【手続補正書】
【提出日】平成26年4月2日(2014.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞生存及び増殖を促進するプロトオンコジーン又はその生物学的に活性の断片若しくはホモログを含む組み換え核酸分子と、アポトーシスを阻害するタンパク質又はその生物学的に活性の断片若しくはホモログをコードする核酸配列を含む組み換え核酸分子と、を含み、
１以上の前記プロトオンコジーン及び／又は前記プロトオンコジーンによりコードされるタンパク質は誘導可能であり、且つ前記プロトオンコジーンは１以上のＭＹＣ又はＩＣＮ−１であり、
前記コードされたタンパク質は、Ｂｃｌ−２ファミリーに属するメンバーであり、
前記条件的に不死化された成人造血幹細胞は、１以上のプロトオンコジーンの発現又は活性化の存在下で、分化多能性を維持する、条件的に不死化された成人造血幹細胞。
【請求項２】
１以上の組み換え核酸分子が、組み込みベクターに含まれる、請求項１記載の条件的に不死化された成人造血幹細胞。
【請求項３】
細胞生存及び増殖を促進するプロトオンコジーン又はその生物学的に活性の断片若しくはホモログは、１以上のＭＹＣ−ＥＲ又はＩＣＮ−１−ＥＲである、請求項１又は２記載の条件的に不死化された成人造血幹細胞。
【請求項４】
細胞生存及び増殖を促進するプロトオンコジーンによりコードされる組み換えタンパク質又はその生物学的に活性の断片若しくはホモログと、アポトーシスを阻害する組み換えタンパク質又はその生物学的に活性の断片若しくはホモログと、を含み、
前記プロトオンコジーンは１以上のＭＹＣ又はＩＣＮ−１であり、
前記タンパク質は、アポトーシスを阻害するＢｃｌ−２ファミリーに属するメンバーであり、
前記条件的に不死化された成人造血幹細胞は、プロトオンコジーンの発現活性化の存在下で、分化多能性を維持する、条件的に不死化された成人造血幹細胞。
【請求項５】
１以上の前記組み換えタンパク質は、外因的に合成されたものである、請求項４記載の条件的に不死化された造血幹細胞。
【請求項６】
１以上の前記組み換えタンパク質は、内因的に合成されたものである、請求項４記載の条件的に不死化された造血幹細胞。
【請求項７】
前記プロトオンコジーン若しくは前記プロトオンコジーンによりコードされるタンパク質又はその両方の発現、転移又は活性化が誘導される、請求項１〜６のいずれかに記載の条件的に不死化された造血幹細胞。
【請求項８】
前記細胞生存及び増殖を促進するプロトオンコジーンがＭＹＣである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の条件的に不死化された造血幹細胞。
【請求項９】
前記細胞生存及び増殖を促進するプロトオンコジーンがＭＹＣ−ＥＲである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の条件的に不死化された造血幹細胞。
【請求項１０】
前記アポトーシスを阻害するタンパク質は、前記幹細胞中でアポトーシス促進性タンパク質を阻害する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の条件的に不死化された造血幹細胞。
【請求項１１】
アポトーシスを阻害する前記タンパク質又はその生物学的に活性の断片若しくはホモログ、又はこれらをコードする核酸配列が、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１、Ｍａｄ−１、及びｈＴＥＲＴの１以上である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の条件的に不死化された造血幹細胞。
【請求項１２】
アポトーシスを阻害する前記タンパク質又はこれをコードする核酸配列がＢｃｌ−２である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の条件的に不死化された造血幹細胞。
【請求項１３】
細胞生存及び増殖を促進するプロトオンコジーン又はその生物学的に活性の断片若しくはホモログによりコードされる前記組み換えタンパク質は、Ｔａｔ融合タンパク質であるか、又は前記アポトーシスを阻害するタンパク質は、Ｔａｔ融合タンパク質であるか、又はその両方である、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の条件的に不死化された造血幹細胞。
【請求項１４】
細胞生存及び増殖を促進するプロトオンコジーン又はその生物学的に活性の断片若しくはホモログによりコードされる前記組み換えタンパク質は、Ｔａｔ−ＭＹＣであり、前記アポトーシスを阻害するタンパク質は、Ｔａｔ−Ｂｃｌ−２である、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の条件的に不死化された造血幹細胞。
