(57)【要約】  血小板の分離方法、例えば臍帯血から血小板を分離する方法が、本願により提供される。特定の実施形態においては、多血小板血漿を調製する方法が本願により提示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液から血小板を分離する方法であって、血漿から赤血球を除去すること、および、血漿から白血球を分離することを含む方法。
【請求項２】
赤血球は血液を遠心分離することによって除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
赤血球は血漿容量拡張剤を血液中に導入することによって除去される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
血漿容量拡張剤を血液に導入した後に赤血球が自発的に沈降する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
血漿容量拡張剤を血液に導入した後に赤血球が遠心分離によって沈降する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記血漿容量拡張剤が、ヘタスターチまたはペンタスターチである、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
血漿中の血小板から白血球を分離するために十分な時間、前記血漿を遠心分離し、これによって多血小板血漿（ＰＲＰ）を生成する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
血漿を約２００ｘＧ〜約５００ｘＧで遠心分離する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
血漿を約３００ｘＧ〜約４００ｘＧで遠心分離する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
血漿を約５分〜約３０分間遠心分離する、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
血漿を約１０分〜約３０分間遠心分離する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
血漿を約１０分〜約２０分間遠心分離する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
血漿を約１０分〜約１５分間遠心分離する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
血液から血小板を分離する方法であって、血液を約１００ｘＧ〜約５００ｘＧで、約１０分〜約３０分間遠心分離し、これによりＰＲＰを生成することを含む方法。
【請求項１５】
血液を約１００ｘＧ〜約２００ｘＧで遠心分離することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
血液を約２０分〜約２５分間、遠心分離することを含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＲＰを緩衝するステップをさらに含む、請求項７〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＲＰを低温保存することをさらに含む、請求項７〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ＰＲＰを凍結することは、ＰＲＰを凍結することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＰＲＰを凍結乾燥することは、ＰＲＰを凍結乾燥することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
凍結乾燥されたＰＲＰを真空下で室温保存するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
血小板をペレット化するために約５００ｘＧ〜約４０００ｘＧで約２０分〜約６０分間、ＰＲＰを遠心分離すること、および、得られた上清を除去することをさらに含む、請求項７〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ＰＲＰを約２０００ｘＧ〜約４０００ｘＧで約１０分〜約２０分間、遠心分離し、血小板をペレット化すること、および、得られた上清を除去することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＰＲＰを約２０００ｘＧで約１５分間、遠心分離することを含む、請求項２３の方法。
【請求項２５】
血小板を緩衝液中に再懸濁することをさらに含む、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
血小板を凍結保存することをさらに含む、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
血小板を凍結保存することは、血小板を凍結することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
血小板を凍結保存することは、血小板を凍結乾燥することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
凍結乾燥血小板を真空下で室温保存することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
血液が臍帯血である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
臍帯血がヒト臍帯血である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３２】
血液が胎盤由来である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
血液がヒト胎盤由来である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
血液が臍帯血である、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
臍帯血がヒト臍帯血である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
血液が胎盤由来である、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
血液がヒト胎盤由来である、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１４年１２月３１日に出願された米国特許出願第６２／０９８，０７９５号公報の利点を請求する。この特許出願に開示された内容全体が、参考として本願に組み込まれる。
【０００２】
１．技術分野
本願において、血小板の分離方法、例えば臍帯血から血小板を分離する方法が提供される。特定の実施形態において、本願により提示される方法には、多血小板血漿（ＰＲＰ）の調製が含まれる。
【背景技術】
【０００３】
２．背景
血小板は、血液の正常な細胞成分である。血小板は、非常に小さいが、潜在的に有益な特性を有する多数の因子、例えば成長因子をもたらす様々なタイプの小胞を含むことが知られている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
３．概要
一の態様において、血液から血小板を分離するための方法が本願により提供される。特定の実施形態において、臍帯血、例えばヒト臍帯血から血小板を分離する方法が本願により提示される。分離された血小板は、自家または同種異系の設定において、例えば、創傷治癒、臓器修復および／または臓器再生、および／または組織修復および／または組織再生の方法を含む様々な用途に使用することができる。
【０００５】
特定の実施形態において、血液、例えば臍帯血、例えばヒト臍帯血から血小板を分離することは、血液から赤血球を除去した後に行う。特定の実施形態において、赤血球を除去した後、得られた血漿を処理して血漿中の血小板を他の血漿成分、例えば白血球などの細胞成分から分離する。
【０００６】
一の実施形態において、赤血球を遠心分離によって血液から除去する。別の実施形態において、赤血球を、自然的にまたは遠心分離によって赤血球沈降をもたらす成分を含む媒体を利用することによって、血液から除去する。特定の実施形態において、このような媒体には、血漿容量拡張剤、例えば、ヘタスターチまたはペンタスターチが含まれる。
【０００７】
一の実施形態において、血液、例えば臍帯血、例えばヒト臍帯血から赤血球を除去した後、得られた血漿を処理して血漿中の血小板濃度を高め、多血小板血漿（ＰＲＰ）を生成する。例えば、血漿は白血球によって枯渇するので、血漿の血小板成分を高めることができる。特定の実施形態においては、２００〜５００ｘＧ、例えば３００〜４００ｘＧで、血漿中の血小板から白血球を分離するために十分な時間、例えば５，１０，１５，２０，２５分間または３０分間、例えば１０〜３０分間、１０〜２０分間または１０〜１５分間、血漿を遠心分離することができる。このような実施形態において、得られる白血球除去血漿は多血小板血漿（ＰＲＰ）である。
【０００８】
特定の実施形態において、使用または貯蔵の前に、ＰＲＰを処理して所望の血小板濃度を得ることができる。一の実施形態においては、例えば、２０００ｘＧ〜４０００ｘＧ、例えば２０００ｘＧで１０〜２０分間、例えば１５分間、ＰＲＰを遠心分離し、得られた上清をペレット化して除去することにより、所望のＰＲＰ血小板濃度を得ることができる。他の実施形態においては、例えば、５００ｘＧ〜２０００ｘＧで２０〜６０分間、ＰＲＰを遠心分離することにより、所望のＰＲＰ血小板濃度を得ることができる。
【０００９】
特定の実施形態において、血液、例えば臍帯血、例えばヒト臍帯血から血小板を分離することを、血液から幹細胞を分離する処理を行った後に行う。他の特定の実施形態においては、血小板は、幹細胞の前保存なしに、血液、例えば臍帯血、例えばヒト臍帯血から血小板を分離してもよい。例えば、血液、例えば臍帯血、例えばヒト臍帯血を処理して、例えば１００〜５００ｘＧ、例えば１００〜２００ｘＧで、１０〜３０分間、例えば２０〜３０分間、遠心分離を行うことによってＰＲＰを生成することができる。次いで、得られたＰＲＰを処理してペレットにし、残部の血漿から血小板を除去するも可能である。
【００１０】
特定の実施形態において、ＰＲＰは使用前に緩衝(buffer)される。別の実施形態において、ＰＲＰ中の血小板を、例えば遠心分離によって血漿の残部から分離し、使用前に緩衝液中に再懸濁する。
【００１１】
特定の実施形態において、ＰＲＰは使用前に緩衝される。別の実施形態においては、ＰＲＰ中の血小板を、例えば遠心分離によって血漿の残部から分離し、使用前に緩衝液中に再懸濁する。
【００１２】
一の実施形態において、ＰＲＰは生成後直ちに使用することができる。特定の実施形態において、ＰＲＰは、使用前に緩衝される。別の実施形態において、ＰＲＰ中の血小板を、例えば遠心分離によって血漿の残部から分離し、使用前に緩衝液中に再懸濁する。
【００１３】
