(57)【要約】  本発明は、従来知られていなかった、ルテニウムおよびインジウムとガストリンとの高い結合親和性を頼りとする。特に、これらの金属は穏やかな条件下でガストリンと直接結合できるため、上昇させられたガストリンレベルに関係した病気の治療または予防の方法や、腫瘍およびＣＣＫ受容体が過剰発現するその他の病気の検出に用いることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
高濃度の非アミド化ガストリンに関係した患者の病気の、治療または予防の方法であって、
インジウムおよびルテニウムから選択される金属の有効量を、前記患者に投与するステップを含む方法。
【請求項２】
非アミド化ガストリンの活性を調整する方法であって、
インジウムおよびルテニウムから選択される金属を前記非アミド化ガストリンに結合させるステップを含む方法。
【請求項３】
前記金属が前記非アミド化ガストリンの鉄結合サイトに結合するように、前記患者に前記金属を投与する、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記インジウムおよびルテニウムが、Ｉｎ３＋およびＲｕ３＋の形態である、
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記インジウムおよびルテニウムが、インジウムおよびルテニウムのラジオアイソトープである、
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記金属が自由イオンを含む溶液の一部である、または前記金属が組成物や塩の構成要素である、
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記金属が、前記非アミド化ガストリンと接触するときにキレート基と結合しない、
請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
病気が、大腸がん、ガストリノーマ、膵島細胞がん、卵巣腫瘍、下垂体腫瘍、甲状腺髄様がん、星細胞腫、小細胞肺がん、髄膜腫、子宮内膜および卵巣腺がん、乳がん、消化管間質腫瘍、膵・消化管腫瘍、萎縮性胃炎、Ｇ細胞過形成、悪性貧血、腎不全、潰瘍性大腸炎、胃腸潰瘍、胃食道逆流、胃カルチノイド、およびゾリンジャー・エリソン症候群よりなる群から選択される、
請求項１、請求項３乃至７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
患者が、ヒト、家畜、またはコンパニオンアニマルを含む哺乳類である、
請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記非アミド化ガストリンの調整が、正常な生物活性を減少させることである、
請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＣＫ受容体の過剰発現に関係した患者の病気の、治療または予防の方法であって、
インジウムおよびルテニウムから選択される金属の有効量を、前記患者に投与するステップを含む方法。
【請求項１２】
前記金属がアミド化ガストリンの鉄結合サイトに結合し、前記ＣＣＫ受容体と前記アミド化ガストリンとの結合時に前記受容体を提示する細胞内に前記金属が取り入れられるように、前記患者に前記金属を投与する、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
インジウムおよびルテニウムより選択される金属を、ＣＣＫ受容体を発現する細胞の内部に輸送する方法であって、
アミド化ガストリンを前記金属と接触させてそこへ結合させ、結合された金属とともに前記アミド化ガストリンを前記ＣＣＫ受容体に接触させて、前記細胞に取り入れさせるステップを含む方法。
【請求項１４】
前記ＣＣＫ受容体は、ＣＣＫ−２受容体である、
請求項１１乃至１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記インジウムおよびルテニウムはラジオアイソトープである、
請求項１１乃至１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
治療または予防される病気、または前記金属を細胞内に輸送する目的が、大腸がん、ガストリノーマ、膵島細胞がん、卵巣腫瘍、下垂体腫瘍、甲状腺髄様がん、星細胞腫、小細胞肺がん、髄膜腫、子宮内膜および卵巣腺がん、乳がん、消化管間質腫瘍、膵・消化管腫瘍、萎縮性胃炎、Ｇ細胞過形成、悪性貧血、腎不全、潰瘍性大腸炎、胃腸潰瘍、胃食道逆流、胃カルチノイド、およびゾリンジャー・エリソン症候群よりなる群から選択される病気を治療または予防することである、
請求項１１乃至１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ガストリン−金属錯体を形成する方法であって、
ガストリンをインジウムおよびルテニウムから選択される金属と接触させるステップを含む方法。
【請求項１８】
ガストリンと、前記ガストリンの鉄結合サイトに結合あるいは錯形成したインジウムおよびルテニウムから選択される金属と、を備える錯体。
【請求項１９】
前記ガストリンが、アミド化ガストリンまたは非アミド化ガストリンである、
請求項１７に記載の方法、または請求項１８に記載の錯体。
【請求項２０】
前記金属が、前記ガストリンと接触するときにキレート基と結合しない、
請求項１１乃至１７のいずれか一項に記載の方法、または請求項１８若しくは１９に記載の錯体。
【請求項２１】
ＣＣＫ受容体陽性がんを診断する方法であって、
インジウムおよびルテニウムから選択される金属ラジオアイソトープに錯形成したアミド化ガストリンを備える、アミド化ガストリン−金属ラジオアイソトープ錯体を患者に投与するステップと、
前記アミド化ガストリン−金属ラジオアイソトープ錯体が前記ＣＣＫ受容体に結合するようにさせるステップと、
前記アミド化ガストリン−金属ラジオアイソトープ錯体内の前記金属ラジオアイソトープの存在を検出するステップと、を含み、
前記金属と結合した前記アミド化ガストリンが、共役、錯形成、あるいはキレート基と関与しないことによって、前記ＣＣＫ受容体陽性がんを診断する方法。
【請求項２２】
非アミド化ガストリンの受容体を検出する方法であって、
インジウムおよびルテニウムから選択される金属ラジオアイソトープに錯形成した非アミド化ガストリンを備える、非アミド化ガストリン−金属ラジオアイソトープ錯体を患者に投与するステップと、
前記非アミド化ガストリン−金属ラジオアイソトープ錯体が前記受容体に結合するようにさせるステップと、
前記非アミド化ガストリン−金属ラジオアイソトープ錯体内の前記金属ラジオアイソトープの存在を検出するステップと、を含み、
前記金属と結合した前記非アミド化ガストリンが、共役、錯形成、あるいはキレート基と関与しないことによって、前記非アミド化ガストリンの受容体を検出する方法。
【請求項２３】
前記錯体が、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴによって検出される、
請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ラジオアイソトープが、１０９Ｉｎ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕおよび１０６Ｒｕよりなる群から選択される、
請求項２１乃至２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
アミド化ガストリンまたは非アミド化ガストリンが、特徴的なガストリンのペンタグルタミン酸配列における５つのグルタミン酸残基のうち少なくとも３つを備えている、
請求項１乃至２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記金属と結合した、アミド化ガストリンまたは非アミド化ガストリンが、共役、錯形成、あるいはキレート基と関与しない、
請求項１乃至２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記金属と結合したガストリンペプチドが、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＨＹＮＩＣ、およびテトラアミンキレート基を備えない、
請求項１乃至２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ガストリンが、ミニガストリン１１若しくはミニガストリン１１類似体、デモガストリン若しくはデモガストリン類似体、および、ミニガストリン若しくはデモガストリンと共役していないＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＨＹＮＩＣよりなる群から選択されない、
請求項１乃至２７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療及び検出方法におけるルテニウムまたはインジウムとガストリンとの高親和性結合の利用、及び、前記ガストリン及び結合されたルテニウムまたはインジウムからなる錯体に関する。特に、排他的ではないが、本発明は、ルテニウム及びインジウムの結合を用いた、高濃度の非アミド化ガストリンまたはガストリン受容体に関係した病気の治療または診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書における背景技術の参照は、そのような技術がオーストラリアまたは他の場所での技術常識を構成することを認めるものとして解釈されるべきでない。
【０００３】
ガストリン、あるいはＧアミド（Gamide）は、消化管ペプチドホルモンとして知られ、元は胃酸分泌の刺激剤として発見された（Dockray, 2001）。それは主として胃幽門洞のＧ細胞によって、及び、小腸上部の不定の範囲で、結腸及び膵臓内ではさらに少ない量で産生される。関連したホルモンのコレシストキニン（ＣＣＫ）は、結合するＣＣＫ１受容体を通じて膵臓酵素分泌の興奮の原因となるが、ガストリンと同じＣ末端テトラペプチドアミドを有する。Ｇアミドによって活性化された胃酸分泌は、コレシストキニン−２（ＣＣＫ−２）受容体によって媒介される。
【０００４】
ヒトのＣＣＫ−２Ｒ（４４７アミノ酸）は、ヒトのＣＣＫ−１Ｒ（４２８アミノ酸）と同一のアミノ酸配列を４６％共有し、両者は典型的な７回膜貫通ドメイン受容体である。ＣＣＫ１Ｒ及びＣＣＫ２Ｒの両者と高い親和性で結合するために必要な最小配列は、アミド化したＣ末端テトラペプチドＴｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅである。ＣＣＫ１Ｒは非硫酸化ＣＣＫ８よりも硫酸化ＣＣＫ８と５００倍も親和して結合する一方で、ＣＣＫ２Ｒにとってのその差は１０倍だけという事実から、二つの受容体は容易に区別され得る。
【０００５】
ヒトのガストリンの活性型の産生は、大きな前駆体分子であるガストリン遺伝子の最初の翻訳産物、プレプロガストリン（１０１アミノ酸）で始まる。プレプロガストリンは、Ｎ末端シグナルペプチドの開裂によってプロガストリン（８０アミノ酸）に転換され、プロガストリンはさらに分泌小胞内でエンドペプチダーゼ及びカルボキシペプチダーゼによってグリシン伸長ガストリンを生成するように加工される。グリシン伸長ガストリン（Ｇｇｌｙ）のＣ末端は、それからペプチジルα−アミド化モノオキシゲナーゼによってアミド化され、さらにタンパク質開裂が成熟アミド化ガストリン（ZGPWLEEEEEAYGWMDFamide, Ｇアミド（Gamide））となる。健康なヒトにおいて、プロガストリン及びグリシン伸長ガストリンは、ガストリン循環の１０％未満を構成する。
