(57)【要約】本発明は、T細胞シグナル誘導陰性のキメラ抗原受容体（N-CARまたはi-CAR）、およびそのようなN-CARとT細胞シグナル誘導陽性のCAR（P-CAR）とを含むT細胞に関し、治療におけるそれらの使用にも関する。2018504104.tif 000028
2018504104.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン；
膜貫通ドメイン；
細胞内ドメイン
を含み、かつ阻害性伝達シグナルの誘導に関与するポリペプチド配列を含む、阻害性キメラ抗原受容体（N-CAR）であって、
該ポリペプチド配列が、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）受容体に由来する少なくとも1種の配列、またはCD200受容体1に由来する少なくとも1種の配列を含む、阻害性キメラ抗原受容体（N-CAR）。
【請求項２】
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）受容体に由来するポリペプチド配列を含む、請求項1記載のN-CAR。
【請求項３】
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）、およびそれらの断片からなるリストより選択されるポリペプチド配列に由来する少なくとも1種のポリペプチド配列を含む、請求項1または2記載のN-CAR。
【請求項４】
前記ポリペプチド配列が、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、もしくはSEQ ID NO：35、またはそれらの断片に由来する配列と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する、請求項1〜3のいずれか一項記載のN-CAR。
【請求項５】
ポリペプチド配列：SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）に由来するアミノ酸番号181〜386、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）に由来するアミノ酸番号230〜468、もしくはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）に由来するアミノ酸番号179〜440、またはそれらの断片のうちの少なくとも1種を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のN-CAR。
【請求項６】
抗原結合ドメインが細胞表面抗原Nに結合し、Nががん性細胞において発現されず、Nが非がん性細胞または健常細胞において発現され、非がん性細胞または健常細胞がP抗原も発現し、P抗原ががん性細胞においても発現されるかまたは過剰発現される、請求項1〜5のいずれか一項記載のN-CAR。
【請求項７】
抗原結合ドメインが、CD56、CD205、CD83、CD206、CD200、CD36、トロポニンC、β1インテグリン、CCKBR、GALR1、CUBN、CD4、CD20、CD22、CD25、MUC1、CD19、BCMA、およびPSMAより選択される少なくとも1種の細胞表面抗原Nに結合する、請求項1〜6のいずれか一項記載のN-CAR。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれか一項記載のN-CARをコードするベクター。
【請求項９】
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン；
膜貫通ドメイン；
細胞内ドメイン
を含むP-CARと、請求項1〜7のいずれか一項記載のN-CARとを含む、免疫細胞、好ましくは初代免疫T細胞。
【請求項１０】
TCRαサブユニットまたはTCRβサブユニットをコードする少なくとも1種の遺伝子が、好ましくは特異的なエンドヌクレアーゼを使用した欠失によって、不活化されている、請求項9記載の免疫細胞。
【請求項１１】
TCRをコードする少なくとも1種の遺伝子およびデオキシシチジンキナーゼ（dck）をコードする遺伝子が、エンドヌクレアーゼ、好ましくはTALENを好ましくは使用した欠失によって、不活化されている、請求項9または10のいずれか一項記載の免疫細胞。
【請求項１２】
医薬として使用するための、請求項9〜11のいずれか一項記載の免疫細胞。
【請求項１３】
血液がん状態、好ましくは、再発性難治性血液がんの防止または処置において使用するための、請求項12記載の免疫細胞。
【請求項１４】
血液がん状態が、白血病または骨髄腫、好ましくは、再発性かつ/もしくは難治性の白血病、または再発性かつ/もしくは難治性の骨髄腫である、請求項13記載の免疫細胞。
【請求項１５】
（d）免疫細胞を準備し、任意で、好ましくはTCRAおよびdCKである候補遺伝子を欠失させる工程；
（e）本発明によるN-CARおよびP-CARを細胞表面において発現させる工程；ならびに
（f）任意で、好ましくはTCRA、PD1、CTLA4、およびdCKより選択される候補遺伝子を欠失させる工程
を含む、請求項9〜14のいずれか一項記載の免疫細胞を操作する方法。
【請求項１６】
免疫細胞が、ドナー、好ましくは健常ドナーから提供される、請求項15記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、T細胞シグナル誘導陰性のキメラ抗原受容体（N-CARまたはi-CAR）、およびそのようなN-CARとT細胞シグナル誘導陽性のCAR（P-CAR）とを含むT細胞に関し、治療におけるそれらの使用にも関する。具体的には、本発明は、少なくとも1種のN-CARと少なくとも1種のP-CARとを発現するよう操作された免疫細胞に関し、P-CARは、第1の抗原に結合し、免疫応答細胞（即ち、細胞傷害）を活性化する一方、N-CARは、第2の抗原に結合し、TRAIL受容体またはCD200R1受容体に由来する配列のシグナリングを通して免疫応答細胞（即ち、細胞傷害）を阻害する。
【０００２】
本発明は、T細胞シグナル誘導陰性のキメラ抗原受容体（N-CARまたはi-CAR）、およびそのようなN-CARとT細胞シグナル誘導陽性のCAR（P-CAR）とを含むT細胞に関し、治療におけるそれらの使用にも関する。具体的には、本発明は、少なくとも1種のN-CARと少なくとも1種のP-CARとを発現するよう操作された免疫細胞に関し、P-CARは、第1の抗原に結合し、免疫応答細胞（即ち、細胞傷害）を活性化する一方、N-CARは、第2の抗原に結合し、非T細胞において通常発現される配列のシグナリングを通して免疫応答細胞（即ち、細胞傷害）を阻害し、但し、該配列は、ITSMではなく、好ましくは、SEQ ID NO：13（ヒトSIGL8）、SEQ ID NO：14（ヒトSIGL7）、SEQ ID NO：17（ヒトSIGL5）、SEQ ID NO：20（ヒトSIGL9）、SEQ ID NO：21（ヒトSIGL6）、SEQ ID NO：22（ヒトCD33）、SEQ ID NO：26（ヒトSIG12）、SEQ ID NO：31（ヒトSIG11）、SEQ ID NO：32（ヒトSIG10）、およびSEQ ID NO：19（ヒトPECA1）からなる群において選択される配列ではないか、または該配列は、SEQ ID NO：13（ヒトSIGL8）、SEQ ID NO：14（ヒトSIGL7）、SEQ ID NO：17（ヒトSIGL5）、SEQ ID NO：20（ヒトSIGL9）、SEQ ID NO：21（ヒトSIGL6）、SEQ ID NO：22（ヒトCD33）、SEQ ID NO：26（ヒトSIG12）、SEQ ID NO：31（ヒトSIG11）、SEQ ID NO：32（ヒトSIG10）、およびSEQ ID NO：19（ヒトPECA1）からなる群において選択される配列を含まない。
【０００３】
この「NOTゲート」の系は、「オフターゲット」の健常細胞または免疫細胞に対する細胞傷害を防止するため、免疫治療において特に有用である。
【背景技術】
【０００４】
序論
エクスビボで生成された自己抗原特異的T細胞の移入を含む養子免疫治療は、ウイルス感染およびがんを処置するための有望な戦略である。養子免疫治療のために使用されるT細胞は、抗原特異的T細胞の増大または遺伝子操作を通したT細胞の向け直しのいずれかによって生成され得る（Park,Rosenberg et al.2011,Trends Biotechnol 29(11):550-7）。ウイルス抗原特異的T細胞の移入は、移植に関連したウイルス感染および稀なウイルス関連悪性疾患の処置のために使用されている、よく確立された手法である。同様に、腫瘍特異的T細胞の単離および移入は、黒色腫の処置において成功が示されている。
【０００５】
T細胞における新規特異性は、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体（CAR）の遺伝子移入を通して、成功裡に生成された（Jena,Dotti et al.2010,Blood 116(7):1035-44）。CARは、単一の融合分子として1個以上のシグナリングドメインと会合したターゲティングモエティからなる合成受容体である。一般に、CARの結合モエティは、フレキシブルリンカーによって接合されたモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の可変断片を含む、単鎖抗体（scFv）の抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドドメインに基づく結合モエティも成功裡に使用されている。第一世代CARのシグナリングドメインは、ζCD3ζの細胞質領域またはFc受容体γ鎖に由来する。第一世代CARは、T細胞の細胞傷害を成功裏に向け直すことが示されているが、インビボで長期の増大および抗腫瘍活性を提供することはできなかった。CAR修飾T細胞の生存を増強し、増殖を増加させるため、CD28、OX40（CD134）、ICOS、および4-1BB（CD137）を含む共刺激分子に由来するシグナリングドメインが、単独で（第二世代）または組み合わせられて（第三世代）、追加された。CARは、リンパ腫および固形腫瘍を含む様々な悪性疾患に由来する腫瘍細胞の表面において発現された抗原に対して、T細胞が向け直されることを、成功裡に可能にしている（Jena,Dotti et al.2010,Blood 116(7):1035-44）。
【０００６】
しかしながら、インビボでの腫瘍根絶のための前例がない効力にも関わらず、CAR T細胞は、患者へ移入された後に急性有害イベントを促進する場合がある。よく立証された有害イベントには、移植片対宿主病（GvHD）、標的抗原を有する正常組織に対する（on-target off-tumor）活性、またはベクター由来の挿入変異による異常なリンパ増殖能が含まれる。従って、そのような有害イベントがインビボで起こることを防止するため、細胞特異的な枯渇系を開発する必要が存在する。
【０００７】
最近、オフターゲット細胞に遭遇した時にT細胞機能にブレーキをかけることを目的として有する阻害性キメラ抗原受容体（N-CAR）が設計された（Fedorov,V.D.,Themeli,M.,Sadelain,M,2013,Sci Transl Med 5(215)）。この論文において、著者らは、内在性T細胞受容体または活性化キメラ受容体を通して誘導されるサイトカイン分泌、細胞傷害、および増殖を選択的に制限し得る、CTLA-4またはPD-1に基づくN-CARを設計した。彼らは、N-CARの初期効果は一時的であり、従って、T細胞は、活性化受容体によって認識される抗原に後に遭遇した時に機能し得ることを示した。
【０００８】
免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ITIM）、免疫受容スイッチチロシンモチーフ（immunoreceptor tyrosine-based switch motif/ITSM）、およびSH2結合モチーフを含有しているタンパク質は、非限定的な例として、T細胞におけるいくつかのシグナリング経路（例えば、TCR）の阻害、調節、およびモジュレーションにおいて主要な役割を果たすことが公知である（Barrow A and Trowsdale J,2006,Eur J Immunol 36(7):1646-53、Sharpe H and Freeman G,2002,Nature Reviews Immunology,(2)116-126）。
【０００９】
しかしながら、操作されたiCAR T細胞またはN-CAR T細胞が、T細胞由来の伝達ドメインを含有している時、野生型T細胞に由来する伝達ドメインへの干渉またはタンパク質相互作用が起こり得る。この問題を免れるため、本発明者らは、T細胞において天然に発現されない細胞内ドメイン、ならびに/またはTRAIL受容体および/もしくはCD200受容体1に由来する細胞内ドメインに基づく、操作された阻害性キメラ抗原受容体（N-CAR）を探究した。このN-CARは、陽性シグナリングCAR（P-CAR）および阻害性ゲート受容体（iCARまたはN-CAR）から構成される「ロジックNOTゲート」系において使用され得る。
【発明の概要】
【００１０】
概要
本発明は、オフ腫瘍（off-tumor）標的（健常細胞）のケースにおいて、操作された免疫細胞、具体的には、T細胞を阻害するための、ロジック「NOTゲート」のような生物学原理の免疫細胞テクノロジーへの適用に関する。具体的には、本発明は、天然T細胞において有意に発現されない伝達シグナルに関与する受容体ならびに/またはTRAIL受容体および/もしくはCD200受容体に由来する細胞内ドメインを含有している阻害性キメラ抗原受容体（iCARまたはN-CAR）に関する。本発明の好ましい細胞内ドメインは、SEQ ID NO：1〜36のポリペプチドとの少なくとも80％の同一性を有する。より好ましくは、本発明のCAR Pの細胞内ドメインは、SEQ ID ID NO:1〜36からなる群より選択される配列を含む。
【００１１】
本発明の別の局面は、N-CARおよび陽性CAR（P-CAR）の両方を発現するT細胞のような操作された免疫細胞であり；それぞれの細胞外結合ドメインはオフ腫瘍細胞（健常細胞）および腫瘍細胞を標的とする。
【００１２】
本発明は、そのようなN-CARおよび単離された免疫細胞の操作の方法、該CARをコードするポリヌクレオチドおよびベクターに関し、そのような操作された免疫細胞を使用した治療的処置にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の異なる単鎖carキメラ抗原受容体（scCAR）のための構成（バージョンV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5）の模式図。
【図２】阻害性ゲート受容体（N-CAR）の設計の模式図：ネイティブの細胞外トポロジカルドメインを、「オフターゲット」健常細胞の抗原または細胞表面マーカーに特異的に結合することができる細胞外結合ドメインに交換するため、ネイティブのシグナリングモジュレーション受容体が操作される。
【図３】CD20抗原を発現する標的細胞を通して媒介された、形質導入されたT細胞のP-CAR（PはCD20である）によって駆動された活性化（CD69の発現によって測定）。CD69は、T細胞活性化を測定するための適切なマーカーである。
【図４】操作された初代T細胞との6時間のコインキュベーションの後の標的細胞の抗原P-CAR-high/抗原N-CAR-highおよび抗原P-CAR-high/抗原N-CAR-lowの割合（％）の比を示す（標的/エフェクターの3種の比：1/1、1/3、および1/10が使用される）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
2018504104.tif 000003
2018504104.tif 000004
2018504104.tif 000005
2018504104.tif 000006
【００１５】
本発明は、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン；
膜貫通ドメイン；
細胞内ドメイン
を含む阻害性キメラ抗原受容体（N-CAR）を提供し、N-CARは、阻害性伝達シグナルの誘導に関与するポリペプチド配列を含む。該ポリペプチド配列は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）受容体に由来する少なくとも1種の配列またはCD200受容体1に由来する少なくとも1種の配列を含む。
【００１６】
本発明は、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン；
膜貫通ドメイン；
細胞内ドメイン
を含む阻害性キメラ抗原受容体（N-CAR）を提供し、N-CARは、抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインが抗原に結合した時の阻害性伝達シグナルの誘導および/またはCTL活性の減少の誘導に関与するポリペプチド配列を含む。該ポリペプチド配列は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）受容体に由来する少なくとも1種の配列またはCD200受容体1に由来する少なくとも1種の配列を含む。
【００１７】
本発明は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）受容体に由来するポリペプチド配列を含む前記のN-CARを提供する。
【００１８】
本発明は、SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）、およびそれらの断片からなるリストより選択されるポリペプチド配列に由来する少なくとも1種のポリペプチド配列を含む前記のN-CARを提供する。
【００１９】
本発明は、ポリペプチド配列がSEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、もしくはSEQ ID NO：35、またはそれらの断片に由来する配列と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する、前記の態様のいずれか一つによるN-CARを提供する。
【００２０】
本発明は、ポリペプチド配列：SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）に由来するアミノ酸番号181〜386、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）に由来するアミノ酸番号230〜468、もしくはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）に由来するアミノ酸番号179〜440、またはそれらの断片のうちの少なくとも1種を含む、前記の態様のいずれか一つによるN-CARを提供する。
【００２１】
本発明は、抗原結合ドメインが、がん性細胞において発現されずかつ非がん性細胞または健常細胞において発現される細胞表面抗原Nに結合する、前記の態様のいずれか一つによるN-CARを提供する。
【００２２】
本発明は、前記の態様のいずれか一つによるN-CARを提供し、ここで抗原結合ドメインは細胞表面抗原Nに結合し、Nは、正常組織に存在するが、腫瘍には存在しないか、またはFACSもしくはウエスタンブロット分析もしくはタンパク質の定量化を可能にする適切な技術によって決定される場合に検出可能なレベルで存在しない。
【００２３】
本発明において、非がん性細胞または健常細胞は、がん性細胞においても発現されるかまたは過剰発現されるP抗原も発現する。
【００２４】
本発明は、抗原結合ドメインが、CD56、CD205、CD83、CD206、CD200、CD36、トロポニンC、β1インテグリン、CCKBR、GALR1、CUBN、CD4、CD20、CD22、CD25、MUC1、CD19、BCMA、およびPSMAより選択される少なくとも1種の細胞表面抗原Nに結合する、前記の態様のいずれか一つによるN-CARを提供する。
【００２５】
本発明は、以下のものも提供する。
【００２６】
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）に由来するアミノ酸番号181〜386から本質的になる少なくとも1種のポリペプチド配列を含む、前記の態様によるN-CAR。
【００２７】
SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）に由来するアミノ酸番号230〜468から本質的になる少なくとも1種のポリペプチド配列を含む、前記の態様のいずれか一つによるN-CAR。
【００２８】
SEQ ID NO：35（ヒトTR10B）に由来するアミノ酸番号179〜440から本質的になる少なくとも1種のポリペプチド配列を含む、前記の態様のいずれか一つによるN-CAR。
【００２９】
CD200受容体1に由来する少なくとも1種のポリペプチド配列、好ましくは、SEQ ID NO：36の配列またはその断片を含むN-CAR。
【００３０】
単鎖（sc）N CARまたは多鎖（mc）N-CARである、前記の態様のいずれか一つによるN-CAR。
【００３１】
SEQ ID NO：102〜SEQ ID NO：212からなるリストより選択される配列によってコードされた少なくとも1種のポリペプチド配列を含む、前記の態様のいずれか一つによるN-CAR。
【００３２】
抗原結合ドメインがオフ組織（off-tissue）抗原に結合する、前記の態様のいずれか一つによるN-CAR。
【００３３】
細胞外ドメインが少なくとも1種の単鎖可変断片scFvを含む、前記の態様によるN-CAR。
【００３４】
抗原結合ドメインがFv、Fab、または(Fab')2を含む、前記の態様のいずれか一つによるN-CAR。
【００３５】
抗原結合ドメインが、P抗原を発現する非がん性細胞または健常細胞において発現された細胞表面抗原Nに結合する、前記の態様のいずれか一つによるN-CAR。
【００３６】
一つの態様において、NはPであり、好ましい態様において、NはPでない。
【００３７】
抗原結合ドメインが、CD19、CD20、CD22、BCMA、PSMA、CD56、CD205、CD83、CD206、CD200、またはCD36に結合する、前記の態様のいずれか一つによるN-CAR。
【００３８】
抗原結合ドメインが、トロポニンC、β1インテグリン、CCKBR、GALR1、またはCUBNに結合する、前記の態様のいずれか一つによるN-CAR。
【００３９】
抗原結合ドメインが、CD4、CD20、CD22、CD25、またはMUC1に結合する、前記の態様のいずれか一つによるN-CAR。
【００４０】
抗原結合ドメインが、トロポニンC、β1インテグリン、CCKBR、GALR1、またはMUC1に結合する、前記の態様のいずれか一つによるN-CAR。
【００４１】
膜貫通ドメインがPD-1の膜貫通領域を含む、前記の態様のいずれか一つによるN-CAR。
【００４２】
PD-1の膜貫通領域またはその断片を含む、前記の態様のいずれか一つによるN-CAR。
【００４３】
膜貫通ドメインがCD8αの膜貫通領域を含む、前記の態様のいずれか一つによるN-CAR。
【００４４】
膜貫通ドメインがヒンジを介してN-CARの細胞外ドメインに付着している、前記の態様のいずれか一つによるN-CAR。
【００４５】
ヒンジがヒト免疫グロブリンヒンジである、前記の態様によるN-CAR。
【００４６】
ヒンジがIhG1ヒンジまたはCD8αヒンジである、前記の態様によるN-CAR。
【００４７】
膜貫通ドメインがT細胞受容体のα鎖、β鎖、もしくはζ鎖、PD-1、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、LAG3、2B4、BTLA4、TIM-3、TIGIT、SIRPA、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、またはCD154の膜貫通領域を含む、前記の態様のいずれか一つによるN-CAR。
【００４８】
本発明は、前記の態様のいずれか一つによるN-CARをコードするベクターを提供する。
【００４９】
本発明は、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン；
膜貫通ドメイン；
細胞内ドメイン；好ましくは、活性化伝達ドメインおよび共刺激ドメインを含む細胞内ドメイン
を含むP-CARと、前記の態様のいずれか一つによるN-CARとを含む免疫細胞、好ましくは、初代免疫T細胞を提供する。
【００５０】
好ましい態様において、N-CARの活性化は、P-CARに関連するシグナル伝達活性を阻害し、具体的には、N-CARおよびP-CARを保持する免疫細胞のCTL活性の減少をもたらす。
【００５１】
一つの好ましい態様において、本発明は、TCRαサブユニットまたはTCRβサブユニットをコードする少なくとも1種の遺伝子が、好ましくは、特異的なエンドヌクレアーゼを使用した欠失によって、不活化されている、前記の態様による免疫細胞を提供する。
【００５２】
一つの態様において、本発明は、TCRをコードする少なくとも1種の遺伝子およびデオキシシチジンキナーゼ（dck）をコードする遺伝子が、好ましくは、エンドヌクレアーゼ、好ましくは、TALENを使用した欠失によって、不活化されている、前記の態様のいずれか一つによる免疫細胞を提供する。
【００５３】
一つの態様において、本発明は、医薬として使用するための、前記の態様のいずれか一つによる免疫細胞を提供する。
【００５４】
一つの態様において、本発明は、血液がん状態、好ましくは、再発性難治性血液がんの防止または処置において使用するための、前記の態様のいずれか一つによる免疫細胞を提供する。
【００５５】
血液がん状態が、白血病または骨髄腫、好ましくは、再発性かつ/もしくは難治性の白血病、または再発性かつ/もしくは難治性の骨髄腫である、前記の態様による免疫細胞。
【００５６】
一つの態様において、本発明は、
（a）免疫細胞を準備し；任意で、好ましくは、TCRAおよびdCKである候補遺伝子を欠失させる工程；
（b）細胞表面において本発明によるN-CARおよびP-CARを発現させる工程； 
（c）任意で、好ましくは、TCRA、PD1、CTLA4、およびdCKより選択される候補遺伝子を欠失させる工程
を含む、前記の態様のいずれか一つによる免疫細胞を操作する方法を提供する。
【００５７】
一つの態様において、本発明は、免疫細胞が、ドナー、好ましくは、健常ドナーから提供される、前記の方法を提供する。
【００５８】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO：102〜SEQ ID NO：212からなるリストより選択される配列を含むベクターを提供する。
【００５９】
T細胞、好ましくは、CD4 T細胞またはCD8 T細胞、より好ましくは、初代CD8 T細胞である、前記の態様による免疫細胞が提供される。
【００６０】
T細胞がヒトT細胞、好ましくは、初代免疫T細胞である、前記の態様による免疫細胞。
【００６１】
P CARが抗原CD123、CD22、CS1、CD38、CD19、CD33、CD20のうちの少なくとも1種に結合する、前記の態様による免疫細胞。
【００６２】
前記の態様による免疫細胞は、初代炎症性Tリンパ球、初代細胞傷害性Tリンパ球、初代制御性Tリンパ球、または初代ヘルパーTリンパ球より選択される。
【００６３】
一つの態様において、本発明は、P-CARの抗原結合ドメインが結合する細胞表面抗原がCD38であり、かつN-CARの抗原結合ドメインが結合する細胞表面抗原がCD56、CD205、CD83、CD206、CD200、またはCD36である、前記の態様のいずれか一つによる免疫細胞を提供する。
【００６４】
一つの態様において、本発明は、P-CARの抗原結合ドメインが結合する細胞表面抗原がCS1であり、かつN-CARの抗原結合ドメインが結合する細胞表面抗原がトロポニンC、β1インテグリン、CCKBR、GALR1、またはCUBNである、前記の態様のいずれか一つによる免疫細胞を提供する。
【００６５】
一つの態様において、本発明は、P-CARの抗原結合ドメインが結合する細胞表面抗原がCD123であり、かつN-CARの抗原結合ドメインが結合する抗原がCD4、CD20、CD22、CD25、またはMUC1である、前記の態様のいずれか一つによる免疫細胞を提供する。
【００６６】
一つの態様において、本発明は、P-CARの抗原結合ドメインが結合する細胞表面抗原がROR1であり、かつN-CARの抗原結合ドメインが結合する細胞表面抗原がトロポニンC、β1インテグリン、CCKBR、GALR1、またはMUC1である、前記の態様のいずれか一つによる免疫細胞を提供する。
【００６７】
一つの態様において、本発明は、医薬として使用するための免疫細胞を提供する。
【００６８】
一つの態様において、本発明は、急性骨髄性白血病（AML）からなる群より選択される白血病の処置のための免疫細胞を提供する。
【００６９】
本発明は、状態がCD123発現細胞またはCLL-1発現細胞を特徴とする前悪性または悪性のがん状態である、治療において使用するための前記の態様による免疫細胞を提供する。
【００７０】
血液がん状態が多発性骨髄腫（MM）である、前記の態様のいずれか一つによる免疫細胞。
【００７１】
状態がCD38発現細胞を特徴とする前悪性または悪性のがん状態である、治療において使用するための前記の態様による免疫細胞。
【００７２】
血液がん状態が慢性リンパ球性白血病（CLL）である、前記の態様による免疫細胞。
【００７３】
状態がCS-1発現細胞またはROR1発現細胞を特徴とする前悪性または悪性のがん状態である、治療において使用するための前記の態様による免疫細胞。
【００７４】
状態が、具体的には、ROR1発現細胞を特徴とする、乳腺腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、または腎腫瘍のような固形腫瘍である、治療において使用するための前記の態様による免疫細胞。
【００７５】
状態がCD22発現細胞を特徴とする前悪性または悪性のがん状態である、治療において使用するための前記の態様による免疫細胞。
【００７６】
P-CARおよびN-CARの両方がそれぞれの抗原に結合する時の免疫細胞の活性化の低下が、P-CARのみが細胞表面抗原に結合する同一の免疫細胞と比較して、かつ/またはN-CARの細胞内ドメインとしてPD-1の完全細胞内ドメインもしくはCTLA-4の完全細胞内ドメインを発現する免疫細胞と比較して、好ましくは、少なくとも5％、10％、15％、20％、または30％、増加している、前記のいずれか一つによる免疫細胞。
【００７７】
免疫細胞の活性化のレベルがサイトカイン産生を測定することによって決定される、前記の態様のいずれか一つによる免疫細胞。
【００７８】
サイトカインがIFNγまたはTNFαである、請求項34記載の免疫細胞。
【００７９】
サイトカイン産生がELISAおよび/またはFACSおよび/またはルミネックス（luminex）によって測定される、前記の態様のいずれか一つによる免疫細胞。
【００８０】
免疫細胞の活性化のレベルが脱顆粒のレベルによって決定される、前記の態様のいずれか一つによる免疫細胞。
【００８１】
脱顆粒がFACSによってCD107aの発現を測定することによって測定される、前記の態様のいずれか一つによる免疫細胞。
【００８２】
免疫細胞の活性化のレベルが、免疫細胞の標的細胞を死滅させる能力をモニタリングすることによって測定される、前記の態様のいずれか一つによる免疫細胞。
【００８３】
本発明は、以下の工程を含む、前記の態様のいずれか一つによる免疫細胞を操作する方法を提供する：
（a）N-CARをコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドおよびCARをコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを細胞へ導入する工程；
（b）細胞においてポリヌクレオチドを発現させる工程。
【００８４】
本発明は、以下の工程を含む、その必要のある患者を処置する方法を提供する：
（a）前記の態様のいずれか一つによる免疫細胞を準備する工程；および
（b）該T細胞を患者へ投与する工程。
【００８５】
本発明は、免疫細胞が患者から回収される、前記の態様のいずれか一つによる患者を処置する方法を開示する。
【００８６】
本発明の種々の目的を、以下に詳細に開示する。
【００８７】
阻害性キメラ抗原受容体（iCARまたはN-CAR）
本発明は、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン；
膜貫通ドメイン；
細胞内ドメイン
を含む、阻害性キメラ抗原受容体（iCARまたはN-CAR）に関し；
細胞内ドメインは、T細胞、好ましくは、初代T細胞において有意に発現されず、かつ/または腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）受容体および/もしくはCD200受容体1に由来する、伝達シグナルに関与するポリペプチド配列を含むが、但し、T細胞において発現されないポリペプチド配列は、ITMSでなく、好ましくは、SEQ ID NO：13（ヒトSIGL8）、SEQ ID NO：14（ヒトSIGL7）、SEQ ID NO：17（ヒトSIGL5）、SEQ ID NO：20（ヒトSIGL9）、SEQ ID NO：21（ヒトSIGL6）、SEQ ID NO：22（ヒトCD33）、SEQ ID NO：26（ヒトSIG12）、SEQ ID NO：31（ヒトSIG11）、SEQ ID NO：32（ヒトSIG10）、およびSEQ ID NO：19（ヒトPECA1）からなる群において選択される配列からなっていない（またはそれを含まない）。
【００８８】
本発明によるCAR-Nの細胞内ドメイン
一つの態様によると、N-CARの細胞内ドメインは、非操作T細胞において有意に発現されない、伝達シグナルに関与する受容体に由来するポリペプチド配列を含む。「有意に発現されない」とは、細胞内ドメインが由来する、伝達シグナルに関与するタンパク質が、非操作T細胞において、同一の培養または増殖の条件において、発現されないかまたは有意に低いレベルで発現されることを意味する。「操作されたT細胞」とは、所定の遺伝子配列を発現するようまたは発現し得ないよう遺伝学的に修飾されたT細胞を意味する。
【００８９】
本明細書において、「有意に発現されない」とは、ポリペプチドの発現、好ましくは、細胞表面発現が、フローサイトメトリー分析、ウエスタンブロット、もしくはELISA試験のような適切な技術を使用した検出のレベルより低いこと、またはポリペプチドが、陽性対照として使用されたポリペプチドを発現することが既知の細胞において測定されるポリペプチドの発現と比較して、所定の細胞において、20％未満、好ましくは、10％未満のレベル、より好ましくは、検出不可能なレベルで発現されることを意味する。
【００９０】
これは、タンパク質の発現が測定され定量化されることを可能にする現在使用されている技術によって、即ち、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー分析、ELISA試験等を使用して、試験され得る。
【００９１】
一つの態様によると、N-CARの細胞内ドメインは、受容体の伝達シグナルに関与するポリペプチド配列を含み、該受容体はT細胞において有意に発現されない。
【００９２】
好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、SEQ ID NO：30（ヒトPVR）、およびそれらの断片からなる群より選択される配列に由来する。
【００９３】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）またはその断片である。
【００９４】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）またはその断片である。
【００９５】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）またはその断片である。
【００９６】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）またはその断片である。
【００９７】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）またはその断片である。
【００９８】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）またはその断片である。
【００９９】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）またはその断片である。
【０１００】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）またはその断片である。
【０１０１】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）またはその断片である。
【０１０２】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）またはその断片である。
【０１０３】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）またはその断片である。
【０１０４】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）またはその断片である。
【０１０５】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）またはその断片である。
【０１０６】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）またはその断片である。
【０１０７】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）またはその断片である。
【０１０８】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）またはその断片である。
【０１０９】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）またはその断片である。
【０１１０】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）またはその断片である。
【０１１１】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）またはその断片である。
【０１１２】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）またはその断片である。
