(57)【要約】  本発明は、β−１，３−グリコシド結合した主鎖と該主鎖にβ−１，６−グリコシド結合した側基とを有するグルカンを分泌する真菌類株を、高せん断ミキサーを用いてカスケード槽内で発酵させる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−１，３−グリコシド結合した主鎖と該主鎖にβ−１，６−グリコシド結合した側基とを有するグルカンを分泌する真菌類株を、第１の容積（ＶＫ１、ＶＫ３１）を有する第１の槽（Ｋ１、Ｋ３１）と、第２の容積（ＶＫ２、ＶＫ３２）を有する第２の槽（Ｋ２、Ｋ３２）と、を少なくとも含むカスケード槽内で発酵させる方法であって、以下：
ａ）前記第１の槽（Ｋ１、Ｋ３１）内の第１の水性媒体（Ｍ１、Ｍ３１）中でかつ前記第１の水性媒体の体積（ＶＭ１、ＶＭ３１）中で前記真菌類株を発酵させて、第１の混合物（Ｓ１、Ｓ３１）を生じさせるステップと、
ｂ）前記第１の混合物（Ｓ１、Ｓ３１）を前記第２の槽（Ｋ２、Ｋ３２）へ移送するステップと、
ｃ）前記第２の槽（Ｋ２、Ｋ３２）内の第２の水性媒体（Ｍ２、Ｍ３２）中でかつ前記第２の水性媒体の体積（ＶＭ２、ＶＭ３２）中で前記第１の混合物（Ｓ１、Ｓ３１）中の前記真菌類株を発酵させて、第２の混合物（Ｓ２、Ｓ３２）を生じさせるステップと、
を少なくとも含み、
その際、前記第２の槽の容積（ＶＫ２、ＶＫ３２）に対する前記第１の混合物の体積（ＶＭ１、ＶＭ３１）の割合が、０．１％以上５０％以下の範囲にあり、かつ、
ステップｂ）における前記第１の混合物（Ｓ１、Ｓ３１）を少なくとも１つの高せん断ミキサーに通し、ここで、前記高せん断ミキサー（１）は、せん断ジオメトリであって前記第１の混合物（Ｓ１、Ｓ３１）全体が該少なくとも１つの高せん断ミキサーの該せん断ジオメトリを完全に通り抜けるようなせん断ジオメトリを有する、
前記方法。
【請求項２】
前記高せん断ミキサー（１）が、ロータ（１０）とステータ（２０）とを有するロータ・ステータミキサーである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ロータ・ステータミキサーが歯付リム分散機である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ロータ・ステータミキサーの前記ロータ（１０）と前記ステータのうちの少なくとも一方が少なくとも２つの同心状の歯付リム（１１、１２）を有し、前記ロータと前記ステータ（２０）のうちの他方が少なくとも１つの歯付リム（２１、２２）を有し、ここで、前記ロータとステータのうちの他方の少なくとも１つの歯付リムは、前記少なくとも２つの同心状の歯付リムと同心状に交互に配置されており、該交互に配置された歯付リムを前記第１の水性媒体（Ｍ１、Ｍ３１）が通り抜ける、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
前記ロータ（１０）とステータのうちの一方の少なくとも２つの同心状の歯付リム（１１、１２）と、前記ロータとステータ（２０）のうちの他方の少なくとも１つの歯付リム（２１、２２）とが等距離の歯ジオメトリを有し、それぞれの外側の歯付リム（１１）の隣接する歯（１３）の間隔は、それぞれの内側の歯付リム（２１）の隣接する歯（２３）の間隔よりも広く、前記第１の水性媒体Ｍ１が、前記交互に配置された歯付リムを、歯の間隔が広くなる方向に通り抜ける、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記第１の混合物（Ｓ１）がギャップ（２）を径方向に通り抜け、ここで、該径方向のギャップは、前記ロータ（１０）とステータのうちの一方の少なくとも２つの同心状の歯付リム（１１、１２）と、前記ロータとステータ（２０）のうちの他方の少なくとも１つの歯付リム（２１、２２）とを同心状に交互に配置することによって形成され、歯付リムの外径と径方向外側に隣接する歯付リムの内径との間の前記ギャップ（２）は、０．２ｍｍ〜２．０ｍｍ、好ましくは０．４ｍｍ〜１．２ｍｍ、より好ましくは０．８ｍｍ〜０．９ｍｍの幅を有する、請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
前記第１の混合物（Ｓ１）が、前記ロータ（１０）とステータのうちの一方の少なくとも２つの同心状の歯付リム（１１、１２）と、前記ロータとステータ（２０）のうちの他方の少なくとも１つの歯付リム（２１、２２）とを通る間に、０．０１秒間〜０．００４秒間、好ましくは０．０２秒間〜０．０７秒間、より好ましくは０．０１秒±０．００１秒間滞留する、請求項４から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記せん断ジオメトリを通る流路に沿った歯（１３、２３）のエッジ（１４、２４）が、少なくとも０．２ｍｍ、特に３ｍｍ超の半径を有する丸み付けられたエッジを有する、請求項３から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記ロータ（１０）が、前記ステータに対して、２５０〜７２００ｒｐｍ、好ましくは１８００〜６０００ｒｐｍ、より好ましくは４０００〜４５００ｒｐｍの速度で回転する、請求項２から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記ロータ（１０）が、２ｍ／ｓ〜６０ｍ／ｓ、好ましくは１５ｍ／ｓ〜５０ｍ／ｓ、より好ましくは３５ｍ／ｓ〜４５ｍ／ｓの周速度で回転する、請求項２から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の槽の容積（ＶＫ２、ＶＫ３２）に対する前記第１の混合物の体積（ＶＭ１、ＶＭ３１）の割合が、１％以上２０％以下の範囲にある、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１種のβ−グルカンが、シゾフィランおよびスクレログルカンからなる群から選択され、前記シゾフィランまたはスクレログルカンは、真菌類株の発酵により得られる、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記真菌類株が、シゾフィルム・コミューネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）またはスクレロチウム・ロルフシイ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ）である、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記カスケード槽が、第３の容積（ＶＫ３３）を有する第３の槽（Ｋ３３）をさらに含み、前記発酵方法がさらに、以下：
ｄ）前記第２の混合物（Ｓ３２）を前記第３の槽（Ｋ３３）へ移送するステップと、
ｅ）前記第３の槽（Ｋ３３）内の第３の水性媒体（Ｍ３３）中で前記第２の混合物（Ｓ３２）中の前記真菌類株を発酵させるステップと、
を少なくとも含み、
その際、前記第３の槽の容積（ＶＫ３３）に対する前記第２の混合物の割合が、０．１％以上５０％以下の範囲にある、請求項１から１３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
ステップｄ）における前記第２の混合物（Ｓ３２）を少なくとも１つの高せん断ミキサーに通し、ここで、該高せん断ミキサー（１）は、せん断ジオメトリであって前記第２の混合物（Ｓ３２）全体が該少なくとも１つの高せん断ミキサーの該せん断ジオメトリを完全に通り抜けるようなせん断ジオメトリを有する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記第３の槽の容積（ＶＫ３３）に対する前記第２の混合物（Ｓ３２）の割合が、１％以上２０％以下の範囲にある、請求項１４または１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−１，３−グリコシド結合した主鎖と該主鎖にβ−１，６−グリコシド結合した側基とを有するグルカンを分泌する真菌類株を、高せん断ミキサーを用いてカスケード槽内で発酵させる方法に関する。
【０００２】
発明の背景
原油の天然の産出において、原油は多孔質の貯留岩の孔隙内に存在しており、これらの孔隙は不浸透性の被覆層によって地表に対して閉じている。これらの孔隙は、極めて微細な孔隙、毛管、孔などであることができる。細孔ネックは、例えばわずか約１ｍの直径を有しうる。天然ガス分を含む原油のほかに、貯留層は塩を含有する水を多少なりとも含む。
【０００３】
原油回収においては、一次回収と二次回収と三次回収とに区別される。一次回収では、原油は、貯留層までの掘削が行われた後に該貯留層の自己圧下で油井を通って表面へと自発的に流れる。しかし、貯留層の種類によっては、通常は、一次回収によって貯留層内に存在する原油量の約５〜１０％しか回収することができず、そうなると固有圧はもはや回収に十分ではない。二次回収では、水および／または水蒸気の注入によって貯留層内の圧力が保持されるが、この技術によっても原油を完全に回収することはできない。原油の三次回収には、適切な化学物質を原油回収のための助剤として使用するプロセスが含まれる。これらには、いわゆる「ポリマーフラッディング（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｆｌｏｏｄｉｎｇ）」が含まれる。ポリマーフラッディングでは、水の代わりに増粘剤ポリマーの水溶液が注入油井を通じて原油貯留層に注入される。これにより、水または水蒸気の使用に比べて採収率をさらに向上させることができる。
【０００４】
原油の三次回収（原油増進回収（ＥＯＲ）としても知られている）に適した増粘ポリマーは、多くの特定の要件を満たさなければならない。粘度が十分であることに加えて、これらのポリマーはさらに、熱的に極めて安定でなければならず、また高い塩濃度であってもその増粘効果を保持しなければならない。
【０００５】
多数の様々な水溶性ポリマーがポリマーフラッディングに向けて提案されており、具体的には、合成ポリマー、例えばポリアクリルアミド、またはアクリルアミドおよび他のモノマーを含むコポリマーと、天然由来の水溶性ポリマーと、の双方が提案されている。
【０００６】