【０００６】
Ｇアミド／ガストリンは、胃上皮にとって重要な成長因子であり、胃及び近位小腸のＥＣＬ細胞の増殖と、胃壁細胞移動を活性化するとして知られている。これらの増殖効果は、ゾリンジャー・エリソン症候群のような病気の長期の高ガストリン血症に二次的なカルチノイド腫瘍形成をもたらす。ヒトの卵巣腺がんの８０％はＧアミドとＣＣＫ２受容体を同時発現するという近年の報告は、多くの胃がんはＧアミドを自己分泌増殖因子として利用できるであろうと示唆している（Goetze JP, 2013）。
【０００７】
前駆体であるプロガストリン及びそのグリシン伸長ガストリン誘導体（Ｇｇｌｙ）は、従来、生理的に不活性だと考えられてきた。しかし、データが蓄積し、Ｇｇｌｙのようなこれらガストリン前駆体はいくつかのがん細胞株の増殖を活性化することを示唆した（Aly A, 2004）（Ferrand A, 2006）。
【０００８】
プロガストリンとＧｇｌｙの大きな生理的役割は、結腸内では、プロガストリン及びＧｇｌｙはイン・ビトロ（in vitro）で結腸細胞株の（Hollande F, 1997）、イン・ビボ（in vivo）で正常粘膜の（Wang TC, 1996）（Koh TJ, 1999）増殖を活性化する。このような非アミド化ガストリンは、大腸がんの成長因子としても機能する（Aly A, 2004）。Wangらは、イン・ビボで正常結腸組織における前駆非アミド化ガストリンの成長効果を実証した（Wang TC, 1996）。例えば、ガストリン不足マウスへのＧｇｌｙの注入は、増殖指数を８０％増加させたが、ガストリン／Ｇｇｌｙの注入は結腸の増殖指数に影響を及ぼさなかった。ヒトのプロガストリンを過剰発現するトランスジェニックマウスは、高濃度の循環プロガストリンと、通常濃度のガストリン／Ｇアミドを肝臓内に有する。これらのマウスは、野生型マウスに比べ、深い陰窩と、近位及び遠位結腸の両方における上昇した増殖指数とともに肥厚性の結腸粘膜をもつ。同様の結果は、Ｇｇｌｙを過剰発現するトランスジェニックマウスについても報告された。
【０００９】
ガストリン遺伝子発生の上方制御は、大腸がん（ＣＲＣ）腫瘍形成に寄与し得る。不完全に加工されたガストリンの増大した濃度は、大腸ポリープと腺がん、及びＣＲＣ患者の循環に存在し、正常な結腸粘膜に細胞分裂促進作用を及ぼし、ＣＲＣ細胞株イン・ビトロ及びイン・ビボに示されている。ガストリンは、血管新生促進の（proangiogenic）性質も有している。ヒトの血管内皮細胞による細管形成はＧアミドとＧｇｌｙのいずれによっても高められる。ヒトのＣＲＣ細胞株のＧｇｌｙによる処理は、重要な血管新生因子、血管内包成長因子（ＶＥＧＦ）の発現を活性化することが示されており、Ｇｇｌｙを過剰発現するトランスジェニックマウスの結腸は、対照マウスと比較して、高レベルのＶＥＧＦ発現及び高い微小血管密度を示すことが実証されている。
【００１０】
これらのガストリン前駆体分子が大腸がんの発達に関与している間、ＣＣＫ−２受容体もまた、腫瘍型がＣＣＫ−２受容体を頻繁に発現させることが示されているがんの別のグループに関与する。特に、Reubiと協同者は、甲状腺髄様がん及び卵巣間質がんの９０％よりも多くが、そして星細胞腫及び小細胞肺がんの５０％よりも多くが、ＣＣＫ−２受容体陽性であることを示した（下の表を参照せよ）（Reubi JC, 1997）。
【表１】
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【００１１】
ＣＣＫ２Ｒ−陽性腫瘍の診断のための金属キレート共役したガストリン誘導体の利用についても、関心がもたれている（Roosenburg S, 2011）。例えば、キレート基１，４，７，１０−テトラアザシクロデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）がミニガストリン１１（D-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2）及び１１１Ｉｎまたは６８Ｇａで放射性標識されたミニガストリン（von Guggenberg E, 2012）と結合されている。このアプローチにとって不利なことの一つは、金属イオンの取り込みが厳しい環境（ｐＨ４．５，９８℃，１５分）を必要とし、潜在的にペプチドに酸化的損傷や組み替えを引き起こすことが示されている。
【００１２】
Ｕ．Ｓ．特許６，１８０，０８２号は、受容体依存の放射性標識された化合物及びそれらの腫瘍組織内の蓄積を、診断及び治療の両方に利用することを記している。コレシストキニン（ＣＣＫ）とソマトスタチンは、適した受容体依存性のペプチドとして開示されている。ＣＣＫがガストリンと関連したペプチドである間、ガストリンペンタグルタミン酸配列（gastrin pentaglutamate sequence）を失う。１１１Ｉｎ−ペンテトレオチドや様々なＤＯＴＡ及びＤＰＴＡの誘導体（有機キレート基）といった、既に利用可能な金属−キレート−ペプチド錯体の一列は、放射性金属と結合するように規定される。このような放射性核種と結合したペプチドキレートをより長い注入時間にわたって輸送することは、ボーラス注入よりも腫瘍組織への蓄積を改善に利点をもたらすと主張されている。
【００１３】
Roosenburg S（２０１１）は、とりわけ、ＣＣＫ及びガストリンペプチドの、放射性標識された化合物の利用を通じた、ＣＣＫ−２Ｒを発現するがんの可視化への利用を記載する。キレート剤のペプチドへの共役は、放射性金属による放射性標識を許容するために不可欠なステップとして議論されているが、いくつかのペプチド−キレート−金属錯体が存在するという欠点が説明されている。特に、特定の錯体は、生成物を形成するために、潜在的にペプチド構造を破壊する加熱のようなステップを必要とし、その他は、イン・ビボで乏しい安定性、及び／または腎臓損傷を引き起こす望ましくない腎臓蓄積を実証することが示されている。再度、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、そしてＨＹＮＩＣもまた、有機金属キレート基として記述されている。デモガストリン１及び２、テトラミン鎖（tetramine chain）がペプチド配列に共役した金属キレート剤群として機能するミニガストリン類似体はまた、放射性核種金属のようなテクネチウム（Ｔｃ）結合と関係しても議論される。
【００１４】
同様に、Fani M 2012は、放射性標識されたペプチドが、腫瘍受容体イメージング及び標的放射性核種治療にとって価値ある生物学的ツールとなり得ることを示した。ＣＣＫ及びガストリンペプチド類似体は議論され、Ｔｃ−デモガストリンならびにＩｎ−ＤＯＴＡミニガストリンは、金属に結合するキレート剤または補欠分子族の共有結合として記述される適切な放射性標識されたペプチドを発達させるメインステップの一つとともに一般的に使用される候補として、記述されている。適したキレート基の開発は、それゆえ、適切な有効性及びイン・ビボ安定性を有する放射性標識されたペプチドを対象にした受容体を生成する技術分野における重要な要素である。
【００１５】
Ｔｃ及びＩｎは、ペプチド錯体へのキレート基に取り付けるための放射性核種として使われてきたが、金属は一般的に様々な抗がん剤としてしばらくの間利用されてきたことが認識されるであろう。ＷＯ２００７／１０１９９７は、がん治療に用いるための新しいルテニウム（Ｒｕ）サンドイッチ錯体の開発を記述している。関連するＲｕサンドイッチ錯体は、錯体のハロ原子（a halo atom）の加水分解を通じてＤＮＡと直接結合し、それによってインターカレーション及び結合のために化合物を活性化することが示されると述べられている。ＷＯ２００７／１０１９９７の化合物は、より早い化合物のハロ原子に対応する部分が直ちに加水分解せず、そのためそれ自身が活性種である完全なサンドイッチ錯体であると考えられる点で、異なって作用する。こうした種のルテニウム原子は、完全に錯化され、そのためそれ自身は他の基に結合できない。それゆえ、Ｒｕサンドイッチ錯体は、活性化された錯体自体が何であったとしても、主に完全な状態のままでとどまり、ＤＮＡ結合を介して活動の直接モードに従う。
【００１６】
ガストリンは二つの第二鉄イオンと結合し、一つ目はＧｌｕ７と、二つ目はＧｌｕ８及びＧｌｕ９とである。第二鉄イオンは、Ｇｇｌｙのような、細胞増殖及び移動の刺激剤としてのペプチドの非アミド化形成の生物活性には不可欠である。それゆえ、Ｇｌｕ７からＡｌａへの置換、または鉄キレート剤デスフェリオキサミンによる治療は、完全にＧｇｌｙの生物活性をブロックする。対照的に、第二鉄イオンは、Ｇアミドの生物活性には必要ではない。Ｂｉ３＋イオンは、Ｇｇｌｙの鉄結合サイトを競うことで、イン・ビトロで、及びマウス及びラットの両方の正常な結腸粘膜内においてイン・ビボで、生物活性をブロックする。
【００１７】
付加金属イオン存在下のＧｇｌｙ蛍光測定によって検出されるように、ＧｇｌｙがＣｏ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、またはＣｒ（ＩＩＩ）とは結合しないことをBaldwinが示したように、Ｇｇｌｙの金属結合サイトは高選択的である（Baldwin GS, 2001）。また、プロガストリンがＣａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）またはＺｎ（ＩＩ）、またはＡｌ（ＩＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩＩ）またはＥｕ（ＩＩＩ）と結合しないことも、放射性５９Ｆｅ３＋イオンとの競合によって検出されるように示された（Baldwin G, 2004）。
【００１８】
Ｇｇｌｙ受容体の天然リガンドは、Ｇｇｌｙ自身よりも、第二鉄イオンがＧｇｌｙと結合するときに形成された錯体であってもよいことを、ＷＯ２００４／０８９９７６は開示している。これと、ＧｇｌｙはＣＣＫ−２受容体とは独立してその作用を有するという知見に基づき、Ｇアミドがその効果を有する場合、Ｇｇｌｙの生物活性をブロックするための酸化金属イオンの使用に基づく選択的治療を彼らは提案した。Ｂｉ３＋及びＧａ３＋についてのデータが与えられており、また、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｕ２＋及びＭｎ２＋イオンは蛍光を消失しないことが示され、２０等量のＡｌ３＋もＧｇｌｙのＮＭＲ信号に有意なシフトを起こさず、そのため三価イオン群内でさえもＧｇｌｙ金属イオン結合の予測できない性質が確認されたことが述べられている。これらの論じられたデータは、ｐＨ４において、第二鉄イオンの１０倍低い５．８μＭの親和性で、Ｇｇｌｙが二つのＢｉ３＋イオンと結合することを示している。
【発明の概要】
【００１９】
本発明は、少なくとも部分的に、ルテニウム及び／またはインジウム金属イオンが、Ｆｅ３＋イオン、さらにその上Ｂｉ３＋及びＧａ３＋について実験的に決定された値よりも数桁低い結合定数でガストリンと結合するであろうという驚くべき発見を根拠にしている。ルテニウム及びインジウムの両者は、アミド化及び非アミド化ガストリンの両者と同じぐらい有効な結合で結合するであろうことが見出されている。金属イオンの結合の大いに予測できない性質がガストリンによって与えられ、ルテニウム及びインジウム結合、及びそれらの著しくより強い結合の範囲は、先行技術からは予測され得なかった。
