(57)【要約】【課題】本発明は、サンプル間で通常型間質性肺炎（UIP）または非ＵＩＰを識別するための、システム、方法および分類器を提供する。【解決手段】機械学習および高次元転写データを使用して経気管支生検における特発性肺線維症を診断するシステムおよび方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺組織サンプルが通常型間質性肺炎（UIP）または非通常型間質性肺炎（非UIP）に陽性か検出する方法であって：
対象の試験サンプル中の第１群の転写産物および第２群の転写産物それぞれの発現レベルをアッセイする工程であって、前記第１群の転写産物が、ＵＩＰにおいて過剰発現され、かつ、表５、７、９、１０、１１および１２のいずれかに挙げた遺伝子のいずれか１つに対応する１つまたは複数の配列を含み、前記第２群の転写産物が、ＵＩＰにおいて過小発現され、かつ、表５、８、９、１０、１１または１２のいずれかに挙げた遺伝子のいずれか１つに対応する１つまたは複数の配列を含む工程と；
前記第１群の転写産物および前記第２群の転写産物それぞれの発現レベルを、対応する転写産物の参照発現レベルと比較する工程であって、（１）前記参照発現レベルと比較して（ａ）前記第１群に対応する発現レベルにおける増加および／または（ｂ）前記第２群に対応する発現レベルにおける低下がある場合に前記肺組織を通常型間質性肺炎（UIP）と分類する、あるいは（２）前記参照発現レベルと比較して（ｃ）前記第２群に対応する発現レベルにおける増加および／または（ｄ）前記第１群に対応する発現レベルにおける低下がある場合に肺組織を非通常型間質性肺炎（非UIP）と分類する、工程と
を含む方法。
【請求項２】
肺組織サンプルが通常型間質性肺炎（UIP）または非通常型間質性肺炎（非UIP）に陽性か検出する方法であって：
対象の肺組織由来試験サンプル中の第１群の転写産物および第２群の転写産物それぞれの発現レベルを配列決定、アレイハイブリダイゼーションまたは核酸増幅によりアッセイする工程であって、前記第１群の転写産物が、ＵＩＰにおいて過剰発現され、かつ、表５、７、９、１０、１１および１２のいずれかに挙げた遺伝子のいずれか１つに対応する１つまたは複数の配列を含み、前記第２群の転写産物が、ＵＩＰにおいて過小発現され、かつ、表５、８、９、１０、１１または１２のいずれかに挙げた遺伝子のいずれか１つに対応する１つまたは複数の配列を含む工程と；
前記第１群の転写産物および前記第２群の転写産物それぞれの発現レベルを、対応する転写産物の参照発現レベルと比較する工程であって、（１）前記参照発現レベルと比較して（ａ）前記第１群に対応する発現レベルにおける増加および／または（ｂ）前記第２群に対応する発現レベルにおける低下がある場合に前記肺組織を通常型間質性肺炎（UIP）と分類する、あるいは（２）前記参照発現レベルと比較して（ｃ）前記第２群に対応する発現レベルにおける増加および／または（ｄ）前記第１群に対応する発現レベルにおける低下がある場合に肺組織を非通常型間質性肺炎（非UIP）と分類する、工程と
を含む方法。
【請求項３】
肺組織サンプルが、ＵＩＰまたは非ＵＩＰに陽性かを検出する方法であり：
前記サンプル中で発現している２つ以上の転写産物の発現レベルを測定する工程と；
コンピュータ生成分類器を使用する工程であって、前記サンプルをＵＩＰおよび非ＵＩＰに分類する、工程と
を含み；
前記分類器が、ＨＰ、ＮＳＩＰ、サルコイドーシス、ＲＢ、細気管支炎、および器質化肺炎（OP）を含む非ＵＩＰ病理学サブタイプの不均質なスペクトラムを使用してトレーニングされる方法。
【請求項４】
前記試験サンプルが、生検サンプルまたは気管支肺胞洗浄サンプルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記試験サンプルが、新鮮凍結または固定される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記発現レベルが、ＲＴ−ＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション、ＲＮＡＳｅｑまたはそれらの組み合わせにより決定される、請求項の１〜３いずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、試験サンプルにおいて発現しているＲＮＡから作製されるｃＤＮＡを検出する工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ｃＤＮＡが、検出工程に先立って複数のｃＤＮＡ転写産物から増幅される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記転写産物の１つまたは複数が標識される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試験サンプル中の少なくとも１つの対照核酸の発現レベルを測定する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記肺組織が、間質性肺疾患（ILD）、ＩＬＤの特定の型、非ＩＬＤ、または非診断のいずれか１つに分類される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記肺組織が、特発性肺線維症（IPF）または非特異性間質性肺炎（NSIP）のいずれかに分類される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、配列番号１〜２２のいずれか１つの１つまたは複数の転写産物の発現レベルについて前記試験サンプルをアッセイする工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
１〜２０個の他の遺伝子の発現レベルについて前記試験サンプルをアッセイする工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、配列番号１〜２２のいずれか１つの１つまたは複数の転写産物の発現レベルについて前記試験サンプルをアッセイする工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
（１）または（２）の分類工程に対する共変量として喫煙状態を使用する工程をさらに含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
喫煙状態が、前記対象の喫煙者状態の指標となる発現プロファイルを検出することにより決定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルの分類が、喫煙者状態のバイアスの影響を受けやすい１つまたは複数の転写産物の発現レベルの検出を含み、喫煙者状態のバイアスの影響を受けやすい前記転写産物に、喫煙者のバイアスの影響を受けにくい転写産物と異なる重み付けをする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルの分類が、喫煙者状態のバイアスの影響を受けやすい１つまたは複数の転写産物の発現レベルの検出を含み、喫煙者状態のバイアスの影響を受けやすい前記転写産物を分類工程から除外する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１群が、２つ以上の異なる転写産物、または３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、または２０個超の異なる転写産物を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２群が、２つ以上の異なる転写産物、または３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、または２０個超の異なる転写産物を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
配列番号１〜２２のいずれか１つの、２つ以上の異なる転写産物、または配列番号１〜２２のいずれか１つの３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、または２０個超の異なる転写産物を検出する工程を含む、請求項１３または１５に記載の方法。
【請求項２３】
配列番号１〜２２の転写産物全ての発現レベルについて前記試験サンプルをアッセイする工程を含む、請求項１３または１５に記載の方法。
【請求項２４】
１〜２０個の他の遺伝子の発現レベルについて前記試験サンプルをアッセイする工程をさらに含む、請求項１５、２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記他の遺伝子が、ＨＭＣＮ２、ＡＤＡＭＴＳＬ１、ＣＤ７９Ｂ、ＫＥＬ、ＫＬＨＬ１４、ＭＰＰ２、ＮＭＮＡＴ２、ＰＬＸＤＣ１、ＣＡＰＮ９、ＴＡＬＤＯ１、ＰＬＫ４、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＫＶ１−９およびＣＮＴＮ４を含むかまたはそれらからなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記分類工程に対する共変量として喫煙状態を使用することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が、前記分類工程に先立って共変量として喫煙状態を使用する、請求項１６または２７に記載の方法。
【請求項２８】
遺伝子発現、バリアント、突然変異、融合、ヘテロ接合性の喪失（LOH）および生物学的経路効果から選択される１つまたは複数の特性を使用してトレーニングされる分類器を実装する工程を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記分類器が、遺伝子発現、配列バリアント、突然変異、融合、ヘテロ接合性の喪失（LOH）および生物学的経路効果を含む特性を使用してトレーニングされる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３０】
前記分類工程が、前記試験サンプル中の配列バリアントを検出する工程と、前記サンプルをＵＩＰまたは非ＵＩＰとして分類するために、前記配列バリアントを参照サンプル中のそれぞれの配列と比較する工程とをさらに含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  この出願は、２０１４年１１月５日に出願された米国特許仮出願第６２／０７５，３２８号、および２０１５年３月１０日に出願された米国特許仮出願第６２／１３０，８００号に対する優先権を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。この出願は、２０１４年３月１４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２９０２９号の全ての主題のその全体も参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
電子的に提出されたテキストファイルの説明
[0002]  これと共に電子的に提出されるテキストファイルの内容は、その全体を参照により本明細書に組み込む：配列表のコンピュータ読み込み可能な形式のコピー（ファイル名：VRCT_003_01WO_SeqList_ST25.txt、記録日：２０１５年１１月０５日、ファイルサイズ64キロバイト。）
【背景技術】
【０００３】
[0003]  間質性肺疾患（ILD）は、類似の臨床症状を持つが、重症度ならびに予後の範囲が広い急性および慢性両側性の実質性肺障害の不均質な群である１、２。これらの中で、特発性肺線維症（IPF）は、最も一般的で、重篤なＩＬＤの１つであり、進行性線維症、肺機能の悪化、死亡によって特徴付けられる３〜６。ＩＰＦと診断された患者のほとんどは、初期診断の５年以内に死亡する７、８。しかしながら、２つの新薬の最近の有効性および開発中の他の治療法は、この事態を変化させる可能性があり９〜１１、適当な治療的介入には正確な診断が極めて重大である５、１２。
【０００４】
[0004]  ＩＰＦは、診断が難しい場合がある。ＩＰＦに対する診断手法は、他の間質性肺炎、ならびに結合組織疾患および環境および職業的な曝露を除外する必要がある３〜６。ＩＰＦの疑いがある患者は、高分解能コンピュータ断層撮影（HRCT）を通常受け、通常型間質性肺炎（UIP）のパターンがはっきりと明らかな場合だけ、疾患を高い特異度で確認する５、１３。にもかかわらず、多くの患者の場合、診断は、間質性肺炎および／またはＵＩＰパターンの組織病理学的特性を明らかにするために侵襲的な外科的肺生検（SLB）を必要とし５、１４、症状の出現からＩＰＦを診断するまでの典型的な時間が１〜２年になる場合がある１５。病理学者間で不一致が起こり、正しい診断が個々の経験によって決まる場合がある１６。組織病理学的評価をしても、確定診断が確認しにくいままの場合もある。呼吸器科医、放射線科医および病理学者の多くの専門家のチーム（MDT）が協議する場合、診断精度が高まることが示されているが１７；残念ながら、全ての患者および医師が、経験あるＭＤＴによるこのレベルの専門家審査を受ける機会を有するわけではない。そのような審査には時間がかかり、患者は、認定された専門知識がある地域施設で診察される必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
[0005]  したがって、ＩＰＦを診断するより有効な方法が必要である。加えて、ＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
[0006]  本明細書において、その精度が、専門家の病理学診断を使用して真のラベルとして確認された分類器を使用して、サンプル間で通常型間質性肺炎（UIP）か非ＵＩＰかを識別するために使用される方法およびシステムが記述される。科学文献では遺伝子発現プロファイリング研究が、ＩＰＦと他のＩＬＤサブタイプとの差異的発現を報告しているが１８、１９、いずれも、臨床医の差異的診断の一部として頻繁に存在する他のサブタイプを含有するデータセットにおいてＵＩＰを分類しようとしてこなかった。
【０００７】
[0007]  いくつかの実施形態において、本発明は、肺組織サンプルが通常型間質性肺炎（UIP）または非通常型間質性肺炎（非UIP）に陽性か検出する方法および／またはシステムを提供する。いくつかの実施形態において、方法は：対象の試験サンプル中の第１群の転写産物および第２群の転写産物それぞれの発現レベルをアッセイするために提供され、第１群の転写産物は、ＵＩＰにおいて過剰発現され、かつ、表５、７、９、１０、１１および１２のいずれかに挙げた遺伝子のいずれか１つまたは複数を含み、第２群の転写産物は、ＵＩＰにおいて過小発現され、かつ、表５、８、９、１０、１１または１２のいずれかに挙げた遺伝子のいずれか１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、第１群の転写産物および第２群の転写産物それぞれの発現レベルを、対応する転写産物の参照発現レベルと比較する工程であって、（１）参照発現レベルと比較して（ａ）第１群に対応する発現レベルにおける増加もしくは（ｂ）第２群に対応する発現レベルにおける低下がある場合に前記肺組織を通常型間質性肺炎（UIP）と分類する、または（２）参照発現レベルと比較して（ｃ）第２群に対応する発現レベルにおける増加もしくは（ｄ）第１群に対応する発現レベルにおける低下がある場合に肺組織を非通常型間質性肺炎（非UIP）と分類する工程をさらに提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、表５、８、９、１１および／または１２に挙げた１つまたは複数の遺伝子のいずれかの配列バリアントを決定および／または比較する工程をさらに提供する。
【０００８】
[0008]  いくつかの実施形態において、本発明は、肺組織サンプルが通常型間質性肺炎（UIP）または非通常型間質性肺炎（非UIP）に陽性か検出する方法および／またはシステムを提供する。いくつかの実施形態において、本方法および／またはシステムを使用して、対象の肺組織由来試験サンプルにおける第１群の転写産物および第２群の転写産物それぞれの発現レベルを配列決定、アレイハイブリダイゼーションまたは核酸増幅によりアッセイし、第１群の転写産物は、ＵＩＰにおいて過剰発現され、かつ、表５、７、９、１０、１１または１２に挙げた遺伝子のいずれか１つまたは複数を含み、第２群の転写産物は、ＵＩＰにおいて過小発現され、かつ、表５、８、９、１０、１１または１２に挙げた遺伝子のいずれか１つまたは複数を含む。特定の実施形態において、本方法および／またはシステムは、第１群の転写産物および第２群の転写産物それぞれの発現レベルを、対応する転写産物の参照発現レベルとさらに比較する工程であって、（１）参照発現レベルと比較して（ａ）第１群に対応する発現レベルにおける増加もしくは（ｂ）第２群に対応する発現レベルにおける低下がある場合に前記肺組織を通常型間質性肺炎（UIP）と分類する、または（２）参照発現レベルと比較して（ｃ）第２群に対応する発現レベルにおける増加もしくは（ｄ）第１群に対応する発現レベルにおける低下がある場合に肺組織を非通常型間質性肺炎（非UIP）と分類する。
【０００９】
[0009]  いくつかの実施形態において、本発明は、
発現している２つ以上の転写産物の発現レベルを測定する工程、および／またはサンプル中で発現している１つもしくは複数の転写産物の配列バリアントを決定する工程；
コンピュータ生成分類器を使用してＵＩＰと非ＵＩＰとを区別する工程
により試験サンプルがＵＩＰまたは非ＵＩＰに陽性か検出するための方法および／またはシステムを提供し；分類器は、ＨＰ、ＮＳＩＰ、サルコイドーシス、ＲＢ、細気管支炎および器質化肺炎（OP）を含む非ＵＩＰ病理学サブタイプの範囲を使用して築かれる。
【００１０】
[0010]  いくつかの実施形態において、試験サンプルは、生検サンプルまたは気管支肺胞洗浄サンプルである。いくつかの実施形態において、試験サンプルは、新鮮凍結または固定される。
【００１１】
[0011]  いくつかの実施形態において、転写産物発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション、ＲＮＡＳｅｑまたはそれらの組み合わせにより決定される。いくつかの実施形態において、転写産物の１つまたは複数が標識される。
【００１２】
[0012]  いくつかの実施形態において、本方法は、試験サンプルにおいて発現しているＲＮＡから作製されるｃＤＮＡを検出する工程を含み、任意選択により、ｃＤＮＡは、検出工程に先立って複数のｃＤＮＡ転写産物から増幅される。
【００１３】
[0013]  いくつかの実施形態において、本発明の方法は、試験サンプル中の少なくとも１つの対照核酸の発現レベルを測定する工程をさらに含む。
【００１４】
[0014]  いくつかの実施形態において、本発明の方法は、肺組織を間質性肺疾患（ILD）、ＩＬＤの特定の型、非ＩＬＤ、または非診断のいずれか１つに分類する。特定の実施形態において、本発明の方法は、肺組織を特発性肺線維症（IPF）または非特異性間質性肺炎（NSIP）のいずれかに分類する。
【００１５】
[0015]  いくつかの実施形態において、本発明の方法および／またはシステムは、配列番号１〜２２のいずれか１つの１つまたは複数の転写産物の発現レベルについて試験サンプルをアッセイする工程を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、１〜２０個の他の遺伝子の発現レベルについて試験サンプルをアッセイする工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、他の遺伝子は、ＨＭＣＮ２、ＡＤＡＭＴＳＬ１、ＣＤ７９Ｂ、ＫＥＬ、ＫＬＨＬ１４、ＭＰＰ２、ＮＭＮＡＴ２、ＰＬＸＤＣ１、ＣＡＰＮ９、ＴＡＬＤＯ１、ＰＬＫ４、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＫＶ１−９およびＣＮＴＮ４のうち１つもしくは複数または任意選択により全てを含む。
【００１６】
[0016]  いくつかの実施形態において、本発明の方法および／またはシステムは、本明細書に開示するＵＩＰ対非ＵＩＰ分類器のトレーニングにおける共変量として喫煙状態を使用する工程をさらに含み、任意選択により、喫煙状態は、対象の喫煙者状態の指標となる発現プロファイルを検出することにより決定される。いくつかの実施形態において、そのような分類器を使用して、試験サンプルがＵＩＰかまたは非ＵＩＰか決定する。
【００１７】
[0017]  いくつかの実施形態において、本発明の方法および／またはシステムは、ＵＩＰ対非ＵＩＰ分類器をトレーニングする工程を含み、分類器トレーニングの間に、喫煙者状態のバイアスの影響を受けやすい遺伝子は除外する、または喫煙者状態のバイアスの影響を受けにくい遺伝子とは異なって重み付けされる。
【００１８】
[0018]  いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載のとおり、肺組織サンプルが通常型間質性肺炎（UIP）または非通常型間質性肺炎（非UIP）に陽性か検出する方法および／またはシステムを提供し、本方法は、喫煙者と非喫煙者を区別する遺伝子シグネチャーを認識するためにトレーニングした第１の分類器を使用して試験サンプルを喫煙者または非喫煙者とする第１の分類を含み；本方法は、試験サンプルをＵＩＰまたは非ＵＩＰとする第２の分類をさらに含み、第２の分類工程は、第２または第３の分類器を使用し、第２および第３の分類器は、喫煙者（喫煙者特異的分類器）および非喫煙者（非喫煙者特異的分類器）それぞれにおけるＵＩＰ対非ＵＩＰを区別するためにトレーニングされ、第２の分類は、（ｉ）第１の分類において試験サンプルが喫煙者に分類された場合に喫煙者特異的分類器、または（ｉｉ）第１の分類において試験サンプルが非喫煙者に分類された場合に非喫煙者特異的分類器のいずれかを使用する。
【００１９】
[0019]  いくつかの実施形態において、本発明は、肺組織サンプルが通常型間質性肺炎（UIP）または非通常型間質性肺炎（非UIP）に陽性か検出する方法および／またはシステムを提供し、本方法は、遺伝子発現、バリアント、突然変異、融合、ヘテロ接合性の喪失（LOH）および生物学的経路効果から選択される１つまたは複数の特性を使用してトレーニングされる分類器を実装する工程を含む。いくつかの実施形態において、分類器は、遺伝子発現、配列バリアント、突然変異、融合、ヘテロ接合性の喪失（LOH）および生物学的経路効果を含む特性を使用してトレーニングされる。
【００２０】
[0020]  いくつかの実施形態において、本発明は、第１群において２つ以上の異なる転写産物、または３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、もしくは２０個超の異なる転写産物および／または第２群において２つ以上の異なる転写産物、または３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、または２０個超の異なる転写産物をアッセイする工程を提供する。
【００２１】
[0021]  いくつかの実施形態において、本方法は、配列番号１〜２２のいずれか１つの２つ以上の異なる転写産物、または配列番号１〜２２のいずれか１つの３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、もしくは２０個超の異なる転写産物を検出する工程を提供する。特定の実施形態において、この方法は、配列番号１〜２２の転写産物全ての発現レベルについて試験サンプルをアッセイする工程を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、１〜２０個の他の遺伝子の発現レベルについて試験サンプルをアッセイする工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ＨＭＣＮ２、ＡＤＡＭＴＳＬ１、ＣＤ７９Ｂ、ＫＥＬ、ＫＬＨＬ１４、ＭＰＰ２、ＮＭＮＡＴ２、ＰＬＸＤＣ１、ＣＡＰＮ９、ＴＡＬＤＯ１、ＰＬＫ４、ＩＧＨＶ３−７２、ＩＧＫＶ１−９およびＣＮＴＮ４のうち１つまたは複数をアッセイする工程を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】[0022]ＩＰＦと診断された３名の患者（患者Ｐ１、Ｐ２およびＰ３）から得られた外植片サンプルに対するペアワイズ相関を示す図である。位置（上または下、中心もしくは周辺）を、各サンプルについて表示する。ＩＰＦサンプルを正常な肺サンプルから分離する上位２００個の差異的に発現している遺伝子を使用してペアワイズピアソン相関係数を計算し、より高い相関がマゼンタ色で表され、より低い相関が緑色で表されるヒートマップとしてプロットした。正常な肺サンプル同士およびそれとの相関は、０．７の範囲である（不掲載）。
【図２Ａ】[0023]図２Ａ〜２Ｄは、マイクロアレイデータを使用して築いた分類器の能力を示す図である。図２Ａ：ＲＯＣ曲線を使用して、リーブワンペイシェントアウト（leave-one-patient-out）（LOPO）交差検定を使用するトレーニングセットの能力を特徴付けた。
【図２Ｂ】個々のサンプルに対するスコアは、トレーニングセットにおける患者全体で示される。患者レベル病理学診断が、ｘ軸に示される。ＵＩＰ病理学ラベルを持つサンプルが黒丸で表示され、病理学によって非ＵＩＰのサンプルが白三角形で示される。水平の点線は、９２％特異性および６４％感度に対応する閾値を示すために描画される。
【図２Ｃ】ＲＯＣ曲線を使用して、固定モデルでサンプルをスコアリングすることにより独立したテストセットの能力を特徴付けた。
【図２Ｄ】個々のサンプルに対するスコアは、独立したテストセットにおける患者全体で示される。患者レベル病理学診断が、ｘ軸に示される。ＵＩＰ病理学ラベルを持つサンプルが黒丸で表示され、病理学によって非ＵＩＰのサンプルが白三角形で示される。水平の点線は、９２％特異性および８２％感度に対応する閾値を示すために描画される。
【図３Ａ】[0024]ＲＮＡＳｅｑを使用して築いた分類器の能力を示す図である。リーブワンペイシェントアウト（LOPO）交差検定を遂行し、受信者動作特性（ROC）曲線をＲＮＡＳｅｑ分類器について作製した。
【図３Ｂ】ＲＮＡＳｅｑを使用して築いた分類器の能力を示す図である。トレーニングセットにおける個々のサンプルのスコアが、ＲＮＡＳｅｑ分類について示される。患者レベル病理学診断が、ｘ軸に示される。ＵＩＰ病理学ラベルを持つサンプルが黒丸で表示され、病理学によって非ＵＩＰのサンプルが白三角形で示される。９５％特異性に対応するスコア閾値を、水平線として表示する。
【図３Ｃ】対応させた組に対するマイクロアレイを使用して築いた分類器の能力を示す図である。リーブワンペイシェントアウト（LOPO）交差検定を遂行し、受信者動作特性（ROC）曲線をマイクロアレイ分類器について作製した。
【図３Ｄ】対応させた組に対するマイクロアレイを使用して築いた分類器の能力を示す図である。トレーニングセットにおける個々のサンプルのスコアが、マイクロアレイ分類について示される。患者レベル病理学診断が、ｘ軸に示される。ＵＩＰ病理学ラベルを持つサンプルが黒丸で表示され、病理学によって非ＵＩＰのサンプルが白三角形で示される。９５％特異性に対応するスコア閾値を、水平線として表示する。
【図４】[0025]分類能力に対する誤ラベルの影響を算定するシミュレーション研究を示す図である。アレイトレーニングセット（n=77）を、本研究に使用した。データセット（ｘ軸）における所与の割合のラベル交換で、個々のサンプルの分類ラベルは、３名の専門家の病理学診断の意見の相違レベルを説明する重み付けとともに別のクラスラベルに交換された。各箱ひげ図は、１００回の反復シミュレーションのＬＯＰＯ  ＣＶ能力（AUC）を使用して描画された。ＡＵＣ＝０．５における水平のより細かい点線は、ランダムな能力を表し、すなわち、分類がない、より粗い点線は、図２Ａに示される分類器能力に対応する。
【図５】[0026]２つのサンプル（サンプルＡおよびサンプルＢ）による仮定的患者に対する中央病理診断プロセスを示す図である。３名の専門の病理学者が、審査プロセスに参加する。サンプルレベル診断の場合、各サンプルのスライドガラスは、各病理学者（病理学者を、Path.と略記する）によって審査される。患者レベル診断の場合、全てのサンプル（この演習においては２つ）のスライドガラスが集められ、各病理学者により一緒に審査される。サンプルレベルおよび患者レベル診断の両方で、同じ審査プロセスを行う。付与後にさえ専門の病理学者の意見が一致しなければ、最終診断として多数決が使用され、その場合、診断における信頼の不足のためサンプルは削除される。全ての保存組織（n=128）の中で、そのような例は１つだけ観察された。
【図６】[0027]３名の正常臓器ドナー（上）およびＩＰＦと診断された３名の患者（下）からの肺サンプリングの位置を示す図である。ドナーＮ１〜Ｎ３およびＰ３は、女性であった。ドナーＰ１およびＰ２は、男性であった。
【図７Ａ】[0028]本明細書に開示する態様を実装するのに使用可能なコンピュータシステムの図解である。
【図７Ｂ】[0029]図７Ａのコンピュータシステムの処理装置の詳細な図解である。
【図７Ｃ】[0100]本発明の非限定的な１つの方法の詳細な図解であって、公知のＵＩＰおよび非ＵＩＰサンプルに対する遺伝子産物発現データを使用して分類器をトレーニングし（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）、それによりＵＩＰ対非ＵＩＰを識別し、任意選択により分類器は、喫煙者状態を共変と見なし、未知のサンプル由来の遺伝子産物発現データをトレーニングされた分類器に入力して、未知のサンプルをＵＩＰまたは非ＵＩＰのいずれかに同定し、分類器による分類の結果を定義し、報告によって出力する。
【図８】[0030]喫煙者と非喫煙者の間のＵＩＰおよび非ＵＩＰサンプルにおける差異的遺伝子発現を示す図である。ＵＩＰと非ＵＩＰサンプルの間で差異的に発現される遺伝子の数は、喫煙者と非喫煙者の間で大きく異なる。
【図９】[0031]ＵＩＰと非ＵＩＰサンプルの間の差異的遺伝子発現が、喫煙者状態のバイアスの影響を受けやすいことを示す図である。差異的遺伝子発現の方向（すなわち、過剰対過小発現）および大きさ（円のサイズ）は、喫煙状態により複雑になる。
【図１０Ａ】[0032]図１０Ａ〜図１０Ｄは、ＵＩＰ対非ＵＩＰにおいて差異的に発現している遺伝子の例および発現レベルに対する喫煙状態の効果を示す図である。図１０Ａは、ＵＩＰ対非ＵＩＰ喫煙者対非喫煙者におけるＩＧＨＶ３−７２の差異的発現を示す。
【図１０Ｂ】ＵＩＰ対非ＵＩＰ喫煙者対非喫煙者におけるＣＰＸＭ１の差異的発現を示す。
【図１０Ｃ】ＵＩＰ対非ＵＩＰ喫煙者対非喫煙者におけるＢＰＩＦＡ１の差異的発現を示す。
【図１０Ｄ】ＵＩＰ対非ＵＩＰ喫煙者対非喫煙者におけるＨＬＡ−Ｕの差異的発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
[0033]  本明細書では「間質性肺疾患」または「ＩＬＤ」（別名びまん性実質性肺疾患［DPLD］）とは、間質（肺の肺胞周りの組織および空間）を侵す１群の肺疾患のことを指す。ＩＬＤは、疑いがある原因もしくは公知の原因により分類することができ、または特発性であることができる。例えば、ＩＬＤは、吸入物質（無機または有機）、薬物誘導性（例えば、抗生物質、化学療法薬、抗不整脈剤、スタチン）、結合組織疾患（例えば、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、紅斑性全身的狼瘡、関節リウマチ）に付随して、肺感染症（例えば、異型肺炎、ニューモシスチス肺炎［PCP］、結核、トラコーマクラミジア、呼吸器合胞体ウイルス）に付随して、悪性度（例えば、癌性リンパ管症）に付随して起こると分類することができ、または特発性（例えば、サルコイドーシス、特発性肺線維症、ハマン−リッチ症候群、抗合成酵素症候群）であり得る。
