(57)【要約】  本発明は、HHPV誘発高悪性前癌病変およびHPV誘発性浸潤性癌ならびに非HPV誘発性婦人科および肛門性器癌を検出するための方法であって、ZIC1および/またはGHSR遺伝子における過剰メチル化の検出を含み、浸潤能を有するHPV誘導性前駆病変、HPV誘発性浸潤性癌および非HPV誘導性婦人科および肛門癌を有するHPV誘導性前駆病変の存在を示す。本発明は、ZIC1および/またはGHSRメチル化の検出のためのこのような方法および試験キットにおけるZIC1および/またはGHSR遺伝子の使用をさらに含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内のGHSRおよび／またはZIC1遺伝子における、浸潤能を有するHPV誘導性前駆病変、HPV誘発性浸潤性癌および非HPV誘発性婦人科および肛門性器癌の存在を示す過剰メチル化の検出を含む、HPV誘発高悪性前癌病変およびHPV誘発性浸潤性癌ならびに非HPV誘発性婦人科および肛門性器癌を検出する方法。
【請求項２】
前記HPV誘発高悪性前癌病変またはHPV誘発性浸潤性癌が、高悪性度の前悪性頸部病変または浸潤性子宮頸癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記HPV誘発性浸潤性癌が、高リスクHPV誘発性浸潤性癌である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記非HPV誘導性婦人科性癌が子宮内膜癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記過剰メチル化が、図１および２に示されるCpGに富む配列において検出される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記過剰メチル化が、比較可能な正常細胞と比較して、試験細胞中のGHSRおよび／またはZIC1 CpGに富むプロモーターおよび/または遺伝子配列のメチル化の増加である、請求項１−５のいずれか１項に記載のHPV誘発高悪性前癌病変およびHPV誘発性侵襲性癌および非HPV誘発性婦人科癌および肛門癌の検出方法。
【請求項７】
試薬が、BssHII、MspI、NotIおよびHpaIIからなる群から選択されるメチル化感受性制限酵素である、請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、ナノテクノロジー、好ましくはラボオンチップ技術を含む、請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
DNAの重亜硫酸塩修飾に基づくメチル化特異的PCRが行われ、続いてCpGに富む配列を標的とする特異的PCR反応が行われる、請求項１−６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
試薬が、図１または２に示される、核酸に結合する核酸プローブまたはプライマーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸プローブまたはプライマーが検出可能な標識を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸プローブが、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項９、１０または１１に記載の方法：
a）  図１に示す配列ZIC1または図２に示す配列GHSRにストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列；
b）  a）のポリヌクレオチドの１つに対して少なくとも70％の同一性を有するポリヌクレオチド；
c）  a）のポリヌクレオチドの1つに相補的なポリヌクレオチド；そして
d）  a）またはb）のポリヌクレオチドの１つの少なくとも１５塩基を含むポリヌクレオチド。
【請求項１３】
GHSRおよびZIC1遺伝子の両方のメチル化が決定される、請求項１−１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
好ましくは、前記マーカーのメチル化が前記病変、癌腫または癌の発生を予測する、HPV誘発高悪性前癌病変およびHPV誘発性浸潤性癌ならびに非HPV誘発性婦人科および肛門性器癌の検出のための分子診断マーカーとしてのGHSRおよび／またはZIC1の使用。
【請求項１５】
細胞が尿試料または子宮頸部試料に由来する、請求項１−１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記子宮頸部試料が自己試料である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
図１のZIC1ヌクレオチド配列および/または図２のGHSRヌクレオチド配列に特異的なプローブおよび/またはプライマーを含むGHSRおよび/またはZIC1メチル化の検出のための手段と、HPVに特異的なプローブおよびプライマーを含むHPV感染の検出を含む、HPV誘発高悪性前癌病変およびHPV誘発性浸潤性癌ならびに非HPV誘発性婦人科および肛門性器癌を検出する方法に使用するための部品キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌予防および医学的診断の分野に関し、癌、特に、浸潤性子宮頸癌および前癌性頸部病変、非HPV誘発性婦人科および肛門癌などのヒトパピローマウイルス（HPV）誘発性の侵襲性癌およびその高悪性前駆病変の分子診断マーカーに関する。特に、本発明は、hrHPV誘導浸潤癌、非HPV誘導性婦人科および肛門癌ならびに浸潤能を有するそれらの前癌病変のマーカーとしてのZIC1およびGHSRゲノムおよび制御配列の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頚部の癌は、世界的に女性で４番目に多い癌であり、年間約250000人の癌による死亡の原因となっている。
【０００３】
子宮頸部扁平上皮癌の発症は、前癌病変の配列、軽度異形成（CIN 1）、中等度異形成（CIN 2）および重度の異形成/上皮内癌（CIN 3）という、いわゆる1〜3段階の子宮頸部上皮内腫瘍（CIN）によって特徴付けられる。CIN 1は低悪性度扁平上皮内病変（LSIL）、CIN 2とCIN 3は高悪性度扁平上皮内病変（HSIL）とも呼ばれている。子宮頸部腺癌の場合、上皮内腺癌（ACIS）は確立された前駆病変である。これらの前悪性病変は原則可逆的であるが、病変が重症であるほど自発的回帰の可能性は低いものとなる。前癌性の段階は剥離細胞診によって検出され、必要時に軽度の副作用を伴うのみで比較的容易に治療されることから、子宮頸癌は予防可能な疾患と考えられている。子宮頸部スクリーニングは、重度の前癌（すなわち、CIN 2/3および上皮内腺癌）および治療可能な癌性病変を早期に診断し、それによって侵襲性子宮頸癌の死亡率を低下させることを目的とする。一般的な医療行為は、子宮頸癌の発症を防ぐため、形態学的に確認されたCIN 2、CIN 3および上皮内腺癌を有する全ての女性の治療を含む。
【０００４】
過去10年間で、高リスクのヒトパピローマウイルス（hrHPV）感染により子宮頸癌の発癌が開始されることは十分に確立されている。p53およびRb腫瘍抑制経路をそれぞれ妨害するウイルス性腫瘍遺伝子E6およびE7の発現が、発癌の開始および悪性表現型の維持の両方に必須であることが示されている。したがって、hrHPV検査は、魅力的な一次スクリーニングツールであると見られていた。しかしながら、発癌の多段階プロセスと同様、hrHPV感染細胞の侵襲性癌細胞への進行のためには、宿主細胞ゲノムのさらなる改変が必要である。高リスクのHPVに感染した女性のごく一部は、高悪性度の前悪性頸部病変（CIN 2/3）を発症し、未治療のままであれば子宮頸癌を発症する。前癌性の頸部病変を有する大部分の女性では、病変は自発的に退行する。人口ベースのスクリーニングに参加する女性のうち、約5-6％が陽性hrHPV検査を受けている。しかしながら、そのうち最大20％（参加している女性の1％）のみがCIN 2/3と同じかそれよりも重度である。したがって、CIN 2/3と同じかそれよりも重度および上皮内腺癌と同じかそれよりも重度のリスクに対するhrHPV陽性女性の層別化を可能にするマーカーが子宮頸部スメアに適用されない限りhrHPV検査による一次スクリーニングは、相当数の重複した追求手順と、女性における無用な不安を伴うものとなる。
【０００５】
