(57)【要約】明視野フーリエ・タイコグラフィー撮像及び蛍光撮像用の撮像装置が、第１波長範囲の励起光を透明ウェルに与えるように構成された第１蛍光照明光源；対向して配置された一対の対物レンズを有する光学系；及び透明ウェルから光学系を通って伝搬した光を受光するように構成されたイメージセンサを具えている。このイメージセンサは、可変照明光源から異なる照射角で順次照射される照明に基づいて、ウェル内の試料を通過する光の一意的な照明による一連の強度測定値を取得するように構成され、さらに、試料が第１波長範囲の励起光に応答して発光する光に基づいて、試料の第１蛍光画像を取得するように構成されている。
2018504628.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明視野フーリエ・タイコグラフィー撮像及び蛍光撮像用の撮像装置であって、
第１波長範囲の励起光を透明なウェルに与えるように構成された第１蛍光照明光源と、
対向して配置された一対の対物レンズを有する光学系と、
前記透明なウェルから前記光学系を通して伝搬された光を受光するように構成されたイメージセンサとを具え、
該イメージセンサは、可変照明光源から異なる照射角で順次照射される照明に基づいて、前記ウェル内の試料を通過する光の、一意的な照明による一連の強度測定値を取得するようにさらに構成され、
前記イメージセンサは、前記試料が前記第１波長範囲の励起光に応答して発生する光に基づいて、前記試料の第１蛍光画像を取得するようにさらに構成されている、撮像装置。
【請求項２】
前記試料の分解能を向上させた明視野像を反復的に決定するように構成されたプロセッサをさらに具え、該分解能を向上させた明視野像は、前記一意的な照明による一連の強度測定値と自己無撞着である、請求項１に記載の撮像装置。
【請求項３】
前記試料の前記分解能を向上させた明視野像及び前記第１蛍光画像を、微速度撮影により周期的に決定する、請求項２に記載の撮像装置。
【請求項４】
前記第１波長範囲の励起光と前記異なる照射角で順次照射される照明とを、異なる画像取得時刻に与える、請求項１に記載の撮像装置。
【請求項５】
前記光学系が、前記対物レンズ間に発光フィルタを有して前記第１波長範囲の励起光を遮光するように構成されている、請求項１に記載の撮像装置。
【請求項６】
前記可変照明光源からの照明が、前記発光フィルタの通過帯域内の波長範囲の照明である、請求項５に記載の撮像装置。
【請求項７】
第２波長範囲の励起光を前記透明なウェルに与えるように構成された第２照明光源をさらに具え、
前記イメージセンサは、前記試料が前記第２波長範囲の励起光に応答して発生する光に基づいて、前記試料の第２蛍光画像を取得するようにさらに構成され、
前記プロセッサは、前記第１蛍光画像と前記第２蛍光画像とを組み合わせて、前記試料の多色蛍光画像を生成するようにさらに構成されている、請求項１に記載の撮像装置。
【請求項８】
前記光学系が、前記対物レンズ間にデュアルバンド発光フィルタを有し、前記デュアルバンド発光フィルタは、前記第１波長範囲の励起光を遮光し、かつ前記第２波長範囲の励起光を遮光するように構成されている、請求項７に記載の撮像装置。
【請求項９】
前記可変照明光源からの照明が、前記デュアルバンド発光フィルタの通過帯域内の波長範囲の照明である、請求項８に記載の撮像装置。
【請求項１０】
前記一対の対物レンズが第１対物レンズ及び第２対物レンズを具え、該第１対物レンズは、前記ウェルからの光を集光するように構成され、前記第２対物レンズは、前記光を前記イメージセンサに焦点を結ぶように集束させるように構成され、前記第１対物レンズ及び前記第２対物レンズが同じ開口数を有する、請求項１に記載の撮像装置。
【請求項１１】
前記対物レンズの各々が０．５５未満の開口数を有する、請求項１に記載の撮像装置。
【請求項１２】
前記第１蛍光照明光源が、前記第１波長範囲の励起光を、前記透明なウェルの底面の平面に対して小さい角度で指向させ、かつ前記透明なウェルの中心に指向させる、請求項１に記載の撮像装置。
【請求項１３】
前記透明なウェルがマルチウェル・プレートである、請求項１に記載の撮像装置。
【請求項１４】
前記透明なウェルが６ウェル・プレートまたは１２ウェル・プレートである、請求項１に記載の撮像装置。
【請求項１５】
前記透明なウェルが少なくとも２０mmの幅を有する、請求項１に記載の撮像装置。
【請求項１６】
フーリエ・タイコグラフィー撮像及び蛍光撮像用のシステムであって、
マルチウェル・プレートを受けるように構成された本体と、
前記マルチウェル・プレート内のウェルと１対１に対応するように配置された撮像装置とを具えたシステムにおいて、
前記撮像装置の各々が、
第１波長範囲の励起光を、対応する前記ウェルに与えるように構成された第１蛍光照明光源と、
対向して配置された一対の対物レンズを有する光学系と、
前記対応するウェルから受光した光に基づいて強度測定値を捕捉するように構成されたイメージセンサとを具え、
前記システムは、可変照明光源によって異なる照射角で順次照射される照明中に取得した、一意的な照明による一連の前記強度測定値に基づいて、フーリエ・タイコグラフィー再構成を用いて前記試料の分解能を向上させた明視野像を生成し、
前記システムは、前記試料が前記第１波長範囲の励起光を受光したことに応答して発生する光に基づいて、第１蛍光画像を生成する、システム。
【請求項１７】
前記試料の分解能を向上させた明視野像を反復的に決定するように構成されたプロセッサをさらに具え、該明視野像は、前記一意的な照明による一連の強度測定値と自己無撞着である、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記試料の前記分解能を向上させた明視野像及び前記第１蛍光画像を、微速度撮影により周期的に決定する、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１９】
前記第１波長範囲の励起光と前記異なる照射角で順次照射される照明とを、異なる画像取得時刻に与える、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２０】
前記光学系が、前記対物レンズ間に発光フィルタを有して前記第１波長範囲の励起光を遮光するように構成されている、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２１】
前記可変照明光源からの照明が、前記発光フィルタの通過帯域内の波長範囲の照明である、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
第２波長範囲の励起光を前記透明なウェルに与えるように構成された第２照明光源をさらに具え、
前記イメージセンサは、前記試料が前記第２波長範囲の励起光に応答して発生する光に基づいて、前記試料の第２蛍光画像を取得するようにさらに構成され、
前記プロセッサは、前記第１蛍光画像と前記第２蛍光画像とをオーバーレイして、前記試料の多色蛍光画像を生成するようにさらに構成されている、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２３】
前記光学系が、前記対物レンズ間にデュアルバンド発光フィルタを有し、前記デュアルバンド発光フィルタは、前記第１波長範囲の励起光を遮光し、かつ前記第２波長範囲の励起光を遮光するように構成されている、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記可変照明光源からの照明が、前記デュアルバンド発光フィルタの通過帯域内の波長範囲の照明である、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
前記一対の対物レンズが第１対物レンズ及び第２対物レンズを具え、該第１対物レンズは、前記ウェルからの光を集光するように構成され、前記第２対物レンズは、前記光を前記イメージセンサに焦点を結ぶように集束させるように構成され、前記第１対物レンズ及び前記第２対物レンズが同じ開口数を有する、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２６】
前記対物レンズの各々が０．５５未満の開口数を有する、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２７】
前記第１蛍光照明光源が、前記第１波長範囲の励起光を、前記透明なウェルの底面の平面に対して小さい角度で指向させ、かつ前記透明なウェルの中心に指向させる、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記透明なウェルがマルチウェル・プレートである、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２９】
前記透明なウェルが６ウェル・プレートまたは１２ウェル・プレートである、請求項１６に記載のシステム。
【請求項３０】
前記透明なウェルが少なくとも２０mmの幅を有する、請求項１６に記載のシステム。
【請求項３１】
可変照明光源を用いた平面波照明により、マルチウェル・プレートを複数の照射角で順次照射するステップと、
前記マルチウェル・プレート内のウェル毎に、前記複数の照射角で順次照射される照明に基づいて、当該ウェル内の試料を通過する光から、一意的な照明による一連の強度測定値を取得するステップと、
前記マルチウェル・プレート内の前記ウェル毎に、前記一意的な照明による一連の強度測定値に基づいて、フーリエ・タイコグラフィー再構成プロセスにより、前記試料の分解能を向上させた明視野像を再構成するステップと
を含む撮像方法。
【請求項３２】
前記可変照明光源内の光源の位置を、前記マルチウェル・プレート内の前記ウェルからの光を受光するイメージセンサの位置に合わせて較正するステップと、
前記順次照射される照明を与える前記可変照明光源の中心発光素子を照射するステップと、
前記マルチウェル・プレート内の前記ウェル内の前記試料を通過する光から強度画像を取得するステップと、
前記輝度画像の中心を特定するステップと、
前記強度画像中のシフトを測定するステップと、
前記中心発光素子の変位を、検索データを用いて見出すステップと、
前記中心発光素子の変位に基づいて、前記複数の照射角を測定するステップと
をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記可変照明光源内の光源の位置を、前記マルチウェル・プレート内の前記ウェルからの光を受光するイメージセンサの位置に合わせて較正するステップと、
前記マルチウェル・プレートを、第１波長範囲の励起光で照射するステップと、
前記マルチウェル・プレート内の前記ウェル毎に、当該ウェル内の前記試料の第１蛍光画像を取得するステップと
をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記マルチウェル・プレートを、第２波長範囲の励起光で照射するステップと、
前記マルチウェル・プレート内の前記ウェル毎に、当該ウェル内の前記試料の第２蛍光画像を取得するステップと、
前記第１蛍光画像と前記第２蛍光画像とをオーバーレイして多色蛍光画像を生成するステップと
をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許仮出願第６２／１０７６３１号、発明の名称”Real-time Cell Culture Monitoring via Fourier Ptychographic Microscopy”、２０１５年１月２６日出願、及び米国特許仮出願第６２／１０７６２８号、発明の名称”Development of 96-well Plate Fluorescence Imaging System”、２０１５年１月２６日出願に基づいて優先権を主張し、これらの仮出願は共に、すべての目的でその全文を参照する形で本明細書に含める。本願は、米国特許出願第１５／００７１９６号（代理人整理番号：CIT1P033/CIT 7093）、発明者：Kim他、発明の名称”ARRAY LEVEL PTYCHOGRAPHIC IMAGING”、本願と同日出願にも関連し、この特許出願も、すべての目的でその全文を参照する形で本明細書に含める。
【０００２】
連邦支援の研究開発
本発明は、米国立衛生研究所によって付与された認可番号OD007307の下で米国政府支援によりなされたものである。米国政府は本発明について特定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
特定の態様は、一般にデジタル撮像に関するものであり、より具体的には、フーリエ・タイコグラフィー及び蛍光撮像用の撮像システム、装置、及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
生細胞撮像及び他の細胞培養監視は、移動、分裂、分化、環境との相互作用、及び細胞小器官レベルの事象のような動的な細胞挙動をより良く理解するための生物科学実験において広く用いられている。細胞培養監視は、早期段階での不測の細胞死及び細胞汚染を検出して、細胞培養の失敗を適時な方法で救済する機会を提供することもできる。
【０００５】
長期的研究のために、生物科学者は伝統的に、http://www.zeiss.com/microscopy/en_us/products/microscope-components/incubation.htmlに説明されているように、特化した培養兼撮像チャンバを従来の顕微鏡上に構築して、培養した細胞を顕微鏡ステージ上で直接撮像する方法を採っていた。しかし、この方法は高価であるだけでなく、大量の用地を研究所内に占める。さらに、視野及び分解能（解像度）は、従来型顕微鏡内の対物レンズの物理特性に結び付く。従って、こうした従来型顕微鏡プラットフォームを用いる際には、視野と分解能とのトレードオフ（妥協、得失評価）を行わなければならない。他の細胞培養監視の従来方法は、http://www.essenbioscience.com/essen-products/incucyte/に説明されているように、撮像システムを培養器内に含めることである。これらの従来型システムは、標準的な顕微鏡も用いることが不都合である。さらに、機械的走査を用いる。その結果、これらの従来型システムでは、広い視野と高分解能撮像とを同時に得ることは困難である。これに加えて、これらのシステムは、構築して維持することが高価であり、その性能は従来型顕微鏡自体によって限定される。即ち、従来型顕微鏡を通してアクセス可能な空間帯域幅積（ＳＢＰ：space-bandwidth product）によって特徴付けられる分解可能な画素の数は、一般に１０メガ画素に制限される。こうしたＳＢＰの制限は、従来型システムによって実現される画像取得または性能に制約を与える。
【０００６】