【００２０】
高親和性結合は、ルテニウムまたはインジウムが比較的温和な条件下で直接ガストリンに結合されるのを可能にし、それによって、ルテニウムまたはインジウムと結合したガストリンの、治療法として、または非アミド化ガストリン受容体の診断及び同定としての利用を可能にする。これは、キレート化ペプチドに放射性標識を導入するために普通厳しい環境を用いなければならない先行技術のペプチドキレート錯体よりも重要な利点を提供する。特に、ルテニウムまたはインジウムのガストリンへの結合は、アミド化または非アミド化ガストリンによって関連づけられ、もしくは引き起こされる様々な病気の治療を可能にする。
【００２１】
ルテニウムまたはインジウムとガストリンから形成される錯体は、放射性標識されたルテニウムまたはインジウムが使われる場合、ガストリンが結合する受容体を同定するプローブとして利用でき、それゆえ特定の病気を同定する診断ツールとしての利用が見いだせる。それゆえ、本発明のアプローチを用いると、ルテニウムまたはインジウムの高親和性結合は、金属がペンタグルタミン酸配列に直接結合するために金属キレートのガストリンペプチドへの結合を必要としないことを意味する。これは、プローブ／治療の合成を容易にし、ガストリンに対する損傷を最小化し、イン・ビボ安定性に対する懸念を低減する。
【００２２】
本発明のさらなる特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
本発明が容易に理解され実際的な効果に含まれるように、好ましい実施形態は、添付する図面の参照による例として説明される。
【図１】図１は、ガストリン結合の２サイトモデルを表している。
【図２】図２は、ＦｅＩＩＩ２ＧｇｌｙのＸＡＳのＫ端近傍のスペクトルである。
【図３】図３のＡ−Ｈは、Ｇｇｌｙで試験した金属錯体の一連のＥＸＡＦＳスペクトル（Ａ，Ｃ，Ｅ及びＧ）、及び対応するフーリエ変換（Ｂ，Ｄ，Ｆ及びＨ）であり、Ａ及びＢはＦｅ３＋イオン、Ｂ及びＣはＧａ３＋イオン、そしてＥ及びＦはＩｎ３＋イオン、そしてＧ及びＨはＲｕ３＋イオンである。
【図４Ａ】図４Ａは、ＦｅＩＩＩ２Ｇｇｌｙの提案された構造モデルである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＲｕＩＩＩ２Ｇｇｌｙの提案された構造モデルである。
【図５】図５は、Ｇａ３＋イオン添加に応じて記録された、ガストリンＧアミド及びＧｇｌｙの吸収変化のグラフ表示である。
【図６】図６は、様々な濃度におけるＩｎ３＋イオン存在下の、Ｆｅ３＋イオン添加に応じて記録された、ガストリンＧアミド及びＧｇｌｙの吸収変化のグラフ表示である。
【図７】図７は、様々な濃度におけるＲｕ３＋イオン存在下の、Ｆｅ３＋イオン添加に応じて記録された、ガストリンＧアミド及びＧｇｌｙの吸収変化のグラフ表示である。
【図８】図８は、Ｒｕ１０６−Ｇアミド錯体の精製を表しており、Ａは、Ｓｅｐ−Ｐａｋ分離後の様々なフラクションで見られる放射能、Ｂは、陰イオン交換ＨＰＬＣによるさらなる錯体精製を表しており、その各１ｍＬフラクション内の放射性はバーで示されている。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（定義）
他で定義されていない限り、本明細書中において用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における通常の技術を有する者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２５】
本明細書中において用いられる用語「ガストリン（gastrin）」及び「ガストリン類（gastrins）」は、プロガストリン、ならびにアミド化ガストリン（Ｇアミド）及び非アミド化ガストリン（グリシン伸長ガストリン）を表す。一実施形態においては、本用語はガストリンとガストリン様ペプチドを除いてもよく、それらは特徴的なペンタグルタミン酸配列の残基のいくつか、または全てを含んでいない。
【００２６】
本明細書中において用いられる用語「アミド化ガストリン」は、プロガストリンから誘導され、ペンタグルタミン酸配列を含み、そのうえ、配列ｔｒｐ−ｍｅｔ−ａｓｐ−フェニルアラニンアミド（phenylalanine-amide）をＣ末端に備えたガストリンを表す。そのようなアミド化ガストリンの例は、アミド化ガストリン３４及びアミド化ガストリン１７（Ｇアミド）を含むが、必ずしもこれらに限定されない。
【００２７】
本明細書中において用いられる用語「非アミド化ガストリン」は、プロガストリンであるかプロガストリンから誘導されて、ペンタグルタミン酸配列を備えるが、フェニルアラニンアミドをＣ末端に備えず、その範囲内にグリシン伸長ガストリンを含む、ガストリンを表す。そのような非アミド化ガストリンの例は、プロガストリン、ならびにグリシン伸長ガストリン１７（Ｇｇｌｙ）及び、グリシン伸長ガストリンのＮ−及びＣ−末端拡張型、ならびに残基５５から７２の間のプロガストリン配列から誘導される短いペプチドを含むが、必ずしもこれらに限定されない。
【００２８】
本明細書中において用いられる用語「ＣＣＫ受容体」、「ＣＣＫ−１受容体」、及び「ＣＣＫ−２受容体」は、コレシストキニン受容体群の一般または特定の亜類型を表す。
【００２９】
本発明の第１の態様によれば、高濃度の非アミド化ガストリンに関係した患者の病気の治療または予防の方法であって、インジウムおよびルテニウムから選択される金属の有効量を、前記患者に投与するステップを含む方法が、提供される。
【００３０】
前記金属が前記非アミド化ガストリンの鉄結合サイトに結合するように、前記患者に前記金属を投与する。
【００３１】
一実施形態においては、本方法は、前記非アミド化ガストリンに結合するルテニウム及びインジウムから選択された金属の投与を必要とすることを含む、そのような治療を必要とする患者を選択するステップを、さらに含む。
【００３２】
アミド化及び非アミド化ガストリンは、異なる組織内の別種の受容体を介して、異なる生物学的効果を引き起こす。アミド化ガストリン（Ｇアミド）は、胃酸分泌及び胃カルチノイドの発生を刺激する一方で、前駆体のグリシン伸長ガストリンは、結腸粘膜の増殖及び大腸がんの発生を刺激する。
【００３３】
上で議論したように、Baldwinはグリシン伸長ガストリン（Ｇｇｌｙ）が２つの第二鉄イオンと高い親和性をもって結合していることを示した（Baldwin, 2001）。鉄リガンドの同一性、それらの結合サイト、及び生物活性における第二鉄イオンの役割についての研究によって、Ｇｌｕ７が最初の第二鉄イオンの結合に重要であり、Ｇｌｕ８及びＧｌｕ９は二つ目の第二鉄イオンの結合に関することが特定された。Ｇｌｕ７がＡｌａに置換されたＧｇｌｙミュータント（ＧｇｌｙＥ７Ａ）の活性の完全な欠如、及び鉄キレート剤デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）によるＧｇｌｙ活性の抑制は、第二鉄イオンの結合がＧｇｌｙの生物活性に不可欠であることを示している。
【００３４】
実験のセクションで示される結果は、インジウム及びルテニウムのイオンが非アミド化ガストリンと予期できないほど高い親和性をもって結合するであろうことを実証する。Ｉｎ３＋は、Ｇｇｌｙの１つ目の鉄結合サイトについて２．１×１０−１３ＭのＫｄ値を有し、対してＦｅ３＋では５．７×１０−９Ｍである。Ｒｕ３＋は、Ｇｇｌｙの１つ目の鉄結合サイトについて５．３×１０−１５ＭのＫｄ値を有する。Ｉｎの親和性は、したがって、数桁高い。ある範囲の金属の結合親和性は、予測可能性の妥当なレベルを除き、非常に多様な結果（ヒ素やアンチモンのような他の１５族は高い親和性結合を示さなかった）で試験されたため、Ｉｎ３＋及びＲｕ３＋イオンの驚くべき高い親和性結合は、非アミド化ガストリンを含むガストリンに関連した病気の範囲の検出及び治療に有用なツールを提供する。
【００３５】
一実施形態においては、前記インジウム及びルテニウムは、＋３の形態、すなわちＩｎ３＋およびＲｕ３＋の形態である。
【００３６】
一実施形態においては、前記インジウムおよびルテニウムは、インジウムおよびルテニウムのラジオアイソトープである。
【００３７】
前記金属は自由イオンを含む溶液の一部、または前記金属が化合物や塩の構成要素であるようにして投与されてもよい。化合物は、解離またはそれ以外で、ガストリンへの結合に利用可能な金属を生成できるものであるべきである。
【００３８】
金属を含む化合物は、単体、錯体、または有機金属の塩もしくは錯体もしくはキレート、多形体、共結晶、またはそれらの複合体であってもよく、それは金属を放出することができるか、非アミド化ガストリンの一つまたは複数の第二鉄イオン結合サイトを占有できるようにすることができ、それゆえにそれらの生物活性をブロックする。有機金属錯体は、都合のよいキャリア、例えばシクロデキストリンに結合された三価金属イオンを含んでもよく、あるいは、抗体またはカチオンのようなターゲット分子が、キレート剤もしくはビピリジン及びターピリジンのルテニウム誘導体のような有機「ラッピング」分子に結合されてもよい。好適な薬学的に許容される単塩は、無機酸または鉱酸またはアンモニアなどのアルカリから誘導されうる。
【００３９】
インジウム及び／またはルテニウムの単純な錯体または塩は、酸化物、炭酸塩、セレン化物、硫酸塩、亜硫酸塩、硝酸塩、三臭化物、三塩化物、酢酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、サリチル酸塩、ガラート、没食子酸塩、グリシン酸塩、グルタミン酸塩、メシル酸塩、ピコリン酸塩、及びトシル酸塩から独立に選択されてもよい。
【００４０】
より大きな錯体は、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩ）塩［Ｒｕ（ＮＨ３）６］Ｃｌ２のような、インジウムまたはルテニウムのジ塩（disalts）を含むが、これらに限定されない。
【００４１】
別の形態では、インジウムまたはルテニウムのカチオンは、体からのクリアランス率を下げるため、あるいは基質からのカチオンの徐放を提供するために、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）やポリ乳酸のような様々な高分子に結合及び／または付着してもよい。
【００４２】
高濃度の非アミド化ガストリンに関係した病気は、Ｇｇｌｙの増加した血中濃度、分泌もしくは活性速度が一つまたは複数の症状の原因である任意の病状であってもよい。この病気は、細胞増殖、細胞移動、あるいは酸分泌を伴ってもよい。
【００４３】
好ましくは、前記病気は、大腸がん、ガストリノーマ、膵島細胞がん、卵巣間質腫瘍を含む卵巣腫瘍、下垂体腫瘍、または甲状腺髄様がん、星細胞腫、小細胞肺がん、髄膜腫、子宮内膜および卵巣腺がん、乳がん、消化管間質腫瘍、膵・消化管腫瘍のような、ＣＣＫ−２受容体から発現する腫瘍、萎縮性胃炎、Ｇ細胞過形成、悪性貧血、腎不全のような、血清ガストリンもしくはそれらの前駆体が上昇する病気、潰瘍性大腸炎のような胃腸粘膜に作用する病気といった、ガストリンを産生する腫瘍よりなる群から選択される。
【００４４】
