(57)【要約】  ヒトまたは動物に免疫不全ウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、１つ以上の抗原および／または免疫原をヒトまたは動物に投与することを含み、１つ以上の抗原および／または免疫原は、１つ以上の進化的に保存されたエピトープを含み、エピトープは、２つ以上の異なる免疫不全ウイルス間で保存されている方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物に免疫不全ウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、１つ以上の抗原および／または免疫原をヒトまたは動物に投与することを含み、前記１つ以上の抗原および／または免疫原は、１つ以上の進化的に保存されたエピトープを含み、前記エピトープは、２つ以上の異なる免疫不全ウイルス間で保存されている、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記エピトープは、ＨＩＶとＦＩＶとの間で保存されている、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
前記エピトープは、ＨＩＶとＳＩＶとＦＩＶとの間で保存されている、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
前記エピトープは、Ｔ細胞エピトープである、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、
前記Ｔ細胞エピトープは、１つ以上のＴ細胞応答を誘導する、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
前記Ｔ細胞応答は、細胞毒、細胞溶解素および／またはサイトカインの生成および／または放出である、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67のうちいずれかのアミノ酸配列、あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなる、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:1, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 19-23, 26, 29-37, 52, 53, 66または67のうちいずれかのアミノ酸配列を含む、またはからなる、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、
前記抗原および／または免疫原は、ペプチドまたはタンパク質であり、前記２つ以上のペプチドまたはタンパク質は、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67の１つ以上のアミノ酸配列、あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなり、前記ヒトまたは動物に投与される、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、
前記抗原および／または免疫原は、ペプチドまたはタンパク質であり、前記ペプチドまたはタンパク質は、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67のうちいずれかの２つ以上のアミノ酸配列、あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなる、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、
前記誘導された免疫応答は、ＣＴＬ関連免疫応答および／またはＴヘルパー（Ｔｈ）免疫応答である、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、
前記誘導された免疫応答は、CD4+および／またはCD8+Ｔ細胞応答の誘導を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、
ヒトは、ＨＩＶおよび／またはＦＩＶからの前記１つ以上の抗原および／または免疫原を投与される、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、
前記動物は、ネコであり、ＦＩＶおよび／またはＨＩＶからの前記１つ以上の抗原および／または免疫原が投与される、方法。
【請求項１５】
１つ以上の進化的に保存されたエピトープであって、前記エピトープは、２つ以上の異なる免疫不全ウイルス間で保存されている、エピトープ。
【請求項１６】
請求項１５に記載のエピトープであって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67のうちいずれかのアミノ酸配列、あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなる、エピトープ。
【請求項１７】
請求項１５に記載のエピトープであって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67のうち２つ以上のアミノ酸配列、あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなる、エピトープ。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれかに記載の１つ以上のペプチドを含む、多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）構造。
【請求項１９】
請求項１８に記載のＭＡＰであって、
１つ以上のペプチドは、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67の１つ以上のアミノ酸配列あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなる、ＭＡＰ。
【請求項２０】
請求項１８に記載のＭＡＰであって、
前記ＭＡＰは、１つ以上のパルミチン酸部分を含む、ＭＡＰ。
【請求項２１】
抗体またはその抗原結合断片であって、
ｉ）ＦＩＶタンパク質またはエピトープに特異的に結合し、ＨＩＶタンパク質またはエピトープには結合しない、または
ｉｉ）ＨＩＶタンパク質またはエピトープに特異的に結合し、ＦＩＶタンパク質またはエピトープには結合しない、、または
ｉｉｉ）ＦＩＶタンパク質またはエピトープに結合し、かつ対応のＨＩＶタンパク質またはエピトープにも結合する、または
ｉｖ）ＦＩＶまたはＨＩＶエピトープを含むペプチドに結合し、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67のうちいずれかのアミノ酸配列、あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなる、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２２】
請求項２１に記載の抗体であって、
前記抗体が、モノクローナル抗体である、抗体。
【請求項２３】
請求項２１に記載の抗体であって、
前記抗体は、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67の１つ以上のアミノ酸配列あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなるエピトープに特異的に結合する、抗体。
【請求項２４】
ｉ）異なる免疫不全ウイルス間で進化的に保存された１つ以上のエピトープ、および／または
ｉｉ）前記１つ以上の進化的に保存されたエピトープを含む１つ以上のポリヌクレオチド、および／または
ｉｉｉ）２つ以上の免疫不全ウイルスからの配列を含む１つ以上のポリペプチド、および／または
ｉｖ）２つ以上の免疫不全ウイルスからの配列を含む１つ以上のポリヌクレオチド、および／または
ｖ）請求項１８〜２０のいずれかに記載のＭＡＰ構造、を含む組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の組成物であって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67のうちいずれかのアミノ酸配列、あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなる、組成物。
【請求項２６】
請求項２４に記載の組成物であって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:1, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 19-23, 26, 29-37, 52, 53, 66または67のうちいずれかのアミノ酸配列を含む、またはからなる、組成物。
【請求項２７】
請求項２４に記載の組成物であって、
前記組成物は、２つ以上のペプチドを含み、前記２つ以上のペプチドは、独立して、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67のうちいずれかのアミノ酸配列、あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなる、組成物。
【請求項２８】
請求項２４に記載の組成物であって、
前記組成物は、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67のうちいずれかの２つ以上のアミノ酸配列あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなるペプチドまたはタンパク質を含む、組成物。
【請求項２９】
請求項２４に記載の組成物であって、
前記組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む、組成物。
【請求項３０】
請求項２４〜２９のいずれかに記載の組成物を含むワクチン。
【請求項３１】
請求項３０に記載のワクチンであって、前記エピトープは、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜67のうちいずれかのアミノ酸配列、あるいは明細書のいずれかの表または図面に示す配列を含む、またはからなる、ワクチン。
【請求項３２】
ウイルスに感染したヒトまたは動物において、免疫不全ウイルスの感染を強化および／または潜伏感染を活性化する方法であって、SEQ ID NO:28, 30または36のアミノ酸配列を含む、またはからなるペプチドあるいは前記ペプチドを含む組成物またはＭＡＰ構造を前記ヒトまたは動物に投与することを含む、方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、
前記ウイルスは、ＦＩＶまたはＨＩＶである、方法。
【請求項３４】
請求項１に記載の方法であって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:20, 26, 30, 35, 36, 37, 52, 53, 66または67のうちいずれかのアミノ酸配列を含む、またはからなる、方法。
【請求項３５】
請求項１５に記載のペプチドであって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:20, 26, 30, 35, 36, 37, 52, 53, 66または67のうちいずれかのアミノ酸配列を含む、またはからなる、ペプチド。
【請求項３６】
請求項１８に記載のＭＡＰであって、
前記ペプチドは、SEQ ID NOs:20, 26, 30, 35, 36, 37, 52, 53, 66または67のうちいずれかのアミノ酸配列を含む、またはからなる、ＭＡＰ。
【請求項３７】
請求項２１に記載の抗体であって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:20, 26, 30, 35, 36, 37, 52, 53, 66または67のうちいずれかのアミノ酸配列を含む、またはからなる、抗体。
【請求項３８】
請求項３０に記載のワクチンであって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:20, 26, 30, 35, 36, 37, 52, 53, 66または67のうちいずれかのアミノ酸配列を含む、またはからなる、ワクチン。
【請求項３９】
請求項１に記載の方法であって、
前記動物は、ネコである、方法。
【請求項４０】
請求項１〜１４、３４または３９のいずれかに記載の方法であって、
前記１つ以上の抗原および／または免疫原は、前記ヒトまたは動物に皮下または経皮投与される、方法。
【請求項４１】
請求項６に記載の方法であって、
前記細胞毒、細胞溶解素および／またはサイトカインは、ＩＬ２、ＩＦＮγ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、パーフォリンまたはグランザイムＡまたはＢのうち１つ以上である、方法。
【請求項４２】
請求項１〜１４、３４または３９のいずれかに記載の方法であって、
前記免疫応答は、前記免疫不全ウイルスによる感染に対する防御を与える防御免疫応答である、方法。。
【請求項４３】
請求項１〜１４、３４または３９のいずれかに記載の方法であって、
前記免疫不全ウイルスは、ＦＩＶである、方法。
【請求項４４】
請求項１〜１４、３４または３９のいずれかに記載の方法であって、
前記免疫不全ウイルスは、ＨＩＶである、方法。
【請求項４５】
請求項４２に記載の方法であって、
前記免疫不全ウイルスは、ＦＩＶである、方法。
【請求項４６】
請求項４２に記載の方法であって、
前記免疫不全ウイルスは、ＨＩＶである、方法。
【請求項４７】
請求項１〜１４または３９に記載の方法であって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:26, 30, 35または88のうちいずれかのアミノ酸配列を含む、またはからなる、方法。
【請求項４８】
請求項１〜１４、３４または３９に記載の方法であって、
前記１つ以上の抗原および／または免疫原を前記ヒトまたは動物に皮下または皮内投与することを含む、方法。
【請求項４９】
請求項１５に記載のペプチドであって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:26, 30, 35または88のうちいずれかのアミノ酸配列を含む、またはからなる、ペプチド。
【請求項５０】
請求項４９に記載の１つ以上のペプチドを含むＭＡＰ構造。
【請求項５１】
請求項２４に記載の組成物であって、
前記エピトープは、SEQ ID NOs:26, 30, 35または88のうちいずれかのアミノ酸配列を含む、またはからなる、組成物。
【請求項５２】
請求項５１に記載の組成物を含むワクチン。
【請求項５３】
２つ以上の異なる免疫不全ウイルス間で保存される１つ以上の進化的に保存されたエピトープをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５４】
請求項１５〜１７、３５または４９のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５５】
請求項５３または５４に記載のポリヌクレオチドであって、
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡから構成される、ポリヌクレオチド。
【請求項５６】
請求項５３または５４に記載のポリヌクレオチドであって、
前記ポリヌクレオチドが、ＲＮＡから構成される、ポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願を相互参照
本出願は、図表、核酸配列、アミノ酸配列または図面をはじめとする、その全内容が本明細書に組み込まれる２０１６年２月２日出願の米国仮特許出願第６２／２９０，２９７号および２０１５年９月２５日出願の米国仮特許出願第６２／２３３，０７号の優先権を主張する。
政府支援
本発明は、米国国立衛生研究所による認可番号Ｒ０１-ＡＩ６５２７６およびＲ０１−ＡＩ３０９０４で政府支援された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶ／ＡＩＤＳの大流行を根絶するために、予防に有効なＨＩＶ−１ワクチンが必要とされているが、かかるワクチンの設計には課題がある。液性および細胞性免疫応答の両方を生成するためのワクチン技術およびアプローチにおける多くの進歩にも係らず、ＨＩＶ／ＡＩＤＳに対する主要なフェーズＩＩおよびＩＩＩワクチン実験はまずまずの成功しか収めていない。タイにおけるフェーズＩＩＩ  ＲＶ１４４プライムブースト試験のささやかな成果は、ＨＩＶに対する確固たる液性および細胞性応答の重要性を再認識させるものであった。抗体関連のアプローチが、あるグループにより推進されているが、他のグループは、細胞媒介免疫をターゲットとするワクチンの開発を試みている。ＨＩＶ複製の制御にはＣＴＬが重要であることが証拠として示されているからである。フェーズＩおよびＩＩａのマルチエピトープワクチン実験は、ＨＩＶサブタイプについて保存された既知のＣＴＬエピトープからなるワクチン免疫原で既に行われているが、これまでのところ、確固とした抗ＨＩＶ  ＣＴＬ応答を誘導するには足りていない。このように、業界では、ＨＩＶに対する有効なワクチンが必要とされている。
【０００３】
飼いネコは、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ肉腫ウイルス（ＦｅＳＶ）、内在性Ｃ型コロナウイルス（ＲＤ−１１４）およびネコ巨細胞形成ウイルス（ＦｅＳＦＶ）をはじめとするいくつかのレトロウイルスによる感染の可能性がある。当然のことながら、ＦｅＬＶは、リンパ腫および骨髄性腫瘍、貧血、免疫介在性疾患、およびヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）と同様の免疫不全症候群をはじめとする様々な症状を引き起こす最も重大な病原体である。最近のＦｅＬＶ−ＡＩＤＳと呼ばれる特定複製欠損ＦｅＬＶ変異体は、免疫抑制特性に特に関連している。
【０００４】
ネコＴリンパ好性レンチウイルス（現在は、ネコ免疫不全ウイルス、ＦＩＶと呼ばれている）の発見はまず、Pedersenら（1987）により報告された。ＦＩＶの特徴は、Yamamotoら（1988a）、Yamamotoら（1988b）およびAckleyら（1990）により報告された。血清疫学的データによれば、ＦＩＶによる感染は、全世界において、飼いネコおよび野生のネコ特有であることが示されている。ＦＩＶの感染には、流産、脱毛、貧血、結膜炎、慢性鼻炎、腸炎、歯肉炎、血便、神経異常、歯周炎および脂漏性皮膚炎をはじめとする様々な症状が関連している。ＦＩＶに感染した飼いネコの免疫学的ホールマークは、ネコのCD4+抹消血液リンパ球の慢性および進行性減少、CD4:CD8細胞比の減少、および、場合によっては、CD8含有リンパ球の増加である。
【０００５】
ＦＩＶのクローニングおよび配列分析は、Olmstedら（1989a）、Olmstedら（1989b）およびTalbottら（1989）により報告されている。HosieおよびJarrett（1990）は、ＦＩＶに感染したネコの血清学応答について記載した。ＦＩＶウイルスサブタイプは、各株から取り出された交差中和抗体のレベルに基づいた免疫型に従って分類することができる（MurphyおよびKingsbury、1990）。最近、ウイルスは、ヌクレオチド配列ホモロジーに基づいた遺伝子型に従ってサブタイプに分類されている。ＨＩＶおよびＦＩＶサブタイプは、遺伝子型に基づくものであるが（Sodoraら1994、Rigbyら1993およびLouwagieら1993）、サブタイプの遺伝子型と免疫型間の相関性についてはほとんど知られていない。ＦＩＶウイルス分離は、５つのＦＩＶサブタイプ、A、B、C、DおよびEに分類されている（Kakinumaら1995、Yamamotoら2007、Yamamotoら2010）。感染分離および感染分子クローンについては、サブタイプCおよびE以外の全てのＦＩＶサブタイプについて記載がある（Sodoraら1994）。サブタイプCのＦＩＶは、元々、カナダのネコの細胞ＤＮＡから確認された（Sodoraら1994、Rigbyら1993、Kakinumaら1995）。業界で確認されているＦＩＶ株としては（株のサブタイプは括弧内）Petaluma（A）、Dixon（A）、UK8（A）、Dutch113（A）、Dutch19K（A）、UK2（A）、SwissZ2（A）、Sendai-1（A）、USCAzepy01A（A）、USCAhnky11A（A）、USCAtt-10A（A）、USCAlemy01（A）、USCAsam-01A（A）、PPR（A）、FranceWo, Netherlands, Bangston（A／B）、Aomori-1（B）、Aomori-2（B）、USILbrny03B（B）、TM2（B）、Sendai-2（B）、USCKlgri02B（B）、Yokohama（B）、USMAsboy03B（B）、USTXmtex03B（B）、USMCglwd03B（B）、CABCpbar03C（C）、CABCpbar07C（C）、CABCpady02C（C）、Shizuoka（D）、Fukuoka（D）、LP3（E）、LP20（E）およびLP24（E）が挙げられる。
【０００６】
ＨＩＶ／ＡＩＤＳに対する４回の主要フェーズのＩＩＢ−ＩＩＩワクチン実験の完了後であっても、有効なＨＩＶ−１ワクチンの市販が迫っているわけではない（Saundersら（2012））。ワクチン防御の機構（Plotkin（2008））および防御ウイルスエピトープの同一性（Motheら（2011）、Koff（2010））についての理解が限定されていることが、有効なワクチンの開発をさらに妨げている。初期の研究は、広範に、ウイルス中和抗体（ｂＮＡｂｓ）を生成することに重きを置いた抗体ベースのワクチン設計に焦点を当てた（Stamatatos（2012））。しかしながら、エンベロープ（Ｅｎｖ）免疫原を用いた２回のフェーズＩＩＩワクチン実験は失敗した（Flynnら（2005）、Pitisuttithumら（2006））。続いて、グローバルＨＩＶ−１分離に対する防御細胞仲介免疫（ＣＭＩ）を生成するＴ細胞ベースのワクチンに焦点が当てられた（Buchbinderら（2008））。有効ワクチンに対して不可欠なＣＭＩ応答には、具体的に、ＨＩＶ−１感染細胞をターゲットとする細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性が含まれる可能性が高い（Oggら（1998）、Walkerら（1988）、Belyakovら（2012））。Ｅｎｖタンパク質に排他的に存在するＮＡｂエピトープとは異なり、Ｔ細胞ベースのワクチンの開発にとって、具体的なワクチンエピトープの選択は難しい。膨大な数のＣＴＬ関連エピトープが、大半のＨＩＶタンパク質の全長に及ぶことがわかっている（ロスアラモス国立研究所（ＬＡＮＬ）データベース、hiv-web.lanl.gov/content/immunology/maps/maps.html）（Llanoら（2009））。Ｔ細胞ベースのワクチンを開発する目的は、抵抗に対する、突然変異による抗ウイルス免疫を避けるウイルスの能力に挑むことである（Liら（2011）、Leslieら（2004））。
【０００７】
gag-pr-gp41-gp120カナリアベクターワクチンによるプライミングと、Ｅｎｖ gp120によるブースティングとからなる最近のフェーズＩＩＩ試験は、液性免疫とＣＭＩの両方を誘導し、中程度の全体的有効性を与えた（Rerks-Ngarmら（2009））。しかしながら、交差サブタイプ保存ＣＴＬ関連ペプチドエピトープからなるフェーズＩおよびＩＩのワクチン実験は、最少ＣＭＩ応答を示した（Sanouら（2012a）、Hankeら（2007）、Salmon-Ceronら（2010））。従って、ＨＩＶ−１サブタイプ間で保存され、ウイルス適合性に悪影響を与えずに変位しない効能のある抗ＨＩＶＴ細胞関連エピトープの綿密な選択（Troyerら（2009）、Goulderら（2008）、Rollandら（2007））は、有効なＨＩＶ−１ワクチンにとって貴重であろう。１つの手法は、保存された変異しないＣＴＬエピトープを、必須のウイルス構造タンパク質または酵素に選択することであり、これらはまた、進化のストレスを生き延びたレンチウイルスの古い亜属に固執している（Yamamotoら（2010））。かかるアプローチは、初期の自然痘ワクチンの開発にうまく用いられた（Jenner （1798））。この戦略と共に、他のレンチウイルス種の保存エピトープの認識は、ＨＩＶ−１陽性（ＨＩＶ+）ヒト（Balla-Jhagjhoorsinghら（1999））、ＨＩＶ−２ワクチンおよびＳＩＶチャレンジ非ヒト霊長類（Walther-Jallowら（2001））およびＨＩＶ−１p24-ワクチンおよびＦＩＶチャレンジネコ（Abbottら（2011）、Colemanら（2005））からＰＢＭＣによりなされてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ウイルス酵素、逆転写酵素（ＲＴ）は、様々なサブタイプからのＨＩＶ−１タンパク質の中で最も低いエントロピー値を有することにより、最も保存されたウイルスタンパク質の一つであり（Yusimら（2002））、多くのＣＴＬ関連エピトープを含んでいる（Walkerら（1988））。ＨＩＶ−１およびＦＩＶのＲＴタンパク質はまた、それらのアミノ酸（aa）配列において最も高い同一性を共有している（Yamamotoら（2010））。ＦＩＶおよびＨＩＶ−１  ＲＴタンパク質での保存ＣＴＬ関連エピトープの同定が現在の研究でなされた。かかる研究の主な目的は、変異に対してより抵抗性があり、有効なＴ細胞ベースのＨＩＶ−１ワクチンの開発に有用な、進化的に保存されたＣＭＩエピトープを同定することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＨＩＶ、ＳＩＶまたはＦＩＶ等の免疫不全ウイルスに対する動物またはヒトに免疫応答を誘導する方法および動物に関する。一実施形態において、本発明の方法は、１つ以上の抗原および／または免疫原をヒトまたは動物に投与することを含み、抗原および／または免疫原は、免疫不全ウイルスの１つ以上の進化的に保存されたエピトープを含む。一実施形態において、エピトープは、ＨＩＶとＦＩＶとの間で保存されるものである。他の実施形態において、エピトープは、Ｔ細胞エピトープである。特定の実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）およびＴヘルパー（Ｔｈ）エピトープである。一実施形態において、本発明のエピトープは、SEQ ID NOs:1〜35の１つ以上に示されるアミノ酸配列を含む。
