(57)【要約】本発明は、脂質化PSAのさまざまな単離および合成形態、ならびに脂質化PSAの糖脂質成分の単離または合成形態、ならびにその組成物、そのような形態を単離する方法を含む製造方法、およびその使用方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖脂質に共有的に結合した多糖A(PSA)を含む、単離された脂質化多糖A(PSA)であって、
糖脂質が、ジアシル化、トリアシル化、テトラアシル化またはペンタアシル化される、単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項２】
糖脂質が、テトラアシル化またはペンタアシル化される、請求項１に記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項３】
1つ以上の14〜17炭素の長さのアシル鎖を含む糖脂質に共有結合した多糖A(PSA)を含む、単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項４】
1つ以上のアシル鎖の長さが、15〜17炭素の範囲である、請求項３に記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項５】
糖脂質が、1つ以上のアシル鎖で置換された二糖を含む、請求項１〜４のいずれか1つに記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項６】
糖脂質が、ジグルコサミンを含む、請求項１〜５のいずれか1つに記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項７】
1つ以上の14〜17炭素の長さのアシル鎖に共有結合した多糖A(PSA)を含む、単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項８】
1つ以上のアシル鎖の長さが、15〜17炭素の範囲である、請求項７に記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項９】
バクテロイデス・フラギリス莢膜中に見出される他の成分を実質的に含まない、請求項１〜８のいずれか1つに記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項１０】
LPSを実質的に含まない、請求項１〜９のいずれか１つに記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項１１】
非結合糖脂質を実質的に含まない、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項１２】
非脂質化PSAを含まない、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項１３】
精製された形態である、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の脂質化多糖A(PSA)。
【請求項１４】
ミセル形態である、請求項１〜１３のいずれか１つに記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項１５】
凍結乾燥形態である、請求項１〜１４のいずれか１つに記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項１６】
ヒトへの投与に適している、請求項１〜１５のいずれか１つに記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項１７】
多糖B(PSB)と比較して、PSAを過剰発現するバクテロイデス・フラギリス細胞から単離される、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項１８】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、未修飾である、請求項３〜１７のいずれか１つに記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項１９】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、修飾されている、請求項３〜１７のいずれか１つに記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項２０】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、未修飾であり、1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、修飾されている、請求項３〜１７のいずれか１つに記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項２１】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、ヒドロキシル基で修飾されている、請求項３〜２０のいずれか１つに記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項２２】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、C16：0-OHである、請求項３〜２１のいずれか１つに記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項２３】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、C17：0-OHである、請求項３〜２２のいずれか１つに記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項２４】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、C14：0-OHである、請求項３〜７または９〜２３のいずれか１つに記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項２５】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、C15：0-OHである、請求項３〜２４のいずれか１つに記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項２６】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、二糖上でN-置換されている、請求項３〜２５のいずれか１つに記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項２７】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、二糖上でO-置換されている、請求項３〜２６のいずれか１つに記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項２８】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが二糖上でN-置換され、1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが二糖上でO-置換されている、請求項３〜２７のいずれか１つに記載の単離された脂質化多糖A(PSA)。
【請求項２９】
60未満の反復四糖単位を含む、請求項１〜２８のいずれか1つに記載の脂質化多糖A(PSA)。
【請求項３０】
PSAが、1〜10個の反復四糖単位を含む、請求項１〜２８のいずれか1つに記載の脂質化多糖A(PSA)。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか1つに記載の脂質化多糖A(PSA)、および0.5％(w/w)未満の遊離の糖脂質を含む医薬組成物 
【請求項３２】
請求項１〜３０のいずれか1つに記載の脂質化多糖A(PSA)、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３３】
組成物が、1％未満または0.5％未満(w/w)の遊離糖脂質を含む、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
界面活性剤または胆汁酸塩をさらに含む、請求項３１〜３３のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項３５】
汁酸塩の界面活性剤が、1％、0.5％または0.1％未満で存在する、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
凍結乾燥形態である、請求項３１〜３５のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項３７】
単離された脂質化多糖A(PSA)が、ミセルまたはリポソームとして提供される、請求項３１〜３６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項３８】
請求項１〜３０のいずれか1つに記載の脂質化多糖A(PSA)および界面活性剤または胆汁酸塩を含む医薬組成物。
【請求項３９】
ミセルまたはリポソーム中に請求項１〜３０のいずれか1つに記載の脂質化多糖(PSA)のいずれかを含む組成物。
【請求項４０】
患者への非経口投与用に製剤化された、請求項３１〜３９のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項４１】
それぞれ独立して14〜17炭素の長さである2〜5個のアシル鎖に共有結合したジグルコサミンを含む単離された糖脂質。
【請求項４２】
ジグルコサミンが、2〜4個のアシル鎖に共有結合する、請求項４１に記載の単離された糖脂質。
【請求項４３】
ジグルコサミンが、4個のアシル鎖に共有結合する、請求項４１に記載の単離された糖脂質。
【請求項４４】
アシル鎖が、15〜17炭素の長さである、請求項４１〜４３のいずれか1つに記載の単離された糖脂質。
【請求項４５】
バクテロイデス・フラギリスから脂質化多糖A(PSA)を単離するための非加水分解法であって、
フェノールと水との混合物を用いてバクテロイデス・フラギリスから莢膜複合体を水相に抽出し；
エタノールを用いて水相から多糖画分を沈殿させ；次いで、
サイズ排除によって多糖画分から脂質化PSAを単離すること；
を含む方法。
【請求項４６】
サイズ排除による単離が、界面活性剤または胆汁酸塩を含むクロマトグラフィーカラムを使用することを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
クロマトグラフィーカラムが、デオキシコール酸塩を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
方法が、約9未満のpHで実施される、請求項４５〜４７のいずれか1つに記載の方法。
【請求項４９】
方法が、単離された脂質化PSAを透析することをさらに含む、請求項４５〜４８のいずれか1つに記載の方法。
【請求項５０】
抽出が、60〜75℃で起こる、請求項４５〜４９のいずれか1つに記載の方法。
【請求項５１】
抽出が、約68℃で起こる、請求項４５〜５０のいずれか1つに記載の方法。
【請求項５２】
方法が、デオキシコール酸ナトリウムの存在下で行われる、請求項４５〜５１のいずれか1つに記載の方法。
【請求項５３】
バクテロイデス・フラギリスが、PSBに比べてPSAを過剰発現するバクテロイデス・フラギリスの突然変異型である、請求項４５〜５２のいずれか1つに記載の方法。
【請求項５４】
単離された脂質化PSAが、非結合糖脂質を実質的に含まない、請求項４５〜５３のいずれか1つに記載の方法。
【請求項５５】
請求項４５〜５４のいずれか1つに記載の方法によって製造された、単離された脂質化多糖Aを含む組成物。
【請求項５６】
組成物が、患者への非経口投与用に製剤化される、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
多糖A(PSA)および糖脂質を基材中または基材上に含む組成物であって、
PSAが糖脂質に共有結合していない組成物。
【請求項５８】
各四糖単位が式Iの構造を有する、1つ以上の四糖単位を含む多糖、および
1つ以上の14〜17炭素の長さのアシル鎖を含む糖脂質を含む組成物であって、
多糖および糖脂質が相互に非結合状態で基材中または基材上に提供される、組成物。
【請求項５９】
基材が、ナノ粒子である、請求項５８または５９に記載の組成物。
【請求項６０】
PSAおよび糖脂質が、10：1〜1：1未満の分子量比で存在する、請求項５８、５９または６０に記載の組成物。
【請求項６１】
非ケトシド結合を介して互いに共有結合した多糖A(PSA)および糖脂質を含む組成物。
【請求項６２】
各四糖単位が式Iの構造を有する、1つ以上の四糖単位を含む多糖、および
1つ以上の14〜17炭素の長さのアシル鎖を含む糖脂質を含む組成物であって、
多糖が非ケトシド結合を介して糖脂質に結合する、組成物。
【請求項６３】
非ケトシド結合が、エステル、アミドまたはエーテル結合である、請求項６１または６２に記載の組成物。
【請求項６４】
糖脂質が、二糖を含む、請求項６１〜６３のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項６５】
二糖が、ジグルコサミンである、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
糖脂質が、2〜5個のアシル鎖を含む、請求項６１〜６５のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項６７】
糖脂質が、4または5個のアシル鎖を含む、請求項６１〜６６のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項６８】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、未修飾である、請求項６１〜６７のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項６９】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、修飾されている、請求項６１〜６８のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項７０】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、未修飾であり、1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、修飾されている、請求項６１〜６９のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項７１】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、ヒドロキシル基で修飾されている、請求項６１〜７０のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項７２】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、C16：0-OHである、請求項６１〜７１のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項７３】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、C17：0-OHである、請求項６１〜７２のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項７４】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、C14：0-OHである、請求項６１〜７３のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項７５】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、C15：0-OHである、請求項６１〜７４のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項７６】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、二糖上でN-置換されている、請求項６１〜７５のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項７７】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、二糖上でO-置換されている、請求項６１〜７６のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項７８】
