(57)【要約】  本開示は、特に、がんの治療における使用のための、（ａ）Ｍｄｍ２阻害剤と（ｂ）（ｉ）ＭＥＫ阻害剤および／または（ｂ）（ｉｉ）Ｂｃｌ２阻害剤とを含む組合せ医薬に関する。本開示はまた、がんの治療のための医薬を調製するためのこのような組み合わせ物の使用、それを必要とする対象においてがんを治療する方法であって、共同治療有効量の前記組み合わせ物を前記対象に投与することを含む方法、このような組み合わせ物を含む医薬組成物およびそれに対する商業的な包装に関する。
2018528206.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（６Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オンまたはその薬学的に許容される塩、および（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンまたはその薬学的に許容される塩から選択されるＭＤＭ２阻害剤と、
（ｂ）
（ｉｉｉ）トラメチニブ、６−（４−ブロモ−２−フルオロフェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸（２−ヒドロキシエトキシ）−アミド、（Ｓ）−５−フルオロ−２−（２−フルオロ−４−（メチルチオ）フェニルアミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシプロポキシ）−１−メチル−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ−１８４３５２、ＲＤＥＡ１１９、ＸＬ５１８、ＡＳ−７０１２５５、ＡＳ−７０１１７３、ＡＳ７０３０２６、ＲＤＥＡ４３６、Ｅ６２０１、ＲＯ４９８７６５５、ＲＧ７１６７、およびＲＧ７４２０、もしくはこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択されるＭＥＫ阻害剤、
および／または
（ｉｖ）ＡＢＴ−７３７、ＡＢＴ−２６３（ナビトクラックス）、およびＡＢＴ−１９９、もしくはこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択されるＢｃｌ２阻害剤と
を含む組合せ医薬。
【請求項２】
（ａ）（６Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オンまたはその薬学的に許容される塩、および（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンまたはその薬学的に許容される塩から選択されるＭＤＭ２阻害剤と、
（ｂ）前記ＭＥＫ阻害剤と
を含む、請求項１に記載の組合せ医薬。
【請求項３】
前記ＭＥＫ阻害剤がトラメチニブまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１または請求項２に記載の組合せ医薬。
【請求項４】
（ａ）（６Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オンまたはその薬学的に許容される塩、および（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンまたはその薬学的に許容される塩から選択されるＭＤＭ２阻害剤と、
（ｂ）前記Ｂｃｌ２阻害剤と
を含む組合せ医薬。
【請求項５】
前記Ｂｃｌ２阻害剤がナビトクラックスまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１または請求項４に記載の組合せ医薬。
【請求項６】
前記ＭＥＫ阻害剤と前記Ｂｃｌ２阻害剤とを含む、請求項１に記載の組合せ医薬。
【請求項７】
ＥＧＦＲ阻害剤をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
【請求項８】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ペリチニブ、ネラチニブ、（Ｒ，Ｅ）−Ｎ−（７−クロロ−１−（１−（４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−エノイル）アゼパン−３−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）−２−メチルイソニコチンアミド、パニツムマブ、マツズマブ、ペルツズマブ、ニモツズマブ、ザルツムマブ、イコチニブ、アファチニブ、およびセツキシマブ、ならびにこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項７に記載の組合せ医薬。
【請求項９】
前記ＥＧＦＲ阻害剤がエルロチニブまたはその薬学的に許容される塩である、請求項７または請求項８に記載の組合せ医薬。
【請求項１０】
ＰＩ３Ｋ阻害剤をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
【請求項１１】
前記ＰＩ３Ｋ阻害剤が、２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）−フェニル］−プロピオニトリル、５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミン、および（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）、またはこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項１０に記載の組合せ医薬。
【請求項１２】
前記ＰＩ３Ｋ阻害剤が、αアイソフォーム特異的ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその任意の薬学的に許容される塩である、請求項１０または請求項１１に記載の組合せ医薬。
【請求項１３】
ＢＲＡＦ阻害剤をさらに含む、請求項１から６または１０から１２のいずれかに記載の組合せ医薬。
【請求項１４】
前記ＢＲＡＦ阻害剤が、ＲＡＦ２６５、ダブラフェニブ、（Ｓ）−メチル−１−（４−（３−（５−クロロ−２−フルオロ−３−（メチルスルホンアミド）フェニル）−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）プロパン−２−イルカルバメート、メチルＮ−［（２Ｓ）−１−（｛４−［３−（５−クロロ−２−フルオロ−３−メタンスルホンアミドフェニル）−１−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］ピリミジン−２−イル｝アミノ）プロパン−２−イル］カルバメート、およびベムラフェニブ、またはこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項１３に記載の組合せ医薬。
【請求項１５】
前記ＢＲＡＦ阻害剤がダブラフェニブまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１３または請求項１４に記載の組合せ医薬。
【請求項１６】
ＣＤ４／６阻害剤をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
【請求項１７】
前記ＣＤ４／６阻害剤が、７−シクロペンチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（（５−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）アミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミドまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１６に記載の組合せ医薬。
【請求項１８】
パクリタキセルをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
【請求項１９】
ｃＭＥＴ阻害剤をさらに含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
【請求項２０】
前記ｃＭＥＴ阻害剤がＰＦ−０４２１７９０３である、請求項１９に記載の組合せ医薬。
【請求項２１】
同時または順次使用のための、先行請求項のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
【請求項２２】
配合物の形態である、先行請求項のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
【請求項２３】
固定されていない組み合わせ物の形態である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
【請求項２４】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の組合せ医薬と、薬学的に許容される少なくとも１種の担体とを含む医薬組成物。
【請求項２５】
医薬品として使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の組合せ医薬または請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
がんの治療における使用のための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の組合せ医薬または請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
がんの治療のための医薬を調製するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の組合せ医薬の使用。
【請求項２８】
それを必要とする対象においてがんを治療する方法であって、治療有効量の請求項１から２３のいずれか一項に記載の組合せ医薬または請求項２４に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２９】
前記がんが固形腫瘍である、請求項２６に記載の使用のための組合せ医薬、または請求項２７に記載の組合せ医薬の使用、または請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記がんが、肺（小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む）、気管支、前立腺、乳房（散発性乳がんおよびカウデン病罹患者を含む）、膵臓、胃腸管、結腸、直腸、結腸癌、結腸直腸がん、甲状腺、肝臓、胆道、肝内胆管、肝細胞、副腎、胃部、胃、神経膠腫、神経膠芽腫、子宮内膜、腎臓、腎盂、膀胱、子宮、子宮頸部、膣、卵巣、多発性骨髄腫、食道、頚部または頭部、脳、口腔および咽頭、喉頭、小腸、黒色腫、絨毛結腸腺腫、肉腫、新生物、上皮性新生物、乳癌、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、光線角化症、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性白血病、および骨髄性白血病を含む）、リンパ腫（非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫を含む）、骨髄様転移を有する骨髄線維症、ワルデンシュトレーム病、およびバレット腺癌からなる群から選択される、請求項２６に記載の使用のための組合せ医薬、または請求項２７に記載の組合せ医薬の使用、または請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記がんが、結腸直腸がん、脂肪肉腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、リンパ腫、白血病、または黒色腫である、請求項２６に記載の使用のための組合せ医薬、または請求項２７に記載の組合せ医薬の使用、または請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記がんが結腸直腸がんである、請求項３１に記載の使用のための組合せ医薬、または請求項３１に記載の組合せ医薬の使用、または請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記がんが転移性結腸直腸がんである、請求項２６に記載の使用のための組合せ医薬、または請求項２７に記載の組合せ医薬の使用、または請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記がんが、機能的ｐ５３または野生型ＴＰ５３を含む、請求項２６または２９から３３のいずれか一項に記載の使用のための組合せ医薬、請求項２７または２９から３３のいずれか一項に記載の組合せ医薬の使用、または請求項２８または２９から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記がんが、ＫＲＡＳ突然変異および／またはＢＲＡＦ突然変異および／またはＭＥＫ１突然変異および／またはＰＩＫ３ＣＡ突然変異および／またはＰＩＫ３ＣＡ過剰発現の１つまたは複数を含む、請求項２６または２９から３４のいずれか一項に記載の使用のための組合せ医薬、請求項２７または２９から３４のいずれか一項に記載の組合せ医薬の使用、または請求項２８または２９から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記がんが、ＫＲＡＳ突然変異の１つまたは複数を含む、請求項２６または２９から３４のいずれか一項に記載の使用のための組合せ医薬、請求項２７または２９から３４のいずれか一項に記載の組合せ医薬の使用、または請求項２８または２９から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記がんが、ＢＲＡＦ突然変異の１つまたは複数を含む、請求項２６または２９から３４のいずれか一項に記載の使用のための組合せ医薬、請求項２７または２９から３４のいずれか一項に記載の組合せ医薬の使用、または請求項２８または２９から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記がんが、ＭＥＫ１突然変異の１つまたは複数を含む、請求項２６または２９から３４のいずれか一項に記載の使用のための組合せ医薬、請求項２７または２９から３４のいずれか一項に記載の組合せ医薬の使用、または請求項２８または２９から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記がんが、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異および／またはＰＩＫ３ＣＡ過剰発現の１つまたは複数を含む、請求項２６または２９から３４のいずれか一項に記載の使用のための組合せ医薬、請求項２７または２９から３４のいずれか一項に記載の組合せ医薬の使用、または請求項２８または２９から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記がんが、ＥＧＦＲ阻害剤での治療に抵抗性である、請求項２１または２４から３４のいずれか一項に記載の使用のための組合せ医薬、請求項２２または２４から３４９のいずれか一項に記載の組合せ医薬の使用、または請求項２３または２４から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
がんが請求項２９から４０のいずれか一項で規定したとおりであり、前記組み合わせによって退縮が実現される、がんの治療における使用のための、請求項１、３、または５から２３のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、特に、がんの治療における使用のための、（ａ）Ｍｄｍ２阻害剤と（ｂ）（ｉ）ＭＥＫ阻害剤および／または（ｂ）（ｉｉ）Ｂｃｌ２阻害剤とを含む組合せ医薬に関する。本開示はまた、がんの治療のための医薬を調製するためのこのような組み合わせ物の使用、それを必要とする対象においてがんを治療する方法であって、共同治療有効量の前記組み合わせ物を前記対象に投与することを含む方法、このような組み合わせ物を含む医薬組成物およびそれに対する商業的な包装に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの標的療法の出現によって、種々の悪性病変について患者の寿命は延び、薬物抵抗性機序の研究を通した腫瘍の複雑さの理解は促進された。標的薬に対する臨床応答が、一般に不完全および／または一時的であるという事実は、大きく２つの部門、すなわち、薬物の最適な投与を妨げ、結果として、目標となる関与を制限する毒性（Brana and Siu 2012、Chapman, Solit et al. 2014）、およびがんが摂動に対してその潜在的増殖能力を適応させ、維持する能力（Druker 2008, Chandarlapaty 2012、Doebele, Pilling et al. 2012、Duncan, Whittle et al. 2012、Katayama, Shaw et al. 2012、Lito, Rosen et al. 2013、Sullivan and Flaherty 2013、Solit and Rosen 2014）、に分けることのできる多数の要素の結果として生じる。薬物の組み合わせ物は、総合的な有効性を向上させ、同時に、腫瘍の強靭さおよび複雑さを標的にして抵抗性を無効にすることにより、これら両方の要素に対処することができる（Robert, Karaszewska et al. 2015、Turner, Ro et al. 2015）。がんを克服するのに、組み合わせ物において、何種類の薬物が必要となり、どの過程を標的とする必要があるのかは未だ明らかでない。しかし、異なる経路または伝達機構を阻害する必要があり、十中八九、２種以上の薬物が必要となることはほぼ確かである（Bozic, Reiter et al. 2013）。これは、がんの治療のための従来の化学療法薬の組み合わせ（DeVita 1975）およびＨＩＶなどの感染性疾患のための組み合わせ療法（Porter, Babiker et al. 2003）の成功、ならびに摂動の程度を増大させることによりどれだけの生物学的強靱さが負荷を受けうるかを示す理論的手法（Lehar, Krueger et al. 2008）によって裏付けられている。
【０００３】
特定のタイプのがんに罹患している患者にとって数多くの治療選択肢があるにもかかわらず、がんの有効な長期治療のために投与することのできる有効かつ安全な組み合わせ療法が依然として求められている。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の目的は、がんの治療を改善する、詳細には、細胞成長（増殖）の阻害およびアポトーシスの誘発を通してがんの治療を改善するための医薬を提供することである。本開示の目的は、増殖を阻害するおよび／またはアポトーシスを誘発することにおいて選択的に相乗作用を示す新奇な組み合わせ療法を見出すことである。
【０００５】
ＭＤＭ２阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＢＣＬ２阻害剤などの阻害剤は、単剤療法として、前臨床アッセイにおいて、インビトロおよびインビボで抗増殖（細胞増殖抑制）およびアポトーシス促進（細胞傷害）活性を示す。驚いたことに、
（ａ）（６Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オンまたはその薬学的に許容される塩、および（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンまたはその薬学的に許容される塩から選択されるＭＤＭ２阻害剤と、
（ｂ）
（ｉ）トラメチニブ、６−（４−ブロモ−２−フルオロフェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸（２−ヒドロキシエトキシ）−アミド、（Ｓ）−５−フルオロ−２−（２−フルオロ−４−（メチルチオ）フェニルアミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシプロポキシ）−１−メチル−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ−１８４３５２、ＲＤＥＡ１１９、ＸＬ５１８、ＡＳ−７０１２５５、ＡＳ−７０１１７３、ＡＳ７０３０２６、ＲＤＥＡ４３６、Ｅ６２０１、ＲＯ４９８７６５５、ＲＧ７１６７、およびＲＧ７４２０、もしくはこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択されるＭＥＫ阻害剤、
および／または
（ｉｉ）ＡＢＴ−７３７、ＡＢＴ−２６３（ナビトクラックス）、およびＡＢＴ−１９９、もしくはこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択されるＢｃｌ２阻害剤と
を含む組合せ医薬（pharmaceutical combination）は、有益な相乗的相互作用を有し、抗がん活性、抗増殖作用、および抗アポトーシス作用が向上していることがわかった。こうした組み合わせ物は、細胞成長阻害、およびアポトーシスによる細胞死の誘導において相乗効果を示した。
【０００６】
さらに、
（ａ）（６Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オンまたはその薬学的に許容される塩、および（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンまたはその薬学的に許容される塩から選択されるＭＤＭ２阻害剤と、
（ｂ）
（ｉ）トラメチニブ、６−（４−ブロモ−２−フルオロフェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸（２−ヒドロキシエトキシ）−アミド、（Ｓ）−５−フルオロ−２−（２−フルオロ−４−（メチルチオ）フェニルアミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシプロポキシ）−１−メチル−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ−１８４３５２、ＲＤＥＡ１１９、ＸＬ５１８、ＡＳ−７０１２５５、ＡＳ−７０１１７３、ＡＳ７０３０２６、ＲＤＥＡ４３６、Ｅ６２０１、ＲＯ４９８７６５５、ＲＧ７１６７、およびＲＧ７４２０、もしくはこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択されるＭＥＫ阻害剤、
