(57)【要約】  抗体はトランスグルタミナーゼの基質である、少なくとも１つのグルタミンを含むＣ末端伸長部を重鎖に持ち、このような抗体を用いてトランスグルタミナーゼによって介在される抗体−薬物結合体の製造が可能になる。
2018510864.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの重鎖が、ＥＥＱＹＡＳＴＹ（配列番号：１）、ＥＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２）、ＥＥＱＹＮＳＴＹ（配列番号：３）、ＥＥＱＹＱＳ（配列番号：２のアミノ酸１から６）、ＥＥＱＹＱＳＴ（配列番号：２のアミノ酸１から７）、ＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２のアミノ酸２から８）、ＱＹＱＳ（配列番号：６のアミノ酸３から６）、またはＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２のアミノ酸３から８）を含むアミノ酸配列を有するＣ末端伸長部を持つ、全長抗体。
【請求項２】
Ｃ末端伸長部が、ＥＥＱＹＡＳＴＹ（配列番号：１）、ＥＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２）またはＥＥＱＹＮＳＴＹ（配列番号：３）を含むアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の全長抗体。
【請求項３】
Ｃ末端伸長部が、ＥＥＱＹＡＳＴＹ（配列番号：１）から成るアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の全長抗体。
【請求項４】
Ｃ末端伸長部が、ＥＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２）から成るアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の全長抗体。
【請求項５】
Ｃ末端伸長部が、ＥＥＱＹＮＳＴＹ（配列番号：３）から成るアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の全長抗体。
【請求項６】
Ｃ末端伸長部が、ＥＥＱＹＱＳ（配列番号：２のアミノ酸１から６）、ＥＥＱＹＱＳＴ（配列番号：２のアミノ酸１から７）、ＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２のアミノ酸２から８）、ＱＹＱＳ（配列番号：６のアミノ酸３から６）、またはＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２のアミノ酸３から８）から成るアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の全長抗体。
【請求項７】
ＩｇＧ１アイソタイプである、請求項１に記載の全長抗体。
【請求項８】
配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する定常領域を持つ、請求項１に記載の全長抗体。
【請求項９】
以下のステップ：
（ａ）少なくとも１つの重鎖が、ＥＥＱＹＡＳＴＹ（配列番号：１）、ＥＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２）、またはＥＥＱＹＮＳＴＹ（配列番号：３）を含むアミノ酸配列を有するＣ末端伸長部を持つ、全長抗体を提供すること；
（ｂ）式：
【化１】
2018510864.tif 000018
［式中、Ｄは薬物を示し、Ｘは薬物Ｄおよびアミン基ＮＨ２を結合する二価のリンカーを示す］
のアミンドナーを提供すること；
（ｃ）トランスグルタミナーゼの存在下で、該抗体および該アミンドナーを接触させること；および
（ｄ）Ｃ末端伸長部におけるグルタミンと該アミンドナーのアミン基ＮＨ２との間に、アミド結合を形成することによって、該抗体および該アミンドナーに抗体薬物結合体を形成させること
を含む、抗体−薬物結合体を製造する方法。
【請求項１０】
以下のステップ：
（ａ）少なくとも１つの重鎖が、ＥＥＱＹＡＳＴＹ（配列番号：１）、ＥＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２）、またはＥＥＱＹＮＳＴＹ（配列番号：３）を含むアミノ酸配列を有するＣ末端伸長部を持つ、全長抗体を提供すること；
（ｂ）式：
【化２】
2018510864.tif 000019
［式中、Ｒ１は第一反応性官能基を示し、Ｘ１は反応性官能基Ｒ１およびアミン基ＮＨ２を結合する二価のリンカーを示す］
のアミンドナーを提供すること；
（ｃ）トランスグルタミナーゼの存在下で、該抗体および該アミンドナーを接触させること；
（ｄ）Ｃ末端伸長部におけるグルタミンと該アミンドナーのアミン基ＮＨ２との間にアミド結合を形成することによって、該抗体および該アミンドナーに第一反応性官能基Ｒ１が結合した修飾抗体を形成させること；
（ｅ）式：
【化３】
2018510864.tif 000020
［式中、Ｒ２は第一反応性官能基Ｒ１と共有結合的に反応する第二反応性官能基であり、Ｄは薬物であり、Ｘは薬物Ｄおよび第二反応性官能基Ｒ２を結合する二価のリンカーである］
の部位を含む薬物と修飾抗体を接触させること；並びに
（ｆ）第一および第二反応性官能基Ｒ１およびＲ２を反応させて、抗体−薬物結合体を形成させること
を含む、抗体−薬物結合体を製造する方法。
【請求項１１】
抗体が、抗体の重鎖のＣ末端伸長部のグルタミン残基の側鎖におけるアミド結合を介して薬物部位に共有結合し、Ｃ末端伸長部がＥＥＱＹＡＳＴＹ（配列番号：１）、ＥＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２）、ＥＥＱＹＮＳＴＹ（配列番号：３）、ＥＥＱＹＱＳ（配列番号：２のアミノ酸１から６）、ＥＥＱＹＱＳＴ（配列番号：２のアミノ酸１から７）、ＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２のアミノ酸２から８）、ＱＹＱＳ（配列番号：６のアミノ酸３から６）、またはＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２のアミノ酸３から８）を含むアミノ酸配列を有する、抗体−薬物結合体。
【請求項１２】
Ｃ末端伸長部がＥＥＱＹＡＳＴＹ（配列番号：１）から成るアミノ酸配列を持つ、請求項１１に記載の抗体−薬物結合体。
【請求項１３】
Ｃ末端伸長部がＥＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２）から成るアミノ酸配列を持つ、請求項１１に記載の抗体−薬物結合体。
【請求項１４】
Ｃ末端伸長部がＥＥＱＹＮＳＴＹ（配列番号：３）から成るアミノ酸配列を持つ、請求項１１に記載の抗体−薬物結合体。
【請求項１５】
Ｃ末端伸長部がＥＥＱＹＱＳ（配列番号：２のアミノ酸１から６）、ＥＥＱＹＱＳＴ（配列番号：２のアミノ酸１から７）、ＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２のアミノ酸２から８）、ＱＹＱＳ（配列番号：６のアミノ酸３から６）、またはＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２のアミノ酸３から８）から成るアミノ酸配列を持つ、請求項１１に記載の抗体−薬物結合体。
【請求項１６】
抗体が抗ＣＤ７０または抗メソテリン抗体である、請求項１１に記載の抗体−薬物結合体。
【請求項１７】
薬物部位がＤＮＡマイナーグルーブ結合剤またはツブリシン類似体である、請求項１１に記載の抗体−薬物結合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスグルタミナーゼ酵素によって薬物部位に結合可能であるような修飾抗体、およびそのような抗体から製造される結合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
（本発明の背景）
