(57)【要約】  常染色体劣性の偽性低アルドステロン症１型（ＰＨＡ  １Ｂ型）の治療のため、または機能欠失型変異ＥＮａＣのＮａ+輸送能力の修復のための、配列番号１：Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒのアミノ酸配列に由来する少なくとも６つの連続するアミノ酸を含む環状ポリペプチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
常染色体劣性の偽性低アルドステロン症１型（ＰＨＡ  １Ｂ型）の治療における使用のため、または機能欠失型変異ＥＮａＣのＮａ+イオン輸送能力の修復における使用のための、配列番号１：
2018528221.tif 000023
のアミノ酸配列からの少なくとも６つの連続するアミノ酸を含む環状ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１のうち、配列番号５：
2018528221.tif 000024
のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の使用のための環状ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列からの、少なくとも７つの連続するアミノ酸で特徴付けられる、請求項１に記載の使用のための環状ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１：
2018528221.tif 000025
のアミノ酸配列で特徴付けられる、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用のための環状ポリペプチド。
【請求項５】
環状のリングが、２つのアミノ酸システイン間のジスルフィド結合を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のための環状ポリペプチド。
【請求項６】
ポリペプチドが、配列番号２：
2018528221.tif 000026
を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用のための環状ポリペプチド。
【請求項７】
環状のリングが、非天然のアミノ酸を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のための環状ポリペプチド。
【請求項８】
非天然のアミノ酸が、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）である、請求項７に記載の使用のための環状ポリペプチド。
【請求項９】
環状のリングが、配列番号１の少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１４個のアミノ酸を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用のための環状ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号３：
2018528221.tif 000027
、または
配列番号４：
2018528221.tif 000028
である、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用のための環状ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項において定義した少なくとも１つの環状ポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項１２】
少なくとも１つの薬学的担体分子によって特徴付けられる、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
常染色体劣性の偽性低アルドステロン症１型（ＰＨＡ  １Ｂ型）に罹患している患者を治療する方法であって、配列番号１：
2018528221.tif 000029
のアミノ酸配列からの少なくとも６つの連続するアミノ酸を含む環状ポリペプチドの有効量を、患者に投与することを含む、方法。
【請求項１４】
機能欠失型変異ＥＮａＣを有する患者のＮａ+輸送能力の、生理的なレベルへの修復のための方法であって、配列番号１：
2018528221.tif 000030
のアミノ酸配列からの少なくとも６つの連続するアミノ酸を含む環状ポリペプチドの有効量を、患者に投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状ポリペプチド、および常染色体劣性の偽性低アルドステロン症１型（ＰＨＡ  １Ｂ型）の治療における、または機能欠失型変異ＥＮａＣのＮａ+輸送能力の修復のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