【００１０】
本発明はまた、免疫不全ウイルスの進化的に保存されたエピトープにも関する。一実施形態において、エピトープは、ＨＩＶとＦＩＶとの間で保存されている。他の実施形態において、エピトープは、ＨＩＶとＳＩＶとＦＩＶとの間で保存されている。一実施形態において、エピトープは、Ｔ細胞エピトープである。特定の実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）およびＴヘルパー（Ｔｈ）エピトープである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
特許または出願書類は、少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面の本特許または特許出願文献のコピーは、要望により、必要な料金を支払えば、特許庁（ＵＳＰＴＯ）により提供される。
【図１】ＭＡＰワクチン実験１に用いたＦＩＶ  ＭＡＰおよびペプチドのアミノ酸（aa）配列および名称。免疫原性のためのオーバーラッピングペプチド分析をＦＩＶ p24、逆転写酵素（RT）、リボヌクレアーゼ、インテグラーゼ（IN）およびトランスメンブランエンベロープ（TM Env）で実施して、ワクチン免疫原を同定した。一方、ＦＩＶマトリックス（MA）、ヌクレオカプシド（NC）および表面（SU）Ｅｎｖの配列類似性を評価した後、ＨＩＶ−１に対する高aa配列類似性をもつものの免疫原性を評価した。免疫原性分析を、ＨＩＶ陽性ヒト被験者およびＦＩＶワクチン接種した実験用ネコからの末梢血単核細胞（PBMC）およびＴ細胞を用いて実施した。要約すると、全てのＦＩＶ構造タンパク質およびＦＩＶ酵素を、挿入表に示すとおりに分析した。  ７つのペプチドを用いて、ＭＡＰ２、ＭＡＰ２ｖ、ＭＡＰ３、ＭＡＰ４、ＭＡＰ５、ＭＡＰ９およびＭＡＰ１１からなる７つの多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）免疫原を発現させた。ＭＡＰ２（エクストラロイシンペプチドFRT3-3およびFRT3-4）、ＭＡＰ２ｖ（ウイルス配列ペプチドFRT3-3およびFRT3-4v）、ＭＡＰ３（ペプチドFp14-3およびFp14-4）およびＭＡＰ５（ペプチドFRT7-1およびFRT7-2）は、括弧内に示す少なくとも２つのペプチドエピトープを含んでいた。ＭＡＰ４（ペプチドFp9-3）、ＭＡＰ９（ペプチドFTM8）およびＭＡＰ１１（ペプチドFMA2）は、単一ペプチドを含んでいた。ＭＡＰ２のペプチドは、追加の「Ｌ（赤のロイシン）」を有することがＭＡＰ２ｖのペプチドとは異なる。ＭＡＰ２ｖのペプチド配列は、実際のウイルス配列である。p24由来のＦＩＶペプチドおよび逆転写酵素は、それぞれ、Roffら（2015）、Sanouら（2013）に初めて記載された。  配列：GSSKEIDMAIVTLKVR（SEQ ID NO:65）; AEVKLYLKQSLSIANA（SEQ ID NO:26）; FAPARMQCRAWYLEA（SEQ ID NO:20）; KKKSGKWRLLIDFRVLNKL（SEQ ID NO:31）; KKKSGKWRLIDFRVLNKL（SEQ ID NO:30）; GRRYVWCSLPQGWVLSPLIY（SEQ ID NO:35）; LLLILCLPTLVDCIRN（SEQ ID NO:16）。
【図２Ａ】行われているＭＡＰワクチン実験Ｉのスケジュール。グループ１（n=5）（図２Ａ）は、不活性化デュアルサブタイプホールウイルスワクチン（IWV）によるシングルプライミングの後、３．７週間後にＭＡＰワクチン接種、その後、５週間の間隔でさらに２回のＭＡＰワクチン接種を受けた。グループ２（n=6）（図２Ｂ）は、５．３〜５．４週間の間隔で３回のＭＡＰワクチン接種を受けた。ワクチン接種毎に用いた個々のＭＡＰおよび括弧内のその皮下投与量／皮内投与量を、３回のＭＡＰワクチン接種のそれぞれに示してある。対照グループ３は、グループ２と同じ免疫付与スケジュールで、アジュバントとネコIL12（FeIL12）（n=3）か、PBS単体（n=3）のいずれかを受けた。グループ１スケジュールのＭＡＰ４の隣の青色矢印は、ＭＡＰ４が全ての３回のワクチン接種に含まれていたが、グループ２は、２回および３回目のワクチン接種ではＭＡＰ４ワクチン接種を受けなかったことを示している。赤色、青色および黒色のＭＡＰは、RT、p24およびMA／TMペプチドをそれぞれ含んでいる。測定した免疫学的パラメータは、ＦＩＶ  ＭＡＰ特異およびペプチド特異CD4+およびCD8+Ｔ細胞増殖（CSFE）、ＩＦＮγおよびＩＬ２の生成、細胞毒／細胞溶解素およびサイトカインmRNAsとＦＩＶ抗原ウエスタンブロット（WB）およびELISAを用いたワクチン誘導抗体の生成であった。行ったウイルス学的分析は、ウイルスセットポイントロードの分析、プロウイルスPCR（pPCR）、感染時のCD4+Ｔ細胞の減少のためのCD4／CD8Ｔ細胞カウント、およびWBを用いた感染誘導ＦＩＶ抗体をはじめとするＦＩＶウイルス分離（VI）であった。
【図２Ｂ】同上
【図３Ａ】試験３〜６週間後のＭＡＰおよびそのペプチドに対するＴ細胞増殖およびサイトカイン生成。ＭＡＰかそのペプチドにより直後に示されたin vitroでの刺激に対応するCD8+Ｔ細胞増殖（図３Ａ）、CD4+Ｔ細胞増殖（図３Ｂ）、PBMCのＩＬ２生成（図３Ｃ）およびPBMCのＩＦＮγ生成（図３Ｄ）が示されている。各バーは、単一のネコからの応答を表しており、赤色バーはプライムブーストグループ１および青色バーは、ＭＡＰワクチン接種のみのグループ２である。グループ２のネコは、（青色バーの１Ｘ）で示されるとおり、ペプチドFp9-3を含むＭＡＰ４の１回のワクチン接種を受けた。ＭＡＰ２ｖと組み合わせたＭＡＰ３およびＭＡＰ２は、３Ｘワクチン接種を受け、ＭＡＰ３、ＭＡＰ９およびＭＡＰ１１は、ＭＡＰ／ペプチド指定に示されるとおり、２Ｘワクチン接種を受けた。Ｔ細胞マイトジェンコンカナバリンＡ（ConA）を、非特異性陽性刺激剤として用いた。  グループ１および２のＭＡＰおよび対応のペプチドの大半は、３ＸのＭＡＰワクチン接種後、高CD8+Ｔ細胞増殖を誘導した。しかしながら、２Ｘのワクチン接種のみのＭＡＰは、ＭＡＰ５およびそのペプチドFRT7-1により誘導されたかなり高いCD8+Ｔ細胞増殖以外は、概して、低応答を誘導した。ＭＡＰ２ｖは、ＭＡＰ２よりもＩＦＮγおよびＩＬ２生成が服なく、良好なワクチン免疫原である。法人契約により実施された前回の従来のＦＩＶワクチン実験は、防御のない高ＩＦＮγ応答の相関性を示した（PuおよびYamamoto、個人発表）。なお、グループ１からのネコOLM（各刺激剤について５番目の赤色バー）は、ＭＡＰおよびそのペプチドに対して最大のＩＦＮγおよびＩＬ２生成を誘導し、４〜６匹のワクチン接種していない対照ネコと共にＦＩＶ感染させた最初の２匹のネコの１匹であった。  %CD4+Ｔ細胞CFSElowに対する%CD8+Ｔ細胞CFSElow比について個々のネコを評価したとき、ペプチドFp9-3は、１１１．７５という最も高いCD8／CD4応答比を誘導し、これにFRT7-1／FRT7-2（比１１）、FRT3-3／FRT3-4（比９）およびFp14-3／Fp14-4（比４．８）が続く。さらに、Fp9-3およびFRT7-1／7-2は、ＩＦＮγ応答を誘導せず、FRT3-3／FRT3-4（531 SFU／106 PBMC）に続きFp14-3／Fp14-4（96 SFU／106 PBMC）は、最大のＩＦＮγ生成を誘導した。高CD8／CD4Ｔ細胞応答比は、CD4+Ｔ細胞活性の誘導は最小、あるいは誘導せず、高いCD8+ＣＴＬを示している。活性CD4+Ｔ細胞は、ＦＩＶの細胞受容体である高レベルの活性マーカーCD134を有している（Weinberg 2002、Shimojimaら2004）。活性CD4+Ｔ細胞は、レンチウイルス複製に必要なプロウイルス組み込みを可能とする（Yamamoto2008、Levy2007）。さらに、ＩＦＮγは、in vitroおよびin vivoでのＦＩＶまたはＡＩＤＳウイルス複製を促進し得る（TanabeおよびYamamoto2001、Yamamotoら1986、Yamamoto2009）。このように、効能のある抗ＦＩＶ  CD8  ＣＴＬ、CD4+Ｔ細胞増殖の少ない、全くない、そして、最小のＩＦＮγ生成を誘導するＦＩＶペプチドは、理想的なワクチンペプチドである。ここに示し、説明したデータに基づくと、最良のワクチン免疫原は、ＭＡＰ４とペプチドFp9-3であり、これにＭＡＰ５（FRT7-1／FRT7-2）、ＭＡＰ３（Fp14-3／Fp14-4）、ＭＡＰ２ｖ（FRT3-3／FRT3-4）が続く。
【図３Ｂ】同上
【図３Ｃ】同上
【図３Ｄ】同上
【図４Ａ−１】最終ワクチン接種後３週間対６週間のＦＩＶペプチド特異免疫の比較。CD8+（図４Ａ−１および４Ａ−２）およびCD4+（図４Ｂ−１および４Ｂ−２）最終ワクチン接種後３週間のＴ細胞増殖応答（図４Ａ−１および４Ｂ−１）を、ＭＡＰ３（ペプチドFp14-3およびFp14-4）ＭＡＰ２ｖ（ペプチドFRT3-3およびFRT3-4）およびＭＡＰ５（ペプチドFRT7-1およびFRT7-2）について、最終ワクチン接種後６週間（図４Ａ−２および４Ｂ−２）のものと比較した。各バーは、図４Ａ−１の挿入箇所に示すとおり、１匹のネコからの応答を表している。プライムブーストグループ１は、赤色バー、ＭＡＰワクチン接種のみのグループ２は、青色バーである。CD8+Ｔ細胞増殖応答は、最終ワクチン接種後６週間の方が３週間より高く、CD4+Ｔ細胞増殖は、６週間より３週間の方が規模は大きいが、６週間でもレベルは低いままである。このように、先のワクチン接種は、６週間の間隔で実施すべきであり、CD8+Ｔ細胞増殖が、CD4+Ｔ細胞増殖より強固なときは、チャレンジには、最終ワクチン接種後６週間後に投与しなければならない。
【図４Ａ−２】同上
【図４Ｂ−１】同上
【図４Ｂ−２】同上
【図５】個々のＭＡＰのワクチン有効性。図４の凡例に記載された免疫原性および現在の有効性の結果に基づき、ＭＡＰ４（Fp9-3）が最良のワクチン免疫原、これにＭＡＰ５（FRT7-1／7-2）、ＭＡＰ３（Fp14-3／Fp14-4）、そしてＭＡＰ２ｖ（FRT3-3／FRT3-4）が続く。最良の４つのＭＡＰの構造を、有効性の結果の下に示す。  図５配列：FAPARMQCRAWYLEA（SEQ ID NO:20）; GRRYVWCSLPQGWVLSPLIY（SEQ ID NO:35）; AEVKLYLKQSLSIANA（SEQ ID NO:26）; KKKSGKWRLIDFRVLNKL（SEQ ID NO:30）。
【図６Ａ】図６Ａは、ＭＡＰ試験２に用いたＭＡＰを示す。図６Ａ配列：FAPARMQCRAWYLEA（SEQ ID NO:20）; GRRYVWCSLPQGWVLSPLIY（SEQ ID NO:35）; AEVKLYLKQSLSIANA（SEQ ID NO:26）; KKKSGKWRLIDFRVLNKL（SEQ ID NO:30）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ワクチンおよび対照グループのネコの分布を示す。
【図７Ａ−１】図７Ａ−１は、CD4+Ｔ細胞増殖（２回目ワクチン接種後６週間）を示す。
【図７Ｂ−１】図７Ｂ−１は、CD8+Ｔ細胞増殖（２回目ワクチン接種後６週間）を示す。
【図７Ａ−２】図７Ａ−２は、CD4+Ｔ細胞増殖（３回目ワクチン接種後３週間）を示す。
【図７Ｂ−２】図７Ｂ−２は、CD8+Ｔ細胞増殖（３回目ワクチン接種後３週間）を示す。
【図７Ａ−３】図７Ａ−３は、CD4+Ｔ細胞増殖（３回目ワクチン接種後６週間）を示す。
【図７Ｂ−３】図７Ｂ−３は、CD8+Ｔ細胞増殖（３回目ワクチン接種後３週間）を示す。
【図８Ａ−１】図８Ａ−１は、ＩＬ２生成（２回目ワクチン接種後６週間）を示す。
【図８Ｂ−１】図８Ｂ−１は、ＩＦＮγ生成（２回目ワクチン接種後６週間）を示す。
【図８Ａ−２】図８Ａ−２は、ＩＬ２生成（３回目ワクチン接種後３週間）を示す。
【図８Ｂ−２】図８Ｂ−２は、ＩＦＮγ生成（３回目ワクチン接種後３週間）を示す。
【図８Ａ−３】図８Ａ−３は、ＩＬ２生成（３回目ワクチン接種後６週間）を示す。
【図８Ｂ−３】図８Ｂ−３は、ＩＦＮγ生成（３回目ワクチン接種後６週間）を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、SQグループ-1ネコR01のmRNA発現を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、SQグループ-2ネコR01のmRNA発現を示す。
【図１０Ａ】ワクチン免疫原および予備チャレンジワクチン免疫原性。ワクチン接種に用いたＭＡＰ免疫原を、カルボキシル末端から２番目から最後のリシン残基にパルミチン酸を含有するリシン（Ｋ）分岐により結合した個々のペプチドにより示す。
【図１０Ｂ】ワクチン免疫原および予備チャレンジワクチン免疫原性。プライミング前（レーン1）、プライミング後少なくとも３週間であるがブースト前（レーン2）、チャレンジ前１週間（レーン3）および終了時（レーン4）のグループ１（SBA, OCA, OCF）およびグループ２（DVD,DVB）のネコの血清IgG免疫ブロット結果。レーン4のネコSBAの血清は、６１wpcまたはチャレンジブースト後１４週間である。陽性対照（+）の血清は、ＦＩＶ感染ネコである。
【図１０Ｃ−Ｆ】ワクチン免疫原および予備チャレンジワクチン免疫原性。CD3+CD8+Ｔ細胞増殖応答は、in vitroで、ペプチドのプールFp4, Fp14, FRT3、個々のペプチド（Pept）Fp4-3, Fp14-1, FRT3-3, FRT3-4; ＭＡＰ１ｃ, ＭＡＰ１ｂ, ＭＡＰ１, ＭＡＰ２;またはコンカナバリンA（ConA）でシミュレートした。  ワクチン免疫原および予備チャレンジワクチン免疫原性。CD3+CD4+Ｔ細胞増殖応答は、in vitroで、ペプチドのプールFp4, Fp14, FRT3、個々のペプチド（Pept）Fp4-3, Fp14-1, FRT3-3, FRT3-4; ＭＡＰ１ｃ, ＭＡＰ１ｂ, ＭＡＰ１, ＭＡＰ２;またはコンカナバリンA（ConA）でシミュレートした。  ワクチン免疫原および予備チャレンジワクチン免疫原性。ＩＦＮγ  ELISpot応答は、in vitroで、ペプチドのプールFp4, Fp14, FRT3、個々のペプチド（Pept）Fp4-3, Fp14-1, FRT3-3, FRT3-4; ＭＡＰ１ｃ, ＭＡＰ１ｂ, ＭＡＰ１, ＭＡＰ２;またはコンカナバリンA（ConA）でシミュレートした。  ワクチン免疫原および予備チャレンジワクチン免疫原性。ＩＬ２  ELISpot応答は、in vitroで、ペプチドのプールFp4, Fp14, FRT3、個々のペプチド（Pept）Fp4-3, Fp14-1, FRT3-3, FRT3-4; ＭＡＰ１ｃ, ＭＡＰ１ｂ, ＭＡＰ１, ＭＡＰ２;またはコンカナバリンA（ConA）でシミュレートした。注：図１０Ａに示さなかったＭＡＰ１cは、ペプチドFp4-3の４つのコピーを含んでいる。バーは、グループ１については青色またはライトブルー、グループ２については赤色またはピンクに色分けしてある。対応の色の各ワクチン接種したネコは、図１０Ｃに挿入してある。ライトブルーおよびピンクのバーは、部分または完全防御を示さなかったネコを表している。
【図１１Ａ】チャレンジワクチンプールと後のＦＩＶチャレンジ誘導ウイルス特異抗体および免疫。ネコ5HS（終了10 wpc）およびOLK（終了12 wpc）以外の、抗体からＦＩＶ膜貫通（TM）領域を、チャレンジ後（wpc）１４週間または終了まで（16-47 wpc）モニターした（図１１Ａ）。ＭＡＰワクチン接種グループ１（黒色線、黒符号）、ＭＡＰワクチン接種グループ２（黒点線、白符号）、1X-プライムグループ3（赤色線、黒符号）および対照グループ4（赤色破線、白符号）が示されている。ネコSBAは、47 wpcでＭＡＰ１／ＭＡＰ２ブーストを受け、チャレンジブースト後１４週でのＩＦＮγ、ＩＬ２、パーフォリン（Perf）、GrzAおよびGrzB mRNA発現について試験した（図１１Ｂ）。各レーンは、Fp4-3とＭＡＰ１c（P1）の組み合わせ、Fp14-1、FRT3-3、FRT3-4、ＭＡＰ２およびＭＡＰ１ｂ（P2）の組み合わせ、マイトジェンブドウ球菌エンテロトキシンA（SEA）（S）および媒体対照（M）で培養されたPBMCからなる。各バンドの相対デンシトメータ値を、図１１Ｃに示す対応のβ-アクチンハウスキーピング遺伝子バンドと比較する。  ペプチド抗原およびＭＡＰ免疫原によるin vitroＦＩＶ関連の直接的増加または減少を試験した（図１１Ｄ）。ＭＡＰ１およびＭＡＰ１ｂは、それぞれ、ペプチドFp4-3プラスFp14-1およびFp14-1からなる（青色バー）。ＭＡＰ２は、FRT3-3およびFRT3-4を含むオーバーラッピング配列である（赤色バー）。ＭＡＰ１プラスＭＡＰ２（ＭＡＰ１+2、茶色バー）およびＭＡＰ１ｂプラスＭＡＰ２（ＭＡＰ１ｂ＋２、黒色バー）も、ＦＩＶウイルス対照（+対照または基準線、白色バー）およびウイルス増加対照としてのマイトジェンConA対照（灰色バー）と比較する。ウイルス対照グループと、ペプチドまたはＭＡ刺激剤グループ間の大きさな差は、バーの上にp<0.05については（*）またはp<0.001については（**）で示してある。対応p値との比較は、チャートに示してある。
【図１１Ｂ】同上
【図１１Ｃ】同上
【図１１Ｄ】同上
【図１２】特定のＦＩＶタンパク質から選択した保存Ｔ細胞エピトープ。ＦＩＶリボヌクレアーゼは除き、保存Ｔ細胞エピトープは、全てのＦＩＶ構造または酵素タンパク質で検出された。構造タンパク質 Gag（緑色）は、マトリックス（MA）、カプシドp24およびヌクレオカプシド（NC）からなる。その他の構造タンパク質は、グリコシド化エンベロープタンパク質（青色）であり、表面エンベロープ（SU）およびトランスメンブランエンベロープ（TM）からなる。試験したウイルス酵素（赤色）は、プロテアーゼ（PR）、逆転写酵素（RT）、RNaseおよびインテグラーゼ（IN）である。ＭＡＰのペプチド配列は、ＭＡＰおよびペプチドコードの下に示す。なお、ＭＡＰ２は、ペプチド配列にエクストラロイシン（L）を有し、ＭＡＰ２vは、ウイルスの完全配列である。皮下（SC）および皮内（ID）免疫付与に用いるＭＡＰもまた、各ワクチン接種グループについて示してある（右下のリスト）。左下の挿入表は、試験した各ＦＩＶタンパク質に存在するアミノ酸の数を示している。
【図１３Ａ】チャレンジ前Ｔ細胞増殖応答。ＭＡＰ、個々のペプチド、不活性化ホールＦＩＶウイルス抗原（IWV）およびコンカナバリンA（ConA）によるin vitro刺激の際の、チャレンジ前の最後のワクチン接種後の各ワクチン接種ネコのCD3+CD8+Ｔ細胞増殖（図１３Ａ）およびCD3+CD4+Ｔ細胞増殖（図１３Ｂ）について分析した。ワクチン接種の数、ＭＡＰコードおよび個々のペプチドは、1x-3x ＭＡＰ４（Fp9-3）; 3x ＭＡＰ３（Fp14-3およびFp14-4）; 2x ＭＡＰ２および2x ＭＡＰ２v（FRT3-3およびFRT3-4）; 2x ＭＡＰ５（FRT7-1およびFRT7-2）; 2x ＭＡＰ9（FTM8）; および2x ＭＡＰ１1（FMA2）である。ＭＡＰ２は、エクストラロイシン（L）を有し、ＭＡＰ２vは、ウイルスの完全配列である。増殖応答は、ＦＡＣＳにより求められるカルボキシフルオセインジアセテートスクリンイミドエステル（ＣＦＳＥ）増殖とされる。赤色バーは、グループ１（n=5）からの応答を表し、青色バーは、グループ２（n=6）からの応答を表す。対応の色の各ワクチン接種ネコをパネルＡの挿入表に示す。対照グループ3からの各刺激剤に対する応答を平均した。対照グループの平均した増殖値を、グループ１および2からの各ワクチン接種ネコの増殖応答から除算した。
【図１３Ｂ】同上
【図１４Ａ】チャレンジ前のサイトカイン生成。図４の凡例に記載したとおり、最後のワクチン接種後、チャレンジ前の各ワクチン接種ネコに、ＭＡＰおよび個々のペプチドによるin vitroでの刺激の際のＩＬ２ELISpot（図１４Ａ）およびＩＦＮγELISpot（図１４Ｂ）応答について分析した。バーは、グループ１については赤色、グループ２については青色に色分けしてある。グループ１および2のネコについてのバーの結果は、50スポット形成単位（SFU）／106 PBMCの除算後のものである。グループ3からの各刺激剤に対する平均値は、<50 SFUであった。
【図１４Ｂ】同上
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、ＨＩＶ、ＳＩＶまたはＦＩＶ等の免疫不全ウイルスに対する動物またはヒトに免疫応答を与える方法および材料に関する。一実施形態において、本発明の方法は、１つ以上の抗原および／または免疫原をヒトまたは動物に投与することを含み、抗原または免疫原は、異なる免疫不全ウイルス間で進化的に保存された１つ以上のエピトープを含む。一実施形態において、エピトープは、ＨＩＶとＦＩＶとの間またはＨＩＶとＳＩＶとの間で保存されたものである。他の実施形態において、エピトープは、ＨＩＶとＳＩＶとＦＩＶとの間で保存されたものである。一実施形態において、ヒトに、抗原および／または免疫原を投与する場合、抗原または免疫原は、ＦＩＶまたはＨＩＶからであり、エピトープは、ＨＩＶとＦＩＶとの間で進化的に保存されている。一実施形態において、動物がネコの場合、抗原および／または免疫原は、ＨＩＶまたはＦＩＶからであり、エピトープは、ＨＩＶとＦＩＶとの間で進化的に保存されている。本発明の方法の一実施形態において、エピトープは、Ｔ細胞エピトープ、すなわち、Ｔ細胞により認識され、Ｔ細胞を刺激して、そのエフェクター活性を作用させるエピトープである。特定の実施形態において、エピトープは、細胞毒（例えば、グランザイムおよび／またはグラニュライシン）、細胞溶解素（例えば、パーフォリン）および／またはサイトカイン（ＩＦＮγ, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13等）の生成および／または放出等の１つ以上のＴ細胞応答を誘導する。特定の実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、多官能性Ｔ細胞エピトープおよび／またはＴヘルパー（Ｔｈ）エピトープである。本発明の抗原および免疫原は、本発明の１つ以上の進化的に保存されたエピトープを含むペプチドおよび／またはタンパク質を含む。
【００１３】
本発明の範囲において意図されるエピトープは、独立に、または可能な組み合わせ（オーバーラッピング配列を含む）によるSEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜101アミノ酸配列、本発明の実施例、図面または表に示したアミノ酸配列あるいはアミノ酸配列の免疫原性断片または変異体を含むペプチドまたはタンパク質を含む。特定の実施形態において、本発明のペプチドまたはタンパク質は、SEQ ID NOs:1, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 19-23, 26, 29-37, 52, 53および66のいずれかに示されるアミノ酸配列あるいはアミノ酸配列の免疫原性断片または変異体を含む。一実施形態において、本発明のエピトープを含む複数のペプチドおよび／またはタンパク質は、ヒトまたは動物に投与される。例えば、一実施形態において、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜101のいずれかのアミノ酸配列あるいはその免疫原性断片または変異体を含む２つ以上のペプチドまたはタンパク質が処方される。例えば、SEQ ID NO:1を含む第１のペプチドとSEQ ID NO:2を含む第２のペプチドを投与することができる。他の実施形態において、本発明の２つ以上のエピトープを含むペプチドまたはタンパク質は、ヒトまたは動物に投与される。例えば、SEQ ID NO:1 とSEQ ID NO:2aの両方のアミノ酸配列を含むペプチドまたはタンパク質を投与することができる。一実施形態において、ペプチドまたはタンパク質は、本発明の２つ以上のペプチド配列を結合する、または単一のタンパク質において２つ以上のペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを有していて、そのポリヌクレオチドを発現させてタンパク質を生成することにより、２つ以上のエピトープを含むことができる。一実施形態において、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜101のいずれかに示す２つ以上のアミノ酸配列、その免疫原性断片または変異体を含むペプチドまたはタンパク質は、ヒトまたは動物に投与される。
【００１４】
一実施形態において、本発明の方法により誘導される免疫応答は、ＣＴＬ関連免疫応答および／またはＴヘルパー細胞応答等のＴ細胞応答である。特定の実施形態において、本発明の方法により誘導される免疫応答は、CD4+および／またはCD8+Ｔ細胞応答および／またはガンマインターフェロン（ＩＦＮγ）生成を含む。一実施形態において、細胞毒（例えば、グランザイムA、グランザイムB等）、細胞溶解素（例えば、パーフォリン）および／またはサイトカイン（ＩＦＮγ, IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13等）が生成される。一実施形態において、免疫応答は、免疫不全ウイルスによる感染からヒトまたは動物を防御する防御免疫応答である。特定の実施形態において、免疫応答は、ヒトまたは動物を、ＨＩＶまたはＦＩＶによる感染から防御する。一実施形態において、抗原または免疫原を受けるヒトまたは動物は、免疫不全ウイルスに既に感染さいている。他の実施形態において、抗原または免疫原の投与前に、ヒトまたは動物は、免疫不全ウイルスに感染していない。
