く、一般的には、試料計量通路４７の各端部の流路２０より広い約５０％など、２０〜６０％の間でありうる。幾つかの実施形態において、計量通路４７は約５００μｍの幅であり、通路２０の直線区画に再合流する前に複数回上下動する。アレイ室４０は比較的浅く、例えば、奥行が約２００μｍなど、計量通路４７とアレイ４０との間の輸送通路２０よりも１０〜５０％浅い。アレイ４０は、上基板１０ｔと底基板１０ｂの接合中に室が潰れないようにする、横方向及び縦方向に離間するデバイダ４０ｄなどの物理構造をアレイ室４０ｃに含みうる。デバイダ４０ｄは、幅広のアレイ室４０での流体流の制御を容易にする。
【０１３０】
底基板１０ｂは、視覚的透過性、例えば透明又はクリア、あるいは半透明、一般的には半透明黒色であり、また一般的にはプラスチックである。底基板１０ｂは約１００〜２００万個の間の「スリット」又は「彗星」形状のビードと反応ウェルのアレイ４０を含む。アレイ４０は、約２００万個の円筒形ウェルを保持しうる。上基板１０ｔの孔は容器として使用されうる。これらは乾燥ビード及び／又は乾燥試料を収容しうる。
【０１３１】
一つ以上の空気透過（フィルタ）膜３５，１３５で覆われると、孔（例えばアクセス開口又はビア）により、リーダが緩衝液をチップ１０へ押入する時に空気が排出されうる。廃棄物容器５５の真空は、凍結融解バルブ２２とともに、再水和された試料を培養室及び／又は反応室５０，５２へ吸入するのに使用されうる。インプット６６（図２Ａ〜２Ｃ，３Ａ〜３Ｃ）を介した油又は他の封止剤は、ビードアレイ４０を撮像して蛍光信号を読み取る前に、個々の反応物を互いに封止するのに使用されうる。当業者には周知のように磁石が装着されたアクチュエータアームを使用して、ビードが装填され、チップ１０内で動かされる。
【０１３２】
ＩＮＡ（例えばＩＮＰ及び／又はその機能的断片、及び／又はこれを包含する微生物）を包含する緩衝液６０ｆ（図２Ａ，３Ａ）は、一般的にはマイクロ流体チップ１０が少なくとも一つの冷却器２５との熱接触状態に置かれた後で、緩衝液インプット６０（図２Ａ，３Ａ）から輸送通路２０へ流動導入されうる。より一般的には、規定の位置に配置された複数の離間した熱電冷却器２５ｔとの熱接触状態になるようにマイクロ流体チップ１０が試験固定／実装アセンブリの所定位置に載置され、そして溶媒和されたＩＮＡを含む緩衝液６０ｆが、通路２０と試薬インプット６３ｉとを含む流体通路に所在する／流体通路を充填するようにマイクロ流体チップ１０へ流動導入される。
【０１３３】
凍結融解バルブ２５は、ＴＥＣ２５ｔなどの冷却器２５を「凍結」作用／モードの為の規定温度、一般的には−１００℃と−１℃の間に設定することにより作動しうる。幾つかの実施形態において、凍結温度は約−４５℃（定常状態内部温度は−３２℃と推定）と約−２０℃（定常状態内部温度は−１１℃と推定）の間でありうる。−４５℃を下回る温度が使用されてもよく、幾つかの実施形態では、温度は約−５０℃以上から約−１℃までである。−２０℃を超える温度が使用されてもよい。一つ以上のＦＴＶ２２の多様な凍結作用は、異なる温度及び／又は時間設定を有する。−４５℃においてＩＮＡ含有緩衝液は、ＩＮＡを含まない対照物の２倍以上も急速にまた、高い再現性で凍結することが分かっている。チップの外面に−２０℃が印加されると、ＩＮＡ含有緩衝液は凍結時間に関して濃度依存作用を示したのに対して、ＩＮＡを含まない緩衝液は観察された時間枠内に全く凍結しなかった。本発明の実施形態は、従来のＦＴＶシステムよりもシステムの凍結時間及び温度要件を低下させることのできるマイクロ流体凍結融解バルブ作用を促進するのに使用されうると考えられる。凍結融解システムは、ガラス及びシリコンなどの非可撓性／非弾性材料を含む多様なマイクロ流体基板との適合性を備え、ユーザにとって利用可能な装置設計の数を拡大しうる。
【０１３４】