さらに別の実施形態において、ＰＲＰを、将来の使用のために保存することができる。例えば、ＰＲＰを、将来の使用のために冷凍しても、または凍結保存してもよい。他の実施形態において、ＰＲＰを、将来の使用のために凍結乾燥してもよい。例えば、凍結乾燥したＰＲＰを凍結保存してもよい。別の例では、凍結乾燥されたＰＲＰを真空下で室温保存してもよい。
【００１４】
別の実施形態において、ＰＲＰ中の血小板を、例えば遠心分離によって血漿の残部から分離し、保存前に緩衝液中に再懸濁する。例えば、ＰＲＰ中の血小板を、例えば遠心分離によって血漿の残部から分離し、将来の使用のために冷凍または凍結保存する前に緩衝液中に再懸濁してもよい。他の実施形態において、ＰＲＰ中の血小板を、例えば遠心分離によって血漿の残部から分離し、将来の使用のために凍結乾燥する前に緩衝液中に再懸濁してもよい。凍結乾燥した血小板を、例えば、低温保存することができる。別の例においては、凍結乾燥した血小板を真空下で室温保存してもよい。
【００１５】
特定の実施形態において、ＰＲＰは保存前に緩衝される。別の実施形態において、ＰＲＰ中の血小板を、例えば遠心分離によって血漿の残部から分離し、貯蔵の前に貯蔵、例えば凍結保存に適した緩衝液中に再懸濁する。
【００１６】
特定の態様において、個体に投与、例えば注射、例えば局所注射によって投与されるように配合された（formulated）、分離されたＰＲＰを含む組成物が、本願により提供される。他の特定の態様において、個体に投与、例えば注射、例えば局所注射によって投与されるように配合された、分離された血小板を含む組成物が、本願により提供される。
【００１７】
特定の態様において、分離されたＰＲＰと幹細胞、例えば胎盤幹細胞（ＰＤＡＣ）とを含む組成物が、本願により提供される。特定の実施形態において、このような組成物は、個体に投与されるように、例えば注射、例えば局所注射によって投与されるように配合される。特定の他の態様においては、分離された血小板と幹細胞、例えばＰＤＡＣとを含む組成物が本願により提供される。特定の実施形態においては、このような組成物は、個体に投与されるように、例えば注射、例えば局所注射によって投与されるように配合される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ＰＲＰと幹細胞、例えば胎盤幹細胞とは、個体に投与、例えば注射する前に、体外で前記組成物を形成するように組み合わされる。他の実施形態において、ＰＲＰは、第１の工程において、個体に投与、例えば注射され、幹細胞、例えば胎盤幹細胞は、第２の工程において、個体のＰＲＰを投与した部位またはその近くに投与、例えば注射され、これにより体内で組成物を形成させる。さらに他の実施形態において、幹細胞、例えば胎盤幹細胞は、第１の工程において、個体に投与、例えば注射され、ＰＲＰは、第２の工程において、個体の幹細胞を投与した部位またはその近くに投与、例えば注射され、これにより体内で組成物を形成させる。
【００１９】
他の実施形態において、血小板と幹細胞、例えば胎盤幹細胞とは、個体への投与、例えば注射の前に、体外で前記組成物を形成するように組み合わされる。他の実施形態において、血小板は、第１の工程において、個体に投与、例えば注射され、幹細胞、例えば胎盤幹細胞は、第２の工程において、個体の血小板を投与した部位またはその近くに投与、例えば注射され、これにより体内で組成物を形成させる。さらに他の実施形態において、幹細胞、例えば胎盤幹細胞は、第１の工程において、個体に投与、例えば注射され、血小板は、第２の工程において、個体の幹細胞を投与した部位またはその近くに投与、例えば注射され、これにより体内で組成物を形成させる。
【００２０】
特定の実施形態において、前記ＰＤＡＣは、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞である。別の特定の実施形態において、前記ＰＤＡＣはＣＤ２００を発現するが、ＨＬＡ−Ｇを発現しない；または、ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ２００を発現する；または、ＣＤ２００およびＯＣＴ−４を発現する；または、ＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現するが、ＨＬＡ−Ｇを発現しない。さらに他の実施形態においては、前記ＰＤＡＣは、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，ＣおよびＡＢＣ−ｐのうち一または複数を発現し、かつ／またはＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＫＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＨ−ＤＲ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥ４およびＣＤ３８のうち一または複数を発現しない。特定の実施形態において、胎盤幹細胞は、免疫細胞の活性を抑制、例えばＴ細胞の増殖を抑制する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、組成物におけるＰＲＰの幹細胞、例えば胎盤幹細胞に対する容積比は約１０：１〜１：１０である。いくつかの実施形態において、組成物におけるＰＲＰの幹細胞、例えば胎盤幹細胞に対する容積比は約１：１である。いくつかの実施形態において、ＰＲＰ中の血小板の幹細胞、例えば胎盤幹細胞数に対する個数比は、約１００：１〜１：１００である。いくつかの実施形態において、ＰＲＰ中の血小板の幹細胞、例えば胎盤幹細胞に対する個数比は、約１：１である。
【００２２】
特定の態様において、マトリックス、ヒドロゲルまたは足場と分離されたＰＲＰとを含む組成物が、本願により提供される。特定の実施形態において、このような組成物は、個体に投与されるように配合される。特定の他の態様においては、マトリックス、ヒドロゲルまたは足場と分離された血小板とを含む組成物が本願により提供される。特定の実施形態において、このような組成物は、個体に投与されるように配合される。特定の実施形態において、このような組成物は、天然マトリックス、例えば羊膜材料のような胎盤生体材料を含む。
【００２３】
特定の態様において、マトリックス、ヒドロゲルまたは足場と分離されたＰＲＰと幹細胞、例えばＰＤＡＣとを含む組成物が、本願により提供される。特定の実施形態において、このような組成物は、個体に投与されるように配合される。特定の他の態様において、マトリックス、ヒドロゲルまたは足場と分離された血小板と幹細胞、例えばＰＤＡＣとを含む組成物が、本願により提供される。特定の実施形態において、このような組成物は、個体に投与されるように配合される。特定の実施形態において、このような組成物は、天然マトリックス、例えば羊膜材料のような胎盤生体材料を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本願により提供される組成物のＰＲＰは自己ＰＲＰである。いくつかの実施形態において、組成物の血小板は自己血小板である。いくつかの実施形態において、本願により提供される組成物のＰＲＰは、同種ＰＲＰである。いくつかの実施形態において、組成物の血小板は同種血小板である。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ＰＲＰは、臍帯血、例えばヒト臍帯血に由来する。いくつかの実施形態において、血小板は、臍帯血、例えばヒト臍帯血に由来する。他の実施形態において、ＰＲＰは、胎盤灌流液、例えばヒト胎盤灌流液に由来する。他の実施形態において、血小板は、胎盤灌流液、例えばヒト胎盤灌流液に由来する。
【００２６】
特定の態様において、本願により提供される組成物は、個体の疾患、障害または医学的状態を治療する際に使用される。例えば、創傷治癒を必要とする個体に本願により提供される組成物を投与することを含む、創傷治癒を促進する方法が本願により提供される。別の例においては、組織または器官の修復または再生を必要とする個体に本願により提供される組成物を投与することを含む、組織または器官の修復または再生の促進を促進する方法が本願により提供される。特定の実施形態において、骨の修復または再生を必要とする個体に本願により提供される組成物を投与することを含む、骨の修復または再生の方法が本願により提供される。
【００２７】
３．１  定義
本願において、「約」という語は、記載された数値に言及する場合、言及された数値の上下１０％以内の値を示す。
【００２８】
本願において、「量」という語は、本願に記載の胎盤幹細胞に言及する場合、特定の個数の胎盤細胞を意味する。
【００２９】
本願において、「幹細胞」という語は、例えば、一または複数のタイプの幹細胞に関連するマーカーまたは遺伝子の発現プロファイル；培養で少なくとも１０〜４０回複製する能力；多能性、例えば試験管内、生体内またはその両方で、３つの胚葉のうちの一または複数の細胞に分化する能力；成長した（すなわち、分化した）細胞特性の欠如などの、幹細胞の少なくとも一の属性を保持する細胞を規定する。
【００３０】
本願において、「由来する」という語は、分離されたか、さもなければ精製されたことを意味する。例えば、胎盤由来接着細胞は、胎盤から分離される。「由来する」という語は、組織、例えば胎盤から分離された細胞および一次分離株から培養または増殖された細胞から培養される細胞を包含する。
【００３１】
本願において、「免疫学的局在化」とは、例えば、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別、磁気細胞選別細胞ソーティング、その場での（in situ）ハイブリダイゼーション、免疫組織化学などにおいて、免疫タンパク質、例えばその抗体または断片を使用する、配合物、例えば細胞マーカーの検出を意味する。
【００３２】
本願において、「ＳＨ２」という語は、マーカーＣＤ１０５上のエピトープに結合する抗体を指す。従って、ＳＨ２＋と称される細胞はＣＤ１０５＋である。
【００３３】
本願において、「ＳＨ３」および「ＳＨ４」という語は、マーカーＣＤ７３上に存在するエピトープに結合する抗体を指す。従って、ＳＨ３＋および／またはＳＨ４＋と称される細胞はＣＤ７３＋である。
【００３４】
本願において、細胞、例えばＰＤＡＣが「分離される」とは、例えば幹細胞の収集および／または培養中に、幹細胞に本来的に関連付けられる他の細胞のうち少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または少なくとも９９％が幹細胞から取り除かれることを意味する。
【００３５】
本願において、「分離された細胞集団」という語は、細胞の集団が得られまたは由来する組織の他の細胞、例えば胎盤から実質的に分離された細胞の集団を意味する。いくつかの実施形態において、例えば幹細胞の集団の収集および／または培養中に幹細胞の集団に本来的に関連付けられる細胞のうち少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または少なくとも９９％が幹細胞集団から「分離される」。
【００３６】
本願において、「胎盤幹細胞」という語は、組織培養基質（例えば、組織培養プラスチックまたはフィブロネクチン被覆組織培養プレート）に付着し、形態学、細胞表面マーカー、または初代培養からの継代数にかかわらず、哺乳動物の胎盤に由来する、例えば哺乳動物の胎盤から分離された幹細胞または前駆細胞を指す。ただし、本願で使用される「胎盤幹細胞」という語は、当業者によって理解されるように、栄養膜、細胞栄養膜、胚生殖細胞、または胚性幹細胞を意味しない。「胎盤幹細胞」および「胎盤由来幹細胞」との語は、互換的に使用される。本願では特に断らない限り、「胎盤」という語は臍帯を含む。本願に開示される胎盤幹細胞は、特定の実施形態において、生体内で多分化能（すなわち、分化条件下において生体内で細胞が分化する）、生体内で多分化能（すなわち、生体内で細胞が分化する）のいずれかまたは双方である。