【００１５】
本発明はまた、免疫不全ウイルスの進化的に保存されたエピトープにも関する。一実施形態において、エピトープは、ＨＩＶとＳＩＶとの間またはＨＩＶとＦＩＶとの間で保存されたものである。他の実施形態において、エピトープは、ＨＩＶとＳＩＶとＦＩＶとの間で保存されたものである。一実施形態において、エピトープは、Ｔ細胞エピトープである。特定の実施形態において、Ｔ細胞エピトープは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープ、多官能性Ｔ細胞（多重サイトカイン、細胞毒、ケモカインおよび増殖等の機能活性を発現するCD3+CD4+およびCD3+CD8+Ｔ細胞）エピトープおよび／またはＴヘルパー（Ｔｈ）エピトープである。一実施形態において、エピトープは、マトリックス（MA）タンパク質からである。他の実施形態において、エピトープは、ウイルスインテグラーゼタンパク質からである。他の実施形態において、エピトープは、ウイルスヌクレオカプシド（NC）タンパク質からである。さらなる実施形態において、エピトープは、ウイルスプロテアーゼ（PR）タンパク質からである。さらなる実施形態において、エピトープは、膜貫通（TM）または表面（SV）エンベロープタンパク質からである。他の実施形態において、エピトープは、p24または逆転写酵素（RT）タンパク質からである。本発明の抗原および免疫原は、本発明の１つ以上の進化的に保存されたエピトープを含むペプチドおよび／またはタンパク質とすることができる。本発明の範囲において意図されるエピトープは、独立に、または可能な組み合わせによるSEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜101のいずれかのアミノ酸配列、本発明の実施例、図面または表に示したアミノ酸配列あるいはアミノ酸配列の免疫原性断片または変異体を含むペプチドまたはタンパク質を含む。特定の実施形態において、本発明のエピトープは、SEQ ID NOs:1, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 19-23, 26, 29-37, 52, 53および66のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むペプチドまたはタンパク質を含む。他の実施形態において、本発明のエピトープは、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜101のいずれかの２つ以上のアミノ酸配列またはその免疫原性断片または変異体を含むペプチドまたはタンパク質を含む。特定の実施形態において、本発明のエピトープは、SEQ ID NO:1, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 19-23, 26, 29-37, 52, 53および66のアミノ酸配列を含むペプチドまたはタンパク質を含む。本発明はまた、本発明のエピトープのアミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチドにも関する。
【００１６】
本発明はまた、本発明の進化的に保存されたエピトープを含む、またはコードする１つ以上の抗原および／または免疫原を含むワクチンおよび免疫原性組成物に関する。本発明のワクチンまたは免疫原性組成物はまた、本発明の進化的に保存されたエピトープを含むペプチドまたはタンパク質をコードする、または本発明のキメラポリペプチドをコードする核酸を含んでいてもよい組換えウイルスベクターベースまたはポリヌクレオチド構造も含む。本発明の範囲において意図されるエピトープは、独立に、または可能な組み合わせによるSEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜101のいずれかのアミノ酸配列、本発明の実施例、図面または表に示したアミノ酸配列あるいはアミノ酸配列の免疫原性断片または変異体を含むペプチドまたはタンパク質を含む。特定の実施形態において、本発明のペプチドまたはタンパク質は、SEQ ID NOs:1, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 19-23, 26, 29-37, 52, 53または66のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、本発明のペプチドまたはタンパク質は、SEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜101のいずれかの２つ以上のアミノ酸配列またはその免疫原性断片または変異体を含むペプチドまたはタンパク質を含むことができる。組換えベクター／ウイスル構造を作製するのに用いることのできる好適なウイルスベクターが、本発明で用いるのに意図される。例えば、アデノウイルス、アビポックス、ヘルペスウイルス、ワクチニア、カナリアポックス、エントモポックス、豚痘、西ナイルウイルスおよび業界知られたその他由来のウイルスベクターを本発明の組成物および方法で用いることができる。成分をコードし発現する組換えポリヌクレオチドベクターは、業界に公知の標準的な遺伝子工学技術を用いて構築することができる。さらに、本明細書に記載した様々なワクチン組成物は、別個に、互いに組み合わせて用いることができる。例えば、動物の一次免疫付与には、単一または複数菌株成分の組換えベクターベースの構造を用い、その後、２回目のブーストは、不活性化ウイルスまたは不活性化ウイルス感染細胞ラインを含むワクチン組成物により行う。本発明のワクチン組成物による、その他の免疫付与プロトコルは、当業者に明白であり、本発明の範囲内で意図されるものとする。
【００１７】
本発明はまた、本発明のエピトープおよび／またはキメラポリペプチドを含む組成物、またはそれらをコードするまたはポリヌクレオチドに関する。一実施形態において、本発明の組成物は、医薬的または生物学的に許容される担体、希釈剤および／またはアジュバントを含む。
【００１８】
本発明はまた、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを含む発現構造に関する。本発明の発現構造はまた、発現構造が発現する目的の宿主細胞において機能する制御エレメントを含む。このように、当業者であれば、例えば、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、植物宿主細胞、昆虫宿主細胞、哺乳類宿主細胞およびヒト宿主細胞に用いる制御エレメントを選択することができる。制御エレメントは、プロモーター、転写停止配列、翻訳停止配列、エンハンサーおよびポリアデニル化エレメントを含む。本明細書で用いる「発現構造」という用語は、操作可能に結合した核酸配列の書き換えを行う核酸配列の組み合わせを指す。本明細書で用いる「操作可能に結合」とは、記載した成分が並置され、成分が意図するやり方で機能する関係にあることを指す。概して、操作可能に結合した成分は、隣接した関係にある。
【００１９】
本発明の発現構造は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に操作可能に結合したプロモータ配列を含むことができる。プロモーターは、業界に公知の標準的な技術を用いてポリヌクレオチドに組み込むことができる。プロモーターまたは多重プロモーターの多重複製を、本発明の発現構造に用いることができる。好ましい実施形態において、プロモーターは、その自然遺伝子環境における転写開始部位からであるため、転写開始部位から略同じ距離に配置される。プロモーター活性が大幅に減少しないのであれば、この距離をある程度変えてもよい。転写開始部位は通常、発現構造に含まれる。
【００２０】
動物細部における発現について、本発明の発現構造は、ポリヌクレオチド配列の転写をドライブすることのできる好適なプロモーターを含むことができる。細胞が哺乳類の細胞である場合、例えば、アクチンプロモーター、メタロチオネインプロモーター、NF-kappaBプロモーター、EGRプロモーター、SREプロモーター、IL-2プロモーター、NFATプロモーター、オステオカルシンプロモーター、SV40アーリープロモーターおよびSV40レートプロモーター、Lckプロモーター、jpg5プロモーター、TRP-1プロモーター、マウス乳癌ウイルス長い末端反復プロモーター、STATプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターを発現構造に用いることができる。
【００２１】
本発明の発現構造は、任意で、転写停止配列、転移停止配列、信号ペプチド配列および／またはエンハンサーエレメントを含んでいてよい。転写停止領域は、概して、真核またはウイルス遺伝子配列の３'非翻訳領域から得ることができる。転写停止配列は、コード配列の下流に位置し、効率的な停止を行う。信号ペプチドは、短いアミノ停止配列のグループであり、操作可能に結合したペプチドの、特定の細胞小器官区画からタンパク質活性および細胞外環境の部位に及ぶ、様々な転写後細胞宛先への移動を担う情報をコードする。操作可能に結合した信号ペプチド配列を用いることにより、ペプチドを、意図する細胞および／または細胞外宛先にターゲッティングすることは、本発明の免疫原で用いられるものと考えられる。ケミカルエンハンサーは、遺伝子転写を増大し、発現構造にも含まれ得るシス作用性エレメントである。ケミカルエンハンサーエレメントは業界に公知であり、これらに限られるものではないが、サイトメガロウイルス（CMV）アーリープロモーターエンハンサーエレメントおよびSV40エンハンサーエレメントが挙げられる。構造遺伝子によりコードされたmRNAの直接ポリアデニル化のＤＮＡ配列もまた、発現構造に含めることもできる。
【００２２】
固有の制限酵素部位は、発現構造の５'および３'端部に含まれており、ポリヌクレオチドベクターへ挿入可能とすることができる。本明細書で用いる「ベクター」とは、例えば、プラスミド、コスミド、染色体、ファージ、ウイルス等をはじめとする遺伝子成分のことを指し、適切な制限酵素と結びつくと複製可能で、細胞間でポリヌクレオチド配列を転写することができる。ベクターは、選択した宿主細胞においてベクターを複製可能とさせるヌクレオチド配列を含む。数多くのベクターが、発現および／またはクローニングに利用可能であり、例えば、これらに限られるものではないが、pBR322、pUCシリーズ、M13シリーズおよびpBLUESCRIPTベクター（Stratagene, La Jolla, CA）が挙げられる。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび発現構造は、リポフェクションにより、in vivo で導入することができる（合成カチオンリピドから調製されたリポホームによるＤＮＡトランスフェクション）（Felgnerら1987）。合成カチオンリピド（LIPOFECTIN, Invitrogen Corp., La Jolla, CA）を用いて、リポソームを調製し、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは発現構造を封入する。本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは発現構造はまた、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿およびパーティクルガン法等、業界に公知の方法を用いて裸のＤＮＡとして導入することもできる。
【００２４】
本発明はまた、ヒトや動物またはヒトや動物から得た細胞における、ＦＩＶ、ＳＩＶまたはＨＩＶ等の免疫不全ウイルスの感染を促進および／または潜伏感染を活性化する方法にも関する。一実施形態において、ヒトまたは動物は、ＨＩＶまたはＦＩＶに潜伏感染している。他の実施形態において、本方法は、動物をウイルスに感染または露出することを含む。一実施形態において、ウイルス感染を促進する本発明の１つ以上のペプチドまたは１つ以上のペプチドを含む組成物またはＭＡＰ構造を、ヒトまたは動物に投与する。特定の実施形態において、アミノ酸配列SEQ ID NO:28, 30,または36を含むペプチドを、ＦＩＶに関連した、または後に感染するであろうネコに投与する。
【００２５】
本明細書で用いる「核酸」および「ポリヌクレオチド配列」とは、一本鎖か二本鎖の形態にあるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーのことを指し、特に限定されない限り、自然起源のヌクレオチドと同様のやり方で機能し得る自然ヌクレオチドと類似の公知のものが含まれる。ポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列とタンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列の両方を含む。ポリヌクレオチド配列は、完全長配列と、完全長配列から誘導される短めの配列の両方を含む。特定のポリヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞においてコドン選択をすべく導入される自然配列の縮重コドンを含む。本発明の範囲に含まれるポリヌクレオチド配列は、例証した配列と特異的にハイブリダイズされる配列をさらに含む。ポリヌクレオチドは、個々の鎖か二重鎖として、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を含む。
【００２６】
本発明の方法は、本発明の抗原、免疫原、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ワクチンおよび／または組成物による一次免疫付与に関わる。後の、または二次免疫付与もまた、本方法の範囲に含まれる。二次免疫付与に用いられる抗原、免疫原、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ワクチンおよび／または組成物は、一次免疫付与に用いたものと同じであっても、異なっていてもよい。例えば、動物の一次免疫付与には、一本鎖または多鎖成分のベクターベースのＨＩＶ、ＦＩＶまたはＳＩＶ構造を用い、その後、２回目のブーストは、同じく、一本鎖または多鎖成分のＨＩＶ、ＦＩＶまたはＳＩＶ感染細胞ラインまたはＨＩＶ、ＦＩＶまたはＳＩＶポリペプチドまたは細胞フリーのＨＩＶまたはＳＩＶウイルスを含む組成物により行う。一次免疫付与はまた、ＨＩＶ、ＦＩＶおよび／またはＳＩＶ  ＤＮＡワクチンを用いることもできる。一実施形態において、組換えベクター構築物を一次免疫付与に用い、タンパク質、タンパク質プラス組換えベクター構造体、サブユニットワクチン組成物を二次ブーストに用いる。本発明のワクチン組成物による他の免疫付与プロトコルは当業者に明白であり、本発明の範囲に含まれるものとする。
【００２７】
本発明はまた、本発明のエピトープに結合する抗体または抗原結合断片にも関する。一実施形態において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。一実施形態において、本発明の抗体は、ＨＩＶタンパク質、例えば、ＨＩＶ  ＭＡタンパク質に特異的に結合する。他の実施形態において、本発明の抗体は、ＦＩＶタンパク質、例えば、ＦＩＶ  ＭＡタンパク質に特異的に結合する。さらなる実施形態において、本発明の抗体は、ＨＩＶおよびＦＩＶタンパク質の両方に特異的に結合する。すなわち、抗体は、ＨＩＶとＦＩＶタンパク質、例えば、ＭＡタンパク質の両方に存在するエピトープと交差反応する。本発明はまた、本発明の抗体により認識されるエピトープにも関する。
【００２８】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルの形態とすることができる。抗体は、エピトープに対して抗体を生成可能な動物由来とすることができ、例えば、ヒト、類人猿、サル、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、豚、牛およびネコが挙げられる。また、本発明の範囲内には、例えば、米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号、第６，１８０，３７０号および第６，４０７，２１３号に記載されているような、業界で公知の標準的な手順を用いて「ヒト化」されたヒト以外の抗体である。
【００２９】
本発明で用いられる抗体は、全免疫グロブリン、Ｆｖ、Ｆａｂおよび同様の断片のような抗体断片、ならびに、可変ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む一本鎖抗体をはじめとする様々な形態とすることができ、全て、本明細書においては広義で「抗体」という。
【００３０】
「抗体断片」という用語は、全長抗体の一部、概して、抗原結合または可変領域を指す。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２およびＦｖ断片が例示される。抗体のパパイン消化により、単一抗原結合部位を有するＦａｂ断片と、容易に結晶化する能力のある、いわゆる残存「Ｆｃ」断片の２つの同一の抗原結合断片が生成される。抗体のペプシン処理により、抗体を架橋可能な２つの抗体結合断片と、残存の他の断片（ｐＦｃ'）の２つの抗体結合断片を有するＦ（ａｂ'）２が得られる。さらなる断片としては、二重特異性抗体、鎖状抗体、一本鎖抗体分子および抗体断片から形成された多特異性抗体が挙げられる。本明細書で用いる抗体に関する「抗原結合断片」とは、例えば、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ'）２断片を指す。
【００３１】
抗体または分析物と選択的に結合する能力を保持できる抗体断片が、本発明の範囲内に含まれ、次のものが挙げられる。
（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合断片を含む抗体の断片である。Ｆａｂ断片は、抗体全体を酵素パパインで消化することにより生成して、無傷の軽鎖および１つの重鎖の一部を得ることができる。
（２）Ｆａｂ'は、抗体分子の断片であり、ペプシンにより全長抗体を処理して、無傷の軽鎖および１つの重鎖の一部を得ることができる。２つのＦａｂ'は断片は、抗体分子毎に得られる。Ｆａｂ'は、１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に、抗体ヒンジ領域から、いくつかの残基を付加することで、Ｆａｂ断面とは異なっている。
（３）（Ｆａｂ'）２は、後の還元なしで、酵素ペプシンにより全抗体を処理することにより得られる抗体の断片である。Ｆ（ａｂ'）２は、２つジスルフィド結合により保持される２つのＦａｂ'のダイマーである。
（４）Ｆｖは、完全抗体認識結合部位を含む最低抗体断片である。この領域は、緊密な非共有結合関係の１つの重鎖と１つの軽鎖可変ドメインのダイマーからなる（ＶＨ−ＶＬダイマー）。この構成において、各可変ドメインの３つのＣＤＲは、相互作用して、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面で抗原結合部位を画定する。集合的に、６つのＣＤＲが、抗原結合特異性を抗体に与える。しかしながら、単一変数ドメイン（または抗体に特異的な３つＣＤＲしか含まないＦｖの半分）でも、全結合部位よりも低めの親和性であるものの、抗体を認識し結合する能力を有している。
（５）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）、遺伝子的に溶融した一本鎖分子として、好適なポリペプチドリンカーにより結合した軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可単一変領域（ＶＨ）を含む遺伝子工学分離として定義される。かかる一本鎖抗体はまた、「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦＶ」抗体断片とも呼ばれる。概して、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨとＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、ｓＦｖが、抗原結合のために所望の構造を形成できるようになっている。ｓＦｖ断片についての考察は、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal 抗体, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, N.Y., pp. 269 315（1994）にある。
【００３２】
本発明の範囲に含まれる抗体は、IgG、IgA、IgE、IgDおよびIgMをはじめとするアイソタイプとすることができる。IgGアイソタイプ抗体は、さらに、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4サブタイプに細分化することができる。IgA抗体は、さらに、IgA1およびIgA2サブタイプに細分化することができる。
【００３３】
本発明で用いる抗体は、標的細胞に特異的な属や種とすることができる。本発明の抗体は、業界に公知の標準的な技術を用いて調製することができる。本発明において有用な抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、業界に公知の標準的な方法を用いて調製することができる（Kohlerら1975）。
【００３４】
本発明はまた、モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマにも関する。
【００３５】
本発明のペプチドおよび／またはポリペプチド抗原および免疫原は、各ペプチドストリングに親油性付加あり、またはなしの多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）構造の形態で提供することもできる。ＭＡＰ構造の調製については、Tam（1988）およびKowalczykら（2010）に記載されている。ＭＡＰ構造は、免疫原（例えば、ペプチド）の多重複製が合成されたリシン残基のコアマトリックスを利用する（Posnettら1988）。一実施形態において、本発明のＭＡＰ構造は、コアマトリックスに付加した１つ以上の脂肪酸を含むことができる。脂肪酸は、約４〜約４８以上の炭素原子を含むことができ、飽和および／または不飽和とすることができる。特定の実施形態において、脂肪酸は、パルミチン酸（ヘキサデカン酸）である。同一またはまたは異なる免疫原をそれぞれ含む多様なＭＡＰ構造を調製し、本発明の方法に従って、ワクチン組成物に処方することができる。一実施形態において、同一または異なるペプチドは、末端同士で結合する。同一または異なるペプチドは、互いに直接（すなわち、リンカー配列なしで）結合させたり、短アミノ酸配列等のリンカー部分（例えば、フーリン官能性リンカー）により結合させることができ、これらに限られるものではないが、例を挙げると、SEQ ID NO:38を含むペプチドがある。一実施形態において、ＭＡＰ構造には、１つ以上のアジュバントが与えられる、および／または処方される。一実施形態において、本発明のＭＡＰは、１つ以上のSEQ ID NOs:1〜37またはSEQ ID NOs:39〜101のアミノ酸配列または免疫原断片またはその変異体を含む１つ以上のペプチドを含む。
【００３６】
免疫不全ウイルスタンパク質およびそのペプチド断片の自然の組換えまたは合成ペプチドおよびポリペプチドもまた、本発明の方法によるワクチン組成物として用いることができる。ペプチドおよびポリペプチドを調製する手順は業界で周知である。例えば、ペプチドおよびポリペプチドは、固相合成法を用いて合成することができる（Merrifield, 1963）。ペプチドおよびポリペプチドはまた、組換えＤＮＡ技術を用いて生成することもできる。タンパク質またはペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を、細菌、酵母または哺乳類細胞ライン等の宿主細胞において発現し、発現したタンパク質またはペプチドを、業界において標準的な技術を用いて精製する。
【００３７】
本発明の方法に従って、本明細書に記載した抗原、免疫原およびワクチン組成物を、感染し易い宿主に有効量および有効なやり方で処方して、後のチャレンジやＦＩＶ、ＳＩＶまたはＨＩＶによる宿主の感染に対する免疫応答および／または防御免疫を誘導することができる。免疫原は、典型的には、例えば、皮下、経皮、筋肉内のいずれかに注射により非経口投与、経口またはび鼻噴投与、またはかかる経路の組み合わせにより投与される。通常、免疫原は、宿主動物に少なくとも２回投与され、投与の間隔は１週間以上である。しかしながら、免疫原の初期およびブースター投与の他の処方も考えられ、それは、施術者の判断および治療する特定の宿主動物に応じて異なる。
【００３８】
