(57)【要約】本発明は、分析物検出デバイス、および試料中の微量の標的分析物を検出するためのそのようなデバイスの使用方法に関する。特に、本発明は、試料を溶液中で第１の検出コンジュゲートおよび第２の検出コンジュゲートと混合する工程を含む、試料中の標的分析物を検出する方法であって、第１の検出コンジュゲートおよび第２の検出コンジュゲートは、結合パートナーに連結された金属ナノ構造を含み、結合パートナーは、試料中に標的分析物が存在する場合にそれに特異的に結合し、第１の検出コンジュゲートと、分析物と、第２の検出コンジュゲートとの間での複合体を形成することが可能であり、複合体形成時の光学シグナルの変化が、試料中の標的分析物の存在を示す、方法を提供する。ナノ構造およびナノ合金、ならびに結合パートナーとコンジュゲートしたナノ構造およびナノ合金の調製方法も記載する。2018528417.tif 000003
2018528417.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）試料を第１の検出コンジュゲートおよび第２の検出コンジュゲートと混合する工程であって、第１の検出コンジュゲートおよび第２の検出コンジュゲートは、結合パートナーに連結された複合金属ナノ構造を含み、該結合パートナーは、試料中に標的分析物が存在する場合にそれに特異的に結合し、第１の検出コンジュゲートと、該分析物と、第２の検出コンジュゲートとの間での複合体の形成が可能である、工程；
（ｂ）該複合体を、紫外−可視−赤外スペクトル内の波長範囲の光源に曝露する工程；ならびに
（ｃ）該複合体からの光学シグナルを測定する工程であって、光学シグナルの変化が試料中の標的分析物の存在を示す、工程
を含む、試料中の標的分析物の検出方法。
【請求項２】
光学シグナルが、反射率、吸光度スペクトル、散乱スペクトルまたは発光スペクトルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
光学シグナルの変化が、スペクトルピーク波長シフトおよび／または全スペクトル波長シフトを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
全スペクトル波長シフトが差スペクトルである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
標的分析物のナノグラム量の存在が検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
標的分析物のピコグラム量の存在が検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
標的分析物のフェムトグラム量の存在が検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）が、分光光度法キュベット、分析用ローター、マイクロウェルプレート、臨床分析器、フローチャンバー、光ファイバーの先端上または透明ゲルにおいて実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
複合金属ナノ構造が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、鉄、ニッケルおよび亜鉛から選択される少なくとも２種の金属を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
複合金属ナノ構造のそれぞれが、第１の金属のコアおよび第２の金属のコーティングを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
複合金属ナノ構造のそれぞれが、金コーティングおよび銀コアを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
複合金属ナノ構造のそれぞれが、銀コーティングおよび金コアを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
複合金属ナノ構造のそれぞれが、第１の金属および第２の金属の合金である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
複合金属ナノ構造が、球形ナノ粒子、ピラミッド形ナノ粒子、六角形ナノ粒子、ナノチューブ、ナノスター、ナノシェル、ナノロッド、ナノアイランド、ナノドット、ナノワイヤーまたはそれらの組合せから選択される幾何構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
結合パートナーが生体高分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
生体高分子が、抗体またはその断片、抗原、レセプター、リガンド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ポリペプチド、ポリサッカライド、リポポリサッカライド、グリコペプチド、リポタンパク質または核タンパク質を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
生体高分子が抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
生体高分子が抗原である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
第１の検出コンジュゲートおよび第２の検出コンジュゲートが、抗体である結合パートナーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体が、標的分析物の異なるエピトープに結合する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
標的分析物が、タンパク質、酵素、抗原、抗体、ペプチド、核酸、ホルモン、糖タンパク質、ポリサッカライド、毒素、ウイルス、ウイルス粒子、薬物分子、ハプテンおよび化学物質から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
標的分析物が、病原性抗原、または病原性抗原に対する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
病原性抗原がウイルス性抗原である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ウイルス性抗原が、ネコ白血病ウイルス、イヌパルボウイルス、口蹄疫ウイルス、インフルエンザウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＩＶウイルス、ヒトパピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルスおよび狂犬病ウイルスから選択されるウイルスに由来する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
病原性抗原が細菌性抗原である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
細菌性抗原が、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細菌性抗原が、エーリキア・カニス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ）、エーリキア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｅｅｎｓｉｓ）、エーリキア・エウィンギイ（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｅｗｉｎｇｉｉ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、アナプラズマ・プラティス（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｌａｔｙｓ）、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）およびリケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
病原性抗原が真菌性抗原または寄生虫性抗原である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
真菌性抗原または寄生虫性抗原が、イヌ糸状虫、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、熱帯熱マラリア原虫、アフリカトリパノソーマ症、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ａ）の混合が、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコールおよびポリアスパラギン酸から選択されるポリマー材料の存在下で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
ポリマー材料がポリエチレングリコールである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
工程（ａ）の混合が、ポリサッカライドの存在下で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
ポリサッカライドが、マルトデキストリン、コーンシロップおよびポリグルコースから選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ポリサッカライドがマルトデキストリンである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
反応混合物中のマルトデキストリンの最終濃度が約２％〜約２０％重量／体積である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
反応混合物中のマルトデキストリンの最終濃度が約５％〜約１０％重量／体積である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ａ）の混合がブロッキング剤の存在下で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
ブロッキング剤が、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、オボアルブミンおよびガンマ−グロブリンから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ブロッキング剤がウシ血清アルブミンである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
反応混合物中のウシ血清アルブミンの最終濃度が約１％〜約５％重量／体積である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
試料中に標的分析物が存在する場合にそれに特異的に結合可能な結合パートナーに連結された金属ナノ構造を含む、第１の検出コンジュゲートと；
試料中に標的分析物が存在する場合にそれに特異的に結合可能な結合パートナーに連結された金属ナノ構造を含む、第２の検出コンジュゲートと
を含む、分析物検出デバイスであって、
第１の検出コンジュゲートおよび／または第２の検出コンジュゲート中の金属ナノ構造が、複合金属ナノ構造である、
分析物検出デバイス。
【請求項４２】
分光光度法キュベット、分析用ローター、マイクロウェルプレートまたはフローチャンバーである、請求項４１に記載の分析物検出デバイス。
【請求項４３】
分析用ローターである、請求項４２に記載の分析物検出デバイス。
【請求項４４】
分析用ローターが、１つまたはそれ以上の反応チャンバーを含み、該反応チャンバーに、第１の検出コンジュゲートおよび第２の検出コンジュゲートが配置される、請求項４３に記載の分析物検出デバイス。
【請求項４５】
第１の検出コンジュゲートおよび／または第２の検出コンジュゲートが凍結乾燥されている、請求項４１に記載の分析物検出デバイス。
【請求項４６】
試験試料を受容するように構成されている、請求項４１に記載の分析物検出デバイス。
【請求項４７】
第１の検出コンジュゲートと、前記分析物と、第２の検出コンジュゲートとの複合体を、紫外−可視−赤外スペクトル内の波長範囲において光源に曝露するように構成されている、請求項４１に記載の分析物検出デバイス。
【請求項４８】