1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが二糖上でN-置換され、1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが二糖上でO-置換されている、請求項６１〜７７のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項７９】
多糖が、約150キロダルトンの分子量を有する、請求項６１〜７８のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項８０】
多糖が、1〜10個の四糖単位を含む、請求項６１〜７９のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項８１】
糖脂質が、式IIの構造を有する、請求項６１〜８０のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項８２】
糖脂質が、式IIIの構造を有する、請求項６１〜８１のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項８３】
多糖および糖脂質が、基材の中または上に存在する、請求項６１〜８２のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項８４】
基材が、フィルム、マトリックスまたは粒子である、請求項５７、５８、６０または８３に記載の組成物。
【請求項８５】
基材が、生分解性である、請求項５７、５８、５９、６０、８３または８４に記載の組成物 。
【請求項８６】
基材が、ナノ粒子である、請求項５７〜６０、８３、８４または８５に記載の組成物。
【請求項８７】
組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項６１〜８６のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項８８】
組成物が、医薬組成物である、請求項６１〜８７のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項８９】
組成物が、非経口投与用に製剤化される、請求項６１〜８８のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項９０】
組成物が、自己免疫障害の治療に有効である、請求項６１〜８９のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項９１】
組成物が、バクテロイデス・フラギリス莢膜中に見出される他の成分を実質的に含まず、ヒトへの投与に適している、請求項６１〜９０のいずれか1つに記載の組成物。
【請求項９２】
1〜50個の四糖単位を含む多糖A(PSA)および糖脂質を含む組成物であって、PSAが糖脂質に共有結合している組成物。
【請求項９３】
各四糖単位が式Iの構造を有する、1〜50個の四糖単位を含む多糖、および1つ以上の14〜17炭素の長さのアシル鎖を含む糖脂質を含む組成物であって、多糖が糖脂質に共有結合している、組成物。
【請求項９４】
多糖が、1〜40個の四糖単位または1〜20個の四糖単位を含む、請求項９３または９４に記載の組成物。
【請求項９５】
多糖が、1〜10個の四糖単位または1〜5個の四糖単位を含む、請求項９３または９４に記載の組成物。
【請求項９６】
本質的に脂質化PSAからなるミセル。
【請求項９７】
脂質化PSAが、単離された脂質化PSAである、請求項９６に記載のミセル。
【請求項９８】
本質的に脂質化PSAからなるミセル、および
界面活性剤または胆汁酸塩、
を含む組成物。
【請求項９９】
界面活性剤または胆汁酸塩が、薬学的に許容される量で存在する、請求項９８に記載の組成物。
【請求項１００】
組成物が、医薬組成物である、請求項９８または９９に記載の組成物。
【請求項１０１】
炎症に関連する状態を有するかまたは発症するリスクがある患者に、有効量の請求項１〜４４、５５〜９５および９８〜１００のいずれか1つに記載の脂質化PSAまたは組成物のいずれかを投与することを含む方法。
【請求項１０２】
状態が、自己免疫疾患である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
自己免疫疾患が、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、またはI型糖尿病である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
状態が、喘息である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
状態が、手術後の癒着である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０６】
組成物が、手術前、手術中および/または手術後に投与される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
状態が、膿瘍である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０８】
患者に抗生物質が投与される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
状態が、肥満である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１０】
組成物が、患者に非経口的に投与される、請求項１０１〜１０９のいずれか1つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法119条(e)の下に、2015年8月19日出願の米国仮出願第61/714,565号、2013年3月15日出願の「脂質化PSA組成物および方法」と題する米国仮出願第62/207,360号に対する利益を主張する。上記出願の開示の全体は、参照することにより本出願に包含される。
技術分野
本発明は、脂質化莢膜多糖A(polysaccharide A：PSA)、それらの糖脂質、組成物、合成方法、単離および/または精製方法、および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バクテロイデス・フラギリス(Bacteroides fragilis(B. fragilis))の多糖A(PSA)は、治療活性および予防活性を有する免疫調節物質であることが報告されている。米国特許第5,679,654号および第5,700,787号；Tzianabos AOら (2000)J Biol Chem 275：6733-40。PSAは最近、脂質部分を有することが発見された。脂質部分は、バクテロイデス・フラギリス外膜に多糖を固定すると仮定された。この「脂質化PSA」は、従来技術で提供される非脂質化PSA(本明細書では「PSA」と称する)形態よりも、有意により強力であることが最近発見された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、脂質部分の性質は、これまでに決定されておらず、PSAと会合する性質も有していない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概略
本発明は、ある種の単離方法を用いてPSAに結合(conjugated)していることが見出される脂質部分の同定および特徴付けに部分的に基づく。本開示は、そのような脂質部分に結合したPSA(本明細書では「脂質化PSA」と称する)の完全な構造同定および特徴付けを提供する。本発明はさらに、新規な単離方法ならびにこのような方法がこれまで可能であったよりも大きな収量の脂質化PSAを達成するという認識を部分的に前提とする。重要なことに、従来技術のPSA単離法の大部分はPSAの脂質化形態を全くもたらさなかった。これは、部分的には、脂質化PSAから脂質部分を放出し、それによって非脂質化PSAを生じる単離プロセスの後期に、比較的厳しい酸加水分解工程を使用することによるものと思われる。
【０００５】
したがって、本開示は、いくつかの態様において、定義された化学構造の単離された脂質化PSA、および単離された脂質化PSAを含む組成物を提供する。そのような組成物は、それに含まれる単離された脂質化PSAの純度および/または濃度によってさらに定義されうる。単離された脂質化PSAは、自己集合してミセル形態になることも発見されている。重要なことに、脂質化PSAはインビボでこのようなコンホメーションを採用しておらず、そのようなミセル形態は天然に存在しない。さらに重要なことに、このようなミセルは非常に安定であり、したがって、破壊することが困難であることが発見されている。これは、ある種の破壊剤(たとえば、界面活性剤および胆汁酸塩など)およびこのような安定なミセルを形成するのに役立つ純度または濃度(本明細書で提供される)を有する単離された脂質化PSAの併用が、ミセルの安定性を低下させ、より脂質化されたPSAをインビボで接近可能にする。
【０００６】
また、1種以上のPSAポリマー(PSAの反復四糖単位の1つ以上を含む各ポリマー)および脂質化PSAの1つ以上の脂質または糖脂質成分を含む、脂質化PSAおよびその組成物の合成形態も提供される。PSAおよび脂質または糖脂質成分は、互いに直接的または間接的に結合していてもよい。そのような結合は、共有結合または非共有結合でありうる。一例として、本発明は、PSAおよび脂質または糖脂質成分を、非結合形態で、ナノ粒子などの基材と共に含む組成物を提供する。脂質化多糖のこれらの合成形態は、天然には見出されないPSA成分(四糖単位など)および脂質または糖脂質成分を含むことができる。
【０００７】
本発明はさらに、脂質化PSAを単離する方法、脂質化PSAの上記合成形態を製造する方法、ならびに本明細書で提供される単離および合成形態の脂質化PSAのインビトロおよびインビボでの使用を提供する。
【０００８】
したがって、1つの態様において、本発明は、糖脂質に共有結合された多糖A(PSA)を含む単離された脂質化多糖A(PSA)を提供し、ここで糖脂質は、ジアシル化、トリアシル化、テトラアシル化またはペンタアシル化される。
いくつかの実施態様では、糖脂質はテトラアシル化またはペンタアシル化される。
【０００９】
もう1つの態様では、本発明は、1つ以上の14〜17炭素の長さのアシル鎖を含む糖脂質に共有結合した多糖A(PSA)を含む単離された脂質化多糖A(PSA)を提供する。
【００１０】
さまざまな実施態様では、糖脂質は、1つ以上のアシル鎖で置換された二糖を含む。さまざまな実施態様では、糖脂質はジグルコサミンを含む。
【００１１】
もう1つの態様では、本発明は、1つ以上の14〜17炭素の長さのアシル鎖に共有結合した多糖A(PSA)を含む単離された脂質化多糖A(PSA)を提供する。
【００１２】
さまざまな実施態様では、1つ以上のアシル鎖の長さは15〜17炭素の範囲である。
【００１３】
さまざまな実施態様では、単離された脂質化多糖A(PSA)は、バクテロイデス・フラギリス莢膜中に見出される他の成分を実質的に含まない。さまざまな実施態様では、単離された脂質化多糖A(PSA)は、LPSを実質的に含まない。さまざまな実施態様では、単離された脂質化多糖A(PSA)は、非結合糖脂質を実質的に含まない。さまざまな実施態様では、単離された脂質化多糖A(PSA)は、非脂質化PSAを含まない。さまざまな実施態様では、単離された脂質化多糖A(PSA)は、精製された形態である。さまざまな実施態様では、脂質化多糖A(PSA)は、多糖B(PSB)と比較して、PSAを過剰発現するバクテロイデス・フラギリス細胞から単離される。
【００１４】
さまざまな実施態様では、単離された脂質化多糖A(PSA)は、バクテロイデス・フラギリス膜を含まない形態で提供されるため、バクテロイデス・フラギリス細胞またはバクテロイデス・フラギリスOMVとして提供されない。さまざまな実施態様では、脂質化多糖A(PSA)の合成された天然に存在しないバージョンなどの単離された脂質化多糖A(PSA)は、リポソームまたはミセル形態で提供され得、このようなリポソームまたはミセル形態は、天然に存在しなくてもよい(たとえば、それは天然に存在する成分を欠いていてもよく、および／または天然に存在しない脂質、界面活性剤、安定剤などの非天然成分をさらに含んでいてもよい)
【００１５】
さまざまな実施態様では、単離された脂質化多糖A(PSA)は、ミセル形態である。
【００１６】
さまざまな実施態様では、単離された脂質化多糖A(PSA)は凍結乾燥形態である。脂質化PSAの凍結乾燥形態は、数日、数週間、数ヶ月または数年の範囲の長期貯蔵に特に適している。
【００１７】
さまざまな実施態様では、単離された脂質化多糖A(PSA)は、ヒトへの投与に適している。
【００１８】
もう1つの態様では、本発明は、PSA成分が100未満、90未満、80未満、70未満、60未満、または50未満の反復四糖単位を含む、上記脂質化多糖A(PSA)のいずれかを提供する。
【００１９】
もう1つの態様では、本発明は、PSA成分が1〜10個の反復四糖単位を含む、上記脂質化多糖A(PSA)のいずれかを提供する。
【００２０】
もう1つの態様では、本発明は、上記脂質化多糖A(PSA)のいずれか、および0.5％(w/w)未満の遊離の糖脂質を含む医薬組成物を提供する。
【００２１】
もう1つの態様では、本発明は、上記脂質化多糖A(PSA)のいずれかおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
さまざまな実施態様では、組成物は遊離糖脂質(w/w)を1％未満または0.5％未満含む。さまざまな実施態様では、組成物は、界面活性剤または胆汁酸塩をさらに含む。さまざまな実施態様では、胆汁酸塩の界面活性剤は、薬学的に許容されるレベルで存在する。さまざまな実施態様では、胆汁酸塩の界面活性剤は、1％、0.5％または0.1％未満で存在する。
【００２３】
さまざまな実施態様では、組成物は、凍結乾燥形態である。
【００２４】
さまざまな実施態様では、単離された脂質化多糖A(PSA)は、ミセルまたはリポソームとして提供される。
【００２５】
もう1つの態様では、本発明は、前述の脂質化多糖A(PSA)のいずれか、および界面活性剤または胆汁酸塩を含む、医薬組成物を提供する。
【００２６】
もう1つの態様では、本発明は、ミセルまたはリポソーム中に上記脂質化多糖(PSA)のいずれかを含む組成物を提供する。
【００２７】
もう1つの態様では、本発明は、1〜50個の四糖単位を含む多糖A(PSA)および糖脂質を含む組成物であって、PSAが糖脂質に共有結合している、組成物を提供する。
【００２８】
もう1つの態様では、本発明は、各四糖単位が式Iの構造を有する、1〜50個の四糖単位を含む多糖、および1つ以上の14〜17炭素の長さのアシル鎖を含む糖脂質を含む組成物であって、多糖が糖脂質に共有結合している、組成物を提供する。
【００２９】