本発明に従って用いることのできる抗原、免疫原およびワクチンに、薬学的に許容される担体または希釈剤を与えることができる。本発明において有用な化合物および組成物は、薬学的に有用な組成物を調製する公知の方法に従って処方することができる。処方の詳細は、当業者に周知され、容易に入手可能な数多くのソースに記載されている。例えば、Remington's Pharmaceutical Science 、E.W. Martin, Easton Pennsylvania, Mack Publishing Company, 19th ed., 1995には、本発明に関連して用いることのできる処方が記載されている。概して、本発明の組成物を処方して、有効量の抗原、免疫原またはワクチンを、好適な担体と組み合わせて、組成物の友好的な処方が促進される。本発明の方法で用いる組成物はまた、様々な形態とすることもできる。例えば、固体、半固体、液体用量形態、例えば、タブレット、ピル、粉末、溶液や懸濁液、座薬、注射可能な不溶性の溶液およびスプレーが挙げられる。好ましい形態は、投与および治療が意図する様式に応じて異なる。組成物はまた、当業者に知られた従来の薬学的に許容される担体または希釈剤を好ましくは含む。対象のペプチド模倣剤と共に用いる担体または希釈剤としては、これらに限られるものではないが、水、塩水、鉱油を含む油類、エタノール、ジメチルスルホキシド、ゼラチン、シクロデキストラン、ステアリン酸マグネシウム、デキストロース、セルロース、糖、炭酸カルシウム、グリセロール、アルミナ、デンプン、等価担体および希釈剤またはこれらのいずれかの混合物が例示される。本発明の免疫原はまた、懸濁剤、防御剤、潤滑剤、バッファー、保存剤および安定剤も含むことができる。所望の治療処置のための用量での処方とするために、本発明の調剤組成物は、担体または希釈剤を含む組成物の重量基準で、有利には、約０．１重量％〜４５重量％、特に、１重量％〜１５重量％の抗原、複数の抗原、免疫原または複数の免疫原を含む。
【００３９】
本発明の抗原、免疫原およびワクチン組成物は、業界に周知の手順により調製することができる。例えば、抗原、免疫原、またはワクチンは、一般的に、注射可能な、例えば、溶液や懸濁液として調製される。抗原、免疫原またはワクチンは、用量処方に適合するやり方で、かつ、受容者にとって治療有効および免疫原となるような量で投与される。特定の抗原、免疫原またはワクチン処方にとって最良の用量および投与パターンは、当業者であれば容易に求めることができる。
【００４０】
抗原、免疫原またはワクチン処方におけるウイルスおよび細胞は、業界に公知の方法を用いて不活性化または弱毒化される。用量中の細胞フリーの全または部分ウイルスの量は、通常、約０．１ｍｇ〜約５ｍｇ、さらに、約０．２ｍｇ〜約２ｍｇである。ウイルス感染細胞ラインを含む処方の用量は、通常、用量あたり約１０６〜約１０８個の細胞、さらに、用量あたり約５ｘ１０６〜約７．５ｘ１０７個の細胞を含む。ネコについての用量中のタンパク質またはペプチド免疫原の量は、用量を摂取する動物のサイズ、年等に応じて異なるが、約０．１μｇ〜１００００μｇまたは約１μｇ〜５０００μｇまたは約１０μｇ〜１０００μｇまたは約２５μｇ〜７５０μｇまたは約５０μｇ〜５００μｇまたは１００μｇ〜２５０μｇである。
【００４１】
一実施形態において、本発明の抗原、免疫原またはワクチンに、抗原または免疫原に対するヒトまたは動物の免疫応答を増大させる１つ以上のアジュバントを与える。本発明の抗原、免疫原およびワクチンに、業界に公知の好適なアジュバントを与えるおよび／または投与する。一実施形態において、アジュバントは、強固な細胞性免疫応答を引き起こす補助となる。本発明の抗原および免疫原処方に用いることのできるアジュバントとしては、トレオニルムラニルジペプチド（MDP）（Byarsら1987）、細胞壁骨格（CWS）成分、Freund'sコンプリートおよびFreund'sインコンプリートアジュバントをはじめとするRibiアジュバント系成分（Corixa Corp., Seattle, WA）、E. coli等の細菌性リポ多糖（LPS）またはこれらの組み合わせが挙げられる。ミョウバン、水酸化アルミニウムおよびサポニンといった本発明の方法およびワクチンに用いるのに好適なその他の様々なアジュバントは、業界に周知であり、本発明で用いられる。サイトカイン（γ-IFN, GM-CSF, CSF等）およびリンフォカインおよびインターロイキン（IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8. IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21およびIL-22）もアジュバントおよび／または助剤として用いられており、本発明で用いることができる。１つ以上の異なるサイトカインおよびリンフォカインを、本発明の抗原、免疫原またはワクチンを含む組成物に含めることができる。一実施形態において、本発明の抗原、免疫原またはワクチンは、任意で他のアジュバントにおいて、リンフォカインインターロイキン-12（IL-12）と組み合わせて動物に投与される。同じく、本発明においてアジュバント組成物の一部として用いることができるのは、リンフォカインインターロイキン-18（IL-18）である。一実施形態において、本発明で用いることのできるアジュバント組成物は、IL-12とIL-15またはIL-15とIL-18またはIL-12とIL-18またはIL-12、IL-15およびIL-18の組み合わせを含む。選択されるサイトカインは、抗原または免疫原を摂取する動物において生物活性を有する種とする。例えば、動物がネコの場合、サイトカインはヒトサイトカインまたはネコサイトカイン、例えば、ネコIL-12、ネコIL-15、ネコIL-18等である。
【００４２】
本明細書で用いるＦＩＶ株の略称を下の表１に示す。
【表１】
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【００４３】
本発明の抗原、免疫原およびワクチンは、例えば、腹腔内か筋肉注射による注射により、皮下、または経皮で、典型的には非経口投与される。投与の他の好適な様式としては、経口または鼻噴投与が挙げられる。通常、抗原、免疫原およびワクチンは、１週間以上の間隔を空けて、少なくとも２回、ヒトまたは動物に投与される。しかしながら、抗原、免疫原およびワクチンの初期およびブースター投与の他の処方も考えられ、それは、施術者の判断および治療する患者に応じて異なる。
【００４４】
本発明の抗原、免疫原およびワクチン組成物は、業界に周知の手順により調製することができる。例えば、抗原、免疫原、またはワクチンは、一般的に、注射可能なもの、例えば、溶液や懸濁液として調製される。抗原、免疫原またはワクチンは、用量処方に適合するやり方で、かつ、受容者にとって治療有効および免疫原となるような量で投与される。特定の抗原、免疫原またはワクチン処方にとって最良の用量および投与パターンは、当業者であれば容易に求めることができる。
【００４５】
本発明に従って用いることのできる抗原、免疫原およびワクチンに、薬学的に許容される担体または希釈剤を与えることができる。一実施形態において、本発明の抗原、免疫原およびワクチンに、抗原または免疫原に対するヒトまたは動物の免疫応答を増大させる１つ以上のアジュバントを与える。本発明の抗原、免疫原およびワクチンに、業界に公知の好適なアジュバントを与えるおよび／または投与する。
【００４６】
本発明で考えられるペプチドは、ここで例証された特定のペプチドおよびそれよりやや長い、または短い等価のペプチドである。例えば、本明細書に記載した技術を用いて、当業者であれば、業界に公知の標準的な技術を用いて、開示されたペプチドの片端または両端に添加された１〜約１５以上のアミノ酸、またはそこから除去された１〜１０のアミノ酸を有するペプチドを容易に作製することができる。添加されたアミノ酸は、ペプチドが誘導される全長タンパク質の対応のアミノ酸とは異なるもの、または同一とすることができる。当業者であれば、本明細書に開示された内容から、長いペプチドと短いペプチドのどちらが、例示された特定のペプチドの免疫原活性を保持しているか容易に判断できる。
【００４７】
本発明のペプチドにおいて具体的に例示されたものや自然に存在する以外のアミノ酸の代替物も本発明の範囲に含まれる。例えば、アミノ酸を替えなかったペプチドと実質的に同じ免疫原活性を保持する限りは、自然でないアミノ酸を、ペプチドのアミノ酸に代替させることができる。自然でないアミノ酸としては、これらに限られるものではないが、一般に、オルニチン、シトルリン、ヒドロキシプロリン、ホモセリン、フェニルグリシン、タウリン、ヨードチロシン、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、γ−アミノ酪酸、ε−アミノヘキサン酸、６−アミノヘキサン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、ノルロイシン、ノルバリン、サルコシン、ホモシトルリン、システイン酸、τ−ブチルグリシン、τ−ブチルアラミン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、β−メチルアミノ酸、Ｃ−メチルアミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸およびアミノ酸類似体といったデザイナーアミノ酸が例示される。自然でないアミノ酸としてはまた、誘導側鎖のあるアミノ酸も挙げられる。さらに、タンパク質中のアミノ酸はＤ（右旋性）形態またはＬ（左旋性）形態とすることができる。
【００４８】
アミノ酸は、概して、非極性、非帯電極性、塩基性および酸性に分類される。ある種類のアミノ酸を有する本発明のペプチドを同じ分類の他のアミノ酸で置き換える保存的置換は、置き換えたものを有するペプチドが、置き換えていないペプチドと実質的に同一の抗原または免疫原活性を保持する限りは、本発明の範囲に含まれる。表２に、各分類にするアミノ酸の例を挙げる。
【００４９】
【表２】
2018528974.tif 000003
【００５０】
本発明の具体的に例示されたペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、短鎖または長鎖ペプチドまたはポリペプチド、または配列中に１つ以上のアミノ酸置換基を有するペプチドは、本発明の範囲に含まれる。本発明はまた、本のペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドの変異体にも関する。変異体配列は、配列の１つ以上のヌクレオチドが、置換、除去および／または挿入された配列を含む。ＤＮＡの自然ヌクレオチドに置換できるヌクレオチドは、これらに限られるものではないが、イオシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、ハイポキサンチン、１−メチルグアニン、５−メチルシトシンおよびトリチル化塩基を含む塩基部分を有する。配列中のヌクレオチドの糖部分もまた変性することができ、これらに限ら得るものではないが、アラビノース、キシルロースおよびヘキソースが挙げられる。さらに、ヌクレオチドのアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシル塩基は、アセチル、メチルおよび／またはチオ基により変性することができる。ヌクレオチド置換、除去および／または挿入を含む配列は、業界に公知の標準的な技術を用いて作製および試験することができる。
【００５１】
本発明の範囲に含まれるペプチドまたはポリペプチドの断片および変異体は、本明細書に記載したとおりに生成され、業界に公知の標準的な技術を用いて、免疫原活性の存在について試験される。
【００５２】
本発明の範囲に含まれるポリヌクレオチド、ペプチドおよびポリペプチドはまた、本明細書に具体的に例示された本発明の配列で、特定の同一性および／または類似性に関して定義することもできる。配列同一性は、典型的に６０％より大きい、好ましくは７５％より大きい、より好ましくは８０％より大きい、さらに好ましくは９０％を超える、そして９５％より大きい。配列の同一性および／または類似性は、本明細書で例示した配列に比べて、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％とすることができる。特に断りのない限り、２つの配列について、本明細書で用いるパーセント配列同一性および／または類似性は、KarlinおよびAltschul（1990）、修正KarlinおよびAltschul（1993）のアルゴリズムを用いて判断することができる。かかるアルゴリズムは、Altschulら（1990）のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTサーチは、NBLASTプログラムにより、スコア＝100、ワード長＝12で行われて、所望のパーセント配列同一性を有する配列が得られる。Altschulら（1997）に記載されているとおり、比較のために、ギャップアラインメント、Gapped BLASTを用いることができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを用いるときは、各プログラム（NBLASTおよびXBLAST）のデフォルトパラメータを用いることができる。ワールドワイドウェブサイトncbi.nlm.nih.govを参照されたい。
【００５３】
好ましい用量の投与計画に影響する因子としては、どの分配システムを用いようと、また、ワクチンを薬剤および／またはワクチン組み合わせの一部として処方されようと、例えば、年齢、体重、性別、栄養状態、活動状態、肺の大きさおよび被験者の状態、投与経路、用いる特定のワクチンの有効性、安全性および免疫期間プロフィールが挙げられる。このように、実際に用いる用量は、特定の動物によって異なるため、規定した典型的な用量からは外れることがある。かかる用量調整を判断するのは、当業者であれば、通常の手段で行える。なお、弱毒化した生ウイルスは自己増殖するため、投与されたウイルスの具体的な量は必ずしも重要ではない。
【００５４】
本発明の抗原、免疫原またはワクチンは、患者に数日、数週間、数か月または数年にわたって、１回、あるいは２回以上投与してよい。ある実施形態において、例えば、ワクチンは２回投与され、２回目の用量（例えば、ブースター）は、１回目から少なくとも約２週間で投与される。ある実施形態において、ワクチンは２回投与され、２回目の用量は、１回目の後８週間以内に投与される。ある実施形態において、２回目の用量は、１回目の後約２週間〜約４年で、１回目の後約２〜約８週間で、または１回目の後約３〜約４週間で投与される。ある実施形態において、１回目およびそれ以降の用量は、例えば、量および／または形態において変わる。ただし、量および形態については、用量は同一であることが多い。単一用量を投与するときは、その用量のみにおける抗原、免疫原またはワクチンの量は、概して、治療有効量の抗原、免疫原またはワクチンを含む。しかしながら、２つ以上の用量を投与するときは、これら用量中の抗原、免疫原またはワクチンは、併せて、治療有効量となるようにする。
【００５５】
ある実施形態において、受容者がウイルスに感染する前に、抗原、免疫原またはワクチンを投与する。かかる実施形態において、抗原、免疫原またはワクチンは、例えば、１つ以上の（典型的には２つ以上の）臨床症状のリスクを予防、減少またはその開始を遅らせるために投与してもよい。
【００５６】
ある実施形態において、受容者がウイルスに感染した後、抗原、免疫原またはワクチンを投与する。かかる実施形態において、抗原、免疫原またはワクチンは、例えば、ウイルスまたは１つ以上の（典型的には２つ以上の）臨床症状を改善、抑制または断つために投与してもよい。
【００５７】
抗原、免疫原またはワクチンは、患者の飲料水および／または食べ物から投与してもよいと考えられる。さらに、抗原、免疫原またはワクチンは、おやつやおもちゃの形態で投与してもよいものと考えられる。
【００５８】
「非経口投与」には、皮下注射、粘膜下注射、静脈注射、筋肉注射、胸骨注射、経皮注射および点滴が挙げられる。注射用製剤（例えば、殺菌した注射可能な水性または油性懸濁液）を、ビヒクル、溶媒、分散液、湿潤剤、乳化剤および／または懸濁剤等の好適な賦形剤を用いて、業界に公知のやり方で処方することができる。典型例として、例えば、水、塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、コーン油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、ベンジルアルコール、1,3−ブタンジオール、リンガー液、等張塩化ナトリウム溶液、無菌の不揮発性油（例えば、合成モノまたはジグリセリド）、脂肪酸（例えば、オレイン酸）、ジメチルアセトアミド、界面活性剤（例えば、イオン性または非イオン性洗剤）、ポリプロピレングリコールおよび／またはポリエチレングリコールが挙げられる。賦形剤はまた、ｐＨ緩衝剤のような少量のその他助剤を含んでいてもよい。
【００５９】
抗原、免疫原またはワクチンは、ワクチンの効率を増大させるために、患者の免疫応答（抗体応答、細胞性応答またはその両方を含む）を向上させる１つ以上の賦形剤を含んでいてもよい。かかる賦形剤（または「アジュバント」）は、不活性化ワクチンを用いるときは、特に有益である。アジュバントは、患者の免疫系の細胞に直接的（例えば、サイトカインまたはカルメット−ゲラン桿菌（「ＢＣＧ」）または間接的効果（リポソーム）のある物質であってもよい。好適なアジュバントとしては、油（例えば、鉱油）、金属塩（例えば、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム）、細菌性成分（例えば、細菌性リポ多糖、Freund'sアジュバントおよび／またはＭＤＰ）、植物成分（例えば、Quil A）および／または担体効果を有する１つ以上の物質（例えば、ベントナイト、ラテックス粒子、リポソームおよび／またはQuil A、ISCOM）が例示される。当然のことながら、本発明には、アジュバントを含む抗原、免疫原またはワクチンも、アジュバントを含まない抗原、免疫原またはワクチンも含まれる。
【００６０】
抗原、免疫原またはワクチンは、保管のために凍結乾燥し（またはその他液体容積を減じ）、投与前または投与時に再構成される。かかる再構成は、例えば、ワクチン等級の水を用いて行われる。
【００６１】
本発明はさらに、上述した方法を実施するのに好適に使われるキットを含む。このキットは、上述した抗原、免疫原またはワクチンを含む用量形態を有する。キットはまた、少なくとも１つの追加のコンポーネントと、典型的には、追加のコンポーネントと共に、抗原、免疫原またはワクチンを使用する説明書も含む。追加のコンポーネントは、抗原、免疫原またはワクチンを投与前または投与中に混合可能な、例えば、１つ以上の追加の成分（例えば、上述した１つ以上の賦形剤、食品および／またはおやつ等）であってよい。追加のコンポーネントは、この代わりに（または追加して）、患者に抗原、免疫原またはワクチンを投与するための１つ以上の装置を含んでいてもよい。かかる装置としては、例えば、シリンジ、吸入器、ネブライザー、ピペット、ピンセットまたは任意の医学的に許容される分配ビヒクルである。ある実施形態において、装置は、抗原、免疫原またはワクチンの皮下投与に好適なものである。ある実施形態において、装置は、抗原、免疫原またはワクチンの鼻腔内投与に好適なものである。
【００６２】
調剤または生物調剤業界において公知のその他賦形剤および投与様式もまた用いてよい。
【００６３】
本発明はまた、ネコ等の動物が、ＦＩＶに対して本発明のＦＩＶワクチンによりワクチン接種されているか、ＦＩＶに感染する、またはＦＩＶに感染しているかどうか判断する方法にも関する。一実施形態において、血液や血清試料といった生物学的試料が、ネコから得られ、試料を分析して、動物が、ＨＩＶ抗原に特異的に結合する抗体を有しているかどうか判断する。ＨＩＶ抗体にのみ認識され、ＦＩＶ抗体には認識されないＨＩＶタンパク質のエピトープを本発明において用いることができる。
【００６４】
【表３】
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【００６５】
【表４】
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【００６６】
全ての特許、特許出願、仮出願および本明細書で参照または引用した文献は、本明細書の明白な教示と矛盾しない範囲で、全ての図表を含む全内容が参考文献として組み込まれる。
【００６７】
以下は、本発明を実施するための手順を例証する実施例である。これらの実施例は、限定するとは解釈されないものとする。特に断りのない限り、パーセンテージは重量基準であり、溶媒混合物比は容積基準である。
【実施例】
【００６８】
実施例１−ネコ免疫不全ウイルスに対する多重抗原ペプチドの免疫原性および防御有効性
ＨＩＶ／ＡＩＤＳに対するワクチン予防における最近の開発によって、防御免疫に関する知識が向上したが[1-3]、世界中に広めるための安全性および有効なワクチンの導入は差し迫っていない。ワクチン開発における調査は数多くなされているものの、これまで、僅か３つの候補しか、大規模フェーズIII臨床試験に達していない（IAVI臨床試験データベース、www.iavireport.org/Trials-Database/Pages/default.aspx, 2015年2月29日に評価）。最も成功したフェーズIII試験、RV144は、ハイリスクグループにおいて、最小防御３．７％で、ＨＩＶ感染のリスクを全体の３１．２％減少した。ＨＩＶ陰性だったワクチン接種被験者は、V1V2ループでＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）に対して高レベルのIgG抗体を有していたが、Ｅｎｖに対するIgA抗体、またはＨＩＶ−１中和抗体は有していなった[5]。エンベロープのV2領域に対する多官能性CD4+Ｔ細胞およびCD4+細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）様活性もワクチンにおいて検出された[6]。
【００６９】
ＨＩＶ  Ｅｎｖにおいて、進化を続けるウイルス抗原と圧倒的な抗原の変化により、液性と細胞仲介免疫（ＣＭＩ）応答の両方を活性化するワクチンアプローチ[4-10]およびウイルスの抗原領域を選択的にターゲットする新規な方法が必要とされている。これらの領域は、変異への耐性があるウイルスサブタイプ間で保存されなければならず、強力な抗ウイルス免疫を誘導する。実用的な研究によって、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）とＨＩＶの逆転写酵素（RT）[11]およびコアタンパク質p24[12]において、保存レンチウイルスCD8+ＣＴＬおよびCD4+Ｔヘルパー（TH）細胞エピトープが確認された。これらのエピトープは、ＨＩＶ−１陽性（ＨＩＶ+）ヒト被験者（RTおよびp24）およびＦＩＶワクチン接種ネコ（p24）からの末梢血単核細胞（PBMC）およびＴ細胞により認識される。ＨＩＶサブタイプにのみ焦点を当てるのではなく、これらの期待できる結果は、強力かつ持続性のある抗ウイルス免疫応答を誘導し得る異なる種のレンチウイルスに存在する機能上重要なエピトープの発見のための戦略的パラダイムをサポートしている。
【００７０】
レンチウイルスワクチンにＴ細胞免疫を導入する重要性は、２００２年に発表された市販のデュアルサブタイプＦＩＶワクチン（Fel-O-Vax(r)ＦＩＶ）により示される[13]。ＨＩＶ、ＦＩＶと同様に、CD4+Ｔ細胞に感染し、自然宿主に免疫不全を引き起こすレンチウイルスである[13,14]。その結果、飼いネコ、自然宿主にＦＩＶ感染および疾病が進行するのは、ＨＩＶワクチンの開発にとって重要な動物モデルである[14]。市販と試作のＦＩＶワクチンは、ワクチン誘導ＦＩＶ中和抗体（ＮＡｂ）および抗ＦＩＶＴ細胞免疫により、相同の密接な関係の株（tier-1および一部のtier-2）に対して防御をする[13,15]。しかしながら、試作のワクチンは、市販のワクチンよりも、抗ＦＩＶＴ細胞免疫により相関している非相同のtier-2およびtier-3に対してより大きな防御をする[13,15]。試作ワクチンで観察された抗ＦＩＶＴ細胞免疫の広範な有効性[13,15,16]、およびＨＩＶワクチンRV144試験からのＥｎｖ V2ペプチドに対するCD4+Ｔ細胞活性とＨＩＶ防御された固体との相関性[5]は、Ｔ細胞ベースのＨＩＶおよびＦＩＶワクチンを開発する重要性をさらに明確なものとさせている[6,13]。
【００７１】
特定範囲のウイルスを標的とすることのできるモダリティを開発することは、レンチウイルスワクチン学においてますます重要になっている[17-20]。デンドリマーまたは多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）として分岐鎖構造にある合成オリゴマーペプチドは、ガン[21,22]、感染症[23,24]、自己免疫疾患[25,26]のエピトープを選択的かつ有効に標的とするのに用いられ、最近では、ＮＡｂベースのＨＩＶおよびＳＩＶワクチンを精製するのに用いられている[27,28]。Ｔ細胞ベースのワクチンを開発するために、p24[12]およびRT[11]の前に確認された抗原領域を標的とするＭＡＰが、試作のＦＩＶワクチンで１回プライミングされ、レンチウイルスＭＡＰで４〜６回ブーストされた特定病原体除去（SPF）ネコで評価された。ＭＡＰベースのＦＩＶワクチンの免疫原性、安全性および有効性を、ＦＩＶネコモデルを用いて評価した。
【００７２】
材料および方法
動物  １５匹のSPFネコを、フロリダ大学アニマルケアサービスと連携して比較免疫学およびレトロウイルス学研究所で飼育した。雌雄の同年齢のネコを４つのグループに分けた（表５）。IACUC認可の方針およびプロトコルに従って、動物実験を行った。
【００７３】
プライム−ブーストワクチン
試作デュアルサブタイプＦＩＶをプライミング用量として１回投与した。市販のデュアルサブタイプＦＩＶワクチン（Fel-O-Vax(r)ＦＩＶ）[13]を模した試作ワクチンは、４μｇの組換えネコIL12（rFeIL12）（R&D Systems, Minneapolis, MN）を入れた１．２０ｍＬのFD-1（水中油型）アジュバント中に処方された、それぞれ３００μｇの不活性ホールウイルス（IWV）ＦＩＶペタルーマおよびIWV  ＦＩＶ静岡（計６００μｇのIWV）からなる。ＭＡＰは、LifeTein LLC（Hillsborough, NJ）により生成された。ＭＡＰは、アミノ末端の第１のリシン骨格にＦＩＶ p24（Fp）またはRT（FRT）ペプチドのいずれかの４つの同一分岐のある、リシン骨格に処方され、カルボキシル末端にパルミチン酸（CH3（CH2）14COOH）の第３のリシンを含んでいる（図１０Ａ）。ＭＡＰ１は、フーリン官能性リンカー（トランスゴルジネットワークの開裂に感受性）と結合したp24ペプチドFp4-3およびFp14-1の分岐鎖からなっていた[29,30]。ＭＡＰ１ｂは、４つの複製ペプチドFp14-1を含み、ＭＡＰ２は、フーリンリンカーのない４つの複製ペプチドFRT3-3およびFRT3-4のオーバーラッピング配列を含んでいた。個々のＭＡＰまたはＭＡＰの組み合わせを、４μｇのrFeIL12を入れた１ｍＬの最終容積のFD-1アジュバントに処方した。