および／または
（ｉｉ）ＡＢＴ−７３７、ＡＢＴ−２６３（ナビトクラックス）、およびＡＢＴ−１９９、もしくはこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択されるＢｃｌ２阻害剤と
の組み合わせ物は、ＥＧＦＲ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、およびＢＲＡＦ阻害剤から選択される別の阻害剤を含むと有利となりうることもわかった。加えて、ＣＤＫ４／６阻害剤、またはパクリタキセルなどの標準治療を、ＭＤＭ２阻害剤（「ＭＤＭ２ｉ」）とトラメチニブの組み合わせ物に加えてもよく、これにより、さらなる相乗効果、またはアポトーシスの強力な誘発をもたらすことができる。ＭＤＭ２阻害剤のＢｃｌ２阻害剤との組み合わせ物を、ＢＲＡＦ阻害剤（例えば、ダブラフェニブ）およびＣＭＥＴ阻害剤（例えば、ＰＦ−０４２１７９０３）で補って、四種組み合わせ物としてもよい。後者の組み合わせ物は、相乗性は弱いものの、アポトーシスを強力に誘発することがわかった。
【０００７】
別の態様では、本開示は、本開示の組合せ医薬と、薬学的に許容される少なくとも１種の担体とを含む医薬組成物に関する。
【０００８】
１つの態様では、本開示は、医薬品として使用するための、本開示の組合せ医薬または医薬組成物に関する。
【０００９】
別の態様では、本開示は、がんの治療における使用のための、本開示の組合せ医薬または医薬組成物に関する。
【００１０】
別の態様では、本開示は、がんの治療のための医薬を調製するための、本開示の組合せ医薬の使用を提供する。
【００１１】
さらに別の態様では、本開示は、それを必要とする対象においてがんを治療する方法であって、治療有効量の本開示の組合せ医薬または本開示の医薬組成物を対象に投与することを含む方法に関する。
【００１２】
詳細には、本開示は、次の態様、有利な特色、および詳細な実施形態を、それぞれ単独でまたは組み合わせて、以下の特許請求の範囲において列挙するとおりに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ａ）（円形）、ＭＥＫ阻害剤トラメチニブ（三角形）、およびこれらの組み合わせ物（菱形）に対する８種のＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系についての用量応答曲線を示すグラフである。ｘ軸は、ｌｏｇ１０の処理希釈を示し、ｙ軸は、ＤＭＳＯと比べた、処理後の細胞計数を示す。組み合わせ物は、単剤を固定比（１：１）で組み合わせて得たものである。濃い破線は、処理開始前の細胞数（「ベースライン」）を示した。
【図２】ＭＤＭ２阻害剤（６Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オン（化合物Ｂ）（円形）、ＭＥＫ阻害剤トラメチニブ（三角形）、およびこれらの組み合わせ物（菱形）に対する８種のＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系についての用量応答曲線を示すグラフである。ｘ軸は、ｌｏｇ１０の処理希釈を示し、ｙ軸は、ＤＭＳＯと比べて、処理後の細胞計数を示す。組み合わせ物は、単剤を固定比（１：１）で組み合わせて得たものである。濃い破線は、処理開始前の細胞数（「ベースライン」）を示した。
【図３】８種のＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系における、ＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ａ）またはＭＤＭ２阻害剤（６Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オン（化合物Ｂ）（ｙ軸）のＭＥＫ阻害剤トラメチニブ（ｘ軸）との組み合わせ物についての７５％の阻害レベルでのアイソボログラム分析を示すグラフである。斜めの曲線上の点は、付加的効果を、その右側の点は、拮抗作用を、その左側の点は、相乗作用を示す。空白の円は、組み合わせ指数が最低である（相乗作用が最強である）組み合わせ物を示す（値については、表２を参照されたい）。
【図４】５種のＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系における、２４時間、４８時間、および７２時間後（異なるモノクロ階調）の、ＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ａ）、ＭＥＫ阻害剤トラメチニブ、およびこれらの組み合わせ物についての最大カスパーゼ３／７誘発を示すグラフである。ｘ軸は、処理を示し、ｙ軸は、各処理について認められた最大カスパーゼ３／７誘発（細胞の％）を示す。
【図５】ＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ａ）およびＭＥＫ阻害剤トラメチニブの単剤および組み合わせ物についての長期コロニー形成アッセイを示す像およびグラフである。「化合物Ａ（Ｌ）」：０．３３μＭ、「化合物Ａ（Ｈ）」：１μＭ、ＬＩＭ２４０５およびＳＷ４８を除く全てについての「トラメチニブ（Ｌ）」：４ｎＭ、ＬＩＭ２４０５およびＳＷ４８を除く全てについての「トラメチニブ（Ｈ）」：１２ｎＭ、ＬＩＭ２４０５およびＳＷ４８についての「トラメチニブ（Ｌ）」：１ｎＭ、ＬＩＭ２４０５およびＳＷ４８についての「トラメチニブ（Ｈ）」：３ｎＭ。（Ａ）クリスタルバイオレット染色後の細胞の代表的な像。（Ｂ）（Ａ）からのクリスタルバイオレットシグナルの定量化。バーは、ｎ＝３回の複製の平均±標準偏差を示す。有意性検定については、表３を参照されたい。ＲＦＵ＝相対蛍光単位。
【図６】ＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ａ）、ＭＥＫ阻害剤トラメチニブ、およびこれらの組み合わせ物についての、処置から２４時間後のＦＡＣＳ分析を示すグラフである。「化合物Ａ（Ｌ）」：０．３３μＭ、「化合物Ａ（Ｈ）」：１μＭ、ＬＩＭ２４０５およびＳＷ４８を除く全てについての「トラメチニブ（Ｌ）」：４ｎＭ、ＬＩＭ２４０５およびＳＷ４８を除く全てについての「トラメチニブ（Ｈ）」：１２ｎＭ、ＬＩＭ２４０５およびＳＷ４８についての「トラメチニブ（Ｌ）」：１ｎＭ、ＬＩＭ２４０５およびＳＷ４８についての「トラメチニブ（Ｈ）」：３ｎＭ。積み重ねバーは、細胞周期相：ｓｕｂＧ１、Ｇ１、Ｓ、およびＧ２のそれぞれにある細胞集団のパーセンテージを示す。
【図７】ＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ａ）、ＭＥＫ阻害剤トラメチニブ、およびこれらの組み合わせ物の、処置から２４時間後のウエスタンブロット分析を示す像である。「化合物Ａ（Ｌ）」：０．３３μＭ、「化合物Ａ（Ｈ）」：１μＭ、ＬＩＭ２４０５およびＳＷ４８を除く全てについての「トラメチニブ（Ｌ）」：４ｎＭ、ＬＩＭ２４０５およびＳＷ４８を除く全てについての「トラメチニブ（Ｈ）」：１２ｎＭ、ＬＩＭ２４０５およびＳＷ４８についての「トラメチニブ（Ｌ）」：１ｎＭ、ＬＩＭ２４０５およびＳＷ４８についての「トラメチニブ（Ｈ）」：３ｎＭ。
【図８】ＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ａ）、ＭＥＫ阻害剤トラメチニブ、およびこれらの組み合わせ物について、処置から１０時間後の、５種の標的遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示すグラフである。「化合物Ａ（Ｌ）」：０．３３μＭ、「化合物Ａ（Ｈ）」：１μＭ、ＬＩＭ２４０５およびＳＷ４８を除く全てについての「トラメチニブ（Ｌ）」：４ｎＭ、ＬＩＭ２４０５およびＳＷ４８を除く全てについての「トラメチニブ（Ｈ）」：１２ｎＭ、ＬＩＭ２４０５およびＳＷ４８についての「トラメチニブ（Ｌ）」：１ｎＭ、ＬＩＭ２４０５およびＳＷ４８についての「トラメチニブ（Ｈ）」：３ｎＭ。バーは、ＤＭＳＯ処理と比べたｌｏｇ２尺度での示差的発現を示し、誤差バーは、ｎ＝２回の複製の標準偏差を示す。
【図９】５種のＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系における、ＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ａ）（円形）、ＭＥＫ阻害剤トラメチニブ（化合物Ｂ、三角形）、ＢＣＬ−２／−ＸＬ阻害剤ナビトクラックス（ＡＢＴ−２６３）（化合物Ｃ、菱形）、ならびにこれらの組み合わせ物Ａ＋Ｂ（円形、点線）、Ａ＋Ｃ（三角形）、Ｂ＋Ｃ（菱形）、およびＡ＋Ｂ＋Ｃ（円形、実線）についての用量応答曲線を示すグラフである。ｘ軸は、ｌｏｇ１０の処理希釈を示し、ｙ軸は、ＤＭＳＯと比べて、処理後の細胞計数を示す。濃い破線は、処理開始前の細胞数（「ベースライン」）を示した。
【図１０】５種のＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系における、２４時間、４８時間、および７２時間後（異なるモノクロ階調）の、ＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ａ）、ＭＥＫ阻害剤トラメチニブ（Ｂ）、およびＢＣＬ−２／−ＸＬ阻害剤ナビトクラックス（ＡＢＴ−２６３）（Ｃ）、ならびにこれらの組み合わせ物Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ、およびＡ＋Ｂ＋Ｃについての最大カスパーゼ３／７誘発を示すグラフである。ｘ軸は、処理を示し、ｙ軸は、各処理について認められた最大カスパーゼ３／７誘発（細胞の％）を示す。
【図１１】５種のＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系における、ＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ａ）（円形）、ＭＥＫ阻害剤トラメチニブ（化合物Ｂ、三角形）、ＥＧＦＲ阻害剤エルロチニブ（化合物Ｃ、菱形）、ならびにこれらの組み合わせ物Ａ＋Ｂ（円形、点線）、Ａ＋Ｃ（三角形）、Ｂ＋Ｃ（菱形）、およびＡ＋Ｂ＋Ｃ（円形、実線）についての用量応答曲線を示すグラフである。ｘ軸は、ｌｏｇ１０の処理希釈を示し、ｙ軸は、ＤＭＳＯと比べて、処理後の細胞計数を示す。濃い破線は、処理開始前の細胞数（「ベースライン」）を示した。
【図１２】５種のＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系における、２４時間、４８時間、および７２時間後（異なるモノクロ階調）の、ＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ａ）、ＭＥＫ阻害剤トラメチニブ（化合物Ｂ）、およびＥＧＦＲ阻害剤エルロチニブ（化合物Ｃ）、ならびにこれらの組み合わせ物Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ、およびＡ＋Ｂ＋Ｃについての最大カスパーゼ３／７誘発を示すグラフである。ｘ軸は、処理を示し、ｙ軸は、各処理について認められた最大カスパーゼ３／７誘発（細胞の％）を示す。
【図１３】５種のＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系における、ＰＩＫ３ＣＡ阻害剤（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ａ）（円形）、ＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ｂ）（三角形）、ＢＣＬ−２／−ＸＬ阻害剤ナビトクラックス（ＡＢＴ−２６３）（化合物Ｃ）（菱形）、ならびにこれらの組み合わせ物Ａ＋Ｂ（円形、点線）、Ａ＋Ｃ（三角形）、Ｂ＋Ｃ（菱形）、およびＡ＋Ｂ＋Ｃ（円形、実線）についての用量応答曲線を示すグラフである。ｘ軸は、ｌｏｇ１０の処理希釈を示し、ｙ軸は、ＤＭＳＯと比較した処理後の細胞計数を示す。濃い破線は、処理開始前の細胞数（「ベースライン」）を示した。
【図１４】５種のＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系における、２４時間、４８時間、および７２時間後（異なるモノクロ階調）の、ＰＩＫ３ＣＡ阻害剤（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ａ）、ＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ｂ）、ＢＣＬ−２／−ＸＬ阻害剤ナビトクラックス（ＡＢＴ−２６３）（化合物Ｃ）、Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ、およびＡ＋Ｂ＋Ｃについての最大カスパーゼ３／７誘発を示すグラフである。ｘ軸は、処理を示し、ｙ軸は、各処理について認められた最大カスパーゼ３／７誘発（細胞の％）を示す。
【図１５】５種のＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系における、ＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ａ）（円形）、ＢＣＬ−２／−ＸＬ阻害剤ナビトクラックス（ＡＢＴ−２６３）（三角形）、および化合物ＡとＡＢＴ−２６３の組み合わせ物（菱形）についての用量応答曲線を示すグラフである。ｘ軸は、ｌｏｇ１０の処理希釈を示し、ｙ軸は、ＤＭＳＯと比較した処理後の細胞計数を示す。濃い破線は、処理開始前の細胞数（「ベースライン」）を示した。
【図１６】５種のＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系における、２４時間、４８時間、および７２時間後（異なるモノクロ階調）の、化合物Ａ、ＡＢＴ−２６３、およびＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ａ）とＢＣＬ−２／−ＸＬ阻害剤ナビトクラックス（ＡＢＴ−２６３）の組み合わせ物についての最大カスパーゼ３／７誘発を示すグラフである。ｘ軸は、処理を示し、ｙ軸は、各処理について認められた最大カスパーゼ３／７誘発（細胞の％）を示す。
【図１７】ＫＲＡＳ突然変異体ＨＣＴ−１１６異種移植を、ＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ａ）、ＭＥＫ阻害剤トラメチニブ（化合物Ｂ）、およびＢＣＬ−２／−ＸＬ阻害剤ＡＢＴ−２６３（化合物Ｃ）、またはこれらの組み合わせ物で処置した。詳細には、異種移植を、ビヒクル（Ｇ１）、ＡＢＴ−２６３（Ｇ２、毎日１００ｍｇ／ｋｇ）、化合物Ａ（Ｇ３、週３回１００ｍｇ／ｋｇ）、トラメチニブ（Ｇ４、毎日０．３ｍｇ／ｋｇ）、化合物Ａとトラメチニブの組み合わせ物（Ｇ５）、または３種全ての薬剤の組み合わせ物（Ｇ６）で処置した。９日目に、Ｇ３〜Ｇ５にＡＢＴ−２６３を追加した。腫瘍体積の初期腫瘍体積に対する平均パーセンテージ変化を示す。誤差バーは、ＳＥＭを表す。
【図１８】コホートＧ３〜Ｇ６（実施例１０および図１７に記載のとおり）における、処置から９日後（Ａ）、および処置から９日後（ＡＢＴ−２６３を順次追加してから１０日後）（Ｂ）の、個々の腫瘍についての腫瘍体積の（初期体積に対する）パーセント変化を示すウォーターフォールプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
１つの態様では、本開示は、
（ａ）（６Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オンまたはその薬学的に許容される塩、および（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンまたはその薬学的に許容される塩から選択されるＭＤＭ２阻害剤と、
（ｂ）
（ｉ）トラメチニブ、６−（４−ブロモ−２−フルオロフェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸（２−ヒドロキシエトキシ）−アミド、（Ｓ）−５−フルオロ−２−（２−フルオロ−４−（メチルチオ）フェニルアミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシプロポキシ）−１−メチル−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ−１８４３５２、ＲＤＥＡ１１９、ＸＬ５１８、ＡＳ−７０１２５５、ＡＳ−７０１１７３、ＡＳ７０３０２６、ＲＤＥＡ４３６、Ｅ６２０１、ＲＯ４９８７６５５、ＲＧ７１６７、およびＲＧ７４２０、もしくはこれらの薬学的に許容される塩からからなる群から選択されるＭＥＫ阻害剤、
および／または
（ｉｉ）ＡＢＴ−７３７、ＡＢＴ−２６３（ナビトクラックス）、およびＡＢＴ−１９９、もしくはこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択されるＢｃｌ２阻害剤と
を含む組合せ医薬に関する。
【００１５】
本組み合わせ物を使用して、がんを効率よく治療できたことが確認された。特に、本組み合わせ物を使用すると、細胞増殖の阻害および／またはアポトーシスの誘発における相乗効果により、がんを効率よく治療できたことが確認された。したがって、本開示の組み合わせ物、特に、三種およびそれ以上の組み合わせ物によって、「細胞増殖抑制性」応答が「細胞傷害性」応答に転換され、したがって、がんの退縮を実現することができる。
【００１６】
本開示について述べる文脈における（特に、以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および同様の参照は、本明細書で別段指摘しない限り、または文脈から明らかに否定されない限り、単数と複数の両方を包含すると解釈される。複数形が、化合物、患者、がんなどに使用されている場合、単一の化合物、患者なども意味すると解釈される。
【００１７】
本明細書で使用する用語「相乗効果」は、例えば、式（Ｉ）の化合物、例えば、化合物Ａと少なくとも１種の本開示のＭＥＫ阻害剤化合物、例えば、化合物Ａと少なくとも１種の本開示のＢＣＬ２阻害剤化合物などの２種または３種の治療剤の効果を生じる作用、例えば、増殖性疾患、特にがん、またはその症状の進行を緩やかにする作用を指し、これは、薬物それ自体をそれぞれ投与した効果を単に加算したものより大きい。相乗効果は、例えば、Ｓｉｇｍｏｉｄ−Ｅｍａｘ方程式（Holford, N. H. G. and Scheiner, L. B., Clin. Pharmacokinet. 6: 429-453 (1981)）、Ｌｏｅｗｅ加算方程式（Loewe, S. and Muischnek, H., Arch. Exp. Pathol Pharmacol. 114: 313-326 (1926)）、半有効方程式（Chou, T. C. and Talalay, P., Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55 (1984)）などの適切な方法を使用して計算することができる。上記に参照されたそれぞれの方程式を実験データに適用して、薬物組み合わせ物の効果を評価するのに役立つ対応するグラフを生成することができる。上記に参照された方程式に関連した対応するグラフは、それぞれ、濃度効果曲線、アイソボログラム曲線、および組み合わせ指数曲線である。
【００１８】
特に、ＴＰ５３野生型結腸直腸がんにおけるＭＤＭ２とＭＥＫの複合阻害では、各単剤と比べて、向上し（実施例１、図１および２、表２）、より長続きする（実施例１、図５、表３）応答が得られることが示されている。また、ＴＰ５３野生型結腸直腸がんにおけるＭＤＭ２とＢｃｌ２の複合阻害では、単剤と比べて、アポトーシスのより強い誘発が示された（実施例５、図１６）。さらにまた、ＭＤＭ２阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＢｃｌ２阻害剤の三種組み合わせ物では、試験したＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞モデル５種のうち２種において、薬物対を越える相乗的阻害が引き起こされ（実施例２、表５）、こうした細胞系のうち４種では、三種組み合わせ物によって、対組み合わせ物に比べてより強いアポトーシスが示された（実施例２、図１０）。したがって、本開示の組み合わせ物は、それぞれの単剤と比較して改善された応答が可能である有効な治療選択肢を提供し、臨床においてより長続きする応答をもたらすことができる。
【００１９】
本明細書で使用する用語「ＭＤＭ２阻害剤」、「ＨＤＭ２阻害剤」、または「Ｍｄｍ２阻害剤」は、ＨＤＭ２／ｐ５３（Ｍｄｍ２／ｐ５３）相互作用会合を阻害するいずれかの化合物を指す。ＨＤＭ２（ネズミ二重微小２のヒト相同体）は、ｐ５３の負の調節因子である。Ｍｄｍ２阻害剤は、Ｍｄｍ２／ｐ５３会合の阻害が示される場合、例えば、腫瘍および／またはがん性細胞成長の治療において、医薬組成物として、ヒトまたは獣医学で使用するのに有用である。Ｍｄｍ２阻害剤は、特に、ヒトのがんの治療においては、そうしたがんの進行が、ｐ５３の「ゲートキーパー」機能の無効化、例えば、Ｍｄｍ２の過剰発現に、少なくとも部分的に依存する場合があるため、有用である。
【００２０】
本開示によれば、Ｍｄｍ２阻害剤は、
（６Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オンまたはその薬学的に許容される塩、および
（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンまたはその薬学的に許容される塩
からなる群から選択される化合物である。
【００２１】
ＭＤＭ２阻害剤は、（６Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オンまたはその薬学的に許容される塩でよい。Ｍｄｍ２阻害剤（６Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オンは、新しい部類のイミダゾピロリジノン化合物に属し、ＭＤＭ２／ｐ５３相互作用（この用語は、特に、Ｈｄｍ２／ｐ５３相互作用を包含する）の強力な阻害を示す。特に、この化合物は、ＭＤＭ２に結合することにより、ＭＤＭ２のｐ５３との相互作用の阻害剤として働く。本開示による最も好ましいＭｄｍ２ｉ阻害剤であるＭＤＭ２阻害剤（６Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オンは、式Ｉの化合物であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／１１１１０５号パンフレットの実施例１０２に記載されている。
