(57)【要約】本出願は、ＦＸＲアゴニスト、および血中グルコースレベルを引き下げ、インスリン分泌を刺激し、かつ／またはインスリン感受性を高める少なくとも１つの更なる治療剤の組合せを含む医薬組成物に関する。本出願は、ＦＸＲ介在性の疾患もしくは症状、例えばＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨ、血中グルコースレベルの上昇、インスリン分泌の低下、および／もしくはインスリン感受性の低下に関係する疾患もしくは症状、例えば高血糖、糖尿病、肥満症、およびインスリン抵抗性の処置または予防のための、あるいは血中グルコースレベルを引き下げ、インスリン分泌を刺激し、かつ／またはインスリン感受性を高めるための医薬組成物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＸＲアゴニスト、少なくとも１つの更なる治療剤、および、任意選択的に、１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物であって、前記少なくとも１つの更なる治療剤は、血中グルコースレベルを引き下げ、インスリン分泌を刺激し、かつ／またはインスリン感受性を高める、医薬組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、グルコースレベルを引き下げる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、インスリン分泌を刺激する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、インスリン感受性を高める、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、インスリンまたはインスリン類似体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、膵臓ベータ細胞内のＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネルの阻害剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、スルホニル尿素である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、メグリチニド、レパグリニド、ナテグリニド、ミチグリニド、およびリノグリリドから選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、インクレチン模擬物である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、ＧＬＰ−１またはそのＧＬＰ−１受容体アゴニストである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、ＧＩＰまたはその類似体である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、ジペプチジルペプチダーゼ−４の阻害剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、ビグアナイドである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、胆汁酸吸着剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、グルコースの代謝を促進する剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、グルコキナーゼ活性剤である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、グルコースの腎臓再吸収を阻止する剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、ＳＧＬＴ−２阻害剤である、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、腸におけるグルコース吸収を低下させる剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、胃内容物排出を減速させる剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、アミリンまたはその類似体である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、ミクロソームのトリグリセリド輸送タンパク質阻害剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、ブロモクリプチン、ベンフルオレクス、およびトルレスタットから選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、グルココルチコイドの濃度を引き下げる剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、１１ベータ−ＨＳＤ１阻害剤である、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記ＦＸＲアゴニストは、式Ｉの化合物：
【化１】
2018510900.tif 000019
またはその薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体であり、式中：
Ｒ１は、水素または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ２は、水素またはα−ヒドロキシルであり；
Ｒ４は、ヒドロキシルまたは水素であり；
Ｒ７は、ヒドロキシルまたは水素である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
Ｒ１は、非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
Ｒ１は、メチル、エチル、またはプロピルである、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
Ｒ１はエチルである、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
Ｒ４はヒドロキシルであり、Ｒ７は水素である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
化合物１：
【化２】
2018510900.tif 000020
またはその薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体、少なくとも１つの更なる治療剤、および、任意選択的に、１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物であって、前記少なくとも１つの更なる治療剤は、血中グルコースレベルを引き下げ、インスリン分泌を刺激し、かつ／またはインスリン感受性を高める、医薬組成物。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、グルコースレベルを引き下げる、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、インスリン分泌を刺激する、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、インスリン感受性を高める、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、インスリンまたはインスリン類似体である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、膵臓ベータ細胞内のＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネルの阻害剤である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、スルホニル尿素である、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、メグリチニド、レパグリニド、ナテグリニド、ミチグリニド、およびリノグリリドから選択される、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、インクレチン模擬物である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、ＧＬＰ−１またはそのＧＬＰ−１受容体アゴニストである、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、ＧＩＰまたはその類似体である、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、ジペプチジルペプチダーゼ−４の阻害剤である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、ビグアナイドである、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、胆汁酸吸着剤である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、グルコースの代謝を促進する剤である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、グルコキナーゼ活性剤である、請求項４６に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、グルコースの腎臓再吸収を阻止する剤である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、ＳＧＬＴ−２阻害剤である、請求項４８に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、腸におけるグルコース吸収を低下させる剤である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤である、請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、胃内容物排出を減速させる剤である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、アミリンまたはその類似体である、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、ミクロソームのトリグリセリド輸送タンパク質阻害剤である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、ブロモクリプチン、ベンフルオレクス、およびトルレスタットから選択される、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、グルココルチコイドの濃度を引き下げる剤である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記少なくとも１つの更なる治療剤は、１１ベータ−ＨＳＤ１阻害剤である、請求項５６に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）または非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を処置または予防する方法であって、請求項１または３２に記載の医薬組成物を、そうすることが必要な対象に投与することを含む方法。
【請求項５９】
前記ＮＡＦＬＤまたは前記ＮＡＳＨは、血中グルコースレベルの上昇、インスリン分泌の低下、および／またはインスリン感受性の低下を伴う、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
血中グルコースレベルの上昇、インスリン分泌の低下、および／またはインスリン感受性の低下に関係する疾患または症状を処置または予防する方法であって、請求項１または３２に記載の医薬組成物を、そうすることが必要な対象に投与することを含む方法。
【請求項６１】
前記疾患または前記症状は、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、高血糖、糖尿病、肥満症、およびインスリン抵抗性から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
血中グルコースレベルを引き下げ、インスリン分泌を刺激し、かつ／またはインスリン感受性を高める方法であって、請求項１または３２に記載の医薬組成物の治療的に有効な量を、そうすることが必要な対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
真性糖尿病およびインスリン抵抗性症候群が挙げられる代謝異常は、広範囲の種々の代謝リスクマーカーにおける異常、例えば高インスリン血症、障害のあるグルコース代謝、トリグリセリドの血漿レベルの上昇、高密度リポタンパク質コレステロールレベルの引下げ、高血圧、および肥満症によって特徴付けられる。血中グルコース濃度の上昇、インスリン分泌の低下、および／またはインスリン抵抗性の増大は、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、種々の慢性肝炎状態（Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、および非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）が挙げられるいくつかの症状に関係している場合がある。現在の処置は、インスリン抵抗性を標的とし（例えば、メトホルミン、チアゾリジンジオン（「ＴＺＤ」））、またはベータ細胞からのインスリン放出を標的とするものである（例えば、スルホニル尿素、エキセナチド）。しかしながら、これらの処置は、副作用、有効性の制限、および不所望の長期間作用が挙げられる種々の欠陥を招く。
【０００２】
胆汁酸は、種々の代謝プロセスの調節に関与しており、そして、それ自体の合成および腸肝循環だけでなく、トリグリセリド、コレステロール、グルコース、およびエネルギーホメオスタシスをも調節している。胆汁酸はまた、インクレチン放出の調節において、そしてエネルギー消費の調節を介した代謝調節において、更なる役割を果たし得る。さらに、胆汁酸吸着剤（ＢＡＳ）は、種々の肝疾患、例えば、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨ、血糖異常（ｄｙｓｇｌｙｃｅｍｉａ）、ならびにＩＩ型糖尿病の処置におけるその役割を示してきた。
【０００３】
胆汁酸は、核内受容体ＦＸＲに結合し、これは、胆汁酸ホメオスタシスに関与する。糖尿病がＦＸＲ発現の調節不全を伴うことが示唆されている。ＦＸＲは、食後の、そして空腹時の肝臓グルコース利用中の、炭水化物誘導遺伝子発現および肝臓グルコース産生の修飾において役割を果たすだけでなく、食後の肝臓グルコース産生およびグリコーゲン蓄積の維持による空腹時低血糖を妨げるのに必須である糖新生遺伝子の複雑なアレイの調節に関与するようである。さらに、ＦＸＲ活性化は、食後の状態において、グルコース反応性遺伝子、例えばＬ型ピルビン酸キナーゼ（Ｌ−ＰＫ）の誘導を阻害する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ゆえに、ＦＸＲアゴニスト、ならびに血中グルコースレベルの上昇、インスリン分泌の低下、および／またはインスリン感受性の低下に関連した種々の疾患または症状を処置または予防するための、血中グルコースレベルを引き下げ、インスリン分泌を刺激し、かつ／またはインスリン感受性を高める少なくとも１つの更なる治療剤を含む医薬組成物についてのニーズが満たされていない。本出願は、そのようなニーズに対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本出願は、（ｉ）第１の化合物、（ｉｉ）少なくとも１つの更なる治療剤、および（ｉｉｉ）任意選択的に、１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物に関し、第１の化合物は、ＦＸＲアゴニストであり、少なくとも１つの更なる治療剤は、血中グルコースレベルを引き下げ、インスリン分泌を刺激し、かつ／またはインスリン感受性を高める。
【０００６】
本出願はまた、本出願の医薬組成物の治療的使用に関する。
【０００７】
一実施形態において、第１の化合物は、式Ｉの化合物：
【化１】
2018510900.tif 000002
またはその薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体であり、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ７は、本明細書中で定義される。
【０００８】
本出願はまた、ＦＸＲ介在性の疾患もしくは症状、ならびに／または血中グルコースレベルの上昇、インスリン分泌の低下、および／もしくはインスリン感受性の低下に関係する疾患もしくは症状を処置または予防する方法であって、本出願の医薬組成物の治療的に有効な量を、そうすることが必要な対象に投与することを含む方法に関する。一実施形態において、ＦＸＲ介在性の疾患または症状は、ＦＸＲ活性化によって処置される。
【０００９】
本出願はまた、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）または非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を処置または予防する方法であって、本出願の医薬組成物の治療的に有効な量を、そうすることが必要な対象に投与することを含む方法に関する。
【００１０】
本出願はまた、血中グルコースレベルを引き下げ、インスリン分泌を刺激し、かつ／またはインスリン感受性を高める方法であって、本出願の医薬組成物の治療的に有効な量を、そうすることが必要な対象に投与することを含む方法に関する。
【００１１】
本出願はまた、高血糖、真性糖尿病、または肥満症を処置または予防する方法であって、本出願の医薬組成物の治療的に有効な量を、そうすることが必要な対象に投与することを含む方法に関する。
【００１２】
本出願はまた、血中グルコースレベルを引き下げ、インスリン分泌を刺激し、インスリン感受性を高め、ＦＸＲ介在性の疾患もしくは症状、ならびに／または血中グルコースレベルの上昇、インスリン分泌の低下、および／もしくはインスリン感受性の低下に関係する疾患もしくは症状を処置または予防し、かつ／あるいはＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、高血糖、真性糖尿病、もしくは肥満症を処置または予防するための、本出願の組成物の使用に関する。一実施形態において、疾患または症状は、ＦＸＲ活性化によって処置される。
【００１３】
本出願はまた、血中グルコースレベルを引き下げ、インスリン分泌を刺激し、インスリン感受性を高め、ＦＸＲ介在性の疾患もしくは症状、ならびに／または血中グルコースレベルの上昇、インスリン分泌の低下、および／もしくはインスリン感受性の低下に関係する疾患もしくは症状を処置または予防し、かつ／あるいはＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、高血糖、真性糖尿病、もしくは肥満症を処置または予防するための、医薬の製造における本出願の医薬組成物の使用に関する。一実施形態において、疾患または症状は、ＦＸＲ活性化によって処置される。
【００１４】
本出願の組成物および方法は、血中グルコース濃度の上昇、インスリン分泌の低下、および／またはインスリン感受性の低下を伴う疾患または障害の処置または予防において満たされていないニーズに対処する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】総ＮＡＳに及ぼす、低用量のオベチコール酸（ＯＣＡ）およびリラグルチド（ＬＩＲＡ）の、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。＊ｐ＜０．０５、対コントロール、そして＄ｐ＜０．０５、対ＯＣＡ。
【図１Ｂ】総ＮＡＳに及ぼす、高用量のＯＣＡおよびＬＩＲＡの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。＊ｐ＜０．０５、対コントロール。
【図２Ａ】ＮＡＳの脂肪変性成分に及ぼす、低用量のＯＣＡおよびＬＩＲＡの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。＊ｐ＜０．０５、対コントロール、そして＄ｐ＜０．０５、対ＯＣＡ。
【図２Ｂ】ＮＡＳの脂肪変性成分に及ぼす、高用量のＯＣＡおよびＬＩＲＡの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。＊ｐ＜０．０５、対コントロール、＄ｐ＜０．０５、対ＯＣＡ、そして＾ｐ＜０．０５、対ＬＩＲＡ。
【図３Ａ】総肝臓トリグリセリド含有量に及ぼす、低用量のＯＣＡおよびＬＩＲＡの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。＃＃＃ｐ＜０．００１、対リーン食ビヒクル、＊＊＊ｐ＜０．００１、対ＤＩＯ−ＮＡＳＨビヒクル；そしてΔｐ＜０．０５、対ＤＩＯ−ＮＡＳＨ  ＯＣＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）。
【図３Ｂ】総肝臓トリグリセリド含有量に及ぼす、高用量のＯＣＡおよびＬＩＲＡの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。＃＃＃Ｐ＜０．００１、対リーン食ビヒクル、＊＊ｐ＜０．０５、そして＊＊＊ｐ＜０．００１、対ＤＩＯ−ＮＡＳＨビヒクル。
【図４Ａ】総肝臓コレステロール含有量に及ぼす、低用量のＯＣＡおよびＬＩＲＡの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。＃＃＃ｐ＜０．００１、対リーン食ビヒクル；＊ｐ＜０．０５、そして＊＊＊ｐ＜０．００１、対ＤＩＯ−ＮＡＳＨビヒクル。
【図４Ｂ】総肝臓コレステロール含有量に及ぼす、高用量のＯＣＡおよびＬＩＲＡの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。＃＃＃ｐ＜０．００１、対リーン食ビヒクル；＊＊ｐ＜０．０１、そして＊＊＊ｐ＜０．００１、対ＤＩＯ−ＮＡＳＨビヒクル。
【図５】研究期間中に体重に及ぼす、低用量のＯＣＡおよびＬＩＲＡの、単独での、そして組み合わせた作用を示すグラフである。
【図６Ａ】体重に対する脂肪組織量の変化に及ぼす、低用量のＯＣＡおよびＬＩＲＡの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。
【図６Ｂ】体重に対する組織量の変化に及ぼす、高用量のＯＣＡおよびＬＩＲＡの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。
【図７Ａ】単独の、そして組み合わされた低用量のＯＣＡおよびＬＩＲＡによる、一意的に調節される遺伝子に及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール。細胞死誘導ＤＦＦＡ様エフェクタＣの発現レベルに及ぼす作用を示す棒グラフである。
【図７Ｂ】単独の、そして組み合わされた低用量のＯＣＡおよびＬＩＲＡによる、一意的に調節される遺伝子に及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール。死エフェクタドメイン含有ＤＮＳ結合タンパク質の発現レベルに及ぼす作用を示す棒グラフである。
【図７Ｃ】単独の、そして組み合わされた低用量のＯＣＡおよびＬＩＲＡによる、一意的に調節される遺伝子に及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール。２−ヒドルキシアシル（Ｈｙｄｒｘｙａｃｙｌ）−ＣｏＡ−リアーゼの発現レベルに及ぼす作用を示す棒グラフである。
【図７Ｄ】単独の、そして組み合わされた低用量のＯＣＡおよびＬＩＲＡによる、一意的に調節される遺伝子に及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール。レクチン、ガラクトース結合タンパク質の発現レベルに及ぼす作用を示す棒グラフである。
【図７Ｅ】単独の、そして組み合わされた低用量のＯＣＡおよびＬＩＲＡによる、一意的に調節される遺伝子に及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール。オキシステロール結合タンパク質様３受容体の発現レベルに及ぼす作用を示す棒グラフである。
【図８Ａ】単独の、そして組み合わされた高用量のＯＣＡおよびＬＩＲＡによる、一意的に調節される遺伝子の発現レベルに及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール、そして＃ｐ＜０．０５、対ビヒクルコントロール。エストロゲン受容体１の発現レベルに及ぼす作用を示す棒グラフである。
【図８Ｂ】単独の、そして組み合わされた高用量のＯＣＡおよびＬＩＲＡによる、一意的に調節される遺伝子の発現レベルに及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール、そして＃ｐ＜０．０５、対ビヒクルコントロール。インスリン誘導遺伝子２の発現レベルに及ぼす作用を示す棒グラフである。
【図８Ｃ】単独の、そして組み合わされた高用量のＯＣＡおよびＬＩＲＡによる、一意的に調節される遺伝子の発現レベルに及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール、そして＃ｐ＜０．０５、対ビヒクルコントロール。リピン１の発現レベルに及ぼす作用を示す棒グラフである。
【図８Ｄ】単独の、そして組み合わされた高用量のＯＣＡおよびＬＩＲＡによる、一意的に調節される遺伝子の発現レベルに及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール、そして＃ｐ＜０．０５、対ビヒクルコントロール。ユビキノール−チトクロームＣレダクターゼヒンジタンパク質の発現レベルに及ぼす作用を示す棒グラフである。
【図９Ａ】総ＮＡＳに及ぼす、高用量のＯＣＡおよびメトホルミン（ＭＥＴ）の、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール。
【図９Ｂ】ＮＡＳの脂肪変性成分に及ぼす、高用量のＯＣＡおよびＭＥＴの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。
【図１０Ａ】４週目にＯＧＴＴを用いた、血中グルコースの引下げに及ぼす、低用量のＯＣＡおよびＭＥＴの、単独での、そして組み合わせた作用を示すグラフである。＃＃ｐ＜０．００１、対リーン食ビヒクル、＊＊ｐ＜０．０１、そして＊＊＊ｐ＜０．００１、対ＤＩＯ−ＮＡＳＨビヒクル、ΔΔΔｐ＜０．０５、対ＤＩＯ−ＮＡＳＨ  ＯＣＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）、そして↑↑ｐ＜０．０５、対ＤＩＯ−ＮＡＳＨ  ＭＥＴ（５０ｍｇ／ｋｇ）。
【図１０Ｂ】４週目にＯＧＴＴを用いた、血中グルコースの引下げに及ぼす、低用量のＯＣＡおよびＭＥＴの、単独での、そして組み合わせた作用を示すグラフである。＃＃ｐ＜０．００１、対リーン食ビヒクル、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、対ＤＩＯ−ＮＡＳＨビヒクル；そしてΔｐ＜０．００５、ΔΔｐ＜０．０，１ΔΔΔｐ＜０．００１、対ＤＩＯ−ＮＡＳＨ  ＯＣＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）。
