(57)【要約】  本発明は、深海熱水環境由来の中温性海洋細菌によって分泌される海洋天然菌体外多糖から調製される低分子量（１５ｋＤａ）過硫酸化菌体外多糖（ＧＹＳ１５）を提供し、また、転移形成の予防又は阻害のための、この低分子量過硫酸化菌体外多糖の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における転移形成の予防又は阻害における使用のための１５ｋＤａの過硫酸化菌体外多糖であって、前記１５ｋＤａの過硫酸化菌体外多糖は、以下の工程：
（ａ）５，０００〜１００，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する解重合ＥＰＳを得るための、アルテロモナス属のＧＹ７８５株由来の海洋天然菌体外多糖（ＥＰＳ）のフリーラジカル解重合化からなる工程；
（ｂ）過硫酸化解重合ＥＰＳを得るための解重合ＥＰＳの硫酸化からなる後続の工程であって、解重合ＥＰＳに、過硫酸化解重合ＥＰＳの総重量に対して１０重量％〜４５重量％の間の硫酸基置換度を有する硫酸化多糖を得るのに十分な量の少なくとも１種の硫酸化剤を添加することを含む、後続の工程；及び
（ｃ）過硫酸化解重合ＥＰＳから１５ｋＤａの過硫酸化菌体外多糖（ＧＹＳ１５）を単離することからなる後続の工程
を含む方法によって得られる、１５ｋＤａの過硫酸化菌体外多糖。
【請求項２】
過硫酸化解重合ＥＰＳからＧＹＳ１５を単離する工程が、分画、特に、サイズ排除クロマトグラフィーによって行われる分画によって行われる、請求項１に記載の使用のための１５ｋＤａの過硫酸化菌体外多糖。
【請求項３】
対象が、がん患者である、請求項１又は請求項２に記載の使用のための１５ｋＤａの過硫酸化菌体外多糖。
【請求項４】
がん患者が、がんを患っているか、又は以前にがんの治療を受けている、請求項３に記載の使用のための１５ｋＤａの過硫酸化菌体外多糖。
【請求項５】
がんを患っているがん患者が、がんの治療中である、請求項４に記載の使用のための１５ｋＤａの過硫酸化菌体外多糖。
【請求項６】
がんが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病からなる群より選択される、請求項３〜５のいずれか１項に記載の使用のための１５ｋＤａの過硫酸化菌体外多糖。
【請求項７】
がんが、骨がん、肺がん、肝臓がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、子宮がん、性器及び生殖器の癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、膀胱がん、腎臓がん、腎細胞癌、腎う癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、神経外胚葉性がん、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、及び下垂体腺腫からなる群より選択される、請求項３〜６のいずれか１項に記載の使用のための１５ｋＤａの過硫酸化菌体外多糖。
【請求項８】
がんが、骨癌である、請求項３〜６のいずれか１項に記載の使用のための１５ｋＤａの過硫酸化菌体外多糖。
【請求項９】
対象における転移形成の予防又は阻害における使用のための、治療有効量の請求項１又は請求項２に規定される１５ｋＤａの過硫酸化菌体外多糖と、少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１０】
対象が、がん患者である、請求項９に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１１】
がん患者が、がんを患っているか、がんに罹患し易いか、又は以前にがんの治療を受けている、請求項１０に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１２】
がんを患っているがん患者が、がんの治療中である、請求項１０又は請求項１１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１３】
がんが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病からなる群より選択される、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１４】
がんが、骨がん、肺がん、肝臓がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、子宮がん、性器及び生殖器の癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、膀胱がん、腎臓がん、腎細胞癌、腎う癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、神経外胚葉性がん、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、及び下垂体腺腫からなる群より選択される、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１５】
がんが、骨癌である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連特許出願）
本出願は、２０１５年９月２８日に出願された欧州特許出願第１５１８７１０７号に基づく優先権を主張する。該欧州特許出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
骨肉腫は、主に若年で発生する最も頻度の高い悪性原発性骨腫瘍であり、１８歳で発生率のピークが観察される。近年の化学療法及び手術の改善にもかかわらず、化学療法に対する非応答性の問題が残っており、この予後不良には、全体的な生存率を改善するための新しい治療戦略が必要である。骨肉腫は、高い転移形成能を特徴とし、これは主要な死因である（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００３】
近年の研究は、新しい治療戦略を同定するのに役立つ可能性のある転移発生の分子機構を記載している（非特許文献３）。炭水化物、特にヘパリン又はヘパラン硫酸は、現在、がんを処置するための、特にがんの転移を処置するための優れた候補と考えられている。しかしながら、これらは両方とも抗凝固活性を示し、そのため有害な出血性合併症を誘発する可能性があるため、その治療用途は限られている。ヘパリン及びヘパラン硫酸の別の欠点は、それらが動物起源であることであり、このことは未知の異種間混入のリスクを高める可能性がある（非特許文献４；非特許文献５）。その結果として、ヘパリン類似物質の治療可能性の探索が現在急発展している。ホスホマンノペンタオース及びＰＩ−８８と名付けられたホスホマンノテトラオースの硫酸化形態（非特許文献６）；マルトヘキソースの硫酸化形態及び硫酸化マルトトリオース（非特許文献７）などの硫酸化オリゴ糖が現在研究されている。近年、プルネラ・ブルガリス  Ｌ．（Ｐｒｕｎｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｌ．）から抽出された２つの多糖の抗肺腺癌活性が報告された（非特許文献８）。
【０００４】
近年では、多様な産業において新しい用途を有し得る新規の微生物多糖の単離及び同定に関心が高まっている。これらは、海藻、甲殻類、動物、又は植物などの他の起源由来の多糖と競合する。十分に活用されていない資源の生物工学的利用への革新的アプローチを代表する、海洋環境由来の微生物の大量培養への関心が相当増大している。硫酸化されると、異なる起源由来の多糖は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、特に、ヘパラン硫酸又はヘパリンといくつかの生物学的特性を共有し得るが、同じ出血性リスクを示すことはなく、かつ、大きな「種の壁（ｓｐｅｃｉｅｓ−ｂａｒｒｉｅｒ）」のために、プリオン又は新たなウイルスなどの非従来型の伝染性物質によって汚染されるリスクが低い（非特許文献９）。
【０００５】
深海熱水条件に関連する海洋細菌は、好気性炭水化物系培地において珍しい細胞外ポリマーを産生するその能力が実証されている。これらは、生物活性化合物を設計してその特異性を改善するために改変することができる原型の構造的特徴を示す（非特許文献１０；非特許文献１１）。特に、生物学的活性を改善する目的で、アルテロモナス・インフェルヌス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ）と名付けられた深海熱水細菌によって産生される菌体外多糖（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）（ＧＹ７８５  ＥＰＳ）の化学修飾（解重合化及び置換反応）が行われてきた。天然ＧＹ７８５  ＥＰＳの構造は報告されている（非特許文献１２）。２４ｋＤａの低分子量（ＬＭＷ）過硫酸化菌体外多糖（ＯＳ−ＥＰＳ）は、この天然ＧＹ７８５  ＥＰＳの化学修飾後に単離された。このＬＭＷ誘導体は、凝固アッセイにおいて、ヘパリンよりも低効率（１０倍）であることが見出された。活性化部分トロンボプラスチン時間では、１０μｇ／ｍｌの濃度の２４ｋＤａ  ＯＳ−ＥＰＳ及び１．５μｇ／ｍｌの濃度のヘパリンで、それぞれ同じ抗凝固効果が得られた（非特許文献１３）。
【０００６】
骨細胞の増殖及び分化は、ヘパラン硫酸によって調節される可能性のある様々な因子によって制御されている。骨生物学に対する２４ｋＤａ  ＯＳ−ＥＰＳの効果は以前に研究されている。この高度に硫酸化されたＬＭＷ誘導体（４０％の硫酸基）の効果が、１３ｋＤａの非過硫酸化ＬＷＭ  ＥＰＳ（１０％の硫酸基）の効果と比較された。観察されたデータは、ＧＡＧ又はＯＳ−ＥＰＳによる異なるレベルの骨吸収制御を示しているが、そのほとんどは吸収促進効果をもたらす（非特許文献１４）。
【０００７】
菌体外多糖の生物学的特性の改善が進歩しているにもかかわらず、当技術分野には、転移がんにおける、特に転移性骨肉腫における全体的な生存率を改善するための新たな治療戦略を提供する必要性が依然として残っている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｎｄｏら，Ｓａｒｃｏｍａ，２０１２，２０１２：５２３４３２〜５２３４３２
【非特許文献２】Ｏｄｒｉら，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１４，１４：１６９〜１７７
【非特許文献３】Ｂａｒｋａｎら，Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２０１０，４６：１１８１〜１１８８
【非特許文献４】Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら，Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７，１２０：Ｓ１０７〜Ｓ１１１
【非特許文献５】Ｖｅｌａｓｃｏら，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，２０１０，１５：５５３〜５６０
【非特許文献６】Ｆｅｒｒｏら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００１，３３２：１８３〜１８９
