(57)【要約】本発明は、組織プラスミノーゲン活性化因子及びその変異体、より具体的にはＴＮＫ−ｔＰＡをＣＨＯ細胞から単離及び精製する新規方法に関し、工業的に適用可能で、簡単で、費用対効果が高く、堅牢で、高効率なＴＮＫ−ｔＰＡ精製方法を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＮＫ−ｔＰＡの単離及び精製方法であって、
（ｉ）ＣＨＯ細胞培養から得られた無細胞回収物を、ＴＮＫ−ｔＰＡを捕捉するために親和性クロマトグラフィーに供し、部分的に精製したＴＮＫ−ｔＰＡを含有する溶出液を得る工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）の前記溶出液を、ＴＮＫ−ｔＰＡの追加精製のために親和性クロマトグラフィーに供し、ＴＮＫ−ｔＰＡを主に含有する溶出液を得る工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の溶出液のウイルス不活化により、ウイルス不活化試料を得る工程、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の前記ウイルス不活化試料を、追加精製のために更なる親和性クロマトグラフィー−ＩＩＩに供し、高度に精製されたＴＮＫ−ｔＰＡを主に含有する溶出液を得る工程、
（ｖ）工程（ｉｖ）の前記溶出液を、陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、高度に精製されたＴＮＫ−ｔＰＡの調製物を含有する溶出液を得る工程、
（ｖｉ）工程（ｖ）の前記溶出液を、存在するウイルスを除去するためウイルス減少濾過に供する工程、
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）の前記試料を濃縮してＴＮＫ−ｔＰＡを得る工程、を含み、前記方法の収率は６０％超であり、得られたＴＮＫ−ｔＰＡの純度がサイズ排除クロマトグラフィーで測定して９５％超である、方法。
【請求項２】
前記ＴＮＫ−ｔＰＡ純度が、サイズ排除クロマトグラフィーで９５％超であり、その他の重要な品質属性が以下である、請求項１に記載の方法。
【表１】
2018504366.tif 000005
【請求項３】
前記親和性クロマトグラフィーが、固定相及び移動相を含み、
前記固定相が、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｌｙｓｉｎｅ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、及びＣｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ａｐａｔｉｔｅ（ＣＨＴ）を含む群から選択され、好ましくは前記固定相がＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦであり、
前記移動相が、リン酸ナトリウム緩衝液、塩化ナトリウム、及び尿素、または混合物を含む群から選択され、好ましくは混合物であり、
前記リン酸ナトリウムが２０〜５０ｍＭの範囲、好ましくは２０〜４０ｍＭの範囲で存在し、塩化ナトリウムが１〜２．５Ｍの範囲、好ましくは１．５〜２Ｍの範囲で存在し、尿素が  １〜４Ｍの範囲内、好ましくは２〜３Ｍの範囲内で存在し、
前記移動相のｐＨが、７〜８の範囲、好ましくは７〜７．６の範囲、より好ましくは７．２〜７．４の範囲で存在する、請求項１の工程（ｉ）に記載の方法。
【請求項４】
前記親和性クロマトグラフィーが、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）において対数減少０．８〜１．５をもたらす、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記親和性クロマトグラフィーが、固定相及び移動相を含み、
前記固定相が、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ、Ｌｙｓｉｎｅ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、及びＣｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ａｐａｔｉｔｅ（ＣＨＴ）を含む群から選択され、好ましくは前記固定相はＬｙｓｉｎｅ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄであり、
前記移動相が、酢酸ナトリウム緩衝液、尿素、及びイプシロンアミノカルボン酸（ＥＡＣＡ）、または混合物を含む群から選択され、好ましくは混合物であり、
前記酢酸ナトリウムが５〜２５ｍＭの範囲、好ましくは５〜１５ｍＭの範囲で存在し、尿素が１〜４Ｍの範囲、好ましくは２〜３Ｍの範囲で存在し、ＥＡＣＡが０．１〜０．４ｍＭの範囲内、好ましくは０．１〜０．２ｍＭの範囲内で存在し、
前記親和性クロマトグラフィーの移動相のｐＨが、ｐＨ３．５〜６の範囲、好ましくは４〜５の範囲、より好ましくは４．５〜５の範囲である、請求項１の工程（ｉｉ）に記載の方法。
【請求項６】
前記親和性クロマトグラフィーが、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）において対数減少１〜１．５、及びウイルスクリアランスで対数減少１〜４をもたらす、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記親和性クロマトグラフィーが、ＸＭｕＬＶで対数減少１．５超、及びＰＲＶで対数減少４超をもたらす、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ウイルス不活化が、低ｐＨ及び化学的不活化によって行われ、
化学的不活化が、尿素の存在下で、コール酸ナトリウム、トリトン、ベータ−プロピオラクトン、トリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）、及びカプリル酸ナトリウムを含む群から選択される化学物質、好ましくはカプリル酸ナトリウムで前記試料を処理することによって行われ、
カプリル酸ナトリウムが、０．００１％〜０．１０ｗ／ｖ％、好ましくは０．０１％〜０．０７％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０５％の範囲で存在し、
尿素の濃度が、１〜４Ｍ、好ましくは２〜３Ｍの範囲で存在し、
ウイルス不活化が、４０〜１８０分間の期間、より好ましくは４０〜８０分間の期間、前記試料を保持することによって行われ、
１５〜４５℃の範囲、より好ましくは２０〜３０℃の範囲の温度で前記試料を保持し、
前記ｐＨが４．０〜４．７の範囲、より好ましくは４．３〜４．７の範囲で存在する、請求項１の工程（ｉｉｉ）に記載の方法。
【請求項９】
前記低ｐＨ及び化学的不活化が、ＸＭｕＬＶ及びＰＲＶで対数減少５超をもたらす、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記親和性クロマトグラフィーが、固定相及び移動相を含み、