さまざまな実施態様では、多糖は、1〜40個の四糖単位または1〜20個の四糖単位を含む。さまざまな実施態様では、多糖は、1〜10個の四糖単位または1〜5個の四糖単位を含む。
【００３０】
さまざまな実施態様では、組成物は、患者への非経口または経腸または経口投与用に製剤化される。さまざまな実施態様では、組成物は、たとえば、リポソームまたは油ベースのデリバリーシステムなどの親油性デリバリー用に製剤化される。本明細書で提供されるさまざまな組成物は、経口投与または経腸投与を意図するものを含む、カプセルまたは他の別個の投与形態として製剤化されうる。
【００３１】
もう1つの態様では、本発明は、それぞれ独立して14〜17炭素の長さである2〜5個のアシル鎖に共有結合したジグルコサミンを含む単離された糖脂質を提供する。糖脂質は、本明細書で提供される糖脂質のいずれか、またはそれらの組み合わせでありうる。
【００３２】
さまざまな実施態様では、ジグルコサミンは、2〜5個または2〜4個のアシル鎖に共有結合する。さまざまな実施態様では、ジグルコサミンは4または5個のアシル鎖に共有結合する。さまざまな実施態様では、アシル鎖は、15〜17炭素の長さである。糖脂質に関する他の実施態様を以下に列挙する。
【００３３】
もう1つの態様では、本発明は、PSAが糖脂質に共有結合していない、多糖A(PSA)および糖脂質を基材中または基材上に含む組成物を提供する。
【００３４】
もう1つの態様では、本発明は、各四糖単位が式Iの構造を有する、1つ以上の四糖単位を含む多糖、および1つ以上の14〜17炭素の長さのアシル鎖を含む糖脂質を含む組成物であって、多糖および糖脂質が相互に非結合状態で基材中または基材上に提供される、組成物を提供する
【００３５】
さまざまな実施態様では、基材はナノ粒子である。
【００３６】
さまざまな実施態様では、PSAおよび糖脂質は、10：1〜1：1未満の分子量比で存在する。
【００３７】
もう1つの態様では、本発明は、非ケトシド結合を介して互いに共有結合した多糖A(PSA)および糖脂質を含む組成物を提供する。
【００３８】
もう1つの態様では、本発明は、各四糖単位が式Iの構造を有する、1つ以上の四糖単位を含む多糖、および1つ以上の14〜17炭素の長さのアシル鎖を含む糖脂質を含む組成物であって、多糖が非ケトシド結合を介して糖脂質に結合する、組成物を提供する。
【００３９】
さまざまな実施態様では、非ケトシド結合は、エステル、アミドまたはエーテル結合である。
【００４０】
さまざまな実施態様では、糖脂質は、二糖を含む。さまざまな実施態様では、二糖は、ジグルコサミンである。
【００４１】
さまざまな実施態様では、糖脂質は、2〜5個のアシル鎖を含む。さまざまな実施態様では、糖脂質は、4または5個のアシル鎖を含む。
【００４２】
さまざまな実施態様では、1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、未修飾である。さまざまな実施態様では、1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、修飾されている。さまざまな実施態様では、1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、未修飾であり、1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、修飾されている。さまざまな実施態様では、1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、ヒドロキシル基で修飾されている。
【００４３】
さまざまな実施態様では、1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、C16：0-OHである。さまざまな実施態様では、1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、C17：0-OHである。さまざまな実施態様では、1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、C14：0-OHである。さまざまな実施態様では、1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、C15：0-OHである。
【００４４】
さまざまな実施態様では、1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、二糖上でN-置換されている。さまざまな実施態様では、1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが、二糖上でO-置換されている。さまざまな実施態様では、1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが二糖上でN-置換され、1つ以上のアシル鎖の少なくとも1つが二糖上でO-置換されている。
【００４５】
さまざまな実施態様では、多糖は、約150キロダルトンの分子量を有する。さまざまな実施態様では、多糖は、1〜10個の四糖単位を含む。
【００４６】
さまざまな実施態様では、糖脂質は、式IIの構造を有する。さまざまな実施態様では、糖脂質は、式IIIの構造を有する。
【００４７】
さまざまな実施態様では、多糖および糖脂質は、基材の中または上に存在する。さまざまな実施態様では、基材は、フィルム、マトリックスまたは粒子である。さまざまな実施態様では、基材は、生分解性である。さまざまな実施態様では、基材は、ナノ粒子である。
【００４８】
さまざまな実施態様では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。さまざまな実施態様では、組成物は、医薬組成物である。さまざまな実施態様では、組成物は、非経口、経腸または経口投与用に製剤化される。さまざまな実施態様では、該組成物は、自己免疫障害の治療に有効である。さまざまな実施態様では、組成物は、バクテロイデス・フラギリス莢膜中に見出される他の成分を実質的に含まず、ヒトへの投与に適している。
【００４９】
もう1つの態様では、本発明は、本質的に脂質化PSAからなるミセルを提供する。さまざまな実施態様では、脂質化PSAは、単離された脂質化PSAである。
【００５０】
もう1つの態様では、本発明は、本質的に脂質化PSAからなるミセル、および界面活性剤または胆汁酸塩を含む組成物を提供する。
【００５１】
さまざまな実施態様では、界面活性剤または胆汁酸塩は、薬学的に許容される量で存在する。
【００５２】
さまざまな実施態様では、組成物は、医薬組成物である。
【００５３】
もう1つの態様では、本発明は、バクテロイデス・フラギリスから脂質化多糖A(PSA)を単離するための非加水分解法であって、フェノールと水との混合物を用いてバクテロイデス・フラギリスから莢膜複合体を水相に抽出し、エタノールを用いて水相から多糖画分を沈殿させ、次いで、サイズ排除によって多糖画分から脂質化PSAを単離することを含む方法を提供する。
【００５４】
さまざまな実施態様では、サイズ排除による単離は、界面活性剤または胆汁酸塩を含むクロマトグラフィーカラムを使用することを含む。さまざまな実施態様では、クロマトグラフィーカラムはデオキシコール酸塩を含む。さまざまな実施態様では、方法は、デオキシコール酸ナトリウムの存在下で行われる。
【００５５】
さまざまな実施態様では、方法は、約9未満のpHで実施される。
【００５６】
さまざまな実施態様では、方法は、単離された脂質化PSAを透析することをさらに含む。
【００５７】
さまざまな実施態様では、抽出は、60〜75℃で起こる。さまざまな実施態様では、抽出は、約68℃で起こる。
【００５８】
さまざまな実施態様では、バクテロイデス・フラギリスは、PSBに比べてPSAを過剰発現するバクテロイデス・フラギリスの突然変異型である。
【００５９】
さまざまな実施態様では、単離された脂質化PSAは、非結合糖脂質を実質的に含まない。
【００６０】
もう1つの態様では、本発明は、前述の方法のいずれかによって製造された単離された脂質化多糖Aを含む組成物を提供する。
【００６１】
さまざまな実施態様では、組成物は、患者への非経口、経腸または経口投与用に製剤化される。
【００６２】
もう1つの態様では、本発明は、炎症に関連する状態を有するかまたは発症するリスクがある患者に、有効量の前記脂質化PSAまたは前記組成物のいずれかを投与することを含む方法を提供する。
【００６３】
さまざまな実施態様では、状態は、自己免疫疾患である。さまざまな実施態様では、自己免疫疾患は、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、またはI型糖尿病である。さまざまな実施態様では、状態は、喘息である。
【００６４】
さまざまな実施態様では、状態は、手術後の癒着である。さまざまな実施態様では、組成物は、手術前、手術中および/または手術後に投与される。さまざまな実施態様では、状態は、膿瘍である。さまざまな実施態様では、患者に抗生物質が投与される。さまざまな実施態様では、状態は、肥満である。
【００６５】
さまざまな実施態様では、組成物は、患者に非経口的にまたは経腸的に投与される。
【００６６】
さまざまな前述の態様および実施態様が重複することが理解されるべきである。上記の実施態様は、上記のさまざまな態様に等しく適用されることが意図される。
【００６７】
前述の概念および以下により詳細に論じる追加の概念(ただし、そのような概念は相互に矛盾しない)のすべての組み合わせが、本明細書に開示された発明の一部であると考えられることが理解されるべきである。特に、本開示の最後に現れる、クレームに記載された対象の全ての組み合わせは、本明細書に開示される本発明の対象の一部であると考えられる。また、本明細書で明示的に用いられる用語は、本明細書に開示された特定の概念と最も一致する意味で解釈されるべきであることが理解されるべきである。
【００６８】
図面は必ずしも縮尺通りではなく、ここで論じたさまざまな概念を全体的に例示することに重点を置いていることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１Ａ】脂質化PSAから放出されたテトラアシル化(下部)およびペンタアシル化(上部)糖脂質の代表的な質量分析(MS)スペクトルを示す。
【図１Ｂ】異なる数のアシル鎖を有するモノリン酸化および非リン酸化糖脂質種を示すバクテロイデス・フラギリスPSA糖脂質アンカーのLC-MS/MSプロファイルを提供する。同数のアシル鎖を有する種は、全鎖長および/またはそのようなアシル鎖の性質(組成)に関して、依然として互いに異なりうる。いくつかの例では、〜30個の総糖脂質種が、同数のアシル鎖を有する一群の種内で同定されている。
【図２Ａ】脂質化PSAから放出されたペンタ-アシル化糖脂質(上からパネル1および2)およびテトラアシル化糖脂質(上からパネル3および4)のMSスペクトルの比較を提供する。パネル1および3の材料は、単離プロセスの初期のより穏やかな加水分解工程を用いて得られた。パネル2および4の材料は、後の分離プロセスの後期のより過酷な加水分解工程を用いて得られた。脂質部分は、パネル1および3では検出可能であるが、パネル2および4では検出可能ではなく、脂質部分に対する過酷なおよび後期の酸加水分解工程の有害な効果を証明する。
【図２Ｂ】バクテロイデス・フラギリスから単離された種の構造のMS/MS割り当てを提供する。m/z 1674.2の種は、飽和またはモノヒドロキシル化C15-C17脂肪酸でペンタアシル化およびモノリン酸化されていると決定されている。
【図３】ジアシル化、トリ-アシル化、テトラ-アシル化およびペンタ-アシル化脂質部分のピークを示す脂質化PSAから放出された脂質部分のMALDI-MSスペクトルである。右の構造は、脂質化PSAからのテトラアシル化糖脂質の例である。構造は、炭素C1およびC4(最も右の置換グルコサミン(または還元糖)上の炭素)におけるヒドロキシル基および炭素C3'およびC4'(最も左の置換グルコサミン(または非還元糖)上の炭素)上のヒドロキシル基を含む。この開示は、C1またはC4'位におけるヒドロキシル(-OH)の代わりにリン酸基(たとえば、-OPO3H)を含むその変異体を包含する。
【図４】PSAに結合した脂質部分の定量分析を示す棒グラフである。6つの異なる脂質部分が示され、それぞれは異なるMS位置を有する。約1350-1378の範囲のm/zを有するテトラアシル化脂質部分および約1604-1634の範囲のm/zを有するペンタアシル化脂質部分が示される。各脂質部分について、2つのバーが示されている：第1は、より過酷な酸加水分解工程を用いて生成された材料(PSA23)に対応し、第2は、より穏やかで早期の酸加水分解工程を用いて生成された材料(PSA24)に対応する。この図は、より穏やかで早期の酸加水分解工程が使用される場合、脂質部分が保存されることを示している。この図はまた、m/z 1378部分が最も多いテトラアシル化されたバージョンであり、m/z 1618部分が最も多いペンタアシル化されたバージョンである、異なる部分の相対的割合を示す。
【図５】脂質化PSA由来の糖脂質の分子種およびその提案されたアシル鎖組成を列挙した表である。この表は、5つの異なるペンタアシル化種、5つの異なるテトラアシル化種、4つの異なるトリアシル化種、および2つの異なるジアシル化種を列挙する。各グループ内で強調表示されている種(たとえば、1632、1618および1604)が、最も豊富な種を表す。ペンタアシル化種のうち、1632および1618種が最も多く、続いて1604種、続いて1646および1590種である。テトラアシル化種のうち、1378および1364種が最も多く、続いて1350種、続いて1392および1336種である。トリアシル化種のうち、1123種と1109種が最も多く、続いて1095種、続いて1081種である。ジアシル化種の場合、899種と885種はほぼ同等の多さである。すべての種のうちで、さまざまな群の豊富さは、以下の通りである(大部分〜最も豊富でない)：テトラ-アシル化、ペンタ-アシル化、トリ-アシル化およびジ-アシル化。脂質化PSAから加水分解されたこれらの糖脂質の典型的な比は、およそで、ジ：トリ：テトラ：ペンタ=痕跡量：0.5：3：2である。図に記載された種は、典型的には、本明細書で提供される方法を用いて単離された脂質化PSAの製造中に観察される。そのような方法は、好ましくは、酸加水分解工程を含まないことによって、従来技術の方法と比較して、より多くの割合の完全脂質化PSAが単離される。このような方法は、場合によってデオキシコール酸塩または他の胆汁塩も含む。
【図６Ａ】図6Aは、脂質化PSAからの糖脂質の代表的な構造を提供する。約1341.1の分子量を有する代表的なテトラアシル化ジグルコサミンが左に示され(本明細書中では式IIと称される)、約1595.3の分子量を有する代表的なペンタアシル化ジグルコサミンが右に示される(本明細書中では式IIIと称される)。左側のテトラアシル化構造はC1、C4、C3'およびC4'位のヒドロキシル基を含む。右側のペンタアシル化構造はC1、C4およびC4'位のヒドロキシル基を含む。C1またはC4'位のヒドロキシルの代わりにリン酸基を含む、これらの化合物のモノリン酸化変異体もここに提供される。
【図６Ｂ】糖脂質のペンタアシル化、モノリン酸化種を提供する。リン酸化は、C1位に存在する。
【図７】IL-10誘導アッセイの結果を示す棒グラフである。より穏やかで早期の酸加水分解工程を用いて調製された材料は、PSA24として同定される。より過酷で後期の酸加水分解工程を用いて調製された材料は、PSA23として同定される。CPCは、野生型バクテロイデス・フラギリス NCTC9373由来の莢膜多糖複合体を表す。
【図８】図8は、脾臓DC+T細胞共培養におけるIL-10誘導アッセイの結果を示す棒グラフである。この図は、ｊ技術の方法と比較して、脂質化PSAのより高い純度を意図して、従来技術の調製物よりも十分に脂質化されているとみなされる脂質化PSAの単離形を使用する。この調製物は、明らかに遊離(または放出された)糖脂質成分を含まないため、本明細書では「完全脂質化PSA」と称する。この図は、単離された完全脂質化PSA調製物(PSAロット34と示される)がデオキシコール酸塩の不在下で凝集し、そのような凝集がIL-10誘導活性を低下させることを示す。凝集体を分散させるかまたは安定性を低下させる少量のデオキシコール酸塩の添加は、Lot34がT細胞によるIL-10産生を刺激する能力を有意に増加させる。この観察は、穏やかな酸処理によって製造されたPSAロット28を用いては、行われなかった。これは、本明細書で提供される方法を用いて単離された完全脂質化PSAが、従来技術の方法を用いて単離された脂質化PSAとは異なる立体配座を採用することを示唆する。