ポリマーフラッディングのための天然由来のポリマーの重要なクラスの中には、グルコースからの分岐したホモ多糖類により形成されるものがある。グルコース単位を構成要素とする多糖類は、グルカンとも呼ばれる。特定の分岐したホモ多糖類は、−１，３結合したグルコース単位を構成要素とする主鎖を有し、これらのグルコース単位は統計的に約３単位毎にさらなるグルコース単位と−１，６−グリコシド結合している。そのように分岐したホモ多糖類の水溶液は、有利な物理化学的特性を示す。このことは、そのように分岐したホモ多糖類がポリマーフラッディングに特に十分に適していることを意味する。
【０００７】
これに関連して特に重要なグルカンは、β−グルカンである。β−グルカンは、いくつかの微生物、特に真菌類および酵母における細胞壁の既知の十分に保存された成分である（Ｎｏｖａｋ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ，Ｍｅｔａｂｏｌ＆Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ−Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ（２００９），９：６７−７５）。生化学的には、β−グルカンは、グリコシドβ（１−３）結合を介して結合したβ−グルコースの非セルロース系ポリマーであり、β（１−６）結合したグルコース分子を伴ってある一定の分岐パターンを示す（Ｎｏｖａｋ、上記文献中）。密接に関連する多数のβ−グルカン、例えばシゾフィラン、スクレログルカン、ペンズラン（ｐｅｎｄｕｌａｎ）、シネリアン（ｃｉｎｅｒｉａｎ）、ラミナリン、レンチナンおよびプルランは類似の分岐パターンを示し、これらはいずれも、β−Ｄ−（１−３）−グルコピラノシル単位の直鎖状主鎖であって、該直鎖状主鎖のβ−Ｄ−グルコピラノシル単位に約０．３の平均分岐度で（１−６）結合した単一のβ−Ｄ−グルコピラノシル単位を有するものを示す（Ｎｏｖａｋ、上記文献中；欧州特許第４６３５４０号明細書（ＥＰ−Ｂ１  ４６３５４０）；Ｓｔａｈｍａｎｎ，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９２），５８：３３４７−３３５４；Ｋｉｍ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００６），２８：４３９−４４６；Ｎｉｋｉｔｉｎａ，Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００７），４５：２３０−２３７）。前述のβ−グルカンのうちの少なくとも２種  −  シゾフィランおよびスクレログルカン  −  は同一の構造の共有もしており、それらの分子量の点で、すなわちそれらの鎖長の点で、わずかにしか相違しない（Ｓｕｒｖａｓｅ，Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００７），１０７−１１８）。
【０００８】
前述の構造のホモ多糖類は、種々の真菌類株によって、例えば糸状に成長する担子菌シゾフィルム・コミューネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）によって分泌され、この担子菌シゾフィルム・コミューネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）は、成長の間に約５〜約２５×１０６ｇ／ｍｏｌの典型的な分子量Ｍｗを有する前述の構造のホモ多糖類（慣用名：シゾフィラン）を分泌する。スクレロチウム・ロルフシイ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ）により分泌される前述の構造のホモ多糖類（慣用名：スクレログルカン）も挙げられる。
【０００９】
−１，３結合したグルコース単位から真菌類株の発酵によって分岐状のホモ多糖を生産する方法は、知られている。欧州特許出願公開第０２７１９０７号明細書（ＥＰ  ０  ２７１  ９０７  Ａ２）および欧州特許出願公開第０５０４６７３号明細書（ＥＰ  ０  ５０４  ６７３  Ａ１）には、主鎖中の−１，３結合したグルコース単位を構成要素とする分岐状のホモ多糖類を生産するための方法および真菌類株が開示されている。生産は、撹拌および通気を行ってこれらの株を非連続的に発酵させることによって行われる。栄養培地は実質的に、グルコース、酵母抽出物、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウムおよび水からなる。このポリマーは真菌によって水性発酵ブロス中に分泌され、最終的に、ポリマー水溶液がバイオマス含有発酵ブロスから例えば遠心分離またはろ過によって分離される。
【００１０】
独国特許出願公開第４０１２２３８号明細書（ＤＥ  ４０  １２  ２３８  Ａ１）には、非イオン性バイオポリマーを生産する際の、特に欧州特許出願公開第０２７１９０７号明細書（ＥＰ  ０  ２７１  ９０７  Ａ２）に開示されている真菌類株の非イオン性バイオポリマーを生産する際の、空時収率を向上させる方法が開示されている。空時収率を向上させるために、一方では酸素を制限し、さらには発酵ブロスの均質化により細胞壁をせん断し、また培養中のペレット形成を回避することが開示されている。せん断のために、バイパスにおける歯車ポンプが提案されている。
【００１１】
真菌類株の発酵方法は、例えば欧州特許出願公開第０２７１９０７号明細書（ＥＰ  ０  ２７１  ９０７  Ａ２）、欧州特許出願公開第０５０４６７３号明細書（ＥＰ  ０  ５０４  ６７３  Ａ１）、独国特許出願公開第４０１２２３８号明細書（ＤＥ  ４０  １２  ２３８  Ａ１）、国際公開第０３／０１６５４５号（ＷＯ  ０３／０１６５４５  Ａ２）から知られている。
【００１２】
特に欧州特許出願公開第０２７１９０７号明細書（ＥＰ  ０  ２７１  ９０７  Ａ２）、欧州特許出願公開第０５０４６７３号明細書（ＥＰ  ０  ５０４  ６７３  Ａ１）および独国特許出願公開第４０１２２３８号明細書（ＤＥ  ４０  １２  ２３８  Ａ１）には製造方法が開示されており、すなわちこの製造は、真菌シゾフィルム・コミューネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）を撹拌および通気を伴って回分発酵させることによって行われる。培養培地は実質的に、グルコース、酵母抽出物、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウムおよび水を含む。欧州特許出願公開第０２７１９０７号明細書（ＥＰ  ０  ２７１  ９０７  Ａ２）には、多糖類の分離方法であって、培養懸濁液を最初に遠心分離し、そしてイソプロパノールを用いて上清から多糖類を沈殿させる方法が記載されている。第２の方法は、加圧ろ過とそれに続く得られた溶液の限外ろ過とを含むが、この方法の詳細は開示されていない。”Ｕｄｏ  Ｒａｕ，”Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｅ，  Ｐｒｏｄｕｋｔｉｏｎ  ｕｎｄ  Ｅｉｇｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ  ｖｏｎ  ｅｘｔｒａｚｅｌｌｕｌａｅｒｅｎ  Ｐｉｌｚ−Ｇｌｕｃａｎｅｎ”，  Ｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎｓｓｃｈｒｉｆｔ，  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，１９９７，ｐ．７０−９５”、および”Ｕｄｏ  Ｒａｕ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ａ．Ｓｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌ編，第６巻，ｐ．６３−７９，ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００２”には、連続発酵または回分発酵によるシゾフィランの製造が記載されている。ペレット形成を防止するために、歯車ポンプを備えた外部回路における発酵ブロスの循環が行われた。”ＧＩＴ  Ｆａｃｈｚｅｉｔｕｎｇ  Ｌａｂｏｒ  １２／９２，ｐ．１２３３−１２３８”には、細胞リサイクルを伴う分岐状のβ−１，３−グルカンの連続的製造が記載されている。国際公開第０３／０１６５４５号（ＷＯ  ０３／０１６５４５  Ａ２）には、スクレロチウム・ロルフシイ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ）を用いたスクレログルカンの連続的な製造方法が開示されている。
【００１３】
米国特許第５，０１０，１８６号明細書（ＵＳ  ５，０１０，１８６）および米国特許第４，８７３，３２３号明細書（ＵＳ  ４，８７３，３２３）には、水性多糖類組成物を硝酸で酸性化してｐＨ値を約２〜０．１とし、この酸性化組成物を約５０℃〜１００℃の温度で約５〜６０分間処理することにより製造される、ろ過性の向上を示す多糖類バイオポリマーが開示されている。
【００１４】
米国特許第４，６６７，０２６号明細書（ＵＳ  ４，６６７，０２６）には、多糖類バイオポリマーの水溶液であって、該多糖類バイオポリマーを３．５〜６．２の範囲のｐＨ値で５分超熱処理してそのろ過性を向上させる該水溶液が記載されている。
【００１５】
ポリマーフラッディングに使用される少なくとも１種のβ−グルカンを含む水溶液は、ゲル粒子または他の小粒子を全く含まないことが極めて重要である。ミクロン範囲の寸法を有する少数の粒子によっても、鉱油を含む形成物における細孔が閉鎖されてしまい、したがって鉱油生産が少なくとも煩雑になるか、またはさらには鉱油生産が停止してしまう。
【００１６】
したがって、少なくとも１種のβ−グルカンを含む水溶液が、細胞および細胞断片を実質的に含まないことも重要である。なぜならば、さもなくばこれらの細胞および／または細胞断片によって鉱油形成が妨害され、これによって鉱油抽出が煩雑になるか、またはさらには鉱油抽出が不可能となるためである。少なくとも１種のβ−グルカンを含む水溶液の品質の特性決定に、いわゆるろ過比（ＦＲ値）を用いることができる。
