(57)【要約】本発明はペプチド原性タンパク質の混合物に対する抗体を生成する方法であって、ペプチド原性タンパク質が開始タンパク質と比べて変化した立体構造動力学を有し、ペプチド原性タンパク質が開始ペプチドに類似する立体構造を有する、方法を記載している。ペプチド原性タンパク質は免疫応答を誘導するために使用することができ、それにより抗体を産生することができ、そして／または哺乳動物にワクチン接種するのに使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答を生成する方法であって、
ａ．開始タンパク質由来のペプチド原性タンパク質の混合物を設計するステップであって、前記ペプチド原性タンパク質が前記開始タンパク質と比べて変化した立体構造動力学を有し、前記ペプチド原性タンパク質が立体構造において前記開始ペプチドに類似している、ステップと
ｂ．動物にペプチド原性タンパク質の前記混合物を導入するステップと、
ｃ．免疫応答を生成するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記立体構造動力学を、
ａ．前記開始タンパク質の３−Ｄ構造を調べ、前記開始タンパク質の非表面アミノ酸残基を同定し、前記開始タンパク質中の少なくとも１つの非表面アミノ酸残基を置き換えて前記ペプチド原性タンパク質を作成すること；または
ｂ．前記開始タンパク質の３−Ｄ構造のモデルを調べ、前記開始タンパク質の非表面アミノ酸残基を同定し、前記開始タンパク質中の少なくとも１つの非表面アミノ酸残基を置き換えて前記ペプチド原性タンパク質を作成すること；または
ｃ．異なる種由来の前記開始タンパク質にオルソロガスなタンパク質にわたって保存されたアミノ酸相同性のパターンを比較して前記開始タンパク質の非表面アミノ酸残基を同定し、前記開始タンパク質中の少なくとも１つの非表面アミノ酸残基を置き換えて前記ペプチド原性タンパク質を作成すること；または
ｄ．前記開始タンパク質の少なくとも１つの非表面アミノ酸残基を置き換えて、前記ペプチド原性タンパク質を作成すること；または
ｅ．少なくとも１つの非表面アミノ酸残基をより小さなアミノ酸残基で置き換えること；または
ｆ．少なくとも１つの非表面アミノ酸残基をアラニンもしくはグリシンで置き換えること；または
ｇ．前記開始タンパク質中の少なくとも１つのジスルフィド結合を取り除くこと
により変化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記開始タンパク質内で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸を置き換える、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記開始タンパク質の立体構造動力学を、
ａ．少なくとも１つのスレオニンをバリン、アラニン、グリシンもしくはセリンで；または
ｂ．少なくとも１つのシステインをアラニン、バリン、グリシン、セリンもしくはスレオニンで；または
ｃ．少なくとも１つのバリンをアラニン、グリシン、ロイシンもしくはイソロイシンで；または
ｄ．少なくとも１つのロイシンをアラニン、バリン、グリシン、もしくはイソロイシンで；または
ｅ．少なくとも１つのイソロイシンをアラニン、バリン、ロイシン、もしくはグリシンで；または
ｆ．少なくとも１つのプロリンをメチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、もしくはグリシンで；または
ｇ．少なくとも１つのメチオニンをアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンもしくはグリシンで；または
ｈ．少なくとも１つのフェニルアラニンをチロシン、メチオニン、ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンもしくはグリシンで；または
ｉ．少なくとも１つのチロシンをフェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンもしくはグリシンで；または
ｊ．少なくとも１つのトリプトファンをチロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンもしくはグリシンで；または
ｋ．少なくとも１つのアスパラギン酸を、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または
ｌ．少なくとも１つのアスパラギンをグリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸で；または
ｍ．少なくとも１つのグルタミン酸をアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または
ｎ．少なくとも１つのグルタミンを、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または
ｏ．少なくとも１つのリシンをアルギニン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または
ｐ．少なくとも１つのアルギニンをリシン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または
ｑ．少なくとも１つのヒスチジンをフェニルアラニン、チロシン、リシン、アルギニン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、グルタミン、アスパラギン、ロイシン、メチオニンもしくはイソロイシンで；または
ｒ．少なくとも１つのアラニンをグリシンまたはプロリンで；または
ｓ．少なくとも１つのグリシンをアラニンもしくはプロリンで；または
ｔ．少なくとも１つのセリンをアラニンもしくはグリシンで；または
ｕ．少なくとも１つの残基を非天然アミノ酸で；または
ｖ．上記の組み合わせのいずれか
で置き換えることによって変化させる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチド原性タンパク質の立体構造動力学の変化が：
ａ．前記開始タンパク質と比べた場合の融解温度の変化；または
ｂ．安定化のギブズ自由エネルギーもしくはタンパク質分解感受性アッセイの変化；または
ｃ．安定化のギブズ自由エネルギーの変化が、尿素もしくはグアニジニウム塩酸塩アンフォールディングなどの変性剤調節平衡アンフォールディングにより測定される、ギブズ自由エネルギーの変化
により測定される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
類似の立体構造が：
ａ．前記ペプチド原性タンパク質と前記開始タンパク質の両方に結合する交差反応抗体；または
ｂ．交差反応性が、免疫沈降アッセイ、表面プラズモン共鳴、等温滴定熱量測定、斜入射反射差（ＯＩ−ＲＤ）、ウェスタンブロット、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、および／もしくはプロテインＡ免疫アッセイにより測定される、（ａ）の前記交差反応抗体；または
ｃ．交差反応性が結合アッセイにより測定される、（ａ）の前記交差反応抗体；または
ｄ．１０−９Ｍ未満もしくはこれに等しい解離定数（ＫＤ）を有する、（ａ）の前記交差反応抗体；または
ｅ．１０−８Ｍ未満もしくはこれに等しい、１０−７Ｍ未満もしくはこれに等しい、もしくは１０−６Ｍ未満もしくはこれに等しい解離定数（ＫＤ）を有する、（ａ）の前記交差反応抗体；
により測定される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記開始タンパク質が：
ａ．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のエンベロープ糖タンパク質、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇｐ４１、ＨＩＶ  ｇｐ１６０、エボラ抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、アレルゲン、毒液、毒素、腫瘍関連抗原、膜貫通ドメインタンパク質、Ｇタンパク質共役受容体、イオンチャネル、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ抗原、Ｚｉｋａウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、マラリア抗原；および／または
ｂ．表２に収載されるマラリア抗原のうちのいずれか１つ；および／または
ｃ．表５に収載される標的のうちのいずれか１つ；および／または
ｄ．ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＧＡＧＥ−Ｉ、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＢＡＧＥ−Ｉ、ＲＡＧＥ−１、ＬＢ３３／ＭＵＭ−１、ＰＲＡＭＥ、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１／ＣＴ７、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｉ、ＬＡＧＥ−Ｉ、ＳＳＸ−Ｉ、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−３、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−ＩおよびＸＡＧＥ、メラニン細胞分化抗原、ｐ５３、ｒａｓ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１、ＰＭＳＡ、ＰＳＡ、チロシナーゼ、メランＡ、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ｇｐ７５、アルファ−アクチニン−４、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質、Ｃａｓｐ−８、ベータ−カテニン、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、ｃｏａ−１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦ２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１１、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡＯ２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ−２、および３、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＯＳ−９、ｐｍｌ−ＲＡＲアルファ融合タンパク質、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ−Ｋ−ｍｅｌ、ＮＡ−８８、ＳＰ１７、およびＴＲＰ２−Ｉｎｔ２、（ＭＡＲＴ−Ｉ）、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタインバーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、アルファ−フェトタンパク質、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３（ＣＡ  ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ＼１７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、チロシナーゼ関連タンパク質、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、またはサイトメガロウイルスリンタンパク質６５（ｐｐ６５）から選択される腫瘍関連抗原
から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチド原性タンパク質が前記動物に直接投与される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチド原性タンパク質が：
ａ．同じ開始タンパク質；または
ｂ．複数の開始タンパク質；または
ｃ．複数の関連する開始タンパク質
由来である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ａ．前記ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの混合物を得るステップと；
ｂ．ポリヌクレオチドの前記混合物を動物内に導入するステップであって、前記ペプチド原性タンパク質が前記ポリヌクレオチドから発現される、ステップと
をさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが：
ａ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成される；または
ｂ．ＤＮＡ；または
ｃ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写された（ＩＶＴ）ｍＲＮＡ；または
ｄ．ポリ（Ａ）テイルを含むＩＶＴ  ｍＲＮＡ；または
ｅ．５’キャップを含むＩＶＴ  ｍＲＮＡ
である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドが：
ａ．いかなるターゲティング構成成分とも会合していない；または
ｂ．細胞もしくは臓器を標的に前記ポリヌクレオチドを向けることができるターゲティング構成成分と会合している；または
ｃ．細胞もしくは臓器を標的に前記ポリヌクレオチドを向けることができるターゲティング構成成分と会合しており、前記ターゲティング構成成分がベクターである、
請求項１０または１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から９のいずれか一項に記載のペプチド原性タンパク質または請求項１０から１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む動物。
【請求項１４】
前記動物が哺乳動物、ヒト、マウス、ウサギ、ラマ、またはウシである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法または請求項１３に記載の動物。
【請求項１５】
前記動物が前記ポリヌクレオチドを注射されている、請求項１０から１２もしくは１４のいずれか一項に記載の方法または請求項１３に記載の動物。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが
ａ．前記動物の筋肉内に直接注射される；
ｂ．前記動物内に複数回注射される、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫応答が抗体を産生する、請求項１から１２または１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体を単離するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体が完全ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体、および／またはポリクローナル抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法により産生される抗体。
【請求項２１】
前記ポリクローナル抗体が、単一の単離された抗体種を得るためにさらに分画される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法により産生される単一抗体種。
【請求項２３】
前記抗体が親和性成熟している、請求項１７から１９もしくは２１のいずれか一項に記載の方法または請求項２０で産生される抗体または請求項２２で産生される単一抗体種。
【請求項２４】
前記親和性成熟が：
ａ．ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、もしくはリボソームディスプレイ；または
ｂ．パニング技法
により起こる、請求項２３に記載の方法または抗体。
【請求項２５】
請求項２３または２４のいずれかに記載の方法により産生される抗体。
【請求項２６】
請求項２０、２２、または２５のいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２７】
異種プロモーターをさらに含む、請求項２６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
ベクター配列をさらに含む請求項２６または２７のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項１１から１２または２５から２８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項３０】
ペプチド原性タンパク質の混合物をコードするポリヌクレオチドの混合物。
【請求項３１】
前記ポリヌクレオチドが：
ａ．同じ開始タンパク質由来のペプチド原性タンパク質の混合物をコードする；または
ｂ．複数の開始タンパク質由来のペプチド原性タンパク質の混合物をコードする；または
ｃ．複数の関連する開始タンパク質由来のペプチド原性タンパク質の混合物をコードする；または
ｄ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成される；または
ｅ．ＤＮＡである；または
ｆ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写された（ＩＶＴ）ｍＲＮＡである；または
ｇ．ポリ（Ａ）テイルを含むＩＶＴ  ｍＲＮＡである；または
ｈ．５’キャップを含むＩＶＴ  ｍＲＮＡである、
請求項３０に記載のポリヌクレオチドの混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年８月１９日に出願された米国仮出願番号第６２／２０７，０２２号に基づく優先権を主張しており、この仮出願はその全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
配列表
本出願はＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含有し、本明細書よって参考としてその全体が組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１６年８月１６日に作成され、Ｃｏｍｂｉｎｅｄ＿ＳＡ＿０１＿ＰＣＴ＿ＳＴ２５＿Ｖ２．ｔｘｔと名付けられ、サイズは１０，８８３，２６３バイトである。
【背景技術】
【０００３】
序論
抗体を作るための方法はおよそ１００年以上の間存在し、当業者によりルーチン的に使用されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ１７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ  １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８（１９８５）を参照。抗体を産生するための改良された方法はこれらの初期の方法を拡張したもので、現在市販されている治療抗体の多くを産生するのに使用されてきた。例えば、ファージディスプレイおよびトランスジェニックマウス、すなわち、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するマウスなどの技術は、完全ヒト抗体を産生するのに使用されてきた。しかし、ある特定の抗原は、最新の技法を使用している場合でも抗体を惹起するために研究者の能力を要求し続けている。
【０００４】
ヒト身体内で細胞媒介性免疫応答を誘導するため、外来タンパク質は、通常８〜２４アミノ酸長の間のより小さなペプチドに分解され、抗原提示細胞の表面でのディスプレイのためにＭＨＣ分子に結合される。ＭＨＣ結合ペプチドはＴ細胞に提示されて細胞媒介性免疫応答を起こす。
【０００５】
タンパク質の三次元（３Ｄ）構造は、タンパク質分解プロセシングおよびエピトープの提示の要因として関係付けられてきた（Ｃａｒｍｉｃｌｅら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００７年）４４巻：１１５９〜１１６８頁参照）。さらに、Ｏｈｋｕｒｉら（Ｏｋｈｕｒｉら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（２０１０年）、１８５巻：４１９９〜４２０５頁参照）は、タンパク質の立体構造安定性は免疫学的に支配的な要因であることを認めている。しかし、正確にどのようにして３Ｄ構造が免疫応答に影響を及ぼすのかに関しては一致した意見はない。
【０００６】
Ｄｅｌａｍａｒｒｅら（Ｄｅｌａｍａｒｒｅら、ＪＥＭ、（２００６年）、２０３巻：２０４９〜２０５５頁参照）は、リソソームタンパク質分解を介した消化をより受けにくい消化性のより低い形態のタンパク質が、免疫原性がより大きいことを見出し、したがって、タンパク質の安定性が増すと免疫応答が改善すると結論付けた。例えば、Ｄｅｌａｍａｒｒｅらは、タンパク質抗原の免疫原性はタンパク質分解に対する感受性を減少させることにより改善できることを示した。同様に、Ｍｉｒａｎｏ−Ｂａｓｃｏｓら（Ｍｉｒａｎｏ−Ｂａｓｃｏｓら、Ｊ．  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、（２０１０年）、８４巻：３３０３〜３３１１頁参照）は、システイン残基を突然変異させて３つのジスルフィド結合のそれぞれが形成されるのを妨ぎ、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は３つの変異体すべてについて広く減少したと決定した。Ｍｉｒａｎｏ−Ｂａｓｃｏｓらは、タンパク質の３−Ｄ構造を全体的に不安定化すると抗原提示が減少し免疫応答が抑制されると同様に結論付けた。例えば、Ｎｇｕｙｅｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ、（２０１５年）、３３巻：２８８７〜２８９６頁などの他の研究では、外部ドメインジスルフィド結合が欠失され、そのような欠失は抗原提示を改善すると期待された。代わりに、エピトープ優性の典型的なパターンが観測され、筆者らは実質的により強い免疫応答を生成することはできない可能性があると結論付けた。
【０００７】
他のグループは同様に、タンパク質安定化は免疫応答に必要であると結論付けている。例えば、Ｄｅｒｅｓｓａら（Ｄｅｒｅｓｓａら、ＰＬＯＳ、（２０１４年）、９巻：１〜１２頁参照）は、抗原のアミノ酸配列のわずかな改変でさえ免疫応答に根本的な定量的および定性的変化を引き起こすと結論付けた。同様に、Ｐｏｒｔａら（Ｐｏｒｔａら、ＰＬＯＳ、（２０１３年）、９巻：１〜８頁参照）は、免疫応答を誘導するには安定性が必要であると報告した。Ｔｈｏｍａｓ（Ｔｈｏｍａｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、（２０１３年）、９巻：７４４〜７５２頁参照）などの他のグループは、ペプチドについての熱安定性が増すとより良好な免疫応答が誘発されると同様に結論付けた。
【０００８】
これとは対照的に、Ｓｏ（Ｓｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、（２００１年）、１０４巻：２５９〜２６８頁参照）などの他のグループは、相反する結果を報告している。Ｓｏらは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞応答の規模に対して交差架橋することの効果（例えば、交差架橋を除去するおよび交差架橋を加える）を調査し、そのような交差架橋を除去すると抗原プロセシングがより良好になり免疫応答が改善されることを見出した。同様に、Ｔｈａｉら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（２００４年）２７９巻：５０２５７〜５０２６６頁）は、表面に露出できる残基を突然変異させると安定性が減少し立体構造動力学が増加してタンパク質抗原の免疫原性を増加させることを報告した。Ｔｈａｉらは、単一抗原の投与も対象としている。
交差架橋を除去するまたは加えると抗原プロセシングを改善するのかまたは阻害するのかに関して一致した意見はない。したがって、タンパク質安定性を増加するまたは減少すると、抗体の広く多様なアレイを含む免疫応答が改善されるのかどうかに関しては当技術分野では明確ではない。
したがって、以前得られたものとは異なり、より広いレパートリーの抗体を提供できる抗体を産生する新しい改良された方法を開発する必要性が存在し続けている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４，８１６，５６７号明細書
【特許文献２】欧州特許第１７１４９６号明細書
【特許文献３】欧州特許第１７３４９４号明細書
【特許文献４】国際公開第８６／０１５３３号
【特許文献５】国際公開第８７／０２６７１号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）
【非特許文献２】Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）
【非特許文献３】Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３（１９８４）
【非特許文献４】Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８（１９８５）
【非特許文献５】Ｃａｒｍｉｃｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００７）ｖｏｌ．４４：１１５９−１１６８
【非特許文献６】Ｏｋｈｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２０１０），ｖｏｌ．１８５：４１９９−４２０５
【非特許文献７】Ｄｅｌａｍａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＥＭ，（２００６），ｖｏｌ２０３：２０４９−２０５５
【非特許文献８】Ｍｉｒａｎｏ−Ｂａｓｃｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，（２０１０），ｖｏｌ．８４：３３０３−３３１１
【非特許文献９】Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，（２０１５），ｖｏｌ．３３：２８８７−２８９６
【非特許文献１０】Ｄｅｒｅｓｓａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ，（２０１４），ｖｏｌ．９：１−１２
【非特許文献１１】Ｐｏｒｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ，（２０１３），ｖｏｌ．９：１−８
【非特許文献１２】Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ＆Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，（２０１３），ｖｏｌ．９：７４４−７５２
【非特許文献１３】Ｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（２００１），ｖｏｌ．１０４：２５９−２６８
【非特許文献１４】Ｔｈａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００４）ｖｏｌ．２７９：５０２５７−５０２６６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の要旨
本要旨は、以下の詳細な説明においてさらに記載されている概念の選択を簡略化した形態で紹介するために提供されている。本要旨は、特許請求されている主題の重要な特色または本質的な特色を特定することを意図しておらず、特許請求されている主題の範囲を決定する補助として使用されることも意図していない。
【００１２】
本明細書に記載されるように、本発明は免疫応答を起こす方法であって、開始タンパク質由来のペプチド原性（ｐｅｐｔｉｄｅｇｅｎｉｃ）タンパク質の混合物を設計するステップであって、ペプチド原性タンパク質が開始タンパク質と比べて変化した立体構造動力学（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ）を有し、ペプチド原性タンパク質が立体構造において開始タンパク質に類似している、ステップと、動物にペプチド原性タンパク質を導入するステップと、免疫応答を生成するステップとを含む、方法を対象とする。ペプチド原性タンパク質は動物内に直接導入する（例えば、接種または免疫化により）ことができるか、または動物内に導入されペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドによりｉｎ  ｖｉｖｏで発現させることができる。これらのペプチド原性タンパク質が発現すると、免疫応答が起こされて、ペプチド原性タンパク質と最初の開始タンパク質の両方に対する抗体を産生する。