前記デバイスが、前記複合体からの光学シグナルを測定するようにさらに構成されており、光学シグナルの変化が、前記試料中の標的分析物の存在を示す、請求項４７に記載の分析物検出デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容が、参照によって全体的に本明細書に組み込まれる、２０１５年８月４日出願の米国仮特許出願第６２／２０１，０５１号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、試料中の標的分析物を検出するためのシステムおよび方法に関する。特に、本発明は、試料中の微量の標的分析物を検出することができる、局在プラズモン共鳴ベースの分析物検出システムを提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
現在のイムノアッセイおよび生体分子結合アッセイでは、典型的に、アッセイを実行するために、複数のステップおよび精巧な装置が必要とされる。そのような不均一アッセイを実行することに関与する感度の欠如および複雑性は、標識化されていない特異的結合パートナーから標識化されたものを分離するための特定のニーズから生じる。
【０００４】
貴金属ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）特性をベースとするアッセイを開発する試みがなされてきた（Ｔｏｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．，Ｖｏｌ．１１４：５７２８ー５７５２，２０１４（非特許文献１））。ＬＳＰＲは、入射光によって誘発された、ナノメートルサイズ構造の電子の集団的振動である。金属ナノ粒子は、それらの付近の屈折率変化に対する強い電磁応答を有し、したがって、ナノ粒子の共鳴振動数のシフトを、ナノ粒子表面への分子結合の指標として測定することができる。結合現象を検出する診断アッセイにおいて、金属ナノ粒子、特に金ナノ粒子が利用されているが、そのようなアッセイは、一般に、低い感度のために困難があり、連続的な結合現象の動力学を定量的に監視するために使用することができない。
【０００５】
したがって、感度の増加を提供しながら、均一フォーマットを利用する、改善されたアッセイ法が必要とされている。分光法などの標準的な検査技術を利用するアッセイも望ましいであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｏｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．，Ｖｏｌ．１１４：５７２８ー５７５２，２０１４
【発明の概要】
【０００７】
本出願は、限定されないが、リガンド、レセプター、転写因子、結合ＤＮＡ因子、抗原および抗体に関与する、特異的結合パートナーに関するアッセイを実行するための局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）技術の使用を記載する。より具体的には、本出願は、複合金属ナノ材料標識パートナーを使用するそのようなアッセイにおける有意な増幅を達成するための方法および材料に関する。
【０００８】
本明細書に記載の種々の実施形態において、本出願は、定性的または定量的様式で特異的結合パートナーの結合を決定するための溶液中の複合ナノ材料標識パートナーの使用に関する。
【０００９】
第１の態様において、本出願は、試料中の標的分析物の検出方法を提供する。一実施形態において、この方法は、結合パートナーに連結された金属ナノ構造を含む第１の検出コンジュゲートおよび第２の検出コンジュゲートと試料を混合する工程であって、結合パートナーは、試料中に標的分析物が存在する場合にそれに特異的に結合し、第１の検出コンジュゲートと、分析物と、第２の検出コンジュゲートとの間での複合体の形成が可能である、工程；複合体を、紫外−可視−赤外スペクトル内の波長範囲の光源に曝露する工程；ならびに複合体からの光学シグナルを測定する工程であって、光学シグナルの変化が試料中の標的分析物の存在を示す、工程を含む。代表的な実施形態において、第１の検出コンジュゲートおよび／または第２の検出コンジュゲート中の金属ナノ構造は、複合金属ナノ構造である。別の代表的な実施形態において、混合工程は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコールおよびポリアスパラギン酸から選択されるポリマー材料の存在下で実行される。好ましい実施形態において、ポリマー材料はＰＥＧである。さらに別の代表的な実施形態において、混合工程は、ポリサッカライドの存在下で実行される。いくつかの実施形態において、ポリサッカライドは、マルトデキストリン、コーンシロップおよびポリグルコースから選択される。好ましい実施形態において、ポリサッカライドはマルトデキストリンである。さらに別の代表的な実施形態において、混合工程は、ブロッキング剤の存在下で実行される。いくつかの実施形態において、ブロッキング剤は、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、オボアルブミンおよびガンマ−グロブリンから選択される。好ましい実施形態において、ブロッキング剤はウシ血清アルブミンである。
【００１０】
いくつかの実施形態において、検出コンジュゲートは、標的分析物に特異的に結合することが可能である結合パートナーを含む。特定の実施形態において、結合パートナーは、ハプテンおよび他の小分子、薬剤、ホルモン、限定されないが、抗体またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、単鎖、ＣＤＲなど）、抗原、レセプター、リガンド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ポリペプチド、ポリサッカライド、リポポリサッカライド、グリコペプチド、リポタンパク質または核タンパク質を含む生体高分子である。特定の代表的な実施形態において、結合パートナーは抗体である。他の代表的な実施形態において、結合パートナーは抗原である。いくつかの実施形態において、検出コンジュゲート（例えば、第１の検出コンジュゲートおよび第２の検出コンジュゲート）は、同種の分子である結合パートナーを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、検出コンジュゲート中の金属ナノ構造は、貴金属またはその複合体から構成されることが可能である。いくつかの実施形態において、検出コンジュゲート中の金属ナノ構造は、遷移金属またはその複合体から構成されてもよい。いくつかの実施形態において、検出コンジュゲート中の金属ナノ構造は、貴金属または遷移金属と組み合わせて、アルカリ金属またはランタニドを含み得る。特定の実施形態において、検出コンジュゲート中の金属ナノ構造は、金、銀、銅、白金、パラジウム、ルテニウム、ロジウム、オスミウム、イリジウム、チタン、クロム、カドミウム、亜鉛、鉄、コバルト、ニッケルおよびその複合体から選択される金属を含む。代表的な実施形態において、金属ナノ構造は金ナノ構造である。別の代表的な実施形態において、金属ナノ構造は銀ナノ構造である。
【００１２】
好ましい実施形態において、検出コンジュゲート中の金属ナノ構造は、少なくとも２種の貴金属、遷移金属、アルカリ金属またはランタニドを含む複合金属ナノ構造である。いくつかの実施形態において、複合金属ナノ構造は、金、銀、銅、白金、パラジウム、ルテニウム、ロジウム、オスミウム、イリジウム、チタン、クロム、カドミウム、亜鉛、鉄、コバルトおよびニッケルから選択される少なくとも２種の金属を含む。他の実施形態において、複合金属ナノ構造は、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、鉄、ニッケルおよび亜鉛をから選択される少なくとも２種の金属を含む。代表的な実施形態において、複合金属ナノ構造は、金および銀を含む。
【００１３】
１つの代表的な実施形態において、第１の結合パートナーは、金または複合ナノ粒子と連結され、第２の結合パートナーは、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウムおよび亜鉛からなる群から選択される２種の金属を含有する別の複合ナノ材料と連結される。別の代表的な実施形態において、第１の結合パートナーは、銀および金を含有するナノ粒子とコンジュゲートされ、第２の結合パートナーは、金および銅を含むナノ粒子とコンジュゲートされる。
【００１４】
本明細書に記載されるとおり、様々なアッセイにおいて有意なシグナル増幅が達成可能である。特定の実施形態において、アッセイは、直接、間接、サンドウィッチ、競合および二次標識化アッセイである。特定のさらなる実施形態において、これらのアッセイは、特定の結合現象を監視するために、吸光、散乱および／または反射率測定を使用し得る。
【００１５】
特定の実施形態において、本発明の方法は、試料中の標的分析物のフェムトグラムからナノグラム量を検出することができる。
【００１６】
上記のとおり、本出願は、定性的または定量的様式で特異的結合パートナーの結合を決定するための、溶液中での、ナノ材料標識パートナー、例えば、複合金属ナノ構造とコンジュゲートした抗体の使用に関する。いくつかの実施形態において、溶液は、ポリサッカライド（例えば、マルトデキストリン）、トレハロース、ポリマー材料（例えば、ＰＥＧ）、ブロッキング剤（例えば、ウシ血清アルブミン）および／または塩化ナトリウムの１種またはそれ以上を含む。代表的な実施形態において、１種またはそれ以上の溶液成分、例えば、マルトデキストリンは、凍結乾燥された形態で、例えば、ビーズまたはペレットとして提供されてもよい。例えば、１種またはそれ以上の溶液成分は、分光光度法キュベット中で、あるいは分析用ローターの１つまたはそれ以上の反応チャンバー中で、ビーズまたはペレットとして提供されてもよい。ビーズまたはペレットは、液体、例えば、水、食塩溶液、液体試料などの添加時に懸濁してもよい。一実施形態において、溶液は、約２％〜約２０％重量／体積（ｗｔ／ｖｏｌ）の最終濃度でマルトデキストリンを含む。別の実施形態において、溶液は、約４％〜約１５％重量／体積の最終濃度でマルトデキストリンを含む。さらに別の実施形態において、溶液は、約５％〜約１０％重量／体積の最終濃度でマルトデキストリンを含む。いくつかの実施形態において、アッセイの感度は、マルトデキストリンが溶液に添加される場合、別の糖、例えば、スクロースまたはｆｉｃｏｌｌを含む溶液中でアッセイが実行される場合と比較して、改善される。
【００１７】
別の態様において、本発明は、試料中の標的分析物を検出するための、本明細書に記載される方法を利用するための分析物検出デバイスを提供する。適切な分析物検出デバイスとしては、限定されないが、分光光度法キュベット、分析用ローター、マイクロウェルプレート、臨床分析器（例えば、Ｃｏｂａｓ  Ｆａｒａ）またはフローチャンバーが含まれ得る。光ファイバーの先端または透明ゲルも、本明細書に開示される検出方法を実行するために利用されてよい。代表的な実施形態において、分析物検出デバイスは、分光光度法キュベットおよび分析用ローターから選択される。
【００１８】
好ましい実施形態において、分析物検出デバイスの構成成分は、遠心ローターまたはディスクに含まれる。いくつかの実施形態において、ローターまたはディスクは、複数の検出コンジュゲートが位置する１つまたはそれ以上の反応チャンバーを含有していてもよい。特定の実施形態において、検出コンジュゲートは、凍結乾燥されたビーズまたはペレットなどの凍結乾燥された組成物の形態で存在する。いくつかの実施形態において、分析物検出デバイスは、１つまたはそれ以上の反応チャンバーを含み、それぞれの反応チャンバーは、複数の検出コンジュゲート（例えば、第１の検出コンジュゲートおよび第２の検出コンジュゲート）を含み、検出コンジュゲートは、金属ナノ粒子、例えば、複合金属ナノ構造に連結されている。ローターまたはディスクが、２つ以上の反応チャンバーを含む実施形態において、検出コンジュゲートは、異なる分析物がそれぞれの反応チャンバーにおいて検出されることができるように選択することができる。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の分析物検出デバイスを含むキットを提供する。一実施形態において、キットは、複数の検出コンジュゲート（例えば、第１の検出コンジュゲートおよび第２の検出コンジュゲート）を含み、検出コンジュゲートは、金属ナノ粒子、例えば、複合金属ナノ構造に連結されている。いくつかの実施形態において、検出コンジュゲートの１つまたはそれ以上は、凍結乾燥されていてもよい。一実施形態において、検出コンジュゲートの全てが凍結乾燥されている。代表的な実施形態において、第１の検出コンジュゲートおよび／または第２の検出コンジュゲート中の金属ナノ構造は、複合金属ナノ構造である。
【００２０】