【図１１】単独の、そして組み合わされた低用量の、そして高用量のＯＣＡおよびＭＥＴによって調節される遺伝子の数を示す棒グラフである。
【図１２Ａ】遺伝子発現に及ぼす、低用量のＯＣＡおよびメトホルミンの、単独での、そして組み合わせた作用を示すヴェン図である。
【図１２Ｂ】遺伝子発現に及ぼす、高用量のＯＣＡおよびＭＥＴの、単独での、そして組み合わせた作用を示すヴェン図である。
【図１２Ｃ】低用量の、そして高用量のＯＣＡおよびＭＥＴによって調節される遺伝子の数を比較するヴェン図である。
【図１３Ａ】コラーゲン６ａ２型のｍＲＮＡ発現に及ぼす、低用量のＯＣＡおよびＭＥＴの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。
【図１３Ｂ】コラーゲン４ａ２型のｍＲＮＡ発現に及ぼす、低用量のＯＣＡおよびＭＥＴの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。
【図１３Ｃ】コラーゲン５ａ１型のｍＲＮＡ発現に及ぼす、低用量のＯＣＡおよびＭＥＴの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。
【図１４Ａ】単独の、そして組み合わされた低用量のＯＣＡおよびＭＥＴによる、一意的に調節される特定の遺伝子の発現レベルに及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール。デコリンのｍＲＮＡ発現に及ぼす、低用量のＯＣＡおよびＭＥＴの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。
【図１４Ｂ】単独の、そして組み合わされた低用量のＯＣＡおよびＭＥＴによる、一意的に調節される特定の遺伝子の発現レベルに及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール。ラマニン（ｌａｍａｎｉｎ）サブユニット１のｍＲＮＡ発現に及ぼす、低用量のＯＣＡおよびＭＥＴの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。
【図１４Ｃ】単独の、そして組み合わされた低用量のＯＣＡおよびＭＥＴによる、一意的に調節される特定の遺伝子の発現レベルに及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール。単球からマクロファージへの分化因子２のｍＲＮＡ発現に及ぼす、低用量のＯＣＡおよびＭＥＴの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。
【図１４Ｄ】単独の、そして組み合わされた低用量のＯＣＡおよびＭＥＴによる、一意的に調節される特定の遺伝子の発現レベルに及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール。トランスフォーミング増殖因子Ｂ１転写産物のｍＲＮＡ発現に及ぼす、低用量のＯＣＡおよびＭＥＴの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。
【図１４Ｅ】単独の、そして組み合わされた低用量のＯＣＡおよびＭＥＴによる、一意的に調節される特定の遺伝子の発現レベルに及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール。腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリ、メンバ１１ｂのｍＲＮＡ発現に及ぼす、高用量のＯＣＡおよびＭＥＴの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。
【図１４Ｆ】単独の、そして組み合わされた低用量のＯＣＡおよびＭＥＴによる、一意的に調節される特定の遺伝子の発現レベルに及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール。腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリ、メンバ１９のｍＲＮＡ発現に及ぼす、低用量のＯＣＡおよびＭＥＴの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。
【図１５Ａ】単独の、そして組み合わされた高用量のＯＣＡおよびＭＥＴによる、調節される特定のコラーゲンの発現レベルに及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール。コラーゲン１４ａ１型のｍＲＮＡ発現に及ぼす、高用量のＯＣＡおよびＭＥＴの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。
【図１５Ｂ】単独の、そして組み合わされた高用量のＯＣＡおよびＭＥＴによる、調節される特定のコラーゲンの発現レベルに及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール。コラーゲン６ａ１型のｍＲＮＡ発現に及ぼす、高用量のＯＣＡおよびＭＥＴの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。
【図１５Ｃ】単独の、そして組み合わされた高用量のＯＣＡおよびＭＥＴによる、調節される特定のコラーゲンの発現レベルに及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール。コラーゲン６ａ２型のｍＲＮＡ発現に及ぼす、高用量のＯＣＡおよびＭＥＴの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。
【図１６Ａ】単独の、そして組み合わされた高用量のＯＣＡおよびＭＥＴによる、一意的に調節される特定の遺伝子の発現レベルに及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール。血小板由来増殖因子受容体ベータのｍＲＮＡ発現に及ぼす、低用量のＯＣＡおよびＭＥＴの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。
【図１６Ｂ】単独の、そして組み合わされた高用量のＯＣＡおよびＭＥＴによる、一意的に調節される特定の遺伝子の発現レベルに及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール。デコリンのｍＲＮＡ発現に及ぼす、低用量のＯＣＡおよびＭＥＴの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。
【図１６Ｃ】単独の、そして組み合わされた高用量のＯＣＡおよびＭＥＴによる、一意的に調節される特定の遺伝子の発現レベルに及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール。コレクチンサブファミリメンバ１０のｍＲＮＡ発現に及ぼす、低用量のＯＣＡおよびＭＥＴの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。
【図１６Ｄ】単独の、そして組み合わされた高用量のＯＣＡおよびＭＥＴによる、一意的に調節される特定の遺伝子の発現レベルに及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール。トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体ＩＩＩのｍＲＮＡ発現に及ぼす、低用量のＯＣＡおよびＭＥＴの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。
【図１６Ｅ】単独の、そして組み合わされた高用量のＯＣＡおよびＭＥＴによる、一意的に調節される特定の遺伝子の発現レベルに及ぼす作用を記載する。＊ｐ＜０．００５、対ビヒクルコントロール。トランスフォーミング増殖因子（ベータ誘導）のｍＲＮＡ発現に及ぼす、低用量のＯＣＡおよびＭＥＴの、単独での、そして組み合わせた作用を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本出願は、（ｉ）第１の化合物、（ｉｉ）少なくとも１つの更なる治療剤、および（ｉｉｉ）任意選択的に、１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物に関し、第１の化合物は、ＦＸＲアゴニストであり、少なくとも１つの更なる治療剤は、血中グルコースレベルを引き下げ、インスリン分泌を刺激し、かつ／またはインスリン感受性を高める。
【００１７】
一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、インスリン分泌を増大させる剤である。別の例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、標的細胞、組織、または器官の、インスリンに対する感受性を高める剤である。別の例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、血中グルコースレベルを引き下げる剤である。
【００１８】
一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、インスリンまたはインスリン類似体である。更なる例において、インスリンまたはインスリン類似体は、ヒューマリン（登録商標）Ｒ、インスリンリスプロ（Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標））、インスリンアスパルト（Ｎｏｖｏｌｏｇ（登録商標））、インスリングルリシン（Ａｐｉｄｒａ（登録商標））、速効型インスリン亜鉛（Ｓｅｍｉｌｅｎｔｅ（登録商標））、インスリングラルギン（Ｌａｎｔｕｓ（登録商標））、インスリンデテミル（Ｌｅｖｅｍｉｒ（登録商標））、イソフェンインスリン、インスリン亜鉛（Ｌｅｎｔｅ（登録商標））、持続型インスリン亜鉛（Ｕｌｔｒａｌｅｎｔｅ（登録商標））、インスリンデグルデク、エクスベラ（登録商標）、およびＡｆｒｅｚｚａ（登録商標）から選択される。
【００１９】
一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、膵臓ベータ細胞内のＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネルの阻害剤である。更なる例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、スルホニル尿素である。更なる例において、スルホニル尿素は、トルブタミド（Ｏｒｉｎａｓｅ（登録商標））、アセトヘキサミド（Ｄｙｍｅｌｏｒ）、トラザミド（Ｔｏｌｉｎａｓｅ（登録商標））、クロルプロパミド（Ｄｉａｂｉｎｅｓｅ（登録商標））、カルブタミド（Ｇｌｕｃｉｄｏｒａｌ（登録商標））、メタヘキサミド、グリピジド（Ｇｌｕｃｏｔｒｏｌ（登録商標））、グリブリドまたはグリベンクラミド（Ｍｉｃｒｏｎａｓｅ（登録商標））、グリコピラミド、グリキドン（Ｇｌｕｒｅｎｏｒｍ）、グリクラジド（Ｕｎｉ  Ｄｉａｍｉｃｒｏｎ）、グリボルヌリド、グリソキセピド、グリメピリド（Ａｍａｒｙｌ（登録商標））、およびＪＢ２５３（Ｂｒｏｉｃｈｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍ．５，Ａｒｔｉｃｌｅ  Ｎｏ．５１１６（２０１４））から選択される。別の更なる例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、メグリチニド、レパグリニド（Ｐｒａｎｄｉｎ（登録商標））、ナテグリニド（Ｓｔａｒｌｉｘ（登録商標））、ミチグリニド、およびリノグリリドから選択される。
【００２０】
一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、ＦＦＡ１／ＧＰＲ４０（遊離脂肪酸受容体１）のアゴニストである。更なる例において、ＦＦＡ１／ＧＰＲ４０アゴニストはファシグリファムである。
【００２１】
一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、インクレチン模擬物である。更なる例において、インクレチン模擬物は、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）またはそのＧＬＰ−１受容体のアゴニストである。更なる例において、ＧＬＰ−１受容体アゴニストは、エキセナチド／エキセンディン−４、リラグルチド、タスポグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、デュラグルチド、セマグルチド、ＢＲＸ−０５８５（Ｐｆｉｚｅｒ／Ｂｉｏｒｅｘｉｓ）、およびＣＪＣ−１１３４−ＰＣ（ヒトアルブミンに結合したエキセンディン−４）から選択される。別の更なる例において、インクレチン模擬物は、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）またはＧＩＰ類似体である。
【００２２】
一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４、当該技術においてＤＰＰ−ＩＶとしても知られている）の阻害剤である。更なる例において、ＤＰＰ−４阻害剤は、ビルダグリプチン（Ｇａｌｖｕｓ（登録商標））、シタグリプチン（Ｊａｎｕｖｉａ（登録商標））、サキサグリプチン（Ｏｎｇｌｙｚａ（登録商標））、リナグリプチン（Ｔｒａｄｊｅｎｔａ（登録商標））、アログリプチン、セプタグリプチン、アナグリプチン、ゲミグリプチン、テネリグリプチン、カルメグリプチン、ゴソグリプチン、デュトグリプチン、ベルベリン、およびルペオールから選択される。
【００２３】
一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、ヒトペルオキシゾーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）ガンマアゴニストである。更なる例において、ＰＰＡＲガンマアゴニストは、チアゾリジンジオンおよびグリタゾン、例えば、ロシグリタゾン、トログリタゾン、ピオグリタゾン、エングリタゾン、バラグリタゾン、リボグリタゾン、シグリタゾン、ロベグリタゾン、およびネトグリタゾンから選択される。
【００２４】
一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、ビグアナイドである。更なる例において、ビグアナイドは、メトホルミン、ブホルミン、およびフェンホルミンから選択される。
【００２５】
一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、胆汁酸吸着剤である。更なる例において、胆汁酸吸着剤は、陰イオン交換樹脂、四級アミン（例えば、コレスチラミンまたはコレスチポール）、および回腸胆汁酸トランスポータ阻害剤から選択される。
【００２６】
一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、グルコースの代謝（例えば、グルコースのリン酸化）を促進する剤である。一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、グルコキナーゼ活性剤である。更なる例において、グルコキナーゼ活性剤は、国際公開第２０００／０５８２９３号パンフレットに記載される化合物である。
【００２７】
一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、グルコースの腎臓再吸収を阻止する剤である。一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、ＳＧＬＴ−２阻害剤である。更なる例において、ＳＧＬＴ−２阻害剤は、カナグリフロジン、ダパグリフロジン、エンパグリフロジン、レモグリフロジン、セルグリフロジン、トホグリフロジン、イプラグリフロジン、およびエルツグリフロジンから選択される。
【００２８】
一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、腸におけるグルコース吸収を低下させる剤である。一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤である。更なる例において、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤は、ミグリトール（Ｇｌｙｓｅｔ（登録商標））、アカルボース（Ｐｒｅｃｏｓｅ（登録商標））、およびボグリボースから選択される。
【００２９】
一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、胃内容物排出を減速させ、かつ／またはグルカゴンを抑制する剤である。一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、アミリンまたはアミリン類似体である。更なる例において、アミリン類似体は、プラムリンチドである。
【００３０】
一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤である。更なる例において、ＭＴＰ阻害剤は、ミダグリゾール、イサグリドール、デリグリドール、イダゾキサン、エファロキサン、およびフルパロキサンから選択される。
【００３１】
一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、ブロモクリプチン、ベンフルオレクス、およびトルレスタットから選択される。
【００３２】
一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、グルココルチコイドの濃度を引き下げる剤である。一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、１１ベータ−ＨＳＤ１阻害剤である。更なる例において、１１ベータ−ＨＳＤ１阻害剤は、グリチルリジン酸、グリチルレチン酸（エノキソロン）、カルベノキソロン、アビエチン酸、フラボノイドナリンゲニン、アントラキノンエモジン、アダマンチル［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］アゼピン、ＢＶＴ−２７３３、ＢＶＴ−１１６４２９、ＢＶＴ−３４９８／ＡＭＧ−３１１、ＡＭＧ−２２１、ＰＦ−９１５２７５、ＨＳＤ−０１６、ＩＮＣＢ−１３７３９、ＩＮＣＢ−２０８１７、ＭＫ０９１６、ＭＫ０７３６、ＡＺＤ−４０１７、ＡＺＤ−８３２９、ＲＧ−４９２９、ＲＧ−７２３４、ＢＭＳ−８１６３３６、およびＪＴＴ−６５４、
【化２】
2018510900.tif 000003
【化３】
2018510900.tif 000004
ならびに以下の表から選択される化合物から選択される。
【化４】
2018510900.tif 000005
【化５】
2018510900.tif 000006
【化６】
2018510900.tif 000007
【００３３】
一例において、医薬組成物の第１の化合物は、式Ｉの化合物：
【化７】
2018510900.tif 000008
またはその薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体であり、式中：
Ｒ１は、水素または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ２は、水素またはα−ヒドロキシルであり；
Ｒ４は、ヒドロキシルまたは水素であり；
Ｒ７は、ヒドロキシルまたは水素である。
【００３４】
一例において、Ｒ１は、非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。更なる例において、Ｒ１は非置換Ｃ１〜Ｃ３アルキルである。更なる例において、Ｒ１は、メチル、エチル、またはプロピルである。更なる例において、Ｒ１はエチルである。
【００３５】
一例において、Ｒ２は水素である。別の例において、Ｒ２はα−ヒドロキシルである。
【００３６】
一例において、Ｒ４はヒドロキシルであり、Ｒ７は水素である。別の例において、Ｒ４は水素であり、Ｒ７はヒドロキシルである。
【００３７】
更なる例において、Ｒ１は、メチル、エチル、およびプロピルから選択され、Ｒ４はヒドロキシルであり、Ｒ７は水素であり、Ｒ２は水素である。更なる例において、Ｒ１はエチルである。
【００３８】
更なる例において、Ｒ１は、メチル、エチル、およびプロピルから選択され、Ｒ４は水素であり、Ｒ７はヒドロキシルであり、Ｒ２は水素である。更なる例において、Ｒ１はエチルである。
【００３９】
更なる例において、Ｒ１は、メチル、エチル、およびプロピルから選択され、Ｒ４はヒドロキシルであり、Ｒ７は水素であり、Ｒ２はα−ヒドロキシルである。更なる例において、Ｒ１はエチルである。
【００４０】
更なる例において、Ｒ１は、メチル、エチル、およびプロピルから選択され、Ｒ４は水素であり、Ｒ７はヒドロキシルであり、Ｒ２はα−ヒドロキシルである。更なる例において、Ｒ１はエチルである。
【００４１】
一例において、アミノ酸抱合体はグリシン抱合体である。一例において、アミノ酸抱合体はタウリン抱合体である。
【００４２】
更なる例において、化合物は、
【化８】
2018510900.tif 000009
またはその薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体である。
【００４３】
本出願が解決しようとする課題の１つが、血中グルコース濃度の上昇に関係する症状、例えばＦＸＲ介在性疾患（例えば、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨ）、高血糖、および糖尿病の処置または予防のための、血中グルコースレベルの引下げのための、インスリン分泌の引上げのための、そしてインスリン感受性の引上げのための併用療法の同定である。例えば、本出願は、血中グルコースレベルを引き下げ、かつ／またはインスリン分泌および／もしくはインスリン感受性を高めることによる、ＦＸＲ介在性疾患（例えば、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨ）の処置または予防のための併用療法を同定する。一実施形態において、疾患または症状は、ＦＸＲ活性化によって処置される。グルコースレベルの上昇に関係する症状用の薬物が入手可能であるが、当該薬物は多くの場合、種々の理由のために、多くの患者に適していない。例えば、多くの薬物に、副作用、例えば吐き気、嘔吐、下痢、めまい、頭痛、および脱力感がある。一部の薬物は、単独で投与される場合、処置が不十分な場合がある。例えば、一部の状況では、一インスリン分泌刺激剤は単独で、多くの患者（例えば、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨの患者）に存在する重篤なレベルの高血糖を制御するのに、不十分である。不活性である、または効力があまりない代謝物質になる高代謝に起因して、一部の薬物は、高用量の投与、またはより頻度が高い投与を必要とする場合がある。リラグルチドが挙げられる治療剤のいくつかのクラスが、注射を介して投与される。第２の治療剤を経口的に共投与する利点は、結果として注射の回数および／または頻度の低減を導き得る。回数および／または頻度を減らすことによって、治療投薬レジメンは、患者の、とりわけ注射に慣れていない可能性があるＮＡＳＨ患者の、より高い遵守を可能にし得る。本明細書中に記載される併用療法は、先で述べられた課題を解決することができ、例えば、相乗作用、薬物の有効性を失うことのない１日の投薬回数の低減、患者における血中グルコースの引下げ、効力、選択性、組織浸透力、半減期、および／または代謝安定性の向上の１つまたは複数の利点を有し得る。
【００４４】
本出願の組成物、パック、またはキット、方法および使用において、第１の化合物は、遊離酸であってもよいし、薬学的に許容可能な塩またはアミノ酸抱合体（例えば、グリシンまたはタウリン抱合体）であってもよい。一例において、第１の化合物は、あらゆるＦＸＲアゴニストである。一態様において、第１の化合物は、式Ｉの化合物である。一態様において、第１の化合物は、オベチコール酸（化合物１）である。一例において、第１の化合物は、式Ｉの化合物の遊離酸である。一例において、第１の化合物は、式Ｉの化合物のグリシン抱合体である。一例において、第１の化合物は、式Ｉの化合物のタウリン抱合体である。
【００４５】
本出願の組成物、パックまたはキット、方法、および使用において、少なくとも１つの更なる治療剤は、本明細書中に記載されるあらゆる剤であってよい。一例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、インスリン分泌を増大させる剤である。別の例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、インスリンに対する標的細胞、組織、または器官の感受性を高める剤である。別の例において、少なくとも１つの更なる治療剤は、血中グルコースレベルを引き下げる剤である。
【００４６】
本出願の化合物はまた、本出願の第１の化合物（例えば式Ｉの化合物）と同一の構造を有するが、１つまたは複数の原子が、自然界で最も一般的に見出される原子量または質量数と異なる原子量または質量数を有する原子によって置換されるという事実について、同位体で標識された第１の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体を包含する。第１の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体中に組み込まれ得る同位体の例として、水素、炭素、窒素、フッ素の同位体、例えば３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、および１８Ｆが挙げられる。
【００４７】
上述の同位体および／または他の原子の他の同位体を含有する第１の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体は、本明細書の範囲内である。第１の同位体標識化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体、例えば、３Ｈおよび／または１４Ｃ等の放射性同位体が組み込まれている第１の化合物が、薬物および／または基質の組織内分配アッセイに有用である。トリチウム同位体、すなわち３Ｈ、および炭素１４、すなわち１４Ｃ同位体が、調製の簡略化および検出能のために用いられる。さらに、重水素、すなわち２Ｈ等のより重い同位体との置換が、より大きな代謝安定性、例えばインビボ半減期の延長または必要投薬量の引下げに由来する特定の治療学的利点を与えることができるので、一部の状況において用いられ得る。第１の同位体標識化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体は一般に、本明細書のスキームおよび／または実施例に開示される手順を実行することにより、容易に入手可能な同位体標識試薬を非同位体標識試薬の代わりに用いることによって、調製され得る。一例において、オベチコール酸、またはその薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体は、同位体標識されない。
【００４８】
本出願はまた、疾患または症状を処置または予防する方法であって、本出願の医薬組成物の治療的に有効な量を、そうすることが必要な対象に投与することを含む方法を提供する。
【００４９】
