(57)【要約】  植物においてロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)を産生する方法が提供される。方法は、宿主または宿主細胞、例えば植物、植物の一部または植物細胞内で、第一、第二および第三ヌクレオチド配列に操作可能に結合した１以上の制御領域(制御領域は宿主または宿主細胞で活性である)を含む１以上の核酸を発現させることを含む。第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列および第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列。該第一、第二および第三は、ロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４およびＶＰ２またはＶＰ６およびＶＰ４またはＶＰ７をコードする。宿主または宿主細胞を、ＮＳＰ４およびＶＰ２またはＶＰ６およびＶＰ４またはＶＰ７が発現され、それによりＲＬＰが産生されるように、核酸の発現を可能にする条件下、インキュベートする。ＲＬＰを含む宿主、ＲＬＰを含む組成物および組成物を使用する方法も提供される。
2018504119.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主または宿主細胞においてロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)を産生する方法であって、
ａ)第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列および第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む１以上の核酸を含む宿主または宿主細胞を提供し、該第一、第二および第三ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードし、該第二ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードし、該第三ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ７またはＶＰ４の一方をコードし；
ｂ)該宿主または宿主細胞を、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７またはＶＰ４の各々が発現され、それにより、ＲＬＰが産生されるように、１以上の核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートする
ことを含む、
方法。
【請求項２】
１以上の核酸がさらに第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列を含み、該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
第一ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードし、第二ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードし、第三および第四ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４またはＶＰ７をコードし、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ２、ＶＰ４およびＶＰ７の２個の各々は、１以上の核酸から発現される、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１以上の核酸がさらに第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列を含み、該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列は、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４の一つをコードし、ここで、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の各々は１以上の核酸から発現される、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
１以上の核酸が該第一、第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質をコードする該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列を含む１核酸を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１以上の核酸が、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸および第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列を含む第二核酸の２核酸を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
１以上の核酸が、第一および第二ロタウイルスタンパク質をコードする第一および第二ヌクレオチド配列を含む第一核酸および第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第三、第四および第五ヌクレオチド配列を含む第二核酸の２核酸を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
１以上の核酸が第一および第二ロタウイルスタンパク質をコードする第一および第二ヌクレオチド配列を含む第一核酸、第三および第四ロタウイルスタンパク質をコードする第三および第四ヌクレオチド配列を含む第二核酸および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列を含む第三核酸の３核酸を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
１以上の核酸が第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第二核酸および第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第三、第四および第五ヌクレオチド配列を含む第三核酸の３核酸を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
１以上の核酸が第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第二核酸、第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む第三核酸および第四および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第四および第五ヌクレオチド配列を含む第四核酸の４核酸を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
１以上の核酸が第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第二核酸、第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む第三核酸、第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列を含む第四核酸および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列を含む第五核酸の５核酸を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
宿主または宿主細胞が昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物、植物の一部または植物細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
宿主または宿主細胞が植物、植物の一部または植物細胞からなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
植物がベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１以上のヌクレオチド配列が１以上の発現エンハンサーに操作可能に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
発現エンハンサーがＣＰＭＶ  ＨＴ、ＣＰＭＶ  １６０、ＣＰＭＶ  １６０＋およびＣＰＭＶ  ＨＴ＋からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
さらに
ｃ)宿主または宿主細胞を採取し、そして
ｄ)宿主または宿主細胞からＲＬＰを精製する
工程を含み、ここで、ＲＬＰは、７０〜１００nmのサイズの範囲である、
請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１７】
ａ)宿主または宿主細胞に第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列および第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む１以上の核酸を導入し、該第一、第二および第三ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードし、該第二ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードし、該第三ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ７またはＶＰ４の一方をコードし；
ｂ)宿主または宿主細胞を、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７またはＶＰ４の各々が発現され、それにより、ＲＬＰが産生されるように、１以上の核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートする
ことを含む、宿主または宿主細胞においてロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)を産生する方法。
【請求項１８】
１以上の核酸がさらに第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列を含み、該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
第一ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードし、第二ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードし、第三および第四ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４またはＶＰ７をコードし、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ２、ＶＰ４およびＶＰ７の２個の各々は、１以上の核酸から発現される、
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
１以上の核酸がさらに第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列を含み、該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列は、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４の一つをコードし、ここで、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の各々は１以上の核酸から発現される、
請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
導入の工程(工程ａ)において、１以上の核酸が２核酸
ｉ)第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸および第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列を含む第二核酸；または
ii)第一および第二ロタウイルスタンパク質をコードする第一および第二ヌクレオチド配列を含む第一核酸および第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第三、第四および第五ヌクレオチド配列を含む第二核酸を含み、
宿主または宿主細胞に導入された第一核酸の量対第二核酸の量の比率が１：０.８〜１：２である、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第一ロタウイルスタンパク質がＮＳＰ４であり、第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質がＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該比率が１：１である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
導入の工程(工程ａ)において、１以上の核酸が３核酸
ｉ)第一および第二ロタウイルスタンパク質をコードする第一および第二ヌクレオチド配列、第三および第四ロタウイルスタンパク質をコードする第三および第四ヌクレオチド配列を含む第二核酸および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列を含む第三核酸または
ii)第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第二核酸および第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第三、第四および第五ヌクレオチド配列を含む第三核酸を含み、
宿主または宿主細胞に導入された第一核酸の量対第二核酸の量および第三核の量の比が１：１：１である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
導入の工程(工程ａ)において、１以上の核酸が、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第二核酸、第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む第三核酸および第四および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第四および第五ヌクレオチド配列を含む第四核酸の４核酸を含み、宿主または宿主細胞に導入される第一核酸の量対第二核酸の量、第三核酸の量および第四核酸の量の比が１：１：１：１である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
導入の工程(工程ａ)において、１以上の核酸が、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第二核酸、第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む第三核酸、第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列を含む第四核酸および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列を含む第五核酸の５核酸を含み、宿主または宿主細胞に導入される第一核酸の量対第二核酸の量、第三核酸の量、第四核酸の量および第五核酸の量の比が１：１：１：１：１である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
請求項３または１９に記載の方法により産生されたＲＬＰであって、ＲＬＰがロタウイルスタンパク質を含む三層ＲＬＰであり、ロタウイルスタンパク質がＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７からなる、ＲＬＰ。
【請求項２７】
対象における免疫応答の誘導のための有効用量の請求項２６に記載のＲＬＰおよび薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項２８】
対象に請求項２７に記載の組成物を投与することを含む、対象にロタウイルス感染に対する免疫を誘発する方法。
【請求項２９】
組成物を対象に経口、皮内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内または皮下で投与する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１、２または３に記載の方法により産生されたＲＬＰを含む植物。
【請求項３１】
請求項１７、１８または１９に記載の方法により産生された、ＲＬＰを含む植物。
【請求項３２】
ロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)におけるＶＰ４、ＶＰ７またはＶＰ４およびＶＰ７両者の取り込みを増加する方法であって、
ａ)第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列および第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む１以上の核酸を含む宿主または宿主細胞を提供し、該第一、第二および第三ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードし、該第二ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードし、該第三ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ７またはＶＰ４の一方をコードし；
ｂ)該宿主または宿主細胞を、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７またはＶＰ４の各々が発現され、それにより、ＮＳＰ４を含まない１以上の核酸を発現する第二宿主または宿主細胞により、同じ条件下で産生されたＶＰ４またはＶＰ７のレベルと比較したとき、ＶＰ４、ＶＰ７またはＶＰ４およびＶＰ７両者のレベルが増強されたＲＬＰが産生されるように、１以上の核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートする
ことを含む、方法。
【請求項３３】
ロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)におけるＶＰ４、ＶＰ７またはＶＰ４およびＶＰ７両者の取り込みを増加する方法であって、
ａ)宿主または宿主細胞に第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列および第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む１以上の核酸を導入し、該第一、第二および第三ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードし、該第二ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードし、該第三ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ７またはＶＰ４の一方をコードし；
ｂ)該宿主または宿主細胞を、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７またはＶＰ４の各々が発現され、それにより、ＮＳＰ４を含まない１以上の核酸を発現する第二宿主または宿主細胞により、同じ条件下で産生されたＶＰ４またはＶＰ７のレベルと比較したとき、ＶＰ４、ＶＰ７またはＶＰ４およびＶＰ７両者のレベルが増強されたＲＬＰが産生されるように、１以上の核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートする
ことを含む、方法。
【請求項３４】
１以上の核酸がさらに第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列を含み、該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードし、該第二ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードし、該第三および第四ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４またはＶＰ７をコードし、ここで、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ２、ＶＰ４およびＶＰ７の２個の各々は、１以上の核酸から発現される、
請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
１以上の核酸がさらに第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列を含み、該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列は、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４の一つをコードし、ここで、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の各々は１以上の核酸から発現される、
請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３６】
さらに
ｃ)宿主または宿主細胞を採取し、
ｄ)宿主または宿主細胞からＲＬＰを精製する
工程を含み、ここで、ＲＬＰは、７０〜１００nmのサイズの範囲である、
請求項３２、３３、３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物、植物の一部または植物細胞において産生されたロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)の表面におけるＶＰ４、ＶＰ７またはＶＰ４およびＶＰ７両者の取り込みを増加させるための、ＮＳＰ４の使用。
【請求項３８】
ロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)におけるＶＰ４、ＶＰ７またはＶＰ４およびＶＰ７両者の取り込みを増加する方法であって、
ａ)第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列、第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列および第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列を含む１以上の核酸を含む宿主または宿主細胞を提供し；該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列は、ロタウイルスタンパク質ＶＰ７、ＶＰ４、ＮＳＰ４およびＶＰ２の一つまたはＶＰ６をコードし；
ｂ)ＶＰ７、ＶＰ４、ＮＳＰ４およびＶＰ２またはＶＰ６の各々が発現され、それにより同じ条件下で、ＮＳＰ４を含まない１以上の核酸を発現する第二宿主または宿主細胞により産生されたＶＰ４またはＶＰ７のレベルと比較したとき、ＶＰ４、ＶＰ７またはＶＰ４およびＶＰ７両者の増強されたレベルを有するＲＬＰを産生するように１以上の核酸の発現を可能にする条件下で宿主または宿主細胞をインキュベートする
ことを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、植物中でのロタウイルス様粒子の産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ロタウイルス感染は、主として５歳未満の小児を冒す世界的な問題である。これは重篤な胃腸炎を起こし、最悪の場合死に至る。
【０００３】
ロタウイルスは、消化器系および呼吸器を冒すウイルスのレオウイルス科(ロタウイルス属)のメンバーである。この名称はネガティブコントラスト電子顕微鏡で観察したときのビリオンの車輪様の外観に由来する。ロタウイルスは通常球状であり、その外殻および内殻または二重殻カプシド構造に因んで名づけられた。それぞれ直径で、外側カプシドは約７０nmであり、内側カプシドは約５５nmである。ロタウイルスの二重殻カプシドは、内側タンパク質殻およびゲノムを含むコアを囲む。ロタウイルスのゲノムは、少なくとも１１個のロタウイルスタンパク質(ウイルス構造タンパク質(ＶＰ)または非構造タンパク質(ＮＳＰ；Desselberger, Virus Res 190: 75-96 (2014)))をコードする二本鎖ＲＮＡセグメントからなる。
【０００４】
ｄｓＲＮＡは、６個の構造タンパク質(ＶＰ)および６個の非構造タンパク質(ＮＳＰ)をコードする。構造タンパク質はＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７を含む。３同心円層は、ＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ７のそれぞれならびにウイルス構造の表面に“スパイク”を形成するＶＰ４の組立(Assembly)により形成される。ＶＰ４はトリプシンによりＶＰ８'およびＶＰ５'へと開裂される。ＶＰ８'およびＶＰ５'は、ＶＰ４のタンパク分解産物である。
【０００５】
ＶＰ２は１０２kDaタンパク質であり、ウイルスコアで最も豊富なタンパク質である。これは最も内側の構造タンパク質層を形成し、ウイルスコアの成分および転写酵素の正確な組立のための足場を形成する(Lawton, 2000)。ＶＰ１は、１２５kDaの最大ウイルスタンパク質であり、ロタウイルスのためのＲＮＡ依存性ポリメラーゼとして作用し、コア複製中間体を形成し、その正二十面体頂上でＶＰ２と結合する(Varani and Allain, 2002; Vende et al., 2002)。ＶＰ３は、９８kDaタンパク質であり、またウイルスゲノムと直接結合し、ウイルスｍＲＮＡに５'キャップ構造を付加するｍＲＮＡキャッピング酵素として作用する。まとめると、ＶＰ１およびＶＰ３は、ＶＰ２カプシド層の外側５角頂点に結合する複合体を形成する(Angel, 2007)。ＶＰ６は、ウイルスコアの中間殻を形成する４２kDaタンパク質であり、主要なカプシドタンパク質であり、ビリオンの総タンパク質質量に占める割合は５０％を超える(Gonzalez et al., 2004; Estes, 1996)。これは遺伝子転写に必須であり、レオウイルス科の他のメンバーであるブルータングウイルスで見られるように、コアにおいてＶＰ１をＶＰ２に固着させることによりロタウイルスＲＮＡの被包に役割を有し得る。これはまたロタウイルスの５群(Ａ〜Ｅ)の分類を決定し、Ａ群が最も一般的にヒトを冒す(Palombo, 1999)。ロタウイルスＡ群のＶＰ６は、少なくとも４個のサブグループ(ＳＧ)を有し、これはＳＧ特異的エピトープであるＳＧ  Ｉ、ＳＧ  II、ＳＧ(Ｉ＋II)およびＳＧ非(Ｉ＋II)の存在または非存在に依存する。Ｂ群およびＣ群は共通Ａ群抗原を欠くがヒトに感染することも知られており、一方Ｄ群は動物、例えばニワトリおよびウシにしか影響しない(Thongprachum, 2010)。
【０００６】
２個の外側カプシドタンパク質は、３７kDa糖タンパク質ＶＰ７(Ｇ)および８７kDaプロテアーゼ感受性ＶＰ４(Ｐ)であり、ウイルスの血清型を決定する。これら２個のタンパク質は中和抗体応答を誘発し、それゆえにロタウイルス血清型をＧ−Ｐ抗原組み合わせによる二重命名法(例えばＧ１  Ｐ[８]またはＧ２  Ｐ[４])で分類するために使用される(Sanchez-Padilla et al., 2009, Rahman et al., J Clin Microbiol 41: 2088-2095 (2003))。ＶＰ４タンパク質は二量体化してウイルスの外殻に６０個のスパイクを形成し、これは宿主細胞侵入の初期段階に直接関与する。スパイクタンパク質は、アミノ酸(ａａ)位置２４８に開裂部位を含む。感染すると、これはプロテアーゼトリプシンにより開裂されて、ＶＰ５(５２９ａａ、６０kDa)およびＶＰ８(２４６ａａ、２８kDa)を生じる(Denisova et al., 1999)。この過程はウイルス感染力(細胞付着および宿主細胞への侵襲)を高め、スパイク構造を安定化させる(Glass, 2006)。ＶＰ７糖タンパク質はウイルスの第三のまたは外部層を形成する。現在まで、２７種のＧおよび３５種のＰ遺伝子型が知られている(Greenberg and Estes, 2009)。ＶＰ４およびＶＰ７はウイルス中和に関与する主要抗原であり、ワクチン開発の重要な標的である(Dennehy, 2007)。
【０００７】
非構造タンパク質(ＮＳＰ)は、感染細胞で合成され、複製サイクルの種々の部分で機能するかまたは宿主タンパク質のいくつかと相互作用し、感染の病因または免疫応答に影響を与える(Greenberg and Estes, 2009)。ロタウイルス非構造タンパク質、ＮＳＰ４は、小胞体(ＥＲ；Tian et al, 1995)からのカルシウムの遊離；ＥＲ膜の崩壊およびウイルス形態形成中の出芽粒子からの一過性外被の除去における重要な役割(図１参照)；微小管に結合する能力によるＥＲからゴルジ複合体への膜輸送への影響(Xu et al 2000)；およびサブウイルス粒子のＥＲへの出芽を助けるための細胞内受容体としての機能(Tian et al 1996)を含む複数の機能を有することが示されている。
【０００８】
感染した哺乳動物細胞において、ロタウイルスは独特な形態形成モードを経て、完全三層ＶＰ２／６／４／７ウイルス粒子を形成する(Lopez et al., 2005)。三層カプシドは極めて安定な複合体であり、それによりウイルスの糞−口腔経由の小腸送達を可能にし、そこで絨毛の先端付近で非分裂分化型腸細胞に感染する(Greenberg and Estes, 2009)。第一に、無傷ウイルスは、ウイルス表面上の６０個のＶＰ４二量体スパイクを介してシアル酸非依存性受容体に結合する(Lundgren and Svensson, 2001)。ウイルス表面上の６０個のＶＰ４二量体スパイクは、ウイルスがこれらの細胞受容体に結合することを可能とする。ＶＰ４はトリプシンによるタンパク質切断に感受性であり、これは立体構造変化をもたらし、一連の共受容体との相互作用のために糖タンパク質の表面上にさらなる付着部位を露出させる。
【０００９】
しかしながら、ウイルスが宿主の原形質膜を通って送達される以外、多段階付着および侵入過程は明確には理解されていない。また侵入過程に関与するＶＰ７外側カプシド殻は、本過程中で除去され、二層粒子(ＤＬＰ)が小胞内の細胞質に送達される(図１；先行文献)。ＤＬＰは小胞から出て、非膜結合細胞質封入体に入る。ＶＰ１によるゲノムの初期転写は、ｄｓＲＮＡが細胞質に決して露出されないように粒子内で開始する。ＲＮＡ複製およびコア形成がこれらの非膜結合細胞質封入体内で起こる。新生(＋)ＲＮＡは続いて細胞質に運搬され、ウイルスタンパク質合成の鋳型として役立つ。ＶＰ４はサイトゾルで産生され、粗面小胞体(ＲＥＲ)に運搬され、ＶＰ７はＲＥＲに分泌される。サイトゾル内でＶＰ２およびＶＰ６が産生され、ビロソーム中で組立られ、続いてＲＥＲ区画に出芽し、その過程で一過性膜外被を受ける(Lopez et al., 2005; Tian et al., 1996)。ＲＥＲにおいて、ウイルス粒子の一過性外被は除去され、ＶＰ４およびＶＰ７タンパク質単量体に置き換わり、ロタウイルス糖タンパク質ＮＳＰ４の重大な関与を伴う(Tian et al., 1996; Lopez et al., 2005; Gonzalez et al., 2000)。ＮＳＰ４はＥＲ膜における細胞内受容体として機能し、新たに製造されたサブウイルス粒子およびおそらくまたスパイクタンパク質ＶＰ４と結合する(Tian et al., 1996)。ＮＳＰ４はまたヒトに毒性であり、下痢の原因因子である。完全な、成熟粒子はその後分泌のためにＲＥＲからゴルジ体を通って原形質膜に輸送される(Lopez et al., 2005)。
【００１０】
ヒト集団を多様な血清型のロタウイルスから保護するのに適するロタウイルスワクチンを産生するために、多種多様な試みが成されている。これらの試みは、種々のジェンナー式方法、免疫原としての生存弱毒化ウイルスの使用、ウイルス様粒子、核酸ワクチンおよびウイルスサブユニットの使用を含む。現在のところ、２種の経口ワクチンが上市されているが、しかしながら、系統変動のために有効性が低い。
【００１１】
米国特許４,６２４,８５０号、４,６３６,３８５号、４,７０４,２７５号、４,７５１,０８０号、４,９２７,６２８号、５,４７４,７７３号および５,６９５,７６７号は、各々、多様なロタウイルスワクチンおよび／またはこれらのワクチンの製造法を記載しており、ここで、ウイルス粒子全体が、ロタウイルスワクチンの各々の創成に使用される。
【００１２】
ロタウイルス様粒子の産生は、１以上の組み換えタンパク質の合成および組立が必要であるため、困難な課題である。ロタウイルスは、４種の異なるタンパク質の１８６０単量体により形成されたカプシドを含む。ＲＬＰ産生のために、２〜３の組み換えタンパク質の同時発現および組立が必要であり得る。例えば、二層または三層粒子を形成するための、ＶＰ２の１２０分子を含む内層、ＶＰ６の７８０分子(中層)および糖タンパク質ＶＰ７の７８０分子および６０  ＶＰ４二量体の外層(Libersou et al. J. of Virology, Mar. 2008)。
【００１３】
Crawford et al.(J Virol. 1994 September; 68(9): 5945-5952)は、バキュロウイルス発現系におけるＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７の発現を記載する。ロタウイルス主要構造タンパク質の種々の組み合わせの同時発現は、安定なウイルス様粒子(ＶＬＰ)の形成をもたらした。ＶＰ２とＶＰ６のみまたはＶＰ４を伴う同時発現は、二層ロタウイルス粒子に類似したＶＰ２／６ＶＬＰまたはＶＰ２／４／６ＶＬＰの産生をもたらした。ＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ７のＶＰ４を伴うまたは伴わない同時発現は、三層ＶＰ２／６／７ＶＬＰまたはＶＰ２／４／６／７ＶＬＰを産生し、これは天然感染性ロタウイルス粒子に類似した。ＶＬＰは、粒子の電子顕微鏡試験で天然粒子の構造特性および機能特性である、ＶＰ４およびＶＰ７上の非中和および中和エピトープ存在およびＶＰ２／４／６／７ＶＬＰの血球凝集活性を維持した。
【００１４】
種々のタンパク質組成のロタウイルス様粒子から産生されたワクチン候補は、サブユニットワクチンとしての可能性が示されている。O'Neal et al.(J. Virology, 1997, 71(11):8707-8717)は、ＶＰ２とＶＰ６またはＶＰ２、ＶＰ６とＶＰ７を含むＶＬＰを産生し、免疫化マウスに、コレラ毒素誘発を防御免疫と共にまたは伴わずにマウスに投与した。コア様粒子(ＣＬＰ)およびＶＬＰはまたウシの免疫化にも使用されており、受動免疫の誘発に、ＶＬＰがＣＬＰより有効である(Fernandez, et al., (Vaccine, 1998, 16(5):507-516))。
【００１５】
組み換えタンパク質の大規模産生のための植物の使用は増えている。例えばＵＳ２００３／０１７５３０３号は、安定にトランスフォームされたトマト植物における、組み換えロタウイルス構造タンパク質ＶＰ６、ＶＰ２、ＶＰ４またはＶＰ７の発現を記載する。
【００１６】
Saldana et al.(Viral Immunol. 19: 42-53 (2006))は、ＶＰ２およびＶＰ６をトマト植物の細胞質で発現させた。電子顕微鏡試験は、タンパク質のごく一部が２／６  ＶＬＰに組立られたことを示した。保護的免疫応答がマウスで検出されており、これは、ある程度、非組立ＶＰによる貢献であり得る。個々のタンパク質は、ＶＰ８およびＶＰ６の場合におけるように、免疫応答を誘発することが示されている(Rodriguez-Diaz et al. Biotechnol Lett. 2011, 33(6):1169-75, Zhou et al., Vaccine 28: 6021-6027 (2010))。
【００１７】
Matsumura et al.(Archives of Virology 147: 1263-1270 (2002))は、トランスジェニックジャガイモ植物におけるウシロタウイルスＡ  ＶＰ６発現を報告した。ＶＰ６は、発現され、精製され、そして免疫原性試験が実施された。成熟マウスにおける免疫応答は、血清中のＶＰ６抗体の存在を示した。しかしながら、組立られたＶＰ６タンパク質の証拠は提供されなかった。ＶＰ６の単量体または三量体が免疫応答の惹起を担うためであり得る。O'Brien et al.(2000, Virol. 270: 10444-10453)は、ジャガイモウイルスＸ(ＰＶＸ)ベクターを使用する、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)におけるＶＰ６組立を示す。正二十面体ＶＬＰへのＶＰ６タンパク質の組立は、ＶＰ６がＰＶＸタンパク質ロッドに融合したときのみ観察された。開裂後、ＶＰ６は正二十面体ＶＬＰに組立られた。
【００１８】
コドン最適化ヒトロタウイルスＶＰ６は、ビートブラックスコーチウイルス(ＢＢＳＶ)介在発現系を使用して、アカザ(Chenopodium amaranticolor)での発現に成功している。タンパク質は、ＢＢＳＶのコートタンパク質の置き換えとして設計された。植物ベースのＶＰ６タンパク質での雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの経口免疫化は、高力価の抗ＶＰ６粘膜ＩｇＡおよび血清ＩｇＧを誘発した(Zhou et al., Vaccine 28: 6021-6027 (2010))。しかしながら、ＶＰ６タンパク質がＶＬＰまたは粒子に組立られたとの教示はない。
【００１９】
ロタウイルスＶＰ７はジャガイモ植物で発現されており、マウスで中和免疫応答を生じることが示された(Yu and Langridge, 2001 Nature Biotechnol 19: 548-552)。トランスジェニックジャガイモ植物において、ＶＰ７遺伝子は、５０世代にわたり安定であり、５０番目の世代からのＶＰ７タンパク質は、成熟マウスで保護的および中和性両者の抗体を産生した(Li et al., 2006, Virol 356:171-178)。
【００２０】
Yang et al.(Yang Y M, Li X, Yang H, et al. Science China Life Science 54: 82-89 (2011))は、タバコ植物でＡ群ＲＶ(Ｐ[８]Ｇ１)の３ロタウイルスカプシドタンパク質ＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ７を共発現させ、これらのタンパク質の発現レベルならびにロタウイルス様粒子の形成および免疫原性を試験した。ＶＬＰはトランスジェニックタバコ植物から精製され、電子顕微鏡およびウェスタンブロットで分析された。これらの結果は、植物由来ＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ７タンパク質が、６０〜８０nm直径の２／６または２／６／７ロタウイルス様粒子に自己凝集することを示す。
【００２１】
ＷＯ２０１３／１６６６０９号は、植物中でロタウイルス構造タンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７を共発現させ、得られたＲＬＰをカルシウム存在下精製することによる、植物中でのロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)の産生を記載した。
【００２２】
ロタウイルスＮＳＰ４は、昆虫細胞(Tian et al. 1996, Arch Virol. 1996; Rodriguez-Diaz et al. Protein Expr. Purif. 2003)および大腸菌(Sharif et al. Medical Journal of the Islamic Republic of Iran 2003)から発現および精製されている。ＮＳＰ４はまた、ジャガイモにおいてコレラ毒素Ｂ(ＣＴＢ)サブユニットとの融合タンパク質５としても発現されている(Arakawa et al., Plant Cell Report 20 : 343-348 (2001))。
【発明の概要】
【００２３】
発明の要約
本発明は、植物中でのロタウイルス様粒子の産生に関する。
【００２４】
植物中でロタウイルス様粒子を産生するのが本発明の目的である。
【００２５】
植物、植物の一部または植物細胞中でロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)を産生するいくつかの方法を記載する。
【００２６】
例えば、宿主または宿主細胞においてロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)を産生する方法(Ａ)は
ａ)第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列および第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む１以上の核酸を含む宿主または宿主細胞を提供し、該第一、第二および第三ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードし、該第二ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードし、該第三ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ７またはＶＰ４の一方をコードし；
ｂ)該宿主または宿主細胞を、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７またはＶＰ４の各々が発現され、それにより、ＲＬＰが産生されるように、１以上の核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートする
ことを含み得る。
【００２７】
上記方法(Ａ)において、１以上の核酸は第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列をさらに含んでよく、該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードし、該第二ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードし、該第三および第四ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４またはＶＰ７をコードし、ここで、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ２、ＶＰ４およびＶＰ７の２個の各々は、１以上の核酸から発現される。
