(57)【要約】  本明細書で提供されるものは、TNFと結合できる、単離された腫瘍壊死因子受容体（TNFR）ポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントであり、ここで、前記ポリペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列又は前記と少なくとも60%同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに前記ポリペプチド又はTNF結合フラグメントはN-末端VPAQVモチーフを含むが、ただし前記ポリペプチドはマウスTNFR p80アイソフォームではないことを条件とする。さらにまた、ある融合パートナーに連結された前記ポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントを含む融合タンパク質が提供され、前記融合パートナーは例えば免疫グロブリン重鎖定常領域のCH2及びCH3ドメインである。本明細書に開示するポリペプチド及び融合タンパク質は、TNF介在症状の（特に非ヒト動物（例えばネコ及びウマ）の）診断目的に及び治療又は予防で用いることができる。
2018504911.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
TNFと結合できる単離された腫瘍壊死因子受容体（TNFR）ポリペプチド又は当該ポリペプチドのTNF結合フラグメントであって、当該ポリペプチドが、配列番号:1のアミノ酸配列又は最適なアラインメント後に前記アミノ酸配列と少なくとも60%同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに当該ポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントがN-末端VPAQVモチーフを含むが、ただし当該ポリペプチドはマウスTNFR p80ではないことを条件とする、前記ポリペプチド又はそのTNF結合フラグメント。
【請求項２】
N-末端VPAQVVFモチーフを含む、請求項1に記載のポリペプチド又はそのTNF結合フラグメント。
【請求項３】
ポリペプチドが、最適なアラインメント後に配列番号:1と少なくとも85%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項2に記載のポリペプチド又はそのTNF結合フラグメント。
【請求項４】
ポリペプチドが、配列番号:1のアミノ酸配列を含むウマTNFRポリペプチドである、請求項2に記載のポリペプチド又はそのTNF結合フラグメント。
【請求項５】
ポリペプチドが、配列番号:2のアミノ酸配列又は最適なアラインメント後に前記と少なくとも85%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項2に記載のポリペプチド又はそのTNF結合フラグメント。
【請求項６】
ポリペプチドが、配列番号:3のアミノ酸配列又は最適なアラインメント後に前記と少なくとも85%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項2に記載のポリペプチド又はそのTNF結合フラグメント。
【請求項７】
ポリペプチドが、配列番号:1、配列番号:2及び配列番号:3から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項８】
N-末端VPAQVALモチーフを含む、請求項1に記載のポリペプチド又はそのTNF結合フラグメント。
【請求項９】
ポリペプチドが、配列番号:36のアミノ酸配列又は最適なアラインメント後に前記と少なくとも85%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項8に記載のポリペプチド又はそのTNF結合フラグメント。
【請求項１０】
ポリペプチドが、配列番号:37のアミノ酸配列又は最適なアラインメント後に前記と少なくとも85%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項8に記載のポリペプチド又はそのTNF結合フラグメント。
【請求項１１】
ポリペプチドが、配列番号:36及び配列番号:37から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る、請求項8に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項1から11のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドが配列番号:6の核酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
融合パートナーに連結された、請求項1から7のいずれか1項に記載のTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメント、を含む融合タンパク質。
【請求項１５】
融合パートナーが免疫グロブリン重鎖定常領域のCH2ドメイン及びCH3ドメインを含む、請求項14に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
融合パートナーがさらに免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域を含む、請求項14又は請求項15に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
ヒンジ領域が、配列番号:35のアミノ酸配列又は最適なアラインメント後に前記アミノ酸配列と少なくとも85%同一性を有するアミノ酸配列を含むウマIgGヒンジ領域である、請求項16に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
融合パートナーが、配列番号:7−13及び54−60から成る群から選択されるアミノ酸、又は最適なアラインメント後に配列番号:7−13及び54−60のいずれかと少なくとも85%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項14に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
融合パートナーが、配列番号:7−13及び54−60から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る、請求項14に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
配列番号:14、15及び21−34から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項14に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
配列番号:14、15及び21−34から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る、請求項14に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
融合パートナーに連結された、請求項8から11のいずれか1項に記載のTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメント、を含む融合タンパク質。
【請求項２３】
融合パートナーが免疫グロブリン重鎖定常領域のCH2ドメイン及びCH3ドメインを含む、請求項22に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
融合パートナーがさらに免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域を含む、請求項22又は請求項23に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
融合パートナーが、配列番号:43−45及び61−63から成る群から選択されるアミノ酸配列、又は最適なアラインメント後に配列番号:43−45及び61−63のいずれかと少なくとも85%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項22に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
融合パートナーが、配列番号:43−45及び61−63から成る群から選択されるアミノ酸から成る、請求項22に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
配列番号:40及び46−51から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項22に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
配列番号:40及び46−51から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る、請求項22に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
配列番号:14から28のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項３０】
請求項1から11のいずれか1項に記載のポリペプチド若しくはそのTNF結合フラグメント、又は請求項14から28のいずれか1項に記載の融合タンパク質、及び医薬的に許容できる担体又は賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項３１】
ウマのTNF介在症状の治療又は予防に使用される、請求項1から7のいずれか1項に記載のポリペプチド若しくはそのTNF結合フラグメント、又は請求項14から21のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
ネコのTNF介在症状の治療又は予防に使用される、請求項8から11のいずれか1項に記載のポリペプチド若しくはそのTNF結合フラグメント、又は請求項22から29のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
TNF介在症状が、炎症媒介症状、慢性炎症性疾患、関節炎、例えば免疫介在多発性関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症、多発性関節炎、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、全身性血管炎、アトピー性皮膚炎、うっ血性心不全、難治性ブドウ膜炎、気管支喘息、アレルギー症状、敗血症、ショック、真性糖尿病、並びに神経変性症状、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、卒中及び筋萎縮性側索硬化症から成る群から選択される、請求項31又は請求項32に記載のポリペプチド又は融合タンパク質。
【請求項３４】
ウマのTNF介在症状の治療又は予防用医薬の調製における、請求項1から7のいずれか1項に記載のポリペプチド若しくはそのTNF結合フラグメント、又は請求項14から21のいずれか1項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項３５】
ネコのTNF介在症状の治療又は予防用医薬の調製における、請求項8から11のいずれか1項に記載のポリペプチド若しくはそのTNF結合フラグメント、又は請求項23から29のいずれか1項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項３６】
TNF介在症状が、炎症媒介症状、慢性炎症性疾患、関節炎、例えば免疫介在多発性関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症、多発性関節炎、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、全身性血管炎、アトピー性皮膚炎、うっ血性心不全、難治性ブドウ膜炎、気管支喘息、アレルギー症状、敗血症、ショック、真性糖尿病、並びに神経変性症状、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、卒中及び筋萎縮性側索硬化症から成る群から選択される、請求項34又は請求項35に記載の使用。
【請求項３７】
ウマのTNF介在症状を治療又は予防する方法であって、請求項1から7のいずれか1項に記載のポリペプチド若しくはそのTNF結合フラグメント、又は請求項14から21のいずれか1項に記載の融合タンパク質の治療的に有効な量をその必要があるウマに投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３８】
ネコのTNF介在症状を治療又は予防する方法であって、請求項8から11のいずれか1項に記載のポリペプチド若しくはそのTNF結合フラグメント、又は請求項22から29のいずれか1項に記載の融合タンパク質の治療的に有効な量をその必要があるネコに投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３９】
TNF介在症状が、炎症媒介症状、慢性炎症性疾患、関節炎、例えば免疫介在多発性関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症、多発性関節炎、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、全身性血管炎、アトピー性皮膚炎、うっ血性心不全、難治性ブドウ膜炎、気管支喘息、アレルギー症状、敗血症、ショック、真性糖尿病、並びに神経変性症状、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、卒中及び筋萎縮性側索硬化症から成る群から選択される、請求項37又は請求項38に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に非ヒト動物で腫瘍壊死因子（TNF）と密接に関係する症状の治療、予防及び診断で有用な作用因子に関する。
【背景技術】
【０００２】
コンパニオン動物、競技用動物及び使役動物（例えばネコ、イヌ及びウマ）は、ヒトで生じる炎症性疾患と同様な疾患を発症し、それらの例には、血漿性リンパ球性滑膜炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、血管炎、及び多様な自己免疫皮膚疾患が含まれる。関節の外傷誘発性疾患は、比較的ありふれたもう1つの（特にウマの）疾患であり、軽度の“捻挫”から関節のための支えが完全に失われる重度の壊滅的損傷にまで広がりしばしば炎症を伴う。特に競走馬では、このことはしばしば、当該動物を実質的な経済的損失及び個人的損失にしたがって安楽死させる必要があることを意味する。
関節炎（例えば慢性関節リウマチ（RA）、変形性関節症、免疫介在多発性関節炎）（しばしば変性性関節疾患（DJD）と称される）は、コンパニオン動物及び競技用動物を悩ますもう1つの炎症症状である。典型的には痛みを伴うので、関節炎は動物が可動性を維持することを困難にする。この症状は、通常、関節軟骨が摩滅するゆっくりと進行する関節の慢性疾患と特徴づけられる。その重篤性及び生活の質における影響にもかかわらず、治療が薦められる場合には、関節炎に対する従来の（特に動物の）レジメンは、単に疾患をどうにかこうにか切り抜けて徴候（例えば痛み、こわばり及び不動性）を軽減するように設計される。例えば、関節炎の症状の重篤性に応じて、獣医師は、非ステロイド系抗炎症剤又は経口若しくは注射用関節サプリメント（例えばヒアルロン酸又はグルコサミン）を処方するかもしれない。罹患関節へのコルチコステロイド及びヒアルロン酸の直接注射もまたいくつかの事例で処方される。DJDは家畜動物（例えばネコ）で一般的であるという研究が報告されているが、コンパニオン動物におけるDJD、痛み及び可動性障害との直接的な関係については比較的わずかしか知られていない。
腫瘍壊死因子（TNF）アンタゴニスト（例えば抗TNF抗体、可溶性TNF受容体タンパク質及びTNF受容体-Fc融合タンパク質）の使用は、TNFによって媒介される炎症誘発作用をヒトで鎮静できることを示した。例えば、組換えTNFR-Fc融合タンパク質、例えばENBRELTM（エタネルセプト（Immunex））は、TNFアンタゴニスト作用を利用してヒト慢性関節リウマチを治療できることを示した。
炎症症状の治療で治療薬としてのENBRELTMの使用は人間では有望であることが示されたが、前記物質の非ヒト動物（例えばイヌ）の炎症症状治療のための使用はヒト疾患モデル以外には示されていない。これは、少なくとも部分的には、別の種に由来する異種タンパク質（例えばENBRELTM）が投与されるときに非ヒト種で生じる免疫原性に起因する。
非ヒト動物の炎症症状とともに、TNF媒介シグナリングによって悪化するか又はそうでなくても前記シグナリングと密接に関係する他の症状を治療することが希求される。
【発明の概要】
【０００３】
本開示は、部分的にはウマ及びネコTNFR p80アイソフォームの細胞外ドメインの正確なアミノ酸配列の同定に基づく。以前に発表されたアミノ酸配列ではこのドメインは同定されず、その結果、動物のTNFR製品の開発は不可能であった。本発明にしたがえば、TNFR p80ウマ及びネコアイソフォーム（そのTNF結合フラグメントを含む）及び前述のいずれかを含む融合タンパク質を治療又は予防薬剤として利用し、ウマ又はネコ対象動物でTNFの生物学的活性と結合させて当該活性を排除、阻害、停止、対抗、或いはまた遮断し、一方で、ウマ又はネコ対象動物への既存の異種薬剤の投与に典型的に随伴する免疫原性を最少化するか又は回避する。これらの薬剤はまた、少なくとも部分的にTNFが介在する症状の診断アッセイの開発で有用である。
ウマTNFR p80に関して、本発明者らは驚くべきことに、予測されたウマp80 TNFR配列（TNFRSF1B）（GenBankアクセッション番号XM_005607617によって示される（配列番号:19））は、ゲノム配列上で不正確に割り当てられたエクソン１に由来する不正確なリーダー配列（MGEEAGVEGARASPFYSYLLHVEKSPITFPLQ（配列番号:18））を有することを見出した。さらにまた、本発明者らは驚くべきことに、予測されたウマTNFR p80アミノ酸配列について示された不正確なリーダー配列はコンセンサスと一致せず、シグナルペプチドとして認識されないことを見出した。シグナルペプチドを欠く分子は（XM_005607617の場合のように）細胞から分泌されず、かくして機能しないであろう。したがって、予測されたウマTNFR p80アイソフォーム（XM_005607617）は、そのシグナル配列を欠くために哺乳動物細胞で発現不能である。
【０００４】
同様に、本発明者らは驚くべきことに、予測されたネコp80 TNFR配列（例えばGenBankアクセッション番号XP_003989632.1によって示される（配列番号:64））もまた、ゲノム配列上で不正確に割り当てられたエクソン１に由来する不正確なリーダー配列（MSNCGHVLALSGVPPGWVWGCS（配列番号:65））を有することを見出した。XP_003989632.1について示された不正確なリーダー配列はコンセンサスと一致せず、シグナルペプチドとして認識されない。シグナルペプチドを欠く分子は（XP_003989632.1の場合と同様に）細胞から分泌されず、したがって機能しないであろう。かくして、予測されたネコTNFR p80アイソフォーム（XP_003989632.1）は、そのシグナル配列を欠くために哺乳動物細胞で発現不能である。
ヒト、マウス、ブタ及びイヌTNFR p80アイソフォームのN-末端配列をコードするDNA配列で設計した縮重プライマーを使用することによって、本発明者らは、ウマ及びネコTNFR p80アイソフォームのN-末端配列を正確に同定した。シグナルペプチドは、翻訳されたアミノ酸配列について予測され、切断部位は類似の位置に存在する。シグナル配列の切断は、N-末端VPAQVモチーフを含む成熟TNFR p80ポリペプチドを生じる。
したがって、本明細書ではTNFと結合できる単離された腫瘍壊死因子受容体（TNFR）ポリペプチド、又は当該ポリペプチドのTNF結合フラグメントが与えられ、ここで、前記ポリペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列、又は最適なアラインメント後に前記配列と少なくとも60%類似性を有するアミノ酸配列を含み、さらに当該ポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントはN-末端VPAQVモチーフを含むが、ただし当該ポリペプチドはマウスTNFR p80ではないことを条件とする。ある実施態様では、当該ポリペプチドは、N-末端VPAQVVFモチーフを含むウマTNFR p80である。別の実施態様では、当該ポリペプチドはN-末端VPAQVALモチーフを含むネコTNFR p80である。
【０００５】
ある実施態様では、TNFに結合できる単離された腫瘍壊死因子受容体（TNFR）ポリペプチド又は当該ポリペプチドのTNF結合フラグメントが本明細書で教示され、ここで、前記ポリペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列、又は最適なアラインメント後に前記と少なくとも60%同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに当該ポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントはN-末端VPAQVモチーフを含むが、ただし当該ポリペプチドはマウスTNFR p80ではないことを条件とする。ある実施態様では、当該ポリペプチドは、N-末端VPAQVVFモチーフを含むウマTNFR p80である。別の実施態様では、当該ポリペプチドはN-末端VPAQVALモチーフを含むネコTNFR p80である。
本明細書では、本明細書に記載のポリペプチド又はTNF結合フラグメントをコードする単離ポリヌクレオチドが与えられる。ある実施態様では、配列番号:6の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドが提供される。
本明細書で教示されるものは、融合パートナーに連結された本明細書に記載のポリペプチド又はTNF結合フラグメントである。
本明細書はまた、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドを教示する。
本明細書で開示されるものは、本明細書に記載のポリペプチド、TNF結合フラグメント又は融合タンパク質のいずれかを含む医薬組成物である。
本明細書で提供されるものはまた、ウマのTNF介在症状の治療又は予防で使用される、本明細書に記載のポリペプチド、TNF結合フラグメント又は融合タンパク質のいずれかである。
さらにまた本明細書で提供されるものは、ネコのTNF介在症状の治療又は予防で使用される、本明細書に記載のポリペプチド、TNF結合フラグメント又は融合タンパク質のいずれかである。
【０００６】
本明細書で開示されるものは、ウマのTNF介在症状の治療又は予防用医薬の調製における、本明細書に記載のポリペプチド、TNF結合フラグメント又は融合タンパク質のいずれかの使用である。
本明細書で教示されるものは、ネコのTNF介在症状の治療又は予防用医薬の調製における、本明細書に記載のポリペプチド、TNF結合フラグメント又は融合タンパク質のいずれかの使用である。
本明細書で意図されるものは、ウマのTNF介在症状を治療又は予防する方法であって、前記方法は、本明細書に記載の当該ポリペプチド、TNF結合フラグメント又は融合タンパク質のいずれかの治療的に有効な量をその必要があるウマに投与する工程を含む。
さらにまた本明細書で意図されるものは、ネコのTNF介在症状を治療又は予防する方法であり、前記方法は、本明細書に記載の当該ポリペプチド、TNF結合フラグメント又は融合タンパク質のいずれかの治療的に有効な量をその必要があるネコに投与する工程を含む。
さらにまた本明細書で提供されるものは、本明細書に記載のTNFRポリペプチド、TNF結合フラグメント又は融合タンパク質のいずれかと特異的に結合することができる作用因子である。
さらにまた本明細書で与えられるものは、対象動物で異常なTNFR発現と密接に関係する症状を治療又は予防する方法であり、前記方法は、本明細書に記載のTNFR p80ポリペプチドに特異的に結合できる作用因子の治療的に有効な量をその必要がある対象動物に投与する工程を含む。
さらにまた本明細書で与えられるものは、TNFR p80の異常発現を伴う症状を対象動物で診断又はモニターする方法であり、前記方法は、TNFR p80の存在及び/又はレベルについて対象動物由来の生物学的サンプルを分析する工程の実施を含み、ここで前記実施工程は、生物学的サンプルを本明細書に記載のTNFR p80と特異的に結合できる作用因子と接触させる工程を含む。
さらにまた本明細書で開示されるものは、少なくとも部分的にTNFが介在する症状を対象動物で診断又はモニターする方法であり、前記方法、TNFRの存在及び/又はレベルについて対象動物由来の生物学的サンプルを分析する工程の実施を含み、ここで前記実施工程は、生物学的サンプルを本明細書に記載のTNFRポリペプチド、そのTNF結合フラグメント又は融合タンパク質と接触させる工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１−１】センスPCRプライマー、EqDegの設計のために用いられたp80 TNFR配列のDNAアラインメントを示す。プライマーEqDegの配列もまた示されている。ウマp80のエクソン2のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列もまた、EqGSP-1及びEqStdRリバースプライマー配列とともに示されている。
【図１−２】図１−１続き。
【図２Ａ】新規なウマTNFR p80エクソン1配列、クローンEqDegR2と対応するヒト、マウス、イヌ及びブタの配列とのアラインメントを示す。
【図２Ｂ】クローンEqDegR2についてシグナルペプチド切断部位のシグナル-P予測を示す（ここで、切断はN-末端バリン残基を含む成熟ウマTNFR p80ポリペプチドを生じる）。
【図３】予測されるウマ及びネコTNFR p80配列とブタ、ヒト、マウス及びイヌの公知の配列とのアラインメントを示す。エクソン1の境界の位置に注目されたい（矢印）。
【図４Ａ】XM_005607617（4A）のアミノ酸配列に対して実施したシグナル-P予測分析を示す。
