(57)【要約】本発明は、細胞の集団におけるＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１の発現を増加させるための組成物および方法、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１の発現が増加したモジュレートされた細胞、ならびにＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１の発現が増加した細胞によって得られた免疫抑制効果に関する方法を対象とする。本発明の第１の目的は、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現を増加させることが可能な１種または複数種の外因性薬剤の存在下で細胞の集団をインキュベートして、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１の発現が増加した細胞の集団を得るステップを含む、細胞の集団をモジュレートするための方法を含む。
2018504122.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現を増加させることが可能な１種または複数種の外因性薬剤の存在下で細胞の集団をインキュベートして、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１の発現が増加した細胞の集団を得るステップを含む、細胞の集団をモジュレートするための方法。
【請求項２】
前記インキュベーションがｅｘ  ｖｉｖｏである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インキュベーションが、約５分間〜約７２時間の間である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記インキュベーションが、約４時間〜約４８時間の間である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記インキュベーションが、約４℃〜約３７℃の間の温度で実施される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記インキュベーションが、約３７℃の温度で実施される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記モジュレートされた細胞におけるＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現の前記増加が、前記外因性薬剤と共にインキュベートされていない細胞と比較して、約３倍〜約８０倍である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記外因性薬剤（複数可）が、ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび小分子から選択される、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記小分子が、グルココルチコイド、プロスタグランジン経路アゴニスト  抗新生物薬、ドーパミン受容体アゴニスト、ムチン酸イソメテプテン、硫酸ジヒドロストレプトマイシン、プロトリプチリン、テレンゼピン、シクロベンザプリンおよび４−アミノサリチル酸を含む、請求項８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−γ、またはそれらの組合せから選択されるインターフェロン受容体アゴニストである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
細胞の前記集団が、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γでモジュレートされる、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドが、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＰＤ−Ｌ１をコードするポリヌクレオチドおよび／またはＩＤＯ−１をコードするポリヌクレオチドから選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロスタグランジン経路アゴニストが、ＰＧＥ２、ｄｍＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、２０−エチルＰＧＥ２、８−イソ−１６−シクロヘキシル−テトラノルＰＧＥ２、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（「ｄｍＰＧＥ２」）、ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２、９−ケトフルプロステノール、５−トランスＰＧＥ２、１７−フェニル−オメガ−トリノルＰＧＥ２、ＰＧＥ２セリノールアミド、ＰＧＥ２メチルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２、８−イソ−１５−ケトＰＧＥ２、８−イソＰＧＥ２イソプロピルエステル、８−イソ−１６−シクロヘキシル−テトラノルＰＧＥ２、２０−ヒドロキシＰＧＥ２、２０−エチルＰＧＥ２、１１−デオキシＰＧＥ１、ノクロプロスト、スルプロストン、ブタプロスト、１５−ケトＰＧＥ２および１９（Ｒ）ヒドロキシＰＧＥ２から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記グルココルチコイドが、メドリゾン、アルクロメタゾン、ジプロピオン酸アルクロメタゾン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ベタメタゾン、安息香酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ブデソニド、シクレソニド、クロベタゾール、酪酸クロベタゾール、プロピオン酸クロベタゾール、クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチゾール、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコート、デソニド、デスオキシメタゾン（desoximetasone）、デスオキシコルトン、デスオキシメタゾン（desoxymethasone）、デキサメタゾン、ジフロラゾン、二酢酸ジフロラゾン、ジフルコルトロン、吉草酸ジフルコルトロン、ジフルオロコルトロン、ジフルプレドナート、フルクロロロン、フルクロロロンアセトニド、フルドロキシコルチド、フルメタゾン（flumetasone）、フルメタゾン（flumethasone）、ピバル酸フルメタゾン、フルニソリド、フルニソリド半水和物、フルオシノロン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオコルチン、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオロコルチゾン、フルオロメトロン、フルペロロン、フルプレドニデン、酢酸フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルチカゾン、プロピオン酸フルチカゾン、ホルモコータル、ハルシノニド、ハロメタゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、アセポン酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンブテプレート、酪酸ヒドロコルチゾン、ロテプレドノール、メプレドニゾン、６ａ−メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、アセポン酸メチルプレドニゾロン、モメタゾン、フロ酸モメタゾン、フロ酸モメタゾン一水和物、パラメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニリデン、リメキソロン、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニドおよびウロベタゾール、ならびにそれらの組合せから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記グルココルチコイドが、ベタメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール、フルメタゾン、フルオシノロンアセトニド、メドリゾン、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、アルクロメタゾンおよびデキサメタゾンから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗新生物薬が、ゲムシタビン、レトロゾールおよびフルダラビンから選択され、前記ドーパミン受容体アンタゴニストがフルフェナジンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
細胞の前記集団が、造血細胞を含む、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
細胞の前記集団が単離されている、請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
造血細胞の前記集団が、臍帯血、末梢血、骨髄または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
造血細胞の前記集団が、ｉＰＳＣから得られる、請求項１から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
細胞の前記集団が、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）を含む、請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
細胞の前記集団が、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％のＨＳＰＣを含む、請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
細胞の前記集団が、ＨＳＰＣの実質的に純粋な集団を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞の前記集団が、前記外因性薬剤との接触の前に、ＣＤ３４＋ＨＰＳＣについて富化される、請求項１から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
請求項１から２４のいずれかに記載の方法によって得られた、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現が増加した細胞の集団。
【請求項２６】
請求項２５に記載の細胞の集団の治療有効量を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、免疫学的障害を処置する方法。
【請求項２７】
細胞の前記集団が、造血細胞を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
造血細胞の前記集団が、臍帯血、末梢血、骨髄またはｉＰＳＣに由来する、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
細胞の前記集団が、ＨＳＰＣを含む、請求項２６から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
細胞の前記集団が、少なくとも約５０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％のＨＳＰＣを含む、請求項２６から２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
細胞の前記集団が、ＨＳＰＣの実質的に純粋な集団を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
細胞の前記集団が、前記外因性薬剤との接触の前に、ＣＤ３４＋ＨＰＳＣについて富化される、請求項２６から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
細胞の前記集団が、前記患者と同種異系である、請求項２６から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
細胞の前記集団が、前記患者とＨＬＡが一致している、請求項２６から３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
細胞の前記集団が、ハプロタイプ決定済増強ＨＳＰＣを含む、請求項２６から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
細胞の前記集団が、前記患者と部分的にＨＬＡが一致しているまたは一致していない、請求項２６から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
細胞の前記集団の前記治療有効量が、約２×１０６〜約２×１０１０のＣＤ３４＋造血細胞を含む、請求項２６から３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
治療有効量の細胞の、１回よりも多い投与を含む、請求項２６から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
投与の頻度が、約隔週〜約６カ月毎の範囲である、請求項２６から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
初回投与が、引き続く投与よりも多い細胞数である、請求項２６から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記免疫学的障害が、急性心筋梗塞、虚血性脳卒中、１型糖尿病、真性糖尿病、多発性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、炎症性脱髄疾患、ループス、クローン病、変形性関節症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎、皮膚炎、過敏性腸症候群、白斑、グレーブス病、橋本病、アジソン病、多発性筋炎、皮膚筋炎、重症筋無力症、自己免疫性肝炎、シェーグレン症候群、自己免疫性胃炎、硬化症、乾癬、喘息またはウェゲナー肉芽腫症から選択される自己免疫性障害である、請求項２６から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記免疫学的障害が、移植片対宿主病または移植拒絶である、請求項２６から４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記移植拒絶が、骨髄移植、実質臓器移植または細胞治療（例えば、単離された幹細胞を含む任意の組成物）から生じたものである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記患者が前処置を受けていない、請求項２６から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記患者が、高用量前処置、強度減弱前処置または骨髄非破壊的前処置のうちの少なくとも１つを受けていない、請求項２６から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記患者が、高用量前処置、強度減弱前処置または骨髄非破壊的前処置のうちの少なくとも１つを受けている、請求項２６から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記患者が、細胞移植の候補ではないか、または移植を受けていない、請求項２６から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
請求項２５に記載の細胞の集団を含む組成物の治療有効量を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、患者において炎症を処置する方法。
【請求項４９】
細胞の前記集団が、造血細胞を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
造血細胞の前記集団が、臍帯血、末梢血、骨髄またはｉＰＳＣに由来する、請求項４８または請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
細胞の前記集団が、ＨＳＰＣを含む、請求項４８から５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
細胞の前記集団が、少なくとも約５０％のＨＰＳＣ、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％のＨＳＰＣを含む、請求項４８から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
細胞の前記集団が、ＨＳＰＣの実質的に純粋な集団を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
細胞の前記集団が、前記外因性薬剤との接触の前に、ＣＤ３４＋ＨＰＳＣについて富化される、請求項４８から５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
細胞の前記集団が、前記患者と同種異系である、請求項４８から５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
細胞の前記集団が、前記患者とＨＬＡが一致している、請求項４８から５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
細胞の前記集団が、ハプロタイプ決定済増強ＨＳＰＣを含む、請求項４８から５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
細胞の前記集団が、前記患者と部分的にＨＬＡが一致しているまたは一致していない、請求項４８から５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
細胞の前記集団の前記治療有効量が、約２×１０６細胞〜約２×１０１０のＣＤ３４＋造血細胞を含む、請求項４８から５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
治療有効量の細胞の、１回よりも多い投与を含む、請求項４８から５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
投与の頻度が、約隔週〜約６カ月毎の範囲である、請求項４８から６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
初回投与が、引き続く投与よりも多い細胞数である、請求項４８から６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
炎症性障害が、肺、関節、結合組織、眼、鼻、腸、腎臓、肝臓、皮膚、中枢神経系、内分泌系、心血管系および心臓の炎症から選択される、請求項４８から６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記肺の前記炎症が、喘息、成人呼吸促迫症候群、気管支炎、肺炎症、肺線維症および嚢胞性線維症から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記関節の前記炎症が、関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、若年性関節リウマチ、変形性関節症、痛風性関節炎および他の関節炎状態から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記眼の前記炎症が、ブドウ膜炎（虹彩炎を含む）、結膜炎、強膜炎、乾性角結膜炎、ならびに糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜色素変性症ならびに萎縮型および滲出型の加齢黄斑変性を含むがこれらに限定されない網膜疾患から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記腸の前記炎症が、クローン病、潰瘍性大腸炎および遠位直腸炎から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記皮膚の前記炎症が、乾癬、湿疹および皮膚炎（例えば、湿疹性皮膚炎、アトピー性皮膚炎および脂漏性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎または刺激性接触皮膚炎、亀裂性湿疹、光アレルギー性皮膚炎、光毒性皮膚炎、植物性光線皮膚炎、放射線皮膚炎およびうっ滞性皮膚炎）、強皮症、外傷、熱傷、水疱性障害または皮膚もしくは粘膜の虚血から生じる潰瘍およびびらん、いくつかの形態の魚鱗癬、表皮水疱症、肥厚性瘢痕、ケロイド、自然老化の皮膚変化、光老化、皮膚の機械的剪断によって引き起こされる摩擦水疱形成、コルチコステロイドの外用使用から生じる皮膚萎縮、口唇炎、唇のひび割れ、鼻刺激、粘膜炎ならびに外陰腟炎から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記内分泌系の前記炎症が、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、ならびに副腎皮質の急性および慢性の炎症から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項７０】
前記心血管系の前記炎症が、冠状動脈梗塞損傷、末梢血管疾患、心筋炎、血管炎、狭窄の血管再生、アテローム動脈硬化症、およびＩＩ型糖尿病と関連する血管疾患から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
前記腎臓の前記炎症が、糸球体腎炎、間質性腎炎、ループス腎炎、ウェゲナー病に対して二次的な腎炎、急性腎炎に対して二次的な急性腎不全、グッドパスチャー症候群、閉塞後症候群および尿細管虚血から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項７２】
前記肝臓の前記炎症が、肝炎（ウイルス感染、自己免疫性応答、薬物処置、毒素、環境因子から生じる、または原発性障害の二次的帰結として生じる）、胆道閉鎖症、原発性胆汁性肝硬変および原発性硬化性胆管炎から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項７３】
前記中枢神経系の前記炎症が、多発性硬化症、およびアルツハイマー病、パーキンソン病、またはＨＩＶ感染と関連する認知症などの神経変性疾患から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項７４】
前記投与が全身投与である、請求項４８から７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
前記投与が局所投与である、請求項４８から７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
前記投与が、静脈内、動脈内、筋内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹腔内、経気管、皮下（真皮下）、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、胸骨内注射である、または注入による、請求項４８から７５のいずれかに記載の方法。