前記固定相が、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ、Ｌｙｓｉｎｅ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、及びＣｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ａｐａｔｉｔｅ（ＣＨＴ）を含む群から選択され、好ましくは前記固定相はＣｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ａｐａｔｉｔｅ（ＣＨＴ）であり、
前記移動相が、リン酸緩衝液、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸水和物（ＭＥＳ−水和物）、塩化ナトリウム、及び尿素、または混合物を含む群から選択され、好ましくは混合物であり、
前記リン酸緩衝液が、５〜５０ｍＭの範囲、好ましくは５〜１５ｍＭの範囲で存在し、ＭＥＳ−水和物が２〜２０ｍＭの範囲で存在し、尿素が１〜４Ｍの範囲、好ましくは１〜３Ｍの範囲で存在し、塩化ナトリウムが０．１〜１．０Ｍの範囲、好ましくは０．１〜０．５Ｍの範囲で存在し、
前記移動相のｐＨが、６〜９の範囲であり、
前記親和性クロマトグラフィーの溶出型が、直線、段階、または両方の組み合わせでもよく、好ましくは、使用される前記溶出が直線塩勾配であり、
この溶出の前記塩は、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、及び硫酸アンモニウムを含む群から選択することができ、好ましくは前記塩が塩化ナトリウムであり、塩化ナトリウムの濃度が０．１〜１．０Ｍ塩化ナトリウムの範囲である、請求項１の工程（ｉｖ）に記載の方法。
【請求項１１】
前記親和性クロマトグラフィーが、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）において対数減少０．５〜１、及びウイルスクリアランスで対数２〜４をもたらす、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記クロマトグラフィーが、ＸＭｕＬＶ及びＰＲＶで対数減少４超、ならびにＭＭＶ及びＲｅｏ３ウイルスで対数減少３超をもたらす、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
親和性クロマトグラフィーが、固定相及び移動相を含み、
固定相が、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＯ３、Ｆｒａｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉｃａｐ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦを含む群から選択され、好ましくは前記固定相がＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＯ３であり、
前記移動相が、Ｌ−アルギニン、Ｏ−リン酸、及びポリソルベート−２０、または混合物含む群、好ましくは混合物から選択され、
前記Ｌ−アルギニンが、１０〜３５０ｍＭの範囲、好ましくは２５０〜３５０ｍＭの範囲で存在し、Ｏ−リン酸が、０．５〜１％の範囲、好ましくは０．６％〜０．８％の範囲で存在し、ポリソルベート−２０が、０．０１〜０．０５％の範囲、好ましくは０．０４〜０．０５％の範囲で存在し、
前記移動相のｐＨが７．０〜７．５の範囲、好ましくは７．３〜７．５の範囲である、請求項１の工程（ｖ）に記載の方法。
【請求項１４】
前記陽イオン交換クロマトグラフィーが、ＭＭＶで対数ウイルスクリアランス１超、及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）に関して対数クリアランス０．５超をもたらす、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ウイルス濾過が、ナノフィルターによる陽イオン交換クロマトグラフィーから得られた溶出液について実施され、前記ナノフィルターがＰＥＳであり、前記ナノフィルターのサイズが１５〜２０ｎｍの範囲である、請求項１の工程（ｖｉ）に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルス濾過が、ＸＭｕＬＶの対数減少４超、ＰＲＶの対数減少３超、Ｒｅｏ−３の対数減少４超、及びＭＭＶの対数減少４．５超をもたらす、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
濾過が、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、マクロ濾過、及び接線流濾過を含む群から選択される濾過法によって前記試料を濃縮するために行われ、好ましくは前記濾過法が接線流濾過であり、
前記フィルターが限外濾過膜であり、
前記限外濾過膜がＰＥＳであり、
前記限外濾過膜のサイズが５〜３０ｋＤａの範囲であり、好ましくは限外濾過膜のサイズが１０ｋＤａである、請求項１の工程（ｖｉｉ）に記載の方法。
【請求項１８】
前記濃縮物がＴＮＫ−ｔＰＡ保持物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
周期的向流クロマトグラフィーが親和性Ｉクロマトグラフィーに使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
インラインコンディショニングアプローチが、親和性Ｉ、親和性ＩＩ、親和性ＩＩＩ（ＭＭＣ）及びＩＥＣクロマトグラフィー用の緩衝液及び負荷調製に使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
急性心筋梗塞及び急性虚血性脳卒中のための液体非経口静注製剤における、請求項１に記載の単離及び調製されたＴＮＫ−ｔＰＡの使用。
【請求項２２】
薬学的に許容可能な賦形剤とともに、請求項１に記載されるように得られた前記ＴＮＫ−ｔＰＡを含む、薬学的組成物。
【請求項２３】
以下を含む、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【表２】
2018504366.tif 000006
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類細胞、より具体的にはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＮＫ−ｔＰＡ）の単離、精製及び生産の新規方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テネクテプラーゼ（ＴＮＫ−ｔＰＡ）は、１７個のジスルフィド架橋を有し、約６７ｋＤａの分子量を有する、天然のヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）において６個のアミノ酸置換を有するセリンプロテアーゼファミリーの組換え糖タンパク質である。ＴＮＫ−ｔＰＡの開発において、天然のｔ−ＰＡでなされた修飾は、ともにクリングル１ドメイン内におけるスレオニン１０３のアスパラギンによる置換、アスパラギン１１７のグルタミンによる置換、ならびにプロテアーゼドメインにおける２９６〜２９９位のリジン、ヒスチジン、及び２つのアルギニンのテトラアラニンアミノ酸による置換を含み、得られるタンパク質を、フィブリン特異性が高く、血漿半減期がより長くなるようにし、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）による分解に対する感受性を天然のｔ−ＰＡと比較して８０％低下させる。