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に記載の検出デバイスおよび方法で使用するための複合金属ナノ構造を調製する方法を提供する。一実施形態において、この方法は、ポリマーおよび塩化金酸の混合物を含む第１の溶液を調製すること、銀および銅ナノ構造を含む第２の溶液を調製すること、ならびに一定期間、第１の溶液を第２の溶液と一緒にインキュベーションすることを含み、得られる混合物は、金コーティング銀ナノ構造または金コーティング銅ナノ構造を含む。特定の実施形態において、アスコルビン酸などの還元剤が、製造されるナノ構造の量を増加させるために、反応混合物に添加される。一実施形態において、第１の溶液中のポリマーは、ポリビニルピロリドンである。別の実施形態において、第１の溶液中のポリマーは、ポリビニルアルコールである。別の実施形態において、この方法は、ＣＨＡＰＳなどの清浄剤および塩化金酸の混合物、ならびに銀または銅塩を含む溶液を含む第１の溶液を調製すること、ならびに第１の溶液を、アスコルビン酸などの還元剤を含有する第２の溶液と一緒にインキュベーションして、複合ナノ構造の形成を誘導することを含む。ナノ構造の径および形状は、使用される金属の比率、清浄剤の濃度、ならびに最終的に使用されるアスコルビン酸の量を変更することによって変動可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本明細書に記載のＬＳＰＲイムノアッセイの基本原理を示す。金属ナノ粒子は、それ自体、金属組成、径、形状および分散媒体の性質に依存する光学スペクトルを示す。最初の一次結合およびその後の二次結合によるナノ粒子の表面におけるわずかな変化は、ナノコンジュゲートと相互作用する光の特徴において漸進的変化を引き起こす。そのような変化を適切な分光計によって記録することができ、定性的ならびに定量的情報が提供される。
【図２】レセプターが複数のリガンド結合部位を有する例を示す。ナノ粒子によって標識化された抗体は、抗原に結合するとスペクトルシフトを引き起こす。
【図３】レセプターが複数の結合部位を有するか、またはレセプターが異なる結合部位を有する場合の、異なるナノ粒子タイプ間のＬＳＰＲカップリング作用を示す。
【図４】ＬＳＰＲシグナルに及ぼすポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の作用を例示する。ＬＳＰＲシグナルは、ＰＥＧの存在下で実質的に増加する。この図は、２．５ｎｇの糸状虫抗原および抗糸状虫ポリクローナル抗体を含有する反応媒体中へのＰＥＧの添加時におけるＬＳＰＲシグナルの１０倍の増大を示す。
【図５】青色金ナノスターを利用することによる、波長シフトの増加を示す。この図中、青色ナノスターにコンジュゲートした抗体は、抗体の赤色コロイド金コンジュゲートと比較した場合、波長シフト率の２倍の増加を提供した。この実験は、２．５ｎｇの粗糸状虫抽出液を抗原として使用してセットアップされ、次に、赤色コロイド金を使用して調製された市販のコンジュゲート、または本発明によって調製された新規青色コンジュゲートのいずれかと反応させた。両種のコンジュゲートにおいて、ポリエチレングリコールが使用された。
【図６】ニワトリ抗プロテインＡの青色コロイドコンジュゲートが、広い濃度範囲においてプロテインＡと反応し、反応速度が長時間にわたって線形であることを示す。
【図７Ａ】ＬＳＰＲ技術が溶液相（図７Ａ）で使用される場合の、固体相（図７Ｂ）で使用される場合と比べての、分析物検出の実質的な改善を示す。反応は、固体相ではＮｉｃｏｙａチップを使用して、または液体相ではＮｉｃｏｙａキュベットアセンブリを使用して実行された。２つの実験において、同Ｎｉｃｏｙａ分光計を使用した。キュベットアッセイ（溶液相）におけるＣＲＰ応答は、固体相よりも約６〜８倍高かった。
【図７Ｂ】ＬＳＰＲ技術が溶液相（図７Ａ）で使用される場合の、固体相（図７Ｂ）で使用される場合と比べての、分析物検出の実質的な改善を示す。反応は、固体相ではＮｉｃｏｙａチップを使用して、または液体相ではＮｉｃｏｙａキュベットアセンブリを使用して実行された。２つの実験において、同Ｎｉｃｏｙａ分光計を使用した。キュベットアッセイ（溶液相）におけるＣＲＰ応答は、固体相よりも約６〜８倍高かった。
【図８Ａ】コロイド金コンジュゲートモノクローナル抗ＴＳＨ抗体を使用する溶液相中でのＴＳＨの検出を示す。
【図８Ｂ】コロイド金コンジュゲートモノクローナル抗ＴＳＨ抗体を使用する溶液相中でのＴＳＨの検出を示す。
【図９Ａ】反応媒体中、ＰＥＧを用いないＴＳＨ検出の比較を示す。２つのモノクローナル抗体（Ｃ１およびＣ６）がコロイド金コンジュゲートとして使用された。２つのコンジュゲートの比率は様々であり、最適シグナルは、３０％のＣ１および７０％のＣ６で得られた。
【図９Ｂ】反応媒体中、ＰＥＧを用いてのＴＳＨ検出の比較を示す。２つのモノクローナル抗体（Ｃ１およびＣ６）がコロイド金コンジュゲートとして使用された。２つのコンジュゲートの比率は様々であり、最適シグナルは、３０％のＣ１および７０％のＣ６で得られた。
【図９Ｃ】反応媒体にＰＥＧが含まれる場合の検出のＴＳＨ  ＬＳＰＲピークシフトの比較を示す。ＰＥＧが、５００秒においてＴＳＨアッセイにおける分析物検出を増強することを示す。
【図１０】次のように合成された金／銀合金ナノ粒子の光学スペクトルを示す：硝酸銀の添加前に塩化金をＣＴＡＢと反応させ、続いて、アスコルビン酸、そして最終的に水酸化ナトリウムを添加した。
【図１１】ナノ合金粒子中の銀含有量の増加に対する、λｍａｘにおける線形青色シフトを示す。
【図１２】金および金／銀合金ナノ粒子とのマウスＩｇＧコンジュゲートの免疫反応性を示す。コンジュゲートは、金または合金粒子上でのマウスＩｇＧの受動的吸着によって合成された。これらは、側方流動ニトロセルロースストリップにおいてストリップされたプロテインＡとの反応性に関して試験された。
【図１３】ＣＨＡＰＳでキャップされた金／銀ナノスターの光学スペクトルを示す。塩化金は、硝酸銀およびクエン酸三ナトリウムの添加の前にＣＨＡＰＳに添加される。ナノスター形成は、アスコルビン酸、ＣＨＡＰＳおよびクエン酸三ナトリウムを含有する還元溶液の添加によって誘導される。その後、特定の銀濃度までのλｍａｘ赤色シフトと、次に青色シフトが生じる。したがって、異なるサイズのナノスターは、反応媒体中の金対銀の比率を変化させることによって製造される。
【図１４】銀の不在下で製造された金のみのナノ粒子へのマウスＩｇＧの結合時の赤色へのピークシフトを示す。
【図１５】約３７．５％の銀の存在下で製造された金／銀ナノスターへのマウスＩｇＧの結合時の赤色へのより大きいピークシフトを示す。
【図１６】ＬＳＰＲシグナルに及ぼすマルトデキストリンの高い好ましい作用を示す。
【図１７】マルトデキストリンおよびＢＳＡがどのように分析用ローター中での沈降を減少させ、高いＬＳＰＲシグナルを維持するかを示す。
【図１８】ＢＳＡ、ＰＥＧおよびマルトデキストリンの様々な濃度下でのＴＳＨのｐｇ／ｍｌ検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、複合金属ナノ構造標識結合パートナーによって、ＬＳＰＲベースのアッセイにおける有意な増幅が達成可能であるという発見に、部分的に基づく。したがって、本発明は、生体分子に連結された複合金属ナノ構造を含む複数の検出コンジュゲートを利用する、分析物検出方法を提供する。
【００２３】
本発明は、一般に複数のステップおよびそのようなステップを実行するために精巧な装置が必要とされる、現在のイムノアッセイ、リガンド−レセプター結合アッセイ、核酸−タンパク質結合アッセイまたは他の特異的結合パートナーアッセイの課題を克服する。そのような不均一アッセイを実行することに関与する感度の欠如および複雑性は、標識化されていない特異的結合パートナーから標識化されたものを分離するための特定のニーズから生じる。本発明は、結合現象が、分光法において当業者によって使用されるいずれかの分光学的技術によってリアルタイムで測定されるＬＳＰＲ特徴を変化させるため、反応および未反応アッセイ成分の分離が不必要である均一フォーマットで、アッセイに関与する全てのステップを実行することによって、そのような制限を克服する。分離を必要としない、本発明のワンポット（ｏｎｅ  ｐｏｔ）アッセイでは、プラズモンカップリングおよび関連作用が使用され、最終ＬＳＰＲ変調シグナルの増幅が提供される。
【００２４】
当業者に明白であるように、本発明は、ヒトおよび動物の両方における感染症と関連するものなどの様々な抗原性分析物、例えば、感染症と関連する抗原およびその応答において生じた抗体の検出に適用されてもよい。抗原および抗体の検出を越えて、本明細書に記載の技術は、リガンドおよびレセプター、ならびに転写因子およびそれらの関連ＤＮＡ結合因子などの特異的結合パートナーに関与するアッセイを実行するためにも使用されてよい。さらに、特異的結合パートナーとの金属ナノ粒子の適切なコンジュゲートを使用して、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはタンパク質−核酸相互作用が検出され得る。
【００２５】
本明細書に提供されるように、本発明は、定性的または定量的様式で特異的結合パートナーの結合を決定するための、（化学的または物理的堆積を介して表面に付着することとは対照的に）溶液中での金属ナノ粒子の使用を記載する。金属ナノ粒子に付着した未結合および結合パートナーを含有する領域と相互作用する光の特徴の変化が測定可能であり、このことから、特異的結合パートナー間の定性的および定量的相互作用の両方が、適切な検出器によって決定可能となる。
【００２６】
第１の態様において、本出願は、試料中の標的分析物の検出方法を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は、結合パートナーに連結された金属ナノ構造を含む複数の検出コンジュゲートと、試料を混合する工程を含む。一実施形態において、この方法は、存在する場合、試料中の標的分析物に特異的に結合し、第１の検出コンジュゲートと、分析物と、第２の検出コンジュゲートとの間での複合体の形成が可能である結合パートナーに連結された金属ナノ構造を含む、第１の検出コンジュゲートおよび第２の検出コンジュゲート；複合体を、紫外−可視−赤外スペクトル内の波長範囲の光源に曝露すること；ならびに光学シグナルの変化が試料中の標的分析物の存在を示す、複合体からの光学シグナルを測定することを含む。代表的な実施形態において、第１の検出コンジュゲートおよび／または第２の検出コンジュゲート中の金属ナノ構造は、複合金属ナノ構造である。別の代表的な実施形態において、混合工程は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコールおよびポリアスパラギン酸から選択されるポリマー材料の存在下で実行される。好ましい実施形態において、ポリマー材料はＰＥＧである。さらに別の代表的な実施形態において、混合工程は、ポリサッカライドの存在下で実行される。いくつかの実施形態において、ポリサッカライドは、マルトデキストリン、コーンシロップおよびポリグルコースから選択される。好ましい実施形態において、ポリサッカライドはマルトデキストリンである。さらに別の代表的な実施形態において、混合工程は、ブロッキング剤の存在下で実行される。いくつかの実施形態において、ブロッキング剤は、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、オボアルブミンおよびガンマ−グロブリンから選択される。好ましい実施形態において、ブロッキング剤はウシ血清アルブミンである。
【００２７】
本明細書に記載の種々の実施形態において、本発明の方法は、サンドウィッチアッセイフォーマット、直接アッセイフォーマット、間接アッセイフォーマット、ならびに競合および二次標識化フォーマットに構成することができる。
【００２８】
いくつかの実施形態で、検出方法は、サンドウィッチアッセイである。そのような実施形態において、検出コンジュゲートは、試料中に存在する場合、標的分析物に特異的に結合が可能である結合パートナーに連結された金属ナノ構造を含む。例えば、一実施形態において、サンドウィッチアッセイフォーマットの方法は、存在する場合、試料中の標的分析物に特異的に結合し、第１の検出コンジュゲートと、分析物と第２の検出コンジュゲートとの間での複合体の形成が可能である結合パートナーに連結された金属ナノ構造を含む、第１の検出コンジュゲートおよび第２の検出コンジュゲートを含む。代表的な実施形態において、第１の検出コンジュゲートおよび／または第２の検出コンジュゲート中の金属ナノ構造は、複合金属ナノ構造である。複合体を光源に曝露し、光学シグナルを測定する。ここで、光学シグナルの変化は、試料中の分析物の存在を示す。例として、標的分析物を含有する試料が、第１および第２の検出コンジュゲートと混合される場合、標的分析物は、検出コンジュゲートの結合パートナーに結合し、第１の検出コンジュゲートと、分析物と、第２の検出コンジュゲートとの間で複合体が形成される。このような複合体形成によって、互いに近接した検出コンジュゲートにおける金属のナノ構造、すなわち、プラズモン−プラズモンカップリングがもたらされる。金属ナノ構造によって吸収、分散または伝導される光量は、複合体中の金属ナノ構造の近接によって影響を受け、したがって、試料中の標的分析物の存在を示すピーク吸収波長のシフト増強がもたらされる。