【請求項７７】
組合せ治療の一部である、請求項４８から７６のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
モジュレートされていない造血細胞の集団におけるＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現のレベルと比較して約３倍〜約８０倍であるＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現の増加したレベルを発現するモジュレートされた造血細胞の集団を含む医薬組成物。
【請求項７９】
薬学的に許容されるキャリアをさらに含む、請求項７８に記載の医薬組成物。
【請求項８０】
造血細胞の前記集団が、臍帯血、末梢血、骨髄またはｉＰＳＣに由来する、請求項７８または請求項７９に記載の医薬組成物。
【請求項８１】
造血細胞の前記集団が、分化したｉＰＳＣに由来する、請求項７８から８０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８２】
造血細胞の前記集団が、ＨＳＰＣを含む、請求項７８から８１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８３】
造血細胞の前記集団が、少なくとも約５０％のＨＰＳＣ、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％のＨＳＰＣを含む、請求項７８から８２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８４】
造血細胞の前記集団が、ＨＳＰＣの実質的に純粋な集団を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
造血細胞の前記集団が、ＣＤ３４＋ＨＰＳＣについて富化されている、請求項７８から８４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８６】
静脈内投与、動脈内投与、筋内投与、髄腔内投与、嚢内投与、眼窩内投与、心臓内投与、真皮内投与、腹腔内投与、経気管投与、皮下（真皮下）投与、表皮下投与、関節内投与、嚢下投与、くも膜下投与、脊髄内投与、胸骨内投与および注入のために製剤化されている、請求項７８から８５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８７】
局所投与または非静脈内投与のために製剤化されている、請求項７８から８６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８８】
造血細胞の前記集団が、約２×１０６〜約２×１０１０のＣＤ３４＋造血細胞を含む、請求項７８から８７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８９】
請求項７８から８９のいずれかに記載の医薬組成物と、組合せ治療における使用のための第２の活性薬剤とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年１月２６日に出願された米国仮出願第６２／１０７，５１７号および２０１５年２月６日に出願された米国仮出願第６２／１１２，６５３号の、米国特許法第１１９条（ｅ）の下の利益を主張し、これらの出願はそれぞれ、その全体が本明細書に参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
制御を受けていない免疫活性化は、致死的であり得、したがって、免疫系は、部分的には、免疫細胞機能を改変する、炎症に応答する経路によって、密に調節される。
【０００３】
Ｂ７−Ｈ１としても公知のＰＤ−Ｌ１は、Ｂ７ファミリーのＴ細胞共阻害分子に属する膜貫通タンパク質である。その受容体ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合は、Ｔ細胞活性化を弱め、増殖および細胞傷害性を減少させ、アポトーシスを誘導する。造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）の免疫調節特性は、ＰＤ−Ｌ１の発現増加によって増強される。ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞の活性化および増殖を遮断する際のその役割について、がん免疫療法において記載されている。より具体的には、ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞上の共刺激分子（例えば、Ｂ７−１および／またはＢ７−２）に対する競合を介して、およびＴ細胞上のＰＤ１の直接的結合を介して、Ｔ細胞活性化を防止することが可能である。したがって、ＰＤ−Ｌ１は、細胞接触依存的様式で、Ｔ細胞活性化を調節することが可能である。さらに、ＨＳＰＣベースの免疫療法の治療潜在力は、ＰＤ−Ｌ１の本質的に低い発現レベルによって制限されるようである。
【０００４】
ＨＳＰＣ上のＰＤ−Ｌ１のレベルの増加は、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養した後で観察されているが、長期にわたる培養期間は、複製ストレス、確率論的な細胞欠陥および染色体異常を生じ得る。
【０００５】
ＩＤＯ−１（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）は、必須アミノ酸トリプトファン（ＴＲＰ）の分解を触媒する酵素である。微小環境中のトリプトファンの枯渇は、Ｔ細胞増殖を停止させ、ＴＨ１細胞アポトーシスを誘導し、調節性Ｔ細胞を活性化する。免疫抑制のこの方法はまた、多くの他の免疫抑制細胞によって天然に使用され、免疫活性化を逃れるために多くの腫瘍によっても使用される。ＩＤＯ酵素は細胞内にあり分泌されないが、隣の細胞がＴＲＰへのアクセスの低減に応答するので、ＩＤＯ−１の代謝的効果は、局所的効果を最初に提供する。しかし、微小環境のＴＲＰが枯渇すると、ＩＤＯ−１発現細胞と近位であるが接触はしていない細胞が影響を受ける。したがって、自己免疫性の状況下では、ＩＤＯ−１は、炎症性微小環境からＴＲＰを枯渇させることによってＴ細胞の活性化および増殖を防止し、免疫応答の調節性Ｔ細胞抑制を活性化する。ＩＤＯ−１の発現は、通常条件下では、造血幹細胞または前駆細胞において非常に低い。したがって、造血幹細胞および前駆細胞におけるＩＤＯ−１レベルのモジュレーションは、これらの細胞の免疫調節特性、および投与の際には患者の細胞の免疫学的特性に影響を与える機会を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセスおよび長期にわたる細胞培養によるストレスに細胞を曝露させることなしに、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現の増加を有するＨＳＰＣを産生するための方法が、当該分野で必要とされている。
【０００７】
本発明は、短期インキュベーションにおいて、ＨＳＰＣを含む細胞上のＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現を、独立してまたは組み合わせて薬理学的に上方調節するいくつかの分子または化合物の同定を介して、これらの制限に対処する。
【０００８】
本開示は、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）およびインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ−１）の発現レベルが増加した細胞の免疫調節特性を介して免疫系をモジュレートするための組成物および方法を提供する。本開示は、細胞の集団におけるＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１の発現を増加させるための組成物および方法、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１の発現が増加したモジュレートされた細胞、ならびにＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１の発現が増加した細胞によって得られた免疫抑制効果に関する方法を対象とする。
【０００９】
本発明の第１の目的は、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現を増加させることが可能な１種または複数種の外因性薬剤の存在下で細胞の集団をインキュベートして、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１の発現が増加した細胞の集団を得るステップを含む、細胞の集団をモジュレートするための方法を含む。
【００１０】
一態様では、インキュベーションは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏである。
【００１１】
一態様では、インキュベーションは、約５分間〜約７２時間の間である。さらなる一態様では、インキュベーションは、約４時間〜約４８時間の間である。
【００１２】
一態様では、インキュベーションは、約４℃〜約３７℃の間の温度で実施される。さらなる一態様では、インキュベーションは、約３７℃の温度で実施される。
【００１３】
一態様では、モジュレートされた細胞におけるＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現の増加は、少なくとも３倍である。一態様では、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１の増加は、外因性薬剤と共にインキュベートされていない細胞と比較して、約３倍〜約８０倍である。
【００１４】
一態様では、外因性薬剤（複数可）は、１種または複数種のポリヌクレオチド、１種または複数種のポリペプチド、１種または複数種の小分子、およびそれらの組合せから選択される。一態様では、ポリペプチドは、インターフェロン受容体アゴニストである。さらなる一態様では、インターフェロン受容体アゴニストは、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−γ、またはそれらの組合せから選択される。特定の一態様では、細胞の集団は、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γでモジュレートされる。
【００１５】
さらに別の一態様では、ポリヌクレオチドは、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＰＤ−Ｌ１をコードするポリヌクレオチドおよび／またはＩＤＯ−１をコードするポリヌクレオチドから選択される。
【００１６】
特定の一態様では、少なくとも２種、少なくとも３種またはそれ超の外因性薬剤が投与される。特定の一態様では、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γおよびポリ（Ｉ：Ｃ）が投与される。
【００１７】
一態様では、ポリヌクレオチドは、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＰＤ−Ｌ１をコードするポリヌクレオチドおよび／またはＩＤＯ−１をコードするポリヌクレオチドから選択される。
【００１８】
一態様では、小分子は、グルココルチコイド、プロスタグランジン経路アゴニスト抗新生物薬、ドーパミン受容体アゴニスト、ムチン酸イソメテプテン（isometheptene mucate）、硫酸ジヒドロストレプトマイシン、プロトリプチリン、テレンゼピン、シクロベンザプリン、４−アミノサリチル酸およびそれらの組合せを含む。一態様では、プロスタグランジン経路アゴニストは、ＰＧＥ２、ｄｍＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、２０−エチルＰＧＥ２、８−イソ−１６−シクロヘキシル−テトラノル（tetranor）ＰＧＥ２、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（「ｄｍＰＧＥ２」）、ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド（acetamidobenzamido））フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２、９−ケトフルプロステノール、５−トランスＰＧＥ２、１７−フェニル−オメガ−トリノル（trinor）ＰＧＥ２、ＰＧＥ２セリノールアミド、ＰＧＥ２メチルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２、８−イソ−１５−ケトＰＧＥ２、８−イソＰＧＥ２イソプロピルエステル、８−イソ−１６−シクロヘキシル−テトラノルＰＧＥ２、２０−ヒドロキシＰＧＥ２、２０−エチルＰＧＥ２、１１−デオキシＰＧＥ１、ノクロプロスト（nocloprost）、スルプロストン、ブタプロスト、１５−ケトＰＧＥ２および１９（Ｒ）ヒドロキシＰＧＥ２から選択される。
【００１９】
一態様では、グルココルチコイドは、メドリゾン、アルクロメタゾン、ジプロピオン酸アルクロメタゾン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ベタメタゾン、安息香酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ブデソニド、シクレソニド、クロベタゾール、酪酸クロベタゾール、プロピオン酸クロベタゾール、クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチゾール、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコート、デソニド、デスオキシメタゾン（desoximetasone）、デスオキシコルトン、デスオキシメタゾン（desoxymethasone）、デキサメタゾン、ジフロラゾン、二酢酸ジフロラゾン、ジフルコルトロン、吉草酸ジフルコルトロン、ジフルオロコルトロン（difluorocortolone）、ジフルプレドナート、フルクロロロン、フルクロロロンアセトニド、フルドロキシコルチド、フルメタゾン（flumetasone）、フルメタゾン（flumethasone）、ピバル酸フルメタゾン、フルニソリド、フルニソリド半水和物、フルオシノロン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオコルチン、フルオコルチンブチル（fluocoritin butyl）、フルオコルトロン、フルオロコルチゾン（fluorocortisone）、フルオロメトロン、フルペロロン、フルプレドニデン、酢酸フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルチカゾン、プロピオン酸フルチカゾン、ホルモコータル（formocortal）、ハルシノニド、ハロメタゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、アセポン酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンブテプレート、酪酸ヒドロコルチゾン、ロテプレドノール、メプレドニゾン、６ａ−メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、アセポン酸メチルプレドニゾロン、モメタゾン、フロ酸モメタゾン、フロ酸モメタゾン一水和物、パラメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニリデン、リメキソロン、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニドおよびウロベタゾール、ならびにそれらの組合せから選択される。さらなる一態様では、グルココルチコイドは、ベタメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール（clobetasol proprionate）、フルメタゾン、フルオシノロンアセトニド（flucinoloneacetonide）、メドリゾン、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、アルクロメタゾンおよびデキサメタゾンから選択される。
【００２０】
一態様では、抗新生物薬は、ゲムシタビン、レトロゾールおよびフルダラビンから選択され、ドーパミン受容体アンタゴニストは、フルフェナジン（fluphernazine）である。
【００２１】
一態様では、細胞の集団は、造血細胞を含む。
【００２２】
一態様では、細胞の集団は、単離されている。特定の一態様では、造血細胞の集団は、臍帯血、末梢血、骨髄または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する。
【００２３】
別の態様では、造血細胞の集団は、ｉＰＳＣから得られる。
【００２４】
一態様では、この集団は、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）を含む。
【００２５】
一態様では、この集団は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％のＨＳＰＣを含む。一態様では、この集団は、ＨＳＰＣの実質的に純粋な集団を含む。
【００２６】
一態様では、細胞の集団は、外因性薬剤との接触の前に、ＣＤ３４＋ＨＰＳＣについて富化される。
【００２７】
本発明の第２の目的は、第１の態様およびその態様に記載された方法によって得られた、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１の発現が増加した細胞の集団を含む。
【００２８】
本発明の第３の目的は、上記実施形態および／または態様のいずれかに記載された方法によって得られた細胞の集団の治療有効量を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、免疫学的障害を処置する方法を含む。
【００２９】
一態様では、細胞の集団は、造血細胞を含む。一態様では、造血細胞の集団は、臍帯血、末梢血、骨髄またはｉＰＳＣに由来する。
【００３０】
なおさらなる一態様では、細胞の集団は、ＨＳＰＣを含む。
【００３１】
さらなる一態様では、細胞の集団は、少なくとも約５０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％のＨＳＰＣを含む。特定の一態様では、細胞の集団は、ＨＳＰＣの実質的に純粋な集団を含む。
【００３２】
なおさらなる一態様では、細胞の集団は、外因性薬剤との接触の前に、ＣＤ３４＋ＨＰＳＣについて富化される。
【００３３】
一態様では、細胞の集団は、患者と同種異系である。さらなる一態様では、細胞の集団は、患者とＨＬＡが一致している。なおさらなる一態様では、細胞の集団は、ハプロタイプ決定済増強（haplotyped enhanced）ＨＳＰＣを含む。別の態様では、細胞の集団は、患者と部分的にＨＬＡが一致しているまたは一致していない。
【００３４】
一態様では、細胞の集団の治療有効量は、約２×１０６〜約２×１０１０のＣＤ３４＋造血細胞を含む。
【００３５】
一態様では、この方法は、治療有効量の細胞の、１回よりも多い投与を含む。一態様では、投与の頻度は、約隔週〜約６カ月毎の範囲である。さらなる一態様では、初回投与は、引き続く投与よりも多い細胞数である。
【００３６】
一実施形態では、免疫学的障害は、急性心筋梗塞、虚血性脳卒中、１型糖尿病、真性糖尿病、多発性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、炎症性脱髄疾患、ループス、クローン病、変形性関節症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎、皮膚炎、過敏性腸症候群、白斑、グレーブス病、橋本病、アジソン病、多発性筋炎、皮膚筋炎、重症筋無力症、自己免疫性肝炎、シェーグレン症候群、自己免疫性胃炎、硬化症、乾癬、喘息またはウェゲナー肉芽腫症から選択される自己免疫性障害である。
【００３７】
特定の一態様では、免疫学的障害は、移植片対宿主病または移植拒絶である。さらなる一態様では、移植拒絶は、骨髄移植、実質臓器移植または細胞治療（例えば、単離された幹細胞を含む任意の組成物）から生じたものである。
【００３８】
一態様では、患者は、高用量前処置、強度減弱前処置または骨髄非破壊的前処置のうちの少なくとも１つを受けている。一態様では、患者は、高用量前処置、強度減弱前処置または骨髄非破壊的前処置のうちの少なくとも１つを受けていない。なおさらなる一態様では、患者は、前処置を受けていない。
【００３９】
一態様では、患者は、細胞移植の候補ではないか、または移植を受けていない。
【００４０】
本発明の第４の目的は、上記実施形態および／または態様のいずれかに記載された方法によって得られた細胞の集団の治療有効量を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、患者において炎症を処置する方法を含む。
【００４１】
一態様では、細胞の集団は、造血細胞を含む。
【００４２】
一態様では、造血細胞の集団は、臍帯血、末梢血、骨髄またはｉＰＳＣに由来する。特定の一態様では、この集団は、ＨＳＰＣを含む。
【００４３】
一態様では、この集団は、少なくとも約５０％のＨＰＳＣ、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％のＨＳＰＣを含む。さらなる一態様では、この集団は、ＨＳＰＣの実質的に純粋な集団を含む。
【００４４】
一態様では、この集団は、外因性薬剤との接触の前に、ＣＤ３４＋ＨＰＳＣについて富化される。
【００４５】
さらなる一態様では、細胞の集団は、患者と同種異系である。
【００４６】
一態様では、細胞の集団は、患者とＨＬＡが一致している。別の態様では、細胞の集団は、患者と部分的にＨＬＡが一致しているまたは一致していない。さらなる一態様では、細胞の集団は、ハプロタイプ決定済増強ＨＳＰＣを含む。
【００４７】
一態様では、細胞の集団の治療有効量は、約２×１０６細胞〜約２×１０１０のＣＤ３４＋造血細胞を含む。
【００４８】
一態様では、本方法は、治療有効量の細胞の、１回よりも多い投与を含む。さらなる一態様では、投与の頻度は、約隔週〜約６カ月毎の範囲である。一態様では、初回投与は、引き続く投与よりも多い細胞数である。
【００４９】
一態様では、炎症性障害は、肺、関節、結合組織、眼、鼻、腸、腎臓、肝臓、皮膚、中枢神経系、内分泌系、心血管系および心臓の炎症から選択される。
【００５０】
一態様では、肺の炎症は、喘息、成人呼吸促迫症候群、気管支炎、肺炎症、肺線維症および嚢胞性線維症から選択される。
【００５１】
一態様では、関節の炎症は、関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、若年性関節リウマチ、変形性関節症、痛風性関節炎および他の関節炎状態から選択される。
【００５２】
一態様では、眼の炎症は、ブドウ膜炎（虹彩炎を含む）、結膜炎、強膜炎、乾性角結膜炎、および糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜色素変性症ならびに萎縮型および滲出型の加齢黄斑変性を含むがこれらに限定されない網膜疾患から選択される。
【００５３】
一態様では、腸の炎症は、クローン病、潰瘍性大腸炎および遠位直腸炎（distalproctitis）から選択される。
【００５４】