【００２４】
[0034]  本明細書では「ＩＬＤ炎症」とは、根底にある炎症により特徴付けられる炎症性ＩＬＤサブタイプの分析群のことを指す。これらのサブタイプは、ＩＰＦおよび／または他の任意の非炎症性肺疾患サブタイプに対する比較器として集合的に使用することができる。「ＩＬＤ炎症」は、ＨＰ、ＮＳＩＰ、サルコイドーシスおよび／または器質化肺炎を含むことができる。
【００２５】
[0035]  「特発性間質性肺炎」または「ＩＩＰ」（非感染性肺炎とも称される）とは、例えば、剥離性間質性肺炎、非特異性間質性肺炎、リンパ性間質性肺炎、原因不明の器質化肺炎および特発性肺線維症を含むＩＬＤのクラスのことを指す。
【００２６】
[0036]  本明細書では「特発性肺線維症」または「ＩＰＦ」とは、肺の支持骨格（間質）の線維形成により特徴付けられる慢性、進行型肺疾患のことを指す。定義により、肺線維症の原因が不明（「特発性」）な場合に、本用語が使用される。顕微鏡的には、ＩＰＦ患者由来の肺組織は、通常型間質性肺炎（UIP）として公知の組織学的／病理学的特性の特徴の組を示し、その特徴はＩＰＦの病理学的対応物である。
【００２７】
[0037]  「非特異性間質性肺炎」または「ＮＳＩＰ」は、安定したもしくは巣状のコラーゲン沈着がある慢性炎症細胞によって定義される細胞類型、およびびまん性巣状線維化によって定義される繊維化類型によって一般に特徴付けられる特発性間質性肺炎の形態である。ＵＩＰとは対照的に、通常型間質性肺炎を特徴付ける蜂巣状所見も線維芽細胞病巣もない。
【００２８】
[0038]  「過敏性肺炎」または「ＨＰ」とは、外因性アレルギー性肺胞炎（EAA）とも呼ばれ、吸入された抗原（例えば、有機性粉末）による過大な免疫応答および過敏性が原因の肺内の肺胞の炎症のことを指す。
【００２９】
[0039]  「肺サルコイドーシス」または「ＰＳ」とは、結節を形成し得る慢性炎症細胞（肉芽腫）の異常な集積を含む症候群のことを指す。ＨＰの炎症プロセスは、肺胞、小気管支および微小血管を一般に含む。ＨＰの急性および亜急性症例において、理学的検査は、通常乾性ラ音を示す。
【００３０】
[0040]  用語「マイクロアレイ」とは、基板上にあるハイブリダイズ可能なアレイ要素、好ましくはポリヌクレオチドプローブの秩序ある配置のことを指す。
【００３１】
[0041]  用語「ポリヌクレオチド」とは、単数もしくは複数で使用される場合、任意のポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチドのことを一般に指し、無修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであることができる。したがって、例えば、本明細書に定義されるポリヌクレオチドには、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖と二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖と二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖、より一般的には、二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域を含み得るＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子があるがこれに限定されない。加えて、本明細書では、用語「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域のことを指す。そのような領域における鎖は、同一分子または異なる分子由来であることができる。この領域は、１つまたは複数の分子の全てを含み得るが、より一般的にはいくつかの分子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の１つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」は、（例えば、フルオロフォアなど検出可能なシグナルを得るための）１つまたは複数の修飾塩基を含有するＤＮＡ（例えば、cDNA）およびＲＮＡを含むこともできる。したがって、安定性もしくは他の理由のために修飾された骨格を持つＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書においてその用語が目的とするような「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンなど通常でない塩基またはトリチウム化塩基などの修飾塩基を含むＤＮＡもしくはＲＮＡは、本明細書に定義される用語「ポリヌクレオチド」に含まれる。一般に、用語「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的および／または代謝的に修飾された全ての形態の無修飾ポリヌクレオチド、ならびに単一および複雑型細胞を含めたウイルスおよび細胞の特徴を示すＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。
【００３２】
[0042]  用語「オリゴヌクレオチド」とは、それだけには限らないが、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび二本鎖ＤＮＡを含む比較的短いポリヌクレオチド（例えば、100、50、20個またはより少ないヌクレオチド）のことを指す。一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、例えば市販の自動化オリゴヌクレオチド合成装置を使用する化学的方法によりしばしば合成される。しかしながら、オリゴヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ媒介技術ならびに細胞および生物におけるＤＮＡの発現を含めた他の様々な方法により作ることができる。
【００３３】
[0043]  用語「遺伝子産物」または「発現産物」は、ｍＲＮＡを含めた遺伝子のＲＮＡ転写産物（RNA転写産物）、およびそのようなＲＮＡ転写産物のポリペプチド翻訳産物のことを指すために本明細書において互換的に使用される。遺伝子産物は、例えば、ポリヌクレオチド遺伝子発現産物（例えば、スプライスされていないRNA、mRNA、スプライスバリアントmRNA、マイクロRNA、断片化RNA、および同種のもの）またはタンパク質発現産物（例えば、成熟ポリペプチド、翻訳後修飾されたポリペプチド、スプライスバリアントポリペプチド、および同種のもの）であることができる。いくつかの実施形態において、遺伝子発現産物は、突然変異、融合、ヘテロ接合性の喪失（LOH）、および／または生物学的経路効果を含む配列バリアントであることができる。
【００３４】
[0044]  遺伝子発現産物に適用されるとき用語「標準化した発現レベル」とは、１つまたは複数の参照（または対照）遺伝子発現産物と比較して標準化された遺伝子産物のレベルのことを指す。
【００３５】
[0045]  遺伝子発現産物に適用されるとき「参照発現レベル」とは、１つまたは複数の参照（または対照）遺伝子発現産物の発現レベルのことを指す。遺伝子発現産物に適用されるとき「参照標準化発現レベル」とは、１つまたは複数の参照（または対照）遺伝子発現産物について標準化した発現レベル値（すなわち標準化した参照発現レベル）のことを指す。いくつかの実施形態において、参照発現レベルは、本明細書に記載のとおり、正常サンプルにおける１つまたは複数の遺伝子産物の発現レベルである。いくつかの実施形態において、参照発現レベルは、実験的に決定される。いくつかの実施形態において、参照発現レベルは、歴史的な発現レベル、例えば、正常サンプルにおける参照発現レベルのデータベース値であり、そのサンプルは、例えば、（ｉ）単一サンプルの参照発現レベルの反復分析からの２つ以上、好ましくは３つ以上の参照発現レベルの平均；（ｉｉ）異なる複数のサンプル（例えば、正常サンプル）の参照発現レベルの分析からの２つ以上、好ましくは３つ以上の参照発現レベルの平均；ならびに（ｉｉｉ）上記の工程（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせ（すなわち、複数のサンプルから分析した参照発現レベルの平均であり、参照発現レベルの少なくとも１つが、反復して分析される）など単一の参照発現レベルまたは複数の参照発現レベルの集計を示す。いくつかの実施形態において、「参照発現レベル」は、例えば、他の手段によりＵＩＰまたは非ＵＩＰであることが最終的に決定された（すなわち確認された病理診断）サンプル中の配列バリアントの発現レベルである。
【００３６】
[0046]  遺伝子発現産物に適用されるとき「参照発現レベル値」とは、１つまたは複数の参照（または対照）遺伝子発現産物の発現レベル値のことを指す。遺伝子発現産物に適用されるとき「参照標準化発現レベル値」とは、１つまたは複数の参照（または対照）遺伝子発現産物について標準化した発現レベル値のことを指す。
【００３７】
[0047]  ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、一般にプローブ長、洗浄温度および塩濃度に応じた経験的な算出である。一般に、より長いプローブは、適当なアニーリングに、より高い温度を必要とし、より短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、相補鎖が融解温度以下の環境に存在するときに、変性ＤＮＡが再アニールする能力によって一般に決まる。プローブとハイブリダイズ可能な配列の間の所望の相同性の程度が高い程、使用できる相対温度はより高くなる。その結果、より高い相対温度により、反応条件がよりストリンジェントになる傾向があるが、より低い温度により、よりストリンジェントでないことになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについてのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Wiley Interscience、 1995）を参照のこと。
【００３８】
[0048]  本明細書に定義される「ストリンジェントな条件」または「高いストリンジェンシー条件」は、一般に：（１）洗浄に低イオン強度溶液および高温度、例えば０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、５０℃を利用し；（２）ハイブリダイゼーションの間に、ホルムアミド、例えば０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５を含む５０％（v/v）ホルムアミドなどの変性剤を４２℃で利用し；または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（0.75M  NaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（pH6.8）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（50μg/mL）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃で利用し、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム）中で４２℃ならびに５５℃で５０％ホルムアミドによる洗浄、その後ＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣで５５℃、からなる高いストリンジェンシーの洗浄を行う。
【００３９】
[0049]  「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Cold Spring Harbor Press、1989）に記述されているように同定することができ、上述したそれより低いストリンジェンシーの洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および%SDS）の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の例は：２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（150mM  NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（pH7.6）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍＬ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で終夜インキュベーションし、その後１×ＳＳＣ中で、約３７〜５０℃でフィルタを洗浄する。当業者は、必要に応じて温度、イオン強度等を調整して、プローブ長などの因子および同種のものに適合させる方法を認識することができる。
【００４０】
[0050]  本明細書では「感度」とは、標的とする障害が実際にある、試験した総数のうちの真の陽性の割合（すなわち、陽性試験結果を有する、標的とする障害がある患者の割合）のことを指す。本明細書では「特異性」とは、標的とする障害が実際にはない、試験した全患者のうち真の陰性の割合（すなわち、陰性試験結果を有する、標的とする障害がない患者の割合）のことを指す。
【００４１】
[0051]  本発明の文脈において、任意の特定の遺伝子セットにおいて挙げた遺伝子のうち「少なくとも１つ」、「少なくとも２つ」、「少なくとも５つ」等への参照は、挙げた遺伝子のいずれか１つまたはいずれかおよび全ての組み合わせを意味する。
【００４２】
[0052]  用語「スプライシング」および「ＲＮＡスプライシング」は、互換的に使用され、イントロンを除去し、エキソンを接続して、真核細胞の細胞質に移動する連続したコード配列を持つ成熟ｍＲＮＡを作製するＲＮＡプロセシングのことを指す。
【００４３】
[0053]  用語「エキソン」とは、成熟ＲＮＡ産物中に表される分断遺伝子の任意の区域のことを指す（B. Lewin, Genes 7V［Cell Press, 1990］）。理論的には、用語「イントロン」とは、転写されるが、そのいずれかの側にあるエキソンと一緒にスプライシングにより転写産物の中から除去されるＤＮＡの任意の区域のことを指す。操作上、エキソン配列は、参照配列番号に定義される遺伝子のｍＲＮＡ配列中に存在する。操作上、イントロン配列は、エキソン配列により囲われ、通常５’および３’境界でＧＴならびにＡＧスプライス共通配列を有する遺伝子のゲノムＤＮＡ内の介在配列である。
【００４４】
[0054]  「コンピュータによるシステム」とは、情報を分析するために使用されるハードウェア、ソフトウェアおよびデータ記憶媒体のシステムのことを指す。患者コンピュータによるシステムのハードウェアは、中央演算処理装置（CPU）、ならびにデータ入力、データ出力（例えば、表示）およびデータ記憶のためのハードウェアを含むことができる。データ記憶媒体は、上述した本情報の記録、またはそのような製品にアクセスすることができるメモリアクセスデバイスを含む任意の製品を含むことができる。
【００４５】
[0055]  本明細書では、用語「モジュール」とは、作動的に接続されている電気成分の任意の組立物および／または一式のことを指し、例えば、メモリ、処理装置、電気トレース、光コネクタ、ソフトウェア（ハードウェアで実行する）、および／または同種のものを含むことができる。例えば、処理装置中で実行されるモジュールは、ハードウェアに基づくモジュール（例えばフィールドプログラマブルゲートアレイ［FPGA］、特定用途向け集積回路［ASIC］、デジタル信号プロセッサ［DSP］）および／またはモジュールと関連する１つもしくは複数の特定の機能を遂行することができるソフトウェアに基づくモジュール（例えば、メモリに保存されているおよび／または処理装置で実行されるコンピュータコードのモジュール）の任意の組み合わせであることができる。
【００４６】
[0056]  コンピュータ読み込み可能な媒体にデータ、プログラミングまたは他の情報を「記録する」とは、当業者に公知の任意のそのような方法を使用して情報を保存するプロセスのことを指す。保存されている情報にアクセスするために使用される手段に基づいて、任意の簡便なデータ記憶構造を選ぶことができる。様々なデータ処理装置プログラムおよび形式を使用して、例えば文書処理テキストファイル、データベース形式等を記憶させることができる。
【００４７】
[0057]  「処理装置」または「コンピューティング手段」は、必要となる機能を遂行することになる任意のハードウェアおよび／またはソフトウェアの組み合わせに参照を付す。例えば、適当な処理装置は、電子制御装置、メインフレーム、サーバまたはパーソナルコンピュータ（卓上または携帯用）などの形態で利用可能なプログラム可能なデジタルマイクロプロセッサであることができる。処理装置がプログラム可能な場合、適当なプログラミングは、遠隔地から処理装置、または以前に保存したコンピュータプログラム製品（磁気、光学または固体素子デバイスを使用するにせよ、携帯型もしくは固定のコンピュータ読み込み可能な記憶媒体など）へと通信することができる。例えば、磁気媒体または光ディスクは、プログラミングを保有することができ、それに対応するステーションで各処理装置と通信する適当な読取機により読み取ることができる。
【００４８】
[0058]  「試験サンプル」は、１つまたは複数の細胞のサンプル、好ましくは対象から得られた組織サンプル（例えば経気管支生検［TBB］サンプルなど、肺組織サンプル）である。いくつかの実施形態において、試験サンプルは、当業者に公知の任意の手段により得られる生検サンプルである。特定の実施形態において、試験サンプルは、ビデオ支援胸腔鏡下手術（VATS）；気管支肺胞洗浄（BAL）；経気管支生検（TBB）；または凍結経気管支生検により得られるサンプルである。いくつかの実施形態において、試験サンプルは、患者が示す臨床徴候および症状（例えば、息切れ［一般に、労作により悪化する］、乾性咳）、ならびに、任意選択により１つまたは複数の画像試験の結果（例えば胸部Ｘ線、コンピュータ断層撮影［CT］）、肺機能試験（例えば、肺活量測定、酸素測定、運動負荷試験）、肺組織分析（例えば、気管支鏡検査、気管支肺胞洗浄、外科生検により得られるサンプルの組織学的および／または細胞学的分析）に基づいて、肺疾患、例えばＩＬＤの疑いがある患者から得られる。
【００４９】
[0059]  「遺伝子シグネチャー」は、遺伝子発現パターン（すなわち、１つまたは複数の遺伝子またはその断片の発現レベル）であり、いくつかの特徴または表現型の指標となる。いくつかの実施形態において、遺伝子シグネチャーとは、遺伝子、複数の遺伝子、遺伝子の断片または１つもしくは複数の遺伝子の複数の断片の発現（および／または発現の欠如）のことを指し、発現および／または発現の欠如は、ＵＩＰ、非ＵＩＰ、喫煙者状態もしくは非喫煙者状態の指標となる。
【００５０】
[0060]  本明細書では、「喫煙者である」は、煙草を現在吸う対象もしくは過去に煙草を吸っていた人または煙草を現在吸うもしくは過去に煙草を吸っていた人の遺伝子シグネチャーを有する人のことを指すことを意味する。
【００５１】
[0061]  本明細書では「バリアント」とは、本発明の分類器のトレーニングの間に使用される特性を記述するために使用される場合、選択的スプライスバリアントのことを指す。
【００５２】
[0062]  本明細書では、「突然変異」とは、本発明の分類器のトレーニングの間に使用される特性を記述するために使用される場合、公知の正常な参照配列からの配列の逸脱のことを指す。いくつかの実施形態において、逸脱は、ＵｎｉＧｅｎｅデータベース（The NCBIハンドブック、Bethesda（MD）：米国バイオテクノロジー情報センター；２００３年にある、Pontius JU, Wagner L, Schuler GD. UniGene：a unified view of the transcriptome. 、本明細書に組み込む）、ＲｅｆＳｅｑ（The NCBIハンドブック［インターネット］、Bethesda （MD）: 国立医学図書館（US）、米国バイオテクノロジー情報センター；２００２年１０月、第１８章、参照配列（RefSeq）プロジェクト、ワールドワイドウェブアドレス：ncbi.nlm.nih.gov/refseq/で利用可能）、Ｅｎｓｅｍｂｌ（EMBL、ワールドワイドウェブアドレス:ensembl.org/index.htmlで利用可能）、および同種のものなど公的に利用可能なデータベースによる、受理された天然の遺伝子配列からの逸脱である。いくつかの実施形態において、突然変異は、参照配列に存在する配列残基への付加、欠失または置換を含む。
【００５３】
[0063]  省略形には、以下がある：ＨＲＣＴ、高分解能コンピュータ断層撮影；ＶＡＴＳ、ビデオ支援胸腔鏡下手術；ＳＬＢ、外科的肺生検；ＴＢＢ、経気管支生検；ＲＢ、呼吸細気管支炎；ＯＰ、器質化肺炎、ＤＡＤ、びまん性肺胞損傷、ＣＩＦ／ＮＯＣ、分類されていない慢性間質性線維症；ＭＤＴ、多くの専門家のチーム；ＣＶ、交差検定；ＬＯＰＯ、リーブワンペイシェントアウト；ＲＯＣ、受信者動作特性；ＡＵＣ、曲線下面積；ＲＮＡＳｅｑ、次世代配列決定技術によるＲＮＡ配列決定；ＮＧＳ、次世代配列決定技術；Ｈ＆Ｅ、ヘマトキシリンエオジン；ＦＤＲ、偽発見率；ＩＲＢ、施設内倫理委員会；ＡＴＳ、米国胸部学会；ＣＯＰＤ、慢性閉塞性肺疾患；ＫＥＧＧ、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ；ＣＩ、信頼区間
【００５４】
[0064]  値の範囲が提供される場合、その範囲の上限下限間の間にある各値は、文脈に別段の明確な記載がない限り下限の単位の１０分の１まで本発明に包含され、他の任意の記載されている値またはその記載されている範囲の間にある値も、本発明に包含されるものと理解される。これらのより狭い範囲の上限下限は、そのより狭い範囲にそれぞれ独立に含まれてもよく、また本発明に包含され、記載されている範囲内で特に除外された任意の境界に制約される。記載されている範囲が境界の一方または両方を含む場合、その含まれている境界のいずれか一方または両方を除外した範囲も、本発明に含まれる。本明細書では、「約」は、指示した値の±１０％を意味する。
【００５５】
[0065]  ＵＩＰを他のＩＬＤサブタイプと識別する分子シグネチャーを使用する方法および／またはシステムを本明細書に開示する。専門家の病理学が得られないサンプルからのＵＩＰの正確な診断は、診断を加速し、したがって治療の決定を容易にし、患者に対する手術危険度および医療制度の費用を減少させることにより、ＩＬＤ患者に恩恵をもたらすことになる。
【００５６】
[0066]  また、対象の喫煙者もしくは非喫煙者状態を使用して、分子シグネチャーを使用して他のＩＬＤサブタイプからのＵＩＰの識別を改善する方法および／またはシステムを本明細書に開示する。
【００５７】
[0067]  したがって、本明細書に開示する方法および／またはシステムは、臨床的もしくは人口統計学的情報の予備知識なしに高次元転写データに基づいてＵＩＰを非ＵＩＰパターンと識別することができる分類器を提供する。
【００５８】
[0068]  いくつかの実施形態において、本発明は、表５、７、８、９、１０、１１もしくは１２のいずれかに示される１つもしくは複数の配列もしくはその断片、もしくは表５、７、８、９、１０、１１および１２のそれぞれからの少なくとも１つの配列もしくはその断片を含むかまたはそれらからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、表５、７、８、９、１０、１１および１２のいずれか１つもしくは複数もしくは全てに提供される配列のうち少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上を含むかまたはそれらからなる分類器を使用するそのような方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、表５、７、８、９、１０、１１および１２のいずれか１つもしくは複数もしくは全てに提供される配列を少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００個以上を含むかまたはそれらからなる分類器を使用するそのような方法を提供し、その分類器は、その間にある全ての整数（例えば、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５個の配列等）および範囲（例えば、表５、７、８、９、１０、１１および１２のいずれか１つもしくは複数もしくは全ての約１〜１０個の配列、約１０〜１５個の配列、１０〜２０個の配列、５〜３０個の配列、５〜５０個の配列、１０〜１００個の配列、５０〜２００個の配列等）を含む。
【００５９】
[0069]  いくつかの特定の実施形態において、本発明は、以下の配列もしくはその断片の１つもしくは複数を含むもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＣＤＫＬ２（配列番号：２）、３）ＧＰＲ９８（配列番号：３）、４）ＰＲＫＣＱ（配列番号：４）、５）ＨＬＡ−Ｇ（配列番号：５）、６）ＰＦＫＦＢ３（配列番号：６）、７）ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：７）、８）ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ（配列番号：８）、９）ＣＤ２７４（配列番号：９）、１０）ＰＲＵＮＥ２（配列番号：１０）、１１）ＡＲＡＰ２（配列番号：１１）、１２）ＤＺＩＰ１（配列番号：１２）、１３）ＭＸＲＡ７（配列番号：１３）、１４）ＰＴＣＨＤ４（配列番号：１４）、１５）ＰＤＬＩＭ３（配列番号：１５）、１６）ＣＮＮ１（配列番号：１６）、１７）ＮＩＰＳＮＡＰ３Ｂ（配列番号：１７）、１８）ＰＡＱＲ７（配列番号：１８）、１９）ＡＣＴＧ２（配列番号：１９）、２０）ＮＡ（配列番号：２０）、２１）ＴＩＭＰ２（配列番号：２１）および２２）ＤＥＳ（配列番号：２２）。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有することができる。他の態様において、分類器は、これらの遺伝子のうち１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くを削除し、任意選択により他の遺伝子を含むことができる。
【００６０】
[0070]  いくつかの実施形態において、本発明は、以下の配列のうち２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；または２１個を任意の組み合わせで含むかまたはそれらからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＣＤＫＬ２（配列番号：２）、３）ＧＰＲ９８（配列番号：３）、４）ＰＲＫＣＱ（配列番号：４）、５）ＨＬＡ−Ｇ（配列番号：５）、６）ＰＦＫＦＢ３（配列番号：６）、７）ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：７）、８）ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ（配列番号：８）、９）ＣＤ２７４（配列番号：９）、１０）ＰＲＵＮＥ２（配列番号：１０）、１１）ＡＲＡＰ２（配列番号：１１）、１２）ＤＺＩＰ１（配列番号：１２）、１３）ＭＸＲＡ７（配列番号：１３）、１４）ＰＴＣＨＤ４（配列番号：１４）、１５）ＰＤＬＩＭ３（配列番号：１５）、１６）ＣＮＮ１（配列番号：１６）、１７）ＮＩＰＳＮＡＰ３Ｂ（配列番号：１７）、１８）ＰＡＱＲ７（配列番号：１８）、１９）ＡＣＴＧ２（配列番号：１９）、２０）ＮＡ（配列番号：２０）、２１）ＴＩＭＰ２（配列番号：２１）および２２）ＤＥＳ（配列番号：２２）の任意の組み合わせ。特定の態様において、そのような分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有する。他の態様において、分類器は、これらの遺伝子のうち１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くを削除し、任意選択により他の遺伝子を含むことができる。
【００６１】
[0071]  いくつかの実施形態において、本発明は、以下の配列の全てを含むもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＣＤＫＬ２（配列番号：２）、３）ＧＰＲ９８（配列番号：３）、４）ＰＲＫＣＱ（配列番号：４）、５）ＨＬＡ−Ｇ（配列番号：５）、６）ＰＦＫＦＢ３（配列番号：６）、７）ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：７）、８）ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ（配列番号：８）、９）ＣＤ２７４（配列番号：９）、１０）ＰＲＵＮＥ２（配列番号：１０）、１１）ＡＲＡＰ２（配列番号：１１）、１２）ＤＺＩＰ１（配列番号：１２）、１３）ＭＸＲＡ７（配列番号：１３）、１４）ＰＴＣＨＤ４（配列番号：１４）、１５）ＰＤＬＩＭ３（配列番号：１５）、１６）ＣＮＮ１（配列番号：１６）、１７）ＮＩＰＳＮＡＰ３Ｂ（配列番号：１７）、１８）ＰＡＱＲ７（配列番号：１８）、１９）ＡＣＴＧ２（配列番号：１９）、２０）ＮＡ（配列番号：２０）、２１）ＴＩＭＰ２（配列番号：２１）および２２）ＤＥＳ（配列番号：２２）。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有する。
【００６２】
[0072]  いくつかの特定の実施形態において、本発明は、以下の配列もしくはその断片の１つもしくは複数を含むもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＨＭＣＮ２、３）ＡＤＡＭＴＳＬ１、４）ＣＤ７９Ｂ、５）ＫＥＬ、６）ＫＬＨＬ１４、７）ＭＰＰ２、８）ＮＭＮＡＴ２、９）ＰＬＸＤＣ１、１０）ＣＡＰＮ９、１１）ＴＡＬＤＯ１、１２）ＰＬＫ４、１３）ＩＧＨＶ３−７２、１４）ＩＧＫＶ１−９および１５）ＣＮＴＮ４。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有することができる。他の態様において、分類器は、これらの遺伝子のうち１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くを削除し、任意選択により他の遺伝子を含むことができる。
【００６３】
[0073]  いくつかの実施形態において、本発明は、以下の配列のうち２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；もしくは１４個を含むもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＨＭＣＮ２、３）ＡＤＡＭＴＳＬ１、４）ＣＤ７９Ｂ、５）ＫＥＬ、６）ＫＬＨＬ１４、７）ＭＰＰ２、８）ＮＭＮＡＴ２、９）ＰＬＸＤＣ１、１０）ＣＡＰＮ９、１１）ＴＡＬＤＯ１、１２）ＰＬＫ４、１３）ＩＧＨＶ３−７２、１４）ＩＧＫＶ１−９および１５）ＣＮＴＮ４。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有することができる。他の態様において、分類器は、これらの遺伝子のうち１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くを削除し、任意選択により他の遺伝子を含むことができる。
【００６４】