一例において、疾患または症状は、ＦＸＲ介在性の疾患または症状である。ＦＸＲ介在性の疾患または症状の例として、限定されないが、肝疾患、例えば胆汁鬱滞性の、または非胆汁鬱滞性の疾患または症状が挙げられる。一実施形態において、ＦＸＲ介在性の疾患または症状は、ＦＸＲ活性化に関係がある。胆汁鬱滞性肝疾患として、限定されないが、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、門脈圧亢進、胆道閉鎖、胆汁酸性下痢、進行性線維症に起因する肝障害、肝線維症、および慢性肝疾患が挙げられる。非胆汁鬱滞性の肝疾患または肝症状として、限定されないが、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、Ｃ型肝炎感染症、アルコール性肝障害、進行性線維症に起因する肝障害、肝臓癌、消化管癌、および胆道癌、例えば肝細胞癌、胆管癌、結腸直腸癌、胃癌、および腎臓癌、肝線維症、メトトレキサート、イソニアジド、オキシフェニスタチン、メチルドパ、クロルプロマジン、トルブタミド、またはアミオダロンによって誘導される肝疾患；自己免疫肝炎；サルコイドーシス、ウィルソン病、血色素沈着症、ゴーシェ病、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩ、ＩＸ、およびＸ型グリコーゲン蓄積疾患、α１−アンチトリプシン欠損症、ツェルヴェーガー症候群；チロシン血症、フルクトース血症、ガラクトース血症、バッド−キアリ症候群、静脈閉塞性疾患、または門脈血栓症を伴う血管障害；ならびに先天性肝線維症が挙げられる。また、ＦＸＲ活性化によって処置可能な疾患または症状の例として、高血糖、糖尿病、肥満症、インスリン抵抗性、高脂血症、高ＬＤＬコレステロール、高ＨＤＬコレステロール、高トリグリセリド、および心血管疾患も挙げられる。
【００５０】
ＮＡＦＬＤは、肝臓における脂肪の蓄積（脂肪浸潤と呼ばれる）によって特徴付けられる医学的症状である。ＮＡＦＬＤは、慢性肝疾患の最も一般的な原因の１つであり、肝細胞における脂質堆積を伴う症状の全形態を包含する。これは、脂肪変性（単純な脂肪肝）から非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）に、そして進行性の線維症および肝硬変にまで及ぶ。疾患は、ほとんどの場合静かであり、多くの場合、付随的に上昇する肝酵素レベルにより発見される。ＮＡＦＬＤは、肥満症およびインスリン抵抗性と強く関連し、現在、多くの人々によって、メタボリックシンドロームの肝臓成分とみなされている。
【００５１】
非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）は、肝臓における脂肪および線維性（瘢痕）組織の炎症および蓄積を引き起こす症状である。血中の肝酵素レベルは、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）で見られる穏やかな上昇よりも高められ得る。類似した症状が、アルコールを乱用する人々において見られ得るが、ＮＡＳＨは、アルコールをほとんど飲まない人々において見られる。ＮＡＳＨは、アメリカ人の２〜５パーセントに発症し、以下の状態の１つまたは複数が見られる人々において、最も頻繁に認められる：肥満症、糖尿病、高脂血症、インスリン抵抗性、特定の医薬品の使用、および毒素への曝露。ＮＡＳＨは増々、慢性肝疾患の世界的に共通の病因となっており、肝硬変が不在の場合でさえ、肝臓関連死亡率および肝臓癌の増大を伴う。ＮＡＳＨは、冒されている個体の１５〜２０％において肝硬変に進行し、今では、米国において、肝臓移植のための優れた指標の１つである。現在、ＮＡＳＨの承認された療法はない。
【００５２】
本出願はまた、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨを処置または予防する方法を提供する。一例において、本出願は、血中グルコースレベルの上昇、インスリン分泌の低下、および／またはインスリン感受性の低下を伴うＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨを処置または予防する方法を提供する。一例において、本出願は、少なくとも部分的に、血中グルコースレベルの引下げ、ならびに／またはインスリン分泌および／もしくはインスリン感受性の引上げにより、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨを処置または予防する方法を提供する。一例において、本出願は、ＮＡＳＨを処置または予防する方法を提供する。一例において、本出願は、血中グルコースレベルの上昇、インスリン分泌の低下、および／またはインスリン感受性の低下を伴うＮＡＳＨを処置または予防する方法を提供する。一例において、本出願は、少なくとも部分的に、血中グルコースレベルの引下げ、ならびに／またはインスリン分泌および／もしくはインスリン感受性の引上げにより、ＮＡＳＨを処置または予防する方法を提供する。
【００５３】
一例において、疾患または症状は、血中グルコースレベルの上昇、インスリン分泌の低下、および／またはインスリン感受性の低下に関係している。疾患または症状の例として、限定されないが、ＦＸＲ介在性疾患（例えば、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨ）、高血糖、糖尿病、肥満症、およびインスリン抵抗性が挙げられる。
【００５４】
一例において、疾患または症状は、ＦＸＲ介在性疾患である。一例において、疾患または症状は、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨである。一例において、疾患または症状は、ＮＡＳＨである。
【００５５】
一例において、疾患または症状は、高血糖、糖尿病、肥満症、またはインスリン抵抗性である。一例において、疾患または症状は、高血糖である。一例において、疾患または症状は、糖尿病である。更なる例において、糖尿病はＩ型糖尿病である。別の更なる例において、糖尿病はＩＩ型糖尿病である。一例において、疾患または症状は、肥満症である。一例において、疾患または症状は、インスリン抵抗性である。
【００５６】
本出願はまた、高血糖、糖尿病、肥満症、またはインスリン抵抗性を処置または予防する方法であって、本出願の医薬組成物の治療的に有効な量を、そうすることが必要な対象に投与することを含む方法を提供する。一例において、対象は、胆汁鬱滞性症状に苦しんでいない。別の例において、対象は、胆汁鬱滞性症状に苦しんでいる。一例において、対象は、肝疾患に苦しんでいない。別の例において、対象は、肝疾患に苦しんでいる。更なる例において、肝疾患は、胆汁鬱滞性肝疾患、例えばＰＢＣ、ＰＳＣ、門脈圧亢進、胆汁酸性下痢、進行性線維症に起因する肝障害、肝線維症、および慢性肝疾患から選択される。更なる例において、対象は、ＰＢＣ、ＮＡＦＬＤ、またはＮＡＳＨに苦しんでいる。更なる例において、対象は、線維症に苦しんでいる。別の更なる例において、対象は、非胆汁鬱滞性肝疾患または症状、例えば非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、Ｃ型肝炎感染症、アルコール性肝障害、進行性線維症に起因する肝障害、肝臓癌、消化管癌、および胆道癌、例えば肝細胞癌、胆管癌、結腸直腸癌、胃癌、および腎臓癌、肝線維症、メトトレキサート、イソニアジド、オキシフェニスタチン、メチルドパ、クロルプロマジン、トルブタミド、またはアミオダロンによって誘導される肝疾患；自己免疫肝炎；サルコイドーシス、ウィルソン病、血色素沈着症、ゴーシェ病、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩ、ＩＸ、およびＸ型グリコーゲン蓄積疾患、α１−アンチトリプシン欠損症、ツェルヴェーガー症候群；チロシン血症、フルクトース血症、ガラクトース血症、バッド−キアリ症候群、静脈閉塞性疾患、または門脈血栓症を伴う血管障害；ならびに先天性肝線維症に苦しんでいる。
【００５７】
本出願はまた、血中グルコースレベルを引き下げ、インスリン分泌を刺激し、かつ／またはインスリン感受性を高める方法であって、本出願の医薬組成物の治療的に有効な量を、そうすることが必要な対象に投与することを含む方法を提供する。一例において、対象は、胆汁鬱滞性症状に苦しんでいない。別の例において、対象は、胆汁鬱滞性症状に苦しんでいる。一例において、対象は、肝疾患に苦しんでいない。別の例において、対象は、肝疾患に苦しんでいる。更なる例において、肝疾患は、胆汁鬱滞性肝疾患、例えばＰＢＣ、ＰＳＣ、門脈圧亢進、胆汁酸性下痢、慢性肝疾患、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、Ｃ型肝炎感染症、アルコール性肝障害、進行性線維症に起因する肝障害、肝臓線維症、および慢性肝疾患から選択される。更なる例において、対象は、ＰＢＣ、ＮＡＦＬＤ、またはＮＡＳＨに苦しんでいる。別の更なる例において、対象は、線維症に苦しんでいる。別の例において、対象は、非胆汁鬱滞性の肝疾患または肝症状、例えば非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、Ｃ型肝炎感染症、アルコール性肝障害、進行性線維症に起因する肝障害、肝臓癌、消化管癌、および胆道癌、例えば肝細胞癌、胆管癌、結腸直腸癌、胃癌、および腎臓癌、肝線維症、メトトレキサート、イソニアジド、オキシフェニスタチン、メチルドパ、クロルプロマジン、トルブタミド、またはアミオダロンによって誘導される肝疾患；自己免疫肝炎；サルコイドーシス、ウィルソン病、血色素沈着症、ゴーシェ病、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩ、ＩＸ、およびＸ型グリコーゲン蓄積疾患、α１−アンチトリプシン欠損症、ツェルヴェーガー症候群；チロシン血症、フルクトース血症、ガラクトース血症、バッド−キアリ症候群、静脈閉塞性疾患、または門脈血栓症を伴う血管障害；ならびに先天性肝線維症に苦しんでいる。
【００５８】
本出願はまた、線維症を阻害し、または回復に向かわせる方法であって、本出願の医薬組成物の治療的に有効な量を、そうすることが必要な対象に投与することを含む方法を提供する。一例において、対象は、胆汁鬱滞性症状に苦しんでいない。別の例において、対象は、胆汁鬱滞性症状に苦しんでいる。
【００５９】
一例において、本出願の医薬組成物の治療的に有効な量が投与される対象は、原発性の肝癌および胆道癌、例えば肝細胞癌、結腸直腸癌、および胆管癌、転移性癌、敗血症、完全非経口的栄養、嚢胞性線維症、ならびに肉芽腫肝疾患からなる群から選択される疾患または症状を伴う胆汁鬱滞性症状に苦しんでいない。一例において、阻害されることになる、または回復に向かわせられることになる線維症は、ＦＸＲが発現される器官において見られる。
【００６０】
一例において、胆汁鬱滞性症状は、アルカリホスファターゼ、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、および／または５’ヌクレオチダーゼの血清レベルが異常に高い症状と定義される。別の例において、胆汁鬱滞性症状はさらに、少なくとも１つの臨床的症候を呈する症状と定義される。一例において、症候はむず痒さ（痒み）である。別の例において、胆汁鬱滞性症状は、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＢＳ）、薬物性胆汁鬱滞、遺伝性胆汁鬱滞、および妊娠性肝内性胆汁鬱滞からなる群から選択される。
【００６１】
一例において、線維症は、肝線維症、腎線維症、および腸内線維症からなる群から選択される。
【００６２】
一例において、本出願の医薬組成物の治療的に有効な量が投与される対象は、Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；寄生虫性肝疾患；移植後の細菌感染症、ウィルス感染症、および真菌感染症；アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）；非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）；非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）；メトトレキサート、イソニアジド、オキシフェニスタチン、メチルドパ、クロルプロマジン、トルブタミド、またはアミオダロンによって誘導される肝疾患；自己免疫性肝炎；サルコイドーシス；ウィルソン病；血色素沈着症；ゴーシェ病；ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩ、ＩＸ、およびＸ型グリコーゲン蓄積疾患；α１−アンチトリプシン欠乏症；ゼルウィガー症候群；チロシン血症；フルクトース血症；ガラクトース血症；バッド−キアリ症候群、静脈閉鎖性疾患、または門脈血栓症を伴う血管障害；ならびに先天性肝臓線維症からなる群から選択される疾患を伴う肝臓線維症を患う。
【００６３】
別の例において、対象は、クローン病、潰瘍性大腸炎、照射後大腸炎（ｐｏｓｔ−ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、および顕微鏡的大腸炎（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｃｏｌｉｔｉｓ）からなる群から選択される疾患を伴う腸内線維症を患う。
【００６４】
別の例において、対象は、糖尿病性腎症、高血圧性腎硬化症、慢性糸球体腎炎、慢性移植片糸球体症、慢性間隙腎炎、および多発性嚢胞腎からなる群から選択される疾患を伴う腎線維症を患う。
【００６５】
別の例において、本出願の医薬組成物の治療的に有効な量が投与される対象は、クローン病、潰瘍性大腸炎、照射後大腸炎、および顕微鏡的大腸炎からなる群から選択される疾患を伴う腸内線維症を患う。
【００６６】
別の例において、本出願の医薬組成物の治療的に有効な量が投与される対象は、糖尿病性腎症、高血圧性腎硬化症、慢性糸球体腎炎、慢性移植片糸球体症、慢性間隙腎炎、および多発性嚢胞腎からなる群から選択される疾患を伴う腎線維症を患う。
【００６７】
本出願はまた、血清ビリルビン、および／または１つもしくは複数の肝酵素の量を引き下げる方法であって、本出願の医薬組成物の治療的に有効な量を、そうすることが必要な対象に投与することを含む方法を提供する。
【００６８】
一例において、本出願の方法は、コントロール対象（例えば、本明細書の組成物が投与されていない対象）と比較して、血清ビリルビンの量を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％引き下げる。一例において、対象は、健康な対象（例えば、本明細書中に記載されるような疾患または症状のない個体）と比較して、ビリルビンのレベルが高い。一例において、本出願の方法は、ビリルビンのレベルを正常なレベル（例えば、本明細書中に記載されるような疾患または症状のない個体におけるビリルビンのレベルに類似）に引き下げる。更なる例において、本出願の方法は、ビリルビンのレベルを、１０ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、１．２ｍｇ／Ｌ、または１ｍｇ／Ｌ未満に引き下げる。更なる例において、本出願の方法は、ビリルビンのレベルを、２ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、１．２ｍｇ／Ｌ、または１ｍｇ／Ｌ未満に引き下げる。
【００６９】
一例において、肝臓酵素は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ、ＡＰ、またはＡｌｋ  Ｐｈｏｓ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ガンマ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、および５’ヌクレオチダーゼからなる群から選択される。一例において、本出願の方法は、１つまたは複数の肝臓酵素の量を、コントロール対象（例えば、本明細書の組成物が投与されていない対象）と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％引き下げる。一例において、対象は、１つまたは複数の肝臓酵素のレベルを、健康な対象（例えば、本明細書中で記載されるような疾患または症状のない個体）と比較して、高めた。一例において、本出願の方法は、１つまたは複数の肝臓酵素（例えば、ＡＬＰ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＧＴ、ＬＤＨ、および５’ヌクレオチダーゼ）のレベルを、正常なレベル（例えば、本明細書中で記載されるような疾患または症状のない個体における肝臓酵素のレベルに類似）に引き下げる。
【００７０】
更なる例において、本出願の方法は、ＡＬＰの血清レベルを、５００ＩＵ／Ｌ（リットルあたりの国際単位）、４００ＩＵ／Ｌ、３００ＩＵ／Ｌ、２００ＩＵ／Ｌ、１８０ＩＵ／Ｌ、１６０ＩＵ／Ｌ、または１５０ＩＵ／Ｌ未満に引き下げる。更なる例において、本出願の方法は、ＡＬＰのレベルを、約４０ＩＵ／Ｌから約１５０ＩＵ／Ｌにまで引き下げる。
【００７１】
更なる例において、本出願の方法は、ＡＬＴのレベルを、２００ＩＵ／Ｌ（リットルあたりの国際単位）、１５０ＩＵ／Ｌ、１００ＩＵ／Ｌ、８０ＩＵ／Ｌ、６０ＩＵ／Ｌ、または５０ＩＵ／Ｌ未満に引き下げる。更なる例において、本出願の方法は、ＡＬＴのレベルを、約５ＩＵ／Ｌから約５０ＩＵ／Ｌにまで引き下げる。
【００７２】
更なる例において、本出願の方法は、ＡＳＴのレベルを、２００ＩＵ／Ｌ（リットルあたりの国際単位）、１５０ＩＵ／Ｌ、１００ＩＵ／Ｌ、８０ＩＵ／Ｌ、６０ＩＵ／Ｌ、５０ＩＵ／Ｌ、または４０ＩＵ／Ｌ未満に引き下げる。更なる例において、本出願の方法は、ＡＳＴのレベルを、約１０ＩＵ／Ｌから約５０ＩＵ／Ｌにまで引き下げる。
【００７３】
更なる例において、本出願の方法は、ＧＧＴのレベルを、２００ＩＵ／Ｌ（リットルあたりの国際単位）、１５０ＩＵ／Ｌ、１００ＩＵ／Ｌ、９０ＩＵ／Ｌ、８０ＩＵ／Ｌ、７０ＩＵ／Ｌ、または６０ＩＵ／Ｌ未満に引き下げる。更なる例において、本出願の方法は、ＧＧＴのレベルを、約１５ＩＵ／Ｌから約５０ＩＵ／Ｌ、または約５ＩＵ／Ｌから約３０ＩＵ／Ｌにまで引き下げる。
【００７４】
更なる例において、本出願の方法は、ＬＤＨのレベルを、５００ＩＵ／Ｌ（リットルあたりの国際単位）、４００ＩＵ／Ｌ、３００ＩＵ／Ｌ、２００ＩＵ／Ｌ、１８０ＩＵ／Ｌ、１６０ＩＵ／Ｌ、１５０ＩＵ／Ｌ、１４０ＩＵ／Ｌ、または１３０ＩＵ／Ｌ未満に引き下げる。更なる例において、本出願の方法は、ＬＤＨのレベルを、約１２０ＩＵ／Ｌから約２２０ＩＵ／Ｌにまで引き下げる。
【００７５】
更なる例において、本出願の方法は、５’ヌクレオチダーゼのレベルを、５０ＩＵ／Ｌ（リットルあたりの国際単位）、４０ＩＵ／Ｌ、３０ＩＵ／Ｌ、２０ＩＵ／Ｌ、１８ＩＵ／Ｌ、１７ＩＵ／Ｌ、１６ＩＵ／Ｌ、１５ＩＵ／Ｌ、１４ＩＵ／Ｌ、１３ＩＵ／Ｌ、１２ＩＵ／Ｌ、１１ＩＵ／Ｌ、１０ＩＵ／Ｌ、９ＩＵ／Ｌ、８ＩＵ／Ｌ、７ＩＵ／Ｌ、６ＩＵ／Ｌ、または５ＩＵ／Ｌ未満に引き下げる。更なる例において、本出願の方法は、５’ヌクレオチダーゼのレベルを、約２ＩＵ／Ｌから約１５ＩＵ／Ｌにまで引き下げる。
【００７６】
本出願はまた、例えば血中の、グルコースレベル（すなわち、グルコースの量）を引き下げる方法であって、本出願の医薬組成物の治療的に有効な量を、そうすることが必要な対象に投与することを含む方法を提供する。一例において、当該方法は、コントロール対象（例えば、本出願の組成物が投与されていない対象）と比較して、食後のグルコースレベルを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％引き下げる。一例において、対象は、健康な対象（例えば、本明細書中に記載されるような疾患または症状のない個体）と比較して、食後のグルコースレベルが高い。一例において、本出願の方法は、食後のグルコースレベルを、正常なレベル（例えば、本明細書中に記載されるような疾患または症状のない個体におけるグルコースレベルに類似）に引き下げる。一例において、当該方法は、コントロール対象（例えば、本出願の組成物が投与されていない対象）と比較して、空腹時グルコースレベルを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％引き下げる。一例において、対象は、健康な対象（例えば、本明細書中に記載されるような疾患または症状のない個体）と比較して、空腹時グルコースレベルが高い。一例において、本出願の方法は、空腹時グルコースレベルを、正常なレベル（例えば、本明細書中に記載されるような疾患または症状のない個体におけるグルコースレベルに類似）に引き下げる。
【００７７】
一例において、対象は、健康な対象（例えば、本明細書中に記載されるような疾患または症状のない個体）と比較して、グルコースレベルが高い。一例において、本出願の方法は、食後のグルコースレベルを、８００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、３５０ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ、２４０ｍｇ／Ｌ、２３０ｍｇ／Ｌ、２２０ｍｇ／Ｌ、２１０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、１９０ｍｇ／Ｌ、１８０ｍｇ／Ｌ、１７０ｍｇ／Ｌ、１６０ｍｇ／Ｌ、または１５０ｍｇ／Ｌ未満に引き下げる。一例において、本出願の方法は、食後のグルコースレベルを、２００ｍｇ／Ｌ、１９０ｍｇ／Ｌ、１８０ｍｇ／Ｌ、１７０ｍｇ／Ｌ、１６０ｍｇ／Ｌ、または１５０ｍｇ／Ｌ未満に引き下げる。一例において、本出願の方法は、空腹時のグルコースレベルを、７０〜８００ｍｇ／Ｌ、７０〜７００ｍｇ／Ｌ、７０〜６００ｍｇ／Ｌ、７０〜５００ｍｇ／Ｌ、７０〜４００ｍｇ／Ｌ、７０〜３５０ｍｇ／Ｌ、７０〜３００ｍｇ／Ｌ、７０〜２５０ｍｇ／Ｌ、７０〜２４０ｍｇ／Ｌ、７０〜２３０ｍｇ／Ｌ、７０〜２２０ｍｇ／Ｌ、７０〜２１０ｍｇ／Ｌ、７０〜２００ｍｇ／Ｌ、７０〜１９０ｍｇ／Ｌ、７０〜１８０ｍｇ／Ｌ、７０〜１７０ｍｇ／Ｌ、７０〜１６０ｍｇ／Ｌ、７０〜１５０ｍｇ／Ｌ、７０〜１４０ｍｇ／Ｌ、７０〜１３０ｍｇ／Ｌ、７０〜１２０ｍｇ／Ｌ、７０〜１１０ｍｇ／Ｌ、７０〜１００ｍｇ／Ｌ、９０〜１３０ｍｇ／Ｌ、９０〜１２０ｍｇ／Ｌ、９０〜１１０ｍｇ／Ｌ、または９０〜１００ｍｇ／Ｌに引き下げる。一例において、本出願の方法は、食後のグルコースレベルを、７０〜２００ｍｇ／Ｌ、７０〜１９０ｍｇ／Ｌ、７０〜１８０ｍｇ／Ｌ、７０〜１７０ｍｇ／Ｌ、７０〜１６０ｍｇ／Ｌ、７０〜１５０ｍｇ／Ｌ、７０〜１４０ｍｇ／Ｌ、７０〜１３０ｍｇ／Ｌ、７０〜１２０ｍｇ／Ｌ、７０〜１１０ｍｇ／Ｌ、７０〜１００ｍｇ／Ｌ、９０〜１３０ｍｇ／Ｌ、９０〜１２０ｍｇ／Ｌ、９０〜１１０ｍｇ／Ｌ、または９０〜１００ｍｇ／Ｌに引き下げる。
【００７８】
本出願はまた、例えば血中の、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）レベル（すなわちＨｂＡ１ｃの量）を引き下げる方法であって、本出願の医薬組成物の治療的に有効な量を、そうすることが必要な対象に投与することを含む方法を提供する。一例において、当該方法は、コントロール対象（例えば、本出願の組成物が投与されていない対象）と比較して、ＨｂＡ１ｃレベルを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％引き下げる。一例において、対象は、健康な対象（例えば、本明細書中に記載されるような疾患または症状のない個体）と比較して、ＨｂＡ１ｃレベルが高い。一例において、本出願の方法は、ＨｂＡ１ｃレベルを、正常なレベル（例えば、本明細書中に記載されるような疾患または症状のない個体におけるＨｂＡ１ｃレベルに類似）に引き下げる。
【００７９】
一例において、対象は、健康な対象（例えば、本明細書中に記載されるような疾患または症状のない個体）と比較して、ＨｂＡ１ｃのレベルが高い。一例において、本出願の方法は、ＨｂＡ１ｃレベルを、１０％、９．５％、９．０％、８．５％、８．０％、７．５％、７．０％、６．５％、６．４％、６．３％、６．２％、６．１％、６．０％、５．９％、５．８％、または５．７％未満引き下げる。一例において、本出願の方法は、ＨｂＡ１ｃレベルを、８．０％、７．９％、７．８％、７．７％、７．６％、７．５％、７．４％、７．３％、７．２％、７．１％、７．０％、６．９％、６．８％、６．７％、６．６％、６．５％、６．４％、６．３％、６．２％、６．１％、６．０％、５．９％、５．８％、または５．７％未満引き下げる。一例において、本出願の方法は、ＨｂＡ１ｃレベルを、６．５％、６．４％、６．３％、６．２％、６．１％、６．０％、５．９％、５．８％、または５．７％未満引き下げる。
【００８０】
本出願はまた、インスリン分泌（すなわちインスリンの量）を増大させる方法であって、本出願の医薬組成物の治療的に有効な量を、そうすることが必要な対象に投与することを含む方法を提供する。一例において、本出願の方法は、コントロール対象（例えば、本出願の組成物が投与されていない対象）と比較して、インスリンの分泌を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％増大させる。一例において、対象は、健康な対象（例えば、本明細書中に記載されるような疾患または症状のない個体）と比較して、インスリンの分泌が少ない。一例において、本出願の方法は、インスリンレベルが２〜９．０ｍＩＵ／ｍｌ、２〜８．９ｍＩＵ／ｍＬ、２〜８．８ｍＩＵ／ｍＬ、２〜８．７ｍＩＵ／ｍＬ、２〜８．６ｍＩＵ／ｍＬ、２〜８．５ｍＩＵ／ｍＬ、２〜８．４ｍＩＵ／ｍＬ、２〜８．３ｍＩＵ／ｍＬ、２〜８．２ｍＩＵ／ｍＬ、２〜８．１ｍＩＵ／ｍＬ、２〜８．０ｍＩＵ／ｍＬ、２〜７．９ｍＩＵ／ｍＬ、２〜７．８ｍＩＵ／ｍＬ、２〜７．７ｍＩＵ／ｍＬ、２〜７．６ｍＩＵ／ｍＬ、２〜７．５ｍＩＵ／ｍＬ、２〜７．４ｍＩＵ／ｍＬ、２〜７．３ｍＩＵ／ｍＬ、２〜７．２ｍＩＵ／ｍＬ、２〜７．１ｍＩＵ／ｍＬ、２〜７．０ｍＩＵ／ｍＬ、２〜６．９ｍＩＵ／ｍＬ、２〜６．８ｍＩＵ／ｍＬ、２〜６．７ｍＩＵ／ｍＬ、２〜６．６ｍＩＵ／ｍＬ、２〜６．５ｍＩＵ／ｍＬ、２〜６．４ｍＩＵ／ｍＬ、２〜６．３ｍＩＵ／ｍＬ、２〜６．２ｍＩＵ／ｍＬ、２〜６．１ｍＩＵ／ｍＬ、２〜６．０ｍＩＵ／ｍＬ、３〜９．０ｍＩＵ／ｍＬ、３〜８．９ｍＩＵ／ｍＬ、３〜８．８ｍＩＵ／ｍＬ、３〜８．７ｍＩＵ／ｍＬ、３〜８．６ｍＩＵ／ｍＬ、３〜８．５ｍＩＵ／ｍＬ、３〜８．４ｍＩＵ／ｍＬ、３〜８．３ｍＩＵ／ｍＬ、３〜８．２ｍＩＵ／ｍＬ、３〜８．１ｍＩＵ／ｍＬ、３〜８．０ｍＩＵ／ｍＬ、３〜７．９ｍＩＵ／ｍＬ、３〜７．８ｍＩＵ／ｍＬ、３〜７．７ｍＩＵ／ｍＬ、３〜７．６ｍＩＵ／ｍＬ、３〜７．５ｍＩＵ／ｍＬ、３〜７．４ｍＩＵ／ｍＬ、３〜７．３ｍＩＵ／ｍＬ、３〜７．２ｍＩＵ／ｍＬ、３〜７．１ｍＩＵ／ｍＬ、３〜７．０ｍＩＵ／ｍＬ、３〜６．９ｍＩＵ／ｍＬ、３〜６．８ｍＩＵ／ｍＬ、３〜６．７ｍＩＵ／ｍＬ、３〜６．６ｍＩＵ／ｍＬ、３〜６．５ｍＩＵ／ｍＬ、３〜６．４ｍＩＵ／ｍＬ、３〜６．３ｍＩＵ／ｍＬ、３〜６．２ｍＩＵ／ｍＬ、３〜６．１ｍＩＵ／ｍＬ、３〜６．０ｍＩＵ／ｍＬ、４〜９．０ｍＩＵ／ｍＬ、４〜８．９ｍＩＵ／ｍＬ、４〜８．８ｍＩＵ／ｍＬ、４〜８．７ｍＩＵ／ｍＬ、４〜８．６ｍＩＵ／ｍＬ、４〜８．５ｍＩＵ／ｍＬ、４〜８．４ｍＩＵ／ｍＬ、４〜８．３ｍＩＵ／ｍＬ、４〜８．２ｍＩＵ／ｍＬ、４〜８．１ｍＩＵ／ｍＬ、４〜８．０ｍＩＵ／ｍＬ、４〜７．９ｍＩＵ／ｍＬ、４〜７．８ｍＩＵ／ｍＬ、４〜７．７ｍＩＵ／ｍＬ、４〜７．６ｍＩＵ／ｍＬ、４〜７．５ｍＩＵ／ｍＬ、４〜７．４ｍＩＵ／ｍＬ、４〜７．３ｍＩＵ／ｍＬ、４〜７．２ｍＩＵ／ｍＬ、４〜７．１ｍＩＵ／ｍＬ、４〜７．０ｍＩＵ／ｍＬ、４〜６．９ｍＩＵ／ｍＬ、４〜６．８ｍＩＵ／ｍＬ、４〜６．７ｍＩＵ／ｍＬ、４〜６．６ｍＩＵ／ｍＬ、４〜６．５ｍＩＵ／ｍＬ、４〜６．４ｍＩＵ／ｍＬ、４〜６．３ｍＩＵ／ｍＬ、４〜６．２ｍＩＵ／ｍＬ、４〜６．１ｍＩＵ／ｍＬ、４〜６．０ｍＩＵ／ｍＬ、５〜９．０ｍＩＵ／ｍＬ、５〜８．９ｍＩＵ／ｍＬ、５〜８．８ｍＩＵ／ｍＬ、５〜８．７ｍＩＵ／ｍＬ、５〜８．６ｍＩＵ／ｍＬ、５〜８．５ｍＩＵ／ｍＬ、５〜８．４ｍＩＵ／ｍＬ、５〜８．３ｍＩＵ／ｍＬ、５〜８．２ｍＩＵ／ｍＬ、５〜８．１ｍＩＵ／ｍＬ、５〜８．０ｍＩＵ／ｍＬ、５〜７．９ｍＩＵ／ｍＬ、５〜７．８ｍＩＵ／ｍＬ、５〜７．７ｍＩＵ／ｍＬ、５〜７．６ｍＩＵ／ｍＬ、５〜７．５ｍＩＵ／ｍＬ、５〜７．４ｍＩＵ／ｍＬ、５〜７．３ｍＩＵ／ｍＬ、５〜７．２ｍＩＵ／ｍＬ、５〜７．１ｍＩＵ／ｍＬ、５〜７．０ｍＩＵ／ｍＬ、５〜６．９ｍＩＵ／ｍＬ、５〜６．８ｍＩＵ／ｍＬ、５〜６．７ｍＩＵ／ｍＬ、５〜６．６ｍＩＵ／ｍＬ、５〜６．５ｍＩＵ／ｍＬ、５〜６．４ｍＩＵ／ｍＬ、５〜６．３ｍＩＵ／ｍＬ、５〜６．２ｍＩＵ／ｍＬ、５〜６．１ｍＩＵ／ｍＬ、または５〜６．０ｍＩＵ／ｍＬとなるように、インスリン分泌を増大させる。