【００３７】
本願において、幹細胞は、例えば、免疫学的局在化、フローサイトメトリー、ＲＴ−ＰＣＴなどによって、特定のマーカーがバックグラウンドを超えて検出可能である場合、そのマーカーに対して「陽性」である。例えば、バックグラウンドよりも検出可能に大きな量である場合（例えばアイソタイプコントロールと比較して）、または任意の所定のアッセイに対して実験的なネガティブコントロールである場合であって、細胞または細胞集団において例えばＣＤ７３が検出可能であるとき、ＣＤ７３に対して陽性であると記載される。例えば、抗体媒介性検出の文脈において、特定の細胞表面マーカーが存在することを示す「陽性」は、そのマーカーに特異的な抗体、例えば蛍光標識された抗体を用いてマーカーが検出可能であることを意味する；「陽性」は、また、細胞または細胞集団が、例えば細胞計、ＥＬＩＳＡなどにおいて、バックグラウンドよりも検出可能に高いシグナルを生成する量によってそのマーカーをディスプレイすることを意味する。例えば、細胞は、ＣＤ１０５に特異的な抗体によって検出可能に標識され、抗体からのシグナルがコントロール（例えば、バックグラウンド）よりも検出できるほどに高い場合、「ＣＤ１０５＋」である。逆に、同じ文脈において、「陰性」は、細胞表面マーカーが、バックグラウンドと比較してそのマーカーに特異的な抗体を用いて検出できるほどではないことを意味する。例えば、細胞または細胞集団は、細胞または細胞集団がＣＤ３４に特異的な抗体で検出可能に標識されてない場合、「ＣＤ３４−」である。本願において特に明記しない限り、抗体を用いて分化（「ＣＤ」）マーカーのクラスターが検出される。例えば、ＯＣＴ−４に対するｍＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲを用いて、例えば３０サイクル検出可能である場合、ＯＣＴ−４が存在すると判定され、細胞はＯＣＴ−４＋である。マーカーが少なくとも１つの他の細胞型と細胞を区別するために使用可能な場合、または、細胞が存在する際または細胞によって発現される際合に細胞を選択または分離するために使用可能な場合、細胞はそのマーカーに対して陽性である。
【００３８】
本願において、「免疫調節」および「免疫調節」は、免疫応答における検出可能な変化を引き起こすか、または引き起こす能力を有すること、および免疫応答における検出可能な変化を全身的または局所的に引き起こす能力を有することを意味する。
【００３９】
本願において、「免疫抑制」および「免疫を抑制し」は、免疫応答の検出可能な低下を引き起こすかまたは引き起こす能力を有すること、ならびに免疫応答の検出可能な抑制を全身的または局所的に引き起こす能力を有することを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
４．詳細な説明
４．１  血小板および多血小板血漿を得る方法
一の態様において、血液から血小板を分離する方法が本願により提供される。特定の実施形態において、臍帯血、例えばヒト臍帯血、または胎盤、例えばヒト胎盤、例えば胎盤灌流液から血小板を分離するための方法が本願により提示される。
【００４１】
本願に記載の方法を用いて分離された血小板の供給源は、ヒトまたは動物の全血の任意の態様であってもよい。例えば、ＰＲＰおよび分離された血小板は、自己由来の供給源、同種異系の供給源、単一供給源、または血小板および／または血漿のプールされた供給源、例えばコド血液から採取された血小板、例えばヒト臍帯血、または胎盤、例えばヒト胎盤、例えば胎盤灌流液から得られる。例えば、本願に示された分離方法において使用される血液の供給源となるドナーは、ヘパリン、ｔＰＡ、またはアスピリンなどの血栓溶解剤を用いて以前に治療されていないドナーであってもよい。いくつかの実施形態においては、そのようなドナーは、血液を採取する前に、少なくとも２時間、１日、２週間、または１ヶ月間、血栓溶解剤を摂取しない。
【００４２】
一の実施形態において、採血用シリンジを用いて全血をドナーから採取すればよい。採取される血液の量は、例えば、所望の血小板の量およびドナーの健康状態を含む多くの因子に依存する。任意の適切な量の血液を採取すればよい。例えば、約３０〜６０ｍｌの全血を採取すればよい。例示的な実施形態においては、約１１ｍｌの血液を、抗凝固剤（例えば、酸−クエン酸−リン酸塩またはクエン酸−リン酸−デキストロース溶液）約５ｍｌを含む注射器内に採血すればよい。シリンジは、アフェレーシス針に取り付けられ、抗凝固剤を下塗り（primed with）してもよい。標準的な無菌プラクティスにより、血液をドナーから採取すればよい。いくつかの実施形態においては、当該分野で公知のアンブソル、ベンゾカイン、リドカイン、プロカイン、ブピバカインまたは任意の適切な麻酔薬などの局所麻酔薬を用いて挿入領域を麻酔することができる。
【００４３】
特定の実施形態において、血小板は、臍帯血、例えばヒト臍帯血から分離される。臍帯血は、当技術分野で周知の標準的な方法を用いて得ることができる。
【００４４】
特定の実施形態において、血小板は、胎盤、例えばヒト胎盤、例えば胎盤灌流液から分離される。胎盤灌流液の分離のための例示的な方法を以下に記載する。
【００４５】
胎盤、例えばヒトの胎盤、例えばヒトの満期胎盤は、室温で滅菌した断熱容器に入れ、出生から４時間以内に検査室に送達しなければならない。胎盤は検査時に臓器の断片化や臍帯血管剥離などの物理的損傷の形跡がある場合は廃棄する。場合により、そのような送達の前に、胎盤およびそれに付着した臍帯は、放血または部分的に放血させることができる。
【００４６】
胎盤を室温（２３℃±２℃）または冷蔵（４℃）の滅菌容器中に２〜２０時間保持する。定期的に、胎盤を２５℃±３℃の滅菌生理食塩水中に浸漬して洗浄し、目に見える表面の血液または破片を除去する。臍帯を胎盤への挿入箇所から約５ｃｍ切断し、臍帯血管に、胎盤の双方向灌流および流出液の回収を可能にする滅菌流体経路に接続されたテフロン（登録商標）またはポリプロピレンのカテーテルを用いてカニューレを挿入する。
【００４７】
胎盤は、細胞動員のための生理学的に適合する環境を装って維持する条件下で維持される。カニューレを、２Ｕ／ｍｌヘパリン（Ｅｌｋｉｎｓ‐Ｓｉｎｎ、ニュージャージー州）を含有するＩＭＤＭ無血清培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、ニューヨーク州）を用いて洗い流す。胎盤の灌流は毎分５０ｍＬの速さで行われる。処置の過程において、胎盤を穏やかにマッサージして、灌流プロセスを助け、細胞物質の回収を補助する。流出液は、動脈カニューレを通して重力排水および重力吸引の両方によって灌流回路から収集される。
【００４８】
灌流および回収手順は、回復された有核細胞の個数が１００個／μＬ未満になるまで繰り返してもよい。灌流液は、プールし、本願に記載されている血小板を分離するために使用する。
【００４９】
特定の実施形態においては、血液から赤血球を除去した後、血液、例えば臍帯血、例えばヒト臍帯血、または胎盤、例えばヒト胎盤、例えば胎盤灌流液から分離される。特定の実施形態においては、赤血球を除去した後、得られた血漿を処理して血漿中の血小板を他の血漿成分、例えば白血球などの細胞成分から分離する。
【００５０】
一の実施形態においては、赤血球は、遠心分離によって血液から除去する。別の実施形態において、赤血球は、自然的にまたは遠心分離によって赤血球沈降を生じさせる成分を含む媒体を利用することによって、血液から除去する。特定の実施形態においては、このような媒体には、血漿容量拡張剤、例えば、ヘタスターチまたはペンタスターチが含まれる。
【００５１】
一の実施形態においては、血液、例えば臍帯血、例えばヒト臍帯血、または胎盤、例えばヒト胎盤、例えば胎盤灌流液から赤血球を除去した後、得られた血漿を処理して、血漿中の血小板の存在を豊富化させることにより、多血小板血漿（ＰＲＰ）を生成する。例えば、血漿は白血球のために欠乏し、これにより血漿中の血小板成分を豊富化することができる。特定の実施形態においては、血漿中の血小板から白血球を分離するのに十分な時間、例えば５，１０，１５，２０，２５分間または３０分間、例えば１０〜３０分間、１０〜２０分間または１０〜１５分間、００〜５００ｘＧ、例えば３００〜４００ｘＧで、血漿を遠心分離することができる、このような実施形態において、得られる白血球除去血漿は、多血小板血漿（ＰＲＰ）である。
【００５２】
特定の実施形態においては、使用前または保存前に、ＰＲＰを処理して所望の血小板濃度を得ることができる。一の実施形態においては、例えば、ＰＲＰを２０００ｘＧ〜４０００ｘＧ、例えば２０００ｘＧで１０〜２０分間、例えば１５分間遠心分離することにより、所望のＰＲＰ血小板濃度を得ることができる。他の実施形態においては、例えば、ＰＲＰを５００ｘＧ〜２０００ｘＧで２０〜６０分間遠心分離することにより、所望のＰＲＰ血小板濃度を得ることができる。
【００５３】
特定の実施形態においては、血液から幹細胞を分離する処理をした後、血液、例えば臍帯血、例えばヒト臍帯血、または胎盤、例えばヒト胎盤、例えば胎盤灌流液から、血小板を分離する。他の特定の実施形態においては、幹細胞の保存を前もって行うことなく、血液、例えば臍帯血、例えばヒト臍帯血、または胎盤、例えばヒト胎盤、例えば胎盤灌流液から、血小板を分離することができる。例えば、血液、例えば臍帯血、例えばヒト臍帯血、または胎盤、例えばヒト胎盤、例えば胎盤灌流液を処理して例えば１００〜５００ｘＧ、例えば１００〜２００ｘＧで１０〜３０分間、例えば２０〜２５分間を遠心分離することによってＰＲＰを産生することができる。次いで、得られたＰＲＰを処理してペレットにし、残りの血漿から血小板を除去することができる。
【００５４】
特定の実施形態において、ＰＲＰは、使用前に緩衝される。別の実施形態においては、ＰＲＰ中の血小板を、例えば遠心分離によって血漿の残部から分離し、使用前に緩衝液中に再懸濁する。
【００５５】
特定の実施形態において、ＰＲＰは、使用前に緩衝される。別の実施形態においては、ＰＲＰ中の血小板を、例えば遠心分離によって血漿の残部から分離し、使用前に緩衝液中に再懸濁する。
【００５６】
一の実施形態においては、ＰＲＰは生成直後に使用することができる。特定の実施形態において、ＰＲＰは、使用前に緩衝される。別の実施形態においては、ＰＲＰ中の血小板を、例えば遠心分離によって血漿の残部から分離し、使用前に緩衝液中に再懸濁する。
【００５７】
特定の実施形態においては、ＰＲＰまたは再懸濁した血小板は、アルカリ性緩衝剤を使用して生理的ｐＨに緩衝化してもうよい。緩衝剤は、ＰＲＰまたは再懸濁した血小板を約６．５〜約８．０の生理的ｐＨに調節可能な、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、一塩基性リン酸塩、一塩基性重炭酸塩、またはこれらの任意の適切な組成物などの生体適合性緩衝液であってもよい。特定の実施形態においては、生理的ｐＨは、約ｐＨ７．３〜約ｐＨ７．５、より具体的には約ｐＨ７．４に調節すればよい。特定の実施形態において、緩衝剤は、８．４％重炭酸ナトリウム溶液であってもよい。特定の実施形態において、全血から分離されたＰＲＰの１ｃｃにつき０．０５ｃｃの８．４％重炭酸ナトリウムを添加すればよい。