最近、従来型顕微鏡のＳＢＰ限界を克服する目的で、オンチップ（チップ上）顕微鏡が開発されてきた。これらのオンチップ顕微鏡は、培養器内からの細胞培養体の良好な高分解能かつ広視野（ＦＯＶ：field-of-view）の撮像を実証してきた。これらのオンチップ顕微鏡の例は、G. Zheng, S. A. Lee, Y. Antebi, M. B. Elowitz, and C. Yang, “The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM)”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108(41), 16889-16894 (2011)（非特許文献１）、J. H. Jung, C. Han, S. A. Lee, J. Kim, and C. Yang, “Microfluidic-integrated laser-controlled microactuators with on-chip microscopy imaging functionality”, Lab Chip 14(19), 3781-3789 (2014)（非特許文献２）、及びC. Han, S. Pang, D. V. Bower, P. Yiu, and C. Yang, “Wide field-of-view on-chip Talbot fluorescence microscopy for longitudinal cell culture monitoring from within the incubator”, Anal. Chem. 85(4), 2356-2360 (2013)（非特許文献３）に見出すことができる。しかし、これらのオンチップ顕微鏡は、細胞をイメージセンサ上で成長させる必要があるという固有の制約を有する。こうした制約は、従来の細胞培養の作業の流れからの著しい逸脱である。培養細胞または生物試料をセンサチップ上で撮像する場合、その表面はシリコン系材料（通常は窒化シリコン）製であり、従って細胞培養の環境が変化する。特別な層を画像センサ上にコーティングすることができるとしても、表面の下層は、従来の細胞培養作業の流れで使用するプラスチックまたはガラスとは異なる。さらに、撮像センサの表面は能動層であり、動作中に熱を出す。従って、システムが冷却用に設計されていない限り、細胞培養環境は、こうした熱に関係する温度変化によって影響され得る。デジタル・インライン・ホログラフィーのような他のレンズなし撮像法は、こうした制約なしに機能することができ、高い撮像ＳＢＰを明視野モードで提供することができるが、光学焦点調節素子がないことは、効果的な蛍光撮像能力を有することの妨げとなる。焦点調節素子は効果的な蛍光撮像能力のために必要である、というのは、予期される蛍光発生は非コヒーレント（非干渉性）かつ低強度であり、焦点調節素子なしでは蛍光撮像の分解能を低下させるからである。デジタル・インライン・ホログラフィーの例は、W. Bishara, T. W. Su, A. F. Coskun, and A. Ozcan, “Lensfree on-chip microscopy over a wide field-of-view using pixel super-resolution”, Opt. Express 18(11), 11181-11191 (2010)（非特許文献４）、W. Bishara, U. Sikora, O. Mudanyali, T. W. Su, O. Yaglidere, S. Luckhart, and A. Ozcan, “Holographic pixel super-resolution in portable lensless on-chip microscopy using a fiber-optic array”, Lab Chip 11(7), 1276-1279 (2011)（非特許文献５）、及びA. Greenbaum, U. Sikora, and A. Ozcan, “Field-portable wide-field microscopy of dense samples using multi-height pixel super-resolution based lensfree imaging”, Lab Chip 12(7), 1242-1245 (2012)（非特許文献６）に見出すことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願第１４／９６０２５２号明細書
【特許文献２】米国特許出願第１４／０６５２８０号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】G. Zheng, S. A. Lee, Y. Antebi, M. B. Elowitz, and C. Yang, “The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM)”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108(41), 16889-16894 (2011)
【非特許文献２】J. H. Jung, C. Han, S. A. Lee, J. Kim, and C. Yang, “Microfluidic-integrated laser-controlled microactuators with on-chip microscopy imaging functionality”, Lab Chip 14(19), 3781-3789 (2014)
【非特許文献３】C. Han, S. Pang, D. V. Bower, P. Yiu, and C. Yang, “Wide field-of-view on-chip Talbot fluorescence microscopy for longitudinal cell culture monitoring from within the incubator”, Anal. Chem. 85(4), 2356-2360 (2013)
【非特許文献４】W. Bishara, T. W. Su, A. F. Coskun, and A. Ozcan, “Lensfree on-chip microscopy over a wide field-of-view using pixel super-resolution”, Opt. Express 18(11), 11181-11191 (2010)
【非特許文献５】W. Bishara, U. Sikora, O. Mudanyali, T. W. Su, O. Yaglidere, S. Luckhart, and A. Ozcan, “Holographic pixel super-resolution in portable lensless on-chip microscopy using a fiber-optic array”, Lab Chip 11(7), 1276-1279 (2011)
【非特許文献６】A. Greenbaum, U. Sikora, and A. Ozcan, “Field-portable wide-field microscopy of dense samples using multi-height pixel super-resolution based lensfree imaging”, Lab Chip 12(7), 1242-1245 (2012)
【非特許文献７】G. Zheng, R. Horstmeyer, and C. Yang, “Wide-field, high-resolution Fourier ptychographic microscopy”, Nat. Photonics 7(9), 739-745 (2013)
【非特許文献８】X. Ou, R. Horstmeyer, C. Yang, and G. Zheng, “Quantitative phase imaging via Fourier ptychographic microscopy”, Opt. Lett. 38(22), 4845-4848 (2013)
【非特許文献９】R. Horstmeyer and C. Yang, “A phase space model of Fourier ptychographic microscopy”, Opt. Express 22(1), 338-358 (2014)
【非特許文献１０】X. Ou, G. Zheng, and C. Yang, “Embedded pupil function recovery for Fourier ptychographic microscopy”, Opt. Express 22(5), 4960-4972 (2014)
【非特許文献１１】X.Ou, R. Horstmeyer, G. Zheng, and C. Yang, “High numerical aperture Fourier ptychography: principle, implementation and characterization”, Opt. Express 23(3), 3472-3491 (2015)
【非特許文献１２】J. Chung, X. Ou, R. P. Kulkarni, and C. Yang, “Counting White Blood Cells from a Blood Smear Using Fourier Ptychographic Microscopy”, PLoS One 10(7), e0133489 (2015)
【非特許文献１３】A. Williams, J. Chung, X. Ou, G. Zheng, S. Rawal, Z. Ao, R. Datar, C. Yang, and R. Cote, “Fourier ptychographic microscopy for filtration-based circulating tumor cell enumeration and analysis”, J. Biomed, Opt. 19(6), 066007 (2014)
【非特許文献１４】R. Horstmeyer, X. Ou, G. Zheng, P. Williams, and C. Yang, “Digital pathology with Fourier ptychography”, Comput. Med. Imaging Graphics 42, 38-43 (2015)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
特定の態様は、マルチウェル系（ＭＷＢ：multi-well based）の、フーリエ・タイコグラフィー撮像及び蛍光撮像のシステム、装置、及び方法に関連する。一部の態様では、複数のＭＷＢシステムを培養器内に実現することができる。一部の態様では、ＭＷＢシステムが複数の撮像装置を単一の本体内に有して、マルチウェル・プレート内の複数の試料を並行して撮像する。
【００１０】
特定の態様は、明視野フーリエ・タイコグラフィー撮像及び蛍光撮像用の撮像装置に関連する。この撮像装置は、第１波長範囲の励起光を透明ウェルに与えるように構成された第１蛍光照明光源を具えている。この撮像装置は、対向して配置された一対の対物レンズを有する光学系をさらに具えている。この撮像装置は、上記透明ウェルから上記光学系を通って伝搬される光を受光するように構成されたイメージセンサをさらに具えている。このイメージセンサは、可変照明光源から異なる照射角で順次照射される照明に基づいて、ウェル内の試料を通過する光の、一意的な照明による一連の強度測定値を取得するようにさらに構成されている。上記イメージセンサは、試料が第１波長範囲の励起光に応答して発生する光に基づいて試料の第１蛍光画像を取得するようにさらに構成されている。特定の実現では、上記イメージセンサが、画像を取得するための制御命令を有するプロセッサからの（例えばコントローラの）信号を受信する。
【００１１】
特定の態様は、フーリエ・タイコグラフィー撮像及び蛍光撮像用のシステムに関連する。このシステムは、マルチウェル・プレートを受けるように構成された本体、及びこのマルチウェル・プレート内のウェルと１対１に対応するように配置された撮像装置を具えている。各撮像装置は、第１波長範囲の励起光を対応するウェルに与えるように構成された第１蛍光照明光源、及び対向して配置された一対の対物レンズを有する光学系を具えている。各撮像装置は、対応するウェルから受光した光に基づいて強度測定値を捕捉するためのイメージセンサをさらに具えている。このシステムは、可変照明光源による異なる照射角で順次照射される照明中に取得した一意的な照明による一連の強度測定値に基づいて、フーリエ・タイコグラフィー再構成を用いて、分解能を向上させた試料の明視野像を生成するように構成されている。このシステムは、試料が上記第１波長範囲の励起光を受光したことに応答して発生する光に基づいて第１蛍光画像を生成するようにも構成されている。
【００１２】
特定の態様は、上記マルチウェル・プレートを平面波照明で、複数の照射角で順次照射するステップを含む撮像方法に関連する。ウェル・プレート内のウェル毎に、この撮像方法は、複数の照射角で順次照射される照明に基づいて、当該ウェル内の試料を通過する光からの一意的な照明による一連の強度測定値を取得する。これに加えて、ウェル・プレート内のウェル毎に、上記一意的な照明による一連の強度測定値に基づいて、フーリエ・タイコグラフィー再構成プロセスにより、分解能を向上させた試料の明視野像を再構成する。特定の実現では、この撮像方法は、可変照明光源内の光源の位置を、マルチウェル・プレート内のウェルからの光を受光するイメージセンサの位置に合わせて較正するステップをさらに含む。
【００１３】
これら及び他の特徴は、添付した図面を参照しながら、以下により詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】一実施形態による、フーリエ・タイコグラフィー明視野撮像及び／または蛍光撮像用の複数のＷＭＢシステムを有する培養システムの構成要素の概略図である。
【図２Ａ】一実施形態による、図１に示すＭＷＢシステムのうちの１つの、構成要素の概略図である。
【図２Ｂ】図２Ａに示すＭＷＢシステムの構成要素の一部の概略分解図である。
【図２Ｃ】図２Ａ及び２Ｂに示すＭＷＢシステムの撮像装置の構成要素の概略側面図である。
【図２Ｄ】一実施形態による、図２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃに示すＭＷＢシステムの構成要素の概略側面図であり、プロセッサ、コンピュータ可読媒体（ＣＲＭ）、及び光学ディスプレイも示す。
【図３Ａ】一実施形態による、シングルバンド蛍光撮像用に構成されたＭＷＢシステムの構成要素の概略平面図である。
【図３Ｂ】一実施形態による、デュアルバンド蛍光撮像用に構成されたＭＷＢシステムの構成要素の概略平面図である。
【図４Ａ】一実施形態による、デュアルバンド蛍光撮像用に構成されたＭＷＢシステムの構成要素の概略図である。
【図４Ｂ】一実施形態による、図４Ａに示すＭＷＢシステムの一部の構成要素の概略図である。
【図５】一実施形態による、ＭＷＢシステムの写真である。
【図６】可変照明光源の離散した発光素子（ＬＥＤ）のイメージセンサに対する位置を較正するための較正プロセスのフローチャートである。
【図７Ａ】一実施形態による、ＬＥＤマトリクスの中心ＬＥＤによる照明中に捕捉したモノクローム・ビネット画像である。
【図７Ｂ】図７Ａの画像を変換した白黒画像である。
【図７Ｃ】他の実施形態による、ＬＥＤマトリクスの中心ＬＥＤによる照明中に捕捉した画像である。
【図７Ｄ】一実施形態による、イメージセンサの中心に対する画像の中心のｘシフト及びｙシフトに関連するＬＥＤ変位の検索プロット図である。
【図８】実施形態による、ＭＷＢシステムの１つ以上の撮像装置の各々によって実現される撮像方法の動作を表すフローチャートである。
【図９】一実施形態による、ＦＰ再構成のフローチャートである。
【図１０】一実施形態による、ＦＰ再構成のフローチャートである。
【図１１Ａ】４Ｘ／ＮＡ０．１対物レンズを有する従来型顕微鏡で平面照明により撮影したＵＳＡＦターゲットの画像である。
【図１１Ｂ】一実施形態による、１：１の撮像構成を有するＭＷＢシステムによって撮影したＵＳＡＦターゲットのＲＡＷ強度画像である。
【図１１Ｃ】一実施形態による、ＭＷＢシステムによって実現されるＦＰ撮像プロセスによって生成したＵＳＡＦターゲットの高分解能明視野像を含む図である。
【図１２Ａ】一実施形態による、ＭＷＢシステムを用いて取得した低分解能明視野像に蛍光画像をオーバーレイした画像である。
【図１２Ｂ】一実施形態による、ＭＷＢシステムによって実現される撮像方法のＦＰ再構成プロセスを用いて生成した再構成高分解能明視野像である。
【図１２Ｃ】一実施形態による、ＭＷＢシステムによって実現される撮像方法のＦＰ再構成プロセスを用いて生成した再構成された位相画像である。
【図１２Ｄ】一実施形態による、上記再構成された位相画像上のビーズの、図１２Ｃ中に示す直線上の厚さをプロットした図である。
【図１３Ａ】ｚ＝＋１００μmにあるＵＳＡＦターゲットのデフォーカスした画像である。
【図１３Ｂ】一実施形態による、図１３Ａに示す画像をデジタル処理でリフォーカスした画像であり、ＭＷＢシステムによって実現される撮像方法のＦＰ再構成プロセス中にデジタル処理でリフォーカスしている。
【図１４Ａ】ｚ＝−１００μmにあるＵＳＡＦターゲットのデフォーカスした画像である。
【図１４Ｂ】一実施形態による、図１４Ａに示す画像をデジタル処理でリフォーカスした画像であり、ＭＷＢシステムによって実現される撮像方法のＦＰ再構成プロセス中にデジタル処理でリフォーカスしている。
【図１５】一実施形態による、図１３Ｂ及び１４Ｂに示す解像可能な最小の特徴の直線軌跡のプロット図である。
【図１６Ａ】デフォーカスしたニューロン培養試料の画像である。
【図１６Ｂ】一実施形態による、ＭＷＢシステムによって実現される撮像方法のＦＰＭ再構成を用いてデジタル処理でリフォーカスした位相画像である。
【図１７】一実施形態による、ＭＷＢシステムによって生成した大視野像を示す図である。
【図１８】一実施形態による、ＭＷＢシステムによって実現される撮像方法のＦＰプロセスによって生成した微速度撮影による一連の位相画像である。
【図１９】一実施形態による、ＭＷＢシステムによって生成した画像に基づいて追跡した標的細胞の位置軌跡をプロットした図である。
【図２０】一実施形態による、ＭＷＢシステムによって実現される撮像方法のＦＰプロセスによって生成した微速度撮影による一連の画像である。
【図２１】一実施形態による、特定のＭＷＢシステム内に存在し得る１つ以上のサブシステムのブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
種々の異なる態様を、添付した図面を参照しながら以下に説明する。図面中に示す特徴は現寸に比例しないことがある。