常染色体劣性（ＡＲ）の偽性低アルドステロン症１型（ＰＨＡ  １Ｂ型）は、稀な、命に関わる疾患であり、出生から最初の数日のうちに発症し、発育障害、体重減少、塩喪失、高カリウム血症および代謝性アシドーシスを伴う。この状態は最初に、１９５８年に特徴付けられた（ＣｈｅｅｋおよびＰｅｒｒｙ、１９５８年）。常染色体劣性の偽性低アルドステロン症１型は命に関わる状態であり、腎臓、結腸、唾液腺および汗腺、ならびに肺中に見出されるナトリウムイオンチャネルＥＮａＣがナトリウムイオン（Ｎａ＋イオン）の細胞層を越える移動を促進する機能を失っている。非機能性のＥＮａＣにより、尿および糞便へのナトリウムの喪失、ならびに体内の重度の塩の不均衡が生じる。典型的な特徴は、血中における低いレベルのナトリウム（低ナトリウム血症）および高いレベルのカリウム（高カリウム血症）である。この障害は複数の臓器系が関与し、したがって、全身性ＰＨＡ１型とも呼ばれ、これは塩の喪失が主として腎臓に制限され、異なる遺伝子中の変異により引き起こされる、より軽度の常染色体優性（ＡＤ）または腎性ＰＨＡ１型とは区別される（Ｒｉｅｐｅ、２００９年）。腎性ＰＨＡ１型と全身性ＰＨＡ１型との間の区別を、Ｎａの必要性、電解質の不均衡の管理の簡便性、発汗試験の結果、および遺伝子検査に基づいて行うことができる（Ａｍｉｎら、２０１３年）。とりわけ、腎性ではなく、全身性の偽性低アルドステロン症を有する小児は、原因不明の下気道の疾病を頻繁に発症し、嚢胞性線維症に罹患しているとしばしば誤診される（Ｈａｎｕｋｏｇｌｕら、１９９４年；Ｍａｒｔｈｉｎｓｅｎら、１９９８年；Ｈｕｂｅｒら、２０１０年）。
【０００３】
ＰＨＡ  １Ｂ型を有することが診断された新生児は最初に、レニンおよびアルドステロンの値の上昇を特徴的に示すが、血圧を維持することが不可能である。ＰＨＡ  １Ｂ型患者の試験所評価から、高い血清アルドステロン濃度および低ナトリウム血症を伴う血漿レニン活性の増加、ならびにすでに言及した高カリウム血症が示される。生存を確保するためには、積極的な塩交換および高カリウム血症の制御が必要である。
【０００４】
常染色体劣性の偽性低アルドステロン症Ｉ型（ＰＨＡ  １Ｂ型）は、上皮性ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）のサブユニット（アルファサブユニット、ベータサブユニット、ガンマサブユニット）をコードする３つの遺伝子のうちのいずれか１つにおけるホモ接合性または複合ヘテロ接合性の変異により引き起こされる。
【０００５】
上皮性ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）のアルファサブユニット、ベータサブユニットおよびガンマサブユニットをコードする３つの遺伝子のうちのいずれか１つにおける変異に起因して、変異体が発現するＥＮａＣタンパク質のアミノ酸配列は不完全であるか、またはそうでなければ、成熟した（変異していない）ＥＮａＣとは異なる。変異体ＥＮａＣは事実上不活性であり、細胞および膜を越えるナトリウムイオンの輸送を促進しない。
【０００６】
全身性ＰＨＡ１型の臨床所見は新生児期内に生じ、汗中のＮａ濃度の上昇、および鼻または直腸における経上皮電圧差の不在に通常基づいて診断される（Ｒｉｅｐｅ、２００９年）。臨床表現型は、重度の腎臓における塩喪失、高カリウム血症、代謝性アシドーシス、ならびに血漿のレニンおよびアルドステロンのレベルの上昇のうちの１つである。ＡＲのＰＨＡ１型に罹患している小児はしばしば、Ｎａ依存性の液体吸収の低下および気道表面の液体の体積の増加の結果生じる肺の合併症を示す（Ｋｅｒｅｍら、１９９９年）。呼吸器の症状は典型的には、出生から数週間または数ヵ月以内に出現し、持続性の鼻漏、再発性の耳および副鼻腔の感染、発熱がしばしば伴う胸部うっ血、咳および頻呼吸、頻繁に観察される喘鳴および湿性ラ音が認められる。年に数回生じる場合がある呼吸器の疾病のこれらのエピソードの間に、患者の胸部Ｘ線が、気管支周囲の肥厚、無気肺および／または小さなふわふわした浸潤を示す場合がある（Ｔｈｏｍａｓら、２００２年）。肺の合併症は時には、致命的であることが判明する場合がある（Ｓｈａｒｍａら、２０１３年）。
【０００７】
常染色体劣性の偽性低アルドステロン症Ｉ型は生涯にわたる疾患であり、時間が経過しても改善はほとんど認められない（Ｚｅｎｎａｒｏら、２００４年）。ＰＨＡ  １Ｂ型に罹患している患者は生涯を通じて、命に関わる塩を喪失する重大局面のリスクを有し、これに重度の高カリウム血症および脱水が組み合わされる（Ｒｉｅｐｅ、２００９年）。
【０００８】
現時点では、ＰＨＡ  １Ｂ型の治療は、液体および電解質の管理に限定されている。現在のＰＨＡ  １Ｂ型の対症治療は、過剰な肺の液体を低下させるためのベータ２アゴニスト療法と、電解質の均衡を修復するための積極的な塩交換および高カリウム血症の制御との組合せである。
【発明の概要】
【０００９】
現時点では、機能欠失型変異ＥＮａＣのＮａ+イオン輸送能力を修復するかまたは少なくとも増加させる、薬物に基づく療法は存在しない。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、機能欠失型変異ＥＮａＣのＮａ+イオン輸送能力を生理的なレベルに修復する、薬物に基づく療法を提供することである。
【００１１】
この目的は、常染色体劣性の偽性低アルドステロン症１型（ＰＨＡ  １Ｂ型）の治療において用いるための、および機能欠失型変異ＥＮａＣのＮａ+イオン輸送能力の修復のために用いるための、配列番号１：
【化１】
2018528221.tif 000002
のアミノ酸配列のうちの少なくとも６つの連続するアミノ酸を含む環状ポリペプチドにより解決される。
【００１２】
現時点では、事実上不活性な変異体のＥＮａＣを、生理的に活性なＥＮａＣに変換する薬物に基づく療法は存在しないが、本発明の環状ポリペプチドが、Ｎａ+イオン輸送能力を修復し、機能欠失型変異ＥＮａＣのアミノ酸の変異を補完して、正常なレベルをもたらすことを見出すに至った。下記に詳述する環状ペプチドは、「正常な」（野生型の活性な）変異していないＥＮａＣのＥＮａＣ活性を調節することが記載されてきたが、これらの環状ペプチドはまた、アミノ酸の変異を補完し、機能欠失型変異ＥＮａＣを修復して正常なレベルに戻すことも可能であることは驚くべきことである。