【非特許文献７】Ｖｉｓｍａｒａら，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１２，１７：９９１２〜９９３０
【非特許文献８】Ｆｅｎｇら，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１０，１５：５０９６〜５１０３
【非特許文献９】ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１２，９４：２９５〜３０５
【非特許文献１０】Ｒｅｈｍら，Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１０，８：５７８〜５９２
【非特許文献１１】Ｃｏｌｌｉｅｃ−Ｊｏｕａｕｌｔら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０１２，４２３〜４４９
【非特許文献１２】Ｒｏｇｅｒら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００４，３３９：２３７１〜２３８０
【非特許文献１３】Ｃｏｌｌｉｅｃ−Ｊｏｕａｕｌｔら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００１，１５２８：１４１〜１５１
【非特許文献１４】Ｖｅｌａｓｃｏら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１，２１：７８１〜７９５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属のＧＹ７８５株由来の海洋天然菌体外多糖（ＥＰＳ）から得られた低分子量過硫酸化多糖が抗転移特性を示すことを示した。実際に、インビトロ実験において、本発明者らは、先ず、骨肉腫細胞株（マウスＰＯＳ−１及びヒトＨＯＳ細胞株）に対する、異なる分子量を有する３種の低分子量過硫酸化多糖（４ｋＤ（ＧＹＳ４）、８ｋＤａ（ＧＹＳ８）、及び１５ｋＤａ（ＧＹＳ１５））の活性を、ヘパリンを基準として使用して比較した。増殖、遊走、細胞周期分析、並びに、ゼラチナーゼＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９などのマトリックスメタロプロテアーゼ並びにそれらの阻害因子ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２の骨肉腫細胞株における発現を試験した。次に、インビトロで最も興味深い特性を示したＧＹＳ１５を、骨肉腫マウスモデルにおいて、原発性悪性骨腫瘍の増殖（傍脛骨（ｐａｒａｔｉｂｉａｌ）モデル）と肺転移の形成の両方について、再度ヘパリンを基準として使用して、インビボで評価した。得られた結果は、ＧＹＳ１５がインビボで肺転移の形成を阻害するのに非常に有効であることを示した。
【００１０】
したがって、第１の態様において、本発明は、対象における転移形成の予防又は阻害における使用のための１５ｋＤａの過硫酸化菌体外多糖に関し、ここで、前記１５ｋＤａの過硫酸化菌体外多糖は、以下の工程：
（ａ）５，０００〜１００，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する解重合ＥＰＳを得るための、アルテロモナス属のＧＹ７８５株由来の海洋天然菌体外多糖（ＥＰＳ）のフリーラジカル解重合化からなる工程；
（ｂ）過硫酸化解重合ＥＰＳを得るための解重合ＥＰＳの硫酸化からなる後続の工程であって、解重合ＥＰＳに、過硫酸化解重合ＥＰＳの総重量に対して１０重量％〜４５重量％の間の硫酸基置換度を有する硫酸化多糖を得るのに十分な量の少なくとも１種の硫酸化剤を添加することを含む、後続の工程；及び
（ｃ）過硫酸化解重合ＥＰＳから１５ｋＤａの過硫酸化菌体外多糖（ＧＹＳ１５）を単離することからなる、後続の工程
を含む方法によって得られる。
【００１１】
特定の実施形態では、過硫酸化解重合ＥＰＳからＧＹＳ１５を単離する工程は、分画、特に、サイズ排除クロマトグラフィーによって行われる分画によって行われる。
【００１２】
特定の好ましい実施形態では、対象はがん患者である。がん患者は、がんを患っていても、又は以前にがんの治療を受けていてもよい。がん患者ががんを患っている場合、該がん患者はがんの治療中であってもよい。
【００１３】
患者のがんは、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病からなる群に属し得る。例えば、がんは、骨がん、肺がん、肝臓がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、子宮がん、性器及び生殖器の癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、膀胱がん、腎臓がん、腎細胞癌、腎う癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、神経外胚葉性がん、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、及び下垂体腺腫からなる群に属し得る。
【００１４】
特定の実施形態では、がんは骨癌である。
【００１５】
同じ第１の態様において、本発明は、対象における転移形成の形成を予防又は阻害するための方法であって、前記対象に治療有効量のＧＹＳ１５を投与する工程を含む、方法を提供する。
【００１６】
本発明の方法の特定の好ましい実施形態では、対象は上記のようながん患者である。
【００１７】
別の態様では、本発明は、対象における転移形成の予防又は阻害における使用のための、治療有効量のＧＹＳ１５と、少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００１８】
本発明の方法の特定の好ましい実施形態では、対象は上記のようながん患者である。
【００１９】
本発明のこれらの及び他の目的、利点、及び特徴は、以下の好ましい実施形態の詳細な説明を読んだ当業者には明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】２つの骨肉腫細胞株、マウスＰＯＳ−１細胞株及びヒトＨＯＳ細胞株に対する分子量の異なるＬＭＷ  ＯＳ−ＥＰＳ誘導体の効果の比較。（Ａ）７日間の処置後の両細胞株の増殖。（Ｂ）ＨＯＳ細胞増殖に対する、用量を増加させたＧＹＳ１５の生物学的活性のキネティクス。トリパンブルーを用いた細胞計数によって増殖アッセイを行って、群間の細胞増殖率を比較した。ＯＳ−ＥＰＳ  １５ｋＤａ（ＧＹＳ１５）、ＯＳ−ＥＰＳ  ８ｋＤａ（ＧＹＳ８）、ＯＳ−ＥＰＳ  ４ｋＤａ（ＧＹＳ４）、ヘパリン（Ｈｅｐ）、及び対照（ＣＴ）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２】異なるＬＭＷ  ＯＳ−ＥＰＳ誘導体（３００μｇ／ｍｌ）の存在下における、ヒトＨＯＳ細胞株の細胞の遊走：ＯＳ−ＥＰＳ  １５ｋＤａ（ＧＹＳ１５）、ＯＳ−ＥＰＳ  ８ｋＤａ（ＧＹＳ８）、ＯＳ−ＥＰＳ  ４ｋＤａ（ＧＹＳ４）、ヘパリン（Ｈｅｐ）、及び対照（ＣＴ）。
【図３】分子量の異なるＬＭＷ  ＯＳ−ＥＰＳ誘導体の存在下における、骨肉腫細胞株、マウスＰＯＳ−１細胞株及びヒトＨＯＳ細胞株の浸潤：２５μｇ／ｍＬのＯＳ−ＥＰＳ  １５ｋＤａ（ＧＹＳ１５）、５０μｇ／ｍＬのＯＳ−ＥＰＳ  ８ｋＤａ（ＧＹＳ８）、５０μｇ／ｍＬのＯＳ−ＥＰＳ  ４ｋＤａ（ＧＹＳ４）、５０μｇ／ｍＬのヘパリン（Ｈｅｐ）、及び対照（ＣＴ）。（Ａ）ＧＹＳ１５又はヘパリンで処置したか、又はしていない浸潤性ＨＯＳ細胞の顕微鏡写真。（Ｂ）ボイデンチャンバーを遊走する細胞を、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して５つの顕微鏡視野で計数した。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．０１。
【図４】骨肉腫細胞株の細胞周期に対するＬＭＷ  ＯＳ−ＥＰＳ  １５ｋＤａ誘導体（ＧＹＳ１５）（３００μｇ／ｍｌ）の効果。ヒトＨＯＳ細胞及びマウスＰＯＳ−１細胞の細胞周期分布を、ＧＹＳ１５による処置の２４時間又は４８時間後にフローサイトメトリーによって調べた。
【図５】ヒトＨＯＳ細胞株の細胞における、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９並びにそれらの阻害因子（ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２）の発現に対する、ＬＭＷ  ＯＳ−ＥＰＳ  １５ｋＤａ誘導体（ＧＹＳ１５）のヘパリンと比較した効果。骨肉腫細胞を５０μｇ／ｍｌの濃度のＧＹＳ１５若しくはヘパリン、又はＰＢＳ（対照）で、１時間、３時間、６時間、８時間、又は２４時間処置した。骨肉腫細胞の上清中のＭＭＰ及びそれらの阻害因子の細胞発現を、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＲＣ）によって測定した。
【図６】インビボＨＯＳ骨肉腫腫瘍増殖に対するＬＭＷ  ＯＳ−ＥＰＳ  １５ｋＤａ誘導体（ＧＹＳ１５）の効果。２２×１０６個のＨＯＳ細胞をマウスモデルの傍脛骨領域に接種した。腫瘍体積が１００ｍｍ３に達したときに、ＧＹＳ１５（毎日２ｍｇ／ｋｇ又は毎日６ｍｇ／ｋｇ）を毎日皮下注射し、そして腫瘍増殖を５日目から３５日目まで測定した。
【図７】肺転移発生率に対するＬＭＷ  ＯＳ−ＥＰＳ  １５ｋＤａ誘導体（ＧＹＳ１５）の効果。（Ａ）処置動物（ＧＹＳ１５又はヘパリン；ｓ．ｃ．毎日６ｍｇ／ｋｇ）対対照（ＰＢＳ）における百分率で表した転移発生率。（Ｂ）処置動物又は対照動物の肺組織の組織学的分析（＊転移巣）、元の倍率：×４００。（Ｃ）対照群（ＰＢＳ）と比較した処置動物（ＧＹＳ１５又はヘパリン）の生存率（％）、カプラン−マイヤー生存曲線。Ｎ＝７マウス／群；ｐ＜０．０５；ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
定義
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、がんを発症する可能性があるが、該疾患を患っていても、又は患っていなくてもよい、ヒト又は他の哺乳動物（例えば、霊長類、イヌ、ネコ、ヤギ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ等）を指す。非ヒト対象は、トランスジェニック動物であっても、又は他の方法で改変された動物であってもよい。本発明の数多くの実施形態において、対象はヒトである。そのような実施形態では、対象は、しばしば、「個体」又は「患者」と称される。これらの用語は特定の年齢を表すものではなく、したがって、新生児、小児、ティーンエイジャー、及び成人を包含する。「患者」という用語は、より具体的には、疾患を患っている個体を指す。したがって、「がん患者」という用語は、がんを患っている個体を指す。がん患者は、がんと診断されていても、又は診断されていなくてもよい。この用語はまた、以前にがんの治療を受けている個体も包含する。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、典型的には、無秩序な細胞増殖、分化不足、及び局所組織に浸潤して、転移する能力を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指すか、又は記載する。がんは、任意の器官の任意の組織に発症する可能性がある。がんの例としては、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が挙げられる。より具体的には、そのようながんの例としては、骨がん、肺がん、肝臓がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、子宮がん、性器及び生殖器の癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、膀胱がん、腎臓がん、腎細胞癌、腎う癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、神経外胚葉性がん、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、及び下垂体腺腫が挙げられる。