【００１７】
原理的には、細胞断片、ゲル粒子および他の小粒子の除去を、小孔径のろ過膜の使用により改善することができるものと考えられる。しかし、孔径が小さくなるにつれて、ろ過膜が保持するβ−グルカン、特に極めて分子量の大きいβ−グルカンの画分も増える。分子量が極めて大きいβ−グルカンが保持されることによって、β−グルカンが失われるとともに、β−グルカンの生産方法全体の経済性が低下する。
【００１８】
さらに、β−グルカンの水溶液は、細菌の侵入の影響を受けやすい。β−グルカンは細菌の栄養素として作用するため、β−グルカンは分解される。このβ−グルカンの分解の際に、細菌の代謝による望ましくない産物、例えば硫化水素が、水溶液中に排出される。この望ましくない産物の形成ゆえ、少なくとも１種のβ−グルカンを含む水溶液を油田用途に使用することはできない。概して、−１，３結合したグルコース単位から真菌類株の発酵によって分岐状のホモ多糖類を生産する方法が従来技術から知られてはいるが、そうした生産には、真菌類が成長中にペレットを形成する傾向にあるという点で問題がある。ペレットのサイズが直径約０．３ｃｍを上回ると、このペレットのコアにおける真菌類にはもはや酸素を十分に供給することができなくなる。酸素制限の現象が生じる。その場合、この条件によって真菌類の細胞死が生じるとともに、望ましくない副産物、例えばエタノールが形成される。このことは、ホモ多糖類の生産の際の空時収率が大幅に低下することを意味する。
【００１９】
真菌類のペレット形成を防ぐための従来技術において規定されている方法は、十分な再現性がなく、したがって、工業的規模で、特に５ｍ３を超える大きさの発酵槽内で行われる方法には用いることができない。したがって、高い空時収率（ＳＴＹ）でホモ多糖類を生産することを可能にする、真菌類株のさらなる発酵方法を提供することが必要とされていた。
【００２０】
したがって、本発明の一目的は、β−１，３−グリコシド結合した主鎖と該主鎖にβ−１，６−グリコシド結合した側基とを有するグルカンを分泌する真菌類株の発酵方法であって、β−１，３−グリコシド結合した主鎖と該主鎖にβ−１，６−グリコシド結合した側基とを有するグルカンを高い空時収率で生産することを可能にする方法を提供することである。
【００２１】
発明の概要
本発明は、独立請求項の主題により、β−１，３−グリコシド結合した主鎖と該主鎖にβ−１，６−グリコシド結合した側基とを有するグルカンを分泌する真菌類株の発酵方法を提供する。さらなる実施形態は、従属請求項に組み込まれる。
【００２２】
例示的な一実施形態によれば、β−１，３−グリコシド結合した主鎖と該主鎖にβ−１，６−グリコシド結合した側基とを有するグルカンを分泌する真菌類株を、第１の容積を有する第１の槽と、第２の容積を有する第２の槽と、を少なくとも含むカスケード槽内で発酵させる方法であって、以下：
ａ）前記第１の槽内の第１の水性媒体中でかつ前記第１の水性媒体の体積中で前記真菌類株を発酵させて、第１の混合物を生じさせるステップと、
ｂ）前記第１の混合物を前記第２の槽へ移送するステップと、
ｃ）前記第２の槽内の第２の水性媒体中でかつ前記第２の水性媒体の体積中で、前記第１の混合物中の前記真菌類株を発酵させて、第２の混合物を生じさせるステップと、
を少なくとも含み、
その際、前記第２の槽の容積に対する前記第１の混合物の体積の割合が、０．１％以上５０％以下の範囲にあり、かつ、
ステップｂ）における前記第１の混合物を少なくとも１つのせん断ミキサーまたは高せん断ミキサーに通し、ここで、前記せん断ミキサーまたは高せん断ミキサーは、せん断ジオメトリであって前記第１の混合物全体が該少なくとも１つのせん断ミキサーまたは高せん断ミキサーの該せん断ジオメトリを完全に通り抜けるようなせん断ジオメトリを有する、
前記方法が提供される。
【００２３】
このようにして、第１の混合物を高せん断混合プロセスで処理することにより、第２の発酵ステップが始まる前に真菌類凝集物のサイズを小さく抑えることができる。これによって、発酵プロセスの効率が大幅に向上する。これらの凝集物は、発酵の間にサイズが大きくなる。大きい凝集物ほど低い相対的発酵速度を有するため、凝集物のサイズをより小さく抑えることが望ましいであろう。凝集物をせん断処置で処理することによってサイズが減少し、それによって後の発酵プロセスがより効率的になる。
【００２４】
第１の槽内での発酵ステップによりグルカンを発酵させ、そして第２の槽内でさらに発酵させるこの方法は、高せん断混合を含む第１の槽から第２の槽への移送を含み、この高せん断混合は、混合物全体が高せん断ミキサーのせん断ジオメトリを通り抜けるように行われるため、このせん断を行うことで、高せん断ミキサーを槽の内部に配置する回分法でのせん断よりも均質になる。後者の場合には、混合物のある部分は高せん断ミキサーを規則的に２回以上通り抜けるものの、一方で他の部分は高せん断ミキサーをまったく通らない。したがって、高せん断混合によってこの高せん断混合の間に混合物全体が高せん断ミキサーのせん断ジオメトリを通り抜けるということが行われなければ、極めて小さな（２回以上通った）粒子と、極めて大きな（通らなかった）粒子と、を含む広範囲の粒径が生じてしまう。しかし本発明により提供されるのは、流動プロセスにおける高せん断ミキサーによって混合物全体がこのミキサーを通るように促され、その結果、混合物のすべての部分がこの高せん断ミキサーのジオメトリを通るため、粒径の範囲がはるかに小さくなる、という手法である。範囲が小さくなることで、後続の発酵がより均等化されたものとなり、その結果、本発明のインライン高せん断ミキサーによって、より良好でより速く、そしてより確実な発酵結果が生じる。したがって、せん断ステップのためのバッチミキサー、例えばＵｌｔｒａｔｕｒａｘ機では、同等の発酵結果は得られない。
【００２５】
グルカンは、モノマー構成単位がグルコースのみであるホモ多糖類の一クラスである。このグルコース分子は、α−グリコシド結合またはβ−グリコシド結合することができ、また様々な程度で分岐することも直鎖状であることもできる。好ましいのは、セルロース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン、リケニン、藻類由来のラミナリン、樹木真菌類由来のパキマンおよびβ−１，３結合を有する酵母グルカン；ニゲラン、真菌類から単離されたマイコデキストラン（α−１，３−グルカン、α−１，４−グルカン）、カードラン（β−１，３−Ｄ−グルカン）、プルラン（α−１，４結合したおよびα−１，６結合したＤ−グルカン）、ならびにシゾフィラン（β−１，３主鎖、β−１，６側鎖）、ならびにプスツラン（β−１，６−グルカン）からなる群から選択されるグルカンである。
【００２６】
グルカンは、好ましくは、β−１，３−グリコシド結合したグルコース単位を構成要素とする主鎖と、該主鎖にβ−１，６−グリコシド結合しかつグルコース単位を構成要素とする側基と、を含む。これらの側基は好ましくは、β−１，６−グリコシド結合した単一のグルコース単位であって、統計的に主鎖が３単位毎にさらなるグルコース単位とβ−１，６−グリコシド結合しているものからなる。供給源および単離方法に応じて、β−グルカンは種々の分岐度と側鎖における結合とを有する。
【００２７】
総じて、ここに特許請求される本発明に関連して、本明細書に記載のβ−グルカンはいかなるβ−グルカンであってもよく、例えばβ−１，４−グルカン、β−１，３−グルカン、β−１，６−グルカンおよびβ−１，３（１，６）−グルカンであることができる。一実施形態において、β−グルカンは、β−Ｄ−（１−３）グルコピラノシル単位の直鎖状主鎖であって、該直鎖状主鎖のβ−Ｄ−グルコピラノシル単位に約０．３の平均分岐度で（１−６）結合した単一のβ−Ｄ−グルコピラノシル単位を有するものからなるポリマーである。ここに特許請求される本発明に関連して、「約０．３の平均分岐度」なる用語は、１０個のβ−Ｄ−（１−３）−グルコピラノシル単位のうち平均で約３個が、単一のβ−Ｄ−グルコピラノシル単位に（１−６）結合していることを意味する。これに関連して、「約」なる用語は、平均分岐度が０．２５〜０．３５の範囲内にあることができ、好ましくは０．２５〜０．３３の範囲内にあることができ、より好ましくは０．２７〜０．３３の範囲内にあることができ、最も好ましくは０．３〜０．３３の範囲内にあることができることを意味する。これは、０．３であっても０．３３であってもよい。β−グルカンの平均分岐度は、当技術分野において知られている方法により測定することができ、例えば周期的な酸化分析、メチル化糖分析およびＮＭＲにより測定することができる（Ｂｒｉｇａｎｄ，Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｇｕｍｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／ＵＳＡ（１９９３），４６１−４７２）。
【００２８】
ここに特許請求される本発明に関連して、本明細書に記載の通りに製造されるべき少なくとも１種のβ−グルカンは好ましくは、シゾフィランおよびスクレログルカンからなる群から選択され、特に好ましくは少なくとも１種のβ−グルカンはシゾフィランである。
【００２９】
シゾフィランおよびスクレログルカンはいずれも、β−１，３−グルカンと呼ぶことができる。シゾフィランおよびスクレログルカンは、０．２５〜０．３３の平均分岐度を有し（Ｎｏｖａｋ、上記文献中；Ｓｕｒｖａｓｅ、上記文献中）；例えばスクレログルカンおよびシゾフィランは、０．３〜０．３３の平均分岐度を有する。これらの多糖類の鎖は通常は、三重らせんの三次元構造を形成し；ポリマー鎖はグルコース単位からなり、これらのグルコース単位の１位および３位のヒドロキシ基がβ結合してポリマー主鎖を形成しており、グルコース単位は３つ毎にさらなるグルコース部分を６位に含んでおり、このさらなるグルコース部分は、そのヒドロキシル官能基によって１位で結合しており（主鎖としてのβ−１，３結合したグルコピラノースおよび側鎖としてのβ−１，６結合したグルコピラノース）、そして、上述のグルコース単位は３つ毎に、構造式：
【化１】
2018504101.tif 000002
［式中、