主要な課題は、臨床的に意味のある病変を有する女性に対するHPV陽性女性の割合を減らすことである。１つの方法は、hrHPV陽性女性のための二次的（いわゆるトリアージ）試験として細胞診を用いることである。それでも、正常な細胞診を有するかなりの数のhrHPV陽性女性（スクリーニング集団の女性の3.5％）が残るが、そのうち10％がCIN 3と同じかそれよりも重度である。さらに、細胞診は自宅採取可能な自己採取された頸膣部検体のための選択肢ではなく、子宮頸部の細胞学的状態を代表するものとはなっていない。もう１つの方法は、HPV16/18遺伝子タイピングを使用することである。しかしこれにより、HPV16/18型以外の女性には、CIN 2/3と同じかそれよりも重度のリスクがあるが、その程度は低くなる。したがって、hrHPV陽性女性をCIN 2/3および上皮内腺癌の有無に階層化するための補足的または代替のトリアージツールが必要である。
【０００６】
癌遺伝子における宿主細胞の変化に基づく疾患マーカーを用いた子宮頸癌の一次スクリーニングは、特異性および感受性が十分高いという条件で有望な代替物を提供する。このオプションは、品質が管理された細胞診がなく、HPV陽性女性のフォローアップアルゴリズムの実施が複雑な中低所得国にとって特に重要である。これらの国においは、自己採取が子宮頸部スクリーニングへのアクセスを容易にすることが示されている（Laczano-Ponceら, Lancet. 2011; 378: 1868-1873）。この意味でも、自己サンプルにも優勢なマーカーを同定することは非常に有用である。医師や看護師などの医療技能者や女性自身が収集した膣スワブで得られた膣スミア上のマーカーの「行動」には大きな違いがあるようである。医師が提供するサンプルに適した多くのマーカーは、自己サンプルでは有用ではないと思われている。1人当たりの医療人員が少なく、多くの場合、他人に膣検体を使用させることに文化的な問題があることから、低所得国と中所得国では、医師のサンプルの代わりに自己サンプルを使用する必要性が高い。
【０００７】
子宮内膜癌は、多くの先進国において最も一般的な婦人科悪性腫瘍である（Siegelら, CA Cancer J. Clin., 64 (2014), pp.9-29）。早期子宮内膜癌は、予後が非常に良い。したがって、早期発見は治癒の機会を増やし、面倒で費用のかかる治療による介入を、回避または低減する。子宮頸部擦過物における腫瘍細胞の脱落が示されているので、非侵襲的サンプリングによる子宮内膜癌の早期検出が実現可能である。しかしながら、子宮頸部擦過物に関する従来の細胞診は、子宮内膜癌の検出に対しての感受性が非常に低い。子宮内膜癌に関連するDNAメチル化のような分子変化の試験は、子宮内膜癌の早期検出のための有望なアプローチを提供し得るものとなる（de Strooperら, J Clin Pathol. 2014;67(12):1067-71, Bakkum-Gamezら, Gynecol Oncol. 2015;137(1):14-22）。同様に、卵巣癌の検出のための子宮頸部擦過物における癌特異的DNA変化の試験が近年提案されている（Kindleら, Sci Transl Med. 2013; 5(167):1-21）。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、HPV誘発性の侵襲性癌、非HPV誘発性の婦人性および肛門性器癌、およびそれらの高悪性前癌病変を検出するための方法を見出しており、前記方法は、細胞中のZIC1および/またはGHSR遺伝子における過剰メチル化の検出を含み、そのような過剰メチル化は、浸潤能を有するHPV誘導性前駆病変、HPV誘発性浸潤性癌、非HPV誘発性婦人科および肛門性器癌の存在を示す。好ましくは、そのような方法において、前記HPV誘発高悪性前癌病変またはHPV誘発性浸潤癌腫は、高悪性度の前癌性頸部病変または浸潤性子宮頸癌、より好ましくは高リスクHPV誘導性浸潤癌である。好ましくは、前記非HPV誘導性婦人科癌は、子宮内膜癌である。好ましくは、前記非HPV誘発肛門性器癌は、外陰または陰茎癌である。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態では、図１および図２に示すように、過剰メチル化がCpGリッチ配列で検出される。
【００１０】
本発明はまた、前記過剰メチル化が、比較可能な正常細胞と比較して、試験細胞中のZIC1および／またはGHSR CpGリッチプロモーターおよび／またはゲノム配列のメチル化の増加である、上記で定義した方法に関する。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態において、（過剰）メチル化の検出は、BssHII、MspI、NotIおよびHpaIIからなる群から選択されるメチル化感受性制限酵素を用いることによって実施される。本発明の別の好ましい実施形態において、（過剰）メチル化の検出は、ナノテクノロジーを用いて行われる。本発明の別の好ましい実施形態において、（過剰）メチル化の検出は、CpGリッチ配列を標的とする特異的PCR反応の後に、DNAの重亜硫酸塩修飾に基づくメチル化特異的PCRを介して行われる。このような方法において、好ましくは、試薬は図１または２に示されるように核酸に結合する核酸プローブまたはプライマーであり、より好ましくは、前記核酸プローブまたはプライマーは検出可能な標識を有する。
【００１２】
本発明の別の実施形態では、核酸プローブは、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する：
a）図１に示す配列ZIC1または図２に示す配列GHSRにストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列；
b）a）のポリヌクレオチドと少なくとも70％の同一性を有するポリヌクレオチド；
c）a）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド；そして
d）a）またはb）のヌクレオチドの少なくとも15塩基を含むポリヌクレオチド。
【００１３】
本発明の本方法においてさらに好ましくは、ZIC1遺伝子およびGHSR遺伝子の両方のメチル化が決定される。
【００１４】
また、本発明の一部は、HPV誘発性浸潤癌、非HPV誘導性婦人科または肛門性器癌、およびそれらの高悪性前癌病変の検出のための分子診断マーカーとしてのZIC1および／またはGHSRの使用である。好ましくは、そのような使用において、前記マーカーのメチル化は、前記病変または癌腫の発生を予測する。
【００１５】
本発明はまた、HPV誘発性浸潤癌、非HPV誘発性婦人科または肛門性器癌、およびそれらの高悪性前癌病変を検出する方法に使用するための部品のキットを含み、
ZIC1および／またはGHSRメチル化の検出を意味し、前記手段は、図１のZIC1ヌクレオチド配列および／または図２のGHSRヌクレオチド配列に特異的なプローブおよび／またはプライマーを含み、
HPVに特異的なプローブおよびプライマーを含む、HPV感染の検出のための手段を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ZIC1 5'調節領域およびコード配列を示す。転写開始点は太字のイタリック体で示され、CpGアイランドは灰色で陰影付けされ、コード配列は大文字で示される。
【図２】図２は、GHSR 5'調節領域およびコード配列を示す。転写開始点は太字のイタリック体で示され、CpGアイランドは灰色で陰影付けされ、コード配列は大文字で示される。
【図３】図３は、初代ケラチノサイト、hrHPV不死化ケラチノサイトおよび子宮頸癌細胞株における定量的メチル化特異的PCRによって測定されたZIC1およびGHSRのレベルの箱ひげ図を示す。y軸上では、メチル化されたDNAのレベルが提示され、x軸上では、細胞株（一次ケラチノサイト、初期継代HPV16およびHPV18不死化ケラチノサイト、後期継代HPV16およびHPV18不死化ケラチノサイトおよび子宮頸癌細胞）が形質転換の程度に従ってグループ化される。ZIC1およびGHSRのメチル化レベルは形質転換の段階で増加し、初代ケラチノサイトおよび早期継代HPV16およびHPV18不死化ケラチノサイトと比較して、後期継代HPV16およびHPV18不死化ケラチノサイト細胞および子宮頸癌細胞で有意に増加する。細胞カテゴリー間のメチル化レベルの有意差が示される。
【図４】図４は、子宮頸部組織標本における定量的メチル化特異的PCRによって測定されたZIC1およびGHSRのレベルの箱ひげ図を示す。y軸上では、メチル化されたDNAのレベルが提示され、x軸上では、サンプルは各疾患ステージおよび組織型についてグループ化される。ZIC1およびGHSRのメチル化レベルは、疾患の段階で増加し、（実質的に）すべてのSCCおよび腺癌（AdCA）において検出される。疾患カテゴリー間のメチル化レベルの有意差が示される。