【０００３】
ＴＮＫ−ＴＰＡ中のＴＮＫは、修飾されたｔ−ＰＡ分子の部位、すなわちＴ１０３、Ｎ１１７、及びＫＨＲＲ  ２９６−２９９を指す。ＴＮＫ−ｔＰＡの上記修飾は、より大きなフィブリン特異性が、より迅速かつ完全な血餅溶解を可能にし、出血合併症の減少をもたらし、長い寿命が、より少ない全身線溶を伴う単一ボーラス用量を可能にし、以前の血餅摘出薬から出血の合併症がより少なくなるため、より良好な治療コンプライアンスを有する、急性心筋梗塞の治療のための改善された治療剤としてその用途を提供する。
【０００４】
ＴＮＫ−ｔＰＡの機構は、腸内プラスミノーゲンをプラスミンに選択的に変換する血栓（血餅）のフィブリン成分へのＴＮＫ−ｔＰＡの結合で開始され、結果として生じるプラスミンは、その非常に特異的な性質のために、フィブリノーゲンを保存し、全身プラスミノーゲン活性化を最小限に抑えながら、閉塞動脈の血栓のマトリックスを分解する。
【０００５】
心筋梗塞患者に見られるＴＮＫ−ｔＰＡの利点、及び急性虚血性脳卒中（ＡＩＳ）の文脈中での動物研究の前向きな結果は、ＴＮＫ−ｔＰＡが、ＡＩＳのためにＵＳＦＤＡによって承認された唯一の薬剤であるアルテプラーゼよりも安全で効果的な治療法であることを証明し得ることを示唆している。過去数年間に、いくつかの臨床試験がＡＩＳにおけるＴＮＫ−ｔＰＡの使用を評価し、ＴＮＫ−ｔＰＡがアルテプラーゼよりも優れた薬理学的プロファイルを有することを証明し、発症後４．５時間以内に報告する患者において、ＡＩＳを治療する上で効果的かつ安全な治療選択肢となり得ることも示唆された。最近、ＴＮＫ−ｔＰＡが肺塞栓症の患者の治療に考慮されており、いくつかの臨床試験が有望な結果を示した。いくつかの適応症におけるＴＮＫ−ｔＰＡの完全で決定的な様相を評価するために、多数の臨床試験が未だ行われている。
【０００６】
ここ数年、バッチ、流加バッチ、半フィードバッチ、及び灌流バイオリアクタープロセスによって組換え糖タンパク質の開発及び製造が行われ、これらのタンパク質の精製のために、吸着及びイオン交換クロマトグラフィーが主に採用された。
【０００７】
ｔ−ＰＡ及びその変異体では、例えば、免疫親和性による精製（抗ｔＰＡヤギポリクローナル抗体）イオン交換、エタノール沈殿、逆相クロマトグラフィー、シリカまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、例えばジエチルアミノエチル、硫酸アンモニウム沈殿、セファデックス−Ｇ−７５等、特定の精製プロトコルが先行技術で知られている。
【０００８】
ＴＮＫ−ｔ−ＰＡの精製方法のいくつかは、国際公開第２０１１／０１５９２２号を含む先行技術に列挙されており、一連のイオン交換クロマトグラフィー工程、免疫親和性クロマトグラフィー、及び限外濾過／血液透析濾過工程が、ＴＮＫ−ｔＰＡの精製に使用される、精製方法が記載されている。国際公開第２０１２／０６６５６９Ａ号は、疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用に主に惹きつけられた精製方法を記載している。
【０００９】
先行技術で使用される免疫親和性クロマトグラフィーは、ＴＮＫ−ｔＰＡの商業的製造に適した技術ではない。それは、多くの規制上の懸案を提起するだけでなく、免疫親和性クロマトグラフィー媒体のコストも、調製のためのモノクローナル抗体の使用のために、従来のクロマトグラフィーマトリックスと比較して非常に高い。ＴＮＫ−ｔＰＡ精製の特定の先行技術に記載された疎水性相互作用クロマトグラフィーでは、有機溶媒であり、タンパク質の凝集及び変性を誘導することが知られ、先行技術の欠点の１つと考えられる、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）をその方法において使用する。ＴＮＫ−ｔＰＡは非常に不安定な分子であるため、タンパク質の変性を引き起こす可能性があるため、精製方法におけるＩＰＡの使用は避けるべきである。さらに、商業規模でＩＰＡを大量に使用するには、ＩＰＡのリサイクルが必要であり、この場合も、追加のエネルギー消費と溶媒回収ユニットなどの余分な投資が求められる。
【００１０】
したがって、上記の方法のいずれも、商業規模でＴＮＫ−ｔＰＡ原薬を一貫して生産し、必要な全ての仕様を満たすことができる効率的で、拡張性があり、堅牢な精製溶液を提供することができない。
【００１１】
したがって、ＴＮＫ−ｔＰＡの精製のための効果的かつ商業的に実行可能な方法が必要とされている。
【００１２】
発明の目的
本発明の目的は、サイズ排除クロマトグラフィーで測定して６０％以上の収率及び９５％超の純度をもたらす、ＴＮＫ−ｔＰＡの生産のための、効率的で、堅牢で、拡張性があり、商業的に実行可能な精製方法を開発することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、組織プラスミノーゲン活性化因子及びその変異体、より具体的にはＴＮＫ−ｔＰＡをＣＨＯ細胞から単離及び精製する新規方法に関し、工業的に適用可能で、簡単で、費用対効果が高く、堅牢で、高効率なＴＮＫ−ｔＰＡ精製方法を記載する。
【００１４】
本発明のＴＮＫ−ｔＰＡの単離及び精製方法であって、
（ｉ）ＣＨＯ細胞培養から得られた無細胞回収物を、ＴＮＫ−ｔＰＡを捕捉するために親和性クロマトグラフィーに供し、部分的に精製したＴＮＫ−ｔＰＡを含有する溶出液を得る工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）の溶出液を、ＴＮＫ−ｔＰＡの追加精製のために親和性クロマトグラフィーに供し、ＴＮＫ−ｔＰＡを主に含有する溶出液を得る工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の溶出液のウイルス不活化により、ウイルス不活化試料を得る工程、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）のウイルス不活化試料を、追加精製のために更なる親和性クロマトグラフィーに供し、高度に精製されたＴＮＫ−ｔＰＡを主に含有する溶出液を得る工程、
（ｖ）工程（ｉｖ）の溶出液を、陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、高度に精製されたＴＮＫ−ｔＰＡの調製物を含有する溶出液を得る工程、
（ｖｉ）工程（ｖ）の溶出液を、存在するウイルスを除去するためウイルス減少濾過に供する工程、
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）の試料を濃縮してＴＮＫ−ｔＰＡを得る工程、を含み、該方法の収率は６０％超であり、得られたＴＮＫ−ｔＰＡの純度がサイズ排除クロマトグラフィーで測定して９５％超である、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】最初のピークが不純物を表し、２番目のピークがＴＮＫ−ｔＰＡを含有する溶出液に対応する親和性Ｉ精製クロマトグラムを描写する。
【図２】レーン番号５、６、及び７が洗浄画分（それぞれ１、２、及び３）を示し、レーン９がＴＮＫ−ｔＰＡを含有する溶出液に対応する、親和性Ｉ精製のＳＤＳ  ＰＡＧＥ（銀染色）プロファイルを描写する。