【００２９】
他の実施形態において、検出方法は、競合アッセイである。そのような実施形態において、第１の検出コンジュゲートは、重要な標的分析物に結合した金属ナノ構造を含む。サンドウィッチアッセイ方法と同様に、第２の検出コンジュゲートは、標的分析物に特異的に結合することが可能である。この種類のアッセイにおいて、第１の検出コンジュゲートは、最初は第２の検出コンジュゲートに結合するであろう。標的分析物を含有する試料が、これらの初期複合体と混合される場合、試料中の未標識または遊離標的分析物は、第２の検出コンジュゲートへの結合に関して、第１の検出コンジュゲートと競合するであろう。この種類のアッセイにおける光学シグナルの変化は、ピーク吸収波長において波長シフトを比例的に減少させるであろう第２の検出コンジュゲートからの第１の検出コンジュゲートにおける金属ナノ構造の置換に起因するであろう。
【００３０】
上記のとおり、本発明の方法は、複数の検出コンジュゲートを利用し得る。検出コンジュゲートは、アッセイ構成次第で、標的分析物または別の検出コンジュゲートに特異的に結合することが可能である結合パートナーに連結された金属ナノ構造を含む。例えば、方法が、サンドウィッチアッセイフォーマットで構成される実施形態において、検出コンジュゲートは、標的分析物に特異的に結合することが可能である結合パートナーに連結またはコンジュゲートされた金属ナノ構造を含む。方法が直接競合アッセイフォーマットで構成される他の実施形態において、検出コンジュゲートの少なくとも１つは、標的分析物に結合またはコンジュゲートされた金属ナノ構造を含む。代表的な実施形態において、第１の検出コンジュゲートおよび／または第２の検出コンジュゲート中の金属ナノ構造は、複合金属ナノ構造である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、検出コンジュゲートは、標的分析物に特異的に結合することが可能である結合パートナーを含む。本明細書で使用される場合、「特異的結合」とは、高い親和性、例えば、少なくとも１０−６Ｍの親和性による標的分子への結合を意味する。いくつかの実施形態において、結合パートナーは、ハプテンおよび他の小分子、薬剤、ホルモン、限定されないが、抗体またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、単鎖、ＣＤＲなど）、抗原、レセプター、リガンド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ポリペプチド、ポリサッカライド、リポポリサッカライド、グリコペプチド、リポタンパク質または核タンパク質を含む生体高分子である。特定の実施形態において、結合パートナーは抗体である。他の実施形態において、結合パートナーは抗原である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、検出コンジュゲート、例えば、第１の検出コンジュゲートおよび第２の検出コンジュゲートは、同種の分子であるが、好ましくは、互いに別個の位置で標的分析物と結合する、結合パートナーを含む。例として、第１の検出コンジュゲートおよび第２の検出コンジュゲートは、両方とも標的分析物を認識する抗体であることが可能であるが、第１の検出コンジュゲートが標的分析物と結合するエピトープは、第２の検出コンジュゲートが標的分析物と結合するエピトープとは別であり、かつ理想的にはオーバーラップしない。したがって、特定の実施形態において、第１の検出コンジュゲートは、標的分析物の第１のエピトープを識別する抗体を含み、かつ第２の検出コンジュゲートは、標的分析物の第２のエピトープを識別する異なる抗体を含む。本明細書に記載の種々の実施形態において、第１の検出コンジュゲートは、標的分析物の第１のエピトープを識別するモノクローナル抗体を含み得る。さらなる実施形態において、第２の検出コンジュゲートは、第１の検出コンジュゲートによって識別されるエピトープとは別であり、かつ理想的にはオーバーラップしない標的分析物の第２のエピトープを識別するモノクローナル抗体を含み得る。代替的に、第１の検出コンジュゲートおよび／または第２の検出コンジュゲートは、ポリクローナル抗体を含み得る。例えば、第２の検出コンジュゲートはモノクローナル抗体を含んでなるが、第１の検出コンジュゲートはポリクローナル抗体を含み得る。いくつかの実施形態において、第１の検出コンジュゲートはポリクローナル抗体を含み、かつ第２の検出コンジュゲートはポリクローナル抗体を含む。
【００３３】
検出コンジュゲート中の金属ナノ構造は、貴金属またはその複合体から構成されることが可能である。いくつかの実施形態において、検出コンジュゲート中の金属ナノ構造は、遷移金属またはその複合体から構成されてもよい。いくつかの実施形態において、検出コンジュゲート中の金属ナノ構造は、貴金属または遷移金属と組み合わせて、アルカリ金属またはランタニドを含み得る。特定の実施形態において、検出コンジュゲート中の金属ナノ構造は、金、銀、銅、白金、パラジウム、ルテニウム、ロジウム、オスミウム、イリジウム、チタン、クロム、カドミウム、亜鉛、鉄、コバルト、ニッケルおよびその複合体から選択される金属を含む。一実施形態において、金属ナノ構造は金ナノ構造である。別の実施形態において、金属ナノ構造は銀ナノ構造である。
【００３４】
好ましい実施形態において、検出コンジュゲート中の金属ナノ構造は、複合金属ナノ構造である。「複合金属ナノ構造」とは、少なくとも２種の貴金属、遷移金属、アルカリ金属またはランタニドを含むナノ構造を意味する。２種以上の金属は合金として一緒に混合されてもよく、または２種以上の金属はナノ構造の別個の部分において存在していてもよい。例えば、１種の金属はナノ構造のコアを形成してよく、第２の金属はナノ構造の外殻またはコーティングを形成する。いくつかの実施形態において、複合金属ナノ構造は、金、銀、銅、白金、パラジウム、ルテニウム、ロジウム、オスミウム、イリジウム、チタン、クロム、カドミウム、亜鉛、鉄、コバルトおよびニッケルから選択される少なくとも２種の金属を含む。他の実施形態において、複合金属ナノ構造は、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、鉄、ニッケルおよび亜鉛から選択される少なくとも２種の金属を含む。１つの特定の実施形態において、複合金属ナノ構造は、金および銀を含む。別の実施形態において、複合金属ナノ構造は、金および銅を含む。さらに別の実施形態において、複合金属ナノ構造は、銀および銅を含む。本発明の方法で使用される複合金属ナノ構造は、球形ナノ粒子、ピラミッド形ナノ粒子、六角形ナノ粒子、ナノチューブ、ナノスター、ナノシェル、ナノロッド、ナノドット、ナノアイランド、ナノワイヤー、ナノディスク、ナノキューブまたはそれらの組合せなどの多数の異なる幾何構造を含むことができる。代表的な実施形態において、複合金属ナノ構造は、ナノスターおよびナノロッドから選択される。
【００３５】
特定の実施形態において、本発明の方法で使用される複合金属ナノ構造は、第１の金属および第２の金属の合金である。いくつかの実施形態において、本発明の方法で使用される複合金属ナノ構造は、第１の金属のコアおよび第２の金属のコーティングを含む。特定の実施形態において、複合金属ナノ構造は、銀コアおよび金コーティングを含む。他の実施形態において、複合金属ナノ構造は、銅コアおよび金コーティングを含む。別の実施形態において、コアは銀であり、かつコーティングは銅である。いくつかの実施形態において、複合金属ナノ構造のそれぞれは、誘電体コア（例えば、二酸化ケイ素、硫化金、二酸化チタン、シリカおよびポリスチレン）、第１の金属の第１のコーティングおよび第２の金属の第２のコーティングを含む。検出方法の１つの特定の実施形態において、コアはシリカであり、第１のコーティング（すなわち、内部コーティング）は銀コーティングであり、第２のコーティングは金コーティング（すなわち、外部コーティング）である。別の実施形態において、コアはシリカであり、第１のコーティング（すなわち、内部コーティング）は銅コーティングであり、第２のコーティングは金コーティング（すなわち、外部コーティング）である。
【００３６】
いくつかの実施形態において、第２の金属によるコーティングプロセスに続いて、第１の金属を含むコアは溶解されて、第２の金属から構成される中空構造が作られる。例えば、金ナノ粒子による銀コアのコーティングによって、銀コアの周囲に金シェルが作成され、銀コアは、その後、溶解されるか、または分解され、中空ナノ金シェル構造が形成される。
【００３７】
金属ナノ構造には、球形ナノ粒子、ならびにナノプレートおよびナノシェルが含まれる。ナノプレートは、それらの厚さより大きい側面寸法（例えば、エッジ長さ）を有する。ナノプレートには、ナノディスク、ナノポリゴン、ナノヘキサゴン、ナノキューブ、ナノリング、ナノスターおよびナノプリズムが含まれる。いくつかの実施形態において、複合ナノ構造を含む金属ナノ構造は、球形ナノ粒子、ピラミッド形ナノ粒子、六角形ナノ粒子、ナノチューブ、ナノスター、ナノシェル、ナノロッド、ナノドット、ナノアイランド、ナノワイヤー、ナノディスク、ナノキューブまたはそれらの組合せから選択される幾何構造を有する。不規則形状を含めて、他の形状も可能である。特定の実施形態において、金属ナノ構造の径および形状は均一ではない、すなわち、金属ナノ構造は、異なる形状および径のナノ構造の不均一混合物である。代表的な実施形態において、金属ナノ構造は、ナノスターである。別の代表的な実施形態において、金属ナノ構造は、ナノロッドである。別の代表的な実施形態において、金属ナノ構造は、複合ナノ球体である。
【００３８】
球形ナノ粒子に関して、適切な直径範囲としては、約５ｎｍ〜約２００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍおよび約２０ｎｍ〜約６０ｎｍが含まれる。ナノロッドに関して、適切な直径範囲としては、約５ｎｍ〜約５０ｎｍ、約８ｎｍ〜約３０ｎｍおよび約１０ｎｍ〜約２５ｎｍが含まれる。さらに、ナノロッドに関して、適切な長さ範囲としては、約２５ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１２０ｎｍおよび約５０ｎｍ〜１００ｎｍが含まれる。いくつかの実施形態において、ナノロッドのアスペクト比、すなわち、長さ／直径は、２〜１０である。ナノプレートに関して、エッジ長さは、約１０ｎｍ〜約８００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約３０ｎｍ〜約１００ｎｍまたは約１０ｎｍ〜約３００ｎｍであってよい。ナノプレートの厚さは、約１〜約１００ｎｍ、約５ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍまたは約５ｎｍ〜約２０ｎｍの範囲であることが可能である。
【００３９】
いくつかの実施形態において、ナノプレートは、２より大きいアスペクト比を有する。アスペクト比は、厚さに対するエッジ長さの比率である。好ましくは、ナノプレートは、約２〜約２５、約３〜約２０、約５〜約１０、約２〜約１５または約１０〜約３０のアスペクト比を有する。
【００４０】
金属ナノ構造への分子のコンジュゲート方法は、当業者に既知である。そのような方法としては、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）、スルホ−ＮＨＳカップリング、疎水性結合またはチオエーテル化学が関与するものなどのコンジュゲーション化学が含まれる。いくつかの実施形態において、結合パートナーまたは標的分析物は、チオール、アミン、ジチオール、アクリルホスホラミダイト、アジドまたはアルキンを含む種々の化学官能性を介して金属ナノ構造に連結させることができる。いくつかの実施形態において、この分子は、より大きいキャリア分子またはタンパク質を介して間接的に金属ナノ構造に連結させることができる。そのような間接カップリングは、この分子が、ホルモン、薬剤、１０ｋＤ未満の他の小分子などのように小さい場合、特に有用である。好ましくは、キャリアタンパク質は、標的分析物との特異的な相互作用の能力を有さない。いくつかの実施形態において、プロテインＡまたはプロテインＧまたはプロテインＡ／Ｇがナノ粒子にコンジュゲートされるか、または連結されてもよい。
【００４１】