【００２２】
【化１】
2018528206.tif 000003
【００２３】
（６Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オンの結晶質形態は、国際公開第２０１３／１１１１０５号パンフレットに、ＥＸ６、ＥＸ７、およびＥＸ８として記載されている。この開示は、（６Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オン化合物のコハク酸共結晶を包含する。この化合物は、エタノール溶媒和物の形態にすることもできる。
【００２４】
ＭＤＭ２阻害剤は、（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンまたはその薬学的に許容される塩でもよい。Ｍｄｍ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンは、式ＩＩの化合物であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／０７６７８６号パンフレットの実施例１０６に記載されている。
【００２５】
【化２】
2018528206.tif 000004
【００２６】
１つの実施形態において、（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンの薬学的に許容される塩は、硫酸水素塩である。（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンの硫酸水素塩の結晶質形態は、国際公開第２０１２／０６６０９５号パンフレットに記載されている。
【００２７】
用語「ＭＥＫ阻害剤」は、本明細書では、ＭＡＰキナーゼであるＭＥＫのキナーゼ活性を標的とする、減少させる、または阻害する化合物を指すと定義される。ＭＥＫ阻害剤の標的としては、限定はしないが、ＥＲＫが挙げられる。ＭＥＫ阻害剤の間接的な標的としては、限定はしないが、サイクリンＤ１が挙げられる。
【００２８】
本開示の組合せ医薬は、トラメチニブ、６−（４−ブロモ−２−フルオロフェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸（２−ヒドロキシエトキシ）−アミド、（Ｓ）−５−フルオロ−２−（２−フルオロ−４−（メチルチオ）フェニルアミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシプロポキシ）−１−メチル−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミド、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ−１８４３５２、ＲＤＥＡ１１９、ＸＬ５１８、ＡＳ−７０１２５５、ＡＳ−７０１１７３、ＡＳ７０３０２６、ＲＤＥＡ４３６、Ｅ６２０１、ＲＯ４９８７６５５、ＲＧ７１６７、およびＲＧ７４２０、またはこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される少なくとも１種のＭＥＫ阻害剤化合物を含んでよい。
【００２９】
ＭＥＫ阻害剤は、トラメチニブ（ＪＰＴ−７４０５７またはＧＳＫ１１２０２１２とも呼ばれるＮ−（３−｛３−シクロプロピル−５−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソ−３，４，６，７−テトラヒドロピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル｝フェニル）アセトアミド）であることが好ましい。トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第０５／１２１１４２号パンフレットに記載されている。この化合物は、Ｍｅｋｉｎｉｓｔ（登録商標）として承認されている。
【００３０】
本開示によれば、本開示の組み合わせ物に適する別のＭＥＫ阻害剤は、式（ＩＩＩ）の６−（４−ブロモ−２−フルオロフェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸（２−ヒドロキシエトキシ）−アミド化合物である。
【００３１】
【化３】
2018528206.tif 000005
ＭＥＫ阻害剤化合物６−（４−ブロモ−２−フルオロフェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸（２−ヒドロキシエトキシ）−アミドは、ＰＣＴ出願国際公開第０３／０７７９１４号パンフレットに記載されており、その調製方法が、例えば、その中の実施例１８に記載されている。
【００３２】
本開示の組み合わせ物に適する追加のＭＥＫ阻害剤は、式（ＩＶ）の（Ｓ）−５−フルオロ−２−（２−フルオロ−４−（メチルチオ）フェニルアミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシプロポキシ）−１−メチル−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドである。
【００３３】
【化４】
2018528206.tif 000006
ＭＥＫ阻害剤化合物（Ｓ）−５−フルオロ−２−（２−フルオロ−４−（メチルチオ）フェニルアミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシプロポキシ）−１−メチル−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドは、ＰＣＴ出願国際公開第２００７／０４４０８４号パンフレットの実施例２５−ＢＢに記載されており、その調製方法が、その中に記載されている。
【００３４】
６−（４−ブロモ−２−フルオロフェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸（２−ヒドロキシエトキシ）−アミドの特に好ましい塩は、塩酸塩または硫酸塩である。６−（４−ブロモ−２−フルオロフェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸（２−ヒドロキシエトキシ）−アミドおよび（Ｓ）−５−フルオロ−２−（２−フルオロ−４−（メチルチオ）フェニルアミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシプロポキシ）−１−メチル−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドの本開示に適する追加の薬学的に許容される塩としては、ＰＣＴ出願国際公開第０３／０７７９１４号パンフレットおよびＰＣＴ出願国際公開第２００７／０４４０８４号パンフレットで開示されている塩が挙げられ、これら出願はどちらも、参照により本出願に組み込まれる。
【００３５】
本開示の組み合わせ物において使用することのできる追加のＭＥＫ阻害剤としては、限定はしないが、ＰＤ０３２５９０１（Ｐｆｉｚｅｒ）（ＰＣＴ国際公開第０２／０６２１３号パンフレットを参照されたい）、ＰＤ−１８４３５２（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＲＤＥＡ１１９（Ａｒｄｅａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＸＬ５１８（Ｅｘｅｌｅｘｉｓ）、ＡＳ−７０１２５５（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）、ＡＳ−７０１１７３（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）、ＡＳ７０３０２６（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）、ＲＤＥＡ４３６（Ａｒｄｅａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ６２０１（Ｅｉｓａｉ）（Goto et al, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics、3331(2): 485-495 (2009)を参照されたい））、ＲＯ４９８７６５５（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）、ＲＧ７１６７、および／またはＲＧ７４２０が挙げられる。
【００３６】
用語「Ｂｃｌ２阻害剤」、「ＢＣＬ２阻害剤」、「ＢＣＬ−２阻害剤」、または「Ｂｃｌ−２阻害剤」は、本明細書では、抗アポトーシス性Ｂ細胞リンパ腫２（Ｂｃｌ−２）ファミリーのタンパク質（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、Ｂｆｌ１／Ａ−１、および／またはＢｃｌ−Ｂ）を標的とする、減少させる、または阻害する化合物を指すと定義される。
【００３７】
１つの実施形態において、本開示の組合せ医薬は、ＡＢＴ−７３７、ＡＢＴ−２６３（ナビトクラックス）、およびＡＢＴ−１９９からなる群から選択される少なくとも１種のＢｃｌ２阻害剤化合物を含む。
【００３８】
本開示の特に好ましいＢｃｌ２阻害剤は、ナビトクラックス（ＡＢＴ−２６３）またはその薬学的に許容される塩である。ナビトクラックスは、Ｂｃｌ−２および同類のアポトーシス阻害因子Ｂｃｌ−ｘＬの選択的な高親和性小分子阻害剤である（Tse C, Shoemaker AR, Adickes J, Anderson MG, Chen J, Jin S, et al. ABT-263: a potent and orally bioavailable Bcl-2 family inhibitor. Cancer Res2008;68:3421-8）。
【００３９】
本開示によれば、組合せ医薬は、ＭＤＭ２阻害剤とＭＥＫ阻害剤を含むものでもよいし、またはＭＤＭ２阻害剤とＢｃｌ２阻害剤を含むものでもよい。本開示によれば、ＭＤＭ２阻害剤とＭＥＫ阻害剤、またはＭＤＭ２とＢｃｌ２阻害剤とを含む組合せ医薬は、別の阻害剤をさらに含むと有利である場合があり、これにより、組み合わせ物の抗腫瘍活性はさらにまた向上する。すなわち、ＭＤＭ２阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＢｃｌ２阻害剤の三種組み合わせ物では、試験したＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞モデル５種のうち２種において、薬物対を越える相乗的な阻害が引き起こされ（実施例２、表５）、こうした細胞系のうち４種では、三種組み合わせ物によって、対組み合わせ物に比べてより強いアポトーシスが示された（実施例２、図１０）。
【００４０】
同様に、（ａ）ＭＤＭ２阻害剤と、（ｂ）（ｉ）ＭＥＫ阻害剤および／または（ｉｉ）Ｂｃｌ２とを含む本開示の組合せ医薬は、ＥＧＦＲ阻害剤をさらに含むと有利である場合がある。
【００４１】
用語「ＥＧＦＲ阻害剤」は、本明細書では、上皮成長因子ファミリーの受容体チロシンキナーゼ（ホモまたはヘテロ二量体としてのＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４）の活性を標的とする、減少させる、もしくは阻害する、またはＥＧＦもしくはＥＧＦ関連リガンドに結合する化合物を指すと定義される。
【００４２】
本開示の組み合わせ物において使用されるＥＧＦＲ阻害剤化合物は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ペリチニブ、ネラチニブ、（Ｒ，Ｅ）−Ｎ−（７−クロロ−１−（１−（４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−エノイル）アゼパン−３−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）−２−メチルイソニコチンアミド、パニツムマブ、マツズマブ、ペルツズマブ、ニモツズマブ、ザルツムマブ、イコチニブ、アファチニブ、およびセツキシマブ、ならびにこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
【００４３】
ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブまたはその薬学的に許容される塩であることが好ましい。
【００４４】
１つの実施形態において、ＭＤＭ２阻害剤とＭＥＫ阻害剤とを含む組合せ医薬は、ＥＧＦＲ阻害剤をさらに含むと有利である場合がある。驚いたことに、この三種組み合わせ物によって、対組み合わせ物に比べてより強いアポトーシスが示されたことがわかった（実施例３、図１２）。
【００４５】
好ましい１つの実施形態において、組合せ医薬は、（６Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オンまたはその薬学的に許容される塩、および（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンまたはその薬学的に許容される塩から選択されるＭＤＭ２阻害剤と、ＭＥＫ阻害剤トラメチニブまたはその薬学的に許容される塩と、ＥＧＦＲ阻害剤エルロチニブまたはその薬学的に許容される塩とを含む。
【００４６】
本開示によれば、（ａ）ＭＤＭ２阻害剤と、（ｂ）（ｉ）ＭＥＫ阻害剤および／または（ｉｉ）Ｂｃｌ２とを含む本開示の組合せ医薬は、ＰＩ３Ｋ阻害剤をさらに含むと有利である場合がある。
【００４７】
用語「ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤」または「ＰＩ３Ｋ阻害剤」は、本明細書では、ＰＩ３−キナーゼを標的とする、減少させる、または阻害する化合物を指すと定義される。ＰＩ３−キナーゼ活性は、インスリン、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、上皮成長因子、コロニー刺激因子、および肝細胞成長因子を始めとするいくつかのホルモンおよび成長因子刺激に応じて増大することが示されており、細胞の成長および形質転換に関係する過程が示唆されている。
【００４８】
本開示に適するホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤は、２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）−フェニル］−プロピオニトリルまたはその薬学的に許容される塩、５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミンまたはその薬学的に許容される塩、および（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
【００４９】
国際公開第２００６／１２２８０６号パンフレットは、イミダゾキノリン誘導体を記載しており、この誘導体は、ＰＩ３Ｋの活性を阻害すると述べられている。その化合物２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）−フェニル］−プロピオニトリルは、式（Ｖ）の化学構造を有する。
【００５０】
【化５】
2018528206.tif 000007
【００５１】
この化合物、ＰＩ３Ｋ阻害剤としてのその有用性、および２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）−フェニル］−プロピオニトリルおよびそのモノメシル酸塩の合成は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００６／１２２８０６号パンフレットの、例えば、それぞれ、実施例７および実施例１５２〜３に記載されている。２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）−フェニル］−プロピオニトリル化合物は、遊離塩基またはその任意の薬学的に許容される塩の形態で存在する場合がある。２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）−フェニル］−プロピオニトリルは、そのモノメシル酸塩の形態であることが好ましい。
【００５２】
国際公開第０７／０８４７８６号パンフレットは、ＰＩ３Ｋの活性を阻害することがわかっている特定のピリミジン誘導体を記載している。その化合物５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミンは、式（ＶＩ）の化学構造を有する。
【００５３】
【化６】
2018528206.tif 000008
【００５４】
この化合物、その塩、ＰＩ３Ｋ阻害剤としてのその有用性、および５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミン化合物の合成は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０８４７８６号パンフレットの、例えば、実施例１０に記載されている。５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミン化合物は、遊離塩基またはその任意の薬学的に許容される塩の形態で存在する場合がある。５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミンは、その塩酸塩の形態であることが好ましい。
【００５５】
国際公開第２０１０／０２９０８２号パンフレットは、ＰＩ３Ｋのαアイソフォームに高度に選択的であることがわかっており、本開示の組み合わせ物に加えることのできる、特定の２−カルボキサミドシクロアミノ尿素誘導体を記載している。その化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）は、式（ＶＩＩ）の化学構造を有する。
【００５６】
【化７】
2018528206.tif 000009
【００５７】
この化合物、その塩、αアイソフォーム選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤としてのその有用性、および（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）化合物の合成は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／０２９０８２号の、例えば、実施例１５に記載されている。（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）化合物は、遊離塩基またはその任意の薬学的に許容される塩の形態で存在する場合がある。（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）は、その遊離塩基の形態であることが好ましい。
【００５８】
本開示の組み合わせ物において使用されるＰＩ３Ｋ阻害剤化合物は、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその任意の薬学的に許容される塩であることが好ましい。
【００５９】
１つの実施形態において、ＭＤＭ２阻害剤とＢｃｌ２阻害剤とを含む組合せ医薬は、ＰＩ３Ｋ阻害剤をさらに含むと有利である場合がある。驚いたことに、この三種組み合わせ物では、試験した細胞モデル５種のうち２種において、薬物対を越える相乗的阻害が引き起こされ（実施例４、表９）、対組み合わせ物に比べてより強いアポトーシスが示されたことがわかった（実施例４、図１４）。
【００６０】
好ましい１つの実施形態において、組合せ医薬は、（６Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オンまたはその薬学的に許容される塩、および（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンまたはその薬学的に許容される塩から選択されるＭＤＭ２阻害剤と、Ｂｃｌ２阻害剤ナビトクラックスまたはその薬学的に許容される塩と、ＰＩ３Ｋ阻害剤（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその任意の薬学的に許容される塩とを含む。
【００６１】
さらに、本開示によれば、（ａ）ＭＤＭ２阻害剤と、（ｂ）（ｉ）ＭＥＫ阻害剤および／または（ｉｉ）Ｂｃｌ２とを含む本開示の組合せ医薬は、ＢＲＡＦ阻害剤をさらに含むと有利である場合がある。
【００６２】
さらに、本開示の組合せ医薬は、（ａ）ＭＤＭ２阻害剤、（ｂ）ＭＥＫ阻害剤、（ｃ）Ｂｃｌ２阻害剤、および（ｄ）ＢＲＡＦ阻害剤を含むと有利である場合がある。
【００６３】
用語「ＢＲＡＦ阻害剤」は、セリン／トレオニンタンパク質キナーゼＢ−Ｒａｆの活性を標的とする、減少させる、または阻害する化合物を指すと定義される。
【００６４】
ＢＲＡＦ阻害剤が、ＲＡＦ２６５、ダブラフェニブ（Ｓ）−メチル−１−（４−（３−（５−クロロ−２−フルオロ−３−（メチルスルホンアミド）フェニル）−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）プロパン−２−イルカルバメート、メチルＮ−［（２Ｓ）−１−（｛４−［３−（５−クロロ−２−フルオロ−３−メタンスルホンアミドフェニル）−１−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］ピリミジン−２−イル｝アミノ）プロパン−２−イル］カルバメート、およびベムラフェニブ、またはこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の組合せ医薬。
【００６５】
本開示によれば、ＢＲＡＦ阻害剤は、ダブラフェニブまたはその薬学的に許容される塩であることが好ましい。１つの実施形態において、本組み合わせ物に加えられるＢＲＡＦ阻害剤は、ＲＡＦ２６５である。
【００６６】