【図９】PBSカラム(上部)およびデオキシコール酸塩カラム(下部)を用いた、完全脂質化PSAロット40のクロマトグラフィー溶出プロフィールを提供する。屈折率による画分の分子サイズのモニタリングは、デオキシコール酸塩で平衡化されたカラムを使用する場合、ロット40のサイズの大きな減少を実証する。これは、単離され、完全脂質化PSAによって形成されたミセルの破壊に起因する。
【図１０】硫酸亜鉛/イミダゾール染色SDS PAGEゲルの写真である。穏やかな酸処理によって製造されたPSA(PSAロット28)と比較して、単離された完全脂質化PSA調製物(PSAロット34)は、はるかに少ない遊離脂質を提示する。
【図１１】PBSおよびPSAロット40処置マウスのEAE累積スコアを示す棒グラフである。PBSマウス、n=8；PSAマウス、n=7。PSA処置：1日おきに強制経口投与(75マイクログラム用量)、2日目から開始。
【図１２】非加水分解法を用いて製造された脂質化PSA調製物から得られた多数のペンタ-、テトラ-およびトリ-アシル化糖脂質のMSスペクトルを提供する(PSAロット40)。
【図１３】非加水分解法を用いて製造された脂質化PSA調製物から得られた多数のペンタ-アシル化糖脂質のMSスペクトルを提供する(PSAロット40)。これらのさまざまな糖脂質種は、アシル鎖長が互いに異なる。
【図１４】非加水分解法を用いて製造された脂質化PSA調製物から得られたさまざまな糖脂質種を列挙した表を提供する(PSAロット40)。この表は、脂質化PSAの糖脂質成分の複雑さを示す。そのような複雑さは、鎖長およびヒドロキシル化の差によって付与される。
【図１５】非加水分解法を用いて製造された脂質化PSA調製物から得られた糖脂質種の代表的な構造を提供する(PSAロット40)。C1またはC4'位のヒドロキシルの代わりにリン酸基を含む、例示化合物のモノリン酸化変異体も本明細書において提供される。
【図１６】図16は、非加水分解法を用いて製造された脂質化PSA調製物から得られた糖脂質種の溶出プロフィーおよび構造を提供する(PSAロット40)。C1またはC4'位のヒドロキシルの代わりにリン酸基を含む、例示化合物のモノリン酸化変異体も本明細書において提供される。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
発明の詳細な記載
本明細書において、脂質化PSAの脂質部分の構造的同定および特徴付けが提供される。本発明によれば、これらの脂質部分は、1つ以上のアシル鎖で置換されたジグルコサミンからなる糖脂質であることが見出された。天然に存在する形態では、糖脂質は、酸加水分解を受けやすい酸不安定結合であるケトシド結合を介して、その隣接する四糖単位に結合される。脂質化PSAは、その非脂質化対応物であるPSAよりも免疫学的に強力であることが明らかにされている。たとえば、実施例に示されるように、脂質化PSAは、非脂質化PSAよりも、IL-10産生をより良好に誘導することができる(したがってTreg細胞とよりよく相互作用することができる)。
【００７１】
脂質化PSA
本発明は、部分的には、脂質化PSAの脂質部分の特徴付けならびに新たに認識された糖脂質構造および脂質化PSAの脂質複雑性(lipid complexity)、およびこの糖脂質構造のPSAへの結合の性質に関する。脂質化PSAが、多糖成分の還元末端に糖脂質部分を含むことが今や発見されている。この糖脂質は、1つ、典型的には2つ以上のアシル鎖で置換された二糖を含む。
【００７２】
多糖成分
脂質化PSAの多糖成分(本明細書においてPSAと称する)は、以下に示す四糖反復単位を含む。それは、その遊離アミン基上の正電荷およびその遊離カルボキシル基上の負電荷(繰返し四糖単位あたり)によって与えられる双性イオン挙動を有する。その天然に存在する状態は、60以上の四糖反復単位(たとえば、最大で約100または約200または約300反復単位を含む)を含み、約150kD(約75kD〜240kDの範囲)の平均分子サイズを有することが報告されている。
【００７３】
PSAの反復四糖単位は、以下の構造を有する：
【化１】
2018528303.tif 000003
(式I)。
【００７４】
四糖反復単位を、以下のように表すこともできる：
【化２】
2018528303.tif 000004
【００７５】
本発明は、より少数の四糖単位(たとえば、1-60、1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、または1-5四糖単位、あるいは本明細書中に明示的に記載されているがこれらに限定されない1、2、3、4、5、6、7、8、9および10単位を含む)を含む脂質化PSAの合成形態を企図する。そのようなより短い変異体は、天然に存在する脂質化PSAを解重合することによって、または脂質化PSAから得られるPSAを解重合することによって得られる。PSAは、たとえば、化学的手段(たとえば、Duan and Kasper、Glycobiology、2011、21(4)：401-409に記載されているような、これに限定されないが、一酸化窒素などの反応性酸素種または反応性窒素種を使用する)、機械的手段および/または当技術分野で公知の酵素的手段を用いて解重合されうる。
【００７６】
本発明はさらに、350、400、500、600、700、800、900または1000単位以上を含むがこれらに限定されない300以上の反復四糖単位を含む合成脂質化PSAの形態を意図する。
【００７７】
本明細書に記載されているように、多糖成分は、糖脂質に共有結合していてもよく、またはある種の合成形態において、糖脂質と非結合であってもよい。共有結合している場合、それは、ケトシド結合または他の酸不安定結合を介して、またはエステル、アミド、またはエーテル結合などの結合を介して結合して、非天然脂質化PSAを形成することができる。
【００７８】
糖脂質成分
糖脂質成分は、1つ以上のアシル鎖で置換されたジグルコサミンを含む。糖脂質との関連した例示的なジグルコサミンを図3および6に提供する。本発明によれば、酸に不安定であり、したがって、従来技術の方法であるストリンジェントな加水分解の影響を受けやすいケトシド結合を介して、ジグルコサミンが多糖成分に結合することが認識されている。
【００７９】
ジグルコサミンは、場合によってリン酸化されていてもいなくてもよい。場合によって、ジグルコサミンはモノリン酸化される。リン酸化は、ジグルコサミンのC1位(還元末端)またはC4 '位で起こりうる。
【００８０】
二糖は、いくつかの例では、たとえば、エステル結合またはアミド結合を介して、2、3、4、5またはそれ以上のアシル鎖などの1つ以上のアシル鎖に結合してもよく、したがって、「O」置換(たとえば、アシル化)または「N」置換(たとえば、アシル化)されてもよい。したがって、各脂質化PSA分子は、1、2、3、4、5またはそれ以上のアシル鎖を含む。したがって、二糖、糖脂質成分および最終的に脂質化されたPSA分子は、それぞれ本明細書では、ジアシル化、トリアシル化、テトラアシル化またはペンタアシル化形態と称されうる。
【００８１】
単離された脂質化PSAのアシル鎖は、場合によって、14〜17炭素の長さの範囲であり得る。そのような種は、天然の総脂質化PSAの95％より多くを占めると考えられる。アシル鎖は修飾されていなくても、あるいは修飾されていてもよい。修飾されている場合、アシル鎖はヒドロキシ修飾されていてもよい。したがって、場合によって、脂質化PSAは、C14：0、C14：0-OH、C15：0、C15：0-OH、C16：0、C16：0-OH、C17：0、およびC17：0-OHとして特徴付けられる1つ以上のアシル鎖を有してもよい。
【００８２】
図1、4および12-16は、脂質化PSAの単一の調製物が多数の異なるアシル化糖脂質を産生し得ることを示す。たとえば、図1Aでは、質量分析(MS)スペクトル上の各ピークは、種がそのアシル鎖組成において相異する、異なる種の糖脂質を表す。この図は、これがテトラアシル化された糖脂質およびペンタアシル化された糖脂質の両方の場合であることを示す。図4は、異なるテトラアシル化(m/z 1350、1364および1378として示す)およびペンタアシル化(m/z 1604、1618および1634として示す)の糖脂質種の絶対量を示す。したがって、バクテロイデス・フラギリスから単離された脂質化PSAのバルク調製物は、潜在的に、限定的ではないが、複数のジアシル化種および/または複数のトリアシル化種および/または複数のテトラアシル化種および/または複数のペンタアシル化種を含む脂質化PSA分子の異種混合物を生じる。
【００８３】
図5は、糖脂質種およびそれらのアシル鎖組成のリストを提供する。たとえば、その表は、以下のアシル鎖の組み合わせを含むペンタ-アシル化種を提供する：
(1)一鎖のC16：0−OH、三鎖のC17：0-OH、および一鎖のC15：0；
(2)二鎖のC16：0−OH、二鎖のC17：0-OH、および一鎖のC15：0；
(3)三鎖のC16：0−OH、一鎖のC17：0-OH、および一鎖のC15：0；
(4)四鎖のC16：0−OH、および一鎖のC15：0；および
(5)四鎖のC16：0−OH、および一鎖のC14：0。
【００８４】
この表は同様に、さまざまな種のテトラ-アシル化、トリ-アシル化およびジ-アシル化アシル鎖を提供する。
【００８５】
したがって、本発明の脂質化PSA形態は、バクテロイデス・フラギリスまたは合成物から単離されているかどうか、および結合形態または非結合形態であるかどうかにかかわらず、限定的ではないが、アシル鎖の前述の組合せのいずれかを含むことができることが理解されるであろう：
(1)C16：0-OHアシル鎖のみ；
(2)C17：0-OHアシル鎖のみ、
(3)C16：0-OHおよびC17：0-OH鎖のみ；
(4)C16：0-OHおよびC17：0-OHおよびC15：0鎖のみ；
(5)C16：0-OHおよびC17：0-OHおよびC14：0鎖。
【００８６】
各タイプの鎖の数はさまざまであり、以下のオプションを含むがこれらに限定されるものではない：
(1)0-4のC16：0-OH鎖；
(2)0-4のC17：0-OH鎖；
(3)0または1のC14：0鎖；および
(4)0または1のC15：0鎖。
【００８７】
図12〜図16に示すように、同様の多様性は、非加水分解法を用いて得られた別の脂質化PSA調製物において明らかである(PSAロット40)。
【００８８】
したがって、本開示は、以下の構造を有する化合物を提供する：
【化３】
2018528303.tif 000005
式I
[式中、
R1およびR5はそれぞれ独立して、-OHもしくは-OPO3H-などのホスフェートを含むか、または-OHもしくは-OPO3H-などのホスフェートである；
R2、R3、およびR4はそれぞれ独立して、-OHもしくは-ORを含むか、または-OHもしくは-ORである；
R6は、-OHもしくは-OR7である；
Rはどの場合も独立して、水素または任意に置換されたアシル鎖である；および
R7は、多糖であるか、または多糖を含む。]
【００８９】
したがって、本開示は、以下の構造を有する化合物を提供する：
【化４】
2018528303.tif 000006
式II
[式中、
R1およびR5はそれぞれ独立して、-OHもしくは-OPO3H-などのホスフェートを含むか、または-OHもしくは-OPO3H-などのホスフェートである；
R2、R3、およびR4はそれぞれ独立して、-OHもしくは-ORを含むか、または-OHもしくは-ORである；
R6は、-OHもしくは-OR7である；
Rはどの場合も独立して、水素または任意に置換されたアシル鎖である；および
R7は、多糖であるか、または多糖を含む。]
【００９０】
いくつかの実施態様では、ホスフェートは、-OPO3H-である。いくつかの実施態様では、ホスフェートは、-OPO3H2-である。
【００９１】
いくつかの実施態様では、アシル鎖は、直鎖および分枝アシル鎖などの本明細書で提供されるアシル鎖のいずれかから選択される。
【００９２】
いくつかの実施態様では、多糖は、PSAであるか、または本明細書に記載されているようにPSAの1つ以上の四糖反復単位を含む多糖類である。
【００９３】
いくつかの実施態様では、R3は、OHである。
【００９４】
いくつかの実施態様では、R1またはR5のいずれかが、リン酸であるか、またはリン酸を含む(すなわち、一方のみがリン酸であるかまたはリン酸を含む)。
【００９５】
前述の例は、限定とみなされるべきではなく、むしろ、本発明は、脂質化PSA組成物に使用される、さまざまな組合せおよび前述の例の組み合わせを企図する。
【００９６】
本発明は、既知の、したがって場合により、所定の糖脂質含量および組成、ならびに既知の、したがって場合により、所定の多糖対糖脂質比を有する、規定された脂質化PSA混合物を提供する。したがって、本発明の脂質化PSAおよびその組成物は、これらの構造的特徴のいずれかに関して特徴付けられ、それによりこれらの組成物を従来技術のものとさらに区別することができる。たとえば、本明細書で提供される教示に基づいて、本発明は、唯一的または優勢的に(たとえば、50％を超える、または少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％ 少なくとも95％など)、限定されるものではないが、テトラ-およびペンタ-アシル化されたものなどの、ジアシル化またはトリアシル化またはテトラアシル化またはペンタアシル化脂質化PSA種、またはそれらのいくつかの組み合わせを含む組成物を提供する。そのような化学的に規定された組成物はこれまで意図されておらず、可能でもなかった。
【００９７】
本発明はさらに、インビボおよびインビトロでの使用のための脂質化PSAおよびその組成物から得られた単離された糖脂質を提供する。上記の糖脂質のいずれか、および上記の脂質の任意の組み合わせが、このような使用のために企図される。
【００９８】
単離された形態
本明細書に記載されるように、本発明によれば、単離方法が、収率および純度に影響を及ぼす、単離された脂質化PSAの存在量に著しく影響を及ぼしうることが見出された。たとえば、酸加水分解工程を除外する単離方法は、たとえその酸加水分解工程が単離プロセスの早期に行われたとしても、酸加水分解工程を含む方法よりもより完全な完全脂質化PSA種を産生することが見出されている。言い換えれば、酸加水分解工程を用いてバクテロイデス・フラギリスから脂質化PSAを採取すれば、そのプロセスにおいて、元の脂質化PSAの一部が脱脂される。これは、たとえば、図10に示すように、硫酸亜鉛/イミダゾール染色で逆染色した16.5％トリス-トリシン SDS-PAGEゲル上で調製物を流すことによって見ることができ、これは、穏やかな酸加水分解を用いて単離された脂質化PSA(ロット28)と、酸加水分解工程なしに単離された脂質化PSA(ロット34)とを比較するものである。この染色プロトコルは、同じゲル系において、脂質化PSAの多糖および脂質部分の両方を観察することを可能にする。従来技術の脂質化PSA調製物は、本発明の脂質化PSA調製物よりも高い程度の放出された糖脂質を含有することが見出されている。
【００９９】
