(57)【要約】Ｔ細胞エピトープ特異性から本質的に独立して、Ｔ細胞受容体（例えば、ＴＣＲα）に結合する抗体及びその抗原結合断片を提供する。Ｔ細胞の操作方法、及びそのような抗体を用いた処置方法を同様に提供する。本発明は、例えば、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。さらに、本発明は、例えば、Ｔ細胞受容体α鎖（ＴＣＲα）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドであって、前記抗体は、前記配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲαポリペプチドのエピトープに結合する、前記単離ポリヌクレオチドを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
（ａ）配列番号２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ２；
（ｃ）ＣＤＹＷ（配列番号２１）；ＣＡＹＷ（配列番号２３）；またはＣＡＹＬ（配列番号２２）に同一であるＨＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４または配列番号９に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ２；及び
（ｆ）配列番号６または配列番号１０に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ３
を含む、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
（ａ）配列番号２に同一であるＨＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号３に同一であるＨＣＤＲ２；
（ｃ）ＣＤＹＷ（配列番号２１）；ＣＡＹＷ（配列番号２３）；またはＣＡＹＬ（配列番号２２）に同一であるＨＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４；または配列番号９に同一であるＬＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５に同一であるＬＣＤＲ２；及び
（ｆ）配列番号６；または配列番号１０に同一であるＬＣＤＲ３
を含む、請求項２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
（ａ）７９Ａ−１５（配列番号２）のＶＨＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ１；
（ｂ）７９Ａ−１５（配列番号３）のＶＨＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ２；
（ｃ）７９Ａ−１５（配列番号２２）のＶＨＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ３；
（ｄ）７９Ａ−１５（配列番号９）のＶＬＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ１；
（ｅ）７９Ａ−１５（配列番号５）のＶＬＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ２；及び
（ｆ）７９Ａ−１５（配列番号１０）のＶＬＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ３
を含む、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
７９Ａ−１５（配列番号１１）のＶＨドメインに少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ−１５（配列番号１２）のＶＬドメインに少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＬドメインを含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
７９Ａ−１５（配列番号１１）のＶＨドメインに９０％〜９９％同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ−１５（配列番号１２）のＶＬドメインに９０％〜９９％同一であるＶＬドメインを含む、請求項５に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
７９Ａ−１５（配列番号１１）のＶＨドメインに同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ−１５（配列番号１２）のＶＬドメインに同一であるＶＬドメインを含む、請求項５に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
（ａ）７９Ａ−１３  ＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＮＷＶ（配列番号２）のＶＨＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ１；
（ｂ）７９Ａ−１３  ＷＩＧＥＩＮＰＮＮ（配列番号３）のＶＨＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ２；
（ｃ）７９Ａ−１３  ＣＡＹＬ（配列番号２２）のＶＨＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ３；
（ｄ）７９Ａ−１３  ＮＴＹＬＥＷＹ（配列番号４）のＶＬＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ１；
（ｅ）７９Ａ−１３  ＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）のＶＬＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ２；及び
（ｆ）７９Ａ−１３  ＭＱＧＳＨＶＰＷ（配列番号１０）のＶＬＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ３
を含む、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
（ａ）ＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＮＷＶ（配列番号２）に同一であるＨＣＤＲ１；
（ｂ）ＷＩＧＥＩＮＰＮＮ（配列番号３）に同一であるＨＣＤＲ２；
（ｃ）ＣＡＹＬ（配列番号２２）に同一であるＨＣＤＲ３；
（ｄ）ＮＴＹＬＥＷＹ（配列番号４）に同一であるＬＣＤＲ１；
（ｅ）ＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）に同一であるＬＣＤＲ２；及び
（ｆ）ＭＱＧＳＨＶＰＷ（配列番号１０）に同一であるＬＣＤＲ３
を含む、請求項８に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
７９Ａ−１３（配列番号１１）のＶＨドメインに少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ−１３（配列番号１４）のＶＬドメインに少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＬドメインを含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
７９Ａ−１３（配列番号１１）のＶＨドメインに９０％〜９９％同一であるＶＨドメイン、または７９Ａ−１３（配列番号１４）のＶＬドメインに９０％〜９９％同一であるＶＬドメインを含む、請求項１０に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
７９Ａ１３（配列番号１１）のＶＨドメインに同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ−１３（配列番号１４）のＶＬドメインに同一であるＶＬドメインを含む、請求項１０に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
（ａ）７９Ａ−１１  ＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＮＷＶ（配列番号２）のＶＨＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ１；
（ｂ）７９Ａ−１１  ＷＩＧＥＩＮＰＮＮ（配列番号３）のＶＨＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ２；
（ｃ）７９Ａ−１１  ＣＡＹＷ（配列番号２３）のＶＨＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ３；
（ｄ）７９Ａ−１１  ＮＴＹＬＥＷＦ（配列番号９）のＶＬＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ１；
（ｅ）７９Ａ−１１  ＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）のＶＬＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ２；及び
（ｆ）７９Ａ−１１  ＭＱＧＳＨＶＰＷ（配列番号１０）のＶＬＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ３
を含む、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
（ａ）ＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＮＷＶ（配列番号２）に同一であるＨＣＤＲ１；
（ｂ）ＷＩＧＥＩＮＰＮＮ（配列番号３）に同一であるＨＣＤＲ２；
（ｃ）ＣＡＹＷ（配列番号２３）に同一であるＨＣＤＲ３；
（ｄ）ＮＴＹＬＥＷＦ（配列番号９）に同一であるＬＣＤＲ１；
（ｅ）ＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）に同一であるＬＣＤＲ２；及び
（ｆ）ＭＱＧＳＨＶＰＷ（配列番号１０）に同一であるＬＣＤＲ３
を含む、請求項１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
７９Ａ−１１（配列番号１３）のＶＨドメインに少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ−１１（配列番号１２）のＶＬドメインに少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＬドメインを含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
７９Ａ−１１（配列番号１３）のＶＨドメインに９０％〜９９％同一であるＶＨドメイン、または７９Ａ−１１（配列番号１２）のＶＬドメインに９０％〜９９％同一であるＶＬドメインを含む、請求項１５に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１７】
７９Ａ１１（配列番号１３）のＶＨドメインに同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ１１（配列番号１２）のＶＬドメインに同一であるＶＬドメインを含む、請求項１５に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１８】
（ａ）７９Ａ  ＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＮＷＶ（配列番号２）のＶＨＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ１；
（ｂ）７９Ａ  ＷＩＧＥＩＮＰＮＮ（配列番号３）のＶＨＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ２；
（ｃ）７９Ａ  ＣＤＹＷ（配列番号２１）のＶＨＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ３；
（ｄ）７９Ａ  ＮＴＹＬＥＷＹ（配列番号４）のＶＬＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ１；
（ｅ）７９Ａ  ＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）のＶＬＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ２；及び
（ｆ）７９Ａ  ＦＱＧＳＨＶＰＷ（配列番号６）のＶＬＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ３
を含む、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１９】
（ａ）ＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＮＷＶ（配列番号２）に同一であるＨＣＤＲ１；
（ｂ）ＷＩＧＥＩＮＰＮＮ（配列番号３）に同一であるＨＣＤＲ２；
（ｃ）ＣＤＹＷ（配列番号２１）に同一であるＨＣＤＲ３；
（ｄ）ＮＴＹＬＥＷＹ（配列番号４）に同一であるＬＣＤＲ１；
（ｅ）ＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）に同一であるＬＣＤＲ２；及び
（ｆ）ＦＱＧＳＨＶＰＷ（配列番号６）に同一であるＬＣＤＲ３
を含む、請求項１８に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２０】
７９Ａ（配列番号７）のＶＨドメインに少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ（配列番号８）のＶＬドメインに少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＬドメインを含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２１】
７９Ａ（配列番号７）のＶＨドメインに９０％〜９９％同一であるＶＨドメイン、または７９Ａ（配列番号８）のＶＬドメインに９０％〜９９％同一であるＶＬドメインを含む、請求項２０に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２２】
７９Ａ（配列番号７）のＶＨドメインに同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ（配列番号８）のＶＬドメインに同一であるＶＬドメインを含む、請求項２０に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２３】
（ａ）ＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＮＷＶ（配列番号１５）に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ１；
（ｂ）ＷＩＧＧＩＮＰＮＮ（配列番号１６）に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ２；
（ｃ）ＣＲＹＷ（配列番号１７）に同一であるＨＣＤＲ３；
（ｄ）ＱＳＩＶＨＧＧＧＮＴＹ（配列番号１８）に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ１；
（ｅ）ＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ２；及び
（ｆ）ＦＱＧＳＨＶＰＷ（配列番号６）に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ３
を含む、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２４】
（ａ）ＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＮＷＶ（配列番号１５）に同一であるＨＣＤＲ１；
（ｂ）ＷＩＧＧＩＮＰＮＮ（配列番号１６）に同一であるＨＣＤＲ２；
（ｃ）ＣＲＹＷ（配列番号１７）に同一であるＨＣＤＲ３；
（ｄ）ＱＳＩＶＨＧＧＧＮＴＹ（配列番号１８）に同一であるＬＣＤＲ１；
（ｅ）ＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）に同一であるＬＣＤＲ２；及び
（ｆ）ＦＱＧＳＨＶＰＷ（配列番号６）に同一であるＬＣＤＲ３
を含む、請求項２３に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２５】
７９Ａ−２３（配列番号１９）のＶＨドメインに少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ−２３（配列番号２０）のＶＬドメインに少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＬドメインを含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２６】
７９Ａ−２３（配列番号１９）のＶＨドメインに９０％〜９９％同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ−２３（配列番号２０）のＶＬドメインに９０％〜９９％同一であるＶＬドメインを含む、請求項２５に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２７】
７９Ａ−２３（配列番号１９）のＶＨドメインに同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ−２３（配列番号２０）のＶＬドメインに同一であるＶＬドメインを含む、請求項２５に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２８】
多重特異性である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２９】
二重特異性である、請求項２８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３０】
Ｆａｂ断片である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３１】
Ｆ（ａｂ）２断片である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３２】
Ｆｖ断片である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３３】
一本鎖抗体である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３４】
多価であり、かつ、少なくとも２つの重鎖及び少なくとも２つの軽鎖を含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３５】
ヒトカッパ定常領域及びヒトラムダ定常領域からなる群から選択される軽鎖定常領域を含む、請求項１〜２９、３３及び３４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３６】
重鎖定常領域またはその断片を含む、請求項１〜３０、及び３３〜３５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３７】
前記重鎖定常領域またはその断片が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、またはＩｇＤである、請求項３６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３８】
前記抗体またはその断片が、ヒト化、霊長類化またはキメラである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３９】
前記抗体またはその断片が、ヒト化である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４０】
リンカーにより分離されるＶＨ及びＶＬドメインを含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４１】
膜貫通ドメインをさらに含む、請求項４０に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４２】
前記ＶＨが、配列番号１１、配列番号１３及び配列番号１９からなる群から選択されるポリペプチドに少なくとも９０％同一であるポリペプチドであり、前記ＶＬが、配列番号１２、配列番号１４及び配列番号２０からなる群から選択されるポリペプチドに少なくとも９０％同一であるポリペプチドである、請求項４０または４１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４３】
前記ＶＨが、配列番号１１に少なくとも９０％同一であるポリペプチドであり、前記ＶＬが、配列番号１２に少なくとも９０％同一であるポリペプチドである、請求項４０または４１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４４】
前記ＶＨが、配列番号１３に少なくとも９０％同一であるポリペプチドであり、前記ＶＬが、配列番号１２に少なくとも９０％同一であるポリペプチドである、請求項４０または４１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４５】
前記ＶＨが、配列番号１１に少なくとも９０％同一であるポリペプチドであり、前記ＶＬが、配列番号１４に少なくとも９０％同一であるポリペプチドである、請求項４０または４１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４６】
前記ＶＨが、配列番号１９に少なくとも９０％同一であるポリペプチドであり、前記ＶＬが、配列番号２０に少なくとも９０％同一であるポリペプチドである、請求項４０または４１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４７】
Ｔ細胞受容体α鎖（ＴＣＲα）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドであって、
前記抗体は、前記配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲαポリペプチドのエピトープに結合する、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項４８】
前記核酸が、配列番号１１、配列番号１３または配列番号１９に少なくとも９０％同一であるＶＨポリペプチドをコードする、請求項４７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４９】
前記核酸が、配列番号１２、配列番号１４または配列番号２０に少なくとも９０％同一であるＶＬポリペプチドをコードする、請求項４７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５０】
前記核酸が、配列番号２に同一であるＨＣＤＲ１アミノ酸配列をコードする、請求項４７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５１】
前記核酸が、配列番号１５に同一であるＨＣＤＲ１アミノ酸配列をコードする、請求項４７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５２】
前記核酸が、配列番号３に同一であるＨＣＤＲ２アミノ酸配列をコードする、請求項４７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５３】
前記核酸が、配列番号１６に同一であるＨＣＤＲ２アミノ酸配列をコードする、請求項４７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５４】
前記核酸が、配列番号２１に同一であるＨＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする、請求項４７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５５】
前記核酸が、配列番号２２に同一であるＨＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする、請求項４７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５６】
前記核酸が、配列番号２３に同一であるＨＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする、請求項４７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５７】
前記核酸が、配列番号１７に同一であるＨＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする、請求項４７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５８】
前記核酸が、配列番号４に同一であるＬＣＤＲ１アミノ酸配列をコードする、請求項４７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５９】
前記核酸が、配列番号９に同一であるＬＣＤＲ１アミノ酸配列をコードする、請求項４７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項６０】
前記核酸が、配列番号１８に同一であるＬＣＤＲ１アミノ酸配列をコードする、請求項４７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項６１】
前記核酸が、配列番号５に同一であるＬＣＤＲ２アミノ酸配列をコードする、請求項４７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項６２】
前記核酸が、配列番号６に同一であるＬＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする、請求項４７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項６３】
前記核酸が、配列番号１０に同一であるＬＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする、請求項４７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項６４】
ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドであって、
前記ＶＨポリペプチドは、配列番号２、３、及び２１をそれぞれ含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＤＣＲ３アミノ酸配列を含み、前記ＶＨポリペプチドを含む抗体または抗原断片は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項６５】
ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドであって、
前記ＶＨポリペプチドは、配列番号２、３、及び２２をそれぞれ含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＤＣＲ３アミノ酸配列を含み、前記ＶＨポリペプチドを含む抗体または抗原断片は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項６６】
ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドであって、
前記ＶＨポリペプチドは、配列番号２、３、及び２３をそれぞれ含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＤＣＲ３アミノ酸配列を含み、前記ＶＨポリペプチドを含む抗体または抗原断片は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項６７】
ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドであって、
前記ＶＨポリペプチドは、配列番号１５、１６、及び１７をそれぞれ含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＤＣＲ３アミノ酸配列を含み、前記ＶＨポリペプチドを含む抗体または抗原断片は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項６８】
ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドであって、
前記ＶＬポリペプチドは、配列番号４、５及び６をそれぞれ含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原断片は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項６９】
ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドであって、
前記ＶＬポリペプチドは、配列番号９、５及び１０をそれぞれ含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原断片は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項７０】
ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドであって、
前記ＶＬポリペプチドは、配列番号４、５及び１０をそれぞれ含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原断片は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項７１】
ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドであって、
前記ＶＬポリペプチドは、配列番号１８、５及び６をそれぞれ含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原断片は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項７２】
請求項４７〜７１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項７３】
前記ポリヌクレオチドは、プロモーターと機能的に結合している、請求項７２に記載のベクター。
【請求項７４】
抗体またはその抗原結合断片の製造方法であって、
（ａ）細胞中で、抗体のＶＬ及びＶＨ鎖をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子（複数可）を発現すること；ならびに
（ｂ）Ｔ細胞受容体α鎖（ＴＣＲα）に特異的に結合する前記抗体を前記細胞から精製すること
を含む、前記方法。
【請求項７５】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲαのエピトープに選択的に結合する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
Ｔ細胞受容体α鎖（ＴＣＲα）を含む細胞の選択方法であって、
（ａ）前記細胞を、ＴＣＲα鎖に結合する抗体またはその抗原断片と接触させること、前記抗体または断片は、複数のＴ細胞エピトープ特異性を有するＴ細胞に結合し；及び
（ｂ）前記抗体または断片の結合に基づいて、前記ＴＣＲα鎖を含む細胞を選択すること
を含む、前記方法。
【請求項７７】
前記ＴＣＲα鎖が、前記配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むエピトープを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記抗体または断片が、レポーターを含み、前記方法が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって前記細胞を選択することをさらに含む、請求項７６または７７に記載の方法。
【請求項７９】
Ｔ細胞の拡張及び／または活性化方法であって、
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片の存在下で、前記Ｔ細胞を人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と接触させること
を含み、
前記エピトープは、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むポリペプチドである、前記方法。
【請求項８０】
前記ａＡＰＣが、Ｋ５６２細胞である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記Ｋ５６２細胞が、Ｔ細胞共刺激リガンドを発現する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記ａＡＰＣが、ＴＣＲの前記エピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片を発現する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記ａＡＰＣが、ＴＣＲの前記エピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片を発現するための発現構築物を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
ＴＣＲのエピトープに結合する前記抗体またはその抗原結合断片が、複数のＴ細胞エピトープ特異性を含むＴ細胞に結合する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８５】
前記抗体またはその抗原結合断片が、請求項１〜４７のいずれか１項に記載によるものである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８６】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２に少なくとも９５％または１００％同一であるＨＣＤＲ１；配列番号３に少なくとも９５％同一であるＨＣＤＲ２；ＣＡＹＬ（配列番号２２）に同一であるＨＣＤＲ３を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号９に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ１；配列番号５に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ２；配列番号１０に少なくとも９５％同一であるＬＣＤＲ３を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２に少なくとも９５％または１００％同一であるＨＣＤＲ１；配列番号３に少なくとも９５％または１００％同一であるＨＣＤＲ２；ＣＡＹＷ（配列番号２３）に同一であるＨＣＤＲ３を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号９に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ１；配列番号５に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ２；配列番号１０に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ３を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号４に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ１；配列番号５に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ２；配列番号１０に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ３を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９１】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１５に少なくとも９５％または１００％同一であるＨＣＤＲ１；配列番号１６に少なくとも９５％または１００％同一であるＨＣＤＲ２；ＣＲＹＷ（配列番号１７）に同一であるＨＣＤＲ３を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９２】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１８に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ１；配列番号５に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ２；配列番号６に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ３を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９３】
前記抗体または抗原結合断片が、リンカーにより分離されるＶＨ及びＶＬドメインを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９４】
前記抗体または抗原結合断片が、膜貫通ドメインをさらに含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記ＶＨが、配列番号１１、配列番号１３及び配列番号１９からなる群から選択されるポリペプチドに少なくとも９０％同一であるポリペプチドであり、前記ＶＬが、配列番号１２、配列番号１４及び配列番号２０からなる群から選択されるポリペプチドに少なくとも９０％同一であるポリペプチドである、請求項９３または９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記ＶＨが、配列番号１１に少なくとも９０％同一であるポリペプチドであり、前記ＶＬが、配列番号１２に少なくとも９０％同一であるポリペプチドである、請求項９１または９２に記載の方法。
【請求項９７】
前記ＶＨが、配列番号１３に少なくとも９０％同一であるポリペプチドであり、前記ＶＬが、配列番号１２に少なくとも９０％同一であるポリペプチドである、請求項９３または９４に記載の方法。
【請求項９８】
前記ＶＨが、配列番号１１に少なくとも９０％同一であるポリペプチドであり、前記ＶＬが、配列番号１４に少なくとも９０％同一であるポリペプチドである、請求項９３または９４に記載の方法。