[0074]  いくつかの実施形態において、本発明は、以下の配列を含むもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＨＭＣＮ２、３）ＡＤＡＭＴＳＬ１、４）ＣＤ７９Ｂ、５）ＫＥＬ、６）ＫＬＨＬ１４、７）ＭＰＰ２、８）ＮＭＮＡＴ２、９）ＰＬＸＤＣ１、１０）ＣＡＰＮ９、１１）ＴＡＬＤＯ１、１２）ＰＬＫ４、１３）ＩＧＨＶ３−７２、１４）ＩＧＫＶ１−９および１５）ＣＮＴＮ４。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有することができる。他の態様において、分類器は、これらの遺伝子のうち１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くを削除し、任意選択により他の遺伝子を含むことができる。
【００６５】
[0075]  いくつかの特定の実施形態において、本発明は、ＨＬＡ−Ｆ（配列番号１）もしくはその断片を含むもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：そのような実施形態において、本方法は、１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）と、２）ＣＤＫＬ２（配列番号：２）、３）ＧＰＲ９８（配列番号：３）、４）ＰＲＫＣＱ（配列番号：４）、５）ＨＬＡ−Ｇ（配列番号：５）、６）ＰＦＫＦＢ３（配列番号：６）、７）ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：７）、８）ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ（配列番号：８）、９）ＣＤ２７４（配列番号：９）、１０）ＰＲＵＮＥ２（配列番号：１０）、１１）ＡＲＡＰ２（配列番号：１１）、１２）ＤＺＩＰ１（配列番号：１２）、１３）ＭＸＲＡ７（配列番号：１３）、１４）ＰＴＣＨＤ４（配列番号：１４）、１５）ＰＤＬＩＭ３（配列番号：１５）、１６）ＣＮＮ１（配列番号：１６）、１７）ＮＩＰＳＮＡＰ３Ｂ（配列番号：１７）、１８）ＰＡＱＲ７（配列番号：１８）、１９）ＡＣＴＧ２（配列番号：１９）、２０）ＮＡ（配列番号：２０）、２１）ＴＩＭＰ２（配列番号：２１）および２２）ＤＥＳ（配列番号：２２）の少なくとも１つを含む分類器を使用する。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有する。
【００６６】
[0076]  いくつかの特定の実施形態において、本発明は、ＨＭＣＮ２もしくはその断片を含むもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：そのような実施形態において、本方法は、ＨＭＣＮ２および１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＣＤＫＬ２（配列番号：２）、３）ＧＰＲ９８（配列番号：３）、４）ＰＲＫＣＱ（配列番号：４）、５）ＨＬＡ−Ｇ（配列番号：５）、６）ＰＦＫＦＢ３（配列番号：６）、７）ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：７）、８）ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ（配列番号：８）、９）ＣＤ２７４（配列番号：９）、１０）ＰＲＵＮＥ２（配列番号：１０）、１１）ＡＲＡＰ２（配列番号：１１）、１２）ＤＺＩＰ１（配列番号：１２）、１３）ＭＸＲＡ７（配列番号：１３）、１４）ＰＴＣＨＤ４（配列番号：１４）、１５）ＰＤＬＩＭ３（配列番号：１５）、１６）ＣＮＮ１（配列番号：１６）、１７）ＮＩＰＳＮＡＰ３Ｂ（配列番号：１７）、１８）ＰＡＱＲ７（配列番号：１８）、１９）ＡＣＴＧ２（配列番号：１９）、２０）ＮＡ（配列番号：２０）、２１）ＴＩＭＰ２（配列番号：２１）および２２）ＤＥＳ（配列番号：２２）の少なくとも１つを含む分類器を使用する。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有する。
【００６７】
[0077]  いくつかの特定の実施形態において、本発明は、ＡＤＡＭＴＳＬ１もしくはその断片を含むもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：そのような実施形態において、本方法は、ＡＤＡＭＴＳＬ１および１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＣＤＫＬ２（配列番号：２）、３）ＧＰＲ９８（配列番号：３）、４）ＰＲＫＣＱ（配列番号：４）、５）ＨＬＡ−Ｇ（配列番号：５）、６）ＰＦＫＦＢ３（配列番号：６）、７）ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：７）、８）ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ（配列番号：８）、９）ＣＤ２７４（配列番号：９）、１０）ＰＲＵＮＥ２（配列番号：１０）、１１）ＡＲＡＰ２（配列番号：１１）、１２）ＤＺＩＰ１（配列番号：１２）、１３）ＭＸＲＡ７（配列番号：１３）、１４）ＰＴＣＨＤ４（配列番号：１４）、１５）ＰＤＬＩＭ３（配列番号：１５）、１６）ＣＮＮ１（配列番号：１６）、１７）ＮＩＰＳＮＡＰ３Ｂ（配列番号：１７）、１８）ＰＡＱＲ７（配列番号：１８）、１９）ＡＣＴＧ２（配列番号：１９）、２０）ＮＡ（配列番号：２０）、２１）ＴＩＭＰ２（配列番号：２１）および２２）ＤＥＳ（配列番号：２２）の少なくとも１つを含む分類器を使用する。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有する。
【００６８】
[0078]  いくつかの特定の実施形態において、本発明は、ＣＤ７９Ｂもしくはその断片を含むもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：そのような実施形態において、本方法は、ＣＤ７９Ｂおよび１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＣＤＫＬ２（配列番号：２）、３）ＧＰＲ９８（配列番号：３）、４）ＰＲＫＣＱ（配列番号：４）、５）ＨＬＡ−Ｇ（配列番号：５）、６）ＰＦＫＦＢ３（配列番号：６）、７）ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：７）、８）ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ（配列番号：８）、９）ＣＤ２７４（配列番号：９）、１０）ＰＲＵＮＥ２（配列番号：１０）、１１）ＡＲＡＰ２（配列番号：１１）、１２）ＤＺＩＰ１（配列番号：１２）、１３）ＭＸＲＡ７（配列番号：１３）、１４）ＰＴＣＨＤ４（配列番号：１４）、１５）ＰＤＬＩＭ３（配列番号：１５）、１６）ＣＮＮ１（配列番号：１６）、１７）ＮＩＰＳＮＡＰ３Ｂ（配列番号：１７）、１８）ＰＡＱＲ７（配列番号：１８）、１９）ＡＣＴＧ２（配列番号：１９）、２０）ＮＡ（配列番号：２０）、２１）ＴＩＭＰ２（配列番号：２１）および２２）ＤＥＳ（配列番号：２２）の少なくとも１つを含む分類器を使用する。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有する。
【００６９】
[0079]  いくつかの特定の実施形態において、本発明は、ＫＥＬもしくはその断片を含むもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：そのような実施形態において、本方法は、ＫＥＬおよび１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＣＤＫＬ２（配列番号：２）、３）ＧＰＲ９８（配列番号：３）、４）ＰＲＫＣＱ（配列番号：４）、５）ＨＬＡ−Ｇ（配列番号：５）、６）ＰＦＫＦＢ３（配列番号：６）、７）ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：７）、８）ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ（配列番号：８）、９）ＣＤ２７４（配列番号：９）、１０）ＰＲＵＮＥ２（配列番号：１０）、１１）ＡＲＡＰ２（配列番号：１１）、１２）ＤＺＩＰ１（配列番号：１２）、１３）ＭＸＲＡ７（配列番号：１３）、１４）ＰＴＣＨＤ４（配列番号：１４）、１５）ＰＤＬＩＭ３（配列番号：１５）、１６）ＣＮＮ１（配列番号：１６）、１７）ＮＩＰＳＮＡＰ３Ｂ（配列番号：１７）、１８）ＰＡＱＲ７（配列番号：１８）、１９）ＡＣＴＧ２（配列番号：１９）、２０）ＮＡ（配列番号：２０）、２１）ＴＩＭＰ２（配列番号：２１）および２２）ＤＥＳ（配列番号：２２）の少なくとも１つを含む分類器を使用する。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有する。
【００７０】
[0080]  いくつかの特定の実施形態において、本発明は、ＫＬＨＬ１４もしくはその断片を含むもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：そのような実施形態において、本方法は、ＫＬＨＬ１４および１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＣＤＫＬ２（配列番号：２）、３）ＧＰＲ９８（配列番号：３）、４）ＰＲＫＣＱ（配列番号：４）、５）ＨＬＡ−Ｇ（配列番号：５）、６）ＰＦＫＦＢ３（配列番号：６）、７）ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：７）、８）ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ（配列番号：８）、９）ＣＤ２７４（配列番号：９）、１０）ＰＲＵＮＥ２（配列番号：１０）、１１）ＡＲＡＰ２（配列番号：１１）、１２）ＤＺＩＰ１（配列番号：１２）、１３）ＭＸＲＡ７（配列番号：１３）、１４）ＰＴＣＨＤ４（配列番号：１４）、１５）ＰＤＬＩＭ３（配列番号：１５）、１６）ＣＮＮ１（配列番号：１６）、１７）ＮＩＰＳＮＡＰ３Ｂ（配列番号：１７）、１８）ＰＡＱＲ７（配列番号：１８）、１９）ＡＣＴＧ２（配列番号：１９）、２０）ＮＡ（配列番号：２０）、２１）ＴＩＭＰ２（配列番号：２１）および２２）ＤＥＳ（配列番号：２２）の少なくとも１つを含む分類器を使用する。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有する。
【００７１】
[0081]  いくつかの特定の実施形態において、本発明は、ＭＰＰ２もしくはその断片を含むもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：そのような実施形態において、本方法は、ＭＰＰ２および１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＣＤＫＬ２（配列番号：２）、３）ＧＰＲ９８（配列番号：３）、４）ＰＲＫＣＱ（配列番号：４）、５）ＨＬＡ−Ｇ（配列番号：５）、６）ＰＦＫＦＢ３（配列番号：６）、７）ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：７）、８）ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ（配列番号：８）、９）ＣＤ２７４（配列番号：９）、１０）ＰＲＵＮＥ２（配列番号：１０）、１１）ＡＲＡＰ２（配列番号：１１）、１２）ＤＺＩＰ１（配列番号：１２）、１３）ＭＸＲＡ７（配列番号：１３）、１４）ＰＴＣＨＤ４（配列番号：１４）、１５）ＰＤＬＩＭ３（配列番号：１５）、１６）ＣＮＮ１（配列番号：１６）、１７）ＮＩＰＳＮＡＰ３Ｂ（配列番号：１７）、１８）ＰＡＱＲ７（配列番号：１８）、１９）ＡＣＴＧ２（配列番号：１９）、２０）ＮＡ（配列番号：２０）、２１）ＴＩＭＰ２（配列番号：２１）および２２）ＤＥＳ（配列番号：２２）の少なくとも１つを含む分類器を使用する。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有する。
【００７２】
[0082]  いくつかの特定の実施形態において、本発明は、ＮＭＮＡＴ２もしくはその断片を含むもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：そのような実施形態において、本方法は、ＮＭＮＡＴ２および１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＣＤＫＬ２（配列番号：２）、３）ＧＰＲ９８（配列番号：３）、４）ＰＲＫＣＱ（配列番号：４）、５）ＨＬＡ−Ｇ（配列番号：５）、６）ＰＦＫＦＢ３（配列番号：６）、７）ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：７）、８）ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ（配列番号：８）、９）ＣＤ２７４（配列番号：９）、１０）ＰＲＵＮＥ２（配列番号：１０）、１１）ＡＲＡＰ２（配列番号：１１）、１２）ＤＺＩＰ１（配列番号：１２）、１３）ＭＸＲＡ７（配列番号：１３）、１４）ＰＴＣＨＤ４（配列番号：１４）、１５）ＰＤＬＩＭ３（配列番号：１５）、１６）ＣＮＮ１（配列番号：１６）、１７）ＮＩＰＳＮＡＰ３Ｂ（配列番号：１７）、１８）ＰＡＱＲ７（配列番号：１８）、１９）ＡＣＴＧ２（配列番号：１９）、２０）ＮＡ（配列番号：２０）、２１）ＴＩＭＰ２（配列番号：２１）および２２）ＤＥＳ（配列番号：２２）の少なくとも１つを含む分類器を使用する。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有する。
【００７３】
[0083]  いくつかの特定の実施形態において、本発明は、ＰＬＸＤＣ１もしくはその断片を含むもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：そのような実施形態において、本方法は、ＰＬＸＤＣ１および１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＣＤＫＬ２（配列番号：２）、３）ＧＰＲ９８（配列番号：３）、４）ＰＲＫＣＱ（配列番号：４）、５）ＨＬＡ−Ｇ（配列番号：５）、６）ＰＦＫＦＢ３（配列番号：６）、７）ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：７）、８）ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ（配列番号：８）、９）ＣＤ２７４（配列番号：９）、１０）ＰＲＵＮＥ２（配列番号：１０）、１１）ＡＲＡＰ２（配列番号：１１）、１２）ＤＺＩＰ１（配列番号：１２）、１３）ＭＸＲＡ７（配列番号：１３）、１４）ＰＴＣＨＤ４（配列番号：１４）、１５）ＰＤＬＩＭ３（配列番号：１５）、１６）ＣＮＮ１（配列番号：１６）、１７）ＮＩＰＳＮＡＰ３Ｂ（配列番号：１７）、１８）ＰＡＱＲ７（配列番号：１８）、１９）ＡＣＴＧ２（配列番号：１９）、２０）ＮＡ（配列番号：２０）、２１）ＴＩＭＰ２（配列番号：２１）および２２）ＤＥＳ（配列番号：２２）の少なくとも１つを含む分類器を使用する。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有する。
【００７４】
[0084]  いくつかの特定の実施形態において、本発明は、ＣＡＰＮ９もしくはその断片を含むもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：そのような実施形態において、本方法は、ＣＡＰＮ９および
１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＣＤＫＬ２（配列番号：２）、３）ＧＰＲ９８（配列番号：３）、４）ＰＲＫＣＱ（配列番号：４）、５）ＨＬＡ−Ｇ（配列番号：５）、６）ＰＦＫＦＢ３（配列番号：６）、７）ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：７）、８）ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ（配列番号：８）、９）ＣＤ２７４（配列番号：９）、１０）ＰＲＵＮＥ２（配列番号：１０）、１１）ＡＲＡＰ２（配列番号：１１）、１２）ＤＺＩＰ１（配列番号：１２）、１３）ＭＸＲＡ７（配列番号：１３）、１４）ＰＴＣＨＤ４（配列番号：１４）、１５）ＰＤＬＩＭ３（配列番号：１５）、１６）ＣＮＮ１（配列番号：１６）、１７）ＮＩＰＳＮＡＰ３Ｂ（配列番号：１７）、１８）ＰＡＱＲ７（配列番号：１８）、１９）ＡＣＴＧ２（配列番号：１９）、２０）ＮＡ（配列番号：２０）、２１）ＴＩＭＰ２（配列番号：２１）および２２）ＤＥＳ（配列番号：２２）の少なくとも１つを含む分類器を使用する。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有する。
【００７５】
[0085]  いくつかの特定の実施形態において、本発明は、ＴＡＬＤＯ１もしくはその断片を含むもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：そのような実施形態において、本方法は、ＴＡＬＤＯ１および１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＣＤＫＬ２（配列番号：２）、３）ＧＰＲ９８（配列番号：３）、４）ＰＲＫＣＱ（配列番号：４）、５）ＨＬＡ−Ｇ（配列番号：５）、６）ＰＦＫＦＢ３（配列番号：６）、７）ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：７）、８）ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ（配列番号：８）、９）ＣＤ２７４（配列番号：９）、１０）ＰＲＵＮＥ２（配列番号：１０）、１１）ＡＲＡＰ２（配列番号：１１）、１２）ＤＺＩＰ１（配列番号：１２）、１３）ＭＸＲＡ７（配列番号：１３）、１４）ＰＴＣＨＤ４（配列番号：１４）、１５）ＰＤＬＩＭ３（配列番号：１５）、１６）ＣＮＮ１（配列番号：１６）、１７）ＮＩＰＳＮＡＰ３Ｂ（配列番号：１７）、１８）ＰＡＱＲ７（配列番号：１８）、１９）ＡＣＴＧ２（配列番号：１９）、２０）ＮＡ（配列番号：２０）、２１）ＴＩＭＰ２（配列番号：２１）および２２）ＤＥＳ（配列番号：２２）の少なくとも１つを含む分類器を使用する。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有する。
【００７６】
[0086]  いくつかの特定の実施形態において、本発明は、ＰＬＫ４もしくはその断片を含むもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：そのような実施形態において、本方法は、ＰＬＫ４および
１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＣＤＫＬ２（配列番号：２）、３）ＧＰＲ９８（配列番号：３）、４）ＰＲＫＣＱ（配列番号：４）、５）ＨＬＡ−Ｇ（配列番号：５）、６）ＰＦＫＦＢ３（配列番号：６）、７）ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：７）、８）ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ（配列番号：８）、９）ＣＤ２７４（配列番号：９）、１０）ＰＲＵＮＥ２（配列番号：１０）、１１）ＡＲＡＰ２（配列番号：１１）、１２）ＤＺＩＰ１（配列番号：１２）、１３）ＭＸＲＡ７（配列番号：１３）、１４）ＰＴＣＨＤ４（配列番号：１４）、１５）ＰＤＬＩＭ３（配列番号：１５）、１６）ＣＮＮ１（配列番号：１６）、１７）ＮＩＰＳＮＡＰ３Ｂ（配列番号：１７）、１８）ＰＡＱＲ７（配列番号：１８）、１９）ＡＣＴＧ２（配列番号：１９）、２０）ＮＡ（配列番号：２０）、２１）ＴＩＭＰ２（配列番号：２１）および２２）ＤＥＳ（配列番号：２２）の少なくとも１つを含む分類器を使用する。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有する。
【００７７】
[0087]  いくつかの特定の実施形態において、本発明は、ＩＧＨＶ３−７２もしくはその断片を含むもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：そのような実施形態において、本方法は、ＩＧＨＶ３−７２および１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＣＤＫＬ２（配列番号：２）、３）ＧＰＲ９８（配列番号：３）、４）ＰＲＫＣＱ（配列番号：４）、５）ＨＬＡ−Ｇ（配列番号：５）、６）ＰＦＫＦＢ３（配列番号：６）、７）ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：７）、８）ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ（配列番号：８）、９）ＣＤ２７４（配列番号：９）、１０）ＰＲＵＮＥ２（配列番号：１０）、１１）ＡＲＡＰ２（配列番号：１１）、１２）ＤＺＩＰ１（配列番号：１２）、１３）ＭＸＲＡ７（配列番号：１３）、１４）ＰＴＣＨＤ４（配列番号：１４）、１５）ＰＤＬＩＭ３（配列番号：１５）、１６）ＣＮＮ１（配列番号：１６）、１７）ＮＩＰＳＮＡＰ３Ｂ（配列番号：１７）、１８）ＰＡＱＲ７（配列番号：１８）、１９）ＡＣＴＧ２（配列番号：１９）、２０）ＮＡ（配列番号：２０）、２１）ＴＩＭＰ２（配列番号：２１）および２２）ＤＥＳ（配列番号：２２）の少なくとも１つを含む分類器を使用する。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有する。
【００７８】
[0088]  いくつかの特定の実施形態において、本発明は、ＩＧＫＶ１−９もしくはその断片を含むもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：そのような実施形態において、本方法は、ＩＧＫＶ１−９および１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＣＤＫＬ２（配列番号：２）、３）ＧＰＲ９８（配列番号：３）、４）ＰＲＫＣＱ（配列番号：４）、５）ＨＬＡ−Ｇ（配列番号：５）、６）ＰＦＫＦＢ３（配列番号：６）、７）ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：７）、８）ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ（配列番号：８）、９）ＣＤ２７４（配列番号：９）、１０）ＰＲＵＮＥ２（配列番号：１０）、１１）ＡＲＡＰ２（配列番号：１１）、１２）ＤＺＩＰ１（配列番号：１２）、１３）ＭＸＲＡ７（配列番号：１３）、１４）ＰＴＣＨＤ４（配列番号：１４）、１５）ＰＤＬＩＭ３（配列番号：１５）、１６）ＣＮＮ１（配列番号：１６）、１７）ＮＩＰＳＮＡＰ３Ｂ（配列番号：１７）、１８）ＰＡＱＲ７（配列番号：１８）、１９）ＡＣＴＧ２（配列番号：１９）、２０）ＮＡ（配列番号：２０）、２１）ＴＩＭＰ２（配列番号：２１）および２２）ＤＥＳ（配列番号：２２）の少なくとも１つを含む分類器を使用する。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有する。
【００７９】
[0089]  いくつかの特定の実施形態において、本発明は、ＣＮＴＮ４もしくはその断片を含むもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：そのような実施形態において、本方法は、ＣＮＴＮ４および
１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＣＤＫＬ２（配列番号：２）、３）ＧＰＲ９８（配列番号：３）、４）ＰＲＫＣＱ（配列番号：４）、５）ＨＬＡ−Ｇ（配列番号：５）、６）ＰＦＫＦＢ３（配列番号：６）、７）ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：７）、８）ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ（配列番号：８）、９）ＣＤ２７４（配列番号：９）、１０）ＰＲＵＮＥ２（配列番号：１０）、１１）ＡＲＡＰ２（配列番号：１１）、１２）ＤＺＩＰ１（配列番号：１２）、１３）ＭＸＲＡ７（配列番号：１３）、１４）ＰＴＣＨＤ４（配列番号：１４）、１５）ＰＤＬＩＭ３（配列番号：１５）、１６）ＣＮＮ１（配列番号：１６）、１７）ＮＩＰＳＮＡＰ３Ｂ（配列番号：１７）、１８）ＰＡＱＲ７（配列番号：１８）、１９）ＡＣＴＧ２（配列番号：１９）、２０）ＮＡ（配列番号：２０）、２１）ＴＩＭＰ２（配列番号：２１）および２２）ＤＥＳ（配列番号：２２）の少なくとも１つを含む分類器を使用する。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有する。
【００８０】
[0090]  いくつかの実施形態において、本発明は、以下の配列のうち２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、もしくは３５個を含むもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＣＤＫＬ２（配列番号：２）、３）ＧＰＲ９８（配列番号：３）、４）ＰＲＫＣＱ（配列番号：４）、５）ＨＬＡ−Ｇ（配列番号：５）、６）ＰＦＫＦＢ３（配列番号：６）、７）ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：７）、８）ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ（配列番号：８）、９）ＣＤ２７４（配列番号：９）、１０）ＰＲＵＮＥ２（配列番号：１０）、１１）ＡＲＡＰ２（配列番号：１１）、１２）ＤＺＩＰ１（配列番号：１２）、１３）ＭＸＲＡ７（配列番号：１３）、１４）ＰＴＣＨＤ４（配列番号：１４）、１５）ＰＤＬＩＭ３（配列番号：１５）、１６）ＣＮＮ１（配列番号：１６）、１７）ＮＩＰＳＮＡＰ３Ｂ（配列番号：１７）、１８）ＰＡＱＲ７（配列番号：１８）、１９）ＡＣＴＧ２（配列番号：１９）、２０）ＮＡ（配列番号：２０）、２１）ＴＩＭＰ２（配列番号：２１）、２２）ＤＥＳ（配列番号：２２）、２３）ＨＭＣＮ２、２４）ＡＤＡＭＴＳＬ１、２５）ＣＤ７９Ｂ、２６）ＫＥＬ、２７）ＫＬＨＬ１４、２８）ＭＰＰ２、２９）ＮＭＮＡＴ２、３０）ＰＬＸＤＣ１、３１）ＣＡＰＮ９、３２）ＴＡＬＤＯ１、３３）ＰＬＫ４、３４）ＩＧＨＶ３−７２、３５）ＩＧＫＶ１−９及び３６）ＣＮＴＮ４。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有することができる。他の態様において、分類器は、これらの遺伝子のうち１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くを削除し、任意選択により他の遺伝子を含むことができる。
【００８１】
[0091]  いくつかの実施形態において、本発明は、以下の配列の全てを含むかもしくはそれからなる分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供する：１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＣＤＫＬ２（配列番号：２）、３）ＧＰＲ９８（配列番号：３）、４）ＰＲＫＣＱ（配列番号：４）、５）ＨＬＡ−Ｇ（配列番号：５）、６）ＰＦＫＦＢ３（配列番号：６）、７）ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：７）、８）ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ（配列番号：８）、９）ＣＤ２７４（配列番号：９）、１０）ＰＲＵＮＥ２（配列番号：１０）、１１）ＡＲＡＰ２（配列番号：１１）、１２）ＤＺＩＰ１（配列番号：１２）、１３）ＭＸＲＡ７（配列番号：１３）、１４）ＰＴＣＨＤ４（配列番号：１４）、１５）ＰＤＬＩＭ３（配列番号：１５）、１６）ＣＮＮ１（配列番号：１６）、１７）ＮＩＰＳＮＡＰ３Ｂ（配列番号：１７）、１８）ＰＡＱＲ７（配列番号：１８）、１９）ＡＣＴＧ２（配列番号：１９）、２０）ＮＡ（配列番号：２０）、２１）ＴＩＭＰ２（配列番号：２１）、２２）ＤＥＳ（配列番号：２２）、２３）ＨＭＣＮ２、２４）ＡＤＡＭＴＳＬ１、２５）ＣＤ７９Ｂ、２６）ＫＥＬ、２７）ＫＬＨＬ１４、２８）ＭＰＰ２、２９）ＮＭＮＡＴ２、３０）ＰＬＸＤＣ１、３１）ＣＡＰＮ９、３２）ＴＡＬＤＯ１、３３）ＰＬＫ４、３４）ＩＧＨＶ３−７２、３５）ＩＧＫＶ１−９及び３６）ＣＮＴＮ４。特定の態様において、分類器は、１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子を含有することができる。他の態様において、分類器は、これらの遺伝子のうち１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くを削除し、任意選択により他の遺伝子を含むことができる。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載される分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムを提供し、その方法は、対象を喫煙者または非喫煙者に分類する分類器を実装する工程をさらに含む。そのような喫煙者状態の分類を、任意選択によりＵＩＰ対非ＵＩＰ分類器を実装するのに先立って実装することができ、または喫煙者状態の分類工程を、本発明のＵＩＰ対非ＵＩＰ分類器のトレーニング（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）において使用される共変量として組み込むことができる。
【００８２】
[0092]  いくつかの実施形態において、代わりに、またはさらに、本明細書に記載される分類器を使用してＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法および／またはシステムは、ＵＩＰ対非ＵＩＰ分類器のトレーニング（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）または実装の間に喫煙者状態のバイアスの影響を受けやすい特定の遺伝子またはそのバリアントに対する差異的重み付けを除外するまたは割り当てる工程をさらに含む。本明細書では、「喫煙者状態の偏り」とは、非喫煙者患者において、ＵＩＰ対非ＵＩＰ患者において差異的に発現されるが、喫煙者である（または、喫煙者であった）ＵＩＰ対非ＵＩＰ患者において検出可能に差異的に発現されない遺伝子またはそのバリアントのことを指す。
【００８３】
[0093]  いくつかの実施形態において、本発明の方法および／またはシステムは、少なくとも第１および第２の分類器を含む段階的分類器を含み、第１の分類器は、喫煙者を非喫煙者と区別する遺伝子シグネチャーを認識するためにトレーニングされ（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）、第２の分類器は、喫煙者または非喫煙者それぞれにおいてＵＩＰ対非ＵＩＰを区別するためにトレーニングされる（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）。
【００８４】
[0094]  いくつかの実施形態において、本発明の方法および／またはシステムは：
試験サンプル（例えば肺組織）から核酸（例えば、ＲＮＡ、例えばトータルＲＮＡなど）を抽出する工程と；