現在強い関心が寄せられている抗癌剤の１種は、抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）であり、免疫結合体としても知られている。ＡＤＣにおいて、治療剤（薬物）は抗体に共有結合しており、その抗原は癌細胞に発現している。抗体は、抗原に結合することによって、ＡＤＣを癌に送達する働きをする。そこに到達すると、共有結合の切断または抗体の分解によって、治療剤が癌部位において放出される。逆に言えば、ＡＤＣが血液系を循環している間、治療剤は抗体に共有結合しているため、不活性に保たれる。このように、ＡＤＣにおける治療剤は、局所的放出のために、通常の化学療法剤と比べてはるかに有用でありうる（すなわち、細胞毒性）。このように、ＡＤＣは３つの要素を含む：（１）抗体、（２）薬物、および（３）抗体と薬物とを共有結合によって結合するリンカー。ＡＤＣの総括としては、Ｓｃｈｒａｍａ ｅｔ ａｌ．２００６を参照されたい。
【０００３】
ＡＤＣの製造において重要なステップは、共有結合によって結合させるステップであり、結合ステップとも称される。効率的な結合のための多くの方法が開示されてきた。最近多くの興味を生じさせているものは、トランスグルタミナーゼ（ＴＧアーゼ）、特に細菌のトランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ）が介在する結合体である。例えば、Ｊｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１０を参照されたい。
【０００４】
ＢＴＧは、グルタミンのカルボキサミド側鎖（アミンアクセプター）とリシンのε−アミノ基（アミンドナー）との間にアミド結合を形成する。特異的に、トランスグルタミナーゼはグルタミン残基に関して選択的であり、例えば、タンパク質ループの可動性部位に位置し、特定のアミノ酸に隣接していることが必要であるが、リシン残基に関しては乱雑であり、例えば、リシンのε−アミノの代替として、アルキレンアミノ化合物のアミノ基を容易に許容する。Ｆｏｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．２００８を参照されたい。
【０００５】
典型的なＢＴＧ介在結合体において、以下に示されるように、グルタミン残基は抗体に存在し、一方でアミノ基はリンカー−薬物部位に位置する：
【化１】
2018510864.tif 000003
このスキームにおいて、抗体はアミンアクセプターとして働き、Ｈ２Ｎ−［リンカー］−［薬物］部位はアミンドナーとして働く。
【０００６】
ポリペプチド鎖におけるグルタミン残基の位置はＢＴＧ介在トランスアミド化に対する感受性に大きな影響を有する。抗体におけるグルタミン残基は全て通常はＢＴＧの基質ではなく、ＢＴＧの感受性を誘導するためには、抗体にいくつかの修飾を行うことが必要である。一般に、抗体は重鎖のアスパラギン２９７（Ｎ２９７）がグリコシル化（Ｎ−結合型グリコシル化）されている。Ｎ２９７Ａ置換によるグリコシル化部位の除去、または翻訳後、酵素による脱グリコシル化のいずれかによる抗体の脱グリコシル化によって、隣接するグルタミン２９５（Ｑ２９５）がＢＴＧ感受性になることが、Ｊｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１０によって発見された。彼らはまた、Ｎ２９７Ｑ置換によってグリコシル化が除去されるだけではなく、同じくアミンアクセプターである第二のグルタミン残基（２９７位）もまた導入されることを示した。このように、単純な脱グリコシル化によって、抗体ごとに２つ（重鎖ごとに１つ、Ｑ２９５において）のＢＴＧ反応性のグルタミン残基が生成し、さらに、Ｎ２９７Ｑ置換を有する抗体は、４つ（重鎖ごとに２つ、Ｑ２９５およびＱ２９７の位置において）のＢＴＧ反応性グルタミン残基を有する。
【０００７】
トランスグルタミナーゼによって介在されるＡＤＣの製造に関する開示としては、以下が挙げられる：Ｄｅｎｎｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ ２０１３、Ｊｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｐｏｎｓ ｅｔ ａｌ．２０１３、およびＳｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．，２０１３。
【０００８】
特に、Ｐｏｎｓ ｅｔ ａｌ．２０１３において、トランスグルタミナーゼ反応性にするために、鎖の１つのＣ末端に位置しうる４つのアミノ酸のグルタミン含有タグを有する抗体の修飾が開示される。（他の文脈において、タグの結合または抗体の鎖のＣ末端の伸長部もまた開示されている。例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２０１４を参照されたい。）
【０００９】
さらに一般的にタンパク質（抗体を含む）のラベル化または修飾に関する、他のトランスグルタミナーゼの開示としては以下が挙げられる：Ｂｒｅｇｅｏｎ ２０１４，Ｂｒｅｇｅｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１３ ａｎｄ ２０１４，Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２００５，Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｋａｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｍｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．２００８，Ｓａｔｏ ２００２，Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．２００１，および Ｓｕｇｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２００７。
【００１０】
本明細書において、第一著者または発明者および年号によって引用される文書の完全な引用は、本明細書の最後に列挙される。
【発明の概要】
【００１１】
ある実施態様において、本発明は、重鎖の少なくとも１つのＣ末端に、トランスグルタミナーゼの基質であるグルタミンを少なくとも１つ含む伸長部を加えることによって該Ｃ末端を修飾することで、トランスグルタミナーゼ、特にＢＴＧの基質であるグルタミン残基を導入するように修飾された完全長抗体を提供する。当該伸長部は、ＥＥＱＹＡＳＴＹ（配列番号：１）、ＥＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２）、ＥＥＱＹＮＳＴＹ（配列番号：３）、ＥＥＱＹＱＳ（配列番号：２のアミノ酸１から６）、ＥＥＱＹＱＳＴ（配列番号：２のアミノ酸１から７）、ＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２のアミノ酸２から８）、ＱＹＱＳ（配列番号：６のアミノ酸３から６）、またはＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２のアミノ酸３から８）を含むアミノ酸配列を有する。
【００１２】
好ましくは、当該伸長部はＥＥＱＹＡＳＴＹ（配列番号：１）、ＥＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２）、またはＥＥＱＹＮＳＴＹ（配列番号：３）から成るアミノ酸配列を有する。
【００１３】
我々はまた、いくつかのＣ末端伸長部が調整されたまたは切断されたバリアントもまた、グルタミン反応性であることを発見した。このような調整されたバリアントはＥＥＱＹＱＳ（配列番号：２のアミノ酸１から６）、ＥＥＱＹＱＳＴ（配列番号：２のアミノ酸１から７）、ＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２のアミノ酸２から８）、ＱＹＱＳ（配列番号：６のアミノ酸３から６）、またはＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２のアミノ酸３から８）によって例示される。調整された配列は、グルタミン反応性であるためにはセリンの存在（配列番号：２のアミノ酸６）が必要であると考えられる。
【００１４】
別の実施態様において、以下のステップを含む、抗体−薬物結合体の製造方法が示される：
（ａ）少なくとも１つの重鎖が、ＥＥＱＹＡＳＴＹ（配列番号：１）、ＥＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２）、またはＥＥＱＹＮＳＴＹ（配列番号：３）を含むアミノ酸配列を有するＣ末端伸長部を持つ、全長抗体を提供すること；
（ｂ）式：
【化２】