【図３】ＵＶ  ２８０ピークがＴＮＫ−ｔＰＡを含有する溶出液に対応する、親和性ＩＩ精製クロマトグラムを描写する。
【図４】９番目のレーンがＴＮＫ−ｔＰＡを含有する溶出液に対応する、親和性ＩＩ精製のＳＤＳ  ＰＡＧＥ（銀染色）プロファイルを描写する。
【図５】親和性ＩＩＩ精製のクロマトグラムを描写し、ＵＶ  ２８０ピーク（第１）がＴＮＫ−ｔＰＡを含有する溶出液に対応する。
【図６】９番目のレーンがＴＮＫ−ｔＰＡを含む溶出液に対応する、親和性ＩＩＩ精製のＳＤＳ  ＰＡＧＥ（銀染色）プロファイルを描写する。
【図７】陽イオン交換精製クロマトグラムを描写し、ＵＶ  ２８０ピークがＴＮＫ−ｔＰＡを含有する溶出液に対応する。
【図８】５番目のレーンがＴＮＫ−ｔＰＡを含む溶出液に対応する、陽イオン交換精製のＳＤＳ  ＰＡＧＥ（銀染色）プロファイルを描写する。
【図９】本発明に記載の工程及びイノベーター製品（Ｍｅｔａｌｙｓｅ）を用いて精製後に得られた原薬の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色）プロファイルを描写する。
【図１０】本発明に記載の工程及びイノベーター製品（Ｍｅｔａｌｙｓｅ）を用いて精製後に得られた原薬の非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（銀染色）プロファイルを描写する。
【図１１】本発明に記載の工程を用いて精製後に得られた原薬のペプチドマップクロマトグラムが、イノベーター製品（Ｍｅｔａｌｙｓｅ）に類似することを描写する。
【図１２】本発明に記載の工程を用いて精製後に得られた原薬のイムノブロッティングが、イノベーター製品（Ｍｅｔａｌｙｓｅ）に類似することを描写する。
【図１３】親和性Ｉ（Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐａｈｒｏｓｅ  ＦＦ）の漏出曲線をバッチモードで描写する。
【図１４】（ａ）カラムＡ−負荷領域の最初のカラム、（ｂ）カラムＢ−負荷領域の第２カラム、（ｃ）カラムＣ−負荷領域の第３カラム、（ｄ）完全なＰＣＣを示す相互に重ね合わされたカラムクロマトグラムについて、２サイクルにわたるＰＣＣのクロマトグラムを描写する。ＵＶは２８０ｎｍで測定された。実行は、ＸＫ１６−５ｍｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗで行った。
【図１５】最初のカラム（カラムＡ）を過負荷しカラムＢで捕捉したクロマトグラムを描写し、ＵＶは２８０ｎｍで測定した。実行は、ＸＫ１６−５ｍｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗで行った。
【図１６】３番目のカラム（カラムＣ）からのクロマトグラムを描写し、全てのポスト負荷洗浄を示す。洗浄ステップの影響は、Ａ−洗浄１、Ｂ−洗浄２、Ｃ−洗浄３、Ｄ−溶出、Ｅ−再生１、Ｆ−再生２、Ｇ−再生３、Ｈ−再生４で示される。ＵＶは２８０ｎｍで測定した。実行は、ＸＫ１６−５ｍｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗで行った。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、組織プラスミノーゲン活性化因子及びその変異体、より具体的にはＴＮＫ−ｔＰＡを単離及び精製する新規方法に関する。無細胞回収物は、バイオリアクターで培養された細胞から得られる。本発明の明細書で使用される記号及び略語の一覧は、以下の表Ａに列挙されている。
【表１】
2018504366.tif 000002
【００１７】
本発明は、組織プラスミノーゲン活性化因子及びその変異体、より具体的にはＴＮＫ−ｔＰＡをＣＨＯ細胞から単離及び精製する新規方法に関し、工業的に適用可能で、簡単で、費用対効果が高く、堅牢で、高効率なＴＮＫ−ｔＰＡ精製方法を記載する。
【００１８】
本発明のＴＮＫ−ｔＰＡの単離及び精製方法であって、
（ｉ）ＣＨＯ細胞培養から得られた無細胞回収物を、ＴＮＫ−ｔＰＡを捕捉するために親和性クロマトグラフィーに供し、部分的に精製したＴＮＫ−ｔＰＡを含有する溶出液を得る工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）の溶出液を、ＴＮＫ−ｔＰＡの追加精製のために親和性クロマトグラフィーに供し、ＴＮＫ−ｔＰＡを主に含有する溶出液を得る工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の溶出液のウイルス不活化により、ウイルス不活化試料を得る工程、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）のウイルス不活化試料を、追加精製のために更なる親和性クロマトグラフィーに供し、高度に精製されたＴＮＫ−ｔＰＡを主に含有する溶出液を得る工程、
（ｖ）工程（ｉｖ）の溶出液を、陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、高度に精製されたＴＮＫ−ｔＰＡの調製物を含有する溶出液を得る工程、
（ｖｉ）工程（ｖ）の溶出液を、存在するウイルスを除去するためウイルス減少濾過に供する工程、
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）の試料を濃縮してＴＮＫ−ｔＰＡを得る工程、を含み、該方法の収率は６０％超であり、得られたＴＮＫ−ｔＰＡの純度がサイズ排除クロマトグラフィーで測定して９５％超である、方法。
【００１９】
本発明の方法は、以下の工程を例証することにより説明することができる：
【００２０】
（ｉ）ＣＨＯ細胞培養から得られた無細胞回収物を、ＴＮＫ−ｔＰＡを捕捉するために親和性クロマトグラフィーに供し、部分的に精製したＴＮＫ−ｔＰＡを含有する溶出液を得る工程。
ＴＮＫ−ｔＰＡを含有する無細胞回収物は、灌流技術に基づくＣＨＯ細胞による発酵系から得ることができる。ＴＮＫ−ｔＰＡを含有する回収物を０．２μで濾過し、滅菌容器に集め、さらなる使用まで２〜８℃で保存する。ＴＮＫ−ｔＰＡを含有する無細胞回収物を親和性クロマトグラフィーに供する。親和性クロマトグラフィーの固定相は、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ、Ｌｙｓｉｎｅ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ａｐａｔｉｔｅ（ＣＨＴ）を含む群から選択することができ、好ましくは固定相がＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦである。カラムは、リン酸緩衝液、塩化ナトリウム、及びポリソルベート２０、またはそれらの混合物を含む緩衝液を使用することによって平衡化され得る。捕捉工程（親和性クロマトグラフィー）のために使用される溶出緩衝液または移動相は、リン酸緩衝液、尿素、及び塩化ナトリウムから選択される個々または組み合わせであり得る。より好ましくは、溶出緩衝液または移動相を組み合わせて使用する。使用される緩衝液中のリン酸ナトリウムの濃度は、好ましくは２０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム、より好ましくは２０〜４０ｍＭである。緩衝液中に使用される塩化ナトリウムの濃度は、１〜２．５ＭのＮａＣｌ、より好ましくは１．５〜２Ｍである。緩衝液中の尿素濃度は、１〜４モルの範囲、好ましくは２〜３モルの範囲である。溶出緩衝液または移動相のｐＨは、７〜８の範囲、好ましくは７〜７．６の範囲、より好ましくは７．２〜７．４の範囲に維持することができる。