核酸を増幅して、発現している核酸ライブラリを作製する（例えば、ｃＤＮＡ［任意選択により標識ｃＤＮＡ］のポリメラーゼ連鎖反応媒介増幅による、そのｃＤＮＡは、逆転写［ＲＴ−ＰＣＲ］により１つまたは複数のＲＮＡサンプルから作製することができる）工程と；
アレイ（例えば、マイクロアレイ）または直接配列決定（例えば、RNAseq）によって核酸ライブラリに存在する１つまたは複数の核酸の発現を検出する（例えば、ＲＴ−ＰＣＲによって作製されたｃＤＮＡ種を測定することによりＲＮＡ発現プロファイルを検出する）工程と；
本明細書に記載されるトレーニングした分類器を使用して試験サンプルがＵＩＰかまたは非ＵＩＰか決定する工程と
を含む。
【００８５】
[0095]  いくつかの実施形態において、本発明の方法および／またはシステムは、喫煙者状態をトレーニング演習に組み込むことをさらに含む。特定の実施形態において、喫煙者状態は、任意選択により以下の方法の１つによって組み込まれる：
（ｉ）喫煙状態を、トレーニング（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）の間ＵＩＰまたは非ＵＩＰ分類器における共変量として使用することによる。
（ｉｉ）ＵＩＰもしくは非ＵＩＰ分類器トレーニング（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）の間に、喫煙者状態のバイアスの影響を受けやすい複数の遺伝子を同定し、そのような遺伝子を除外する、または任意選択により、そのようなバイアスの影響を受けにくい遺伝子と異なる重み付けをすることによる。
（ｉｉｉ）喫煙者を非喫煙者と区別する遺伝子シグネチャーを認識するためにトレーニングされる（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）初期分類器を使用して、試験サンプルの遺伝子シグネチャーに基づいて試験サンプルを「喫煙者」または「非喫煙者」に前分類し；次いで、前分類の後に、喫煙者もしくは非喫煙者いずれかにおいてＵＩＰ対非ＵＩＰを区別するためにトレーニングされた（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）固有の分類器が実装される段階的分類を構築することによる。例えば、前分類器が、試験サンプルが喫煙者由来であると決定する場合、ＵＩＰ対非ＵＩＰ分類は、喫煙者由来のＵＩＰおよび非ＵＩＰサンプルでトレーニングされた（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）分類器を使用して遂行される。反対に、前分類器が、試験サンプルが非喫煙者由来であると決定する場合、ＵＩＰ対非ＵＩＰ分類は、非喫煙者由来のＵＩＰおよび非ＵＩＰサンプルでトレーニングされた（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）分類器を使用して遂行される。いくつかの実施形態において、少なくとも部分的には、分類器トレーニングにおいて喫煙者状態のバイアスの影響を受けやすい遺伝子の包含に起因するバックグラウンドノイズの減少により、そのような喫煙者または非喫煙者特異的分類器は、診断能力の改善をもたらす。
【００８６】
[0096]  したがって、本発明は、本明細書に開示するように、ＵＩＰを非ＵＩＰと識別する方法に使用する適当な分類器も提供する。様々な実施形態において、本発明は、ＵＩＰを非ＵＩＰと識別するのに適当な分類器を提供し、分類器は、専門の病理学者によって決定された１つもしくは複数の組織病理学ラベルに対応するサンプルからのマイクロアレイまたは配列決定データを使用してトレーニングされる（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）。いくつかの実施形態において、サンプルはラベルされたＵＩＰまたは非ＵＩＰである。
【００８７】
[0097]  いくつかの実施形態において、本発明は、表５、７、８、９、１０、１１もしくは１２のいずれかに示される１つもしくは複数の配列もしくはその断片、もしくは表５、７、８、９、１０、１１もしくは１２のそれぞれからの少なくとも１つの配列もしくはその断片を含むかまたはそれらからなる分類器を示す。いくつかの実施形態において、本発明は、表５、７、８、９、１０、１１および１２のいずれか１つもしくは複数もしくは全てに提供される配列のうち少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上を含むかまたはそれらからなる分類器を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、表５、７、８、９、１０、１１もしくは１２のいずれか１つもしくは複数もしくは全てに提供される配列を少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００個以上を含むかまたはそれらからなる分類器を提供し、その分類器は、その間にある全ての整数（例えば、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５個の配列等）および範囲（例えば、表５、７、８、９、１０、１１、もしくは１２のいずれか１つもしくは複数もしくは全てからの約１〜１０個の配列、約１０〜１５個の配列、１０〜２０個の配列、５〜３０個の配列、５〜５０個の配列、１０〜１００個の配列、５０〜２００個の配列等）を含む。一実施形態において、本発明は、表５に提供される全ての配列、表７に提供される全ての配列、表８に提供される全ての配列、表９に提供される全ての配列、表１０に提供される全ての配列、表１１に提供される全ての配列もしくは表１２に提供される全ての配列を含むかまたはそれらからなる分類器を提供する。一実施形態において、本発明は、表５、７、８、９、１０、１１もしくは１２のそれぞれに提供される全ての配列を含むかまたはそれらからなる分類器を提供する。
【００８８】
[0098]  いくつかの特定の実施形態において、本発明は、ＵＩＰを非ＵＩＰと識別するための分類器を提供し、分類器は、以下の配列もしくはその断片の１つもしくは複数を含むかまたはそれらからなる：１）ＨＬＡ−Ｆ（配列番号：１）、２）ＣＤＫＬ２（配列番号：２）、３）ＧＰＲ９８（配列番号：３）、４）ＰＲＫＣＱ（配列番号：４）、５）ＨＬＡ−Ｇ（配列番号：５）、６）ＰＦＫＦＢ３（配列番号：６）、７）ＣＥＡＣＡＭ１（配列番号：７）、８）ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ（配列番号：８）、９）ＣＤ２７４（配列番号：９）、１０）ＰＲＵＮＥ２（配列番号：１０）、１１）ＡＲＡＰ２（配列番号：１１）、１２）ＤＺＩＰ１（配列番号：１２）、１３）ＭＸＲＡ７（配列番号：１３）、１４）ＰＴＣＨＤ４（配列番号：１４）、１５）ＰＤＬＩＭ３（配列番号：１５）、１６）ＣＮＮ１（配列番号：１６）、１７）ＮＩＰＳＮＡＰ３Ｂ（配列番号：１７）、１８）ＰＡＱＲ７（配列番号：１８）、１９）ＡＣＴＧ２（配列番号：１９）、２０）ＮＡ（配列番号：２０）、２１）ＴＩＭＰ２（配列番号：２１）および２２）ＤＥＳ（配列番号：２２）。一実施形態において、分類器は、上記の配列の全２２個を含むかまたはそれらからなる。いくつかの実施形態において、本発明はＵＩＰを非ＵＩＰと識別するための分類器を提供し、分類器は、上記の２２個の配列のうち２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；もしくは２１個を含むかまたはそれらからなる。特定の態様において、分類器は１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くの追加の遺伝子もしくはその断片を含有する。他の態様において、分類器は、上記の２２個の配列のうち１、２、３、４、５、６、７、８個またはより多くを削除し、任意選択により他の遺伝子を含む。他の態様において、２２個の遺伝子のそれぞれは、他の遺伝子のいずれか１つまたは複数、２０個までと組み合わせて使用することができる。
【００８９】
組織サンプル
[0099]  対象となる分析または診断方法に使用する肺組織サンプルは、生検サンプル（例えば、ビデオ支援胸腔鏡下手術；VATSにより得られる生検サンプル）；気管支肺胞洗浄（BAL）サンプル；経気管支生検；凍結経気管支生検；および同種のものであることができる。分析用の肺組織サンプルは、適当な保存液に入れて提供することができる。
【００９０】
[00100]  組織サンプルは、患者が示す臨床徴候および症状（例えば、息切れ［一般に、労作により悪化する］、乾性咳）、ならびに、任意選択により１つまたは複数の画像試験の結果（例えば胸部Ｘ線、コンピュータ断層撮影［CT］）、肺機能試験（例えば、肺活量測定、酸素測定、運動負荷試験）、肺組織分析（例えば、気管支鏡検査、気管支肺胞洗浄、外科生検により得られるサンプルの組織学的および／または細胞学的分析）に基づいて、肺疾患、例えばＩＬＤの疑いがある患者から得ることができる。
【００９１】
[00101]  肺組織サンプルは、様々な方法のいずれかで処理することができる。例えば、肺組織サンプルは、細胞溶解に供することができる。肺組織サンプルは、ＲＮＡ保護溶液（ＲＮＡ分解を阻害する溶液、例えば、ＲＮＡのヌクレアーゼ消化を阻害する）中に保存することができ、その後細胞溶解に供することができる。核酸および／またはタンパク質などの構成成分は、肺組織サンプルから濃縮もしくは単離することができ、濃縮もしくは単離された構成成分は、対象となる方法に使用することができる。核酸およびタンパク質などの構成成分を濃縮ならびに単離する方法は当業者に公知であり；任意の公知の方法を使用することができる。発現分析用のＲＮＡを単離する方法は、当業者に記述されている。
【００９２】
発現産物レベルを決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法
[00102]  ＵＩＰ対非ＵＩＰ分類において観察されるゲノムシグナルをさらに実証するパネルの発現を算定するためのさらなる手法は、多様な生化学アッセイおよび検出方法にわたって強力である。特に、コホートのサブセットについてＲＮＡＳｅｑデータを生成し、ＣＶ下で能力を評価した。対応させたアレイデータとの能力比較により、ＲＮＡＳｅｑデータを使用する分類が、マイクロアレイプラットフォームから生成されるデータと類似の能力を実現することが実証された。
【００９３】
[00103]  遺伝子発現産物レベルを決定する一般的な方法は、当業者に公知であり、それだけには限らないが：追加の細胞学的アッセイ、特定のタンパク質もしくは酵素活性のアッセイ、タンパク質もしくはＲＮＡもしくは特定のＲＮＡスプライスバリアントを含めた特定の発現産物のアッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、全もしくは部分的ゲノム発現分析、マイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ、遺伝子発現連鎖分析（SAGE）、酵素結合免疫吸光度アッセイ、質量分析、免疫組織化学、ブロッティング、配列決定、ＲＮＡ配列決定、ＤＮＡ配列決定（例えば、ＲＮＡから得られるｃＤＮＡの配列決定）；次世代配列決定、ナノ細孔配列決定、パイロシークエンス、またはナノストリング配列決定の１つもしくは複数を含むことができる。例えば、遺伝子発現産物レベルは、Ｋｉｍ、らに記述される方法によって決定することができる（Lancet Respir Med. 2015 Jun;3（6）:473-82、全ての補足を含め、その全体を本明細書に組み込む）。本明細書では、用語「アッセイする」もしくは「検出する」もしくは「決定する」は、遺伝子発現産物レベルの決定に関して互換的に使用され、いずれの場合にも、遺伝子発現産物レベルを決定する上記の方法は、遺伝子発現産物レベルを検出またはアッセイするのに適当であると考えられる。遺伝子発現産物レベルは、トータルｍＲＮＡまたはグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼもしくはチューブリンを含むがこれに限定されない特定の遺伝子の発現レベルなどの内部標準に対して標準化することができる。
【００９４】
[00104]  様々な実施形態において、サンプルは、組織サンプル（例えば、TBBサンプルなど肺組織サンプル）から採取される細胞を含む。細胞は、当業者に公知のまたは本明細書に開示される標準的な技術を使用してサンプルから採取することができる。例えば、一実施形態において、細胞は、細胞サンプルを遠心分離し、ペレットになった細胞を再懸濁することによって採取される。細胞は、リン酸緩衝食塩水（PBS）などの緩衝液に再懸濁することができる。細胞懸濁液を遠心分離して細胞ペレットを得た後、細胞を溶解して、核酸、例えば、メッセンジャーＲＮＡを抽出することができる。対象から得られるサンプルは全て、どんな種類のさらなる処理を受けるものも含めて、対象から得られると考えられる。
【００９５】
[00105]  一実施形態において、サンプルは、本明細書に記載のとおり遺伝子発現産物の検出を遂行される前にさらに処理される。例えば、細胞または組織サンプル中のｍＲＮＡは、サンプルの他の構成成分から分離することができる。ｍＲＮＡは天然の環境にないので、サンプルを濃縮および／または精製して、非天然の状態にｍＲＮＡを単離することができる。例えば、研究は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｍＲＮＡの高次構造が、同じ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ構造と異なることを示した（例えば、Rouskin et al. ［2014］Nature 505, pp. 701-705を参照のこと、全ての目的のためにその全体を本明細書に組み込む）。
【００９６】
[00106]  一実施形態においてサンプル由来のｍＲＮＡは、合成ＤＮＡプローブとハイブリダイズされ、いくつかの実施形態において合成ＤＮＡプローブは検出部分（例えば、検出可能な標識、捕捉配列、バーコードレポート配列）を含む。したがって、これらの実施形態において、非天然のｍＲＮＡ−ｃＤＮＡ複合体を最終的に製作し、使用して、遺伝子発現産物を検出する。別の実施形態において、サンプル由来のｍＲＮＡは、検出可能な標識、例えば、フルオロフォアで直接標識される。さらなる実施形態において、非天然の標識ｍＲＮＡ分子は、ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズされ、複合体が検出される。
【００９７】
[00107]  一実施形態において、ｍＲＮＡが、サンプルから一度得られたら、ハイブリダイゼーション反応において相補的ＤＮＡ（cDNA）に変換されるかまたは１つもしくは複数のｃＤＮＡプローブと共にハイブリダイゼーション反応に使用される。ｃＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在せず、したがって非天然の分子である。さらにまた、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドは合成であり、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しない。ｃＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないことに加えて、デオキシリボ核酸を含むがリボ核酸を含まないので、ｃＤＮＡは必然的にｍＲＮＡと異なる。ｃＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または当分野の技術者に公知の他の増幅方法により次いで増幅される。例えば、利用可能な他の増幅方法には、リガーゼ連鎖反応（LCR）（Wu and Wallace, Genomics, 4:560［1989］、Landegren et al., Science, 241:1077（1988）、全ての目的のためにその全体を参照により組み込む）、転写増幅（Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173［1989］、全ての目的のためにその全体を参照により組み込む）、全ての目的のためにその全体を参照により組み込む自家持続配列複製法（Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87:1874［1990］、全ての目的のためにその全体を参照により組み込む）、および核酸配列ベース増幅（NASBA）がある。ＰＣＲ増幅用のプライマーを選択するためのガイドラインは、当分野の技術者に公知である。例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込むＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＰＣＲ  Ｂａｓｉｃｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｂｅｎｃｈ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、２０００年を参照のこと。この増幅反応の産物、すなわち、増幅ｃＤＮＡも、必然的に非天然の産物である。第１に、上述のとおり、ｃＤＮＡは非天然の分子である。第２に、ＰＣＲの場合、増幅プロセスは、出発材料のあらゆる個々のｃＤＮＡ分子に対し何億個ものｃＤＮＡコピーを作るのに役立つ。生成されるコピー数は、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在するｍＲＮＡのコピー数とは全く異なる。
【００９８】
[00108]  一実施形態において、ｃＤＮＡは、（例えば、アダプタ特異的プライマーを使用して）断片に追加のＤＮＡ配列（例えば、アダプタ、レポータ、捕捉配列または部分、バーコード）を導入するプライマーによって増幅される、またはｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡ遺伝子発現産物配列は、追加の配列（例えば、アダプタ、レポータ、捕捉配列または部分、バーコード）を含むｃＤＮＡプローブに直接ハイブリダイズされる。追加の配列を導入し、非天然のハイブリッドを形成させることにより、増幅および／またはｃＤＮＡプローブへのｍＲＮＡのハイブリダイゼーションは、したがって非天然の一本鎖ｃＤＮＡ、もしくはｍＲＮＡから非天然の二本鎖分子を作るのに役立つ。さらに、当分野の技術者に公知であるように、増幅手順には、それに付随する誤差率がある。したがって、増幅はｃＤＮＡ分子にさらなる修飾を導入する。一実施形態において、アダプタ特異的プライマーによる増幅の間、検出可能な標識、例えば、フルオロフォアが、一本鎖ｃＤＮＡ分子に付加される。したがって増幅は、少なくとも（ｉ）ｃＤＮＡはｉｎ  ｖｉｖｏで存在せず、（ｉ）アダプタ配列がｃＤＮＡ分子の末端に付加されて、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないＤＮＡ配列が作られ、（ｉｉ）増幅に付随する誤差率のために、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないＤＮＡ配列をさらに作られ、（ｉｉｉ）天然に存在するそれと比較してｃＤＮＡ分子の構造が異なり、（ｉｖ）ｃＤＮＡ分子への検出可能な標識の化学的付加のため、天然に存在しないＤＮＡ複合体を作るのにも役立つ。
【００９９】
[00109]  いくつかの実施形態において、対象の遺伝子発現産物の発現は、非天然のｃＤＮＡ分子の検出によって核酸レベルで検出される。
【０１００】
[00110]  本明細書に記載される遺伝子発現産物は、対象とする核酸配列のいずれかの全長もしくは部分的配列、または逆転写反応においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成的に得られるそれらの非天然のｃＤＮＡ産物を含めたＲＮＡを含む。用語「断片」とは、少なくとも１０、１５、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１０００、１２００もしくは、１５００個の隣接するヌクレオチド、または本明細書に開示する完全長遺伝子発現産物ポリヌクレオチドに存在するヌクレオチド数までを一般に含むポリヌクレオチドの一部のことを指すものとする。遺伝子発現産物ポリヌクレオチドの断片は、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１５０、２００もしくは２５０個の隣接するアミノ酸、または本発明の完全長遺伝子発現産物タンパク質に存在するアミノ酸の総数までを一般にコードすることになる。
【０１０１】
[00111]  特定の実施形態において、遺伝子発現プロファイルは、全トランスクリプトームのショットガン配列決定により得ることができ（「WTSS」または「RNAseq」；例えば、Ryan et al BioTechniques 45: 81- 94を参照のこと）、これは、サンプルのＲＮＡ含有量についての情報を得るためにハイスループット配列決定技術を使用してｃＤＮＡを配列決定する。一般論として、ｃＤＮＡがＲＮＡから作られ、ｃＤＮＡが増幅され、増幅産物が配列決定される。
【０１０２】
[00112]  増幅後に、ｃＤＮＡは、任意の簡便な方法を使用して配列決定することができる。例えば、断片は、Ｉｌｌｕｍｉｎａの可逆的ターミネーター法、Ｒｏｃｈｅのパイロシークエンス法（454）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのライゲーションによる配列決定（SOLiDプラットフォーム）またはＬｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔプラットフォームを使用して配列決定することができる。そのような方法の例は、以下の参照：Margulies et al（Nature 2005 437: 376-80）；Ronaghi et al（Analytical Biochemistry 1996 242: 84-9）；Shendure（Science 2005 309: 1728）；Imelfort et al（Brief Bioinform. 2009 10:609-18）；Fox et al（Methods Mol Biol. 2009;553:79-108）；Appleby et al（Methods Mol Biol. 2009;513: 19-39）、およびMorozova（Genomics. 2008 92:255-64）に記述されており、それらを、方法の一般的な説明ならびに工程のそれぞれに関する全ての出発産物、試薬および最終産物を含めた方法の特定の工程について参照により組み込む。明らかなように、選択した次世代配列決定プラットフォームに適合するフォワードおよびリバース配列決定プライマー部位を、増幅工程の間に断片の末端に付加することができる。
【０１０３】
[00113]  他の実施形態において、産物はナノ細孔配列決定を使用して配列決定することができる（例えば、Soni et al Clin Chem 53: 1996-2001 2007に記述される、またはOxford Nanopore Technologiesに記述される）。ナノ細孔配列決定は、単一分子配列決定技術であり、ＤＮＡの単一分子は、ナノ細孔を通過する際に直接配列決定される。ナノ細孔は、ほぼ直径１ｎｍ程度の小さい穴である。導電性流動体へのナノ細孔の浸漬およびそれを跨ぐ電位（電圧）の適用により、ナノ細孔を通るイオンの伝導のため、微弱電流を得られる。流れる電流の量は、ナノ細孔のサイズおよび形状の影響を受ける。ＤＮＡ分子がナノ細孔を通過するときに、ＤＮＡ分子上の各ヌクレオチドは異なる程度でナノ細孔をふさぎ、異なる程度でナノ細孔を通る電流の大きさを変化させる。したがって、ＤＮＡ分子がナノ細孔を通過するときのこの電流の変化が、ＤＮＡ配列のリードを表す。ナノ細孔配列決定技術については、米国特許第５，７９５，７８２号、第６，０１５，７１４号、第６，６２７，０６７号、第７，２３８，４８５号および第７，２５８，８３８号ならびに米国特許出願公開第２００６００３１７１号および第２００９００２９４７７号に開示されている。
【０１０４】
[00114]  いくつかの実施形態において、対象とする方法の遺伝子発現産物はタンパク質であり、特定の生体サンプル中のタンパク質の量は、サンプルのコホートから得られるタンパク質データから得られる分類器を使用して分析される。タンパク質の量は：酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、質量分析、ブロッティングまたは免疫組織化学のうち１つもしくは複数によって決定することができる。
【０１０５】
[00115]  いくつかの実施形態において、遺伝子発現産物マーカーおよび選択的スプライシングマーカーは、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイ、ｃＤＮＡマイクロアレイ、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、スポットしたマイクロアレイ、またはＢｉｏｒａｄ、Ａｇｉｌｅｎｔ、もしくはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ製の他のマイクロアレイ製品を使用するマイクロアレイ分析によって決定することができる。マイクロアレイは、１回の実験でアッセイできる多数の遺伝子または選択的スプライスバリアントを含有できるので、特別な利点を提供する。いくつかの場合において、マイクロアレイデバイスは、全ヒトゲノムもしくはトランスクリプトームまたはその大量の画分を含有することができるので、遺伝子発現パターン、ゲノム配列もしくは選択的スプライシングの包括的な評価が可能になる。マーカーは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２００１年ならびにＢａｌｄｉ，Ｐ．およびＨａｔｆｉｅｌｄ，Ｗ．Ｇ．、ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ２００２年に記載の標準的な分子生物学およびマイクロアレイ分析技術を使用して見出すことができる。
【０１０６】
[00116]  マイクロアレイ分析は、当業者に公知の方法を使用して生体サンプル（例えば生検または細針吸引液）から核酸を抽出し、精製することにより一般に始まる。発現ならびに選択的スプライシング分析の場合、ＤＮＡからＲＮＡを抽出および／または精製することが有利になり得る。ｔＲＮＡならびにｒＲＮＡなど他の型のＲＮＡからｍＲＮＡを抽出および／または精製することがさらに有利になり得る。
【０１０７】
[00117]  精製した核酸は、例えば逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ライゲーション、化学反応もしくは他の技術により、蛍光標識、放射性核種、またはビオチン、ジゴキシゲニン、もしくはジゴキシンなどの化学的標識でさらに標識することができる。標識は、直接または結合段階をさらに必要とする場合がある間接的であることもできる。結合段階は、例えばアミノアリル−ＵＴＰならびにＮＨＳアミノ反応性色素（シアニン色素など）を使用してハイブリダイゼーションに先立って、または例えば、ビオチンおよび標識ストレプトアビジンを使用して後に、起こすことができる。一例として、修飾ヌクレオチド（例えば１  ａａＵＴＰ：４  ＴＴＰ比）が、正常ヌクレオチドと比較してより低い率で酵素的に付加され、一般に６０塩基毎に１つ得られる（分光光度計で測定される）。ａａＤＮＡは、例えばカラムまたは透析濾過デバイスにより次いで精製することができる。アミノアリル基は、核酸塩基に結合している長いリンカー上のアミン基であり、それは反応性標識（例えば蛍光色素）と反応する。
【０１０８】
[00118]  標識サンプルは、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、ＳＳＣ、硫酸デキストラン、ブロッキング薬剤（COT1 DNA、サケ精子DNA、仔ウシ胸腺DNA、PolyAまたはPolyTなど）、デンハルト液、フォルマミン（formamine）、またはそれらの組み合わせを含有することができるハイブリダイゼーション溶液と次いで混合できる。
【０１０９】
[00119]  ハイブリダイゼーションプローブは、可変長のＤＮＡもしくはＲＮＡの断片であり、それを使用してＤＮＡまたはＲＮＡサンプル中にあるプローブ内の配列と相補的なヌクレオチド配列（DNA標的）の存在を検出する。その塩基配列が、プローブと標的の間の相補性のためプローブ−標的塩基対合を可能にするプローブは、それにより一本鎖核酸（DNAまたはRNA）にハイブリダイズする。標識プローブは、単一ＤＮＡ鎖に先ず変性され（加熱またはアルカリ条件による）、次いで標的ＤＮＡにハイブリダイズされる。
【０１１０】
[00120]  標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションを検出するために、プローブは、分子マーカーでタグ付けされ（または、標識され）；一般に使用されるマーカーは、３２Ｐまたはジゴキシゲニンであり、ジゴキシゲニンは非放射性抗体に基づくマーカーである。プローブに対して中程度〜高い配列相補性（例えば少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはより高い相補性）を有するＤＮＡ配列またはＲＮＡ転写産物は、オートラジオグラフィーもしくは他の画像化技術でハイブリダイズしたプローブを可視化することにより、次いで検出される。中程度または高い相補性を持つ配列の検出は、どれくらいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が適用されるかによって決まり；高いハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション緩衝液の低い塩などの強いストリンジェンシーは、極めて類似している核酸配列同士のハイブリダイゼーションだけを可能にし、一方でより低い温度ならびに高い塩などの弱いストリンジェンシーは、配列の類似性が低い場合でもハイブリダイゼーションを可能にする。ＤＮＡマイクロアレイに使用されるハイブリダイゼーションプローブとは、コーティングされたスライドガラスなどの不活性表面に共有結合されたＤＮＡまたは遺伝子チップのことを指し、そこに移動性のｃＤＮＡ標的がハイブリダイズされる。
【０１１１】
[00121]  アレイ上のプローブにハイブリダイズすることになる標的核酸を含む混合物を、加熱または化学的手段により変性させ、マイクロアレイの開口部に添加することができる。穴を次いで密封し、マイクロアレイを、例えば、マイクロアレイが回転によりまたは混合器内で混合されるハイブリダイゼーションオーブン内でハイブリダイズさせることができる。終夜ハイブリダイゼーションさせた後、非特異的結合を（例えばSDSおよびSSCで）洗い流すことができる。マイクロアレイを、次いで乾燥させ、色素を励起するレーザーおよび色素による放射を測定する検出器を備える機械でスキャンすることができる。画像に鋳型グリッドを重層することができ、特性（例えばいくつかのピクセルを含む特性）の強度を定量化することができる。
【０１１２】