【０１１３】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）またはその断片である。
【０１１４】
より好ましい態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：30（ヒトPVR）またはその断片である。
【０１１５】
本発明によるもう一つの態様において、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、SEQ ID NO：30（ヒトPVR）より選択される配列に由来する配列と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する。
【０１１６】
上記の配列は、以下の表1に提示される。
【０１１７】
いくつかの例示的なN-CARの構成は、以下の表2に提示される。
【０１１８】
（表１）非操作T細胞において有意に発現されない伝達シグナルに関与する受容体に由来する細胞内ドメインのアミノ酸配列（配列SEQ NO:13（ヒトSIGL8）、SEQ ID NO：14（ヒトSIGL7）、SEQ ID NO：17（ヒトSIGL5）、SEQ ID NO：20（ヒトSIGL9）、SEQ ID NO：21（ヒトSIGL6）、SEQ ID NO：22（ヒトCD33）、SEQ ID NO：26（ヒトSIG12）、SEQ ID NO：31（ヒトSIG11）、SEQ ID NO：32（ヒトSIG10）、およびSEQ ID NO：19は本発明の一部ではない）
2018504104.tif 000007
2018504104.tif 000008
2018504104.tif 000009
2018504104.tif 000010
2018504104.tif 000011
2018504104.tif 000012
2018504104.tif 000013
【０１１９】
（表２）本発明によるN-CARの例
2018504104.tif 000014
2018504104.tif 000015
2018504104.tif 000016
2018504104.tif 000017
2018504104.tif 000018
2018504104.tif 000019
2018504104.tif 000020
【０１２０】
一つの態様によると、本発明のN-CARは、表1の「使用された阻害性ポリペプチドのアミノ酸」の列に記載されたポリペプチド配列のうちのいずれか少なくとも1種を含む。
【０１２１】
一つの態様によると、本発明のN-CARの阻害性シグナリング伝達ドメインは、表1の「使用された阻害性ポリペプチドのアミノ酸」の列に記載された伝達シグナルに関与する受容体に由来するポリペプチド配列のうちのいずれか1種からなる。
【０１２２】
一つの態様によると、N-CARの細胞内ドメインは、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）受容体に由来するポリペプチド配列を含む。
【０１２３】
内在性TRAILは、細胞膜に固定され、細胞表面に提示される、281アミノ酸のII型膜貫通タンパク質として発現される。TRAILは独立に同定された（Wiley SR,Schooley K Smolak PJ,Din WS,Huang CP,Nicholl JK,et al."Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis.Immunity 1995；3:673-82；およびPitti RM,Marsters SA,Ruppert S,Donahue CJ,Moore A,Ashkenazi A,1996." Induction of apoptosis by Apo-2 ligand,a new member of the tumor necrosis factor cytokine family".J Biol Chem;271:12687-90）。最初の発表において、配列アライメントによって、他のデスリガンドとの近い関係が示され、最も高い配列類似性はFasリガンド（FasL）について報告された。
【０１２４】
TRAILは、ナチュラルキラー細胞によって発現され、細胞間接触の確立の後、標的細胞においてTRAIL依存性のアポトーシスを誘導することができる（Smyth MJ,Cretney E,Takeda K,Wiltrout RH,Sedger LM,Kayagaki N,et al.,2001,"Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)contributes to interferon γ-dependent natural killer cell protection from tumor metastasis.J Exp Med;193:661-70）。
【０１２５】
生理学的には、TRAILシグナリング系は、Tヘルパー細胞1対Tヘルパー細胞2および「ヘルプレス」CD8+T細胞の数の制御を通して免疫系を形成するため、そして自然腫瘍形成の抑制のため、免疫監視にとって不可欠であることが示された（Janssen EM,Droin NM,Lemmens EE,Pinkoski MJ,Bensinger SJ,Ehst BD,et al.2005,"CD4+ T-cell help controls CD8+ T-cell memory via TRAIL-mediated activation-induced cell death".Nature;434:88-93.）。
【０１２６】
発表（Hellwig CT,and Rehm M,2012 "TRAIL Signaling and Synergy Mechanisms Used in TRAIL-Based Combination Therapies",Mol Cancer Ther.11(1):3-13）において概説されたように、TRAILおよびTRAILデス受容体に対するアゴニスト抗体は、高度に有望な新しい抗がん剤である。この概説には、TRAILシグナリングの分子的理解の最近の進展、ならびに単独治療および組み合わせ治療におけるTRAILまたはアゴニスト抗体の臨床的使用においてなされた進歩が記載されている。TRAIL-R1（マパツムマブ）またはTRAIL-R2（レクサツムマブ）を標的とするヒトアゴニストモノクローナル抗体は、数種の転移性三重（エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、およびHER2）陰性がん細胞株を処置するために使用された（Malin D,Chen F,Schiller C,Koblinski J,Cryns VL.2011"Enhanced metastasis suppression by targeting TRAIL receptor 2 in a murine model of triple-negative breast cancer." Clin Cancer Res.17(15):5005-15）。
【０１２７】
これらの発表は、TRAIL受容体に特異的な細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体を開示している。本発明は、TRAIL受容体、具体的には、TR10D（別名：TNFRSF10D：DCR2、TRAILR4、TRUNDD）、TR10A（TNF受容体スーパーファミリーメンバー10、TRAIL-R1、もしくはCD261）、またはTR10B（TNF受容体スーパーファミリーメンバー10B、TRAIL-R2、もしくはCD262）より選択されるTRAIL受容体に由来する細胞内シグナリングドメインを含むiCAR（またはN CAR）に関する。
【０１２８】
本発明は、TRAIL受容体に由来する細胞内シグナリングドメインを含むiCAR（またはN CAR）に関し、TRAIL受容体は、タンパク質分解活性化およびさらなるNFκB活性化を通したカスパーゼ8によって媒介されるアポトーシスに関与している。
【０１２９】
一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）より選択される少なくとも1種の配列を含む細胞内シグナリングドメインを含むiCAR（またはN CAR）を提供する；一つの態様によると、N-CARの細胞内ドメインは、SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）より選択されるポリペプチド配列のいずれか一つからなる。
【０１３０】
別の態様において、本発明は、SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する少なくとも1種の配列を含む細胞内シグナリングドメインを含むiCAR（またはN CAR）を提供する。
【０１３１】
好ましいものとして、受容体のポリペプチド配列は、SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する。ヒトTR10Dは、TNFRSF10D、DCR2、TRAILR4、またはTRUNDDとも呼ばれ、ORF名UNQ251/PRO288を有する。ヒトTR10Aは、TNFRSF10A、APO2、DR4、またはTRAILR1とも呼ばれる。ヒトTR10Bは、TNFRSF10B、DR5 KILLER、TRAILR2、TRICK2、またはZTNFR9とも呼ばれ、ORF名UNQ160/PRO186を有する。
【０１３２】
別の態様によると、N-CARの細胞内ドメインは、CD200受容体1に由来するポリペプチド配列、より好ましくは、SEQ ID NO：36の配列を含む配列を含む。
【０１３３】
別の態様において、本発明は、SEQ ID NO：36と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する少なくとも1種の配列を含む細胞内シグナリングドメインを含むiCAR（またはN CAR）を提供する。細胞表面糖タンパク質CD200受容体1（Uniprot ref：Q8TD46）は、本発明のiCAR（またはN CAR）の細胞内ドメイン部分の別の例を表す。CD200/OX2細胞表面糖タンパク質のためのこの阻害性受容体は、選択された刺激に応答して、TNFα、インターフェロン、および誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）を含む炎症誘発性分子の発現を阻害することによって、炎症を制限する（Wright GJ,Cherwinski H,Foster-Cuevas M,Brooke G,Puklavec MJ,Bigler M,Song Y,Jenmalm M,Gorman D,McClanahan T,Liu MR,Brown MH,Sedgwick JD,Phillips JH,Barclay AN.2003 "Characterization of the CD200 receptor family in mice and humans and their interactions with CD200.J Immunol."171(6):3034-46）。
【０１３４】
好ましいものとして、受容体のポリペプチド配列は、SEQ ID NO：36（ヒト細胞表面糖タンパク質CD200受容体1）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する。
【０１３５】
上記の配列は、以下の表2にリストされる。
【０１３６】
（表２）腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）受容体および細胞表面糖タンパク質CD200受容体1に由来する細胞内ドメインのアミノ酸配列
2018504104.tif 000021
【０１３７】
本発明によるN CARの細胞外結合ドメイン
本発明による阻害性キメラ抗原受容体（iCARまたはN-CAR）および陽性キメラ抗原受容体（P-CAR）は、細胞外リガンド結合ドメインを含む。
【０１３８】
「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、本明細書において使用されるように、リガンドに結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドと定義される。好ましくは、ドメインは細胞表面分子と相互作用することができるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するよう選択され得る。N-CARおよびP-CARの各細胞外ドメインによる異なるリガンドの認識に相当する少なくとも2種のインプットシグナルの組み合わせは、N-CARに含有される阻害性伝達ドメインを介したP-CARの阻害を可能にする。
【０１３９】
本発明の系は、特に（がん性細胞に存在するのみならず正常細胞にも存在し得る）抗原の特異性の欠如のため、操作された免疫細胞が腫瘍細胞のみを標的としない「オフターゲット」イベントを回避することを目標とする。
【０１４０】
従って、本発明の範囲内の細胞外結合ドメインは、P-CARに属するものがオンターゲット細胞（即ち、腫瘍細胞）を認識し、N-CARに属するものがオフターゲット細胞（正常細胞）を認識するよう選択される。従って、操作された免疫細胞ががん性細胞に遭遇した時、P-CARのみがそれに結合することができ、N-CARはそうでなく、従って、P-CARが活性化され、がん性細胞が殺傷され得る。他の問題において、操作された免疫細胞が正常細胞に遭遇した時には、P-CARおよびN-CARの両方がそれに結合することができ、従って、N-CARがP-CARを不活化することができ：正常細胞は保存されるであろう。
【０１４１】
N-CARの抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびその機能性断片を含むが、これらに限定されるわけではない、オフ組織抗原に結合する任意のドメインであり得る。
【０１４２】
ヒト化抗体は、CDRグラフティング（例えば、各々参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、欧州特許番号EP 239,400；国際公開番号WO 91/09967；ならびに米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、および第5,585,089号を参照すること）、ベニヤリング（veneering）またはリサーフェイシング（resurfacing）（例えば、各々参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、欧州特許番号EP 592,106およびEP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka et al.,1994,Protein Engineering,7(6):805-814；ならびにRoguska et al.,PNAS,91:969-973を参照すること）、チェーンシャフリング（chain shuffling）（例えば、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第5,565,332号を参照すること）、ならびに、例えば、各々参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開番号US2005/0042664、米国特許出願公開番号US2005/0048617、米国特許第6,407,213号、米国特許第5,766,886号、国際公開番号WO 9317105、Tan et al.,J.Immunol.,169:1119-25(2002)、Caldas et al.,Protein Eng.,13(5):353-60(2000)、Morea et al.,Methods,20(3):267-79(2000)、Baca et al.,J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997)、Roguska et al.,Protein Eng.,9(10):895-904(1996)、Couto et al.,Cancer Res.,55(23 Supp):5973s-5977s(1995)、Couto et al.,Cancer Res.,55(8):1717-22(1995)、Sandhu J S,Gene,150(2):409-10(1994)、およびPedersen et al.,J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994)に開示された技術を含むが、これらに限定されるわけではない、当技術分野において公知の多様な技術を使用して作製され得る。しばしば、抗原結合を改変するため、例えば、改善するため、フレームワーク領域内のフレームワーク残基が、CDRドナー抗体に由来する対応する残基に置換されるであろう。これらのフレームワーク置換は、当技術分野において周知の方法によって、例えば、抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するためのCDRおよびフレームワークの残基の相互作用のモデル化、ならびに特定の位置における稀なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって、同定される。（例えば、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、Queenらの米国特許第5,585,089号；およびRiechmann et al.,1988,Nature,332:323を参照すること）。
【０１４３】
好ましい態様において、細胞外リガンド結合ドメインは、単鎖抗体断片（scFv）である。後者は、一般的には、フレキシブルリンカーによって接合された標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖（VL）および重鎖（VH）の可変断片を含む。非限定的な例として、ラクダ科シングルドメイン抗体断片、血管内皮増殖因子ポリペプチドのような受容体リガンド、インテグリン結合ペプチド、ヘレグリン、またはIL-13ムテイン、抗体結合ドメイン、抗体超可変ループ、またはCDRのような、scFv以外の結合ドメインも、リンパ球の予め定義されたターゲティングのために使用され得る。
【０１４４】
いくつかの態様において、抗体結合ドメインは、Fv、Fab、(Fab’)2、または二機能性（例えば、二重特異性）ハイブリッド抗体（例えば、Lanzavecchia et al.,Eur.J.Immunol.17,105(1987)）である。いくつかの態様において、本発明のN-CARの抗原結合ドメインは、野生型のまたは増強された親和性でオフ組織抗原に結合する。
【０１４５】
「親和性」とは、結合強度の尺度を意味する。理論に拘束されないが、親和性は、抗体の結合部位と抗原決定基との間の立体化学的適合の近さ、それらの接触の区域のサイズ、ならびに荷電基および疎水基の分布に依る。親和性には、可逆性の複合体の形成後の抗原抗体結合の強度をさす「アビディティ」という用語も含まれる。親和性を計算するための結合実験の使用を含む、抗体の抗原に対する親和性を計算する方法は、当技術分野において公知である。機能アッセイ（例えば、フローサイトメトリーアッセイ）における抗体活性も、抗体親和性を反映する。抗体および親和性は、機能アッセイ（例えば、フローサイトメトリーアッセイ）を使用して、表現型的に特徴決定され比較され得る。
【０１４６】
いくつかの事例において、scFvは、当技術分野において公知の方法に従って調製され得る（例えば、Bird et al.,(1988)Science 242:423-426およびHuston et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883を参照すること）。ScFv分子は、フレキシブルポリペプチドリンカーを使用して、VH領域およびVL領域を共に連結することによって作製され得る。scFv分子は、最適化された長さおよび/またはアミノ酸組成を有するリンカー（例えば、SerGlyリンカー）を含む。リンカー長は、scFvの可変領域が如何に折り畳まれ相互作用するかに大いに影響を与えることができる。実際、短いポリペプチドリンカー（例えば、5〜10アミノ酸）が利用される場合、鎖内折り畳みが防止される。鎖間折り畳みも、2個の可変領域が機能性のエピトープ結合部位を共に形成するために必要とされる。リンカーの方向およびサイズの例については、例えば、参照によって本明細書に組み入れられる、Hollinger et al.1993 Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448、米国特許出願公開番号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794、ならびにPCT公開番号WO2006/020258およびWO2007/024715を参照すること。
【０１４７】
scFvは、VL領域とVH領域との間に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、またはそれ以上のアミノ酸残基のリンカーを含んでいてよい。リンカー配列は、任意の天然に存在するアミノ酸を含んでいてよい。リンカー配列はアミノ酸グリシンおよびセリンを含んでいてよい。リンカー配列は、(Gly4Ser)n（nは1以上の正の整数である）のようなグリシンおよびセリンのリピートのセットを含んでいてよい。リンカーは(Gly4Ser)4または(Gly4Ser)3であってよい。リンカー長の変動は、活性を保持するかまたは増強し、活性研究において優れた効力を生じ得る。
【０１４８】
好ましい態様において、N-CARの抗原結合ドメインはscFvを含む。N-CARの抗原結合ドメインによって認識されるオフ組織抗原は、好ましくは、P-CARによって標的とされる腫瘍細胞に存在しないかまたは低レベルに存在する抗原である。
【０１４９】
好ましい態様において、N-CARの抗原結合ドメインはscFvを含む。N-CARの抗原結合ドメインによって認識されるオフ組織抗原は、好ましくは、P-CARによって標的とされる腫瘍細胞に存在しないかまたは低レベルに存在し、かつ正常組織（非前がん性または非がん性）において発現される抗原である。
【０１５０】
「がん性細胞または腫瘍細胞」とは、無調節に増殖し、侵襲性になることを可能にする多くの方式において、正常細胞と異なる細胞を意味する。がん細胞は、正常細胞より専門化されておらず、絶えず分裂し続ける。それらは、身体が不要細胞を除去するために使用する、通常、分裂を中止するよう細胞に命じるか、またはプログラム細胞死もしくはアポトーシスとして公知の過程を開始するシグナルを無視することができる。
【０１５１】
P-CARによって標的とされる腫瘍細胞に低レベルに存在する、とは、オフ組織抗原の発現が、抗原検出の公知の技術（例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、ウエスタンブロット）を使用して、腫瘍細胞において検出不可能であるか、または陽性対照として使用された細胞もしくは組織における発現と比較して10％未満の発現を表すことを意味する。
【０１５２】
一つの態様において、N-CARの抗原結合ドメインは、抗原CD56、CD205、CD83、CD206、CD200、CD36、RARRES1、トロポニンC、β1インテグリン、CCKBR、GALR1、CD4、CD20、CD22、CD25、MUC1抗原CD20のいずれか一つに特異的な少なくとも1種のscFvを含む。
【０１５３】
一つの態様において、N-CARの抗原結合ドメインは、抗原CD56、CD205、CD83、CD206、CD200、CD36、またはRARRES1のいずれか一つに特異的な少なくとも1種のscFvを含む。
【０１５４】
一つの態様において、N-CARの抗原結合ドメインは、抗原トロポニンC、β1インテグリン、CCKBR、またはGALR1のいずれか一つに特異的な少なくとも1種のscFvを含む
【０１５５】
一つの態様において、N-CARの抗原結合ドメインは、抗原CD4、CD20、CD22、CD25、MUC1抗原のいずれか一つに特異的なscFvを含む。一つの態様において、N-CARの抗原結合ドメインは、抗原CD20、PSMA、BCMA、CD19のいずれか一つに特異的な少なくとも1種のscFvを含む。以下の表3は、N-CARおよびP-CARの抗原の組み合わせの例を提供する。抗D33、FLT3、MUC16、および抗MUC17 CARに対するP-CARのN-CARカウンターパートとの組み合わせは、本発明の一部ではない。
【０１５６】
2018504104.tif 000022
2018504104.tif 000023
【０１５７】
本発明によるN-CARの細胞外結合ドメイン
本明細書に記述される局面の様々な態様において、抗原のNCARとの結合は、細胞内シグナリングドメインを活性化し、免疫応答、好ましくは、CTL活性の減少をもたらす。
【０１５８】
本発明において、N-CARの抗原結合ドメインは、正常組織に存在するが、腫瘍には存在しないか、または正常組織における同一の細胞と比較してより低いレベルで存在する細胞表面タンパク質に結合する。該結合ドメインはオフ組織抗原に結合する。
【０１５９】
N-CAR抗原には、P-CARが標的としている抗原とは無関係であり、関心対象の腫瘍においてダウンレギュレートされているが、関係のある全ての正常組織に存在する抗原も含まれ得る。膵管腺がんのためのそのような抗原の例は、TMPRSS11B、CYP17A1、およびATP4Bであり、腎臓明細胞がんのためのそのような抗原の例は、GP2、MUC21、CLCA4、およびSLC27A6である。
【０１６０】
ある種の態様において、対象は、転移性乳がん、血液悪性疾患、または固形腫瘍を有し、ヒト白血球抗原（HLA）は、HLA-Iである。ある種の態様において、対象は、上皮間葉転換（EMT）を受けた腫瘍を有し、抗原は、上皮間葉転換（EMT）抗原、Eカドヘリン、およびサイトケラチンのうちの1種以上である。様々な態様において、阻害性キメラ抗原受容体と抗原との結合は、抗原を含む細胞の細胞死を減少させる。方法は、対象における移植片対宿主病（GVHD）またはその症状を低下させることができる。
【０１６１】
P-CARの細胞外結合ドメイン
本発明によるP CARの細胞外リガンド結合ドメインには、標的の抗原に結合するペプチド、標的の抗原に結合する抗体に結合するペプチドまたはタンパク質、増殖因子のようなペプチドまたはタンパク質のリガンド、標的上の受容体または増殖因子受容体のような受容体に由来するドメインに結合する非限定的な例としてのサイトカインまたはホルモン、標的上のペプチドまたはタンパク質のリガンドに結合する非限定的な例としてのサイトカイン受容体またはホルモン受容体も含まれ得る。好ましくは、標的は細胞である。
【０１６２】
非限定的な例として、標的のリガンドは、ErbB2（HER2/neu）、がん胎児性抗原（CEA）、上皮細胞接着分子（EpCAM）、上皮増殖因子受容体（EGFR）、CD19、CD20、CD30、CD40、ジシアロガングリオシドGD2、GD3、C型レクチン様分子1（CLL-1）、管上皮ムチン、gp36、TAG-72、糖スフィンゴ脂質、神経膠腫関連抗原、βヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（AFP）、レクチン反応性AFP、チログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2（AS）、腸カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、プロスターゼ（prostase）、プロスターゼ特異抗原（PSA）、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、プロステイン（prostein）、PSMA、サバイビン（surviving）およびテロメラーゼ、前立腺がん腫瘍抗原1（PCTA-1）、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD22、インスリン増殖因子（IGF1）-I、IGF-II、IGFI受容体、メソテリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合性複合体（MHC）分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンのエクストラドメインA（EDA）およびエクストラドメイン（EDB）およびテネイシンCのA1ドメイン（TnC A1）および線維芽細胞関連タンパク質（fap）、LRP6、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）、CD38/CS1、MART1、WT1、MUC1、LMP2、イディオタイプ、NY-ESO-1、Ras変異体、gp100、プロテイナーゼ3、bcr-abl、チロシナーゼ、hTERT、EphA2、ML-TAP、ERG、NA17、PAX3、ALK、アンドロゲン受容体のような腫瘍関連表面抗原；CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD34、CD79、CD116、CD117、CD135、CD123、CD133、CD138、CTLA-4、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、エンドグリン、主要組織適合性複合体（MHC）分子、BCMA（CD269、TNFRSF 17）のような系統特異的もしくは組織特異的な抗原、または（HIV gp120のような）HIVに特異的な抗原；EBVに特異的な抗原、CMVに特異的な抗原、HPVに特異的な抗原、Lasseウイルスに特異的な抗原、インフルエンザウイルスに特異的な抗原のようなウイルスに特異的な表面抗原、ならびにこれらの表面マーカーの誘導体またはバリアントであり得る。具体的なケースにおいて、キメラ抗原受容体が認識するリガンドは、標的細胞、具体的には、がん細胞またはウイルス細胞の表面上に存在する。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体が認識するリガンドは、腫瘍微小環境に存在する。本発明のいくつかの局面において、キメラ抗原受容体が認識するリガンドは、増殖因子である。
【０１６３】
好ましい態様において、CD33、BCMA、およびEGFRVIIIは、本発明に属さない。
【０１６４】
N-CAR構成および他の成分
本発明のN-CARは、単鎖または多鎖の構成を有し得る。多鎖コンフォメーションはWO2014039523に開示されている。
【０１６５】
本発明のN-CARは、
細胞外結合ドメイン、
膜貫通ドメイン、および
伝達シグナル、好ましくは、阻害性伝達シグナルに関与する少なくとも1種のポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を少なくとも含有する膜貫通ポリペプチドであり、ポリペプチド配列はT細胞において有意に発現されず、かつ/またはポリペプチド配列は（TRAIL）受容体および/もしくはCD200受容体1に由来するが、但し、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：13（ヒトSIGL8）、SEQ ID NO：14（ヒトSIGL7）、SEQ ID NO：17（ヒトSIGL5）、SEQ ID NO：20（ヒトSIGL9）、SEQ ID NO：21（ヒトSIGL6）、SEQ ID NO：22（ヒトCD33）、SEQ ID NO：26（ヒトSIG12）、SEQ ID NO：31（ヒトSIG11）、SEQ ID NO：32（ヒトSIG10）、およびSEQ ID NO：19（ヒトPECA1）からなる群より選択される配列ではない。
【０１６６】
好ましい態様において、細胞内ドメインは、阻害性伝達ドメインとも呼ばれるポリペプチド配列を含む。「阻害性伝達ドメイン」とは、本明細書において、阻害性伝達シグナルをコードする領域を含有する膜貫通ポリペプチドを意味する。好ましい態様において、阻害性伝達シグナルは、免疫細胞の活性、具体的には、CTL活性、好ましくは、本発明のP-CARの結合によって誘導されるCTL活性を減弱させる。
【０１６７】
好ましい態様によると、N-CARは、
細胞外結合ドメイン、
膜貫通ドメイン、および
伝達シグナル、好ましくは阻害性伝達シグナルに関与する少なくとも1種のポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を少なくとも含み、ポリペプチド配列はT細胞において有意に発現されず、かつ/またはポリペプチド配列は（TRAIL）受容体および/もしくはCD200受容体1に由来するが、但し、ポリペプチド配列は、SEQ ID NO：13（ヒトSIGL8）、SEQ ID NO：14（ヒトSIGL7）、SEQ ID NO：17（ヒトSIGL5）、SEQ ID NO：20（ヒトSIGL9）、SEQ ID NO：21（ヒトSIGL6）、SEQ ID NO：22（ヒトCD33）、SEQ ID NO：26（ヒトSIG12）、SEQ ID NO：31（ヒトSIG11）、SEQ ID NO：32（ヒトSIG10）、およびSEQ ID NO：19（ヒトPECA1）からなる群より選択される配列ではなく、
阻害性膜貫通ポリペプチドは、SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する配列を含む。
【０１６８】
より好ましい態様によると、N-CARは、
細胞外結合ドメイン、
膜貫通ドメイン、および
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）からなるリストより選択される配列を含む阻害性膜貫通ポリペプチドを含む、細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０１６９】
一態様によると、N-CARは、
細胞外結合ドメイン、
膜貫通ドメイン、および
SEQ ID NO：36（CD200受容体1）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する配列を含む阻害性膜貫通ポリペプチドを含む、細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０１７０】
より好ましい態様によると、N-CARは、
細胞外結合ドメイン、
膜貫通ドメイン、および
SEQ ID NO：36（CD200受容体1）の配列を含む、細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０１７１】
好ましい態様によると、N-CARは
細胞外結合ドメイン、
膜貫通ドメイン、および
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する配列を含む、細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０１７２】
さらに好ましい態様によると、N-CARは、
細胞外結合ドメイン、
膜貫通ドメイン、ならびに
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）からなるリストより選択される配列を含む、細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０１７３】
一つのより好ましい態様によると、N-CARは、
細胞外結合ドメイン、
膜貫通ドメイン、および
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する配列を含む、細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０１７４】
一つのより好ましい態様によると、N-CARは、
細胞外結合ドメイン、
膜貫通ドメイン、および
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）の配列を含む、細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０１７５】
一つのより好ましい態様によると、N-CARは、
細胞外結合ドメイン、
膜貫通ドメイン、および
SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する配列を含む、細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０１７６】
一つのより好ましい態様によると、N-CARは、
細胞外結合ドメイン、
膜貫通ドメイン、および
SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）の配列を含む、細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０１７７】
一つのより好ましい態様によると、N-CARは、
細胞外結合ドメイン、
膜貫通ドメイン、および
SEQ ID NO：35（ヒトTR10B）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する配列を含む、細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０１７８】
一つのより好ましい態様によると、N-CARは、
細胞外結合ドメイン、
膜貫通ドメイン、および
SEQ ID NO：35（ヒトTR10B）の配列を含む、細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０１７９】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン；
SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）に由来するアミノ酸番号201〜375から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０１８０】
「から本質的になるポリペプチド配列」とは、ポリペプチドが本明細書において提示されたN-CARにおいて使用される阻害性分子の一部と同一のものであることを意味する。しかしながら、必要である場合には、阻害機能のモジュレーションをもたらすため、少なくとも1個〜少数のアミノ酸置換が本発明において企図される。