【図４Ｂ】XM_005607617（4A）のヒトホモローグNM_001066（4B）のアミノ酸配列に対して実施したシグナル-P予測分析を示す。
【図５】ウマTNFR1A（p60）アイソフォームの正確な予測アミノ酸配列を示す。
【図６】ウマTNFR p80アイソフォームをコードするヌクレオチド配列を示す。
【図７】イヌ、マウス、ヒト及びブタTNFR p80アイソフォームのN-末端アミノ酸配列とアラインメントしたウマTNFR p80のN-末端アミノ酸配列を示す。TNFRシグナル配列切断部位は矢印で示されている。
【図８】縮重PCRフォワード（センス）及びリバース（アンチセンス）プライマー、FeGSP-1、FeGSP2及びFeGSP2nestのヌクレオチド配列を示す。鋳型は、FeGSP2でプライムしたネコ第一鎖cDNAであった。取消し線は、以前に予測されたネコTNFR p80のアミノ酸配列の不正確な5’配列（例えばGenbankアクセッション番号XP_003989632.1（配列番号:64）によって示される）である。
【図９】先に図8に示した、センス（EqDeg）及びアンチセンス（ネコGSP-1[GSP-1]又はネコGSP2nest[GSP2nest]）プライマーを用いて生成したPCR生成物の顕微鏡写真を示す。ネコGSP-1により得られたPCR生成物は約276bp（172bp＋104bp[骨格]）である。GSP2nestにより得られたPCR生成物は約356bp（252bp＋骨格）である。100bpラダーは顕微鏡写真の一番左に示されている。
【図１０】予測されるN-末端ウマ及びネコTNFR p80アミノ酸配列とブタ、ヒト、マウス及びイヌの公知のアミノ酸配列とのアラインメントを示す。シグナルペプチド切断部位は矢印で示される。“cat_1”及び“cat_2”アミノ酸配列は、縮重プライマーを用いた結果得られた異なるクローンを表す（図1参照）。2つのクローンは、シグナル配列内の6位のただ1つのアミノ酸残基が相違する。
【図１１】ネコTNFR p80の予測アミノ酸配列について実施したシグナル-P予測分析を示す。
【図１２Ａ】ネコTNFR p80融合ペプチド、NV-12（成熟ネコTNFR p80ポリペプチドの細胞外ドメイン並びにネコIgG1重鎖定常領域のヒンジ領域、CH2及びCH3ドメインを含むネコTNFR p80:HC1、NV-12（配列番号:40））の精製に用いられた条件を示す：MabSelect SuReクロマトグラフィー（図12A）。
【図１２Ｂ】ネコTNFR p80融合ペプチド、NV-12（成熟ネコTNFR p80ポリペプチドの細胞外ドメイン並びにネコIgG1重鎖定常領域のヒンジ領域、CH2及びCH3ドメインを含むネコTNFR p80:HC1、NV-12（配列番号:40））の精製に用いられた条件を示す：HiTrap Q XL:陰イオン交換クロマトグラフィー（図12B）。
【図１２Ｃ】ネコTNFR p80融合ペプチド、NV-12（成熟ネコTNFR p80ポリペプチドの細胞外ドメイン並びにネコIgG1重鎖定常領域のヒンジ領域、CH2及びCH3ドメインを含むネコTNFR p80:HC1、NV-12（配列番号:40））の精製に用いられた条件を示す：CHTセラミックヒドロキシアパタイト精製（図12C）。
【図１３】ネコTNFR p80-Fc融合ペプチド、NV-12のSDS-PAGEゲルの光学顕微鏡図である。これは、（i）MabSelect SuReクロマトグラフィー、（ii）HiTrap Q XL:陰イオン交換クロマトグラフィー及び（iii）CHTセラミックヒドロキシアパタイト精製を用いる3-工程プロセスによって精製された。SDS-PAGEゲル光学顕微鏡図の第一及び第三レーンは分子量マーカーを示し、第二及び第四のレーンは、非還元条件下（NR；第二レーン）及び還元条件下（R；第四レーン）の精製NV-12融合タンパク質のタンパク質バンドを示す。
【図１４】図12に示す3-工程精製プロセスの後のネコTNFR p80-Fc融合ペプチド、NV-12の溶出プロフィールを示す。
【図１５Ａ】ウマTNFR p80融合ペプチド、NV-11（成熟ウマTNFR p80のECD及びウマIgG2重鎖定常領域を含むウマTNFR p80:HC2（配列番号:14））の精製に用いられた条件を示す：MabSelect SuReクロマトグラフィー（図15A）。
【図１５Ｂ】ウマTNFR p80融合ペプチド、NV-11（成熟ウマTNFR p80のECD及びウマIgG2重鎖定常領域を含むウマTNFR p80:HC2（配列番号:14））の精製に用いられた条件を示す：QセファロースXL陰イオン交換クロマトグラフィー（図15B）。
【図１６】（i）MabSelect SuReクロマトグラフィー及び（ii）QセファロースXL陰イオン交換クロマトグラフィーを用いる2-工程プロセスによって精製されたウマTNFR p80-Fc融合ペプチド、NV-11の非還元条件下（A）及び還元条件下（B）のSDS-PAGEゲルの光学顕微鏡図を示す。各SDS-PAGEゲル光学顕微鏡図の第一レーンは分子量マーカーを示す。各SDS-PAGEゲル光学顕微鏡図の第二、第三及び第四のレーンは、出発材料（細胞培養上清：第二レーン）、その後のMabSelect SuReクロマトグラフィー精製（第三レーン）、及びその後に続くQセファロースXL陰イオン交換クロマトグラフィー精製（第四レーン）によるNV-11タンパク質バンドを示す。
【図１７】図15に示す2-工程精製プロセス後のウマTNFR p80-Fc融合ペプチド、NV-11の溶出プロフィールを示す。
【図１８】NV-12の薬物動態を示す。約2mg/kg体重のNV-12を2匹のネコ（対象動物番号1336及び85364）の静脈内に投与した。酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって、NV-12の血中レベルを投与後の種々の時点で測定した。NV-12の終末相半減期は約3.6日と概算された。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
特段の規定がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本発明が属する技術分野の通常の技量を有する者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似するか又は同等な任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験で用いることができるが、好ましい方法及び材料が記載される。本発明の目的のために、下記の用語は以下のように規定される。
冠詞“a”及び“an”は、当該冠詞の文法上の目的語の1つ又は2つ以上（すなわち少なくとも1つ）を指す。例示すれば、“a polypeptide”は、特段に指示がなければ、1つのポリペプチド又は2つ以上のポリペプチドを意味する。
本明細書を通して、文脈がまた違ったことを要求しないかぎり、“comprise（含む）”、“comprises”及び“comprising”という語は、記述された工程若しくは成分又は工程若しくは成分群を包含するが他の任意の工程若しくは成分又は工程若しくは成分群を排除しないことを暗示すると理解されよう。したがって、“comprising”などの用語の使用は、当該列挙された成分が要求されるか又は必須であるが、他の成分は任意選択であり存在してもしなくてもよいことを示す。
本開示は、少なくとも部分的にはTNFが介在する症状（炎症症状を含む）を、その必要があるウマ又はネコ対象動物で治療又は予防するためのポリペプチド、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、組成物、キット、使用及び方法を提供する。本明細書に記載するポリペプチド、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、組成物、キット、使用及び方法は、ウマ又はネコ対象動物で全身的に又は特定の解剖学的局所でTNF活性の排除、停止、対抗、阻害、或いはまた遮断のために役立つ。
【０００９】
ウマTNFRポリペプチド
本発明は、少なくとも部分的には本発明者らの以下の驚くべき発見を前提にしている：ウマ腫瘍壊死因子受容体（TNFR）p80アイソフォームは、切断されたときにN-末端バリン（V）残基を含むウマTNFR p80の成熟形（より具体的にはN-末端VPAQVモチーフ）を生じるシグナルペプチド配列を含む。このことは、以前に予測されたウマp80 TNFR配列（TNFRSF1B；Genbankアクセッション番号XM_005607617（配列番号:21））と対照的であり、本発明者らは、XM_005607617はゲノム配列上で不正確に割り当てられたエクソン1に由来する不正確なリーダー配列（MGEEAGVEGARASPFYSYLLHVEKSPITFPLQ（配列番号:20））を有することを明らかにした。XM_005607617で示された不正確なリーダー配列はコンセンサスと一致せず、シグナルペプチドとして認識されない。シグナルペプチドを欠くこの分子は、それが発現される細胞から分泌されず、したがって機能しない。
ヒト、マウス、ブタ及びイヌのそれぞれのTNFR p80アイソフォームのN-末端配列をコードする公知のDNA配列から設計した縮重プライマーを用いることによって、本発明者らは、ウマp80 TNFRのp80アイソフォームの正確なN-末端配列を同定した。シグナルペプチドは翻訳されたアミノ酸配列について予測され、シグナル配列の切断は、N-末端VPAQVモチーフを含む成熟ウマp80 TNFRポリペプチドを生じる。
したがって、本明細書で開示されるものは、TNFと結合できる単離ウマ腫瘍壊死因子受容体（TNFR）ポリペプチド又は当該ポリペプチドのTNF結合フラグメントであり、ここで、当該ポリペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列又は最適なアラインメント後に前記配列と少なくとも60%類似性を有するアミノ酸配列を含み、さらに当該ポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントはN-末端VPAQVモチーフを含むが、ただし当該ポリペプチドはマウスTNFR p80ではないことを条件とする。
さらにまた本明細書で開示されるものは、TNFと結合できる単離されたウマ腫瘍壊死因子受容体（TNFR）ポリペプチド又は当該ポリペプチドのTNF結合フラグメントであり、ここで、当該ポリペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列又は最適なアラインメント後に前記配列と少なくとも60%同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに当該ポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントはN-末端VPAQVモチーフを含むが、ただし当該ポリペプチドはマウスTNFR p80ではないことを条件とする。
【００１０】
マウスTNFR p80の成熟形はN-末端VPAQVVLモチーフ（GenBankアクセッション番号NP_035740（配列番号:53））を含む（予測シグナル配列切断部位を考慮した）。したがって、本明細書に開示するある実施態様では、当該ポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントはN-末端VPAQVVLモチーフを含まない。別の実施態様では、当該ポリペプチドは配列番号:52又は53のアミノ酸配列を含まない。
本明細書に開示するある実施態様では、当該ポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントは、ウマTNFR p80ポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントであり、N-末端VPAQVVFモチーフを含む。
理論又は特定の作用態様に拘束されないが、本発明の単離TNFR p80ポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントは、天然のままのウマTNFR p80アイソフォームのN-末端アミノ酸配列と配列同一性を共有するN-末端モチーフを有するために、当該単離ポリペプチド又はフラグメントをウマ対象動物へ投与した後の免疫原性が低いと期待される。このことは、アクセッション番号XM_005607617（配列番号:19）によって表される予測されたポリペプチド配列に基づくウマTNFR p80ポリペプチドと対照的であり、XM_005607617はそれが投与されたウマ宿主で異種抗体を生じる可能性がより高い。なぜならば、XM_00560761はウマにとって外来物であるN-末端アミノ酸配列を含むと思われるからである（すなわち、は天然のままのウマTNFR p80の正確なN-末端アミノ酸配列を含まない）。
ある実施態様では、当該ポリペプチドは、最適なアラインメント後に配列番号:1と少なくとも85%類似性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、当該ポリペプチドは、最適なアラインメント後に配列番号:1と少なくとも85%同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある実施態様では、当該ポリペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列を含むウマTNFRポリペプチドである。
ある実施態様では、当該ポリペプチドは、配列番号:2のアミノ酸配列又は最適なアラインメント後に前記と少なくとも85%類似性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、当該ポリペプチドは、最適なアラインメント後に配列番号:2と少なくとも85%同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある実施態様では、当該ポリペプチドは、配列番号:3のアミノ酸配列又は最適なアラインメント後に前記と少なくとも85%類似性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、当該ポリペプチドは、最適なアラインメント後に配列番号:3と少なくとも85%同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある実施態様では、当該ポリペプチドは、配列番号:1、配列番号:2及び配列番号:3からなる群から選択されるアミノ酸配列から成る。
本明細書に規定されるように、“equine（ウマ（科の動物））”及び“horse（ウマ）”という用語は、三名法による名称、エクウス・フェルス・カバルス（Equus ferus caballus）を有する亜種に属する種（蹄を有する（有蹄）哺乳動物である）に対して互換的に用いられる。ウマはウマ科（Equdae）の亜種であり、その中に分類される任意の種を含み、公知の300を超える品種のウマに及ぶ。
【００１１】
ネコTNFRポリペプチド
本発明はまた少なくとも部分的に以下の本発明者らの驚くべき発見に基づく：ネコTNFR p80アイソフォームは、切断されたときにN-末端バリン（V）残基を含むネコTNFR p80の成熟形（より具体的にはN-末端VPAQVモチーフ）を生じるシグナルペプチド配列を含む。このことは、例えばGenbankアクセッション番号XP_003989632.1（配列番号:64）によって表される、ゲノム配列で不正確に割り当てられたエクソン1に由来する不正確なリーダー配列（MSNCGHVLALSGVPPGWVWGCS（配列番号:65））を有する予測されたネコp80 TNFR配列と対照的である。XP_003989632.1で示される不正確なリーダー配列はコンセンサスと一致せず、シグナルペプチドとして認識されない。結果として、シグナルペプチドを欠くこの分子は、それが発現される細胞から分泌されず、したがって機能しない。
ヒト、マウス、ブタ及びイヌのTNFR p80アイソフォームのN-末端配列をコードする公知のDNA配列から設計した縮重プライマーを用いることによって、本発明者らは、ネコTNFRのp80アイソフォームの正確なN-末端配列を同定した。シグナルペプチドは翻訳されたアミノ酸配列について予測され、シグナル配列の切断は、N-末端VPAQVモチーフを含む成熟ネコp80 TNFRポリペプチドを生じる。
したがって、本明細書で開示されるものは、TNFと結合できる単離ネコ腫瘍壊死因子受容体（TNFR）ポリペプチド又は当該ポリペプチドのTNF結合フラグメントであり、ここで、当該ポリペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列又は最適なアラインメント後に前記と少なくとも60%類似性を有するアミノ酸配列を含み、さらに当該ポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントはN-末端VPAQVモチーフを含むが、ただし当該ポリペプチドはマウスTNFR p80ではないことを条件とする。
さらにまた本明細書で開示されるものは、TNFと結合できる単離されたネコ腫瘍壊死因子受容体（TNFR）ポリペプチド又は当該ポリペプチドのTNF結合フラグメントであり、ここで、当該ポリペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列又は最適なアラインメント後に前記と少なくとも60%同一性を有するアミノ酸配列を含み、さらに当該ポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントはN-末端VPAQVモチーフを含むが、ただし当該ポリペプチドはマウスTNFR p80ではないことを条件とする。
【００１２】
本明細書の別の箇所に特記したように、マウスTNFR p80の成熟形はN-末端VPAQVVLモチーフ（GenBankアクセッション番号NP_035740（配列番号:53））を含む（予測シグナル配列切断部位を考慮した）。したがって、本明細書に開示するある実施態様では、当該ポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントはN-末端VPAQVVLモチーフを含まない。別の実施態様では、当該ポリペプチドは配列番号:52又は53のアミノ酸配列を含まない。
本明細書に開示するある実施態様では、当該ポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントは、ネコTNFR p80ポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントであり、N-末端VPAQVALモチーフを含む。
理論又は特定の作用態様に拘束されないが、本発明の単離TNFR p80ポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントは、天然のままのネコTNFR p80アイソフォームのN-末端アミノ酸配列と配列同一性を共有するN-末端VPAQVモチーフを有するために、当該単離ポリペプチド又はフラグメントをネコ対象動物へ投与した後の免疫原性が低いと期待される。このことは、例えばアクセッション番号XP_003989632.1（配列番号:64）によって表される予測されたネコTNFR p80ポリペプチドと対照的であり、XP_003989632.1はそれが投与されたネコ対象動物で異種抗体を生じる可能性がより高い。なぜならば、XP_003989632.1はネコにとって外来物であるN-末端アミノ酸配列を含むと思われるからである（すなわち、天然のままのネコTNFR p80の正確なN-末端アミノ酸配列を含まない）。
本明細書に開示するある実施態様では、当該ポリペプチドは、配列番号:36のアミノ酸配列、又は最適なアラインメント後に前記と少なくとも85%類似性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書に開示する別の実施態様では、当該ポリペプチドは、最適なアラインメント後に配列番号:36と少なくとも85%同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書に開示するある実施態様では、当該ポリペプチドは、配列番号:37のアミノ酸配列、又は最適なアラインメント後に前記と少なくとも85%類似性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書に開示する別の実施態様では、当該ポリペプチドは、最適なアラインメント後に配列番号:37と少なくとも85%同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書に開示するある実施態様では、当該ポリペプチドは、配列番号:36及び配列番号:37から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る。
【００１３】
本明細書で用いられる“免疫原性の”、“免疫原性”などという用語は、典型的にはレシピエントに投与されたとき（液性又は細胞性）免疫応答を引き出すポリペプチドの能力の測定を指す。ある実施態様では、本発明のTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントは免疫原性をもたない。すなわち、標的種（すなわちウマ又はネコ）に投与されたときに、前記に対して異種抗体は当該ポリペプチドのN-末端配列に関して上昇しないであろう。別の実施態様では、本発明のTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントは検出可能な免疫原性をもたないであろう。すなわち、標的種（すなわちウマ又はネコ）に投与されたときに、前記に対して異種抗体力価は当該ポリペプチドのN-末端配列に関して上昇しないであろう。さらに別の実施態様では、本発明のTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントは低い免疫原性を有するであろう。すなわち、当該標的種（すなわちウマ又はネコ）へのその投与後に生じる検出可能な異種抗体力価は存在する可能性はあるけれども、当該異種抗体の力価は、標的種でTNFの生物学的活性を排除、阻害、停止、対抗、或いはまた低下させる、本明細書に記載するような、当該TNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントの能力に有害な影響を与えないほど低いであろう。“異種抗体”及び“複数の異種抗体”という用語は、典型的には宿主にとって外来物であるエピトープに対して宿主が生成する抗体を指す。
【００１４】
TNFRポリペプチド配列が標的種の生来のTNFRポリペプチド配列により類似すればするほど（すなわち配列同一性の程度が高ければ高いほど）、前記が投与される標的種でそれが異種抗体を生じる可能性が低いことは当業者には理解されよう。しかしながら、異種抗体の生成（又は異種抗体生成のリスク）は、その使用目的にとっては取るに足らないか又は重要ではない場合があり得ることもまた当業者には理解されよう。標的種の生来のTNFRポリペプチド配列と比較して、本発明のTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントのパーセンテージ同一性は、したがって所望される使用又は適用に左右され得る。例えば、TNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントがウマ又はネコ対象動物にシングル用量として（例えば急性TNF介在症状の治療又予防のために）投与される場合には、標的種のTNFR p80アイソフォームの生来の配列（例えばウマTNFR p80については配列番号:3、ネコTNFR p80については配列番号:36又は37によって表されるアミノ酸配列を含む）と比較して、パーセンテージ同一性は比較的低くあってもよい。なぜならば、in vivoでTNFと結合するTNFRポリペプチド又はTNF結合フラグメントの能力を中和、排除、停止、対抗、遮断或いはまた阻害するほど十分な異種抗体を当該投与されたTNFRポリペプチド又はフラグメントが生成するリスクは低いからである。
逆に、TNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントが一連のマルチ用量として（例えば慢性TNF介在症状の長期的治療又は予防のために）投与されるべき場合には、TNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントが、天然のままのTNFR p80アミノ酸配列（例えばウマTNFR p80については配列番号:3、ネコTNFR p80については配列番号:36又は37によって表される）とより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことは有益である（必ずしも必須というわけではない）。
“ポリペプチド”、“ペプチド”、“タンパク質”などの用語は、一連の直鎖状アミン酸残基であって隣接する残基のアルファアミノ基とカルボキシ基との間でペプチド結合によって互いに連結されてあるものを指すために、本明細書では互換的に用いられる。アミノ酸残基は通常は天然の“L”異性型である。しかしながら、所望の機能的特性が当該ポリペプチドによって維持される限り、“D”異性型の残基でいずれかのL-アミノ酸残基を置き換えることができる。
【００１５】
配列類似性及び同一性
“少なくとも60%”というのは、例えば、最適なアラインメント又は最良一致分析後の60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又100%配列類似性又は同一性を含む。
本明細書で用いられる“類似性”という用語は、比較される配列間のヌクレオチド又はアミノ酸レベルにおける正確な同一性を含む。ヌクレオチドレベルで同一性がない場合、“類似性”は、異なるアミノ酸を生じるがそれにもかかわらず構造的、機能的、生化学的及び/又は配座的レベルで互に関連する配列間の相違を含む。アミノ酸レベルで同一性がない場合、“類似性”は、それにもかかわらず構造的、機能的、生化学的及び/又は配座的レベルで互に関連するアミノ酸を含む。本明細書に開示するある実施態様では、ヌクレオチド及びアミノ酸配列比較は、類似性ではなく同一性のレベルで実施される。
2つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド間の配列の関係を記載するために用いられる用語には、“参照配列”、“比較ウインドウ”、“配列類似性”、“配列同一性”、“パーセンテージ配列類似性”、“パーセンテージ配列同一性”、“実質的に類似”及び“実質的な同一性”が含まれる。“参照配列”は、長さが少なくとも12の、しかししばしば15から18の、及びしばしば少なくとも25又はそれより大きい、例えば30のモノマーユニット（ヌクレオチド及びアミノ酸残基を含む）である。2つのポリヌクレオチドは各々、（1）2つのヌクレオチド間で類似する配列（すなわち完全なポリヌクレオチド配列の一部分のみ）、及び（2）2つのポリヌクレオチド間で不一致である配列を含むので、2つ（3つ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には2つのポリヌクレオチドの配列を“比較ウインドウ”にわたって比較して配列類似性を持つ局所領域を同定及び比較することによって実施される。“比較ウインドウ”は、参照配列と比較される例えば約12の連続するヌクレオチドの概念上のセグメントを指す。比較ウインドウは、2つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列と比較して約20%未満の付加又は欠失（すなわちギャップ）を含むことができる（参照配列は付加又は欠失を含まない）。比較ウインドウのアラインメントのための最適な配列アラインメントは、アルゴリズム（GAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA））のコンピュータによる実行、又は精査及び選択したいずれかの多様な方法によって作製した最良のアラインメント（すなわち比較ウインドウにわたって最高パーセンテージの相同性をもたらす）によって達成できる。参照もまた、例えばAltschulら（Altschul et al. (1997) Nucl. Acids. Res. 25:3389）が開示したプログラムのBLASTファミリーに対して実施できる。配列分析の詳細な考察は以下の文献のユニット19.3で見出すことができる（Ausubel et al. (1994-1998) In: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc.）。
【００１６】
本明細書で用いられる“配列類似性”及び“配列同一性”という用語は、配列が、ある比較ウインドウにわたって一ヌクレオチド毎に又は一アミノ酸毎に同一である程度、又は機能的若しくは構造的に類似である程度を指す。したがって、例えば“配列同一性のパーセンテージ”は、2つの最適にアラインメントした配列を比較ウインドウにわたって比較し、同一の核酸塩基（例えばA、T、C、G、I）又は同一のアミノ酸残基（例えばAla、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys及びMet）が両配列で生じる位置の数を決定してマッチした位置の数を入手し、マッチした位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数（すなわちウインドウサイズ）で割り、さらに結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを入手することによって計算される。本発明の目的のためには、“配列同一性”は、DNASISコンピュータプログラム（ウインドウズ用バージョン2.5；日立ソフトウェアエンジニアリング（Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, USA）から入手できる）で、当該ソフトウェアに付随する参照マニュアルで用いられる標準デフォルトを用いることによって計算される“マッチパーセンテージ”を意味することは理解されるであろう。同様な注釈が配列類似性に関して適用される。
本明細書で用いられる“配列同一性”という用語は、比較される配列間のヌクレオチド又はアミノ酸レベルにおける正確な同一性を含む。本明細書ではこの用語はまた、ヌクレオチド又はアミノ酸レベルにおける正確ではない同一性（すなわち類似性）を含むためにも用いられ、この場合、配列間のいずれの相違も、当該相違にもかかわらず互いに構造的、機能的、生化学的及び/又は配座的レベルで互に関連するアミノ酸（又はヌクレオチドの場合には、前記ヌクレオチドによってコードされるアミノ酸）に関する。ある実施態様では、ヌクレオチド及び配列比較は、類似性ではなく同一性のレベルで実施される。例えば、ロイシンはイソロイシン又はバリンのために代用できる。これは保存的置換と称することができる。ある実施態様では、アミノ酸配列は、その中に含まれるアミノ酸残基のいずれかを保存的置換の方法によって改変でき、したがって当該改変は、未改変ポリペプチドと比較したとき、改変されたポリペプチドの結合特異性又は機能的活性に全く又はほとんど影響を与えない。
【００１７】
本発明のポリペプチド又はそのTNF結合フラグメント、又は前記のいずれかを含む本明細書に記載の融合タンパク質に関する配列同一性は、配列をアラインメントし必要な場合にはギャップを導入して最大パーセンテージ相同性を達成した後で、かつ配列同一性の部分として保存的置換を考慮しないで、対応するポリペプチド、フラグメント又は融合タンパク質の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージに関する。N-若しくはC-末端伸長も挿入も配列同一性又は相同性を減じるとは解されない。
TNFRポリペプチドのTNFに対する結合親和性は当該ポリペプチドのアミノ酸配列に応じて変動し得ることは当業者には理解されよう。例えば、いくつかの事例では、TNFR p80の細胞外ドメインの末端短縮型を含むTNFRポリペプチドは、例えば天然のままのTNFR p80配列又は対応するウマ若しくはネコTNFR p80（例えば配列番号:36または37）の完全な細胞外ドメインを含むTNFR p80ポリペプチドと比較して、ウマ又はネコTNFに対して低い結合親和性を有し得るが、それでもなおウマ又はネコTNFと結合し、それによってその生物学的活性をin vitro又はin vivoで排除、阻害、停止、対抗、或いはまた遮断することができる。TNFRポリペプチドのウマ又はネコTNFに対する結合親和性を決定する方法は当業者には公知であろうが、その例示的な例は本明細書の別の箇所に開示される。in vivoでウマ又はネコTNFの生物学的活性を排除、阻害、停止、対抗、或いはまた遮断する有効量でその必要があるウマ又はネコ対象動物に治療薬剤又は予防薬剤として本発明のTNFRポリペプチド有効量を投与できるように、当該TNFRポリペプチドがウマ又はネコTNFに対し十分に高い結合親和性を有することは一般的に所望されよう。本明細書に開示するある実施態様では、TNFRポリペプチドは、平衡解離定数（KD）1ｘ10-8以下の結合親和性でウマTNF-アルファと結合する。
【００１８】
TNF結合フラグメント
本明細書で用いられる、“TNF結合フラグメント”、“結合フラグメント”などは、TNFRポリペプチドに関するときは、in vitro又はin vivoでTNF（例えばTNF-アルファ及び/又はTNF-ベータ）と、特に同じ種のTNF（すなわちウマ及び/又はネコTNF）と結合する能力を保持しているTNFRポリペプチドの部分を指す。本発明のTNFRポリペプチドのフラグメントがウマ又はネコTNFと結合できるか否かを決定する適切な方法は、当業者には公知であろう。例えば、ウマ又はネコTNF:TNFR-フラグメント複合体の形成を可能にするある期間及び条件下で、フラグメントをウマ又はネコTNFリガンドに暴露し、生じた混合物を例えばゲル電気泳動によって分離し、それによって形成された複合体をサイズに基づいてフラグメント及びリガンドから区別することができる。いくつかの実施態様では、フラグメント又はリガンドを検出可能な部分（例えば放射性同位元素又は蛍光色素）で標識し、ウマ又はネコTNF:TNFR複合体の検出を促進できる。TNF結合フラグメントのウマ又はネコTNFと結合する能力はまた適切な機能的アッセイを用いることによって決定できる。例えば、ある方法を用いて、TNF結合フラグメントがウマ又はネコTNFと結合しその活性を阻害できるか否かを決定できる。本明細書で用いられる、“生物学的活性”という用語は、TNFの任意の1つ以上の固有の生物学的活性（in vivoで見出されるように天然に存在するか、又は組換え手段によって提供若しくは可能であるかにかかわらない）を指す。ウマ又はネコTNFに付随する生物学的活性は当業者には公知であろう。例示的な例には、受容体結合及び/又は活性化、細胞シグナリング又は細胞分裂の誘発、細胞増殖阻害、サイトカイン生成誘発、アポトーシス及び酵素活性の誘発が含まれるが、ただしこれらに限定されない。ウマTNFの生物学的活性を決定する方法もまた当業者には公知であろう。例示的な例には細胞系アッセイが含まれる。例えば、TNFRを発現し、ウマ又はネコTNFへの暴露時に測定可能な生物学的作用を生じる細胞を、本発明のTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントの存在下又は非存在下でウマTNFに暴露する。続いて測定を実施するか観察を行い、TNFRポリペプチド又はそのフラグメントが、ウマ又はネコTNFによって当該細胞で誘発された生物学的作用を排除、阻害、停止、対抗、或いはまた低下させたか否かを決定する。
【００１９】
ある実施態様では、TNF結合フラグメントは、トランスメンブレン及び細胞質ドメインを欠きしかもTNF結合部分（ウマ又はネコTNFと結合できる）を含む細胞外ドメインを維持する末端短縮TNFRポリペプチドを含むか、前記末端短縮めTNFRポリペプチドから成るか、又は本質的に前記末端短縮TNFRポリペプチドから成る。
本明細書に開示するある実施態様では、TNF結合フラグメントは、ウマTNFR p80のCDR2又はCDR3 TNF結合ドメインを含むウマTNFR p80のTNF結合フラグメントである。本明細書に開示するある実施態様では、TNF結合フラグメントは、ウマTNFR p80のCDR2ドメイン及びCDR3ドメインを含むウマTNFR p80のTNF結合フラグメントである。ある実施態様では、TNF結合フラグメントは、配列番号:1のアミノ酸配列、又は前記配列に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、96%、97%、98%又は99%配列類似性を有するアミノ酸配列から成り、ここで、当該TNF結合フラグメントはN-末端VPAQVモチーフを含む。別の実施態様では、TNF結合フラグメントは、配列番号:1のアミノ酸配列、又は前記配列に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するアミノ酸配列から成り、ここで、当該TNF結合フラグメントはN-末端VPAQVモチーフを含む。ある実施態様では、TNF結合フラグメントはVPAQVVモチーフを含む。別の実施態様では、TNF結合フラグメントはN-末端VPAQVVFモチーフを含む。
ある実施態様では、TNF結合フラグメントは配列番号:3のアミノ酸配列から成る。
本明細書に開示するさらに別の実施態様では、TNF結合フラグメントは、ネコTNFR p80のCDR2又はCDR3 TNF結合ドメインを含むネコTNFR p80のTNF結合フラグメントである。本明細書に開示するある実施態様では、TNF結合フラグメントは、ネコTNFR p80のCDR2ドメイン及びCDR3ドメインを含むネコTNFR p80のTNF結合フラグメントである。ある実施態様では、TNF結合フラグメントは、配列番号:36若しくは配列番号:37のアミノ酸配列、又は前記配列に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、96%、97%、98%又は99%配列類似性を有するアミノ酸配列から成り、ここで、当該TNF結合フラグメントはN-末端VPAQVモチーフを含む。別の実施態様では、TNF結合フラグメントは、配列番号:36若しくは配列番号:37のアミノ酸配列、又は前記配列に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するアミノ酸配列から成り、ここで、当該TNF結合フラグメントはN-末端VPAQVモチーフを含む。べつの実施態様では、TNF結合フラグメントはN-末端VPAQVAモチーフを含む。別の実施態様では、TNFRポリペプチドはN-末端VPAQVALモチーフを含む。
【００２０】
ある実施態様では、TNF結合フラグメントは、配列番号:36又は配列番号:37のアミノ酸配列から成る。
典型的には、本明細書に記載するTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントはTNF中和ポリペプチド又はフラグメントである。本明細書で用いられる、“中和”という用語は、TNFRポリペプチド又はTNF結合部分を含むフラグメントを言う（TNF-結合部分は、すなわち、ウマ又はネコTNFと結合でき、TNFの生物学的活性をin vivo又はin vitroで排除、阻害、停止、対抗、或いはまた遮断するTNFRポリペプチド部分である）。ある実施態様では、中和TNFRポリペプチド又はフラグメント（TNFアンタゴニスト、アンタゴニスト性TNFRポリペプチド、又は遮断TNFRポリペプチド（特異的及び好ましくは選択的）とも称される）はウマTNFと結合して、ウマTNFの1つ以上の生物学的活性を阻害する。例えば、中和TNFRポリペプチドは、ウマTNFとその標的受容体（例えば細胞膜結合TNF受容体1（TNFR1）受容体（CD120a））との結合を阻害できる。別の実施態様では、中和TNFRポリペプチド又はフラグメントは、特異的及び好ましくは選択的にネコTNFと結合し、ネコTNFの1つ以上の生物学的活性を阻害する。例えば、中和TNFRポリペプチドは、ネコTNFとその標的受容体（例えば細胞膜結合TNF受容体1（TNFR1）受容体（CD120a））との結合を阻害できる。
“特異的に結合する”という語句は、本明細書に記載するTNFRポリペプチド又はフラグメントとTNF（特異的にウマ又はネコTNF）との結合を指す（当該TNFは他の物質（他のポリペプチド及びタンパク質を含む）の不均質集団中に存在する）。したがって、特異的な免疫アッセイ中に存在するとき、本発明のTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントはウマ又はネコTNFと結合し、存在し得る他のタンパク質とは結合しないであろう（又は有意な量では結合しないであろう）。
【００２１】
融合タンパク質
さらに本明細書で開示されるものは、融合パートナーに連結した又は別な方法で融合パートナーに接着した、本明細書に記載するTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントである。
本明細書に開示する融合タンパク質はキメラ融合タンパク質でもよい。すなわち、キメラ融合タンパク質は異なる種に由来する少なくとも2つのドメインを含んでもよい。これらのドメインは、キメラ、ダイマー又は融合ポリペプチドとしてまとめられる。例えば、本明細書に記載のTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントは、ウマTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントであることができ、融合パートナーは非ウマ種に由来してもよい（すなわち、ウマ以外の種に由来するアミノ酸配列を含んでもよい）。同様に、本明細書に記載のTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントは、ネコTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントであることができ、融合パートナーは非ネコ種に由来してもよい（すなわち、ネコ以外の種に由来するアミノ酸配列を含んでもよい）。本明細書に開示するある実施態様では、キメラ融合タンパク質は、ネコに由来する融合パートナーに連結された、ウマTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントを含む。本明細書に開示する別の実施態様では、キメラ融合タンパク質は、ウマに由来する融合パートナーに連結された、ネコTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントを含む。しかしながら、融合タンパク質が、ある標的種に投与されるべき治療薬剤又は予防薬剤として（或いは治療薬剤又は予防薬剤の部分として）用いられる場合、融合タンパク質は当該標的種にとって生来の融合タンパク質を含み、それによって、もしそうでなければ異種構成要素（すなわち当該標的種以外の種に由来する構成要素）を含む融合タンパク質の使用に付随するであろう免疫原性は最少化又は回避されることは理解されるであろう。したがって、本明細書に開示するある実施態様では、融合タンパク質は、ウマに由来する融合パートナーに連結した、本明細書に記載のウマTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントを含む。本明細書に開示する別の実施態様では、融合タンパク質は、ネコに由来する融合パートナーに連結した、本明細書に記載のネコTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントを含む。
【００２２】
本明細書に開示するある実施態様では、TNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントは、前記ポリペプチド又はフラグメントのC-末端又はN-末端で融合パートナーに連結、接着、或いはまた結合させられる。融合パートナーの好ましい連結、接着又は結合は、当該融合パートナーがTNFと結合するべき前記ポリペプチド又はフラグメントの能力を阻害或いはまた遮断しないような位置で生じることは理解されるであろう。本明細書に開示するある実施態様では、TNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントは、前記ポリペプチド又はフラグメントのC-末端で融合パートナーと連結、接着、或いはまた結合される。
TNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントは、当業者に公知の適切な手段によって融合パートナーに連結、接着、或いはまた結合させることができる。例示的な例では、融合パートナーは、共有結合又は非共有結合の手段によってTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントに連結できる。別の例示的な例では、融合パートナーは、本明細書の別の箇所に記載するように、組換え手段によってTNFRポリペプチド又はそのTNF結合タンパク質に連結できる（すなわち、融合タンパク質は組換え手段（例えば組換えDNA技術）によって生成される）。
融合パートナーの選択は、融合タンパク質の提案される適用又は使用によって少なくとも部分的に決定されるであろう。例えば、いくつかの実施態様では、融合パートナーは、所望の解剖学的作用部位（例えば異常なTNF活性の部位）へのTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントの標的誘導を助けるであろう。この目的のための適切な融合パートナーは当業者には公知であろう。例示的な例では、融合パートナーは、細胞又は組織によって発現されるある標的リガンド（例えばタンパク質、抗原、エピトープ、核酸分子）と結合できる標的誘導部分であろう。適切な標的誘導部分の例には、標的リガンドと特異的に結合できる受容体（例えば可溶性受容体）及び抗体又はそのリガンド結合フラグメント（例えば単鎖Fv（scFv）、Fabなど）が含まれる。いくつかの実施態様では、融合パートナーは、それが連結されるTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントのin vivoクリアランスの低下を助けるであろう。他の実施態様では、融合パートナーは、それが連結されるTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントのin vivo安定性の改善を助けるであろう。融合パートナーが連結されるTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントの安定性を改善することができる適切な融合パートナーは当業者には公知であろう。例示的な例には、免疫グロブリン分子（例えばIgG）のFc領域又はその部分（例えば免疫グロブリン重鎖定常領域）が含まれる。理論又はいずれの特定の作用態様にも拘束されないが、免疫グロブリン（例えばIgG）重鎖定常領域のFc領域又はその部分は、TNFRポリペプチドのin vitro及びin vivoにおける可溶性、半減期及び/又は安定性を改善できることは理解される。Fc領域又はその部分の利用はまた、例えばタンパク質G/タンパク質A親和性クロマトグラフィーによる精製を容易にさせる。
【００２３】
任意の種に由来する融合パートナー（例えばヒト、イヌ、ネコ、ブタ及びネズミFc免疫グロブリン領域又はその部分）を、本発明の融合タンパク質で用いることができる。本明細書の別の箇所で特記するように、いくつかの例では、ある標的種（例えばウマ又はネコ）に投与したときに異種抗体の生成リスクを最少化又は回避する融合タンパク質を作製することが所望され得る。例えば、実質的に免疫学的に不活性な融合パートナーを用いることによって標的種に投与したときの免疫原性が最少化又は回避される。すなわち、本発明の融合タンパク質が標的種（例えばウマ又はネコ）に投与されるときに異種抗体を生じるリスクが最少化又は回避される。このことは、融合タンパク質が対象動物にある期間にわたってマルチ用量で投与される場合には特に有益である（例えば、少なくとも部分的にTNFが介在する慢性症状の治療のため）。
本明細書に開示するある実施態様では、融合パートナーは、免疫グロブリン重鎖定常領域のCH2ドメイン及び/又はCH3ドメインを含む。
本明細書の別の箇所で特記するように、融合タンパク質が、標的種に投与されるべき治療薬剤又は予防薬剤として（或いは治療薬剤又は予防薬剤の部分として）用いられる場合には、当該融合タンパク質は当該標的種にとって生来のものであり、それによって、そうでなければ異種構成要素（すなわち標的種以外の種に由来する構成要素）を含む融合タンパク質の使用に付随するであろう免疫原性は最小化又は回避される。したがって、融合タンパク質がウマに投与される場合は、ウマにとって生来の免疫グロブリン重鎖定常領域のCH2ドメイン及び/又はCH3ドメイン（例えばウマ免疫グロブリンに由来する）が用いられよう。同様に、融合タンパク質がネコに投与される場合は、ネコにとって生来の免疫グロブリン重鎖定常領域のCH2ドメイン及び/又はCH3ドメイン（例えばネコ免疫グロブリンに由来する）が用いられよう。
【００２４】
本明細書に開示するある実施態様では、融合タンパク質は、ウマIgGの重鎖定常領域のCH2ドメイン及び/又はCH3ドメインを含む。ウマ免疫グロブリン重鎖定常領域（ウマIgG及びそのアイソタイプを含む）のアミノ酸配列は当業者には公知であろう。ウマ免疫グロブリンガンマ（IgG）に関しては、7つの別個の重鎖定常ドメインアイソタイプ（IgG1−IgG7）が同定されている。したがって、ある実施態様では、融合パートナーは、IgG1（配列番号:7）、IgG2（配列番号:8）、IgG3（配列番号:9）、IgG4（配列番号:10）、IgG5（配列番号:11）、IgG6（配列番号:12）、及びIgG7（配列番号:13）から成る群から選択されるウマIgGアイソタイプの重鎖定常領域のCH2ドメイン及び/又はCH3ドメインを含む。本明細書に開示するある実施態様では、融合パートナーは、本明細書に記載するウマIg分子（例えばウマIgG分子）の重鎖定常領域のCH2ドメイン及びCH3ドメインを含む。
本明細書に開示する別の実施態様では、融合タンパク質は、ネコ免疫グロブリン分子の重鎖定常領域のCH2ドメイン及び/又はCH3ドメインを含む。ネコ免疫グロブリン重鎖定常領域（それらのCH2及びCH3ドメインを含む）のアミノ酸配列は、例えば本明細書に開示する配列番号:43−45に示すように当業者には公知であろう。ある実施態様では、ネコ免疫グロブリンはネコIgGである。本明細書に開示するある実施態様では、融合パートナーは、本明細書に記載するネコIg分子（例えばネコIgG分子）の重鎖定常領域のCH2ドメイン及びCH3ドメインを含む。
本明細書に開示する別の実施態様では、融合パートナーはさらに免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域を含む。免疫グロブリン重鎖定常領域に由来する適切なヒンジ領域は当業者には公知であろう。しかしながら、融合タンパク質が、ある標的種に投与されるべき治療薬剤又は予防薬剤として（或いは治療薬剤又は予防薬剤の部分として）用いられる場合、ヒンジ領域は当該標的種にとって生来のヒンジ領域であることが所望され得ることは理解されるであろう。それによって、もしそうでなければ異種ヒンジ領域（すなわち当該標的種以外の種の免疫グロブリンに由来するヒンジ領域）の使用に付随するであろう免疫原性は最少化又は回避される。したがって、融合タンパク質がウマに投与される場合は、ウマにとって生来のヒンジ領域（例えばウマ免疫グロブリンに由来する）を使用することが所望される。同様に、融合タンパク質がネコに投与される場合は、ネコにとって生来のヒンジ領域（例えばネコ免疫グロブリンに由来する）を使用することが所望される。
【００２５】
本明細書に開示するある実施態様では、ヒンジ領域はウマ免疫グロブリンヒンジ領域である。適切なウマ免疫グロブリンヒンジ領域は当業者には公知であり、その例示的な例にはウマIgG及びそのサブタイプが含まれる。したがって、本明細書に開示するある実施態様では、ヒンジ領域はウマIgGヒンジ領域である。ある実施態様では、ウマIgGヒンジ領域は、配列番号:7−13及び54−60に示されるヒンジ領域のアミノ酸配列、又は最適なアラインメント後に配列番号:7−13及び54−60のいずれかと少なくとも85%類似性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、ウマIgGヒンジ領域は、最適なアラインメント後に配列番号:7−13及び54−60のいずれかと少なくとも85%同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施態様では、ウマIgGヒンジ領域は、配列番号:7−13及び54−60のいずれか1つに示されるヒンジ領域のアミノ酸配列から成る。別の実施態様では、ヒンジ領域は、配列番号:35のアミノ酸配列、又は最適なアラインメント後に前記と少なくとも85%類似性を有するアミノ酸配列を含むウマIgGヒンジ領域である。別の実施態様では、ヒンジ領域は、最適なアラインメント後に配列番号:35と少なくとも85%同一性を有するアミノ酸配列を含むウマIgGヒンジ領域である。別の実施態様では、ヒンジ領域は配列番号:35のアミノ酸配列から成る。