上述したある種の実施形態は、緩衝液インプット６０（例えば図２Ａ，３Ａ）などを介して主要（作用）緩衝液に溶媒和されたＩＮＡを提案しているが、流体マイクロチップ１０にＩＮＡを提供及び／又は導入する他の手法も考えられる。例えば、マイクロ流体チップ１０の一つ以上の流体通路にＩＮＡ含有緩衝液が（部分的又は完全に）充填されてから乾燥されることにより、通路又は通路区画をＩＮＡで受動的にコーティングする。そしてこれらのタンパク質は装置を再水和した後に凍結核を形成するのに使用されうる。タンパク質が時間とともに洗い流された場合にはこの方法での無限数のバルブ作用ステップは可能ではないが、装置の操作の為にわずかなアクチュエータが使用されると、うまく機能する。その例は、装置使用の初期段階のみで凍結が必要とされるか、さもなければ、ＩＮＡを洗い流す緩衝液の交換を最小にしてわずかな凍結ステップのみが行われる装置を含む。
【０１３５】
例えばＰＥＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ連結の化学的性質によりＩＮＡを通路壁に共有結合で付着させて、洗浄のみの除去に対する耐性を一定の核形成箇所が備えるという利点を伴う類似の作用を達成することも可能である。
【０１３６】
非共有結合による付着を通して、ＩＮＡの標的展開も可能である。その事例の一つは、（例えば組み換え発現中に直接、又はその後で共有結合により）ストレプトアビジンをＩＮＡに、そしてＩＮＡが所望される装置の領域にビオチンを結合することであろう。ストレプトアビジン改変ＩＮＡであれば、それが所望されるエリアに強固に結合される。非共有結合による標的展開の別の事例は、標的分子により装置の領域を改変してから、標的分子の部位に接合する抗体又はアプタマーにＩＮＡを結合することを伴う。ポリスチレン微小球などの大きな粒子も、粒子への（共有結合による、又は受動的な）付着に続いて、ＩＮＡの担体として使用されうる。付加的に、疎水性又は親水性の表面の相互作用や、他の非共有結合又は静電気の力により、ＩＮＡがマイクロ流体通路壁に吸着されうる。最後に、システムがタンパク質の抽出及び溶媒和を必要としない場合には、有機体全体（例えば未変化のシュードモナス・シリンゲ）又はＩＮＡ含有膜を使用する代わりに抽出プロセスが完全に不要となる。最も高い可能な氷核形成温度（およそ−２℃から−６℃）が必要とされるシステムでは、細胞膜からＩＮＰを除去した後にこれらの核形成部位の＞９９．９％が失われるので、未変化の有機体又は膜の使用が必要である。
【０１３７】
ＩＮＡを含む凍結融解バルブを使用する溶液（例えば水溶液）の凍結は、このようなＩＮＡを含まない周知の従来マイクロ流体チップよりも高い温度で開始されうる。ＩＮＡは任意で、流体添加材として細菌から採取されうる。凍結プロセスは、ＩＮＡの不在時に必要とされるものと比較して比較的高い温度で発生しうる。ＩＮＡは約−２℃の温度で氷晶化プロセスを開始することができるのに対して、水はおよそ−４０℃まで過冷却され、（純水中で、又は凹凸のない通路を備えるマイクロ流体装置に）核形成部位が不在であると結晶化しない。高い温度での凍結の誘発に加えて、及び／又は、これに代わって、ＩＮＡは、結晶化が発生する前に水が氷点未満に保持されなければならない平均時間を著しく短縮できる。ＩＮＡ凍結融解処理技術の実行は、精密な流体制御によりチップアーキテクチャの製造を簡単かつ容易にするのに使用され、可動バルブ部品を不要にし、製作及び運転コストを大幅に削減する。
【０１３８】
幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、試料を調製する方法で使用されうる。例えば、ＩＮＡは、細胞溶解を限定的ではなく含む試料調製の一部として流体分析装置の試料計量ループで試料の凍結を向上させるのに使用されうる。幾つかの実施形態において、試料は複数の細胞を包含し、複数の細胞の少なくとも一部分は、試料計量ループで少なくとも一つの凍結融解バルブを使用して試料計量ループを電子選択的に冷却し、少なくとも一つの凍結融解バルブ及び／又は試料の少なくとも一部分を凍結させることにより溶解されうる。