(57)【要約】血液中の細胞外タンパク質分解経路の阻害剤を１種以上投与すること、及び血液又はその分画中のベータアミロイドペプチドを検出することによって、個体におけるベータアミロイドペプチドの血中レベルを検出するための方法。阻害剤の一例は、抗凝固薬である。Ａβ１-４０及びＡβ１-４２等の所望のベータアミロイドペプチドのレベルは、個体から採取した血液サンプル中で測定可能である。【選択図】図１
2018528404.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において、血中のＡβペプチドを検出する方法であって、
ａ）前記個体に、血液タンパク質分解経路の阻害剤を含む組成物を、この経路の一以上のステップを阻害するのに十分な量で、投与すること；
ｂ）適切な期間の後に、前記個体から血液サンプルを採取すること；及び
ｃ）前記サンプル又はその分画中の１種以上のＡβペプチドの量を測定すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記血液タンパク質分解経路の阻害剤が、抗凝固薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗凝固薬が低分子量ヘパリンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記低分子量ヘパリンが、アルデパリン、ベミパリン、エノキサパリン、セルトパリン、ダルテパリン、ナドロパリン、レビパリン、パルナパリン及びチンザパリンからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗凝固薬が、アピキサバン、リバーロキサバン、ダビガトラン、ワルファリン及びヘパリンである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記Ａβペプチドが、Ａβ１-４０及び／又はＡβ１-４２である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記血液サンプル中のＡβペプチドのレベルを、参照と比較する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ａβペプチドの量を測定する前に、血液から血漿を調製する工程をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記阻害剤の投与後少なくとも５分後に、前記個体から血液を採取する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
個体においてアミロイドβプラークの増加を特定する方法であって、
ａ）前記個体に血液タンパク質分解経路の阻害剤を、この経路の一以上のステップを阻害するのに十分な量で投与する工程；
ｂ）適切な期間の経過後に、又は投与の経過中に、又は投与の終了後に、前記個体から血液サンプルを採取する工程；及び
ｃ）前記サンプル中のＡβペプチドの量を測定する工程；を含み、
この際、参照サンプルと比べた、前記個体から得たサンプル中のＡβペプチドの量の増加が、個体におけるアミロイドβプラークの増加の指標となる、方法。
【請求項１１】
前記血液タンパク質分解経路の阻害剤が、抗凝固薬である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗凝固薬が低分子量ヘパリンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記低分子量ヘパリンが、アルデパリン、ベミパリン、エノキサパリン、セルトパリン、ダルテパリン、ナドロパリン、レビパリン、パルナパリン及びチンザパリンからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗凝固薬が、アピキサバン、リバーロキサバン、ダビガトラン、ワルファリン及びヘパリンからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ａβペプチドが、Ａβ１-４０及び／又はＡβ１-４２である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記個体が、アルツハイマー病と診断されているか、又はアルツハイマー病に罹患しているか、又はアルツハイマー病を発症するリスクがある、請求項１又は請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記増加したアミロイドβプラークが脳内に存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
個体においてアルツハイマー病(ＡＤ)治療の効果をモニターする方法であって、
ａ）ＡＤのための治療を受けている個体に、血液タンパク質分解経路の阻害剤を、この経路の一以上のステップを阻害するのに十分な量で投与する工程；
ｂ）適切な期間の経過後に、又は阻害剤の投与の経過中に、又は阻害剤の投与終了後に、前記個体から血液サンプルを採取する工程、及び
ｃ）前記サンプル、又は前記サンプルから調製した血漿又は血清中の、１種以上のＡβペプチドのレベルを測定する工程；及び
ｄ）ＡＤ治療の有効性を特定するために、参照レベルと、前記サンプル中の前記１種以上のＡβペプチドのレベルを比較する工程；
を含む方法。
【請求項１９】
前記血液タンパク質分解経路の阻害剤が、エノキサパリンであり、前記Ａβペプチドが、Ａβ１-４０及び／又はＡβ１-４２である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
個体の血中のＡβペプチドのレベルを検出するためのキットであって、
ａ）一以上の用量の、血液タンパク質分解経路の阻害剤を含む組成物；及び
ｂ）血液サンプル又はその分画中の、１種以上のＡβペプチドを検出するための試薬；及び、
ｃ）任意で、以下の一以上のための説明書：阻害剤の投与、阻害剤の貯蔵、及びＡβペプチドを検出するための試薬の使用；
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
この発明は、国立衛生研究所によって付与された認可番号R01CA164574の下、政府支援を受けて完成された。合衆国政府は本発明に所定の権利を有する。
【０００２】
本願は、２０１５年６月３０日に出願された米国仮出願62/186,439に基づく優先権を主張し、その開示は参照により本願に包含される。
【背景技術】
【０００３】
アミロイドβ(Aβ)は、老人斑の主成分であり、アルツハイマー病(AD)の病理学の特徴の一つであり、アミロイド前駆体タンパク質(APP)のタンパク質分解的切断によって生じる。切断部位に応じて異なるAβアイソフォームが生成し得るが、Aβ1-40及びAβ1-42は、主要なアイソフォームである。APPの遺伝子変異又は増加した遺伝子量(ダウン症候群；DS)は、脳においてAβ産生の増加を引き起こし、脳Aβの蓄積と凝集につながる。脳Aβは、脳脊髄液及び血漿へと除去される。脳内でのAβクリアランスの減少及びAβ産生の増加の両方が、孤発性ADで報告されている。Aβ1-42は、細胞膜に結合しているAPPが、セクレターゼによってタンパク質切断されることによって産生され、血漿中に低レベルで存在する。Aβ1-40はAPPのタンパク質切断によっても産生される。Aβ1-40とAβ1-42は、ADの主要な促進力であると考えられている。Aβ1-42とAβ1-40の血漿レベルは、家族性ADとDSでは２〜３倍まで増加し得るが、孤発性ADでは、増加があったとしてもごくわずかであり、現在はADバイオマーカーとは考えられていない。したがって、ADの血液バイオマーカーの分野には、満たされていない需要がある。
【発明の概要】
【０００４】
本開示において、我々は、タンパク質とポリペプチドを検出及び分解する血液中のタンパク質分解経路を記述する。我々は、プロリダーゼ(PEPD)及びSRCの例を用いて、この経路の存在とメカニズムを実証し、且つ、この経路が、Aβ1-42及びAβ1-40などのAPP産物の急速な分解の原因であることも実証する。
【０００５】
我々は、血液循環に入る際、あるタンパク質が、第XII因子(FXII)に結合し活性化することによって、内因性凝固カスケードを急速に活性化することができ、これがその後、プレカリクレイン(PK)、高分子キニノーゲン(HMWK)、第XI因子(FXI)及び第IX因子(FIX)を含む内因性凝固カスケード、及び、第X因子(FX)及び第II因子(FII)を含む通常の凝固カスケードの一部を活性し、これが次に、外因性凝固カスケードの主要因子である第VII因子(FVII)を活性化することを実証する（図１２）。活性化されたFVII(FVIIa)は、前記タンパク質を急速に分解する。この経路により分解されるタンパク質の例には、プロリダーゼ、SRC、及びAβペプチド(例えば、Aβ1-42及びAβ1-40)が含まれる。血液凝固活性は、またこの経路の活性化に起因して増加すると思われる。
【０００６】
これらの結果は、血漿凝固因子の潜在的機能を明らかにし、FXII及びFVIIaを、血漿における多成分・多段階タンパク質分解経路のセンサー/開始剤及び実行剤のそれぞれとして認定する。我々のAβ1-42及びAβ1-40の結果は、それらがアルツハイマー病(AD)の主要な促進力であるため、特に注目に値する。我々は、さらに、タンパク質分解経路の一時的な薬理的阻害が、血漿においてAβ1-42及びAβ1-40の分解を遮断することを示す。
【０００７】
我々の発見に基づくと、一面では、本開示は、血液又はその分画中のAβペプチドを検出するための方法を提供する。血液中で検出される前記Aβペプチドは、Aβ1-40及びAβ1-42を含むが、これらに限定されない。
【０００８】
このような検出は、脳又は他の場所においてAβ含有プラークの増加が存在するコンディションの診断に役立つ。前記方法は、Aβ含有プラーク形成を伴うコンディションの状態又は進行をモニタリングするためにも、及び、そのようなコンディションの処置に関する治療の状態又は進行をモニタリングするためにも使用できる。前記方法は、個体におけるタンパク質分解経路の阻害(例えば、個体にタンパク質分解経路の阻害剤を投与することによる)を含み、それによって、血液中のAβペプチド(例えば、Aβ1-42及びAβ1-40)を蓄積させ、血液中のAβペプチドの検出を可能にする。一実施形態では、前記タンパク質分解経路の阻害は、個体から血液を採取した後に実施できる。前記方法は、ADを検出するために、ADの進行を見守るために、及び／又は治療効果をモニタリングするために使用できる。前記ADは家族性であっても、孤発性であってもよい。
【０００９】
一面では、本開示は、ADを検出するためのキットを提供する。前記キットはタンパク質分解経路を阻害するための試薬、及び、血液又はその分画(例えば、血清又は血漿)のAβペプチド(例えば、Aβ1-42及び／又はAβ1-40)を検出するための試薬を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
［図１］血漿におけるPEPD分解
（Ａ）エノキサパリン(EP)及び／又は組換えヒトPEPD(hPEPD)で処置した野生型(WT)マウスにおける血漿PEPD濃度。EP(2.5 mg/kg)を、マウスの腹腔内に、１日１回５日間投与した。hPEPD(0.2又は10 mg/kg)又はビヒクルを、マウスの腹腔内に単独で、又は最後のEP投与の１時間後に投与した。酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)による血漿PEPDの測定のために、hPEPD/ビヒクル処置後１時間又は２４時間目に、血液サンプルをマウスから採取した。
（Ｂ〜Ｊ）EP及び／又はhPEPDで処置したWTマウスにおける血漿凝固因子の変化。マウスを、Ａで記載したようにEPで処置した。hPEPD(0.2 mg/kg)又はビヒクルを、マウスの腹腔内に単独で、又は最後のEP投与の１時間後に投与した。血液サンプルを、hPEPD/ビヒクル処置後６時間目にマウスから採取した；サンプル当たり7.5μLの血漿を、免疫ブロット法(IB)で分析した。矢印は、切断フラグメントを示す。凝固因子I(FI；フィブリノーゲンとしても知られる)の血漿レベルをELISAによって測定した。Ａ及びＪにおけるエラーバーは、SDを示す(n＝3)。Ａでは二元配置ANOVAによって、Ｊでは一元配置ANOVAによって、続いてTukey多重比較検定によってデータを分析した。Ａのデータは、ANOVA前にlog変換した。* P＜0.05；**** P＜0.0001
【００１１】
［図２］FVIIaによるhPEPD分解
（Ａ）hPEPD(90 nM)を、室温(RT)で、CaCl2-含有リン酸緩衝食塩水(PBS)中で、活性化ヒト凝固第VII因子(FVIIa)(10 nM)＋ヒト組織因子(TF)(10 nM)とともにインキュベートし、その後、酵素活性分析によって、残存hPEPDを、様々な時点で測定した。
（Ｂ）10 nM(+ΛΛ)、40 nM(+Λ)又は90 nM(+)のhPEPDを、室温で６０分間、CaCl2-含有PBS中で、FVIIa(10 nM)＋TF(10 nM)とともにインキュベートした。残存hPEPDを、酵素活性分析によって測定した。
（Ｃ）hPEPD(90 nM)を、室温にて、CaCl2-含有PBS中で、単独で、又はFVIIa(10 nM)＋TF(10 nM)とともにインキュベートし、その後、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分離し、銀で染色した。コントロールとして、FVIIa＋TFを、hPEPDなしでもインキュベートした。
（Ｄ）hPEPD(90 nM)を、室温にて、CaCl2-含有PBS中で、TF(10 nM)有り又は無しで、FVIIa(10 nM)とともにインキュベートし、続いて、残存hPEPD酵素活性を測定した。
（Ｅ）hPEPD(90 nM)を、室温で２４時間、CaCl2-含有PBS中で、単独で、ヒト凝固第VII因子(FVII)(10 nM)とともに、FVII(10 nM)＋TF(10 nM)とともに、FVII(10 nM)＋活性化ヒト凝固第II因子(FIIa)(100 nM)とともに、又はFVII(10 nM)＋TF(10 nM)及びFIIa(100 nM)とともに、インキュベートし、続いて、酵素的分析によって、残存hPEPDを測定した。Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥにおけるエラーバーは、SDを示す(n＝3)。一元配置ANOVAによって、続いてTukey多重比較検定によって、Ｂ、Ｄ及びＥのデータを分析した。* P＜0.05；** P＜0.01；**** P＜0.0001
【００１２】
［図３］hPEPDは、FXII中のPRDに結合し、FXIIを活性化する
（Ａ、Ｂ）hPEPD又は変異体(40 nM)を、PBS中で血液凝固因子(0.5μM)とともに、３７℃で、２時間インキュベートし、続いて免疫沈降法(IP)及びIBを行った。
（Ｃ）ヒト凝固第XII因子(FXII)(0.97 nM)を、室温で、ZnCl2-含有PBS中で、hPEPD又は変異体とともにインキュベートした；FXII活性化を、発色アッセイによって測定した。エラーバーは、SDを示す(n＝3)。
（Ｄ）hPEPD(40 nM)を、室温にて、ZnCl2(15μM)有り又は無しで、PBS(0.1 ml体積)中で、FXII(0.5μM)とともにインキュベートし、続いてIBを行った(サンプル当たり7.5μl)