本明細書に開示するある実施態様では、融合パートナーは、配列番号:7−13及び54−60、又は最適なアラインメント後に配列番号:7−13及び54−60のいずれかと少なくとも85%類似性を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。本明細書に開示する別の実施態様では、融合パートナーは、最適なアラインメント後に配列番号:7−13及び54−60のいずれかと少なくとも85%同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、融合パートナーは、配列番号:7−13及び54−60から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る。
本明細書に開示するある実施態様では、融合タンパク質は、配列番号:14、15及び21−34、又は最適なアラインメント後に配列番号:14、15及び21−34のいずれかと少なくとも85%類似性を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。本明細書に開示する別の実施態様では、融合タンパク質は、最適なアラインメント後に配列番号:14、15及び21−34のいずれかと少なくとも85%同一性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書に開示するある実施態様では、融合タンパク質は、配列番号:14、15及び21−34から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る。
【００２６】
本明細書に開示する別の実施態様では、ヒンジ領域はネコ免疫グロブリンヒンジ領域である。適切なネコ免疫グロブリンヒンジ領域は当業者には公知であり、その例示的な例にはネコIgG及びそのサブタイプが含まれる。したがって、本明細書に開示するある実施態様では、ヒンジ領域はネコIgGヒンジ領域である。ある実施態様では、ネコIgGヒンジ領域は、配列番号:43−45及び61−63に示されるヒンジ領域のアミノ酸配列、又は最適なアラインメント後に配列番号:43−45及び61−63のいずれかと少なくとも85%類似性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、ネコIgGヒンジ領域は、最適なアラインメント後に配列番号:43−45及び61−63のいずれかと少なくとも85%同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施態様では、ネコIgGヒンジ領域は、配列番号:43−45及び61−63のいずれか1つに示されるヒンジ領域のアミノ酸配列から成る。
本明細書に開示するある実施態様では、融合パートナーは、配列番号:43−45及び61−63、又は最適なアラインメント後に配列番号:43−45及び61−63のいずれかと少なくとも85%類似性を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。本明細書に開示する別の実施態様では、融合パートナーは、最適なアラインメント後に配列番号:43−45及び61−63のいずれかと少なくとも85%同一性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書に開示する別の実施態様では、融合パートナーは、配列番号:43−45及び61−63から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る。
本明細書に開示するある実施態様では、融合タンパク質は、配列番号:40及び46−51、又は最適なアラインメント後に配列番号:40及び46−51のいずれかと少なくとも85%類似性を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。本明細書に開示する別の実施態様では、融合タンパク質は、最適なアラインメント後に配列番号:40及び46−51のいずれかと少なくとも85%同一性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書に開示するある実施態様では、融合タンパク質は、配列番号:40及び46−51から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る。
【００２７】
TNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントは、共有結合によって融合パートナーと連結させることができる。いくつかの実施態様では、リンカー（例えばポリペプチドリンカー）を用いて、TNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントを共有結合により連結して融合タンパク質を形成できる。本明細書では前記融合タンパク質はまた、融合ポリペプチド、キメラ融合ポリペプチド又はイムノコンジュゲートと称される。いくつかの実施態様では、リンカー領域は必要とされない。例えば、構造的可撓性が免疫グロブリン重鎖定常領域のヒンジ領域によって付与され、そのようなヒンジ領域（又はそのフラグメント）が、本明細書に記載する本発明の融合タンパク質に存在する場合である。別の実施態様では、融合タンパク質はさらに、TNFRポリペプチドと融合パートナーとの間に機能的に挿入されたリンカーを含む。
“リンカー”とは、2つの分子（すなわちTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメント及び融合パートナー）を連結し、当該2つの分子を所望の配座に置く1つの分子又は分子群（例えばモノマー又はポリマー）を意味する。
ある実施態様では、本発明の融合タンパク質は、TNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントのC-末端に結合される融合パートナーを含む。別の実施態様では、融合タンパク質は、TNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントのN-末端に結合される融合パートナーを含み、ウマTNFと結合しin vitro又はin vivoでTNFの生物学的活性を排除、停止、対抗、阻害或いはまた遮断するTNFRポリペプチドの能力に有害な影響を与えない。
【００２８】
本発明は、TNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントを融合パートナーに結合させる、当業者に公知の任意の適切な方法を意図し、その非限定的な例には以下が含まれる：
（i）カルボジイミド又は他の適切なカップリング剤を用いて、TNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントの遊離アミノ基と、融合パートナー又は融合パートナーに融合或いは結合したリンカーの遊離カルボキシル基との間にアミド結合を形成する；
（ii）カルボジイミド又は他の適切なカップリング剤を用いて、融合パートナーの遊離アミノ基と、TNFRポリペプチド若しくはそのTNF結合フラグメントの遊離カルボキシル基、又はTNFRポリペプチド若しくはそのTNF結合フラグメントに融合或いは結合したリンカーペプチドの遊離カルボキシル基との間にアミド結合を形成する；
（iii）MBS（m-マレイミドネムゾイックアシド（m-maleimidonemzoic acid）N-ヒドロキシスクシンイミドエステル）を用い、TNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントのC-末端に付加したシステインのチオール基、又はTNFRポリペプチド若しくはそのTNF結合フラグメントに結合或いは融合されたリンカーペプチドのC-末端に付加したシステインのチオール基を介して、融合パートナーのN-末端の遊離アミノ基に連結する；
（iv）MBS（m-マレイミドネムゾイックアシドN-ヒドロキシスクシンイミドエステル）を用い、融合パートナーのC-末端に付加したシステインのチオール基、又は融合パートナーに接着或いは融合したリンカーペプチドのC-末端に付加したシステインのチオール基を介してTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントのN-末端の遊離アミノ基に連結する；
（v）グルタルアルデヒドを用いて、融合パートナー又は融合パートナーに融合或いは接着したリンカータンパク質上の遊離アミノ基と、TNFRポリペプチド若しくはそのTNF結合フラグメント又はTNFRポリペプチド若しくはそのTNF結合フラグメントに融合或いは接着したリンカータンパク質上の遊離アミノ基とで複合体を形成させる；
（vi）グルタルアルデヒドを用いて、TNFRポリペプチド若しくはそのTNF結合フラグメント又はTNFRポリペプチド若しくはそのTNF結合フラグメントに融合或いは接着したリンカータンパク質上の遊離アミノ基と、融合パートナー又は融合パートナーに融合或いは接着したリンカータンパク質上の遊離アミノ基とで複合体を形成させる；
（vii）SO2Cl又はトリアゾールを用いて、融合パートナーのアミンをTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントのアルデヒド含有部分とカップリングさせる；又は
（viii）SO2Cl又はトリアゾールを用いて、TNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントのアミンを融合パートナーのアルデヒド含有部分とカップリングさせる。
【００２９】
融合パートナーをTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントに接着する他の適切な方法は、当業者には公知であろう。例示的な例として、TNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントは融合パートナーと、C-末端又はN-末端から伸長するリンカーペプチドを用いて又は用いないで、組換え融合により、又はペプチド-ペプチド共有結合により複合物を形成する。リンカーはまた間隔を置いて配置されるいくつかの反応残基により調製でき、前記反応残基を介して複数のスルフォニルウレア化合物と複合物を形成できる。
ある実施態様では、（介在リンカーを含む又は含まない）融合タンパク質は、当業者に公知の、ペプチド合成によって、又は任意の適切な原核細胞又は真核細胞発現系（細菌、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞を含むが、ただしこれらに限定されない）を用いる組換え発現によって形成できる。
本明細書に開示するある実施態様では、融合タンパク質はN-末端VPAQVモチーフを含むが、ただしN-末端モチーフはVPAQVVLではないことを条件とする。別の実施態様では、融合タンパク質はN-末端VPAQVVFモチーフを含み、成熟ウマTNFR p80アイソフォームのN-末端モチーフと一致する（すなわちシグナル配列の切断後）。さらに別の実施態様では、融合タンパク質はN-末端VPAQVAFを含み、成熟ネコTNFR p80アイソフォームのN-末端モチーフと一致する（すなわちシグナル配列の切断後）。
ある実施態様では、本明細書に開示する融合タンパク質は標的種で免疫原性をもたないであろう。すなわち、標的種に投与されたときにそれに対して異種抗体を生じないであろう。別の実施態様では、本明細書に開示する融合タンパク質は検出可能な免疫原性をもたないであろう。すなわち、標的種に投与されたとき、それに対して検出可能な異種抗体は生じないであろう。さらに別の実施態様では、本明細書に開示する融合タンパク質は低い免疫原性を有するであろう。すなわち、標的種へのその投与後に検出可能な異種抗体力価が生じるけれども、その異種抗体力価は、レシピエントでTNFの生物学的活性を排除、阻害、停止、対抗、或いはまた低下させる融合タンパク質の能力に有害な影響を与えないほど十分に低いであろう。“異種抗体”及び“複数の異種抗体”という用語は、典型的にはレシピエントにとって外来物であるエピトープに対して当該レシピエントによって生成される抗体を指す。
【００３０】
ある実施態様では、本融合タンパク質はウマTNFと結合し、その生物学的活性をin vitro又はin vivoで排除、阻害、停止、対抗、或いはまた遮断することができる。別の実施態様では、融合タンパク質は、ウマTNF-アルファ（TNF-α）及び/又はTNF-ベータ（TNF-β）と結合し、その活性を排除、阻害、停止、対抗、或いはまた遮断することができる。ある実施態様では、融合タンパク質は、ウマTNF-アルファと結合し、その活性を排除、阻害、停止、対抗、或いはまた遮断することができる。
ある実施態様では、本融合タンパク質はネコTNFと結合し、その生物学的活性をin vitro又はin vivoで排除、阻害、停止、対抗、或いはまた遮断することができる。別の実施態様では、融合タンパク質は、ネコTNF-アルファ（TNF-α）及び/又はTNF-ベータ（TNF-β）と結合し、その活性を排除、阻害、停止、対抗、或いはまた遮断することができる。ある実施態様では、融合タンパク質は、ネコTNF-アルファと結合し、その活性を排除、阻害、停止、対抗、或いはまた遮断することができる。
本融合タンパク質のTNFRポリペプチド部分の結合親和性は当該部分の配列にしたがって変動し得ることは、当業者には理解されよう。例えばいくつかの事例では、TNFR p80アイソフォームの細胞外ドメインの末端短縮型を含むTNFRポリペプチドは、例えば天然のままのTNFR p80ポリペプチド又はTNFR p80の完全な細胞外ドメインを含むTNFR p80ポリペプチドと比較して、TNFに対してより低い結合親和性を有し得るが、それでもなおTNFと結合して、TNFの生物学的活性を排除、阻害、停止、対抗、或いはまた遮断することができる。本発明の融合タンパク質のTNF（例えばウマ又はネコTNF）に対する結合親和性を決定する方法は、本明細書の別の箇所で特記するように当業者には公知であろう。一般的には、融合タンパク質のTNFRポリペプチドは、標的に投与される融合タンパク質の有効量がTNFの生物学的活性を標的で（in vivoで）排除、阻害、停止、対抗、或いはまた遮断することができるように、標的TNFに対して十分に高い結合親和性を有することが所望されるであろう。本明細書に開示するある実施態様では、融合タンパク質は、平衡解離定数（KD）1ｘ10-8以下の結合親和性でウマTNF-アルファと結合する。本明細書に開示する別の実施態様では、融合タンパク質は、平衡解離定数（KD）1ｘ10-8以下の結合親和性でネコTNF-アルファと結合する。
【００３１】
本明細書に開示する融合タンパク質は、一般的には改善された安定性及び/又はin vivo半減期を示す。さらにまた、融合タンパク質は、抗TNF化合物の標的種への投与に付随するこれまでの問題を、もっとも具体的には標的への投与時におけるそれらに対する異種抗体の生成を制限することによって少なくとも部分的に解決する。
融合パートナーが免疫グロブリン重鎖定常領域のCH2ドメイン及び/又はCH3ドメインを含むいくつかの事例では、融合タンパク質は、補体の補充、固定及び活性化、ADCC、並びにFc受容体の結合及び活性化のようないずれの下流エフェクター機能も媒介しない。融合パートナーのアミノ酸配列への変異導入、置換及び付加を実施して、下流エフェクター機能を最小化するか又は惹起されないように担保することができる。他の実施態様で、融合パートナーが免疫グロブリン重鎖定常領域のCH2ドメイン及び/又はCH3ドメインを含む場合、免役グロブリンアイソタイプは、下流エフェクター機能を媒介しないというそれらの所望の特性を基準に選択できる。他の実施態様では、天然のままの免疫グロブリン重鎖定常領域のアミノ酸配列又はアミノ酸残基に対する改変、又はそれらに由来するCH2及び/又はCH3ドメイン対する改変を実施できる。そのような改変は、1つ以上のアミノ酸残基の付加、置換又は欠失を含むことができる。いくつかの実施態様では、アミノ酸の変更は、融合パートナーの機能的特徴を改変するために、例えば、当該配列に付随し得る任意のエフェクター機能を阻害するか、そうでなければ除去するために実施される。例示的な例として、アミノ酸改変は、免疫グロブリン重鎖定常領域によって、又は前記領域に由来するCH2及び/又はCH3ドメインによって媒介される下流のエフェクター機能を妨げるために、（例えば、融合パートナーのFc受容体結合能力、補体活性化能力及び/又はADCC誘発能力を妨げることによって）実施し得る。改変はまた、融合パートナーのアミノ酸残基に対して実施して、融合タンパク質のin vivo半減期を改変できる。
【００３２】
他の実施態様では、融合パートナーが免疫グロブリン重鎖定常領域のCH2ドメイン及び/又はCH3ドメインを含む場合、当該融合タンパク質は下流エフェクター機能を含む（例えば、補体の補充、固定及び活性化、ADCC、並びにFc受容体の結合及び活性化）。変異導入、置換及び付加を融合パートナーのアミノ酸配列に対して実施して下流のエフェクター機能を強化できる。他の実施態様では、融合パートナーが免疫グロブリン重鎖定常領域のCH2ドメイン及び/又はCH3ドメインを含む場合、免疫グロブリンアイソタイプは、下流エフェクター機能を媒介するというそれらの所望の特性を基準に選択できる。他の実施態様では、天然のままの免疫グロブリン重鎖定常領域のアミノ酸配列又はアミノ酸残基に対する改変、又はそれらに由来するCH2及び/又はCH3ドメイン対する改変を実施できる。そのような改変は、1つ以上のアミノ酸残基の付加、置換又は欠失を含むことができる。いくつかの実施態様では、アミノ酸の変更は、融合パートナーの機能的特徴を改変するために、例えば、当該配列に付随する下流のエフェクター機能を強化するために実施される。
他の実施態様では、融合パートナーは、修正されたグリコシル化パターンを有する免疫グロブリン重鎖定常領域のCH2ドメイン及び/又はCH3ドメインを含む。例えば、融合パートナーのアミノ酸残基のグリコシル化の程度を増加又は低下させるために、融合パートナーを修正することができる。ポリペプチドのグリコシル化は典型的にはN-結合又はO-結合である。N-結合は、アスパラギン残基の側鎖との炭水化物部分の結合を指す。アスパラギン-X-セリン及びアスパラギン-X−スレオニンのトリペプチド（Xはプロリンを除く任意のアミノ酸）は、炭水化物部分とアスパラギン側鎖との酵素的付加の認識配列である。したがって、これらトリペプチドのどちらかの配列がポリペプチド中に存在することは潜在的なグリコシル化部位をもたらす。O-結合は、N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロース糖の1つとヒドロキシアミノ酸、もっとも一般的にはセリン又はスレオニン（ただし5-ヒドロキシプロリン又は5-ヒドロキシリジンもまた用いることができる）との結合を指す。
いくつかの実施態様では、融合タンパク質は、それをポリエチレングリコール（PEG）誘導体と反応させることによってPEG化され得る。いくつかの実施態様では、融合タンパク質は脱フコシル化され、したがってフコース残基を欠く。
【００３３】
いくつかの実施態様では、改変は以下の（a）−（c）に影響を与える置換を選択することによって達成できる：（a）置換領域における当該ポリペプチドの骨格の（例えばシート又はヘリックスの配座としての）構造、（b）当該分子の標的部位における荷電又は疎水性、又は（c）側鎖の嵩。アミノ酸はそれらの側鎖の特性の類似性にしたがって以下のように分類できる（A. L. Lehninger, in Biochemistry, 2nd Ed., 73-75, Worth Publishers, New York, 1975）：（1）非極性：Ala (A), VaI（V）、Leu（L）、Ile（I）、Pro（P）、Phe（F）、Trp（W）、Met（M）；（2）非荷電極性：GIy（G）、Ser（S）、Thr（T）、Cys（C）、Tyr（Y）、Asn（N）、Gln（Q）；（3）酸性：Asp（D）、Glu（E）；及び（4）塩基性：Lys（K）、Arg（R）、His（H）。また別に、天然に存在する残基は以下のように共通の側鎖の特性を基準に分類できる：疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；（2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；（3）酸性：Asp、Glu；（4）塩基性：His、Lys、Arg；（5）鎖の向きに影響を与える残基：Gly、Pro；及び（6）芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーによる別のクラスの交換を必要とする。そのような置換残基はまた保存的置換部位に導入されることも残りの（例えば非保存的）部位に導入されることもある。
典型的には、本発明の融合タンパク質はTNF中和融合タンパク質である。この関係では、“中和”という用語は、標的種のTNF（例えばウマ及び/又はネコTNF）と結合して、標的TNFの生物学的活性を排除、阻害、停止、対抗、或いはまた遮断することができるTNF結合部分（すなわちTNFRポリペプチド部分）を含む融合タンパク質を言う。ある実施態様では、中和融合タンパク質（TNFアンタゴニスト、アンタゴニスト性融合タンパク質、又は遮断融合タンパク質と称することができる）は、特異的に及び好ましくは選択的に標的種のTNFと結合し、当該標的種のTNFの1つ以上の生物学的活性を阻害する。例えば、中和融合タンパク質は、ウマTNFとその標的受容体（例えば細胞膜結合TNF受容体1（TNFR1）受容体（CD120a））との結合を阻害できる。同様に、中和融合タンパク質は、ネコTNFとその標的受容体（例えば細胞膜結合TNF受容体1（TNFR1）受容体（CD120a））との結合を阻害できる。
“〜と特異的に結合する”などという語句は、当該融合体と標的種のTNF（例えばウマ及び/又はネコTNF）（他のポリペプチド及びタンパク質を含む他の物質の不均一集団に存在し得る）との結合を指す。したがって、特異的な免疫アッセイ条件下に存在するとき、本発明の融合タンパク質は標的TNFと結合し、サンプルに存在し得る他のタンパク質と有意な量では結合しない。
【００３４】
本明細書で用いられる、“生物学的活性”という用語は、（in vivoで見出される天然に存在するものであれ組換え手段によって提供され又は可能になるものであれ）分子の1つ以上の固有の生物学的特性のいずれかを指す。TNFに付随する生物学的特性は当業者には公知であろう。例示的な例には、受容体の結合及び/又は活性化、細胞シグナリング又は細胞分裂の誘発、細胞増殖の阻害、サイトカイン生成の誘発、アポトーシス及び酵素活性の誘発が含まれるが、ただしこれらに限定されない。TNFの生物学的活性を決定する方法もまた当業者には公知であろう。例示的な例には細胞系アッセイが含まれる。例えば、TNFRを発現し、TNF暴露時に測定可能な生物学的作用を生じる細胞が、TNFRポリペプチド及び/又は本発明の融合タンパク質（そのTNF結合フラグメントを含む）及び/又は前記をコードするポリヌクレオチドの存在下でTNFに暴露される。続いて測定を実施するか観察を行って、TNFRポリペプチド、融合タンパク質、フラグメント及び/又はポリヌクレオチドが、当該細胞でTNF媒介生物学的作用を阻害するか否かを決定する。
本明細書で用いられる“本質的に〜から成る”又は“本質的に〜から成り”という用語は、典型的には、TNFRポリペプチド、そのTNF結合フラグメント、又は融合タンパク質が、記載された特色又は成分以外の追加の特色又は成分を有し得ることを意味するが、ただしそのような追加の特色又は成分がTNFと特異的に結合するそれらの能力に実質的に影響を与えないことを条件とする。すなわち、TNFRポリペプチド、そのTNF結合フラグメント又は融合タンパク質は、標的種のTNF（例えばウマ又はネコTNF）に結合して、当該TNF分子の生物学的活性を排除、阻害、停止、対抗、或いはまた低下させるTNF結合部分の能力に有意な影響を与えない追加の特色又は成分を有することができる。TNFRポリペプチド、フラグメント又は融合タンパク質の免疫原性を低下させるために、そのような改変をアミノ酸配列に導入できる。例えば、本質的にある特定の配列から成るポリペプチドは、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又は6つ以上の付加、欠失又は置換アミノ酸を当該配列の一方の末端又は両端に含むことができるが、ただしこれらのアミノ酸が、TNFとTNF結合部分との結合、及び当該TNF分子の生物学的活性の排除、阻害、停止、対抗、或いはまた低下に干渉しないことを条件とする。同様に、TNFRポリペプチド、フラグメント又は融合タンパク質を1つ以上の官能基で化学的に改変することができるが、ただしそのような官能基が、TNFR結合部分がTNFと結合してその生物学的活性を排除、阻害、停止、対抗、或いはまた低下させる能力に干渉しないことを条件とする。
【００３５】
ポリヌクレオチド
本開示はさらに、本明細書に記載する、本発明のTNFRポリペプチド、そのTNF結合フラグメント及び融合タンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドに及ぶ。
本発明のTNFRポリペプチド、TNF結合フラグメント及び融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当業界で公知の技術を用いて当業者によって容易に調製され得る。前記公知の技術は例えば以下の文献に記載された技術である：Sambrook et al. “Molecular Cloning”, A laboratory manual, cold Spring Harbor Laboratory Press, Volumes 1-3, 2001（ISBN-0879695773）；及びAusubel et al. Short Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, 4th Edition, 1999（ISBN-0471250929）。
本発明のTNFRポリペプチド、TNF結合フラグメント及び融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、少なくとも1つの核酸を含むプラスミド、ベクター、転写又は発現カセットの形を有する構築物として提供できる。構築物は1つ以上の構築物を含む組換え宿主細胞内に含まれ得る。発現は、適切な核酸配列を含む組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって都合よく達成できる。発現に続いて、本明細書に記載する、本発明のTNFRポリペプチド、フラグメント及び融合タンパク質を、当業者に公知の任意の適切な技術を用いて単離及び/又は精製できる。