【００２８】
宿主または宿主細胞においてロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)を産生する方法(Ｂ)がさらに記載され、該方法は
ａ)第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列および第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む１以上の核酸を含む宿主または宿主細胞を提供し、該第一、第二および第三ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一、第二および第三ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４、ＶＰ６の一つおよびロタウイルスタンパク質ＶＰ７またはＶＰ４の一つをコードし；
ｂ)該宿主または宿主細胞を、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７またはＶＰ４の各々が発現され、それにより、ＲＬＰが産生されるように、１以上の核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートする
ことを含み得る。
【００２９】
上記方法(Ｂ)において、１以上の核酸は第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列をさらに含んでよく、該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４、ＶＰ６の一つおよびロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ７またはＶＰ４の二つをコードし、ここで、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ２、ＶＰ７またはＶＰ４の二つの各々は１以上の核酸から発現される。
【００３０】
上記方法(Ａ)および(Ｂ)において、１以上の核酸は第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列をさらに含んでよく、該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列は、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４の一つをコードし、ここで、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の各々は１以上の核酸から発現される。
【００３１】
上記方法(Ａ)または(Ｂ)において、１以上の核酸が第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列、第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列、第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列を含み、該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列が、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されている宿主または宿主細胞が提供されるならば、１以上の核酸は、該第一、第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質をコードする該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列を含んでよく、または１以上の核酸は、例えば２核酸、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸および第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列を含む第二核酸を含んでよく、または１以上の核酸は、例えば２核酸、第一および第二ロタウイルスタンパク質をコードする第一および第二ヌクレオチド配列を含む第一核酸および第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第三、第四および第五ヌクレオチド配列を含む第二核酸を含んでよく、または１以上の核酸は、例えば３核酸、第一および第二ロタウイルスタンパク質をコードする第一および第二ヌクレオチド配列を含む第一核酸、第三および第四ロタウイルスタンパク質をコードする第三および第四ヌクレオチド配列を含む第二核酸および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列を含む第三核酸を含んでよく、または１以上の核酸は、例えば３核酸、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第二核酸および第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第三、第四および第五ヌクレオチド配列を含む第三核酸を含んでよく、または１以上の核酸は、例えば４核酸、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第二核酸、第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む第三核酸および第四および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第四および第五ヌクレオチド配列を含む第四核酸を含んでよく、または１以上の核酸は、例えば５核酸、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第二核酸、第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む第三核酸、第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列を含む第四核酸および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列を含む第五核酸を含んでよい。
【００３２】
上記方法(Ａ)または(Ｂ)は、さらに
ｃ)宿主または宿主細胞を採取し、そして
ｄ)宿主または宿主細胞からＲＬＰを精製する
工程をさらに含んでよく、ここで、ＲＬＰは、７０〜１００nmのサイズの範囲である。
【００３３】
上記方法(Ａ)または(Ｂ)の１以上のヌクレオチド配列は、１以上の発現エンハンサーに操作可能に結合され得る。さらに、発現エンハンサーは、ＣＰＭＶ  ＨＴ、ＣＰＭＶ  １６０、ＣＰＭＶ  １６０＋およびＣＰＭＶ  ＨＴ＋からなる群から選択され得る。
【００３４】
ａ)宿主または宿主細胞に第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列および第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む１以上の核酸を導入し、該第一、第二および第三ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードし、該第二ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードし、該第三ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ７またはＶＰ４の一方をコードし；
ｂ)宿主または宿主細胞を、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７またはＶＰ４の各々が発現され、それにより、ＲＬＰが産生されるように、１以上の核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートする
ことを含む、宿主または宿主細胞においてロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)を産生する方法(Ｃ)も記載する。
【００３５】
上記方法(Ｃ)において、１以上の核酸は第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列をさらに含んでよく、該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードし、該第二ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードし、該第三および第四ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４またはＶＰ７をコードし、ここで、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ２、ＶＰ４およびＶＰ７の２個の各々は、１以上の核酸から発現される。
【００３６】
ａ)宿主または宿主細胞に第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列および第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む１以上の核酸を導入し、該第一、第二および第三ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一、第二および第三ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４、ＶＰ６の一つおよびロタウイルスタンパク質ＶＰ７またはＶＰ４の一つをコードし；
ｂ)宿主または宿主細胞を、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７またはＶＰ４の各々が発現され、それにより、ＲＬＰが産生されるように、１以上の核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートする
ことを含む、宿主または宿主細胞においてロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)を産生する方法(Ｄ)も記載される。
【００３７】
上記方法(Ｄ)において、１以上の核酸は第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列をさらに含んでよく、該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４、ＶＰ６の一つおよびロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ７またはＶＰ４の二つをコードし、ここで、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ２、ＶＰ７またはＶＰ４の二つの各々は１以上の核酸から発現される。
【００３８】
上記方法(Ｃ)および(Ｄ)において、１以上の核酸は第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列をさらに含んでよく、該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列は、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４の一つをコードし、ここで、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の各々は１以上の核酸から発現される。
【００３９】
上記方法(Ｃ)または(Ｄ)は、さらに
ｃ)宿主または宿主細胞を採取し、そして
ｄ)宿主または宿主細胞からＲＬＰを精製する
工程を含んでよく、ここで、ＲＬＰは、７０〜１００nmのサイズの範囲である。
【００４０】
上記方法(Ｃ)または(Ｄ)において、１以上の核酸が第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列、第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列、第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列を含み、該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されている宿主または宿主細胞が提供されるならば、導入の工程(工程ａ)において、１以上の核酸は、ＮＳＰ４をコードする第一核酸およびＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７をコードする第二核酸の２核酸を含み、植物、植物の一部または植物細胞に導入された第一核酸対第二核酸の量の比が１：０.８〜１：２である。比は１：１であり得る。あるいは、１以上の核酸は、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列および第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第一核酸および第三〜第五ロタウイルスタンパク質をコードする第三〜第五ヌクレオチド配列を含む第二核酸の２核酸を含み得る。
【００４１】
上記方法(Ｃ)または(Ｄ)において、導入の工程(工程ａ)において、１以上の核酸は、第一および第二ロタウイルスタンパク質をコードする第一および第二ヌクレオチド配列、第三および第四ロタウイルスタンパク質をコードする第三および第四ヌクレオチド配列を含む第二核酸および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列を含む第三核酸の３核酸を含んでよく、ここで、植物、植物の一部または植物細胞に導入された第一核酸対第二核酸および第三核酸の比は、１：１：１である。
【００４２】
あるいは、上記方法(Ｃ)または(Ｄ)において、導入の工程(工程ａ)において、１以上の核酸は、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第二核酸および第三〜第五ロタウイルスタンパク質をコードする第三〜第五ヌクレオチド配列を含む第三核酸の３核酸を含んでよく、ここで、植物、植物の一部または植物細胞に導入された第一核酸対第二核酸および第三核酸の比は、１：１：１である。
【００４３】
さらに、上記方法(Ｃ)または(Ｄ)において、導入の工程(工程ａ)において、１以上の核酸は、４核酸、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一核酸を含む第一核酸、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第二核酸、第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む第三核酸および第四および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第四および第五ヌクレオチド配列を含む第四核酸を含んでよく、ここで、植物、植物の一部または植物細胞に導入された第一核酸対第二核酸、第三核酸および第四核酸の量の比は、１：１：１：１である。
【００４４】
上記方法(Ｃ)または(Ｄ)において、導入の工程(工程ａ)において、１以上の核酸は、５核酸、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第二核酸、第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む第三核酸、第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列を含む第四核酸および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列を含む第五核酸を含んでよく、植物、植物の一部または植物細胞に導入された第一核酸対第三核酸、第四核酸および第五核酸の量の比は１：１：１：１：１である。
【００４５】
上記方法(Ｃ)または(Ｄ)の１以上のヌクレオチド配列は、１以上の発現エンハンサーに操作可能に結合され得る。さらに、発現エンハンサーは、ＣＰＭＶ  ＨＴ、ＣＰＭＶ  １６０、ＣＰＭＶ  １６０＋およびＣＰＭＶ  ＨＴ＋からなる群から選択され得る。
【００４６】
ロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)におけるＶＰ４、ＶＰ７またはＶＰ４およびＶＰ７両者の取り込みを増加させる方法(Ｅ)も記載され、該方法は
ａ)第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列および第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む１以上の核酸を含む宿主または宿主細胞を提供し、該第一、第二および第三ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードし、該第二ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードし、該第三ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ７またはＶＰ４の一方をコードし；
ｂ)該宿主または宿主細胞を、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７またはＶＰ４の各々が発現され、それにより、ＮＳＰ４を含まない１以上の核酸を発現する第二宿主または宿主細胞により、同じ条件下で産生されたＶＰ４またはＶＰ７のレベルと比較したとき、ＶＰ４、ＶＰ７またはＶＰ４およびＶＰ７両者のレベルが増強されたＲＬＰが産生されるように、１以上の核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートする
ことを含む。
【００４７】
上記方法(Ｅ)において、１以上の核酸は第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列をさらに含んでよく、該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードし、該第二ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードし、該第三および第四ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４またはＶＰ７をコードし、ここで、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ２、ＶＰ４およびＶＰ７の２個の各々は、１以上の核酸から発現される。
【００４８】
ロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)におけるＶＰ４、ＶＰ７またはＶＰ４およびＶＰ７両者の取り込みを増加させる方法(Ｆ)も記載され、該方法は
ａ)第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列および第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む１以上の核酸を含む宿主または宿主細胞を提供し、該第一、第二および第三ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一、第二および第三ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４、ＶＰ６の一つおよびロタウイルスタンパク質ＶＰ７またはＶＰ４の一つをコードし；
ｂ)該宿主または宿主細胞を、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７またはＶＰ４の各々が発現され、それにより、ＮＳＰ４を含まない１以上の核酸を発現する第二宿主または宿主細胞により、同じ条件下で産生されたＶＰ４またはＶＰ７のレベルと比較したとき、ＶＰ４、ＶＰ７またはＶＰ４およびＶＰ７両者のレベルが増強されたＲＬＰが産生されるように、１以上の核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートする
ことを含む。
【００４９】
上記方法(Ｆ)において、１以上の核酸は第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列をさらに含んでよく、該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４、ＶＰ６の一つおよびロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ７またはＶＰ４の二つをコードし、ここで、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ２、ＶＰ７またはＶＰ４の二つの各々は１以上の核酸から発現される。
【００５０】
上記方法(Ｅ)および(Ｆ)において、１以上の核酸は第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列をさらに含んでよく、該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列は、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４の一つをコードし、ここで、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の各々は１以上の核酸から発現される。
【００５１】
上記方法(Ｅ)または(Ｆ)の１以上のヌクレオチド配列は、１以上の発現エンハンサーに操作可能に結合され得る。さらに、発現エンハンサーは、ＣＰＭＶ  ＨＴ、ＣＰＭＶ  １６０、ＣＰＭＶ  １６０＋およびＣＰＭＶ  ＨＴ＋からなる群から選択され得る。
【００５２】
ロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)におけるＶＰ４、ＶＰ７またはＶＰ４およびＶＰ７両者の取り込みを増加させる方法(Ｇ)も記載され、該方法は
ａ)宿主または宿主細胞に第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列および第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む１以上の核酸を導入し、該第一、第二および第三ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードし、該第二ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードし、該第三ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ７またはＶＰ４の一方をコードし；
ｂ)該宿主または宿主細胞を、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７またはＶＰ４の各々が発現され、それにより、ＮＳＰ４を含まない１以上の核酸を発現する第二宿主または宿主細胞により、同じ条件下で産生されたＶＰ４またはＶＰ７のレベルと比較したとき、ＶＰ４、ＶＰ７またはＶＰ４およびＶＰ７両者のレベルが増強されたＲＬＰが産生されるように、１以上の核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートする
ことを含む。
【００５３】
上記方法(Ｇ)において、１以上の核酸は第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列をさらに含んでよく、該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードし、該第二ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードし、該第三および第四ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４またはＶＰ７をコードし、ここで、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ２、ＶＰ４およびＶＰ７の２個の各々は、１以上の核酸から発現される。
【００５４】
ロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)におけるＶＰ４、ＶＰ７またはＶＰ４およびＶＰ７両者の取り込みを増加させる方法(Ｈ)も記載され、該方法は
ａ)宿主または宿主細胞に第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列および第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む１以上の核酸を導入し、該第一、第二および第三ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一、第二および第三ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４、ＶＰ６の一つおよびロタウイルスタンパク質ＶＰ７またはＶＰ４の一つをコードし；
ｂ)該宿主または宿主細胞を、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７またはＶＰ４の各々が発現され、それにより、ＮＳＰ４を含まない１以上の核酸を発現する第二宿主または宿主細胞により、同じ条件下で産生されたＶＰ４またはＶＰ７のレベルと比較したとき、ＶＰ４、ＶＰ７またはＶＰ４およびＶＰ７両者のレベルが増強されたＲＬＰが産生されるように、１以上の核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートする
ことを含む。
【００５５】
上記方法(Ｈ)において、１以上の核酸は第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列をさらに含んでよく、該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４、ＶＰ６の一つおよびロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ７またはＶＰ４の二つをコードし、ここで、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ２、ＶＰ７またはＶＰ４の二つの各々は１以上の核酸から発現される。
【００５６】
上記方法(Ｇ)および(Ｈ)において、１以上の核酸は第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列をさらに含んでよく、該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列は、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４の一つをコードし、ここで、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の各々は１以上の核酸から発現される。
【００５７】
上記方法(Ｇ)および(Ｈ)において、１以上の核酸は第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列をさらに含んでよく、該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列は、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４の一つをコードし、ここで、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の各々は１以上の核酸から発現される。
【００５８】
上記方法(Ｇ)または(Ｈ)において、導入の工程(工程ａ)において、１以上の核酸は、ＮＳＰ４をコードする第一核酸およびＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７をコードする第二核酸の２核酸を含み、植物、植物の一部または植物細胞に導入された第一核酸対第二核酸の量の比が１：０.８〜１：２である。比は１：１でもあり得る。あるいは、１以上の核酸は、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列および第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第一核酸および第三〜第五ロタウイルスタンパク質をコードする第三〜第五ヌクレオチド配列を含む第二核酸の２核酸を含み得る。
【００５９】
上記方法(Ｇ)または(Ｈ)において、導入の工程(工程ａ)において、１以上の核酸は、第一および第二ロタウイルスタンパク質をコードする第一および第二ヌクレオチド配列、第三および第四ロタウイルスタンパク質をコードする第三および第四ヌクレオチド配列を含む第二核酸および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列を含む第三核酸の３核酸を含んでよく、ここで、植物、植物の一部または植物細胞に導入された第一核酸対第二核酸および第三核酸の比は、１：１：１である。
【００６０】
あるいは、上記方法(Ｇ)または(Ｈ)において、導入の工程(工程ａ)において、１以上の核酸は、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第二核酸および第三〜第五ロタウイルスタンパク質をコードする第三〜第五ヌクレオチド配列を含む第三核酸の３核酸を含んでよく、ここで、植物、植物の一部または植物細胞に導入された第一核酸対第二核酸および第三核酸の比は、１：１：１である。
【００６１】
さらに、上記方法(Ｇ)または(Ｈ)において、導入の工程(工程ａ)において、１以上の核酸は４核酸、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一核酸を含む第一核酸、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第二核酸、第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む第三核酸および第四および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第四および第五ヌクレオチド配列を含む第四核酸を含んでよく、ここで、植物、植物の一部または植物細胞に導入された第一核酸対第二核酸、第三核酸および第四核酸の量の比は、１：１：１：１である。
【００６２】
上記方法(Ｇ)または(Ｈ)において、導入の工程(工程ａ)において、１以上の核酸は５核酸、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第二核酸、第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む第三核酸、第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列を含む第四核酸および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列を含む第五核酸を含んでよく、植物、植物の一部または植物細胞に導入された第一核酸対第三核酸、第四核酸および第五核酸の量の比は１：１：１：１：１である。
【００６３】
上記方法(Ｇ)または(Ｈ)の１以上のヌクレオチド配列は、１以上の発現エンハンサーに操作可能に結合され得る。さらに、発現エンハンサーは、ＣＰＭＶ  ＨＴ、ＣＰＭ  １６０、ＣＰＭＶ  １６０＋およびＣＰＭＶ  ＨＴ＋からなる群から選択され得る。
【００６４】
上記方法(Ｇ)または(Ｈ)は、さらに
ｃ)宿主または宿主細胞を採取し、そして
ｄ)宿主または宿主細胞からＲＬＰを精製する
工程を含んでよく、ここで、ＲＬＰは、７０〜１００nmのサイズの範囲である。
【００６５】
上記方法(Ａ)、方法(Ｂ)、方法(Ｃ)、方法(Ｄ)、方法(Ｅ)、方法(Ｆ)、方法(Ｇ)または方法(Ｈ)において、１以上の核酸は、第一、第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質をコードする該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列を含む１核酸を含み得る。
【００６６】
上記方法(Ａ)、方法(Ｂ)、方法(Ｃ)、方法(Ｄ)、方法(Ｅ)、方法(Ｆ)、方法(Ｇ)または方法(Ｈ)において、１以上の核酸は、２核酸、例えば、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸および第二〜第五ロタウイルスタンパク質をコードする第二〜第五ヌクレオチド配列を含む第二核酸を含み得る。あるいは、１以上の核酸は、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列および第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第一核酸および第三〜第五ロタウイルスタンパク質をコードする第三〜第五ヌクレオチド配列を含む第二核酸の２核酸を含み得る。
【００６７】
上記方法(Ａ)、方法(Ｂ)、方法(Ｃ)、方法(Ｄ)、方法(Ｅ)、方法(Ｆ)、方法(Ｇ)または方法(Ｈ)において、１以上の核酸はまた、３核酸、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列、第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列および第四ロタウイルスタンパク質をコードする第二核酸第四ヌクレオチド配列および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列を含む第三核酸を含み得る。あるいは、１以上の核酸は、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第二核酸および第三〜第五ロタウイルスタンパク質をコードする第三〜第五ヌクレオチド配列を含む第三核酸の３核酸を含み得る。
【００６８】
上記方法(Ａ)、方法(Ｂ)、方法(Ｃ)、方法(Ｄ)、方法(Ｅ)、方法(Ｆ)、方法(Ｇ)または方法(Ｈ)において、１以上の核酸は、４核酸、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第二核酸、第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む第三核酸および第四および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第四および第五ヌクレオチド配列を含む第四核酸を含む。
【００６９】
さらに、上記方法(Ａ)、方法(Ｂ)、方法(Ｃ)、方法(Ｄ)、方法(Ｅ)、方法(Ｆ)、方法(Ｇ)または方法(Ｈ)において、１以上の核酸は、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第二核酸、第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む第三核酸、第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列を含む第四核酸および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列を含む第五核酸の５核酸を含み得る。
【００７０】
上記方法(Ａ)、方法(Ｂ)、方法(Ｃ)、方法(Ｄ)、方法(Ｅ)、方法(Ｆ)、方法(Ｇ)または方法(Ｈ)の１以上のヌクレオチド配列は、１以上の発現エンハンサーに操作可能に結合され得る。さらに、発現エンハンサーは、ＣＰＭＶ  ＨＴ、ＣＰＭ  １６０、ＣＰＭＶ  １６０＋およびＣＰＭＶ  ＨＴ＋からなる群から選択され得る。
【００７１】
上記方法(Ａ)、方法(Ｂ)、方法(Ｃ)、方法(Ｄ)、方法(Ｅ)、方法(Ｆ)、方法(Ｇ)または方法(Ｈ)において、宿主または宿主細胞は、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物、植物の一部または植物細胞を含み得る。植物はベンサミアナタバコであり得る。
【００７２】
上記方法(Ａ)、方法(Ｂ)、方法(Ｃ)、方法(Ｄ)、方法(Ｅ)、方法(Ｆ)、方法(Ｇ)または方法(Ｈ)により産生されたＲＬＰもここに記載され、ここで、ＲＬＰはロタウイルスタンパク質を含む三層ＲＬＰであり、ロタウイルスタンパク質はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７からなる。ＲＬＰはＮＳＰ４を含まなくてよい。
【００７３】
対象における免疫応答の誘発のための有効用量のＲＬＰおよび薬学的に許容される担体を含む組成物および組成物を投与することを含む対象にロタウイルス感染に対する免疫を誘発する方法も記載される。免疫を誘発する方法において、組成物を、経口、皮内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内または皮下で対象に投与し得る。
【００７４】
上記方法(Ａ)、方法(Ｂ)、方法(Ｃ)、方法(Ｄ)、方法(Ｅ)、方法(Ｆ)、方法(Ｇ)または方法(Ｈ)により産生された、ＲＬＰを含む植物もここに記載する。
【００７５】
上記方法(Ａ)、方法(Ｂ)、方法(Ｃ)、方法(Ｄ)、方法(Ｅ)、方法(Ｆ)、方法(Ｇ)または方法(Ｈ)において、１以上の核酸は、第一、第二および第三ロタウイルスタンパク質をコードする第一、第二および第三ヌクレオチド配列を含む１核酸を含み得る。さらに、上記方法(Ａ)、方法(Ｂ)、方法(Ｃ)、方法(Ｄ)、方法(Ｅ)、方法(Ｆ)、方法(Ｇ)または方法(Ｈ)において、１以上の核酸は、２核酸、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸および第二および第三ロタウイルスタンパク質をコードする第二および第三ヌクレオチド配列を含む第二核酸を含み得る。さらに、上記方法(Ａ)、方法(Ｂ)、方法(Ｃ)、方法(Ｄ)、方法(Ｅ)、方法(Ｆ)、方法(Ｇ)または方法(Ｈ)において、１以上の核酸は、２核酸、第一および第二ロタウイルスタンパク質をコードする第一および第二ヌクレオチド配列を含む第一核酸および第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む第二核酸を含み得る。あるいは、上記方法(Ａ)、方法(Ｂ)、方法(Ｃ)、方法(Ｄ)、方法(Ｅ)、方法(Ｆ)、方法(Ｇ)または方法(Ｈ)において、１以上の核酸は、３核酸、第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列を含む第一核酸、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列を含む第二核酸および第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む第三核酸を含み得る。
【００７６】
ここに記載するように、ＮＳＰ４を、ＶＰ６およびＶＰ４またはＶＰ７と共に、宿主または宿主細胞、例えば植物、植物の一部または植物細胞で共発現させることにより、ＶＰ６およびＶＰ４またはＶＰ７をコードし、ＮＳＰ４をコードしない１以上の核酸を発現する、第二宿主または宿主細胞、例えば植物、第二植物の一部または第二植物細胞により、該第二宿主または第二宿主細胞、例えば第二植物、植物の第二の一部または第二植物細胞が、宿主または宿主細胞、例えば植物、植物の一部または植物細胞と同じ条件下でインキュベートまたは増殖させたとき、産生されたＲＬＰにおけるＶＰ４およびＶＰ７のレベルと比較したとき、増加したレベルのＶＰ４、ＶＰ７またはＶＰ４およびＶＰ７両者を含むＲＬＰが観察される。
【００７７】
本発明の概要は、必ずしも本発明の全ての特徴を記載していない。
【００７８】
図面の簡単な説明
本発明のこれらおよび他の特性は、添付する図面を参照する次の記載からより明らかとなり、図面は以下のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】ロタウイルス細胞侵入および複製を示す。ロタウイルスが細胞に入ったとき、ＶＰ４およびＶＰ７が失われ、二層粒子(ＤＬＰ)が形成される。ｄｓＲＮＡの転写が始まり、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７の翻訳に至る。レプリカーゼ活性を有する子孫コアが、ウイルス工場(別名バイロプラズム)で産生される。後期転写が、これらの子孫コアで起こる。ウイルス工場の末端で、これらのコアはＶＰ６で被覆され、小胞体の膜をとおして発芽する未熟ＤＬＰを形成し、ＥＲ常在ウイルス糖タンパク質ＮＳＰ４およびＶＰ７で修飾される一過性脂質膜を獲得する；これらの被覆粒子は、ＶＰ４も含む。粒子がＥＲシスターネ内部に移動するに連れ、一過性脂質膜および非構造タンパク質ＮＳＰ４は失われるが、ウイルス表面タンパク質ＶＰ４およびＶＰ７は、再編成されて、最外側ウイルスタンパク質層を形成し、成熟感染性三層粒子を生じる(Swiss Institute of Bioinformatics (ViralZone): viralzone.expasy.org/viralzone/all_by_species/107.html参照)
【００８０】
【図２】イオジキサノール密度勾配上の超遠心分離法によるロタウイルス様粒子精製を示す。図２Ａは、ロタウイルス様粒子の精製に使用した勾配の各層のイオジキサノールのパーセンテージおよび体積を表す。遠心分離後、勾配を、チューブの底から初めて、１mlフラクションに分画する。フラクション１〜１３のおよその局在化を矢印で示す。図２Ｂは、ロタウイルスＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７抗原を発現する葉からの粗製タンパク質抽出物に適用したイオジキサノール密度勾配分離からのフラクション１〜１０のタンパク質含量のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【００８１】
【図３】ロタウイルスタンパク質発現を示す。図３Ａは、ＮＳＰ４存在下または非存在下、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７を発現する葉からの粗製タンパク質抽出物に適用したイオジキサノール密度勾配分離からのフラクション２および３のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。別の構築物にあるＮＳＰ４と共に、各構造的抗原の個々の構築物(“単一遺伝子構築物”)を使用して(左パネル)；別の構築物にあるＮＳＰ４と共に、各々２構造的抗原の遺伝子を有する２構築物(“デュアル遺伝子構築物”)を使用して(中央パネル)；またはＮＳＰ４発現のための別の構築物と共に、４構造的抗原の共発現のための単一構築物(四重遺伝子構築物)を使用して(右パネル)、ロタウイルス構造タンパク質ＶＰ２、ＶＰ６、ＶＰ７、ＶＰ４が発現された。ロタウイルスＶＰ２およびＶＰ６抗原の位置を矢印で示す。図３Ｂは、特定するとおり、抗ロタウイルスＶＰ４またはＶＰ７抗体を使用して、図３Ａにおけるのと同じ処理をしたフラクションＦ２のウェスタンブロット分析を示す。