（Ｅ）FXII又は変異体(0.5μM)を、３７℃にて２時間、PBS中でhPEPD(40 nM)とともにインキュベートし、続いてIP及びIBを行った。
【００１３】
［図４］FXIIは、血漿PEPD分解を開始させる
（Ａ）コントロールマウス、及びEP、hPEPD、又はEP＋hPEPDで処置したマウスにおける血漿PEPD濃度。EP(2.5 mg/kg)を、マウスの腹腔内に、１日１回５日間投与した。hPEPD(0.2 mg/kg)又はビヒクルを、マウスの腹腔内に単独で、又は最後のEP投与の１時間後に投与した。ELISAによる血漿PEPDレベルの測定のために、hPEPD/ビヒクル処置後６時間目に、血液サンプルをマウスから採取した。エラーバーは、SDを示す(n＝3)。データは、二元配置ANOVA前にlog変換し、続いてTukey多重比較検定を行った。* P＜0.05；**** P＜0.0001
（Ｂ）Ａに記載したように処置したマウスにおける血漿凝固因子の変化。サンプル当たり7.5μlの血漿を、IBによって分析した。矢印は、切断フラグメントを示す。
【００１４】
［図５］血漿PEPDは、もっぱらFVIIaによって分解される
（Ａ，Ｂ）hPEPD(9.2 pmol)を、室温で、FIIa又は活性化ヒト凝固第X因子(FXa)(10 pmol)有り又は無しで、血漿(100μl)とともに２４時間インキュベートし、沈殿物を取り除くために遠心分離した後、残存PEPDを酵素活性分析によって測定した。沈殿物をPBSで洗浄し、IBによって、hPEPDの存在を調べた（この際、活性化ヒト凝固第XIII因子(FXIIIa)と純粋なhPEPDを、結合コントロール及び標準物質としてそれぞれ使用した)。
（Ｃ）未処置WTマウスの血漿サンプルを、FVII及びFVIIaの両方に結合する抗体ともにインキュベートした；免疫複合体をタンパク質Ａセファロースを用いてプルダウンした。通常の血漿サンプルと併せた上清分画のFVII/FVIIaレベルを、IBによって分析した。サンプル中のFVIIaは検出不能であった。
（Ｄ）hPEPD(9.2 pmol)を、室温で２４時間、FIIa(10 pmol)の不存在下又は存在下で、通常の血漿又はFVII/FVIIa-枯渇血漿(100μl)とともにインキュベートした；残存hPEPDを、hPEPD酵素活性によって測定した。Ｂ及びＣで使用した血漿サンプルは、抗凝固薬を用いずにマウスから採取した血液から調製した。
（Ｅ，Ｆ）コントロールマウス及びhPEPD処置後６時間目のマウスの血漿PEPD及び凝固因子；PEPD濃度をELISAによって測定し、凝固因子をIBによって分析した(サンプル当たり7.5μl血漿)。矢印は切断フラグメントを示す。Ａ，Ｄ及びＥのエラーバーは、SD(n＝3)を示す。Ａでは一元配置ANOVA、Ｄ及びＥでは二元配置ANOVAによって、続いてTukey多重比較検定によってデータを分析した。Ｅのデータは、ANOVA前にlog変換した。* P＜0.05；**** P＜0.0001
【００１５】
［図６］SRCは、FXII中のPRDに結合し、FXIIを活性化するが、FVIIaによって分解される
（Ａ）マウスSRC(mSRC)(40 nM)を、３７℃にて２時間、PBS中でFXII又は変異体(0.5μM)とともにインキュベートし、その後IP及びIBを行った。
（Ｂ）mSRC(0, 20及び200 nM)を、室温にてZnCl2-含有PBS中で、FXII(0.97 nM)とともにインキュベートした；FXII活性化を、発色アッセイによって測定した。各値は、平均値±SDである(n＝3)。
（Ｃ）mSRC(0.17μM)を、室温にて表示時間の間、CaCl2-含有PBS中で、単独で又はFVIIa(10 nM)及びTF(10 nM)とともにインキュベートし、SDS-PAGEで分離し、銀で染色した。コントロールとして、FVIIa及びTFをmSRC無しでインキュベートした。
【００１６】
［図７］FXII-FVIIタンパク質分解経路は、SRCを検出し、分解する
WTマウス、FXII-/-マウス、及びFVIItTA/tTAマウスを、ビヒクル又はmSRCで腹腔内処置した；血液サンプルを処置後６時間目にマウスから採取した。
（Ａ）mSRCの血漿濃度を、ELISAによって測定した。
（Ｂ〜Ｊ）血漿凝固因子の変化を、IB(サンプル当たり7.5μlの血漿)又はELISAによって測定した。矢印は、切断フラグメントを示す。Ａ及びＪのエラーバーは、SD(n＝3)を示す。Ａでは二元配置ANOVA、Ｊでは一元配置ANOVAによって、続いてTukey多重比較検定によってデータを分析した。Ａのデータは、ANOVA前にlog変換した。**** P＜0.0001；ns（有意差なし）
【００１７】
［図８］Aβ1-42は、FXII中のFN2Dに結合し、FXIIを活性化するが、FVIIaによって分解される
（Ａ）ヒトAβ1-42(hAβ1-42)(0、0.05、0.5及び11.1μM)を、室温にて、ZnCl2-含有PBS中で、FXII(0.97 nM)とともにインキュベートした。FXII活性化を、発色アッセイによって測定した。各値は、平均値±SDである(n＝3)。
（Ｂ）hAβ1-42(200 nM)を、室温にてPBS中でFXII又は変異体(20 nM)とともにインキュベートした；hAβ1-42はインキュベーション中に凝集した。溶液中に残存する(S)又はhAβ1-42凝集塊に結合している(A)、FXII又はその変異体(後者は2％SDS中に再溶解した)を、IBによって測定した。
（Ｃ）hAβ1-42(2.2μM)を、室温にて表示時間の間、CaCl2-含有PBS中で、単独で、又はFVIIa(10 nM)及びTF(10 nM)とともにインキュベートした；凝集塊を2％SDS中に再溶解し、上清分画と混合し、SDS-PAGEで分離し、銀で染色した。コントロールとして、FVIIa及びTFを、hAβ1-42無しでインキュベートした。
【００１８】
［図９］FXII-FVIIタンパク質分解経路は、Aβ1-42を検出し、分解する
WTマウス、FXII-/-マウス、及びFVIItTA/tTAマウスを、ビヒクル又はhAβ1-42で腹腔内処置した；血液サンプルを処置後６時間目にマウスから採取した。
（Ａ）Aβ1-42の血漿濃度を、ELISAによって測定した。
（Ｂ〜Ｊ）血漿凝固因子の変化を、IB(サンプル当たり7.5μlの血漿)又はELISAによって測定した。矢印は、切断フラグメントを示す。Ａ及びＪのエラーバーは、SD(n＝3)を示す。Ａでは二元配置ANOVA、Ｊでは一元配置ANOVAによって、続いてTukey多重比較検定によってデータを分析した。Ａのデータは、ANOVA前にlog変換した。**** P＜0.0001；ns（有意差なし）
【００１９】
［図１０］EPは、血漿Aβ1-42の分解を抑制し、Aβ1-42によるFX、FII及びFVIIの活性化を妨げる
（Ａ）コントロールマウス、及びEP、hAβ1-42、又はEP＋hAβ1-42で処置したマウスにおける血漿Aβ1-42濃度。EP(2.5 mg/kg)を、WTマウスの腹腔内に１日１回５日間投与した。hAβ1-42(40μg/kg)又はビヒクルを、マウスの腹腔内に単独で、又は最後のEP投与の１時間後に投与した。ELISAによる血漿Aβ1-42の測定のために、hAβ1-42/ビヒクル処置後６時間目に、血液サンプルをマウスから採取した。エラーバーは、SDを示す(n＝3)。データを、一元配置ANOVA前にlog変換し、続いてTukey多重比較検定を行った。**** P＜0.0001
（Ｂ〜Ｉ）コントロールマウス、及び、Ａで記載したようにEP、hAβ1-42、又はEP＋hAβ1-42で処置したマウスにおける血漿凝固因子の変化；サンプル当たり7.5μLの血漿を、IBで分析した。矢印は、切断フラグメントを示す。
【００２０】
［図１１］FXII-FVIIタンパク質分解経路は、組織障害に応答する
マウスを、ビヒクル(●：CCl4用のコーンオイル；■：hPEPD用のPBS)、CCl4(0.5 g/kg)又はhPEPD(4 mg/kg)で腹腔内処置した；血液サンプル及び様々な臓器を２４時間後に採取した。
（Ａ〜Ｃ）マウスPEPD(mPEPD)及び／又はhPEPD、mSRC及びマウスAβ1-42(mAβ1-42)の血漿レベルを、ELISAによって測定した。エラーバーは、SD(n＝3)を示す；二元配置ANOVA前にデータをlog変換し、続いてTukey多重比較検定を行った。** P＜0.01；*** P＜0.001；**** P＜0.0001
（Ｄ）ERBB1及びERBB2並びにそれらのリン酸化状態の組織レベルを、IBによって測定した。GAPDHはローディング・コントロールである。各レーンは、異なるマウスから得たサンプルを表す。
【００２１】
［図１２］PEPD、SRC及びAβ1-42を検出し、分解する、FXII-FVIIタンパク質分解経路、及びEPによるその阻害
PEPD、SRC又はAβ1-42は、FXIIの異なるドメインに結合することによってFXIIを活性化する。FXII活性化は、FX及びFIIの活性化を引き起こし、これは次にFVIIを活性化し、活性化されたFVIIは、PEPD、SRC及びAβ1-42を分解する。EPは、アンチトロンビンIII(AT)に結合し、活性化することによって、血漿中のPEPD、SRC及びAβ1-42の分解を遮断し、これによりタンパク質分解経路の複数の凝固因子を抑制する。符号「↓」及び「Ｔ」は、それぞれ活性化及び阻害を示す。
【００２２】
［図１３］mPEPDの特徴、及びそのタンパク質分解経路の活性化
（Ａ）mPEPD を、IBによって測定し、hPEPDと比較した。
（Ｂ）mPEPD をSDS-PAGEで測定し、その後銀染色し、hPEPDと比較した
（Ｃ、Ｄ）mPEPDで処置したマウスにおけるmPEPD及びフィブリノーゲン(FI)の血漿レベルをELISAによって測定した。エラーバーは、SDを示す(n＝3)；二元配置ANOVAによって、続いてTukey多重比較検定によってデータを分析した。ＣのデータはANOVA前にlog変換した。**** P＜0.0001
（Ｅ〜Ｌ）マウスにおける血漿凝固因子に対するmPEPDの効果をIBによって測定した。血漿サンプルは、溶媒又はmPEPD(0.2 mg/kg)の腹腔内注射後６時間目に、WTマウス及びFXII-/-マウスから採取した。各レーンは、7.5 mlの血漿サンプルを表す。矢印は切断フラグメントを示す。
【００２３】
［図１４］hPEPD安定性に、FXa及びFIIaは影響しない
hPEPD(90 nM)を室温にて特定の時間、5 mM CaCl2を含むPBS(総容積0.1 ml)中で、単独で、FXa(100 nM)とともに、又はFIIa(100 nM)とともにインキュベートした。インキュベートしたサンプルにおける残存hPEPDをIBによって(Ａ、Ｃ)、又はhPEPD酵素活性の測定によって(Ｂ、Ｄ)分析した。エラーバーは、SDを示す(n＝3)。
【００２４】
［図１５］hPEPD及びその変異体の配列情報
各タンパク質は、そのカルボキシ末端にタグ付けされた6×Hisを有する。
【００２５】
［図１６］FXII及びその変異体の特徴
（Ａ）ヒトFXIIにおける様々な領域の位置
（Ｂ）FXII変異体の配列情報
（Ｃ）組換えFXII及びその変異体の相対分子サイズの比較。FXII及びその変異体を、CHO-K1細胞中で産生し、NI-NTAアガロースクロマトグラフィーで精製し、IBによって分子サイズを比較した（この際、それらのＣ末端又はＣ末端Hisタグのどちらかに結合する抗体を使用した）。
（Ｄ）精製したFXII及びその変異体を、SDS-PAGEによって分離し、銀で染色して純度を評価した。
【００２６】
［図１７］WTマウス、FXII-/-マウス及びFVIItTA/tTAマウスにおける、FXII及びFVIIの血漿レベル
血漿サンプル(各7.5 ml)をIBによって分析した。
【００２７】
［図１８］hPEPDは、FX、FII又はFVIIを直接活性化しない
hPEPD(40 nM)を、室温にて２４時間、PBS中、5 mM CaCl2の存在下で、FX、FII又はFVII(各因子0.5 mM)とともにインキュベートし、その後IBによって分析した。この実験では、FXa、FIIa及びFVIIaをポジティブコントロールとして使用した。
【００２８】
［図１９］CCl4で処置した後の、AST及びALTの血漿レベルの、及び肝臓重量の変化
WTマウス及びFXII-/-マウスを、0.5 g/kgのビヒクル又はCCl4を用いて腹腔内処置した；２４時間後、マウスを殺し、血漿サンプルを調製し、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)及びアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)活性を測定し、肝臓の重量を測定した。エラーバーは、SDを示す(n＝3)。二元配置ANOVAによって、続いてTukey多重比較検定によってデータを分析した。*** P＜0.001；**** P＜0.0001；ns（有意差なし）
【００２９】
［図２０］FXII-FVII経路因子のバックグラウンド活性化
未処理のWTマウス、FXII-/-マウス及びFVIItTA/tTAマウスから得た血漿サンプル(各7.5 ml)を、IBによって分析した。各レーンは、一匹のマウスを表す。注：各因子の微小レベルの切断フラグメント(単数又は複数)を検出するために、全てのフィルムを高度に露出過度にした。矢印は切断フラグメントを示す。
【００３０】
［図２１］hAβ1-40はFXIIを活性化し、FVIIaによって分解される
（Ａ）表示濃度のhAβ1-40を、室温にてZnCl2-含有PBS中で、ヒトFXII(0.97 nM)とともにインキュベートし、FXII活性化を発色アッセイによって測定した。各値は、平均値±SDである(n＝3)。
（Ｂ）hAβ1-40(2.2μM)を、表記時間の間、室温にて、CaCl2-含有PBS中で、単独で、又はFVIIa(10 nM)＋ヒトTF(10 nM)とともにインキュベートし、続いてSDS-PAGEを行った。
【００３１】
［図２２］EPは、hAβ1-40の血漿レベルを上昇させる
オスのC57BL/6マウス(７〜８週齢)を、１日１回５日間、ビヒクル又はEP(0.5 mg/kg)で腹腔内処置した。５回目のビヒクル/EP投与の１時間後、hAβ1-40(40μg/kg)をマウスに腹腔内投与し、６時間後、血液をマウスから採取した。hAβ1-40の血漿レベルを、ELISAによって測定した。エラーバーは、SDを示す(n＝3)。
【００３２】
［図２３］EPは、ADマウスにおいてAβ1-40/Aβ1-42の血漿レベルを上昇させる
１ヶ月齢及び３ヶ月齢のWTマウス及びADマウスを、１日１回５日間、ビヒクル又はEP(0.5 mg/kg)で腹腔内処置した。最終処置の６時間後にマウスから血液を採取し、ELISAによって、Aβ1-40及びAβ1-42の総血漿レベルを測定した。エラーバーは、SDを示す(n＝3)。WTマウスとADマウスとの間のAβ1-40及びAβ1-42の血漿レベルの違いの様々な計算も示される。
【００３３】
［図２４］J20 ADマウスにおける凝固プロテアーゼの活性化、しかしEPは凝固因子FX、FII及びFVIIの活性化を抑制する
１ヶ月齢のADマウス及びそれらの正常な対応物を、１日１回５日間、ビヒクル又はEP(0.5 mg/kg)で腹腔内処置した。最後のビヒクル/EP投与の６時間後にマウスから血液を採取し、ウエスタンブロット法によって凝固プロテアーゼを分析した。矢印は切断フラグメントを示す。
【００３４】
［図２５］J20 ADマウスにおける凝固プロテアーゼの活性化、しかしEPは凝固因子FX、FII及びFVIIの活性化を抑制する