2018510864.tif 000004
［式中、Ｄは薬物を示し、Ｘは薬物Ｄおよびアミン基ＮＨ２を結合する二価のリンカー基を示す］
のアミンドナーを提供すること；
（ｃ）トランスグルタミナーゼの存在下で、抗体およびアミンドナーを接触させること；および
（ｄ）Ｃ末端伸長部におけるグルタミンとアミンドナー部位のアミン基ＮＨ２との間にアミド結合を形成することによって、抗体およびアミンドナーに抗体薬物結合体を形成させること。
【００１５】
本明細書はさらに、以下のステップを含む、抗体−薬物結合体を製造する別の方法を提供する：
（ａ）抗体が、少なくとも１つの重鎖に、ＥＥＱＹＡＳＴＹ（配列番号：１）、ＥＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２）、またはＥＥＱＹＮＳＴＹ（配列番号：３）を含むアミノ酸配列を有するＣ末端伸長部を加えることによって修飾された、全長抗体を提供すること；
（ｂ）式：
【化３】
2018510864.tif 000005
［式中、
Ｒ１は第一反応性官能基を示し、Ｘ１は反応性官能基Ｒ１と、アミン基ＮＨ２とを結合する二価のリンカーを示す］
のアミンドナーを提供すること；
（ｃ）トランスグルタミナーゼの存在下で、抗体およびアミンドナーを接触させること；
（ｄ）Ｃ末端伸長部におけるグルタミンと、アミンドナーのアミン基ＮＨ２との間にアミド結合を形成することによって、抗体およびアミンドナーに、第一反応性官能基Ｒ１が結合した修飾抗体を形成させること；
（ｅ）式：
【化４】
2018510864.tif 000006
［式中、Ｒ２は、第一反応性官能基Ｒ１と共有結合的に反応する第二反応性官能基であり、Ｄは薬物であり、Ｘは薬物Ｄと第二反応性官能基Ｒ２とを結合する二価のリンカーである］
の部位を含む薬物と修飾抗体を接触させること；並びに
（ｆ）第一および第二反応性官能基Ｒ１およびＲ２を反応させて、抗体−薬物結合体を形成させること。
【００１６】
別の実施態様において、本発明は抗体−薬物結合体を提供し、ここで、抗体は、抗体の重鎖のＣ末端伸長部におけるグルタミン残基の側鎖におけるアミド結合を介して、薬物部位に共有結合しており、Ｃ末端伸長部はＥＥＱＹＡＳＴＹ（配列番号：１）、ＥＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２）、またはＥＥＱＹＮＳＴＹ（配列番号：３）を含むアミノ酸配列を有する。好ましくは、抗体は抗ＣＤ７０または抗メソテリン抗体である。好ましくは、薬物部位はＤＮＡマイナーグルーブ結合剤（特に、結合の際にＤＮＡもまたアルキル化するもの）またはツブリシン類似体である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
図１ａおよび１ｂは、合わせて、アミンドナー（Ａ）の合成のスキームを示す。
【００１８】
図２は、１段階結合反応によって合成された結合体の活性を示す。
【００１９】
図３は、２段階結合反応によって合成された２つの結合体の活性を比較している。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
実施態様の記述
ＩｇＧ１アイソタイプである抗体は、重鎖の定常領域の、２９７−３００位において、アミノ酸配列ＥＥＱＹＮＳＴＹ（配列番号：３、Ｋａｂａｔにおけるものと同様にＥＵごとの番号付け）を含む。前記のように、グルタミン残基Ｑ２９５は、２９７番目の位置に通常結合しているグリコシド基がＮ結合型グリコシド結合の形成を防ぐために、酵素によって除去されるか、またはＮ２９７の置換が設計されているかのいずれかによって欠失していなければ、トランスグルタミナーゼの基質ではない。
【００２１】
我々は、配列ＥＥＱＹＮＳＴＹ（配列番号：３）が抗体の重鎖のＣ末端に、その伸長部として付加されている場合、グルタミン残基はトランスグルタミナーゼの基質となり、トランスグルタミナーゼが介在する結合に適するように抗体を修飾できることを発見した。さらに、我々は、この配列のバリアントである、ＥＥＱＹＡＳＴＹ（配列番号：１）およびＥＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２）が同様に有効であることを発見した。これらにおいて、いずれのグルタミン残基も、トランスグルタミナーゼ反応性であることが発見された。
【００２２】
ＡＤＣにおいて抗体に結合する薬物部位の数は、薬物−抗体比またはＤＡＲと称される。それぞれの重鎖に、ＥＥＱＹＡＳＴＹ（配列番号：１）またはＥＥＱＹＮＳＴＹ（配列番号：３）を含むアミノ酸配列を有するＣ末端伸長部を持つ抗体の例において、ＤＡＲの理論的最大値は、それぞれの重鎖に１つの薬物部位が結合した、２である。それぞれの重鎖に、ＥＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２）を含むアミノ酸配列を有するＣ末端伸長部を持つ抗体の例において、ＤＡＲの理論値は、各伸長部のそれぞれのグルタミン残基に１つの薬物部位が結合した、４である。当業者にとって当然のことながら、結合反応は常に１００％の効率ではなく、所定のＡＤＣ合成について、少ない数、例えば、最大理論値が２である場合に１．７のＤＡＲの観測値、または最大理論値が４である場合に３．５のＤＡＲの観測値が得られうる。
【００２３】
好ましくは、本発明に用いられる抗体は、２つの同一の重鎖、および２つの同一の軽鎖（カッパまたはラムダ）を有する全長抗体である。好ましくは、両方の重鎖は本発明に記載のＣ末端伸長部を有する。好ましくは、抗体はＩｇＧ１アイソタイプである。さらに好ましくは、抗体は、配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するＩｇＧ１バリアントである、重鎖の定常領域を持つ。このバリアントは、Ｒ２１４／Ｅ３５６／Ｍ３５８のアロタイプであり、適宜、Ｋ４４７が翻訳後に除去されたＣ末端を持つ（Ｋａｂａｔにおけるものと同様にＥＵごとの番号付け）。抗体は好ましくは、モノクローナル抗体であり、さらに好ましくは、ヒトモノクローナル抗体である。
【００２４】
我々は、抗体が、天然の抗体に生じるようにＣ末端のリシンを有する場合、当該リシンがアミンドナーとして働き、抗体の重鎖を架橋しうることを発見した。そのため、Ｃ末端のリシンを除去することが望ましい。また、抗体が組み換えによって生成される場合、いくつかの重鎖のＣ末端鎖のリシン残基（図２における４４７位のアミノ酸）は、発現の間、または宿主細胞での生産から酵素によって精製するステップの間に、しばしば除去され、不均一な生成物（いずれのリシンも存在するもの、１つのリシンが除去されたもの、またはいずれのリシンも除去されたもの）を生じる。このような不均一性は望ましくない。初期生成物をさらに酵素処理することによって、または、組み換え発現を用いて核酸配列からＣ末端のリシンのコドンを除去することによって、両方のリシンを意図的に除去することで、より不均一な生成物を得ることができる。ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．１９９２。本明細書において開示されるシステイン置換を有し、重鎖のＣ末端のリシン残基を欠損した抗体のバリアントもまた、本発明の範囲内である。両方のＣ末端のグリシンおよびリシンが除去された抗体のバリアントもまた既知であり、本発明の範囲に含まれる。
【００２５】
本発明において用いられる好ましいトランスグルタミナーゼは、ストレプトミセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）からのＢＴＧであり、市販されているか、または組み換えによって調製できる。
【００２６】
本発明のＣ末端伸長部を有する抗体は、１段階または２段階の反応によって結合可能である。
【００２７】
模式的に、１段階結合は、これに限定されるものではないが、例として、１つのグルタミン（すなわち、配列番号：１または番号：３に記載のもの）を有するＣ末端伸長部を持つ抗体を用いて、以下のように表すことができる。
【化５】
2018510864.tif 000007
【００２８】
アミンドナーは、式（Ｉ）：
【化６】
2018510864.tif 000008
［式中、Ｄは薬物であり、Ｘは薬物Ｄとトランスグルタミナーゼ反応性アミン基Ｈ２Ｎとを結合する二価のリンカーである］
で表すことができる。
【００２９】
リンカーＸは、アルキレン鎖およびポリ（エチレングリコール）鎖の単体または組み合わせを含んでもよく、以下のように示される：
【化７】