一態様では、皮膚の炎症は、乾癬、湿疹および皮膚炎（例えば、湿疹性皮膚炎（eczematousdermatitides）、アトピー性皮膚炎および脂漏性皮膚炎（topic and seborrheicdermatitis）、アレルギー性皮膚炎または刺激性接触皮膚炎、亀裂性湿疹（eczema craquelee）、光アレルギー性皮膚炎、光毒性皮膚炎、植物性光線皮膚炎、放射線皮膚炎およびうっ滞性皮膚炎）、強皮症、外傷、熱傷、水疱性障害または皮膚もしくは粘膜の虚血から生じる潰瘍およびびらん、いくつかの形態の魚鱗癬（ichthyoses）、表皮水疱症（epidermolysis bullosae）、肥厚性瘢痕、ケロイド、自然老化の皮膚変化、光老化、皮膚の機械的剪断によって引き起こされる摩擦水疱形成、コルチコステロイドの外用使用から生じる皮膚萎縮、口唇炎、唇のひび割れ、鼻刺激、粘膜炎ならびに外陰腟炎から選択される。
【００５５】
一態様では、内分泌系の炎症は、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、ならびに副腎皮質の急性および慢性の炎症から選択される。
【００５６】
一態様では、心血管系の炎症は、冠状動脈梗塞損傷（coronary infarctdamage）、末梢血管疾患、心筋炎、血管炎、狭窄の血管再生、アテローム動脈硬化症（artherosclerosis）、およびＩＩ型糖尿病と関連する血管疾患から選択される。
【００５７】
一態様では、腎臓の炎症は、糸球体腎炎、間質性腎炎、ループス腎炎、ウェゲナー病（Wegener'sdisease）に対して二次的な腎炎、急性腎炎に対して二次的な急性腎不全、グッドパスチャー症候群、閉塞後症候群（post-obstructive syndrome）および尿細管虚血から選択される。
【００５８】
一態様では、肝臓の炎症は、肝炎（ウイルス感染、自己免疫性応答、薬物処置、毒素、環境因子から生じる、または原発性障害の二次的帰結として生じる）、胆道閉鎖症、原発性胆汁性肝硬変および原発性硬化性胆管炎から選択される。
【００５９】
一態様では、中枢神経系の炎症は、多発性硬化症、およびアルツハイマー病、パーキンソン病、またはＨＩＶ感染と関連する認知症などの神経変性疾患から選択される。
【００６０】
一態様では、投与は全身投与である。別の態様では、投与は局所投与である。
【００６１】
一態様では、投与は、静脈内、動脈内、筋内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹腔内、経気管、皮下（真皮下）、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、胸骨内（intrastemal）注射である、または注入による。
【００６２】
一態様では、本方法は、組合せ治療の一部である。
【００６３】
本発明の第５の目的は、モジュレートされていない造血細胞の集団におけるＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現のレベルと比較して約３倍〜約８０倍であるＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現の増加したレベルを発現するモジュレートされた造血細胞の集団を含む医薬組成物を含む。
【００６４】
一態様では、医薬組成物は、薬学的に許容されるキャリアをさらに含む。
【００６５】
一態様では、造血細胞の集団は、臍帯血、末梢血、骨髄またはｉＰＳＣに由来する。
【００６６】
特定の一態様では、造血細胞の集団は、分化したｉＰＳＣに由来する。
【００６７】
一態様では、この集団は、ＨＳＰＣを含む。さらなる一態様では、この集団は、少なくとも約５０％のＨＰＳＣ、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％のＨＳＰＣを含む。なおさらなる一態様では、造血細胞の集団は、ＨＳＰＣの実質的に純粋な集団を含む。
【００６８】
一態様では、この集団は、ＣＤ３４＋ＨＰＳＣについて富化されている。
【００６９】
一態様では、組成物は、静脈内投与、動脈内投与、筋内投与、髄腔内投与、嚢内投与、眼窩内投与、心臓内投与、真皮内投与、腹腔内投与、経気管投与、皮下（真皮下）投与、表皮下投与、関節内投与、嚢下投与、くも膜下投与、脊髄内投与、胸骨内投与および注入のために製剤化されている。
【００７０】
一態様では、医薬組成物は、局所投与または非静脈内投与のために製剤化されている。
【００７１】
一態様では、細胞の集団は、約２×１０６〜約２×１０１０のＣＤ３４＋造血細胞を含む。
【００７２】
本発明の第６の目的は、本発明の第１の目的から得られたモジュレートされた細胞または本発明の第５の目的に従う医薬組成物と、組合せ治療における使用のための第２の活性薬剤とを含むキットを含む。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｅは、ＰＤ−Ｌ１発現増加のための造血幹細胞および前駆細胞のモジュレーション後の遺伝子発現を示す図である。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｅは、ＰＤ−Ｌ１発現増加のための造血幹細胞および前駆細胞のモジュレーション後の遺伝子発現を示す図である。
【図１−３】図１Ａ〜１Ｅは、ＰＤ−Ｌ１発現増加のための造血幹細胞および前駆細胞のモジュレーション後の遺伝子発現を示す図である。
【００７４】
【図２−１】図２Ａ〜２Ｄは、ＰＤ−Ｌ１発現増加のためのモジュレーション後の造血幹細胞および前駆細胞上のＰＤ−Ｌ１表面発現を示す図である。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｄは、ＰＤ−Ｌ１発現増加のためのモジュレーション後の造血幹細胞および前駆細胞上のＰＤ−Ｌ１表面発現を示す図である。
【図２−３】図２Ａ〜２Ｄは、ＰＤ−Ｌ１発現増加のためのモジュレーション後の造血幹細胞および前駆細胞上のＰＤ−Ｌ１表面発現を示す図である。
【００７５】
【図３】図３は、モジュレートされたＰＤ−Ｌ１発現を有するＨＳＣの存在下でのＴ細胞増殖を示す図である。
【００７６】
【図４】図４は、ＰＤ−Ｌ１発現増加のための造血幹細胞および前駆細胞のモジュレーション後の遺伝子発現を示す図である。
【００７７】
【図５−１】図５Ａ〜Ｄは、ＩＤＯ−１発現増加のためのモジュレーション後の造血幹細胞および前駆細胞におけるＩＤＯ−１遺伝子発現レベルを示す図である。
【図５−２】図５Ａ〜Ｄは、ＩＤＯ−１発現増加のためのモジュレーション後の造血幹細胞および前駆細胞におけるＩＤＯ−１遺伝子発現レベルを示す図である。
【００７８】
【図６】図６は、ＩＤＯ−１発現増加のためのさらなる外因性薬剤による３７℃で２４時間のモジュレーションを示す図である。
【００７９】
【図７】図７は、６時間、２４時間または４８時間にわたるＰＤ−Ｌ１発現増加のためのモジュレーション後の造血幹細胞および前駆細胞上のＰＤ−Ｌ１表面発現を示す図である。
【００８０】
【図８】図８は、モジュレーション後に、種々の条件において維持した場合、モジュレートされた細胞が生存可能であり、細胞表面にＰＤ−Ｌ１を発現することを実証する図である。
【００８１】
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、ｅｘ  ｖｉｖｏ処理されたヒト幹細胞および前駆細胞が、自家Ｔ細胞および同種異系Ｔ細胞の両方の増殖を抑制することを実証する図である。
【００８２】
【図１０】図１０は、ヒトＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞におけるＰＤ−Ｌ１の遺伝子過剰発現が、Ｔ細胞増殖の抑制を増強することを実証する図である。
【００８３】
【図１１】図１１は、ヒトＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞におけるＩＤＯ−１の遺伝子過剰発現が、Ｔ細胞増殖の抑制を増強することを実証する図である。
【００８４】
【図１２】図１２は、上方調節されたＩＤＯ−１発現を実証する造血細胞のモジュレートされた集団由来の培地で処理されたＴ細胞が、Ｔ細胞増殖を顕著に抑制したことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
Ｉ．定義
冠詞「１つの（a）」、「１つの（an）」および「この（the）」は、その冠詞の文法上の目的語のうち１つ、または１つよりも多く（例えば、少なくとも１つ）を指すために、本明細書で使用される。例として、「１つの（an）エレメント」とは、１つのエレメントまたは１つよりも多いエレメントを意味する。
【００８６】
選択肢（例えば「または」）の使用は、それらの選択肢のうちいずれか１つ、両方またはそれらの任意の組合せを意味すると理解すべきである。
【００８７】
本明細書で使用する場合、用語「約」または「およそ」とは、参照の量（quantity）、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量（amount）、重量または長さに対して、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％も変動する、量（quantity）、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量（amount）、重量または長さを指す。一実施形態では、用語「約」または「およそ」とは、参照の量（quantity）、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量（amount）、重量または長さについて、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％または±１％の、量（quantity）、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量（amount）、重量または長さの範囲を指す。
【００８８】
本明細書で使用する場合、用語「実質的に」とは、参照の量（quantity）、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量（amount）、重量または長さの９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ超である、量（quantity）、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量（amount）、重量または長さを指す。一実施形態では、「実質的に同じ」とは、参照の量（quantity）、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量（amount）、重量または長さとおよそ同じである効果、例えば生理学的効果を生じさせる、量（quantity）、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量（amount）、重量または長さを指す。
【００８９】
本明細書で使用する場合、用語「〜を実質的に含まない」および「〜を本質的に含まない」は、相互交換可能に使用され、細胞集団または培養培地などの組成物を記載するために使用される場合、指定の物質を含まない、例えば、指定の物質を９５％含まない、９６％含まない、９７％含まない、９８％含まない、９９％含まない、または従来の手段によって測定した場合に検出不能である、組成物を指す。一実施形態では、「実質的に純粋な」は、その組成物または構成成分が、他の細胞型などの夾雑物を実質的に含まないことを示すために使用され得る。組成物の特定の物質または構成成分の非存在に言及する場合、類似の意味が、用語「〜の非存在」に適用され得る。
【００９０】
「一実施形態（one embodiment）」、「一実施形態（an embodiment）」、「特定の一実施形態」、「関連の一実施形態」、「ある特定の一実施形態」、「さらなる一実施形態（an additional embodiment）」もしくは「さらなる一実施形態（afurther embodiment）」またはそれらの組合せに対する、本明細書を通じた言及は、その実施形態と関連して記載された特定の特色、構造または特徴が、本発明の少なくとも１つの実施形態中に含まれることを意味している。したがって、本明細書を通じた種々の場所における上述の語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態に言及するわけではない。さらに、特定の特色、構造または特徴は、１または複数の実施形態において任意の適切な様式で組み合わされ得る。
【００９１】
本明細書を通じて、文脈が他を要求しない限り、単語「含む（comprise）」、「含む（comprises）」および「含む（comprising）」は、複数のステップまたは複数のエレメントの、述べられた１つのステップもしくは１つのエレメントもしくは１つの群を含むが、複数のステップまたは複数のエレメントの、任意の他の１つのステップもしくは１つのエレメントもしくは１つの群を排除しないことを暗に示すと理解される。本明細書で使用する場合、用語「含む（include）」および「含む（comprise）」は、同意語として使用される。
【００９２】
「〜からなる」とは、語句「〜からなる」に続くものを全て含み、それらに限定されることを意味する。したがって、語句「〜からなる」は、列挙されたエレメントが必要とされるまたは必須であること、および他のエレメントが存在できないことを示す。
【００９３】
「〜から本質的になる」とは、その語句の後に列挙された任意のエレメントを含み、列挙されたエレメントについて本開示中で指定された活性または作用に干渉することもそれらに寄与することもない他のエレメントに限定されることを意味する。したがって、語句「〜から本質的になる」は、列挙されたエレメントが必要とされるまたは必須であること、および他のエレメントは任意選択ではなく、列挙されたエレメントの活性または作用にそれらが影響するか否かに依存して、他のエレメントが存在する場合も存在しない場合もあることを示している。
【００９４】
用語「ｅｘ  ｖｉｖｏ」とは、好ましくは、天然条件の最小の変更を伴って、生物の外側で起こる活動、例えば、生物の外側の人工的環境中の生存組織中でまたは生存組織上で実施される実験または測定を一般に指す。特定の実施形態では、「ｅｘ  ｖｉｖｏ」手順は、通常は無菌条件下で、情況に依存して、典型的には数時間または最大で約２４時間にわたるが最大で４８時間または７２時間を含む、生物から採取され、実験室装置中で培養またはモジュレートされた生存細胞または組織を含む。ある特定の実施形態では、かかる組織または細胞は、収集および凍結され得、ｅｘ  ｖｉｖｏ処置のために後に解凍され得る。一実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏモジュレーションは、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２４時間または少なくとも約３６時間にわたる。一実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏモジュレーションは、約１時間〜約７２時間、約２時間〜約４８時間、約４時間〜約４８時間、約６時間〜約４８時間、約１２時間〜約４８時間、約１時間〜約２４時間、約２時間〜約２４時間、約４時間〜約２４時間、約６時間〜約２４時間、約１２時間〜約２４時間、約１時間〜約１２時間、約４時間〜約１２時間、約６時間〜約１２時間または約８時間〜約１２時間の範囲の期間（a time period ranging from time period ranging from）にわたる。生存細胞または組織を使用して数日よりも長く持続する組織培養実験または手順は、典型的には「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」であるとみなされるが、ある特定の実施形態では、この用語は、ｅｘ  ｖｉｖｏと相互交換可能に使用され得る。
【００９５】
用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」とは、生物の内側で起こる活動を一般に指す。
【００９６】
記述「ｅｘ  ｖｉｖｏ投与」、「ｅｘ  ｖｉｖｏ処理」または「ｅｘ  ｖｉｖｏモジュレーション」は、１または複数の臓器、細胞または組織が、生存しているまたは最近死亡した被験体から得られ、任意選択で精製／富化され、処置または手順（例えば、造血幹細胞または前駆細胞などの特定の細胞の生着を増強するために、本発明の組成物または薬剤と共に細胞をインキュベートすることが関与する、ｅｘ  ｖｉｖｏ投与ステップ）に曝露される、医学的手順に一般に関する。ｅｘ  ｖｉｖｏ処理された細胞は、ドナーまたは異なる生存被験体に投与され得る。
【００９７】
かかるｅｘ  ｖｉｖｏの治療適用は、例えば、治療潜在力を有する細胞を、生存被験体に１または複数回投与することによる、任意選択のｉｎ  ｖｉｖｏ処置または手順のステップもまた含み得る。局所投与および全身投与の両方が、当該分野で周知の技術に従って、本明細書の他の箇所に記載されるように、これらの実施形態について企図される。被験体に投与される治療用細胞の量は、その被験体の特徴、例えば、全般的健康状態、年齢、性別、体重、および薬物に対する耐容性、ならびに薬物および／または細胞移植物に対する反応の程度、重症度および型に依存する。
【００９８】
本明細書で使用する場合、用語「インキュベートする（incubating）」は、細胞または細胞の集団が操作される特定のステップ（単数または複数）を記載するために使用される。インキュベーションステップは、細胞または細胞の集団をモジュレートする特定の温度、薬剤または条件を含み得る。
【００９９】
本明細書で使用する場合、用語「外因性」は、用語「異種（heterologous）」と相互交換可能に使用されて、そのネイティブの供給源以外のいくつかの供給源に由来する物質を指す。例えば、用語「外因性タンパク質」または「外因性細胞」とは、非ネイティブの供給源または場所由来であり、生物学的系に人工的に供給された、タンパク質または細胞を指す。対照的に、用語「内因性タンパク質」または「内因性細胞」とは、生物学的系、種または個体にとってネイティブであるタンパク質または細胞を指す。
【０１００】
語句「幹細胞」とは、本明細書で使用する場合、（１）長期自己再生、または元の細胞の少なくとも１つの同一のコピーを生成する能力、（２）複数の、一部の場合には１つだけの特化した細胞型への、単一細胞レベルでの分化、および（３）組織のｉｎ  ｖｉｖｏでの機能的再生、が可能な未分化細胞である細胞を指す。幹細胞は、全能性、多能性、複能性（multipotent）およびオリゴ／単能性（oligo/unipotent）としてのそれらの発生潜在力に従って、下位分類される。「前駆細胞」は、自己再生する能力およびより成熟した細胞へと分化する能力もまた有するが、ある系列にコミットされており（例えば、造血前駆体は、血液系列にコミットされ；骨髄系前駆体は、骨髄系系列にコミットされ；リンパ系前駆体は、リンパ系系列にコミットされている）、一方で幹細胞は、必ずしもそのように限定されるわけではない。「自己再生」とは、変更されていない娘細胞を産生する、したがって、その集団数を補給および維持する独自の能力、ならびに特化した細胞型を生成する独自の能力（ポテンシー）を有する細胞を指す。自己再生は、２つの方法で達成され得る。非対称的細胞分裂は、親細胞と同一である１つの娘細胞、および親細胞とは異なり、よりコミットした前駆体または分化した細胞である１つの娘細胞を産生する。対称的細胞分裂は、２つの同一の娘細胞を産生する。細胞の「増殖」または「拡大増殖（expansion）」は、対称的に分裂している細胞を指す。
【０１０１】
本明細書で使用する場合、用語「前駆体」または「前駆細胞」とは、自己再生する能力およびより成熟した細胞へと分化する能力を有する細胞を指す。前駆細胞は、多能性幹細胞および複能性幹細胞と比較して、低減されたポテンシーを有する。多くの前駆細胞は、単一の系列に沿って分化するが、相当に広範囲に及ぶ増殖能もまた有し得る。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、用語「造血幹細胞および前駆細胞（hematopoieticstem and progenitor cell）」または「ＨＳＰＣ」とは、抗原マーカーＣＤ３４の存在（ＣＤ３４＋）によって同定された細胞を指し、したがって、ＣＤ３４＋細胞およびかかる細胞の集団として特徴付けられる。特定の実施形態では、用語「ＨＳＰＣ」とは、抗原マーカーＣＤ３４の存在（ＣＤ３４＋）および系列（Ｌｉｎ）マーカーの非存在によって同定された細胞を指し、したがって、ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ（−）細胞およびかかる細胞の集団として特徴付けられる。ＣＤ３４＋および／またはＬｉｎ（−）細胞を含む細胞の集団は、造血前駆細胞もまた含むと認識される。用語「造血細胞」とは、ＨＳＰＣから、骨髄系系列およびリンパ系系列の全ての細胞を含む完全に分化した血液細胞までの範囲の細胞の連続体を指す。
【０１０３】
本明細書で使用する場合、用語「人工多能性幹細胞」またはｉＰＳＣとは、これらの幹細胞が、誘導または変化された、即ち、３つ全ての胚葉または皮層層：中胚葉、内胚葉および外胚葉、の組織へと分化することが可能な細胞へと再プログラムされた、分化した成体、新生仔または胎生期の細胞から産生されることを意味する。産生されたｉＰＳＣは、天然に見出される細胞を指さない。
【０１０４】
本明細書で使用する場合、「非接触」、「非処理」または「未処理」細胞は、対照薬剤以外の、薬剤で処理されていない、例えば、そのような薬剤と共に培養、それと接触またはそれと共にインキュベートされていない細胞である。ＤＭＳＯ（対照薬剤）と接触させた細胞、または別のビヒクルと接触させた細胞は、非接触細胞である。
【０１０５】
本明細書で使用する場合、用語「単離された」とは、その元の環境から取り出された材料を指す。例えば、「単離された細胞の集団」、「単離された細胞の供給源」または「単離されたＨＳＰＣ」などとは、本明細書で使用する場合、それらの天然の細胞環境からの、および組織または臓器の他の構成成分との会合からの、１または複数の細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ分離を指し、即ち、それは、ｉｎ  ｖｉｖｏ物質と有意には会合しない。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、用語「薬剤」および「外因性薬剤」は相互交換可能に使用され、その薬剤と接触させられる細胞においてＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１の発現を増加させることが可能な化合物または分子を指す。
【０１０７】
本明細書で使用する場合、用語「被験体」とは、任意の動物、好ましくは、ヒト患者、家畜または他の飼い慣らされた動物を指す。
【０１０８】
本明細書で使用する場合、用語「処置」、「処置する」などとは、疾患の症状の改善または排除を達成することを限定なしに含む、所望の薬理的効果および／または生理的効果を得ることを指す。この効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防することに関して予防的であり得、ならびに／あるいは症状の改善もしくは排除を達成すること、または疾患および／もしくはその疾患に帰せられ得る有害作用の部分的もしくは完全な治癒を提供することに関して、治療的であり得る。「処置」は、本明細書で使用する場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置をカバーし、これには以下が含まれる：（ａ）その疾患の素因があり得るが、その疾患を有するとはまだ診断されていない被験体において、疾患が発生するのを防止すること；（ｂ）疾患を阻害すること、即ち、その発達を停止させること；（ｃ）疾患を軽減させること、例えば、疾患の退縮を引き起こして、例えば、その疾患の症状を完全にまたは部分的に排除すること；および（ｄ）個体を疾患前状態にまで回復させること、例えば、造血系を再構成すること。
【０１０９】
