(57)【要約】本開示は、注射剤と経皮投与とに適するアジュバント組成物を提供する。このアジュバント組成物は概して、親油性物質と、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーと、生理食塩水と、コレステロールと、サポニンと、水酸化ナトリウムとを含む。本開示のワクチン組成物とＤＮＡ成分とを概して含むワクチン組成物も提供する。本開示のアジュバント組成物を用いた、動物とヒトへのワクチンの接種方法も提供する。
2018510874.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．親油性物質と、
ｂ．アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーと、
ｃ．生理食塩水と、
ｄ．コレステロールと、
ｅ．アルコールと、
ｆ．サポニンと、
ｇ．水酸化ナトリウムと、
を含むアジュバント組成物。
【請求項２】
前記親油性物質がＬａｂｒａｆａｃ（商標）である、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項３】
前記アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーがＣａｒｂｏｐｏｌ（商標）である、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項４】
前記コレステロールが、植物由来のコレステロールである、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項５】
前記アルコールがエタノールである、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項６】
前記サポニンがＱｕｉｌ−Ａである、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項７】
前記親油性物質が、約０．０１体積％〜約５体積％の量で存在する、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項８】
前記アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーが、約０．１体積％〜約３体積％の量で存在する、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項９】
前記コレステロールが、約０．００１体積％〜約３体積％の量で存在する、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項１０】
前記アルコールが、約０．０１体積％〜約３体積％の量で存在する、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項１１】
前記サポニンが、約０．００１体積％〜約０．５体積％の量で存在する、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項１２】
室温において、かつ凍結乾燥したときに、安定している、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項１３】
筋内投与、皮下投与、経皮投与、粘膜投与、経口投与及びこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択した投与経路用に調合されている、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項１４】
前記アジュバントを抗原と組み合わせて、ワクチン組成物を形成させる、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項１５】
ｉ．アジュバント組成物であって、
ａ．親油性物質、
ｂ．アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー、
ｃ．生理食塩水、
ｄ．コレステロール、
ｅ．アルコール、
ｆ．サポニン及び
ｇ．水酸化ナトリウム
を含む前記アジュバント組成物と、
ｉｉ．抗原と、
を含むワクチン組成物。
【請求項１６】
前記親油性物質がＬａｂｒａｆａｃ（商標）である、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
前記アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーがＣａｒｂｏｐｏｌ（商標）である、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
前記コレステロールが、植物由来のコレステロールである、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
前記アルコールがエタノールである、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
前記サポニンがＱｕｉｌ−Ａである、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
前記親油性物質が、約０．０１体積％〜約５体積％の量で存在する、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
前記アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーが、約０．１体積％〜約３体積％の量で存在する、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
前記コレステロールが、約０．００１体積％〜約３体積％の量で存在する、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
前記アルコールが、約０．０１体積％〜約３体積％の量で存在する、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
前記サポニンが、約０．００１体積％〜約０．５体積％の量で存在する、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項２６】
筋内投与、皮下投与、経皮投与、粘膜投与、経口投与及びこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択した投与経路用に調合されている、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項２７】
前記抗原が、非複製型コンピテントであるＤＮＡである、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項２８】
前記抗原が、プラスミドの形態の非複製型コンピテントＤＮＡである、請求項２７に記載のワクチン組成物。
【請求項２９】
プラスミドの形態の前記非複製型コンピテントＤＮＡが、前記ワクチン組成物に、約１０μｇ〜３０μｇの量で存在する、請求項２８に記載のワクチン組成物。
【請求項３０】
室温で、少なくとも１８カ月間、保存安定性を有する、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項３１】
室温で、少なくとも２年間、保存安定性を有する、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項３２】
凍結乾燥したときに安定している、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項３３】
ａ．親油性物質と、
ｂ．アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーと、
を含むアジュバント組成物。
【請求項３４】
ａ．親油性物質と、
ｂ．コレステロールと、
ｃ．サポニンと、
を含むアジュバント組成物。
【請求項３５】
請求項１に記載のアジュバント組成物の投与が必要な動物に、請求項１に記載のアジュバント組成物を１回投与する工程を含む、免疫応答の惹起方法。
【請求項３６】
請求項３３に記載のアジュバント組成物の投与が必要な動物に、請求項３３に記載のアジュバント組成物を１回投与する工程を含む、免疫応答の惹起方法。
【請求項３７】
請求項３４に記載のアジュバント組成物の投与が必要な動物に、請求項３４に記載のアジュバント組成物を１回投与する工程を含む、免疫応答の惹起方法。
【請求項３８】
請求項１７に記載のワクチン組成物の投与が必要な動物に、請求項１７に記載のワクチン組成物を１回投与する工程を含む、免疫応答の惹起方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本願は、紙の形式とコンピューター可読形式の配列表を含み、その配列表の教示及び内容は、参照により、本明細書に援用される。
【０００２】
本開示の分野は、バイオ医薬調製剤で使用するアジュバント組成物に関するものである。このアジュバントは、哺乳動物の細胞または組織内の非複製型または複製型ＤＮＡのような精製ＤＮＡ成分を含むバイオ医薬調製剤とともに用いるのに特に適している。
【背景技術】
【０００３】
アジュバントは、ワクチン組成物の成否に影響を及ぼしたり、さらには、その成否を決定したりする可能性がある。加えて、アジュバントによって、所定の抗原の投与方法が決定したり、または補強されたりする場合が多い。さらに、治療または予防目的で用いるＤＮＡワクチン及び遺伝子ワクチンの分野では、ＤＮＡワクチンを作製するときに、有効性を得るために、Ｃａ＋＋及び二価陽イオンが必要となると考えられている。Ｃａ＋＋及び二価陽イオンは、水性（水）溶液に懸濁されていると不安定であるリポソーム送達ビヒクルの誘導体に加えるか、またはこの誘導体として形成する場合が多い。これらの物質のこれらの工程と生成は、時間がかかり、ワクチン製造コストを増大させる。ＤＮＡワクチンは、被投与者を攻撃から保護する免疫応答を惹起するためには、複数回投与する必要があることが当該技術分野では知られている。さらに、ＤＮＡワクチンでは、１回の投与につき数百マイクログラムからミリグラムの範囲の精製ＤＮＡという高用量のＤＮＡが必要となる。
【０００４】
すべてのワクチン投与経路は、有効性の向上と調合の制御（より少ない抗原を用いて同等以上の免疫原性反応を得る能力を含む）から恩恵を受け得る。当該技術分野では、陽イオンまたはリポソーム送達ビヒクルの使用を必要としないＤＮＡワクチンに適合するように配合できるアジュバント組成物が必要とされている。さらに、ワクチンを１回投与後に有効なワクチンをもたらすアジュバント調合物が必要とされている。このような組成物は、被投与者に対するストレスが少なく、コスト効率が高い。そして、免疫の発現及び持続時間などの機能が改善された組成物も、当該技術分野において必要とされている。静脈内、皮下、筋内、経皮、経口及び粘膜などの多数の接種経路によって送達できる組成物も、当該技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、先行技術に固有の課題を克服するものであり、ヒト、ならびにトリ及び哺乳動物を含む動物での使用に適するアジュバント組成物とワクチン組成物を提供する。加えて、本開示は、このようなアジュバント組成物とワクチン組成物に関連する方法を提供する。本開示のアジュバント組成物は特に、ＤＮＡとその他の関連する遺伝物質とを含む医薬調製剤とともに用いるのに適する。ＤＮＡが組み込まれている本開示のワクチンは、驚くべきことに、従来のワクチン調合物よりも、必要とされるＤＮＡが少ないことが分かったとともに、Ｃａ＋＋、二価陽イオンまたは二価陽イオン由来のリポソームビヒクルを使用せずに製造できる。さらに、本開示のアジュバントが組み込まれている本開示のワクチン組成物には、少ないＤＮＡ用量のワクチン組成物を１回投与後に、被投与者を攻撃から保護することになる免疫応答を誘導するという予想外の利点がある。これらの特徴は、当該技術分野を進歩させ、被投与者のためにもなる。
【０００６】
本開示のアジュバント組成物は、核酸ベースのワクチンまたは免疫原性組成物とともに使用するのに特に適する。ＤＮＡベースのワクチンまたは免疫原性組成物は、免疫応答を誘導できるいずれかの組成物であって、ＤＮＡをその組成物の抗原部分として有する組成物である。本開示の目的においては、ＤＮＡは、「骨格ＤＮＡ」を指すことができるが、本開示はそれに限定されない。いくつかの実施形態では、このＤＮＡ骨格は、非複製型（死滅型）の、好ましくは高精製の二本鎖環状共有結合性スーパーコイル化ＤＮＡである。別の実施形態では、ＤＮＡ骨格は複製型である。骨格ＤＮＡは、外来遺伝子を挿入するためのマルチクローニングサイト、哺乳動物細胞においてのみ活性化する真核生物特異的プロモーターモチーフ、ポリＡ付加サイトまたはこれらのいずれかの組み合わせ（ただし、これらに限らない）から選択した特徴を含むことができる。さらなる実施形態では、非複製型ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡを保持する宿主細胞を選択できるようにする選択可能なマーカー遺伝子と、細菌において多数のコピーが作られるようにするための高コピー性複製型コンピテントモチーフを用いることによって、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって駆動されるような細菌発酵で増幅できる。さらに別の実施形態では、ＤＮＡ骨格は、哺乳動物細胞で発現させるための異なるタイプの遺伝子インサートを受け入れるのに適したものである。さらなる実施形態では、ＤＮＡベースのワクチンは、哺乳動物細胞または組織でのワクチン投与または遺伝子療法で使用するウイルス粒子、ウイルス様粒子またはウイルスベクターの複製に必要な遺伝子の相補体全体をコードできる。追加の実施形態では、本開示のワクチンまたは免疫原性組成物のＤＮＡ成分は、哺乳動物細胞において複製コンピテントであり、哺乳動物細胞でＤＮＡ複製を開始させるためのモチーフ、哺乳動物細胞で遺伝子の転写を開始及び終結させるためのモチーフ、哺乳動物細胞から得られる複製型コンピテントＤＮＡに由来する遺伝物質の封入物またはパッケージ体を作るための遺伝子モチーフ及びこれらの組み合わせ（ただし、これらに限らない）から選択した１つ以上のモチーフを含む。