【０１８１】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０１８２】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：1（ヒトKIR2DL2）に由来するアミノ酸番号206〜348から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０１８３】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：4（ヒトKIR2DL3）に由来するアミノ酸番号206〜341から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０１８４】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０１８５】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：6（ヒトKIR2DL4）に由来するアミノ酸番号203〜377から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０１８６】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：7（ヒトKIR3DL1）に由来するアミノ酸番号301〜444から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０１８７】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：5（ヒトKIR3DL2）に由来するアミノ酸番号301〜455から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０１８８】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：24（ヒトFRGR2B）に由来するアミノ酸番号204〜310から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０１８９】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）に由来するアミノ酸番号214〜343から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０１９０】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）に由来するアミノ酸番号216〜448の受容体のポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０１９１】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）に由来するアミノ酸番号420〜631から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０１９２】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）に由来するアミノ酸番号296〜410から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０１９３】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
−抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
−膜貫通ドメイン、
−SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）に由来するアミノ酸番号419〜590から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０１９４】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）に由来するアミノ酸番号420〜598から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０１９５】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）に由来するアミノ酸番号375〜515から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０１９６】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）に由来するアミノ酸番号753〜977から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０１９７】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）に由来するアミノ酸番号388〜508から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０１９８】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）に由来するアミノ酸番号292〜429から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０１９９】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）に由来するアミノ酸番号564〜734から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０２００】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）に由来するアミノ酸番号147〜269から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０２０１】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）に由来するアミノ酸番号151〜303から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０２０２】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：30（ヒトPVR）に由来するアミノ酸番号329〜417から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０２０３】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：36（ヒトCD200受容体1）に由来するアミノ酸番号229〜325から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０２０４】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）に由来するアミノ酸番号181〜386から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０２０５】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）に由来するアミノ酸番号230〜468から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０２０６】
一つの好ましい態様によると、本発明のN-CARは、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、；
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：35（ヒトTR10B）に由来するアミノ酸番号179〜440から本質的になるポリペプチド配列を含む、細胞内ドメイン
を含む。
【０２０７】
別の好ましい態様によると、N-CARは、
細胞外結合ドメイン、
膜貫通ドメイン、および
細胞外結合ドメインと膜貫通ドメインとの間のリンカー
を少なくとも含み、リンカーは当業者に公知の任意のものであり得る。
【０２０８】
好ましくは、このリンカーは、SEQ ID NO：39およびSEQ ID NO：40の配列を含むGSリンカー1またはGSリンカー2であり、より好ましくは、このリンカーは、SEQ ID NO：39およびSEQ ID NO：40の配列からなるGSリンカー1またはGSリンカー2である。
【０２０９】
従って、N-CARの細胞外部分は、
健常細胞において発現される「オフターゲット」抗原に結合するための、モノクローナル抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外結合ドメイン（好ましくは、「オフターゲット」抗原は、P-CARによって標的とされる細胞においては発現されない）、
膜貫通ドメイン、および
2種の上記成分を共に結合するリンカー
を含んでいてよい。
【０２１０】
前記のモノクローナル抗体のscFvは、好ましくは、健常組織または健常細胞において発現される「オフターゲット」抗原に結合する。
【０２１１】
例えば、急性骨髄性白血病（AML）の処置のため、P-CARによって標的とされる抗原がCD123である時、N-CARの細胞外結合ドメインは、（虫垂、骨髄、リンパ節、扁桃腺、および脾臓において発現される）CD4抗原、（主として、脾臓、虫垂、およびリンパ節において発現される）CD20抗原、（特に、虫垂、リンパ節、扁桃腺、および脾臓において発現される）CD22抗原、（主として、膀胱およびリンパ節において発現される）CD25抗原、ならびに（腎臓において発現される）MUC1抗原より選択される抗原の中から選択され得る、健常細胞または健常免疫細胞において発現される少なくとも1種の「オフターゲット」抗原に結合する。
【０２１２】
従って、一つの態様において、本発明のN-CARは、
CD4抗原、CD20抗原、CD22抗原、CD25抗原、および/もしくはMUC1抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFv；またはそれらの組み合わせを含む細胞外ドメイン、
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40を有するリンカー；ならびに
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）からなるリストより選択される配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０２１３】
別の態様において、本発明のN-CARは、
CD4抗原、CD20抗原、CD22抗原、CD25抗原、および/またはMUC1抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン；
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40を有するリンカー；ならびに
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０２１４】
別の態様において、本発明のN-CARは、
CD4抗原、CD20抗原、CD22抗原、CD25抗原、および/またはMUC1抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン；
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40を有するリンカー；ならびに
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０２１５】
別の態様において、本発明のN-CARは、
CD4抗原、CD20抗原、CD22抗原、CD25抗原、および/またはMUC1抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン；
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40を有するリンカー；ならびに
膜貫通ドメイン、
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）からなるリストより選択される配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０２１６】
別の態様において、本発明のN-CARは、
CD4抗原、CD20抗原、CD22抗原、CD25抗原、および/またはMUC1抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン；
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40を有するリンカー；ならびに
SEQ ID NO：36（CD200受容体1）の配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０２１７】
別の態様において、本発明のN-CARは、
CD4抗原、CD20抗原、CD22抗原、CD25抗原、および/またはMUC1抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン；
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40を有するリンカー；ならびに
SEQ ID NO：36（CD200受容体1）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０２１８】
例えば、多発性骨髄腫（MM）の処置のため、P-CARによって標的とされる抗原がCD38である時、N-CARの細胞外結合ドメインは、（ニューロン細胞、神経膠細胞、骨格筋細胞、およびナチュラルキラー細胞の表面において発現される）CD56抗原、（胸腺皮質上皮細胞および樹状細胞（DC）サブセットにおいて発現される）CD205抗原、（活性化リンパ球、ランゲルハンス細胞、および指状嵌入皮質細胞において発現される）CD83抗原、（マクロファージおよび樹状細胞の表面、ヒト皮膚繊維芽細胞およびケラチノサイトのような皮膚細胞の表面において発現される）CD206抗原；（造血細胞に起因する細胞、活性化T細胞、内皮ニューロン細胞、および生殖器、卵巣および胎盤栄養膜の細胞において発現される）CD200抗原；（脂肪細胞、内皮細胞、および単球において発現される）CD36抗原；RARRES1抗原（この遺伝子の発現はタザロテンによってもレチノイン酸受容体によってもアップレギュレートされる）より選択される抗原の中から選択され得る、健常細胞において発現される少なくとも1種の「オフターゲット」抗原に結合する。
【０２１９】
例えば、多発性骨髄腫（MM）の処置のため、P-CARによって標的とされる抗原がCD22である時、N-CARの細胞外結合ドメインは、（ニューロン細胞、神経膠細胞、骨格筋細胞、およびナチュラルキラー細胞の表面において発現される）CD56抗原、（胸腺皮質上皮細胞および樹状細胞（DC）サブセットにおいて発現される）CD205抗原、（活性化リンパ球、ランゲルハンス細胞、および指状嵌入皮質細胞において発現される）CD83抗原、（マクロファージおよび樹状細胞の表面、ヒト皮膚繊維芽細胞およびケラチノサイトのような皮膚細胞の表面において発現される）CD206抗原；（造血細胞に起因する細胞、活性化T細胞、内皮ニューロン細胞、および生殖器、すなわち卵巣および胎盤栄養膜の細胞において発現される）CD200抗原；（脂肪細胞、内皮細胞、および単球において発現される）CD36抗原；RARRES1抗原（この遺伝子の発現はタザロテンによってもレチノイン酸受容体によってもアップレギュレートされる）より選択される抗原の中から選択され得る、健常細胞において発現される少なくとも1種の「オフターゲット」抗原に結合する。
【０２２０】
従って、一つの態様において、本発明のN-CARは、
CD56抗原、CD205抗原、CD83抗原、CD206抗原；CD200抗原；CD36抗原、および/またはRARRES1抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン、
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40を有するリンカー；ならびに
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０２２１】
一つの態様において、本発明のN-CARは、
CD56抗原、CD205抗原、CD83抗原、CD206抗原；CD200抗原；CD36抗原、および/またはRARRES1抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン；
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40を有するリンカー；ならびに
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）からなるリストより選択される配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０２２２】
別の態様において、本発明のN-CARは、
CD56抗原、CD205抗原、CD83抗原、CD206抗原；CD200抗原；CD36抗原、および/またはRARRES1抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン；
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40を有するリンカー；ならびに
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０２２３】
別の態様において、本発明のN-CARは、
CD56抗原、CD205抗原、CD83抗原、CD206抗原；CD200抗原；CD36抗原、および/またはRARRES1抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン；
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40を有するリンカー；ならびに
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）からなるリストより選択される配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０２２４】
別の態様において、本発明のN-CARは、
CD56抗原、CD205抗原、CD83抗原、CD206抗原；CD200抗原；CD36抗原、および/またはRARRES1抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン；
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40を有するリンカー；ならびに
SEQ ID NO：36（CD200受容体1）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０２２５】
別の態様において、本発明のN-CARは、
CD56抗原、CD205抗原、CD83抗原、CD206抗原；CD200抗原；CD36抗原、および/またはRARRES1抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン；
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40を有するリンカー；ならびに
SEQ ID NO：36（CD200受容体1）の配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０２２６】
例えば、慢性リンパ球性白血病（CLL）の処置のため、P-CARによって標的とされる抗原がCS1である時、N-CARの細胞外結合ドメインは、（心臓において発現される）トロポニンC抗原；（内皮細胞および繊維芽細胞、腸、結腸、精巣、卵巣、胸腺、脾臓、および前立腺において発現される）β1インテグリン抗原；（胃、膵臓、脳、および胆嚢において発現される）CCKBR抗原；（副腎において発現される）GALR1抗原；ならびに（腎臓および小腸において発現される）CUBN抗原の中から選択され得る、健常細胞において発現される「オフターゲット」抗原に結合する。
【０２２７】
従って、一つの態様において、本発明のN-CARは、
トロポニンC抗原；β1インテグリン抗原；CCKBR抗原；GALR1抗原、およびCUBN抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン；
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40を有するリンカー；ならびに
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含んでいてよい。
【０２２８】
一つの態様において、本発明のN-CARは、
トロポニンC抗原；β1インテグリン抗原；CCKBR抗原；GALR1抗原、およびCUBN抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン；
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40とのリンカー；ならびに
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）からなるリストより選択される配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０２２９】
別の態様において、本発明のN-CARは、
トロポニンC抗原；β1インテグリン抗原；CCKBR抗原；GALR1抗原、およびCUBN抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン；
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40を有するリンカー；ならびに
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０２３０】
別の態様において、本発明のN-CARは、
トロポニンC抗原；β1インテグリン抗原；CCKBR抗原；GALR1抗原、およびCUBN抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン；
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40を有するリンカー；ならびに
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）からなるリストより選択される配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０２３１】
別の態様において、本発明のN-CARは、
トロポニンC抗原；β1インテグリン抗原；CCKBR抗原；GALR1抗原、およびCUBN抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン；
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40を有するリンカー；ならびに
SEQ ID NO：36（CD200受容体1）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０２３２】
別の態様において、本発明のN-CARは、
トロポニンC抗原；β1インテグリン抗原；CCKBR抗原；GALR1抗原、および/またはCUBN抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン；
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40を有するリンカー；ならびに
SEQ ID NO：36（CD200受容体1）の配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０２３３】
例えば、慢性リンパ球性白血病（CLL）または固形腫瘍の処置のため、P-CARによって標的とされる抗原がROR1である時、N-CARの細胞外結合ドメインは、（心臓において発現される）トロポニンC抗原；（内皮細胞および繊維芽細胞、腸、結腸、精巣、卵巣、胸腺、脾臓、および前立腺において発現される）β1インテグリン抗原；（胃、膵臓、脳、および胆嚢において発現される）CCKBR抗原；（副腎において発現される）GALR1抗原、または（腎臓において発現される）MUC1抗原からなるリストより選択される、健常細胞において発現される少なくとも1種の「オフターゲット」抗原に結合する。
【０２３４】
従って、一つの態様において、本発明のN-CARは、
トロポニンC抗原；β1インテグリン抗原；CCKBR抗原；GALR1抗原、および/またはMUC抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン；
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40を有するリンカー；ならびに
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０２３５】
一つの態様において、本発明のN-CARは、
トロポニンC抗原；β1インテグリン抗原；CCKBR抗原；GALR1抗原、および/またはMUC抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン；
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40を有するリンカー；ならびに
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）からなるリストより選択される配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０２３６】
別の態様において、本発明のN-CARは、
トロポニンC抗原；β1インテグリン抗原；CCKBR抗原；GALR1抗原、および/またはMUC抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン；
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40を有するリンカー；ならびに
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有する配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含んでいてよい。
【０２３７】
別の態様において、本発明のN-CARは、
トロポニンC抗原；β1インテグリン抗原；CCKBR抗原；GALR1抗原、および/またはMUC抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン；
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、またはSEQ ID NO：40を有するリンカー；ならびに
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）からなるリストより選択される配列を含む細胞内ドメイン
を少なくとも含む。
【０２３８】
別の態様において、本発明のN-CARは、
トロポニンC抗原；β1インテグリン抗原；CCKBR抗原；GALR1抗原、および/またはMUC抗原より選択される抗原に特異的に結合する抗体に由来する少なくとも1種のscFvを含む細胞外ドメイン
を少なくとも含む。
【０２３９】
他の態様において、本発明のN-CARは、
細胞外結合ドメイン；
阻害性伝達ドメインを含む細胞内ドメイン
を少なくとも含有する膜貫通ポリペプチドであり、
細胞内ドメインの阻害性伝達ドメインは、単独で使用され、別に選ばれた膜貫通ドメインに融合され、任意で、膜貫通ドメインはヒンジによって細胞外結合ドメインに融合されている。
【０２４０】
膜貫通ドメイン
一つの態様において、膜貫通ドメインは、T細胞受容体のα鎖、β鎖、もしくはζ鎖、PD-1、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、LAG3、2B4、BTLA4、TIM-3、TIGIT、SIRPA、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、またはCD154の膜貫通領域を含む。
【０２４１】
適切な膜貫通ドメインの特徴的な特色には、細胞、本発明において、好ましくは、免疫細胞、具体的には、リンパ球またはナチュラルキラー（NK）細胞の表面において発現され、予め定義された標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を指図するために共に相互作用する能力が含まれる。膜貫通ドメインは、天然起源に由来してもよいしまたは合成起源に由来してもよい。膜貫通ドメインは、膜結合型タンパク質または膜貫通タンパク質に由来してよい。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、α、β、?、または?のようなT細胞受容体のサブユニット、CD3複合体を構成するポリペプチド、IL2受容体p55（α鎖）、p75（β鎖）、または?鎖、Fc受容体、具体的には、Fc?受容体IIIのサブユニット鎖、またはCDタンパク質であってよい。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、ロイシンおよびバリンのような疎水性の残基を主に含んでいてもよい。好ましい態様において、膜貫通ドメインは、ヒトCD8α鎖（例えば、NP_001139345.1）に由来する。膜貫通ドメインは、CD8膜貫通ドメイン（α鎖およびβ鎖）であってもよい。膜貫通ドメインは、強制的な異種二量体または同種二量体を作製するため、操作されていてもよい。具体的な態様において、CARは、リガンド認識の後にのみ二量体を形成することができる膜貫通ドメインまたは細胞内ドメインを含んでいてよい。膜貫通ドメインの別の例は、NKG2-D受容体であり得る。NKG2D（ナチュラルキラー細胞2D群）は、NK細胞、γδ-TcR+T細胞、およびCD8+αβ-TcR+T細胞において発現されるC型レクチン様受容体である（Bauer,Groh et al.,1999,Science 285(5428):727-9）。NKG2Dは、PI-3キナーゼのp85サブユニットにその細胞質ドメインが結合する膜貫通アダプタータンパク質DAP10に関連している（Wu,Song et al.1999,Science 285(5428):730-2）。
【０２４２】
膜貫通ドメインの別の例は、受容体型チロシンキナーゼであり得る。受容体型チロシンキナーゼは、細胞増殖、細胞分化、細胞生存、細胞移動、および細胞周期調節を含む種々の重大な細胞制御過程に関与する細胞表面受容体である。受容体型チロシンキナーゼは、細胞外ドメイン、一回膜貫通ヘリックス、ならびに付加的なカルボキシ末端ドメインおよび膜近傍ドメインによって大部分の時間自己制御されているチロシンキナーゼ機能を含む細胞内ドメインを含む。受容体型チロシンキナーゼの活性化は、一般に、リガンドによって媒介される二量体形成によって誘発される。二価のため、成長ホルモンリガンドは、2個の受容体モノマーと同時に相互作用する能力を有し、二量体形成を促進する。そのような二量体形成は、コンフォメーション変化後の細胞内ドメイン内に位置する種々のチロシンのトランスリン酸化を通して、細胞内キナーゼドメインの活性化を誘導する。最終的に生成された種々のホスホチロシンは、細胞制御経路を活性化する下流シグナリングパートナーのリクルートメントのためのドッキング部位として役立つ。CARは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに/またはTrkA、c-Kit、FGFR、およびEGFR/Erbからなる群より好ましくは選択される受容体型チロシンキナーゼの細胞内ドメインを含むことができる。チロシンキナーゼ膜貫通ドメインおよび/または細胞内ドメインは、本発明による細胞外リガンド結合ドメインおよび細胞内ドメインに連結されていてよい。操作された細胞は、種々の膜貫通ドメインを含む種々のN-CARおよびP-CARを含むことができる。
【０２４３】
膜貫通ドメインは、インテグリンであってもよい。インテグリンは、全ての白血球において発現されるLFA-1（インテグリンリンパ球機能関連抗原1）を共に形成する?鎖および? ?鎖から構成される異種二量体膜内在性タンパク質である。LFA-1は、リガンドICAM 1〜3（細胞間接着分子1〜3）との相互作用を通して白血球細胞間接着において中心的な役割を果たし、リンパ球共刺激シグナリングにおいても重要な役割を有する（Chen and Flies 2013,Nat Rev Immunol 13(4):227-42）。LAF-1とその免疫グロブリンICAM-1との結合の分子的詳細は、周知であり、LAF-1結合部位の慎重な操作を可能にしている。ICAM-1に対する?Lドメインの親和性は、LAF-1における特異的ループの改変にコンフォメーション的に関連しているC末端ヘリックスの置換によって制御される。活性コンフォメーションおよび低コンフォメーションは、500倍および10,000倍異なる。LFA-1のための二つの型のアンタゴニストが公知であり、作用機序が公知であることに注目することも興味深い。インテグリン細胞表面接着受容体は、外部から内部へのみならず、その逆にも、シグナルを伝達することができる。内部から外部にメッセージを送るためにインテグリンテールLFA-1に結合するタリンのような細胞骨格タンパク質が存在する。
【０２４４】
一つの態様によると、膜貫通ドメインは、PD-1の膜貫通領域またはCD8αの膜貫通領域を含む。
【０２４５】
一つの好ましい態様によると、膜貫通ドメインは、CD8αの膜貫通領域を含む。本発明の一つの局面において、膜貫通ドメインは、ヒンジを介して、N-CARの細胞外ドメインに付着させられる。
【０２４６】
ヒンジ
好ましい態様において、N-CARのヒンジは、ヒト免疫グロブリンヒンジである。
【０２４７】
より好ましい態様において、N-CARのヒンジは、IgG1ヒンジまたはCD8αヒンジである。
【０２４８】
本明細書において使用される（ヒンジ領域とも呼ばれる）「ストーク領域」という用語は、一般に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するために機能するオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。具体的には、ストーク領域は、細胞外リガンド結合ドメインについて、より多くのフレキシビリティおよび到達可能性を提供するために使用される。ストーク領域は、300個までのアミノ酸、好ましくは、10〜100個のアミノ酸、最も好ましくは、25〜50個のアミノ酸を含んでいてよい。ストーク領域は、CD8、CD4、CD28、もしくはRTKの細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部のような、天然に存在する分子の全部または一部に由来し得る。あるいは、ストーク領域は、天然に存在するストーク配列に相当する合成配列であってもよいし、または完全に合成のストーク配列であってもよい。
【０２４９】
本発明には、前記定義のN-CARをコードする配列を含む組換えDNA構築物が包含され、N-CARは、オフ腫瘍抗原に特異的に結合する抗体断片のような細胞外ドメインを含み、細胞外ドメインの配列は、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインをコードする核酸配列と連続しており、同一のリーディングフレームにある。例示的なN-CAR構築物は、任意でのリーダー配列、細胞外オフ組織抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、および細胞内阻害性シグナリングドメインを含んでいてよい。
【０２５０】
一つの好ましい態様によると、本発明によるヒンジは、IgG1もしくはCD8αに由来する配列を含み、好ましくは、SEQ ID NO：51および50の配列を含む。
【０２５１】
操作された免疫細胞
一つの局面において、本発明は、（前記の）本発明による少なくとも1種のN-CARを含む免疫細胞を提供する。
【０２５２】
一つの局面において、本発明は、（前記の）本発明による少なくとも1種のN-CARと、本発明による少なくとも1種のP-CARとを含む免疫細胞を提供する。
【０２５３】
本発明の一つの局面において、単離された免疫細胞は、
抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン；
膜貫通ドメイン；
細胞内ドメイン
を含むP-CARと、上記のN-CARとを含む。
【０２５４】
本発明は、単鎖（sc）または多鎖（mc）のN-CARとsc P-CARとを含む免疫細胞を包含する。
【０２５５】
本発明は、単鎖（sc）または多鎖（mc）のN-CARとmc P-CARとを含む免疫細胞を包含する。
【０２５６】
本発明は、単鎖（sc）N-CARとsc P-CARとを含む免疫細胞を包含する。
【０２５７】
本発明は、多鎖（mc）N-CARとsc P-CARとを含む免疫細胞を包含する。
【０２５８】
本発明は、多鎖（mc）N-CARとmc P-CARとを含む免疫細胞を包含する。本発明は、細胞を操作する該方法によって入手可能な単離された細胞または細胞株にも関する。
【０２５９】
本発明は、本発明による細胞を操作する方法によって入手可能な単離された細胞または細胞株にも関する。
【０２６０】
免疫細胞とは、自然免疫および/または適応免疫の応答の開始および/または実行に機能的に関与する造血系起源の細胞をさす。本発明による免疫細胞は、幹細胞に由来してよい。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より具体的には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞であってよい。代表的なヒト細胞はCD34+細胞である。単離された細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、NK細胞、B細胞、またはT細胞であってもよい。単離された細胞は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むN-CARおよびCARの集団を含んでいてよい。具体的には、単離された細胞は、N-CARおよびP-CARをコードする外来性のポリヌクレオチド配列を含む。
【０２６１】
一つの好ましい態様において、前記の1種のN-CARおよび1種のCARを少なくとも含む単離された細胞は、T細胞である。
【０２６２】
より好ましい態様において、前記の1種のN-CARおよび1種のCARを少なくとも含む単離された細胞は、ヒトT細胞である。
【０２６３】