【００１３】
好ましい実施形態では、環状ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列のうちの少なくとも９つの連続するアミノ酸を含む。
【００１４】
配列番号１のうち、アミノ酸配列
【化２】
2018528221.tif 000003
（＝配列番号５）を含む環状ポリペプチドが、ＥＮａＣ受容体に対する最も強力な結合を示すことが判明した。したがって、一実施形態では、環状ポリペプチドが、配列番号１のうちの、配列番号５
【化３】
2018528221.tif 000004
のアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００１５】
一実施形態では、環状ポリペプチドは、アミノ酸配列
【化４】
2018528221.tif 000005
によって特徴付けられる。
【００１６】
リングを形成させて本発明の環状ポリペプチドを提供する異なる手段がある。
【００１７】
ａ）一実施形態では、ペプチド骨格を形成するための、ポリペプチド中の単一のアミノ酸間のアミド結合と、リングを形成するための、２つのアミノ酸システイン間のジスルフィド架橋とにより、環状のリングが形成される。したがって、一実施形態は、２つのアミノ酸システイン間のジスルフィド結合を含む。
【００１８】
その実施形態では、ポリペプチドは、好ましくは、配列番号２
【化５】
2018528221.tif 000006
（式中、ジスルフィド結合は、配列番号２のＣｙｓ  １とＣｙｓ  １７との間で形成される）を含む。
【００１９】
この場合には、好ましい環状ポリペプチドは、ＡＰ３０１とも呼ばれている、配列番号３
【化６】
2018528221.tif 000007
であろう。
【００２０】
ｂ）一実施形態では、環状ポリペプチドを形成するための、ポリペプチド中の単一のアミノ酸間のアミド結合により、環状のリングが形成される。一実施形態では、そのような環状のリングは、非天然のアミノ酸、例としてγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を含む。
【００２１】
この場合には、好ましい環状ポリペプチドは、ＡＰ３１８とも呼ばれている、配列番号４、すなわち、
【化７】
2018528221.tif 000008
であろう。
【００２２】
最も好ましくは、上記で言及した全ての実施形態において、環状ポリペプチドは、環状のリングが配列番号１の少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１４個のアミノ酸を含むことを特徴とする。
【００２３】
本発明の一態様は、上記で言及した環状ポリペプチドを含む医薬組成物に関する。
【００２４】
本発明は、本発明の環状ペプチド（または本発明のペプチドの混合物）、および薬学的担体分子を含有する医薬組成物に関する。この医薬組成物を、ＰＨＡ  １Ｂ型の治療のために使用する。
【００２５】
用語「医薬組成物」は、機能欠失型変異ＥＮａＣのＮａ+イオン輸送能力を正常なレベルに修復する、上記で定義した環状ペプチドを含有する任意の組成物または調製物を指す。特に、語「医薬組成物」は、本発明の環状ペプチド、および薬学的に許容できる担体分子または賦形剤（両方の用語を相互互換的に使用する）を含む組成物を指す。適切な担体または賦形剤、例えば、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、緩衝液、ハンクス液、ベシクル形成化合物、不揮発性油、エチルオレエート、生理食塩水中のデキストロース、等張性および化学的安定性を増強する物質、緩衝液および保存剤は、当業者に公知である。その他の適切な担体は、それ自体が患者中で患者にとって有害である抗体の産生を誘発しない任意の担体を含む。その例は、十分な寛容であるタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸およびアミノ酸コポリマーである。この医薬組成物を、（薬物として）当業者に公知の適切な手順を介して投与することができる。好ましい投与経路は、エアロゾルとしての肺からの吸入、または静脈内投与である。非経口投与のために、本発明の医薬組成物を、上記で定義した薬学的に許容できる賦形剤と併せて製剤化した注射用の投与単位剤型、例えば、液剤、懸濁剤または乳剤として提供する。しかし、投与量および投与方法は、治療される個々の患者に依存する。一般に、本発明のペプチドを、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの間、より好ましくは、１０μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの間、最も好ましくは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与する。好ましくは、組成物の投与は腹腔内ボーラス投与として行う。また、連続注入も適用することができる。この場合には、ペプチドを、５〜２０μｇ／ｋｇ／分、より好ましくは、７〜１５μｇ／ｋｇ／分の用量で注入して送達する。
【００２６】