【図５】図５は、（HPV陰性およびHPV陽性の両方の擦過物を含む）子宮頸部疾患を有しない女性、CIN 3を有する女性、SCCを有する女性およびAdCAを有する女性の子宮頸部擦過物における、定量的メチル化特異的PCRによって測定されたZIC1およびGHSRレベルの箱ひげ図を示す。y軸上には、メチル化されたDNAのレベルが提示され、x軸上には、各疾患ステージおよび組織型についてサンプルがグループ化される。ZIC1およびGHSRのメチル化レベルは、疾患の段階で増加し、すべてのSCCおよびAdCAにおいて検出される。 疾患カテゴリー間のメチル化レベルの有意差が示される。
【図６】図６は、子宮内膜癌の女性の子宮頸部擦過物における定量的メチル化特異的PCRによって測定されたGHSRのレベルの箱ひげ図を示す。y軸上では、メチル化されたDNAのレベルが提示され、x軸上では、サンプルは子宮頸部疾患を有しない女性の擦過物と子宮内膜癌を有する女性の擦過物として分類される。GHSRメチル化レベルは、コントロールと比較して、子宮内膜癌を有する事実上全ての女性において有意に増加する。
【図７】図７は、子宮頸癌の女性の尿サンプルにおける定量的メチル化特異的PCRによって測定されたZIC1（A）およびGHSR（B）のレベルの箱ひげ図およびROC曲線を示す。左パネル：メチル化DNAのy軸上のレベルが提示される。x軸上では、コントロール女性の尿（n=20）および子宮頸癌女性の尿（n=16）としてサンプルを分類する。ZIC1およびGHSRのメチル化レベルは、コントロールと比較して子宮頸癌を有する女性において有意に増加する。右パネルのROC曲線は、癌患者と対照との優れた差異を示しており、ZIC1についてはAUCが0.994、GHSRについてはAUCが1.0である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
「HPV誘発性侵襲癌」という用語は、周辺組織に侵入する高リスクHPVによって誘導される癌腫を意味する。口腔、口腔咽頭、肛門直腸、陰茎、外陰部、膣などの関連する器官におけるすべてのHPV誘導性癌腫組織型、すなわち扁平上皮癌、腺癌、腺扁平上皮癌および神経内分泌癌を含む。特に、頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）、子宮頸部扁平上皮癌および子宮頸部腺癌を含む。
【００１８】
「侵襲性子宮頸癌」という用語は、周囲の組織に侵入する子宮頸癌を意味する。これには、すべての癌組織型、すなわち扁平上皮細胞癌、腺癌、腺扁平上皮細胞癌および神経内分泌癌が含まれる。
【００１９】
「非HPV誘発婦人科または肛門癌」という用語は、HPV陰性である子宮内膜癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、肛門癌および陰茎癌を意味する。
【００２０】
「前悪性病変」および「前駆病変」という用語は、癌腫に進行する機会が強く増加した多段階の細胞進化における癌への段階を意味する。古典的な形態学では、病理学者は、個々の患者においてこれらの病変の進行または退行を予測することができない。この特許では、侵襲性癌またはその高悪性前駆病変を予測することができる方法を示す。
【００２１】
「高悪性度前悪性頸部病変」という用語は、子宮頸癌に進行する機会が強く増加した子宮頸癌への多段階細胞進化の段階を意味する。「特異的にハイブリダイズすることができる」という用語は、核酸配列が相補的な核酸配列と特異的に塩基対合し、それと結合して核酸二重鎖を形成することができることを意味する。
【００２２】
「相補体」または「相補的配列」は、ワトソン−クリック塩基対の規則に従ってヌクレオチドの別の配列と水素結合二本鎖を形成するヌクレオチドの配列である。例えば、5'-AAGGCT-3 'の相補的塩基配列は、3'-TTCCGA-5'である。
【００２３】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、ハイブリッドの安定性、例えば温度、塩濃度、pH、ホルムアミド濃度などに影響を及ぼすハイブリダイゼーション条件を意味する。これらの条件は、特異的結合を最大にし、その標的核酸配列へのプライマーまたはプローブの非特異的結合を最小にするために経験的に最適化される。使用される用語は、プローブまたはプライマーが他の配列よりも検出可能な程度に（例えば、バックグラウンドに対して少なくとも2倍）、その標的配列にハイブリダイズする条件への言及を含む。 ストリンジェントな条件は、配列に依存し、異なる状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、特定のイオン強度およびpHでの特定の配列の熱融点（Tm）よりも約5℃低く選択される。Tmは、（規定されたイオン強度およびpHの下で）相補的な標的配列の50％が完全に一致したプローブまたはプライマーにハイブリダイズする温度である。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度は約1.0M未満のNaイオン、典型的にはpH7.0〜8.3で約0.01〜1.0MのNaイオン（または他の塩の）濃度であり、そして、温度は、短いプローブまたはプライマー（例えば、10〜50ヌクレオチド）の場合は少なくとも約30℃であり、長いプローブまたはプライマー（例えば、50ヌクレオチド以上）の場合は少なくとも約60℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成され得る。例示的な低ストリンジェント条件または「ストリンジェンシーの低減条件」は、30％ホルムアミド、1M NaCl、1％SDSの緩衝溶液との37℃でのハイブリダイゼーションおよび40℃での2xSSC中での洗浄を含む。例示的な高ストリンジェンシー条件は、37℃での50％ホルムアミド、1M NaCl、1％SDS中のハイブリダイゼーションおよび60℃での0.1xSSC中での洗浄を含む。ハイブリダイゼーション手順は、例えば、AusubelらのCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994などで、当該分野で周知である。
【００２４】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドモノマー（通常は6〜100ヌクレオチド）の短い配列が、リン結合（例えば、ホスホジエステル、アルキルおよびアリールホスフェート、ホスホロチオエート）または非リン結合（例えば、ペプチド、スルファメートおよび他のもの）によって結合されたものを意味する。オリゴヌクレオチドは、修飾された塩基（例えば、5-メチルシトシン）を有する修飾されたヌクレオチド、および、修飾された糖基（例えば、2'-O-メチルリボシル、2'-O-メトキシエチルリボシル、2'-フルオロリボシル、2'-アミノリボシルなど）を含み得る。オリゴヌクレオチドは、環状、枝分かれしたまたは直鎖状の形状を有し、場合により安定な二次構造（例えば、ステム−ループおよびループ−ステム−ループ構造）を形成することができるドメインを含む、二本鎖および一本鎖DNAおよび二本鎖および一本鎖RNAの天然または合成分子であり得る。
【００２５】
「プライマー」という用語は、、DNAポリメラーゼをアニーリングさせてDNA合成開始点となるオリゴヌクレオチドであって、DNAポリメラーゼのような重合のための試薬およびヌクレオチドの存在下で、適切な温度およびpHで、誘導されるものを意味する。（増幅）プライマーは、増幅効率を最大にするために、好ましくは一本鎖である。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは重合剤の存在下で伸長生成物の合成を準備するのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、プライマーの温度および供給源を含む多くの因子に依存している。本明細書において使用される「一対の双方向性プライマー」とは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅のようなDNA増幅の分野において一般的に使用される、１つの順方向および１つの逆方向プライマーのことを意味する。
【００２６】
「プローブ」という用語は、標的核酸配列分析物またはそのcDNA誘導体中の相補的配列と水素結合二重鎖を認識し形成する一本鎖オリゴヌクレオチド配列を意味する。
【００２７】