【００２３】
「侵襲性（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）」及び「浸潤性（ｉｎｖａｓｉｖｅ）」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。本明細書においてがんを特徴付けるために使用される場合、これらの用語は、腫瘍がその境界を越えて隣接組織中に拡大する傾向を指す。浸潤性がんは、腫瘍が特定の器官に限定されている臓器限局性がんと対比することができる。腫瘍の浸潤特性は、基質物質及び基底膜物質を分解して、腫瘍が被膜（ｃａｐｓｕｌｅ）の境界を越えて、またその腫瘍が位置する特定の組織の境界を越えて拡大できるようにする、コラゲナーゼなどのタンパク質分解酵素の生成（ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）をしばしば伴う。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「転移」という用語は、１つの器官又は組織から別の場所への腫瘍細胞の広がりを指す。該用語はまた、転移の結果として新しい位置に形成される腫瘍組織も指す。「転移がん」は、その元の、又は原発の位置から広がるがんであり、「二次がん」又は「二次腫瘍」と称される場合もある。一般に、転移性腫瘍は、それが由来する原発性腫瘍の組織に由来して命名される。腫瘍転移のプロセスは、局所浸潤及び細胞内マトリックスの破壊、血管、リンパ管、又は他の輸送チャネルへの異物侵入、循環中の生存、二次部位における血管からの管外溢出、及び新たな位置での増殖が関与する多段階事象である。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「阻害する」という用語は、何かが起きることを予防するか、何かが起こることの発生を遅延させるか、及び／又は何かが起こることの程度又は可能性を低減することを意味する。したがって、本明細書において互換可能に使用される「転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）を阻害する」、「転移（ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）を阻害する」、及び「転移の形成を阻害する」という用語は、転移の発生を予防するか、遅延させるか、及び／又はその可能性を低減すること、並びに、転移の数、増殖率、大きさ等．．．を減少させることを包含することが意図される。
【００２６】
「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、本明細書において、（１）疾患若しくは状態の発症を遅延させるか、若しくは予防すること；（２）疾患若しくは状態の症状の進行、深刻化、若しくは悪化を減速させるか、若しくは停止させること；（３）疾患若しくは状態の症状の改善をもたらすこと；又は（４）疾患若しくは状態を治癒することを目的とした方法又はプロセスを特徴付けるために使用される。処置は、治療効果を目的として、疾患又は状態の開始後に施され得る。代替的に、処置は、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）効果を目的として、疾患又は状態の発症前に施されてもよい。この場合、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語が使用される。
【００２７】
「医薬組成物」は、本明細書において、有効量の本発明の低分子量（ＬＭＷ）過硫酸化菌体外多糖誘導体（すなわち、ＯＳ−ＥＰＳ  １５ｋＤａ又はＧＹＳ１５）と、少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含むものと定義される。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、その意図された目的、例えば、細胞、組織、全身系、又は対象における所望の生物学的又は医学的応答を実現するのに十分な、化合物、薬剤、又は組成物の任意の量を指す。
【００２９】
「薬学的に許容可能な担体又は賦形剤」という用語は、有効成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、かつ、それが投与される濃度で受容者に対して過度に毒性でない担体媒体を指す。該用語は、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、及び吸収遅延剤等を包含する。医薬活性物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野においてよく知られている（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，１８ｔｈＥｄ．，１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．：Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡを参照されたい）。
【００３０】
数字に関して本明細書で使用される場合、「おおよそ」及び「約」という用語は、一般に、別段の記述がないか、又は文脈から明らかでない限り、数字のいずれかの方向（該数字より大きいか、又は小さい）に１０％の範囲内に入る数字を包含する（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
【００３１】
［特定の好ましい実施形態の詳細な説明］
上述のように、本発明は、抗転移特性を示す低分子量過硫酸化菌体外多糖誘導体（ＧＹＳ１５）、及び転移形成の予防のためのこの低分子量過硫酸化菌体外多糖誘導体の使用を提供する。
【００３２】
Ｉ−低分子量過硫酸化菌体外多糖誘導体
本発明は、ＧＹＳ１５、すなわち、アルテロモナス属（アルテロモナス・インフェルヌス）のＧＹ７８５株由来の海洋天然菌体外多糖（ＥＰＳ）から調製された、低分子量（ＬＭＷ）（１５ｋＤａ）過硫酸化菌体外多糖（ＯＳ−ＥＰＳ）の使用に関する。ＧＹ７８５株由来の海洋天然ＥＰＳは以前に記載されている（Ｇｕｅｚｅｎｎｅｃら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍ．，１９９８，３７：１９〜２４）。
【００３３】
本発明に係る海洋天然菌体外多糖から低分子量過硫酸化多糖誘導体を得るためのプロセスは、国際出願ＷＯ第２００６／００３３２号に、またＣｏｌｌｉｅｃ  Ｊｏｕａｕｌｔ  Ｓ．らによってＢｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２００１，１５２８（２〜３）：ｐ．１４１〜１５１に、またＧｕｅｚｅｎｅｃ  Ｊ．らによってＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  １９９８，３７（１）：ｐ．１９〜２４に十分に記載されている。
【００３４】
本発明の実施において、ＧＹＳ１５は、
（ａ）５，０００〜１００，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する解重合ＥＰＳを得るための、アルテロモナス属のＧＹ７８５株由来の海洋天然菌体外多糖（ＥＰＳ）のフリーラジカル解重合化からなる工程；
（ｂ）過硫酸化解重合ＥＰＳを得るための解重合ＥＰＳの硫酸化からなる後続の工程であって、解重合ＥＰＳに、過硫酸化解重合ＥＰＳの総重量に対して１０重量％〜４５重量％の間の硫酸基置換度を有する硫酸化多糖を得るのに十分な量の少なくとも１種の硫酸化剤を添加することを含む、後続の工程；及び
（ｃ）過硫酸化解重合ＥＰＳから１５ｋＤａの過硫酸化菌体外多糖（ＧＹＳ１５）を単離することからなる後続の工程
を含む方法を使用して調製される。
【００３５】
特定の実施形態では、工程（ａ）後に得られる解重合誘導体は凍結乾燥される。
【００３６】
他の実施形態では、プロセスの工程（ｂ）に透析工程が続く。
【００３７】
第１の解重合化工程の際、天然ＥＰＳは、液体の形態で、すなわち細菌によって培養培地中に分泌されたままの状態で、使用することができる。好ましくは、培養培地を遠心分離し、そして天然ＥＰＳを含有し、かつ細菌のデブリを含まない上清のみを収集する。天然ＥＰＳは、例えば膜限外ろ過などの当業者に知られている任意の好適な技術によって収集することができ、次いで、場合により、そのままの状態で又は付加塩の形態で凍結乾燥することができる。
【００３８】
天然ＥＰＳのフリーラジカル解重合化からなる工程は、好ましくは、天然ＥＰＳを含む反応混合物に、好ましくは金属触媒の存在下で、酸化剤の溶液を添加することによって行われる。酸化剤は、好ましくは、過酸化物、特に過酸化水素、並びに過酸、特に過酢酸及び３−クロロ過安息香酸から選択される。添加は、好ましくは、連続的にかつ撹拌しながら、３０分〜１０時間の間の期間行われる。反応混合物は、好ましくは、フリーラジカル解重合化反応の持続期間を通して、例えば水酸化ナトリウムなどの塩基性化剤の添加によって６〜８の間のｐＨに、かつおおよそ３０℃〜７０℃の間の温度に維持される。
【００３９】
本発明の特定の実施形態によれば、この工程では、天然ＥＰＳは、反応混合物中に、反応混合物の約２ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で存在する。
【００４０】
好ましい実施形態では、酸化剤は、好ましくは約０．１重量％〜約０．５重量％の間、好ましくは０．１重量％〜０．２重量％程度の濃度を有する過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の溶液であり、そしてＶｌ／１０００〜Ｖｌ／１０ｍｌ／分、好ましくはＶ１／５０〜Ｖ１／５００ｍｌ／分、より好ましくはＶ１／１００ｍｌ／分程度の流速で添加され、ここで、Ｖ１は、過酸化水素の溶液が添加される海洋菌体外多糖（ＥＰＳ）を含有する反応媒体の体積である。
【００４１】
解重合化工程の際に使用することができる金属触媒は、特許出願ＥＰ第０２２１９７７号に具体的に記載されているように、好ましくはＣｕ＋＋、Ｆｅ＋＋、及びＣｒ＋＋＋イオン、並びにＣｒ２Ｏ７２−アニオンから選択される。特定の実施形態によれば、金属触媒は、反応混合物中に、約１０−３Ｍ〜１０−１Ｍの間の濃度で、好ましくは約０．００１Ｍ〜約０．０５Ｍの間の濃度で存在する。