エアロゾルとしての肺からの吸入のために、本発明の医薬組成物を、上記で定義した薬学的に許容できる賦形剤と併せて製剤化した適切な投与単位剤型をとる乾燥粉末または液体の調製物、例えば、凍結乾燥および／または噴霧乾燥により調製した乾燥粉末粒子として、液剤、懸濁剤および乳剤として提供する。肺からの吸入に適切なエアロゾル粒子は、乾燥粉末粒子または液体のエアロゾル粒子のいずれであっても、５０μｍ未満、より好ましくは、１０μｍ未満の直径の粒子を有する。乾燥粉末粒子は、乾燥粉末用の吸入器により吸入することができる。液体の粒子は、ネブライザーにより吸入することができる。しかし、肺からの吸入のための投与量および投与方法は、治療される個々の患者に依存する。一般に、本発明のペプチドを、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの間、より好ましくは、１０μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの間、最も好ましくは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与する。好ましくは、組成物の投与は、反復吸入投与として行う。また、連続吸入も適用することができる。この場合には、ペプチドを、５〜２０μｇ／ｋｇ／分、より好ましくは、７〜１５μｇ／ｋｇ／分の用量で送達する。
【００２７】
本発明の一態様は、上記で言及した環状ペプチドを含む常染色体劣性の偽性低アルドステロン症１型（ＰＨＡ  １Ｂ型）に罹患している患者を治療する方法に関する。
【００２８】
アミロライド感受性の上皮性ナトリウムイオンチャネル（ＥＮａＣ）
機能的に活性なＥＮａＣは通常、ベータユニットおよびガンマユニットと一緒になった、１または２つのアルファサブユニットまたはデルタサブユニットで構成される。それぞれのＥＮａＣポリペプチド鎖が、細胞内に位置する短い−ＮＨ2末端および−ＣＯＯＨ末端、ならびに大きな細胞外ループドメインの両側にある２つの膜貫通領域で構成される。
【００２９】
ＥＮａＣは、肺、遠位の結腸、遠位のネフロン、汗腺および唾液腺、ならびにその他の臓器および組織の分極している上皮細胞の頂端膜中に位置する。極性を有する密着した上皮においては、ＥＮａＣが、Ｎａ+イオン吸収についての律速段階であり；異常なＥＮａＣの機能が、塩および水のホメオスタシス、ならびに生理的な働きが生じる臓器および組織中でのそうした働きを撹乱する（ＧａｒｔｙおよびＰａｌｍｅｒ、１９９７年；ＫｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒおよびＳｃｈｉｌｄ、２００２年）。細胞を通るＮａ+イオンの経上皮輸送は、２段階のプロセスとして説明することができ、このプロセスのための推進力が、頂端膜を横切って存在するＮａ+イオンについての大きな電気化学的勾配により提供される。機能性の活性なＥＮａＣは、膜の頂端部側からのＮａ+イオンの進入を媒介する。Ｎａ+のＥＮａＣを通るこの頂端部からの進入を、マイクロモル以下の濃度のアミロライドの適用により遮断することができる。
【００３０】
哺乳動物の肺においては、Ｎａ＋イオン輸送の調節は、効率的なガス交換に必要な、肺胞内壁の液体の最適なレベルを維持するのに極めて重要である（Ｅａｔｏｎら、２００９年）。
【００３１】
ＥＮａＣ遺伝子内部または上流の調節領域中のいずれかの変異がＥＮａＣの正常な発現を混乱させ、その結果、チャネルの機能不全および異常な調節が生じる。
【００３２】
ＰＨＡ  １Ｂ型患者は、ＥＮａＣのアルファサブユニット中に機能欠失型の変異を伴い、ベータサブユニットおよびガンマサブユニット中の変異が観察される頻度はより低い。
【００３３】
元々のＡＰ３０１ペプチドは、野生型ヒトＴＮＦの残基Ｃ１０１〜Ｅ１１６に対応する、ＴＮＦ−アルファのレクチン様のドメインまたはＴＩＰドメインを模倣する（Ｌｕｃａｓら、１９９４年）。ＡＰ３０１、すなわち、シクロ（ＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＣ）、理論平均分子質量：１９２３．１においては、Ｃ１０１がグリシンにより、Ｅ１１６がシステインにより置き換えられた状態になっており、Ｎ末端のシステインが付加され、レクチン様のドメインに相当するアミノ酸残基の配列が、末端のシステイン残基の側鎖間のジスルフィド結合を介して環状構造に拘束される。末端のシステイン残基を酸化してジスルフィド架橋を形成することによって、環化を達成する。
【００３４】
ＡＰ３１８、すなわち、シクロ（４−アミノブタン酸−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＤ）、理論平均分子質量：１９０１．０は、ＴＩＰペプチドであり、この場合には、Ｎ末端の４−アミノブタン酸のアミノ基と、Ｃ末端のアスパラギン酸残基のベータ−炭素につながる側鎖のカルボキシル基との間でアミド結合を作り出すことによって、環化を達成する。
【００３５】
ＡＰ３０１
［ＣＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＣ］（シクロＣベータ１−Ｃベータ１７）
【化８】
2018528221.tif 000009
【化９】
2018528221.tif 000010
【００３６】
ＡＰ３１８
［Ｇａｂａ−ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＤ−ＯＨ］（シクロ１−Ｄγ１７）
【化１０】
2018528221.tif 000011
【００３７】
本発明のさらなる詳細を、図面およびそれらの説明において示す。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ペプチドＡＰ３０１とＡＰ３１８との比較を示す図である。