DNAメチル化は、高等生物における正常な発生にとって重要な生化学的過程である。それは、シトシンピリミジン環の5位にメチル基を、またはアデニンプリン環の6位に窒素を付加することを含む。シトシンの5位のDNAメチル化は、遺伝子発現を減少させる特異的な効果を有し、試験したすべての脊椎動物において見出されている。成体の体細胞では、DNAメチル化は、典型的にはCpGジヌクレオチドの状況で起こる。
【００２８】
子宮頚部組織標本およびHPV不死化細胞株についてのゲノムワイドDNAメチル化スクリーニングを用いることで、Zic family member 1（ZIC1；Genbankアクセッション番号NM_003412とも称される）および成長ホルモン分泌促進レセプター（GHSR; Genbankアクセッション番号NM_198407とも称される）をコードする遺伝子は、CIN 3病変および子宮頸癌における場合と同様に、全長HPV16およびHPV18によって不死化された初代ケラチノサイトにおけるDNAメチル化によって標的化され、ZIC1およびGHSRプロモーターのメチル化がhr-HPV誘導性発癌の重要な決定因子であることが、今般発見された。したがって、ZIC1およびGHSRゲノムおよび制御配列は、侵襲性子宮頸癌およびその高悪性前駆病変を診断するための貴重なマーカーを提供する。さらに、本発明は、非子宮頸部のhrHPV関連浸潤癌およびそれらの高悪性前駆病変を診断するのに適している。さらに、GHSRメチル化は、子宮内膜および他の非HPV誘導婦人科および肛門性器癌を診断するためにさらに適している。
【００２９】
子宮頸癌は、ほぼ専らヒトパピローマウイルス（HPV）感染と関連している。ヒトパピローマウイルスは、DNA配列の変異によって同定されるように、150種類を超える一群のウイルスを構成している。様々なHPVは、様々な皮膚および粘膜疾患を引き起こす。HPVは、感染細胞の悪性変化を誘導する能力に基づいて、低リスク型と高リスク型とに大別される。1、2、4、6、11、13および32などの低リスクのHPV型は、主に良性病変または一般的ないぼに関連しており、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66および68のような高リスク型は、主に前悪性および悪性上皮病変に関連している。高リスクHPV型は、子宮頸部の浸潤性癌腫、ならびに肛門性器管および／または頭頚部領域の他の場所の浸潤性癌腫を引き起こすことが判明している。したがって、本発明は、侵襲性子宮頸癌およびその前駆体ステージを検出するのに適しているばかりでなく、HPV、特に高リスク型によって誘導される他の侵襲性癌および対応する前駆体ステージも検出するのに適している。したがって、本発明は、任意のHPV誘発性の高悪性の前悪性病変または浸潤性の癌のリスク評価のための方法を提供する。
【００３０】
本発明の文脈における非常に適切なHPV誘発性前駆病変および浸潤性癌には、子宮頸部前癌病変および侵襲性子宮頸癌のみならず、口腔、中咽頭、肛門、直腸、陰茎、外陰、膣などの他の組織における高リスクHPVによって誘導される前駆病変および侵襲性癌をも含まれる。
【００３１】
上記のように、GHSRマーカーはまた、非HPV誘導前駆病変および浸潤性癌を検出することができる。本発明の文脈において、そのような癌は、好ましくは、HPV陰性である子宮内膜癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、肛門癌および陰茎癌である。
【００３２】
試験細胞は、（前）新生細胞、増殖性子宮頸部細胞、または任意の他の細胞であり得、それらにおいて、侵襲性電位、HPV誘発性浸潤性癌、非HPV誘発性婦人科および肛門性器癌を有するHPV誘導前駆病変の存在が検出されるべきである。
【００３３】
ZIC1遺伝子は、転写因子として機能し、C2H2型ジンクフィンガータンパク質のZICファミリーのメンバーである48kDaタンパク質をコードする。このファミリーのメンバーは、発生において重要なものである。ZIC1は神経発生に関与している。それは、CNSの器官形成の初期段階、ならびに背側脊髄の発達および小脳の成熟中に重要な役割を果たす（Grinberg and Millen, Clin Genet. 2005, 67(4):290-6に総説される）。 ZIC1過剰メチル化は、結腸直腸癌、胃癌、卵巣癌および肝細胞癌における記載がある（Gan et al., PLoS One. 2011, 6(2):e16916; Wangら, Biochem Biophys Res Commun. 2009,379(4):959-63; Huangら, Epigenetics. 2013, 8(6):624-34; Wangら, Tumour Biol. 2014,35(8):7429-33）。これは、子宮頸部スワブのin situおよび癌の癌腫における過剰メチル化遺伝子のスクリーニングで2200以上の遺伝子の中から見出されたが、1つだけであった（Wangら, Cancer Med. 2015, 4(1):43-55）。
【００３４】
GHSR遺伝子は、Gタンパク質共役型受容体ファミリーのメンバーである41kDaタンパク質をコードする（Howardら, Science 1996,273(5277):974-7）。GHSR過剰メチル化は、肺癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、グリア芽細胞腫およびB細胞慢性リンパ性白血病の癌において記載がある（Moskalevら, Oncotarget 2015,6(6):4418-27）。全癌マーカーとして特徴付けられているものの、HPV誘発癌との関連は未だ開示されていない。他のがんタイプにも見られたこのマーカーは、驚くべきことに、HPV誘発性癌のマーカーであると思われる。hrHPVによってしばしば引き起こされる頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）の研究において、HPV誘導性HNSCCおよびHPVに関連しないHNSCCのメチロームに差異があることが見出されている（Sartorら, 2011, Epigenetics 6(6):777-787）。これは他の研究で支持されており、例えば、 Colacinoらは、E54742は、SPDEF、RASSF1、STAT5A、MGMT、ESR2、JAK3およびHSD17B12の過剰メチル化がHPV陰性HNSCCと有意に関連していることを示した（2013 PLOS 1、8（1））。同様に、Kostarelliらは、ALDH1A2、FKBP4、GDNF、OSR2、PROX1およびWIF1のメチル化が、正常粘膜に比べてHPV陰性HNSCCにおいて有意に増加するが、これらの遺伝子はHPV誘導性HNSCCにおいて過剰メチル化を示さなかったことを示した（J.Clin Investigation、2013,123（6）：2488-2501）。口腔咽頭癌で研究されたCDKN2Aメチル化は、HPV陰性癌でのみ検出され、HPV陽性癌では検出されなかった（Taioliら., 2009, BMC Cancer, 9: e354）。また、例えば 硬化性苔癬 （LS）に関連する外陰癌において、メチル化パターンは、HPV誘導性癌とHPVに関連しない癌とでは異なっていた（Guerreroら、2010、Int J Cancer 28：2853-2864）。例えば、RASSF2Aは、HPV陰性であるLSに関連する外陰癌において排他的にメチル化されることが判明した。HPV誘発性外陰癌ではRASSF2Aメチル化は検出されなかった。
【００３５】
本発明者らは、子宮頸癌における扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、腺癌および神経内分泌癌の組織型とそれらの高悪性前駆病変の両方において、ZIC1およびGHSRプロモーターのメチル化が頻繁に起こることを立証した。最も興味深いことに、本発明者らは、ZIC1およびGHSRプロモーターの過剰メチル化が子宮頸管の擦過物標本において検出され得、この特徴により高悪性度CIN病変または浸潤性癌腫の存在を予測することができることを示した。さらに、ZIC1およびGHSRプロモーターのメチル化は、自己サンプリングによって収集された子宮頸部−膣標本において検出され得、基礎となる高悪性度CIN病変または侵襲性子宮頸癌の存在と関連することが見出された。さらにより有利なことに、ZIC1およびGHSRプロモーターのメチル化が、尿試料中で検出され得ることも示された。そのような検出は、より迅速に行うことができ、試料採取方法も煩雑にならない。
【００３６】
ZIC1およびGHSRプロモーターの過剰メチル化も、HPV陽性およびHPV陰性外陰癌およびそれらの高リスク前駆病変において検出することができる。
