(57)【要約】  本発明は、豚へのワクチンの全身投与により、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の無症候性感染に関連する１日あたりの平均体重増加（ＡＤＷＧ）に対する悪影響を豚において軽減するための方法における使用のための、非生菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗原と、医薬的に許容可能な担体と、を含むワクチンに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
豚へのワクチンの全身投与によりローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の無症候性感染に関連する１日あたりの平均体重増加（ＡＤＷＧ）に対する悪影響を前記豚において軽減するための方法での使用のための、非生菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗原と、医薬的に許容可能な担体と、を含むワクチン。
【請求項２】
請求項１に記載の使用のためのワクチンであって、前記方法が、前記豚の仕上げ期中のＡＤＷＧに対する悪影響を軽減するためのものであることを特徴とする、ワクチン。
【請求項３】
請求項１または２の何れか１項に記載の使用のためのワクチンであって、前記方法が、さらに、感染の結果としての豚によるローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）細菌排出の減少のためのものであることを特徴とする、ワクチン。
【請求項４】
請求項１〜３の何れかに記載の使用のためのワクチンであって、１回のみ投与されることを特徴とする、ワクチン。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかに記載の使用のためのワクチンであって、前記豚が３〜１０日齢であるときに前記ワクチンを投与することを特徴とする、ワクチン。
【請求項６】
請求項１〜５の何れかに記載の使用のためのワクチンであって、前記非生菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗原が、生菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）においてこれらの細菌の外側の細胞膜と会合する炭水化物を含むことを特徴とする、ワクチン。
【請求項７】
請求項１〜６の何れかに記載の使用のためのワクチンであって、前記非生菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗原が、死菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）を含む組成物から精製された抗原であることを特徴とする、ワクチン。
【請求項８】
請求項１〜７の何れかに記載の使用のためのワクチンであって、前記非生菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗原が死菌全細胞ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）であることを特徴とする、ワクチン。
【請求項９】
非生菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗原を医薬的に許容可能な担体と混合することにより、豚へのワクチンの全身投与によってローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の無症候性感染に関連する１日あたりの平均体重増加に対する悪影響を前記豚において軽減するための方法における使用のためのワクチンを製造するための、非生菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗原の使用。
【請求項１０】
非生菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗原と医薬的に許容可能な担体とを含むワクチンを豚に全身投与することによる、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の無症候性感染に関連する前記豚の１日あたりの平均体重増加（ＡＤＷＧ）に対する悪影響を軽減するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、豚において、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の無症候性感染に関連する１日あたりの平均体重増加（ＡＤＷＧ）に対する悪影響を軽減するための方法における使用のためのワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