【請求項９９】
前記ＶＨが、配列番号１９に少なくとも９０％同一であるポリペプチドであり、前記ＶＬが、配列番号２０に少なくとも９０％同一であるポリペプチドである、請求項９３または９４に記載の方法。
【請求項１００】
前記Ｔ細胞が、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項７９〜９９に記載の方法。
【請求項１０１】
処置を必要とする動物における自己免疫疾患またはＴ細胞白血病の処置方法であって、
配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲαポリペプチドを標的にするキメラ抗原受容体を含む宿主細胞を、前記動物に投与すること
を含む、前記方法。
【請求項１０２】
前記宿主細胞が、ＮＫまたはガンマデルタＴ細胞である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲα鎖に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含み、
前記抗体またはその抗原結合断片は、複数のＴ細胞エピトープ特異性を有するＴ細胞に選択的に結合する、宿主細胞。
【請求項１０４】
前記細胞が、哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、繊毛虫細胞、または昆虫細胞からなる群から選択される、請求項１０３に記載の宿主細胞。
【請求項１０５】
ＶＨをコードするポリヌクレオチド、及びＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞であって、
前記ＶＨをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２及び３からそれぞれなるＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ならびにＨＣＤＲ３アミノ酸配列ＣＡＹＬ（配列番号２２）を含むＶＨポリペプチドをコードし、前記ＶＬをコードするポリヌクレオチドは、配列番号９、５及び１０をそれぞれ含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬポリペプチドをコードし、ポリヌクレオチドをコードする前記ＶＨ及びＶＬによりコードされる抗体またはその抗原断片は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲα鎖ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、前記組換え宿主細胞。
【請求項１０６】
ＶＨをコードするポリヌクレオチド、及びＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞であって、
前記ＶＨをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２及び３をそれぞれ含むＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ならびにＨＣＤＲ３アミノ酸配列ＣＡＹＷ（配列番号２３）を含むＶＨポリペプチドをコードし、前記ＶＬをコードするポリヌクレオチドは、配列番号９、５及び１０をそれぞれ含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬポリペプチドをコードし、ポリヌクレオチドをコードする前記ＶＨ及びＶＬによりコードされる抗体またはその抗原断片は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲα鎖ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、前記組換え宿主細胞。
【請求項１０７】
ＶＨをコードするポリヌクレオチド、及びＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞であって、
前記ＶＨをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２及び３からそれぞれなるＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ならびにＨＣＤＲ３アミノ酸配列ＣＡＹＬ（配列番号２２）を含むＶＨポリペプチドをコードし、前記ＶＬをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４、５及び１０をそれぞれ含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬポリペプチドをコードし、ポリヌクレオチドをコードする前記ＶＨ及びＶＬによりコードされる抗体またはその抗原断片は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲα鎖ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、前記組換え宿主細胞。
【請求項１０８】
ＶＨをコードするポリヌクレオチド、及びＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞であって、
前記ＶＨをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５及び１６からそれぞれなるＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ならびにＨＣＤＲ３アミノ酸配列ＣＲＹＷ（配列番号１７）を含むＶＨポリペプチドをコードし、前記ＶＬをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１８、５及び６をそれぞれ含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬポリペプチドをコードし、ポリヌクレオチドをコードする前記ＶＨ及びＶＬによりコードされる抗体またはその抗原断片は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲα鎖ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、前記組換え宿主細胞。
【請求項１０９】
配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲαポリペプチドのエピトープに特異的に結合し、かつ、腫瘍関連抗原を標的にする抗体またはその抗原含有断片をさらに含む表面抗体またはその抗原含有断片を含む、組換え宿主細胞。
【請求項１１０】
腫瘍関連抗原を標的にする前記抗体またはその抗原含有断片が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１０７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１１】
配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲαポリペプチドを標的にするキメラ抗原受容体を含む、宿主細胞であって、
前記宿主細胞が、ＮＫまたはガンマデルタＴ細胞である、前記宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年９月１５日に出願された米国特許仮出願番号第６２／２１８，９９０号の利益を主張し、その出願は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の組み込み
本出願は、配列表を含み、これは、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、これによりその全体が参照により組み込まれる。２０１６年９月１５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０１００−００２１ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは１５ｋｂである。
本発明は、一般的に、分子生物学及び免疫学の分野に関する。さらに具体的には、αβ−ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）に結合するモノクローナル組換え抗体、ならびに身体の内側及び外側のαβ−ＴＣＲ＋Ｔ細胞の操作におけるそのような抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞ベース療法は、広範囲の疾患を処置するために現在調査されている。しかしながら、あらゆるＴ細胞ベース療法における大きな障害の１つは、療法で使用するためのＴ細胞の効率的な選択（単離）及び数値拡張である。さらに、Ｔ細胞は、活性化及び免疫抑制のために身体の内側で変化させることができる。従って、Ｔ細胞をインビボ及びエクスビボで操作するために使用することができる新しい方法及び組成物が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０００４】
実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、８．４×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍを超えない解離定数（ＫＤ）により特徴付けられた親和性をもつ配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する。実施形態では、ＫＤは、約５×１０−９Ｍ〜約６×１０−９Ｍである。さらなる実施形態では、ＫＤは、約１×１０−９Ｍ〜約２×１０−９Ｍである。
【０００５】
さらなる実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ２；（ｃ）ＣＤＹＷ（配列番号２１）；ＣＡＹＷ（配列番号２３）；またはＣＡＹＬ（配列番号２２）に同一であるＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号４または配列番号９に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号５に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号６または配列番号１０に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ３を含む、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片に関する。
【０００６】
本発明は、（ａ）７９Ａ−１５（配列番号２）のＶＨＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ１；（ｂ）７９Ａ−１５（配列番号３）のＶＨＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ２；（ｃ）７９Ａ−１５（配列番号２２）のＶＨＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ３；（ｄ）７９Ａ−１５（配列番号９）のＶＬＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ１；（ｅ）７９Ａ−１５（配列番号５）のＶＬＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）７９Ａ−１５（配列番号１０）のＶＬＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ３を含む、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をさらに提供する。
【０００７】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）７９Ａ−１３  ＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＮＷＶ（配列番号２）のＶＨＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ１；（ｂ）７９Ａ−１３  ＷＩＧＥＩＮＰＮＮ（配列番号３）のＶＨＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ２；（ｃ）７９Ａ−１３  ＣＡＹＬ（配列番号２２）のＶＨＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ３；（ｄ）７９Ａ−１３  ＮＴＹＬＥＷＹ（配列番号４）のＶＬＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ１；（ｅ）７９Ａ−１３  ＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）のＶＬＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）７９Ａ−１３  ＭＱＧＳＨＶＰＷ（配列番号１０）のＶＬＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ３を含む、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０００８】
実施形態では、本発明はさらに、（ａ）７９Ａ−１１  ＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＮＷＶ（配列番号２）のＶＨＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ１；（ｂ）７９Ａ−１１  ＷＩＧＥＩＮＰＮＮ（配列番号３）のＶＨＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ２；（ｃ）７９Ａ−１１  ＣＡＹＷ（配列番号２３）のＶＨＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ３；（ｄ）７９Ａ−１１  ＮＴＹＬＥＷＦ（配列番号９）のＶＬＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ１；（ｅ）７９Ａ−１１  ＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）のＶＬＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）７９Ａ−１１  ＭＱＧＳＨＶＰＷ（配列番号１０）のＶＬＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ３を含む、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片に関する。
【０００９】
本発明はまた、（ａ）７９Ａ  ＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＮＷＶ（配列番号２）のＶＨＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ１；（ｂ）７９Ａ  ＷＩＧＥＩＮＰＮＮ（配列番号３）のＶＨＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ２；（ｃ）７９Ａ  ＣＤＹＷ（配列番号２１）のＶＨＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ３；（ｄ）７９Ａ  ＮＴＹＬＥＷＹ（配列番号４）のＶＬＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ１；（ｅ）７９Ａ  ＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）のＶＬＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）７９Ａ  ＦＱＧＳＨＶＰＷ（配列番号６）のＶＬＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ３を含む、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１０】
実施形態では、本発明は、（ａ）ＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＮＷＶ（配列番号１５）に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ１；（ｂ）ＷＩＧＧＩＮＰＮＮ（配列番号１６）に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ２；（ｃ）ＣＲＹＷ（配列番号１７）に同一であるＨＣＤＲ３；（ｄ）ＱＳＩＶＨＧＧＧＮＴＹ（配列番号１８）に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ１；（ｅ）ＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）ＦＱＧＳＨＶＰＷ（配列番号６）に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ３を含む、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、Ｔ細胞受容体α鎖（ＴＣＲα）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドをさらに提供し、前記抗体は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲαポリペプチドのエピトープに結合する。
【００１２】
さらなる実施形態では、本発明は、Ｔ細胞受容体α鎖（ＴＣＲα）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供し、前記抗体は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲαポリペプチドのエピトープに結合する。
【００１３】
さらに別の実施形態では、本発明は、（ａ）細胞中で、抗体のＶＬ及びＶＨ鎖をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を発現すること；及び（ｂ）Ｔ細胞受容体α鎖（ＴＣＲα）に特異的に結合する抗体を細胞から精製することを含む、抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。
【００１４】
本発明は、（ａ）細胞を、ＴＣＲα鎖に結合する抗体またはその抗原断片と接触させること、抗体または断片は、複数のＴ細胞エピトープ特異性を有するＴ細胞に結合し；及び（ｂ）抗体または断片の結合に基づいて、ＴＣＲα鎖を含む細胞を選択することを含む、Ｔ細胞受容体α鎖（ＴＣＲα）を含む細胞の選択方法をさらに提供する。
【００１５】
さらなる実施形態では、本発明は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片の存在下で、Ｔ細胞を人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と接触させることを含み、前記エピトープは、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むポリペプチドである、Ｔ細胞の拡張及び／または活性化方法を提供する。
【００１６】
ある特定の態様では、本発明は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲαポリペプチドを標的にするキメラ抗原受容体を含む宿主細胞を、動物に投与することを含む、処置を必要とする前記動物における自己免疫疾患またはＴ細胞白血病の処置方法を提供する。
【００１７】
さらなる実施形態では、本発明は、ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲα鎖に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含み、抗体またはその抗原結合断片は、複数のＴ細胞エピトープ特異性を有するＴ細胞に選択的に結合する、宿主細胞を提供する。
【００１８】
さらなる実施形態は、複数のＴ細胞エピトープ特異性を有するＴ細胞に結合する本実施形態の抗体、または、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合する抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む宿主細胞、及び哺乳動物Ｔ細胞の増殖を増加させる少なくとも第１の薬剤を含むキットを提供する。ある特定の態様では、キットは、ＡＰＣをさらに含む。
【００１９】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様を説明するために含まれている。本発明は、本明細書に示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて１つ以上の図面を参照することによってもっと理解することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】Ａ）モノクローナル抗体（クローン７９Ａ）の結合特異性。ＥＬＩＳＡは、直鎖ＴＣＲ不変鎖特異的合成ペプチドで被覆された固相上で行った。抗体用量曲線は、１０００ｎｇ／ｍＬ〜７．５ｎｇ／ｍＬの濃度範囲で実行した。対照には、アッセイにおける非特異的ペプチド、二次抗体対照、及び緩衝液対照が含まれる。Ｖｉｃｔｏｒ（商標）プレートリーダーによって、アッセイプレートをＯＤ４５０で読み取った。試料は、重複して実行した。Ｂ）Ａｌａ−スキャンライブラリーにより、固相ＥＬＩＳＡ上に被覆された凍結乾燥ペプチド（Ｍｉｍｏｔｏｐｅ（商標）Ａｌａ−スキャンペプチドライブラリー）上のｍＡｂ  ７９Ａの直鎖エピトープ特異性が確認された。グラフは、選択されたＡＡをアラニンで置換する際に、７９Ａ  ｍＡｂの最も高い結合強度を示す。Ｃ）アラニンで置換された、図に示す特異的ペプチドへの７９Ａの中程度の結合。Ｄ）ＧＳＴＬＧＲ（配列番号１）は、ＴＣＲ  Ｖａ２４及びＪａ１８のジャンクションを表し、アラニンによるこれらのＡＡの置換の７９Ａ結合焦点は、結合を完全に抑制する。Ｅ（ｉ）及びＥ（ｉｉ））７９Ａは、ＴＣＲ−ＣＤＲ３不変鎖に対する立体構造上の適合度が欠如している。フローサイトメトリーアッセイは、７９Ａが、精製されたｉＮＫＴ細胞（画像における）またはレギュラーαβ＋−Ｔ細胞（後に示す）のいずれかに結合しないことを示し、ｉＮＫＴ特異的ｍＡｂとして、６Ｂ１１は、ｉＮＫＴ細胞上の立体配座エピトープを検出する。
【図１Ｂ】同上
【図１Ｃ】同上
【図１Ｄ】同上
【図１Ｅ−１】同上
【図１Ｅ−２】同上
【００２１】
【図２】ｍＡｂクローン７９ＡのＶ遺伝子増幅。アガロースゲル画像は、ハイブリドーマクローンＡ７９のＶＨ及びＶＬ鎖の増幅を示す。ＶＨ鎖（４００〜ｂｐ）は、（高縮退及び低縮退の混合物を含有する）マウス重鎖ＦＲ１領域プライマーと一緒にマウス重鎖定常領域プライム（ＭＨ−ＩｇＧ１）の混合物を用いた増幅後の画像で示し、ＶＬ鎖（３７０〜ｂｐ）は、マウスカッパ鎖ユニバーサル縮退プライマー及びカッパ鎖定常プライマーの混合物を用いた増幅後である。全ての５’プライマーは、ＦＲ１の第１のヌクレオチドで開始するＶＬ及びＶＨの両方について設計された。
【００２２】
【図３Ａ】Ａ〜Ｂ）抗体（７９Ａ）ホモロジーモデル。ＡＢＲに基づいた７９Ａホモロジーモデルの構築は、（Ｒｅｆ．Ｋｕｎｉｋ，Ｖ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ｂ．ａｎｄ  Ｏｆｒａｎ，Ｙ．（２０１２）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ａｍｏｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ．ＰＬｏＳ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，８，ｅ１００２３８８．）（Ｋｕｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．４０，Ｗ５２１−５２４）によって分析した。ＷＡＭサーバー（ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋでのワールド・ワイド・ウェブ）を使用して、ＶＬ鎖を構築し、ＶＨ鎖ＣＤＲは短いため、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ（ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇでのワールド・ワイド・ウェブ）を使用して、ＶＨドメインを構築した。パラメーターは、サーバー仕様のとおりである。Ｃ）ＴＣＲ不変鎖特異的ペプチドをもつ７９ＡのＺ−ドッキングモデル。ドッキングモデルは、７９Ａが、２ＣＤＥに由来するＴＣＲ不変鎖特異的ペプチドとの立体配置特異的適合を誘発しないことを示している。Ｄ）ドッキングモデルは、ウェブサーバーＺＤＯＣＫで構築されたαβ−ＴＣＲ（ＰＤＢコード１ＫＧＣ）と複合した７９Ａ抗体を示し、ＢｕｉｌｄＭｏｄｅｌ機能を介して出力を得た。ＦｏｌｄＸによってドッキングモデルを分析した。Ａｌａ−スキャンを行って、抗体ＣＤＲにおける個々のアミノ酸のエネルギー寄与を描出した。相互作用エネルギー（ΔΔＧ）の総変化は、変種の相互作用エネルギーから野生型の相互作用エネルギーを引くことによって算出した。
【図３Ｂ】同上
【図３Ｃ】同上
【図３Ｄ】同上
【００２３】
【図４Ａ】ＦｏｌｄＸの複合体Ａｌａ−スキャン機能に基づいた相互作用エネルギー（ΔΔＧ）の変化。（＊ΔΔＧ＝ΔＧＭＵ−ΔＧＷＴ（−９．９８））抗体から得られた総相互作用エネルギー（ΔΔＧ）を、Ａｌａ−スキャニング後にモデルドッキングした。ΔΔＧ＊は、変種の相互作用エネルギーから野生型のものを引くことによって算出した。赤色丸印は、相互作用エネルギーの最低の変化と、突然変異に適切な残基を示す。Ａ）Ｌ鎖のＣＤＲ１の４１位のチロシン（Ｙ）をフェニルアラニン（Ｆ）に変異させた。Ｌ鎖のＣＤＲ３の９４位のフェニルアラニン（Ｆ）をメチオニン（Ｍ）に変えた。Ｂ）Ｈ鎖のＣＤＲ３の９９位のアスパラギン酸（Ｄ）をアラニン（Ａ）に変異させた。Ｈ鎖のＣＤＲ３の１０１位のトリプトファン（Ｗ）をロイシン（Ｌ）に変異させた。Ｃ）散布折れ線グラフは、抗体７９Ａ  ＣＤＲ（ＶＨ及びＶＬ領域）に沿った、Ｋｃａｌ／モルの分子相互作用エネルギー（ΔΔＧ）の分布を表す。相互作用エネルギーが低いアミノ酸（＜０．５Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）は、突然変異の候補として考えられ、（赤色矢印で）マークされる。関連する突然変異は、７９Ａ軽鎖ＣＤＲ１における３２位でセリンからグリシン（Ｓ３２Ｇ）、３３位でアスパラギンからグリシン（Ｎ３３Ｇ）、重鎖ＣＤＲ１における３１位でアスパラギン酸からグリシン（Ｄ３１Ｇ）、重鎖ＣＤＲ２における５０位でアスパラギン酸からグリシン（Ｄ５０Ｇ）、及び７９Ａ重鎖のＣＤＲ３における９９位でアスパラギン酸からアルギニン（Ｄ９９Ｒ）である。関連する突然変異を７９Ａ抗体可変領域に導入し、変異型組換え抗体クローンＳ２３を構築した。
【図４Ｂ】同上
【図４Ｃ】同上
【００２４】
【図５Ａ−１】Ａ（ｉ）変異型組換え抗体発現ベクターＳ１５（一本鎖の親和性が最適化された新規の変種１５）のための分子構築物。概略図は、組換え抗体を生成するために、切断型ＩｇＧ１  Ｆｃに融合した７９Ａ変異型ｓｃＦｖを示す。抗体遺伝子発現カセットは、可変重鎖（ＶＨ変異体１５）及び可変軽鎖（ＶＬ変異体１５）とフレーム結合したＶＨ５シグナルペプチドからなる。発現は、ＳＶ４０プロモーターの制御下であり、ポリＡシグナルで停止した。発現は、ＳＶ４０プロモーターの制御下であり、ポリＡシグナルで終了した。Ａ（ｉｉ）ベクターマップは、組換え抗体（Ｓ１５）を生成するために、切断型ＩｇＧ１  Ｆｃに融合した７９Ａ変異型ｓｃＦｖを示す。抗体発現カセットは、可変重鎖（ＶＨ変異体１５）及び可変軽鎖（ＶＬ変異体１５）とフレーム結合したＶＨ５シグナルペプチドからなる。発現は、ＳＶ４０プロモーターの制御下であり、ポリＡシグナルで終了した。Ｂ）変異体２３（Ｓ２３）のＶＨ及びＶＬを表す分子構築物。修飾（Ｄ３１Ｇ、Ｄ５０Ｇ及びＤ９９Ｒ）を有するＶＨ可変領域をヒトＩｇＧ１  Ｆｃガンマ定常鎖に融合し、修飾（Ｓ３２Ｇ及びＮ３３Ｇ）を有するＶＬをヒトκ定常軽鎖に融合する。全長抗体配列をＰＣＲ増幅した後、高発現ベクター（Ｌａｋｅ  Ｐｈａｒｍａ）のＭＣＳにクローンし、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトして、一過性発現させた。培養上清を抗体精製に使用した。
【図５Ａ−２】同上
【図５Ｂ】同上
【００２５】
【図６−１】Ａ）組換え抗体（Ｓ１１、Ｓ１３及びＳ１５）のホモロジー及び純度。クマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、プロテインＡ精製後の組換え抗体調製物のホモロジー及び純度を示す。画像に示すものは、哺乳動物２９３Ｔ細胞で発現された３つの異なる変異型抗体である。Ｂ）７９Ａ変異体（一本鎖ｍＡｂ）は、変性した全Ｔ細胞溶解物中のＴＣＲ−アルファ鎖を検出する。ドナーＰＢＭＣまたは精製Ｔ細胞から抽出された全細胞溶解物を、変性したＰＡＧＥ（２Ｘブロモフェノールブルーと組み合わせたＳＤＳ＋２ＭＥ）で実施した。等量（１０ｕｇ）のタンパク質を正規化後に各レーンにロードした。親ｍＡｂ  ７９Ａ及び変異体ｍＡｂ（変異体１３及び変異体１５）は、一次抗体として使用した後、検出のためのマッチした二次抗体にＨＲＰ結合させた。化学発光によってブロットを視覚化し、Ｂｉｏｒａｄイメージャーによって画像を取得した。最大検出感度が、変異体ｍ１５について達成され、最も高いΔΔＧが、親Ａ７９  ｓｃＦｖと変異体ｍＡｂ（Ｓ１３及びＳ１５）の間の「相互作用エネルギーの変化」と相関していた。Ｃ）Ｔ細胞のαβ−ＴＣＲへの組換えｍＡｂ  Ｓ１５の立体配座特異的結合。フロープロットは、Ｓ１５がそのネイティブ構成でαβ−ＴＣＲ＋Ｔ細胞に結合できたことを示す。ｓ１５（変異体１５）の結合改善は、７９Ａ鎖に導入した部位特異的突然変異に相関する。左パネルで、親ｍＡｂ  ７９Ａは、ＰＢＭＣ由来のＴ細胞に結合しない。しかしながら、Ｓ１５は、αβ−ＴＣＲ＋Ｔ細胞と共染色し、結合は、市販の抗αβ−ＴＣＲ（ＷＴ３１）抗体に匹敵する。Ｄ）組換えタンパク質（Ｓ１５及びＳ２３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＴＧＸ予め染色されたゲル（Ｍｉｎｉｐｒｏｔｅａｎ、Ｂｉｏｒａｄ）上で実施した。試料を２βＭＥで還元し、ゲルをロードする前に２分間加熱（９５℃）した。Ｂｉｏｒａｄイメージングシステム（ＣｈｅｍｉＤｏｃ）によって画像を取得した。プロテインＡ親和性精製された試料の重鎖及び軽鎖の両方の位置を図に示す。Ｅ）ドットプロットは、培養物（ｎ＝３）から採取された活性化αβ＋Ｔ細胞への変異型組換え抗体Ｓ１５の結合が改善されたことを示す。細胞を、マッチした蛍光結合二次抗体と一緒に一次抗体７９ＡまたはＳ１５で染色し、方法で記載されたフローサイトメーター上で実施した。ＢＤ  ＦＡＣＳキャリバー上の所定のフォーワード＆サイドスキャッター設定に基づいて、生細胞をリンパ球にゲートした。５０万個の細胞のデータを取得した。
【図６−２】同上
【図６−３】同上
【００２６】
【図７Ａ】Ａ）Ｋ５６２活性化及び増殖細胞（ＡａＰＣ）上にＳ１５（変異体ＶＨリンカー変異体ＶＬ）をテザーする分子構築物。プラスミドコードＳ１５（変異体ＶＨリンカー変異体ＶＬ）を導入するための分子構築物。画像に示すように、５’ＬＴＲ（長い末端反復）を、選択マーカーとして、異種エンハンサーＲＳＶラウス肉腫ウイルス、ＨＩＶパッケージングシグナルψ、ＲＲＥ逆応答エレメント、ｃＰＰＴセントラルポリプリントラクト、Ｉｇｋリーダー鎖配列、Ｓ１５−ＶＨ変異体抗体可変重鎖、Ｓ１５−ＶＬ可変軽鎖、４グリシン−３セリンリンカー反復、ＨＡタグを有するＣＤ８  ＴＭ膜貫通、及び切断型ＣＤ８膜貫通、ＨＢＶ  ＰＲＥウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節因子、及び自己不活性化ＨＩＶ  ＬＴＲ、Ａｍｐ  Ｒアンピシリン耐性遺伝子に融合した。パッケージングベクター（ｐｓＰＡＸ２）及びエンベロープ（ｐＶＳＶ−Ｇ）プラスミドを別々に加える。全てのプラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、レンチウイルス粒子を産生する。Ｂ）操作されたＫ５６２−ＡａＰＣ（Ｋ５６２−Ｓ１５及びＫ５６２−ＯＫＴ３）は、Ｔ細胞活性化及び共刺激リガンドを発現する。ヒストグラムは、Ｓ１５  ｓｃＦｖ（抗ＨＡタグにより検出）、Ｔ細胞共刺激リガンドＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ、及びサイトカインリガンドＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａを発現するように形質導入されたＫ５６２細胞レンチウイルスの免疫表現型を示す。また、Ｋ５６２細胞を操作して、ＣＤ６４を発現し、ＣＤ３ε  ｍＡｂ  ＯＫＴ３、及び同様の共刺激リガンドをロードした。Ｃ）ＣＦＳＥベースの色素希釈アッセイは、ＣＤ２８及びＯＫＴ３（ＣＤ３ε特異的ｍＡｂ）と比較して、プレート結合組換え抗体Ｓ１５及びＳ２３を介した活性化後のＴ細胞分裂を示す。細胞を生死について染色し、ＣＤ３＋ゲートＴ細胞上のフローサイトメトリーによって分析した。ＣＦＳＥ強度は、フローサイトメトリーによって４８８ｎｍ励起で捕捉した。各ピークは、２日目の抗体刺激後に生成されたＣＤ３陽性Ｔ細胞の異なる集団を表す。Ｄ）ＣＦＳＥベースの色素希釈アッセイは、６日目のプレート結合抗体の活性化後のＴ細胞増殖を示す。ＣＦＳＥをロードした未刺激ＰＢＭＣ（暗灰色ヒストグラム）は、アッセイにおいて対照として使用する。Ｅ）Ｋ５６２−ＡａＰＣで拡張されたＴ細胞の成長速度。照射されたＫ５６２−ＡａＰＣ上で２週間の共培養後の健常なドナーＰＢＭＣ由来のＣＤ３＋αβ−ＴＣＲ＋Ｔ細胞の拡張。生細胞は、トリパンブルー色素排除法によって計数し、絶対細胞数として表した。グラフは、Ｔ細胞共刺激リガンドの存在下でＳ１５及びＯＫＴ３を介して刺激したＴ細胞を示す。Ｆ）抗体（Ｓ１５のみ）と共にロードしたＫ５６２細胞上のＴ細胞の同様の成長速度。Ｋ５６２親細胞は、陰性対照として作用し、ＯＫＴ３をロードしたＫ５６２は、陽性対照として作用する。Ｇ）エクスビボ培養された活性化Ｔ細胞の免疫表現型。活性化された生Ｔ細胞は、αβ−ＴＣＲ（ＷＴ３１）、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞マーカー（ＢＤ）の細胞表面発現についてフローサイトメトリーによって分析した。図に示すものは、Ｋ５６２（親）、共刺激によるＫ５６２  Ｓ１５、共刺激によるＫ５６２  ＯＫＴ３��用いた共培養の７日目に採取された活性化Ｔ細胞におけるマーカーの免疫表現型発現を表す擬似カラープロットである。Ｈ）組換え抗体によって活性化されたエクスビボ繁殖されたＴ細胞を、ａｂ−ＴＣＲ発現及びａｂ−ＴＣＲ発現について分析し、ＣＤ３と共に示した。Ｉ）抗体による活性化の前後のＣＤ４発現のＴ細胞表現型。Ｊ）抗体による活性化の前後のＣＤ８発現のＴ細胞表現型。Ｋ）及びＬ）メモリーまたはエフェクターメモリー表現型の生成をもたらす活性化のレベルを評価するためのＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ４５ＲＯ発現に基づいたＴ細胞分化マーカー。エクスビボ繁殖された生Ｔ細胞（固定可能生存性色素陰性）及び健常なドナーＰＢＭＣ由来のＴ細胞は、フローサイトメトリーによって分析した。細胞をＣＤ１９及びＣＤ１４で染色し、Ｂ細胞及び単球を除外した。全ての生細胞をＣＤ３＋ＣＤ５６陰性Ｔ細胞集団にゲートした。ＰＢＭＣ由来の操作されていないＴ細胞集団と比較して、ＯＫＴ３刺激後にＣＤ４＋Ｔ細胞パーセンテージが減少するように思われ、Ｓ２３は高いＣＤ４組成物を維持しながら、逆に、ＣＤ８パーセンテージは、ＯＫＴ３刺激群において最も高かった。細胞分化の場合、ＣＤ４５ＲＡ陰性集団は、ＯＫＴ３群において最も高かった一方、ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性集団は、刺激に使用した抗体クローンに関わりなく細胞の各群内で安定したままである。（Ｍ）Ｔ細胞の疲弊化のマーカーＰＤ１は、Ｓ１５またはＳ２３媒介活性化と比較して、ＯＫＴ３刺激群において上方調節される。
【図７Ｂ】同上
【図７Ｃ】同上
【図７Ｄ】同上
【図７Ｅ】同上
【図７Ｆ】同上
【図７Ｇ】同上
【図７Ｈ】同上
【図７Ｉ】同上
【図７Ｊ】同上
【図７Ｋ】同上
【図７Ｌ】同上
【図７Ｍ】同上
【００２７】
【図８Ａ−１】Ａ）Ｓ１５またはＯＫＴ３−ＣＤ３ε刺激によってａＡＰＣ上に拡張された活性化Ｔ細胞と比較した健常なドナーＰＢＭＣ由来のＴ細胞のＴＣＲＶβレパートリーは、異種Ｔ細胞レパートリーによるＴ細胞の集団の生成を示す。活性化されインビトロ拡張されたＴ細胞のレパートリーの予想外のゆがみは、全く気付かれない。Ｂ）Ｓ１５刺激（ＣＳ１Ｓ１５）またはＯＫＴ３Ｔ細胞のいずれかによって増殖された活性化Ｔ細胞のＴＣＲＶβレパートリー。レパートリーは、クローン型の任意の特異的増殖のないポリクローナルＴ細胞集団を表す。Ｃ）エクスビボ増殖後のＴ細胞クローン頻度及び分布の次世代ディープシーケンス調査。クローン型の共通性は、ＯＫＴ３刺激と比較して、Ｓ１５媒介活性化後により良くＰＢＭＣと整列することが見られる。Ｄ）表は、活性化後に生成されたＴ細胞のクローン頻度を表すピアソン係数値（ｒ２）を示す。Ｔ細胞クローン頻度は、（親Ｋ５６２／ＡＣＴ）、（Ｋ５６２−Ｓ１５−共刺激）及び（Ｋ５６２−ＯＫＴ３−共刺激）で刺激されたＴ細胞間で比較する。ＰＢＭＣと比較した試料重複は、Ｓ１５  Ｔ細胞についてｒ２値０．０４３及びｏ＝０．４７２、及びＯＫＴ３−ＰＢＭＣについてｒ２＝０．０５５及び試料重複ｏ＝０．１７２を示す。クローンの重複は、Ｓ１５活性化Ｔ細胞が優れている。
【図８Ａ−２】同上
【図８Ｂ】同上
【図８Ｃ】同上
【図８Ｄ】同上
【００２８】
【図９】Ｖ−Ｊ対合遺伝子頻度。積み上げヒストグラムは、共刺激によりＫ５６２−Ｓ１５（クローンＣＳ１Ｓ１５）上で増殖されたＴ細胞、及び共刺激によりＫ５６２−ＯＫＴ３（クローンＫ５６２  ＯＫＴ３）上で増殖されたＴ細胞の任意の特定の遺伝子座におけるＶ−Ｊ対合遺伝子頻度を示す。
【００２９】
【図１０】ディープシークエンシング後のＮＧＳデータから分析した際の操作されていないＴ細胞対活性化Ｔ細胞のクローン階層。Ｔ細胞活性化及び増殖で使用された健常なドナーＰＢＭＣ試料における各クローンによって表された、生産的なシークエンシングリードのパーセンテージに基づいた最も高いランキング（１〜１０）のクローン（上パネル）。表は、対応するＴＣＲ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列を、Ｖ及びＪファミリー対立遺伝子と共に、ならびにそれぞれのパーセンテージを示す。Ｋ５６２−Ｓ１５対Ｋ５６２−ＯＫＴ３によって活性化されたＴ細胞間のトップクローン頻度の比較をヒストグラムとして示す（下パネル）。Ｙ軸は、試料当たりの総カウントのパーセンテージを表す。
【００３０】
【図１１】Ｓ１５活性化Ｔ細胞及びＯＫＴ３活性化Ｔ細胞の両方のＣＤＲ３鎖長の釣鐘曲線分布。ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞と比較した場合の活性化Ｔ細胞のＣＤＲ３鎖長。ＣＤＲ３鎖の全ての分布にわたる摂動は観察されない。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