2018510864.tif 000009
［式中、下付文字ｇは０または１であり、下付文字ｈは１から２４であり、好ましくは２から４である］
およびこれらの組み合わせ。これらの断片は以下に示されるように結合することができる：
【化８】
2018510864.tif 000010
【００３０】
リンカーＸはまた、標的部位に到達した後に、結合体から薬物Ｄを放出するための切断可能な基を含むことができる。切断可能な基の例としては、ジスルフィド（ジスルフィド交換によって切断される）、ヒドラゾン（低ｐＨにおいて切断される）およびペプチド（酵素切断）などが挙げられる。あるいは、切断可能な基が存在しない場合、結合体からの薬物Ｄの放出は、抗体の異化を介して起こりうる。
【００３１】
また、リンカーＸは、以下の明細書でさらに記述される、自己犠牲基を含みうる。
【００３２】
切断可能なペプチドを有するアミンドナー部位（Ｉ）の好ましい態様は、式（Ｉａ）から（Ｉｃ）：
【化９】
2018510864.tif 000011
［式中、
Ｄは薬物であり；
ＡＡａおよびそれぞれのＡＡｂは独立して、アラニン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンから成る群から選択され；
ｐは１、２、３、または４であり；
Ｔは自己犠牲基であり；
ｔは０または１である］
によって示される。
【００３３】
式（Ｉａ）、（Ｉｂ）および（Ｉｃ）において、−ＡＡａ−［ＡＡｂ］ｐ−は、長さがｐの値によって決定されるポリペプチドを表す（ｐが１であればジペプチド、ｐが３であればテトラペプチド、など）。ＡＡａはポリペプチドのカルボキシ末端に存在する。反対に最後のＡＡｂは、ポリペプチドのアミノ末端に存在する。好ましいポリペプチド−ＡＡａ−［ＡＡｂ］ｐ−は、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ、Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｇｌｎ、およびＡｓｐ−Ｖａｌ−Ｃｉｔであり、これらは、Ｈ２Ｎ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＣＯ２Ｈのように、一般的なＮからＣ方向に記述されている。さらに好ましくは、ポリペプチドは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、またはＶａｌ−Ａｌａである。好ましくは、ポリペプチド−ＡＡａ−［ＡＡｂ］ｐ−は、標的（癌）細胞内に存在する酵素、例えば、カテプシン、特にカテプシンＢによって切断可能である。
【００３４】
下付文字ｔが０または１に等しいことによって示されるように、自己犠牲基Ｔは、適宜、アミンドナー（Ｉａ）、（Ｉｂ）、および（Ｉｃ）中に存在する。存在する場合、自己犠牲基は、薬物Ｄがポリペプチドの酵素切断による薬物の放出を立体的に阻害するのを避けるために、薬物Ｄとポリペプチドとの間の空間的な隔離を提供する。自己犠牲基Ｔは、好ましくは、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）基であり、この構造は以下：
【化１０】
2018510864.tif 000012
に示され、アスタリスク（＊）は薬物Ｄのアミン窒素に結合したＰＡＢＣの末端を表し、波線
【化１１】
2018510864.tif 000013
はポリペプチド−ＡＡａ−[ＡＡｂ]ｐ−に結合した末端を表す。
【００３５】
模式的に、２段階反応は、これに限定されるものではないが、例として、それぞれに１つのグルタミンを有するＣ末端伸長部を持つ抗体を用いて、以下のように表すことができる：
【化１２】
2018510864.tif 000014
【００３６】
このスキームにおいて、Ｘ１およびＸはリンカーであり、Ｄは薬物部位であり、Ｒ１およびＲ２は、互いに共有結合的に反応して（Ｒ１Ｒ２）を形成し、ＡＤＣの形成を完成させる、相補的反応性官能基である。リンカーＸの要素は、１段階反応の文脈において、前記で記述されている。リンカーＸ１は、前記でリンカーＸについて記載されるように、アルキレンおよびポリ（エチレングリコール）鎖を含みうる。
【００３７】
反応性官能基Ｒ１およびＲ２の組み合わせ、並びにそれらの反応産物（Ｒ１Ｒ２）の例は、以下の表Ｉに示される。
【表１】
2018510864.tif 000015
【００３８】
このように、表Ｉに基づいて以下の反応性官能基Ｒ１およびＲ２の組み合わせが考慮される：
（ａ）第一反応性官能基Ｒ１がアジド基であり、第二反応性官能基Ｒ２がジベンゾシクロオクチン基である；
（ｂ）第一反応性官能基Ｒ１がジベンゾシクロオクチン基であり、第二反応性官能基Ｒ２がアジド基である；
（ｃ）第一反応性官能基Ｒ１がマレイミド基であり、第二反応性官能基Ｒ２がチオール基である；
（ｄ）第一反応性官能基Ｒ１がマレイミド基であり、第二反応性官能基Ｒ２がチオール基である；
（ｅ）第一反応性官能基Ｒ１がケトン基であり、第二反応性官能基Ｒ２がヒドロキシルアミン基である；
（ｆ）第一反応性官能基Ｒ１がケトン基であり、第二反応性官能基Ｒ２がヒドロキシルアミン基である。
【００３９】
ＡＤＣは一般に癌治療に用いられるため、前記薬物は好ましくは、標的癌細胞の死を引き起こす細胞毒性薬である。ＡＤＣにおいて用いられうる細胞毒性薬としては、以下の種類の化合物およびそれらの類似体および誘導体が挙げられる：
（ａ）カリケアミシン（例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８７，１０９，３４６４および３４６６を参照されたい）およびウンシアラマイシン（例えば、Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ２００７／０３８８６８ Ａ２（２００７）およびＣｈｏｗｄａｒｉ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ８，７０９，４３１ Ｂ２（２０１２）を参照されたい）などのエンジイン；
（ｂ）ツブリシン（例えば、Ｄｏｍｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ７，７７８，８１４ Ｂ２（２０１０）；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ８，３９４，９２２ Ｂ２（２０１３）；およびＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ２０１４／０２２７２９５ Ａ１（２０１４）を参照されたい）；
（ｃ）ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシン（例えば、Ｂｏｇｅｒ、ＵＳ６，５４５８，５３０ Ｂ１（２００３）；Ｓｕｆｉ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ８，４６１，１１７ Ｂ２（２０１３）；およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ２０１２／０３０１４９０ Ａ１（２０１２）を参照されたい)などの、ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤／アルキル化剤；
（ｄ）エポチロン（例えば、Ｖｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ２００７／０２７５９０４ Ａ１（２００７）およびＵＳ ＲＥ４２９３０ Ｅ（２０１１）を参照されたい）；
（ｅ）オーリスタチン（例えば、Ｓｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ６，８４４，８６９ Ｂ２（２００５）およびＤｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ７，４９８，２９８ Ｂ２（２００９）を参照されたい）；
（ｆ）ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）ダイマー（例えば、Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ２０１３／００５９８００ Ａ１（２０１３）；ＵＳ２０１３／００２８９１９ Ａ１（２０１３）；およびＷＯ２０１３／０４１６０６ Ａ１（２０１３）を参照されたい）；並びに