増殖性腸疾患は、回腸炎とも呼ばれ、偏性細胞内細菌であるローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）によって引き起こされる、世界中で見られる離乳後の豚の一般的な腸疾患である。特徴的な病変は、回腸の腸陰窩における未成熟腸細胞の増殖であり；これらの細胞は通常、それらの頂端の細胞質内に原因細菌を含有する。剖検時に、組織学的病変は、特に腸細胞において１．５〜２．５μｍの長さのビブリオ様の形態の細菌が見られることによって、ローソニア陽性であるものとして確認され得るが、また、これらの細菌は、陰窩の間および腸間膜リンパ節において粘膜固有層に位置するマクロファージ内にあることも多い。腸細胞からの細菌の排除は、関連する増殖病変の解消につながるが、これは陰窩上の細菌の直接的な局所的影響を示す（ＭｃＯｒｉｓｔら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ａｎｄ  ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ：ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１１５，１９９６，ｐｐ３５−４５）。これらの病変におけるローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の存在は、無症候性感染のみを示す動物（下痢または異常糞便を示さない動物）におけるように、疾患を示す動物（すなわち下痢または異常な赤黒色のタール便を示し、結果的に死に至る可能性がある。）の両方においてＰＣＲを用いて示された。臨床症例は通常、育成−仕上げ期に存在し、一部のより高齢の仕上げ期の豚では、急性出血型が記録されている。
【０００３】
ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）血清陽性豚と臨床的または無症候性感染を示す豚の割合との間の関係は、以前に研究されている（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｉｊｄｅｎ，Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ  ａｍｏｎｇ  ｓｌａｕｇｈｔｅｒ−ａｇｅ  ｐｉｇｓ．，Ｒｅｓ  Ｖｅｔ  Ｓｃｉ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００４，７７（３），ｐｐ１９７−２０２）。一部の豚は保菌豚であり得、すなわち感染しているが、回腸炎の臨床徴候はないと思われる。特に、ヨーロッパにおいて、発病していないとみなされる動物は、腸における屠殺時の細菌の残存によって証明されるように、無症候性感染を有すると思われる。臨床疾患のない集団におけるローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）細菌の存在に関する陽性結果に対する説明は、これらの集団が、それらの仕上げ期の群を通じてローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）を伝達させるということである。ある種の状況においてのみ、ローソニア感染の結果、急性出血性腸疾患の症例を含む臨床的問題が生じる。
【０００４】
臨床的に疾患の無い集団において、ローソニア感染に対するワクチン接種はまれである。しかし、無症候性感染が豚の１日あたりの平均体重増加（ＡＤＷＧ）に悪影響を及ぼし得ることが知られているので、一部の育成−仕上げ農場は、腸における局所感染に対抗するために、市場で唯一の市販の回腸炎ワクチン、すなわちＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍから入手可能）を使用する。このワクチンは、弱毒化生菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）を含有し、経口投与される。実際に、現時点では、腸の局所感染は局所免疫を誘導することによってしか対抗できないと考えられる。これは、臨床的疾患を呈する動物に対しては異なる。これらの動物は、非生ワクチンによる全身的ワクチン接種によって首尾よく保護され得ることが示されている（国際公開第２００９／１４４０８８号、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＢＶに譲渡）。理論に縛られるものではないが、これに対する理由は、これらの動物が感染をその系に曝露させる重度の胃腸病変を有するということであり、これは、なぜ全身免疫反応が感染を食い止めるのに役立つのかということを説明すると考えられる。しかし、腸の微量局所感染に対応する無症候性感染のみがある場合、感染を食い止めるためにはＩｇＡおよび細胞性免疫を含む局所免疫反応が必要とされると考えられる。このためには、局所投与される生菌を含むワクチンが必要である。これは、２００５年１０月１３〜１５日、スペイン、バルセロナでのＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍで発表された、Ｔｈｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓと呼ばれるＭｉｋｅ  Ｒｏｏｆの論文で確認される。２頁目の表１．１で、全身投与された死菌ワクチンが「液性／全身性免疫」を誘導し得るものの、「粘膜免疫」および「細胞性免疫」の両方を誘導できないことが示されている。