好ましい態様において、単離された免疫細胞は、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球からなる群より選択される。
【０２６４】
前記細胞は、CD4+Tリンパ球およびCD8+Tリンパ球からなる群に由来してよい。本発明の細胞の増大および遺伝子修飾の前に、細胞の起源は、多様な非限定的な方法を通して対象から入手され得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、多数の非限定的な起源から入手され得る。本発明のある種の態様において、当業者に入手可能であり公知である多数のT細胞株が使用され得る。
【０２６５】
一つの態様において、単離された免疫細胞は、健常ドナーから回収される。
【０２６６】
別の態様において、単離された免疫細胞は、がんを有すると診断された患者または感染を有すると診断された患者から回収される。
【０２６７】
前記細胞は、異なる表現型的特徴を提示する細胞の混合集団の一部であってもよい。上記の方法によって形質転換されたT細胞から入手された細胞株も、本発明の範囲に包含される。
【０２６８】
一つの態様によると、P-CARの抗原結合ドメインが結合する抗原はCD38であり、かつN-CARの抗原結合ドメインが結合する抗原はCD56、CD205、CD83、CD206、CD200、およびCD36からなるリストより選択される抗原である。
【０２６９】
一つの態様によると、P-CARの抗原結合ドメインが結合する抗原はCD19であり、かつN-CARの抗原結合ドメインが結合する抗原はCD56、CD205、CD83、CD206、CD200、およびCD36からなるリストより選択される抗原である。
【０２７０】
一つの態様によると、P-CARの抗原結合ドメインが結合する抗原はCD20であり、かつN-CARの抗原結合ドメインが結合する抗原はCD56、CD205、CD83、CD206、CD200、およびCD36からなるリストより選択される抗原である。
【０２７１】
一つの態様によると、P-CARの抗原結合ドメインが結合する抗原はPCMAであり、かつN-CARの抗原結合ドメインが結合する抗原はCD56、CD205、CD83、CD206、CD200、およびCD36からなるリストより選択される抗原である。
【０２７２】
別の態様によると、P-CARの抗原結合ドメインが結合する抗原はCS1であり、かつN-CARの抗原結合ドメインが結合する抗原はトロポニンC、β1インテグリン、CCKBR、GALR1、またはCUBNからなるリストより選択される抗原である。
【０２７３】
別の態様によると、P-CARの抗原結合ドメインが結合する抗原はCD123であり、かつN-CARの抗原結合ドメインが結合する抗原はCD4、CD20、CD22、CD25、またはMUC1からなるリストより選択される抗原である。
【０２７４】
別の態様によると、P-CARの抗原結合ドメインが結合する抗原はROR1であり、かつN-CARの抗原結合ドメインが結合する抗原はトロポニンC、β1インテグリン、CCKBR、GALR1、またはMUC1からなるリストより選択される抗原である。
【０２７５】
陽性キメラ抗原受容体（P-CAR）
本発明は、前記のN-CARの他に、操作された免疫細胞が腫瘍標的細胞の破壊を誘発することを可能にする少なくとも1種のP-CARを含む「ロジカルNOT」ゲートに関する。
【０２７６】
本発明の範囲において使用されるP-CARは、単鎖または多鎖のCARであり得る。
【０２７７】
一つの態様において、P-CARは単鎖CARであり；1種の細胞外リガンド結合ドメインと、シグナル伝達ドメインを含む1種の細胞外ドメインとを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを含む。
【０２７８】
いくつかの態様において、免疫細胞は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられるWO2014/039523において定義されるような多鎖P-CARを含む。
【０２７９】
多鎖CARとは、少なくとも2種のポリペプチドが共に会合して機能性の多鎖キメラ抗原受容体を形成するよう、少なくとも（1）少なくとも1種の細胞外リガンド結合ドメインを含む膜貫通ポリペプチド；および（2）少なくとも1種の伝達ドメインを含む膜貫通ポリペプチドのような、異なるポリペプチドを含むCAR構造を意味する（WO2014039523）。
【０２８０】
別の態様において、このP-CARは、WO2014039523に記載されたような多鎖CARであり、
少なくとも1種の細胞外リガンド結合ドメインを含む1種の膜貫通ポリペプチド；および
少なくとも1種のシグナル伝達ドメインを含む1種の膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含む。
【０２８１】
例えば、多鎖CARは、
（a）細胞外リガンド結合ドメインに融合したFcsRIα鎖の膜貫通ドメインを含む1種のポリペプチド、
（b）FcRIβ鎖の膜貫通ドメインに融合したN末端およびC末端の細胞質テールの一部を含む1種のポリペプチド、ならびに/または
（c）FcRIγ鎖の細胞質内テールおよび/もしくは膜貫通ドメインの一部を各々含む2種の付加的なポリペプチド
の成分のうちの少なくとも2種を含んでいてよく、従って、これらの異なるポリペプチドは、共に自然に多量体形成して、二量体CAR、三量体CAR、または四量体CARを形成する。
【０２８２】
好ましい態様において、鎖は共有結合で連結されない。
【０２８３】
四量体P-CARの例は、WO2013176915の図3に図示され、多鎖P-CARの異なるバージョンはWO2013176915の図4に表される。そのようなP-CARは、本発明によるT細胞を入手するため、本開示によるN-CARと共に、前記開示の方法を使用して入手されたT細胞において発現され得る。
【０２８４】
いくつかの態様において、本発明は、本明細書において定義されるN-CARと、US7446190、WO2008/121420、US8252592、US20140024809、WO2012/079000、WO2014153270、WO2012/099973、WO2014/011988、WO2014/011987、WO2013/067492、WO2013/070468、WO2013/040557、WO2013/126712、WO2013/126729、WO 2013/126726、WO2013/126733、US8399645、US20130266551、US20140023674、WO2014039523、US7514537、US8324353、WO2010/025177、US7446179、WO2010/025177、WO2012/031744、WO2012/136231A1、WO2012/050374A2、WO2013074916、WO/2009/091826A3、WO2013/176915、またはWO/2013/059593のいずれかにおいて定義されるP-CARとを含む免疫細胞に関する。
【０２８５】
P-CARの膜貫通ドメインは、N-CARについて既に説明されたものに類似した基準に応答する。P-CARの細胞外リガンド結合ドメインについても、前記に提示されたような抗原標的に対する特異性の違いを除き、同様である。
【０２８６】
好ましいTMは、CD8αに由来し、より好ましくは、SEQ ID NO：50のものである。
【０２８７】
四量体P-CARの例は、WO2013176915の図3に図示され、多鎖P-CARの異なるバージョンは、WO2013176915の図4に表される。そのようなP-CARは、本発明によるT細胞を入手するため、本開示によるN-CARと共に、前記開示の方法を使用して入手されたT細胞において発現され得る。
【０２８８】
いくつかの態様において、本発明は、本明細書において定義されるN-CARと、US7446190、WO2008/121420、US8252592、US20140024809、WO2012/079000、WO2014153270、WO2012/099973、WO2014/011988、WO2014/011987、WO2013/067492、WO2013/070468、WO2013/040557、WO2013/126712、WO2013/126729、WO 2013/126726、WO2013/126733、US8399645、US20130266551、US20140023674、WO2014039523、US7514537、US8324353、WO2010/025177、US7446179、WO2010/025177、WO2012/031744、WO2012/136231A1、WO2012/050374A2、WO2013074916、WO/2009/091826A3、WO2013/176915、またはWO/2013/059593のいずれかにおいて定義されるP-CARとを含む免疫細胞に関する。
【０２８９】
本発明によるp-CARのシグナリングドメインまたは「シグナリングタンパク質」は、操作免疫細胞の正常な機能のうちの少なくとも一つの活性化に関与する。例えば、T細胞の機能は、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。従って、「シグナリングタンパク質」という用語は、伝達ドメイン機能シグナルを伝達し、専門の機能を実施するよう細胞に指図するタンパク質をさす。具体的な態様において、シグナリングドメインは、シグナリングタンパク質であり得る。シグナルの伝達は、タンパク質/タンパク質相互作用、タンパク質/DNA相互作用、タンパク質/RNA相互作用、タンパク質/低分子相互作用、翻訳後タンパク質修飾、コンフォメーション変化、細胞内再局在化：に起因し得る。
【０２９０】
シグナリングタンパク質は、核内の遺伝子を活性化することができる。シグナリングタンパク質の例は、活性化T細胞においてインターロイキン2プロモーターに結合することができる誘導可能因子であるNFAT転写因子ファミリーのメンバーであり得る。NFATタンパク質の制御は、カルシウム、カルシニューリン、およびホーマー足場タンパク質のような、代謝物質およびタンパク質を含む。シグナリングタンパク質は、カルシニューリンおよびホーマータンパク質による制御を回避するNFATの活性化された操作型であり得る。シグナリングタンパク質は、T細胞の活性化を可能にするI?bによる細胞質への隔離を回避するために操作されたNFκBであり得る。シグナリングタンパク質は、3種のIKKサブユニット（IKKα、IKKβ、IKKγ）の発現であってもよい。再構成されたIKK複合体は、IκBのユビキチン化を誘発することによって、NF?B経路を活性化した。JNKシグナリングの活性化も、シグナリングタンパク質AP-1（転写因子）の直接発現を通して誘発され得る。シグナリングタンパク質は、NFATおよびNF-kbと同一の遺伝子を特異的に標的とし、その転写を活性化する操作されたTALエフェクター（transcription activator like effector；TALE）結合ドメインであり得る。
【０２９１】
本発明によると、シグナリングタンパク質は、タンパク質間相互作用を通してシグナリング経路を阻害するか、またはシグナリング経路を阻害するために核内の遺伝子を活性化することができる。シグナリングタンパク質は、細胞外シグナル制御キナーゼ（ERK）シグナリングタンパク質を脱リン酸し不活化するマイトジェン活性化プロテインキナーゼホスファターゼ（MKP）ファミリーのメンバーであるワクシニアH1関連タンパク質（VHR）であってよい。
【０２９２】
本発明によると、P-CARにおいて使用するためのシグナル伝達ドメインは、抗原受容体会合後にシグナル伝達を開始するよう協調的に作用するT細胞受容体およびコレセプターの細胞質配列、ならびに同一の機能的能力を有するこれらの配列の誘導体またはバリアントおよび合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインには、細胞質シグナリング配列の2種の別個のクラス、抗原依存性の一次活性化を開始するもの、および二次的または共刺激的なシグナルを提供する抗原非依存的に作用するものが含まれ得る。
【０２９３】
主要な細胞質シグナリング配列には、ITAMの免疫受容活性化チロシンモチーフとして公知のシグナリングモチーフが含まれ得る。ITAMは、syk/zap70クラスチロシンキナーゼのための結合部位として役立つ多様な受容体の細胞質内テールに見出される十分に定義されたシグナリングモチーフである。本発明において使用されるITAMの例には、非限定的な例として、TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するものが含まれ得る。好ましい態様において、本発明による多鎖CARのシグナリング伝達ドメインには、CD3ζシグナリングドメインまたはFcRIβ鎖もしくはγ鎖の細胞質内ドメインが含まれ得る。
【０２９４】
具体的な態様において、本発明のP-CARのシグナル伝達ドメインには、共刺激シグナル分子が含まれる。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。「共刺激リガンド」とは、T細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、TCR/CD3複合体のペプチドが負荷されたMHC分子との結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化等を含むが、これらに限定されるわけではない、T細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子をさす。「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、以下に限定されるわけではないが、増殖のような細胞による共刺激応答を媒介する、T細胞上の同族結合パートナーをさす。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLA、およびトールリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０２９５】
本発明による共刺激リガンドには、CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（ICOS-L）、細胞間接着分子（ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3に特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。共刺激リガンドには、とりわけ、以下に限定されるわけではないが、CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、CD83に特異的に結合するリガンドのような、T細胞上に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体も包含される。
【０２９６】
前記に提示されたようなN-CARと組み合わせて使用され得る好ましい例示的なP-CARは、CD19、CD123、CD38、CS1、ROR1、CLL-1、またはCD22細胞表面マーカー抗原を認識する細胞外結合ドメインを有するものである。
【０２９７】
抗CD28 CAR、抗CD30 CAR、抗CD138 CAR、抗CD171 CAR、抗CD19 CAR、抗CEA CAR（CEAはがん胎児性抗原である）、抗_ERB B CAR（HER-2/neuのリガンド）、抗FAP CAR（繊維芽細胞活性化タンパク質）、抗GD2 CAR、抗GPC3 CAR（グリピカン3抗原）、抗ルイスY CAR（糖鎖抗原）、抗NKG2DリガンドCAR、抗MSLN CAR（メソテリン抗原）、抗NY-ESO-1 CAR（がん精巣抗原）、抗PSCA CAR（前立腺幹細胞抗原）、抗GPC3（グリピカン3抗原）CAR、抗CD20 CAR、抗HER1 CAR（EGFR/HER-1オンコアンチゲン）、または抗CD47 CARのような、本発明によるN-CARと組み合わせて使用され得るその他のP-CARも、本発明において企図される。これらのP-CARは単鎖または多鎖の構成を有し得る。
【０２９８】
CD123 P-CAR
一つの態様によると、操作された免疫細胞において発現されるP-CARは、N-CARと組み合わせて、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの1種を有するCD123特異的キメラ抗原受容体（CAR）であり、構造は、モノクローナル抗CD123抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０２９９】
好ましいバリアントとして、使用され得るモノクローナル抗CD123抗体に由来するVHおよびVLは、Klon-43に由来する（それぞれ、SEQ ID NO：47〜48）。
【０３００】
可能なオプションとして、それぞれ、FcγRIIIα、CD8α、IgG1に由来する短いヒンジ、中程度のヒンジ、または長いヒンジ（SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51）が使用され得る。
【０３０１】
好ましい膜貫通ドメインとしては、4-1BBまたはCD8α（SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：52）が好ましく、より好ましくは、CD8αである。
【０３０２】
好ましい態様において、操作された免疫細胞において発現されるP-CARは、N-CARと組み合わせて、図1に図示されるV1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの1種を有するCD123特異的キメラ抗原受容体であり、構造は、モノクローナル抗CD123抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含み、123 CARは、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58、またはSEQ ID NO：60のいずれかとの少なくとも80％の配列同一性を有する。
【０３０３】
CS1 P-CAR
別の態様によると、操作された免疫細胞において発現されるP-CARは、N-CARと組み合わせて、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの1種を有するCS1特異的キメラ抗原受容体（CAR）であり、構造は、モノクローナル抗CS1抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３０４】
モノクローナル抗CS1抗体に由来するVH鎖およびVLに関して、それらは、マウスのscFv Luc63抗体、Luc90抗体、Luc34抗体、LucX1抗体、およびLucX2抗体（WO 2015121454 A1におけるSEQ ID NO：38〜47）に由来してよく、任意で、これらからヒト化されていてもよい。
【０３０５】
CD38 P-CAR
別の態様によると、操作された免疫細胞において発現されるP-CARは、N-CARと組み合わせて、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの1種を有するCD38特異的キメラ抗原受容体（CAR）であり、構造は、モノクローナル抗CD38抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３０６】
好ましくは、P-CARとしての抗CD38 CARは、（25A10 mAbに基づく）SEQ ID NO：64〜66、（28F5 mAbに基づく）SEQ ID NO：67〜69、（16B5に基づく）SEQ ID NO：70〜72からなる群より選択される配列との少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性を示すポリペプチド配列を含む。
【０３０７】
これらのCD38 scCARおよびCS1 scCAR について、好ましいヒンジまたは膜貫通ドメインの選択は、CD123 CARと同一のままである。
【０３０８】
CD38を発現する細胞も、多くの他の腫瘍抗原マーカーCS1を発現する細胞も、CARの魅力的な標的と見なされ得るが、そのような抗原マーカーは大部分のT細胞の表面においても発現されるという事実が、免疫治療を実施するためのこれらのマーカーの選択を有意に妨げている。従って、好ましい態様によると、抗CD38陽性CARまたは抗CS1陽性CARは、免疫細胞の表面において発現されるそのようなCD38またはCS1を不活化するためにさらに操作されている免疫細胞において、N-CARと組み合わせて発現される。この方法はWO2015/121454に記載される。この遺伝子不活化は、TALEヌクレアーゼのような特異的なエンドヌクレアーゼの使用によって実施され得る。
【０３０９】
CLL-1 P-CAR
別の態様によると、操作された免疫細胞において発現されるP-CARは、N-CARと組み合わせて、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの1種を有するCLL-1特異的キメラ抗原受容体（CAR）であり、構造は、モノクローナル抗CLL-1抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３１０】
モノクローナル抗CLL-1抗体に由来するVLおよびVHは、好ましくは、文献中、WO2005/00894（出願人：Crucell Holland BV）において、SCO02-357、SC02-378、およびSC02-161；WO2013/169625（出願人：Cellerant Therapeutics）において、M26、M31、G4、M22、M29、M2、M5、G12；WO2009/051974（出願人：Nuvelo Inc）において、21.26、1075.7と呼ばれる抗体より選択される。
【０３１１】
好ましいヒンジまたは膜貫通ドメインの選択は、上記のscCARと同一のままである。
【０３１２】
CD22 P-CAR
別の態様によると、操作された免疫細胞において発現されるP-CARは、N-CARと組み合わせて、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの1種を有するCD22特異的キメラ抗原受容体（CAR）であり、構造は、モノクローナル抗CD22抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３１３】
P-CARの不活化のレベル
いくつかの態様において、P-CAR抗原結合ドメインが抗原に結合する時、本発明の免疫細胞は活性化される。いくつかの態様において、N-CAR抗原結合ドメインが抗原に結合する時、そのような活性化は低下する。
【０３１４】
いくつかの態様において、活性化のそのような低下は、PD-1の完全な細胞内ドメインを含むN-CARを含む同一の免疫細胞と比較して、本発明によるN-CARを含む免疫細胞において、好ましくは、少なくとも5％、10％、15％、20％、または30％増加する。
【０３１５】
いくつかの態様において、活性化のそのような低下は、CTLA-4の完全な細胞内ドメインを含むN-CARを含む同一の免疫細胞と比較して、本発明によるN-CARを含む免疫細胞において、好ましくは、少なくとも5％、10％、15％、20％、または30％増加する。
【０３１６】
いくつかの態様において、P-CARの抗原との結合による活性化は、P-CAR抗原結合ドメインが単独で抗原に結合する時と比較して、N-CARおよびP-CARの抗原結合ドメインの両方がそれぞれの抗原に結合する時、少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％低下する。
【０３１７】
いくつかの態様において、免疫細胞の活性化のレベルは、サイトカイン産生を決定することによって測定される。
【０３１８】
いくつかの態様において、免疫細胞の活性化のレベルは、ELISAおよび/またはFACSおよび/またはルミネックスアッセイによって、IFNγ産生をモニタリングすることによって測定される。
【０３１９】
いくつかの態様において、免疫細胞の活性化のレベルは、ELISAおよび/またはルミネックスアッセイによって、TNFα産生をモニタリングすることによって測定される。
【０３２０】
いくつかの態様において、免疫細胞の活性化のレベルは、例えば、FACSによってCD107aレベルを測定することによって、脱顆粒をモニタリングすることによって測定される。
【０３２１】
いくつかの態様において、免疫細胞の活性化のレベルは、免疫細胞の標的細胞を死滅させる能力をモニタリングすることによって測定される。
【０３２２】
いくつかの態様において、本発明によるP-CARおよびN-CARを含む免疫細胞が、P-CAR抗原およびN-CAR抗原の両方を有するオフ組織環境における先の不活化にも関わらず、P-CAR抗原のみに遭遇した時に活性化され得ることを確実にするため、N-CARの陰性シグナルは、短期的であり、かつ可逆性である。
【０３２３】
mAb特異的エピトープ/ミモトープ
別の態様によると、本発明は、少なくとも1種のmAb特異的エピトープの挿入によって細胞外結合ドメイン（scFv）が修飾されている、改善された阻害性キメラ抗原受容体（iCAR）に関する。
【０３２４】
そのような挿入は、N-CARを付与された免疫細胞の選別および/または枯渇の両方を可能にするよう設計される。
【０３２５】
別の態様によると、免疫細胞は、そのような少なくとも1種のmAb特異的エピトープが挿入されているP-CARを発現するようさらに操作される。
【０３２６】
好ましくは、2種のmAb特異的エピトープが挿入される。
【０３２７】
そのようなエピトープは、N-CARまたはP-CARの細胞外部分の何処か、N末端部分、scFvのVH鎖とVL鎖との間、またはヒンジもしくはリンカーとscFvとの間に挿入される。好ましくは、複数種のmAb特異的エピトープが使用される時、それらは、タンデム（並行）ではない。
【０３２８】
好ましい態様において、キメラscFvに導入されるエピトープはCD20抗原であり、選別および/または枯渇の目的のため、それを標的とするために使用される、注入されるmAbは、リツキシマブである。そのようなエピトープ標的配列は、SEQ ID NO：82のCD20抗原との80％を超える同一性、好ましくは90％を超える、より好ましくは95％を超える同一性、より好ましくは100％の同一性を有する。そのような好ましい自殺遺伝子系は、WO2013153391に記載されたいわゆるRQR8ポリペプチドに含まれるような、抗CD20 mAbリツキシマブ、具体的には、QBen10によって認識される抗原性モチーフを含む組換え抗原性ポリペプチドを利用する。次いで、認可された抗体薬であるリツキシマブが、必要時に、細胞枯渇のために使用され得る。
【０３２９】
別の態様によると、エピトープはミモトープである。エピトープの構造を模倣する高分子、しばしばペプチドとして、ミモトープは、従来のエピトープより小さいという利点を有し、従って、非コンフォメーション配列のために有益であり、CARのような長いポリペプチドにおいて再現するのがより容易であり得る。セツキシマブ（Riemer et al.,2005）のための2種の10アミノ酸ペプチドまたはパリビズマブ（Arbiza et al,1992）のための24aaのような、数種の薬学的に承認されているmAbのためのミモトープが、公知である。これらのミモトープは、ファージディスプレイによって同定され得るため、同一のmAbについてのscFvを妨害しない配列を入手するため、数種を試みることが可能である。さらに、それらの使用は、補体依存性細胞傷害（CDC）を増強することができる。
【０３３０】
例として、CD20のミモトープは、
SEQ ID NO：73（CPYSNPSLC）；
2018504104.tif 000024
の、セツキシマブの使用に対応するミモトープ；
2018504104.tif 000025
の、パリビズマブの使用に対応するミモトープ；または
2018504104.tif 000026
の、ニボルマブの使用に対応するミモトープ
である。
【０３３１】
本発明は、N-CARを発現する免疫細胞、CARを発現する免疫細胞のインビボ枯渇および/またはインビトロ選別の方法にも関し、それらの治療的な使用にも関する。
【０３３２】
単離された免疫細胞
本発明による細胞とは、自然免疫および/または適応免疫の応答の開始および/または実行に機能的に関与する造血系起源の細胞をさす。本発明による細胞は、好ましくは、ドナーから入手されたT細胞である。本発明によるT細胞は、幹細胞に由来してよい。幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、より具体的には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞であってよい。好ましい態様において、細胞は、ヒト細胞、具体的には、ヒト幹細胞である。
【０３３３】
代表的なヒト幹細胞はCD34+細胞である。単離された細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、NK細胞、B細胞、または炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、もしくはヘルパーTリンパ球からなる群より選択されるT細胞であり得る。別の態様において、細胞は、CD4+Tリンパ球およびCD8+Tリンパ球からなる群に由来してもよい。本発明の細胞の増大および遺伝子修飾の前に、細胞の起源は、多様な非限定的な方法を通して対象から入手され得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、多数の非限定的な起源から入手され得る。本発明のある種の態様において、当業者に入手可能であり公知である多数のT細胞株が使用され得る。別の態様において、細胞は、好ましくは、健常ドナーに由来する。別の態様において、細胞は、異なる表現型的特徴を提示する細胞の混合集団の一部である。
【０３３４】
好ましくは、幹細胞の単離および調製は、少なくとも1個のヒト胚の破壊を必要としない。免疫細胞は、自己処置の実施を考慮して、患者に起因してもよいし、または同種処置において使用され得る同種細胞の作製を考慮して、ドナーに起因してもよい。
【０３３５】
本発明は、前記に提示されたようなP-CARおよびN-CARを含む単離された免疫細胞にも関する。
【０３３６】
P-CARは、WO2014/039523において定義された単鎖CARまたは多鎖P-CARであり得る。
【０３３７】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、および
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）に由来する配列と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の、さらに好ましくは、100％の同一性を有する配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれるP-CARと
を少なくとも含み、
P-CARは、任意で、共刺激ドメインと共に、CD123抗原に結合することができる1種の細胞外リガンド結合ドメインおよび1種のシグナル伝達ドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを含む。
【０３３８】
別の好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）からなる群より選択される配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれるP-CARと
を少なくとも含み、
P-CARは、任意で、共刺激ドメインと共に、CD123抗原に結合することができる1種の細胞外リガンド結合ドメインおよび1種のシグナル伝達ドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを含む。
【０３３９】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：81（CD4抗原）、SEQ ID NO：82（CD20抗原）、SEQ ID NO：83（CD22抗原）、SEQ ID NO：84（CD25抗原）、またはSEQ ID NO：85（MUC1抗原）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）と80％、好ましくは、90％、より好ましくは、95％を超える、さらに好ましくは、100％の同一性を有する配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれるP-CARと
を少なくとも含み、
P-CARは、任意で、共刺激ドメインと共に、CD123抗原に結合することができる1種の細胞外リガンド結合ドメインおよび1種のシグナル伝達ドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを含む。
【０３４０】
別の好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：81（CD4抗原）、SEQ ID NO：82（CD20抗原）、SEQ ID NO：83（CD22抗原）、SEQ ID NO：84（CD25抗原）、またはSEQ ID NO：85（MUC1抗原）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）の配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれるP-CARと
を少なくとも含み、
P-CARは、任意で、共刺激ドメインと共に、CD123抗原に結合することができる1種の細胞外リガンド結合ドメインおよび1種のシグナル伝達ドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを含む。
【０３４１】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）からなる群より選択されるポリペプチド配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれるP-CARと
を少なくとも含み、
P-CARは、任意で、共刺激ドメインと共に、CD123抗原に結合することができる1種の細胞外リガンド結合ドメインおよび1種のシグナル伝達ドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを含む。
【０３４２】
別の好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）の配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれるP-CARと
を少なくとも含み、
P-CARは、任意で、共刺激ドメインと共に、CD123抗原に結合することができる1種の細胞外リガンド結合ドメインおよび1種のシグナル伝達ドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを含む。
【０３４３】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：81（CD4抗原）、SEQ ID NO：82（CD20抗原）、SEQ ID NO：83（CD22抗原）、SEQ ID NO：84（CD25抗原）、またはSEQ ID NO：85（MUC1抗原）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を有する配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CD123特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CD123特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CD123抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３４４】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：81（CD4抗原）、SEQ ID NO：82（CD20抗原）、SEQ ID NO：83（CD22抗原）、SEQ ID NO：84（CD25抗原）、またはSEQ ID NO：85（MUC1抗原）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有するポリペプチド配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれるP-CARと
を少なくとも含み、
P-CARは、任意で、共刺激ドメインと共に、CD123抗原に結合することができる1種の細胞外リガンド結合ドメインおよび1種のシグナル伝達ドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを含む。
【０３４５】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：81（CD4抗原）、SEQ ID NO：82（CD20抗原）、SEQ ID NO：83（CD22抗原）、SEQ ID NO：84（CD25抗原）、またはSEQ ID NO：85（MUC1抗原）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン；
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）のポリペプチド配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれるP-CARと
を少なくとも含み、
P-CARは、任意で、共刺激ドメインと共に、CD123抗原に結合することができる1種の細胞外リガンド結合ドメインおよび1種のシグナル伝達ドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを含む。
【０３４６】
より好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：81（CD4抗原）、SEQ ID NO：82（CD20抗原）、SEQ ID NO：83（CD22抗原）、SEQ ID NO：84（CD25抗原）、またはSEQ ID NO：85（MUC1抗原）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を有するポリペプチド配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CD123特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CD123特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CD123抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３４７】