【００８２】
【図４】発現エンハンサー存在下のロタウイルスタンパク質発現を示す。図４Ａは、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４を共発現する葉からの粗製タンパク質抽出物に適用したイオジキサノール密度勾配からのフラクションＦ２およびＦ３のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ロタウイルス構造タンパク質ＶＰ２、ＶＰ６、ＶＰ７、ＶＰ４は、単一遺伝子構築物およびＮＳＰ４を発現する１構築物(左パネル)または２個のデュアル遺伝子構築物およびＮＳＰ４を発現する１構築物(中央および右パネル))から発現された。各構築物は、常にＣＰＭＶ−ＨＴエンハンサーを含んだＮＳＰ４以外、ＣＰＭＶ  ＨＴ(左および中央パネル)またはＣＭＰＶ  １６０(右パネル)いずれかの発現エンハンサーを含んだ。比率は、形質転換に使用した細菌懸濁液におけるアグロバクテリウム株を示す：左パネル  −  ５単一遺伝子構築物(ＶＰ２、ＶＰ６、ＶＰ４、ＶＰ７およびＮＳＰ４；１：１：１：１：１比)；中央および右パネル  −  構造タンパク質(ＶＰ６／２およびＶＰ７／４)をコードするデュアル遺伝子構築物および非構造タンパク質(ＮＳＰ４；１：１：１比)をコードする構築物。図４Ｂは、特定したとおり、抗ロタウイルスＶＰ４またはＶＰ７抗体を使用して図４Ａと同じ処理したＦ２からのウェスタンブロット分析を示す。比率は、形質転換に使用した細菌懸濁液におけるアグロバクテリウム株を示す：左パネル  −  ５単一遺伝子構築物(ＶＰ２、ＶＰ６、ＶＰ４、ＶＰ７およびＮＳＰ４；１：１：１：１：１比)；中央および右パネル  −  構造タンパク質(ＶＰ６／２およびＶＰ７／４)をコードするデュアル遺伝子構築物および非構造タンパク質(ＮＳＰ４；１：１：１比)をコードする構築物。
【００８３】
【図５】ロタウイルスタンパク質発現を示す。上部パネルは、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４を共発現する葉からの粗製タンパク質抽出物に適用したイオジキサノール密度勾配からのフラクションＦ２およびＦ３のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し、下部パネルは、上部パネルからの対応するＦ２フラクションのウェスタンブロット分析を示す。ロタウイルス構造タンパク質ＶＰ２、ＶＰ６、ＶＰ７およびＶＰ４は四重遺伝子構築物内で発現され、非構造タンパク質ＮＳＰ４は、別個の単一遺伝子構築物から共発現されたか(レーン１および２)、または構造タンパク質ＶＰ２、ＶＰ６、ＶＰ７、ＶＰ４および非構造タンパク質ＮＳＰ４が五重遺伝子構築物で発現された(レーン３)。構築物のアグロインフィルトレーションの比を示す。細菌懸濁液中のアグロバクテリウム株の０.４のＯＤを１として示す。細菌懸濁液中のアグロバクテリウム株の０.６のＯＤを１.５として示す。
【００８４】
【図６】本発明の構築物に使用し得る数エンハンサー配列の例の一般的模式図を示す。図６Ａおよび図６Ｂは、目的のヌクレオチド配列(例えばロタウイルス構造タンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７または非構造タンパク質ＮＳＰ４をコードする)に融合したＣＰＭＶ  ＨＴおよびＣＰＭＶ  ＨＴ＋エンハンサー配列の一般的模式図を示す。図５Ａまたは５Ｂに示す全ての要素が、エンハンサー配列内で必ずしも必要ではない可能性がある。コモウイルス３'非翻訳領域(ＣＰＭＶ  ３'ＵＴＲ)またはプラストシアニン３'ＵＴＲ(３'ＵＴＲ)をコードする配列を含むさらなる要素が、目的のヌクレオチド配列の３'末端に包含され得る。図６Ｃおよび６Ｄは、ここに記載する、ＣＰＭＶＸおよびＣＰＭＶＸ＋(ＣＰＭＶＸと、この非限定的例においては、複数クローニング部位および植物コザック配列を含むスタッファーフラグメントを含む)のエンハンサー配列の一般的模式図を示す。ＣＰＭＶＸおよびＣＰＭＶＸ＋は、各々、５'末端で植物制御領域に、３'末端で、連続して、目的のヌクレオチド配列(ＡＴＧ開始部位およびＳＴＯＰ部位を含む)、３'ＵＴＲおよびターミネーター配列に操作可能に結合することが示される。ここに記載する構築物ＣＰＭＶＸの例は、ＣＰＭＶ１６０である。ここに記載する構築物ＣＰＭＶＸ＋の例は、ＣＰＭＶ１６０＋である。
【００８５】
【図７】構築物番号１７１０(２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(ＷＡ)ＶＰ２(ｏｐｔ)／ＮＯＳの製造に使用した配列構成要素を示す。図７Ａは、ＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ２(ｏｐｔ).ｓ１＋３ｃのヌクレオチド配列(配列番号１９)を示す。図７Ｂは、ＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ２(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒのヌクレオチド配列(配列番号２０)を示す。図７Ｃは、株ＷＡからのロタウイルスＡ  ＶＰ２の最適化コード配列(配列番号２１)を示す。図７Ｄは、構築物１１９１の模式図を示す。図７Ｅは、構築物１１９１のヌクレオチド配列(配列番号２２)を示す。図７Ｆは、発現カセット番号１７１０のヌクレオチド配列(配列番号２３)を示す。図７Ｇは、ロタウイルスＡ  ＷＡ株からのＶＰ２のアミノ酸配列(配列番号２４)を示す。図７Ｈは、構築物番号１７１０の模式図を示す。
【００８６】
【図８】構築物番号１７１３(２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(ＷＡ)ＶＰ６(ｏｐｔ)／ＮＯＳ)の製造に使用した配列構成要素を示す。図８Ａは、ＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ６(ｏｐｔ).ｓ１＋３ｃのヌクレオチド配列(配列番号２５)を示す。図８Ｂは、ＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ６(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒのヌクレオチド配列(配列番号２６)を示す。図８Ｃは、株ＷＡからのロタウイルスＡ  ＶＰ６の最適化コード配列(配列番号２７)を示す。図８Ｄは、発現カセット番号１７１３のヌクレオチド配列(配列番号２８)を示す。図８Ｅは、ロタウイルスＡ  ＷＡ株からのＶＰ６のアミノ酸配列(配列番号２９)を示す。図８Ｆは、構築物番号１７１３の模式図を示す。
【００８７】
【図９】構築物番号１７３０(２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ４(ｏｐｔ)／ＮＯＳ)の製造に使用した配列構成要素を示す。図９Ａは、ＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ４(ｏｐｔ).ｓ１＋３ｃのヌクレオチド配列(配列番号３０)を示す。図９Ｂは、ＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ４(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒのヌクレオチド配列(配列番号３１)を示す。図９Ｃは、株ＲＶＡ／ワクチン／ＵＳＡ／Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]からのロタウイルスＡ  ＶＰ４の最適化コード配列(配列番号３２)を示す。図９Ｄは、発現カセット番号１７３０のヌクレオチド配列(配列番号３３)を示す。図９Ｅは、ロタウイルスＡ  Ｒｏｔａｒｉｘ株からのＶＰ４のアミノ酸配列(配列番号３４)を示す。図９Ｆは、構築物番号１７３０の模式図を示す。
【００８８】
【図１０】構築物番号１７３４(２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ７(Ｏｐｔ)／ＮＯＳ)の製造に使用した配列構成要素を示す。図１０Ａは、ＩＦ−ＴｒＳＰ＋Ｒｔｘ＿ＶＰ７(ｏｐｔ).ｓ１＋３ｃのヌクレオチド配列(配列番号３５)を示す。図１０Ｂは、ＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ７(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒのヌクレオチド配列(配列番号３６)を示す。図１０Ｃは、株ＲＶＡ／ワクチン／ＵＳＡ／Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]からのロタウイルスＡ  ＶＰ７の最適化コード配列(配列番号３７)を示す。図１０Ｄは、発現カセット番号１７３４のヌクレオチド配列(配列番号３８)を示す。図１０Ｅは、ロタウイルスＡ  ワクチンＵＳＡ／Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からのＴｒＳｐ−ＶＰ７のアミノ酸配列(配列番号３９)を示す。図１０Ｆは、構築物番号１７３４の模式図を示す。
【００８９】
【図１１】構築物番号１７０６(２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(ＷＡ)ＮＳＰ４／ＮＯＳ)の製造に使用した配列構成要素を示す。図１１Ａは、ＩＦ−ＷＡ＿ＮＳＰ４.ｓ１＋３ｃのヌクレオチド配列(配列番号４０)を示す。図１１Ｂは、ＩＦ−ＷＡ＿ＮＳＰ４.ｓ１−４ｒのヌクレオチド配列(配列番号４１)を示す。図１１Ｃは、株ＷＡからのロタウイルスＡ  ＶＰ６のコード配列(配列番号４２)を示す。図１１Ｄは、発現カセット番号１７０６のヌクレオチド配列(配列番号４３)を示す。図１１Ｅは、ロタウイルスＡ  ＷＡ株からのＮＳＰ４のアミノ酸配列(配列番号４４)を示す。図１１Ｆは構築物番号１７０６を示す。
【００９０】
【図１２】構築物番号１１０８(２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＲＶＡ(ＷＡ)ＶＰ２(ｏｐｔ)／ＮＯＳ)の製造に使用した配列構成要素を示す。図１２Ａは、ＩＦ(Ｃ１６０)−ＷＡ＿ＶＰ２(ｏｐｔ).ｃ(配列番号４５)のヌクレオチド配列を示す。図１２Ｂは、構築物１１９０の模式図を示す。図１２Ｃは、構築物１１９０ヌクレオチド配列(配列番号４６)のを示す。図１２Ｄは、発現カセット番号１１０８のヌクレオチド配列(配列番号４７)を示す。図１２Ｅは構築物番号１１０８の模式図を示す。
【００９１】
【図１３】構築物番号１１２８(２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＲＶＡ(ＷＡ)ＶＰ６(ｏｐｔ)／ＮＯＳ)の製造に使用した配列構成要素を示す。図１３Ａは、ＩＦ(Ｃ１６０)−ＷＡ＿ＶＰ６(ｏｐｔ).ｃのヌクレオチド配列(配列番号４８)を示す。図１３Ｂは、発現カセット番号１１２８のヌクレオチド配列(配列番号４９)を示す。図１３Ｃは構築物番号１１２８の模式図を示す。
【００９２】
【図１４】構築物番号１１７８(２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ４(ｏｐｔ)／ＮＯＳ)の製造に使用した配列構成要素を示す。図１４Ａは、ＩＦ(Ｃ１６０)−Ｒｔｘ＿ＶＰ４(ｏｐｔ).ｃのヌクレオチド配列(配列番号５０)を示す。図１４Ｂは、発現カセット番号１１７８のヌクレオチド配列(配列番号５１)を示す。図１４Ｃは構築物番号１１７８をの模式図示す。
【００９３】
【図１５】構築物番号１１９９(２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＴｒＳｐ−ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ７(Ｏｐｔ)／ＮＯＳ)の製造に使用した配列構成要素を示す。図１５Ａは、ＩＦ(Ｃ１６０)−ＴｒＳＰ＋Ｒｔｘ＿ＶＰ７(ｏｐｔ).ｃのヌクレオチド配列(配列番号５２)を示す。図１５Ｂは、発現カセット番号１１９９のヌクレオチド配列(配列番号５３)を示す。図１５Ｃは構築物番号１１９９の模式図を示す。
【００９４】
【図１６】構築物番号１７０８(ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット下のＶＰ６およびＶＰ２発現のための二重遺伝子構築物)の模式図を示す。
【００９５】
【図１７】構築物番号１７１９(ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット下のＶＰ７およびＶＰ４発現のための二重遺伝子構築物)の模式図を示す。
【００９６】
【図１８】構築物番号２４００(ＣＰＭＶ−１６０発現カセット下のＶＰ６およびＶＰ２発現のための二重遺伝子構築物)の模式図を示す。
【００９７】
【図１９】構築物番号２４０８(ＣＰＭＶ−１６０発現カセット下のＶＰ７およびＶＰ４発現のための二重遺伝子構築物)の模式図を示す。
【００９８】
【図２０】構築物番号１７６９(ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット下のＶＰ７、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ２発現のための四重遺伝子構築物)の模式図を示す。
【００９９】
【図２１】構築物番号２４４１(ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット下のＶＰ４、ＶＰ７、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ２発現のための五重遺伝子構築物)の模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
詳細な記載
次の記載は、好ましい態様である。
【０１０１】
本発明は、１以上のロタウイルス構造タンパク質を含むウイルス様粒子(ＶＬＰ)(すなわちロタウイルス様粒子、ロタウイルスＶＬＰまたはＲＬＰ)および何らかの宿主、特に植物、植物の一部または植物細胞においてロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)を産生する方法に関する。他の宿主は、例えば、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む。ロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)は、１以上のロタウイルス構造タンパク質を含み得る。ＲＬＰは、三層であり得る。ＲＬＰは、植物におけるロタウイルス構造タンパク質および非構造タンパク質の共発現により産生され得るが、しかしながら、ＲＬＰは、あらゆるロタウイルス非構造タンパク質を含まない。
【０１０２】
宿主または宿主細胞は、植物、真菌、細菌、昆虫および動物を含む、任意の源由来であり得る。好ましい態様において、宿主または宿主細胞は植物または植物細胞である。
【０１０３】
本発明は、一部、植物、植物の一部または植物細胞のような宿主において、ロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)を産生する方法に関する。方法は、植物、植物の一部または植物細胞のような宿主において活性な制御領域(制御領域は１以上のロタウイルス構造タンパク質および１以上のロタウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列と操作可能に結合している)を含む、１以上の核酸を、植物、植物の一部または植物細胞のような宿主に導入することを含む。その後、植物、植物の一部または植物細胞のような宿主を、核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートし、それにより１以上のロタウイルス構造タンパク質を含むＲＬＰを産生する。１以上のロタウイルス構造タンパク質はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６またはＶＰ７であり得る。ロタウイルス非構造タンパク質はＮＳＰ４であり得る。ＲＬＰは三層であり得る。ＲＬＰはロタウイルス構造タンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７を含んでよく、非構造タンパク質ＮＳＰ４を含まない。
【０１０４】
本発明は、一部、宿主または宿主細胞においてロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)を産生するさらなる方法を提供し、該方法は、
第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列および第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を含む１以上の核酸を含む宿主または宿主細胞を提供し、該第一、第二および第三ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一、第二および第三ヌクレオチド配列はＮＳＰ４および１または２のロタウイルスタンパク質ＶＰ２またはＶＰ６および１または２のロタウイルスタンパク質ＶＰ７またはＶＰ４をコードし；
宿主または宿主細胞を、ＮＳＰ４およびＶＰ２、ＶＰ４およびＶＰ７またはＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ７またはＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ４またはＶＰ６、ＶＰ４およびＶＰ７のいずれかが発現され、それによりＲＬＰが産生されるように、１以上の核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートする
ことを含む。
【０１０５】
さらに、１以上の核酸は、第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列を含み得る。該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして該第一ヌクレオチド配列、第二ヌクレオチド配列、第三および第四ヌクレオチド配列はロタウイルスタンパク質ＶＰ２またはＶＰ６、ＶＰ４またはＶＰ７およびＮＳＰ４をコードし、ここで、ＮＳＰ４およびＶＰ２またはＶＰ６およびＶＰ４またはＶＰ７のいずれかが１以上の核酸から発現される。
【０１０６】
さらに、本発明は、一部、植物、植物の一部または植物細胞のような宿主においてロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)ワクチン候補を産生する方法を提供する。方法は、植物または植物の一部のような宿主において、植物、植物の一部または植物細胞のような宿主で活性な１以上の制御領域を含む１以上の核酸(Ｒ１〜Ｒ５)を発現させることを含み、制御領域がヌクレオチド配列Ｒ１〜Ｒ５に操作可能に結合されており、ここで、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、ヌクレオチド配列Ｒ２はロタウイルスタンパク質Ｘ２をコードし、ヌクレオチド配列Ｒ３はロタウイルスタンパク質Ｘ３をコードし、ヌクレオチド配列Ｒ４はロタウイルスタンパク質Ｘ４をコードし、そしてヌクレオチド配列Ｒ５はロタウイルスタンパク質Ｘ５をコードし、Ｘ１〜Ｘ５の各々がロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４からなる群から選択され、それにより、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の各々が植物、植物の一部または植物細胞のような宿主で発現される(表１参照)。ＲＬＰは、ロタウイルス構造タンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７を含み得る。ＲＬＰは非構造タンパク質ＮＳＰ４を含まない。
【０１０７】
植物または植物の一部のような宿主にロタウイルス構造タンパク質およびロタウイルス非構造タンパク質を導入し、共発現させることにより、産生されるＲＬＰの収量が調節され得ることが判明した。特に、植物、植物の一部または植物細胞のような宿主においてロタウイルス構造タンパク質をロタウイルス非構造タンパク質ＮＳＰ４と共に共発現させることにより、ＲＬＰへの構造タンパク質ＶＰ４、ＶＰ７またはＶＰ４およびＶＰ７両者の取り込みが、同じ条件下で、同じロタウイルス構造タンパク質を発現するが、ロタウイルス非構造タンパク質を発現しない第二植物、第二植物の一部または第二植物細胞のような第二宿主により産生されるＶＰ４およびＶＰ７のレベルと比較して、増加し得ることが判明した。
【０１０８】
例えば、ロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)におけるＶＰ４、ＶＰ７またはＶＰ４およびＶＰ７両者の取り込みを増加させる方法が提供される。該方法は、
ａ)第一ロタウイルスタンパク質をコードする第一ヌクレオチド配列、第二ロタウイルスタンパク質をコードする第二ヌクレオチド配列、第三ロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列および第四ロタウイルスタンパク質をコードする第四ヌクレオチド配列を含む１以上の核酸を含む宿主または宿主細胞を提供し；該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列は、該宿主または宿主細胞で活性な１以上の制御領域に操作可能に結合されており；そして
該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列は、ロタウイルスタンパク質ＶＰ７、ＶＰ４、ＮＳＰ４およびＶＰ２の一つまたはＶＰ６をコードし；
ｂ)ＶＰ７、ＶＰ４、ＮＳＰ４およびＶＰ２またはＶＰ６の各々が発現され、それにより同じ条件下で、ＮＳＰ４を含まない１以上の核酸を発現する第二宿主または宿主細胞により産生されたＶＰ４またはＶＰ７のレベルと比較したとき、ＶＰ４、ＶＰ７またはＶＰ４およびＶＰ７両者の増強されたレベルを有するＲＬＰを産生するように１以上の核酸の発現を可能にする条件下で宿主または宿主細胞をインキュベートする
ことを含む。
【０１０９】
さらに、ロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)におけるＶＰ４、ＶＰ７またはＶＰ４およびＶＰ７両者の産生を増加させる別法は
ａ)植物、植物の一部または植物細胞に、第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列に操作可能に結合した１以上の制御領域を含む１以上の核酸を導入し、該１以上の制御領域は植物、植物の一部または植物細胞で活性であり、該第一ヌクレオチド配列は第一ロタウイルスタンパク質をコードし、該第二ヌクレオチド配列は第二ロタウイルスタンパク質をコードし、該第三ヌクレオチド配列は第三ロタウイルスタンパク質をコードし、該第四ヌクレオチド配列は第四ロタウイルスタンパク質をコードし、そして、該第五ヌクレオチド配列は第五ロタウイルスタンパク質をコードし、該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列の各々は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４の一つをコードし、そして
ｂ)植物、植物の一部または植物細胞を、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の各々が一過性に発現され、それにより、同じ条件下で、ＮＳＰ４を含まない１以上の核酸を発現する第二植物、第二植物の一部または第二植物細胞により産生されたＶＰ４およびＶＰ７のレベルと比較したとき、増強されたレベルのＶＰ４およびＶＰ７を有する
ことを含み得る。
【０１１０】
所望により、該方法は、さらに
ｃ)植物、植物の一部または植物細胞を採取し、そして
ｄ)植物、植物の一部または植物細胞からＲＬＰを精製する
工程をさらに含んでよく、ここで、ＲＬＰは、７０〜１００nmのサイズの範囲である。
【０１１１】
ロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)におけるＶＰ４、ＶＰ７またはＶＰ４およびＶＰ７両者の産生を増加させる別法も提供し、該方法は
ａ)第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列に操作可能に結合した１以上の制御領域を含む１以上の核酸を含む植物、植物の一部または植物細胞を提供し、該１以上の制御領域は植物、植物の一部または植物細胞で活性であり、該第一ヌクレオチド配列は第一ロタウイルスタンパク質をコードし、該第二ヌクレオチド配列は第二ロタウイルスタンパク質をコードし、該第三ヌクレオチド配列は第三ロタウイルスタンパク質をコードし、該第四ヌクレオチド配列は第四ロタウイルスタンパク質をコードし、そして該第五ヌクレオチド配列は第五ロタウイルスタンパク質をコードする、該第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列の各々はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４の一つをコードし、そして
ｂ)植物、植物の一部または植物細胞を、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４が発現され、それにより同じ条件下で、ＮＳＰ４を含まない１以上の核酸を発現する第二植物、第二植物の一部または第二植物細胞により産生されるＶＰ４およびＶＰ７のレベルと比較したとき、増強されたレベルのＶＰ４およびＶＰ７を有するＲＬＰを産生するように、１以上の核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートする
ことを含む。
【０１１２】
植物、植物の一部または植物細胞のような宿主での一過性発現中のロタウイルス構造タンパク質をコードする核酸を含む構築物と、非構造タンパク質ＮＳＰ４をコードする核酸を含む構築物の比率を調節することにより、ＲＬＰ産生の収量および構造タンパク質ＶＰ４およびＶＰ７のＲＬＰへの取り込みが改善され得ることも判明した。
【０１１３】
理論に縛られることを望まないが、ロタウイルス非構造タンパク質、例えばＮＳＰ４と１以上のロタウイルス構造タンパク質、例えばＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６および／またはＶＰ７の共発現は、ＶＰ４および／またはＶＰ７のＲＬＰへの取り込みを増加させ得る。このＶＰ４および／またはＶＰ７のＲＬＰへの取り込みの増加は、ロタウイルスタンパク質の発現または産生の増加によりおよび／またはＲＬＰの組立の有効性の増加によりおよび／またはＲＬＰ組立部位へのロタウイルスタンパク質の動員の増加により、生じ得る。
【０１１４】
図３Ａおよび３Ｂに示すとおり、植物におけるロタウイルス非構造タンパク質ＮＳＰ４とロタウイルス構造タンパク質ＶＰ２、ＶＰ６、ＶＰ４およびＶＰ７の共発現は、ＮＳＰ４非存在下の構造タンパク質ＶＰ２、ＶＰ６、ＶＰ４およびＶＰ７の発現と比較して、ＶＰ４およびＶＰ７のＲＬＰへの取り込みを増加させる(図３Ｂ参照)。
【０１１５】
植物、植物の一部または植物細胞のような宿主で一過性に発現される種々の構造タンパク質および非構造タンパク質をコードする構築物の比は、２、３、４または５構築物上にロタウイルス構造タンパク質および非構造タンパク質ＮＳＰ４をコードする核酸配列を含む構築物を提供し、宿主に構築物を導入する工程(植物、植物の一部または植物細胞にアグロバクテリウムを使用)中に、各構築物の量を変えることにより、改変し得る。例えば、各々一つの構造タンパク質および非構造タンパク質をコードする５個の別々の構築物を、種々の比率で共発現して、植物、植物の一部または植物細胞内で種々の比率での核酸の共発現をもたらし得る。あるいは、下記のとおり、核酸配列を、２、３または４構築物に種々の組み合わせで提供し、構築物を、種々の比率で植物、植物の一部または植物細胞に導入し得る。
【０１１６】
さらに、これら核酸配列は、同じ構築物に提供され得る。
【０１１７】
“ロタウイルスタンパク質”は、ロタウイルス構造タンパク質またはロタウイルス非構造タンパク質を指し得る。“ロタウイルス構造タンパク質”は、あらゆる天然に存在するロタウイルス株または単離株またはあらゆる天然に存在するバリアントに存在する、ロタウイルスから単離されたロタウイルス構造タンパク質の全てまたは一部を指し得る。それゆえに、用語ロタウイルス構造タンパク質は、天然に存在するロタウイルス構造タンパク質またはウイルス生活環中の変異により生じ得るまたは選択圧(例えば、薬物治療、宿主細胞指向性拡張または感染力など)に応答して生じるロタウイルス構造タンパク質のバリアントを含む。当業者には明らかなとおり、このようなロタウイルス構造タンパク質およびそのバリアントは、組み換え技術を使用しても産生できる。ロタウイルス構造タンパク質は、カプシドタンパク質、例えばＶＰ２およびＶＰ６、表面タンパク質、例えばＶＰ４またはカプシドと表面タンパク質の組み合わせを含み得る。構造タンパク質は、さらに、例えばＶＰ７を含み得る。
【０１１８】
ロタウイルス“構造タンパク質ではないタンパク質”、“非構造タンパク質”、“非−構造タンパク質”、“ＮＳＰ”または“非構造的ロタウイルスタンパク質”により、ロタウイルスゲノムによりコードされるが、ウイルス粒子に包含されないタンパク質を意味する。ロタウイルス非構造タンパク質の非限定的例は、ロタウイルスＮＳＰ４である。
【０１１９】
“共発現”により、２または２を超えるヌクレオチド配列が、植物内、植物の同じ組織内および植物の同じ細胞内でほぼ同時に発現されることを意味する。ヌクレオチド配列は、必ずしも正確に同時に発現されない。むしろ、２以上のヌクレオチド配列は、コード化産物が、所望の細胞内区画内で相互作用する機会を有するような方法で、発現される。例えば、非構造タンパク質は、好ましくは構造タンパク質が発現される前または発現中に発現され得る。２または２を超えるヌクレオチド配列は、２以上の配列が、該２以上の配列が発現される条件下、ほぼ同時に植物内に導入される、一過性発現系を使用して、共発現され得る。２または２を超える配列は異なる構築物に存在し、共発現は、構築物の各々の植物、植物の一部または植物細胞への導入を必要とする可能性がありまたは２または２を超える配列が１構築物に存在し、該構築物を植物、植物の一部または植物細胞に導入する可能性がある。
【０１２０】
用語“ウイルス様粒子”(ＶＬＰ)または“ウイルス様粒子”または“ＶＬＰ”は、自己組立て、例えばロタウイルス構造タンパク質、例えばＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７構造タンパク質の組み合わせであるが、これらに限定されないような１以上の構造タンパク質を含む、構造をいう。ロタウイルス構造タンパク質を含むＶＬＰは、“ロタウイルスＶＬＰ”、“ロタウイルス様粒子(ＲＶＬＰ)”、“ロタウイルス様粒子(ＲＬＰ)”、“ロタウイルス様粒子”、“ＲＶＬＰ”または“ＲＬＰ”とも称する。ＶＬＰまたはＲＬＰは、一般に形態学的および抗原性に、感染において生じるビリオンに類似するが、複製に十分な遺伝情報を欠き、故に非感染性である。ＶＬＰは、植物宿主細胞を含む適当な真核宿主細胞で産生され得る。宿主細胞からの抽出物後ならびに適当な条件下での単離およびさらなる精製により、ＶＬＰは、完全な構造物として取得され得る。ＲＬＰは、単層、二層または三層ＲＬＰであり得る。三層ＲＬＰは、３以上のロタウイルス構造タンパク質の同時発現と、ここに記載するとおり、１以上の非構造タンパク質の共発現により得られ得る。例えば、構造タンパク質ＶＰ２、ＶＰ６、ＶＰ７、ＶＰ４および非構造タンパク質ＮＳＰ４の共発現は、三層ＲＬＰの産生に至る。
【０１２１】
ＶＰ４の、ＶＰ２、ＶＰ６、ＶＰ７と、そして必要に応じて１以上の非構造タンパク質との共発現は、天然ロタウイルスに似たスパイクを伴う粒子をもたらす。ＶＰ４は、プロセシングまたは開裂されて、ＶＰ５およびＶＰ８を生じ得る。このプロセシングは、内在性プロテアーゼを使用して、または適当なプロテアーゼ、例えば、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、スブチリシンの共発現により、宿主内で起こり得る。あるいは、ＶＰ４を、ＲＬＰ抽出手順の何らかの工程中またはＲＬＰ精製後に、適当なプロテアーゼ、例えば、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、スブチリシンを添加することにより、ＶＰ５およびＶＰ８を生じるようにプロセシングし得る。
【０１２２】
ロタウイルス構造タンパク質の各々は、特徴およびサイズが異なり、ＲＬＰへの組込のための必要な量が異なる。用語“ロタウイルスＶＬＰ”、“ロタウイルスウイルス様粒子(ＲＶＬＰ)”、“ロタウイルスウイルス様粒子(ＲＬＰ)”、“ロタウイルスウイルス様粒子”、“ＲＶＬＰ”または“ＲＬＰ”は、１以上のロタウイルス構造タンパク質を含むウイルス様粒子(ＶＬＰ)をいう。ロタウイルス構造タンパク質の例は、ＶＰ２、ＶＰ４(またはＶＰ５およびＶＰ８)、ＶＰ６およびＶＰ７構造タンパク質を含み得るが、これらに限定されない。ＲＬＰは、ロタウイルス非構造タンパク質を含み得ない。
【０１２３】
本発明は、植物においてＲＬＰを産生する方法を提供し、ここで、植物において活性な１以上の制御領域を含む１以上の核酸(Ｎ１〜Ｎ５)がヌクレオチド配列Ｒ１〜Ｒ５に操作可能に結合し、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、ヌクレオチド配列Ｒ２はロタウイルスタンパク質Ｘ２をコードし、ヌクレオチド配列Ｒ３はロタウイルスタンパク質Ｘ３をコードし、ヌクレオチド配列Ｒ４はロタウイルスタンパク質Ｘ４をコードし、そしてヌクレオチド配列Ｒ５はロタウイルスタンパク質Ｘ５をコードし、Ｘ１〜Ｘ５は、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４からなる群から選択され、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４は、各々１回選択される(表１参照)。宿主のトランスフォームに使用する核酸の最終セットまたは組み合わせは、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の発現と、ＲＬＰの形成をもたらす、宿主内での各ロタウイルスタンパク質の発現に至る。
【０１２４】
例えば、表１を参照して、２核酸(Ｎ１およびＮ２)を宿主のトランスフォームに使用できる(例番号２.１参照)。この場合、Ｎ１はＲ１ヌクレオチド配列を含み、Ｒ１はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４の１個をコードし得る。核酸Ｎ２は、４配列Ｒ２〜Ｒ５を含み、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の各々が宿主内で発現され、それによりＲＬＰが産生されるように、Ｒ２〜Ｒ５の各々はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４の一つをコードするが、Ｒ１によりコードされるタンパク質をコードしない。非限定的例として、Ｎ１は、ＶＰ２をコードし得るＲ１を含んでよく、Ｎ２は、それぞれＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４をコードし得るＲ２〜Ｒ５を含んでよい。
【０１２５】
表１は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７を含むＲＬＰを産生するために、宿主内で発現または共発現され得る、核酸(Ｎ)およびヌクレオチド配列(Ｒ)の、限定と見なしてはならない組み合わせの概要を提供する。
【０１２６】
【表１】
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【０１２７】
１. １個の構築物
１.１  五重遺伝子構築物
ここに記載するとおり、第一、第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５)をコードする第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列(Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５)を含む核酸(Ｎ１；第一核酸)が、植物または植物の一部で発現される、植物においてＲＬＰを産生する方法を提供する(表１、組み合わせ番号１.１参照)。
【０１２８】
従って、核酸Ｎ１はヌクレオチド配列Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５を含み、ここで、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ５は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ５は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３およびＲ５は、Ｘ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ５はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ４は、Ｘ５ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４をコードするヌクレオチド配列は核酸Ｎ１に含まれ、それによりトランスフォーム宿主における各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の発現を可能にする。
【０１２９】
核酸は、ヌクレオチド配列Ｒ１(ここで、Ｒ１は、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４をコードできる)およびヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５(ここで、Ｒ２〜Ｒ５はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４から選択されるロタウイルスタンパク質をコードし、該ロタウイルスタンパク質はＲ１によりコード化されない)を含み得る。限定と解釈すべきではない例として、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ２をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５はロタウイルスタンパク質ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４をいずれの順番でコードしてもよいが、Ｒ２〜Ｒ５はＶＰ２をコードし得ない。限定と見なしてはならない他の例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ４をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４をいずれの順番でコードしてもよいが、Ｒ２〜Ｒ５はＶＰ４をコードし得ない。さらに別の非限定的例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ７およびＮＳＰ４をいずれの順番でコードしてもよいが、Ｒ２〜Ｒ５はＶＰ６をコードし得ない。限定と見なしてはならないさらに他の例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ７をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４をいずれの順番でコードしてもよいが、Ｒ２〜Ｒ５はＶＰ７をコードし得ない。限定と見なしてはならないさらに他の例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７をいずれの順番でコードしてもよいが、Ｒ２〜Ｒ５はＮＳＰ４をコードし得ない。
【０１３０】
限定と解釈すべきではない例として、ヌクレオチド配列(Ｎ１)は、第一ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ７をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)、第二ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ４をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)、第三ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)、第四ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)および第五ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ２をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む。
【０１３１】
さらなる非限定的例において、ヌクレオチド配列(Ｎ１)は、第一ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ４をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)、第二ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ７をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)、第三ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)、第四ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)および第五ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ２をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む。
【０１３２】
さらなる非限定的例において、ヌクレオチド配列(Ｎ１)は、第一ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ４をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)、第二ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ７をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)、第三ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)、第四ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ２をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)および第五ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む。