非アミド化ガストリン前駆体は、結腸粘膜における増殖因子として作用することが知られているため、これらガストリン前駆体の特定の阻害剤は、潰瘍性大腸炎及び消化管がんのような胃腸増殖障害の治療として有用である。特に、長期にわたるガストリン濃度の上昇は大腸がんあるいは膵臓がんのリスクを上昇させることが知られている。特に、長期にわたるガストリン濃度の上昇は結腸がんあるいは膵臓がんのリスクを上昇させることが知られている。従って、本発明は、これらの病気の治療または予防に適用できる。結腸がんのリスクは、食事で脂肪または肉が多い個体、または家族性腺腫性ポリポーシスのような結腸がんの家族歴をもつ個体においても上昇し、彼らもそれゆえ本発明に関する予防的治療に適する候補者である。
【００４５】
非アミド化ガストリンはまた、アミド化ガストリンによる酸分泌の刺激を促進するので、特定の阻害剤は、胃食道逆流、胃カルチノイド、ゾリンジャー・エリソン症候群のような、プロトンポンプ阻害薬やＨ２ブロッカーで治療されるものを含む病気による、患者内の過剰酸産生の治療にも有用である。
【００４６】
本発明は、非アミド化ガストリンの生物活性をブロックする、新奇かつ予期できない方法を示す。インジウムまたはルテニウムによる非アミド化ガストリンの金属イオン結合サイトの占有は第二鉄イオンの結合を阻害し、それでペプチドを不活性化する。このアプローチの大きな長所は、不活性化の選択性である。Ｇｇｌｙ／Ｇアミド結合サイトを飽和させるために必要なルテニウムまたはインジウムのカチオンが低濃度のとき、他の生体内作用と結合していない金属イオンによる干渉はほとんどないであろう。
【００４７】
患者は、哺乳類、特にヒトまたは家畜またはコンパニオンアニマルとすることができる。本発明の化合物はヒトの医学的治療における使用に適すると特に考えられている一方で、これらは、イヌやネコのようなコンパニオンアニマル、及びウマ、ウシ、及びヒツジのような家畜、またはネコ科、イヌ科、ウシ科、及び有蹄動物のような動物園の動物の治療を含む、獣医学的治療にも適用できる。
【００４８】
Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition (2000), Williams & Williams, USAのような教科書に記載されているように、金属を含む医薬組成物の調製のための方法及び医薬担体は、当技術分野において周知である。
【００４９】
本発明の化合物及び組成物は、任意の適切な経路または投与形態（徐放投与形態を含む）によって投与されてもよく、当業者は、治療される病気の最も適切な経路及び用量を容易に決定することができるであろう。投薬は、担当医師または獣医の裁量であるだろうし、治療される病気の性質及び状態、治療される被験体の年齢及び全身の健康状態、投与経路、及び投与されうる任意の従来の治療法に依存するであろう。ボーラス注入及びＩＶ注入は、有用かもしれない、単なる二つのアプローチである。
【００５０】
キャリアまたは希釈剤、及びその他の賦形剤は、投与経路または投与形態に依存し、そして当業者は、各特定のケースについての最も適切な調合を容易に決定することができるであろう。
【００５１】
本発明は、病気を改善するために有用な、様々な医薬組成物を含む。本発明の一実施形態による医薬組成物は、本発明に係る金属または金属を含む化合物または誘導体、錯体、キレート、または塩、それらの共重合体、または本発明の化合物と一つまたは複数の他の薬学的に活性な物質の複合体を、キャリア、賦形剤、及び添加剤または補助剤を用いて、被験体に投与するのに適した形態にすることによって調合される。
【００５２】
たびたび用いられるキャリアまたは補助剤には、炭酸マグネシウム、ケイ酸アルミニウム・マグネシウム、二酸化チタン、二酸化ケイ素、ラクトース、マンニトール及びその他の糖類、タルク、乳タンパク質、ゼラチン、デンプン、ビタミン類、セルロース及びその誘導体、動物油類及び植物油類、ポリエチレングリコール類、及び、滅菌水、アルコール類、グリセロール及び多価アルコールといった溶媒類、を含むが、これらに限定されない。静脈内輸送手段は、水と栄養補充液を含む。防腐剤は、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガスを含む。他の薬学的に許容されるキャリアは、水溶液と非毒性賦形剤を含み、それは塩、防腐剤、バッファー、及び、例えば参照することにより内容が本書に含まれるRemington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed. Williams & Wilkins (2000)及びThe British National Formulary 43rd ed. (British Medical Association and Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, 2002; http://bnf.rhn.net)に記載されているような同種のものを含む。医薬組成物の様々な成分のｐＨ及び精密な濃度は、当技術分野の日常技術（routine skills）によって調製される。GoodmanとGilmanのThe Pharmacological Basis for Therapeutics (7th ed., 1985)を参照されたい。
【００５３】
医薬組成物は、好ましくは投薬単位で調製され、投与される。固体の投薬単位は、タブレット、カプセル、及び坐薬を含む。被験体の治療のため、化合物の活性、投与方法、障害の性質及び重さ、被験体の年齢及び体重に依存して、異なる一日量を用いることができる。特定の状況のもとでは、しかしながら、より高いもしくは低い一日量が投与されてもよい。一日量の投与は、個々の投薬単位の形態における単回投与または他のいくつかの小さな投薬単位によって、及び特定の間隔で細分化された投薬の複数の投与の両方によって行われることができ、あるいは拡張されたデポ（depot）もしくは徐放型で与えられてもよい。
【００５４】
本発明による医薬組成物は、局所的に、あるいは好ましくは、全身的に治療効果のある量で投与されてもよい。この使用に効果的な量は、もちろん、病気の重さ、及び被験体の年齢と全身状態に依存するであろう。典型的には、イン・ビトロで用いられる投薬量は、医薬組成物のイン・サイチュ（in situ）での投与に有用な量について有用な指針を提供することができ、また、動物モデルは、もしあれば細胞毒性の副作用の治療のための有効な投薬量を決定するために使用されてもよい。経口使用のための調合は、有効成分が不活性の固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリンとともに混合されている、硬ゼラチンカプセルの形であってもよい。それらは、有効成分が水、またはピーナッツオイル、流動パラフィンもしくはオリーブオイルといった油媒体と混合されている軟ゼラチンカプセルの形であってもよい。
【００５５】
水性懸濁液は、通常、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物中に活物質を含む。そのような賦形剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、キサンタンガム、トラガカントゴム及びアカシアゴム、ケイ酸マグネシウムのような懸濁化剤であってもよく；分散剤もしくは湿潤剤であってもよく、それは（ａ）レシチンのような天然に発生するリン脂質；（ｂ）アルキレンオキサイドと脂肪酸との縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンステアレート（polyoxyethylene stearate）；（ｃ）エチレンオキサイドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール（heptadecaethylenoxycetanol）；（ｄ）エチレンオキサイドと、脂肪酸及びヘキシトールから得られる部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート（polyoxyethylene sorbitol monooleate）、または（ｅ）エチレンオキサイドと、脂肪酸及びヘキシトール無水和物から得られる部分エステルとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（polyoxyethylene sorbitan monooleate）であってもよい。
【００５６】
医薬組成物は、無菌の注射可能な水性もしくは油性懸濁液の形であってもよい。この懸濁液は、既知の方法によって、適切な分散剤もしくは湿潤剤及び懸濁化剤を用いて調合されてもよい。無菌の注射可能な調合剤は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容される希釈剤もしくは溶媒の中の、無菌の注射可能な溶液もしくは懸濁液であってもよい。利用される好ましい輸送手段及び溶媒の中には、水、リンゲル液、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、無菌の不揮発性油は、溶媒もしくは懸濁媒体として慣習的に利用されている。この目的のために、合成モノグリセリドもしくはジグリセリドを含む、任意の無菌性の不揮発性油が用いられてもよい。加えて、オレイン酸のような脂肪酸が注射物質の調合剤に用いられてもよい。
【００５７】
本発明の金属はまた、様々な単純または複雑な輸送システムの形で投与されてもよく、それは小型の単層ベシクル、大型の単層ベシクル、及び多層ベシクルのようなリポソーム輸送システムを含むが、それに限定されるものではない。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンのような様々なリン脂質から形成され得る；注射可能なマイクロ粒子；ナノ粒子；マトリックスインプラント（matrix implants）及びデバイス及び／またはビードコーティング。これらの輸送システムは、本発明の金属の一定の放出、遅延放出、パルス放出、または順次的放出の、濃度を提供するように工夫されてもよい。キャリアもしくは原料は、シクロデキストリン類、乳酸−グリコール酸共重合体、ポリ無水物類、ポリ乳酸類、ポリオルトエステル類、及び、ＨＰＭＣまたは他のセルロース誘導体から構成されるヒドロゲル類、を含んでもよい。金属またはそれらを含む化合物は、抗体または受容体分子のようなターゲット分子に付着されてもよい。
【００５８】
金属の輸送形態、すなわち化合物、錯塩などは、金属をガストリンに結合できるようにするために、加水分解またはその他の解離が可能でなければならない。
【００５９】
本発明の金属の投薬量レベルは、通常、約０．００１ｍｇ〜約２５０ｍｇ／体重ｋｇのオーダーで、好ましい投薬量の範囲は、約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ／体重ｋｇ・日であろう（平均的な患者に１日あたり約０．１ｇ〜３ｇ）。一回の投薬を調製するためにキャリア原料と混合され得る活性な金属イオンの量は、治療されるホスト及び特定の投与方法に依存して変化するであろう。例えば、ヒトへの経口投与を意図した調合は、約１ｍｇ〜１ｇの活性な金属を、適切かつ好都合な量のキャリア材料とともに含んでもよく、それは組成物全体の約５〜９５％で変化してもよい。投薬単位の形態は、一般的に約１ｍｇ〜５００ｍｇの間で有効成分を含むであろう。
【００６０】
しかしながら、あらゆる特定の患者に対する特有の服用レベルは、使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、排出速度、薬の組み合わせ、及び治療を受ける特定の病気の重さ、を含む様々な要因に依存するであろう。