ポリペプチド、そのフラグメント及び融合タンパク質を多様な異なる宿主細胞でクローニング及び発現するための系は当業者に周知である。適切な宿主細胞の例には、細菌、哺乳動物細胞、酵母、昆虫及びバキュロウイルス系が含まれる。当業界で利用可能な、異種ポリペプチド発現用哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎細胞及びNSOマウスミエローマ細胞が含まれる。一般的な好ましい細菌宿主は大腸菌（E. coli）である。本明細書に記載する、本発明のTNFRポリペプチド、フラグメント又は融合タンパク質の原核細胞（例えば大腸菌）での発現もまた当業界で良好に確立されている。真核細胞培養での発現もまた、ポリペプチド生成の選択肢として当業者には利用可能である。
【００３６】
ある実施態様では、単離ヌクレオチドは、本明細書に記載するウマ又はネコTNFR p80ポリペプチドのいずれかをコードする。ある実施態様では、ポリヌクレオチドは配列番号:6の核酸配列を含む。別の実施態様では、ポリヌクレオチドは配列番号:42の核酸配列を含む。
ある実施態様では、ポリヌクレオチドは、TNFRシグナル配列をコードする核酸配列に作動できるように連結された、本明細書に記載する本発明のTNFRポリペプチドをコードする核酸配列を含む。本明細書の別の箇所で特記するように、本発明者らは初めて、ウマTNFR80のための正確なシグナル配列を同定し、この配列はアミノ酸配列、MAPVAVWAALAVGLQLWAAGRA（配列番号:4）によって表される。本発明者らはまた、初めてネコTNFR80のための正確なシグナル配列を同定し、この配列は配列番号:38又は配列番号:39のアミノ酸配列によって表される。このことは初めて、ウマ又はネコTNFR p80ポリペプチド又はそのTNF結合フラグメント、又は前記ポリペプチド又はフラグメントを含む融合タンパク質の組換え発現を可能にする。この発現は、ウマ又はネコTNFR p80ポリペプチド部分の成熟機能型の輸送及び宿主細胞からの遊離を促進する正確なシグナル配列を発現させることによって実現する。
したがってある実施態様では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する、本発明のTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントをコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、アミノ酸配列MAPVAVWAALAVGLQLWAAGRA（配列番号:4）又は最適なアラインメント後に前記配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、96%、97%、98%若しくは99%配列類似性を有するアミノ酸配列を含むTNFRシグナル配列をコードする核酸配列に作動できるように連結される。別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する、本発明のTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントをコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、最適なアラインメント後に配列番号:4と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むTNFRシグナル配列をコードする核酸配列に作動できるように連結される。別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する、本発明のTNFRポリペプチドをコードする核酸配列を含み、アミノ酸配列MAPVAVWAALAVGLQLWAAGRA（配列番号:4）から成るTNFRシグナル配列をコードする核酸配列に作動できるように連結される。
【００３７】
いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号:5のアミノ酸配列又は最適なアラインメント後に前記配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、96%、97%、98%若しくは99%配列類似性を有するアミノ酸配列を含むウマTNFR p80前駆体分子をコードする核酸配列を含み、ここで、当該TNFR前駆体分子は宿主細胞で発現されることができ、さらに発現時にTNFRシグナル配列は切断されて、N-末端VPAQVモチーフを有する、機能的なウマTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントを生じる（ただし当該TNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントはN-末端VPAQVVLモチーフをもたないことを条件とする）。別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、最適なアラインメント後に配列番号:5と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、96%、97%、98%若しくは99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むウマTNFR p80前駆体分子をコードする核酸配列を含み、ここで、当該TNFR前駆体分子は宿主細胞で発現されることができ、さらに発現時にTNFRシグナル配列は切断されて、N-末端VPAQVモチーフを有する機能的なウマTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントを生じる（ただし当該TNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントはN-末端VPAQVVLモチーフをもたないことを条件とする）。ある実施態様では、TNFRポリペプチド又はそのフラグメントはN-末端VPAQVVFモチーフを含む。ある実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号:5のアミノ酸配列から成るウマTNFR p80前駆体分子をコードする核酸配列を含む。
【００３８】
別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、当該配列は、アミノ酸配列MAPVAVWAALAVGLQLWAAGRA（配列番号:4）又は最適なアラインメント後に前記配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、96%、97%、98%若しくは99%配列類似性を有するアミノ酸配列を含むウマTNFR p80シグナル配列をコードする核酸配列に作動できるように連結され、ここで、当該核酸配列は、宿主細胞での発現時に（TNFRシグナル配列で）切断されてN-末端VPAQVモチーフを有する融合タンパク質を形成できるTNFR前駆体分子を含む融合タンパク質をコードする（ただし当該融合タンパク質はN-末端VPAQVVLモチーフをもたないことを条件とする）。別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、当該配列は、最適なアラインメント後に配列番号:4と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、96%、97%、98%若しくは99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むウマTNFR p80シグナル配列をコードする核酸配列に作動できるように連結され、ここで、当該核酸配列は、宿主細胞での発現時に（TNFRシグナル配列で）切断されてN-末端VPAQVモチーフを有する融合タンパク質を形成できるTNFR前駆体分子を含む融合タンパク質をコードする（ただし当該融合タンパク質はN-末端VPAQVVLモチーフをもたないことを条件とする）。ある実施態様では、融合タンパク質はN-末端VPAQVVFモチーフを含む。別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、当該配列は、アミノ酸配列MAPVAVWAALAVGLQLWAAGRA（配列番号:4）から成るTNFRシグナル配列をコードする核酸配列に作動できるように連結される。
【００３９】
別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号:16若しくは配列番号:17のアミノ酸配列又は最適なアラインメント後に前記配列のいずれかと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、96%、97%、98%若しくは99%配列類似性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、ここで、当該融合タンパク質は、宿主細胞での発現時に（TNFRシグナル配列で）切断されてN-末端VPAQVモチーフを含む融合タンパク質を形成できる（ただし当該融合タンパク質はN-末端VPAQVVLモチーフをもたないことを条件とする）。別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、最適なアラインメント後に配列番号:16又は配列番号:17と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、ここで、当該融合タンパク質は、宿主細胞での発現時に（TNFRシグナル配列で）切断されてN-末端VPAQVモチーフを含む融合タンパク質を形成できる（ただし当該融合タンパク質はN-末端VPAQVVLモチーフをもたないことを条件とする）。ある実施態様では、融合タンパク質は、切断されてN-末端VPAQVVFモチーフを含む融合タンパク質を形成できる。
別の実施態様では、ポリヌクレオチドは配列番号:17又は配列番号:18から成るアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
さらにまた本明細書で開示されるものは、本明細書に記載するポリヌクレオチドを含む組換えベクターである。ある実施態様では、ベクターはプロモーターの制御下にあるか、又はプロモーターに作動できるように連結される。
“ポリヌクレオチド”及び“核酸”という用語は互換的に用いられ、任意の長さのヌクレオチドポリマー型を指す。ポリヌクレオチドという用語はまた互換的に二本鎖及び一本鎖核酸分子を指す。
“作動できるように連結される”、“作動可能な連結”などという用語は、例えばプロモーターと転写されるべき核酸配列及び、適切な場合には、追加の調節エレメント（例えばターミネーター及び/又はポリアデニル化シグナル）との連続的な編成を意味し、したがって当該調節エレメントの各々は、核酸配列の編成にしたがって核酸配列が転写されるときその機能を果たすことができる。化学的な意味での直接的連結は必ずしも必要ではないことは理解されよう。遺伝的な制御配列、例えばエンハンサー配列もまた、他の核酸分子から遠位の位置で（すなわちさらにいっそう離れて）標的配列でそれらの機能を示すことができる。いくつかの実施態様では、転写されるべき核酸配列はプロモーターとして機能する配列の後ろに配置され、したがって両配列は互に共有結合的に連結される。
【００４０】
生成及び/又は精製方法
本開示はまた、本明細書に記載する、本発明のTNFRポリペプチド、そのTNF結合フラグメント及び融合タンパク質のいずれかを生成及び/又は精製する方法に及ぶ。適切な生成及び精製方法は当業者には公知であろう。
例示的な例では、本明細書に記載する、本発明のTNFRポリペプチド、TNF結合フラグメント及び融合タンパク質は組換えDNA技術を用いて生成できる。天然のままのウマ又はネコTNFR p80アイソフォームの正確なシグナル配列を初めて同定したことによって、本明細書に記載する組換えTNFRポリペプチド、そのTNF結合フラグメント及び組換え融合タンパク質を組換えDNA技術によって宿主細胞により発現及び生成することができる方法が本発明で可能である。これは、少なくとも部分的にはウマ及びネコTNFR p80アイソフォームの正確に同定されたTNFRシグナル配列によって容易になる。これは、配列番号:19（ウマ；XM_00507617）及び配列番号:64（ネコ；XP_003989632.1）で表される予測されたウマ及びネコTNFR p80アイソフォーム（正確なシグナル配列を欠き、したがって機能的なTNFRポリペプチドを生成できない）と対照的である。
適切な宿主細胞は当業者には公知であろう。例示的な例には真核細胞及び原核細胞が含まれる。いくつかの実施態様では、組換えベクターは、本明細書に記載する本発明のベクターである。いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する本発明のポリヌクレオチドである。
さらにまた別の特徴では、本明細書に記載する本発明のTNFRポリペプチド、そのTNF結合フラグメント及び融合タンパク質を生成する、宿主細胞株又はその誘導細胞若しくは子孫細胞が提供される。
【００４１】
本発明の別の特徴では、本明細書に記載する本発明の融合タンパク質の精製方法が提供される。本発明者らは、タンパク質Aクロマトグラフィーは、ウマ免疫グロブリンのHC2アイソタイプの精製に有用なツールであり得るが、HC6ではそうではないことを以前に確認している。したがって、IgG2タイプのウマ由来免疫グロブリン重鎖ドメインはIgG6タイプのものより効率的に精製される。かくして、本発明のある実施態様にしたがえば、融合タンパク質の精製は、融合パートナーがウマIgG2の免疫グロブリン重鎖定常ドメインに由来するアミノ酸配列を含む場合に、ウマIgG6と比較してより高収量を提供する。このことは、タンパク質Aマトリックスによるタンパク質精製は、治療に使用されるタンパク質の商業的に対応し得る収量を得るためにしばしば用いられるという点で有利である。したがって、免疫グロブリン重鎖定常領域がウマIgG2に由来する場合、本発明の実施態様にしたがい融合タンパク質の精製にタンパク質A精製を使用することによって高収量が提供される。この特色は、得られた精製タンパク質は、ウマに投与したとき補体を動員せずまた下流エフェクター機能を媒介しないという驚くべき観察と併せて、治療目的のためにウマに都合よく投与できる本発明の組成物、特にタンパク質治療薬（ヒト起源のポリペプチドを含む融合タンパク質を凌ぐ驚くべき利点を有する）を提供することができる。
したがって、本発明のある特徴では、本明細書に記載する本発明の融合タンパク質のダイマー型を精製する方法が提供され、前記方法は、pH4.7から5.3でタンパク質Aから融合タンパク質のダイマー型を溶出する工程を含む。ある実施態様では、融合タンパク質のダイマー型はpH4.8から5.2でタンパク質Aから溶出される。別の実施態様では、融合タンパク質は、ウマIgG2免疫グロブリン重鎖定常領域のCH2ドメイン及び/又はCH3ドメイン、又はそのフラグメントを含む。
本発明のさらに別の特徴は、宿主細胞発現によって形成されたより高分子量のマルチマーから、本発明の融合タンパク質の好ましいダイマー型を最適pHでタンパク質Aカラムから溶出させることによる選択的な精製を提供し、特に前記融合タンパク質は、ウマIgG2の免疫グロブリン重鎖定常領域又はその部分（例えばCH2及び/又はCH3ドメインを有する）を含む。
上記方法をタンパク質Aクロマトグラフィーによる精製の標準方法の改変として適用して、所望のTNFR融合タンパク質ダイマーをその凝集型から精製することができる。前記によって、より高比活性及び高純度の生成物が都合よく採集され、さらにまた凝集物の除去は潜在的免疫原性を低下させる。免疫グロブリンのタンパク質A精製のための標準的な手順は当業者には公知で、典型的には中性pHでの結合及び低pHでの溶出を含む。
【００４２】
ある実施態様では、本発明の融合タンパク質を生成するプロセスはTNFR細胞外ドメインの提示をもたらし、本発明者らの分析に基づけば当該受容体の立体構造を保持し、結合特異性及びアビジティーを維持し、さらに腎臓で排除されるサイズを超えて当該受容体のサイズを増加させ、一方、免疫原性エピトープの存在を減少させる（前記エピトープは、未修正型で標的宿主に投与された場合に当該受容体に対して生成される中和抗体（特に異種抗体）を生じ得る）。
本明細書に記載する、本発明のTNFRポリペプチド又は融合タンパク質（TNF結合フラグメントを含む）は、完全に又は部分的に化学合成によって生成することができる。例えば、TNFRポリペプチド、そのTNF結合フラグメント及び融合タンパク質は、当業者に周知の技術によって、例えば標準的な液体ペプチド合成又は固相ペプチド合成方法によって調製できる。また別には、本明細書に記載する、本発明のTNFRポリペプチド、フラグメント及び融合タンパク質は、液相ペプチド合成技術を用いて、又はさらに固相、液相及び溶液化学の組合せによって溶液中で調製できる。
本発明の別の特徴では、ウマ又はネコIgG免疫グロブリンのCH2ドメイン及びCH3ドメインを含むポリペプチドに作動できるように連結されたTNFRポリペプチドを含む融合タンパク質を生成する方法が提供され、前記方法は以下の工程を含む：
（i）本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現できる組換えベクターを含む宿主細胞を提供する工程；
（ii）当該融合タンパク質の発現に適切な条件下で宿主細胞を培養する工程；及び
（iii）当該融合タンパク質を回収する工程。
“単離された”という用語は、本明細書に記載する、本発明のTNFRポリペプチド、TNF結合フラグメント若しくは融合タンパク質、又は前記をコードする本明細書に記載のポリヌクレオチドに関して用いられるときは、前記ポリペプチド、フラグメント、タンパク質及びポリヌクレオチドが単離及び/又は精製形態で提供されるという記述に該当する。すなわち、それらは、それらの天然の環境から分離、単離又は精製されており、実質的に純粋又は均質な形態で提供され、又は核酸の場合には、要求される機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の起原を有する核酸又は遺伝子を含まないか又は実質的に含まない。したがって、そのような単離ポリペプチド、フラグメント、タンパク質及びポリヌクレオチドは、天然にそれらに付随する物質、例えばそれらの天然の環境で、又はそれらが調製される環境（例えば細胞培養）でin vitro又はin vivoで実施される組換えDNA技術により調製されるときに、一緒に見出される他のポリペプチド又は核酸を含まないか又は実質的に含まないであろう。
【００４３】
医薬組成物及びキット
本開示はまた、本明細書に記載する本発明のTNFRポリペプチド、TNF結合フラグメント及び融合タンパク質のいずれかを含む医薬組成物に及ぶ。したがって、本明細書に開示する別の特徴では、本明細書に記載する本発明のTNFRポリペプチド、そのTNF結合フラグメント又は融合タンパク質及び医薬的に許容できる担体又は賦形剤を含む医薬組成物が提供される。さらにまた本明細書に開示されるものは、本明細書に記載する本発明のTNFRポリペプチド、そのTNF結合フラグメント又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び医薬的に許容できる担体又は賦形剤を含む医薬組成物である。
ある実施態様では、医薬組成物はさらに、少なくとも1つのさらに別のTNFアンタゴニスト及び/又は抗炎症化合物を含む。ある実施態様では、TNFアンタゴニストはメトトレキセートである。いくつかの実施態様では、医薬組成物はさらに、少なくとも1つの鎮痛剤、NSAID、オピオイド、コルチコステロイド、ステロイド又は神経成長因子のアンタゴニストを含む。
本明細書に記載する、本発明のTNFRポリペプチド、そのTNF結合フラグメント、融合タンパク質又はポリヌクレオチドは希釈剤又はアジュバントと一緒に処方され、さらになお実際的な目的のために単離形態で提供されるように検討できる。例えば、TNFRポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質又はポリヌクレオチドは、免疫アッセイで使用されるマイクロタイタープレートの被覆に用いられる場合にはゼラチン又は他の担体と混合でき、或いはまた、診断又は治療で用いられるときは医薬的に許容できる担体又は賦形剤と混合できる。TNFRポリペプチド、フラグメント及び/又は融合タンパク質は、天然の状態で又は異種真核細胞系（例えばCHO又はNSO細胞）によってグリコシル化することができ、或いはまた、それらは（例えば原核細胞での発現によって生成される場合は）グリコシル化されてなくてもよい。
【００４４】
本発明はまた、本明細書に記載する本発明のTNFRポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質又はポリヌクレオチドを含む不均質調製物に及ぶ。いくつかの実施態様では、そのような調製物は融合タンパク質とTNFRポリペプチドとの混合物であることができ、当該TNFRポリペプチドは、融合パートナーを欠き様々な程度にグリコシル化され、及び/又は誘導アミノ酸を有し、例えばN-末端グルタミン酸が環化されてピログルタミン酸残基を形成する。
いくつかの実施態様では、本発明の医薬組成物は、液体処方物、凍結乾燥処方物、液体として再構成される凍結乾燥処方物又はエーロゾル処方物として処方される。ある実施態様では、本明細書に記載する本発明のTNFRポリペプチド、フラグメント及び/又は融合タンパク質は、約0.5mg/mLから約250mg/mL、約0.5mg/mLから約45mg/mL、約0.5mg/mLから約100mg/mL、約100mg/mLから約200mg/mL、又は約50mg/mLから約250mg/mLの濃度で組成物中に存在する。
いくつかの実施態様では、組成物はさらに緩衝液を含む。典型的には、組成物のpHは約pH5.5からpH6.5である。いくつかの実施態様では、緩衝液は約4mMから約60mMのヒスチジン緩衝液、約5mMから約25mMのコハク酸緩衝液、又は約5mMから25mMの酢酸緩衝液を含むことができる。いくつかの実施態様では、緩衝液は、約10mMから300mMの濃度又は125mM辺りの濃度の塩化ナトリウム、及び約5mMから50mM、典型的には25mMの濃度のクエン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施態様では、組成物はさらに界面活性剤を、例えば丁度0%以上から約0.2%の濃度で含む。適切な界面活性剤は当業者には公知であろう。例示的な例には、ポリソルベート-20、ポリソルベート-40、ポリソルベート-60、ポリソルベート-65、ポリソルベート-80、ポリソルベート-85、又は前記の組み合わせが含まれる。ある実施態様では、界面活性剤はポリソルベート-20であり、さらに塩化ナトリウムを約125mMの濃度で及びクエン酸ナトリウムを約25mMの濃度で含むことができる。
【００４５】
本明細書に記載する本発明のTNFRポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質及び/又はポリヌクレオチドは単独で投与できる。いくつかの実施態様では、それらは、一般的には適切な医薬的に許容できる賦形剤、希釈剤又は担体（例えば意図される投与ルートに応じて選択される）を含む医薬組成物として投与されるであろう。適切な医薬担体は当業者には公知である。例示的な例には水、グリセロール、エタノールなどが含まれる。
本明細書に記載する本発明のTNFRポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質及び/又はポリヌクレオチドは、その必要がある対象動物（すなわちウマ又はネコ）に外因的に又は任意の他の適切な投与ルートにより投与できる。典型的には、組成物は注射又は輸液により非経口的に投与できる。適切な非経口投与ルートは当業者には公知であろう。例示的な例には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下又は経粘膜が含まれる。投与ルートにはさらに、局所及び経腸、例えば粘膜（肺を含む）、経口、経鼻及び直腸が含まれ得る。
本発明の医薬組成物が、注射可能組成物として例えば静脈内、皮内又は皮下適用で投与される実施態様では、活性成分は、非経口的に許容可能であり、発熱物質を含まず適切なpH、等張性及び安定性を有する水溶液の形態中に存在し得る。当業者は、例えば等張なビヒクル（例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液又は乳酸リンゲル注射液）を用いて適切な溶液を良好に調製できる。保存料、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤及び/又は他の添加物もまた必要に応じて加えることができる。医薬組成物はまた、微小球、リポソーム、他のミクロ粒子デリバリー系、又は一定の組織（血液を含む）に配置される徐放性処方物により投与することができる。
上記で述べた技術及びプロトコル及び本発明にしたがって用いることができる他の技術及びプロトコルの例は以下で見出すことができる：Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Gennaro, A.R., Lippincott Williams & Wilkins; 20th edition ISBN 0-912734-04-3；及びPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems; Ansel, H.C. et al. 7th Edition ISBN 0-683305-72-7。
本発明の別の特徴では、本明細書に記載する本発明のTNFRポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質及び/又はポリヌクレオチドを含むキットが提供される。TNF介在症状の治療及び/又は予防のためにそのようなキットを用いことができ、したがって前記キットはさらにそのような使用のための指示を含むことができる。
【００４６】
治療又は予防のための方法及び使用
本明細書の別の箇所で特記するように、本開示は、本発明者らのウマ及びネコTNFR p80アイソフォームの細胞外ドメインの正確なアミノ酸配列の驚くべき発見を前提にする。したがって、本明細書に記載する前述のいずれかを含むTNFRポリペプチド、そのTNF結合フラグメント及び融合タンパク質を治療又は予防薬剤として用いて、ウマ又はネコ対象動物でTNFの生物学的活性と結合させて、これを排除、阻害、停止、対抗、或いはまた遮断することができる。さらにまた、当該標的種（すなわちウマ又はネコ）にとって天然のままのN-末端アミノ酸配列を有するために、そうでなければ当該標的種にとって外来物質であるN-末端アミノ酸配列を有するTNFR 80ポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントの使用に付随する免疫原性を回避又は最小化することができる。