[00122]  様々なキットを使用して対象とする方法の核酸を増幅し、プローブを生成することができる。本発明に使用することができるキットの例には、それだけには限らないが、Ｎｕｇｅｎ  ＷＴ−Ｏｖａｔｉｏｎ  ＦＦＰＥキット、Ｎｕｇｅｎ  Ｅｘｏｎ  ＭｏｄｕｌｅおよびＦｒａｇ／Ｌａｂｅｌモジュールを含むｃＤＮＡ増幅キットがある。ＮｕＧＥＮ  ＷＴ−Ｏｖａｔｉｏｎ（商標）ＦＦＰＥシステムＶ２は、ＦＦＰＥサンプルから得られる小さく分解したＲＮＡの膨大なアーカイブに対して広範な遺伝子発現分析を行うことを可能にする全トランスクリプトーム増幅システムである。システムは、わずか５０ｎｇのトータルＦＦＰＥ  ＲＮＡの増幅に必要な試薬および手順から構成される。手順は、ｑＰＣＲ、サンプルのアーカイブ化、断片化および標識に使用することができる。増幅したｃＤＮＡは、ＮｕＧＥＮのＦＬ−Ｏｖａｔｉｏｎ（商標）ｃＤＮＡ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｍｏｄｕｌｅ  Ｖ２を使用してＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）３’発現アレイ分析用として２時間未満で断片化し、標識することができる。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）Ｅｘｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  ＳＴアレイを使用する分析の場合、増幅したｃＤＮＡを、ＷＴ−Ｏｖａｔｉｏｎ  Ｅｘｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅで使用し、次いでＦＬ−Ｏｖａｔｉｏｎ（商標）ｃＤＮＡ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｍｏｄｕｌｅ  Ｖ２を使用して断片化し、標識することができる。Ａｇｉｌｅｎｔアレイでの分析の場合、増幅したｃＤＮＡは、ＮｕＧＥＮのＦＬ−Ｏｖａｔｉｏｎ（商標）ｃＤＮＡ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｏｄｕｌｅを使用して断片化し、標識することができる。
【０１１３】
[00123]  いくつかの実施形態において、Ａｍｂｉｏｎ  ＷＴ−発現キットを使用することができる。Ａｍｂｉｏｎ  ＷＴ−発現キットは、独立したリボソームＲＮＡ（rRNA）除去工程なしにトータルＲＮＡの直接増幅を可能にする。Ａｍｂｉｏｎ（商標）ＷＴ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎキットにより、トータルＲＮＡ  ５０ｎｇ程度のサンプルを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（商標）ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）ヒト、マウス、およびラットＥｘｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴアレイで分析することができる。より少ない投入ＲＮＡの必要量およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（商標）方法とＴａｑＭａｎ（商標）リアルタイムＰＣＲデータとの高い一致に加えて、Ａｍｂｉｏｎ（商標）ＷＴ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎキットは、感度の有意な増加をもたらす。例えば、Ａｍｂｉｏｎ（商標）ＷＴ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎキットによるシグナル対ノイズ比の増加の結果として、バックグラウンドより高く検出されるより多数のプローブセットをエキソンレベルで得ることができる。Ａｍｂｉｏｎ（商標）−発現キットは、さらなるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ標識キットと組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態において、ＡｍｐＴｅｃ  Ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｎａｎｏ  ｍＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（6299-A15）を対象とする方法に使用することができる。ＥｘｐｒｅｓｓＡｒｔ（商標）ＴＲｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍＲＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｎａｎｏ  ｋｉｔは、投入トータルＲＮＡ  １ｎｇ〜７００ｎｇの広い範囲に適している。投入トータルＲＮＡの量およびａＲＮＡの必要な収量によって、＞１０μｇの範囲のａＲＮＡ収量に、１回転（投入＞トータルＲＮＡ  ３００ｎｇ）または２回転（最小投入量、トータルRNA  １ｎｇ）を使用することができる。ＡｍｐＴｅｃの登録商標のＴＲｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅプライミング技術により、ｒＲＮＡに対する選択と組み合わせてｍＲＮＡの優先的な増幅（普遍的な真核生物3'-poly(A)配列の影響を受けない）を得られる。ＡｍｐＴｅｃ  Ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｎａｎｏ  ｍＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔについてのより多くの情報は、ｗｗｗ．ａｍｐｔｅｃ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍで得ることができる。このキットは、ｃＤＮＡ変換キットおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ標識キットと組み合わせて使用することができる。
【０１１４】
[00124]  生データは、例えば、バックグラウンド強度を差し引き、その後各チャネルで等しい特性の合計強度または参照遺伝子の強度のいずれかをもたらす強度で割ることにより次いで標準化することができ、次いで、全ての強度についてｔ値を算出することができる。より高度な方法には、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップ用などのｚ−比、ｌｏｅｓｓおよびｌｏｗｅｓｓ回帰ならびにＲＭＡ（ｒｏｂｕｓｔ  ｍｕｌｔｉｃｈｉｐ分析）がある。
【０１１５】
[00125]  いくつかの実施形態において、上記の方法を使用して転写産物発現レベルを決定し、それにより対象が喫煙者か非喫煙者か識別するための分類器をトレーニングする（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）ことができる。いくつかの実施形態において、上記の方法を使用して転写産物発現レベルを決定し、それにより対象がＵＩＰか非ＵＩＰか識別するための分類器をトレーニングする（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）ことができる。
【０１１６】
データ分析
（ｉ）正常に対するサンプルの比較
[00126]  いくつかの実施形態において、対象由来のサンプル（「試験サンプル」）に対して遂行した分子プロファイリングの結果を、正常であることが公知のまたはその疑いがある生体サンプル（「正常サンプル」）と比較することができる。いくつかの実施形態において、正常サンプルは、評価段階でＩＬＤ、もしくは症状を含まないもしくは含まないと思われる、または評価段階で１つもしくは複数のＩＬＤに対する分子プロファイリングアッセイにおいて陰性を試験することになったサンプルである。いくつかの実施形態において、正常サンプルは、どんなＩＬＤも含まない、もしくは含まないと思われるものであり、または分子プロファイリングアッセイにおいてどんなＩＬＤについても陰性を試験することになったサンプルである。正常サンプルは、試験した対象と異なる対象または同じ対象由来であることができる。いくつかの場合において、正常サンプルは、例えば試験した対象などの対象から得られる肺組織サンプルである。正常サンプルは、試験サンプルと同時にまたは異なるときにアッセイすることができる。いくつかの実施形態において、正常サンプルは、非喫煙者由来であることが公知であるまたはその疑いがあるサンプルである。特定の実施形態において、正常サンプルは、非ＵＩＰであることが少なくとも２名の専門の病理学者により確認されたサンプルである。特定の実施形態において、正常サンプルは、非ＩＰＦであることが少なくとも２名の専門の病理学者により確認されたサンプルである。
【０１１７】
[00127]  試験サンプルに対するアッセイの結果は、公知の病状（例えば、正常、選択されたILD［例えば、IPF、NSIP等］に罹患している、喫煙者、非喫煙者）を有するサンプルに対する同じアッセイの結果と比較することができる。いくつかの場合において、正常サンプルに対するアッセイの結果は、データベースまたは参照のものである。いくつかの場合において、正常サンプルに対するアッセイの結果は、当業技術者に公知のまたは一般に受け入れられる値もしくはその範囲の値である。いくつかの場合において、比較は定性的である。他の場合において、比較は定量的である。いくつかの場合において、定性的または定量的比較は、それだけには限らないが：蛍光値、スポット強度、吸光度値、化学発光シグナル、ヒストグラム、臨界閾値、統計的有意性値、遺伝子産物発現レベル、遺伝子産物発現レベル変化、選択的エキソン使用、選択的エキソン使用の変化、タンパク質レベル、ＤＮＡ多型、コピー数変動、１つもしくは複数のＤＮＡマーカーもしくは領域の有無の指標、もしくは核酸配列の比較のうち１つもしくは複数を含むことができる。
【０１１８】
（ｉｉ）結果の評価
[00128]  いくつかの実施形態において、分子プロファイリングの結果は、遺伝子産物発現レベルまたは選択的エキソン使用を特定のＩＬＤなど特定の表現型もしくは正常状態(normalcy)（例えば疾患または症状がない）と相関させるための当業者に公知の方法を使用して評価される。いくつかの場合において、指定の統計的信頼レベルを決定して、診断信頼レベルを得ることができる。例えば、９０％を超える信頼レベルが、ＩＬＤの存在または喫煙者もしくは非喫煙者状態の有用な予測手段になり得ると決定することができる。他の実施形態において、程度の差はあるが厳しい信頼レベルを選ぶことができる。例えば、約または少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、９９．５％、または９９．９％の信頼レベルを、有用な表現型予測手段として選ぶことができる。得られた信頼レベルは、いくつかの場合において、サンプルの品質、データの品質、分析の品質、使用した具体的な方法、および／または分析した遺伝子発現産物の数と関連する。診断を可能にするための指定の信頼レベルは、偽陽性もしくは偽陰性の期待数および／または費用に基づいて選ぶことができる。指定の信頼レベルを実現するまたは診断力があるマーカーを同定するためのパラメータを選ぶ方法には、それだけには限らないが、受診者動作特性（ROC）曲線分析、二項ＲＯＣ（binormal ROC）、主成分分析、部分最小二乗法分析、特異値分解、リーストアブソリュートシュリンケージアンドセレクションオペレータ（least absolute shrinkage and selection operator）分析、最少角回帰法、および閾値勾配正則化法（threshold gradient directed regularization method）がある。
【０１１９】
（ｉｉｉ）データ分析
[00129]  生の遺伝子発現レベルならびに選択的スプライシングデータは、データの標準化および／または信頼度を改善するように設計された方法および／またはプロセスの適用によって、いくつかの場合において改善され得る。本開示のいくつかの実施形態において、処理される個々のデータ点が多数のため、データ分析は、本明細書に記載される様々な方法および／または処理の適用のためにコンピュータもしくは他のデバイス、機械もしくは装置を必要とする。「機械学習分類器」とは、コンピュータ使用予測データ構造または方法のことを指し、遺伝子発現プロファイルを特徴付けるために利用される。例えば、マイクロアレイ利用ハイブリダイゼーションアッセイにより得られる特定の発現レベルに対応するシグナルは、発現プロファイルを分類するために分類器に一般に供される。教師あり学習(supervised learning)は、分類器を「トレーニング」して、クラス間の差異を認識し、次いで独立したテストセットに対する分類器の精度を「試験する」ことを一般に含む。新たな、不明なサンプルの場合、分類器を使用して、サンプルが属するクラスを予測することができる。様々な実施形態において、そのようなトレーニングは、例えば、分類器トレーニングモジュールを使用して実現される。
【０１２０】
[00130]  いくつかの場合において、ロバストマルチアレイ平均法（robust multi-array average）（RMA）を使用して生データを標準化することができる。ＲＭＡ方法は、いくつかのマイクロアレイに関してそれぞれ対応させた細胞についてバックグラウンド修正強度を計算することにより始められる。バックグラウンド修正値は、Ｉｒｉｚａｒｒｙら、Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２００３年４月４日（２）：２４９〜６４頁に記載のとおり正の数に限定される。バックグラウンド修正の後、バックグラウンド修正した対応させた細胞の各強度の底２の対数を、次いで得る。各入力アレイおよび各プローブ発現値に対してアレイパーセンタイルプローブ値が、全てのアレイパーセンタイル点の平均と置き換えられるクォンタイル標準化法を使用して、各マイクロアレイに対してバックグラウンド修正し、対数変換し、対応させた強度を次いで標準化する。この方法については、Ｂｏｌｓｔａｄら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００３年により完全に記述されている。次いで、クォンタイル標準化後に、標準化したデータを線形モデルに当てはめて、各マイクロアレイについて各プローブの発現計測を得ることができる。次いで、チューキーのメジアンポリッシュアルゴリズムmedian polish algorithm）（Tukey, J. W.,Exploratory Data Analysis. 1977）を使用して、標準化したプローブセットデータについて対数目盛発現レベルを決定することができる。
【０１２１】
[00131]  他の様々なソフトウェアおよび／またはハードウェアモジュールもしくはプロセスを実装することができる。特定の方法において、特性選択およびモデル推定は、ｇｌｍｎｅｔを使用してｌａｓｓｏペナルティを用いるロジスティック回帰により遂行することができる（Friedman J, Hastie T, Tibshirani R. Regularization Paths for Generalized Linear Models via Coordinate Descent. Journal of statistical software 2010; 33(1): 1-22）。生のリードは、ＴｏｐＨａｔを使用してアラインすることができる（Trapnell C, Pachter L, Salzberg SL. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics 2009; 25(9): 1105-11.）。遺伝子数は、ＨＴＳｅｑ（Anders S, Pyl PT, Huber W. HTSeq-a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics 2014.）を使用して得ることができ、ＤＥＳｅｑ（Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-Seq data with DESeq2; 2014）を使用して標準化できる。方法において、上位の特性（Ｎは、10〜200の範囲にある）を使用して、ｅ１０７１ライブラリ（Meyer D. Support vector machines: the interface to libsvm in package e1071. 2014.）を使用する線形サポートベクターマシン（SVM）（Suykens JAK, Vandewalle J. Least Squares Support Vector Machine Classifiers. Neural Processing Letters 1999; 9(3): 293-300）をトレーニングした。信頼区間は、ｐＲＯＣパッケージを使用して計算することができる（Robin X, Turck N, Hainard A, et al. pROC: an open-source package for R and S+ to analyze and compare ROC curves. BMC bioinformatics 2011; 12: 77）
【０１２２】
[00132]  加えて、データをフィルタリングして、疑わしいと考え得るデータを除去することができる。いくつかの実施形態において、約４、５、６、７または８個未満のグアノシン＋シトシンヌクレオチドを有するマイクロアレイプローブから得られるデータは、異常ハイブリダイゼーション性向もしくは二次構造問題のため、信頼できないと考え得る。同様に、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個より多くのグアノシン＋シトシンヌクレオチドを有するマイクロアレイプローブから得られるデータは、異常ハイブリダイゼーション性向もしくは二次構造問題のため信頼できないと考え得る。
【０１２３】
[00133]  いくつかの場合において、一連の参照データセットに対してプローブセットの信頼度を順位付けすることにより信頼できないプローブセットを選択して、データ分析から除外することができる。例えば、ＲｅｆＳｅｑまたはＥｎｓｅｍｂｌ（EMBL）は、非常に高品質の参照データセットと考えられる。ＲｅｆＳｅｑまたはＥｎｓｅｍｂｌ配列に合うプローブセットのデータは、いくつかの場合、高い信頼度が期待されるためマイクロアレイ分析実験に特に含めることができる。同様に、あまり信頼性が高くない参照データセットに合うプローブセットのデータは、さらなる分析から除外する、または包含について個別的な基準で検討することができる。いくつかの場合において、Ｅｎｓｅｍｂｌ高スループットｃＤＮＡ（HTC）および／またはｍＲＮＡ参照データセットを使用して、別々にまたは一緒にプローブセットの信頼度を決定することができる。他の場合において、プローブセットの信頼度を順位付けすることができる。例えば、全ての参照データセット、例えばＲｅｆＳｅｑ、ＨＴＣ、ＨＴＳｅｑ、ならびにｍＲＮＡなどに完全に合うプローブおよび／またはプローブセットは、最も信頼性が高いと順位付けすることができる（１）。さらにまた、３つの参照データセット中で２つに合うプローブおよび／またはプローブセットは、次に最も信頼性が高いと順位付けすることができ（２）、３つの参照データセット中で１つに合うプローブおよび／またはプローブセットは、次に順位付けすることができ（３）ならびに参照データセットに合わないプローブおよび／またはプローブセットは、最後に順位付けすることができる（４）。次いでプローブおよび／またはプローブセットを、その順位付けに基づいて分析に含めるかまたは除外することができる。例えば、さらなる分析のために区分１、２、３および４プローブセット；区分１、２および３プローブセット；区分１ならびに２プローブセット；または区分１プローブセットからのデータを含むように選ぶことができる。別の例において、プローブセットは、参照データセット登録情報に対する塩基対ミスマッチの数により順位付けすることができる。分子プロファイリング用の所与のプローブおよび／またはプローブセットの信頼度を算定するための多数の方法が当業者に理解されており、本開示の方法は、これらの方法およびそれらの組み合わせのいずれも包含するものと理解される。
【０１２４】
[00134]  本発明のいくつかの実施形態において、プローブセットからのデータが、発現されないまたは検出不能なレベル（バックグラウンド以下）で発現される場合、それらを分析から除外することができる。いずれかの群について：
標準正規分布のＴ０〜∞の積分値＜有意性（0.01）
［式中、T0=Sqr（群サイズ）（T-P）/Sqr（Pvar）；群サイズ＝群内のＣＥＬのファイル数、Ｔ＝プローブセット中のプローブスコアの平均、Ｐ＝ＧＣ含量のバックグラウンドプローブ平均の平均、およびＰｖａｒ＝バックグラウンドプローブ分散の合計／（プローブセット内のプローブ数）２］
である場合、プローブセットは、バックグラウンドより高く発現していると判断される。
【０１２５】
[00135]  これにより、プローブセットに対するバックグラウンドの中点であるプローブセットプローブとして、郡内のプローブセットの平均が類似のＧＣ含量のバックグラウンドプローブの平均発現より大きいプローブセットを含めることが可能になり、バックグラウンドプローブセット分散からプローブセット分散度を導くことが可能になる。
【０１２６】
[00136]  本開示のいくつかの実施形態において、分散を呈さないまたは低く呈するプローブセットを、さらなる分析から除外することができる。低分散のプローブセットは、カイ二乗検定によって分析から除外される。プローブセットは、その変換された分散が自由度（N-1）でのカイ二乗分布の９９％信頼区間の左側にある場合、低分散であると見なされる。（N-1）＊プローブセット分散／（遺伝子プローブセット分散）。Ｃｈｉ−Ｓｑ（N-1）について、式中、Ｎは、入力ＣＥＬファイルの数であり、（N-1）は、カイ二乗分布の自由度であり、「遺伝子のプローブセット分散」は、遺伝子全部のプローブセット分散の平均である。本発明のいくつかの実施形態において、所与の遺伝子または転写産物クラスターに対するプローブセットに含まれる、ＧＣ含量、信頼度、分散および同種のものに関して以前に記載されているフィルタ工程を通過するプローブの数が最小数より少ない場合、それをさらなる分析から除外することができる。例えばいくつかの実施形態において、所与の遺伝子または転写産物クラスターに対するプローブセットが、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個未満、もしくは約２０個未満のプローブを含有する場合、それをさらなる分析から除外することができる。
【０１２７】
[00137]  遺伝子発現レベルまたは選択的スプライシングのデータ分析の方法は、本明細書に提供される特性選択の方法および／またはプロセスの使用をさらに含むことができる。本発明のいくつかの実施形態において、特性選択は、ＬＩＭＭＡソフトウェアパッケージの使用により得られる（Smyth, G. K. (2005). Limma: linear models for microarray data. In: Bioinformatics and Computational Biology Solutions using R and Bioconductor, R. Gentleman, V. Carey, S. Dudoit, R. Irizarry, W. Huber (eds.), Springer, New York, pages 397-420）。
【０１２８】
[00138]  遺伝子発現レベルおよび／または選択的スプライシングのデータ分析の方法は、前分類器方法および／またはプロセス（例えば、前分類器分析モジュールにより実装する）の使用をさらに含むことができる。例えば、方法および／またはプロセスは、細胞特異的分子指紋を使用して、その組成物によりサンプルを前分類し、次いで修正／標準化因子を適用することができる。このデータ／情報を、最終診断の補助にその情報を組み込むことができる最終的な分類法および／またはプロセスへ次いで送ることができる。
【０１２９】
[00139]  特定の実施形態において、本発明の方法は、本発明のＵＩＰ／非ＵＩＰ分類器を適用する前にサンプルを喫煙者もしくは非喫煙者に前分類する分子指紋を使用する前分類器方法および／またはプロセス（例えば、前分類器分析モジュールにより実装する）の使用を含む。
【０１３０】
[00140]  遺伝子発現レベルおよび／または選択的スプライシングのデータ分析の方法は、本明細書に提供される分類器方法および／またはプロセス（例えば、分類器分析モジュールにより実装する）の使用をさらに含むことができる。本発明のいくつかの実施形態において、対角線形判別分析、ｋ−最近傍分類器、サポートベクターマシン（SVM）分類器、線形サポートベクターマシン、ランダムフォレスト分類器、もしくは確率モデル利用法またはそれらの組み合わせが、マイクロアレイデータの分類に提供される。いくつかの実施形態において、サンプル（例えば第２のILDからの第1のILD、正常対ILD）を区別するまたはサブタイプ（例えばIPF対NSIP）を区別する同定されたマーカーを、対象のクラス間の発現レベルにおける差異の統計的有意性に基づいて選択する。いくつかの場合において、統計的有意性は、ベンジャミンホッホバーグまたは偽発見率（FDR）のための別の修正を適用することにより調整される。
【０１３１】
[00141]  いくつかの場合において、分類器は、ＦｉｓｈｅｌおよびＫａｕｆｍａｎら、２００７年  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３（１３）：１５９９〜６０６頁に記述されるそれなどのメタ分析手法で補足することができる。いくつかの場合において、分類器は、再現性分析などのメタ分析手法で補足することができる。いくつかの場合において、再現性分析は、少なくとも１つの予測発現産物マーカーセットに現れるマーカーを選択する。
【０１３２】
[00142]  マイクロアレイデータの分析に対する事後確率を導き、適用する方法は当業者に公知であり、例えばＳｍｙｔｈ，Ｇ．Ｋ．２００４年  Ｓｔａｔ．Ａｐｐｉ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３：第３項目に記述されている。いくつかの場合において、事後確率を使用して、分類器により提供されるマーカーを順位付けすることができる。いくつかの場合において、マーカーを事後確率にしたがって順位付けすることができ、選んだ閾値を通過するものを、その差異的発現が例えばＩＰＦもしくはＮＳＩＰであるサンプルの指標または診断になるマーカーとして選ぶことができる。例示的な閾値には、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９２５、０．９５、０．９７５、０．９８、０．９８５、０．９９、０．９９５またはより高い事前確率がある。
【０１３３】
[00143]  分子プロファイリングの結果の統計的評価は：診断精度の尤度；ＩＬＤの尤度；特定のＩＬＤの尤度；特定の治療的介入の成功の尤度、対象が喫煙者である尤度、および対象が非喫煙者である尤度のうち１つまたは複数の指標となる定量値（単数または複数）を提供することができるが、提供することに限定されない。したがって、遺伝学または分子生物学においてトレーニングされる可能性が低い医師は、生データを理解する必要はない。むしろ、データは、患者治療を指導するのに最も有用な形態で医師に直接示される。分子プロファイリングの結果は：スチューデントｔ検定、両側ｔ検定、ピアソン順位和分析、隠れマルコフモデル分析、ｑ−ｑプロットの分析、主成分分析、一元配置分散分析、二元配置分散分析、ＬＩＭＭＡおよび同種のものを含むがそれだけには限らない当業者に公知のいくつかの方法を使用して統計学的に評価することができる。［００１８２］本発明のいくつかの実施形態において、分子プロファイリング単独もしくは細胞学的分析と組み合わせての使用は、約８５％〜約９９％もしくは約１００％正確な分類、同定または診断を提供することができる。いくつかの場合において、分子プロファイリングプロセスおよび／または細胞診断学は、約もしくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．７５％、９９．８％、９９．８５％、もしくは９９．９％正確なＩＬＤの分類、同定、診断を提供する。いくつかの実施形態において、分子プロファイリングプロセスおよび／または細胞診断学は、約もしくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．７５％、９９．８％、９９．８５％、もしく９９．９％正確な特定のＩＬＤ型（例えばIPF；NSIP；HP）の存在の分類、同定または診断を提供する。
【０１３４】
[00144]  いくつかの場合において、精度は、経時的に対象を追跡して、元の診断の正確さを決定することにより決定することができる。他の場合において、精度は、決定論的な方式または統計的方法を使用して確立することができる。例えば、受信者動作特性（ROC）分析を使用して、最適なアッセイパラメータを決定し、それにより特定のレベルの精度、特異性、陽性予測値、陰性予測値および／または偽発見率を実現することができる。
【０１３５】
[00145]  本開示のいくつかの実施形態において、第１のＩＬＤと第２のＩＬＤの間（例えば、IPFとNSIPの間）、ＩＬＤと正常の間、および／または喫煙者と非喫煙者の間で発現レベルに最大の差異もしくは選択的スプライシングに最大の差異を呈することが決定される産物をコードしているヌクレオチドの遺伝子発現産物および組成物を、本開示の分子プロファイリング試薬としての使用に選ぶことができる。そのような遺伝子発現産物は、当業者に公知のもしくは使用されている他の方法より広いダイナミックレンジ、より大きなシグナル対ノイズ、改善された診断力、偽陽性もしくは偽陰性のより低い尤度、またはより高い統計的信頼レベルを提供することにより、特に有用になり得る。
【０１３６】
[00146]  本発明の他の実施形態において、当業者に公知の標準的な細胞学的技術の使用と比較した場合、分子プロファイリング単独または細胞学的分析と組み合わせての使用は、診断できないとスコアリングされるサンプル数を約もしくは少なくとも約１００％、９９％、９５％、９０％、８０％、７５％、７０％、６５％、もしくは約６０％まで減少させ得る。いくつかの場合において、本発明の方法は、当業者に使用される標準的な細胞学的方法と比較した場合、中間または疑わしいとスコアリングされるサンプル数を約もしくは少なくとも約１００％、９９％、９８％、９７％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、もしくは約６０％まで減少させ得る。
【０１３７】
[00147]  いくつかの場合において、分子プロファイリングアッセイの結果は、分子プロファイリング事業者、個人、医療提供者、または保険提供者の代表者もしくは代理人による利用のためにデータベースに登録される。いくつかの場合において、アッセイ結果は、医療専門家などの代表者、代理人、または事業コンサルタントによるサンプル分類、同定、もしくは診断を含む。他の場合において、データのコンピュータ分析が、自動で得られる。いくつかの場合において、分子プロファイリング事業は、遂行した分子プロファイリングアッセイ、コンサルティングサービス、データ分析、結果の報告、もしくはデータベース利用のうち１つもしくは複数について個人、保険提供者、医療提供者、研究者、または政府機関に請求することができる。
【０１３８】
[00148]  本発明のいくつかの実施形態において、分子プロファイリングの結果は、コンピュータ画面上の報告または紙記録として示される。いくつかの場合において、報告は、差異的に発現している遺伝子の数、元サンプルの適合性、差異的選択的スプライシングを示す遺伝子の数、診断、診断の統計的信頼、対象が喫煙者である尤度、ＩＬＤの尤度、および指示された療法の１つまたは複数などの情報を含み得るが、これに限定されない。
【０１３９】
（ｉｖ）分子プロファイリング結果に基づくサンプルの類別化