用語「増強する」、「促進する」、「増加させる」および「活性化する」とは、ビヒクルまたは対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、細胞においてより大きい生理学的応答（即ち、下流効果）、例えば、例えば造血幹細胞および前駆細胞などの細胞におけるＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現の増加を生じさせるまたは引き起こす薬剤の能力を一般に指す。測定可能な生理学的応答は、被験体における免疫応答をモジュレートする細胞の能力の増加を含み得る。「増加した」または「増強された」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクル（薬剤の非存在）または対照組成物によって生じる応答の１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍またはそれを上回る倍数（例えば、５００倍、１０００倍）（それらの間にある、および１を上回る全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）の増加を含み得る。
【０１１０】
用語「減少させる」、「低下させる」、「低める」、「低減させる」および「減らす」とは、ビヒクルまたは対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、細胞においてより小さい生理学的応答（即ち、下流効果）を生じさせるまたは引き起こす薬剤の能力を一般に指す。「減少した」または「低減された」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクル（薬剤の非存在）または対照組成物によって生じる応答の１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍またはそれを上回る倍数（例えば、５００倍、１０００倍）（それらの間にある、および１を上回る全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）の減少を含み得る。
【０１１１】
細胞の「治療潜在力」とは、細胞の治療品質、被験体に投与された場合に治療利益を提供する細胞の能力を指す。特定の実施形態では、細胞の治療潜在力は、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１の発現の増加によって、測定、定量、決定、同定または検証され得る。治療潜在力には、被験体における免疫応答を阻害する細胞の能力が含まれるがこれに限定されない。
【０１１２】
用語「遺伝子」とは、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味する；遺伝子は、コード領域に先行する領域およびコード領域の後に続く領域（リーダーおよびトレーラー）、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
【０１１３】
「遺伝子発現」または「発現」とは、本明細書で使用する場合、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｎＲＮＡ）の産生における遺伝子の転写、ならびにタンパク質の産生におけるｍＲＮＡの翻訳、または転写された遺伝子の翻訳産物の相対的レベルを指す。遺伝子発現および／または遺伝子の発現のパターンは、生物学的試料、例えば、造血細胞、造血幹細胞および前駆細胞、または造血幹細胞および前駆細胞を含むがこれらに限定されない幹細胞もしくは前駆細胞を含む細胞の集団において検出され得る。
【０１１４】
「発現ベクター」は、宿主細胞における特定の核酸の転写を可能にする一連の指定の核酸エレメントを有する、組換えによってまたは合成によって生成された核酸構築物である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスまたは核酸断片の一部であり得る。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結した、転写される核酸を含む。
【０１１５】
用語「ＰＤ−Ｌ１」とは、ＣＤ２７４遺伝子によってコードされる４０ｋＤａの１型膜貫通タンパク質である、プログラム死−リガンド１を指す。ＰＤ−Ｌ１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞および骨髄系細胞上で見出されるその受容体ＰＤ−１に結合する。ＰＤ−Ｌ１は、「ＣＤ２７４」、「Ｂ７ホモログ１」および「Ｂ７−Ｈ１」としても公知である。
【０１１６】
「ＩＤＯ−１」とは、必須アミノ酸トリプトファン（ＴＲＰ）の酸化的異化を触媒し、キヌレニン（ＫＹＮ）経路代謝物を産生する４６ｋＤＡの酵素、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼを指す。
【０１１７】
用語「モジュレートする」または「モジュレーション」とは、本明細書で使用する場合、細胞の生理学的状態における変化、または細胞の特性を改変もしくは変更することを指す。例えば、所望の標的遺伝子、例えばＰＤ−Ｌ１および／もしくはＩＤＯ−１の発現を増加させること、または細胞からの免疫応答を増加もしくは減少させること。
ＩＩ．細胞モジュレーション
【０１１８】
本発明は、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）およびインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ−１）の発現レベルが増加した細胞の免疫調節特性を介して免疫系をモジュレートするための組成物および方法を提供する。本発明は一般に、細胞におけるＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現の増加を達成するために、外因性薬剤で細胞をモジュレートするための方法および組成物に関する。本発明はまた、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１の発現が増加した細胞、ならびに免疫学的障害および炎症の処置を含む治療適用においてかかる細胞を使用する方法に関する。
【０１１９】
本発明の一部の態様は、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現の増加を達成するために細胞をモジュレートするための条件に関する。一部の実施形態では、かかる条件は、細胞を、この細胞においてＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現を増加させることが可能な１種または複数種の外因性薬剤と接触させるステップを含む。一実施形態では、この細胞は、少なくとも２種または少なくとも３種の外因性薬剤と接触させられる。
【０１２０】
かかる接触は、例えば、細胞においてＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現を増加させることが可能な１種または複数種の外因性薬剤の存在下で細胞をインキュベートすることによって起こり得る。細胞を接触させるための条件は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、例えば、標準的な培養条件下などに、存在し得る。
【０１２１】
本発明の別の一態様は、細胞が、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現を増加させることが可能な１種または複数種の薬剤と接触させられる間の期間に関する。一部の実施形態では、細胞は、約５分間〜約９６時間の間の時間にわたって、１種または複数種の薬剤と接触させられる。他の実施形態では、細胞は、約１時間、約２時間、約３時間、約５時間、約１０時間、約２４時間、約４８時間、約９６時間、またはこれらの具体的に言及された時間に介在する任意の期間にわたって、１種または複数種の薬剤と接触させられる。一実施形態では、細胞は、約４時間〜約４８時間にわたって接触させられる。本発明の一部の態様では、細胞は、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現を増加させることが可能な１種または複数種の薬剤の存在下で拡大増殖される。本発明の別の態様は、細胞が少なくとも１種の外因性薬剤でモジュレートされる温度に関する。したがって、細胞は、細胞においてＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１の発現の増加を生じさせる任意の温度でモジュレートされ得る。本発明の一部の非限定的な実施形態では、細胞は、約４℃〜約３７℃の間の温度でモジュレートされる。一実施形態では、細胞は、約３７℃でモジュレートされる。
【０１２２】
本発明の一態様は、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現を増加させることが可能な１種または複数種の薬剤でモジュレートされることから生じる、細胞におけるＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現の量的増加に関する。かかる増加は、処理前の細胞よりも、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１５０％、約２００％またはそれ超であり得ることが企図される。特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１の発現が増加した細胞は、対照細胞と比較して、モジュレートされた細胞において、少なくとも２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０または８０倍もしくはそれ超、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現を増加させるのに十分な条件下でモジュレートされている。かかる増加は、遺伝子発現の増加またはタンパク質発現の増加に関し得る。
【０１２３】
試料中の遺伝子発現のレベルを決定するための適切な方法には、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号）、リガーゼ連鎖反応（Barany、Proc. Natl. Acad. Sci. USA８８巻：１８９〜９３頁、１９９１年）、自己持続配列複製（self-sustained sequence replication）（Guatelliら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA８７巻：１８７４〜７８頁、１９９０年）、転写増幅系（Kwohら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA８６巻：１１７３〜７７頁、１９８９年）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Lizardiら、Bio/Technology６巻：１１９７頁、１９８８年）、ローリングサークル複製（米国特許第５，８５４，０３３号）、または任意の他の核酸増幅法による核酸増幅と、その後の、当業者に周知の技術を使用した、増幅された分子の検出とが含まれるがこれらに限定されない。
【０１２４】
本明細書で使用する場合、用語「十分な条件」または「十分な条件下」とは、対照、ビヒクルまたは非処理細胞と比較して、驚くべきおよび予測しないレベルまで、細胞におけるＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現を増加させるために、１種または複数種の薬剤で細胞を処理するための条件を指す。条件には、細胞を処理するために使用される薬剤および薬剤（複数可）の濃度、細胞が薬剤（複数可）に曝露される時間、ならびに処理の温度が含まれるがこれらに限定されない。
Ａ．モジュレート剤
【０１２５】
本発明の一態様は、ＰＤ−Ｌ１発現増加のために細胞をモジュレートするために使用される薬剤に関する。かかる薬剤には、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、小分子、またはそれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。細胞をモジュレートするための小分子には、グルココルチコイドおよび／またはプロスタグランジン経路アゴニスト  抗新生物薬、ドーパミン受容体アゴニストならびに他の薬剤が含まれるがこれらに限定されない。
【０１２６】
ｉ．ペプチド
ａ．インターフェロン受容体アゴニスト
【０１２７】
本発明の一部の態様では、細胞は、１種または複数種のインターフェロン受容体アゴニストと接触させることによってモジュレートされる。本発明での使用に適切なインターフェロン受容体アゴニストには、受容体に結合し、受容体を介したシグナル伝達を引き起こす、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型インターフェロン受容体の任意の天然に存在するまたは天然に存在しないリガンドが含まれるがこれらに限定されない。かかるインターフェロン受容体アゴニストには、天然に存在するインターフェロン、改変インターフェロン、合成インターフェロン、ペグ化インターフェロン、インターフェロンおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質、シャッフルされたインターフェロンを含むインターフェロン、インターフェロン受容体に対して特異的な抗体（単数または複数）、非ペプチド化学物質アゴニストなどが含まれる。
【０１２８】
本発明の一部の態様では、このインターフェロン受容体アゴニストは、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−γ、またはそれらの組合せからなる群から選択されるインターフェロンを含む。本発明の非限定的な一実施形態では、細胞は、ＩＦＮ−βでモジュレートされる。本発明の非限定的な別の実施形態では、細胞は、ＩＦＮ−γでモジュレートされる。さらに別の実施形態では、細胞は、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γでモジュレートされる。
ｂ．ペプチドをコードするポリヌクレオチド
【０１２９】
本発明の一部の態様では、細胞は、ポリ（Ｉ：Ｃ）を含むポリヌクレオチドでモジュレートされる。ポリイノシン・ポリシチジン酸としても公知のポリ（Ｉ：Ｃ）は、ポリリボイノシン酸（polyriboinosinic acid）（ポリＩ）の鎖およびポリリボシチジン酸（polyribocytidylicacid）（ポリＣ）の鎖からなる合成二本鎖ＲＮＡである。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、Ｂ細胞、マクロファージおよび樹状細胞の膜において発現されるｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）と相互作用することが公知である。本発明での使用のためのポリ（Ｉ：Ｃ）の商業的供給源には、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（商標）（ＣＡＳ番号３１８５２−２９−６）；Ｔｏｃｒｉｓ（商標）（ＣＡＳ番号２４９３９−０３−５）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）（製品コード２７−４７３２−０１）、およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（商標）（ＣＡＳ番号４２４２４−５０−０）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１３０】
本発明の一部の態様では、細胞は、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現を増加させることが可能な１種または複数種のポリヌクレオチドでモジュレートされる。適切なポリヌクレオチドには、１種または複数種の機能的ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドが含まれる。適切なポリヌクレオチドには、１種または複数種の機能的ＩＤＯ−１ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドが含まれ得る。かかるポリヌクレオチドは、外因性ＰＤ−Ｌ１またはＩＤＯ−１ポリペプチドを発現するように細胞を遺伝子改変するために使用される発現カセットの一部を形成し得る。本発明での使用のためのポリヌクレオチドには、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、ウシ、ウマ、ヤギまたは非ヒト霊長類のＰＤ−Ｌ１またはＩＤＯ−１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれるがこれらに限定されない。
【０１３１】
一実施形態では、発現カセットがベクター中に含まれる。したがって、一態様では、細胞は、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現を増加させることが可能な１種または複数種のポリヌクレオチドを含むベクターでモジュレートされる。かかる目的のために使用されるベクターの例には、標的細胞において核酸の発現を指示することが可能な発現プラスミドが含まれる。他の例では、ベクターは、標的細胞をトランスフェクトすることが可能なウイルスゲノム中に核酸が取り込まれる、ウイルスベクター系である。好ましい一実施形態では、ポリヌクレオチドは、所望の標的宿主細胞において遺伝子の発現を指示し得る発現配列および制御配列に作動可能に連結し得る。したがって、標的細胞において適切な条件下で核酸の発現を達成することができる。
【０１３２】
本発明の核酸の発現において有用なウイルスベクター系には、例えば、天然に存在するまたは組換えのウイルスベクター系が含まれる。特定の適用に依存して、適切なウイルスベクターには、複製コンピテント、複製欠損および条件付き複製性のウイルスベクターが含まれる。例えば、ウイルスベクターは、ヒトまたはウシのアデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、ＨＩＶ、シンドビスウイルス、およびレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルスを含むがこれに限定されない）、センダイウイルス、ならびにＭｏＭＬＶのゲノムに由来し得る。典型的には、目的の遺伝子は、典型的にはウイルスＤＮＡが付随した遺伝子構築物のパッケージングと、その後の感受性宿主細胞の感染および目的の遺伝子の発現とを可能にするために、かかるベクター中に挿入される。したがって、一実施形態では、モジュレートされる細胞は、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現を増加させることが可能な１種または複数種のポリヌクレオチドを含むウイルスベクターと接触させられる。
ｉｉ．プロスタグランジン経路アゴニスト
【０１３３】
本発明の一部の態様では、細胞は、１種または複数種のプロスタグランジン経路アゴニストとの接触によって、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現を増加させるためにモジュレートされる。かかるプロスタグランジン経路アゴニストには、ｃＡＭＰアナログまたはエンハンサー、Ｇα−ｓアクチベーター、ＰＧＥ２  ＥＰ２またはＰＧＥ２  ＥＰ４受容体を選択的に結合する化合物、グルココルチコイド、およびそれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。
【０１３４】
本明細書で使用する場合、用語「プロスタグランジン経路アゴニスト」とは、ＰＧＥ２Ｒ２および／またはＰＧＥ２Ｒ４細胞シグナル伝達経路を刺激する薬剤を含む、プロスタグランジン細胞シグナル伝達経路を刺激する薬剤を指す。本発明に従って細胞をモジュレートすることにおける使用に適切なプロスタグランジン経路アゴニストの例示的な例には、ＰＧＥ２、ｄｍＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、２０−エチルＰＧＥ２、８−イソ−１６−シクロヘキシル−テトラノルＰＧＥ２およびＰＧＥ２アナログが含まれるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、ＰＧＥ２Ｒ２およびＰＧＥ２Ｒ４アゴニストならびにそれらのアナログが、特に目的とされ、一部の実施形態では、この薬剤は、ＰＧＥ２  ＥＰ２またはＰＧＥ２  ＥＰ４受容体を優先的に結合し、それらを活性化する。
【０１３５】
本明細書で使用する場合、用語「プロスタグランジンＥ２」または「ＰＧＥ２」は、限定なしに、任意の天然に存在するまたは化学合成されたＰＧＥ２分子、ならびにそれらの「アナログ」を含む。本明細書で使用する場合、用語「アナログ」は、別の化学物質、例えばＰＧＥ２と構造および機能が類似し、しばしば単一のエレメントまたは基が構造的に異なるが、親化学物質と同じ機能を保持する場合には、１よりも多い基（例えば、２、３または４つの基）の改変によって異なり得る化学的分子に関する。
【０１３６】
ＰＧＥ２「アナログ」の例示的な例には、限定なしに、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（「ｄｍＰＧＥ２」）、ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２、９−ケトフルプロステノール、５−トランスＰＧＥ２、１７−フェニル−オメガ−トリノルＰＧＥ２、ＰＧＥ２セリノールアミド、ＰＧＥ２メチルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２、８−イソ−１５−ケトＰＧＥ２、８−イソＰＧＥ２イソプロピルエステル、８−イソ−１６−シクロヘキシル−テトラノルＰＧＥ２、２０−ヒドロキシＰＧＥ２、２０−エチルＰＧＥ２、１１−デオキシＰＧＥ１、ノクロプロスト、スルプロストン、ブタプロスト、１５−ケトＰＧＥ２および１９（Ｒ）ヒドロキシＰＧＥ２が含まれる。９位がハロゲンで置換された、ＰＧＥ２と類似の構造を有するプロスタグランジンアナログ（例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２００１１１２５９６を参照のこと）、ならびに２−デカルボキシ−２−ホスフィニコ（phosphinico）プロスタグランジン誘導体、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０２４７２１４号に記載されるものもまた含まれる。
【０１３７】
限定なしにアルプロスタジルを含むＰＧＥ１アナログもまた、ＰＧＥ２Ｒ２（ＥＰ２）およびＰＧＥ２Ｒ４（ＥＰ４）細胞シグナル伝達経路を活性化するために使用され得、本発明の方法において有用な薬剤として企図される。
【０１３８】
いずれの特定の理論にも機構にも限定されないが、ＰＧＥ２Ｒ２（ＥＰ２）およびＰＧＥ２Ｒ４（ＥＰ４）細胞シグナル伝達経路の刺激／活性化は、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１の発現の増加を生じる。したがって、一実施形態では、ＰＧＥ２Ｒ２およびＰＧＥ２Ｒ４受容体に結合しこれらを刺激する「非ＰＧＥ２ベースのリガンド」（即ち、ＰＧＥ２Ｒ２／ＰＧＥ２Ｒ４アゴニスト）が、本発明の方法における使用のために企図される。非ＰＧＥ２ベースのＥＰ２受容体アゴニストの例示的な例には、ＣＡＹ１０３９９、ＯＮ０Ｏ＿８８１５Ｌｙ、ＯＮＯ−ＡＥ１−２５９、ＣＰ−５３３，５３６ならびにＷＯ２００７／０７１４５６に開示されるカルバゾールおよびフルオレンが含まれる。
【０１３９】