【００１６】
Ｉ．導入部
特定の態様は、マルチウェル系（ＭＷＢ）システム、装置、及び高分解能フーリエ・タイコグラフィー明視野撮像及び中分解能蛍光撮像に関連する。複数の態様では、ＭＷＢシステムが、マルチウェル・プレート（例えば６ウェル・プレートまたは１２ウェル・プレート）を受けるように設計された本体を含み、そして、これらのマルチウェル・プレート内の対応するウェルを撮像するための複数の撮像装置を含む。これらの態様では、各撮像装置が、対応するウェルに蛍光照明を与えるための１つ以上の高出力蛍光照明光源、結像コラム内に対向して配置された一対の対物レンズ（例えば、低ＮＡ（numerical aperture：開口数）の対物レンズ）を有する光学系、及びイメージセンサを有する。イメージセンサは、対応するウェルから光学系によって伝搬され、集光され集束されて焦点を結ぶ光を受光する。ＬＥＤ（light emitting diode：発光ダイオード）マトリクスまたは他の可変照明光源が、ウェル・プレート内のウェルを異なる照射角から順次照射してフーリエ・タイコグラフィー照明を与える。一部の態様では、発光フィルタを一対の対物レンズ間に配置して、１つ以上の蛍光照明光源からの励起光を遮光する。１つの態様では、可変照明光源からの照射の波長が発光フィルタの通過帯域内に入り、これにより、イメージセンサは、発光フィルタを除去しなければならないことなしに、フーリエ・タイコグラフィー照明に基づく一意的な照明による一連の明視野像、及び蛍光照明に基づく一連の蛍光画像を取得することができる。ＦＰ（Fourier ptychographic：フーリエ・タイコグラフィー）再構成プロセスを用いて、イメージセンサによって捕捉した、一意的な照明による試料の明視野像から、各ウェル内の試料の、分解能を向上させた明視野像を生成することができる。従って、特定のＭＷＢシステムは、複数のウェル内の試料の、高分解能の明視野像及び中分解能の蛍光画像の両方を並行して生成することができる。特定のＭＷＢシステムの撮像装置は小型化して平行なコラム内に配置することができるので、これらの撮像装置は、マルチウェル・プレートとおよそ同じフットプリント（設置面積）を有することができ、そして単一の培養器内に配置することができる。
【００１７】
フーリエ・タイコグラフィー（ＦＰ）技術を用いて、従来型撮像システムのＳＢＰ限界を克服することができる。ＦＰ技術を用いる従来型顕微鏡システムの一部の例は、G. Zheng, R. Horstmeyer, and C. Yang, “Wide-field, high-resolution Fourier ptychographic microscopy”, Nat. Photonics 7(9), 739-745 (2013)（非特許文献７）、X. Ou, R. Horstmeyer, C. Yang, and G. Zheng, “Quantitative phase imaging via Fourier ptychographic microscopy”, Opt. Lett. 38(22), 4845-4848 (2013)（非特許文献８）、R. Horstmeyer and C. Yang, “A phase space model of Fourier ptychographic microscopy”, Opt. Express 22(1), 338-358 (2014)（非特許文献９）、X. Ou, G. Zheng, and C. Yang, “Embedded pupil function recovery for Fourier ptychographic microscopy”, Opt. Express 22(5), 4960-4972 (2014)（非特許文献１０）、X.Ou, R. Horstmeyer, G. Zheng, and C. Yang, “High numerical aperture Fourier ptychography: principle, implementation and characterization”, Opt. Express 23(3), 3472-3491 (2015)（非特許文献１１）、J. Chung, X. Ou, R. P. Kulkarni, and C. Yang, “Counting White Blood Cells from a Blood Smear Using Fourier Ptychographic Microscopy”, PLoS One 10(7), e0133489 (2015)（非特許文献１２）、A. Williams, J. Chung, X. Ou, G. Zheng, S. Rawal, Z. Ao, R. Datar, C. Yang, and R. Cote, “Fourier ptychographic microscopy for filtration-based circulating tumor cell enumeration and analysis”, J. Biomed, Opt. 19(6), 066007 (2014)（非特許文献１３）、及びR. Horstmeyer, X. Ou, G. Zheng, P. Williams, and C. Yang, “Digital pathology with Fourier ptychography”, Comput. Med. Imaging Graphics 42, 38-43 (2015)（非特許文献１０）に説明され、これらの文献は説明用に参照する形で本明細書に含める。
【００１８】
特定の態様は、明視野高分解能の撮像のためにＦＰ技術を実現することができ、そして中分解能の蛍光画像を取得することもできる撮像装置に関連する。ＦＰ技術を実現するために、一連の離散光源を有する可変照明光源（例えば、ＬＥＤマトリクス）が、平面波照明を、一連の照射方向で順次、試料に与えることができる。試料が異なる照射方向で順次照射される間に、イメージセンサは、異なる露光時刻に試料を通過する光から、一連の強度分布測定値（ＲＡＷ強度画像）を捕捉する。この強度画像どうしを、フーリエ・タイコグラフィー再構成プロセスを用いて空間周波数領域内で組み合わせて高分解能画像を生成することができる。（低い開口数（ＮＡ）を有する）低倍率の対物レンズを集光素子として用いることによって、撮像装置は、広視野を維持しつつ分解能を向上させることができる。
【００１９】
特定の態様では、ＭＷＢシステムの撮像装置が、高性能細胞培養体撮像用に構成されている。これらの場合、撮像装置の構成要素は、複数の試料を並行して撮像することができる単純な小型ＭＷＢシステム用に設計されて単一の本体内に配置されている。ＭＷＢシステムが小型であるので、多数の細胞培養体の並列的監視用に、複数のＭＷＢシステムを培養システム内に組み込むことができる。このＭＷＢシステムの撮像装置は、試料をイメージセンサ上に配置することを必要としないので、細胞培養体をマルチウェル・プレート内で成長させて撮像することができる。
【００２０】
特定の態様では、ＭＷＢシステムの撮像装置が、ミスアライメント（位置不整合）及び／またはデフォーカス（焦点ぼけ）のような実験誤差を許容する撮像技術を用い、こうした撮像技術は、中断なしの長期的監視（例えば、長期的研究）にとって有用であり得る。特定の場合、ＭＷＢシステムの撮像装置は、ＦＰ再構成プロセスの一部として、マルチウェル・プレートのミスアライメントを修正すること、及び／または高分解能画像をデジタル処理でリフォーカス（焦点合わせ直し）することができる較正プロセスを有する撮像方法を実現する。ＦＰ再構成プロセスで得られるデジタル・リフォーカス能力は、ウェル・プレートの小さいドリフト（ゆらぎ）及び機械的不安定性に対して有用であり得る。このことは、システムのユーザにとって顕著な利益である、というのは、ユーザは、従来の撮像技術では受け付けられなかったかも知れない画像を保持してリフォーカスすることができるからである。これに加えて、このことは、機械的なオートフォーカス（自動焦点調整）の解決策の必要性を解消して撮像装置を簡略化する。ＦＰ技術のデジタル・リフォーカス能力のある程度の詳細は、非特許文献７に記載されている。構成要素及びその配置を単純にすることができるので、これらの撮像装置は小型で費用効果的にすることができる。複数の撮像装置ユニットを有するシステムは、費用効果的かつ小型に作製して、例えば同時の撮像能力を提供することができる。並列的な撮像を実行する能力は、システムの有効なＳＢＰを、並列なユニットの数に等しい倍率で増強することができる。
【００２１】
特定の態様では、ＭＷＢシステムの撮像装置が、試料の代表的な部分を監視するのに十分な大きさの広視野を有するように設計され、このことは、生物研究において細胞培養監視を最も効果的に行うために有用である。一部の場合には、撮像装置が０．０１mm2〜１００cm2の範囲内の視野を有する。特定の態様では、撮像装置が、関心のある細胞変化を区別するのに十分な高さの分解能で画像を生成するように設計されている。一部の場合には、撮像装置が２μm〜１０μmの空間分解能を有する。
【００２２】
ＩＩ．フーリエ・タイコグラフィー明視野撮像及び蛍光撮像用システム
特定の態様は、１つ以上のＭＷＢシステムを入れ込むことができる容積を有する培養器を具えた培養システムに関連する。特定の場合、ＭＷＢシステムが、単一の本体内に平行に配置され垂直方向の結像コラムを有する複数の撮像装置（撮像ユニットとも称する）を有する。設計通りに、このＭＷＢシステムは、この本体上に載置したマルチウェル・プレートの複数のウェル内の試料を同時に（並行して）撮像することができる。このＭＷＢシステムの各撮像装置は、マルチウェル・プレート内の対応するウェル内の試料の、フーリエ・タイコグラフィー明視野高分解能撮像及び中分解能蛍光撮像の両用に構成されている。培養器の例は、２００リットルの容積を有する生物培養器である。
【００２３】
一部の場合には、培養システムが、容積内で水平方向に間隔をおいた複数の水平棚を有する。これらの水平棚は、プレート（平皿、平板）、フラスコ、及び／または１つ以上のＭＷＢシステムのような種々の備品を保持するようなサイズ及び間隔を有する。１つの態様では、培養システムが、１つ以上のＭＷＢシステムを１つの水平棚上に載置することができるようなサイズ及び間隔の水平棚を有する。一例では、隣接する水平棚間の間隔が少なくとも２５０mm間隔である。培養システムは、各ＭＷＢシステム内の撮像装置と、プロセッサ（例えばマイクロプロセッサ）及び／または電源との間の電気接続部も含む。
【００２４】
１つの態様では、培養システムが、１つ以上のＭＷＢシステムを載置することができる水平棚の上方にある表面または他の構造上に配置された可変照明光源（例えば、ＬＥＤマトリクス）を含む。一例では、載置される水平棚が培養器の下側の棚である。この場合、ＬＥＤマトリクスまたは他の可変照明光源は下向きであり、この下側の棚の上方にある水平棚の下面上に配置されている。他の場合、載置される水平棚が培養器の最上部の棚である。この場合、ＬＥＤマトリクスまたは他の可変照明光源は下向きであり、培養器の容積をなす上側水平壁の内面上に配置されれいる。本明細書では、培養システムの特定例を、棚毎に６つのＭＷＢシステムを有する２つの水平棚の培養器で説明しているが、本発明はそれに限定されす、培養システムの他の例は、より多数または少数の棚を有すること、及び／または、１つの水平棚上により多数または少数のＭＷＢシステムを載置することができるように構成された培養器を有することができることは明らかである。
【００２５】
図１は、一実施形態による、フーリエ・タイコグラフィー明視野撮像及び／または蛍光撮像用の複数のＭＷＢシステム１００を有する培養システム１０の構成要素の概略図である。培養システム１０は、容積１４（例えば、２００リットル）、容積１４内の２つの水平棚１６、及び培養器１２の下面に近接した水受けトレイ３０を具えている。水平棚１６どうしは間隔をおいている（例えば、少なくとも２５０mmの間隔）。フーリエ・タイコグラフィー明視野撮像及び／または蛍光撮像用の１２個のＭＷＢシステムを、培養器１２の容積１４内の２つの水平棚１６上に（１つの棚に６個）載置して示す。この培養システムは、カラーＬＥＤマトリクスの形態の２つの可変照明光源１１０を含む。第１可変照明光源１１０は、培養器１２の水平棚１６上に載置された６個のＭＷＢシステムに順次照射されるＦＰ照明を与えるように構成されている。第１可変照明光源１１０は、培養器１２の容積１４の上側水平壁の下面に取り付けられている。第２可変照明光源１１０は、ＭＷＢシステム１００を載置された下側の水平棚の上方に、上側の水平棚１６の下面に取り付けられている。培養システム１０は、ＭＷＢシステム１００とプロセッサ及び／または電源との間の電気接続部（図２Ｄに示す）も含む。
【００２６】
図示する例では、各水平棚１６上の６個のＭＷＢシステム１００が、可変照明光源１１０を共用する。可変照明光源１１０は、順次照射される照明を異なる照射角で、ＭＷＢシステム１００のウェル・プレート内の試料に与える。他の例では、各ＭＷＢシステム１００が、自前の可変照明光源１１０を有するか、あるいはより多数またはより少数のＭＷＢ１００と共用する。
【００２７】
特定の態様は、複数の並列な撮像装置を有するＭＷＢシステムに関連する。各撮像装置は、垂直方向に整列した構成要素を有し、これにより、これらの並列な撮像装置を単一の本体内に配置して、この本体上に載置されたマルチウェル・プレート内の複数のウェル内の試料を同時に撮像することを可能にすることができる。各撮像装置は、マルチウェル・プレート（例えば、６ウェル・プレートまたは１２ウェル・プレート）の単一ウェル内の試料のフーリエ・タイコグラフィー明視野高分解能撮像及び中分解能蛍光撮像の両用に構成されている。このＭＷＢシステムの本体は、マルチウェル・プレートを受けて保持するように設計されている。例えば、この本体は、マルチウェル・プレートを据え置くための、マルチウェル・プレートの外周の形状のリップ（へり）を含むことができる。
【００２８】
本明細書で用いるマルチウェル・プレートは、複数のウェルを有する透明材料製の平板を参照する。一般に、これらのウェルは円形または正方形の形状であり、試料を受けるために開口した上端及び閉じた底部を有する。一例では、マルチウェル・プレートの各ウェルが円形であり、３４mmの直径を有する。一例では、マルチウェル・プレートの各ウェルが円形であり、２３mmの直径を有する。ウェル内で撮像される試料は、１つ以上の物体及び／または物体の１つ以上の部分で構成することができる。各物体は、例えば、生物学的実体、無機物、等とすることができる。撮像することができる生物学的実体のいくつかの例は、細胞全体、細胞成分、バクテリアまたはウィルスのような微生物、及びタンパク質のような細胞成分を含む。撮像することができる無機物の例は半導体ウェハーである。こうした試料は液体のような媒質中に用意することができる。
【００２９】
特定の態様では、ＭＷＢシステムの撮像装置が、可変照明光源から順次照射される照射を受け（あるいは、可変照明光源を他の撮像装置と共用し）、励起光を与えるように構成された少なくとも１つの高出力蛍光照明光源、及び垂直方向のコラム内に配置された結像光学系を有する結像部を含む。一部の場合には、撮像装置またはＭＷＢシステムが可変照明光源を含む。特定の実現では、結像光学系が１：１光学系である。他の比率を用いることができる。一部の場合には、結像光学系が、対物レンズの分解能をイメージセンサの画素サイズの半分に一致させるように設計されている。
【００３０】
本明細書では、ＭＷＢシステムの特定例を、６ウェル・プレート内にある６つのウェル内の試料を独立して撮像するための６つの撮像装置を有するように説明しているが、本発明はそれに限定されず、ＭＷＢシステムがより少数またはより多数の撮像装置（ユニット）を有することができることは明らかである。例えば、あるＭＷＢシステムは、１２ウェル・プレートの１２個のウェル内の試料を撮像するための１２個の撮像装置を有することができる。
【００３１】
本明細書で用いる可変照明光源は、平面波照明を順次に、ｎ通りの異なる角度で１つ以上のＭＷＢシステムの試料に与えるように構成することができる装置を参照する。各照射角は、フーリエ領域内の対応する領域の位置に対応する。各可変照明光源は、複数の離散した発光素子を異なる位置に、例えば二次元格子、直線アレイ、同心円、等の形に配置した配列を具えている。一部の場合には、離散した発光素子の各々が、複数の光源、例えば赤色光源、青色光源、及び緑色光源を含む。図１では、例えば、可変照明光源１１０が三色ＬＥＤ（の二次元）マトリクスであり、各ＬＥＤは赤色光源、青色光源、及び緑色光源を含む。異なる位置にあるｎ個の異なる離散素子（あるいはそのグループ）を順次照射することによって、可変照明光源が平面波照明をｎ通りの異なる照射角で与える。１つの態様では、可変照明光源が二次元マトリクス（例えば、３２×３２マトリクス、１００×１００マトリクス、３２×６４マトリクス、６４×６４マトリクス、及び１２８×１２８マトリクス）の形態である。