【０１３３】
他の非限定的例において、ヌクレオチド配列(Ｎ１)は、第一ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ７をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)、第二ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ４をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)、第三ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)、第四ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ２をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)および第五ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む(図５参照)。植物は、第一、第二、第三、第四および第五タンパク質の各々が植物で発現されるように、第一、第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質をコードする第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列(Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５)を含む単一核酸(Ｎ１)でトランスフォームし得る。ロタウイルスタンパク質は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４が植物で発現されるように、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択される。単一核酸を、植物に、一過性にまたは安定的に導入し得る。
【０１３４】
ＶＰ４は、適当なプロテアーゼ、例えば、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、スブチリシンをコードする核酸の共発現により、宿主内でＶＰ５およびＶＰ８を産生するようにプロセシングまたは開裂され得る。あるいは、ＶＰ４は、ＲＬＰ抽出物の任意の工程中またはＲＬＰ精製後、適当なプロテアーゼ、例えば、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、スブチリシンの添加により、プロセシングし得る。
【０１３５】
１.２  四重遺伝子構築物
ここに記載するとおり、第一、第二、第三および第四ロタウイルスタンパク質(Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４)をコードする第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列(Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４)を含む核酸(Ｎ１；第一核酸)が、植物または植物の一部で発現される、植物においてＲＬＰを産生する方法を提供する(表１、組み合わせ番号１.２参照)。
【０１３６】
従って、核酸Ｎ１はヌクレオチド配列(Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４)を含んでよく、ここで、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ４は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ４は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３はＸ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４をコードするヌクレオチド配列は核酸Ｎ１に含まれ、それによりトランスフォーム宿主における各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の発現を可能にする。
【０１３７】
限定と解釈すべきではない例として、ヌクレオチド配列(Ｎ１)は、第一ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)、第二ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ４をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)、第三ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ２をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)および第四ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)を含む。
【０１３８】
さらに、核酸Ｎ１はヌクレオチド配列(Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４)を含んでよく、ここで、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ４は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ４は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４はＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３はＸ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４をコードするヌクレオチド配列は核酸Ｎ１に含まれ、それによりトランスフォーム宿主における各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の発現を可能にする。
【０１３９】
限定と解釈すべきではない例として、ヌクレオチド配列(Ｎ１)は、第一ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)、第二ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ７をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)、第三ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ２をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)および第四ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)を含む。
【０１４０】
さらに、核酸Ｎ１はヌクレオチド配列(Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４)を含んでよく、ここで、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ７、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ４は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ７、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ４は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ７、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４はＶＰ７、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３はＸ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ７、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４をコードするヌクレオチド配列は核酸Ｎ１に含まれ、それによりトランスフォーム宿主における各ロタウイルスタンパク質ＶＰ７、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の発現を可能にする。
【０１４１】
限定と解釈すべきではない例として、ヌクレオチド配列(Ｎ１)は、第一ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)、第二ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ４をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)、第三ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ７をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)および第四ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)を含む。
【０１４２】
１.３  三重遺伝子構築物
ここに記載するとおり、第一、第二および第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３)をコードする第一、第二および第三ヌクレオチド配列(Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３)を含む核酸(Ｎ１；第一核酸)が、植物または植物の一部で発現される、植物においてＲＬＰを産生する方法を提供する(表１、組み合わせ番号１.３参照)。
【０１４３】
従って、核酸Ｎ１は、ヌクレオチド配列(Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３)を含んでよく、ここで、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ３は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２はＸ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４をコードするヌクレオチド配列は核酸Ｎ１に含まれ、それによりトランスフォーム宿主における各ロタウイルスタンパク質ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の発現を可能にする。
【０１４４】
限定と解釈すべきではない例として、ヌクレオチド配列(Ｎ１)は、第一ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)、第二ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ４をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)、第三ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)を含む。
【０１４５】
さらに、従って、核酸Ｎ１は、ヌクレオチド配列(Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３)を含んでよく、ここで、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ３は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２はＸ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４をコードするヌクレオチド配列は核酸Ｎ１に含まれ、それによりトランスフォーム宿主における各ロタウイルスタンパク質ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の発現を可能にする。
【０１４６】
限定と解釈すべきではない例として、ヌクレオチド配列(Ｎ１)は、第一ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)、第二ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質ＶＰ７をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)、第三ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルスタンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)を含む。
【０１４７】
２. ２個の構築物
２.１  四重遺伝子構築物＋単一遺伝子構築物
本発明はまた、第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)が、第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列(Ｒ１〜Ｒ５)が植物で共発現されるように、第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ２〜Ｘ５)をコードする４ヌクレオチド配列(Ｒ２〜Ｒ５)参照を含む第二核酸(Ｎ２)と共発現される、植物においてＲＬＰを産生する方法も提供する(表１、組み合わせ番号２.１)。
【０１４８】
この非限定的例においては、Ｎ１はヌクレオチド配列(Ｒ１)を含み、Ｎ２はヌクレオチド配列(Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５)を含み、ここで、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質が、両構築物Ｎ１およびＮ２の組み合わせでコード化され、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ５は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ５は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３およびＲ５は、Ｘ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ５はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ４は、Ｘ５ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０１４９】
限定と解釈すべきではない例として、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ２をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５はロタウイルスタンパク質ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４をいずれの順番でコードしてもよいが、Ｒ２〜Ｒ５はＶＰ２をコードし得ない。他の非限定的例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ４をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４をいずれの順番でコードしてもよいが、Ｒ２〜Ｒ５はＶＰ４をコードし得ない。さらに別の非限定的例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ７およびＮＳＰ４をいずれの順番でコードしてもよいが、Ｒ２〜Ｒ５はＶＰ６をコードし得ない。限定と見なしてはならないさらに他の例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ７をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４をいずれの順番でコードしてもよいが、Ｒ２〜Ｒ５はＶＰ７をコードし得ない。さらに別の非限定的例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７をいずれの順番でコードしてもよいが、Ｒ２〜Ｒ５はＮＳＰ４をコードし得ない。
【０１５０】
第一核酸(Ｎ１)および第二核酸(Ｎ２)は、同じ工程で植物に導入されても、逐次的に植物に導入されてもよい。
【０１５１】
限定と解釈すべきではない例として、第一ロタウイルスタンパク質、例えばＮＳＰ４をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一ヌクレオチド配列(Ｎ１)を、それぞれ第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質、例えばＶＰ７、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ２をコードする４ヌクレオチド配列(Ｒ２〜Ｒ５)を含む第二核酸(Ｎ２)と共発現させる(図５参照)。
【０１５２】
他の非限定的例において、第一ロタウイルスタンパク質、例えばＮＳＰ４をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一ヌクレオチド配列(Ｎ１)を、それぞれ第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質、例えばＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＶＰ２をコードする４ヌクレオチド配列(Ｒ２〜Ｒ５)を含む第二核酸(Ｎ２)と共発現させる。さらに別の非限定的例において、第一ロタウイルスタンパク質、例えばＮＳＰ４をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一ヌクレオチド配列(Ｎ１)を、それぞれ第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質、例えばＶＰ７、ＶＰ４、ＶＰ２およびＶＰ６をコードする４ヌクレオチド配列(Ｒ２〜Ｒ５)を含む第二核酸(Ｎ２)と共発現させる。さらに別の非限定的例において、第一ロタウイルスタンパク質、例えばＮＳＰ４をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一ヌクレオチド配列(Ｎ１)を、それぞれ第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質、例えばＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ２およびＶＰ６をコードする４ヌクレオチド配列(Ｒ２〜Ｒ５)を含む第二核酸(Ｎ２)と共発現させる。さらに別の非限定的例において、第一ロタウイルスタンパク質、例えばＮＳＰ４をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一ヌクレオチド配列(Ｎ１)を、それぞれ第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質、例えばＶＰ６、ＶＰ２、ＶＰ４およびＶＰ７をコードする４ヌクレオチド配列(Ｒ２〜Ｒ５)を含む第二核酸(Ｎ２)と共発現させる。さらに別の非限定的例において、第一ロタウイルスタンパク質、例えばＮＳＰ４をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一ヌクレオチド配列(Ｎ１)を、それぞれ第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質、例えばＶＰ６、ＶＰ２、ＶＰ７およびＶＰ４をコードする４ヌクレオチド配列(Ｒ２〜Ｒ５)を含む第二核酸(Ｎ２)と共発現させる。さらに別の非限定的例において、第一ロタウイルスタンパク質、例えばＮＳＰ４をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一ヌクレオチド配列(Ｎ１)を、それぞれ第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質、例えばＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７をコードする４ヌクレオチド配列(Ｒ２〜Ｒ５)を含む第二核酸(Ｎ２)と共発現させる。さらに別の非限定的例において、第一ロタウイルスタンパク質、例えばＮＳＰ４をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一ヌクレオチド配列(Ｎ１)を、それぞれ第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質、例えばＶＰ７、ＶＰ６、ＶＰ４およびＶＰ２をコードする４ヌクレオチド配列(Ｒ２〜Ｒ５)を含む第二核酸(Ｎ２)と共発現させる。さらに別の非限定的例において、第一ロタウイルスタンパク質、例えばＶＰ７をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一ヌクレオチド配列(Ｎ１)を、それぞれ第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質、例えばＮＳＰ４、ＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ４をコードする４ヌクレオチド配列(Ｒ２〜Ｒ５)を含む第二核酸(Ｎ２)と共発現させる。さらに別の非限定的例において、第一ロタウイルスタンパク質、例えばＶＰ４をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一ヌクレオチド配列(Ｎ１)を、それぞれ第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質、例えばＮＳＰ４、���Ｐ２、ＶＰ６およびＶＰ７をコードする４ヌクレオチド配列(Ｒ２〜Ｒ５)を含む第二核酸(Ｎ２)と共発現させる。
【０１５３】
第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)を発現する植物を、第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列が植物で共発現されるように、第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ２〜Ｘ５)をコードする４ヌクレオチド配列(Ｒ２〜Ｒ５)を含む第二核酸(Ｎ２)でトランスフォームし得る。さらに、ロタウイルスタンパク質Ｘ２〜Ｘ５をコードする４ヌクレオチド配列(Ｒ２〜Ｒ５)を含む第一核酸(Ｎ２)を発現する植物を、第一および第二ヌクレオチド配列Ｒ１〜Ｒ５が植物で共発現されるように、ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第二核酸(Ｎ１)でトランスフォームしてよい。ロタウイルスタンパク質Ｘ１はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、ロタウイルスタンパク質Ｘ２〜Ｘ５はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよいが、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４が発現されるように、Ｘ１ではない。さらに、植物を、第一および第二ヌクレオチド配列Ｒ１〜Ｒ５が植物で共発現されるように、ロタウイルスタンパク質Ｘ２〜Ｘ５をコードする４ヌクレオチド配列(Ｒ２〜Ｒ５)を含む第一核酸(Ｎ２)およびロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)で同時に共トランスフォームし得る。ロタウイルスタンパク質Ｘ１はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、ロタウイルスタンパク質Ｘ２〜Ｘ５は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよいが、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４が発現されるように、Ｘ１で選択したタンパク質ではない。第一核酸(Ｎ１)および第二核酸(Ｎ２)を、植物に、一過性にまたは安定的に導入し得る。
【０１５４】
限定と解釈すべきではない例として、第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)、例えばＮＳＰ４をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)を発現する植物を、ＮＳＰ４、ＶＰ７、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ２が植物で共発現されるように、第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ２〜Ｘ５)、例えばＶＰ７、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ２をコードする４ヌクレオチド配列(Ｒ２〜Ｒ５)をコードする第二核酸(Ｎ２)でトランスフォームし得る。
【０１５５】
第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)を発現する第一植物を、第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ２〜Ｘ５)をコードする４ヌクレオチド配列(Ｒ２〜Ｒ５)を含む第二核酸(Ｎ２)を発現する第二植物と交配させて、該第一、第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ１〜Ｘ５)を共発現する子孫植物(第三植物)を産生し得る。さらに、ロタウイルスタンパク質Ｘ２〜Ｘ５をコードする４ヌクレオチド配列(Ｒ２〜Ｒ５)を含む第一核酸(Ｎ２)を発現する第一植物を、ヌクレオチド配列Ｒ１〜Ｒ５が子孫植物で共発現されるように、ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)を発現する第二植物と交配させ得る。ロタウイルスタンパク質は、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、ここで、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４は、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４が子孫植物で発現されるように１回選択する。
【０１５６】
ＶＰ４は、適当なプロテアーゼ、例えば、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、スブチリシンをコードする核酸の共発現により、宿主内でＶＰ５およびＶＰ８を産生するようにプロセシングまたは開裂され得る。あるいは、ＶＰ４は、ＲＬＰ抽出物の任意の工程中またはＲＬＰ精製後、適当なプロテアーゼ、例えば、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼ、スブチリシンの添加により、プロセシングし得る。
【０１５７】
２.２  三重遺伝子構築物＋デュアル遺伝子構築物
本発明はまた、それぞれ第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)および第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)をコードする２ヌクレオチド配列(Ｒ１およびＲ２)を含む第一核酸(Ｎ１)を、第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列が植物で共発現されるように、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ３〜Ｘ５)をコードする３ヌクレオチド配列(Ｒ３〜Ｒ５)を含む第二核酸(Ｎ２)と共発現させる、植物においてＲＬＰを産生する方法も提供する(表１、組み合わせ番号２.２参照)。
【０１５８】
非限定的例において、Ｎ１はヌクレオチド配列(Ｒ１、Ｒ２)を含み、Ｎ２はヌクレオチド配列(Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５)を含み、ここで、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質がコードされ、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ５は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ５は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３およびＲ５は、Ｘ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ５はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ４は、Ｘ５ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０１５９】
それゆえに、第一核酸(Ｎ１)は、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４をコードし得るヌクレオチド配列Ｒ１およびＲ１によりコード化されないＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質をコードし得る第二ヌクレオチド配列Ｒ２を含み得る。第二核酸(Ｎ２)はヌクレオチド配列Ｒ３〜Ｒ５を含んでよく、ここで、Ｒ３〜Ｒ５は、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４をコードするが、Ｒ１またはＲ２によりコード化されるロタウイルスタンパク質をコードしない。限定と解釈すべきではない例として、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ２をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５はロタウイルスタンパク質ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４をいずれの順番でコードしてもよいが、Ｒ２〜Ｒ５はＶＰ２をコードし得ない。他の非限定的例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ４をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５は、任意の順番で、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４をコードしてよい。さらに他の例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５は、任意の順番でロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ７およびＮＳＰ４をコードしてよい。さらに別の非限定的例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ７をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５は、任意の順番でロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４をコードしてよい。さらに別の非限定的例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５は、任意の順番でロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７をコードしてよい。
【０１６０】
第一および第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ１＋Ｘ２)をコードする第一および第二ヌクレオチド配列(Ｒ１＋Ｒ２)を含む第一核酸(Ｎ１)を発現する植物を、第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列が植物で共発現されるように、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ３〜Ｘ５)をコードする３ヌクレオチド配列(Ｒ３〜Ｒ５)を含む第二核酸(Ｎ２)でトランスフォームし得る。第一核酸(Ｎ１)および第二核酸(Ｎ２)を、植物に、一過性様式または安定性様式で導入し得る。
【０１６１】
さらに、第一、第二および第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ３〜Ｘ５)をコードする３ヌクレオチド配列(Ｒ３〜Ｒ５)を含む第一核酸(Ｎ２)を発現する植物を、第一および第二核酸Ｒ１〜Ｒ５が植物で共発現されるように、第四ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第二核酸(Ｎ１)でトランスフォームし得る。ロタウイルスタンパク質Ｘ１はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、ロタウイルスタンパク質Ｘ２〜Ｘ５はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよいが、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４が発現されるように、Ｘ１ではない。限定と解釈すべきではない例として、第一、第二および第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ３〜Ｘ５)、例えばＶＰ７、ＶＰ４およびＶＰ６をコードするヌクレオチド配列(Ｒ３〜Ｒ５)を含む第一核酸(Ｎ２)を発現する植物を、ＮＳＰ４、ＶＰ７、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ２が植物で共発現されるように、第四および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ１〜〜Ｘ２)、例えばＶＰ２およびＮＳＰ４をコードする第四および第五ヌクレオチド配列(Ｒ１〜Ｒ２)を含む第二核酸(Ｎ１)でトランスフォームし得る。さらに、植物を、第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列が植物で共発現されるように、第一および第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ１＋Ｘ２)をコードする第一および第二ヌクレオチド配列(Ｒ１＋Ｒ２)を含む第一核酸(Ｎ１)および第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ３〜Ｘ５)をコードする３ヌクレオチド配列(Ｒ３〜Ｒ５)を含む第二核酸(Ｎ２)で同時に共トランスフォームし得る。第一核酸(Ｎ１)および第二核酸(Ｎ２)を、植物に、一過性にまたは安定的に導入し得る。
【０１６２】
第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)および第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第一核酸(Ｎ１)を発現する第一植物を、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ３〜Ｘ５)をコードする３ヌクレオチド配列(Ｒ３〜Ｒ５)を含む第二核酸(Ｎ２)を発現する第二植物と交配させて、該第一、第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ１〜Ｘ５)を共発現する子孫植物(第三植物)を産生し得る。さらに、ロタウイルスタンパク質Ｘ３〜Ｘ５をコードする３ヌクレオチド配列(Ｒ３〜Ｒ５)を含む第一核酸(Ｎ２)を発現する第一植物を、ヌクレオチド配列Ｒ１〜Ｒ５が子孫植物で共発現されるように、ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)および第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を発現する第二植物と交配させ得る。ロタウイルスタンパク質は、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、ここで、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４は、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４が子孫植物で発現されるように１回選択する。
【０１６３】
２.３  三重遺伝子構築物＋単一遺伝子構築物
本発明はまた、第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードする１ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)を、第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列が植物において共発現されるように、第二、第三および第四ロタウイルスタンパク質(Ｘ２〜Ｘ４)をコードする３ヌクレオチド配列(Ｒ２〜Ｒ４)を含む第二核酸(Ｎ２)と共発現させる、植物においてＲＬＰを産生する方法も提供する(表１、組み合わせ番号２.３参照)。
【０１６４】
非限定的例において、Ｎ１はヌクレオチド配列(Ｒ１)を含み、Ｎ２はヌクレオチド配列(Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４)を含み、ここで、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質がコードされ、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ４は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ４は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３はＸ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０１６５】
さらなる非限定的例において、Ｎ１はヌクレオチド配列(Ｒ１)を含み、Ｎ２はヌクレオチド配列(Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４)を含み、ここで、ＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質がコードされ、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ４は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ４は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４はＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３はＸ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０１６６】
さらに別の非限定的例において、Ｎ１はヌクレオチド配列(Ｒ１)を含み、Ｎ２はヌクレオチド配列(Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４)を含み、ここで、ＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質がコードされ、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ４は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ４は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４はＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３はＸ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０１６７】
２.４  ２個の二重遺伝子構築物
本発明はまた、第一および第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ１〜Ｘ２)をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１〜Ｒ２)を含む第一核酸(Ｎ１)を、第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列が植物で共発現されるように、第三および第四ロタウイルスタンパク質(Ｘ３〜Ｘ４)をコードする２ヌクレオチド配列(Ｒ３〜Ｒ４)を含む第二核酸(Ｎ２)と共発現させる、植物においてＲＬＰを産生する方法も提供する(表１、組み合わせ番号２.４参照)。
【０１６８】
非限定的例において、Ｎ１はクレオチド配列(Ｒ１、Ｒ２)を含み、Ｎ２はヌクレオチド配列(Ｒ３、Ｒ４)を含み、ここで、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質がコードされ、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ４は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ４は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３はＸ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０１６９】
さらなる非限定的例において、Ｎ１はヌクレオチド配列(Ｒ１、Ｒ２)を含み、Ｎ２はヌクレオチド配列(Ｒ３、Ｒ４)を含み、ここで、ＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質がコードされ、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ４は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ４は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４はＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３はＸ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０１７０】