【００８１】
本出願はまた、インスリン感受性を高める（すなわち、インスリン抵抗性を低下させる）方法であって、本出願の医薬組成物の治療的に有効な量を、そうすることが必要な対象に投与することを含む方法を提供する。一例において、本出願の方法は、インスリン感受性を、コントロール対象（例えば、本出願の組成物が投与されていない対象）と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高める（すなわち、インスリン抵抗性を低下させる）。一例において、対象は、健康な対象（例えば、本明細書中に記載されるような疾患または症状のない個体）と比較して、インスリン感受性が低い（すなわち、インスリン抵抗性が高い）。
【００８２】
インスリン感受性は、インスリンの作用に対して体がどれくらい感受性であるかを指す。インスリン感受性であると言われる人は、血中グルコースレベルを低くするのに、感受性が低い誰かよりも、必要とすることとなるインスリンの量が少ない。
【００８３】
インスリン抵抗性（ＩＲ）は、細胞、組織、または器官が、インスリンの正常な作用に反応しない生理学的症状である。したがって、細胞組織、または体内の器官は、インスリンに対して抵抗して、正常な細胞、組織、または器官（例えば、健康な対象の細胞、組織、または器官）と同じくらい効果的にインスリンを用いることができない。
【００８４】
一例において、対象は哺乳類である。一例において、哺乳類はヒトである。
【００８５】
一例において、第１の化合物および１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）は、相互的な（ｔｗｏ−ｗａｙ）組合せで投与される。別の例において、第１の化合物および２つ以上の更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）は、相互的な組合せで投与される。
【００８６】
第１の化合物は、少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）と共に、相乗作用、例えば、個々の治療に対して抵抗性となり得るグルコースレベル、ＨｂＡ１ｃレベル、および／またはインスリン抵抗性の相乗的引下げを達成することができる。それゆえに、第１の化合物および少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）の組合せは、有利である。第１の化合物および少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）のそのような組合せが、遵守を、そしてそれゆえに有効性を高めるように設計された、医薬の許容可能なキャリアを有する単一の医薬組成物で（例えば単一のカプセル形態で）提供されることは、特に有利であり得る。したがって、本出願はさらに、第１の化合物の有効量、および少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）の有効量を、１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、アジュバント、または賦形剤と共に含む医薬組成物を提供する。
【００８７】
一例において、第１の化合物および少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）は、同時に投与される。例えば、第１の化合物および少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）は、医薬の許容可能なキャリアと共に、単一の医薬組成物で投与される。別の例において、第１の化合物と少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中で記載される更なる治療剤）は、逐次的に投与される。例えば、第１の化合物は、少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）よりも前に、またはそれよりも後に投与される。
【００８８】
一例において、第１の化合物が、第１の期間、第１の用量にて投与されてから、第１の化合物が、第２の期間、第２の用量にて投与される。一例において、第１の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体が、第１の期間、０．１〜１５００ｍｇ、０．２〜１２００ｍｇ、０．３〜１０００ｍｇ、０．４〜８００ｍｇ、０．５〜６００ｍｇ、０．６〜５００ｍｇ、０．７〜４００ｍｇ、０．８〜３００ｍｇ、１〜２００ｍｇ、１〜１００ｍｇ、１〜５０ｍｇ、１〜３０ｍｇ、４〜２６ｍｇ、または５〜２５ｍｇの１日総量にて投与されてから、第２の化合物が、０．１〜１５００ｍｇ、０．２〜１２００ｍｇ、０．３〜１０００ｍｇ、０．４〜８００ｍｇ、０．５〜６００ｍｇ、０．６〜５００ｍｇ、０．７〜４００ｍｇ、０．８〜３００ｍｇ、１〜２００ｍｇ、１〜１００ｍｇ、１〜５０ｍｇ、１〜３０ｍｇ、４〜２６ｍｇ、または５〜２５ｍｇの１日総量にて投与される。一例において、総量が、１日１回経口投与される。一例において、第１の用量は、第２の用量と異なる。更なる例において、第１の用量は、第２の用量よりも低い。別の例において、第１の用量は、第２の用量よりも高い。一例において、第１の用量は、約５ｍｇ（例えば、４．８ｍｇから５．２ｍｇ）であり、第２の用量は、約１０ｍｇ（例えば、９．８ｍｇから１０．２ｍｇ）である。一例において、第１の期間は約６ヵ月である。一例において、第２の期間は約６ヵ月である。
【００８９】
一例において、医薬組成物は、経口的に、非経口的に、または局所的に投与される。別の例において、医薬組成物は経口投与される。
【００９０】
本出願に従う組成物は典型的に、第１の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体、および少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）を、それぞれの所望される１日用量が、単一の単位剤型で、例えば錠剤またはカプセルで、または１日の間に同時に、もしくは間隔を置いて投与されることになる２つ以上の単位剤型で、それらが必要な対象に投与されるのを可能にするほど十分に含有することとなる。
【００９１】
本明細書の方法において、活性物質が、１日単回用量で、または１日あたり２、３、４回、もしくはそれ以上の同一もしくは異なる分割用量で投与されてよく、これらは１日の間で同時に投与されてもよいし、異なる時点にて投与されてもよい。通常、活性物質は同時に、より一般的には単一の組合せ剤型で、投与されることとなる。
【００９２】
一態様において、第１の化合物および少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）は、それぞれの単剤療法において投与される投薬量と実質的に同じ投薬量にて投与される。一態様において、第１の化合物は、その単剤療法の投薬量よりも少ない（例えば、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満）投薬量で投与される。一態様において、少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）は、その単剤療法の投薬量よりも少ない（例えば、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満）投薬量にて投与される。一態様において、第１の化合物および少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）は双方とも、それぞれの単剤療法の投薬量よりも少ない（例えば、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満）投薬量で投与される。
【００９３】
本出願の医薬組成物は、経口投与に都合のいいあらゆる形態、例えば錠剤、カプセル、粉末、ロゼンジ、ピル、トローチ、エリキシル、凍結乾燥した粉末、溶液、顆粒、懸濁液、エマルジョン、シロップ、またはチンキであってよい。徐放性の形態または遅延放出性の形態、例えば、コーティングされた粒子、多層錠剤、カプセル内カプセル、カプセル内錠剤、または微粒剤の形態が調製されてもよい。
【００９４】
経口投与用の固体形態は、薬学的に許容可能な結合剤、甘味料、崩壊剤、希釈剤、香味剤、コーティング剤、防腐剤、潤滑剤、および／または時間遅延剤を含有してよい。適切な結合剤として、アラビアゴム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、またはポリエチレングリコールが挙げられる。適切な甘味料として、スクロース、ラクトース、グルコース、アスパルテーム、またはサッカリンが挙げられる。適切な崩壊剤として、コーンスターチ、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、キサンタンゴム、ベントナイト、アルギン酸、またはアガーが挙げられる。適切な希釈剤として、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、デキストロース、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、またはリン酸二カルシウムが挙げられる。適切な香味剤として、ペパーミント油、冬緑油、チェリー、オレンジ、またはラズベリー香料が挙げられる。適切なコーティング剤として、ポリマーもしくはコポリマー、アクリル酸および／もしくはメタクリル酸、ならびに／またはそれらのエステル、ワックス、脂肪アルコール、ゼイン、セラック、もしくはグルテンが挙げられる。適切な防腐剤として、安息香酸ナトリウム、ビタミンＥ、アルファ−トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベン、または亜硫酸水素ナトリウムが挙げられる。適切な潤滑剤として、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、またはタルクが挙げられる。適切な時間遅延剤として、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルが挙げられる。
【００９５】
経口投与用の液体形態は、上記の剤に加えて、液体キャリアを含有してよい。適切な液体キャリアとして、水、油、例えばオリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油、ヒマワリ油、サフラワー油、ラッカセイ油、ココヤシ油、液体パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール、トリグリセリド、またはそれらのミクスチュアが挙げられる。
【００９６】
経口投与用の懸濁液としてさらに、分散剤および／または懸濁剤が挙げられ得る。適切な懸濁剤として、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、またはセチルアルコールが挙げられる。適切な分散剤として、レシチン、脂肪酸、例えばステアリン酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビトールモノ−またはジ−オレエート、−ステアレートまたは−ラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノ−またはジ−オレエート、−ステアレートまたは−ラウレート等が挙げられる。
【００９７】
経口投与用のエマルジョンとしてさらに、１つまたは複数の乳化剤が挙げられ得る。適切な乳化剤として、先で例示される分散剤または天然ゴム、例えばアラビアゴムもしくはトラガカントゴムが挙げられる。
【００９８】
本出願の医薬組成物は、第１の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体、および少なくとも１つの更なる治療剤を、選択された賦形剤、キャリア、アジュバント、および／または希釈剤と一緒に混合（ｂｌｅｎｄｉｎｇ）、粉砕、均質化、懸濁、溶解、乳化、分散、かつ／または混合（ｍｉｘｉｎｇ）することによって、調製されてよい。錠剤またはカプセルの形態の本出願の医薬組成物の一タイプが、（ａ）第１の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体から選択される活性物質の少なくとも１つ、および少なくとも１つの更なる治療剤を、所望されるあらゆる賦形剤、キャリア、アジュバント、および／または希釈剤と共に含む第１の錠剤を調製し、かつ（ｂ）第２の錠剤またはカプセルを調製することによって、調製されてよく、第２の錠剤またはカプセルは、残りの活性物質および第１の錠剤を含む。カプセルの形態の本出願の医薬組成物の別のタイプが、（ａ）第１の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体から選択される活性物質の少なくとも１つ、および更なる治療剤を、所望されるあらゆる賦形剤、キャリア、アジュバント、および／または希釈剤と共に含む第１のカプセルを調製し、かつ（ｂ）第２のカプセルを調製することによって、調製されてよく、第２のカプセルは、残りの活性物質および第１のカプセルを含む。錠剤の形態の本出願の医薬組成物の更なるタイプが、（ａ）第１の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体から選択される活性物質の少なくとも１つ、および少なくとも１つの更なる治療剤を、所望されるあらゆる賦形剤、キャリア、アジュバント、および／または希釈剤と共に含むカプセルを調製し、かつ（ｂ）錠剤を調製することによって、調製されてよく、錠剤は、残りの活性物質およびカプセルを含む。
【００９９】
例において、少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）は、即時放出性錠剤として、または徐放錠剤として用いられる。特に、徐放錠剤で提供される場合に有効である。種々の更なる治療剤の徐放錠剤が市販されている。長期間にわたって作用するには、錠剤は徐放形態であることが好ましい。
【０１００】
別の例において、本出願の医薬組成物は、第１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体を含有するカプセル内に、少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）を含有するカプセルを含む。典型的には、この形態において、少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）は、即時放出性の形態で示される。その場合、組成物を１日３回投与するのが普通である。投与の別のモードは、少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）を、先に記載されるように徐放形態または非徐放形態のいずれかで含有する組成物を、１日２回与えるものであり、投与される組成物の１日量は、所望される１日投薬量を患者に与えるのに十分な量の活性物質を含有する。
【０１０１】
一例において、本出願の医薬組成物は、第１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体を、０．１〜１５００ｍｇ、０．２〜１２００ｍｇ、０．３〜１０００ｍｇ、０．４〜８００ｍｇ、０．５〜６００ｍｇ、０．６〜５００ｍｇ、０．７〜４００ｍｇ、０．８〜３００ｍｇ、１〜２００ｍｇ、１〜１００ｍｇ、１〜５０ｍｇ、１〜３０ｍｇ、４〜２６ｍｇ、または５〜２５ｍｇの１日総量で含む剤型である。
【０１０２】
本出願の医薬組成物は、患者によって生涯用いられて、生存を延ばし得る。血中グルコースの引下げ、インスリン分泌の増大、および／またはインスリン抵抗性の低下は、関連する疾患、例えば糖尿病および肥満症の進行の軽減を確実にする。第１の化合物および少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）の組合せは、高血糖を伴う原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）の、そして抵抗性の原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）の選択療法となる見込みがある。本出願によって提供される投薬は単純であるため、本出願の併用療法は、患者の体重および臨床反応に応じた用量の増大に用いられ得る。
【０１０３】
本明細書中に開示される第１の化合物は、従来の方法（例えば、米国特許出願公開第２００９／００６２５２６号明細書、米国特許第７１３８３９０号明細書、および国際公開第２００６／１２２９７７号パンフレットに記載されるもの）によって、例えば、以下のスキーム１に示される、高度に純粋な化合物１（オベチコール酸またはＯＣＡ）を生産するための、６ステップ合成に続く１精製ステップによって、調製され得る。
【化９】
2018510900.tif 000010
【０１０４】
上記のプロセスは、国際公開第２０１３／１９２０９７号パンフレットに記載されており、この出願の内容は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。当該プロセスは、６ステップ合成に続く１精製ステップである。ステップ１は、メチルエステル化合物ａを生産するための、酸性触媒および熱の存在下でメタノールを用いる、７−ケトリトコール酸（ＫＬＣＡ）のＣ−２４カルボン酸のエステル化である。ステップ２は、化合物ｃを生産するための、強塩基を用いてからクロロシランによる処理が続く、化合物１からのシリルエノールエーテルの形成である。ステップ３は、化合物ｄを生産するための、シリルエノールエーテル化合物ｃおよびアセトアルデヒドのアルドール縮合反応である。ステップ４は、化合物ｅを生産するための、化合物ｄのＣ−２４メチルエステルの鹸化である。ステップ５は、化合物ｆを生産するための、化合物ｅの６−エチリデン部分の水素添加である。ステップ６は、結晶化合物１を生産するための、７α−ヒドロキシ基への化合物ｆの７−ケト基の選択的還元である。ステップ７は、結晶化合物の、化合物１（オベチコール酸形態１またはＯＣＡ形態１）への変換である。
【０１０５】
本出願の医薬組成物の生物活性および／または治療活性は、当該技術において知られている従来方法によって測定され得る。本出願の開示を限定することなく、いくつかの適切な方法が本明細書中で提供される。
【０１０６】
肝細胞の単離
ツーステップインサイチュコラゲナーゼ潅流法が、肝細胞を単離するのに利用され得る。肝細胞が、適切な動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ）から単離される。適切な潅流の後、肝臓が摘出されて、潅流バッファに移される。生じた細胞懸濁液が濾過されて、収集される。肝細胞が（例えば、Ｐｅｒｃｏｌｌ密度遠心分離技術を用いて）分離される。
【０１０７】
肝細胞のサンドイッチ培養
単離された肝細胞が、コラーゲンでコーティングされた組織培養プレート上で培養されて、血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、表皮増殖因子、インスリン、グルカゴン、およびヒドロコルチゾンが補われた培地中で維持される。サンドイッチ系について、更なるコラーゲンゲル溶液が、細胞上に分配される。培養プレートは、３７℃にてインキュベートされて、第２のゲル層のゲル化および付着が生じ得る。培地は毎日替えられて、更なる分析用に−２０℃にて保存される。本出願の医薬組成物は、肝細胞に施されてから、細胞に及ぼす作用が測定される。
【０１０８】
肝細胞の懸濁培養
単離の後直ちに、肝細胞が洗浄されて、再懸濁される。懸濁された細胞は、本出願の医薬組成物の不在下または存在下で培養される。ポジティブコントロール（例えば、グルカコン（ｇｌｕｃａｃｏｎ）の存在下で培養された細胞）が含まれてよい。
【０１０９】
インキュベーション期間の後、培地中に放出されたグルコースが（例えば、Ｔｒｉｎｄｅｒアッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を用いたグルコースオキシダーゼ法で）判定されることとなる。
【０１１０】
また、［５−３Ｈ］−グルコースの存在下での肝細胞のインキュベーション後、グルコース利用が、（脂肪酸酸化実験に関しての）トリチウム水の生産として判定され得る。２−［３Ｈ］−デオキシグルコースの吸収が、インスリン有り、または無しで判定される（Ｐｅｒｄｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，２７１７７（２００４））。グリコーゲン中へのＤ−［１４Ｃ］−グルコースの組込みは、インスリンの不在下または存在下で測定され得る（Ｐｅｒｄｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。
【０１１１】
ＨｅｐＧ２細胞培養
ヒト肝芽腫細胞（ＨｅｐＧ２）が、記載される（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２２，１６２２（２００８））ようにして、培地中で増殖される。翌日、細胞が、本出願の医薬組成物で処理される。処理後、細胞は、ＴＰＡ、ＬＰＳ、またはＴＮＦ−αで処理されてから、ＲＮＡの単離用に収集される。
【０１１２】
ＨｅｐＧ２細胞の一過性トランスフェクションが（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて）実行されることとなる。トランスフェクションの２４時間後に、細胞が、本出願の医薬組成物で前処理される。その後、細胞は、ＬＰＳもしくはＴＰＡ有り、または無しで処理される。その後、細胞は収穫されて、ルシフェラーゼ活性が、デュアルルシフェラーゼリポータアッセイ系を用いて判定されることとなる。
【０１１３】
マウスモデル
マウス（例えば、野生型またはＦＸＲ−／−）が、標準的な１２：１２時間の明／暗サイクル下の病原体フリー動物施設内で維持される。マウスは、標準的な齧歯類食および水が不断給餌される。マウスは、一晩断食されてから、ＬＰＳ、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または本出願の医薬組成物の単回用量が腹膜内注射されてから、水が不断給餌される。注射後、マウスは殺されて、血液および肝臓が、更なる分析用に取り出される。全ての手順は、ラボ動物の取扱いおよび使用についての国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）のガイドラインに従った。
【０１１４】
ＭｅｔＳウサギモデル
ＭｅｔＳのＨＦＤ誘発ウサギモデルが、以前に記載される（Ｆｉｌｉｐｐｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｅｘｕａｌ  Ｍｅｄ．６，３２７４（２００９））ようにして得られる。雄Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅウサギが、ランダムに番号をつけられて、２つの異なる群に割り当てられる：１２週間、コントロール食（ＣＯＮ）を給餌した未処理群、またはＨＦＤ（例えば、０．５％コレステロールおよび４％ピーナッツ油）を給餌した処理群。ＨＦＤウサギの亜群が、本出願の医薬組成物で処理される。
【０１１５】
血液サンプルが、ベースラインにて、そして１２週目に得られる。処理の１２週後、ウサギは殺されて、肝臓、ＶＡＴ（腸係蹄と腸間膜との間に蓄積）、および胆嚢の標本が、その後の分析用に摘出され、秤量され、収集され、そして処理される。全ウサギ群由来のＶＡＴサンプルはまた、前脂肪細胞の単離用に処理される。生化学的分析およびホルモンによる血清分析（ｈｏｒｍｏｎａｌ  ｓｅｒｕｍ  ａｎａｌｙｓｅ）が、以前に記載される（Ｆｉｌｉｐｐｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９，Ｍｏｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２，８０（２０１２），Ｖｉｇｎｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２１２，７１（２０１２））ようにして、実行される。
【０１１６】
ＭｅｔＳの作用を評価するために、以下の要因の１つまたは複数の、ダミー変数としての存在を考慮するアルゴリズムが設計される：高血糖、高トリグリセリドレベル、高コレステロールレベル、高血圧、および内臓脂肪蓄積。各因子についてのカットオフが、ＣＯＮウサギにおいて測定された、分析されたパラメータの平均±２Ｓ．Ｄ．によって導き出される。３またはそれ以上の要因についての陽性が、ＭｅｔＳを示す。
【０１１７】
ＶＡＴの組織形態計測的分析
以前に記載される（Ｍａｎｅｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）ように、脂肪細胞の直径を測定するために、ＶＡＴ標本が、ヘマトキシリンおよびエオシン染色によって分析される。
【０１１８】
低酸素状態の検出および免疫組織化学
以前に記載される（Ｍａｎｅｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｍｏｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，２０１３，Ｖｉｇｎｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）ようにして、生体内還元性薬物ピモニダゾール塩酸塩を用いて、殺す前にｉ．ｐ．注射されて、ＶＡＴ酸化が分析された。
【０１１９】
総および膜／細胞質ゾル画分の調製
ＶＡＴサンプルからのタンパク質抽出のために、凍結された組織が液体窒素中ですり潰されて、２つのアリコートに分割される：一方が総タンパク質抽出用、そして他方が膜／細胞質ゾル調製用。膜画分および細胞質ゾル画分が調製される。タンパク質抽出物が、ＢＣＡ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，米国）で定量化されて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析される。以前に記載される（Ｍａｎｅｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）ようにして、ウエスタンブロット分析が実行される。
【０１２０】
肝臓の組織学