【図２】αＧ７０Ｓβγ−ｈＥＮａＣに対する、ＡＰ３０１の効果を示す図である。αＧ７０Ｓβγ−ｈＥＮａＣを一過性に発現しているＨＥＫ−２９３細胞の全細胞についてのＩ／Ｖの関係を、対照について、２４０ｎＭのＡＰ３０１の存在下で、および１０μｍのアミロライドを添加した後にプロットした。
【図３】αβγＧ４０Ｓ−ｈＥＮａＣに対する、ＡＰ３０１の効果を示す図である。αβγＧ４０Ｓ−ｈＥＮａＣを一過性に発現しているＨＥＫ−２９３細胞の全細胞についてのＩ／Ｖの関係を、対照について、２４０ｎＭのＡＰ３０１の存在下で、および１０μｍのアミロライドを添加した後にプロットした。
【図４】δＧ７１Ｓβγ−ｈＥＮａＣに対する、ＡＰ３０１の効果を示す図である。δＧ７１Ｓβγ−ｈＥＮａＣを一過性に発現しているＨＥＫ−２９３細胞の全細胞についてのＩ／Ｖの関係を、対照について、２４０ｎＭのＡＰ３０１の存在下で、および１０μｍのアミロライドを添加した後にプロットした。
【図５】ＰＨＡ  Ｉｂ型の変異体のαβＧ３７Ｓγ−ｈＥＮａＣに対する、ＡＰ３０１の効果を示す図である。αβＧ３７Ｓγ−ｈＥＮａＣを一過性に発現しているＨＥＫ−２９３細胞の全細胞についてのＩ／Ｖの関係を、対照について、２４０ｎＭのＡＰ３０１の存在下で、および１０μｍのアミロライドを添加した後にプロットした。
【図６】アミロライド感受性の内向きナトリウム電流を示す棒グラフである。表示した変異体のサブユニットを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞に対して、全細胞モードでパッチを行った；内向き電流を−１００ｍＶで惹起した。２００ｎＭのＡＰ３１８またはＡＰ３０１を適用した。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
環状ペプチドの合成
ペプチドは全て、固相法により合成する；それらは、レクチン様のドメインのネイティブの立体構造をできるだけ保持するように設計されており、かつ同時に、直鎖状の配列の環化をもたらすための連結の代替の解決策も探索する。
【００４０】
固相ペプチド合成により、フルオレニルメチルオキシカルボニル／ｔ−ブチル保護戦略に従って、２−クロロトリチルクロリド樹脂上でペプチドを合成する。ジイソプロピルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールを、カップリング試薬として使用する。カップリングのステップは全て、Ｎ−Ｎ−ジメチルホルムアミド中で実施する。保護されているアミノ酸を、ペプチド鎖に、Ｃ末端のアミノ酸から始めて連続してカップリングさせる。フルオレニルメトキシカルボニルの脱保護を、Ｎ−Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％のピペリジン中で実施する。酢酸とジクロロメタンとの１：１の混合物中で、完成した、部分的に保護されているペプチドを樹脂から切断する。ソルナチド（ｓｏｌｎａｔｉｄｅ）および変異体のＴＩＰペプチドの場合は、樹脂からの切断後に、側鎖の脱保護を９５％のトリフルオロ酢酸、５％の水中で実施し、続いて、未精製の直鎖状のペプチドにｐＨ８．５で９０時間通気することによる、末端のシステイン残基の酸化によって環化を行う。未精製のペプチド生成物を、逆相中圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＭＰＬＣ）により、ＲＰ−Ｃ１８−シリカゲルカラム上で５％〜４０％のアセトニトリルの勾配を用いて精製する。最後に、Ｌｅｗａｔｉｔ  ＭＰ６４カラム上で、トリフルオロ酢酸対イオンを酢酸塩により置き換える（酢酸塩の形態）。水中での最後の洗浄の後に、酢酸の塩として精製したペプチドを凍結乾燥し、白色〜灰白色の粉末として得る。システインを含有しないペプチドの場合は、２−クロロトリチルクロリド樹脂からの切断後に、部分的に保護されている直鎖状のペプチドに対して環化のステップを実施する。システインを含有しないペプチドの選択的環化の後に、システイン含有ペプチドの場合と同様に、トリフルオロ酢酸中での側鎖の脱保護、続いて、分取ＲＰ−ＭＰＬＣ、トリフルオロ酢酸イオンの酢酸塩による置き換え、およびペプチドの酢酸塩の形態の凍結乾燥を実施した。アスパラギン酸の側鎖のカルボキシル基を通して、環化にアミド結合の形成が関与するＡＰ３１８の場合は、フルオレニルメチルオキシカルボニル基によりＮ保護されており、かつ三級ブチル（ＯｔＢｕ）基によりＣ−アルファカルボキシル保護されているＣ末端のアスパラギン酸を使用して合成を開始することによって、選択的環化を達成する。側鎖のカルボキシル基を通してＣ末端のアスパラギン酸残基をトリチル樹脂に連結し、続いて、保護されているアミノ酸残基をペプチド鎖に段階的に付加することによって合成を進める。Ｎ末端の４−アミノブタン酸のアミノ基の脱保護、および樹脂からの側鎖が保護されているペプチドの切断後に、遊離の側鎖のカルボキシル基とＮ末端の４−アミノブタン酸のアミノ基とを通して環化を実施する。最後に、その他のペプチドの場合と同様に、側鎖の保護基をトリフルオロ酢酸を用いて除去し、ペプチドをＲＰ−ＭＰＬＣにより精製する。
【００４１】
ペプチドの分子質量を、エレクトロスプレーイオン化質量分析またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより確認し、それらの純度を、分析用高速液体クロマトグラフィーにより決定する。
【００４２】
内因性および異種性に発現させたＥＮａＣの、ＡＰ３０１およびＡＰ３１８による活性化の電気生理学的アッセイ