【００３７】
さらに、GHSRメチル化は、子宮内膜や他の非HPV誘導婦人科癌および肛門癌の診断に適している。
【００３８】
したがって、本発明は、HPV誘発高悪性前癌病変およびHPV誘発性浸潤癌、非HPV誘発婦人科および子宮内膜癌などの肛門癌を検出する方法であって、ZIC1および／またはGHSRにおける過剰メチル化の検出を含む方法を提供し、そのような過剰メチル化は、侵襲的潜在性およびHPV誘発性浸潤性癌および非HPV誘導性婦人科および子宮内膜癌などの肛門癌を有するHPV誘導前駆病変の存在を示す。
【００３９】
被験体の試験細胞は、頸部細胞などの粘膜細胞の試料、ならびに口腔、口腔咽頭、陰茎、外陰、肛門、直腸、子宮内膜、卵巣および他の組織のような他の組織由来の細胞を含むことができ、 HPVまたは非HPV誘発婦人科、肛門癌または口腔咽頭癌に関連する病変または癌が検出されるべきである。このようなサンプルは全て、本発明の方法におけるサンプルとして使用することができる。好ましくは、患者の細胞のサンプルは、子宮頸部細胞または試験細胞としての肛門性器または口腔咽頭管の他の上皮細胞を含む。子宮頸部細胞は、例えば、組織学的または細胞学的標本として提示することができる。細胞学的標本は、従来の子宮頸部塗抹標本ならびに頸部標本および頸部−膣または膣標本の薄層調製物を、自己採取によって収集する。あるいは、細胞は尿試料中に提示され得る。子宮頸部および隣接組織における癌を検出する他の既知の方法よりも特に有利な本発明における試験細胞は、自己サンプルから得られた試験細胞である。
【００４０】
本発明の方法は、高リスクのHPVによって誘導されるか、（女性の）肛門生殖管から誘導される、高悪性前癌病変およびZIC1および／またはGHSRに関連する侵襲性癌の検出に特に適している。侵襲性潜在性HPV誘発性侵襲性癌および非HPV誘発性婦人科および肛門性器癌を有するHPV誘発高悪性前癌病変を検出する方法は、ZIC1および／またはGHSRプロモーターを測定することを含むことができる。
【００４１】
図１は、ZIC1遺伝子のCpGリッチプロモーター領域ならびにコード配列を示す。
【００４２】
図２は、GHSR遺伝子のCpGリッチプロモーター領域ならびにコード配列を示す。
【００４３】
メチル化の検出は、DNAなどの核酸に対して行われる。使用される試薬は、典型的には、試験細胞DNA上のメチル基の存在を検出するための核酸（DNA）プローブまたは（PCR）プライマーまたは制限酵素、好ましくはメチル化感受性制限酵素である。
【００４４】
試験細胞成分は、in situにて直接検出することができ、または試薬と接触させる前に当業者に公知の一般的な方法によって他の細胞成分から単離することができる。（“Current Protocols in Molecular Biology”, Ausubelら, 1995. 4th edition, John Wiley and Sons; “A Laboratory Guide to RNA: Isolation, analysis, and synthesis”, Krieg (編), 1996, Wiley-Liss; “Molecular Cloning: A laboratory manual”, J. Sambrook, E.F. Fritsch. 1989. 3 Vols, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照)。
【００４５】
提示された例ではZIC1プロモーターの頻繁なメチル化を示すので、ZIC1遺伝子が高メチル化されているかどうかを直接決定することが望ましい。同様に、GHSR遺伝子が高メチル化されているかどうかを直接決定することも望ましい。特に、遺伝子の5'調節領域に主に位置する「CpGアイランド」と呼ばれるシトシンに富む領域は、通常はメチル化されていない。「過剰メチル化」という用語は、ZIC1またはGHSR遺伝子配列（例えば、ZIC1またはGHSRプロモーター、第１のエクソンおよび第１のイントロン配列、それぞれ図１および２参照）において通常はメチル化されていない位置におけるシトシンのメチル化を含むことを意味する。DNAメチル化は、現在科学研究で使用されている以下のアッセイによって検出することができる：
・重亜硫酸ナトリウムとCpGジヌクレオチドのメチル化されていないシトシンをウラシルまたはUpGに変換し、続いて伝統的なPCRを行うDNAとの亜硫酸水素ナトリウムの化学反応に基づくメチル化特異的PCR（MSP）。しかしながら、メチル化シトシンはこのプロセスでは変換されず、プライマーはメチル化またはメチル化されていないメチル化状態を決定することを可能にする目的のCpG部位と重なるように設計される。
・DNAメチル化のハイスループットゲノムワイド分析であるBS-Seqとしても知られている全ゲノムバイサルファイトシークエンシング。これは前述のゲノムDNAの重亜硫酸ナトリウム変換に基づいており、次世代シークエンシングプラットフォームで配列決定される。次いで、得られた配列を参照ゲノムに再整列させ、非メチル化シトシンからウラシルへの変換から生じるミスマッチに基づいてCpGジヌクレオチドのメチル化状態を決定する。
・DNAメチル化のハイスループットゲノムワイド分析であるBS-Seqとしても知られている全ゲノムバイサルファイトシークエンシング。これは前述のゲノムDNAの重亜硫酸ナトリウム変換に基づいており、次世代シークエンシングプラットフォームで配列決定されます。次いで、得られた配列を参照ゲノムに再整列させ、非メチル化シトシンからウラシルへの変換から生じるミスマッチに基づいてCpGジヌクレオチドのメチル化状態を決定する。
・メチル化および非メチル化CpG DNA部位を認識および切断する制限酵素の異なる能力に基づいているHELPアッセイ。
・商業的に調製された抗体のMeCP2のようなDNAメチル化関連タンパク質に結合する能力に基づくChIP-on-chipアッセイ。
・制限酵素ランドマークゲノムスキャニング法、メチル化および非メチル化CpG部位の制限酵素の差別的認識に基づく、現在では稀にしか使用されない複雑なアッセイ。 
このアッセイは、概念がHELPアッセイと同様である。
・メチル化DNA免疫沈降（MeDIP）、染色体免疫沈降に類似して、DNAマイクロアレイ（MeDIPチップ）またはDNA配列決定（MeDIP-seq）のようなDNA検出方法への入力のためにメチル化DNAフラグメントを単離するために免疫沈降が用いられる。
・亜硫酸水素塩処理したDNAのパイロシークエンシング。これは、選択された遺伝子をPCRに供するための、通常のフォワードプライマーとbiatenylated リバースプライマーによって作製されたアンプリコンの配列決定法である。次いで、パイロシークエンサーは、DNAを変性させ、ユーザーにより与えられた配列に従って、一度に１ヌクレオチドずつヌクレオチドを添加することによって、サンプルを分析する。ミスマッチが存在する場合、それが記録され、ミスマッチが存在するDNAのパーセンテージが記録される。 これにより、CpGアイランドあたりのメチル化率が百分率で示される。
・DNAアデニンメチルトランスフェラーゼ活性のMolecular break light assay。フルオロフォアおよびクエンチャーで標識されたオリゴヌクレオチド中の完全にメチル化された（アデニンメチル化）GATC部位についての制限酵素DpnIの特異性に依存するアッセイである。アデニンメチルトランスフェラーゼはオリゴヌクレオチドをメチル化し、これをDpnIの基質とする。DpnIによるオリゴヌクレオチドの切断は蛍光増加を生じる。
・メチル感受性サザンブロッティングは、HELPアッセイと同様であるが、サザンブロッティング技術を用いて制限消化物を用いてメチル化の遺伝子特異的差異を調べる。この技術は、プローブの結合部位付近の局所メチル化を評価するために使用される。
・量子ドットに基づくメチル化アッセイ。MSPの高い特異性、および量子ドットFRET（QD-FRET）技術（Zhang, C.ら, 2005, Nat. Mater. 4:826-831) の高感度および単純性が組み合わされた、Bailey, V.らによって記述されたアッセイ(Genome Res. 19:1455-1461, 2009) 。
・ナノチップ技術を用いたDNAメチル化検出。この技術は、重亜硫酸塩変換およびPCR増幅を必要とせずに、最小限の量の臨床材料において高感度および特異性でDNAメチル化を検出することができる。固体状態のナノ細孔を用いる方法は、Shim, J. ら(Sci. Rep. 3:1389, 2013)によって記述された。ラボオンチップ技術のための装置は、国際公開第2009104967（A1）号に記載されている。
【００４６】