後者２つは、細胞内病原体を伴う腸の局所感染を食い止めるために必要とされるものとして一般に知られている（Ｉｖａｎ  Ｒｏｉｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｓｅｖｅｎｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１、２０６頁「Ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｓｕｒｆａｃｅｓ」、２０９頁「Ｄｅｆｅｎｃｅ  ｉｓ  ｂｙ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ」および２１０頁「Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｋｉｌｌ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐａｒａｓｉｔｅｓ」）。２００５年のＭｉｋｅ  Ｒｏｏｆの論文において、「死菌バクテリンプロトタイプに注目している初期の研究において、死菌ワクチンが腸の定着に対して防御反応をもたらさなかったことが確認された」と述べられている（２頁、左側の列、第２段落全体）。
【０００５】
生ワクチンＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓは感染に関連する体重増加の喪失を軽減するという主張が実際に認可され、その目的のために使用される。このワクチンの短所は、豚にワクチン接種するという日常的な方法ではなく、経口投与を行う必要があり、６日間にわたり動物において抗菌薬の使用を中断しなければならないということである（そうしないとワクチン中の細菌が死滅し得るため）。別の欠点は、このワクチンが、細菌排出の減少について認可されていないことである。一見したところ、製造承認のために使用されたデータは、細菌排出の減少を示さなかった。最近の刊行物（Ｒｉｂｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ３３，２０１５，１５６−１６２）は、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓが感染後のローソニア細菌の排出に対して防御を全くもたらさないことを確認した。これは、全動物にワクチン接種し、体重増加の問題および臨床症状が顕著に軽減されるとしても、動物集団におけるローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の感染が残り得ることを示し得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００９／１４４０８８号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＭｃＯｒｉｓｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１１５，１９９６，ｐｐ３５−４５
【非特許文献２】Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｉｊｄｅｎ，Ｒｅｓ  Ｖｅｔ  Ｓｃｉ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００４，７７（３），ｐｐ１９７−２０２
【非特許文献３】Ｍｉｋｅ  Ｒｏｏｆ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，２００５年１０月１３〜１５日、スペイン、バルセロナ
【非特許文献４】Ｉｖａｎ  Ｒｏｉｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｓｅｖｅｎｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，２０６頁、２０９頁および２１０頁
【非特許文献５】Ｒｉｂｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ３３，２０１５，１５６−１６２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の無症候性感染に関連するＡＤＷＧに対する悪影響を軽減するために使用し得る改善ワクチンを提供することが本発明の主な目的である。無症候性感染動物において細菌の排出の減少をさらにもたらす改善ワクチンを提供することがさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の主要な目的に合致させるために、本明細書の上記の技術分野セクションに記載のような医薬組成物が考案され、この組成物は、非生菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗原と医薬的に許容可能な担体とを含み、全身投与に適切である。
【００１０】