【００５８】
さらに別の実施形態においては、ＰＲＰは、将来の使用のために保存することができる。例えば、ＰＲＰは、将来の使用のために凍結してもよく、または別の方法で凍結保存してもよい。特定の実施形態においては、凍結前にＤＭＳＯ、グリセロール、またはＥＰＩＬＩＦＥ（登録商標）細胞凍結培地（Cascade Biologics）の凍結保存剤を添加しておく。
【００５９】
他の実施形態においては、ＰＲＰは、将来の使用のために凍結乾燥してもよい。例えば、凍結乾燥したＰＲＰを凍結保存してもよい。別の例においては、凍結乾燥されたＰＲＰを真空下で室温保存してもよい。
【００６０】
別の実施形態において、ＰＲＰ中の血小板は、例えば遠心分離によって血漿の残部から分離し、保存前に緩衝液中に再懸濁する。例えば、ＰＲＰ中の血小板を、例えば遠心分離によって血漿の残部から分離し、将来の使用のために凍結または他の方法で凍結保存する前に緩衝液中に再懸濁することができる。特定の実施形態においては、凍結前にＤＭＳＯ、グリセロール、またはＥＰＩＬＩＦＥ（商標）細胞凍結培地（Cascade Biologics）などの凍結保存剤を添加しておく。
他の実施形態においては、ＰＲＰ中の血小板を、例えば遠心分離によって血漿の残部から分離し、将来の使用のために凍結乾燥する前に緩衝液中に再懸濁する。凍結乾燥された血小板は、例えば、低温保存してもよい。別の例においては、凍結乾燥された血小板を真空下で室温保存してもよい。
特定の実施形態においては、ＰＲＰは保存前に緩衝される。別の実施形態においては、ＰＲＰ中の血小板を、例えば遠心分離によって血漿の残部から分離し、貯蔵の前に凍結保存、例えば凍結保存に適した緩衝液中に再懸濁する。
【００６１】
４．２．血小板および血小板の豊富な血漿を含む組成物
特定の態様においては、本願に提示される方法によって得られた、分離されたＰＲＰを含む組成物が、本願により提供される。いくつかの実施形態においては、本願により提供される組成物は、ＰＲＰを生成するために使用される全血、例えば未処理全血中の血小板の濃度よりも少なくとも１．１倍高い濃度の血小板細胞を有するＰＲＰを含む。いくつかの実施形態において、本願により提供される組成物は、ＰＲＰを生成するために使用される全血、例えば未処理全血中の血小板の濃度よりも約１．１倍〜約１０倍高い濃度の血小板細胞を有するＰＲＰを含む。いくつかの実施形態において、本願により提供される組成物は、ＰＲＰを生成するために使用される全血、例えば未処理全血中の血小板の濃度よりも約１．５，２．０，２．５，３．０，３．５，４，４．５，５，５．５，６，６．５，７，７．５，８，８．５，９，９．５，１０倍または１０倍を超える濃度の血小板細胞を有するＰＲＰを含む。
【００６２】
特定の他の態様においては、本願に提示される方法によって得られた血小板を含む組成物が、本願により提供される。いくつかの実施形態においては、本願により提供される組成物は、分離された血小板を生成するために使用される全血、例えば未処理全血の血小板の濃度よりも少なくとも１．１倍高い濃度の血小板細胞を含む。いくつかの実施形態においては、本願により提供される組成物は、分離された血小板を生成するために使用される、全血、例えば未処理全血中の血小板の濃度よりも約１．１倍〜約１０倍高い濃度の血小板細胞を含む。いくつかの実施形態においては、本願により提供される組成物は、分離された血小板を生成するために使用される全血、例えば未処理全血中の血小板の濃度より１０倍、または１０倍以上高い濃度の血小板細胞を含む。
【００６３】
一般に、１マイクロリットルの全血は、１４０，０００〜５００，０００個の血小板を含む。いくつかの実施形態において、本願により提供される組成物中の血小板の濃度は、１マイクロリットル当たり約１５０，０００〜約２，０００，０００個である。いくつかの実施形態において、本願により提供される組成物中の血小板の濃度は、１マイクロリットル当たり約１５０，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、１，１００，０００、１，２００，０００、１，３００，０００、１，４００，０００、１，５００，０００、１，６００，０００、１，７００，０００、１，８００，０００、１，９００，０００個または２，０００，０００個である。いくつかの実施形態においては、本願により提示される組成物中の血小板の濃度は、１マイクロリットル当たり約１５０，０００〜約２５，０００，０００個、または約５，０００，０００〜約７，０００，０００個である。
【００６４】
特定の態様においては、個体に投与、例えば注射、例えば局所注射によって投与されるように配合された、分離されたＰＲＰを含む組成物が、本願により提供される。他の特定の態様において、個体に投与、例えば注射、例えば局所注射によって投与されるように配合された、分離された血小板を含む組成物が、本願により提供される。
【００６５】
特定の態様において、分離されたＰＲＰと幹細胞、例えば胎盤幹細胞（ＰＤＡＣ）とを含む組成物が、本願により提供される。特定の実施形態においては、このような組成物は、個体に投与、例えば、注射、例えば局所注射）によって投与されるように配合される。特定の他の態様においては、分離された血小板と幹細胞、例えばＰＤＡＣとを含む組成物が、本願により提供される。特定の実施形態においては、このような組成物は、個体に投与、例えば注射、例えば局所注射）によって投与されるように配合される。
【００６６】
いくつかの実施形態において、ＰＲＰと幹細胞、例えば胎盤幹細胞とは、個体への投与、例えば注射前に、生体外で前記組成物を形成させるように組み合わされる。他の実施形態においては、ＰＲＰは、第１のステップにおいて個体に投与、例えば注射され、幹細胞、例えば胎盤幹細胞は、第２のステップにおいて、個体のＰＲＰを投与した部位またはその近く投与、例えば注射され、これにより生体内で組成物を形成させる。さらに他の実施形態においては、幹細胞、例えば胎盤幹細胞が、第１のステップにおいて個体に投与、例えば注射され、ＰＲＰは、第２のステップにおいて、個体の幹細胞を投与した部位またはその近くに投与、例えば注射され、これにより生体内で組成物を形成させる。
【００６７】
他の実施形態においては、個体への投与、例えば注射前に、血小板と幹細胞、例えば胎盤幹細胞とを組み合わせて生体外で前記組成物を形成する。他の実施形態においては、血小板は、第１のステップにおいて、個体に投与、例えば注射され、幹細胞、例えば胎盤幹細胞は、第２ステップにおいて、個体の血小板を投与した部位またはその近くに投与、例えば注射され、これにより生体内で組成物を形成させる。さらに他の実施形態においては、幹細胞、例えば胎盤幹細胞は、第１のステップにおいて個体に投与、例えば注射され、血小板は、第２ステップにおいて、個体の幹細胞を投与した部位またはその近くに投与、例えば注射され、これにより生体内で組成物を形成させる。
【００６８】
本願に記載された組成物および方法において有用な胎盤幹細胞は、本願ならびに例えば米国特許第７，３１１，９０４号公報、米国特許第７，３１１，９０５号公報、米国特許第７，４６８，２７６号公報、米国特許第８，０５７，７８８号公報および米国特許第８，２０２，７０３号公報に記載されており、これら公報の開示内容は、参考として全体が本願に組み込まれる。
【００６９】
特定の実施形態において、前記ＰＤＡＣは、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞である。別の特定の実施形態において、ＣＤ１０＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋胎盤幹細胞は、さらにＣＤ４５＋またはＣＤ９０＋である。別の特定の実施形態において、このような細胞は、さらにＣＤ８０−および／またはＣＤ８６−である。
【００７０】
特定の実施形態において、前記胎盤幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ２００＋、ならびに、フローサイトメトリーによって検出される、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ１３３−、ＨＬＡ−ＤＲ，ＤＲ，ＤＱ−、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＰＤＬ１＋、ＡＢＣ−ｐ＋および／またはＯＣＴ−４＋の一又は複数である。他の実施形態において、上記ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞のいずれかは、さらに、ＣＤ２９＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ５４＋、ＳＨ３＋およびＳＨ４＋の一または複数である。別の特定の実施形態において、上記細胞はさらにＣＤ４４＋である。上記の分離されたＣＤ３４＋、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋胎盤幹細胞のいずれかの別の特定の実施形態において、細胞は、さらに、ＣＤ１１７−、ＣＤ１３３−、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−およびプログラムされたデス−１リガンド（ＰＤＬ１）＋の一又は複数、ならびにこれらの任意の組み合わせである。
【００７１】
別の実施形態において、ＣＤ３４＋、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞は、さらに、ＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリンｌｏｗ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ−およびＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ−１リガンド（ＰＤＬ１）＋の一又は複数、ならびにこれらの任意の組み合わせである。別の実施形態において、ＣＤ３４−、ＣＤ１０＋、ＣＤ１０５＋細胞は、さらに、ＣＤ１３＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４／ＩＣＡＭ＋、ＣＤ６２Ｅ−、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ６２Ｐ−、ＳＨ３＋（ＣＤ７３＋）、ＳＨ４＋（ＣＤ７３＋）、ＣＤ８０−、ＣＤ８６−、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋（ＣＤ１０５＋）、ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ＋、ＣＤ１１７−、ＣＤ１４４／ＶＥ−カドヘリンｌｏｗ、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４−、ＣＤ２００＋、ＣＤ１３３−、ＯＣＴ−４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＡＢＣ−ｐ＋、ＫＤＲ−（ＶＥＧＦＲ２−）、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−、ＨＬＡ−Ｇ−およびＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ−１１リガンド（ＰＤＬ１）＋である。