さらに別の非限定的例において、Ｎ１はヌクレオチド配列(Ｒ１、Ｒ２)を含み、Ｎ２はヌクレオチド配列(Ｒ３、Ｒ４)を含み、ここで、ＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質がコードされ、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ４は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ４は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４はＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３はＸ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０１７１】
２.５  二重遺伝子構築物＋単一遺伝子構築物
本発明はまた、第一および第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ１〜Ｘ２)をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１〜Ｒ２)を含む第一核酸(Ｎ１)を、第一、第二および第三ヌクレオチド配列が植物で共発現されるように、第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ３)をコードするヌクレオチド配列(Ｒ３)を含む第二核酸(Ｎ２)と共発現させる、植物においてＲＬＰを産生する方法も提供する(表１、組み合わせ番号２.５参照)。
【０１７２】
非限定的例において、Ｎ１はヌクレオチド配列(Ｒ１、Ｒ２)を含み、Ｎ２はヌクレオチド配列(Ｒ３)を含み、ここで、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質がコードされ、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ３は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ２はＸ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０１７３】
さらなる非限定的例において、Ｎ１はヌクレオチド配列(Ｒ１、Ｒ２)を含み、Ｎ２はヌクレオチド配列(Ｒ３)を含み、ここで、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質がコードされ、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ３は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ２はＸ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０１７４】
３. ３個の構築物
３.１  ２個のデュアル遺伝子構築物＋１個の単一遺伝子構築物
本発明はまた、第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)および第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第一核酸(Ｎ１)を、第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列が植物で共発現されるように、第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ３)をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)および第四ロタウイルスタンパク質(Ｘ４)をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)を含む第二核酸(Ｎ２)ならびに第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ５)をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む第三核酸(Ｎ３)を共発現させる、植物においてＲＬＰを産生する方法も提供する(表１、組み合わせ番号３.１参照)。
【０１７５】
この非限定的例においては、Ｎ１は(Ｒ１、Ｒ２)を含み、Ｎ２は(Ｒ３、Ｒ４)を含み、Ｎ３は(Ｒ５)を含み、ここで、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質が１回コード化され、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ５は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ５は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３およびＲ５は、Ｘ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ５はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ４は、Ｘ５ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０１７６】
例えば、第一核酸(Ｎ１)は、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４をコードし得るヌクレオチド配列Ｒ１およびＲ１によりコード化されないＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４から選択される任意のロタウイルスタンパク質をコードし得る第二ヌクレオチド配列Ｒ２を含み得る。第二ヌクレオチド配列はヌクレオチド配列Ｒ３およびＲ４を含んでよく、ここで、Ｒ３はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４をコードするが、Ｒ１またはＲ２によりコード化されるロタウイルスタンパク質ではなく、Ｒ４はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４をコードするが、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３によりコード化されるロタウイルスタンパク質ではない。第三ヌクレオチド配列はヌクレオチド配列Ｒ５を含んでよく、ここで、Ｒ５は、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４をコードするが、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４の各々が宿主で発現されるように、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ２またはＲ４によりコード化されたロタウイルスタンパク質ではない。
【０１７７】
限定と解釈すべきではない例として、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ２をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５はロタウイルスタンパク質ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４をいずれの順番でコードしてもよいが、Ｒ２〜Ｒ５はＶＰ２をコードし得ない。他の例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ４をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５は、任意の順番で、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４をコードしてよい。さらに他の例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５は、任意の順番でロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ７およびＮＳＰ４をコードしてよい。さらに別の非限定的例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ７をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５は、任意の順番でロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４をコードしてよい。さらに別の非限定的例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５は、任意の順番でロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７をコードしてよい。
【０１７８】
限定と解釈すべきではない例として、第一ロタウイルスタンパク質、例えばＶＰ６をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)および第二ロタウイルスタンパク質、例えばＶＰ２をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第一核酸(Ｎ１)を、第三ロタウイルスタンパク質、例えばＶＰ７をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)および第四ロタウイルスタンパク質、例えばＶＰ４をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)を含む第二核酸(Ｎ２)ならびに第五ロタウイルスタンパク質、例えばＮＳＰ４をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む第三核酸(Ｎ３)と共発現させる(図２および３参照)。
【０１７９】
第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)を発現する植物および第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)を、第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ３)をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)および第四ロタウイルスタンパク質(Ｘ４)をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)を含む第二核酸(Ｎ２)でトランスフォームし得る。植物を、さらに、第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列が植物で共発現されるように、第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ５)をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む第三核酸(Ｒ３)でトランスフォームし得る。ロタウイルスタンパク質Ｘ１〜Ｘ５は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択でき、ここで、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４が植物で発現されるように、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４は１回選択される。さらに、植物を、第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列が植物で共発現されるように、第一および第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ１＋Ｘ２)をコードする第一および第二ヌクレオチド配列(Ｒ１＋Ｒ２)を含む第一核酸(Ｎ１)、第三および第四ロタウイルスタンパク質(Ｘ３＋Ｘ４)をコードする第三および第四ヌクレオチド配列(Ｒ３＋Ｒ４)を含む第二核酸(Ｎ２)ならびに第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ５)をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む第三核酸(Ｎ３)で同時に共トランスフォームし得る。第一核酸(Ｎ１)、第二核酸(Ｎ２)および第三核酸(Ｎ３)を、植物に、一過性にまたは安定的に導入し得る。
【０１８０】
３.２  ２個の単一遺伝子構築物＋１個の三重遺伝子構築物
第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)を、第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列が植物で共発現されるように、第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第二核酸(Ｎ２)および第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ３)をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)、第四ロタウイルスタンパク質(Ｘ４)をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ５)をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む第三核酸(Ｎ３)と共発現させる、植物においてＲＬＰを産生する別法も提供する(表１、組み合わせ番号３.２参照)。
【０１８１】
別の例において、Ｎ１は(Ｒ１)を含み、Ｎ２は(Ｒ２)を含み、Ｎ３は(Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５)を含み、ここで、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質が１回コード化され、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ５は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ５は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３およびＲ５は、Ｘ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ５はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ４は、Ｘ５ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０１８２】
限定と解釈すべきではない例として、第一核酸(Ｎ１)は、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４をコードし得るヌクレオチド配列Ｒ１およびＲ１によりコード化されないＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４から選択される任意のロタウイルスタンパク質をコードし得る第二ヌクレオチド配列Ｒ２を含み得る。第二ヌクレオチド配列はヌクレオチド配列Ｒ３およびＲ４を含んでよく、ここで、Ｒ３はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４をコードするが、Ｒ１またはＲ２によりコード化されるロタウイルスタンパク質ではなく、Ｒ４はロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４をコードするが、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３によりコード化されるロタウイルスタンパク質ではない。第三ヌクレオチド配列はヌクレオチド配列Ｒ５を含んでよく、ここで、Ｒ５は、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４をコードするが、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４によりコード化されるロタウイルスタンパク質ではなく、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７またはＮＳＰ４は１回コード化される。例えばヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ２をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５はロタウイルスタンパク質ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４をいずれの順番でコードしてもよいが、Ｒ２〜Ｒ５はＶＰ２をコードし得ない。他の例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ４をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５は、任意の順番で、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４をコードしてよい。さらに他の例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５は、任意の順番でロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ７およびＮＳＰ４をコードしてよい。さらに他の例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ７をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５は、任意の順番でロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４をコードしてよい。さらに他の例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５は、任意の順番でロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７をコードしてよい。
【０１８３】
第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)を発現する植物を、第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第二核酸(Ｎ２)でトランスフォームし得る。植物を、第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列が植物で共発現されるように、第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ３)をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)、第四ロタウイルスタンパク質(Ｘ４)をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ５)をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む第三核酸(Ｎ３)でさらにトランスフォームし得る。ロタウイルスタンパク質Ｘ１〜Ｘ５は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択でき、ここで、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４が植物で発現されるように、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４は１回選択される。さらに、植物を、第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列が植物で共発現されるように、第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)、第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第二核酸(Ｎ２)ならびに第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ３〜Ｘ５)をコードする第三、第四および第五ヌクレオチド配列(Ｒ３〜Ｒ５)を含む第三核酸(Ｎ３)で同時に共トランスフォームし得る。第一核酸(Ｎ１)、第二核酸(Ｎ２)および第三核酸(Ｎ３)を、植物に、一過性にまたは安定的に導入し得る。
【０１８４】
例えば、第一、第二および第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ１、Ｘ２およびＸ３)をコードする第一、第二および第三ヌクレオチド配列(Ｒ１、Ｒ２およびＲ３)を含む第一核酸(Ｎ１)を発現する第一植物を、第四ロタウイルスタンパク質(Ｘ４)をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)を含む第二核酸(Ｎ２)を発現する第二植物と交配させて、子孫植物(第三植物)を産生し得る。第三植物を、第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ５)をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む第三核酸(Ｎ３)を発現する第四植物と交配させて、第一、第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ１〜Ｘ５)を共発現する子孫植物を産生し得る。さらに、第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)を発現する第一植物を、第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第二核酸(Ｎ２)を発現する第二植物と交配させて、子孫植物(第三植物)を産生し得る。第三植物を、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ３、Ｘ４およびＸ５)をコードする第三、第四および第五ヌクレオチド配列(Ｒ３、Ｒ４およびＲ５)を含む第三核酸(Ｎ３)を発現する第四植物と交配させて、第一、第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ１〜Ｘ５)を共発現する子孫植物を産生し得る。ロタウイルスタンパク質Ｘ１〜Ｘ５は、植物で各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４が発現されるように、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択され得る。
【０１８５】
３.３  ２個の単一遺伝子構築物＋１個のデュアル遺伝子構築物
第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)を、第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列が植物において共発現されるように第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第二核酸(Ｎ２)ならびに第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ３)をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)および第四ロタウイルスタンパク質(Ｘ４)をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)を含む第三核酸(Ｎ３)と共発現させる、植物においてＲＬＰを産生する別法も提供する(表１、組み合わせ番号３.３参照)。
【０１８６】
非限定的例として、Ｎ１は(Ｒ１)を含み、Ｎ２は(Ｒ２)を含み、Ｎ３は(Ｒ３、Ｒ４)を含み、ここで、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質は１回コード化され、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ４は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ４は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３はＸ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０１８７】
他の非限定的例として、Ｎ１は(Ｒ１)を含み、Ｎ２は(Ｒ２)を含み、Ｎ３は(Ｒ３、Ｒ４)を含み、ここで、ＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質は１回コード化され、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ４は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ４は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４はＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３はＸ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０１８８】
さらなる非限定的例として、Ｎ１は(Ｒ１)を含み、Ｎ２は(Ｒ２)を含み、Ｎ３は(Ｒ３、Ｒ４)を含み、ここで、ＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質は１回コード化され、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ４は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ４は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４はＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３はＸ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０１８９】
３.４  ３個の単一遺伝子構築物
第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)を、第一、第二および第三ヌクレオチド配列が植物で共発現されるように、第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第二核酸(Ｎ２)および第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ３)をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)含む第三核酸(Ｎ３)と共発現させる、植物においてＲＬＰを産生する別法も提供する(表１、組み合わせ番号３.４参照)。
【０１９０】
非限定的例として、Ｎ１は(Ｒ１)を含み、Ｎ２は(Ｒ２)を含み、Ｎ３は(Ｒ３)を含み、ここで、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質は１回コード化され、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ３は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ２はＸ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０１９１】
さらなる非限定的例として、Ｎ１は(Ｒ１)を含み、Ｎ２は(Ｒ２)を含み、Ｎ３は(Ｒ３)を含み、ここで、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質は１回コード化され、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ３は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ２はＸ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０１９２】
４. ４個の構築物
４.１  ３個の単一遺伝子構築物＋１個のデュアル遺伝子構築物
またここに提供されるのは、第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)を、第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列が植物で共発現されるように、第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第二核酸(Ｎ２)、第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ３)をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)含む第三核酸(Ｎ３)ならびに第四ロタウイルスタンパク質(Ｘ４)をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ５)をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む第四核酸(Ｎ４)と共発現させる、植物においてＲＬＰを産生する方法である(表１、組み合わせ番号４.１参照)。
【０１９３】
この例において、Ｎ１は(Ｒ１)を含み、Ｎ２は(Ｒ２)を含み、Ｎ３は(Ｒ３)を含み、Ｎ４は(Ｒ４およびＲ５)を含み、ここで、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質がコードされ、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ５は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ５は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３およびＲ５は、Ｘ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ５はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ４は、Ｘ５ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０１９４】
４核酸は、任意の順番で植物に導入され得る。限定と解釈すべきではない例として、第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)を発現する植物を、第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第二核酸(Ｎ２)でトランスフォームし得る。植物を、さらに、第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ３)をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)含む第三核酸(Ｎ３)でトランスフォームし得る。さらに、植物を、第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列が植物で共発現されるように、第四ロタウイルスタンパク質(Ｘ４)をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ５)をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む第四核酸(Ｎ４)でトランスフォームし得る。さらに、植物を、第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列が植物で共発現されるように、第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)、第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第二核酸(Ｎ２)、第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ３)をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)含む第三核酸(Ｎ３)および第四および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ４〜Ｘ５)をコードする第四および第五ヌクレオチド配列(Ｒ４〜Ｒ５)を含む第四核酸(Ｎ４)で同時に共トランスフォームし得る。第一核酸(Ｎ１)、第二核酸(Ｎ２)、第三核酸(Ｎ３)および第四核酸(Ｎ４)を、植物に、一過性にまたは安定的に導入し得る。
【０１９５】
さらに、第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ４)をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ４)および第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ５)をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む第一核酸(Ｎ４)を発現する植物を、第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第二核酸(Ｎ１)でトランスフォームし得る。植物を、さらに、第四ロタウイルスタンパク質(Ｘ３)をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第三核酸(Ｎ２)でトランスフォームし得る。次いで、植物を、さらに、第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列が植物で共発現されるように、第五ロタウイルスタンパク質をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ３)および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ３)をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ３)を含む第四核酸(Ｎ３)でさらにトランスフォームし得る。ロタウイルスタンパク質Ｘ１〜Ｘ５は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択でき、ここで、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４が植物で発現されるように、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４は１回選択される。第一核酸(Ｎ４)、第二核酸(Ｎ１)、第三核酸(Ｎ２)および第四核酸(Ｎ３)を、植物に、一過性にまたは安定的に導入し得る。
【０１９６】
第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)を発現する第一植物を、第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第二核酸(Ｎ２)を発現する第二植物と交配させて、子孫植物(第三植物)を産生し得る。第三植物を、第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ３)をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)含む第三核酸(Ｎ３)を発現する第四植物と交配させて、子孫植物(第五植物)を産生し得る。第五植物を、第四ロタウイルスタンパク質(Ｘ４)をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ５)をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む第四核酸(Ｎ４)を発現する第六植物と交配させて、第一、第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ１〜Ｘ５)を共発現する子孫植物を産生し得る。
【０１９７】
さらに、第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ４)をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ４)および第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ５)をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む第一核酸(Ｎ４)を発現する第一植物を、第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第二核酸(Ｎ２)を発現する第二植物と交配させて、子孫植物(第三植物)を産生し得る。第三植物を、第四ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第三核酸(Ｎ２)を発現する第四植物と交配させて、子孫植物(第五植物)を産生し得る。第五植物を、第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ３)をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ３)を発現する第六植物と交配させて、第一、第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ１〜Ｘ５)を共発現する子孫植物を産生し得る。ロタウイルスタンパク質Ｘ１〜Ｘ５は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択でき、ここで、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４が植物で発現されるように、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４は１回選択される。
【０１９８】
４.２  ４個の単一遺伝子構築物
またここに提供されるのは、第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)を、第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列が植物で共発現されるように、第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第二核酸(Ｎ２)、第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ３)をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)含む第三核酸(Ｎ３)および第四ロタウイルスタンパク質(Ｘ４)をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)を含む第四核酸(Ｎ４)と共発現させる、植物においてＲＬＰを産生する方法である(表１、組み合わせ番号４.２参照)。
【０１９９】
非限定的例において、Ｎ１は(Ｒ１)を含み、Ｎ２は(Ｒ２)を含み、Ｎ３は(Ｒ３)を含み、Ｎ４は(Ｒ４)を含み、ここで、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質がコードされ、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ４は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ４は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３はＸ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０２００】
他の非限定的例において、Ｎ１は(Ｒ１)を含み、Ｎ２は(Ｒ２)を含み、Ｎ３は(Ｒ３)を含み、Ｎ４は(Ｒ４)を含み、ここで、ＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質がコードされ、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ４は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ４は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４はＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３はＸ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０２０１】
さらなる非限定的例において、Ｎ１は(Ｒ１)を含み、Ｎ２は(Ｒ２)を含み、Ｎ３は(Ｒ３)を含み、Ｎ４は(Ｒ４)を含み、ここで、ＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質がコードされ、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ４は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ４は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４はＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４の群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３はＸ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ６およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０２０２】
５. ５個の構築物
５. ５個の単一遺伝子構築物