非ＰＧＥ２ベースのＥＰ４アゴニストの例示的な例には、ＯＮＯ−４８１９、ＡＰＳ−９９９Ｎａ、ＡＨ２３８４８、ＯＮＯ−ＡＥ１−３２９、ならびにＷＯ／２０００／０３８６６３；米国特許第６，７４７，０３７号；および米国特許第６，６１０，７１９号に開示される他の非ＰＧＥ２ベースのＥＰ４アゴニストが含まれる。
【０１４０】
本発明の一部の態様では、細胞は、ＰＧＥ２  ＥＰ４受容体に対して選択的であり、ＰＧＥ２  ＥＰ４受容体に優先的に結合する薬剤でモジュレートされる。かかる薬剤は、他の３種のＥＰ受容体、即ち、ＥＰ１、ＥＰ２およびＥＰ３のいずれかに対してよりも、ＥＰ４受容体に対して高い親和性を有する。ＰＧＥ  ＥＰ４受容体に選択的に結合する薬剤には、５−［（１Ｅ，３Ｒ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニル−ｌ−ブテン−ｌ−イル］−ｌ−［６−（２Ｈ−テトラゾール−５Ｒ−イル）ヘキシル］−２−ピロリジノン；２−［３−［（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（Ｅ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−［２−（メトキシメチル）フェニル］ペンタ−１−エニル］−５−オキソシクロペンチル］スルファニルプロピルスルファニル］酢酸；メチル４−［２−［（１Ｒ，２Ｒ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−［（Ｅ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−［３−（メトキシメチル）フェニル］ブタ−１−エニル］−５−オキソシクロペンチル］エチルスルファニル］ブタノエート；１６−（３−メトキシメチル）フェニル−ｒｏ−テトラノル−５−チアＰＧＥ；５−｛３−［（２Ｓ）−２−｛（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］ブチル｝−５−オキソピロリジン−１−イル］プロピル］チオフェン−２−カルボキシレート；［４’−［３−ブチル−５−オキソ−１−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−１，５−ジヒドロ−［１，２，４］トリアゾール−４−イルメチル］−ビフェニル−２−スルホン酸（３−メチル−チオフェン−２−カルボニル）−アミド］；および（（Ｚ）−７−｛（１Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−５−［（Ｅ）−５−（３−クロロ−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル）−３−ヒドロキシ−ペンタ−１−エニル］−４−ヒドロキシ−３，３−ジメチル−２−オキソ−シクロペンチル｝−ヘプタ−５−エン酸）、ならびにこれらの薬剤のいずれかの薬学的に許容される塩からなる群から選択される薬剤が含まれるがこれらに限定されない。
【０１４１】
特定の実施形態では、プロスタグランジン経路アゴニストは、ＰＧＥ２、１６，１６−ｄｍＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、２０−エチルＰＧＥ２または８−イソ−１６−シクロヘキシル−テトラノルＰＧＥ２を含む。
ｉｉｉ．グルココルチコイド
【０１４２】
本発明の一部の態様では、細胞は、グルココルチコイドおよび／またはグルココルチコイド受容体アゴニストとの接触によって、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現増加のためにモジュレートされる。
【０１４３】
本発明での使用に適切なグルココルチコイドおよびグルココルチコイド受容体アゴニストの例示的な例には、メドリゾン、アルクロメタゾン、ジプロピオン酸アルクロメタゾン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ベタメタゾン、安息香酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ブデソニド、シクレソニド、クロベタゾール、酪酸クロベタゾール、プロピオン酸クロベタゾール、クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチゾール、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコート、デソニド、デスオキシメタゾン（desoximetasone）、デスオキシコルトン、デスオキシメタゾン（desoxymethasone）、デキサメタゾン、ジフロラゾン、二酢酸ジフロラゾン、ジフルコルトロン、吉草酸ジフルコルトロン、ジフルオロコルトロン、ジフルプレドナート、フルクロロロン、フルクロロロンアセトニド、フルドロキシコルチド、フルメタゾン（flumetasone）、フルメタゾン（flumethasone）、ピバル酸フルメタゾン、フルニソリド、フルニソリド半水和物、フルオシノロン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオコルチン、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオロコルチゾン、フルオロメトロン、フルペロロン、フルプレドニデン、酢酸フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルチカゾン、プロピオン酸フルチカゾン、ホルモコータル、ハルシノニド、ハロメタゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、アセポン酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンブテプレート、酪酸ヒドロコルチゾン、ロテプレドノール、メプレドニゾン、６ａ−メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、アセポン酸メチルプレドニゾロン、モメタゾン、フロ酸モメタゾン、フロ酸モメタゾン一水和物、パラメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニリデン、リメキソロン、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニドおよびウロベタゾール、ならびにそれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。
【０１４４】
特定の実施形態では、グルココルチコイドは、ベタメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール、フルメタゾン、フルオシノロンアセトニド、メドリゾン、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、アルクロメタゾンまたはデキサメタゾンを含む。より特定の実施形態では、グルココルチコイドは、メドリゾンである。
ｉｖ．他の薬剤
【０１４５】
ＩＤＯ−１に関し特に興味深い他の薬剤には、抗新生物薬（例えば、ゲムシタビン、レトロゾールおよびフルダラビン）、ドーパミン受容体アンタゴニスト（例えば、フルフェナジン）、ならびにムチン酸イソメテプテン、硫酸ジヒドロストレプトマイシン、プロトリプチリン、テレンゼピン、シクロベンザプリンおよび４−アミノサリチル酸などの種々の他のものが含まれる。
Ｂ．細胞
【０１４６】
本発明の態様は、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現増加を達成するためにモジュレートされる細胞に関する。したがって、本発明は、細胞または細胞の組合せにおいてＰＤ−Ｌ１発現を増加させることが可能な１種または複数種の薬剤によるモジュレーションに応答する任意の細胞または細胞の組合せを用いて実施され得る。
【０１４７】
本発明での使用のための細胞は、それらが投与される被験体に関して、自家、同種異系、同系または異種であり得る。「自家」とは、本明細書で使用する場合、同じ被験体由来の細胞を指す。「同種異系」とは、本明細書で使用する場合、比較される細胞とは遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。「同系」とは、本明細書で使用する場合、比較される細胞と遺伝的に同一である異なる被験体の細胞を指す。「異種」とは、本明細書で使用する場合、比較される細胞とは異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態では、本発明の細胞は、同種異系である。
【０１４８】
本発明での使用のための細胞には、幹細胞、前駆細胞および分化した細胞が含まれるがこれらに限定されない。本明細書に記載される幹細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、骨髄幹細胞、臍帯幹細胞、胎盤幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、心臓幹細胞、Ｔ細胞、腎臓幹細胞、造血幹細胞および筋肉幹細胞を含み得る。これらの細胞は、組織外植片、細胞の初代培養物、クローン性細胞、または連続的に拡大増殖した細胞から得られ得る。
【０１４９】
細胞は、細胞集団中に存在し得る。細胞集団は、全血試料、例えば、臍帯全血、動員された（mobilized）末梢全血、全骨髄試料；特定のマーカー、例えばＣＤ３４＋を発現する単離された細胞；ならびに造血幹細胞および前駆細胞を含む。本発明の方法における使用のための細胞の適切な供給源には、造血起源の細胞を含む身体の臓器または組織から単離されたまたは得られた細胞が含まれるがこれらに限定されない。「単離された」とは、その元の環境から取り出された材料を意味する。例えば、細胞は、そのネイティブの状態でそれに通常付随する構成成分の一部または全てから分離される場合、単離される。例えば、「単離された細胞の集団」、「単離された細胞の供給源」または「単離された造血幹細胞」などとは、本明細書で使用する場合、それらの天然の細胞環境からの、および組織または臓器の他の構成成分との会合からの、１または複数の細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ分離を指し、例えば、それは、ｉｎ  ｖｉｖｏ物質と有意には会合しない。
【０１５０】
本明細書に記載される細胞の集団は、骨髄、臍帯血、動員された末梢血、ワルトン膠質、胎盤、胎生期血液から得られ得る、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から得られ得る。
【０１５１】
一実施形態では、本組成物および方法は、「造血細胞」、例えば、ＨＳＰＣから、骨髄系系列およびリンパ系系列の全ての細胞を含む完全に分化した血液細胞までの範囲の細胞の連続体から選択される細胞を使用し得る。したがって、一実施形態では、本発明の方法における使用のための細胞の適切な供給源には、造血起源の細胞を含む身体の臓器または組織から単離されたまたは得られた細胞が含まれるがこれらに限定されない。別の実施形態では、細胞は、ｉＰＳＣまたはｉＰＳＣの集団から得られ得、このｉＰＳＣ（複数可）は、分化して造血細胞を形成する。
【０１５２】
したがって、本明細書に記載される方法におけるモジュレーションおよび使用のための造血細胞は、骨髄から得られ得る。本明細書に記載される方法におけるモジュレーションおよび使用のための造血細胞は、臍帯血から得られ得る。本明細書に記載される方法におけるモジュレーションおよび使用のための造血細胞は、動員された末梢血から得られ得る。本明細書に記載される方法におけるモジュレーションおよび使用のための造血細胞は、ワルトン膠質から得られ得る。本明細書に記載される方法における使用のための造血細胞は、胎盤から得られ得る。本明細書に記載される方法におけるモジュレーションおよび使用のための造血細胞は、胎生期血液から得られ得る。
【０１５３】
本明細書に記載される造血細胞は、大腿骨、股関節（例えば、腸骨稜）、肋骨、胸骨、または髄を含有する任意の他の骨を含む、成体の分画されていない骨髄または分画された骨髄から得られまたは単離され得る。本明細書に記載される造血細胞は、骨髄区画から放出もしくは動員されるように細胞を誘導するサイトカイン、例えばＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）による前処置のしばしば後に、針およびシリンジを使用して股関節からの、または血液からの取り出しによって、直接得られまたは単離され得る。本明細書に記載される造血細胞の他の供給源には、臍帯血、胎盤血および動員された末梢血が含まれる。
【０１５４】
本明細書に記載される造血細胞は、造血供給源、例えば、骨髄細胞、臍帯血または動員された末梢血細胞から回収（例えば、単離）され得る。造血幹細胞および前駆細胞を「回収する（harvesting）」とは、マトリックスからの細胞の取り出しまたは分離として定義される。これは、例えば、酵素的、非酵素的、遠心分離、電気的もしくはサイズベースの方法を含む当該分野で公知のいくつかの方法を使用して、または好ましくは、培地（例えば、細胞がインキュベートされる培地）を使用して細胞をフラッシュすることによって、達成され得る。特定の実施形態では、移植に十分な量の細胞を回収することは、ドナーにおいて幹細胞および前駆細胞を動員することによって得られ得る。
【０１５５】
本発明の一部の態様では、ＨＰＳＣは、動員された末梢血から得られる。「造血幹細胞動員」とは、移植前の、白血球除去を目的とした、骨髄から末梢血循環中への幹細胞の放出を指す。造血成長因子、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または化学療法剤が、動員を刺激するために使用される場合が多い。市販の幹細胞動員薬物、例えばＭＯＺＯＢＩＬ（商標）が、被験体中への移植に十分な量のＨＰＳＣを動員するために、Ｇ−ＣＳＦと組み合わせて使用され得る。動員された末梢血は、骨髄から末梢血中への造血幹／前駆細胞（ＨＰＳＣ）のリクルートメントを促進する薬剤でドナーを処置することによって得られ得る。本発明における使用のために末梢血を動員するのに適切な薬剤および方法には、それらの開示が、それらの全体が参照によって組み込まれる以下の参考文献に開示されたものが含まれるがこれらに限定されない：Lemoliら、Haematologica、２００８年３月：９３巻：３２１〜３２４頁；Pelus、Curr Opin Hematol、２００８年７月；１５巻（４号）：２８５〜９２頁；および米国特許出願公開第２０１２／０００３１８９号。
【０１５６】
本発明の治療用組成物および方法における使用のための造血細胞は、多能性幹細胞供給源（例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および胚性幹細胞（ＥＳＣ））から得られ得る。本明細書で使用する場合、用語「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」とは、多能性状態へと再プログラムされた非多能性細胞を指す。被験体の細胞が多能性状態へと再プログラムされると、次いで、それらの細胞は、所望の細胞型、例えば、造血幹細胞または前駆細胞へと分化し得る。本明細書で使用する場合、用語「再プログラムする」とは、あまり分化していない状態へと細胞のポテンシーを増加させる方法を指す。細胞（例えば、体細胞）をｉＰＳＣへと再プログラムするのに適切な方法および材料には、それらの全内容が参照によって組み込まれる以下の文献に開示されるものが含まれるがこれらに限定されない：米国特許出願公開第２０１１／００７６６７８号、米国特許出願公開第２０１３／０１０２０７４号、米国特許出願公開第２０１０／０３１０５２５号、米国特許出願公開第２０１１／０１１０８９９号、米国特許出願公開第２００７／０２５４８８４号、米国特許出願公開第２０１２／００２８３５１号、米国特許出願公開第２０１２／０２６４２１８号、米国特許第８，９３２，８５６号、Yamanakaら、Cell、２００６年８月２５日；１２６巻（４号）：６６３〜７６頁、Zhouら、Cell Stem Cell Stem Cell、２００９年５月８日；４巻（５号）：３８１〜４頁；Wemigら、Nature、２００７年７月１９日；４４８巻（７１５１号）：３１８〜２４頁；Okitaら、Science、２００８年１１月７日；３２２巻（５９０３号）：９４９〜５３頁；Woltjenら、Nature、２００９年４月９日；４５８巻（７２３９号）：７６６〜７０頁、米国特許出願公開第２０１０／０２３３８０４号；米国特許出願公開第２０１２／０２６４２１８号；米国特許第７，５９２，１７７号；米国特許第７，９５１，５９２号；米国特許第８，０７１，３６９号；米国特許第８，３０９，５５５号；および米国特許第８，９０６，６７７号。
【０１５７】
本明細書に記載される造血細胞は、当該分野で周知の技術を使用して精製され得る。例えば、本明細書に記載されるヒト造血細胞（例えば、ＨＳＰＣ）は、当該分野で理解され、例えば、参照によって本明細書に完全に組み込まれる米国特許出願第１３／２５７，２９０号（米国特許出願公開第２０１２０２０２２８８号）中で例証されるように、ＦＡＣＳまたはフローサイトメトリーを使用して精製され得る。本発明での使用のためのＨＳＰＣは、クローン性細胞株にも由来し得る。
【０１５８】
臍帯血、骨髄、末梢血または他の供給源のいずれから得られたものであれ、本明細書に記載される造血細胞は、所望に応じて血清ありまたはなしの、任意の適切な市販の培地またはカスタム定義の培地中で成長、処理または拡大増殖され得る（例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるHartshornら、Cell Technology for Cell Products、２２１〜２２４頁、R. Smith編；Springer Netherlands、２００７年を参照のこと）。例えば、ある特定の実施形態では、無血清培地は、無血清培地中での例えばＣＤ３４＋細胞の成長および拡大増殖に有用であり得る、アルブミンおよび／またはトランスフェリンを利用し得る。サイトカインには、とりわけ、Ｆｌｔ−３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびＩＬ−６などが含まれ得るがこれらに限定されない。造血細胞（例えば、ＨＳＰＣ）は、バイオリアクターなどの容器中で成長させられ得る（例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるLiuら、Journal of Biotechnology １２４巻：５９２〜６０１頁、２００６年を参照のこと）。ＨＳＰＣのｅｘ−ｖｉｖｏ拡大増殖に適切な培地は、ＨＳＰＣ支持細胞、例えば、間質細胞（例えば、リンパ細網間質細胞）を含み得る。間質細胞は、例えば、リンパ系組織の脱凝集から得ることができる。間質細胞は、ＨＳＰＣならびにそれらの子孫の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの維持、成長および分化を支持し得る。
【０１５９】
照射されたヒトに移植する場合、本明細書に記載される造血細胞（例えば、モジュレートされた造血細胞）は、赤血球（erythroid）、好中球−マクロファージ、巨核球およびリンパ系造血細胞プールを再配置させ得る。本明細書に記載されるＨＳＰＣは、特定の表現型または遺伝子型マーカーに従って同定され得る。例えば、ＨＳＰＣは、それらの小さいサイズ、系列（ｌｉｎ）マーカーの欠如、ローダミン１２３（ローダミンＤＵＬＬ、ｒｈｏｌｏとも呼ばれる）またはＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２などの生体色素による低い染色（サイドポピュレーション）によって、およびそれらの表面上の種々の抗原マーカーの存在によって同定され得、抗原マーカーの多くは、一連の表面抗原分類（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＣＤ１０５、および幹細胞因子の受容体ｃ−ｋｉｔ）に属する。一部の態様では、ＨＳＰＣは、ＣＤ３４＋細胞である。本明細書に記載されるＨＳＰＣは、系列にコミットしたことを検出するために典型的に使用されるマーカーについて陰性であるとみなされ得、したがって、Ｌｉｎ（−）細胞と呼ばれる場合が多い。ほとんどのヒトＨＳＰＣ（例えば、ｈＨＳＰＣ）は、ＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８１０１−、Ｃ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋およびＬｉｎ（−）として特徴付けられ得る。しかし、特定のＨＳＰＣはＣＤ３４−／ＣＤ３８−であるので、全ての幹細胞がこれらの組合せによってカバーされるわけではない。また、一部の研究は、最も初期の幹細胞が細胞表面上にｃ−ｋｉｔを欠如し得ることを示唆している。ＨＳＰＣについて、ＣＤ１３３は、初期マーカーを表し得る。ある特定の場合には、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣおよびＣＤ３４−ＨＳＰＣは、ＣＤ１３３＋であることが示されている。ＣＤ３４＋およびＬｉｎ（−）細胞は、造血前駆細胞もまた含み得る。
【０１６０】
本明細書に記載される細胞は、ＨＬＡ型決定され得、投与のための具体的な被験体と一致し得る、または部分的に一致し得る。あるいは、細胞は、投与のための具体的な被験体と一致しない場合がある。ＨＬＡ型とは、ヒト白血球抗原と呼ばれるタンパク質の独自のセットを指す。これらのタンパク質は、各個体の細胞上に存在し、免疫系が「自己」を「外来」から認識することを可能にする。外来と認識される細胞または組織の投与は、例えば、免疫拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含む、適合性の問題をもたらし得る。６つの主要なＨＬＡ（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡＤＰおよびＨＬＡ−ＤＱ）が存在する。各ＨＬＡ抗原は、ヒト集団において複数のアイソフォームを有し、各個体は、ヒトのゲノムの二倍体の性質に起因して、各ＨＬＡについて２つの異なるアイソフォームを有し得る。したがって、完全な一致は、１２のアイソフォームのうち１２と一致する。意図したレシピエントと同じ個体または意図したレシピエントの同一の双生児から提供された細胞または組織は、完全なＨＬＡ型を有し、同系または自家と呼ばれる。民族的背景および人種を含むがこれらに限定されない特定の因子もまた、特定のＨＬＡ型と相関することが理解される。
【０１６１】
多くのメジャーＨＬＡおよびマイナーＨＬＡアイソフォームが存在し、適切な一致は、メジャーＨＬＡのサブセット、全てのメジャーＨＬＡ、一部のもしくは全てのメジャーＨＬＡおよびマイナーＨＬＡ、または免疫拒絶もしくはＧＶＨＤを緩和する当該分野で公知の任意の組合せ間での一致を含み得ることが理解される。良好なＨＬＡ型一致を構成するものについての具体的なガイドラインが、多くの因子に依存することもまた理解される。したがって、所与の個体中への移植のための所与の細胞または組織試料の適切性を評価するために、当業者によって判定がなされるべきである。
【０１６２】
ＨＬＡ型は、例えば、血清型決定などによる、または抗体ベースの方法を使用する低解像度の方法を含む、当該分野で公知の方法を使用して決定され得る。血清型決定は、ＨＬＡ型に対する抗体認識に基づく。血清型決定は、２８の異なるＨＬＡ−Ａ遺伝子、５９のＨＬＡ−Ｂ遺伝子および２１のＨＬＡ−Ｃ遺伝子間を識別し得る。血清型決定法による完全な一致は、各個体中に存在する各ＨＬＡ（Ａ、ＢおよびＣ）についての２つの対立遺伝子に関する６つのうち６つの一致である。ある特定の場合には、６つのうち５つの一致またはそれ未満が、当業者に決定されるように、良好な一致とみなされ得る。
【０１６３】