３ヶ月齢のADマウス及びそれらの正常な対応物を、１日１回５日間、ビヒクル又はEP(0.5 mg/kg)で腹腔内処置した。最後のビヒクル/EP投与の６時間後にマウスから血液を採取し、ウエスタンブロット法によって凝固プロテアーゼを分析した。矢印は切断フラグメントを示す。
【００３５】
［図２６］hAβ1-42の血漿レベルに対する経口抗凝固薬の影響
オスのC57BL/6マウス(７〜８週齢)を、１日１回５日間、ビヒクル、ワルファリン(1又は3 mg/kg)、リバーロキサバン(10又は20 mg/kg)又はダビガトラン(22.5又は45 mg/kg)を用いて経口挿管によって処置した。５回目の投与の１時間後、hAβ1-42(40μg/kg)をマウスに腹腔内投与し、６時間後に、マウスから血液を採取した。hAβ1-42の血漿レベルを、ELISAによって測定した。エラーバーは、SDを示す(n＝3)。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本開示は、循環においてあるタンパク質の分解をもたらす、血中の細胞外タンパク質分解経路の特定に基づくものである。本開示は、ある血中タンパク質又はポリペプチドの分解を抑制するように、前記分解経路を阻害し、それによってタンパク質に持続的な作用を持たせるか、又はタンパク質を蓄積させてそれらを検出に適したものとする方法を提供する。
【００３７】
例えば、本開示は、アミロイドプラークタンパク質を含有している脳(又は他の場所)のプラークが増加するコンディションを検出する方法を提供する。前記プラークは、ADに付随する老人斑であってもよい。前記方法は、血中で生じるタンパク質分解経路の阻害剤を個体に投与すること；適切な期間後、阻害剤の投与の間又は投与後、前記個体から体液サンプルを採取すること：及び、前記個体から採取した体液サンプル中、又は当該体液サンプルの分画部分(例えば、血液から調製した血漿又は血清)中の一以上のAβペプチド(例えば、Aβ1-42、Aβ1-40又は他のAβペプチド)のレベルを検出すること；を含む。前記阻害剤は、Aβペプチドの分解を遮断又は阻害し、それによって、サンプル中のこれらのペプチドのレベルを増加させ、検出可能にすると考えられる。参照対照に対するこれらのペプチドのレベルの増加は、個体の脳(あるいは他の場所)での、Aβプラークの増加の指標となる。プラークの増加は、個体がADを発症する危険性があること、又はADに罹患していることを明らかにし得る。
【００３８】
用語「ベータアミロイドペプチド」又は「Aβペプチド」又は「Aβ」は、同じ意味で用いられ、２〜３のアミノ酸から４３のアミノ酸長であるAPPのペプチド断片を指す。例えば、前記ペプチド断片は、１０〜４３のアミノ酸長であってもよい。前記ペプチドは、２つのプロテアーゼ(β-セクレターゼ及びγ-セクレターゼ)によるAPPの切断産物として生体内で産生される。例として、Aβ1-40及びAβ1-42が挙げられる。
【００３９】
血液タンパク質分解経路の阻害剤の例は抗凝固薬である。抗凝固薬は、低分子量ヘパリン(LMWH)、ヘパリン、ワルファリン、又は、血液タンパク質分解経路(図１２に図示される)の一以上のステップを阻害する他の任意の分子であってもよい。例えば、血液タンパク質分解経路の一以上のステップを阻害する、血液タンパク質分解経路に関与する分子のペプチド模倣物又は抗体あるいはそのフラグメントが使用できる。低分子量ヘパリンは、未分画のヘパリンに由来するものであってもよく、通常10,000以下の平均分子量を有する。例えば、低分子量ヘパリンは、3,000〜8,000の平均分子量を有し得る。
【００４０】
いなかる特定の理論に拘束されることも意図しないが、FXII-FVIIタンパク質分解経路は、組織障害などのコンディションの間、例えばAβ1-40、Aβ1-42、PEPD、SRCなどのタンパク質又はポリペプチドを低血漿レベルに維持するのに役立つと考えられる。ERBB1及びERBB2のリガンドであるPEPDの場合、前記タンパク質分解経路は、様々な組織(心臓、腎臓及び肝臓)におけるレセプター(ERBB1及びERBB2)に対するリガンド-誘発性インパクトを最小化するのに役立ち、これには、チロシンリン酸化のレセプター及び下方制御のレセプターの両方の阻害が含まれる。これらの結果は、組織障害又は外因性侵襲の間、FXII-FVIIタンパク質分解経路が、防御機構として役立つことを示す。
【００４１】
SRCは、細胞内非受容体型チロシンキナーゼであるが、血漿中で何らかの生理学的役割を果たすことは知られていない。血漿中のその存在は、損傷を受けた細胞及び組織からの漏出に起因すると思われる。FXII-FVIIタンパク質分解経路による血漿SRCの分解は、タンパク質分解経路による非機能性タンパク質の除去の一例を示す。
【００４２】
Aβ1-42及びAβ1-40がFXII-FVIIタンパク質分解経路を活性化し、その後FXII-FVIIタンパク質分解経路によって分解されるという我々の発見は、この経路が、AD及びDSにおいて有意に活性化され得ることを示唆する。我々の結果は、例えばエノキサパリン(EP)を使用する、FXII-FVIIタンパク質分解経路の一時的な薬理学的阻害が、ADにおいてAβ1-42及びAβ1-40の血漿レベルの検出を可能にし、このことにより、疾患検出用のADバイオマーカーとしての血漿Aβ1-42又はAβ1-40の発展、及び、疾患進行の及び治療に対する反応性の、より良い評価が可能になることを示す。我々のデータは、Aβ1-42との違いがわずか２つのアミノ酸であるAβ1-40もまた、FXII-FVIIタンパク質分解経路によって血中で分解することを示す。これらの結果は、FXII-FVIIタンパク質分解経路が、AD発症機序において重要な役割を果たし得ることも示唆する。しかしながら、この経路による血漿でのAβ分解は疾患予防的であり得る一方、この経路のFXII及び他の因子の活性化は、HMWKからのブラジキニン遊離、β-FXIIa及びカリクレインを経る補体活性化、及び凝固活性の増加をもたらす可能性があり、これらは血管生理機能、免疫応答、炎症、及びフィブリン塊による微小血管の閉塞に影響を与えることによって、疾患の発症を促進するかもしれない。
【００４３】
さらに、FXII-FVIIタンパク質分解経路は、あるタンパク質治療を開発するために、橋渡し的な意義を有する可能性がある。多くの治療タンパク質は、短い血漿半減期を有し、現在のアプローチは、胆汁、肝臓又は腎臓排出によるそれらの除去を遅くすることを目的にしている。我々の発見は、これらのタンパク質のいくつかが、FXII-FVII経路に関与するかもしれず、この経路の阻害が、血漿でのそれらの滞留を増加させ得る可能性を高める。適切な例として、EPは、マウスにおいてERBB2主導腫瘍を阻害するためのhPEPDの減量剤として使用された。
【００４４】
本発明の方法は、ある分解経路の存在の特定に基づくものであり、Aβ1-42は、その経路によって急速に分解される。この経路は、血液凝固経路中の因子を含む(前記因子のこのタンパク質分解機能は、凝固機能と異なると思われるが)。一実施形態では、血液タンパク質分解経路の一以上のステップを阻害する剤(本明細書で「タンパク質分解経路阻害剤」と称する)が使用できる。一実施形態では、前記阻害剤は、低分子量ヘパリン(LMWH)である。これらは、一般的には抗凝固薬として使用されている。例として、アルデパリン、ベミパリン、セルトパリン、エノキサパリン、ダルテパリン、ナドロパリン、レビパリン、パルナパリン及びチンザパリンが挙げられる。タンパク質分解経路の阻害剤である他の非LMWH系抗凝固薬には、FXa及び／又はFIIaを標的にする剤が含まれ、例えば、アピキサバン、リバーロキサバン及びダビガトラン、並びにワルファリン及びヘパリンも使用できる。さらにモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ナノボディなどを含む抗体及び／又はその抗原結合フラグメントも使用できる。前記抗体又はペプチド模倣物は、FXII、FIX、FX、FII、及び／又はFVIIを含むカスケード内の一以上の因子に結合し得る、及び／又は一以上の因子の機能を妨害し得る。様々な実施形態において、前記LMWH、非LMWH小分子、ペプチド模倣物又は抗体は、FXII、FIX、FX、及び／又はFIIを妨害する。前記阻害剤は、正常な止血を有意に妨げないことが好ましい。
【００４５】
我々は、FVIIの特別な役割を確認した。よって、FVIIの上流ステップに作用する、又はFVIIに直接作用するいかなる阻害剤も使用できる。一実施形態では、前記阻害剤は、血液タンパク質分解経路(本明細書において、血液タンパク質分解性経路又は細胞外タンパク質分解経路とも称される)を阻害するが、止血には影響しないか、最小限の影響しか与えないものである。例として、FXIIの特定の阻害剤、例えば、小分子阻害剤又は抗体などが挙げられる。前記阻害剤は、エノキサパリン、又はその薬学的に許容できる塩であってもよい。例えば、前記エノキサパリンは、エノキサパリンナトリウムであってもよい。これは、商品名Lovenox、Xaparin及びClexaneとして入手可能である。
【００４６】
前記阻害剤は、それを個体の血液循環に導入できるいかなる手段によって投与されてもよい。例えば、前記阻害剤は、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内、鼻腔内、皮下、経口などによって、導入されてもよい。前記阻害剤は、丸薬、錠剤、カプセル、液剤などの形態で経口的に投与されてもよい。
【００４７】
前記阻害剤(単数又は複数)は、任意の適切な薬学的に許容できるキャリア、賦形剤及び／又は安定剤とそれらを組み合わせて、投与用の医薬組成物として提供されてもよい。薬学的に許容できるキャリア、賦形剤及び安定剤の例は「Remington: The Science and Practice of Pharmacy(2005) 21st Edition, Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins」に見い出すことができる。例えば、適切なキャリアには、使用する投与量及び濃度においてレシピエントに毒性を示さない賦形剤、又は安定剤が含まれ、及び、バッファー、例えば、酢酸塩、トリス、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンなどの抗酸化剤；保存剤、例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；及び m-クレゾール；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アルパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン；単糖類、二糖類、及び他の炭水化物(グルコース、マンノース、又はデキストリンなど)；キレート剤、例えばEDTA；等張化剤、例えばトレハロース及び塩化ナトリウム；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；界面活性剤、例えば、ポリソルベート；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばTween又はポリエチレングリコール(PEG)；が含まれる。前記医薬組成物は、他の治療薬を含んでもよい。
【００４８】
阻害剤を含む組成物は、一回以上投与されてもよい。前記組成物は、二以上の阻害剤を含んでもよい。複数回投与は、日中に行われてもよく、これは適切な期間にわたって続けられてもよい(例えば、Aβ1-40、Aβ1-42及び他のAβペプチドを測定するための血液を採取する前の１〜１０日又はそれ以上)。
【００４９】
前記複数回投与は、同じルート(例えば、静注ルート)により行われてもよく、あるいは異なるルートを使用して行われてもよい。例えば、最初の投与は静注ルートにより行われ、続く投与は異なるルート(例えば経口ルート)によって行われてもよい。
【００５０】
阻害剤の投与量は、Aβ1-42、Aβ1-40又は他のAβペプチドの分解を低下させる又は妨げるのに十分な、血中のタンパク質分解を阻害する量である。阻害剤は、一回又は複数回投与されてもよい。本開示の利益を前提として、当業者は、所望の阻害剤の適切な範囲及び／又は最適な投与量を決定できる。一実施形態では、エノキサパリンの投与当たりの用量は、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、1.5 mg/kg、2.0 mg/kg又は2.5 mg/kgである。一実施形態では、前記投与量は40 mgであり、１日１回、２週間までの間、皮下投与される。一実施形態では、エノキサパリンの投与量は、0.1 mg/kg〜10 mg/kg(及びその間の小数点第十位までの全ての値)であり、12又は24時間ごとに(又は要望通りに)投与される。他の阻害剤の投与量及び投与計画は、本明細書の開示に基づいて、当業者によって決定されることができる。
【００５１】
タンパク質分解の阻害剤の投与は、個体によって自己投与できるものであってもよい。例えば、皮下投与のために、前記阻害剤は、自己投与できるペン(例えば、インスリン投与のために使用されるもの)による投与用として製剤化されてもよい。一実施形態では、摂取又は投与のための説明書とともに、注射用製剤又は経口製剤を個体に与えてもよい。
【００５２】
本開示の方法によって試験される個体は、ADに罹患している疑いがある、又はADに罹患しているリスクのある個体であってもよい。例えば、前記個体は孤発性ADに罹患している疑いがある、又は孤発性ADに罹患しているリスクのある個体であってもよい。個体がADを発症するリスクがあるかどうかは、臨床診療において、当業者によって確認できる。前記リスクは、家族歴、DS、頭部損傷、原因物質への暴露、環境因子、又は他の任意の関連する状況に関連していてもよい。
【００５３】
さらに、本発明の方法は、個体において、ADの進行をテストするために使用されてもよい。このように、本発明の方法は、ADの状態又は進行をモニターするために所望の間隔で実施されることができる。さらに、本発明の方法は、治療を受けた個体において、ADの状態又は進行に対する治療の効果をモニターするために使用されてもよい。それゆえ、一実施形態では、前記方法は、AD治療を受けている個体に、一以上のタンパク質分解経路阻害剤を投与すること、適切な阻害剤投与計画の後、前記個体から体液サンプルを採取すること、及び前記体液サンプル(又は、それから派生した別のサンプル−例えば、血液から得た血漿又は血清)において、Aβ1-40及び／又はAβ1-42のレベルを測定すること、を含んでもよい。Aβ1-40及び／又はAβ1-42のレベルは、参照標準物質(ADに罹患していないことが分かっている個体から確立される)と比較されてもよく、あるいは同じ個体の参照レベル(例えば、治療的処置の開始前のレベル)と比較されてもよい。一実施形態では、ADの状態又は進行をモニターするために、前記方法は、ｉ）個体に一以上のタンパク質分解経路阻害剤を、所望の間隔で投与すること、ii）適切な阻害剤投与計画の後、前記個体から体液サンプルを採取すること、及びiii）前記体液サンプル(又は、それから派生した別のサンプル−例えば、血液から得た血漿又は血清)において、Aβ1-40及び／又はAβ1-42のレベルを測定すること、を含む。Aβ1-40及び／又はAβ1-42のレベルは、参照標準物質(ADに罹患していないことが分かっている個体から確立される)と比較されてもよく、あるいは同じ個体の参照レベル(例えば、これらのマーカーのレベルをテストする最初のステップ時のレベル)と比較されてもよい。前記レベルは、個体の状態がモニターされるべき期間にわたって、又は、個体が指示により処置される期間にわたって測定されてもよい。血液、血漿又は血清のAβペプチドレベルの測定は、定期的な間隔で、又は臨床指示に従って実施可能である。