幾つかの実施形態において、試料計量ループ及び／又は少なくとも一つの凍結融解バルブが加熱されて、試料計量ループ、少なくとも一つの凍結融解バルブ、及び／又は試料の少なくとも一部分を融解する。試料計量ループ及び／又は少なくとも一つの凍結融解バルブの加熱は、能動加熱又は受動加熱でありうる。能動加熱は、試料計量ループ及び／又は少なくとも一つの凍結融解バルブを電子選択的に加熱できる。能動加熱は熱源（例えば熱電供給源）を使用して、凍結融解バルブ及び／又は試料計量ループの温度を上昇させる。受動加熱は、熱源からの熱の能動印加を伴わずに周囲環境に基づいて凍結融解バルブ及び／又は試料計量ループが室温まで温まる（例えば融解する）時のものである。
【０１３９】
図６は、分析物を処理及び／又は分析する方法を実行できる例示的な動作を図示している。図のように、複数の離間した凍結融解バルブとＩＮＡを含む流体通路とを備える流体装置が用意される（ブロック１６０）。凍結融解バルブが凍結温度まで冷却されると、凍結融解バルブでの液体の流れを停止させる（ブロック１７０）。凍結融解バルブが融解温度まで加熱されると、液体が凍結融解バルブを流れる（ブロック１８０）。凍結融解バルブの加熱は能動的であっても受動的であってもよい。
【０１４０】
ＩＮＡは、細菌のような有機体から採取される、及び／又は、有機体に由来する（ブロック１６２）。
【０１４１】
ＩＮＡは、凍結融解バルブと関連する少なくとも一つの流体通路へ液体中で流動導入されうる（ブロック１６５）。流動導入は単一又は連続的な規定量又はボーラス（つまりバッチ）であるか、継続的に実行されうる。単一のマイクロ流体装置での連続的な処理操作において、ＩＮＡの量は一定であるか、増加するか、又は減少しうる。
【０１４２】
装置は、（直接的又は間接的に合体される）底基板と上基板とを有するマイクロ流体チップでありうる。底基板は０．０１ｍｍと１０ｍｍの間の厚さを有する（ブロック１６４）。
【０１４３】
流体マイクロチップとの熱連通状態にある熱電冷却器（ＴＥＣ）を使用して、冷却及び加熱が実行されうる（ブロック１７５）。ＴＥＣの幾つかは底基板に隣接して所在し、また幾つかは上基板に隣接して所在する。凍結温度までの冷却の為、ＴＥＣは−１００℃と−１℃の間の温度に設定されうる（ブロック１７７）。
【０１４４】
抽出されたＩＮＡ溶液が、緩衝液に対する適当な量、単なる例として挙げると１：１０から１：１０，０００で希釈された緩衝溶液に添加されうる（ブロック１６６）。幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、１μＬ当たり約１分子又は有機体から１μＬ当たり１００億分子又は有機体の量で、及び／又はその中の何らかの範囲及び／又は個々の値で、緩衝溶液に存在しうる。幾つかの実施形態において、ＩＮＡは、幾つかの特定実施形態での１０〜５０ｎＭを含めて、約１ナノモルから１００ミリモルまでの量で緩衝溶液に存在しうる。
【０１４５】
ＩＮＡは、凍結融解バルブと関連する流体流路と関連する少なくとも一つの表面にコーティングとして設けられる、及び／又はこれに接合される（ブロック１７２）。接合／コーティング表面は、装置上に、あるいは流体装置との流体連通状態にある移動経路と関連する導管又は他の装置にある。
【０１４６】
凍結融解バルブの幾つか又はすべてを連続的又は同時的に（つまり選択的に）凍結させるように、冷却が制御可能に実行されうる（ブロック１７３）。同様に、凍結融解バルブの幾つか又はすべてを連続的又は同時的に（つまり選択的に）加熱するように、加熱が制御可能に実行されうる。凍結融解バルブの幾つか又はすべては、能動加熱又は受動加熱されうる。
【０１４７】
ＩＮＡは、一つ以上のＩＮＰ、氷核形成（ＩＮ）核酸、ＩＮ脂質、及び／又は、ＩＮ炭水化物を包含するか、これらである（ブロック１７４）。
【０１４８】
ＩＮＡは、一つ以上の合成アプタマーを包含するか、これである（ブロック１７６）。
【０１４９】