【請求項１５】
細胞生存及び増殖を促進するプロトオンコジーンによりコードされる１以上のタンパク質若しくは該タンパク質をコードする組み換え核酸、又はアポトーシスを阻害する組み換えタンパク質若しくは該タンパク質をコードする組み換え核酸を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の条件的に不死化された造血幹細胞。
【請求項１６】
前記幹細胞がヒト幹細胞である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の条件的に不死化された造血幹細胞。
【請求項１７】
前記幹細胞が遺伝的に改変された幹細胞である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の条件的に不死化された造血幹細胞。
【請求項１８】
複数の請求項１〜１７のいずれかに記載の条件的に不死化された造血幹細胞と、幹細胞成長因子の組み合わせを含む培養培地と、を含む、条件的に不死化された造血幹細胞培養物。
【請求項１９】
前記幹細胞成長因子が、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ＩＬ−３、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む、請求項１８記載の条件的に不死化された造血幹細胞培養物。
【請求項２０】
前記培地は無血清培地であり、前記幹細胞成長因子は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−３、ＩＬ−６、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２）、および線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ−１）を含む、請求項１８記載の条件的に不死化された造血幹細胞培養物。
【請求項２１】
前記幹細胞成長因子の組み合わせは、ＩＬ−３、ＩＬ−６、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ３−Ｌ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２）、および線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ−１）からなる群から選択される、請求項１８記載の条件的に不死化された造血幹細胞培養物。
【請求項２２】
条件的に不死化された成人幹細胞を作製する方法であり、
ａ）細胞生存および増殖を促進するプロトオンコジーン又はその生物学的に活性の断片若しくはホモログによりコードされたタンパク質、又は該タンパク質をコードする核酸分子を、１以上の成人造血幹細胞内に送達するステップであり、前記プロトオンコジーン若しくは前記プロトオンコジーンによりコードされるタンパク質又はその両方の１以上が誘導可能であり、且つ１以上のＭＹＣ又はＩＣＮ−１であるステップと、
ｂ）前記細胞のアポトーシスを阻害するタンパク質、該タンパク質をコードする核酸分子、又は前記細胞内のプロアポトーシスタンパク質を阻害する核酸分子若しくはタンパク質を、前記１以上の成人造血幹細胞内に送達することにより、前記１以上の成人造血幹細胞のアポトーシスを阻害するステップであって、前記タンパク質は、アポトーシスを阻害するＢｃｌ−２ファミリーのメンバーであるステップと、
ｃ）条件的に不死化された成人造血幹細胞を作製するために、幹細胞成長因子の組み合わせの存在下、１以上の前記プロトオンコジーン又は前記プロトオンコジーンによりコードされるタンパク質が活性である条件下で、前記１以上の成人造血幹細胞を増殖させるステップと、
を含み、
前記条件的に不死化された成人造血幹細胞は、１以上のプロトオンコジーンの発現又は前記プロトオンコジーンによりコードされるタンパク質の活性化の存在下で、分化多能性を維持する、方法。
【請求項２３】
条件的に不死化された成人幹細胞を作製する方法であり、
ａ）細胞生存及び増殖を促進するプロトオンコジーン又はその生物学的に活性の断片若しくはホモログを含む核酸分子を、成人造血幹細胞に形質導入するステップであって、前記プロトオンコジーン若しくは前記プロトオンコジーンによりコードされるタンパク質又はその両方の１以上が誘導可能であり、且つ１以上のＭＹＣ又はＩＣＮ−１であるステップと、
ｂ）アポトーシスを阻害するタンパク質又はその生物学的に活性の断片若しくはホモログをコードする核酸配列を含む核酸分子を、成人造血幹細胞に形質導入するステップであって、前記コードされたタンパク質は、アポトーシスを阻害するＢｃｌ−２ファミリーのメンバーであるステップと、