【００１３】
好ましい実施形態では、開始タンパク質の立体構造動力学は好ましくは、開始タンパク質の熱力学的安定性を変化させることにより変化する。さらなる好ましい実施形態では、開始タンパク質の立体構造動力学は、開始タンパク質の少なくとも１つの非表面アミノ酸残基を置き換えてタンパク質のペプチド原性を改変することにより変化する。立体構造動力学を変化させる方法は、開始タンパク質の３−Ｄ構造（実験的にまたは相同性に基づいて予測される）のモデルを調べ、開始タンパク質の非表面アミノ酸残基を同定し、開始タンパク質中の少なくとも１つの非表面アミノ酸残基を置き換えてペプチド原性タンパク質を作成すること、および／または異なる種由来の開始タンパク質にオルソロガスなタンパク質にわたって保存されたアミノ酸相同性のパターンを比較して開始タンパク質の非表面アミノ酸残基（例えば、保存された疎水性残基）を暫定的に同定し、開始タンパク質中の少なくとも１つの非表面アミノ酸残基を置き換えて、ペプチド原性タンパク質を作成することを含むがこれらに限定されない。非表面（すなわち、埋没）アミノ酸残基を予測するまたは経験的に発見する他の方法も使用することができる。これらの方法は、二次構造を予測および／または開始タンパク質の無秩序な領域を同定して、置換えのためのこれらの構造もしくは秩序のある領域内の少なくとも１つの非表面アミノ酸残基を同定するバイオインフォマティクスツールを使用すること、ならびに少なくとも１つの非表面アミノ酸残基を置き換えてペプチド原性タンパク質を作成することも含む（例えば、Ｃｈｅｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２００５年）３３巻：Ｗ７２〜６頁；Ｈｕａｎｇら（２０１４年）、ＤｉｓＭｅｔａ：  Ａ  Ｍｅｔａ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｃｈｅｎ  ｅｄｉｔｏｒ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ３〜１６頁参照）。一部の実施形態では、無秩序な領域での置換は回避される。例えば、突然変異を作る秩序のある領域を選択するために、無秩序予測因子を使用して秩序のある／構造化された領域を同定することができる［同文献］。さらに他の方法は、疎水性残基のアラニンスキャニングまたは匹敵する方法を通じてなどのコア残基を同定するための生化学実験を使用して、置換えのためのこれらの構造または領域内の少なくとも１つの非表面アミノ酸残基を同定すること、および少なくとも１つの非表面アミノ酸残基を置き換えてペプチド原性タンパク質を作成することを含む。したがって、一部の実施形態では、置換えのための残基は既知の構造に基づいて同定することができ、他の実施形態では、置換えのための残基は保存された疎水性残基に基づいて同定することができる。
【００１４】
好ましい実施形態では、非表面アミノ酸残基は、より小さなアミノ酸残基で置き換えられている。さらに好ましい実施形態では、より小さなアミノ酸はアラニンまたはグリシンである。別の好ましい実施形態では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸を開始タンパク質において置き換える。さらに別の好ましい実施形態では、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸または少なくとも５０アミノ酸を開始タンパク質において置き換える。さらに他の好ましい実施形態では、複数のアミノ酸置換えはタンパク質の混合物にわたって分布される。例えば、一実施形態では、１０個の異なる残基を突然変異させるため、開始タンパク質を１０の異なる回数突然変異させて１０個の異なるペプチド原性タンパク質を作成し、それぞれが単一アミノ酸置換えを有する。１０個のタンパク質のそれぞれが一緒に混合されて動物に接種される。いくつかの場合では、野生型開始タンパク質、すなわち、突然変異のないタンパク質は、混合物の一部である。さらなる好ましい実施形態では、例えば、システインをアラニン、セリン、および／またはグリシン等で置き換えるなど、少なくとも１つのジスルフィド結合が開始タンパク質中で取り除かれる。さらなる好ましい実施形態では、開始タンパク質中で少なくとも１つのジスルフィド結合の形成に関与している両方のシステインはアラニン、セリン、および／もしくはグリシン、または好ましくはアラニンもしくはグリシン等で置き換えられる。さらに好ましい実施形態では、開始タンパク質の立体構造動力学は、（ａ）少なくとも１つのスレオニンをバリン、アラニン、グリシンもしくはセリンで；または（ｂ）少なくとも１つのシステインをアラニン、バリン、グリシン、セリンもしくはスレオニンで；または（ｃ）少なくとも１つのバリンをアラニン、グリシン、ロイシンもしくはイソロイシンで；または（ｄ）少なくとも１つのロイシンをアラニン、バリン、グリシン、もしくはイソロイシンで；または（ｅ）少なくとも１つのイソロイシンをアラニン、バリン、ロイシン、もしくはグリシンで；または（ｆ）少なくとも１つのプロリン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンをアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、もしくはグリシンで；または（ｇ）少なくとも１つのアスパラギン酸もしくはアスパラギンをグリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｈ）少なくとも１つのグルタミン酸もしくはグルタミンをアスパラギン酸、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｉ）少なくとも１つのリシンをアルギニン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｊ）少なくとも１つのアルギニンをリシン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｋ）少なくとも１つのヒスチジンをリシン、アルギニン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、グルタミン、アスパラギン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｌ）少なくとも１つのアラニンをグリシンで；または（ｍ）少なくとも１つの残基を非天然アミノ酸で；および／または（ｎ）任意の上記の組み合わせで置き換えることによりにより変化させられる。
【００１５】
なおさらに好ましい実施形態では、開始タンパク質の立体構造動力学は、（ａ）少なくとも１つのトリプトファンをチロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニンもしくはグリシンで；または（ｂ）少なくとも１つのチロシンをフェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニンもしくはグリシンで；または（ｃ）少なくとも１つのフェニルアラニンをチロシン、メチオニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニンもしくはグリシンで；または（ｄ）少なくとも１つのプロリンをメチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、もしくはグリシンで；または（ｅ）少なくとも１つのヒスチジンをフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、グリシン、リシン、アルギニン、セリン、スレオニン、アスパラギン、もしくはグルタミンで；または（ｆ）少なくとも１つのメチオニンをイソロイシン、ロイシン、バリン、アラニンもしくはグリシンで；または（ｇ）少なくとも１つのイソロイシンをロイシン、バリン、アラニンもしくはグリシンで；または（ｈ）少なくとも１つのロイシンをイソロイシン、バリン、アラニンもしくはグリシンで；または（ｉ）少なくとも１つのバリンをアラニン、グリシン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｊ）少なくとも１つのシステインをアラニン、バリン、グリシン、セリンもしくはスレオニンで；または（ｋ）少なくとも１つのアスパラギン酸をグルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｌ）少なくとも１つのグルタミン酸をアスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｍ）少なくとも１つのアラニンをグリシンもしくはプロリンで；または（ｎ）少なくとも１つのセリンをアラニンもしくはグリシンで；または（ｏ）少なくとも１つのグリシンをアラニンもしくはプロリンで；または（ｐ）少なくとも１つのリシンをアルギニン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシンもしくはイソロイシンで；または（ｑ）少なくとも１つのアスパラギンをグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸で；または（ｒ）少なくとも１つのグルタミンをグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、もしくはヒスチジンで；または（ｓ）少なくとも１つのアルギニンをリシン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニンバリン、メチオニン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｔ）少なくとも１つのスレオニンをバリン、アラニン、グリシンもしくはセリンで；または（ｕ）疎水性残基をより小さな類似の疎水性残基で；または（ｖ）少なくとも１つの残基を非天然アミノ酸で；または（ｗ）任意の上記の組み合わせ置き換えることによりにより変化させられる。コンビナトリアルアプローチを使用してペプチド原性を増加させる最適な置換を決定してもよい。
【００１６】
好ましい実施形態では、ペプチド原性タンパク質の立体構造動力学の変化は、開始タンパク質と比べた場合の融解温度の変化によりおよび／または安定化のギブズ自由エネルギーの変化を測定することにより測定される。ギブズ自由エネルギーを測定する好ましい方法は、変性剤調節平衡アンフォールディングを含むがこれに限定されない。好ましい変性剤は尿素および／またはグアニジニウム塩酸塩である。あるいは、立体構造動力学の変化は、例えば、カテプシンおよび／または他のプロテアーゼを用いて消化を測定し、次いで質量分析（ＭＳ）またはドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により混合物を分析することによるなどの、タンパク質分解感受性アッセイの変化を検出することによりアッセイすることができる。
【００１７】
好ましい実施形態では、ペプチド原性タンパク質が開始タンパク質に類似する立体構造を有するかどうかの決定は、ペプチド原性タンパク質上と開始タンパク質上の両方の３Ｄ立体構造エピトープ（不連続エピトープであることが多い）に結合する交差反応抗体により測定することができる。抗体結合を測定するための方法として、免疫沈降アッセイ、表面プラズモン共鳴、等温滴定熱量測定、斜入射反射差（ＯＩ−ＲＤ）、ウェスタンブロット、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、および／もしくはプロテインＡ免疫アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
さらなる好ましい実施形態では、交差反応性を測定するための試験は、結合アッセイによる。さらなる好ましい実施形態では、ペプチド原性タンパク質に結合する抗体（交差反応抗体を含む）は、１０−９Ｍ未満もしくはこれに等しい、１０−８Ｍ未満もしくはこれに等しい、１０−７Ｍ未満もしくはこれに等しい、および／または１０−６Ｍ未満もしくはこれに等しい解離定数（ＫＤ）を有する。
【００１９】
好ましい実施形態では、開始タンパク質は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のエンベロープ糖タンパク質、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇｐ４１、ＨＩＶ  ｇｐ１６０、エボラ抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）抗原、Ｚｉｋａウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、ウイルス抗原、マラリア抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、アレルゲン、毒液、毒素、または腫瘍関連抗原、膜貫通ドメインタンパク質、イオンチャネルタンパク質、および／またはＧタンパク質共役受容体から選択される。
【００２０】
さらに好ましい実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＧＡＧＥ−Ｉ、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＢＡＧＥ−Ｉ、ＲＡＧＥ−１、ＬＢ３３／ＭＵＭ−１、ＰＲＡＭＥ、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１／ＣＴ７、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｉ、ＬＡＧＥ−Ｉ、ＳＳＸ−Ｉ、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−３、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−ＩおよびＸＡＧＥ、メラニン細胞分化抗原、ｐ５３、ｒａｓ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１、ＰＭＳＡ、ＰＳＡ、チロシナーゼ、メランＡ、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ｇｐ７５、アルファ−アクチニン−４、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質、Ｃａｓｐ−８、ベータ−カテニン、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、ｃｏａ−１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦ２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１１、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡＯ２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ−２、および３、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＯＳ−９、ｐｍｌ−ＲＡＲアルファ融合タンパク質、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ−Ｋ−ｍｅｌ、ＮＡ−８８、ＳＰ１７、およびＴＲＰ２−Ｉｎｔ２、（ＭＡＲＴ−Ｉ）、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタインバーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、アルファ−フェトタンパク質、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３（ＣＡ  ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ＼１７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、チロシナーゼ関連タンパク質、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、およびサイトメガロウイルスリンタンパク質６５（ｐｐ６５）から選択される。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、ペプチド原性タンパク質は複合体の一部であるタンパク質である。例えば、埋没界面残基は、例えば、三量体複合体を形成しＨＩＶ感染に関与するエンベロープ糖タンパク質であるｇｐ１２０などのタンパク質でのアミノ酸置換の標的にしてもよい。
【００２２】
好ましい実施形態では、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの混合物はｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができる。ポリヌクレオチドは好ましくはＤＮＡまたはｍＲＮＡのいずれかを含むこともできる。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドはｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写された（ＩＶＴ）ｍＲＮＡである。ＩＶＴ  ｍＲＮＡを含むｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）テールおよび／または５’キャップをさらに含むことができる。別の好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは、カップリングされたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳（ＩＶＴＴ）の使用によるを含めて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳されてペプチド原性タンパク質を生成することができる。
【００２３】
ポリヌクレオチドの混合物は、同じ開始タンパク質由来または複数の開始タンパク質由来の異なるペプチド原性タンパク質をコードする配列を含むことができる。さらなる好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞または臓器を標的にポリヌクレオチドを向けるターゲティング構成成分と会合することができる。あるいは、ポリヌクレオチドはターゲティング構成成分と会合しないことができる。ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドはベクター配列を含んでいてもよい。
【００２４】
これらのポリヌクレオチドの混合物ならびにポリヌクレオチドの混合物を発現している動物（遺伝的に改変されたまたは遺伝的に改変されていない）も企図される。好ましい実施形態では、動物は哺乳動物であり、さらなる好ましい実施形態では、哺乳動物はヒト、マウス、ウサギ、ラマ、またはウシである。
【００２５】
さらなる好ましい実施形態では、方法は免疫応答を誘導する。免疫応答はｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こり得る。
【００２６】
ポリヌクレオチドの混合物を含むがこれに限定されない、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは注射により動物に送達することができる。好ましい実施形態では、注射は動物の筋肉で行う。動物へのポリヌクレオチドの送達はワクチン接種目的で、研究、または抗体開発において使用することができる。
【００２７】
さらなる好ましい実施形態では、記載された方法により生成される抗体は回収され単離される。好ましい実施形態では、抗体は完全ヒト抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ラクダ科抗体、ヒト化抗体、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。好ましい実施形態では、ポリクローナル抗体は単一の単離された抗体種にさらに分画される。他の好ましい実施形態では、生成された抗体は、例えば、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイまたはパニング技法などにより親和性成熟される。
【００２８】
本明細書に記載される方法により生成される抗体をコードするポリヌクレオチドも企図される。これらの抗体をコードするポリヌクレオチドは異種プロモーターおよび／またはベクター配列も含むことができる。
【００２９】
ペプチド原性タンパク質および／またはペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの混合物を使用して哺乳動物にワクチン接種することもできる。好ましい実施形態では、ワクチンは、ペプチド原性タンパク質を含むがんワクチン、ＨＩＶワクチン、ＨＣＶワクチン、ＨＢＶワクチン、インフルエンザウイルスワクチン、ＭＥＲＳ−ＣｏＶワクチン、Ｚｉｋａワクチン、マラリアワクチン、および／またはエボラウイルスワクチンである。
【００３０】
さらなる好ましい実施形態では、本発明はペプチド原性タンパク質をプロセシングする方法であって、抗原提示細胞にペプチド原性タンパク質を導入するステップであって、ペプチド原性タンパク質が開始タンパク質と比べて変化した立体構造動力学を有し、ペプチド原性タンパク質が開始タンパク質に類似する立体構造を有する、ステップと、抗原提示細胞がペプチド原性タンパク質由来のＴ細胞エピトープをプロセシングして表示するのを可能にするステップとを含む、方法である。
【００３１】
好ましい実施形態では、抗原提示細胞は樹状細胞、Ｂ細胞、単球またはマクロファージである。さらなる好ましい実施形態では、方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。さらなる好ましい実施形態では、抗原提示細胞はペプチド原性タンパク質（単数または複数）をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトされるおよび／またはペプチド原性タンパク質（単数または複数）と接触させる。さらなる好ましい実施形態では、抗原提示細胞はペプチド原性タンパク質（単数または複数）またはポリヌクレオチド（単数または複数）の食作用または飲作用を受ける。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
概説
本明細書には、タンパク質の３−Ｄ立体構造を維持しつつ開始タンパク質の立体構造動力学を変化させることを通してタンパク質の「ペプチド原性潜在力（ｐｅｔｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｃｙ）」を使用することにより抗体の産生を増強することを含む、免疫応答を生成する新規の方法を記載している。次いで、これらのペプチド原性タンパク質は、ワクチンとして使用して免疫応答を開始する、および／または抗体を産生するのに使用することができる。
【００３３】
したがって、本発明は、免疫応答を起こす方法であって、開始タンパク質由来のペプチド原性タンパク質の混合物を設計するステップであって、ペプチド原性タンパク質が開始タンパク質と比べて変化した立体構造動力学を有し、ペプチド原性タンパク質が立体構造において開始タンパク質に類似しているステップと、動物にペプチド原性タンパク質を導入して免疫応答を生成するステップとを含む、方法を対象とする。ペプチド原性タンパク質は動物内に直接導入することができる（例えば、接種または免疫化により）、または動物に導入されていてペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドによりｉｎ  ｖｉｖｏで発現させることができる。これらのペプチド原性タンパク質が発現すると、免疫応答が起こされて、好ましくはペプチド原性タンパク質と最初の開始タンパク質の両方に対する抗体を産生する。
【００３４】
ポリヌクレオチドの導入は、例えば、直接または樹状細胞のｅｘ  ｖｉｖｏトランスフェクションを最初に実施した後で行うことができる。さらに、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを作成して動物内に導入することができる。次いで、ペプチド原性タンパク質を動物内で生成して、ペプチド原性タンパク質に対する抗体を産生することができる。本明細書に記載される方法は、タンパク質の免疫原性に大いに影響を与える潜在力を有する。タンパク質において変化する好ましい生物物理的および生化学的特性は、タンパク質の立体構造動力学、熱力学安定性、ＭＨＣ−ＩＩ結合、および／または開始タンパク質のプロテアーゼ感受性を含むがこれらに限定されない。本明細書に記載される方法は、異なるペプチド原性タンパク質（同じまたは異なる開始タンパク質のいずれかに由来する）に対する交差反応抗体を同時に生成するのに使用することもでき、これは抗体が、動物において単回注射により得ることができる抗体のレパートリーとして目下産生されている方式を大いに変化させる潜在力を有し、抗体開発およびワクチン接種有効性を合理化する潜在力を有する。
【００３５】
本発明者らは、タンパク質の立体構造動力学は免疫応答を開始するタンパク質の能力に極めて重要であることを認識した。免疫化後にペプチド断片をｉｎ  ｖｉｖｏで効率的にもたらす抗原の傾向を本発明者らは「ペプチド原性」と名付けた。タンパク質混合物として直接投与するまたはポリヌクレオチドの混合物により動物内で同時に発現させることができるペプチド原性タンパク質の混合物を設計するために開始タンパク質の立体構造動力学を変更する能力を有することは、費用効果の高い様式で単回注射を用いて広いレパートリーの抗体を産生する潜在力を有する。
【００３６】
したがって、本明細書で開示されるように、動物をペプチド原性タンパク質の混合物で免疫化すると免疫系を強く刺激して、抗原提示細胞に接触させるとより強力かつ／またはより優れた免疫系を生成することができる。
【００３７】
ペプチド原性タンパク質の混合物（またはコンビナトリアルカクテル）を用いた免疫化は、ペプチドを生成するタンパク質抗原（単数または複数）へのタンパク質分解攻撃の複雑さのせいで有利である。例えば、異なるアミノ酸配列を有する複数の異なるペプチド原性タンパク質を提供すると、適切な時間枠で所与のペプチド（Ｔ細胞エピトープ）の生成に最適な「チューニング突然変異（単数または複数）」が別のペプチドの生成に最適な突然変異とは異なり得る環境が作り出される。例えば、樹状細胞などの一部の細胞は活性化期中にＴ細胞応答を媒介する。これらの細胞がこの活性化窓の外側（例えば、活性化の前または後）で抗原を提示された場合には、Ｔ細胞応答は起こらない可能性がある。したがって、Ｔ細胞は、免疫応答を起こすためには適切な時期に抗原を提示される必要があり、この時期は抗原提示細胞中のタンパク質分解（例えば、プロテオリシス）の速度に支配される。抗原を混合物として与えることにより、非常に多くの異なるペプチド原性タンパク質を単一の細胞でエンドサイトーシスすることができ、これにより、その細胞により生成され表示されるペプチドの多様性は理論的には最大になる。あるいは、抗原を混合物として与えることにより、非常に多くの異なるペプチド原性タンパク質を複数の細胞でエンドサイトーシスすることができ、これによりこれらの細胞に生成され表示されるペプチドの多様性は理論的には最大になる。さらに、増加した立体構造動力学を有するペプチド原性タンパク質は、免疫応答を最大にすると期待される改善されたＭＨＣクラスＩＩ結合をもたらす可能性がある。例えば、安定しすぎていて、したがって、プロテアーゼ分解が阻害され、それによってそれに続くペプチド提示が低下して、適応免疫での免疫応答が減弱してしまうために比較的非免疫原性である、および／または良好なワクチン構成成分ではないタンパク質では、そのようなタンパク質は、開始タンパク質と比べて類似する立体構造を維持しつつ立体構造動力学を変化させたペプチド原性タンパク質の混合物を作成するために本明細書に記載される通りに変化され得る。
【００３８】
好ましい実施形態では、試験開始タンパク質とも呼ばれる開始タンパク質は、体系的に突然変異させて、対応する折り畳みタンパク質の三次元構造を著しく変化させることなく開始タンパク質の熱力学的安定性を変化させて、開始タンパク質と本質的に同じ３Ｄ（立体構造）表面エピトープを表示しつつペプチド原性が増加したペプチド原性タンパク質を作成することができる。
【００３９】
したがって、開始タンパク質の免疫原性を、その立体構造動力学を変化させることにより増加させて多数のペプチド原性タンパク質を生成し、次いでこれを動物内に同時に導入することができることにより、強い免疫応答を発生させ、より広いレパートリーのポリクローナル抗体を産生させ、単一の単離された種にさらに分画する（例えば、そのそれぞれのコードｍＲＮＡを介して分子的にクローニングすることにより）ことができる潜在力を有する。