【０００７】
一実施形態では、本開示は、ＤＮＡベースのワクチンまたは免疫原性組成物の効率的な送達を改善させ、また、それにより、従来のＤＮＡベースのワクチンと比べて、被投与者における免疫応答を増大させる。さらには、進化している疾患に対する応答時間をさらに迅速化させ、これは、新たな病原体の流行に応じて、ワクチンまたは免疫原性組成物をさらに迅速に開発できることを意味する。本開示のアジュバントを用いることにより、感染した動物（ヒトを含む）から単離した組織から遺伝子を単離できるとともに、その組織を調製してから数時間以内に、その遺伝子を増幅でき、ほんの数日で、その遺伝子配列を単離し、遺伝子配列を評価する方法が提供される。したがって、本開示のアジュバントを用いると、従来の技術では数カ月または数年かかるところを、数日ほどで、ＤＮＡベースのワクチン骨格に新たな遺伝子を直接導入でき、新たなワクチンを用意できる。すなわち、本開示のアジュバントは、ヒトと動物の両方において、進化している疾患の問題に対処する方法であって、規制当局による製造許可承認を迅速に得られ、製造に際してコスト効率がよく、被投与者にとって有益である方法をもたらす。さらなる利点は、攻撃に対する有効性を得るのに必要なのは、本開示のアジュバント組成物を含むワクチンを１回投与することである点である。しかしながら、複数回投与してもよく、その場合には、２回、３回、４回及び５回の投与が想定される。
【０００８】
本開示のアジュバント組成物は概して、親油性物質の使用を含み、この親油性物質は、好ましくは、Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）（フランスのリヨンのＧａｔｔｅｆｏｓｓｅ）として市場で知られている組成物またはレシチンから選択する。本開示のアジュバントが組み込まれている本開示のワクチンの有効性は、レシチンの有無に左右されない。しかしながら、レシチンを含むアジュバントの方が概して、注射を必要とする投与経路（これらに限らない）に適し、その一方で、Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）を含むアジュバント組成物の方が概して、注射と針無投与方法を必要とする投与経路（これらに限らない）に適する。
【０００９】
本開示のアジュバント組成物は好ましくは、その組成物への抗原の吸収が０．１％〜２０％高く、その結果、投与したときに、さらに有効な免疫応答が得られる。したがって、より少ない量の抗原を用いて、必要なレベルの免疫応答を誘導できる。より好ましくは、その吸収または反応は、約１％〜２０％高く、１％〜１５％、５％〜２０％、１％〜１８％、２％〜１８％、０．５％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％及び１９％といった範囲と値が想定される。
【００１０】
本開示のアジュバント組成物は、ワクチンまたは免疫原性組成物などで抗原と組み合わせると、本開示に示されていないアジュバントを含む従来のワクチンまたは免疫原性組成物と比べて、ワクチンの抗原部分をワクチンの被投与者の免疫系に提示する機能を向上させる。このような提示機能の向上は、本開示の一部ではないアジュバント組成物と組み合わせたときの同じ抗原との比較である。好ましくは、提示機能の向上によって、より少ない量の抗原を使用して、同じレベルの免疫系反応を得ることができるようになる。免疫系反応のレベルは、免疫応答のマーカーによって測定した場合の応答強度によって測定することも、免疫の持続時間によって測定することも、これらの２つの免疫系反応指標を組み合わせることによって測定することもできる。さらに好ましくは、抗原提示機能の向上により、同じ種の動物に投与するときに、９５％の量の抗原、より好ましくは９０％、さらに好ましくは、８５％、８０％、７５％、６０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％およびこれらの数値群のいずれかの２つの値によって形成される範囲の量の抗原を用いて、別のアジュバントと組み合わせた同じ抗原と同じレベルの免疫系反応が得られるようになる。
【００１１】
レシチンは、すべてのタイプの抗原に有用であるわけではないことが示されているので、本開示のアジュバント組成物と、関連する方法のさらなる利点は、いくつかの実施形態には、レシチンが含まれない点である。本開示のアジュバント組成物は好ましくは、レシチンを使用しない有効なアジュバント組成物と、関連する方法であって、その抗原に対する免疫応答をレシチンが誘導しないか、またはもたらさない抗原に対する免疫応答を増大させることが示されている組成物と関連する方法を提供する。
【００１２】
本開示のアジュバント組成物は概して、親油性物質と、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーと、生理食塩水と、コレステロールと、アルコールと、サポニンと、水酸化ナトリウムとを含む。本アジュバント組成物は、針無投与、経皮投与及びその他の投与経路で機能することが示されている。
【００１３】
有益なことに、本開示のアジュバント組成物は、抗原に対する殺ウイルス作用と細胞障害作用が低く、これは、このアジュバント組成物が抗原を分解して、被投与者において適切な免疫応答を誘導する効果を無効にすることがないことを意味する。同じ理由から、本アジュバントを抗原に組み合わせると、得られる組成物を用いて、インビトロでの免疫応答をスクリーニングできる。好ましくは、脂質濃度が５％未満の脂質のときに、本アジュバントの殺ウイルス活性は、組織培養ＥＩＤ５０を有する。細胞培養液に対する細胞障害作用は、用いる細胞培養液によって様々であるが、安全な範囲は、０．０２５％〜５％であることができる。好ましい範囲は、５％未満、より好ましくは４％未満、さらに好ましくは０．２５％〜約３％、さらに好ましくは約０．２５％〜２％である。
【００１４】
本開示のアジュバント組成物は、液体形態において室温（約６０〜７５℃）で作製したとき、または冷蔵温度（２℃〜７℃）で保存したとき、好ましくは少なくとも６カ月、より好ましくは少なくとも１２カ月、さらに好ましくは少なくとも１８カ月、さらに好ましくは少なくとも２４カ月またはそれ以上、保存安定性を有する。本開示のアジュバントは、−１８〜−２２℃または−４０〜−８０℃で冷凍して保存することもできる。本開示のアジュバントは、凍結乾燥して、（２℃〜７℃）で保存して、ワクチンと生体物質とともに使用する際のアジュバントの汎用性を高くすることができる。
【００１５】
本開示はさらに、本開示のアジュバント組成物と抗原とを含むワクチンまたは免疫原性組成物を提供する。この抗原は、免疫原性組成物またはワクチンとして使用するのに適するいずれかの抗原であることができる。好ましい実施形態では、抗原はＤＮＡであり、このＤＮＡとしては、複製型コンピテントＤＮＡまたは非複製型コンピテントＤＮＡが挙げられる。好ましくは、共有結合性閉環状スーパーコイル化プラスミド形態の非複製型コンピテントＤＮＡまたは合成由来のＤＮＡである。好ましくは、本開示のアジュバントと抗原との比は、約１：２０〜１：１、より好ましくは、約１：２０、１：１７、１：１５、１：１２、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２及び１：１．５であり、１：５が特に好ましい。
【００１６】
本開示のワクチンは好ましくは、本開示のアジュバント調合物とＤＮＡ成分とを含む。最も好ましくは、抗原は、プラスミドの形態の非複製型または複製型コンピテントＤＮＡであることができる。ＤＮＡベースのワクチン周辺の当該技術では、ワクチンのＤＮＡ成分の有効な送達にはＣａ＋＋が必要であることが示されており、当該技術分野においては、陽イオン系が普及している。本開示のワクチンは驚くべきことに、Ｃａ＋＋または陽イオンを使用しなくても有効であり、これにより、当該技術分野を進歩させる。さらなる実施形態では、本開示のワクチンは、少量のＤＮＡしか必要としない。好ましくは、このＤＮＡは、１回の投与につき約２５０μｇ〜０．２５μｇの量で存在し、１００〜２５０μｇ、２５〜５０μｇ、３０〜６０μｇ、１〜３０μｇ、０．２５〜２５μｇ、０．３μｇ、０．５μｇ、０．７５μｇ、１μｇ、１．２５μｇ、５μｇ、１０μｇ、１２μｇ、１５μｇ、１７μｇ、２０μｇ、２２μｇ、２５μｇ、２７μｇ、３０μｇ、３５μｇ、５５μｇ、６０μｇ、８０μｇ、９０μｇ、１１０μｇ、１５０μｇ、２００μｇ及び２２５μｇといった範囲と値が想定される。この量は、ＤＮＡベースの市販のワクチンで用いられるＤＮＡの量よりも、好ましくは少なくとも３０％少なく、より好ましくは少なくとも５０％少なく、さらに好ましくは少なくとも９０％少なく、より好ましくは少なくとも４０％少なく、より好ましくは少なくとも７５％少なく、より好ましくは少なくとも９０％少なく、この場合、４０％少ない値、４５％少ない値、５５％少ない値、６０％少ない値、７０％少ない値、９５％少ない値及び９８％少ない値などが想定される。好ましい実施形態では、ＤＮＡの量は、１回のワクチン投与当たりで定める。
【００１７】
本開示は、１回投与型ワクチンも提供する。この１回投与型ワクチンは、本開示のアジュバント調合物と、少なくとも１つのＤＮＡ成分を含む。このＤＮＡ成分は好ましくは、細菌発酵物から得られるかまたはＤＮＡ合成によるプラスミドＤＮＡに由来する直鎖状、リラックス型環状または共有結合性閉環状スーパーコイル化ＤＮＡであることができる二本鎖ＤＮＡ複合体に組み込まれた非複製型コンピテントＤＮＡまたは複製型コンピテントＤＮＡからなる群から選択する。この１回投与型ワクチン組成物には、動物において、１回投与後に、感染症の重症度または臨床徴候の発生率を低下させる免疫応答を誘導する効果がある。本開示の目的においては、１回投与とは、動物にワクチンを１回だけ投与することを意味する。好ましくは、本開示の１回投与型ワクチンは、Ｃａ＋＋を含まず、リポソーム送達が行われず、かつＤＮＡの用量が少ない調合物である。
【００１８】
本開示のワクチン組成物または免疫原性組成物は、１回投与を行うか、複数回投与を行うかを問わず、好ましくは少なくとも６カ月、より好ましくは少なくとも１２カ月、さらに好ましくは少なくとも１８カ月、最も好ましくは少なくとも２４カ月またはそれ以上、保存安定性を有する。好ましくは、本開示のワクチンにタンパク質が組み込まれているときには、そのワクチン組成物は、少なくとも１２カ月安定している。本開示のワクチンがＤＮＡ成分を含む実施形態では、そのワクチンは、少なくとも１２カ月、より好ましくは少なくとも１８カ月、最も好ましくは少なくとも２４カ月またはそれ以上安定している。
【００１９】
動物またはヒトへのワクチン接種方法も提供する。この方法の工程は好ましくは、本開示のワクチン組成物の投与を必要とする被投与者に、本開示のワクチン組成物を投与することを含む。このワクチンは、針無投与によって投与することも、注射することもでき、注射投与方法としては、皮下注射、筋内注射、皮内及び静脈内経路の接種が挙げられるが、これらに限らない。被投与者は好ましくは、ヒトまたは動物であり、その動物は、トリ、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ラバ、ヒツジ、サル、ペット及びその他の哺乳動物（ただし、これらに限らない）から選択する。一実施形態では、ワクチン組成物は、１回投与する。針無投与方法としては、ワクチン銃、経皮パッチ、エアゾール剤、粘膜投与方法、皮膚接着方法、乾燥粒子の噴射、湿式噴射、金／不活性粒子銃、空気式銃、粘膜及び経口経路の接種が挙げられるが、これらに限らない。
【００２０】
本開示は、ブタに適するワクチンまたは免疫原性組成物も提供し、そのワクチンは、Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）及びＤＮＡが組み込まれている本開示のアジュバントを含み、そのＤＮＡは、複製型コンピテントであっても、非複製型コンピテントであってもよい。ブタに適するワクチンは好ましくは、経皮投与によって投与し、その場合、ワクチン銃を使用することができるが、これは必須ではない。
【００２１】
本開示について、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」について言及する場合はいずれも、「〜から本質的になる」または「〜からなる」というクレーム語句の原理も示すものとする。例えば、組成物がＡとＢを含むことが本開示に示されている場合には、その組成物は、ＡとＢから本質的になることも、さらには、ＡとＢからなることもでき、このいずれも、本開示の各部分について具体的に書かれているかのように十分に開示されていることが分かる。これらの用語はいずれも、請求項の前提部分で用いられているときには、その通常の意味が与えられるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例７から得た緩衝液とアジュバントからの二本鎖共有結合性ＤＮＡの、時間に対する回収率のグラフ表示である。