【００７４】
免疫付与およびチャレンジ
８匹のSPFネコに、試作デュアルサブタイプＦＩＶワクチン（IWV）[13]により１回プライミングし、ＭＡＰ１（ペプチドFp4-3／Fp14-1）、ＭＡＰ１ｂ（ペプチドFp14-1）および／またはＭＡＰ２（ペプチドFRT3-3／FRT3-4）の組み合わせでブーストした（グループ1および2、表５）。免疫付与は、皮下（SC, 500 μg IWV）および皮内（ID, 100 μg IWV）経路を用いたプライミング１回の後、４〜６週間後に、３〜１２週間の間隔で、ＭＡＰ（ＭＡＰ SC毎に150μgプラスＭＡＰ ID毎に50μg）を４〜６回行った。SC免疫付与容積は、プライミング用の１ｍＬ（500μg）のIWV、ブースト用の０．７５ｍＬ  ＭＡＰ（150μg単一ＭＡＰまたは300μg  ＭＡＰ１+2）からなり、ID免疫付与は、２つの部位で免疫付与された０．１ｍＬ／部位（５０μｇ／部位IWV）または０．１２５ｍＬ／部位（25μg／部位単一ＭＡＰまたは50μg  ＭＡＰ１+2）からなる。ネコは、最後のブーストから６週間、in vivo由来サブタイプ-B 病原体ＦＩＶFC1の１５×５０％のネコ感染用量（15 CID50）で静脈内チャレンジを受けた[13]。３匹のIWV-プライミングネコ（グループ３）および４匹のPBS-免疫付与ネコ（グループ４）は対照として用いた（表５）。
【００７５】
ＩＦＮγおよびＩＬ２  ELISpot分析
ＩＦＮγおよびＩＬ２  ELISpot分析を、記載されているとおり、ネコＩＦＮγ  ELISpotおよびネコＩＬ２  ELISpotキット（R&D Systems, Cat# SEL764およびSEL1890）を用いて行った[31]。閾値は、MVS  ELISpotリーダー（MVS Pacific, LLC）で計数したとき、1x106 PBMCあたり、?50のスポット形成単位（SFU）として定義する。各結果は、媒体対照の平均値の除算後の複製試料の平均である。
【００７６】
Ｔ細胞増殖およびCD4／CD8表現型分析
カルボキシフルオセインジアセテートスクリンイミドエステル（CFSE）増殖を、メーカーのプロトコル（Invitrogen, Grand Island, NY）に従って行い、前述の修正を用いて処理した[11,12]。修正は、培養媒体（RPMI媒体25g／mLゲンタマイシンおよび10%熱不活性化ウシ胎児血清（FBS））中4μg／mLペプチドにより、2.5x105 CFSE標識ネコPBMCを５日間刺激した（37°C, 5% CO2）。ペプチドプールは、それぞれ4μg／mLの3-5オーバーラッピングペプチドからなっていた。フローサイトメトリーベースの増殖分析は、二次ヤギ抗マウスIgG3- APC／CY7 M Ab（SouthernBiotech, Birmingham, AL; Cat# 1100-19）と組み合わせたマウス抗ネコ（Fe）CD3モノクローナル抗体（Drs. Yorihiro NishimuraおよびTakayuki Miyazawa の好意により提供されたMabクローン[32]）、マウス抗FeCD4-PE MAb（SouthernBiotech, Cat# 8130-09）および二次ヤギ抗マウスIgG2a-PE／CY7（Southern Biotech, Cat# 1080-17）と組み合わせたマウス抗FeCD8 MAb（Dr. Nazareth Gengozianの好意により提供されたMAbクローン[33]）からなっていた。ネコB細胞（SouthernBiotech, Cat#1665-11）を検出するためのマウス抗B220-APC Mabおよび前述のCFSE のためのMAbsを、FACSフェノタイプのために用いた。FACSフェのタイプとCFSE-増殖分析は両方共、BD LSRIIおよびFACSDivaTM ソフトウェア（BD Biosciences, San Jose, CA）を用いて行った。各試料の最終値は、>1 CFSElowの正の閾値を用いて、媒体対照の平均値の減算後誘導した。
【００７７】
ＦＩＶ感染および抗ＦＩＶ抗体のモニタリング
ＦＩＶ感染を、実験中および実験終了後に集めたPBMCからウイルス分離することにより判断した。骨髄（BM）およびリンパ節（LN）を、実験終了時に集めた。連続モニタリングのために防御済みネコ（SBA）についてBM吸引物およびLN生検を集めた。４週間にわたって、１週間毎に２回採取した培養液のRT分析および培養組織（PBMC、BMおよびLN）のenv特異プロウイルスPCRにより、ＦＩＶ感染を検出した[13,34]。PBMCウイルス負荷を、チャレンジ後（wpc）１４週間からモニターし、2-4 時点から判断した。ウイルス負荷分析は、合計１ｍＬの培養媒体（37°C, 5% CO2）において、未感染SPFネコから2.5x105フィーダーPBMCにより４倍で共生培養した各チャレンジネコからの101、102、103、104、105および106 PBMCからなっていた。PBMCを、3-4日毎に２週間にわたって新たな培養媒体に再懸濁し、集めた流体のＦＩＶ力価をRT分析により評価した。４匹のネコ（OCA, OCF, 5HS, DVC）は、9-14 wpcで終了して、早期感染中およびウイルスセットポイントを判断するには早すぎる時点で、病原体ＦＩＶFC1-誘導病理学について組織を評価した。
【００７８】
p24およびRTに対してワクチン抗体の検出を避けるために、前述したとおり、200ng／ウエルの膜貫通ペプチド（TM, aa694-705: QELGCNQNQFFC（SEQ ID NO:68））を用いて、ELISAにより感染誘導FIV抗体について、チャレンジ後抗体を評価した[36,37]。抗TM抗体の陽性閾値を0.2O.Dで設定した。前述したとおり、チャレンジ直前のワクチン後抗体のＦＩＶPetおよびＦＩＶFC1に対するＮＡｂ力価についてＮＡｂ分析により評価した[13]。前述したとおり、ワクチン接種後／チャレンジ前抗体のワクチンペプチドに対する抗体についてELISAにより、各ペプチドを基質として用い、ＦＩＶ免疫ブロットにより、ミニブロット修正して、試験した[36]。全ELISA閾値を、15-20SPFネコからの個々の抗体の平均の２倍に設定した。
【００７９】
ネコSBAのサイトカインおよび細胞毒
チャレンジ後ＭＡＰ１／ＭＡＰ２ブースト後61wpcまたは１４週のネコSBAからのPBMCおよびSPFネコからのPBMCを７〜８時間（37°C, 5% CO2）、各ペプチドまたはＭＡＰの存在下、RT-PCRの採取前に培養した。試験したペプチドおよびＭＡＰは、次のものからなっていた。5% FBSおよび2.5x106PBMC／mLの培養媒体中、ペプチド／ＭＡＰ組み合わせ1（P1: 5 μg／mLそれぞれFp4-3プラスＭＡＰ１c）、ペプチド／ＭＡＰ組み合わせ2（P2: 5 μg／mLそれぞれFp14-1, FRT3-3, FRT3-4, ＭＡＰ１ｂプラスＭＡＰ２）およびＴ細胞マイトジェンブドウ球菌エンテロトキシンA（SEA, 0.2 μg／mL）。前述したとおり、ネコＩＦＮγ、ＩＬ２、パーフォリン、グランザイムA（GrzA）およびGrzBのmRNAレベルをRT-PCRにより求めた[16]。ネコサイトカインおよび細胞毒についてのプライマーセットの配列を表６に示す。各アクセッション番号は、誘導された完全または部分配列のものである。複数のアクセッション番号は、プライマー対配列および増殖生成物のサイズで観察された１００％保存を表している。増殖配列は、Eruofins MWG Operon LLC（Louiville, KY）により配列決定し、対応のサイトカインまたは細胞毒について正しい配列と判断された。
【００８０】
ＦＩＶ増加および減少分析
ＦＩＶウイルス増加または減少を、ＩＦＮαのＩＦＮγおよびＦＩＶ抑制作用のＦＩＶ増加活性について記載した方法の４８ウェル修正版を用いて求めた[37]。簡単に述べると、非感染のSPFドナーからの0.25-0.5x106非刺激PBMCを、7μg／mLのＭＡＰ１、ＭＡＰ２、ＭＡＰ１ｃ、ＭＡＰ１ｂ、ＭＡＰ１＋ＭＡＰ２（合計14μg／mL）またはペプチドFp4-3、Fp14-1、FRT3-3、FRT3-4または負の対照ペプチドHp15-1により、最終容積1mL／ウェルで培養した。ＭＡＰ１ｃは、ペプチドFp4-3の４つの分岐鎖を含んでいた。4μg／mLのＴ細胞マイトジェンコンカナバリンA（ConA）を、感染増加対照として用いた。ペプチド、ＭＡＰまたはConA培養６時間後、異なる希釈度のＦＩＶFC1をウェルに添加した。７２時間後、同量の対応のペプチド、ＭＡＰ、ConAまたは媒体を用いて、ConA-刺激自家PBMC（0.25-0.5x106）による新たな培養媒体中で細胞を再培養した。培養7、10および13日に、0.5mLの媒体液体を集め、0.5mLの新たな媒体を添加して、一定の容積に維持した。採取した培養試料を、前述のRT分析を用いてＦＩＶ力価について分析した[13,34]。結果を、異なるSPFドナーからのPBMCを用いた２つの実験からの終点希釈力価として示す。
【００８１】
統計的分析
ペプチドまたはＭＡＰ培養試料と、ウイルス制御試料または特定のＭＡＰ培養試料の終点希釈力価間の統計的有意差を、両側分布による対スチューデントｔ検定を用いて計算した（SigmaPlotバージョン11.0）。ワクチン接種前後の統計的比較を同時に行った。比較は、p<0.05のとき統計的に有意と考えられた。
【００８２】
結果
ＭＡＰブーストの液性免疫原性
IWVプライミングの３週間後、p24に対する抗体応答を検出したが、RTでは検出されなかった（図１０Ｂ、レーン2）。最後のＭＡＰブースト後かつチャレンジ前５週間で、試験した全５匹のIWV／ＭＡＰ-ワクチン接種ネコの血清は、p24に対する抗体レベルを維持または減少させた（図１０Ｂ、レーン3）。1X IWVプライムは、SUまたはTM抗体を含んでいなかった。個々のペプチド特異ELISA分析を行って、IWVにより誘導された抗体を、ＭＡＰ中の個々のペプチドにより誘導された抗体と区別した。ワクチン接種全体にわたって、ペプチドFp4-3、Fp14-1、FRT3-3およびFRT3-4に対する特定の抗体は検出されなかった（データ示さず）。予測どおり（プライミング後、SUまたはTMに対する抗体がないため）、チャレンジ前のワクチン接種ネコにおいて、ＦＩＶウイルスＮＡｂは検出されなかった（データ示さず）。
【００８３】
ＭＡＰブーストのＣＭＩおよびＴ細胞免疫原性
中程度のＩＬ２生成（図１０Ｄ）以外に、ＦＩＶ p24、RTペプチドおよびペプチドプールに対する強固なＴ細胞増殖（図１０Ｃ、図１０Ｄ）およびＩＦＮγ生成（図１０Ｃ）が、最後のブーストと後４週間かつチャレンジ前にグループ１および２のＭＡＰワクチン接種ネコのＴ細胞およびPBMCで観察された。ペプチドプールFp4、Fp14およびFRT3は、それぞれ、Fp4-3、Fp14-1およびFRT3-3／FRT3-4ペプチドと、前述したとおり、2-3オーバーラッピングおよび／または近接ペプチドとを含んでいた[11,12]。特に、ワクチン接種ネコのCD3+CD4+Ｔ細胞は、CD3+CD8+Ｔ細胞も高レベルおよび頻度で、ペプチドプールFp4およびペプチドFp4-3に応答した（図１０Ｃ、図１０Ｄ）。しかしながら、CD3+CD8+Ｔ細胞は、CD3+CD4+Ｔ細胞よりも高い頻度および大きな規模で、ペプチドプールFRT3およびペプチドFRT3-3、FRT3-4に応答した。プールFp14およびペプチドFp14-1に対するＴ細胞応答は、FRT3プールおよびFRT3-3／FRT3-4ペプチドに対するCD8+Ｔ細胞や、Fp4プールおよびFp4-3ペプチドに対するCD4+Ｔ細胞応答よりも低く、頻度が低かった。概して、ペプチドプールによる刺激は、個々のペプチドよりもやや高い頻度および大きな規模であった（図１０Ｃ〜図１０Ｆ）。４匹のワクチン接種しなかったSPFネコおよび８匹のワクチン接種前のSPFネコは、これらのペプチドプールおよびペプチドに対する応答が、最小（すなわち、2 CFSElow〜FRT3-3のネコDVC、3 CFSElow〜FRT3-4のネコOLI）〜応答なし、であった（データは示さず）。ペプチドプールは、ペプチドと、近接するオーバーラッピングペプチドの関連セグメントの添加の影響を判断するために含められた（表７）。ターゲットペプチドと同一の８つ以上のオーバーラッピングaaのプールのペプチドは（すなわち、ＭＡＰワクチン接種に用いられるもの）は、MHCのポケット結合能に基づいて、Ｔ細胞を刺激する能力を有している。従って、これは、ペプチドプールの応答が大きな規模および高い頻度となっている。個々のペプチドに比べて、これら配列のプール内の全体量が多いからである。
【００８４】
ペプチドFp4-3とFp14-1の間で、ペプチドFp4-3に対する最も大きな規模および高い頻度が、CD4+Ｔ細胞増殖で観察され、一方、最も大きな規模であるが、低い頻度（３７％）の応答が、ペプチドFp14-1に対するCD8+Ｔ細胞増殖で観察された（図１０Ｃ、図１０Ｄ）。Ｔ細胞応答の異なるパターンが、ＭＡＰ１ワクチン接種されたネコにより、ペプチドFp4-3およびFp14-1で観察されたという事実は、これらの応答が、個々に開裂したペプチドの独立した認識を表していた。従って、ペプチドFp14-1およびFp4-3は、フーリン感受性リンカー（RVKR）（SEQ ID NO:38）で、エンドプロテアーゼフーリンにより最も開裂しそうであった[29,30]。ＭＡＰ１ワクチン接種ネコのPBMCによりこれらの各ペプチドにより誘導されたＩＦＮγ生成の規模および頻度はさらに、この結論をサポートしている（図１０Ｅ）。
【００８５】
概して、全てのペプチドは、大きい規模および高い頻度で実質的なＩＦＮγ応答を誘導した（図１０Ｅ）。５匹のワクチン接種していないSPFネコのPBMCは<15 SFUであった。ペプチドFp4-3（161 SFU）に対する実質的なＩＦＮγ生成によるネコOCAを除き、部分および完全防御ネコ（グループ１およびグループ２ｂ）の共通の特徴は、ＭＡＰ１を含むFp4-3を受けても、Fp4-3に対するＩＦＮγ生成が減少（SBA, 60 SFU）または生成しない（OCF, DVB）ことであった。ＭＡＰ１およびＭＡＰ２（図１０Ｅ）に対する強固なＩＦＮγ応答が、全てのＭＡＰに対する中程度のＴ細胞増殖応答に比例して観察された。この観察は、ＭＡＰ処方が、ペプチドを、ＩＦＮγ生成細胞により効率的に与えるか、および／またはより多くのＩＦＮγ誘導細胞を採用するかのいずれかであることを示唆している。ＩＦＮγ応答はPBMC中で検出されるため、親油性パルミチン酸塩を含むＭＡＰは、大量のＩＦＮγを生成し、アジュバント活性を有すると考えられるＮＫ細胞およびＴ細胞に沿ったＮＫＴ細胞により認識される[39,40]。全体として、ペプチドとＭＡＰは両方共、ＭＡＰワクチン接種ネコ（図１０Ｃ〜１０Ｆ）からのPBMCおよびＴ細胞を刺激したが、ワクチン接種していないネコからのPBMCおよびＴ細胞を刺激しなかった（データは示さず）。これらの結果は、ＭＡＰワクチン接種が、CD4+およびCD8+Ｔ細胞、そして潜在的にNK免疫を含む強固なペプチド特異性ＣＭＩを誘導することを示している。さらに、全てのＭＡＰワクチン接種ネコは、ＭＡＰワクチン接種による観察される有害な臨床兆候や観察される注射部位反応は示さなかった。
【００８６】
プライムブースト免疫付与のチャレンジ有効性
チャレンジの際、ＭＡＰワクチン接種グループ１の４匹のネコ（SBA）のうち１匹は、ウイルス分離およびプロウイルスPCRによりＦＩＶ陰性であり、ウイルス特異ＦＩＶ抗体について陰性であった（表５、図１０Ａ、レーン４、図１１Ａ）。このネコは、実験全体にわたって通常のCD4+Ｔ細胞数を示した。グループ１の他の２匹のネコ（OCA, OCF）は、部分的な防御を示し、１匹のネコは、CD4+Ｔ細胞喪失における大幅な遅延を示した（表５）。部分的防御は、感染ウイルス検出の遅延、CD4+Ｔ細胞における遅延および／またはウイルスコントロールに比べて低いウイルスセットポイントと定義された（グループ４）。また、１回のＭＡＰ１ブーストのみのグループ２の４匹のネコ（DVB）のうち１匹も部分的防御を示した（表５）。また、ネコDVBは、抗TM抗体に対する閾値（0.2 O.D.）がかなり低い（図１１Ａ）。完全防御されたネコ（SBA）以外全てのネコは、実験終了時、全ての試験組織（PBMC, BM, LN）において、ウイルス分離およびプロウイルスPCRにより陽性であった（表５）。
【００８７】
興味深いことに、チャレンジ後の抗TM抗体は、２匹のグループ３のネコ（5HSおよびOLK）および１匹のグループ２のネコ（DVD）は、増加したTM抗体力価を3wpcで示した（図１１Ａ）。グループ１と２の初期の比較では、グループ２における追加の２回のブーストで防御が減少したのを示した（表５）。さらに、ＭＡＰ１の代わりにＭＡＰ１ｂでワクチン接種したサブグループ２ｂは、１匹の部分的に防御されたネコで、全体的に低いウイルスセットポイントで、サブグループ２ａより低い抗TM抗体力価であった（表５、図１１Ａ）。ＭＡＰ１ｂは、ペプチドFp14-1しか含んでいなかったため、ＭＡＰ１におけるペプチドFp4-3の存在は、ＭＡＰ１の防御能力を阻害する。
【００８８】
1Xプラムグループ３は、3 wpcによる３匹のうち２匹のネコにおいて、ウイルス分離に若干の増加を示し、早期のCD4+Ｔ細胞喪失および極めて早期の抗TM抗体力価を示した（表５、図１１Ａ）。グループ３のネコは全て3 wpc によるプロウイルスPCRで陽性であった（表５）。ネコの数が少ないため、統計的には顕著でないが、グループ３におけるＦＩＶ増加傾向は、過剰に多い用量のIWVによるプライミングは、ＦＩＶ p24上の非防御かつ潜在的増殖能を持つエピトープに対する応答を誘導することを示している。それでも、グループ１におけるＭＡＰ１／ＭＡＰ２による４回のブーストによって、抗抗原プライムの潜在的な悪影響を回避することができ、その結果、４匹のうち３匹のネコが部分〜完全防御された（表５）。
【００８９】
完全防御ネコにおけるワクチンペプチドの影響
理想的には、全てのネコにＦＩＶチャレンジの前にＣＴＬ関連細胞毒mRNA分析を行っておき、感染の遅延および低いワクチン接種ネコのウイルス負荷は、期待される成果であったが、完全な防御ネコを与えられることは予想していなかった。従って、ペプチド特異Ｔ細胞増殖およびサイトカイン（ＩＦＮγおよびＩＬ２）生成分析を実施した後、これらのネコは感染についてチャレンジおよび評価を受け、組織について終了した。１匹の防御されたネコSBAだけが終了せず、１年にわたって感染およびチャレンジ後ブースト免疫について続けてモニターした。他のペプチドの防御潜在性を減少させるFp4-3ペプチドの可能性を試験するために、ＭＡＰ１プラスＭＡＰ２により47 wpcでブーストさせた。チャレンジブースト後１４週で、Fp4-3とＭＡＰ１ｃの組み合わせ、およびFp14-1／FRT3-3／FRT3-4ペプチドと、ＭＡＰ１ｂと、ＭＡＰ２との組み合わせに対して、サイトカイン（ＩＦＮγおよびＩＬ２）ならびに細胞毒（パーフォリン、GrzA、GrzB）のmRNA生成についてPBMCを分析した。Fp4-3刺激は、PBMCにおいて、SEA刺激に匹敵する、Fp4-3に対する高ＩＦＮγ mRNAレベルならびに低ＩＬ２およびGrzA mRNAレベルであるが、検出可能でないレベルのFp4-3特異パーフォリンまたはGrzBを誘導した（図１１Ｂ、１１Ｃ）。
【００９０】
比較として、Fp14-1／FRT3-3／FRT3-4／ＭＡＰ１ｂ＋２の組み合わせによる刺激では、ＩＬ２およびＣＴＬ−細胞毒パーフォリンとGrzAの高mRNA生成を誘導したが、ＩＦＮγの生成は少なく、GrzBは生成しなかった。ワクチン接種しなかったSPFネコは、任意のペプチド／ＭＡＰ組み合わせによる刺激で、サイトカインまたは細胞毒を生成しなかった。重要なのは、SEA刺激によるGrzB生成は、SPFネコに比べてSBAネコでは非常に低いことである。このように、この結果によれば、ＩＦＮγでなくパーフォリンおよびGrzAは、Fp14-1／FRT3-3／FRT3-4の組み合わせにより優位に誘導され、防御されたSBAネコにおいてのみ、ＦＩＶに対するＣＭＩ活性を媒介することが示唆される。対照的に、ペプチドFp4-3は最小のＣＴＬ関連細胞毒生成を誘導し、主に、より広くは炎症誘発するＩＦＮγを誘導した。
【００９１】
in vitroＦＩＶ感染におけるワクチンペプチドの直接的影響
防御ネコの応答結果およびグループ３における感染の潜在的な増加は、ＦＩＶ感染に対するp24およびRTペプチドのウイルスの増加と減少の影響の評価を促すものである。ペプチドFp4-3およびＭＡＰ１は、ＦＩＶ感染を大幅に増加するが、Fp14-1およびＭＡＰ１ｂは影響されない（図１１Ｄ）。ペプチドFRT3-4およびＭＡＰ２は、ＦＩＶ感染を大幅に減少した（p<0.05）が、ペプチドFRT3-3では大幅な増加が観察された（p<0.001）。恐らく、ＭＡＰ２におけるFRT3-3とFRT3-4の自然なオーバーラップにより、FRT3-3ペプチドよりFRT3-4の方が細胞処理または細胞認識がなされ、感染の大幅な抑制となった。
【００９２】
高レベルのＭＡＰ１、特に、Fp4-3を含有するグループにより与えられる最小の防御のために、ＭＡＰ１、ＭＡＰ２およびＭＡＰ１ｂの様々な組み合わせの刺激の影響を、ウイルス増加／減少分析を用いて評価した。ＭＡＰ１プラスＭＡＰ１（ＭＡＰ１＋２）の組み合わせによる処理は、未処理対照（p<0.001）に比べ、大幅に高いウイルス感染となった。ウイルスの全体のレベルは、個々のＭＡＰ１とＭＡＰ２の間で表された（図１１Ｄ）。この組み合わせは、ＭＡＰ２のＦＩＶ減少効果を大幅に減少し（p<0.001）、ＭＡＰ１のＦＩＶ増加影響も大幅に減少（p<0.01）し、中間表現型となる可能性が高い。これらin vitro観察に基づいて、組み合わせたＭＡＰ１＋２による免疫付与は、ペプチドFp4-3のＦＩＶ増加活性を減少したが、SBAネコで観察されたFp14-1とFRT3-3／FRT3-4の組み合わせにより誘導されるＣＴＬ様活性が増大した（図１１Ｂ）。
【００９３】
ペプチドFp4-3なしのＭＡＰ２プラスＭＡＰ１ｂの組み合わせは、ＦＩＶ増加活性はなかったが、ＭＡＰ２のＦＩＶ減少活性も示さなかった。パルミチン酸を全ＭＡＰに添加して（Pam-ＭＡＰ）Toll様受容体（ＴＬＲ）を刺激することによりアジュバント活性を増大し、抗原呈示細胞によりＭＡＰの取り込みを増加した[17]。このように、減少活性の喪失は、１ｍＬ培養系において、ＭＡＰ１ｂとＭＡＰ２の両方に対するパルミチン酸添加の影響により生じる過剰なＴＬＲ活性という結果になる。現在のin vitro観察により、グループ２におけるＭＡＰブースト６回が、グループ１におけるＭＡＰブースト４回より効果が少ない理由が説明される。パルミチン酸によるＴＬＲの過剰刺激により、非特異性刺激が多くなる結果、潜在的な防御効率が減少または失われる。さらなる実験で、Pam-ＭＡＰをＭＡＰ単体または細胞浸透活性のみ有するTatに共有結合したＭＡＰと比較する[41]。
【００９４】
考察
これまで、ＨＩＶ−１に対する最良の臨床ワクチン実験（RV144）は、カナリア痘等ウイルス（ＡＬＶＡＣ）ベクタードＨＩＶ−１  gag／pr／env 免疫付与２回に続いて、組換えＥｎｖ−Ｂ／Ｅ（ＡＩＤＳＶＡＸ）と組み合わせたＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ免疫付与２回からなるプライムブーストアプローチを用いてきた[4]。ＦＩＶ／ネコモデルの同様のプライムブーストアプローチを用いて、ＡＬＶＡＣサブタイプ−Ａ  ＦＩＶVille-Franche gag／pr／envによるプライミング２回に続いて、サブタイプ−Ａ  ＦＩＶPet感染細胞ワクチン（ICV）によるブースト１回により、相同のチャレンジに対する１００％の防御および非相同チャレンジに対する１００％の一部〜１００％の防御を与えた[42]。本実験において、ネコは、試作IWVによりプライミングされ、レンチウイルス内に保存された３つのＴ細胞エピトープペプチドおよびＦＩＶサブタイプ内にのみ保存された他のＴ細胞ペプチド（Fp4-3）を含有するＭＡＰワクチン処方の組み合わせによりブーストされた。試作デュアルサブタイプＦＩＶワクチン（IWV）は、Ｔ細胞免疫をさらに誘導し、市販のＦＩＶワクチンよりもtier-2およびtier-3ウイルスに対する防御を与えると報告されている[13,15,16]。この予備実験は、プライムブーストモデルを用いた抗ＦＩＶＴ細胞免疫を生成しかつ評価し、Pam-ＭＡＰの安全性を評価するために設計されたものであり、大きな防御を与えるとは考えられなかった。しかしながら、設計されたワクチンは、限られたペプチドレパートリーにおいて有効性が証明されており、ＭＡＰワクチングループ１において７５％の一部または全ての防御を与えた（表５）。
【００９５】
本実験の元も革新的な特徴は、ＭＡＰ処方において選択したＦＩＶペプチドを用いることであった。ＭＡＰ１におけるＦＩＶp24ペプチドFp14-1ならびにＭＡＰ２におけるRTペプチドFRT3-3およびFRT3-4は、前に報告された保存レンチウイルスエピトープである[11,12]。これらのエピトープは、ＦＩＶワクチン接種ネコ（Fp14-1）とＨＩＶ＋ヒト被験者（FRT3-3, FRT3-4）の両方に認識され[11,12]、他のＡＩＤＳレンチウイルスと有意のaa配列保存を有する（表７）。ＨＩＶ＋被験者による研究において、これらのペプチドおよびペプチドプール（Fp14およびFRT3）は、CD4+およびCD8+Ｔ細胞ならびに強固なCD8+Ｔ細胞増殖の両方において、中程度のＩＦＮγ応答およびＣＴＬ様細胞毒の中〜高程度の生成を誘導した[11,12]。試作ＦＩＶワクチン接種ネコにおいて、ペプチドFp14-1およびFp14プールは、CD8+およびCD4+Ｔ細胞の両方で大きな規模と高い頻度の増殖を誘導したが、ペプチドFRT3-3およびFRT3-4は、小さな規模と低い頻度の応答しか誘導しなかった（PuおよびYamamoto, pers. comm.）。p24タンパク質に比べてIWVワクチン中にのＦＩＶ  ＲＴタンパク質が少量であるため、FRT3-3およびFRT3-4に対する低い頻度の応答が予測された。本実験において、高濃度のオーバーラッピングFRT3-3／FRT3-4ペプチドによるＭａｐ２免疫付与は、大きな規模と高い頻度のCD8+Ｔ細胞増殖および両ペプチドに対するＩＦＮγ生成となった（図１１Ａ、１１Ｃ）。比較として、Fp14-1によるＭＡＰ１免疫付与は、Fp14-1ペプチドに対して低い頻度のＴ細胞増殖を誘導したが、より一定のCD4+Ｔ細胞増殖およびFp14プールに対するＩＦＮγ生成となった（図１０Ｃ、１０Ｄ）。このように、ＭＡＰ２処方における多量のRTペプチドは、ワクチン接種ネコにおけるRTペプチドに対する応答、およびグループ１で観察された部分〜完全防御に寄与しそうなＭＡＰ２におけるFRT3-3／FRT3-4に対する強固なCD8+Ｔ細胞応答を誘導した。