いくつかの実施形態において、第１の検出コンジュゲートにおいて利用される金属は、第２の検出コンジュゲートにおける金属ナノ構造が製造される金属と同一であることが可能である。例えば、一実施形態において、第１の検出コンジュゲートは、金ナノ構造を含み、かつ第２の検出コンジュゲートは、金ナノ構造を含む。他の実施形態において、第１の検出コンジュゲートにおいて利用される金属は、第２の検出コンジュゲートにおける金属ナノ構造を製造するために使用される金属と異なる。例えば、いくつかの実施形態において、第１の検出コンジュゲートは、銀ナノ構造を含み、かつ第２の検出コンジュゲートは、金ナノ構造を含む。他の実施形態において、第１の検出コンジュゲートは、金ナノ構造を含み、かつ第２の検出コンジュゲートは、銀ナノ構造を含む。ある特定の実施形態において、第１の検出コンジュゲートは、金ナノ構造を含み、かつ第２の検出コンジュゲートは、複合ナノ構造を含む。関連する実施形態において、複合ナノ構造は、金コーティング銀ナノ構造を含む。他の特定の実施形態において、第１の検出コンジュゲートは、金ナノ構造を含み、かつ第２の検出コンジュゲートは、金コーティング銅ナノ構造を含む複合ナノ構造を含む。さらに他の実施形態において、第１の検出コンジュゲートは、金ナノ構造を含み、かつ第２の検出コンジュゲートは、金コーティングマグネタイトナノ構造を含む複合ナノ構造を含む。さらに他の実施形態において、第１の検出コンジュゲートは、金ナノ構造を含み、かつ第２の検出コンジュゲートは、金およびアルカリ金属またはランタニドを含む複合ナノ構造を含む。
【００４２】
特定の実施形態において、第１の検出コンジュゲートを製造するために使用される金属ナノ構造の径は、第２の検出コンジュゲートにおいて使用される金属ナノ構造の径と類似する。そのような実施形態において、２組のナノ構造の径を合わせることによって、反射率、発光または散乱スペクトルにおける最適な波長シフトを提供することができる。
【００４３】
いくつかの実施形態において、反応環境は、適切な緩衝剤、イオン強度および他の促進剤によって調整され得る。好ましい実施形態において、反応環境は、本明細書に記載されるように、ＬＳＰＲシグナルの強度を増強することができるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。限定されないが、ポリビニルピロリドン、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコールおよびポリアスパラギン酸を含む他の類似のポリマー材料が使用されてもよい。
【００４４】
本発明は、試料中の標的分析物を検出するために、本明細書に記載の方法を利用するための分析物検出デバイスも提供する。適切な分析物検出デバイスとしては、限定されないが、分光光度法キュベット、分析用ローター、マイクロウェルプレートまたはフローチャンバーが含まれてよい。当業者によって理解されるように、光ファイバーの先端または透明ゲルも、本明細書に開示される検出方法を実行するために利用されてよい。
【００４５】
特定の実施形態において、本明細書に記載の分析物検出デバイスの全ての構成成分は、遠心ローターまたはディスクに含まれる。例えば、ローターまたはディスクは、複数の検出コンジュゲートが位置する１つまたはそれ以上の反応チャンバーを含有していてもよい。いくつかの実施形態において、検出コンジュゲートは、凍結乾燥されたビーズまたはペレットなどの凍結乾燥された組成物の形態で存在する。いくつかの実施形態において、分析物検出デバイスは、１つまたはそれ以上の反応チャンバーを含むローターまたはディスクを含み、それぞれの反応チャンバーは、複数の検出コンジュゲート（例えば、第１の検出コンジュゲートおよび第２の検出コンジュゲート）を含み、検出コンジュゲートは、金属ナノ粒子に連結されている。そのようなデバイスは、ワンステップ分析物検出アッセイを提供し、それによって、試験試料がローターまたはディスクと接触し、ローターまたはディスクへの遠心力の適用によって、反応チャンバーへと試験試料が送達され、そこで、試料は、第１の検出コンジュゲートおよび第２の検出コンジュゲートと混合される。ローターまたはディスクが２つ以上の反応チャンバーを含む実施形態において、検出コンジュゲートは、異なる分析物がそれぞれの反応チャンバーにおいて検出されることができるように選択することができる。これらのローターフォーマット検出デバイスは、サンドウィッチアッセイフォーマット、直接競合フォーマットで、またはローターが複数の反応チャンバーを含む場合は両方で構成されることが可能である。
【００４６】
本明細書に記載の金属ナノ構造の種類のいずれも、これらのローターフォーマット検出デバイスによって使用可能である。いくつかの実施形態において、第１の検出コンジュゲートは、金ナノ構造を含み、かつ第２の検出コンジュゲートにおける金属ナノ構造は、金ナノ構造である。他の実施形態において、第１の検出コンジュゲートは、銀ナノ構造を含み、かつ第２の検出コンジュゲートにおける金属ナノ構造は、金ナノ構造である。さらに他の実施形態において、第１の検出コンジュゲートは、金ナノ構造を含み、かつ第２の検出コンジュゲートは、複合ナノ構造を含む。例えば、一実施形態において、複合ナノ構造は、金コーティング銀ナノ構造である。別の実施形態において、複合ナノ構造は、金コーティング銅ナノ構造である。
【００４７】
本発明は、本明細書に開示される本発明の分析物検出デバイスを含むキットも含む。一実施形態において、キットは、複数の検出コンジュゲート（例えば、第１の検出コンジュゲートおよび第２の検出コンジュゲート）を含み、その中で検出コンジュゲートは、金属ナノ粒子に連結されている。いくつかの実施形態において、検出コンジュゲートの１つまたはそれ以上は、例えば、ペレットまたはビーズの形態で凍結乾燥されてもよい。一実施形態において、検出コンジュゲートの全てが凍結乾燥される。さらなる実施形態において、キットは、１種またはそれ以上の追加の試薬を含んでもよい。いくつかの実施形態において、１種またはそれ以上の追加の試薬は、凍結乾燥された形態で提供される。いくつかの実施形態において、キットは、ブロッキング剤、糖、ポリマー性促進材料、塩化ナトリウムおよび／またはそれらの組合せを含んでよい。「ブロッキング剤」は、検出可能な薬剤および／または分析物と、試料中に存在するタンパク質との会合を防ぐ薬剤である。ブロッキング剤は、典型的に、それら自体がタンパク質であり、それらとしては、限定されないが、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、オボアルブミン、ガンマグロブリンおよび非免疫動物からのＩｇＧが含まれうる。いくつかの実施形態において、糖はポリサッカライドである。一実施形態において、ポリサッカライドは、マルトデキストリン、コーンシロップおよびポリグルコースから選択される。好ましい実施形態において、ポリサッカライドはマルトデキストリンである。別の実施形態において、糖はトレハロースである。いくつかの実施形態において、試薬キットは、マルトデキストリンおよびトレハロースを含んでよい。いくつかの実施形態において、ポリマー性促進材料はＰＥＧである。
【００４８】
本発明のキットは、試験試料中の分析物を検出するためのデバイスを使用するための指示、生物学的試料を回収するためのデバイスまたはツール、ならびに／または土壌、食品および生物学的組織などの固体材料から試料を得るための抽出緩衝剤を含んでもよい。
【００４９】
本明細書に記載されるように、試験試料は、生物学的試料または環境もしくは食品試料から調製された抽出液を含む、いずれの種類の液体試料であることが可能である。１つの特定の実施形態において、試験試料は、生物学的試料である。生物学的試料としては、限定されないが、全血、血漿、血清、唾液、尿、胸水、汗、胆汁、脳脊髄液、糞便、腟液、精子、眼レンズ液、粘膜、滑液、腹水、羊水、生検組織、唾液および細胞溶解物が含まれる。生物学的試料は、がん、感染性疾患（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫または真菌感染）、心臓血管疾患、代謝疾患、自己免疫疾患などの疾患状態を有することが疑われるヒト対象または動物対象から得ることができる。生物学的試料は、定期健康診断を受けている健康な対象（例えば、ヒトまたは動物）から得ることもできる。
【００５０】
方法のいくつかの実施形態において、試験試料は、第１の検出コンジュゲートと混合され、混合物は、その後、第２の検出コンジュゲートと接触する。特定の実施形態において、試料、第１の検出コンジュゲートおよび第２の検出コンジュゲートは、同時に接触する。例えば、両試薬との試料の接触が、本明細書に記載のローターフォーマット検出デバイスにおいて同時に起こってよい。
【００５１】
上記のとおり、本出願は、定性的または定量的様式で特異的結合パートナーの結合を決定するための、溶液中の複合ナノ材料標識パートナーの使用に関する。本発明者らは、驚くべきことに、ポリサッカライド、例えば、マルトデキストリンが溶液に添加される場合、スクロース、トレハロースまたはｆｉｃｏｌｌなどの他の糖の添加と比較して、溶液ベースアッセイの感度が有意に増強されることを見出した。遠心ローターフォーマットにおいて、分析用チャンバー中に試料を送達するために、低速遠心分離が必要とされる。溶液へのポリサッカライド、例えば、マルトデキストリンの添加は、遠心分離間および後に、複合ナノ材料標識パートナー、例えば、金−銀ナノスターとコンジュゲートした抗体の凝集および沈降を防ぐことに特に有効である。スクロース、トレハロースまたはｆｉｃｏｌｌなどの他の糖と比べての感度の改善は予想外であった。凝集および沈降の減少によって、アッセイの感度増加が達成される。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ポリサッカライド、例えば、マルトデキストリン、コーンシロップまたはポリグルコースを含む溶液中で実行される。
【００５２】
一実施形態において、溶液は、約２％〜約２０％重量／体積の最終濃度でポリサッカライドを含む。別の実施形態において、溶液は、約４％〜約１５％重量／体積の最終濃度でポリサッカライドを含む。さらに別の実施形態において、溶液は、約５％〜約１０％重量／体積の最終濃度でポリサッカライドを含む。代表的な実施形態において、溶液は、それらの間の全ての値を含めて、約５％、６％、７％、８％、９％または１０％の最終濃度でポリサッカライドを含む。本明細書に記載の種々の実施形態において、アッセイの感度は、ポリサッカライドが溶液に添加される場合、別の糖、例えば、スクロースまたはｆｉｃｏｌｌを含む溶液中でアッセイが実行される場合と比較して、改善され得る。代表的な実施形態において、ポリサッカライドは、マルトデキストリンである。
【００５３】
一実施形態において、溶液は、約０．１％〜約２０％重量／体積の最終濃度でブロッキング剤を含む。別の実施形態において、溶液は、約０．５％〜約１０％重量／体積の最終濃度でブロッキング剤を含む。さらに別の実施形態において、溶液は、約１％〜約５％重量／体積の最終濃度でブロッキング剤を含む。代表的な実施形態において、溶液は、それらの間の全ての値を含めて、約１％、２％、３％、４％または５％の最終濃度でブロッキング剤を含む。本明細書に記載の種々の実施形態において、アッセイの感度は、ブロッキング剤が溶液に添加される場合、ブロッキング剤の不在下でアッセイが実行される場合と比較して、改善され得る。いくつかの実施形態において、ブロッキング剤は、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、オボアルブミンおよびガンマ−グロブリンから選択される。代表的な実施形態において、ブロッキング剤は、ウシ血清アルブミンである。
【００５４】
いくつかの実施形態において、溶液は、マルトデキストリン、トレハロース、ＰＥＧ、ブロッキング剤（例えばウシ血清アルブミン）および／または塩化ナトリウムの１種またはそれ以上を含む。代表的な実施形態において、溶液成分の１種またはそれ以上、例えば、マルトデキストリンは、液体、例えば、水、食塩溶液または液体試料の添加時に懸濁する凍結乾燥されたビーズまたはペレットとして提供されてもよい。例えば、溶液成分の１種またはそれ以上は、液体の添加後に溶液中で懸濁するビーズとして分光光度法キュベットまたは分析用ローターの反応チャンバー中に提供されてもよい。
【００５５】
追加の実施形態において、ＬＳＰＲシグナルは、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコールおよびポリアスパラギン酸から選択されるポリマー性促進材料の存在下で第１および第２の検出コンジュゲートを分析物と混合することによって、実質的に増加し得る。代表的な実施形態において、ポリマー材料は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。一実施形態において、反応混合物は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの最終濃度でポリマー材料、例えば、ＰＥＧを含む。別の実施形態において、反応混合物は、約０．２ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの最終濃度でポリマー材料、例えば、ＰＥＧを含む。さらに別の実施形態、反応混合物は、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度でポリマー材料、例えば、ＰＥＧを含む。さらに別の実施形態において、反応混合物は、約２ｍｇ／ｍＬ〜約８ｍｇ／ｍＬの最終濃度でポリマー材料、例えば、ＰＥＧを含む。代表的な実施形態において、反応混合物は、それらの間の全ての値を含めて、約２、３、４、５、６、７または８ｍｇ／ｍＬの最終濃度でポリマー材料、例えば、ＰＥＧを含む。