したがって、本明細書で提供される調製物は、それらの放出された、または遊離の糖脂質の含量によって特徴付けられ得る。そのような含量は、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、1％未満、0.5％未満、0.1％未満、0.05％未満、0.001％未満、 0.0005％未満、0.0001％未満(脂質化PSAに対して放出された糖脂質、w/w)でありうる。いくつかの例では、組成物または調製物は、たとえば、本明細書に記載のゲル電気泳動法を用いて測定した場合に、検出されないレベルの放出または遊離糖脂質を有する。これらの例では、脂質化PSAは、放出された糖脂質を含まない、または実質的に含まないと考えられる。脂質化PSAはまた、純粋である(すなわち、放出された糖脂質および任意の他の天然に存在する混入物質を含まないかまたは実質的に含まない)とみなされうる。純度は、少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％ 99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、または99.9％またはそれ以上でありうる。
【０１００】
したがって、本発明は、これまで達成されていなかった純度および/または濃度で単離された脂質化PSAを含む組成物などの、単離された脂質化PSAを含む組成物を提供する。また、特定の種の脂質化PSAまたは脂質化PSA種の特定のサブセットを含むかまたは本質的にそれからなる組成物も提供される。これらの種は、それらの糖脂質成分に関して特徴付けられ、したがって、他の種から、およびバルク単離された脂質化PSAから区別されうる。糖脂質成分は、それらが有するアシル鎖の数、位置および種類により特徴付けられうる。たとえば、それらは、脂質化PSAのジアシル化、トリアシル化、テトラアシル化、または優勢的にペンタアシル化された形態の、天然に存在する割合に対して増加した量を含みうる。これらの増加した量は、特定の種の自然発生的な発現を超える可能性があり、したがって、そのような量は、特定の種に依存して変化する。たとえば、組成物は、ジアシル化脂質化PSAの少なくとも5％、10％、15％、20％またはそれ以上を含んでもよく、あるいは少なくとも70％、75％、80％、85％ 90％、95％、またはそれ以上のテトラアシル化および/またはペンタアシル化脂質化PSAを含んでもよい。
【０１０１】
組成物は、たとえば、それらの糖脂質成分に関して、または非脂質化PSAなどのその混入物質の含量に関して、それらの純度によって定義されうる。組成物は、脂質化PSAの濃度、またはPSA成分および/または糖脂質成分の濃度、またはそれらのPSA対糖脂質成分の比によって定義されうる。
【０１０２】
合成形態
本発明はさらに、脂質化PSAの合成される、天然に存在しない種を提供する。場合によって、これらの天然に存在しない種は、脂質化PSAの単離された形態で観察されるよりも低い四糖/糖脂質比(またはより低いPSA/糖脂質比、ここで、PSAは、1つまたは複数の反復四糖単位からなるポリマーである)を有することを特徴とする。このような比は、モル比または分子量比であってもよい。本発明は、多糖(PSA)または四糖および糖脂質および/または脂質化PSAから得られるか、またはそれに由来する脂質成分を、非天然結合形態で含む他の組成物をさらに提供する。たとえば、多糖および糖脂質成分は、天然には存在しない連結(linkage)を介して互いに結合(conjugate)していてもよい。連結は、非ケトシド連結であってもよく、限定されるものではないが、エステルまたはアミドまたはエーテルであってもよい。他の組成物では、多糖および糖脂質成分などの成分が、非結合であってもよい。さらに他の組成物では、結合または非結合である、多糖(または四糖)および糖脂質(または脂質)成分は、基材または送達ビヒクルの中または上に存在する。
【０１０３】
たとえば、バクテロイデス・フラギリス細胞から単離されたもの、合成されて単離された形態とは異なる多糖/糖脂質比を有するもの、非結合多糖および糖脂質成分として提供されるものなどの、脂質化PSAのこれらのさまざまな形態の全ては、活性剤であると考えられる。「脂質化PSA」に関連するさまざまな態様および実施態様は、これらのさまざまな態様に等しく適用され、別段の指示があるか、または明記されない限り、単離形態または共有結合形態のみに適用されることを意味しない。
【０１０４】
脂質化PSA組成物
本発明はさらに、単離された脂質化PSAを含む組成物を提供する。本明細書において、脂質化PSAに関して、用語「単離された」は、脂質化PSAが、バクテロイデス・フラギリスから製造されるか、または得られ、その自然環境(たとえば、バクテロイデス・フラギリス細胞、バクテロイデス・フラギリス細胞の成分、および/またはバクテロイデス・フラギリス細胞莢膜複合体(限定的ではないが、PSBなど)の成分)から物理的に分離されていることを意図する。
【０１０５】
いくつかの実施態様では、組成物は、核酸(たとえば、DNAおよびRNA)、タンパク質、およびバクテロイデス・フラギリスおよび/またはバクテロイデス・フラギリス莢膜の他の成分などの天然に存在する混入物質を実質的に含まない。本明細書で使用される、実質的に含まないとは、これらの混入物質が、約5重量％未満、1重量％未満、0.5重量％未満、または0.1重量％未満(もしくはそれ未満)(混入物質の重量対脂質化PSA形態の重量)に相当することを意図する。場合によって、そのような混入物質は検出されないことがありうる。
【０１０６】
さまざまな組成物は、LPSを含んでも含まなくてもよい。LPSは、約0.5％(脂質化PSA成分に対するLPSのw/w)の量で存在してもよい。
【０１０７】
いくつかの組成物は、少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上(w/w)の脂質化PSAおよび5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、1％未満、0.5％未満の遊離の放出された糖脂質を含む。いくつかの実施態様では、遊離の放出された糖脂質は、検出不可能である。
【０１０８】
したがって、脂質化PSAを含む特定の組成物は、単離された形態であろうと合成された形態であろうと、LPSおよび/または遊離の放出された糖脂質を含む他の成分を含んでも含まなくてもよい。いくつかの実施態様では、このような組成物中に存在するLPSの量は、約0.5％(w/w)以下である。いくつかの実施態様では、脂質化PSAに対する放出されたか、または遊離の糖脂質の量は、約0.5％(w/w)以下である。さまざまな他の実施態様では、このような組成物中に存在する非脂質化PSAの量は、約10％(w/w)以下、5％以下、または1％以下である。いくつかの実施態様では、組成物は非脂質化PSAを実質的に含まない。
【０１０９】
脂質化PSA、放出(非結合)糖脂質、および/またはLPSなどのこれらのさまざまな成分および混入物質の存在および量は、本明細書に記載されたようなゲル系を用いて決定されうる。
【０１１０】
脂質化PSAのいくつかの組成物は、少なくとも約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％またはそれ以上の多糖成分(非脂質化PSA)(多糖と糖脂質の合計重量に対する多糖の重量)を含む。脂質化PSAのいくつかの組成物は、約50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％またはそれ以下の糖脂質成分(多糖と糖脂質の合計重量に対する糖脂質の重量)を含む。脂質化PSAのいくつかの組成物は、約99％の多糖成分(非脂質化PSA)および約0.5％の糖脂質成分を含みうる。脂質化PSAのいくつかの組成物は、約80％の多糖成分(非脂質化PSA)および約20％の糖脂質成分を含みうる。これらは、脂質化PSAの単離形態または合成形態でありうる。したがって、それらは、多糖成分と糖脂質成分とが互いに結合した形態であってもよく、または、これらが互いに結合していない形態であってもよい。結合は、直接的または間接的結合であってもよく、さらに、それは共有結合または非共有結合であってもよい。多糖および糖脂質成分が、脂質化PSA成分(すなわち、式Iの1つ以上の四糖単位および本明細書に記載の糖脂質から形成され、1つ以上のアシル鎖に結合した二糖を含むポリマー)であることが理解されるべきである。
【０１１１】
例として、一つの場合、組成物は、6つの四糖単位および1つのテトラ-アシル化糖脂質単位を有する合成形態の脂質化PSAを含みうる(たとえば、図6Aの式IIを参照)。該組成物は、約20％の糖脂質および80％の多糖(上記で定義したw/w)を含みうる。合成組成物は、それらの糖脂質および多糖成分の量および比によって、そのような成分が互いに結合しているかどうかに関係なく定義されうる。他の組成物および組み合わせが企図され、当業者には容易に理解されるであろう。
【０１１２】
本発明の組成物は、典型的には、複数の脂質化PSA分子を含み、場合によって複数の脂質化PSA分子が脂質の程度または性質において変化を示すことが理解されるべきである。本発明は、組成物が、脂質化PSAの特定の種の特定の割合、および/または脂質化PSAの特定のサブセットを有することを企図する。その割合は、w/wの割合(たとえば、組成物中の全脂質化PSAの重量に対する特定の種の重量)であってもよい。そのような割合は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％ 75％、80％、85％、90％、95％、またはそれ以上の定義された種または種のサブセットである。たとえば、特定の種は、式IIの糖脂質を含む脂質化PSA、または式IIIの糖脂質を含む脂質化PSA、または図5に列挙されるアシル鎖の組合せのいずれか1つを含む脂質化PSAでありうる。脂質化PSA種の特定のサブセットは、テトラアシル化糖脂質を含む脂質化PSA、またはペンタアシル化糖脂質を含む脂質化PSA、またはテトラもしくはペンタアシル化糖脂質を含む脂質化PSAでありうる。さまざまなサブセットが企図され、本開示に基づいて明らかになるであろう。
【０１１３】
本発明は、インビトロおよびインビボで使用するための組成物を提供する。インビトロでは、組成物は、分析ツールまたはアッセイ標準として使用されうる。インビボでは、組成物は、ヒト疾患の動物モデルなどの実験モデル、または免疫調節を必要とするヒトまたは他の患者において使用されうる。インビボで使用される場合、組成物は、それらが患者への投与に適していることを意図して、薬学的に許容されるものである。それらは、そのような患者において予防的または治療的に使用されてもされなくてもよい。
【０１１４】
脂質化PSA形態は、単独での活性薬剤として使用されてもよく、または他の活性薬剤と組み合わせて使用されてもよい。薬剤の併用は、相加的であってもよいし、超相加的(たとえば、相乗的)であってもよい。脂質化PSA形態は、他の活性剤と一緒にまたは別々に製剤化されうる。脂質化PSA形態は、他の活性剤と同一または異なる経路を介して投与されうる。一緒に製剤化されない場合、脂質化PSA形態および他の活性薬剤は、同じか、または実質的に同じ投与計画(一緒に製剤化されていないが実質的に同時に投与されることを含む)で投与されてもよく、または異なる投与計画によって投与されてもよい。脂質化PSA形態は、急性および/または慢性的に投与されうる。
【０１１５】
単離および合成方法
本発明は、バクテロイデス・フラギリスから脂質化PSAを単離および精製する方法、ならびに本明細書に記載の脂質化PSAのさまざまな合成形態を作製する方法をさらに提供する。
【０１１６】
PSAを単離および精製するために使用された従来技術の方法が、多糖から脂質部分を除去し、それによってPSAのための多糖構造のみを予め得られることが最近認識された。公開PCT出願WO 2013/009945を参照されたい。しかしながら、脂質部分の性質およびPSAへのその特定の結合は、本発明までは知られていなかった。
【０１１７】
単離方法
本発明によれば、脂質化PSAが、加水分解工程の不在下で単離され得ることが見出された。したがって、本明細書では、バクテリオイデス・フラギリス菌株から脂質化PSAを単離するための非加水分解法(すなわち、酸加水分解工程などの加水分解工程を欠く方法)が提供される。脂質化PSAが加水分解工程なしでバクテロイデス・フラギリス菌株から単離されうることは、以前は認識されていなかった。
【０１１８】
脂質化PSAが、デオキシコール酸塩などの胆汁酸塩の存在下で単離されうることも見出された。これまでは、界面活性剤またはデオキシコール酸ナトリウムなどの胆汁酸塩の存在は、単離プロセスにとって有害であり、脂質化PSAの収率が低下すると考えられていた。予期せぬことに、加水分解ステップが不在で、任意に界面活性剤(デオキシコール酸塩など)を利用する本明細書で提供されるさまざまな方法は、脂質化PSAの適切な収率、および場合によって、脂質化PSAのより高い収率を提供する。酸加水分解工程を単離工程から完全に除外することにより、PSAからの糖脂質の加水分解が防止され、それによって、脂質化PSA対非脂質化PSAの割合が高くなる。これは、そのような調製物中の放出された(非結合)糖脂質の量が減少すること、そして、ほとんどの場合に検出されないことによって証明される。放出された糖脂質は、ゲル電気泳動または質量分析などの本明細書に記載の分析技術のいずれかを用いて観察されうる。
【０１１９】
場合によって、そのような方法は、本明細書に記載の単離法を用いて、脂質化PSAを単離し、単離された脂質化PSAを精製して、これまでに達成されなかった純度および/または濃度レベルに達することを包含する。本明細書において実証されるように、このような純度および/または濃度レベルは、脂質化PSAの凝集(たとえば、ミセルとして)の程度によって、および場合によって、このような組成物の生物学的活性を増加させるデオキシコール酸塩などの脱凝集剤の効果によって、明らかとなる。
【０１２０】
脂質化PSAは、非脂質化PSAよりも生物学的に活性であると考えられるので、本明細書で提供される単離方法は、これまでに報告された調製物よりも高い重量当たりの活性を有する脂質化PSAをもたらす。このような活性は、たとえば、IL-10誘導活性でありうる。
【０１２１】
この方法は、バクテロイデス・フラギリスから脂質化PSAを単離および精製するための一般的かつ特異的な方法を提供する。これらの方法は、脂質化PSAを産生する菌株であれば、バクテロイデス・フラギリスの任意の菌株で実施されうることが理解されるべきである。そのような菌株には、天然に存在する菌株または天然に存在しない菌株が包含される。天然に存在しない菌株の一例は、バクテロイデス・フラギリス株9343のデルタ44変異体である。この突然変異株は、9343などの野生型菌株に見出されるPSAおよびPSBではなく、PSAのみを発現する。
【０１２２】
単離方法は、一般に、嫌気性条件下でのバクテロイデス・フラギリス(野生型または変異体株)の増殖、バクテロイデス・フラギリスからの多糖莢膜複合体の抽出、多糖画分の単離、およびその画分からの脂質化PSAの精製を含む。抽出工程は、任意に高温(たとえば、約60〜80℃)で行うことができる、フェノール/水抽出を用いて達成されうる。次に、莢膜多糖類を含む水相を、水に対して透析し、その後、総体積を減らすために部分的に凍結乾燥することができる。次いで、得られた溶液を、典型的には、多糖画分をさらに精製するために、DNアーゼおよびRNアーゼなどのヌクレアーゼおよびプロナーゼなどのプロテイナーゼで処理する。次いで、多糖画分をエタノール沈殿させ、沈殿物を回収し、洗浄し、サイズ排除技術に付して脂質化PSAを、たとえばLPSを含む他の多糖類からさらに単離する。典型的なサイズ排除技術は、カラムクロマトグラフィーである。適切なカラムは、S-400サイズ排除カラムである。実施例に記載されているように、デオキシコール酸ナトリウムの形態の生物学的界面活性剤を含有するクロマトグラフィーカラムを用いて、脂質化PSAを単離した。脂質化PSAを含有するカラム画分を同定し、プールし、次いで、プールした混合物を、必要に応じてさらに透析し、凍結乾燥することができる。さらに、再構成の後、混合物は、保存または遅延使用のために、さらに透析され、エタノール沈殿され、および/または凍結乾燥されうる。単離中のpHは、好ましくは9以下(たとえば、約4〜約9以下)であり、ほとんどの工程において中性範囲に維持される。
【０１２３】
前述の方法は、酸加水分解工程なしに実施されうる。しかしながら、脂質化PSA、および種とその種のそのサブセットが、デオキシコール酸ナトリウムなどの界面活性剤を使用せずに酸加水分解工程および/またはサイズ排除工程を含む方法を用いて収穫されうることが理解されるべきである。