ｎは、７０００〜３５０００の範囲にある数であり、ここで、ｎは、ＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）により測定される５×１０５ｇ／ｍｏｌ〜２５×１０６ｇ／ｍｏｌの重量平均分子量（Ｍｗ）を有するβ−１，３−グルカン成分を提供する数である］
を有する。
【００３０】
このようなグルカンを分泌する真菌類株は、当業者に知られている。こうした真菌類株は好ましくは、シゾフィルム・コミューネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）、スクレロチウム・ロルフシイ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ）、スクレロチウム・グルカニカム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｇｌｕｃａｎｉｃｕｍ）、モニリニア・フルクチゲナ（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｇｅｎａ）、レンチヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ  ｅｄｏｄｅｓ）およびボトリチス・シネラ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒａ）からなる群から選択される。適切な真菌類株は、例えば欧州特許出願公開第０２７１９０７号明細書（ＥＰ  ０  ２７１  ９０７  Ａ２）および欧州特許出願公開第０５０４６７３号明細書（ＥＰ  ０  ５０４  ６７３  Ａ１）にも挙げられている。使用される真菌類株は、特に好ましくはシゾフィルム・コミューネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）またはスクレロチウム・ロルフシイ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ）であり、極めて特に好ましくはシゾフィルム・コミューネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）である。この真菌株は、β−１，３−グリコシド結合したグルコース単位を構成要素とする主鎖上で統計的に見てこの主鎖が３単位毎にさらなるグルコース単位とβ−１，６−グリコシド結合しているグルカンを分泌し；すなわち、このグルカンは好ましくはいわゆるシゾフィランである。
【００３１】
典型的なシゾフィランは、約５×１０５ｇ／ｍｏｌ〜２５×１０６ｇ／ｍｏｌの重量平均分子量Ｍｗを有する。
【００３２】
これらの真菌類株を、適切な水性媒体または栄養培地中で発酵させる。発酵の過程で、これらの真菌類は水性媒体中に上述のクラスのグルカンを分泌する。
【００３３】
上述の真菌類株の発酵方法は、原則として当業者に知られており、例えば欧州特許出願公開第０２７１９０７号明細書（ＥＰ  ０  ２７１  ９０７  Ａ２）、欧州特許出願公開第０５０４６７３号明細書（ＥＰ  ０  ５０４  ６７３  Ａ１）、独国特許出願公開第４０１２２３８号明細書（ＤＥ  ４０  １２  ２３８  Ａ１）、国際公開第０３／０１６５４５号（ＷＯ  ０３／０１６５４５  Ａ２）および”Ｕｄｏ  Ｒａｕ，”Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｅ，  Ｐｒｏｄｕｋｔｉｏｎ  ｕｎｄ  Ｅｉｇｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ  ｖｏｎ  ｅｘｔｒａｚｅｌｌｕｌａｅｒｅｎ  Ｐｉｌｚ−Ｇｌｕｃａｎｅｎ  ［Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｕｎｇａｌ  ｇｌｕｃａｎｓ］”，  Ｐｏｓｔｄｏｃｔｏｒａｌ  ｔｈｅｓｉｓ，  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，  １９９７”から知られている。これらの文献には、それぞれ適切な水性培地または栄養培地も記載されている。
【００３４】
これらの真菌類株を好ましくは、水性媒体中で、１５℃〜４０℃の範囲の温度で、特に好ましくは２５℃〜３０℃の範囲の温度で、好ましくは通気および撹拌を伴って、例えば撹拌機を用いて、培養する。
【００３５】
これらの真菌類株の効率的な発酵方法を確実なものとするために、発酵はカスケード槽内で行われる。これに関連して、先行する槽内では、後続の槽内での発酵をできるだけ速やかに生じさせるのに適した量の真菌類株と、したがってさらにはそうした体積の水性媒体も、生産される。
【００３６】
例示的な一実施形態によれば、高せん断ミキサーは、ロータとステータとを有するロータ・ステータミキサーである。
【００３７】
これにより、特に混合物を第１の槽から第２の槽へ移送する際に、効率的なせん断プロセスを提供することができる。ロータ・ステータミキサーは、高い通過流容量と確実なせん断特性とを有する。さらに、ロータ・ステータミキサーによってインラインプロセスが可能となる。このことは、混合物が一旦せん断ジオメトリを通ると十分にせん断されることを意味する。例示的な一実施形態によれば、ロータ・ステータミキサーとしては、例えば歯付リムディスパーサー、環状ギャップミルおよびコロイドミルといった種類が挙げられる。
【００３８】
例示的な一実施形態によれば、ロータ・ステータミキサーは、歯付リム分散機である。
【００３９】
これにより、確実なせん断ジオメトリを提供することができる。せん断プロセス後の凝集物が小さすぎる場合、またはせん断の際に凝集物が破壊される場合には、発酵プロセスも効率が低くなりうる。歯付リム分散機によって、凝集物を破壊しすぎることなく十分にせん断することが可能となる。
【００４０】
例示的な一実施形態によれば、キャビテーション力を発生させる手段を有するロータ・ステータミキサーが使用される。この種の手段は、混合チャンバ内に突出したロータ側のおよび／またはステータ側の隆起部であることができ、またこの種の手段は、少なくとも１つの面であって、法線が、接線方向の部分、例えばピン、歯もしくはブレード、または径方向に配置されたスリットを有する同軸リングを有する面を有することができる。
【００４１】
例示的な一実施形態によれば、ロータ・ステータミキサーは、ロータ側に、回転対称に配置された少なくとも１つの歯付リムおよび／または径方向のスリット（歯溝の幅）を有する回転対称に配置された少なくとも１つのリングを有する。この種の装置は、歯付リムディスパーサーまたは歯付リム分散機とも呼ばれる。特に、ロータ・ステータミキサーは、ロータ側とステータ側との双方に、回転対称に配置された少なくとも１つの歯付リムおよび／または径方向のスリット（歯溝の幅）を有するリングを有し、これらのロータ側に配置された歯付リムおよび／またはリングとステータ側に配置された歯付リムおよび／またはリングとが同軸状に互いに噛み合うように配置されることで、環状ギャップが形成される。
【００４２】
例示的な一実施形態によれば、ロータ・ステータミキサーは、中にスリットの入った環状隆起体を有するスタンドと中にスリットの入った環状隆起体を有するロータとに相当する構造を有しており、これらの環状隆起体は、同心状に配置されているとともに、互いに噛み合うような間隔で配置されている。このロータ・ステータミキサーを用いて、ロータを回転させながら水性媒体または混合物をこのスタンド／ステータとロータとの間の中間部分に供給すると、ロータが、この水性媒体または混合物を中間部分のスリットおよびギャップの中央を通じて周囲方向に押す。
【００４３】
例示的な一実施形態によれば、ロータ・ステータミキサーのロータとステータのうちの少なくとも一方は少なくとも２つの同心状の歯付リムを有し、ロータとステータのうちの他方は少なくとも１つの歯付リムを有し、このロータとステータのうちの他方の少なくとも１つの歯付リムは、これらの少なくとも２つの同心状の歯付リムと同心状に交互に配置（ｉｎｔｅｒｌｅａｖｅ）されており、これらの交互に配置された歯付リムを第１の水性媒体が通り抜ける。
【００４４】
これにより、高せん断ミキサーを通る所定の流路を有することが可能である。せん断ジオメトリは、十分に定められたせん断プロセスを可能にするジオメトリを有することができ、その結果、適切なサイズ分布を有する凝集物が得られる。
【００４５】
例示的な一実施形態によれば、ロータとステータのうちの一方の少なくとも２つの同心状の歯付リムと、ロータとステータのうちの他方の少なくとも１つの歯付リムとは、等距離の歯ジオメトリを有し、それぞれの外側の歯付リムの隣接する歯の間隔は、それぞれの内側の歯付リムの隣接する歯の間隔よりも広く、第１の水性媒体は、これらの交互に配置された歯付リムを、歯の間隔が広くなる方向に通り抜ける。
【００４６】
このようにして、ロータ・ステータミキサー内に擬似段階的なせん断プロセスを設けることができる。ロータのすべての歯付リムが同一の毎分回転数で回転するため、径方向外側のリムのトラック速度は、径方向内側のリムのトラック速度よりも高い。径方向外側のリムにおいて歯の間隔がより大きくなるように準備すると、せん断効果を適合させることができ、また特に外側リムにおける凝集物の破壊を回避することができる。さらに、高せん断ミキサーの流路における目詰まり作用を回避することができる。
【００４７】
例示的な一実施形態によれば、第１の混合物はギャップを径方向に通り抜け、ここで、この径方向のギャップは、ロータとステータのうちの一方の少なくとも２つの同心状の歯付リムと、ロータとステータのうちの他方の少なくとも１つの歯付リムとを同心状に交互に配置することによって形成され、この歯付リムの外径と、径方向外側に隣接する歯付リムの内径と、の間のギャップは、０．２ｍｍ〜２．０ｍｍ、好ましくは０．４ｍｍ〜１．２ｍｍ、より好ましくは０．８ｍｍ〜０．９ｍｍの幅を有する。
【００４８】
これにより、せん断ミキサーを離れる際の凝集物のサイズが特定のサイズ範囲となりうる。このサイズ範囲によって、高せん断ミキサーの後の後続の槽内での発酵プロセスが特に効率的となりうる。
【００４９】