定義
本明細書で使用する場合、特定の成分において「本質的に含まない」は、指定された成分のいずれも意図的に組成物に処方されていない及び／または汚染物質としてのみ、もしくは微量に存在していることを意味するために本明細書で使用される。従って、組成物の意図しない汚染から得られる指定された成分の合計量は、好ましくは０．０１％を下回る。最も好ましいのは、指定された成分を標準的な分析方法で全く検出することができない組成物である。
【００３２】
本明細書及び特許請求の範囲で使用する場合、「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。本明細書及び特許請求の範囲で使用する場合、用語「含む」と組み合わせて使用する場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つまたは２つ以上を意味し得る。本明細書及び特許請求の範囲で使用する場合、「別の」または「さらなる」は、少なくとも第２またはそれ以上を意味し得る。
【００３３】
本明細書及び特許請求の範囲で使用する場合、「約」という用語は、値に、装置の固有の変動、値を定量するために使用される方法の固有の変動、または研究対象に存在する変動が含まれることを示すために使用される。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を含むことが意図され、アミド結合（ペプチド結合とも知られる）によって直線的に連結した単量体（アミノ酸）からなる分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の１つ以上の鎖を指し、特定の長さの産物を指さない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２つ以上のアミノ酸の任意の１つ以上の鎖を指すために用いられる任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらのいずれかの用語の代わりに用いられてもよく、またはこれらの用語と同義に用いられてもよい。「ポリペプチド」という用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図される。発現後修飾には、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、または非天然アミノ酸による修飾が含まれるが、それに限定されるわけではない。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来してもよく、組換え技術によって産生されてもよいが、必ずしも、指定された核酸配列から翻訳されるとは限らない。ポリペプチドは、化学合成を含む任意のやり方で作製することができる。
【００３５】
本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上、または２，０００以上アミノ酸のサイズでもよい。ポリペプチドは、規定された三次元構造を有してもよいが、必ずしも、このような構造を有するとは限らない。規定の三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれていると呼ばれ、規定の三次元構造を有さないが多数の異なる立体構造をとることができるポリペプチドは、折り畳まれていないと呼ばれる。本明細書で使用する際、糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基、例えば、セリン残基またはアスパラギン残基の酸素含有側鎖または窒素含有側鎖を介してタンパク質に取り付けられた少なくとも１つの炭水化物部分と結合しているタンパク質を指す。
【００３６】
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、変種、もしくは誘導体とは、天然の環境にはないポリペプチドを意図している。特定のレベルの精製は必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その自然または天然の環境から取り出されていてもよい。宿主細胞内で発現された合成組換えポリペプチド及び／またはタンパク質は、本発明の目的で単離されているとみなされ、同様に、任意の適切な技法によって分離されている、分画されている、または部分的もしくは実質的に精製されている自然のポリペプチドまたは組換えポリペプチドも単離されているとみなされる。
【００３７】
本発明のポリペプチドとして、前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、または変種、及びその任意の組み合わせも含まれる。「断片」、「変種」、「誘導体」、及び「類似体」という用語は本発明の抗ＴＣＲ抗体または抗体ポリペプチドを指す時には、本発明の対応する抗体または抗体ポリペプチドの抗原結合特性の少なくとも一部を保持している任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの断片には、本明細書の他の場所で議論される特定の抗体断片に加えて、タンパク質分解断片、及び欠失断片が含まれる。本発明の抗ＴＣＲ抗体及び抗体ポリペプチドの変種には、前記の断片が含まれ、アミノ酸置換、欠失、または挿入のためにアミノ酸配列が変化しているポリペプチドも含まれる。変種は、天然のものでもよく、非天然のものでもよい。非天然変種は、当該技術分野において公知の突然変異誘発技術を用いて生成されてもよい。変種ポリペプチドは、保存的もしくは非保存的なアミノ酸置換、欠失、または付加を含んでもよい。変種ポリペプチドはまた、本明細書において「ポリペプチド類似体」と呼ばれることもある。本明細書で使用する場合、抗ＴＣＲ抗体または抗体ポリペプチドの「誘導体」は、官能基側鎖基の反応によって１つ以上の残基が化学的に誘導体化された目的のポリペプチドを指す。２０種類の標準アミノ酸の中の１つ以上の天然アミノ酸誘導体を含有するペプチドも「誘導体」として含まれる。例えば、プロリンの代わりに４−ヒドロキシプロリンが用いられてもよく、リジンの代わりに５−ヒドロキシリジンが用いられてもよく、ヒスチジンの代わりに３−メチルヒスチジンが用いられてもよく、セリンの代わりにホモセリンが用いられてもよく、リジンの代わりにオルニチンが用いられてもよい。本発明の抗ＴＣＲ抗体及び抗体ポリペプチドの誘導体は、本発明の参照抗体または抗体ポリペプチドでは見られないさらなる特徴を示すように変えられているポリペプチドを含んでもよい。
【００３８】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸ならびに複数の核酸を包含することが意図され、単離された核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または従来にはない結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）において見られる結合）を含んでもよい。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチドに存在する任意の１つ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドとは、自然環境から取り出されている核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図している。例えば、ベクターの中に含まれる、抗ＴＣＲ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的では単離されているとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞の中で維持されている組換えポリヌクレオチド、または溶解状態にある（部分的もしくは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたＲＮＡ分子には、本発明のポリヌクレオチドのインビボＲＮＡ転写物またはインビトロＲＮＡ転写物が含まれる。さらに、本発明の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、合成により生成されたこのような分子が含まれる。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節エレメントでもよく、これを含んでもよい。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部とみなされることがある。だが、隣接配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、どれもコード領域の一部でない。本発明の２つ以上のコード領域が１つのポリヌクレオチド構築物の中に存在してもよく、例えば、１つのベクターにあってもよく、別々のポリヌクレオチド構築物に、例えば、別々の（異なる）ベクターにあってもよい。さらに、どのベクターもコード領域を１つしか含んでいなくてもよく、２つ以上のコード領域を含んでもよい。例えば、免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするベクター及び免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするベクターが別々にあってもよい。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、抗ＴＣＲ抗体またはその断片、変種、もしくは誘導体をコードする核酸と融合した状態で、または融合していない状態で異種コード領域をコードしてもよい。異種コード領域には、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインなどの特殊なエレメントまたはモチーフが含まれるが、それに限定されるわけではない。
【００４０】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１つ以上のコード領域と機能的に結合しているプロモーター及び／または他の転写調節エレメントもしくは翻訳調節エレメントを含んでもよい。機能的に結合しているとは、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドが調節配列（複数可）の影響または制御を受けて発現されるように、遺伝子産物のコード領域が１つ以上の調節配列と結合している時である。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域及びこれらと結合しているプロモーター）は、プロモーター機能の誘導によって望ましい遺伝子産物をコードするｍＲＮＡが転写されれば、及び２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、発現調節配列が遺伝子産物の発現を誘導する能力を妨げず、またはＤＮＡテンプレートが転写される能力を妨げないのであれば「機能的に結合している」。従って、プロモーター領域は、このプロモーターが核酸の転写に影響を与えることができる場合、ポリペプチドコード核酸と機能的に結合しているだろう。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡを実質的に転写する細胞特異的プロモーターでもよい。細胞特異的転写を誘導するために、プロモーターのほかに他の転写調節エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルがポリヌクレオチドと機能的に結合していてもよい。適切なプロモーター及び他の転写制御領域が本明細書において開示される。
【００４１】
様々な転写制御領域が当業者に公知である。これらには、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域が含まれるが、それに限定されるわけではない。脊椎動物細胞において機能する転写制御領域には、サイトメガロウイルスに由来するプロモーター及びエンハンサーセグメント（最初期プロモーターとイントロン−Ａ）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、ならびにレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）などがあるが、これに限定されない。他の転写制御領域には、脊椎動物遺伝子、例えば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、及びウサギβ−グロビンに由来する転写制御領域、ならびに真核細胞において遺伝子発現を制御することができる他の配列が含まれる。さらなる適切な転写制御領域には、組織特異的プロモーター及びエンハンサーならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導されるプロモーター）が含まれる。
【００４２】
同様に、様々な翻訳調節エレメントが当業者に公知である。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始コドン及び翻訳終結コドン、ならびにピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位すなわちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が含まれるが、これに限定されない。
【００４３】
他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形をしたＲＮＡである。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を誘導する分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードする、さらなるコード領域と結合してもよい。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されたタンパク質には、シグナルペプチド配列または分泌リーダー配列があり、粗面小胞体を通る成長タンパク質鎖の輸送が開始したらシグナルペプチド配列または分泌リーダー配列は成熟タンパク質から切断される。当業者であれば、脊椎動物細胞によって分泌されたポリペプチドは、一般的に、ポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチドが融合しており、シグナルペプチドは、完全なまたは「完全長」のポリペプチドから切断されて、分泌形態または「成熟」形態のポリペプチドを産生することを知っている。ある特定の態様では、天然シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖シグナルペプチドを使用するか、または機能的に結合しているポリペプチドの分泌を誘導する能力を保持している、その配列の機能誘導体が用いられる。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチドまたはその機能誘導体が用いられてもよい。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列と置換してもよい。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「ＴＣＲ」という用語は、「Ｔ細胞受容体」を指す。Ｔ細胞受容体は、Ｔリンパ球（「Ｔ細胞」）の表面上の分子である。実施形態では、受容体は、Ｔ細胞受容体がアルファ（α）及びベータ（β）鎖を含むことを意味する、αβ−ＴＣＲ受容体であり、典型的には、ＣＤ３鎖分子との複合体の一部として発現される。従って、「αβ−ＴＣＲ＋Ｔ細胞」は、α及びβ鎖を含むその表面上にＴ細胞受容体を含有するＴリンパ球である。α及びβ鎖の両方は、非常に可変であるが、Ｔ細胞受容体α鎖は、定常（保存領域）、すなわち、Ｖａ２４−Ｊａ１８ジャンクション（アミノ酸配列ＧＳＴＬＧＲ（配列番号１））を含有する。
【００４６】
本発明の「結合分子」または「抗原結合分子」は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。１つの実施形態では、結合分子は、ＴＣＲ、例えば、Ｔ細胞受容体、例えば、Ｔ細胞受容体α鎖に特異的に結合する。実施形態では、結合分子は、Ｔ細胞受容体α鎖のＶａ２４−Ｊａ１８ジャンクション（アミノ酸配列ＧＳＴＬＧＲ（配列番号１））に特異的に結合する。別の実施形態では、本発明の結合分子は、親和性を増加させるために点突然変異を含む抗体またはその抗原結合断片である。別の実施形態では、本発明の結合分子は、抗体分子の少なくとも１つの重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、１つ以上の抗体分子に由来する少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、１つ以上の抗体分子に由来する少なくとも３つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、１つ以上の抗体分子に由来する少なくとも４つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、１つ以上の抗体分子に由来する少なくとも５つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、１つ以上の抗体分子に由来する少なくとも６つのＣＤＲを含む。
【００４７】
本発明は、ある特定の抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体に関する。具体的に天然抗体などのフルサイズ抗体について言及している場合を除いて、「抗ＴＣＲ抗体」という用語は、フルサイズ抗体ならびにこのような抗体、例えば、天然抗体もしくは免疫グロブリン分子の抗原結合断片、変種、類似体、もしくは誘導体、または抗体分子と同様に抗原に結合する操作された抗体分子もしくは断片を含む。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「ヒト」抗体または「完全ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、または下記のように、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載のように１つ以上のヒト免疫グロブリンの遺伝子が導入されているが、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。「ヒト」抗体または「完全ヒト」抗体はまた、少なくとも重鎖可変ドメインを含むか、または少なくとも重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、可変ドメイン（複数可）は、ヒト免疫グロブリン可変ドメイン（複数可）のアミノ酸配列を有する。
【００４９】
「ヒト」抗体または「完全ヒト」抗体はまた、本明細書に記載の抗体分子（例えば、ＶＨ領域及び／またはＶＬ領域）の変種（誘導体を含む）を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなり、抗体またはその断片がＴＣＲまたはその断片もしくは変種に免疫特異的に結合する、前記の「ヒト」抗体または「完全ヒト」抗体を含む。アミノ酸を置換する部位特異的変異誘発及びＰＣＲを介した変異誘発を含むが、これに限定されない、当業者に公知の標準的な技法を用いて、ヒト抗ＴＣＲ抗体をコードするヌクレオチド配列に変異を導入することができる。好ましくは、変種（誘導体を含む）は、参照のＶＨ領域、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、またはＬＣＤＲ３を基準として、５０アミノ酸未満の置換、４０アミノ酸未満の置換、３０アミノ酸未満の置換、２５未満のアミノ酸未満の置換、２０アミノ酸未満の置換、１５アミノ酸未満の置換、１０アミノ酸未満の置換、５アミノ酸未満の置換、４アミノ酸未満の置換、３アミノ酸未満の置換、または２アミノ酸未満の置換をコードする。
【００５０】
ある特定の実施形態では、アミノ酸置換は、以下でさらに議論される保存的アミノ酸置換である。あるいは、突然変異は、例えば、飽和突然変異誘発によって、コード配列の全てまたは一部に沿って無作為に導入されてもよく、活性を保持している変種を同定するために、結果として得られた変種は、生物学的活性（例えば、ＴＣＲポリペプチド、例えば、ヒトＴＣＲ、マウスＴＣＲ、またはヒトＴＣＲ及びマウスＴＣＲの両方に結合する能力）についてスクリーニングされてもよい。「ヒト」抗体または「完全ヒト」抗体のこのような変種（またはその誘導体）はまた、「最適化された」または「抗原結合に最適化された」ヒト抗体または完全ヒト抗体と呼ばれることもあり、抗原に対する親和性が改善した抗体を含む。
【００５１】
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において同義に用いられる。抗体または免疫グロブリンは、少なくとも重鎖可変ドメインを含み、通常、少なくとも重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。脊椎動物系における免疫グロブリン基本構造は、かなりよく理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。
【００５２】
以下でさらに詳細に議論するように、「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に区別することができる様々な広範囲のクラスのポリペプチドを含む。当業者であれば、重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンと分類され、これらの中にはいくつかのサブクラス（例えば、ガンマ１〜ガンマ４）があると理解するだろう。抗体の「クラス」を、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥと決めるのは、この鎖がどういったものであるかということである。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などは、はっきり特徴付けられており、機能の専門化を付与することが知られている。本開示を考慮すれば、これらのクラス及びアイソタイプのそれぞれの改変バージョンは当業者であれば容易に認めることができ、従って、本発明の範囲内である。明らかに、全ての免疫グロブリンクラスが本発明の範囲内である。以下の考察は、概して、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関するものであろう。ＩｇＧについて、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量が約２３，０００ダルトンの２本の同一の軽鎖ポリペプチド、及び分子量が５３，０００〜７０，０００の２本の同一の重鎖ポリペプチドを含む。４本の鎖は、典型的には、「Ｙ」立体配置をとってジスルフィド結合しており、軽鎖は、「Ｙ」の口元から始まり可変領域まで延びて重鎖の添え木となる。
【００５３】
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖のクラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかと結合してもよい。一般的に、軽鎖及び重鎖は互いに共有結合しており、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子操作された宿主細胞によって産生された時には、２本の重鎖の「テール」部分は、ジスルフィド共有結合または非共有結合によって互いに結合している。重鎖のアミノ酸配列は、Ｙ立体配置の二またに分かれた末端にあるＮ末端から、各鎖の底部にあるＣ末端まで延びている。
【００５４】
軽鎖及び重鎖は両方とも構造及び機能に相同性のある領域に分けられる。機能上、「定常」及び「可変」という用語が用いられる。これに関して、軽鎖部分の可変ドメイン（ＶＬまたはＶＫ）及び重鎖部分の可変ドメイン（ＶＨ）が抗原認識及び特異性を決定することが理解されるだろう。逆に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）は、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインのナンバリングは、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から離れるにつれて大きくなる。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分には定常領域がある；ＣＨ３ドメイン及びＣＬドメインは、実際には、それぞれ、重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００５５】
前記のように、可変領域があると、抗体は抗原にあるエピトープを選択的に認識し、抗原にあるエピトープに特異的に結合することが可能になる。すなわち、抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインまたはこれらの可変ドメインの中にある相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが一緒になって、三次元抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この四次抗体構造は、Ｙの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。さらに具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のそれぞれにある３つのＣＤＲによって規定される。本明細書で使用する場合、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３という用語は、それぞれ、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３を指す。同様に、本明細書で使用する場合、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３という用語は、それぞれ、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、及びＶＬ  ＣＤＲ３を指す。場合によっては、例えば、ラクダ科の種に由来する、またはラクダ科の免疫グロブリンに基づいて操作された、ある特定の免疫グロブリン分子では、完全な免疫グロブリン分子は重鎖のみからなり、軽鎖が無いことがある。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）を参照されたい。
【００５６】
天然抗体において、それぞれの抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」は、抗体が水環境内で三次元立体配置をとる時に抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置される短く非連続のアミノ酸配列である。抗原結合ドメインにある残りのアミノ酸は「フレームワーク」領域と呼ばれ、分子内の変化がより少ない。フレームワーク領域は、主にシート立体構造をとり、ＣＤＲは、βシート構造をつなぐループを形成し、場合によっては、βシート構造の一部を形成する。従って、フレームワーク領域は、非共有結合性の鎖間相互作用によってＣＤＲを正しい方向に配置する足場を形成するように働く。配置されたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を規定する。この相補的な表面は、抗体とそのコグネイトエピトープとの非共有結合を促進する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域を含むアミノ酸は、それぞれ正確に定められているので（以下を参照されたい）、当業者であれば、所定の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインについてＣＤＲ及びフレームワーク領域を含むアミノ酸を容易に特定することができる。
【００５７】
当該技術分野において用いられる、及び／または受け入れられている用語の２つ以上の定義がある場合、本明細書で使用する用語の定義は、はっきりと反対のことが述べられている場合を除いて、このような全ての意味を含むことが意図される。具体例は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語が、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域の中に見られる非連続の抗原結合部位について述べるために用いられることである。この特定の領域は、参照により本明細書に組み入れられる、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」及びＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）によって説明され、Ｋｕｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４０：Ｗ５２１−Ｗ５２４（２０１２）によって最近更新されており、ここでは、これらの定義は、互いに比較した時にアミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体またはその変種のＣＤＲを言うために一方の定義を用いても、本明細書において定義及び使用されたような用語の範囲の中にあると意図される。前記で引用された各参考文献によって定義されたようなＣＤＲを含む適切なアミノ酸残基を、比較として下記の表１に示す。ある特定のＣＤＲを含む正確な残基番号は、ＣＤＲの配列及びサイズに応じて異なる。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列があれば、どの残基が特定のＣＤＲを構成するか日常的に確かめることができる。
【００５８】
Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．は、どの抗体にも適用可能な可変ドメイン配列のナンバリングシステムを定めた。当業者であれば、配列そのものの他にどの実験データにも頼ることなく、この「Ｋａｂａｔナンバリング」システムを任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用する場合、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」に記載のナンバリングシステムを指す。
【００５９】
Ｋｕｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４０：Ｗ５２１−Ｗ５２４（２０１２）は、配列または構造に基づいて、抗体中の抗原結合領域を系統的に同定するためのオンラインツール、Ｐａｒａｔｏｍｅを開示した。通常、Ｐａｒａｔｏｍｅベース分析は、Ｋａｂａｔナンバリングと一致するが、従来のＣＤＲに隣接する残基も含み得る。特別の定めがない限り、本発明の抗ＴＣＲ抗体ＣＤＲまたはその抗原結合断片、変種、または誘導体における特定のアミノ酸残基位置のナンバリングに関する言及は、Ｐａｒａｔｏｍｅ同定に基づいたナンバリングシステムに準じたものである。
【００６０】
本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬドメインまたはＶＨドメインを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生された断片、ならびに抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書において開示された抗ＴＣＲ抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）が含まれるが、これに限定されない。ＳｃＦｖ分子は当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２など）、またはサブクラスのものでよい。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「重鎖部分」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中部、及び／または下部のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその変種もしくは断片の少なくとも１つを含む。例えば、本発明において使用するための結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、及びＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含んでもよい。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明において使用するための結合ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全てまたは一部）を欠いてもよい。前記で示したように、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）は、アミノ酸配列の点で天然免疫グロブリン分子と異なるように改変されてもよいことが当業者に理解されるだろう。
【００６２】
本明細書において開示された、ある特定の抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体において、多量体の１本のポリペプチド鎖の重鎖部分は、多量体の第２のポリペプチド鎖にある重鎖部分と同一である。あるいは、本発明の重鎖部分を含有する単量体は、同一ではない。例えば、本発明の重鎖部分含有単量体は同一でない。例えば、それぞれの単量体は、異なる標的結合部位、例えば、二重特異性抗体を形成する異なる標的結合部位を含んでもよい。
【００６３】
本明細書において開示された診断方法及び処置方法において使用するための結合分子の重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来してもよい。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に由来するＣ．ｓｕｂ．Ｈ１ドメイン及びＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含んでもよい。別の例では、重鎖部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、一部がＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含んでもよい。別の例では、重鎖部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、一部がＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含んでもよい。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「軽鎖部分」という用語は、免疫グロブリン軽鎖、例えば、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖部分は、ＶＬドメインまたはＣＬドメインの少なくとも１つを含む。
【００６５】
本明細書において開示された抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、これらが認識または特異的に結合する、抗原、例えば、本明細書において開示された標的ポリペプチド（例えば、ＴＣＲ）のエピトープ（複数可）または部分（複数可）の観点から説明または特定されてもよい。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的ポリペプチド部分が、「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的ポリペプチドは、１個のエピトープを含んでもよく、典型的には少なくとも２個のエピトープを含み、抗原のサイズ、立体構造、及びタイプに応じて任意の数のエピトープを含むことができる。さらに、標的ポリペプチドにある「エピトープ」は、非ポリペプチドエレメントでもよく、またはそれを含んでもよく、例えば、エピトープは、炭水化物側鎖を含んでもよいことに留意すべきである。
【００６６】
抗体に対するペプチドまたはポリペプチドエピトープの最小サイズは、約４〜５個のアミノ酸と考えられている。ペプチドまたはポリペプチドエピトープは、好ましくは少なくとも７個、より好ましくは少なくとも９個、最も好ましくは少なくとも約１５〜約３０個のアミノ酸を含有する。ＣＤＲは、三次構造の形で抗原性のペプチドまたはポリペプチドを認識することができるので、エピトープを含むアミノ酸は、連続している必要はなく、場合によっては、同じペプチド鎖にさえなくてもよい。本発明の抗ＴＣＲ抗体によって認識されるペプチドまたはポリペプチドエピトープは、ＴＣＲの少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、より好ましくは少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５、または約１５〜約３０個の連続したまたは非連続のアミノ酸の配列を含有してもよい。
【００６７】
「特異的に結合する」とは、一般的に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合することを意味し、結合が、抗原結合ドメインとエピトープとのある程度の相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、抗体は、ランダムな関連しないエピトープに結合するより容易に抗体の抗原結合ドメインを介してエピトープに結合する時に、エピトープに「特異的に結合する」と言われる。「特異性」という用語は、ある特定の抗体がある特定のエピトープに結合する相対親和性を評価するために本明細書において用いられる。例えば、抗体「Ａ」は、ある特定のエピトープに対して抗体「Ｂ」より高い特異性を有すると考えられてもよく、抗体「Ａ」は、関連エピトープ「Ｄ」より高い親和性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言われてもよい。
【００６８】
「優先的に結合する」とは、関連した、類似の、相同の、または似ているエピトープにより容易に、抗体がエピトープに特異的に結合することを意味する。従って、所定のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、関連エピトープと交差反応することがあっても、このエピトープに結合する可能性が関連エピトープより高いだろう。
【００６９】
非限定的な例として、抗体は、第２のエピトープに対する抗体の解離定数（ＫＤ）より低いＫＤで第１のエピトープに結合すれば、第１のエピトープに優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な例では、抗体は、第２のエピトープに対する抗体のＫＤより少なくとも１桁低い親和性で第１のエピトープに結合すれば、第１のエピトープに優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な例では、抗体は、第２のエピトープに対する抗体のＫＤより少なくとも２桁低い親和性で第１のエピトープに結合すれば、第１のエピトープに優先的に結合するとみなすことができる。