本開示の組み合わせ物、特に、ＭＤＭ２阻害剤とＭＥＫ阻害剤（トラメチニブなど）の組み合わせ物は、ＣＤＫ４／６阻害剤をさらに含んでもよい。本明細書で定義する「サイクリン依存性キナーゼ４／６（ＣＤＫ４／６）阻害剤」は、サイクリン−ＣＤＫ複合体と相互に作用してキナーゼ活性を遮断する小分子を指す。サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、哺乳動物細胞周期の開始、進行、および完了を調節する、大きなファミリーのタンパク質キナーゼである。ＣＤＫ４／６阻害剤は、７−シクロペンチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（（５−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）アミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミドまたはその薬学的に許容される塩であることが好ましい。
【００６７】
用語「薬学的に許容される塩」とは、生物学的有効性および化合物の特性を保持しており、通常、生物学的にまたは他の点で望ましい塩を指す。化合物は、アミノ基が存在することで、酸付加塩を形成することができる場合がある。
【００６８】
別段指定しない限り、または本文から明確に示唆されない限り、本開示の組合せ医薬において有用な治療剤への言及は、化合物の遊離塩基および化合物の薬学的に許容される全ての塩の両方を包含する。
【００６９】
用語「組み合わせ物」または「組合せ医薬」は、本明細書では、１個の単位剤形の配合物（fixed combination）、固定されていない組み合わせ物（non-fixed combination）、または治療剤が一緒に、同時に、もしくは時間間隔の範囲内で、とりわけこの時間間隔が、組み合わせ相手が協調的な、例えば相乗的な効果を示すことを好ましくは可能にする範囲内で別々に、独立して投与されうる組み合わせ投与のためのキットの一部を指すと定義される。したがって、本開示の組合せ医薬の単一化合物は、同時にまたは順次投与される場合がある。
【００７０】
さらに、本開示の組合せ医薬は、配合物の形態でも、または固定されていない組み合わせ物の形態でもよい。
【００７１】
用語「配合物」とは、治療剤、例えば、組み合わせ物の単一の諸化合物が、単一の実体または剤形の形態になっていることを意味する。
【００７２】
用語「固定されていない組み合わせ物」とは、治療剤、例えば、組み合わせ物の単一の諸化合物が、別個の実体もしくは剤形として同時に、または特定の制限時間なしに順次、患者に投与されることを意味し、このような投与によって、それを必要とする対象、例えば哺乳動物またはヒトの身体において、２種の治療剤の治療に有効なレベルが実現されることが好ましい。
【００７３】
組合せ医薬は、薬学的に許容される少なくとも１種の担体をさらに含んでよい。したがって、本開示は、本開示の組合せ医薬と、薬学的に許容される少なくとも１種の担体とを含む医薬組成物に関する。
【００７４】
本明細書で使用するとき、用語「担体」または「薬学的に許容される担体」は、当業者の知るところとなるような、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗かび剤）、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物安定剤、結合剤、添加剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、着香剤、色素など、およびこれらの組み合わせ物を包含する（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289- 1329を参照されたい）。従来の任意の担体が活性成分と適合しないのでない限り、治療のためまたは医薬組成物におけるその使用が企図される。
【００７５】
語句「薬学的に許容される」は、本明細書では、健全な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に応じて、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適する化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すのに用いる。
【００７６】
一般に、用語「医薬組成物」は、本明細書では、対象、例えば哺乳動物またはヒトに投与される少なくとも１種の治療剤を含有する混合物または溶液を指すと定義される。本組合せ医薬は、経腸または非経口投与に適する医薬組成物、例えば、糖衣錠、錠剤、カプセル剤または坐剤、アンプル剤などの単位剤形にしたものに製剤することができる。別段指摘しない場合、これらは、それ自体が公知である方法で、例えば、従来の種々の混合、粉砕、直接圧縮、造粒、糖コーティング、溶解、凍結乾燥工程、または当業者に直ちに明白となる製作技術によって調製される。各剤形の個々の用量に含まれる組み合わせ相手の単位含有量は、複数の投薬単位の投与によって必要な有効量に到達しうるため、それ自体で有効量をなす必要がないことは理解されよう。医薬組成物は、約０．１％〜約９９．９％、好ましくは約１％〜約６０％の治療剤を含有してよい。当業者は、剤形の所望される特定の性質を基準にして、型通りの実験によって、過度の負担なく、前述の担体の１種または複数を選択することができる。各担体の使用量は、当業界における通常の範囲内で様々となりうる。次の参考文献で、経口剤形の製剤に使用される技術および添加剤が開示されている。Pharmaceutical Excipients, 4th edition, Rowe et al., Eds., American Pharmaceuticals Association (2003)、およびRemington: the Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, Gennaro, Ed., Lippincott Williams & Wilkins (2003)のハンドブックを参照されたい。こうした任意選択の付加的な従来の担体は、１種または複数の従来の担体を造粒前もしくは造粒中の初期混合物に混ぜる、または１種または複数の従来の担体を、経口剤形における薬剤の組み合わせ物もしくは薬剤の組み合わせ物の個々の薬剤を含む顆粒と合わせることにより、経口剤形に組み込むことができる。後の実施形態において、合わせられた混合物は、例えばＶ型ブレンダーによってさらに混和し、引き続いて、圧縮もしくは成形して錠剤、例えば一体式の錠剤とする、カプセルによってカプセル化する、またはサシェに充填することができる。本開示の組合せ医薬を医薬品の製造に使用できることは明白である。
【００７７】
本開示は、医薬品として特に有用である組合せ医薬または薬学的組成物に関する。
【００７８】
詳細には、本開示の組み合わせ物または組成物は、がんの治療において適用することができる。
【００７９】
本開示はまた、がんの治療のための医薬を調製するための本開示の組合せ医薬または医薬組成物の使用、およびそれを必要とする対象においてがんを治療する方法であって、治療有効量の本開示による組合せ医薬または本開示による医薬組成物を対象に投与することを含む方法に関する。
【００８０】
本明細書で使用する用語「治療」は、対象において少なくとも１種の症状を除去、軽減、もしくは緩和する、無増悪生存期間、全生存期間を延長する、応答持続期間を延長する、または疾患の進行を遅らせる治療を含む。例えば、治療は、がんなどの障害の１つまたはいくつかの症状の減少、または障害の完全な根絶である場合がある。本開示の意味の範囲内で、用語「治療」は、患者、例えば哺乳動物において、発症（すなわち、疾患の臨床的な顕在化より前の期間）を阻止する、遅らせる、および／または疾患の進展および悪化のリスクを低減することを意味し、特に、患者は、ヒトである。本明細書で使用する用語「治療」は、原発腫瘍成長の直接の阻害および／または転移がん細胞の全身性の阻害が織り込まれた、腫瘍成長の阻害を含む。
【００８１】
「対象」、「個体」、または「患者」は、本明細書では区別なく使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳動物は、限定はしないが、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用動物、および愛玩動物を含む。
【００８２】
本開示の化合物（例えば、化学的実体または生物薬）の「治療有効量」という用語は、対象の生物学的もしくは医学的応答、例えば、酵素もしくはタンパク質活性の低下もしくは阻害を誘発する、または症状を改善する、状態を緩和する、疾患の進行を緩徐にするもしくは遅延させる、または疾患を予防するなどの、本開示の化合物の量を指す。１つの実施形態において、インビボ治療有効量は、投与経路に応じて、約０．１〜５００ｍｇ／ｋｇの間、または約１〜１００ｍｇ／ｋｇの間の範囲でよい。
【００８３】
がんの治療のための各組み合わせ相手の最適投与量は、公知の方法を使用して各個体用に経験的に求めることができ、限定はしないが、疾患の進行度、個体の年齢、体重、一般健康状態、性別、および食事、投与の時期および経路、ならびに個体が受けている他の薬物療法を始めとする様々な要素に応じて決まる。最適投与量は、当業界で周知の型通りの試験および手順を使用して打ち立てることができる。単一剤形を製造するために担体材料と合わせることのできる各組み合わせ相手の量は、治療を受ける個体および特定の投与方式に応じて様々となる。一部の実施形態において、本明細書に記載のとおりの薬剤の組み合わせ物を含有する単位剤形は、組み合わせ物の各薬剤を、薬剤を単独で投与するときに通常投与される量で含有する。
【００８４】
投与頻度は、使用する化合物、および治療または予防がなされる特定の状態に応じて様々となりうる。一般に、有効な療法となるのに十分である最小投与量の使用が好ましい。一般に、当業者の精通するところとなる、治療または予防がなされる状態に適するアッセイを使用して、治療有効性について患者をモニターすることができる。
【００８５】
（６Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オンの治療量または用量は、経口投与するとき、３週間毎に１００ｍｇ〜１５００ｍｇの間、特に、３週間毎に１００ｍｇ〜８００ｍｇの間、または毎日５０ｍｇ〜６００ｍｇの間の範囲でよい。（６Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オンの治療量または用量は、２８日毎のサイクルの最初の２１日間の毎日の投与については、４００ｍｇでよく、より好ましくは３００ｍｇである。別法として、（６Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オンの合計治療量または合計用量は、１サイクルあたり５６０ｍｇ（２週間毎日４０ｍｇ／２週間休薬、または１週間毎日８０ｍｇ／３週間休薬）である。静脈内用量は、それに応じて少なくする必要があることになる。
【００８６】
（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンの治療量または用量は、経口投与するとき、５００ｍｇ〜２０００ｍｇの間、特に５００ｍｇ〜１２００ｍｇの間である。好ましい実施形態において、（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンの治療量または用量は、５００ｍｇ、より好ましくは８００ｍｇである。静脈内用量は、それに応じて少なくする必要があることになる。
【００８７】
ＭＥＫ阻害剤トラメチニブの推奨用量は、毎日２ｍｇである。有害反応の管理のために、毎日１ｍｇまで用量を減らす必要がある場合もある。
【００８８】
ＭＥＫ阻害剤化合物６−（４−ブロモ−２−フルオロフェニルアミノ）−７−フルオロ−３−メチル−３Ｈ−ベンゾイミダゾール−５−カルボン酸（２−ヒドロキシエトキシ）−アミドは、体重１ｋｇあたり１日約０．００１〜約１００ｍｇ、好ましくは約１〜約３５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の有効投与量で、単一または分割用量として、適切な対象に毎日投与することができる。７０ｋｇのヒトでは、これは、約０．０５〜７ｇ／日、好ましくは約０．０５〜約２．５ｇ／日という好ましい投与量範囲になることになる。
【００８９】
ＭＥＫ阻害剤化合物（Ｓ）−５−フルオロ−２−（２−フルオロ−４−（メチルチオ）フェニルアミノ）−Ｎ−（２−ヒドロキシプロポキシ）−１−メチル−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリジン−３−カルボキサミドは、体重１ｋｇあたり１日約０．００１〜約１００ｍｇ、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約３５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の有効投与量で、単一または分割用量として、適切な対象に毎日投与することができる。７０ｋｇのヒトでは、これは、約０．０７〜２．４５ｇ／日、好ましくは約０．０５〜約１．０ｇ／日という好ましい投与量範囲になることになる。
【００９０】
Ｂｃｌ−２阻害剤ナビトクラックスの有効用量は、毎日約１００ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲となりうる。用量は、減らしてもよく、または１５０ｍｇの７日導入用量を用いてもよい。導入用量の後、３２５ｍｇの用量または、４２５ｍｇまでの用量を毎日投与することができる。
【００９１】
ＥＧＦＲ阻害剤エルロチニブの推奨用量は、毎日１００ｍｇまたは１５０ｍｇである。
【００９２】
ＰＩ３Ｋ阻害剤化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）は、成人では、一般に、１日約３０ｍｇ〜４５０ｍｇ、例えば、１日１００〜４００ｍｇの範囲の用量で経口投与される。日用量は、１日１回または１日２回のスケジュールで投与することができる。（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）は、体重１ｋｇあたり１日約０．０５〜約５０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の有効投与量で、単一または分割用量として、適切な対象に毎日投与することができる。７０ｋｇのヒトでは、これは、１日約３５〜７００ｍｇという好ましい投与量範囲になることになる。投与量範囲は、１日約３５〜４００ｍｇであることがより好ましい。
【００９３】
ＰＩ３Ｋ阻害剤化合物２−メチル−２−［４−（３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）−フェニル］−プロピオニトリルは、成人では、一般に、１日約１００ｍｇ〜１２００ｍｇ、約２００ｍｇ〜１０００ｍｇ、約３００ｍｇ〜８００ｍｇ、または約４００ｍｇ〜６００ｍｇの範囲の用量で経口投与される。日用量は、１日１回または１日２回のスケジュールで投与することができる。
【００９４】
ＰＩ３Ｋ阻害剤化合物５−（２，６−ジ−モルホリン−４−イル−ピリミジン−４−イル）−４−トリフルオロメチル−ピリジン−２−イルアミンは、成人では、一般に、１日約３０ｍｇ〜３００ｍｇもしくは約６０ｍｇ〜１２０ｍｇ、または約１００ｍｇの範囲の用量で経口投与される。日用量は、１日１回または１日２回のスケジュールで投与することができる。
【００９５】
ＢＲＡＦ阻害剤ダブラフェニブの推奨用量は、単剤として１日２回経口で１５０ｍｇ、またはトラメチニブと組み合わせて１日１回経口で２ｍｇである。
【００９６】
各治療剤は、好都合に、例えば個々の１投与量単位で投与される場合もあり、または複数の投与量単位に分割される場合もあると理解される。さらに、各治療剤は、１日１回の用量または１日４回までの用量で好都合に投与してよいと理解される。
【００９７】
用語「がん」は、本明細書では、広い範囲の腫瘍、特に固形腫瘍を意味するのに使用する。そのような腫瘍の例としては、限定はしないが、肺（小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む）、気管支、前立腺、乳房（散発性乳がんおよびカウデン病罹患者を含む）、膵臓、胃腸管、結腸、直腸、結腸癌、結腸直腸がん、甲状腺、肝臓、胆道、肝内胆管、肝細胞、副腎、胃部、胃、神経膠腫、神経膠芽腫、子宮内膜、腎臓、腎盂、膀胱、子宮、子宮頸部、膣、卵巣、多発性骨髄腫、食道、頚部または頭部、脳、口腔および咽頭、喉頭、小腸、黒色腫、絨毛結腸腺腫、肉腫、新生物、上皮性新生物、乳癌、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、光線角化症、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性白血病、および骨髄性白血病を含む）、リンパ腫（非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫を含む）、骨髄様転移を有する骨髄線維症、ワルデンシュトレーム病、およびバレット腺癌が挙げられる。
【００９８】
がんは、結腸直腸がん、黒色腫、脂肪肉腫、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、リンパ腫、または白血病であることが好ましい。好ましい実施形態において、がんは、結腸直腸がんである。本明細書で使用する用語「結腸直腸がん」とは、結腸がん、直腸がん、または腸がんとしても知られる、結腸または直腸におけるがんを指す。１つの実施形態において、本開示は、転移性結腸直腸がんに関する。
【００９９】
本組み合わせ物は、機能的ｐ５３またはｐ５３野生型がんにおいて優れた効果を実現することが予想される。ＴＰ５３遺伝子は、ヒトがんにおいて最も頻繁に突然変異する遺伝子の１つである。すなわち、腫瘍抑制因子ｐ５３は、ヒトがんのほぼ５０％において、突然変異または欠失によって機能が損なわれている。残りのヒトがんでは、ｐ５３は、野生型状態を保持しているが、その機能は、その主要な細胞性阻害因子であるネズミ二重微小２（Ｍｄｍ２、ＭＤＭ２；ＨＤＭ２（ネズミ二重微小２のヒト相同体））によって阻害される。Ｍｄｍ２は、ｐ５３腫瘍抑制因子のマイナスの調節因子である。Ｍｄｍ２タンパク質は、ｐ５３のプロテアソーム分解をもたらすＥ３ユビキチンリガーゼとして、またｐ５３転写活性化の阻害因子として機能する。Ｍｄｍ２は、ｐ５３野生型腫瘍において増幅が認められることが多い。Ｍｄｍ２とｐ５３の相互作用は、野生型ｐ５３を保持するがんにおけるｐ５３機能の阻害の主要な機序であるため、ＭＤＭ２阻害剤を含む本開示の組み合わせ物は、機能的ｐ５３またはｐ５３野生型がんの治療に特に有用である。
【０１００】
加えて、本組み合わせ物の有効性は、ＫＲＡＳ突然変異および／またはＢＲＡＦ突然変異および／またはＭＥＫ１突然変異および／またはＰＩＫ３ＣＡ突然変異および／またはＰＩＫ３ＣＡ過剰発現の１つまたは複数により特徴付けられるがんにおいて増大することが予想される。
【０１０１】
報告されている結腸直腸がん症例の５０％〜６０％を合わせて占める（Fearon 2011）、ＫＲＡＳまたはＢＲＡＦ突然変異を含む結腸直腸がんの患者は、一般に、不良な予後と関連付けられる（Arrington, Heinrich et al. 2012、Safaee Ardekani, Jafarnejad et al. 2012）。本開示の組み合わせ物は、ＫＲＡＳ突然変異の１つまたは複数またはＢＲＡＦ突然変異の１つまたは複数を含むがんの治療に特に有用である。
【０１０２】
ＢＲＡＦ突然変異の例としては、限定はしないが、Ｖ６００Ｅ、Ｒ４６１Ｉ、Ｉ４６２Ｓ、Ｇ４６３Ｅ、Ｇ４６３Ｖ、Ｇ４６５Ａ、Ｇ４６５Ｅ、Ｇ４６５Ｖ、Ｇ４６８Ａ、Ｇ４６８Ｅ、Ｎ５８０Ｓ、Ｅ５８５Ｋ、Ｄ５９３Ｖ、Ｆ５９４Ｌ、Ｇ５９５Ｒ、Ｌ５９６Ｖ、Ｔ５９８Ｉ、Ｖ５９９Ｄ、Ｖ５９９Ｅ、Ｖ５９９Ｋ、Ｖ５９９Ｒ、Ｖ６００Ｋ、Ａ７２７Ｖが挙げられる。これらの突然変異のほとんどは、ＮローブのグリシンリッチＰループと、活性化セグメントおよび隣接領域という２つの領域に群生している。Ｖ６００Ｅ突然変異は、様々ながんにおいて検出されており、ヌクレオチド１７９９におけるチミンのアデニンでの置換によるものである。これにより、コドン６００においてバリン（Ｖ）がグルタミン酸（Ｅ）で置き換えられる（ここで、Ｖ６００Ｅと呼ばれる）。
【０１０３】
ＭＥＫ１突然変異は、例えば、ＭＥＫ１  Ｓ７２Ｇ突然変異でよい。
【０１０４】
ＰＩＫ３ＣＡ突然変異および／またはＰＩＫ３ＣＡ過剰発現の例としては、限定はしないが、ＰＩ３Ｋのαアイソフォームの増幅、ＰＩＫ３ＣＡの体細胞突然変異、ＰＴＥＮの生殖細胞突然変異もしくは体細胞突然変異、ｐ８５−ｐ１１０複合体を上向き調節する働きをするｐ８５αの突然変異および転座、またはＰＩ３Ｋのβアイソフォームの増幅もしくは過剰発現が挙げられる。
【０１０５】
本開示の組合せ医薬は、ＥＧＦＲ阻害剤での治療に抵抗性である、またはＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して抵抗性になっている、またはＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して抵抗性になるリスクが高まっている、がん、特に結腸直腸がんの治療に特に有用であり、特に、ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、およびアファチニブからなる群から選択される。
【０１０６】
本開示の組合せ医薬は、予後不良患者、特に、ＥＧＦＲ阻害剤を用いる治療に抵抗性になるがん、特に結腸直腸がん、例えば、ＥＧＦＲ阻害剤での治療に当初は応答し、次いで再発したような患者のがんを有するような予後不良患者の治療にも適する。別の例では、前記患者は、ＦＧＦＲ阻害剤を用いる治療を受けたことがない。このがんは、１種または複数のＥＧＦＲ阻害剤による前の治療の間に抵抗性を獲得していてもよい。例えば、ＥＧＦＲ標的療法は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＸＬ−６４７、ＨＫＩ−２７２（ネラチニブ）、ＢＩＢＷ２９９２（アファチニブ）、ＥＫＢ−５６９（ペリチニブ）、ＡＶ−４１２、カネルチニブ、ＰＦ００２９９８０４、ＢＭＳ６９０５１４、ＨＭ７８１−３６ｂ、ＷＺ４００２、ＡＰ−２６１１３、セツキシマブ、パニツムマブ、マツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、またはこれらの薬学的に許容される塩による治療を含む場合がある。特に、ＥＧＦＲ標的療法は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、およびアファチニブによる治療を含むものでよい。獲得された抵抗性の機序としては、限定はしないが、ＥＧＦＲ遺伝子それ自体における第２の突然変異、例えばＴ７９０Ｍの発生、ＥＧＦＲ増幅；および／またはＦＧＦＲ調節解除、ＦＧＦＲ突然変異、ＦＧＦＲリガンド突然変異、ＦＧＦＲ増幅、もしくはＦＧＦＲリガンド増幅が挙げられる。