[00149]  分子プロファイリングの結果は、喫煙者、非喫煙者、ＩＬＤ、特定の型のＩＬＤ、非ＩＬＤ、または診断できない（ILDの有無について十分な情報が得られない）のうちの１つに分類することができる。いくつかの場合において、分子プロファイリングの結果は、ＩＰＦ対ＮＳＩＰ区分に分類することができる。特定の場合において、結果はＵＩＰまたは非ＵＩＰに分類することができる。
【０１４０】
[00150]  本発明のいくつかの実施形態において、結果は、トレーニングされた分類器を使用して分類される。本発明のトレーニングされた分類器は、１つもしくは複数の組織病理があるサンプルを含むがこれに限定されない、公知のＩＬＤおよび正常サンプル、公知の喫煙者および非喫煙者サンプル、または喫煙者および／または非喫煙者由来の公知のＩＬＤおよび正常サンプルの組み合わせの参照セットを使用して開発された方法および／またはプロセスを実装する。いくつかの実施形態において、トレーニング（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）は、第１のＩＬＤ由来の第１の組のバイオマーカーにおける遺伝子発現産物レベルと第２のＩＬＤ由来のバイオマーカーの第２の組における遺伝子発現産物レベルとの比較を含み、バイオマーカーの第１の組は、第２の組にないバイオマーカーを少なくとも１つ含む。いくつかの実施形態において、トレーニング（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）は、非ＵＩＰである第１のＩＬＤ由来の第１の組のバイオマーカーにおける遺伝子発現産物レベルとＵＩＰである第２のＩＬＤ由来のバイオマーカーの第２の組における遺伝子発現産物レベルとの比較を含み、バイオマーカーの第１の組は、第２の組にないバイオマーカーを少なくとも１つ含む。いくつかの実施形態において、トレーニング（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）は、喫煙者である第１の対象由来の第１の組のバイオマーカーにおける遺伝子発現産物レベルと非喫煙者である第２の対象由来のバイオマーカーの第２の組における遺伝子発現産物レベルとの比較をさらに含み、バイオマーカーの第１の組は、第２の組にないバイオマーカーを少なくとも１つ含む。いくつかの実施形態において、分類器全体または分類器の部分のいずれかを、分類器に使用される他の全てのバイオマーカーパネル（または、他の全てのバイオマーカーシグネチャー）に対する分類パネル内のバイオマーカーパネルの発現レベルの比較を使用してトレーニングする（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）ことができる。
【０１４１】
[00151]  サンプルの類別化に適した分類器には、それだけには限らないがｋ−最近傍分類器、サポートベクターマシン、線形判別分析、対角線形判別分析、ｕｐｄｏｗｎ分析、単純ベイズ分類器、ニューラルネットワーク分類器、隠れマルコフモデル分類器、遺伝子分類器、またはその任意の組み合わせがある。
【０１４２】
[00152]  いくつかの場合において、本発明のトレーニングされた分類器は、それだけには限らないが、ＤＮＡ多型データ、配列決定データ、本発明の細胞学者もしくは病理学者によるスコアリングもしくは診断、本開示の前分類器方法および／またはプロセスにより得られる情報、または本開示の対象の病歴についての情報など遺伝子発現もしくは選択的スプライシングデータ以外のデータを組み込むことができる。
【０１４３】
[00153]  ＩＬＤの診断のために生体サンプルを分類する場合、２成分分類器から起こり得る結末が一般に２つある。同様に、喫煙者の診断のために生体サンプルを分類する場合、２成分分類器から起こり得る結末が一般に２つある。２成分分類器を実際の真の値（例えば、生体サンプルからの値）と比較した場合、起こり得る結末が一般に４つある。予測からの結末がｐであり（「p」は、特定のILDなど陽性の分類器出力である）、実測値もｐである場合、それは真の陽性（TP）と呼ばれ；しかしながら、実測値がｎである場合、それは偽陽性（FP）と言われる。反対に、予測結末および実測値の両方が、ｎである（「n」は、ILDでない、または本明細書に記載の特定の疾患組織がないなど陰性分類器出力である）場合、真の陰性が起こり、実測値がｐだが予測結末がｎである場合、偽陰性である。一実施形態において、人が特定の疾患を有するかどうか決定しようとする診断試験を考慮する。人が陽性反応を示すが、実際には疾患がない場合、この場合偽陽性が起こる。人が陰性反応を示し、健康であることが示唆される場合に、実際に疾患がある場合、一方で偽陰性が起こる。いくつかの実施形態において、サブタイプの現実の有病率と仮定される受信者動作特性（ROC）曲線は、該当する割合で利用可能なサンプルにおいて実現された誤りを再サンプリングすることにより生成され得る。
【０１４４】
[00154]  陽性の予測値（PPV）、または精度率、もしくは疾患の試験後確率は、正しく診断される陽性試験結果の患者の割合である。その割合は、陽性試験が試験される基礎となる症状を反映する確率を反映するので、診断方法で最も重要な計測である。しかしながら、その値は疾患の有病率によって決まり、変化し得る。一例において、ＦＰ（偽陽性）；ＴＮ（真の陰性）；ＴＰ（真の陽性）；ＦＮ（偽陰性）。偽陽性率（α）＝ＦＰ／（FP+TN）−特異性；偽陰性率（β）＝ＦＮ／（TP+FN）−感度；力＝感度＝１−β；尤度比陽性＝感度／（1-特異性）；尤度比陰性＝（1-感度）／特異性。
【０１４５】
[00155]  陰性予測値は、正しく診断される陰性試験結果の患者の割合である。ＰＰＶおよびＮＰＶ測定は、適当な疾患サブタイプ有病率推定値を使用して得ることができる。プールした疾患有病率の推定値は、手術によりＢ対Ｍにおおまかに分類する予測不能なもののプールから算出することができる。いくつかの実施形態において、サブタイプ特異的推定値の場合、利用可能なサンプルが全くないので、時には疾患有病率が算出できない場合がある。これらの場合において、サブタイプ疾患有病率は、プールした疾患有病率推定値により置換することができる。
【０１４６】
[00156]  いくつかの実施形態において、発現産物のレベルまたは選択的エキソンの使用は、ＩＰＦ、ＮＳＩＰもしくはＨＰのうち１つの指標となる。
【０１４７】
[00157]  いくつかの実施形態において、発現産物のレベルまたは選択的エキソンの使用は、対象が喫煙者もしくは非喫煙者である指標となる。
【０１４８】
[00158]  いくつかの実施形態において、対象とする方法の発現分析の結果は、所与の診断が正しいという統計的信頼レベルを提供する。いくつかの実施形態において、そのような統計的信頼レベルは、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくそれ以上、またはより高い。
【０１４９】
報告
[00159]  対象とする方法および／またはシステムは、サンプル（肺組織サンプル）がＩＬＤサンプルであるという指標を提供する報告を生成する（例えば報告モジュールを使用する）工程を含み得る。対象とする診断方法は、試験される個体がＩＬＤかどうかに関する指標を提供する報告を生成する工程を含み得る。対象とする診断方法は、試験される個体が喫煙者かそうでないかに関する指標を提供する報告を生成する工程を含み得る。対象とする方法（または、報告モジュール）は、試験される個体がＩＰＦかどうか（およびIPFでない、例えば、IPF以外のILD；例えば、報告は、個体がIPFでありNSIPでないことを示し得る）に関する指標を提供する報告を生成する工程を含み得る。
【０１５０】
[00160]  いくつかの実施形態において、ＩＬＤを診断する対象とする方法は、報告を生成する（例えば報告モジュールを使用する）工程を含む。そのような報告は、患者がＩＬＤであるという尤度；患者が喫煙者であるという尤度；さらなる評価に関する勧告；治療薬および／またはデバイス介入に関する勧告；ならびに同種のものなどの情報を含むことができる。
【０１５１】
[00161]  例えば、本明細書に開示する方法は、対象とする診断方法の結果を提供する報告を生成するまたは出力する工程をさらに含むことができ、その報告は、電子媒体の形態（例えば、コンピュータモニタ上の電子表示）で、または有形媒体の形態（例えば、紙または他の有形の媒体に印刷された報告）で提供することができる。対象とする診断方法の結果に関する判定（例えば、個体がILDであるという尤度；個体がIPFであるという尤度；個体が喫煙者であるという尤度）は、「報告」または単純に「スコア」と称することができる。人または報告を作成する実体（「報告書作成プログラム」）は、サンプル収集、サンプル処理などの工程も遂行することができる。あるいは、報告書作成プログラム以外の実体が、サンプル収集、サンプル処理および同種のものなどの工程を遂行することもできる。診断判定報告を、利用者に提供することができる。「利用者」は、医療専門家（例えば、臨床医、実験室技術者、医師［例えば、心臓病専門医］、等）であることができる。
【０１５２】
[00162]  対象とする報告は：１）業務提供者情報；２）患者データ；３）所与の遺伝子産物もしくは遺伝子産物の組の発現レベル、スコアまたは分類器決定に関するデータ；４）追跡評価勧告；５）治療的介入または勧告；および６）他の特性のうち１つまたは複数をさらに含むことができる。
【０１５３】
さらなる評価
[00163]  所与の遺伝子産物もしくは遺伝子産物の組の発現レベルに基づいて、および／または報告（上述のとおり）に基づいて、医師もしくは他の資格のある医療関係者は、被験者（患者）のさらなる評価が必要かどうか決定することができる。さらなる評価には、例えば、肺活量測定があり得る。
【０１５４】
治療的介入
[00164]  所与の遺伝子産物もしくは遺伝子産物の組の発現レベルに基づいて、および／または報告（上述のとおり）に基づいて、医師もしくは他の資格のある医療関係者は、適当な治療的介入が助言されるかどうか決定することができる。
【０１５５】
[00165]  治療的介入には、薬物を使用する治療的介入、デバイスを使用する治療的介入および外科的介入がある。報告が、個体がＩＰＦであるという尤度を示す場合、薬物を使用する治療的介入には、例えば、個体への有効量のピルフェニドン、プレドニゾン、アザチオプリン、またはＮ−アセチルシステインの投与がある。外科的介入には、例えば、動脈バイパス手術がある。
【０１５６】
コンピュータで実装される方法、システムおよびデバイス
治療的介入
[00166]  本開示の方法は、方法工程（例えば、アッセイ、比較、算出、および同種のもの）が全てまたは部分的に自動化されるように、コンピュータで実装することができる。
【０１５７】
[00167]  したがって、本開示は、差異的診断を含めた間質性肺疾患の診断（例えば、IPF、NSIP、HP等の診断）を容易にするコンピュータで実装される方法に関連する方法、コンピュータシステム、デバイスおよび同種のものを提供する。
【０１５８】
[00168]  本開示は、喫煙者状態（例えば、喫煙者対非喫煙者）の決定を容易にするコンピュータで実装される方法に関連する方法、コンピュータシステム、デバイスおよび同種のものをさらに提供する。
【０１５９】
[00169]  本開示は、差異的診断を含めた間質性肺疾患の診断（例えば、IPF、NSIP、HP等の診断）を容易にするコンピュータで実装される方法に関連する方法、コンピュータシステム、デバイスおよび同種のものをさらに提供し、本方法は、対象の喫煙者状態（喫煙者対非喫煙者）を決定する工程と、喫煙者状態を対象の間質性肺疾患診断の決定に組み込む工程とをさらに含む。いくつかの実施形態において、（ｉ）トレーニング（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）中に使用されるモデルにおいて、喫煙者状態が、共変量として間質性肺疾患診断に組み込まれる。この手法は、特に喫煙者から得られたデータ（ノイズがより高い）においてシグナル対ノイズ比を向上させ、喫煙者および非喫煙者から得られるデータを組み合わせ、同時に使用可能にする。いくつかの実施形態において、（ｉｉ）間質性肺疾患の診断分類器トレーニングの間に喫煙者状態のバイアスの影響を受けやすい１つもしくは複数の遺伝子を同定し、そのような遺伝子を除外するまたは喫煙者状態の影響を受けにくい他の遺伝子と異なる重み付けをすることにより、喫煙者状態が間質性肺疾患診断に組み込まれる。いくつかの実施形態において、（ｉｉｉ）初期分類器が喫煙者を非喫煙者と区別する遺伝子シグネチャーを認識するためにトレーニングされる（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）段階的分類を構築することにより、喫煙者状態が、間質性肺疾患診断に組み込まれる。一旦患者サンプルが「喫煙者」または「非喫煙者」に前分類されたら（例えば前分類器分析モジュールを使用する）、喫煙者もしくは非喫煙者それぞれにおいてＵＩＰ対非ＵＩＰを区別するためにそれぞれトレーニングされた固有の分類器を実装して、間質性肺疾患を診断することができる。なおさらなる実施形態において、喫煙者状態を対象の間質性肺疾患診断の決定に組み込む工程を含む方法は、上記のような組み込み手段の１つまたは複数の組み合わせを含む（すなわち、直上の段落における実施形態（ｉ）〜（ｉｉｉ）の２つ以上の組み合わせ）。
【０１６０】
[0100]  例えば、バイオマーカーレベルの値を得る工程と、標準化したバイオマーカー（遺伝子）発現レベルを対照レベルと比較する工程と、ＩＬＤの尤度を算出する（および任意選択により対象が喫煙者であるという尤度）工程と、報告を生成する工程と、同種の工程を含めた方法工程は、コンピュータプログラム製品により完全にまたは部分的に遂行することができる。得られた値は、例えばデータベースに電子的に保存することができ、プログラムされたコンピュータにより実行される分類器に供する（例えば分類器分析モジュールを使用する）ことができる。
【０１６１】
[0101]  例えば、本開示の方法および／またはシステムは、バイオマーカーレベル（例えば、遺伝子産物の標準化した発現レベル）を分類器分析モジュールに入力して、方法および／またはプロセスを実行し、それにより本明細書に記載される比較および算出工程を遂行し、例えば、コンピュータに対して局所または遠隔位置にある出力デバイスへ報告を表示または印刷することにより本明細書に記載の報告を生成する（例えば報告モジュールを使用する）工程を含むことができる。報告への出力は、スコア（例えば、数値的スコア［数値の表記］）または非数値的スコア（例えば、数値または数値範囲の非数値的出力表記［例えば、「IPF」、「IPFの証拠がない」］）であることができる。他の態様において、出力は「ＵＩＰ」対「非ＵＩＰ」を示すことができる。他の態様において、出力は「喫煙者」対「非喫煙者」を示すことができる。
【０１６２】
[0102]  したがって、本開示は、保存されているソフトウェアおよび／またはハードウェアモジュールを有するコンピュータ読み込み可能な記憶媒体を含むコンピュータプログラム製品を提供する。ソフトウェアおよび／またはハードウェアモジュールは、処理装置により実行される場合、個体からの１つまたは複数の生体サンプル（例えば、肺組織サンプル）の分析から得られる値に基づいて関連する算出を実行することができる。コンピュータプログラム製品は、算出を遂行するためのコンピュータプログラムの中に保存した。
【０１６３】
[0103]  本開示は、上述したプログラムを実行するためのシステムを提供し、そのシステムは以下を一般に含む：ａ）ソフトウェアおよび／またはハードウェアモジュールを実行する中央コンピューティング環境または処理装置；ｂ）患者データを受信するためにコンピューティング環境に作動的に接続されており、患者データが、例えば上述のとおり、患者由来の生体サンプルを使用するアッセイから得られるバイオマーカーレベルまたは他の値を含むことができる入力デバイス；ｃ）利用者（例えば、医療関係者）に情報を提供するためにコンピューティング環境に接続されている出力デバイス；ならびにｄ）中央コンピューティング環境（例えば、処理装置）によって実行される方法および／またはプロセスであり、その方法および／またはプロセスが入力デバイスによって受信したデータに基づいて実行され、その方法および／またはプロセスが値を算出し、本明細書に記載のとおり、その値が、対象がＩＬＤであるという尤度の指標となる、方法および／またはプロセス。
【０１６４】
[0104]  本開示は、上述したプログラムを実行するためのシステムも提供し、そのシステムは以下を一般に含む：ａ）ソフトウェアおよび／またはハードウェアモジュールを実行する中央コンピューティング環境または処理装置；ｂ）患者データを受信するためにコンピューティング環境に作動的に接続されており、患者データが、例えば上述のとおり、患者由来の生体サンプルを使用するアッセイから得られるバイオマーカーレベルまたは他の値を含むことができる入力デバイス；ｃ）利用者（例えば、医療関係者）に情報を提供するためにコンピューティング環境に接続されている出力デバイス；ならびにｄ）中央コンピューティング環境（例えば、処理装置）によって実行される方法および／またはプロセスであり、その方法および／またはプロセスが入力デバイスによって受信したデータに基づいて実行され、その方法および／またはプロセスが値を算出し、本明細書に記載のとおり、その値が、対象がＩＬＤであるという尤度の指標となり、トレーニング中に使用されたモデルにおいて、その方法および／またはプロセスが、共変量として喫煙状態（喫煙者対非喫煙者）を使用する方法および／またはプロセス。いくつかの実施形態において、本方法および／またはプロセスは分類器トレーニングは、喫煙者状態のあバイアスの影響を受けやすい１つまたは複数の遺伝子を除外するかまたは異なる重み付けをして、トレーニングに使用される特性空間を、喫煙状態により混乱または影響を受けない遺伝子について濃縮する。
【０１６５】
[0105]  なおさらなる実施形態において、  本開示は、上述したプログラムを実行するためのシステムを提供し、そのシステムは以下を一般に含む：ａ）ソフトウェアおよび／またはハードウェアモジュールを実行する中央コンピューティング環境または処理装置；ｂ）患者データを受信するためにコンピューティング環境に作動的に接続されており、患者データが、例えば上述のとおり、患者由来の生体サンプルを使用するアッセイから得られるバイオマーカーレベルまたは他の値を含むことができる入力デバイス；ｃ）利用者（例えば、医療関係者）に情報を提供するためにコンピューティング環境に接続されている出力デバイス；ならびにｄ）中央コンピューティング環境（例えば、処理装置）によって実行される第１の方法および／またはプロセスであり、第１の方法および／またはプロセスが、入力デバイスによって受信したデータに基づいて実行され、第１の方法および／またはプロセスが値を算出し、本明細書に記載のとおり、その値が、対象が喫煙者または非喫煙者であるという尤度の指標となり、喫煙者または非喫煙者である対象の状態が第１の方法および／またはプロセスに喫煙者または非喫煙者それぞれにおいてＵＩＰ対非ＵＩＰを区別するために特にトレーニングされている（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）第２の方法および／またはプロセスを適用させる、第１の方法および／またはプロセス、ｅ）中央コンピューティング環境（例えば、処理装置）によって実行される第２の方法および／またはプロセスであり、第２の方法および／またはプロセスが入力デバイスによって受信したデータに基づいて実行され、第２の方法および／またはプロセスが値を算出し、本明細書に記載のとおり、その値が、対象がＩＬＤであるという尤度の指標となる方法および／またはプロセス。
【０１６６】
コンピュータシステム
[0106]  図７Ａは、バスもしくはバス群１１０によって接続されている少なくとも１つの処理装置１０２、または処理ユニットもしくは複数の処理装置、メモリ１０４、少なくとも１つの入力デバイス１０６および少なくとも１つの出力デバイス１０８を含む処理システム１００を例示する。処理システムは、例えば、ホストデバイス、パーソナルコンピュータ、携帯もしくはラップトップデバイス、パーソナル携帯情報機器、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサ型システム、プログラム可能な家電デバイス、ミニコンピュータ、サーバコンピュータ、ウェブサーバコンピュータ、メインフレームコンピュータなどの任意の適当なデバイス、および／または上記のシステムもしくはデバイスいずれかを含む分散型コンピューティング環境上で実装することができる。
【０１６７】
[0107]  特定の実施形態において、入力デバイス１０６および出力デバイス１０８は、同じデバイスであることができる。インターフェイス１１２はまた、１つまたは複数の周辺デバイスへ処理システム１００を接続するために提供でき、例えば、インターフェイス１１２は、ＰＣＩカードまたはＰＣカードであることができる。少なくとも１つのデータベース１１６を収容する少なくとも１つの記憶デバイス１１４を提供することもできる。
【０１６８】
[0108]  メモリ１０４は、任意の形態のメモリデバイス、例えば、揮発性または不揮発性メモリ、固体記憶デバイス、磁気デバイス等であることができる。例えば、いくつかの実施形態において、メモリ１０４は、ランダムアクセスメモリ（RAM）、メモリバッファ、ハードディスク、読出し専用メモリ（ROM）、消去可能プログラム可能読み取り専用メモリ（EPROM）、データベース、および／または同種のものであることができる。
【０１６９】
[0109]  処理装置１０２は、例えば処理システム１００内で異なる機能を扱うために２つ以上の固有の処理デバイスを含むことができる。処理装置１００は、汎用処理装置（GPP）、中央処理ユニット（CPU）、アクセラレーテッドプロセッシングユニット（APU）、グラフィックスプロセッサユニット（GPU）、特定用途向け集積回路（ASIC）、および／または同種のものなど１組の命令もしくはコード（例えば、メモリに保存されている）を走らせるもしくは実行するように構成されている任意の適当な処理デバイスであることができる。そのような処理装置１００は、パーソナルコンピュータアプリケーション、モバイルアプリケーション、インターネットウェブブラウザ、携帯および／または無線通信（ネットワークによる）および／または同種のものの使用と関連付けてメモリに保存されている１組の命令もしくはコードを走らせるもしくは実行することができる。より具体的には、処理装置は、本明細書に記載のとおり、データの分析および分類と関連付けてメモリ１０４に保存されている１組の命令またはコードを実行することができる。
【０１７０】
[0110]  入力デバイス１０６は、入力データ１１８を受信し、例えば、キーボード、ペン様デバイスもしくはマウスなどのポインタデバイス、マイクロホンなど音声制御起動用のオーディオ受信デバイス、モデムもしくは無線データアダプタなどのデータ受信装置もしくはアンテナ、データ収集カード等を含むことができる。入力データ１１８は、異なる供給源、例えばネットワークを介して受信したデータと組み合わせたキーボード命令によってもたらされ得る。
【０１７１】
[0111]  出力デバイス１０８は、出力データ１２０を作製または生成し、例えば、表示デバイスもしくはモニタ、その場合出力データ１２０は視覚的であり、プリンタ、その場合出力データ１２０は印刷され、ポート、例えばＵＳＢポート、周辺成分アダプタ、モデムもしくは無線ネットワークアダプタなどのデータ送信機もしくはアンテナ等を含むことができる。出力データ１２０は固有であり、異なる出力デバイスから得られ、例えばネットワークに送信されたデータと組み合わされたモニタ上の視覚的表示であることができる。利用者は、例えば、モニタ上でもしくはプリンタを使用することによりデータ出力、またはデータ出力の解釈を見ることができる。
【０１７２】
[0112]  いくつかの実施形態において、入力デバイス１０６および／または出力デバイス１０８は、ネットワークを介してデータを送信および／または受信するように構成されている通信インターフェイスであることができる。より具体的には、そのような実施形態において、処理システム１００は、１つまたは複数のクライアントデバイスに対するホストデバイスとして機能することができる（図７Ａには示さない）。したがって、処理システム１００は、クライアントデバイスへデータを送信し（例えば、出力データ１２０）、そこからデータを受信する（例えば、入力データ１１８）ことができる。そのような通信インターフェイスは、１つもしくは複数のネットワークインターフェイスカードまたは同種のものなど、処理システム１００をクライアントデバイスと通信させることができる任意の適当なモジュールおよび／またはデバイスであることができる。そのようなネットワークインターフェイスカードには、例えば、ネットワークを介してクライアントデバイス１５０をホストデバイス１１０と通信させることができるイーサネットポート、ＷｉＦｉ（登録商標）無線、ブルートゥース（登録商標）無線、近距離無線通信（NFC）、および／または携帯無線、または同種のものがあり得る。
【０１７３】
[0113]  記憶デバイス１１４は、データまたは情報記憶手段の任意の形態、例えば、揮発性もしくは不揮発性のメモリ、固体記憶デバイス、磁気デバイス等であることができる。例えば、いくつかの実施形態において、記憶デバイス１１４は、ランダムアクセスメモリ（RAM）、メモリバッファ、ハードドライブ、読出し専用メモリ（ROM）、消去可能プログラム可能読み取り専用メモリ（EPROM）、データベース、および／または同種のものであることができる。
【０１７４】
[0114]  使用にあたっては、処理システム１００は、有線もしくは無線通信手段を介してデータもしくは情報を少なくとも１つのデータベース１１６に保存するおよび／またはそこから取り出すことができるように構成される。インターフェイス１１２は、処理ユニット１０２と専門用途に使用できる周辺成分との間の有線および／または無線通信を可能にできる。一般に、処理装置１０２は、入力デバイス１０６を介して入力データ１１８として命令を受信することができ、出力デバイス１０８を利用することにより処理結果または他の出力を利用者に表示することができる。２つ以上の入力デバイス１０６および／または出力デバイス１０８を備えることができる。処理システム１００は、端末、サーバ、専用ハードウェア、または同種のものの任意の適当な形態であることができる。処理システム１００は、ネットワーク化された通信システムの一部であることができる。
【０１７５】
[0115]  処理システム１００は、ネットワーク、例えば、ローカルエリアネットワーク（LAN）、バーチャルローカルエリアネットワーク（VLAN）などの仮想ネットワーク、ワイドエリアネットワーク（WAN）、メトロポリタンエリアネットワーク（MAN）、ワールドワイドインターオペラビリティフォーマイクロウェーブアクセスネットワーク（WiMAX）、携帯型ネットワーク、インターネット、および／または有線および／または無線ネットワークとして実装される他の任意の適当なネットワークに接続することができる。例えば、ＬＡＮネットワーク環境において使用される場合、コンピューティングシステム環境１００は、ネットワークインターフェイスまたはアダプタを介してＬＡＮに接続される。ＷＡＮネットワーク環境において使用される場合、コンピューティングシステム環境は、モデム、またはインターネットなどＷＡＮを介して通信を確立するための他の手段を一般に含む。内部または外部的であり得るモデムは、利用者入力インターフェイスもしくは別の適当な機序を介してシステムバスに接続することができる。ネットワーク化環境において、コンピューティングシステム環境１００、またはその部分と関連して表わされるプログラムモジュールは、遠隔メモリ記憶デバイスに保存できる。図７の例示されたネットワーク接続は例であり、複数のコンピュータ間の通信リンクを確立する他の手段を使用できることが認められる。
【０１７６】
[0116]  入力データ１１８および出力データ１２０は、ネットワークを介して他のデバイスと通信することができる。ネットワークを介する情報および／またはデータの転送は、有線通信手段もしくは無線通信手段を使用して実現することができる。サーバは、ネットワークと１つまたは複数のデータベースの間のデータ転送を容易にすることができる。サーバおよび１つまたは複数のデータベースは、情報源の一例を提供する。
【０１７７】
[0117]  したがって、図７Ａに例示される処理コンピューティングシステム環境１００は、１つまたは複数の遠隔コンピュータへの論理的接続を使用するネットワーク化環境において操作することができる。遠隔コンピュータは、パーソナルコンピュータ、サーバ、ルータ、ネットワークＰＣ、ピアデバイスもしくは他の一般的なネットワークノードであることができ、上述した要素の多くまたは全てを一般に含む。
【０１７８】
[0118]  図７Ｂは、より詳細に図７Ａの処理装置１０２を例示する。処理装置１０２は、特定のモジュールを実行するように構成することができる。モジュールは、例えば、ハードウェアモジュール、メモリ１０４に保存されているおよび／または処理装置１０２において実行されるソフトウェアモジュール、および／またはその任意の組み合わせであることができる。例えば、図７Ｂに示すように、処理装置１０２は、前分類器分析モジュール１３０、分類器トレーニングモジュール１３２、分類器分析モジュール１３４および報告モジュール１３６を含むおよび／または実行する。図７Ｂに示すように、前分類器分析モジュール１３０、分類器トレーニングモジュール１３２、分類器分析モジュール１３４および報告モジュール１３６を接続し、および／または電気的に結合させることができる。このように、信号を、前分類器分析モジュール１３０、分類器トレーニングモジュール１３２、分類器分析モジュール１３４および報告モジュール１３６の間で送信することができる。
【０１７９】
[0119]  分類器トレーニングモジュール１３２は、データのコーパス（例えば遺伝子発現データ、配列決定データ）を受信し、分類器をトレーニングするように構成することができる。例えば、ＵＩＰおよび非ＵＩＰとして以前に同定された（例えば、専門家による）サンプルからの臨床注釈データを、入力デバイス１０６によって受信し、分類器トレーニングモジュール１３２で使用してＵＩＰならびに非ＵＩＰとして以前に同定されたサンプル間の相関を同定することができる。例えば、専門家のＴＢＢ組織病理ラベル（すなわち、ＵＩＰまたは非ＵＩＰ）、専門家のＨＲＣＴラベル、および／または専門家の患者レベルの臨床結末ラベルを得て、単独もしくは組み合わせて使用して、マイクロアレイおよび／または配列決定データを使用して分類器をトレーニングすることができる。使用した特性空間は、遺伝子発現、バリアント、突然変異、融合、ヘテロ接合性の喪失（LOH）、生物学的経路効果および／または機械学習アルゴリズムをトレーニングするための特性として抽出することができる他の任意の次元のデータを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＵＩＰ対非ＵＩＰ分類器、喫煙者対非喫煙者分類器、またはＵＩＰ対非ＵＩＰおよび喫煙者対非喫煙者分類器をトレーニングするために使用した特性空間は、遺伝子発現、バリアント、突然変異、融合、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）ならびに生物学的経路効果を含む。いくつかの実施形態において、ＵＩＰ対非ＵＩＰ分類器、喫煙者対非喫煙者分類器、またはＵＩＰ対非ＵＩＰおよび喫煙者対非喫煙者分類器をトレーニングするために使用した特性空間は、遺伝子発現ならびにバリアント次元を含む。
【０１８０】