ｃ）条件的に不死化された成人造血幹細胞を作製するために、幹細胞成長因子の組み合わせの存在下、前記プロトオンコジーンの発現若しくは前記プロトオンコジーンによりコードされるタンパク質の活性化、又はその両方がある条件下で、前記成人造血幹細胞を増殖させるステップと、
を含み、
前記条件的に不死化された成人造血幹細胞は、１以上のプロトオンコジーンの発現若しくは前記プロトオンコジーンによりコードされるタンパク質の活性化又はその両方の存在下で、分化多能性を維持する、方法。
【請求項２４】
前記（ａ）若しくは（ｂ）の核酸分子、又はその両方が組み換えベクターに含まれている、請求項２２または２３記載の方法。
【請求項２５】
前記（ａ）若しくは（ｂ）の核酸分子、又はその両方が、薬剤感受性タンパク質をコードする核酸配列を含む組み換えベクターに含まれている、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
条件的に不死化された成人造血幹細胞の製造方法であって、
ａ）細胞生存及び増殖を促進するプロトオンコジーン又はその生物学的に活性の断片若しくはホモログによりコードされる第１の組み換えタンパク質を、１以上の成人造血幹細胞に送達するステップであって、前記プロトオンコジーンが１以上のＭＹＣ又はＩＣＮ−１であるステップ；
ｂ）アポトーシスを阻害する第２の組み換えタンパク質又はその生物学的に活性の断片若しくはホモログを、１以上の成人造血幹細胞に送達するステップであって、前記タンパク質は、Ｂｃｌ−２ファミリーに属するメンバーであるステップ；および
ｃ）１以上の条件的に不死化された成人造血幹細胞を作製するために、幹細胞成長因子の組み合わせの存在下、前記第１の組み換えタンパク質及び前記第２の組み換えタンパク質が活性となる条件で、前記１以上の条件的に不死化された成人造血幹細胞を増殖させるステップ、を含み、
前記１以上の条件的に不死化された成人造血幹細胞は、第１の組み換えタンパク質の存在下で分化多能性を維持する、方法。
【請求項２７】
前記第１の組み換えタンパク質若しくは第２の組み換えタンパク質、またはその両方を前記１以上の成人造血幹細胞に送達するステップは、前記第１の組み換えタンパク質若しくは第２の組み換えタンパク質、またはその両方の存在下で、前記１以上の成人造血幹細胞を培養するステップを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の組み換えタンパク質若しくは前記第２の組み換えタンパク質、またはその両方は、外因的に合成されたものである、請求項２６または２７記載の方法。
【請求項２９】
前記増殖のステップが、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ＩＬ−３、および幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む培地で行われる、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記増殖のステップが、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−６、ＩＬ−３、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２）、および線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ−Ｉ）を含む無血清培地で行われる、請求項１、請求項９、または請求項１０に記載の方法。
【請求項３１】
更に、前記１以上の成人造血幹細胞の分化を可能にするために、前記細胞生存及び増殖を促進するタンパク質の発現、転移又は送達の１以上を停止するステップを含む、請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
更に、前記幹細胞のアポトーシスを阻害するタンパク質の発現又は送達の１以上を停止するステップを含む、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
更に、特異的な細胞型に分化を導くサイトカインの少なくとも１つの存在下で、１以上の前記成人造血幹細胞を培養するステップを含む、請求項３１又は３２記載の方法。
【請求項３４】
前記サイトカインはエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含む、請求項３３記載の方法
【請求項３５】
更に、ＳＣＦ、ＩＬ−３、又はＩＬ−６の少なくとも１つの存在下で、１以上の前記成人造血幹細胞を培養するステップを含む、請求項３１又は３２記載の方法。