【図２】抽出サンプルから回収された二本鎖共有結合性ＤＮＡの保持の定性的説明を示すゲルの写真であり、本開示のアジュバントとともにインキュベートしてから１８カ月後には、ＤＮＡの分解は観察されない。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本開示のアジュバント組成物は好ましくは、親油性物質と、アクリル酸もしくはメタクリル酸のポリマー、またはいずれかの粒子タイプ成分を含む。別の実施形態では、アジュバント組成物は、生理食塩水、免疫調節剤、小分子、サイトカイン、コレステロールを含むステロール、アルコール、サポニン及び水酸化ナトリウムのうちの少なくとも１つをさらに含む。
【００２４】
親油性物質は、中鎖トリグリセリドを有するいずれかの親油性物質であることができる。好ましくは、親油性物質は、中鎖ＥＰトリグリセリド、中鎖トリグリセリドＮＦ、中鎖脂肪酸トリグリセリドＪＰＥ、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド及びこれらの組み合わせからなる群から選択されている。好ましい実施形態では、親油性物質は、Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）（フランスのリヨンのＧａｔｔｅｆｏｓｓｅ）である。代替的な実施形態では、親油性物質は、レシチンである。
【００２５】
好ましい実施形態では、親油性物質は、本開示のアジュバント組成物に、その組成物の総体積の約０．０１％〜約５％の量で存在し、この場合、０．１体積％〜４．７体積％、０．２体積％〜４．５体積％、０．３〜４．４体積％、０．５体積％〜４．３体積％、０．７体積％〜４．２体積％、０．９体積％〜４．１体積％、１体積％〜４体積％、２体積％〜４体積％、２体積％〜５体積％、０．１体積％〜０．５体積％、０．１体積％〜０．８体積％、０．１体積％〜１体積％、０．３体積％〜１．５体積％、０．３体積％〜１．５体積％、３体積％〜５体積％、０．１体積％、０．２体積％、０．３体積％、０．４体積％、０．５体積％、０．６体積％、０．７体積％、０．８体積％、０．９体積％、１．０体積％、１．１体積％、１．２体積％  １．３体積％、１．４体積％、１．５体積％、１．６体積％、１．７体積％、１．８体積％、１．９体積％、２体積％、２．２体積％、２．４体積％、２．６体積％、２．８体積％、３．０体積％、３．２体積％、３．４体積％、３．５体積％、３．８体積％、４体積％、４．２体積％、４．５体積％、４．８体積％及び５体積％を含む量と、上記の値の間のいずれかの２つの点からのすべての範囲とが想定される。最も好ましい実施形態では、親油性物質は、約０．４体積％の量で存在する。
【００２６】
アクリル酸またはメタクリル酸化合物のポリマーは好ましくは、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー及び無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーから選択されている。このような化合物の例としては、特に糖のポリアルケニルエーテルまたは多価アルコールで架橋されているアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーが挙げられる。これらの化合物は、カルボマーという語で知られている（Ｐｈａｍｅｕｒｏｐａ  Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．２，Ｊｕｎｅ  １９９６）。当業者は、ヒドロキシル基を少なくとも３個、好ましくは８個以下有するポリヒドロキシ化化合物で架橋されているこのようなアクリル酸ポリマーであって、その少なくとも３個のヒドロキシルの水素原子が、少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族基に置換されているアクリル酸ポリマーについて説明している米国特許第２，９０９，４６２号も参照することができる。好ましい不飽和脂肪族基は、２〜４個の炭素原子を含む基、例えばビニル、アリル及びその他のエチレン性不飽和基である。その不飽和基は、それ自体が、メチルのような他の置換基を含んでよい。Ｃａｒｂｏｐｏｌ（商標）という名称で販売されている製品（米国オハイオ州のＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ）が特に適している。これらは、アリルスクロースまたはアリルペンタエリスリトールで架橋されている。本開示で用いるのに適するＣａｒｂｏｐｏｌ（商標）製品には、様々な種類がある。最も好ましいのは、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（商標）９７４Ｐ  ＮＦというポリマーを使用することである。
【００２７】
好ましい実施形態では、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーは好ましくは、本開示のアジュバント組成物に、約０．０２５体積％〜約３．０体積％の量で存在し、０．０２５％〜１％、０．０５％〜０．１５％、０．１％〜０．２％、０．１％〜１．５％、０．５％〜１％、０．５％〜２％、０．５％〜３％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、０．９４％、０．９５％、０．９６％、０．９７％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．２％、２．４％、２．６％、２．８％及び３．０％といった値が想定される。最も好ましい実施形態では、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーは、約０．２体積％の量で存在する。
【００２８】
生理食塩水成分は、アジュバント組成物での使用に適する塩化ナトリウムと水のいずれかの溶液であることができる。典型的には、生理食塩水は、０．９０％ｗ／ｖＮａＣｌ溶液（約３００ｍＯｓｍ／Ｌまたは１リットル当たり９．０ｇ）を指すが、本開示の目的においては、生理食塩水は、この溶液に限定されない。最も好ましい実施形態では、生理食塩水は、カルシウムまたはマグネシウム不含のダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（Ｃｅｌｌｇｒｏカタログ番号２１−ＣＶ）である。
【００２９】
好ましい実施形態では、生理食塩水は、本開示のアジュバント組成物の約５０体積％〜９８体積％の量で存在し、６０％〜９８％、７０％〜９８％、８０％〜９８％、９０％〜９８％、５０％〜６０％、５５％〜７５％、６３％〜９１％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９１．１％、９１．２％、９１．３％、９１．４％、９１．５％、９１．６％、９１．７％、９１．８％、９１．９％、９２％、９２．１％、９２．２％、９２．３％、９２．４％、９２．５％、９２．６％、９２．７％、９２．８％、９２．９％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％及び９８％といった量が想定される。最も好ましい実施形態では、生理食塩水は、本開示のアジュバント組成物に、約９２体積％の量で存在する。
【００３０】
アルコール成分は好ましくは、エタノール、イソプロパノール、ブタノール及びこれらの組み合わせからなる群から選択されている。好ましい実施形態では、エタノールが用いられている。好ましくは、エタノールは、９０％〜１００％溶液であるが、本開示の目的においては、１０％〜９０％エタノール溶液を用いることもできる。
【００３１】
好ましい実施形態では、アルコールは、本開示のアジュバント組成物の約０．０１体積％〜３体積％の量で存在し、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．２％、２．４％、２．６％、２．８％及び３．０％といった値が想定される。さらに、上記の値のうちのいずれかの２つの値が含まれる範囲も想定される。例えば、０．０１％〜１％、０．０１％〜２％、０．３％〜１％、０．３％〜１．５％、０．０３％〜０．０７％、０．０５％〜２．４％及び１％〜１．６％のすべてが、本開示に含まれる。最も好ましい実施形態では、アルコールは、本開示のアジュバント組成物に、約０．０５体積％の量で存在する。アルコールは、サポニン、好ましくはＱｕｉｌ  Ａを可溶化するのに有用であり、多くまたは大半（少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれ以上）が蒸発して、最終生成物中のアルコールの終濃度は、非常に低くなる。
【００３２】
本開示の目的におけるサポニンは、その部類のサポニンから選択したいずれかであることができる。概して、サポニンは、様々な植物種で特に豊富にみられる化学化合物の部類である。好ましくは、サポニンは、現象論的には、水溶液中で振盪すると石鹸のように発泡することによって、構造的には、親油性のトリテルペン誘導体と組み合わさった１つ以上の親水性配糖体部分を有することによって分類される両親媒性配糖体である。好ましい実施形態では、サポニンは、精製または半精製されているとともに、凍結乾燥されている。好ましくは、サポニンは、Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉａという南米の木の樹皮から得られる抽出物である。最も好ましくは、サポニンはＱｕｉｌ  Ａである。
【００３３】
好ましい実施形態では、サポニンは、本開示のアジュバント組成物に、約０．０００１％〜約０．５％の量で存在し、０．０００１％、０．０００２％、０．０００５％、０．０００７％、０．０００８％、０．０００８５％、０．０００９％、０．０００９５％、０．０００９９％、０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１％、０．０１５％、０．０２％、０．０２５％、０．０３％、０．０３５％、０．０４％、０．０４５％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％及び０．５％といった値が想定される。さらに、上記のいずれかの２つの離散値を含む範囲も想定される。例えば、サポニンは、本開示のアジュバント組成物に、約％〜０．００３％、０．００３％〜０．０１％、０．００３％〜０．０５％、０．０１％〜０．０３％、０．１％〜０．５％、０．０７％〜０．２％などの量で存在してよい。最も好ましい実施形態では、サポニンは、約０．００２％の量で存在する。
【００３４】
本開示のアジュバント組成物は好ましくは、ステロールを含む。植物、動物及び真菌で見られるものを含め、いずれのステロールも、本開示の目的において機能する。ステロールは好ましくは、植物の供給源から得たものであるが、ステロールは、フィトステロール、動物ステロール、コレステロール、カンペステロール、シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール及びこれらの組み合わせ（ただし、これらに限らない）から選択してよい。最も好ましい実施形態では、ステロールはフィトステロールであり、より好ましくはコレステロール、好ましくは非動物由来のコレステロールである。コレステロールは、アジュバント組成物での使用に適するいずれかのコレステロール源であることができる。コレステロールは好ましくは、動物または植物に由来するものであり、最も好ましくは、コレステロールは、植物由来のものである。
【００３５】
好ましい実施形態では、コレステロールは、本開示のアジュバント組成物に、約０．０００１体積％〜約３体積％の量で存在し、０．０００１％〜０．００５％、０．０００５％〜１％、０．０００８％〜０．００８％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．２％、２．４％、２．６％、２．８％及び３．０％といった値が想定される。さらに、これらの体積のうちのいずれかの２つを含む範囲も想定される。最も好ましい実施形態では、コレステロールは、約０．００２体積％の量で存在する。
【００３６】
本開示のアジュバント組成物は好ましくは、その組成物のｐＨをｐＨ約６〜８、より好ましくはｐＨ７まで中和する成分を含む。いずれかの従来の中和剤を用いることができるが、好ましくは、中和剤は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化アンモニウムからなる群から選択されている。最も好ましい実施形態では、本溶液のｐＨを中和する成分は、水酸化ナトリウムである。
【００３７】
好ましい実施形態では、アジュバント組成物のｐＨを中和する成分は、約０．１％〜１０％の量で存在し、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．２５％、１．５％、１．７５％、２％、２．２５％、２．５％、２．７５％、３％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９％、９．２５％、９．５％、９．７５％及び１０％といった値が想定される。加えて、上記の値のうちの２つを含むいずれの範囲も想定され、２％〜８％、２％〜６％、３％〜８％、４％〜６％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％及び９．５％（ただし、これらに限らない）を含む値が想定される。最も好ましい実施形態では、アジュバント組成物のｐＨを中和する成分は、約５体積％の量で存在する。
【００３８】