[0120]  いくつかの実施形態において、分類器トレーニングモジュール１３２は、受信したサンプルが喫煙者または非喫煙者と関連するかどうかと関連付けられた指標に基づいて喫煙者分類器および非喫煙者分類器をトレーニングすることができる。他の実施形態において、喫煙者／非喫煙者を、特質（モデル共変量）として使用して、単一の分類器をトレーニングすることができる。分類器がトレーニングされた後、それを使用して、本明細書に記載の新しく受信した不明なサンプルを同定および／または分類することができる。
【０１８１】
[0121]  前分類器分析モジュール１３０は、サンプルが喫煙者または非喫煙者と関連するかどうか同定することができる。具体的には、前分類器分析モジュール１３０は、任意の適切な方法を使用して、喫煙する（または、大量喫煙歴がある）個体対喫煙しない（または、喫煙歴がない）個体に由来するサンプルを同定および／または分類することができる。分類は、利用者からの指標の受信、喫煙者状態のバイアスの影響を受けやすい遺伝子の同定、機械学習分類器の使用など任意の適当な方式、および／または本明細書に記載される他の任意の適当な方法で行うことができる。
【０１８２】
[0122]  分類器分析モジュール１３４は、サンプルを分類器へ入力して、ＵＩＰおよび非ＵＩＰと関連付けるように受信したサンプルを同定および／または分類することができる。具体的には、分類器分析モジュール１３４は、トレーニングされた分類器を使用して、サンプルがＵＩＰまたは非ＵＩＰを示すかどうか同定することができる。いくつかの実施形態において、分類器分析モジュール１３４は、ＵＩＰまたは非ＵＩＰと関連付けられるサンプルのパーセンテージもしくは信頼スコアを示すことができる。いくつかの実施形態において、分類器分析モジュール１３４は、２つの別々の分類器：一方は喫煙者サンプル用、他方は非喫煙者サンプル用（前分類器分析モジュール１３０で決定される）を実行することができる。他の実施形態において、単一の分類器が、喫煙者状態の入力とともに喫煙者および非喫煙者サンプルの両方に対して実行される。
【０１８３】
[0123]  報告モジュール１３６は、本明細書でさらに詳細に記載される分類器分析モジュール１３４の結末に基づいて任意の適当な報告を生成するように構成することができる。いくつかの場合において、報告は、差異的に発現している遺伝子の数、元サンプルの適合性、差異的選択的スプライシングを示す遺伝子の数、診断、診断の統計的信頼、対象が喫煙者である尤度、ＩＬＤの尤度、および指示した療法の１つまたは複数などの情報を含み得るが、これに限定されない。
【０１８４】
[0124]  図７Ｃは、本発明の１つの非限定的な実施形態のフローチャートを例示し、公知のＵＩＰおよび非ＵＩＰサンプルに対する遺伝子産物発現データを使用して分類器をトレーニングし（例えば分類器トレーニングモジュールを使用する）、それによりＵＩＰ対非ＵＩＰを識別し、任意選択により分類器は喫煙者状態を共変と見なし、未知のサンプル由来の遺伝子産物発現データをトレーニングされた分類器に入力して、未知のサンプルをＵＩＰまたは非ＵＩＰのいずれかに同定し、分類器による分類の結果を定義し、報告によって出力する。
【０１８５】
[0125]  特定の実施形態は、図７Ａのコンピューティングシステム環境１００など１つまたは複数のコンピューティングデバイスにより遂行される操作の行為および象徴的表現を参照して記述され得る。このように、コンピュータで実行されると時々称されるそのような行為および操作が、構造形態でデータを表す電気信号の、コンピュータの処理装置による扱いを含むことは理解されよう。この扱いは、データを変換するまたはデータをコンピュータのメモリシステム内の場所に維持し、当業技術者に理解される方式でコンピュータの操作を再構成する、さもなければ改変する。データが維持されるデータ構造は、データの形式によって定義される特定の特性を有するメモリの物理的な位置である。しかしながら、実施形態が前の文脈に記述されているが、当業者が、以下に記述される行為および操作もハードウェアにおいて実装できることを認めることになると限定するものではない。
【０１８６】
[0126]  実施形態は、他の多くの汎用または特殊用途のコンピューティングデバイスおよびコンピューティングシステム環境もしくは構成で実装され得る。実施形態での使用に適し得る他のコンピューティングシステム、環境および構成の例には、パーソナルコンピュータ、携帯もしくはラップトップデバイス、パーソナル携帯情報機器、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサ型システム、プログラム可能な家電、ネットワーク、ミニコンピュータ、サーバコンピュータ、ウェブサーバコンピュータ、メインフレームコンピュータ、および上記システムまたはデバイスのいずれかを含む分散型コンピューティング環境があるが、これに限定されない。
【０１８７】
[0127]  実施形態は、ハードウェアおよび／またはソフトウェアモジュールなど、コンピュータ実行可能な命令の一般的な文脈で記述できる。実施形態は、作業が通信ネットワークを介して連結されている遠隔処理デバイスによって遂行される分散型コンピューティング環境において実施することもできる。分散型コンピューティング環境において、プログラムモジュールは、メモリ記憶デバイスを含めた局所および遠隔コンピュータ記憶媒体の両方に位置することができる。
【０１８８】
コンピュータプログラム製品
[0128]  本開示は、図７を参照して上述されるそれなどプログラム可能なコンピュータにおいて実行される場合に本開示の方法を実施することができるコンピュータプログラム製品を提供する。前述のとおり、本明細書に記載される主題は、所望の構成に応じてシステム、装置、方法、および／または物品で具現され得る。これらの様々な実装は、特殊もしくは汎用であることができ、記憶システムからデータおよび命令を受信し、そこへデータおよび命令を伝達するために接続されている少なくとも１つのプログラム可能な処理装置、少なくとも１つの入力デバイス（例えばビデオカメラ、マイクロホン、ジョイスティック、キーボード、および／またはマウス）、および少なくとも１つの出力デバイス（例えば表示モニタ、プリンタ等）を含むプログラム可能なシステム上で実行および／または解釈可能な１つもしくは複数のコンピュータプログラムにおける実装を含むことができる。
【０１８９】
[0129]  コンピュータプログラム（別名プログラム、ソフトウェア、ソフトウェアアプリケーション、アプリケーション、コンポーネント、またはコード）は、プログラム可能な処理装置のための命令を含み、高レベルの手順および／またはオブジェクト指向のプログラミング言語、および／またはアセンブリ／機械言語で実装され得る。本明細書では、用語「機械読み込み可能な媒体」とは、機械読み込み可能な信号として機械命令を受信する機械読み込み可能な媒体を含め、プログラム可能な処理装置に機械命令および／またはデータを提供するために使用される任意のコンピュータプログラム製品、装置および／またはデバイス（例えば、磁気ディスク、光ディスク、メモリ等）のことを指す。
【０１９０】
[0130]  本開示の態様が、ソフトウェア、ハードウェア、ファームウェア、またはその任意の組み合わせにおいて少なくとも一部具現され得ることはこの説明から明らかになる。したがって、本明細書に記載される技術は、ハードウェア回路および／またはソフトウェアのどんな特定の組み合わせにも、またはコンピュータもしくは他のデータ処理システムにより実行される命令に対するどんな特定の供給源にも限定されない。むしろ、これらの技術は、任意の型のＲＯＭ、ＲＡＭ、キャッシュメモリ、ネットワークメモリ、フロッピーディスク、ハードドライブディスク（HDD）、固体デバイス（SSD）、光ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、および磁気−光ディスク、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリ、または電子形式で命令を保存するのに適当な他の任意の型の媒体を含めたメモリもしくは他のコンピュータ読み込み可能な媒体に保存されている命令のシーケンスを実行するマイクロプロセッサなど、１つもしくは複数の処理装置に応答してコンピュータシステムもしくは他のデータ処理システムにおいて実施され得る。
【０１９１】
[0131]  加えて、処理装置は、１つもしくは複数のプログラム可能な汎用もしくは特殊用途マイクロプロセッサ、デジタル信号プロセッサ（DSP）、プログラム可能コントローラー、特定用途向け集積回路（ASIC）、プログラム可能論理デバイス（PLD）、トラステッドプラットフォームモジュール（TPM）、もしくは同種のもの、もしくはそのようなデバイスの組み合わせであることができる、またはそれらを含むことができる。別の実施形態において、論理回路または他のハードウェアに組み込まれた回路などの特殊用途ハードウェアを、ソフトウェア命令と組み合わせて使用して、本明細書に記載される技術を実装することができる。
【０１９２】
アレイおよびキット
[0132]  本開示は、対象評価方法または対照診断方法を実施するのに使用するアレイおよびキットを提供する。
【０１９３】
アレイ
[0133]  対象アレイは、複数の核酸を含むことができ、それのそれぞれは、ＩＬＤについて試験された個体から得られる組織サンプルに存在する細胞において差異的に発現される遺伝子にハイブリダイズする。
【０１９４】
[0134]  対象アレイは、複数の核酸を含むことができ、それのそれぞれは、喫煙者状態について試験された個体から得られる組織サンプルに存在する細胞において差異的に発現される遺伝子にハイブリダイズする。
【０１９５】
[0135]  対象アレイは、複数の核酸を含むことができ、それのそれぞれは、喫煙者状態およびＩＬＤ両方について試験された個体から得られる組織サンプルに存在する細胞において差異的に発現される遺伝子にハイブリダイズする。
【０１９６】
[0136]  対象アレイは、複数のメンバーの核酸を含むことができ、そのメンバー核酸のそれぞれが、異なる遺伝子産物にハイブリダイズする。いくつかの場合において、２つ以上のメンバー核酸が、同じ遺伝子産物にハイブリダイズする；例えば、いくつかの例において２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはより多くのメンバー核酸が、同じ遺伝子産物にハイブリダイズする。メンバー核酸は、約５ヌクレオチド（nt）〜約１００ｎｔ、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７  １８、１９、２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、または９０〜１００ｎｔの長さを有することができる。核酸は、１つまたは複数のリン酸骨格修飾を有することができる。
【０１９７】
[0137]  対象アレイは、約１０〜約１０５個の固有のメンバー核酸、または１０５個より多くの固有のメンバー核酸を含むことができる。例えば、対象アレイは、約１０〜約１０２、約１０２〜約１０３、約１０３〜約１０４、約１０４〜約１０５、または１０５個より多くの固有のメンバー核酸を含むことができる。
【０１９８】
省略形
【０１９９】
【表Ａ−１】
2018504138.tif 000002
【０２００】
【表Ａ−２】
2018504138.tif 000003
【０２０１】
[0138]  「ＥＮＳＥＭＢＬ  ＩＤ」とは、Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒデータベースの遺伝子識別子番号のことを指す（ワールドワイドウェブアドレス：ensembl.org/index.htmlを参照のこと、本明細書に組み込む）。各識別子は、「Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｇｅｎｅ」を意味するために、文字ＥＮＳＧで始まる。各ＥＮＳＥＭＢＬ  ＩＤ番号（すなわち、Ensemblデータベース中の各「遺伝子」）とは、特定のヒト染色体上の特定の開始および停止位置により定義される遺伝子のことを指し、したがってヒトゲノムの特定の座を定義する。平均的な当業者が十分に認めるように、本明細書に開示される遺伝子記号の全ては、遺伝子配列のことを指し、一般公開されているデータベース、例えば、ＵｎｉＧｅｎｅデータベース（The NCBIハンドブック、Bethesda（MD）：米国バイオテクノロジー情報センター；２００３年中にある、Pontius JU, Wagner L, Schuler GD. UniGene：a unified view of the transcriptome. 、ワールドワイドウェブアドレスncbi.nlm.nih.gov/unigeneで利用可能、本明細書に組み込む）、ＲｅｆＳｅｑ（The NCBIハンドブック［インターネット］、Bethesda （MD）: 国立医学図書館（US）、米国バイオテクノロジー情報センター；２００２年１０月、第１８章、参照配列（RefSeq）プロジェクトワールドワイドウェブアドレス：ncbi.nlm.nih.gov/refseq/で利用可能、本明細書に組み込む）、Ｅｎｓｅｍｂｌ（EMBL、ワールドワイドウェブアドレス：ensembl.org/index.htmlで利用可能、本明細書に組み込む）、および同種のものですぐに利用できる。遺伝子記号、Ｅｎｓｅｍｂｌ  ＩＤおよびＥｎｔｒｅｚ  ＩＤによって本明細書に開示される遺伝子の配列は、その全体を本明細書に組み込む。
【０２０２】
[0139]  本明細書に引用される参照、特許および特許出願の全ては、全ての目的のためにその全体を組み込む。
【実施例】
【０２０３】
実施例１
サンプル採集、病理学診断およびラベル
[0140]  ビデオ支援胸腔鏡下手術（VATS）標本を、Ｖｅｒａｃｙｔｅ社（South San Francisco、CA）の後援のもとに、施設内倫理委員会（IRB）に承認された進行中の多施設共同臨床手順、新規のゲノム試験（BRAVE）用の気管支サンプル採集の一部としてあらかじめ採取した。さらなるＶＡＴＳおよび外科的肺生検標本を、保存供給源から得た。
【０２０４】
[0141]  手術後に、組織検査スライドを採取し、非特定化し、専門家の病理学審査に提出した。選択したスライドをスキャンして、顕微鏡画像の永久デジタルファイルを構築した（Aperio、Vista、CA）。スライドを、図５に記述される中央病理診断プロセスにしたがって評価し、サンプルレベルおよび患者レベル両方の病理学診断を得た。病理学区分を、表３に要約する。患者は、２つ以上のサンプルレベル診断（すなわち患者当たりVATSサンプル当たり１つ、ほとんどの場合右肺の下葉および上葉のそれぞれから１つ）を有し得るが、１つの患者レベル診断しか有し得ない。
【０２０５】
【表Ｂ】
2018504138.tif 000004
【０２０６】
[0143]  大部分の診断用語は、米国胸部学会（ATS）２０１１年または２０１３年ガイドライン５、６に従うが、葉レベルで特性をよりよく特徴付けるために専門の病理学者委員会によりいくつかの変更を行った。特に、「典型的なＵＩＰ」および「困難なＵＩＰ」を、ＡＴＳ  ２０１１年ガイドラインに記載の「明確なＵＩＰ」ならびに「可能性のあるＵＩＰ」の代わりに含めた。分類されていない慢性間質性線維症（CIF/NOC）は、分類不能な線維性ＩＬＤに対応する。ＣＩＦ／ＮＯＣの３つのサブカテゴリ、「有利なＵＩＰ」、「有利なＮＳＩＰ」および「有利なＨＰ」を定義して、専門家の病理学委員会の判断においてＵＩＰ、非特異的間質性肺炎（NSIP）、または過敏性肺炎（HP）を示唆する特性を呈する分類不能な線維形成の症例を指定した。喫煙関連間質性線維症（SRIF）の診断も含める２０。
【０２０７】
[0144]  分類のために、サンプルレベル病理学診断を、２成分クラスラベル（UIPおよび非UIP）に変換した。病理学診断区分（表３）の中で、「ＵＩＰ」クラスは、（１）ＵＩＰ、（２）典型的なＵＩＰ、（３）困難なＵＩＰ、および（４）ＣＩＦ／ＮＯＣ、有利なＵＩＰを含む。診断不能（ND）以外の他の全ての病理学診断を、「非ＵＩＰ」クラスに割り当てた。
【０２０８】
実施例２
サンプル処理
[0145]  凍結組織サンプルを、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  Ｏ．Ｃ．Ｔ．媒体（Sakura Finetek U.S.A.）を使用して切片作製のために封入し、ＣＭ１８００クリオスタット（Leica Biosystems、Buffalo Grove、Illinois）を使用して２×２０μｍ切片を生成した。組織カールを、ＲＮＡｐｒｏｔｅｃｔ（QIAGEN、Valencia、California）に直ちに浸漬し、４℃で終夜インキュベートし、抽出まで−８０℃で保存した。可能な場合はいつでも、隣接する５μｍ組織カールをスライドガラスへ封入し、標準的な手順にしたがってヘマトキシリンエオジン（H&E）染色用に処理した。
【０２０９】
[0146]  核酸を、製造業者のガイドラインにしたがってＡｌｌＰｒｅｐ  Ｍｉｃｒｏキット（QIAGEN）を使用して抽出した。トータルＲＮＡの収量および品質を、Ｑｕａｎｔ−ｉｔ（Invitrogen）ならびにＰｉｃｏ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒキット（Agilent）を使用して決定した。トータルＲＮＡ  １５ｎｇを、製造業者の手順にしたがってＯｖａｔｉｏｎ  ＦＦＰＥ  ＷＴＡ  Ｓｙｓｔｅｍ（NuGEN、San Carlos、California）を使用して増幅し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｇｅｎｅ  ＳＴ  １．０（Affymetrix、Santa Clara、California）マイクロアレイにハイブリダイズさせ、処理し、スキャンした。発現データを、ロバストマルチアレイ平均法（RMA）により標準化した。
【０２１０】
実施例３
次世代ＲＮＡ配列決定
[0147]  全トランスクリプトームＲＮＡ配列決定を、サンプル当たり８０００００００個のペアエンドリードの目標最小リード深度で、選択したサンプルに対して遂行した。簡潔には、製造業者の命令にしたがってトータルＲＮＡ  １０ｎｇを、Ｏｖａｔｉｏｎ  ＲＮＡＳｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｖ２（NuGEN、San Carlos、California）を使用して増幅し、ＴｒｕＳｅｑ（Illumina、San Diego、California）配列決定ライブラリを調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑで配列決定した。生のリードを、ＴｏｐＨａｔ２を使用してｈｇ１９ゲノムアセンブリにアラインした。遺伝子カウントを、ＨＴＳｅｑを使用して得て、ＤＥＳｅｑ２パッケージ内のｖａｒｉａｎｃｅＳｔａｂｉｌｉｚｉｎｇＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ機能を使用してＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒで標準化した。生カウントおよび標準化した発現レベルを、５５０９７個の転写産物について得た。
【０２１１】
実施例４
コホート選択および分類器トレーニング
[0148]  研究コホートは、保存された（n=128）およびあらかじめ採集したＢＲＡＶＥ（n=38）組織の両方を最初に含んだ。Ｈ＆Ｅ染色に対して細胞性が乏しい（１名の患者からn=4）または正常肺組織所見（n=1）を持つ保存サンプルは、「分類不能な線維性ＩＬＤ」、すなわちＣＩＦ／ＮＯＣと診断されたサンプル（n=3）もしくは少なくとも２名の病理学者により病理学的合意がなかったサンプル（n=29）なので、除外された。ＢＲＡＶＥサンプルの場合、ＣＩＦ／ＮＯＣサンプルを除外しなかった。中央病理診断を逃したため、１つだけ、ＢＲＡＶＥコホートサンプルを削除した。残留ゲノムＤＮＡ汚染がある処理したＲＮＡサンプル（n=2）または低品質ＲＮＡ（RNAインテグリティナンバー［RIN］<4）（n=1）も、除外した。全てを除外した後、８６名の患者からの１２５個のサンプルが、分類用として残った。含まれる患者の年齢、性別、喫煙歴および病理学診断を、表１に要約する。
【０２１２】
【表Ｃ】
2018504138.tif 000005
【０２１３】
[0150]  １２５個のサンプル（８６名の患者）が、マイクロアレイ分類に利用可能であった。患者レベル病理学サブタイプの偏りを制御しながら、８６名の患者をトレーニングおよびテストセットにランダム化した（表１）。マイクロアレイトレーニングセットは、５４名の患者由来の７７個のサンプル（UIP  39個および非UIP  38個）からなる。マイクロアレイテストセットは、３２名の患者由来の４８個のサンプル（UIP  22個対非UIP  26個）からなる。
【０２１４】
[0151]  ＲＮＡＳｅｑデータを、２９名の患者（表１）由来の３６個のサンプルのサブセット（UIP  17個および非UIP  19個）について生成し、ＩＬＤサブタイプの範囲を表した。３６個のサンプルの中で、２２個がマイクロアレイトレーニングセットと重なり、１４個がマイクロアレイテストセットと重なる。このデータセットのサンプルサイズが小さいため、分類能力を、交差検定（CV）だけで評価した。
【０２１５】
実施例５
トレーニングモデル、分類、特性選択
[0152]  全ての統計分析を、Ｒ  ３．０．１２１版を使用して実施した。マイクロアレイ分類器の場合、ＵＩＰと非ＵＩＰクラスの間で差異的に発現している遺伝子を、ｌｉｍｍａにより順位付けし、次いで最も低い偽発見率（FDR）（<0.0003）を持つ上位２００個の遺伝子を、モデル構築の候補遺伝子として先に進めた。いくつかのモデルを、異なる方法を使用して構築し、誤りが最も低いものを選んだ。特性選択およびモデル推定は、ｇｌｍｎｅｔを使用してｌａｓｓｏペナルティを用いるロジスティック回帰により遂行した。ＲＮＡＳｅｑ分類器の場合、遺伝子を、生カウントデータに対してＤＥＳｅｑ２パッケージで実装されるワルドスタイル検定から得られるＦＤＲにより順位付けした。上位の特性（Ｎは、10〜200の範囲にある）を使用して、標準化した発現データに対してｅ１０７１ライブラリを使用する線形サポートベクターマシン（SVM）をトレーニングした。
【０２１６】
[0153]  分類器能力をＣＶにより評価し、利用可能な場合、独立したテストセットによって評価した。過剰当てはめを最小化するために、トレーニング／テストセットおよびＣＶパーティションを定義する際に、単一の患者を最小単位として維持した；すなわち、同じ患者のものであるサンプル全てを、トレーニング／テストセットまたはＣＶパーティションにおいて１群としてまとめた。使用したＣＶ方法は、リーブワンペイシェントアウト（LOPO）および１０倍の患者レベルＣＶを含む。
【０２１７】
[0154]  能力を、所与のスコア閾値での曲線下面積（AUC）、ならびに特異性（1.0−偽陽性率）および感度（1.0−偽陰性率）として報告した。少なくとも＞９０％の特異性を必要とするようにスコア閾値を設定した。各能力測定について、９５％信頼区間を、２０００層化ブートストラップ再標本化およびｐＲＯＣパッケージを使用して計算し、［上下ＣＩ］として報告した。
【０２１８】
実施例６
外植された肺からのサンプリングにおける空間的不均質性
[0155]  ３名の正常肺ドナー（n=7）およびＩＰＦと診断された患者由来の３つの肺（n=53）からの合計６０個のサンプリングを、ゲノム規模でのマイクロアレイデータを使用して分析した。移植手順の間に得られた完全に正常なおよび疾患のある肺を、Ｉｎｏｖａ  Ｆａｉｒｆａｘ、Ｆａｌｌｓ  Ｃｈｕｒｃｈ、Ｖｅｒｇｉｎｉａの施設内倫理委員会（IRB）により承認された手順にしたがって採取した。３名の正常ドナーならびにＩＰＦと診断された３名の患者由来の外植された肺の上下葉を、中央および周辺でサンプル採取した。外植体サンプルの位置および数を、図６に例示する。外科病理学および最終的な臨床診断は、発信機関により提供された。３名の専門の病理学者による病理学オーバーリードは、３つ全てのＩＰＦ患者外植肺におけるＵＩＰを全員一致で確認した。
【０２１９】
[0156]  遺伝子発現を、７つの正常および５３個のＩＰＦの外植肺サンプルで評価した。正常とＩＰＦ患者外植サンプルの間で差異的に発現している遺伝子を同定し、Ｒ  ｌｉｍｍａパッケージ（Smyth, G. K.［2005］）を使用して偽発見率（FDR）により順位付けした。マイクロアレイトレーニングセットにおいてＵＩＰと非ＵＩＰクラスの間で差異的に発現している上位２００個の遺伝子を表１２に示す。最低のＦＤＲ調整済Ｐ値（<1.45e-07）を持つ上位２００個の遺伝子を使用して、５３個のＵＩＰサンプル全ての対についてピアソン相関係数を算出した。
【０２２０】
【表Ｄ−１】
2018504138.tif 000006
【０２２１】
【表Ｄ−２】
2018504138.tif 000007
【０２２２】
【表Ｄ−３】
2018504138.tif 000008
【０２２３】
【表Ｄ−４】
2018504138.tif 000009
【０２２４】
【表Ｄ−５】
2018504138.tif 000010
【０２２５】
[0158]  サンプリングの数および位置（上対下および中央対周辺）を図６に、ＩＰＦ患者の臨床的特徴を表４に示す。空間的不均質性を測定するのに有用な遺伝子を同定するために、正常対ＩＰＦサンプルにおいて差異的発現を探した。この比較は、約５０００個のＦＤＲ＜０．０５で有意に差異的に発現しているＲＮＡ転写産物を作製した（データ不掲載）。上位２００個の差異的に発現している遺伝子を選択し、ペアワイズ相関を測定した。ＩＰＦと診断された３名の患者の結果を、図１に示す。全てのＩＰＦサンプル全体にわたって相関が高いにもかかわらず、３つの固有のパターンが、ＩＰＦサンプルの間の相関構造において明らかになる。ある患者（P1）は、上葉対下葉の遺伝子発現において大きな差異、すなわち遺伝子信号における低い相関を示す。ある患者（P3）は、上葉と下葉サンプリングの間でより高い相関を示す。第３の患者（P2）は、これら２つの症例間で中間の結果を示し、上葉および下葉からのサンプリングの間に時にはより高く、時にはより低い相関がある。少数の患者に関してであるとはいえ、これらの結果は、葉特異的病理学を持つサンプルが、分類器開発のトレーニング段階においてより正確であり得ることを示唆する。この情報に基づいて、葉由来病理学を使用して、サンプルレベルで割り当てた真のラベルを持つＳＬＢ組織を使用して分類器を調製した。実施例７に提示する結果は、高い期待精度でＵＩＰおよび非ＵＩＰサンプルを分類するＳＬＢ組織における分子シグネチャーの存在を実証する。
【０２２６】
【表Ｅ】
2018504138.tif 000011
【０２２７】
実施例７
外科的肺生検に対するマイクロアレイ分類器の能力
[0160]  ＶＡＴＳ中に得られた生検に対するサンプル特異的病理学ラベルを使用して、マイクロアレイ分類器を、ＵＩＰおよび非ＵＩＰサンプルを分離している上位２００個の遺伝子に対するロジスティック回帰によりトレーニングした（表１２を参照のこと）。最終的なモデルを、２２個の遺伝子で構築した（表５）。
【０２２８】
[0161]  発現データを、ロバストマルチアレイ平均法（RMA）により標準化した。特性選択およびモデル推定は、ｇｌｍｎｅｔ３を使用してｌａｓｓｏペナルティを用いるロジスティック回帰により遂行した。生のリードは、ＴｏｐＨａｔを使用してアラインした。遺伝子数は、ＨＴＳｅｑを使用して得て、ＤＥＳｅｑを使用して標準化した。上位の特性（Ｎは、10〜200の範囲にある）を使用して、ｅ１０７１ライブラリを使用する線形サポートベクターマシン（SVM）をトレーニングした。信頼区間は、ｐＲＯＣパッケージを使用して計算した。
【０２２９】
[0162]  ＬＯＰＯ  ＣＶ能力を、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線として要約する（図２Ａ）。ＡＵＣは０．９[CI 0.82〜0.96]であり、特異性９２％[CI 84%〜100%]および感度６４％[CI 49%〜79%]である。個々のＬＯＰＯ  ＣＶ分類スコアを、全ての患者について示す（図２Ｂ）。３つの誤分類された非ＵＩＰサンプルの中で、２つは閾値に非常に近いスコア（0.86および1.30）を有し、１つは高いスコア（4.21）を有する。高いスコアを持つ後者のサンプルは、サンプルレベルおよび患者レベル両方で「分類不能な線維性ＩＬＤ」と診断された。ＵＩＰサンプルの中で、１５個（36%）が閾値以下のスコアである（偽陰性）が、それらサンプルのいずれも大きな陰性スコアではない。特定の場合においてＬＯＰＯ  ＣＶは、能力を過大評価する潜在性を有するので、非常によく似た能力（５回反復した１０倍ＣＶのＡＵＣ中央値が、０．８８である）を与える１０倍の患者レベルＣＶ（すなわち、患者の１０％が、各ループにおいて除外される）も評価した。
【０２３０】
【表Ｆ】
2018504138.tif 000012
【０２３１】
[0164]  省略形：ＴＣＩＤ＝転写産物クラスター識別；記号＝遺伝子記号；ｌｏｇＦＣ＝ログ倍率変化；ＭｅｄＥｘｐｒ．ＵＩＰ＝ＵＩＰサンプルの全体にわたる発現レベルの中央値；ＭｅｄＥｘｐｒ．Ｎｏｎ  ＵＩＰ＝ＵＩＰサンプルの全体にわたる発現レベルの中央値；ＦＤＲ＝偽発見率；
【０２３２】
[0165]  独立したテストセット能力を図２Ｃに示し、ＡＵＣ  ０．９４[CI 0.86〜0.99]の、特異性９２％[CI 81%〜100%]および感度８２％[CI 64%〜95%]を示す。個々の分類スコア分布は、ＵＩＰと非ＵＩＰクラスの間の良好な分離を示す（図２Ｄ）。誤分類された２つの非ＵＩＰサンプルは、診断において不確定度を示す「分類不能な線維性ＩＬＤ」の専門家の診断を、患者レベルおよびサンプルレベルの両方で有する。恐らく一連のサブ分類器を各ＣＶループ内に適用することに固有である一層大きな変動のため、単一モデルを適用することにより得られるスコアと比較して、テストセットにおいて観察されるスコア範囲（図２Ｄ）は、ＬＯＰＯ  ＣＶスコアにおいて見られる範囲（図２Ｂ）より狭い。９５％信頼区間を含む分類能力を、表６に要約する。
【０２３３】
【表Ｇ】
2018504138.tif 000013
【０２３４】
[0167]  我々の手法は、有意な利点を提供する。初期の遺伝子発現プロファイリング研究は、ＩＰＦ対ＨＰもしくはＮＳＩＰなどいくつかの非ＩＰＦ  ＩＬＤサブタイプ、またはＩＬＤではない対象に対する比較に重点を置いた１８，１９，２３，２５。ここで報告される非ＵＩＰコホートは、ＨＰ、ＮＳＩＰ、サルコイドーシス、ＲＢ、細気管支炎、器質化肺炎（OP）、その他を含む広い範囲の病理学サブタイプを表し、したがって診療において直面するＩＬＤの多様性に近い。加えて、分類器を、保存したおよびあらかじめ採集したＳＬＢの組み合わせを使用してトレーニングならびに試験して、サンプルの取り扱いおよび採集における潜在的差異に対する頑健性を確実にした。最終的に、初期の多くの研究は、分類エンジンを構築することなく、差異的遺伝子発現分析だけに重点を置いた。それに対し、本手法は、適切にトレーニングされ、検証された場合、独立したデータセットに対してよく一般化された分子試験を開発する厳密な方法である。
【０２３５】
実施例８
外科的肺生検に対するＲＮＡＳｅｑ分類器の能力
[0168]  ＲＮＡＳｅｑデータによる３６個のサンプルのサブセットを使用して、線形ＳＶＭ分類器およびＬＯＰＯ  ＣＶにより評価される能力をトレーニングした。ＡＵＣは、１０〜２００個に及ぶ遺伝子数に対して一貫して０．８０を上回る（データ不掲載）。さらなる検査のために１００個の遺伝子を使用するモデルを選んだ。ＡＵＣは、０．９[CI 0.77〜1.00]（特異性=95% [CI 84%〜100%]、感度=59% [CI 35%〜82%]）である（図３Ａ）。１つだけ非ＵＩＰサンプルが誤分類される（図３Ｂ）。このサンプルに対するサンプルレベル病理学は、呼吸細気管支炎（RB）であり、患者での病理学は、びまん性肺胞損傷（DAD）であり、数が少ないため２つのサブタイプはモデル化が困難であった。同じ組のサンプルに対して対応させたアレイデータを使用して類似の分析を実施した；アレイ利用分類器は、１６０個の遺伝子を使用して類似の能力を実現する（AUC=0.86 [CI 0.73〜0.96]）。特異性は、９５％[CI 84%〜100%]であり、感度は、４７％[CI 24%〜71%]である（図３Ｃ）。興味深いことに、ＲＮＡＳｅｑ分類器によりＵＩＰとして誤分類された同じ非ＵＩＰサンプルは、マイクロアレイ分類器によっても誤分類される（図３Ｄ）。全体として、ＲＮＡＳｅｑに基づく分類は、アレイプラットフォームと同程度の能力を実現する。