図７は、一体型リーダ３００と、マイクロ流体チップ１０の為の保持アセンブリ２５０とを備える例示的な自動検査システム２００を図示している。システム２００は、例えば電圧及び流体のインプットのような冷却器２５の為の制御インプットを含むサポートモジュール２００ｈを有している。ワイヤ材料及びチューブ材料Ｗ，Ｔは、保持アセンブリ２５０をモジュール２００ｈの制御／流体インプットに接続する。電圧及び／又は流体インプットはマイクロ流体チップ１０を保持する同じモジュールに一体化されるか、例えば別々の協働サブアセンブリ又はモジュール２００ｈであってもよい。システム２００は、取り付けアセンブリ２５０とリーダ３００とを支持するベース２０２を含みうる。ベース２０２は、凍結融解バルブ２２での作用の為に流体流路への流体導入用のＩＮＡを一般的に包含する二次試薬流体６３ｆ及び／又は緩衝液を支持する。
【０１５０】
システム２００は、凍結融解バルブ２２の動作を制御及び／又は指示する為にタイミング／温度入力をユーザが選択できるようにするディスプレイ２１０とグラフィックユーザインタフェース（ＧＵＩ）２６０（図９）とを備える制御装置２００ｃ（図８）を含むか、これとの通信状態にある。特定の試料又はタイプ又はチップサイズ及び／又は構成について凍結融解バルブセットのデフォルト動作及び／又は電子選択可能な規定動作メニューが、利便性の為にプリセットされうる。ディスプレイ２１０は、システム２００、モジュール２００ｈに搭載されるか、システム２００及び／又はモジュール２００ｈから離間している。
【０１５１】
図８を参照すると、システム制御装置２００ｃはシステム２００に搭載されるかシステムから離間しており、一つ以上及び／又は異なるＦＴＶ２２によるセットについての温度パラメータ又は指示のような設定をユーザが調節する為のＧＵＩ２６０を備えるように構成されうる。システム制御装置２００ｃは、全体がローカルコンピュータに、一部がローカルコンピュータに保持される、及び／又は、複数のデータベース／サーバ（例えばＣＬＯＵＤベース）の間で分散されうる。「コンピュータ」の語は、ＦＴＶ２２の制御とこれとの通信により動作の制御を可能にする、一般的には少なくとも一つのデジタル信号プロセッサを包含する電子装置を含むように広く使用される。コンピュータはローカルであっても、モジュール２００ｈを含む部位から離間していてもよい。
【０１５２】
ディスプレイ２１０は、システム２００に搭載されていても、これから離間していてもよい。ディスプレイ２１０は、スマートフォン、電子ノートブック、その他のような、普及型コンピューティング装置と関連するディスプレイを包含しうる。ＧＵＩ２６０はＡＰＰにより用意されうる（ＡＰＰは一般的には一つ以上のアイコンを介してアクセス可能な規定の機能を有する）。システム制御装置２００ｃは、一つ以上の冷却器２５、例えばＴＥＣ要素２５ｔの為の一つ以上の温度制御装置２０５を制御できる。温度制御装置２０５は、ラブビュー（LabVIEW）又は他の適当なオペレーティングプログラムを実行するコンピュータにより制御されうるナショナルインスツルメンツ（National Instruments）データ取得／電圧出力カードにより制御されうる波長電子機器（ボーズマン（Bozeman），ＭＴ）ＰＴＣ５Ｋ−ＣＨ  ５Ａ温度制御装置のように適当な温度制御装置でありうる。各ＴＥＣ要素２５ｔは、独自のＰＴＣ５Ｋ−ＣＨ制御装置又はセットを有するか、すべてが温度制御装置を共有しうる。幾つかの実施形態において、ＴＥＣ要素２５ｔの動作を制御するのに、カスタム温度制御回路が使用されうる。電気路１２８は、温度制御装置２０５を一つ以上のＴＥＣ要素２５ｔに接続できる。
【０１５３】
図９は、ステップ及びタイミング調節とともに、凍結融解バルブ２２（図のバルブ１０〜１５）の為のユーザ選択可能な温度調節（Ｔｉ）を含むＧＵＩ２６０の直感操作スクリーンを図示している。チップ１０のレイアウトのグラフィック表示が、ディスプレイ２１０に提示されうる。ユーザは、ＧＵＩ２６０を使用して凍結融解バルブ２２と関連するそれぞれの冷却器２５の設定及び持続時間を調節できる。
【０１５４】