過剰メチル化は、好ましくは、ZIC1またはGHSRポリヌクレオチド（遺伝子）の制限酵素処理およびサザンブロット分析によって検出することができる。CGをその認識部位の一部として含み、Cがメチル化されたときに阻害される任意の制限酵素を利用することができる。このような制限酵素の例は、BssHII、MspI、NotIまたはHpaIIのようなメチル化感受性制限酵素である。他のメチル化感受性制限酵素は、当業者に公知であろう。
【００４７】
メチル化配列を試験する別の好ましい手段はメチル化特異的PCRであり、これはまたDNAの重亜硫酸塩修飾に基づいており、続いてCpGリッチ配列を標的とする特異的PCR反応が行われる。
【００４８】
メチル化配列を検出し、メチル化DNAと非メチル化DNAとを区別するための第３の好ましい手段は、ナノテクノロジーに基づく。
【００４９】
本発明の目的において、ZIC1またはGHSRに特異的な核酸プローブは、生物学的液体または組織における（核酸プローブを用いた）ZIC1またはGHSRポリヌクレオチドの存在を検出するために使用され得る。ZIC1またはGHSR配列における任意のコード配列領域および制御配列領域に基づくオリゴヌクレオチドプライマーは、例えばPCRによってDNAを増幅するために有用である。
【００５０】
PCRプライマー、核酸プローブまたは制限酵素を使用する場合、（それぞれ図１および２に明記されるように）ZIC1またはGHSR配列の5'調節領域、第1のイントロン配列およびコード配列を分析する。
【００５１】
検出可能な量のZIC1またはGHSRポリヌクレオチドを含む任意の標本を用いることができる。本発明の方法による試験のための好ましい試料には、（頸部または膣）擦過物、頸膣洗浄または綿棒、尿、血液および／または（子宮頸部）生検などのような検体が含まれる。被験体は任意の哺乳動物であり得るが、好ましくは被験体はヒトである。
【００５２】
障害の検出のための診断方法には、試験のための試料が提供され、その試料は、頚部または他の組織からの細胞調製物を含む方法が含まれる。好ましくは、このようなサンプルは、スメアまたは他の細胞学的サンプルとして提供される。追加の適切なサンプルには、尿および血液が含まれる。
【００５３】
HPV誘発高悪性前癌病変およびHPV誘導性浸潤癌および非HPV誘発婦人科癌および肛門癌のリスクまたはその存在を確実に予測するマーカーにおけるプロモーターメチル化の変化を検出するために使用することができるその自己サンプルは、医師が得たサンプルで達成することができるものと同じ検出がされるか明らかではない。
【００５４】
自己検体および医師が採取した子宮頸部擦過物は、異なる細胞組成を有し、正常細胞よりも頸部病変から剥離した指標細胞の異なる画分によって反映され、自己サンプルの場合にはほとんどが膣細胞である。したがって、自己サンプルでは、膣および子宮頸部指標細胞の、よりランダムな分布が見られる。自己サンプル中の高メチル化陽性子宮頸部指標細胞の割合が最も低いことが、これらの試料についての細胞形態学的検査および分子検査の性能に影響を及ぼすものであることが知られている。このことは、細胞学（異常細胞を検出するための細胞形態学的分析）が自己サンプリングされた物質に対して確実に実施できないことを示す文献データ（Nobbenhuisら, J. Clin. Pahtol. 55:435, 2002; Garcia et al, Obstet Gynecol 102: 266-272, 2003）によって裏付けられている。
【００５５】
さらに、過剰メチル化指標細胞の存在についての自己サンプルと医師により採取された擦過物との直接比較を、宿主細胞遺伝子のDNAメチル化レベルを評価することにより記載した研究では、自己サンプル中のCIN 3の検出は、子宮頸部擦過物と比較して、より低い感度を示している：
−  Chang, BMC Cancer 15:418, 2015では、図２において、自己サンプルのメチル化分析によるもCIN 3の検出が擦過物よりも少ないことが示されている；
−  Luttmerら, Br J Cancer 2016 , Jul 14. doi: 10.1038/bjc.2016.200では、FAM19A4メチル化分析のCIN3感受性は、自己サンプルでは78.4％、擦過物では88.2％であったことが示されている；
−  Boersら, Br J Cancer 111: 1095-1101, 2015では、JAM3のCIN3+感度は、自己サンプルで71％、擦過物で82％であることが示されている）。
さらに、全体のメチル化レベル／比は、対応する医師が採取した擦過物と比較して、しばしば自己検体においてより低い（Boersらによる図３のhTERTについて、最も明確に示されている）。
【００５６】
結論として、1）CIN3を検出するための自己試料に関する細胞学的分析の信頼性が低いこと、2）医師が採取したスクラップと比較して自己サンプルを用いたCINの検出のメチル化分析の感度が低いこと、および3）外科医が採取したスクラップと比較して、自己サンプル中に見られるメチル化レベルが低いことは、医師が採取したスクラップと比較して、異なる細胞組成および自己サンプル中の指標細胞の割合が低いことを示す。
【００５７】
したがって、ZIC1および／またはGSHRプロモーターの過剰メチル化が、自己試料で評価した場合において、HPV誘発高悪性前癌病変、HPV誘発性浸潤性癌、および、非HPV誘発性婦人科および肛門性器腫瘍の検出のための信頼できる手段を提供するものであることは、驚くべきことである。それらの高い特異性に加えて、それらはまた、すべての（100％）子宮頸癌の検出を可能にする。
【００５８】
さらに、サンプルは、尿サンプルに由来してもよい。実施例８に示されるように、尿試料中の過剰メチル化を検出することが可能であることが示されている。このことはもちろん、子宮頸部試料を得ることが困難な場合に非常に有利である。
【００５９】
哺乳動物、好ましくはヒトから得られる細胞または組織試料は、適切に前処理され、ZIC1またはGHSRを検出しZIC1またはGHSR遺伝子のメチル化の変化を検出する試薬を用いて、前記サンプルに含まれる試験細胞の細胞DNAを比較することができる。サンプルは、個々の細胞の観察を可能にするために、適切な支持体上に載せてもよい。周知の支持体材料の例には、ポリ−L−リシンまたはシランの層のような試料の細胞接着および固定化を改善するための層が任意に設けられたガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリウレタンが含まれる。子宮頸部塗抹標本または生検は、例えば、当業者に知られているパパニコロウ（Papa）試験またはその任意の適切な改変について調製することができ、試薬の標的成分への適切なアクセスを可能にする手順によって固定することができる。本発明の特定の実施形態において、細胞学的標本は、従来のスメア試料または子宮頸部細胞または液体ベースの細胞学試料の薄層調製物または当業者に公知の他の種類の調製物として提供される。保存が必要な場合、ルーチンの手順では、固定されたホルマリンを用いてパラフィン包埋し、十分に保存された組織構造を提供する。
【００６０】
本発明の方法の一実施形態では、試験細胞中のZIC1および／またはGHSRプロモーターのメチル化の増加が、比較可能な正常細胞と比較して検出される。
【００６１】
本発明はまた、請求項において定義されるような、被験体の試験細胞におけるZIC1および／またはGHSRに関連する浸潤能を有するHPV誘導性前駆病変、HPV誘発性浸潤性癌および非HPV誘導性婦人科および肛門性器癌の検出方法における使用のためのキットのパーツを提供する。このようなキットは、試験細胞を収集するために収集培地で満たされた容器と一緒に（子宮頸部）擦過を行うためのブラシまたはスパチュラを適切に含み得る。あるいは、頸膣洗浄によって子宮頸部細胞を採取するために、洗浄シリンジ、使い捨ての女性尿カテーテル、および灌流液を入れた容器からなる採取装置が含まれる。さらに、尿を採取するための容器が好適であり、好ましくは初尿検体を採取するために使用される。本発明によるキットは、ZIC1および／またはGHSRプロモーターのメチル化を検出するためのプライマーおよびプローブを含み得る。
【００６２】
本発明によるキットは、ZIC1および／またはGHSRプロモーターメチル化、例えばメチル化感受性制限酵素、または図１および／または図２のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるプローブまたはプライマーなどの検出手段を含む。
【００６３】