環状ペプチドのＥＮａＣを活性化させる特性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ホールセルおよび単一細胞のパッチクランプ法を使用して電気生理学的に試験する（Ｈａｚｅｍｉら、２０１０年；Ｔｚｏｔｚｏｓら、２０１３年；Ｓｈａｂｂｉｒら、２０１３年）。環状ペプチドについて、ホールセルパッチクランプアッセイを使用して、誘発されたアミロライド感受性のＮａ＋電流を測定し、濃度−応答曲線を計算し、こうして最大応答の半値における有効濃度（ＥＣ５０）として測定される効力を推定する。
【００４３】
ＨＥＫ−２９３細胞、ＣＨＯ細胞およびＡ５４９細胞中で、パッチクランプ実験を実施して、一過性に発現しているαβγ−ｈＥＮａＣに対するＡＰ３０１／ＡＰ３１８の効力を推定する。
【００４４】
ＰＨＡ  １Ｂ型に罹患している患者の肺の症状の治療のためにＡＰ３０１およびＡＰ３１８を適用することの可能性の検討についての理論的根拠の要約
偽性低アルドステロン症１Ｂ型（ＰＨＡ  １Ｂ型）は、アミロライド感受性の上皮性ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）をコードする遺伝子中の機能欠失型の変異により引き起こされる。この状態は、新生児において、腎臓、結腸、肺、ならびに汗腺および唾液腺が関与するナトリウムの喪失に起因して、命に関わる重度の脱水、低ナトリウム血症および高カリウム血症として現われ、ナトリウム依存性の液体吸収の低下の結果、肺の液体レベルが上昇するために、小児に肺の病気が発症する。この疾患は年齢と共に改善を示すことはなく、患者はカリウムレベルを低下させるために、生涯にわたる塩の補充および食事の操作を必要とする。
【００４５】
パッチクランプアッセイにおいて、ＡＰ３０１およびＡＰ３１８を適用して、ヒトＥＮａＣサブユニットを異種性に発現している細胞の応答を試験することができ、これらのサブユニット中には、ＰＨＡ  １Ｂ型を引き起こすことが公知の機能欠失型の変異が部位特異的変異誘発により導入されている。このようにして、機能欠失型変異ＥＮａＣのこれらのサブユニットを発現している細胞中のアミロライド感受性のナトリウム電流を修復するＡＰ３０１およびＡＰ３１８の能力を測定することができる。環状ペプチドの存在下におけるナトリウム電流の増加は、環状ペプチドには、ＰＨＡ  １Ｂ型の変異を伴う機能欠失型ＥＮａＣによるＮａ+イオンの移動を修復する能力を示し、したがって、ＥＮａＣの機能を修復する能力があること、およびＰＨＡ  １Ｂ型患者のための療法となる可能性があることを示している。
【００４６】
驚くべきことに、環状ペプチド、例としてＡＰ３０１およびＡＰ３１８が、機能欠失型変異ＥＮａＣに対して、Ｎａ+イオン輸送活性を修復することができることを検出するに至った。したがって、ＡＰ３０１およびＡＰ３１８には、ＰＨＡ  ＩＢ型の肺の症状のための療法となる可能性がある。
【実施例】
【００４７】
実験プロトコール
異種性に発現させた、ＰＨＡ  ＩＢ型の変異を伴うＥＮａＣに対するＡＰ３０１およびＡＰ３１８の効果のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究
アミロライド感受性のＮａ＋電流に対する環状ペプチドの効果を、ヒトＥＮａＣのサブユニットを異種性に発現しているＨＥＫ細胞中で観察した（ＨＥＫ細胞は、ＥＮａＣの内因性の発現を示さない［Ｒｕｆｆｉｅｕｘ−Ｄａｉｄｉｅら、２００８年］）；これらのサブユニット中には、ＰＨＡ  ＩＢ型に罹患している患者の病的な表現型に関与することが見出されている変異と同じであるアルファＥＮａＣ、ベータＥＮａＣおよびガンマＥＮａＣの単一の点変異が、部位特異的変異誘発により導入されていた。さらに、変異体のデルタＥＮａＣサブユニットもまた部位特異的変異誘発により構築し、これらのサブユニットは、その他の３つのＥＮａＣサブユニット中で保存されている位置において観察される変異に相同する変異を含有した。
【００４８】
ＥＮａＣのＰＨＡ  Ｉ型の変異体の構築、およびＨＥＫ２９３中での発現
プラスミドベクター中にクローニングされた野生型ＥＮａＣのサブユニットのＤＮＡに対して部位特異的変異誘発を行うことによってＥＮａＣの変異の多様な型を再現することができる。
【００４９】
部位特異的変異誘発
点変異を、アルファＥＮａＣ、ベータＥＮａＣ、ガンマＥＮａＣおよびデルタＥＮａＣをコードするｃＤＮＡ中に、市販されている部位特異的変異誘発キット（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特異的変異誘発キット；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して導入した。アルファ、ベータおよびガンマ−ｈＥＮａＣをコードするｃＤＮＡは、Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ  Ｓｎｙｄｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ、Ｃａｒｖｅｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ、ＩＡ）により供与され；デルタ−ｈＥＮａＣをコードするｃＤＮＡは、Ｄｒ．Ｍｉｋｅ  Ａｌｔｈａｕｓ（Ｊｕｓｔｕｓ−Ｌｉｅｂｉｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｇｉｅｓｓｅｎ、ドイツ）により供与された。
【００５０】