【０２３６】
実施例９
分類器によって使用される遺伝子と関連する生物学的経路
[0169]  機械学習プロセスにより選択された遺伝子全体にわたり共通の生物学的基礎があるかどうか決定するために、過剰リプリゼンテーション（over-representation）分析（ORA）を使用して、選択された経路における遺伝子の統計的に有意な関与を同定した。ＯＲＡテストセットとしてマイクロアレイテストセット（n=77）においてＧｅｎｅＴｒａｉｌソフトウェア（genetrail.bioinf.uni-sb.de/）およびｌｉｍｍａによりＵＩＰと非ＵＩＰサンプルの間で差異的に発現している上位１０００個の遺伝子（FDR < 0.013）を使用して、過剰／過少リプリゼンテーション分析（Over/under-representation analyses）（ORA）を遂行した。ＯＲＡ参照セットは、ヒト全遺伝子（n=44829）およびＫＥＧＧ経路の注釈ならびに遺伝子オントロジー（GO）データベースを含んだ。有意性は、修正ＦＤＲ閾値ｐ＜０．０５でフィッシャーの正確確率検定によって評価された。
【０２３７】
[0170]  ＵＩＰ対非ＵＩＰ比較において見出した上位１０００個の遺伝子を調査するにあたって、固有の発見が明らかになった（表２）。
【０２３８】
【表Ｈ−１】
2018504138.tif 000014
【０２３９】
【表Ｈ−２】
2018504138.tif 000015
【０２４０】
[0172]  省略形：ＦＤＲ＝偽発見率；ＧＯ＝遺伝子オントロジー；ＫＥＧＧ＝Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ；ＯＲＡ＝過剰リプリゼンテーション分析。
【０２４１】
[0173]  ＵＩＰにおいて、細胞接着、筋肉疾患、細胞移動および運動性に関係する遺伝子は、優勢である。これらの結果は、ＩＰＦにおいて差異的に調節される経路の以前の報告と一致する１８，１９，２２，２３。それに対し、他の非ＵＩＰサブタイプは、適応と先天性両方のシステムを含めた免疫プロセスに関係する遺伝子を過剰発現する。この強化は、非ＵＩＰコホートに存在するＲＢおよびＨＰサブタイプにより；免疫成分を呈することが公知の疾患であり得た２４。ＫＥＧＧ経路および遺伝子オントロジー群において過剰に表れる遺伝子を表７および８に要約した。
【０２４２】
【表Ｉ−１】
2018504138.tif 000016
【０２４３】
【表Ｉ−２】
2018504138.tif 000017
【０２４４】
【表Ｊ−１】
2018504138.tif 000018
【０２４５】
【表Ｊ−２】
2018504138.tif 000019
【０２４６】
【表Ｊ−３】
2018504138.tif 000020
【０２４７】
実施例１０
誤ラベルシミュレーション研究
[0176]  ２成分分類ラベル（UIPまたは非UIP）交換シミュレーション研究を、マイクロアレイトレーニングセットに対して遂行した。サンプルを、シミュレーションセット当たり合計割合１％〜４０％の範囲で、ラベル入れ替えするためにランダムに選択した。３名の専門家の病理学診断の盲検審査における合意のレベルは、３／３（n=44）、２／２（n=8）、２／３（n=24）、および１／３（n=1）である。サンプルラベルを、３名の専門の病理学者の盲検審査における意見の相違レベル：３／３または２／２の合意に対して５％、２／３の合意に対して５０％、および１／３の合意に対して９０％の割合を占める確率に比例する重みにより他のクラスに変えた。シミュレーションを、各割合で１００回繰り返した。
【０２４８】
[0177]  ＬＯＰＯ  ＣＶ能力（AUC）を、交換したラベルの一連の割合全体におよぶ１００回の反復シミュレーションにより評価した（図４）。ラベル交換がない場合、能力の中央値は図２Ａに示されるアレイ分類器能力に非常に近い（AUC=0.9）。（サンプルおよびラベルの同じセットを使用して、モデル推定にはわずかな変動があり得る）。交換率が増加するにつれて、能力は単調に減少する。ラベルの４０％が交換される場合、能力の中央値は０．５に近づき、分類が偶然と変わらないことを示す。
【０２４９】
実施例１１
ＵＩＰ／非ＵＩＰ差異的遺伝子発現の大きさおよび方向は、喫煙者対非喫煙者試験対照において異なる。
[0178]  間質性肺疾患は、喫煙したことがない人より、喫煙する人または止める前に喫煙歴が長かった人においてより優勢である。喫煙者および非喫煙者ＵＩＰまたは非ＵＩＰ対象から得られるサンプルの差異的遺伝子発現プロファイルを比較して、喫煙状態がＵＩＰ診断分類器の能力に影響を及ぼすかどうか決定した。
【０２５０】
[0179]  経気管支生検サンプルを調製した［実施例１および２に記述される方法にしたがって、ならびにＲＮＡ配列決定分析を、実施例３に記述される方法にしたがって遂行した］。ＲＮＡＳｅｑデータを、２４個のサンプル（９個のＵＩＰおよび１５個の非ＵＩＰ）のサブセットについて生成し、差異的遺伝子発現を３つの２成分比較により分析した：（ｉ）ＵＩＰ対非ＵＩＰ、それぞれｎ＝９および１５サンプル；（ｉｉ）非喫煙者ＵＩＰ対非喫煙者非ＵＩＰ、それぞれｎ＝３および５サンプル；ならびに（ｉｉｉ）喫煙者ＵＩＰ対喫煙者非ＵＩＰ、それぞれｎ＝１２および４サンプル。
【０２５１】
[0180]  群（ｉ）〜（ｉｉｉ）に対する発現分析の結果をそれぞれ表９〜１１に示し、図８〜１０に要約する。ＵＩＰと非ＵＩＰサンプルの間で差異的に発現される遺伝子の数は、喫煙者と非喫煙者の間で大きく異なる。（喫煙者由来サンプルにおいて６４個が差異的に発現し、非喫煙者由来サンプルにおいて６７１個が差異的に発現した）（図８）。さらに、非喫煙者において差異的に上方制御された特定の遺伝子は、喫煙者において下方制御された、または差異的に発現されなかった（図９および１０）。これらのデータは、非喫煙者由来サンプルのＵＩＰ分類に有用な特定の遺伝子が、有益でない、または喫煙者における同じ疾患の診断と矛盾する場合があることを実証する。遺伝子発現における喫煙者状態の差異は、従来の２クラスの機械学習法を使用して生成される遺伝子発現分類器予測の能力を減少させ得る。任意選択により組み合わせられるまたはＵＩＰ対非ＵＩＰ分類器と個々に組み合わせて使用される３つの異なる技術および本明細書に開示される診断方法によるＵＩＰ対非ＵＩＰ診断の方法を使用してこの問題を解決する。
【０２５２】
[0181]  最初の手法において、喫煙状態（喫煙者対非喫煙者）が、トレーニングの間にモデルにおいて共変量として使用される。この単純な手法は、特に喫煙者から得られたデータ（ノイズがより高い）においてシグナル対ノイズ比を向上させ、喫煙者および非喫煙者から得られるデータを組み合わせ、同時に使用可能にする。
【０２５３】
[0182]  第２の手法において、分類器トレーニングの間に、喫煙者状態のバイアスの影響を受けやすい遺伝子を同定し、除外し、または任意選択により、そのようなバイアスの影響を受けにくい遺伝子と異なる重み付けをする。この方法は、トレーニングに使用される特性空間を、喫煙状態により混乱または影響を受けない遺伝子について濃縮する。
【０２５４】
[0183]  第３の手法において、初期分類器が喫煙者を非喫煙者と区別する遺伝子シグネチャーを認識するためにトレーニングされる段階的分類の取り組みが、利用される。一旦患者サンプルが「喫煙者」または「非喫煙者」に前分類されたら、喫煙者もしくは非喫煙者それぞれにおいてＵＩＰ対非ＵＩＰを区別するためにそれぞれトレーニングされた固有の分類器を実装する。そのような喫煙者または非喫煙者特異的分類器は、診断能力の改善をもたらす。
【０２５５】
【表Ｋ−１】
2018504138.tif 000021
【０２５６】
【表Ｋ−２】
2018504138.tif 000022
【０２５７】
【表Ｋ−３】
2018504138.tif 000023
【０２５８】
【表Ｋ−４】
2018504138.tif 000024
【０２５９】
【表Ｋ−５】
2018504138.tif 000025
【０２６０】
【表Ｋ−６】
2018504138.tif 000026
【０２６１】
【表Ｋ−７】
2018504138.tif 000027
【０２６２】
【表Ｋ−８】
2018504138.tif 000028
【０２６３】
【表Ｋ−９】
2018504138.tif 000029
【０２６４】
【表Ｌ−１】
2018504138.tif 000030
【０２６５】
【表Ｌ−２】
2018504138.tif 000031
【０２６６】
【表Ｌ−３】
2018504138.tif 000032
【０２６７】
【表Ｌ−４】
2018504138.tif 000033
【０２６８】
【表Ｌ−５】
2018504138.tif 000034
【０２６９】
【表Ｌ−６】
2018504138.tif 000035
【０２７０】
【表Ｌ−７】
2018504138.tif 000036
【０２７１】
【表Ｌ−８】
2018504138.tif 000037
【０２７２】
【表Ｌ−９】
2018504138.tif 000038
【表Ｌ−１０】
2018504138.tif 000039
【０２７３】
【表Ｌ−１１】
2018504138.tif 000040
【０２７４】
【表Ｌ−１２】
2018504138.tif 000041
【０２７５】
【表Ｌ−１３】
2018504138.tif 000042
【０２７６】
【表Ｌ−１４】
2018504138.tif 000043
【０２７７】
【表Ｌ−１５】
2018504138.tif 000044
【表Ｌ−１６】
2018504138.tif 000045
【０２７８】
【表Ｌ−１７】
2018504138.tif 000046
【０２７９】
【表Ｌ−１８】
2018504138.tif 000047
【表Ｌ−１９】
2018504138.tif 000048
【０２８０】
【表Ｌ−２０】
2018504138.tif 000049
【０２８１】
【表Ｌ−２１】
2018504138.tif 000050
【０２８２】
【表Ｌ−２２】
2018504138.tif 000051
【０２８３】
【表Ｌ−２３】
2018504138.tif 000052
【０２８４】
【表Ｍ−１】
2018504138.tif 000053
【０２８５】
【表Ｍ−２】
2018504138.tif 000054
【０２８６】
【表Ｍ−３】
2018504138.tif 000055
【０２８７】
【表Ｍ−４】
2018504138.tif 000056
【０２８８】
【表Ｍ−５】
2018504138.tif 000057
【０２８９】
【表Ｍ−６】
2018504138.tif 000058
【０２９０】
【表Ｍ−７】
2018504138.tif 000059
【０２９１】
【表Ｍ−８】
2018504138.tif 000060
【０２９２】
【表Ｍ−９】
2018504138.tif 000061
【０２９３】
【表Ｍ−１０】
2018504138.tif 000062
【０２９４】
【表Ｍ−１１】
2018504138.tif 000063
【０２９５】
【表Ｍ−１２】
2018504138.tif 000064
【０２９６】
【表Ｍ−１３】
2018504138.tif 000065
【０２９７】
【表Ｍ−１４】
2018504138.tif 000066
【０２９８】
【表Ｍ−１５】
2018504138.tif 000067
【０２９９】
【表Ｍ−１６】
2018504138.tif 000068
【０３００】
【表Ｍ−１７】
2018504138.tif 000069
【０３０１】
【表Ｍ−１８】
2018504138.tif 000070
【０３０２】
[0187]  上述した様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。この明細書において参照されおよび／または出願データシートに挙げられる米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物の全ては、参照によりその全体を本明細書に組み込む。実施形態の態様は、様々な特許、出願および刊行物の概念を利用してなおさらなる実施形態を提供するために必要であれば、修飾することができる。
【０３０３】
[0188]  これらのおよび他の変更を、上の詳細な記述に照らして実施形態に作ることができる。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を明細書および特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきでなく、そのような特許請求の範囲が権利を有する等価物の全範囲とともに考え得る全ての実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は開示により限定されない。
【０３０４】
[0189]  本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、コンピュータで実装される様々な操作を遂行するための命令またはコンピュータコードを有する非一時的なコンピュータ読み込み可能な媒体（非一時的な処理装置読み込み可能な媒体と呼ぶこともできる）を持つコンピュータ記憶製品に関する。コンピュータ読み込み可能な媒体（または処理装置読み込み可能な媒体）は、それ自体が一時的伝播信号（例えば、空間またはケーブルなど伝播媒体に情報を保有している伝播電磁波）を含まないという意味で非一時的である。媒体およびコンピュータコード（コードと呼ぶこともできる）は、特定の目的（単数または複数）のために設計および構築されたものであることができる。非一時的なコンピュータ読み込み可能な媒体の例には、ハードディスク、フロッピーディスクおよび磁気テープなど磁気記憶媒体；コンパクトディスク／デジタルビデオディスク（CD/DVD）など光記憶媒体、コンパクトディスク−読み取り専用メモリ（CD-ROM）、およびホログラフィックデバイス；光ディスクなど光磁気記憶媒体；搬送波信号プロセッシングモジュール；ならびに特定用途向け集積回路（ASIC）、プログラム可能な論理デバイス（PLD）、読み取り専用メモリ（ROM）およびランダムアクセスメモリ（RAM）デバイスなど、プログラムコードを保存し、実行するように特別に構成されるハードウェアデバイスがあるが、これに限定されない。本明細書に記載される他の実施形態は、コンピュータプログラム製品に関し、その製品は、例えば、本明細書に検討される命令および／またはコンピュータコードを含むことができる。
【０３０５】
[0190]  いくつかの実施形態および／または本明細書に記載される方法は、ソフトウェア（ハードウェア上で実行される）、ハードウェア、またはそれらの組み合わせにより遂行することができる。ハードウェアモジュールは、例えば、汎用処理装置、フィールドプログラマブルゲートアレイ（FPGA）、および／または特定用途向け集積回路（ASIC）を含むことができる。ソフトウェアモジュール（ハードウェア上で実行される）は、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（商標）、Ｒｕｂｙ、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ（商標）、Ｒ、および／または他のオブジェクト指向、手順的、統計的を含めた様々なソフトウェア言語（例えば、コンピュータコード）、または他のプログラミング言語および開発ツールで表すことができる。コンピュータコードの例には、マイクロコードまたはマイクロ命令、コンパイラにより作製されるなどの機械命令、ウェブサービスを作製するのに使用されるコード、およびインタープリターを使用してコンピュータにより実行されるより高レベルの命令を含有するファイルがあるが、これに限定されない。例えば、実施形態は、命令型プログラミング言語（例えば、C、フォートラン等）、関数型プログラミング言語（例えば、Haskell、Erlang等）、論理プログラミング言語（例えば、Prolog）、オブジェクト指向プログラミング言語（例えば、Java、C++等）、統計的プログラミング言語および／または環境（例えば、R等）または他の適当なプログラミング言語および／または開発ツールを使用して実装することができる。コンピュータコードのさらなる例には、制御信号、暗号化されたコードおよび圧縮コードがあるが、これに限定されない。
【０３０６】
参考文献
以下の参考文献の全ては、その全体を本明細書に組み込む。
1. du Bois RM. Strategies for treating idiopathic pulmonary fibrosis. Nature reviews Drug discovery 2010; 9(2): 129-40.
2. Hodnett PA, Naidich DP. Fibrosing Interstitial Lung Disease: A Practical HRCT Based Approach to Diagnosis and Management and Review of the Literature. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine 2013.
3. American Thoracic Society. Idiopathic pulmonary fibrosis: diagnosis and treatment. International consensus statement. American Thoracic Society (ATS), and the European Respiratory Society (ERS). American journal of respiratory and critical care medicine 2000; 161(2 Pt 1): 646-64.
4. King TE, Jr., Pardo A, Selman M. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet 2011; 378(9807): 1949-61.
5. Raghu G, Collard HR, Egan JJ, et al. An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement: idiopathic pulmonary fibrosis: evidence-based guidelines for diagnosis and management. American journal of respiratory and critical care medicine 2011; 183(6): 788-824.
6. Wells AU. The revised ATS/ERS/JRS/ALAT diagnostic criteria for idiopathic pulmonary fibrosis (IPF)--practical implications. Respiratory research 2013; 14 Suppl 1: S2.
7. Fernandez Perez ER, Daniels CE, Schroeder DR, et al. Incidence, prevalence, and clinical course of idiopathic pulmonary fibrosis: a population-based study. Chest 2010; 137(1): 129-37.
8. du Bois RM, Weycker D, Albera C, et al. Ascertainment of individual risk of mortality for patients with idiopathic pulmonary fibrosis. American journal of respiratory and critical care medicine 2011; 184(4): 459-66.
9. King TE, Jr., Bradford WZ, Castro-Bernardini S, et al. A phase 3 trial of pirfenidone in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. N Engl J Med 2014; 370(22): 2083-92.
10. Richeldi L, du Bois RM, Raghu G, et al. Efficacy and safety of nintedanib in idiopathic pulmonary fibrosis. N Engl J Med 2014; 370(22): 2071-82.
11. Woodcock HV, Maher TM. The treatment of idiopathic pulmonary fibrosis. F1000prime reports 2014; 6: 16.
12. Cottin V, Richeldi L. Neglected evidence in idiopathic pulmonary fibrosis and the importance of early diagnosis and treatment. European respiratory review : an official journal of the European Respiratory Society 2014; 23(131): 106-10.
13. Sumikawa H, Johkoh T, Colby TV, et al. Computed tomography findings in pathological usual interstitial pneumonia: relationship to survival. American journal of respiratory and critical care medicine 2008; 177(4): 433-9.
14. Wells AU. Managing diagnostic procedures in idiopathic pulmonary fibrosis. European respiratory review : an official journal of the European Respiratory Society 2013; 22(128): 158-62.
15. Collard HR, King TE, Jr., Bartelson BB, Vourlekis JS, Schwarz MI, Brown KK. Changes in clinical and physiologic variables predict survival in idiopathic pulmonary fibrosis. American journal of respiratory and critical care medicine 2003; 168(5): 538-42.
16. Nicholson AG, Addis BJ, Bharucha H, et al. Inter-observer variation between pathologists in diffuse parenchymal lung disease. Thorax 2004; 59(6): 500-5.
17. Flaherty KR, King TE, Jr., Raghu G, et al. Idiopathic interstitial pneumonia: what is the effect of a multidisciplinary approach to diagnosis? American journal of respiratory and critical care medicine 2004; 170(8): 904-10.
18. Selman M, Pardo A, Barrera L, et al. Gene expression profiles distinguish idiopathic pulmonary fibrosis from hypersensitivity pneumonitis. American journal of respiratory and critical care medicine 2006; 173(2): 188-98.
19. Lockstone HE, Sanderson S, Kulakova N, et al. Gene set analysis of lung samples provides insight into pathogenesis of progressive, fibrotic pulmonary sarcoidosis. American journal of respiratory and critical care medicine 2010; 181(12): 1367-75.
20. Katzenstein AL. Smoking-related interstitial fibrosis (SRIF), pathogenesis and treatment of usual interstitial pneumonia (UIP), and transbronchial biopsy in UIP. Modern pathology : an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc 2012; 25 Suppl 1: S68-78.
21. Team RC. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria http://wwwR-projectorg/ 2014.
22. Pardo A, Gibson K, Cisneros J, et al. Up-regulation and profibrotic role of osteopontin in human idiopathic pulmonary fibrosis. PLoS medicine 2005; 2(9): e251.
23. DePianto DJ, Chandriani S, Abbas AR, et al. Heterogeneous gene expression signatures correspond to distinct lung pathologies and biomarkers of disease severity in idiopathic pulmonary fibrosis. Thorax 2014.
24. Selman M, Pardo A, King TE, Jr. Hypersensitivity pneumonitis: insights in diagnosis and pathobiology. American journal of respiratory and critical care medicine 2012; 186(4): 314-24.
25. Yang IV, Coldren CD, Leach SM, et al. Expression of cilium-associated genes defines novel molecular subtypes of idiopathic pulmonary fibrosis. Thorax 2013.
26. Garcia-Alvarez J, Ramirez R, Checa M, et al. Tissue inhibitor of metalloproteinase-3 is up-regulated by transforming growth factor-beta1 in vitro and expressed in fibroblastic foci in vivo in idiopathic pulmonary fibrosis. Experimental lung research 2006; 32(5): 201-14.
27. Piotrowski WJ, Gorski P, Pietras T, Fendler W, Szemraj J. The selected genetic polymorphisms of metalloproteinases MMP2, 7, 9 and MMP inhibitor TIMP2 in sarcoidosis. Medical science monitor : international medical journal of experimental and clinical research 2011; 17(10): CR598-607.
28. Chaudhuri R, McSharry C, Brady J, et al. Low sputum MMP-9/TIMP ratio is associated with airway narrowing in smokers with asthma. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology 2014; 44(4): 895-904.
29. Hviid TV, Milman N, Hylenius S, Jakobsen K, Jensen MS, Larsen LG. HLA-G polymorphisms and HLA-G expression in sarcoidosis. Sarcoidosis, vasculitis, and diffuse lung diseases : official journal of WASOG / World Association of Sarcoidosis and Other Granulomatous Disorders 2006; 23(1): 30-7.
30. Li GY, Kim M, Kim JH, Lee MO, Chung JH, Lee BH. Gene expression profiling in human lung fibroblast following cadmium exposure. Food and chemical toxicology : an international journal published for the British Industrial Biological Research Association 2008; 46(3): 1131-7.
31. Ozsolak F, Milos PM. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nature reviews Genetics 2011; 12(2): 87-98.
32. Mutz KO, Heilkenbrinker A, Lonne M, Walter JG, Stahl F. Transcriptome analysis using next-generation sequencing. Current opinion in biotechnology 2013; 24(1): 22-
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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