本発明のキットのさらなる別の実施形態では、ZIC1および／またはGHSRプロモーターメチル化の検出のための手段は、好ましくはハイリスク型のHPV感染の検出のためのHPV感染の検出のための手段と組み合わせることができる。そのような手段は、HPV特異的プライマーまたはプローブ、HPV感染のためのタンパク質マーカー、またはHPV感染の代用マーカーを含むことができ、当該分野で公知である。
【００６４】
本発明を以下の非限定的な実施例によって例示する。
【実施例】
【００６５】
実施例１．HPV誘導形質転換におけるメチル化標的としてのZIC1およびGHSRの発見
【００６６】
インビトロおよびインビボでの頸部発癌のHPV誘発形質転換に関連するゲノム全体のDNAメチル化変化の包括的な分析が、子宮頸部組織標本と同様のHPV16およびHPV18不死化ケラチノサイトの連続継代のMBD配列決定によって行われた。細胞培養物には、初代ヒト包皮ケラチノサイトの2個のDNA単離物、全長HPV16およびHPV18 DNAをトランスフェクトしたケラチノサイト（細胞株FK16A、FK16B、FK18A、FK18Bの異なる継代数のもの；Steenbergenら、Oncogene 1996,13(6):1249-57）の10個のDNA単離物、HPV16E6E7（Steenbergenら、J. Pathology 2013;231(1):53-62）で形質導入されたケラチノサイトの2個のDNA単離物および子宮頸癌細胞株SiHaが含まれる。子宮頸部組織標本は、10個の細胞腫、12個の高悪性度子宮頸部上皮内腫瘍（CIN 2/3）および3個の低悪性度子宮頸部上皮内腫瘍（CIN 1）から成っていた。
【００６７】
MBDシーケンシング法は、メチル結合ドメインを用いたCpGメチル化断片の濃縮に続く、大規模な並列配列決定に基づいている（Serreら、Nucleic Acids Res. 2010;38(2):391-9）。これらの断片を参照ゲノムにマッピングすることにより、推定メチル化遺伝子座を決定することができる。
【００６８】
このアプローチにより、インビボでのHPV誘発形質転換およびインビボでの子宮頸部発癌における新規メチル化標的として、ZIC1およびGHSRを同定した。
【００６９】
初代ケラチノサイトにおける定量的メチル化特異的PCR（qMSP）、HPV16およびHPV18-不死化ケラチノサイトおよび子宮頸癌細胞株の初期および後期継代により、ZIC1およびGHSRプロモーター領域のメチル化が確認された。qMSPのプライマーとプローブを表１に示す。ハウスキーピング遺伝子のβ-アクチン（ACTB）は、全DNA入力測定の基準として選択された。定量は、比較Ct法（Schmittgenら、Nat Protoc 2008, 3:1101-1108）を用いて行った。ZIC1およびGHSRのメチル化レベルは形質転換の段階で増加し、初代ケラチノサイトおよび初期継代HPV16およびHPV18不死化ケラチノサイトと比較して、後期継代HPV16およびHPV18不死化ケラチノサイトおよび子宮頸癌細胞において有意に増加する（図３）。
【００７０】
実施例２．ZIC1およびGHSRプロモーターメチル化は、高悪性度CIN病変、子宮頸部扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、腺癌および神経内分泌癌における一般的な事象である
【００７１】
次に、qMSPにより子宮頸部組織標本におけるZIC1およびGHSRプロモーターのメチル化を分析した。試験した組織サンプルは、30の正常な子宮頸管対照試料、13のCIN1病変、29のCIN3病変および24の子宮頸部扁平上皮癌（SCC）を含んでいた。ハウスキーピング遺伝子のβ-アクチン（ACTB）は、全DNA入力測定の基準として選択された。定量は、比較Ct法（Schmittgenら、Nat Protoc 2008, 3:1101-1108）を用いて行った。ZIC1プロモーターのメチル化が、CIN 3病変およびSCCにおいて、正常およびCIN1病変と比較して有意に増加したことを見出した。さらに、メチル化レベルは、CIN 3病変と比較してSCCにおいて有意に増加した（図４Ａ）。90％の特異性をもたらす閾値設定では、ほぼすべて（96％）のSCCおよび79％のCIN3病変が、ZIC1メチル化について陽性であった。子宮頸部扁平上皮癌の次に、子宮頸部腺癌におけるZIC1プロモーターのメチル化についても分析を行った。子宮頸癌の20％を占める腺癌は、全身の子宮頸癌スクリーニングプログラムを有する国では、子宮頸部腺癌の発生率が同じであるか、またはさらに増加している場合において、特に重要である。これは、子宮頸部腺癌およびその腺前駆病変、すなわち、腺癌（ACIS）が、細胞診に基づくスクリーニングでは、しばしば見逃されることを示す。子宮頸部扁平上皮癌と子宮頸部腺癌との間の比較的な遺伝的および後成的研究に基づいて、両方の腫瘍組織型が異なる発癌経路を介して発生することが見出されている（Dongら, 2001, Kangら, 2005, Wiltingら, 2006, Henkenら, 2007）。したがって、子宮頸部扁平上皮癌の検出を可能にするほとんどのバイオマーカーは、必ずしも子宮頸部腺癌を検出するとは限らない。
【００７２】
興味深いことに、ZIC1プロモーターメチル化は、ほとんどの既知のマーカーとは対照的に、試験した1つ（86％）のAdCaを除いて、ZIC1メチル化レベルが増加していた（図４Ａ）。頸部腺扁平上皮癌および神経内分泌癌についても同様の結果が得られている。
【００７３】
したがって、ZIC1プロモーターのメチル化は、すべての子宮頸癌腫組織型の普遍的なメチル化マーカーであると思われる。
【００７４】
GHSRプロモーターメチル化の分析は、正常およびCIN 1病変と比較して、CIN 3病変、SCCおよびAdCaにおいて有意に増加したメチル化レベルを示した。さらに、メチル化レベルは、CIN3病変と比較してSCCにおいて有意に増加した（図４Ｂ）。90％の特異性をもたらす閾値設定では、SCC、AdCaの全て（100％）およびCIN 3病変の69％がGHSRメチル化について陽性であった。したがって、GHSRプロモーターのメチル化はまた、すべての子宮頸癌腫組織型の普遍的メチル化マーカーである。
【００７５】
実施例３．hrHPV陽性頸部擦過物におけるZIC1およびGHSRプロモーターメチル化の検出
【００７６】
人口ベースのスクリーニングに参加している女性から、CIN 3と診断されたhrHPV陽性女性（n=56）と、最大でCIN 1と診断されたhrHPV陰性女性および陽性女性（それぞれn=40およびn=87）の子宮頸部擦過物を研究した。さらに、子宮頸部のSCC（n=23）およびAdCa（n=3）と診断された女性の子宮頸部擦過物を試験した。これらの女性の子宮頸部擦過物は、核酸が十分に保存されている保存培地中に集められた。
【００７７】
ZIC1のメチル化は、HPV陰性対照およびHPV陽性対照と比較して、CIN 3、SCCおよびAdCaを有する女性の擦過物において有意に増加した。メチル化レベルもまた、CIN 3を有する女性と比較してSCCを有する女性の擦過物において有意に増加した（図５Ａ）。90％の特異性をもたらす閾値設定では、女性SCCおよびAdCaのすべての（100％）擦過物は陽性であり、CIN 3病変の56％がZIC1メチル化陽性と判定された。70％の特異性で、CIN 3病変の86％が検出される。
【００７８】
GHSRメチル化は、HPV陰性およびHPV陽性対照と比較して、CIN 3、SCCおよびAdCaを有する女性の擦過物において有意に増加した。メチル化レベルもまた、CIN 3を有する女性と比較してSCCを有する女性の擦過物において有意に増加した（図５Ｂ）。90％の特異性をもたらす閾値設定では、女性SCCおよびAdCaのすべての（100％）擦過物は陽性であり、CIN 3病変の58％がGHSRメチル化について陽性と判定された。70％の特異性で、CIN 3病変の80％が検出される。現在のデータは、ZIC1およびGHSRメチル化分析の両方が、高い感度および特異性で子宮頸部擦過物における基礎となる子宮頸管疾患（CIN 3+）の検出を可能にすることを示している。特に、高い特異性の設定では、ZIC1およびGHSRは、他の公表されたメチル化マーカーより優れており、すべての癌を検出する。
【００７９】
それにより、これらの遺伝子は、一次HPV検査によるスクリーニングにおいて有望なトリアージマーカーを提供する。
【００８０】
実施例４．ZIC1およびGHSRプロモーターの一次スクリーニングマーカーとしてのメチル化
【００８１】
これまでに試験されたメチル化マーカーは、CIN 2/3および癌に対して許容可能な感度では特異性が低すぎるため、一次スクリーニングでの使用には十分適していない。例えば、CADM1、MAL、miR-124および/またはFAM19A4の様々な組合せからなるマーカーまたはマーカーパネルは、CIN 2/3の許容感度（70％）と子宮頸癌の100％までの検出において、70-75％の特異性およびを有している。