したがって、本明細書に開示するある特徴では、TNFが介在するネコの症状の治療又は予防で使用される、本明細書に記載のTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメント又は融合タンパク質が提供される。本明細書に開示する別の特徴では、TNFが介在するウマの症状の治療又は予防で使用される、本明細書に記載のTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメント又は融合タンパク質が提供される。
本明細書に開示するさらに別の特徴では、TNFが介在するネコの症状の治療用又は予防用医薬の調製における、本明細書に記載のTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメント又は融合タンパク質の使用が提供される。本明細書に開示するさらにまた別の特徴では、TNFが介在するウマの症状の治療用又は予防用医薬の調製における、本明細書に記載のTNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメント又は融合タンパク質の使用が提供される。
本明細書に開示するさらにまた別の特徴では、TNFが介在する症状をウマで治療又は予防する方法が提供され、前記方法は、本明細書に記載するTNFRポリペプチド、又はそのTNF結合フラグメント、又は融合タンパク質の治療的に有効な使用量をその必要があるウマに投与する工程を含む。本明細書に開示するさらに別の特徴では、TNFが介在する症状をネコで治療又は予防する方法が提供され、前記方法は、本明細書に記載するTNFRポリペプチド、又はそのTNF結合フラグメント、又は融合タンパク質の治療的に有効な使用量をその必要があるネコに投与する工程を含む。
【００４７】
TNFが介在するウマ又はネコの症状は当業者には公知であろう。例示的な例には以下が含まれる：炎症媒介症状、慢性炎症性疾患、関節炎、例えば免疫介在多発性関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症、多発性関節炎、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、全身性血管炎、アトピー性皮膚炎、うっ血性心不全、難治性ブドウ膜炎、気管支喘息、アレルギー症状、敗血症、ショック、真性糖尿病、及び神経変性症状、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、卒中、筋萎縮性側索硬化症、ベーチェット病、水疱性皮膚炎、好中球皮膚炎、中毒性表皮壊死、全身性血管炎、壊疽性膿皮症、膿疱性皮膚炎、脳マラリア、溶結性尿毒症症候群、子癇前症、同種移植片拒絶、中耳炎、蛇咬傷、結節性紅斑、骨髄異形成症候群、移植片対宿主病、皮膚筋炎、及び多発性筋炎。
本明細書に開示するある実施態様では、TNF介在症状は以下から成る群から選択される：炎症媒介症状、慢性炎症性疾患、関節炎、例えば免疫介在多発性関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症、多発性関節炎、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、全身性血管炎、アトピー性皮膚炎、うっ血性心不全、難治性ブドウ膜炎、気管支喘息、アレルギー症状、敗血症、ショック、真性糖尿病、及び神経変性症状、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、卒中、及び筋萎縮性側索硬化症。
ある実施態様では、TNF介在症状は関節炎又は関節炎性症状（前記の症候群を含む）である。ある種の実施態様では、関節炎又は関節炎性症状には、免疫介在多発性関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、若年性特発性関節炎、強直性脊椎炎及び関連症状から成る群から選択される症状が含まれる。いくつかの実施態様では、関節炎又は関節炎性症状の治療は、免疫応答の緩和、阻害、軽減又は抑制を含む（免疫応答は当該関節性症状の端緒であるか、前記と密接に関係するか、或いは前記の原因である）。
【００４８】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載する本発明のTNFRポリペプチド、TNF結合フラグメント又は融合タンパク質は、高親和性結合でウマ又はネコTNFと結合し、それによりTNFの生物学的機能（活性）を中和するであろう。本明細書の別の箇所で述べるように、かつ理論にも又は特定のいずれの作用態様にも拘束されないが、本明細書に記載する本発明のTNFRポリペプチド、TNF結合フラグメント及び融合タンパク質はTNFとTNFR細胞膜結合受容体との結合を阻害する。
本明細書の別の箇所で特記するように、融合タンパク質に関しては、免疫学的に不活性な（例えば標的種に存在するアミノ酸残基のみを含む）融合パートナーを用いることが所望され得る。そうすれば、標的（ウマ又はネコ）に投与したときに、融合タンパク質に対する免疫原性は最小化又は回避される。したがって、本明細書に記載する本発明のTNFRポリペプチド、そのTNF結合フラグメント及び融合タンパク質は、少なくとも部分的にTNFが介在する症状を標的種で治療又は予防するための長期投与（例えば多数回投薬レジメンの部分として）に特に適切である。
本明細書で用いられる、“有効量”又は“治療的に有効な量”という用語は、互換的に用いられて、TNFと内因性の細胞結合TNF受容体との結合をin vivoで阻害、拮抗、停止、或いはまた遮断し、したがってTNFの生物学的活性をin vivoで阻害、対抗、停止、或いはまた遮断するために必要である、本明細書に記載するTNFRポリペプチド、そのTNF結合フラグメント及び融合タンパク質の量を意味する。“有効量”及び“治療的に有効な量”という用語はまた、有益な又は所望の結果を達成するために十分である、本明細書に記載するTNFRポリペプチド、そのTNF結合フラグメント及び融合タンパク質の量を意味する。“有効量”はしたがって以下の1つ以上を達成する量であり得る：TNFレベルの低下、炎症性応答の軽減、又はTNF介在疾患若しくは症状又は前記の徴候の軽減、予防又は緩和。有効量はシングル用量又は投与によって達成されるとは限らないが、本明細書に記載のTNFRポリペプチド、そのTNF結合フラグメント及び/又は融合タンパク質を2用量又は投与以上で投与することによって達成され得る。当該抽出物の1日の全量が1から24時間にわたって異なる量又は均等な量で投与される場合には分割投与もまた利用できる。例えば、半分量が12時間毎に2回投与される。
ウマ又はネコ対象動物に実施できる投薬レジメンの例は以下から成る群から選択できる（ただしこれらに限定されない）：1μg/kg/日から20mg/kg/日、1μg/kg/日から10mg/kg/日及び10μg/kg/日から1mg/kg/日。いくつかの実施態様では、投薬は、1μg/mLから100μg/mLの血中抗体濃度が得られるものである。しかしながら、投与されるべき実際の用量並びに投与速度及びタイムコースは、治療されるべき症状の性質及び重篤度、治療されるウマ又はネコ対象動物の齢、性別及び重量とともに投与ルートにより左右されることは当業者には理解されるであろう。組成物の特性、例えばその結合活性及びin vivo血中寿命、処方物中の本明細書に記載する本発明のTNFRポリペプチド、TNF結合フラグメント及び/又は前記をコードするポリヌクレオチドの濃度に対して更なる配慮を払うことができる。治療の処方箋（例えば投薬に関する決定など）は最終的には獣医系熟練者及び他の獣医師の責任及び裁量内であり、典型的には治療されるべき疾患、問題のウマ対象動物の症状、デリバリー部位、投与方法及び熟練者に公知の他の要件（前記のいくつかは本明細書に記載される）が考慮される。
【００４９】
本発明はまた併用療法に及ぶ。例えば、ある実施態様では、当該方法はさらにその必要があるウマ又はネコ対象動物に、同時に又は連続的に少なくとも1つのさらに別の作用因子を投与する工程を含み、前記作用因子は、本明細書に記載する本発明のTNFRポリペプチド、そのTNF結合フラグメント又は融合タンパク質の有効性を強化及び/又は補充する。いくつかの実施態様では、本発明の前述の使用及び方法はさらに、その必要があるウマ又はネコ対象動物に同時に又は連続的に、少なくとも1つの追加のTNF阻害剤（TNFアンタゴニスト）及び/又は抗炎症剤を投与する工程を含む。前記追加の作用因子は、慢性炎症症状（特にTNF介在症状）の治療に有用な薬剤を含む。いくつかの実施態様では、追加の作用因子は、TNFアンタゴニスト（例えばメトトレキセート）、鎮痛剤、サイトカイン抑制抗炎症薬である化合物、NSAID、オピオイド、コルチコステロイド又はステロイドであり得る。
適切な鎮痛剤は当業者には公知であろう。例示的な例には、ブトルファノール、ブプレノルフィン、フェンタニル、フルニキシンメグルミン、メルピジン、モルヒネ、ナルブフィン、及び前記の誘導体が含まれる。適切なNSAIDには、アセトアミノフェン、アセチルサリチル酸、カルプロフェン、エトドラク、ケトプロフェン、メロキシカム、フィロコキシブ、ロベナコキシブ、デラコキシブなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
いくつかの実施態様では、少なくとも1つのさらに別の作用因子は、抗生物質、抗真菌薬、抗原虫薬、抗ウイルス剤、及び類似の治療薬剤から成る群から選択される治療的に活性な薬剤であり得る。いくつかの実施態様では、少なくとも1つのさらに別の作用因子は、炎症媒介物質の阻害剤、例えばPGE-受容体アンタゴニスト、免疫抑制剤（例えばシクロスポリン）、又は抗炎症性グルココルチコイドであり得る。いくつかの実施態様では、少なくとも1つのさらに別の作用因子は、認知機能不全又は障害（例えば記憶喪失）又は高齢馬でさらに増加する可能性がある関連症状の治療に用いられる薬剤であり得る。さらにまた、少なくとも1つのさらに別の作用因子は、抗高血圧剤又は心脈管系機能不全の治療（例えば高血圧、心筋虚血、うっ血性心不全などの治療）に用いられる化合物であり得る。さらにまた、少なくとも1つのさらに別の作用因子は、利尿剤、血管拡張剤、ベータアドレナリン受容体アンタゴニスト、アンギオテンシンII変換酵素阻害剤、カルシウムチャネル遮断剤、又はHMG-CoAレダクターゼ阻害剤であり得る。
本明細書に記載する本発明のTNFRポリペプチド、そのTNF結合フラグメント及び融合タンパク質は、典型的には外因的に、例えば静脈内又は皮下投与によって投与される。しかしながらある種の実施態様では、ベクターを用いて標的の細胞内にポリヌクレオチドをデリバーできる（前記ポリヌクレオチドは、本明細書の別の箇所に記載するようにTNFRポリペプチド、フラグメント又は融合タンパク質をコードする）。
本明細書の別の箇所で特記するように、投薬レジメンは、本明細書に記載する本発明のTNFRポリペプチド、TNF結合フラグメント、融合タンパク質又はポリヌクレオチドのシングル投与、又は必要に応じてマルチ投与用量を含むことができる。本明細書に記載する本発明のTNFRポリペプチド、TNF結合フラグメント、融合タンパク質又はポリヌクレオチドは、連続的に、同時に又は別々に、他の抗炎症性薬剤又はTNFアンタゴニストとともに投与できる。いくつかの実施態様では、TNFRポリペプチド又はそのTNF結合フラグメントは、連続的に、同時に又は別々に、本明細書に記載する本発明の融合タンパク質とともに投与できる。
【００５０】
治療及び診断のための薬剤並びに方法
本明細書に記載する、ウマ又はネコTNFR p80アイソフォームの正確なアミノ酸情報から、ウマ又はネコTNFR p80アイソフォームと結合できる薬剤を開発できる。かくして、さらに本明細書で提供されるものは、本明細書に記載する、TNFRポリペプチド、そのTNF結合フラグメント又は融合タンパク質のいずれかと特異的に結合できる作用因子である。
ある実施態様では、この作用因子は免疫相互反応性分子である。本開示の関係では、免疫相互反応性分子は、本明細書に記載する、ウマ又はネコTNFR p80ポリペプチドとin vitro又はin vivoで特異的に結合できる分子である。ある実施態様では、当該作用因子は、TNFRポリペプチドのN-末端に位置するエピトープと特異的に結合し、ここでエピトープはN-末端VPAQVモチーフを含む。ある実施態様では、TNFRポリペプチドはウマTNFR p80アイソフォームであり、当該作用因子が特異的に結合するエピトープはN-末端VPAQVAFモチーフを含む。別の実施態様では、TNFRポリペプチドはネコTNFR p80アイソフォームであり、当該作用因子が特異的に結合するエピトープはN-末端VPAQVVLモチーフを含む。
適切な作用因子は当業者には公知であろう。例示的な例には、TNFR p80ポリペプチド、フラグメント又は融合タンパク質と特異的に結合できる抗体又はそのフラグメントが含まれる。本明細書に開示する方法にしたがって使用される適切な抗体は当業者には公知であろう。例示的な例には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一特異的抗体、多重特異抗体（二重特異的抗体を含む）、ヒト化抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異導入抗体、及びCDR移植抗体が含まれる。抗体及びその結合フラグメントを生成する多様な技術は当業界で公知である。抗体は任意の種に由来することができ、前記種にはラット、マウス、ヤギ、モルモット、ロバ、ウサギ、ウマ、ラマ、ラクダ、又は鳥類の任意の種（例えばニワトリ、アヒル）が含まれるがこれらに限定されない。抗体は任意の適切なアイソタイプ、例えばIgG、IgM、IgA、IgD、IgE、又は前記の任意のサブクラスであり得る。本明細書の方法にしたがって使用するために組換えによって又は他の手段によって生成される抗体には、本明細書に記載するTNFR p80アイソフォームとなお結合できるか或いはまた前記を認識することができるフラグメントが含まれることは当業者には理解されるであろう。例にはFab、F(ab)2、Fv、scFvフラグメントが含まれる。ある実施態様では、抗体はモノクローナル抗体又はそのTNFR p80結合フラグメントである。モノクローナル抗体はヒト化するか、又は非ヒト抗体の脱免疫化型であり得る。
【００５１】
本明細書に開示する別の実施態様では、作用因子は、少なくとも2つのエピトープと特異的に結合できる多重特異抗体であり、ここで、少なくとも2つの抗原の1つはウマ又はネコTNFR p80ポリペプチドのエピトープである。多重特異抗体は二重特異抗体でもよい。
ある実施態様では、作用因子は細胞表面結合TNFR p80ポリペプチドと特異的に結合できる。
本明細書に開示する別の実施態様では、作用因子は、ウマ又はネコTNFR p80ポリペプチドを発現する細胞を標的とする細胞傷害性因子である。この関係では、作用因子は細胞傷害性部分で標識することができる。適切な細胞傷害性部分は当業者に公知であり、その例示的な例には毒素、アポトーシス作用因子又は放射性同位元素が含まれる。別の実施態様では、作用因子は、補体指令手段によって細胞を傷害する抗体である。
本明細書が可能にするものはまた、異常なTNFR発現と密接に関係する症状をネコ対象動物で治療又は予防する方法であり、前記方法は、本明細書に記載するネコTNFR p80ポリペプチドに特異的に結合できる作用因子の治療的に有効な量をその必要があるネコに投与する工程を含む。本明細書が可能にするものはまた、異常なTNFR発現に付随する症状をウマ対象動物で治療又は予防する方法であり、前記方法は、本明細書に記載するウマTNFR p80ポリペプチドに特異的に結合できる作用因子の治療的に有効な量をその必要があるウマに投与する工程を含む。
“異常な”という用語は、典型的には、TNFR p80の発現レベルが望ましくない病理学的又は生理学的症状又は状態（その1つの徴候を含む）と相関性を有するか又はそれらに付随する場合のTNFR p80の発現レベルを意味し、この発現レベルは例えば（i）生物学的サンプル中のTNFR p80ポリペプチドの濃度、（ii）TNFR p80ポリペプチドを発現する対象動物の細胞数、及び/又は（iii）細胞表面のTNFR p80ポリペプチドの発現レベル、によって決定される。TNFR p80ポリペプチドの発現レベルは当業者に公知の任意の手段によって決定でき、その例示的な例にはウェスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）及び蛍光活性化細胞選別（FACS）分析が含まれる。
本明細書が可能にするものはまた、異常なTNFR p80発現に付随する症状の治療用医薬の製造における、本明細書に記載するウマ又はネコTNFR p80アイソフォームと特異的に結合できる作用因子の使用である。
【００５２】
本明細書が可能にするものはまた、TNFR p80の異常な発現に不随する症状を対象動物で診断又はモニターする方法であり、前記方法は、対象動物の生物学的サンプルをTNFR p80の存在及び/又はレベルについて分析する工程を実行する工程を含み、前記実行工程は、本明細書に記載するTNFR p80ポリペプチドと特異的に結合できる作用因子と当該生物学的サンプルを接触させる工程を含み、当該作用因子とTNFR p80ポリペプチドとの結合はTNFR p80ポリペプチドを発現する細胞の存在の指標となる。当業者は、本明細書に記載する正確なアミノ酸配列に関する情報を用いて、TNFR p80ポリペプチド（例えば本明細書に記載するウマ又はネコTNFR p80ポリペプチド）と特異的に結合できる適切な作用因子を開発できよう。作用因子の例示的な例は本明細書の別の箇所に記載される。
本明細書に開示するある実施態様では、本明細書に記載するTNFR p80ポリペプチドと特異的に結合できる作用因子は、TNFR p80ポリペプチドと作用因子の結合の検出を容易にするために検出可能な標識を用いて標識することができる。適切な検出可能標識は当業者に公知であり、その例示的な例には、直接的又は間接的に検出でき、標的（例えばTNFR p80）の存在を明らかにする任意の分子が含まれる。本発明にしたがって用いることができる検出可能標識の適切な例には、発蛍光団、放射性同位元素、発色団、電気化学発光標識、生物発光標識、ポリマー、ポリマー粒子、ビーズ若しくは他の固体表面、金若しくは他の金属粒子又は重原子、スピン標識、ハプテン、myc、ニトロチロシン、ビオチン及びアビジンが含まれる。他のものにはリン光体粒子、ドープ粒子、ナノ結晶又は量子ドットが含まれる。ある実施態様では、直接検出が可能な標識が用いられる。直接検出可能標識は、追加の分子を必要としないでそれ自体検出され得る。別の実施態様では、間接検出が可能な標識が用いられ、これは、検出可能な分子複合体（例えばビオチン-アビジン複合体）の形成のために1つ以上の追加の分子の利用を必要とする。
【００５３】
本明細書で開示されるものはまた、少なくとも部分的にTNFが介在する症状を対象動物で診断又はモニターする方法であり、前記方法は、対象動物の生物学的サンプルをTNFの存在及び/又はレベルについて分析する工程を実行する工程を含み、ここで、前記実行工程は、本明細書に記載するTNFRポリペプチド、そのTNF結合フラグメント又は融合タンパク質と当該生物学的サンプルを接触させる工程を含み、ここで、ポリペプチド、結合フラグメント又は融合タンパク質とTNFとの結合はサンプル中のTNFの存在の指標となる。
本明細書に開示するある実施態様では、本明細書に記載するTNFRポリペプチド、そのTNF結合フラグメント又は融合タンパク質は、当該ポリペプチド、結合フラグメント又は融合タンパク質とTNFとの結合の検出を容易にするために検出可能な標識を用いて標識することができる。適切な検出可能標識は当業者に公知であり、その例示的な例には、直接的又は間接的に検出でき、標的（例えばTNF）の存在を明らかにする任意の分子が含まれる。本発明にしたがって用いることができる検出可能標識の適切な例には、発蛍光団、放射性同位元素、発色団、電気化学発光標識、生物発光標識、ポリマー、ポリマー粒子、ビーズ若しくは他の固体表面、金若しくは他の金属粒子又は重原子、スピン標識、ハプテン、myc、ニトロチロシン、ビオチン及びアビジンが含まれる。他のものにはリン光体粒子、ドープ粒子、ナノ結晶又は量子ドットが含まれる。ある実施態様では、直接検出が可能な標識が用いられる。直接検出可能標識は、追加の分子を必要としないでそれ自体検出され得る。別の実施態様では、間接検出が可能な標識が用いられ、これは、検出可能な分子複合体（例えばビオチン-アビジン複合体）の形成のために1つ以上の追加の分子の利用を必要とする。
必要な場合には、本明細書に開示する診断及び/又はモニターの方法は、二次結合因子を用いて当該方法の感度を増す工程を含むことは、当業者には理解されよう。本明細書で用いられる、“二次結合因子”という用語は、本明細書に記載するTNFR p80ポリペプチド、そのTNF結合フラグメント又は融合タンパク質と結合或いはまた認識できる任意の物質、又はTNFと結合する作用因子と結合或いはまた認識できる任意の物質を意味する。適切な二次結合因子は当業者には公知であろう。例示的な例には抗体又はその抗原結合フラグメントが含まれ、本明細書では二次抗体とも称される。二次結合因子として用いられる適切な抗体は当業者には公知で、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異導入抗体、及びCDR移植抗体が含まれる。抗体は、上記に記載した任意の種から誘導でき、任意の適切なアイソタイプ、例えばIgG、IgM、IgA、IgD、IgE、又はそれらの任意のサブクラスであり得る。本明細書の方法にしたがって使用するために組換えによって又は他の手段によって生成される抗体には、一次結合薬剤となお結合できるか或いはまた前記を認識することができる抗原結合フラグメントが含まれることは当業者には理解されるであろう。例示的な例にはFab、F(ab)2、Fv、及びscFvフラグメントが含まれる。
【００５４】
本明細書で用いられる、“認識する”、“認識”などという用語は、ある物質（例えば結合作用因子）が直接的又は間接的に標的分子と、当該標的との相互作用が検出可能な仕方で相互作用する事象を意味する。いくつかの例では、結合作用因子は標的と反応するか若しくは標的と直接結合でき、又は結合作用因子は、別の物質と直接結合し前記物質が続いて標的と結合若しくは反応することによって標的と間接的に反応若しくは結合することができる。2つ以上の実体間での結合に関して本明細書で用いられる、“〜に特異的な”、“特異的に”などという用語は、結合が、非特異的な凝集又は会合を介するものではなく、補完的な結合パートナー間での特異的な相互作用を介するものであることを意味する。
本明細書に記載する診断方法はまた、少なくとも部分的にTNFが介在する症状又は異常なTNFR p80発現と密接に関係する症状の重篤度をモニターするために用いることができる。本明細書に記載する診断方法はまた、少なくとも部分的にTNFが介在する症状又は異常なTNFR p80発現と密接に関係する症状の治療レジメンの有効性をモニターするために用いることができる。例えば、当該症状の経過中に（例えば毎日、毎週、毎月などの間隔で）対象動物からサンプルを入手し、TNF及び/又はTNFR p80の存在及び/又は発現レベルについて本明細書に記載の方法によって各サンプルを分析することができる。TNF及び/又はTNFR p80の発現レベルの変化（発現の有無を含む）は当該症状の重篤度の典型的な指標である。ある期間にわたって対象動物を経過観察して、したがって当該症状の重篤度の変化を時間の経過にしたがってモニターすることができ、必要な場合には治療レジメンを処方するか又は重篤度の変化を埋め合わせるために治療レジメンを改変できる。別の例示的な例では、治療レジメンの開始前及び/又は開始後に対象動物からサンプルを入手して、TNF及び/又はTNFR p80の発現の存在及び/又はレベルについて本明細書に開示の方法によって分析することができる。TNF及び/又はTNFR p80の発現レベルの変化（発現の有無を含む）は、本明細書に記載する症状の重篤度の典型的な指標である。ある期間にわたって対象動物を経過観察して、したがって当該症状の重篤度の変化を時間の経過にしたがってモニターすることができ、必要な場合には、重篤度の変化を埋め合わせるために治療レジメンを改変できる（例えば治療レジメンの投薬を増加させる）。
以下の実施例を参照しながら、本発明がこれから説明されるであろう（前記実施例は例示を目的として提供され、本発明の範囲を制限すると解されることを意図しない）。本発明の方法及び技術は、当業界で周知であり、種々の一般的かつより具体的な参考書（特段の指示がなければ本明細書を通して引用され考察されている）に記載されている通常的な方法にしたがって概ね実施される。
【実施例１】
【００５５】
ウマTNFR p80ポリペプチド
本明細書の別の箇所に記載するように、本発明者らは、従来のウマTNFR p80（XM_005607617）の予測アミノ酸配列はシグナルペプチドとして機能しない不正確なリーダー配列を含むことを明らかにした。ウマTNFRのp80アイソフォームの正確なリーダー配列を同定するために、TNFRのp80アイソフォームのヒト、マウス、ブタ及びイヌ末端配列をコードするDNA配列の情報から縮重プライマーEqDegを設計した。図1は、センスプライマーEqDegの設計に用いたイヌ（科の動物）、ヒト、ネズミ（科の動物）（マウス）及びブタ（科の動物）（ブタ）のp80 TNFRヌクレオチド配列のアラインメントを示す。
50mLのウマ血液から調製したバッフィーコート細胞から総RNAを単離した。特異的にプライミングした第一鎖のcDNAを2μgのウマ総RNAから調製した。プライマーEqGSP-1（図1参照）を第一鎖合成のプライミングに用いた。続いてこの特異的にプライミングした第一鎖cDNAを、縮重フォワードプライマーEqDeg及びネステッドリバースプライマーEqStdRを用いる標準的PCR増幅のための鋳型として用いた。230bpのPCR生成物を入手し、これをサブクローニングして配列を決定した。翻訳した配列決定PCR生成物EqDegR2のアミノ酸アラインメントは図2に示す。
図2Aに示すアラインメントデータは、ウマp80 TNFRの正確なコード配列が同定されたことを確認する。
シグナルペプチドは、ヒトp80 TNFRについて予測されたものと類似する位置に切断を有する翻訳EqDegR2について予測される。シグナルペプチド切断部位はSignalPソフトウェアから予測された(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。SignalPアルゴリズムは、パターン認識のための神経ネットワークを利用して、シグナルペプチドのコンセンサス配列を予測する。シグナルペプチド切断部位は図2Bに示される（図4Bも参照されたい）。