【０１０７】
以下の実施例は、上述の開示を説明するものであるが、本開示の範囲を一切限定するものではない。それ自体が当業者に公知である他の試験モデルでも、請求項に係る開示の有益な効果を明らかにすることができる。
【実施例】
【０１０８】
本明細書では、「化合物Ａ」、「化合物Ｂ」などによって、特定の化合物が表示される。それぞれの化合物の表示は、全ての例または組み合わせ物について同じでない場合もある。むしろ、化合物は、各例において新たに表示される。
【実施例１】
【０１０９】
ＭＤＭ２阻害剤とＭＥＫ阻害剤を組み合わせることの増殖に対するインビトロ効果
この研究は、ＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系において、ＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ａ）またはＭＤＭ２阻害剤（６Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オン（化合物Ｂ）をＭＥＫ阻害剤トラメチニブ（化合物Ｃ）と組み合わせることの増殖に対するインビトロ効果を調査するように設計された。
【０１１０】
方法
化合物Ａ、Ｂ、およびＣを１００％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ２６５０）に２０ｍＭの濃度で溶解させ、使用するまで−２０℃で保存した。
【０１１１】
この研究に使用した結腸直腸がん細胞系を、商業的供給者のＡＴＣＣ、ＥＣＡＣＣ、ＤＳＭＺ、およびＣｅｌｌＢａｎｋ  Ａｕｓｔｒａｌｉａから得て、培養し、処理した（表１）。全ての細胞系の培地には、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００７１．０３）を補充した。ＬＩＭ２４０５用の培地には、０．６ｕｇ／ｍｌのインスリン（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｉ９２７８）、１ｕｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｈ０１３５）、および１０μＭの１−チオグリセロール（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｍ６１４５）を追加的に補充した。
【０１１２】
【表１】
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【０１１３】
細胞系を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターにおいて培養し、Ｔ−７５フラスコ中に増やした。全ての場合において、細胞は、凍結貯蔵物から解凍し、１：３希釈を使用して≧１継代によって増やし、播く前に、ＶｉＣｅｌｌ計測器（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して計数し、生存度について評価した。細胞系を分け、増やすために、細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号２５２００）を使用して、フラスコから取り除いた。Ｉｄｅｘｘ  Ｒａｄｉｌ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＯ，ＵＳＡ）において実施したＰＣＲ検出法によって確認し、ＳＮＰパネルの検出によって正確に鑑定したところ、全ての細胞系が、マイコプラスマ汚染なしと判定された。
【０１１４】
化合物Ａまたは化合物Ｂを化合物Ｃと組み合わせることの細胞増殖に対する効果を試験するため、底が透明の黒色３８４ウェルマイクロプレート（Ｍａｔｒｉｘ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４３３２）において、ウェル１つあたり５０ｕｌの培地に、５００〜１２５０細胞／ウェルの細胞密度で細胞を播き（表１）、３７度、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞系１つあたり１つの３８４ウェルプレートを、処理を受けることなく、顕微鏡検査法（以下を参照されたい）による細胞計数用に準備した（＝「ベースライン」）。他の細胞プレートは、ＨＰ  Ｄ３００  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（Ｔｅｃａｎ）を使用して処理し、２．５×の希釈ステップを用いた６段階での用量応答曲線を作成した。
【０１１５】
化合物Ａは、５１ｎＭ〜５ｕＭの最終濃度範囲で、化合物Ｂは、１０ｎＭ〜１ｕＭの最終濃度範囲で、化合物Ｃは、１ｎＭ〜１００ｎＭの最終濃度範囲で使用した。
【０１１６】
化合物Ａまたは化合物Ｂを化合物Ｃと組み合わせることについて、単剤を６段階の単剤用量で組み合わせて、６×６＝３６の組み合わせ処理の用量行列を生成した。加えて、陰性対照（ＤＭＳＯ＝「ビヒクル」）および陽性対照（スタウロスポリン＝細胞死滅、１６ｎｍ〜１ｕＭの用量範囲について７段階の１：２連続希釈）を処理対照として移した。細胞をその倍加時間に応じて７２〜９６時間処理した（表１）。処理終了時に、細胞を顕微鏡検査法による細胞計数に向けて調製した。細胞を、ＰＢＳ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号ＢＭ−２２０）中の４％ＰＦＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１５７１４）、０．１２％ＴＸ−１００（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２２１４０）において、４５分間にわたって固定および透過処理した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、それらのＤＮＡをＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｈ３５７０）により最終濃度４μｇ／ｍｌで３０分間染色した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次にプレートをＰｌａｔｅＬｏｃ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用によりアルミニウムシール（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０６６４４−００１）でヒートシールし、画像化するまで４℃で保存した。ウェル／処理毎の全ての細胞を、４×対物レンズおよびＤＡＰＩ励起／発光フィルターを備えたＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する蛍光顕微鏡検査法により単一画像を撮った。
【０１１７】
アポトーシスの誘発に対する組み合わせ物の効果を試験するために、上述の増殖アッセイと同様の実験ステップを使用し、化合物Ａの化合物Ｃとの組み合わせ物を試験するだけとして、カスパーゼ３／７アッセイを実施した。化合物を薬物マスタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号７８８８７６）に配置し、２０００×の濃度で、３倍に連続希釈（７ステップ）した。ＡＴＳ音響液体分配器（ＥＣＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の使用により、薬物マスタープレートから２５ｎｌの２０００×化合物を５０ｕＬの細胞に移して、最終濃度を１×とすることにより細胞を処理した。
【０１１８】
化合物Ａは、１３ｎＭ〜１０ｕＭの最終濃度範囲で、化合物Ｃは、０．４ｎＭ〜０．３ｕＭの最終濃度範囲で使用した。加えて、陰性対照（ＤＭＳＯ＝「ビヒクル」）および陽性対照（スタウロスポリン＝細胞死滅、１６ｎｍ〜１ｕＭの用量範囲について７段階の１：２連続希釈）を処理対照として移した。
【０１１９】
化合物を添加した後、５０ｎｌの２ｍＭ  ＣｅｌｌＥｖｅｎｔ  カスパーゼ３／７緑色検出試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ１０４２３）を、ＨＰ  Ｄ３００  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（Ｔｅｃａｎ）の使用により、３回の複製のうちの１回に加えた。カスパーゼ３／７誘発を、処理により誘発されたアポトーシスの代理として測定した。細胞をその倍加時間に応じて７２〜９６時間処理し（表１）、カスパーゼ３／７活性化を、４×対物レンズおよびＦＩＴＣ励起／発光フィルターを備えたＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する顕微鏡検査法により２４時間毎に測定した。処理終了時に、細胞を、細胞増殖アッセイについて上述したとおりに、顕微鏡検査法による細胞計数および画像用に調製した。
【０１２０】
以前に記載された方法（Horn, Sandmann et al. 2011）を適用し、ＲのＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＥＢＩｍａｇｅ（Pau, Fuchs et al. 2010）を使用した後、画像を分析した。両方のチャネルにおける対象物、ＤＡＰＩ（Ｈｏｅｃｈｓｔ／ＤＮＡ用）およびＦＩＴＣ（カスパーゼ３／７用）を、適応閾値化（adaptive thresholding）により別々にセグメント化し、計数した。カスパーゼ３／７陽性対象物の閾値は、陰性対照（ＤＭＳＯ）と陽性対照（スタウロスポリン）とを比較した後、細胞系１つ毎に手作業により画定した。ＤＮＡチャネルにおいて対象物／核の１７の追加的な特徴（形状および強度特徴）を分析することによって、細片／断片化核を確認した。このため、細胞系１つ毎に、陽性対照（スタウロスポリン）と陰性対照（ＤＭＳＯ）の追的な特徴の分布を、手作業により比較した。条件によって差が生じうる特徴（例えば、ＤＭＳＯとスタウロスポリンとを比較した特徴測定分布におけるシフト）を、「生存」核の集団に対して「細片」集団を画定するために使用した。細片計数を生の核計数から差し引いた。得られる核の数を、細胞増殖の測度（「細胞計数」）として使用した。
【０１２１】
細胞増殖に対する化合物の効果を、陰性対照（ＤＭＳＯ）の細胞計数に対する処理細胞計数から計算し、図１および２では、ｙ軸に「正規化細胞計数」と示されている。アイソボログラム分析（Greco, Bravo et al. 1995）（図３）、およびＬｏｅｗｅモデル（Loewe 1928）で相乗作用について試験する組み合わせ指数の計算（Chou, Talalay 198）（表２）によって、組み合わせ物の相乗作用を評価した。ＣＩ分析は、７５％等効果レベル（単剤処理で、組み合わせ処理に比べて７５％の阻害）について行った。「最良ＣＩ」（図３における赤い点および表２）は、特定の細胞系における、この組み合わせ物について認められた最低の組み合わせ指数である。
【０１２２】
組み合わせ指数（ＣＩ）は、
ＣＩ＜１：相乗作用
ＣＩ＝１：相加効果
ＣＩ＞１：拮抗作用
とされる、組み合わせ効果の指標であり、例えば、０．５の組み合わせ指数は、組み合わせ物において、同じ効果（ここでは、７５％阻害）に達するのに必要となる単独での単剤用量に比べて、各単剤の半分しか必要とならないことを示す。
【０１２３】
ＩＣ７５は、ＤＭＳＯに対して７５％の細胞計数が得られる化合物濃度である。ＩＣ７５の算出（表２を参照されたい）は、データにおいて３パラメーターロジスティック回帰を実施することにより行った。
【０１２４】
【表２】
2018528206.tif 000011
【０１２５】
アポトーシスに対する化合物の効果は、生の細胞計数（細片を差し引く前）と比べた、処理および時点毎の活性化カスパーゼ３／７を有する細胞のパーセンテージを計算することによって決定した（図４のｙ軸）。実験的に測定しなかった時点の細胞計数は、０日目および処理終了時の対数変換細胞計数に線形モデルを当てはめる（指数関数的な細胞成長を推定する）回帰分析によって得た。
【０１２６】
コロニー形成アッセイ（図５）では、１２ウェルの組織培養処理済プレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３５１３）において、ＣＯＬＯ−６７８については６０００細胞／ウェル、ＳＷ４８については５０００細胞／ウェル、ＧＰ２ｄについては２０００細胞／ウェル、ＬｏＶｏについては２５００細胞／ウェル、ＬＳ−１８０については２５００細胞／ウェル、ＬＩＭ２４０５については２５００細胞／ウェル、ＲＫＯについては１０００細胞／ウェル、およびＨＣＴ−１１６については１０００細胞／ウェルで、１ｍｌの培地に細胞を播いた。細胞を７２時間成長させた後、化合物を加え、ＨＰ  Ｄ３００  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（Ｔｅｃａｎ）を使用して、１４日までの間４８時間毎に（新たな培地で）処理を更新した。処理終了時に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、固定し、４％のＰＦＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１５７１４）および２ｍｇ／ｍｌのクリスタルバイオレット（ＥＭＤ、カタログ番号１９２−１２）を含有する溶液を使用して室温で３０分間染色し、水で３回洗浄した。プレートを終夜乾燥させ、Ｏｄｙｓｓｅｅ  ｉｍａｇｅｒ（Ｌｉｃｏｒ）を使用して走査した。ＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏソフトウェア（Ｌｉｃｏｒ）を使用して、図５のクリスタルバイオレットシグナルを定量化した。有意性検定については、表３を参照されたい。
【０１２７】
【表３】
2018528206.tif 000012
【０１２８】
細胞周期分析（図６）では、１０ｃｍの組織培養処理済ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４３０１６７）において、ＣＯＬＯ−６７８については３５０万細胞、ＳＷ４８については２７５万細胞、ＧＰ２ｄについては２５０万細胞、ＬｏＶｏについては２５０万細胞、ＬＳ−１８０については２５０万細胞、ＬＩＭ２４０５については１５０万細胞、ＲＫＯについては１５０万細胞、およびＨＣＴ−１１６については２００万細胞を１０ｍｌの培地に播いた。２４時間後に、薬物処理を手作業で行った。処理から２４時間後に、上清を集め、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号２５２００）を使用するトリプシン処理によって細胞を回収することにより、試料を採取した。細胞を播き、ＰＢＳで１回洗浄し、再びペレット化した後、（ボルテックス撹拌しながらペレットに滴下した）１ｍｌの氷冷７０％エタノール中にて４℃で３０分間固定した。次に、細胞をより高速（８５０×ｇ）で５分間ペレット化し、ペレットをリン酸−クエン酸緩衝液（０．２ＭのＮＡ２ＨＰＯ４、０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ７．８に調整）において２回洗浄し、同じ速度で（５分間）遠心分離した。最後にペレットを０．５ｍｌのＰＩ／ＲＮａｓｅ染色用緩衝液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５０８２５）に溶解させた。室温で１５分間インキュベートした後、（１条件あたり１０，０００事象を分析する）ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩシステムで細胞周期を分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータを解析した。
【０１２９】
ウエスタンブロット（図７）では、１０ｃｍの組織培養処理済ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４３０１６７）において、ＣＯＬＯ−６７８については８００万細胞、ＳＷ４８については４００万細胞、ＧＰ２ｄについては３００万細胞、ＬｏＶｏについては４００万細胞、ＬＳ−１８０については４５０万細胞、ＬＩＭ２４０５については２００万細胞、ＲＫＯについては３５０万細胞、およびＨＣＴ−１１６については３５０万細胞を１０ｍｌの培地に播いた。細胞を２４時間成長させた後、化合物を加えた。２４時間の処理後、細胞を掻き落として氷冷ＰＢＳ中に集め、ホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４９０６８３７００１）およびプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４６９３１１６００１）を含有する溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号９８０３）中で３０分間溶解させた。可溶化液を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２３２２５）を使用して定量化し、濃度を標準化し、添加用緩衝液を加え（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＮＰ０００７）、２５〜５０ｕｇのタンパク質を、予め成形された４〜１５％のポリアクリルアミド勾配ゲル（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号５６７１０８４）に載せ、電気泳動システム（Ｂｉｏｒａｄ）において３００Ｖで３０〜３５分間泳動させた。ｉＢｌｏｔ転写システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｉＢｌｏｔＧｅｌ転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＩＢ３０１００１）を使用して、タンパク質をニトロセルロース膜に移した。図５に示すタンパク質を、次の一次抗体：ｐ５３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−１２６、１：５００）、ＭＤＭ２（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、＃ＯＰ４６、１：５００）、ＥＲＫ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃４６９５、１：１０００）、ｐＥＲＫ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＃４３７０、１：１０００）、ｐ２１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃２９４７、１：１０００）、ｐ２７（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−５２８、１：５００）、ＣｙｃｌｉｎＤ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−７１８、１：５００）、ＢＩＭ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃２８１９、１：５００）、ｃＰＡＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃９５４１、１：５００）、ＰＵＭＡ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃４９７６、１：５００）、およびβ−アクチン（Ａｍｂｉｏｎ、ＡＭ４３０２、１：１００００）を使用して検出した。次の二次抗体を使用した。ＨＲＰヤギ抗ウサギ（Ｂｉｏｒａｄ、１７０−５０４６、１：１００００）、ＨＲＰヤギ抗マウス（Ｂｉｏｒａｄ、１７０−５０４７、１：１００００）、およびＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷヤギ抗マウス（Ｌｉｃｏｒ、９２５−３２２１０、１：１００００）。膜を現像機（Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴ  ２０００Ａ）でフィルム（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ、カタログ番号１７８  ８２０７）に現像し、または（β−アクチ���については）Ｏｄｙｓｓｅｅ  ｉｍａｇｅｒ（Ｌｉｃｏｒ）で画像処理した。
【０１３０】
ｑＲＴ−ＰＣＲ分析（図８）では、６ウェル組織培養処理済プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５１６）において、ＣＯＬＯ−６７８については７５万細胞、ＳＷ４８については５０万細胞、ＧＰ２ｄについては４０万細胞、ＬｏＶｏについては４０万細胞、ＬＳ−１８０については４０万細胞、ＬＩＭ２４０５については２５万細胞、ＲＫＯについては２５万細胞、ＨＣＴ−１１６については３０万細胞を播いた。２４時間後に、薬物処理を手作業で行った。処理から１０時間後に試料を採取した。上清を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いで、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１０４）を使用してＲＮＡを抽出した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００を使用してＲＮＡを定量化し、合計１μｇのＲＮＡを、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１７０−８８９１）を使用するｃＤＮＡ合成に使用した。Ｔａｑｍａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲを、３８４ウェルプレートにおいてＡＢＩ  ＶｉｉＡ  ７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって実施した。反応あたり、６μｌの２×ＰＣＲマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号４３５  ２０４２）、０．６μｌのβ−アクチンプライマー／プローブセット（２０×）、０．６μｌの標的プライマー／プローブセット（２０×）、および４．８μｌのｃＤＮＡ（ｃＤＮＡ合成からの生成物の１：４希釈物）。次のプログラムを実施した：５０℃で２分、９５℃で１０分、ならびに９５℃で１０秒および６０℃で１分を４０サイクル。次のプローブ／プライマーセット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ）を使用した：ＣＤＫＮ１Ａ／ｐ２１（Ｈｓ００３５５７８２＿ｍ１）、ＢＡＸ（Ｈｓ００１８０２６９＿ｍ１）、ＢＢＣ３／ＰＵＭＡ（Ｈｓ００２４８０７５＿ｍ１）、ＢＭＦ（Ｈｓ００３７２９３７＿ｍ１）、ＮＯＸＡ１（Ｈｓ００７３６６９９＿ｍ１）。