驚くべきことに、全身投与された非生菌ローソニア抗原（国際公開第２００９／１４４０８８号に記載のような異なるタイプの非生菌ローソニア抗原など）は、ＩｇＡおよび細胞性免疫を誘導することができないと一般に理解されており、まして腸内で局所免疫反応に影響を及ぼすことなどできないにもかかわらず、このような組成物がローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の無症候性感染に関連するＡＤＷＧに対する悪影響を軽減させ得ることが分かった。これに対する理由は不明である。当技術分野で公知のような生ワクチンに対する新規組成物の長所は明らかであり：新規組成物は、全身的に、例えば筋肉内または皮内に投与し得、非生菌ローソニア抗原のみを含むので、抗菌薬の使用を中断する必要はない。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
ワクチンは、病原性微生物のワクチン接種後感染を防御する構成物、すなわち、ワクチン接種宿主において、典型的には、例えば抗体を介して、微生物それ自身を妨害することにより、微生物による感染または感染の結果起こる障害を予防または軽減する構成物である。したがって、ワクチン接種は、感染を予防するかまたは少なくとも感染のレベルを低下させ、および／またはその感染から生じる障害を予防するかまたは少なくともそのレベルを低下させる。
【００１２】
野生型細菌の非生菌抗原は、対応する病原性細菌またはその病原性因子の１つ以上がこの免疫反応の結果として宿主の免疫系により認識され、少なくとも部分的に中和されるように、免疫学的反応を誘発しようとする、それ自体生菌以外の、何らかの物質または化合物である。野生型細菌の非生菌抗原の典型例は、死菌全細胞バクテリア、表面発現タンパク質などの細菌のサブユニットおよび毒素である。後者２つは組み換え発現されていてもよく、またはされていなくてもよい。ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）に関しては、いくつかのタイプの非生菌抗原が当技術分野で公知であり、例えば国際公開第２００９／１４４０８８号（死菌全細胞）、国際公開第２００５／０７０９５８号（サブユニット）および国際公開第９７／２００５０号（死菌全細胞）に知られている。
【００１３】
医薬的に許容可能な担体は、生体適合性媒体、すなわち対象動物において投与後に顕著な有害反応を誘導しない媒体であり、ワクチンの投与後に対象動物の免疫系に対して抗原を提示可能である。このような担体は、水および／または何らかの他の生体適合性溶媒を含有する液体であり得るが、凍結乾燥ワクチンを得るために一般に使用されるもののような固形物（糖および／またはタンパク質に基づく）でもあり得る。
【００１４】
ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の無症候性感染は、ほぼまたは完全に無症状であり（徴候または症状がない）、特に下痢または糞便の異常を示さない。したがって、無症候性感染動物は、腸内細菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の無症状保菌動物であるが、体重増加の低下を伴い得る。無症候性感染の存在は、糞便または腸の微生物学的培養（後者は屠殺後）またはそのポリメラーゼ連鎖反応などのＤＮＡ技術によって同定される。
【００１５】
抗原の全身投与は、抗原が身体の循環系（この系は心臓血管系およびリンパ系を含む。）に到達するように投与され、したがって消化管などの特定部位ではなく全身的に影響を及ぼすことを意味する。全身投与は、例えば、筋肉組織（筋肉内）に、皮膚（皮内）に、皮膚の下（皮下）に、粘膜の下（粘膜下）に、および静脈（静脈内）に抗原を投与することによって行われ得る。
【００１６】
豚の仕上げ期は、豚が約１０週齢（体重およそ２５〜３０ｋｇ）〜約２８週齢（体重約１１０〜１３０ｋｇ）の間である期間である。仕上げ期は、全飼育期間、すなわち離乳（およそ３週齢）から殆どの豚が屠殺される週齢である２８週齢の間の期間の一部である。
【００１７】
死菌全細胞を抗原として含む組成物は、生菌全細胞の死滅に由来する抗原を含む。本発明の意味において、これは、殺菌工程中に少なくとも部分的に細菌細胞が破裂するか、または死菌全細胞の抽出物またはホモジネートが実際には「死菌全細胞を含むワクチン」中で抗原として提供されることを排除しない。死菌全細胞ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）は、例えば国際公開第２００９／１４４０８８号および国際公開第９７／２００５０号から公知である。
【００１８】
実施形態
ワクチンの第１の実施形態において、その使用のための方法は、豚の仕上げ期中のＡＤＷＧに対する悪影響を軽減するためのものである。仕上げ期に殆どの重量が動物の身体に付加される。この期間において、ＡＤＷＧに対する悪影響は最終体重に最悪の影響がある。したがって、この期間のＡＤＷＧに対する悪影響を軽減することが可能であることは、本明細書の以下の実施例セクションに示されているように、非常に有効である。
【００１９】
本発明によるワクチンの第２の実施形態において、この方法は、さらに、無症候性感染の結果としての豚によるローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）細菌の排出を減少させるためのものである。大変驚くべきことに、無症候性感染動物のローソニア細菌の排出さえも、今回のワクチンで減少させ得る。したがって、無症候性ローソニア感染に関連するＡＤＷＧに対する悪影響を軽減するように豚における感染に影響を及ぼし得るだけでなく、無症候性感染動物によって排出される細菌が顕著に少なくなるように感染が実際に軽減されると思われる。これは、動物集団における細菌の拡散を制御しようとするあらゆる飼育業者にとって重要な長所である。