【００５６】
本発明の検出方法は、標的分析物の定性的または定量的な量を決定するために使用されてよい。そのような方法は、試料中の標的分析物のおよその量を決定するために特に有用であり、これは、特に、特定の医学的状態を診断するか、または薬物療法の有効性を評価するために使用することができる。一実施形態において、標的分析物の量は、既知量の標的分析物を有する試料に関して、本明細書に記載の金属ナノ粒子からの光学シグナルの変化を測定することによって、特定の分析物に対する標準曲線を確立すること；試験試料に関する光学シグナルの変化を決定すること；そして試験試料に関する光学シグナルの変化を、標準曲線に関して得られる値と比較することによって、決定することができる。いくつかの実施形態において、第１の試薬と第２の試薬との間の複合体の量を決定することは、試験試料からの吸光度比および／または反応速度と、既知量の複合体を有する一試料からの吸光度比および／または反応速度とを比較すること、それによって、試験試料中の複合体の量を決定することを含む。試験試料から得られた定量的な値は、標的分析物の異常または正常レベルのいずれかを示す、あらかじめ決定された閾値と比較されてもよい。
【００５７】
本発明の検出方法は、試料中の微量の標的分析物を検出するために非常に感度が高い技術を提供する。いくつかの実施形態において、プラズモン共鳴ベースのシグナルの増幅は、標的分析物のナノグラム量が試料中で検出されることができるように、金ナノ構造コンジュゲートによって達成することができる。したがって、この方法の一実施形態において、標的分析物のナノグラム量の存在が検出される。いくつかの実施形態において、金ナノ粒子を含む検出コンジュゲートからのプラズモン共鳴ベースのシグナルは、複合金属ナノ構造検出コンジュゲートを使用して増幅することができる。分析物に特異的な抗体にコンジュゲートされた金コーティング銀ナノ構造の使用によって、標的分析物のピコグラム量の検出が可能となり得る。したがって、この方法のいくつかの実施形態において、標的分析物のピコグラム量の存在が検出される。方法の他の実施形態において、標的分析物のフェムトグラム量の存在が検出される。複合金属ナノ構造の組成および／または形状を変更することによって、より高い感度が得られうる。
【００５８】
入射光が金属ナノ構造に適用される場合、金属中の伝導帯電子は、入射電磁波の同一周波数において集合的に振動する。これらの共鳴振動の結果として、ナノ構造は、特定の波長範囲において強く光を吸収し、散乱する。貴金属または遷移金属を含む金属ナノ構造に関して、この波長範囲は、ナノ構造の特定の組成に依存して、紫外−可視−赤外スペクトルにある。したがって、本発明の方法での使用に適切な電磁エネルギーを適用するための光源としては、アークランプおよびレーザーを含めて、紫外−可視スペクトルまたは紫外−可視−赤外スペクトル内の波長範囲を適用し得るいずれの光源も含むことができる。いくつかの実施形態において、光の特定の波長が適用されるように、光源にモノクロメータが備えられてもよい。
【００５９】
金属ナノ構造の光学的特性は、それらの径、形状および組成に依存する。例えば、固体金ナノ粒子は、粒径に依存して、約５１５ｎｍ〜約５６０ｎｍの吸収ピーク波長（λｍａｘ）を有する。３０ｎｍの直径を有する金球形ナノ粒子は、約５２０ｎｍにおいて最大吸収を有するが、λｍａｘは、粒子直径が増加するほど、より長い波長にシフトする。銀および銅粒子は、紫外／青色または赤色領域（例えば、約３５０ｎｍ〜約５００ｎｍ）においてλｍａｘを有するが、粒子直径が増加すると、λｍａｘは、より長い波長にシフトする。金属ナノロッドは、横方向λｍａｘ１および縦方向λｍａｘ２を有する。異なる金属の合金は、典型的に、含まれる金属の吸収ピーク間の中間範囲において吸収ピークを示す。例えば、金および銀の５０／５０合金を含むナノ構造は、約４８０ｎｍのλｍａｘを示すが、金の量が増加すると、吸収ピークは、より長い波長にシフトする。局在媒体屈折率における変化に対するＬＳＰＲシグナルの感度は、ナノ構造の形状または幾何構造を変化させることによって調節することができる。例えば、ナノ球体粒子（例えば、ナノプリズム、ナノロッド、ナノシェルなど）では、球体と比較して、増加したＬＳＰＲ感度を有する。いくつかの実施形態において、光学的特性（例えば、特定の波長における吸収／散乱）は、検出コンジュゲートで利用される金属ナノ構造の径、形状または組成を変化させることによって、特定の用途のために調整される。
【００６０】
入射光および金属ナノ構造の間の相互作用は、反射光または透過光として監視することができる。吸収または散乱される入射光の量は、反射モードでの吸収スペクトルまたは透過モードでの吸収スペクトルとして測定することができる。いくつかの実施形態において、金属ナノ構造から測定される光学シグナルは、光学反射、吸光度スペクトル、散乱スペクトルおよび／または発光スペクトルであることが可能である。
【００６１】
結合パートナーと標的分析物との間での複合体形成から得られる検出コンジュゲートにおける金属ナノ構造間のプラズモンカップリングは、金属ナノ構造の局在表面プラズモン共鳴スペクトルの変化を生じる。例えば、そのような変化としては、光学的吸光の増加、光学的反射の増加ならびに／または散乱および／もしくは発光シグナルの増加を含むことができる。いくつかの実施形態において、試料中の標的分析物の存在を示す光学シグナルにおける変化としては、シフト、光学的散乱の増加または減少、あるいはこれらの特徴の組合せが含まれる。特定の実施形態において、試料中の標的分析物の存在を示す光学シグナルの変化は、スペクトルピーク波長シフトである。特定の他の実施形態において、試料中の標的分析物の存在を示す光学シグナルの変化は、ピーク以外の位置での波長シフトである。例えば、試料中の標的分析物の存在を示す光学シグナルの変化は、中点スペクトル波長シフト、波長ベースでのスペクトル波長シフト、または差スペクトルなどの全スペクトル波長シフトであり得る。一実施形態において、光学スペクトルピークにおける波長シフトは、２００ｎｍ〜１２００ｎｍのスペクトル窓領域内での赤色シフト（例えば、より長波長へのシフト）であり得る。別の実施形態において、光学スペクトルピークにおける波長シフトは、２００ｎｍ〜１２００ｎｍのスペクトル窓領域内での青色シフト（例えば、より短波長へのシフト）であり得る。光学シグナルの変化は、設定反応時間後の特定の時点で測定することができる。さらに、あるいは代わりに、反応期間（例えば、速度決定）の光学シグナルの変化が測定されてもよい。両種類の測定を、標的分析物の定性または定量分析に使用することができる。
【００６２】
異なる波長において光学シグナルを測定し、吸光、散乱また発光スペクトルを得るための様々な手段は、当該技術において知られている。いずれの分光光度または光度測定計器も、開示された方法における使用に適切である。いくつかの非限定的な例としては、プレートリーダー、Ｃｏｂａｓ  ＦａｒａアナライザーおよびＰｉｃｃｏｌｏ  ｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ならびにＶｅｔｓｃａｎアナライザー（Ａｂａｘｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、光ファイバーリーダー（例えば、ＬｉｇｈｔＰａｔｈ（商標）Ｓ４（ＬａｍｄａＧｅｎ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ））、ＳＰＲ計器（例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能なＢｉａｃｏｒｅ計器）、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｈｉｔａｃｈｉなどからの遠心アナライザーが含まれる。
【００６３】
本発明は、（ｉ）結合パートナーに連結された金属ナノ構造を含む第１の検出コンジュゲート、（ｉｉ）標的分析物、および（ｉｉｉ）結合パートナーに連結された金属ナノ構造を含む第２の検出コンジュゲートを含み、第１の検出コンジュゲートの結合パートナーが、標的分析物上の第１のエピトープに結合し、そして第２の検出コンジュゲートの結合パートナーが、標的分析物上の第２のエピトープに結合し、それによって、第１の検出コンジュゲート、標的分析物および第２の検出コンジュゲートを含む複合体が形成される、アッセイ複合体も含む。いくつかの実施形態において、アッセイ複合体は、遠心ローターでの使用に適合されるキュベットに含まれる。他の実施形態において、アッセイ複合体は、遠心ローターまたはディスク中の反応チャンバー内に含まれる。
【００６４】
いずれの種類の標的分析物も、本発明の方法、デバイスおよびアッセイ複合体、特に疾患の診断で重要なものを使用して検出することができる。標的分析物としては、限定されないが、タンパク質、酵素、抗原、抗体、ペプチド、核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、ホルモン、糖タンパク質、ポリサッカライド、毒素、ウイルス、ウイルス粒子、薬物分子、ハプテンまたは化学物質を含むことができる。いくつかの実施形態において、標的分析物は、ヒトおよび／または動物における感染症と関連するマーカーまたは抗原である。他の実施形態で、標的分析物は、特定の生理学的状態または病理学的状態と関連するマーカーまたは抗原である。
【００６５】
特定の実施形態において、標的分析物は、病原性抗原または病原性抗原への抗体である。例えば、病原性抗原は、ウイルス性抗原（例えば、ネコ白血病ウイルス、イヌパルボウイルス、口蹄疫ウイルス、インフルエンザウイルス、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＩＶウイルス、ヒトパピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルス、狂犬病ウイルスなど）、細菌性抗原（例えば、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）など）、真菌性抗原、または寄生虫性抗原（例えば、イヌ糸状虫、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）、熱帯熱マラリア原虫、アフリカトリパノソーマ症、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）など）であることが可能である。特定の実施形態において、細菌性抗原は、エーリキア・カニス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ）、エーリキア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｅｅｎｓｉｓ）、エーリキア・エウィンギイ（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｅｗｉｎｇｉｉ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、アナプラズマ・プラティス（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｌａｔｙｓ）、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）およびリケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）であり得る。他の実施形態において、標的分析物は、疾患関連抗原または疾患関連抗原への抗体である。疾患関連抗原としては、限定されないが、がん関連抗原またはマーカー（例えば、ＰＳＡ、ＡＦＰ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＵＣ１、ＧＭ３、ＧＤ２、ＥＲＢＢ２など）、心臓血管疾患関連抗原またはマーカー（例えば、トロポニン、Ｃ−反応性タンパク質、脳ナトリウム利尿ペプチド、ＣＫＭＢ、脂肪酸結合タンパク質など）、代謝関連抗原またはマーカー（例えば、甲状腺刺激ホルモン、チロキシン、レプチン、インスリン）、あるいは自己免疫疾患関連抗原またはマーカー（例えば、自己抗体）が含まれる。特定の実施形態において、標的分析物は、炎症抗原またはマーカー（例えば、Ｃ−反応性タンパク質、ＭＲＰ１４、ＭＲＰ８、２５Ｆ９など）である。他の実施形態において、標的分析物は、妊娠関連抗原またはマーカー（例えば、胎児抗原、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン）である。
【００６６】