ＨＬＡ型を決定するための他の低解像度または中解像度の方法は、個体のＨＬＡアイソフォームを試験するが、個体のＨＬＡ対立遺伝子の実際の配列の決定には依存しない。しばしば、ドナーは、試料を受けている個体に関係し、かかる場合には、単独または他の低解像度もしくは中解像度の方法と組み合わせた血清型決定が、試料が投与に適切かどうかを決定するために十分であり得る。ドナーがレシピエントに関係しない場合、ＨＬＡ型は、６つのうち５つまたはそれより低い一致であり得る。かかる場合には、より良いＨＬＡ型一致を見出すために時間および努力を費やすよりも、むしろより低い一致を有する細胞または組織を使用することが有用であり得る。
【０１６４】
高解像度の方法には、ＨＬＡ遺伝子または遺伝子発現産物（タンパク質またはＲＮＡ）の具体的な配列を試験することが関与する。高解像度の方法は、数千の異なるアイソフォーム間を識別し得る。ＨＳＰＣおよび増強ＨＳＰＣのＨＬＡ型決定は、例えば、低解像度／スプリット抗原レベルで、６つのＨＬＡ遺伝子座、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲについて実施され得る。
【０１６５】
ＤＮＡベースの試験方法が、ＨＬＡ−ＤＲ型決定のために利用され得る。ＤＮＡベースの試験は、ＨＬＡ−Ａおよび−Ｂのために使用され得る。被験体、家族の型決定のため、および潜在的な無関係のドナーのＨＬＡ型を確認するための移植センターのガイドラインは、ＤＲＢＩについて対立遺伝子レベルの解像度で、ならびにＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂについて低解像度／スプリット抗原レベルで、主にＤＮＡベースの試験方法を使用して、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲ遺伝子座を型決定することを含む。被験体および選択されたドナーの型決定は、ＨＬＡの同一性を保証するために、新鮮な組織試料を用いて、同じセットの試薬、方法論および解釈基準を使用して実施され得る。ＨＬＡ試験のための品質保証および品質管理に従う。
【０１６６】
したがって、本明細書に記載される方法で使用される組成物は、ハプロタイプ決定済増強ＨＳＰＣを含み得る。増強ＨＳＰＣは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＣおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１に基づいてＨＬＡ型決定され得る。増強ＨＳＰＣは、具体的なヒト被験体とのＨＬＡ群の一致に基づいてＨＬＡ型決定され得る。ＨＬＡハプロタイプ決定済増強ＨＳＰＣは、具体的なヒト被験体との６つのうち６つのＨＬＡ一致を含み得る。ＨＬＡハプロタイプ決定済増強ＨＳＰＣは、具体的なヒト被験体との６つのうち５つのＨＬＡ一致を含み得る。ＨＬＡハプロタイプ決定済増強ＨＳＰＣは、具体的なヒト被験体との６つのうち４つのＨＬＡ一致を含み得る。ＨＬＡマッチングは、対立遺伝子または抗原、およびそれらの組合せに基づき得る。
【０１６７】
細胞の集団中の、型による細胞の百分率
【０１６８】
本明細書に記載される方法および組成物は、約０．１％〜約１％、約１％〜約３％、約３％〜約５％、約１０％〜約１５％、約１５％〜２０％、約２０％〜２５％、約２５％〜３０％、約３０％〜３５％、約３５％〜４０％、約４０％〜４５％、約４５％〜５０％、約６０％〜７０％、約７０％〜８０％、約８０％〜９０％、約９０％〜９５％または約９５％〜約１００％のＨＳＰＣである複数の細胞（例えば、細胞集団）を含み得る。細胞の集団は、約０．１％〜約１％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約１％〜約３％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約３％〜約５％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約１０％〜約１５％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約１５％〜２０％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約２０％〜２５％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約２５％〜３０％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約３０％〜３５％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約３５％〜４０％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約４０％〜４５％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約４５％〜５０％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約６０％〜７０％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約７０％〜８０％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約８０％〜９０％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約９０％〜９５％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約９５％〜約１００％のＨＳＰＣであり得る。
【０１６９】
本明細書に記載される方法および組成物は、約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のＨＳＰＣである複数の造血細胞（例えば、細胞集団）を含み得る。細胞の集団は、約１％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約５％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約１０％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約２０％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約３０％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約４０％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約５０％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約６０％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約７０％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約８０％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約８５％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約９０％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約９５％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約９６％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約９７％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約９８％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約９９％のＨＳＰＣであり得る。細胞の集団は、約１００％のＨＳＰＣであり得る。
【０１７０】
上記細胞の集団は、約０．１％〜約１％、約１％〜約３％、約３％〜約５％、約１０％〜約１５％、約１５％〜２０％、約２０％〜２５％、約２５％〜３０％、約３０％〜３５％、約３５％〜４０％、約４０％〜４５％、約４５％〜５０％、約６０％〜７０％、約７０％〜８０％、約８０％〜９０％、約９０％〜９５％または約９５％〜約１００％のＣＤ３４＋細胞を含み得る。上記細胞の集団は、約１％のＣＤ３４＋細胞を含み得る。上記細胞の集団は、約３％のＣＤ３４＋細胞を含み得る。上記細胞の集団は、約５％のＣＤ３４＋細胞を含み得る。上記細胞の集団は、約１０％のＣＤ３４＋細胞を含み得る。上記細胞の集団は、約２０％のＣＤ３４＋細胞を含み得る。上記細胞の集団は、約３０％のＣＤ３４＋細胞を含み得る。上記細胞の集団は、約４０％のＣＤ３４＋細胞を含み得る。上記細胞の集団は、約５０％のＣＤ３４＋細胞を含み得る。上記細胞の集団は、約６０％のＣＤ３４＋細胞を含み得る。上記細胞の集団は、約７０％のＣＤ３４＋細胞を含み得る。上記細胞の集団は、約８０％のＣＤ３４＋細胞を含み得る。上記細胞の集団は、約８５％のＣＤ３４＋細胞を含み得る。上記細胞の集団は、約９０％のＣＤ３４＋細胞を含み得る。上記細胞の集団は、約９５％のＣＤ３４＋細胞を含み得る。上記細胞の集団は、約９６％のＣＤ３４＋細胞を含み得る。上記細胞の集団は、約９７％のＣＤ３４＋細胞を含み得る。上記細胞の集団は、約９８％のＣＤ３４＋細胞を含み得る。上記細胞の集団は、約９９％のＣＤ３４＋細胞を含み得る。上記細胞の集団は、約１００％のＣＤ３４＋細胞を含み得る。
【０１７１】
細胞は、モジュレートされる前に、いくつかの操作を受け得る。例えば、細胞は、治療潜在力を増加させるためおよび／または細胞集団を拡大増殖させるための１種または複数種の薬剤によるモジュレーションの前またはその後で、精製、拡大増殖、分割、凍結保存または酵素消化され得る。
【０１７２】
一実施形態では、造血細胞は、他の細胞型の枯渇、または所望の細胞マーカーについての精製によって、富化または精製され得る。本明細書に記載される方法における使用のための本明細書に記載される造血細胞からは、骨髄吸引物、臍帯血または動員された末梢血（動員された白血球除去産物）に由来する成熟造血細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、赤血球細胞およびそれらのコミットした前駆物質（precursor）が枯渇され得る。成熟した、系列にコミットした細胞は、当該分野で公知の方法を使用する免疫枯渇によって枯渇され得る。例えば、免疫枯渇は、系列抗原のパネル：（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１２３またはＣＤ２３５ａ）に結合する抗体で固体基材を標識することによって実施され得る。引き続くステップが、細胞の集団をさらに精製するために実施され得る。引き続くステップは、ＣＤ３４＋抗原に結合する抗体で標識された基材を含む。かかる技術は、原始造血幹細胞および前駆細胞を単離するために使用され得る。種々の細胞供給源から造血幹細胞および前駆細胞を精製するためのキットが市販されており、特定の実施形態では、これらのキットは、本発明の方法での使用に適切である。造血幹細胞および前駆細胞を精製するための例示的な市販のキットには、Ｌｉｎｅａｇｅ（Ｌｉｎ）Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）；ＣＤ３４＋富化キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）；ＲｏｓｅｔｔａＳｅｐ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１７３】
複数の造血細胞（例えば、「細胞集団」または「集団」）は、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満の間葉系幹細胞を含み得る。複数の造血細胞は、約１０％以下の間葉系幹細胞を含み得る。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨芽細胞、筋細胞、軟骨細胞および脂肪細胞を含む系列へと容易に分化し得る複能性幹細胞である（Pittengerら、Science、２８４巻、１４３頁（１９９９年）；Haynesworthら、Bone、１３巻、６９頁（１９９２年）；Prockop、Science、２７６巻、７１頁（１９９７年））。
【０１７４】
複数の造血細胞は、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満の内皮前駆細胞を含み得る。複数の造血細胞は、約１０％未満の内皮前駆細胞を含み得る。本明細書で使用する場合、用語「内皮前駆細胞」とは、血管内皮細胞へと分化する潜在力を有する複能性または単能性細胞を指す。複数の造血細胞は、約１０％以下の間葉系幹細胞または内皮前駆細胞を含み得る。
【０１７５】
ドナーから得られた（例えば、ドナーから単離された）または他の方法で提供された複数の造血細胞は、間葉系幹細胞および／または内皮前駆細胞を実質的に含まない（例えば、約１０％未満の間葉系幹細胞および約１０％未満の内皮前駆細胞）ことができる。複数の造血細胞からは、代替的に、当該分野で公知の方法を使用して、例えば、免疫磁気選択技術、蛍光活性化セルソーティングまたはそれらの組合せを使用して、間葉系幹細胞および／または内皮前駆細胞が枯渇され得る。枯渇方法は、本明細書に記載される細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つに対して特異的な少なくとも１つの抗体を使用することをさらに含み得る。
【０１７６】
複数の造血細胞からは、ＣＤ１４細胞表面マーカーについて陽性でありＣＤ４５について陰性である内皮前駆細胞（ＣＤ１４＋／ＣＤ４５−）および／またはＶＷＦ（フォンビルブランド因子）について陽性である細胞（ＶＷＦ＋）を含む内皮前駆細胞が枯渇され得る。複数のＨＳＰＣからは、ＣＤ７３および／またはＣＤ１４０Ｂ細胞表面マーカーについて陽性である細胞（ＣＤ７３＋／ＣＤ１４０Ｂ＋）が枯渇され得る。複数の造血細胞は、細胞表面マーカーＣＤ３４について陽性である細胞を含み得、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満の、ＣＤ７３、ＣＤ１４０Ｂ、ＣＤ１４およびＶＷＦからなる群から選択される細胞表面マーカーについて陽性である細胞を含み得る。
【０１７７】
複数の造血細胞は、ＣＤ３４＋細胞を含み得、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満のＣＤ１４＋／ＣＤ４５−細胞を含み得る。複数の造血細胞は、ＣＤ３４＋細胞を含み得、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満のＶＷＦ＋細胞を含み得る。複数のＨＳＰＣは、ＣＤ３４＋細胞を含み得、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満のＣＤ１４０Ｂ＋細胞を含み得る。
【０１７８】
複数のヒト造血細胞は、ＣＤ３４＋造血細胞を含み得、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満のＣＤ１４＋／ＣＤ４５−細胞、ＶＷＦ＋細胞、ＣＤ７３＋細胞およびＣＤ１４０Ｂ＋細胞を含み得る。複数のヒト造血細胞は、細胞表面マーカーＣＤ３４について陽性であり得、ＣＤ１４、ＶＷＦ、ＣＤ７３およびＣＤ１４０Ｂからなる群からの少なくとも１つの細胞表面マーカーについて陰性であり得る。複数のヒト造血細胞は、細胞表面マーカーＣＤ３４について陽性であり得、細胞表面マーカーＣＤ１４、ＶＷＦ、ＣＤ７３およびＣＤ１４０Ｂについて陰性であり得る。
【０１７９】
本明細書に記載される造血細胞は、投与の前に拡大増殖または分割されてもされなくてもよい。造血細胞は、被験体への投与の前にｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大増殖されてもされなくてもよい。拡大増殖されていない複数のモジュレートされた造血細胞が得られ得、被験体に投与され得るが、このとき、複数のモジュレートされた造血細胞は、本明細書に記載される方法を使用して（例えば、本明細書に記載されるようにｅｘ  ｖｉｖｏで造血細胞を処理して）得る。複数のモジュレートされた造血細胞を生成するための方法は、投与の前に外因性薬剤を除去するための洗浄ステップをさらに含み得る。細胞は、（例えば、臍帯血を介して）ドナーから得られ得、本明細書に記載される細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ処理の前もしくはその後に、または被験体への投与の前のいずれの時点でも、拡大増殖することができない。したがって、拡大増殖されていない複数の造血細胞は、本明細書に記載されるようにｅｘ  ｖｉｖｏで接触させられ得、それによって、本明細書に記載される複数のモジュレートされた造血細胞を生成し、集団中の細胞の任意の実質的なｅｘ  ｖｉｖｏ細胞分裂の前に、またはｅｘ  ｖｉｖｏでの任意の実質的な細胞分裂に必要な時間の前に、被験体に投与され得る。拡大増殖されていない細胞の集団は、本明細書に記載されるようにｅｘ  ｖｉｖｏで接触させられ得、集団中の細胞の任意の実質的なｅｘ  ｖｉｖｏ有糸分裂の前に、またはｅｘ  ｖｉｖｏでの任意の実質的な有糸分裂に必要な時間の前に、被験体に投与され得る。拡大増殖されていない複数の造血細胞は、本明細書に記載されるようにｅｘ  ｖｉｖｏ処理され得、集団中の細胞の倍加時間の前に、被験体に投与され得る。拡大増殖されていない複数の造血細胞は、本明細書に記載されるようにｅｘ  ｖｉｖｏ処理され得、本明細書に記載される方法を使用する細胞の処理の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または２４時間以内に、ならびにこれらの具体的な時点に介在する任意の時間以内に、被験体に投与され得る。拡大増殖されていない複数の造血細胞は、本明細書に記載されるようにｅｘ  ｖｉｖｏで接触させられ得、細胞の処理の約２時間以内に被験体に投与され得る。さらに、拡大増殖されていない複数の造血細胞は、本明細書に記載されるようにｅｘ  ｖｉｖｏで接触させられ得、引き続いて、被験体への投与の前に、ある期間にわたって凍結保存され得る。モジュレートされた造血細胞の凍結保存は、本明細書に記載される方法を使用する細胞の処理の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または２４時間以内に、ならびにこれらの具体的な時点に介在する任意の時間以内に、行われ得る。
【０１８０】
造血細胞は、本明細書に記載される外因性薬剤（例えば、グルココルチコイド）とのｅｘ  ｖｉｖｏ接触の前に、培養されてもされなくてもよい。造血細胞が外因性薬剤とのｅｘ  ｖｉｖｏ接触の前に培養される態様では、造血細胞は、約２４時間未満、約１２時間未満、約１０時間未満、約８時間未満、約６時間未満、約４時間未満または約２時間未満培養され得る。造血細胞は、被験体への投与の前に培養されてもされなくてもよい。造血細胞が被験体への投与の前に培養される場合、造血細胞は、約２４時間未満または約１２時間未満、約１０時間未満、約８時間未満、約６時間未満、約４時間未満または約２時間未満にわたって培養され得る。造血細胞は、約２時間にわたって培養され得る。造血細胞は、約２４時間未満にわたって培養され得る。造血細胞は、約１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間または２時間未満にわたって培養され得る。造血細胞は、約２時間にわたって培養され得る。
【０１８１】
造血細胞は、本明細書に記載されるモジュレートされた造血細胞を得るための、造血細胞と外因性薬剤との接触の前に、拡大増殖されてもされなくてもよい。臍帯血、骨髄、末梢血、ワルトン膠質、胎盤血または他の供給源のいずれから得られたものであれ、造血細胞は、所望に応じて血清ありまたはなしの、任意の適切な市販の培地またはカスタム定義の培地中で成長または拡大増殖され得る（例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるHartshornら、Cell Technology for Cell Products、２２１〜２２４頁、R. Smith編；Springer Netherlands、２００７年を参照のこと）。例えば、無血清培地は、無血清培地中でのＣＤ３４＋細胞の成長および拡大増殖に有用であることが示されている、アルブミンおよび／またはトランスフェリンを利用することができる。
【０１８２】
本明細書に記載される薬剤とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させられ、引き続いて被験体に投与される造血細胞は、細胞の不均一な集団（例えば、複数の不均一な造血細胞）であり得る。複数の不均一な造血細胞には、全骨髄、臍帯血、動員された末梢血、造血幹細胞、造血前駆細胞、ならびに、例えば、顆粒球（例えば、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（erythrocyte）（例えば、網状赤血球、赤血球）、血小板（thrombocyte）（例えば、巨核芽球、血小板（platelet）産生巨核球、血小板（platelet））および単球（例えば、単球、マクロファージ）を含む、造血幹細胞および前駆細胞の子孫を含み得る。
【０１８３】
造血細胞を有するヒト臍帯血、骨髄細胞または動員された末梢血細胞を、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１を増加させる外因性薬剤と接触させることは、被験体に投与されるＨＳＰＣのｉｎ  ｖｉｖｏ免疫調節特性を増加させ得る。造血細胞を有するヒト臍帯血、骨髄細胞または動員された末梢血細胞を、約室温よりも高い温度で本明細書に記載される外因性薬剤と接触させることは、被験体に投与されるＨＳＰＣ集団のｉｎ  ｖｉｖｏ免疫調節特性を増加させ得る。造血細胞を有するヒト臍帯血、骨髄細胞または動員された末梢血細胞を、約室温よりも高い温度で約１２０分間にわたって本明細書に記載される外因性薬剤と接触させることは、被験体に投与される造血細胞集団のｉｎ  ｖｉｖｏ免疫調節特性を増加させ得る。
【０１８４】
Ｌｉｎ（−）ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの精製された集団を本明細書に記載される外因性薬剤と接触させることは、被験体に投与される造血幹細胞または前駆細胞集団のｉｎ  ｖｉｖｏ拡大増殖を増加させ得る。Ｌｉｎ（−）ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの精製された集団を、約室温よりも高い温度で本明細書に記載される外因性薬剤と接触させることは、被験体に投与される造血幹細胞または前駆細胞集団の免疫調節特性を増加させ得る。Ｌｉｎ（−）ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの精製された集団を、約室温よりも高い温度で約１２０分間にわたって本明細書に記載される外因性薬剤と接触させることは、被験体に投与される造血幹細胞または前駆細胞集団の免疫調節特性を増加させ得る。
【０１８５】