【０１３１】
結果
この報告では、２種のＭＤＭ２阻害剤（化合物Ａおよび化合物Ｂ）およびＭＥＫ阻害剤トラメチニブ（化合物Ｃ）の有効性を、合計で８種のＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系において、個別および組み合わせにより評価した。細胞系の５種は、ＫＲＡＳ突然変異体（ＧＰ２ｄ、ＬＳ−１８０、ＨＣＴ−１１６、ＬｏＶｏ、ＣＯＬＯ−６７８）であり、細胞系の２種は、ＢＲＡＦ突然変異体（ＲＫＯ、ＬＩＭ２４０５）であり、１種の細胞系は、ＭＥＫ１の突然変異体（ＳＷ４８）であった。細胞系の４種は、ＰＩＫ３ＣＡについての突然変異体（ＧＰ２ｄ、ＲＫＯ、ＬＳ−１８０、ＨＣＴ−１１６）でもあった（表１）。化合物Ａは、単剤として、マイクロモル未満からマイクロモルのＩＣ７５値により、化合物Ｂは、（ＣＯＬＯ−６７８を除いて）マイクロモル未満のＩＣ７５値により、化合物Ｃは、（ＣＯＬＯ−６７８、ＲＫＯ、およびＧＰ２ｄを除いて）ナノモルのＩＣ７５値により、全ての細胞系の成長を阻害した（図１および２、表２）。組み合わせ処理では、組み合わせ指数（ＣＩ）が示すとおり、試験した全ての細胞モデルにおいて、相乗的な阻害を（Ｌｏｅｗｅモデルに従って）引き起こした（図３および表２）。さらなる機序研究では、化合物Ａのトラメチニブとの組み合わせ物に焦点を当てた。組み合わせ物は、アポトーシスの弱い誘発（カスパーゼ３／７誘発を測定することにより評価したもの）を示した（図４）。コロニー形成アッセイでは、組み合わせ物によって、クローンの増殖が、単剤それぞれより有意に良好に妨げられ、組み合わせ物の長期有効性も示された（図５および表３）。２４時間の処理後にＦＡＣＳ分析を行い、ＭＤＭ２阻害によって、細胞周期のＳ期の細胞が激減し、Ｇ１および／またはＧ２期の細胞が阻止されたことが示された（図６）。ＭＥＫ阻害に対する応答は、より細胞系依存的であったが、モデルの大半で、これによりＧ１集団が増加する結果となった。組み合わせ物は、主として、Ｓ期の激減を示し、８つのうち５つのモデルにおいて、細胞死を示唆するｓｕｂ−Ｇ１集団の増加も示した。組み合わせ処理後の細胞周期停止および細胞死において役割を果たした要素を突き止めるために、本発明者らは、細胞周期およびアポトーシスの調節因子のウエスタン（２４時間の処理後）およびｑＰＣＲ（１０時間の処理後）分析を行った（図７および８）。ウエスタンおよびｑＰＣＲの結果から、ＭＤＭ２阻害後のＧ１停止は、ｐ２１（ＣＤＫＮ１Ａ）が誘導されたためであったことが示唆された。試験したモデルの一部では、ＭＥＫ阻害によってｐ２７タンパク質（ＣＤＫＮ１Ｂ）が誘導されており（図７のウエスタンを参照されたい）、これにより、組み合わせ物において細胞周期停止が強まった可能性もありうる。ＭＤＭ２阻害によって、アポトーシス促進因子ＰＵＭＡおよびＢＡＸ（図７）の発現が転写的に誘発されており、ＰＵＭＡの誘導は、ウエスタン（図８）でも確認された。ＭＥＫ阻害によって、アポトーシス促進タンパク質ＢＩＭのレベルの上昇が示され（図７）、アポトーシス促進因子ＢＭＦおよびＮＯＸＡ１の発現が転写的に増加した（図８）。まとめると、薬物組み合わせ物においてこうした遺伝子およびタンパク質が誘導されたことで、ＣＯＬＯ−６７８以外の全てのモデルで組み合わせ物においてＰＡＲＰ切断（ｃＰＡＲＰ）の増加が認められたことの説明がつけられることになる（図７）。ｃＰＡＲＰは、アポトーシスの誘導の指標である。
【０１３２】
結論
結論として、データから、ＭＤＭ２とＭＥＫを組み合わせた阻害によって、補完的な細胞周期停止タンパク質のセットが調節されて（ｐ２１およびｐ２７誘導）、Ｇ１および／またはＧ２細胞周期停止が誘発され、アポトーシス促進タンパク質が調節されて（例えば、ＢＡＸ、ＢＩＭ、およびＰＵＭＡの誘導）、アポトーシスによる細胞死が誘発された可能性があることが示唆された。ＴＰ５３野生型結腸直腸がんにおけるＭＤＭ２とＭＥＫを組み合わせた阻害は、それぞれの単剤と比較して改善された応答が可能である有効な治療様式を提供し、臨床においてより長続きする応答をもたらすことができる。
【実施例２】
【０１３３】
ＭＤＭ２阻害剤およびＭＥＫ阻害剤をＢｃｌ２阻害剤と組み合わせることの増殖に対するインビトロ効果
この研究は、ＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系において、ＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ａ）およびＭＥＫ阻害剤トラメチニブ（化合物Ｂ）をＢＣＬ−２／−ＸＬ阻害剤ナビトクラックス（ＡＢＴ−２６３）（化合物Ｃ）と組み合わせることの増殖に対するインビトロ効果を調査するように設計された。
【０１３４】
方法
化合物Ａ、Ｂ、およびＣを１００％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ２６５０）に２０ｍＭの濃度で溶解させ、使用するまで−２０℃で保存した。化合物を薬物マスタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号７８８８７６）に配置し、２０００×の濃度で、３倍に連続希釈（７ステップ）した。
【０１３５】
この研究に使用した結腸直腸がん細胞系は、商業的供給者のＡＴＣＣ、およびＥＣＡＣＣから得て、培養し、処理した（表４）。全ての細胞系培地を、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００７１．０３）で補充した。
【０１３６】
【表４】
2018528206.tif 000013
【０１３７】
細胞系を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターにおいて培養し、Ｔ−７５フラスコ中に増やした。全ての場合において、細胞は、凍結貯蔵物から解凍し、１：３希釈を使用して≧１回以上の継代によって増やし、播く前に、ＶｉＣｅｌｌ計測器（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して計数し、生存度について評価した。細胞系を分け、増やすために、細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号２５２００）を使用して、フラスコから取り除いた。Ｉｄｅｘｘ  Ｒａｄｉｌ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＯ，ＵＳＡ）において実施したＰＣＲ検出法によって確認し、ＳＮＰパネルの検出によって正確に鑑定したところ、全ての細胞系が、マイコプラスマ汚染なしと判定された。
【０１３８】
化合物Ａと化合物Ｂと化合物Ｃを組み合わせることの細胞増殖に対する効果を試験するために、底が透明の黒色３８４ウェルマイクロプレート（Ｍａｔｒｉｘ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４３３２）において、ウェル１つあたり５０ｕｌの培地に、５００〜１２５０細胞／ウェルの細胞密度で細胞を播き（表４）、３７度、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞系１つあたり１つの３８４ウェルプレートを、処理を受けることなく、顕微鏡検査法（以下を参照されたい）による細胞計数用に準備した（＝「ベースライン」）。他の細胞プレートは、ＡＴＳ音響液体分配器（ＥＣＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の使用により、薬物マスタープレートから２５ｎｌの２０００×化合物を移し、最終濃度を１×とすることにより処理した。化合物Ａは、１３ｎＭ〜１０μＭの最終濃度範囲で使用し、化合物Ｂは、１３ｎＭ〜１０ｕＭの最終濃度範囲で使用し、化合物Ｃは、０．４ｎＭ〜０．３μＭの最終濃度範囲で使用した（７段階の１：３希釈ステップ）。三種組み合わせ物の効果を評価するために、個々の全ての化合物（Ａ、Ｂ、Ｃ）、３通りの全ての対組み合わせ物（Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ）、および三種組み合わせ物（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）を同じ実験で試験した。対組み合わせ物および三種組み合わせ物を、各希釈度において、（薬物対については）１：１および（薬物３種組については）１：１：１の固定比で試験した結果、処理あたり７つの組み合わせ条件となった。加えて、陰性対照（ＤＭＳＯ＝「ビヒクル」）および陽性対照（スタウロスポリン＝細胞死滅、１６ｎｍ〜１ｕＭの用量範囲について７段階の１：２連続希釈）を処理対照として移し、試験した細胞系において有効性のない化合物を化合物Ａおよび化合物Ｂと組み合わせて組み合わせ対照（より有効な単剤の有効性を越えない組み合わせ物＝「非相互作用」組み合わせ物）として使用した。化合物を添加した後、ＨＰ  Ｄ３００  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（Ｔｅｃａｎ）を使用して、５０ｎｌの２ｍＭのＣｅｌｌＥｖｅｎｔ  カスパーゼ３／７緑色検出試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ１０４２３）を、３回の複製のうち１回に加えた。カスパーゼ３／７誘発を、処理により誘発されたアポトーシスの代理として測定した。細胞をその倍加時間に応じて７２〜９６時間処理し（表４）、４×対物レンズおよびＦＩＴＣ励起／発光フィルターを備えたＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する顕微鏡検査法によって、カスパーゼ３／７活性化を２４時間毎に測定した。処理終了時に、顕微鏡検査法による細胞計数に向けて細胞を調製した。細胞を、ＰＢＳ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号ＢＭ−２２０）中の４％のＰＦＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１５７１４）、０．１２％のＴＸ−１００（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２２１４０）において、４５分間にわたって固定および透過処理した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、それらのＤＮＡをＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｈ３５７０��により最終濃度４μｇ／ｍｌで３０分間染色した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次にプレートをＰｌａｔｅＬｏｃ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用によりアルミニウムシール（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０６６４４−００１）でヒートシールし、画像化するまで４℃で保存した。ウェル／処理毎の全ての細胞を、４×対物レンズおよびＤＡＰＩ励起／発光フィルターを備えたＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する蛍光顕微鏡検査法により単一画像を撮った。
【０１３９】
以前に記載された方法（Horn, Sandmann et al. 2011）を適用し、ＲのＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＥＢＩｍａｇｅ（Pau, Fuchs et al. 2010）を使用した後、画像を分析した。両方のチャネルにおける対象物、ＤＡＰＩ（Ｈｏｅｃｈｓｔ／ＤＮＡ用）およびＦＩＴＣ（カスパーゼ３／７用）を適適応閾値化により別々にセグメント化し、計数した。カスパーゼ３／７陽性対象物の閾値は、陰性対照（ＤＭＳＯ）と陽性対照（スタウロスポリン）とを比較した後、細胞系１つ毎に手作業により画定した。ＤＮＡチャネルにおける対象物／核の１７の追加的な特徴（形状および強度特徴）を分析することによって、細片／断片化核を確認した。このため、細胞系１つ毎に、陽性対照（スタウロスポリン）と陰性対照（ＤＭＳＯ）における追加的な特徴の分布を、手作業により比較した。条件によって差が生じうる特徴（例えば、ＤＭＳＯとスタウロスポリンとを比較した特徴測定分布におけるシフト）を、「生存」核の集団に対して「細片」集団を画定するために使用した。細片計数を、生の核計数から差し引いた。得られる核の数を細胞増殖の測度（「細胞計数」）として使用した。
【０１４０】
細胞増殖に対する化合物の効果を、陰性対照（ＤＭＳＯ）の細胞計数に対する処理の細胞計数から計算し、図９では、ｙ軸に「正規化細胞計数」（＝「ｘｎｏｒｍ」）と示されている。相乗的組み合わせ物は、帰無仮説の最高単剤モデル（ＨＳＡ）（Berenbaum 1989）を使用して確認した。ＨＳＡモデルにおける超過から、阻害標的間の機能的な繋がりが予測される（Lehar, Zimmermann et al. 2007、Lehar, Krueger et al. 2009）。モデルの入力は、薬物用量毎の阻害値とした。
Ｉ＝１−ｘｎｏｒｍ
Ｉ：阻害
ｘｎｏｒｍ：正規化細胞計数（３回の複製の中央値）
【０１４１】
組み合わせ処理のあらゆる用量点において、組み合わせ物の阻害と２種の単剤のより強力な方の阻害との差を計算した（＝残差モデル）。同様に、あらゆる用量点における三種組み合わせ物の相乗作用を評価するために、薬物３種組による阻害と最強の薬物対による阻害の差も計算した。高い阻害での組み合わせ効果に有利とするために、残差には、同じ用量点で観察された阻害を加重した。薬物組み合わせ物の総合的組み合わせスコアＣは、全ての濃度の加重残差の合計である。
Ｃ＝Σ濃度（Ｉデータ＊（Ｉデータ−Ｉモデル））
Ｉデータ：測定阻害値
Ｉモデル：ＨＳＡ帰無仮説による阻害値
【０１４２】
堅牢な組み合わせｚ−スコア（ｚＣ）を、処理の組み合わせスコアＣと、非相互作用組み合わせ物の中央絶対偏差（ｍａｄ）との比として計算した。
ｚＣ＝Ｃ／ｍａｄ（Ｃゼロ）
Ｃゼロ：非相互作用組み合わせ物の組み合わせスコア
ｚＣは、組み合わせ物の強さの指標である。
ｚＣ≧３：相乗作用
３＞ｚＣ≧２：弱い相乗作用
ｚＣ＜２：相乗作用なし
【０１４３】
ＩＣ５０は、ＤＭＳＯに対して５０％の細胞計数をもたらす化合物濃度である。ＩＣ５０の計算（表５を参照されたい）は、ＲのＤＲＣパッケージ（Ritz and Streibig 2005）を使用し、データに４−パラメーター対数ロジスティック関数を当てはめて行った。
【０１４４】
アポトーシスに対する化合物の効果は、生の細胞計数（細片を差し引く前）と比べた、処理および時点毎の活性化カスパーゼ３／７を有する細胞のパーセンテージを計算することによって決定した（図１０のｙ軸）。実験的に測定しなかった時点の細胞計数は、０日目および処理終了時の対数変換細胞計数に線形モデルを当てはめる（指数関数的な細胞成長を想定する）回帰分析によって得た。
【０１４５】
【表５】
2018528206.tif 000014
【０１４６】
結果
この報告では、ＭＤＭ２阻害剤（化合物Ａ）、ＭＥＫ阻害剤（トラメチニブ、化合物Ｂ）、およびＢＣＬ−２／−ＸＬ阻害剤（ＡＢＴ−２６３、化合物Ｃ）の有効性を、合計で５種のＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系において、個別およびまた組み合わせにより評価した。細胞系の４種は、ＫＲＡＳ突然変異体（ＧＰ２ｄ、ＬＳ−１８０、ＨＣＴ−１１６、ＬｏＶｏ）であり、１種の細胞系は、ＢＲＡＦ突然変異体（ＲＫＯ）であった（表４）。化合物Ａは、単剤として、マイクロモル未満からマイクロモルのＩＣ５０値により、細胞系の成長を阻害した。化合物Ｂは、単剤として、ナノモルのＩＣ５０値により、１種（ＧＰ２ｄ）を除いて全ての細胞系の成長を阻害したが、化合物Ｃは、単剤の有効性を示さなかった（図９および表５）。三種組み合わせ物（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）では、試験した５種のうち２種の細胞モデルにおいて、薬物対を上回る相乗的な阻害を（ＨＳＡモデルに従って）引き起こした（表５）。三種組み合わせ物は、細胞系の４種（ＧＰ２ｄ、ＨＣＴ−１１６、ＲＫＯ、ＬｏＶｏ）において、対組み合わせ物に比べてより強いアポトーシス（カスパーゼ３／７誘発を測定することにより評価したもの）を示した（図１０）。
【０１４７】
結論
まとめると、ＴＰ５３野生型ＣＲＣにおけるＭＤＭ２とＭＥＫとＢＣＬ−２／−ＸＬとを組み合わせた阻害は、それぞれの単剤と比較して改善された応答が可能である有効な治療様式を提供し、臨床においてより長続きする応答をもたらすことができる。
【０１４８】
加えて、（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ａ）およびＭＥＫ阻害剤トラメチニブ（化合物Ｂ）のＢＣＬ−２／−ＸＬ阻害剤ナビトクラックス（ＡＢＴ−２６３）（化合物Ｃ）との組み合わせ物に、ＰＩ３Ｋ阻害剤（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミドを加えて四種組み合わせ物とし、１種のＫＲＡＳ突然変異体細胞系において一緒に試験しており、相乗性は弱く（ＬＳ−１８０、組み合わせｚ−スコア２．６３）、アポトーシスを強力に誘発する（最大６１％）こともわかった。
【実施例３】
【０１４９】
ＭＤＭ２阻害剤およびＭＥＫ阻害剤をＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせることの増殖に対するインビトロ効果
この研究は、ＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系において、ＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ａ）およびＭＥＫ阻害剤トラメチニブ（化合物Ｂ）をＥＧＦＲ阻害剤エルロチニブ（化合物Ｃ）と組み合わせることの増殖に対するインビトロ効果を調査するように設計された。
【０１５０】
方法
化合物Ａ、Ｂ、およびＣを１００％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ２６５０）に２０ｍＭの濃度で溶解させ、使用するまで−２０℃で保存した。化合物を薬物マスタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号７８８８７６）に配置し、２０００×の濃度で、３倍に連続希釈（７ステップ）した。
【０１５１】
この研究に使用した結腸直腸がん細胞系は、商業的供給者のＡＴＣＣ、およびＥＣＡＣＣから得て、培養し、処理した（表６）。全ての細胞系培地を、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００７１．０３）で補充した。
【０１５２】
【表６】
2018528206.tif 000015
【０１５３】
細胞系を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターにおいて培養し、Ｔ−７５フラスコ中に増やした。全ての場合において、細胞は、凍結貯蔵物から解凍し、１：３希釈を使用して≧１回以上の継代によって増やし、播く前に、ＶｉＣｅｌｌ計測器（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して計数し、生存度について評価した。細胞系を分け、増やすために、細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号２５２００）を使用して、フラスコから取り除いた。Ｉｄｅｘｘ  Ｒａｄｉｌ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＯ，ＵＳＡ）において実施したＰＣＲ検出法によって確認し、ＳＮＰパネルの検出によって正確に鑑定したところ、全ての細胞系が、マイコプラスマ汚染なしと判定された。
【０１５４】