【００５４】
前記体液サンプルは、 血液、血漿、血清、脳脊髄液及び同様のものであってもよい。前記サンプルは、新鮮なうちに使用されてもよく、又は後の使用のために貯蔵(冷蔵又は冷凍)されてもよい。血液の場合、血漿を調製し、新鮮なまま使用してもよく、又は後の使用のために貯蔵してもよい。前記サンプルは、阻害剤の投与計画の間に採取されてもよく、又は投与計画の終了後、適切な期間経過後に採取されてもよい。例えば、サンプルは、最後の阻害剤を投与した後、数分(例えば、５分)〜数日(例えば、１０日)後に採取されてもよい。所望により、さらなるサンプルが採取されてもよい。
【００５５】
アミロイドβフラグメントの存在は、免疫学的方法によって、又は分析化学的方法(例えば、HPLC又は質量分析と連動した液体クロマトグラフィー)によって、検出することができる。例えば、Aβ1-42又はAβ1-40は、市販の抗体又は分析キットを使用して、ELISAによって検出されてもよい。例えば、Aβ1-42 ELISAキット及びAβ1-40 ELISAキットは、Life Technologies(カタログ番号：KHB3441及びKHB3481)から入手できる。これらの抗原のための抗体は、Santa Cruz Biotechnologiesから入手できる。
【００５６】
前記阻害剤の投与後に採取された血液中のAβペプチドのレベルは、参照値(基準値)と比較できる。前記参照値は、阻害剤投与前の同一個体の同一Aβペプチドのレベルであってもよく、又は、対照集団(例えば、ADに罹患していない個体の集団)におけるAβペプチドのレベルであってもよい。あるいは、参照値との比較は、対照タンパク質(その血中レベルが、ADに罹患していないものであることが分かっている)の変化に対して、Aβペプチド値の変化を正規化する形で行われてもよい。例えば、PEPDを対照タンパク質として使用することができる。
【００５７】
一実施形態では、前記方法は、体液サンプルを得た後の分解をさらに低減させるために、採取した体液をタンパク質分解経路阻害剤に接触させることをさらに含む。例えば、エノキサパリンを、新しく調製した血漿に添加してもよい(又は血漿をエノキサパリンに接触させてもよい)。
【００５８】
本開示は、本発明の方法を実行するためのキットも提供する。このキットは、タンパク質分解経路の阻害剤を一種以上、任意で、阻害剤投与ツール、例えばペン型シリンジ、任意で、投与説明書、体液サンプルの採取ツール(例えば、血液採取用シリンジ及び同様のもの)、生体サンプル又は生体サンプルから調製した液体(例えば、血清又は血漿)中のAβ1-40及び／又はAβ1-42を測定するための化学物質及び説明書の一以上を含むことができる。
【００５９】
本開示は、個体において、アミロイド前駆体タンパク質の血中タンパク質分解産物のレベルを増加させるための方法を提供し、この方法は、細胞外分解経路の阻害剤を含む組成物を、個体に投与することを含む。前記細胞外分解経路(例えば、図１２に図示したもの)は、血中で生じ得る。前記阻害剤は、図１２に示す分解経路の一以上のステップを阻害できる。前記阻害剤は、小分子阻害剤、ペプチド又はタンパク質、例えば、分解経路に関与している凝固因子に結合する及びその活性を中和するモノクローナル抗体であってもよい。例えば、阻害剤は、FXIIからFXIIaへの変換、FIXからFIXaへの変換、FXからFXaへの変換、FIIからFIIaへの変換、FXIからFXIaへの変換、及び、FVIIからFVIIaへの変換を阻害し得る。ステップの「阻害」とは、ステップの効率(すなわち、ステップの最終産物の産生)が低下すること、又はステップが完全に遮断されることを意味する。
【００６０】
本開示は、個体において、血中タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのレベルを増加させる方法を提供し、この方法は、細胞外分解経路(例えば、図１２に図示したもの)の阻害剤を含む組成物を、個体に投与することを含む。前記タンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、治療薬又は診断薬であってもよい。
【００６１】
血中の分解経路の阻害は、インビボ又はインビトロで実施することができる。例えば、循環血液を、個体から血液サンプルを採取する前に、又は血液サンプルの採取後に、前記阻害剤と接触させることができる。阻害剤は、血液を採取した管にすぐに添加されてもよく、又は、血液採取の前に管を阻害剤と接触させてもよい。
【００６２】
例えば、本発明の方法は、個体から血液サンプルを得ること、採取した血液(又はそれから得られた血漿又は血清)を、細胞外タンパク質分解経路(例えば、図１２に図示したもの)の阻害剤の一種以上と接触させること、及び、所望のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドのレベルを測定すること、を含むことができる。前記タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドは、他のより大きいタンパク質又はポリペプチドのタンパク質分解産物であってもよい。例えば、前記ポリペプチドは、アミロイドβ前駆体タンパク質のタンパク質分解産物であってもよい。前記タンパク質分解産物は、Aβ1-40又はAβ1-42であってもよい。
【００６３】
以下の例は、本開示を説明するために提供される。
【００６４】
個体において、血中のアミロイド前駆体タンパク質のタンパク質分解産物を検出する方法であって、ａ）個体に細胞外タンパク質分解経路の阻害剤を、この経路の一以上のステップを阻害するのに十分な量で投与すること；ｂ）前記阻害剤を投与した後適切な期間の経過後に、又は投与の経過中に、前記個体から血液サンプルを採取すること、及びｃ）前記サンプル又はその分画中のAβ1-40及び／又はAβ1-42の量を測定すること、を含む。細胞外タンパク質分解経路の阻害剤は、低分子量ヘパリンであってもよい。細胞外タンパク質分解経路の阻害剤の例として、アルデパリン、ベミパリン、エノキサパリン、セルトパリン、ダルテパリン、ナドロパリン、レビパリン、パルナパリン、チンザパリン、アピキサバン、リバーロキサバン及びダビガトラン、ワルファリン及びヘパリン、並びに、モノクローナル抗体又はペプチド模倣阻害剤が挙げられる。本明細書の開示に基づいて、他の阻害剤を特定することができる。任意の阻害剤又はそれらの薬学的に許容できる塩が使用できる。Aβ1-40及び／又はAβ1-42又は他のAβペプチドの定量は、全血、血漿又は血清あるいは任意の他の分画中で実施できる。阻害剤は一以上の時点で投与でき、血液は選択された期間又は所望の期間の後に採取できる。Aβペプチドのレベルは、参照値と比較することができる。参照は、兆候の無いことが知られている個体から得た評価済みのポリペプチド又はタンパク質の値であってもよく、あるいは、兆候の無い個体の集団の平均値であってもよく、あるいは、阻害剤の投与前に同じ個体から得た値であってもよい。前記個体は、アルツハイマー病と診断された、又はアルツハイマー病に罹患している、又はアルツハイマー病を発症するリスクがある個体であってもよい。
【００６５】
個体においてアミロイドβプラークの増加を特定する方法は、ａ）個体に細胞外タンパク質分解経路の阻害剤を、この経路の一以上のステップを阻害するのに十分な量で投与する工程；ｂ）適切な期間の経過後に、又は投与の経過中に、又は投与計画の終了後に、前記個体から血液サンプルを採取する工程、及びｃ）前記サンプル中のAβ1-40及び／又はAβ1-42の量を測定する工程を含み、この際、参照サンプルと比べた、前記個体のサンプル中のAβ1-40及び／又はAβ1-42の量の増加は、個体におけるアミロイドβプラークの増加の指標となる。前記参照は、兆候の無いことが知られている個体から得た評価済みのポリペプチド又はタンパク質の値であってもよく、あるいは、個体の集団の平均値であってもよく、あるいは、阻害剤の投与前に同じ個体から得た値であってもよい。前記細胞外タンパク質分解経路の阻害剤は、低分子量ヘパリンであってもよい。細胞外タンパク質分解経路の阻害剤の例として、アルデパリン、ベミパリン、エノキサパリン、セルトパリン、ダルテパリン、ナドロパリン、レビパリン、パルナパリン、チンザパリン、アピキサバン、リバーロキサバン及びダビガトラン、ワルファリン及びヘパリンが挙げられる。任意の阻害剤又はそれらの薬学的に許容できる塩が使用できる。Aβ1-40及び／又はAβ1-42、又はAPPの他のタンパク質分解産物の定量は、全血、血漿又は血清あるいは任意の他の分画中で実施できる。阻害剤は一以上の時点で投与でき、血液は選択された期間又は所望の期間の後に採取できる。前記個体は、アルツハイマー病と診断された、又はアルツハイマー病に罹患している、又はアルツハイマー病を発症するリスクがある個体であってもよい。増加したアミロイドβプラークは、脳内に存在し得る。
【００６６】
個体においてAD治療の効果をモニターする方法は、ａ）ADのための治療を受けている個体に、細胞外タンパク質分解経路の阻害剤を、この経路の一以上のステップを阻害するのに十分な量で投与する工程；ｂ）適切な期間の経過後に、又は阻害剤の投与の経過中に、又は阻害剤の投与終了後に、前記個体から血液サンプルを採取する工程、及びｃ）前記サンプル、又は前記サンプルから調製した血漿又は血清中のAβ1-40及び／又はAβ1-42の濃度(レベル)を測定する工程；及び任意でｄ）AD治療の有効性を特定するために、参照レベルと、サンプル中のAβ1-40及び／又はAβ1-42のレベルを比較する工程を含む。前記参照は、兆候の無いことが知られている個体から得た評価済みのポリペプチド又はタンパク質の値であってもよく、あるいは、個体の集団の平均値であってもよく、あるいは、阻害剤の投与前に同じ個体から得た値であってもよい。血液は、阻害剤の投与の開始後、所望の期間の後に採取できる。血液、血漿又は血清中のAβペプチドのレベルは、治療の有効性の評価を提供するために、AD治療の開始前に、及び治療開始後の所望の時点で、及び／又は治療の休止又は中断後に測定することができる。必要であれば、一以上のAβペプチドのレベルに基づいて、AD治療を中断すること、継続すること、又は修正することができる。
【００６７】
一面では、本開示は、血中Aβペプチドを検出するためのキットを提供する。このキットは、血液タンパク質分解経路の阻害剤を一種以上、及び一種以上のAβペプチドを検出するための試薬を含む。このキットは、任意で、さらにバッファー、及び阻害剤の投与説明書及び試験試薬の使用説明書を含んでもよい。阻害剤は、本明細書に記載した抗凝固薬であってもよい。一実施形態では、前記阻害剤はエノキサパリンであり、試薬は、Aβ1-40及び／又はAβ1-42のレベルを試験するためのものである。前記阻害剤は、個々の投与量を含む複数の容器として含まれてもよく、又は複合累積投与量として含まれてもよい。試験試薬は、単一試験用のものであっても、多重試験用のものであってもよい。試験キットは、ELISAによってAβペプチドを試験するためのものであってもよい。任意で、血液採取装置及び容器も含まれることができる。
【００６８】
以下の実施例は、本発明を説明するために提供される。これらは制限を目的とするものではない。
【実施例１】
【００６９】
この実施例は、血中のタンパク質のタンパク質分解経路の特定を記載する。この実施例における材料及び方法の節は、実施例２にも適用される。
【００７０】
材料
【００７１】
hPEPD)及びその変異体(カルボキシ末端に6×Hisをタグ付)は、最近の報告にしたがって、産生し、精製し、特性化した(Yang et a., Cell Death Dis 2014; 5: e1211; Yang et al., J Biol Chem 2013; 288(4): 2365-2375)。mPEPDは、マウスの腎臓から精製した(方法の節、図１３Ａ及びＢ参照)。hAβ1-42(A9810)及びCCl4は、Sigma-Aldrichから購入した。mSRC(50311-M20B)及びEPは、Sino Biological及びSanofi-Aventisからそれぞれ購入した。以下のヒト凝固因子は、Haematologic Technologiesから購入した：FXII(HCXII-0155)、FXI(HCXI-0150)、FX(HCX-0050)、FXa(HCXA-0060)、FVII(HCVII-0030)、FVIIa(HCVIIA-0031)、TF(RTF-0300)、FII(HCP-0010)、及びFIIa(HCT-0020)。ヒトPK(HPK 1302)、ヒトHMWK(HK 1300)は、Enzyme Research Laboratoriesから購入した。以下の抗体は、Santa Cruz Biotechnologyから購入した。抗-6XHis tag(sc-803)、抗-HMWK(sc-25885)、抗-FII(sc-16972)、抗-SRC(sc-8056)、抗-Aβ1-42(sc-374527、sc-9129)、及び、ロバ抗-ヤギIgG-西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)(sc-2020)。以下の抗体は、Cell Signaling Technologyから購入した：抗-ERBB1(2232)、抗-pY1173-ERBB1(4407)、抗-ERBB2(2165)、抗-pY1221/1222-ERBB2(2243)、及び抗-SRC(2123)。以下の抗体は、GeneTexから購入した：抗-FXII(GTX21008)、抗-FXI(GTX79765)、抗-FIX(GTX79802)、抗-FX(GTX110300)、及び抗-FVII(GTX79785)。抗-PEPD(ab86507)及び抗-GAPDH(MAB374)は、Abcam及びMilliporeからそれぞれ購入した。ロバ抗-ウサギIgG-HRP(NA934V)、及びヒツジ抗-マウスIgG-HRP(NA931V)は、GE Healthcareから購入した。
【００７２】
組換えヒトFXII及びその変異体の産生