例示的な一実施形態によれば、第１の混合物は、ロータとステータのうちの一方の少なくとも２つの同心状の歯付リムと、ロータとステータのうちの他方の少なくとも１つの歯付リムとを通る間に、０．０１秒間〜０．００４秒間、好ましくは０．０２秒間〜０．０７秒間、より好ましくは０．０１秒±０．００５秒間滞留する。
【００５０】
このようにして、せん断プロセスを最適化することができる。混合物がせん断ミキサー中に長く留まるほど、せん断プロセスに要する時間は長くなる。一方で、急速に通った場合には、凝集物が破壊されることがあり、また凝集物サイズが大きすぎて発酵プロセスを効率的に行うことができなくなる可能性もある。
【００５１】
例示的な一実施形態によれば、せん断ジオメトリを通る流路に沿った歯のエッジは、少なくとも０．２ｍｍ、特に３ｍｍ超の半径を有する丸み付けられたエッジを有する。
【００５２】
それによって、凝集物が鋭いエッジと衝突することも、凝集物が切断されることもなくなる。エッジが丸み付けられていることで、凝集物のせん断が可能になると同時に、高せん断ミキサー内で凝集物が意図せず切断されることのないように凝集物が保護される。さらに、特定の凝集物もしくはその一部または他の残留物がせん断ジオメトリ内に残留するのを回避することができる。
【００５３】
例示的な一実施形態によれば、ロータは、ステータに対して、２５０〜７２００ｒｐｍ、好ましくは１８００〜６０００ｒｐｍ、より好ましくは４０００〜４５００ｒｐｍの速度で回転する。
【００５４】
したがって、せん断プロセスは、特に上記のジオメトリおよび寸法の点で効率的であり、また後続の発酵プロセスも効率的である。
【００５５】
例示的な一実施形態によれば、ロータは、２ｍ／ｓ〜６０ｍ／ｓ、好ましくは１５ｍ／ｓ〜５０ｍ／ｓ、より好ましくは３５ｍ／ｓ〜４５ｍ／ｓの、最外側の歯付リムの周速度／トラック速度で回転する。
【００５６】
これにより、高せん断ミキサー内で最大の力を特定の範囲に保持することができる。特に、凝集物は、該凝集物の破壊を招く可能性のある高張力処理を受けない。
【００５７】
例示的な一実施形態によれば、第２の槽の容積に対する第１の混合物の体積の割合は、１％以上２０％以下の範囲にある。
【００５８】
これにより、発酵プロセスをより効率的なものとすることができる。例示的な一実施形態によれば、第２の槽の容積に対する第１の混合物の体積の割合は、２．５％以上１５％以下の範囲にある。
【００５９】
例示的な一実施形態によれば、少なくとも１種のβ−グルカンは、シゾフィランおよびスクレログルカンからなる群から選択され、その際、シゾフィランまたはスクレログルカンは真菌類株の発酵により得られる。例示的な一実施形態によれば、真菌類株は、シゾフィルム・コミューネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）またはスクレロチウム・ロルフシイ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ）である。
【００６０】
例示的な一実施形態によれば、真菌類株の発酵方法は、第３の容積を有する第３の槽をさらに含むカスケード槽内で行われ、本方法はさらに、以下：
ｄ）前記第２の混合物を前記第３の槽へ移送するステップと、
ｅ）前記第３の槽内の第３の水性媒体中で前記第２の混合物中の真菌類株を発酵させるステップと、
を少なくとも含み、
その際、前記第３の槽の容積に対する前記第２の混合物の割合は、０．１％以上５０％以下の範囲にある。
【００６１】
このようにして、さらなるカスケードステップを設けることができる。発酵プロセス全体を改良することができる。２つのせん断プロセスを間に挟んだ３つの発酵ステップによって、真菌類株のより制御された発酵方法が可能となる。方法全体を高速化することができ、また効率を向上させることができる。
【００６２】
例示的な一実施形態によれば、ステップｄ）における第２の混合物を少なくとも１つの高せん断ミキサーに通し、ここで、該高せん断ミキサーは、せん断ジオメトリであって第２の混合物全体が該少なくとも１つの高せん断ミキサーの該せん断ジオメトリを完全に通り抜けるようなせん断ジオメトリを有する。
【００６３】
例示的な一実施形態によれば、第３の槽の容積に対する第２の混合物の割合は、１％以上２０％以下の範囲にあり、特に２．５％以上１５％以下の範囲にある。
【００６４】
高せん断ミキサーは好ましくは、上記のロータ・ステータミキサーおよび高圧ホモジナイザーからなる群から選択される高せん断ミキサーである。
【００６５】
例示的な一実施形態によれば、β−１，３−グリコシド結合した主鎖と該主鎖にβ−１，６−グリコシド結合した側基とを有するグルカンを分泌する真菌類株を、第１の容積を有する第１の槽と、第２の容積を有する第２の槽と、第３の容積を有する第３の槽と、第４の容積を有する第４の槽と、を少なくとも含むカスケード槽内で発酵させる方法であって、以下：
ａ）前記第１の槽内の第１の水性媒体中でかつ前記第１の水性媒体の体積中で前記真菌類株を発酵させて、第１の混合物を生じさせるステップと、
ｂ）前記第１の混合物を前記第２の槽へ移送するステップと、
ｃ）前記第２の槽内の第２の水性媒体中でかつ前記第２の水性媒体の体積中で前記第１の混合物中の真菌類株を発酵させて、第２の混合物を生じさせるステップと、
ｄ）前記第２の混合物を前記第３の槽へ移送するステップと、
ｅ）前記第３の槽内の第３の水性媒体中でかつ前記第３の媒体の体積中で前記第２の混合物中の真菌類株を発酵させて、第３の混合物を生じさせるステップと、
ｆ）前記第３の混合物を前記第４の槽へ移送するステップと、
ｇ）前記第４の槽内の第４の水性媒体中で前記第３の混合物中の真菌類株を発酵させるステップと、
を少なくとも含み、
その際、前記第２の槽の容積に対する前記第１の混合物の体積の割合が、０．１％以上５０％以下の範囲にあり、
前記第３の槽の容積に対する前記第２の混合物の体積の割合が、０．１％以上５０％以下の範囲にあり、かつ
前記第４の槽の容積に対する前記第３の混合物の体積の割合が、０．１％以上５０％以下の範囲にあり、
ステップｂ）における前記第１の混合物を少なくとも１つの高せん断ミキサーに通し、および／または
ステップｄ）における前記第２の混合物を少なくとも１つの高せん断ミキサーに通し、および／または
ステップｆ）における前記第３の混合物を少なくとも１つの高せん断ミキサーに通し、
ここで、前記高せん断ミキサーの少なくとも１つは、せん断ジオメトリであって前記各混合物全体が該少なくとも１つの高せん断ミキサーの該せん断ジオメトリを完全に通り抜けるようなせん断ジオメトリを有する、
前記方法が提供される。
【００６６】
例示的な一実施形態によれば、第２の槽の容積に対する第１の水性媒体の体積の割合は、１％以上２０％以下の範囲にあり、特に２．５％以上１５％以下の範囲にある。
【００６７】
例示的な一実施形態によれば、第３の槽の容積に対する第２の水性媒体の体積の割合は、１％以上２０％以下の範囲にあり、特に２．５％以上１５％以下の範囲にある。
【００６８】
例示的な一実施形態によれば、第４の槽の容積に対する第３の水性媒体の体積の割合は、１％以上２０％以下の範囲にあり、特に２．５％以上１５％以下の範囲にある。
【００６９】
例示的な一実施形態によれば、発酵は、製造すべきグルカンの水性媒体中での濃度が、カスケード反応器の最後の槽内での発酵プロセスの終了時に少なくとも３ｇ／ｌとなるように行われる。上限は、原則的には制限されない。上限は、どのような粘度であれば、使用される槽内での取扱いがなおも可能であるかに応じて決まる。
【００７０】
例示的な一実施形態によれば、移送ステップにおいて使用される高せん断ミキサーは、個々のステップにおいて同一のまたは異なる設計を有する。例示的な一実施形態によれば、個々のステップにおける移送ステップで使用されるロータ・ステータミキサーは、同一または異なる設計を有する。
【００７１】
ロータ・ステータミキサーには原則的に、回転対称であってよい高速ロータがステータと協働することで実質的に環状ギャップの形状の１つ以上のプロセス領域が形成される、あらゆる種類の動的ミキサーも含まれうる。これらのプロセス領域において混合材料は激しいせん断応力を受けるが、一方で、環状ギャップ内で多くの場合優勢である高水準の乱流によっても同様に混合操作が促進される。
【００７２】
さらなる一実施形態において、高せん断ミキサーは、高圧ホモジナイザーである。そのようなミキサー内で、水性媒体は高圧下に小さな開口部を通って押し出される。
【００７３】
好ましくは、この高圧とは、１００バール〜２０００バールの範囲にあり、特に好ましくは２００バール〜１０００バールの範囲にある。
【００７４】
好ましくは、この小さな開口部は、０．５〜２．５ｃｍの範囲の直径を有し、特に好ましくは０．８〜２．０ｃｍの範囲の直径を有する。
【００７５】
さらなる一実施形態において、発酵プロセスの終了時に少なくとも１種のβ−グルカンとバイオマス（細胞成分を含むかまたは含まない真菌類細胞）とを含む発酵ブロスをろ過する。
【００７６】
好ましくは、発酵後の発酵槽の内容物を、非対称的なろ過膜または対称的なろ過膜を用いてろ過する。
【００７７】
あるいは、発酵ブロスを、側流を通じてプラントから連続的にまたは断続的に除去し、そして、少なくとも１種のβ−グルカンを含む水溶液をクロスフロー精密ろ過によってそれから分離する。残りの水性発酵ブロスにおいてはバイオマスが以前よりも高い濃度を有しており、この水性発酵ブロスを、発酵容器に少なくとも部分的に再循環させることができる。
【００７８】
クロスフロー精密ろ過法は原則として当業者に知られており、例えば”Ｍｅｌｉｎ，  Ｒａｕｔｅｎｂａｃｈ，  Ｍｅｍｂｒａｎｖｅｒｆａｈｒｅｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００７，  ｐ．３０９−ｐ．３６６”に記載されている。ここで、「精密ろ過」とは、当業者には、約０．１μｍ〜約１０μｍのサイズを有する粒子の除去を意味するものと理解される。
【００７９】
クロスフローろ過では、ろ過すべき液体流を、例えば適切な循環ポンプによって、ろ材として使用される膜の表面に対して平行に付与する。したがって、液体流がろ過膜上を連続的に流れ、それによって、膜の表面上に堆積物が生じることが妨げられるかまたは少なくとも低減される。原則的には、ポンプとしてあらゆる種類のポンプが適している。しかし、搬送すべき媒体の粘度が高いことから、特に容積移送式ポンプが、極めて特に偏心スクリューポンプおよびロータリーピストンポンプが、有用であることが判明した。