【００２１】
哺乳動物細胞で産生される産物からの宿主細胞タンパク質の除去は、常に困難な作業である。本発明において、本発明の捕捉クロマトグラフィーとして最適化された工程は、精製ＴＮＫ−ｔＰＡ調製物中のＨＣＰの最終濃度を１００ｐｐｍ未満にするのに役立つ、対数０．８〜１．５、より具体的には対数１．０の範囲で、宿主細胞タンパク質を選択的に除去する。
【００２２】
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が減少するだけでなく、アルブミン、ゲンタマイシン、メトトレキセート（ＭＴＸ）等の方法関連不純物もまた、本発明に記載の捕捉クロマトグラフィーによって効果的に除去される。
【００２３】
（ｉｉ）工程（ｉ）の溶出液を、ＴＮＫ−ｔＰＡの追加精製のために親和性クロマトグラフィーに供し、ＴＮＫ−ｔＰＡを主に含有する溶出液を得る工程。
工程（ｉ）の溶出液は親和性クロマトグラフィーに供してもよい。固定相またはカラム材料は、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ、Ｌｙｓｉｎｅ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ａｐａｔｉｔｅ（ＣＨＴ）等を含む群から選択することができ、好ましくは固定相はＬｙｓｉｎｅ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄである。親和性クロマトグラフィー工程で使用される平衡緩衝液は、リン酸緩衝液、塩化ナトリウム、及びポリソルベートから選択される個々または組み合わせであってもよい。より好ましくは、平衡緩衝液を組み合わせて使用する。
【００２４】
カラムは、酢酸ナトリウム、尿素、及びイプシロン−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）から選択される、個々または組み合わせを含む群から選択される溶出緩衝液または移動相によって溶出することができる。親和性クロマトグラフィー溶出緩衝液のｐＨは、ｐＨ３．５〜６、好ましくは４〜５、より好ましくは４．５〜５の範囲で行うことができる。
【００２５】
中間精製のために使用されるクロマトグラフィーマトリックスは、親和性ＩＩクロマトグラフィー工程が、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ、Ｌｙｓｉｎｅ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、及びＣｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ａｐａｔｉｔｅ（ＣＨＴ）を含む群から選択することができ、好ましくは使用されるクロマトグラフィーマトリックスはＬｙｓｉｎｅ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄである。
【００２６】
親和性クロマトグラフィー工程で使用される溶出緩衝液は、ｐＨ４．０〜５．０を有する５〜２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１〜４Ｍの尿素、０．１〜０．４ＭのＥＡＣＡであり得る。溶出緩衝液中の酢酸ナトリウムの濃度は５〜２５ｍＭ、好ましくは５〜１５ｍＭの範囲である。緩衝液中のＥＡＣＡの濃度は０．１〜０．４ｍＭ、好ましくは０．１〜０．２Ｍの範囲である。尿素の濃度は緩衝液中で１〜４Ｍ、好ましくは２〜３Ｍの範囲である。
【００２７】
この工程において酸性ｐＨでＥＡＣＡを使用することによる溶出緩衝液の本発明の利点は、最も適切な条件を提供することである。本明細書に記載の本発明の方法は、ウイルス不活化に最も適しており、取り扱い及び材料消費を数倍減少させる。本発明で使用される親和性クロマトグラフィーにより、ウイルスクリアランスで対数減少約２〜４、及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少１〜１．５が達成される。本発明で使用される親和性クロマトグラフィーによって、平均して、ＸＭｕＬＶで対数減少１．６９、及びＰＲＶで対数減少４．３０が達成される。
【００２８】
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の溶出液のウイルス不活化により、ウイルス不活化試料を得る工程、
工程（ｉｉ）から得られる溶出液のウイルス不活化は、熱処理（低温殺菌、凍結乾燥／乾熱）、照射、紫外線（ＵＶ）、高静水圧、低ｐＨインキュベーション、化学的及び溶媒／界面活性剤処理等の、任意の方法によって実施されてもよい。化学的不活化またはウイルス不活化は、コール酸ナトリウム、トリトン、ベータ−プロピオラクトン、トリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）、及びカプリル酸ナトリウムを含む群から選択される化学物質で試料を処理することによって行われ、好ましくは尿素の存在下で低ｐＨでカプリル酸ナトリウムで試料を処理する。化学薬品／洗剤の濃度は、０．００１％〜０．１０ｗ／ｖ％の範囲、好ましくは０．０１％〜０．０７％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０５％である。尿素の濃度は、１〜４Ｍの範囲、好ましくは２〜３Ｍである。ウイルス活性化はまた、１５〜４５℃の温度範囲で、より好ましくは２０〜３０℃の範囲で、４０〜１８０分、より好ましくは４０〜８０分の期間、試料をインキュベートすることによって行ってもよい。
【００２９】
一般に、低ｐＨは、精製方法におけるウイルス不活化の選択肢であり、最も広く使用されている方法である。低ｐＨはエンベロープを有するウイルスを不活化することが知られているが、高耐性非エンベロープウイルスを不活化することはできない。ｐＨは４．０〜４．７の範囲、より好ましくは４．３〜４．７の範囲である。
【００３０】
本発明に記載のウイルス不活化緩衝液の組成は、エンベロープ及び非エンベロープウイルスの両方を効率的に不活化することができるような方法で最適化される。本発明の化学物質／界面活性剤、尿素、ＥＡＣＡ、及び低ｐＨの使用は、エンベロープ及び非エンベロープウイルスに対して致命的な条件とし、その組み合わせを高耐性ウイルスを不活化するための最適な選択肢にする。本発明の低ｐＨ及び化学的不活化によって、平均して、ＸＭｕＬＶで対数減少５．６５、及びＰＲＶで対数減少５．３８が達成される。
【００３１】
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）のウイルス不活化試料を更なる親和性クロマトグラフィーに供し、ＴＮＫ−ｔＰＡを含有する溶出液を得る工程、