組換えヒトFXII及びその変異体(6×His C-末端タグを有する)(図１４Ａ及びＢ)は、以下に記載するようにして産生した。終止コドン無しの完全長ヒトFXIIコード配列を、表１に示すプライマー(特有の制限酵素部位を含む)を使用して正常なヒト肝臓cDNAからPCRによって増幅した。PCR条件は、以下の通りである：９５℃・３分、９４℃・３０秒２９サイクル、６１℃・３０秒、及び６８℃・２分、最終伸長６８℃・１０分。増幅PCR産物は、適用可能な制限酵素(EcoR1及びSalI)を用いて消化し、続いて、同じ制限酵素であらかじめ消化されたpCMV6-XL5(Origene)へのライゲーションを行った。6×His C-末端タグを、表１に挙げるプライマーを使用して、PCRに基づく部位特異的変異誘発によって発現構築物に付加した。挿入は、DNA配列解析によって確認した。プロリンのアラニンへの変異、及び、FXIIコード配列(20I-50Pdel-FXII、153T-172Rdel-FXII、315L-368Sdel-FXII、6Psdel-FXII、及び13Ps＞13As-FXIIを含む)中の特異的欠失は、QuikChange Lightningマルチ部位特異的変異誘発キット又はQuikChange Lightning部位特異的変異誘発キット(Agilent Technologies)を使用して、表１に挙げるプライマーを使用して、行った。全ての反応は、製造者の説明書に従って実施した。正確な変化を確認するために、全ての構築物を配列決定した。これらのプラスミドは、CHO-K1細胞(ATCC)中で組換えタンパク質を産生するために使用された。CHO-K1細胞は、加湿したインキュベーター中で、３７℃・5％CO2にて、10％FBS(Gibco)を補充したF-12K培地(Gibco)中で培養した。6-ウェルプレートで増殖させた細胞は、FuGENE HD(Promega)を用いて、FXII又は上述の変異体を発現するpCMV6-XL5プラスミドを用いてトランスフェクトされた(ウェル当たり1〜2μgのDNA・４８時間)。その後細胞を回収し、PBSで洗浄し、及び107細胞あたり0.5mLの溶解バッファー(50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、10 mM イミダゾール、0.05％Tween 20：NaOHを使用してpHを8に調整)中に懸濁した。細胞溶解を、氷上での超音波処理によって増強した。４℃にて、10,000×g・１０分間で遠心分離することによって、溶解物からデブリを除去した。6×His-タグ化FXII及びその変異体は、Ni-NTAアガロースクロマトグラフィーによって精製した。各タンパク質の相対分子サイズは、IBによって調べ(図１６Ｃ)、高純度の各タンパク質を、Invitrogenから得たキット(LC 6070)を使用して、SDS-PAGE及び銀染色によって確認した(図１６Ｄ)。全てのサンプルのタンパク質濃度は、ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキット(Pierce)によって測定した。
【００７３】
動物実験
全ての動物実験は、ロズウェルパーク癌研究所の動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って行った。野生型(WT)マウス(C57BL/6)、及び、FXIIを欠損したマウス(C57BL/6-FXII-/-)又はFVIIを欠損したマウス(C57BL/6-FVIItTA/tTA)を含む、７〜８週齢のオスのマウスを使用した。WT C57BL/6マウスは、Taconicから購入した。C57BL/6-FXII-/-マウス及びC57BL/6-FVIItTA/tTAマウスは、我々自身の施設で繁殖させ、遺伝子型を同定した。ブリーダーは、ノートルダム大学のDr. Francis J. Castellinoによって、提供された。全ての処置は、以下のようにして腹腔内で行われた：単一用量のビヒクル、hPEPD、mPEPD、mSRC、hAβ1-42又はCCl4；EP １日１回で５日間、続いて、EPの最終投与後１時間目に、単一用量のビヒクル、hPEPD又はhAβ1-42。CCl4はコーンオイル中に溶解し、他の物質は全て、PBS中に溶解した。ビヒクル又は試験物質は、体重20 g当たり0.1 ml体積にて、マウスに与えた。血液は、二酸化炭素により屠殺した時に、心穿刺によって特定の時点でマウスから採取し、心臓、肝臓及び腎臓も、マウスの数匹から採取した。血液は、特別の定めが無いかぎり、K3 EDTA-含有チューブ(Sarstedt社のMultivette 600)内に採取した。全ての血液サンプルは、血漿サンプルを得るために、迅速に遠心分離した。
【００７４】
PEPD、SRC、Aβ1-42及びFIの血漿レベルの測定
hPEPD、mPEPD、mSRC、hAβ1-42、mAβ1-42及びFI(フィブリノーゲンとしても知られている)の血漿濃度を、ELISAによって測定した。mAβ1-42、総Aβ1-42(mAβ1-42＋hAβ1-42)又はmSRCの血漿レベルを測定するために、96-ウェルELISAプレートを、抗-Aβ1-42マウスモノクローナル抗体(sc-374527)又は抗-SRCマウスモノクローナル抗体(sc-8056)を用いて、0.25μg/100μl/ウェルで被覆した(４℃・一晩)。プレートを、リン酸緩衝食塩水tween-20(PBST)で三回洗浄し、被覆したウェルを、200μl/ウェルの1％BSA含有PBSを用いて、少なくとも２時間室温でインキュベーションすることによってブロックした。PBSTを用いてもう一巡洗浄を行った後、適切に希釈したAβ1-42標準物質、SRC標準物質又は血漿サンプル(100μl/ウェル)とともに、プレートを室温で２時間インキュベートした。その後プレートをPBSTで洗浄し、抗-Aβ1-42ウサギポリクローナル抗体(sc-9129)又は抗-SRCウサギモノクローナル抗体(2123)とともに、室温で２時間、100μl/ウェルにてインキュベートした。プレ−トを、PBSTで再び洗浄し、各ウェルを、ヤギ抗-ウサギIgG-HRPコンジュゲート(100μl)とともに、室温で１時間インキュベートした。さらにPBSTでもう一巡の洗浄を行った後、各ウェルを、100μlのHRP基質3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(Cell Signaling, 7004)とともにインキュベートした。十分に発色してから、100μlの停止液(Cell Signaling, 7002)を各ウェルに添加し、450 nmでの吸光度を、マイクロタイター・プレートリーダーによって迅速に記録した。血漿FI濃度を、GenWay Biotechのアッセイキット(400-374-130050)を用いて、製造者の説明書に従って測定した。
【００７５】
IB
組織サンプルを、2 mMのフッ化フェニルメタンスルホニル、プロテイナーゼ阻害剤ミックス(Roche Applied Science)、及びホスファターゼ阻害剤カクテル２(Sigma-Aldrich)を補充したRIPAバッファー(25 mM Tris-HCl、pH 7.6、150 mM NaCl、1％ノニデットP-40、1％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS)と混合した。組織サンプルを、Dounceホモジナイザーで破砕し、破砕物を、４℃にて、12,000×g・１５分で遠心分離して、クリアにした。全サンプル中のタンパク質濃度を、BCAアッセイキットによって測定した。血漿サンプルは、さらなる処理無しで使用した(サンプルごとに20μl)。各サンプルを、四倍量のローディングダイと混合し、９５℃にて５分間加熱し、その後SDS-PAGE(8-12.5％)によって分離した。サンプルごとに7.5μlの最初の血漿を分析した。タンパク質を、フッ化ポリビニリデン膜に移し、特異的抗体でプローブし、ECL Plusキット(Amersham)又はSuperSignal West Picoキット(Thermo Scientific)を使用して検出した。
【００７６】
hPEPD、mSRC及びhAβ1-42の生体外分解の測定
血液凝固因子がhPEPDを分解するかどうかを判定するために、90 nM又はそれより低い濃度(10又は40 nM)のhPEPDを、溶媒、100 nM FIIa、100 nM FXa、10 nM FVIIa(10 nM TF有り又は無し)、又は10 nM FVII(10 nM TF有り又は無し)、及び／又は100 nM FIIaとともに、PBS(総容積100μl：5 mM CaCl2含有)中で室温にて所望の時間インキュベートした。TFは、10 mM CHAPS中に可溶化し、最終アッセイではこれを10倍に希釈した。様々な血漿サンプルのhPEPD-分解活性を比較するために、9.2 pmolのhPEPDを、WTマウス又はFVIItTA/tTAマウスから得た血漿100μlとともに、室温で、FIIa又はFXa(10 pmol)有り又は無しで、インキュベートし、活性の検出を最大化するために、すべてのインキュベーションを２４時間続行した。血液は、抗凝固薬無しで、プラスチックチューブ中に取り込んだが、即時に遠心分離して細胞及び血小板を除去した；我々は本明細書でこのようなサンプルを血漿と称する。いくらかの凝固活性が、血液サンプルの遠心分離前及び途中で生じるかもしれないが、我々の実験は、凝固因子、例えばFVIIの活性化が非常に限定されたものであることを示す(図５Ａ参照)。残存hPEPDを測定するために、インキュベートしたサンプルを遠心分離して潜在的なフィブリン塊を除去し、その後、SDS-PAGE及び銀染色(InvitrogenのLC 6070キットを使用)、IB又はhPEPD酵素活性の測定によって、このサンプルを分析した。hPEPD酵素活性は、基質としてグリシル-プロリンを使用して測定した(Zbucka et al., Folia Histochem Cytobiol 2007; 45 Suppl 1: S181-185に記載の通り)。各インキュベートサンプルからの沈殿物をPBSで二回洗浄し、その後2.5％SDS(サンプル当たり20μl)中に再懸濁した；各溶液を、10μlのローディングダイと混合し、IBによってhPEPDを分析した(基準物質として純粋なhPEPDを、結合コントロールとして因子FXIIIaをそれぞれ使用)。
【００７７】
FVII及びFVIIaを除去した又は除去しない血漿サンプルにおけるhPEPDの分解を測定するために、上述のWTマウスから得た血漿サンプルを、直接使用するか、又は使用前にFVII及びFVIIaを免疫枯渇させて使用した。血漿からFVII及びFVIIaを除去するために、500μlの血漿を、FVII/FVIIaに特異的な抗体(GTX79785；10μg) 及びタンパク質Ａセファロースビーズとともに、室温で１時間インキュベートした。４℃、13,000×g・１分間の遠心分離後、上清分画を収集し、IBによって分析して、FVII及びFVIIaの枯渇を確認した。次に、9.2 pmolのhPEPDを、100μlの通常の血漿又は、FVII/FVIIa枯渇血漿とともに、FIIa(10 pmol)有り又は無しで、２４時間、室温でインキュベートした。インキュベーションの間に形成された潜在的なフィブリン塊を、インキュベーションの終了時に遠心分離によって除去し、残存hPEPDを、hPEPD酵素活性分析によって測定した。
【００７８】
FVIIaによるmSRC又はhAβ1-42の分解を測定するために、mSRC(0.17μM)又はhAβ1-42(2.2μM)を、FVIIa(10 nM)及びTF(10 nM)有り又は無しで、PBS(総容積100μl：5 mM CaCl2含有)中で室温にて所望の時間インキュベートした。インキュベーション後、全サンプルをSDS-PAGEで分離し、銀で染色した。インキュベーション中に凝集したAβ1-42の場合は、凝集塊を30μlの2％SDS中に再溶解し、SDS-PAGE前に上清分画と併せた。
【００７９】
凝固因子又はその変異体への、hPEPD、mSRC又はhAβ1-42の結合の測定
結合反応は、３７℃にて２時間、総容積100μlのPBS中で実施した。HMWK、PK、FXI、FXII又はFXII変異体へのhPEPDの結合を評価するために、40 nMのhPEPDを、0.5μMの潜在的な結合パートナーとともにインキュベートした。全てのFXII変異体をHisタグ化し、他方FXIIは、実験に応じて、6×His-タグ化するか(我々自身の研究所で産生した)、又はHis-タグ化しなかった(市場で購入した)。FXIIへの結合についてhPEPDとその変異体とを比較するために、hPEPD又は変異体(40 nM)を、0.5μMのFXIIとともにインキュベートした。同様に、FXII及びその変異体へのmSRCの結合を評価するために、mSRC(40 nM)を、0.5μMのFXII又は変異体とともにインキュベートした。インキュベーション終了時に、特異的一次抗体を含む300μlのPBSを、インキュベーション溶液に添加し、これをさらに４℃で一晩インキュベートし、続いて、タンパク質Ｇ-アガロースによるIPを行い、沈殿物をIBによって分析した。hAβ1-42は凝集する傾向があるため、上記アプローチは、FXII及びその変異体へのhAβ1-42の結合を評価するためには使用しなかった。代わりに、hAβ1-42(200 nM)は、FXII又は変異体(20 nM)とともに、PBS(総容積100μl)中で室温にて２時間インキュベートした：その後溶液を低速で遠心分離して沈殿物から上清を分離した。沈殿物は、30μlの2％SDS中に再溶解し、これを上清とともにIBによって分析した。
【００８０】
FXII活性化の測定
インビトロでのhPEPD、その変異体、mSRC又はhAβ1-42によるFXII活性化を、前述のように発色アッセイによって測定した(Maas et al., J Clin Invest 2008; 118(9): 3208-3218)。hPEPD及びその変異体をそれぞれ、40及び400 nMで評価した。hAβ1-42は、0.05、0.5及び11.1μMで評価した。mSRCは、20及び200 nMで評価した。FXII活性化を、マイクロタイター・プレートリーダーによって、405 nmでの発色基質の変換をモニターすることによって、室温で３時間経過観察した。我々の実験の全ての反応において、反応溶液からのFXIIの除去は、発色基質の変換を抑止したので、このアッセイは、FXIIの活性化を特異的に測定する。
【００８１】
統計解析
データは、分散分析(ANOVA)によって、続いてTukey多重比較検定によって分析した。図の説明文に示すように、高度に歪んだデータについては、ANOVA前に対数変換を行った。0.05以下のP値は、統計的に有意と見なされた。
さらなる材料及び方法
【００８２】
材料
ヒト凝固因子FX(HCX-0050)及びFII(HCP-0010)は、Haematologic Technologiesから購入した。
【００８３】
マウスPEPD(mPEPD)の調製
mPEPDは、免疫親和性精製によって、C57BL/6マウスの腎臓から得た。まず、PEPD抗体を、タンパク質Ａセファロースビーズに共有結合した。5 mgの抗-PEPD(Ab111851, Abcam)を、50 mlの6 mg/mlタンパク質Ａセファロースビーズ(17-6002-35, GE Healthcare Life Sciences)とともに、室温で１時間インキュベートした。抗体が結合したビーズを、PBSで三回洗浄し、2 mMの架橋剤BS3(Pierce)とともに、３０分間インキュベートした(室温)。この混合物(最終、pH 7.5)に50 mMのTrisを添加することによって、架橋反応を終了させ、続いて室温で１５分間インキュベートした。抗体が結合したビーズを、PBSで三回洗浄し、BS3上の残存NHS-エステル基をブロックするために、各架橋反応を経たビーズを、100 mMのエタノールアミンを含む1 mlのブロッキングバッファー(pH 8.2)中で、室温にて１５分間インキュベートし、続いて、ビーズ複合体をPBSで三回洗浄した。次に、８週齢のC57BL/6マウスの腎臓を、ハサミで刻み、Dounceホモジナイザーを用いて、氷冷した50 mM Tris-HCl(pH 7.4)中で、10倍の体積(v/w)まで均質化した。破砕物を、9000×gで２０分間(４℃)で遠心分離して、組織デブリを除去した。上清サンプルを、PEPD抗体-タンパク質Ａセファロースビーズ・コンジュゲートとともに、４℃で一晩インキュベートした(0.5 mlのサンプルに、50 mlのビーズ)。その後ビーズを50 mM Tris(pH 8.0)で三回洗浄し、及び、結合mPEPD分子を、1 mlの100 mMグリシン-HCl(pH 2.8)を用いて四回溶出した。溶出液をプールし、1 M Tris-HCl(pH 9.5)を用いて、溶液のpHを約7.4に調節した。その後、Ultracel YM-30 Centricon(Millipore)を使用して、このmPEPD溶液を濃縮した。サンプル中のタンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイキットによって測定した。mPEPD標本を、ウエスタンブロット法でチェックし、その純度をSDS-PAGEで、続いて銀染色で確認した(hPEPDを比較用に使用)(図１３Ａ及びＢ)。