（ｇ）ＤＭ１およびＤＭ４（例えば、Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ５，２０８，０２０（１９９３）およびＡｍｐｈｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ７，３７４，７６２ Ｂ２（２００８）を参照されたい）などのメイタンシノイド。
【００４０】
このように、薬物部位Ｄは、エンジイン、ツブリシン、ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤／アルキル化剤、エポチロン、オーリスタチン、ピロロベンゾジアゼピンまたはメイタンシノイド、またはそれらの類似体もしくは誘導体であることができる。好ましい薬物部位Ｄは、ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤／アルキル化剤である。
【００４１】
１段階結合反応に用いるために設計されたアミンドナーの例は、以下に示される：
【化１３】
2018510864.tif 000016
【００４２】
化合物（Ａ）において、薬物はＤＮＡのマイナーグルーブに結合し、次いでＤＮＡをアルキル化する、ＣＣ−１０６５／デュオカルマイシン類似体である。リンカーは、ＡＤＣから薬物を放出するためのリンカーの切断を可能にする、リソソーム酵素カテプシンＢの基質である、バリン−シトルリン（Ｖａｌ−Ｃｉｔ）ジペプチドを含む。
【００４３】
本発明の実施は、以下の実施例を参照することによってさらに理解することができ、これらは限定するためではなく、説明するために提供される。
【実施例】
【００４４】
実施例１−Ｃ末端伸長部を有する抗体
抗ＣＤ７０抗体１Ｆ４の重鎖の発現ベクター（Ｃｏｃｃｉａ ｅｔ ａｌ．２０１０）を、重鎖の定常領域をコードする元の核酸配列を、ＥＥＱＹＡＳＴＹＲ Ｃ末端伸長部（配列番号：５）を含む修飾配列で置換することによって改変した。そのように改変された発現ベクターを、１Ｆ４軽（カッパ）鎖の発現ベクターと共に、ＣＨＯ−Ｓ細胞に共導入した。配列番号：６の重鎖の定常領域を有する抗体１Ｆ４を生産するために、安定なクローンを選択し、これによって、末端アルギニンが翻訳後に切り取られた後に、ＥＥＱＹＡＳＴＹ（配列番号：１）Ｃ末端伸長部を有する抗体１Ｆ４が生じる（「抗ＣＤ７０−ａ」）。
【００４５】
同様に、配列番号８の重−ＣＤ７０ｙ鎖の定常領域を有する抗体１Ｆ４を生産するために、配列番号：７の核酸配列が用いられ、これによって、末端アルギニンが翻訳後に切り取られた後に、ＥＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２）を有する抗体１Ｆ４が生じる（「抗ＣＤ７０−ｂ」）。
【００４６】
ＥＥＱＹＡＳＴＹ（配列番号：１）またはＥＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２）のいずれかの重鎖のＣ末端伸長部を有する抗メソテリン抗体６Ａ４（Ｔｅｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．２０１２）は、必要な変更を加えて同様に調製した。
【００４７】
実施例２−トランスグルタミナーゼによって介在される結合
１段階および２段階法による結合のための代表的な方法を、以下に記述する。
【００４８】
方法１（１段階法）：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の〜２ｍｇ／ｍｌの抗体を、抗体のｍｇあたり３ユニットの組み換え細菌トランスグルタミナーゼの存在下で、部位あたり１０当量のアミンドナーと反応させた。反応を５時間、３７℃において、穏やかに混合し続けた。
【００４９】
結合体をカチオン交換クロマトグラフィー精製の前に、０．２μｍフィルターで濾過した。ＳＰセファロース高速カチオン交換カラムを、５ＣＶ（カラム体積）の５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ グリシン、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５（緩衝液Ｂ）で再生した。再生後に、カラムを３ＣＶの平衡緩衝液、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ グリシン、ｐＨ５．５（緩衝液Ａ）で平衡化した。結合体をロードし、カラムを１回、平衡緩衝液で洗浄した。結合体を６ＣＶにわたって、０−１００％Ｂの直線状勾配で溶出した。溶出液を画分に回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン解析によって解析した。
【００５０】
方法２（２段階法）：ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の、〜２ｍｇ／ｍｌのＣ末端伸長部を有する抗体を、抗体のｍｇあたり３ユニットの組み換え細菌トランスグルタミナーゼの存在下で、トランスグルタミナーゼ反応性グルタミンあたり２０当量のＯ−（２−アミノエチル−Ｏ’−（２−アジドエチル））ペンタエチレングリコール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と反応させ、一晩、３７℃で穏やかに混合し続けた。
【００５１】
アミノアジド修飾抗体（アジド−ｍＡｂ）はｍＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製し、次いで、あらかじめ１ＸＰＢＳ、ｐＨ８．０で平衡化したカラムにロードした。アジド−ｍＡｂを、２５ｍＭ グリシン、１０ｍＭ コハク酸、ｐＨ５．０でカラムから溶出した。溶出液を画分に回収して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。
【００５２】
精製したアジド−ＭａｂをＰＢＳ、ｐＨ７．４中で透析し、４ｍｇ／ｍＬに濃縮した。アジド−Ｍａｂは、アジド基に対して５×当量の、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）基を有する薬物−リンカー化合物と反応させた。反応は室温で４時間行った。結合体を０．２μｍフィルターで濾過し、緩衝液を製剤緩衝液（６Ｘ体積）（２０ｍｇ／ｍｌソルビトール、１０ｍｇ／ｍｌグリシン、ｐＨ５．０）に交換した。製剤化原薬を、０．２μｍＰＥＳフィルターを介して無菌チューブに濾過し、−８０℃で保管した。
【００５３】
２段階反応は、相補的な反応性官能基としてアジドおよびＤＩＢＯが例示されているが、他の相補的な反応性官能基の組み合わせを適宜変更して用いることができることが、当業者には理解される。
【００５４】
実施例３−アミンドナー（Ａ）の合成
化合物３．４−ニトロ安息香酸１（Ａｌｄｒｉｃｈ、２．３６ｇ、１４．１２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（５０ｍＬ）中の溶液に、炭酸カリウム（１．９５２ｇ、１４．１２ｍｍｏｌ）、次いで、（ブロモメチル）ベンゼン２（Ａｌｄｒｉｃｈ、１．８４８ｍＬ、１５．５３ｍｍｏｌ）を加えた。６０℃で一晩攪拌した後、反応液を室温（ＲＴ）まで冷却し、濃縮して、アセトニトリルを留去した。得られた白色の固形物を１００ｍＬの水および５０ｍＬの酢酸エチル中に溶解した。有機層を分離して、ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空で濃縮した。残留物をトルエン（２ｘ８ｍＬ）中に懸濁させ、真空で濃縮して、粗製のベンジル ４−ニトロベンゾアート３（３、３．８６ｇ、１５．０１ｍｍｏｌ、収率１０６％）を白色の固形物として得た。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ８．２６（ｍ，４Ｈ）、７．４４（ｍ，５Ｈ）、５．４２（ｓ，２Ｈ）。
【００５５】