本発明はまた、第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)を、第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列が植物で共発現されるように、第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第二核酸(Ｎ２)および第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ３)をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)含む第三核酸(Ｎ３)および第四ロタウイルスタンパク質(Ｘ４)をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)を含む第四核酸(Ｎ４)および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ５)をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む第五核酸(Ｒ５)と共発現させる、植物においてＲＬＰを産生する方法も提供する(表１、組み合わせ番号５参照)。
【０２０３】
この非限定的例においては、Ｎ１は(Ｒ１)を含み、Ｎ２は(Ｒ２)を含み、Ｎ３は(Ｒ３)を含み、Ｎ４は(Ｒ４)を含み、Ｎ５は(Ｒ５)を含み、ここで、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択される各ロタウイルスタンパク質およびここで、Ｒ１はロタウイルスタンパク質Ｘ１をコードし、Ｘ１はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ２〜Ｒ５は、Ｘ１ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ２はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１およびＲ３〜Ｒ５は、Ｘ２ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ３はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、Ｘ３ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ４はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ３およびＲ５は、Ｘ４ではないロタウイルスタンパク質をコードし、Ｘ５はＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰからなる群から選択される任意のロタウイルスタンパク質であってよく、Ｒ１〜Ｒ４は、Ｘ５ではないロタウイルスタンパク質をコードし、その結果、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４が宿主で発現される。
【０２０４】
限定と解釈すべきではない例として、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ２をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５はロタウイルスタンパク質ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４をいずれの順番でコードしてもよいが、Ｒ２〜Ｒ５はＶＰ２をコードし得ない。他の非限定的例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ４をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５は、任意の順番で、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４をコードしてよい。さらに別の非限定的例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ６をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５は、任意の順番でロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ７およびＮＳＰ４をコードしてよい。限定と見なしてはならないさらに他の例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＶＰ７をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５は、任意の順番でロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＮＳＰ４をコードしてよい。さらに別の非限定的例において、ヌクレオチド配列Ｒ１はロタウイルスタンパク質ＮＳＰ４をコードしてよく、ヌクレオチド配列Ｒ２〜Ｒ５は、任意の順番でロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７をコードしてよい。
【０２０５】
限定と解釈すべきではない例として、第一ロタウイルスタンパク質、例えばＶＰ２をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)を、第二ロタウイルスタンパク質、例えばＶＰ６をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第二核酸(Ｎ２)、第三ロタウイルスタンパク質、例えばＶＰ４をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)を含む第三核酸(Ｎ３)、第四ロタウイルスタンパク質、例えばＶＰ７をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)を含む第四核酸(Ｎ４)および第五ロタウイルスタンパク質、例えばＮＳＰ４をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む第五核酸(Ｎ５)と共発現させる(図３参照)。
【０２０６】
５核酸は、任意の順番で植物に導入され得る。限定と解釈すべきではない例として、第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)を発現する植物を、第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第二核酸(Ｎ２)でトランスフォームし得る。植物を、さらに、第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ３)をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)含む第三核酸(Ｎ３)でトランスフォームし得る。次いで、植物を、さらに第四ロタウイルスタンパク質(Ｘ４)をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)を含む第四核酸(Ｎ４)でトランスフォームし得る。次いで、植物を、第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列が植物で共発現されるように、第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ５)をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む第五核酸(Ｎ５)でトランスフォームし得る。ロタウイルスタンパク質Ｘ１〜Ｘ５は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択でき、ここで、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４が植物で発現されるように、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４は１回選択される。さらに、植物を、第一、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列が植物で共発現されるように、第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)、第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第二核酸(Ｎ２)、第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ３)をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)含む第三核酸(Ｎ３)、第四ロタウイルスタンパク質(Ｘ４)をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)を含む第四核酸(Ｎ４)および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ５)をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む第五核酸(Ｎ５)で同時にトランスフォームし得る。第一核酸(Ｎ１)、第二核酸(Ｎ２)、第三核酸(Ｎ３)、第四核酸(Ｎ４)および第五核酸(Ｎ５)を、植物に、一過性にまたは安定的に導入し得る。
【０２０７】
第一ロタウイルスタンパク質(Ｘ１)をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)を発現する第一植物を、第二ロタウイルスタンパク質(Ｘ２)をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第二核酸(Ｎ２)を発現する第二植物と交配させて、子孫植物(第三植物)を産生し得る。第三植物を、第三ロタウイルスタンパク質(Ｘ３)をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)含む第三核酸(Ｎ３)を発現する第四植物と交配させて、子孫植物(第五植物)を産生し得る。第五植物を、第四ロタウイルスタンパク質(Ｘ４)をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)を含む第四核酸(Ｎ４)を発現する第六植物と交配させて、子孫植物(第七植物)を産生し得る。第七植物を、第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ５)をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む第五核酸(Ｎ５)を発現する第八植物と交配させて、第一、第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質(Ｘ１〜Ｘ５)を共発現する子孫植物を産生し得る。ロタウイルスタンパク質Ｘ１〜Ｘ５は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４の群から選択でき、ここで、各ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４が植物で発現されるように、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４は１回選択される。
【０２０８】
宿主のトランスフォームに使用する核酸(Ｎ)の比
図５に見られるように、植物、植物の一部または植物細胞におけるＲＬＰ蓄積のレベルは、植物で発現されるロタウイルス構造タンパク質および非構造タンパク質をコードする核酸の比の影響を受け得る。限定と解釈すべきではない例として、植物に導入される核酸(Ｎ)の比は、植物、植物の一部または植物細胞の浸潤に使用するアグロバクテリウムの異なる量を提供することにより修飾でき、ここで、各アグロバクテリウムは、上の表１(および付随する本文)に示す核酸(Ｎ)を含む構築物を含む。限定と解釈すべきではない例として、構造タンパク質含有アグロバクテリウム対非構造タンパク質含有アグロバクテリウムの比は、例えば約０.８：１〜約２.５：１.５(構造タンパク質：非構造タンパク質)またはその間の任意の数値、例えば、約０.８：１、０.９：１、１：１、１.１：１、１.２：１、１.３：１、１.４：１、１.５：１、１.６：１、１.７：１、１.８：１、１.９：１、２：０.５、２：１、２.２：１、２.３：１、２.４：１、２.５：１、２.５：１.１、２.５：１.２、２.５：１.３、２.５：１.４、２.５：１.５(構造タンパク質：非構造タンパク質)またはその間の任意の数値の範囲であり得る。例えば、下記のとおり、ロタウイルス構造タンパク質対非構造タンパク質の比は、例えば、種々の比のロタウイルス構造タンパク質および非構造タンパク質(Ｘ)をコードする１以上のヌクレオチド配列(Ｒ)を含む１以上の核酸(Ｎ)を含むアグロバクテリウムを宿主、例えば植物、植物の一部または植物細胞に導入することにより変えることができる。例えば、細菌懸濁液中のアグロバクテリウム株の吸光度または光学密度(ＯＤ)を、構造タンパク質を含むアグロバクテリウム株対非構造タンパク質を含むアグロバクテリウム株の比を確立する指標として使用し得る。限定と解釈されない例として、ＯＤは、例えば約０.２：０.４〜約１：０.６(細菌懸濁液中の構造タンパク質含有アグロバクテリウム株：非構造タンパク質アグロバクテリウム株)またはその間の任意の数値、例えば約０.２：０.４、０.３：０.４、０.４：０.４、０.５：０.４、０.６：０.４、０.７：０.４、０.８：０.４、０.９：０.４、１：０.４、０.２：０.５、０.３：０.５、０.４：０.５、０.５：０.５、０.６：０.５、０.７：０.５、０.８：０.５、０.９：０.５、１：０５、０.２：０.６、０.３：０.６、０.４：０.６、０.５：０.６、０.６：０.６、０.７：０.６、０.８：０.６、０.９：０.６、１：０６、０.３：０.４、０.３：０.５、０.３：０.６、０.４：０.４、０.４：０.５、０.４：０.６、０.５：０.４、０.５：０.５、０.５：０.６、０.６：０.４、０.６：０.５、０.６：０.６、０.７：０.４、０.７：０.５、０.７：０.６、０.８：０.４、０.８：０.５、０.８：０.６、０.９：０.４、０.９：０.５、０.９：０.６、１：０.４、１：０.５、１：０.６(細菌懸濁液中の構造タンパク質含有アグロバクテリウム株：非構造タンパク質アグロバクテリウム株)またはその間の任意の数値の範囲であり得る。限定と解釈されない例として、細菌懸濁液中のアグロバクテリウム株の０.４のＯＤは、１の基準として指定することができる。それゆえに、構造タンパク質対非構造タンパク質の１.５：１の比は、細菌懸濁液における構造タンパク質含有アグロバクテリウム株の０.６のＯ��対非構造タンパク質含有アグロバクテリウム株の０.４のＯＤにより決定され得る。
【０２０９】
ロタウイルス構造タンパク質対非構造タンパク質の比は、例えば植物、植物の一部または植物細胞にロタウイルス構造タンパク質および非構造タンパク質(Ｘ)をコードする１以上のヌクレオチド配列(Ｒ)を含む１以上の核酸(Ｎ)を含むアグロバクテリウムを種々の非で導入することにより変え得る。あるいは、ロタウイルス構造タンパク質および非構造タンパク質が同じ構築物に存在し、それゆえに１アグロバクテリウムを使用して植物、植物の一部または植物細胞に導入されるならば、ロタウイルス構造タンパク質および非構造タンパク質の所望の比が得られるように、適当なプロモーターを使用して、植物、植物の一部または植物細胞で異なって発現させ得る。
【０２１０】
それゆえに、ここに記載するとおり、ロタウイルス構造タンパク質(Ｘ)をコードする１以上のヌクレオチド配列(Ｒ)を含む１以上の核酸(Ｎ)と、ロタウイルス非構造タンパク質(Ｘ)をコードする１以上のヌクレオチド配列(Ｒ)を含む１以上の核酸(Ｎ)の比を調節することにより、ＲＬＰ産生収量増加、ＶＰ４およびＶＰ７収量増加またはＲＬＰＳならびにＶＰ４およびＶＰ７両者の収量増加のための方法が提供される。
【０２１１】
例えば、ロタウイルス非構造タンパク質を含むアグロバクテリウムの比率は、植物、植物の一部または植物細胞浸潤に使用するアグロバクテリウム総量の２０％〜６０％またはその間の任意の率であり得る。例えばロタウイルス非構造タンパク質含有アグロバクテリウムのパーセンテージは、植物、植物の一部または植物細胞浸潤に使用する総アグロバクテリウムの２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％またはその間の任意の率であり得る。同様に、浸潤アグロバクテリウムの総量中の構造タンパク質含有アグロバクテリウムのパーセンテージは、植物、植物の一部または植物細胞浸潤に使用する総アグロバクテリウムの８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％、５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％または４０％またはその間の任意の率であり得る。
【０２１２】
例えば、ロタウイルス構造タンパク質含有アグロバクテリウム対非構造タンパク質含有アグロバクテリウムパーセンテージ比は、７０％：３０％、６０％：４０％、５０％：５０％、４０％：６０％またはその間の任意のパーセンテージ比率であり得る。例えば、構造タンパク質含有アグロバクテリウムと非構造タンパク質含有アグロバクテリウムのパーセンテージ比は、５０％：５０％、５１％：４９％、５２％：４８％、５３％：４７％、５４％：４６％、５５％：４５％、５６％：４４％、５７％：４３％、５８％：４２％、５９％：４１％、６０％：４０％またはその間の任意のパーセンテージ比であり得る。
【０２１３】
下記のとおり、ロタウイルス構造タンパク質対ロタウイルス非構造タンパク質の比は、例えば、ロタウイルス構造タンパク質およびロタウイルス非構造タンパク質を異なって発現させることにより、さらに変わり得る。発現は、ロタウイルス構造タンパク質、ロタウイルス非構造タンパク質またはロタウイルス構造タンパク質およびロタウイルス非構造タンパク質両者の例えば複製、転写、翻訳またはそれらの組み合わせの調節により変え得る。例えば、プロモーター、増幅要素、エンハンサーまたはそれらの組み合わせを含む、異なる制御要素を、上記のとおり、浸潤させたロタウイルス構造タンパク質含有アグロバクテリウム対ロタウイルス非構造タンパク質含有アグロバクテリウムの比の変更に加えて、使用し得る。制御要素の第一セットまたは組み合わせを、ロタウイルス構造タンパク質をコードする１以上のヌクレオチド配列を含む１以上の核酸の複製、転写またはそれらの組み合わせの制御に使用してよく、制御要素の第二セットまたは組み合わせを、ロタウイルス非構造タンパク質をコードする１以上のヌクレオチド配列の複製、転写またはそれらの組み合わせの制御に使用してよい。制御要素の第一セットまたは組み合わせは制御要素の第二セットまたは組み合わせと異なり、インビボでロタウイルス構造タンパク質：ロタウイルス非構造タンパク質の比の調節を可能とするために、ロタウイルス構造タンパク質をコードする１以上のヌクレオチド配列を含む１以上の核酸およびロタウイルス非構造タンパク質をコードする１以上のヌクレオチド配列を含む１以上の核酸の異なった発現を可能とする。
【０２１４】
限定と解釈すべきではない例として、制御要素のあるセットまたは組み合わせ、例えば第一セットは、エンハンサー要素、例えばＣＰＭＶ  ＨＴまたはＣＰＭＶ  １６０のようなＣＰＭＶから得た要素を含み得る(図６参照)。ＣＭＰＶ  ＨＴはＵＳ６１／９７１,２７４号(これは、引用により本明細書に包含させる)に記載され、ＣＰＭＶ  １６０はＵＳ６１／９２５,８５２号(これは、引用により本明細書に包含させる)に記載される。エンハンサー要素、例えばＣＰＭＶ、例えばＣＰＭＶ  ＨＴまたはＣＰＭＶ  １６０から得たもの(図６参照；それぞれＵＳ６１／９７１,２７４号およびＵＳ６１／９２５,８５２号)は、制御要素の他のセットまたは組み合わせ、例えば第二セットに存在しなくてよい。あるいは、第二セットは、エンハンサー要素(例えばＣＰＭＶ、例えばＣＰＭＶ  ＨＴまたはＣＰＭＶ  １６０から得た要素)を含んでよく、同時に増幅要素(例えばＣＰＭＶ、例えばＣＰＭＶ  ＨＴまたはＣＰＭＶ  １６０から得た要素)が、制御要素の第一セットまたは組み合わせに存在しなくてよい。類似の方法で、プロモーターの強度が第一および第二セットまたは制御要素の組み合わせで異なってよく、または、インビボでロタウイルス構造タンパク質対ロタウイルス非構造タンパク質の異なった発現が達成されるように、プロモーターの一方が誘導性であり、他方が構成的であってよい。
【０２１５】
例えば、ロタウイルス構造タンパク質対非構造タンパク質の比は、例えば、第一ロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルス非構造タンパク質ＮＳＰ４をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)を含むアグロバクテリウムと、第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質、例えば任意の順番でロタウイルス構造タンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７をコードする４ヌクレオチド配列(Ｒ２〜Ｒ５)を含む第二核酸(Ｎ２)を含むアグロバクテリウムを、異なる比で導入することにより、変えることができる。例えば、ロタウイルス非構造タンパク質ＮＳＰ４をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)を含むアグロバクテリウム対ロタウイルス構造タンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７をコードする４ヌクレオチド配列(Ｒ２〜Ｒ５)を含む第二核酸(Ｎ２)を含むアグロバクテリウムの比は、０.８：１〜１：２(Ｎ１を含むアグロバクテリウム対Ｎ２を含むアグロバクテリウム)またはその間の任意の量、例えば１：１.５(Ｎ１を含むアグロバクテリウム対Ｎ２を含むアグロバクテリウム)であり得る。
【０２１６】
さらに、ロタウイルス構造タンパク質対非構造タンパク質の比は、エンハンサー要素を使用して、ロタウイルス構造タンパク質に対する非構造タンパク質を、植物、植物の一部または植物細胞内で異なって発現させることにより変えることができる。例えば、ロタウイルス構造タンパク質対非構造タンパク質の比は、例えば、第一ロタウイルスタンパク質、例えば非構造タンパク質ＮＳＰ４をコードするヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)と、第二、第三、第四および第五ロタウイルスタンパク質、例えば任意の順番でロタウイルス構造タンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７をコードする４ヌクレオチド配列(Ｒ２〜Ｒ５)を含む第二核酸(Ｎ２)を、植物、植物の一部または植物細胞内で共発現させることにより変えることができ、ここで、第二、第三、第四および第五ヌクレオチド配列は、下記のとおり、エンハンサー配列、例えばＣＰＭＶ  ＨＴ、ＣＰＭ  １６０、ＣＰＭＶ  １６０＋およびＣＰＭＶ  ＨＴ＋に操作可能に結合される(それぞれ、本明細書に引用により包含させるＵＳ６１／９７１,２７４号およびＵＳ６１／９２５,８５２号に記載)。他の例において、ロタウイルス構造タンパク質対非構造タンパク質の比は、例えば、第一ロタウイルスタンパク質、例えば構造タンパク質ＶＰ６またはＶＰ７をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)および第二ロタウイルスタンパク質、例えば構造タンパク質ＶＰ２またはＶＰ４をコードするおよび第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第一核酸(Ｎ１)、第三ロタウイルスタンパク質、例えば構造タンパク質ＶＰ７またはＶＰ６をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)および第四ロタウイルスタンパク質、例えば構造タンパク質ＶＰ４またはＶＰ２をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)を含む第二核酸(Ｎ２)および第五ロタウイルスタンパク質、例えば非構造タンパク質ＮＳＰ４をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む第三核酸(Ｎ３)を、植物、植物の一部または植物細胞で共発現させることにより変えることができ、ここで、該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列は、下記のとおり、エンハンサー配列、例えばＣＰＭＶ  ＨＴ、ＣＰＭＶ  １６０、ＣＰＭＶ  １６０＋およびＣＰＭＶ  ＨＴ＋に操作可能に結合される。
【０２１７】
他の例において、ロタウイルス構造タンパク質対非構造タンパク質の比は、例えば、第一ロタウイルスタンパク質、例えば構造タンパク質ＶＰ６またはＶＰ７をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)および第二ロタウイルスタンパク質、例えば構造タンパク質ＶＰ２またはＶＰ４をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)、第三ロタウイルスタンパク質、例えば構造タンパク質ＶＰ７またはＶＰ６をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)および第四ロタウイルスタンパク質、例えば構造タンパク質ＶＰ４またはＶＰ２をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)および第五ロタウイルスタンパク質、例えば非構造タンパク質ＮＳＰ４をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む１以上の核酸を植物、植物の一部または植物細胞で共発現させることにより変えることができ、ここで、該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列は、下記のとおりエンハンサー配列、例えばＣＰＭ  １６０、ＣＰＭＶ  １６０＋およびＣＰＭＶ  ＨＴ＋に操作可能に結合され、第五ヌクレオチド配列は、下記のとおりＣＰＭＶ  ＨＴに操作可能に結合される。
【０２１８】
他の例において、ロタウイルス構造タンパク質対非構造タンパク質の比は、例えば、第一ロタウイルスタンパク質、例えば構造タンパク質ＶＰ６またはＶＰ７をコードする第一ヌクレオチド配列(Ｒ１)を含む第一核酸(Ｎ１)、第二ロタウイルスタンパク質、例えば構造タンパク質ＶＰ２またはＶＰ４をコードする第二ヌクレオチド配列(Ｒ２)を含む第二核酸(Ｎ２)、第三ロタウイルスタンパク質、例えば構造タンパク質ＶＰ７またはＶＰ６をコードする第三ヌクレオチド配列(Ｒ３)を含む第三核酸(Ｎ３)、第四ロタウイルスタンパク質、例えば構造タンパク質ＶＰ４またはＶＰ２をコードする第四ヌクレオチド配列(Ｒ４)を含む第四核酸(Ｎ４)および第五ロタウイルスタンパク質、例えば非構造タンパク質ＮＳＰ４をコードする第五ヌクレオチド配列(Ｒ５)を含む第五核酸(Ｎ５)を植物、植物の一部または植物細胞内で共発現させることにより変えることができ、ここで、該第一、第二、第三および第四ヌクレオチド配列は、下記のとおり、エンハンサー配列、例えばＣＰＭＶ  ＨＴ、ＣＰＭＶ  １６０、ＣＰＭＶ  １６０＋およびＣＰＭＶ  ＨＴ＋に操作可能に結合される。
【０２１９】
増幅要素およびエンハンサー要素／制御要素
ロタウイルスタンパク質またはポリペプチドは、ウイルスベースの、ＤＮＡまたはＲＮＡ発現系、例えば、限定しないが、コモウイルスベースの発現カセットおよびジェミニウイルスベースの増幅要素を含む、発現系で発現させ得る。
【０２２０】
エンハンサー要素を使用して、ロタウイルス構造タンパク質および非構造タンパク質の高レベルの一過性発現を達成し得る。エンハンサー要素は、ササゲモザイクウイルスのような、コモウイルスを含むＲＮＡ植物ウイルスに基づき得る(ＣＰＭＶ；例えば、ＷＯ２００７／１３５４８０号；ＷＯ２００９／０８７３９１号；ＵＳ２０１０／０２８７６７０号、Sainsbury F. et al., 2008, Plant Physiology; 148: 121-1218; Sainsbury F. et al., 2008, Plant Biotechnology Journal; 6: 82-92; Sainsbury F. et al., 2009, Plant Biotechnology Journal; 7: 682-693; Sainsbury F. et al. 2009, Methods in Molecular Biology, Recombinant Proteins From Plants, vol. 483: 25-39参照)。
【０２２１】
ＣＰＭＶ  １６０(ＣＰＭＶＸ)およびＣＰＭＶ  １６０＋(ＣＰＭＶＸ＋)
ある態様において、エンハンサー要素は、“ＣＰＭＶＸ”(別名“ＣＰＭＶ  １６０”)および／または“ＣＰＭＶＸ＋”(別名“ＣＰＭＶ  １６０＋”)と称され、ＵＳ６１／９２５,８５２号(これは、引用により本明細書に包含させる)に記載される。
【０２２２】
発現エンハンサー“ＣＰＭＶＸ”は、コモウイルスササゲモザイクウイルス(ＣＰＭＶ)５'非翻訳領域(ＵＴＲ)を含む。ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２配列(配列番号１)のヌクレオチド１〜１６０からの５'ＵＴＲは、転写開始部位から第一フレーム内開始コドン(１６１位)で開始し、これは、野生型コモウイルスゲノムセグメントによりコード化される２個のカルボキシコターミナルタンパク質の長い方の産生の開始部位として働く。さらに、ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノム配列の１１５位の(または対応する)‘第三'開始部位も変異、欠失または他に改変させてよい。ＡＵＧ  １６１の除去に加えて、ＡＵＧ  １１５の除去は、不完全Ｍタンパク質と組み合わせたとき、発現を増強することが示されている(Sainsbury and Lomonossoff, 2008, Plant Physiology; 148: 1212-1218；ＷＯ２００９／０８７３９１号；これらは、引用により本明細書に包含させる)。
【０２２３】
ＣＰＭＶＸは、配列番号１のＸヌクレオチド(ここで、Ｘ＝配列番号１の１６０、１５５、１５０または１１４である)またはＣＰＭＶＸと８０％〜１００％配列類似性を含む配列(ここで、Ｘ＝配列番号９３の１６０、１５５、１５０または１１４)を含む。この発現エンハンサーは、一般にＣＰＭＶＸと称される(図６ｃ参照)。
【０２２４】
発現エンハンサーＣＰＭＶＸ(ここで、Ｘ＝１６０)は、配列番号１のヌクレオチド１〜１６０からなる。
【化１】
2018504119.tif 000004
【０２２５】
ＣＰＭＶＸエンハンサー配列を、さらに、スタッファー配列と融合させてよく、ここで、ＣＭＰＶＸは配列番号１のＸヌクレオチド(ここで、Ｘ＝配列番号１の１６０、１５５、１５０または１１４またはＣＰＭＶＸと８０〜１００％配列類似性を含む配列(ここで、Ｘ＝配列番号１の１６０、１５５、１５０または１１４)を含み、スタッファー配列は、ＣＭＰＶＸ配列の３'末端に融合した１〜１００ヌクレオチドを含む。例えば、スタッファー配列は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ヌクレオチドまたはその間の任意の数のヌクレオチドを含み得る。
【０２２６】
ＣＭＰＶＸ配列がスタッファーフラグメントを含むならば、この発現エンハンサーはＣＰＭＶＸ＋と称し(図６ｄ)、ここで、Ｘ＝配列番号１の１６０、１５５、１５０、１１４であり、これはまた、スタッファー配列を含むＣＭＰＶＸと称しても、それぞれ、Ｘ＝１６０、１５５、１５０または１１４であるとき、ＣＰＭＶ１６０＋；ＣＰＭＶ１５５＋；ＣＰＭＶ１５０＋；ＣＰＭＶ１１４＋と称してもよい。スタッファー配列を含まないＣＰＭＶＸを含む構築物は、ＣＰＭＶＸ＋と称してよく、ここで、Ｘ＝配列番号１の１６０、１５５、１５０、１１４であり、スタッファー配列は０ヌクレオチド長である。
【０２２７】
スタッファー配列は、ヌクレオチド１６０の３'に位置する天然ＣＭＰＶ５'ＵＴＲ配列の短縮化、欠失または置換により修飾し得る。修飾スタッファー配列は、５'ＵＴＲに結合した最初のまたは未修飾(すなわち天然)スタッファー配列と比較して、除去され、置換され、切断されまたは短縮されていてよい(Sainsbury F., and Lomonossoff G.P., 2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218に記載のとおり)。スタッファー配列は、１以上の制限部位(ポリリンカー、複数クローニング部位、１以上のクローニング部位)、１以上の植物コザック配列、１以上のリンカー配列、１以上の組み換え部位またはそれらの組み合わせを含み得る。限定と解釈すべきではない例として、スタッファー配列は、連続して、植物コザック配列に融合した所望の長さの複数クローニング部位を含み得る。スタッファー配列は、天然ＣＰＭＶ  ５'ＵＴＲのヌクレオチド１６０の３'に位置する天然５'ＵＴＲ配列からのヌクレオチド配列、例えば、Sainsbury F.およびLomonossoff G.P.(2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218；これは、引用により本明細書に包含させる)の図１に示すヌクレオチド１６１〜５１２または先行技術ＣＰＭＶ  ＨＴ配列のヌクレオチド１６１〜５０９を含まない。すなわち、先行技術ＣＰＭＶ  ＨＴ配列(Sainsbury F., and Lomonossoff G.P., 2008の図１)に存在する不完全Ｍタンパク質が、本発明の５'ＵＴＲから除去される。
【０２２８】
植物コザックコンセンサス配列は、当分野で知られる(例えばRangan et al. Mol. Biotechnol., 2008, July 39(3), pp. 207-213参照)。天然に存在するおよび合成両者のコザック配列を発現エンハンサーに使用しても、ここに記載する目的のヌクレオチド配列に融合してもよい。
【０２２９】
植物コザック配列は、次の植物コンセンサス配列を含むが、これらに限定されないあらゆる既知植物コザック配列であり得る(例えばL. Rangan et. al. Mol. Biotechnol.2008参照)。
ｃａＡ(Ａ／Ｃ)ａ    (配列番号２；植物界)
ａａＡ(Ａ／Ｃ)ａ    (配列番号３；双子葉類)
ａａ(Ａ／Ｇ)(Ａ／Ｃ)ａ    (配列番号４；シロイヌナズナ)
植物コザック配列または
ＡＧＡＡＡ  (配列番号５)
ＡＧＡＣＡ  (配列番号６)
ＡＧＧＡＡ  (配列番号７)
ＡＡＡＡＡ  (配列番号８)
ＡＡＡＣＡ  (配列番号９)
ＡＡＧＣＡ  (配列番号１０)
ＡＡＧＡＡ  (配列番号１１)
ＡＡＡＧＡＡ  (配列番号１２)
ＡＡＡＧＡＡ  (配列番号１３)
(Ａ／−)Ａ(Ａ／Ｇ)(Ａ／Ｇ)(Ａ／Ｃ)Ａ(配列番号１４；コンセンサス配列)
からなる群から選択され得る。
【０２３０】
発現エンハンサーＣＰＭＶＸまたはＣＰＭＶＸ＋は、植物宿主内での目的のヌクレオチド配列の発現を駆動するためいん、エンハンサー配列の５'末端で、植物で活性である制御領域と操作可能に結合し、目的のヌクレオチド配列に発現エンハンサーの３'末端で操作可能に結合し得る(図６ｃ)。
【０２３１】
ＣＰＭＶ  ＨＴ＋、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋[ＷＴ１１５]、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋[５１１]
他の態様において、エンハンサー要素は、ＵＳ６１／９７１,２７４号(これは、引用により本明細書に包含させる)に記載する“ＣＰＭＶ  ＨＴ＋”である。発現エンハンサー“ＣＰＭＶ  ＨＴ＋”(図６ｂ参照)は、コモウイルス５'非翻訳領域(ＵＴＲ)および修飾、延長または切断スタッファー配列を含む。
【０２３２】
１または１を超えるここに記載する発現エンハンサー(例えばＣＰＭＶ  ＨＴ＋、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋[ＷＴ１１５]、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋[５１１])に操作可能に結合した制御領域ならびにロタウイルス構造タンパク質または非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第一核酸配列を含む植物発現系も提供される。さらに、ロタウイルス構造タンパク質または非構造タンパク質をコードする１以上の核酸配列に融合した植物コザック配列と共にプロモーター(制御領域)配列、コモウイルス５'ＵＴＲおよびスタッファー配列を含む発現エンハンサー(例えばＣＰＭＶ  ＨＴ＋またはＣＰＭＶ  ＨＴ＋[ＷＴ１１５])を含む核酸が記載される。核酸は、さらに、ロタウイルス構造タンパク質または非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、コモウイルス３'非翻訳領域(ＵＴＲ)、プラストシアニン３'ＵＴＲまたは他の３'ＵＴＲ配列の上流に挿入されるように、ロタウイルス構造タンパク質または非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列(図６ａで目的のヌクレオチドと称する)の３'末端に操作可能に結合した、コモウイルス３'非翻訳領域(ＵＴＲ)、例えば、プラストシアニン３'ＵＴＲまたは植物で活性な他の３'ＵＴＲおよびターミネーター配列、例えばＮＯＳターミネーターを含む配列を含み得る。
【０２３３】
配列番号１５は、先行技術(例えばSainsbury and Lomonossoff 2008, Plant Physiol. 148: pp. 1212-1218の図１；これは、引用により本明細書に包含させる)で知られる、“ＣＰＭＶ  ＨＴ”発現エンハンサーを含む。ＣＰＭＶ  ＨＴは、配列番号１５のヌクレオチド１〜１６０の５'ＵＴＲ配列を含み、１１５位(ｃｇｔ)に修飾ヌクレオチドおよび１６２位(ａｃｇ)に修飾ヌクレオチドを伴う不完全Ｍタンパク質を伴い、植物コザック配列を欠く(５'ＵＴＲ：ヌクレオチド１〜１６０；不完全Ｍタンパク質下線、ヌクレオチド１６１〜５０９)。配列番号１５はまた先行技術ＣＰＭＶ  ＨＴ配列には存在しない複数クローニング部位(斜体、ヌクレオチド５１０〜５２８)も含む。
【化２】
2018504119.tif 000005
【０２３４】
植物コザックコンセンサス配列を伴うＣＰＭＶ  ＨＴ＋は、配列番号１６に提供する(ヌクレオチド１〜１６０、５'ＵＴＲ、１１５位(ＧＴＧ)に修飾ＡＴＧを含む(小文字太字および斜体)；１６２位(ＡＣＧ)に修飾ヌクレオチドを伴う、不完全Ｍタンパク質(下線)、ヌクレオチド１６１〜５０９；複数クローニング部位(斜体)、ヌクレオチド５１０〜５２８；およびコンセンサス植物コザック配列(大文字および太字)、ヌクレオチド５２９〜５３４を含む、スタッファーフラグメント)。
【化３】
2018504119.tif 000006
【０２３５】
配列番号１７(“ＣＰＭＶ  ＨＴ＋５１１”)は、ヌクレオチド１〜１５４からのＣＰＭＶ  ＲＮＡ  ２ゲノムの天然配列のセグメントを含む。配列番号１７のヌクレオチド１〜５１１からの５'ＵＴＲ配列は、ヌクレオチド１６１〜５１１からの１１５位(“ａ”の代わりに“ｇ”；斜体太字)および１６２位(“ｔ”の代わりに“ｃ”；斜体太字)および不完全Ｍタンパク質(下線)に修飾“ａｔｇ”配列を含む。ＣＰＭＶ  ＨＴ＋５１１は、天然Ｍタンパク質コザックコンセンサス配列(ヌクレオチド５０８〜５１１；太字)を含む。
【化４】
2018504119.tif 000007
【０２３６】
ＣＰＭＶ  ＨＴ＋エンハンサー配列の他の非限定的例は、配列番号１８の配列(ＣＰＭＶ  ＨＴ＋[ＷＴ１１５])により提供される。ＣＰＭＶ  ＨＴ＋を含み、配列番号１８の発現エンハンサー配列およびロタウイルス構造的または非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合した３'末端で転写開始部位(ＡＴＧ)と操作可能に結合した植物制御領域を含む発現カセットまたはベクターも本発明の一部である。
【０２３７】
配列番号１８(ＣＰＭＶ  ＨＴ＋[ＷＴ１１５])ヌクレオチド１〜１６０、５'ＵＴＲ、１１５〜１１７位のＡＴＧを伴う(小文字太字)；不完全Ｍタンパク質(下線)、ヌクレオチド１６１〜５０９；１６１〜１５３位に修飾ＡＴＧ(小文字太字および下線)、複数クローニング部位(斜体)、ヌクレオチド５１０〜５２８；および植物コザック配列(大文字および太字)、ヌクレオチド５２９〜５３４を含むスタッファーフラグメント)。
【化５】
2018504119.tif 000008
【０２３８】
配列番号１８の植物コザック配列は、配列番号２〜１４の配列の一つを含むが、これらに限定されない、あらゆる植物コザック配列であり得る。
【０２３９】
１または１を超えるここに記載する発現エンハンサー(例えばＣＰＭＶ  ＨＴ＋、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋[ＷＴ１１５]、ＣＰＭＶ  ＨＴ＋[５１１])およびロタウイルス構造タンパク質または非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合した制御領域を含む第一核酸配列を含む植物発現系も提供される。さらに、ロタウイルス構造タンパク質、または非構造タンパク質をコードする１以上の核酸配列に融合した、植物コザック配列を伴うプロモーター(制御領域)配列、コモウイルス５'ＵＴＲおよびスタッファー配列を含む発現エンハンサー(例えばＣＰＭＶ  ＨＴ＋またはＣＰＭＶ  ＨＴ＋[ＷＴ１１５])を含む核酸が記載される。核酸は、さらに、ロタウイルス構造的または非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、コモウイルス３'非翻訳領域(ＵＴＲ)、プラストシアニン３'ＵＴＲまたは他の３'ＵＴＲ配列の上流に挿入されるように、ロタウイルス構造的または非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列(図６ａで目的のヌクレオチドと称する)の３'末端に操作可能に結合した、コモウイルス３'非翻訳領域(ＵＴＲ)、例えば、プラストシアニン３'ＵＴＲまたは植物で活性な他の３'ＵＴＲおよびターミネーター配列、例えばＮＯＳターミネーターを含む配列を含む。
【０２４０】
ここに記載する方法を使用して産生したＲＬＰの発生は、任意の適当な方法、例えば密度勾配遠心分離またはサイズ排除クロマトグラフィーを使用して検出できる。ＲＬＰは、例えば電子顕微鏡、サイズ排除クロマトグラフィーまたは当業者には明白な他の技術で、構造およびサイズについて評価し得る。
【０２４１】
サイズ排除クロマトグラフィーに関して、総可溶性タンパク質を、抽出物緩衝液中の凍結粉砕植物原料のサンプルの均質化(Polytron)し、不溶性物質を遠心分離により除去することにより植物組織から抽出し得る。氷冷アセトンまたはＰＥＧでの沈殿も有益であり得る。可溶性タンパク質を定量し、抽出物をSephacrylTMカラム、例えばSephacrylTM  Ｓ５００カラムをとおす。Blue Dextran 2000を較正標準として使用し得る。クロマトグラフィー後、フラクションを免疫ブロットでさらに分析して、フラクションのタンパク質含量を決定し得る。