【００７０】
別の非限定的な例では、抗体は、第２のエピトープに対する抗体のオフレートｋ（ｏｆｆ）より低いオフレート（ｋ（ｏｆｆ））で第１のエピトープに結合すれば、第１のエピトープに優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な例では、抗体は、第２のエピトープに対する抗体のｋ（ｏｆｆ）より少なくとも１桁低い親和性で第１のエピトープに結合すれば、第１のエピトープに優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な例では、抗体は、第２のエピトープに対する抗体のｋ（ｏｆｆ）より少なくとも２桁低い親和性で第１のエピトープに結合すれば、第１のエピトープに優先的に結合するとみなすことができる。本明細書において開示された抗体、または抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×１０−３秒−１、もしくは１０−３秒−１より低いオフレート（ｋ（ｏｆｆ））またはこれに等しいオフレート（ｋ（ｏｆｆ））で、本明細書において開示された標的ポリペプチド（例えば、ＴＣＲ、例えば、ヒトＴＣＲ、マウスＴＣＲ、もしくはヒトＴＣＲ及びマウスＴＣＲの両方）またはその断片もしくは変種に結合すると言うことができる。より好ましくは、本発明の抗体は、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１、または１０−５秒−１、５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１、または１０−７秒−１より低いオフレート（ｋ（ｏｆｆ）またはこれに等しいオフレート（ｋ（ｏｆｆ））で、本明細書において開示された標的ポリペプチド（例えば、ＴＣＲ、例えば、ヒトＴＣＲ、マウスＴＣＲ、もしくはヒトＴＣＲ及びマウスＴＣＲの両方）またはその断片もしくは変種に結合すると言うことができる。
【００７１】
本発明の抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、「多重特異性」、例えば、二重特異性、三重特異性でもよく、さらに大きな多重特異性でもよい。これは、１つ以上の異なる抗原（例えば、タンパク質）に存在する２つ以上の異なるエピトープを同時に認識する、またはこれらに結合することを意味する。従って、抗ＴＣＲ抗体が「単一特異性」か「多重特異性」、例えば、「二重特異性」かどうかは、結合ポリペプチドが反応する異なるエピトープの数を指している。多重特異性抗体は、本明細書に記載の標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異性があってもよく、標的ポリペプチドならびに異種エピトープ、例えば、異種ポリペプチドまたは固体支持体材料に対して特異性があってもよい。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「結合価（ｖａｌｅｎｃｙ）」という用語は、結合ポリペプチドまたはＴＣＲ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片に存在する潜在的な結合ドメイン、例えば、抗原結合ドメインの数を指す。それぞれの結合ドメインは１つのエピトープに特異的に結合する。結合ポリペプチドまたはＴＣＲ結合分子が複数の結合ドメインを含む時には、それぞれの結合ドメインは同じエピトープに特異的に結合してもよく、２つの結合ドメインがある抗体については「二価単一特異性」と呼ばれ、異なるエピトープに特異的に結合してもよく、２つのドメインを有する抗体については「二価二重特異性」と呼ばれる。抗体またはその抗原結合断片はまた二重特異性であり、かつそれぞれの特異性について二価でもよい（「二重特異性四価抗体」と呼ばれる）。別の実施形態では、四価ミニボディまたはドメイン欠失抗体を作製することができる。
【００７３】
二重特異性二価抗体及びこれを作る方法は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号；同第５，８０７，７０６号；同第５，８２１，３３３号；ならびに米国特許出願公開第２００３／０２０７３４号及び同第２００２／０１５５５３７号に記載されている。これらの全ての開示が参照により本明細書に組み入れられる。二重特異性四価抗体及びこれを作る方法は、例えば、ＷＯ０２／０９６９４８及びＷＯ００／１４７８８に記載されている。これらの両方の開示が参照により本明細書に組み入れられる。概略については、ＰＣＴ公報であるＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４，４７１，８９３号；同第４，７１４，６８１号；同第４，９２５，６１８号；同第５，５７３，９２０号；同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい。
【００７４】
前記で示したように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造及び三次元立体配置が周知である。本明細書で使用する場合、「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、「ＣＨ１ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖の最初の（最もアミノ末端側にある）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接しており、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端側にある。
【００７５】
本明細書で使用する場合、「ＣＨ２ドメイン」という用語は、例えば、従来の番号付けの手法を用いて抗体の約残基２４４〜残基３６０（残基２４４〜３６０、Ｋａｂａｔナンバリングシステム；及び残基２３１〜３４０、ＥＵナンバリングシステム；Ｋａｂａｔ  ＥＡ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい）に及ぶ重鎖分子部分を含む。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと接近して対になっていない点で独特である。もっと正確に言うと、インタクトな自然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に２本のＮ結合型の分枝した炭水化物鎖が配置されている。ＣＨ３ドメインは、ＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端に及んでおり、約１０８個の残基を含むことも詳細に記録が残されている。
【００７６】
本明細書で使用する場合、「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインをつなぐ重鎖分子部分を含む。このヒンジ領域は約２５個の残基を含み、可動性がある。従って、２つのＮ末端抗原結合領域は独立して動くことができる。ヒンジ領域は、３つの特異なドメイン：上部ヒンジ領域、中央ヒンジ領域、及び下部ヒンジ領域にさらに分けることができる（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３（１９９８））。
【００７７】
本明細書で使用する場合、「ジスルフィド結合」という用語は、２個の硫黄原子間で形成された共有結合を含む。アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成するか、もう１つのチオール基と架橋することができるチオール基を構成する。ほとんどの天然ＩｇＧ分子において、ＣＨ１領域及びＣＬ領域は、ジスルフィド結合によって連結され、２本の重鎖は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを用いた場合、２３９及び２４２に対応する位置（位置２２６または２２９、ＥＵナンバリングシステム）にある２個のジスルフィド結合によって連結されている。
【００７８】
本明細書で使用する場合、「キメラ抗体」という用語は、免疫反応性領域または免疫反応性部位が第１の種から得られているか、または由来し、定常領域が第２の種から得られている（インタクトでもよく、部分的なものでもよく、本発明に従って改変されてもよい）任意の抗体を意味すると考えられる。実施形態では、標的結合領域または標的結合部位は、非ヒト供給源に由来し（例えば、マウスまたは霊長類）、定常領域は、ヒトである。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「操作された抗体」という用語は、重鎖もしくは軽鎖またはその両方における可変ドメインが、既知の特異性の抗体に由来する１つ以上のＣＤＲの少なくとも部分的置換によって変えられ、必要に応じて、部分的なフレームワーク領域置換及び配列変化によって変えられている抗体を指す。ＣＤＲは、フレームワーク領域が得られた抗体と同じクラスさらにはサブクラスの抗体に由来してもよいが、ＣＤＲは、異なるクラスの抗体から、好ましくは、異なる種に由来する抗体から得られると想定される。既知の特異性の非ヒト抗体に由来する１つ以上の「ドナー」ＣＤＲがヒト重鎖フレームワーク領域または軽鎖フレームワーク領域に移植されている操作された抗体は、本明細書において「ヒト化抗体」と呼ばれる。ある可変ドメインの抗原結合能力を別の可変ドメインに移すために、ＣＤＲの全てを、ドナー可変ドメインに由来する完全なＣＤＲと交換することは必要でない場合がある。逆に、標的結合部位の活性を維持するのに必要な残基を移すことだけ必要な場合がある。
【００８０】
さらに、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはその両方における可変ドメインの中にあるフレームワーク領域がヒト由来残基しか含まない場合があることが認められており、この場合、ヒト化抗体のこれらのフレームワーク領域は「完全ヒトフレームワーク領域」と呼ばれる。あるいは、必要に応じて、正しい結合を維持するために、またはＴＣＲ抗原との結合を増強するために、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはその両方における可変ドメインのヒトフレームワーク領域（複数可）の対応する位置の中にある、ドナー可変ドメインのフレームワーク領域（複数可）の１つ以上の残基が操作されてもよい。従って、このように操作されているヒトフレームワーク領域は、ヒトフレームワーク残基及びドナーフレームワーク残基の混合物を含み、本明細書において「部分的ヒトフレームワーク領域」と呼ばれる。
【００８１】
例えば、抗ＴＣＲ抗体のヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従って、ヒト抗ＴＣＲ抗体の対応する配列を、げっ歯類または変異体げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置換することによって行うことができる。参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；同第５，８５９，２０５号も参照されたい。結果として生じたヒト化抗ＴＣＲ抗体は、ヒト化抗体の重鎖及び／または軽鎖の可変ドメインの完全ヒトフレームワーク領域の中に少なくとも１つのげっ歯類ＣＤＲまたは変異体げっ歯類ＣＤＲを含むだろう。場合によっては、ヒト化抗ＴＣＲ抗体の１つ以上の可変ドメインのフレームワーク領域の中にある残基は、対応する非ヒト（例えば、げっ歯類）残基によって交換される（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；及び同第６，１８０，３７０号を参照されたい）。この場合、結果として生じたヒト化抗ＴＣＲ抗体は、重鎖及び／または軽鎖の可変ドメインの中に部分的ヒトフレームワーク領域を含むだろう。
【００８２】
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体の性能をさらに改良するために（例えば、望ましい親和性を得るために）加えられる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、及び典型的に２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ここで、ＣＤＲの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲに対応し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である。ヒト化抗体はまた、任意で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、参照により本明細書に組み入れられる、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｉｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。従って、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に小さい配列が非ヒト種に由来する対応配列によって置換されている抗体を含んでもよい。実際には、ヒト化抗体は、典型的に、一部のＣＤＲ残基、場合によっては一部のフレームワーク残基が、げっ歯類抗体の類似部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体である。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；第５，８５９，２０５号を参照されたい。ヒト化抗体及び所定の抗原に対する親和性が改善したヒト化抗体を産生するための技法が開示されている、米国特許第６，１８０，３７０号及び国際公開公報第０１／２７１６０号も参照されたい。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「連結した」、「融合した」、または「融合」という用語は、同義に用いられる。これらの用語は、化学的結合または組換え手段を含むどんな手段でも、２つ以上の要素または成分を一緒に結び付けることを指す。「インフレーム融合」は、２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を結び付けて、元のＯＲＦの正しい翻訳読み枠を維持するように、連続したさらに長いＯＲＦを形成することを指す。従って、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含有する１つのタンパク質である（これらのセグメントは、通常、天然では、このようにつながっていない）。従って、リーディングフレームは、融合セグメント全体を通して連続しているが、セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列によって物理的または空間的に分離されてもよい。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドは、インフレームで融合しているが、「融合した」ＣＤＲが連続したポリペプチドの一部として同時翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域またはさらなるＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって分離されてもよい。
【００８４】
ポリペプチドの文脈において、「直線配列」または「配列」は、配列内で互いに隣接する残基がポリペプチドの一次構造において連続している、アミノ末端からカルボキシル末端方向へのポリペプチド内のアミノ酸の順序である。
【００８５】
本明細書で使用する場合、「発現」という用語は、遺伝子が、生化学的因子、例えば、ポリペプチドを産生するプロセスを指す。このプロセスは、遺伝子ノックダウンならびに一過的発現及び安定発現を含むが、それに限定されるわけではない、細胞内での遺伝子の機能的存在の現れを含む。発現は、遺伝子からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写、及びこのようなｍＲＮＡからポリペプチド（複数可）への翻訳を含むが、それに限定されるわけではない。望ましい最終産物が生化学的因子であれば、発現は、この生化学的因子及び任意の前駆体の生成を含む。遺伝子発現によって「遺伝子産物」が産生される。本明細書で使用する、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって生成されるメッセンジャーＲＮＡでもよく、転写物から翻訳されたポリペプチドでもよい。さらに、本明細書に記載の遺伝子産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化が加えられた核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの結合、タンパク質切断などが加えられたポリペプチドを含む。
【００８６】
本明細書で使用する場合、「処置する」または「処置」という用語は、治療的処置及び予防的処置または防止的処置の両方を指す。予防的処置もしくは防止的処置では、望ましくない生理学的変化または生理学的障害、例えば、多発性硬化症、関節炎、または癌の進行を阻止及び／または遅らせる（弱める）ことを目的とする。有益なまたは望ましい臨床結果には、検出可能でも検出不可能でも、症状の軽減、疾患の程度の低下、疾患の安定した（すなわち、悪化していない）状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の回復または寛解、及び軽快（部分的または全面的）が含まれるが、これに限定されない。「処置」はまた、処置を受けていない場合の期待生存率と比較して生存期間を延ばすことも意味する。処置を必要とする人には、状態または障害に既に罹患している人、ならびに状態もしくは障害に罹患しやすい人、または状態もしくは障害を予防しようとする人が含まれる。
【００８７】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後、または療法が所望される任意の対象、特に、哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、家畜動物、農場動物、動物園動物、競技動物、またはペットの動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛などが含まれる。
【００８８】
本明細書で使用する場合、「抗ＴＣＲ抗体の投与から利益を得る対象」及び「処置を必要とする動物」及び「処置を必要とする対象」という句は、例えば、抗ＴＣＲポリペプチドの検出（例えば、診断手順のため）のために、例えば、Ｔ細胞の特定の集団を数値拡張のためにインビボで刺激することに、使用される抗ＴＣＲ抗体の投与から、及び／または抗ＴＣＲ抗体を用いた疾患の処置、すなわち寛解もしくは予防のために使用された抗ＴＣＲ抗体の投与から利益を得る対象、例えば、哺乳動物対象を含む。本明細書においてさらに詳述するように、抗ＴＣＲ抗体は、非結合体の形で用いられてもよく、例えば、薬物、プロドラッグ、または同位体と結合されてもよい。
【００８９】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の特定の実施形態を示す一方で、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正はこの詳細な説明から当業者に明らかとなるため、説明するためだけに示されていることを理解されたい。
【００９０】
ＩＩ．導入
特定の抗原（例えば、腫瘍関連抗原）を標的にするＴ細胞を採用する治療薬は、癌から感染症までの様々な疾患を処置するために現在調査中である。しかしながら、これらの剤の複雑さは、Ｔ細胞の精製、増殖及び／または活性化のための専用ツールを必要とする。本出願の実施形態は、中程度の親和性によるＴＣＲへの結合を特に介して、Ｔ細胞に特異的に結合し、これを用いて、Ｔ細胞により認識されるエピトープとは独立して、Ｔ細胞を選択的に精製、繁殖、及び／または活性化することができる、抗体またはその抗原結合断片、例えば、ｓｃＦｖを提供する。例えば、一態様では、ＴＣＲα鎖に特異的に結合し、複数のＴ細胞エピトープを認識するＴ細胞に関与する抗体を提供する。改変された７９Ａ−１５（「Ｓ１５」）、７９Ａ−１１（「Ｓ１１」）、７９Ａ−１３（「Ｓ１３」）、７９Ａ−２３（「Ｓ２３」）モノクローナル抗体は、例えば、αβ−ＴＣＲに関与するように特定の立体配置内で、ＴＣＲαに特異的に結合する。この立体配座の特異的結合を使用して、Ｔ細胞を分析、単離、または繁殖、及び／または活性化する。実施形態の細胞表面抗ＴＣＲ抗体を含むＫ５６２細胞などのａＡＰＣを使用して、一次Ｔ細胞集団を活性化し、そのため繁殖することができる。（例えば、図７を参照）。本発明のいくつかの態様では、Ｋ５６２細胞は、ＨＬＡＣ陽性であり、他の態様では、Ｋ５６２細胞は、ＨＬＡＣ陰性である。さらに、抗ＴＣＲ抗体を発現するそのようなａＡＰＣにより拡張されたＴ細胞集団は、ポリクローナルＴ細胞レパートリーを包含する多種多様なクローン型を示している（図８〜１０）。さらに、ＴＣＲ特異的ｓｃＦｖを介したＴ細胞の最適刺激は、現在流行中のＴ細胞刺激の類似の他の方法よりも良くドナーＴ細胞レパートリーを保存した。従って、本明細書に詳述される方法は、一般的なＴ細胞増殖のための新しい方法を提供する。
【００９１】
ＩＩＩ．標的ポリペプチド
実施形態では、本発明の結合分子は、α及びβ鎖を含有するＴ細胞受容体（αβ−ＴＣＲ）に特異的に結合する。実施形態では、本発明の結合分子は、Ｔ細胞受容体α鎖のＶａ２４−Ｊ１８ジャンクション領域（ＧＳＴＬＧＲ（配列番号１））に位置する、ＴＣＲα鎖の不変異領域に特異的に結合する。実施形態では、Ｔ細胞は、αβ−ＴＣＲ＋Ｔ細胞中のＴＣＲアルファ鎖特異的結合分子を介したαβ−ＴＣＲ架橋によって、拡張及び／または活性化することができる。従って、実施形態では、本発明の結合分子は、Ｔ細胞のクローン型にかかわらず、不変種ＧＳＴＬＧＲ（配列番号１）を含有するＴＣＲに特異的に結合する。
【００９２】
ＩＶ．抗ＴＣＲ抗体
ある特定の実施形態では、ＴＣＲポリペプチドに結合し、Ｔ細胞成長をエクスビボで刺激する抗体またはその断片である。ある特定の態様では、本明細書で提供される抗体は、ＴＣＲにより認識されるエピトープから本質的に独立してＴＣＲに結合し、これを使用して、様々なクローン型を有するＴ細胞の増殖を刺激することができる。抗体は、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、もしくは抗原結合抗体断片または天然もしくは合成リガンドからなる群から選択することができる。好ましくは、抗ＴＣＲ抗体は、モノクローナル抗体またはヒト化抗体である。
【００９３】
本実施形態に好適な抗体断片の例としては、限定されないが、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる「Ｆｄ」断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなる「Ｆｖ」断片；（ｉｖ）ＶＨドメインからなる「ｄＡｂ」断片；（ｖ）単離ＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの結合Ｆａｂ断片を含む二価断片のＦ（ａｂ’）２断片；（ｖｉｉ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、２つのドメインを会合させて結合ドメインを形成するペプチドリンカーにより結合している一本鎖Ｆｖ分子（「ｓｃＦｖ」）；（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（米国特許第５，０９１，５１３号を参照）；ならびに（ｉｘ）遺伝子融合により構築される多価または多重特異性断片のダイアボディ（米国特許出願公開第２００５０２１４８６０号）が挙げられる。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはダイアボディ分子は、ＶＨ及びＶＬドメインを結合させるジスルフィド架橋の取り込みにより安定化させることができる。ＣＨ３ドメインに結合しているｓｃＦｖを含むミニボディを作製することもできる（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【００９４】
抗体様結合ペプチド模倣体も、実施形態では企図される。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）は、削減抗体として作用し、より長い血清半減期及びより煩雑でない合成法のある利点を有するペプチドである「抗体様結合ペプチド模倣体」（ＡＢｉＰ）を記載している。
【００９５】
１つの実施形態では、抗体は、キメラ抗体、例えば、異種非ヒト、ヒト、またはヒト化配列（例えば、フレームワーク及び／または定常ドメイン配列）にグラフトされた非ヒトドナーからの抗原結合配列を含む抗体である。モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖定常ドメインをヒト起源の類似のドメインにより置き換え、無傷な外来抗体の可変領域を残す方法が開発されている。あるいは、「完全ヒト」モノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックなマウス中で産生される。げっ歯類、例えば、マウス、及びヒトアミノ酸配列の両方を有する抗体可変ドメインを組換え構築することによりモノクローナル抗体の可変ドメインをよりヒト形態に変換する方法も開発されている。「ヒト化」モノクローナル抗体では、超可変ＣＤＲのみがマウスモノクローナル抗体に由来し、フレームワーク及び定常領域は、ヒトアミノ酸配列に由来する（米国特許第５，０９１，５１３号及び同第６，８８１，５５７号を参照）。げっ歯類に特徴的な抗体中のアミノ酸配列をヒト抗体の対応する位置中に見出されるアミノ酸配列により置き換えることは、治療的使用中の有害免疫反応の見込みを低減させることが考えられる。ハイブリドーマまたは抗体を産生する他の細胞は、遺伝子突然変異または他の変化に供することもでき、それはハイブリドーマにより産生される抗体の結合特異性を変更してもしなくてもよい。
【００９６】
置換型変種は、典型的には、タンパク質内の１つ以上の部位における１つのアミノ酸の別のアミノ酸への交換を含有し、ポリペプチドの１つ以上の特性を、他の機能または特性の損失の有無にかかわらずモジュレートするように設計することができる。置換は、保存的であり得、すなわち、１つのアミノ酸が類似形状または電荷の１つにより置き換えられる。保存的置換は、当該技術分野において周知であり、それとしては、例えば、アラニンのセリンへの変化；アルギニンのリジンへの変化；アスパラギンのグルタミンまたはヒスチジンへの変化；アスパラギン酸のグルタミンへの変化；システインのセリンへの変化；グルタミンのアスパラギンへの変化；グルタミン酸のアスパラギン酸への変化；グリシンのプロリンへの変化；ヒスチジンのアスパラギンまたはグルタミンへの変化；イソロイシンのロイシンまたはバリンへの変化；ロイシンのバリンまたはイソロイシンへの変化；リジンのアルギニンへの変化；メチオニンのロイシンまたはイソロイシンへの変化；フェニルアラニンのチロシンへの変化；ロイシンのメチオニンへの変化；セリンのトレオニンへの変化；トレオニンのセリンへの変化；トリプトファンのチロシンへの変化；チロシンのトリプトファンまたはフェニルアラニンへの変化；及びバリンのイソロイシンまたはロイシンへの変化が挙げられる。あるいは、置換は、ポリペプチドの機能または活性が影響を受けるように非保存的であり得る。非保存的変化は、典型的には、残基を化学的に異なるものにより置換すること、例えば、極性または荷電アミノ酸を非極性または非荷電アミノ酸により置換することを含み、逆もまた同様である。
【００９７】
タンパク質は、組換え体であり得、またはインビトロで合成することができる。あるいは、非組換えまたは組換えタンパク質は、細菌から単離することができる。このような変種を含有する細菌を組成物及び方法において実現することができることも企図される。結果的に、タンパク質は、単離される必要がない。
【００９８】
抗体または好ましくは抗体の免疫学的部分は、他のタンパク質に化学的に結合させ、または融合タンパク質として発現させることができる。本明細書及び添付の特許請求の範囲の目的のため、全てのこのような融合タンパク質は、抗体または抗体の免疫学的部分の定義に含まれる。
【００９９】
実施形態では、本発明は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０１００】
実施形態では、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、（ａ）配列番号２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ２；（ｃ）ＣＤＹＷ（配列番号２１）；ＣＡＹＷ（配列番号２３）；またはＣＡＹＬ（配列番号２２）に同一であるＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号４または配列番号９に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号５に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号６または配列番号１０に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ３を含む。実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号２に同一であるＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号３に同一であるＨＣＤＲ２；（ｃ）ＣＤＹＷ（配列番号２１）；ＣＡＹＷ（配列番号２３）；またはＣＡＹＬ（配列番号２２）に同一であるＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号４；または配列番号９に同一であるＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号５に同一であるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号６；または配列番号１０に同一であるＬＣＤＲ３を含む。
【０１０１】
本発明は、（ａ）７９Ａ−１５（配列番号２）のＶＨ  ＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ１；（ｂ）７９Ａ−１５（配列番号３）のＶＨ  ＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ２；（ｃ）７９Ａ−１５  ＣＡＹＬ（配列番号２２）のＶＨ  ＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ３；（ｄ）７９Ａ−１５（配列番号９）のＶＬ  ＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ１；（ｅ）７９Ａ−１５（配列番号５）のＶＬ  ＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）７９Ａ−１５（配列番号１０）のＶＬ  ＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ３を含む、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をさらに提供する。
【０１０２】
本発明はさらに、７９Ａ−１５（配列番号１１）のＶＨドメインに少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ−１５（配列番号１２）のＶＬドメインに少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＬドメインを含むＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する、単離抗体または抗原結合断片を提供する。実施形態では、単離抗体または抗原結合断片は、７９Ａ−１５（配列番号１１）のＶＨドメインに９０％〜９９％同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ−１５（配列番号１２）のＶＬドメインに９０％〜９９％同一であるＶＬドメインを含む。さらなる実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、７９Ａ−１５（配列番号１１）のＶＨドメインに同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ−１５（配列番号１２）のＶＬドメインに同一であるＶＬドメインを含む。
【０１０３】
本発明は、（ａ）７９Ａ−１３  ＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＮＷＶ（配列番号２）のＶＨ  ＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ１；（ｂ）７９Ａ−１３  ＷＩＧＥＩＮＰＮＮ（配列番号３）のＶＨ  ＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ２；（ｃ）７９Ａ−１３  ＣＡＹＬ（配列番号２２）のＶＨ  ＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ３；（ｄ）７９Ａ−１３  ＮＴＹＬＥＷＹ（配列番号４）のＶＬ  ＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ１；（ｅ）７９Ａ−１３  ＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）のＶＬ  ＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）７９Ａ−１３  ＭＱＧＳＨＶＰＷ（配列番号１０）のＶＬ  ＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ３を含む、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合断片をさらに提供する。さらなる実施形態では、本発明は、（ａ）ＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＮＷＶ（配列番号２）に同一であるＨＣＤＲ１；（ｂ）ＷＩＧＥＩＮＰＮＮ（配列番号３）に同一であるＨＣＤＲ２；（ｃ）ＣＡＹＬ（配列番号２２）に同一であるＨＣＤＲ３；（ｄ）ＮＴＹＬＥＷＹ（配列番号４）に同一であるＬＣＤＲ１；（ｅ）ＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）に同一であるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）ＭＱＧＳＨＶＰＷ（配列番号１０）に同一であるＬＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０１０４】
さらなる実施形態では、本発明は、７９Ａ−１３（配列番号１１）のＶＨドメインに少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ−１３（配列番号１４）のＶＬドメインに少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＬドメインを含むＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。実施形態では、単離抗体または抗原結合断片は、７９Ａ−１３（配列番号１１）のＶＨドメインに９０％〜９９％同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ−１３（配列番号１４）のＶＬドメインに９０％〜９９％同一であるＶＬドメインを含む。さらなる実施形態では、単離抗体または抗原結合断片は、７９Ａ−１３（配列番号１１）のＶＨドメインに同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ−１３（配列番号１４）のＶＬドメインに同一であるＶＬドメインを含む。
【０１０５】
本発明は、（ａ）７９Ａ−１１  ＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＮＷＶ（配列番号２）のＶＨ  ＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ１；（ｂ）７９Ａ−１１  ＷＩＧＥＩＮＰＮＮ（配列番号３）のＶＨ  ＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ２；（ｃ）７９Ａ−１１  ＣＡＹＷ（配列番号２３）のＶＨ  ＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ３；（ｄ）７９Ａ−１１  ＮＴＹＬＥＷＦ（配列番号９）のＶＬ  ＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ１；（ｅ）７９Ａ−１１  ＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）のＶＬ  ＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）７９Ａ−１１  ＭＱＧＳＨＶＰＷ（配列番号１０）のＶＬ  ＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ３を含む、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片をさらに提供する。実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）ＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＮＷＶ（配列番号２）に同一であるＨＣＤＲ１；（ｂ）ＷＩＧＥＩＮＰＮＮ（配列番号３）に同一であるＨＣＤＲ２；（ｃ）ＣＡＹＷ（配列番号２３）に同一であるＨＣＤＲ３；（ｄ）ＮＴＹＬＥＷＦ（配列番号９）に同一であるＬＣＤＲ１；（ｅ）ＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）に同一であるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）ＭＱＧＳＨＶＰＷ（配列番号１０）に同一であるＬＣＤＲ３を含む。
【０１０６】
実施形態では、本発明は、７９Ａ−１１（配列番号１３）のＶＨドメインに少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ−１１（配列番号１２）のＶＬドメインに少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＬドメインを含む、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供する。実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、７９Ａ−１１（配列番号１３）のＶＨドメインに９０％〜９９％同一であるＶＨドメイン、または７９Ａ−１１（配列番号１２）のＶＬドメインに９０％〜９９％同一であるＶＬドメインを含む。さらなる実施形態では、請求項１６に記載の単離抗体またはその抗原結合断片は、７９Ａ１１（配列番号１３）のＶＨドメインに同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ１１（配列番号１２）のＶＬドメインに同一であるＶＬドメインを含む。