シグナル配列の切断は、N-末端“VPAQV”モチーフを含む成熟ウマp80 TNFRポリペプチドを生じる。
ウマp80 TNFRの以前のデータベース登録（TNFRSF1B、以下で見いだされる：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/XM_005607617）は下記のアミノ酸配列（配列番号:19）を含むことは特記されるべきである。
【００５６】
配列番号１９
【化１】
2018504911.tif 000003
【００５７】
枠で囲まれた配列はゲノム配列（図3参照）のエクソン1に由来し、ヒトではエクソン2の21,626bp上流に位置する。本発明者らは、TNFR1B遺伝子のエクソン1とエクソン2との間には大きな隔たりがあるので、エクソン予測ソフトはコンパニオン動物のゲノム配列で正確なエクソン1を同定できないであろうと気付いた。これは図4Aで証明される。枠で囲まれた配列をシグナルペプチド予測プログラム（例えば（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）に入力したときシグナルペプチドは予測されない（図4A参照）。これは、ヒトp80配列を用いて実施した同じ分析と対照的である（図2B及び4B参照）。
‘リーダー配列’、MGEEAGVEGARASPFYSYLLHVEKSPITFPLQを有する、ウマp80 TNFRについて従来のデータベースに示される不正確な配列は当該コンセンサスと一致せず、シグナルペプチドとして認識されない。予測ウマp80 TNFR配列（XM_005607617）の場合のように、シグナルペプチドを欠く分子は細胞から分泌されず、したがって機能しないであろう。
当該ウマTNFRのp80アイソフォームとは対照的に、p60アイソフォーム（TNFR1A）はウマゲノム配列から正確に予測される。ヒト及びウマp60配列間のアラインメントは図5に示される。TNFR1A遺伝子のエクソン1とエクソン2との間の距離は、ウマp80 TNFR1B遺伝子のエクソン1とエクソン2との間の距離21,626bpと比較してわずかに7512bpである。
図6は、ウマp80 TNFRのエクソン1をコードするDNA配列、EqDegR2を示す。
要約すれば、従来の予測ウマTNFR p80アイソフォーム（XM_005607617）は、不完全なウマTNFR p80細胞外ドメインをコードする不完全版と認定され、シグナル配列を欠き成熟ペプチド（VPAQV）N-末端配列を持たないために、哺乳動物細胞で発現され得ない。TNFRのp80アイソフォームのヒト、マウス、ブタ及びイヌのN-末端配列をコードするDNA配列に関する情報を基づいて設計された縮重プライマー、EqDegを用いることによって、本発明者らは、ウマp80 TNFRのp80アイソフォームの正確なN-末端配列を同定した。
【実施例２】
【００５８】
ウマTNFRポリペプチドおよびウマTNFR-Fc融合タンパク質の精製
配列番号:5、配列番号:16及び配列番号:17のいずれか1つ以上をコードする発現プラスミドをCHO細胞にトランスフェクトし、ウマTNFR p80前駆体の発現を得る。前記前駆体は続いて切断されてシグナル配列を遊離して機能的な成熟ウマTNFR p80アイソフォームを生じる。前記アイソフォームを試験し、さらに等価のヒトTNFRポリペプチド又は等価のヒトTNFR融合タンパク質ポリペプチドと比較することができる（ここで、当該融合タンパク質は、ヒトIgGのヒンジ領域並びにCH2及びCH3ドメインを含むポリペプチドとN-末端で融合されたヒトTNFR p80細胞外ドメインを含む）。
続いて、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて、生成された機能的なウマTNFRポリペプチド又は融合タンパク質とウマTNFとの結合を、例えば抗ウマIgGポリクローナル二次抗体-HRP結合物を用いて決定する。
組換えウマ融合タンパク質は、用いたIgG重鎖定常領域由来融合パートナーの配列に応じて、タンパク質A及びタンパク質Gセファロースタンデムカラムでのポストアフィニティー捕捉によって上清から精製できる。本発明者らは、タンパク質AクロマトグラフィーはウマIgGサブタイプ（HC2）の精製を補助し、さらにIgG2タイプのウマ由来免疫グロブリン重鎖ドメインはIgG6タイプの重鎖ドメインよりも効率的に精製され得ることを以前に示した。したがって、本発明の実施態様による融合タンパク質の精製は、融合パートナーがウマIgG2サブタイプに由来する場合には、ウマIgG6サブタイプと比較してより高収量を提供する。
タンパク質A及び/又はタンパク質Gアフィニティー精製の生成物を続いて非還元SDS-PAGEゲル電気泳動によって分析し、ウマTNFR融合タンパク質の回収（すなわち収量）を確認する。
【実施例３】
【００５９】
ウマTNF活性の阻害
本発明のTNFRポリペプチド又は融合タンパク質、又はそのフラグメントがTNF活性を阻害することができるか否かを決定するために、細胞系アッセイを用いる。NF-kB-EGFPレポーター構築物pTRH1（Vince et al., Cell, 131, 682, 2007）をトランスフェクトした293-HEK細胞を、TNFRポリペプチド及び/又は融合タンパク質及び/又はそのフラグメントの存在下又は非存在下でウマTNF-アルファ（R&D systems, 1ng/mL）に暴露する。これらの細胞は蛍光によりウマTNFと応答して、TNFRポリペプチド、融合タンパク質又はそのフラグメントの非存在下の蛍光レベルと比較したとき、コントロールグループで適切である蛍光からの減少によって結合の阻害が証明される。
【実施例４】
【００６０】
TNF受容体融合タンパク質は補体活性を欠く
本発明の融合タンパク質をウマTNF（4μg/mL）で予め被覆したプレートでインキュベートする。比較のために、TNFRに特異性を有するイヌ化モノクローナル抗体（MAb（イヌアイソタイプHCB））をイヌTNF被覆プレートでインキュベートする。続いて、このプレートを洗浄し、さらに補体供給源として正常血清又は加熱不活化ヒト血清とともにインキュベートする。補体C1qの結合はC1q反応ポリクローナル抗体-HRP結合物を用いて検出される。
【実施例５】
【００６１】
ネコTNFR p80ポリペプチド
本明細書の別の箇所に特記するように、本発明者らは、ネコTNFRのp80アイソフォームの核酸配列を初めて同定した。本明細書の別の箇所に記載するように、TNFRのp80アイソフォームのヒト、マウス、ブタ及びイヌ末端配列をコードするDNA配列の情報から縮重プライマーEqDegを設計した。図1は、縮重センスプライマーEqDegの設計に用いたイヌ（科の動物）、ヒト、ネズミ（科の動物）（マウス）及びブタ（科の動物）（ブタ）のp80 TNFRヌクレオチド配列のアラインメントを示す。
50mLのネコ血液から調製したバッフィーコート細胞から総RNAを単離した。特異的にプライミングした第一鎖のcDNAを2μgのネコ総RNAから調製した。アンチセンスプライマーFeGSP-1（図8参照）を第一鎖合成のプライミングに用いた。続いてこの特異的にプライミングした第一鎖cDNAを、縮重フォワードプライマーEqDeg及びネステッドリバースプライマーFeGSP2nestを用いる標準的PCR増幅のための鋳型として用いた。約356bpのPCR生成物を入手し、これをサブクローニングして配列を決定した（図9参照）。翻訳した配列決定PCR生成物のアミノ酸アラインメントは図10に示される。
シグナルペプチドは、図10に示されるように翻訳したネコp80について予測される（矢印参照）。シグナルペプチド切断部位はSignalPソフトウェアから予測された(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。SignalPアルゴリズムは、パターン認識のための神経ネットワークを利用して、図11に示されるように、シグナルペプチドのコンセンサス配列を予測する。
シグナル配列の切断は、N-末端“VPAQV”モチーフを含む成熟ネコp80 TNFRポリペプチドを生じる。
【実施例６】
【００６２】
ネコTNFR融合タンパク質の精製
配列番号:41のいずれか1つ以上をコードする発現プラスミドをCHO細胞にトランスフェクトし、ネコTNFR p80前駆体を含む融合タンパク質の発現を得る。このタンパク質は続いて切断されてシグナル配列を遊離して機能的な成熟ネコTNFR p80ポリペプチドを生じる。前記ポリペプチドを試験し、さらに等価のヒトTNFR融合タンパク質ポリペプチドと比較することができる（当該融合ペプチドは、例えばヒトIgGのヒンジ領域並びにCH2及びCH3ドメインを含むポリペプチドとN-末端で融合されたヒトTNFR p80細胞外ドメインを含む）。
続いて、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて、発現されたネコTNFR融合タンパク質の上清とネコTNFとの結合を決定する（抗ネコIgGポリクローナル二次抗体-HRP結合物を用いて検出）。
続いて、組換えネコ融合タンパク質は、キメラ融合ポリペプチドのFc領域の配列に応じて、タンパク質A及びタンパク質Gセファロースタンデムカラムでのポストアフィニティー捕捉によって上清から精製できる。本発明者らは、タンパク質AクロマトグラフィーはネコIgG2サブタイプ（HC2）の精製を補助できることを以前に示した。したがって、本発明の実施態様のキメラ融合ポリペプチドの精製は、タンパク質Aセファロースカラムにより達成できる。
タンパク質Aアフィニティー精製の生成物を続いて非還元SDS-PAGEゲル電気泳動によって分析し、ネコTNFRキメラ融合タンパク質の回収（すなわち収量）を確認する。
【実施例７】
【００６３】
ネコTNF活性の阻害
本発明のネコTNFR融合タンパク質又はそのフラグメントがTNF活性を阻害することができるか否かを決定するために、細胞系アッセイを用いることができる。例えば、NF-kB-EGFPレポーター構築物pTRH1（Vince et al., Cell, 131, 682, 2007）をトランスフェクトした293-HEK細胞を、ネコTNFR融合タンパク質及び/又はそのフラグメントの存在下又は非存在下でTNF-アルファ（R&D systems, 1ng/mL）に暴露する。これらの細胞は蛍光によりネコTNFと応答して、TNFR融合タンパク質又はそのフラグメントの非存在下の蛍光レベルと比較したとき、コントロールグループのように蛍光の減少によって結合の阻害が証明される。
【実施例８】
【００６４】
ネコTNF受容体融合タンパク質は補体活性を欠く
本発明のネコ融合タンパク質をネコTNF（4μg/mL）で予め被覆したプレートでインキュベートする。比較のために、TNFRに特異性を有するイヌ化モノクローナル抗体（Mab（イヌアイソタイプHCB））をイヌTNF被覆プレートでインキュベートする。続いて、このプレートを洗浄し、さらに補体供給源として正常血清又は加熱不活化ヒト血清とともにインキュベートする。補体C1qの結合はC1q反応ポリクローナル抗体-HRP結合物を用いて検出される。
【実施例９】
【００６５】
ネコTNFR受容体融合タンパク質の精製
ネコTNFR p80-Fc融合ペプチド（標識されたNV-12、配列番号:40に示すアミノ酸配列を有する）を以下の工程を含む3-工程プロセスによって精製した：（i）MabSelect SuReクロマトグラフィー（工程1；図12A参照）、HiTrap Q XL:陰イオン交換クロマトグラフィー（工程2；図12B参照）及びCHTセラミックヒドロキシアパタイト精製（工程3；図12C）。続いて、精製ネコTNFR p80-Fc融合ペプチドを還元及び非還元状態で図13に示すようにSDS-PAGEゲルで泳動した。図14は、上記及び図12A−Cに概略した3-工程精製にしたがって入手した精製ネコTNFR p80-Fc融合ペプチド、NV-12の溶出プロフィールを示す。
ネコTNFR p80-Fc融合ペプチドの薬物動態を決定するために、NV-12（本明細書に開示の3-工程プロセスによって精製したNV-12の約2mg/kg体重）を2匹のネコ（対象動物番号1336及び85364）の静脈内に投与し、血中NV-12レベルを投与後の種々の時点で酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって測定した。データは図18に提示される。NV-12の終末相半減期は約3.6日と概算された。
【実施例１０】
【００６６】
ウマTNFR受容体融合タンパク質の精製
ネコTNFR p80-Fc融合ペプチド（標識されたNV-11、配列番号:14に示すアミノ酸配列を有する）を以下の工程を含む2-工程プロセスによって精製した： MabSelect SuReクロマトグラフィー（工程1；図15A参照）及びQセファロースXL陰イオン交換クロマトグラフィー（工程2；図15B参照）。続いて、精製ウマTNFR p80-Fc融合ペプチドを還元及び非還元状態で図16に示すようにSDS-PAGEゲルで泳動した。図17は、上記及び図15A及び15Bに概略した2-工程精製にしたがって入手した精製ウマTNFR p80-Fc融合ペプチド、NV-11の溶出プロフィールを示す。
本明細書に引用した全ての文書類は参照により本明細書に含まれる。本発明の範囲を逸脱しない、本発明に記載の実施態様に対する多様な改変及び変更が当業者には明白であろう。本発明を具体的な好ましい実施態様との関係でこれまで記載してきたが、特許請求の範囲の発明はそのような具体的な実施態様に不当に限定されるべきでないことは理解されよう。実際のところ、本発明の記載の実施態様の多様な改変（当業者には明白である）を本発明に包含することが意図される。
【００６７】
配列の簡単な記載
配列番号:1（Mukaiら（Science Signaling 3(148):ra83）記載のヒトTNFR p80アイソフォームのCDR2及びCDR3結合ドメインから予測したCDR2及びCDR3 TNF結合ドメインを含むウマTNFR p80ポリペプチドの末端短縮細胞外ドメイン）
VPAQVVFPRSIPEPSNLCQPREYYDERAQRRCSQCPPGCRAKSFCNETSDTVCVPCEDSTYTQLWNWLPECLSCGSRCSTGQVETQACTLKQNRICTCEPGRYCILPRQEGCQVCGLLRKCPPGFGVAKPGTATSNVVCA
【００６８】
配列番号:2（成熟ウマTNFR p80ポリペプチドの細胞外ドメイン）
VPAQVVFPRSIPEPSNLCQPREYYDERAQRRCSQCPPGCRAKSFCNETSDTVCVPCEDSTYTQLWNWLPECLSCGSRCSTGQVETQACTLKQNRICTCEPGRYCILPRQEGCQVCGLLRKCPPGFGVAKPGTATSNVVCAACAPGTFSDRTSSTDTCRPHRNCSSVAVPGNASMDAVCKSVLPTPRVASEPASAPQPGSTRSHHAELTRGPSTAPGTSPLPPMVPSPPAEGLITGN
【００６９】
配列番号:3（成熟ウマTNFR p80アイソフォーム（細胞外ドメイン（ECD：太字及び下線）及びトランスメンブレンドメインを含む））
【化２】
2018504911.tif 000004
【００７０】
配列番号:4（ウマTNFR p80シグナル配列）
MAPVAVWAALAVGLQLWAAGRA
【００７１】
配列番号:5（予測ウマTNFR p80ポリペプチド前駆体（シグナル配列（太字＋下線）、ECD及びトランスメンブレンドメインを含む））
【化３】
2018504911.tif 000005
【００７２】
配列番号:6（ウマTNFR p80ポリペプチドをコードする核酸コード（センス）配列）
ATGGCGCCCGTCGCCGTCTGGGCCGCGCTGGCCGTCGGACTACAGCTCTGGGCCGCGGGGCGCGCCGTGCCGGCCCAGGTGGTGTTTCCCCGCTCTATCCCGGAGCCCAGCAACTTGTGCCAGCCAAGAGAATACTACGACGAGAGGGCCCAGAGGCGGTGCAGCCAGTGTCCACCCGGCTGCCGCGCAAAAAGTTTCTGCAACGAGACCTCAGATACGGTGTGTGTCCCCTGCGAGGACAGCACATACACCCAGCTCTGGAACTGGCTCCCCGAGTGCCTGAGCTGTGGCTCCCGCTGCAGCACCGGCCAAGTGGAAACTCAAGCCTGTACTTTGAAGCAGAACCGCATCTGCACCTGCGAGCCGGGCAGGTACTGCATACTTCCAAGGCAGGAGGGGTGCCAGGTCTGCGGGCTGCTGCGCAAGTGCCCGCCCGGCTTCGGCGTGGCCAAGCCAGGAACTGCGACATCAAACGTGGTGTGCGCTGCCTGTGCCCCAGGGACATTCTCCGACAGGACGTCGTCCACAGATACTTGCAGGCCCCACCGGAACTGTAGCTCGGTGGCCGTCCCTGGCAATGCCAGCATGGATGCCGTCTGCAAGTCTGTGCTTCCCACCCCGAGAGTGGCCTCGGAGCCAGCCTCTGCGCCCCAGCCAGGGTCCACGAGATCCCATCACGCGGAGCTGACCCGCGGGCCCAGCACAGCTCCTGGTACCTCCCCCCTGCCCCCGATGGTTCCAAGCCCCCCAGCTGAAGGGCTCATCACTGGCAACTTCTCCCTTCCAATTGGGCTGATCGTGGGAGTGACAGCCTTGGGTCTGCTAGTAATCGGGCTGGTGAACTGTGTCATCATGACCCAGAAGAAAAAGAAGTCCTTCTGCCTGCAAGGAGAAGCCAAGGTGCCTCACCTGCCTGCTGATAAGGCCGGAGGGGCTCCGGGCCAGGAGCAGCAGCACCTGCTGACCACGGCGCAAAGCTCCAGCAGCAGCTCCCTGGAGAGCTCGGCCAGCACCGCGGACAAGAGGGCGCCCACGGGGGACCAGCTGCATGCCCCAGGCACGGGGAAGGCCAGCGGGCCTGGGGAGGTGCGGGCCAGCTCCAGCAGCTCAGCAGAGCCTTCCTCTGGCAGCCACGGGACCCAGGTCAACGTCACATGCATCGTGAATGTTTGCAGCAATTCCGGCCACGGCTCCCAGTGCCCCTCCCAGACCAGCTCCACTGCGGGGGACACGGATGCCAGCCCCTCAGACTCCCTGAAGGACGAGCAGGTCCCCTTCTCCAAGGAGGAATGCCCTTGTCAGTCCCAGTCGGGGGCTTCAGAGACTCTGCTGCAGAACCCAGAGGAGAAGCCGCTGCCCCTTGGCGTGCCCGAGGGAGGGGTGAAGTCGTTAACCAGGCCAGCAAGGGACGCGTCACAGCCGAGAGGCGCTGATCTCTGGGCCTTCTAG
【００７３】
配列番号:7（ウマIgG1重鎖定常領域；HC1；ヒンジ領域並びにHC2及びHC3ドメインには下線が付されている）
ASTTAPKVFALAPGCGTTSDSTVALGCLVSGYFPEPVKVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGFYSLSSMVTVPASSWTSETYICNVVHAASNFKVDKRIEPIPDNHQKVCDMSKCPKCPAPELLGGPSVFIFPPNPKDTLMITRTPEVTCVVVDVSQENPDVKFNWYMDGVEVRTATTRPKEEQFNSTYRVVSVLRIQHQDWLSGKEFKCKVNNQALPQPIERTITKTKGRSQEPQVYVLAPHPDELSKSKVSVTCLVKDFYPPEINIEWQSNGQPELETKYSTTQAQQDSDGSYFLYSKLSVDRNRWQQGTTFTCGVMHEALHNHYTQKNVSKNPGK
【００７４】
配列番号:8（ウマIgG2重鎖定常領域；HC2；ヒンジ領域並びにHC2及びHC3ドメインには下線が付されている）
ASTTAPKYFQLTPSCGITSDATVALGCLVSDYYPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPSVLQSSGLYALSSMVTVPASTWTSETYICNVAHPASSTKVDKRIPPCVLSAEGVIPIPSVPKPQCPPYTHSKFLGGPSVFIFPPNPKDALMISRTPVVTCVVVNLSDQYPDVQFSWYVDNTEVHSAITKQREAQFNSTYRVVSVLPIQHQDWLSGKEFKCSVTNVGVPQPISRAISRGKGPSRVPQVYVLPPHPDELAKSKVSVTCLVKDFYPPDISVEWQSNRWPELEGKYSTTPAQLDGDGSYFLYSKLSLETSRWQQVESFTCAVMHEALHNHFTKTDISESLGK
【００７５】
配列番号:9（ウマIgG3重鎖定常領域；HC3；ヒンジ領域並びにHC2及びHC3ドメインには下線が付されている）
STTAPKVFPLAPSCGNTSDSTVALGCLVSSYFPEPVTVSWNSGTLTSGVRTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPASSLESKTYICNVAHPASSTKVDKRIEPVLPKPTTPAPTVPLTTTVPVETTTPPCPCECPKCPAPELLGGPSVFIFPPKPKDVLMITRMPEVTCLVVDVSHDSSDVLFTWYVDGTEVKTAKTMPNEEQNNSTYRVVSVLRIQHQDWLNGKKFKCKVNNQALPAPVERTISKATGQTRVPQVYVLAPHPDELSKNKVSVTCLVKDFYPTDITVEWQSNEHPEPEGKYRTTEAQKDSDGSYFLYSKLTVEKDRWQQGTTFTCVVMHEALHNHVMQKNISKNPGK
【００７６】
配列番号:10（ウマIgG4重鎖定常領域；HC4；ヒンジ領域並びにHC2及びHC3ドメインには下線が付されている）
ASTTAPKVFPLASHSAATSGSTVALGCLVSSYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPASSLKSQTYICNVAHPASSTKVDKKIVIKECNGGCPAECLQVGPSVFIFPPKPKDVLMISRTPTVTCVVVDVGHDFPDVQFNWYVDGVETHTATTEPKQEQFNSTYRVVSVLPIQHKDWLSGKEFKCKVNNKALPAPVERTISKPTGQPREPQVYVLAPHRDELSKNKVSVTCLVKDFYPTDIDIEWKSNGQPEPETKYSTTPAQLDSDGSYFLYSKLTVETNRWQQGTTFTCAVMHEALHNHYTEKSVSKSPGK
【００７７】
配列番号:11（ウマIgG5重鎖定常領域；HC5；ヒンジ領域並びにHC2及びHC3ドメインには下線が付されている）
ESPKAPDVFPLTICGNTPDPTVPVGCLVSNYFPEPVTVSWNCDALKGDIHTFPLDLSNSAHHSLSSMMAVPRSSLNQTYICSVAHPASSTKVDKRIVVKGSPCPKCPAPELPGGPSVFIFPPKPKDVLKISRKPEVTCVVVDLGHDDPDVQFTWFVDGVETHTATTEPKEEQFNSTYRVVSVLPIQHQDWLSGKEFKCSVTNKALPAPVERTTSKAKGQLRVPQVYVLAPHPDELAKNTVSVTCLVKDFYPPEIDVEWQSNEHPEPEGKYSTTPAQLNSDGSYFLYSKLSVETSRWKQGESFTCGVMHEAVENHYTQKNVSHSPGK
【００７８】
配列番号:12（ウマIgG6重鎖定常領域；HC6；ヒンジ領域並びにHC2及びHC3ドメインには下線が付されている）
ASTTAPKVFQLASHSAGTSDSTVALGCLVSSYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPSVRQSSGLYSLSSMVTVPASSLKSQTYICNVAHPASSTKVDKRIVIKEPCCCPKCPGRPSVFIFPPNPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQENPDVKFNWYVDGVEAHTATTKAKEKQDNSTYRWSVLPIQHQDWRRGKEFKCKVNNRALPAPVERTITKAKGELQDPKVYILAPHREEVTKNTVSVTCLVKDFYPPDINVEWQSNEEPEPEVKYSTTPAQLDGDGSYFLYSKLTVETDRWEQGESFTCWMHEAIRHTYROKSITNFPGK
【００７９】
配列番号:13（ウマIgG7重鎖定常領域；HC7；ヒンジ領域並びにHC2及びHC3ドメインには下線が付されている）
ASTTAPKVFPLASHSAATSGSTVALGCLVSSYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPASSLKSQTYICNVAHPASSTKVDKKIVIKECGGCPTCPECLSVGPSVFIFPPKPKDVLMISRTPTVTCVVVDVGHDFPDVQFNWYVDGVETHTATTEPKQEQNNSTYRVVSILAIQHKDWLSGKEFKCKVNNQALPAPVQKTISKPTGQPREPQVYVLAPHRDELSKNKVSVTCLVKDFYPTDIDIEWKSNGQPEPETKYSTTPAQLDSDGSYFLYSKLTVETNRWQQGTTFTCAVMHEALHNHYTEKSVSKSPGK
【００８０】
配列番号:14（融合タンパク質、eqTNFRp80:HC2（成熟ウマTNFR p80のECD及びウマIgG2重鎖定常領域を含む；ウマTNFR p80のECDは太字＋下線となっている））
【化４】
2018504911.tif 000006
【００８１】
配列番号:15（融合タンパク質、eqTNFRp80:HC6（成熟ウマTNFR p80のECD及びウマIgG6重鎖定常領域を含む；ウマTNFR p80のECDは太字＋下線となっている））
【化５】
2018504911.tif 000007
【００８２】
配列番号:16（融合タンパク質、eqpreTNFRp80:HC2（ウマTNFR p80ポリペプチド前駆体のECD及びウマIgG2重鎖定常領域を含む；シグナルペプチドは太字＋下線となっている）
【化６】
2018504911.tif 000008
【００８３】
配列番号:17（融合タンパク質、eqpreTNFRp80:HC2（ウマTNFR p80ポリペプチド前駆体のECD及びウマIgG2重鎖定常領域を含む；シグナルペプチドは太字＋下線となっている））
【化７】
2018504911.tif 000009
【００８４】
配列番号:18（GenBankアクセッション番号XM_005607617で示されるリーダー配列）
MGEEAGVEGARASPFYSYLLHVEKSPITFPLQ.