定義
【００４０】
別に定義されていなければ、本明細書で使用される専門および科学用語はすべて、ペプチド化学、細胞培養およびファージディスプレイ、核酸化学ならびに生化学の技術分野などの当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。分子生物学、遺伝的および生化学的方法では、参照により本明細書に組み込まれる標準技法が使用される（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、２００１年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９年）第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．参照）。
【００４１】
本明細書で使用されるように、「ペプチド原性（ｐｅｐｔｉｄｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）」とは、免疫応答をもたらすのに使用することができる頑強なセットの多様なペプチドを効率的に産生するタンパク質の傾向を指す。ペプチド原性を測定するための種々のアッセイが存在する（例えば、Ｓｏら、Ｆｉｇｓ．  ２ｃ−ｄ；Ｔｈａｉら、Ｆｉｇ．  ７ｃ−ｆ；ならびにＤｅｌａｍａｒｒｅら、Ｆｉｇ．  １ｂ−ｃ、４ｂ−ｃおよび５ａ−ｂ参照）。
【００４２】
本明細書で使用されるように、「ペプチド原性タンパク質（ｐｅｐｔｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」とは、開始タンパク質に類似する立体構造を維持しつつ開始タンパク質配列と比べてその立体構造動力学を変化させるようにそのアミノ酸配列が改変されている突然変異されたタンパク質を指す。
【００４３】
本明細書で使用されるように、「非表面残基」は、タンパク質の３Ｄ構造に関して表面に露出できない残基、例えば、未変性タンパク質の３Ｄ構造の内部に埋没している残基である。好ましい実施形態では、「非表面」残基はＬｅｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓの方法により定義されており（例えば、Ｌｅｅ  Ｂら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（１９７１年）；５５巻（３号）：３７９−ＩＮ４．ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／００２２−２８３６（７１）９０３２４−Ｘ参照）、未変性タンパク質中の残基の相対的溶媒露出度は５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、もしくは０％であり、または同じ方法により、絶対的溶媒露出表面積と完全に伸張したＡｌａ−Ｘ−Ａｌａトリペプチドの表面積の差（例えば、Ｇｒｅａｄｙ  ＪＥら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．（１９９７年）；６巻（５号）：９８３〜９８頁．ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏ．５５６００６０５０４．参照）は４０Å２よりも大きい、５０Å２よりも大きい、６０Å２よりも大きい、７０Å２よりも大きい、８０Å２よりも大きい、９０Å２よりも大きい、１００Å２よりも大きい、１１０Å２よりも大きい、または１２０Å２よりも大きい。さらなる好ましい実施形態では、「非表面」残基は、当業者がよく知っている構造分析ソフトウェアパッケージにより計算した場合、１０Å２未満、５Å２未満、２．５Å２未満、または１Å２未満の溶媒露出表面積を有する残基として定義される（例えば、ＵＣＳＦ  Ｃｈｉｍｅｒａ（例えば、Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ  ＥＦら、Ｊ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｃｈｅｍ．（２００４年）；２５巻（１３号）：１６０５〜１２頁．Ｅｐｕｂ  ２００４／０７／２１参照）、ＰｙＭｏｌ（例えば、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，  ＬＬＣ．  Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、１．８．版  ２０１５年参照）、等。
【００４４】
本明細書で使用されるように、「開始タンパク質」または「試験開始タンパク質」とは、ペプチド原性タンパク質を導き出すために使用される「最初の」または「基準」タンパク質のアミノ酸配列を指す。一部の例では、「開始タンパク質」はさらに改変されているペプチド原性タンパク質であり得る。
【００４５】
本明細書で使用されるように、「免疫応答」とは、タンパク質をプロセシングした後抗原提示細胞により起こされる液性免疫応答および／または細胞媒介性免疫応答を指す。液性免疫応答では、Ｂリンパ球が未変性の未プロセシング抗原と反応する抗体を生成する。これらの抗原−抗体反応は一部の場合、補体カスケードを活性化する細胞表面抗原を含むことがあり、この補体カスケードはそれらの抗原を担持する細胞の溶解を引き起こす。細胞媒介性免疫応答では、Ｔリンパ球は、外来性として認識されたプロセシングされたペプチド抗原の存在下でマクロファージを動員する。活性化されたＴリンパ球は外来性抗原を担持する細胞を直接攻撃することもできる。
【００４６】
本明細書で使用されるように、「抗原提示細胞」とはタンパク質をペプチドに分解（「プロセシング」）し、ペプチドをＭＨＣ対立遺伝子、好ましくは主要ＨＬＡ複合体クラスＩまたはクラスＩＩ分子と併せて、細胞表面で提示することができる細胞を指す。抗原提示細胞の例は、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および単球を含むがこれらに限定されない。
【００４７】
本明細書で使用されるように、「立体構造動力学」とは、タンパク質分子中の互いに関する原子または原子群の空間配置でのタンパク質構造の現象関連立体構造変化および柔軟性として定義される。立体構造動力学は、「呼吸」動作を含み、タンパク質分子中共有結合的結合により接合しており、内因的復元力に支配されるが、水素結合、ファンデルワールス力、および静電相互作用などの非共有結合相互作用により調節される原子の振動、屈曲、湾曲、回転、および他の許される運動モードを含む。これらの動作はピコ秒以下の時間尺度でタンパク質の幾何配置を微妙に変化させることができ、立体構造状態の広大な多様性をマイクロ秒からミリ秒の時間尺度で生じることができる。タンパク質の立体構造分子動力学はコンピューターシミュレーションを使用して研究されることが多い。例えば、Ｓｈａｗら、（２０１０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３０巻、３４１頁を参照されたい。さらに本明細書で使用されるように、開始タンパク質の立体構造動力学は、化学修飾、アミノ酸置換、および欠失、挿入、切り詰めなどの他の突然変異、またはそれらの任意の組合せ等により変化させることができる。ペプチド原性タンパク質の立体構造動力学は野生型タンパク質に関して多様であると述べることは、ペプチド原性タンパク質の１つまたは複数のアミノ酸置換により野生型タンパク質と比べて変化した立体構造動力学がもたらされることを意味する。
【００４８】
本明細書で使用されるように、「熱力学的安定性」とは、放出されるまたは消費されるエネルギーがないまたは最小である、したがって、熱エネルギー変化がないまたは最小しか存在せず、系が所与のセットの実験条件下でその最低のエネルギー状態にある化学系という点から定義される。さらに本明細書で使用されるように、「熱力学的安定性の減少」または「減少した熱力学的安定性」とは、ペプチド原性タンパク質の熱力学的安定性に関するパラメーターが同じ条件下で測定された開始タンパク質のパラメーターに比べて減弱していることを意味し、この減少はペプチド原性タンパク質において、化学修飾、アミノ酸置換、および他の遺伝子突然変異を介した開始タンパク質の分子構造に対する変更により達成することが可能であるが、これだけに限定されない。熱力学的安定性の減少を測定する方法は当技術分野では公知であり本明細書に記載されており、融解温度および尿素またはグアニジニウム塩酸塩誘導平衡アンフォールディング（変性）などのパラメーターの測定を組み込んでいるプロトコールを含む。これらのパラメーターは典型的には、平衡または準平衡の条件下で温度または変性剤濃度の関数としてタンパク質アンフォールディング反応をモニターすることにより到達される。折り畳まれた状態の濃度と比べて折り畳まれていない状態の濃度を測定することによりアンフォールディング反応をモニターするための方法は、ＵＶ吸収、蛍光、および円偏光二色性を含むがこれらに限定されない。このアプローチにより、同じ条件下で測定される開始タンパク質の安定化自由エネルギーと比べた突然変異タンパク質の安定化自由エネルギー（ギブズ自由エネルギー）の計算が可能になる。自由エネルギーの差は典型的には、ΔΔＧ＝ΔＧ変異体−ΔＧ標準（例えば、ｗｔ）により表され、式中、ΔＧ変異体およびΔＧ標準（例えば、ｗｔ）はそれぞれ突然変異と「標準」（例えば、ｗｔまたは野生型）タンパク質の安定化自由エネルギーであり、ΔΔＧは差である。ΔΔＧ＞０は標準タンパク質ほど安定していない突然変異タンパク質を示し、ΔΔＧ＜０は標準タンパク質よりも安定している突然変異タンパク質を示す。
【００４９】
本明細書で使用されるように、タンパク質の非表面残基を突然変異させた（および、結果的にその全体的立体構造動力学を潜在的に改変した）後に、抗体がペプチド原性タンパク質と開始タンパク質の両方と交差反応するのを可能にするのに３−Ｄ構造が十分維持されている場合には、ペプチド原性タンパク質は開始タンパク質に「類似する立体構造」を有する。「交差反応性」は、本明細書に記載されるまたは当技術分野で周知である結合アッセイにより測定することができ、解離定数（ＫＤ）、オフレート（ｋｏｆｆ）、および／またはオンレート（ｋｏｎ）に基づく「結合親和性」として測定される。ペプチド原性タンパク質は開始タンパク質と同一の３−Ｄ構造を有する必要はなく、たとえ結合親和性が同一でない可能性があっても、抗体が両方のタンパク質を認識するのを可能にする類似の３Ｄ立体構造エピトープ（不連続エピトープを含む）を示す十分に類似する構造だけである。
【００５０】
本発明では、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、ペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。したがって、用語抗体は、全抗体分子だけではなく、抗体断片ならびに抗体および抗体断片の変異体（融合タンパク質などの誘導体を含む）も包含する。本出願において用語「抗体」により記載される分子の例は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆｖ、およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかかを含む、あるいはそれからなる断片を含むがこれらに限定されない。本明細書で使用される用語「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」とは、抗体のＶＨドメインに連結された抗体のＶＬドメインを含むポリペプチドを指す。Ｃａｒｔｅｒ（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６巻：２４３頁を参照されたい。
【００５１】
さらに、本発明の抗体は、モノクローナル、多特異的、二重特異的、ヒト、ヒト化、マウス、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、ラクダ科抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、ドメイン抗体および上記のいずれかのエピトープ結合断片を含むがこれらに限定されない。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであり得る。
【００５２】
抗体はヒト抗体であるのが最も好ましい。本明細書で使用されるように、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーおよびヒト抗体を生成するように遺伝的に操作された異種マウスまたは他の生物から単離された抗体を含む。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生成するための少数の技術についての詳細な考察ならびにそのような抗体を生成するためのプロトコールについては、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０５９８８７７号；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；および５，９３９，５９８号；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照。
【００５３】
ヒト抗体または「ヒト化」キメラモノクローナル抗体は、本明細書に記載されるまたは当技術分野で他に公知である技法を使用して生成することができる。例えば、キメラ抗体を生成するための方法は当技術分野では公知である。概説については以下の参考文献Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ１７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ１７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８（１９８５）を参照されたい。
【００５４】
本発明の抗体は一価、二価、三価または多価であってもよい。例えば、一価ｓｃＦｖは化学的にまたは別のタンパク質もしくは物質との会合により多量体化することができる。ヘキサヒスチジンタグまたはＦｌａｇタグに融合されているｓｃＦｖは、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してまたは抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）を使用して多量体化することができる。
【００５５】
本発明の抗体は、単一特異的、二重特異的、三重特異的またはより大きな多特異性のものであってもよい。多特異的抗体はペプチド原性タンパク質に、１つよりも多いペプチド原性タンパク質に、開始タンパク質に特異的でもよく、または多特異的抗体はペプチド原性タンパク質および／もしくは開始タンパク質の両方ならびに異種ポリペプチドなどの異種エピトープもしくは固体支持材料に特異的であってもよい。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号；同第４，７１４，６８１号；同第４，９２５，６４８；同第５，５７３，９２０号；同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語「断片」とは、ペプチド原性タンパク質または開始タンパク質のアミノ酸配列のうちの少なくとも５アミノ酸残基、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも１５アミノ酸残基、少なくとも２０アミノ酸残基、少なくとも２５アミノ酸残基、少なくとも３０アミノ酸残基、少なくとも３５アミノ酸残基、少なくとも４０アミノ酸残基、少なくとも４５アミノ酸残基、少なくとも５０アミノ酸残基、少なくとも６０アミノ残基、少なくとも７０アミノ酸残基、少なくとも８０アミノ酸残基、少なくとも９０アミノ酸残基、少なくとも１００アミノ酸残基、少なくとも１２５アミノ酸残基、少なくとも１５０アミノ酸残基、少なくとも１７５アミノ酸残基、少なくとも２００アミノ酸残基または少なくとも２５０アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態では、断片は、約８〜２４アミノ酸残基または約５〜３０アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドも指し得る。
【００５７】
本明細書で使用される用語「融合タンパク質」とは、ペプチド原性タンパク質、開始タンパク質、および／またはペプチド原性タンパク質に対して産生された抗体のアミノ酸配列ならびに１つまたは複数の異種ペプチドおよび／もしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む、あるいはそれからなるポリペプチドを指す。ワクチン適用では、ペプチド原性タンパク質に融合された異種ポリペプチド配列は好ましくはウイルスタンパク質由来である。
【００５８】
本明細書で使用される用語「宿主細胞」とは、核酸分子をトランスフェクトされた特定の対象細胞およびそのような細胞の子孫または潜在的な子孫を指す。子孫は、後世に起こることがある突然変異もしくは環境の影響もしくは発生ステップまたは核酸分子の宿主細胞ゲノムへの組込みのせいで核酸分子をトランスフェクトされた親細胞と同一でなくてもよい。
【００５９】
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が化学的性質（例えば、サイズ、電荷、立体的特色［例えば、ベータ分岐した対ベータ分岐していない］、極性［親水性対疎水性］、芳香族対非芳香族等）が類似する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。特定の置換が「保存的」とみなされるかどうかは、置換が起こる折り畳まれたタンパク質の構造的状況にも依拠することがある。アミノ酸側鎖はある点では化学的に類似しているが別の点では化学的に類似していないことがあり、状況は、その特定の置換がどれほど「保存的」である（すなわち、最も破壊的でない）かの点からこれらの特性のうちのどれが支配しているかを決定することができる。化学的に類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐した側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。一部の側鎖は、生理的に適切なｐＨ範囲でｐＨ依存性であるハイブリッドな性状を有する。例えば、ヒスチジン（ｐＫａ約６）はｐＨ６よりも下ではより正電荷になり（塩基性）、ｐＨ７．５およびそれよりも上では極性であるが実質的に非電荷になる。システイン（ｐＫａ約８．５）はｐＨ８より下では実質的に非電荷で（および特に極性はない）がｐＨ９では負電荷を帯びている（および酸性）。チロシンフェノール側鎖もより高いｐＨでは部分的にイオン化し、負電荷を帯びている。さらに、タンパク質の残りの局所的静電環境（状況）はこれらの効果的ｐＨ値を実質的に移動させることができる。さらに、酸性タンパク質システインチオレート側鎖は、酸化型グルタチオンなどの中間ジスルフィド含有化合物を含むチオール−ジスルフィド交換を介して、別のタンパク質システインチオールと反応して分子内ジスルフィド結合を形成することができ、そのような結合は高度に疎水性である（非極性）。さらに、天然に存在するおよび／または天然に存在しない両方のアミノ酸をペプチド原性タンパク質に使用することができる。
【００６０】
突然変異はコード配列のすべてまたは一部に沿って部位特異的形式でまたは無作為に導入することができる。突然変異体のライブラリーは、所与の残基部位に単一アミノ酸置換、２アミノ酸置換、３アミノ酸置換、４アミノ酸置換など、１９アミノ酸置換まで導入するよう設計することができる。さらに他の実施形態では、突然変異体のライブラリーは１９よりも多いアミノ酸置換（天然および非天然アミノ酸を含む）を所与の残基部位に導入するよう設計することができる。さらに、ライブラリーは、２つの部位、３つの部位、４つの部位などで複数の突然変異を同時に生成するように組み合わせ的に設計することができる。変異誘発に続いて、コードされたタンパク質はルーチン的に発現してよく、コードされたタンパク質の立体構造動力学および／またはペプチド原性は本明細書に記載される技法を使用してまたは当技術分野で公知の技法をルーチン的に改変することにより決定することができる。得られる突然変異タンパク質は、変化した熱力学的安定性についてまたはペプチド原性についてまたは開始タンパク質に類似の立体構造についてスクリーニングし評価することができる。あるいは、設計されたライブラリー由来の発現されたタンパク質「出力」は、タンパク質特性について前スクリーニングせずに動物を免疫化するのに使用することができる。
【００６１】
本明細書で使用されるように、「患者」または「処置に適した対象」は、齧歯類（例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス（ｍｏｕｓｅ））、マウス（ｍｕｒｉｎｅ）（例えば、マウス（ｍｏｕｓｅ））、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）（例えば、イヌ（ｄｏｇ））、ネコ（ｆｅｌｉｎｅ）（例えば、ネコ（ｃａｔ））、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）（例えば、ウマ（ｈｏｒｓｅ））、霊長類、サル（ｓｉｍｉａｎ）（例えば、サル（ｍｏｎｋｅｙ）または類人猿）、サル（ｍｏｎｋｅｙ）（例えば、マーモセット、ヒヒ、アカゲザル）、類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）、またはヒトなどの哺乳動物であってよい。他の実施形態では、非ヒト哺乳動物、特にヒトにおいて治療効果を実証するためのモデルとして習慣的に使用されている哺乳動物（例えば、マウス（ｍｕｒｉｎｅ）、霊長類、ブタ、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）、ラクダ、ラマ、またはウサギ）を用いてもよい。
【００６２】
本発明の他の態様および実施形態は、本明細書に記載される態様および実施形態に用語「からなる」で置き換えられる用語「含む」を、上に記載される態様および実施形態に用語「本質的にからなる」で置き換えられる用語「含む」を提供する。
【００６３】
本明細書で使用されるように、「および／または」は、他を含むまたは含まず、２つまたはそれよりも多い特定の特色または構成成分のそれぞれの具体的な開示と解釈するべきである。例えば、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」は、まるでそれぞれが個別に提示されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、（ｉｉｉ）Ｃ、（ｉｖ）ＡおよびＢ、（ｖ）ＡおよびＣ、（ｖｉ）ＢおよびＣならびに（ｖｉｉ）ＡおよびＢおよびＣそれぞれの具体的な開示と解釈するべきである。
タンパク質の立体構造動力学を変化させる方法
【００６４】
ペプチド原性タンパク質は当技術分野で周知の標準分子生物学変異誘発技法を使用して作成することができる。例えば、ペプチド原性タンパク質は、例えば、エラープローンＰＣＲ、無作為ヌクレオチド挿入もしくは欠失または組換えに先立つ他の方法などの当技術分野で周知である無作為変異誘発により作成することができる。
【００６５】
ペプチド原性タンパク質を作成するためには、タンパク質操作を用いてもよい。単一もしくは複数アミノ酸置換、欠失、挿入、または融合タンパク質を含む、当業者に公知である組換えＤＮＡ技術を使用してペプチド原性タンパク質を作り出すことができる。そのようなペプチド原性タンパク質は、本明細書に記載される開始タンパク質に類似する立体構造を維持しつつ変化した立体構造動力学を有するペプチド原性タンパク質に対してスクリーニングしてもよい。
【００６６】
例えば、ペプチド原性タンパク質の立体構造動力学を増加するために、以下の表、表１は、Ｌｏｌａｄｚｅら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．３２０巻、３４３〜３５７頁（２００２年）の表１および２に由来するタンパク質の範囲の例示的なアミノ酸置換についてのギブズ自由エネルギーの平均変化を示している［注記：この研究論文は突然変異体と野生型タンパク質の間のギブズ自由エネルギーを表す場合は非標準的慣例を使用しており、すなわち、不安定化を示すのにマイナスの値（ΔΔＧ＝ΔＧ（突然変異体）−ΔＧ（ＷＴ））を使用している；標準的慣例はプラスの変化が不安定化を示していることである（ΔΔＧ＝ΔＧ（ＷＴ）−ΔＧ（突然変異体）、上の段落［００４０］を参照）］。例えば、ＶａｌおよびＬｅｕ（および他のより大きな非極性アミノ酸残基）は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、および／またはＧｌｙなどのより小さなアミノ酸残基で置換することができる。さらに、未変性タンパク質構造中のＧｌｕの埋没部位はＬｅｕ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、および／またはＧｌｙで置換することができる。示されている種類の単一部位アミノ酸置換は、一般に開始タンパク質の全体的立体構造にほとんど影響を与えない。
【表１】
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【００６７】
タンパク質のコアにおいて立体構造動力学を増加させる不安定化突然変異を記載している別の説明に役立つ研究論文はＫｉｍら、（１９９３年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２巻：５８８〜５９６頁である。この研究では、筆者らは、突然変異Ｐｈｅ２２−＞Ａｌａ（２．１ｋｃａｌ／モル）、Ｔｙｒ２３−＞Ａｌａ（７．０ｋｃａｌ／モル）、Ｔｙｒ３５−＞Ｇｌｙ（５．７ｋｃａｌ／モル）、Ａｓｎ４３−＞Ｇｌｙ（６．０ｋｃａｌ／モル）、およびＰｈｅ４５−＞Ａｌａ（７．２ｋｃａｌ／モル）は、ＢＰＴＩの全体的３Ｄ構造を著しく破壊することなく、ｐＨ３．５でウシ膵臓トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）をカッコに示されるそれぞれの量だけ不安定化することを示している。
【００６８】
さらに、当技術分野で公知の一般則に従って選択される遺伝子欠失、挿入、反転、反復、およびタイプ置換は活性にほとんど効果を有さないはずである。例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換の作り方に関するガイダンスはＢｏｗｉｅ，  Ｊ．  Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７巻：１３０６〜１３１０頁（１９９０年）に提供されており、そこで、筆者らは、変化に対するアミノ酸配列の寛容を研究するためには２つの主なアプローチがあることを示している。第１の方法は、進化の過程に依拠し、突然変異は自然淘汰により受け入れられるかまたは拒絶される。第２のアプローチは、クローニングされた遺伝子の特定の位置にアミノ酸変化を導入する遺伝子操作および機能性を維持する配列を同定する選択またはスクリーニングを使用する。
【００６９】
筆者らが述べているように、これらの研究により、タンパク質がアミノ酸置換に驚くほど寛容であることが明らかにされた。筆者らは、どのアミノ酸変化がタンパク質のある特定の位置で許容的になる可能性があるかをさらに示している。例えば、大半の埋没アミノ酸残基は非極性側鎖を必要とし、一般的に保存されている表面側鎖の特色はほとんどない。他のそのような表現型的にサイレントな置換は、上記のＢｏｗｉｅ，  Ｊ．Ｕ．ら、およびそこに引用される参考文献に記載されている。典型的に保存的置換として見られるのが、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間の互いの置換え；ヒドロキシル担持残基、ＳｅｒおよびＴｈｒの相互交換；酸性残基、ＡｓｐおよびＧｌｕの交換；側鎖アミド担持残基、ＡｓｎおよびＧｌｎ間の置換；塩基性アミノ酸、ＬｙｓおよびＡｒｇの交換；ならびに芳香族残基、ＰｈｅおよびＴｙｒ間の置換えである。
【００７０】