【００６１】
加えて、本発明の化合物のいくつかは、水または一般的な有機溶媒とともに溶媒和物を形成してもよい。そのような溶媒和物は、本発明の範囲に包含される。
【００６２】
本発明の化合物は、効き目のある組み合わせ、または共治療（co-treatment）のために他の化合物と追加的に組み合わせることができる。組み合わせが本発明の金属の活性に負の影響を与えない限り、薬学的に活性な物質の、化学的に混合可能な組み合わせを含むことが意図される。
【００６３】
本発明の第２の態様によると、非アミド化ガストリンの活性を調整する方法であって、インジウムおよびルテニウムから選択される金属を前記非アミド化ガストリンに結合させるステップを含む方法が提供される。
【００６４】
第１の態様に関してされた全てのコメントは、第２の態様にも同様に適用される。
【００６５】
非アミド化ガストリンの調節は、その通常の生物活性の低下であろう。これは、鉄結合サイトをブロックするルテニウムまたはインジウムによりもたらされ、鉄結合は通常活性に必要である。
【００６６】
本発明の第３の態様によると、ＣＣＫ受容体の過剰発現に関係した患者の病気の、治療または予防の方法であって、インジウムおよびルテニウムから選択される金属の有効量を、前記患者に投与するステップを含む方法が提供される。
【００６７】
金属は、アミド化ガストリンの鉄結合サイトに結合し、ＣＣＫ受容体とアミド化ガストリンとの結合時に受容体を提示する細胞内に金属が取り入れられるように、患者に金属を投与する。
【００６８】
一実施形態において、前記ＣＣＫ受容体は、ＣＣＫ−１もしくはＣＣＫ−２受容体である。
【００６９】
好ましくは、前記ＣＣＫ受容体はＣＣＫ−２受容体である。
【００７０】
Ｇｇｌｙに関して上述で論じたように、本発明者は、インジウムまたはルテニウムイオンが予期できないほど高い親和性をもってアミド化ガストリンとも結合することを見出した。Ｉｎ３＋は、Ｇアミドの１つ目の鉄結合サイトについて６．５×１０−１５ＭのＫｄ値をもち、対してＦｅ３＋では３．０×１０−１０Ｍであることを見出した。Ｒｕ３＋は、Ｇアミドの１つ目の鉄結合サイトについて２．６×１０−１３ＭのＫｄ値をもつことを見出した。どちらの金属も、したがって、鉄より数桁高い親和性で結合する。
【００７１】
本明細書で述べられる実施形態の恩恵は、ＲｕまたはＩｎがＧアミド自体のペンタグルタミン酸配列への結合の高い選択性及び親和性をうまく利用することにある。さらに、高親和性は、金属−ガストリン錯体の安定性の向上をもたらす。
【００７２】
ＣＣＫ受容体の役割は、腫瘍に関して既に議論されており、したがって、本発明はルテニウムまたはインジウムのカチオンを細胞毒性剤として利用することを可能にする。腫瘍がＣＣＫ−１もしくはＣＣＫ−２受容体陽性である場合、治療は、任意の結合した金属イオンとともに、一度ガストリン／Ｇアミドが結合するとＣＣＫ２Ｒが内在化されるという知見に基づくことができる。インジウム及びルテニウムの両方のイオンの場合で立証されているように、金属イオンが強くかつ不可逆的に結合しているならば、また十分に高い比放射能で放射性標識されているならば、細胞の内容に対する放射性損傷は細胞死に導きうる。この「トロイの木馬」アプローチにおいて、中間の半減期をもつβ粒子放射体は効果的である。ガストリン／Ｇアミドに付着したルテニウムまたはインジウムの結合、それからＣＣＫ２Ｒ発現腫瘍細胞との複合体は、多くの重要なＦｅ含有タンパク質及び酵素内のＦｅを置換するイオンの細胞内濃度の上昇を引き起こすことになり、それによって細胞の生存に必須な多数の細胞内プロセスを阻害することになる。
【００７３】
インジウムまたはルテニウムの放射性同位体は、そのような治療において望ましいが、必須ではない。ルテニウムは周期表において鉄のすぐ下であり、したがって最も近接している利用可能な鉄の同族体と予想できる。したがって、Ｒｕ−ＧアミドのＣＣＫ２Ｒ発現腫瘍細胞への結合は、多くの重要な鉄含有タンパク質及び酵素内の鉄を置換するルテニウムの細胞内濃度の上昇を引き起こすことになり、それによって細胞の生存に必須な多数の細胞内プロセスを阻害することになる。同様の干渉効果は、インジウムイオンからも得られるであろう。
【００７４】
したがって、一実施形態において、インジウム及びルテニウムはラジオアイソトープである。
【００７５】
治療される病気は、ＣＣＫ受容体に関する任意の病気であってもよく、第１の態様に列挙された、ＣＣＫ受容体の発現に関する病気を含む。組成物、投薬及び輸送形態は、第１の態様について記載されたものであってもよい。
【００７６】
一実施形態において、アミド化ガストリンと接触されたとき、金属はキレート基と結合しない。すなわち、金属は、ペプチド−キレート複合体または錯体の成分として輸送されない。そのような、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＨＹＮＩＣ及びテトラアミンを含むキレート基は、本明細書で議論される。
【００７７】
本発明の第４の態様は、インジウムおよびルテニウムより選択される金属を、ＣＣＫ受容体を発現する細胞の内部に輸送する方法であって、アミド化ガストリンを前記金属と接触させてそこへ結合させ、結合された金属とともに前記アミド化ガストリンを前記ＣＣＫ受容体に接触させて、前記細胞に取り入れさせるステップを含む方法にある。
【００７８】
第４の態様は、第３の態様で記述されたように与えられてもよく、列挙された全ての要素は、したがって、第４の態様に明確に繰り返されると考えられる。
【００７９】
本発明の第５の態様によると、ガストリン−金属錯体を形成する方法であって、ガストリンをインジウムおよびルテニウムから選択される金属と接触させるステップを含む方法が提供される。
【００８０】
本発明の第６の態様は、ガストリンと、前記ガストリンの鉄結合サイトに結合したインジウムおよびルテニウムから選択される金属と、を備える錯体にある。
【００８１】
第５及び第６の態様の一実施形態において、ガストリンはアミド化ガストリンである。
【００８２】
第５及び第６の態様のその他の実施形態において、ガストリンは非アミド化ガストリンである。
【００８３】
本発明のガストリン−ルテニウム及びガストリン−インジウム錯体は、それらの高親和性結合のために驚くほど安定であることが見出されている。グリシン伸長gastrin17と三価金属イオンとの錯体の構造は、Ｘ線吸収微細構造分光法によって決定されており、実験のセクションで議論される。この高い親和性はまた、金属をガストリンに結合させるために温和な状態を用いることができ、そのためペプチドへの損傷がはるかに起こりにくいことを意味する。
【００８４】
本発明の第７の態様は、ＣＣＫ受容体陽性がんを診断する方法であって、
(i) インジウムおよびルテニウムから選択される金属ラジオアイソトープに錯形成したアミド化ガストリンを備える、アミド化ガストリン−金属ラジオアイソトープ錯体を患者に投与するステップと、
(ii) 前記アミド化ガストリン−金属ラジオアイソトープ錯体が前記ＣＣＫ受容体に結合するようにさせるステップと、
(iii) 前記アミド化ガストリン−金属ラジオアイソトープ錯体内の前記金属ラジオアイソトープの存在を検出するステップと、を含み、
それによって前記ＣＣＫ受容体陽性がんを診断する方法にある。
【００８５】
本発明の第８の態様は、非アミド化ガストリンの受容体を検出する方法であって、
(i) インジウムおよびルテニウムから選択される金属ラジオアイソトープに錯形成した非アミド化ガストリンを備える、非アミド化ガストリン−金属ラジオアイソトープ錯体を患者に投与するステップと、
(ii) 前記非アミド化ガストリン−金属ラジオアイソトープ錯体が前記受容体に結合するようにさせるステップと、
(iii) 前記非アミド化ガストリン−金属ラジオアイソトープ錯体内の前記金属ラジオアイソトープの存在を検出するステップと、を含み、
それによって前記非アミド化ガストリンの受容体を検出する方法にある。
【００８６】
第７及び第８の態様に関して、ＣＣＫ受容体陽性がんまたは非アミド化ガストリン受容体の検出は、ＲｕまたはＩｎのガストリンへの結合の高選択性及び高親和性を経由して達成される。
【００８７】
結合は、ミニガストリン１１には存在しないガストリンのペンタグルタミン酸配列に対してであるため、上述の８つの態様の任意の１つの一実施形態において、ガストリンはミニガストリン１１またはミニガストリン１１類似体ではない。有利なことに、ラベリングは室温で急速に生じ、そのためペプチドが損傷を受けることは起こりそうもない。特に、高親和性は金属−ガストリン錯体の安定性向上をもたらし、それによって先行技術の金属キレート基と結合したガストリンの欠点の一つを回避する。少なくとも下に示すＲｕ及びＩｎ同位体は、単光子放出コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）またはポジトロン放出型断層撮影法（ＰＥＴ）によって、ガストリン結合受容体、及びそれらを示すＣＣＫ２Ｒ陽性腫瘍を含む細胞の場所によく適合されるであろう。
ＳＰＥＣＴは１１１Ｉｎ−Ｇアミド（γエミッター、ｔ１／２＝６７ｈ）、９７Ｒｕ−Ｇアミド（γエミッター、ｔ１／２＝６５ｈ）である。
ＰＥＴは１０９Ｉｎ−Ｇアミド（βエミッター、ｔ１／２＝４．３ｈ）である。
【００８８】
したがって、腫瘍がＣＣＫ−１もしくはＣＣＫ−２受容体陽性である場合、Ｇアミドとルテニウムまたはインジウムの適した放射性同位体との錯体はＰＥＴもしくはＳＰＥＣＴによって原発腫瘍もしくはその転移を示すために診断上利用できるかもしれない。
【００８９】
前記ラジオアイソトープは、１０９Ｉｎ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕおよび１０６Ｒｕよりなる群から選択される。
【００９０】
本明細書中において示されるデータは、ＲｕまたはＩｎの放射性同位体が、単光子放出コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ，９７Ｒｕ，１１１Ｉｎ）及びポジトロン放出型断層撮影法（ＰＥＴ，１０９Ｉｎ）におけるＣＣＫ受容体プローブとしての利用のために、アミド化ガストリンと直接錯化できることを示す。当技術分野で知られているように、運搬可能なジェネレータの使用は、このアプローチをより実行可能にする。このアプローチの一つの長所は、錯形成が室温で急速に進行するためにペプチドに対する酸化的損傷が防がれるであろうことである。
【００９１】
豊富な構造−ＣＣＫ２Ｒに利用可能な機能情報とは対照的に、プロガストリン及びＧｇｌｙといった非アミド化ガストリンの受容体の同一性は、未だ議論を呼んでいる。Ｇｇｌｙ及びプロガストリンがＲｕ及びＩｎ金属の両方と高親和的に結合するという認識は、非アミド化ガストリン受容体の同定のための新奇なツールを提供する。上に示したＲｕ及びＩｎ同位体は、腫瘍及びそのような受容体を発現する他の病気状態の場所に、そしてそれに続くＳＰＥＣＴまたはＰＥＴによる同定に、よく適すると予想される。
【００９２】
上述の８つの態様の任意の一つまたは複数の一実施形態において、アミド化もしくは非アミド化ガストリンは、少なくとも特徴的なガストリンペンタグルタミン酸配列の５つのグルタミン酸残基の中の３つを含む。
【００９３】
上述の８つの態様の任意の一つまたは複数の一実施形態において、アミド化もしくは非アミド化ガストリンは、少なくとも特徴的なガストリンペンタグルタミン酸配列のうち４つまたは５つのグルタミン酸残基を含む。