【００２０】
別の実施形態において、ワクチンは１回のみ投与される。ワクチンの単回投与が効果的であることが示されている。ワクチンの第２の投与は、一般的には第１の投与の２〜４週間後に行われ、免疫反応のレベルを向上させ得る。
【００２１】
別の実施形態において、ワクチンは、豚が３〜１０日齢であるときに投与される。この幼若な週齢で豚にワクチン接種することにより、早期防御、すなわち離乳直後の防御が提供され得る。
【００２２】
また別の実施形態において、非生菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗原は、生菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）においてこれらの細菌の外側の細胞膜と会合する炭水化物を含む。これらの炭水化物は、特異的な抗ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）免疫反応を可能にし、上昇させることが示されている（国際公開第２００９／１４４０８８号参照）。
【００２３】
さらに別の実施形態において、非生菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗原は、死菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）を含む組成物から精製される抗原である。精製によって、例えば存在する場合には何らかの部位反応を減少させるために、非特異的細菌物質が実際の抗原から除去され得る。
【００２４】
実際的な実施形態において、非生菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗原は、死菌全細胞ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）である。
【００２５】
［実施例］
実験１
実験１の設計
この実験は、オランダの集団で、より高齢の仕上げ期の豚および繁殖未経産雌豚におけるローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）（ＬＩ）感染により実施した。この実験は、無作為化比較盲検計画に従った。
【００２６】
３〜１０日齢の１５８匹の仔豚（その殆どが３〜５日齢）を、同腹仔内で無作為に試験群または対照群に割り当てた。試験群中の仔豚に、水中油エマルジョン中の不活性化ローソニアバクテリンワクチン（国際公開第２００９／１４４０８８号、実施例３参照）を用いて、登録時および再び３週間後にワクチン接種した。対照群の仔豚は、同じ日にプラセボ注射（抗原を含まないエマルジョン）を受けた。試験動物において、ＬＩに対して有効であった抗生物質群治療（例えば、タイロシン、リンコマイシン、チアムリン、テトラサイクリン）は認可されなかった。
【００２７】
離乳後、すなわち育成期および仕上げ期において、試験および対照群の仔豚を一緒に維持した。さらに、育成期および肥育中に、非実験豚を同じ豚房であるが、実験動物とは異なるペンに収容した。
【００２８】
各ワクチン接種の４時間後、１日後、３日後、１週間後および２週間後に、局所および全身反応について仔豚を定期的に検査した。
【００２９】
全ての豚から、ファイルド（ｆｉｌｅｄ）感染への予想される曝露期間中、１週間または２週間間隔で糞便試料を採取した。処置群ごとに、１０匹の動物の糞便試料をプールし、ｑＰＣＲ（これ以降、「ＰＣＲ」とも呼ぶ。）によってＬＩ細菌の存在について分析した。プールされた糞便試料が細菌の存在を示した場合、そのプールからの元の試料を個別に分析した。最初の試料が陽性になったらすぐに、個々の糞便試料を試験した。最初のワクチン接種時、最初のワクチン接種の１０、１６および２１〜２３週間後に、全動物の体重を測定した。
【００３０】
実験１の結果
実験中、ローソニア感染は、糞便におけるＰＣＲデータによって証明されるように、集団に伝達された（下記参照）。対照群の１匹の動物を除いて、何らかの臨床症状があった動物はいなかったので、この群は、（野生型）細菌の野外曝露から生じる無症候性感染に罹患していた。
【００３１】
糞便中の細菌負荷
平均ＰＣＲ結果を表１で示し、陽性動物の数およびＬＩ−ＤＮＡの平均濃度を表２で示す。
【００３２】
第１３週以降、多数の対照動物において、ＬＩ由来のＤＮＡが見出された。糞便試料が陽性である対照動物のパーセンテージは、最初のワクチン接種後１２週での０から、１３〜１５週での２〜８％を介して、１６〜１８週での１８％前後まで徐々に増加し、その後第２０週の後に０％まで低下した。
【表１】
2018504424.tif 000002
【００３３】
試験（ワクチン）群において、１匹の動物に対して１回の回収日に１つのＰＣＲ陽性糞便試料しか見出されなかった（７２匹のうち１匹陽性、すなわち１．４％）。対照群において、７５匹中３１匹が少なくとも１つのＰＣＲ陽性糞便試料を有していた（４１．３％）。群間の差は統計学的に有意であった（フィッシャーの直接確率検定：ｐ値＜０．００１）。
【表２】