好ましくは、前記の抗CD123 CAR（P-CAR）は、図1に図示されるV1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CD123抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含み、CD123 CARは、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、またはSEQ ID NO：60のいずれかとの少なくとも80％の配列同一性を有する。
【０３４８】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：86（CD56抗原）、SEQ ID NO：87（CD205抗原）、SEQ ID NO：88（CD83抗原）、SEQ ID NO：89（CD206抗原）、SEQ ID NO：90（CD200抗原）、またはSEQ ID NO：91（CD36抗原）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、および
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を有する配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CD123特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CD123特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CD123抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３４９】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、および
、SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を有する配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CD38特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CD38特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、任意で、共刺激ドメインと共に、CD38抗原を特異的に認識する1種の細胞外結合ドメインおよび細胞内シグナリングドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを少なくとも含有している。
【０３５０】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、および
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）の阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CD38特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CD38特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、任意で、共刺激ドメインと共に、CD38抗原を特異的に認識する1種の細胞外結合ドメインおよび細胞内シグナリングドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを少なくとも含有している。
【０３５１】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：86（CD56抗原）、SEQ ID NO：87（CD205抗原）、SEQ ID NO：88（CD83抗原）、SEQ ID NO：89（CD206抗原）、SEQ ID NO：90（CD200抗原）、またはSEQ ID NO：91（CD36抗原）と80％、好ましくは90％、より好ましくは95％を超える同一性、さらに好ましくは100％の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、および
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を有する配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CD38特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CD38特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CD38抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３５２】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：86（CD56抗原）、SEQ ID NO：87（CD205抗原）、SEQ ID NO：88（CD83抗原）、SEQ ID NO：89（CD206抗原）、SEQ ID NO：90（CD200抗原）、またはSEQ ID NO：91（CD36抗原）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは100％の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、および
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）の配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CD38特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CD38特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CD38抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３５３】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：86（CD56抗原）、SEQ ID NO：87（CD205抗原）、SEQ ID NO：88（CD83抗原）、SEQ ID NO：89（CD206抗原）、SEQ ID NO：90（CD200抗原）、またはSEQ ID NO：91（CD36抗原）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは100％の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、ならびに
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは100％の同一性を有するポリペプチド配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CD38特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CD38特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CD38抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３５４】
好ましくは、P-CARとしての抗CD38 CARは、（25A10 mAbに基づく）SEQ ID NO：64〜66、（28F5 mAbに基づく）SEQ ID NO：67〜69、または（16B5 mAbに基づく）SEQ ID NO：70〜72より選択されるものとの少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性を示すポリペプチド配列を含む。
【０３５５】
より好ましい態様によると、本発明の抗CD38特異的キメラ抗原受容体（抗CD38 CAR）は、（25A10 mAbに基づく）SEQ ID NO：64〜66または（28F5 mAbに基づく）SEQ ID NO：67〜69より選択されるものとの少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性を示すポリペプチド配列を含む。
【０３５６】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、および
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を有する配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CS1特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CS1特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、任意で、共刺激ドメインと共に、CS1抗原を特異的に認識する1種の細胞外結合ドメインおよび細胞内シグナリングドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを少なくとも含有している。
【０３５７】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、および
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）の阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CS1特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CS1特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、任意で、共刺激ドメインと共に、CS1抗原を特異的に認識する1種の細胞外結合ドメインおよび細胞内シグナリングドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを少なくとも含有している。
【０３５８】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：92（トロポニンC）、SEQ ID NO：93（β1インテグリン）、SEQ ID NO：94（CCKBR抗原）、SEQ ID NO：95（GALR1抗原）、またはSEQ ID NO：96（CUBN抗原）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の、さらに好ましくは、100％の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を有する配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CS1特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CS1特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CS1抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３５９】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：92（トロポニンC）、SEQ ID NO：93（β1インテグリン）、SEQ ID NO：94（CCKBR抗原）、SEQ ID NO：95（GALR1抗原）、またはSEQ ID NO：96（CUBN抗原）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の、さらに好ましくは、100％の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）の阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CS1特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CS1特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CS1抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３６０】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、ならびに
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を有するポリペプチド配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CS1特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CS1特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、任意で、共刺激ドメインと共に、CS1抗原を特異的に認識する1種の細胞外結合ドメインおよび細胞内シグナリングドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを少なくとも含有している。
【０３６１】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、ならびに
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）のポリペプチド配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CS1特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CS1特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、任意で、共刺激ドメインと共に、CS1抗原を特異的に認識する1種の細胞外結合ドメインおよび細胞内シグナリングドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを少なくとも含有している。
【０３６２】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：92（トロポニンC）、SEQ ID NO：93（β1インテグリン）、SEQ ID NO：94（CCKBR抗原）、SEQ ID NO：95（GALR1抗原）、またはSEQ ID NO：96（CUBN抗原）との80％、好ましくは、90％、より好ましくは95％を超える、さらに好ましくは、100％の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、ならびに
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を有するポリペプチド配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CS1特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CS1特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CS1抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３６３】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：92（トロポニンC）、SEQ ID NO：93（β1インテグリン）、SEQ ID NO：94（CCKBR抗原）、SEQ ID NO：95（GALR1抗原）、またはSEQ ID NO：96（CUBN抗原）との80％、好ましくは、90％、より好ましくは95％を超える、さらに好ましくは、100％の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、ならびに
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）のポリペプチド配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CS1特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CS1特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CS1抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３６４】
好ましくは、（P-CARとしての）前記のCS1特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、任意で、ヒト化されている、（WO2015121454A1 SEQ ID NO：38〜47に記載されたような）マウスscFv Luc63抗体、Luc90抗体、Luc34抗体、LucX1抗体、およびLucX2抗体のようなモノクローナル抗CS1抗体にVH鎖よびVL鎖が由来する細胞外リガンド結合ドメインを含む。
【０３６５】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、および
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を有する配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）ROR1特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
ROR1特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、任意で、共刺激ドメインと共に、CS1抗原を特異的に認識する1種の細胞外結合ドメインおよび細胞内シグナリングドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを少なくとも含有している。
【０３６６】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、および
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）の配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）ROR1特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み；
ROR1特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、任意で、共刺激ドメインと共に、CS1抗原を特異的に認識する1種の細胞外結合ドメインおよび細胞内シグナリングドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを少なくとも含有している。
【０３６７】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：92（トロポニンC）、SEQ ID NO：93（β1インテグリン）、SEQ ID NO：94（CCKBR抗原）、SEQ ID NO：95（GALR1抗原）、またはSEQ ID NO：96（CUBN抗原）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の、さらに好ましくは、100％の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）ROR1特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
ROR1特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗ROR1抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３６８】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：92（トロポニンC）、SEQ ID NO：93（β1インテグリン）、SEQ ID NO：94（CCKBR抗原）、SEQ ID NO：95（GALR1抗原）、またはSEQ ID NO：96（CUBN抗原）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の、さらに好ましくは、100％の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）の配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）ROR1特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
ROR1特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗ROR1抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３６９】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、ならびに
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を有するポリペプチド配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）ROR1特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
ROR1特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、任意で、共刺激ドメインと共に、ROR1抗原を特異的に認識する1種の細胞外結合ドメインおよび細胞内シグナリングドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを少なくとも含有している。
【０３７０】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、ならびに
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）のポリペプチド配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）ROR1特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
ROR1特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、任意で、共刺激ドメインと共に、ROR1抗原を特異的に認識する1種の細胞外結合ドメインおよび細胞内シグナリングドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを少なくとも含有している。
【０３７１】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：92（トロポニンC）、SEQ ID NO：93（β1インテグリン）、SEQ ID NO：94（CCKBR抗原）、SEQ ID NO：95（GALR1抗原）、またはSEQ ID NO：96（CUBN抗原）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の、さらに好ましくは、100％の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、ならびに
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を有するポリペプチド配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）ROR1特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
ROR1特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗ROR1抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３７２】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：92（トロポニンC）、SEQ ID NO：93（β1インテグリン）、SEQ ID NO：94（CCKBR抗原）、SEQ ID NO：95（GALR1抗原）、またはSEQ ID NO：96（CUBN抗原）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の、さらに好ましくは、100％の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、ならびに
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）のポリペプチド配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）ROR1特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
ROR1特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗ROR1抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３７３】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞または免疫細胞において発現される「オフサイト（off-site）」細胞表面抗原に結合する細胞外結合ドメイン、
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を有する配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CLL-1特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CLL-1特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CLL-1抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３７４】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞または免疫細胞において発現される「オフサイト」細胞表面抗原に結合する細胞外結合ドメイン、
SEQ ID NO：1（ヒトKI2L2）、SEQ ID NO：2（ヒトKI2L1）、SEQ ID NO：3（ヒトFCG2B）、SEQ ID NO：4（ヒトKI2L3）、SEQ ID NO：5（ヒトKI3L2）、SEQ ID NO：6（ヒトKI2L4）、SEQ ID NO：7（ヒトKI3L1）、SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）、またはSEQ ID NO：30（ヒトPVR）の配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CLL-1特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CLL-1特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CLL-1抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３７５】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞または免疫細胞において発現される「オフサイト」細胞表面抗原に結合する細胞外結合ドメイン、
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性、さらに好ましくは、100％の同一性を有するポリペプチド配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CLL-1特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CLL-1特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CLL-1抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３７６】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞または免疫細胞において発現される「オフサイト」細胞表面抗原に結合する細胞外結合ドメイン、
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）のポリペプチド配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CLL-1特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CLL-1特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CLL-1抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３７７】
例として、VLおよびVHは、好ましくは、文献中、WO2005/00894（出願人：Crucell Holland BV）において、SCO02-357、SC02-378、およびSC02-161；WO2013/169625（出願人：Cellerant Therapeutics）において、M26、M31、G4、M22、M29、M2、M5、G12；WO2009/051974（出願人：Nuvelo Inc）において、21.26、1075.7と呼ばれた抗体より選択される。
【０３７８】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上または免疫細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、および
SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）に由来するアミノ酸番号201〜375、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：1（ヒトKIR2DL2）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：4（ヒトKIR2DL3）に由来するアミノ酸番号206〜341、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：6（ヒトKIR2DL4）に由来するアミノ酸番号203〜377、SEQ ID NO：7（ヒトKIR3DL1）に由来するアミノ酸番号301〜444、SEQ ID NO：5（ヒトKIR3DL2）に由来するアミノ酸番号301〜455、SEQ ID NO：24（ヒトFRGR2B）に由来するアミノ酸番号204〜310、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）に由来するアミノ酸番号214〜343、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）に由来するアミノ酸番号216〜448、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）に由来するアミノ酸番号420〜631、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）に由来するアミノ酸番号296〜410、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）に由来するアミノ酸番号419〜590、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）に由来するアミノ酸番号420〜598、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）に由来するアミノ酸番号375〜515、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）に由来するアミノ酸番号753〜977、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）に由来するアミノ酸番号388〜508、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）に由来するアミノ酸番号292〜429、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）に由来するアミノ酸番号564〜734、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）に由来するアミノ酸番号147〜269、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）に由来するアミノ酸番号151〜303、SEQ ID NO：30（ヒトPVR）に由来するアミノ酸番号329〜417、SEQ ID NO：36（ヒトCD200受容体1）に由来するアミノ酸番号229〜325、SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）に由来するアミノ酸番号181〜386、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）に由来するアミノ酸番号230〜468、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）に由来するアミノ酸番号179〜440から本質的になる配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれるP-CARと
を少なくとも含み、
P-CARは、任意で、共刺激ドメインと共に、CD123抗原に特異的に結合することができる1種の細胞外リガンド結合ドメインおよび1種のシグナル伝達ドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを含む。
【０３７９】
別の好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上または免疫細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、および
SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）に由来するアミノ酸番号201〜375、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：1（ヒトKIR2DL2）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：4（ヒトKIR2DL3）に由来するアミノ酸番号206〜341、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：6（ヒトKIR2DL4）に由来するアミノ酸番号203〜377、SEQ ID NO：7（ヒトKIR3DL1）に由来するアミノ酸番号301〜444、SEQ ID NO：5（ヒトKIR3DL2）に由来するアミノ酸番号301〜455、SEQ ID NO：24（ヒトFRGR2B）に由来するアミノ酸番号204〜310、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）に由来するアミノ酸番号214〜343、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）に由来するアミノ酸番号216〜448、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）に由来するアミノ酸番号420〜631、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）に由来するアミノ酸番号296〜410、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）に由来するアミノ酸番号419〜590、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）に由来するアミノ酸番号420〜598、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）に由来するアミノ酸番号375〜515、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）に由来するアミノ酸番号753〜977、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）に由来するアミノ酸番号388〜508、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）に由来するアミノ酸番号292〜429、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）に由来するアミノ酸番号564〜734、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）に由来するアミノ酸番号147〜269、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）に由来するアミノ酸番号151〜303、SEQ ID NO：30（ヒトPVR）に由来するアミノ酸番号329〜417、SEQ ID NO：36（ヒトCD200受容体1）に由来するアミノ酸番号229〜325、SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）に由来するアミノ酸番号181〜386、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）に由来するアミノ酸番号230〜468、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）に由来するアミノ酸番号179〜440から本質的になる配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれるP-CARと