【００８４】
hPEPDによる、FX、FII又はFVIIの潜在的活性化の測定
hPEPD(40 nM)を、PBS中で、FX、FII又はFVII(0.5 mM)とともに、室温にて、5 mM CaCl2の存在下で、２４時間インキュベートし、続いて各凝固因子の潜在的活性化/切断を確認するためにIB解析を行った。この実験では、ポジティブコントロールとして、FXa、FIIa及びFVIIaを使用した。
【００８５】
アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)及びアラニントランスアミナーゼ(ALT)の血漿レベルの測定
血漿AST活性は、InfinityTM AST(GOT)試薬キット(Thermo, TR70121)を使用して測定した。血漿ALT活性は、InfinityTM ALT(GPT)試薬キット(Thermo, TR71121)を使用して測定した。各アッセイは、製造者の説明書に従って行われた。
【００８６】
結果
【００８７】
PEPDは、凝固プロテアーゼによって血漿中で 分解されるが、エノキサパリンはこの分解を抑制する
マウスPEPD(mPEPD)の平均血漿レベルは、コントロールマウスでは0.9 nMであり、これは、我々が以前に得た値に非常に近く(Yang et al., J Biol Chem 2013; 288(4): 2365-2375)、且つ、10 mg/kgの組換えヒトPEPD(hPEPD)の腹腔内注射(i.p.)後、総PEPD(hPEPD＋mPEPD)の平均血漿レベルは、１時間及び２４時間で、それぞれ19.4倍及び15.1倍に増加した(図１Ａ)。驚くべきことに、0.2 mg/kgのhPEPD注射後１時間及び２４時間目では、総PEPDの平均血漿レベルは、それぞれ、コントロールのわずか51％及び46％であった(図１Ａ)。これは、hPEPDが、それ自身及びマウス血漿由来のmPEPDの迅速な除去を誘発している可能性を示唆した。
【００８８】
アンチトロンビンの活性化剤は、ラットにおいて血漿PEPDレベルを上昇させると思われる。我々は、エノキサパリン(EP)、臨床使用されている低分子ヘパリン(アンチトロンビンIIIを活性化する)を用いて、マウスを2.5 mg/kg i.p.にて毎日５日間処置し、及びhPEPD(0.2 mg/kg)を、最後のEP投与後１時間目に腹腔内に投与した；総PEPDの平均血漿レベルは、hPEPD処置後、同じ用量のhPEPDを単独で用いて処置したマウスのものより、１時間及び２４時間目でそれぞれ、35.2倍及び63.8倍高かった(図１Ａ)。EPも、mPEPDの平均血漿レベルを2.1倍増加させた(図１Ａ)。hPEPD処置は、マウスにおいて多くの凝固因子(第XII因子(FXII)、プレカリクレイン(PK)、高分子キニノーゲン(HMWK)、第XI因子(FXI)、第IX因子(FXI)、第X因子(FX)、第II因子(FII)、第I因子(FI)及び第VII因子(FVII)を含む)の切断又は活性化を引き起こした(図１Ｂ〜Ｊ)。FXII、PK、HMWK、FXI、FIXは、内因性血液凝固カスケードの構成要素であり、他方FVIIは、通常は、血管の損傷により組織因子(TF)を経て活性化される、外因性血液凝固カスケードに属する。この二つのカスケードは、FXに収束し、その活性化は、FII活性化につながり、FIを切断する。EPそれ自体は、これらの因子に影響を及ぼさず、hPEPDがFXII、PK、HMWK、FXI及びFIXを活性化するのを妨げなかったが、hPEPDがFX、FII、FI及びFVIIの活性化又は切断を引き起こすのを妨げた(図１Ｂ〜Ｊ)。EPは、アンチトロンビンIIIを活性化することによって、FIXa、FXa及びFIIa(FIX、FX及びFIIの活性型)を阻害することが知られている。FIIa及びFXaの両方がFVIIを活性化できるため、hPEPDが、内因性及び共通の凝固カスケードを活性化することによって、FVIIを活性化することが示唆された。hPEPDはヒト起源のものであり、Hisタグを有するが、いかなるタグも有さないmPEPDのマウスへの注射は、hPEPDがしたように、同じ応答を誘発した(図１３Ｃ〜Ｌ)。
【００８９】
我々は次に、hPEPDに対するいくつかのヒト凝固因子の影響を評価した。PEPD分解のEP阻害が、これらの因子の阻害と関連していたので、我々は、FXa、FIIa及びFVIIa(FVIIの活性型)に着目した。FXa及びFIIaは、hPEPD安定性に影響を及ぼさなかったが(図１４Ａ〜Ｄ)、FVIIa(10 nM)＋TF(10 nM)は、急速かつ大規模なhPEPDタンパク質分解を引き起こした(図２Ａ〜Ｃ)。例えば、hPEPDを、６０分間、10、40及び90 nMにてFVIIa及びTFとともにインキュベートした後、hPEPDのわずか35.9％、46.3％及び52.4％のhPEPDがそれぞれ残存した(図２Ｂ)。注目すべきことに、FVIIの正常な血漿濃度が約10 nMであることを考えると(Bajaj et al., J Biol Chem 1981; 256(1): 253-259)、上記実験で使用したFVIIa濃度は、その生理学的濃度よりはおそらくはるかに高く、これはその活性の検出を促進することを目的としていた。しかしながら、後述するように、FVIIaは血漿におけるhPEPD分解に必須である。TFは予想通り、FVIIaのタンパク質分解活性を増強するが、TFは内皮下組織に存在し、且つ血管の損傷は、hPEPDを注射したマウスにおけるFVII及び他の凝固プロテアーゼの活性化に関与していないように思われるので、それは生体内でのFVIIaによるPEPD分解に必ずしも関与していないかもしれない。TFの可溶性の生理活性型が血中を循環する一方、FVIIaによるPEPD分解におけるこの因子の潜在的な関与は未知のままである。注目すべきことに、TF不存在下でFVIIaは、hPEPDを分解した(図２Ｄ)。さらに、TF有り又は無しでFVIIが、hPEPDへのタンパク質分解活性を示さなかったのに対して、この混合物に生理学的に適切な濃度(100 nM)のFIIaを添加すると、著しいhPEPD分解が生じた(図２Ｅ)。これらの結果は、さらに、hPEPDが内因性及び共通の凝固カスケードを経てFVIIを活性化することを示し、且つ、FVIIaがhPEPDを分解することも明らかにする。FVIIaはトリプシン用セリンプロテアーゼであり、アルギニン及びリジンのカルボキシル側で、ペプチド結合を切断し、及び、FIX及びFXを切断することが知られている。しかしながらFVIIaによるhPEPDの大規模なタンパク質分解は、FIX(二つのタンパク質分解サイト)及びFX(一つのタンパク質分解サイト)に関するその限られたタンパク質分解とは対照的である(Schmidt et al., Trends Cardiovasc Med 2003; 13(1): 39-45; Leonardi et al., Toxicon 2008; 52(5): 628-637)。FVIIaに関するhPEPD中のタンパク質分解サイトはまだ知られていない。
【００９０】
hPEPDはFXIIに直接結合し活性化する
我々は次に、hPEPDといくつかのヒト凝固因子との相互作用を評価した。FXIIは、HMWK、PK及びFXIと相互作用し、内因性凝固カスケードを開始させるが、hPEPDはFXIIにのみ結合する(図３Ａ)。hPEPDは、ホモ二量体タンパク質であり、493のアミノ酸からなる各サブユニットを有し、Ｎ-末端制御領域、リンカー及びＣ-末端触媒領域を含む(それぞれ、アミノ酸＃1-174、175-185及び186-493)。我々は、FXIIと、４つのhPEPD変異体(278G＞D-hPEPD、1M-265Rdel-hPEPD、185V-493Kdel-hPEPD及び266T-493Kdel-hPEPDを含む)との相互作用を評価した(図１５)。278G＞D-hPEPD以外の変異体は、ホモ二量体を形成することができない(Yang et al., Cell Death Dis 2014; 5: e1211)。酵素的に不活性な278G＞D-hPEPD(Ledoux et al., Am J Hum Genet 1996; 59(5): 1035-1039)及び1M-265Rdel-hPEPDは、FXII結合に関してhPEPDとほとんど区別がつかず、他方、185V-493Kdel-hPEPDも266T-493Kdel-hPEPDも、FXIIに結合できなかった(図３Ｂ)。FXIIは単鎖チモーゲンであり；R353-V354でのタンパク質分解的切断がFXIIaを産生し、これはジスルフィド結合によって結びついたＮ-末端重鎖及びＣ-末端触媒軽鎖(β-FXIIa)を有する(Stavrou et al., Thromb Res 2010; 125(3): 210-215)。hPEPD及び278G＞D-hPEPDは、FXIIを活性化する点で異ならなかったが、1 M-228Hdel-hPEPDは約50％の活性であった(図３Ｃ)。これらの結果は、１）hPEPDの酵素機能は、FXII結合及び活性化に関与しない；２）各hPEPDモノマーが、FXIIに独立的に結合する；３）hPEPDのＣ-末端配列はFXIIに結合するが、hPEPDの他の配列は、完全なXII活性化に関与する、ことを示す。Zn2+は、FXII活性化に関与する。hPEPDによるFXII活性化も、Zn2+を必要とした(図３Ｄ)。
【００９１】
我々は次に、hPEPDへの結合に関し、ヒトFXIIとその変異体(20I-50Pdel-FXII、153T-172Rdel-FXII、315L-368Sdel-FXII、6Psdel-FXII、及び13Ps＞13As-FXIIを含む)とを比較した(図１６Ａ〜４Ｄ)。負に帯電した表面及び他の物質が、FXII中のフィブロネクチンII型領域(FN2D)又はフィブロネクチンI型領域(FN1D)内の配列に結合することによってFXIIを活性化する一方、関連結合サイトを欠くFXII変異体(20I-50Pdel-FXII及び153T-172Rdel-FXII)は、FXIIと同様に良く、hPEPDに結合した(図３Ｅ)。しかしながら、プロリンリッチ領域(PRD；315L-368Sdel-FXII)を欠くFXII変異体は、hPEPDに結合できなかった(図３Ｅ)。FXIIのPRD中の１３のプロリンのうち(図１６Ａ)、最初の６つのプロリンが欠損したもの(6Psdel-FXII)は、hPEPDへのFXII結合をわずかに減弱しただけだったが、１３のプロリンすべてを１３のアラニンで置き換えたものは(13Ps＞13As-FXII)、hPEPDへのその結合を完全に消失させた(図３Ｅ)。これらの結果は、hPEPDがPRDを経てFXIIに結合すること、及びプロリンの全てではないもののほとんどが結合に関与していることを示す。これは、FXII中のPRDの生理的機能も明らかにする。
【００９２】
FXIIは、血漿中でPEPD分解を惹起する
我々はさらに、FXIIノックアウトマウス(C57BL/6-FXII-/-)、それらのWT対応物、及びEPを使用して、血漿PEPD分解を研究した。FXIIは、FXII遺伝子のエクソン３〜８が、ネオマイシン耐性遺伝子で置換されているFXII-/-マウスの血漿中には存在しなかった(図１７)。mPEPDの基礎血漿レベルは、FXII-/-マウスでは、WTマウスより2.2倍高かった(図４Ａ)。EP処置(2.5 mg/kg i.p.５日間毎日)は、WTマウスではmPEPDの血漿レベルを2.0倍上昇させたが、FXII-/-マウスでは上昇させなかった(図４Ａ)。EP前処置が無い場合、hPEPD処置(0.2 mg/kg i.p.)後６時間目に、先に示したように、総PEPDの血漿レベルはWTマウスでは66％減少したが、FXII-/-マウスでは12.5倍に増加した(図４Ａ)；総PEPDの平均血漿レベルは、FXII-/-マウスでは、WTマウスより53.8倍高い。EP前処置が有る場合、hPEPD処置(0.2 mg/kg i.p.)後６時間目に、総PEPDの平均血漿レベルは、WTマウスで19.7 nMであり、これはFXII-/-マウスよりなお14.6％低く(図４Ａ)、EPが、WTマウスにおけるFXII-惹起PEPD分解を完全に阻害しなかったことを示唆する。しかしながら、EPはFXII-/-マウスにおける血漿PEPDレベルに有意な影響を示さなかった(図４Ａ)。これらの結果は、FXIIが血漿PEPDの分解に必須であることを示す。FXII-/-マウスでは、hPEPD処置は、HMWK、FXI、PK及びFIXの活性化を引き起こさなかったが、FX、FII及びFVIIのわずかな活性化を引き起こし(FIは測定されなかった)、これはEPによって大きく阻害された(図４Ｂ)。hPEPDによるFX、FII及びFVIIのFXII-非依存性活性化のメカニズムは分からないままであるが、hPEPDは、これらの因子のいずれもを直接活性化しない(図１８)。我々の結果は、FVIIのFXII-非依存性活性化が、血漿PEPD分解に有意に寄与することは示さない。FXII-/-マウスにおける血漿PEPDレベルにEPが影響を与えないことは、WTマウスにおいて血漿PEPDレベルを著しく上昇させるその能力に反しており(図１Ａ)、さらに、血漿からのPEPD排出を調節する(例えば、マトリクス内へのその隔離又は細胞によるその取り込み)よりむしろ、FXII-介在性タンパク質分解経路を阻害することによって、EPがWTマウスにおける血漿PEPDレベルを上昇させることも示す。まとめると、我々は、血漿PEPD分解が、PEPDによる直接的FXII活性化から生じると結論付ける。
【００９３】
血漿PEPDは、もっぱらFVIIaによって分解される