【００３２】
順次照射される照明を与えるために、可変照明光源は、ＦＰ像取得プロセス中に、異なる位置にある異なる離散素子（またはそのグループ）を照射する。可変照明光源の離散素子を作動させる順序及びタイミングは、照明命令中に提供される。一例では、照明の順序が円形パターンであり、中心位置から始まり中心位置で終わる。他の例では、照明の順序が、最上行から最下行までの蛇行パターンに従う。
【００３３】
一般に、可変照明光源の光源はコヒーレント（可干渉性）光源であり、１つの態様では、非コヒーレント光を発光する有限サイズの活性領域を有する光源を用いることができる。この有限サイズの光源において非コヒーレントであるこうした光は、試料平面へ伝搬する際に部分的にコヒーレントな場を形成し、フーリエ再構成プロセスにおいて計算による補正を適用して、入射する照明の部分的にコヒーレントな性質を説明付けることができる。
【００３４】
一部の態様では、可変照明光源が可視光を与える。可視光を与える可変照明光源の例は発光ダイオード（ＬＥＤ）マトリクスである。この例では、各ＬＥＤが発光素子である。可視光を与える可変照明光源の他の例は液晶ディスプレイ（ＬＣＤ：liquid crystal display）である。
【００３５】
ＭＷＢシステムの各撮像装置は、蛍光照明を与えるための１つ以上の高出力蛍光照明光源を有する蛍光照明部を含み、この蛍光照明は試料内のフルオロフォア（蛍光色素素子）を活性化するための励起光である。各高出力蛍光照明光源は、特定波長範囲の励起光を発生するように設計されている。多色（マルチカラー）蛍光撮像の例では、各撮像装置が、撮像する帯域（バンド）毎に別個の高出力蛍光照明を有する。
【００３６】
各高出力蛍光照明光源は、１つ以上の高出力光源（例えば、高出力ＬＥＤ）、及びある波長範囲の励起光を通過させて他の波長を阻止するための励起フィルタを含む。一例では、高出力蛍光照明光源が６つの高出力ＬＥＤを含む。一例では、高出力蛍光照明光源が１つの高出力ＬＥＤを含む。一例では、高出力蛍光照明光源が複数の高出力ＬＥＤを含む。単色（単一帯域）蛍光撮像については、各撮像装置が、少なくとも１つの高出力蛍光照明光源を有し、この蛍光照明光源は、高出力光源（例えば、ＬＥＤ）及び特定波長範囲の励起光を通過させて他の波長を阻止するための励起フィルタを有する。多色（マルチ（多）チャンネル）蛍光撮像については、高出力光源とフィルタの組の数が、蛍光チャネルの数と共に増加する。マルチバンド（多帯域）蛍光撮像については、蛍光チャンル毎に異なる高出力蛍光照明光源を用いる。各高出力蛍光照明光源は、異なる画像取得時刻に照射され、これにより、モノクローム蛍光画像がチャネル毎に別個に取得される。プロセッサは、モノクローム蛍光画像をカラー蛍光画像に変換するための命令を実行することができる。多色の実施形態では、プロセッサは、複数のカラー蛍光画像からの画像データをオーバーレイ（重ね合わせ）することによって多色蛍光画像を生成することができる。例えば、プロセッサは、青色蛍光画像及び緑色蛍光画像からの画像データをオーバーレイすることによって青色−緑色蛍光画像を生成することができる。
【００３７】
特定の態様によれば、小型のシステムを維持しつつ蛍光照明を与えるために、撮像装置の１つ以上の高出力蛍光照明光源を、照射されるウェルの側部に配置することができる。こうした側部の位置で、１つ以上の高出力蛍光照明光源が、上記可変照明光源からの光路を阻止することなしに、ウェルの側部から直接試料に向けて励起光を発光することができる。１つの態様では、各撮像装置の１つ以上の高出力蛍光照明光源が、マルチウェル・プレート内またはマルチウェル・プレートの側部に設置されている。一般に、上記１つ以上の高出力蛍光照明光源は（高出力光源及び励起フィルタが共に）ウェルの中心に向けて傾斜し、これにより、上記直接の励起光の経路は各ウェルの中心（即ち、各ウェルの関心領域）に至る。一部の場合には、上記１つ以上の高出力蛍光照明光源が、ウェルの下側内面の平面からある角度をなして配置されている。これらの角度は、強力な非散乱励起光の受光を防止するために、第１対物レンズの開口数（ＮＡ）外であるように選択する。１つの態様では、この角度が６度である。他の態様では、この角度が４．６度である。
【００３８】
１つの態様では、ＬＥＤマトリクスまたは他の可変照明光源を複数の撮像装置及び／または複数のＭＷＢシステムが共用する。この態様では、単一の照明発光素子（例えば、ＬＥＤ）が平面波照明を複数の撮像装置及び／またはＭＷＢシステムに同時に与えることができる。例えば、図１に関して説明した培養システム１０は各水平棚２０上に６つのＭＷＢシステム１００を有し、６つのＭＷＢシステム１００の全部が、水平棚２０の上方にある表面上の可変照明光源１１０を共用する。共用する構成により各撮像装置のフットプリントが低減され、このことは、培養器内部の限られた容積内でのより並列的な実験を可能にする。こうした共用する構成は、マルチウェル・プレートと可変照明光源との間の空間も解放し、これにより、マルチウェル・プレートに容易にアクセスするための空間が提供され、追加的表面からの無用な反射の可能性がなくなる。特定の態様によれば、ＭＷＢシステムが、垂直方向に整列した撮像装置の集合を単一の本体内に含む。各撮像装置の撮像部は、例えばＣＭＯＳ（complementary metal oxide semiconductor：相補型金属酸化物半導体）センサカメラの光学系及びイメージセンサを含む。この光学系は、結像コラム内に対向して配置された一対の対物レンズ、及びこれらの対物レンズ間の発光フィルタを有する。これらの対物レンズは、試料から出る光を集光する第１集光対物レンズ、及びこの光をイメージセンサに焦点を結ぶように集束させる第２集束対物レンズを含む。特定の実現では、上記光学系が１：１光学系であり、イメージセンサ上への試料の１対１の結像を可能にする。こうした１：１結像光学系は、低倍率（低ＮＡ）の第１集光対物レンズを用いることによって、ウェル内の試料の広視野撮像をもたらす。一部の場合には、光学系が、約３６mm以上の直径を有するウェルの領域全体にわたって撮像するための視野用に設計されている。
【００３９】
一例では、第１集光対物レンズが約０．１のＮＡを有する。他の例では、第１集光対物レンズが約０．２のＮＡを有する。他の例では、第１集光対物レンズが約０．４のＮＡを有する。他の例では、第１集光対物レンズが０．０５未満のＮＡを有する。他の例では、第１集光対物レンズが０．０１未満のＮＡを有する。
【００４０】
同じ対物レンズのうちの２つを用いることによって、撮像装置は、同じフットプリントを維持することにより、対物レンズの分解能を低下させることなしに、より小型に作製することができる。また、２つの対物レンズ間に無限大の平面を作ることによって、撮像装置を、各ウェルの倍率を変化させることなしに独立して各ウェルに焦点を結ぶように微調整することができる。一例では、各対物レンズがオリンパス社製の４Ｘ／ＮＡ０．１（４倍／開口数０．１）対物レンズである。
【００４１】
一部の場合には、上記光学系が、試料のフーリエ面内の第１対物レンズと第２対物レンズとの間に発光フィルタも有する。この発光フィルタは、装置の１つ以上の高出力蛍光照射光源からの励起光を遮光する。１つの態様では、この発光フィルタが干渉フィルタである。単チャネル蛍光撮像用の撮像装置の例では、上記発光フィルタがバンドパス（帯域通過）またはローパス（低域通過）フィルタである。マルチチャネル蛍光撮像用の撮像装置の例では、上記発光フィルタがマルチバンド・フィルタである。
【００４２】
１つの態様では、可変照明光源からの明視野照明の波長範囲が上記発光フィルタの通過帯域内に入り、これにより、発光フィルタは、ウェル内の試料を通過する可変照明光源からの光を通過させる。この場合、イメージセンサは、発光フィルタを定位置に置いたままで、一意的な照明による一連の明視野像及び一連の蛍光画像を共に取得することができる。他の態様では、可変照明光源からの明視野照明の波長範囲が上記発光フィルタの波長範囲内に入らず、ＦＰ像取得プロセス中には発光フィルタを除去する。
【００４３】
特定の態様によれば、ＭＷＢシステムの各撮像装置がイメージセンサ（例えば、ＣＭＯＳセンサ）を含み、このイメージセンサは、ＦＰ画像取得プロセス中には一意的な照明によるｎ個の強度画像を取得することができ、各蛍光画像取得プロセス中には蛍光画像を取得することができる。このイメージセンサは、露光時間全体にわたってイメージセンサのセンサ（検出）領域に入射する光の強度分布を測定することによって各画像を取得する。多数の例では、このイメージセンサがＵＳＢ（universal serial bus）カメラの一部分である。このイメージセンサはモノクローム検出器である。
【００４４】
１つの態様では、イメージセンサのサイズが、対物レンズの視野数に一致し、及び／または、各センサ素子（画素）のサイズが、対物レンズが提供することができる分解能の半分に一致する。こうしたサイズ設定は、撮像装置が対物レンズの視野を完全に利用することを可能にする。光学系のＳＢＰを完全に利用するために、センサの画素サイズは、対物レンズの分解能の半分に等しくするかそれよりも小さくするべきであり、センサ表面のサイズは、対物レンズの視野に等しくするかそれよりも大きくするべきである。上記の条件が共に「等しくする」である際に、システムは良好に設計され最も効果的である。
【００４５】
各蛍光画像取得プロセス中には、高出力蛍光照明光源がある波長範囲の蛍光照明（励起光）を与える間に、イメージセンサがモノクローム蛍光画像を取得する。このモノクローム像はプロセッサによってカラー蛍光画像に変換される。ＭＷＢシステムが複数の高出力蛍光照明光源を有する場合、イメージセンサは複数のモノクローム蛍光画像を取得することができ、各蛍光画像は、これらの高出力蛍光照明光源のうちの１つが蛍光照明を与える間に取得される。
【００４６】
画像取得（サンプル）時間は、イメージセンサの露光期間中のある時刻を参照し、この露光期間中にイメージセンサは強度分布を測定して単一の強度画像を取得する。ＦＰ像取得プロセス中には、イメージセンサは一意的な照明によるｎ個（例えば、ｎ＝１、２、５、１０、２０、３０、５０、１００、１０００、１００００、等）の強度画像を捕捉する。一部の場合には、サンプリング速度を１秒当たり０．１〜１０００フレームの範囲内にすることができる。
【００４７】
上述したように、イメージセンサは、ＦＰ画像取得プロセス中に一意的な照明によるｎ個の強度画像を捕捉する。イメージセンサによって捕捉した一意的な照明によるｎ個の強度画像の各々が、フーリエ空間内の１つの領域に関連する。フーリエ空間内では、隣接する領域どうしがオーバーラップ（重複）する領域を共有し、このオーバーラップする領域上では、これらの隣接する領域が同じフーリエ領域データをサンプリングする。一例では、フーリエ空間内で隣接する領域どうしが、これらの領域の一方の面積の約２％〜約９９．５％だけオーバーラップする。他の例では、フーリエ空間内で隣接する領域どうしが、これらの領域の一方の面積の約６５％〜約７５％だけオーバーラップする。他の例では、フーリエ空間内で隣接する領域どうしが、これらの領域の一方の面積の約６５％だけオーバーラップする。他の例では、フーリエ空間内で隣接する領域どうしが、これらの領域の一方の面積の約７０％だけオーバーラップする。他の例では、フーリエ空間内で隣接する領域どうしが、これらの領域の一方の面積の約７５％だけオーバーラップする。
【００４８】
図２Ａは、一実施形態による、図１に示すＭＷＢシステムのうちの１つの構成要素の概略図である。図示するＭＷＢシステム１００は、６ウェル・プレート２０に適合するように設計されている。ＭＷＢシステム１００は、単一の本体１０２内に平行に配置された６つの撮像装置２００で構成される。設計通りに、６つの撮像装置は６ウェル・プレート２０の６つのウェル２２内の試料を撮像することができる。図２Ａでは、６ウェル・プレート２０は、ＭＷＢシステム１００の本体１０２内の最上部に載置されている。図２Ｂは、図２Ａに示すＭＷＢシステム１００の構成要素の一部の概略分解図である。
【００４９】
特定の態様では、ＭＷＢシステムの各撮像装置が、ＦＰ照明部、蛍光照明部、及び撮像部を含む。図２Ａ及び２Ｂでは、ＦＰ照明部が、他のＭＷＢシステム１００と共用される可変照明光源１１０の形態である。可変照明光源１１０は、ＦＰ照明、即ち、異なる照射角で順次照射される照明を、水平棚１６上のＭＷＢシステム１００の６ウェル・プレート内の試料に与える。
【００５０】
図２Ａ及び２Ｂでは、各撮像装置２００が、高出力蛍光照明光源２２０の形態の蛍光照明部も含む。高出力蛍光照明光源２２０は、励起光（蛍光照明）をウェル・プレート２０の側部からウェル２２へ与えるように構成されている。１つの態様では、高出力蛍光照明源２２０が、ウェル・プレート２００内またはウェル・プレート２００の側部に設置されている。
【００５１】
図２Ａ及び２Ｂでは、各撮像装置２００が撮像部２４０も含む。撮像部２４０は光学系及びイメージセンサ２７０を含む。図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃでは、イメージセンサの各々が５ＭＰ（メガピクセル（画素））のＣＭＯＳカメラ（例えば、２．２μmの画素サイズを有するイメージング・ソース社製のDMK 23UP031）内にある。光学系は一対の同じ対物レンズ（例えば、オリンパス社製の４Ｘ，ＮＡ０．１または他の低倍率対物レンズ）を有し、これらは、対向して配置されて垂直方向の結像コラムを形成する第１対物レンズ２５０及び第２対物レンズ２６０を含む。この１：１結像光学系は、イメージセンサ２７０上への試料の１対１の結像を可能にする。大視野の撮像を可能にするために、対物レンズ２５０及び２６０は低倍率のものである。一例では、対物レンズ２５０、２６０の各々が約０．１０のＮＡを有する。一例では、対物レンズ２５０、２６０の各々が約０．０８のＮＡを有する。一例では、対物レンズ２５０、２６０の各々が約０．１３のＮＡを有する。対物レンズ２５０及び２６０の一部の例は低コストで市販されている。
【００５２】
上記１：１光学系は、第１対物レンズ２５０と第２対物レンズ２６０との間に配置された発光フィルタ２５５も含む。発光フィルタ２５５は、高出力蛍光照明光源２２０からの励起光を遮光する。図示する例では、可変照明光源１１０からの明視野照明の波長範囲が発光フィルタ２５５の通過帯域内に入り、これにより、センサ２７０は、発光フィルタ２５５を除去することなしに、一意的な照明による一連の明視野像及び一連の蛍光画像を共に取得することができる。
【００５３】
図２Ａ及び２Ｂに示す各撮像装置２００は、可変照明光源が順次照射される照明を異なる照射角から与える間に、イメージセンサ２７０を用いて一連のＲＡＷ明視野像を捕捉することができる。１つの態様では、異なるＬＥＤを順に点灯する間に、イメージセンサ２７０がＲＡＷ画像を順次捕捉する。対物レンズ２５０及び２６０が低倍率のものであるので、各ＲＡＷ明視野像は一般に分解能が貧弱である。第１対物レンズ２５０の低倍率に起因して、試料の大きな視野を撮像することができる。撮像装置２００は、フーリエ・タイコグラフィー（ＦＰ）技術を用いて、イメージセンサによって取得した低分解能の強度画像により、試料の高分解能明視野像を生成することができる。ＦＰ技術を用いて、一意的な照明によるＲＡＷ強度画像どうしを、ＦＰ再構成プロセスにおける位相回復演算を用いてフーリエ領域内でまとめ合わせ、これにより高分解能の明視野像が生じる。ＦＰ再構成プロセスの詳細は非特許文献７に見出すことができ、この文献はその全文を参照する形で本明細書に含める。ＦＰ再構成プロセスのある程度の詳細はＩＩＩ節中に見出すことができる。
【００５４】
図２Ａ及び２Ｂ中の各撮像装置２００は、高分解能かつ広視野の撮像及び中分解能の蛍光撮像を共に用いて、およそ６ウェル・プレート分のシステム・フットプリントで、各ウェル２２内に配置された試料（例えば細胞培養体）を監視することができる。垂直方向の結像コラム内の同じ対物レンズ２５０及び２６０を有する光学系を用いることによって、撮像装置２００のサイズを低減して、６ウェル・プレート分の間隔未満の（例えば、中心間３０mmの）間隔をＭＷＢシステム１００内で可能にする。この構成は、高分解能のＦＰ撮像及び中分解能の蛍光撮像（シングルバンド（単帯域）またはマルチバンド）の両方において、撮像装置２００を６ウェル・プレート２０の各ウェル２２に割り当てることを可能にする。この構成により、ＭＷＢシステム１００は、機械的移動を用いることなしに、マルチウェル・プレート内の複数のウェルを同時に撮像することができ、マルチウェル・プレートを撮像するために使用される従来型システムでは、一般に機械的移動を必要とする。
【００５５】