好ましい実施形態では、開始タンパク質の立体構造動力学は、（ａ）少なくとも１つのスレオニンをバリン、アラニン、グリシンもしくはセリンで；または（ｂ）少なくとも１つのシステインをアラニン、バリン、グリシン、セリンもしくはスレオニンで；または（ｃ）少なくとも１つのバリンをアラニン、グリシン、ロイシンもしくはイソロイシンで；または（ｄ）少なくとも１つのロイシンをアラニン、バリン、グリシン、もしくはイソロイシンで；または（ｅ）少なくとも１つのイソロイシンをアラニン、バリン、イソロイシン、もしくはグリシンで；または（ｆ）少なくとも１つのプロリン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンをアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、もしくはグリシンで；または（ｇ）少なくとも１つのアスパラギン酸をグルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンで；または（ｈ）少なくとも１つのグルタミン酸をアスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｉ）少なくとも１つのリシンをアルギニン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｊ）少なくとも１つのアルギニンをリシン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｋ）少なくとも１つのヒスチジンをリシン、アルギニン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、もしくはグルタミンで；または（ｌ）少なくとも１つのアラニンをグリシンもしくはプロリンで；または（ｍ）少なくとも１つのアスパラギンをグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、グルタミン、アスパラギン酸、もしくはグルタミン酸で；または（ｎ）少なくとも１つのグルタミンをグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、もしくはヒスチジンで；または（ｏ）少なくとも１つのグリシンをアラニンもしくはプロリンで；または（ｐ）少なくとも１つの残基を非天然アミノ酸で；または（ｑ）（ａ）〜（ｐ）の任意の組み合わせで置き換えることによりにより変化させられる。なおさらに好ましい実施形態では、開始タンパク質の立体構造動力学は、（ａ）少なくとも１つのトリプトファンをチロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニンもしくはグリシンで；または（ｂ）少なくとも１つのチロシンをフェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニンもしくはグリシンで；または（ｃ）少なくとも１つのフェニルアラニンをチロシン、メチオニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニンもしくはグリシンで；または（ｄ）少なくとも１つのプロリンをメチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、もしくはグリシンで；または（ｅ）少なくとも１つのヒスチジンをフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、グリシン、リシン、アルギニン、セリン、スレオニン、アスパラギン、もしくはグルタミンで；または（ｆ）少なくとも１つのメチオニンをイソロイシン、ロイシン、バリン、アラニンもしくはグリシンで；または（ｇ）少なくとも１つのイソロイシンをロイシン、バリン、アラニンもしくはグリシンで；または（ｈ）少なくとも１つのロイシンをイソロイシン、バリン、アラニンもしくはグリシンで；または（ｉ）少なくとも１つのバリンをアラニン、グリシン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｊ）少なくとも１つのシステインをアラニン、バリン、グリシン、セリンもしくはスレオニンで；または（ｋ）少なくとも１つのアスパラギン酸をグルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｌ）少なくとも１つのグルタミン酸をアスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｍ）少なくとも１つのアラニンをグリシンもしくはプロリンで；または（ｎ）少なくとも１つのセリンをアラニンもしくはグリシンで；または（ｏ）少なくとも１つのグリシンをアラニンもしくはプロリンで；または（ｐ）少なくとも１つのリシンをアルギニン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシンもしくはイソロイシンで；または（ｑ）少なくとも１つのアスパラギンをグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸で；または（ｒ）少なくとも１つのグルタミンをグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、もしくはヒスチジンで；または（ｓ）少なくとも１つのアルギニンをリシン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニンバリン、メチオニン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｔ）少なくとも１つのスレオニンをバリン、アラニン、グリシンもしくはセリンで；または（ｕ）疎水性残基をより小さな類似の疎水性残基で；または（ｖ）少なくとも１つの残基を非天然アミノ酸で；または（ｗ）任意の上記の組み合わせで置き換えることによりにより変化させられる。一部の実施形態では、疎水性残基が置換えの標的にされる。
【００７１】
機能、立体構造、および／または構造に不可欠でありタンパク質表面対内部に位置している開始タンパク質中のアミノ酸は、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４巻：１０８１〜１０８５頁（１９８９年））などの当技術分野で公知の方法により同定することができる。後者の手順では分子中のすべての残基に単一アラニン突然変異を導入する。次いで、得られた突然変異分子は、開始タンパク質に類似する立体構造を維持しつつ変化した立体構造動力学を有する分子に対して試験される。
【００７２】
追加の実施形態では、開始タンパク質のアミノ酸配列は１つまたは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０または５０アミノ酸）を上記の置換アミノ酸（保存的または非保存的置換のいずれか）で置き換えられてペプチド原性タンパク質を生成する。例えば、開始タンパク質の活性を含まない位置および／またはタンパク質構造の内部での置換は容易に行える。リガンド−受容体結合に極めて重要である部位も、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２４巻：８９９〜９０４頁（１９９２年）；およびｄｅ  Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５巻：３０６〜３１２頁（１９９２年））などの構造分析により決定することができる。
【００７３】
当業者に公知のコンビナトリアル変異誘発および合成的ＤＮＡ合成アプローチを用いる組換えＤＮＡ技術を使用して、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または融合タンパク質を含むペプチド原性タンパク質を作り出すこともできる。次いで、そのような改変ポリペプチドは、開始タンパク質に類似する立体構造を維持しつつ変化した立体構造動力学に対してスクリーニングしてもよい。
【００７４】
このようにして、１つまたは複数のアミノ酸残基が欠失、付加、または置換されているペプチド原性タンパク質を作って、変化した立体構造動力学を有するペプチド原性タンパク質を作成することができる。例えば、タンパク質の疎水性「コア」の残基は、コアに空洞を作り出し詰込みを破壊するためにより小さな側鎖（上記参照）を有する非極性残基で置換することができ、システイン残基は、ジスルフィド架橋（タンパク質コアに見出されることが多い）を取り除くために欠失させるまたは他のアミノ酸残基で置換することができる。一部の実施形態では、例えば、システインをアラニン、セリン、および／またはグリシン等で置き換えるなど、少なくとも１つのジスルフィド結合が開始タンパク質で取り除かれる。さらなる好ましい実施形態では、少なくとも１つのジスルフィド結合の形成に関与する両システインはアラニン、セリン、および／もしくはグリシンで、または好ましくはアラニンもしくはグリシン等で置き換えられる。
【００７５】
ペプチド原性タンパク質は好ましくは単離された形態で提供され、好ましくは、実質的に精製されている。さらに、ペプチド原性タンパク質は、Ｂ細胞活性化のために安定した３Ｄ立体構造エピトープを示し、合成されたペプチド（化学合成によってなどの）は同時投与することができ、これによりＭＨＣ−ＩＩ提示のためにエピトープを最適化できる。あるいは、ペプチド原性タンパク質およびペプチドはポリヌクレオチドの混合物により発現させることができる。さらに他の実施形態では、ペプチド原性タンパク質は野生型開始タンパク質および合成ペプチド（単数または複数）と組み合わせて免疫応答を誘発することができる。
【００７６】
一部の実施形態では、ポリペプチド分解の速度は、ペプチドの最適ミックスを生成し、適切な時間枠で、抗原提示細胞上で表示されるペプチドの最大の多様性を可能にするように調整してもよい。
【００７７】
表示のためのペプチドを生成するタンパク質抗原（単数または複数）へのタンパク質分解攻撃の複雑さのせいで、抗原の混合物（コンビナトリアルカクテルなどの）を用いた免疫化は有利である。したがって、適切な時間枠での所与のペプチド（Ｔ細胞エピトープ）の生成に最適な「チューニング突然変異（単数または複数）」は別のペプチドの生成に最適な突然変異とは異なっていることがある。混合物として抗原を与えることにより、非常に多くの異なる突然変異タンパク質は単一細胞または複数の細胞によりエンドサイトーシスされ得、これにより、その細胞により生成され表示されるペプチドの多様性が最大になる。
【００７８】
同じ全体的表面特色（すなわち、交差反応Ｂ細胞エピトープ）を有するが立体構造動力学は異なる２つまたはそれよりも多いはっきり異なる抗原で対象が免疫化されるコンビナトリアル免疫化は、Ｔ細胞エピトープの多様性を富ませる。単回接種（タンパク質ベースとヌクレオチドベースの両方）で何百または何千もの異なる免疫原を含むこのコンビナトリアルアプローチはＢ細胞エピトープレパートリーを大いに増加させることができる。なぜならば、ミックス中のすべての分子が野生型様立体構造を維持しつつ１つまたは複数の独特のＴ細胞エピトープに貢献できるからである。一部の態様では、野生型立体配置が維持されるために、Ｂ細胞エピトープレパートリーは、アンサンブル中の最も安定な（およびおそらく野生型様の）分子のほうに偏っている。
ペプチド原性タンパク質は開始タンパク質と類似する立体構造を有する
【００７９】
ペプチド原性タンパク質が「開始タンパク質に類似する立体構造」を有するかどうかの運用試験は交差反応抗体、特に、立体構造（３Ｄ）エピトープを認識する抗体がペプチド原性タンパク質と開始タンパク質の両方に特異的に結合するかどうかである。本発明では、「交差反応性」または「交差反応抗体」は、解離定数（ＫＤ）、オフレート（ｋｏｆｆ）、および／またはオンレート（ｋｏｎ）に基づいて測定することができる「結合親和性」の点から定義される。
【００８０】
例えば、交差反応抗体はペプチド原性タンパク質と開始タンパク質の両方に５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍもしくは１０−８Ｍ未満またはこれに等しい解離定数またはＫＤで結合する。さらにより好ましくは、交差反応抗体はペプチド原性タンパク質と開始タンパク質の両方に５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、もしくは１０−１４Ｍ未満またはこれに等しい解離定数ＫＤで結合する。本発明は、個々の列挙される値のそれぞれの間にある範囲のいずれか１つ内であるペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質についての解離定数またはＫＤを包含する。さらに、ペプチド原性タンパク質に結合する抗体についてのＫＤは開始タンパク質に関するそのＫＤと同一でなくてもよいことが具体的に企図されており、好ましい実施形態では、ペプチド原性タンパク質に結合する抗体についてのＫＤは開始タンパク質へのその結合についてのＫＤよりも低い。操作上、この場合のＫＤとは抗原に対する抗体の機能的親和性を指すことは理解されている。機能的なまたは「見掛けの」親和性は抗原に結合できる複数の相互作用部位（例えば、Ｆａｂアーム）を含有する多価抗体で増強されてもよい（「結合活性効果」）。
【００８１】
さらに、交差反応抗体はペプチド原性タンパク質と開始タンパク質の両方に５×１０−２ｓｅｃ−１、１０−２ｓｅｃ−１、５×１０−３ｓｅｃ−１もしくは１０−３ｓｅｃ−１未満またはこれに等しいオフレート（ｋｏｆｆ）で結合する。より好ましくは、交差反応抗体はペプチド原性タンパク質と開始タンパク質の両方に５×１０−４ｓｅｃ−１、１０−４ｓｅｃ−１、５×１０−５ｓｅｃ−１、または１０−５ｓｅｃ−１、５×１０−６ｓｅｃ−１、１０−６ｓｅｃ−１、５×１０−７ｓｅｃ−１もしくは１０−７ｓｅｃ−１未満またはこれに等しいオフレート（ｋｏｆｆ）で結合する。本発明は、個々の列挙される値のそれぞれの間にある範囲のいずれか１つ内であるペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質についてのオフレート（ｋｏｆｆ）を包含する。さらに、ペプチド原性タンパク質に対する抗体のｋｏｆｆは開始タンパク質のｋｏｆｆと同一でなくてもよいことが具体的に企図されており、好ましい実施形態では、ペプチド原性タンパク質への抗体の結合についての（ｋｏｆｆ）は開始タンパク質への抗体の結合についての（ｋｏｆｆ）よりも大きい。
【００８２】
交差反応性について試験するアッセイは本明細書に記載されているまたは当技術分野では公知である。例えば、結合アッセイは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１（１９９２））、ビーズ上（例えば、Ｌａｍ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４（１９９１））、チップ上（例えば、Ｆｏｄｏｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６（１９９３））、細菌上（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号）、芽胞上（例えば、特許第５，５７１，６９８号；同第５，４０３，４８４号；および同第５，２２３，４０９号）、プラスミド上（例えば、Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９（１９９２））またはファージ上（例えば、Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６（１９９０）；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２（１９９０）；およびＦｅｌｉｃｉ，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０（１９９１））で実施することができる。そのようなアッセイの例は下の実施例においてさらに記載されている。
抗体を産生するためのペプチド原性タンパク質の使用
【００８３】
ペプチド原性タンパク質を使用して、例えば、当技術分野で記載される方法などの当業者に周知の方法により抗体を産生することができる。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、（上記参照）；Ｗｉｌｓｏｎら、（上記参照）；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２巻：９１０〜９１４頁（１９８５年）；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６巻：２３４７〜２３５４頁（１９８５年）を参照されたい。ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化を使用した場合、動物は本明細書に記載されるペプチド原性タンパク質および／またはペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて免疫化してもよい。
【００８４】
ウサギ、ラット、マウス、ラマ、ラクダ、および／またはウシなどの動物はペプチド原性タンパク質および／またはペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて免疫化することができる。例えば、ペプチド原性タンパク質もしくは担体タンパク質およびフロイントアジュバントまたは免疫応答を刺激することで知られている他の任意のアジュバントを約１００マイクログラム含有するエマルジョンの腹腔内および／または皮内注射を使用してもよい。例えば、固体表面に直接的にまたは間接的に（例えば、ビオチン化ＡｖｉＴａｇを介して）吸着された遊離のペプチド原性タンパク質を使用するＥＬＩＳＡアッセイにより検出することができる有用な力価の抗ペプチド原性タンパク質抗体を提供するためには、数回の追加免役注射が、例えば、約２週間の間隔で必要になることがある。免疫動物由来の血清中の抗ペプチド原性タンパク質抗体の力価は、例えば、当技術分野で周知の方法に従って固体支持体上のペプチド原性タンパク質への吸着および選択された抗体の溶出により抗ペプチド原性タンパク質抗体を選択することによって増加してもよい。そのような選択は開始タンパク質を使用しても行うことができる。
【００８５】
さらに、開示された方法により産生される抗体は、例えば、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイまたはリボソームディスプレイなどのディスプレイ技術を使用して親和性成熟させることができる。一例では、ファージ粒子表面に表示された一本鎖抗体分子（「ｓｃＦｖ」）は、ペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質に免疫特異的に結合するｓｃＦｖを同定するためにスクリーニングされる。本発明は、ペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質に免疫特異的に結合することが確認されているｓｃＦｖとその部分の両方を包含する。そのようなｓｃＦｖは、例えば、ｓｃＦｖのＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を、定常ドメイン配列を含有し免疫グロブリン分子の発現を指示するように操作されている発現ベクターに挿入することにより、ルーチン的に免疫グロブリン分子に「変換する」ことができる。
【００８６】
ペプチド原性タンパク質および／または本発明のペプチド原性タンパク質（ｓｃＦｖおよびその抗体断片または変異体を含む、あるいはそれからなる他の分子（例えば、本発明の抗体の重もしくは軽鎖またはその部分または本発明の一本鎖抗体）を含む）をコードするポリヌクレオチドを使用して産生される抗体の組換え発現には、抗体またはその断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター（単数または複数）を構築する必要がある。本発明の抗体分子（例えば、全抗体、抗体の重もしくは軽鎖、またはその変異体もしくは部分（好ましくは、重または軽鎖可変ドメインを含有するが、必ずしも含有しなくてもよい））をコードするポリヌクレオチドが得られた後は、抗体分子の生成のためのベクター（単数または複数）は、当技術分野で周知の技法を使用する組換えＤＮＡ技術により生成してもよい。したがって、コードヌクレオチド配列をコードする抗体を含有するポリヌクレオチドを発現させることにより抗体を調製するための方法は本明細書に記載されている。当業者に周知である方法を使用して、抗体コード配列（ペプチド原性タンパク質をコードする配列はもちろん）ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えを含む。したがって、本発明は、プロモーターに作動可能に連結したペプチド原性タンパク質またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体（例えば、全抗体、抗体の重もしくは軽鎖、抗体の重もしくは軽鎖可変ドメイン、もしくはその部分、または重もしくは軽鎖ＣＤＲ、一本鎖Ｆｖ、またはその断片もしくは変異体）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ／８６／０５８０７；ＰＣＴ公開ＷＯ／８９／０１０３６、および米国特許第５，１２２，４６４号参照）、抗体の可変ドメインは全重鎖、全軽鎖、または全重および軽鎖の両方の発現のためにそのようなベクターにクローニングしてもよい。
【００８７】
発現ベクター（単数または複数）は従来の技法により宿主細胞に移入することができ、次いでトランスフェクトされた細胞は従来の技法により培養されてペプチド原性タンパク質またはペプチド原性タンパク質に対して産生された抗体のいずれかを生成する。したがって、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結した、ペプチド原性タンパク質またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体（例えば、全抗体、その重もしくは軽鎖、もしくはその部分、または本発明の一本鎖抗体、もしくはその断片もしくは変異体）をコードするポリヌクレオチド（単数または複数）を含有する宿主細胞を含む。好ましい実施形態では、下に詳述されるように、全抗体分子の発現では、重鎖と軽鎖の両方をコードするベクターを全免疫グロブリン分子の発現のための宿主細胞において同時発現させてもよい。
【００８８】
種々の宿主発現ベクター系を利用して、ペプチド原性タンパク質またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体を発現させてもよい。そのような宿主発現系は目的のコード配列が作成され、引き続いて精製される媒体を表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされると、ペプチド原性タンパク質またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体を発現し得る細胞も表す。これらは、配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの微生物；コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）が感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）が感染したもしくはコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノムに由来する（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスに由来する（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）プロモーターを含有する組換え発現構築物を宿す哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）を含むがこれらに限定されない。好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、より好ましくは、真核細胞がペプチド原性タンパク質または組換え抗体分子のいずれかの発現に使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと併せて、効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ  ４５巻：１０１頁（１９８６年）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８巻：２頁（１９９０年））。
【００８９】
細菌系では、使用目的に応じていくつかの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、大量のタンパク質（ペプチド原性タンパク質であれペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体であれ）を生成しようとする場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましいことがある。そのようなベクターは、融合タンパク質が生成されるようにコード配列が個々にベクター中ｌａｃ  Ｚコード領域とインフレームにライゲートされてもよいＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ  １．２巻：１７９１頁（１９８３年））；ｐＩＮベクター（ＩｎｏｕｙｅおよびＩｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３巻：３１０１〜３１０９頁（１９８５年）；Ｖａｎ  ＨｅｅｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２４巻：５５０３〜５５０９頁（１９８９年））；および同類のものを含むがこれらに限定されない。ｐＧＥＸベクターを使用して、外来ポリペプチドをグルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させてもよい。一般には、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合、続いて遊離のグルタチオンの存在下での溶出により溶解した細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から放出できるように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【００９０】
昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして使用してペプチド原性タンパク質またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体を発現させてもよい。ウイルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞で増殖する。コード配列はウイルスの必須ではない領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれてもよい。
【００９１】
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルスベースの発現系を利用してもよい。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的のコード配列はアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三連リーダー配列にライゲートしてもよい。次いで、このキメラ遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入してもよい。
【００９２】
ウイルスゲノムの必須ではない領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入により、生存可能であり感染した宿主においてペプチド原性タンパク質またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体を発現することができる組換えウイルスが得られる（例えば、ＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８  １巻：３５５〜３５９頁（１９８４年）参照）。
【００９３】
挿入されたコード配列の効率的な翻訳には特定の開始シグナルも必要になることがある。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、開始コドンは、全インサートの翻訳を確実にするためには所望のコード配列のリーディングフレームと同調していなければならない。これら外来性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然でも合成でも、種々の起源のものであってよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写終結因子等を含むことにより増強されることがある（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３巻：５１〜５４４頁（１９８７年）参照）。
【００９４】
さらに、挿入された配列の発現を調節する、または所望の具体的な形式で遺伝子産物を改変しプロセシングする宿主細胞株を選んでもよい。タンパク質産物のそのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）はタンパク質の機能に重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的で特異的なメカニズムを有する。発現された外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするため適切な細胞系列または宿主系を選ぶことができ、この目的のため、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用してもよい。そのような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ならびに、特に、例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄなどの乳がん細胞系列、ならびに、例えば、ＣＲＬ７Ｏ３ＯおよびＨｓＳ７８Ｂｓｔなどの正常な乳腺細胞系列を含むがこれらに限定されない。