種々の実施形態では、細胞は、遺伝子改変された細胞ではない。他の実施形態では、細胞は、例えば、タンパク質コード遺伝子配列を含むレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなどのポリヌクレオチドで遺伝子改変される。一部の実施形態では、細胞は、遺伝的欠陥を修正するために遺伝子改変され、他の実施形態では、細胞は、野生型または変異体タンパク質の産生を増加または減少させるために遺伝子改変される。細胞におけるタンパク質の発現を増加させるために使用されるポリヌクレオチドは、細胞において適切な発現を指示するためのポリヌクレオチド配列、およびポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含み得る。細胞におけるタンパク質の発現を減少させるために使用されるポリヌクレオチドは、分解のための野生型ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを標的とするポリヌクレオチド配列を含み得る。一部の実施形態では、本発明に従ってモジュレートされた細胞は、精製された細胞、または細胞型の混合物を含む細胞の集団である。本発明の一部の実施形態では、造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現を増加させるためにモジュレートされる。造血幹細胞は、骨髄系系列（例えば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）およびリンパ系系列（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、ならびに当該分野で公知の他のものを含む、生物の全ての血液細胞型を生じさせる複能性幹細胞である（Fei, R.ら、米国特許第５，６３５，３８７号；McGlaveら、米国特許第５，４６０，９６４号；Simmons, P.ら、米国特許第５，６７７，１３６号；Tsukamotoら、米国特許第５，７５０，３９７号；Schwartzら、米国特許第５，７５９，７９３号；Tsukamotoら、米国特許第５，７１６，８２７号を参照のこと）。造血前駆細胞は、生物の寿命にわたって成熟血液細胞の全レパートリーを生成することが可能なコミットした造血前駆細胞を生じさせる。本発明の一部の態様では、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣは、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現増加を達成するためにモジュレートされる。
ＩＩＩ．使用の方法
【０１８６】
モジュレートされた細胞は、細胞移植、障害および疾患の処置、ならびに遺伝子治療を含む種々の臨床設定において有用であり得る。したがって、語句「それを必要とする被験体」とは、本明細書で開示される疾患または障害について処置される個体を指す。特定の実施形態では、モジュレートされた細胞は、免疫学的障害または炎症性障害を処置することにおいて用途を見出す。一部の態様では、モジュレートされた細胞は、被験体における免疫応答を阻害することによって、免疫学的障害または炎症性障害を処置する。本明細書で使用する場合、語句「免疫学的障害」には、自己免疫性障害、移植片対宿主病および移植拒絶が含まれるがこれらに限定されない。
【０１８７】
本発明のモジュレートされた細胞は、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１発現が増加した細胞の投与に応答する任意の自己免疫性障害を処置することにおいて用途を見出す。モジュレートされた細胞で処置され得る自己免疫性障害の例には、急性心筋梗塞、虚血性脳卒中、１型糖尿病、真性糖尿病、多発性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、炎症性脱髄疾患、ループス、クローン病、変形性関節症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎、皮膚炎、過敏性腸症候群、白斑、グレーブス病、橋本病、アジソン病、多発性筋炎、皮膚筋炎、重症筋無力症、自己免疫性肝炎、シェーグレン症候群、自己免疫性胃炎、硬化症、乾癬、喘息またはウェゲナー肉芽腫症が含まれるがこれらに限定されない。
【０１８８】
一実施形態では、モジュレートされた細胞は、炎症状態または障害を処置する。本明細書で使用する場合、炎症状態または障害は、炎症に基礎を有するまたは炎症の構成成分を有する状態または障害である。一部の免疫学的障害は、炎症の基礎または構成成分を有し、したがって、以下にさらに議論される炎症状態としても分類されることが認識される。本発明のモジュレートされた細胞の投与によって処置され得る炎症状態の例には、肺、関節、結合組織、眼、鼻、腸、腎臓、肝臓、皮膚、中枢神経系、内分泌系、血管系および心臓の炎症が含まれるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、本発明によって処置され得る炎症状態には、罹患組織中への白血球または他の免疫エフェクター細胞の浸潤に起因する炎症が含まれる。本発明によって処置され得る炎症状態の他の関連の例には、ウイルス、細菌、真菌および寄生生物を含むがこれらに限定されない感染因子によって引き起こされる炎症が含まれる。
【０１８９】
炎症性肺状態には、喘息、成人呼吸促迫症候群、気管支炎、肺炎症、肺線維症および嚢胞性線維症（これには、胃腸管または他の組織（複数可）がさらにまたは代替的に関与し得る）が含まれるがこれらに限定されない。炎症性関節状態には、関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、若年性関節リウマチ、変形性関節症、痛風性関節炎および他の関節炎状態が含まれる。炎症の構成成分を有する眼疾患には、ブドウ膜炎（虹彩炎を含む）、結膜炎、強膜炎、乾性角結膜炎、ならびに糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜色素変性症ならびに萎縮型および滲出型の加齢黄斑変性を含むがこれらに限定されない網膜疾患が含まれるがこれらに限定されない。炎症性腸状態には、クローン病、潰瘍性大腸炎および遠位直腸炎が含まれる。
【０１９０】
炎症性皮膚疾患には、細胞増殖と関連する状態、例えば、乾癬、湿疹および皮膚炎（例えば、湿疹性皮膚炎、アトピー性皮膚炎および脂漏性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎または刺激性接触皮膚炎、亀裂性湿疹、光アレルギー性皮膚炎、光毒性皮膚炎、植物性光線皮膚炎、放射線皮膚炎およびうっ滞性皮膚炎）が含まれるがこれらに限定されない。他の炎症性皮膚疾患には、強皮症、外傷、熱傷、水疱性障害または皮膚もしくは粘膜の虚血から生じる潰瘍およびびらん、いくつかの形態の魚鱗癬、表皮水疱症、肥厚性瘢痕、ケロイド、自然老化の皮膚変化、光老化、皮膚の機械的剪断によって引き起こされる摩擦水疱形成ならびにコルチコステロイドの外用使用から生じる皮膚萎縮が含まれるがこれらに限定されない。さらなる炎症性皮膚状態には、粘膜の炎症、例えば、口唇炎、唇のひび割れ、鼻刺激、粘膜炎ならびに外陰腟炎が含まれる。
【０１９１】
内分泌系の炎症性障害には、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、ならびに副腎皮質の急性および慢性の炎症が含まれるがこれらに限定されない。心血管系の炎症状態には、冠状動脈梗塞損傷、末梢血管疾患、心筋炎、血管炎、狭窄の血管再生、アテローム動脈硬化症、およびＩＩ型糖尿病と関連する血管疾患が含まれるがこれらに限定されない。
【０１９２】
腎臓の炎症状態には、糸球体腎炎、間質性腎炎、ループス腎炎、ウェゲナー病に対して二次的な腎炎、急性腎炎に対して二次的な急性腎不全、グッドパスチャー症候群、閉塞後症候群および尿細管虚血が含まれるがこれらに限定されない。
【０１９３】
肝臓の炎症状態には、肝炎（ウイルス感染、自己免疫性応答、薬物処置、毒素、環境因子から生じる、または原発性障害の二次的帰結として生じる）、胆道閉鎖症、原発性胆汁性肝硬変および原発性硬化性胆管炎が含まれるがこれらに限定されない。
【０１９４】
中枢神経系の炎症状態には、多発性硬化症、およびアルツハイマー病、パーキンソン病、またはＨＩＶ感染と関連する認知症などの神経変性疾患が含まれるがこれらに限定されない。
【０１９５】
他の炎症状態には、歯周疾患、慢性炎症における組織壊死、エンドトキシンショック、平滑筋増殖障害、移植片対宿主病、虚血再灌流傷害後の組織損傷、および移植手術後の組織拒絶が含まれる。
【０１９６】
本発明は、本発明のモジュレートされた細胞を含む組成物を患者に投与するステップを含む、該患者において手術後創傷治癒を含む創傷治癒と関連する炎症を処置する方法をさらに提供する。
【０１９７】
本発明のモジュレートされた細胞は、炎症の構成成分を有する任意の疾患、例えば、上に列挙した疾患を処置するために使用され得ることに留意すべきである。さらに、上に列挙した炎症状態は、網羅的ではなく、例示的であることを意味する。
【０１９８】
当業者は、さらなる炎症状態（例えば、傷害、発作（insult）、感染、遺伝性障害、または被験体の生理機能への環境中毒性物質もしくは攪乱物質に起因する、全身的または局所的な免疫不均衡または機能不全）が、本発明のモジュレートされた細胞で処置され得ることを認識する。したがって、本発明の方法は、上に列挙した疾患を含むがこれらに限定されない、炎症の構成成分を有する任意の疾患を処置するために使用され得る。
【０１９９】
一実施形態では、モジュレートされた細胞を受けている患者は、移植を受けるまたは移植を必要とすると予測されない。一態様では、モジュレートされた細胞を受けている患者は、移植を受けていない。一態様では、モジュレートされた細胞を受けている患者は、造血区画を再構築するための造血移植の候補ではない。非限定的な一実施形態では、モジュレートされた細胞は、細胞の投与の前に前処置を受けていない被験体に投与される。「前処置」とは、本明細書で使用する場合、造血幹細胞移植の前に典型的に投与される処置を伝える（convey）ことを意味する。典型的には、かかる前処置は、放射線療法または化学療法を用いて実施される。一態様では、モジュレートされた細胞は、高用量（骨髄破壊的）前処置を経験していない被験体に投与される。別の態様では、モジュレートされた細胞は、高用量前処置または強度減弱前処置のいずれも経験していない患者に投与される。さらに別の一態様では、モジュレートされた細胞は、高用量前処置、強度減弱前処置または骨髄非破壊的前処置のいずれも経験していない患者に投与される。
【０２００】
別の実施形態では、モジュレートされた細胞は、移植治療から生じる免疫学的障害、例えば、移植片対宿主病および移植拒絶などを処置することにおいても用途を見出す。したがって、モジュレートされた細胞は、骨髄移植、実質臓器移植または細胞治療（例えば、単離された幹細胞を含む任意の組成物）から生じる移植片対宿主病または移植拒絶を処置するために使用され得る。細胞治療と関連する移植には、被験体において所望のタンパク質またはポリヌクレオチドを産生するように改変された遺伝子操作された細胞の投与が含まれるがこれに限定されない。本発明の態様では、モジュレートされた細胞は、移植片対宿主病および／または移植拒絶を予防するために、移植の前にまたは移植の時点で、被験体に投与される。いずれの特定の理論にも機構にも限定されないが、移植の前にまたは移植の時点でモジュレートされた細胞で被験体を処置することは、移植物レシピエントにおける免疫学的応答を弱め、移植物の受容および生着を改善する。
【０２０１】
非限定的な一実施形態では、モジュレートされた細胞は、骨髄移植（または細胞治療）を受けた被験体に投与され、ここで、該移植は、造血生着または再構築を目的とする。かかる被験体には、がんに対する化学療法または放射線療法を受けている被験体、ならびに非悪性血液障害、特に、免疫不全（例えば、とりわけ、ＳＣＩＤ、ファンコニー貧血、重症再生不良性貧血、または先天性ヘモグロビン異常症、または代謝性蓄積症（metabolic storage disease）、例えば、ハーラー病（Hurler'sdisease）、ハンター病（Hunter's disease）、マンノース症）またはがん、特に、血液学的悪性腫瘍、例えば、急性白血病、慢性白血病（骨髄系またはリンパ系）、リンパ腫（ホジキンまたは非ホジキン）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、もしくは非血液学的がん、例えば、固形腫瘍（乳がん、卵巣がん、脳がん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、皮膚がん、肝臓がんまたは膵臓がんを含む）を患っている（例えば、それに苦しむ）被験体が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、モジュレートされた細胞はＨＳＣである、またはモジュレートされた骨髄移植物が、被験体において造血生着または再構築を提供することを目的として投与され、ここで、モジュレートされた細胞または骨髄は、移植片対宿主病もしくは移植拒絶を回避する、または移植片対宿主病もしくは移植拒絶に対してあまり感受性でなくされる。
【０２０２】
被験体は、再生不良性貧血、脊髄形成異常症、サラセミア（thalassemaia）、鎌状赤血球症またはウィスコット・アルドリッチ症候群の処置において骨髄移植または細胞治療を受けた個体もまた含む。一部の実施形態では、被験体は、別の一次処置、例えば、放射線療法、化学療法、またはジドバジン（zidovadine）、クロラムフェニカル（chloramphenical）もしくはガンシクロビル（gangciclovir）などの骨髄抑制薬物による処置の所望しない副作用または合併症の結果である障害を患っている。かかる障害には、好中球減少症、貧血、血小板減少症および免疫機能不全が含まれる。
【０２０３】
被験体へのある「量」のモジュレートされた細胞の投与とは、限定なしに被験体の処置を含む、所望の治療結果または予防結果を達成するのに「有効な量」の投与を指す。したがって、本明細書の目的のための細胞の「治療有効量」は、当該分野で公知のような考慮事項によって決定され、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の応答を惹起する細胞の能力などの因子に従って変動し得る。用語「治療有効量」は、被験体（例えば、患者）を「処置する」のに有効である量を含む。治療有効量はまた、細胞の任意の毒性作用または有害作用を治療的に有益な効果が凌ぐ量である。
【０２０４】
「予防有効量」とは、所望の予防的結果を達成するのに有効な治療潜在力を有する細胞の量を指す。必然的にではないが典型的には、疾患の初期段階の前または疾患の初期段階において被験体において予防的用量が使用される場合、予防有効量は、治療有効量未満である。
【０２０５】
被験体に投与されるモジュレートされた造血細胞の量は、例えば、部分的または単一の臍帯の血液中のＨＳＰＣの量であり得る。モジュレートされた造血細胞の量は、少なくとも２×１０６細胞、少なくとも２．５×１０６細胞、少なくとも３×１０６細胞、少なくとも４×１０６細胞、少なくとも５×１０６細胞、少なくとも１×１０７細胞、少なくとも１．５×１０７細胞、少なくとも２×１０７細胞、少なくとも２．５×１０７細胞または少なくとも３×１０７細胞であり得る。
【０２０６】
被験体に投与されるモジュレートされた造血細胞の量は、約２×１０６細胞、約３×１０６細胞、約５×１０６細胞、約７×１０６細胞、約１０×１０６細胞、約１５×１０６細胞、約１．７×１０７細胞、約２．０×１０７細胞、約２．５×１０７細胞、約３．０×１０７細胞、約５．０×１０７細胞、約１．０×１０８細胞、約３．０×１０８細胞、約５．０×１０８細胞、約１．０×１０９細胞、約３．０×１０９細胞、約５．０×１０９細胞または約１．０×１０１０細胞であり得る。
【０２０７】
被験体に投与されるモジュレートされた造血細胞の量は、例えば、約２×１０６細胞〜約２×１０１０細胞；約２×１０６細胞〜約７×１０９細胞；約２×１０６細胞〜約５×１０７細胞；約２×１０６細胞〜約３×１０７細胞；または約２×１０６細胞〜約２．５×１０７細胞であり得る。被験体に投与されるモジュレートされた造血細胞の量は、例えば、約２×１０６細胞であり得る。被験体に投与されるモジュレートされた造血細胞の量は、例えば、約５×１０６細胞であり得る。被験体に投与されるモジュレートされた造血細胞の量は、例えば、約１×１０７細胞であり得る。被験体に投与されるモジュレートされた造血細胞の量は、例えば、約５×１０７細胞であり得る。モジュレートされた造血細胞は、約２×１０８細胞未満の量で被験体に投与され得る。モジュレートされた造血細胞は、約２×１０７細胞未満の量で被験体に投与され得る。
【０２０８】
被験体に投与されるモジュレートされた造血細胞の量は、少なくとも約１×１０６細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約１．２５×１０６細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約１．５×１０６細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約１．７５×１０６細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約２×１０６細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約２．５×１０６細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約３×１０６細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約４×１０６細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約５×１０６細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約１×１０７細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約１．５×１０７細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約２×１０７細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約２．５×１０７細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約３×１０７細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約５×１０７細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約７×１０７細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約１×１０８細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約３×１０８細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約５×１０８細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約７×１０８細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約１×１０９細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約３×１０９細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約５×１０９細胞／体重１ｋｇ、少なくとも約７×１０９細胞／体重１ｋｇまたは少なくとも約３×１０１０細胞／体重１ｋｇであり得る。
【０２０９】
別の実施形態では、被験体に投与されるモジュレートされた造血細胞の量は、部分的または単一の臍帯の血液中の造血細胞の量、または約１×１０５細胞〜約２×１０８細胞；約１．０×１０６細胞〜約２×１０７細胞；約２×１０６細胞〜約１×１０７細胞、約２×１０６細胞〜約７×１０６細胞、約２×１０６細胞〜約５×１０６細胞もしくは約２×１０６細胞〜約３×１０６細胞である。
【０２１０】
本発明のモジュレートされた細胞は、被験体に１または複数回投与され得る。例えば、本発明の方法は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くの投与を企図する。一実施形態では、反復投与は、自己免疫性障害の１または複数の症状が減少するまで、持続し得る。別の実施形態では、反復投与は、症状の特定のレベルを維持するために、被験体の寿命にわたって持続し得る。
【０２１１】
一実施形態では、投与は、毎週２回〜６カ月毎に１回の範囲の間隔であり得る。例えば、投与は、２週間毎、３週間毎、４週間毎、毎月、隔月、３カ月毎、４カ月毎または６カ月毎であり得る。一実施形態では、モジュレートされた細胞の投与間の間隔は、２週間毎である。一実施形態では、モジュレートされた細胞の投与間の間隔は、６週間毎である。
【０２１２】
一実施形態では、患者には、初回間隔での初回用量で、初回治療サイクルまたは処方された治療レジメンが投与され得、その後、維持用量および維持間隔による別の治療サイクルが投与され得る。一実施形態では、初回用量は、維持用量よりも高い用量である。あるいは、初回用量は、潜在的な副作用が観察される場合、維持用量より低くてもよい。さらに、一実施形態では、維持間隔は、例えば、「ブースター」投与を用い、治療サイクルにおける初回間隔より長くてもよい。別の実施形態では、維持間隔は、初回間隔より短くてもよい。
【０２１３】
本明細書に記載される方法において使用されるモジュレートされた細胞を投与するのに適切な方法には、血管内投与、例えば、静脈内投与および動脈内投与の方法を含むがこれらに限定されない非経口投与が含まれる。本発明の細胞を投与するためのさらなる例示的な方法には、筋内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹腔内、経気管、皮下（真皮下）、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内および胸骨内注射ならびに注入が含まれる。
【０２１４】
一実施形態では、モジュレートされた細胞は、局所投与される。別の実施形態では、モジュレートされた細胞は、全身投与される。
【０２１５】
一実施形態では、投与経路は、造血移植のために使用される経路ではない。例えば、造血移植は、一般に、全身静脈内注入である。したがって、局所投与または非静脈内投与は、造血移植のために使用される経路ではない。
【０２１６】
治療的利点は、本組成物を含む組合せレジメンを介して実現され得る。当業者は、本明細書に記載されるモジュレートされた細胞が、免疫調節疾患または炎症状態の処置のための組合せ治療アプローチの一部として投与され得ることを理解する。例えば、ＰＤ−Ｌ１および／またはＩＤＯ−１の発現レベルが増加した、本モジュレートされた造血細胞は、第２の活性薬剤と組み合わされ得る。組合せ治療では、それぞれの薬剤は、同時に、または任意の順序で逐次、投与され得る。逐次投与される場合、構成成分は同じ経路によって投与されることが好ましい場合がある。
【０２１７】
あるいは、構成成分は、組合せ生成物として、単一の投薬単位で一緒に製剤化され得る。本発明の組成物と組み合わせて使用され得る適切な薬剤は、当業者に公知である。
【０２１８】
ある特定の実施形態では、本発明は、ａ）本発明のモジュレートされた造血細胞の集団を含む１または複数の単一の投薬形態；ｂ）組合せ治療における使用のための第２の活性薬剤の１または複数の単一の投薬形態、ならびにｃ）本発明のモジュレートされた造血細胞の集団および第２の活性薬剤の投与のための指示、を含むキットを提供する。
【０２１９】
一態様では、本発明は、ａ）本発明のモジュレートされた造血細胞の集団を含む医薬製剤（例えば、１または複数の単一の投薬形態）；およびｂ）例えば、上で議論した障害または状態、例えば炎症性疾患を処置または予防するための医薬製剤の投与のための指示、を含むキットを提供する。
【０２２０】
本発明の特定の実施形態は、以下の実施例によって、ここでより完全に記載される。しかし、本発明は、多くの異なる形態で具体化され得、本明細書に示される実施形態に限定されると解釈すべきではない；むしろ、これらの実施形態は、本開示が、徹底的かつ完全になるように、および当業者に対して本発明の範囲を完全に伝えるように、提供されるものである。
【実施例】
【０２２１】
（実施例１）