【０１０７】
本発明は、（ａ）７９Ａ  ＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＮＷＶ（配列番号２）のＶＨ  ＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ１；（ｂ）７９Ａ  ＷＩＧＥＩＮＰＮＮ（配列番号３）のＶＨ  ＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ２；（ｃ）７９Ａ  ＣＤＹＷ（配列番号２１）のＶＨ  ＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ３；（ｄ）７９Ａ  ＮＴＹＬＥＷＹ（配列番号４）のＶＬ  ＣＤＲ１に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ１；（ｅ）７９Ａ  ＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）のＶＬ  ＣＤＲ２に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）７９Ａ  ＦＱＧＳＨＶＰＷ（配列番号６）のＶＬ  ＣＤＲ３に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ３を含む、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合断片をさらに提供する。実施形態では、単離抗体または抗原結合断片は、（ａ）ＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＮＷＶ（配列番号２）に同一であるＨＣＤＲ１；（ｂ）ＷＩＧＥＩＮＰＮＮ（配列番号３）に同一であるＨＣＤＲ２；（ｃ）ＣＤＹＷ（配列番号２１）に同一であるＨＣＤＲ３；（ｄ）ＮＴＹＬＥＷＹ（配列番号４）に同一であるＬＣＤＲ１；（ｅ）ＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）に同一であるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）ＦＱＧＳＨＶＰＷ（配列番号６）に同一であるＬＣＤＲ３を含む。
【０１０８】
本発明は、７９Ａ（配列番号７）のＶＨドメインに少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ（配列番号８）のＶＬドメインに少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＬドメインを含む、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合断片をさらに提供する。実施形態では、単離抗体または抗原結合断片は、７９Ａ（配列番号７）のＶＨドメインに９０％〜９９％同一であるＶＨドメイン、または７９Ａ（配列番号８）のＶＬドメインに９０％〜９９％同一であるＶＬドメインを含む。実施形態では、単離抗体または抗原結合断片は、７９Ａ（配列番号７）のＶＨドメインに同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ（配列番号８）のＶＬドメインに同一であるＶＬドメインを含む。
【０１０９】
実施形態では、本発明は、（ａ）ＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＮＷＶ（配列番号１５）に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ１；（ｂ）ＷＩＧＧＩＮＰＮＮ（配列番号１６）に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＨＣＤＲ２；（ｃ）ＣＲＹＷ（配列番号１７）に同一であるＨＣＤＲ３；（ｄ）ＱＳＩＶＨＧＧＧＮＴＹ（配列番号１８）に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ１；（ｅ）ＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）ＦＱＧＳＨＶＰＷ（配列番号６）に少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＬＣＤＲ３を含む、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する、単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）ＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＮＷＶ（配列番号１５）に同一であるＨＣＤＲ１；（ｂ）ＷＩＧＧＩＮＰＮＮ（配列番号１６）に同一であるＨＣＤＲ２；（ｃ）ＣＲＹＷ（配列番号１７）に同一であるＨＣＤＲ３；（ｄ）ＱＳＩＶＨＧＧＧＮＴＹ（配列番号１８）に同一であるＬＣＤＲ１；（ｅ）ＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）に同一であるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）ＦＱＧＳＨＶＰＷ（配列番号６）に同一であるＬＣＤＲ３を含む。
【０１１０】
本発明は、７９Ａ−２３（配列番号１９）のＶＨドメインに少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ−２３（配列番号２０）のＶＬドメインに少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＬドメインを含む。実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、７９Ａ−２３（配列番号１９）のＶＨドメインに９０％〜９９％同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ−２３（配列番号２０）のＶＬドメインに９０％〜９９％同一であるＶＬドメインを含む抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片をさらに提供する。さらなる実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、７９Ａ−２３（配列番号１９）のＶＨドメインに同一であるＶＨドメイン、及び７９Ａ−２３（配列番号２０）のＶＬドメインに同一であるＶＬドメインを含む。
【０１１１】
実施形態では、本明細書で提供される抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片は、多重特異性、例えば、二重特異性である。実施形態では、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する、本明細書で提供される抗体及び抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、及び／または一本鎖である。実施形態では、本明細書で提供される抗ＴＣＲ抗体及び抗原結合断片は、多価であり、かつ、少なくとも２つの重鎖及び少なくとも２つの軽鎖を含む。実施形態では、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する、本明細書で提供される抗体及び抗原結合断片は、ヒトカッパ定常領域及びヒトラムダ定常領域からなる群から選択される軽鎖定常領域を含む。
【０１１２】
実施形態では、本明細書で提供される抗ＴＣＲ抗体及び抗原結合断片は、重鎖定常領域またはその断片を含む。実施形態では、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する、本明細書で提供される抗体及び抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、またはＩｇＤである重鎖定常領域またはその断片を含む。
【０１１３】
実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、８．４×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍを超えない解離定数（ＫＤ）により特徴付けられた親和性をもつ配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する。実施形態では、ＫＤは、約５×１０−９Ｍ〜約６×１０−９Ｍである。さらなる実施形態では、ＫＤは、約１×１０−９Ｍ〜約２×１０−９Ｍである。
【０１１４】
実施形態では、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する、本明細書で提供される抗体及び抗原結合断片は、ヒト化、霊長類化またはキメラである。実施形態では、ＴＣＲαポリペプチドに特異的に結合する、本明細書で提供される抗体及び抗原結合断片は、ヒト化である。
【０１１５】
実施形態では、本発明の抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片は、リンカーにより分離されるＶＨ及びＶＬドメインを含む。実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、膜貫通ドメインをさらに含む。実施形態では、リンカーにより分離されるＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１１、配列番号１３及び配列番号１９からなる群から選択されるポリペプチドに少なくとも９０％同一であるＶＨポリペプチドを含み、ＶＬは、配列番号１２、配列番号１４及び配列番号２０からなる群から選択されるポリペプチドに少なくとも９０％同一であるポリペプチドである。
【０１１６】
実施形態では、本明細書において開示された抗ＴＣＲ抗体または断片は、配列番号１１に少なくとも９０％同一であるＶＨポリペプチド、及び配列番号１２に少なくとも９０％同一であるＶＬポリペプチドを含有し、ＶＨ及びＶＬは、リンカーにより分離される。
【０１１７】
実施形態では、本明細書において開示された抗ＴＣＲ抗体または断片は、配列番号１３に少なくとも９０％同一であるＶＨポリペプチド、及び配列番号１２に少なくとも９０％同一であるＶＬポリペプチドを含有し、ＶＨ及びＶＬは、リンカーにより分離される。
【０１１８】
本発明は、配列番号１１に少なくとも９０％同一であるＶＨポリペプチド、及び配列番号１４に少なくとも９０％同一であるＶＬポリペプチドを含有する抗ＴＣＲ抗体または断片をさらに提供し、ＶＨ及びＶＬは、リンカーにより分離される。
【０１１９】
実施形態では、本明細書において開示された抗ＴＣＲ抗体または断片は、配列番号１９に少なくとも９０％同一であるＶＨポリペプチド、及び配列番号２０に少なくとも９０％同一であるＶＬポリペプチドを含有し、ＶＨ及びＶＬは、リンカーにより分離される。
【０１２０】
従って、実施形態では、本明細書において開示された抗ＴＣＲ抗体または抗原結合断片は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、例えば、単一ポリペプチドを形成する、リンカーにより接続されるＶＨ及びＶＬドメインを含有するヘテロ二量体である。
【０１２１】
実施形態では、リンカーは、１０〜３０個の長さのアミノ酸、１５〜２５個の長さのアミノ酸、１５及び２０個の長さのアミノ酸のポリペプチドである。実施形態では、リンカーは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２５個の長さのアミノ酸である。ｓｃＦｖに好適なリンカーは、当業者に知られている。例えば、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４ＳまたはＧｌｙ４Ｓｅｒ）の多量体は、好適なリンカーである。例示のＧ４Ｓ多量体としては、１５マー（Ｇ４Ｓ）３、及び２０マー（Ｇ４ｓ）４が挙げられる。さらなる例示のリンカーは、１８マーＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧである。エピトープタグ、またはＣｒｅ−Ｌｏｘ組換え部位を含有するコード配列、またはｓｃＦｖ特性を改善させる配列などの、機能性を加えた例示の配列もまた、リンカー配列と考えられる。
【０１２２】
Ｖ．抗ＴＣＲ抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明は、本明細書の他箇所に記載の本発明のポリヌクレオチドの断片も含む。さらに、上記の融合ポリヌクレオチド、Ｆａｂ断片、及び他の誘導体をコードするポリヌクレオチドも本発明で考えられる。
【０１２３】
ポリヌクレオチドは、当該技術分野において公知の任意の方法により産生または製造される。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知である場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学合成オリゴヌクレオチドから組み立てることができ（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載される通り）、手短に述べると、抗体をコードする配列の部分を含有する重複オリゴヌクレオチドを合成し、それらのオリゴヌクレオチドをアニール及びライゲートし、次いでライゲートされたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅を含む。
【０１２４】
あるいは、本発明の抗ＴＣＲ抗体、またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、好適な資源からの核酸から生成することができる。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンは入手可能でないが、抗体分子の配列が既知の場合、抗体をコードする核酸は、化学合成することができ、または好適な資源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体もしくは他の抗ＴＣＲ抗体を発現する任意の組織もしくは細胞、例えば、抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞から生成されたｃＤＮＡライブラリー、またはそれから単離された核酸、好ましくは、ポリＡ＋ＲＮＡ）から、配列の３’及び５’末端にハイブリダイズする合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅により、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングにより、例えば、抗体または他の抗ＴＣＲ抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定することにより得ることができる。次いで、ＰＣＲにより生成された増幅核酸を、当該技術分野において周知の任意の方法を使用して複製可能なクローニングベクター中にクローニングすることができる。
【０１２５】
抗ＴＣＲ抗体、またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列を決定したら、そのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作の分野において周知の方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異導入、ＰＣＲなどを使用して操作して（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ）に記載の技術を参照されたい、これらは両方とも参照により全体として本明細書に組み込まれる）、例えば、アミノ酸置換、欠失、及び／または挿入を作出するために異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成することができる。
【０１２６】
抗ＴＣＲ結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、未改変ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成することができる。例えば、抗ＴＣＲ抗体、またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、１本鎖及び２本鎖ＤＮＡ、１本鎖及び２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖及び２本鎖ＲＮＡ、ならびに１本鎖及び２本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖またはより典型的には２本鎖または１本鎖及び２本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成することができる。加えて、抗ＴＣＲ結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む３本鎖領域から構成することができる。抗ＴＣＲ結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾塩基または安定性もしくは他の理由のために修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格も含有し得る。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基及び特殊塩基、例えば、イノシンが含まれる。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに作製することができ；従って、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的修飾形態を包含する。
【０１２７】
免疫グロブリン（例えば、免疫グロブリン重鎖部分または軽鎖部分）に由来するポリペプチドの非天然変種をコードする単離ポリヌクレオチドは、１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされるタンパク質中に導入されるように、１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列中に導入することにより作出することができる。突然変異は、標準的な技術、例えば、部位特異的突然変異導入及びＰＣＲ媒介突然変異導入により導入することができる。好ましくは、保存アミノ酸置換は、１つ以上の非必須アミノ酸残基において作製される。
【０１２８】
実施形態では、本発明は、ＴＣＲα鎖に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドを提供し、前記抗体は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲαポリペプチドのエピトープに結合する。
【０１２９】
実施形態では、本発明は、配列番号１１、配列番号１３または配列番号１９に少なくとも９０％同一であるＶＨポリペプチドをコードする核酸を提供する。実施形態では、本発明は、配列番号１２、配列番号１４または配列番号２０に少なくとも９０％同一であるＶＬポリペプチドをコードする核酸をコードする核酸を提供する。
【０１３０】
本発明は、配列番号２または配列番号１５に同一であるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号３または配列番号１６に同一であるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；及び／または配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号１７に同一であるＨＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする核酸をさらに提供する。
【０１３１】
本発明は、配列番号４、９または１８に同一であるＬＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号５に同一であるＬＣＤＲ２アミノ酸配列をコードする核酸、及び／または配列番号６、または１０に同一であるＬＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする核酸をさらに提供する。
【０１３２】
本発明は、ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドをさらに提供し、前記ＶＨポリペプチドは、配列番号２、３、及び２１をそれぞれ含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記ＶＨポリペプチドを含む抗体または抗原断片は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する。
【０１３３】
本発明はまた、ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドを提供し、前記ＶＨポリペプチドは、配列番号２、３、及び２２をそれぞれ含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記ＶＨポリペプチドを含む抗体または抗原断片は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する。
【０１３４】
実施形態では、本発明は、ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドに関し、前記ＶＨポリペプチドは、配列番号２、３、及び２３をそれぞれ含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記ＶＨポリペプチドを含む抗体または抗原断片は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する。
【０１３５】
さらなる実施形態では、本発明は、ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドを提供し、前記ＶＨポリペプチドは、配列番号１５、１６、及び１７をそれぞれ含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記ＶＨポリペプチドを含む抗体または抗原断片は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する。
【０１３６】
本発明はさらに、実施形態では、ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドに関し、前記ＶＬポリペプチドは、配列番号４、５及び６をそれぞれ含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原断片は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する。
【０１３７】
実施形態では、本発明は、ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドを提供し、前記ＶＬポリペプチドは、配列番号９、５及び１０をそれぞれ含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原断片は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する。
【０１３８】
本発明は、ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドをさらに提供し、前記ＶＬポリペプチドは、配列番号４、５及び１０をそれぞれ含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原断片は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する。
【０１３９】
実施形態では、本発明は、ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチドを提供し、前記ＶＬポリペプチドは、配列番号１８、５及び６をそれぞれ含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原断片は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する。
【０１４０】
ＶＩ．融合タンパク質及び抗体複合体
本明細書の他の場所においてさらに詳細に議論するように、抗ＴＣＲ結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、さらに、Ｎ末端またはＣ末端において異種ポリペプチドと組換えにより融合されてもよく、ポリペプチドまたは他の組成物と化学的に結合されてもよい（共有結合及び非共有結合による結合を含む）。例えば、抗ＴＣＲ抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子及びエフェクター分子、例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種、または毒素と組換えにより融合されてもよく、結合されてもよい。例えば、ＰＣＴ国際公開公報第９２／０８４９５号；同第９１／１４４３８号；同第８９／１２６２４号；米国特許第５，３１４，９９５号；及びＥＰ３９６，３８７を参照されたい。
【０１４１】
本発明の抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、改変された誘導体、すなわち、共有結合によって抗体と標的ＴＣＲとの結合が妨げられないように、任意のタイプの分子を抗体に共有結合することによって改変された誘導体を含んでもよい。例えば、限定されるわけではないが、抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質との連結などによって改変されている抗体を含む。特異的な化学切断、アセチル化、ホルミル化などを含むが、これに限定されない公知の技法によって、非常に多くの化学修飾のうちどれでも行うことができる。さらに、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含有してもよい。
【０１４２】
抗ＴＣＲ結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、ペプチド結合または改変されたペプチド結合、すなわち、ペプチドアイソスターによって互いにつながったアミノ酸からなってもよく、遺伝子によってコードされる２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸を含有してもよい。例えば、抗ＴＣＲ抗体は、翻訳後プロセシングなどの天然プロセスによって改変されてもよく、当該技術分野において周知の化学修飾技術によって改変されてもよい。このような改変は、基本的な教科書及びさらに詳しい研究書ならびに膨大な研究論文において詳細に説明されている。ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、及びアミノ末端もしくはカルボキシル末端を含む抗ＴＣＲ結合分子のどの場所にでも、または炭水化物などの部分に改変を加えることができる。所定の抗ＴＣＲ結合分子の中のいくつかの部位において同程度または様々な程度で、同じタイプの改変が存在してもよいことが理解されるだろう。または、所定の抗ＴＣＲ結合分子は、多くのタイプの改変を含有してもよい。抗ＴＣＲ結合分子は、分枝していてもよく、例えば、ユビキチン結合の結果として分枝していてもよく、分枝して、または分枝することなく環状になっていてもよい。環状、分枝、及び分枝環状の抗ＴＣＲ結合分子は、翻訳後天然プロセスから得られてもよく、合成法によって作製されてもよい。改変には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのトランスファーＲＮＡを介したアミノ酸付加、例えば、アルギニル化、及びユビキチン結合が含まれる。（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ；２ｎｄ  ｅｄ．（１９９３）；Ｊｏｈｎｓｏｎ，ｅｄ．（１９８３）Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ），ｐｇｓ．１−１２；Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）を参照されたい）。
【０１４３】
本発明はまた、抗ＴＣＲ抗体、またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体、及び異種ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。抗体が融合する異種ポリペプチドは、抗ＴＣＲポリペプチド発現細胞を機能させるのに有用であり、または抗ＴＣＲポリペプチド発現細胞を標的にするのに有用である。例えば、ＴＣＲの結合及び／または架橋により、サイトカイン産生、増殖、及び殺傷などのＴ細胞エフェクター機能をもたらす。別の実施形態では、抗体または変異体を含むその誘導体を使用して、トランスフェクト細胞（複数可）上で融合構築物を所望の表面発現し、及び／またはエフェクター機能の改善を引き起こすキメラによって認識された所望の標的認識を可能にするヒト免疫細胞表面受容体の膜貫通ドメインに融合させてもよい。
【０１４４】
１つの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、本発明の抗体のＶＨドメインのいずれか１つ以上のアミノ酸配列または本発明の抗体のＶＬドメインのいずれか１つ以上のアミノ酸配列、またはその断片もしくは変種、及び異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。
【０１４５】
別の実施形態では、本明細書において開示された診断方法及び処置方法において使用するための融合タンパク質は、抗ＴＣＲ抗体、またはその断片、変種、もしくは誘導体のＶＨドメインのＣＤＲのいずれか１つ、２つ、または３つのアミノ酸配列、または抗ＴＣＲ抗体、またはその断片、変種、もしくは誘導体のＶＬドメインのＣＤＲのいずれか１つ、２つ、または３つのアミノ酸配列、及び異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。１つの実施形態では、融合タンパク質は、本発明の抗ＴＣＲ抗体の少なくとも１つのＶＨドメインのアミノ酸配列、及び本発明の抗ＴＣＲ抗体またはその断片、誘導体、もしくは変種の少なくとも１つのＶＬドメインのアミノ酸配列、ならびに異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含む。好ましくは、融合タンパク質のＶＨドメイン及びＶＬドメインは、ＴＣＲの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する単一供給源の抗体（またはｓｃＦｖもしくはＦａｂ断片）に対応する。さらに別の実施形態では、本明細書において開示された診断方法及び処置方法において使用するための融合タンパク質は、抗ＴＣＲ抗体のＶＨドメインのＣＤＲのいずれか１つ、２つ、３つ以上のアミノ酸配列、及び抗ＴＣＲ抗体またはその断片もしくは変種のＶＬドメインのＣＤＲのいずれか１つ、２つ、３つ以上のアミノ酸配列、ならびに異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含む。好ましくは、ＶＨドメインまたはＶＬドメインの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ以上のＣＤＲは、本発明の単一供給源の抗体（またはｓｃＦｖもしくはＦａｂ断片）に対応する。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子も本発明に含まれる。
【０１４６】
文献において報告された例示的な融合タンパク質には、Ｔ細胞受容体（Ｇａｓｅｏｉｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２９３６−２９４０（１９８７））；ＣＤ４（Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５−５３１（１９８９）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：６８−７０（１９８９）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ  ９：３４７−３５３（１９９０）；及びＢｙｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６６７−６７０（１９９０））；Ｌ−セレクチン（ホーミング受容体）（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：２２２１−２２２９（１９９０）；及びＷａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：１６４−１６７（１９９１））；ＣＤ４４（Ａｒｕｆｆｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６１：１３０３−１３１３（１９９０））；ＣＤ２８及び１３７（Ｌｉｎｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１−７３０（１９９１））；ＣＴＬＡ−４（Ｌｉｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１−５６９（１９９１））；ＣＤ２２（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６６：１１３３−１１４４（１９９１））；ＴＮＦ受容体（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２８８３−２８８６（１９９１）；及びＰｅｐｐｅｌｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３−１４８９（１９９１））；ならびにＩｇＥ受容体ａ（Ｒｉｄｇｗａｙ  ａｎｄ  Ｇｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１１５，Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．１４４８（１９９１））の融合が含まれる。
【０１４７】
本明細書の他の場所において議論するように、ポリペプチドのインビボ半減期を延ばすために、または当該技術分野において公知の方法を用いてイムノアッセイにおいて使用するために、抗ＴＣＲ結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、異種ポリペプチドと融合されてもよい。例えば、１つの実施形態では、本発明の抗ＴＣＲ抗体のインビボ半減期を延ばすために、ＰＥＧを本発明の抗ＴＣＲ抗体と結合することができる。Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：１０６（２００１）；Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：５３１（２００２）；またはＷｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０：５１２（２００２）を参照されたい。
【０１４８】
さらに、抗ＴＣＲ結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、精製または検出を容易にするために、ペプチドなどのマーカー配列と融合することができる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド、例えば、特に、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．，９１３１１）の中に入れて提供されているタグである。マーカーアミノ酸配列の多くは市販されている。Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載のように、例えば、ヘキサヒスチジンを用いると融合タンパク質が便利に精製される。精製に有用な他のペプチドタグには、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４））及び「ｆｌａｇ」タグが含まれるが、これに限定されない。
【０１４９】
融合タンパク質は、当該技術分野において周知の方法を用いて調製することができる（例えば、米国特許第５，１１６，９６４号及び同第５，２２５，５３８号を参照されたい）。融合がなされる正確な部位は、融合タンパク質の分泌または結合特性を最適化するように経験的に選択することができる。次いで、発現のために、融合タンパク質をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入する。
【０１５０】
抗ＴＣＲ結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、非結合型で用いられてもよく、様々な分子、例えば、分子の治療特性を改善する分子、標的検出を容易にする分子、または患者のイメージングもしくは療法のための分子の少なくとも１つと結合されてもよい。精製前もしくは精製後、または精製が行われている時に、抗ＴＣＲ結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を標識または結合することができる。
【０１５１】
特に、本発明の抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調節剤、薬剤、またはＰＥＧと結合されてもよい。
【０１５２】
当業者であれば、結合しようとする選択された剤に応じて様々な技法を用いて複合体を組み立てることができると理解するだろう。例えば、ビオチンとの複合体は、例えば、結合ポリペプチドと、ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのビオチン活性化エステルとの反応によって調製される。同様に、蛍光マーカーとの複合体は、カップリング剤、例えば、本明細書において列挙したカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネート、好ましくは、フルオレセイン−イソチオシアネートとの反応によって調製することができる。本発明の抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体の複合体も同様に調製される。
【０１５３】