工程（ｉｉｉ）のウイルス不活化試料は、更なる親和性クロマトグラフィーに供されてもよい。親和性クロマトグラフィーの固定相またはカラム材料は、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ、Ｌｙｓｉｎｅ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、及びＣｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ａｐａｔｉｔｅ（ＣＨＴ）等の群から選択することができ、好ましくは使用される固定相またはクロマトグラフィーマトリックスはＣｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ａｐａｔｉｔｅ（ＣＨＴ）である。固定相またはカラムは、リン酸緩衝液、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸水和物（ＭＥＳ−水和物）、塩化ナトリウム、及び尿素から選択される個々または組み合わせを含む群から選択される移動相または緩衝液によって溶出することができる。親和性クロマトグラフィー溶出緩衝液のｐＨは、ｐＨ範囲が６〜９、好ましくは６〜８、より好ましくは６〜７で行うことができる。
【００３２】
親和性クロマトグラフィー工程で使用される移動相または溶出緩衝液は、５〜５０ｍＭリン酸緩衝液、好ましくは５〜１５ｍＭの範囲であり得る。尿素の濃度は、緩衝液中で１〜４Ｍの範囲、好ましくは１〜３Ｍの範囲で使用される。使用されるＭＥＳ−水和物の濃度は、緩衝液中で２〜２０ｍＭであり得る。溶出は塩の濃度を上げることによって行うことができる。この溶出の塩は、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、及び硫酸アンモニウムの群から選択することができ、好ましくは塩が塩化ナトリウムであり、塩化ナトリウムの濃度が０．１〜１．０Ｍ塩化ナトリウムの範囲である。溶出型は、直線、段階、または両方の組み合わせでもよく、好ましくは、使用される溶出が直線塩勾配である。
【００３３】
本発明で使用される親和性クロマトグラフィー（マルチモードクロマトグラフィー）は、痕跡量の不純物、具体的には宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤ）、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、及びウイルス不純物があればそれを除去するためにある。本発明で述べた親和性ＩＩＩクロマトグラフィーを用いて、ウイルスクリアランスで対数減少およそ２〜４、及びＨＣＰの対数減少０．５〜１が達成される。本発明で用いられる親和性クロマトグラフィーにより、平均して、ＸＭｕＬＶで対数減少４．２３、ＰＲＶで対数減少４．０６、Ｒｅｏ−３で対数減少３．７３、及びＭＭＶで対数減少２．９７が達成される。
【００３４】
（ｖ）工程（ｉｖ）の溶出液を、陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、製剤緩衝液中の高度に精製されたＴＮＫ−ｔＰＡの調製物を含有する溶出液を得る工程、
工程（ｉｖ）の溶出液の陽イオン交換クロマトグラフィーは、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＯ３、Ｆｒａｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉｃａｐ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ等を含む群から選択されるマトリックスまたは固定相を用いて行うことができ、好ましくは使用されるクロマトグラフィーマトリックスまたは固定相は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＯ３である。陽イオン交換クロマトグラフィーで使用される平衡緩衝液は、リン酸緩衝液、尿素、ＭＥＳ、及び塩化ナトリウムを含む群から選択される個々または組み合わせであってよく、好ましくは平衡緩衝液を組み合わせて使用することができる。
【００３５】
陽イオン交換クロマトグラフィーで使用される溶出緩衝液または移動相は、Ｌ−アルギニン、Ｏ−リン酸、及びポリソルベート−２０から選択される個々または組み合わせであってよく、好ましくは溶出緩衝液は組み合わせてまたは混合物として使用される。移動相または溶出緩衝液は、１０〜３５０ｍＭの範囲、好ましくは２５０〜３５０ｍＭの範囲で存在するＬ−アルギニン、０．５〜１％の範囲、好ましくは０．６％〜０．８％の範囲で存在するＯ−リン酸、０．０１〜０．０５％の範囲、好ましくは０．０４〜０．０５％の範囲で存在するポリソルベート−２０を含んでいる、陽イオン交換クロマトグラフィーに使用した。陽イオン交換クロマトグラフィー溶出緩衝液または移動相のｐＨは、７．０〜７．５の範囲、好ましくは７．３〜７．５の範囲で行うことができる。
【００３６】
一般に、イオン交換クロマトグラフィーは、捕捉、中間、及び研磨クロマトグラフィーとして、バルクまたは微量の不純物を除去するために使用される。本発明において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、従来使用されていたものとは多少異なって使用される。ここで、以前のクロマトグラフィーの溶出液が陽イオン交換クロマトグラフィーに直接負荷され、アルギニン、オルトリン酸、及びポリソルベート２０を含有する最終製剤緩衝液中の高度に精製されたＴＮＫ−ｔＰＡの調製物を得る。陽イオン交換クロマトグラフィーを異なる方法で使用する利点は、緩衝液交換及び同時濃縮及び精製が単一工程で達成されることである。先行技術では、ゲル濾過クロマトグラフィー及び接線流濾過（ＴＦＦ）を用いる血液透析濾過のような技術を緩衝液交換に用いる。これらの技術は、効率的であり、緩衝液交換のために最も一般的に使用されるが、標的タンパク質をさらに精製することはできない。ゲル濾過クロマトグラフィーではカラム容量に対して試料の最大３０％しか負荷することができない事実により、イオン交換クロマトグラフィーと比較してより大きなカラムサイズが必要とされる。ゲル濾過クロマトグラフィーはまた、緩衝液交換の間に標的タンパク質の希釈を引き起こし、さらにＴＦＦのようないくつかのさらなる濃縮工程を必要とする。血液透析濾過を使用した緩衝液交換は、非常に多量の緩衝液交換を必要とし、大きなサイズのＵＦ／ＤＦユニットを必要とするため、緩衝液換される容量がより多い場合には実現不可能である。従来の緩衝液交換技術の前述の限界を考慮すると、本発明に記載の陽イオン交換クロマトグラフィーは緩衝液交換工程を提供することができ、さらに精製も助ける。本発明のイオン交換クロマトグラフィーを用いて、非エンベロープウイルス、例えばＭＭＶで対数１．２１のウイルス減少係数を達成することが可能である。
【００３７】
（ｖｉ）工程（ｖ）の溶出液を、存在するウイルスを除去するためウイルス減少濾過に供する工程、
ウイルス濾過は、親和性クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、及び接線流濾過工程の後に行うことができ、より好ましくは、ウイルス濾過工程が陽イオン交換クロマトグラフィー後に行われる。この工程のために選択されるナノフィルターは、１５ｎｍ、２０ｎｍ、及びそれ以上であり得る。好ましくは、ナノフィルターのサイズは１５〜２０ｎｍである。使用されるナノフィルターは、セルロース、ＰＥＳ、ＰＶＤＦ等で構成されてもよい。より好ましくは、使用されるフィルターはＰＥＳである。
【００３８】