【００９４】
上述の８つの態様の任意の一つまたは複数の一実施形態において、アミド化もしくは非アミド化ガストリンは、ペンタグルタミン酸配列を備える。
【００９５】
ペンタグルタミン酸配列及び関心のあるガストリン内で実際にそこに含まれるグルタミン酸残基の数に関する上述の３つの記述は、放射性金属と結合したガストリンが、患者への投与のような利用の前に実際に生成される実施形態に、特に適用可能である。これに関して、本発明の錯体及び方法に用いられるガストリンは、ミニガストリン１１のような、ペンタグルタミン酸配列を含まないガストリン誘導体からははっきりと区別される。
【００９６】
ペンタグルタミン酸配列の全ての５つのグルタミン酸残基が存在することは、必須でなくてもよい。例えば、ａｌａで置換されたｇｌｕ６をもつＧｇｌｙは、親ペプチドと同程度の親和性で２つのＦｅと依然結合する。特定の残基が特に重要であると本実験において観察された一方で、特徴的なペンタグルタミン酸配列の天然のグルタミン酸残基のうち３つが本発明の錯体及び方法に用いられるガストリン内に存在する間、よい結果が得られるであろう。しかし、天然グルタミン酸残基の、少なくとも４つ、さらに好ましくは５つ全てが、天然ペンタグルタミン酸配列の形態に存在することが望ましい。
【００９７】
上述の８つの態様の任意の一つまたは複数において、アミド化もしくは非アミド化ガストリンは、キレートフリーである。すなわち、ガストリンは、ルテニウムもしくはインジウムが結合するまたは結合するように意図されているキレートもしくは補欠分子族と、結合、錯化、あるいはその他で関連していない。再度、これは、本発明で使用されているのとは根本的に違うメカニズムによって、金属と結合及び輸送する先行技術のミニガストリン１１−ＤＯＴＡ及び類似のアプローチと区別する。
【００９８】
特定の実施形態において、したがって、上述の８つの態様の任意の一つまたは複数におけるガストリンはＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＨＹＮＩＣもしくはテトラアミンキレート基を備えない。
【００９９】
特定の実施形態においては、上述の８つの態様の任意の一つまたは複数におけるガストリンは、ミニガストリン１１若しくはミニガストリン１１類似体、デモガストリン若しくはデモガストリン類似体、および、ミニガストリン若しくはデモガストリンと共役していないＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＨＹＮＩＣよりなる群から選択されない。
【０１００】
本発明が、ルテニウムまたはインジウムの「未修飾」ガストリンへの直接結合を利用し、金属結合を可能にするために特異的に付加された任意の基との結合に対する必要性を避ける点は、大きな長所である。これは、ガストリン自体がガストリン／金属錯体の調製の間に損傷されにくく、イン・ビボ安定性を有意に改善する可能性があることを意味する。
【０１０１】
本発明は、以下の非限定の実施例及び図面のみを参照して詳細に記述されることになる。
【０１０２】
上述の個々のセクションで述べられた本発明の様々な特徴及び実施形態は、必要に応じて、変更すべきところは変更して、他のセクションにも適用される。したがって、一セクションで明記された特徴は、他のセクションで明記された特徴と、必要に応じて組み合わせてもよい。
【０１０３】
以下の実施例は、説明を目的として提供されるもので、少しも本発明の範囲を限定するものではない。
【０１０４】
（実験）
（材料及び方法）
（ペプチドと金属イオン）
Ｇアミド及びＧｇｌｙ（それぞれ純度８８％及び９３％）は、Ａｕｓｐｅｐ（Ｃｌａｙｔｏｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入された。不純物は水及び塩から成っていた。１０ｍＭ塩酸（ＨＣｌ）中において、金属イオン（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の溶液は調整され、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｐｙｍｂｌｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）において、高周波誘導結合プラズマ発光分光分析法を用いて、それらの濃度は測定された。Ｒｕ１０６（６Ｍ塩酸中２ｍＣｉ／ｍｌ）は、Ｅｃｋｅｒｔ＆Ｚｉｅｇｌｅｒ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）から購入された。
【０１０５】
（吸光分光法）
金属イオンの濃度上昇下において、ペプチド（１０ｍＭ酢酸ナトリウム中１０μＭ、ｐＨ４．０、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む）の２８０ｎｍ吸光は、バッファーブランクに対して、２９８Ｋに温度調節された１ｍｌ石英キュベット内において、Ｃａｒｙ  ５  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｖａｒｉａｎ、Ｍｕｌｇｒａｖｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて測定した。
【０１０６】
（Ｘ線吸光試料の調整、分光法、及び分析）
Ｘ線吸光分光法（ＸＡＳ）に用いるサンプルは、１ｍＭペプチド、５０ｍＭＭＯＰＳ、１０％ＤＭＳＯ、及び凍結保護材として２０％グリセロールとして、調整された。金属ストック溶液は、対応する硝酸塩を用いて調節され、終濃度２ｍＭまで増量された。データ収集後、比較のため、２ｍＭのＧａまたはＩｎを含有するサンプルは、さらに、１ｍＭ鉄を用いて滴定された。データ収集前に、すべてのサンプルは、液体窒素中において凍結された。ＸＡＳ測定は、略４５０ｍＡ、３．０ＧｅＶのＳＰＥＡＲストレージリングを用いて、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいて、データ取得プログラムＸＡＳ  Ｃｏｌｌｅｃｔ(29)を使用して、行われた。鉄、ガリウム、及びインジウムのＫ殻のデータは、２０−ｐｏｌｅ  ２  Ｔｅｓｌａ  ｗｉｇｇｌｅｒ  ｓｏｕｒｃｅを用いて作動しケイ素二結晶分光器を採用している構造分子生物学的ＸＡＳビームライン７−３上において、収集された。鉄及びガリウムの分光法に関して、下流の垂直方向に平行なロジウムコートミラーは、高調波がカットオフより上に落ちるように、高調波除去のために採用された。入射Ｘ線強度は、窒素充填イオン化チャンバーを用いてモニターされ、Ｘ線吸光は、３０個のゲルマニウム検出器のアレイを使用して、Ｘ線Ｋα蛍光励起スペクトル（Ｘ−ｒａｙ  Ｋα  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ）として、測定された。Ｘ線蛍光は、ソーラースリットアセンブリ（Ｓｏｌｌｅｒ  ｓｌｉｔ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）を介して収集され、検出器を用いて記録された固有のサンプル蛍光は、６または９吸光ユニット厚さ（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｕｎｉｔ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）（鉄についてマンガン、ガリウムについて亜鉛、及び、インジウムについて銀）のフィルターを用いて除去した。データ収集の間、サンプルは、液体ヘリウムフロークライオスタット（ｌｉｑｕｉｄ  ｈｅｌｉｕｍ  ｆｌｏｗ  ｃｒｙｏｓｔａｔ）（Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、略１０Ｋの温度に維持された。それぞれのデータセットは、それぞれのサンプルについて６〜９の走査を累積し、エネルギーは、それぞれの走査と同時に測定した同じ元素の基準薄片の吸光を基準として、キャリブレーションされた（鉄について７，１１１．３、ガリウムについて１０，３６８．２、インジウムについて２７，９４０．０ｅＶを最も低いエネルギー変曲点と仮定する）。
【０１０７】
ＥＸＡＦＳ振動χ（ｋ）は、ＦＥＦＦｖ８．２０ｘ５（Ｒｅｈｒ、１９９１）を使用して計算される基本的な（ａｂ  ｉｎｉｔｉｏ）理論的位相及び振幅関数を用いた公知の方法（Ｇｅｏｒｇｅ、１９９６）に従ったコンピュータプログラムのＥＸＡＦＳＰＡＫ  ｓｕｉｔｅ（http://www-ssrl.slac.stanford.edu/exafspak.html）を使用したカーブフィッティングを用いて、定量的に分析された。拡張Ｘ線吸光微細構造（ＥＸＡＦＳ）の振動（ｋ＝０Å−１）のエネルギー閾値は、鉄について７，１３０、ガリウムについて１０，３８５、インジウムについて２７，９６０ｅＶと仮定された。鉄のデータは、１４．２Å−１のＫ範囲に収集され、ガリウムは１４．０Å−１のＫ範囲、及び、インジウムは１６．２Å−１のＫ範囲に収集された。
【０１０８】
（Ｓｅｐ−Ｐａｋ精製）
Ｒｕ１０６−Ｇアミド錯体（Ｒｕ１０６−Ｇアミド  ｃｏｍｐｌｅｘ）は、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）中、２５０ｐｍｏｌのＲｕ１０６及び２５０ｐｍｏｌのＧアミドを、室温において、ｐＨ４．０で1時間インキュベートすることによって作製され、逆相Ｃ１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  Ｃ１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ）（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）上において精製された。Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジは、まず、１０ｍＬのバッファーＡ（１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４）、１０ｍＬのバッファーＢ（１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４、５０％アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ））、及び、１０ｍＬのバッファーＡの通過により、活性化された。次に、反応混合物（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ）が通過され、カートリッジは、未結合のＲｕ１０６を除去するために１０ｍＬのバッファーＡを用いてウォッシュされた。Ｒｕ１０６−Ｇアミド錯体は、バッファーＢを用いて溶出され、そして、β−ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）を用いて連続したフラクション中（それぞれ１ｍＬ）の放射能を測定した。フラクション１及び２は、Ｒｕ１０６−Ｇアミド錯体を含有し、ＨＰＬＣに注入される前に、バッファーＡを用いて希釈され、２回ろ過されるか、または、結合アッセイ用に結合バッファー（下記参照）に再懸濁される前に、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ（Ｓａｖａｎｔ、Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ、ＮＹ）中において、２ｍＬから略１００μＬまで結合及び乾燥される。