本開示の別の実施形態では、アジュバント組成物は、Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）と、コレステロールと、Ｑｕｉｌ−Ａを含む。追加の実施形態では、本開示のアジュバント組成物は、Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）と、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（商標）と、生理食塩水と、コレステロールと、エタノールと、Ｑｕｉｌ−Ａと、水酸化ナトリウムを含む。さらなる実施形態では、本開示のアジュバント組成物は、Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）と、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（商標）９７４Ｐと、生理食塩水と、植物由来のコレステロールと、エタノールと、Ｑｕｉｌ−Ａと、水酸化ナトリウムを含む。別の実施形態では、本開示のアジュバント組成物は、Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）を約０．０４体積％と、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（商標）を約０．２体積％と、生理食塩水を約９２体積％と、コレステロールを約０．００２体積％と、エタノールを約０．５体積％と、Ｑｕｉｌ−Ａを約０．００２体積％と、水酸化ナトリウムを約１％含む。一実施形態では、この組成物の残りは水である。別の実施形態では、本開示のアジュバント組成物は、Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）を約２．０体積％と、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（商標）を約１．０体積％と、生理食塩水を約９２体積％と、コレステロールを約０．００２体積％と、エタノールを約０．５体積％と、Ｑｕｉｌ−Ａを約０．０１体積％と、水酸化ナトリウムを約１％含む。別の実施形態では、Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）がレシチンに置き換えられている。
【００３９】
一実施形態では、本開示のアジュバント組成物は、顕微鏡または粒子計数器によって測定した場合に、直径が１０ｎｍ〜２０００ｎｍの粒子を好ましくは形成する乳剤を形成する。好ましくは、粒径は、被投与者の抗原提示細胞によって処理できるように、８０ｎｍ〜５００ｎｍでなければならない。
【００４０】
本開示のアジュバント組成物は、好ましくは少なくとも６カ月、より好ましくは少なくとも１２カ月、さらに好ましくは少なくとも１８カ月、さらに好ましくは少なくとも２４カ月以上、保存安定性を有する。この安定性は好ましくは、インキュベート後、長期間、室温（約６０°Ｆ〜８０°Ｆ、約１８℃〜２６℃）及び冷蔵温度（２℃〜７℃）のいずれかで、生物物理学的特徴と有効性の特徴を保つ能力を指す。本開示のアジュバント組成物は、冷凍（−１８℃〜−２２℃、−４０℃〜−８５℃）または凍結乾燥するとともに、凍結乾燥後に再懸濁するときに、冷蔵温度（２℃〜７℃）で保存することもできる。
【００４１】
本開示は、ワクチン組成物または免疫原性組成物も提供する。このワクチンまたは免疫原性組成物は好ましくは、本開示のアジュバント組成物と、抗原（複数可）を含む。好ましくは、この抗原（複数可）はＤＮＡであり、このＤＮＡは、プラスミドに組み込んで、複製型コンピテントＤＮＡ及び／または非複製型コンピテントＤＮＡとして供給してよい。複製型コンピテントＤＮＡは、哺乳動物細胞のＤＮＡ複製複合体を増幅させて、送達ビヒクルによって細胞に送達されるＤＮＡを複製する遺伝子配列モチーフをコードする二本鎖の共有結合性閉環状スーパーコイル化（ｄｓＣＣＳＣ）ＤＮＡ、二本鎖の直鎖状ＤＮＡ（ｄｓＬ）または二本鎖リラックス型環状（ｄｓＲＣ）ＤＮＡの形態であることができるＤＮＡとして説明される。複製型コンピテントＤＮＡは、形成するウイルスベクター及びウイルス様粒子のコード領域全体も含むことができる。
【００４２】
非複製型コンピテントＤＮＡとしては、哺乳動物細胞内で複製できない二本鎖の共有結合性閉環状スーパーコイル化（ｄｓＣＣＳＣ）ＤＮＡ、二本鎖の直鎖状ＤＮＡ（ｄｓＬ）または二本鎖リラックス型環状（ｄｓＲＣ）ＤＮＡが挙げられる。非複製型ＤＮＡの例は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＮＴＣ）１によって説明されたＲＩＧ−Ｉ  ＤＮＡワクチンによるものである。ＮＴＣ  ＤＮＡワクチンは、レチノイン酸誘導性遺伝子−１（ＲＩＧ−Ｉ）活性化ＤＮＡ配列を含み、ＤＮＡワクチン投与を改善させる進歩的なベクターである。本開示のＲＩＧ−Ｉ  ＤＮＡは、ＤＮＡワクチンによって誘導される自然免疫応答を高めるとともに、大型動物及びヒトでのワクチン投与の際に適応免疫を高めるモチーフを含む。レチノイン酸誘導性遺伝子１（ＲＩＧ−Ｉ）は、ウイルス感染に応じて自然免疫を活性化させるために必要とされる重要な細胞質二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）パターンレセプターである。ＲＩＧ−Ｉが活性化すると、インターフェロン−βプロモーター刺激因子１（ＩＰＳ−１）へのシグナル伝達を通じて、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）とサイトカインが産生される。ＮＴＣは、最適化された強力なプラスミドによってコードされ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって発現されるＲＮＡベースの最適化型ＲＩＧ−Ｉアゴニスト（ｅＲＮＡ）（例えばｅＲＮＡ４１Ｈ）であって、ＤＮＡワクチンベクターの骨格に組み込まれるＲＩＧ−Ｉアゴニストを開発した。複合型のＲＩＧ−ＩアゴニストｅＲＮＡ４１Ｈ（ｅＲＮＡ１１ａ及びアデノウイルスＲＮＡ  ＶＡＩ）は、ヒト細胞株（ＨＥＫ２９３及びＡ５４９）ならびにマウス細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３及びＬ９２９）において、ＩＦＮβレポーターを活性化する（Ｌｕｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１１ａ）。これらのプラスミドはｄｓＣＣＳＣ  ＤＮＡであり、哺乳動物細胞内で組み換えタンパク質を発現させるための安全で最小限の抗生物質不含選択用ベクターとして特別に設計されている。
−−−−−−−−−−−−−−−−−
１  Ｌｕｋｅ  Ｊ，Ｃａｒｎｅｓ  ＡＥ，Ｈｏｄｇｓｏｎ  ＣＰ，ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＪＡ．（２００９）  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＲＮＡ  ｂａｓｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７：６４５４−６５５９
Ｌｕｋｅ  Ｊ，Ｓｉｍｏｎ  ＧＧ，Ｓｏｄｅｒｈｏｌｍ  Ｊ，Ｅｒｒｅｔｔ  ＪＳ，Ａｕｇｕｓｔ  ＪＴ，Ｇａｌｅ  Ｍ  Ｊｒ．，Ｈｏｄｇｓｏｎ  ＣＰ，ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＪＡ．（２０１１ａ）  Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ＲＩＧ−Ｉ  Ａｇｏｎｉｓｔ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８５：１３７０−１３８３
Ｌｕｋｅ  Ｊ．，  Ｖｉｎｃｅｎｔ  ＪＭ，  Ｄｕ  ＳＸ，  Ｗｈａｌｅｎ  Ｂ，  Ｌｅｅｎ  Ａ，  Ｈｏｄｇｓｏｎ  ＣＰ，  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＪＡ．（２０１１ｂ）  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｆｒｅｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｂｙ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １８：  ３３４−３４３
【００４３】
本開示の一実施形態では、標的遺伝子のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉプラスミド複製または哺乳動物細胞発現に必須ではない配列はすべて除去した。合成真核ｍＲＮＡリーダー及びターミネーターをベクター設計で用いて、ヒトゲノムとのＤＮＡ配列相同性を限定して、染色体に組み込まれる可能性を低くした。このベクターは、Ｋｏｚａｋ翻訳開始コンセンサス配列とＡＴＧ開始コドンをコードする。
【００４４】
好ましくは、標的遺伝子の発現は、最適化キメラプロモーター−イントロン（ＳＶ４０−ＣＭＶ−ＨＴＬＶ−１  Ｒ合成イントロン）から駆動する。ＣＭＶプロモーターとＳＶ４０エンハンサーとの境界を最適化して、哺乳動物細胞内での発現を大きく向上させている（Ｌｕｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１１ｂ）。このキメラＣＭＶプロモーターにより、発現レベルは、従来のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターベースのベクターよりも著しく高くなる（Ｌｕｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００９，２０１１ｂ）”。
【００４５】
本開示のアジュバント組成物の量、抗原の量及び抗原製造法は、選択する投与方法に左右される。当業者は、そのような投与方法に対して適切な比率を定めることができるであろう。好ましくは、本開示のアジュバント組成物は、ワクチン組成物の総体積の約１体積％〜３０体積％の量で存在し、１％〜２５％、１％〜２０％、１％〜１５％、１５％〜３０％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜２０％、１５％〜２５％、２０％〜３０％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％及び３０％といった値と範囲が想定される。最も好ましい実施形態では、アジュバント組成物は、約５体積％〜２０体積％の量で存在する。代替的な実施形態では、ワクチン組成物における本開示のアジュバント組成物と抗原の量との比は、上記のとおりであり、好ましくは１：１〜１：５である。
【００４６】
本開示は、ワクチン組成物または免疫原性組成物も提供する。このワクチン組成物は、本開示のアジュバントと抗原を含むか、これらからなるかまたはこれらから本質的になる。この抗原は、ワクチン組成物での投与に適するいずれかの抗原であってよい。好ましい実施形態では、抗原はＤＮＡである。このＤＮＡは、二本鎖の共有結合性閉環状スーパーコイル化（ｄｓＣＣＳＣ）ＤＮＡ、二本鎖の直鎖状ＤＮＡ（ｄｓＬ）または二本鎖のリラックス型環状（ｄｓＲＣ）ＤＮＡの形態であることができる。ＤＮＡは、一本鎖の共有結合性閉環状（ｓｓＣＣ）ＤＮＡまたは一本鎖の直鎖状（ｓｓＬ）ＤＮＡの形態であることもできる。好ましくは、ＤＮＡは、ｄｓＣＣＳＣ  ＤＮＡであるプラスミドに組み込まれた複製型コンピテントＤＮＡ及び／または非複製型コンピテントＤＮＡから選択する。
【００４７】
本開示のワクチンまたは免疫原性組成物は好ましくは、本開示のアジュバント調合物とＤＮＡ成分を含む。最も好ましくは、このＤＮＡは、ｄｓＣＣＳＣ  ＤＮＡであるプラスミドに組み込まれた複製型コンピテントＤＮＡまたは非複製型コンピテントＤＮＡから選択されている。ＤＮＡベースのワクチン周辺の当該技術では、ワクチンのＤＮＡ成分の有効な送達及び免疫感作にはＣａ＋＋が必要であることが示されており、当該技術分野においては、陽イオン系が普及している。本開示のワクチンは驚くべきことに、Ｃａ＋＋の使用、またはＤＮＡもしくは送達ビヒクルの陽イオン処理がなくても有効であり、これにより、当該技術分野を進歩させる。本開示のワクチンまたは免疫原性組成物では、陽イオン化リポソームも不要である。さらなる実施形態では、本開示のワクチンは、少量のＤＮＡしか必要としない。好ましくは、このＤＮＡは、１回の投与につき約１００μｇ〜０．０２５μｇの量で存在し、０．０２５μｇ〜２５０μｇ、０．０２５〜５０μｇ、０．０２５μｇ〜０．２５μｇ、０．０５μｇ〜１μｇ、０．０５μｇ〜０．２５μｇ、１〜３μｇ、０．２５〜２５μｇ、０．５μｇ、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、１２μｇ、１５μｇ、１７μｇ、２０μｇ、２２μｇ、２５μｇ、２７μｇ、３０μｇ、３５μｇ、５５μｇ、６０μｇ、８０μｇ、９０μｇ、１１０μｇ、１５０μｇ、２００μｇ及び２２５μｇといった範囲と値が想定される。この量は、ＤＮＡベースの市販のワクチンで用いられるＤＮＡの量よりも、好ましくは少なくとも３０％少なく、より好ましくは少なくとも５０％少なく、さらに好ましくは少なくとも９０％少なく、より好ましくは少なくとも４０％少なく、より好ましくは少なくとも７５％少なく、より好ましくは少なくとも９０％少なく、４０％少ない値、４５％少ない値、５５％少ない値、６０％少ない値、７０％少ない値、９５％少ない値及び９８％少ない値などが想定される。好ましい実施形態では、ＤＮＡの量は、１回のワクチン投与当たりで定める。
【００４８】
本開示は、１回投与型ワクチンまたは免疫原性組成物も提供する。この１回投与型ワクチンは、本開示のアジュバント調合物と、少なくとも１つのＤＮＡ成分を含む。このＤＮＡは好ましくは、ｄｓＣＣＳＣ  ＤＮＡであるプラスミドに組み込まれた複製型コンピテントＤＮＡまたは非複製型コンピテントＤＮＡから選択する。この１回投与型ワクチン組成物には、動物において、１回投与後に防御免疫応答を誘導する効果がある。本開示の目的においては、１回投与とは、動物にワクチンを１回だけ投与することを意味する。好ましくは、本開示の１回投与型ワクチンは、Ｃａ＋＋処置ＤＮＡまたはリポソームを含まない調合剤である。