我々は、次にFVII-欠損マウスに取り掛かった。マウスのFVII対立遺伝子の両方を、FVII cDNAに付着したテトラサイクリントランス活性化因子(tTA)プロモーターを含む構築物(FVIItTA/tTA)で置き換えると、FVII発現は無視できる程度となる(Rosen et al., Thromb Haemost 2005; 94(3): 493-497)。FVIIは、FVIItTA/tTAマウスの血漿で検出できなかった(図１７)。我々は、FVIItTA/tTAマウス及びWTマウスから得た血漿サンプルのhPEPD-分解活性を比較した。FVII及び他の因子の活性を評価するために、血液を抗凝固薬(EDTA)無しでマウスから採取したが、直ちに遠心分離して細胞と血小板を除去した。同じ実験条件下で、FVIItTA/tTA血漿とインキュベーションした後は、hPEPDの分解は検出できなかったが、WT血漿とインキュベーションした後は、残存hPEPDは88.8％のみとなり(図５Ａ)、これは前もって作られたか又はインキュベーション中に産生された、WT血漿における低濃度のFVIIaの存在を暗示した。WT血漿にヒトFIIa又はFXaを添加すると、hPEPD分解は著しく増加したが、どちらの因子もFVIItTA/tTA血漿では効果を示さなかった(図５Ａ)。インキュベートした溶液は全て、分析前に、遠心分離によって沈殿物(潜在的なフィブリン塊)を除去された。PBSで洗浄後の沈殿物を、2.5％SDS中に懸濁し、hPEPDの存在をIBによって分析し、結合コントロールとしては第XIIIa因子(FXIIIa)を使用した(FXIIIaはフィブリンに結合することが知られているため)。しかしながら、hPEPDはどのサンプルでも検出できず(図５Ｂ)、FXIIIaも２つのサンプルで不存在であったが、これは明らかにPBS洗浄中の微量の沈殿物の損失に起因していた。さらに、免疫枯渇によるWT血漿からのFVII/FVIIaの除去は、残存hPEPD分解又はFIIa-対応hPEPD分解を消失させた(図５Ｃ及びＤ)。mPEPDの基礎血漿レベルは、FVIItTA/tTAマウスでは、WTマウスより2.5倍高かった(図５Ｅ)。hPEPD処置後(0.2 mg/kg i.p.)６時間目に、総PEPDの血漿レベルは、WTマウスでは56.3％減少したが、FVIItTA/tTAマウスでは12.0倍に増加し、２つの遺伝子型の間には68.9倍の差があった(図５Ｅ)。FVIItTA/tTAマウスは、それらが血漿PEPDを分解できない点でFXII-/-マウスに良く似ているが、図４Ｂに示すように、hPEPD-処置FXII-/-マウスで活性化されなかった凝固因子は、FVIIを除き、hPEPD-処置FVIItTA/tTAマウスでは全て活性化された(図５Ｆ)。まとめると、我々は、血漿PEPDはもっぱらFVIIaによって分解され、且つ、FXa及びFIIaは両方とも、PEPDによるFXII活性化後に形成され、FVIIを活性化すると結論付ける。
【００９４】
FXII-FVIIタンパク質分解経路による血漿SRCの分解
多くのタンパク質は、SH3、WW又はEVH1領域を経て、プロリン-リッチモチーフに結合する。我々は、SH3-含有マウスSRC(mSRC)と、FXII-FVII経路との相互作用を試験した。mSRCは、細胞内チロシンキナーゼであるが、後述するように、血漿中に低濃度で存在し、これはおそらく損傷を受けた細胞からの放出に起因している。mSRCは、FXIIに直接結合し、活性化した(図６Ａ及びＢ)。 FXII中のPRDの欠失(315L-368Sdel-FXII)は、mSRC結合を完全に消滅させたが、この結合は、負に帯電した表面及び他の物質に結合するFN2D又はFN1Dにおける配列の欠失(20I-50Pdel-FXII又は153T-172Rdel-FXII)では変化しなかった(図６Ａ)。しかしながら、mSRCは、FXIIへのその結合が、FXIIのPRD中の最初の６つのプロリンの欠失後に、著しく減少し(図６Ａ)、他方このような欠失は、前述のようにFXIIへのhPEPD結合をごくわずかに減弱する点で、hPEPDとは異なっている。
【００９５】
FVIIa(10 nM)及びTFとともにmSRCをインキュベーションすると、時間依存性で広範なmSRCの断片化が生じた(図６Ｃ)；それゆえ、mSRCもFVIIaの基質である。FVIIaに関してmSRC中の正確なタンパク質分解サイトはまだ知られていない。内在性mSRCの平均血漿レベルは、WTマウスで3.4 nMであったが、FXII-/-マウス及びFVIItTA/tTAマウスではそれぞれ、2.1倍及び2.2倍高かった(図７Ａ)。WTマウスでは、総mSRCの平均血漿レベルは、0.1又は0.5 mg/kgでのmSRCの腹腔内注射後６時間目で、それぞれコントロールの49％及び147％であった(図７Ａ)。総SRCの血漿レベルに対する低用量mSRCの効果は、図１Ａに示すように低用量のhPEPDで見られたものを連想させる。上述のmSRC注射後６時間目では、総mSRCの平均血漿レベルは、WTマウスと比べて、FXII-/-マウスでは45.2〜58.2倍高く、FVIItTA/tTAマウス(0.5 mg/kgのmSRCのみで処置した)では62.2倍高かった(図７Ａ)。血漿サンプルの解析は、mSRC注射が、WTマウスではFXII、PK、HMWK、FXI、FIX、FX、FII、FI及びFVIIの用量依存性の活性化/切断を引き起こし、FXII-/-マウスではどの因子にも変化を生じさせず、及びFVIItTA/tTAマウスでは、FVII以外の全ての因子を活性化させたことを示した(図７Ｂ〜Ｊ)。しかしながら、hPEPD及びmPEPDとは異なり、mSRCは、FX、FII及びFVIIのFXII-非依存性活性化を生じさせなかった。我々は、FXII-/-マウス及びFVIItTA/tTAマウスではFI切断を測定しなかった。まとめると、我々の結果は、FXII-FVII経路がmSRCも検出し分解することを示す。
【実施例２】
【００９６】
この実施例は、実施例１で記載したタンパク質分解経路が、アミロイドβタンパク質又はペプチドの分解の原因となることも実証する。
【００９７】
FXII-FVIIタンパク質分解経路による血漿Aβ1-42の分解
ヒトAβ1-42(hAβ1-42)も、ヒトFXIIを用量依存的に活性化する(図８Ａ)が、FXIIとその変異体によるhAβ1-42結合の比較は、hAβ1-42がFXII中のFN2D(20I-50P)に結合することを示した(図８Ｂ)。FVIIa(10 nM)及びTFとともにhAβ1-42をインキュベーションすると、時間依存的且つ広範なhAβ1-42断片化が生じた(図８Ｃ)。その切断パターンは、hAβ1-42が、アルギニン(残基＃5)又はリジン(残基＃16、28)が存在する３つの部位全てで、FVIIaによって切断されたらしいことを示唆する。Aβ1-42は凝集する傾向があるので、FVIIa処置後に形成された高分子量バンド(図８Ｃ)は、hAβ1-42又はそのフラグメントの凝集塊かもしれない。
【００９８】
内在性のマウスAβ1-42(mAβ1-42)の平均血漿レベルは、WTマウスでは0.1 nMであったが、FXII-/-マウス及びFVIItTA/tTAマウスでは、2.2〜2.6倍高かった(図９Ａ)。WTマウスでは、2μg/kgのhAβ1-42の腹腔内注射後６時間目に、総Aβ1-42(mAβ1-42＋hAβ1-42)の血漿レベルは、39.3％減少したが、8又は40μg/kgのhAβ1-42注射後、それは1.5及び5.1倍増加した(図９Ａ)。低用量のhAβ1-42に応答した総Aβ1-42の血漿レベルの低下は、前述した低用量のhPEPD又はmSRCで観察されたものを想起させる。同じhAβ1-42処理下において、総Aβ1-42の血漿レベルは、FXII-/-マウス及びFVIItTA/tTAマウスでは、WTマウスと比べて62.7〜94.1倍高かったが、FXII-/-マウスとFVIItTA/tTAマウスの間の差は、統計的に有意ではなかった(図９Ａ)。
【００９９】
hAβ1-42は、WTマウスでは、FXII、PK、HMWK、FXI、FIX、FX、FII、FI及びFVIIの活性化/切断をもたらし、FXII-/-マウスでは、FX、FII及びFVIIのわずかな活性化のみをもたらし、FVIItTA/tTAマウスでは、FVII以外の全ての上記因子の活性化をもたらした(図９Ｂ〜Ｊ)。我々は、FXII-/-マウス及びFVIItTA/tTAマウスではFI切断を測定しなかった。hAβ1-42によるFX、FII及びFVIIのわずかなFXII-非依存性活性化は、前述のhPEPD及びmPEPDのものを連想させるが、Aβ1-42分解には有意に寄与しなかった。我々の結果は、Aβ1-42が、FXII-FVII経路を経て血漿中のFVIIaによってもっぱら分解されることを示す。
【０１００】
EPは、血漿Aβ1-42の分解を阻害する
Aβ1-42が、ADの主要な促進力であると仮定して、我々は、FXII-FVII経路の薬理学的な破壊が、血漿Aβ1-42分解を阻止するかどうかを確定しようとした。我々は、WTマウスを、ビヒクル又はEP(2.5 mg/kg i.p.)で、１日１回５日間処置し、且つ、最後のEP/ビヒクル投与後１時間目に、マウス腹腔内にhAβ1-42(40μg/kg)又はビヒクルを投与した。血液サンプルは、hAβ1-42/ビヒクル処置後６時間目にマウスから採取した。内在性mAβ1-42の平均血漿レベルは、コントロールマウスでは0.1 nMであったが、EP-処置マウスでは1.7倍高かった(図１０Ａ)。総Aβ1-42の血漿レベルは、hAβ1-42単独での処置後に5.5倍増加したが、EP＋hAβ1-42による処置後には406.0倍増加した(図１０Ａ)。それでもやはり、上記結果と、前述したEP無しの同じhAβ1-42処置を受けたFXII-/-マウス及びFVIItTA/tTAマウスにおける結果を比較すると、EPが血漿Aβ1-42分解を完全に遮断するようには思えなかった(図９Ａ)。
【０１０１】
EPそれ自体は、測定した前記FXII-FVII経路因子のいずれにも影響を与えなかったが、hAβ1-42処置マウスにおいて、FX、FII及びFVIIの活性化を大きく阻害した(図１０Ｂ〜Ｉ)。これらの結果は、前述した血漿PEPD分解のEP阻害で示されたものに類似している。
【０１０２】
組織障害及びその保護機能の期間中のFXII-FVIIタンパク質分解経路の活性化
四塩化炭素(CCl4)は、肝臓にダメージを与え、血清PEPDレベルを増加させる(これはおそらく、損傷を受けた組織からのPEPD放出に起因している)。CCl4処置(0.5 g/kg)は、WTマウス及びFXII-/-マウスの間で、著しいしかし類似した肝臓のダメージを与えた(図１９)。mPEPDの血漿レベルは、CCl4処置前は、FXII-/-マウスで、WTマウスより2.1倍高く、及びCCl4処置後２４時間目に、mPEPDの血漿レベルは、WTマウスでは3.7倍増加したが、FXII-/-マウスでは16.7倍増加した(図１１Ａ)。先に論じたmPEPDの結果を裏付けるために、我々はマウスを4 mg/kgのhPEPDで処置した。hPEPDのこの用量は、hPEPD-処置WTマウスにおける総PEPDの血漿レベルが、CCl4-処置WTマウスにおけるものと類似するように選択された。hPEPD処置後２４時間目に、総PEPDの血漿レベルは、WTマウスでは3.3倍増加したが、FXII-/-マウスでは134.6倍増加した(図１１Ａ)。このように、PEPDが損傷を受けた組織から放出されるにしろ、外因的に導入されるにしろ、それはFXII-FVII経路を活性化し、次にPEPDを分解する。CCl4又はhPEPDで処置されたWTマウスでは、mSRC及びmAβ1-42の平均血漿レベルは、41.2〜56.1％減少した(図１１Ｂ及びＣ)。対照的に、FXII-/-マウスでは、mSRC及びmAβ1-42の平均血漿レベルは、CCl4処置後にそれぞれ6.7％及び24.9％増加したが、hPEPD処置後には変わらないままであった(図１１Ｂ及びＣ)。CCl4-処置FXII-/-マウスにおけるmSRC及びmAβ1-42の血漿レベルのわずかな増加は、損傷を受けた組織からのそれらの放出に起因しているのかもしれない。これらの物質が、様々な臓器及び組織で発現されることを考えると(特に、PEPD)、上記結果から、多様な臓器及び組織における傷害が、血液循環へのこれらの及び他のFXII活性化剤の放出によりFXII-FVII経路を活性化し得ることが示唆される。さらに、一つのタンパク質によるこの経路の活性化が、FVIIaの基質である複数の血漿タンパク質の分解を引き起こすかもしれない。
【０１０３】
PEPDは、細胞表面レセプターであるERBB1及びERBB2のリガンドである。我々は、FXII-FVII経路が、レセプターに対する、血漿PEPD(損傷を受けた組織から放出されるか又は外因的に侵入する)の阻害効果を最小化するかどうか確認しようとした。FXII-/-マウスと比べて、CCl4又はhPEPDで処置したWTマウスは、低血漿レベルのPEPDだけではなく(図１１Ａ)、受容体チロシンリン酸化における変化の減少(代表的なリン酸化部位を測定)及び様々な組織(心臓、腎臓及び肝臓)における受容体枯渇も示した(図１１Ｄ)。このように、FXII-FVII経路は、血漿PEPDを分解することによって、正常な組織内のERBB1及びERBB2に対するPEPDの阻害効果を明らかに減弱する。
【０１０４】
PEPD、SRC及びAβ1-42を検出し分解するFXII-FVII経路、及びEPによるその阻害を図１２にまとめる。FVIIaは、構造的に異なるPEPD、SRC及びAβ1-42を分解する。PEPD及びSRCは、FXIIのPRDへ結合することによってFXIIを活性化し、他方Aβ1-42は、FXIIのFN2Dへ結合することによってFXIIを活性化する。インビトロにて、FXII活性化のために使用したこれらのプローブの濃度は、それらを用いた処置後の、FXII-/-マウス及びFVIItTA/tTAマウスの血漿で検出されたそれらの濃度に基づいている；同じ処置条件下でこの経路が強く活性化され、プローブの分解を引き起こしたWTマウスとは異なり、これらのマウスではタンパク質分解経路は破壊された。FXIIの他の既知の活性化剤は、FXII内のFN2D又はFN1Dと相互作用する。このように、FXII内の複数のドメインがその活性化を媒介する。多数の細胞内タンパク質は、それらのSH3、WW又はEVH1領域を経てプロリン-リッチモチーフに結合する。我々のSRCの結果は、他のPRD-結合性細胞内タンパク質も、血液循環に放出された際、前記タンパク質分解経路に関与する可能性があることを示唆する。他方、他のメカニズムも、循環からのこれらの及び他のタンパク質及びペプチドの除去(腎臓排出、肝臓排出、様々な組織内のマトリクスへの結合、及び、細胞取り込み並びに分解など)に関与する可能性がある。特に、未処置マウスにおいてFXII-FVII経路の多様な因子がごくわずかに活性化することは(図２０)、この経路が、正常なコンディション下では有意に活性化しないことを示唆している；採血後、EDTAの抗凝固効果が開始する前に、前記因子のわずかな活性化が存在するように思われたため、このような活性化の検出は若干難しかった。
【０１０５】
我々の結果は、FXII-FVII経路が、血漿から望まれない又は有害なタンパク質及びペプチドを除去することによって、組織の恒常性に寄与し得ること、他方EPのような抗凝固薬は、このタンパク質分解経路を妨害することによって、これらの物質の血漿レベルを上昇させ得ることを示唆する。注目すべきことに、PEPD、SRC及びAβ1-42について、血中の生理的機能は知られておらず、且つAβ1-42は、ADの主要な促進力であるため、有害でさえある。しかしながら、我々の結果は、この経路の活性化が、FIの重要な切断を生じさせ、これは血液凝固リスクを高めるかもしれないことも示す(本研究ではマウスにおける血液凝固の兆候はなかったが)。さらに、この経路の活性化は、HMWKからのブラジキニン遊離、及びβ-FXIIa及びカリクレインを経る補体活性化ももたらす可能性があり、これは潜在的に、血管生理機能、免疫応答及び炎症に影響しうる。
【０１０６】
血漿Aβ1-42が、FXII-FVII経路によって検出され且つ分解されるという我々の発見は、ADへの洞察を提供する。我々の結果は、FXIIの活性化が、FVII活性化及びFVIIaによるAβ1-42の分解につながることを示す。Aβ1-42及びAβ1-40は、ADの病態の特徴の一つである老人班の主成分であり、ADの主要な促進力と考えられている。Aβ1-42と同じく、Aβ1-40は、セクレターゼによる細胞膜結合Aβ前駆体タンパク質のタンパク質分解的切断によって産生され、血漿中にも低濃度で存在する。我々は、Aβ1-40もFXII-FVII経路によって分解されることを示す。hAβ1-42注射後、Aβ1-42の総血漿レベルが、FXII又はFVIIのいずれかが欠損したマウスにおいて、又は、EP-前処置WTマウスにおいて、EP-未処置WTマウスと比べて63〜95倍高いという事実は(図９Ａ及び１０Ａ)、新しく発見された血漿タンパク質分解経路が、血漿Aβ1-42のクリアランスに、中心的役割を果たすことの明らかな証拠である。