【０１２４】
酸加水分解工程が使用される場合、それは好ましくは穏やかな加水分解(たとえば、約4、または4〜5の範囲のpHで)であり、好ましくは精製工程の早期段階(たとえば、最初のエタノール沈殿の後)に組み込まれるのが好ましい。使用される場合、酸加水分解は、高温で希酸(たとえば、1〜2％酢酸)を用いて実施されうる。高温は80〜100℃、85〜95℃の範囲であり、場合によって、約90℃であってもよい。処理は、1時間、2時間、3時間またはそれ以上続けてもよい。場合によって、酸処理は、2％酢酸を用いて90℃にて3時間実施される。
【０１２５】
上記の方法は、クロマトグラフィーカラムおよび/または溶出液中の界面活性剤またはデオキシコール酸(たとえば、デオキシコール酸ナトリウム)などの胆汁酸塩を用いて実施されうる。デオキシコール酸ナトリウムは、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、または約1％未満の濃度で存在しうる。しかしながら、脂質化PSAが、デオキシコール酸塩などの界面活性剤を使用しないサイズ排除工程を含む方法を用いて収穫されうることが理解されるべきである。
【０１２６】
したがって、例示的な単離方法は、場合によって、高温でフェノールと水との混合物を用いてバクテロイデス・フラギリスからの莢膜複合体を水相中に抽出すること、場合によって、DNAおよび/またはRNAおよび/またはタンパク質消化後にエタノールを用いて水相から多糖画分を沈殿させること、およびたとえば、デオキシコール酸ナトリウムを含有するクロマトグラフィーカラムなどの、サイズ排除によって脂質化PSAを他の多糖類から単離することを含む。
【０１２７】
一旦単離されたバクテロイデス・フラギリスから調製された脂質化PSA形態は、さらに修飾されてもよい。たとえば、多糖成分は、天然に見出されるものよりも少ない四糖単位を有する別の非天然型を生成するために解重合されうる。これは、機械的、化学的または酵素的手段によって達成されうる。Duan and Kasper、Glycobiology、2011、21(4)：401-409)に記載されるように、化学的解重合の一例は、限定的ではないが、一酸化窒素などの反応性酸素種または反応性窒素種を含む。グリコシダーゼは、酵素解重合に使用されうる。機械的解重合は、せん断を伴いうる。一例として、PSAポリマーは、25％、50％、75％、またはそれ以上短縮されることができ、それにより、天然に存在する脂質化PSAとは構造的に異なる脂質化PSAが生じる。そのような修飾は、約50、40、30、20、または約1〜10個の四糖単位の長さを有するPSAまたは脂質化PSAを生成しうる。
【０１２８】
PSAの脂質化および脱脂バージョンは、たとえば、液体クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィー、または他のサイズベースまたはイオンベースの分離技術を使用して多糖の長さにしたがって解重合および分画されうる。
【０１２９】
脂質化PSAの単離された形態は、単独で製剤化されてもよく、その場合、それらは緊密なミセル様構造を形成する。重要なことに、脂質化PSAは、インビボで存在する場合、そのようなミセル様構造を形成しない。そのような変化した構造は、比較的純粋な形態の脂質化PSAの単離の際に観察される(したがって可能である)。さらに、これらのミセル様構造は、界面活性剤または他の脱凝集剤がそれらを破壊するか、またはそれらをあまり安定にさせないようにすることが必要であるほど非常に安定であり、よって、それに含まれる脂質化PSAが利用しやすくなる。
【０１３０】
これらのさまざまな非天然形態では、アシル鎖は、ミセル様構造の外部に位置し、したがって、標的細胞およびそれらの受容体に接近可能である。そのような細胞として、抗原提示細胞が挙げられ、そのような受容体として、TLR2などのTLRが挙げられる。Wangら、J. Exp. Med 203(13)：2853-63およびRoundら、Science 2011、332(6032)：974-7を参照されたい。
【０１３１】
単離された脂質化PSAを、得られた組成物が、天然に存在しない割合のジ-、トリ-、テトラ-およびペンタ-アシル化PSAを含むように、糖脂質の性質に基づいて分画することもできる。
【０１３２】
したがって、本開示は、天然に存在する脂質化PSAと比較して、より少ない四糖単位を有する脂質化PSAのさらなる天然に存在しない種を企図する。
【０１３３】
他の方法
本発明の合成脂質化PSA形態は、多糖および糖脂質成分の天然に存在するか、または合成的に生成された形態を用いて製造されうる。脂質化PSAの加水分解(たとえば、酸処理)を検討し(deliberating)、それによって多糖と糖脂質との間のケトシド連結を切断することにより、天然に存在する形態を製造することができる。多糖および糖脂質成分は、互いに分離され、それによって液体クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動または他のサイズベースまたは電荷ベースの分離技術を用いて単離されうる。
【０１３４】
多糖は、機械的、化学的および/または酵素的手段によってさらに修飾されてもよい。これは、所望であれば多糖成分の長さを減少させるのに役立ちうる。多糖類(PSA)は、当技術分野で公知であり本明細書に記載される、たとえば、機械的および/または酵素的手段を用いて解重合されうる。
【０１３５】
同様に、本発明は、脂質化PSAから得られる天然に存在する糖脂質をそのアシル化の程度にしたがって分画し、次いで、特定のサブセットを多糖成分と再結合させることを意図する。たとえば、ペンタアシル化またはテトラアシル化された糖脂質サブセットを単離し、多糖成分と再結合させることができる。最終生成物は、糖脂質と多糖との間の天然に存在する連結を含んでいてもよく、またはエステル、アミド、エーテルまたはそれらの組み合わせなどの天然に存在しない連結を含んでいてもよい。多糖類および糖脂質は、限定的ではないが、2-(Boc-アミノ)エチルブロミドなどの二官能性リンカー分子を介して結合させることもできる。他のリンカー分子を使用することができ、当該分野で公知である。
【０１３６】
別法として、脂質化PSAの成分を合成し、次いで、組み合わせることができる。たとえば、糖脂質を合成し、バクテロイデス・フラギリスから単離された多糖成分と共に使用することができる。たとえば、糖脂質は、Imotoら(Tet. Lett. 1984、25：25、2667-2670)に記載されている技術を用いて合成されうる。これらの技術を用いて、合成脂質化PSAの結合形態および非結合形態の両方を製造することができる。簡潔にするために、本明細書中で使用される場合、「脂質化PSA」という用語は、一緒に提供されるが非結合形態である(たとえば、以下に説明するように、基材の中または上にある)、多糖および糖脂質成分を含む合成形態を包含することが理解されるべきである。
【０１３７】
合成脂質化PSA形態は、基材内および/または基材上を含めて提供されうる。基材は、固体または半固体であってもよく、さまざまな形状または形態のいずれか1つをとってもよい。基材は、生分解性であってもよく、それ自体は、天然および/または天然に存在しない成分(たとえば、天然および/または天然に存在しないポリマーなど)から構成されてもよい。適切な基材の1つの例は、粒子である。粒子は、微粒子(平均直径1〜999ミクロン)またはナノ粒子(平均直径1〜900ナノメートル)であってもよい。粒子は、多孔質粒子であっても、非多孔質粒子であってもよい。活性剤をその中または上に有するそのような粒子を製造する方法は、当技術分野で公知である。したがって、本発明は、本明細書で企図されるようなある種の脂質化PSA組成物を製造するための、そのような方法のいずれかおよびそのような粒子のいずれかの使用を企図する。
【０１３８】
場合によって、糖脂質またはPSA成分は、粒子の表面に結合される。
【０１３９】
場合によって、糖脂質およびPSA成分は、リポソームまたはリポソーム様構造で提供される。場合によって、糖脂質およびPSA成分は、リポソームまたはリポソーム様構造体内に提供される。糖脂質成分がリポソームの外部にあってもよく、多糖成分がリポソームの内部にあってもよい。リポソームは、脂質化PSA由来の糖脂質およびPSA成分のみを含んでもよく、または限定的ではないが、他の脂質などの他の成分を含んでもよい。外部に面した脂質成分は、抗原提示細胞上のTLR2と相互作用し、それによってリポソームのこのような細胞への進入およびPSA成分の細胞内放出を促進すると考えられる。
【０１４０】
天然または非天然の脂質化PSAのリポソームまたはミセル形態は、典型的には、表面に糖脂質成分を含み、細胞およびTLR2などの特定の受容体との相互作用に利用可能である。
【０１４１】
脂質化PSAは、より大きな治療効率のために、特定の細胞型を標的とするように製剤化されうる。たとえば、単離されているかまたは合成された脂質化PSAが、ナノ粒子などの基材に関連して提供される場合、基材は、樹状細胞およびB細胞といったような抗原提示細胞(APC)などの免疫細胞への基材のホーミングまたは結合を増加させる部分をさらに含み得る。
【０１４２】
脂質化PSAの天然に存在しない形態の例として、糖脂質と多糖成分との間に天然に存在しない連結を含むもの、天然に存在する形態の脂質化PSAよりも短いまたは長いPSAポリマーを有するもの、天然に存在する割合よりも低いまたは高い割合で存在するもの、またはこれらの特徴のいくつかの組み合わせまたはすべてを持つものが挙げられる。
【０１４３】
脂質化PSAの分析および特徴付けのための方法
本発明は、脂質化PSAの存在を検出するための方法、場合によって、試料または組成物中の脂質化PSAの量を定量化する方法を提供する。
【０１４４】
構造的特徴付け
単離された画分の純度は、プロトンNMRおよび/またはSDS PAGEゲルによって評価されうる。プロトンNMRプロフィールは、600MHz NMRを用いて生成されうる。他の組成物についても、同様の方法で脂質化PSAの存在について試験されうる。
【０１４５】
これらのアプローチは、脂質化PSAの糖脂質成分を特徴付けるために使用することもできる。たとえば、図1および2に示すように、脂質化PSAのテトラアシル化およびペンタアシル化された糖脂質は、質量分析法を用いて互いに区別されうる。同様に、MADLI-TOF-TOFは、脂質化PSAからのジ-、トリ-、テトラ-およびペンタ-アシル化糖脂質を検出および区別するために使用されうる。したがって、これらのアプローチを用いて特定の糖脂質の存在を試験することができる。
【０１４６】
酸処理経時変化を用いて脂質化PSAの存在を同定することも可能であり、それによって、放出された(非結合の)脂質部分は、硫酸亜鉛/イミダゾール染色で逆染色された16.5％トリス-トリシンSDS-PAGEゲルを用いて視覚化されうる。この染色プロトコルは、同じゲル系において、脂質化PSAの多糖および脂質部分の両方を観察することを可能にする。一例として、脂質化PSA含量について試験されている試料を、90℃にて2％酢酸でさまざまな時間処理し、続いてNaOHで中和し、透析することができる。次いで、得られた生成物100μgを16.5％トリス-トリシンSDS-PAGEゲル上に流し、上記のように逆染色する。加水分解時間の増加に伴って約5kDにて1つ以上の脂質バンドの付随した出現を伴う脂質化PSAバンド(PSAの脂質化および非脂質化バージョンを表す60kDを超える主要バンド)の強度の減少は、脂質化PSAの存在を証明する。約6kDおよび8kDのLPSバンドもまた、時間の増加と共に強度が低下する。
【０１４７】
このアプローチはまた、遊離の放出された糖脂質の存在について脂質化PSA調製物を試験するために使用されうる。図10は、穏やかな酸加水分解(PSAロット28)で製造された調製物および酸加水分解工程を全く用いないで製造された調製物(PSAロット34)のSDS PAGEゲル分析の結果を示す。非加水分解法を用いて単離されたロット34は、遊離の放出された糖脂質を含まないが、穏やかな加水分解を用いて単離されたロット28は、含む。遊離の放出された糖脂質は、多糖類PSAに対する非結合型糖脂質を意味し、そのような糖脂質は、遊離した、放出された、または非結合である糖脂質と互換的に称されうることが理解されるべきである。
【０１４８】
機能的特徴付け
脂質化PSAは、その非脂質化対応物(すなわち、非脂質化PSA)よりも強力であることが明らかにされている。脂質化PSAの免疫学的活性は、インビトロおよびインビボでアッセイされうる。インビトロ試験の一例は、脾臓樹状細胞(DC)およびT細胞共培養におけるIL-10産生の誘導である。このアッセイは以下のように行うことができる：(1)マウス抗CD11cマイクロビーズ(Miltenyi Biotec cat＃130-052-001)を用いて脾臓DCを単離する；(2)マウスT細胞CD4サブセットカラムキット(R＆D systems cat＃MCD4C-1000)を用いてCD4+T細胞を単離する；(3)2x104個のCD11c+ DCおよび105個のCD4+ T細胞を混合し、1μg/ mlの抗CD3(BD Pharmingen cat＃553057)を添加する；(4)次に、培養物を100μg/ mlの脂質化PSAで刺激し、細胞を5日間インキュベートする；そして(5)上清を採取し、ELISAによりIL-10の存在について分析する。
【０１４９】
図7は、この共培養系を用いて、より穏やかで早期の酸加水分解工程を用いて製造された脂質化PSA(PSA24として示す)が、より過酷で後期の酸加水分解工程を用いて作製された材料(PSA23として示す)より約3倍強力であることを実証する。
【０１５０】
図8は、酸加水分解工程なしで製造された脂質化PSA(PSA34、各バーペアの第2バーとして示される)のこの同じアッセイにおける活性を示す。この調製物のIL-10誘導活性は、デオキシコール酢酸塩(DOC)の添加後、約2倍に増加する。穏やかな酸加水分解工程を用いて製造された脂質化PSA(PSA28、各バーペアの第1バーとして示される)では、同様の増加は観察されない。デオキシコール酸塩の添加による活性の増加は、脂質化PSAが緊密に凝集し、このような凝集形態は安定性が低く、したがって、脂質化PSAが、デオキシコール酸塩の存在下で、より利用しやすくなることを示唆している。
【０１５１】
インビボでの脂質化PSAの免疫学的活性を研究するために、多発性硬化症の動物モデル(EAE)を使用することができる。このモデルでは、EAE誘発の6日前に開始して3日ごとに、マウスを脂質化PSA(1マウスあたり約75〜100μgのオーダーで)または対照(生理食塩水、PBS)で処置する。200μlの完全フロインドアジュバント(Sigma)中の250μgのMOG33-55(Peptides International)をマウスに皮下接種する。チャレンジ後0日目および2日目に、250ngの百日咳菌(Bordetella pertussis)毒素(List Biological Laboratories)をマウスに腹腔内注射する。疾患は確立された0〜5のスケールでスコア化され、5は進行した神経疾患である。マウスは病気の進行について毎日モニターされ、採点される。
【０１５２】
使用方法
インビトロおよびインビボでの脂質化PSAのさまざまな形態の使用方法もまた提供される。脂質化PSAのさまざまな形態は、先に記載された非脂質化形態のPSAよりも強力である。本明細書で提供されるさまざまな形態は、特にそれらのIL-10誘発活性およびTreg成熟活性の増強の観点から、免疫調節物質として使用されうる。これらの形態は、インビトロおよびインビボでの使用が意図される。インビトロでの使用として、分析ツール(たとえば、バクテロイデス・フラギリスの存在のマーカーとして)およびアッセイ標準または対照(たとえば、脂質化PSAの陽性マーカーまたはIL-10誘導アッセイなどのインビトロアッセイにおける比較器として)が挙げられる。インビボでの使用として、動物モデルにおける使用、また、限定的ではないが、自己免疫疾患(たとえば、多発性硬化症および炎症性腸疾患)などの炎症状態を治療または予防するための臨床的使用が挙げられる。
【０１５３】