肝臓の脂肪変性が、肝臓切片のＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色によって評価される。凍結された切片がクリオスタット内でカットされて、固定されて、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏで染色される。Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色後に、肝細胞核を強調するために、切片は洗浄されて、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色される。最後に、切片は写真に撮られて、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを用いたバックグラウンド除去後に、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ陽性のコンピュータ支援定量化がなされる。
【０１２１】
肝臓切片中の炎症性マーカーについての免疫組織化学
肝臓切片が、種々の炎症性マーカー（例えば、ＴＮＦα、Ｃｄ６８、Ｉｌ−６、Ｉｌ−１ｂ、およびＩｌ−１２）に対する一次抗体とインキュベートされる。切片はリンスされて、ビオチン化された二次抗体と、その後ストレプトアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体とインキュベートされる。反応産物は、クロモゲンとしての３’，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で現像される。コントロール実験は、一次抗体を除くことによって実行される。炎症性マーカーに対する染色のコンピュータ支援定量化が、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを用いたバックグラウンド除去後になされる。
【０１２２】
ウサギ内蔵脂肪の前脂肪細胞の単離、特徴付け、および分化
ＶＡＴからのウサギ前脂肪細胞（ｒＰＡＤ）の単離は、以前に記載される（Ｍａｎｅｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）ようにして実行される。細胞は、完全培地中で培養される。Ｐ１培養体が用いられる。ｒＰＡＤは、種々のモノクローナル抗体（例えば、以前に記載される（Ｍａｎｅｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）、ＣＤ３４−ＰＥ、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ、ＣＤ３１−ＦＩＴＣ、ＣＤ１４−ＰＥ、ＣＤ９０−ＰＥ、ＣＤ１０６−ＦＩＴＣ、およびＣＤ１０５−ＰＥ）によるフローサイトメトリによって特徴付けられる。コンフルエンスの２日後に、ｒＰＡＤの分化が、ｒＰＡＤを分化ミクスチュア（ＤＩＭ）（例えば、５％ｓｔｒｉｐｐｅｄ  ＦＢＳを補ったＤＭＥＭ中、５ｍｇ／ｍｌインスリン、１ｍＭデキサメタゾン、および０．５ｍＭ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を含有するミクスチュア）に曝すことによって、誘導される。
【０１２３】
グルコース吸収
ｒＰＡＤによるグルコース吸収が、以前に記載される（Ｍａｎｅｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）ようにして測定される。ＤＩＭに曝されたｒＰＡＤが、血清フリー培地内で２４時間培養されてから、インスリンの濃度を増大させてインキュベーションされて、インスリン依存性の刺激が評価される。インキュベーション期間の終了後、ｒＰＡＤがさらに、３Ｈ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースとインキュベートされる。組み込まれた放射活性が、シンチレーション分光測定法を用いて測定される。
【０１２４】
実験動物および食餌
動物は、１２：１２時間の明暗サイクルで、２２℃の標準的なケージ内に個々に収容される。マウスは、（例えば、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｕｒ，ＭＥ）から）購入され得る。雄ＧＬＰ−１受容体欠損（ＧＬＰ−１ＲＫＯ）マウスが、ヘテロ交配対に由来する（Ｓｃｒｏｃｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２，１２５４（１９９６））。ＮＡＳＨを誘導するために、高脂肪、高フルクトース、および高コレステロールで構成される、脂肪源がトランス脂肪またはラードとなる２食が試験される。フルクトースもコレステロールも含まない低脂肪食が、コントロール食として用いられる。
【０１２５】
研究および薬物投与
ＮＡＳＨの進行を特徴付けるために、低脂肪食（ＬＦＤ）、高トランス脂肪、高フルクトース、高コレステロール食（ＨＴＦ）、または高ラード脂肪、高フルクトース、高コレステロール食（ＨＬＦ）のＬｅｐｏｂ／ＬｅｐｏｂマウスまたはＢ６マウスが（例えば、８または１２週間）維持される。マウスは、ビヒクル（例えば、滅菌水中５０％ＤＭＳＯ）または本出願の医薬組成物を送達する単一の浸透圧ミニポンプが皮下移植される。加えて、または代わりに、マウスは、ビヒクル、または本出願の医薬組成物が、経口強制飼養を介して１日１回投与されてよい。
【０１２６】
肝臓エンドポイントに及ぼす体重損失の影響を評価するために、先に記載されるＬＦＤ食またはＨＴＦ食に曝されたＬｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂマウスにおける最初の研究が、繰り返されてよい。ＬＦＤ食またはＨＴＦ食に基づく８週後に、全マウスは、ビヒクルまたは本出願の医薬組成物を送達する浸透圧ミニポンプが移植される。加えて、または代わりに、マウスは、ビヒクル、または本出願の医薬組成物が、他の投与経路、例えば経口強制飼養を介して、１日１回投与されてよい。ＨＴＦ群のサブセットは、ビヒクル含有ミニポンプが移植され、かつカロリー制限されて、薬物処理されるマウスにおいて観察されるのと類似した体重損失の程度が誘発される。
【０１２７】
肝臓組織の組織学的分析および生化学的分析
終了後、肝臓組織が摘出されて、（例えば、１０％中性緩衝ホルマリン内で）固定される。肝臓組織がパラフィン包埋されて、切片化されて、マウントされて、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色される。線維症を視覚化するために、切片の別のセットが、マッソントリクローム染色で染色される。切片は最初に、ワイゲルト鉄へマトキシリンで、続いてビーブリッヒスカーレット、リンタングステン酸／リンモリブデン酸、およびアニリンブルー処理で染色される。切片の第２のセットが、マクロファージマーカーＭａｃ−２を標的とする抗体を用いて免疫染色される。全ての組織学的分析は、処理条件について盲検化された病理医によって行われる。
【０１２８】
血漿ホルモンおよび代謝物質の分析
血漿グルコース、トリグリセリド、総コレステロール、ＡＬＴ、およびアスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のレベルが（例えば、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）を用いることによって）測定される。血漿サンプルが、標準曲線の範囲内でのＡＬＴおよびＡＳＴの検出のために、ＰＢＳで１：１０に希釈される。総血漿アディポネクチンが（例えば、市販のＥＬＩＳＡを用いて、メーカーの説明書に従って（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）測定される。
【０１２９】
定義
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において用いられる特定の用語が、ここに収集される。
【０１３０】
本明細書中で用いられる用語「ＦＸＲアゴニスト」は、ＦＸＲを活性化するあらゆる化合物を指す。一態様において、ＦＸＲアゴニストは、ＣＤＣＡに対して、ＦＸＲの少なくとも５０％の活性化を達成し、アッセイ法において適切なポジティブコントロールが、国際公開第２０００／０３７０７７号パンフレットに記載されている。別の態様において、ＦＸＲアゴニストは、シンチレーション近接アッセイ、または国際公開第２０００／０３７０７７号パンフレットに記載されるＨＴＲＦアッセイにおいて、ＦＸＲの１００％の活性化を達成する。ＦＸＲアゴニストの例として、米国特許第７１３８３９０号明細書；米国特許第７９３２２４４号明細書；米国特許出願公開第２０１２０２８３２３４号明細書；米国特許出願公開第２０１２０２３２１１６号明細書；米国特許出願公開第２０１２００５３１６３号明細書；米国特許出願公開第２０１１０１０５４７５号明細書；米国特許出願公開第２０１００２１０６６０号明細書；米国特許出願公開第２０１００１８４８０９号明細書；米国特許出願公開第２０１００１７２８７０号明細書；米国特許出願公開第２０１００１５２１６６号明細書；米国特許出願公開第２０１０００６９３６７号明細書；米国特許出願公開第２０１０００６３０１８号明細書；米国特許出願公開第２０１０００２２４９８号明細書；米国特許出願公開第２００９０２７０４６０号明細書；米国特許出願公開第２００９０２１５７４８号明細書；米国特許出願公開第２００９０１６３４７４号明細書；米国特許出願公開第２００９００９３５２４号明細書；米国特許出願公開第２００８０３００２３５号明細書；米国特許出願公開第２００８０２９９１１８号明細書；米国特許出願公開第２００８０１８２８３２号明細書；米国特許出願公開第２００８００３９４３５号明細書；米国特許出願公開第２００７０１４２３４０号明細書；米国特許出願公開第２００６００６９０７０号明細書；米国特許出願公開第２００５００８００６４号明細書；米国特許出願公開第２００４０１７６４２６号明細書；米国特許出願公開第２００３０１３０２９６号明細書；米国特許出願公開第２００３０１０９４６７号明細書；米国特許出願公開第２００３０００３５２０号明細書；米国特許出願公開第２００２０１３２２２３号明細書；および米国特許出願公開第２００２０１２０１３７号明細書に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３１】
本明細書中で用いられる用語「オベチコール酸」または「ＯＣＡ」は、化学構造：
【化１０】
2018510900.tif 000011
を有する化合物を指す。
【０１３２】
オベチコール酸は、オベチコール酸形態１、ＩＮＴ−７４７、３α，７α−ジヒドロキシ−６α−エチル−５β−コラン−２４−酸、６α−エチル−ケノデオキシコール酸、６−エチル−ＣＤＣＡ、６ＥＣＤＣＡ、コラン−２４−酸、６−エチル−３，７−ジヒドロキシ−，（３α，５β，６α，７α）またはとも呼ばれ、米国特許出願公開第２００９／００６２５２６Ａ１号明細書、米国特許第７１３８３９０号明細書、および国際公開第２００６／１２２９７７号パンフレットに記載される方法によって調製され得る。オベチコール酸についてのＣＡＳ登録番号は、４５９７８９−９９−２である。
【０１３３】
本明細書中で用いられる用語「結晶オベチコール酸」は、化学構造：
【化１１】
2018510900.tif 000012
を有する化合物のあらゆる結晶形態を指す。
【０１３４】
結晶オベチコール酸は、化合物が、三空間次元における特定の結晶充填配置に結晶化され、または化合物が外表面（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｆａｃｅ  ｐｌａｎｅ）を有することを意味する。オベチコール酸の固体形態は、様々な結晶充填配置に結晶化し得、それらの全てが、オベチコール酸の同じ元素組成を有する。様々な結晶形態は通常、Ｘ線回折パターン、赤外線スペクトル、融点、密度、硬度、結晶形状、光学的特性および電気的特性、安定性、ならびに溶解度が異なる。再結晶溶媒、結晶化速度、保存温度、および他の要因により、一結晶形態が優位を占め得る。オベチコール酸の結晶は、様々な条件下、例えば、様々な溶媒、温度その他の下での結晶化によって、調製され得る。ＯＣＡの結晶形態の例が、同時係属中の米国特許出願公開第２０１３０３４５１８８号明細書に記載されている。
【０１３５】
用語「第１の化合物」は、式Ｉの化合物もしくは化合物１、またはそれらの薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体を意味する。当該用語が本明細書の文脈で用いられる場合はいつでも、遊離基、同位体標識化合物、結晶化合物、またはそれらの対応する薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体がその状況下で可能であり、かつ／または適切であるならば、そのようなものに言及していることが理解されるべきである。
【０１３６】
本明細書中で用いられる用語「アミノ酸抱合体」は、本明細書の第１の化合物（例えば式Ｉの化合物）の、あらゆる適切なアミノ酸を有する抱合体を指す。例えば、式Ｉの化合物のそのような適切なアミノ酸抱合体は、胆汁または腸液における完全性が増強されるという付加的な利点を有し得る。適切なアミノ酸として、グリシン、サルコシンおよびタウリンが挙げられるが、これらに限定されない。ゆえに、本明細書は、本明細書の第１の化合物（例えば化合物１）のグリシン抱合体、サルコシン抱合体およびタウリン抱合体を包含する。
【０１３７】
「処置すること」は、症状、疾患、障害、その他の向上をもたらすあらゆる効果、例えば、小さくすること、引き下げること、調節すること、または除外することを含む。疾患状態を「処置する」こと、または疾患状態の「処置」は：疾患状態を阻害すること、すなわち、疾患状態もしくはその臨床的症候の進行を抑えること、または疾患状態を和らげること、すなわち、疾患状態もしくはその臨床的症候の一時的退行もしくは永続的退行を引き起こすことを含む。
【０１３８】
疾患状態を「予防すること」は、疾患状態に曝され得、または疾患状態の傾向があり得るが、疾患状態の症候をまだ経験も示しもしていない対象において、疾患状態の臨床的症候を進行させないことを含む。
【０１３９】
本明細書中で用いられる用語「阻害すること」または「阻害」は、疾患または症状の発症または進行に及ぼすあらゆる検出可能なポジティブ効果を指す。そのようなポジティブ効果は、疾患または症状の少なくとも１つの症候または徴候の発症の遅延または予防、症候または徴候の緩和または反転、および症候または徴候の更なる悪化の減速または予防を含み得る。
【０１４０】
「疾患状態」は、あらゆる疾患、障害、症状、症候、または徴候を意味する。
【０１４１】
本明細書中で用いられる用語「有効な量」または「治療的に有効な量」は、適切な用量の投与直後の急性的な、または長期間にわたる治療効果を、単独で、または組み合わせてもたらす第１の化合物（例えば、ＦＸＲ活性化リガンド）、または少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）の量を指す。一例において、第１の化合物（例えば、ＦＸＲ活性化リガンド）の有効な量または治療的に有効な量は、少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）と組み合わされて、適切な用量の投与直後の急性的な、または長期間にわたる治療効果をもたらす。当該効果として、疾患／症状（例えば、肝臓、腎臓、または腸の線維症）、および関連する合併症の症候、徴候、および根底にある病状の、何らかの検出可能な程度までの予防、矯正、阻害、または反転が挙げられる。「有効な量」または「治療的に有効な量」は、第１の化合物、更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）、疾患およびその重篤度、ならびに処置されることになる対象の年齢、体重その他に応じて変わることとなる。
【０１４２】
第１の化合物の治療的に有効な量が、ヒトまたは非ヒト動物への投与用の、１つまたは複数の更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）、および、任意選択的に、１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリアと共に製剤化され得る。したがって、本出願の医薬組成物は、例えば経口経路、非経口経路、または局所的経路を介して投与されて、第１の化合物および更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）の有効な量を提供することができる。代替例において、本出願の組成物は、医療デバイス、例えばステントをコーティングする、または含浸させるのに用いられてよい。
【０１４３】
本明細書中で用いられる「薬理効果」は、療法の意図される目的を達成する、対象においてもたらされる効果を包含する。一例において、薬理効果は、処置されることになる対象の主な徴候（ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）が予防され、緩和され、または引き下げられることを意味する。例えば、薬理効果は、処置された対象における主な徴候の予防、緩和、または引下げをもたらすものであろう。別の例において、薬理効果は、処置されることになる対象の主な徴候の障害または症候が予防され、緩和され、または引き下げられることを意味する。例えば、薬理効果は、処置された対象における障害または症候の予防、緩和、または引下げをもたらすものであろう。
【０１４４】
特に明記しない限り、不斉炭素原子から生じる異性体（例えば、全てのエナンチオマーおよびジアステレオマー）が、本明細書の範囲内に含まれることが理解されるべきである。そのような異性体は、古典的な分離技術によって、そして立体化学的に制御される合成によって、実質的に純粋な形態で得られ得る。
【０１４５】
「医薬組成物」は、治療剤、例えば第１の化合物および少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）を、対象への投与に適した形態で含有する製剤である。一例において、医薬組成物は、バルクまたは単位剤型である。投与の簡略化および投薬量の均一性のために、組成物を投薬量単位形態で製剤化することが有利であり得る。本明細書中で用いられる投薬量単位形態は、処置されることになる対象にとってユニタリ投薬量として適した、物理的に不連続な単位を指す；各単位は、必要とされる医薬キャリアと協働して所望の治療効果をもたらすと算出される活性試薬の所定量を含有する。本明細書の投薬量単位形態についての仕様は、活性剤の固有の特性、および達成されることになる特定の治療効果、ならびに個体の処置用のそのような活性剤を調合する、当該技術において固有の制限によって決定され、そしてこれらに直接依存する。
【０１４６】
用語「単位剤型」は、ヒトおよび他の哺乳類にとってユニタリ投薬量として適した物理的に不連続な単位を指し、各単位は、本明細書中で記載されるように、適切な医薬賦形剤と協働して所望の治療効果をもたらすと算出される活性物質の所定量を含有する。
【０１４７】
単位剤型は、種々の形態のいずれかであり、例えば、カプセル、ＩＶバッグ、錠剤、エーロゾル吸入器上の単一ポンプ、またはバイアルが挙げられる。第１の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくはアミノ酸抱合体の、組成物の単位用量での量は、有効量であり、関係する特定の処置および／または治療に使用される更なる治療剤に従って変動する。当業者であれば、患者の年齢および症状に応じて、投薬量をルーチン的に変えることが時折必須であることを理解するであろう。投薬量はまた、投与の経路によっても決まることとなる。種々の経路が考えられ、経口、肺、直腸、腸管外、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹膜内、吸入、口腔内、舌下、胸膜内、髄腔内、鼻腔内等が挙げられる。本発明の化合物の局所投与または経皮投与のための剤型として、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、および吸入薬が挙げられる。一例において、第１の化合物および／または少なくとも１つの更なる治療剤は、滅菌条件下で、薬学的に許容可能なキャリアと、そして必要とされるあらゆる防腐剤、バッファ、または推進剤と混合される。
【０１４８】
本明細書中で用いられる「ＰＯ」または「経口の」は、経口投与を指し；「ＳＱ」は、皮下投与を指し；そして「ＱＤ」は、１日１回の投与を指す。
【０１４９】
用語「フラッシュ用量」は、迅速に分散する剤型である製剤を指す。
【０１５０】
用語「即時放出」は、比較的短い期間、一般に最大約６０分での、剤型からの治療剤（例えば、第１の化合物または少なくとも１つの更なる治療剤）の放出と定義される。用語「調節放出」は、遅延放出、徐放、およびパルス化放出を含むと定義される。用語「パルス化放出」は、剤型からの薬物の一連の放出と定義される。用語「徐放（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）」または「徐放（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）」は、長期間にわたる剤型からの治療剤の連続的放出と定義される。
【０１５１】
「対象」として、哺乳類、例えば、ヒト、ペット（例えば、イヌ、ネコ、鳥類等）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、家禽等）、および実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、鳥類等）が挙げられる。一例において、対象はヒトである。一態様において、対象はメスである。一態様において、対象はオスである。
【０１５２】
本明細書中で用いられるフレーズ「薬学的に許容可能な」は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、炎症、アレルギー反応もなければ、他の問題も合併症もない、ヒトおよび動物の組織と接触する使用に適し、妥当な利点／リスク比に相応した化合物、材料、組成物、キャリア、および／または剤型を指す。
【０１５３】
「薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤」は、概して安全な、非毒性の、生物学的にも、それ以外ででも不所望でない医薬組成物を調製するのに有用なキャリアまたは賦形剤を意味し、動物用途およびヒト医薬用途に許容可能である賦形剤が挙げられる。明細書および特許請求の範囲において用いられる「薬学的に許容可能な賦形剤」は、１つのそのような賦形剤および複数のそのような賦形剤の双方を含む。
【０１５４】
第１の化合物を、いかなる製剤化もなく直接投与することが可能である一方、第１の化合物は、薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬製剤の形態で投与され得る。当該製剤は、経口、口腔内、直腸、鼻腔内、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、および鼻腔内が挙げられる種々の経路によって投与され得る。
【０１５５】
一例において、第１の化合物および／または少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載される更なる治療剤）は、経皮投与され得る。経皮投与するために、経皮送達装置（「パッチ」）が必要である。そのような経皮パッチは、本明細書の化合物の連続的注入または非連続的注入を、量を制御して実現するのに用いられ得る。医薬剤の送達用の経皮パッチの構築および使用は、当該技術において周知である。例えば、米国特許第５０２３２５２号明細書参照。そのようなパッチは、医薬剤の連続送達、パルス状送達、またはオンデマンド送達用に構築され得る。
【０１５６】
一例において、本明細書の医薬組成物は、口腔内投与および／もしくは舌下投与、または経鼻投与に適している。この例は、胃複合体（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、例えば胃系による、そして／または肝臓を通しての第１の通過代謝を回避するようにして、第１の化合物の投与を実現する。この投与経路はまた、吸着時間を短くして、治療利点のより迅速な出現を実現し得る。
【０１５７】
第１の化合物は、広い投薬量範囲にわたって投与され得る。例えば、１日あたりの投薬量が通常、体重の約０．０００１〜約３０ｍｇ／ｋｇの範囲内に入る。成人の処置において、約０．１〜約１５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲が、単回用量または分割用量で用いられる。一例において、製剤は、約０．１ｍｇ〜約１５００ｍｇの第１の化合物を含む。別の例において、製剤は、約１ｍｇ〜約１００ｍｇの第１の化合物を含む。別の例において、製剤は、約１ｍｇ〜約５０ｍｇの第１の化合物を含む。別の例において、製剤は、約１ｍｇ〜約３０ｍｇの第１の化合物を含む。別の例において、製剤は、約４ｍｇ〜約２６ｍｇの第１の化合物を含む。別の例において、製剤は、約５ｍｇ〜約２５ｍｇの第１の化合物を含む。別の例において、製剤は、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、または約５０ｍｇの第１の化合物を含む。しかしながら、実際に投与される第１の化合物の量は、処置されるべき症状、選択される投与経路、投与される第１の化合物の形態、投与される更なる治療剤、個々の患者の年齢、体重および反応、ならびに患者の症候の重篤度が挙げられる、関連する状況に照らして、医師によって決定されることとなることが理解されよう。したがって、先の投薬量範囲は、本明細書の範囲をいかなる形であれ限定することが意図されない。前述の範囲の下限を下回る投薬量レベルが十二分に適切であり得る場合もある一方で、さらにより大きな用量が、１日を通しての投与用に、いくつかのより小さな用量に最初に分割されることを条件として、そのようなより大きな用量が、いかなる有害な副作用も引き起こすことなく使用され得る場合もある。
【０１５８】
「線維症」は、組織または器官における、過剰な線維性結合組織、例えば瘢痕組織の発達を包含する症状を指す。瘢痕組織のそのような生成は、疾患、外傷、化学毒性等に起因する器官の感染、炎症、または損傷に応じて、起こり得る。線維症は、肝臓、腎臓、腸、肺、心臓その他が挙げられる種々の異なる組織および器官において発症し得る。
【０１５９】
本明細書中で用いられる「胆汁鬱滞性症状」は、肝臓からの胆汁排泄が損なわれ、または阻止されるあらゆる疾患または症状を指し、これらは、肝臓において、または胆管において起こり得る。肝内胆汁鬱滞および肝外胆汁鬱滞が、胆汁鬱滞性症状の２つの型である。肝内胆汁鬱滞（肝臓の内側で起こる）は、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、敗血症（全身感染症）、急性アルコール性肝炎、薬物毒性、完全非経口的栄養（静脈内に供給される）、悪性腫瘍、嚢胞性線維症、および妊娠において最も一般的に見られる。肝外胆汁鬱滞（肝臓の外側で起こる）は、胆管腫瘍、狭窄、嚢胞、憩室、総胆管における結石形成、膵炎、膵腫瘍または膵仮性嚢胞、および近隣器官における腫瘤または腫瘍に起因する圧迫によって引き起こされ得る。
【０１６０】