図１０は、ＴＥＣ部材／要素２５ｔが熱伝導ブロックとの適切な熱接触又はＴＥＣ部材２５ｔとの直接接触を有するようにマイクロ流体チップ１０を保持する為の実装アセンブリ２５０を図示している。実装アセンブリ２５０は、チップ１０の上基板及び底基板１０ｔ，１０ｂと片側で、ＴＥＣ２５ｔと他の側でそれぞれ当接する金属（例えば銅又は他の適当な熱伝導材料）のシムのような、複数の熱伝導部材２６を含みうる。幾つかの実施形態において、熱伝導材料及び／又はブロック２６は基板１０ｔ及び／又は１０ｂに装着されてから、ＴＥＣ部材２５ｔとの熱連通状態で実装アセンブリ２５０に載置される。図１０に示されているように、ＴＥＣ部材２５ｔは、マイクロ流体チップ１０のバルブ箇所と整合された保持基板（例えばプレート）２５１ｂの上に載置されうる。
【０１５５】
箔又は熱伝導コーティングは、少なくとも凍結融解バルブ２２（不図示）の領域で基板１０ｂ，１０ｔに形成されうる。
【０１５６】
ＴＥＣ部材２５ｔと実装装置とは容易な交換を可能にするように構成され、モジュール設計はさらなる設計変更を促進できる。
【０１５７】
図１０に示されているように、実装アセンブリ２５０は、窓部２５１ｗの周りに延在する外周を有する剛性の上プレート２５１ｔを含みうる。図８は、輸送通路２０の分析物について分析データを取得できる回路及び／又は少なくとも一つのプロセッサ２００ｐを備えるコンピュータ２００ｃを含みうることも図示している。「コンピュータ」の語は、一般的には少なくとも一つのデジタル信号プロセッサを包含して動作を制御する電子装置を含むように広く使用されている。コンピュータはローカルであるか、装置１０を含む部位から離間している。
【０１５８】
リーダ３００は、輸送通路２０及び／又はアレイ４０での分析物分子の一連の画像を撮影する検出器と励起源とを含みうる。システム２００のリーダ３００は、（ミラー及びレンズ又は他の対物レンズを任意で含みうる）（一般的には蛍光標識が付けられた分子を励起する光を発生させる為の）励起光源と、カメラ、光電子増倍管、又はフォトダイオードのうち一つ以上のような画像作成装置又は検出器とを含みうる。対物レンズ／レンズは、使用の際に、装置１０の主要面の下又は上に所在しうる。電気インプット／アウトプット及び流動操作部は、装置１０の反対側に所在しうる。装置１０は、図のように実質的に水平ではなく、側面を下にして作動するように起こされて（平坦な主要面が直立又は傾斜していて）もよい。
【０１５９】
以下の非限定的な例で、本発明がより詳しく説明される。
【０１６０】
バルブ作動時間と低温での可変性とを低減する為の氷核形成タンパク質の使用
免疫検定法に適したブロッキング緩衝液（５０ｍＭトリス＋１０％牛新生仔血清＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０＋０．０５％アジ化ナトリウム，ｐＨ＝７．４）が、およそ１ｍｍの厚さを各々が持つ２枚の基板から成る幅２５０μｍで奥行２５０μｍの通路を含む厚さ２ｍｍのプラスチックマイクロ流体チップへの供給に使用された。バルブ作用が所望される箇所で通路がＴＥＣ要素（図１Ａ／１Ｂ）の上に配置されるように、ＴＥＣの上にチップが載置された。通路内容物の凍結及び融解は、ＴＥＣを−４５℃と＋２５℃にそれぞれ設定することによりチップ上で実施された。結果的におよそ−３２℃の定常状態温度を示すようにプラスチックでの熱損失がモデリングされるので、通路のＦＴＶ領域に見られる実際の温度は−４５℃よりかなり高いことに注意すべきである。各凍結及び融解事象は、明視野顕微鏡による通路の監視に従ってタイミング調整され、時間は、２５℃からのＴＥＣの冷却又は−４５℃からのチップの加熱の開始時に始まる（時間は、自身とチップとを冷却又は加熱するのにＴＥＣが必要とする時間を含む）。氷の急速な出現が各凍結事象の終点として使用されたのに対して、その消滅は各融解事象の終点として使用された。ＩＮＰ抽出物の１０倍希釈（１：１０，１：１００，１：１，０００，１：１０，０００）がトリス緩衝液で調製され、これらの試料の各々により同じタイミング実験が実行された。ＩＮＰ非含有トリス緩衝液は３７秒の平均時間を必要とし、標準偏差は２．０秒であった（推定では通路温度≒−３２℃）。ＩＮＰ抽出物の添加は凍結時間と再現性とに大きく影響し、すべての場合に凍結はおよそ１８〜２０秒で発生し標準偏差はおよそ１秒であるので、検査された四つのＩＮＰ濃度において濃度依存作用は観察されなかった。