【００９５】
組換えタンパク質の長期の高収率生成のためには、安定した発現が好ましい。例えば、ペプチド原性タンパク質またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体を安定的に発現する細胞系列を操作してもよい。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するよりはむしろ、宿主細胞は適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位等）により制御されるポリヌクレオチドおよび選択可能マーカーで形質転換することができる。外来ポリヌクレオチドの導入に続いて、操作された細胞を強化培地で１〜２日間増殖させておいてもよく、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミド中の選択可能マーカーにより、選択に対して耐性を与えられ、細胞がプラスミドをその染色体に安定的に組み込み、増殖して細胞増殖巣を形成するのが可能になり、次にクローニングして細胞系列に拡大させることができる。この方法を、ペプチド原性タンパク質またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体を発現する細胞系列を操作するために有利に使用してもよい。
【００９６】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１巻：２２３頁（１９７７年））、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋａおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ４８巻：２０２頁（１９９２年））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ  ２２巻：８号１７頁（１９８０年））遺伝子を含むがこれらに限定されないいくつかの選択系を使用してもよく、これらの遺伝子はそれぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞で用いることができる。さらに、以下の遺伝子：メトトレキセート耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７巻：３５７頁（１９８０年）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８巻：１５２７頁（１９８１年））；ミコフェノール酸耐性を与えるｇｐｔ（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８巻：２０７２頁（１９８１年））；アミノグリコシドＧ−４１８耐性を与えるｎｅｏ（Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２  １５（Ｍａｙ；１９９３））およびハイグロマイシン耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ  ３０巻：１４７頁（１９８４年））について代謝拮抗剤耐性を選択の基準として使用することができる。組換えＤＮＡ技術の分野で一般に公知の方法をルーチン的に適用して所望の組換えクローンを選択してもよく、そのような方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、（ｅｄｓ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；およびＣｈａｐｔｅｒｓ  １２  ａｎｄ  １３，  Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら、（ｅｄｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；  Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載されている。
【００９７】
ペプチド原性タンパク質またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体の発現レベルはベクター増幅により増加させることができる（概説については、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ、３巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７年）参照）。ペプチド原性タンパク質またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体を発現しているベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞培養物中に存在する阻害剤のレベルが増加するとマーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅された領域はコード配列と関連しているために、ペプチド原性タンパク質またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体の生成も増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３巻：２５７頁（１９８３年））。
【００９８】
ベクター配列に含めることができる他のエレメントは、異種シグナルペプチド（分泌シグナル）、膜アンカー配列、イントロン、選択的スプライシング部位、翻訳開始および停止シグナル、インテイン、ビオチン化部位および翻訳後修飾を促進する他の部位、精製タグ、他のタンパク質またはペプチドに融合物をコードする配列、配列内リボソーム再進入部位により分離される別々のコード領域、例えば、選択可能性（例えば、抗生物質耐性）または分別性（例えば、蛍光）を与える「マーカー」タンパク質をコードする配列、修飾ヌクレオチド、ならびに他の公知のポリヌクレオチドシス作用特色を含むが、これらの例に限定されない。
【００９９】
抗体の場合、宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター、重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２のベクターで同時トランスフェクトしてもよい。２つのベクターは、重および軽鎖ポリペプチドの同等な発現を可能にする同一の選択可能マーカーを含有していてもよい。あるいは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方をコードし発現することができる単一ベクターを使用してもよい。そのような状況では、軽鎖は好ましくは重鎖の前に置かれて過剰な有毒の遊離重鎖を回避する（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２巻：５２頁（１９８６年）；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７巻：２号  １９７頁（１９８０年））。重および軽鎖のコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡ配列を含んでもよい。
【０１００】
ペプチド原性タンパク質またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体が組換え発現により生成された後は、ペプチド原性タンパク質またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体は、タンパク質の精製のための当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性（特に、プロテインＡ親和性および特定の抗原に対する免疫親和性により）、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差次的可溶性により、またはタンパク質の精製のための他の任意の標準技法により精製されてもよい。さらに、ペプチド原性タンパク質またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体は、精製を促進するために本明細書に記載されるまたは当技術分野で他に公知の異種ポリペプチド配列に融合させてもよい。
【０１０１】
一例では、本明細書に記載されるペプチド原性タンパク質またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインもしくはその部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはその任意の組合せおよびその部分）、またはアルブミン（組換えヒトアルブミンまたはその断片もしくは変異体を含むがこれらに限定されない（例えば、１９９９年３月２日発行の米国特許第５，８７６，９６９号、欧州特許第０４１３６２２号および１９９８年６月１６日発行の米国特許第５，７６６，８８３号参照））と融合させて、キメラポリペプチドを得てもよい。そのような融合タンパク質は精製を促進することがあり、ｉｎ  ｖｉｖｏで半減期を増加することがある。これは、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている。例えば、ＥＰ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３１巻：８４〜８６頁（１９８８年）を参照されたい。上皮性関門を通過して免疫系までの抗原の増強された送達は、ＩｇＧまたはＦｅ断片などのＦｃＲｎ結合パートナーにコンジュゲートされた抗原（例えば、インスリン）について実証されている（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２２０２４およびＷＯ９９／０４８１３参照）。ＩｇＧ部分ジスルフィド結合のせいでジスルフィド連結二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク質は、単量体ポリペプチドまたはその断片単独より他の分子と結合しそれを中和するのがより効率的であることも見出されている。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０巻：３９５８〜３９６４頁（１９９５年）を参照されたい。本明細書に記載されるペプチド原性タンパク質または抗体をコードする核酸は、発現されたポリペプチドの検出および精製に役立つように、エピトープタグ（例えば、赤血球凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグタグ）として目的の遺伝子と組み換えることもできる。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらにより記載される系は、ヒト細胞系列で発現される非変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８巻：８９７２〜８９７頁）。この系では、目的の遺伝子は、遺伝子のオープンリーディングフレームが６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳的に融合されるように、ワクシニア組換えプラスミド内にサブクローニングされる。タグは融合タンパク質のためのマトリックス結合ドメインとしての役割を果たす。組換えワクシニアウイルスが感染している細胞由来の抽出物はＮｉ２＋ニトリロ酢酸アガロースカラムにロードされ、ヒスチジンタグ付きタンパク質はイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶出させることができる。
ワクチン接種
【０１０２】
ペプチド原性タンパク質および／またはペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの混合物を使用して動物にワクチン接種することができる。このワクチン接種によりペプチド原性タンパク質に対する抗体が産生される可能性がある。上記の処置に適した対象は、齧歯類（例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス（ｍｏｕｓｅ））、マウス（ｍｕｒｉｎｅ）（例えば、マウス（ｍｏｕｓｅ））、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）（例えば、イヌ（ｄｏｇ））、ネコ（ｆｅｌｉｎｅ）（例えば、ネコ（ｃａｔ））、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）（例えば、ウマ（ｈｏｒｓｅ））、霊長類、サル（ｓｉｍｉａｎ）（例えば、サル（ｍｏｎｋｅｙ）または類人猿）、サル（ｍｏｎｋｅｙ）（例えば、マーモセット、ヒヒ、アカゲザル）、類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）、またはヒトなどの哺乳動物であってよい。一部の好ましい実施形態では、対象はヒトである。他の実施形態では、非ヒト哺乳動物、特にヒトにおいて治療効果を実証するためのモデルとして習慣的に使用されている哺乳動物（例えば、マウス（ｍｕｒｉｎｅ）、霊長類、ブタ、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）、またはウサギ動物）を用いてもよい。
【０１０３】
一部の実施形態では、ペプチド原性タンパク質は、ワクチンのために使用されるキメラ融合タンパク質、例えば、別のタンパク質に融合されているウイルスタンパク質である。
【０１０４】
ワクチン接種戦略は、ペプチド原性タンパク質に対する記憶Ｂ細胞および記憶Ｔ細胞の発生を可能にするため、本明細書に記載される対象へのペプチド原性タンパク質および／またはペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの反復投与に基づくことができる。ワクチン接種は予防的または治療的のいずれかで行うことができる。ペプチド原性タンパク質は同じ開始タンパク質由来または複数の開始タンパク質由来であり得る。予防的ワクチン接種戦略は病原体に対する予防的適応免疫を生成するのに対象の免疫系を刺激することを目指すが、治療的ワクチン接種戦略の目標は、疾患がすでに確立した後にまたは対象中に存在する臨床的状況を改善するために行われる。
【０１０５】
タンパク質分解プロセシングは、ペプチド原性タンパク質などの抗原が、エンドサイトーシスおよびエンドソームのリソソームとの融合後抗原提示細胞においてプロセシングされることを含む。次いで、エンドソームはクラスＩＩ  ＭＨＣ分子を含有するゴルジ装置由来のエキソサイトーシス小胞とマージして、それに生じたペプチドが結合する。次いで、ＭＨＣ−ペプチド複合体は細胞膜まで通行し、そこで抗原はＣＤ４＋Ｔ細胞への表示に利用可能である。ペプチド原性タンパク質のタンパク質分解プロセシングのいかなる制限もペプチド産物の多様性の狭小化を促進するおそれがあり、そのためクラスＩＩ  ＭＨＣ分子が与えられる安定な結合パートナーを選択するもとの選択肢が少なくなり、このために主要抗原決定基の現象が悪化するおそれがある。高められた免疫優性は、今度は集団中の非応答者の割合を増やし得る。なぜならば、免疫応答性はクラスＩＩ  ＭＨＣ対立遺伝子の遺伝的特徴に支配されているからである。したがって、本明細書に記載されるペプチド原性タンパク質および／またはペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの混合物を使用するワクチンはエンドソーム内タンパク質分解プロセシングから生じる抗原ペプチドの多様性を増加するはずであり、したがって、ワクチンの有効性を増加すると予想される。
ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの動物への導入
【０１０６】
ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは動物に直接導入することもできる。例えば、米国特許第５，６７６，９５４号；同第６，８７５，７４８号；同第５，６６１，１３３号；Ｓａｈｉｎら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，２０１４  Ｏｃｔ；１３（１０）：７５９−８０；Ｋａｒｉｋｏら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２００８  Ｎｏｖ；１６（１１）：１８３３−４０；Ｋａｒｉｋｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ，２０１１，Ｎｏｖ；３９（２１）：ｅ１４２；米国特許第６，５１１，８３２号を参照。一例では、ペプチド原性タンパク質の混合物をコードするＤＮＡ配列などのポリヌクレオチドは宿主動物に直接注射され、ポリヌクレオチドは核内に入ってｍＲＮＡに転写され、ペプチド原性タンパク質を生成する。
【０１０７】
同様に、ポリヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡ（ＩＶＴ  ｍＲＮＡ）などのｍＲＮＡ配列でもあり得る。本質的に、合成ｍＲＮＡはペプチド原性タンパク質を発現するように操作することができ、理想的には、ｍＲＮＡは核に入らずに細胞の細胞質で翻訳される。細胞質では、ｍＲＮＡはリボソームにより解読されてペプチド原性タンパク質に翻訳される。
【０１０８】
どちらの方法でも、次に、ペプチド原性タンパク質はプロセシングされ、使用されてタンパク質を用いた免疫化同様に、抗体を産生する。ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、遺伝子コドン縮重および標準ＤＮＡ合成技法を使用して合成することができる。同じペプチド原性タンパク質、同じ開始タンパク質に由来する異なるペプチド原性タンパク質、および／または異なる開始タンパク質に由来する異なるペプチド原性タンパク質をコードする異なるポリヌクレオチドの混合物を使用することができる。
【０１０９】
抗体を産生するために使用することができる動物はウサギ、ラット、マウス、ラマ、および／またはウシを含むがこれらに限定されない。本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、筋肉内、皮内、鼻腔内、皮下、静脈内、気管内、およびくも膜下腔内送達を介して動物に注射することができる。抗体を産生するこの方法は従来の方法論と比べて多くの種の抗体の同時生成を可能にし、生成される抗体のレパートリーを実質的に増加させる。
製剤
【０１１０】
医薬組成物は、本明細書に記載されるペプチド原性タンパク質、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体を、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、希釈剤、充填剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤、潤滑剤、または当業者に周知の他の材料と共に含んでもよい。適切な材料は無菌で発熱物質を含まない、適切な等張性および安定性を有する。例は、無菌生理食塩水（例えば、０．９％ＮａＣｌ）、水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールもしくは同類の物またはそれらの組合せを含む。そのような材料は非毒性であるべきで、活性化合物の有効性を妨害するべきではない。担体または他の材料の正確な性質は投与経路に依拠し、この経路はボーラス、注入、注射または下で考察される他の任意の適切な経路によるものでもよい。組成物は、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝化剤または同類の物などの補助剤をさらに含有してもよい。適切な担体、賦形剤等は標準医薬品テキスト、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９９０年に見出すことができる。
【０１１１】
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される」とは、妥当な利益／リスク比と釣り合っており、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症がなく堅実な医学的判断の範囲内で対象（例えば、ヒト）の組織に接触させて使用するのに適している化合物、材、組成物、および／または剤形に関係する。各担体、賦形剤等は、製剤中の他の成分と適合するという意味でも「許容でき」なければならない。
【０１１２】
一部の実施形態では、ペプチド原性タンパク質、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体は、投与に先立つ再構成のために凍結乾燥形態で提供してもよい。例えば、凍結乾燥試薬は、対象への投与に先立って減菌水で再構成され生理食塩水と混合されてもよい。
【０１１３】
さらに、ペプチド原性タンパク質、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体の「カクテル」が具体的に企図されている。例えば、異なるペプチド原性タンパク質または同じ開始タンパク質由来の異なるペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの混合物を使用して免疫応答を開始することができる。あるいは、異なるペプチド原性タンパク質または異なる開始材料由来の異なるペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの混合物を使用して免疫応答を開始することもできる。
【０１１４】
製剤は単位剤形で都合よく提示してもよく、薬学分野で周知の任意の方法によって調製してもよい。そのような方法は、活性化合物を１つまたは複数の副成分を構成する担体と混ぜ合わせるステップを含む。一般に、製剤は、活性化合物を液体担体または微粉化した固体担体または両方と均一に密接に混ぜ合わせ、次いで必要な場合は、製品に成形することにより調製される。
【０１１５】
製剤は液体剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤、シロップ剤、錠剤、ロゼンジ剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、アンプル剤、坐剤、膣坐剤、軟膏剤、ゲル剤、ペースト剤、クリーム剤、スプレー剤、ミスト剤、フォーム剤、ローション剤、油剤、ボーラス剤、舐剤、またはエアゾール剤の形態であってもよい。
【０１１６】
任意選択で、他の治療または予防剤を医薬組成物または製剤に含んでいてもよい。
【０１１７】
処置は、ヒトであれ動物（例えば、獣医学的用途）であれ、任意の処置および治療でもよく、ある程度の所望の治療効果、例えば、状態の進行の阻害もしくは遅延が達成され、治療効果は進行速度の低下、進行速度の抑止、状態の寛解、状態の治癒もしくは軽快（部分的であれ全体的であれ）、１つまたは複数の症状および／もしくは状態の徴候の予防、遅延、低減もしくは停止、または処置をしなかった場合に予想されるよりも長い対象もしくは患者の生存の延長を含む。
【０１１８】
予防的措置（すなわち、予防法）としての処置も含まれる。例えば、疾患の発生または再発を受けやすいまたはそのリスクがある対象は本明細書に記載される通りに処置してもよい。そのような処置は対象において疾患の発生または再発を予防または遅延し得る。
【０１１９】
本明細書で使用される用語「治療有効量」は、妥当な利益／リスク比と釣り合っており、ある程度の所望の治療効果を生み出すのに有効であるペプチド原性タンパク質またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体の量に関係する。
【０１２０】
ペプチド原性タンパク質またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体の適切な投与量は患者によって変動し得ることは認識されている。最適投与量を決定することは一般に、投与の任意のリスクまたは有害な副作用に対する治療利益のレベルのバランスをとることを含む。選択される投与量レベルは、投与経路、投与時間、活性化合物、他の薬物、化合物、および／もしくは組み合わせて使用される材料の排泄速度、ならびに患者の年齢、性別、体重、状態、健康全般、および過去の病歴を含むがこれらに限定されない種々の要因に依拠する。ペプチド原性タンパク質、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体の量および投与経路は、最終的には医師の裁量によるが、一般には、投与量は、実質的に害になるまたは有害な副作用を引き起こさずに治療部位で活性化合物の濃度を達成するべきである。
【０１２１】
一般に、ペプチド原性タンパク質またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体の適切な用量は１日当たり対象の１キログラム体重当たり約１００μｇ〜約２５０ｍｇの範囲である。ペプチド原性タンパク質またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体が塩、エステル、プロドラッグ、または同類の物である場合、投与される量は親化合物に基づいて計算されるので、使用される実重量は比例的に増加する。
【０１２２】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与は、１回用量で、連続してまたは断続的に（例えば、適切な間隔を置いて分割用量で）実施することができる。投与の最も効果的な手段および投与量を決定する方法は当業者には周知であり、治療のために使用される製剤、治療の目的、処置されている標的細胞、および処置されている対象により変動する。単回または複数回投与は、医師により選択されている用量レベルおよびパターンを用いて行うことができる。
【０１２３】
「同時」投与とは、ペプチド原性タンパク質、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体が、単回用量で同じ投与経路により対象に投与されることを意味する。
【０１２４】
「分離」投与とは、ペプチド原性タンパク質、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体が、同時に起こる２つの異なる投与経路により対象に投与されることを意味する。これは、例えば、一方の薬剤が注入または非経口的に投与され、他方の薬剤が注入または非経口投与の経過中に経口的に与えられる場合に起こってもよい。
【０１２５】
「逐次」とは、ペプチド原性タンパク質、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体が、第２の薬剤が投与される時刻に対象中に最初に投与される薬剤の活性が存在し進行しているという条件で、異なる時点で投与されることを意味する。好ましくは、逐次投薬は、２つの薬剤のうちの第２の薬剤が、第１の薬剤から１２、６、４、２または１時間以内などの、４８時間以内に、好ましくは２４時間以内に投与されるように起こる。
【０１２６】
ペプチド原性タンパク質、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび／またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体の複数用量を投与してもよい。例えば、２、３、４、５または５よりも多い用量をペプチド原性タンパク質、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび／またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体の投与後に投与してもよい。ペプチド原性タンパク質、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび／またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体の投与は最初の投与後長時間続いてもよい。例えば、ペプチド原性タンパク質、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体を用いた処置は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１か月間または少なくとも２か月間続けてもよい。ペプチド原性タンパク質、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体を用いた処置は、治療応答を達成するのに必要な限り期間続けてもよい。
【０１２７】