化合物４．ベンジル ４−ニトロベンゾアート（３、３．７６ｇ、１４．６２ｍｍｏｌ）のアセトン（４０ｍＬ）中の溶液に、０℃で、亜鉛末（４．７８ｇ、７３．１ｍｍｏｌ）、次いで、塩化アンモニウム（７．８２ｇ、１４６ｍｍｏｌ）の水溶液を加えた。室温で１時間攪拌した後、反応液をセライトＴＭ濾過担体を介して濾過し、次いで真空で濃縮した。残留物を酢酸エチル中に懸濁させ、水、次いでブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空で濃縮した。残留物を、Ｉｓｃｏ８０ｇカラムを用いてフラッシュクロマトグラフィーで精製し、０−５０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出して、ベンジル ４−アミノベンゾアート４（２．９３ｇ、１２．８９ｍｍｏｌ、収率８８％）を白色の固形物として得た。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ７．９１（ｄ，２Ｈ）、７．３０−７．４１（ｍ，５Ｈ）、６．６５（ｄ，２Ｈ）、５．３３（ｓ，２Ｈ）、４．１２（ｓ，２Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ２２８（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００５６】
化合物６．２００ｍＬフラスコに、ベンジル ４−アミノベンゾアート４（３．６ｇ、１５．８４ｍｍｏｌ）、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−ウレイドペンタン酸５（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ、５．２５ｇ、１３．２０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ水和物（Ａｌｄｒｉｃｈ、３．０３ｇ、１９．８０ｍｍｏｌ）、およびＥＤＣ（ＡＣＴ、３．５４ｇ、１８．４８ｍｍｏｌ）を充填した。フラスコに窒素をパージし、ジクロロメタン（ＤＣＭ、２０ｍＬ）、次いで、ＤＭＦ（５ｍＬ）を加えた。塩化銅（ＩＩ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、２．１３０ｇ、１５．８４ｍｍｏｌ）を次いで加え、均一な黒褐色の溶液が得られた。室温で４時間攪拌した後、さらにＨＯＢｔおよびＥＤＣを加えた。室温で一晩攪拌を継続した。反応混合物を真空で濃縮して、残留物を２つのバッチに分け、それぞれをＩｓｃｏ１２０ｇカラムを用いてフラッシュクロマトグラフィーで精製し、０−１０％メタノール／ＤＣＭで溶出した。このようにして得られた生成物を最小量のＴＨＦ中に溶解させ、酢酸エチルで希釈し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空で濃縮した。得られた固形物を酢酸エチルで粉砕し、化合物６（３．３４ｇ、５．５１ｍｍｏｌ、収率４１．７％）を黄色の固形物として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ６０７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００５７】
化合物７．化合物６（３．３４ｇ、５．５１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）中の溶液に、室温で、ピペリジン（２．７３ｍＬ、２７．５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で６０分間攪拌した後、反応混合物を真空で濃縮した。粗製の生成物をＩｓｃｏ８０ｇカラムを用いてフラッシュクロマトグラフィーで精製し、０−２０％メタノール／ＤＣＭで溶出して、化合物７（２．２４ｇ、５．８３ｍｍｏｌ、収率１０６％）を白色の固形物として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ３８５（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００５８】
化合物９．５０ｍＬフラスコに、化合物７（２６８ｍｇ、０．６９７ｍｍｏｌ）、化合物８（ＴＣＩ、３５５ｍｇ、１．０４６ｍｍｏｌ）、およびＥＤＣ（ＡＣＴ、２００ｍｇ、１．０４６ｍｍｏｌ）を充填した。フラスコを窒素でパージし、ＤＣＭ（５ｍＬ）、次いで、ＤＭＦ（１ｍＬ）を加えた。室温で１時間攪拌した後、反応を完了し、反応混合物を凝固させた。反応混合物を濃縮して、ＤＣＭを除去し、酢酸エチルで希釈し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、１０％塩化リチウム水溶液、および、次いで、再び飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を次いで濾過して、沈殿した粗製の化合物９（４４３ｍｇ、０．６２８ｍｍｏｌ、収率９０％）を、白色の固形物として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ７０６（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００５９】
実施例１０．化合物９（０．４４ｇ、０．６２３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍＬ）中の溶液に、室温で、ピペリジン（Ａｌｄｒｉｃｈ、０．３０９ｍＬ、３．１２ｍｍｏｌ）を加えた。室温で６０分間攪拌した後、反応混合物を凝固させ、さらに５ｍＬのＴＨＥを加えた。室温でさらに２時間攪拌した後、反応液を真空で濃縮した。残留物を１０％メタノール／ＤＣＭ中に懸濁させ、濾過し、粗製の化合物１０（２４５ｍｇ、０．５０７ｍｍｏｌ、収率８１％）を得た。濾液を真空で濃縮し、残留物をＩｓｃｏ４０ｇカラムを用いてフラッシュクロマトグラフィーで精製し、０−２０％メタノール／ＤＣＭで溶出して、化合物１０（６４ｍｇ、０．１３２ｍｍｏｌ、収率２１％）を白色の固形物として得た。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ ７．７−８．１（ｍ，５Ｈ）、７．３０−７．４９（ｍ，５Ｈ）、５．５８（ｓ，１Ｈ）、５．３４（ｓ，２Ｈ）、４．３２（ｔ，１Ｈ）、３．６１（ｓ，１Ｈ）、２．９８（ｍ，２Ｈ）、１．６２−１．９３（ｍ，３Ｈ）、１．４３（ｍ，２Ｈ）、０．９２（ｄｄ，６Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ４８４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００６０】
化合物１２．化合物１１（Ａｌｄｒｉｃｈ、１．５ｇ、５．４１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２０ｍＬ）中の溶液に、０℃で、ＤＩＰＥＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ、１．８８９ｍＬ、１０．８２ｍｍｏｌ）および、次いで、２−ブロモアセチルクロライド（Ａｌｄｒｉｃｈ、０．４９５ｍＬ、５．９５ｍｍｏｌ）を加えた。０℃で１０分間攪拌した後、冷却槽を除去して、攪拌を室温で１時間継続した。反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液で反応を停止させ、ＤＣＭで抽出した。回収した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空で濃縮した。残留物をＩｓｃｏ４０ｇカラムを用いて、フラッシュクロマトグラフィーで精製し、０−７０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出して、化合物１２（１．１５ｇ、２．８９ｍｍｏｌ、収率５３．４％）を橙色の油状物として得た。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．００（ｂ，１Ｈ）、３．９１（ｓ，２Ｈ）、３．５０−３．７１（ｍ，１４Ｈ）、２．５４（ｔ，２Ｈ）、１．４６（ｓ，９Ｈ）。
【００６１】
化合物１３．化合物１０（３００ｍｇ、０．６２０ｍｍｏｌ）、化合物１２（２９７ｍｇ、０．７４４ｍｍｏｌ）、ヨウ化カリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ、１０３ｍｇ、０．６２０ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ、０．２１７ｍＬ、１．２４１ｍｍｏｌ）の、ＤＭＦ（３ｍＬ）中の混合物を、４０℃で６時間攪拌した。室温まで冷却した後、反応液を酢酸エチルで希釈し、順次、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、１０％塩化リチウム溶液、およびブラインで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空で濃縮した。残留物をＩｓｃｏｒ４０ｇカラムを用いてフラッシュクロマトグラフィーで精製し、０−１０％メタノール／ＤＣＭで溶出して、化合物１３（３３６ｍｇ、０．４２０ｍｍｏｌ、収率６７．６％）を黄色の油状物として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ８０１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００６２】