【０１０７】
さらに、EPが血漿Aβ1-42及びAβ1-40分解を抑制するという我々の発見は、ADバイオマーカーの開発への新規なアプローチを提供するかもしれない。ADの血液ベースのバイオマーカーは、まだ満たされていない医学的ニーズである。血漿Aβレベルは、脳プラーク量との相関性が乏しく、現在はADバイオマーカーと見なされていない(Blennow et al., Nat Rev Neurol 2010; 6(3): 131-144; Hansson et al., J Alzheimers Dis 2012; 28(1): 231-238; Rissman et al., J Neural Transm 2012; 119(7): 843-850; Toledo et al., Alzheimers Res Ther 2013; 5(2):8)。我々の結果は、FXII-FVIIタンパク質分解経路の一時的な阻害(例えば、EPの使用による)が、ADにおいて、Aβ1-42、Aβ1-40及び他のAβペプチドの高い血漿レベルの検出を可能にし得ること、及びそのようなアプローチが、疾患検出のための、並びに疾患進行及び治療に対する反応性の評価のための、ADバイオマーカーとしての血漿Aβの開発を可能にし得ることを示唆する。
【０１０８】
FXII-FVIIタンパク質分解経路の発見は、あるタンパク質療法を開発するのに重要な意義も有するかもしれない。多くの治療的タンパク質は、短い血漿半減期を有し、現在のアプローチは、胆汁、肝臓又は腎臓排出を経るそれらの除去を遅延させることを目標としている。我々の発見は、これらのタンパク質のいくつかが、FXII-FVII経路に関与しているかもしれないこと、及び、この経路の阻害が、血漿におけるそれらの滞留を増加させるかもしれないことを示唆する。代表例を挙げると、EPは生体内でPEPD分解を阻害し、マウスにおけるERBB2-誘発性腫瘍の阻害のために要求されるその血漿濃度を減少させることなく、hPEPD用量を少なくとも50倍まで減らすことを可能にする。さらに、EPは血液凝固に対するhPEPDの刺激作用を最小化し得るため、EPとhPEPDの組み合わせは、hPEPDをより安全な抗腫瘍剤にし得る。
【表１】
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【実施例３】
【０１０９】
この実施例は、hAβ1-40がFXIIを活性化し、且つFVIIaによって分解されることを実証する。ヒトアミロイドβ1-40(hAβ1-40)は、Sigmaから購入した(A1075)。分析手順及び試薬は、実施例１及び２で記載した通りである。hAβ1-40(0、0.05、0.5μM)は、室温にて、ZnCl2-含有PBS中で、ヒトFXII(0.97 nM)とともにインキュベートされた。FXII活性化は、発色アッセイによって測定した。各値は、平均値±SDである(n＝3)。(B) hAβ1-40(2.2μM)は、単独で、又は、FVIIa(10 nM)＋ヒトTF(10 nM)とともに、CaCl2-含有PBS中で、室温にて表示の時間インキュベートされた；上清分画を除去した後、各インキュベーション管を、潜在的な凝集塊を溶解するために少量の2％SDSですすぎ、すすぎ液を、上清分画と混合し、SDS-PAGEによって分離し、銀で染色した。コントロールとして、FVIIa及びTFを、hAβ1-40無しでインキュベートした。
【０１１０】
図２１Ａは、hAβ1-40が、FXIIを用量及び時間依存的に活性化することを示す。図２１Ｂは、活性化第VII因子(FVIIa)が組織因子(TF)とともに、hAβ1-40を分解することを示す。このように、hAβ1-40は、FXIIの活性化及びFVIIaによる分解という点で、hAβ1-42と類似している。
【実施例４】
【０１１１】
オスのC57BL/6マウス(７〜８週齢)は、Taconicから購入し、ビヒクル(PBS)及びEP(0.5 mg/kg)で１日１回５日間処置(腹腔内)した。５回目の投与後１時間目に、このマウスにhAβ1-40(40μg/kg)を腹腔内投与し、６時間後、このマウスを二酸化炭素によって屠殺し、その時点で心穿刺により血液を採取した。血液は、K3 EDTA-含有チューブ(Sarstedt社のMultivette 600)内に採取した。EP及びhAβ1-40は、それぞれPBS(体重20 g当たり0.1 ml)を用いて投与した。hAβ1-40の血漿レベルは、ELISAによって測定した。簡単に説明すると、96-ウェルELISAプレートを、hAβ1-40-検出用マウスモノクローナル抗体で被覆した(４℃・一晩)。このプレートを、tween-20を含むリン酸緩衝食塩水(PBST)で三回洗浄し、被覆したウェルを、1％BSAを含むPBS(200μl/ウェル)とともに少なくとも２時間室温(RT)でインキュベーションすることによって、ブロックした。PBSTでもう一巡の洗浄を行った後、プレートを、適切に希釈したhAβ1-40標準物質又は血漿サンプルとともに(100μl/ウェル)室温で２時間インキュベートした。プレートをその後PBSTで洗浄し、抗-hAβ1-40ウサギポリクローナル抗体とともに、室温で２時間インキュベートした。プレートを、PBSTで再度洗浄し、各ウェルをヤギ抗-ウサギIgG-HRPコンジュゲート(100μl)とともに、室温で１時間インキュベートした。PBSTでもう一巡の洗浄を行った後、各ウェルを、100μlのHRP基質3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(Cell Signaling, 7004)とともにインキュベートした。十分に発色してから、100μlの停止液(Cell Signaling, 7002)を各ウェルに添加し、450 nmにおける吸光度を、マイクロタイター・プレートリーダーで迅速に記録した。
【０１１２】
図２２に示すように、EP前処置が無い場合、平均血漿hAβ1-40濃度は0.403 nMであるが、EP前処置は、平均血漿hAβ1-40濃度を77.4倍まで上昇させる。これは、先に示したようにEPが生体内でhAβ1-42分解を遮断したことに加えて、EPが生体内でhAβ1-40分解を遮断したことを示す。
【実施例５】
【０１１３】
B6.Cg-Tg(PDGFB-APPSwlnd) 20Lms/2JMjaxマウス(J20マウスとしても知られている)は、Jackson Laboratoryから購入した。J20マウスは、Swedish(K670N/M671L)及びIndiana(V717F)変異の両方を有するヒトAβ前駆体タンパク質(APP)の変異型(APPSwlnd)を発現する(Mucke et al., J Neurosci, 2000, 20, 4050-4058)。トランスジェニック挿入物の神経系発現は、ヒト血小板由来増殖因子βポリペプチド(PDGFB)プロモーターによって指示される。C57BL/6バックグラウンドのJ20マウス(オスのヘミ接合体)は、野生型(WT)のメスC57BL/6Jマウス(Jackson Laboratoryから購入)と繁殖させた。F1マウスは、ヘミ接合体と非-トランスジェニック同腹仔を特定するために、離乳時に、PCRによって遺伝子型を同定した。１ヶ月齢及び３ヶ月齢の時点で、ビヒクル又はEP(0.5 mg/kg)を用いて、１日１回５日間マウスを処置(腹腔内)した。EPは、PBS(体重20 gあたり0.1 ml)を用いて投与した。最後のPBS/EP投与後６時間目に、このマウスを二酸化炭素によって屠殺し、その時点で心穿刺により血液を採取した。血液は、K3 EDTA-含有チューブ(Sarstedt社のMultivette 600)内に採取した。
【０１１４】
Aβ1-40及びAβ1-42の総血漿レベルを、ELISAによって測定した。簡単に説明すると、96-ウェルELISAプレートを、抗-Aβ1-42モノクローナル抗体(sc-374527)で、0.25μg/100μl/ウェルにて、４℃で一晩被覆した。このプレートを、tween-20を含むリン酸緩衝食塩水(PBST)で三回洗浄し、被覆したウェルを、1％BSAを含むPBS(200μl/ウェル)とともに少なくとも２時間室温でインキュベーションすることによってブロックした。PBSTでもう一巡の洗浄を行った後、プレートを、適切に希釈したhAβ1-42標準物質又は血漿サンプルとともに(100μl/ウェル)室温で２時間インキュベートした。プレートをその後PBSTで洗浄し、抗-Aβ1-42ウサギポリクローナル抗体(sc-9129)とともに、室温で２時間インキュベートした(100μl/ウェル)。プレートを、PBSTで再度洗浄し、各ウェルをヤギ抗-ウサギIgG-HRPコンジュゲート(100μl)とともに、室温で１時間インキュベートした。PBSTでもう一巡の洗浄を行った後、各ウェルを、100μlのHRP基質3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(Cell Signaling, 7004)とともにインキュベートした。十分に発色してから、100μlの停止液(Cell Signaling, 7002)を各ウェルに添加し、450 nmにおける吸光度を、マイクロタイター・プレートリーダーで迅速に記録した。注目すべきことに、上記ELISAアッセイは、ヒト型及びマウス型両方で、Aβ1-40及びAβ1-42の両方を検出する。
【０１１５】
WTマウスにおけるAβ1-40及びAβ1-42の総血漿レベルは低く(約0.45 nM)、オスのマウスとメスのマウス間で同様であり、且つ、１ヶ月齢及び３ヶ月齢でも同様である(図２３)。ADマウスにおけるAβ1-40及びAβ1-42の総血漿レベルは、オスのマウスとメスの間では差が無いが、WTマウスよりは有意に高く、時間依存的に増加する(図２３)。EPは、WTマウスにおいてAβ1-40及びAβ1-42の総血漿レベルに対して限定的な影響を有し、１ヶ月齢及び３ヶ月齢の両方で約1.6倍の増加を引き起こす。対照的に、EPは、ADマウスにおいてAβ1-40及びAβ1-42の総血漿レベルを著しく増加させ、１ヶ月齢で約2.3倍の増加、及び３ヶ月齢で3.6〜4.2倍の増加を引き起こす(図２３)。中でも注目すべきことに、Aβ1-40及びAβ1-42の総血漿レベルにおけるEP誘発性増加の、WTマウスに対するADマウスの比は、１ヶ月齢時で8.71〜9.32であり、３ヶ月齢時で47.53〜56.85である(図２３)。これらの結果は、ADマウスにおいて、脳から末梢循環へ放出されるAβ1-40及びAβ1-42の分解を、EPがブロックすることを示す。
【０１１６】
凝固因子(FXII、PK、HMWK、FXI、FIX、FX、FII及びFVIIを含む)は、ADマウスで切断され又は活性化され、切断/活性化は、３ヶ月齢で、１ヶ月齢よりも著しく(図２４及び図２５)、これは、Aβ1-40及びAβ1-42の血漿濃度の増加を反映している。EPは、FX、FII及びFVIIの活性化を抑制する(図２４及び図２５)。
【実施例６】
【０１１７】
EPに加えて、我々は、３種類の臨床的に使用されている経口抗凝固薬の、血漿Aβ分解(一例として、hAβ1-42を使用)に対する影響を測定した。この３種には、リバーロキサバン(直接的FXa阻害剤；Roehrig et al., J Med Chem, 2005, 48, 5900-5908)、ダビガトラン(直接的FIIa阻害剤；van Ryn et al., Thromb Haemost, 2010, 103, 1116-1127)、及びワルファリン(FII、FVII、FIX及びFXを含む、ビタミンＫ依存性因子の合成を阻害する；Whitlon et al., Biochemistry, 1978, 17, 1371-1377)が含まれる。マウスでの凝固に対するそれらの効果に関する文献データに基づいて(Zhou et al., Stroke, 2013, 44, 771-778; Pfeilschifter et al., Stroke, 2011, 42, 1116-1121; Sato et al., Jpn Pharmacol, 1998, 78, 191-197; Sparkenbaugh et al., Blood, 2014, 123, 1747-1756; DeFeo et al., Cancer Biol Ther, 2010, 10, 1001-1008)、Taconicから購入したオスのC57BL/6マウス(７〜８週齢)を、ビヒクル、リバーロキサバン(10又は20 mg/kg)、ダビガトラン(22.5又は45 mg/kg)又はワルファリン(1又は3 mg/kg)で、経口挿管によって１日１回５日間処置した。５回目の投与後１時間目に、hAβ1-42(40μg/kg)をマウスに腹腔内投与し、６時間後に、このマウスを二酸化炭素によって屠殺し、その時点で心穿刺により血液を採取した。血液は、K3 EDTA-含有チューブ(Sarstedt社のMultivette 600)内に採取した。hAβ1-42の血漿レベルを、ELISAによって測定した。リバーロキサバン、ダビガトラン(ダビガトランエテキシラート)及びワルファリン(ワルファリンナトリウム錠)は、それぞれBristol-Myers-Squibb、Combi-Blocks、及びAdvanced Chemblocksから入手した。リバーロキサバンは、10％エタノール、40％Solutol HS15(Sigma)及び50％水に溶解し、体重20 gあたり0.2 ml体積でマウスに投与した。ダビガトランは、2％ジメチルスルホキシドを含む大豆油(Sigma)に溶解し、体重20 gあたり0.2 ml体積でマウスに投与した。ワルファリンは水に溶解し、体重20 gあたり0.1 ml体積でマウスに投与した。リバーロキサバン及びダビガトランの一番多い用量は、最大溶解量であり、ワルファリンの一番多い用量は、最大耐用量である。
【０１１８】
図２６に示すように、hAβ1-42の平均血漿レベルは、40μg/kgのhAβ1-42の注射後６時間目のマウスで0.53〜0.56 nMである。1及び3 mg/kgのワルファリンによる前処置は、hAβ1-42の血漿レベルを、それぞれ33.2倍及び42.4倍に上昇させた。10及び20 mg/kgのリバーロキサバンによる前処置は、hAβ1-42の血漿レベルを、それぞれ47.2倍及び55.5倍に上昇させた。22.5及び45 mg/kgのダビガトランによる前処置は、hAβ1-42の血漿レベルを、それぞれ14.1倍及び21.3倍に上昇させた。このように、３種類の剤のうち、血漿hAβ1-42レベルの上昇について、リバーロキサバンが最も効果が高く、ダビガトランが最も効果が低かった。これは、リバーロキサバンが直接的FXa阻害剤(AβペプチドによるFXIIを経るFVIIの活性化をより完全に遮断すると考えられる)であり、ダビガトランが直接的FIIa阻害剤(AβペプチドによるFXIIを経るFVIIの活性化を部分的にのみ遮断すると考えられる)であり、ワルファリンが複数の凝固プロテアーゼ(FII、FVII、FIX及びFX)を間接的に阻害するという事実と一致している。しかしながら、リバーロキサバンは、hAβ1-42の血漿レベルの上昇に関し、EPほど効果的ではない。EPは、アンチトロンビンIIIを活性化することによって、FIXa、FXa及びFIIaを阻害することが知られている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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