さらに、本発明は、診断剤または治療剤と結合した、抗ＴＣＲ結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を包含する。抗ＴＣＲ抗体は、その抗原結合断片、変種、及び誘導体を含めて、臨床試験法の一部として、例えば、所定の処置法及び／または予防法の効力を確かめる臨床試験法の一部として、例えば、疾患の発症または進行をモニタリングするために診断に使用することができる。例えば、検出は、抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体と検出可能な物質とをカップリングすることによって容易にすることができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子団、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、様々な陽電子放射型断層撮影法を用いる陽電子放射金属、及び非放射性の常磁性金属イオンが含まれる。本発明による診断剤として使用するために抗体と結合することができる金属イオンについては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適切な補欠分子団複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが含まれる。適切な蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが含まれる。発光材料の一例にはルミノールが含まれる。生物発光材料の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが含まれる。適切な放射性材料の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、または９９Ｔｃが含まれる。
【０１５４】
抗ＴＣＲ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、細胞毒、治療剤、または放射性金属イオンなどの治療部分と結合されてもよい。細胞毒または細胞傷害剤には、細胞に有害な任意の剤が含まれる。
【０１５５】
抗ＴＣＲ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体はまた、化学発光または蛍光化合物などのレポーターとカップリングすることによって検出可能に標識することもできる。次に、標識された抗ＴＣＲ結合分子の存在は、化学反応中に生じた発光の存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、及びシュウ酸エステルである。
【０１５６】
抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を検出可能に標識することができる手法の１つは、これらと酵素を連結し、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）において連結産物を使用することによる手法である（Ｖｏｌｌｅｙ，Ａ．，「Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）」ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ２：１−７（１９７８）；Ｖｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）；Ｍａｇｇｉｏ，ｅｄ．（１９８０）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．；Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８１）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｋｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ，Ｔｏｋｙｏ）。酵素は、抗ＴＣＲ抗体に結合しており、例えば、分光光度法、蛍光測定法、または視覚的手段によって検出可能な化学部分を生じるように、適切な基質、好ましくは、発色基質と反応する。抗体を検出可能に標識するのに使用することができる酵素には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これに限定されない。さらに、検出は、酵素の発色基質を用いる比色法によって達成することができる。検出はまた、同じように調製された標準と比較して基質の酵素反応の程度を視覚的に比較することによって達成することもできる。
【０１５７】
検出はまた、様々な他のイムノアッセイのいずれを用いても達成することができる。例えば、抗ＴＣＲ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を放射性標識することによって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いて結合分子を検出することができる（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ（Ｍａｒｃｈ，１９８６）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）を参照されたい）。放射性同位体は、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、またはオートラジオグラフィーを含むが、これに限定されない手段によって検出することができる。
【０１５８】
抗ＴＣＲ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体はまた、１５２Ｅｕなどの蛍光放出金属またはランタニド系列の他の蛍光放出金属を用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート基を用いて結合分子に取り付けることができる。
【０１５９】
様々な部分と、抗体（例えば、抗ＴＣＲ抗体）またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を結合するための技法は周知である。例えば、Ａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ．Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．），ｐｐ．２４３−５６；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｅｄ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．），ｐｐ．６２３−５３）；Ｔｈｏｒｐｅ（１９８５）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｅｄ．Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ｐｐ．４７５−５０６；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ．Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．３０３−１６（１９８５）；及びＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇ」，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８を参照されたい。
【０１６０】
ＶＩＩ．抗ＴＣＲ抗体ポリペプチドの発現
抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ配列は、周知の方法に従って逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを用いて同時にまたは別々に作製することができる。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマーによって開始されてもよく、公開された重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列に基づく、さらに特異性のあるプライマーによって開始されてもよい。前記で議論したように、抗体軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するために、ＰＣＲも使用することができる。この場合、コンセンサスプライマーまたはさらに大きな相同プローブ、例えば、マウス定常領域プローブによってライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０１６１】
ＤＮＡ、典型的には、プラスミドＤＮＡを、当該技術分野において公知の技法を用いて細胞から単離し、例えば、組換えＤＮＡ技術に関する前述の参考文献に詳述された標準的な周知の技法に従って制限地図を作製し、配列決定することができる。もちろん、ＤＮＡは、単離プロセスまたは後の分析の間のどの時点であっても本発明に従って合成ＤＮＡでもよい。
【０１６２】
本発明の抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を得るために、単離された遺伝物質を操作した後に、抗ＴＣＲ抗体をコードするポリヌクレオチドは、典型的には、望ましい量の抗ＴＣＲ抗体を産生するのに使用することができる宿主細胞に導入するために発現ベクターに挿入される。
【０１６３】
本明細書に記載の標的分子、例えば、ＴＣＲに結合する、抗体またはその断片、誘導体、もしくは類似体、例えば、抗体の重鎖または軽鎖の組換え発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖またはその一部（好ましくは、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインを含有する部分）をコードするポリヌクレオチドが得られたら、当該技術分野において周知の技法を用いた組換えＤＮＡ技術によって、抗体分子を産生するためのベクターを作製することができる。従って、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製する方法が本明細書に記載されている。当業者に周知の方法を用いて、抗体コード配列ならびに適切な転写制御シグナル及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組換えが含まれる。従って、本発明は、プロモーターと機能的に連結された、本発明の抗体分子またはその重鎖もしくは軽鎖または重鎖可変ドメインもしくは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでもよく（例えば、ＰＣＴ国際公開公報第８６／０５８０７号；ＰＣＴ国際公開公報第８９／０１０３６号；及び米国特許第５，１２２，４６４号を参照されたい）、重鎖全体または軽鎖全体を発現させるために、抗体の可変ドメインをこのようなベクターにクローニングすることができる。
【０１６４】
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、望ましい遺伝子を宿主細胞に導入し、宿主細胞において発現させるためのビヒクルとして本発明に従って用いられるベクターを意味するために本明細書において用いられる。当業者に公知のように、このようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、及びレトロウイルスからなる群から容易に選択することができる。一般的に、本発明と適合するベクターは、選択マーカー、望ましい遺伝子のクローニングを容易にする適切な制限部位、ならびに真核細胞または原核細胞において進入及び／または複製する能力を含む。
【０１６５】
特定の態様では、本発明は、本明細書において開示された抗ＴＣＲ抗体及び抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。実施形態では、ベクターは、ウイルス性、非ウイルス性、エピソーム、または組み込みである。実施形態では、ベクターは、トランスポゾン、例えば、スリーピングビューティートランスポゾンである。実施形態では、ベクターは、レンチウイルスバックボーン成分を含むベクターである。例示的なバックボーン成分としては、ｐＦＵＧＷ、及びｐＳＭＰＵＷが含まれるが、これに限定されない。
【０１６６】
本発明の目的では、非常に多くの発現ベクター系を使用することができる。例えば、あるクラスのベクターでは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、もしくはＭＯＭＬＶ）、またはＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルスに由来するＤＮＡエレメントが用いられる。他のベクターでは、ポリシストロニック系と内部リボソーム結合部位が用いられる。さらに、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって、ＤＮＡを細胞染色体に組み込んでいる細胞を選択することができる。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、または銅などの重金属耐性を提供してもよい。選択マーカー遺伝子は、発現させようとするＤＮＡ配列と直接連結されてもよく、同時形質転換によって同じ細胞に導入されてもよい。最適なｍＲＮＡ合成のために、さらなるエレメントも必要とされることがある。これらのエレメントは、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、及び終結シグナルを含んでもよい。
【０１６７】
特に好ましい実施形態では、クローニングされた可変領域遺伝子は、前記のように合成された重鎖定常領域遺伝子及び軽鎖定常領域遺伝子（好ましくは、ヒト）と共に発現ベクターに導入される。もちろん、真核細胞において発現を誘発することができる任意の発現ベクターを本発明において使用することができる。適切なベクターの例には、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、及びｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能）、ならびにプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から入手可能）が含まれるが、これに限定されない。一般的に、多数の形質転換細胞から、適切に高いレベルの免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を発現する形質転換細胞をスクリーニングすることは、例えば、ロボットシステムによって行うことができる日常的な実験法である。
【０１６８】
さらに一般的には、抗ＴＣＲ抗体の単量体サブユニットをコードするベクターまたはＤＮＡ配列が調製されたら、発現ベクターを適切な宿主細胞に導入することができる。宿主細胞へのプラスミドの導入は当業者に周知の様々な技法によって達成することができる。これらには、トランスフェクション（電気泳動及びエレクトロポレーションを含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープのあるＤＮＡとの細胞融合、マイクロインジェクション、ならびにインタクトなウイルスの感染が含まれるが、これに限定されない。Ｒｉｄｇｗａｙ（１９８８）「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」ｉｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，ｅｄ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．），Ｃｈａｐｔｅｒ  ２４．２，ｐｐ．４７０−４７２を参照されたい。典型的に、宿主へのプラスミドの導入はエレクトロポレーションによるものである。発現構築物を有する宿主細胞を軽鎖及び重鎖の産生に適切な条件下で増殖させ、重鎖タンパク質及び／または軽鎖タンパク質の合成についてアッセイする。例示的なアッセイ技術には、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化セルソーター分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが含まれる。
【０１６９】
発現ベクターを従来技術によって宿主細胞に導入し、次いで、トランスフェクトされた細胞を従来技術によって培養して、本明細書に記載の方法において使用するための抗体を産生する。従って、本発明は、異種プロモーターと機能的に連結された、本発明の抗体またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。二本鎖抗体の発現に好ましい態様では、下記で詳述するように、免疫グロブリン分子全体を発現させるために、重鎖及び軽鎖を両方ともコードするベクターを宿主細胞において同時発現させることができる。
【０１７０】
本明細書で使用する「宿主細胞」とは、組換えＤＮＡ技術を用いて構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターを有する細胞を指す。組換え宿主から抗体を単離するためのプロセスの説明において、「細胞」、及び「細胞培養物」という用語は、特に断りのない限り、抗体の供給源を指すために同義に用いられる。言い換えると、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠心沈殿した全細胞からの回収を意味してもよく、培地及び懸濁細胞の両方を含有する細胞培養物からの回収を意味してもよい。
【０１７１】
本明細書に記載の方法において使用するための抗体分子を発現させるために、様々な宿主発現ベクター系を利用することができる。このような宿主発現系は、関心対象のコード配列が産生され、その後に精製されるビヒクルであるが、適切なヌクレオチドコード配列によって形質転換またはトランスフェクトされた時に本発明の抗体分子をインサイチューで発現することができる細胞でもある。これらには、微生物、例えば、抗体コード配列を含有する、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターによって形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターによって形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；抗体コード配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、もしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）によって形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞ゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が含まれるが、これに限定されない。特に、組換え抗体分子全体を発現させるために、好ましくは、細菌細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、より好ましくは、真核細胞は、組換え抗体分子の発現のために用いられる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞と、ヒトサイトメガロウイルスに由来する主要中間初期（ｍａｊｏｒ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターが有効な抗体発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０１７２】
タンパク質発現に用いられる宿主細胞株は、哺乳動物に由来することが多い。当業者であれば、発現しようとする望ましい遺伝子産物に最も適した特定の宿主細胞株を優先的に決定する能力があると信じられている。例示的な宿主細胞株には、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原を含むＣＶＩ誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、及び２９３（ヒト腎臓）が含まれるが、これに限定されない。宿主細胞株は、典型的には、商業サービス、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、または公表された文献から入手することができる。
【０１７３】
さらに、挿入された配列の発現を調節する、またはある決まったやり方で遺伝子産物を修飾及びプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能に重要な場合がある。異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾のための特徴的かつ特異的な機構を有する。発現された外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするように、適切な細胞株または宿主系を選択することができる。このために、一次転写物の正しいプロセシング、グリコシル化、及び遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。
【０１７４】
組換えタンパク質を長期間、高収率で産生するために、安定発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定発現する細胞株を操作してもよい。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）及び選択マーカーによって制御されたＤＮＡによって、宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡを導入した後に、操作された細胞を強化倍地中で１〜２日間、増殖させてもよく、次いで、選択培地に移す。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択耐性を付与し、細胞がプラスミドを細胞染色体に安定に組み込み、増殖してフォーカス（ｆｏｃｉ）を形成し、次に、フォーカスがクローン化し、細胞株まで発達するのを可能にする。この方法は、抗体分子を安定発現する細胞株を操作するのに有利に使用することができる。
【０１７５】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ａｎｄ  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２２：８１７（１９８０））を含むが、これに限定されない多数の選択系を使用することができる。遺伝子は、それぞれ、ｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞、またはａｐｒｔ−細胞において使用することができる。また、代謝拮抗剤耐性を、以下の遺伝子：メトトレキセート耐性を付与する、ｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））；ミコフェノール酸耐性を付与する、ｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシド  Ｇ−４１８耐性を付与する、ｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）及びＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（Ｍａｙ，１９９３））；ならびにハイグロマイシン耐性を付与する、ｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））の選択の基礎として使用することができる。使用することができる、当該技術分野において一般に知られている組換えＤＮＡ技術の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ）；Ｋｒｉｅｇｉｅｒ（１９９０）「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」ｉｎ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ）Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １２  ａｎｄ  １３；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１に記載されている。これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７６】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって高めることができる（総説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ（１９８７）「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）Ｖｏｌ．３を参照されたい）。抗体を発現するベクター系の中にあるマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養物に存在する阻害剤のレベルが上昇することによってマーカー遺伝子のコピー数が増加するであろう。増幅領域は抗体遺伝子と関連しているので、抗体の産生も増加するだろう（Ｃｒｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０１７７】
インビトロで産生されたら、スケールアップによって多量の望ましいポリペプチドを得ることができる。組織培養条件下で哺乳動物細胞を培養するための技法は、当該技術分野において公知であり、均一な懸濁培養、例えば、エアリフト型リアクターもしくは連続スターラーリアクターにおける懸濁培養、または固定化細胞培養もしくは捕捉細胞培養（ｅｎｔｒａｐｐｅｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、例えば、中空糸の中、マイクロカプセルの中、アガロースミクロビーズ上、もしくはセラミックカートリッジ上での固定化細胞培養もしくは捕捉細胞培養を含む。必要に応じて及び／または所望に応じて、例えば、合成ヒンジ領域ポリペプチドを優先的に生合成した後に、または本明細書に記載のＨＩＣクロマトグラフィー段階の前もしくは後に、従来通りのクロマトグラフィー法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィー、または（イムノ）アフィニティクロマトグラフィーによってポリペプチド溶液を精製することができる。
【０１７８】
本発明の抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体をコードする遺伝子はまた、昆虫細胞、細菌細胞もしくは酵母細胞、または植物細胞などの非哺乳動物細胞において発現させることもできる。核酸を容易に取り込む細菌には、ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅのメンバー、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの株；Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅが含まれる。さらに、細菌において発現させた時に、異種ポリペプチドは典型的に封入体の一部になることが理解されるだろう。異種ポリペプチドを単離し、精製し、次いで、機能分子に組み立てなければならない。四価型抗体が望ましいのであれば、サブユニットは四価抗体に自己集合する（ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２）。
【０１７９】
細菌系では、発現させる抗体分子に意図された用途に応じて、多くの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体分子の薬学的組成物を作製するために、多量のこのようなタンパク質を産生しようとする時に、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を誘導するベクターが望ましい場合がある。このようなベクターには、以下が含まれるが、これに限定されない：融合タンパク質が産生されるように、抗体コード配列が個々にベクターに入れられてｌａｃＺコード領域とインフレームに連結することができる、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１９８３））；ＯＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））など。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために、ｐＧＥＸベクターも使用することもできる。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリクスグルタチオン−アガロースビーズに吸着及び結合させた後に、遊離グルタチオンの存在下で溶出することによって溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から放出できるようにトロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
【０１８０】
原核生物に加えて、真核生物微生物も使用することができる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅすなわち一般的なパン酵母が真核生物微生物の中で最も一般的に用いられるが、多くの他の株、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが一般的に用いられる。
【０１８１】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける発現のために、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０：１５７（１９８０））が一般的に用いられる。このプラスミドは、トリプトファン中での増殖能が無い変異酵母株、例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５：１２（１９７７））に選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子を既に含有している。次いで、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてｔｒｐ１損傷が存在すれば、トリプトファンの非存在下での増殖によって形質転換を検出するのに有効な環境となる。
【０１８２】
昆虫系では、典型的に、オートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が外来遺伝子を発現するベクターとして用いられる。このウイルスは、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞において増殖する。抗体コード配列を個々にウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に入れてクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
【０１８３】
本発明の抗体分子が組換えにより発現されたら、当該技術分野において公知の任意の免疫グロブリン分子精製法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、特に、プロテインＡ後の特異的抗原に対するアフィニティクロマトグラフィー、及びサイジング（ｓｉｚｉｎｇ）カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、またはタンパク質精製のための他の任意の標準的な技法によって精製することができる。あるいは、本発明の抗体の親和性を高める好ましい方法が米国特許出願公開第２００２０１２３０５７Ａ１号に開示される。
【０１８４】
従って、本発明は、（ａ）細胞中で、抗体のＶＬ及びＶＨ鎖をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子（複数可）を発現すること；及び（ｂ）抗体を細胞から精製することを含み、抗体は、ＴＣＲα鎖に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲα鎖のエピトープに選択的に結合する。
【０１８５】
ＶＩＩＩ．ＴＣＲを含有する細胞の選択方法
さらなる実施形態では、（ａ）細胞を、ＴＣＲに結合する抗体と接触させること、抗体は、複数のＴ細胞エピトープ特異性を有するＴ細胞に結合する；及び（ｂ）抗体の結合に基づいて、ＴＣＲを含む細胞を選択することを含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む細胞を選択する方法を提供する。ある特定の態様では、抗体は、（ｉ）ＴＣＲの結合について、７９Ａ、７９Ａ−２３、７９Ａ−１５、７９Ａ−１１または７９Ａ−１３モノクローナル抗体と競合し；（ｉｉ）Ｔ細胞エピトープ特異性から本質的に独立してＴ細胞に結合し；（ｉｉｉ）Ｔ細胞のＴＣＲ活性をアゴナイズし；または（ｉｖ）Ｔ細胞増殖を刺激する。
【０１８６】
ＴＣＲを含有する細胞を選択する方法のいくつかの態様では、抗体は、ＴＣＲαポリペプチドに結合する。他の態様では、抗体は、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲαポリペプチドのエピトープに結合する。いくつかの態様では、細胞は、インビボである。いくつかの態様では、抗体は、レポーターを含み、方法は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって、ＴＣＲを含む細胞を選択することを含む。いくつかの態様では、細胞を選択することは、常磁性ビーズを用いて選択することを含む。ある特定の態様では、抗体は、支持体に結合している。例えば、支持体は、ビーズ、表面、カラム、または宿主細胞である。ある特定の態様では、方法は、Ｔ細胞を精製または濃縮する方法としてさらに定義される。さらなる態様では、細胞を抗体と接触させることは、ＴＣＲを含む細胞において活性化または成長を誘発することを含む。いくつかの態様では、ＴＣＲを含む細胞を精製または濃縮することは、細胞の増殖を刺激することを含む。
【０１８７】
ＩＸ．人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）
場合によっては、人工抗原提示細胞（「ａＡＰＣ」）は、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体の拡張、増殖、及び／または活性化、ならびにＴ細胞ベースの治療用組成物及び細胞治療製品の調製に有用な細胞（ａＡＰＣ）を活性化し、増殖させることも指す。Ｔ細胞治療用組成物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、または任意のキメラ受容体を含むように遺伝的に改変されるＴ細胞を含むことができる。
【０１８８】
実施形態に従って使用されるａＡＰＣとしては、樹状細胞、マクロファージ、不死化細胞、及び人工抗原提示細胞が含まれるが、これらに限定されない。１つの態様では、ａＡＰＣは、トランスジェニックＫ５６２細胞であってもよい。本発明のいくつかの態様では、ａＡＰＣは、ＨＬＡＣ陰性であり、本発明のいくつかの態様では、ａＡＰＣは、ＨＬＡＣ陽性である。ある特定の態様では、ａＡＰＣは、実施形態の抗ＴＣＲ結合抗体に結合する。さらなる態様では、ａＡＰＣは、抗ＴＣＲ結合抗体（例えば、膜結合型抗体）を表面発現するための発現構築物を含む。抗原提示系の調製及び使用に関する一般的指針については、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、同第６，３６２，００１号、及び同第６，７９０，６６２号、米国特許公開第２００９／００１７０００号、及び同第２００９／０００４１４２号、ならびに国際公開第２００７／１０３００９号を参照されたい。
【０１８９】
ａＡＰＣは、いくつかの場合では、Ｔ細胞を活性化または共刺激する追加の分子を含んでもよい。追加の分子は、いくつかの場合では、膜結合型Ｃγサイトカインを含んでもよい。なおもまださらなる態様では、ＡａＰＣは、不活性化もしくは照射される、または感染性物質に関して検査され、これを含まないと確認されている。さらに別の態様では、ａＡＰＣの存在下で細胞を培養することは、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、及び／またはＩＬ−２などの可溶性サイトカインを含む培地中で細胞を培養することを含む。細胞は、約１０：１〜約１：１０；約３：１〜約１：５；約１：１〜約１：３（免疫エフェクター細胞対ＡａＰＣ）；またはその間で誘導可能な任意の範囲の比率で培養されてもよい。例えば、Ｔ細胞とａＡＰＣの共培養は、約１：１、約１：２、または約１：３の比率であることができる。いくつかの態様では、遺伝的に改変されたＴ細胞またはＴ細胞をエクスビボ培養することは、１４日間以下、７日間以下、または３日間以下にわたる。他の態様では、遺伝的に改変されたＴ細胞またはＴ細胞は、２１日未満、例えば、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１日未満にわたって、エクスビボ培養される。
【０１９０】
例えば、エクスビボ培養（例えば、ＡａＰＣまたはａＡＰＣの存在下で培養）は、Ｔ細胞を倍増させる１つの集団未満で行うことができる。さらに別の態様では、Ｔ細胞は、ＡａＰＣまたはａＡＰＣの存在下でエクスビボ培養されない。
【０１９１】
１つの態様では、ａＡＰＣは、ＣＤ１３７Ｌを発現し得る。他の態様では、ａＡＰＣは、ＣＤ１９、ＣＤ６４、ＣＤ８６、または膜結合型ＩＬ−１５をさらに発現し得る。いくつかの態様では、膜結合型ＩＬ−１５（ｍＩＬ−１５）は、ＩＬ−１５〜ＩＬ−１５Ｒａの融合タンパク質を含む。さらなる態様では、ｍＩＬ−１５構築物は、セリン−グリシンリンカーで全長ＩＬ−１５Ｒａ（ＮＭ００２１８９．３）に融合したＩＬ−１５  ｃＤＮＡ配列（ＮＭ  ０００５８５．４）を含む。ＩｇＥシグナルペプチド（ｇｂ｜ＡＡＢ５９４２４．１）を、ｍＩＬ１５融合構築物に使用することができる。ｍＩＬ−１５の一例は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ／２０１４／１８６４６９に記載されている。
【０１９２】
実施形態では、切断型ＣＤ８膜貫通タンパク質（ｔＣＤ８−ＴＭ）または切断型ヒトＦｃ−ｔＣＤ８−ＴＭドメイン（ＨＡタグ有無）または同様の細胞外足場分子を抗ＴＣＲ抗体またはその断片に融合して、共刺激リガンドＣ８６、ＣＤ１３７Ｌ、もしくはＩＬ１５（膜結合型製剤として含む）、またはその任意の組み合わせと一緒に、例えば、Ｋ５６２に由来する細胞上に発現される。本発明の態様では、配列番号２４は、ヒト切断型ＣＤ８ドメインの一例であり、配列番号２５は、ヒトＣＤ８ａ膜貫通ドメインの一例であり、配列番号２６は、ｈＣＤ８ａ細胞外ドメインの一例である。
【０１９３】