【００４２】
本発明に係る上記のようなフリーラジカル解重合化プロセスによって、単一工程で、かつ良好な収率で、均一な低分子量多糖誘導体を得ることが可能になる。本発明の文脈において、「均一な誘導体」という用語は、高速サイズ排除クロマトグラフィーを使用して評価した場合に、多分散指数Ｉ（Ｍｗ／Ｍｎ）＜５（式中、Ｍｗは重量平均分子量であり、Ｍｎは数平均分子量である）によって特徴付けられる、サイズに関して均一な多糖鎖の集団が優勢であることを表す単一の主ピークを示す誘導体を意味することが意図される。
【００４３】
特定の実施形態では、解重合化反応が終了したときに、得られた多糖誘導体は、その還元末端が非常に反応性である鎖を安定化するために、また特には「剥離」反応による鎖の加水分解を回避するために、還元剤を使用して還元される。この趣旨で使用することができる還元剤の性質は重要ではない。具体的には、還元剤は水素化ホウ素ナトリウムであり得る。
【００４４】
解重合化工程において使用される金属触媒は、任意の好適な方法を使用して、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、好ましくは、予め不動態化された弱カチオン交換樹脂によって、又はＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を用いた処理によって、解重合化反応終了時に（又は、還元工程が行われる場合には、還元反応終了時に）除去することができる。
【００４５】
解重合化及び／又は還元から生じる多糖誘導体は、必要であれば、例えば膜限外ろ過又は透析などの当業者によく知られている任意の好適な技術によって回収することができる。次に、それらを凍結乾燥し、そしてサイズ排除クロマトグラフィーによって分画して、後続の硫酸化工程を改善するのに必要とされる純度を高める。最後に、精製した多糖誘導体は、例えば、ピリジン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、水酸化テトラブチルアンモニウム、及び水酸化ナトリウムから選択され得る弱又は強塩基の添加によって塩形態に調整される。この凍結乾燥塩は、例えば、例えばＤＯＷＥＸ（登録商標）の名称でＤｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社によって販売されているものなどのイオン交換樹脂カラムにおける、１〜８ｍｇ／ｍｌの間の濃度の多糖誘導体の水溶液の溶出によって調製され得る。溶出液は、ｐＨが酸性、例えば５未満である間、収集され、続いてｐＨが、上に規定した所望の塩基を用いておおよそ６．５に調整される。次いで、塩の形態の多糖誘導体が、限外ろ過及び凍結乾燥される。
【００４６】
付加塩の形態にあることもある凍結乾燥多糖誘導体は、好ましくは、硫酸化工程の開始時に無水溶媒に溶解される。溶媒は、好ましくは、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミド、及びそれらの混合物から選択される。無水溶媒中に存在する多糖誘導体の量は、おおよそ１〜１０ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの間であってよく、さらに好ましくはこの量は約２．５ｍｇ／ｍｌである。ＥＰＳの無水溶媒への溶解は、好ましくは、撹拌しながら、周囲温度で約１時間〜約２時間、そして次に４０℃〜５０℃の間の温度で、好ましくは約４５℃の温度で約２時間、モレキュラーシーブを用いてアルゴン又は窒素下で行われる。
【００４７】
硫酸化工程の際に使用される１又は複数の化学的硫酸化剤を、凍結乾燥形態にあるか又は溶液の形態にある解重合及び／又は還元ＥＰＳに添加することができる。
【００４８】
硫酸化剤は、好ましくは、ピリジン硫酸（遊離又はポリマーに結合している）、ジメチルホルムアミド硫酸、トリエチルアミン硫酸、及びトリメチルアミン硫酸の錯体から選択される。１又は複数の化学的硫酸化剤を、多糖誘導体の溶液に、溶液中の多糖誘導体の質量の好ましくは約４〜約６倍、さらにより好ましくは約５倍に相当する重量で添加する。次いで、化学的硫酸化反応は、好ましくは、望まれる硫酸化度に応じて、２〜２４時間の間の期間、撹拌しながら行われる。望まれる硫酸化度に達したときに、硫酸化反応を、反応媒体の冷却後に、
−  塩化ナトリウム飽和アセトンの、又はメタノールの存在下で沈殿させ、次いで沈殿物を水に溶解するか；
−  又は、好ましくは、反応容量の好ましくは１／１０に等しい比率で水を添加し、そして、例えば水酸化ナトリウム（３Ｍ）などの塩基性化剤を用いて、反応媒体のｐＨを９に調整する
ことのいずれかによって停止させる。
【００４９】
特定の実施形態によれば、硫酸化多糖誘導体の溶液を、好ましくは、様々な塩を除去するために透析し、次いで凍結乾燥する。典型的には正確な分子量及び低い多分散指数を有する最終生成物（すなわち、ＧＹＳ１５）は、得られた低分子量解重合ＥＰＳからの単離によって得られる。単離は、当技術分野で知られている任意の好適な方法によって行われ得る。好ましくは、単離は、サイズ排除クロマトグラフィーによって行われる分画によって行われる。
【００５０】
本発明に係るＧＹＳ１５は、５未満、好ましくは１．５〜４、より好ましくは２未満の低い多分散指数を有する。本発明に係る多分散指数（ＰＤＩ）は、誘導体の分子質量の分布の尺度である。計算されるＰＤＩは、重量平均分子量を数平均分子量で割ったものである。ＰＤＩは、典型的には、サイズ排除クロマトグラフィーによって測定される。
【００５１】
本発明に係るＧＹＳ１５は、硫酸化多糖誘導体の総重量に対して１０重量％〜４５重量％の間の硫酸基置換度を有する。特定の実施形態では、硫酸基置換度は、１０％〜４０％の間、２０％〜４５％の間、又は２０％〜４０％の間である。
【００５２】
ＩＩ−低分子量ＯＳ−ＥＰＳ誘導体の使用
１−治療用途
Ａ．適応症
本発明のＧＹＳ誘導体は、対象における転移の形成の予防又は阻害において使用され得る。
【００５３】
本発明の予防方法は、ＧＹＳ１５又はその医薬組成物を使用して達成され得る。これらの方法は、一般に、それを必要とする対象への、有効量の（上に定義したような）ＧＹＳ１５、又はその医薬組成物の投与を含む。投与は、当業者に知られている方法のいずれかを使用して行われ得る。特に、ＧＹＳ１５又はその組成物は、これらに限定されるものではないが、エアロゾル、非経口、経口、又は局所経路を含めた様々な経路のいずれかによって投与され得る。
【００５４】
一般に、対象はヒトがん患者である。がん患者は、がんを患っていても、又は以前にがんの治療を受けていてもよい。
【００５５】
本発明の実施において、がんは、任意の器官の任意の組織に発症する任意のがんであってよい。したがって、がんは、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病であり得る。がんの例としては、これらに限定されるものではないが、骨がん、肺がん、肝臓がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、子宮がん、性器及び生殖器の癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、膀胱がん、腎臓がん、腎細胞癌、腎う癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、神経外胚葉性がん、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、及び下垂体腺腫が挙げられる。特定の実施形態では、がんは骨癌である。
【００５６】
一般に、ＧＹＳ１５又はその組成物は、有効量、すなわち、その意図された目的を達成するのに十分な量で投与されることとなる。投与すべきＧＹＳ１５又は医薬組成物の正確な量は、処置すべき対象の年齢、性別、体重、及び全般的健康状態、望まれる生物学的又は医学的応答等に応じて、対象毎に変わることとなる。特定の実施形態では、有効量は、転移形成の発生を予防し、遅延させ、及び／若しくはその可能性を低減するもの、並びに／又は、転移が対象に既に存在する場合には、転移の数、増殖率、大きさ等．．．を減少させるものである。本発明に係る処置の効果は、当技術分野において知られている診断アッセイ、試験、及び手順のうちのいずれかを使用してモニターされ得る。
【００５７】
特定の実施形態では、ＧＹＳ１５又はその組成物は、本発明に係る予防方法に従って単独で投与される。他の実施形態では、ＧＹＳ１５又はその組成物は、少なくとも１種の追加的な治療剤又は治療手順と組み合わせて投与される。ＧＹＳ１５又はその組成物は、治療剤若しくは治療手順を施す前に、治療剤若しくは手順と同時に、及び／又は、治療剤若しくは手順を施した後に投与され得る。
【００５８】
ＧＹＳ１５又はその組成物と組み合わせて投与され得る治療剤は、一般にがんの処置において又は患者に対して有益な効果を有することが知られている多種多様な生物学的に活性な化合物（例えば、抗がん剤、抗炎症剤、免疫調節剤、鎮痛剤、抗微生物剤、抗菌剤、抗生物質、抗酸化剤、殺菌剤、及びそれらの組み合わせ）の中から選択され得る。ＧＹＳ１５又はその組成物の投与と組み合わせて行われ得る治療手順としては、これらに限定されるものではないが、手術、放射線療法等が挙げられる。
【００５９】
ＧＹＳ１５又はその組成物と組み合わせて投与され得る抗がん剤としては、従来、以下の群のうちの１つに分類されている薬物が挙げられる：アルキル化剤、プリンアンタゴニスト、ピリミジンアンタゴニスト、植物アルカロイド、インターカレーティング抗生物質、アロマターゼ阻害剤、代謝拮抗薬、有糸分裂阻害剤、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生物学的応答調節剤、抗ホルモン剤、及び抗アンドロゲン剤。そのような抗がん剤の例としては、これらに限定されるものではないが、ＢＣＮＵ、シスプラチン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、パクリタキセル、テモゾロミド、トポテカン、フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、プロカルバジン、デカルバジン、アルトレタミン、メトトレキサート、メルカプトプリン、チオグアニン、リン酸フルダラビン、クラドリビン、ペントスタチン、シタラビン、アザシチジン、エトポシド、テニポシド、イリノテカン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、イダルビシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、タモキシフェン、フルタミド、リュープロリド、ゴセレリン、アミノグルチミド（ａｍｉｎｏｇｌｕｔｈｉｍｉｄｅ）、アナストロゾール、アムサクリン、アスパラギナーゼ、ミトキサントロン、ミトタン、及びアミホスチンが挙げられる。
【００６０】