【００８２】
一次スクリーニングのためのマーカーとしてのZIC1およびGHSRメチル化の使用を評価したところ、驚くことに、これらのマーカーの両方が、非常に高い特異性で癌を検出するために極めて高い感受性を有することが見出された。HPV陰性対照に基づく100％特異性（およびHPV陽性対照に基づく90％特異性）で、ZIC1メチル化は、SCCの100％、AdCaの100％およびCIN 3病変の55％を検出する。
【００８３】
HPV陰性対照に基づく95％特異性（およびHPV陽性対照に基づく90％特異性）で、GHSRメチル化は、SCCの100％、AdCaの100％およびCIN 3病変の57％を検出する。したがって、ZIC1および／またはGHSRによる一次スクリーニングにより、実質的にすべての子宮頸癌を非常に高い特異性（95−100％）で検出することが可能になる。
【００８４】
実施例５．自己採取標本におけるZIC1およびGHSRプロモーターのメチル化
【００８５】
続いて、VibaBrush（Rovers Medical Devices、オス、オランダ）またはDelphi-スクリーナ（Delphi BioScience BV、スケルペンゼール、オランダ）のいずれかを用いて採取した自己採取子宮膣標本を分析した。自己採取試料は、HPV検査に関して医師が採取した試料と同等である（Brinkら、J Clin Microbiol 2006;44:2518-23）。自己サンプル中のhrHPVの試験は、応答性のある女性の一致した集団における通常のスクリーニングによって見出されるような、この集団における少なくともCIN 2の病変と同等以上のものをもたらす（Baisら, Int J Cancer: 2007, 120:1505-1510; Gokら, BMJ 2010;340:c1040)。しかし、HPV自己採取の場合にも、hrHPV陽性女性をCIN 2/3以上および腺癌以上のであるまたはない女性にインサイチュで階層化するためのトリアージツールが必要である。従来の細胞診は、自己採集された子宮膣標本に対して確実に実施することができないことに対して（Brinkら、J Clin Microbiol 2006;44:2518-23）、DNAメチル化分析は、自己採集された子宮膣洗浄液に適用することができる（Eijsinkら, Gynecol Oncol 2011;120:280-3.）。重要なことに、本知見は、メチル化マーカーのGHSRおよびZIC1が、自己採集された子宮膣洗浄検体に適用される場合だけでなく、自己採取された膣ブラシ検体にも同様に適用されることを示す。後者は、従来の既知のマーカーがしばしば低い臨床感受性で実施された検体のタイプである。結果的に、ZIC1およびGHSRマーカーは、医師が摘出した子宮頸部塗抹標本、洗浄液ベースの自己標本およびブラシベースの自己標本で等価な全検出マーカーと考えることができる。
【００８６】
フォローアップにおいて臨床的に意味のある疾患の証拠のないhrHPV陽性女性の一連の20個の自己採集膣ブラシサンプルが、異常なフォローアップスミアおよびCIN 3以上の病変を有するhrHPV陽性女性の25個の自己採集膣ブラシサンプルと同様に、ZIC1およびGHSRプロモーターのメチル化のためのqMSPによりテストされた。事実上、後で癌と診断された女性の自己採集膣ブラシサンプルのすべてが、特異性70％でZIC1およびGHSRメチル化が陽性とされた。さらに、後にCIN 3と診断された女性の自己採集膣ブラシサンプルの半分以上が、ZIC1およびGHSRプロモーターメチル化について陽性であった。
【００８７】
最も興味深いことに、hrHPV陽性女性の24人の自己採集された子宮膣洗浄検体の分析は、ZIC1またはGHSRメチル化分析を用いて100％までの特異性で100％の癌腫の検出を明らかにした。ZIC1のメチル化は、90％の特異性でCIN 3病変の70％を検出した。自己採集された子宮膣洗浄検体に適用された既知のメチル化マーカーと比較し(Chang, Boersら、およびLuttmerらの先に引用した文献, Eijsinkら, Gynecol Oncol 2011;120:280-3; Verhoefら., Lancet Oncol 2014; 15: 315-22)、自己採集した子宮膣洗浄検体におけるZIC1のマーカーポテンシャルは著しく高い。
【００８８】
これらのデータは、自己採取膣ブラシ試料および自己採集子宮膣洗浄試料の両方から得られた自己採取物質に関するZIC1およびGHSRプロモーターメチル化分析は、十分に実行可能であり、基礎となる高悪性度子宮頸疾患の検出を改善することを示している。最も興味深いことに、自己採集された子宮膣洗浄検体に関するZIC1メチル化分析は、一次スクリーニングにも適している（100％特異性での子宮頸癌に対する100％感受性）。
【００８９】
実施例６．子宮内膜癌を有する女性の子宮頸部擦過物におけるGHSRプロモーターメチル化
【００９０】
子宮内膜癌を有する計24名の女性の子宮頸部擦過物で、GHSRのメチル化の検査がされた。最大CIN 1が診断されたhrHPV陰性および陽性の女性（それぞれn=40およびn=87）の子宮頸部擦過物と比較して、子宮内膜癌女性のGHSRメチル化レベルは有意に上昇していた（図６）。対照の約8％が陽性と判定された特定の閾値設定では、子宮内膜癌の80％が検出された。
【００９１】
実施例７．HPV陽性およびHPV陰性外陰癌およびそれらの高悪性前駆病変におけるZIC1およびGHSRプロモーターのメチル化
【００９２】
子宮頸部前癌病変のように、ほとんどの外陰部前癌病変（外陰上皮内腫瘍；VIN）はHPV感染に起因する。その病変の一部のみが、外陰部扁平上皮癌（VSCC）への進行のリスクが高くなっている。ZIC1およびGHSRのメチル化が、癌への進行リスクが病変の中から、癌への進行の高いリスクを有する病変を識別できるかどうかを決定するため、以下の組織標本をqMSPによって分析した：
正常な外陰部組織（n=8；小唇形成術から得られたコントロールの外陰部組織），少なくとも10年間のフォローアップ期間中にVSCCを発症しなかった女性のHPV陽性VIN病変（n=15；癌に進行するリスクの低い病変），VSCCを有する女性のHPV陽性VIN病変（n=15；癌に進行するリスクの高い病変）および外陰部扁平上皮細胞癌（VSCC；38例のHPV陰性および12例のHPV陽性がんを含む）
【００９３】
ZIC1およびGHSRの両方のメチル化レベルは、VSCCを有する女性のHPV陽性VIN病変において、VSCCを有さない女性のHPV陽性VINと比較して、有意に増加していた。さらに、VSCCに関連するVIN病変におけるメチル化レベルは、VSCCで検出されるメチル化レベルと同様であった。これは、ZIC1およびGHSRのメチル化が、外陰部のHPV誘発前癌病変のリスク評価に使用できることを示している。
【００９４】
実施例８．子宮頸癌患者の尿サンプルにおけるZIC1およびGHSRプロモーターのメチル化
【００９５】
尿中のHPV検査が、子宮頸部擦過物に関するHPV検査の有望な代替手段であることを示すという事実を考慮し（Pathakら、BMJ 2014; 349：g5264）、尿中のメチル化マーカー検出が子宮頸癌の検出を可能にするか否か、評価した。
【００９６】
16人の子宮頸がん患者および年齢が一致した女性対照の20人の尿サンプルから採取した尿サンプルのZIC1およびGHSRメチル化を分析した。ここでは、16人の子宮頸癌患者および年齢が一致した女性対照の20人の尿サンプルから採取した尿サンプルのZIC1およびGHSRメチル化を分析した。
【００９７】
図７に示されるように、GHSRおよびZIC1メチル化レベルの両方が、対照と比較して子宮頸癌患者において有意に増加することが見出された（p＜0.01）。受信者操作特性曲線（ROC）分析で、濃度曲線下面積（AUC）がZIC1で0.994、GHSRで1.0であった。これは、尿のZIC1およびGHSRメチル化分析が一次スクリーニングに適していることを示している。
【００９８】
【表１】
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表１  ZIC1およびGHSR定量的MSP分析に使用されるプライマーおよびプローブ配列（5'-3 '）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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