化合物Ａと化合物Ｂと化合物Ｃを組み合わせることの細胞増殖に対する効果を試験するために、底が透明の黒色３８４ウェルマイクロプレート（Ｍａｔｒｉｘ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４３３２）において、ウェル１つあたり５０ｕｌの培地に、５００〜１２５０細胞／ウェルの細胞密度で細胞を播き（表６）、３７度、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞系１つあたり１つの３８４ウェルプレートを、処理を受けることなく、顕微鏡検査法（以下を参照されたい）による細胞計数用に準備した（＝「ベースライン」）。他の細胞プレートは、ＡＴＳ音響液体分配器（ＥＣＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の使用により、薬物マスタープレートから２５ｎｌの２０００×化合物を移し、最終濃度を１×とすることにより処理した。化合物Ａは、１３ｎＭ〜１０ｕＭの最終濃度範囲で使用し、化合物Ｂは、１３ｎＭ〜１０ｕＭの最終濃度範囲で使用し、化合物Ｃは、１３ｎＭ〜１０μＭの最終濃度範囲で使用した（７段階の１：３希釈ステップ）。三種組み合わせ物の効果を評価するために、個々の全ての化合物（Ａ、Ｂ、Ｃ）、３通りの全ての対組み合わせ物（Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ）、および三種組み合わせ物（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）を同じ実験で試験した。対組み合わせ物および三種組み合わせ物を、各希釈度において、（薬物対については）１：１および（薬物３種組については）１：１：１の固定比で試験した結果、処理あたり７つの組み合わせ条件となった。加えて、陰性対照（ＤＭＳＯ＝「ビヒクル」）および陽性対照（スタウロスポリン＝細胞死滅、１６ｎｍ〜１ｕＭの用量範囲について７段階の１：２連続希釈）を処理対照として移し、試験した細胞系において有効性のない化合物を化合物Ａおよび化合物Ｂと組み合わせて組み合わせ対照（より有効な単剤の有効性を越えない組み合わせ物＝「非相互作用」組み合わせ物）として使用した。化合物を添加した後、５０ｎｌの２ｍＭ  ＣｅｌｌＥｖｅｎｔ  カスパーゼ３／７緑色検出試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ１０４２３）を、ＨＰ  Ｄ３００  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（Ｔｅｃａｎ）の使用により３回の複製のうちの１回に加えた。カスパーゼ３／７誘発を、処理により誘発されたアポトーシスの代理として測定した。細胞をその倍加時間に応じて７２〜９６時間処理し（表６）、カスパーゼ３／７活性化を、４×対物レンズおよびＦＩＴＣ励起／発光フィルターを備えたＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する顕微鏡検査法により２４時間毎に測定した。処理終了時に、細胞を顕微鏡検査法による細胞計数に向けて調製した。細胞を、ＰＢＳ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号ＢＭ−２２０）中の４％のＰＦＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１５７１４）、０．１２％のＴＸ−１００（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２２１４０）において、４５分間にわたって固定および透過処理した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、それらのＤＮＡをＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｈ３５７０）に��り最終濃度４μｇ／ｍｌで３０分間染色した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次にプレートをＰｌａｔｅＬｏｃ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用によりアルミニウムシール（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０６６４４−００１）でヒートシールし、画像化するまで４℃で保存した。ウェル／処理毎の全ての細胞を、４×対物レンズおよびＤＡＰＩ励起／発光フィルターを備えたＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する蛍光顕微鏡検査法により単一画像を撮った。
【０１５５】
以前に記載された方法（Horn, Sandmann et al. 2011）を適用し、ＲのＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＥＢＩｍａｇｅ（Pau, Fuchs et al. 2010）を使用した後、画像を分析した。両方のチャネルにおける対象物、ＤＡＰＩ（Ｈｏｅｃｈｓｔ／ＤＮＡ用）およびＦＩＴＣ（カスパーゼ３／７用）を適応閾値化により別々にセグメント化し、計数した。カスパーゼ３／７陽性対象物の閾値は、陰性対照（ＤＭＳＯ）と陽性対照（スタウロスポリン）とを比較した後、細胞系１つ毎に手作業により画定した。ＤＮＡチャネルにおいて対象物／核の１７の追加的特徴（形状および強度特徴）を分析することによって、細片／断片化核を確認した。このため、細胞系１つ毎に、陽性対照（スタウロスポリン）と陰性対照（ＤＭＳＯ）における追加的な特徴の分布を、手作業により比較した。条件によって差が生じうる特徴（例えば、ＤＭＳＯをスタウロスポリンと比較した特徴測定分布におけるシフト）を、「生存」核の集団に対して「細片」集団を画定するために使用した。細片計数を、生の核計数から差し引いた。得られる核の数を、細胞増殖の測度（「細胞計数」）として使用した。
【０１５６】
細胞増殖に対する化合物の効果を、陰性対照（ＤＭＳＯ）の細胞計数に対する処理細胞計数から計算し、図１１では、ｙ軸に「正規化細胞計数」（＝「ｘｎｏｒｍ」）と示されている。相乗的な組み合わせ物は、帰無仮説の最高単剤モデル（ＨＳＡ）（Berenbaum 1989）を使用して確認した。ＨＳＡモデルにおける超過から、阻害標的間の機能的な繋がりが予測される（Lehar, Zimmermann et al. 2007、Lehar, Krueger et al. 2009）。モデルの入力は、薬物用量あたりの阻害値とした。
Ｉ＝１−ｘｎｏｒｍ
Ｉ：阻害
ｘｎｏｒｍ：正規化細胞計数（３回の複製の中央値）
【０１５７】
組み合わせ処理のあらゆる用量点において、組み合わせ物による阻害と２種の単剤のより強力な方による阻害の差を計算した（＝残差モデル）。同様に、あらゆる用量点における三種組み合わせ物の相乗作用を評価するために、薬物３種組による阻害と最強の薬物対による阻害の差も計算した。高い阻害での組み合わせ効果に有利とするために、残差には、同じ用量点で観察された阻害を加重した。薬物組み合わせ物の全体的組み合わせスコアＣは、全ての濃度にかけての、加重残差の合計である。
Ｃ＝Σ濃度（Ｉデータ＊（Ｉデータ−Ｉモデル））
Ｉデータ：測定阻害値
Ｉモデル：ＨＳＡ帰無仮説による阻害値
【０１５８】
堅牢な組み合わせｚ−スコア（ｚＣ）を、処理の組み合わせスコアＣと、非相互作用組み合わせ物の絶対偏差の中央値（ｍａｄ）との比として計算した。
ｚＣ＝Ｃ／ｍａｄ（Ｃゼロ）
Ｃゼロ：非相互作用組み合わせ物の組み合わせスコア
ｚＣは、組み合わせ物の強さの指標である。
ｚＣ≧３：相乗作用
３＞ｚＣ≧２：弱い相乗作用
ｚＣ＜２：相乗作用なし
【０１５９】
ＩＣ５０は、ＤＭＳＯに対して５０％の細胞計数をもたらす化合物濃度である。ＩＣ５０の計算（表７を参照されたい）は、ＲのＤＲＣパッケージ（Ritz and Streibig 2005）を使用し、データに４−パラメーター対数ロジスティック関数を当てはめて行った。
【０１６０】
アポトーシスに対する化合物の効果は、生の細胞計数（細片を差し引く前）と比べた、処理および時点毎の活性化カスパーゼ３／７を有する細胞のパーセンテージを計算することによって決定した（図１２のｙ軸）。実験的に測定しなかった時点の細胞計数は、０日目および処理終了時の対数変換細胞計数に線形モデルを当てはめる（指数関数的な細胞成長を推定する）回帰分析によって得た。
【０１６１】
【表７】
2018528206.tif 000016
【０１６２】
結果
この報告では、ＭＤＭ２阻害剤（化合物Ａ）、ＭＥＫ阻害剤（トラメチニブ、化合物Ｂ）、およびＥＧＦＲ阻害剤（エルロチニブ、化合物Ｃ）の有効性を、合計で５種のＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系において、個別および組み合わせにより評価した。細胞系の４種は、ＫＲＡＳ突然変異体（ＧＰ２ｄ、ＬＳ−１８０、ＨＣＴ−１１６、ＬｏＶｏ）であり、１種の細胞系は、ＢＲＡＦ突然変異体（ＲＫＯ）であった（表６）。化合物Ａは、単剤として、マイクロモル未満からマイクロモルのＩＣ５０値により、細胞系の成長を阻害した。化合物Ｂは、単剤として、ナノモルのＩＣ５０値により、１種（ＧＰ２ｄ）を除く全ての細胞系の成長を阻害したが、化合物Ｃは、５種のうち４種の細胞系で単剤の有効性を示さず、ＫＲＡＳ突然変異体ＬｏＶｏにおいてマイクロモルのＩＣ５０を示した（図１１および表７）。三種組み合わせ物（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）では、ＫＲＡＳ突然変異体モデルＬｏＶｏにおいて、薬物対を上回る弱い相乗的阻害を（ＨＳＡモデルに従って）引き起こした（表７）。この細胞系において、三種組み合わせ物は、対組み合わせ物に比べてより強いアポトーシス（カスパーゼ３／７誘発を測定することにより評価したもの）を示した（図１２）。
【０１６３】
結論
ＴＰ５３野生型ＣＲＣにおけるＭＤＭ２とＭＥＫとＥＧＦＲとを組み合わせた阻害は、それぞれの単剤と比較して改善された応答が可能である有効な治療様式を提供し、臨床においてより長続きする応答をもたらすことができる。
【実施例４】
【０１６４】
ＰＩ３Ｋ阻害剤およびＭＤＭ２阻害剤をＢｃｌ２阻害剤と組み合わせることの増殖に対するインビトロ効果
この研究は、ＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系において、ＰＩＫ３ＣＡ阻害剤（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（化合物Ａ）およびＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ｂ）をＢＣＬ−２／−ＸＬ阻害剤ナビトクラックス（ＡＢＴ−２６３）（化合物Ｃ）と組み合わせることの増殖に対するインビトロ効果を調査するように設計された。
【０１６５】
方法
化合物Ａ、Ｂ、およびＣを１００％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ２６５０）に２０ｍＭの濃度で溶解させ、使用するまで−２０℃で保存した。化合物を薬物マスタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号７８８８７６）に配置し、２０００×の濃度で、３倍に連続希釈（７ステップ）した。
【０１６６】
この研究に使用した結腸直腸がん細胞系は、商業的供給者のＡＴＣＣ、およびＥＣＡＣＣから得て、培養し、処理した（表８）。全ての細胞系培地を、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００７１．０３）で補充した。
【０１６７】
【表８】
2018528206.tif 000017
【０１６８】
細胞系を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターにおいて培養し、Ｔ−７５フラスコ中に増やした。全ての場合において、細胞は、凍結貯蔵物から解凍し、１：３希釈を使用して≧１回以上の継代によって増やし、播く前に、ＶｉＣｅｌｌ計測器（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して計数し、生存度について評価した。細胞系を分け、増やすために、細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号２５２００）を使用して、フラスコから取り除いた。Ｉｄｅｘｘ  Ｒａｄｉｌ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＯ，ＵＳＡ）において実施したＰＣＲ検出法によって確認し、ＳＮＰパネルの検出によって正確に鑑定したところ、全ての細胞系が、マイコプラスマ汚染なしと判定された。
【０１６９】
化合物Ａと化合物Ｂと化合物Ｃを組み合わせることの細胞増殖に対する効果を試験するために、底が透明の黒色３８４ウェルマイクロプレート（Ｍａｔｒｉｘ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４３３２）において、ウェル１つあたり５０ｕｌの培地に、５００〜１２５０細胞／ウェルの細胞密度で細胞を播き（表８）、３７度、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞系１つあたり１つの３８４ウェルプレートを、処理を受けることなく、顕微鏡検査法（以下を参照されたい）による細胞計数用に準備した（＝「ベースライン」）。他の細胞プレートは、ＡＴＳ音響液体分配器（ＥＣＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の使用により、薬物マスタープレートから２５ｎｌの２０００×化合物を移し、最終濃度を１×とすることにより処理した。化合物Ａは、１３ｎＭ〜１０ｕＭの最終濃度範囲で使用し、化合物Ｂは、１３ｎＭ〜１０ｕＭの最終濃度範囲で使用し、化合物Ｃは、１３ｎＭ〜１０μＭの最終濃度範囲で使用した（７段階の１：３希釈ステップ）。三種組み合わせ物の効果を評価するために、個々の全ての化合物（Ａ、Ｂ、Ｃ）、３通りの全ての対組み合わせ物（Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ）、および三種組み合わせ物（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）を同じ実験で試験した。対組み合わせ物および三種組み合わせ物を、各希釈度において、（薬物対については）１：１および（薬物３種組については）１：１：１の固定比で試験した結果、処理あたり７つの組み合わせ条件となった。加えて、陰性対照（ＤＭＳＯ＝「ビヒクル」）および陽性対照（スタウロスポリン＝細胞死滅、１６ｎｍ〜１ｕＭの用量範囲について７段階の１：２連続希釈）を処理対照として移し、試験した細胞系において有効性のない化合物を化合物Ａおよび化合物Ｂと組み合わせて組み合わせ対照（より有効な単剤の有効性を越えない組み合わせ物＝「非相互作用」組み合わせ物）として使用した。化合物を添加した後、５０ｎｌの２ｍＭ  ＣｅｌｌＥｖｅｎｔ  カスパーゼ３／７緑色検出試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ１０４２３）を、ＨＰ  Ｄ３００  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（Ｔｅｃａｎ）の使用により３回の複製のうちの１回に加えた。カスパーゼ３／７誘発を、処理により誘発されたアポトーシスの代理として測定した。細胞をその倍加時間に応じて７２〜９６時間処理し（表８）、カスパーゼ３／７活性化を、４×対物レンズおよびＦＩＴＣ励起／発光フィルターを備えたＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する顕微鏡検査法により２４時間毎に測定した。処理終了時に、細胞を顕微鏡検査法による細胞計数に向けて調製した。細胞を、ＰＢＳ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号ＢＭ−２２０）中の４％のＰＦＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１５７１４）、０．１２％のＴＸ−１００（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２２１４０）において、４５分間にわたって固定および透過処理した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、それらのＤＮＡをＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｈ３５７０）に��り最終濃度４μｇ／ｍｌで３０分間染色した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次にプレートをＰｌａｔｅＬｏｃ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用によりアルミニウムシール（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０６６４４−００１）でヒートシールし、画像化するまで４℃で保存した。ウェル／処理毎の全ての細胞を、４×対物レンズおよびＤＡＰＩ励起／発光フィルターを備えたＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する蛍光顕微鏡検査法により単一画像で撮った。
【０１７０】
以前に記載された方法（Horn, Sandmann et al. 2011）を適用し、ＲのＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＥＢＩｍａｇｅ（Pau, Fuchs et al. 2010）を使用した後、画像を分析した。両方のチャネルにおける対象物、ＤＡＰＩ（Ｈｏｅｃｈｓｔ／ＤＮＡ用）およびＦＩＴＣ（カスパーゼ３／７用）を、適応閾値化により別々にセグメント化し、計数した。カスパーゼ３／７陽性対象物の閾値は、陰性対照（ＤＭＳＯ）と陽性対照（スタウロスポリン）とを比較した後、細胞系１つ毎に手作業により画定した。ＤＮＡチャネルにおいて対象物／核の１７の追加的特徴（形状および強度特徴）を分析することによって、細片／断片化核を確認した。このため、細胞系１つ毎に、陽性対照（スタウロスポリン）と陰性対照（ＤＭＳＯ）の付加的な特徴の分布を、手作業により比較した。条件によって差が生じうる特徴（例えば、ＤＭＳＯとスタウロスポリンとを比較した特徴測定分布におけるシフト）、「生存」核の集団に対して「細片」集団を画定するために使用した。細片計数を、生の核計数から差し引いた。得られる核の数を、細胞増殖の測度（「細胞計数」）として使用した。
【０１７１】
細胞増殖に対する化合物の効果を、陰性対照（ＤＭＳＯ）の細胞計数に対する処理細胞計数から計算し、図１３では、ｙ軸に「正規化細胞計数」（＝「ｘｎｏｒｍ」）と示されている。相乗的組み合わせ物は、帰無仮説の最高単剤モデル（ＨＳＡ）（Berenbaum 1989）を使用して確認した。ＨＳＡモデルにおける超過から、阻害標的間の機能的な繋がりが予測される（Lehar, Zimmermann et al. 2007、Lehar, Krueger et al. 2009）。モデルの入力は、薬物用量毎の阻害値とした。
Ｉ＝１−ｘｎｏｒｍ
Ｉ：阻害
ｘｎｏｒｍ：正規化細胞計数（３回の複製の中央値）
【０１７２】
組み合わせ処理の全ての用量点において、組み合わせ物の阻害と２つの単剤のより強力な方の阻害との差を計算した（＝残差モデル）。同様に、全ての用量点における三種組み合わせ物の相乗作用を評価するために、薬物３種組の阻害と最強の薬物対の阻害の差も計算した。高い阻害での組み合わせ効果に有利とするために、残差には、同じ用量点で観察された阻害を加重した。薬物の組み合わせ物の総合的組み合わせスコアＣは、全ての濃度の加重残差の合計である。
Ｃ＝Σ濃度（Ｉデータ＊（Ｉデータ−Ｉモデル））
Ｉデータ：測定阻害値
Ｉモデル：ＨＳＡ帰無仮説による阻害値
【０１７３】
堅牢な組み合わせｚ−スコア（ｚＣ）を、処理の組み合わせスコアＣと、非相互作用組み合わせ物の絶対偏差の中央値（ｍａｄ）との比として計算した。
ｚＣ＝Ｃ／ｍａｄ（Ｃゼロ）
Ｃゼロ：非相互作用組み合わせ物の組み合わせスコア
ｚＣは、組み合わせ物の強さの指標である。
ｚＣ≧３：相乗作用
３＞ｚＣ≧２：弱い相乗作用
ｚＣ＜２：相乗作用なし
【０１７４】
ＩＣ５０は、ＤＭＳＯに対して５０％の細胞計数をもたらす化合物濃度である。ＩＣ５０の計算（表９を参照されたい）は、ＲのＤＲＣパッケージ（Ritz and Streibig 2005）を使用し、データに４−パラメーター対数ロジスティック関数を当てはめて行った。
【０１７５】
アポトーシスに対する化合物の効果は、生の細胞計数（細片を差し引く前）と比べた、処理および時点毎の活性化カスパーゼ３／７を有する細胞のパーセンテージを計算することによって決定した（図１４のｙ軸）。実験的に測定しなかった時点の細胞計数は、０日目および処理終了時に対数変換細胞計数に線形モデルを当てはめる（指数関数的な細胞成長を推定する）回帰分析によって得た。
【０１７６】
【表９】
2018528206.tif 000018
【０１７７】
結果
この報告では、ＰＩＫ３ＣＡ阻害剤（ＢＹＬ７１９、化合物Ａ）、ＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ｂ）、およびＢＣＬ−２／−ＸＬ阻害剤（ＡＢＴ−２６３、化合物Ｃ）の有効性を、合計で５種のＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系において、個別および組み合わせにより評価した。細胞系の４種は、ＫＲＡＳ突然変異体（ＧＰ２ｄ、ＬＳ−１８０、ＨＣＴ−１１６、ＬｏＶｏ）であり、１種の細胞系は、ＢＲＡＦ突然変異体（ＲＫＯ）であった。化合物Ａは、単剤として、マイクロモルのＩＣ５０値により、細胞系の２種の成長を阻害し、他の３種の細胞系では、最高用量（１０ｕＭ）でしか活性を示さなかった（図１３および表９）。化合物Ｂは、単剤として、マイクロモル未満からマイクロモルのＩＣ５０値により、細胞系の成長を阻害したが、化合物Ｃは、単剤の有効性を示さなかった（図１３および表９）。三種組み合わせ物（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）では、試験した５種のうち２種の細胞モデルにおいて、薬物対を上回る相乗的な阻害を（ＨＳＡモデルに従って）引き起こした（表９）。三種組み合わせ物は、細胞系の４つ（ＨＣＴ−１１６、ＬｏＶｏ、ＲＫＯ、ＬｏＶｏ）において、対組み合わせ物に比べてより強いアポトーシス（カスパーゼ３／７誘発を測定することにより評価したもの）を示した（図１４）。
【０１７８】
結論
まとめると、ＴＰ５３野生型ＣＲＣにおけるＰＩＫ３ＣＡとＭＤＭ２とＢＣＬ−２／−ＸＬとを組み合わせた阻害は、それぞれの単剤と比較して改善された応答が可能である有効な治療様式を提供し、臨床においてより長続きする応答をもたらすことができる。
【実施例５】
【０１７９】
ＭＤＭ２阻害剤とＢｃｌ２阻害剤を組み合わせることの増殖に対するインビトロ効果
この研究は、ＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系において、ＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ａ）とＢＣＬ−２／−ＸＬ阻害剤ナビトクラックス（ＡＢＴ−２６３）（化合物Ｃ）を組み合わせることの増殖に対するインビトロ効果を調査するように設計された。
【０１８０】
方法
化合物ＡおよびＢを１００％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ２６５０）に２０ｍＭの濃度で溶解させ、使用するまで−２０℃で保存した。化合物を薬物マスタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号７８８８７６）に配置し、２０００×の濃度で、３倍に連続希釈（７ステップ）した。