化合物１４．化合物１３（０．３３ｇ、０．４１２ｍｍｏｌ）のジオキサン（５ｍＬ））中の溶液に、ジオキサン（１０ｍＬ）中の４Ｎ ＨＣｌを加えた。室温で１時間攪拌した後、反応混合物を真空で濃縮し、粗製の化合物１４を無色の粘着性の油状物として得、これをさらに精製を行うことなく、直接用いた。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ７４５（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００６３】
化合物１５．５０ｍＬフラスコに、化合物１４（３０７ｍｇ、０．４１２ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル（５−アミノペンチル）カルバメート（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ、１００ｍｇ、０．４９４ｍｍｏｌ）、およびＢＯＰ（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ、２３７ｍｇ、０．５３６ｍｍｏｌ）を加えた。フラスコを窒素でパージして、ＤＭＦ（２ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（０．１８０ｍＬ、１．０３０ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間攪拌した後、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、順次、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、１０％塩化リチウム水溶液、および再び、飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空で濃縮した。残留物をＩｓｃｏ４０ｇカラムを用いて、フラッシュクロマトグラフィーで精製し、０−１０％メタノール／ＤＣＭで溶出して、化合物１５（２６１ｍｇ、０．２８１ｍｍｏｌ、収率６８．２％）を無色の泡状物として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ９２９（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００６４】
化合物１６．化合物１５（２６１ｍｇ、０．２８１ｍｍｏｌ）および１０％Ｐｄ／Ｃ（Ａｌｄｒｉｃｈ、１．４９５ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍＬ）中の溶液を、水素（バルーン）雰囲気下で、２時間攪拌した。反応容器に窒素を通気し、セライトＴＭ濾過担体を加えた。混合物をセライトＴＭ濾過担体の薄いパッドを介して濾過し、メタノールで洗浄した。濾液を濃縮して、粗製の生成物を、Ｉｓｃｏ４０ｇカラムを用いてフラッシュクロマトグラフィーで精製し、０−２０％メタノール／ＤＣＭで溶出した。得られた油状物をアセトニトリル／水で凍結乾燥し、化合物１６（２０６ｍｇ、０．２３８ｍｍｏｌ、収率８５％）を白色の固形物として得た。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ） δ ８．２１（ｔ，１Ｈ）、７．９２（ｄ，２Ｈ）、７．８０（ｔ，１Ｈ）、７．７５（ｄ，２Ｈ）、６．７５（ｔ，１Ｈ）、６．０３（ｔ，１Ｈ）、５．４５（ｓ，２Ｈ）、４．５１（ｔ，１Ｈ）、２．８１−３．６５（ｍ，２５Ｈ）、２．３０（ｔ，２Ｈ）、１６２−１．８９（ｍ，８Ｈ）、１．３５（ｓ，９Ｈ）、１．２４（ｔ，２Ｈ）、０．９２（ｄｄ，６Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ８３９（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００６５】
化合物１８．化合物１６（３５ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）、２−（３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル）−１，１，３，３−テトラメチルイソウロニウムヘキサフルオロホスフェート（Ｖ）（ＨＡＴＵ、Ｏａｋｗｏｏｄ、１２．６９ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）の、ＤＭＦ（１ｍＬ）中の溶液に、ＤＩＰＥＡを加えて、ｐＨを８以上に調整した。反応混合物を室温で１５分間攪拌した。これに、化合物１７（ＵＳ８，８５２，５９９；１９．６８ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）を加えた。さらにＤＩＰＥＡを加えて、反応混合物のｐＨを８以上に調整した。反応混合物を室温で３０分間攪拌した。ＨＰＬＣ解析によって、反応が完了したことが示された。反応混合物を分取ＨＰＬＣによって、１０−６５％アセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡを含む、２０ｍＬ／分）を用いて、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ ５μ、Ｃ１８ １５０×２１．２ｍｍカラムで精製した。目的の生成物を含む画分を合わせて、凍結乾燥して、化合物１８（２１ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ．４９．３４％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ １２９２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００６６】
アミンドナー（Ａ）．化合物１８（２１ｍｇ）のＤＣＭ（１ｍＬ）中の溶液に、ＴＦＡ（１ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温で３０分攪拌し、濃縮して、分取ＨＰＬＣによって、１０−６５％アセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡを含む、２０ｍＬ／分）を用いて、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ ５μ、Ｃ１８ １５０×２１．２ｍｍカラムで精製した。目的の生成物を含む画分を合わせて、凍結乾燥し、アミンドナー（Ａ）（１６ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、８１．３％）を得た、１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ） δ １１．９５（ｓ，１Ｈ）、１０．５４（ｓ，１Ｈ）、１０．１８（ｓ，１Ｈ）、８．８５（ｓ，１Ｈ）、８．３６（ｓ，１Ｈ）、８．３１（ｓ，１Ｈ）、７．２０−８．３１（ｍ，１２Ｈ）、６．２３（ｓ，１Ｈ）、５．４８（ｓ，１Ｈ）、３．９９−４．９５（ｍ，７Ｈ）、２．１０−３．９９（ｍ，２８Ｈ）、１．２８−１．８５（ｍ，８Ｈ）、０．９２（ｄｄ，６Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ １１９２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００６７】
実施例３−１段階反応によって製造された結合体の活性
図２は、１段階結合反応によって製造された結合体の活性を示す。抗体は、ＥＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号：２）Ｃ末端伸長部を有する抗体ＣＤ７０−ｂ（前記実施例１を参照されたい）であり、薬物はアミンドナーＡ（前記実施例３を参照されたい）であった。ＤＡＲは３．９であった。ＳＣＩＤマウス腫瘍モデルにおける活性は、ＣＤ７０を発現しているヒト肝臓癌細胞株である７８６−Ｏ細胞に対して試験された。線によって示されるように、結合体は腫瘍の増殖の抑制において有効であった。