胆汁鬱滞性症状の臨床的症候および徴候として：むず痒さ（痒み）、疲労、黄疸にかかったような皮膚または眼、特定の食物の消化不能、吐き気、嘔吐、白色便、暗色尿、および右上腹部痛が挙げられる。患者の血清中のアルカリホスファターゼ、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、５’ヌクレオチダーゼ、ビリルビン、胆汁酸、およびコレステロールのレベルの測定が挙げられる、一組の標準的な臨床検査に基づいて、胆汁鬱滞性症状のある患者が臨床的に診断かつ追跡され得る。通常、診断マーカーであるアルカリホスファターゼ、ＧＧＴ、および５’ヌクレオチダーゼの３つ全ての血清レベルが、異常に高いとみなされるならば、患者は胆汁鬱滞性症状があると診断される。これらのマーカーの正常な血清レベルは、試験プロトコルに応じて、ラボごとに、そして手順ごとに、ある程度変わり得る。ゆえに、医師は、特定のラボおよび試験手順に基づいて、各マーカーについて、異常に高い血中レベルがどれほどのものであるかを決定することができるであろう。例えば、胆汁鬱滞性症状に苦しむ患者は一般に、血中のアルカリホスファターゼが約１２５ＩＵ／Ｌ超、ＧＧＴが約６５ＩＵ／Ｌ超、そして５’’ヌクレオチダーゼが約１７ＩＵ／Ｌ超である。血清マーカーのレベルの変動性のため、胆汁鬱滞性症状は、先で言及される症候、例えばむず痒さ（痒み）の少なくとも１つに加えて、これらの３つのマーカーの異常なレベルに基づいて、診断され得る。
【０１６１】
用語「原発性胆汁性肝硬変」は、用語「原発性胆汁性胆管炎」と互換的に用いられ、多くの場合ＰＢＣと省略される。ＰＢＣは、肝臓の小胆管のゆっくりした進行性の破壊によって示される肝臓の自己免疫疾患であり、小葉内管（Ｈｅｒｉｎｇ管）が、疾患の初期に冒される。当該管が損傷を受けた場合、胆汁が肝臓内で蓄積して（胆汁鬱滞）、経時的に組織に損傷を与える。これは、瘢痕化、線維症、および肝硬変の原因となり得る。原発性胆汁性肝硬変は、小葉間胆管の破壊によって特徴付けられる。原発性胆汁性肝硬変の組織病理学的発見として：上皮内リンパ球によって特徴付けられる胆管の炎症、および管周囲類上皮肉芽腫が挙げられる。ＰＢＣの４つのステージがある。
【０１６２】
ステージ１−門脈ステージ：正常なサイズの三管；門脈炎症、微妙な胆管の損傷。肉芽腫が多くの場合、このステージにおいて検出される。
ステージ２−門脈周囲ステージ：拡大した三管；門脈周囲線維症および／または炎症。典型的に、このステージは、小胆管の増殖の発見によって特徴付けられる。
ステージ３−隔壁ステージ：能動線維中隔および／または受動線維中隔。
ステージ４−胆汁性肝硬変：小節が存在する；花輪（ｇａｒｌａｎｄ）。
【０１６３】
用語「原発性硬化性胆管炎」（ＰＳＣ）は、肝内（肝臓の内側）レベルおよび肝外（肝臓の外側）レベルの双方で、胆管の炎症およびその後の閉塞症を引き起こす胆管の疾患である。炎症は、腸への胆汁のフローを妨げ、これは最終的に、肝硬変、肝不全、および肝癌の原因となり得る。
【０１６４】
用語「非アルコール性脂肪肝炎」（ＮＡＳＨ）は、肝臓における脂肪の蓄積によって引き起こされる肝臓炎症である。一部の人々において、脂肪の蓄積は、肝臓の炎症を引き起こす。炎症のため、肝臓は機能しないし、機能するはずもない。ＮＡＳＨはよりひどくなって肝臓の瘢痕化を引き起こし、これが肝硬変の原因となり得る。ＮＡＳＨは、長期の、大量飲酒によって引き起こされるような肝疾患に類似するが、ＮＡＳＨはアルコールを乱用しない人々において起こる。
【０１６５】
用語「器官」は、細胞および組織からなり、かつ生体において一部の特定の機能を実行する、分化した構造体（心臓、肺、腎臓、肝臓、その他にみられる）を指す。当該用語はまた、機能を実行し、または活動に協力する身体の部分（例えば、眼、および視覚的な器官を構成する関連した構造体）を包含する。用語「器官」はさらに、分化した細胞のあらゆる部分的構造、および完全な構造体に潜在的に発達することができる組織（例えば、肝臓の葉または切片）を包含する。
【０１６６】
本明細書中で引用される全ての刊行物および特許文書は、そのような各刊行物または各文書が参照によって本明細書に組み込まれることが具体的に、かつ個々に示されているがごとく、参照によって本明細書に組み込まれる。刊行物および特許文書の引用は、いずれも関連する先行技術であるという承認として意図されないし、その内容または日付に関していかなる承認も構成しない。本明細書は次に、説明文として記載され、当業者であれば、本明細書に記載される組成物および方法が、種々の実施例で実行され得ること、そして本明細書中に提供される記載および実施例が、後に続く特許請求の範囲の限定のためにではなく説明のためにあることを認識するであろう。
【０１６７】
本明細書において、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、単数形は複数も含む。別段の定めがない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾がある場合、本明細書が優先されることとなる。本明細書中で用いられる全てのパーセンテージおよび比率は、特に明記されない限り、重量による。
【実施例】
【０１６８】
実施例１：Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスにおける食餌誘導肥満ＮＡＳＨ
食餌誘導肥満ＮＡＳＨマウスにおける代謝パラメータ、肝臓病理、およびＮＡＳ活性スコアに及ぼす、オベチコール酸（ＯＣＡ）、および血中グルコースレベルを減少させ、インスリン分泌を刺激し、かつ／またはインスリン感受性を高める治療剤の、単独での、または組み合わせての作用を評価する研究を行った。実施例２、３および４で用いた治療剤はそれぞれ、リラグルチド（ＬＩＲＡ）、メトホルミン（ＭＥＴ）、またはシタグリプチン（ＳＩＴ）であった。一研究において、抗血糖剤は、エンパグリフロジン（ＥＭＰ）である。加えて、組合せが、いずれの単剤療法処置によっても調節されない新規の遺伝子を調節するか、そして／または単剤療法によっても影響が与えられる遺伝子をより強く調節するかを判定するために、肝臓遺伝子発現プロファイリングおよびその後の経路分析を実行した。
【０１６９】
【表１】
2018510900.tif 000013
【０１７０】
動物、収容、および食餌
５週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＪａｎＶｉｅｒ、フランスから購入して、試験小屋に移した。順化および高脂肪食誘導期間中に、マウスを、１２：１２時間の明暗サイクル（午前３時〜午後３時の明）下、制御温度条件（２２±１℃；５０±１０％の相対湿度）のオーダーメードのキャビネット内に、１ケージあたり５頭を群で収容した。食餌誘導および研究期間の全体を通して、マウスを、高脂肪食（ｎ＝１１０、ＤＩＯ−ＮＡＳＨ）（Ｄ０９１００３０１、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ、米国）（４０％脂肪（１８％トランス脂肪）、４０％炭水化物（２０％フルクトース）、および２％コレステロール）または定期的な齧歯類食（ｎ＝１０、ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷ）（Ａｌｔｒｏｍｉｎ  １３２４、Ｂｒｏｇａａｒｄｅｎ、デンマーク）、および水道水に自由裁量でアクセスさせた。動物は実験前に２８週間食餌を続け、研究期間の全体を通して食餌を維持した。手術後の回収の間、そして研究期間の全体を通して、全動物を一個体で収容した。
【０１７１】
研究への割当て、階層化した無作為化、およびベースラインモニタリング
食餌誘導の２７週後、組織学的評価による肝臓の脂肪変性進行用の肝生検を得た。投薬以前の−２週目（ＳＩＴ組合せ）または−１週目（ＬＩＲＡおよびＭＥＴ組合せ）に、処置群への階層化した無作為化を、脂肪変性スコアおよび体重に従って実行した。体組成分析を判定するために、ＥｃｈｏＭＲＩ（ＥｃｈｏＭＲＩ、米国）を用いて、動物をスキャンした。ＥｃｈｏＭＲＩスキャンは、脂肪、および脂肪のない組織量を測定する。ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＧ、およびＴＣレベルのベースライン血漿分析のために、非空腹時の、意識がある状態で、頬（顎下）から血液サンプルを収集した。
【０１７２】
プレ生検手順
手術手順の日に、マウスを１００％酸素中イソフルラン（２〜３％）で麻酔した。正中線において小さく開腹して、肝臓の左葉を露出させた。肝臓組織の円錐形状の楔部分（約１００ｍｇ）を、葉の遠位部分から摘出して、秤量して、組織学用に４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で固定した。肝臓のカット表面を即座に、バイポーラ凝固（ＥＲＢＥ  ＶＩＯ  １００電気手術器）を用いて電気凝固させた。肝臓を腹腔に戻して、腹壁を縫合して、皮膚をホッチキスで閉じた。手術後の回復のために、手術日に、そして手術後１および２日目に、所定のカルプロフェン（５ｍｇ／ｍｌ〜０．０１ｍｌ／１０ｇ）およびエンロフロキサジン（ｅｎｒｏｆｌｏｘａｚｉｎ）（５ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｌ／ｋｇ）をマウスに皮下投与した。
【０１７３】
組織学的評価のための肝生検の調製：４％ＰＦＡ中での一晩の保存後、自動化Ｍｉｌｅｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔｉｓｓｕｅ−ＴＥＫ  ＶＩＰ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ内で肝生検をパラフィン中で一晩中浸透させてから、パラフィンブロック中に包埋した。５頭の異なる動物由来の生検を、１ブロックに包埋した。その次にブロックをトリミングして、２つの３μｍ切片を、Ｍｉｃｒｏｍ  ＨＭ３４０Ｅ  Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で（Ｈ＆Ｅ染色用に）カットした。２つのブロックを一スライド上に置いて、１０頭の異なる動物を代表する、スライドあたり合計１０個の生検を与えた。切片を一晩乾燥させたままにした。処置群への階層化および無作為化のための脂肪変性程度の評価を、処理条件について盲検化された組織学者が、Ｋｌｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）によって概説されるように実行した。
【０１７４】
血液および血漿の分析
血液サンプルを、ヘパリン処理した１０μＬガラス毛細管チューブ中に収集した。サンプルを直ちにバッファ（０．５ｍｌのグルコース／ラクテート系溶液（ＥＫＦ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ））中に懸濁して、試験日に、ＢＩＯＳＥＮ  ｃ−Ｌｉｎｅグルコースメータ（ＥＫＦ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ）を用いて、グルコースについて分析した。トリグリセリドおよびコレステロールの含有量について、１００μｌの血液を、リチウム−ヘパリンチューブ中に収集した。血漿を分離して、分析前にサンプルを４℃にて１日保存した。
【０１７５】
経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）
処置の４週目（ＬＩＲＡおよびＭＥＴ組合せ）または６週目（ＳＩＴ組合せ）に、意識のある、自由に動く動物に、ＯＧＴＴを実行した。ＯＧＴＴの約１８時間前に、最後の薬物用量を投与した。動物は、試験前に、薬物投薬を受けなかった。試験開始前の４時間、動物を断食させた（午前６時から午前１０時まで食物を取下げ）。ｔ＝０にて、マウスは、経口強制飼養（１０ｍｌ／ｋｇ）によって、グルコースの経口ボーラス（２００ｍｇ／ｍｌ；  Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｋａｂｉ、スウェーデン）を受けた（２ｇ／ｋｇ）。血液サンプルを、尾部静脈から（切って）収集して、血中グルコースを、経口グルコース投与後、０、１５、３０、６０および１２０分の時点にて測定した。血液サンプリング、および通常通りの薬物の投薬後に、マウスを再給餌した。
【０１７６】
殺処分および死体解剖
動物を、非空腹状態で８週目（処置５６日目）に殺処分した。最後の薬物用量を、殺処分の約１８時間前に投与した。動物は、殺処分前に、薬物投薬を受けなかった。動物をＣＯ２／Ｏ２によって誘導して、麻酔（イソフルラン）中に腹腔を開き、終末の血漿を収集するために心臓血液を得た。死体解剖と同時に、肝臓全体を収集し、秤量した。左葉を破片に分割して、遺伝子発現分析のために液体窒素中で、そして組織学的分析および生化学的分析のために４％ＰＦＡ中で急速凍結した。肝臓の破片を、生化学的分析のために液体窒素中で急速凍結した。
【０１７７】
肝臓組織のプロセシング
終末の肝臓組織：処置の８週後、肝臓全体を収集し、秤量し、左葉由来の肝生検を摘出して直ちに、４％ＰＦＡ（約１５０〜２００ｍｇ）中に入れて急速凍結した（約５０ｍｇ）。肝臓破片（約１００ｍｇ）をＦａｓｔＰｒｅｐチューブ内に収集して、液体窒素中で急速凍結した。
【０１７８】
組織学用の固定、包埋、および切片：４％ＰＦＡ中での一晩の固定後、自動化Ｍｉｌｅｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔｉｓｓｕｅ−ＴＥＫ  ＶＩＰ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ内で肝生検をパラフィン中で一晩中浸透させてから、パラフィンブロック中に包埋した。５頭の異なる動物由来の生検を、１ブロックに包埋した。ブロックをトリミングして、１ブロックあたり２つの３μｍ切片を、Ｍｉｃｒｏｍ  ＨＭ３４０Ｅ  Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でカットした。
【０１７９】
肝臓トリグリセリドおよびコレステロールの分析用の組織ホモジェネーション（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｉｏｎ）：１ｍＬの５％ＮＨ−４０／ｄｄＨ２Ｏ溶液（ａｂ１４２２２７，Ａｂｃａｍ）を、高速用ＦａｓｔＰｒｅｐチューブに加えた。チューブをＦａｓｔＰｒｅｐホモジェナイザ内に入れて、２×６０秒間振盪させた。ホモジェナイゼーション後、サンプルを加熱ブロック内で３分間、８０〜１００℃にゆっくり加熱した。室温に冷却した後、加熱ステップを繰り返した。マイクロセントリフュージを用いて、サンプルをトップスピードにて２分間遠心分離して、あらゆる不溶性物質を除去した。上澄みを、使用まで−８０℃にて保存した。市販のキットによるオートアナライザＣｏｂａｓ  Ｃ−１１１（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ）を用いて、メーカーの説明書に従って、トリグリセリドおよび肝臓ホモジェネートのコレステロール含有量を、１回の判定で測定した。
【０１８０】
ＲＮＡｓｅｑ用のＲＮＡ精製：ＭＰ  ＦａｓｔＰｒｅｐ系を用いて、組織の溶解を実行した。簡潔に、供給会社によって推奨されるようにして、３０〜５０ｍｇの肝生検をホモジナイズして、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌｕｓ  ＲＮＡカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）でのＲＮＡ抽出に用いる。ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＲＮＡの量を評価した。
【０１８１】
肝臓の脂肪変性の評価
肝臓の脂肪変性を評価するために、肝臓切片をＨ＆Ｅで染色してから、Ｖｉｓｉｏｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）で分析した。特定の目的で設計したプロトコルを用いて、総面積のパーセンテージとして、脂肪変性の終末の肝臓定量的評価を記載した。ＨＥ染色：パラフィン包埋切片をキシレン中で脱パラフィンして、一連の勾配エタノール中で再水和させた。次に、切片をＭａｙｅｒ’ｓ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｃａｔ  ｎｏ．Ｓ３３０９，Ｄａｋｏ）中で５分間インキュベートして、流れる水道水中で５分間洗浄してから、Ｅｏｓｉｎ  Ｙ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＴ１１０２８０  ２．５Ｌ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で１５秒間染色した。スライドを水和させて、Ｐｅｒｔｅｘでマウントして、スキャン前に乾燥させた。
【０１８２】
総ＮＡＦＬＤ（ＮＡＳ）活性スコア
ＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）は、おそらくＮＡＳＨである患者に数値を与えるものであり、脂肪変性（０〜３）、小葉炎症（０〜３）、および肝細胞風船様腫大（０〜３）についての別々のスコアの総計である。大部分のＮＡＳＨ患者は、≧５のＮＡＳスコアを呈する。当該実験において、Ｋｌｅｉｎｅｒおよび共同研究者らによって概説される臨床基準（Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ，Ｋｌｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４１；２００５）を用いて、左葉由来の終末の肝臓組織を、ＮＡＳ用に収集した。ＮＡＳを判定するのに用いた基準を、以下の表１に記載する。
【０１８３】
【表２】
2018510900.tif 000014
【０１８４】
ＲＮＡｓｅｑ：肝臓の終末の遺伝子発現、および生物情報科学的分析
Ｓｐｌｉｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｏ  ａ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いて、配列データを、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースから得たハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ゲノムに対してアラインした。ＨＴＳｅｑパッケージ内で利用可能なパイソンスクリプトＨＴＳｅｑ−カウントを用いて、注釈領域にマッピングするリードの数をカウントした。全下流分析ステップを、Ｒについてのスクリプトとして実行した。バイオインフォマティクス分析のために、標準的なＲＮＡｓｅｑ品質コントロールパラメータを用いて、データの品質を評価した。群間変動および群内変動を評価するために、主成分分析および階層的クラスタリングを実行した。示差的に発現された遺伝子を同定するために、Ｒ−パッケージのｅｄｇｅＲを用いた。示差的に発現された遺伝子のリストを、確立されたＮＡＳＨバイオマーカーに関する情報と相互参照した。経路分析を実行して、群間での示差的に変動した経路を同定した。
【０１８５】
実施例２．Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスにおける食餌誘導肥満ＮＡＳＨ：オベチコール酸（ＯＣＡ）±リラグルチド（ＬＩＲＡ）
この研究のためのプロトコルおよび分析を、実施例１に記載している。
【０１８６】
処置群
群１：ビヒクル（ＰＯ）＋ビヒクル（ＳＱ）
マウス（ｎ＝１２）に、０から８週までビヒクルを投与した。
群２：ＯＣＡ（ＰＯ）＋ビヒクル（ＳＱ）
マウス（ｎ＝１２）に、０から８週まで、１０ｍｇ／ｋｇの用量にてＯＣＡを投与した。
群３：ＬＩＲＡ（ＳＱ）＋ビヒクル（ＰＯ）
マウス（ｎ＝１２）に、０から８週まで、０．１ｍｇ／ｋｇの用量にてＬＩＲＡを投与した。
群４：ＯＣＡ（ＰＯ）＋ビヒクル（ＳＱ）
マウス（ｎ＝１２）に、０から８週まで、３０ｍｇ／ｋｇの用量にてＯＣＡを投与した。
群５：ＬＩＲＡ（ＳＱ）＋ビヒクル（ＰＯ）
マウス（ｎ＝１２）に、０から８週まで、０．４ｍｇ／ｋｇの用量にてＬＩＲＡを投与した。
群６：ＯＣＡ（ＰＯ）＋ＬＩＲＡ（ＳＱ）
マウス（ｎ＝１２）に、０から８週まで、１０ｍｇ／ｋｇの用量にてＯＣＡを、そして０．１ｍｇ／ｋｇの用量にてＬＩＲＡを投与した。
群７：ＯＣＡ（ＰＯ）＋ＬＩＲＡ（ＰＯ）
マウス（ｎ＝１２）に、０から８週まで、３０ｍｇ／ｋｇの用量にてＯＣＡを、そして０．４ｍｇ／ｋｇの用量にてＬＩＲＡを投与した。
群８：リーン食コントロール群
マウス（ｎ＝９）に、０から８週まで、リーン食を給餌した。
【０１８７】
化合物および投薬
全マウスは、ＰＯ（ＯＣＡ）またはＳＱ（ＬＩＲＡ）投薬を１日１回受けた。０日目が投薬の最初の日であった一方、５５日目が最後の日であった。ゆえに、０日目から５５日目まで、５５日目を含めて、マウスに１日１回投薬した。マウスは、治療剤またはビヒクルを単独で合計１１２用量受けた。動物を、午後２：００〜４：００の間に処理した。ＯＣＡを、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇの最終用量濃度にするために、それぞれ１ｍｇ／ｍｌおよび３ｍｇ／ｍｌの最終ストック濃度に溶解した。ＯＣＡに用いるビヒクルは、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）であった。
【０１８８】
結果および考察
ＮＡＳスコア
非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の診断は、肝生検の脂肪変性、炎症、および肝細胞風船様腫大の特性パターンの存在によって確立される。ＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）は、おそらくＮＡＳＨである患者に数値を与えるものであり、大部分のＮＡＳＨ患者は、ＮＡＳ値が≧５である。ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスにおいて、全体の、そして個々の成分のＮＡＳ値に及ぼす、ＯＣＡ（１０および３０ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ）およびＬＩＲＡ（０．１および０．４ｍｇ／ｋｇ、ＳＱ）の、単独での、そして組み合わせた作用を評価した。例１Ａにおいて用いたように、低用量の組合せは、ＯＣＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）／ＬＩＲＡ（０．１ｍｇ／ｋｇ）を指す一方、高用量は、ＯＣＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）／ＬＩＲＡ（０．４ｍｇ／ｋｇ）を指す。
【０１８９】
図１Ａおよび図１Ｂはそれぞれ、８週の処置後のＯＣＡおよびＬＩＲＡの低用量の組合せおよび高用量の組合せの、ＮＡＳスコアの引下げを表す。データは、低用量の組合せおよび高用量の組合せが双方とも、コントロールに対して、総ＮＡＳを引き下げることを示している。特に、ＯＣＡおよびＬＩＲＡの低用量組合せの作用は、ビヒクル群およびＯＣＡ単独の低用量に対して、統計学的に有意であった。ＮＡＳにおける最大の向上は、約３ポイントであった。高用量組合せによる向上は、ＮＡＳ値を４．６から１．６まで引き下げた（ｐ＜０．０５、対ＯＣＡ単剤療法）。おおよそ２ポイントは、脂肪変性成分の引下げに起因した。脂肪変性成分に及ぼすＯＣＡおよびＬＩＲＡの低用量の組合せおよび高用量の組合せの作用を、それぞれ図２Ａおよび図２Ｂに示す。双方の用量組合せは、統計学的に有意に（ｐ＜０．０５、対ＯＣＡ単剤療法またはＬＩＲＡ単剤療法）、脂肪変性を改善した。
【０１９０】
肝臓のトリグリセリドおよびコレステロール
トリグリセリドおよびコレステロールが挙げられる脂質の蓄積によって脂肪肝が特徴付けられるので、ＯＣＡおよびＬＩＲＡの低用量の組合せおよび高用量の組合せの作用を調査した。８週の処置後、当該組合せは、図３Ａおよび図３Ｂに示すように、肝臓トリグリセリドを統計学的に有意に引き下げた。双方の用量組合せが、肝臓トリグリセリドおよびコレステロールのレベルを引き下げた一方、低用量の組合せが相乗作用を実現した。コレステロールに関して、高用量の組合せは、図４Ａおよび図４Ｂに示すように、肝臓中のコレステロールレベルを統計学的に有意に引き下げた。
【０１９１】
体重および組成
ＬＩＲＡは、米国において、肥満した個体における長期間にわたる体重管理のためのライフスタイルの付属物として示されている。しかしながら、甲状腺髄様癌、および壊死性膵炎が挙げられる急性膵炎のリスクが挙げられる、ＬＩＲＡに関連する潜在的リスクに起因して、ＲＥＭＳ（リスク評価・リスク緩和戦略：Ｒｉｓｋ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ）が、ＦＤＡによって要求された。ゆえに、より低い用量のＬＩＲＡを用いる一方で、その最大体重減少作用を維持することが非常に所望される。体重に及ぼす低用量の組合せの作用を、図５に示す。図５に示すように、ＯＣＡおよびＬＩＲＡの低用量の組合せは、単剤療法単独に対して、体重を約１３％、相乗的に減少させた。体組成に関して、図６Ａおよび図６Ｂは、低用量の組合せおよび高用量の組合せが、体重に対して脂肪過多（または脂肪組織量）を引き下げたことを明らかにしている。特に、ＯＣＡおよびＬＩＲＡの高用量組合せは、マウスにおける脂肪過多を相乗的に引き下げた。
【０１９２】
トランスクリプトミクス分析
研究マウス由来の肝臓ｍＲＮＡサンプルにＲＮＡ配列決定を実行して、併用療法による総ＮＡＳの改善に関する、根底にある機構および経路に対する洞察を得た。以下の遺伝子を調査した：細胞死誘導ＤＦＦＡ様エフェクタＣ；死エフェクタドメイン含有ＤＮＡ結合タンパク質２；２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡリアーゼ１、レクチングラクトース（ｇｌａｃｔｏｓｅ）結合；オキシステロール結合タンパク質様３；エストロゲン受容体；インスリン誘導遺伝子、リピン１；およびユビキノール−チトクロームＣレダクターゼヒンジタンパク質。低用量の組合せと、高用量の組合せと、コントロールと、各単剤療法との間で示差的に調節される遺伝子を比較した。研究由来の高脂肪食でマウスを維持した影響により、有意に上方制御される遺伝子および下方制御される遺伝子が、単剤療法処置または併用療法処置に応じて変化したプロセスが示される。単剤療法に対して、低用量組合せに影響された発現レベルの定量値を、図７Ａ〜図７Ｅに示す。表２は、線維症の進行に関与する遺伝子の予測される機能および質的調節を記載している。組合せは、遺伝子発現を、ビヒクル群に対して統計学的に有意に調節した。
【０１９３】
【表３】
2018510900.tif 000015
【０１９４】
高用量の組合せに影響される発現レベルの比較を、図８Ａ〜図８Ｄに記載する。表３は、ＮＡＳＨの進行における各遺伝子の予測された役割または機能を記載している。
【０１９５】
【表４】
2018510900.tif 000016
【０１９６】
実施例３．Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスにおける食餌誘導肥満ＮＡＳＨ：オベチコール酸（ＯＣＡ）±メトホルミン（ＭＥＴ）
この研究用のプロトコルおよび分析を、実施例１に記載している。
【０１９７】
処置群
群１：ビヒクル（ＰＯ）
マウス（ｎ＝１１）に、０〜８週までビヒクル（０．５％のＣＭＣ）を投与した。
群２：ＯＣＡ（ＰＯ）＋ビヒクル（ＰＯ）
マウス（ｎ＝１１）に、０〜８週まで、１０ｍｇ／ｋｇの用量にてＯＣＡを投与した。
群３：ＭＥＴ（ＰＯ）＋ビヒクル（ＰＯ）
マウス（ｎ＝１２）に、０〜８週まで、５０ｍｇ／ｋｇの用量にてＭＥＴを投与した。
群４：ＯＣＡ（ＰＯ）＋ビヒクル（ＰＯ）
マウス（ｎ＝１１）に、０〜８週まで、３０ｍｇ／ｋｇの用量にてＯＣＡを投与した。
群５：ＭＥＴ（ＰＯ）＋ビヒクル（ＰＯ）
マウス（ｎ＝１２）に、０〜８週まで、１５０ｍｇ／ｋｇの用量にてＭＥＴを投与した。
群６：ＯＣＡ（ＰＯ）＋ＭＥＴ（ＰＯ）
マウス（ｎ＝１２）に、０〜８週まで、１０ｍｇ／ｋｇの用量にてＯＣＡを、そして５０ｍｇ／ｋｇの用量にてＭＥＴを投与した。
群７：ＯＣＡ（ＰＯ）＋ＭＥＴ（ＰＯ）
マウス（ｎ＝１０）に、０〜８週まで、３０ｍｇ／ｋｇの用量にてＯＣＡを、そして１５０ｍｇ／ｋｇの用量にてＭＥＴを投与した。