図２Ｃは、一実施形態による、図２Ａ及び２Ｂに示すＭＷＢシステム１００の撮像装置２００の構成要素の概略側面図である。撮像装置２００は、順次照射されるＦＰ照明１１２を与えるための可変照明光源１１０を具えている。本明細書で用いる順次照射されるＦＰ照明は、ＦＰ・ＲＡＷ画像取得サイクル中にｎ通りの異なる照射角で順次に与えられる平面波照明を参照する。１つの態様では、可変照明光源１１０の異なる位置にある異なる離散発光素子（例えば、ＬＥＤ）を順次照射することによって、順次照射されるＦＰ照明を達成する。図２Ｃでは、可変照明光源１１０を、異なる発光素子を１つずつ順に照射することによって、３回の画像取得時に３つの異なる照射角で照明を与えるように示している。図２Ｃは取得時刻ｔiを表し、ここにｉ＝１〜ｎである。この取得時刻ｔiでは、実線の矢印で表す平面波照明が可変照明光源によって照射角θで与えられる。破線の矢印は、可変照明光源１１０によって他の取得時刻に与えられる平面波照明を表す。
【００５６】
撮像装置２００は、励起光２２３を与えるための高出力蛍光照明光源２２０も含む。高出力照明光源２２０は、ウェル２２の側部から励起光２２３を与えるように設置されている。高出力蛍光照明光源２２０は、高出力ＬＥＤ２２１（例えば、６つの高出力ＬＥＤ）及び励起フィルタ２２２を含む。励起フィルタ２２２は、励起光２２３を通過させて他の波長を阻止する。高出力照明光源２２０は、励起光２２３を、ウェル２２の底部内面２３の平面から小さい角度αで指向させて、励起光２２３が第１対物レンズ２５０によって集光されることを防止するように配置されている。図示する例に表す取得時刻ｔiには、高出力蛍光照明光源２２０は、破線の矢印で示すように、現在、励起光２２３を与えていない。励起光２２３は他の画像取得時刻に与える。
【００５７】
撮像装置２００は、光学系２４４を有する撮像部２４０、及び例えばＵＳＢ接続カメラのイメージセンサ２７０も含む。光学系２４４は、結像コラムを形成する第１対物レンズ２５０及び第２対物レンズ２６０を含む。対物レンズ２５０と２６０は同じものであり、対向して配置されて結像コラムを形成し、この結像コラムは、ＵＳＢ接続カメラのイメージセンサ２７０上への試料の１対１の結像を可能にする。大視野の撮像のために、対物レンズ２５０、２６０は低倍率のものである。１：１光学系２４４は、試料のフーリエ面内の、第１対物レンズ２５０と第２対物レンズ２６０との間に配置された発光フィルタ２５５も含む。発光フィルタ２５５は、高出力蛍光照明光源２２０からの励起光を遮光する。
【００５８】
図２Ｄは、一実施形態による、図２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃに示すＭＷＢシステム１００の構成要素の概略側面図であり、プロセッサ１８０、コンピュータ可読媒体（ＣＲＭ：computer readable medium）１８２、及び随意的なディスプレイ１８２（破線で表す）も含む。この図では、ＭＷＢシステム１００の撮像装置２００のうちの２つを示し、これらは、（図２Ａ及び２Ｂに示す）６ウェル・プレート２０のウェル２２に順次照射されるＦＰ照明１１２を与えるための可変照明光源１１０を共用する。図２Ｄでは、可変照明光源１１０を、異なる発光素子対を対毎に順次照射することによって、３つの画像取得時刻に３つの異なる照射角で各ウェル２２に照明を与えるように示している。図示する例に表す取得時刻に、可変照明光源１１０によって、可変照明光源１１０の一対の発光素子から平面波照明が与えられる。破線の矢印は、他の取得時刻における平面波照明を表す。
【００５９】
各撮像装置２００は、当該撮像装置２００のウェル２２の側部から励起光２２３を与えるための高出力蛍光照明光源２２０を含む。各高出力蛍光照明光源２２０は、高出力ＬＥＤ２２１、及び励起光２２３を通過させて他の波長を阻止するための励起フィルタ２２２を含む。高出力蛍光照明光源２２０は、励起光２２３を、ウェル２２の底部内面２３の平面から（図２Ｃに示す）小さい角度で指向させるように配置されている。図示する例に表す取得時刻ｔiには、高出力蛍光照明光源２２０は、点線の矢印で示すように励起光２２３を与えていない。即ち、この図示する例に示す時刻には、可変照明光源１１０が点灯されて平面波照明１１２を一対の発光素子からウェル２２に与え、高出力蛍光照明光源２２０は点灯されない。
【００６０】
各撮像装置２００は、光学系２４４、及び例えばＵＳＢ接続カメラのイメージセンサ２７０を有する撮像部２４０も含む。光学系２４４は、結像コラムを形成する第１対物レンズ２５０及び第２対物レンズ２６０を含む。対物レンズ２５０と２６０は同じものであり、対向して配置されて結像コラムを形成し、この結像コラムは、ＵＳＢ接続カメラのイメージセンサ２７０上への試料の１：１の結像を可能にする。大視野の撮像のために、対物レンズ２５０及び２６０は低倍率のものである。光学系２４４は、試料のフーリエ面内の第１対物レンズ２５０と第２対物レンズ２６０との間に配置された発光フィルタ２５５も含む。発光フィルタ２５５は、高出力蛍光照明光源２２０からの励起光を遮光する。図２Ｃでは、発光フィルタ２５５は試料のフーリエ面内の同じ対物レンズ１５０と１６０との間にある。
【００６１】
図２Ｄは、プロセッサ１８０、コンピュータ可読媒体（ＣＲＭ）１８４、及び随意的なディスプレイ１８２も示し、ディスプレイ１８２は、図１に示す培養システム１０のＭＷＢシステム１００が共用する。ＣＲＭ１８４はプロセッサ１８０と通信する。随意的なディスプレイ１８２はプロセッサ１８０と通信する。プロセッサ１８０はイメージセンサ２７０の各々とも通信する。随意的に、プロセッサ１８０は、点線で表すように可変照明光源１１０及び／または高出力蛍光照明光源２２０とも通信する。１つの態様では、プロセッサ１８０、ディスプレイ１８２、及びＣＲＭ１８４は、例えばスマートホン、デスクトップ・コンピュータ、タブレット、等のようなコンピュータ装置の構成要素である。
【００６２】
図２Ａ〜２Ｄに示すＭＷＢシステム１００の代表的な動作中には、各イメージセンサ２７０は、ｎ通りの照射角で順次照射されるＦＰ照明中に、一意的な照明によるｎ個の一連の強度画像を捕捉する。例えば、二次元の１３×１３ＬＥＤマトリクス内の各ＬＥＤを点灯してから、１６９通りの照射角で順次照射される照明により１６９個の一連の画像を捕捉する。プロセッサ１８０は、ＦＰ再構成プロセスを用いて、一意的な照明によるｎ個の一連の強度画像からのデータを空間周波数領域内でまとめ合わせて、イメージセンサ２７０に関連するウェル２２内の試料の、より高分解能の明視野像を生成する。ＭＷＢシステム１００は、捕捉される蛍光画像に関連する作動中のフルオロフォア毎に異なる高出力蛍光照明光源で試料を照射することによる蛍光撮像を実行する。１つの場合には、可変照明光源の明視野照明波長が発光フィルタ２５５の通過帯域内に入り、発光フィルタ２５５が対物レンズ２５０と２６０との間の定位置にある間に、イメージセンサ２７０は明視野像及び蛍光画像を共に収集することができる。他の場合には、発光フィルタ２５５が、蛍光撮像サイクルの前に対物レンズ２５０と２６０との間に挿入され、及び／または、ＦＰ画像取得プロセスの前に対物レンズ２５０と２６０との間から除去される。
【００６３】
シングルバンドの実施形態では、ＭＷＢシステムの撮像装置が、単一の高出力蛍光照明光源を含むだけでよい。例えば、図２Ａに示す撮像装置１００は単一の高出力蛍光照明光源を含み、この高出力蛍光照明光源は、６つの高出力ＬＥＤ、及び第１波長範囲を通過させる第１励起フィルタを有する。この態様では、撮像装置が、第１対物レンズと第２対物レンズとの間の１対１光学系のフーリエ面内にシングルバンド発光フィルタも含む。このシングルバンド発光フィルタは、第１波長範囲の励起光を遮光する。
【００６４】
デュアルバンド（二重帯域）の実施形態では、撮像装置が少なくとも２つの高出力蛍光照明光源、即ち：第１高出力蛍光照明光源及び第２高出力蛍光照明光源を有する。第１高出力蛍光照明光源は、高出力光源、及び第１波長範囲の励起光を通過させる第１励起フィルタを有する。１つの場合には、第１波長範囲が３２０nm〜３８０nmの範囲である。他の場合には、第１波長範囲が４１０nm〜４６０nmの範囲である。他の場合には、第１波長範囲が４７０nm〜５００nmの範囲である。第２高出力蛍光照明光源は、高出力光源、及び第２波長範囲の励起光を通過させる第２励起フィルタを有する。１つの場合には、第２波長範囲が４７０nm〜５００nmである。他の場合には、第２波長範囲が５７０nm〜６００nmである。他の場合には、第２波長範囲が４５０nm〜５００nmである。デュアルバンドの実施形態では、撮像装置が、第１対物レンズと第２対物レンズとの間の１対１光学系のフーリエ面内にデュアルバンド発光フィルタも含む。このデュアルバンド発光フィルタは、第１波長範囲の励起光を遮光し、かつ第１波長範囲の励起光を遮光する。
【００６５】
デュアルバンドの実施形態では、撮像装置が、第１波長範囲に基づいて第１モノクローム蛍光画像を生成し、第２波長範囲に基づいて第２モノクローム蛍光画像を生成することができる。１つの態様では、プロセッサが、これらのモノクローム蛍光画像の一方または両方をカラー蛍光画像に変換する命令を実行する。このプロセッサは、カラー蛍光画像どうしを組み合わせて二色（デュアルカラー）蛍光画像にする命令を実行することができる。この二色蛍光画像は、生物学的検査において、試料の異なる特徴を異なる色で表示して区別するために有用である。
【００６６】
図３Ａは、シングルバンドの実施形態による、シングルバンド蛍光撮像用に構成されたＭＷＢシステム３００の概略平面図である。ＭＷＢシステム３００の構成要素は、図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び２Ｄに関して説明したものと同様である。この例では、ＭＷＢシステム３００の撮像装置がシングルバンド発光フィルタ（図示せず）を対物レンズ間に有する。図示するＭＷＢシステム３００は、本体３０１内に配置された６つの同じ撮像装置を具えて、本体３０１上に載置された６ウェル・プレート内にある全６つのウェル３０３内の試料を撮像することができる。撮像装置の各々は、第１波長範囲の励起光を与えるための高出力蛍光照明光源３２０を含む。高出力蛍光照明光源３２０は、撮像される試料を有するウェル３０３に近接した６ウェル・プレート３０２の側部から励起光３０２を与えるように設置されている。高出力蛍光照明光源３２０はウェル３０３の中心に指向されている。各高出力蛍光照明光源３２０は、高出力光源（例えばＬＥＤ）３２１及び励起フィルタ３２２を含む。励起フィルタ３２２は、第１波長範囲の励起光を通過させて他の波長を阻止する。上記蛍光撮像方法の期間中には、ＭＷＢシステム３００の高出力光源（例えばＬＥＤ）３２１が点灯されて、ＭＷＢシステム３００は６つのウェル３０３内の各試料の蛍光画像を取得することができる。第１蛍光画像は、第１波長範囲によって活性化された試料中のフルオロフォアから集光された発光に基づく。
【００６７】
図３Ｂは、デュアルバンドの実施形態による、ＭＷＢシステム４００の構成要素の概略平面図である。図示するＭＷＢシステム４００は、本体４０１内に配置された６つの同じ撮像装置を具えて、本体４０１上に載置された６ウェル・プレート４０２内にある全６つのウェル４０３内の試料を撮像することができる。撮像装置の各々は、第１波長範囲の励起光を与えるための第１高出力蛍光照明光源４２０、及び第２波長範囲の励起光を与えるための第２高出力蛍光照明光源４３０を含む。高出力蛍光照明光源４２０及び高出力蛍光照明光源４３０は、撮像される試料を有するウェル４０３に近接した６ウェル・プレートの側部から励起光を与えるように設置されている。高出力蛍光照明光源４２０及び高出力蛍光照明光源４３０は、ウェル４０３の中心に励起光を指向させるように配向されている。各第１高出力蛍光照明光源４２０は、高出力光源（例えばＬＥＤ）４２１及び第１励起フィルタ４２２を含む。各第２高出力蛍光照明光源４３０は、高出力光源（例えばＬＥＤ）４３１及び第２励起フィルタ４３２を含む。第１励起フィルタ４２２は、第１波長範囲の励起光を通過させて他の波長を阻止する。第２励起フィルタ４３２は、第２波長範囲の光を通過させて他の波長を阻止する。この例では、ＭＷＢシステム４００の撮像装置は、デュアルバンド発光フィルタ（図示せず）を対物レンズ間に有する。対物レンズ間のデュアルバンド発光フィルタ（図示せず）は、第１波長範囲及び第２波長範囲の励起光を遮光する。上記蛍光撮像方法の期間中には、ＭＷＢシステム４００の高出力光源（例えばＬＥＤ）４２１が点灯されて、各撮像装置のイメージセンサは、対応するウェル内の試料の第１モノクローム蛍光画像を取得する。この第１蛍光画像は、第１波長範囲によって活性化された試料中のフルオロフォアからの発光に基づく。蛍光撮像プロセス中の他の時刻には、ＭＷＢシステム４００の高出力光源（例えばＬＥＤ）４３１が点灯されて、各撮像装置のイメージセンサは、対応するウェル内の試料の第２モノクローム蛍光画像を取得する。この第２蛍光画像は、第２波長範囲によって活性化された試料中のフルオロフォアからの発光に基づく。ＭＷＢシステム４００は、プロセッサを用いて、第１及び第２モノクローム蛍光画像を第１及び第２カラー蛍光画像に変換して、これらの第１及び第２蛍光画像からのデータをオーバーレイして二色蛍光画像を生成する。
【００６８】
図４Ａは、デュアルバンドの実施形態によるＭＷＢシステム５００の概略図である。ＭＷＢシステム５００の構成要素の一部は、図３Ｂに関して説明したものと同様である。図示するＭＷＢシステム５００は、単一の本体５０２内に配置された６つの同じ撮像装置で構成されて、６ウェル・プレート内にある全６つのウェル内の試料を撮像することを可能にする。図４Ｂは、一実施形態による、図４Ａに示すＭＷＢシステム５００の一部の構成要素の概略図である。この図では、構成要素の一部は、その内側の構成要素が見えるように、透明であるように図示している。ＭＷＢシステム５００は、リボンケーブルの形態の接続部５０５を可変照明光源とプロセッサとの間に含む。
【００６９】
撮像装置５０１の各々は、第１波長範囲の励起光を与えるための第１高出力蛍光照明光源５２０、及び第２波長範囲の励起光を与えるための第２高出力蛍光照明光源５３０を含む。高出力蛍光照明光源５２０及び高出力蛍光照明光源５３０は、撮像される試料を有するウェルの側部から励起光を与えるように設置されている。高出力蛍光照明光源５２０及び５３０は、ウェルの底部内面の平面からある角度をなして配置されている。この角度は、強力な非散乱励起光の受光を防止するために、第１対物レンズの開口数（ＮＡ）外である。高出力蛍光照明光源５２０及び高出力蛍光照明光源５３０は、励起光を概ねウェルの中心に指向させるように配向されている。各高出力照明光源５２０は、１つ以上の高出力光源（例えばＬＥＤ）及び第１励起フィルタを含む。各高出力蛍光照明光源５３０は、１つ以上の高出力光源（例えばＬＥＤ）及び励起フィルタを含む。第１励起フィルタは、第１波長範囲の励起光を通過させて他の波長を阻止する。第２励起フィルタは、第２波長範囲の光を通過させて他の波長を阻止する。この例では、ＭＷＢシステム５００の撮像装置は、デュアルバンド発光フィルタ（図示せず）を各撮像装置の対物レンズ間に有する。対物レンズ間のデュアルバンド発光フィルタ（図示せず）は、第１波長範囲及び第２波長範囲の励起光を遮光する。上記蛍光撮像方法の期間中には、第１高出力蛍光照明光源５２０の高出力光源（例えばＬＥＤ）が点灯されて、イメージセンサは、上記６つのウェル内の各試料の第１蛍光画像を取得することができる。この第１蛍光画像は、第１波長範囲によって活性化された試料中のフルオロフォアからの発光に基づく。蛍光撮像方法の期間中の他の時刻には、第２高出力蛍光照明光源５３０の高出力光源（例えばＬＥＤ）が点灯されて、イメージセンサは、上記６つのウェル内の各試料の第２蛍光画像を取得することができる。この第２蛍光画像は、第２波長範囲によって活性化された試料中のフルオロフォアからの発光に基づく。ＭＷＢシステム５００は、プロセッサを用いて、第１及び第２モノクローム蛍光画像を第１及び第２カラー蛍光画像に変換して、第１及び第２カラー蛍光画像からのデータをオーバーレイして二色蛍光画像を生成する。
【００７０】
ＭＷＢシステム５００は、コントローラ５０４を有する回路基板または他の絶縁体基板５０３も含む。上記可変照明光源は、回路基板５０３上または回路基板５０３内に電気的かつ物理的に結合することができる。可変照明光源の導電リード線は、回路基板５０３の第１面または上面上にプリントされるか、さもなければ堆積された導電トレースを介してコントローラ５０４に電気結合することができ、その間に、可変照明光源の発光部を、回路基板５０３の第２面または下面から離れるように光学系に向けて光を放射するように配向することができる。図示する実現では、コントローラ５０４は、可変照明光源と同じ回路基板５０３上に実装されている。他の一部の実現では、コントローラ５０４を、回路基板５０３に電気接続された別個の回路基板上に実装することができる。
【００７１】