科学報告の原書中に記載されている個々の変異に基づいて、変異誘発プライマーを個々に設計した。製造元のウェブサイト上に提供されているプライマー設計のプログラムをガイドとして使用し、プライマー自体はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈに注文した。Ｐｆｕに基づくＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲにより、アルファ、ベータ、ガンマまたはデルタ−ｈＥＮａＣをコードする１００ｎｇの野生型（ＷＴ）ｃＤＮＡを使用して、変異体の鎖を合成した。親（ＷＴ）の鎖を除去し、結果として得られた変異しているＥＮａＣを含有するプラスミドＤＮＡを、大腸菌のコンピテントな細胞中に形質転換した。大腸菌細胞を培養して成長させた後に、プラスミドＤＮＡをそれらの細胞から、市販されているプラスミド単離キット（ＧｅｎｅＪＥＴ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット；Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出し、カラムクロマトグラフィーにより単離した。変異体の構築物は全て、制限部位のマッピング、および配列決定により調べた。
【００５１】
ｈＥＮａＣの異種性の発現のためのＨＥＫ−２９３細胞のトランスフェクション
ＨＥＫ−２９３細胞に、変異体のアルファ−、ベータ−、ガンマ−およびデルタ−ｈＥＮａＣプラスミドＤＮＡ、ならびにＷＴのアルファ−、ベータ−、ガンマ−およびデルタ−ｈＥＮａＣプラスミドＤＮＡを、市販されているキット（Ｘ−ｔｒｅｍｅ  Ｇｅｎｅ  ＨＰトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ））を使用して、製造元が推奨するプロトコールに従ってトランスフェクトした。１つの変異体のサブユニットと、残りの２つのＷＴのサブユニットとを一緒にして、同時にトランスフェクトして、三量体型の変異ＥＮａＣを発現させた。ＷＴのアルファ−、ベータ−およびガンマ−ｈＥＮａＣプラスミドＤＮＡ、またはＷＴのデルタ−、ベータ−およびガンマ−ｈＥＮａＣプラスミドＤＮＡを同時にトランスフェクトすることによって、ＷＴのＥＮａＣを発現させた。
【００５２】
変異ＥＮａＣを一過性に発現しているＨＥＫ細胞中での、ＡＰ３０１およびＡＰ３１８のＥＮａＣを活性化させる能力のパッチクランプ試験
ホールセルパッチクランプアッセイにおいて、ＷＴのαβγ−ｈＥＮａＣ、ＷＴのδβγ−ｈＥＮａＣ、またはＷＴのサブユニットと同時発現させる変異体のｈＥＮａＣサブユニットを一過性に発現しているＨＥＫ−２９３細胞系をそれぞれＡＰ３０１を用いて試験し、保存されている位置において、選択された変異をＡＰ３１８を用いて試験した。ホールセルの電流を以前の記載に従って記録した（Ｓｈａｂｂｉｒら、２０１３年）。
【００５３】
濃度対応答の測定
濃度−応答曲線をプロットし、ＥＣ５０値およびヒル係数を、Ｍｉｃｒｏｃａｌ  Ｏｒｉｇｉｎ  ７．０を使用して決定した。ＷＴのαβγ−ｈＥＮａＣ、ＷＴのδβγ−ｈＥＮａＣ、または変異体のｈＥＮａＣを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞のホールセルのナトリウム電流を、ＡＰ３０１のストック溶液を浴溶液に追加しながら添加して、続いて−８０ｍＶの保持電位（Ｅｈ）で記録し、その結果、３．５〜２４０ｎＭの範囲に及ぶソルナチドの最終濃度を得た。最後に、アミロライドを添加して、アミロライド感受性のＮａ＋電流におけるペプチドが誘発する増加を推定することを可能にした。ｈＥＮａＣの発現の、培養した細胞の異なるバッチ間の変動のため、対にしたアミロライド応答のパーセントとして、ＡＰ３０１の活性を表現した。ＷＴのαβγ−ｈＥＮａＣ、ＷＴのδβγ−ｈＥＮａＣ、または変異体のｈＥＮａＣに対して、アミロライドを１０μＭで使用した；これらの濃度は、９５％超のｈＥＮａＣの阻害をもたらした。明らかなアミロライド応答を示す細胞のみを、データの分析に含めた。
【００５４】
電流と電圧との関係
αβγ−ｈＥＮａＣ、ＷＴのδβγ−ｈＥＮａＣ、または変異体のｈＥＮａＣを一過性に感染させたＨＥＫ−２９３細胞の、ホールセルの電流と電圧との関係（Ｉ／Ｖ）を、それぞれ対照（ＡＰ３０１を添加する前）について、２４０ｎＭのＡＰ３０１を用いる処理について、および１０μｍのアミロライドを添加した後について決定した。ＧＯｈｍ−シール（Ｇ’Ω−シール）の形成、および５分間の平衡化の後に、ナトリウム電流を−８０ｍＶから＋８０ｍＶまでのＥｈにおいて、２０ｍＶ単位で増加させて、それぞれのＥｈで１分間保持して記録した。
【００５５】
統計学的分析
データは、別段の記載がない限り、平均±Ｓ．Ｅ．を示す；ＨＥＫ−２９３の異種性の発現系中の３〜７つのバッチの独立にトランスフェクトした細胞に対して、実験を実施した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、３．０２版（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用する、対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して、異なる群間の統計学的有意性を決定した。
【００５６】
結果
【００５７】
【表１】
2018528221.tif 000012
【００５８】
ＰＨＡ  ＩＢ型のαβＧ３７Ｓγ−ｈＥＮａＣおよび相同体に対するＡＰ３０１の効果