を少なくとも含み、
P-CARは、任意で、共刺激ドメインと共に、CD123抗原に結合することができる1種の細胞外リガンド結合ドメインおよび1種のシグナル伝達ドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを含む。
【０３８０】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：81（CD4抗原）、SEQ ID NO：82（CD20抗原）、SEQ ID NO：83（CD22抗原）、SEQ ID NO：84（CD25抗原）、またはSEQ ID NO：85（MUC1抗原）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン；および
SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）に由来するアミノ酸番号201〜375、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：1（ヒトKIR2DL2）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：4（ヒトKIR2DL3）に由来するアミノ酸番号206〜341、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：6（ヒトKIR2DL4）に由来するアミノ酸番号203〜377、SEQ ID NO：7（ヒトKIR3DL1）に由来するアミノ酸番号301〜444、SEQ ID NO：5（ヒトKIR3DL2）に由来するアミノ酸番号301〜455、SEQ ID NO：24（ヒトFRGR2B）に由来するアミノ酸番号204〜310、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）に由来するアミノ酸番号214〜343、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）に由来するアミノ酸番号216〜448、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）に由来するアミノ酸番号420〜631、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）に由来するアミノ酸番号296〜410、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）に由来するアミノ酸番号419〜590、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）に由来するアミノ酸番号420〜598、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）に由来するアミノ酸番号375〜515、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）に由来するアミノ酸番号753〜977、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）に由来するアミノ酸番号388〜508、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）に由来するアミノ酸番号292〜429、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）に由来するアミノ酸番号564〜734、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）に由来するアミノ酸番号147〜269、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）に由来するアミノ酸番号151〜303、SEQ ID NO：30（ヒトPVR）に由来するアミノ酸番号329〜417、SEQ ID NO：36（ヒトCD200受容体1）に由来するアミノ酸番号229〜325、SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）に由来するアミノ酸番号181〜386、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）に由来するアミノ酸番号230〜468、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）に由来するアミノ酸番号179〜440から本質的になる配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれるP-CARと
を少なくとも含み、
P-CARは、任意で、共刺激ドメインと共に、CD123抗原に結合することができる1種の細胞外リガンド結合ドメインおよび1種のシグナル伝達ドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを含む。
【０３８１】
別の好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：XX（CD4抗原）、SEQ ID NO：XX（CD20抗原）、SEQ ID NO：XX（CD22抗原）、SEQ ID NO：XX（CD25抗原）、またはSEQ ID NO：XX（MUC1抗原）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、
SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）に由来するアミノ酸番号201〜375、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：1（ヒトKIR2DL2）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：4（ヒトKIR2DL3）に由来するアミノ酸番号206〜341、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：6（ヒトKIR2DL4）に由来するアミノ酸番号203〜377、SEQ ID NO：7（ヒトKIR3DL1）に由来するアミノ酸番号301〜444、SEQ ID NO：5（ヒトKIR3DL2）に由来するアミノ酸番号301〜455、SEQ ID NO：24（ヒトFRGR2B）に由来するアミノ酸番号204〜310、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）に由来するアミノ酸番号214〜343、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）に由来するアミノ酸番号216〜448、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）に由来するアミノ酸番号420〜631、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）に由来するアミノ酸番号296〜410、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）に由来するアミノ酸番号419〜590、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）に由来するアミノ酸番号420〜598、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）に由来するアミノ酸番号375〜515、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）に由来するアミノ酸番号753〜977、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）に由来するアミノ酸番号388〜508、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）に由来するアミノ酸番号292〜429、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）に由来するアミノ酸番号564〜734、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）に由来するアミノ酸番号147〜269、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）に由来するアミノ酸番号151〜303、SEQ ID NO：30（ヒトPVR）に由来するアミノ酸番号329〜417、SEQ ID NO：36（ヒトCD200受容体1）に由来するアミノ酸番号229〜325、SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）に由来するアミノ酸番号181〜386、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）に由来するアミノ酸番号230〜468、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）に由来するアミノ酸番号179〜440から本質的になる配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれるP-CARと
を少なくとも含み、
P-CARは、任意で、共刺激ドメインと共に、CD123抗原に結合することができる1種の細胞外リガンド結合ドメインおよび1種のシグナル伝達ドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを含む。
【０３８２】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上または免疫細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、ならびに
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）のポリペプチド配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれるP-CARと
を少なくとも含み、
P-CARは、任意で、共刺激ドメインと共に、CD123抗原に結合することができる1種の細胞外リガンド結合ドメインおよび1種のシグナル伝達ドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを含む。
【０３８３】
別の好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上または免疫細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、および
SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）に由来するアミノ酸番号201〜375、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：1（ヒトKIR2DL2）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：4（ヒトKIR2DL3）に由来するアミノ酸番号206〜341、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：6（ヒトKIR2DL4）に由来するアミノ酸番号203〜377、SEQ ID NO：7（ヒトKIR3DL1）に由来するアミノ酸番号301〜444、SEQ ID NO：5（ヒトKIR3DL2）に由来するアミノ酸番号301〜455、SEQ ID NO：24（ヒトFRGR2B）に由来するアミノ酸番号204〜310、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）に由来するアミノ酸番号214〜343、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）に由来するアミノ酸番号216〜448、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）に由来するアミノ酸番号420〜631、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）に由来するアミノ酸番号296〜410、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）に由来するアミノ酸番号419〜590、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）に由来するアミノ酸番号420〜598、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）に由来するアミノ酸番号375〜515、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）に由来するアミノ酸番号753〜977、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）に由来するアミノ酸番号388〜508、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）に由来するアミノ酸番号292〜429、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）に由来するアミノ酸番号564〜734、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）に由来するアミノ酸番号147〜269、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）に由来するアミノ酸番号151〜303、SEQ ID NO：30（ヒトPVR）に由来するアミノ酸番号329〜417、SEQ ID NO：36（ヒトCD200受容体1）に由来するアミノ酸番号229〜325、SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）に由来するアミノ酸番号181〜386、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）に由来するアミノ酸番号230〜468、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）に由来するアミノ酸番号179〜440から本質的になる配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれるP-CARと
を少なくとも含み、
P-CARは、任意で、共刺激ドメインと共に、CD123抗原に結合することができる1種の細胞外リガンド結合ドメインおよび1種のシグナル伝達ドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを含む。
【０３８４】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：XX（CD4抗原）、SEQ ID NO：XX（CD20抗原）、SEQ ID NO：XX（CD22抗原）、SEQ ID NO：XX（CD25抗原）、またはSEQ ID NO：XX（MUC1抗原）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、および
SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）に由来するアミノ酸番号201〜375、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：1（ヒトKIR2DL2）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：4（ヒトKIR2DL3）に由来するアミノ酸番号206〜341、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：6（ヒトKIR2DL4）に由来するアミノ酸番号203〜377、SEQ ID NO：7（ヒトKIR3DL1）に由来するアミノ酸番号301〜444、SEQ ID NO：5（ヒトKIR3DL2）に由来するアミノ酸番号301〜455、SEQ ID NO：24（ヒトFRGR2B）に由来するアミノ酸番号204〜310、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）に由来するアミノ酸番号214〜343、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）に由来するアミノ酸番号216〜448、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）に由来するアミノ酸番号420〜631、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）に由来するアミノ酸番号296〜410、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）に由来するアミノ酸番号419〜590、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）に由来するアミノ酸番号420〜598、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）に由来するアミノ酸番号375〜515、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）に由来するアミノ酸番号753〜977、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）に由来するアミノ酸番号388〜508、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）に由来するアミノ酸番号292〜429、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）に由来するアミノ酸番号564〜734、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）に由来するアミノ酸番号147〜269、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）に由来するアミノ酸番号151〜303、SEQ ID NO：30（ヒトPVR）に由来するアミノ酸番号329〜417、SEQ ID NO：36（ヒトCD200受容体1）に由来するアミノ酸番号229〜325、SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）に由来するアミノ酸番号181〜386、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）に由来するアミノ酸番号230〜468、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）に由来するアミノ酸番号179〜440から本質的になる配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CD123特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CD123特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CD123抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３８５】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：XX（CD4抗原）、SEQ ID NO：XX（CD20抗原）、SEQ ID NO：XX（CD22抗原）、SEQ ID NO：XX（CD25抗原）、またはSEQ ID NO：XX（MUC1抗原）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有するポリペプチド配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれるP-CARと
を少なくとも含み、
P-CARは、任意で、共刺激ドメインと共に、CD123抗原に結合することができる1種の細胞外リガンド結合ドメインおよび1種のシグナル伝達ドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを含む。
【０３８６】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：XX（CD4抗原）、SEQ ID NO：XX（CD20抗原）、SEQ ID NO：XX（CD22抗原）、SEQ ID NO：XX（CD25抗原）、またはSEQ ID NO：XX（MUC1抗原）細胞外結合ドメインと80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）のポリペプチド配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれるP-CARと
を少なくとも含み、
P-CARは、任意で、共刺激ドメインと共に、CD123抗原に結合することができる1種の細胞外リガンド結合ドメインおよび1種のシグナル伝達ドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを含む。
【０３８７】
より好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：XX（CD4抗原）、SEQ ID NO：XX（CD20抗原）、SEQ ID NO：XX（CD22抗原）、SEQ ID NO：XX（CD25抗原）、またはSEQ ID NO：XX（MUC1抗原）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、ならびに
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有するポリペプチド配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CD123特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CD123特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CD123抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３８８】
好ましくは、前記の抗CD123 CAR（P-CAR）は、図1に図示されるV1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CD123抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、CD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含み、123 CARは、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、またはSEQ ID NO：46のいずれかとの少なくとも80％の配列同一性を有する。
【０３８９】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
SEQ ID NO：XX（CD56抗原）、SEQ ID NO：XX（CD205抗原）、SEQ ID NO：XX（CD83抗原）、SEQ ID NO：XX（CD206抗原）、SEQ ID NO：XX（CD200抗原）、またはSEQ ID NO：8（CD36抗原）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を共有するポリペプチド配列を含む細胞外結合ドメイン、および
SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）に由来するアミノ酸番号201〜375、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：1（ヒトKIR2DL2）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：4（ヒトKIR2DL3）に由来するアミノ酸番号206〜341、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：6（ヒトKIR2DL4）に由来するアミノ酸番号203〜377、SEQ ID NO：7（ヒトKIR3DL1）に由来するアミノ酸番号301〜444、SEQ ID NO：5（ヒトKIR3DL2）に由来するアミノ酸番号301〜455、SEQ ID NO：24（ヒトFRGR2B）に由来するアミノ酸番号204〜310、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）に由来するアミノ酸番号214〜343、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）に由来するアミノ酸番号216〜448、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）に由来するアミノ酸番号420〜631、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）に由来するアミノ酸番号296〜410、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）に由来するアミノ酸番号419〜590、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）に由来するアミノ酸番号420〜598、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）に由来するアミノ酸番号375〜515、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）に由来するアミノ酸番号753〜977、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）に由来するアミノ酸番号388〜508、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）に由来するアミノ酸番号292〜429、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）に由来するアミノ酸番号564〜734、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）に由来するアミノ酸番号147〜269、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）に由来するアミノ酸番号151〜303、SEQ ID NO：30（ヒトPVR）に由来するアミノ酸番号329〜417、SEQ ID NO：36（ヒトCD200受容体1）に由来するアミノ酸番号229〜325、SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）に由来するアミノ酸番号181〜386、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）に由来するアミノ酸番号230〜468、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）に由来するアミノ酸番号179〜440から本質的になる配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CD123特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CD123特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CD123抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３９０】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、および
SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）に由来するアミノ酸番号201〜375、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：1（ヒトKIR2DL2）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：4（ヒトKIR2DL3）に由来するアミノ酸番号206〜341、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：6（ヒトKIR2DL4）に由来するアミノ酸番号203〜377、SEQ ID NO：7（ヒトKIR3DL1）に由来するアミノ酸番号301〜444、SEQ ID NO：5（ヒトKIR3DL2）に由来するアミノ酸番号301〜455、SEQ ID NO：24（ヒトFRGR2B）に由来するアミノ酸番号204〜310、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）に由来するアミノ酸番号214〜343、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）に由来するアミノ酸番号216〜448、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）に由来するアミノ酸番号420〜631、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）に由来するアミノ酸番号296〜410、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）に由来するアミノ酸番号419〜590、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）に由来するアミノ酸番号420〜598、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）に由来するアミノ酸番号375〜515、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）に由来するアミノ酸番号753〜977、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）に由来するアミノ酸番号388〜508、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）に由来するアミノ酸番号292〜429、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）に由来するアミノ酸番号564〜734、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）に由来するアミノ酸番号147〜269、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）に由来するアミノ酸番号151〜303、SEQ ID NO：30（ヒトPVR）に由来するアミノ酸番号329〜417、SEQ ID NO：36（ヒトCD200受容体1）に由来するアミノ酸番号229〜325、SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）に由来するアミノ酸番号181〜386、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）に由来するアミノ酸番号230〜468、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）に由来するアミノ酸番号179〜440から本質的になる配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CD38特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CD38特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、任意で、共刺激ドメインと共に、CD38抗原を特異的に認識する1種の細胞外結合ドメインおよび細胞内シグナリングドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを少なくとも含有している。
【０３９１】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、および
SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）に由来するアミノ酸番号201〜375、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：1（ヒトKIR2DL2）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：4（ヒトKIR2DL3）に由来するアミノ酸番号206〜341、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：6（ヒトKIR2DL4）に由来するアミノ酸番号203〜377、SEQ ID NO：7（ヒトKIR3DL1）に由来するアミノ酸番号301〜444、SEQ ID NO：5（ヒトKIR3DL2）に由来するアミノ酸番号301〜455、SEQ ID NO：24（ヒトFRGR2B）に由来するアミノ酸番号204〜310、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）に由来するアミノ酸番号214〜343、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）に由来するアミノ酸番号216〜448、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）に由来するアミノ酸番号420〜631、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）に由来するアミノ酸番号296〜410、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）に由来するアミノ酸番号419〜590、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）に由来するアミノ酸番号420〜598、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）に由来するアミノ酸番号375〜515、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）に由来するアミノ酸番号753〜977、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）に由来するアミノ酸番号388〜508、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）に由来するアミノ酸番号292〜429、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）に由来するアミノ酸番号564〜734、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）に由来するアミノ酸番号147〜269、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）に由来するアミノ酸番号151〜303、SEQ ID NO：30（ヒトPVR）に由来するアミノ酸番号329〜417、SEQ ID NO：36（ヒトCD200受容体1）に由来するアミノ酸番号229〜325、SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）に由来するアミノ酸番号181〜386、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）に由来するアミノ酸番号230〜468、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）に由来するアミノ酸番号179〜440から本質的になる配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチドと
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CD38特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CD38特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、任意で、共刺激ドメインと共に、CD38抗原を特異的に認識する1種の細胞外結合ドメインおよび細胞内シグナリングドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを少なくとも含有している。
【０３９２】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上または免疫細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、
SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）に由来するアミノ酸番号201〜375、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：1（ヒトKIR2DL2）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：4（ヒトKIR2DL3）に由来するアミノ酸番号206〜341、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：6（ヒトKIR2DL4）に由来するアミノ酸番号203〜377、SEQ ID NO：7（ヒトKIR3DL1）に由来するアミノ酸番号301〜444、SEQ ID NO：5（ヒトKIR3DL2）に由来するアミノ酸番号301〜455、SEQ ID NO：24（ヒトFRGR2B）に由来するアミノ酸番号204〜310、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）に由来するアミノ酸番号214〜343、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）に由来するアミノ酸番号216〜448、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）に由来するアミノ酸番号420〜631、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）に由来するアミノ酸番号296〜410、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）に由来するアミノ酸番号419〜590、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）に由来するアミノ酸番号420〜598、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）に由来するアミノ酸番号375〜515、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）に由来するアミノ酸番号753〜977、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）に由来するアミノ酸番号388〜508、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）に由来するアミノ酸番号292〜429、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）に由来するアミノ酸番号564〜734、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）に由来するアミノ酸番号147〜269、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）に由来するアミノ酸番号151〜303、SEQ ID NO：30（ヒトPVR）に由来するアミノ酸番号329〜417、SEQ ID NO：36（ヒトCD200受容体1）に由来するアミノ酸番号229〜325、SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）に由来するアミノ酸番号181〜386、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）に由来するアミノ酸番号230〜468、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）に由来するアミノ酸番号179〜440から本質的になる配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CD19特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CD19特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CD19抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３９３】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、および
SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）に由来するアミノ酸番号201〜375、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：1（ヒトKIR2DL2）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：4（ヒトKIR2DL3）に由来するアミノ酸番号206〜341、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：6（ヒトKIR2DL4）に由来するアミノ酸番号203〜377、SEQ ID NO：7（ヒトKIR3DL1）に由来するアミノ酸番号301〜444、SEQ ID NO：5（ヒトKIR3DL2）に由来するアミノ酸番号301〜455、SEQ ID NO：24（ヒトFRGR2B）に由来するアミノ酸番号204〜310、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）に由来するアミノ酸番号214〜343、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）に由来するアミノ酸番号216〜448、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）に由来するアミノ酸番号420〜631、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）に由来するアミノ酸番号296〜410、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）に由来するアミノ酸番号419〜590、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）に由来するアミノ酸番号420〜598、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）に由来するアミノ酸番号375〜515、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）に由来するアミノ酸番号753〜977、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）に由来するアミノ酸番号388〜508、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）に由来するアミノ酸番号292〜429、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）に由来するアミノ酸番号564〜734、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）に由来するアミノ酸番号147〜269、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）に由来するアミノ酸番号151〜303、SEQ ID NO：30（ヒトPVR）に由来するアミノ酸番号329〜417、SEQ ID NO：36（ヒトCD200受容体1）に由来するアミノ酸番号229〜325、SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）に由来するアミノ酸番号181〜386、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）に由来するアミノ酸番号230〜468、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）に由来するアミノ酸番号179〜440から本質的になる配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CD19特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CD19特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CD19抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３９４】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、および
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有するポリペプチド配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CD19特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CD19特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CD38抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３９５】
一態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、および
SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）に由来するアミノ酸番号201〜375、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：1（ヒトKIR2DL2）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：4（ヒトKIR2DL3）に由来するアミノ酸番号206〜341、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：6（ヒトKIR2DL4）に由来するアミノ酸番号203〜377、SEQ ID NO：7（ヒトKIR3DL1）に由来するアミノ酸番号301〜444、SEQ ID NO：5（ヒトKIR3DL2）に由来するアミノ酸番号301〜455、SEQ ID NO：24（ヒトFRGR2B）に由来するアミノ酸番号204〜310、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）に由来するアミノ酸番号214〜343、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）に由来するアミノ酸番号216〜448、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）に由来するアミノ酸番号420〜631、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）に由来するアミノ酸番号296〜410、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）に由来するアミノ酸番号419〜590、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）に由来するアミノ酸番号420〜598、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）に由来するアミノ酸番号375〜515、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）に由来するアミノ酸番号753〜977、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）に由来するアミノ酸番号388〜508、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）に由来するアミノ酸番号292〜429、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）に由来するアミノ酸番号564〜734、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）に由来するアミノ酸番号147〜269、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）に由来するアミノ酸番号151〜303、SEQ ID NO：30（ヒトPVR）に由来するアミノ酸番号329〜417、SEQ ID NO：36（ヒトCD200受容体1）に由来するアミノ酸番号229〜325、SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）に由来するアミノ酸番号181〜386、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）に由来するアミノ酸番号230〜468、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）に由来するアミノ酸番号179〜440から本質的になる配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CD19特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CD19特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、任意で、共刺激ドメインと共に、CD19抗原を特異的に認識する1種の細胞外結合ドメインおよび細胞内シグナリングドメインを少なくとも含む1種の膜貫通ポリペプチドを少なくとも含有している。
【０３９６】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、および
SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）に由来するアミノ酸番号201〜375、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：1（ヒトKIR2DL2）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：4（ヒトKIR2DL3）に由来するアミノ酸番号206〜341、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：6（ヒトKIR2DL4）に由来するアミノ酸番号203〜377、SEQ ID NO：7（ヒトKIR3DL1）に由来するアミノ酸番号301〜444、SEQ ID NO：5（ヒトKIR3DL2）に由来するアミノ酸番号301〜455、SEQ ID NO：24（ヒトFRGR2B）に由来するアミノ酸番号204〜310、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）に由来するアミノ酸番号214〜343、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）に由来するアミノ酸番号216〜448、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）に由来するアミノ酸番号420〜631、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）に由来するアミノ酸番号296〜410、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）に由来するアミノ酸番号419〜590、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）に由来するアミノ酸番号420〜598、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）に由来するアミノ酸番号375〜515、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）に由来するアミノ酸番号753〜977、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）に由来するアミノ酸番号388〜508、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）に由来するアミノ酸番号292〜429、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）に由来するアミノ酸番号564〜734、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）に由来するアミノ酸番号147〜269、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）に由来するアミノ酸番号151〜303、SEQ ID NO：30（ヒトPVR）に由来するアミノ酸番号329〜417、SEQ ID NO：36（ヒトCD200受容体1）に由来するアミノ酸番号229〜325、SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）に由来するアミノ酸番号181〜386、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）に由来するアミノ酸番号230〜468、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）に由来するアミノ酸番号179〜440から本質的になる配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CD19特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CD19特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CD19抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３９７】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、および
SEQ ID NO：8（ヒトKI2LA）に由来するアミノ酸番号201〜375、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：1（ヒトKIR2DL2）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：4（ヒトKIR2DL3）に由来するアミノ酸番号206〜341、SEQ ID NO：2（ヒトKIR2DL1）に由来するアミノ酸番号206〜348、SEQ ID NO：6（ヒトKIR2DL4）に由来するアミノ酸番号203〜377、SEQ ID NO：7（ヒトKIR3DL1）に由来するアミノ酸番号301〜444、SEQ ID NO：5（ヒトKIR3DL2）に由来するアミノ酸番号301〜455、SEQ ID NO：24（ヒトFRGR2B）に由来するアミノ酸番号204〜310、SEQ ID NO：9（ヒトMILR1）に由来するアミノ酸番号214〜343、SEQ ID NO：10（ヒトLIRB4）に由来するアミノ酸番号216〜448、SEQ ID NO：11（ヒトLIRB3）に由来するアミノ酸番号420〜631、SEQ ID NO：12（ヒトKI3L3）に由来するアミノ酸番号296〜410、SEQ ID NO：15（ヒトLIRB5）に由来するアミノ酸番号419〜590、SEQ ID NO：16（ヒトLIRB2）に由来するアミノ酸番号420〜598、SEQ ID NO：18（ヒトFCRL4）に由来するアミノ酸番号375〜515、SEQ ID NO：23（ヒトFCRL5）に由来するアミノ酸番号753〜977、SEQ ID NO：24（ヒトFCRL2）に由来するアミノ酸番号388〜508、SEQ ID NO：25（ヒトFCRL1）に由来するアミノ酸番号292〜429、SEQ ID NO：27（ヒトFCRL3）に由来するアミノ酸番号564〜734、SEQ ID NO：28（ヒトMPZL1）に由来するアミノ酸番号147〜269、SEQ ID NO：29（ヒトPILRA）に由来するアミノ酸番号151〜303、SEQ ID NO：30（ヒトPVR）に由来するアミノ酸番号329〜417、SEQ ID NO：36（ヒトCD200受容体1）に由来するアミノ酸番号229〜325、SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）に由来するアミノ酸番号181〜386、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）に由来するアミノ酸番号230〜468、またはSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）に由来するアミノ酸番号179〜440から本質的になる配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CD19特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CD19特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CD19抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３９８】
好ましい態様によると、単離された免疫細胞は、
健常細胞上の「オフターゲット」抗原に結合することができる細胞外結合ドメイン、ならびに
SEQ ID NO：33（ヒトTR10D）、SEQ ID NO：34（ヒトTR10A）、およびSEQ ID NO：35（ヒトTR10B）と80％超、好ましくは90％超、より好ましくは95％超の同一性を有するポリペプチド配列を有する阻害性膜貫通ポリペプチド
を少なくとも含むN-CARと；
N-CARと組み合わせて、操作された免疫細胞に含まれる（P-CARとしての）CD19特異的キメラ抗原受容体（CAR）と
を少なくとも含み、
CD19特異的キメラ抗原受容体（CAR）は、図1に図示されるV1〜V6、好ましくは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有し、構造は、モノクローナル抗CD19抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【０３９９】
上記に定義されたようなN-CARおよびP-CARの両方を発現するよう操作された免疫細胞は、医薬として使用されることが意図される。
【０４００】
好ましくは、そのような操作された免疫細胞は、がんの処置のために使用されることが意図される。
【０４０１】
より好ましくは、そのような操作された免疫細胞は、難治性再発性がんの処置のために使用されることが意図される。
【０４０２】
「再発性がん」とは、改善の期間の後に復活するがんをさす。これは、がんが処置されたか、未処置であったかに関わらず、当てはまる。
【０４０３】
「難治性がん」とは、がんが処置に対して直ちに抵抗性であるか、処置の間に抵抗性を発達させるかに関わらず、処置に対して抵抗性であると判明しているかまたは処置に応答しないがんをさす。
【０４０４】
免疫細胞を操作する方法
本発明者らは、「NOTゲート」に基づくタスクを実行するための人工回路における制御モジュールの合理的組み合わせに基づくそのような免疫細胞を操作する方法を開発した。「ゲート」という用語は、2種以上のインプットシグナルに応答して特定の（予定された）アウトプットを生じる装置または分子機序をさすために使用される。本発明によると、ロジカルNOTゲートとは、2種の異なる抗原との同時結合に起因する、特異的なタンパク質（シグナリングタンパク質）の阻害を通した、免疫細胞、具体的には、T細胞による標的細胞に対する細胞傷害の阻害をさす。
【０４０５】
一つの態様において、免疫を操作する方法は、以下の工程を含んでいてよい：
（a）免疫細胞を準備する工程；
（b）細胞の表面においてN-CARおよびP-CARを発現させる工程。
【０４０６】
別の態様において、免疫細胞を操作する方法は、以下の工程を含んでいてよい：
（a）N-CARをコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドおよびCARをコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを細胞へ導入する工程；
（b）細胞においてポリヌクレオチドを発現させる工程。
【０４０７】
P-CARおよびそれを含む免疫細胞は、広範囲に開示されており、公知の方法に従って、当業者によって調製され得る。例えば、P-CARおよびそのようなP-CARを含む細胞を調製するための方法論は、全て参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、US7446190、WO2008/121420、US8252592、US20140024809、WO2012/079000、WO2014153270、WO2012/099973、WO2014/011988、WO2014/011987、WO2013/067492、WO2013/070468、WO2013/040557、WO2013/126712、WO2013/126729、WO 2013/126726、WO2013/126733、US8399645、US20130266551、US20140023674、WO2014039523、US7514537、US8324353、WO2010/025177、US7446179、WO2010/025177、WO2012/031744、WO2012/136231A1、WO2012/050374A2、WO2013074916、WO2009/091826A3、WO2013/176915、またはWO/2013/059593に開示されている。P-CARおよびN-CARを含む免疫細胞は、前述の参照において開示された方法論に従って、当業者によって調製され得る。好ましい態様において、P-CARおよびN-CARを含む免疫細胞は、WO2013/176915において開示された方法論に従って、当業者によって調製され得る。
【０４０８】
一つの態様において、本発明のT細胞を操作する方法は、以下の工程を含んでいてよい：
（a）好ましくは、細胞培養物または血液試料から、T細胞を準備する工程；
（b）DNA切断、好ましくは、二本鎖破損によって、それぞれ、T細胞受容体（TCR）の成分をコードする少なくとも1種の遺伝子を選択的に不活化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする核酸によってT細胞を形質転換する工程；
（d）T細胞において低頻度切断エンドヌクレアーゼを発現させる工程；
（e）細胞表面においてTCRを発現しない形質転換されたT細胞を選別する工程。
【０４０９】
いくつかの態様において、本発明のT細胞を操作する方法は、以下の工程を含んでいてよい：
（a）好ましくは、細胞培養物または血液試料から、T細胞を準備する工程；
（b）免疫抑制剤の標的を発現する遺伝子をT細胞において選択する工程；
（c）DNA切断、好ましくは、二本鎖破損によって、それぞれ、免疫抑制剤の標的をコードする遺伝子およびT細胞受容体（TCR）の成分をコードする少なくとも1種の遺伝子を選択的に不活化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする核酸によってT細胞を形質転換する工程；
（d）T細胞において低頻度切断エンドヌクレアーゼを発現させる工程；
（e）細胞表面においてTCRを発現しない形質転換されたT細胞を選別する工程；
（f）任意で、免疫抑制剤の存在下で、細胞を増大させる工程。
【０４１０】
TCR遺伝子のそのような不活化は、出願WO2014/184143の実施例1に記載されたように実施され得る。
【０４１１】
いくつかの態様において、本発明の細胞を操作する方法は、一つまたは複数の付加的なゲノム修飾工程をさらに含む。付加的なゲノム修飾工程とは、1種または複数種の関心対象のタンパク質の、操作すべき細胞への導入を意味する。関心対象のタンパク質は、P-CARおよび/またはN-CARであり得る。
【０４１２】
「免疫抑制剤」とは、免疫系の活性を阻害するかまたは防止する薬物を意味する。
【０４１３】
いくつかの態様において、本発明のT細胞を操作する方法は、以下の工程を含んでいてよい：
（a）免疫抑制剤の標的を発現する第1の遺伝子、および
T細胞受容体（TCR）の成分をコードする第2の遺伝子
を少なくとも不活化することによって、T細胞を修飾する工程、
（b）任意で、免疫抑制剤の存在下で、細胞を増大させる工程。
【０４１４】
免疫抑制剤は、いくつかの作用機序のうちの一つによって免疫機能を抑制する薬剤である。換言すると、免疫抑制剤は、免疫応答の程度および/または正確さを減じる能力によって示される、化合物が果たす役割である。非限定的な例として、免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシン標的タンパク質、インターロイキン2 u鎖ブロッカー、イノシン一リン酸脱水素酵素の阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素の阻害剤、コルチコイド、または免疫抑制性代謝拮抗薬であってよい。
【０４１５】
具体的な態様において、方法の遺伝子修飾工程は、CD52、GR、TCRα、およびTCRβからなる群より選択される1種の遺伝子の不活化に頼る。別の態様において、方法の遺伝子修飾工程は、dCK、CD52およびGR、CD52およびTCRα、CDR52およびTCRβ、GRおよびTCRα、GRおよびTCRβ、TCRαおよびTCRβからなる群より選択される2種の遺伝子の不活化に頼る。別の態様において、方法の遺伝子修飾工程は、2種を超える遺伝子の不活化に頼る。遺伝子修飾は、好ましくは、エクスビボで操作される。
【０４１６】
例えば、TALEヌクレアーゼによる、CD52遺伝子、CTLA-4遺伝子、および/またはPD-1遺伝子の不活化は、出願WO2014/184744の実施例2、3、および4にそれぞれ記載されたように実施され得る。
【０４１７】
T細胞における遺伝子を不活化するために使用される低頻度切断エンドヌクレアーゼは、好ましくは、TALエフェクター（TALE）であるが、WO 2013/176915およびWO 2014/191128にそれぞれ記載されたようなRNAガイドにカップリングされたCas9であってもよい。
【０４１８】
組成物/製剤
本発明の別の局面は、前記のような少なくとも1種のN-CARおよび少なくとも1種のP-CARを発現する遺伝学的に操作された免疫細胞と、少なくとも1種の薬学的に許容される担体または媒体とを含有している組成物または製剤に関する。
【０４１９】
遺伝学的に修飾された免疫細胞を含む本発明の組成物は、選択されたpHに緩衝されていてよい、無菌の液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、乳濁液、分散液、または粘着性組成物として便利に提供され得る。液体調製物は、通常、ゲル、その他の粘着性組成物、および固体組成物より調製するのが容易である。さらに、液体組成物は、具体的には、注射によって投与するのが、多少、より便利である。他方で、粘着性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間を提供するため、適切な粘度範囲内で製剤化され得る。液体または粘着性組成物は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、およびそれらの適当な混合物を含有している溶媒または分散媒であり得る担体を含んでいてよい。
【０４２０】
無菌の注射可能溶液は、所望により、様々な量の他の成分と共に、本発明の実施において利用される遺伝学的に修飾された免疫応答細胞を、必要とされた量の適切な溶媒に組み込むことによって調製され得る。そのような組成物は、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロース等のような、適当な担体、希釈剤、または賦形剤と混和されていてもよい。組成物は凍結乾燥物であってもよい。組成物は、投与ルートおよび所望の調製物に依って、湿潤剤、分散剤、または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、pH緩衝剤、ゲル化もしくは粘度増強のための添加剤、保存剤、風味剤、着色剤等のような補助物質を含有していてもよい。過度の実験なしに適当な調製物を調製するため、参照によって本明細書に組み入れられる"REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE",17th edition,1985のような標準的な参考書を参考にすることができる。
【０４２１】
抗微生物保存剤、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝剤を含む、組成物の安定性および無菌性を増強する様々な添加剤を添加することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等によって確実にされ得る。注射可能な薬学的形態の吸収の長期化は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。しかしながら、本発明によると、使用される媒体、希釈剤、または添加剤は、遺伝学的に修飾された免疫応答細胞またはそれらの前駆細胞と適合性でなければならないであろう。
【０４２２】
組成物は、等張であってよく、即ち、血液および涙液と同一の浸透圧を有していてよい。本発明の組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウム、またはデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、もしくはその他の無機もしくは有機の溶質のようなその他の薬学的に許容される薬剤を使用して達成され得る。塩化ナトリウムは、特に、ナトリウムイオンを含有している緩衝液のため、好ましい。
【０４２３】
組成物の粘度は、所望により、薬学的に許容される増粘剤を使用して、選択されたレベルに維持され得る。メチルセルロースは、容易に経済的に入手可能であり、取り扱いが容易であるため、好ましい。他の適当な増粘剤には、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマー等が含まれる。増粘剤の好ましい濃度は、選択された薬剤に依るであろう。重要な点は、選択された粘度を達成するであろう量を使用することである。明らかに、適当な担体およびその他の添加剤の選択は、正確な投与ルートおよび具体的な剤形、例えば、液体剤形の性質（例えば、組成物が、溶液に製剤化されるか、懸濁液に製剤化されるか、ゲルに製剤化されるか、それとも徐放性形態もしくは液体充填形態のような別の液体形態に製剤化されるか）に依るであろう。
【０４２４】
組成物の成分は、化学的に不活性であり、本発明において記載される遺伝学的に修飾された免疫応答細胞の生存度または効力に影響を与えないよう選択されるべきであることを、当業者は認識するであろう。これは、化学的および薬学的な原理における当業者にとって問題とならないか、または問題は、標準的な参考書を参照することによって、もしくは本開示および本明細書に引用された文書からの（過度の実験を含まない）単純な実験によって、容易に回避され得る。
【０４２５】
当業者は、本発明の方法において投与される組成物の中の細胞ならびにオプションの添加剤、媒体、および/または担体の量を容易に決定することができる。典型的には、（活性細胞および/または薬剤に加えて）添加剤は、リン酸緩衝生理食塩水中に0.001〜50％（重量）溶液の量で存在し、活性成分は、約0.0001〜約5wt％、好ましくは、約0.0001〜約1wt％、さらに好ましくは、約0.0001〜約0.05wt％または約0.001〜約20wt％、好ましくは約0.01〜約10wt％、さらに好ましくは、約0.05〜約5wt％のようなマイクログラム〜ミリグラム程度で存在する。従って、当然、動物またはヒトへ投与される組成物について、投与の具体的な方法について、例えば、適当な動物モデル、例えば、マウスのような齧歯類において致死用量（LD）およびLD50を決定することによって毒性を決定し；適当な応答を誘発する組成物の投薬量、その中の成分の濃度、および組成物を投与するタイミングを決定することが好ましい。そのような決定は、当業者の知識、本開示、および本明細書に引用された文書からの過度の実験を必要としない。連続投与の時間も、過度の実験なしに確認され得る。
【０４２６】
送達方法
前記の種々の方法は、細胞の表面においてN-CARおよびP-CARを発現させることを含む。非限定的な例として、N-CARおよびP-CARは、細胞へそれらを導入することによって発現され得る。CARは、1種のプラスミドベクターによってコードされたトランスジーンとして導入され得る。プラスミドベクターは、ベクターを受容した細胞の同定および/または選択を提供する選択マーカーも含有していてよい。
【０４２７】
ポリペプチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞への導入の結果として、細胞においてインサイチューで合成され得る。あるいは、ポリペプチドを細胞外で作製し、次いで、細胞へ導入してもよい。ポリヌクレオチド構築物を細胞へ導入する方法は、当技術分野において公知であり、非限定的な例として、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムに組み込まれる安定的形質転換法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムに組み込まれない一過性形質転換法、およびウイルスによって媒介される方法を含む。ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソーム等によって細胞へ導入され得る。例えば、一過性形質転換法には、例えば、微量注入、電気穿孔、または微粒子銃が含まれる。ポリヌクレオチドは、細胞において発現されることを考慮して、ベクター、より具体的には、プラスミドまたはウイルスに含まれていてよい。
【０４２８】
ポリヌクレオチドおよびベクター
一つの態様において、本発明による単離された細胞は、「NOTゲート」受容体（N-CARおよびP-CAR）をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０４２９】
本発明は、本発明による前記のN-CARおよびP-CARをコードするポリヌクレオチド、ベクターにも関する。