【０１０９】
（ＨＰＬＣ精製）
Ｒｕ１０６−Ｇアミド錯体（以下においてさらに論じる）は、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＰａｋＱ  ８ＨＲ（５×５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上において、アニオン交換ＨＰＬＣを用いて、バッファーＡ中において０Ｍから１Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の勾配を用いて５５分間に渡り流速１ｍＬ／ｍｉｎで、精製された。１ｍＬフラクション中における放射能は、β−ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）を用いて測定された。
【０１１０】
（カーブフィッティングと統計）
データ（平均±標準誤差でテーブルされる）は、ＢｉｏＥｑｓプログラムを用いて１サイトまたは２サイト順序モデル（ｏｎｅ−ｓｉｔｅ  ｏｒ  ｔｗｏ−ｓｉｔｅ  ｏｒｄｅｒｅｄ  ｍｏｄｅｌｓ）（図１のように）にフィッティングされた。実験的に決定された平衡定数、及び、ＧアミドまたはＧｇｌｙと第二鉄イオンとの相互作用についてテーブル1に示される吸光度比は、第二鉄イオン存在下において他の金属イオンとＧアミドまたはＧｇｌｙとの相互作用を示すデータをフィッティングする間中、一定に保たれていた。
【０１１１】
（結果）
（ガストリンへの金属イオンの結合）
イオン結合：Ｆｅ３＋イオンの添加が吸光スペクトルに及ぼす影響と、ｐＨ４．０におけるＧアミド及びＧｇｌｙの蛍光と、はすでに報告されている（Ｂａｌｄｗｉｎ、２００１）。蛍光データの線形変換（ｌｉｎｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のフィッティングは、図１に示すように、μＭ親和性（μＭ  ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ）の２結合サイトに一致していた。材料及び方法のセクションに記載したように、新しい吸光データセットが取得され、Ｂｉｏｅｑｓプログラムを用いてフィッティングされた。適切なフィッティングは、Ｇアミドについては３．０×１０−１０及び８．５×１０−１１Ｍ、及び、Ｇｇｌｙについては５．７×１０−９及び７．０×１０−９Ｍの親和性を用いて、取得された（テーブル１）。図１に示すように、２サイトモデルにおいて、ガストリンは、解離定数がＫｄ１Ｍ及びＫｄ２Ｍである２つの金属イオンに結合している。２サイト競合モデルにおいて、ガストリンは、解離定数がＫｄ１Ｆｅ及びＫｄ２Ｆｅである２つの第二鉄イオンに結合しており、さらに、解離定数がＫｄ１Ｍ及びＫｄ２Ｍである２つの同じサイトに金属イオンＭを結合している。解離定数Ｋｄ３Ｍは、混合鉄ガストリンＭ錯体（ｍｉｘｅｄ  ＦｅＧａｓｔｒｉｎＭ  ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成されていることを示す。
【０１１２】
（Ｆｅ２ＧｇｌｙのＥＸＡＦＳ特性）
ＦｅＩＩＩ２Ｇｇｌｙ（図２）のＸ線吸光スペクトルＫ端近傍スペクトル（ＸＡＳ  Ｋ−ｅｄｇｅ  ｎｅａｒ  ｅｄｇｅ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ）は、１ｓ→３ｄ（ｔ２ｇ）及び１ｓ→３ｄ（ｅｇ）遷移に起因する７，１１４ｅＶを中心とするプレエッジピーク（ｐｒｅ−ｅｄｇｅ  ｐｅａｋｓ）を示す。これらのピーク間における比較的大きな分離（Δ＝１．２ｅＶ）は、低いｔ２ｇレベルに比較して、ｅｇレベルの上昇に起因し、低スピン第二鉄イオンの指標となる。この大きな分離は、また、第二鉄イオンがグルタミン酸側鎖のカルボキシレート供与体（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｄｏｎｏｒｓ）によって主に配位されるという予想にも一致する。
【０１１３】
ＦｅＩＩＩ２ＧｇｌｙのＥＸＡＦＳデータ（図３Ａ―  Ｇｇｌｙ錯体についてのＫ端拡張Ｘ線吸光微細構造（ＥＸＡＦＳ）スペクトル（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、黒塗り太線）、及び、Ｇｇｌｙと、Ｆｅ３＋イオン（Ａ、Ｂ）、Ｇａ３＋イオン（Ｃ、Ｄ）、Ｉｎ３＋イオン（Ｅ、Ｆ）またはＲｕ３＋イオン（Ｇ、Ｈ）との錯体に対応するフーリエ変換（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）は、テーブル２に示す散乱経路パラメーターを使用して計算された最良のフィッティング（赤色／薄く、かつ細い線）と共に表される。）は、２Å直下のＦｅ−Ｏ後方散乱相互作用（Ｆｅ−Ｏ  ｂａｃｋｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｊｕｓｔ  ｂｅｌｏｗ  ２Å）及び〜３．３Åの外殻後方散乱Ｆｅ…Ｆｅ相互作用（ｏｕｔｅｒ  ｓｈｅｌｌ  ｂａｃｋｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  Ｆｅ…Ｆｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｔ  〜３．３Å）によって支配されている。データへの最良のフィッティングは、１．９０Åの２つの短いＦｅ−Ｏ後方散乱相互作用、２．０３Åの４Ｆｅ−Ｏ、２．５７Åの１Ｆｅ…Ｃ相互作用（テーブル２）を含む単一散乱経路を使用して取得された。構造パラメーターは、メタンモノオキシゲナーゼ（ｍｅｔｈａｎｅ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）、及び、鉄原子が比較的近くにあり、金属中心の間を架橋するカルボキシレートを含む複数のカルボキシレートによって結合されている、ジ−鉄錯体（ｄｉ−ｉｒｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）に類似するような、ジ−第二鉄−非ヘム鉄結合タンパク質（ｄｉｆｅｒｒｉｃ  ｎｏｎ−ｈｅｍｅ  ｉｒｏｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を連想させる。ＥＸＡＦＳデータに顕著に現れる配位リガンドの数（ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ）、及び、より長い範囲のＦｅ…Ｃの散乱相互作用に基づいて、２つの第二鉄イオンは、少なくとも１つの架橋カルボキシレートを有するカルボキシレート供与体によって、主に結合された。核内分離（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅａｒ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）は、Ｆｅ３＋への単座デカンテートカルボキシレート供与体（ｍｏｎｏ−ｄｅｎｔａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｄｏｎｏｒｓ）もまた同様の錯体において、この原子間距離の範囲に近づくことができるので、この場合には特に診断的（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）ではないが、場合によってはＯ２−またはＯＨ−として、酸素原子の架橋を示す可能性がある、より短いＦｅ−Ｏ結合長さ（１．９０Å）の包含についての明確な優先もある。
【０１１４】
ＥＸＡＦＳデータは、単一Ｆｅ…Ｆｅ後方散乱相互作用（Ｆｅ…Ｆｅ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を用いると最もフィッティングされた。この観察は、図３に示すＥＸＡＦＳのデータに基づいたＦｅＩＩＩ２Ｇｇｌｙの構造のモデルを提案し、しかし、Ｇｇｌｙ及び変異ペプチドの以前のＮＭＲ及び可視分光学的実験を用いて一定であることも指し示す、図４に示唆されるように、ジ−イオン配位環境においてＧｇｌｙがＦｅ３＋に結合することを指し示す。図４のモデル中における２つのＦｅＩＩＩイオンは、グルタミン酸７が両方のＦｅＩＩＩイオンのリガンドとして作用し、グルタミン酸６、７、８、９、及び１０のカルボキシレート側鎖によって配位される。２つの酸素原子もまた、２つのＦｅＩＩＩイオン間の架橋として作用する。ペプチドの骨格及び非配位側鎖は、簡略化のため、図４において省略されている。ジ−イオン配位環境において、Ｆｅ３＋のＧｇｌｙ結合は、鉄−カルボキシレート錯体の多核小分子結晶構造（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｒ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）においてしばしば見られるように、更なる第二鉄イオンの見かけ上の引き抜き（ａｐｐａｒｅｎｔ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）なしに起こる。Ｆｅ…Ｃ相互作用は、それぞれの鉄の中心が、多くとも２つの架橋カルボキシレート、及び、少なくとも１つの架橋相互作用に関与しない更なるカルボキシレートと相互作用することを示唆する。
【０１１５】
ガリウム結合：図５に見られるように、Ｇａ３＋イオンの添加は、ｐＨ４．０におけるＧアミド及びＧｇｌｙ両方の２８０ｎｍの吸光の増大を引き起こした。図５においては、ｐＨ４．０における、塩化第二鉄（ｆｅｒｒｉｃ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（▲）、または、硝酸ガリウム（ｇａｌｌｉｕｍ  ｎｉｔｒａｔｅ）（▼）のアリコート（ａｌｉｑｕｏｔ）の、１０ｍＭ酢酸ナトリウム中１０μＭのＧアミド又はＧｇｌｙ、１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０への、２９８Ｋにおける添加は、２８０ｎｍでの吸光度のモル比２．０までの増加を起こし、そして、Ｇａ３＋について３．３×１０−７Ｍ、及び、Ｇアミドについて１．１×１０−６Ｍ、及び、Ｇｇｌｙについて１．７×１０−８Ｍ及び２．３×１０−６Ｍ（テーブル１）の親和性を生じるＢｉｏｅｑｓプログラムにフィッティングした。図５において、点は少なくとも３回の独立した実験を意味する。バーは、標準誤差を表す。線は、図１に示す２サイトモデルへのＢｉｏｅｑｓプログラムを用いた最適なフィッティングを表し、テーブル１に適切なＫｄと最大吸光度値を示す。
【０１１６】
（Ｇａ２ＧｇｌｙのＥＸＡＦＳ特性）
ＧａＩＩＩ２ＧｇｌｙのＥＸＡＦＳフーリエ変換（図３Ｄ）における一次後方散乱のピークは、より対称的に表れるが、著しく改善されたフィッティングは、１．８８Åにおいて２つ、１．９９Åにおいて３つの、２つの別々のＧａ−Ｏ後方散乱相互作用を含むことによって得られた。１．８８Åにおいて、３番目のＧａ−Ｏ後方散乱を含めるとフィッティングに小さな変化を生じることは、混合物の可能性を除外できないが、Ｇａ３＋の中央が５または６配位であることを示唆する。ＥＸＡＦＳデータ（図３Ｃ）もまた、３．０５Åにおいて、Ｇａ…Ｇａ後方散乱相互作用を明らかに示し、そして、ＧａＩＩＩ２Ｇｇｌｙデータ（テーブル２）に使用された単一散乱経路モデルの結果は、ジ−イオンＥＸＡＦＳモデルとよく一致する。構造的な意味合いは、Ｇａ３＋は、Ｇｇｌｙに配位している場合、ジ−核配位部位（ｄｉ−ｎｕｃｌｅａｒ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）の局所配位環境において、最小限の構造変化によるＦｅ３＋の置換を表す。