ＰＨＡ  １Ｂ型の変異体のαβＧ３７Ｓγ−ｈＥＮａＣ、または実験室で構築したその相同体うちの１つを発現しているＨＥＫ−２９３細胞に対するＡＰ３０１の効果を、下記の図に示す。ＨＥＫ−２９３細胞中で一過性に発現させた機能欠失型変異ｈＥＮａＣそれぞれについて、ホールセルの電流と電圧との関係（Ｉ／Ｖ）、ならびに対照とする相において、２４０ｎＭのＡＰ３０１を添加した後、および最後にアミロライド（１０ｍＭ）を浴溶液に添加した後の、−８０ｍＶの保持電位における、内向き電流密度の絶対平均値を示す（下記の図）。
【００５９】
ＰＨＡ  ＩＢ型の変異体のＥＮａＣに対するＡＰ３１８の効果
ＰＨＡ  １Ｂ型の変異体のＥＮａＣにおける活性を修復する効果は、ＡＰ３０１のみの効果であるかどうか、またはそうした効果が環状ペプチド一般に認められる特性であるかどうかを試験するために、ホールセルパッチクランプアッセイにおいて、ＡＰ３１８およびＡＰ３０１の存在下で、α−、β−およびγ−ｈＥＮａＣサブユニット中にそれぞれ変異を含有する、ＰＨＡ  ＩＢ型の変異体のＥＮａＣ３つを試験した。３つの変異体は全て、ＰＨＡ  １Ｂ型に罹患している患者において観察されたことがあり、ＥＮａＣのサブユニット中で保存されている位置において生じている；これらの変異体のうちの２つ、すなわち、αＱ１０１Ｋβγ−ｈＥＮａＣおよびαβＧ３７Ｓγ−ｈＥＮａＣはＡＰ３０１を用いて以前に試験してあった。第３の変異は、γサブユニット中で生じ、αβγＶ５４３ｆｓ−ｈＥＮａＣをもたらし、これは、これまでに試験したいずれの変異体とも異なり、フレームシフト変異体であり、その結果、切り詰められたγサブユニットが生じる。
【００６０】
ホールセルパッチクランプアッセイにおいて、ＡＰ３１８およびＡＰ３０１の存在下で、これらの変異体ＥＮａＣを発現しているＨＥＫ−２９３細胞を試験した結果を表２および図６に示す。
【００６１】
【表２】
2018528221.tif 000013
【００６２】
以下の結論を、これまでに得た結果から引き出すことができる。
１）ＰＨＡ  ＩＢ型の変異の結果、ＷＴのｈＥＮａＣと比較して、ＥＮａＣを介するアミロライド感受性のナトリウム電流の機能欠失が生じた。
２）ＡＰ３０１は、Ｎａ+イオン輸送能力を修復し、ＰＨＡ  ＩＢ型の患者において観察される、機能欠失型変異ｈＥＮａＣの全て、すなわち、αβＧ３７Ｓγ−、αＱ１０１Ｋβγ−およびαＧ３２７Ｃβγ−ｈＥＮａＣのアミノ酸の変異を補完した。
３）ＷＴのαβγ−およびδβγ−ｈＥＮａＣを用いて観察された、アミロライド感受性のナトリウムイオン電流の生理的なレベルと比較して、ＡＰ３０１は、機能欠失型変異ＥＮａＣのアミロライド感受性のナトリウムイオン電流を、変異していない活性なＥＮａＣと同等のレベルに修復した。
４）ＰＨＡ  ＩＢ型の変異体のαβＧ３７Ｓγ−ｈＥＮａＣおよび対応する相同体についての濃度−応答曲線およびＥＣ５０値から、ＡＰ３０１には、変異体のこれらのＥＮａＣチャネルの全てにおいて活性を修復し、アミノ酸の変異を補完する可能性があることが示されている；これらのチャネルにおいてはＷＴのαβγ−およびδβγ−ｈＥＮａＣと比較して、機能が欠失している。
５）ＰＨＡ  ＩＢ型の変異体のαβＧ３７Ｓγ−ｈＥＮａＣおよび対応する相同体についての電流と電圧との関係（Ｉ／Ｖ）により、変異体のこれらのチャネルに対するＡＰ３０１の修復効果がより詳細に特徴付けられている。ｈＥＮａＣの種々のサブユニット中で保存されている位置において存在する変異と同じ変異を起こした結果、異なる機能特性および表現型の効果を示すナトリウムイオンチャネルが生じ、こうしたチャネルは、ＡＰ３０１の存在下で活性が修復されることが明らかに示されている（表３）。
６）ＡＰ３０１およびＡＰ３１８の非存在下におけるホールセルの電気生理学的アッセイの結果から、野生型と比較して、αβγ−ｈＥＮａＣサブユニット全てにおけるＰＨＡ  １Ｂ型の変異の結果、機能欠失が生じることが示されている。ＡＰ３０１およびＡＰ３１８の存在下では、ナトリウムイオンチャネルの正常な機能の修復を示す、ＰＨＡ−１Ｂ変異体を介したアミロライド感受性のナトリウムイオン電流の顕著な増加が観察された。
【００６３】
全体的な結論
これらの結果から、ＡＰ３０１およびＡＰ３１８は、機能が欠失しているＰＨＡ  ＩＢ型の変異体のｈＥＮａＣにおいて、Ｎａ+イオン輸送を修復し、アミノ酸の変異を補完することができると結論付けることができ、このことは、環状ペプチドには、これらの変異体において、損傷しているＥＮａＣの機能を修復し、アミノ酸の変異を補完し、それにより、全身性のＰＨＡ  Ｉ型に罹患している患者を治療するための療法として作用する可能性があることを示している。
【００６４】
参考文献
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2018528221.tif 000015
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2018528221.tif 000017
2018528221.tif 000018
2018528221.tif 000019
2018528221.tif 000020
2018528221.tif 000021
2018528221.tif 000022
【図１】
2018528221.tif 000031
【図２】
2018528221.tif 000032
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018528221.tif 000038
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