【００４９】
本開示のアジュバント組成物は、好ましくは少なくとも６カ月、より好ましくは少なくとも１２カ月、さらに好ましくは少なくとも１８カ月、さらに好ましくは少なくとも２４カ月またはそれ以上、保存安定性を有する。この安定性は好ましくは、室温（約６０°Ｆ〜８０°Ｆ、１８℃〜２６℃）または冷蔵温度（２℃〜７℃）のいずれかで長期間インキュベート後、生物物理学的特徴と有効性の特徴を保つ能力を含む。本開示のアジュバント組成物は、冷凍（−１８℃〜−２２℃、−４０℃〜−８５℃）または凍結乾燥するとともに、凍結乾燥後、再懸濁するときに冷蔵温度（２℃〜７℃）で保存することもできる。
【００５０】
加えて、本開示は、動物またはヒトへのワクチン接種方法を提供する。この方法は好ましくは、本開示のワクチンまたは免疫原性組成物をその被投与者に投与する工程を含む。あるいは、本開示の方法は、本開示のアジュバントを抗原と組み合わせて、組成物を形成する工程と、その組成物の投与が必要な動物またはヒトに、その組成物を投与する工程を含む。好ましくは、その抗原は、免疫原性組成物またはワクチン組成物で典型的に用いられている抗原であり、好ましくは、被投与者において免疫応答を惹起できるものである。被投与者は好ましくは、ヒトまたは動物である。被投与者が動物である実施形態では、その動物は好ましくは、トリ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ラバ、サル、ペット及びその他の哺乳動物からなる群から選択するが、これらに限らない。
【００５１】
本開示は、動物における免疫応答の惹起方法であって、その方法の工程が、動物に、少なくとも１回、本開示のワクチンまたは免疫原性組成物を接種することを含む方法も提供する。その後もワクチンを投与することが想定され、その場合、ワクチン組成物は、２回、３回、４回または５回投与してよい。
【００５２】
抗原は、本開示のワクチンまたは免疫原性組成物の目的においては、被投与者において免疫原性反応を誘導するのに適するいずれかの抗原または抗原の組み合わせであることができる。被投与者は、動物またはヒトであってよい。本開示で用いる抗原は、上に定められている定義内に収まるいずれかの所望の抗原であってよい。抗原は、市販のものであるか、または当業者は、そのような抗原を製造できる。好ましい実施形態では、抗原は、ｄｓＣＣＳＣ  ＤＮＡであるプラスミドに組み込まれた複製型コンピテントＤＮＡまたは非複製型コンピテントＤＮＡから好ましくは選択したＤＮＡである。このＤＮＡワクチンは、被投与者における免疫応答の標的であるいずれかの遺伝子の配列をコードできる。ＤＮＡワクチンにおいてコードできる遺伝子配列には、ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｍ  ｈｙｏ）、ブタ増殖性腸炎、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤ）、ボーダー病、レプトスピラ症、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属の細菌を原因とするブルセラ症、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉによって産生される特異的神経毒を原因とする破傷風毒血症、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、豚痘、エペリスロゾーン症、ブタコレラ（ＣＳＦ）またはアフリカブタコレラ（ＡＳＦ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａと様々な種のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、典型的にはＳ．ｓｕｉｓを原因とする肺炎性パスツレラ症及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、レンサ球菌性髄膜炎、仮性狂犬病、ブタインフルエンザウイルス、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉという細菌を原因とするスピロヘータ性大腸炎、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｈｅｒｉａｅという細菌を原因とするブタ赤痢、コロナウイルス、ブタパルボウイルス、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ（Ｈｐｓ）という細菌を原因とするグレーサー病、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓという細菌を原因とする滲出性麦皮炎、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅという細菌を原因とする豚丹毒、Ｅｐｅｒｙｔｈｒｏｚｏｏｎｏｓｉｓ  ｓｕｉｓという細菌を原因とするエペリスロゾーン症（Ｅｐｅ）、脳心筋炎、ヘルペスウイルス、ヘルペスウイルスを原因とするブタサイトメガロウイルス感染症（ＰＣＭＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥ）、コロナウイルスを原因とするブタ流行性下痢（ＰＥＤ）、ブタ呼吸性コロナウイルス感染症（ＰＲＣＶ）、ロタウイルス、狂犬病、ブタ水胞症（ＳＶＤ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを原因とする結核、ブタ小水疱性発疹（ＶＥＳ）ウイルス、水疱性口内炎（ＶＳ）ウイルス、ならびに東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＥＥＥＶ）（ただし、これらに限らない）から選択される免疫原性配列をコードする遺伝子または遺伝子モチーフを含む。
【００５３】
本ワクチンまたは免疫原性組成物を構成する抗原部分は、生きているかもしくは死んでいる修飾微生物、微生物もしくはその他の細胞（腫瘍細胞が挙げられるが、これに限らない）から精製した天然物、合成生成物、遺伝子操作したタンパク質、ペプチド、多糖もしくは同様の生成物、またはアレルゲンのいずれかであることができる。抗原部分は、タンパク質、ペプチド、多糖または同様の生成物のサブユニットであることもできる。抗原は、遺伝性抗原、すなわち、免疫応答を引き起こすかまたは誘導するＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。本開示に従って使用できる抗原の代表的なものとしては、予防または治療用ワクチン及びアレルゲンで使用できる自己免疫疾患、ホルモンまたは腫瘍抗原に加えて、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫及びその他の感染性物質に由来する天然生成物、組み換え生成物または合成生成物が挙げられるが、これらに限らない。ウイルス産物または細菌産物は、酵素的切断によって作られる有機体である成分であることも、当業者に周知である組換えＤＮＡ法によって作られた有機体の成分であることもできる。本開示及びその送達経路の性質から、本開示が、ホルモン、抗生物質及び抗ウイルス剤のような薬物の送達系としても機能することはかなり想像できる。本開示のワクチン組成物での使用に適する抗原の例としては、ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｍ  ｈｙｏ）、ブタ増殖性腸炎、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤ）、ボーダー病、レプトスピラ症、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属の細菌を原因とするブルセラ症、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉによって産生される特異的神経毒を原因とする破傷風毒血症、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、豚痘、エペリスロゾーン症、ブタコレラ（ＣＳＦ）またはアフリカブタコレラ（ＡＳＦ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ及び様々な種のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、典型的にはＳ．ｓｕｉｓを原因とする肺炎性パスツレラ症及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、レンサ球菌性髄膜炎、仮性狂犬病、ブタインフルエンザウイルス、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉという細菌を原因とするスピロヘータ性大腸炎、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｈｅｒｉａｅという細菌を原因とするブタ赤痢、コロナウイルス、ブタパルボウイルス、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ（Ｈｐｓ）という細菌を原因とするグレーサー病、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓという細菌を原因とする滲出性麦皮炎、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅという細菌を原因とする豚丹毒、Ｅｐｅｒｙｔｈｒｏｚｏｏｎｏｓｉｓ  ｓｕｉｓという細菌を原因とするエペリスロゾーン症（Ｅｐｅ）、脳心筋炎、ヘルペスウイルス、ヘルペスウイルスを原因とするブタサイトメガロウイルス感染症（ＰＣＭＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥ）、コロナウイルスを原因とするブタ流行性下痢（ＰＥＤ）、ブタ呼吸性コロナウイルス感染症（ＰＲＣＶ）、ロタウイルス、狂犬病、ブタ水胞症（ＳＶＤ）���Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを原因とする結核、ブタ小水疱性発疹（ＶＥＳ）ウイルス、水疱性口内炎（ＶＳ）ウイルス、ならびに東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＥＥＥＶ）が挙げられるが、これらに限らない。あるいは、本開示のワクチンは、アデノ随伴ウイルス、アイチウイルス、オーストラリアコウモリリッサウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、バンナウイルス、バーマ森林ウイルス、ブニヤンベラウイルス、ブニヤウイルスラクロス、カンジキウサギブニヤウイルス、オナガザルヘルペスウイルス、チャンディプラウイルス、チクングニヤウイルス、コサウイルスＡ、牛痘ウイルス、コクサッキーウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、デングウイルス、ドーリウイルス、ジュグベウイルス、デュベンヘイジウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エボラウイルス、エコーウイルス、脳心筋炎ウイルス、エプスタインバーウイルス、ヨーロッパコウモリリッサウイルス、ＧＢウイルスＣ／Ｇ型肝炎ウイルス、ハンターンウイルス、ヘンドラウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス、馬痘ウイルス、ヒトアデノウイルス、ヒトアストロウイルス、ヒトコロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトエンテロウイルス６８、７０、ヒトヘルペスウイルス１、ヒトヘルペスウイルス２、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス７、ヒトヘルペスウイルス８、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス１、ヒトパピローマウイルス２、ヒトパピローマウイルス１６、１８、ヒトパラインフルエンザ、ヒトパルボウイルスＢ１９、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ヒトライノウイルス、ヒトＳＡＲＳコロナウイルス、ヒトスプーマレトロウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、ヒトトロウイルス、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、イスファハンウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、日本脳炎ウイルス、フニンアレナウイルス、ＫＩポリオーマウイルス、クンジンウイルス、ラゴスコウモリウイルス、ビクトリア湖マールブルグウイルス、ランガトウイルス、ラッサウイルス、ローズデールウイルス、跳躍病ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、マチュポウイルス、マヤロウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、麻疹ウイルス、メンゴ脳炎ウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス、モコラウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、サル痘ウイルス、ムンプスウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、ニューヨークウイルス、ニパウイルス、ノーウォークウイルス、オニョンニョンウイルス、オルフウイルス、オロプーシェウイルス、ピチンデウイルス、ポリオウイルス、プンタトロフレボウイルス、プーマラウイルス、狂犬病ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロサウイルスＡ、ロスリバーウイルス、ロタウイルスＡ、ロタウイルスＢ、ロタウイルスＣ、風疹ウイルス、サギヤマウイルス、サリウイルスＡ、スナバエ熱シチリア型ウイルス、サッポロウイルス、セムリキ森林ウイルス、ソウルウイルス、シミアン泡沫状ウイルス、シミアンウイルス５、シンドビスウイルス、サウサンプトンウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性ポワッサンウイルス��トルクテノウイルス、トスカーナウイルス、ウークニエミウイルス、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、痘瘡ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ＷＵポリオーマウイルス、ウエストナイルウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、ヤバ様疾患ウイルス、黄熱ウイルス、ジカウイルス及びこれらの組み合わせ（ただし、これらに限らない）に存在する遺伝子配列から選択した遺伝子配列の配列をコードできる。当業者及びいずれかのタイプの抗原を持つワクチンの有用性によって分かるように、生体全体、巨大分子、サブユニット、核酸、発現タンパク質及びこれらの組み合わせを含め、抗原のすべての変形形態が本開示によって想定される。