【００９６】
ペプチドFp14-1の他に、ＭＡＰ１は、Fp14-1に対する低いＴ細胞応答に寄与するペプチドFp4-3を含有し（図１０Ｃ）、Fp14-1ペプチドにより誘導される防御免疫を弱毒化した。IWVワクチン接種ネコにおいて、ペプチドFp14-1は、大きな規模（7-14 CFSElow）および高い頻度（75%）のCD4+Ｔ細胞増殖だが、低い頻度（33%）のCD8+Ｔ細胞増殖を誘導した（PuおよびYamamoto, pers. comm.）。高濃度のFp14-1ペプチドによるＭＡＰ１免疫付与は、試作ワクチンに誘導されるものよりもＴ細胞増殖が多くなければならなかったが、ペプチドFp14-1に対する低いCD4+Ｔ細胞増殖しか観察されなかった（図１０Ｄ）。ペプチドFp4-3は、レンチウイルス保存のない処方に用いられる唯一のペプチドである（表８）。しかしながら、このエピトープは、ＦＩＶサブタイプの中で高度に保存され、ワクチン設計に関して大きな懸念を引き起こす。というのは、この実験は、Fp4-3ペプチドはin vitroＦＩＶ感染を増加し、ネコにおける潜在的な防御を阻害することを示しているからである。有効性についての本実験は、最も多い量のFp4-3を受けたグループ２において防御は示さなかった。特に、完全防御ネコのみが、実質的に大きな、チャレンジ前CD8+Ｔ細胞増殖およびペプチドFp4-3に対するよりもペプチドFRT3-3／FRT3-4に対するＩＦＮγ生成であった（図１０Ｃ、１０Ｅ）。低CD4+Ｔ細胞増殖およびSBAネコにおけるFp4-3に対するＩＦＮγ応答（図１０Ｄ、１０Ｅ）は、防御免疫に対するFp4-3の悪影響の他の指標である。さらに、防御ネコにおける全ての試験済みＦＩＶペプチドに対するCD4+Ｔ細胞増殖は、概して、他のＭＡＰワクチン接種ネコのものより低かった（図１０Ｄ）。このように、完全な防御は、ペプチドFRT3-3／3-4に対する最大の免疫および強固なCD8+Ｔ細胞増殖を必要とするが、ペプチドFp4-3に対する最小の応答および低CD4+Ｔ細胞増殖を必要とする。
【００９７】
FRT3-3／3-4に対する増加した免疫およびFp4-3に対する最小の応答のために、防御は、一回のチャレンジ、ＭＡＰ１／ＭＡＰ２ブースト後のSBAネコのチャレンジ後免疫によりサポートされる。Fp4-3刺激は、高レベルのＩＦＮγmRNA発現およびＩＬ２およびGrzAの中程度の発現を誘導し、Fp14-1、FRT3-3およびFRT3-4の組み合わせは、Th1サイトカインＩＬ２およびＣＴＬ関連細胞毒パーフォリンおよびGrzAの高発現を誘導した（図１１Ｂ）。NK細胞は、概して、ペプチド特異応答を誘導しないため[44]、多重細胞毒のアップレギュレーションは、ＣＴＬの抗原特異活性を表す[16]。これらの観察に基づいて、ペプチドFp4-3は、最小の防御ＣＴＬ様活性を誘導したが、Fp14-1／FRT3-3／FRT3-4の組み合わせは、ＦＩＶに対して強固なＣＴＬ様活性を誘導し、これは、SBAネコの完全防御の一因となる。
【００９８】
ペプチドFp4-3は、ＣＴＬ関連細胞毒を大量に生成することなく、ＩＦＮγ応答を主に誘導した。細胞毒を生成しないＩＦＮγ応答のみでは、ＨＩＶ−１に対する強固なＣＴＬ活性は生成しないことが報告されている[45,46]。重要なのは、ＩＦＮγは、感染を増大し、高いウイルスセットポイントとなる、ＨＩＶ−１感染の初期段階において生成される主要な抗炎症サイトカインであることが報告されていることである[47,48]。さらに、ＩＦＮγは、ＨＩＶ−のヒト被験者およびＦＩＶ−ネコからの一次PBMCにおけるＨＩＶ−１とＦＩＶの両方のin vitro感染を直接増加することが報告されている[37,49]。従って、Fp4-3刺激による（図１１Ｄ）ＦＩＶのin vitroでの増加は、培養における増加したＩＦＮγ生成により仲介される。このように、ＩＦＮγを主に誘導するFp4-3のようなペプチドは、ワクチン免疫原として禁忌である。重要なのは、本実験が、ＭＡＰ１におけるペプチドFp4-3のＦＩＶ増加免疫活性が、ＭＡＰワクチン接種ネコの大半について、ＭＡＰ２におけるFRT3-3／FRT3-4の防御免疫をブロックした、ということを示唆することである。従って、ワクチンのためのＴ細胞エピトープペプチドの選択は、多官能性Ｔ細胞サイトカインおよびＣＴＬ分析に基づくばかりでなく、これらのペプチドのＦＩＶエンハンサー／サプレッサーを評価する分析も含むものとする。
【００９９】
保存レンチウイルスＴ細胞エピトープペプチドの使用に加えて、グループ１で観察された防御有効性は、rFeIL12を含むFD-1アジュバントを含むＭＡＰの使用に因る。rFeIL12の試作ＦＩＶワクチンへの添加は、FD-1アジュバントにおいてのみ処方されるワクチンよりも非相同のＦＩＶ分離に対する有効性を増加すると報告されている[13]。また、ＭＡＰを用いて示されたペプチドは、同じアジュバントにおける等量のペプチド単体よりもペプチドに対しての免疫を増大することが報告されている[21,50]。ＭＡＰのパルミトイル化反応を含む脂質化は、ＴＬＲをトリガーすることによるペプチド特異応答およびペプチドの細胞への輸送をさらに増加し[17,51-53]、遊離アミノ基によるＭＡＰ毒性の減少も報告されている[51]。ＮＡｂエピトープターゲットペプチドを用いるＭＡＰは、ＨＩＶ−１に対して高レベルのＮＡｂを誘導した[26,27]。また、Th2エピトープをターゲットとするＭＡＰを、V3 ＮＡｂエピトープをターゲットとするＭＡＰと組み合わせて用いて、ＮＡｂ力価を増やす[27]。対照的に、脂質化あり、またはなしの、pＤＮＡ、修正ワクチンウイルスベクターおよび複数鎖ペプチドからなるＴ細胞エピトープベースのワクチン設計を、フェーズＩ実験したが、成功しなかった（[54]に評価あり）。しかしながら、腫瘍抗原のＴ細胞エピトープに基づくＭＡＰは、治療有効性を示した[22,55]。
【０１００】
ＦＩＶ特異ＣＴＬ活性を誘導するペプチドのアゴニスト／拮抗薬活性は、ＭＡＰ１／ＭＡＰ２ワクチン接種ネコにおいて重要な因子であった。ＨＩＶ−１マトリックスおよびp24に対する抗ＨＩＶアゴニスト／拮抗薬ペプチドは、HLA-B8またはHLA-B27限定ＣＴＬそれぞれについて報告されている[19]。p24ペプチドは、アゴニストKRWIIMGLNK（SEQ ID NO:69）（KK10）、アゴニストKRWIILGLNK（SEQ ID NO:70）を含んでいた[19]。HLA-DRB制限CD4+Ｔ細胞は、拮抗薬PEVIPMFSALSEG（SEQ ID NO:72）（PG13）を含む、アゴニストPEVIPMFSALSEGATP（SEQ ID NO:71）（PP16）のようなp24ペプチドを認識した[18]。（注：太字のaaはチャレンジまたはCOOH末端切り捨てを表す）。定義した抗ＨＩＶ  ＣＴＬのアゴニスト／拮抗薬ペプチドのＦＩＶの対応物は、ＦＩＶエンハンサー（Fp4-3およびFRT3-3）またはサプレッサー（FRT3-4）ペプチドと本実験ではオーバーラップしない。FRT3-3／FRT3-4は、ＨＩＶ＋被験者により認識されるオーバーラップペプチドであり[11]、PP16／PG13は、ＨＩＶ＋被験者から誘導されるＣＴＬクローンにより認識されるアゴニスト／拮抗薬対である[18]。なお、両PP16／PG13およびFRT3-3／FRT3-4対は、ペプチドの選択およびワクチン設計において考慮すべき、異なる細胞開裂の結果となる。
【０１０１】
保存レンチウイルスエピトープの慎重な選択およびスクリーニングにより、本実験はまず、Ｔ細胞エピトープベースのＭＡＰを用いて、ＦＩＶに対する部分的〜完全防御を与えるＣＴＬ関連および多官能性Ｔ細胞活性を誘導することを示した。
【０１０２】
【表５】
2018528974.tif 000006
表５  脚注
a   略称:  試作 デュアルサブタイプ不活性ホールウイルスワクチン（IWV）、ＭＡＰ１プラスＭＡＰ２（ＭＡＰ１＋２）、ウイルス分離（VI）、プロウイルスPCR（PCR）、ウイルスセットポイント（VS）、実施せず（n）、陰性（-）、骨髄（BM）、リンパ節（LN）、チャレンジ後週（wpc）、抗膜貫通Ab（TM Ab）
b 14-47wpc未満、最後のレーンは、14 wpc で開始したPBMCからの複数の時点でのウイルスセットポイントの平均である。
c  60%のCD4+Ｔ細胞喪失が検出されたときの、チャレンジ後週数。SBAネコのCD4+Ｔ細胞数およびCD4+／CD8+Ｔ細胞比は 61 wpcでなお標準であった。
d  検出可能なTM Ab 力価による第１の時点（図１２Ａの0.2 O.D.の閾値）。
e  部分的防御は、VIにおける遅延、CD4+Ｔ細胞喪失における遅延および／または対照グループに比べて低いウイルスセットポイントを表している。
f  5HSネコ、OLKネコおよび２匹以上のネコ（OCA, DVC）を、それぞれ、10 wpc、12 wpcおよび14 wpcで安楽死させた。全組織を、終末時にＦＩＶ試験したが、ウイルスセットポイントは、早い時点であるため、OLKネコについてのみ判断した。
【０１０３】
【表６】
2018528974.tif 000007
【０１０４】
【表７】
2018528974.tif 000008
【０１０５】
【表８】
2018528974.tif 000009
【０１０６】
実施例２  ネコにおけるＭＡＰワクチン実験１および継続ＭＡＰワクチン研究２
ＭＡＰワクチン研究１に関する情報は全て、ＦＩＶペプチドエピトープの選択についての特定の情報を除き、手書き原稿である。ペプチド選択は、下記の表９および１０の要約データに記載してある。
【０１０７】
Ｔ細胞活性を誘導するエピトープを有するＦＩＶペプチドの選択
ＨＩＶ−１およびＦＩＶワクチンのためのエピトープの選択は、ＦＩＶとＨＩＶ−１の間で保存されたウイルスエピトープを認識するために、ＨＩＶ−１陽性（ＨＩＶ+）のヒト被験者とＦＩＶワクチン接種ネコの両方からのＴ細胞の能力に基づいていた。なお、ペプチドエピトープは、エフェクター活性を発揮するＴ細胞を刺激することのできる最小アミノ酸（aa）配列である。本実験において、CD3+CD4+Ｔ細胞およびCD3+CD8+Ｔ細胞のペプチド特異免疫学的活性を評価して、CD4+Ｔヘルパー（TH）、CD4+細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、多官能性CD4+Ｔ細胞、多官能性CD8+Ｔ細胞およびCD8+ＣＴＬエフェクター活性を確認した。このように、強固な抗ＨＩＶおよび抗ＦＩＶエフェクター活性を誘導するペプチドエピトープが、ワクチン免疫原として選択される。
【０１０８】
ＦＩＶおよびＨＩＶ−１構造と酵素タンパク質のオーバーラッピングペプチドプールを用いて、ＨＩＶ−１およびＦＩＶp24のエピトープマッピングならびに逆転写酵素（RT）について前述したとおり、ＨＩＶ+被験者からの末梢血単核細胞（PBMC）およびＴ細胞を刺激した（Sanouら2013; Roffら2015）。インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）生成および／またはＴ細胞増殖のいずれかに対する陽性応答をするペプチドプールにおける個々のペプチドを、ＩＦＮγELISpot分析、CFSEベースのCD3+CD4+およびCD3+CD8+Ｔ細胞増殖分析の後、細胞溶解素（パーフォリン）および細胞毒（グランザイムA[GrzA]およびGrzB）用のFACSベースの細胞内染色（ＩＣＳ）により求めた（Sanouら2013; Roffら2015）。ウイルスp24およびRTタンパク質の他に、同一のアプローチを用いて、ウイルスマトリックス（MA）、ヌクレオカプシド（NC）、プロテアーゼ（PR）、RNAase、インテグラーゼ（IN）、表面エンベロープ（SU Ｅｎｖ）およびトランスメンブランエンベロープ（TM Env）での抗ＨＩＶ／ＦＩＶＴ細胞エピトープを同定した（図１２）。in vitro分析からの第１のセットの結果を、ＦＩＶペプチドについては表９に、ＨＩＶ−１ペプチドについては表１０に示す。これらの結果は、パーセンテージでのレスポンダーの頻度、個々のペプチドにより試験した被験者の総数について、ペプチドに対するレスポンダーの数で示されている。
【０１０９】
同時に、ＦＩＶ構造／酵素タンパク質のオーバーラッピングペプチドプールを用いて、ＦＩＶワクチン接種ネコからのPBMCおよびＴ細胞を刺激した。ネコは、市販のＦＩＶワクチンに対する試作であった試作デュアルサブタイプＦＩＶワクチンによりワクチン接種した（Colemanら2014）。ＩＣＳ分析は除き、ヒト分析（Sanouら2013; Roffら2015）と等価のネコ分析（実施例１）を用いた。細胞溶解素／細胞毒についてのＩＣＳの代わりに、ＩＬ２  ELISpot分析を行った。続いて、陽性応答のペプチドプールにおける個々のペプチドを、同じ分析システムによりさらに試験した。ＦＩＶワクチン接種ネコについての結果には、ＩＦＮγおよびＩＬ２生成とCD3+CD4+およびCD3+CD8+Ｔ細胞増殖が含まれていた（表９、第２のセットの結果）。
【０１１０】
続いて、in silicoでのヒト白血球抗原（HLA）分析を、ＨＩＶ+被験者および／またはワクチン接種ネコのＴ細胞に反応性のあるペプチドで行った。用いたアルゴリズムは、HLAクラスI（HLA-A, -B, -C）については、NetMHC 3.2サーバー[www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/]、HLAクラスII（HLA-DRB1）については、NetMHCII 2.2サーバー[www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/]、細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）に係るHLA-Aおよび-Bについては、Net 1.2サーバー[www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/]であった（表９、第３のセットの結果）。in silico分析により、別基準標本と呼ばれる、HLAおよびネコ白血球抗原（FLA、HLAのネコ対応部分）対立遺伝子タンパク質ペプチド結合ポケットに対する選択したＦＩＶペプチドの反応性を求めた。CD4+Ｔ細胞が、マクロファージや樹状細胞のような抗原提示細胞や感染標的細胞のHLAクラスIIのウイルスペプチドを認識することは十分に確立されている。対照的に、CD8+Ｔ細胞は、CD4+Ｔ細胞、マクロファージや樹状細胞のような感染標的細胞のHLAクラスIに結合したウイルスペプチドを認識する。このように、個々の宿主で発現したHLA／FLAアレル／別基準標本は、どのペプチドエピトープが、ウイルス感染を排除する宿主の免疫系により認識できるか判断する。宿主が、対立遺伝子部位で同型でなくても、それぞれ、HLA-A, HLA-B, HLA-CおよびHLA-DRB1からの２つの異なるアレルを有する。HLAクラス-II DQおよびDPについてのin silicoアルゴリズムは、まだ初期段階で、本実験では用いず言及しない。ヒトと同様に、飼いネコは、３つのFLAクラスI遺伝子座を有することができる。各遺伝子座は、２つのFLAアレルを各染色体ストランドから与える。対照的に、ネコは、FLAクラスII DRB1の２〜３の遺伝子座を有するが、DQの遺伝子がない、または完全DPアレルがない。従って、宿主集団に広がった最も一般的なHLAクラスIおよびII別基準標本により認識されるウイルスエピトープは、一般的でないHLAアレル／別基準標本よりもウイルス感染に対するエフェクター活性を誘導するのにより効率的であると考えられる。
【０１１１】
飼いネコは、ペプチド結合ポケットのHLAアレル／別基準標本に似たFLAアレル／別基準標本を用いる。ネコは、スーパータイプA3（評価した60アレルの75%）、同様に、B27（53%）, B7（33%）, B44（33%）, A24（33%）, A2（13%）およびA1（6.7%）に似たFLAアレルを有している。特に、確認された交差反応性保存ＦＩＶペプチドは、スーパータイプに対して反応性のあるエピトープを有していた（最も類似性のある順で）A3, B27, A24, A2、続いて、B44, B58, A1およびB7である。このように、抗ＦＩＶＴ細胞活性を有し、HLAスーパータイプA3およびB27に似たＦＩＶペプチドは、スーパータイプA1, A26およびB8と反応するものよりもより多くのネコを防御する。
【０１１２】
最後に、選択されたＦＩＶペプチドの、in vitroＦＩＶ感染を増加または減少する可能性について試験した。この分析は、ＦＩＶ感染のエンハンサー／サプレッサー（E／S）分析と呼ばれる（表９、最後のセットの結果）。このネコ分析（実施例１）は、ＨＩＶ−１感染のE／Sについて記載されたヒト分析と同様であり（Roffら2015）、未感染ネコPBMCおよびＦＩＶ接種材料を、ヒトPBMCおよびＨＩＶ−１接種材料の代わりに用いることが異なる。
【０１１３】
ネコにおけるＭＡＰワクチン実験のためのＦＩＶペプチドの選択
ＭＡＰワクチン実験１
試作ＭＡＰワクチン実験１は、主に、手書き原稿（実施例１）およびヒト細胞を用いて同様のデータによる２つの文献（Sanouら2013; Roffら2015）におけるＦＩＶワクチン接種ネコのPBMCおよびＴ細胞の予備免疫分析からのデータに基づいていた。これらの文献は、ＨＩＶ+被験者からのPBMCおよびＴ細胞が選択したＦＩＶペプチドと交差反応性であることを示している。
【０１１４】
CD8+Ｔ細胞増殖および細胞溶解素／細胞毒またはＩＬ２生成において>25%のレスポンダー頻度を有し、ＦＩＶ増加能力のないＦＩＶペプチドを、実験用ネコにおけるワクチン実験に選択した。さらに、多重または主要HLA／FLA別基準標本に対して反応性で、ＨＩＶ−１とＦＩＶの両方において一般的なエピトープを有するＦＩＶペプチドをさらに選択した。選択したペプチドを、多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）処方へ合成し、継続ＭＡＰワクチン実験２においてワクチン免疫原として用いた（図１２）。
【０１１５】
ＭＡＰワクチン実験２
ワクチンペプチドの選択はまた、ペプチドFp4-3が、ワクチン免疫原として有益でなく、実際は、ＦＩＶ感染を増加し、オーバーラッピングFRT3-3／FRT3-4ペプチドの防御有効性が失われることが分かったＭＡＰワクチン実験１（実施例１参照）からの結果にも基づいていた。E／S分析はまた、Fp4-3のＦＩＶ増加活性も示した（図１１Ｄ）。ペプチドFp14-1を有するＭＡＰは、ＭＡＰワクチン実験１において有効性が最小であったため、ＭＡＰワクチン実験２には含めなかった。ペプチドFRT3-3はin vitroＦＩＶ増加活性を有するという事実から、ＭＡＰ２は、オーバーラッピングFRT3-3／FRT3-4ペプチドからなっていた。オーバーラップの形態において、このペプチドは、むしろ、in vitroでＦＩＶ減少活性を有しており（図１１Ｄ）、これを用いた（図１２）。
【０１１６】
最大数のＭＡＰのネコグループ１（n=5）において、合計で６つのペプチド（すなわち、６つのＭＡＰ）を、ワクチン免疫原として用いた。これらのペプチドのうち３つは、２つのペプチドエピトープの自然オーバーラップを有していた（Fp14-3／Fp14-4, FRT3-3／FRT3-4, およびFRT7-1／FRT7-2）（図１２、aa配列のもの）。グループ２は、合計で５つのペプチド（すなわち、５つのＭＡＰ）を受け、同じく２つのペプチドエピトープを有する同じ３つのペプチドを有していた。ＭＡＰ４は、グループ２の最後の２回のワクチン接種では除いた（n=6）。グループ１と２のワクチン組成の他の違いは、グループ１は、試作デュアルサブタイプＦＩＶワクチンによるワクチンプライミングされるが、グループ２は、多重ＭＡＰワクチンによる３回のワクチン接種前にプライミングされないことである。各ワクチン接種は、異なる免疫原比率の皮内（ID）および皮下（SC）免疫付与からなる（図１２）。ワクチン接種インターバルは４〜６週間であった。グループ３（n=6）は、PBS（n=3）またはアジュバントありのPBS（n=3）のいずれかを受けるプラセボ対照グループからなっていた。継続実験２は、前の予備ワクチン実験（表５）に基づく試作ＦＩＶワクチンのみのグループは含んでおらず、試作ＦＩＶワクチンの一回の免疫付与により、防御は示さなかったが、ＦＩＶ感染の増加は示した。なお、試作と市販のＦＩＶワクチンは両者共、２回のワクチン接種で30-50%を与え（Yamamoto, personal communique）、チャレンジＦＩＶ株の非相同性に応じて、３回のワクチン接種で>70%を与える（Colemanら2014）。
【０１１７】
予備ＭＡＰワクチン実験１の概要
予備実験で、３つのＦＩＶペプチドを、FD-1アジュバント（Fort Dodge Animal Health）（水中油型）に混合した３つのＭＡＰ処方へと処方し（Colemanら2014）、混合ＭＡＰワクチンとして用いた。１つのＭＡＰは、単一のペプチドエピトープ（Fp14-1）を含んでいた。残りの２つのペプチドまたはＭＡＰは、２つの明確に定義されたＴ細胞エピトープ（FRT3-3／FRT3-4, Fp4-3／Fp14-1）を含んでいた。in vitro分析において、ペプチドFp4-3は、最小のＩＬ２生成で、有意のCD4+Ｔ細胞増殖および中程度のＩＦＮγ生成を誘導した（表９）。同様に、ペプチドFp14-1は、CD8+Ｔ細胞増殖（25%）よりもCD4+Ｔ細胞増殖（37.5%）において、僅かに多いレスポンダー頻度を有していた。このペプチドは、高レスポンダー頻度のＩＬ２生成（62.5%）および僅かな頻度のＩＦＮγタンパク質（12.5%）を有していた。対照的に、ＭＡＰ２におけるオーバーラッピングFRT3-3／FRT3-4ペプチドおよび個々のペプチドは、CD8+Ｔ細胞増殖（44.4%）においては相当のレスポンダー頻度であったが、CD4+Ｔ細胞増殖（0%-33.3%）においては、ゼロ〜中程度の頻度を誘導した（表９）。ＭＡＰ２は、高ＩＬ２生成を誘導し、これは、ＩＦＮγ生成より僅かに高かった。FRT3-3とFRT3-4は両方共、中程度の頻度のＩＬ２を誘導したが、FRT3-4だけはFRT3-3による最小の頻度で、中程度の頻度のＩＦＮγを誘導した。
【０１１８】
CD4+またはCD8+Ｔ細胞免疫のいずれかを誘導した合計で４つのペプチドエピトープは、グループ１において４のうち１が完全な防御を、グループ２において４のうち２が部分的防御を与えた。部分的防御は、ＦＩＶ感染の遅延、CD4+Ｔ細胞数の緩やかな減少および／またはグループ３および４に比べたウイルス負荷の低さからなっていた。防御ネコのいないグループ２に比べると、グループ１はＭＡＰ１ｂ（Fp14-1）による免疫付与がなく、ＭＡＰ１（Fp4-3／Fp14-1）またはＭＡＰ２（FRT3-3／FRT3-4）による免疫付与が少なかった。試作ＦＩＶワクチンの１回の免疫付与のグループ３およびPBSプラセボの対照グループ４では防御が観察されなかった。
【０１１９】
各グループの動物の数は少ないが、本実験から６つの主な知見が得られた。第１に、４つのＴ細胞エピトープを含有するＭＡＰワクチン接種によるブーストは、部分的〜全体防御を与えた（グループ１）。第２に、有意のCD4+Ｔ細胞増殖を誘導するエピトープ（Fp4-3およびFp14-1）含めても、防御が増加するわけではなく、防御エピトープの効率を減少する。第３に、CD8+Ｔ細胞を誘導したエピトープは、防御に重要であると思われた。第４に、ＭＡＰワクチンは、飼いネコに安全に投与することができる。第５に、これは、in vitroＦＩＶ感染を増加した２つのエピトープFp14-3およびFRT3-3を示す初の報告である。さらに、増加エピトープ（FRT3-3）とＦＩＶ減少エピトープ（FRT3-4）のオーバーラップは、ＦＩＶ増加活性をブロックし、ＦＩＶ減少活性となった。第６に、試作ＦＩＶワクチンによる一回のプライミングは、防御は与えなかったが、代わりに、増加したＦＩＶ感染となった。知見２および３は、CD8+Ｔ細胞活性のみを誘導する（例えば、FRT3-3／FRT3-4）またはCD4+Ｔ細胞活性のみを誘導する（例えば、Fp4-3およびFp14-1）エピトープのいずれからなる追加実験によりさらに確認しなければならない。後述するＭＡＰワクチン実験２において、有意のCD8+Ｔ細胞活性を誘導したＦＩＶエピトープがＭＡＰへ処方され、混合ＭＡＰワクチンをネコに免疫付与し、ＦＩＶチャレンジに対する予防有効性について試験した。
【０１２０】
継続ＭＡＰワクチン改定実験２
ＭＡＰワクチン実験２において、有意のCD8+Ｔ細胞誘導活性を備えたＦＩＶエピトープを、ＦＩＶ構造／酵素タンパク質のペプチドエピトープと組み合わせた。各ＭＡＰを、予備ＭＡＰ実験で実施したように、ネコIL12（FeIL12）を補ったアジュバントと別箇に混合し、免疫付与の一回ワクチンとして混合する前に１０〜２０時間冷蔵した。１７匹の同年齢の特異病原体フリーのネコを３つのグループに分けた。グループ１（n=5）は、試作ＦＩＶワクチンでプライミングし、混合ＭＡＰワクチンで３回ブーストした。グループ２（n=6）は、プライミングなしで、混合ＭＡＰワクチンで３回ワクチン接種した。グループ３（n=6）は、半分に分け、PBSまたはFeIL12を補ったアジュバント中PBSにより免疫付与した。ワクチン接種期間のインターバルは４〜５週間の間で変え、最後のワクチン接種とＦＩＶチャレンジのインターバルは、グループ１については５週間、グループ２および３については６週間であった。予備ＭＡＰワクチン実験と同じく、ネコに、ＳＣおよびＩＤ免疫付与した。しかしながら、ＭＡＰの総量は、前回の実験と異なっていた。グループ１および２の各ワクチン接種の用量を図１２に示す。継続実験は、２回および３回目のワクチン接種でＭＡＰの総量が多く、ＭＡＰ免疫原は、ＩＤワクチン接種の方がＳＣワクチン接種よりも多かった。後者の理由は、ＩＤワクチン接種は、概して、粘膜部により多くのＴ細胞免疫を誘導するため、パルミチン酸を含むＭＡＰ骨格に対する抗体生成の可能性を減じるからである。予備実験において、ＭＡＰにおける個々のＦＩＶペプチドに対するELISA抗体は、検出されず、ＭＡＰ１に対する抗体は、２〜３回目のブーストと同じ位早く検出され、ＭＡＰ２に対する抗体は４回目のブースト後に有意に検出された。継続実験において、ネコは、抗ＭＡＰ抗体生成の可能性を減じるために、３回のＭＡＰワクチン接種のみを受けた。さらに、３回のワクチン接種は、４回のワクチン接種より、獣医にとっても楽である。