そのような抗がん剤の他の例としては、これらに限定されるものではないが、慢性リンパ球性白血病の処置に使用されるアレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（商標））などの抗ＣＤ５２抗体；結腸直腸がん及び乳がんの処置に使用されるベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標））を含めた抗ＶＥＧＦ抗体；急性骨髄性白血病の処置に使用されるゲムツズマブ  オゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標））を含めた抗ＣＤ３３抗体；リンパ腫の処置に使用されるイブリツモマブ（ＺＥＶＡＬＩＮ（商標））、ホジキンリンパ腫の処置に使用されるリツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標））、ホジキンリンパ腫の処置に使用されるトシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（商標））、及び慢性リンパ球性白血病の処置に使用されるオファツムマブ（ＡＲＺＥＲＲＡ（商標））を含めた抗−ＣＤ２０抗体；結腸直腸がん、頭頸部がん、及び扁平上皮癌の処置に使用されるセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（商標））、並びに結腸直腸がんの処置に使用されるパニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＥＸ（商標））などの抗ＥＧＦＲ抗体；乳がん及び胃がんの処置に使用されるトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標））を含めた抗Ｈｅｒ２抗体；黒色腫の処置に使用されるイピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（商標））を含めた抗ＣＴＬＡ４抗体；アドネクチン；並びに、ドメイン抗体を含めた、がんの処置に使用される治療用抗体が挙げられる。これらの抗体の活性フラグメント及び融合体もまた、本明細書における使用が見出される。
【００６１】
Ｂ．投与
所望の投与量のＧＹＳ１５（場合により、１又は複数の適切な薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を用いて製剤化した後のもの）は、それを必要とする対象に、任意の好適な経路で投与することができる。錠剤、カプセル剤、注射可能液剤、リポソームへのカプセル化、微粒子剤、マイクロカプセル剤等を含めた、様々な送達系が知られており、また本発明のＧＹＳ誘導体を投与するために使用することができる。投与方法としては、これらに限定されるものではないが、経皮、皮内、筋肉内、腹腔内、病変内、静脈内、皮下、鼻腔内、経肺、硬膜外、経眼、及び経口経路が挙げられる。ＧＹＳ１５又はその組成物は、任意の好都合な、又は他の適切な経路によって、例えば、輸液又はボーラス注射によるか、上皮又は粘膜皮膚内層（例えば、口腔、粘膜、直腸及び腸粘膜等）を介した吸収によって投与され得る。投与は全身又は局所とすることができる。非経口投与は、カテーテル法によるなどの、患者の所与の組織を対象とするものであり得る。当業者に理解されるように、ＧＹＳ１５が追加的な治療剤と共に投与される実施形態では、ＧＹＳ１５及び該治療剤は、同じ経路（例えば、経口）によって投与されても、又は異なる経路（例えば、経口及び静脈内）によって投与されてもよい。
【００６２】
Ｃ．投与量
本発明に係るＧＹＳ１５（又はその組成物）の投与は、送達される量が意図された目的に有効であるような投与量となる。投与経路、製剤、及び投与される投与量は、望まれる治療効果、処置されている障害の重症度、何らかの感染症の存在、患者の年齢、性別、体重、及び全般的健康状態に、並びに、ＧＹＳ１５の効力、バイオアベイラビリティ、及びインビボ半減期、併用療法の使用（又は非使用）、並びに他の臨床的因子に依存することとなる。これらの因子は、治療の過程で担当医師が容易に決定できるものである。代替的又は追加的に、投与すべき投与量は、動物モデルを使用した試験から決定することができる。これらの方法又は他の方法に基づいて最大有効性を達成するために用量を調整することは、当技術分野においてよく知られており、また訓練された医師の能力の範囲内である。ＧＹＳ１５を使用して研究が行われるにつれて、適切な投与量レベル及び処置期間に関してさらなる情報が出てくるであろう。
【００６３】
本発明に係る処置は、単回投与からなるものでも、又は複数回投与からなるものでもよい。したがって、ＧＹＳ１５又はその組成物の投与は、一定期間一定であっても、又は周期的かつ特定の間隔であっても、例えば、毎時、毎日、毎週（又は他の複数の日の間隔で）；毎月、毎年（例えば、徐放形態で）であってもよい。代替的に、送達は、所与の期間中に複数回、例えば、週２回以上、月２回以上など、行われてもよい。送達は、一定期間の連続送達、例えば、静脈内送達であってもよい。
【００６４】
ＩＩＩ−医薬組成物
上述のように、本発明のＧＹＳ誘導体は、それ自体で投与されても、又は医薬組成物として投与されてもよい。したがって、本発明は、有効量のＧＹＳ１５と、少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、１又は複数の追加的な生物学的に活性な薬剤をさらに含む。
【００６５】
ＧＹＳ１５又はその医薬組成物は、所望の予防的治療効果を達成するのに有効な、任意の量で、かつ任意の投与経路を使用して投与され得る。最適な医薬製剤は、投与経路及び望まれる投与量に応じて変えることができる。そのような製剤は、投与された有効成分の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度、及びインビボクリアランスの速度に影響し得る。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、投与の容易さ及び投与量の均一性のために単位剤形で製剤化され得る。本明細書で使用される場合、「単位剤形」という表現は、処置すべき患者のための物理的に別個の単位を指す。しかしながら、組成物の総１日投与量は、担当医師によって正当な医学的判断の範疇で決定されることとなることが理解されるであろう。
【００６７】
Ａ．製剤
注射可能調製物、例えば、滅菌注射可能水性又は油性懸濁液は、好適な分散剤又は湿潤剤、及び懸濁化剤を使用して、既知の技術に従って製剤化され得る。滅菌注射可能調製物はまた、例えば、２，３−ブタンジオール中の溶液のような、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の滅菌注射可能溶液、懸濁液、又は乳濁液であってもよい。用いられ得る許容可能なビヒクル及び溶媒には、水、リンゲル液（Ｕ．Ｓ．Ｐ．）、及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌不揮発性油は、従来、溶液又は懸濁媒体として用いられている。この目的のために、合成モノ−又はジ−グリセリドを含めた、任意の無菌性不揮発性油を用いることができる。オレイン酸などの脂肪酸もまた、注射可能製剤の調製に使用され得る。滅菌液体担体は、非経口投与のための滅菌液状組成物において有用である。
【００６８】
注射可能製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通したろ過によって、又は、使用前に、滅菌水若しくは他の滅菌注射可能媒体に溶解若しくは分散させることができる滅菌固形組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって、滅菌することができる。滅菌溶液又は懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下注射によって投与することができる。注射は、一押し（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｕｓｈ）によるものであっても、又は段階的輸液（ｇｒａｄｕａｌ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ）によるものであってもよい。必要な又は所望の場合、組成物は、注射部位における痛みを緩和するための局所麻酔薬を含んでもよい。
【００６９】
有効成分の効果を延長するために、皮下又は筋肉内注射からの成分の吸収を遅くさせることがしばしば望ましい。非経口的に投与される有効成分の吸収遅延は、成分を油性ビヒクルに溶解するか又は懸濁することによって達成され得る。注射可能デポー剤形は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に有効成分のマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって作製される。ポリマーに対する有効成分の比率及び用いられる具体的なポリマーの性質に応じて、成分放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射可能製剤はまた、身体組織に適合性のあるリポソーム又はマイクロ乳濁液に有効成分を封入することによっても調製することができる。
【００７０】
経口投与のための液体剤形としては、これらに限定されるものではないが、薬学的に許容可能な乳濁液、マイクロ乳濁液、液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤、及び加圧組成物が挙げられる。ＧＹＳ誘導体に加えて、液体剤形は、当技術分野において一般的に使用されている不活性希釈剤、例えば、水、又は、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタン脂肪酸エステル、並びにそれらの混合物などの他の溶媒、可溶化剤、及び乳化剤などを含有してもよい。不活性希釈剤の他に、経口組成物はまた、湿潤剤、懸濁化剤、防腐剤、甘味剤、着香剤、及び芳香剤、増粘剤、色素、粘度調整剤、安定化剤、又は浸透圧調節剤などのアジュバントを含むこともできる。経口投与のための好適な液体担体の例としては、水（カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液のように、上記のような添加物、例えば、セルロース誘導体を含み得る）、アルコール（一価アルコール及びグリコールなどの多価アルコールを含む）及びそれらの誘導体、並びに油（例えば、分画されたヤシ油及び落花生油）が挙げられる。加圧組成物については、液体担体は、ハロゲン化炭化水素又は他の薬学的に許容可能な噴射剤とすることができる。
【００７１】