【００８０】
好ましくは、非対称的なろ過膜または対称的な管状膜がクロスフロー精密ろ過に使用される。非対称ろ過膜は、異なる孔径を有する少なくとも２つの異なる層、すなわち少なくとも１つの支持層と分離層とからなる。支持層は比較的厚く、また比較的大きな孔を有する。これによって、ろ過膜に機械的強度が付与される。この支持層に、この支持層の孔よりも微細な孔を有する少なくとも１つの分離層が付与される。孔径の測定に、例えば水銀圧入法を原則的に知られている様式で用いることができる。必要に応じて、この分離層と支持層との間に１つ以上の中間層を配置することもできる。
【００８１】
非対称的な膜は、例えば金属膜またはセラミック膜であることができる。使用される非対称的な膜は、好ましくは非対称的なセラミック膜である。非対称的なセラミック膜の詳細は、例えば”Ｍｅｌｉｎ，  Ｒａｕｔｅｎｂａｃｈ，  Ｍｅｍｂｒａｎｖｅｒｆａｈｒｅｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００７，  ｐ．５１−ｐ．５２”に記載されている。
【００８２】
対称的な管状膜とは、膜壁の断面全体にわたって実質的に一定な孔分布を有する管状膜である。対称的な管状膜は当業者に知られており、特に”Ｍｅｌｉｎ，  Ｒａｕｔｅｎｂａｃｈ，  Ｍｅｍｂｒａｎｖｅｒｆａｈｒｅｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００７，  ｐ．２０”に記載されている。
【００８３】
少なくとも１種のβ−グルカンを含む水溶液の品質が良好であることは、ろ過特性が良好であることから明らかとなるであろう。ろ過特性が良好であることは、ろ過比（ＦＲ値）が低いことにより表される。好ましい一実施形態において、生成物のＦＲ値は、好ましくは１．０以上１．８以下の範囲にあることができ、より好ましくは１．０以上１．５以下の範囲にあることができ、さらにより好ましくは１．０以上１．３以下の範囲にあることができる。
【００８４】
他の好ましい実施形態において、ろ過後の少なくとも１種のβ−グルカンの収率、すなわち、ろ過前に発酵ブロス中に存在する少なくとも１種のβ−グルカンの量に対する発酵ブロスから回収することができる少なくとも１種のβ−グルカンの量は、好ましくは２５％以上９７％以下の範囲にあり、より好ましくは３０％以上９５％以下の範囲にあり、最も好ましくは５０％以上９３％以下の範囲にある。
【００８５】
少なくとも１種のβ−グルカンを含む水溶液をさらに後処理して濃縮することで、少なくとも１種のβ−グルカンを高濃縮された形態で得ることができる。一実施形態において、少なくとも１種のβ−グルカンを含む水溶液を少なくとも１種の沈殿剤と接触させることで、水と少なくとも１種の沈殿剤とを含む溶媒混合物中で、沈殿した少なくとも１種のβ−グルカンを得ることができる。好ましくは、少なくとも１種の沈殿剤は、低沸点液体、高沸点液体およびそれらの混合物からなる群から選択される。低沸点液体の例としては、ギ酸エステル類、例えばギ酸メチル、非環式エーテル類、例えばジメトキシメタン、環状エーテル類、例えばテトラヒドロフラン、２−メチル−１，２−ジオキソラン、カルボン酸エステル類、例えば酢酸エチルエステル、アルコール類、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノールもしくはプロパノール、ケトン類、例えばアセトンもしくはメチルエチルケトン、またはそれら少なくとも２種の混合物が挙げられる。高沸点液体の例としては、好ましくは１０〜２００ｋＤの範囲内の、より好ましくは１５〜１２０ｋＤの範囲内の分子量を有するポリエチレングリコール、５〜１００ｋＤの範囲内の、より好ましくは１０〜３０ｋＤの範囲内の分子量を有するポリプロピレングリコール、またはそれら少なくとも２種の混合物が挙げられる。総じて、少なくとも１種の沈殿剤と少なくとも１種のβ−グルカンを含む水溶液との体積比が、得られる混合物全体を基準としてそれぞれ、好ましくは０．１：１〜２０：１の範囲となり、より好ましくは０．２：１〜２：１の範囲となり、最も好ましくは０．２：１〜１．５：１の範囲となるように、該沈殿剤を該水溶液に加える。
【００８６】
沈殿した少なくとも１種のβ−グルカンを、水と少なくとも１種の沈殿剤とを含む溶媒混合物から分離することで、沈殿したβ−グルカンを高濃縮された形態で得ることができる。この分離を、総じて当業者に知られているいずれの方法によって行うこともでき、例えば特に、遠心分離、沈降、浮選およびろ過により行うことができる。
【００８７】
特許請求される方法により得られるβ−グルカン、例えばシゾフィランを、ろ過し、そして必要に応じて濃縮した後に、さらに変性させることができる。β−グルカン、例えばシゾフィランを、酸化、酵素転化、酸加水分解、熱および／または酸デキストリン化またはせん断によって転化させることができる。β−グルカン、例えばシゾフィランを、化学的、酵素的または物理的に変性させることもできる。シゾフィランの適切な化学的誘導体としては例えば、エステル類、例えば酢酸エステルおよび半エステル類、例えばコハク酸エステル、オクテニルコハク酸エステルおよびテトラデセニルコハク酸エステル、リン酸誘導体、エーテル類、例えばヒドロキシアルキルエーテル類およびカチオン性エーテル類、もしくは任意の他の誘導体またはそれらの組み合わせが挙げられる。変性は、化学的架橋であってもよい。本発明における使用に適した架橋剤としては例えば、オキシ塩化リン、エピクロロヒドリン、トリメタリン酸ナトリウムおよびアジピン酸／酢酸混合無水物が挙げられる。
【００８８】
上記の特徴が組み合わせられることもできることに留意すべきである。詳細な明示がなくとも、上記の特徴の組み合わせによって相乗効果が奏されることもある。
【００８９】
本発明のこれらのおよび他の態様は、以下に記載する実施形態から明らかとなり、また、本発明のこれらのおよび他の態様を、以下に記載する実施形態を参照して説明する。
【００９０】
本発明の例示的な実施形態を、以下の図面を参照して以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、例示的な一実施形態による、１つのせん断プロセスを間に挟んだ２ステップの発酵プロセスを示す。
【図２】図２は、例示的な一実施形態による、２つのせん断プロセスを間に挟んだ３ステップの発酵プロセスを示す。
【図３】図３は、例示的な一実施形態による、３つのせん断プロセスを間に挟んだ４ステップの発酵プロセスを示す。
【図４】図４は、例示的な一実施形態による高せん断混合ジオメトリの断面図を示す。
【図５】図５ａは、例示的な一実施形態による高せん断混合ミキサーのロータとステータのうちの一方の上面図を示す。図５ｂは、図５ａによる一実施形態による高せん断ミキサーのロータとステータのうちの他方の上面図を示す。
【図６】図６は、例示的な一実施形態による高せん断ミキサーのジオメトリの断面図の詳細な一部分を示す。
【図７】図７は、モルホロジ制御を行う／行わない実験用発酵槽についての経時的な空時収率の例示的なチャートを示す。
【図８】図８は、モルホロジ制御を行う／行わないパイロットプラント発酵槽についての経時的な空時収率の例示的なチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
例示的な実施形態の詳細な説明
図１は、例示的な一実施形態による１つのせん断プロセスを間に挟んだ２ステップの発酵プロセスを示す。図１は特に、槽とせん断ミキサー構造体との全般的なセットアップを示す。第１の槽Ｋ１は第１の槽の容積ＶＫ１を有し、第１の水性媒体Ｍ１が収容される。この第１の水性媒体Ｍ１中で真菌類株の発酵を行うことで、第１の混合物Ｓ１が得られる。発酵の間に、これらの真菌類株は凝集物を形成する。これらの真菌類株の凝集物を含む第１の混合物Ｓ１を、第２の槽の容積ＶＫ２を有する第２の槽Ｋ２へ移送する。この第１の混合物Ｓ１に第２の水性媒体Ｍ２を加えることができ、その結果、この第２の槽内の第２の水性媒体中の第１の混合物中の真菌類株のさらなる発酵が生じ、それによって第２の混合物Ｓ２が生じる。第１の槽Ｋ１から第２の槽Ｋ２へと移送する前の第１の混合物中の凝集物は大きく、第２の槽内での効率的な発酵プロセスを許容しないため、第１の混合物Ｓ１は、第１の槽Ｋ１と第２の槽Ｋ２との間に配置された高せん断ミキサー１を通って流れる。第２の槽の容積ＶＫ２に対する第１の混合物の体積ＶＭ１の割合は、０．１％〜５０％の範囲にある。高せん断ミキサー１は、せん断ジオメトリの点で、第１の混合物Ｓ１全体が該高せん断ミキサー１のせん断ジオメトリを完全に通り抜けるような種類のものである。高せん断ミキサーの詳細なジオメトリについては、図４、図５ａ、図５ｂおよび図６に関連して後述する。
【００９３】
図２は、例示的な一実施形態による２つのせん断プロセスを間に挟んだ３ステップの発酵プロセスを示す。図２は、第１の槽の容積ＶＫ３１を有する第１の槽Ｋ３１を示す。この第１の槽の容積ＶＫ３１中に、第１の水性媒体Ｍ３１が存在する。この第１の槽の容積ＶＫ３１中の第１の水性媒体Ｍ３１中で真菌類株の発酵を行うことで、第１の混合物Ｓ３１が生じる。この第１の混合物Ｓ３１を、第２の槽の容積ＶＫ３２を有する第２の槽Ｋ３２へ移送する。この第２の槽の容積ＶＫ３２中の第１の混合物Ｓ３１に水性媒体Ｍ３２を加えることで、この第２の水性媒体Ｍ３２中の第１の混合物中の真菌類株の発酵が生じる。これらの真菌類株は、この第１の槽内での発酵の間に凝集物を形成するため、これらの凝集物のサイズを、例えば、第１の槽Ｋ３１と第２の槽Ｋ３２との間に配置された高せん断ミキサー１によるせん断プロセスによって低減すべきである。その結果、第１の混合物Ｓ３１が高せん断ミキサー１を通って流れてせん断され、次いで第２の槽Ｋ３２に入る。この第２の槽Ｋ３２の容積に対する第１の混合物の体積ＶＭ３１の割合は、０．１％〜５０％の範囲にあることができる。第１の混合物Ｓ３１は高せん断ミキサー１を完全に通り抜け、ここで、該高せん断ミキサー１は、せん断ジオメトリであって該第１の混合物Ｓ３１全体が該高せん断ミキサー１の該せん断ジオメトリを完全に通り抜けるようなせん断ジオメトリを有する。このことは、せん断ミキサーが、流れのジオメトリを有することを意味する。第１の混合物中でかつ第２の水性媒体Ｍ３２中で真菌類株をさらに発酵させた後、得られる第２の混合物Ｓ３２を第３の槽Ｋ３３へ移送する。再び形成される凝集物を、第３の槽Ｋ３３に入る前に再度せん断する目的で、この第２の混合物Ｓ３２はさらなる高せん断ミキサー１を通る。第３の槽内で、この第２の混合物Ｓ３２を第３の水性媒体Ｍ３３に加えることで、この第３の槽Ｋ３３の容積ＶＫ３３中でさらなる発酵が生じうる。