2018504424.tif 000003
【００３４】
体重増加
体重および１日あたりの平均体重増加を以下の表３および４でまとめる。ＡＤＷＧは、ローソニアワクチンの有効性を測定するために使用されることが多い関連パラメータであると考えられる。しかし、このパラメータはいくつかの異なる条件（二次感染、気候、飼料など）により影響を受けるため、非特異的である。１日あたり２５グラムのＡＤＷＧ差で統計学的に有意な（ｐ＜０．０５）値を得るための予備計算試料サイズは、１群あたり約３００匹である必要がある。効率上の理由により、実際に使用した群はかなり小さくなった。この予備研究において、群のサイズは僅か７８および８０匹であった。したがって、ＡＤＷＧの差が１日あたり約２５グラムであっても、得られるｐ値は何れの場合でも０．０５を上回ると推定された。
【表３】
2018504424.tif 000004
【００３５】
仕上げ期中の１日あたりの平均体重増加の治療群比較（下記参照）から、予想どおり、統計学的有意差は得られなかった（ｐ値０．２０４２）。ベースライン値に対して補正した場合、ワクチン接種群は、対照群よりも仕上げ期における体重増加が平均で１日あたり２１．４グラム多く、９０％信頼区間は、１日あたり６．４グラム低いものから、１日あたり４９．２グラム高いものまでの範囲であった。それ自体の１日あたり２１．４グラムの平均差は、ＡＤＷＧにおける実質的な相違である。２つの群の１日あたりの平均体重増加に対する最小二乗平均（ＬＳＭ）は、ワクチン接種群では１日あたり８８１グラムであり、対照群では１日あたり８６０グラムであった。これらのＬＳＭは、ＡＮＣＯＶＡによる群比較に適合するが、群間の共変量の「ワクチン接種時の体重」の小さな差について補正されるので、表３からの通常の平均とは僅かに異なる。
【表４】
2018504424.tif 000005
【００３６】
全体的な１日あたりの平均体重増加に対する処置効果についてのｐ値は、０．２８０４であった。ベースライン値に対して補正した場合、ワクチン接種群は、対照群より１２．５ｇ／日高かった１日あたりの平均体重増加を示した。この推定値に対する９０％信頼区間は、対照群よりもワクチン接種群において、６．６ｇ／日低い成長から、３１．５ｇ／日の高い成長までの範囲であった。
【００３７】
実験２
実験２の設計
この実験の目的は、野外条件下の豚の仕上げ期での最初の実験で使用されたものと同じワクチンの、しかしワンショットワクチンとして使用した場合の有効性を評価することであった。この実験は、臨床的有効性に関する、食塩水を用いた無作為化盲検比較試験として行った。３〜４週齢の仔豚約７５０匹を試験群または対照群に同腹仔内で無作為に割り当てた。試験群の仔豚に２ｍＬのワクチンを筋肉内注射で１回接種し、対照群の仔豚に２ｍＬの食塩水を注射した。
【００３８】
１０（±１）週齢で、６４８匹の試験仔豚を、各処置群から３２４匹で仕上げ農場に輸送した。それ以降、対照豚を同じユニットでワクチン接種豚とは別のペン（ユニットあたり、８〜１１匹の８個のペン／処置群）に屠殺（２５週齢）まで収容した。
【００３９】
評価した第１のパラメータは、登録時、仕上げ農場に移行後および屠殺直前の、異なる体重測定間の豚の１日あたりの平均体重増加（ＡＤＷＧ）であった。評価した第２のパラメータは、仕上げ農場に移行後、１５および２０週齢および屠殺直前の、ローソニア排出であった。
【００４０】
実験２の結果
この第２の実験中、ローソニア感染は、糞便におけるＰＣＲデータによって証明されるように、集団に伝達された。対照群の１匹の動物のみで僅かな臨床症状（剖検後に判定されるようにローソニア感染の結果であることが確認された。）があった。したがって、この群は、（野生型）細菌の野外曝露の結果起こる無症候性感染に罹患したことが確認され得る。
【００４１】
ＡＤＷＧに対する影響を表５で示す。以上のように、育成期中の１日あたりの平均体重増加は、試験群では１日あたり３１９グラムであり、対照群では１日あたり３０７グラムであった。育成期中の１日あたりの平均体重増加（ＡＤＷＧ）の差は、対照群と試験群との間で有意に異なっていた（ＡＮＯＶＡ：ｐ＝０．０２０３）。仕上げ期のＡＤＷＧおよび全体的なＡＤＷＧも試験群において高かった。対照群と試験群との間の１日あたり７グラムの差は、商業的に価値がある（およそ１．４ｋｇの最終重量の差につながる）ものの、統計学的に有意ではなかった。
【表５】
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【００４２】
ローソニア排出に関しては、実験第６週で、全ての糞便試料がローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）について陰性であったと思われる。第１１週では、対照群からの７つの試料（１９％）が陽性であり、試験群では陽性の試料はなかった。第１６週では、対照群からの７つの試料（１９％）および試験群のうち１つの試料が陽性であった。第２１週で全ての動物が再び陰性となった。実験中のＰＣＲローソニア陽性糞便試料（１または２週間連続）があるペンの数は、対照群と比較して試験群において有意に少なかった（フィッシャーの直接確率検定、ｐ＜０．００１）。
【国際調査報告】
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