ウイルス濾過後に実施される濾過は、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、マクロ濾過、接線流濾過等から選択することができる。より好ましくは、濾過は接線流濾過である本発明で使用されるウイルス減少濾過によって、平均して、ＸＭｕＬＶで対数減少４．１５、ＰＲＶで対数減少３．４０、Ｒｅｏ−３で対数減少４．４１、ＭＭＶで対数減少４．７６が達成される。
【００３９】
全体的下流プロセスは、ＸＭｕＬＶで対数減少１５超、ＰＲＶで対数減少１７回超、Ｒｅｏ−３で対数減少８超、及びＭＭＶで対数減少８超を提供する。
【００４０】
ＴＮＫ  ｔ−ＰＡの方法における最も有害な汚染物質はＣＨＯ細胞由来レトロウイルスであり、ＸＭｕＬＶはＣＨＯ細胞の非Ｃ型レトロウイルスであり、ＸＭｕＬＶについて対数減少１５超が得られることが、ウイルスの安全性の点で最も重要であり、高い保証を与える。
【００４１】
（ｖｉｉ）ＴＮＫ−ｔＰＡを得るために、工程（ｖｉ）の試料を濃縮する。
工程（ｖｉｉ）で得られた濾液を、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、精密濾過、及び接線流濾過を含む群から選択される濾過方法に供し、好ましくは濾過方法は接線流濾過である。この工程のために選択された限外濾過膜は、５、１０、３０、または５０ｋＤａであり得る。好ましくは、使用される限外濾過膜は５〜３０ｋＤａの範囲であり、より好ましくは、使用される限外濾過膜のサイズは１０ｋＤａである。使用される限外濾過膜は、セルロース、ＰＥＳ、ＰＶＤＦ等で構成されていてもよい。より好ましくは、使用されるフィルターはＰＥＳである。ＴＮＫ−ｔＰＡ保持物の濃度は、１．０±０．４ｍｇ／ｍｌ〜７．０±０．４ｍｇ／ｍｌの範囲であり得る。より好ましくは、ＴＮＫ−ｔＰＡの濃度は、１．０±０．４ｍｇ／ｍｌ〜６．０±０．４ｍｇ／ｍｌの範囲であり得る。最も好ましくは、ＴＮＫ−ｔＰＡの濃度は５．５±０．４ｍｇ／ｍｌである。
【００４２】
ＴＮＫ−ｔＰＡ原薬（テネクテプラーゼ）は、好ましくは、ＰＥＳ、ＰＶＤＦ、及びセルロースからなる０．２μの殺菌グレードのフィルターを用いてＴＦＦ保持物を滅菌濾過することによって得ることができる。より好ましくは、滅菌フィルターはＰＥＳからなる。
【００４３】
本発明はまた、バッチ親和性Ｉクロマトグラフィーが、周期的向流クロマトグラフィー（ＰＣＣ）を用いて連続モードで操作されてもよい方法を開示する。ＰＣＣの使用は、例えばバッファ消費量の削減、生産性の向上、定常状態の操作、及びより優れた方法制御等、追加の利点を提供する。。
【００４４】
本発明は、６００Ｌ／時の最大流速を有する５つのポンプに基づくカスタマイズされたＡＫＴＡプロセス系によるインラインバッファー及びクロマトグラフィー負荷調節兼調製の使用をその範囲内に含む。該活性は、例１〜４で述べた親和性Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＥＣクロマトグラフィー工程の、緩衝液及びクロマトグラフィー負荷調製の、フローフィードバックまたはｐＨ−フローフィードバックモードの制御によって行うことができる。
【００４５】
本発明の方法は、増加した収率及び純度でＴＮＫ−ｔＰＡの精製生成物を生じる。本発明の方法によって得られたＴＮＫ−ｔＰＡの属性は、表Ｂに詳細に記載されている。
【表２】
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【００４６】
一実施形態では、本発明の方法は、スケールダウンされた精製方法を使用して評価されるような、潜在的な不定剤としてウイルスを除去または不活化することができる。ＸＭｕＬＶ、ＰＲＶ、Ｒｅｏ−３、及びＭＭＶについて得られた高い対数クリアランス値は、検出されないか、または生産方法にアクセスし得る可能性のある任意の不定ウイルスが、 本発明で述べた高性能な精製方法の間、除去／不活化され、したがって、患者の安全性に対する全体的なリスクを低減するという、非常に良い保証を提供する。
【００４７】
ウイルス安全性のより高い保証に加えて、ＴＮＫ−ｔＰＡの精製方法における前述の改善は、より高い収量のＴＮＫ−ｔＰＡ調製のためのヒトの介入の減少、資本及び操作上の支出の低減の点でも有益である。
【００４８】
一実施形態では、本発明は、急性心筋梗塞及び急性虚血性脳卒中のための薬学的に許容される賦形剤を含む液体非経口静注製剤中に本発明の方法から得られたＴＮＫ−ｔＰＡ保持物を含む薬学的組成物を提供する。
【００４９】
一実施形態では、本発明の薬学的組成物は、以下を含む。
【表３】
2018504366.tif 000004
【００５０】
別の実施形態において、本発明は、急性心筋梗塞及び急性虚血性脳卒中のための液体非経口静注製剤における単離及び調製されたＴＮＫ−ｔＰＡの使用を提供する。
【００５１】
本発明は、以下の例に関して本明細書中で以下に詳細に記載されるが、これらの例は単に例証のために提供され、決して本発明の範囲を限定することを意図しない。当業者に明らかであり得る任意の実施形態は、本発明の範囲内にあるとみなされる。
【００５２】
例−１
ＴＮＫ−ｔＰＡを含有する無細胞回収物をＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦを充填した親和性クロマトグラフィーカラムに供する。負荷前に、カラムを平衡緩衝液の５カラム容量（ＣＶ）で平衡化する。カラムが飽和するまで負荷を停止する。カラムの負荷容量は、１〜２ｍｇ／ｍｌの範囲のカラムの動的結合容量（ＤＢＣ）に基づいて決定される。負荷後、緩やかな結合方法及び生成物関連不純物が平衡洗浄で洗い流されるまで、カラムを平衡緩衝液で洗浄する。宿主細胞タンパク質をさらに除去するために、尿素、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びポリソルベート２０からなる別の洗浄緩衝液を使用する。
【００５３】
カラム洗浄後、２０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１〜２ＭのＮａＣｌ、２〜３Ｍの尿素、及び０．０４〜０．１％のポリソルベート２０を含有する溶出緩衝液を用いてＴＮＫ−ｔＰＡを溶出する。親和性Ｉ溶出液を０．２μｍフィルターで濾過する。試料を採取し、純度プロファイル及び一本鎖／二本鎖含有量を知るために、還元及び非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析する。当業者は最終的なＴＮＫ−ｔＰＡ薬物物質中の一本鎖／二本鎖組成物の重要性を理解することができる。
【００５４】
本発明は、大型の混合タンク内で混合することなく、清澄化回収物を直接捕捉するために有利である。
【００５５】
例−２
親和性Ｉクロマトグラフィー溶出液を、ｐＨ７．２で、２０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．０４〜０．１％のポリソルベート２０を含有する親和性ＩＩ希釈液または親和性クロマトグラフィー平衡緩衝液で希釈して、１５ｍｓ／ｃｍ未満まで導電率を減少させる。希釈した試料を０．２μフィルターを用いて清澄化し、親和性ＩＩクロマトグラフィーに負荷する。カラムを平衡化緩衝液で洗浄して、ＵＶ２８０吸光度をベースラインにする。カラムをさらに洗浄して、ｐＨ７．２で、２０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１〜３ＭのＮａＣｌ、０．０４〜０．１％のポリソルベート２０を含有する洗浄緩衝液で、方法及び生成物関連不純物を除去する。精製したＴＮＫ−ｔＰＡを回収し、ｐＨ４．０〜５．０で、５〜２５ｍＭの酢酸ナトリウム、１〜４Ｍの尿素、０．１〜０．４ＭのＥＡＣＡからなる溶出緩衝液を通過させることにより、カラムから溶出する。負荷、フロースルー、洗浄、及び溶出を含む全てのクロマトグラフィー試料を、以下の分析方法を使用して分析した。