【００９４】
図３は、例示的な一実施形態による３つのせん断プロセスを間に挟んだ４ステップの発酵プロセスを示す。第１の槽Ｋ４１における容積ＶＫ４１中での第１の水性媒体Ｍ４１中の真菌類株を発酵させることで、第１の混合物Ｓ４１が得られる。発酵プロセスの間に、真菌類株は凝集物を形成する。これらの凝集物によって効率的なさらなる発酵ができなくなる可能性があるため、第２の槽の容積ＶＫ４２を有する第２の槽Ｋ４２内でのさらなる発酵を開始する前に、これらの凝集物をせん断すべきである。したがって、第１の混合物Ｓ４１を第２の槽Ｋ４２へ移送し、この第１の混合物Ｓ４１は、移送の間に、第１の槽Ｋ４１と第２の槽Ｋ４２との間の高せん断ミキサー１を通る。これらのせん断された凝集物を含む第１の混合物Ｓ４１を第２の水性媒体Ｍ４２に加えることで、さらなる発酵が生じることができ、それによって第２の混合物Ｓ４２が得られる。次いで、この第２の混合物Ｓ４２を、第３の槽の容積ＶＫ４３を有する第３の槽Ｋ４３へ移送する。この第２の混合物Ｓ４２は高せん断ミキサー１を通り、その結果、第２の発酵の間に形成される凝集物がせん断される。この第３の槽Ｋ４３内の第２の混合物を、第３の水性媒体Ｍ４３に加える。これによって、槽の容積ＶＫ４３中で第３の発酵プロセスが行われることができ、それによって第３の混合物Ｓ４３が得られる。この第３の混合物Ｓ４３も凝集物を含むことがあり、これらの凝集物によってさらなる発酵の効率が低下しうる。したがって、この第３の混合物Ｓ４３も、第４の槽の容積ＶＫ４４を有する第４の槽Ｋ４４に入る前に高せん断ミキサー１を通る。第４の槽の容積ＶＫ４４中で、第４の水性媒体Ｍ４４に第３の混合物Ｓ４３を加える。この第４の槽の容積ＶＫ４４中で、さらなる発酵が生じうる。
【００９５】
明示はされていないが、図３に関して上述した４つのステップを上回るステップを有する発酵プロセスを提供することも可能であることに留意すべきである。２つのそれぞれの槽の間の高せん断ミキサー１は、発酵後のそれぞれの槽内の凝集物の予想される構造に応じて異なる仕様を有しうることに留意すべきである。
【００９６】
さらに、上述の図１、図２および図３の３つの実施形態のいずれにおいても、第２の槽の容積ＶＫ２、ＶＫ３２、ＶＫ４２に対する第１の混合物の体積ＶＭ１、ＶＭ３１、ＶＭ４１の割合は、０．１％〜５０％の範囲でありうることに留意すべきである。さらに、図１、図２および図３に関する上述の３つの実施形態のいずれに関しても、第２の槽の容積ＶＫ２、ＶＫ３２、ＶＫ４２に対する第１の混合物の体積ＶＭ１、ＶＭ３１、ＶＭ４１の割合は、１％〜２０％の範囲でありうることに留意すべきである。
【００９７】
さらに、図２および図３に関して記載した実施形態、すなわち３ステップの発酵プロセスおよび４ステップの発酵プロセスに関して、第３の槽の容積ＶＫ３３、ＶＫ４３に対する第２の混合物Ｓ３２、Ｓ４２の割合は、０．１％〜５０％の範囲にあることができ、特に１％〜２０％の範囲でありうることに留意すべきである。
【００９８】
さらに、図３に関して記載した実施形態における第４の槽の容積ＶＫ４４に対する第３の混合物Ｓ４３の割合は、０．１％〜５０％の範囲にあることができ、特に１％〜２０％の範囲でありうることに留意すべきである。
【００９９】
図４は、一実施形態による高せん断混合ジオメトリの断面図を示す。示される図４の実施形態による高せん断ミキサーは、ロータ１０とステータ２０とを含む。このロータは、複数の歯１３を有する第１の歯付リム１１を有する。このロータ１０はさらに第２の歯付リム１２を有し、この第２の歯付リム１２も複数の歯１３を含む。ステータ２０も、複数の歯２３を有する第１の歯付リム２１を有する。さらに、このステータは第２の歯付リム２２を有し、この第２の歯付リム２２も複数の歯２３を含む。これらの歯付リム１１、１２、２１、２２のそれぞれの歯は、高せん断ミキサー１の回転軸と同心状の１つの円に沿って配置されている。このロータの歯付リム１１、１２とステータの歯付リム２１、２２とは、歯自体とロータ本体およびステータ本体のそれぞれとの間にギャップ２が形成されるように交互に配置されている。せん断すべき混合物を例えばロータ１０の貫通孔を通じて供給し、これが図４中の二重矢印に沿って流れることで、混合物Ｓ１が、隣接するリムの歯の間でせん断される。この混合物Ｓ１の供給をステータの貫通孔を通じて行うこともできることに留意すべきであるが、但しこの規定は図４には明示されていない。さらに、ロータの歯付リムの数およびステータの歯付リムの数は２を上回りうることに留意すべきである。
【０１００】
図５ａは、一実施形態による高せん断ミキサーのロータとステータのうちの一方の上面図を示す。特に図５ａは、複数の歯１３を含む第１の歯付リム１１を有するロータ１０を示す。さらに、このロータには第２の歯付リム１２が設けられている。図５ａに示す構成は、ステータについての構成でもありうることに留意すべきである。第１および第２の歯付リム１１、１２の歯１３は、周方向でのこれらの歯の幅およびそれらの間のギャップの幅と同様に、異なっていてもよい。
【０１０１】
図５ｂは、図５ａによる一実施形態による高せん断ミキサーのロータとステータのうちの他方の、特にステータ２０の、上面図を示す。ステータ２０は、複数の歯２３を有する少なくとも１つのリム２１を有する。図５ａと図５ｂとの間の点線によって分かるように、図４に示すように対にして合わせた場合に、ロータ１０の歯付リムとステータ２０の歯付リムとは、交互に配置されている。
【０１０２】
図６は、例示的な一実施形態による高せん断ミキサーのジオメトリの断面図の詳細な一部分を示す。図６は、歯付リムのそれぞれの歯を有するロータ１０およびステータ２０を示す。ロータ１０および／またはステータ２０は、類似のジオメトリを有するさらなる歯付リムを有しうることに留意すべきである。ロータ１０およびステータ２０の歯付リム１１および２１の歯１３および２３はそれぞれ、丸み付けられたエッジを有する。これらのエッジは、これらの歯とステータ本体との間での、またはこれらの歯とロータ本体との間での、さらにはこれらの歯とギャップ２との間での、スムーズな移行が提供されるような半径Ｒを有する。これらの丸み付けられたエッジ１４、２４によって混合物の凝集物に対する衝撃が低減され、それによって、凝集物が歯１３、２３の鋭いエッジによって切断または破壊されて発酵プロセスが悪化する、ということが起こらなくなる。これらの丸み付けられたエッジを、特に隣接するリムの歯の間のエッジに設けることができることに留意すべきである。さらに、丸み付けられたエッジを、単一のリムの隣接する歯の間に設けることもできる。ギャップ２の幅が多少なりとも連続するように、隣接するリムの歯の半径Ｒを互いに適合させることができる。
【実施例】
【０１０３】
例
使用したシゾフィルム・コミューネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）株は、欧州特許第０５０４６７３号明細書（ＥＰ  ０  ５０４  ６７３）に開示されている。前培養物および本培養物に適した栄養培地ならびに培養条件は、例えば、欧州特許第５０４６０７３号明細書（ＥＰ  ５０４  ６０７３）、欧州特許第０２７１９０７号明細書（ＥＰ  ０  ２７１  ９０７）および”Ｐｒｏｃｅｓｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄａｔａ  ｏｆ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  １，３−β−Ｄ−ｇｌｕｃａｎｓ  ｉｎ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｘａｎｔｈａｎ，  Ｕ．  Ｒａｕ，  Ｒ．  −Ｊ．  Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｋ．  Ｃｏｒｄｅｓ，  Ｊ．  Ｋｌｅｉｎ，  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  １９９０，  Ｖｏｌｕｍｅ  ５，  Ｉｓｓｕｅ  ２，  ｐｐ  ８９−９３”および”Ｕｄｏ  Ｒａｕ，”Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｅ，  Ｐｒｏｄｕｋｔｉｏｎ  ｕｎｄ  Ｅｉｇｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ  ｖｏｎ  ｅｘｔｒａｚｅｌｌｕｌａｅｒｅｎ  Ｐｉｌｚ−Ｇｌｕｃａｎｅｎ  ［Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｕｎｇａｌ  ｇｌｕｃａｎｓ］”，  Ｐｏｓｔｄｏｃｔｏｒａｌ  ｔｈｅｓｉｓ，  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，  １９９７”に供覧されている。
【０１０４】
使用する栄養培地：３０ｇ／ｌグルコース、３ｇ／ｌ酵母抽出物、１ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
１．前培養
株の保持およびバイオマスの培養については、例えば”Ｏｘｙｇｅｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  β−１，３−ｇｌｕｃａｎｓ，  Ｕ．  Ｒａｕ，  Ｃ．  Ｂｒａｎｄｔ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９４，  Ｖｏｌｕｍｅ  １１，  Ｉｓｓｕｅ  ４，  ｐｐ  １６１−１６５”に記載されている。移送時の体積比は、約５％であった。
【０１０５】
前培養のすべての槽を、ｐＯ２が常に６０％を上回るように一定の速度およびガス処理速度で運転した。グルコースが５ｇ／ｌ未満に低下することのないように、前培養の期間を選択した。