ａＡＰＣを使用して、一般的にまたはＴＣＲエピトープ特異的な方法で、Ｔ細胞を拡張及び／または活性化してもよい。腫瘍抗原との遭遇の間、抗原提示細胞によってＴ細胞に送られたシグナルは、Ｔ細胞プログラミング及び以降の細胞の治療有効性に影響し得る。これに刺激を受け、Ｔ細胞に与えられるシグナルに対する至適なコントロールを可能にする、人工抗原提示細胞の開発への取組みがなされた（Ｔｕｒｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＴＣＲ結合抗体などの抗体に加えて、ＡＰＣ系はまた、少なくとも１つの外因性補助分子も含んでもよい。任意の好適な数及び組み合わせの補助分子を利用してもよい。補助分子は、共刺激分子及び接着分子などの補助分子から選択されてもよい。例示的な共刺激分子としては、Ｃ８６、ＣＤ１３７Ｌ及びｍＩＬ１５またはＯＸ４０Ｌ（ＣＤ１３４Ｌ）が挙げられ；ＣＤ７０及びＢ７．１（Ｂ７またはＣＤ８０とも呼ばれる）と共に、Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８、４−１ＢＢまたはＯＸ４０分子に結合することができ、これにより、例えば、Ｔ細胞拡張、Ｔｈ１分化、Ｔ細胞短期間生存、及びインターロイキン（ＩＬ）−２などのサイトカイン分泌に影響を及ぼす。接着分子として、セレクチンなどの炭水化物結合糖タンパク質、インテグリンなどの膜貫通型結合糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、及び細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）などの単回膜貫通型免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質などを挙げることができ、これらは、例えば、細胞対細胞、または細胞対マトリックスの接触を促進する。例示的な接着分子としては、ＬＦＡ−３及びＩＣＡＭ−１などのＩＣＡＭが挙げられる。共刺激分子及び接着分子を含む例示的な補助分子の選択、クローニング、調製、及び発現に有用な技術、方法、及び試薬は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、及び同第６，３６２，００１号に例示されている。
【０１９４】
場合によっては、ａＡＰＣになるように選択された細胞は、細胞内抗原プロセシング、細胞内ペプチド輸送、及び／または細胞内ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ分子−ペプチド負荷が欠失しているか、または変温性（すなわち、温度攻撃に対して哺乳動物細胞株よりも感受性が低い）であるか、またはこれら欠失と変温性特性の両方を保有している。いくつかの態様では、ａＡＰＣになるように選択された細胞はまた、外因性ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子、及び細胞内に導入される補助分子成分に対して、少なくとも１つの内因性対応物（例えば、内因性ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ分子、及び／または上記内因性補助分子）を発現する能力をも欠失している。さらに、ａＡＰＣは、ａＡＰＣを生成するためのそれらの修飾以前に細胞が保有していた欠失及び変温性特性を保持することができる。例示的なａＡＰＣは、昆虫細胞株などの抗原プロセシング関連トランスポーター（ＴＡＰ）−欠失細胞株を構成するか、もしくはその細胞株由来である。例示的な変温性昆虫細胞株は、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２細胞株などのショウジョウバエ細胞株である（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．ｍ  １９７２）。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２細胞の調製、増殖、培養に関する実例となる方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、及び同第６，３６２，００１号に記載されている。
【０１９５】
ａＡＰＣは、凍結解凍サイクルにも曝される。例えば、ａＡＰＣを収容する好適な容器を、適量の液体窒素、固体二酸化炭素（ドライアイス）、または急速に凍結を起こすような同様の低温材料と接触させることにより、ａＡＰＣを凍結してもよい。続いて、低温材料をａＡＰＣから除去して、周囲室温条件に曝すことにより、または、微温湯浴もしくは温かい手を用いて解凍時間の短縮を促進する促進化解凍プロセスのいずれかにより、凍結したａＡＰＣを解凍する。さらに、ａＡＰＣを凍結し、解凍まで長期間保存してもよい。また、凍結したａＡＰＣを解凍し、続いてさらに用いるまで凍結乾燥してもよい。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び他の防腐剤などの凍結解凍手順に悪影響を及ぼし得る防腐剤は、本質的にそのような防腐剤を欠く培地にａＡＰＣを移すことなどにより、凍結解凍サイクルを受けるａＡＰＣを含む培地には有利に含まれず、または本質的に除去される。
【０１９６】
他の実施形態では、不活化後に、細胞増殖、核酸の複製または発現が本質的に起こらないように、異種核酸及びａＡＰＣに内因性の核酸を架橋により不活化してもよい。例えば、外因性ＭＨＣ及び補助分子の発現、このような分子のａＡＰＣ表面上への提示、ならびに選択された単一のペプチドまたは複数のペプチドによる提示されたＭＨＣ分子の負荷に続く点で、ａＡＰＣが不活化されてもよい。従って、このような不活化されて選択したペプチド負荷ａＡＰＣは、本質的に増殖不能または複製不能にされているものの、選択したペプチド提示機能を保持し得る。架橋によっても、ａＡＰＣの抗原提示細胞機能を実質的に低下させることなく、細菌及びウイルスなどの微生物汚染が本質的にないＡＰＣがもたらされる。従って、架橋は、ａＡＰＣの重要なＡＰＣ機能を維持する一方で、ａＡＰＣを用いて開発された細胞療法産物の安全性に関する懸念を軽減するのに役立つ。架橋及びａＡＰＣに関する方法については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９００１７０００号を参照されたい。
【０１９７】
Ｘ．Ｔ細胞を拡張及び／または活性化する方法
本発明は、Ｔ細胞を生成するための、Ｔ細胞を活性化し、エクスビボ及びインビボで増殖する方法を提供する。エクスビボ活性化及び増殖に関する実施形態では、Ｔ細胞は、臨床グレードである。実施形態では、方法は、本発明の抗体または抗原結合断片を用いたαβ−ＴＣＲ架橋によってＴ細胞を活性化する。実施形態では、Ｔ細胞は、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）である。さらなる実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）または任意のキメラ受容体を含むように遺伝的に改変されるＴ細胞を含むことができる。いくつかの態様では、Ｔ細胞はまた、Ｔ細胞の増殖及び／または生存を刺激するサイトカインで改変されてもよい。例えば、Ｔ細胞は、膜結合型バージョンのＩＬ−７、ＩＬ−１５、またはＩＬ−２１を含み得る。いくつかの態様では、サイトカインは、サイトカインの受容体とサイトカインコード配列の融合によって膜に繋ぎ止められる。例えば、細胞は、ＩＬ−１５−ＩＬ−１５Ｒａ融合タンパク質を発現するためのベクターを含むことができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４１８６４６９を参照されたい。
【０１９８】
さらなる態様では、Ｔ細胞は、トランスフェクト細胞のゲノム中にＣＡＲまたはＴＣＲコード配列の組み込みを促進するトランスポゼースでさらに改変される。いくつかの態様では、トランスポゼースは、ＤＮＡ発現ベクターとして提供される。しかしながら、好ましい態様では、トランスポゼースは、トランスポゼースの長期発現がトランスジェニック細胞で起きないように、発現可能なＲＮＡまたはタンパク質として提供される。例えば、いくつかの態様では、トランスポゼースは、ｍＲＮＡ（例えば、キャップ及びポリＡ尾部を含むｍＲＮＡ）として提供される。任意のトランスポゼース系を実施形態に従って使用してもよい。しかしながら、いくつかの態様では、トランスポゼースは、サケ科型Ｔｅｌ様トランスポゼース（ＳＢ）である。例えば、トランスポゼースは、いわゆる「スリーピングビューティ」トランスポゼースであり得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４８９，４５８号を参照されたい。ある特定の態様では、トランスポゼースは、酵素活性が増した遺伝子操作酵素である。トランスポゼースのいくつかの具体例としては、ＳＢ１０、ＳＢ１１、ＳＢ１００ｘトランスポゼース（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＭａｔｅｓ  ｅｔ  ａｈ、２００９を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、方法には、ＳＢ１０、ＳＢ１１、ＳＢｌ００ｘ、またはＳＢ１１０ｘトランスポゼースをコードするｍＲＮＡを持つ細胞のエレクトロポレーションを伴い得る。
【０１９９】
Ｔ細胞を活性化すること、またはＴ細胞活性化は、Ｔ細胞の数値拡張（すなわち、Ｔ細胞の数を増加させる）（Ｔ細胞拡張とも呼ばれる）、ならびにサイトカインを産生し、特定の細胞（例えば、腫瘍抗原提示細胞）を殺傷するためにＴ細胞を刺激することが含まれる。
【０２００】
本発明のＴ細胞を拡張及び／または活性化する方法を臨床の場で使用して、罹患した対象、すなわち、これらを必要とする対象のＴ細胞集団を拡張及び／または活性化する、またはドナーのＴ細胞集団、すなわち、罹患した対象以外の供給源に由来するＴ細胞を拡張及び／または活性化することができる。
【０２０１】
本発明はさらに、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片の存在下で、Ｔ細胞を人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と接触させることを含み、前記エピトープが、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むポリペプチドである、Ｔ細胞を拡張及び／または活性化する方法を提供する。実施形態では、ａＡＰＣは、ＴＣＲエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片に結合する。実施形態では、ａＡＰＣは、ＴＣＲの前記エピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片を発現するための発現構築物を含む。実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、立体配置特異的な方法でαβ−ＴＣＲと関与し、複数のＴ細胞エピトープ特異性を介した認識を通じて、ポリクローナルＴ細胞応答を誘発する。
【０２０２】
本明細書において開示されたＴ細胞を拡張及び／または活性化する方法では、実施形態では、抗体または抗原結合断片は、本明細書において開示された抗ＴＣＲ抗体である。例えば、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２に少なくとも９５％または１００％同一であるＨＣＤＲ１；配列番号３に少なくとも９５％同一であるＨＣＤＲ２；ＣＡＹＬ（配列番号２２）に同一であるＨＣＤＲ３を含む。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ１；配列番号５に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ２；配列番号１０に少なくとも９５％同一であるＬＣＤＲ３を含む。さらに、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２に少なくとも９５％または１００％同一であるＨＣＤＲ１；配列番号３に少なくとも９５％または１００％同一であるＨＣＤＲ２；ＣＡＹＷ（配列番号２３）に同一であるＨＣＤＲ３を含む。
【０２０３】
本明細書において開示されたＴ細胞を拡張及び／または活性化する方法では、実施形態では、抗体または抗原結合断片は、本明細書において開示された抗ＴＣＲ抗体である。例えば、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ１；配列番号５に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ２；配列番号１０に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ３を含む。実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ１；配列番号５に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ２；配列番号１０に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ３を含む。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１５に少なくとも９５％または１００％同一であるＨＣＤＲ１；配列番号１６に少なくとも９５％または１００％同一であるＨＣＤＲ２；ＣＲＹＷ（配列番号１７）に同一であるＨＣＤＲ３を含む。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１８に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ１；配列番号５に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ２；配列番号６に少なくとも９５％または１００％同一であるＬＣＤＲ３を含む。
【０２０４】
本明細書において開示されたＴ細胞を拡張及び／または活性化する方法では、実施形態では、抗体または抗原結合断片は、本明細書において開示された抗ＴＣＲ抗体である。例えば、抗体または抗原結合断片は、リンカーにより分離されるＶＨ及びＶＬドメインを含む。実施形態では、抗体または抗原結合断片は、膜貫通ドメイン（例えば、ｈＣＤａｌｐｈａ（配列番号２５））をさらに含む。本明細書において開示されたＴ細胞を拡張及び／または活性化する方法では、実施形態では、抗体または抗原結合断片は、本明細書において開示された抗ＴＣＲ抗体である。例えば、ＶＨは、配列番号１１、配列番号１３及び配列番号１９からなる群から選択されるポリペプチドに少なくとも９０％同一であるポリペプチドであり、ＶＬは、配列番号１２、配列番号１４及び配列番号２０からなる群から選択されるポリペプチドに少なくとも９０％同一であるポリペプチドである。実施形態では、ＶＨは、配列番号１１に少なくとも９０％同一であるポリペプチドであり、前記ＶＬは、配列番号１２に少なくとも９０％同一であるポリペプチドである。さらなる実施形態では、ＶＨは、配列番号１３に少なくとも９０％同一であるポリペプチドであり、前記ＶＬは、配列番号１２に少なくとも９０％同一であるポリペプチドである。さらなる実施形態では、ＶＨは、配列番号１１に少なくとも９０％同一であるポリペプチドであり、前記ＶＬは、配列番号１４に少なくとも９０％同一であるポリペプチドである。さらなる実施形態では、ＶＨは、配列番号１９に少なくとも９０％同一であるポリペプチドであり、前記ＶＬは、配列番号２０に少なくとも９０％同一であるポリペプチドである。
【０２０５】
本発明のある特定の態様では、一次Ｔ細胞の刺激は、本発明の抗ＴＣＲ可溶性抗体または抗原結合断片を培養中で使用することで達成される。他の態様では、持続的な活性化は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、またはＩＬ−２１などのＴ細胞成長促進サイトカインの存在下で、本発明の可溶性抗ＴＣＲ抗体または抗原結合断片を介してＴ細胞のαβ−ＴＣＲを関与させることで行われる。他の態様では、Ｔ細胞は、支持体（例えば、磁気ビーズ／ポリスチレン表面）を通じて、または照射されたＫ５６２フィーダー細胞などの細胞を通じて、ＴＣＲリガンドの一定の関与によって数値的に拡張される。培養条件及びリガンド提示モードを変化させて、活性化及び刺激に影響を与え、Ｔ細胞の数値拡張をもたらす。
【０２０６】
ＸＩ．治療用抗ＴＣＲ抗体を用いた処置方法
本発明はまた、処置を必要とする動物において、自己免疫疾患もしくはＴ細胞白血病もしくはＴ細胞リンパ腫を処置し、または同種異系移植片（骨髄または固形臓器）の拒絶を防止／制御する方法を提供する。本方法は、本発明の抗ＴＣＲ抗体及び／または抗原結合断片を可溶性タンパク質、抗体の一部として、または、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲαポリペプチドを標的にするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む宿主細胞標的として動物に投与することを含む。実施形態では、宿主細胞は、内因性アルファベータＴＣＲの発現を防止するように操作されているＮＫまたはガンマデルタＴ細胞またはＴ細胞である。
【０２０７】
ＣＡＲは、典型的には、抗原認識のための細胞外抗体由来一本鎖可変ドメイン（ｓｃＦｖ）からなり、膜貫通ドメイン及び、Ｔ細胞活性化のためのＣＤ３ζを含む細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）に連結したフレキシブルリンカーによってつながっている。通常、Ｔ細胞がインビボで活性化される場合、Ｔ細胞は、サイトカイン（すなわち、ＩＬ−２及びＩＬ−２１）の産生を誘発するＣＤ２８から二次共刺激シグナル伝達によるＴＣＲシグナルを誘発させた一次抗原を受けて、自己分泌／傍分泌様式でシグナル伝達ループにフィードバックされる。これを考慮して、ＣＡＲは、ＣＤ２８細胞質シグナル伝達ドメイン、または４−１ＢＢシグナル伝達ドメインなどの他の共刺激分子シグナル伝達ドメインを含むことができる。キメラＣＤ２８共刺激は、抗アポトーシス分子の上方調節及びＩＬ−２の産生、ならびに末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）に由来するＴ細胞の拡張によって、Ｔ細胞持続性を改善させる。
【０２０８】
１つの実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインとＣＤ３ゼータエンドドメインに融合したモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合体である。そのような分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答して、ゼータシグナルの伝達をもたらす。
【０２０９】
実施形態では、ＣＡＲは、エクトドメイン（細胞外）、膜貫通ドメイン、及びエンドドメイン（細胞内）を有してもよい。ＣＡＲエクトドメインの１つの実施形態では、シグナルペプチドは、新生タンパク質を小胞体に向かわせる。これは、例えば、受容体がグリコシル化されかつ細胞膜に固定されるべきである場合には必須である。任意の真核生物シグナルペプチド配列は、機能的であると考えられる。一般的に、大部分のアミノ末端成分に天然に付着したシグナルペプチドが用いられる（例えば、軽鎖−リンカー−重鎖という配向を有するｓｃＦｖでは、軽鎖の天然シグナルが用いられる）。使用することができる例示的なシグナルペプチドとしては、免疫グロブリン由来のシグナルペプチド、ＣＤ３、ＣＤ３ζ、ＣＤ８アルファ（ＣＤ８ａ）、及びＣＤ２８が挙げられる。
【０２１０】
抗原認識ドメインは、ｓｃＦｖであってもよい。しかしながら、代替物が存在し得る。天然Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及びベータ一本鎖由来の抗原認識ドメインは、単純なエクトドメイン（例えば、ＨＩＶ感染細胞を認識するＣＤ４エクトドメイン）、及び（サイトカイン受容体を所持する細胞の認識につながる）、ならびに連結された、例えば、サイトカインなどの他の認識成分を有するものとして記載されている。所与の標的に高親和性で結合するほぼ何もかもを、抗原認識領域として用いることができる。さらなる態様では、ｓｃＦｖは、配列番号７、１１、１３、１９、２０、８、１２、１４、１９、及び／または２０に由来することができる。さらなる態様では、ｓｃＦｖは、各々の場合に、リンカーにより必要に応じて分離される、配列番号７及び８；配列番号１１及び１２；配列番号１３及び１４；または配列番号１９及び２０を含む。さらに別の態様では、ｓｃＦｖは、配列番号２、３、２１、４、５、及び／または６；配列番号２、３、２２、９、５及び／または１０；配列番号２、３、２３、９、５及び／または１０；配列番号２、３、２２、４、５及び／または１０；または配列番号１５、１６、１７、１８、５及び／または６を含む。
【０２１１】
一般的に、ＣＡＲは、二量体化形態で存在し、細胞外ｓｃＦｖ（ＶＬに連結したＶＨ）領域、ストークドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達モチーフを連結する融合タンパク質として発現される。第一世代ＣＡＲのエンドドメインは、ＣＤ３−ζシグナル伝達を介してＴ細胞活性化のみを誘発する。第二世代ＣＡＲは、ＣＤ３−ζ及びＣＤ２８、または４−１ＢＢもしくはＯＸ４０などの他のエンドドメインを介して活性化シグナル伝達を提供する。第三世代ＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、またはＯＸ４０などの３つのシグナル伝達モチーフの、ＣＤ３−ζを含有する組み合わせを介してＴ細胞を活性化する。
【０２１２】
実施形態では、ＣＡＲのエクトドメインと膜貫通ドメインの間に、ストークドメインが組み込まれる。本明細書で使用する場合、「ストークドメイン」という用語は、一般的に、膜貫通ドメインを、ポリペプチド鎖中のｓｃＦｖまたは細胞質ドメインのいずれかに連結するように機能する任意のオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。ストークドメインは、Ｆｃヒンジなどのフレキシブルヒンジ、及び必要に応じて、Ｆｃの１つまたは２つの定常ドメインを含むことができる。
【０２１３】
本発明の態様では、抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片の配列を使用して、免疫細胞の特異性または結合を向け直す。例えば、抗ＴＣＲ本発明の抗体または抗原結合断片の抗原結合配列を使用して、免疫細胞上で発現する場合に、前記免疫細胞の特異性または結合を向け直すように使用することができる膜結合型タンパク質を生成する。
【０２１４】
さらなる実施形態では、本発明は、（ａ）配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲαポリペプチドを標的にする抗体またはその抗原結合断片、及び（ｂ）腫瘍関連抗原を標的にする少なくとも１つの抗体またはその抗原結合断片を含む多重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを動物に投与することを含む、処置を必要とする動物における癌または病原体による感染などの疾患を処置する方法を提供する。配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲαポリペプチドを標的にする例示的な抗体またはその抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。腫瘍関連抗原を標的にする例示的な抗体またはその抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。例示的な多重特異的Ｔ細胞エンゲージャーは、ＴＣＲαポリペプチドを標的にするｓｃＦｖ、ならびに腫瘍関連抗原を標的にするｓｃＦｖを含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである。三重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、例えば、ＴＣＲαポリペプチドを標的にするｓｃＦｖ、及び腫瘍関連抗原を標的にする第１及び第２のｓｃＦｖを含む。さらなる態様では、この実施形態におけるＴＣＲαポリペプチドを標的にするｓｃＦｖは、配列番号７、８、１１、１２、１３、１４、１９、及び／または２０を含む。さらなる態様では、ｓｃＦｖは、配列番号７及び８；配列番号１１及び１２；配列番号１３及び１４；または配列番号１９及び２０を含み、各々の場合に、配列は、リンカーにより必要に応じて分離される。さらに別の態様では、ｓｃＦｖは、配列番号２、３、２１、４、５、及び／または６；配列番号２、３、２２、９、５及び／または１０；配列番号２、３、２３、９、５及び／または１０；配列番号２、３、２２、４、５及び／または１０；または配列番号１５、１６、１７、１８、５及び／または６を含む。
【０２１５】
他の実施形態では、配列ＧＳＴＬＲＧ（配列番号１）を含むＴＣＲαポリペプチドを標的にする例示的な抗体またはその抗原結合断片は、腫瘍抗原に結合して、可溶性の組換え「バインダー」を生成する他のｓｃＦｖまたはタンパク質と組み合わせてもよい。腫瘍に関与する際、バインダーは、ＴＣＲの架橋によってＴ細胞を活性化し、増殖、サイトカイン産生、及び殺傷などのＴ細胞のエフェクター機能を活性化することができる。
【０２１６】
本発明の処置方法において、ある特定の態様では、処置を必要とする動物は、ヒトである。
【０２１７】
ある特定の実施形態では、多重特異的Ｔ細胞エンゲージャーは、腫瘍関連抗原または病原体特異的抗原結合ドメインを標的にする抗体またはその抗原結合断片を含み、デクチン−１などのパターン認識受容体によって認識される炭水化物抗原を含む。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞表面上に発現される限り、いかなる種類の抗原であってもよい。腫瘍関連抗原の例示的な実施形態として、ＣＤ１９、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ５６、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＡＫＴ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓなどが挙げられる。
【０２１８】
ある特定の実施形態では、ＨＡ−１、サバイビン、ＷＴ１、及びｐ５３などの細胞内腫瘍関連抗原を標的化してもよい。これは、ＨＬＡとの関連で細胞内腫瘍関連抗原から記述された処理されたペプチドを認識するユニバーサルＴ細胞上で発現されたｓｃＦｖによって達成することができる。さらに、ユニバーサルＴ細胞は、ＨＬＡとの関連で細胞内処理された腫瘍関連抗原を認識するＴ細胞受容体ペアを発現するように遺伝的に改変されてもよい。ある特定の実施形態では、少量の腫瘍関連抗原がある場合に、Ｔ細胞は、膜結合型サイトカインと共発現し、持続性を改善することができる。例えば、ＣＡＲは、膜結合型ＩＬ−１５と共発現することができる。
【０２１９】
実施形態では、本発明の抗ＴＣＲ抗体及び抗原結合断片は、例えば、Ｔ細胞を過剰に活性化させることで、これらを必要とする対象における免疫系をインビボで抑制し、Ｔ細胞及び免疫抑制の損失につながる。例えば、臓器、骨髄、及び幹細胞移植は、生活の質を改善し、生存を延ばすことができる。しかしながら、移植された組織の拒絶には、様々な手段による免疫系の抑制を必要とする。従って、本発明は、抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片を、それを必要とする患者に投与することを含む、免疫系を抑制する方法を提供する。実施形態では、本発明の抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片を、静脈（ＩＶ）注射を介して、１日１回、１日２回または１日３回で２〜２１日間、１〜２０ｍｇ／日の用量で、それを必要とする患者に投与する。実施形態では、本発明の抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片を、ＩＶ注射を介して、１日１回で５〜１５日間、５〜１０ｍｇ／日の用量で、それを必要とする患者に投与する。実施形態では、本発明の抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片を、ＩＶ注射を介して、１日１回で１０〜１４日間、５ｍｇ／日の用量で、それを必要とする患者に投与する。
【０２２０】
さらなる実施形態では、Ｔ細胞をインビボで活性化し、及び／または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのエフェクター機能をインビボで活性化する治療方法において、本発明の抗ＴＣＲ抗体及び抗原結合断片を、これらを必要とする対象に投与する。実施形態では、本発明の抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片を、静脈（ＩＶ）注射を介して、１日１回、１日２回または１日３回で２〜２１日間、１〜２０ｍｇ／日の用量で、それを必要とする患者に投与する。実施形態では、本発明の抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片を、ＩＶ注射を介して、１日１回で５〜１５日間、５〜１０ｍｇ／日の用量で、それを必要とする患者に投与する。実施形態では、本発明の抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片を、ＩＶ注射を介して、１日１回で１０〜１４日間、５ｍｇ／日の用量で、それを必要とする患者に投与する。
【０２２１】
ＸＩＩ．薬学的組成物及び投与方法
抗ＴＣＲ結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を調製する方法、及びこれらを必要とする対象に投与する方法は当業者に周知であるか、当業者によって容易に決定される。抗ＴＣＲ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体の投与経路は、例えば、経口経路、吸入による非経口経路、または局所経路でもよい。本明細書で使用する非経口という用語は、例えば、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与、または腟投与を含む。これらの全ての形の投与がはっきりと本発明の範囲内と意図されるが、投与の形の一例は、注射用溶液、特に、静脈内または動脈内の注射用または点滴用の溶液であろう。通常、注射に適切な薬学的組成物は、緩衝液（例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、任意で、安定剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含んでもよい。しかしながら、本明細書における開示と適合した他の方法では、抗ＴＣＲ結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を有害細胞集団の部位に直接送達し、それによって、治療剤への罹患組織の曝露を高めることができる。
【０２２２】
本明細書において議論したように、ＴＣＲ発現細胞を介した疾患、例えば、ある特定のタイプの癌、自己免疫疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症疾患及び末梢神経系（ＰＮＳ）炎症疾患を含む炎症疾患、ならびに浸潤性血管形成をインビボで処置するために、抗ＴＣＲ結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は薬学的に有効な量で投与することができる。これに関して、開示された本発明の結合分子は、投与を容易にし、活性物質の安定性を促進するように処方されることが理解されるだろう。好ましくは、本発明による薬学的組成物は、薬学的に許容される、無毒で、無菌の担体、例えば、生理食塩水、無毒の緩衝液、防腐剤などを含む。本発明の用途のために、結合された、または結合されていない、抗ＴＣＲ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体の薬学的に有効な量とは、標的と効果的に結合し、利益を得るのに十分な量、例えば、疾患もしくは障害の症状を寛解するのに十分な量、または物質もしくは細胞を検出するのに十分な量を意味するとみなされるものとする。
【０２２３】
本発明において用いられる薬学的組成物は、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ろう、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂を含む、薬学的に許容される担体を含む。
【０２２４】
非経口投与用の調製物には、無菌の水溶液または非水溶液、懸濁液、及びエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油、及び注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。水性担体には、例えば、食塩水及び緩衝化培地を含む、水、アルコール溶液／水溶液、エマルジョン、または懸濁液が含まれる。本発明において、薬学的に許容される担体には、０．０１〜０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液または０．８％食塩水が含まれるが、これに限定されない。他の一般的な非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガー液デキストロース（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、体液補充薬及び栄養分補充薬、電解質補充薬、例えば、リンガー液デキストロースをベースとするものなどが含まれる。防腐剤及び他の添加剤、例えば、殺菌剤、抗酸化物質、キレート剤、及び希ガスなども存在してもよい。
【０２２５】
さらに具体的には、注射使用に適した薬学的組成物には、滅菌した水溶液（水溶性の場合）または分散液、及び滅菌した注射液または分散液を即時調製するための滅菌散剤が含まれる。このような場合、組成物は滅菌されていなければならず、容易な注射可能性が存在する程度まで液状であるべきである。これは製造及び保存の条件下で安定でなければならず、好ましくは、細菌及び菌類などの微生物の汚染作用を防ぐように保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒でもよい。例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合では必要とされる粒径を維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって適切な流動性を維持することができる。本明細書において開示された治療方法において使用するのに適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）１６ｔｈ  ｅｄ．（１９８０）に記載されている。
【０２２６】
微生物の活動は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって阻止することができる。多くの場合、等張性の剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めることによって可能になる。
【０２２７】
どのような場合でも、必要とされる量の活性化合物（例えば、抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体それ自体、または他の活性物質との組み合わせ）を単独で、または必要に応じて本明細書において列挙された成分の１つまたは組み合わせと適切な溶媒に溶解して組み込み、その後に濾過滅菌することによって、滅菌注射液を調製することができる。一般的に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒及び前記で列挙された成分に由来する必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥である。真空乾燥及び凍結乾燥によって、活性成分と任意のさらなる望ましい成分の予め濾過滅菌された溶液から、活性成分と任意のさらなる望ましい成分の散剤が得られる。注射用の調製物は加工され、アンプル、バック、瓶、注射器、またはバイアルなどの容器に入れられ、当該技術分野において公知の方法に従って無菌条件下で密封される。さらに、調製物は、キット、例えば、米国特許公開第２００２／０１０２２０８号に記載のキットの形で包装及び販売されてもよい。このような製造品には、好ましくは、関連した組成物が、疾患もしくは障害に罹患している、または疾患もしくは障害の素因のある対象の処置に有用なことを示すラベルまたは添付文書があるだろう。
【０２２８】
非経口製剤は単一ボーラス量でもよく、注入でもよく、または負荷ボーラス量の後に維持量が続いてもよい。これらの組成物は、特定の決まった間隔で、または変化する間隔で、例えば、１日に１回、または「必要に応じて」投与されてもよい。
【０２２９】
本発明において用いられるある特定の薬学的組成物は、例えば、カプセル、錠剤、水性懸濁液、または溶液を含む許容可能な剤形にして経口投与することができる。ある特定の薬学的組成物はまた、鼻用エアゾール剤または吸入によって投与することもできる。このような組成物は、ベンジルアルコールもしくは他の適切な防腐剤、バイオアベイラビリティを高める吸収促進剤、及び／または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を用いて食塩水に溶解した溶液として調製されてもよい。
【０２３０】
担体材料と組み合わせて１つの剤形を生成することができる、抗ＴＣＲ結合分子、例えば、抗体またはその断片、変種、または誘導体の量は、処置される宿主及び特定の投与方法に応じて異なるだろう。組成物は、単回投与、複数回の投与として、または注入中に所定の期間にわたって投与することができる。望ましい最適の応答（例えば、治療応答または予防応答）が得られるように、投与計画も調整することができる。
【０２３１】
本開示の範囲に合わせて、上述の処置方法に従って、治療効果を生じるのに十分な量の本発明の抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体をヒトまたは他の動物に投与することができる。本発明の抗ＴＣＲ抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体は、公知の技法に従って、本発明の抗体と従来の薬学的に許容される担体または希釈剤とを組み合わせることによって調製された従来の剤形にして、このようなヒトまたは他の動物に投与することができる。薬学的に許容される担体または希釈剤の形及び特徴は、組み合わされる活性成分の量、投与経路、及び他の周知の変数によって決まることが当業者に認識されるだろう。さらに、当業者であれば、抗ＴＣＲ結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体の１つ以上の種を含むカクテルが特に有効であると判明することがあることを理解するだろう。
【０２３２】
「治療に有効な用量または量」または「有効量」とは、投与された時に、処置しようとする疾患を有する患者の処置に関して正の治療応答をもたらす、抗ＴＣＲ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片の量を意味する。
【０２３３】