群８：リーン食コントロール群
マウス（ｎ＝１０）に、０〜８週まで、リーン食を給餌した。
【０１９８】
化合物および投薬
全マウスは、ＰＯ投薬を１日１回受けた。０日目が投薬の最初の日であった一方、５５日目が最後の日であった。ゆえに、０日目から５５日目まで、５５日目を含めて、マウスに１日１回投薬した。マウスは、合計５６用量受けた。動物を、午後２：００〜４：００の間に処理した。ＯＣＡを、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇの最終用量濃度にするために、それぞれ１ｍｇ／ｍｌおよび３ｍｇ／ｍｌの最終ストック濃度に溶解した。投薬容量は、１０ｍＬ／ｋｇであった。ＭＥＴを、５０ｍｇ／ｋｇおよび１５０ｍｇ／ｋｇの最終用量濃度にするために、それぞれ５ｍｇ／ｍｌおよび１５ｍｇ／ｍｌの最終ストック濃度に調製した。投薬容量は、１０ｍＬ／ｋｇであった。ＯＣＡおよびＭＥＴに用いるビヒクルは、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）であった。
【０１９９】
結果
ＮＡＳスコア
非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の診断は、肝生検の脂肪変性、炎症、および肝細胞風船様腫大の特性パターンの存在によって確立される。ＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）は、おそらくＮＡＳＨである患者に数値を与えるものであり、大部分のＮＡＳＨ患者は、ＮＡＳスコアが≧５である。ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスにおいて、全体の、そして個々の成分のＮＡＳに及ぼす、ＯＣＡ（１０および３０ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ）およびＭＥＴ（５０および１５０ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ）の、単独での、そして組み合わせた作用を調査した。例１Ｂにおけるように、低用量の組合せは、ＯＣＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）／ＭＥＴ（５０ｍｇ／ｋｇ）を指す一方、高用量の組合せは、ＯＣＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）／ＭＥＴ（１５０ｍｇ／ｋｇ）を指す。
【０２００】
図９Ａは、総ＮＡＳに及ぼす、ＯＣＡおよびＭＥＴの高用量の組合せの作用を表す。ＯＣＡおよびＭＥＴの高用量の組合せは、研究の終了時、ＮＡＳを、統計学的に有意に引き下げた（ｐ＜０．０５、対ＯＣＡコントロール）。個々の成分に関して、脂肪変性成分に及ぼす、ＯＣＡおよびＭＥＴの高用量の組合せの作用を、図９Ｂに示す。
【０２０１】
血中グルコースレベル
経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）は、血液からグルコースが一掃される時間を判定するために、グルコースを経口投与して、後になって血液サンプルを採る医学的試験である。アッセイを実行して、糖尿病、インスリン抵抗性、および障害のあるベータ細胞の機能を試験する。研究の４週目に、グルコースの用量を経口投与して、血中レベルを４時間後に分析した。図１０Ａおよび図１０Ｂは、ＯＣＡおよびＭＥＴの低用量の組合せおよび高用量の組合せが、ＤＩＯ−ＮＡＳＨビヒクル群と比較して、処置の４週目に血中グルコースを引き下げたことを示す。表４は、ＯＧＴＴにおいて測定したように、低用量の組合せおよび高用量の組合せの血中グルコースレベル（ＡＵＣ）を記載する。
【０２０２】
【表５】
2018510900.tif 000017
【０２０３】
示差的遺伝子発現分析
研究マウス由来の肝臓ｍＲＮＡサンプルにＲＮＡ配列決定を実行して、併用療法による総ＮＡＳの改善に関する、根底にある機構および経路に対する洞察を得た。ＯＣＡおよびＭＥＴで単独で、そして組み合わせて処理した動物から収集した終末の肝臓サンプルに、示差的遺伝子発現分析を行った。低用量の組合せと各単剤療法との間で示差的に調節される遺伝子を比較した。図１１、および表５のデータは、ＯＣＡおよびＭＥＴによって単独で、そして組み合わせて調節された遺伝子の数を開示している。通常、単剤療法処置は、ビヒクル群に対して、遺伝子を変えない一方、組み合わされて、ビヒクル群に対して、いくつかの遺伝子が一意的に調節され、これは、ＮＡＳＨを改善する相乗作用と矛盾がない。図１２Ａ〜図１２Ｃのヴェン図は、調節された遺伝子の数の比較を容易にする。結果は、特有の線維症関連遺伝子が、単剤療法群に対して、組み合わされて調節されたことを実証しており、これは、ＮＡＳＨを改善する相乗作用と矛盾がない。
【０２０４】
【表６】
2018510900.tif 000018
【０２０５】
低用量の組合せについて、コラーゲン受容体ファミリにおける以下の遺伝子が、一意的に調節された：コラーゲン１４ａ１型、コラーゲン６ａ１型、およびコラーゲン６ａ２型。それぞれ図１３Ａ〜図１３Ｃ参照。調節された他の注目する遺伝子は、デコリン受容体、コレクチンサブファミリメンバ１０、トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩＩ、およびトランスフォーミング増殖因子（ベータ誘導）である。図１４Ａ〜図１４Ｆ参照。
【０２０６】
高用量の組合せについて、コラーゲン受容体ファミリにおける、示差的に調節された遺伝子は、コラーゲン１４ａ１型、コラーゲン６ａ１型、およびコラーゲン６ａ２型である。それぞれ図１５Ａ〜図１５Ｃ参照。他の注目する遺伝子、例えば、血小板由来増殖因子受容体ベータ、デコリン、コレクチンサブファミリメンバ１０、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体ＩＩＩ、およびトランスフォーミング増殖因子（ベータ誘導）（図１６Ａ〜図１６Ｅ）を調査した。
【０２０７】
線維症因子遺伝子に関して、コラーゲン受容体ファミリが特に注目される。コラーゲンは、全身の多くの場所に見られる。しかしながら、ヒト体内のコラーゲンの９０％超は、Ｉ型である。動物組織中には２９の遺伝的に異なるコラーゲンが存在する。コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、およびＸＩ型は、Ｄ周期の横紋細線維（Ｄ−ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｃｒｏｓｓ−ｓｔｒｉａｔｅｄ  ｆｉｂｒｉｌ）に自己集合する。ここで、Ｄはおおよそ６７ｎｍであり、コラーゲンの軸方向の定期性は特徴的である。これらは、脊椎動物において最も豊富なコラーゲンを形成する。
【０２０８】
ラミニン１受容体は、膜リモデリングに関与している（より低いラミニンレベルを達成することが、線維症を処置するために所望される）。コレクチンは、コラーゲン様配列および炭水化物認識ドメインを有するタンパク質であるＣ−レクチンファミリのメンバをコードする。このファミリの他のメンバは、分泌タンパク質であり、微生物上の炭水化物抗原に結合して、その認識および除去を促進する。デコリンは、コラーゲン細線維集合において役割を果たす。このタンパク質の、多様な細胞表面受容体への結合が、自食および炎症に及ぼす促進作用、ならびに血管形成および腫瘍形成に及ぼす阻害作用が挙げられる、腫瘍抑制におけるその役割を果たす。腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリおよびトランスフォーミング増殖因子は、炎症／線維化の進行に関与している。
【０２０９】
実施例４．Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスの食餌誘導肥満ＮＡＳＨ：オベチコール酸（ＯＣＡ）±シタグリプチン（ＳＩＴ）
この研究用のプロトコルおよび分析を、実施例１に記載している。
【０２１０】
処置群
群１：ビヒクル（ＰＯ）＋ビヒクル（ＰＯ）
マウス（ｎ＝１１）に、０〜８週まで、ビヒクル（０．５％ＣＭＣ）を投与した。
群２：ＯＣＡ（ＰＯ）＋ビヒクル（ＳＱ）
マウス（ｎ＝１１）に、０〜８週まで、１０ｍｇ／ｋｇの用量にてＯＣＡを投与した。
群３：ＳＩＴ（ＰＯ）＋ビヒクル（ＰＯ）
マウス（ｎ＝１２）に、０〜８週まで、１０ｍｇ／ｋｇの用量にてＳＩＴを投与した。
群４：ＯＣＡ（ＰＯ）＋ビヒクル（ＳＱ）
マウス（ｎ＝１１）に、０〜８週まで、３０ｍｇ／ｋｇの用量にてＯＣＡを投与した。
群５：ＳＩＴ（ＰＯ）＋ビヒクル（ＰＯ）
マウス（ｎ＝１２）に、０〜８週まで、３０ｍｇ／ｋｇの用量にてＳＩＴを投与した。
群６：ＯＣＡ（ＰＯ）＋ＳＩＴ（ＰＯ）
マウス（ｎ＝１２）に、０〜８週まで、１０ｍｇ／ｋｇの用量にてＯＣＡを、そして１０ｍｇ／ｋｇの用量にてＳＩＴを投与した。
群７：ＯＣＡ（ＰＯ）＋ＳＩＴ（ＰＯ）
マウス（ｎ＝１０）に、０〜８週まで、３０ｍｇ／ｋｇの用量にてＯＣＡを、そして３０ｍｇ／ｋｇの用量にてＳＩＴを投与した。
群８：リーン食コントロール群
マウス（ｎ＝１０）に、０〜８週まで、リーン食を給餌した。
【０２１１】
化合物および投薬
全マウスは、ＰＯ投薬を１日１回受けた。０日目が投薬の最初の日であった一方、５５日目が最後の日であった。ゆえに、０日目から５５日目まで、５５日目を含めて、マウスに１日１回投薬した。マウスは、合計５６用量受けた。動物を、午後２：００〜４：００の間に処理した。ＯＣＡを、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇの最終用量濃度にするために、それぞれ１ｍｇ／ｍｌおよび３ｍｇ／ｍｌの最終ストック濃度に溶解した。投薬容量は、１０ｍＬ／ｋｇであった。ＳＩＴを、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇの最終用量濃度にするために、それぞれ５ｍｇ／ｍｌおよび１５ｍｇ／ｍｌの最終ストック濃度に調製した。投薬容量は、１０ｍＬ／ｋｇであった。ＯＣＡおよびＳＩＴに用いるビヒクルは、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）であった。
【０２１２】
結果
ＤＰＰ−ＩＶ活性
処置の２週目のＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの血漿ＤＰＰ−ＩＶ活性に及ぼすＯＣＡ（１０および３０ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ）の単独での、そしてＳＩＴ（１０および３０ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ）と組み合わせた作用を調査した。低用量の組合せは、ＯＣＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）／ＳＩＴ（１０ｍｇ／ｋｇ）を指す一方、高用量の組合せは、ＯＣＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）／ＳＩＴ（３０ｍｇ／ｋｇ）を指す。ＯＣＡおよびＳＩＴの低用量の組合せは、ＤＰＰ−ＩＶ活性を、統計学的に有意に引き下げた（ｐ＜０．０１、対ＤＩＯ−ＮＡＳＨビヒクル）。さらに、ＯＣＡおよびＳＩＴの高用量の組合せは、ＤＰＰ−ＩＶ活性を、統計学的に有意に引き下げた（ｐ＜０．０１、対ＤＩＯ−ＮＡＳＨビヒクル）。薬理学的結果は、治療剤が、予想される作用、すなわちＤＰＰ−ＩＶ阻害をもたらしたことを実証している。
【０２１３】
実施例５．オベチコール酸（ＯＣＡ）±エンパグリフロジン（ＥＭＰ）
処置群
群１：ビヒクル（ＰＯ）
マウスに、週０〜８までビヒクル（０．５％ＣＭＣ）を投与する。
群２：ＯＣＡ（ＰＯ）＋ビヒクル（ＰＯ）
マウスに、週０〜８まで、１０ｍｇ／ｋｇの用量にてＯＣＡを投与する。
群３：ＥＭＰ（ＰＯ）＋ビヒクル（ＰＯ）
マウスに、週０〜８まで、３ｍｇ／ｋｇの用量にてＥＭＰを投与する。
群４：ＯＣＡ（ＰＯ）＋ビヒクル（ＰＯ）
マウスに、週０〜８まで、３０ｍｇ／ｋｇの用量にてＯＣＡを投与する。
群５：ＥＭＰ（ＰＯ）＋ビヒクル（ＰＯ）
マウスに、週０〜８まで、１０ｍｇ／ｋｇの用量にてＥＭＰを投与する。
群６：ＯＣＡ（ＰＯ）＋ＥＭＰ（ＰＯ）
マウスに、週０〜８まで、１０ｍｇ／ｋｇの用量にてＯＣＡを、そして３ｍｇ／ｋｇの用量にてＥＭＰを投与する。
群７：ＯＣＡ（ＰＯ）＋ＥＭＰ（ＰＯ）
マウスに、週０〜８まで、３０ｍｇ／ｋｇの用量にてＯＣＡを、そして１０ｍｇ／ｋｇの用量にてＥＭＰを投与する。
群８：リーン食コントロール群
マウス（ｎ＝１０）に、週０〜８まで、リーン食を給餌する。
【０２１４】
化合物および投薬
全マウスは、ＰＯ投薬を１日１回受けることになる。０日目が投薬の最初の日である一方、５５日目が最後の日であった。ゆえに、０日目から５５日目まで、５５日目を含めて、マウスに１日１回投薬する。マウスは、合計５６用量受けることとなる。動物を、午後２：００〜４：００の間に処理する。ＯＣＡを、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇの最終用量濃度にするために、それぞれ１ｍｇ／ｍｌおよび３ｍｇ／ｍｌの最終ストック濃度に溶解する。投薬容量は、１０ｍＬ／ｋｇである。ＥＭＰを、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの最終用量濃度にするために、それぞれ５ｍｇ／ｍｌおよび１５ｍｇ／ｍｌの最終ストック濃度に調製した。投薬容量は、１０ｍＬ／ｋｇであった。ＯＣＡおよびＥＭＰに用いるビヒクルは、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）であった。
【０２１５】
Ｈｏｎｄａ，ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＳＧＬＴ２  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｉｐｒａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ  Ｈａｓ  ａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ」，ＰｌｏＳ，２０１６は、ナトリウムグルコース共輸送体２阻害剤（例えばエンパグリフロジン）の、ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスにおける作用について調査したことを記載している。
【０２１６】
実施例６：肝細胞のサンドイッチ培養
試薬および溶液
適切な細胞培地として、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ  ＭＢ−７５２／１、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’培地Ｅ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ１５、および改変Ｃｈｅｅ’ｓ培地が挙げられる。ＩＶ型コラゲナーゼ、Ｉ型コラーゲン、パーコール、培地、および補助剤が、培地（例えば、血清、抗生物質、アミノ酸、ホルモン、例えばＤＥＸ、インスリン、および増殖因子）、潅流バッファ、および他の溶液に加えられて、市販され、または市販の材料から製造された。他のタイプのコラーゲン（ＩＩ〜ＩＶ型）、ラミニン、フィブロネクチン、およびヘパリン硫酸プロテオグリカンを、サンドイッチ肝細胞培養に用いることができる。しかしながら、細胞を培養する際に、Ｉ型およびＩＶ型コラーゲンが、フィブロネクチンおよびラミニンよりも優れていたことが示された。
【０２１７】
肝細胞の単離
肝細胞を単離するのに、ツーステップインサイチュコラゲナーゼ潅流法を利用する。簡潔に、肝細胞を雌ルイスラットから単離する。動物を麻酔する。肝臓を最初に、門脈を通してインサイチュで、潅流バッファで潅流する。潅流液は、肝臓に入る前に平衡化される。その後、肝臓を、潅流バッファ中コラゲナーゼで潅流する。肝臓を摘出して、氷冷した潅流バッファに移す。肝被膜を解し分けて（ｔｅａｓｅ  ａｐａｒｔ）、生じた細胞懸濁液を濾過する。細胞ペレットを遠心分離によって収集して、再懸濁させる。パーコールを懸濁液に加えて、パーコール密度遠心分離技術を用いて、肝細胞を分離する。ミクスチュアを遠心分離して、細胞ペレットを培地で２回洗浄する。肝細胞生存率を、トリパンブルー排除によって判定する。これ以外にも、フレッシュに単離した肝細胞の代わりに、低温保存した肝細胞を用いる。
【０２１８】
肝細胞のサンドイッチ培養
コラーゲンコーティングした組織培養プレート上で、単離した肝細胞を培養して、血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、表皮増殖因子、インスリン、グルカゴン、およびヒドロコルチゾンを補った培地中で維持する。Ｉ型コラーゲン溶液および培地を混合することによって、コラーゲンゲル化溶液を調製する。組織培養プレートをゲル化溶液でコーティングし、そして３７℃でインキュベートして、ゲル形成を促進する。肝細胞を適切な密度で播種して、３７℃にて維持する。培地を２４時間毎に置き換える。
【０２１９】
サンドイッチ系について、培養の１日後、細胞を覆うように更なるコラーゲンゲル溶液を分配する。コラーゲンゲルの第２の層が、プレート全体をおおって平らに広がるのを確実にするように、培地を注意深く除去する。培養プレートを３７℃にてインキュベートして、第２のゲル層のゲル化および付着が認められてから、培地を置き換える。培地は毎日変える。培地サンプルを、更なる分析用に、−２０℃にて保存する。
【０２２０】
ゲル化したコラーゲンの層の間で培養された肝細胞は、インビボで観察されるのと類似する、三次元の立方体様の形状、および細胞骨格タンパク質の分布を維持する。
【０２２１】
胆細管ネットワーク形成の最適化
タウロコール酸塩の蓄積および胆汁排泄を最適化するために、特定の培地、例えばＷｉｌｌｉａｍｓ’培地ＥおよびＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ培地を、サンドイッチ肝細胞培養に用いることができる。
【０２２２】
被験物質
研究用に意図するＦＸＲアゴニストは、「ＯＣＡ」および６−エチルケノデオキシコール酸（６−ＥＣＤＣＡ）としても知られているオベチコール酸である。
【０２２３】
実施例７：肝細胞からのグルコース放出に及ぼす被験物質の作用の評価
肝細胞の単離
断食の１２時間後に、６ヵ月齢の雌のブタから肝臓を得る。組織を動物から収穫する。Ｓｅｇｌｅｎ（Ｓｅｇｌｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３，２９（１９７６））によって記載される手順に基づくツーステップインサイチュコラゲナーゼ潅流法の改変によって、肝細胞を単離する。動物を殺して１５分以内に、肝臓の右葉を取り出してから、３７℃の肝臓潅流培地で１５〜２０分間、続いて肝臓消化培地で２０〜３０分間、潅流する。肝細胞を、懸濁培地［５．５ｍＭグルコースおよび１ｍＭピルビン酸Ｎａが入ったＤＭＥＭ中、２６．５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、８．９９ｍＭ  Ｎａ−ＨＥＰＥＳ、０．２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＢＳＡ画分Ｖ、２．２２ｍＭ  Ｄ−フクルトース］中での消化した肝臓の穏やかな破壊によって単離して、２００μｍメッシュで濾過する。生じた細胞懸濁液を５００ｒｐｍにて遠心分離して、上澄みを破棄する。細胞ペレットを、予め温めた（３７℃）懸濁培地中に再懸濁させる。細胞生存率は、トリパンブルー排除法（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて評価すると、一貫して８５％よりも高い。細胞計数を３反復実行して、平均値を得る。
【０２２４】
懸濁培養
単離の後直ちに、肝細胞を、グルコースもピルビン酸塩もない血清フリーＤＭＥＭで３回洗浄してから、６００μｌの同じ培地中に、５０ｍｌのコニカルチューブ中３０×１０６／ｍｌの細胞密度にて再懸濁させる。チューブを継続的に振盪しながら、単独で、または、濃度を増大させた、本出願の化合物（例えばＯＣＡ）、および少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載するもの）と一緒に、１０、２０、そして４０分間、３７℃にてインキュベートする。各実験において、１００ｎＭグルカゴンによる刺激後のグルコース産生を、ポジティブコントロールとして用いる。
【０２２５】
インキュベーション期間の後、培地中に放出されるグルコースを、Ｔｒｉｎｄｅｒアッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて、グルコースオキシダーゼ法で判定して、全反復の結果を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキットを用いて判定するタンパク質含有量について、正規化する。
【０２２６】
実施例８：肝細胞におけるグルコース代謝に及ぼす被験物質の作用の評価
細胞培養
以前に記載される（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６２，４２５（１９８９））ようにして、雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２００〜２５０ｇ）から肝細胞を、肝臓のコラゲナーゼ潅流によって単離する。トリパンブルー排除によって評価する生存率は、ごく普通に９０％を超える。６ウェルの、コラーゲンコーティングしたプレートに、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎児血清を含有する２ｍＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地と共に、ウェルあたり１０６個の生細胞をロードする。１時間（この間、生細胞のみがプレートに付着した）後に、培地を（付着していない死細胞と共に）吸い出して、フレッシュな培地と置き換える。細胞を、最大４８時間維持する（少なくとも１回、培地を２４時間目に変える）。動物の手順は、米国科学アカデミー（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の人道的取扱い基準（ｈｕｍａｎｅ  ｃａｒｅ  ｃｒｉｔｅｒｉａ）に従う。
【０２２７】
グルコース代謝
肝細胞グルコース代謝のパラメータを、本出願の化合物（例えばＯＣＡ）、および少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載するもの）の不在下または存在下での１８時間のインキュベーション後に、測定する。［５−３Ｈ］−グルコースの存在下（６．５μＣｉ／ｍＬ）での２時間の肝細胞のインキュベーション後、グルコース利用を、（脂肪酸酸化実験に関しての）トリチウム水の生産として判定する。２−［３Ｈ］−デオキシグルコース（ＤＯＧ；１０μｍｏｌ／Ｌ、０．５μＣｉ／ｍＬ）の吸収を、各期間中、１００ｎｍｏｌ／Ｌインスリンを含めた、または含めないプレインキュベーションの３０分後に、５分にわたって判定する（Ｐｅｒｄｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，２７１７７（２００４））。グリコーゲン中へのＤ−［１４Ｃ］−グルコース（２μＣｉ／ｍＬ）の組込みを、１時間にわたって、インスリンの不在下または存在下で測定する（Ｐｅｒｄｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。
【０２２８】
実施例９：肝細胞およびマウスにおける、グルコース代謝に及ぼす被験物質の作用の評価
細胞培養および一過性トランスフェクション
記載される（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２２，１６２２（２００８））ようにして、ヒト肝芽腫細胞（ＨｅｐＧ２）を、６ウェルプレート中に播種して（１×１０６細胞／ウェル）、完全培地［１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）不活化ウシ胎児血清および１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）抗生物質−抗真菌薬を与えた高グルコースＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（Ｌ−グルタミン入り）］中で増殖させる。翌日、細胞を、本出願（例えばＯＣＡ）の化合物、および少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載するもの）で処理する。処理の１８時間後に、細胞を、ＴＰＡ（５０ｎＭ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）、またはＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）で処理してから、６時間のインキュベーション後に、ＲＮＡ単離のために収集する。
【０２２９】
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、ＨｅｐＧ２細胞の一過性トランスフェクションを実行する。特に明記しない限り、細胞を１８時間、本出願の化合物（例えばＯＣＡ）、および少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載するもの）で前処理する。細胞を、ＬＰＳもしくはＴＰＡ有り、または無しで処理する。６時間のインキュベーション後に、細胞を収穫して、デュアルルシフェラーゼリポータアッセイ系を用いて、メーカーの説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に従って、ルシフェラーゼ活性を判定する。コントロールチミジンキナーゼ駆動レニラルシフェラーゼプラスミド、ｐｈＲＬ−Ｔｋのコトランスフェクションを介して、ルシフェラーゼ活性を正規化する。データを、非刺激セットの活性化に対する活性化の倍数として表す。
【０２３０】
マウス一次肝細胞培養
記載される（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１８，２４０２（２００４），Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３，１３７（２００４），Ｑｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２，２６２９（２００１））ようにして、８週齢のマウスから、一次肝細胞を調製する。細胞を、本出願（例えばＯＣＡ）の化合物、および少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載するもの）で処理する。処理の１８時間後に、細胞を、ＬＰＳ（２０μｇ／ｍＬ）、ＴＰＡ（１５０ｎＭ）、またはＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）で処理してから、６時間のインキュベーション後に、ＲＮＡ単離のために収集する。
【０２３１】
ＲＮＡ単離および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
ＨｅｐＧ２細胞、一次マウス肝細胞、およびマウス肝臓からの全ＲＮＡ単離、ならびに定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、記載される（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７，８６３（２００７））ようにして、実行する。内部基準として、β−アクチンの増幅を用いる。