【０１０６】
２．本培養
本培養を、酸素制限条件下で文献に記載された方法にしたがって行った。本培養の手順は、例えば”Ｏｘｙｇｅｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  β−１，３−ｇｌｕｃａｎｓ，  Ｕ．  Ｒａｕ，  Ｃ．  Ｂｒａｎｄｔ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９４，  Ｖｏｌｕｍｅ  １１，  Ｉｓｓｕｅ  ４，  ｐｐ  １６１−１６５”、”Ｕｄｏ  Ｒａｕ，”Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｅ，  Ｐｒｏｄｕｋｔｉｏｎ  ｕｎｄ  Ｅｉｇｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ  ｖｏｎ  ｅｘｔｒａｚｅｌｌｕｌａｅｒｅｎ  Ｐｉｌｚ−Ｇｌｕｃａｎｅｎ  ［Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｕｎｇａｌ  ｇｌｕｃａｎｓ］”，  Ｐｏｓｔｄｏｃｔｏｒａｌ  ｔｈｅｓｉｓ，  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，  １９９７”および”  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄａｔａ  ｏｆ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  １，３−β−Ｄ−ｇｌｕｃａｎｓ  ｉｎ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｘａｎｔｈａｎ，  Ｕ．  Ｒａｕ，  Ｒ．  −Ｊ．  Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｋ．  Ｃｏｒｄｅｓ，  Ｊ．  Ｋｌｅｉｎ，  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  １９９０，  Ｖｏｌｕｍｅ  ５，  Ｉｓｓｕｅ  ２，  ｐｐ  ８９−９３”に記載されている。
【０１０７】
３．ロータ・ステータミキサーを用いた、本培養への前培養物の移送
独国特許出願公開第４０１２２３８号明細書（ＤＥ  ４０１２２３８  Ａ１）記載のバイパスにおける歯車ポンプの使用による本培養における体積当たりの生産性の増加は、再現できなかった。実験では、独国特許出願公開第４０１２２３８号明細書（ＤＥ  ４０１２２３８  Ａ１）記載のバイパスによる再循環によって、本培養における体積当たりの生産性が著しく低下するという、逆の効果が観察された。
【０１０８】
驚くべきことに、前培養物を本培養へと移送する際に連続運転されるロータ・ステータミキサーを使用することでＳＴＹが著しく増加することが判明した。この実験では、Ｃａｖｉｔｒｏｎからのロータ・ステータミキサーであるチャンバシステムを備えたベンチ機器ＣＤ  １０００を使用し、これを５〜２０  ｌ／分で、周速度３〜５０ｍ／ｓで運転させた。
【０１０９】
ロータ・ステータミキサーを、カスケード反応器内の前培養の最後の槽から本培養槽への管路に組み込み、挿入前に蒸気滅菌することにより無菌操作ができるようにした。
【０１１０】
４．空時収率の測定
文献に記載された方法を用いて７２時間の運転後に採取したサンプル中のグルカンの濃度を測定することによって、空時収率（ＳＴＹ）（これは体積当たりの生産性とも呼ばれる）を決定した。測定した濃度を、サンプルを採取するまでの運転時間（７２時間）で除すことで、空時収率が求められる。簡略化のために、相対的ＳＴＹを示す。高せん断ミキサーを使用せずに達成されたＳＴＹを、１００％とした。
【０１１１】
５．ろ過比（ＦＲ値）の決定
測定原理：
ろ過比（ＦＲ値）の決定において、所定のフィルタを通り抜けるろ液の量を、時間の関数として求める。ＦＲ値を、下記の式（Ｉ）
ＦＲ＝（ｔ１９０ｇ−ｔ１７０ｇ）／（ｔ７０ｇ−ｔ５０ｇ）          （Ｉ）
にしたがって求め、ここで、変数および等式は以下の意味を有する：
ｔ１９０ｇ＝ろ液１９０ｇが得られる時間、
ｔ１７０ｇ＝ろ液１７０ｇが得られる時間、
ｔ７０ｇ＝ろ液７０ｇが得られる時間、
ｔ５０ｇ＝ろ液５０ｇが得られる時間。
【０１１２】
したがって、それぞれろ液２０ｇが通って流れるのに必要な期間、すなわちろ過プロセスにおける早い時点と遅い時点での期間をそれぞれ求め、これら２つの期間から商を算出する。ＦＲ値が大きいほど、ろ過プロセスの継続時間の経過とともにろ過速度が遅くなる。このことは、例えばゲルまたは粒子によるフィルタの目詰まりの増加を示す。
【０１１３】
ＦＲ値を、以下の方法により求める：
５．１．装置
ａ）Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ加圧ろ過装置１６２４９；フィルタ直径４７ｍｍ；２００ｍｌ温浸シリンダ（φｉ＝４１ｍｍ）
ｂ）Ｉｓｏｐｏｒｅメンブレン１．２μｍ；φ４７ｍｍ；Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅより入手可能なＮｏ．ＲＴＴＰ０４７００
ｃ）秤量装置。
【０１１４】
５．２．グルカン溶液の調製
まず、実験から得られたグルカン溶液と水との混合物５０ｇを、すなわちグルカンの濃度が１．７５ｇ／ｌとなるような比で、調製する。この混合物を１０分間撹拌し、均質性について目視により検査する。この混合物がまだ不均質である場合には、この混合物が均質になるまでさらに撹拌を行う。次いで、この混合物を、超純水２００ｇを用いて総量が２５０ｇとなるようにする。その後、均質化のために少なくとも１時間にわたって撹拌を行い、その後、０．１Ｍ  ＮａＯＨによりｐＨを６．０に調整し、次いで再度１５分間撹拌を行う。ｐＨが６．０であることを再度確認する。この混合物中でのグルカンの最終濃度は、０．３５ｇ／ｌである。
【０１１５】
５．３．ろ過試験の実施
ろ過試験を、室温（Ｔ＝２５℃）で１．０バールの圧力（圧縮空気またはＮ２）で行う。
【０１１６】
・篩トレイ上に、目の粗い支持格子を配置する
・篩トレイ上に、目の細かい支持格子を配置する
・上にメンブレンフィルタを配置する
・シール（Ｏリング）を挿入する
・シリンダに篩トレイおよび出口タップをねじ止めする
・出口タップを閉鎖する
・溶液２２０ｇ（約２２０ｍｌ）を導入する
・シリンダに上部カバーをねじ止めする
・給気管上にクランプ止めする
・圧力を確認し、１．０バールに調整する
・ろ過装置の下方の秤量装置にビーカーを載置する。風袋を押す
・出口タップを開放する
・これ以上ろ液が出てこなくなったら、試験を停止する。
【０１１７】
秤量装置によって、ろ液の量を時間の関数として測定する。それぞれの場合に示された質量を目視により読み取るが、もちろん自動的に読み取ることもでき、そして評価する。
【０１１８】
図７は、モルホロジ制御を行う／行わない実験用発酵槽についての相対的な経時的空時収率の例示的なチャートを示す。図７から分かるように、モルホロジ制御を行う実験室用発酵槽は、モルホロジ制御を行わない実験室用発酵槽よりも高い相対的空時収率を示す。したがって、モルホロジ制御を行う実験室用発酵槽の効率は、モルホロジ制御を行わない実験室用発酵槽よりも高い。具体的には、図７は、３段階の前培養を伴う実験室規模（２１  ｌ）での製造に関する相対的ＳＴＹの比較を示す。ペレットまたは凝集物の形成を回避すべくモルホロジ制御を行った場合には、ＳＴＹが著しく増加することが分かる。
【０１１９】
図８は、モルホロジ制御を行う／行わないパイロットプラント発酵槽についての相対的な経時的空時収率の例示的なチャートを示す。図８から分かるように、モルホロジ制御を行うパイロットプラント規模の発酵槽の相対的空時収率は、モルホロジ制御を行わないパイロットプラント規模の発酵槽の相対的空時収率より若干高い。具体的には、図８は、３段階の前培養を伴うパイロットプラント規模（３ｍ３）での製造に関する相対的ＳＴＹの比較を示す。ペレット／凝集物の形成を回避すべくモルホロジ制御を行った場合には、ＳＴＹが著しく増加することが分かる。
【符号の説明】
【０１２０】
参照リスト：
１  高せん断ミキサー
２  ギャップ
１０  ロータ
１１  ロータの歯付リム
１２  ロータの歯付リム
１３  ロータの歯付リムの歯
１４  歯のエッジ
２０  ステータ
２１  ステータの歯付リム
２２  ステータの歯付リム
２３  ステータの歯付リムの歯
２４  歯のエッジ
Ｋ１  第１の槽
Ｋ２  第２の槽
Ｋ３１  第１の槽
Ｋ３２  第２の槽
Ｋ３３  第３の槽
Ｋ４１  第１の槽
Ｋ４２  第２の槽
Ｋ４３  第３の槽
Ｋ４４  第４の槽
Ｍ１  第１の水性媒体
Ｍ２  第２の水性媒体
Ｍ３１  第１の水性媒体
Ｍ３２  第２の水性媒体
Ｍ３３  第３の水性媒体
Ｍ４１  第１の水性媒体
Ｍ４２  第２の水性媒体
Ｍ４３  第３の水性媒体
Ｍ４４  第４の水性媒体
Ｓ１  第１の物質
Ｓ２  第２の物質
Ｓ３１  第１の混合物
Ｓ３２  第２の混合物
Ｓ４１  第１の混合物
Ｓ４２  第２の混合物
Ｓ４３  第３の混合物
ＶＫ１  第１の槽の容積
ＶＫ２  第２の槽の容積
ＶＫ３１  第１の槽の容積
ＶＫ３２  第２の槽の容積
ＶＫ３３  第３の槽の容積
ＶＫ４１  第１の槽の容積
ＶＫ４２  第２の槽の容積
ＶＫ４３  第３の槽の容積
ＶＫ４４  第４の槽の容積
ＶＭ１  第１の水性媒体の体積
ＶＭ２  第２の水性媒体の体積
ＶＭ３１  第１の水性媒体の体積
ＶＭ３２  第２の水性媒体の体積
ＶＭ３３  第３の水性媒体の体積
ＶＭ４１  第１の水性媒体の体積
ＶＭ４２  第２の水性媒体の体積
ＶＭ４３  第３の水性媒体の体積
ＶＭ４４  第４の水性媒体の体積
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ−５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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