図５は、一実施形態によるＭＷＢシステム５５０の写真である。ＭＷＢシステム５５０は、図１に示す培養器１２のような培養器内に配置された様子を示している。ＭＷＢシステム６００は、本体、及び６ウェル・プレートの上方に距離をおいて配置されたＬＥＤマトリクスの形態の可変照明光源を有する。ＭＷＢシステム５５０は、高出力ＬＥＤモジュールとプロセッサ及び／または電源との間の電気接続部を含む。ＭＷＢシステム５５０のサイズは、６ウェル・プレート及び高出力ＬＥＤモジュールを含めて１２５mm（幅）×１３３mm（長さ）×１７０mm（高さ）である。図示する例では、本体はMakerbot社製の３Ｄ（三次元）プリンタを用いてプリント（作製）されている。
【００７２】
このＭＷＢシステムの特定構成要素は、他の構成要素及び／または１つ以上のプロセッサと電子通信する。これら種々の構成要素間の電子通信は、有線及び／または無線形式にすることができる。例えば、図４Ａは、ＭＷＢシステム５００の可変照明光源１１０へのリボンケーブルの形態の電気接続部５０５を示す。
【００７３】
特定の態様によれば、培養システムまたはＭＷＢシステムが、１つ以上のプロセッサ及び１つ以上のコンピュータ可読媒体（ＣＲＭ）を含む。一部の場合には、ディスプレイも含む。例えば、図２Ｄは、プロセッサ１８０、コンピュータ可読媒体（ＣＲＭ）１８４、及び随意的な（点線で表す）ディスプレイ１８２を有するＭＷＢシステム１００を示す。このプロセッサは、ＣＲＭと電子通信し、そして随意的に可変照明光源及び／または高出力蛍光照明光源と電子通信して、制御信号を送信する。例えば、制御信号を、可変照明光源及びイメージセンサに送信して、順次照射される照明をイメージセンサの露光（サンプリング）時刻と同期させることができる。
【００７４】
ＣＲＭはプロセッサと電子通信して、データを記憶し読み出す。随意的なディスプレイは、プロセッサと電子通信して、画像及び他のデータを表示するための表示データを受信する。一部の態様では、プロセッサ、随意的なディスプレイ、及びＣＲＭが、例えばスマートホン、ラップトップ・コンピュータ、デスクトップ・コンピュータ、タブレット、等のようなコンピュータ装置の構成要素である。図示する例に関しては、単一のプロセッサ及び単一のＣＲＭを記載しているが、複数のプロセッサ及び／または複数のＣＲＭを用いることができる。
【００７５】
上記プロセッサ（例えば、マイクロプロセッサ）は、ＣＲＭ上に記憶された命令を受信し、これらの命令を実行して、１つ以上のＭＷＢシステム及び／または培養システムの１つ以上の機能を実行する。プロセッサの例は、例えば、１つ以上の汎用プロセッサ（ＣＰＵ：central processing unit：中央演算装置）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ：application specific integrated circuit）、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ：field-programmable gate array）のようなプログラマブル・ロジック・デバイス（ＰＬＤ：programmable logic device）、または１つ以上のＣＰＵ、ＡＳＩＣ、ＰＬＤ並びにメモリ及び種々のインタフェースを含むシステム・オン・チップ（ＳｏＣ：system-on-chip）を含む。上記プロセッサは、イメージセンサから画像データを受信するように構成されている。一例では、上記プロセッサが命令を実行して、ＦＰ再構成プロセス及び／またはＦＰ撮像方法の他の動作を実行する。他の例では、上記プロセッサがＣＲＭ上に記憶された命令を実行して、制御信号を可変照明光源に送信して、順次照射される照明用の離散した発光素子を順次発光させ、及び／または、ＣＲＭ上に記憶された命令を実行して、制御信号をイメージセンサに送信して、露光時間全体にわたって強度を測定してＲＡＷ強度測定値（画像）を取得する。他の例では、上記プロセッサがＣＲＭ上に記憶された命令を実行して、例えば次のようなシステムの１つ以上の他の機能を実行する：１）取得した一連の強度画像からの画像データを解釈する、２）取得した一連の強度画像からのデータから、より高分解能の画像を再構成する、３）蛍光画像を生成する、４）第１波長範囲に関連する第１蛍光画像に第２波長範囲に関連する第２蛍光画像をオーバーレイすることによって、デュアルバンド蛍光画像を生成する、及び／または、５）１つ以上の画像または他の出力をディスプレイ上に表示する。
【００７６】
１つの態様では、上記プロセッサが、制御命令を有する信号を１つ以上のＭＷＢシステムの構成要素に送信してシステムの１つ以上の機能を実行するコントローラの一部分である。１つの場合には、このコントローラが１つ以上のＭＷＢシステムの電源構成要素を含むこともできる。一例では、コントローラが、可変照明光源、蛍光照明光源、及び／またはイメージセンサの動作を制御する。１つの場合には、このコントローラが、例えば、光源のうちの特定のものまたは部分集合のみが、種々の画像取得期間中の特定時刻に特定の持続時間だけ種々の照明パターンを形成することを可能にすることによって、可変照明光源内の光源により順次照射される照明を制御する。このコントローラは、少なくとも１つの内部メモリ装置とも通信する。この内部メモリ装置は、プロセッサで実行可能なコード（または命令）を記憶するための不揮発性メモリアレイを含むことができ、これらのコード（または命令）は、プロセッサが読み出して、本明細書中に記載した種々の機能または動作を実行して、画像データに対する種々の演算またはＭＷＢシステムの他の機能を実行することができる。この内部メモリ装置は、ＲＡＷ画像データ及び／または処理済み画像データ（ＦＰ再構成された画像及びＲＡＷ強度画像を含む）を記憶することもできる。一部の実現では、この内部メモリ装置または別個のメモリ装置が、実行される命令並びに処理、記憶、または表示される画像データを一時的に記憶するための揮発性メモリアレイを追加的に、あるいは代わりに含むことができる。一部の実現では、上記コントローラ自体が揮発性メモリを含むことができ、一部の実現では不揮発性メモリも含むことができる。
【００７７】
上記ＭＷＢシステムは、一般に、イメージセンサから画像データを受信するように構成された１つ以上のプロセッサを実装する。一部の実現では、このプロセッサがＣＲＭ上に記憶された命令を実行して、高分解能画像を生成し、画像をリフォーカスし、及び／または収差補正するためのＦＰ撮像プロセスのような１つ以上の処理動作を実行する。一部の実現では、上記１つ以上のプロセッサが、ＲＡＷ画像データまたは処理済画像データを通信インタフェース（例えば、図４Ａ及び４Ｂ中のリボンケーブル５０５）上に出力するように構成されているかユーザにより構成可能である。実際に、一部の実現では、ＭＷＢシステムの動作のうちの１つ以上をこうした外部コンピュータ装置によって実行することができる。一部の実現では、上記プロセッサを、ＲＡＷ画像データ並びに処理済み画像データを、外部メモリ装置またはシステムに記憶するために通信インタフェース上に出力するように構成するかユーザにより構成可能にすることもできる。このネットワーク通信インタフェースを用いて、ソフトウェアまたはファームウェアの更新のような情報、あるいはダウンロード用の他のデータを受信することもできる。一部の実現では、ＭＷＢシステムが、例えば種々のユニバーサル・シリアル・バス（ＵＳＢ）インタフェースのような１つ以上の他のインタフェース、あるいは他の通信インタフェースをさらに含む。こうした追加的なインタフェースを用いて、例えば、種々の周辺機器及び有線キーボードまたはマウスのような入力／出力（Ｉ／Ｏ：input/output）装置を接続するか、あるいは、種々の無線接続可能な周辺機器を無線接続するに当たり使用するドングルを接続することができる。こうした追加的なインタフェースは、例えばリボンケーブルに接続するためのインタフェースのようなシリアル・インタフェースを含むこともできる。ＭＷＢシステムの構成要素のうちの１つ以上は、適切なインタフェース及びケーブルのうち特に、例えばＵＳＢインタフェース及びケーブル、リボンケーブル、イーサネット（登録商標）ケーブルのような種々の適切なインタフェース及びケーブルのうちの１つ以上を通して上記コントローラと通信するように電気結合することができることも明らかである。
【００７８】
一部の実現では、イメージセンサが出力するデータ信号を、プロセッサに伝達する前に、マルチプレクサ、シリアライザ、またはイメージセンサの他の電気構成要素によって、多重化、シリアル化、さもなければ合成することができる。こうした実現では、プロセッサは、デマルチプレクサ、デシリアライザ、またはイメージセンサの各々から画像データを分離するための他の装置または構成要素をさらに含むことができ、これにより、試料ウェル毎の画像フレーム（強度分布測定値）を並列に処理することができる。
【００７９】
ＣＲＭ（例えばメモリ）は、１つ以上のＭＷＢシステム及び／または培養システムの特定機能を実行するための命令を記憶することができる。これらの命令はプロセッサによって実行可能である。ＣＲＭは、一連の（低分解能）強度測定値、蛍光画像、及び上記撮像方法に関連する他のデータを記憶することもできる。
【００８０】
随意的なディスプレイは、プロセッサと電子通信して、例えば培養システムのオペレータ（操作員）に対してディスプレイ上に表示するための表示データを受信する。一般に、ディスプレイはカラーディスプレイである。
【００８１】
多数の例では、ＭＷＢシステムを培養器内に実現されるものとして説明しているが、ＭＷＢシステムは他の環境内でも実現することができる。１つの態様では、ＭＷＢシステムをクリーンルーム内に実現することができる。他の態様では、ＭＷＢシステムを製造設備内に実現することができる。
【００８２】
ＩＩＩ．フーリエ・タイコグラフィー（ＦＰ）明視野撮像及び蛍光撮像のための撮像方法
ＭＷＢシステムは、ＦＰ技術を用いてマルチウェル・プレート内の試料の各々の分解能を向上させた明視野像を生成する（ＦＰ撮像プロセス）ことができると共に、各試料の蛍光画像を生成する（蛍光撮像プロセス）ことができる撮像方法を実現する。
【００８３】
ＦＰ撮像プロセスは、一般に、ＲＡＷ画像取得（データ収集）プロセス及びＦＰ再構成プロセスを含む。ＦＰ画像取得プロセス中には、可変照明光源がｎ通りの異なる照射角から平面波照明を与える間に、イメージセンサが一意的な照明によるｎ個の強度の明視野像を取得する。各画像取得（サンプル）時刻に、イメージセンサは、単一の照射角に関連する一意的な照明による強度画像を取得する。ＦＰ画像取得プロセス中に、照明シーケンス（配列）内の各発光素子（例えば、１つ以上のＬＥＤ）が点灯して、イメージセンサは、試料を通過する光から強度分布を記録して、ｎ通りの異なる照射角に関連する一連の強度画像（即ち、一意的な照明による強度画像）を取得して保存する。ＦＰ再構成プロセスを用いて低分解能画像どうしを組み合わせて、試料の高分解能複合画像を生成する。ＦＰ再構成プロセスの例の詳細は非特許文献７に記載され、その全文を参照する形で本明細書に含める。
【００８４】
画像取得プロセス中には、可変照明光源を用いて試料をｎ通りの一連の照射角で照射する。画像取得プロセス中には、光学系が可変照明光源から試料を通過する光をフィルタ処理して、一意的な照明によるｎ個の強度画像を取得する。ＦＰ再構成プロセス中には、ｎ個の強度画像をフーリエ領域内で反復的に組み合わせて、より高分解能の画像データを生成する。各反復では、特定の平面波入射角についてフーリエ領域内でフィルタを適用し、逆フーリエ変換を適用してより低分解能の画像を生成し、より低分解能の画像の強度を強度測定値に置き換え、フーリエ変換を適用し、そしてフーリエ空間内の対応する領域を更新する。
【００８５】
再構成プロセスは、角度ダイバーシティを用いて試料の複合画像を復元する位相回復技術を用いる。この復元プロセスは、空間領域内で取得した既知の画像データの強化と、フーリエ領域内の固定制約とを交互させる。こうした位相回復による復元は、例えば、交互投影手順、問題の凸再公式化、または中間の非凸の変形法を用いて実現することができる。機械的手段によって試料を横方向に平行移動することを必要とする代わりに、再構成プロセスは、フーリエ領域内のスペクトル制約を変化させて、フーリエ通過帯域を単一の捕捉画像の通過帯域を超えるように拡張して、より高分解能の試料画像を復元する。
【００８６】
１つの態様では、ＦＰ撮像プロセスが、リフォーカス（伝搬）プロセスのような収差補正プロセスを含む。リフォーカス・プロセスは、試料がｚ＝ｚ0にある試料平面に配置され、光学素子の焦点面（焦平面）がｚ＝０に位置する場合に有用であり得る。換言すれば、捕捉した試料の像は試料平面における像ではなく、光学素子の焦点面から−ｚ0の距離だけ伝搬した試料のプロファイル（外形）である。これらの場合に、ＦＰ撮像プロセスは、画像データをｚ0の距離だけ試料平面へ戻すように伝搬させることによって、試料をｚ方向に機械的に移動させなければならないことなしに試料をリフォーカスする。このリフォーカス（伝搬）ステップは、フーリエ空間内で位相係数を乗算することによって実行することができる。
【００８７】
多重化の一実施形態では、各ＲＡＷ画像の捕捉（露光期間全体にわたる強度分布の測定）中に、複数の発光素子（ＬＥＤ）を一意的なパターンで同時に点灯させることができる。多重化プロセスを用いて、各捕捉したＲＡＷ画像から照射角に関連する強度データを分離することができる。多重化プロセスの一例は、米国特許出願第１４／９６０２５２号、発明の名称”MULTIPLEXED FOURIER PTYCHOGRAPHY IMAGING SYSTEMS AND METHODS”、２０１５年１２月４日出願（特許文献１）に見出すことができ、その全文を参照する形で本明細書に含める。
【００８８】
蛍光画像プロセスは、一意的な波長範囲の蛍光照明毎に蛍光画像を生成するステップを含む。蛍光撮像プロセス中に、高出力蛍光照明光源を点灯させて、イメージセンサによってモノクローム蛍光画像を取得する。プロセッサは、モノクローム蛍光画像からの画像データを用いてカラー蛍光画像を生成することができる。マルチバンド、マルチチャネルの実施形態では、高出力蛍光照明光源の各々を別個に点灯させて、蛍光照明毎に別個のモノクローム蛍光画像を取得する。この場合、上記蛍光撮像プロセスは、複数のカラー蛍光画像をオーバーラップさせる命令を実行して単一の多色蛍光画像を生成するステップをさらに含む。
【００８９】
上記フーリエ・タイコグラフィー再構成プロセスは、ＲＡＷ強度画像どうしを空間周波数領域内の適正な位置にまとめ合わせるために、可変照明光源により順次照射されるＦＰ照明に関連する正確な照射方向情報を必要とする。ＭＷＢシステムの本体は可変照明光源から分離されているので、正確なＦＰ再構成のためには、イメージセンサに対する発光素子の位置を較正するための較正プロセスが存在する必要がある。この構成プロセスは、例えば、ＭＷＢシステムの上方にある水平棚にＬＥＤマトリクスを設置した培養器内にＭＷＢシステムを設置する際のように、ＭＷＢシステムをイメージセンサに対して配置または再配置する際に必要である。
【００９０】
図６は、可変照明光源の離散した発光素子（ＬＥＤ）の位置をイメージセンサの各々に対して較正するための較正プロセスの動作を表すフローチャート６００である。この較正プロセスは、ＭＷＢシステムを可変照明光源に対して配置または再配置する際に用いる。
【００９１】
動作６２１では、可変照明光源の中心発光素子（例えばＬＥＤ）を照射する。例えば、可変照明光源を複数のＭＷＢシステム間で共用する場合、可変照明光源のある領域内の発光素子が特定のＭＷＢシステムにＦＰ照明を与える。この場合、ＦＰ照明を与えるために使用する領域の中心発光素子を照射する。単一の可変照明光源を用いてＭＷＢシステム用のＦＰ照明を与える場合、この可変照明光源の中心発光素子を照射する。中心発光素子は、対物レンズの中心の最も近くに配置されたＬＥＤである。この場合、イメージセンサから最も明るい画像を作り出す１つのＬＥＤを照射する。最も明るい画像を作り出すＬＥＤの位置は１つしか存在しない。そのＬＥＤがイメージセンサに対する中心発光素子である。これらの動作はイメージセンサ毎に実行される。
【００９２】
一実施形態では、上記較正プロセスが、発光素子を順次点灯させて、発光素子の照明毎に画像を捕捉することによって中心発光素子を特定する。最高強度の画像は、捕捉した複数の画像から特定される。中心発光素子は、複数の発光素子による照明中に捕捉した最高強度の画像に基づいて特定される。
【００９３】
動作６２２では、中心発光素子（例えばＬＥＤ）の照射中に、イメージセンサがビネット・モノクローム画像を捕捉する。この画像を白黒に変換する。発光素子とイメージセンサとの間にミスアライメント（位置不整合）が存在する場合、画像の中心をイメージセンサの中心からシフトさせる。動作６２３では、画像の中心を特定する。動作６２４では、画像の中心のシフトをｘ方向（ｘシフト）及びｙ方向（ｙシフト）について測定する。動作６２５では、画像のｘシフト及びｙシフトに基づいて、中心発光素子の変位を、検索表／プロット図を用いて測定する。検索表／プロット図は、ｘシフト及びｙシフトの異なる値に関連する中心発光素子の異なる変位を提供する。一旦、中心発光素子の変位を検索表／プロット図から測定すると、可変照明光源内の当該発光素子に関連する照射角を、可変照明光源の幾何学的形状に基づいて決定することができる。動作６２６では、中心発光素子の変位を用いて、ＦＰ照明に関連するｎ通りの照射角を測定する。