【００７２】
別の特定の実施形態においては、本願に記載の胎盤幹細胞のいずれかは、さらに、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって定まるように、フローサイトメトリーまたはＯＣＴ−４＋（ＰＯＵ５Ｆ１＋）によって検出されるＡＢＣ−ｐ＋であって、ここで、ＡＢＣ−ｐ＋は胎盤特異的ＡＢＣトランスポータータンパク質（乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）およびミトキサントロン耐性タンパク質（ＭＸＲ）としても知られる）であり、ＯＣＴ−４はＯｃｔａｍｅｒ−４タンパク質（ＰＯＵ５Ｆ１）である。
【００７３】
別の特定の実施形態において、本願に記載の胎盤幹細胞のいずれかは、さらに、フローサイトメトリーによって定まるＳＳＥＡ３−またはＳＳＥＡ４−であり、ここで、ＳＳＥＡ３はステージ固有の胎児性抗原３であり、ＳＳＥＡ４はステージ固有の胎児性抗原４であるる。他の特定の実施形態においては、本願に記載の胎盤幹細胞は、さらにＳＳＥＡ３−およびＳＳＥＡ４−である。
【００７４】
別の特定の実施形態においては、本願に記載の胎盤幹細胞のいずれかは、ＭＨＣ−I＋（例えば、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋）およびＭＨＣ−II−（例えば、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−）のうちの一または複数である。別の特定の実施形態においては、本願に記載の胎盤幹細胞のいずれかは、ＭＨＣ−I＋（例えば、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ＋）、ＭＨＣ−II−（例えば、ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ−）およびＨＬＡ−Ｇ＋のうちの一または複数である。
【００７５】
さらに別の特定の実施形態においては、前記ＰＤＡＣはＣＤ２００を発現し、ＨＬＡ−Ｇを発現しない；あるいはＣＤ７３、ＣＤ１０５、およびＣＤ２００を発現する；あるいはＣＤ２００およびＯＣＴ−４を発現する；あるいはＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、ＨＬＡ−Ｇを発現しない。さらに他の実施形態においては、前記ＰＤＡＣは、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，ＣおよびＡＢＣ−ｐのうちの一または複数を発現し、および／あるいはＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＫＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＨ−ＤＲ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥ４およびＣＤ３８のうちの一又は複数を発現しない。特定の実施形態において、胎盤幹細胞は、免疫細胞の活性を抑制、例えば、Ｔ細胞の増殖を抑制する。
【００７６】
いくつかの実施形態において、組成物中の幹細胞、例えば胎盤幹細胞に対するＰＲＰの容積比は、約１０：１〜１：１０である。いくつかの実施形態において、組成物中の幹細胞、例えば胎盤幹細胞に対するＰＲＰの容積比は約１：１である。いくつかの実施形態において、幹細胞、例えば胎盤幹細胞の個数に対するＰＲＰ中の血小板の個数比は、約１００：１〜１：１００である。いくつかの実施形態において、幹細胞、例えば胎盤幹細胞の個数に対するＰＲＰ中の血小板の個数比は、約１：１である。
【００７７】
いくつかの実施形態において、ＰＲＰに対する幹細胞、例えば胎盤幹細胞の容積比は、約１０：１、９．５：１、９：１、８．５：１、８：１、７．５：１、７：１、６．５：１、６：１、５．５：１、５：１、４．５：１、４：1、３．５：１、３：１、２．５：１、２：１、１．５：１、１．１：１、１：１．５、１：２、１：２．５、１：３、１：３．５、１：４、１：４．５、１：５、１：５．５、１：６、１：６．５、１：７、１：７．５、１：８、１：８．５、１：９、１：９．５または１:１０である。いくつかの実施形態において、ＰＲＰに対する幹細胞、例えば胎盤幹細胞の容積比は、約１００：1、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１:１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５，１：５０、１：５５、１:６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５または１：１００である。特定の実施形態において、幹細胞、例えば胎盤幹細胞の、ＰＲＰ中の血小板に対する個数比は、約１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：1、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１:１５、１：２０、１：２５、１:３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５または１：１００である。
【００７８】
本願により提供される幹細胞、例えば胎盤幹細胞とＰＲＰまたは血小板とを含む組成物は、幹細胞、例えば胎盤幹細胞、またはＰＲＰもしくは血小板、またはその両方の治療有効量を含有することができる。組み合わせた組成物は、少なくとも１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０または１×１０１１個の幹細胞、例えば胎盤幹細胞、血小板、例えばＰＲＰ中の血小板またはその両方、あるいは１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０または１×１０１１個の幹細胞、例えば胎盤幹細胞、血小板、例えばＰＲＰ中の血小板、またはその両方を含む。
【００７９】
一実施形態において、このような組成物は、約３億個の幹細胞、例えば胎盤幹細胞を含む。特定の他の実施形態において、このような組成物は、１００万〜１００億個の幹細胞、例えば胎盤幹細胞、１０００万〜１０億個の幹細胞、例えば胎盤幹細胞、または１億〜５億個の幹細胞、例えば胎盤幹細胞を含む。
【００８０】
特定の態様において、マトリックス、ヒドロゲルまたは足場と分離されたＰＲＰとを含む組成物が、本願により提供される。特定の実施形態において、このような組成物は、個体に投与されるように配合される。特定の他の態様においては、マトリックス、ヒドロゲルまたは足場と分離された血小板とを含む組成物が、本願により提供される。特定の実施形態において、このような組成物は、個体に投与されるように配合される。特定の実施形態において、このような組成物は、天然マトリックス、例えば胎盤生体材料、例えば羊膜材料を含む。
【００８１】
特定の態様においては、マトリックス、ヒドロゲルまたは足場と分離されたＰＲＰと幹細胞、例えばＰＤＡＣとを含む組成物が、本願により提供される。特定の実施形態において、このような組成物は、個体に投与されるように配合される。特定の他の態様においては、マトリックス、ヒドロゲルまたは足場と分離された血小板と幹細胞、例えばＰＤＡＣとを含む組成物が、本願により提供される。特定の実施形態において、このような組成物は、個体に投与されるように配合される。
【００８２】
特定の実施形態においては、本願に提示される組成物は、天然のマトリックス、例えば胎盤の生体材料、例えば羊膜材料を含む。このような羊膜材料は、例えば哺乳動物の胎盤から直接解剖された羊膜であってもよい；固定処理または熱処理された羊膜、実質的に乾燥した（すなわち、Ｈ２Ｏが２０％未満）羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥した絨毛膜、実質的に乾燥した羊膜および絨毛膜などを含む。特定の実施形態においては、その全体が本願に組み込まれるＨａｒｉｒｉの米国出願公開第２００４／００４８７９６号公報に記載された胎盤生体材料を、ＰＲＰまたは分離された血小板と選択的な幹細胞、例えば胎盤幹細胞に添加することができる。さらに、その全体が本願に組み込まれるＨａｒｉｒｉの米国出願公開第２００８／０１８１９３５号公報に記載されている生体材料を、ＰＲＰまたは分離された血小板と選択的な幹細胞、例えば胎盤幹細胞とに添加することができる。
【００８３】
他の実施形態において、本願により提示される組成物は、ＰＲＰまたは分離された血小板と、選択的に幹細胞、例えば胎盤幹細胞とを含み、これらはヒドロゲル溶液、例えば注射に適したヒドロゲル溶液に懸濁される。このような組成物に適したヒドロゲルには、例えばＲＡＤ１６のような自己組織化ペプチドが例えば含まれる。一の実施形態においては、ＰＲＰまたは分離された血小板と選択的に幹細胞、例えば胎盤幹細胞とを含むヒドロゲル溶液を、例えば鋳型内で硬化させて、移植のためのマトリックスを形成することができる。幹細胞、例えば胎盤幹細胞を含む実施形態においては、移植前に細胞が有糸分裂的に増殖するように、このようなマトリックスを培養することもできる。特定の実施形態においては、ヒドロゲルは、例えば、共有結合、イオン結合、または水素結合を介して架橋され、水分子を捕捉してゲルを形成する三次元開格子構造を生成する有機ポリマー（天然または合成）である。ヒドロゲルを形成する材料は、例えば、イオン結合により架橋されている、アルギン酸塩およびその塩などの多糖類、ペプチド、ポリホスファジン、およびポリアクリル酸塩、またはブロックポリマー、例えば温度またはｐＨによって架橋されたポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコール  ブロックポリマーを含むものであってもよい。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルまたはマトリックスは生分解性である。
【００８４】
いくつかの実施形態において、本願に提示される組成物は、その場で重合可能なゲルを含む（例えば、米国特許出願公開２００２／００２２６７６号公報；Ａｎｓｅｔｈら、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，７８（１−３）：１９９−２０９（２００２）；Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４（２２）：３９６９−８０（２００３）を参照）。
【００８５】
いくつかの実施形態において、ポリマーは、帯電した側基を有するか水溶液、例えば、水、緩衝塩溶液、または水性アルコール溶液、またはその一価イオン塩であり、少なくとも部分的に可溶性である。カチオンと反応し得る酸性側基を有するポリマーの例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、ポリ（酢酸ビニル）およびスルホン化ポリマー、例えばスルホン化ポリスチレンである。アクリル酸またはメタクリル酸とビニルエーテルモノマーまたはポリマーとの反応によって形成された酸性側基を有するコポリマーも使用することができる。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくはフッ素化）アルコール基、フェノール性ＯＨ基および酸性ＯＨ基である。
【００８６】