ペプチド原性タンパク質、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体およびこれらの分子を含む組成物は、経口（例えば、経口摂取により）；ならびに、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、心臓内、くも膜下腔内、脊髄内、嚢内、嚢下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、くも膜下、および胸骨内を含む注射による；例えば、皮下にまたは筋肉内にデポーの移植による非経口を含むがこれらに限定されない、全身的に／末梢的にであれ所望の作用部位にであれ、任意の都合の良い投与経路によって対象に投与してもよい。通常、投与は静脈内経路によるが、腹腔内、皮下、経皮、経口、経鼻、筋肉内または他の都合の良い経路などの他の経路を除外するものではない。
【０１２８】
ペプチド原性タンパク質、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体を含む医薬組成物は、意図される投与経路に適した適切な投与単位製剤に製剤化してもよい。
【０１２９】
経口投与に適している製剤（例えば、経口摂取により）はカプセル剤、カシェ剤、または錠剤などの別々の単位として提示してもよく、それぞれが、散剤もしくは顆粒剤として；水性もしくは非水性液体での溶液剤もしくは懸濁剤として、または水中油液体乳剤もしくは油中水液体乳剤として；ボーラス剤として；舐剤として；またはペースト剤として所定量の活性化合物を含有している。
【０１３０】
錠剤は従来の手段、例えば、任意選択で１つまたは複数の副成分と一緒に圧縮または成形により作成してもよい。圧縮錠剤は、適切な機械で活性化合物を、任意選択で１つまたは複数の結合剤（例えば、ポビドン、ゼラチン、アカシア、ソルビトール、トラガント、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤または希釈剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロース、リン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ）；崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、交差架橋ポビドン、交差架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）；表面活性または分散または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）；および保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、ソルビン酸）と混合して、粉末または顆粒などの流動性形態で圧縮することにより調製してもよい。すりこみ錠剤は、適切な機械で不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を成形することにより作成してもよい。錠剤は任意選択でコーティングまたは刻み目を付けてもよく、例えば、所望の放出プロファイルを提供するように様々な割合でヒドロキシプロピルメチルセルロースを使用してその中の活性化合物の遅効または徐放を提供するように製剤化してもよい。錠剤は任意選択で、胃以外の腸の部分で放出させるように腸溶コーティングして提供してもよい。
【０１３１】
非経口投与（例えば、皮膚、皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む注射による）に適した製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、安定化剤、静菌薬、および製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質を含有してもよい水性および非水性等張で発熱物質を含まない無菌注射液；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含んでいてもよい水性および非水性無菌懸濁液、ならびに化合物を標的の血液構成成分または１つもしくは複数の臓器に向けるように設計されているリポソームまたは他の微小粒子系を含む。そのような製剤で使用するための適切な等張溶剤の例は、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、または乳酸リンゲル注射液を含む。典型的には溶液中の活性化合物の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、例えば、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約１２０ｍｇ／ｍｌ、または生物学的薬物（例えば、タンパク質、抗体等）の投与に適した他の任意の濃度である。製剤は、単回用量または複数回用量が密封された容器、例えば、アンプルおよびバイアルで提示してもよく、使用直前に無菌液体担体、例えば、注射用水の添加しか必要としないフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存してもよい。即席注射液および懸濁液は無菌粉末、顆粒、および錠剤から調製してもよい。製剤は、活性化合物を標的の血液構成成分または１つもしくは複数の臓器に向けるように設計されているリポソームまたは他の微小粒子系の形態でもよい。
【０１３２】
ペプチド原性タンパク質、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および／またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体を含む組成物はそれに続く希釈のために濃縮液の形態で調製してもよく、または投与の準備ができている分割用量の形態でもよい。あるいは、試薬は、ヒトまたは動物対象への投与に先立って、混合するためにキット内で別々に提供されてもよい。
【０１３３】
ペプチド原性タンパク質、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および／またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体は、単独でまたは他の処置と組み合わせて、個々の状況に応じて同時にまたは逐次に、投与してもよい。例えば、本明細書に記載されるペプチド原性タンパク質、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはペプチド原性タンパク質に対して産生される抗体は、１つまたは複数の追加の活性化合物と組み合わせて投与してもよい。
【０１３４】
本発明の種々のさらなる態様および実施形態は、本開示に照らして当業者に明らかになる。
【０１３５】
本出願は、文脈が別の方法で要求していなければ、上記の態様および上に記載される実施形態のいずれかの互いの組合せすべてを開示していることを理解されたい。同様に、本出願は、文脈が別の方法で要求していなければ、好ましいおよび／または任意選択の特色のすべての組合せを単一でまたは他の態様のいずれかと一緒に開示している。
【０１３６】
上記実施形態の改変物、さらなる実施形態およびその改変物は本開示を読めば当業者には明らかになり、したがって、これらの改変物は本発明の範囲内である。本明細書で言及されているすべての文書および配列データベースエントリーはあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。本発明は、以下の実施例を参照して下にさらに説明される。
【実施例】
【０１３７】
（実施例１）
ペプチド原性抗原の産生
ペプチド原性タンパク質を作成するために、開始タンパク質をそのコア残基で修飾（例えば、１つまたは複数の変異）してその立体構造動力学を変更することができる。複数の異なるペプチド原性タンパク質を設計および発現させて、動物（例えば、ウサギ）を免疫して、ポリクローナル抗体応答を生成することができる。あるいは、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、直接的に動物に投与してｉｎ  ｖｉｖｏでペプチド原性タンパク質を作成することができる。応答は、以下の２つの相補的かつ相互に補強される方法によってモニターされる（Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、２０１４年；図２）：  
（ａ）免疫した動物の血液、脾臓、および骨髄からＢ細胞を精製すること、重鎖および軽鎖の可変領域コードするｍＲＮＡからｃＤＮＡを単離すること、ならびにディープＤＮＡシークエンシングを介してこのレパートリーを分析すること；ならびに
（ｂ）固体の支持体に付着させた抗原を使用して免疫血清からポリクローナルＦａｂまたは（Ｆａｂ’）２断片を免疫親和性精製すること、溶出させたＦａｂ／（Ｆａｂ’）２をプロテアーゼで消化すること、および得られたペプチドをＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用してシークエンシングすること。
【０１３８】
具体的には、立体構造は開始タンパク質と類似するが、ペプチド原性タンパク質の立体構造動力学が変動する、種々のペプチド原性タンパク質（またはペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド）での試験動物（ウサギ）の免疫を実施することができる。次世代ＤＮＡシークエンシング技術を用いて、動物における体液性応答を包括的に特徴付けすることができる。Ｂリンパ球から免疫グロブリンＶ領域をクローニングし、大量に並列的にディープシークエンシングに供することができる（５〜８）。これと共に、同じ試験動物からのポリクローナル抗体は、免疫親和性クロマトグラフィーによって精製し、次にプロテアーゼ消化し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供して、ペプチド配列を決定することができる（９、１０）。これらの２つのデータセットの比較により、ポリクローナル応答を含む個々の抗体のレパートリーが解明される（９）。
【０１３９】
例えば、生物物理学的に極めてよく特徴付けられてきた小型哺乳動物タンパク質を試験抗原として使用することができる。好ましい例には、ウシ膵臓トリプシン阻害剤および／またはアルツハイマー型アミロイド前駆体タンパク質Ｋｕｎｉｔｚドメインが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイト抗原などの満たされていないワクチンニーズに関連性のある抗原も、この方法において産生し、試験することができる。加えて、構成成分タンパク質の立体構造動力学に関して合成ワクチンの最適化（または再最適化）（おそらく、異なるコア不安定化変異での同じ抗原の幾つかのバージョンの組合せカクテルで単一構成成分を置き換えること）も、生成することができる。臨床治験においてこれらの新しいワクチンを試験することには、上述の手順に類似する、血液由来Ｂ細胞Ｖ領域レパートリーの類似のＤＮＡ配列分析および免疫親和性精製したポリクローナル抗体ペプチドのプロテオーム特徴付けを使用する、ワクチン接種した個体のモニタリングが関わり得る。
【０１４０】
本明細書中に記載される本発明の実施形態に従って使用することができる抗原の他の好ましい例には、マラリアポリペプチド、例えばトロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）および／または頂端膜抗原１（ＡＭＡ１）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）ｇｐ１２０およびｇｐ４１、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）エンベロープ糖タンパク質Ｅ１およびＥ２、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）スパイク糖タンパク質、ヒトインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）カプシドコア、並びに類人猿、サル、トリ、ブタ、ラクダ、および他の動物に感染する関連ウイルスからの抗原に由来する抗原もしくは抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４１】
好ましい実施形態では、以下の表２に列挙されるＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍタンパク質抗原のいずれか１つは、ペプチド原性タンパク質を誘導するための、開始タンパク質として使用することができる。加えて、表２に列挙される複数の抗原は、抗体を生じさせることを含む、免疫応答を生成する、ワクチンとして使用される複数の異なるペプチド原性タンパク質を誘導するための、開始タンパク質として使用することができる。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【０１４２】
開始タンパク質の立体構造動力学を変更させるために、以下の表３に示される、ギブズ自由エネルギーにおける変化を考慮することができる：
【表３】
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【０１４３】
Ｌｏｌａｄｚｅら（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３２０巻、３４３〜３５７頁（２００２年）に論じられているように、以下のアミノ酸置換が、熱力学的な安定性（例えば、ギブズ自由エネルギーに反映される）を減少させ得るおよび開始タンパク質の立体構造動力学を変化させることができる。例えば、ＶａｌおよびＬｅｕ（および他のより大きな非極性アミノ酸残基）は、より小さなもの、例えばＡｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、および／またはＧｌｙで置換することができる。加えて、開始タンパク質中のＧｌｕの埋没部位は、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、および／またはＧｌｙで置換することができる。これらの単一部位アミノ酸置換は、開始タンパク質より低い安定性を有するが、類似する立体構造を有するペプチド原性タンパク質を作成させると予想される。
【０１４４】
あるいは、開始タンパク質の立体構造動力学は、（ａ）少なくとも１つのスレオニンをバリン、アラニン、グリシンもしくはセリンで；または（ｂ）少なくとも１つのシステインをアラニン、バリン、グリシン、セリンもしくはスレオニンで；または（ｃ）少なくとも１つのバリンをアラニン、グリシン、ロイシンもしくはイソロイシンで；または（ｄ）少なくとも１つのロイシンをアラニン、バリン、グリシン、もしくはイソロイシンで；または（ｅ）少なくとも１つのイソロイシンをアラニン、バリン、ロイシン、もしくはグリシンで；または（ｆ）少なくとも１つのプロリン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンをアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、もしくはグリシンで；または（ｇ）少なくとも１つのアスパラギン酸もしくはアスパラギンをグリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンで；または（ｈ）少なくとも１つのグルタミン酸もしくはグルタミンをアスパラギン酸、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｉ）少なくとも１つのリシンをアルギニン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｊ）少なくとも１つのアルギニンをリシン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｋ）少なくとも１つのヒスチジンをリシン、アルギニン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、グルタミン、アスパラギン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｌ）少なくとも１つのアラニンをグリシンで；または（ｍ）少なくとも１つの残基を非天然アミノ酸で；および／または（ｎ）任意の上記の組み合わせで置き換えることによりにより変化させられる。
【０１４５】
なおさらに好ましい実施形態では、開始タンパク質の立体構造動力学は、（ａ）少なくとも１つのトリプトファンをチロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニンもしくはグリシンで；または（ｂ）少なくとも１つのチロシンをフェニルアラニン、メチオニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニンもしくはグリシンで；または（ｃ）少なくとも１つのフェニルアラニンをチロシン、メチオニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニンもしくはグリシンで；または（ｄ）少なくとも１つのプロリンをメチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、もしくはグリシンで；または（ｅ）少なくとも１つのヒスチジンをフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、グリシン、リシン、アルギニン、セリン、スレオニン、アスパラギン、もしくはグルタミンで；または（ｆ）少なくとも１つのメチオニンをイソロイシン、ロイシン、バリン、アラニンもしくはグリシンで；または（ｇ）少なくとも１つのイソロイシンをロイシン、バリン、アラニンもしくはグリシンで；または（ｈ）少なくとも１つのロイシンをイソロイシン、バリン、アラニンもしくはグリシンで；または（ｉ）少なくとも１つのバリンをアラニン、グリシン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｊ）少なくとも１つのシステインをアラニン、バリン、グリシン、セリンもしくはスレオニンで；または（ｋ）少なくとも１つのアスパラギン酸をグルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｌ）少なくとも１つのグルタミン酸をアスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｍ）少なくとも１つのアラニンをグリシンもしくはプロリンで；または（ｎ）少なくとも１つのセリンをアラニンもしくはグリシンで；または（ｏ）少なくとも１つのグリシンをアラニンもしくはプロリンで；または（ｐ）少なくとも１つのリシンをアルギニン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニン、バリン、メチオニン、ロイシンもしくはイソロイシンで；または（ｑ）少なくとも１つのアスパラギンをグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸で；または（ｒ）少なくとも１つのグルタミンをグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、もしくはヒスチジンで；または（ｓ）少なくとも１つのアルギニンをリシン、ヒスチジン、グリシン、セリン、スレオニン、アラニンバリン、メチオニン、ロイシン、もしくはイソロイシンで；または（ｔ）少なくとも１つのスレオニンをバリン、アラニン、グリシンもしくはセリンで；または（ｕ）疎水性残基をより小さな類似の疎水性残基で；または（ｖ）少なくとも１つの残基を非天然アミノ酸で；または（ｗ）任意の上記の組み合わせで置き換えることにより変化させられている。コンビナトリアルアプローチを使用して、免疫原性を増加させる至適な置換を決定し得る。
（実施例２）
ウシ膵臓トリプシン阻害剤のペプチド原性タンパク質。
【０１４６】
ウシ膵臓トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）は、極めてよく特徴付けられた小さなタンパク質であり、そのフォールディング、構造、活性、熱力学的な特性、発現特性、およびプロテアーゼ特異性を記載する実質的な主要部の文献が存在する（１５）。本発明者ら自身の研究室は、組換えＢＰＴＩを初めて発現させ、部位特異的突然変異誘発を使用してその特性を操作した（１６、１７）。野生型ＢＰＴＩは３つのジスルフィド結合を有し、ジスルフィド１４〜３８、３０〜５１、および５〜５５が架橋される；１４〜３８ジスルフィドは表面にあり、他の２つのジスルフィドはタンパク質の疎水性コアに深く埋没する。これらのジスルフィドのいずれか１つを、２つのジスルフィドシステインをアラニン残基で置き換えることによる変異は、ＢＰＴＩ分子を不安定化する（１８）。ＢＰＴＩのジスルフィド結合変異体の全ての可能な組合せが、本発明者ら自身によっておよび他者によって作製されており、全てが著明に不安定化される。重要なことに、１つまたは２つのネイティブなジスルフィド結合がノックアウトされたＢＰＴＩの全ての組合せの変異体について調べた場合、タンパク質は、それにもかかわらず、野生型ＢＰＴＩに匹敵する類似の三次元構造およびトリプシン阻害剤活性を維持する（１９〜２２）。したがって、＞１００℃から＜４０℃の範囲のＴｍによって明示される安定性差にもかかわらず、実質的に同一の３Ｄ立体構造エピトープでないとしても、野生型分子およびそのジスルフィド変異体は全てが類似性を示す。例えば、４０℃では、変異体タンパク質はほとんど５０％が体温ではアンフォールドであり、また＞１００℃（水の沸点より高い）では、野生型タンパク質は公知の最も耐熱性のタンパク質の１つである。
【表４】
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【０１４７】
本発明者らは、抗原からｉｎ  ｖｉｖｏでのプロテアーゼ消化およびペプチド産生に興味を持っていたので、本発明者らのＢＰＴＩでの免疫学的な実験について、本発明者らは表４に記載されるＢＰＴＩ変異体を作製する。変異させた残基に下線を引き、システイン残基は太字で示される。これらは表面ジスルフィド１４〜３８がアラニンに変異された野生型ＢＰＴＩからなり、これにより還元剤に対して増加した安定性が与えられることが示されている。ＢＰＴＩ変異体は、［Ｌｙｓ１５→Ａｌａ］バックグラウンドにおいても作製される。Ｌｙｓ１５−Ａｌａ変異は、Ｐ１残基側鎖を切除し、トリプシンおよび他のプロテアーゼに向けたＢＰＴＩの親和性を１０７倍程度まで低減させ、それをプロテアーゼ阻害剤として本質的に不活性にした（２３）。タンパク質（例えば、Ｆ２２Ａ、Ｙ２３Ａ、Ｎ４３Ｇ、Ｆ４５Ａ）のコア内の追加の変異は、タンパク質を不安定化することに貢献し、野生型ＢＰＴＩに匹敵する３Ｄ構造をなおも維持すると同時に種々の程度に立体構造動力学を変化させる。この表は、本発明の実施形態に関して非限定的であることが意図される。
【０１４８】
類似の変異は、ＢＰＴＩに対して相同的なヒトプロテアーゼ阻害剤である、アルツハイマー型アミロイド前駆体タンパク質Ｋｕｎｉｔｚ阻害剤（ＡＰＰ−ＫＩ）に作製することができる。ＡＰＰ−ＫＩは、相対的に低い等電点（ｐＩ）を有することから、ＢＰＴＩとは異なり、リソソームｐＨ中での電荷において静電気的にほぼ中性であるはずである。ＢＰＴＩ同様、ＡＰＰ−ＫＩは、以前に発現させ、フォールディング、活性、および３Ｄ構造の点で特徴付けられており、ＢＰＴＩ中に見出されているものと正確に相同的な３つのジスルフィド結合を有する。
【０１４９】
本発明者らは、フランキングタグ配列がある場合および無い場合の両方で変異体を発現させる。本発明者らが溶解性を変動させるため使用したタグには、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）タグが含まれ、これは高度に可溶性であり、ＴｒｐＬＥタグに関しては高度に不溶性である（２４）。しかしながら、特に好適な構築物では、本発明者らは、三部分からなるタグであるＡｖｉＴａｇ−ｈｅｘａＨｉｓ−ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を使用する。このタグは、中等度の溶解性を与え、ＢｉｒＡビオチンリガーゼ（２５）を使用してビオチン化することができ、精製および／またはオンカラムリフォールディングのためＨｉｓＴｒａｐカラムへの結合を可能にし（ＣａｍｐｂｅｌｌおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、準備中）、必要に応じて、抗原を切り離すことができる。抗原を使用して、タグの無い場合（すなわち、ＴＥＶ切断後）またはタグがインタクトである場合のいずれかで動物を免疫することができ、続いて抗タグ抗体を減じて枯渇させる（Ｓ．  ＢｌａｃｋｓｈａｗおよびＤ．  Ｅｉｃｈｉｎｇｅｒ、パーソナルコミュニケーション）。
（実施例３）
本発明の好ましい標的。
【０１５０】
本明細書中に使用されるように、「標的」は、表５に開示され、具体的に選択されるタンパク質であり、これを本明細書中に記載されるような改善されたペプチド原性を有するように修飾することができる。１列目は、配列表に提供される配列に対応する配列番号を列挙する。２列目は各標的の「タンパク質名」を列挙し、３列目は２列目に列挙される各標的についての機能、発現および配列情報の両方の公知および確立された説明を提供する当技術分野において使用される、ユニークな「カタログ」番号である「ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号」（ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号は、例えば、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＧＲＣ）によって作成されるような参照ゲノムアセンブリに対するプロテオームのマッピングを提供する）を提供する。各標的に対応する配列情報を含む、この公共の情報（２０１６年８月１０日にＵｎｉＰｒｏｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）から検索された）は、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。配列表および表５は、変異を作製して、各位置で置換することができる特定のアミノ酸に沿って、対応するペプチド原性タンパク質を作成することができる、各標的タンパク質中の特異的な残基の位置を記載する。好ましい実施形態では、複数の置換は、配列表中の参照位置および表５中に示されるように、各標的タンパク質中に作製することができる。さらなる好ましい実施形態では、各標的タンパク質について配列表および／または表５に列挙される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くの残基は、任意の組合せにおいて、配列表中に列挙されるアミノ酸を使用しておよび／または実施例１の最後の２段落に記載されたように、２列目に列挙されるそれぞれの開始標的タンパク質において変化させることができる。複数の位置および／または標的タンパク質にわたって変異を広げることによって、およびこれらの変異させた分子を一緒に混合することによって、免疫カクテルを作り出すことができる。
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【表５−８】
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【表５−９】
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【表５−１０】
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【表５−１１】
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【表５−１２】
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【表５−１３】
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【表５−１４】
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【表５−１５】
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【表５−１６】
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【表５−１７】
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【表５−１８】
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【表５−１９】
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【表５−２０】