【００６８】
実施例４−２段階反応によって製造された結合体の活性
ＥＥＱＹＡＳＴＹ（配列番号：１）Ｃ末端伸長部を有する抗体ＣＤ７０−ａ（前記実施例１を参照されたい）を、２段階反応を用いて、薬物としてのツブリシン類似体に結合した。適切なツブリシン類似体は、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ８，３９４，９２２ Ｂ２（２０１３）；およびＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ２０１４／０２２７２９５ Ａ１（２０１４）において記述される。反応性官能基の相補対は、Ｒ１としてアジド、およびＲ２としてシクロオクチンであった。ＤＡＲは１．８であった。
【００６９】
同様に、抗メソテリン抗体６Ａ４（Ｔｅｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．２０１２）をＥＥＱＹＡＳＴＹ（配列番号：１）Ｃ末端伸長部によって改変し、次いで、２段階反応によって、同様のツブリシン類似体に結合させ、ＤＡＲが１．６の結合体を得た。
【００７０】
２つの結合体の有効性を、メソテリンを発現するが、ＣＤ７０を発現しない、胃癌細胞株であるＮ８７細胞に対して試験した。結果を図３に示す。ＣＤ７０結合体は、ＣＤ７０を発現していないため、予想されたように、Ｎ８７細胞に対する有効性は大きく低下した。
【００７１】
前記の本発明の詳細な説明は、本発明の特定の部分または実施態様と、主に、または排他的に関係する節を含む。当然のことながら、これは、ある特徴が、開示されている節の他にも関連しうること、および、本明細書の開示が、異なる節で記載される情報の適切な組み合わせをすべて含むことの明瞭化および簡便化のためである。同様に、本明細書の様々な図および記述は、本発明の具体的な実施態様に関連するが、当然のことながら、具体的な特徴が、特定の図または実施態様の文脈において開示される時、このような特徴はまた、適切な範囲で、他の図または実施態様の文脈において、他の特徴との組み合わせにおいて、または一般に本発明においてもまた用いられうる。
【００７２】
さらに、本発明はいくつかの好ましい実施態様の観点において記述されているが、本発明はそれらの好ましい実施態様に限定されない。さらに、本発明の範囲は、付記される特許請求の範囲によって定義される。
【００７３】
参考文献
第一著書（または発明者）によって簡潔に引用された以下の参考文献、および本明細書よりも早い日付の全ての引用が、以下に示される。これらの参考文献のそれぞれは、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。
【００７４】
Ｂｒｅｇｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ２０１３／０１８９２８７ Ａ１（２０１３）
【００７５】
Ｂｒｅｇｅｏｎ，ＷＯ２０１４／２０２７７３ Ａ１（２０１４）
【００７６】
Ｂｒｅｇｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ２０１４／２０２７７５ Ａ１（２０１４）
【００７７】
Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ２００５／０１３６４９１ Ａ１（２００５）
【００７８】
Ｃｏｃｃｉａ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ２０１０／０１５０９５０ Ａ１（２０１０）
【００７９】
Ｄｅｎｎｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２０１４，２５，５６９−５７８
【００８０】
Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ２０１４／０７２４８２ Ａ１（２０１４）
【００８１】
Ｆｏｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００８，６０，１３−１８
【００８２】
Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ，「Ａ Ｎｅｗ Ｓｉｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ」，ＡＤＣ Ｓｕｍｍｉｔにおける発表，Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，２０１３年１０月１５日
【００８３】
Ｊｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１０，４９，９９９５
【００８４】
Ｋａｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ２０１１／０１８４１４７ Ａ１（２０１１）
【００８５】
Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，４５４２−４５４３
【００８６】
Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ８，８６５，８７５ Ｂ２（２０１４）
【００８７】
Ｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２００９，３８４−３８９
【００８８】
Ｍｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２００８，１９，２７１−２７８
【００８９】
Ｐｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ２０１３／０２３０５４３ Ａ１（２０１３）
【００９０】
Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ６，３２２，９９６ Ｂ１（２００１）
【００９１】
Ｓａｔｏ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００２，５４，４８７−５０４
【００９２】
Ｓｃｈｉｂｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ２００７／０１８４５３７ Ａ１（２００７）
【００９３】
Ｓｃｈｒａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．２００６，５，１４７
【００９４】
Ｓｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３，２０，１６１−１６７
【００９５】
Ｓｕｇｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７，１３１，１２１−１２７
【００９６】
Ｔｅｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ８，２６８，９７０ Ｂ２（２０１２）
【００９７】
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ８，８５２，５９９ Ｂ２（２０１４）
【００９８】
配列表
配列番号：１から配列番号：８を含む「ＳＥＱＴ＿１２４５２ＷＯＰＣＴ．ｔｘｔ」という名前の配列表が、引用によりその全体が本明細書に援用され、これには本明細書で開示される核酸および／またはアミノ酸配列が含まれる。配列表は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ ｔｅｘｔ形式で本明細書と共に提出され、その紙およびコンピューター可読形式の両方を構成する。配列表は、最初に、２０１５年２月２５日に、ＰａｔｅｎｔＩｎ ３．５を用いて作られ、およそ２０ＫＢの大きさである。
【００９９】
以下の表ＩＩにおいて、本出願において開示される配列の記載がまとめられる。
【表２】
2018510864.tif 000017
【図１ａ】
2018510864.tif 000021
【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
2018510864000001.app
【国際調査報告】
2018510864.tif 000025
2018510864.tif 000026