特定の実施形態においては、本願に提示される組成物は、例えば、その場での注入に適した三次元フレームワークまたは足場における、ＰＲＰまたは分離された血小板と、選択的な幹細胞、例えば胎盤幹細胞とを含む。
【００８７】
このような組成物に使用することができる足場の例として、例えば、不織マット、多孔質フォーム、または自己組織化ペプチドが挙げられる。不織布マットは、例えば、グリコール酸および乳酸の合成吸収性コポリマー（例えば、ＰＧＡ／ＰＬＡ）（ＶＩＣＲＹＬ，Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ニュージャージー州）からなる繊維を用いて形成することができる。凍結乾燥または凍結乾燥（例えば、米国特許第６，３５５，６９９号公報を参照）などのプロセスによって形成され、例えばポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーからなる発泡体を、足場として使用することもできる。他に、足場は、例えば、酸化セルロースまたは酸化再生セルロースを含んでいてもよい。
【００８８】
別の実施形態において、足場は、ナノ繊維足場、例えばエレクトロスピンナノ繊維足場であるか、またはこれを含む。より具体的な実施形態においては、前記ナノ繊維足場は、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、I型コラーゲン、フッ化ビニリデンとトリフルオロエチルとのコポリマー（ＰＶＤＦ−ＴｒＦＥ）、ポリ（−カプロラクトン）、ポリ（Ｌ−乳酸−ｃｏ−ε−カプロラクトン）［Ｐ（ＬＬＡ−ＣＬ）（例えば７５：２５）および／またはポリ（３−ヒドロキシブチラート−ｃｏ−ε−ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）とI型コラーゲンとのコポリマーを含む。別のより具体的な実施形態において、前記足場は、胎盤幹細胞の軟骨細胞への分化を促進する。ナノ繊維足場、例えばエレクトロスピンされたナノ繊維足場を製造する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｘｕら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０（７）：１１６０−１１６８（２００４）；Ｘｕら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２５：８７７−８８６（２００４）；Ｍｅｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  １８（１）：８１−９４（２００７）を参照。
【００８９】
さらに別の実施形態において、本願に提示される組成物は、ＰＲＰまたは分離された血小板と、選択的に幹細胞、例えば胎盤幹細胞と、生体的に適用可能なセラミックス材料、例えばモノ−，ジ−，トリ−，α−トリ−，β−トリ−，テトラ−カルシウムアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、例えばＢＩＯＧＬＡＳＳ（登録商標）などの生物活性ガラスおよびこれらの混合物とを含む。生物的適合性を有する多孔質セラミックス材料は、現在市販されており、例えば、ＳＵＲＧＩＢＯＮＥ（登録商標）（ＣａｎＭｅｄｉｃａ  Ｃｏｒｐ．、カナダ）、ＥＮＤＯＢＯＮ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  Ｆｒａｎｃｅ、フランス）、ＣＥＲＯＳ（登録商標）（Ｍａｔｈｙｓ，ＡＧ，Ｂｅｔｔｌａｃｈ、スイス）、およびＨＥＡＬＯＳ（登録商標）（ＤｅＰｕｙ  Ｉｎｃ．，Ｒａｙｎｈａｍ、マサチューセッツ州）、ＶＩＴＯＳＳ（登録商標）、ＲＨＡＫＯＳＳ（登録商標）、およびＣＯＲＴＯＳＳ（登録商標）（Ｏｒｔｈｏｖｉｔａ，Ｍａｌｖｅｒｎ、ペンシルベニア州）などの鉱化コラーゲン骨移植製品が含まれる。フレームワークは、天然材料および／または合成材料の混合物、ブレンドまたは複合体であってもよい。
【００９０】
別の実施形態において、本願に提示される組成物は、ＰＲＰまたは分離された血小板と、選択的な幹細胞、例えば胎盤幹細胞と、例えば、生体吸収性材料、例えばＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーまたはこれらのブレンド、またはヒアルロン酸から形成されたマルチフィラメント糸からなる毛氈とを含む。
【００９１】
特定の実施形態において、本願により提示される組成物は、ＰＲＰまたは分離された血小板と、選択的な幹細胞、例えば胎盤幹細胞と、発泡体足場、例えば複合構造からなる発泡体足場とを含む。このような発泡体足場は、例えば、修復、交換、または増強されるべき体内の特定構造の部分のように有用な形状に形成することができる。いくつかの実施形態において、ＰＲＰまたは分離された血小板と選択的な幹細胞、例えば胎盤幹細胞を含む前に、フレームワークを、例えば、０．１Ｍ酢酸で処理し、続いてポリリジン、ＰＢＳおよび／またはコラーゲン中で培養して、細胞の付着を促進する。マトリックスの外面は、マトリックスをプラズマコーティングすることによって、あるいは、一または複数のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、網状繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、硫酸ケラチンなど）、細胞マトリックスおよび／または他の物質、例えば、ゼラチン、アルギネート、寒天、アガロースおよび植物ガムなどが挙げられるが、これらに限定されないものによって、例えば、細胞の付着または成長、および必要に応じて、組織の区別が改善されるように修飾される。
【００９２】
いくつかの実施形態において、足場は、非血栓とする材料を含むか、またはこれによって処理されている。これらの処理および材料は、また、内皮増殖、移動、および細胞外マトリックス沈着を促進および維持し得る。これらの材料および処理の例として、ラミニンおよびIV型コラーゲンなどの基底膜タンパク質、ＥＰＴＥＥなどの合成材料、ＰＵＲＳＰＡＮ（商標）（Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、カナダ）などのセグメント化ポリウレタン尿素シリコーンが含まれる。足場は、また、ヘパリンなどの抗血栓剤を含むことができる。骨格は、胎盤幹細胞を播種する前に表面電荷（例えば、血漿によるコーティング）を変化させるために処理しておくことも可能である。
【００９３】
いくつかの実施形態において、本願により提供される組成物のＰＲＰは、自己ＰＲＰである。いくつかの実施形態において、組成物の血小板は自己血小板である。いくつかの実施形態において、本願により提供される組成物のＰＲＰは、同種ＰＲＰである。いくつかの実施形態において、組成物の血小板は同種血小板である。本願により提供される組成物は、多血小板血漿と組み合わせた胎盤幹細胞であって、それを必要とする個体への組成物の投与は、多血小板血漿と組み合わせていない胎盤幹細胞の投与と比較して、注射または移植の部位において胎盤幹細胞の局在が長期化する。特定の実施形態において、胎盤幹細胞はヒトである。他の実施形態において、多血小板血漿はヒトであり、例えば、ヒトの供給源から得られる、またはそれに由来する。他の実施形態において、胎盤幹細胞およびＰＲＰが共にヒトである。
種々の実施形態において、多血小板血漿に対する胎盤幹細胞の容積比は、約１０：１から１:１０の間であればよい。
【００９４】
他の実施形態において、多血小板血漿と組み合わせた胎盤幹細胞を含む前記組成物の移植は、多血小板血漿と組み合わせていない胎盤幹細胞の移植と比較して、移植後少なくとも１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０日または２１日後において、注射または移植部位において胎盤幹細胞の局在が長期化する。別のより具体的な実施形態においては、多血小板血漿と組み合わせた胎盤幹細胞を含む前記組成物は、移植後少なくとも２１日またはそれ以上に亘って、注射または移植部位において胎盤幹細胞の局在が長期化させる。特定の実施形態においては、多血小板血漿と組み合わされた胎盤幹細胞を含む前記組成物は、移植後少なくとも２５，３０，３５，４０，４５，５０，５５週間または１年あるいはそれ以上に亘って、注射または移植部位において胎盤幹細胞の局在が長期化する。
【００９５】
４．３．医薬組成物
本願に記載のようにして得られたＰＲＰまたは分離された血小板と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も本願により提供される。さらに、ＰＲＰまたは分離された血小板と、選択的に幹細胞、例えば胎盤幹細胞と、本願に記載の組成物の組み合わせと、薬学的に許容される担体とを含む組成物の医薬組成物も本願により提示される。
一の実施形態において、例えば、本願に記載のようにして得られたＰＲＰまたは分離された血小板は、薬学的に許容される担体を含む注射可能剤（例えば、その全体が参照により本願に組み入れられるＷＯ９６／３９１０１号公報を参照）として配合してもよい。一の実施形態において、例えば、本願に記載のようにして得られたＰＲＰまたは分離された血小板を含む本願により提示される組成物は、注射可能なものとして配合してもよい（例えば、ＷＯ９６／３９１０１号公報参照）。別の実施形態において、本願により提示される組成物は、例えば、米国特許第５，７０９，８５４号公報、米国特許第５，５１６，５３２４号公報、米国特許第５，６５４，３８１号公報に記載されているような重合性または架橋性ヒドロゲルと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を用いて配合してもよい。
【００９６】
一の実施形態において、本願により提示される組成物の各成分、例えばＰＲＰまたは分離された血小板および幹細胞、例えば胎盤幹細胞は、使用前、例えば個体への投与前に、生体内で本願に記載されるような組成物を生成するために連続的または共に投与される組成物を含む。各成分は、別個の容器、例えば１つのバッグ（例えば、Ｂａｘｔｅｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｅｄｃｅｐ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｔｅｒｕｍｏなどの血液保存バッグ）または別個の注射器内で保存および／または使用してもよく、これには単一型の細胞または細胞集団が含まれる。特定の実施形態においては、ＰＲＰまたは分離された血小板が一のバッグに収容され、胎盤幹細胞、例えば胎盤灌流液または胎盤灌流液由来の胎盤幹細胞が別のバッグに収容される。
【００９７】
特定の実施形態においては、医薬組成物は、細胞分化を誘導する一以上の薬剤を含んでもよい。ある実施形態において、分化を誘導する薬剤は、Ｃａ２＋、ＥＦＧ、αーＦＧＦ、βーＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ＴＧＦ−β、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ、ＴＦＮ）、レチノイン酸、トランスフェリンホルモン（例えば、アンドロゲン、エストロゲン、インスリン、プロラクチン、トリヨードチロキシン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン）、酪酸ナトリウム、ＴＰＡ、ＤＭＳＯ、ＮＭＦ、ＤＭＦ、マトリックス要素（例えば、コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標））、またはこれらの組み合わせを、限定されるものではないが含む。