【００９４】
図７Ａは、一実施形態による、ＬＥＤマトリクスの中心ＬＥＤによる照明中に捕捉したモノクローム・ビネット画像である。図７Ｂは、図７Ａの画像を変換した白黒版である。この例では、白黒画像の中心７２２がイメージセンサの中心７２３と同じ位置に存在し、ＬＥＤの位置がＣＭＯＳカメラのイメージセンサと良好に整合している。図７Ｃは、他の実施形態による、ＬＥＤマトリクスの中心ＬＥＤによる照明中に捕捉した画像である。この場合、中心ＬＥＤとイメージセンサとの間にミスアライメントが存在する。図に示すように、画像の中心７３２とイメージセンサの中心７２３との間にミスアライメントが存在する。この場合、ｘ方向のシフト（画素シフトＸ）及びｙ方向のシフト（画素シフトＹ）が存在する。図７Ｄは、一実施形態による、イメージセンサの中心７２３に対する画像の中心７３２のｘシフト及びｙシフトに関連するＬＥＤ変位の検索プロット図である。この例では、検索表は、ＬＥＤマトリクスをイメージセンサに対して既知の量だけ移動させて、ＬＥＤ変位に関連する画像の中心の異なるシフト量を測定することによって作成されている。
【００９５】
図８は、複数の実施形態による、ＭＷＢシステムの１つ以上の撮像装置の各々によって実現される撮像方法の動作を表すフローチャート８００である。ＭＷＢシステムの複数の撮像装置が撮像方法を並列に実行することができる。１つの態様では、撮像方法が、ＭＷＢシステムのイメージセンサにより可変照明光源の位置を較正する随意的な動作（点線で表す）から、その最初の撮像実行を開始する。較正プロセスの一例は、図６のフローチャート６００に関して説明している。この撮像方法は、蛍光撮像プロセス及び／またはＦＰ高分解能明視野撮像プロセスを実行する。この撮像方法は、例えば周期的なベースで反復する。１つの態様では、撮像方法の各実行が、蛍光撮像プロセス及びＦＰ高分解能明視野撮像プロセスを含む。
【００９６】
蛍光撮像プロセスを実行する場合、撮像方法は動作８３０ヘ進む。動作８３０では、第１高出力蛍光照明光源が第１波長範囲の励起光を与える。第１高出力蛍光照明光源は、高出力光源（例えば高出力ＬＥＤ）、及び第１波長範囲の励起光を通過させて他の波長を阻止する励起フィルタを含む。第１波長範囲の励起光は試料の中心に指向される。試料中のフルオロフォアが励起光によって活性化されて、他の波長範囲の光（放射）（例えば、青色、緑色、または赤色の光）を発光する。励起光はこの放射よりも強いので、第１高出力蛍光照明光源は、ＭＷＢシステムの光学系の第１集光対物レンズに直接対向する。
【００９７】
動作８３５では、第１集光対物レンズが試料から生じる光を受光する。第１集光対物レンズと第２集光対斑レンズとの間にある発光フィルタが、第１波長範囲のあらゆる励起光を遮光して、上記放射を第２集光対物レンズに渡す。第２集光対物レンズはこの放射を受光して、ＭＷＢシステムのイメージセンサに焦点を結ぶように集束させる。動作８４０では、第１高出力蛍光照明光源による蛍光照明中に、イメージセンサが第２集光対物レンズからの放射を受光して、モノクローム蛍光強度画像を取得する。このモノクローム蛍光画像の画像データはカラー蛍光画像に変換することができる。
【００９８】
マルチバンド、マルチチャネルの実施形態については、動作８３０、８３５及び８４０をバンド毎に反復する。デュアルバンドの実施形態については、例えば、第２高出力蛍光照明光源が第２波長範囲の励起光を与える（動作８３０）。第２高出力蛍光照明光源は、高出力光源（例えば高出力ＬＥＤ）、及び第２波長範囲の励起光を通過させて他の波長を阻止する励起フィルタを含む。第１集光対物レンズは、試料から生じる光を受光する（動作８３５）。デュアルバンドの実施形態では、上記発光フィルタが、第１波長範囲の励起光及び第２波長範囲の励起光を共に遮光するデュアルバンド・フィルタである。この場合、このデュアルバンド・フィルタは、第２波長範囲の励起光を遮光して上記放射を第２集光レンズに渡す。第２集光対物レンズは、この放射を受光してＭＷＢシステムのイメージセンサに焦点を結ぶように集束させる。このイメージセンサは、第２高出力照明光源による蛍光照明中に第２集光対物レンズからの放射を受光して、第２モノクローム蛍光強度画像を取得する（動作８４０）。
【００９９】
上記撮像方法は、マルチバンド、マルチチャネルの実施形態のための随意的な動作８４５（点線で表す）を実行する。マルチバンド、マルチチャネルの実施形態では、複数のカラー蛍光画像どうしをオーバーレイして多色蛍光画像を生成することができる。１つの態様では、動作８４５の後に、上記撮像方法は、反復の前に、表示データを有する信号をプロセッサからディスプレイに送信して、カラー蛍光画像または他のデータをディスプレイ上に表示するステップをさらに含むことができる。動作８４５の後に、上記撮像方法は、蛍光撮像プロセスまたはＦＰ高分解能明視野撮像プロセスの実行を反復する。
【０１００】
ＦＰ撮像プロセスを実行する場合、上記撮像方法は動作８６０へ進む。ＦＰ撮像プロセスは、一般に、画像取得プロセス（動作６６０、６７０、及び６８０）及びＦＰ再構成プロセス（ステップ６９０）を含む。
【０１０１】
動作８６０では、可変照明光源が、平面波照明によりｎ通りの照射角で試料を順次に照射する。１つの態様では、可変照明光源が、発光素子（ＬＥＤ）を照射する順序を定める照射命令に基づいて順次照射される照明を与える。
【０１０２】
動作８７０では、上記光学系が試料から生じる光を集光してイメージセンサへ伝搬させる。光学系の第１対物レンズは、可変照明光源から試料を通過する光を集光する。一部の場合には、可変照明光源からの光が、第１対物レンズと第２対物レンズとの間にある発光フィルタを通過する波長範囲の光である。これらの場合には、ＦＰ撮像プロセス中に発光フィルタを除去する必要がない。第２対物レンズは発光フィルタからの光を受光して、この光をイメージセンサに焦点を結ぶように集束させる。上記光学系の第１対物レンズは、ＦＰ照明中に可変照明光源から試料を通過する光を受光する。第１対物レンズは、その開口数により、第１角度範囲の光を受け入れる（フィルタ処理する）。フーリエ空間内では、第１対物レンズのフィルタ処理機能は、ＮＡ×ｋ0の半径を有する円形瞳孔によって表され、ここにｋ0＝２π／λは真空中の波数である。ＦＰ撮像プロセスは、フーリエ空間内で、第１対物レンズのこうしたフィルタ処理機能及び上記ｎ通りの照射角によって規定される円形領域を更新する。
【０１０３】
動作８８０では、上記光学系によって伝搬される光をイメージセンサが受光する。ｎ通りの照射角で順次照射されるＦＰ照明中に、イメージセンサは、異なる照射角に関連する一意的な照明によるｎ個の強度測定値（画像）を取得する。イメージセンサは、露光時間中に強度分布を測定して強度測定値（画像）を取得する。ＭＷＢシステムのプロセスは、一意的な照明によるｎ個の強度測定値（画像）からのデータを有する信号を受信する。
【０１０４】
動作８９０では、ＭＷＢシステムのプロセッサが、上記撮像方法を用いて、一意的な照明によるｎ個の強度測定値（画像）によりフーリエ空間内の領域を反復的に更新することによって、分解能を向上させた画像を再構成する。このプロセッサは、ＦＰ再構成プロセスを用いて、分解能を向上させた画像を再構成する。ＦＰ再構成プロセスの２例を、図９及び図１０に関して詳細に説明する。１つの態様では、動作８９０の後に、上記撮像方法は、反復の前に、画像データをプロセッサからディスプレイへ送信して、高分解能明視野像または他のデータをディスプレイ上に表示するステップをさらに含むことができる。動作８９０の後に、上記撮像方法は、蛍光撮像プロセスまたはＦＰ高分解能明視野撮像プロセスの実行を反復する。
【０１０５】
１つの態様では、上記プロセッサが、蛍光撮像プロセスによって生成した蛍光画像とＦＰ撮像プロセスによって生成した高分解能明視野像とをオーバーレイすることによって、試料の蛍光画像と高分解能明視野像との合成画像を生成する。他の態様では、上記プロセッサが、蛍光撮像プロセスによって生成した蛍光画像とＦＰ撮像プロセスの取得プロセス中に捕捉した低分解能明視野像とをオーバーレイすることによって、試料の蛍光画像と低分解能明視野像との合成画像を生成する。他の態様では、上記プロセッサが、ＦＰ撮像プロセスにおける位相データに基づいて、試料の高分解能位相画像を生成する。
【０１０６】
１つの態様では、ＭＷＢシステムが、上記撮像方法を微速度撮影または他の長期撮像向けに実行することができる。例えば、上記撮像方法は、例えば１時間間隔、２時間間隔、１日間隔、等のような間隔で各回の実行を反復することができる。上記撮像方法は、各回の撮像の実行を、設定期間（例えば、１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、等）の間隔で継続することができ、あるいは、オペレータが撮像方法を停止するまで継続することができる。この長期の撮像が継続する間に、ＭＷＢシステムを培養器内に配置することができる。
【０１０７】
ＦＰ再構成プロセス
ＦＰ再構成プロセスの特定の詳細は、非特許文献４、及び米国特許出願第１４／０６５２８０号、発明の名称”Fourier Ptychographic Imaging Systems, Devices, and Methods”、２０１３年１０月２８日出願(特許文献２）に見出すことができる。ＦＰ再構成プロセス中に、フーリエ空間内のオーバーラップ領域を低分解能強度画像データで反復的に更新して、分解能を向上させた画像を生成する。
【０１０８】
2018504628.tif 000003
【０１０９】
2018504628.tif 000004
【０１１０】
９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、及び９７０の反復動作では、ＭＷＢシステムのプロセッサを用いて、低分解能強度測定値をフーリエ空間内で組み合わせることによって、試料の高分解能画像を再構成する。随意的な動作９２０及び９４０は、試料がｚ0なる量だけ焦点から外れている場合に実行することができる。
【０１１１】
2018504628.tif 000005
【０１１２】
2018504628.tif 000006
【０１１３】
2018504628.tif 000007
【０１１４】
2018504628.tif 000008
【０１１５】
2018504628.tif 000009
【０１１６】
動作９６０では、上記プロセッサが、一意的な照明によるｎ個の低分解能強度画像のすべてについて動作１５１０〜１５６０を完了したか否かを判定する。すべての画像について動作１５１０〜１５６０を完了していなければ、次の画像について動作１５１０〜１５６０を反復する。
【０１１７】
動作９７０では、上記プロセッサが、高分解能の解が収束したか否かを判定する。一例では、プロセッサが、高分解能の解が自己無撞着（セルフコンシステント）な解に収束したか否かを判定する。１つの場合には、プロセッサが、前回の反復における前回の高分解能の解または上記初期推定値を現在の高分解能の解と比較し、その差が特定値未満であれば、現在の解を自己無撞着な解に収束したものと判定する。動作９７０において、解が収束していないものとプロセッサが判定した場合、動作９１０〜９６０を反復する。一実施形態では、動作９１０〜９６０を１回反復する。他の実施形態では、動作９１０〜９６０を２回以上反復する。解が収束すれば、プロセッサは、フーリエ空間内で収束した解を空間領域に変換して、分解能を向上させた画像
2018504628.tif 000010
を復元して、ＦＰ再構成プロセスを終了する。
【０１１８】
2018504628.tif 000011
【０１１９】
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【０１２０】
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【０１２１】
動作１００５、１０１０、１０３０、１０４５、１０５０、１０６０、及び１０７０の反復動作では、ＮＷＢシステムのプロセッサを用いて、低分解能の強度測定値をフーリエ空間内で組み合わせることによって、試料の高分解能画像をコンピュータで再構成する。
【０１２２】
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【０１２３】
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【０１２４】
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【０１２５】
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【０１２６】
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【０１２７】
動作１０６０では、上記プロセッサが、一意的な照明によるｎ個の低分解能強度画像のすべてについて動作１００５〜１０５０を完了したか否かを判定する。すべての画像について動作１００５〜１０５０を完了していなければ、次の画像について動作１００５〜１０５０を反復する。
【０１２８】
動作１０７０では、上記プロセッサが、高分解能の解が収束したか否かを判定する。一例では、プロセッサが、高分解能の解が自己無撞着な解に収束したか否かを判定する。１つの場合には、プロセッサが、前回の反復における前回の高分解能の解または上記初期推定値を現在の高分解能の解と比較し、その差が特定値未満であれば、現在の解を自己無撞着な解に収束したものと判定する。解が収束していないものとプロセッサが判定した場合、動作１００５〜１０７０を反復する。一実施形態では、動作１００５〜１０７０を１回反復する。他の実施形態では、動作１００５〜１０７０を２回以上反復する。解が収束すれば、プロセッサは、フーリエ空間内で収束した解を空間領域に変換して、高分解能画像
2018504628.tif 000019
を復元して、ＦＰ再構成プロセスを終了する。
【０１２９】
特定の態様では、画像毎に反復的に更新された、フーリエ空間内で隣接する領域どうしがオーバーラップする。更新された領域どうしがオーバーラップする領域では、ＭＷＢシステムが同じフーリエ空間上で複数回のサンプリングを行っている。１つの態様では、隣接する領域どうしがオーバーラップする領域が、隣接する領域の一方の面積の２％〜９９．５％の面積を有する。他の態様では、隣接する領域どうしがオーバーラップする領域が、隣接する領域の一方の面積の６５％〜７５％の面積を有する。他の態様では、隣接する領域どうしがオーバーラップする領域が、隣接する領域の一方の面積の約６５％の面積を有する。
【０１３０】
ＩＶ．ＭＷＢシステムの実例
図１１Ａは、４Ｘ／ＮＡ０．１対物レンズを有する従来型顕微鏡で平面照明により撮影したＵＳＡＦ（United States Air Force：米国空軍）ターゲットの画像である。図１１Ｂは、一実施形態による、１：１の結像構成を有するＭＷＢシステムによって撮影したＵＳＡＦターゲットのＲＡＷ強度画像である。このＲＡＷ強度画像は、中心のＬＥＤ照明（即ち、ＵＳＡＦターゲットの中心の上方に配置されたＬＥＤ）に基づいている。両方の場合に、解像可能な最小の特徴はグループ７、要素５（２．４６μmの線幅）である。このことは、ＭＷＢシステムが、１：１の結像構成における第１対物レンズの開口数によって提供される全視野を有することを示している。
【０１３１】
図１１Ｃは、一実施形態による、ＭＷＢシステムによって実現されるＦＰ撮像プロセスによって生成したＵＳＡＦターゲットの高分解能明視野像を含む。この高分解能画像は、ＦＰ構成プロセスの画像取得期間中に取得した１６９個のＲＡＷ画像（ｎ＝１６９）からのデータを組み合わせることによって生成した。これら１６９個のＲＡＷ画像は、ＬＥＤマトリクスの１６９個の異なるＬＥＤを順次照射することによって取得した。１６９個の画像によるＦＰ構成プロセスを用いて、ＭＷＢシステムの合成ＮＡは０．４２になり、ＭＷＢシステムの分解能は４倍増加しており、グループ９、要素５の特徴（０．６２μmの線幅）を解像している。図１１Ｃは、分解能を向上させた明視野像１１０２の四角形内の領域の拡大画像１１０４も含む。
【０１３２】
図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃでは、４．５μmの緑色蛍光ビーズと非蛍光体のビーズの混合物を試料に追加している。図１２Ａは、一実施形態による、ＭＷＢシステムを用いて取得した低分解能明視野像と蛍光画像とのオーバーレイ画像である。試料のＲＡＷ明視野像は、ＭＷＢシステムによって実現される撮像方法のＦＰ画像取得プロセス中に取得した。蛍光画像は、この撮像方法の蛍光撮像プロセス中に生成した。図１２Ａでは、矢印が緑色蛍光ビーズを指し示す。