【００５４】
本開示のワクチン接種方法は好ましくは、本開示のアジュバントと抗原とを含む組成物を投与することを含み、この投与は、針無または注射である。ＤＮＡ成分が組み込まれている本開示の実施形態の目的においては、投与方法は、好ましくは筋内、皮下または経皮投与であるが、その他の投与方法を用いてもよい。一実施形態では、投与方法は、局所、筋内、経鼻、経口、経皮、粘膜、針無投与方法及び皮下からなる群から選択されている。針無投与方法としては、ワクチン銃、経皮パッチ、エアゾール剤、粘膜投与方法、皮膚接着方法、乾燥粒子の噴射、湿式噴射、金／不活性粒子銃及び空気式銃が挙げられるが、これらに限らない。
【００５５】
さらに、本開示は、ワクチン組成物のブタへの投与方法を提供する。この方法は好ましくは、本開示のアジュバント組成物を抗原と組み合わせる工程と、そのワクチン組成物の投与が必要なブタに、そのワクチン組成物を投与する工程を含む。本開示のアジュバント組成物は、経皮送達に特に適している。本開示のアジュバント組成物により、通常は経皮吸収の難しい抗原が、被投与者の皮膚を通じて吸収可能になるからである。本開示のアジュバントは好ましくは、他のアジュバント組成物と比べて、抗原の経皮吸収率を０．００１％〜８０％高くする。好ましくは、このような実施形態では、本開示のアジュバントは、Ｌａｂｒｏｆａｃ（商標）を親油性物質として含む。
【００５６】
本明細書に示されているいずれの上限値にも、それよりも低いすべての上限値が、本明細書に明示的に書かれているかのように含まれることを理解すべきである。本明細書に示されているいずれの下限値にも、それよりも高いすべての下限値が、本明細書に明示的に書かれているかのように含まれる。本明細書に明示的に示されているいずれの数値範囲にも、その広い数値範囲に含まれるすべての狭い数値範囲が、本明細書に明示的に書かれているかのように含まれる。
【００５７】
本願に開示されている組成物と方法は、本明細書に記載されている本開示の必須要素と制限と、本明細書に記載されているか、またはさもなければ、本明細書に記載されているような組成物と方法において有用であるいずれかの任意または追加の成分、構成要素、工程または制限とを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなることができる。
【実施例】
【００５８】
実施例１
この実施例は、本開示の提供するアジュバントの例示的な製造方法を示している。
【００５９】
材料と方法
用いた材料は、下記のとおりであった。
Ａ．Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  ＷＬ１３４９（Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅカタログ番号３１３９）
Ｂ．Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９７４Ｐ  ＮＦポリマー（Ｌｕｂｒｉｚｏｌカタログ番号ＣＢＰ９７４ＰＮＦ）
Ｃ．カルシウムもしくはマグネシウム不含のダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（Ｃｅｌｌｇｒｏカタログ番号２１−０３１−ＣＶ）、または同等物
Ｄ．コレステロール、植物由来（Ａｖａｎｔｉカタログ番号７００１００Ｐ）
Ｅ．エタノール、１００％溶液（Ａｃｒｏｓカタログ番号６１５０９−００１０）または同等物
Ｆ．Ｑｕｉｌ−Ａ（Ｂｒｅｎｎｔａｇカタログ精製サポニンＱｕｉｌ−Ａ、凍結乾燥）
Ｇ．５Ｎ水酸化ナトリウム（ＶＷＲカタログ番号ＢＤＨ３２２５−１）または同等物
【００６０】
表１：アジュバント０６ストックの配合
2018510874.tif 000003
【００６１】
表２：コレステロールストック
2018510874.tif 000004
【００６２】
続いて、コレステロールをエタノールに加えることによって、コレステロールストックを調製した。そして、溶解するまで混合した。次に、０．２μｍのフィルターを用いて、この溶液を滅菌濾過した。続いて、この溶液を２〜７℃で保存した。
【００６３】
表３：Ｑｕｉｌ−Ａストック
2018510874.tif 000005
【００６４】
次に、Ｑｕｉｌ−ＡサポニンをＲＯ／ＤＩ水に加えることによって、Ｑｕｉｌ−Ａストックを調製し、その際、溶解するまで混合した。続いて、０．２μｍのフィルターを用いて、この溶液を滅菌濾過した。次に、この溶液を２〜７℃で保存した。このストックは、Ｑｕｉｌ−Ａの５×ストックとして１％であった。
【００６５】
アジュバント０６の調製
アジュバント０６ストックを用いて、Ｑｕｉｌ  Ａ２０ｍＬをアジュバント０６ストック８０ｍＬに加えることによって、Ｑｕｉｌ  Ａストックの１：５希釈液を調製し、その希釈液は、旋回によって混合した。次に、コレステロールストック５６ｍＬをバルクのアジュバント０６ストックに加えた。コレステロールストック５６ｍＬを含むこの残りのバルクアジュバント０６ストックに、Ｑｕｉｌ  Ａの１：５希釈液１００ｍＬを加えた。続いて、このアジュバント混合物を約１５分混合した。混合しながら、アジュバントを６０ｍＬ滅菌ＰＥＴＧボトルに５０ｍＬずつ無菌分注した。続いて、各ボトルをねじ式トップキャップで密閉した。そして、２年を超えない期間、アジュバント０６のボトルを２〜７℃で保存した。
【００６６】
アジュバント０５の調製
実施例１で上記したように作製する。ただし、Ｑｕｉｌ  Ａまたはコレステロールは、この配合物では使用しない。
【００６７】
アジュバント０１の調製
実施例１で上記したように作製する。ただし、Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）をレシチンに置き換える。
【００６８】
アジュバント０３の調製
実施例１について上記したように作製する。ただし、Ｌａｂｒｏｆｅｃをレシチンに置き換え、Ｑｕｉｌ  Ａまたはコレステロールを加えない。
【００６９】
アジュバント０２の調製
実施例１について上記したように作製する。ただし、Ｌａｂｒａｆａｃ（商標）をレシチンに置き換え、コレステロールは、実施例１で記載した濃度が１：１０であり、Ｑｕｉｌ  Ａの濃度は、実施例１に記載した濃度と同じままである。
【００７０】
使用の説明
これらの調査用の１×ストックを作製するためには、１部の５×ストックアジュバント０６を４部の抗原とともに用いるものとして、上記したアジュバント０６のストックの量を計算して、抗原と混合できる。この５×ストックを希釈して、２×（１部の５×アジュバント０６と２．５部の抗原）または４×（１部の５×アジュバント０６と０．２５部の抗原）の抗原濃度物を形成することもできる。
【００７１】
使用前に、アジュバント０６の容器を十分に混合しなければならない。少量のアジュバント０６を滅菌シリンジと１８ゲージのニードルで無菌吸引採取してから、排気して、シリンジからすべての空気を除去した。続いて、所望の量のアジュバント０６をシリンジに徐々に引き上げた。続いて、測定済みの体積のアジュバント０６ストックを抗原に加えて、十分に混合した。
【００７２】
実施例２
この調査の目的は、２つの異なるアジュバント調合物（それぞれ、本開示の別の実施形態）が、ワクチンと使用する際に想定される濃度まで希釈したときに、マウスで試験できるかを判断することであった。
【００７３】
材料と方法
２つの死菌Ｋ９９  Ｅ．ｃｏｌｉワクチン（１つはアジュバント添加ワクチンで、１つは、ＰＢＳ中に調製したワクチン）も、この調査に含めて、抗原を加えた場合に、同じ試験アジュバント調合物のみと比べて、マウスに異なる作用が及ぶのかを判断した。
【００７４】
約６週齢で平均体重が２７ｇの成体雌ＣＦ−１マウスに、１×終濃度まで希釈した上記の５種類のアジュバント調合物をそれぞれ０．５ｍｌ接種した。マウスには、死菌Ｋ９９Ｅ．ｃｏｌｉワクチンもそれぞれ０．５ｍｌ接種した。各処置グループは、後頸部皮下注射または腹腔内注射のいずれかによって接種を行った８匹のマウスで構成させた。接種後、すべてのマウスを７日間飼育し、健康状態を観察した。
【００７５】
後頸部皮下注射によって接種したすべてのマウスは、接種後７日、健康に見えたが、アジュバント添加死菌Ｋ９９Ｅ．ｃｏｌｉワクチンを接種した８匹のマウスのうちの３匹では、調査の７日目までに、注射部位に病変が見られた。腹腔内注射によって接種した各グループの８匹のマウスのうちの少なくとも６匹が、接種後２４〜４８時間に死亡した。
【００７６】
動物
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た６４匹の雌ＣＦ−１マウスは、試験物質の投与時には、生後約６週間（４４日）であった。受領時、マウスの体重は、平均１９グラムであった。０日目、試験物質の投与前に、再度マウスの体重を量ったところ、平均２７グラムであった。
【００７７】
試験物質
アジュバント
アジュバント０６（実施例１）−５×
アジュバント０６（実施例１）−５×
ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）：Ｃｅｌｌｇｒｏ、カタログ：２１−０３１−ＣＶ、ロット：２１０３１４３９  Ｅｘｐ．３０Ｓｅｐ１６
【００７８】
死菌Ｋ９９Ｅ．ｃｏｌｉワクチン
実施例１のアジュバント０６  ４×と、Ｋ９９  ｐｉｌｉを発現する死菌Ｅ．ｃｏｌｉを含むワクチン
ＰＢＳと、Ｋ９９  ｐｉｌｉを発現する死菌Ｅ．ｃｏｌｉを含むワクチン
【００７９】
方法
調査のタイムライン
表４：調査のタイムライン
2018510874.tif 000006
【００８０】
調査設計
表５：調査設計
2018510874.tif 000007
１ＳＣ−後頸部皮下注射、ＩＰ＝腹腔内注射
２実施例１から算出したような４×濃度
【００８１】
動物の受領、馴化及び無作為化
受領時に、マウスの体重を１度に５匹測定し、各マウスを別々のケージに入れた。１つのケージに入れられたマウスが４匹になるまで、このプロセスを繰り返した。
【００８２】
７日の馴化期間中、健康状態を毎日観察した。
【００８３】
容器から２つのケージ番号を引いて、それらをグループＴ０１に割り付けることによって、ケージ１〜１６を処置グループＴ０１〜Ｔ０８に無作為に割り付けた。次に引いた２つのケージ番号をグループＴ０２に割り付け、すべてのケージを処置グループに割り付けるまで、これを続けた。ケージ番号の各処置グループへの割り付けについては、表４を参照されたい。
【００８４】
試験物質の調製
すべての試験物質の調製は、投与日に無菌で行った。
【００８５】
アジュバントの調製
実施例１で記載したような５×アジュバントストックのボトルを室温まで昇温させてから、少なくとも３０回、上下振盪して混合した。４×アジュバントを作るために、該当するアジュバントをＤＰＢＳによって１：１．２５で希釈し（０．２５部のＤＰＢＳ＋１部のアジュバント）、少なくとも３０回、上下振盪することによって混合した。調製した試験物質を２つの別の５ｍｌ滅菌輸送管に分注し、該当する処置グループのラベルを付けた。
【００８６】
死菌Ｋ９９ワクチン
死菌Ｋ９９＋ＰＢＳワクチンは、この調査で使用する前に、２〜７℃で保存した。ワクチンボトルを室温まで昇温させ、上下振盪して混合してから、その物質をワクチンバイアルから直接取り出して、該当する処置グループに接種した。
【００８７】
投与処置
マウスの健康状態を調べてから、試験物質を投与した。２つのケージのマウス（合わせて８匹のマウス）に、各試験物質を０．５ｍｌ投与した。後頸部皮下（ＳＣ）注射は、３ｍｌのシリンジとともに、２５ｇ、５／８”または２５ｇ、１”のニードルのいずれかを用いて行った。腹腔内（ＩＰ）注射は、３ｍｌのシリンジとともに、２５ｇ、５／８”のニードルを用いて行った。すべての投与処置と投与時間を記録した。
【００８８】
体重
マウスの体重は、受領時に、５匹のグループで、卓上秤を用いて測定し、そのグループの平均体重を割り出した。
【００８９】