【請求項３６】
遺伝子欠損の修正、遺伝子発現の沈黙、又は遺伝子の過剰発現のために、１以上の前記成人造血幹細胞を遺伝的に改変するステップを更に含む、請求項２２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記成人造血幹細胞が、低温保存された血液、プラセンタ、骨髄、又は正常患者または顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）で処置された患者の、末梢血液の１以上から得られた成人造血幹細胞である、請求項２２〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記１以上の条件的に不死化された成人造血幹細胞が、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の条件的に不死化された成人造血幹細胞の１以上である、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の方法により得られる、条件的に不死化された成人造血幹細胞又はそこから分化した細胞。
【請求項４０】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の１以上の条件的に不死化された成人造血幹細胞への前記細胞生存及び増殖を促進するタンパク質の発現、活性化又は送達の１以上を停止するステップと、
前記１以上の条件的に不死化された成人造血幹細胞とＥＰＯとを接触させることと、
を含む、赤血球細胞の調製方法。
【請求項４１】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の１以上の条件的に不死化された成人造血幹細胞への前記細胞生存及び増殖を促進するタンパク質の発現、活性化又は送達の１以上を停止するステップと、
ＳＣＦ、ＩＬ−３、又はＩＬ−６の少なくとも１つの存在下で、前記幹細胞を培養するステップと、
を含む、ＮＫ又はＮＫＴ細胞の調製方法。
【請求項４２】
請求項１〜１７及び３８のいずれか１項に記載の条件的に不死化された成人造血幹細胞又はそこから分化した細胞を含む、個人へ投与するための医薬。
【請求項４３】
請求項２２〜３７、４０及び４１のいずれか１項に記載の方法により得られる条件的に不死化された成人造血幹細胞又はそこから分化した細胞を含む、個人へ投与するための医薬。
【請求項４４】
前記条件的に不死化された成人造血幹細胞又はそこから分化した細胞が、前もって冷凍された前記細胞のストックから得られたものである、請求項４２又は４３に記載の医薬。
【請求項４５】
前記個人が、癌、免疫不全症、及び貧血症から選択される１以上の状態である、請求項４２又は４３に記載の医薬。
【請求項４６】
前記個人が、外科的処置を受けているか、免疫細胞の機能の改善を必要とするか、又は幹細胞により修正される遺伝的欠陥を有する、請求項４２又は４３に記載の医薬。
【請求項４７】
前記個人が、成人造血幹細胞又はそこから分化した細胞を必要としている、請求項４２又は４３に記載の医薬。
【請求項４８】
Ｔａｔタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン；及び
前記Ｔａｔタンパク質のタンパク質形質導入ドメインと付着し、細胞生存及び増殖を促進することが可能なＭＹＣタンパク質、
を含む、融合タンパク質。
【請求項４９】
請求項４８記載の融合タンパク質；並びに
アポトーシスを抑制するＢｃｌ−２ファミリーメンバー及びＴａｔタンパク質のタンパク質形質導入ドメインを含む融合タンパク質、
を含む組成物。
【請求項５０】
インビトロで培養された１以上の細胞の細胞増殖又は細胞生存の１以上を促進する方法であって、
前記１以上の細胞に、請求項４８記載の融合タンパク質又は請求項４９記載の組成物を提供するステップ；及び
培地中で前記１以上の細胞を培養するステップ、を含み、
前記融合タンパク質又は組成物に暴露されなかった対応する細胞と比較して、前記１以上の細胞の前記増殖又は生存の１以上が増加している、方法。
【請求項５１】
系統決定並びに／又は細胞分化及び発達を制御する化合物を同定する方法であり、
ａ）請求項１〜１７及び３８のいずれか１項に記載の条件的に不死化された成人造血幹細胞又はそこから分化した細胞を、テストする化合物と接触させるステップと、
ｂ）前記化合物の非存在下での前記幹細胞との比較において、前記（ａ）の幹細胞の、少なくとも一つの遺伝子型または表現型の特徴を検出するステップであり、と、
を含み、
前記化合物の存在下における前記特徴の差の検出により、前記化合物が前記幹細胞の前記特徴に影響することを示す、方法。