【０２４２】
分離したフラクションは、例えば上清(遠心したら、沈降または沈殿)または濾液(濾過したら)にある可能性があり、タンパク質または上部構造タンパク質が富化され、単層(ｓｌ)、二層(ｄｌ)または三層(ｔｌ)ＲＬＰのような高分子量、粒子を含む。
【０２４３】
分離したフラクションを、例えば、さらなる遠心分離工程、沈殿、クロマトグラフィー工程(例えばサイズ排除、イオン交換、親和性クロマトグラフィー)、タンジェント流濾過またはそれらの組み合わせにより、タンパク質、上部構造タンパク質または高次粒子を単離、精製、濃縮またはそれらの組み合わせのためにさらに処理し得る。精製タンパク質、上部構造タンパク質またはＲＬＰのような高次粒子の存在は、例えば、適切な検出抗体、キャピラリー電気泳動、電子顕微鏡または当業者には明らかな任意の他の方法を使用する、未変性またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタン分析により確認し得る。
【０２４４】
本発明により製造したＲＬＰは、当業者に知られる方法を使用して、植物、植物の一部または植物から精製、部分的精製しても、経口ワクチンとして投与してもよい。
【０２４５】
ＲＬＰ精製は、勾配遠心分離を含み、例えばスクロース、イオジキサノール、OptiPrepTMまたはセシウムクロライド(ＣｓＣｌ)密度勾配を、トランスフォーム植物バイオマスからのＲＬＰの精製または部分的精製に使用し得る。例えば図４に示すとおり、イオジキサノール段階勾配またはイオジキサノール連続勾配が、ＲＬＰおよび／または発現ロタウイルス構造タンパク質の精製に使用される。
【０２４６】
カルシウム(Ｃａ２＋)濃度は、三層粒子(ＴＬＰ)から二層粒子(ＤＬＰ)への変換に重要であり、株依存的であることが示されている(例えば、引用により本明細書に包含させるMartin et al. Journal of Virology, Jan 2002参照)。ＴＬＰからの外側カプシドタンパク質の完全喪失(ＴＬＰ脱カプシド化)は、ナノモル範囲の[Ｃａ２＋]中で起こる。それゆえに、ＲＬＰの抽出および／または精製は、カルシウム存在下で実施し、勾配遠心分離の工程は、カルシウム存在下、例えばＣａＣｌ２存在下で実施し得る。ＣａＣｌ２の濃度は、例えば、１mM〜１０００mMまたはその間の任意の量、例えば２mM、３mM、４mM、５mM、６mM、７mM、８mM、９mM、１０mM、１１mM、１２mM、１３mM、１４mM、１５mM、２０mM、２５mM、３０mM、４０mM、５０mM、１００mM、１５０mM、２００mM、２５０mM、３００mM、３５０mM、４００mM、４５０mM、５００mM、５０mM、６００mM、６５０mM、７００mM、７５０mM、８００mM、８５０mM、９００mM、９５０mMまたはその間の任意の量であり得る。
【０２４７】
植物または植物フラグメントは、最小限加工され得る。用語“最小加工”は、植物抽出物、ホモジネート、植物ホモジネートのフラクションなど(すなわち最小限加工)を得るために部分的精製された、目的のタンパク質および／またはＲＬＰを含む植物、例えば、植物またはその一部を意味する。部分的精製は、植物細胞構造を破壊し、それにより例えば、限定しないが、遠心分離、濾過またはそれらの組み合わせにより分離され得る可溶性植物成分および不溶性植物成分を含む組成物を作製することを含み得るが、これらに限定されない。これに関し、葉または他の組織の細胞外空間内に分泌されたタンパク質は、吸引または遠心抽出を使用して容易に得られ、またはタンパク質を細胞外空間内から絞り出すまたは遊離させるために、組織をローラーを通すかまたは粉砕などにより、加圧下に抽出する。これらの調製物の二次的植物産物による汚染は無視できるので、最小加工はまた可溶性タンパク質の粗製抽出物の水性抽出を含む。さらに、最小加工は、葉からの可溶性タンパク質の水性抽出、および次いで行う適当な塩類による沈殿操作を含む。他の方法は、抽出物の直接使用を可能にするための、大規模浸漬および浸漬液取得を含む。ＲＬＰは、任意の適当な方法、例えば機械的または生化学的抽出を使用して、精製または抽出し得る。
【０２４８】
１以上のロタウイルス構造タンパク質を、植物生重量１kgあたり、最大２ｇの収量で製造し得る。例えば、製造された構造タンパク質の重量は、植物生重量１kgあたり１〜２ｇまたはその間の重量、例えば植物生重量１kgあたり、１.０ｇ、１.１ｇ、１.２ｇ、１.３ｇ、１.４ｇ、１.５ｇ、１.６ｇ、１.７ｇ、１.８ｇ、１.９ｇ、２ｇまたはその間の何れかの重量であり得る。例えば、構造タンパク質は、植物生重量１kgあたり最大１.５４ｇの量で合成され得る。
【０２４９】
上に定義したＲＬＰのサイズ(すなわち直径)は、例えば動的光散乱法(ＤＬＳ)または電子顕微鏡(ＥＭ)技術により測定でき、通常５０〜１１０nmまたはその間の任意のサイズである。例えば、完全なＲＬＰ構造のサイズは、約７０nm〜約１１０nmまたはその間の任意のサイズ、例えば、７５nm、８０nm、８５nm、９０nm、９５nm、１００nm、１０５nmまたはその間の何れかのサイズであり得る。
【０２５０】
ヌクレオチド配列
本発明は、さらに植物で活性な制御領域に操作可能に結合した１以上のロタウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。ヌクレオチド配列は、例えばヒトコドン使用または植物コドン使用に最適化され得る。さらに、１以上のロタウイルス構造タンパク質を、１または１を超える増幅要素と操作可能に結合し得る。さらに、１以上のロタウイルス構造タンパク質を、１または１を超える区画ターゲティング配列に操作可能に結合し得る。ヌクレオチド配列によりコード化される１以上のロタウイルス構造タンパク質は、例えばＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６またはＶＰ７であり得る。さらに、ヌクレオチド配列によりコード化される１以上のロタウイルス構造タンパク質は、例えば任意のロタウイルスＡ群〜Ｇ群からであり得るが、より好ましくはロタウイルスＡ群からであり得る。さらに、ヌクレオチド配列によりコード化される１以上のロタウイルス構造タンパク質は、Ｇ１Ｐ[８]、Ｇ２Ｐ[４]、Ｇ２Ｐ[８]、Ｇ３Ｐ[８]、Ｇ４Ｐ[８]、Ｇ９Ｐ[６]、Ｇ９Ｐ[８]、ロタウイルスＡ  ＷＡ株、ロタウイルスＡワクチンＵＳＡ／Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株またはロタウイルスＳＡ１１株を含むが、これらに限定されない、Ｇ１〜Ｇ２７およびＰ１〜Ｐ３４、より好ましくはＧ１〜Ｇ１９およびＰ１〜Ｐ２７からのＧ型およびＰ型の任意の組み合わせの遺伝子型を有する任意のロタウイルス株からであり得る。
【０２５１】
本発明において言及される核酸配列は、核酸配列が、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、ここに定義する核酸配列の１または１を超えるヌクレオチド配列または相補鎖とハイブリダイズするならば、該配列または配列の相補鎖と“実質的に相同”、“実質的に類似”または“実質的に同一”である。配列は、ヌクレオチドの少なくとも約７０％または７０〜１００％またはその間の任意の比率、例えば７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、１００％またはその間の任意の比率が、ヌクレオチド配列の規定の長さにわたりマッチするとき、“実質的に相同”、“実質的に類似”、“実質的に同一”であるが、ただし、このような相同配列は、ここに記載する配列またはコード化産物の１または１を超える性質を示す。
【０２５２】
例えば、本発明は、例えば配列番号２１、２７、３２、３７または４２に定義する配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはその間の任意の率で同一である、１以上のロタウイルスタンパク質、例えばロタウイルス構造タンパク質または非構造タンパク質をコードする、ヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、当分野で知られる方法のいずれかによりヒトコドン最適化され得る。ヌクレオチド配列は、例えば、配列番号２４、２９、３４、３９または４４のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはその間の任意の率で同一であるロタウイルスタンパク質をコードし得る。
【０２５３】
さらに、本発明は、例えば配列番号２１、２７、３２、３７または４２に定義する配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはその間の任意の率で同一である核酸により、例えばコード化される、ロタウイルス構造タンパク質を含むＲＬＰＳを提供する。
【０２５４】
このような配列類似性または同一性は、ＤＮＡＳＩＳ(例えば次のパラメータを使用するが、これに限定されない：ＧＡＰペナルティ５、頂点対角数５、固定ＧＡＰペナルティ１０、ｋタプル２、フローティングギャップ１０およびウインドウサイズ５)内に提供さえるようなヌクレオチド配列比較プログラムを使用して、決定し得る。しかしながら、比較のための配列のアライメントの他の方法が当分野で周知であり、例えばSmith & Waterman(1981, Adv. Appl. Math. 2:482)、Needleman & Wunsch(J. Mol. Biol. 48:443, 1970)、Pearson & Lipman(1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444)のアルゴリズムおよびこれらのアルゴリズムのコンピュータ化実行(ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ、ＮＩＨから入手可能)または手動アライメントおよび目視検査(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995 supplement参照)またはストリンジェント条件下サザンもしくはノーザンハイブリダイゼーションの使用(Maniatis et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)がある。好ましくは、実質的に相同である配列は、規定した長さの分子にわたり、少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％配列類似性を示す。
【０２５５】
一つのこのようなストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は、４×ＳＳＣ、６５℃で一夜(約１６〜２０時間)ハイブリダイゼーションし、次いで０.１×ＳＳＣ、６５℃で１時間洗浄するか、または各２０分もしくはは３０分、０.１×ＳＳＣ、６５℃で２回洗浄することである。また、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、４２℃で、一夜(１６〜２０時間)行い、次に０.１×ＳＳＣ、６５℃で１時間洗浄または各２０分もしくはは３０分、０.１×ＳＳＣ、６５℃での２回洗浄するか、Ｃｈｕｒｃｈリン酸緩衝水溶液(７％ＳＤＳ；０.５Ｍ  ＮａＰＯ４緩衝液ｐＨ７.２；１０mM  ＥＤＴＡ)中、６５℃で一夜(１６〜２０時間)ハイブリダイゼーションし、５０℃で各２０分もしくは３０分の０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳでの２回洗浄または独特の配列領域について各２０分もしくは３０分の６５℃、２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳでの２回洗浄である。
【０２５６】
ロタウイルス構造ポリペプチドをコードする核酸は、“ロタウイルス核酸”、“ロタウイルスヌクレオチド配列”と記載し得る。限定と解釈すべきではない例として、１以上のロタウイルス構造タンパク質またはロタウイルス構造ポリペプチドを含むウイルス様粒子は、“ロタウイルスＶＬＰ”、“ＲＶＬＰ”または“ＲＬＰ”と記載し得る。
【０２５７】
多くの生物が、成長しているペプチド鎖への特定のアミノ酸の挿入をコードするために特定のコドンの使用についてバイアスを示す。生物間のコドン使用の差異であるコドン優先性またはコドンバイアスは、遺伝コードの縮重により提供され、多くの生物で十分証明されている。コドンバイアスは、しばしば、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)の翻訳効率と相関し、これは、とりわけ、翻訳されるコドンの性質および特定のトランスファーＲＮＡ(ｔＲＮＡ)分子の利用能に依存すると考えられている。細胞中の選択ｔＲＮＡの優性は、一般にペプチド合成で最も高頻度で使用されるコドンを反映する。従って、遺伝子を、コドン最適化に基づき、ある生物での最適遺伝子発現のためにあつらえることができる。異種性に発現するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の最適化処理は、発現収量改善のための重要な工程であり得る。最適化要求は、外来タンパク質を産生するための宿主の能力を改善する工程を含み得る。
【０２５８】
“コドン最適化”は、天然配列の少なくとも１またはそれ以上相当数のコドンを、他の生物または種の遺伝子でより高頻度のまたは最も高頻度のコドンに置き換えることにより、目的の細胞での発現を増強するための核酸配列の修飾として定義される。様々な種が、特定のアミノ酸のあるコドンに特定のバイアスを示す。
【０２５９】
本発明は、コドン最適化されている、合成ポリヌクレオチド配列、例えば、ヒトコドン使用または植物コドン使用のために最適化されている配列を含む。次いで、コドン最適化ポリヌクレオチド配列を植物で発現させ得る。より具体的に、ヒトコドン使用または植物コドン使用のために最適化された配列を、植物で発現させ得る。理論に縛られることを望まないが、ヒトコドンのために最適化された配列は、配列のグアニン−シトシン含量(ＧＣ含量)が増加し、植物での発現収量が改善されると考えられる。
【０２６０】
翻訳非効率的タンパク質コーディング領域の翻訳動態を改善する種々の当分野で知られるコドン最適化技術がある。この技術は、主に、ある宿主生物のためのコドン使用の特定に依存する。ある遺伝子または配列を特定の生中で発現させようするなら、目的の配列のコドンが、宿主生物でより高頻度で使用されるコドンに置き換えるように、該遺伝子および配列のコーディング配列を修飾する。
【０２６１】
アミノ酸配列
ロタウイルス構造タンパク質の非限定的例は、ロタウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７ならびにＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７のフラグメントである。本発明により使用し得るＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７またはＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７タンパク質のフラグメントんぼ非限定的例は、ロタウイルス株Ｇ９  Ｐ[６]、ロタウイルスＡ  ＷＡ株、ロタウイルスＡワクチンＵＳＡ／Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株およびロタウイルスＳＡ１１株からのＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７タンパク質を含む。例えば、限定はしないが、Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ：ＶＰ４(受託番号ＪＮ８４９１１３)、ＶＰ７：(受託番号ＪＮ８４９１１４)、ロタウイルスＡ  ＷＡ株：ＶＰ２(受託番号Ｘ１４９４２)、ＶＰ４：(受託番号Ｌ３４１６１)、ＶＰ６(受託番号Ｋ０２０８６)、ＶＰ７：(受託番号ＧＵ７２３３２７)、ＮＳＰ４(受託番号Ｋ０２０３２)、ロタウイルスＳＡ１１株：ＶＰ２(受託番号ＮＣ＿０１１５０６)、ＶＰ４(受託番号ＮＣ＿０１１５１０)、ＶＰ６(受託番号ＮＣ＿０１１５０９)、ＶＰ７(受託番号ＮＣ＿０１１５０３)およびＮＳＰ４(受託番号ＮＣ＿０１１５０４)。
【０２６２】
限定と解釈してはならないＶＰ２構造タンパク質の例は、配列番号２４のアミノ酸配列に示す。さらに、ＶＰ２構造タンパク質は、配列番号２４に示す配列またはそれと少なくとも約９０〜１００％配列類似性(これらの範囲内のあらゆる類似性パーセント、例えば、それと９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列類似性を含む)を有する配列を含む。さらに、ＶＰ２構造タンパク質は、配列番号２１に示すヌクレオチド配列またはそれと少なくとも約８０〜１００％配列類似性(これらの範囲内のあらゆる類似性パーセント、例えば、それと８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列類似性を含む)を有する配列によりコード化され得る。
【０２６３】
限定と解釈してはならないＶＰ４構造タンパク質の例は、配列番号３４のアミノ酸配列に示す。さらに、ＶＰ４構造タンパク質は、配列番号３４に示す配列またはそれと少なくとも約９０〜１００％配列類似性(これらの範囲内のあらゆる類似性パーセント、例えば、それと９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列類似性を含む)を有する配列を含み得る。さらに、ＶＰ４構造タンパク質は、配列番号３２に示すヌクレオチド配列またはそれと少なくとも約８０〜１００％配列類似性(これらの範囲内のあらゆる類似性パーセント、例えば、それと８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列類似性を含む)を有する配列によりコード化され得る。
【０２６４】
限定と解釈してはならないＶＰ６構造タンパク質の例は、配列番号２９のアミノ酸配列に示す。さらに、ＶＰ６構造タンパク質は、配列番号２９に示す配列またはそれと少なくとも約９０〜１００％配列類似性(これらの範囲内のあらゆる類似性パーセント、例えば、それと９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列類似性を含む)を有する配列を含み得る。さらに、ＶＰ６構造タンパク質は、配列番号２７に示すヌクレオチド配列またはそれと少なくとも約８０〜１００％配列類似性(これらの範囲内のあらゆる類似性パーセント、例えば、それと８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列類似性を含む)を有する配列によりコード化され得る。
【０２６５】
限定と解釈してはならないＶＰ７構造タンパク質の例は、配列番号３９のアミノ酸配列に示す。さらに、ＶＰ７構造タンパク質は、配列番号３９に配列またはそれと少なくとも約９０〜１００％配列類似性(これらの範囲内のあらゆる類似性パーセント、例えば、それと９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列類似性を含む)を有する配列を含み得る。さらに、ＶＰ７構造タンパク質は、配列番号３７に示すヌクレオチド配列またはそれと少なくとも約８０〜１００％配列類似性(これらの範囲内のあらゆる類似性パーセント、例えば、それと８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列類似性を含む)を有する配列によりコード化され得る。
【０２６６】
限定と解釈してはならないＮＳＰ４構造タンパク質の例は、配列番号４４のアミノ酸配列に示す。さらに、ＮＳＰ４非構造タンパク質は、配列番号４４に示す配列またはそれと少なくとも約９０〜１００％配列類似性(これらの範囲内のあらゆる類似性パーセント、例えば、それと９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列類似性を含む)を有する配列を含み得る。さらに、ＮＳＰ４非構造タンパク質は、配列番号４２に示すヌクレオチド配列またはそれと少なくとも約８０〜１００％配列類似性(これらの範囲内のあらゆる類似性パーセント、例えば、それと８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列類似性を含む)を有する配列によりコード化され得る。
【０２６７】
アミノ酸配列類似性または同一性は、ＢＬＡＳＴ（basic local alignment search tool)２.０アルゴリズムを用いるＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮプログラムを使用して計算し得る。アミノ酸配列類似性または同一性を計算する技術は当業者に周知であり、ＢＬＡＳＴアルゴリズムの使用は、ALTSCHUL et al.(1990, J Mol. Biol. 215: 403-410)およびALTSCHUL et al.(1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402)に記載されている。
【０２６８】
理論に縛られることを望まないが、タンパク質濃度および種々のロタウイルス構造タンパク質の比は、ＲＬＰの組立効率に重要であり得る。それゆえに、感染の多重度および時は、植物におけるタンパク質濃度およびＲＬＰの総体的組立効率の操作に重要であり得る。
【０２６９】
本発明の構築物は、植物または植物の一部で一過性に発現させ得る。植物、植物の一部または植物細胞における、組み換えアグロバクテリウム・ツメファシエンスのエピクロモソーム(epichromosomal)発現に依存する一過性発現系を、種々の細胞区画または亜区画を標的とした、ロタウイルス構造タンパク質の発現に使用し得る。一過性発現系は、高速の産生を可能にする。さらに、大量のタンパク質が、植物への組み換えアグロバクテリウム浸潤の数日後に達成され得る(Rybicki, 2010; Fischer et al., 1999)。長遺伝子配列の発現および１を超える遺伝子の同じ細胞での同時発現が可能であり、多量体タンパク質の効率的組立を可能にする(Lombardi et al., 2009)。
【０２７０】
ロタウイルス構造タンパク質および非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、１、２、３、４または５トランスフォームアグロバクテリウム・ツメファシエンス株を使用して、植物宿主にトランスファーし得る(表１および付随する本文に記載するとおり)。
【０２７１】
一過性発現中、転写後遺伝子サイレンシングが、植物における異種性タンパク質の発現を制限し得る。サイレンシングのサプレッサー、例えば、限定しないが、トマト黄化壊疽病ウイルスからのＮｓｓの共発現が、トランスジーンｍＲＮＡの特定の分解の阻害に使用され得る(Brigneti et al., 1998)。サイレンシングの代替的サプレッサーは当分野で周知であり、ここに記載するとおりに使用でき(Chiba et al., 2006, Virology 346:7-14；これは、引用により本明細書に包含させる)、例えば、ＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ(タバコエッチ病ウイルス−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ)、ＢＹＶ−ｐ２１、トマトブッシースタントウイルスのｐ１９(ＴＢＳＶ  ｐ１９)、トマトクリンクルウイルスのカプシドタンパク質(ＴＣＶ−ＣＰ)、キュウリモザイク病ウイルスの２ｂ(ＣＭＶ−２ｂ)、ジャガイモウイルスＸのｐ２５(ＰＶＸ−ｐ２５)、ジャガイモウイルスＭのｐ１１(ＰＶＭ−ｐ１１)、ジャガイモウイルスＳのｐ１１(ＰＶＳ−ｐ１１)、ブルーベリースコーチ病ウイルスのｐ１６(ＢＳｃＶ−ｐ１６)、カンキツトリステザウイルスのｐ２３(ＣＴＶ−ｐ２３)、ブドウ葉巻随伴ウイルス−２のｐ２４、(ＧＬＲａＶ−２  ｐ２４)、ブドウウイルスＡのｐ１０(ＧＶＡ−ｐ１０)、ブドウウイルスＢのｐ１４(ＧＶＢ−ｐ１４)、ハナウド潜在ウイルスのｐ１０(ＨＬＶ−ｐ１０)またはニンニク潜在ウイルスのｐ１６(ＧＣＬＶ−ｐ１６)であるが、これらに限定されない。それゆえに、サイレンシングのサプレッサー、例えばＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ、ＢＹＶ−ｐ２１、ＴＢＳＶ  ｐ１９、ＴＣＶ−ＣＰ、ＣＭＶ−２ｂ、ＰＶＸ−ｐ２５、ＰＶＭ−ｐ１１、ＰＶＳ−ｐ１１、ＢＳｃＶ−ｐ１６、ＣＴＶ−ｐ２３、ＧＬＲａＶ−２  ｐ２４、ＧＢＶ−ｐ１４、ＨＬＶ−ｐ１０、ＧＣＬＶ−ｐ１６またはＧＶＡ−ｐ１０を、植物または植物の一部内での高レベルのタンパク質産生をさらに隔日にするために、１以上のロタウイルス構造的または非構造タンパク質、例えばＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７およびＮＳＰ４またはそれらの組み合わせと共発現させ得る。
【０２７２】
本発明はまた、さらなる(第二、第三、第四、第五または第六)ヌクレオチド配列が植物内で発現され、サイレンシングのサプレッサーをコードするさらなる(第二、第三、第四、第五または第六)ヌクレオチド配列が、植物で活性であるさらなる(第二、第三、第四、第五または第六)制御領域と操作可能に結合される、上記方法も提供する。サイレンシングのサプレッサーをコードするヌクレオチド配列は、例えばＮｓｓ、ＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ、ＢＹＶ−ｐ２１、ＴＢＳＶ  ｐ１９、ＴＣＶ−ＣＰ、ＣＭＶ−２ｂ、ＰＶＸ−ｐ２５、ＰＶＭ−ｐ１１、ＰＶＳ−ｐ１１、ＢＳｃＶ−ｐ１６、ＣＴＶ−ｐ２３、ＧＬＲａＶ−２  ｐ２４、ＧＢＶ−ｐ１４、ＨＬＶ−ｐ１０、ＧＣＬＶ−ｐ１６またはＧＶＡ−ｐ１０であり得る。
【０２７３】
下記のとおり、一過性発現方法を、本発明の構築物の発現に使用できる(Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348参照；これは、引用により本明細書に包含させる)。あるいは、Kapila et al., 1997(これは、引用により本明細書に包含させる)に記載の吸引ベースの一過性発現方法を使用し得る。これらの方法は、例えば、アグロイノキュレーションまたはアグロインフィルトレーション、シリンジ浸潤の方法を含み得るが、これらに限定されず、しかしながら、他の一過性方法も上記のとおり使用できる。アグロイノキュレーション、アグロインフィルトレーションまたはシリンジ浸潤で、所望の核酸を含むアグロバクテリウムの混合物は、組織、例えば葉、植物の気部(幹、葉および花を含む)、植物の他の部分(幹、根、花)または植物全体の細胞間空間に入る。表皮通過後、アグロバクテリウムは感染し、ｔ−ＤＮＡコピーを細胞内に転移させる。ｔ−ＤＮＡは、エピソームで転写され、ｍＲＮＡが翻訳され、感染細胞における目的のタンパク質の産生に至るが、しかしながら、ｔ−ＤＮＡの核内の通過は一過性である。
【０２７４】
トランスフォーム植物細胞の同定を助けるために、本発明の構築物をさらに操作して、植物選択可能マーカーを含ませ得る。有用な選択可能マーカーは、抗生物質、例えば、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシンまたはホスフィノトリシン、グリホサート、クロルスルフロンなどのような除草剤のような化学物質に対する抵抗性を提供する酵素を含む。同様に、ＧＵＳ(ベータ−グルクロニダーゼ)のような色変化またはルシフェラーゼもしくはＧＦＰのような発光により同定可能な化合物の産生を提供する酵素も使用し得る。
【０２７５】
本発明の一部とまた考えられるのは、構築物ここに記載するトランスジェニック植物、植物細胞または種子である。植物細胞から植物全体を再生する方法も当分野で知られる。一般に、トランスフォーム植物細胞を、選択可能マーカーをトランスフォーム植物細胞の同定促進に使用する場合、抗生物質のような選択剤を含み得る、適切な培地で培養する。カルスが形成されたら、芽形成を、既知方法により適切な植物ホルモンを用いて促進し、植物の再生のために芽を発根培地に移し得る。植物を、次いで、種子からまたは栄養繁殖技術を使用して、反復産生の確立に使用し得る。トランスジェニック植物は、組織培養を使用しなくても、産生できる。
【０２７６】
本願における用語“制御領域”、“制御要素”または“プロモーター”の使用は、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡとＲＮＡの両者を含み得る、遺伝子のタンパク質コーディング領域の、一般に、しかし必ずしもではなく、上流の核酸の部分を反映するよう意図される。制御領域が活性であり、目的の遺伝子と操作可能に結合または操作可能に結合されているならば、目的の遺伝子の発現がもたらされ得る。制御要素は、臓器特異性の仲介ができるかまたは発生的または時間的遺伝子活性化の制御が可能であり得る。“制御領域”は、プロモーター要素、基底プロモーター活性を示すコアプロモーター要素、外的刺激に応答して誘導性である要素、プロモーター活性を仲介する要素、例えば負の制御要素または転写エンハンサーも含み得る。ここで使用する“制御領域”はまた転写後活性な要素、例えば、翻訳および転写エンハンサー、翻訳および転写リプレッサー、上流活性化配列およびｍＲＮＡ不安定性決定因子のような、遺伝子発現を調節する制御要素も含み得る。これらの後者の要素のいくつかは、コーディング領域の近位に位置し得る。
【０２７７】
本明細書の文脈において、用語“制御要素”または“制御領域”は、一般に、ＲＮＡポリメラーゼの認識および／または特定の部位で転写開始に必要な他の因子を提供することにより、コーディング領域の発現を制御する、構造的遺伝子のコード配列の、通常、しかし、常にではなく、上流(５')のＤＮＡ配列をいう。しかしながら、イントロン内または配列の３'に位置する他のヌクレオチド配列も、目的のコーディング領域の発現の制御に貢献し得る。特定の部位での開始を確実にするためのＲＮＡポリメラーゼまたは他の転写因子の認識のために提供する制御要素の例は、プロモーター要素であり得る。大部分の、しかし全てはないが、真核プロモーター要素は、通常転写開始部位の約２５塩基対上流に位置するアデノシンおよびチミジンヌクレオチド塩基対からなる保存的核酸配列であるＴＡＴＡボックスを含む。プロモーター要素は、転写の開始を担う基底プロモーター要素ならびに遺伝子発現を修飾する他の制御要素(上記のとおり)を含む。
【０２７８】
発生的に制御される、誘導性または構成的のものを含む、数タイプの制御領域がある。発生的に制御されるまたはその制御下に遺伝子の異なった発現を制御する制御領域は、ある臓器または組織の発生の特定の時間の間、該臓器または臓器の組織内で活性化される。しかしながら、発生的に制御されるある制御領域は、特定の発生的段階である臓器または組織内で優先的に活性化でき、それらはまた、発生的に制御される方法でまたは植物な胃に同様に他の臓器または組織において基底レベルで活性化され得る。組織特異的制御領域、例えば種子特異的制御領域は、ナピンプロモーターおよびクルシフェリンプロモーターを含む(Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130)。葉特異的プロモーターの例は、プラストシアニンプロモーターを含む(引用により本明細書に包含させるＵＳ７,１２５,９７８号参照)。
【０２７９】
誘導性制御領域は、インデューサーに応答して１以上のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接的または間接的に活性化できるものである。インデューサー非存在下、ＤＮＡ配列または遺伝子は転写されない。一般に、転写活性化のために誘導性制御領域に特異的に結合するタンパク質因子は、不活性形態で存在でき、次いで、これはインデューサーにより、直接的または間接的に活性化形態に変換される。しかしながら、タンパク質因子は存在しなくてもよい。インデューサーは、タンパク質、代謝物、成長調節因子、除草剤またはフェノール性化合物のような化学物質または熱、冷却、塩または毒性要素により直接的にまたはウイルスのような病原体または疾患因子の作用により間接的に負荷される生理学的ストレスであり得る。誘導性制御領域を含む植物細胞は、噴霧、給水、加熱または類似方法によるように、細胞または植物にインデューサーを外的に適用することにより、インデューサーに曝し得る。誘導性制御要素は、植物または非植物遺伝子に由来し得る(例えばGatz, C. and Lenk, LR.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358；これは、引用により包含させる)。可能性のある誘導性プロモーターの例は、テトラサイクリン誘導性プロモーター(Gatz, C.,1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. BioI. 48,89-108；これは、引用により包含させる)、ステロイド誘導性プロモーター(Aoyama. T. and Chua, N.H.,1997, Plant 1. 2, 397-404；これは、引用により包含させる)およびエタノール誘導性プロモーター(Salter, M.G., et aI, 1998, Plant 10urnal 16, 127-132; Caddick, M.X., et al,1998, Nature Biotech. 16, 177-180、これらは、引用により包含させる)、サイトカイニン誘導性ＩＢ６およびＣＫＩ  １遺伝子(Brandstatter, I. and K.ieber, 1.1.,1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274,982-985；これらは、引用により包含させる)およびオーキシン誘導性要素、ＤＲ５(Ulmasov, T., et aI., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971；これは、引用により包含させる)を含むが、これらに限定されない。
【０２８０】
構成的制御領域は、植物の種々の部分にわたりおよび植物発生をとおして連続的に遺伝子発現を指示する。既知構成的制御要素の例は、ＣａＭＶ  ３５Ｓトランスクリプト(Odell et aI., 1985, Nature, 313: 810-812)、コメアクチン１(Zhang et aI, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165)、アクチン２(An et al., 1996, Plant J., 10: 107-121)またはｔｍｓ  ２(引用により本明細書に包含させるＵ.Ｓ.５,４２８,１４７号)およびトリオースホスフェートイソメラーゼ１(Xu et. aI., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467)遺伝子、メイズユビキチン１遺伝子(Cornejo et ai, 1993, Plant Mol. BioI. 29: 637-646)、アラビドプシスユビキチン１および６遺伝子(Holtorf et aI, 1995, Plant Mol. BioI. 29: 637-646)およびタバコ翻訳開始因子４Ａ遺伝子(Mandel et aI, 1995, Plant Mol. BioI. 29: 995-1004)と関係するプロモーターを含む。
【０２８１】
ここで使用する用語“構成的”は、必ずしも、構成的制御領域制御下の遺伝子が、全細胞型で、同レベルで発現されることを意味せず、遺伝子が、量の変動はしばしば観察されるが、広範な細胞型で発現されることを意味する。構成的制御要素を他の配列と結合して、さらにそれらが操作可能に結合しているヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を促進し得る。例えば、ＣＰＭＶ−ＨＴ系は、ササゲモザイクウイルス(ＣＰＭＶ)の非翻訳領域に由来し、関連するコード配列の翻訳増強を示す。“天然”により、核酸またはアミノ酸配列が天然に存在するかまたは“野生型”であることを意味する。“操作可能に結合”により、特定の配列、例えば制御要素および目的のコーディング領域が、直接的または間接的に、遺伝子発現の仲介または調節のような意図する機能の実施のために相互作用することを意味する。操作可能に結合した配列の相互作用は、例えば、操作可能に結合した配列と相互作用するタンパク質が介在し得る。
【０２８２】
植物内で産生されるＲＬＰは、植物特異的Ｎ−グリカンを含むロタウイルスＶＰ７構造タンパク質を産生し得る。それゆえに、本発明はまた、植物特異的Ｎ−グリカンを有するＶＰ７を含むＲＬＰのためにも提供される。
【０２８３】
さらに、植物におけるＮ−グリカンの修飾は知られ(例えばＵ.Ｓ.６０／９４４,３４４号参照；これは、引用により本明細書に包含させる)、修飾Ｎ−グリカンを有するＶＰ７が産生され得る。修飾グリコシル化パターン、例えばフコシル化、キシロシル化またはフコシル化およびキシロシル化が低減されたＶＰ７を含むＮ−グリカンを得ることができ、または修飾グリコシル化パターンを有するＶＰ７が得られ、ここで、タンパク質はフコシル化、キシフコシル化または両者を欠き、ガラクトシル化が増加されている。さらに、翻訳後修飾、例えば、末端ガラクトース付加の調節は、ＶＰ７を発現する野生型植物と比較したとき、発現ＶＰ７のフコシル化およびキシフコシル化の減少をもたらし得る。
【０２８４】
限定と解釈すべきではない例として、修飾グリコシル化パターンを有するＶＰ７の合成は、ＶＰ７と、ベータ−１,４−ガラクトシルトランスフェラーゼ(ＧａｌＴ)、例えば、限定されないが、哺乳動物ＧａｌＴまたはヒトＧａｌＴをコードする、ヌクレオチド配列の共発現により達成できるが、しかしながら他の源からのＧａｌＴも使用し得る。ＧａｌＴの触媒ドメインをＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(ＧＮＴ１)のＣＴＳドメイン(すなわち細胞質テイル、膜貫通ドメイン、幹領域)に融合し、ＧＮＴ１−ＧａｌＴハイブリッド酵素を産生し、ハイブリッド酵素をＶＰ７と共発現させ得る。ＶＰ７はまたＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(ＧｎＴ−III)、例えば、限定されないが哺乳動物ＧｎＴ−IIIまたはヒトＧｎＴ−IIIをコードするヌクレオチド配列と共発現でき、他の源からのＧｎＴ−IIIも使用し得る。さらに、ＧｎＴ−IIIに融合したＧＮＴ１のＣＴＳを含むＧＮＴ１−ＧｎＴ−IIIハイブリッド酵素も使用し得る。
【０２８５】
それゆえに、本発明はまた、修飾Ｎ−グリカンを有するＶＰ７を含むＲＬＰを提供する。
【０２８６】
理論に縛られることを望まないが、ＶＰ７への植物Ｎ−グリカンの存在は、抗原提示細胞によるＶＰ７の結合の促進により、免疫応答を刺激し得る。植物Ｎ−グリカンを使用する免疫応答の使用は、Saint-Jore-Dupas et al.(2007)により提案されている。
【０２８７】
表２は、本発明の種々の態様において提供される配列を記載する。
【表２】
2018504119.tif 000009
【表３】
2018504119.tif 000010
【０２８８】
本発明を、次の実施例でさらに説明する。
【実施例】
【０２８９】
実施例１
物質および方法
【表４】
2018504119.tif 000011
【０２９０】
１. ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(ＷＡ)ＶＰ２(ｏｐｔ)／ＮＯＳ(構築物番号１７１０)
ロタウイルスＡ  ＷＡ株からのＶＰ２をコードする最適化配列を、次のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセット含有プラスミドにおける２Ｘ３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ−ＮＯＳ発現系にクローン化した。ＶＰ２コード配列含有フラグメントを、プライマーＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ２(ｏｐｔ).ｓ１＋３ｃ(図７ａ、配列番号１９)およびＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ２(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒ(図７Ｂ、配列番号２０)を使用して、最適化ＶＰ２遺伝子配列(図７Ｃ、配列番号２１)を鋳型として使用して増幅した。配列最適化のために、ＶＰ２タンパク質配列(Genbank受託番号ＣＡＡ３３０７４)を戻し翻訳し、ヒトコドン使用、ＧＣ含量およびｍＲＮＡ構造について最適化した。ＰＣＲ産物を、In-Fusionクローニング系(Clontech, Mountain View, CA)を使用して２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系にクローン化した。構築物番号１１９１(図７Ｄ)をＳａｃIIおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、直線化プラスミドをIn-Fusion組立反応に使用した。構築物番号１１９１は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットへの目的の遺伝子の“In Fusion”クローニングのためのアクセプタープラスミドである。アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下、ＴＢＳＶ  Ｐ１９サイレンシングのサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物も組み込む。主鎖はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左から右ｔ−ＤＮＡ境界の配列を図７Ｅ(配列番号２２)に示す。得られた構築物の番号を１７１０(図７Ｆ、配列番号２３)とした。ロタウイルスＡ  株ＷＡからのＶＰ２のアミノ酸配列を図７Ｇ(配列番号２４)に示す。プラスミド１７１０の模式図を図７Ｈに示す。
【０２９１】
２. ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(ＷＡ)ＶＰ６(ｏｐｔ)／ＮＯＳ(構築物番号１７１３)