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【表５−２１】
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【表５−２２】
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【表５−２３】
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【表５−２４】
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【表５−２５】
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【表５−２６】
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【表５−２７】
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【表５−２８】
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【表５−２９】
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【表５−３０】
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【表５−３１】
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【表５−３２】
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【表５−３３】
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【表５−３４】
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【表５−３５】
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【表５−３６】
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【表５−３７】
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【表５−３８】
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【表５−３９】
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【表５−４０】
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【表５−４１】
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【表５−４２】
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【表５−４３】
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【表５−４８】
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【表５−４９】
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【表５−５０】
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【表５−５１】
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【表５−５３】
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【表５−５４】
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【表５−５５】
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【表５−５６】
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【表５−５７】
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【表５−５８】
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【表５−５９】
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【表５−６０】
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【表５−６１】
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【表５−６３】
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【表５−６４】
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【表５−７０】
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【表５−７１】
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【表５−７２】
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【表５−７３】
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【表５−７４】
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【表５−７５】
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【表５−７６】
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【表５−７７】
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【表５−７８】
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【表５−７９】
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【表５−８０】
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【表５−８１】
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【表５−８２】
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【表５−８３】
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【表５−８４】
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【表５−８５】
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【表５−８６】
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【表５−８７】
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【表５−８８】
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【表５−８９】
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【表５−９０】
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【表５−９１】
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【表５−９２】
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【表５−９３】
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【表５−９４】
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【表５−９５】
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【表５−９６】
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【表５−９７】
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【表５−９８】
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【表５−９９】
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【表５−１００】
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【表５−１０１】
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（実施例４）
立体構造動力学における変更を測定するアッセイ
【０１５１】
立体構造動力学における変更は、当技術分野において公知の標準法によって測定することができる。好ましい実施形態では、立体構造動力学における変更は、尿素誘発性平衡アンフォールディング（ｕｒｅａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）研究および／または開始タンパク質と比べた場合のギブズ自由エネルギーにおける、融解温度の変化を測定することによって示すことができる。
【０１５２】
融解温度の変化は、以下のプロトコールによって示すことができる。例えば、ペプチド原性タンパク質（０．２０ｍｇ／ｍｌ）および開始タンパク質（対照として）は、Ｊａｓｃｏのプログラム可能なペルチェ素子によって制御される、１度ｘ分−１の加熱速度で０．１ｃｍ石英キュベット中で１０℃から７２℃に加熱される。２０９ｎｍでのダイクロイック活性および光電子増倍管管電圧（ＰＭＴＶ）は、０．５℃毎に並行して連続的にモニターされる。全てのサーマルスキャンは、異なる温度での溶媒寄与に関して補正される。融解温度（Ｔｍ）値は、温度に関して２０９ｎｍで楕円率（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｔｙ）の一次導関数をとることによって計算される。全ての変性実験は、三連で実施される（Ｌｏｒｉら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、５；８巻（６号）：ｅ６４８２４頁（２０１３年）を参照されたい）。
【０１５３】
尿素誘発性平衡アンフォールディングにおける変化は、以下のプロトコールによって示すことができる。ペプチド原性タンパク質（終濃度４０ｕｇ／ｍｌ）および開始タンパク質（対照として）は、（非ジスルフィド含有タンパク質について）０．２Ｍ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ＤＴＴの存在下で２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で増加させた濃度の尿素（０〜８Ｍ）中で１０℃でインキュベートされる。１０分後、平衡に達し、内因性蛍光発光、２８７ｎｍでの吸光度、および／または遠ＵＶ  ＣＤスペクトル（０．５ｃｍキュベット）が、１０℃で並行して記録される。アンフォールディングの可逆性を試験するために、ペプチド原性タンパク質は、２ｍＭ  ＤＴＴおよび０．２Ｍ  ＮａＣｌの存在下で２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で０．４ｍｇ／ｍｌタンパク質濃度で７．０Ｍ尿素中で１０℃でアンフォールドされる。１０分後、リフォールディングが、１０倍希釈のアンフォールディング混合物によって１０℃で開始され、尿素濃度を減少させて含有するアンフォールディングのために使用される同じ緩衝剤の溶液へと移る。最終タンパク質濃度は、４０ｕｇ／ｍｌである。１５分間から２４時間のインキュベーション期間後、内因性蛍光発光、２８７ｎｍでの吸光度、および／またはＣＤスペクトルは、１０℃での尿素濃度の関数として記録される（Ｌｏｒｉら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、５；８巻（６号）：ｅ６４８２４頁（２０１３年）を参照されたい）。
【０１５４】
ギブズ自由エネルギーにおける変更は、以下のプロトコールによって示すことができる。ギブズ自由エネルギーを測定するために、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）実験が、ＶＰ−ＤＳＣ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ  Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）機器でスキャン速度１．５ｄｅｇ／分で実施される。可能な場合、ペプチド原性タンパク質の温度誘発性アンフォールディングが、第１および第２のＤＳＣスキャンを比較することによって可逆性に関して確認される。フォールディングおよびアンフォールディングの可逆性は、本明細書に記載いされるペプチド原性タンパク質に関する必要条件ではないことが理解される。タンパク質の部分的なモル濃度熱容量Ｃｐ，ｐｒ（Ｔ）は、試料（タンパク質溶液を含有）と参照（対応する緩衝液を含有）細胞との間の見かけの熱容量差ΔＣ＿ｐ＾ａｐｐ（Ｔ）の実験的な測定から得られる。タンパク質濃度は、公知のモル吸光係数を使用して分光光度的に測定される。２状態モデルに従う熱容量プロファイルの分析は、非直線回帰ルーチンＮＬＲＥＧおよび社内で書かれたスクリプトを使用して行う。参照条件下で標準熱力学的関数は、以下の通り計算される：
【数１】
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【０１５５】
式中のΔＨ（Ｔ）、ΔＳ（Ｔ）、およびΔＧ（Ｔ）はペプチド原性タンパク質のエンタルピー、エントロピーおよびギブズエネルギー関数であり、それぞれΔＨｃａｌは遷移温度Ｔｍでのアンフォールディングのエンタルピー、およびΔＣｐはアンフォールディングの熱容量である（Ｌｏｌａｄｚｅら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３２０巻、３４３〜３５７頁（２００２年）を参照されたい）。
（実施例５）
ペプチド原性を測定するアッセイ
【０１５６】
本明細書に記載されるようにペプチド原性タンパク質のプロセシングに関与し得る細胞内状態の１つは、タンパク質分解である。タンパク質分解におけるペプチド原性タンパク質の差次的安定性の影響は、幾つかのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏアッセイの１つを使用して決定することができる。
【０１５７】
（ａ）カテプシンＬタンパク質分解
一実施形態では、タンパク質分解に向けたペプチド原性タンパク質の挙動の検査は、それらを、タンパク質抗原プロセシングに決定的に重要であることが公知である酵素の１つであるカテプシンＬの作用に供することによって測定される（Ｈｓｉｅｈ，Ｃ．  Ｓ．、ｄｅＲｏｏｓ，Ｐ．、Ｈｏｎｅｙ，Ｋ．、Ｂｅｅｒｓ，Ｃ．、およびＲｕｄｅｎｓｋｙ，Ａ．  Ｙ．（２００２年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６８巻、２６１８〜２６２５頁）。タンパク質分解に対するペプチド原性タンパク質の感受性は、リソソームのカテプシンＬを使用してアセスメントされる。ペプチド原性タンパク質（０．５ｕｇ／ｕｌ）は、様々な量（例えば、１．５ｍ単位）の酵素を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５中に含むもので、様々な時間の長さで３７℃でインキュベートされる。消化は０．１％  ＴＦＡを使用して停止され、タンパク質分解はＣ１８逆相カラム（Ｖｙｄａｃ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）における逆相ＨＰＬＣによってモニターされる。タンパク質分解性産物の溶出は、０．１％  ＴＦＡを含有するアセトニトリル／水の直線勾配で実施される。
【０１５８】
（ｂ）アルファ−キモトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＹを使用するタンパク質分解
別の実施形態では、タンパク質分解に向けたペプチド原性タンパク質の挙動の検査は、それらを、アルファ−キモトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＹの作用に供することによって測定される。アルファ−キモトリプシンは、芳香族アミノ酸のカルボキシル末端で切断するエンドペプチダーゼである；カルボキシペプチダーゼＹは、カルボキシル末端から連続的にアミノ酸を除去するエキソペプチダーゼである。これらの酵素でのタンパク分解性消化は、不安定な立体構造に対して特異的であり、それ故、ペプチド原性タンパク質の立体構造安定性が、タンパク分解性消化に対するそれらの耐性／感受性を決定する。０．５ｍｌの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水ｐＨ７．５中の１ｍｇ／ｍｌでのペプチド原性タンパク質が、１００ｕｇのウシ膵臓からのアルファ−キモトリプシンおよび酵母からのカルボキシペプチダーゼＹで３７℃でインキュベートされる。各インキュベーションは様々な時点で終了され、消化された試料は−２０℃で分析するまで貯蔵される。試料は、１５％アクリルアミドゲルに通す還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析され、次に可視化のためクーマシーブリリアントブルーで染色される。
【０１５９】
（ｃ）リソソーム抽出物を使用するタンパク質分解
別の実施形態では、タンパク質分解に向けたペプチド原性タンパク質の挙動の検査は、それらを、骨髄由来樹状細胞のリソソーム抽出物の作用に供することによって測定される。ペプチド原性タンパク質は、骨髄由来樹状細胞からの粗製リソソーム抽出物からの等量のタンパク質の存在下で様々な濃度でインキュベートされる。混合物は、０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、および２ｍＭジチオスレイトール中ｐＨ４．５でインキュベートされる。各インキュベーションは様々な時点で終了され、消化された試料は−２０℃で分析するまで貯蔵される。試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析される。実験は、水酸化アルミニウムなどのアジュバントにおけるペプチド原性タンパク質の前吸着がある場合および無い場合で反復される。骨髄由来樹状細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子中で培養される骨髄から抗ＣＤ１１ｃマイクロビーズを使用ことで精製される。例えば、Ｄｅｌａｍａｒｒｅらの図４を参照されたい。
（ｄ）骨髄由来樹状細胞によるインターナリゼーション後のタンパク質分解
【０１６０】
別の実施形態では、タンパク質分解に向けたペプチド原性タンパク質の挙動の検査は、それらを、骨髄由来樹状細胞をＦＩＴＣタンパク質でインキュベートし、ＦＩＴＣ＋、ＣＤ１１ｃ＋細胞のパーセンテージを経時的に測定する、製造者のプロトコールによるＦＩＴＣでの標識化によって測定される。骨髄由来樹状細胞は、０．５ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識ペプチド原性タンパク質を１時間ロードし、洗浄され、次に３７℃で様々な時間量で培養される。ＦＡＣＳを次に使用して、０時間でのＦＩＴＣ＋、ＣＤ１１ｃ＋細胞のパーセンテージを引き算した各時点でのＦＩＴＣ＋、ＣＤ１１ｃ＋細胞のパーセンテージを決定される。これは、ペプチド原性タンパク質のタンパク質分解のパーセンテージを表す。実験は、水酸化アルミニウムなどのアジュバントにおけるＦＩＴＣ標識ペプチド原性タンパク質の前吸着がある場合および無い場合で反復される。
（実施例６）
抗体産生およびシークエンシング
【０１６１】
抗体レパートリーのＩｇ−ｓｅｑは、以前に記載されたプロトコール（１０、２９）に軽微な修正を加えて従ってもよい。Ｂ細胞は、高度に免疫された（ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）ウサギの血清、脾臓、または他の組織から単離することができる。シークエンシングライブラリーの複雑性を低減させるために、この集団をソーティングして、ＣＤ１９＋ＣＤ３−ＣＤ２７＋ＣＤ３８ｉｎｔメモリーＢ細胞または標的抗原を認識するＢ細胞を濃縮することができる（５、３０、３１）。これらの細胞は次に溶解され、ｍＲＮＡが標準方法を使用して単離され、ＩｇＨまたはＩｇＬ定常領域に特異的な３’プライマーでの５’ＲＡＣＥを使用してｃＤＮＡに逆転写される（９、３２）。ｃＤＮＡライブラリーは、次に必要とされる対の末端アダプター配列および任意選択のバーコードを含有するプライマーで増幅され、鋳型の定量および複数の読取りを平均することによって誤差補正が可能とされる（８、９）。
【０１６２】
抗体配列の完全な決定には、ネイティブなＶＨ−ＶＬ対を同定することが要求される。各ＶＨおよびＶＬ配列は別々のｍＲＮＡによってコードされるので、クローンのシークエンシングはｍＲＮＡ単離、逆転写、および重複伸長または連鎖ＰＣＲの前に、ナノリットル容量以下のウェル（５）またはマイクロエマルジョン（９）中で単一Ｂ細胞を単離することによって実施され得る。代替として、内因性ＶＨ−ＶＬ対は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの前に、精製されたＦａｂを部分的に架橋することによって同定することができる。これは、適切な条件下で、鎖間架橋を形成するＦａｂ重および軽鎖の一部分を生じ、生じたペプチド質量を使用してネイティブな対形成が決定される。
【０１６３】
ペプチド原性タンパク質の混合物に対する応答において生じた抗体を同定するために、配列情報を、高分解能の質量分析からのデータと組み合わせることができる。プロテインＡ精製されたＩｇＧをパパインで消化して２つのＦａｂをＦｃドメインから放出させることができる。これらは、次に固体の支持体上に固定化されたペプチド原性タンパク質を使用して調製されたカスタムカラム上で免疫親和性精製することができ、溶出させたＦａｂはタンパク分解性に消化され、ペプチド産物は質量分析に供される。生じたペプチド質量を完全抗体シークエンシングデータと比べて、抗原を認識するＣＤＲ配列を同定することができる。ＩｇＧ  ＶＨおよびＶＬ配列の対形成は、タンパク分解性消化の前に、免疫親和性精製されたＦａｂの化学的な架橋によって達成することができる；Ｙｏｕｎｇらは、このアプローチの可能性を実証した（３３）。
（実施例７）
ペプチド原性タンパク質の混合物を使用する免疫
【０１６４】
哺乳動物において抗体を生じさせる方法は、当技術分野において周知されている。一例において、ペプチド原性タンパク質に対するポリクローナル抗血清は、病原菌フリーなウサギをペプチド原性タンパク質の合計５００μｇの混合物で２か月の期間にわたって免疫することによって生じる。例えば、ペプチド原性タンパク質は、ＰＢＳ中に溶解し、等容量のフロイントアジュバントで乳化することができる。最終的なブースター後、ウサギの血清を分離してポリクローナル抗血清の力価を決定することができる。モノクローナル抗体を得るために、４〜６週齡のＢａｌｂ／ｃマウスを、ペプチド原性タンパク質（例えば、最初の注射に対してフロイント完全アジュバントおよび引き続く免疫化に対してフロイント不完全アジュバント中に溶解させた１０〜１００μｇ／注射での２週インターバルで４回）で免疫することができる。脾細胞は、単離され、融合細胞系列、例えばＳｐ２／０ミエローマ細胞と融合され、続いて限界希釈される。成長しているクローンは、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用してスクリーニングされる。９６セルプレートは、ペプチド原性タンパク質または対照タンパク質で被覆される。培養上清が、添加され、続いて洗浄され、検出のため標識抗マウス抗体が付加される。ペプチド原性タンパク質特異的抗体産生ハイブリドーマの限界希釈クローニング後、安定なハイブリドーマが得られる。各細胞から、上清が収集され、プロテインＡセファロースカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、モノクローナル抗体を精製することができる。
（実施例８）
ペプチド原性タンパク質の混合物を使用する免疫の別の例
【０１６５】
追加の動物モデルにおいて、５匹のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）の群を、ヒトワクチンに最も一般的に使用されるアジュバントであるアラム中に乳化された５μｇのエンドトキシンフリーなペプチド原性タンパク質で皮下免疫することができる。３週後、マウスを放血させ、ペプチド原性タンパク質特異的な抗体の存在を、ＥＬＩＳＡ（ウェルにおける直接的または間接的（ビオチン化されたタグおよびストレプトアビジンを介して）な野生型ＢＰＴＩまたはＡＰＰ−ＫＩ被覆に対する血清中の抗体の直接的な結合）によって血清を力価測定することによって決定することができる。ペプチド原性タンパク質が、開始タンパク質と類似の立体構造を有することを確認するために、競合阻害アッセイが実施され、このアッセイでは、開始タンパク質およびペプチド原性タンパク質の力価測定した量が、開始タンパク質被覆プレートに添加される前に、血清とプレインキュベートされる。これにより、免疫学的なプローブで、ペプチド原性タンパク質の３Ｄ構造が、操作した変異によって損なわれていないことの追加の証拠が提供される。
【０１６６】
ペプチド原性タンパク質がより良好な二次抗体応答を生じるかどうかを決定するために、マウスの群を上述のように免疫することができ、一次免疫の６週後、それらに二度目の免疫をすることができる。二次免疫の１週後、マウスを放血させ、抗原特異性の抗体応答が、上述のようにＥＬＩＳＡによって決定される。マウス樹状細胞は強い抗体応答を発生することができるペプチド原性タンパク質でｉｎ  ｖｉｔｒｏでパルスされ、２４時間後ＭＨＣＩＩによって提示されるペプチド原性タンパク質由来ペプチドが単離され、それらの質量が液体クロマトグラフィーおよび質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によって分析される。これらの研究には、ｉｎ  ｖｉｖｏでの樹状細胞発生を駆動するサイトカインであるＦＬＴ−３Ｌを発現する、マウス腫瘍株（樹状細胞で充填されたこれらのマウスの脾臓；Ｓｅｇｕｒａら、２００９年）で以前に注射されたマウスから精製された、多数（＞１０７）の樹状細胞が必要とされる。ピーク同定および質量分析によるＭＨＣＩＩ−ペプチドの定量を可能にするために、ペプチド原性タンパク質を、ＤＣに対するフィーディング前に安定な同位体、例えば１３Ｃおよび１５Ｎ（組換えタンパク質の作成の間、上記を参照されたい）で生合成的に標識することができる（Ｈｏｅｄｔら  ２０１４年）。
（実施例９）
ペプチド原性タンパク質の混合物をコードする配列を使用する免疫
【０１６７】
ポリヌクレオチドを動物に直接的に注射する方法は、当技術分野において十分に記載される。例えば、米国特許第５，６７６，９５４号；同第６，８７５，７４８号；同第５，６６１，１３３号を参照されたい。簡潔に述べると、遺伝コードの公知の縮重を使用して、本明細書に記載されるペプチド原性タンパク質の混合物をコードするポリヌクレオチドを、標準ＤＮＡ合成技術を使用して合成することができる。ポリヌクレオチドを、次に動物、例えばマウスなどに直接的に注射することができる。具体的には、ペプチド原性タンパク質の混合物をコードするポリヌクレオチドの混合物を、拘束され覚醒しているマウス（雌性６〜１２週齡ＢＡＬＢ／ｃまたはＮｕｄｅ（ｎｕ／ｎｕ）、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ製、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）の四頭筋に注射することができる。一実施形態では、５０μｇのポリヌクレオチドを５０μｌ溶液中に含むものを使用し、マイクロピペットチップから切ったプラスチックカラー（ｐｌａｓｔｉｃ  ｃｏｌｌａｒ）でフィットさせた使い捨ての無菌のプラスチックインスリンシリンジおよび２８Ｇ１／２針（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．、カタログ番号３２９４３０）を使用して、Ｈａｒｔｉｋｋａ，  Ｊ．ら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７巻：１２０５〜１２１７頁（１９９６年）に記載されているようにマウスに注射することができる。