０日目（試験物質の投与日）の直前に、受領時と同じ秤を用いて、マウス１匹当たりの体重を割り出した。各ケージの重さを測定した。そのケージについて記録した値を、そのケージ内のマウス数（４）で除した。記録された値は、ケージ平均値である。
【００９０】
健康状態の観察
７日の調査を通じて、少なくとも１日に１回、マウスの健康状態を観察した。健康状態の観察結果は、すべて記録した。
【００９１】
０日目の観察では、最後の試験物質を投与してから約８２〜８９分後に、マウスの健康状態を観察した。
【００９２】
測定基準
主要変数または評価項目は、７日の調査中における、試験物質に起因する有害事象の有無であった。この変数は、各アジュバントと投与経路について割り出した。記録した観察結果は下記の２つであった。
【００９３】
注射部位の有害事象：７日の生存段階中に、注射部位で観察された病変を記録した。
【００９４】
死亡：マウスが死亡していることが分かったり、病的状態のために殺処分したりした場合に、死亡したことを記録した。
【００９５】
結果及び結論
試験物質の投与時におけるすべてのマウスの平均体重は、２６．８７ｇであった。
【００９６】
健康状態の観察結果
ＳＣ注射によって、アジュバントまたは死菌Ｋ９９＋ＰＢＳワクチンのいずれかを接種したいずれのマウスにおいても、７日の調査期間を通じて、副作用は見られなかった。ＩＰ注射によって、アジュバントのいずれかを接種した各グループにおける８匹のマウスのうちの少なくとも６匹が、接種後２４〜４８時間以内に死亡した。ＩＰ注射によって、死菌Ｋ９９＋ＰＢＳワクチンを接種したマウスのみが、７日の調査期間中、健康を維持した。表５には、調査中に死亡したマウスが示されている。
【００９７】
表６：調査中に死亡したマウスの概要
2018510874.tif 000008
＊マウスは、調査を通じて健康であったが、７日までに、注射部位に病変が発生した。
【００９８】
考察
この調査の結果に基づくと、この試験において、実施例１で説明した４×濃度で試験した５つのアジュバント調合物のいずれかとともに調製したワクチンは、最終生成物を後頸部ＳＣ注射によって投与した場合に、９ＣＦＲ  １１３．３３によるマウス安全性試験に適合できるようである。
【００９９】
抗原と組み合わせたアジュバントをこの経路によって投与すると、注射部位に病変が発生する可能性があるようであるが、他の副作用は観察されなかったので、病変により、安全試験に不適合となる可能性は低い。
【０１００】
マウスが、規定体重の２２ｇを超えないように注意したが、７週齢を超えるマウスはいなかった。
【０１０１】
結論
実施例１で説明した４×濃度で、アジュバント調合物０６、０５または０１とともに調製したアジュバント添加ワクチンは、使用可能であるとともに、９ＣＦＲ  １１３．３３に従って試験すると、後頸部皮下注射によって投与した場合に、マウスの安全性を満たす結果をもたらすことができる。
【０１０２】
実施例３
この実施例は、特許請求するアジュバント組成物を鳥インフルエンザＨ５ＤＮＡワクチンとともに用いたときの有効性を示すものである。
【０１０３】
材料と方法
この調査では、雄及び雌の病原体未感染のニワトリ１６０羽を使用した。調査設計は、下記の表６のとおりであった。Ｔ０１を除く各処置グループに、Ｈ５プラスミドＤＮＡロット番号ＤＮＡ１３０４１４ＴＫＷＩで予防接種を行った。このＤＮＡは、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を挟む真核プロモーター（ＣＭＶ初期プロモーター）とポリＡ付加終結部位（ＳＶＶ４０）を含むｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に由来する骨格ＤＮＡである。このプラスミドは、発酵においてプラスミドを増幅中に、真核細胞において選択するための選択マーカーのネオマイシンと、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて選択するためのアンピシリン耐性マーカーを有する。鳥インフルエンザのＨ５Ｎ９  ｔｕｒｋｅｙ／ＷＩ／６８分離株に由来する赤血球凝集遺伝子（ＨＡ）をこのベクターのＭＣＳにクローニングした。このＤＮＡを単離して、ＡＩＶ  Ｈ５  ＤＮＡとした。異なるＤＮＡ骨格を含む第２のＤＮＡを調製し、このＤＮＡは、同じＨ５Ｎ９  ｔｕｒｋｅｙ／ＷＩ／６８  ＡＩＶ  ＨＡ遺伝子インサートを有していたが、この調査用に、Ｎａｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＴ）によって構築されたものであった。そのＮＴプラスミド骨格は、ＮＴＣ８６８５−ｅＲＮＡ４１Ｈ−Ｕ７９４５６  ＨＡを含み、ＡＩＶ  Ｈ５ＤＮＡ（ｎｔ）とした。
【０１０４】
表７
2018510874.tif 000009
１この調査では、処置グループ（ＴＧ）の明示によって、ニワトリと試験物質が定められる。
２ＩＭ−筋内注射
３各ニワトリには、左胸部筋肉に０．２ｍｌの体積、右胸部筋肉に０．２ｍｌの体積を接種する。
４コントロールのＴ０１を除き、ＡＩＶ  Ｈ５ＤＮＡ（ｂｂｌ）を各処置に含めた。
【０１０５】
表８：調査のタイムライン
2018510874.tif 000010
【０１０６】
調査方法
無作為化と馴化
ニワトリに対する毎日の健康状態の観察結果を、調査するすべてのトリについて、馴化フェーズ中、記録した。トリは、少なくとも３日間、馴化する。臨床観察を毎日行い、記録した。
【０１０７】
投与経路
すべてのトリに対して、試験物質を筋内注射によって胸部の左側と右側に投与した。
【０１０８】
試験物質の投与−０日目と１４日目
０日目に、トリの健康状態と外観が正常か調べ、調査に参加させた。１つのケージが１つの処置グループを表す。
【０１０９】
Ｔ０１の１０羽のトリには接種せず、ネガティブコントロールとして機能させた。残りの各処置グループ（Ｔ０５〜Ｔ１６）の１０羽のトリには、調査の０日目と１４日目に、該当する試験物質を筋内注射によって接種した。
【０１１０】
サンプルの採取と試験
１４日目（１４日目に試験物質をブースター投与する前）と２８日目に、現場の手順に従って、各トリから血液を採取した。血液を凝固させてから、遠心分離して、血清を回収した。続いて、採血の４８時間以内に試験を行わない場合には試験まで、及び／または血清を試験した後に、その血清を−１８±５℃で保存した。そして、赤血球凝集抑制アッセイ（ＨＡＩ）によって、血清のセロコンバージョンレベルについてアッセイした。
【０１１１】
健康状態の観察と有害事象
試験物質を投与後、調査終了（２８日目）まで、臨床観察結果を毎日、少なくとも１回記録した。臨床観察結果は、すべて記録した。
【０１１２】
結果の評価／データ解析
ＨＡＩによって、血清サンプルのセロコンバージョンをアッセイした。続いて、各処置グループの各血清サンプルのＨＡＩ価を割り出した。次に、１×アジュバントで接種したトリのＨＡＩ価を、２×及び４×の各アジュバント調合物で接種したトリのＨＡＩ価と比較して、ＤＮＡ／アジュバント調合物を用いて有効性を得るための、各アジュバントの濃度範囲を明示した。
【０１１３】
試験物質の調製
投与日に、試験物質を調製し、臨床現場に移した。
【０１１４】
試験物質の調製は、無菌法を用いて、バイオセーフティーキャビネットで行った。トリに投与前に、すべての試験物質の最終配合物を室温で３０±５分、インキュベートした。
【０１１５】
試験物質
ＡＩＶ  Ｈ５プラスミドＤＮＡ（ｂｂｌ）ロット番号ＤＮＡ１３０４１４ＴＫＷＩ（純度と品質について試験済み）
【０１１６】
ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）、Ｃｅｌｌｇｒｏ、カタログ：２１−０３１−ＣＶ、ロット：２１０３１４３９
【０１１７】
表９：アジュバントストックの識別
2018510874.tif 000011
【０１１８】
表１０：各処置グループの試験物質の配合
2018510874.tif 000012
１各アジュバントの配合は、実施例１に記載されている。
【０１１９】
ＣａＣｌ沈殿：終濃度
プラスミドＤＮＡ：７５ｕｇ／ｍＬ
塩化カルシウム：２．６８ｍＭ
リン酸ナトリウム：２．６８ｍＭ
クエン酸ナトリウム：０．６６９ｍＭ
【０１２０】
結果と結論
表１１：調査の１３日目と２８日目におけるセロコンバージョンデータとＧＭＴ
2018510874.tif 000013
【０１２１】
表１１には、接種後の各処置グループのセロコンバージョンしたトリの数と、ＧＭＴ抗体価を含め、この調査の概要が示されている。結果から、Ｃａ＋＋沈殿ＤＮＡを用いて、ニワトリに、ＩＭ経路によってワクチン投与するのに、低用量のＤＮＡ（１回の投与につき３０ｕｇ以下）を使用できることが示されている。実施例１によって説明したような４×濃度のアジュバント０５調合物が、最も有効であり、これらのアジュバント調合物は、最適化でき、有効性を発揮する機会が幅広く存在することが示された。さらに、最適な用量のすべてのトリが、１回のワクチン投与だけでプライミングされた。すべてのトリが、２回目の投与後、セロコンバージョンしていたので、すべてのトリは、１回目の投与後にプライミングされていたはずである。
【０１２２】
実施例４
この調査は、本開示のアジュバントの６カ月にわたる安定性を示すものである。
【０１２３】
材料と方法
安定性試験物質の調製
１回の投与につきＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）５０ｕｇという標的濃度となるように、２つの異なるアジュバント調合物をＢＳＡと組み合わせた。調製したすべての試験物質をゴム栓付きの滅菌ガラスバイアルに無菌分注し、圧着して閉じた。
【０１２４】
市販のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を上記のようなバイアルに分注することによって、試験物質ＰＢＯ／冷温を調製し、冷蔵温度で保存した。５００ｕｇ／ｍ１（０．１ｍＬの用量当たり５０ｕｇ）という標的濃度になるように、４部のＢＳＡと１部のＰＢＳを加えることによって、試験物質ＢＳＡ／ＰＢＳ／室温とＢＳＡ／ＰＢＳ／冷温を調製し、周囲温度または冷蔵温度で保存した。０．２５部のＢＳＡと１部のアジュバント０１（実施例１による）を加えることによって、５００ｕｇ／ｍ１（０．１ｍＬの用量当たり５０ｕｇ）という標的濃度になるように、試験物質ＢＳＡ／Ａｄｊ０１／室温とＢＳＡ／Ａｄｊ０１／冷温を調製し、周囲温度または冷蔵温度で保存した。５００ｕｇ／ｍｌ（０．１ｍＬの用量当たり５０ｕｇ）という標的濃度になるように、０．２５部のＢＳＡと１部のアジュバント０６（実施例１による）を加えることによって、試験物質ＢＳＡ／Ａｄｊ０６／室温とＢＳＡ／Ａｄｊ０６／冷温を調製し、周囲温度または冷蔵温度で保存した。
【０１２５】
調査方法
馴化
毎日の健康状態の観察結果を、調査するすべての動物について、馴化フェーズ中、記録した。動物は、少なくとも６日間、馴化した。
【０１２６】
試験手順における収容
識別のために、マウスの耳に切れ込みを入れた。マウスを調査用ケージに入れ、１ケージ当たり５匹のマウスを入れた。また、６カ月の試験中、マウスの体重を測定した。
【０１２７】
投与処置
マウスの健康状態と外観が正常か調べ、調査に参加させた。処置グループに従って、マウスを維持し、５匹のマウスの入った２つのケージがそれぞれ、１つの処置グループを表している。プラセボ（ＰＢＯ）を接種するマウス（５匹のマウスの入った１つのケージから構成されていた）は、例外とした。
【０１２８】
０日目の時点に、「保存条件」にかかわらず、各処置グループの１つのバイアルを無菌で３つのアリコートに分けた。すぐに（０日目に）、１つのアリコートをマウスに投与した。第２のアリコートは、１４日目にマウスに投与するまで、２〜７℃で保存し、「安定性」サンプルとみなさなかった。第３のアリコートは、保持サンプルとして、２〜７℃で保持し、これも、「安定性」サンプルとみなさなかった。すべての試験物質は、マウスに、肩の間の背部の皮下に投与した。
【０１２９】
健康状態の観察と有害事象
調査が終わるまで、有害事象を含む臨床観察結果を毎日記録した。
【０１３０】
投与経路
すべてのマウスには、試験物質を皮下注射によって、肩の間の背部に投与する。
【０１３１】
プレスクリーニングサンプルの採取−−４日目〜０日目（ベースラインマウスのみ）
−４日目と０日目との間に１回、ベースラインマウス（調査で使用しないマウス）から血液を採取し、プールして、プレスクリーニング血清を得た。この時には、マウスの平均体重に基づき、総血液体積の１０％以下を採取した。血液を凝固させてから、遠心分離して、血清を回収した。その血清をプールし、試験で用いるマウスのＢＳＡ血清反応が陰性であることを確認するために、ＥＬＩＳＡによって試験するまで、２〜７℃または−１８±５℃で保存した。
【０１３２】
表１２：処置グループの明細
2018510874.tif 000014
１実施例１に記載したようにして調製したアジュバント
【０１３３】
表１３：安定性試験物質の概要
2018510874.tif 000015
１０日目と１４日目に接種するのに用いた各アリコートの残りの体積分は、使用日に破棄する。残りの保持アリコートは、保持しておく。
【０１３４】
表１４：安定性試験物質の明細
2018510874.tif 000016
１５００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡストック、１回の投与につきＢＳＡ５０ｕｇ
２各処置グループの略称
【０１３５】
表１５：新鮮な試験物質の明細
2018510874.tif 000017
１ＢＳＡストック１ｍ１当たり５００ｕｇ、１回の投与につきＢＳＡ５０ｕｇ
２各処置グループの略称
３新鮮な試験物質の調製に用いた成分の保存温度
５１８〜２７℃で保存した安定性サンプルと同じ保存場所と保存温度で保存した５×アジュバントストック
【０１３６】
表１６：臨床調査設計
2018510874.tif 000018