ヒト幹細胞および前駆細胞におけるＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４）またはＩＤＯ−１の上昇した遺伝子発現レベル
【０２２２】
３人のドナー由来の動員された末梢血から単離されたヒトＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞を、１種または複数種の外因性薬剤と共に、３７℃で２４時間にわたり、ＳＴＥＭＳＰＡＮ（登録商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でｅｘ  ｖｉｖｏ処理した。細胞処理後、総計のｍＲＮＡレベルを、ＲＴ−ｑＰＣＲ前に、未処理細胞からの総計のｍＲＮＡレベルに対して正規化した。ＰＤ−Ｌ１またはＩＤＯ−１  ｍＲＮＡのレベルを、Ａｓｓａｙ  ｏｎ  Ｄｅｍａｎｄ  ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＰＩＣＯＰＵＲＥ（登録商標）単離されたｍＲＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から定量した。
【０２２３】
モジュレーション後のＰＤ−Ｌ１発現の結果を、表１に示す。
【表１】
2018504122.tif 000003
【０２２４】
図１は、単一の外因性薬剤（Ａ）１０μＭデキサメタゾン；（Ｂ）１０００Ｕ／ｍＬインターフェロンベータ（ＩＦＮβ）；（Ｃ）５ｎｇ／ｍＬインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）；（Ｄ）１０μｇ／ｍＬ高分子量ポリイノシン・ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））、または複数の外因性薬剤；（Ｅ）１０００Ｕ／ｍＬ  ＩＦＮβ、５ｎｇ／ｍＬ  ＩＦＮγおよび１０μｇ／ｍＬポリ（Ｉ：Ｃ）で処理した３人の個々のドナーのＣＤ３４＋細胞の平均として、ＰＤ−Ｌ１遺伝子発現レベルの結果を示す。図４は、３７℃で２４時間にわたるさらなるグルココルチコイドによるモジュレーションの結果を示す。
【０２２５】
モジュレーション後のＩＤＯ−１発現の結果を、表２に示す。
【表２】
2018504122.tif 000004
【０２２６】
図５Ａ〜Ｄは、単一の外因性薬剤（Ａ）１０００Ｕ／ｍＬインターフェロンベータ（ＩＦＮβ）；（Ｂ）５ｎｇ／ｍＬインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）；（Ｃ）１０μｇ／ｍＬ高分子量ポリイノシン・ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））、または複数の外因性薬剤；（Ｄ）１０００Ｕ／ｍＬ  ＩＦＮβ、５ｎｇ／ｍＬ  ＩＦＮγおよび１０μｇ／ｍＬポリ（Ｉ：Ｃ）で処理した３人の個々のドナーのＣＤ３４＋細胞の平均として、ＩＤＯ−１遺伝子発現レベルの結果を示す。図６は、抗新生物剤、ドーパミン受容体アンタゴニストなどを含むさらなる外因性薬剤との３７℃で２４時間にわたるインキュベーションを示す。
【０２２７】
（実施例２）
ヒト幹細胞および前駆細胞上のＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４）またはＩＤＯ−１表面タンパク質の上昇したレベル
【０２２８】
動員された末梢血から単離されたヒトＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞（ＨＳＣ）を、１種または複数種の外因性薬剤と共に、３７℃で２４時間にわたり、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３−リガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）を含むＳＴＥＭＳＰＡＮ（登録商標）無血清拡大増殖培地（ＳＦＥＭ）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でｅｘ  ｖｉｖｏ処理した。細胞処理後、ＰＤ−Ｌ１またはＩＤＯ−１細胞表面タンパク質のレベルを、抗ＣＤ３４、抗ＰＤ−Ｌ１または抗ＩＤＯ−１、および７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で細胞を染色することによって、生存ＣＤ３４＋細胞上で測定した。データを、ＦＯＲＴＥＳＳＡ（登録商標）Ｘ−２０（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で獲得し、ＦＬＯＷＪＯ（登録商標）（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して分析した。
【０２２９】
図２は、単一の外因性薬剤（Ａ）１０００Ｕ／ｍＬ  ＩＦＮβ、（Ｂ）５ｎｇ／ｍＬ  ＩＦＮγ、（Ｃ）１０μｇ／ｍＬポリ（Ｉ：Ｃ）、または複数の外因性薬剤（Ｄ）１０００Ｕ／ｍＬ  ＩＦＮβ、５ｎｇ／ｍＬ  ＩＦＮγおよび１０μｇ／ｍＬポリ（Ｉ：Ｃ）で処理した３人の個々のドナーのＣＤ３４＋細胞についての、未処理の試料と比較した、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）によるＰＤ−Ｌ１の平均変化倍率を示す。
【０２３０】
（実施例３）
Ｔ細胞増殖は、モジュレートされたＨＳＰＣの存在下で低減される。
【０２３１】
ＨＳＣを、１０００Ｕ／ｍＬ  ＩＦＮβ、５ｎｇ／ｍＬ  ＩＦＮγおよび１０μｇ／ｍＬポリＩ：Ｃを含む培地またはビヒクルを含む培地中で、２４時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、自家Ｔ細胞と１：１の比で合わせた。Ｔ細胞マイトジェンを添加し、共培養物を５日間インキュベートした。図３は、フローサイトメトリーによって測定したＴ細胞増殖を示す。
【０２３２】
（実施例４）
ＰＤ−Ｌ１発現の時間経過
【０２３３】
動員された末梢血から単離されたヒトＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞（ＨＳＣ）を、１種または複数種の外因性薬剤と共に、３７℃で６時間、２４時間または４８時間にわたり、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３−リガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）を含むＳＴＥＭＳＰＡＮ（登録商標）無血清拡大増殖培地（ＳＦＥＭ）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でｅｘ  ｖｉｖｏ処理した。細胞処理後、ＰＤ−Ｌ１細胞表面タンパク質のレベルを、抗ＣＤ３４、抗ＰＤ−Ｌ１および７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で細胞を染色することによって、生存ＣＤ３４＋細胞上で測定した。データを、ＦＯＲＴＥＳＳＡ（登録商標）Ｘ−２０（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で獲得し、ＦＬＯＷＪＯ（登録商標）（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して分析した。
【０２３４】
外因性薬剤：
１０００Ｕ／ｍＬ  ＩＦＮβ；
５ｎｇ／ｍＬ  ＩＦＮγ；
１０μｇ／ｍＬポリ（Ｉ：Ｃ）；
１０００Ｕ／ｍＬ  ＩＦＮβ＋５ｎｇ／ｍＬ  ＩＦＮγ；
５ｎｇ／ｍＬ  ＩＦＮγ＋１０μｇ／ｍＬポリ（Ｉ：Ｃ）；または
１０００Ｕ／ｍＬ  ＩＦＮβ＋５ｎｇ／ｍＬ  ＩＦＮγ＋１０μｇ／ｍＬポリ（Ｉ：Ｃ）。
【０２３５】
図７は、３人の個々のドナーのＣＤ３４＋細胞についての、未処理の試料と比較した、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）によるＰＤ−Ｌ１の平均変化倍率を示す。
【０２３６】
（実施例５）
モジュレーション後の貯蔵およびＰＤ−Ｌ１発現
【０２３７】
動員された末梢血から単離されたヒトＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞（ＨＳＣ）を、１種または複数種の外因性薬剤と共に、３７℃で２４時間にわたり、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３−リガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）を含むＳＴＥＭＳＰＡＮ（登録商標）無血清拡大増殖培地（ＳＦＥＭ）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でｅｘ  ｖｉｖｏ処理した。細胞処理後、培地／試薬を洗浄し、細胞を、ＨＢＳＳ（「即時」群のため）、ＳＦＥＭまたは適切な低温培地のいずれか中に再懸濁した。引き続いて、細胞を、測定し（「即時」）、または３７℃、４℃で２４時間にわたって配置し、または凍結保存した。２４時間後、細胞を、解凍または室温に戻し、ＰＤ−Ｌ１細胞表面タンパク質のレベルを、抗ＣＤ３４または抗ＰＤ−Ｌ１、および７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で細胞を染色することによって、生存ＣＤ３４＋細胞上で測定した。データを、ＦＯＲＴＥＳＳＡ（登録商標）Ｘ−２０（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で獲得し、ＦＬＯＷＪＯ（登録商標）（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して分析した。
【０２３８】
図８は、モジュレーション後に、種々の条件において維持した場合、モジュレートされた細胞が生存可能であり、ＰＤ−Ｌ１を発現することを実証している。したがって、モジュレートされた細胞は、モジュレーション後に貯蔵され得る。
【０２３９】
（実施例６）
一致したおよび一致していないＣＤ３４＋細胞集団における免疫抑制
【０２４０】
動員された末梢血から単離されたヒトＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞を、３７℃で６時間、２４時間および４８時間にわたり、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３−リガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）を補充したおよびＩＦＮβ＋ＩＦＮγ（ガンマ＋ベータ）またはＩＦＮβ＋ＩＦＮγ＋ポリ（Ｉ：Ｃ）（「Ｔｒｉｆｅｃｔａ」群とも呼ぶ）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でｅｘ  ｖｉｖｏ処理した。細胞処理後、ＣＤ３４細胞を洗浄し、ＣＤ３／２８ビーズ活性化Ｔ細胞と共に共培養した。５日間の共培養の完了時に、生存ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の数を、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８および７アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で細胞を染色することによって定量した。データを、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で獲得し、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して分析した。データは、ＤＭＳＯ処理したＣＤ３４条件におけるＴ細胞の数に対して正規化した、各共培養条件についてのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数における変化倍率として表される。
【０２４１】
図９Ａおよび９Ｂは、ｅｘ  ｖｉｖｏ処理されたヒト幹細胞および前駆細胞が、自家Ｔ細胞および同種Ｔ細胞の両方の増殖を抑制することを実証している。
【０２４２】
（実施例７）
ＰＤ−Ｌ１ポリヌクレオチドによるＰＤ−Ｌ１のモジュレーション、および免疫抑制
【０２４３】
動員された末梢血から単離されたヒトＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞を、３７℃で２４時間にわたり、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３−リガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、ヒトＰＤ−Ｌ１のトランスジェニック発現のためのレンチウイルスベクターで形質導入した。形質導入されたＣＤ３４＋細胞を、ＧＦＰレポーター発現を使用するフローサイトメトリーによって単離し、形質導入された（ＰＤ−Ｌ１＋）細胞または形質導入されていない（ＰＤ−Ｌ１−）細胞を、ＣＤ３／２８ビーズ活性化Ｔ細胞と共に共培養した。５日間の共培養の完了時に、生存ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の数を、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８および７アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で細胞を染色することによって定量した。データを、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で獲得し、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して分析した。データは、ＤＭＳＯ処理したＣＤ３４条件におけるＴ細胞の数に対して正規化した、各共培養条件についてのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数における変化倍率として表される。
【０２４４】
図１０は、ヒトＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞におけるＰＤ−Ｌ１の遺伝子過剰発現が、Ｔ細胞増殖の抑制を増強することを実証している。
【０２４５】
（実施例８）
ＩＤＯ１ポリヌクレオチドによるＩＤＯ−１の遺伝子過剰発現、および免疫抑制
【０２４６】
動員された末梢血から単離されたヒトＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞を、３７℃で２４時間にわたり、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３−リガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、ヒトＩＤＯ１のトランスジェニック発現のためのレンチウイルスベクターで形質導入した。形質導入されたＣＤ３４＋細胞を、ＧＦＰレポーター発現を使用するフローサイトメトリーによって単離し、これらの細胞を、ＣＤ３／２８ビーズ活性化自家Ｔ細胞または同種Ｔ細胞と共に、ＩＤＯ１阻害剤１−メチル−Ｄ−トリプトファン（１ＭＴ）の存在下または非存在下で共培養した。５日間の共培養の完了時に、生存ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の数を、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８および７アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で細胞を染色することによって定量した。データを、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で獲得し、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して分析した。データは、形質導入されていないＣＤ３４条件におけるＴ細胞の数に対して正規化した、各共培養条件についてのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数における変化倍率として表される。
【０２４７】
図１１は、ヒトＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞におけるＩＤＯ−１の遺伝子過剰発現が、Ｔ細胞増殖の抑制を増強することを実証している。
【０２４８】
（実施例９）
モジュレートされた細胞の接触非依存的効果
【０２４９】
動員された末梢血から単離されたヒトＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞を、３７℃で２４時間にわたり、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３−リガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、ヒトＩＤＯ−１のトランスジェニック発現のためのレンチウイルスベクターで形質導入した。形質導入されたＣＤ３４＋細胞を、ＧＦＰレポーター発現を使用するフローサイトメトリーによって単離し、これらの細胞を、ＣＤ３／２８ビーズ活性化自家Ｔ細胞または同種Ｔ細胞と共に、ＩＤＯ−１阻害剤１−メチル−Ｄ−トリプトファン（１ＭＴ）の存在下または非存在下で共培養した。形質導入されたＨＳＣからの培地を、１：１の容量でヒトＴ細胞の集団に添加し、インキュベートした。５日間のインキュベーションの完了時に、生存ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の数を、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８および７アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で細胞を染色することによって定量した。データを、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で獲得し、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して分析した。
【０２５０】
データは、形質導入されていないＣＤ３４条件におけるＴ細胞の数に対して正規化した、各共培養条件についてのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数における変化倍率として表される。
【０２５１】
結果：
【０２５２】
図１２に示されるように、上方調節されたＩＤＯ−１発現を実証する造血細胞のモジュレートされた集団からの培地で処理されたＴ細胞は、Ｔ細胞増殖を有意に抑制した。Ｔ細胞の抑制は、細胞のモジュレートされた集団が、接触非依存的様式でＴ細胞応答を抑制することを実証している。
【０２５３】
（実施例１０）
グルココルチコイド処理されたＣＤ３４＋細胞は、１型糖尿病のモデルにおいて、Ｔ細胞の増殖およびエフェクター機能を減少させる
【０２５４】
方法
【０２５５】
造血細胞の改変：
【０２５６】
ＣＤ３４＋細胞の集団を、３７℃で２４時間にわたって、いくつかの異なるグルココルチコイドと、ＨＳＣ培地中で接触させる。かかる接触は、Ｔ細胞共阻害タンパク質ＰＤＬ−１の発現を有意に上方調節する。ＰＤ−１／ＰＤＬ−１免疫チェックポイント経路は、自己反応性Ｔ細胞の増殖を阻害することにおいて重要な役割を果たし、これが次に、自己免疫を低減させ、自己寛容を促進する。ＣＤ３４＋細胞の集団を洗浄し、注射前にＨＢＳＳ中に再懸濁して、微量のグルココルチコイドおよび培養培地を除去した。
【０２５７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫抑制：
【０２５８】
糖尿病誘発性Ｔ細胞に対するｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトＣＤ３４＋細胞の免疫抑制潜在力を決定するために、８週齢の免疫不全ＮＳＧ−ＨＬＡ−Ａ２／ＨＨＤ変異体マウス（これは、ヒトＨＬＡクラス１重鎖および軽鎖を発現する）に、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）患者からの１０×１０６のＨＬＡ−Ａ２＋末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射する。Ｔ１Ｄ  ＰＢＭＣの養子移入の３日後、動物に、Ｈａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）培地中で２４時間成長させた健康な患者の動員された末梢血から単離された１０６のＣＤ３４＋細胞（未処理ＣＤ３４）、またはグルココルチコイドを補充したＨＳＣ培地中で２４時間成長させた１０６のＣＤ３４＋細胞（ＧＣ−ＣＤ３４）（即ち、モジュレートされた細胞）のいずれかを注射する。
【０２５９】
ＰＢＭＣの注射後の７日目および１４日目に、脾臓、骨髄および膵臓を回収する。ヒト特異的遺伝子発現プロファイリング、ならびに抗体染色された細胞調製物のフローサイトメトリー分析を使用して、これらの組織におけるヒトＣＤ３４＋およびＴ細胞の蓄積を定量する。さらに、膵臓中に存在するヒトＴ細胞の免疫表現型およびエフェクター機能を、フローサイトメトリーによって評価して、標的組織中に存在するヒトＴ細胞の分化および活性化プロファイルを特徴付ける。
【０２６０】
最後に、マウスの別々のコホートを使用して、膵臓を収集し、ランゲルハンス島の免疫蛍光分析のために調製して、β細胞インスリン産生、および炎症性浸潤の性質を決定する。上記のように、ヒト特異的遺伝子発現プロファイリングおよびフローサイトメトリー分析を使用して、これらの組織におけるヒトＣＤ３４＋およびＴ細胞の蓄積を定量する。膵臓中に存在するヒトＴ細胞の免疫表現型およびエフェクター機能を、フローサイトメトリーによって評価して、標的組織中に存在するヒトＴ細胞の分化および活性化プロファイルを特徴付ける。
【０２６１】
結果：
【０２６２】
Ｔ細胞の増殖およびエフェクター機能は、ビヒクル処理したＣＤ３４と比較して、７日目および１４日目の両方において、ＧＣ−ＣＤ３４細胞を注射したＴ１Ｄ  ＰＢＭＣ動物の膵臓において、有意に低減される。これは、ヒトＴ細胞の増殖の減少および再刺激後のＩＮＦγを分泌するそれらの能力の低減によって明らかになる。さらに、膵臓Ｔ細胞細胞傷害性のＧＣ−ＣＤ３４媒介性の低減の結果として、膵臓β細胞は、インスリン産生の増加を有する。
【０２６３】
まとめると、グルココルチコイド処理したＣＤ３４細胞は、このヒト化Ｔ１Ｄモデルにおいて、未処理のＣＤ３４細胞と比較して、Ｔ細胞媒介性の膵臓β細胞毒性のより有効な処理である。
【０２６４】
上記種々の実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わされ得る。本明細書で言及されるおよび／または出願データシート中に列挙される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は全て、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。なおさらなる実施形態を提供するために、種々の特許、出願および刊行物の概念を使用することが必要な場合、これらの実施形態の態様は改変され得る。
これらおよび他の変更が、上に詳述した記載に照らして、これらの実施形態に対してなされ得る。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、明細書および特許請求の範囲に開示された具体的実施形態に限定すると解釈すべきではなく、むしろそのような特許請求の範囲が権利付与される均等物の全範囲と共に、全ての可能な実施形態を含むと解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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