【０１６１】
ＴＥＣの上の単一の厚さ１ｍｍのプラスチック基板についてのＩＲカメラからの温度測定を使用すると、凍結の時点で内部温度は≒−２２℃であると推定される。１０回の凍結／融解試験が各試料について実施され、これらのデータは図１１に示されている。
【０１６２】
融解時間はＩＮＰ濃度に全く影響されず、ＩＮＰ非含有緩衝液（図１２に図示）についての事例を含むすべての事例ではおよそ２０〜２２秒であった。
【０１６３】
図１１は、トリスブロッキング緩衝液での凍結時間に対するＩＮＰ抽出希釈液の作用を図示している。ＩＮＰ非含有対照物と比較して、四つのＩＮＰ抽出希釈液すべてが−４５℃ではおよそ２倍急速に凍結し、濃度依存作用は見られなかった。−２０℃で、ＩＮＰ非含有緩衝液は５回の３０分試験では凍結しなかった。必要な凍結時間と標準偏差（絶対及び相対パーセントの両方）は、この温度でのＩＮＰ濃度と相関して減少する。−２０℃（*）での１：１０，０００のＩＮＰ緩衝液は１５回の３分試験では１０回だけ凍結した。−４５℃の試験についてはＮ=１０であり、−２０℃の試験についてはＮ＝１５であった。エラーバーは、各方向での一つの標準偏差を表す。
【０１６４】
図１２は、トリス緩衝液での五つの異なるＩＮＰ濃度についての凍結時間を図示している。初期温度は、通路を凍結させるのに使用される温度を指し、通路はこの温度から通路がすぐに融解するように設定されている。いずれの温度での融解についても濃度依存作用は明白ではなかった。ＩＮＰ非含有緩衝液は−２０℃では凍結しなかった為、この温度でのこの緩衝液には融解時間が適用できなかった。−４５℃の試験についてはＮ＝１０であり、−２０℃の試験についてはＮ＝１５であった。エラーバーは、各方向の一つの標準偏差を表している。
【０１６５】
高いバルブ作用温度についての温度要件を軽減する為の氷核形成タンパク質の使用
低温の自由融解バルブ作用に使用されるシステム及びＩＮＰ抽出希釈液が、低温試験について説明したのと同じように再び検査されたが、ただし、使用された凍結温度は−２０℃であった（通路内部の定常状態温度は−１１℃と推定）。１５回の試験が実施され、そのデータが図１１に示されている。ＩＮＰ非含有ブロッキング緩衝液は、−２０℃に設定されたＴＥＣでは５回の３０分試験中に凍結が観察されなかった。すべてのＩＮＰ含有試料は、濃度依存作用を伴ってこの温度で凍結した。１：１０及び１：１００のＩＮＰ抽出希釈液は−４５℃で凍結するのに長くかかり、平均凍結時間はそれぞれ３３秒±２．０秒と３６秒±２．０秒であった（両方の場合に推定される通路温度は−１１℃）。１：１，０００のＩＮＰ抽出希釈液は、−４５℃でトリス緩衝液のものと類似の作用を示し、凍結時間（平均４４秒）は類似しており、標準偏差は大きかった（６．５秒）。１５回の３分試験において、１：１０，０００のＩＮＰ抽出希釈液は１０回凍結し、平均は９１秒で標準偏差は４５秒と極めて大きかった。その最短凍結時間は４１秒、最長は１７４秒であった。−４５℃での試験のように、融解時間はＩＮＰ濃度に影響されなかった。すべての−２０℃試験においておよそ１５秒で凍結し、標準偏差は１秒未満であった。これらのデータは図１２に示されている。
【０１６６】
薄型チップで作動時間を短縮する為の氷核形成タンパク質の使用