経口投与のための固体剤形としては、例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、及び顆粒剤が挙げられる。そのような固体剤形では、本発明のＧＹＳ誘導体は、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウムなどの少なくとも１種の不活性な薬学的に許容可能な賦形剤又は担体と、（ａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール（ｍａｎｎｉｔａｌ）、及びケイ酸などの充填剤又は増量剤；（ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及びアラビアゴム（ａｃａｃｉａ）などの結合剤；（ｃ）グリセロールなどの保水剤；（ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；（ｅ）パラフィンなどの溶液遅延剤；第４級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；（ｇ）例えば、セチルアルコール及びグリセロールモノステアレートなどの湿潤剤；（ｈ）カオリン及びベントナイト粘土などの吸着剤；並びに、（ｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムなどの潤滑剤、並びにそれらの混合物のうちの１又は複数と共に混合され得る。固体製剤に好適な他の賦形剤としては、非イオン性及びアニオン性表面改質剤などの表面改質剤が挙げられる。表面改質剤の代表例としては、これらに限定されるものではないが、ポロキサマー１８８、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ワックス、ソルビタンエステル、コロイド状二酸化ケイ素、リン酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、及びトリエタノールアミンが挙げられる。カプセル剤、錠剤、及び丸剤の場合、剤形はまた、緩衝剤を含んでもよい。
【００７２】
同様のタイプの固体組成物はまた、ラクトース又は乳糖、及び高分子量ポリエチレングリコール等などの賦形剤を使用した軟質及び硬質充填ゼラチンカプセル剤における充填剤として用いてもよい。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、及び顆粒剤の固体剤形は、腸溶コーティング、放出制御コーティング、及び医薬製剤分野でよく知られている他のコーティングなどのコーティング及びシェルを用いて調製することができる。これらは、場合により不透明化剤を含有してもよく、また、有効成分を、単独で、又は好ましくは、腸管の特定部分において場合により遅延様式で放出するような組成物とすることもできる。使用することができる包埋組成物の例としては、ポリマー物質及びワックスが挙げられる。
【００７３】
特定の実施形態では、本発明の組成物を特定領域に局所的に投与することが望ましい場合がある。これは、例えば、限定するものではないが、手術中の局所注入、局所塗布によるか、注射によるか、カテーテルによるか、坐剤によるか、又は皮膚パッチ若しくはステント又は若しくは他のインプラントによって達成され得る。
【００７４】
局所投与の場合、組成物は、好ましくは、水、グリセロール、アルコール、プロピレングリコール、脂肪アルコール、トリグリセリド、脂肪酸エステル、又は鉱油などの担体を含み得るゲル剤、軟膏剤、ローション剤、又はクリーム剤として製剤化される。他の局所用担体としては、液体石油、パルミチン酸イソプロピル、ポリエチレングリコール、エタノール（９５％）、水中のポリオキシエチレンモノラウレート（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅｍｏｎｏｌａｕｒａｔ）（５％）、又は水中のラウリル硫酸ナトリウム（５％）が挙げられる。必要に応じて、抗酸化剤、保水剤、粘度安定剤などの他の材料、及び同様の薬剤を添加してもよい。
【００７５】
加えて、特定の場合には、本発明の組成物を、皮膚の上、中、又は下に置かれる経皮デバイス内に配置することが想定される。そのようなデバイスとしては、受動的放出機構又は能動的放出機構のいずれかによって有効成分を放出するパッチ、インプラント、及び注射が挙げられる。経皮投与は、体表面、並びに、上皮及び粘膜組織を含めた身体通路の内層を横切るすべての投与を包含する。そのような投与は、本組成物を、ローション剤、クリーム剤、フォーム剤、パッチ剤、懸濁剤、液剤、及び坐剤（直腸及び膣）で使用して行われ得る。
【００７６】
経皮投与は、有効成分（すなわち、ＧＹＳ誘導体）と、皮膚に対して非毒性であり、かつ皮膚を介した血流中への全身吸収のための成分の送達を可能にする担体とを含有する経皮パッチの使用によって達成してもよい。担体は、クリーム剤及び軟膏剤、ペースト剤、ゲル剤、及び閉塞デバイスなどの様々な形態をとり得る。クリーム剤及び軟膏剤は、粘稠液、又は、水中油型若しくは油中水型のいずれかの半固体乳濁液であり得る。有効成分を含有するペトロリアム又は親水性ペトロリアム中に分散させた吸収性粉末からなるペーストが好適な場合もある。担体を含むか、又は含まない有効成分を含有する容器を被覆する半透過性膜、又は有効成分を含有するマトリックスなどの、有効成分を血流中に放出させるための様々な閉塞デバイスが使用され得る。
【００７７】
坐剤製剤は、坐剤の融点を変えるためのワックスが添加されているか、又は添加されていないカカオバター、及びグリセリンを含めた従来の材料から製造され得る。また様々な分子量のポリエチレングリコールなどの水溶性坐剤基剤も使用され得る。
【００７８】
様々な製剤を製造するための材料及び方法が当技術分野において知られており、また、標題発明の実施に適合させることができる。抗体の送達に好適な製剤は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，１８ｔｈＥｄ．，１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．：Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ中に見出すことができる。
【００７９】
Ｂ．追加的な生物学的に活性な薬剤
特定の実施形態では、ＧＹＳ１５は、本発明の医薬組成物中の唯一の有効成分である。他の実施形態では、医薬組成物は、１又は複数の生物学的に活性な薬剤をさらに含む。好適な生物学的に活性な薬剤の例としては、これらに限定されるものではないが、抗がん剤、抗炎症剤、免疫調節剤、鎮痛剤、抗微生物剤、抗菌剤、抗生物質、抗酸化剤、殺菌剤、及びそれらの組み合わせが挙げられる。抗がん抗体を含めた具体的な抗がん剤の例は上に列挙されている。
【００８０】
そのような医薬組成物において、ＧＹＳ誘導体及び少なくとも１種の追加的な治療剤は、該ＧＹＳ誘導体及び治療剤の、同時、個別、又は逐次投与のために、１又は複数の調製物中で組み合わせられ得る。より具体的には、本発明の組成物は、ＧＹＳ誘導体及び治療剤を、一緒に、又は互いに独立して投与できるような方法で製剤化され得る。例えば、ＧＹＳ誘導体及び治療剤は、単一組成物中に一緒に製剤化することができる。代替的に、ＧＹＳ誘導体及び治療剤は、個別に（例えば、異なる組成物及び／又は容器中に）維持及び投与してもよい。
【００８１】
Ｃ．キットの医薬パック
別の態様では、本発明は、本発明のＧＹＳ誘導体の投与を可能にする本発明の医薬組成物の１又は複数の成分を含有する１又は複数の容器（例えば、バイアル、アンプル、試験管、フラスコ、又はボトル）を含む医薬パック又はキットを提供する。
【００８２】
医薬パック又はキットの異なる成分は、固体（例えば、凍結乾燥されている）又は液体の形態で供給され得る。各成分は、一般に、個別の容器に分注されるか、又は濃縮形態で提供されるのに適したものとなるであろう。本発明に係るパック又はキットは、凍結乾燥成分の再構成のための媒体を含んでもよい。キットの個々の容器は、商業的販売のために好ましくは密閉して維持されることとなる。
【００８３】
特定の実施形態では、パック又はキットは、１又は複数の追加的な治療剤を含む。場合により、容器に、医薬品又は生物学的製品の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって規定された形態の通知又は添付文書（ここで、通知は、該機関による、ヒト投与のための製造、使用、又は販売の承認を反映している）が付属し得る。添付文書の通知は、本明細書に開示される処置方法に係る医薬組成物の使用のための指示を含み得る。
【００８４】
識別子、例えば、バーコード、無線周波数、ＩＤタグ等がキット中又はキット上に存在してもよい。該識別子は、例えば、品質管理、在庫管理、ワークステーション間の移動の追跡等の目的でキットを一意的に識別するために使用することができる。
【００８５】
この発明のさらなる態様及び利点は、以下の図面及び実施例において開示されることとなるが、これらは例示であって、この出願の範囲を限定するものではないとみなされるべきである。
【実施例】
【００８６】
以下の実施例は、本発明の製造及び実施の好ましい様式のうちのいくつかを記載する。しかしながら、実施例は単に例証を目的とするものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。さらに、実施例の記載が過去時制で示されている場合を除き、該文章は、本明細書の他の部分と同様に、実験が実際に行われたか、又はデータが実際に得られたことを示すことを意図するものではない。
【００８７】
材料及び方法
概要
細菌性ＧＹ７８５菌体外多糖（ＥＰＳ）は、以前に記載されているように、産生、精製、及び特性決定した（Ｇｕｅｚｅｎｎｅｃら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍ．，１９９８，３７：１９〜２４）。低分子量（ＬＭＷ）過硫酸化（ＯＳ）ＥＰＳ誘導体の調製、精製、及び特性決定は以前に報告されているように行った（Ｒｕｉｚ  Ｖｅｌａｓｃｏら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１，２１：７８１〜７９５；ＷＯ２００６／００３２９０）。簡潔には、天然高分子量（ＨＭＷ）ＧＹ７８５  ＥＰＳを、先ずフリーラジカル解重合化プロセスを使用して解重合化して、分子量の異なるＬＭＷ誘導体を得た。次いで、ＬＭＷ  ＧＹ７８５  ＥＰＳ誘導体を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、ピリジン硫酸を硫酸化剤として使用して硫酸化して、ＬＭＷ  ＯＳ−ＥＰＳ誘導体に導いた。硫酸化前後の分子量（Ｍｗｓ）をＨＰＳＥＣ−ＭＡＬＳによって、そして硫黄含量（重量％Ｓ）をＨＰＡＥＣクロマトグラフィーによって決定した。ＡＴＲ−ＦＴＩＲ及びＮＭＲ分光法を使用して、硫酸化反応の効率を評価した。ブタ腸粘膜Ｈ４７８４由来ヘパリンナトリウム塩はＳｉｇｍａから購入した。
【００８８】
増殖アッセイ
ＰＯＳ−１細胞株由来の細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を含むＲＰＭＩ（ロズウェルパーク記念研究所、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）培地中で培養した。ＫＨＯＳ／ＮＰ細胞株（ＨＯＳ、（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ））由来の細胞を、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で培養した。初めに５０×１０３細胞／ｃｍ２の濃度で播種した細胞を、湿度飽和制御雰囲気及び５％ＣＯ２で３７℃でインキュベートした。コンフルエントになったら、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、トリプシン：０．５ｇ／Ｌ；ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）：０．２ｇ／Ｌ）を使用して細胞を剥がした。ＦＢＳ含有培地を添加することによってトリプシンを中和し、そして細胞を４００ｇで遠心分離後に収集した。ＰＯＳ−１及びＨＯＳ細胞株由来の細胞を、５００μＬの培地を含む２４ウェルプレートに１ウェルあたり２０００細胞でトリプリケートで播種し、そしてＧＹＳ４若しくはＧＹＳ８若しくはＧＹＳ１５（２５、５０、又は１００μｇ／ｍｌ）の存在下で、又はＰＢＳ（対照）で処理した。マラッセ（Ｍａｌａｓｓｅｚ）セルを使用してトリパンブルーを用いて生細胞を手動で計数することによって増殖アッセイを行って、群間の細胞増殖率を比較した。