ＴＣＲ発現細胞を介した疾患、例えば、ある特定のタイプの癌、例えば、頭頚部癌、前立腺癌、結腸癌、乳癌、及び肺癌；自己免疫疾患、例えば、関節炎、多発性硬化症、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症疾患及び末梢神経系（ＰＮＳ）炎症疾患を含む炎症疾患；ならびに浸潤性血管形成を処置するための、本発明の組成物の治療に有効な用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物療法、及び処置が予防であるか治療であるかを含めて多くの異なる要因に左右される。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も処置することができる。安全性及び効力を最適化するたけに、当業者に公知の日常的な方法を用いて処置投与量を滴定することができる。
【０２３４】
投与しようとする少なくとも１つの抗ＴＣＲ結合分子、例えば、抗体またはその結合断片の量は、本発明の開示があれば過度の実験なく当業者によって容易に求められる。投与モード、及び少なくとも１つの抗ＴＣＲ結合分子、例えば、抗体、その抗原結合断片、変種、または誘導体のそれぞれの量に影響を及ぼす要因には、疾患の重篤度、病歴、ならびに療法を受けている個体の年齢、身長、体重、健康状態、及び身体状態が含まれるが、これに限定されない。同様に、投与しようとする抗ＴＣＲ結合分子、例えば、抗体またはその断片、変種、もしくは誘導体の量は、投与モード、及び対象がこの剤の単回投与または複数回投与を受けるかどうかに左右されるだろう。
【０２３５】
本発明はまた、例えば、関節炎、多発性硬化症、ＣＮＳ炎症疾患及びＰＮＳ炎症疾患、または癌を含む、自己免疫疾患及び／または炎症疾患を処置するための医薬の製造における、抗ＴＣＲ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体の使用も提供する。
【０２３６】
本発明はまた、自己免疫疾患及び／または炎症疾患を処置するために対象を処置するための、または癌を処置するための医薬の製造における、抗ＴＣＲ結合分子、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体の使用も提供する。ここで、医薬は、少なくとも１つの他の療法によって前処置されている対象において用いられる。「前処置された」または「前処置」とは、対象が、抗ＴＣＲ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を含む医薬を受ける前に、１つ以上の他の療法を受けている（例えば、少なくとも１つの他の癌療法によって処置されている）ことを意図する。「前処置された」または「前処置」とは、対象が、抗ＴＣＲ結合分子、例えば、本明細書において開示されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を含む医薬を用いた処置が開始する前、２年以内に、１８ヶ月以内に、１年以内に、６ヶ月以内に、２ヶ月以内に、６週間以内に、１ヶ月以内に、４週間以内に、３週間以内に、２週間以内に、１週間以内に、６日以内に、５日以内に、４日以内に、３日以内に、２日以内に、さらには１日以内に、少なくとも１つの他の療法によって処置されていることを含む。対象が、以前の療法を用いた前処置に対するレスポンダーであったことは必要でない。従って、抗ＴＣＲ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を含む医薬が与えられる対象は、以前の療法を用いた前処置、または前処置が複数の種類の療法を含んでいた場合、以前の療法の１つ以上に応答していてもよく、または応答していなくてもよい（例えば、癌は難治性であった）。抗ＴＣＲ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変種、もしくは誘導体を含む医薬を受ける前に、対象が前処置を受けていてもよい他の癌療法の例には、外科手術；放射線療法；化学療法、任意で、自己由来骨髄移植と組み合わせた化学療法、この場合、適切な化学療法剤には、本明細書において前記で列挙された化学療法剤が含まれるが、これに限定されない；他の抗癌モノクローナル抗体療法；本明細書において前記で列挙された低分子を含むが、これに限定されない、低分子に基づく癌療法；ワクチン／免疫療法に基づく癌療法；ステロイド療法；他の癌療法；またはその任意の組み合わせが含まれるが、これに限定されない。本発明の実施は、特段の記載がない限り、当業者の技術の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子組換え生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来の技術を利用することになる。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，（１９８５）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎ��  ＩＩ；Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＩＤ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５；Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＩＤ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；及びｉｎ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）を参照されたい。
【０２３７】
抗体工学の一般的な原理は、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄ．（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）に示されている。タンパク質工学の一般的な原理は、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．）に示されている。抗体及び抗体−ハプテン結合の一般的な原理は、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ（１９８４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．）；及びＳｔｅｗａｒｄ（１９８４）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）に示されている。さらに、一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９４）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（８ｔｈ  ｅｄ；Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）及びＭｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ）（１９８０）Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＷＩＴ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ＮＹ）のように、当該技術分野において公知であり、具体的に述べられていない免疫学における標準的な方法に従う。
【０２３８】
免疫学の一般的な原理を示している標準的な参考文献には、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ（１９８２）Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ）；Ｋｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８０）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ（１９８４）“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”  ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｂｕｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｅｌｓｅｖｅｒｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｇｏｌｄｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（２０００）Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｎｏｌｏｇｙ（４ｔｈ  ｅｄ．；Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｄ＆Ｃｏ．）；Ｒｏｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（６ｔｈ  ｅｄ．；Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ）；Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（５ｔｈ  ｅｄ．；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｌｅｗｉｎ（２００３）Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩＩ（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ  ２００３）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（２００３）ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）が含まれる。
【０２３９】
前記で引用された全ての参考文献ならびに本明細書において引用された全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０２４０】
ＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を説明するために含められる。後に続く実施例に開示された技術は、発明者が発明の実施に十分に機能すると見出した技術を示し、その実施に好ましいモードを構成するものと考えられ得ることを当業者により認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を踏まえて、開示された具体的実施態様において多くの変更がなし得ること、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同様なまたは類似の結果が得られることを認識するべきである。
【０２４１】
実施例１−Ｔ細胞のエクスビボ生成及び分析
ハイブリドーマ−ＣＤ１Ｄノックアウトマウスを、ｍＣＤ８ａに融合したＴＣＲ不変鎖（ＩＣＶＶＳＤＲＧＳＴＬＧＲＬ）をコードする融合タンパク質を発現するマウスＬ−線維芽細胞で免疫化した。ハイブリドーマクローンは、ＰＥＧ−１５００を用いた標準的な細胞融合法を介して生成された。不変鎖エピトープに特異的な抗体クローンは、免疫原を発現するＬ細胞上のスクリーニング後に選択された。正極バインダーは、１００ｎｇの遊離ペプチドで被覆された間接ＥＬＩＳＡによって、免疫原を表す合成ペプチドで確認された（図１Ａ）。最も高いＯＤ４５０をもつ最良のバインダー７９Ａをさらなる分析用に選択した。
【０２４２】
抗体生成及び特徴付け−ＴＣＲＶａ２４−Ｊａ１８ジャンクション（アミノ酸配列：ＧＳＴＬＧＲ（配列番号１））に向かって狭い直鎖エピトープ特異性をもち、ＴＣＲα−ＣＤＲ３α鎖に向かって明らかな立体配置特異性をもたないモノクローナル抗体（クローン７９Ａ）を、抗体モデリング及び親和性改善のために選択した。抗体クローン７９Ａの特異性は、直鎖ペプチドのＥＬＩＳＡによってチェックし、ａｌａ−ペプチドライブラリー、またフローサイトメトリー分析によっても確認された（図１Ｂ〜１Ｄ）。
【０２４３】
結合アッセイ−結合アッセイは、Ｖａ２４−Ｊａ１８領域にわたって直鎖ペプチド配列で被覆された固相ＥＬＩＳＡ上で行った（図１Ｂ）。フローサイトメトリーは、一次抗体として７９Ａまたは変異体抗体、及び検出用のマッチした蛍光共役二次抗体（抗マウスＦａｂ  ＰＥまたは抗ヒトガンマＦｃ  ＰＥヤギＦａｂポリクローナルのいずれか）を用いて、ＰＢＭＣ由来の生ＣＤ３＋Ｔ細胞で実施した（図１Ｅ）。ウエスタンブロットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分解した全細胞溶解（ＰＢＭＣ、Ｔ細胞のいずれか）から単離された変性タンパク質で行った。
【０２４４】
Ｖ遺伝子増幅及びｓｃＦｖ生成−直鎖エピトープＧＳＴＬＧＲ（配列番号１）に特異的なクローン７９ＡをｓｃＦｖ生成のために選択した。抗体Ｖ遺伝子は、５’プライマー用のマウスＶＨ  ＦＲ１と３’プライマー用のＩｇ定常領域の縮退プライマーの標準混合を伴うＰＣＲによって、７９Ａ  ｃＤＮＡから増幅した（図２）（Ｗａｎｇ，Ｚ．，Ｒａｉｆｕ，Ｍ．，Ｈｏｗａｒｄ，Ｍ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｄ．，Ｇｏｌｄｓｂｙ，Ｒ．ａｎｄ  Ｒａｔｎｅｒ，Ｄ．（２０００）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ：ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ａｎ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ３’  ｔｏ  ５’  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ，２３３，１６７−１７７）。正しいサイズのＶＨ／ＶＬアンプリコンが、アガロースゲル電気泳動によって検証された。ＰＣＲ増幅したＶ遺伝子産物をアガロースゲルから切り取り、ゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製し、製造者の指示に従ってＰＣＲ産物をＴＯＰＯベクターにクローニングした。抗体遺伝子のシークエンシングは、Ｔ３／Ｔ７またはＭ１３Ｆ、Ｍ１３Ｒプライマー（ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ）のいずれかを用いて、サンガーシークエンシング法によって行った。少なくとも４つのクローンを使用して、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ上にＶＨ及びＶＬのコンセンサス配列を得た。抗体ＣＤＲは、ＩＭＧＴ／Ｖ−Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔでのワールド・ワイド・ウェブで入手可能）の助けを借りて分析したコンセンサスＶＨまたはＶＬ配列を用いて同定した。（Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ，Ｖ．，Ｃｈａｕｍｅ，Ｄ．ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．（２００４）ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ，ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｖ−Ｊ  ａｎｄ  Ｖ−Ｄ−Ｊ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２，Ｗ４３５−４４０）。ＣＤＲ位は、Ｖ−Ｂａｓｅ（ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇでのワールド・ワイド・ウェブで入手可能）と名付けられた別のソフトウェアによってさらに確認された。
【０２４５】
分子モデリング及びドッキング−抗体ホモロジーモデリング及びドッキングを使用して、ＴＣＲアルファ鎖不変異領域に向かって直鎖エピトープ特異性をもつ抗体（７９Ａ）ＣＤＲ中の残基のエネルギー寄与を試験した。Ｐａｒａｔｏｍｅサーバー（図３Ａ）によって７９Ａ  ｓｃＦｖ配列にＡＢＲ分析を施し、ＶＨ及びＶＬ領域におけるＣＤＲ残基の正しい位置決めが確認された。抗体ホモロジーモデルは、ＷＡＭサーバー（Ｗｈｉｔｅｌｅｇｇ，Ｎ．Ｒ．ａｎｄ  Ｒｅｅｓ，Ａ．Ｒ．（２０００）ＷＡＭ：ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＷＥＢ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１３，８１９−８２４）及びＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬによって開発した（図３Ｂ）。ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ（Ｂｉａｓｉｎｉ，Ｍ．，Ｂｉｅｎｅｒｔ，Ｓ．，Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，Ａ．，Ａｒｎｏｌｄ，Ｋ．，Ｓｔｕｄｅｒ，Ｇ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｔ．，Ｋｉｅｆｅｒ，Ｆ．，Ｃａｓｓａｒｉｎｏ，Ｔ．Ｇ．，Ｂｅｒｔｏｎｉ，Ｍ．，Ｂｏｒｄｏｌｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ：ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｅｒｔｉａｒｙ  ａｎｄ  ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｕｓｉｎｇ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，４２，Ｗ２５２−２５８）を適用して、Ａ７９がその重鎖中に非常に短いＣＤＲ３を含有する際にＶＨドメインを構築した。最終抗体モデル構造の品質は、ＰＲＯＣＨＥＣＫでチェックした。７９Ａ及びＴＣＲ−モデル（ＰＤＢ供給源）をＺＤＯＣＫサーバー上で使用して、ドッキングモデル（図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ）を作製した。モデルでは、ラマチャンドランプロットの最優遇領域または寛容な領域に位置したアミノ酸残基のパーセントは、９９．４％であった。Ａ７９及びＴＣＲのドッキングモデル［プロテインデータバンク（ＰＤＢ）ＩＤコード１ＫＧＣ４）］は、ＺＤＯＣＫサーバーで構築された（図３Ｄ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｂ．Ｇ．，Ｗｉｅｈｅ，Ｋ．，Ｈｗａｎｇ，Ｈ．，Ｋｉｍ，Ｂ．Ｈ．，Ｖｒｅｖｅｎ，Ｔ．ａｎｄ  Ｗｅｎｇ，Ｚ．（２０１４）ＺＤＯＣＫ  ｓｅｒｖｅｒ：ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ａｎｄ  ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ），３０，１７７１−１７７３）。ドッキングモデルの分析では、Ｆｏｌｄ  Ｘの経験的力場を適用した。Ｆｏｌｄ  Ｘの複合体「Ａｌａスキャン」機能を使用して、結合親和性を増加させるように潜在的に変異させることができたアミノ酸残基を同定した。変異型Ａ７９モデルは、「モデル構築」機能を用いて生成した。相互作用エネルギー（ΔΔＧ）の変化は、＊（ΔＧ＝ΔＧＭＵ−ΔＧＷＴ）として算出した後、それを使用して、同族受容体に向かう（抗体結合領域のＣＤＲにおける）関連ＡＡのエネルギー寄与を定義した。総エネルギーは、変異体の結合エネルギー−野生型の結合エネルギーとして定義した。
【０２４６】
ＦｏｌｄＸソフトウェアの複合体−ＡＬＡ−スキャン機能を使用して、潜在的なアミノ酸（ＡＡ）残基を同定した。その結果、ＴＣＲ−アルファ鎖に向かう７９Ａ  ＣＤＲの親和性強化が可能になった（図４Ａ、４Ｃ）。
【０２４７】
分子構築物及び抗体発現カセット−（切断型ＩｇＧ１  Ｆｃに融合したＡ７９変異型ｓｃＦｖをコードする）組換え抗体発現ベクターの概略図、すなわち、ベクター図を図５Ａ及び５Ｂに提供する。簡単に言えば、抗体遺伝子発現カセットは、可変重鎖（ＶＨ−変種）及び可変軽鎖（ＶＬ−変種）とフレーム結合したＶＨ５シグナルペプチドからなる。ＶＨ及びＶＬを改変グリシンセリンＧ３Ｓ配列によって連結し、Ａ７９−ｓｃＦｖを生成した。４つのこのような変種を作製した（Ｓ１１、Ｓ１３、Ｓ１５及びＳ２３）。４つの変種のうち、ΔΔＧが改善した２つの異なるバージョン（Ｓ１５及びＳ２３）を、機能性アッセイのために、全ＩｇＧまたはＫ５６２細胞表面上で発現されたｓｃＦｖのいずれかとして使用した。その後、Ａ７９−ｓｃＦｖを切断型ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ配列とフレームで融合した。変異体Ａ７９−ｓｃＦｖを表すｃＤＮＡは、遺伝原糸生成物（Ｇｅｎｅａｒｔ））としてデノボ合成した後、プロモーターエレメントをＳＶ４０ポリＡ尾部で終結した複製起点として、ＳＶ４０を含有するプラスミドバックボーンにクローニングした。指定された発現プラスミドを介して、哺乳動物細胞中の可溶性タンパク質として抗体を発現した。親和性精製（プロテインＡ）によって組織培養上清から分泌抗体を精製した後、ＰＢＳに透析した（ｐＨ７．２）。組換え抗体の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥでチェックし、タンパク質濃度をＢＣＡによって測定した（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。組換え抗体のアリコートは、使用するまで−８０℃で凍結保存した。
【０２４８】
７９Ａ  ＣＤＲ中の部位特異的突然変異誘発は、変異型組換え抗体Ｓ１５（一本鎖の親和性が最適化された新規の変異体１５）の再フォーマット化をもたらし、これは、汎特異的ＴＣＲアルファ鎖への親和性及び立体配置特異的結合の改善を示した（図６Ａ〜６Ｃ）。ゲル電気泳動画像は、組換え変異体２３（Ｓ２３）のホモロジー及び純度を示す（図６Ｄ）。Ｓ１５を用いて提供したさらなる結合データを図６Ｅに示す。
【０２４９】
Ｋ５６２  ＨＬＡＣ細胞上の組換え抗体Ｓ１５のベクター設計及び表面発現−切断型ＣＤ８膜貫通（ｔＣＤ８−ＴＭ）または切断型ヒトＦｃ−ｔＣＤ８−ＴＭドメインのいずれかにＳ１５配列を融合し（ＨＡタグ有無（図７Ａ））、共刺激リガンドＣ８６、ＣＤ１３７Ｌ、及びＩＬ１５−１５Ｒａと一緒にＫ５６２Ｃ細胞上で発現させた（図７Ｂ）。ベクター設計及び発現は、Ｓ２３配列についても同様であった。
【０２５０】
細胞増殖アッセイ−変異型ｓｃＦｖｓを介したＣＤ３複合体ＯＫＴ３またはαβ−ＴＣＲ関与を通じた刺激後の細胞の増殖を評価するため、ＣＦＳＥ色素希釈方法（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。生細胞を（製造者のプロトコルに従って）５ｕＭのＣＦＳＥ色素と共にロードした後、ＯＫＴ３、Ｓ１５、Ｓ２３を単独で、または１０μｇ／ｍＬ濃度のＣＤ２８との組み合わせのいずれかで被覆されたポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ）上に完全ＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ＦＢＳ、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、及びＩＬ−２；５０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２）中で１００万個の細胞／ｍＬの密度で播種した。活性化細胞を１日目、２日目、及び６日目にサンプリングし、ＣＦＳＥ減少を定量化するためにフローサイトメトリー上で実施した。ＢＤ  ＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ上の適切なフィルターで、４８８ｎｍ励起でＣＦＳＥ蛍光について生ＣＤ３＋Ｔ細胞を分析した。Ｔ細胞の連続生成ごとの明確なピークとしてＣＦＳＥ発現を示すヒストグラムとしてデータを表した（図７Ｃ及び７Ｄ）。ＣＦＳＥをロードしたＰＢＭＣは、陽性対照として使用した。市販の抗ＣＤ２８抗体は、Ｔ細胞シミュレーションのための実験抗体対照として使用した。
【０２５１】
Ｋ５６２操作された人工抗原提示細胞−Ｓ１５配列は、ＨＡタグと一緒に切断型ヒトＣＤ８膜貫通（ｔＣＤ８ＴＭ）ドメインまたは切断型ヒトＦｃ−ｔＣＤ８ＴＭドメインのいずれかに融合させた（図７Ａ）。Ｓ１５−ｔＣＤ８ＴＭ−ＨＡまたはＳ１５−ｔＣＤ８ＴＭ−ｔＦｃ融合タンパク質を表すｃＤＮＡは、遺伝原糸生成物（Ｇｅｎｅａｒｔ）として合成した。ゲートウェイ組換え法を用いて、Ｓ１５は、ＨＩＶ調節エレメント、ゲートウェイクローニング部位が隣接したＩｇカッパリーダーペプチド配列を含有するプラスミドベクターｐＬＶ３００にもどってクローン化した。２９３−ＭＥＴＲ細胞を、一過性発現のためにプラスミドでトランスフェクトした後、ウイルス粒子を培養から採取し、その後、Ａｍｉｃｏｎ超遠心分離濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で濃縮した。Ｋ５６２細胞をトランスフェクトし、ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ１５−１５ＲａなどのＴ細胞共刺激リガンドを発現させた。導入されたリガンドの表面発現は、ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ１５−１５Ｒａ（ＢＤ）及びＨＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の市販の抗体、または抗ヒトＦｃ抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）を用いて、フローサイトメトリーによって評価し、Ｓ１５融合タンパク質を検出した。組換え抗体が共刺激の不在下でＴ細胞を刺激する有効性を評価するため、ＣＤ６４を発現するようにＫ５６２細胞を操作した後、前述のように全抗体と共にロードした。
【０２５２】
Ｋ５６２−Ｓ１５フィーダー細胞（ＡａＰＣ）上のＴ細胞のエクスビボ増殖−Ｋ５６２細胞を操作して、Ｔ細胞活性化が完全なエクスビボであるように、Ｔ細胞共刺激リガンドと一緒にＳ１５またはその誘導体を発現させた。Ｓ１５を単独で、または全抗体と共にロードした共刺激リガンドもしくはＫ５６２−ＣＤ６４細胞と組み合わせて安定的に発現するＫ５６２細胞は、照射後にフィーダー細胞として使用した（図７Ｂ）。ＰＢＭＣまたは臍帯血Ｔ細胞（ＵＣＢ）由来の単核細胞を、ＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍＬ）と一緒に１：１の比率で、操作された照射Ｋ５６２と共培養させた。細胞を、Ｋ５６２−ＰＢＭＣ共培養系で、７日間隔で２回刺激した。生細胞をカウントすることで成長速度を監視した（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ（商標）トリパンブルー色素排除）（図７Ｃ〜７Ｄ）。免疫表現型は、拡張されたＴ細胞の特徴を確認するように完了した（図７Ｅ）。ＣＤ３＋ＣＤ５６ｎｅｇＴ細胞集団の出現は、フローサイトメトリーによって評価した。絶対細胞数を監視して、異なるａＡＰＣ（Ｋ５６２細胞のみ、Ｓ１５単独で／または共刺激リガンドと共にＳ１５を有するＫ５６２、抗ＣＤ３ε  ｍＡｂ（ＯＫＴ３）単独で／または共刺激と共にＯＫＴ３を有するＫ５６２、またはＳ１５、Ｓ２３、もしくはＯＫＴ３と共にロードしたＫ５６２−ＣＤ６４）上の細胞成長を推定した。エクスビボで拡張されたＴ細胞の免疫表現型検査を行い、マーカー関連の枯渇及びメモリー表現型を評価した（図７Ｅ及び７Ｆ）。
【０２５３】
フローサイトメトリー−ＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０を使用して、Ｔ細胞のマルチパラメトリック免疫表現型分析を行った。簡単に言えば、健常なドナーＰＢＭＣまたはエクスビボで培養した生Ｔ細胞を、２％ＦＢＳと共にＰＢＳを含有する冷却ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、暗所で氷上にて２０分間、蛍光色素結合抗体でインキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、生死染色用の固定可能生存可能色素で室温にて５分間インキュベートした。生細胞上でゲーティングを行い、ダンプチャネル上で単球（ＣＤ１４Ｐｏｓ）及びＢ細胞（ＣＤ１９Ｐｏｓ）を排除した。Ｔ細胞をＣＤ３ＰｏｓＣＤ５６ｎｅｇとして同定した後、αβ−ＴＣＲの発現、細胞分化（ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＤ４５ＲＯ）、Ｔｈ表現型（ＣＤ２９４及びＣＤ２５）、及び枯渇（ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＢＬＩＭＰ）のマーカーを分析した。抗体希釈及び使用は、製造者のガイドラインに従って行った。マルチパラメーター分析の補償は、較正ビーズ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行った。補償データは、Ｆｌｏｗ  ＪｏソフトウェアＶ１０によって分析し、ドットプロットとして表現した。各実験は、３人以上のドナーで行った（図７Ｇ）。
【０２５４】
高スループットディープシークエンシングによるＴＣＲレパートリー分析−活性化Ｔ細胞のＶ遺伝子再構成は、ＴＣＲβ遺伝子でコードされたヒトＴＣＲ−ＣＤＲ３領域を標的にすることによって詳細に分析した（Ａｄａｐｔｉｖｅ  ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのヒトＴＣＲβディープレベルアッセイ）。アッセイは、合成免疫受容体の類似体を組み込んで、増幅バイアスを避けて、ＴＣＲＢレパートリーＩｍｍｕＳＥＱＴＭソフトウェアの定量化を正確にするために第２のＰＣＲを含む、独自のマルチプレックスＰＣＲプライマー、増幅ステップを伴う（Ｒｏｂｉｎｓ，Ｈ．Ｓ．，Ｃａｍｐｒｅｇｈｅｒ，Ｐ．Ｖ．，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｓ．Ｋ．，Ｗａｃｈｅｒ，Ａ．，Ｔｕｒｔｌｅ，Ｃ．Ｊ．，Ｋａｈｓａｉ，Ｏ．，Ｒｉｄｄｅｌｌ，Ｓ．Ｒ．，Ｗａｒｒｅｎ，Ｅ．Ｈ．ａｎｄ  Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｃ．Ｓ．（２００９）Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ−ｃｈａｉｎ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  ａｌｐｈａｂｅｔａ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ，１１４，４０９９−４１０７．）。結果を図８Ａ〜８Ｂに示す。
【０２５５】
エクスビボで繁殖されたＴ細胞の免疫レパートリーは、ＴＣＲ−ＣＤＲ３をコードするＴＣＲβ遺伝子の次世代ディープシークエンシングによって評価した（ｈＴＣＲβディープレベルアッセイ、Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）。ＣＤ３＋Ｔ細胞（ＰＢＭＣ対照）またはエクスビボで拡張されたＴ細胞から単離されたゲノムＤＮＡをＴＣＲレパートリー分析に使用した。アッセイに使用した様々なＡＰＣグループは、Ｋ５６２Ｃ−（未改変対照）、Ｓ１５のみを発現するＫ５６２Ｃ−、共刺激分子（ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ、及びＩＬ１５−１５Ｒａ）と一緒にＳ１５を発現するＫ５６２Ｃ−、ＯＫＴ３（抗ＣＤ３ε  ｍＡｂ）、及び共刺激分子（ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ、及びＩＬ１５−１５Ｒａ）と共にロードしたＫ５６２Ｃ−であった。ベンダー提供キットで提供された独自のプライマー混合物を介した多重化によってアンプリコンを生成した（Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｃ．Ｓ．，Ｅｍｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｏ．，Ｓｈｅｒｗｏｏｄ，Ａ．Ｍ．，Ｄｅｓｍａｒａｉｓ，Ｃ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｍ．Ｗ．，Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｔｅｅｎ，Ｍ．Ｓ．，ＬａＭａｄｒｉｄ−Ｈｅｒｒｍａｎｎｓｆｅｌｄｔ，Ｍ．Ａ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．，Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｕｓｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｔｅｍｐｌａｔｅｓ  ｔｏ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎ  ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，４，２６８）。２段階増幅プロセスは、合成免疫受容体の類似体をＴＣＲβレパートリーの不偏推定のために導入した場合に行った。（Ｒｏｂｉｎｓ，Ｈ．Ｓ．，Ｃａｍｐｒｅｇｈｅｒ，Ｐ．Ｖ．，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｓ．Ｋ．，Ｗａｃｈｅｒ，Ａ．，Ｔｕｒｔｌｅ，Ｃ．Ｊ．，Ｋａｈｓａｉ，Ｏ．，Ｒｉｄｄｅｌｌ，Ｓ．Ｒ．，Ｗａｒｒｅｎ，Ｅ．Ｈ．ａｎｄ  Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｃ．Ｓ．（２００９）Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ−ｃｈａｉｎ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  ａｌｐｈａｂｅｔａ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ，１１４，４０９９−４１０７）。ＴＣＲライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｍｉＳＥＱプラットフォーム上で生成され、データは、標準的なＱＣチェック後にＩｍｍｕｎｏＳｅＱアナライザーによって分析した（Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）。免疫シークエンシングデータは、活性化Ｔ細胞の各群、ならびに操作していない健常なドナーＰＢＭＣ  Ｔ細胞から得られた。全てのデータは、操作の前後に比較した（一次Ｔ細胞対活性化Ｔ細胞）。ＴＣＲＶ遺伝子頻度、ＣＤＲ３鎖長、対合遺伝子頻度を表すデータが報告された。トップクローン分布もまた、試料群内の個体クローンごとに占めるシークエンシングリードのパーセンテージに基づいて追跡した。散布図分析は、試料群ごとのクローンの出現頻度を推定するために提供した。シャノンエントロピーに対するクローン性スコア、ピアソン係数値（ｒ２）は、異なる戦略によって活性化されたＴ細胞の各群の間で起きているクローン重複を確かめるために算出した（操作していないドナーＰＢＭＣ  Ｔ細胞と比較した、Ｓ１５対ＯＫＴ３）（図８Ｄ）。
【０２５６】
議論−発明者らは、臨床品質のＴ細胞を生成するための、Ｔ細胞を活性化し、エクスビボで増殖する別の方法を説明している。スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８  ｍＡｂと一緒にＣＤ３ε特異的ｍＡｂ  ＯＫＴ３を介したＣＤ３複合体活性化とは対照的に、Ｋ５６２−ＡａＰＣに繋ぎ止められた操作されたＴＣＲアルファ鎖特異的組換え抗体断片を介したαβ−ＴＣＲ架橋によってＴ細胞を活性化した（活性化及び増殖細胞）。
【０２５７】
αβ−ＴＣＲ＋Ｔ細胞への高親和性を有する、一本鎖の親和性が最適化された新規の変種１５及び２３（Ｓ１５及びＳ２３）を使用して、ＴＣＲ架橋によって、培養中の一次Ｔ細胞を活性化し、繁殖させた。Ｓ１５−ＡａＰＣ媒介Ｔ細胞活性化の成長速度及び表現型は、ＣＤ３ε特異的ＯＫＴ３  ｍＡｂ刺激によって達成されたものと類似していた。
【０２５８】
活性化Ｔ細胞のゲノムＤＮＡの高スループットディープシークエンシングにより、Ｓ１５を介したＴＣＲ架橋によって、クローン集団の異なるＶ遺伝子再構成及び保存が明らかになった。分析により、機能性Ｖ遺伝子再構成の予期しないいずれの変化も免疫レパートリーのいずれのゆがみも示されなかった。ＴＣＲ架橋を介して生成されたαβ＋ＴＣＲ＋Ｔ細胞は、クローン集団の保存がエクスビボでの活性化及び増殖後に望ましい状況下で役立つことができる（図９〜１１を参照）。
【０２５９】
本明細書に開示され特許請求された方法の全ては、本開示に照らせば、過度の実験なしに実施及び実行され得る。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して記載されてきたが、バリエーションが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなしに、本明細書に記載される方法に、及び方法のステップまたは一連のステップにおいて適用され得ることが、当業者に明らかである。より具体的には、化学的及び生理学的の両方で関連するある特定の作用物質（ａｇｅｎｔ）が、同じまたは類似の結果を達成する限り、本明細書に記載される作用物質の代わりに用いられてもよいことが、明らかである。当業者に明らかな全てのかかる類似の代用物及び改変は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲及び概念の範囲内であるとみなされる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ−１】
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【図１Ｅ−２】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ−１】
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【図５Ａ−２】
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【図５Ｂ】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図７Ｌ】
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【図７Ｍ】
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【図８Ａ−１】
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【図８Ａ−２】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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