ロタウイルスＡ  ＷＡ株からのＶＰ６をコードする最適化配列を、次のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセット含有プラスミドにおける２Ｘ３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ−ＮＯＳ発現系にクローン化した。ＶＰ６コード配列含有フラグメントを、プライマーＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ６(ｏｐｔ).ｓ１＋３ｃ(図８Ａ、配列番号２５)およびＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ６(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒ(図８Ｂ、配列番号２６)を使用して、最適化ＶＰ６遺伝子配列(図８Ｃ、配列番号２７)を鋳型として使用して増幅した。配列最適化のために、ＶＰ６タンパク質配列(Genbank受託番号ＡＡＡ４７３１１)を戻し翻訳し、ヒトコドン使用、ＧＣ含量およびｍＲＮＡ構造について最適化した。ＰＣＲ産物を、In-Fusionクローニング系(Clontech, Mountain View, CA)を使用して２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系にクローン化した。構築物番号１１９１(図７Ｄ)をＳａｃIIおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、直線化プラスミドをIn-Fusion組立反応に使用した。構築物番号１１９１は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットへの目的の遺伝子の“In Fusion”クローニングのためのアクセプタープラスミドである。アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下、ＴＢＳＶ  Ｐ１９サイレンシングのサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物も組み込む。主鎖はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左から右ｔ−ＤＮＡ境界の配列を図７Ｅ(配列番号２２)に示す。得られた構築物の番号を１７１３(図８Ｄ、配列番号２８)とした。ロタウイルスＡ株ＷＡからのＶＰ６のアミノ酸配列を図８Ｅ(配列番号２９)に示す。プラスミド１７１３の模式図を図８Ｆに示す。
【０２９２】
３. ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ４(ｏｐｔ)／ＮＯＳ(構築物番号１７３０)
ロタウイルスＡワクチンＵＳＡ／Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からのＶＰ４をコードする最適化配列を、次のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセット含有プラスミドにおける２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳにクローン化した。ＶＰ４コード配列含有フラグメントを、プライマーＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ４(ｏｐｔ).ｓ１＋３ｃ(図９Ａ、配列番号３０)およびＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ４(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒ(図９Ｂ、配列番号３１)を使用して、最適化ＶＰ４遺伝子配列(図９Ｃ、配列番号３２)を鋳型として使用して増幅した。配列最適化のために、ＶＰ４タンパク質配列(Genbank受託番号ＡＥＸ３０６６０)を戻し翻訳し、ヒトコドン使用、ＧＣ含量およびｍＲＮＡ構造について最適化した。ＰＣＲ産物を、In-Fusionクローニング系(Clontech, Mountain View, CA)を使用して２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現カセットにクローン化した。構築物番号１１９１(図７Ｄ)をＳａｃIIおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、直線化プラスミドをIn-Fusion組立反応に使用した。構築物番号１１９１は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットへの目的の遺伝子の“In Fusion”クローニングのためのアクセプタープラスミドである。アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下、ＴＢＳＶ  Ｐ１９サイレンシングのサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物も組み込む。主鎖はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左から右ｔ−ＤＮＡ境界の配列を図７Ｅ(配列番号２２)に示す。得られた構築物の番号を１７３０(図９Ｄ、配列番号３３)とした。ロタウイルスＡワクチンＵＳＡ／Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]のＶＰ４のアミノ酸配列を図９Ｅ(配列番号３４)に示す。プラスミド１７３０の模式図を図９Ｆに示す。
【０２９３】
４. ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＴｒＳｐ−ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ７(ｏｐｔ)／ＮＯＳ(構築物番号１７３４)
ロタウイルスＡワクチンＵＳＡ／Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からの天然シグナルペプチドの切断バージョンを伴うＶＰ７をコードする最適化配列を、次のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセット含有プラスミドにおける２Ｘ３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ−ＮＯＳ発現系にクローン化した。ＶＰ７コード配列含有フラグメントを、プライマーＩＦ−ＴｒＳＰ＋Ｒｔｘ＿ＶＰ７(ｏｐｔ).ｓ１＋３ｃ(図１０Ａ、配列番号３５)およびＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ７(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒ(図１０Ｂ、配列番号３６)を使用して、最適化ＶＰ７遺伝子配列(図１０Ｃからのｎｔ８８〜８９１に対応、配列番号３７)を鋳型として使用して増幅した。配列最適化のために、ＶＰ７タンパク質配列(Genbank受託番号ＡＥＸ３０６８２)を戻し翻訳し、ヒトコドン使用、ＧＣ含量およびｍＲＮＡ構造について最適化した。ＰＣＲ産物を、In-Fusionクローニング系(Clontech, Mountain View, CA)を使用して２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系にクローン化した。構築物番号１１９１(図７Ｄ)をＳａｃIIおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、直線化プラスミドをIn-Fusion組立反応に使用した。構築物番号１１９１は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットへの目的の遺伝子の“In Fusion”クローニングのためのアクセプタープラスミドである。アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下、ＴＢＳＶ  Ｐ１９サイレンシングのサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物も組み込む。主鎖はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左から右ｔ−ＤＮＡ境界の配列を図７Ｅ(配列番号２２)に示す。得られた構築物の番号を１７３４(図１０Ｄ、配列番号３８)とした。ロタウイルスＡワクチンＵＳＡ／Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からの切断シグナルペプチドを有するＶＰ７のアミノ酸配列を図１０Ｅ(配列番号３９)に示す。プラスミド１７３４の模式図を図１０Ｆに示す。
【０２９４】
５. ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(ＷＡ)ＮＳＰ４／ＮＯＳ(構築物番号１７０６)
ロタウイルスＡ  ＷＡ株からのＮＳＰ４をコードする配列を、次のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセット含有プラスミドにおける２Ｘ３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ−ＮＯＳ発現系にクローン化した。ＮＳＰ４コード配列含有フラグメントを、プライマーＩＦ−ＷＡ＿ＮＳＰ４.ｓ１＋３ｃ(図１１Ａ、配列番号４０)およびＩＦ−ＷＡ＿ＮＳＰ４.ｓ１−４ｒ(図１１Ｂ、配列番号４１)を使用し、合成ＮＳＰ４遺伝子(ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｋ０２０３２からのｎｔ４２〜５６９に対応)(図１１Ｃ、配列番号４２)を鋳型として使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、In-Fusionクローニング系(Clontech, Mountain View, CA)を使用して２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＮＯＳ発現系にクローン化した。構築物番号１１９１(図７Ｄ)をＳａｃIIおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、直線化プラスミドをIn-Fusion組立反応に使用した。構築物番号１１９１は、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットへの目的の遺伝子の“In Fusion”クローニングのためのアクセプタープラスミドである。アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下、ＴＢＳＶ  Ｐ１９サイレンシングのサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物も組み込む。主鎖はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左から右ｔ−ＤＮＡ境界の配列を図７Ｅ(配列番号２２)に示す。得られた構築物の番号を１７０６(図１１Ｄ、配列番号４３)とした。ロタウイルスＡ株ＷＡのＮＳＰ４のアミノ酸配列を図１１Ｅ(配列番号４４)に示す。プラスミド１７０６の模式図を図１１Ｆに示す。
【０２９５】
６. ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＲＶＡ(ＷＡ)ＶＰ２(ｏｐｔ)／ＮＯＳ(構築物番号１１０８)
ロタウイルスＡ  ＷＡ株からのＶＰ２をコードする最適化配列を、次のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセット含有プラスミドにおける２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＮＯＳ発現系にクローン化した。ＶＰ２コード配列含有フラグメントを、プライマーＩＦ(Ｃ１６０)−ＷＡ＿ＶＰ２(ｏｐｔ).ｃ(図１２Ａ、配列番号４５)およびＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ２(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒ(図７Ｂ、配列番号２０)を使用して、最適化ＶＰ２遺伝子配列(図７Ｃ、配列番号２１)を鋳型として使用して増幅した。配列最適化のために、ＶＰ２タンパク質配列(Genbank受託番号ＣＡＡ３３０７４)を戻し翻訳し、ヒトコドン使用、ＧＣ含量およびｍＲＮＡ構造について最適化した。ＰＣＲ産物を、In-Fusionクローニング系(Clontech, Mountain View, CA)を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＮＯＳ発現系にクローン化した。構築物番号１１９０(図１２Ｂ)をＳａｃIIおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、直線化プラスミドをIn-Fusion組立反応に使用した。構築物番号１１９０は、ＣＰＭＶ−１６０ベースの発現カセットへの目的の遺伝子の“In Fusion”クローニングのためのアクセプタープラスミドである。アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下、ＴＢＳＶ  Ｐ１９サイレンシングのサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物も組み込む。主鎖はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左から右ｔ−ＤＮＡ境界の配列を図１２Ｃ(配列番号４６)に示す。得られた構築物の番号を１１０８(図１２Ｄ、配列番号４７)とした。ロタウイルスＡ株ＷＡからのＶＰ２のアミノ酸配列を図７Ｇ(配列番号２４)に示す。プラスミド１１０８の模式図を図１２Ｅに示す。
【０２９６】
７. −  ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＲＶＡ(ＷＡ)ＶＰ６(ｏｐｔ)／ＮＯＳ(構築物番号１１２８)  −
ロタウイルスＡ  ＷＡ株からのＶＰ６をコードする最適化配列を、次のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセット含有プラスミドにおける２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＮＯＳ発現系にクローン化した。ＶＰ６コード配列含有フラグメントを、プライマーＩＦ(Ｃ１６０)−ＷＡ＿ＶＰ６(ｏｐｔ).ｃ(図１３Ａ、配列番号４８)およびＩＦ−ＷＡ＿ＶＰ６(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒ(図８Ｂ、配列番号２６)を使用して、最適化ＶＰ６遺伝子配列(図８Ｃ、配列番号２７)を鋳型として使用して増幅した。配列最適化のために、ＶＰ６タンパク質配列(Genbank受託番号ＡＡＡ４７３１１)を戻し翻訳し、ヒトコドン使用、ＧＣ含量およびｍＲＮＡ構造について最適化した。ＰＣＲ産物を、In-Fusionクローニング系(Clontech, Mountain View, CA)を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＮＯＳ発現系にクローン化した。構築物番号１１９０(図１１Ｂ、配列番号４０)をＳａｃIIおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、直線化プラスミドをIn-Fusion組立反応に使用した。構築物番号１１９０は、ＣＰＭＶ−１６０ベースの発現カセットへの目的の遺伝子の“In Fusion”クローニングのためのアクセプタープラスミドである。アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下、ＴＢＳＶ  Ｐ１９サイレンシングのサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物も組み込む。主鎖はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左から右ｔ−ＤＮＡ境界の配列を図１１Ｃ(配列番号４１)に示す。得られた構築物の番号を１１２８(図１３Ｂ、配列番号４９)とした。ロタウイルスＡ株ＷＡからのＶＰ６のアミノ酸配列を図８Ｅ(配列番号２８)に示す。プラスミド１１２８の模式図を図１３Ｃに示す。
【０２９７】
８. Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ４(ｏｐｔ)／ＮＯＳ(構築物番号１１７８)
ロタウイルスＡワクチンＵＳＡ／Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からのＶＰ４をコードする最適化配列を、次のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセット含有プラスミドにおける２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＮＯＳにクローン化した。ＶＰ４コード配列含有フラグメントを、プライマーＩＦ(Ｃ１６０)−Ｒｔｘ＿ＶＰ４(ｏｐｔ).ｃ(図１４Ａ、配列番号５０)およびＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ４(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒ(図９Ｂ、配列番号３０)を使用して、最適化ＶＰ４遺伝子配列(図９Ｃ、配列番号３１)を鋳型として使用して増幅した。配列最適化のために、ＶＰ４タンパク質配列(Genbank受託番号ＡＥＸ３０６６０)を戻し翻訳し、ヒトコドン使用、ＧＣ含量およびｍＲＮＡ構造について最適化した。ＰＣＲ産物を、In-Fusionクローニング系(Clontech, Mountain View, CA)を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＮＯＳ発現系にクローン化した。構築物番号１１９０(図１１Ｂ、配列番号４０)をＳａｃIIおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、直線化プラスミドをIn-Fusion組立反応に使用した。構築物番号１１９０は、ＣＰＭＶ−１６０ベースの発現カセットへの目的の遺伝子の“In Fusion”クローニングのためのアクセプタープラスミドである。アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下、ＴＢＳＶ  Ｐ１９サイレンシングのサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物も組み込む。主鎖はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左から右ｔ−ＤＮＡ境界の配列を図１１Ｃ(配列番号４１)に示す。得られた構築物の番号を１１７８(図Ｈ２、配列番号Ｈ２)とした。ロタウイルスＡワクチンＵＳＡ／Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]からのＶＰ４のアミノ酸配列を図９Ｅ(配列番号３３)に示す。プラスミド１１７８の模式図を図１４Ｃに示す。
【０２９８】
９. ２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＴｒＳｐ−ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ７(ｏｐｔ)／ＮＯＳ(構築物番号１１９９)
ロタウイルスＡワクチンＵＳＡ／Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からの天然シグナルペプチドの切断バージョンを伴うＶＰ７をコードする最適化配列を、次のＰＣＲベースの方法を使用して、Ｐｌａｓｔｏ＿ｐｒｏ／Ｐ１９／Ｐｌａｓｔｏ＿ｔｅｒ発現カセット含有プラスミドにおける２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＮＯＳ発現系にクローン化した。ＶＰ７コード配列含有フラグメントを、プライマーＩＦ(Ｃ１６０)−ＴｒＳＰ＋Ｒｔｘ＿ＶＰ７(ｏｐｔ).ｃ(図１５Ａ、配列番号５２)およびＩＦ−Ｒｔｘ＿ＶＰ７(ｏｐｔ).ｓ１−４ｒ(図１０Ｂ、配列番号３５)を使用して、最適化ＶＰ７遺伝子配列(図１０Ｃからのｎｔ８８〜８９１に対応、配列番号３６)を鋳型として使用して増幅した。配列最適化のために、ＶＰ７タンパク質配列(Genbank受託番号ＡＥＸ３０６８２)を戻し翻訳し、ヒトコドン使用、ＧＣ含量およびｍＲＮＡ構造について最適化した。ＰＣＲ産物を、In-Fusionクローニング系(Clontech, Mountain View, CA)を使用して、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＮＯＳ発現系にクローン化した。構築物番号１１９０(図１１Ｂ、配列番号４０)をＳａｃIIおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、直線化プラスミドをIn-Fusion組立反応に使用した。構築物番号１１９０は、ＣＰＭＶ−１６０ベースの発現カセットへの目的の遺伝子の“In Fusion”クローニングのためのアクセプタープラスミドである。アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下、ＴＢＳＶ  Ｐ１９サイレンシングのサプレッサーの共発現のための遺伝子構築物も組み込む。主鎖はｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドであり、左から右ｔ−ＤＮＡ境界の配列を図１１Ｃ(配列番号４１)に示す。得られた構築物の番号を１１９９(図１５Ｂ、配列番号５３)とした。ロタウイルスＡワクチンＵＳＡ／Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からの切断シグナルペプチドを有するＶＰ７のアミノ酸配列を図１０Ｅ(配列番号３８)に示す。プラスミド１１９９の模式図を図１５Ｃに示す。
【０２９９】
１０. ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット下のＶＰ６およびＶＰ２の発現のための二重遺伝子構築物(構築物番号１７０８)
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現系制御下のロタウイルスＡ  ＷＡ株からのＶＰ６およびロタウイルスＡ  ＷＡ株からのＶＰ２の共発現のための単一ベクターを、次の制限酵素／リガーゼベースの方法を使用して組立た。ドナープラスミドＤＮＡ(構築物番号１７１０；２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(ＷＡ)ＶＰ２(ｏｐｔ)／ＮＯＳ)(図７Ｆ、配列番号２３)をＡｖｒII(２Ｘ３５Ｓプロモーター前に位置)およびＡｓｃＩ(ＮＯＳターミネーター後に位置)制限酵素で消化し、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(ＷＡ)ＶＰ２(ｏｐｔ)／ＮＯＳ発現カセットに対応するフラグメントをゲル精製した。このフラグメントを、次いで、ＸｂａＩおよびＡｓｃＩ制限酵素(両部位は、ＶＰ６発現カセットのＮＯＳターミネーター後に位置)を使用して直線化したアクセプター構築物番号１７１３(２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(ＷＡ)ＶＰ６(ｏｐｔ)／ＮＯＳ)(図８Ｄ、配列番号２８)に挿入した。得られた構築物の番号を１７０８とした。プラスミド１７０８の模式図を図１６に示す。
【０３００】
１１. ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット下のＶＰ７およびＶＰ４の発現のための二重遺伝子構築物(構築物番号１７１９)
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現系制御下のロタウイルスＡワクチンＵＳＡ／Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からの天然シグナルペプチドの切断バージョンを伴うＶＰ７およびロタウイルスＡワクチンＵＳＡ／Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からのＶＰ４の共発現のための単一ベクターを、次の制限酵素／リガーゼベースの方法を使用して組立た。ドナープラスミドＤＮＡ(構築物番号１７３０；２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ４(ｏｐｔ)／ＮＯＳ)(図９Ｄ、配列番号３２)をＡｖｒII(２Ｘ３５Ｓプロモーター前に位置)およびＡｓｃＩ(ＮＯＳターミネーター後に位置)制限酵素で消化し、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ４(ｏｐｔ)／ＮＯＳ発現カセットに対応するフラグメントをゲル精製した。このフラグメントを、次いで、ＸｂａＩおよびＡｓｃＩ制限酵素(両部位はＶＰ７発現カセットのＮＯＳターミネーター後に位置)を使用して直線化した、アクセプター構築物番号１７３４(２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＴｒＳｐ−ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ７(ｏｐｔ)／ＮＯＳ)(図１０Ｄ、配列番号３７)に挿入した。得られた構築物の番号を１７１９とした。プラスミド１７１９の模式図を図１７に示す。
【０３０１】
１２. ＣＰＭＶ−１６０発現カセット下のＶＰ６およびＶＰ２の発現のための二重遺伝子構築物(構築物番号２４００)
ＣＰＭＶ−１６０発現系制御下のロタウイルスＡ  ＷＡ株からのＶＰ６およびロタウイルスＡ  ＷＡ株からのＶＰ２の共発現のための単一ベクターを、次の制限酵素／リガーゼベースの方法を使用して組立た。ドナープラスミドＤＮＡ(構築物番号１１０８；２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＲＶＡ(ＷＡ)ＶＰ２(ｏｐｔ)／ＮＯＳ)(図１２Ｄ、配列番号４７)をＡｖｒII(２Ｘ３５Ｓプロモーター前に位置)およびＡｓｃＩ(ＮＯＳターミネーター後に位置)制限酵素で消化し、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＲＶＡ(ＷＡ)ＶＰ２(ｏｐｔ)／ＮＯＳ発現カセットに対応するフラグメントをゲル精製した。このフラグメントを、次いで、ＸｂａＩおよびＡｓｃＩ制限酵素(両部位は、ＶＰ６発現カセットのＮＯＳターミネーター後に位置)を使用して直線化した、アクセプター構築物番号１１２８(２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＲＶＡ(ＷＡ)ＶＰ６(ｏｐｔ)／ＮＯＳ)(図１３Ｂ、配列番号４９)に挿入した。得られた構築物の番号を２４００とした。プラスミド２４００の模式図を図１８に示す。
【０３０２】
１３. ＣＰＭＶ−１６０発現カセット下のＶＰ７およびＶＰ４の発現のための二重遺伝子構築物(構築物番号２４０８)
ＣＰＭＶ−１６０発現系制御下のロタウイルスＡワクチンＵＳＡ／Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からの天然シグナルペプチドの切断バージョンを伴うＶＰ７およびロタウイルスＡワクチンＵＳＡ／Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からのＶＰ４の共発現のための単一ベクターを、次の制限酵素／リガーゼベースの方法を使用して組立た。ドナープラスミドＤＮＡ(構築物番号１１７８；２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ４(ｏｐｔ)／ＮＯＳ)(図１４Ｂ、配列番号５１)をＡｖｒII(２Ｘ３５Ｓプロモーター前に位置)およびＡｓｃＩ(ＮＯＳターミネーター後に位置)制限酵素で消化し、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ４(ｏｐｔ)／ＮＯＳ発現カセットに対応するフラグメントをゲル精製した。このフラグメントを、次いで、ＸｂａＩおよびＡｓｃＩ制限酵素(両部位はＶＰ７発現カセットのＮＯＳターミネーター後に位置)を使用して直線化したアクセプター構築物番号１１９９(２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−１６０／ＴｒＳｐ−ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ７(ｏｐｔ)／ＮＯＳ)(図１５Ｂ、配列番号５３)に挿入した。得られた構築物の番号を２４０８とした。プラスミド２４０８の模式図を図１９に示す。
【０３０３】
１４. ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット下のＶＰ７、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ２の発現のための四重遺伝子構築物(構築物番号１７６９)
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現系制御下のロタウイルスＡワクチンＵＳＡ／Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からの天然シグナルペプチドの切断バージョンを伴うＶＰ７、ロタウイルスＡワクチンＵＳＡ／Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からのＶＰ４、ロタウイルスＡ  ＷＡ株からのＶＰ６およびロタウイルスＡ  ＷＡ株からのＶＰ２の共発現のための単一ベクターを、次の制限酵素／リガーゼベースの方法を使用して組立た。ドナープラスミドＤＮＡ(構築物番号１７３０；２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ４(ｏｐｔ)／ＮＯＳ)(図９Ｄ、配列番号３２)をＡｖｒII(２Ｘ３５Ｓプロモーター前に位置)およびＡｓｃＩ(ＮＯＳターミネーター後に位置)制限酵素で消化し、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ４(ｏｐｔ)／ＮＯＳ発現カセットに対応するフラグメントをゲル精製した。このフラグメントを、次いで、ＸｂａＩおよびＡｓｃＩ制限酵素(両部位はＶＰ７発現カセットのＮＯＳターミネーター後に位置)を使用して直線化したアクセプター構築物番号１７３４(２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＴｒＳｐ−ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ７(ｏｐｔ)／ＮＯＳ)(図１０Ｄ、配列番号３７)に挿入した。ＡｖｒIIおよびＸｂａＩにより産生された粘着性末端のライゲーションは、元の制限部位を破壊し、第二発現カセットのＮＯＳターミネーターの末端に、同じ独特のＸｂａＩおよびＡｓｃＩ制限酵素部位を有する一過性アクセプターベクターを産生した(左から右Ｔ−ＤＮＡ)。ＣＰＭＶ−ＨＴ発現系下発現したＶＰ６(構築物番号１７１３；図８Ｄ、配列番号２８)およびＶＰ２(構築物番号１７１０；図７Ｆ、配列番号２３)を、次いで、得られた一過性アクセプターベクターに、同じ消化戦略を使用して逐次的に挿入し、最終をＶＰ７／ＶＰ４／ＶＰ６／ＶＰ２構築物得た。得られた構築物の番号を１７６９とした。プラスミド１７６９の模式図を図２０に示す。
【０３０４】
１５. ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット下のＶＰ４、ＶＰ７、ＮＳＰ４、ＶＰ６およびＶＰ２の発現のための五重遺伝子構築物(構築物番号２４４１)
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現系制御下のロタウイルスＡワクチンＵＳＡ／Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からのＶＰ４、ロタウイルスＡワクチンＵＳＡ／Ｒｏｔａｒｉｘ−Ａ４１ＣＢ０５２Ａ／１９８８／Ｇ１Ｐ１Ａ[８]株からの天然シグナルペプチドの切断バージョンを伴うＶＰ７、ロタウイルスＡ  ＷＡ株からのＮＳＰ４、ロタウイルスＡ  ＷＡ株からのＶＰ６およびロタウイルスＡ  ＷＡ株からのＶＰ２の共発現のための単一ベクターを、次の制限酵素／リガーゼベースの方法を使用して組立た。ドナープラスミドＤＮＡ(構築物番号１７３４；２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＴｒＳｐ−ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ７(ｏｐｔ)／ＮＯＳ)(図１０Ｄ、配列番号３７)をＡｖｒII(２Ｘ３５Ｓプロモーター前に位置)およびＡｓｃＩ(ＮＯＳターミネーター後に位置)制限酵素で消化し、２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＴｒＳｐ−ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ７(ｏｐｔ)／ＮＯＳ発現カセットに対応するフラグメントをゲル精製した。このフラグメントを、次いで、ＸｂａＩおよびＡｓｃＩ制限酵素(両部位はＶＰ４発現カセットのＮＯＳターミネーターに位置)を使用して直線化したアクセプター構築物番号１７３０(２Ｘ３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ／ＲＶＡ(Ｒｔｘ)ＶＰ４(ｏｐｔ)／ＮＯＳ)(図９Ｄ、配列番号３２)に挿入した。ＡｖｒIIおよびＸｂａＩにより産生された粘着性末端のライゲーションは、元の制限部位を破壊し、第二発現カセットのＮＯＳターミネーターの末端に、同じ独特のＸｂａＩおよびＡｓｃＩ制限酵素部位を有する一過性アクセプターベクターを産生した(左から右Ｔ−ＤＮＡ)。ＣＰＭＶ−ＨＴ発現系下発現したＮＳＰ４(構築物番号１７０６；図１１Ｄ、配列番号４２)、ＶＰ６(構築物番号１７１３；図８Ｄ、配列番号２８)およびＶＰ２(構築物番号１７１０；図７Ｆ、配列番号２３)を、次いで、得られた一過性アクセプターベクターに、同じ消化戦略を使用して逐次的に挿入し、最終を得たＶＰ４／ＶＰ７／ＮＳＰ４／ＶＰ６／ＶＰ２構築物。得られた構築物の番号を２４４１とした。プラスミド２４４１の模式図を図２１に示す。
【０３０５】
実施例２：ＮＳＰ４の共発現は、ＲＬＰにおけるＶＰ４およびＶＰ４取り込みを増加させる
ロタウイルスＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７構造的抗原を、実施例１に記載のアグロインフィルトレーションを使用して、ＮＳＰ４発現構築物存在下または非存在下、ベンサミアナタバコ植物に一過性に共発現させた。ＲＬＰ産生植物からの粗製タンパク質抽出物は、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける縞模様パターンにより示されるとおり、大量の宿主タンパク質を含んだ(図２Ｂ、充填)。ロタウイルス様粒子は、イオジキサノール密度勾配での超遠心分離法により植物タンパク質から分離できる。遠心分離後、イオジキサノール密度勾配からのフラクションの分析は、ＲＬＰが３５％イオジキサノールフラクションに移動し(図２ＢのＦ２およびＦ３)、一方宿主タンパク質の大部分が２５〜３０％イオジキサノールフラクション(図２ＢにおけるＦ４〜Ｆ１０)に残ることを示した。ロタウイルス構造的抗原共発現植物からのＲＬＰを、イオジキサノール密度勾配で精製し、ＲＬＰ含有フラクション(Ｆ２およびＦ３)の分析は、ＲＬＰが、単一、デュアルおよび四重遺伝子構築物を含む図３Ａで示すように、構築物あたりの遺伝子の数と無関係に、効率的に産生できることを示した。得られた結果は、また、ＮＳＰ４の共発現がＲＬＰ発現を減少させたことを示した(図３Ａにおける−ＮＳＰ４および＋ＮＳＰ４下のフラクション比較)。各フラクションの等体積を、体積あたりのＲＬＰ含量を比較するためにゲルに充填したことに注意。
【０３０６】
同じ実験からのＲＬＰ含有フラクション２をウェスタンブロットで分析して、ＶＰ４およびＶＰ７取り込みに対するＮＳＰ４共発現の影響を評価した。この比較のために、等量のＲＬＰＳをゲルに充填した。得られたウェスタンブロット結果は、ＮＳＰ４存在下、ＲＬＰにおけるＶＰ４およびＶＰ７に対する強いシグナルの産生を示した(図３Ｂ、−ＮＳＰ４および＋ＮＳＰ４下のレーン参照)。これらの結果は、ＮＳＰ４共発現が、ＲＬＰ表面へのＶＰ４およびＶＰ７取り込みを増加させることを明らかに示す。
【０３０７】
４ロタウイルス抗原および非構造タンパク質ＮＳＰ４をコードする遺伝子を、ＣＰＭＶ−ＨＴおよびＣＰＭＶ１６０に発現の比較のためにクローン化した。共発現試験と、続くイオジキサノール密度勾配における超遠心分離法による抽出および精製により、両発現が、勾配におけるフラクション２および３におけるＶＰ６の量(図４Ａ)および同処理のフラクション２におけるＶＰ４およびＶＰ７の量(図４Ｂ)により示されるとおり、ＲＬＰを効率的に産生したことを示した。この試験はまた、ロタウイルスタンパク質発現のためにＣＰＭＶ−ＨＴ系を使用したとき、単一遺伝子構築物が、デュアル遺伝子構築物と同程度ＲＬＰを産生し(図４Ａ、左パネル対中央パネル)、表面抗原、ＶＰ４およびＶＰ７での類似被覆率をもたらすことを示した(図４Ｂ、左パネル対中央パネル)。
【０３０８】
五重遺伝子構築物(同じプラスミドに５遺伝子を含む)は、４構造的抗原とＮＳＰ４の共発現について評価している。図５に示すとおり、五重遺伝子構築物の使用は、四重遺伝子構築物と別のプラスミド上のＮＳＰ４遺伝子の使用と類似のＲＬＰ産生レベル(図５、上部パネル)ならびに同等レベルのＶＰ４およびＶＰ７取り込み(図５、下部パネル)をもたらした。
【０３０９】
アグロバクテリウム形質転換
全プラスミドを、エレクトロポレーション(ＭMattanovich et al., 1989, Nucleic Acid Res. 17:6747)によるアグロバクテリウム・ツメファシエンス(ＡＧＬ１；ATCC, Manassas, VA 20108, USA)のトランスポレーションに使用し、あるいはＣａＣｌ２調製コンピテント細胞(XU et al., 2008, Plant Methods 4)を使用し得る。産生したアグロバクテリウム・ツメファシエンス株におけるプラスミドの完全性を制限マッピングにより産生した。
【０３１０】
植物バイオマスの産生、接種、アグロインフィルトレーションおよび収穫
ベンサミアナタバコ植物を、市販の泥炭ゴケ基質で満たしたフラットで種子から育てた。植物を温室で１６／８光周期および２５℃昼／２０℃夜温度レジメで育てた。種まき３週間後、個々の小植物を採取し、鉢に移植し、温室でさらに３週間、同じ環境条件で生育させた。
【０３１１】
各構築物でトランスフェクトしたアグロバクテリウムを、１０mM  ２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸(ＭＥＳ)および５０μg／ml  カナマイシンｐＨ５.６添加植物起源ＬＢ培地で、ＯＤ６００が０.６〜２.５に到達するまで増殖させた。アグロバクテリウム懸濁液を、各構築物が適切な比になるよう混合し、浸潤培地(１０mM  ＭｇＣｌ２および１０mM  ＭＥＳ  ｐＨ５.６)で２.５Ｘ  ＯＤ６００とした。アグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液を、一夜、４℃で保存した。浸潤の日、培養バッチを浸潤培地で希釈し、使用前に温めた。ベンサミアナタバコの植物全体を、気密性ステンレススチールタンクで、２０〜４０Torr、２分の吸引下、細菌懸濁液に倒置して入れた。浸潤後、植物を、収穫するまで９日のインキュベーション期間、温室に戻した。収穫バイオマスを、粒子精製まで凍結した(−８０℃)。
【０３１２】
ロタウイルス様粒子の超遠心分離法による抽出およびスクリーニング
タンパク質を、２体積の抽出物緩衝液(ＴＮＣ：１０mM  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７.４、１４０mM  ＮａＣｌ、１０mM  ＣａＣｌ２)を入れたブレンダー中、機械的抽出により、凍結バイオマスから抽出した。スラリーを大孔ナイロンフィルターで濾過して、大きな残骸を除去し、５０００ｇで５分、４℃で遠心分離した。上清を採取し、再び５０００ｇで３０分(４℃)遠心分離して、さらなる残骸を除去した。次いで、上清を不連続イオジキサノール密度勾配に充填する。
【０３１３】
分析的密度勾配遠心分離を次のとおり実施した。ＴＮＣ緩衝液中不連続イオジキサノール密度勾配(イオジキサノール４５％を１.２ml、３５％を２ml、３０％を５mlおよび２５％を５ml)を含む３８mlチューブを調製し、ロタウイルス様粒子含有抽出物２５mlで重層した。勾配を１２００００ｇで４時間(４℃)遠心分離した。遠心分離後、１mlフラクションを下部〜上部から回収し、フラクション２および３(３５％イオジキサノールに対応)を、タンパク質染色またはウェスタンブロットと組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０３１４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング
タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ(Pierce Biochemicals, Rockport, IL)により決定した。タンパク質を、CriterionTM TGX Stain-FreeTMプレキャストゲル(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)を使用して還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、タンパク質をGel DocTM EZ造影系(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)で可視化した。
【０３１５】
免疫ブロッティングのために、電気泳動したタンパク質をポリビニレンジフルオライド(ＰＶＤＦ)膜(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)に電気泳動転写した。免疫ブロッティング前に、膜を５％脱脂粉乳および０.１％Ｔｗｅｅｎ−２０のＴｒｉｓ緩衝化食塩水(ＴＢＳ−Ｔ)で、１６〜１８時間、４℃でブロックした。
【０３１６】
免疫ブロッティングを、適当な抗体(表４)と、２％脱脂粉乳の０.１％ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０中、インキュベートすることにより実施した。化学発光検出に使用した二次抗体は表４に示し、２％脱脂粉乳の０.１％ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０で記載するとおり希釈した。免疫反応性複合体を、基質としてルミノールを使用する化学発光により検出した(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)。
【０３１７】
【表５】
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【０３１８】
全ての引用文献は、引用によりここに包含させる。
【０３１９】
本発明は、１以上の態様に関連して記載している。しかしながら、多数の変化および修飾を、特許請求の範囲に規定する本発明の範囲から逸脱することなくなし得ることは、当業者には明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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