【００９８】
別の実施形態において、医薬組成物は、細胞分化を抑制する一または複数の薬剤を含んでいてもよい。特定の実施形態において、分化を抑制する薬剤は、ヒトＤｅｌｔａ−１およびヒトＳｅｒｒａｔｅ−１ポリペプチド（Ｓａｋａｎｏら、米国特許第６，３３７，３８７号公報を参照）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、幹細胞因子、またはこれらの組み合わせを、限定されるものではないが含む。
本願により提供される医薬組成物は、例えば、個体へＴＢＦ−αの活性を調節する化合物を投与する前に適用してもよい。このような化合物は、例えば、米国特許出願公開第２００３／０２３５９０９号公報に詳細に開示されており、その開示全体が本願に組み込まれる。
【００９９】
４．４  血小板と血小板の豊富なプラセボを使用する方法
特定の態様において、本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板および組成物は、個体における疾患、障害または医学的状態を治療する際に有用である。例えば、ＰＲＰ、分離された血小板または本願により提供される組成物を、創傷治癒を必要とする個体に投与することを含む、創傷治癒を促進する方法が本願により提供される。別の例においては、本願により提供される組成物を、組織または器官の修復または再生を必要とする個体に投与することを含む、組織または器官の修復または再生の促進を促進する方法が本願により提供される。特定の実施形態においては、本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物を、骨の修復または再生を必要とする個体に投与することを含む、骨の修復または再生の方法が本願により提供される。
【０１００】
一の実施形態において、本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物を、創傷治癒を必要とする個体に投与することを含む、創傷治癒を促進する方法が本願により提示される。このような方法は、表皮創傷、皮膚創傷、慢性創傷、急性創傷、外傷、内傷および先天性創傷（例えば、ジストロフィー性表皮剥離水疱）を含むがこれらに限定されない創傷の治療を含む。従って、別の態様において、本願により提示される治療有効量のＰＲＰ、分離された血小板または組成物を、個体に投与することを含む、創傷を有する個体を治療する方法が本願により提示される。
【０１０１】
他の実施形態において、本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物は、創傷感染、例えば創傷感染、外科的または外傷性創傷を鎮圧する治療のために個体に投与される。このような創傷感染は、当該技術分野において公知の任意の微生物、例えば、病原体の既知の病原巣である人体内に由来、または環境に由来する創傷に感染する微生物によるものであってもよい。本願に記載の方法および組成物によって創傷における増殖が減少または防止され得る、微生物の非限定的な例は、表皮ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、ベータ溶血性連鎖球菌、大腸菌、クレブシエラおよびシュードモナス種、および、嫌気性細菌、そのなかでも、主に深部外傷性創傷のガス壊疽の原因であるクロストリジウム・ウェルチ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｅｌｃｈｉｉ）またはＣ．タータチウム（Ｃ．ｔａｒｔｉｕｍ）である。
【０１０２】
他の実施形態において、本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物は、第１度熱傷、第２度熱傷（中間層熱傷）、第３度熱傷（全層性熱傷）、創傷の感染、ドナー部位の感染、以前に移植または治癒した火傷または皮膚移植片ドナー部位からの上皮の損失、および創傷膿痂疹を含むが、これらに限定されない熱傷を治癒するために投与される。
【０１０３】
特定の実施形態において、本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物は、潰瘍、例えば、脚潰瘍の治療に使用することができる。様々な実施形態において、前記脚潰瘍は、例えば、静脈性脚潰瘍、動脈性脚潰瘍、糖尿病性脚潰瘍、褥瘡性潰瘍、または中間層皮膚移植された潰瘍あるいは創傷であってもよい。本文脈において、「脚部潰瘍の治療」には、脚部潰瘍の少なくとも一の態様を改善するために有効な量の本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物を脚部潰瘍に接触させることが含まれる。本願における「脚潰瘍の態様」には、潰瘍の大きさ、深度または面積、炎症の程度、上皮および／または中胚葉組織の内殖、癒合プロセスと相関する潰瘍組織内の遺伝子発現など、および、患者の健康、改善の知覚、潰瘍に伴う痛みまたは不快感の知覚、治療が成功するという患者の知覚などの主観的に測定可能なパラメータが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０４】
特定の実施形態において、本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物を静脈性脚部潰瘍の少なくとも一の態様を改善するために有効になるように投与する方法が本願により提供される。静脈うっ血潰瘍または静脈不全潰瘍（慢性または非治癒性創傷の一種）としても知られている静脈脚潰瘍は、米国で広く流行しており、およそ約７００万人が罹患している。全世界では、１〜３％の人が静脈脚潰瘍に罹患していると推定されている。全脚潰瘍のうち約７０％が静脈性潰瘍である。静脈脚潰瘍は、しばしば、脚の遠位３分の１の範囲に位置し、典型的には脚の内側に位置する。潰瘍は、感染しない限り通常は痛みがない。静脈脚潰瘍は、典型的には、表在静脈と深静脈とを接続する弁が適切に機能しないために生じる。この弁が故障すると、血液が深静脈から表在静脈に流れ出る。この不適切な流れは、重力の影響にもよって、下肢組織の腫脹および損傷を引き起こす。
【０１０５】
静脈脚潰瘍に罹患している患者は、しばしば深部静脈血栓症、脚傷害、肥満、静脈炎、以前の静脈手術、および長期間立つ必要がある生活習慣を履歴として有する。静脈脚潰瘍の慢性化には、不十分な循環を含む他の要因が関与し得る。これは、動脈硬化症；アテローム性動脈硬化症に関連した、または関連しない凝固および循環の障害；糖尿病；腎（腎臓）不全；高血圧（治療済みまたは未治療）；リンパ浮腫（脚または足に腫脹を引き起こす液体の蓄積）；血管炎、ループス、強皮症または他のリウマチ状態などの炎症性疾患；高コレステロール、心臓病、高血圧、鎌状赤血球貧血症、または腸障害などの医学的状態；喫煙歴（現在または過去）；長時間に亘って同じ位置に横たわることによって引き起こされる圧力；遺伝学（静脈疾患の素因）；悪性腫瘍（腫瘍または癌性腫瘤）；感染症；ある種の薬によってしばしば引き起こされる。
【０１０６】
従って、別の実施形態において、静脈脚の少なくとも一の態様を改善するのに十分な量の、本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物を静脈脚と接触させることを含む静脈脚潰瘍を治療する方法が本願により提供される。別の特定の実施形態において、本方法は、さらに静脈脚潰瘍の根底にある原因を治療することを含む。
【０１０７】
本願により提供される静脈脚潰瘍を治療する方法は、さらに、治療に有効な量の本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物を、静脈脚の治療の過程において一または複数の療法または治療と共に投与することを含む。一または複数の追加の療法を、本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物の投与前、同時、または投与後に使用してもよい。いくつかの実施形態において、一または複数の追加の治療には、浮腫または腫脹を小さくするための脚を圧迫することが含まれる。いくつかの実施形態において、圧迫治療には、治療用圧迫ストッキング、多層圧迫包帯を着用すること、またはＡＣＥ包帯または手当て用品を、つま先または足から膝の下の領域に巻き付けることが含まれる。
【０１０８】
動脈脚潰瘍は、しばしばアテローム性動脈硬化症を原因として、下肢に血液を送達する一または複数の動脈の機能不全によって生じる。動脈性潰瘍は、通常、足、特にかかとまたはつま先に見られ、潰瘍の境界はまるで「打ち抜かれた（ｐｕｎｃｈｅｄ  ｏｕｔ）」ように見える。動脈性潰瘍はしばしば痛みを伴う。この痛みは、より多くの血液が重力によって脚に流入するように足を床の上に降ろすと緩和される。動脈性潰瘍は、通常、冷たい白色または青みがかった光沢のある足と関連付けられる。
【０１０９】
動脈脚潰瘍の治療は、圧迫は既に不十分な血液の供給を悪化させるおそれがあるので、圧迫が禁忌であるという点で静脈脚潰瘍の治療とは対照的であり、全く示されていない場合、デブリードマン（創傷清拭く）は制限される。従って、別の実施形態においては、動脈脚潰瘍の根底にある原因、例えば動脈硬化症を治療すること、および、動脈脚潰瘍の少なくとも一の態様を改善するために十分な量の、本願により提供されるＰＲＰ量、分離された血小板または組成物を動脈脚潰瘍に接触させることを含む動脈脚潰瘍の治療方法が本願により提供される。特定の実施形態において、治療方法には、圧迫療法は含まれない。
【０１１０】
糖尿病性足部潰瘍は、糖尿病の合併症の結果として生じる潰瘍である。糖尿病性潰瘍は、典型的には、小動脈閉塞と神経損傷との組み合わせによって生じ、神経障害および圧迫の影響を受ける他の領域で生じるが、足で生じるのが最も一般的である。糖尿病性潰瘍は、動脈性潰瘍と類似した特徴を有するが、かかと、土踏まず部、足の先端、つま先の間、または骨ばった隆起部がベッドシート、靴下または靴にこすれるような圧力点に位置する傾向がある。
【０１１１】
糖尿病性脚潰瘍の治療は、一般的には圧迫しないが、概して静脈脚潰瘍の治療と同様である。さらに、根底の原因である糖尿病を治療または管理する。従って、別の実施形態において、根底の原因である糖尿病を治療すること、および、糖尿病性脚部潰瘍の少なくとも一の態様を改善するのに十分な量の、本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物を糖尿病性脚部潰瘍に接触させることを含む、糖尿病性脚潰瘍を処置する方法が本願により提供される。
【０１１２】
一般的に褥瘡または圧迫潰瘍と呼ばれる褥瘡潰瘍は、圧力がその領域に吸収されて数時間後に消失する、非常に穏やかなピンク色の色調の皮膚から、骨にまで及ぶ非常に深い傷までの範囲にわたり得る。褥瘡潰瘍は、局所的な圧迫の影響により皮膚の損失を被る四肢麻痺および下肢麻痺など、長時間の安静を伴う患者に頻繁に生じる。結果として生じる圧痛は、皮膚浸食および表皮および皮膚付属物の喪失を示す。褥瘡潰瘍の発症に関連することが知られている要因には、高齢、静止、不十分な栄養、および失禁が含まれる。ステージ１の褥瘡潰瘍は、無傷の皮膚に消失しない紅斑を示す。ステージ２の褥瘡潰瘍は、表在性または部分的な厚さの皮膚損失を示す。ステージ３の褥瘡潰瘍は、皮下損傷を伴う全厚の皮膚損失を示す。潰瘍は、下にある筋膜にまで広がり、深い裂け目として現れる。最後に、ステージ４の褥瘡潰瘍は、広範な破壊、組織壊死、および下にある筋肉、骨、腱または関節包への損傷を伴う全層皮膚喪失を示す。従って、別の実施形態において、根底にある糖尿病を治療すること、および、脚部褥瘡の少なくとも一の態様を改善するために十分な量の、本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物を足部褥瘡に接触させることを含む、脚部褥瘡の治療方法が本願により提供される。