【００８９】
遊走アッセイ
６ウェルプレートにデュプリケートで播種した細胞（４×１０５）をマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ−４μｇ／ｍｌで１時間）で処理して細胞増殖をブロックし、そして細胞の遊走を、ＧＹＳ４若しくはＧＹＳ８若しくはＧＹＳ１５（２５又は５０μｇ／ｍｌ）の存在下で、又はＰＢＳ（対照）を用いて評価した。コンフルエントになったら、細胞を注意深く引っ掻いてギャップを生成した。ギャップの画像を、インキュベーション開始直後、並びにインキュベーション開始の２４時間、４８時間、及び７２時間後に、オリンパスＤＰ１２−２カメラ（オリンパス株式会社、東京、日本）を使用して取得した。
【００９０】
浸潤アッセイ
培養細胞（ＰＯＳ−１及びＨＯＳ）の浸潤を、２４ウェルプレート（ＭＵＬＴＩＷＥＬＬ（商標）２４、ＦＡＬＣＯＮ（登録商標））において、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コーティング（冷ＰＢＳ中、２μｇ／１００μＬ／ウェル）を有するポリエチレンテレフタレートメンブレンで被覆されたボイデンチャンバー（８μｍ孔、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）を使用して分析した。細胞播種の３０分前に、ＬＭＷ  ＯＳ−ＥＰＳ  ４又は８又は１５ｋＤａ誘導体（２５、５０、１００、又は２００μｇ／ｍｌ）をマトリゲル上に添加した。マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ−４μｇ／ｍｌで１時間）で前処理した細胞を、５００μｌカップの上部区画に１％ＦＢＳ培地中に播種し（２ｘ１０４ＰＯＳ−１細胞又は３ｘ１０４ＨＯＳ細胞）、そして２４時間のインキュベートの間、３７℃で５％ＣＯ２の加湿雰囲気中に放置した。系の底部ウェルを、化学誘引物質としての１０％ＦＢＳ培地（７００μｌ）で満たした。２４時間の期間の終了時に、非浸潤性細胞を綿棒で除去し、そして膜の下表面に存在する浸潤性細胞を３％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）で固定し、メチレンブルーで染色した。乾燥後、浸潤細胞をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（Ｌｅｉｃａ）を使用して５つの顕微鏡視野で計数した。すべての実験をデュプリケートで３回行った。浸潤は平均細胞数／視野で表される。
【００９１】
細胞周期分析
細胞を、ＬＭＷ  ＯＳ−ＥＰＳ誘導体を含むか又は含まない培地中で、２４時間、４８時間、又は７２時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、トリプシン処理した細胞を、０．１２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１２ｍｍｏｌ／Ｌのエチレンジアミン四酢酸、及び１００μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅフリーＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ）を含有するリン酸緩衝食塩水中でインキュベートした。次に、５０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを添加し、そして細胞を暗所にて４℃で２０分間インキュベートした。細胞周期分布を、２Ｎ及び４ＮのＤＮＡ含量に基づいてフローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｒｏｉｓｓｙ、Ｆｒａｎｃｅ）によって試験し、そしてＤＮＡ細胞周期分析ソフトウェア（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｆｌｏｗ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ）を使用して分析した（Ｋａｐｐら，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔ．２０１３，２３：１２７３〜１２９５）。
【００９２】
マトリックスメタロプロテアーゼ発現
細胞を、ペトリ皿（直径６０ｍｍ）に、ＦＢＳを含む３ｍｌの培地中に播種した（５×１０５）。コンフルエントになったら、細胞を、５０μｇ／ｍｌのＬＭＷ  ＯＳ−ＥＰＳ  １５ＫＤａ誘導体、ＧＹＳ１５、若しくはヘパリンで、又はＰＢＳ（対照）で、１時間、３時間、６時間、８時間、又は２４時間処理した。マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）及び組織メタロプロテアーゼ阻害因子（ＴＩＭＰ）の発現を、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって決定した。ＲＮＡをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡＩＩ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して抽出し、そしてＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用したファーストストランドｃＤＮＡ合成に使用した。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ試薬（Ｂｉｏｒａｄ）を使用してＣｈｒｏｍｏ４装置（Ｂｉｏｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で行った。
【００９３】
動物倫理
動物が関与するすべての手続きは、科学的目的のために使用される動物の保護に関する２０１０年９月２２日の欧州議会及び理事会の指令２０１０／６３／ＥＵに従って行った。この試験で提示したプロトコルは、フランス倫理委員会（ＣＥＥＡ  ＰｄＬ．０６）によって、プロトコル番号２０１０．３４として、権限を与えられた研究者の監督下で承認されたものである。Ｅｌｅｖａｇｅｓ  Ｊａｎｖｉｅｒ（Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ  Ｓａｉｎｔ  Ｉｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）からの４週齢の雄ＮＭＲＩヌードマウス［ｎ＝６］及び４週齢の雄Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス［ｎ＝７］を、フランス倫理委員会（ＣＥＥＡ  Ｐａｙｓ  ｄｅ  ｌａ  Ｌｏｉｒｅ−０６）の機関内指針に従って、実験的治療ユニット（Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎａｎｔｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）において病原体フリーの条件下で維持した。
【００９４】
骨肉腫マウスモデル
４週齢の雄ＮＭＲＩヌードマウス［１群あたりｎ＝６］をイソフルラン／空気混合物（１．５％、１Ｌ／分）の吸入により麻酔した後、傍脛骨領域に２×１０６個のＨＯＳ細胞の筋肉内注射を行った（５０μｌのＰＢＳ緩衝液中）（Ｍｏｒｉｃｅａｕら，Ｃａｎｃｅｒ，２０１２，１１８：７５０〜７６０）。同様に、４週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１．５×１０６個のＰＯＳ−１細胞［１群あたりｎ＝６］を接種した（Ｓｅｇａｌｉｎｙら、「Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３４  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ」，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２０１５，ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）。腫瘍は８日後に注射部位に現れた。腫瘍体積（Ｖ）を、カリパスを使用した２つの垂直直径の測定値から、以下の式：Ｖ＝０．５×Ｌ×（Ｓ）２（式中、Ｌ及びＳはそれぞれ最大及び最小垂直腫瘍直径である）に従って算出した。腫瘍体積が１００ｍｍ３に達したときに、治療プロトコルを行い、マウスをＰＢＳ（対照）で、又はＬＭＷ  ＯＳ−ＥＰＳ誘導体で処置した。ＰＢＳ緩衝液（５０μＬ）中に希釈した多糖を２ｍｇ／ｋｇ又は６ｍｇ／ｋｇで毎日皮下注射し、そして腫瘍増殖を５日目から３５日目まで測定した。このマウスモデル（傍脛骨モデル）は、脛骨中への腫瘍細胞の直接注入を使用したモデル（脛骨内モデル）よりも好まれたが、これは、２つのモデルにおいて実験終了時の骨病変が非常によく似ているため、また、前者のモデル（すなわち、傍脛骨モデル）の方が結果の再現性が高いためである。加えて、傍脛骨モデルの方が、ヒトにおいて観察される骨病変により厳密に似ている。
【００９５】
肺転移マウスモデル
骨肉腫の転移能に対するＬＭＷ  ＯＳ−ＥＰＳ誘導体の効果を試験するために、１．５×１０５個のＰＯＳ−１細胞を、静脈洞の後眼窩注射技術を使用して注入した（Ｏｒｙら，Ｃａｎｃｅｒ，２００５，１０４：２５２２〜２５２９）。マウスを、イソフルラン／空気併用剤（１．５％、１Ｌ／分）の吸入によって麻酔し、そして腫瘍細胞注射後にブプレノルフィンを投与した（０．０５ｍｇ／ｋｇ；ＴＥＭＧＥＳＩＣ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）。ＰＢＳ、ヘパリン、及びＧＹＳ１５の３つの処置群に分けた４週齢の雄Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス［１群あたりｎ＝７］を用いて予防的プロトコルを確立した。ＰＯＳ−１細胞注射の３０分前に、最初の皮下注射（５０μｌのＰＢＳ中、１２ｍｇ／ｋｇのＧＹＳ１５又はヘパリン）を行った。次に、４回の皮下注射を、ＧＹＳ１５又はヘパリンについては６ｍｇ／ｋｇで、毎日行った。マウスが肺転移発症の徴候（呼吸困難、衰弱、体重減少、背部後弯）を示したら、マウスを安楽死させた。組織学的分析及び巨視的分析のために肺を収集した：肺を転移の大きさ（大又は小）に従って分類した。
【００９６】
統計分析
すべてのインビトロ実験を３回行った。ノンパラメトリック・ウィルコクソン検定によって、視野あたり細胞数の平均数を比較した。平均腫瘍体積を、クラスカル・ウォリス検定を使用して比較した。肺転移の大きさのカテゴリー変数をフィッシャーの正確確率検定によって分析した。ｐ＜０．０５のときに差を有意とみなした。
【００９７】
結果
骨肉腫細胞株に対するＬＭＷ  ＯＳ−ＥＰＳのインビトロ効果