【０１２１】
予想通り、２回目のＭＡＰワクチン接種後のワクチン接種ネコのＦＩＶ特に免疫は、有意のCD8+Ｔ細胞増殖およびPBMCによる十分なＩＦＮγ生成であるが、少ないＩＬ２生成を示した。しかしながら、３回目のＭＡＰワクチン接種後、十分なCD8+Ｔ細胞増殖と更なるCD4+Ｔ細胞増殖が観察された。前の予備実験の結果と同様に、CD4+Ｔ細胞増殖より高いレスポンダー頻度が、CD8+Ｔ細胞増殖で観察された（図１３Ａ対４Ｂ、CD8+対CD4+Ｔ細胞応答の94対68バー）。グループ１においてＭＡＰ４、ＭＡＰ３およびＭＡＰ２／ＭＡＰ２ｖを３回ワクチン接種したが、グループ２は、ＭＡＰ３およびＭＡＰ２／ＭＡＰ２ｖを３回、ＭＡＰ４は１回のみであった。その他３つのＭＡＰ（ＭＡＰ５、ＭＡＰ９、ＭＡＰ１１）に２回ワクチン接種した。従って、２回ワクチン接種したＭＡＰおよび個々のペプチドに対しては低い応答が予想された。特に、ＭＡＰ４および個々のペプチドFp9-3に対するCD8+Ｔ細胞応答は、ＭＡＰ４による１回のワクチン接種でしか観察されなかった。概して、グループ１は、グループ２よりもＭＡＰおよびそのペプチドに対する免疫応答が多かった（図１３および１４）。グループ１は、試作ＦＩＶワクチンによりさらに１回プライミングされているため、このプライミングが、３回のＭＡＰブーストと共に、４回のワクチン接種となり、ＭＡＰおよび個々のペプチドに対する規模およびレスポンダー頻度が大幅に増大したと考えられる。特に、３回目のワクチン接種後、ＩＬ２生成が大幅に増加した。ＩＬ２およびＩＦＮγ応答は、前の予備実験で観察されたものよりもはるかに大きかった（図１０に比較して図１４）。目標は、ＩＬ２生成の規模およびレスポンダー頻度を増加し、ＭＡＰについて１０００ＳＦＵ未満のＩＦＮ生成を維持することであった。ＩＬ２生成についての目標は、グループ１とグループ２のＭＡＰ２で達成された。しかしながら、ＩＦＮγ生成の目標はグループについては達成されたが、グループ１では、非常に大きな規模のＩＦＮγ生成であったため達成されなかった。ＩＦＮγは、炎症サイトカインとして作用し、ＩＦＮγによる処理は、in vitroＦＩＶおよびＨＩＶ-1感染の増加を示した（TanabeおよびYamamoto, 2001; Yamamotoら1986）。継続実験において、予備実験よりも高いCD8+Ｔ細胞応答およびＩＬ２生成が観察され、これは、ＩＦＮγのＦＩＶ感染増加活性をブロックするのに役立つ。チャレンジ有効性からの結果（チャレンジ日、２０１５年９月２３日）が、かかる事象が生じたか判断することになる。
【０１２２】
ＨＩＶ−１ワクチン開発についての今後の実験
表１０は、交差反応性ＦＩＶペプチドエピトープのＨＩＶ−１の対応ペプチドも、ＨＩＶ+被験者のPBMCおよびＴ細胞において実質的なＨＩＶ特異免疫応答を刺激することを示している。この観察は、交差反応性ＦＩＶエピトープおよびその対応ＨＩＶエピトープは比較的保存されていることを示唆している。これはまた、かかる配列の変化は、ＨＩＶ−１とＦＩＶの両方のウイルス適合性に悪影響を及ぼすから、エピトープ配列のアミノ酸（aa）が、実質的に変化しないことも示している。HLA／FLA別基準標本に結合するaa残基のＨＩＶ／ＦＩＶ対応エピトープは、比較的保存またはより類似のaa変化である。実験では、ＨＩＶ／ＦＩＶ構造および酵素タンパク質にあえてＴ細胞エピトープを選択した。これらのタンパク質は、補助タンパク質（Vpr, Vpu, Nef）よりウイルス適合性に影響しそうなためである。さらに、ＦＩＶウイルスは、Vpr、VpuまたはNefを有さず、これらの補助遺伝子のない市販のＦＩＶワクチンの開発は成功していた（Sidneyら、2008）。このように、ウイルス構造／酵素タンパク質のＨＩＶ対応エピトープペプチドは、Ｔ細胞ベースのＨＩＶ−１ワクチンのための免疫原として有用である。
【０１２３】
ＭＡＰワクチン実験１および２において、ネコに、対応ＨＩＶペプチドの代わりに、ＨＩＶ／ＦＩＶ特異Ｔ細胞活性を刺激するＦＩＶペプチドを用いた。対応ＨＩＶペプチドの反応性について示すデータはないが、ＦＩＶワクチン接種ネコのPBMCとＴ細胞の両方が、ＦＩＶペプチドプールと、プール中の個々のペプチドに対する高応答とは異なり、対応ＨＩＶペプチドプールに対して低い応答か、または応答はなかった。この観察の理由として、Ｔ細胞は、ＦＩＶ感染ネコからでなく、ワクチン接種ネコからだったからという可能性がある。試作ＦＩＶワクチンは、不活性化デュアルサブタイプホールウイルスであり、感染中生じるのと同様のやり方でワクチンタンパク質を処理しない。部分的に有効なＨＩＶ−１ワクチン（すなわち、?40%有効性のワクチン）が利用できないため、ＨＩＶ+ヒト被験者からのPBMCおよびＴ細胞を用いた。それでも、ＨＩＶ+被験者のＴ細胞を用いることは、ＨＩＶ+被験者の免疫療法に必要なＨＩＶワクチンの免疫原として作用させるために、保存ＨＩＶ／ＦＩＶエピトープの可能性に関する直接的な情報を提供するのに重要である。かかるＴ細胞ベースのＨＩＶ−１ワクチンは、潜在的なＨＩＶ関連を活性化するために、ARTや薬剤（例えば、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤、JAK／STATトランスデューサーを活性化するサイトカイン、およびJAK／STATシグナリング経路の活性化因子）と組み合わせて用いるとき、ＨＩＶ感染の治療努力のために重要である（Mcllroy, 2013）。従って、ＦＩＶ感染を増加したペプチドFp4-3は、潜在的なＦＩＶ感染を活性化するのに有用である。Fp4-3の対応ＨＩＶペプチドおよびその他ＨＩＶペプチドは、ＨＩＶ−１感染を増加させる可能性について現在評価されている。
【０１２４】
ＭＡＰワクチン実験と同様に、対応ＨＩＶ−１エピトープペプチドはまず、免疫原性のためにHLAトランスジェニックマウスならびにＨＩＶ−１チャレンジに対するワクチン免疫および有効性のためにヒト化マウスにおいてＨＩＶ−１ワクチンのための免疫原として用いられる。交差反応性ＦＩＶエピトープペプチドは、対応ＨＩＶペプチドが、ＨＩＶ+被験者のＴ細胞を有するＦＩＶペプチドよりはるかに小さい応答を誘導する場合にのみ考慮される。
【０１２５】
Ｔ細胞活性を誘導するエピトープを含むＨＩＶ−１ペプチドの選択
ＨＩＶ−１ペプチドの選択は、ＦＩＶペプチドを評価するのと同様である。目標は、ヒト用のＨＩＶワクチンを開発することであるため、表９に示した交差反応性ＦＩＶペプチドのＨＩＶペプチド（表１０）対応物を、ＨＩＶ+被験者のPBMCおよびＴ細胞で試験した。分析された免疫機能は、ELISpotによるヒトＩＦＮγ生成、ＩＣＳによる細胞溶解素／細胞毒生成、およびＨＩＶ+被験者のCD3+CD4+およびCD3+CD8+Ｔ細胞のCFSEベースの増殖であった（表１０、第１のセットの結果）。また、ロスアラモス国立研究所（ＬＡＮＬ）データベースを用いて、保存対応ＨＩＶペプチドの配列内に存在し得るＣＴＬ活性を有するＨＩＶエピトープ配列のHLAアレルを同定した（表９、ＬＡＮＬ  ＣＴＬ）。太字HLAクラス-Iサブタイプおよび太字２桁アレルは、「最良のCD8+ＣＴＬエピトープ」のものであり、太字でないものは、潜在的なＣＴＬエピトープのアレルである。HLA-AおよびHLA-Bのみが、HLA別基準標本のポケットに結合するペプチドにおける類似性に基づいてスーパータイプと呼ばれるグループに分類された（Sidneyら2008）。HLA-DRB1のようなHLAクラスIIは、スーパータイプにはまだ完全には分類されていないため、HLA-DRB1アレルについての４桁の命名で示されている。
【０１２６】
表１０に示す予備データは、それぞれ、表９のＦＩＶペプチドFp14-1, Fp14-3, Fp14-4, FRT3-3, FT3-4およびFRT3-5の対応物であるＨＩＶ−１ペプチドHp14-1, Hp14-2, Hp14-3, HRT3-3, HRT3-4およびHRT3-5を示す。これらのＨＩＶ−１ペプチドおよび対応ＦＩＶペプチドは、多数のＨＩＶ+被験者において、CD8+Ｔ細胞増殖および細胞溶解素／細胞毒発現を誘導する。これらのＨＩＶ-１ペプチドは、異なるHLAアレルを有する非感染のヒトPBMCを用いてin vitro ＨＩＶ-１感染におけるエンハンサーおよびサプレッサーについてさらに試験される。目標は、表１０を完成させ、表１０から多数のＨＩＶ-１ペプチドを選択し、HLAトランスジェニックマウスおよびヒト化マウスにおいてワクチン免疫原として試験することである。
【０１２７】
表１０からの保存ＨＩＶ−１ペプチドをさらに選択するためのHLA分析の使用
表１０のＨＩＶ−１ペプチドの大半が、多くのＨＩＶ−１サブタイプ（サブタイプA, B, CおよびD）（表１１および１２）で保存されているため、ＨＩＶ−１サブタイプA, B, CおよびDによるＨＩＶ−１常在国におけるワクチン免疫原として有用なペプチドとなるはずである。さらに重要なのは、ＨＩＶ−１サブタイプCは、世界的に蔓延しているサブタイプであり、これにサブタイプBおよびAが続く（Taylorら2008）。
【０１２８】
これらのＨＩＶエピトープの次に重要なことは、ＨＩＶ常在地域における集団の優勢なHLAサブタイプおよびアレルが、これらのペプチドエピトープを認識するHLAサブタイプまたはアレル／別基準標本と同一または同様であるかどうかということである（表１０）。表１０においてＨＩＶ対応ペプチドについて最も多く観察されるHLAスーパータイプ（CTLの下に太字）は、B27およびA3、続いてB7およびB44である。B27を除いて、３つのスーパータイプは、米国において、アフリカ系アメリカ人および白色人種に蔓延している（表１３）。対照的に、スーパータイプB27は、１０位中第６位〜第８位である（表１３）。
【０１２９】
蔓延しているHLAの結合能を増加するために、HIVと同一の１−２aaをアミノ末端またはカルボキシル末端に加えることにより、これらのペプチドをさらに改善することができる。例えば、ペプチドをA3およびA2に結合させるために、ウイルスペプチドHPR1配列のアミノ末端にあるイソロイシンを加えた（表１０）。さらに、ペプチドが、HLA別基準標本のペプチド結合ポケットに接触する部位のaaを変更して、親和性を増加し、より強固な抗ウイルス免疫応答を与える。これらの改善を、HLAトランスジェニックマウスおよびヒト化マウスを用いて試験することができる。
【０１３０】
【表９】
2018528974.tif 000010
表９  脚注
a  B太字イタリックペプチドは、ＭＡＰワクチン実験で用いた。
b  レスポンダーの頻度:  0%-1.4%（-）, 1.5%-12.4%（±）, 12.5%-25%（+）, 25.1%-40%（++）, 40.1%-54%（+++）, >54%（++++）。
c  略称: CD4+Ｔ細胞（CD4+T）およびCD8+Ｔ細胞（CD8+T）増殖、細胞溶解素/細胞毒（cyto）生成、ＨＩＶ感染のエンハンサー／サプレッサー（E／S）
d  ネコのHLAアレルと同様の太字HLAスーパータイプ[5]または太字2-または4-桁アレル
e  HLAクラスI（Net MHC）、クラスII（NetMHCII）および細胞障害性Ｔ細胞（NetCTL）のHLAスーパータイプについてのMHCベースのネットワーク
f  太字HLAスーパータイプまたは2桁アレルは、飼いネコのネコ白血球抗原（FLA）のペプチド結合ポケットに似たHLAタンパク質（すなわち、別基準標本）を発現する。
黄色のハイライトは、ブルーのハイライトの前に最初に終了することを表している。
【０１３１】
【表１０】
2018528974.tif 000011
表１０  脚注
a  B太字イタリックペプチドは、ＭＡＰワクチン実験で用いたＦＩＶペプチドのＨＩＶ-1対応物。
b  レスポンダーの頻度:  0%-1.4%（-）, 1.5%-12.4%（±）, 12.5%-25%（+）, 25.1%-40%（++）, 40.1%-54%（+++）, >54%（++++）。
c  略称: CD4+Ｔ細胞（CD4+ T）およびCD8+Ｔ細胞（CD8+T）増殖、CD4+（CyCD4）およびCD8+（CyCD8）Ｔ細胞の細胞溶解素および細胞毒生成、ＨＩＶ感染のエンハンサー／サプレッサー（E／S）
d  LANL CTLの太字スーパータイプまたは2桁アレルは、LANLの最良CTLリストからであり、アンダーライン／イタリックは、NetMHCおよび／またはNetCTLにより求められるのと共通している。
e  HLAスーパータイプ[5]または2-または4-桁アレル
f  HLAクラスI（Net MHC）、クラスII（NetMHCII）および細胞障害性Ｔ細胞（NetCTL）のHLAスーパータイプについてのMHCベースのネットワーク。
g  太字のHLAスーパータイプまたは2-桁アレルは、LANL CTLの太字と共通、下線／イタリックは、LANL CTLの下線／イタリックと共通
黄色のハイライトは、ブルーのハイライトの前に最初に終了することを表している。
【０１３２】
【表１１】
2018528974.tif 000012
【０１３３】
【表１２】
2018528974.tif 000013
【０１３４】
【表１３】
2018528974.tif 000014
表１３  脚注
a  2014年の特定の国の合計人口数（Pop. No.）
b  CIA World Factbook using http://www.indexmundi.com/g/からの2013年度(HIVPR)の成人のHIV/AIDSの死亡または生存人口および%HIV有病率。
c  世界人口データベース（www. allelefrequencies.net/hla6006a.asp）におけるアレル頻度:  USA NMDPヨーロッパ白色人種、USA NMDPアフリカ系アメリカ人、ナイジェリア（258）、ケニヤルオ族（265）、南アフリカ黒色人種（204）、南アフリカ白色人種（102）、フランスリヨン（4815）、ポーランドpop 3（2907）、中国雲南省（101）およびタイpop 4（16807）、骨髄（BM）レジストリ、幹細胞（SC）レジストリまたは人類学（Anthro）スタディ。
d  [5]および生物医学糖尿病リサーチ学会に基づくスーパータイプ:  www.socbdr.org/rds/authors/unit_tables_conversions_and_genetic_dictionaries/genotype_ serotype_and_supertype_classification/
e  太字スーパータイプ: 遺伝子座の>20%。
f  各HLA遺伝子座での共優性発現に基づく100%までのHLA-AまたはHLA-B。
g  AIDSの進行の遅さ（*）または速さ（**）に関連する多重アレルのスーパータイプ。
h  HLA-A29、B*4415、B48およびB*8201は、スーパータイプ状態が未知のため除いた。
i  2013年に報告された多数の突然死についての理由は不明。前年までの少ない人数の補正と思われる。
【０１３５】
【表１４】
2018528974.tif 000015
表１４  脚注
CD8+Ｔ細胞細胞毒（パーフォリン、GrzAおよびB）（Cyto）;CD4+Ｔ細胞細胞毒 も高い（*）;MAP（Fp4-3／Fp14-1）（**）;ウイルス増加または減少（E／S）;Tat-MAP（tMAP）;パルミトイル化Pam-MAP（pMAP; ロスアラモス国立研究所データベース（LANL;進行中（Prog）;実施せず（N）;9月30日（Sept）または8月31日（Aug）に終了;レスポンダー頻度:0%-1.4%（-）,1.5%-12%（±）,12.5%-25%（+）,26%-40%（++）,41%-54%（+++）,>54%（++++）。合計スコア = MHCスコアプラス３回生物学的スコア。太字HLAアレルは、FLAアレルと同様のペプチド結合領域またはポケット結合パターンを有する。EpiVax IncによるFLA／HLA混合複合分析に基づくFLA予想:  FLA／HLA-*A3（75%） > B27（53%） > B44（33%）=A24（33%）=B7（33%） > A2（17%）=A1（13%） > B62（7%）=B8（7%） > A26／B39／B58（0%）; FLA／HLA-DRB1*0101（40%） >0301（29%） >0401／0404／0405（20%）  >1501（13%） >0801（7%） >1101（4%）。
【０１３６】
実施例２の材料および方法
動物および免疫付与
生後８週間の特定病原体除去（SPF）ネコをリバティ研究所から購入またはフロリダ大学で繁殖した。SPFネコを図６Ｂに示すようにグループに分け、第１回の免疫付与の前に３週間順化させた。全てのネコに、ＭＡＰワクチン（アジュバントまたはアジュバント／IL12入り）、FD-1アジュバント、FD-1アジュバント／IL12またはPBSのいずれかにより、６週間の間隔で、皮下または皮内経路により、合計３回免疫付与した。
【０１３７】
CD4+およびCD8+Ｔ細胞増殖
カルボキシフルオセインジアセテートスクリンイミドエステル（CFSE）増殖分析は、メーカーのプロトコル（Invitrogen, Grand Island, NY）に従って行い、前述のとおり、次の修正を用いて処理した（Roffら（2015））。修正は、APC共役抗マウスIgG3（Southern Biotech, Birmingham, AL）と組み合わせた、T. Miyazawa（日本、東京大学）の好意により提供された抗ネコCD3抗体（（クローンNZM1）、）、PE共役抗ネコCD4抗体（Southern Biotech）およびPE／Cy7-共役抗マウスIgG2b（Southern Biotech）と組み合わせた抗ネコCD8抗体（テネシー大学のN. Gengozianの好意により提供（Gengozianら（1997）））：これにより、ネコCD3+CD4+Ｔ細胞およびネコCD3+CD4+Ｔ細胞の増殖を検出した。図（図７Ａ−１、７Ｂ−１、７Ａ−２、７Ｂ−２、７Ａ−３、７Ｂ−３）に示した結果は全て、全対照ネコからの各結果の平均値を除算した後のものである。CFSE増殖の閾値は?0.5 CFSElowである。
【０１３８】
ＩＦＮγおよびＩＬ２生成応答
ＦＩＶ  ＭＡＰおよびペプチドに対するPBMCのネコＩＦＮγおよびＩＬ２  ELISpot分析を、前述のとおり（Abbottら（2012））、ネコＩＦＮγモジュラーキット（R&D Systems, Minneapolis, MN）およびネコＩＬ２モジュラーキット（R&D Systems）を用いて行った。図（図８Ａ−１、８Ｂ−１、８Ａ−２、８Ｂ−２、８Ａ−３、８Ｂ−３）に示した結果は全て、全対照ネコからの各結果の平均値を除算した後のものである。ＩＦＮγおよびＩＬ２応答は、1x106 PBMCあたり、?50スポット形成単位（SFU）である。
【０１３９】
サイトカイン、細胞溶解素および細胞毒 mRNA分析
サイトカイン（ＩＦＮγ, ＩＬ２, ＴＮＦα）、細胞溶解素（パーフォリン）および細胞毒（グランザイムAおよび B）mRNA分析を、前述したとおり、全ネコからのPBMCを用いて行った（Aranyosら（2016）; Omoriら（2004））。全サイトカインmRNAおよびパーフォリンmRNAについてはPCR増幅サイクルを35とし、グランザイムAおよびB mRNAについては45とする修正を行った。図９Ａおよび９Ｂに示した結果は全て、全対照ネコからの各結果の平均値を除算した後のものである。閾値は?2%相対密度値である。
【０１４０】
実施例２  ＭＡＰ実験２の免疫原性
序論
多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）実験の目的は、１）前のＭＡＰ実験１で最良の免疫原性を与えた４つのＭＡＰを用いてＭＡＰワクチンの免疫原性および２）個々のＭＡＰを構成するペプチドの最良の免疫原性を誘導するワクチン接種経路を判断することであった。全ての特定病原体除去（SPF）ネコに、100μgの各ＭＡＰから構成されたＭＡＰワクチンをワクチン接種し、ワクチン用量あたり合計400μgとした。この量は、前のＭＡＰ実験１での合計量より半分近く少なかった。
【０１４１】
ＭＡＰ実験２で用いた４つのＭＡＰは、左側の最も高い免疫原から右側の最も低い免疫原で示してある（図６Ａ）。ＭＡＰ４は、ＭＡＰ５より僅かに高い免疫原で、ＭＡＰ３、次にＭＡＰ２ｖが続く。ＭＡＰ４およびＭＡＰ３は、ＦＩＶコアタンパク質であるＦＩＶ p24（Fp）からの２つのペプチドからなっていた。一方、ＭＡＰ５およびＭＡＰ２ｖは、ウイルス酵素であるＦＩＶ逆転写酵素（FRT）からのペプチドで処方された。
【０１４２】
ＭＡＰは、リシン（Ｋ）骨格のカルボキシル末端にあるパルミチン酸（Pam）からなっており、２つのリシン分岐がＭＡＰのアミノ末端にあって、各リシン分岐は、２つの同一のＦＩＶペプチドに付加していて、ＭＡＰ毎に４つの同一のＦＩＶペプチドとなる（図６Ｂ）。ＭＡＰ４は、ＦＩＶ p24の中央領域にある単一の15merペプチドFp9から構成され、ＭＡＰ５は、ＦＩＶ RTの中央領域にあるペプチドFRT7-1およびFRT7-2のオーバーラッピングペプチド（FRT7-1／2）であった。ＭＡＰ３は、ＦＩＶ p24のカルボキシル末端に向かって位置しているペプチドFp14-3およびFp14-4のオーバーラッピングペプチド（Fp-14-3／4）から構成されていた。さらに、ＭＡＰ２ｖは、ＦＩＶ RTのアミノ末端に向かって位置するペプチドFRT3-3およびFRT3-4のオーバーラッピングペプチド（FRT3-3／4）からなっていた。
【０１４３】
試験したワクチン接種経路は皮下（SQ;ワクチングループ１）および皮内（ID;ワクチングループ２）ワクチン接種であり（図６Ｂ）、６週間の間隔で合計３回のワクチン接種を行った。最も一般的な市販のネコワクチンは、SQ経路のワクチン接種を麻酔なしで定期的に実施するものであるため、本実験は、ＭＡＰ実験１で用いたのと同じアジュバントFD-1を用いたＩＤワクチン接種と比較したSQワクチン接種の免疫原性を評価した。FD-1アジュバントは、水中油型で、市販の不活性化ＦＩＶおよびネコ白血病ウイルスワクチンに安全に用いられている（Uhlら（2002））。前のＭＡＰ実験１でもIDワクチン接種を用い、そのワクチンにネコIL12（5μg／用量）を補った。本実験２の免疫原性を、前の実験１のＭＡＰワクチンの免疫原性と比較するために、本実験２においても、IDワクチン接種のためのＭＡＰワクチンに、ネコIL12（図６Ｂ）を補った。
【０１４４】
ワクチングループ１および２は、それぞれ７匹のSPFネコからなっていた（n=7、図６Ｂ）。アジュバント対照グループ３ａおよび３ｂならびにPBS免疫付与グループ３ｃは、それぞれ３匹のSPFネコからなっており（n=3）、免疫付与していない対照グループ３ｄは、１匹のSPFネコからなっていた（n=1）。できる限り、ＩＤコードの最初の２文字によって識別される別腹生まれのSPFネコは、ワクチングループと対照グループに均一に分散させた（図６Ｂ）。SPFネコは全て、１回目の免疫付与の時は１０週であった。
【０１４５】
経時での免疫原性分析
前のＭＡＰ実験１に基づいて、本実験２は、ワクチン接種２回目６週間後（図７Ａ−１、７Ｂ−１、８Ａ−１、８Ｂ−１）、ワクチン接種３回目３週間後（図７Ａ−２、７Ｂ−２、７Ａ−３、７Ｂ−３）およびワクチン接種３回目６週間後（図７Ａ−３、７Ｂ−３）の免疫原性を評価した。実験１と同様の免疫パラメータを、実験２で評価した。評価した第１のパラメータは、個々のＭＡＰおよび各ＭＡＰを構成するＦＩＶペプチドに対するCD4+Ｔ細胞（図７Ａ−１、７Ａ−２、７Ａ−３）およびCD8+Ｔ細胞（図７Ｂ−１、７Ｂ−２、７Ｂ−３）の増殖応答であった。分析は、CD3+CD4+Ｔ細胞（またはCD4+Ｔ細胞）およびCD3+CD8+Ｔ細胞（またはCD8+Ｔ細胞）を同定するために、ネコCD4, CD8およびCD3に対して個々に標識抗体と組み合わせて用いられる、蛍光活性化セルソーター（FACS）ベースのカルボキシフルオセインジアセテートスクリンイミドエステル（CFSE）増殖分析からなっていた（Aranyosら（2016））。CD8+Ｔ細胞のＦＩＶ特異活性化により、CD8+Ｔ細胞の下位個体群を、ＦＩＶチャレンジしたワクチン接種ネコにおいてＦＩＶ感染細胞を殺すCD8+細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）へ分化させることができる。同様に、CD4+Ｔ細胞のＦＩＶ特異活性化により、CD4+Ｔ細胞の下位個体群を、ＦＩＶチャレンジのワクチン接種ネコにおいてＦＩＶ感染細胞を殺すCD4+ＣＴＬへ分化させることができる（Abbasら（2015）; Brownら（2010））。また、かかるワクチン誘導活性化により、ワクチン接種ネコにおいて、直接的または間接的にＦＩＶ特異CD8+ＣＴＬおよびCD4+ＣＴＬ活性を増加するCD4+Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞になるCD4+Ｔ細胞の下位固体群を誘導することができる（Abbasら（2015）; Brownら（2010））。
【０１４６】
評価した第２のパラメータは、ネコＩＬ２およびＩＦＮγ  ELISpot分析を用いて、ＦＩＶ  ＭＡＰおよびペプチド（図８Ａ−１、８Ａ−２、８Ａ−３、８Ｂ−１、８Ｂ−２、８Ｂ−３）に応答するＩＬ２およびインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）タンパク質を生成する、ワクチン接種および対照ネコの末梢血単核細胞（PBMC）の能力であった（Aranyosら（2016）; Abbottら（2012））。ＩＬ２は、ＦＩＶ特異CD4+Ｔ細胞およびCD8+Ｔ細胞の増殖を増加する。ＩＦＮγは、ワクチン接種ネコにおいてＦＩＶ特異ＣＴＬ活性を増加することが知られている（Abbasら（2015））。
【０１４７】