【０１１３】
また、脚潰瘍を治療する過程において使用される一または複数の療法または治療と組み合わせて、胎盤幹細胞および多血小板血漿を含む組成物を投与することによって脚潰瘍を治療する方法が、本願により提供される。一または複数の追加の療法を、本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物の投与前、同時、または投与後に使用してもよい。本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物を単独で使用、または、一または複数の追加の療法を単独で使用しても、脚潰瘍の一または複数の態様の改善、維持、または悪化を軽減するには不十分である場合には、本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物、および、一または複数の追加の治療を使用してもよい。
【０１１４】
特定の実施形態において、一または複数の追加の治療は、限定されないが、創傷治癒剤（例えばＰＤＧＦ、ＰＥＧＲＡＮＥＸ（登録商標））による脚潰瘍の治療；抗炎症性化合物の投与；鎮痛薬の投与；抗生物質の投与；抗血小板剤または抗凝固剤の投与；補綴物（例えば、湿った状態の包帯（moist to moist dressing）、ヒドロゲル／ハイドロコロイド、アルギン酸塩包帯、コラーゲンを基剤とする創傷包帯、抗菌包帯、複合包帯；合成皮膚代替物など）の塗布などが挙げられる。別の実施形態においては、追加の治療は、脚の潰瘍を蜂蜜と接触させることを含む。上記実施形態のいずれかにおいて、特定の実施形態では、脚潰瘍は、静脈性脚潰瘍、褥瘡潰瘍、糖尿病性潰瘍または動脈性脚潰瘍である。
【０１１５】
別の特定の実施形態において、追加の治療は鎮痛薬である。従って、本願において、また本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物を脚潰瘍に接触させること、および、脚潰瘍の痛みを軽減または除去するために鎮痛薬を投与することを含む、特定の実施形態において、鎮痛薬は、局所鎮痛薬である。
【０１１６】
別の具体的な実施形態において、追加の治療は抗感染薬である。一の実施形態において、抗感染剤は、脚部潰瘍の周囲および下にある健康な組織に対して細胞傷害性を有しない。従って、ヨウ素および漂白剤のような化合物は好ましくない。従って、一の実施形態において、脚潰瘍の治療は、本願によりで提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物を脚潰瘍と接触させること、および、抗感染剤を投与することを含む。抗感染剤は、局所、経口、頬、静脈、筋肉、肛門などの任意の経路で投与すればよい。特定の例において、抗感染薬は、抗生物質、静菌薬、抗ウイルス化合物、ウイルス抑止薬、抗真菌化合物、静真菌薬または抗菌化合物である。 別の特定の実施形態においては、抗感染剤は銀イオンである。特定の実施形態においては、銀イオンはヒドロゲル内に含まれる。 特定の実施形態において、脚潰瘍は、静脈性脚潰瘍、動脈性脚潰瘍、褥瘡潰瘍または糖尿病性潰瘍である。
【０１１７】
本願に記載の治療方法の別の特定の実施形態において、本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物は、骨欠損、椎間板ヘルニアおよび変性椎間板疾患を含むがこれらに限定はされない整形外科的欠陥の治療に使用される。従って、別の態様において、治療的に有効な量の、本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物を個体に投与することを含む、骨欠損、椎間板ヘルニアまたは変性椎間板疾患を罹患する個体を治療する方法が本願により提供される。
【０１１８】
特定の態様において、被験者の骨欠損を治療するために十分なように、移植可能または注射可能な本願に記載の組成物を治療に有効な量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、被験者の骨欠損を治療する方法が本願により提供される。特定の実施形態においては、骨欠損は、例えば融合が必要な、癌、骨折、または脊椎に関連する溶骨性病変である。特定の実施形態においては、溶骨性病変は、多発性骨髄腫、骨癌または転移性癌に関連する。特定の実施形態においては、移植可能な組成物が被験者に投与される。特定の実施形態においては、移植可能な組成物が、例えば骨欠損の部位に外科的に移植される。特定の実施形態においては、注射可能な組成物が被験者に投与される。特定の実施形態においては、注射可能な組成物は、骨欠損の領域に外科的に投与される。
【０１１９】
特に、本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物の投与を含む、ヘルニア化した椎間板および退行性椎間板疾患の治療方法が、本願により提示される。いくつかの実施形態において、変性椎間板疾患は、脊柱のＸ線検査またはＭＲＩスキャンにおいて、隣接する椎骨間の正常な「椎間板空間」の狭小化として特徴付けられる。
【０１２０】
医学的には脊椎症と呼ばれる椎間板変性は、体の軟骨の水分およびタンパク質の含量が変化する年齢で起こり得る。この変化によって、軟骨は、弱く、脆く、薄くなる。椎骨（椎間関節）を積み重ねる椎間板および関節は共に、部分的に軟骨で構成されているため、これらの領域は、変性変化を受け、椎間板組織がヘルニア化する。椎骨間の椎間板の漸進的な変性は、変性椎間板疾患と呼ばれる。椎間板の変性は、患部に局所的な痛み、例えば、神経根障害、すなわち椎骨間の椎間板の損傷によって引き起こされる神経刺激をもたらす可能性がある。特に、外側リングの弱体化は、椎間板の膨隆およびヘルニアにつながる。その結果、椎間板の中央の軟らかい部分は、椎間板の外側リングを通って破裂し、脊柱に出て脊髄またはその神経に当接することがある。
【０１２１】
脊椎は、どのようなレベルにおいても、椎間板の変性によって影響され得る。従って、いくつかの実施形態において、本願により提供される方法によって治療可能な変性椎間板疾患は、頸椎椎間板疾患、すなわち、腕のチクチク（ヒリヒリ）する痛みをしばしば伴う刺痛感を伴って頸部の脊柱に影響を及ぼす椎間板変性である。いくつかの実施形態において、変性椎間板疾患は、胸部椎間板疾患、すなわち、背中中央部（mid-back）に影響を及ぼす椎間板変性である。いくつかの実施形態において、変性椎間板疾患は、腰痛、すなわち、腰椎に影響を及ぼす椎間板変性である。
【０１２２】
特定の実施形態においては、被験者の変性椎間板疾患を治療する方法は、被験体において子宮頚部または腰部の根神経障害を治療するのに十分なように、治療に有効な量の、本願に記載の移植可能または注射可能な組成物を必要とする被験者に投与することを含む。いくつかの実施形態において、腰部神経根障害には、膀胱および／または腸の失禁が伴う。いくつかの実施形態において、被験者の変性椎間板疾患を治療する方法は、被験者における坐骨神経痛を緩和するのに十分なように、治療に有効な量の、本願に記載の移植可能または注射可能な組成物を投与することを含む。
【０１２３】
本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物を用いて個体における椎間板変性を治療する方法のいくつかの実施形態においては、個体の椎間板変性は、Ｃ１とＣ２の間、Ｃ２とＣ３の間、Ｃ３とＣ４との間、Ｃ４とＣ５の間、Ｃ５とＣ６の間、Ｃ６とＣ７の間、Ｃ７とＴ１の間、Ｔ１とＴ２の間、Ｔ２とＴ３の間、Ｔ３とＴ４の間。Ｔ４とＴ５の間、Ｔ５とＴ６の間、Ｔ６とＴ７の間、Ｔ７とＴ８の間、Ｔ８とＴ９の間、Ｔ９とＴ１０の間、Ｔ１０とＴ１１の間、Ｔ１１とＴ１２の間、Ｔ１２とＬ１の間、Ｌ１とＬ２の間、Ｌ２とＬ３の間、Ｌ３とＬ４の間、またはＬ４とＬ５の間の椎間板で生じる。
【０１２４】
本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物を用いて個体における椎間板変性を治療する方法のいくつかの実施形態においては、椎間板ヘルニアは、Ｃ１とＣ２の間、Ｃ２とＣ３の間、Ｃ３とＣ４との間、Ｃ４とＣ５の間、Ｃ５とＣ６の間、Ｃ６とＣ７の間、Ｃ７とＴ１の間、Ｔ１とＴ２の間、Ｔ２とＴ３の間、Ｔ３とＴ４の間。Ｔ４とＴ５の間、Ｔ５とＴ６の間、Ｔ６とＴ７の間、Ｔ７とＴ８の間、Ｔ８とＴ９の間、Ｔ９とＴ１０の間、Ｔ１０とＴ１１の間、Ｔ１１とＴ１２の間、Ｔ１２とＬ１の間、Ｌ１とＬ２の間、Ｌ２とＬ３の間、Ｌ３とＬ４の間、またはＬ４とＬ５の間の椎間板で生じる。
【０１２５】
椎間関節の変性関節炎（変形性関節症）もまた、単純Ｘ線検査で検出することができる限局性腰痛の原因である。椎間関節軟骨の摩耗および隣接する関節の骨の変化は、変性椎間関節疾患または脊椎の変形性関節症と呼ばれる。
【０１２６】
本願により提供される変形性椎間板疾患を治療する方法は、変形性椎間板疾患を治療する過程において使用される一または複数の療法または治療と共に、治療に有効な量の、本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物をさらに投与することを含む。一または複数の治療を、本願により提供されるＰＲＰ、分離された血小板または組成物の投与前、同時、または投与後に用いてもよい。いくつかの実施形態において、一または複数の追加の治療は、痛みおよび筋肉痙攣を緩和するための薬剤の投与、脊髄周囲へのコルチゾン注射（硬膜外注射）、物理療法（熱、マッサージ、超音波、電気刺激）および安静（ベッドでの安静に限らず、再度の傷の発生の抑制を含む）を含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、一または複数の追加の治療は、例えば、患者が苦しい痛み、重度の機能障害、または失禁（脊髄刺激を示す可能性がある）を伴う場合に、手術的な介入を含む。いくつかの実施形態において、手術的な介入には、穿刺椎間板切除（脊髄を取り囲む脊椎の骨に小さな穴を生成する）、椎弓切除（神経組織に隣接する骨壁の除去）、皮膚を介して針技術（経皮的椎間板切除術）、椎間板溶解手順（化学的髄核分解）などが含まれる。
【０１２８】
同等物
本願に開示された組成物および方法は、本願に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。本願に実際に記載されたものに加えて、組成物および方法の様々な改変は、上記の説明および添付の図面から当業者には明らかであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲に記載の請求項に係る発明の範囲内に入ることが意図される。
【０１２９】
様々な刊行物、特許公報および特許出願公報が本願に引用されており、これらの開示全体が参考と本願に組み込まれる。
【国際調査報告】
2018504395.tif 000002
2018504395.tif 000003