本発明は、複合金属ナノ構造を調製する方法も提供する。一実施形態において、この方法は、ポリマーおよび塩化金酸の混合物を含む第１の溶液を調製すること、銀および銅ナノ構造を含む第２の溶液を調製すること、ならびに一定期間、第１の溶液を第２の溶液と一緒にインキュベーションすることを含み、得られる混合物は、金コーティング銀ナノ構造または金コーティング銅ナノ構造を含む。得られる混合物は、好ましくは、約５１５ｎｍ〜約６７０ｎｍまたは約５２０ｎｍ〜約５６０ｎｍのピーク吸光度を有する。一実施形態において、得られる混合物は、約５３０ｎｍ〜約５４５ｎｍのピーク吸光度を有する。別の実施形態において、この方法は、ＣＨＡＰＳなどの清浄剤および塩化金酸の混合物、ならびに銀または銅塩を含む溶液を含む第１の溶液を調製すること、ならびに第１の溶液を、アスコルビン酸などの還元剤を含有する第２の溶液と一緒にインキュベーションして、複合ナノ構造の形成を誘導することを含む。ナノ構造の径および形状は、使用される金属の比率、清浄剤の濃度、ならびに最終的に使用されるアスコルビン酸の量を変更することによって変動可能である。
【００６７】
第１の溶液の調製において使用されるポリマーは、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリレート、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、種々のガム、ゼラチンまたは上記のいずれかを含む混合ポリマーのいずれか１つであることが可能である。１つの特定の実施形態において、ポリマーは、ポリビニルピロリドンである。ポリマーの分子量を変化させることによって、種々の種類のコーティングナノ構造を得ることができる。ポリマーの適切な分子量の範囲には、約５，０００ダルトン〜約１５０，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン〜約１００，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン〜約８０，０００ダルトンが含まれる。いくつかの実施形態において、ポリマーは、５０，０００ダルトン未満の分子量を有する。他の実施形態において、ポリマーは、２０，０００ダルトン未満の分子量を有する。ある特定の実施形態において、ポリマーは、約１０，０００ダルトンの分子量を有する。
【００６８】
金コーティングの特徴は、ポリマー：塩化金酸の濃度比を調整することによって制御することができる。例えば、ポリマー：塩化金酸の濃度比は、約１００：１〜約１：１００、約２：１〜約５：１、または約１．５：１〜約８：１である。いくつかの実施形態において、ポリマー：塩化金酸の濃度比は１：１である。ポリマーの適切な濃度としては、限定されないが、水またはエタノール中約０．１％〜約２０％ｗｔ／ｗｔが含まれる。塩化金酸の適切な濃度としては、限定されないが、約０．００１Ｍ〜約１．０Ｍ、約０．０１０Ｍ〜約０．５００Ｍおよび約０．０５０Ｍ〜約０．１００Ｍが含まれる。
【００６９】
コーティング効率および厚さは、コーティング溶液（すなわち、第１の溶液）のｐＨおよびハロゲン化物含有量によっても影響を受ける可能性がある。特定の実施形態において、溶液のｐＨは、約３〜約１４の範囲に保持される。溶液のハロゲン化物含有量は、いくつかの実施形態において、１５０ｍＭ未満である。他の実施形態において、溶液のハロゲン化物含有量は、約０〜約５０ｍＭの範囲にある。
【００７０】
銀および銅ナノ構造の溶液を調製する方法は、当業者に知られている。例えば、銀または銅ナノ構造を含む第２の溶液は、それぞれ、参照によって全体的に本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／０１０１００７号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０１０５９８２号明細書または米国特許出願公開第２０１３／０２３０７１７号明細書に記載の方法のいずれかによって調製することができる。一実施形態において、銀または銅ナノ構造を含む第２の溶液は、銀または銅供給源を還元剤と混合することによって調製される。適切な銀供給源としては、硝酸銀などの銀塩が含まれる。適切な銅供給源としては、硫酸銅（ＩＩ）、塩化銅（ＩＩ）、水酸化銅（ＩＩ）および硝酸銅（ＩＩ）、酢酸銅（ＩＩ）、ならびにトリフルオロ酢酸銅（ＩＩ）が含まれる。銀または銅供給源と反応してナノ構造を形成することができる還元剤としては、グルコース、アスコルビン酸、水素化ホウ素ナトリウムおよびＰＶＰなどのポリマーのアルカリ性溶液（例えば、ｐＨ７．５より高いもの）を含むことができる。特定の実施形態において、還元剤はアスコルビン酸である。銀ナノ構造または銅ナノ構造の所望の形状および光学スペクトルピークは、当業者に既知であるように反応物の比率または濃度を調整することによって達成することができる。例としてのみであるが、高濃度の還元剤によって、五角形および両すい形ナノ構造をもたらすことができるのに対して、低濃度の還元剤によって、細長いナノワイヤーまたはチューブをもたらすことができる。ナノ構造の特定の形状次第で、銀または銅ナノ構造を含む第２の溶液は、約５４０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約６００ｎｍ〜約７００ｎｍ、約６３０ｎｍ〜約６８０ｎｍ、約７５０ｎｍ〜約８５０ｎｍ、約９００ｎｍ〜約９４０ｎｍ、約５８０ｎｍ〜約６２０ｎｍまたは約５５０ｎｍ〜約７５０ｎｍのピーク吸光度を有し得る。特定の実施形態において、銀ナノ構造を含む第２の溶液は、約６００ｎｍ（すなわち、５９５ｎｍ〜６０５ｎｍ、両端の値を含む）のピーク吸光度を有する。いくつかの実施形態において、銅ナノ構造を含む第２の溶液は、約５８５ｎｍ（すなわち、５８０ｎｍ〜５９０ｎｍ、両端の値を含む）のピーク吸光度を有する。いくつかの実施形態において、銅ナノ構造を含む溶液のピーク吸光度は、同様の径および形状の銀ナノ構造を含む溶液のピーク吸光度より高い（すなわち、赤色シフト）。
【００７１】
いくつかの実施形態において、第２の溶液との第１の溶液のインキュベーション時間は、少なくとも１２時間である。他の実施形態において、第２の溶液との第１の溶液のインキュベーション時間は、２４時間より長く、好ましくは４８時間より長く、より好ましくは少なくとも７２時間である。反応混合物のピーク吸光度の変化は、それに応じてインキュベーション時間を調整するために、インキュベーション期間中に監視することができる。例えば、ピーク吸光度のより短波長、例えば、５２０ｎｍ〜５５０ｎｍ領域へのシフトは、金コーティングナノ構造が安定したことを示すことができる。特定の実施形態において、得られたナノ構造の塩化ナトリウム（例えば、０．２５〜１Ｍ）への安定性は、ナノ構造の適切なコーティングを示すために使用される。ナノロッドなどのＣＴＡＢコーティング粒子は、塩化ナトリウムに対して耐性がある。
【００７２】
特定の実施形態において、本発明は、約５０／ｍＬより高い光学密度を有するナノ構造の合成方法を提供する。一実施形態において、この方法は、本明細書に記載のポリマーと塩化金酸とを混合すること、第１の期間、設定温度で混合物を撹拌すること、混合物にアスコルビン酸を添加すること、第２の期間、混合物をインキュベーションすることを含む。ナノ構造の径および形状は、ポリマー対塩化金酸の濃度比ならびにインキュベーションの温度および時間によって規定される。ポリマーおよび塩化金酸の濃度は、上記の範囲にあることが可能である。温度は、所望のナノ構造の径および形状に基づいて調整することができるが、約４℃〜約１００℃の範囲にあってよい。同様に、インキュベーション期間（すなわち、第１の期間）は、ナノ構造の所望の特性に基づいて調整することができるが、約１５分〜１日の範囲にあってよい。
【００７３】
いくつかの実施形態において、第１のインキュベーション期間後、約０．１〜１部（例えば、約１〜５Ｍ）のアスコルビン酸を混合物に添加する。アスコルビン酸の添加後の第２のインキュベーション期間は、約１〜約２４時間であってよい。理論によって拘束されないが、アスコルビン酸の添加によって、製造されるナノ構造の量の実質的な増加がもたらされる。
【００７４】
特定の実施形態において、この方法は、約１〜約１００部の塩化金（例えば、約０．００１Ｍ〜１Ｍ）または硝酸銀（例えば、約０．００１Ｍ〜１Ｍ）または他の金属（例えば、貴金属、遷移金属、アルカリ金属もしくはランタニド）を混合物に加えるまたはドープすることをさらに含む。このドーピングステップによって、得られるナノ構造の共鳴強度をさらに増加させることができる。いくつかの実施形態において、塩化金、硝酸銀または他の金属は、アスコルビン酸が反応に添加される前に混合物に添加される。他の実施形態において、塩化金、硝酸銀または他の金属は、アスコルビン酸の添加の後に混合物に添加される。金属およびアスコルビン酸の添加の順番は、得られるナノ構造を所望の形状および径に調整するために調整されてもよい。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本開示は、複合ナノ粒子の合成方法を提供する。特定の実施形態において、銀／金ナノ粒子は、単一容器中で、連続的に、かつ強力に混合しながら、次の試薬のあらかじめ決められた量を添加することによって合成される：（１）界面活性剤（例えば、イオン性［アニオン性、カチオン性もしくは両性イオン性］または非イオン性）、あるいはキャッピング剤、例えば、３−（（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ）−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎもしくはいずれかのスルホベタイン清浄剤、（２）塩化金、（３）水、（４）硝酸銀、（５）クエン酸三ナトリウムおよび最終的に（６）アスコルビン酸がナノ粒子の形成を開始するために添加される。他の実施形態において、ナノ粒子は、単一容器中で、次のあらかじめ決められた量を次の順番で添加することによって合成される：（１）界面活性剤またはキャッピング剤、例えば、ＣＨＡＰＳ、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、ＣＴＡＢもしくはいずれかのスルホベタイン清浄剤、（２）塩化金、（３）硝酸銀、（４）クエン酸三ナトリウム、（５）水および（６）還元体。いくつかの実施形態において、還元体は、ＣＨＡＰＳ、アスコルビン酸、クエン酸三ナトリウムおよび水から構成される。さらなる実施形態において、還元体は、約２００ｍｇのＣＨＡＰＳ、約４ｇのアスコルビン酸、約１１７．６ｍｇのクエン酸三ナトリウムおよび約１５．６８ｇの水から構成される。いくつかの実施形態において、約１ｍＬの１％（ｗｔ／ｗｔ）ＣＨＡＰＳ水溶液を、連続的に、約０．２５ｍＬの０．１Ｍ塩化金、約０．５ｍＬの０．０２Ｍ硝酸銀、約０．０５ｍＬの１Ｍクエン酸三ナトリウム、約６．２ｍＬの水および約２ｍＬの還元体と混合する。金属塩、キャッピング剤、還元体などの種々の活性成分の濃度ならびに溶液のｐＨを変化させることによって、異なる粒子の種類（例えば、ナノ球体、ナノスターまたはナノロッド）およびナノ粒子の異なる組成物がもたらされる。
【００７６】
いくつかの実施形態において、ナノスターは、順番に、水、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化金、アスコルビン酸および予め形成された金ナノ球体シードを混合することによって形成される。さらなる実施形態において、約０．８２５ｍＬの水、約０．１ｍＬの２０％ＣＴＡＢ、約０．０２５ｍＬの０．１Ｍ塩化金、約０．０５ｍＬの１Ｍアスコルビン酸および約０．０５ｍＬの金ナノ球体シードが、その順序で混合される。シードの古さ（ａｇｅ）およびシード対金属イオンの比率は、ナノ粒子の幾何構造、したがって、光学スペクトルに影響を与える。
【００７７】
本明細書に提供される方法を使用するナノ材料の形成は、本質的に数分以内に完了するが、一晩かけて平衡に到達させてもよい。ナノ粒子の合成は分光法によって監視することができ、走査または透過電子顕微鏡法によって確認することができる。
【００７８】
いくつかの実施形態において、径、したがって、光学的特性は、界面活性剤またはキャッピング剤、アスコルビン酸、クエン酸三ナトリウム、塩化金および／または硝酸銀の濃度を変更することによって変更することができる。合成されたナノスターの径は、銀含有量が増加すると特定の点まで増加するが、次いで減少する。これらの変化は、銀／金の比率の増加時にピークが赤色シフトするが、次いで、金：銀モル比５：２において青色シフトが開始し、合成されたナノスターのＬＳＰＲピークにおいて反映される。反応混合物中の選択された清浄剤の最終濃度は、０．０５〜５％で変動可能であり、清浄剤の濃度がより高いほど、より小さい粒子が優位を占める。アスコルビン酸の濃度を増加させることによって、より小さいナノスターが製造され、アスコルビン酸の最終濃度は０．０５〜０．２Ｍまで変動する。同様に、クエン酸三ナトリウムの濃度を１０ｍＭから１００ｍＭまで増加させることによって、ナノスターの径が減少する。
【００７９】