【０１８１】
この研究に使用した結腸直腸がん細胞系は、商業的供給者のＡＴＣＣ、およびＥＣＡＣＣから得て、培養し、処理した（表１０）。全ての細胞系培地を、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００７１．０３）で補充した。
【０１８２】
【表１０】
2018528206.tif 000019
【０１８３】
細胞系を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターにおいて培養し、Ｔ−７５フラスコ中に増やした。全ての場合において、細胞は、凍結貯蔵物から解凍し、１：３希釈を使用して≧１回以上の継代によって増やし、播く前に、ＶｉＣｅｌｌ計測器（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して計数し、生存度について評価した。細胞系を分け、増やすために、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号２５２００）を使用して、細胞をフラスコから取り除いた。Ｉｄｅｘｘ  Ｒａｄｉｌ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＯ，ＵＳＡ）において実施したＰＣＲ検出法によって確認し、ＳＮＰパネルの検出によって正確に鑑定したところ、全ての細胞系が、マイコプラスマ汚染なしと判定された。
【０１８４】
化合物Ａと化合物Ｂを組み合わせることの細胞増殖に対する効果を試験するために、底が透明の黒色３８４ウェルマイクロプレート（Ｍａｔｒｉｘ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４３３２）において、ウェル１つあたり５０ｕｌの培地に、５００〜１２５０細胞／ウェルの細胞密度で細胞を播き（表１０）、３７度、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞系１つあたり１つの３８４ウェルプレートを、処理を受けることなく、顕微鏡検査法（以下を参照されたい）による細胞計数用に準備した（＝「ベースライン」）。他の細胞プレートは、ＡＴＳ音響液体分配器（ＥＣＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の使用により、薬物マスタープレートから２５ｎｌの２０００×化合物を移し、最終濃度を１×とすることにより処理した。化合物Ａは、１３ｎＭ〜１０ｕＭの最終濃度範囲で使用し、化合物Ｂも、１３ｎＭ〜１０μＭの最終濃度範囲で使用した（７段階の１：３希釈ステップ）。化合物Ａと化合物Ｂの組み合わせ物では、単剤を、各希釈において１：１の固定比で組み合わせて、７つの組み合わせ処理をもたらした。加えて、陰性対照（ＤＭＳＯ＝「ビヒクル」）および陽性対照（スタウロスポリン＝細胞死滅、１６ｎｍ〜１ｕＭの用量範囲について７段階の１：２連続希釈）を処理対照として移し、試験細胞系に有効性のない化合物を化合物Ａおよび化合物Ｂと組み合わせて、組み合わせ対照（より有効な単剤の有効性を越えない組み合わせ物＝「非相互作用」組み合わせ物）として使用した。化合物を添加した後、５０ｎｌの２ｍＭ  ＣｅｌｌＥｖｅｎｔ  カスパーゼ３／７緑色検出試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ１０４２３）を、ＨＰ  Ｄ３００  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（Ｔｅｃａｎ）の使用により３回の複製のうちの１回に加えた。カスパーゼ３／７誘発を、処理により誘発されたアポトーシスの代理として測定した。細胞をその倍加時間に応じて７２〜９６時間処理し（表１０）、カスパーゼ３／７活性化を、４×対物レンズおよびＦＩＴＣ励起／発光フィルターを備えたＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する顕微鏡検査法により２４時間毎に測定した。処理終了時に、細胞を顕微鏡検査法による細胞計数に向けて調製した。細胞を、ＰＢＳ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号ＢＭ−２２０）中の４％のＰＦＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１５７１４）、０．１２％のＴＸ−１００（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２２１４０）において、４５分間にわたって固定および透過処理した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、それらのＤＮＡをＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｈ３５７０）により最終濃度４μｇ／ｍｌで３０分間染色した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次にプレートをＰｌａｔｅＬｏｃ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用によりアルミニウムシール（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０６６４４−００１）でヒートシールし、画像化するまで４℃で保存した。ウェル／処理毎の全ての細��を、４×対物レンズおよびＤＡＰＩ励起／発光フィルターを備えたＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する蛍光顕微鏡検査法により単一画像を撮った。
【０１８５】
以前に記載されていた方法（Horn, Sandmann et al. 2011）を適用し、ＲのＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＥＢＩｍａｇｅ（Pau, Fuchs et al. 2010）を使用した後、画像を分析した。両方のチャネルにおける対象物、ＤＡＰＩ（Ｈｏｅｃｈｓｔ／ＤＮＡ用）およびＦＩＴＣ（カスパーゼ３／７用）を適応閾値化により別々にセグメント化し、計数した。カスパーゼ３／７陽性対象物の閾値は、陰性対照（ＤＭＳＯ）と陽性対照（スタウロスポリン）とを比較した後、細胞系１つ毎に手作業により画定した。ＤＮＡチャネルにおいて対象物／核の１７の追加的特徴（形状および強度特徴）を分析することによって、細片／断片化した核を確認した。このため、細胞系１つ毎に、陽性対照（スタウロスポリン）と陰性対照（ＤＭＳＯ）の追加的な特徴の分布を、手作業により比較した。条件によって差が生じうる特徴（例えば、ＤＭＳＯとスタウロスポリンとを比較した特徴測定分布におけるシフト）を、「生存」核の集団に対して「細片」集団を画定するために使用した。細片計数を、生の核計数から差し引いた。得られる核の数を細胞増殖の測度（「細胞計数」）として使用した。
【０１８６】
細胞増殖に対する化合物の効果を、陰性対照（ＤＭＳＯ）の細胞計数に対する処理細胞計数から計算し、図１５では、ｙ軸に「正規化細胞計数」（＝「ｘｎｏｒｍ」）と示されている。相乗的組み合わせ物は、帰無仮説の最高単剤モデル（ＨＳＡ）（Berenbaum 1989）を使用して確認した。ＨＳＡモデルにおける超過から、阻害標的間の機能的な繋がりを予測される（Lehar, Zimmermann et al. 2007、Lehar, Krueger et al. 2009）。モデルの入力は、薬物用量毎の阻害値とした。
Ｉ＝１−ｘｎｏｒｍ
Ｉ：阻害
ｘｎｏｒｍ：正規化細胞計数（３回の複製の中央値）
【０１８７】
組み合わせ処理の全ての用量点において、組み合わせ物の阻害と、２つの単剤のより強力な方の阻害との差を計算した（＝残差モデル）。高い阻害での組み合わせ効果に有利とするために、残差には、同じ用量点で観察された阻害を加重した。薬物組み合わせ物の全体的な組み合わせスコアＣは、全ての濃度の加重残差の合計である。
Ｃ＝Σ濃度（Ｉデータ＊（Ｉデータ−Ｉモデル））
Ｉデータ：測定阻害値
Ｉモデル：ＨＳＡ帰無仮説による阻害値
【０１８８】
堅牢な組み合わせｚ−スコア（ｚＣ）を、処理の組み合わせスコアＣと、非相互作用組み合わせ物の絶対偏差の中央値（ｍａｄ）の比として計算した。
ｚＣ＝Ｃ／ｍａｄ（Ｃゼロ）
Ｃゼロ：非相互作用組み合わせ物の組み合わせスコア
ｚＣは、組み合わせ物の強さの指標である。
ｚＣ≧３：相乗作用
３＞ｚＣ≧２：弱い相乗作用
ｚＣ＜２：相乗作用なし
【０１８９】
ＩＣ５０は、ＤＭＳＯに対して５０％の細胞計数をもたらす化合物濃度である。ＩＣ５０の計算（表１１を参照されたい）は、ＲのＤＲＣパッケージ（Ritz and Streibig 2005）を使用し、データに４−パラメーター対数ロジスティック関数を当てはめて行った。
【０１９０】
アポトーシスに対する化合物の効果は、生の細胞計数（細片を差し引く前）と比べた、処理および時点毎の活性化カスパーゼ３／７を有する細胞のパーセンテージを計算することによって決定した（図１６のｙ軸）。実験的に測定しなかった時点の細胞計数は、０日目および処理終了時の対数変換細胞計数を線形モデルに当てはめる（指数関数的な細胞成長を想定する）回帰分析によって得た。
【０１９１】
【表１１】
2018528206.tif 000020
【０１９２】
結果
この報告では、ＭＤＭ２阻害剤（化合物Ａ）およびＢＣＬ−２／−ＸＬ阻害剤（化合物Ｂ）の有効性を、合計で５種のＴＰ５３野生型結腸直腸がん細胞系において、個別および組み合わせにより評価した。細胞系の４種は、ＫＲＡＳ突然変異体（ＧＰ２ｄ、ＬＳ−１８０、ＨＣＴ−１１６、ＬｏＶｏ）であり、１種の細胞系は、ＢＲＡＦ突然変異体（ＲＫＯ）であり、細胞系の４種は、ＰＩＫ３ＣＡについての突然変異体（ＧＰ２ｄ、ＲＫＯ、ＬＳ−１８０、ＨＣＴ−１１６）でもあった（表１０）。化合物Ａは、単剤として、マイクロモル未満からマイクロモルのＩＣ５０値により、全ての細胞系の成長を阻害した（図１５および表１１）。化合物Ｂは、単剤の有効性を示さなかった（図１５および表１１）。組み合わせ処理は、５種のうち３種の細胞モデルにおいて、相乗的な阻害を（ＨＳＡモデルに従って）引き起こし、もう１種のモデルにおいて、弱い相乗的な阻害を引き起こした（表１１）。組み合わせ物では、単剤に比べてアポトーシスのより強い誘発（カスパーゼ３／７誘発を測定することにより評価した）も示され（図１６）、ＧＰ２ｄ、ＨＣＴ−１１６、およびＬｏＶｏにおいて、最も強い誘発が認められた。
【０１９３】
結論
ＴＰ５３野生型ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ突然変異体結腸直腸がんにおけるＭＤＭ２とＢＣＬ−２／−ＸＬとを組み合わせた阻害は、それぞれの単剤と比較して改善された応答が可能である有効な治療様式を提供し、臨床においてより長続きする応答をもたらすことができる。
【実施例６】
【０１９４】
ＭＤＭ２阻害剤とＭＥＫ阻害剤とＢｃｌ２阻害剤を組み合わせることの増殖に対するインビトロ効果
先行する実施例において記載したのと同様に、４種のＫＲＡＳ突然変異体モデル（ＨＣＴ−１１６、ＧＰ２ｄ、ＬｏＶｏ、およびＬＳ−１８０）において、（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンとトラメチニブとＲＡＦ２６５の三種組み合わせ物を試験した。この組み合わせ物は、４種のうち２種のモデルにおいて相乗作用を示し（ＨＣＴ−１１６、ＧＰ２ｄ、組み合わせｚ−スコアは、それぞれ９．２および５．５）、４種のうち１種において弱い相乗作用を示した（ＬｏＶｏ、組み合わせｚ−スコアは２．８）。ＬＳ−１８０モデルでは、相乗作用が認められなかった（組み合わせｚ−スコアは０．２）。さらに、この三種組み合わせ物は、Ｇｐ２ＤおよびＬｏＶｏモデルにおいて、薬物対に比べて、アポトーシスのより強い誘発（カスパーゼ３／７活性化を測定することにより評価した）を示した（ＧＰ２ｄでは最大６７％、ＬｏＶｏでは８３％のアポトーシス）。ＨＣＴ−１１６およびＬＳ−１８０において三種組み合わせ物が引き起こした、観察されたアポトーシスレベルは、それぞれ４９％および１５％であった。
【実施例７】
【０１９５】
ＭＤＭ２阻害剤とＭＥＫ阻害剤とＢＲＡＦ阻害剤を組み合わせることの増殖に対するインビトロ効果
先行する実施例において記載したのと同様に、１種のＢＲＡＦ突然変異体モデル（ＲＫＯ）において、（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンとトラメチニブとダブラフェニブの三種組み合わせ物を試験した。本発明者らは、この三種組み合わせ物が相乗的であること（組み合わせｚ−スコアは３．５）、および薬物対に比べて、アポトーシスのより強い（しかし、最大１１％であり、全体としては弱い）誘発（カスパーゼ３／７活性化を測定することにより評価した）を示したことを見出した。
【実施例８】
【０１９６】
ＭＤＭ２阻害剤とＢＲＡＦ阻害剤とＢｃｌ２阻害剤とを、任意選択でＰＩ３Ｋ阻害剤またはｃＭＥＴ阻害剤も一緒に組み合わせることの増殖に対するインビトロ効果
先行する実施例において記載したのと同様に、４種のＫＲＡＳ突然変異体モデル（ＨＣＴ−１１６、ＧＰ２ｄ、ＬｏＶｏ、およびＬＳ−１８０）において、（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンとＲＡＦ２６５とナビトクラックス（ＡＢＴ−２６３）の三種組み合わせ物を試験した。この組み合わせ物は、４種のうち１種のモデルにおいて相乗作用を示し（ＧＰ２ｄ、組み合わせｚ−スコアは５）、試験した４種全てのモデルにおいて、薬物対に比べて、アポトーシスのより強い誘発（カスパーゼ３／７活性化を測定することにより評価した）を示した（ＧＰ２ｄおよびＬｏＶｏでは最大１００％、ＨＣＴ−１１６では６４％、ＬＳ−１８０では３２％のアポトーシス）。ＨＣＴ−１１６、ＬＳ−１８０、およびＬｏＶｏでは、相乗作用が認められなかった（組み合わせｚ−スコアは、それぞれ１．３、１．２、および０．５）。
【０１９７】
同じ部門において、（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンとダブラフェニブとナビトクラックス（ＡＢＴ−２６３）の三種組み合わせ物を、１種のＢＲＡＦ突然変異体モデル（ＲＫＯ）で試験した。本発明者らは、この三種組み合わせ物が相乗的であり（組み合わせｚ−スコアは３）、全ての対がアポトーシスの弱いないしゼロの誘発しか示さなかったのに対し、アポトーシスの強い誘発（最大１００％）を示す（カスパーゼ３／７活性化を測定することにより評価した）ことを見出した。
【０１９８】
さらに、ＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン、ＢＲＡＦ阻害剤ダブラフェニブ、およびＢＣｌ阻害剤ナビトクラックス（ＡＢＴ−２６３）を含んだ、２通りの四種組み合わせ物を試験した。最初の組み合わせ物は、ＰＩ３Ｋ阻害剤（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミドとのものであり、１種のＢＲＡＦ突然変異体細胞系において微弱に相乗的であり（ＲＫＯ、組み合わせｚ−スコアは２）、アポトーシスを強く誘発する（最大７９％）ことがわかった。次の組み合わせ物は、ｃＭＥＴ阻害剤ＰＦ−０４２１７９０３（Ｐｆｉｚｅｒ）を含むものであった。試験すると、１種のＢＲＡＦ突然変異体細胞系において、三種組み合わせ物に比べて微弱に相乗的に作用し（ＲＫＯ、組み合わせｚ−スコアは４．４）、アポトーシスを強く誘発する（最大７７％）ことがわかった。
【実施例９】
【０１９９】
ＭＤＭ２阻害剤とＭＥＫ阻害剤とＣＤ４／６阻害剤またはパクリタキセルを組み合わせることの増殖に対するインビトロ効果
（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンとトラメチニブの組み合わせ物に、ＣＤ４／６阻害剤（詳細には、７−シクロペンチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（（５−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）アミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミド）を加えると、試験した５種のうち２種のモデルにおいて、相乗効果がもたらされ（ＨＣＴ−１１６、ＬｏＶｏ；ｚ−スコアは、それぞれ５．１、３．３）、５種のうち２種のモデルで、微弱に相乗的に働いた（ＬＳ−１８０、ＲＫＯ；ｚ−スコアは、それぞれ２、２．８）。ＧＰ２ｄでは、相乗作用が認められなかった（ｚ−スコアは１．７）。アポトーシスの誘発は認められなかった。
【０２００】
この組み合わせ物にパクリタキセル（標準治療処理）を加えると、試験した５種のうち１種のモデルにおいて相乗効果がもたらされ（ＧＰ２ｄ、ｚ−スコアは４．３）、試験した５種のうち３種のモデルにおいて弱い相乗効果がもたらされた（ＨＣＴ−１１６、ＬｏＶｏ、ＬＳ−１８０；ｚ−スコアは、それぞれ２．４、２、および２．４）。ＲＫＯでは、相乗作用が認められなかった（ｚ−スコアは１．１）。さらに、この組み合わせ物では、アポトーシスが強く誘発された（ＧＰ２ｄ：１００％、ＨＣＴ−１１６：５９％、ＬｏＶｏ：６１％、ＬＳ−１８０：２０％、およびＲＫＯ  ６５％）。
【実施例１０】
【０２０１】
ＭＤＭ２阻害剤をＭＥＫ阻害剤およびＢＣＬ−２／−ＸＬ阻害剤と組み合わせることの結腸直腸がんのＴＰ５３野生型モデルにおける増殖に対するインビボ効果
担腫瘍マウスの作製および処置
全ての動物実験は、スイス国の動物保護法を厳格に遵守して行った。雌のＣｒｌ：ＮＵ（ＮＣｒ）−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ（ドイツ国）から購入し、病原体がコントロールされた環境で飼養した。ＨＣＴ−１１６（ＫＲＡＳ突然変異体、ＰＩＫ３ＣＡ突然変異体、ｐ５３野生型）の皮下腫瘍を、１００μｌのＰＢＳ中に３００万個の細胞を濃縮し、ヌードマウスの右側腹部にこれを注射することによって誘発した。マウスを無作為にグループ分けし、腫瘍サイズが５０〜２５０ｍｍ３に達したとき、処置を開始した。各コホートに、８匹のマウスを含めた。腫瘍サイズを週３回モニターし、体積を次式：
（ｍｍ３）＝長さ×幅２×０．５
によって計算した。
【０２０２】
粉末形態のＭＤＭ２阻害剤（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ａ）、ＭＥＫ阻害剤トラメチニブ（化合物Ｂ）、およびＢＣＬ−２／−ＸＬ阻害剤ＡＢＴ−２６３（化合物Ｃ）は、＋４℃で保存した。化合物Ａは、０．５％のヒドロキシプロピルメチルセルロースに溶解させ、化合物Ｂは、０．５％の蒸留水中Ｔｗｅｅｎ−８０％（ｐＨ７．６〜８．０）を含有する１％のカルボキシメチルセルロースに溶解させ、化合物Ｃは、Ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｐｒｅ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ５に溶解させた。全ての薬物を、５〜１０ｍｌ／ｋｇを使用して経口的に服用させた。化合物Ａは、１００ｍｇ／ｋｇで週３回（３ｑｗ）投与した。化合物Ｂおよび化合物Ｃは、それぞれ０．３および１００ｍｇ／ｋｇで毎日（ｑ２４ｈ）投与した。組み合わせ物投与スケジュールおよび投与量は、単一試薬と同じであった。
【０２０３】
６つの処置コホート（Ｇ１〜Ｇ６）を試験した。
−  Ｇ１：ビヒクル（ＤＭＳＯ）
−  Ｇ２：化合物Ｃ
−  Ｇ３：化合物Ａ＝＞９日間の処置後、化合物Ｃを加えた
−  Ｇ４：化合物Ｂ＝＞９日間の処置後、化合物Ｃを加えた
−  Ｇ５：化合物Ａ＋化合物Ｂ＝＞９日間の処置後、化合物Ｃを加えた
−  Ｇ６：化合物Ａ＋化合物Ｂ＋化合物Ｃ
【０２０４】
統計分析
各時点における各腫瘍について、処置開始前のサイズに対して正規化して、「腫瘍体積変化％」を取得した（図１７〜１８、ｙ軸）。図１７については、各時点において、コホート毎の全ての腫瘍のサイズ平均値を計算し、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を使用してサイズの誤差を計算した。図１８については、片側ｔ検定を使用してｐ値を計算した。
【０２０５】
結果
ＨＣＴ−１１６細胞の異種移植モデルにおいて、化合物Ａとトラメチニブの組み合わせ処置（Ｇ５）は、単剤処置それぞれ（Ｇ３〜Ｇ４は、進行性疾患を示す）に比べて、有意に良好であり（安定した疾患）、化合物ＡとトラメチニブとＡＢＴ−２６３の三種組み合わせ物（Ｇ６）では、腫瘍退縮が顕著となり、応答がＧ５に比べて有意に良好であった（図１７および図１８Ａ）。図１７は、集約した生存曲線を示し、図１８は、処置開始後９日および１９日の時点のウォーターフォールプロットを示す。９日後に単剤化合物ＡにＡＢＴ−２６３を順次加えても、付加的な利益はなかったが、単剤トラメチニブに加えたときは、これにより腫瘍の進行が停止した。ＡＢＴ−２６３では、化合物Ａとトラメチニブの組み合わせ物に加えたとき、腫瘍退縮が顕著となり、１９日の時点で、同時と順次の処置の応答は、区別しがたくなった（図１８Ｂ）。
【０２０６】
参考文献
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【図１】
2018528206.tif 000021
【図２】
2018528206.tif 000022
【図３】
2018528206.tif 000023
【図４】
2018528206.tif 000024
【図５】
2018528206.tif 000025
【図６】
2018528206.tif 000026
【図７】
2018528206.tif 000027
【図８】
2018528206.tif 000028
【図９】
2018528206.tif 000029
【図１０】
2018528206.tif 000030
【図１１】
2018528206.tif 000031
【図１２】
2018528206.tif 000032
【図１３】
2018528206.tif 000033
【図１４】
2018528206.tif 000034
【図１５】
2018528206.tif 000035
【図１６】
2018528206.tif 000036
【図１７】
2018528206.tif 000037
【図１８】
2018528206.tif 000038
【国際調査報告】
2018528206.tif 000039
2018528206.tif 000040
2018528206.tif 000041