【０１１７】
インジウム結合：図６に見られるように、Ｉｎ３＋イオンの添加は、ｐＨ４．０において、ＧアミドまたはＧｇｌｙの各々の２８０ｎｍにおける吸光度の増加をほとんど起こさなかった。図６のグラフ表示は、バッファー中１０μＭのＧアミドまたはＧｇｌｙへの硝酸インジウム（▼）のアリコートの添加から得られ、塩化第二鉄（▲）のアリコートの添加の際に見られる変化に比較した場合、２８０ｎｍにおける吸光度の変化をほとんど生じなかった。しかしながら、３．９９（■）または３９．８５μＭ（●）の硝酸インジウム存在下において、塩化第二鉄のアリコートの添加の際に見られる吸光度の変化は、硝酸インジウムの非存在下において見られる変化と明らかに異なっていた。点は、少なくとも３回の独立した実験を表し、バーは、標準誤差を表す。線は、解離定数、及び、ＢｉｏＥｑｓプログラムを用いて図１に示すように、データを２サイト競合モデルにフィッティングすることによって得られる最大吸光度値（テーブル１）を用いて構成される。
【０１１８】
３９．８５μＭのＩｎ３＋イオン存在下において、Ｇアミド及びＧｇｌｙのいずれも２８０ｎｍにおける吸光度は、Ｆｅ３＋イオンの添加時に、より急激に上昇し、モル比１付近まで最大吸光度が到達した単一部位結合において予想されるカーブに近づいた。これらの観察は、吸光度に変化を全く起こさずに、Ｉｎ３＋イオンがＦｅ３＋イオンよりも大きな親和性によって第１のＦｅ３＋イオン結合サイトに結合することができるという仮説に一致する。実際、Ｉｎ３＋イオンは、Ｉｎ３＋イオン濃度の上昇により得られるカーブのファミリー（ｆａｍｉｌｙ）がＢｉｏｅｑｓプログラムを用いて図１に示す２サイト競合モデルに合理的によくフィッティングしているため、両方のＦｅ３＋イオン結合サイトに競合するようだ。第１のＦｅ３＋イオン結合サイトについて、イオンの最もフィッティングする親和性は、実質的にＦｅ３＋イオンよりも高く、Ｇアミド及びＧｇｌｙについてそれぞれ６．５×１０−１５及び２．１×１０−１３ＭのＩｎ３＋におけるＫｄ値を有していた（テーブル１）。
【０１１９】
（Ｉｎ２ＧｇｌｙのＥＸＡＦＳ特性）
ＩｎＩＩＩ２ＧｇｌｙについてのＥＸＡＦＳフーリエ変換（図３Ｆ）は、２．１Åにおける一次後方散乱のピーク中心の短い距離側のショルダーを示し、短いＩｎ−Ｏ後方散乱相互作用の含有は、フィッティングを著しく改善した。ＥＸＡＦＳデータ（図３Ｅ）のｋ範囲を１４Å−１まで切り捨てると、酸素のような軽い原子との後方散乱相互作用に期待されるように、フーリエ変換におけるこの明らかなピークが低ｋ範囲データに合理的に表されており、ノイズやその他のアーチファクトに起因するものではないことが確かめられた。全体的に、ＥＸＡＦＳデータに対する最適なフィッティングは、２．１３Åにおける５つの等価なＩｎ−Ｏ後方散乱相互作用のように、１．９８Åにおける単一の短い金属−Ｏ原子経路を含有することによって、得られた。Ｉｎ…Ｉｎ後方散乱相互作用は３．２６Åにおいて観察された。ＩｎＩＩＩ２Ｇｇｌｙについてフィッティングパラメーターは、親ＦｅＩＩＩ２Ｇｇｌｙ錯体（ｐａｒｅｎｔ  ＦｅＩＩＩ２Ｇｇｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）に用いられたものに合理的によく一致していることは、Ｇａ３＋のように、Ｉｎ３＋が２インジウム結合環境下において、Ｆｅ３＋錯体に構造が似ていることを示唆する。
【０１２０】
ルテニウム結合：類似ファミリーのカーブは、結合実験が図７に示すようにＩｎ３＋イオンの変わりにＲｕ３＋イオンと共に繰り返された場合に得られた。図７のグラフ表示は、バッファー中１０μＭのＧアミドまたはＧｇｌｙに塩化ルテニウムのアリコートを添加することから得られ、塩化鉄（▲）のアリコートの添加の際に見られる変化よりも、かなり小さい２８０ｎｍにおける吸光度の上昇を引き起こした。しかしながら、５．３０（■）または２６．４８μＭ（●）の塩化ルテニウムの存在下において塩化第二鉄のアリコートの添加の際に見られる吸光度の変化は、塩化ルテニウムの非存在下において見られるものとは明らかに異なる。点は、３回の独立した実験を表し、バーは、標準誤差を表す。線は、解離定数、及び、ＢｉｏＥｑｓプログラムを用いて図１に示すようにデータを２サイト競合モデルにフィッティングすることによって得られる最大吸光度値（テーブル１）を用いて構成される。
【０１２１】
ルテニウムとインジウムの観察結果の主な相違点は、Ｒｕ３＋イオンの添加はそれ自体がｐＨ４．０においてＧアミド及びＧｇｌｙの両方の２８０ｎｍにおける吸光度の顕著な上昇を起こしたことである。それにも関わらず、Ｒｕ３＋イオンの濃度上昇によって得られたカーブのファミリーは、Ｂｉｏｅｑｓプログラムを用いて、図１に示される競合２サイトモデルによくフィッティングしていた。第１のＦｅ３＋イオン結合サイトについてＲｕ３＋の最適なフィッティングの親和性は、実質的にＦｅ３＋イオンよりも高く、Ｇアミド及びＧｇｌｙについてそれぞれ２．６×１０−１３及び５．３×１０−１５ＭのＲｕ３＋におけるＫｄ値を有していた（テーブル１）。
【０１２２】
（Ｒｕ２ＧｇｌｙのＥＸＡＦＳ特性）
ジ−Ｒｕ３＋錯体（図３Ｈ）のＥＸＡＦＳフーリエ変換は、調べられた他の錯体のそれとは著しく異なり、〜２．１Å及び〜２．４Åにおける２つの強い後方散乱のピーク中心を示す。図３Ｈにおけるフーリエ変換のピークの大きさは、図３Ｂ、Ｄ，及びＦに示された他の錯体のそれに比較して大幅に低下し、個々のＲｕの散乱経路間における顕著な相殺の結果である。データへの最適なフィッティングは、ＲｕＲｕ核、架橋カルボキシレート、及びＯ原子及びＲｕ中心の１つに結合した単一塩素と競合した残りの配位を含有する、ジ−核ＲｕＩＩＩ錯体を使用して、得られた（図４Ｂ）。ＥＸＡＦＳ（図３Ｇにデータ）実験は、Ｒｕ中心についてすべての配位環境の重ね合わせを同時に与えるため、フィッティングパラメーター（テーブル２）は、非等価な配位環境を示すために、〜２．４ÅにおけるＯ原子の部分占有（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｏｃｃｕｐａｎｃｙ）と同様に、Ｃｌの部分占有を必要とする。この混合ジ−核配位環境もまた、実験データによると、最大ＥＸＡＦＳを相殺させた。Ｒｕ中心間における短い核内分離（２．４Å）は、直接の金属−金属結合を示す。
【０１２３】
要約すると、金属カチオンのかなりな数の統計的スクリーニングは、Ｇｇｌｙ及びＧアミドがいずれも、Ｆｅ３＋に加えて、Ｇａ３＋、Ｉｎ３＋、またはＲｕ３＋に結合することを明らかにした。３価のガリウムカチオンでは、Ｇａ３＋濃度が上昇する場合において、ガストリンの吸光の変化は、ガストリン／Ｇアミドについて、０．３３及び１．１μＭ、または３．３×１０−７及び１．１×１０−６、及び、Ｇｇｌｙについて、１．７×１０−８及び２．３×１０−６の解離定数（Ｋｄ）と共に、２サイトモデルを用いてフィッティングされた。ガストリンの吸光はＩｎ３＋イオンの添加によって変化しなかったが、インジウムイオン存在下においてＦｅ３＋イオンが結合する場合の吸光度の変化は、Ｉｎ３＋についてのＫｄ値が６．５×１０−１５及び１．７×１０−７Ｍの２サイト競合モデルを用いてフィッティングされた。同様の結果が、Ｒｕ３＋についてのＫｄ値が２．６×１０−１３及び１．２×１０−５ＭのＲｕ３＋イオンにおいて得られた（テーブル１）。結果は、ガストリン／Ｇアミド及びＧｇｌｙが、選択的に３価のインジウムまたはルテニウムイオンに、第二鉄またはガリウムイオンよりも著しく高い親和性で結合することを実証する。
【表２】
2018504428.tif 000004
【表３】
2018504428.tif 000005
【０１２４】
（Ｒｕ１０６−Ｇアミド錯体の精製及び安定性）
Ｒｕ１０６−Ｇアミド錯体の精製における第１ステップは、Ｃ１８ＳｅｐＰａｋカートリッジを利用した。未結合のＲｕ１０６は最初のフロースルーにおいてカラムを通過し、一方、Ｒｕ１０６−Ｇアミド錯体はフラクション１及び２において溶出した（図８Ａ）。Ｒｕ１０６−Ｇアミド錯体をさらに精製するために、Ｃ１８ＳｅｐＰａｋカートリッジからフラクション１及び２は、プールされ、そして、アニオン交換ＨＰＬＣにかけられた（図８Ｂ）。フラクション１１に見られた放射能は、明らかにＧアミドの吸光度ピークに一致している。同様の結果が、Ｒｕ１０６−Ｇｇｌｙ錯体から得られた（データなし）。重要なことに、Ｒｕ１０６−アミド化ガストリン錯体は、中性ｐＨにおいて、１６．８±３．２日の非常に安定した半減期である。
【０１２５】
詳細には、図８Ａに示されるデータについて、１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４中のＲｕ１０６−Ｇアミド錯体（２つの各組において最も右である暗い黒色のバー）は、Ｃ１８ＳｅｐＰａｋカートリッジへの結合、続いて、１０ｍＬの１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４を用いたウォッシュ、及び、５０％アセトニトリルを含む１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４の１ｍＬアリコートを用いた溶出によって、未結合のＲｕ１０６から分離された。Ｒｕ１０６（２つの各組において最も左である明るい黒色のバー）のみカートリッジにアプライされた場合、大半の放射能は、最初のウォッシュの中に見られる。図８Ｂに関して、Ｒｕ１０６−Ｇアミド錯体は、５５分かけてｐＨ４の１０ｍＭ酢酸ナトリウム中０から１Ｍに示された塩化ナトリウムの線形勾配を使用してＨＰＬＣアニオン交換を用いて、さらに精製された。それぞれの１ｍＬフラクションにおける放射能は、縦棒を用いて示されている。
【０１２６】
本発明の様々な実施形態の上記説明は、関連技術の当業者の説明のために、提供される。 網羅的であること、または、本発明を単一の開示された実施形態に限定することは、意図されない。上述したように、本発明の多くの代替及び変形は、上記の教示の当業者には明らかだろう。したがって、いくつかの代替の実施形態が具体的に議論されているが、他の実施形態は、当業者にとって、明らか、または、比較的容易に開発されるだろう。したがって、この特許明細書は、本明細書で論じた本発明の全ての代替、改変、及び変形、及び、上記発明の主旨および範囲の内に入る他の実施形態を包含することが意図されている。
【０１２７】
以下の特許請求の範囲および本発明の前述の説明において、文脈が明示的な言語または必要な意味のために明白に別段の必要がある場合を除いて、“ｃｏｍｐｒｉｓｅ（備える）”という言葉、または、“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”や“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（備えた）”を含むそれの変形語は、包括的な意味で使用され、すなわち、定められた数値の存在を記述するが、本発明の１つ以上の実施形態におけるさらなる数値の存在または追加を排除するものではない。
【０１２８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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