【０４３０】
ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのバキュロウイルスベクターのようなウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのレンチウイルスのようなプラスミドベクターもしくはウイルスベクター）に含まれていてよい。
【０４３１】
具体的な態様において、2Aペプチドをコードする配列のようなリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含む1個のポリヌクレオチドまたはベクターに、異なる核酸配列が含まれていてもよい。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された2Aペプチドは、コドンによってコードされた2個のアミノ酸の間にペプチド結合を形成することなく、1個のコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（Doronina,Wu et al.,2008,Mol Cell Biol 28(13):4227-39を参照すること）。「コドン」とは、リボソームによって1個のアミノ酸残基へ翻訳される、mRNA上（またはDNA分子のセンス鎖上）の3ヌクレオチドを意味する。従って、インフレームにある2Aオリゴペプチド配列によってポリペプチドが分離されている時、mRNA内の単一の連続的なオープンリーディングフレームから2個のポリペプチドが合成され得る。そのようなリボソームスキップ機序は、当技術分野において周知であり、単一のメッセンジャーRNAによってコードされたいくつかのタンパク質の発現のため、いくつかのベクターによって使用されることが公知である。
【０４３２】
膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へ差し向けるため、（リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても公知の）分泌シグナル配列が、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列において提供される。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に機能的に連結される、即ち、2個の配列は正確なリーディングフレーム内で接合され、新たに合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へ差し向けるために位置付けられる。分泌シグナル配列は、一般的に、関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列の5'に位置付けられるが、ある種の分泌シグナル配列は、関心対象の核酸配列の他の場所に位置付けられてもよい（例えば、Welchら、米国特許第5,037,743号；Hollandら、米国特許第5,143,830号を参照すること）。
【０４３３】
当業者は、遺伝暗号の縮重を考慮して、これらのポリヌクレオチド分子の間には相当の配列変動が可能であることを認識するであろう。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のため、好ましくは、ヒト細胞における発現のため、コドン最適化される。コドン最適化とは、関心対象の配列において、所定の種の高発現遺伝子において一般に希少なコドンを、交換されるコドンと同一のアミノ酸をコードする、そのような種の高発現遺伝子において一般に高頻度であるコドンへ交換することをさす。
【０４３４】
治療的適用
別の態様において、種々の方法によって入手された少なくとも1種のN-CARおよび少なくとも1種のP-CARの両方を発現する単離された細胞、または上記の単離された細胞に由来する細胞株は、医薬として使用され得る。
【０４３５】
別の態様において、医薬は、その必要のある患者におけるがんを処置するために使用され得る。
【０４３６】
別の態様において、本発明による単離された細胞または単離された細胞に由来する細胞株は、その必要のある患者におけるがんの処置のための医薬の製造において使用され得る。
【０４３７】
別の態様において、少なくとも1種のN-CARおよび少なくとも1種のP-CARの両方を発現する操作された細胞は、状態が血液がん状態である場合の治療において使用されることが意図される。具体的には、そのような血液がん状態は白血病である。
【０４３８】
より具体的には、そのような操作された細胞は、白血病が急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病（CLL）、および骨髄異形成症候群からなる群より選択される場合の治療において使用されることが意図される。
【０４３９】
好ましい態様において、操作された細胞は、状態がCD123発現細胞を特徴とする前悪性または悪性のがん状態である場合の治療において使用されることが意図される。具体的には、そのような状態はCD123発現細胞の過多を特徴とする。
【０４４０】
具体的な態様において、そのような操作された細胞は、白血病が急性骨髄性白血病（AML）である場合の治療において使用されることが意図される。従って、これは、特に、CD123発現細胞またはCLL-1発現細胞を特徴とする前悪性または悪性のがんAML状態を処置するために特に適している。
【０４４１】
好ましい態様において、操作された細胞は、状態が、特に、CD38発現細胞を特徴とする多発性骨髄腫（MM）のような前悪性または悪性のがん状態である場合の治療において使用されることが意図される。
【０４４２】
別の具体的な態様において、そのような操作された細胞は、白血病が慢性リンパ球性白血病（CLL）である場合の治療において使用されることが意図される。従って、これは、特に、CS1発現細胞を特徴とする前悪性または悪性のがんCLL状態を処置するために特に適している。
【０４４３】
別の具体的な態様において、操作された細胞は、状態がROR1発現細胞を特徴とする前悪性または悪性のがんCLL状態である場合の治療において使用されることが意図される。
【０４４４】
別の態様において、悪性リンパ増殖性障害がリンパ腫である場合の治療において使用するための操作された細胞。より具体的には、そのような操作された細胞は、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに濾胞性リンパ腫（小細胞型および大細胞型）からなる群より選択されるリンパ腫を処置するために使用され得る。
【０４４５】
別の具体的な態様において、操作された細胞は、状態が、特に、ROR1発現細胞を特徴とする乳腺腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、または腎腫瘍のような固形腫瘍である場合の治療において使用されることが意図される。
【０４４６】
好ましい態様において、操作された細胞は、状態が、CD22発現細胞を特徴とする前悪性または悪性のがん状態である場合の治療において使用されることが意図される。
【０４４７】
別の局面において、本発明は、以下の工程のうちの少なくとも一つを含む、その必要のある患者を処置する方法に頼る：
（a）上記の方法のいずれか一つによって入手可能な免疫細胞を準備する工程；
（b）形質転換された免疫細胞を患者へ投与する工程。
【０４４８】
一つの態様において、本発明のT細胞は、頑強なインビボT細胞増大を受けることができ、延長された時間、存続することができる。
【０４４９】
処置は、寛解的、治癒的、または予防的であり得る。それは、自己免疫治療の一部または同種免疫治療処置の一部のいずれかであり得る。自己とは、患者を処置するために使用される細胞、細胞株、または細胞の集団が、患者またはヒト白血球抗原（HLA）適合性ドナーに起因することを意味する。同種とは、患者を処置するために使用される細胞または細胞の集団が、患者ではなくドナーに起因することを意味する。
【０４５０】
TALEヌクレアーゼのような開示された方法によって使用され得る細胞。
【０４５１】
処置は、がん、ウイルス感染、自己免疫障害、または移植片対宿主病（GvHD）を有すると診断された患者を処置するために使用され得る。処置され得るがんには、血管形成されていないかまたは実質的に血管形成されていない腫瘍が含まれ、血管形成された腫瘍も含まれる。がんには、（血液腫瘍、例えば、白血病およびリンパ腫のような）非固形腫瘍が含まれ、または固形腫瘍も含まれ得る。本発明のN-CARおよびP-CARによって処置されるがんの型には、細胞腫、芽細胞腫、および肉腫、ならびにある種の白血病またはリンパ系悪性疾患、良性腫瘍および悪性腫瘍、ならびに悪性疾患、例えば、肉腫、細胞腫、および黒色腫が含まれるが、これらに限定されるわけではない。成人の腫瘍/がんおよび小児科の腫瘍/がんも含まれる。
【０４５２】
それは、抗体治療、化学療法、サイトカイン治療、樹状細胞治療、遺伝子治療、ホルモン治療、レーザー光線治療、および放射線治療の群より選択される、がんに対する1種または複数種の治療と組み合わせられた処置であってもよい。
【０４５３】
本発明による細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、内服、輸液、植え込み、または移植を含む、任意の便利な様式で、実施され得る。本明細書に記載された組成物は、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内注射もしくはリンパ内注射によって、または腹腔内に、患者へ投与され得る。一つの態様において、本発明の細胞組成物は、好ましくは、静脈内注射によって投与される。
【０４５４】
細胞または細胞の集団の投与は、体重1kg当たり104〜1010個の細胞、好ましくは、体重1kg当たり105〜106個の細胞（これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む）の投与からなっていてよい。細胞または細胞の集団は、単回投与されてもよいしまたは複数回投与されてもよい。別の態様において、有効量の細胞が単回投与される。別の態様において、有効量の細胞がある期間にわたり複数回投与される。投与のタイミングは、管理する医師の判断の範囲内であり、患者の臨床状態に依る。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーのような任意の起源から入手されてよい。個々の必要性は変動するが、特定の疾患または状態のための所定の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当技術分野の技術の範囲内である。有効量とは、治療的または予防的な利益を提供する量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、もしあれば、同時処置の種類、処置の頻度、ならびに望まれる効果の性質に依るであろう。
【０４５５】
別の態様において、有効量の細胞またはそれらの細胞を含む組成物は、非経口投与され得る。投与は、静脈内投与であり得る。腫瘍内注射によって直接投与を行うこともできる。
【０４５６】
本発明のある種の態様において、細胞は、抗ウイルス治療、シドホビルおよびインターロイキン2、（ARA-Cとしても公知の）シタラビンのような薬剤による処置、またはMS患者のためのナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ処置、またはPML患者のためのその他の処置を含むが、これらに限定されるわけではない、多数の関連する処置モダリティと併せて（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）患者へ投与されてよい。さらなる態様において、本発明のT細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノラート、およびFK506のような免疫抑制剤、CAMPATH、抗CD3抗体、またはその他の抗体治療のような抗体またはその他の免疫除去（immunoablative）剤、シトキシン（cytoxin）、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、ならびに照射と組み合わせて使用されてよい。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびFK506）、または増殖因子によって誘導されるシグナリングにとって重要であるp70S6キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Henderson,Naya et al.,1991,Immunology 73(3):316-21；Liu,Albers et al.,1992,31(16):3896-601；Bierer,Hollander et al.,1993,Curr Opin Immunol 5(5):763-73）。さらなる態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビン、外照射療法（XRT）、シクロホスファミドのような化学療法剤、またはOKT3もしくはCAMPATHのような抗体のいずれかを使用したT細胞除去治療と併せて（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）患者へ投与される。
【０４５７】
別の態様において、本発明の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなB細胞除去治療の後に投与される。例えば、一つの態様において、対象は、高用量化学療法による標準的な処置を受けた後、末梢血幹細胞移植を受けることができる。ある種の態様において、移植の後、対象は、本発明の増大した免疫細胞の注入を受容する。さらなる態様において、増大した細胞は、手術の前または後に投与される。
【０４５８】
その他の定義
ポリペプチド配列内のアミノ酸残基は、1文字コードに従って本明細書において表記され、例えば、QはGlnまたはグルタミン残基を意味し、RはArgまたはアルギニン残基を意味し、DはAspまたはアスパラギン酸残基を意味する。
【０４５９】
ヌクレオチドは以下のように表記され：1文字コードがヌクレオシドの塩基を表記するために使用される：aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドのため、rはgまたはa（プリンヌクレオチド）を表し、kはgまたはtを表し、sはgまたはcを表し、wはaまたはtを表し、mはaまたはcを表し、yはtまたはc（ピリミジンヌクレオチド）を表し、dはg、a、またはtを表し、vはg、a、またはcを表し、bはg、t、またはcを表し、hはa、t、またはcを表し、nはg、a、t、またはcを表す。
【０４６０】
本明細書において使用されるように、「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生成された断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成された断片のようなヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチドをさす。核酸分子は、（DNAおよびRNAのような）天然に存在するヌクレオチドもしくは天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドの鏡像異性体）であるモノマー、または両方の組み合わせから構成されていてよい。修飾されたヌクレオチドは、糖モエティおよび/またはピリミジン塩基モエティもしくはプリン塩基モエティに改変を有していてもよい。糖修飾には、1個以上のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基への交換が含まれ、または糖がエーテルもしくはエステルとして官能化されていてもよい。さらに、糖モエティ全体が、アザ糖および炭素環式糖類似体のような立体的かつ電子的に類似の構造に交換されていてもよい。塩基モエティにおける修飾の例には、アルキル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンもしくはピリミジン、またはその他の周知のヘテロ環式置換基が含まれる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのような結合の類似体によって連結されていてよい。核酸は、一本鎖であってもよいしまたは二本鎖であってもよい。
【０４６１】
キメラ抗原受容体（CAR）とは、特異的な抗標的細胞性免疫活性を示すキメラタンパク質を生成するため、標的細胞上に存在する成分に対する結合ドメイン、例えば、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体に基づく特異性を、T細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせた分子を表す。一般に、CARは、T細胞抗原受容体複合体ζ鎖の細胞内シグナリングドメインに融合した細胞外単鎖抗体（scFv）（scFv:ζ）からなり、T細胞において発現された時、モノクローナル抗体の特異性に基づき、抗原認識を向け直す能力を有する。
【０４６２】
「送達ベクター」とは、本発明において必要とされる薬剤/化学物質および分子（タンパク質または核酸）を、細胞と接触させるため（即ち、「接触」）、または細胞もしくは細胞内コンパートメントへ送達するため（即ち、「導入」）、本発明において使用され得る送達ベクターを表す。それには、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬物送達ベクター、化学的担体、ポリマー担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、マイクロバブル（超音波コントラスト剤）、ナノ粒子、エマルション、またはその他の適切な移入ベクターが含まれるが、これらに限定されるわけではない。これらの送達ベクターは、分子、化学物質、高分子（遺伝子、タンパク質）、またはプラスミド、Diatosによって開発されたペプチドのような他のベクターの送達を可能にする。これらのケースにおいて、送達ベクターは分子担体である。「送達ベクター」とは、トランスフェクションを実施するための送達法も表す。
【０４６３】
「ベクター」という用語は、連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子をさす。本発明における「ベクター」には、染色体核酸、非染色体核酸、半合成核酸、または合成核酸からなっていてよい、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または直鎖状もしくは環状のDNA分子もしくはRNA分子が含まれるが、これらに限定されるわけではない。好ましいベクターは、連結された核酸の自律複製（エピソームベクター）および/または発現（発現ベクター）が可能なものである。多数の適当なベクターが、当業者に公知であり、市販されている。
【０４６４】
ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）のようなマイナス鎖RNAウイルス、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスのようなプラス鎖RNAウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリアポックス）を含む二本鎖DNAウイルスが含まれる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプーマウイルスが含まれる（Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,In Fundamental Virology,Third Edition,B.N.Fields,et al.,Eds.,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996）。
【０４６５】
「レンチウイルスベクター」とは、比較的大きいパッケージング能力、低下した免疫原性、および広範囲の異なる細胞型を高い効率で安定的に形質導入する能力のため、遺伝子送達のために極めて有望である、HIVに基づくレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、一般的には、3種（パッケージング、エンベロープ、および移入）またはそれ以上のプラスミドの産生細胞への一過性トランスフェクションの後に生成される。HIVと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質の細胞表面上の受容体との相互作用を通して標的細胞に侵入する。侵入後、ウイルスRNAは、ウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は、二本鎖直鎖状ウイルスDNAであり、それが、感染細胞のDNAへのウイルス組み込みのための基質となる。「組込み型レンチウイルスベクター（またはLV）」とは、非限定的な例として、標的細胞のゲノムに組み込まれることができるそのようなベクターを意味する。反対に、「非組込み型レンチウイルスベクター（またはNILV）」とは、ウイルスインテグラーゼの作用を通して標的細胞のゲノムに組み込まれない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。
【０４６６】
送達ベクターおよびベクターは、ソノポレーション（sonoporation）もしくは電気穿孔のような細胞透過処理技術またはこれらの技術の変法と関連しているかまたは組み合わせられてよい。
【０４６７】
「変異」とは、ポリヌクレオチド（cDNA、遺伝子）またはポリペプチド配列における1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、20個、25個、30個、40個、50個、またはそれ以上のヌクレオチド/アミノ酸の置換、欠失、挿入を表す。変異は、遺伝子のコード配列またはその制御配列に影響を与える場合がある。それは、ゲノム配列の構造またはコードされたmRNAの構造/安定性に影響を与える場合もある。
【０４６８】
「機能性バリアント」とは、タンパク質またはタンパク質ドメインの触媒活性変異体を意味し；そのような変異体は、親タンパク質または親タンパク質ドメインと比較して、同一の活性、または付加的な特性、またはより高いかもしくはより低い活性を有し得る。
【０４６９】
「同一性」とは、2個の核酸分子またはポリペプチドの間の配列同一性をさす。同一性は、比較の目的のために整列化されていてよい各配列の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列の位置が同一の塩基によって占有される時、その分子はその位置において同一である。核酸またはアミノ酸の配列の間の類似性または同一性の程度は、核酸配列によって共有された位置における同一のまたは一致するヌクレオチドの数の関数である。GCG配列分析パッケージ（University of Wisconsin,Madison,Wis.）の一部として入手可能なFASTAまたはBLASTを含む、様々なアライメントアルゴリズムおよび/またはプログラムを、2個の配列の間の同一性を計算するために使用することができ、例えば、デフォルト設定で使用することができる。例えば、本明細書に記載された具体的なポリペプチドとの少なくとも70％、85％、90％、95％、98％、または99％の同一性を有し、好ましくは、実質的に同一の機能を示すポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、企図される。
【０４７０】
「対象」または「患者」という用語には、本明細書において使用されるように、非ヒト霊長類およびヒトを含む動物界の全メンバーが含まれる。
【０４７１】
「TALエフェクター（TALE）」とは、ザントモナス（Xanthomonas）またはラルストニア（Ralstonia）の細菌タンパク質に起因する一連の33〜35アミノ酸リピートによって配列特異性が駆動される結合ドメインタンパク質を意味する。これらのリピートは、塩基対との相互作用を特定する2個のアミノ酸位置によって本質的に異なる（Boch,Scholze et al.2009,Science 326(5959):1509-12；Moscou and Bogdanove 2009,Science 326(5959):1501）。DNA標的内の各塩基対は、単一のリピートに接触し、その特異性はリピートの2個のバリアントアミノ酸（いわゆる反復可変ジペプチド、RVD）に起因する。TALE結合ドメインは、標的とされた配列の第1のチミン塩基（T0）の必要性を担うN末端移行ドメインおよび核移行シグナル（NLS）を含有するC末端ドメインを含む。TALE核酸結合ドメインは、一般に、複数のTALEリピート配列を含む操作されたコアTALE足場に相当し、各リピートはTALE認識部位の各ヌクレオチド塩基に特異的なRVDを含む。本発明において、コア足場の各TALEリピート配列は、30〜42個、より好ましくは、33個または34個のアミノ酸から作成されており、12位および13位に位置する2個の重要アミノ酸（いわゆる反復可変ジペプチド、RVD）がTALE結合部位配列の1ヌクレオチドの認識を媒介し；等価な2個の重要アミノ酸は、特に、33アミノ酸長または34アミノ酸長より長いTALEリピート配列においては、12位および13位以外の位置に位置していてもよい。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連したRVDは、Cを認識するためのHD、Tを認識するためのNG、Aを認識するためのNI、GまたはAを認識するためのNNである。別の態様において、重要アミノ酸12および13は、ヌクレオチドA、T、C、およびGに対する特異性をモジュレートするため、具体的には、この特異性を増強するため、他のアミノ酸残基に変異させられてもよい。TALE核酸結合ドメインは、一般的に、8〜30個のTALEリピート配列を含む。より好ましくは、本発明のコア足場は、8〜20個のTALEリピート配列、より好ましくは、15個のTALEリピート配列を含む。それは、TALEリピート配列のセットのC末端に位置する20アミノ酸から作成された付加的な単一の短縮型TALEリピート配列、即ち、付加的なC末端半TALEリピート配列を含んでいてもよい。
【０４７２】
「初代細胞」とは、持続的な腫瘍形成性の細胞株または人為的に不死化された細胞株と比較して、集団倍化をほとんど受けておらず、従って、それらが由来する組織の主要な機能的成分および特徴をより代表している、生組織（即ち、生検材料）から直接採取され、インビトロでの成長のために確立された細胞を表す。
【０４７３】
一般的な方法
初代T細胞培養物
フィコール勾配密度培地を使用して、バフィーコート試料からT細胞を精製した。PBMC層を回収し、市販のT細胞濃縮キットを使用して精製した。精製されたT細胞を、20ng/mlヒトIL-2、5％ヒト、およびビーズ:細胞比1:1のDynabeads Human T-Activator CD3/CD28（Life Technologies）が補足されたX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）において活性化した。
【０４７４】
CAR mRNAトランスフェクション
T細胞の精製および活性化の後、4日目または11日目にトランスフェクションを行った。5百万個の細胞に、異なるCAR構築物をコードする15μgのmRNAをトランスフェクトした。200μlの最終体積の「Cytoporation buffer T」（BTX Harvard Apparatus）において、0.4cmギャップキュベットにおいて、3000V/cmでの2回の0.1mSパルスの後の325V/cmでの4回の0.2mSパルスを適用することによって、Cytopulseテクノロジーを使用して行われたT7 mRNAポリメラーゼトランスフェクションを使用して、CAR mRNAを作製した。細胞を、X-Vivo（商標）-15培地で直ちに希釈し、5％CO2で37℃でインキュベートした。電気穿孔の2時間後に、IL-2を20ng/mLで添加した。
【０４７５】
脱顆粒アッセイ（CD107a動員）
T細胞を、適切な対照を使用してフローサイトメトリー分析によって決定された、様々なレベルのP抗原（例えば、発現CD123もしくはCD20）および検出不可能なレベルのN抗原を発現する等しい量の細胞と共に、または様々なレベルのP抗原（例えば、発現CD123もしくはCD20）および検出可能なレベルのN抗原を発現する等しい量の細胞と共に、96穴プレートにおいてインキュベートした（40,000細胞/ウェル）。共培養物を、5％CO2で37℃で6時間、100μlの最終体積のX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）において維持した。1μg/mlの抗CD49d、1μg/mlの抗CD28、および1×モネンシン溶液と共に、蛍光性抗CD107a抗体を、共培養の最初に添加することによって、細胞刺激中にCD107a染色を行った。6時間のインキュベーション期間の後、細胞を、固定可能な生死判定色素および蛍光色素コンジュゲート抗CD8によって染色し、フローサイトメトリーによって分析した。CD8+細胞におけるCD107a染色について平均蛍光強度シグナル（MFI）を決定することによって、CD8+/CD107a+細胞の割合（％）として、脱顆粒活性を決定した。脱顆粒アッセイは、mRNAトランスフェクションの24時間後に実施された。
【０４７６】
IFNγ放出アッセイ
T細胞を、様々なレベルのP CARおよび/またはN-CARの発現タンパク質を発現する細胞株と共に、96穴プレートにおいてインキュベートした（40,000細胞/ウェル）。共培養物を、5％CO2で37℃で24時間、100μlの最終体積のX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）において維持した。このインキュベーション期間の後、プレートを1500rpmで5分間遠心分離し、上清を新しいプレートに回収した。細胞培養物上清中のIFNγ検出をELISAアッセイによって行った。mRNAトランスフェクションの24時間後に細胞共培養を開始することによって、IFNγ放出アッセイを実施した。
【０４７７】
細胞傷害アッセイ
T細胞を、同一ウェルにおいて、10,000個の標的細胞（CD123発現）および10,000個の対照細胞（CD123陰性）と共に、96穴プレートにおいてインキュベートした（100,000細胞/ウェル）。標的細胞および対照細胞を蛍光細胞内色素（CFSEまたはCell Trace Violet）によって標識した後、CAR+T細胞と共培養した。共培養物を5％CO2で37℃で4時間インキュベートした。このインキュベーション期間の後、細胞を固定可能な生死判定色素によって標識し、フローサイトメトリーによって分析した。各細胞集団（標的細胞またはP CAR/NCAR陰性対照細胞）の生存度を決定し、特異的細胞溶解の割合（％）を計算した。mRNAトランスフェクションの48時間後に細胞傷害アッセイを実施した。
【０４７８】
T細胞形質導入
CARを発現する組換えレンチウイルスベクターによるT細胞の形質導入を、T細胞の精製/活性化の3日後に実施した。ヒトCARの発現タンパク質の細胞外ドメインとマウスIgG1 Fc断片との融合物からなる組換えタンパク質を使用して、T細胞の表面におけるCAR検出を行った。このタンパク質のCAR分子との結合を、タンパク質のマウスFc部分を標的とする蛍光色素コンジュゲート二次抗体によって検出し、フローサイトメトリーによって分析した。
【実施例】
【０４７９】
実施例1．阻害性ゲート受容体の設計
N-CARを構築するための配列を、Uniprotデータベースから入手し、ヒトタンパク質に限定し、さらにII型膜タンパク質（膜の細胞質側にN末端）を除外した。
【０４８０】
N-CARは、完全細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および第1の注釈付きの細胞外トポロジカルドメインまでのアミノ酸配列を含む、SEQ ID NO：1〜36の関心対象の膜受容体に、SEQ ID NO：39またはSEQ ID NO：40の短い古典的な-GS-リンカーを介して融合された、抗原ターゲティングドメイン（SEQ ID NO：45〜46の抗CD20 VHおよびVL、SEQ ID NO：41〜42の抗BCMA VHおよびVL、ならびにSEQ ID NO：43〜44の抗PSMA VHおよびVL鎖）から構成されるように（図2に図式化されたように）設計される。細胞外トポロジカルドメインに明確な注釈がない場合には、他の類似した受容体に基づき、融合点を決定した。得られた細胞外ドメインが短かい場合、第1の注釈付きの細胞外トポロジカルドメインの付加的な部分を追加した。
【０４８１】
哺乳動物発現プラスミドにおいて、SEQ ID NO：98〜99のレポーターマーカー（例えば、蛍光タンパク質）が後続するSEQ ID NO：97の2Aシス作用性加水分解酵素要素の上流に、N-CARをクローニングする。PCR、酵素制限消化、およびライゲーションのような標準的な分子生物学技術を、全ての構築を作製するために適用して、SEQ ID NO：100〜212を得る。
【０４８２】
CARおよびN-CARをベクター化するためのレンチウイルス粒子の作製は、製造業者のプロトコルに従って、市販のレンチウイルスパッケージングミックス（Invitrogen）を使用して実施されるか、あるいは、レンチウイルス粒子は、商業的な製造業者（Vectalys）から直接入手される。
【０４８３】
実施例2．不死化ヒトT細胞におけるN-CARの特徴決定
（CD20抗原を発現し；SEQ ID NO：213によって形質導入された）P-CARモデル細胞株を、不死化ヒトT細胞株（Jurkat）のレンチウイルス形質導入によって生成する。形質導入された細胞を、バルクFACSソーティングまたは磁性分離を使用して、陽性表面CAR+発現について精製する。次いで、完全バルクCAR+集団を、陽性CAR+によって駆動される活性化（脱顆粒/細胞傷害）、増殖、およびサイトカイン放出について評価する。結果は図3に提示される。高発現、中発現、および低発現のCAR+亜集団またはクローン細胞を同定し単離する。
【０４８４】
次いで、適切なP-CAR（またはCAR+）Jurkat細胞株または集団を、実施例1において提示されたようなN-CARをコードする個々のDNAプラスミドまたはDNAプラスミドの組み合わせによってトランスフェクトする。P-CARおよびN-CARの標的抗原の両方を発現するモデル細胞株、P-CAR抗原のみを発現するモデル細胞株、ならびにN-CAR抗原のみを発現するモデル細胞株を使用して、活性化（脱顆粒/サイトカイン分泌）のレベルを、P-CAR/N-CAR陽性Jurkat細胞においてFACSによって評価する。
【０４８５】
標的細胞の存在下または非存在下でP-CAR陽性細胞に対して試験されるP-CAR/N-CAR陽性細胞の細胞傷害は、以下の表3に提示される。結果は、標的細胞の存在下および標的細胞の非存在下でのP-CAR/N-CARまたはP-CARを発現するT細胞のCD69蛍光の比として表される。
【０４８６】
（表３）標的細胞と共にまたは標的細胞なしで試験された時の、P-CARのみをコードするT細胞に対する、多様なN-CARと組み合わせられたP-CARをコードするT細胞の細胞傷害の試験（平均CD69蛍光強度+/-標的細胞の比に基づく）
2018504104.tif 000027
【０４８７】
全てのN-CARが（CD20 scFvをコードする）P-CARに対して有意な阻害効果を提示するという結果が、表3に示される。これは、P-CARのみを付与されたT細胞と比較した時の、標的細胞の存在下での、N-CARおよびP-CARの両方を付与されたT細胞の平均CD69蛍光強度の比の著しい低下によって反映される。
【０４８８】
これは、TRAIL阻害性受容体TR10A、TR10B、およびTR10DをコードするN-CARについて特に当てはまる。
【０４８９】
実施例3．初代T細胞におけるN-CARの特徴決定
実施例2に従って同定されたP-CARシグナル（脱顆粒/サイトカイン分泌）の減弱を可能にするN-CAR構築物を、標準的な分子生物学を使用して、レンチウイルス産生プラスミドにサブクローニングし、SEQ ID NO：214〜217を得る。
【０４９０】
初代T細胞を、N-CARレンチウイルス粒子SEQ ID NO：215およびSEQ ID NO：217ならびにSEQ ID NO：218のP-CARを使用して連続的に形質導入する。N-CARによって形質導入されたT細胞を、FACSソーティングを使用して、陽性表面発現について精製する。次いで、P-CAR陽性集団を、N-CARレンチウイルス粒子によって形質導入する。P-CAR/N-CARおよびN-CARによって操作された初代T細胞の相対的な効果を、P-CARおよびN-CARの標的抗原を発現する2種の主要集団を含有している操作された標的細胞株（HEK293）を使用して評価する（抗原P-CAR-high/抗原N-CAR-highおよび抗原P-CAR-high/抗原N-CAR-low）。次いで、標的細胞集団を、異なる操作された初代T細胞と共に6時間インキュベートし、2種の標的集団（CD19抗原およびPMSA抗原を発現する生細胞）の相対的な割合を記録する。
【０４９１】
データは、抗原P-CAR-high/抗原N-CAR-high標的細胞集団が、TR10D操作N-CARの存在下で、抗原CAR-high/抗原N-CAR-low標的細胞と比較して、保護されることを明確に示した。実際、2種の標的細胞集団の間の生細胞の百分率の比の増加が測定される（標的/エフェクターの3つの比が使用される：1/1、1/3、および1/10、図4）。
【０４９２】
データは、N-CARによって誘導された低下における用量依存性の効果を示す。
【０４９３】
驚くべきことに、同一の条件において阻害性分子PD-1を含むN-CARを試験する時、標的細胞の抗原P-CAR-high/抗原N-CAR-highおよび抗原P-CAR-high/抗原N-CAR-lowの％の比の増加が測定される。
【図１】
2018504104.tif 000029
【図２】
2018504104.tif 000030
【図３】
2018504104.tif 000031
【図４】
2018504104.tif 000032
【配列表】
2018504104000001.app
【国際調査報告】
2018504104.tif 000033
2018504104.tif 000034
2018504104.tif 000035
2018504104.tif 000036
2018504104.tif 000037
2018504104.tif 000038
2018504104.tif 000039