本発明はさらに、脂質化PSAの個々の多糖および糖脂質成分の使用を企図する。たとえば、糖脂質成分を単一の薬剤として使用することができる。別の例として、多糖および糖脂質成分は、非結合形態で一緒に使用されうる。
【０１５４】
インビボでの使用として、限定的ではないが、ヒト患者に関わるものが挙げられる。たとえば、インビボでの使用として、免疫応答を調節するために、たとえば、陽性対照または比較器としての非ヒト患者への脂質化PSA分子およびその組成物の投与、投与が挙げられる。
【０１５５】
また、本明細書に記載の脂質化PSAをそのような患者に投与することによって、患者における免疫応答を調節する方法も企図される。患者は、異常な免疫応答を有するか、または発現する可能性があるものでありうる。典型的には、異常な免疫応答は増強された免疫応答であり、脂質化PSAは免疫応答を下方制御するように作用する。増強された免疫応答は、典型的には、自己免疫疾患などの炎症状態に関連するが、これに限定されるものではない。
【０１５６】
したがって、脂質化PSAの単離または合成形態、脂質化PSAの結合形態または非結合形態、または脂質化PSAの糖脂質成分を単剤として、またはPSA以外の多糖類と組み合わせて含む本発明の組成物は、自己免疫疾患を有するかまたは発症するリスクのある患者における免疫応答を調節する(および典型的には下方制御する)ために使用され得る。当業者に理解されるように、自己免疫疾患を有する患者は、典型的には、自己免疫疾患に関連する1つ以上の「事象」または再発を経験する。たとえば、炎症性腸疾患を有する患者は、症状の存在または症状の重症度の増加を特徴とする、疾患の一時的に隔離された攻撃を経験することがある。本発明は、疾患のこのような将来の再発の可能性を低減するため、または疾患に関連する症状の重篤度(たとえば、疼痛、発熱、不快感、疲労など)を軽減するために組成物をそのような患者に使用しうることを意図する。したがって、組成物はこのような再発の前に投与されてもよく、このような様式で規則的な頻度で任意に、慢性的に投与されてもよい。例として、1日に1回、2、3、4、5または6日に1回、または1週間に1回などが挙げられる。本発明はまた、症状の重篤度を軽減するため、または再発の時間を短縮化するために、再発の間に組成物を患者に投与することも企図する。
【０１５７】
したがって、一例として、本発明は、炎症に関連する状態の再発のリスクがある患者に、限定されるものではないが、単剤またはPSA以外の薬剤と組み合わせて、脂質化PSAの単離または合成形態、および/または脂質化PSAの結合または非結合形態、または脂質化PSAの有効量の脂質成分などの本明細書で提供される形態のいずれかで、有効量の脂質化PSAを投与することを含む方法を提供する。方法は、状態の再発の可能性を減少させるか、または将来の再発の頻度を減少させる可能性がある。方法は、症状に関連する症状の重篤度を、そのような症状が最初の症状であるか、再発であるか、または慢性的に存在するかにかかわらず、低減することができる。
【０１５８】
自己免疫疾患は当該分野で公知である。自己免疫疾患の例として、多発性硬化症、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、関節リウマチ、乾癬、I型糖尿病、ブドウ膜炎、セリアック病、悪性貧血、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、全身性エリテマトーデス、急性播種性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、ギラン・バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、巨細胞性動脈炎、再生不良性貧血、自己免疫性肝炎、川崎病、混合結合組織病、甲状腺炎、多発性関節炎、原発性胆汁性硬化症、ライター症候群、高安動脈炎、白斑、温式自己免疫性溶血性貧血、ウェゲナー肉芽腫症、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、およびサルコイドーシスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１５９】
重要な態様において、自己免疫疾患は、多発性硬化症である。他の重要な態様において、自己免疫疾患は、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含むがこれに限定されない炎症性腸疾患である。他の実施態様では、自己免疫疾患は、関節リウマチまたはI型糖尿病でありうる。
【０１６０】
場合によって、本発明の組成物を、自己免疫疾患(その症状を含む)をまだ発現していないが、既知の遺伝的または家族性素因に基づく疾患などの発症のリスクがある患者に投与することができる。このような患者には、その疾患に罹患している1人以上の家族がいる可能性がある。
【０１６１】
場合によって、本発明の組成物は、移植片対宿主病を有するか、または発症するリスクがある患者に投与される。投与は、器官または組織(血液または血液製剤を含む)を患者に移植する前、最中および/または後に行われうる。
【０１６２】
さらに他の場合では、組成物は、炎症に関連する状態を有するか、または発症するリスクがある患者に投与されうる。
【０１６３】
一例として、組成物を、喘息を有する患者に投与することができる。当該技術分野において理解されるように、喘息を有する患者は、典型的には喘息発作または呼吸障害を特徴とする事象を経験する。本発明は、本明細書中に記載される組成物が、喘息患者に対して急性(たとえば、単回の大きな用量)または慢性(たとえば、反復される、より少ない用量)で投与されうることを意図する。したがって、場合によって、組成物は、喘息発作の前に投与されて、発作の発生を防止し、発作の頻度を低減し、および/または発作の重篤度を軽減する。場合によって、組成物は、その重篤度を低減し、および/または発作の持続時間を減少させるために、発作中に投与され得る。
【０１６４】
炎症に関連する別の状態は、手術後の癒着である。本発明は、外科手術後の癒着を有するかまたは発症するリスクのある患者への本明細書に記載の組成物の投与を意図する。組成物は、このような癒着の発生を防止し、および/または重篤度を低下させるために、手術前、手術中および/または手術直後に、あるいは手術前および手術中に限定されないが、それらの任意の組合せで投与されうる。組成物は、手術後1週間、2週間、3週間、1ヶ月、または数ヶ月間、たとえば、毎日、2日毎、3日毎等などで手術後に繰り返し投与されうる。
【０１６５】
炎症に関連する別の状態は、腹腔内への腸内容物の漏出の際に起こりうる腹部膿瘍を含むがこれに限定されない膿瘍である。これらの場合、治療される患者に抗生物質などの抗菌剤を投与することもできる。
【０１６６】
したがって、別の例として、有効量の本明細書に記載の脂質化PSA形態または脂質化PSAの糖脂質成分(多糖成分から分離)またはその組成物のいずれかを、膿瘍を有するかまたは発症するリスクのある患者に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施態様では、患者には、抗生物質などの抗菌剤も投与される。いくつかの実施態様では、脂質化PSAは、膿瘍の発生前および/または膿瘍に伴う症状の発現の前に投与される。いくつかの実施態様では、脂質化PSAまたは糖脂質は、膿瘍が検出または診断された後、および/または膿瘍に伴う症状が現れた後に投与される。
【０１６７】
炎症に関連する別の状態は肥満であり、したがって、本発明は、肥満である患者における本明細書に記載の組成物の投与も企図する。そのような患者は、典型的には、肥満指数(BMI)30以上として定義される。場合によって、組成物は、BMIが20より大きく、または25より大きい患者に投与されうる。この組成物は、さらなる体重増加を防止し、および/またはこのような患者において体重減少を誘発することを意図する。
【０１６８】
患者は、本発明の組成物の投与から利益を得るか、または本発明の組成物を投与されうる任意の患者を意図する。重要な実施態様では、患者は、ヒト患者である。患者はまた、イヌまたはネコなどのコンパニオンアニマル、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジなどの農業用家畜、マウス、ラット、ウサギ、サルなどの実験動物、または動物園で飼育されるか、または捕獲された動物などの動物である。
【０１６９】
さまざまな投与経路が利用可能である。選択される特定の様式は、もちろん、治療される特定の状態、治療される状態の重篤度、および治療有効性に必要とされる用量に依存する。一般的に言えば、本発明の方法は、臨床的に受け入れられない副作用を引き起こすことなく活性化合物の有効量を産生する任意の様式を意味する、医学的に許容される任意の投与様式を使用して実施されうる。このような投与様式として、経口、直腸、局所、経鼻、吸入(たとえば、吸入器または噴霧)、または非経口経路が挙げられる。用語「非経口」として、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、または注入が挙げられる。
【０１７０】
製剤
投与される場合、本発明の活性薬剤は、薬学的に許容される組成物または製剤として製剤化される。そのような組成物または調製物は、通常、薬学的に許容される担体、塩の集合(concentrations of salt)、緩衝剤、保存剤、他の免疫調節剤、および場合により他の治療剤を含み得る。本明細書で使用され、以下でより十分に記載される「薬学的に許容される担体」という用語は、ヒトまたは他の動物への投与に適した1つまたは複数の適合する固体または液体充填剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。「担体」という用語は、活性物質を組み合わせて投与するため、長期保存するため、安定性を促進するためなどの天然または合成の有機または無機成分を意味する。本発明の活性薬剤は、所望の薬効を実質的に損なう相互作用がないような様式で、医薬組成物の他の成分と混ぜ合わせることができる。
【０１７１】
医薬組成物を、単位剤形で提供することができ、薬学の分野で知られている方法のいずれかによって製造することができる。全ての方法は、活性薬剤を1つ以上の補助成分を構成する担体と組み合わせる工程を含む。一般に、組成物は、液体担体、細かく分割された固体担体、またはその両方に、活性物質を均一かつ密接に接触させ、次いで必要に応じて生成物を成形することによって製造される。経口投与に適した組成物を、カプセル、錠剤、ロゼンジなどの別個の単位として提供することができ、各錠剤は、所定量の活性剤を含有する。他の組成物として、たとえば、シロップ、エリキシルまたはエマルジョンなどの水性液体または非水性液体中の懸濁液が挙げられる。
【０１７２】
活性薬剤を、それ自体(純粋な)または薬学的に許容される塩の形態で投与することができる。薬学的に許容される塩を、インビボ用途およびインビトロ用途に使用することができる。非薬学的に許容される塩は、その薬学的に許容される塩を製造するために使用されてもよく、本発明の範囲から除外されない。薬学的に許容される塩には、以下の酸から調製されたものが含まれるが、これらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、p-トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン-2-スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。また、薬学的に許容される塩を、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩などのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩として製造することができる。
【０１７３】
適切な緩衝剤として、以下のものが挙げられる：酢酸および塩(1〜2％w/v)；クエン酸および塩(1〜3％w/v)；ホウ酸および塩(0.5〜2.5％w/v)；およびリン酸および塩(0.8〜2％w/v)を含む。適切な保存剤として、塩化ベンザルコニウム(0.003-0.03％w/v)；クロロブタノール(0.3-0.9％w/v)；パラベン(0.01-0.25％w/v)およびチメロサール(0.004-0.02％w/v)が挙げられる。
【０１７４】
非経口投与に適した組成物は、レシピエントの血液と等張性でありうる活性剤の滅菌水性調製物を含むのが好都合である。使用することができる許容されるビヒクルおよび溶媒として、水、リンガー溶液、および等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、滅菌不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来から使用されている。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性の固定油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が、注射剤の製造に使用される。皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内などの投与に適したキャリア製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、PAに見出されうる。
【０１７５】
いくつかの実施態様では、脂質化PSAまたは糖脂質成分は、脂質化PSA凝集を制限または防止するために、限定的ではないがTweenなどの界面活性剤、または限定的ではないがデオキシコール酸などの胆汁酸塩を用いて製剤される。このような界面活性剤または胆汁酸塩は、依然として薬学的に許容されるように低濃度で使用されうる。たとえば、それは、約または0.0001％、0.0005％、0.001％、0.002％、0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.07％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％ 0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％未満もしくはそれ以上で存在しうる。図8は、酸加水分解を伴わずに生成した約0.0025％のデオキシコール酸塩および単離された脂質化PSAを含む組成物を提供する。
【０１７６】
脂質化PSAの糖脂質および多糖成分への分解は、本明細書に記載の質量スペクトルまたは亜鉛ゲルを用いて測定されうる(たとえば、後者の場合、放出された脂質は、より速い移動バンドとして明確に同定される)。これは、図10に示される。
【０１７７】
上述したように、医薬製剤は、有効量で投与される。治療的適用のためには、有効量とは、一般に、医学的に望ましい結果を達成するのに十分な量である。一般に、治療有効量は、症状の再発の可能性、頻度および/または重症度を低下させることを含む、治療される特定の状態の発症を遅延させる、進行を阻害する、または完全に停止させるために必要な量である。一例として、有効量は、治療または予防される障害の症状(たとえば、疼痛、発熱など)の発症を軽減、緩和または遅延させるのに役立つ量でありうる。有効量は、投与様式、治療される特定の状態および所望する結果に依存する。それはまた、状態のステージ、状態の重症度、治療される患者の年齢および身体状態、併用療法の性質(もしあれば)、治療の持続時間、特定の投与経路および医療従事者の知識と専門知識の範囲内にある同様の要因にも依存する。予防的適用のためには、有効量は、予防される特定の状態の発症を遅延させるのに十分な量、進行を阻害するか、または完全に停止させるのに十分な量であって、症状の発症を予防するのに必要な量によって調整されうる。
【０１７８】