【０１６８】
あるいは、６週齡Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ雌性マウス（体重２０〜２５グラム）は、注射前最初の２４時間にそれらの飲料水中に５０００ｐｐｍ  ＺｎＯＳＯ４を与えられてもよい。この量の亜鉛は、メタロチオネインプロモーターを活性化できることが示されている。各マウスは、次に２５ゲージ針での尾静脈穿刺によって静脈内に、総体積３０μｌ中に１５０μｇリポソーム（（商標））と複合化（ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ）させた３０μｇのペプチド原性タンパク質の混合物をコードするポリヌクレオチドを注射される。一実施形態では、マウス注射されるポリヌクレオチド混合物は、同じ開始タンパク質に関連する、異なるペプチド原性タンパク質をコードする。あるいは、ペプチド原性タンパク質のライブラリーは、ライブラリーが異なる開始タンパク質に関連する、ポリヌクレオチドの混合物によってコードされ得る。動物の管理は、研究を通して維持され、「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ）に従って、実施されるべきである。
【０１６９】
注射した、ペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、動物の細胞に送達された後、ペプチド原性タンパク質は次にｉｎ  ｖｉｖｏで発現される。ペプチド原性タンパク質は、次にペプチド原性タンパク質に特異的な抗体の産生を刺激することができる。これらの抗体を単離し、ポリクローナル混合物として使用するまたは単一種またはモノクローナルに更に単離することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの外来抗原に対する免疫応答および抗体の産生のプロセスは、当技術分野において周知されている。抗体産生の伝統的なプロトコールとは異なり、本明細書に記載されるプラットホーム発明により、複数のペプチド原性タンパク質（それらが同じ開始タンパク質に依存するかどうかにかかわらず）に対する抗体の群を同時に生じさせることができる。このポリヌクレオチドの混合物を使用する複数のタンパク質に対する抗体の同時産生は、抗体産生が現在実施されている方式を変化させる潜在能力を有する。
（実施例１０）
ペプチド原性タンパク質をコードするｍＲＮＡを使用する免疫
【０１７０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写された（ＩＶＴ）ｍＲＮＡを動物に直接的に注射する方法は、当技術分野において周知されている。Ｓａｈｉｎら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２０１４年１０月；１３巻（１０号）：７５９〜８０頁；Ｋａｒｉｋｏら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、２００８年１１月；１６巻（１１号）：１８３３〜４０頁；Ｋａｒｉｋｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ、２０１１年、１１月；３９巻（２１号）：ｅ１４２頁；米国特許第６，５１１，８３２号を参照されたい。例えば、ペプチド原性タンパク質の混合物をコードする直線化したＤＮＡプラスミド鋳型を、使用することができる。全てのｍＲＮＡを設計して、細胞に転移した後にｍＲＮＡ分子の翻訳活性および安定性を決定するのを支援することができる、５’および３’非翻訳領域、オープンリーディングフレーム、ならびに長いポリ（Ａ）テールを含有することができる。
【０１７１】
例えば、ペプチド原性タンパク質をコードするｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）テールを含む）は、プソイドウリジンの三リン酸誘導体および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）（ＴｒｉＬｉｎｋ）を使用して合成して修飾ヌクレオシド含有ＲＮＡを生成することができる。５’キャップを、転写反応に非可逆性キャップ類似体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）である、６ｍｍｏｌ／ｌの３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７ＧｐｐｐＧを補充し、グアノシン三リン酸の濃度を低下させること（３．７５ｍｍｏｌ／ｌ）することによってｍＲＮＡに添加することができる。転写物の精製は、Ｔｕｒｂｏ  ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）消化、続いてＬｉＣｌ沈殿および７５％エタノール洗浄によって実施することができる。水中に再構成されるＲＮＡの濃度は、光学密度を２６０ｎｍで測定することによって決定することができる。転写物への修飾ヌクレオチドの効率的な取り込みは、ＨＰＬＣ分析によって決定することができる。全てのＲＮＡ試料は、品質保証のために変性アガロースゲル電気泳動法によって分析することができる。次いで、リポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびｍＲＮＡは、トランスフェクションを増強するためリン酸緩衝液中に複合化される。５０μｌの複合体のＲＮＡ−リポフェクチンを組み立てるために、最初に１０μｇ／μｌウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する０．４μｌリン酸カリウム緩衝液（０．４ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ６．２）を６．７μｌ  ＤＭＥＭに添加し、次に０．８μｌリポフェクチンを混合し、試料を１０分間インキュベートする。別々のチューブにおいて、０．２５〜３μｇのＲＮＡが、最終体積３．３μｌまでＤＭＥＭに添加される。希釈されたＲＮＡは、リポフェクチンミックスに添加され、１０分間インキュベートされる。最終的に、ＲＮＡ−リポフェクチン複合体は、３８．８μｌ  ＤＭＥＭを添加することによってさらに希釈される。
【０１７２】
ペプチド原性タンパク質をコードするＲＮＡは、次に本明細書に記載されるマウスモデルに注射することができる。一般に、１μｌのリポフェクチンおよび異なる量のペプチド原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有する６０μｌの最終的な容量を含む組成物は、２７Ｇ１／２針を付けた１ｍｌシリンジに（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して側静脈に注射される。あるいは、ポリヌクレオチドは、筋肉内、皮内、鼻腔内、皮下、静脈内、気管内、およびクモ膜下腔内送達を介して注射することができる。ポリヌクレオチドが細胞に送達された後、ペプチド原性タンパク質はｉｎ  ｖｉｖｏで合成される。ペプチド原性タンパク質によって惹起される免疫応答および動物における抗体の引き続く産生が、本明細書に記載される。
（実施例１１）
ファージディスプレイを使用するペプチド原性タンパク質に対する親和性成熟抗体
【０１７３】
ペプチド原性タンパク質を提示させることおよび例えば本明細書の実施例に記載される抗原提示細胞によるプロセシングを受けさせることによってペプチド原性タンパク質に対して抗体がひとたび生じると、生じた抗体はディスプレイアプローチを使用して成熟させることができる。例えば、標的特異的な抗体をコードするＢ細胞ｍＲＮＡに由来するｓｃＦｖまたはＦａｂをディスプレイするファージのライブラリーは、ペプチド原性タンパク質に対してまたは開始タンパク質に対して免疫特異的に結合するｓｃＦｖまたはＦａｂをディスプレイするファージを同定するアッセイにおいてスクリーニングすることができる。固定化されたペプチド原性タンパク質または開始タンパク質に結合するｓｃＦｖまたはＦａｂをディスプレイするファージは、固定化されたペプチド原性タンパク質または開始タンパク質におけるパニングおよび固定化されたペプチド原性タンパク質または開始タンパク質への結合についてのＥＬＩＳＡによるアセスメント後に、同定することができる。これらのアッセイに関してプレートに固定化されたペプチド原性タンパク質または開始タンパク質は、Ｍｏｏｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５巻：２６０〜２６３頁に記載されているようにバキュロウイルス発現構築物で感染させたＳｆ９細胞の上清からまたはＨＥＫ２９３細胞からの上清から精製することができる。同定されたｓｃＦｖまたはＦａｂの各々は、次に配列決定することができる。
【０１７４】
ユニークなｓｃＦｖまたはＦａｂの各々の特異性を決定するために、ファージＥＬＩＳＡを、ペプチド原性タンパク質または開始タンパク質および対照ウェルに対して各ｓｃＦｖまたはＦａｂについて実施することができる。ユニークなｓｃＦｖまたはＦａｂの１つを提示するファージミドを含有する個々のＥ．ｃｏｌｉコロニーを、１つのウェル当たり１００μｌ  ２ＴＹＡＧ培地を含有する９６ウェルプレートに接種することができる。プレートは、３７℃で４時間振盪してインキュベートされる。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージは次にＭＯＩ  １０まで各ウェルに添加され、プレートはさらに１時間３７℃でインキュベートされる。プレートは、２０００ｒｐｍで１０分間、卓上型遠心分離機において遠心分離される。上清が除去され、細胞ペレットは１００μｌ  ２ＴＹＡＫ中に再懸濁され、３０℃で一晩振盪してインキュベートされる。
【０１７５】
次の日に、プレートは２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離され、各ウェルからの１００μｌファージ含有上清が新鮮な９６ウェルプレートに慎重に移される。２０μｌの６ｘＭＰＢＳが、各ウェルに添加され、ＥＬＩＳＡの前にファージをプレブロックするため室温で１時間インキュベートされる。
【０１７６】
フレキシブル９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）は、ＰＢＳ中のペプチド原性タンパク質（直接的または間接的に１ｍｇ／ｍｌで）、ＰＢＳ中のＢＳＡ（１ｇ／ｍｌ）、またはＰＢＳで一晩４℃で被覆される。被覆後、溶液がウェルから除去され、プレートがＭＰＢＳ中で１時間室温でブロッキングされる。プレートはＰＢＳで３回洗浄され、次に５０μｌのプレブロッキングされたファージが各ウェルに添加される。プレートは、室温で１時間インキュベートされ、次にＰＢＳＴを３回交換し続いてＰＢＳを３回交換して洗浄される。各ウェルに、ＭＰＢＳ中に１から５０００希釈で５０μｌの抗遺伝子ＶＩＩＩ−ＨＲＰコンジュゲート（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が添加され、プレートは室温で１時間インキュベートされる。各プレートは、ＰＢＳＴで３回洗浄され続いてＰＢＳで３回洗浄される。次に、３％  ＭＰＢＳ中に１／５０に希釈された５０μｌのＨＲＰ標識抗マウス抗体（ＤＡＫＯ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ）が、添加され、１時間室温でインキュベートされる。各プレートは、次にＰＢＳＴで３回洗浄され続いてＰＢＳで３回洗浄される。５０μｌのＴＭＢ基質が、次に各ウェルに添加され、室温で３０分間または発色するまでインキュベートされる。反応は、２５μｌの０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加によって停止される。発生したシグナルは、マイクロタイタープレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ３５５０）を使用して４５０ｎｍでの吸光度（Ａ４５０）を読み取ることによって測定される。
【０１７７】
ＩｇＧ１形式へのｓｃＦｖまたはＦａｂの変換は、以下のように実施することができる。本発明者らがＩｇＧ分子への変換を望むｓｃＦｖまたはＦａｂのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、完全な重または軽鎖分子が、適切な宿主細胞にトランスフェクトされた場合に、これらのベクターから発現できるように、適切な重（ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、など）または軽鎖（ヒトカッパまたはヒトラムダ）定常領域のヌクレオチド配列を含有するベクターにクローニングすることができる。さらに、クローニングされた重および軽鎖は、両方が１つの細胞系列（１つまたは２つのベクターのいずれかからの）において発現される場合、それらは細胞培養培地に分泌される完全な機能的な抗体分子へと組み立てられ得る。ｓｃＦｖまたはＦａｂを従来の抗体分子に変換するための方法は、当技術分野内で周知されている。
【０１７８】
発酵ブロスからのＩｇＧの精製は、抗体産生のために一般に使用される従来技術の組合せを用いて実施される。典型的に、培養の収穫物は、精製スキームを開始する前に、細胞および細胞細片を除去するために清澄化される。これは、収穫物の遠心分離または濾過のいずれかを使用して通常は達成されるであろう。清澄後、抗体は、典型的に捕獲され、プロテインＡセファロースにおいてアフィニティークロマトグラフィーを使用して著しく精製される。抗体は、塩基性ｐＨでプロテインＡセファロースに結合させられ、マトリックスの洗浄後にｐＨの低減によって溶出される。抗体のさらなる精製は、次にゲル濾過によって達成される。抗体と異なる分子量を有する構成成分を除去することと同様に、このステップを使用して所望の最終的な製剤緩衝液に緩衝液交換することもできる。
（実施例１２）
抗体の特徴付けおよび交差反応性を測定するため使用されるアッセイ
【０１７９】
抗体（ペプチド原性タンパク質に対して交差反応するまたは抗体を生じるかのいずれにせよ）（ｓｃＦｖもしくはＦａｂおよび抗体断片またはそのバリアントを含む他の分子、あるいはｓｃＦｖもしくはＦａｂおよび抗体断片またはそのバリアントからなる他の分子を含む）は、種々のアッセイにおいてスクリーニングされ得、そのいくつかを、ペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質に結合する抗体を同定するために、以下に記載する。
【０１８０】
１つの特定のアッセイにおいて、ビオチン化されたタンパク質（ペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質）に結合する、抗体（ペプチド原性タンパク質に対して交差反応するまたは抗体を生じる）は、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ上に捕獲することができる。このアッセイは、ペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質に対して中和するおよび／または結合する、抗体（ペプチド原性タンパク質に対して交差反応するまたは抗体を生じる）を同定するため適用し得る。加えて、抗体は、本明細書に記載されるまたはそうでなければ当技術分野において公知である、中和アッセイにおいてアッセイし得る。例えば、標的タンパク質がＢｌｙＳである場合、抗体は、ＩＭ９細胞への結合からペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質を阻害するそれらの能力について試験し得る。このアッセイにおいて、標識ペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質（例えば、ビオチン化された）は、抗体とインキュベートされて、タンパク質−抗体複合体が形成される。インキュベーション後、タンパク質−抗体試料のアリコートは、ＩＭ９細胞に添加される。結合は、当技術分野において公知の技術を使用して決定され得る。例えば、ビオチン化されたタンパク質（ペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質）とＩＭ９細胞の結合は、ストレプトアビジン−デルフィアの添加後に蛍光光度計を使用して検出され得る。タンパク質を中和する抗体によって結合されない場合、ビオチン化されたタンパク質は、細胞に結合し、検出することができる。したがって、（タンパク質が無関係な抗体とプレインキュベートされるまたは全く抗体なしでプレインキュベートされる対照試料と比較して）ＩＭ９細胞に結合するビオチン化されたタンパク質の量を減少させる抗体は、タンパク質に結合するおよび中和するものとして同定される。
【０１８１】
交差反応性を分析するおよび／またはペプチド原性タンパク質に対して生じる抗体を特徴付けるため使用することができる他の免疫アッセイには、わずかに例を挙げると、ウエスタンブロット、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、およびプロテインＡ免疫アッセイなどの技術を使用する競合的および非競合的なアッセイシステムが含まれるが、これらに限定されない。このようなアッセイは、ルーチンであり、当技術分野において周知されている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、編、１９９４年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。
【０１８２】
例示的な免疫アッセイは、以下に簡潔に記載される（しかし、これらは限定の目的を意図されていない）。免疫沈降プロトコールは、一般にプロテインホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補充された、ＲＩＰＡ緩衝液（１％  ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１％トラジロール）などの溶解緩衝液中で細胞を溶解すること、目的の交差反応する抗体を細胞溶解物に添加すること、ある期間（例えば、１から４時間）４℃でインキュベートすること、プロテインＡおよび／またはプロテインＧ  セファロースビーズを細胞溶解物に添加すること、約１時間またはそれよりも多く４℃でインキュベートすること、ビーズを溶解緩衝液中で洗浄することならびにビーズをＳＤＳ／試料緩衝液中に再懸濁することを含む。ペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質を免疫沈降する目的の抗体の能力は、例えば、ウエスタンブロット分析または質量分析によってアセスメントすることができる。当業者は、ペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質への抗体の結合を増加させるおよびバックグラウンドを減少（例えば、セファロースビーズで細胞溶解物をプレクリアする）させるように、修飾することができるパラメーターに関して精通しているであろう。免疫沈降プロトコールに関するさらなる考察について、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、編、１９９４年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｔ  １０．１６．１を参照されたい。
【０１８３】
ウエスタンブロット分析は、一般にタンパク質試料を調製すること、ポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に依存して８％−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）におけるタンパク質試料の電気泳動法、タンパク質試料をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンなどの膜に移すこと、膜をブロッキング溶液（例えば、３％  ＢＳＡまたは無脂肪ミルクを有するＰＢＳ）中でブロッキングすること、膜を洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）中で洗浄すること、膜をブロッキング緩衝液中に希釈した一次抗体（目的の抗体）でブロッキングすること、膜を洗浄緩衝液中で洗浄すること、膜をブロッキング緩衝液中に希釈した酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２１１）にコンジュゲートされた二次抗体（これは一次抗体、例えば抗ヒト抗体を認識する）でブロッキングすること、膜を洗浄緩衝液中で洗浄すること、および抗原の存在を検出することを含む。当業者は、検出されたシグナルを増加させるおよびバックグラウンドノイズを低減させるように、修飾することができるパラメーターに関して精通しているであろう。ウエスタンブロットプロトコールに関するさらなる考察について、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、編、１９９４年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｔ  １０．８．１を参照されたい。
【０１８４】
さらなる例において、ＥＬＩＳＡは、ペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質を調製すること、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルをペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質で（直接的または間接的に）被覆すること、ウェルに結合しないペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質を洗浄除去すること、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物にコンジュゲートされた目的の抗体をウェルに添加すること、ある期間インキュベートすること、非結合性抗体または非特異的結合抗体を洗浄除去すること、ならびにウェルを被覆するペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質への抗体特異的な結合の存在を検出することを含む。ＥＬＩＳＡにおいて、目的の抗体は、必ずしも検出可能な化合物にコンジュゲートされない；代わりに、検出可能な化合物にコンジュゲートされた二次抗体（これは目的の抗体を認識する）が、ウェルに添加され得る。
【０１８５】
さらに、抗原でウェルを被覆する代わりに、抗体がウェルに被覆され得る。この場合、検出可能な分子は、検出可能な化合物、例えば酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）にコンジュゲートされたペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質であり得る。当業者は、検出されたシグナルを増加させるように、修飾することができるパラメーター並びに当技術分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して精通しているであろう。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察について、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、編、１９９４年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｔ  １１．２．１を参照されたい。ペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質に対する抗体の結合親和性ならびに抗体−タンパク質相互作用のオフレートは、競合的な結合アッセイによって決定することができる。競合的な結合アッセイの１つの例は、標識ペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と目的の抗体を増加した量の非標識ペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質の存在下でのインキュベーション、ならびに標識ペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質への抗体結合の検出を含む放射免疫アッセイである。ペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質に対する本発明の抗体の親和性ならびに結合オフレートは、スキャッチャードプロット分析によるデータから決定することができる。二次抗体との競合は、放射免疫アッセイを使用して決定することもできる。この場合、ペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質は、標識化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）にコンジュゲートされた目的の抗体と増加した量の非標識二次抗ペプチド原性タンパク質抗体存在下でインキュベーションされる。
【０１８６】
好ましい実施形態では、ＢＩＡｃｏｒｅ動態解析を使用して、ペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質に対する抗体における結合およびオフレートを決定することができる。ＢＩＡｃｏｒｅ動態解析は、それらの表面に固定化された抗体を有するチップからのペプチド原性タンパク質および／または開始タンパク質の結合および解離を分析することを含む。
（実施例１３）
ワクチン接種
【０１８７】
さらに、本明細書に記載されるようにペプチド原性タンパク質の混合物は、ワクチンとして使用することができる。例えば、ペプチド原性タンパク質のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、１５５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ３）中の３２０ｕｇ／ｍＬの濃度は、等容量のＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１で無菌的に乳化されて最終ワクチン濃度の１６０ｕｇ／ｍＬが得られる。エマルジョンは、Ｏｍｎｉ  Ｍｉｘｅｒ−ＥＳホモジナイザー（Ｏｍｎｉ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｗａｒｒｅｎ−ｔｏｎ、ＶＡ）を使用して室温で６分間６０００ｒｐｍで４００ｍＬ容器中に体積２００ｍＬの混合物をホモジナイズすることによって達成される。各ワクチンは、包括的な品質管理分析を受けて、一般的な安全性、純度、同一性、統合性、および均一な油中水型液滴サイズが保証される。２〜８℃で貯蔵されたワクチンの安定性は、ヒト免疫化の終結後４〜１０か月まで、ワクチン安全性、作用強度、均一性、純度、および統合性を検証するために、マウス免疫原性試験ならびに物理的および生化学的なアッセイを使用して定期的に評価される。１６０ｕｇ／ｍＬペプチド原性タンパク質ワクチンは、免疫化前に、最終用量形態の１０ｕｇ／ｍＬまたは４０ｕｇ／ｍＬにＰＢＳ／ＩＳＡ５１（アジュバント対照ワクチン）で希釈される。異なる程度の希釈の結果として、これらのワクチンは、２つの異なる比のワクチン含有対ワクチンフリー水滴、すなわち、それぞれ１：１５および１：３の比の１０ｕｇ／ｍＬおよび４０ｕｇ／ｍＬ製剤を含有した。試験および対照ワクチンは、高度に粘稠性であり、均一性を保証するため操作の前後でボルテックスを必要とし得る。ワクチンは、針およびシリンジによって筋肉内に投与することができる。ワクチン誘導性Ｔ細胞応答が、適格な細胞内サイトカイン染色アッセイの手段によってさらに評価される。末梢血単核球は、インターロイキン−２、インターフェロン−γ、または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を産生する、トータルおよびメモリーＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の比率を決定するため定量される。
【０１８８】
ペプチド原性タンパク質の混合物をコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを患者に投与することによってワクチンとして使用することもできる。
［引用文献］
【数２−１】
2018528191.tif 000110
【数２−２】
2018528191.tif 000111
【数２−３】
2018528191.tif 000112
【配列表】
2018528191000001.app
【国際調査報告】
2018528191.tif 000113
2018528191.tif 000114
2018528191.tif 000115