【０２３２】
動物
特に明記しない限り、８週齢のマウス用いる。野生型マウスおよびＦＸＲ−／−マウスを、標準的な１２：１２時間の明／暗サイクル下の病原体フリー動物施設内で維持する。マウスに、標準的な齧歯類食および水を不断給餌する。８週齢の雌の野生型マウスおよびＦＸＲ−／−マウスを、一晩断食させてから、ＬＰＳ（２０ｍｇ／ｋｇ）もしくはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または本出願の化合物（例えばＯＣＡ）および少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載するもの）の単回用量を腹膜内注射してから、水を不断給餌する。注射の６時間後に、マウスを殺して、血液および肝臓を、更なる分析用に取り出す。全ての手順は、ラボ動物の取扱いおよび使用についての国立衛生研究所のガイドラインに従った。
【０２３３】
実施例１０：動物モデルにおける被験物質の作用の評価
インスリン抵抗性は、メタボリックシンドローム（ＭｅｔＳ）において、脂肪組織（ＡＴ）機能障害を肝臓炎症および脂肪変性と関連付ける推定の重要な基礎的機構である。ＯＣＡが、インスリン抵抗性および代謝プロフィールを改善して、ＭｅｔＳの高脂肪食（ＨＦＤ）誘導ウサギモデルにおける内臓ＡＴ（ＶＡＴ）の量を著しく引き下げることが実証されてきた。免疫組織化学、ウエスタンブロット、およびＲＴ−ＰＣＲによるＶＡＴおよび肝臓の分析により、脂肪細胞サイズ、低酸素症、ならびに、コントロール食に基づくウサギと比較して、ＨＦＤウサギから単離されるＶＡＴにおいて有意に増大する、ペリリピンおよび細胞質ゾルインスリン調節グルコーストランスポータＧＬＵＴ４（ＳＬＣ２Ａ４）の発現を、インビボＯＣＡ投薬が正常化することが示されてきた。インビボＯＣＡ投薬はまた、ＨＦＤウサギにおける脂肪変性および炎症マーカーの発現を正常化する。
【０２３４】
ＭｅｔＳウサギモデル
以前に記載されるようにして（Ｆｉｌｉｐｐｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｅｘｕａｌ  Ｍｅｄ．６，３２７４（２００９））、ＭｅｔＳのＨＦＤ誘導ウサギモデルを得る。約３ｋｇの体重の雄Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅウサギにランダムに番号をつけて、２つの異なる群：１２週間、コントロール食（ＣＯＮ）を給餌した未処理群、またはＨＦＤ（０．５％コレステロールおよび４％ピーナッツ油）を給餌した処理群に割り当てる。ＨＦＤウサギの亜群を、本出願の化合物（例えばＯＣＡ）および少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載するもの）で処理する。用いるＯＣＡの用量を、齧歯類における有効性、および実行する薬物動態学的分析に基づいて、選択してよい（Ｐｅｌｌｉｃｃｉａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５，３５６９（２００２））。また、本明細書中に記載するもの等の更なる治療剤の用量を、文献において公開されるように、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ）における有効性、および薬物動態学的分析に基づいて、選択してよい。
【０２３５】
全ての群において、ベースラインにて、そして１２週目に、耳末梢静脈から血液サンプルを得る。以前に記載される（Ｆｉｌｉｐｐｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９）ようにして、平均動脈圧測定および経口グルコース負荷試験を、殺す前に実行する。処理の１２週後、致死量のペントバルビタール（１００ｍｇ／ｋｇ）を用いてウサギを殺して、肝臓、ＶＡＴ（腸係蹄と腸間膜との間に蓄積）、および胆嚢の標本を、その後の分析用に注意深く摘出し、秤量し、収集し、そして処理する。全ウサギ群由来のＶＡＴサンプルを、前脂肪細胞の単離用に処理する。以前に記載される（Ｆｉｌｉｐｐｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９，Ｍｏｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２，８０（２０１２），Ｖｉｇｎｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２１２，７１（２０１２））ようにして、生化学的分析およびホルモンによる血清分析を実行する。
【０２３６】
ＭｅｔＳの作用を評価するために、以下の要因の１つまたは複数の、ダミー変数としての存在を考慮するアルゴリズムを設計する：高血糖、高トリグリセリドレベル、高コレステロールレベル、高血圧、および内臓脂肪蓄積。各因子についてのカットオフを、ＣＯＮウサギにおいて測定した、分析したパラメータの平均±２Ｓ．Ｄ．によって導き出す。３またはそれ以上の要因についての陽性が、ＭｅｔＳを示す。
【０２３７】
サンプルサイズ
ＭｅｔＳの発生の可能性をＣＯＮ群において２．５％、そしてＨＦＤ群において可能性を６０％とみなして（Ｆｉｌｉｐｐｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９，Ｖｉｇｎｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｅｘｕａｌ  Ｍｅｄ．８，５７（２０１１），Ｖｉｇｎｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｍａｎｅｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２１５，３４７（２０１２），Ｍｏｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｍｏｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ７３，４２８（２０１３））、群間の割当て比率を１：１にして７４頭のウサギを用いると、２つの処理群間でのＭｅｔＳの進行速度の差異を区別するのに、１００％に近い力が認められることとなる。ＭｅｔＳの発生の可能性を、ＨＦＤを供給した群において６０％に等しく、そしてＨＦＤ、ならびに本出願の化合物（例えばＯＣＡ）および少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載するもの）を供給した群において可能性を１０％とみなして（Ｖｉｇｎｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ｍｏｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）、割当て比率を２：１にして５４頭のウサギを用いると、２つの処理群間でのＭｅｔＳの進行速度の差異を区別するのに、約９５％の力が認められることとなる。
【０２３８】
ＶＡＴの組織形態計測的分析
以前に記載される（Ｍａｎｅｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）ようにして、脂肪細胞の直径を測定するために、フリーソフトウェアプログラムＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ、米国）を備えるＮｉｋｏｎ  Ｍｉｃｒｏｐｈｏｔ−ＦＸＡ顕微鏡（株式会社ニコン、東京、日本）を用いて、脂肪細胞が一様に球形であるとみなして、ヘマトキシリンおよびエオシン染色によって、ＶＡＴ標本を分析する。
【０２３９】
低酸素症の検出および免疫組織化学
以前に記載される（Ｍａｎｅｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｍｏｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，２０１３，Ｖｉｇｎｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）ようにして、生体内還元性薬物ピモニダゾール塩酸塩（ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１、６０ｍｇ／ｋｇ）を用いて、殺す１時間前にｉ．ｐ．注射して、ＶＡＴ酸化を分析する。
【０２４０】
ウエスタンブロット分析用の総および膜／細胞質ゾル画分の調製
ＶＡＴサンプルからのタンパク質抽出のために、凍結した組織を液体窒素中ですり潰して、２つのアリコートに分割する：一方が総タンパク質抽出用、そして他方が膜／細胞質ゾル調製用。ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ抽出キット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を用いて、メーカーの説明書に従って、膜画分および細胞質ゾル画分を調製する。タンパク質抽出物を、ＢＣＡ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，米国）で定量化して、各サンプルの１５ｍｇを、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。以前に記載される（Ｍａｎｅｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）ようにして、抗グルコーストランスポータ４型（ＧＬＵＴ４）抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ、米国）および抗ペリリピン抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）によるウエスタンブロット分析を実行する。抗アクチン抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で膜を再プロービングすることによって、等しいタンパク質ローディングを確認する。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを用いて、バンド強度の濃度測定分析を実行する。
【０２４１】
肝臓の組織学
肝臓の脂肪変性を、肝臓切片のＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色によって評価する。凍結した切片をクリオスタット内でカットして、４％パラホルムアルデヒド中で室温（ＲＴ）にて２０分間固定する。次に、切片をイソプロパノールで２〜５分間処理して、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏで２０分間染色する。ストック溶液（１００ｍｌイソプロパノール中０．３ｇＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ）を水で希釈（３：２）してから濾過することによって、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏを調製する。Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色後に、肝細胞核を強調するために、切片を水中で数回洗浄して、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。最後に、切片を写真に撮って、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを用いたバックグラウンド除去後に、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ陽性のコンピュータ支援定量化を行う。
【０２４２】
肝臓切片中の炎症性マーカーについての免疫組織化学
肝臓切片を、種々の炎症性マーカー（例えば、ＴＮＦα、Ｃｄ６８、Ｉｌ−６、Ｉｌ−１ｂ、およびＩｌ−１２）に対する一次抗体と、４８℃にて一晩インキュベートする。切片をＰＢＳ中でリンスして、ビオチン化された二次抗体と、その後ストレプトアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体とインキュベートする（Ｕｌｔｒａｖｉｓｉｏｎ  ｌａｒｇｅ  ｖｏｌｕｍｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｔｉ−ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ，Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ、米国）。反応産物を、クロモゲンとしての３’，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で現像する。一次抗体を除くことによって、コントロール実験を実行する。Ｎｉｋｏｎ  Ｍｉｃｒｏｐｈｏｔ−ＦＸＡ顕微鏡を用いて、スライドを評価して、写真に撮る。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを用いたバックグラウンド除去後に、炎症性マーカーに対する染色のコンピュータ支援定量化を行う。
【０２４３】
ウサギ内蔵脂肪の前脂肪細胞の単離、特徴付け、および分化
以前に記載される（Ｍａｎｅｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）ようにして、ＶＡＴからのウサギ前脂肪細胞（ｒＰＡＤｓ）の単離を実行する。簡潔に、ＶＡＴサンプルを、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ２型（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１時間消化して、赤血球溶解バッファ（１５５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；室温にて１０分）で処理してから、２０００ｇで室温にて１０分間遠心分離して、完全培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＢ）、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および１ｍｇ／ｍｌアンホテリシンＢを含有するＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に再懸濁させて、１５０ｍｍのメッシュフィルタで濾過して、残渣を除去する。最後に、細胞を、完全培地中で、９５％空気−５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で３７℃にて培養する。継代０（Ｐ０）でのサブコンフルエント（細胞培養皿の９０％）な均質の線維芽細胞様細胞集団が、培養の４〜５日後に得られる。サブコンフルエントな細胞をトリプシン処理して、細胞培養皿内にプレーティングする（Ｐ１）。全ての実験について、Ｐ１培養体のみを用いる。各実験群について、少なくとも３つの異なるｒＰＡＤ調製体を用いて、実験を繰り返す。以下の結合モノクローナル抗体：以前に記載される（Ｍａｎｅｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）、ＣＤ３４−ＰＥ、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ、ＣＤ３１−ＦＩＴＣ、ＣＤ１４−ＰＥ、ＣＤ９０−ＰＥ、ＣＤ１０６−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、米国）、およびＣＤ１０５−ＰＥ（Ａｎｃｅｌｌ，Ｂａｙｐｏｒｔ，ＭＮ、米国）によるフローサイトメトリによって、ｒＰＡＤを特徴付ける。コンフルエンスの２日後（０時）に、５％ｓｔｒｉｐｐｅｄ  ＦＢＳを補ったＤＭＥＭ中５ｍｇ／ｍｌインスリン、１ｍＭデキサメタゾン、および０．５ｍＭ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を含有する分化ミクスチュア（ＤＩＭ）にｒＰＡＤを８日間曝すことによって、ｒＰＡＤの分化を誘導する。培地を４８時間毎に置き換えてから、細胞を４８時間、５ｍｇ／ｍｌのインスリンを含有する培地中に移す。
【０２４４】
グルコース吸収
以前に記載される（Ｍａｎｅｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）ようにして、ｒＰＡＤによるグルコース吸収を測定する。ＤＩＭに曝したｒＰＡＤを、血清フリー培地内で２４時間培養してから、グルコースフリーＫｒｅｂｓリン酸バッファ（２．５ｍｍｏｌ  Ｃａ２Ｃおよび１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中に希釈するインスリンの濃度を引き上げて（１、５、１０、および５０ｎＭ）インキュベーションして、インスリン依存性の刺激を評価する。インキュベーション期間の終了後、ｒＰＡＤをさらに、３Ｈ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（１６ｍＭ（１ｍＣｉ／ｍｌ）；ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ、米国）と５分間インキュベートする。細胞をＰＢＳで洗浄して、０．５Ｍ  ＮａＯＨで溶解して、β−カウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いたシンチレーション分光測定法によって、組み込まれた放射活性を測定する。データを、タンパク質含有量で正規化する。
【０２４５】
統計学的分析
指定するように、ｎ実験についての平均＋Ｓ．Ｅ．Ｍ．として、結果を表す。群間の差を評価するために、一元配置ＡＮＯＶＡ検定に続くＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ事後分析によって統計学的分析を実行し、Ｐ＜０．０５が有意であるとみなす。Ｓｐｅａｒｍａｎ法を用いて相関を評価し、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＰＳＳ，Ｉｎｃ．）ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  １５．０により統計学的分析を実行する。適切な場合はいつでも、段階的多重線形回帰を多変量解析に用いる。コンピュータープログラムＡＬＬＦＩＴを用いて、半最大反応作用濃度（ＥＣ５０）値および最大作用（Ｅｍａｘ）値を算出する。
【０２４６】
実施例１１：動物モデルにおける被験物質の作用の評価
実験動物および食餌
動物を、１２：１２時間の明暗サイクルで、２２℃の標準的なケージ内に個々に収容する。約７週齢の雄Ｃ５７ＢＬ６（Ｂ６）マウスまたはＬｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂマウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｕｒ，ＭＥ）から購入する。試験食を、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）から供給する。ＮＡＳＨを誘導するために、高脂肪（４０％ｋｃａｌ）および高フルクトース（２２ｗｔ％）で構成される食餌を試験する。ここで、脂肪源は、トランス脂肪である（部分的に水素添加された植物油ショートニングのプレミックス、ｃａｔ．ｎｏ．Ｄ０９１００３０１）。フルクトースもコレステロールも含まない低脂肪食（１０％ｋｃａｌ／脂肪）を、コントロール食として用いる（ｃａｔ．ｎｏ．Ｄ０９１００３０４）。ＨＴＦ食がＮＡＳＨの誘導に優れていると考えて、その後の研究に利用する。
【０２４７】
研究および薬物投与
これらの食餌に基づくＮＡＳＨの進行を特徴付けるために、低脂肪食（ＬＦＤ）、高トランス脂肪、高フルクトース、高コレステロール食（ＨＴＦ）、または高ラード脂肪、高フルクトース、高コレステロール食（ＨＬＦ）のＬｅｐｏｂ／ＬｅｐｏｂマウスまたはＢ６マウスをそれぞれ、８または１２週間維持する。マウスに、ビヒクル（滅菌水中５０％ＤＭＳＯ）または本出願の化合物（例えばＯＣＡ）および少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載するもの）を送達する単一の浸透圧ミニポンプ（ｍｏｄｅｌ  ２００４；Ａｌｚｅｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）を皮下移植する。加えて、または代わりに、マウスに、ビヒクル、または本出願の医薬組成物を、経口強制飼養を介して１日１回投与してよい。体重を毎週測定する。体組成を、ベースライン（ポンプ注入の前日）にて、そして終了時に、ＮＭＲ（Ｅｃｈｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）によって測定する。
【０２４８】
肝臓エンドポイントに及ぼす体重損失の影響を評価するために、先に記載するＬＦＤ食またはＨＴＦ食に曝したＬｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂマウスにおける最初の研究を繰り返す。ＬＦＤ食またはＨＴＦ食に基づく８週後に、全マウスに、本出願の化合物（例えばＯＣＡ）および少なくとも１つの更なる治療剤（例えば、本明細書中に記載するもの）を８または１２週間、経口投与する。
【０２４９】
終了後、肝臓組織を摘出して、１０％中性緩衝ホルマリン内で（室温にて少なくとも７日）固定する。次に、肝臓組織をパラフィン包埋して、切片化して、マウントして、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色することにする。線維症を視覚化するために、切片の別のセットを、Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で染色する。切片を最初に、ワイゲルト鉄へマトキシリンで、続いてビーブリッヒスカーレット、リンタングステン酸／リンモリブデン酸、およびアニリンブルー処理で染色する。切片の第２のセットを、マクロファージマーカーＭａｃ−２（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）を標的とする抗体を用いて、標準的なプロトコルに従って免疫染色する。全ての組織学的分析を、処理条件について盲検化された病理医が行う。
【０２５０】
Ｆｏｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２６，４９７（１９５７））を改変したプロトコルを用いて、総肝臓脂質を肝臓から抽出する。おおよそ０．５ｇの凍結した肝臓組織を、１０ｍｌの２：１クロロホルム／メタノール溶液中でホモジナイズする。脂肪フリー紙を用いて、ホモジェネートを濾過して、予め計量した１５ｍｌのガラス遠心管に送る。次に、更なる５ｍｌの２：１クロロホルム／メタノール溶液に続いて、２．５ｍｌの０．９％ＮａＣｌを加える。その後、濾過した抽出物を混合して、２，０００ｒｐｍ、１０℃にて５分間遠心分離する。水層を破棄して、脂質ペレットが乾燥するまで、チューブを窒素でフラッシュする。脂質ペレットを含有するチューブを秤量して、出発肝臓のグラムあたりの抽出総脂質を算出する。
【０２５１】
ウエスタンブロット分析用に、摘出した肝臓組織を秤量してから、液体窒素中で急速凍結して、処理するまで−８０℃にて保存する。タンパク質を、各肝臓のフラグメントから以下のように単離する。凍結した肝臓組織をドライアイス上で破砕してから、プロテアーゼ阻害剤により溶解バッファ中でホモジナイズする（ｃａｔ．ｎｏ．０５８９２７９１００１；Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｔａｂｌｅｔｓ；および０．６ｍＭ  ＰＭＳＦ）。一掃した上澄みのタンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で測定する。肝臓組織溶解物（５０μｇ）を、メーカーのプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に従って、還元Ｎｕｐａｇｅゲル上で分離して、ＰＶＤＦ膜に移す。５０ｋＤａと６０ｋＤａのマーカー間で膜をカットして、５％Ｂｌｏｔｔｏでブロックする；上半分を抗コラーゲン１型（１：３５０；ｃａｔ．ｎｏ．ＮＢＰ１−３００５４；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ）で、そして正規化用に、下半分を抗ＧＡＰＤＨ（１：１０，０００；ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合；ｃａｔ  ｎｏ．３６８３；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）でプロービングする。ホースラディッシュペルオキシダーゼ抗ウサギ抗体とのインキュベーション後に、タンパク質発現を、増強化学ルミネセンス（Ｐｉｅｒｃｅ）により検出する。ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて、濃度測定を実行する。
【０２５２】
組織遺伝子発現
終了後、肝臓を摘出して、秤量して、液体窒素中で急速凍結して、保存する（−８０℃）。ＴＲＩ試薬（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いて、ＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）により、全ＲＮＡを抽出して、ＲＥＴＲＯｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ逆転写系（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、ｃＤＮＡを生じさせる。ＮＡＳＨ病理に関与する遺伝子（例えば、脂肪変性、炎症、および線維症に関与する遺伝子）についての定量的リアルタイムＰＣＲ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。Ｔａｑｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−ｄｅｍａｎｄおよびＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、アッセイを実行することができる。
【０２５３】
血漿ホルモンおよび代謝物質の分析
Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ４００ｅ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）を用いて、血漿グルコース、トリグリセリド、総コレステロール、ＡＬＴ、およびアスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のレベルを測定する。血漿サンプルを、標準曲線の範囲内でのＡＬＴおよびＡＳＴの検出のために、ＰＢＳで１：１０に希釈する。総血漿アディポネクチンを、市販のＥＬＩＳＡを用いて、メーカーの説明書に従って（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）測定する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2018510900.tif 000027
【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【国際調査報告】
2018510900.tif 000066