最後に、評価した第３のパラメータは、前述の研究所のmRNA分析システムを用いて、ＦＩＶ  ＭＡＰおよびペプチド（図９Ａ〜９Ｂ）に応答するサイトカイン（ＩＦＮγ, ＩＬ２, ＴＮＦα）、細胞溶解素（パーフォリン[Perf]）および細胞毒（グランザイムA[GrzA]およびB[GrzB]）mRNAを誘導する、３回目のワクチン接種／免疫付与後６週間のワクチン接種および対照ネコのPBMCの能力であった（Aranyosら（2016））。ＦＩＶ特異ＣＴＬは、ＦＩＶ感染細胞を破壊するパーフォリン、GrzAおよびGrzBを放出する。ELISA、ELISpotおよびFACS分析においてこれらのタンパク質を検出のに用いることのできるネコパーフォリン、GrzAおよびGrzBに対する抗体は、ネコには利用できないため、本評価では、代わりに、Perf、GrzAおよびGrzBに対するmRNAレベルを測定した。
【０１４８】
全対照ネコの平均結果は、図に示したワクチン接種ネコの各免疫原性結果から除算した（図７Ａ−１、７Ａ−２、７Ａ−３、７Ｂ−１、７Ｂ−２、７Ｂ−３、８Ａ−１、８Ａ−２、８Ａ−３、８Ｂ−１、８Ｂ−２、８Ｂ−３、９Ａ−９Ｂ）。従って、対照ネコの結果は示さなかった。
【０１４９】
ワクチン誘導CD4+Ｔ細胞およびCD8+Ｔ細胞増殖
ＦＩＶ特異CD4+Ｔ細胞増殖応答は、さらなるワクチン接種により、頻度（ＭＡＰおよびペプチドバーの総数）および規模（各ＭＡＰまたはペプチドバーの高さ）が増加した（図７Ａ−１対７Ａ−３）。Ｔ細胞応答は、ペプチドと相互作用する主要組織適合遺伝子複合体（MHC）に基づくため（Abbasら（2015））、不活性化ホールＦＩＶウイルス（IWV）を、陰性または最小応答対照刺激剤として用い、Ｔ細胞マイトジェンコンカナバリンA（ConA）を陽性対照として用いた。実験２における３回目のワクチン接種後３週間と、３回目のワクチン接種後６週間のＦＩＶ特異応答の頻度の比較をしたところ、略同じであった（図７Ａ−２対７Ａ−３）。さらに、SQ ＭＡＰワクチン接種ネコからのCD4+Ｔ細胞は、ＭＡＰワクチン接種ネコからのものよりも、ＦＩＶ特異CD4+Ｔ細胞増殖応答が多かった（灰色バーの数が、青色バーの数より多い、図７Ａ−１、７Ａ−２、７Ａ−３）。ＦＩＶ特異CD4+Ｔ細胞増殖応答は前の実験１よりも頻度も大きかった（実験１のデータは示していないが、前回提出してある）。
【０１５０】
前の実験１において、ＦＩＶ特異CD8+Ｔ細胞増殖応答は、ＦＩＶ特異CD4+Ｔ細胞増殖応答よりかなり多かった（データは示していないが、前回提出してある）。本実験２では、CD4+Ｔ細胞増殖応答は、ＦＩＶ特異CD8+Ｔ細胞増殖応答より多かった（図７Ａ−１対７Ｂ−１、７Ａ−２対７Ｂ−２、７Ａ−３対７Ｂ−３）。特に、SQ ＭＡＰワクチン接種ネコからのCD8+Ｔ細胞は、ID ＭＡＰワクチン接種ネコからよりも、ＦＩＶ特異CD4+Ｔ細胞増殖応答が少なく（青色バーの数が、灰色バーの数より少ない、図７Ｂ−１、７Ｂ−２、７Ｂ−３）、SQワクチン接種がより免疫原性があったことを示している。
【０１５１】
全体として、強固なCD4+Ｔ細胞およびCD8+Ｔ細胞増殖応答が、本実験２の３回のワクチン接種により観察された。重要なのは、CD8+Ｔ細胞増殖応答より多いCD4+Ｔ細胞増殖応答が、ＦＩＶ  ＭＡＰおよびペプチドに応答して、観察されたことである。
【０１５２】
ワクチン誘導ＩＬ２およびＩＦＮγ生成
ＦＩＶ  ＭＡＰおよびペプチドに対する最も高いＩＬ２応答頻度が、３回目のワクチン接種後６週間よりも、２回目のワクチン接種後３週間のワクチン接種ネコからのPBMCで観察された（図８Ａ−１対８Ａ−３）。ＩＬ２応答の最も高い頻度は、２回目のワクチン接種後６週間で、ペプチドFRT3-3、Fp14-4およびFRT7-2で観察されたが、ＩＬ２応答の最も高い頻度は、ペプチドFRT3-4でしか観察されたなかった（図８Ａ−１対８Ａ−３）。この観察結果は、エピトープ応答の変化が、経時で生じたことを示していた。概して、ＩＬ２生成応答の頻度は、SQ ＭＡＰワクチン接種ネコからのPBMCとID ＭＡＰワクチン接種ネコからのPBMC間と同様であった（図８Ａ−１、８Ａ−２、８Ａ−３）。
【０１５３】
上記のＩＬ２応答の最も高い頻度での時間と同様に、ＦＩＶ  ＭＡＰおよびペプチドに対するＩＦＮγ応答の最も高い頻度は、３回目のワクチン接種後６週間よりも２回目のワクチン接種後６週間のＭＡＰワクチン接種ネコからのPBMCで観察された（図８Ｂ−１対８Ｂ−３）。最大のＦＩＶ特異ＩＦＮγ応答は、２回目のワクチン接種後６週間のSQ とID ＭＡＰワクチン接種ネコの両方からのPBMCにおいてFRT7-2で観察され（１００％の割合）、３回目のワクチン接種後３〜６週間で大幅に減少した（２１．４％および２８．６％の割合）（図８Ｂ−１対８Ｂ−２、８Ｂ−１対８Ｂ−３）。対照的に、ペプチドFRT3-4に対するＩＦＮγ応答率は、２回目のワクチン接種後６週間で１４のうちわずか２であった（１４．３％）が、１４のうち９まで増えた（６４．３％）（図８Ｂ−１対８Ｂ−３）。これら２つの観察結果によれば、エピトープ応答の変化が経時で生じたことを示していた。ワクチン接種後全ての３時点でなされた一定の観察結果は、より頻度の多いＩＦＮγ応答が、SQ ＭＡＰワクチン接種ネコよりもID ＭＡＰワクチン接種ネコからのPBMCで観察されたということである（図８Ｂ−１、８Ｂ−２、８Ｂ−３）。後者の観察結果は、SQワクチンにおいてなかったIL12補充が、IDワクチンでなされたということによるものであろう。IL12は、PBMCからＩＦＮγの生成を増加することが知られている（Abbasら（2015））。
【０１５４】
全体として、一貫して観察されたのは、SQ ワクチン接種ネコからのPBMCのＩＬ２応答の頻度は、ワクチン接種後違う時点でのIDワクチン接種ネコからのものと大幅に違わなかったことである。逆に、ＩＦＮγ応答は、IDワクチン接種ネコからのPBMCにおいて主に検出された。
【０１５５】
サイトカイン／パーフォリン／グランザイムAおよびBのワクチン誘導mRNA発現
予備のサイトカイン／パーフォリン／グランザイムmRNA分析によれば、ペプチドFRT3-3、FRT3-4およびオーバーラップFRT3-3／4の組み合わせは、１匹のSQ ＭＡＰワクチン接種ネコからのPBMCにおいて、ＩＦＮγ、ＩＬ２、ＴＮＦαおよびGrzAの大部分のmRNA発現かつ非常に低レベルのパーフォリンを誘導することが示された（図９Ａ）。次の最も頻度の多いmRNA発現は、Fp14-3、Fp14-4およびオーバーラップFp14-3／4からなるペプチドプールの同じネコからのPBMCの刺激の際のＩＬ２、ＴＮＦαおよびGrzAについてであった。しかしながら、Fp9-3刺激ではmRNA発現は観察されず、FRT7-1、FRT7-2およびオーバーラップFRT7-1／2ペプチドプールで刺激したときにＴＮＦαおよびＩＬ２  mRNA発現のみが検出された。ID ＭＡＰワクチン接種ネコのPBMCにおいて、Fp14-3、Fp14-4およびオーバーラップFp14-3／4のペプチドプールおよびFRT3-3、FRT3-4およびFRT3-3／4のペプチドプールの刺激により、ＩＬ２発現は全て除き、ＩＦＮγ、ＩＬ２、ＴＮＦα、GrzAおよびGrzB mRNA発現が明らかに検出された（図９Ｂ）。これらの予備の結果によれば、サイトカイン／perf／Grz mRNA発現は、ＭＡＰワクチン接種ネコからのPBMCにおいてＦＩＶペプチドにより誘導できることを証明している。mRNA発現のペプチド特異誘導はまた、ＣＴＬ活性が、ＭＡＰワクチン接種ネコからのPBMCいにおいても存在していることが示される。
【０１５６】
表１５
抗レンチウイルス免疫原性、ネコ白血球抗原（FLA）相互作用およびレンチウイルスaa配列保存に基づく、ＦＩＶにおけるＴ細胞エピトープ選択
【０１５７】
試験した220ＦＩＶペプチドから求めた22のＦＩＶペプチドの免疫原性結果を、表１５に示す。これらのペプチドは、対応ＨＩＶ−１配列により、かなり高いaa配列保存であった。リストには、これらＦＩＶペプチドが含まれ、これらは、概して、６〜１０匹のＦＩＶワクチン接種ネコからのＴ細胞またはPBMCにおいて、最も多いCD8+Ｔ細胞増殖応答および中程度〜高いＩＦＮγおよびＩＬ２生成を誘導した。さらに、これらのペプチドを、８〜３０名のＨＩＶ+被験者からのPBMCまたはＴ細胞のＩＦＮγ生成、CD4+およびCD8+Ｔ細胞増殖、細胞溶解素（パーフォリン）、細胞毒（グランザイム A（GrzA）およびGrzB））mRNA生成についても分析した。レスポンダーの頻度は、６〜８匹のワクチン接種していないネコまたは８〜２０名のＨＩＶ陰性被験者からのPBMCまたはＴ細胞応答の平均除算後のワクチン接種ネコまたはＨＩＶ+被験者の個々の応答に基づくものである。用いたＨＩＶ+被験者は、低いＨＩＶ特異免疫応答を生じる抗レトロウイルス療法を受けていたため、p24またはRTからでないこれらのＦＩＶペプチドは非常に低い応答であった。
【０１５８】
陽性ＩＦＮγおよびＩＬ２  ELISpot応答の閾値は、106 PBMCあたり、?50スポット形成単位（SFU）である。CFSEベースのCD4+およびCD8+Ｔ細胞増殖は、?2% CD4+Ｔ細胞CFSElowまたはCD8+Ｔ細胞CFSElowである。FACSベースの細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）は、?0.2%である。レスポンダーの頻度を、試験した合計についての閾値レベル以上のレスポンダー数のパーセントで示す。0%-1.4%（-）, 1.5%-12.4%（±）, 12.5%-25%（+）, 25.1%-40%（++）, 40.1%-54%（+++）, >54%（++++）。黒色の９つのＦＩＶペプチドを、本ＭＡＰワクチン実験で用い、青色の１３のペプチドは用いなかった。赤枠の４つのＦＩＶペプチド（FRT3-3, FRT3-4, Fp4-3, Fp14-1）は、予備ＭＡＰワクチン実験で用いた。ＭＡＰおよび対応のペプチドの、ネコPBMC（ペプチドのE／SおよびＭＡＰのE／S）のin vitroＦＩＶ感染を増加または減少する能力についても試験した。
【０１５９】
理想的なＴ細胞ベースのＦＩＶワクチンは、抗ウイルスCD8+細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性を誘導する高レベルの細胞溶解素／細胞毒mRNAと共に、高レベルのCD8+Ｔ細胞増殖応答を誘導するワクチンペプチドを含有するものである。対照的に、高レベルのCD4+Ｔ細胞増殖およびＩＦＮγ生成を刺激するＦＩＶペプチドは、次の理由に基づいて、ＦＩＶ感染を増加する。高発現ＦＩＶ受容体（CD134またはOX40も活性マーカーである）による活性化CD4+Ｔ細胞は、ＦＩＶ感染を受けやすい（Weinberg, 2002; Shimojimaら2004）。さらに、ＩＦＮγは、PBMCのin vitroＦＩＶ感染を増加する（TanabeおよびYamamoto, 2001）。理想的なCD8+Ｔ細胞誘導ワクチンペプチドは、ウイルス適合性が、主要突然変異に大きく影響される配列部位のＡＩＤＳレンチウイルスによる高配列保存のものとする。
【０１６０】
これらのＦＩＶペプチドのヒト主要組織適合遺伝子複合体（MHC）またはヒト白血球抗原（HLA）に対する反応性について分析した。ネコのMHCまたはネコ白血球抗原（FLA）分子は、HLAと同様に結合ポケットを有するということを前に確認した。太字のHLAアレルは、FLAと同様のペプチド結合ポケットを有する。Net-MHC3.4サーバーは、HLAクラスI別基準標本に結合するペプチドを定義する。Net-CTL1.2は、結合してCD8+CTL活性を誘導し得るペプチドを定義する。Net-MHC2.2は、HLAクラスII（HLA-DRB）別基準標本に結合するペプチドを定義する。in silico分析によれば、本ＭＡＰワクチン実験に用いる９つのペプチドが、FLAに結合する可能性が高い１つ以上のエピトープを有することを示している。従って、これらのペプチドは、in silicoアルゴリズムにおいても、免疫原性となる可能性が高く、ＦＩＶワクチン接種ネコからのPBMCまたはＴ細胞により誘導される免疫原性により示される生物活性によって実証される。
【０１６１】
【表１５】
2018528974.tif 000016
表１５  脚注
CD8+Ｔ細胞細胞溶解素/細胞毒（パーフォリン, GrzAおよびB）（Cyto）; CD4+Ｔ細胞細胞毒も高い（*）;なお、p24またはRTからのペプチドは全て、有意のＨＩＶ+患者を用いてARTで分析したため、応答は非常に低い; ウイルス増加または減少（E／S）;レスポンダーの頻度: 0%-1.4%（-）, 1.5%-12.4%（±）, 12.5%-25%（+）, 25.1%-40%（++）, 40.1%-54%（+++）, >54%（++++）。太字HLAアレルは、FLAアレルと同様のペプチド結合ポケットを有する。
【０１６２】
表１６  抗レンチウイルス免疫原性、ヒト白血球抗原（HLA）相互作用およびレンチウイルスaa配列変換に基づくＨＩＶ−１でのＴ細胞エピトープの選択
ＦＩＶペプチドの対応ＨＩＶ−１ペプチドも、ＨＩＶ+被験者からのPBMCおよびＴ細胞を用いて免疫原性について試験した。これらＨＩＶ−１ペプチドは全て、対応ＦＩＶ配列による実質的に高いaa配列変換を有していた。p24またはRTからではないこれらのＨＩＶ−１ペプチドは、抗レトロウイルス療法（ART）のＨＩＶ+被験者からの結果であるため、非常に低い応答を有している。ARTのＨＩＶ+被験者は、概して、以前から報告があり（Mcllroy, 2013; Shanら2012）、本表に示すとおり、低いＨＩＶ特異免疫応答を有している。HRT7-1およびHRT7-2のまた、ARTのＨＩＶ+被験者からの細胞で試験した。陽性ＩＦＮγ  ELISpot応答の閾値は、106 PBMCあたり、?75スポット形成単位（SFU）である。CFSEベースCD4+（CD4+T）およびCD8+（CD8+T）Ｔ細胞増殖の閾値は、?2% CD4+Ｔ細胞CFSElowまたはCD8+Ｔ細胞CFSElowである。CD4+Ｔ細胞（CyCD4）およびCD8+Ｔ細胞（CyCD8）におけるFACSベース細胞溶解素（パーフォリン）および細胞毒（グランザイムAおよびB）の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）の閾値は、?0.2%である。レスポンダーの頻度を、試験した合計についての閾値レベル以上のレスポンダー数のパーセントで示す。0%-1.4%（-）, 1.5%-12.4%（±）, 12.5%-25%（+）, 25.1%-40%（++）, 40.1%-54%（+++）, >54%（++++）。黒色の９つのＨＩＶ−１ペプチドは、本ＭＡＰワクチン実験で用いた対応ＦＩＶペプチドであるが、青色の１３のペプチドは用いなかった。
【０１６３】
これらＨＩＶ−１ペプチドは、図２からのレンチウイルス保存ＦＩＶペプチドの対応であるため、aa配列類似性にも基づくＨＩＶペプチド配列（図９に示す選択されたペプチド）は、レンチウイルス保存され、容易に特別変異しそうもないと考えられる。
【０１６４】
【表１６】
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表１６  脚注
CD4+およびCD8+Ｔ細胞細胞溶解素／細胞毒（パーフォリン, GrzAおよびB）（CyCD4およびCyCD8）。なお、HRT7-1およびHRT7-2を除いて、p24またはRTからではないペプチドは全て、ARTの有意のＨＩＶ+患者を使って分析したため、応答は非常に低い。レスポンダーの頻度: 0%-1.4%（-）, 1.5%-12.4%（±）, 12.5%-25%（+）, 25.1%-40%（++）, 40.1%-54%（+++）, >54%（++++）。太字のＬＡＮＬ HLAアレルは、太字のin silico HLAアレルと共通。
【０１６５】
表１７  中央ネコ感染用量（15CID50）での病原体ＦＩＶチャレンジに対するＭＡＰワクチンの有効性
チャレンジ後12 wk（wpc）までで、対照グループ３で防御が観察されなかったとき、グループ１および２は、それぞれ、６０％および５０％の防御率である。前の予備ＭＡＰワクチン実験における同じチャレンジ用量（15 CID50）で、最後の対照ネコは、12 wpcで感染し、これは、本ＭＡＰワクチン実験１と同時である。自然ＦＩＶ感染用量は、2 CID50であるため（Yamamoto, 2009）、前および本チャレンジ用量は、12.5x自然感染用量である。より重要なのは、チャレンジＦＩＶFC1ウイルスは、市販のデュアルサブタイプＦＩＶワクチンにより誘導されるウイルス中和抗体に対して抵抗性がある病原体株であることであるウイルス中和抗体（Colemanら2014）。
【０１６６】
【表１７】
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【０１６７】
表１８  各ワクチン接種ネコで観察されたワクチンペプチドに対する合計免疫応答のまとめ
合計CD8+Ｔ細胞増殖応答、合計CD4+Ｔ細胞増殖および全てのワクチンペプチドに対する累積CD8+Ｔ細胞／CD4+Ｔ細胞応答比を追加し示した（上３行）。合計で１１のペプチドを分析したとき、CD8+Ｔ細胞増殖およびCD4+Ｔ細胞増殖のペプチドのパーセンテージ（%）、続いて、CD4+Ｔ細胞増殖によるペプチドの％に対するCD8+Ｔ細胞増殖によるペプチドの％を示す（中３行）。全てのワクチンペプチドに対するSFU／106 PBMCでの合計ＩＦＮγ応答および合計ＩＬ２応答を、各ワクチン接種ネコについて示す（最後２行）。赤色のグループ１（DV4, OLM）およびグループ２（DU5, DX1, OLL）は感染し、赤色の値は、これらのネコの防御が欠けている潜在的な理由を示唆するものである。6 wpc感染したグループ１の２匹のネコは、DVAとOLMである。これらのネコについては、ＩＦＮγおよびＩＬ２生成は最も高かったが、CD8 T-Cell／CD4Ｔ細胞応答比は最も低かった。9 wpc 感染したグループ２のネコは、DU5とDX1であり、１匹のネコOLLは、12 wpc感染であった。これらのネコについては、３匹とも、ＩＦＮγおよびＩＬ２生成は最も高かったが、２匹については、CD8Ｔ細胞／CD4Ｔ細胞応答比は最も低かった。代わりに、ネコDX1は、２番目に高いCD8／CD4Ｔ細胞応答比であったが、最高数（45%）のワクチンペプチド誘導CD4+Ｔ細胞増殖でもあった。DX1におけるCD4／CD8Ｔ細胞応答比は除き、12 wpcでの本結果は、高CD8／CD4Ｔ細胞応答比および低レベルのＩＦＮγおよびＩＬ２生成のワクチン接種ネコで防御が観察されることを示している。グループ１（DU1, DY2, EA4）およびグループ２（BFA, DU4, DX5）の防御ネコをさらに６週間モニターしたところ、完全防御か防御遅延のいずれかを示した。完全防御を確認するために、ネコは全て、PBMCばかりでなく、胸腺、骨髄、リンパ節細胞についてもＦＩＶ感染陰性でなければならず、感染誘導ＦＩＶ抗体について陰性でなければならない。
【０１６８】
【表１８】
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【０１６９】
表１９  ＦＩＶサブタイプA-Eについて配列保存されたワクチンペプチド
ＭＡＰの各ペプチドの、５つの全てのＦＩＶサブタイプ（A,B,C,D,E）中、アミノ酸（aa）配列保存について分析した。２つのペプチド配列間の符号は次のとおりである。同一aa（*）;非常に類似aa（:）;中程度に類似aa（.）;赤色aa残基は、ＦＩＶ（A,B,C,D,E）の対応のaa残基と類似していない。ＦＩＶサブタイプEのポリメラーゼ配列は、NCBI GenBankで利用不可である。ＭＡＰ４のp24ペプチドFp9-3は、評価した５つの全てのＦＩＶサブタイプの中で１００％配列同一性を有しており、優れたワクチンペプチドである。次に高いaa同一性および類似性のぺプチドは、ＭＡＰ５のFRT7-1／FRT7-2であり、ＭＡＰ３のFp14-3／Fp14-4およびＭＡＰ２vのFRT3-3／FRT3-4がこれに続く。結論として、上位４つのＭＡＰにおけるＦＩＶペプチドは全て、高いaa同一性および類似性を有しており、これらは高度に保存され、優れたワクチンペプチドとなる。
【０１７０】
【表１９】
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【０１７１】
表２０Ａ−２０Ｄ  ＦＩＶワクチンペプチドおよび対応ＨＩＶ-1ペプチドのアミノ酸配列保存
ＦＩＶに対するワクチンについて４つの最良のＦＩＶペプチドもまた、ＨＩＶ+被験者からのＴ細胞により認識される。ＭＡＰワクチン実験１の２つの最良のワクチンペプチドは、ペプチドFp9-3（表２０Ａ）とオーバーラッピングペプチドFRT7-1／FRT7-2である（表２０Ｂ）。ＦＩＶペプチドFp9-3は、対応のＨＩＶ-1ペプチド配列より類似性（５３％）および同一性（１３％）は少ないが（表２０Ａ）、このペプチドは、ＨＩＶ+被験者のCD8+Ｔ細胞により一貫して大きな規模で検出される。ＦＩＶオーバーラッピングペプチドFRT7-1／FRT7-2は、ＨＩＶ-1より、次に類似性（６５％）および同一性（５５％）の少ないものである（表２０Ｂ）。他の２つのＦＩＶオーバーラッピングペプチドFp14-3／Fp14-4（表２０Ｃ）およびFRT3-3／FRT3-4（表２０Ｄ）は、対応ＨＩＶ-1ペプチド配列に対して、大きなaa配列類似性（表２０Ｃにおいて７５％、表２０Ｄにおいて８０％）、中程度〜大きなaa配列同一性（表２０Ｃにおいて３１−３７％、表２０Ｄにおいて７０％）である。かかる配列保存はまた、対応のＳＩＶペプチド配列にも存在する。このように、配列保存は、これらのＦＩＶおよび対応のＨＩＶ-1ペプチド配列は、突然変異に対して抵抗がある可能性があり、主要突然変異はウイルス適合性に大きく影響し得るため、優れたワクチン免疫原として機能する。
【０１７２】
レンチウイルス配列保存はまた、対応ＨＩＶ-1およびＳＩＶ配列を比べることにより、配列保存セクションを求めるのは難しいことも示している。というのは、配列は、ＦＩＶ配列より互いにより類似しているからである。このように、対応ＨＩＶ-1およびＳＩＶ配列に比べると、ＦＩＶ配列の使用によって、ウイルスタンパク質の進化的に保存またはレンチウイルス保存配列セクションが容易に求められる。
【０１７３】
【表２０Ａ】
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【０１７４】
【表２０Ｂ】
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【０１７５】
【表２０Ｃ】
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【０１７６】
【表２０Ｄ】
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【０１７７】
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【配列表フリーテキスト】
【０１７８】
配列の説明
SEQ ID NOs:1-35および39-101は、本発明の範囲内のエピトープである。
SEQ ID NO:36は、FRT3-3ペプチド（KKKSGKWRLIDFRV）である。
SEQ ID NO:37は、FRT3-4ペプチド（WRLIDFRVLNKL）である。
SEQ ID NO:38は、本発明のペプチド（RVKR）に結合させるのに用いることができるリンカー配列の例である。
【図１】
2018528974.tif 000025
【図２Ａ】
2018528974.tif 000026
【図２Ｂ】
2018528974.tif 000027
【図３Ａ】
2018528974.tif 000028
【図３Ｂ】
2018528974.tif 000029
【図３Ｃ】
2018528974.tif 000030
【図３Ｄ】
2018528974.tif 000031
【図４Ａ−１】
2018528974.tif 000032
【図４Ａ−２】
2018528974.tif 000033
【図４Ｂ−１】
2018528974.tif 000034
【図４Ｂ−２】
2018528974.tif 000035
【図５】
2018528974.tif 000036
【図６Ａ】
2018528974.tif 000037
【図６Ｂ】
2018528974.tif 000038
【図７Ａ−１】
2018528974.tif 000039
【図７Ａ−２】
2018528974.tif 000040
【図７Ａ−３】
2018528974.tif 000041
【図７Ｂ−１】
2018528974.tif 000042
【図７Ｂ−２】
2018528974.tif 000043
【図７Ｂ−３】
2018528974.tif 000044
【図８Ａ−１】
2018528974.tif 000045
【図８Ａ−２】
2018528974.tif 000046
【図８Ａ−３】
2018528974.tif 000047
【図８Ｂ−１】
2018528974.tif 000048
【図８Ｂ−２】
2018528974.tif 000049
【図８Ｂ−３】
2018528974.tif 000050
【図９Ａ】
2018528974.tif 000051
【図９Ｂ】
2018528974.tif 000052
【図１０Ａ】
2018528974.tif 000053
【図１０Ｂ】
2018528974.tif 000054
【図１０Ｃ−Ｆ】
2018528974.tif 000055
【図１１Ａ】
2018528974.tif 000056
【図１１Ｂ】
2018528974.tif 000057
【図１１Ｃ】
2018528974.tif 000058
【図１１Ｄ】
2018528974.tif 000059
【図１２】
2018528974.tif 000060
【図１３Ａ】
2018528974.tif 000061
【図１３Ｂ】
2018528974.tif 000062
【図１４Ａ】
2018528974.tif 000063
【図１４Ｂ】
2018528974.tif 000064
【配列表】
2018528974000001.app
【国際調査報告】
2018528974.tif 000065
2018528974.tif 000066
2018528974.tif 000067