純度及び一本鎖／二本鎖含有量に関するＳＤＳ  ＰＡＧＥ（還元／非還元）。
凝集体含有量のサイズ排除高性能クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）。
血餅溶解アッセイによって測定したＴＮＫ−ｔＰＡ含有量。
Ｂｒａｄｆｏｒｄ及びＵＶ２８０ｎｍによる総タンパク質。
ＥＬＩＳＡを用いたＨＣＰ含有量（Ｃｙｇｎｕｓ第３世代キット）。
【００５６】
親和性クロマトグラフィーは、方法及び生成物関連不純物を除去するために最適化される。この工程における溶出の方法は、それがウイルス不活化工程を補完するように最適化され、組成物は溶出緩衝液の条件、例えば、尿素、ＥＡＣＡ、及び低ｐＨが、ウイルス不活化に則して最適化される。親和性ＩＩクロマトグラフィー工程の後、ウイルスクリアランスで対数減少約２〜４、及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の対数減少１．０〜１．５が達成される。
【００５７】
他の利点は、中性ｐＨでのＬ−アルギニン及びＥＡＣＡにも関わらず、溶出緩衝液中の親和性クロマトグラフィー−ＩＩにおける酸性ｐＨでのＥＡＣＡの使用である。精製工程におけるこの特定の変化は、Ｌ−アルギニンのコストを低減する上で有益であり、ウイルス不活化の最適条件も提供する。したがって、同じ工程がＴＮＫ−ｔＰＡ溶出に有利であるばかりでなく、ウイルス不活化に最適であり、時間の経過とともに作業負荷及び材料消費を減少させると言える。
【００５８】
例−３
親和性クロマトグラフィーの溶出は、カプリル酸ナトリウムを用いて低ｐＨ及び化学的不活化に供される。混合物を２０〜２５℃で６０分間インキュベートする。ウイルス不活化工程では、使用されるカプリル酸ナトリウムは、大きな混合容器の必要性を排除する、非常に少ない量である。先行技術では、捕捉クロマトグラフィー前に存在するウイルスを不活化するためにカプリル酸ナトリウムが使用され、容量が比較的多く、したがってカプリル酸ナトリウムの必要量もまた多かった。本発明において、カプリル酸ナトリウムは第２のクロマトグラフィー工程の後に添加され、取り扱われる容量が少なく、したがってカプリル酸ナトリウムの量が少なくてすみ、取り扱うための容器がはるかに小さい。それとは別に、中性またはアルカリ性のｐＨと比較して、ｐＨ４．５でのカプリル酸ナトリウムの使用は、この方法においてより有効で強力なウイルス不活化を提供する。
【００５９】
ウイルス不活化後、溶液をリン酸緩衝液を用いて希釈して、親和性クロマトグラフィー（混合モードクロマトグラフィー）にかけ、痕跡量の不純物、特にＨＣＤ、ＨＣＰ、及びウイルス不純物があればそれを除去する。親和性クロマトグラフィーにより、ウイルスクリアランスで対数減少約２〜４、及びＨＣＰクリアランスで対数減少０．５〜１が達成される。先行技術では、組織プラスミノーゲン活性化因子精製のために同じセラミックヒドロキシアパタイトが記載されているが、方法のどれもが不純物、例えばＨＣＰ、ＤＮＡ、及びウイルスを除去する能力を記載していない。そのような不純物の除去の重要性は、これらの不純物の量が最終製品（ウイルス量を除く）で試験され、最終原薬放出仕様の一部であるという事実によって明らかである。負荷、フロースルー、洗浄、及び溶出を含む全てのクロマトグラフィー試料を、以下の分析方法を使用して分析する。
純度及び一本鎖／二本鎖含有量に関するＳＤＳ  ＰＡＧＥ（還元／非還元）。
凝集体含有量のサイズ排除高性能クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）。
血餅溶解アッセイによって測定したＴＮＫ−ｔＰＡ含有量。
Ｂｒａｄｆｏｒｄ及びＵＶ２８０ｎｍによる総タンパク質。
ＥＬＩＳＡを用いたＨＣＰ含有量（Ｃｙｇｎｕｓ第３世代キット）。
【００６０】
例−４
調節なしの親和性クロマトグラフィー溶出液は、標的タンパク質の濃縮及び緩衝液交換のために陽イオン交換クロマトグラフィーに直接負荷される。陽イオン交換クロマトグラフィーは、フィード調節のための煩雑な希釈工程を避けるように最適化され、したがって、親和性ＩＩＩ溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィーに直接負荷することができる。ＴＮＫ−ｔＰＡは、５５ｍｇ／ｍｌのＬ−アルギニン、１７ｍｇ／ｍｌのオルトリン酸、０．４３ｍｇ／ｍｌのポリソルベート２０、及びｐＨ７．４を含む溶出緩衝液を通過させることによってカラムから回収される。陽イオン交換クロマトグラフィー溶出液をウイルス除去のための濾過に供し、得られた濾液を接線流濾過（ＴＦＦ）系を用いてさらに濃縮して、最終薬剤物質濃度を達成する。濃縮後、ＴＦＦ保持物を滅菌濾過し、さらなる使用のために−２０℃に保つ。本発明の精製方法によって製造された原薬は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、Ｎ末端配列分析、及びペプチドマップによる同一性及び純度のチェックを含む、従来技術及び妥当性のある分析手順によって完全に分析されるが、これに限定されない。
ＥＬＩＳＡを用いたＨＣＰ測定、
血餅溶解アッセイを用いた生物活性及びＴＮＫ−ｔＰＡ定量、
ｑＰＣＲを用いた宿主細胞ＤＮＡの定量、
ＬＡＬ試験を用いたエンドトキシン定量、
サイズ排除ＨＰＬＣを用いた凝集体及び一本鎖／二本鎖含有量、
アルギニン含有量及び浸透圧、
シアル酸、中性糖、Ｉ型及びＩＩ型糖化分析、
社内で開発した方法を用いた、方法関連不純物、例えばゲンタマイシン、ＭＴＸ、尿素、カプリル酸ナトリウム、及びＥＡＣＡの分析。
【００６１】
イノベーター製品との広範な分析及び生物物理学的比較の後、本発明に記載された方法によって精製された製品は、６０％超の全方法収率でイノベーター製品と非常に類似したＴＮＫ−ｔＰＡ製品を生成すると結論付けることができる。
【００６２】
例５：
親和性Ｉ工程のための周期的向流クロマトグラフィー（ＰＣＣ）は、灌流に基づくバイオリアクターからのＴＮＫ−ｔＰＡを含有する細胞培養上清で行われた。バッチモードでは、親和性Ｉクロマトグラフィー媒体の動的結合能力を評価し、漏出分析から得られた情報に基づいて、ＸＫ１６−５ｍｌ  ＢＬＵＥ  ＳＥＰＡＨＲＯＳＥ  ＦＦで、３カラムＰＣＣを実験した。クロマトグラフィー緩衝液組成物は、例１に述べたものと同じとした。
【００６３】
例６：
必要な緩衝液、希釈液のｐＨ及びイオン強度を制御した液体混合物の調製方法、及び／またはＴＮＫ−ｔＰＡ下流プロセスのための最大流速６００Ｌ／時を有する、５ポンプに基づくカスタマイズされたAＫＴＡプロセス系による、クロマトグラフィー負荷の調節。定義された製法を有する上記の系で調製された液体混合物は、例１〜４で述べたような異なるクロマトグラフィー段階でのＴＮＫ−ｔＰＡの精製に適する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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