いくつかの実施形態において、金−銀ナノ合金は、ＣＴＡＢ（例えば、アルコールに溶解されたＣＴＡＢ）を塩化金および硝酸銀と混合することによって、アルカリ還元条件下で合成され得る。いくつかの実施形態において、ナノ合金の形成は、順番に、水、ＣＴＡＢ、塩化金（０．５ｍＭ〜５ｍＭ）、硝酸銀（金の２０％〜８０％）、アスコルビン酸（１０ｍＭ〜２００ｍＭ）またはアスコルビン酸、クエン酸三ナトリウムおよびＣＨＡＰＳを含有する還元体、ならびにＮａＯＨ（アスコルビン酸の５０％〜２００％）を混合することによって誘導され得る。さらなる実施形態において、ナノ合金は、約０．８２５ｍｌの水、イソプロパノール中で調製された約０．１ｍｌの２０％ＣＴＡＢ、約０．０２５ｍｌの０．１Ｍ塩化金、約０．００５〜０．０２５ｍｌの０．１Ｍ硝酸銀、約０．０５ｍｌの１Ｍアスコルビン酸および約０．０５ｍｌの１Ｍ  ＮａＯＨを混合することによって形成される。ＣＴＡＢの濃度は、０．０５Ｍから０．２Ｍまで様々であることが可能であるが、より低い濃度であるほど、合成されたナノスターのより高い含有量に有利に作用する。酸性ｐＨは、ナノロッドの形成に有利に作用し、ｐＨの減少によって、より高いアスペクト比が得られる。
【００８０】
本発明は、限定するものとして解釈されるべきでない次の追加の実施例によって、さらに例証される。当業者は、本開示を考慮に入れて、開示される特定の実施形態に多くの変更が実施されてよいことを理解し、それによって、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、なお同様または類似の結果を得ることができることを認識する。
【００８１】
本開示を通して参照された全ての特許および非特許文献は、全ての目的に関して、参照によって全体的に本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００８２】
実施例１．ＬＳＰＲシグナルの増幅を利用する直接アッセイ
本実施例において、ブランク反応は、抗糸状虫ポリクローナル抗体のコロイドコンジュゲートを含有する溶液、リン酸緩衝塩水などの適切な分散媒体および糸状虫抗原を欠く試料を添加することによって構成される。スペクトル変化を一定期間にわたって記録する。次いで、陽性対照の組は、上記ブランク溶液で使用される反応溶液に既知量の糸状虫抗原を添加することによって構成される。あるいは、ブランク反応を記録し、次いで、既知量の糸状虫抗原を添加して、スペクトル走査におけるシフトを抗原の濃度と関連づける較正曲線を調製する。次いで、この較正曲線を使用して、未知試料中の糸状虫抗原の量を計算する。スペクトル走査におけるシフトとは、（ｉ）λｍａｘにおける変化、（２）陽性および陰性試料間の差スペクトル、または（３）微分スペクトルを意味する。
【００８３】
実施例２．ＬＳＰＲシグナルの増幅を利用するサンドウィッチアッセイ
サンドウィッチアッセイは、分析物が、特異的結合パートナーにそれぞれの部位が結合する、少なくとも２つの別個の結合部位（抗原のエピトープ）を示す場合に、最も適切である。したがって、本実施例において、ＣＲＰの１つのエピトープに対する抗体が、金および／または銀ナノ粒子上に固定され、非オーバーラップエピトープに対する第２の抗体が、コロイド金および／または銀で標識化される。試料中のＣＲＰ抗原の量がスペクトル変化の範囲を決定するため、この構成によってＣＲＰ抗原の測定が可能となる。第２の抗体が標識化されないが、スペクトル変化が数桁低い場合も、スペクトル変化が観察される。ナノ粒子の金属組成は、反応条件を最適化するように変化されてもよい。
【００８４】
実施例３．ローター中でのアッセイ実行
直接競合アッセイまたはサンドウィッチアッセイは、米国特許第５，０６１，３８１号明細書、同第５，１２２，２８４号明細書、同第５，１８６，８４４号明細書、同第５，３０４，３４８号明細書、同第５，４５７，０５３号明細書および同第５，６９３，２３３号明細書に記載されるローターなどの遠心ローター中で実行されてもよい。この場合、対となる２つのモノクローナル抗体または２つ以上のエピトープに結合するポリクローナル抗体混合物のナノ粒子コンジュゲートは、凍結乾燥されたビーズとして添加される。溶液相ＬＳＰＲアッセイは、モノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方で機能する。
【００８５】
実施例４．ポリエチレングリコールまたは類似ポリマーによるＬＳＰＲシグナルの増強
図４および図９Ａ〜９Ｃに表されたデータは、ＬＳＰＲシグナルが、ポリエチレングリコールの存在下で実質的に増加することを示す。異なる分子量を有するＰＥＧは、所与のアッセイにおいて所望の選択性を得るために、最適化された濃度で使用されてよい。所与のナノ粒子の組合せおよび／または特異的結合パートナーの組合せに関して最適化された反応条件を得るために、ＰＥＧは、ポリビニルピロリドンまたは類似ポリマー材料で置換されてよい。
【００８６】
実施例５．マルトデキストリンの添加によるアッセイ感度の改善
沈降作用を最小化し、ＬＳＰＲシグナルを維持する種々の糖および他の薬剤の影響を決定するために、複数の実験を実行した。図１６に示されるように、マルトデキストリンは驚くべきことにシグナルを上昇させ、これはＢＳＡの存在によってさらに改善された。対照的に、トレハロース、ソルビトールまたはシクロデキストリンが添加された場合、ＬＳＰＲシグナルの強度はそれほど強くはなかった（データは示していない）。加えて、マルトデキストリンおよびＢＳＡの添加によって、沈降の問題も解決された（図１７）。約５０ｐｇ／ｍｌのＴＳＨが、特定の量のＰＥＧ、ＢＳＡおよびマルトデキストリンを用いて検出可能であった（図１８）。
【００８７】
実施例６．金ナノスターおよび金−銀合金粒子の合成ならびにその使用
本明細書に記載の溶液相プラズモンアッセイなどのプラズモンアッセイで使用するためのナノ材料を合成するために、新規方法が利用された。
【００８８】
ＣＨＡＰＳコーティングナノスターまたはＣＴＡＢコーティングナノスターは、次の方法を使用して調製した。ＣＨＡＰＳコーティングナノスターに関しては、適切な容器中で、１ｍｌの１％（重量／重量）ＣＨＡＰＳ（３−（（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ）−１−プロパンスルホネート）水溶液を調製した。０．２５ｍｌの０．１Ｍ塩化金、０．５ｍｌの０．０２Ｍ硝酸銀、０．０５ｍｌの１Ｍクエン酸三ナトリウム、６．２ｍｌの水および最終的に２ｍｌの還元体（２００ｍｇのＣＨＡＰＳ、４ｇのアスコルビン酸、１１７．６ｍｇのクエン酸三ナトリウム、１５．６８ｇの水）を、連続的に容器中で撹拌し、そして少なくとも１時間、十分に混合した。水中で１：２０まで希釈後、光学スペクトルを読んだ。いくつかの実施形態において、径、したがって、光学特性は、ＣＨＡＰＳ、アスコルビン酸、クエン酸三ナトリウム、塩化金および硝酸銀の濃度を変化させることによって変更することができる。
【００８９】
ＣＴＡＢコーティングナノスターに関しては、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を２０％（ｗｔ／ｗｔ）の濃度でイソプロパノール中に溶解した。他の全ての試薬は水性であった。ナノスターの形成は、０．８２５ｍｌの水、０．１ｍｌの２０％ＣＴＡＢ、０．０２５ｍｌの０．１Ｍ塩化金、０．０５ｍｌの１Ｍアスコルビン酸および最終的に０．０５ｍｌの予め形成された金ナノ球体シードを順番に混合することによって誘導された。いくつかの実施形態において、径、したがって、光学特性は、成分の濃度を変えることによって変更することができる。ナノロッドをシーディングするために新しいシードが使用される場合、３０℃において、ＣＴＡＢの水溶液からナノロッドが製造された。イソプロパノール中で調製されたＣＴＡＢ溶液は、室温で使用することが可能であるが、ナノロッドよりもナノスターの合成に有利に作用する。
【００９０】
金−銀ナノ合金は、イソプロパノール中に溶解されたＣＴＡＢを塩化金および硝酸銀と混合することによって、アルカリ還元条件下で合成された。ナノ合金の形成は、水（合計１ｍｌの反応体積を与える）、０．２ｍｌの２０％ＣＴＡＢ（イソプロパノール中）、０．０２５ｍｌの０．１Ｍ塩化金、０〜０．０５ｍｌの０．０２Ｍ硝酸銀、アスコルビン酸、ＣＨＡＰＳおよびクエン酸三ナトリウムを含有する０．０２ｍｌの還元体、ならびに最終的に０．０５ｍｌの１Ｍ  ＮａＯＨを順番に混合することによって誘導された。いくつかの実施形態において、還元体は、ＣＨＡＰＳ、クエン酸三ナトリウムおよびアスコルビン酸を含有する。酸性ｐＨは、シードの古さに依存するが、ナノスターおよびナノロッドの製造に有利に作用する。
【００９１】
硝酸銀の添加と、それに続く、アスコルビン酸、そして最終的に、水酸化ナトリウムの添加の前に、塩化金をＣＴＡＢと反応させることによって合成された金／銀合金ナノ粒子の光学スペクトルを図１０に提供する。図１１で示されるように、ナノ合金粒子中の銀含有量が増加すると、λｍａｘにおける線形青色シフトが得られ、ナノ合金粒子中の金含有量が増加すると、赤色シフトが得られる。
【００９２】
ＣＨＡＰＳでキャップされた金／銀ナノスターを調製するために、硝酸銀およびクエン酸三ナトリウムの添加の前に塩化金をＣＨＡＰＳに添加した。ナノスターの形成は、アスコルビン酸、ＣＨＡＰＳおよびクエン酸三ナトリウムを含有する還元溶液の添加によって誘導された。ＣＨＡＰＳでキャップされた金／銀ナノスターの光学スペクトルを図１３に示す。λｍａｘは、特定の銀濃度まで赤色シフトし、次いで、その後、青色シフトした。したがって、反応媒体中の金対銀の比率を変化させることによって、異なる径のナノスターが製造された。
【００９３】
次の方法を使用して、抗体をナノスターまたはナノ合金に付加した。適切な体積のナノスターまたはナノ合金溶液を、適切なｇ力で遠心分離した。上清を慎重に除去し、等体積の１％ＣＨＡＰＳで置き換えた。水中で１：２０に希釈し、λｍａｘにおけるスペクトルおよびＯＤを読んだ。２ｍｌのマイクロチューブ中、水、０．５Ｍボレート（ｐＨ９．２）、１％のＣＨＡＰＳ、ステップ１からの洗浄ナノスター／ナノ合金および所望の抗体を、その順番で添加した。ＣＨＡＰＳの最終濃度が０．１％であり、ボレートが０．０５〜０．１Ｍであり、粒子ＯＤが１ｍｌあたり２であり、かつ抗体濃度が１〜１０μｇ／ＯＤであるように、溶液の量は調整された。５〜１０分のインキュベーション後、等体積のコンジュゲート希釈剤ＣＧ（３ｘＰＢＳ、１％のＢＳＡ、２％のＣＨＡＰＳおよび０．１％のアジ化ナトリウム）を添加して、十分に混合した後、１０分間、５０００ｇにおいて遠心分離し、上清を除去し、コンジュゲートを、最初の体積まで、コンジュゲート希釈剤ＣＧ中で再び懸濁させた。遠心分離ステップを１回繰り返し、そして最終ペレットを、コンジュゲート希釈剤ＣＧの最初の体積の１／５で再び懸濁させた。１：１０希釈のＯＤスペクトルを読んだ。この時点で、コンジュゲートは、イムノアッセイでの治療または使用に使用可能である。文献で知られるように、抗体は、抗体をナノ粒子の希釈溶液に添加することによって、合成されたままのナノ粒子に付加される。
【００９４】
図１２は、金および金／銀（５０％／５０％等モル）合金ナノ粒子によるマウスＩｇＧコンジュゲートの免疫反応性を示す。金または合金粒子上へのマウスＩｇＧの受動的吸着によって合成されたコンジュゲートは、側方流動ニトロセルロースストリップにおいてストリップされたプロテインＡとの反応性に関して試験された。
【００９５】
金／銀ナノスターは、銀の不在下で製造された金のみのナノ粒子と比較して、マウスＩｇＧの結合時に赤色へのより大きいピークシフトを示した。金のみのナノ粒子へのマウスＩｇＧの結合時の赤色へのピークシフトは図１４に示され、約３７．５％の銀の存在下で製造された金／銀ナノスターへのマウスＩｇＧの結合時の赤色へのより大きいピークシフトは図１５に示される。
【００９６】
いくつかの実施形態において、遠心分離条件、イオン強度、ｐＨおよび抗体対ナノ材料比は、それぞれの種類の抗体−ナノ材料の組合せに関して最適化されてよい。共有結合を使用するコンジュゲーションのための別の方法は、当業者に周知である。
【００９７】
開示された発明は、変更可能である記載された特定の方法論、プロトコルおよび材料に限定されないことは理解される。また、本明細書で使用された専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのためであり、かつ添付の請求の範囲によってのみ限定されるであろう本発明の範囲を制限するように意図されないことも理解される。
【００９８】
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を認識するか、またはルーチンな実験を使用して確認することができるであろう。そのような同等物は、次の請求の範囲によって包括されるように意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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