最終的な一連の実験は、底基板の厚さが１ｍｍではなく０．５ｍｍであることを除いて上記の試験で使用されたもの（標準チップ）と同一である薄型チップを利用して実行された。ＩＮＰを含むか含まないトリス緩衝液を使用して、−４５℃及び−２０℃のＴＥＣ温度で凍結時間が再び検査された。これらの実験では、ＩＮＰ抽出液の１：１００希釈液のみが検査された。基板厚さを半分にする作用は顕著であった。−４５℃で、ＩＮＰを含むか含まないと凍結時間はそれぞれ１３秒±０．４８秒と２２秒±０．９２秒であったのに対して、これらの条件での標準チップでは１９秒±１．１秒と３７秒±２．０秒であった。−２０℃でＩＮＰを含んでいると、凍結には１８秒±０．７４秒を必要とし、これは標準チップでＩＮＰを含む−４５℃の場合とほぼ同じであった。標準チップのように、ＩＮＰを含まないと−２０℃では割り当てられた時間内に凍結が観察されなかった。これらのデータと、関係する標準チップデータとの比較が、図１３に示されている。
【０１６７】
図１３は、ＩＮＰを含むか含まない標準チップ（１ｍｍ基板）と薄型チップ（０．５ｍｍ基板）の間の凍結時間の比較を図示している。各凍結温度及び緩衝液条件について、ＩＮＰを含まない−２０℃の場合を除いて、標準チップよりも薄型チップでかなり急速に凍結が発生し、いずれのチップ内容物も割り当て時間内には凍結しなかった。観察された最速の凍結時間は、−４５℃でＩＮＰを含む薄型チップにおいて発生した（標準チップについては〜１３秒と〜１９秒）。最大の性能差は−２０℃で発生し、薄型チップは標準チップのおよそ２倍の速さで凍結した（〜１８秒と〜３６秒）。温度は−４５℃から−２０℃まで上昇し、ＩＮＰを含む薄型チップについて必要な追加時間は〜５秒のみであり、一方で、標準チップについては必要な追加凍結時間は〜１８秒であり、効果的に２倍になった。薄型チップ試験すべてについてＮ＝１０であった。エラーバーは各方向の一つの標準偏差を表す。
【０１６８】
上記は本発明を例示しており、これを限定するものとは解釈されない。本発明のわずかな例示的実施形態が説明されたが、本発明の新規の教示及び利点を大きく逸脱することなく例示的実施形態には多くの変形が可能であることを当業者は容易に認識するだろう。したがって、このような変形はすべて、請求項に規定された本発明の範囲に含まれることが意図されている。本発明は、以下の請求項と、これに含まれる請求項の同等物により規定される。
【符号の説明】
【０１６９】
１０  マイクロ流体チップ
１０ｂ  底部
１０ｔ  上面
２０  流体輸送通路
２２  凍結融解バルブ（ＦＴＶ）
２２ｂ  曲線エルボ
２２ｔ  ＴＥＣ要素
２５  冷却器
２５ｔ  熱電冷却器（ＴＥＣ）
２６  熱伝導材料
３５，１３５  空気透過膜
４０  ビードウェルアレイ
４０ｃ  アレイ室
４０ｄ  デバイダ
４５  試料インプット
４５ａ  アクセス開口又はビア
４７  試料計量ループ
５０  ビード貯蔵／試料培養室
５０ａ  アクセスビア又は開口
５２  ビード洗浄・二次試薬培養室
５２ａ  アクセス開口又はビア
５５  廃棄物容器
５５ａ  貫通孔又はビア
６０  緩衝液インプット
６０ａ  アクセスビア又は開口
６０ｆ  緩衝液
６３  二次試薬インプット
６３ａ  アクセス開口又はビア
６３ｆ  二次試薬流体
６３ｉ  インプット通路
６６  封止剤インプット
６６ａ  アクセス開口又はビア
６８  アレイ前処理試薬室
６８ａ  貫通孔又はビア
６９  アレイ洗浄・オイルパージ廃棄物室
６９ａ  貫通孔又はビア
７０  検出基板
７０ａ  アクセス開口又はビア
１２５  温度制御部材
１２８  電気路
２００  自動検査システム
２００ｃ  制御装置／コンピュータ
２００ｈ  サポートモジュール
２００ｐ  プロセッサ
２０２  ベース
２１０  ディスプレイ
２５０  保持アセンブリ
２５１ｂ  保持基板
２５１ｔ  上プレート
２５１ｗ  窓部
２６０  グラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）
３００  一体型リーダ
Ｆ  熱的フットプリント
Ｌ  幅
Ｔ  チューブ材料
Ｗ  ワイヤ材料
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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