【０１３３】
図１２Ｂは、一実施形態による、ＭＷＢシステムによって実現される撮像方法のＦＰ撮像プロセスを用いて生成した高分解能明視野像である。図１２Ｃは、一実施形態による、ＭＷＢシステムによって実現される撮像方法のＦＰ撮像プロセスを用いて生成した再構成された位相画像である。図に示すように、蛍光ビーズはその蛍光信号によって非蛍光ビーズと明確に区別可能である。互いに付着した２個のビーズは、図１２Ｂ及び１２Ｃの再構成された強度画像及び位相画像から解像され、図１２Ａの蛍光画像は、ビーズのうちのどれが蛍光ビーズであるかについての情報を与える。１つの態様では、ＭＷＢシステムを用いて、特定の蛍光体としてラベル付けされるか特定の蛍光体を表すターゲットを識別するための蛍光画像、及び回折限界のあるターゲットの蛍光画像を補償するための分解能を向上させたＦＰ再構成画像を生成することができる。
【０１３４】
試料の強度及び位相情報を含む複素数体を、非特許文献１０に記載された反復（逐次）的なＦＰ再構成プロセスによってレンダリングすることができ、非特許文献１０は、この説明のために参照する形で本明細書に含める。位相情報の定量的な精度を検証するために、次式２を用いて、再構成した位相情報をビーズの厚さに変換することができる：
【数１】
2018504628.tif 000020
ここに、Ｔはビーズの厚さであり、λは光の波長であり、Δφは背景位相に対する位相であり、Δｎは試料と背景との屈折率差である。図１２Ａ、１２Ｂ、及び１２Ｃでは、ポリスチレン・ビーズ（ｎ＝１．５８）が油（ｎ＝１．５１５）内に浸漬され、緑色ＬＥＤ（５３０nm）を照明用に用いている。図１２Ｃに示す直線形状を変換して図１２Ｄに示す。図１２Ｄは、再構成された位相画像上のビーズの、図１２Ｃ中に示す直線上の厚さをプロットした図である。再構成された位相画像は、ＭＷＢシステムによって実現される撮像方法のＦＰ再構成プロセスによって生成した。測定値の曲線は、理想的な球体の想定されるプロファイルと極めて一致し、ＦＰＭ（FP method：ＦＰ法）で再構成したＭＷＢシステムの位相情報を示す。
【０１３５】
１つの態様では、ＭＷＢシステムがＦＰ再構成プロセスをデジタル・リフォーカス用に用いることができる。デジタル・リフォーカスは、システムのゆらぎまたはマルチウェル・プレートのミスアライメントにより生じる画像のデフォーカスによって何日間または何週間の実験を無駄にすることがある生細胞の撮像において特に有用である。非特許文献４に記載されているように、ＦＰＭ再構成中に、空間周波数領域内のサポート制約中に二次のデフォーカス位相項を導入することによって、デフォーカスしたＲＡＷ画像をデジタル処理で再リフォーカスすることができる。
【０１３６】
ＭＷＢシステムのリフォーカス性能を特性化するために、ＵＳＡＦターゲットを意図的にデフォーカスして、ＦＰ再構成プロセス中にデジタル処理でリフォーカスした。図１３Ａは、ｚ＝＋１００μmにあるＵＳＡＦターゲットのデフォーカスした画像である。図１３Ｂは、一実施形態による、図１３Ａに示す画像をデジタル処理でリフォーカスした画像であり、ＭＷＢシステムによって実現される撮像方法のＦＰ再構成プロセス中にデジタル処理でリフォーカスしている。図１４Ａは、ｚ＝−１００μmにあるＵＳＡＦターゲットのデフォーカスした画像である。図１４Ｂは、一実施形態による、図１４Ａに示す画像をデジタル処理でリフォーカスした画像であり、ＭＷＢシステムによって実現される撮像方法のＦＰ再構成プロセス中にデジタル処理でリフォーカスしている。図１３Ｂ及び１４Ｂ中の画像によって例示されるように、±１００μmのデフォーカス範囲内では、ＭＷＢシステムが試料を良好にリフォーカスしている。
【０１３７】
図１５は、一実施形態による、図１３Ｂ及び１４Ｂに示す解像可能な最小の特徴の直線軌跡のプロット図である。図１５には、焦点を合わせた試料及びｚ＝±１００μmだけデフォーカスした試料の場合に解像される最小の特徴についての直線軌跡を示す。すべての場合において、３本の暗線が直線軌跡と明確に区別され、このことはＭＷＢシステムの被写界深度（ＤＯＦ：depth-of-field）が約２００μmであることを示す。
【０１３８】
図１６Ａは、デフォーカスしたニューロン培養試料の画像である。図１６Ｂは、一実施形態による、ＭＷＢシステムによって実現される撮像方法のＦＰＭ再構成を用いてデジタル処理でリフォーカスした位相画像である。図１６Ａ及び１６Ｂの例で用いた試料は、撮像のためにパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ：paraformaldehyde）で固定され、リン酸緩衝食塩水中に浸漬させた。
【０１３９】
図１７は一実施形態による、ＭＷＢシステムによって生成した大視野像を示す。画像１７２２及び１７２８は、蛍光画像とオーバーレイしたＲＡＷ画像である。画像１７２４及び１７３０は、画像１７２２及び１７２８に対応する再構成された位相画像である。画像１７２２及び１７２８は、蛍光画像とオーバーレイしたＲＡＷ画像である。画像１７２６及び１７３２は、画像１７２２及び１７２８に対応する２チャネルの位相勾配画像である。
【０１４０】
図１７中の画像１７２０に示すように、ＭＷＢシステムの１つの撮像装置の全視野は５．７mm×４．３mmである。撮像した試料は、元々、ｅＧＦＰ（enhanced green fluorescent protein：高感度緑色蛍光タンパク質）を表現するように操作したドーパミン作動性（ＤＡ：dopaminergic）ニューロンを有する種子であった。図１７中の画像１７２０に示す視野内で観測したｅＧＦＰ信号により、１５個のＤＡニューロンを識別した。画像１７２２、１７２４、１７２６、１７２８、１７３０、及び１７３２は、２つの代表的なＤＡニューロンのものである。図１７の画像１７２２及び１７２８中に示すように、これらのＤＡニューロンからのｅＧＦＰ蛍光信号強度は、標的細胞を識別するのに十分なほど強力であった。図１７の画像１７２４及び１７３０は、視野の中心からそれぞれ２．３mm及び１．９mmの距離の、ＦＰＭで再構成した画像を示す。図１７の画像１７２６及び１７３２は２チャネルの位相勾配画像を示し、これらは再構成された位相画像１７２４及び１７３０から生成した。これらの再構成された位相画像中の位相ラッピング（折り返し）によって生じるアーティファクト（画像１７３０中に矢印で示す）は、位相画像を位相勾配画像に変換することによって除去することができる。
【０１４１】
ＭＷＢシステムを用いた生細胞培養体撮像の例を導き出すために、ＧＥＮＳＡＴ（Gene Expression Nervous System ATlas：プロジェクト名）チロシン・ヒドロキシラーゼ（チロシン水酸化酵素）（ＴＨ：tyrosine hydroxylase）−ｅＧＦＰ系統の、ＴＨプロモーターからｅＧＦＰを駆動するＢＡＣ（Bacterial Artificial Chromosome：細菌人工染色体）トランスジェニック（遺伝子導入、形質転換）マウス細胞株からの中脳腹側部の試料を培養した。ニューロン−グリア中脳腹側部培養体の各々がグリア細胞の単層、ＴＨ−ｅＧＦＰを生成するＤＡニューロン、及び他の中脳ニューロンから成る。この中脳腹側部培養体は、胎生１４日目のマウス胎児から得たものであり、これらのマウス胎児は、時点を定めて妊娠したマウスから抽出した。これらのグリア細胞及び中脳ニューロンは６ウェル・プレート内で成長させ、培養器（培地）は、３週間の撮像期間にわたって３日間隔で交換した。ＭＷＢシステムを用いて、６ウェル・プレート内の培養体を３週間の期間にわたって撮像し監視した。ＭＷＢシステムは、ＦＰ撮像取得プロセス中に、ｎ個の一連の低分解能明視野強度画像を各ウェルから１時間間隔で捕捉した。蛍光撮像プロセスは、ウェル毎に１日１回実行した。図１８は、一実施形態による、ＭＷＢシステムによって実現される撮像方法のＦＰプロセスによって生成した微速度撮影による一連の位相画像１８１０、１８２０、１８３０、及び１８４０である。位相画像１８１０、１８２０、１８３０、及び１８４０は、上述したマウス・ニューロン培養体のものである。位相画像１８１０、１８２０、１８３０、及び１８４０は、それぞれ４日目、７日目、１０日目、及び１６日目に撮影したものである。追跡中のＤＡニューロンは、ｅＧＦＰ蛍光信号を用いて良好に識別され、黄色い円で印を付けている。後続する各画像を比較することによって、前回のタイムフレーム（時間枠）における標的細胞との位置及びサイズの変化が最小である細胞を、現在のタイムフレームの標的細胞として選定した。１時間の微速度撮影では、この追跡方法は大部分の細胞について良好に機能した。標的細胞は、培養実験の期間中に追跡した。図１９は、一実施形態による、ＭＷＢシステムによって生成した画像に基づいて追跡した標的細胞の位置軌跡をプロットした図である。
【０１４２】
図２０は、一実施形態による、ＭＷＢシステムによって実現される撮像方法のＦＰプロセスによって生成した微速度撮影による一連の画像２０１０、２０２０、２０３０、及び２０４０である。駆動細胞の微速度撮影を行うために、マウスの中脳腹側部培養体を、混合された初代混合培養体とした。２１日間の培養実験中に、微速度撮影による画像２０１０、２０２０、２０３０、及び２０４０から活性駆動細胞が見出された。矢印で識別する２つの推定母細胞が娘細胞に分裂した。これらの細胞は、培養のおよそ１４日目に分裂を開始した。こうした細胞分裂は、６ウェル・プレート内の６つのウェルの各々で観測された。
【０１４３】
Ｖ．サブシステム
図２１は、一実施形態による、特定のＭＷＢシステム内に存在し得る１つ以上のサブシステムのブロック図である。プロセッサは、イメージセンサの構成要素とすることも別個の構成要素とすることもできる。
【０１４４】
前の図面中に記載した種々の構成要素は、１つ以上のサブシステムを用いて動作して、本明細書中に説明した機能を促進することができる。図面中のあらゆる構成要素が、適切な任意数のサブシステムを用いて、本明細書中に説明した機能を促進することができる。こうしたサブシステム及び／または構成要素の例を図２１に示す。図２１に示すサブシステムは、システムバス２４２５を介して相互接続される。プリンタ２４３０、キーボード２４３２、固定ディスク２４３４（またはコンピュータ可読媒体を具えた他の記憶装置）、ディスプレイ・アダプタ２４３８に結合されたディスプレイ５６、その他のような追加的なサブシステムを示す。周辺機器及び入力／出力（Ｉ／Ｏ）装置は、Ｉ／Ｏコントローラ２４４０に結合され、シリアルポート２４４２のような現在技術において既知の任意数の手段によって接続することができる。例えば、シリアルポート２４４２または外部インタフェース２４４４を用いて、コンピュータ装置の構成要素を、インターネットのような広域ネットワーク、マウス入力装置、またはスキャナに接続することができる。システムバス２４２５を介した相互接続は、プロセッサが各サブシステムと通信すること、及びシステムメモリ２４４６または固定ディスク２４３４からの命令の実行を制御すること、並びにサブシステム間での情報の交換を可能にする。一部の場合には、システムメモリ２４４６及び／または固定ディスク２４３４がＣＲＭを具体化することができる。これらの要素のいずれも、前述した特徴内に存在することができる。
【０１４５】
一部の実施形態では、フーリエ・カメラシステムのプリンタ２４３０またはディスプレイ１８２が種々の形式のデータを出力することができる。例えば、上記ＭＷＢシステムは、２Ｄ（two-dimensiional：二次元）カラー／モノクローム画像（強度及び／または位相）、これらの画像に関連するデータ、またはＭＷＢシステムが実行する分析に関連する他のデータを出力することができる。
【０１４６】
本発明の範囲から逸脱することなしに、上述した実施形態のいずれに対しても、修正、追加、または省略を行うことができる。本発明の範囲から逸脱することなしに、上述した実施形態のいずれも、より多数、より少数、または他の特徴を含むことができる。これに加えて、本発明の範囲から逸脱することなしに、上述した特徴のステップを任意の適切な順序で実行することができる。
【０１４７】
上述した本発明は、モジュール様式または統合様式のコンピュータ・ソフトウェアを用いる制御論理回路の形態で実現することができることは明らかである。本明細書中に提供する開示及び技術に基づいて、通常の当業者は、ハードウェア及びハートウェアとソフトウェアの組合せを用いて本発明を実現する他の手段及び／または方法を認知し理解する。
【０１４８】
本願中に説明したソフトウェア・コンポーネントまたは機能は、例えばＪａｖａ（登録商標）、Ｃ＋＋、またはＰｅｒｌ（登録商標）のような、例えば従来技術またはオブジェクト指向技術を用いるあらゆる適切なコンピュータ言語を用いた、プロセッサによって実行されるソフトウェア・コードとして実現することができる。このソフトウェア・コードは、一連の命令またはコマンドとして、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ：random access memory）、読出し専用メモリ（ＲＯＭ：read only memory）、ハードディスク・ドライブまたはフロッピー（登録商標）ディスクのような磁気媒体、あるいはＣＤ−ＲＯＭ（compact disc read only memory：コンパクトディスク読出し専用メモリ）のような随意的な媒体といったＣＲＭ上に記憶することができる。こうしたＣＲＭのいすれも、単一のコンピュータ装置上またはコンピュータ装置内に存在することができ、あるいは、システムまたはネットワーク内の異なるコンピュータ装置上またはコンピュータ装置内に存在することができる。
【０１４９】
以上に開示した実施形態は、理解を促進するために幾分詳細に説明してきたが、説明した実施形態は例示的であり限定的ではないものと考えるべきである。添付した特許請求の範囲内で特定の変更または修正を実施することができることは、通常の当業者にとって明らかである。
【０１５０】
本発明の範囲から逸脱することなしに、任意の実施形態からの１つ以上の特徴を、他の実施形態の１つ以上の特徴と組み合わせることができる。さらに、本発明の範囲から逸脱することなしに、いずれの実施形態に対しても、修正、追加、または省略を行うことができる。本発明の範囲から逸脱することなしに、特定の必要性に応じて、いずれの実施形態の構成要素も、統合または分離することができる。
【図１】
2018504628.tif 000021
【図２Ａ】
2018504628.tif 000022
【図２Ｂ】
2018504628.tif 000023
【図２Ｃ】
2018504628.tif 000024
【図２Ｄ】
2018504628.tif 000025
【図３Ａ】
2018504628.tif 000026
【図３Ｂ】
2018504628.tif 000027
【図４Ａ】
2018504628.tif 000028
【図４Ｂ】
2018504628.tif 000029
【図５】
2018504628.tif 000030
【図６】
2018504628.tif 000031
【図７Ａ】
2018504628.tif 000032
【図７Ｂ】
2018504628.tif 000033
【図７Ｃ】
2018504628.tif 000034
【図７Ｄ】
2018504628.tif 000035
【図８】
2018504628.tif 000036
【図９】
2018504628.tif 000037
【図１０】
2018504628.tif 000038
【図１１Ａ】
2018504628.tif 000039
【図１１Ｂ】
2018504628.tif 000040
【図１１Ｃ】
2018504628.tif 000041
【図１２Ａ】
2018504628.tif 000042
【図１２Ｂ】
2018504628.tif 000043
【図１２Ｃ】
2018504628.tif 000044
【図１２Ｄ】
2018504628.tif 000045
【図１３Ａ】
2018504628.tif 000046
【図１３Ｂ】
2018504628.tif 000047
【図１４Ａ】
2018504628.tif 000048
【図１４Ｂ】
2018504628.tif 000049
【図１５】
2018504628.tif 000050
【図１６Ａ】
2018504628.tif 000051
【図１６Ｂ】
2018504628.tif 000052
【図１７】
2018504628.tif 000053
【図１８】
2018504628.tif 000054
【図１９】
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【図２０】
2018504628.tif 000056
【図２１】
2018504628.tif 000057
【国際調査報告】
2018504628.tif 000058
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