細胞増殖及び細胞生存能。  対照と比較して、ＧＹＳ４及びＧＹＳ１５のみが、マウスＰＯＳ−１とヒトＨＯＳの両方の細胞増殖を有意に阻害した。骨肉腫細胞株の増殖を阻害する最も効力の高いＬＭＷ  ＯＳ−ＥＰＳ誘導体はＧＹＳ４であることが見出された（図１Ａ）。ＧＹＳ８は、ＰＯＳ−１細胞増殖を阻害するのにヘパリンと同等の効力を有したが、これらはＨＯＳ細胞株の細胞に対してはさほど効果的に作用しなかった（図１Ａ）。ＧＹＳ１５を用いた３日間の処置はＨＯＳ細胞増殖に対して何ら有意な効果をもたらさなかったが、２５μｇ／ｍＬのＧＹＳ１５は、７日間の処置後にＨＯＳ細胞増殖を顕著に減少させた（図１Ｂ）。細胞生存能の観点では、対照と比較すると、試験したすべての化合物の間に有意差は観察されなかった（データは示さず）。これらの結果に基づくと、ＬＭＷ  ＯＳ−ＥＰＳ誘導体（ＧＹＳ４及びＧＹＳ８）は、二次的生物学的メッセンジャーの放出を必要とする間接的な作用によってそれらの活性を発揮するという仮説を立てることができる。これらのデータは、骨芽細胞についてＯＳ−ＥＰＳ  ２４ｋＤａを用いて得られたデータと一致する（Ｒｕｉｚ  Ｖｅｌａｓｃｏら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１，２１：７８１〜７９５）。
【００９８】
細胞の遊走。  本発明者らは、インビトロ創傷治癒アッセイを使用することによって、骨肉腫細胞の遊走に対するＬＭＷ  ＯＳ−ＥＰＳ誘導体の効果を調査した。評価した全ての化合物（ＧＹＳ４、ＧＹＳ８、ＧＹＳ１５、及びヘパリン）は、マウスＰＯＳ−１骨肉腫細胞の遊走を阻害することが見出された（データは示さず）。この細胞株とは対照的に、ＧＹＳ４及びＧＹＳ１５のみがヒトＨＯＳ骨肉腫細胞の遊走を阻害する能力を示し（図２）、特に、ＧＹＳ１５は、他の化合物と比較して、ＨＯＳ細胞の遊走を著しく減速させることが見出された。
【００９９】
一般に抗凝固剤として投与されるヘパリンは、特にがん細胞に対して、様々な追加的な生物学的活性を有することが認められている（Ｌａｕｂｌｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．，２００９，２７：４７４〜４８１；Ｆａｌａｎｇａら，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．，２００７，３３：６８８〜６９４）。インビトロ及びインビボの実験的証拠により、ヘパリンが細胞の遊走、接着、及び転移の有効な阻害剤であることが実証された（Ｌａｕｂｌｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．，２００９，２７：４７４〜４８１）。ヘパラナーゼ又はＰ−／Ｌ−セレクチンの阻害のような血小板−腫瘍細胞血栓形成を伴う一般的な分子経路が、この活性に関与している可能性がある（Ｆｒｉｔｚｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００６，７２：４７４〜４８５）。ヘパリンとは対照的に、本研究において評価したＬＭＷ  ＯＳ−ＥＰＳ誘導体は、骨肉腫の細胞遊走を阻害し、ヘパラナーゼ及びセレクチンから独立した作用機序を示唆している。インテグリン活性の阻害に関連する機構という仮説を立てることができる（Ｋａｐｐら，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔ．，２０１３，２３：１２７３〜１２９５）。
【０１００】
細胞浸潤。  他の化合物とは対照的に、ＧＹＳ１５のみが、２４時間後に９０％に近い阻害率で骨肉腫細胞の浸潤性を阻害することが見出された（図３Ａ）。この効果は、２５μｇ／ｍＬの濃度においてマウスＰＯＳ−１細胞株とヒトＨＯＳ細胞株の両方で観察された（図３Ｂ）。
【０１０１】
細胞周期。  ３００μｇ／ｍｌの濃度において、ＧＹＳ１５は、マウスＰＯＳ−１とヒトＨＯＳの両細胞株の細胞周期に対して有意な効果をもたらさなかった（図４）。ヘパリンは、同濃度で細胞周期に対して効果をもたらさなかった（データは示さず）。同様のデータが処置の７２時間後に得られた（データは示さず）。
【０１０２】
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）及びそれらの阻害因子（ＴＩＭＰ）のヒト骨肉腫（ＨＯＳ）細胞株における発現
ＧＹＳ１５がヒトＨＯＳ骨肉腫細胞の遊走及び浸潤を調節することが見出されたため、本発明者らは、これらのプロセスの主要な制御因子、特にＭＭＰ及びそれらのＴＩＭＰ阻害因子の発現を分析した。予想されたように、ヒトＨＯＳ骨肉腫細胞は、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、並びにそれらの阻害因子ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２を発現した（図５）。ＭＭＰ−２及びその阻害因子（ＴＩＭＰ−２）は、ＧＹＳ１５によるか、又はヘパリンによる処置によって調節されなかった。対照的に、ＭＭＰ−９発現は、ＧＹＳ１５によって時間依存的に増加した。実際、５０μｇ／ｍｌのＧＹＳ１５は、未処置細胞と比較すると、ＭＭＰ−９ｍＲＮＡ発現の２倍の増加を誘導した（図５）。同時に、ＧＹＳ１５は、ＭＭＰ−９活性の天然の阻害因子であるＴＩＭＰ−１の発現を上方調節することが見出された。ヘパリンはＴＩＭＰ−１の発現を調節しただけであった（図５）。
【０１０３】
ＭＭＰ−９が骨肉腫細胞の遊走、増殖、及び浸潤に関連しているかどうか（Ｚｈａｎｇら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０１５，２４：５０〜５８；Ｍａら，Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２０１３，１７：１１０２〜１１０９）、骨肉腫患者における生存率のバイオマーカーとしてのＭＭＰ−９の使用には未だ議論の余地がある（Ｌｉら，Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．，２０１４，５：５４８７〜５４９１；Ｚｈａｎｇら，Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．，２０１５，３６：３５：５〜６）。そうは言うものの、ＧＹＳ１５の抗浸潤及び抗遊走特性は、ＭＭＰ−９とその阻害因子ＴＩＭＰ−１との間のバランスの調節によってある程度説明することができる（Ｃｏｔｔａｍ及びＲｅｅｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，１９９３，２：８６１〜８７２）。ＧＹＳ１５は、ＭＭＰ−９とＴＩＭＰ−１の両方を増加させたが、その結果もたらされる酵素とその阻害因子との間のバランスは阻害に有利なものとなる。
【０１０４】
インビボ試験
原発性悪性骨腫瘍の増殖。  マウスＰＯＳ−１細胞株又はヒトＨＯＳ細胞株の細胞の接種によって誘導された骨肉腫のマウスモデル（傍脛骨モデル）に対して治療的処置を行った。腫瘍体積が１００ｍｍ３に達したとき（０日目）に処置を開始し、マウスを、１−ＰＢＳで処置（対照）；２−ＧＹＳ１５で処置、そして、３−ヘパリンで処置の３群に分けた。多糖を、２ｍｇ／ｋｇ又は６ｍｇ／ｋｇで毎日皮下注射（５０μＬ）し、そして腫瘍増殖を５日目から９日目まで測定した。腫瘍増殖は３群において同様であった（データは示さず）。これらの結果は、ＧＹＳ１５とヘパリンの両方とも、マウスＰＯＳ−１細胞株（データは示さず）又はヒトＨＯＳ細胞株（図６）のいずれかによって誘発された原発性骨肉腫腫瘍には効果をもたらさなかったことを実証している。多糖は両方とも、前臨床骨肉腫マウスモデルにおいて原発性腫瘍増殖を阻害することができなかった。ＧＹＳ１５は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識染色（ＴＵＮＥＬ）によって分析すると、骨肉腫細胞に対してアポトーシス促進効果をもたらさなかった（データは示さず）。
【０１０５】
マウス骨肉腫由来の肺転移のモデル。  マウスにおける静脈洞の後眼窩注射技術によって骨肉腫の転移能に対するＧＹＳ１５の効果を調べるための予防的処置を考案した（Ｃｏｔｔａｍ及びＲｅｅｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，１９９３，２：８６１〜８７２）。この実験では、マウスにＰＯＳ−１細胞を投与すると、ＰＯＳ−１細胞株の注射後に自発発生的に転移が生じた。ＧＹＳ１５処置マウスは、未処置マウス又はヘパリン処置マウスより有意に少ない転移を示した（おおよそ４０％の減少）（ｐ＜０．００１）（図７Ａ）。肺組織の組織学的分析では、ビヒクル（ＰＢＳ）で処置した対照群とは対照的に、ＧＹＳ１５処置マウスは、ヘパリンと同様に、転移巣の存在を示さないことが示された（図７Ｃ）。この検出可能な肺転移の発生率の低さは、動物の生存率の改善を伴い、処置動物の７０％はＰＯＳ−１細胞株の注射後６５日間生存したが、一方、対照群においてそのように長く生存した動物は１４％のみであった（図７Ｃ）。予想されたように、ヘパリンは、肺転移発症の発生率を減少させた（Ｌａｕｂｌｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．，２００９，２７：４７４〜４８１；Ｆａｌａｎｇａら，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．，２００７，３３：６８８〜６９４）。マウスではＧＹＳ１５の副作用は観察されなかった。したがって、ＧＹＳ１５は、抗転移活性を示し、かつ、凝固アッセイにおける効率が低く（Ｒｏｇｅｒら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００４，３３９：２３７１〜２３８０；Ｒｕｉｚ  Ｖｅｌａｓｃｏら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１，２１：７８１〜７９５）、これは、明らかに付加的な治療価値である。
【０１０６】
結論
本試験では、３種の過硫酸化低分子量海洋細菌性菌体外多糖の治療上の重要性が実証された。これらは、凝固アッセイにおける効率が低く、かつ、骨肉腫細胞のインビトロ浸潤性及び転移プロセスを低減する能力を有することから、ＬＭＷ  ＯＳ−ＥＰＳは、腫瘍学において重要性の高い新種の多糖を表す。本試験では、ＧＹＳ１５のみがインビトロで骨肉腫細胞の遊走と浸潤の両方を効果的に阻害することができた。さらに、ＧＹＳ１５は、インビボでの肺転移の形成の阻害に非常に効果的であることが見出された。
【０１０７】
このような多糖はまた、それらの作用機序が未だ不明であっても、従来の化学療法剤の新規な送達系の開発に有用である可能性がある（Ａｒｐｉｃｃｏら，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１４，１９：３１９３〜３２３０）。
【０１０８】
この出願全体にわたって、様々な参考文献が本発明が属する技術水準を説明している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示中に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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