【００８５】
配列番号:19（予測ウマp80 TNFR、TNFRSF1B；XM_00507617）
【化８】
2018504911.tif 000010
【００８６】
配列番号:20（融合タンパク質、eqpreTNFRp80:HC1（ウマTNFR p80ポリペプチド前駆体の細胞外ドメイン、ウマIgG1ヒンジ領域並びにウマIgG1重鎖定常領域のCH2及びCH3ドメインを含む；シグナルペプチドは枠で囲まれ強調されている）
【化９】
2018504911.tif 000011
【００８７】
配列番号:21（成熟ウマTNFR p80のECD、ウマIgG1ヒンジ領域並びにウマIgG1重鎖定常領域のCH2及びCH3ドメインを含む融合タンパク質（成熟ウマTNFR p80のECDは太字＋下線となっている））
【化１０】
2018504911.tif 000012
【００８８】
配列番号:22（成熟ウマTNFR p80のECD、ウマIgG2ヒンジ領域並びにウマIgG2重鎖定常領域のCH2及びCH3ドメインを含む融合タンパク質（成熟ウマTNFR p80のECDは太字＋下線となっている））
【化１１】
2018504911.tif 000013
【００８９】
配列番号:23（成熟ウマTNFR p80のECD、ウマIgG3ヒンジ領域並びにウマIgG3重鎖定常領域のCH2及びCH3ドメインを含む融合タンパク質（成熟ウマTNFR p80のECDは太字＋下線となっている））
【化１２】
2018504911.tif 000014
【００９０】
配列番号:24（成熟ウマTNFR p80のECD、ウマIgG4ヒンジ領域並びにウマIgG4重鎖定常領域のCH2及びCH3ドメインを含む融合タンパク質（成熟ウマTNFR p80のECDは太字＋下線となっている））
【化１３】
2018504911.tif 000015
【００９１】
配列番号:25（成熟ウマTNFR p80のECD、ウマIgG5ヒンジ領域並びにウマIgG5重鎖定常領域のCH2及びCH3ドメインを含む融合タンパク質（成熟ウマTNFR p80のECDは太字＋下線となっている））
【化１４】
2018504911.tif 000016
【００９２】
配列番号:26（成熟ウマTNFR p80のECD、ウマIgG6ヒンジ領域並びにウマIgG6重鎖定常領域のCH2及びCH3ドメインを含む融合タンパク質（成熟ウマTNFR p80のECDは太字＋下線となっている））
【化１５】
2018504911.tif 000017
【００９３】
配列番号:27（成熟ウマTNFR p80のECD、ウマIgG7ヒンジ領域並びにウマIgG7重鎖定常領域のCH2及びCH3ドメインを含む融合タンパク質（成熟ウマTNFR p80のECDは太字＋下線となっている））
【化１６】
2018504911.tif 000018
【００９４】
配列番号:28（ウマTNFR p80の予測CDR2及びCDR3 TNF結合ドメイン、ウマIgG1ヒンジ領域並びにウマIgG1重鎖定常領域のCH2及びCH3ドメインを含む融合タンパク質（ウマTNFR p80の予測CDR2及びCDR3 TNF結合ドメインは太字＋下線となっている））
【化１７】
2018504911.tif 000019
【００９５】
配列番号:29（ウマTNFR p80の予測CDR2及びCDR3 TNF結合ドメイン、ウマIgG2ヒンジ領域並びにウマIgG2重鎖定常領域のCH2及びCH3ドメインを含む融合タンパク質（ウマTNFR p80の予測CDR2及びCDR3 TNF結合ドメインは太字＋下線となっている））
【化１８】
2018504911.tif 000020
【００９６】
配列番号:30（ウマTNFR p80の予測CDR2及びCDR3 TNF結合ドメイン、ウマIgG3ヒンジ領域並びにウマIgG3重鎖定常領域のCH2及びCH3ドメインを含む融合タンパク質（ウマTNFR p80の予測CDR2及びCDR3 TNF結合ドメインは太字＋下線となっている））
【化１９】
2018504911.tif 000021
【００９７】
配列番号:31（ウマTNFR p80の予測CDR2及びCDR3 TNF結合ドメイン、ウマIgG4ヒンジ領域並びにウマIgG4重鎖定常領域のCH2及びCH3ドメインを含む融合タンパク質（ウマTNFR p80の予測CDR2及びCDR3 TNF結合ドメインは太字＋下線となっている））
【化２０】
2018504911.tif 000022
【００９８】
配列番号:32（ウマTNFR p80の予測CDR2及びCDR3 TNF結合ドメイン、ウマIgG5ヒンジ領域並びにウマIgG5重鎖定常領域のCH2及びCH3ドメインを含む融合タンパク質（ウマTNFR p80の予測CDR2及びCDR3 TNF結合ドメインは太字＋下線となっている））
【化２１】
2018504911.tif 000023
【００９９】
配列番号:33（ウマTNFR p80の予測CDR2及びCDR3 TNF結合ドメイン、ウマIgG6ヒンジ領域並びにウマIgG6重鎖定常領域のCH2及びCH3ドメインを含む融合タンパク質（ウマTNFR p80の予測CDR2及びCDR3 TNF結合ドメインは太字＋下線となっている））
【化２２】
2018504911.tif 000024
【０１００】
配列番号:34（ウマTNFR p80の予測CDR2及びCDR3 TNF結合ドメイン、ウマIgG7ヒンジ領域並びにウマIgG7重鎖定常領域のCH2及びCH3ドメインを含む融合タンパク質（ウマTNFR p80の予測CDR2及びCDR3 TNF結合ドメインは太字＋下線となっている））
【化２３】
2018504911.tif 000025
【０１０１】
配列番号:35（ウマIgG1ヒンジ領域）
EPIPDNHQKVCDMSKCPKCP
【０１０２】
配列番号:36（Mukaiら（Science Signaling 3(148):ra83）記載のヒトTNFR p80アイソフォームのCDR2及びCDR3結合ドメインから予測したCDR2及びCDR3 TNF結合ドメインを含むネコTNFR p80ポリペプチドの末端短縮細胞外ドメイン）
RCEDSTYTKLWNWVRECLSCDSRCTSDQVETQACTPEQNRVCTCRPGWYCTLKRQKGCRLCAPLHRCRPGFGVTRPGTATSNVACA
【０１０３】
配列番号:37（成熟ネコTNFR p80ポリペプチドの細胞外ドメイン（N-末端VPAQVモチーフを含む））
VPAQVALLPYVPEPGSSCQLTEYFDERTQMCCSKCQPGYHAQSLCSETSNTVCARCEDSTYTKLWNWVRECLSCDSRCTSDQVETQACTPEQNRVCTCRPGWYCTLKRQKGCRLCAPLHRCRPGFGVTRPGTATSNVACAPCGPGTFSDTTSSTDVCRPHRICGSVAIPGNATMDAVCASVPPTLRMAPRPAPTSQPASTLSQQVEPTPGPRTAPSTSLLFVMVPTPPAEGLSTGD
【０１０４】
配列番号:38（ネコTNFR p80シグナル配列）
MAPVAVWATLAVGLQLWAAGRA
【０１０５】
配列番号:39（また別のネコTNFR p80シグナル配列）
MAPAALWATLAVGLQLWAAGRA
【０１０６】
配列番号:40（融合タンパク質、feTNFRp80:HC1（成熟ネコTNFR p80ポリペプチドの細胞外ドメイン並びにヒンジ領域、ネコIgG1重鎖定常領域のCH2及びCH3ドメイン（アミノ酸残基237−473）を含む））
VPAQVALLPYVPEPGSSCQLTEYFDERTQMCCSKCQPGYHAQSLCSETSNTVCARCEDSTYTKLWNWVRECLSCDSRCTSDQVETQACTPEQNRVCTCRPGWYCTLKRQKGCRLCAPLHRCRPGFGVTRPGTATSNVACAPCGPGTFSDTTSSTDVCRPHRICGSVAIPGNATMDAVCASVPPTLRMAPRPAPTSQPASTLSQQVEPTPGPRTAPSTSLLFVMVPTPPAEGLSTGDRKTDHPPGPKPCDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKAKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIKSFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFVYSKLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPGK**
【０１０７】
配列番号:41（融合タンパク質、fepreTNFRp80:HC1（ネコTNFR p80ポリペプチド前駆体の細胞外ドメイン、ネコヒンジ領域、並びにネコIgG1重鎖定常領域のCH2及びCH3ドメインを含む；シグナルペプチド（配列番号:38）には下線を付されている）
MAPVAVWATLAVGLQLWAAGRAVPAQVALLPYVPEPGSSCQLTEYFDERTQMCCSKCQPGYHAQSLCSETSNTVCARCEDSTYTKLWNWVRECLSCDSRCTSDQVETQACTPEQNRVCTCRPGWYCTLKRQKGCRLCAPLHRCRPGFGVTRPGTATSNVACAPCGPGTFSDTTSSTDVCRPHRICGSVAIPGNATMDAVCASVPPTLRMAPRPAPTSQPASTLSQQVEPTPGPRTAPSTSLLFVMVPTPPAEGLSTGDRKTDHPPGPKPCDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKAKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIKSFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFVYSKLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPGK**
【０１０８】
配列番号:42（ネコTNFR p80ポリペプチドをコードする核酸コード（センス）配列）
ATGGCGCCCGTCGCCGTGTGGGCCACGCTGGCCGTCGGACTGCAGCTCTGGGCCGCGGGGCGCGCCGTGCCCGCCCAGGTTGCGTTACTCCCCTACGTTCCGGAGCCTGGAAGCTCATGCCAACTGACAGAATACTTCGATGAGAGGACCCAGATGTGCTGTAGCAAGTGTCAGCCTGGCTACCATGCACAGTCGCTGTGCTCCGAGACCTCAAATACCGTGTGTGCCCGCTGCGAGGACAGCACCTACACCAAGCTCTGGAACTGGGTGCGCGAGTGCTTGAGCTGTGACTCCCGCTGCACCTCTGACCAAGTGGAGACTCAGGCCTGCACTCCGGAACAGAACCGCGTCTGCACCTGCAGGCCGGGCTGGTACTGCACGTTGAAGAGGCAGAAAGGGTGCCGGCTGTGTGCGCCCCTGCACAGGTGCCGCCCGGGCTTCGGCGTGACCAGGCCAGGAACTGCAACGTCAAATGTGGCGTGCGCTCCCTGTGGCCCAGGGACGTTCTCCGACACAACGTCGTCCACAGATGTCTGCAGGCCCCACCGGATCTGTGGCTCAGTGGCCATCCCTGGCAATGCAACCATGGATGCCGTCTGCGCATCTGTGCCTCCTACCCTGAGGATGGCCCCACGCCCAGCCCCCACGTCCCAGCCAGCGTCTACACTATCCCAGCAAGTGGAGCCGACTCCAGGCCCTCGCACGGCCCCTAGCACCTCCCTTCTGTTTGTGATGGTCCCAACCCCCCCAGCTGAAGGGCTCAGCACGGGCGACATCTCTCTCCTCATTGGACTGATTGTGGCTGTGACATCCTTGGGTCTGGTGATCATAGGGCTGGTGAAATGTGTCATTATGACCCAGAAAAAAAAGAAGCCCTTCTGTCTACAAGGAGAAGCCAAAGTGCCTCACCTGCCTGCTGACAAGGCCCGAAGTGCCCCCGGCCCCGAGCAGCAGCACCTGCTGACCACAGCGCCCAGCTCCAGCAGCAGCTCCCTGGAGAGCTCAGGCAGCACCGCAGACGGGAGGGCGCCCACCGGGACCCGGCTGCCCGCACCAGGCACGGAGAAGGCCGCCGGGTCTGGGGAGGCCTGGGCCAGCTCCAGCAGCTCAGAGCCTTCCTCTGGCAGCCACGGGACCCAGGTCAACGTCACATGCATCGTGAATGTGTGCAGCGCCTCCGACCACGGCTCTCAGTGCGCCTCCCAGGCCAGCTACACGATGGGGGACGTGGATGCCAGCTCCTCCGGCTCCCCAAATGACGAGCAGGTCCCCTTCTCCAAGGAAGAATGCCCTTTTCAGTCTCAGCCAGGGGCCCCGGAGACTCTGCTGGAGAACCCGGAGGAGAAGCCCCTGCCCCTTGGTGTGCCTGATGCTGGGATGAAGCCCAGTTAG
【０１０９】
配列番号:43（ネコIgG1a重鎖定常領域（GenBankアクセッション番号AB0167710）；ヒンジ領域、CH2及びCH3ドメインには下線が付されている）
ASTTAPSVFPLAPSCGTTSGATVALACLVLGYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQASGLYSLSSMVTVPSSRWLSDTFTCNVAHPPSNTKVDKTVRKTDHPPGPKPCDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKAKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIKSFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFVYSKLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPGK
【０１１０】
配列番号:44（ネコIgG1b重鎖定常領域（GenBankアクセッション番号AB016711）；ヒンジ領域、CH2及びCH3ドメインには下線が付されている）
ASTTAPSVFPLAPSCGTTSGATVALACLVLGYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQASGLYSLSSMVTVPSSRWLSDTFTCNVAHPPSNTKVDKTVRKTDHPPGPKPCDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPGK
【０１１１】
配列番号:45（ネコIgG2重鎖定常領域（GenBankアクセッション番号KF811175）；ヒンジ領域、CH2及びCH3ドメインには下線が付されている）
ASTTASSVFPLAPSCGTTSGATVALACLVLGYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPSVLQASGLYSLSSMVTVPSSRWLSDTFTCNVAHRPSSTKVDKTVPKTASTIESKTGEGPKCPVPEIPGAPSVFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSNVQITWFVDNTEMHTAKTRPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSAMERTISKAKGQPHEPQVYVLPPTQEELSENKVSVTCLIKGFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYQTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPGK
【０１１２】
配列番号:46（ネコTNFR p80（太字）、ネコIgG1a重鎖定常領域のヒンジ領域、CH2及びCH3ドメイン（下線）を含む融合タンパク質）
【化２４】
2018504911.tif 000026
【０１１３】
配列番号:47（ネコTNFR p80（太字）並びにネコIgG1b重鎖定常領域のヒンジ領域、CH2及びCH3ドメイン（下線）を含む融合タンパク質）
【化２５】
2018504911.tif 000027
【０１１４】
配列番号:48（ネコTNFR p80（太字）並びにネコIgG2重鎖定常領域のヒンジ領域、CH2及びCH3ドメイン（下線）を含む融合タンパク質）
【化２６】
2018504911.tif 000028
【０１１５】
配列番号:49（末端短縮ネコTNFR p80 TNF結合領域（太字）、ネコIgG1a重鎖定常領域のヒンジ領域、CH2及びCH3ドメイン（下線）を含む融合タンパク質）
【化２７】
2018504911.tif 000029
【０１１６】
配列番号:50（末端短縮ネコTNFR p80 TNF結合領域（太字）並びにネコIgG1b重鎖定常領域のヒンジ領域、CH2及びCH3ドメイン（下線）を含む融合タンパク質）
【化２８】
2018504911.tif 000030
【０１１７】
配列番号:51（末端短縮ネコTNFR p80 TNF結合領域（太字）並びにネコIgG2重鎖定常領域のヒンジ領域、CH2及びCH3ドメイン（下線）を含む融合タンパク質）
【化２９】
2018504911.tif 000031
【０１１８】
配列番号:52（マウスTNFR p80（ECD及びトランスメンブレンドメインを含む）、GenBankアクセッション番号CAA74969.1）
MAPAALWVAL VFELQLWATG HTVPAQVVLT PYKPEPGYEC QISQEYYDRK AQMCCAKCPP
GQYVKHFCNK TSDTVCADSD TVCADCEASM YTQVWNQFRT CLSCSSSCST DQVETRACTK
QQNRVCACEA GRYCALKTHS GSCRQCMRLS KCGPGFGVAS SRAPNGNVLC KACAPGTFSD
TTSSTDVCRP HRICSILAIP GNASTDAVCA PESPTLSAIP RTLYVSQPEP TRSQPLDQEP
GPSQTPSILT SLGSTPIIEQ STKGGISLPI GLIVGVTSLG LLMLGLVNCF ILVQRKKKPS
CLQRDAKVPH VPDEKSQDAV GLEQQHLLTT APSSSSSSSL ESSASAGDRR APPGGHPQAR
VMAEAQGSQE ARASSRISDS SHGSHGTHVN VTCIVNVCSS SDHSSQCSSQ ASATVGDPDA
KPSASPKDEQ VPFSQEECPS QSPYETTETL QSHEKPLPLG VPDMGMKPSQ AGWFDQIAVK
VA
【０１１９】
配列番号:53（マウスTNFR p80（ECD及びトランスメンブレンドメインを含む）、GenBankアクセッション番号P25119.1又はNP_035740.2）
MAPAALWVAL VFELQLWATG HTVPAQVVLT PYKPEPGYEC QISQEYYDRK AQMCCAKCPP
GQYVKHFCNK TSDTVCADCE ASMYTQVWNQ FRTCLSCSSS CTTDQVEIRA CTKQQNRVCA
CEAGRYCALK THSGSCRQCM RLSKCGPGFG VASSRAPNGN VLCKACAPGT FSDTTSSTDV
CRPHRICSIL AIPGNASTDA VCAPESPTLS AIPRTLYVSQ PEPTRSQPLD QEPGPSQTPS
ILTSLGSTPI IEQSTKGGIS LPIGLIVGVT SLGLLMLGLV NCIILVQRKK KPSCLQRDAK
VPHVPDEKSQ DAVGLEQQHL LTTAPSSSSS SLESSASAGD RRAPPGGHPQ ARVMAEAQGF
QEARASSRIS DSSHGSHGTH VNVTCIVNVC SSSDHSSQCS SQASATVGDP DAKPSASPKD
EQVPFSQEEC PSQSPCETTE TLQSHEKPLP LGVPDMGMKP SQAGWFDQIA VKVA
【０１２０】
配列番号:54（ウマIgG1重鎖定常領域のヒンジ領域並びにCH2及びCH3ドメイン）
EPIPDNHQKVCDMSKCPKCPAPELLGGPSVFIFPPNPKDTLMITRTPEVTCVVVDVSQENPDVKFNWYMDGVEVRTATTRPKEEQFNSTYRVVSVLRIQHQDWLSGKEFKCKVNNQALPQPIERTITKTKGRSQEPQVYVLAPHPDELSKSKVSVTCLVKDFYPPEINIEWQSNGQPELETKYSTTQAQQDSDGSYFLYSKLSVDRNRWQQGTTFTCGVMHEALHNHYTQKNVSKNPGK
【０１２１】
配列番号:55（ウマIgG2重鎖定常領域のヒンジ領域並びにCH2及びCH3ドメイン）
PPCVLSAEGVIPIPSVPKPQCPPYTHSKFLGGPSVFIFPPNPKDALMISRTPVVTCVVVNLSDQYPDVQFSWYVDNTEVHSAITKQREAQFNSTYRVVSVLPIQHQDWLSGKEFKCSVTNVGVPQPISRAISRGKGPSRVPQVYVLPPHPDELAKSKVSVTCLVKDFYPPDISVEWQSNRWPELEGKYSTTPAQLDGDGSYFLYSKLSLETSRWQQVESFTCAVMHEALHNHFTKTDISESLGK
【０１２２】
配列番号:56（ウマIgG3重鎖定常領域のヒンジ領域並びにCH2及びCH3ドメイン）
EPVLPKPTTPAPTVPLTTTVPVETTTPPCPCECPKCPAPELLGGPSVFIFPPKPKDVLMITRMPEVTCLVVDVSHDSSDVLFTWYVDGTEVKTAKTMPNEEQNNSTYRVVSVLRIQHQDWLNGKKFKCKVNNQALPAPVERTISKATGQTRVPQVYVLAPHPDELSKNKVSVTCLVKDFYPTDITVEWQSNEHPEPEGKYRTTEAQKDSDGSYFLYSKLTVEKDRWQQGTTFTCVVMHEALHNHVMQKNISKNPGK
【０１２３】
配列番号:57（ウマIgG4重鎖定常領域のヒンジ領域並びにCH2及びCH3ドメイン）
VIKECNGGCPAECLQVGPSVFIFPPKPKDVLMISRTPTVTCVVVDVGHDFPDVQFNWYVDGVETHTATTEPKQEQFNSTYRVVSVLPIQHKDWLSGKEFKCKVNNKALPAPVERTISKPTGQPREPQVYVLAPHRDELSKNKVSVTCLVKDFYPTDIDIEWKSNGQPEPETKYSTTPAQLDSDGSYFLYSKLTVETNRWQQGTTFTCAVMHEALHNHYTEKSVSKSPGK
【０１２４】
配列番号:58（ウマIgG5重鎖定常領域のヒンジ領域並びにCH2及びCH3ドメイン）
VVKGSPCPKCPAPELPGGPSVFIFPPKPKDVLKISRKPEVTCVVVDLGHDDPDVQFTWFVDGVETHTATTEPKEEQFNSTYRVVSVLPIQHQDWLSGKEFKCSVTNKALPAPVERTTSKAKGQLRVPQVYVLAPHPDELAKNTVSVTCLVKDFYPPEIDVEWQSNEHPEPEGKYSTTPAQLNSDGSYFLYSKLSVETSRWKQGESFTCGVMHEAVENHYTQKNVSHSPGK
【０１２５】
配列番号:59（ウマIgG6重鎖定常領域のヒンジ領域並びにCH2及びCH3ドメイン）
VIKEPCCCPKCPGRPSVFIFPPNPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQENPDVKFNWYVDGVEAHTATTKAKEKQDNSTYRWSVLPIQHQDWRRGKEFKCKVNNRALPAPVERTITKAKGELQDPKVYILAPHREEVTKNTVSVTCLVKDFYPPDINVEWQSNEEPEPEVKYSTTPAQLDGDGSYFLYSKLTVETDRWEQGESFTCWMHEAIRHTYROKSITNFPGK
【０１２６】
配列番号:60（ウマIgG7重鎖定常領域のヒンジ領域並びにCH2及びCH3ドメイン）
VIKECGGCPTCPECLSVGPSVFIFPPKPKDVLMISRTPTVTCVVVDVGHDFPDVQFNWYVDGVETHTATTEPKQEQNNSTYRVVSILAIQHKDWLSGKEFKCKVNNQALPAPVQKTISKPTGQPREPQVYVLAPHRDELSKNKVSVTCLVKDFYPTDIDIEWKSNGQPEPETKYSTTPAQLDSDGSYFLYSKLTVETNRWQQGTTFTCAVMHEALHNHYTEKSVSKSPGK
【０１２７】
配列番号:61（ネコIgG1a重鎖定常領域のヒンジ領域並びにCH2及びCH3ドメイン）
RKTDHPPGPKPCDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKAKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIKSFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFVYSKLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPGK
【０１２８】
配列番号:62（ネコIgG1b重鎖定常領域のヒンジ領域並びにCH2及びCH3ドメイン）
RKTDHPPGPKPCDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKDKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIEGFYPSDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSRWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPGK
【０１２９】
配列番号:63（ネコIgG2重鎖定常領域のヒンジ領域並びにCH2及びCH3ドメイン）
PKTASTIESKTGEGPKCPVPEIPGAPSVFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSNVQITWFVDNTEMHTAKTRPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSAMERTISKAKGQPHEPQVYVLPPTQEELSENKVSVTCLIKGFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYQTTPPQLDSDGTYFLYSRLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPGK
【０１３０】
配列番号:64（予測ネコp80 TNFR、TNFRSF1B；XP_003989632.1）
MSNCGHVLAL SGVPPGWVWG CSPGLLIPHV ALLPYVPEPG SSCQLTEYFD ERTQMCCSKC
QPGYHAQSLC SETSNTVCAR CEDSTYTKLW NWVRECLSCD SRCTSDQVET QACTPEQNRV
CTCRPGWYCT LKRQKGCRLC APLHRCRPGF GVTRPGTATS NVACAPCGPG TFSDTTSSTD
VCRPHRICGS VAIPGNATMD AVCASVPPTL RMAPRPAPTS QPASTLSQQV EPTPGPRTAP
STSLLFVMVP TPPAEGLSTG DISLLIGLIV AVTSLGLVII GLVKCVIMTQ KKKKPFCLQG
EAKVPHLPAD KARSAPGPEQ QHLLTTAPSS SSSSLESSGS TADGRAPTGT RLPAPGTEKA
AGSGEAWASS SSSEPSSGSH GTQVNVTCIV NVCSASDHGS QCASQASYTM GDVDASSSGS
PNDEQVPFSK EECPFQSQPG APETLLENPE EKPLPLGVPD AGMKPS
【０１３１】
配列番号:65（GenBankアクセッション番号XP_003989632.1で示されるリーダー配列）
MSNCGHVLAL SGVPPGWVWG CS
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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