一般に、本発明の活性薬剤の用量は、約0.01mg/kg/日〜1000mg/kg/日、好ましくは約0.1mg/kg/日〜200mg/kg/日、最も好ましくは約0.2mg kg/日〜約20mg/kg/日の用量で、1日またはそれ以上の期間、1回または複数回投与される。1〜500mg/kg、好ましくは1〜100mg/kgの範囲の用量、さらにより好ましくは1〜50mg/kgの範囲の用量が適切であると予想される。好ましい量は、薬剤の最適な投与量レベルを決定するための標準的な慣習に従い、当業者によって決定されうる。最大用量が、健全な医学的判断による最も安全な用量であることが一般に好ましい。
【０１７９】
場合によって、ヒト患者のための1日の総投与量は、約50〜100マイクログラムの脂質化PSAまたは多糖成分から単離された糖脂質成分の範囲でありうる。
【０１８０】
医薬製剤は、単独で、または1つ以上の他の活性薬剤と組み合わせて投与されうる。
【０１８１】
医薬製剤は、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、喘息、関節リウマチなどの自己免疫疾患に適した活性物質と併用して使用されるか、または投与されうる。
【０１８２】
そのような薬剤の例は、抗炎症剤を包含する。例として、ステロイドおよびコルチゾンなどのコルチコステロイド；アスピリン、サルサレート、セレコキシブ、ジクロフェナク、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、およびトルメチンなどの非ステロイド系抗炎症薬；スルファサラジンおよびメサラミン、バルサラジドおよびオルサラジンを含む5-アミノサリチル酸塩などのアミノサリチル酸；アザチオプリン；メルカプトプリン；シクロスポリン；ベータインターフェロン；酢酸グラチラマー；フマル酸ジメチル；フィンゴリモド；ミトキサントロン；メトトレキセート、レフルノミド、ヒドロキシクロロキンおよびスルファサラジンなどの疾患修飾抗リウマチ薬(DMARD)が挙げられる。
【０１８３】
そのような薬剤の別の例には、抗体または抗体断片が含まれる。例として、インフリキシマブ(Remicade)、アダリムマブ(Humira)、およびゴリムマブ(Simponi)などのTNFアルファ阻害剤；ナタリズマブ(Tysabri)、ベドリズマブ(Entyvio)；ウステキヌマブ(Stelara)；アバタセプト(Orencia)；アナキンラ(Kineret)；セルトリズマブ(Cimzia)、エタネルセプト(Enbrel)、リツキシマブ(Rituxan)、トシリズマブ(Actemra)、およびトファシチニブ(Xeljanz)が挙げられる。
【０１８４】
本発明は、本明細書に記載されたさまざまな形態の脂質化PSAまたは脂質化PSAの単離された糖脂質成分と、上記のような標準的治療とを併用することにより、標準的な治療のより低い用量を可能にする、および/またはそのような標準的治療に伴う副作用の発生率および/または重症度が低下することを企図する。
【０１８５】
一実施態様では、医薬製剤は、ペニシリンG、ペニシリンV、アンピシリン、アモキシシリン、バカンピシリン、シクラシリン、エピシリン、ヘタシリン、ピバンピシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、カルベニシリン、チカルシリン、アボロシリン、メズロシリン、ピペラシリン、アムジノシリン、セファレキシン、セフラジン、セファドキシル、セファクロル、セファゾリン、セフロキシムアキセチル、セファマンドール、セフォキシド、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフメネノキシム、セフトリアキソン、モキサラクタム、セフォテタン、セフォペラゾン、セフタジミド、イミペネム、クラブラン酸塩、チメンチン、スルバクタム、ネオマイシン、エリスロマイシン、メトロニダゾール、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、バンコマイシン、トリメトプリム-スルファメトキサゾール、アミノグリコシド、キノロン、テトラサイクリンおよびリファンピンからなる群から選択される抗生物質などの1つ以上の抗細菌剤と組み合わせて与えられる。
【０１８６】
以下の実施例は、説明のために包含されるものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例
【実施例１】
【０１８７】
脂質化PSAの単離
簡単に言えば、バクテロイデス・フラギリスを嫌気的条件で増殖させた。バクテロイデス・フラギリスの莢膜複合体を熱フェノール/水抽出で単離した。DNAse、RNaseおよびプロナーゼ処理後、多糖画分をエタノールで沈殿させた。脂質化PSAを他の多糖構成成分から分離するために、沈殿物をサイズ排除クロマトグラフィーに付した。対象となる画分を分析し、プールし、透析し、凍結乾燥した。脂質化PSAの純度を、核磁気共鳴分光法および質量分析法によって評価した。
【０１８８】
脂質化PSAの単離および精製プロセスを、以下に詳述する。
【０１８９】
バクテロイデス・フラギリス Delta44突然変異株は、菌株9343から実験的に得られ、さらに特徴づけすると、PSBよりもPSAを過剰発現することが判明した。Delta44を血液寒天プレート上に播種し、37℃にて一晩増殖させた。大量にコロニーを形成したプレートからのスワブを、ペプトン酵母ブロスの500mlスターター培養物に継代培養した。スターター培養物を同じ培地の16リットル培養液に播種し、pHを5M NaOHで中性になるように滴定した。嫌気性ガス混合物を密閉した培養物に通して泡立てた。
【０１９０】
pH7に維持して一晩培養した後、細菌をグラム染色および継代培養によって検査した。微生物を8,000×gで20分間遠心分離することによって収集した。細菌ペレットを生理食塩水で2回洗浄して約1リットルの細菌ペレットを得た。
【０１９１】
バクテリアのペレットを68℃の融解した結晶性フェノールに懸濁し、約37％v/vのフェノールの最終濃度(フェノール/水調製物を得る)とし、68℃で30分間混合し、次いで、4℃で48時間撹拌した。フェノール/水調製物をガラスボトルに等分し、1500rpmで遠心分離した。上部の水層を採取した。採取した水相に含まれる残留フェノールを、等量のエチルエーテルで抽出した。次いで、分液漏斗を用いてエーテル相を除去し、水相中の残留エーテルを蒸発させて、フェノール/水調製物から最終水相を得た。
【０１９２】
水相を水に対して透析し、4℃で5日間にわたり複数回変化させ、その後、ほぼ乾燥するまで(約5mlの水が残るまで)凍結乾燥した。凍結乾燥した生成物に、マグネシウム、カルシウムおよびナトリウムアジド(全体積61ml)を含む0.05Mトリスの溶液を添加して、全体積を約66mlにした。
【０１９３】
溶解した生成物に、DNase(0.07mg/ml)およびRNase(0.33mg/ml)を含む10mlのトリス緩衝液を添加した。懸濁液全体を0.45ミクロンのフィルターで濾過し、濾液を37℃で撹拌した。DNase/RNase処理を、同様の濃度で新鮮な酵素を混合物に添加することによって繰り返し、2時間撹拌した。
【０１９４】
次いで、この混合物を10mlトリス/マグネシウム/カルシウム溶液中の25mgのプロナーゼと合わせ、混合物を37℃で24時間撹拌した。この工程を繰り返した。
【０１９５】
5倍量のエタノールを4℃で混合物に添加することにより多糖画分を沈殿させた。次いで、溶液を12,000xgで30分間遠心分離して、多糖画分をペレット化した。上清を除去し、ペレットを392mlのタイプ1 H2Oに再懸濁した。
【０１９６】
次いで、溶解した画分を、4℃で16リットルのタイプ1 H2Oを2回交換して透析した。凍結乾燥によって体積を約50mlに減少させた。
【０１９７】
PBSおよび1％デオキシコール酸ナトリウムに懸濁したS400の5×200cmカラムで20mlアリコートをクロマトグラフィーに付し、画分を集めた。脂質化PSAが溶出した場所を判定するために、画分を、脂質化PSAと非脂質化PSAの両方と反応する抗体を用いて寒天中で二重拡散によって試験した。アリコートを280nmでのUV吸収について試験し、脂質化PSA含有画分がUV吸収性材料を有さないことが決定された。
【０１９８】
次いで、脂質化PSAを含む画分をプールし、濃縮し、100mlの導電率が50μS未満になるまで10,000mwのカットオフ膜を有するMinitan濃縮器(Millipore)上のタイプ1 H2Oに対して透析した。次いで、脂質化PSAを凍結乾燥した。
【０１９９】
多糖および糖脂質の純度および構造を、600MHz分光計および質量分析によるプロトン核磁気共鳴分光法によって測定した。MALDI-TOF-TOFおよびLC-MS分析のために、脂質化PSA試料を2％酢酸中10μg/μLに再懸濁し、90℃で90分間加熱した。MALDI-TOF-TOF分析のために、試料を1：1〜1％マトリックス(CHCAまたはDHB)溶液と混合し、ステンレス鋼MALDIプレートに直接ロードした。LC-MS分析のために、試料を液体-液体抽出(クロロホルム-水)工程に付すか、または付さずに、次いで、乾燥し、50：50のイソプロパノール：アセトニトリルに再懸濁し、注入した。
【０２００】
等価物
いくつかの本発明の実施態様を本明細書に記載して説明してきたが、当業者は、機能を実行し、および/または結果および/または記載された利点の1つまたは複数を得るためのさまざまな他の手段および/または構造を、当業者は容易に想像し、 そのような変形および/または修正の各々は、本明細書に記載される本発明の実施態様の範囲内にあるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載されている全てのパラメータ、寸法、材料、および構成は、例示的なものであることを容易に理解し、かつ、実際のパラメータ、寸法、材料、および/または構成が、本発明の教示が使用される1つ以上の特定の用途に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載の特定の本発明の実施態様に対する多くの均等物を認識するか、または日常的な実験にすぎないものを用いて確認することができる。したがって、前述の実施態様は単なる例として提示されるものであり、添付の特許請求の範囲およびその等価物の範囲内で、本発明の実施態様は、具体的に記載および請求される以外の方法で実施されうることが理解されるべきである。本開示の本発明の実施態様は、本明細書に記載される個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および/または方法に関する。さらに、2つ以上のこのような特徴、システム、物品、材料、キット、および/または方法の任意の組み合わせは、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、および/または方法が相互に矛盾しない場合、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
【０２０１】
本明細書で定義され使用されている全ての定義は、辞書的定義、参照により組み込まれた文献の定義、および/または定義された用語の通常の意味を調整すると理解されるべきである。
【０２０２】
本明細書中に開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、各々が引用されている事項についての引用により組み込まれており、ある場合には、その全体が包含される。
【０２０３】
本明細書および特許請求の範囲において使用される「a」および「an」という不定冠詞は、明確に反対の指示がない限り、「少なくとも1つ」を意味すると理解されるべきである。
【０２０４】
本明細書および特許請求の範囲で使用される「および/または」という語句は、そのように結合された要素の「一方または両方」、すなわち、いくつかの場合には結合的に存在し、他の場合には離接的に存在する要素であることを意味すると理解されるべきである。「および/または」と記載された複数の要素は、同じように、すなわち、そのように結合された要素の「1つ以上」と解釈されるべきである。「および/または」という語句によって具体的に特定される要素以外の要素は、具体的に特定された要素と関連しているかどうかにかかわらず、存在することができる。したがって、非限定的な例として、「含む」などの制限のない言語と併せて使用される場合、「Aおよび/またはB」への言及は、1つの実施態様では、Aのみ(任意にB以外の要素を含む)意味し、もう1つの実施態様では、Bのみ(任意にA以外の要素を含む)を意味し、さらにもう1つの実施態様では、AおよびBの両方(任意に他の要素を含む)を意味することができる。
【０２０５】
本明細書および特許請求の範囲において使用される「または」は、上で定義した「および/または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。たとえば、リスト中の項目を分離する場合、「または」または「および/または」は、多くの要素またはリストされた要素、すなわち、少なくとも1つであるが、2つ以上のものも含むものと解釈され、任意に、リストにない項目が追加される。特許請求の範囲で使用される場合、「〜のうちの1つのみ」または「〜のうちの厳密に1つ」などの対照的に明確に示された用語、あるいは「〜からなる」という用語のみが、多くの要素またはリストされた要素のうちの厳密に1つの要素を含むことを意味する。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、「いずれか」、「のうちの1つ」、「のうちのただ1つ」、または「のうちの厳密に1つ」などの排他性の条件(すなわち、「どちらか一方であるが両方ではない」)が先行する場合に、排他的な選択肢を示すものとしてのみ解釈される。特許請求の範囲で使用される場合、「本質的に、からなる」とは、特許の分野で使用される通常の意味を有するものとする。
【０２０６】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、1つ以上の要素のリストに関する「少なくとも1つ」という語句は、要素のリスト内の任意の1つ以上の要素から選択された少なくとも1つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素のリスト内に具体的に列挙された各要素の少なくとも1つを含む必要はなく、要素のリスト内の要素の任意の組合せを排除するものではない。また、この定義は、特に明示されている要素と関連しているか否かにかかわらず、「少なくとも1つ」という語句が示す要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が任意に存在することを可能にする。したがって、非限定的な例として、「AおよびBの少なくとも1つ」(または、等価的に「AまたはBの少なくとも1つ」または等価的に「Aおよび/またはBの少なくとも1つ」)は、1つの実施態様では、Bが存在しない、1つ以上のAを任意に含む少なくとも1つを意味することができ、もう1つの実施態様では、Aが存在しない少なくとも1つの、任意に2つ以上のB(および場合によってはA以外の要素を含む)を意味することができ、さらにもう1つの実施態様では、少なくとも1つ、場合によっては1つ以上のA、および少なくとも1つ、場合によっては1つ以上のB(場合により他の要素を含む)などを意味することができる。
【０２０７】
明確に反対の指示がない限り、2つ以上の工程または行為を含む本明細書で請求されるいずれかの方法において、工程または行為の順序は、必ずしも、列挙された方法の工程または行為の順序に限定されない。
【０２０８】
特許請求の範囲および上記の明細書では、「含む」、「包含する」、「持つ」、「有する」、「関連する」、「保持する」および「から構成される」などのすべての過渡的な表現は、制限がない、すなわち、包含するが限定的ではないことを意味すると理解されるべきである。移行句である「からなる」および「本質的にからなる」のみが、特許審査手続の米国特許庁マニュアルのセクション2111.03に記載されているように、それぞれ制限または半制限の移行句であるものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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