１この調査では、処置グループ（ＴＧ）の明示によって、マウスと試験物質が定められることになる。
２マウスには、皮下注射によって肩の間の背部に接種する。
３試験物質を接種しなかった追加のマウス、ベースライン血液サンプルを得るために使用
【０１３７】
表１７：調査設計
2018510874.tif 000019
【０１３８】
投与処置−０日目
マウスの健康状態と外観が正常か調べ、調査に参加させた。各ケージが、１つの処置グループを表す。
【０１３９】
各処置グループ調製剤の１つのバイアルを無菌で３つのアリコートに分けた。すぐに（０日目に）、１つのアリコートをマウスに投与した。１つのアリコートは、１４日目にマウスに投与するまで、２〜７℃で保存した。最後のアリコートは、保持サンプルとして２〜７℃に保持した。すべての処置グループ調製剤（ＴＧごとの調製剤）は、調査設計に従って、マウスの肩の間の背部の皮下に投与した。
【０１４０】
サンプルの採取−１〜２８日目（ベースラインマウスのみ）
１〜２８日目に、必要に応じて、ベースラインマウス（調査で使用しないマウス）から血液を採取し、プールした。３〜４週間の期間内に、マウスの平均体重に基づき、総血液体積の１０％以下を採取した。血液を凝固させてから、遠心分離して、血清を回収した。続いて、その血清をプールし、ネガティブコントロールとしてＥＬＩＳＡで使用するまで、２〜７℃または−１８±５℃で保存した。
【０１４１】
サンプルの採取と試験
１３日目と２８日目に、各接種済み動物から血液を採取した。３〜４週間の期間内に、マウスの平均体重に基づき、総血液体積の１０％以下を採取した。血液を凝固させてから、遠心分離して、血清を回収した。続いて、試験まで、その血清を２〜７℃または−１８±５℃で保存した。続いて、血清のセロコンバージョンレベルをＥＬＩＳＡによってアッセイした。
【０１４２】
投与処置−１４日目
すべての処置グループ調製剤（ＴＧごとの調製剤）は、調査設計に従って、マウスに、皮下注射によって、肩の間の背部に投与した。
【０１４３】
健康状態の観察と有害事象
調査のタイムラインに示されているように、試験物質の投与後、臨床観察結果を毎日記録した。
【０１４４】
解析の評価／データ解析
血清サンプルのセロコンバージョンをＥＬＩＳＡによってアッセイした。各処置グループの各血清サンプルにおける抗体産生レベルを割り出した。アジュバント＋ＢＳＡを投与したマウスにおける抗体産生量を、ＢＳＡポジティブコントロールを投与したマウスにおける抗体産生量と比較した。各種のアジュバント調合物を投与したマウスにおける抗体産生量を比較した。安定性解析のために保存しておいた試験物質を投与したマウスにおける抗体産生量を、この調査の０日目に新たに調製した試験物質を投与したマウスと比較した。
【０１４５】
この調査で接種を行ったマウスにおける抗体産生レベルを、実施した１回目の安定性調査で産生された抗体レベルと比較した。
【０１４６】
ネガティブコントロールと比べて、すべての処置グループの有効性を判断するのに適切なときには、記述統計学を使用する。両側スチューデントｔ検定またはその他の適切な方法を行うことによって、幾何平均と統計的有意性を割り出す。
【０１４７】
結果と結論
表１８：安定性に関するＢＳＡアジュバント０６のＥＬＩＳＡの結果から抽出したマウス安定性ＧＭＴ値
2018510874.tif 000020
【０１４８】
表１９：採血液から得られたデータ
2018510874.tif 000021
１セロコンバージョンしたマウスの数／処置したマウスの数
２セロコンバージョンなしについては、１０という値を用いた
３ＢＳＡ／Ａｄｊ０６幾何平均÷ＢＳＡ／ＰＢＳ幾何平均
４未実施
【０１４９】
表２０：６カ月時点のデータ
2018510874.tif 000022
１セロコンバージョンしたマウスの数／処置したマウスの数
２セロコンバージョンなしについては、１０という値を用いた
３ＢＳＡ／Ａｄｊ０６幾何平均÷ＢＳＡ／ＰＢＳ幾何平均
【０１５０】
表２１：幾何平均
2018510874.tif 000023
【０１５１】
データによって、本開示のアジュバントは、タンパク質サンプル（このケースでは、ＢＳＡであった）とともに、またはこのタンパク質サンプルなしでインキュベートしたところ、６カ月の期間にわたり安定していたことが示されている。データから分かるように、アジュバント０６の全サンプルは、６カ月後に安定していた。このデータによって、本開示のアジュバントは、周囲温度において、少なくとも６カ月、保存安定性を有することが示されている。これにより、アジュバントを出荷したり、保存したり、かつ抗原と組み合わせないか、または組み合わせるかのいずれかでアジュバントを使用したりしやすくなる。
【０１５２】
実施例５
この実施例は、特定病原体未感染の（ＳＰＦ）ニワトリにおける免疫応答を惹起する能力を測定することによって、ＤＮＡまたはアジュバントをＣａ＋＋で処置せずに、様々な濃度の本開示のアジュバント調合物を用いて、皮下投与した本開示のＤＮＡワクチンの有効性を示すものである。
【０１５３】
材料と方法
この調査では、雄及び雌のＳＰＦニワトリ１４０羽を使用した。調査設計は、下記の表２２に示されている。調査の１４日目と２８日目に、血液を採取した。
【０１５４】
表２２：調査設計
2018510874.tif 000024
１この調査では、処置グループ（ＴＧ）の明示によって、ニワトリと試験物質が定められることになる。
２ＳＣ−皮下注射、ＩＭ−筋内
３各ニワトリに、合わせて０．４ｍＬを接種する。
４ＢＢＬプラスミドＴＫＷＩ−００１（１回の投与につき３０ｕｇ）
５ＮＴプラスミドＮＴＣ８６８５−ｅＲＮＡ４１Ｈ−Ｕ７９４５６ＨＡ（１回の投与につき３０ｕｇ）
注記：処置グループ０２、０３および０４では、Ｃａ＋＋でＤＮＡを処置し、すべての処置グループにおいて、実施例１で説明したような５×ストックアジュバントを使用した。
【０１５５】
表２３：調査のタイムライン
2018510874.tif 000025
【０１５６】
調査方法
無作為化と馴化
すべてのケージに、合計１０羽のトリが入るまで、出荷ボックスから取り出した順に、トリを調査用ケージに入れた。識別のために、トリに個々にタグを付けた。
【０１５７】
毎日の健康状態の観察結果を、調査するすべてのトリについて、馴化フェーズ中、記録した。トリは、少なくとも３日間馴化した。臨床観察を毎日行い、記録した。
【０１５８】
投与経路
トリに、胸部の左側と右側に筋内注射するか、または後頸部における１つの部位に皮下注射するかのいずれかによって、試験物質を投与した。
【０１５９】
試験物質の投与−０日目と１４日目
０日目に、トリの健康状態と外観が正常か調べ、調査に参加させた。１つのケージが、１つの処置グループを表していた。
【０１６０】
Ｔ０１の１０羽のトリにＰＢＳを接種して、ネガティブコントロールとして機能させた。処置グループＴ０３及びＴ０４の１０羽のトリには、調査の０日目と１４日目に、該当する試験物質を筋内注射によって接種した。残りの処置グループＴ０２、Ｔ０５〜Ｔ１４には、調査の０日目と１４日目に、該当する試験物質を皮下注射によって接種した。
【０１６１】
健康状態の観察と有害事象
試験物質を投与後、調査終了（２８日目）まで、臨床観察結果を毎日、少なくとも１回記録した。
【０１６２】
サンプルの採取と試験
１４日目の試験物質のブースター投与の前と２８日目に、現場の手順に従って、各トリから血液を採取した。採血は、文書化した。血液を凝固させてから、遠心分離して、血清を回収した。試験するまで、血清を２〜７℃または−１８±５℃で保存したとともに、−１８±５℃で長期保存した。赤血球凝集抑制アッセイ（ＨＡＩ）によって、血清のセロコンバージョンレベルをアッセイした。
【０１６３】
結果の評価／データ解析
ＨＡＩによって、血清サンプルのセロコンバージョンについてアッセイした。各処置グループの各血清サンプルのＨＡＩ価を割り出した。４×アジュバントで接種したトリのＨＡＩ価を、２×の各アジュバント調合物で接種したトリのＨＡＩ価と比較して、各アジュバントのどの濃度が最も有効か割り出した。
【０１６４】
各種アジュバント調合物を投与したトリにおけるＨＡＩ価を互いに比較した。
【０１６５】
ネガティブコントロールと比べて、すべての処置グループの有効性を判断するのに適切なときには、記述統計学を使用した。両側スチューデントｔ検定またはその他の適切な方法を行うことによって、幾何平均と統計的有意性を割り出してよい。
【０１６６】
試験物質の調製
投与日に、試験物質を調製し、臨床現場に移した。
【０１６７】
試験物質の調製は、無菌法を用いて、バイオセーフティーキャビネットで行った。各成分の体積を割り出すのに用いた予め検証済みのワークシートに従って、試験物質を調製した。予め検証済みのワークシートは、調査ファイル内に保持した。トリに投与前に、すべての試験物質の最終配合物を室温で、３０±５分間インキュベートした。
【０１６８】
試験物質
ＢＢＬ  ＡＩＶ  Ｈ５プラスミドＤＮＡ、純度と品質について試験済み
ＮＴ  ＡＩＶ  Ｈ５プラスミドＤＮＡ、純度と品質について試験済み
ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）、Ｃｅｌｌｇｒｏ、カタログ：２１−０３１−ＣＶ
【０１６９】
結果と結論
表２４：１３日目と２８日目における血清反応とＧＭＴ
2018510874.tif 000026
【０１７０】
この調査結果により、実施例１に記載したような様々なアジュバント成分濃度と比率を用いて、赤血球凝集抑制価によって割り出したところ、本開示のアジュバントを用いたワクチンが、保護効果をもたらす証拠が示されている。この調査では、ＤＮＡもアジュバントも、Ｃａ＋＋またはいずれかの二価陽イオンで処置しなかったので、二価陽イオンは、有効性を得るのに必須ではない。この調査では、ＨＡＩ抗体応答によって測定したところ、最も高い免疫応答を惹起したアジュバント調合物０５が最適であった。さらに、この調査で用いたアジュバント調合物では、２回投与後に、すべてのトリがセロコンバージョンしたという点で、ＩＭ接種による調査（実施例３）で見られたものと同種の結果が得られた。このことにより、１回の投与で（低いＤＮＡ濃度で）すべてのトリがプライミングされ、１回投与後に、攻撃から保護される可能性が高いことが示されている。加えて、この調査におけるワクチンは、上記のように調合すると、ＩＭで投与する必要がなく、トリを免疫学的にプライミングするには、反復投与は必須ではなく、本開示のアジュバントを用いるときには、必要なのは、ごく低用量のプラスミドＤＮＡのみとなる。最も意義深いことには、送達ビヒクル（アジュバント）もＤＮＡも、有効性を得るために、二価陽イオン、特にＣａ＋＋で処置する必要がない。
【０１７１】
実施例６
この実施例は、本開示のアジュバントを用いて、筋内または皮下投与したＤＮＡワクチンの３０ｕｇの最小免疫量と安定性との比較調査を示すものである。この調査では、アジュバントが、特定病原体未感染のニワトリにおける免疫応答を惹起する能力を測定した。
【０１７２】
材料と方法
ニワトリは、調査開始時に２週齢であった。１００羽のトリを使用し、調査の２４日目に血液を採取した。
【０１７３】
調査設計は、下記の表２５に示されている。
【０１７４】
表２５：調査設計
2018510874.tif 000027
１この調査では、処置グループ（ＴＧ）の明示によって、ニワトリと試験物質が定められることになる。
２ＳＣ−皮下注射、ＩＭ−筋内
３各ニワトリに、合わせて０．４ｍＬを接種する（１部位に０．４ｍＬ／ＳＣ、２部位に０．２ｍＬずつ／胸部）
４ＢＢＬプラスミド
５ＮＴプラスミド
６安定性サンプル
注記：処置グループ０２、０６、０７、０９及び０１０は、カルシウム沈殿ＤＮＡによって行った。
【０１７５】
表２６：調査のタイムライン
2018510874.tif 000028
【０１７６】
無作為化と馴化
孵化した順に、１ケージ当たり２０〜２５羽で、トリを無作為に調査用ケージに入れた（−１４日目）。生後１週間の時点（−７日目）に、１ケージ当たり少なくとも１０羽でトリを分け、１処置グループ当たり１ケージとした。続いて、識別のために、トリに個々にタグを付けた。そして、トリの受領、タグの識別、ケージへの配置を文書化した。
【０１７７】
毎日の健康状態の観察結果を、調査するすべてのトリについて、馴化フェーズ中、記録した。トリは、少なくとも３日間馴化した。臨床観察を毎日行い、記録した。
【０１７８】
投与経路
トリに、胸部の左側と右側に筋内注射するか、または後頸部における１つの部位に皮下注射するかのいずれかによって、試験物質を投与した。
【０１７９】
試験物質の投与−０日目と１４日目
０日目に、２週齢のトリの健康状態と外観が正常か調べ、調査に参加させた。１つのケージが、１つの処置グループを表していた。
【０１８０】
Ｔ０１の少なくとも１０羽のトリに、皮下注射によって、ＰＢＳを接種して、ネガティブコントロールとして機能させた。処置グループＴ０２、Ｔ０３、Ｔ０６、Ｔ０７、Ｔ０９及びＴ１０の少なくとも１０羽のトリには、調査の０日目と１４日目に、該当する試験物質を筋内注射によって接種した。残りの処置グループＴ０４、Ｔ０５及びＴ０８には、調査の０日目と１４日目に、該当する試験物質を皮下注射によって接種した。
【０１８１】
健康状態の観察と有害事象
試験物質を投与後、調査終了（２８日目）まで、臨床観察結果を毎日、少なくとも１回記録した。
【０１８２】
サンプルの採取と試験
１４日目の試験物質のブースター投与の前と２８日目に、現場の手順に従って、各トリから血液を採取した。血液を凝固させてから、遠心分離して、血清を回収した。試験するまで、血清を２〜７℃または−１８±５℃で保存したとともに、−１８±５℃で長期保存した。赤血球凝集抑制アッセイ（ＨＡＩ）によって、血清のセロコンバージョンレベルをアッセイした。
【０１８３】
ＨＡＩによって、血清サンプルのセロコンバージョンについてアッセイした。各処置グループの各血清サンプルのＨＡＩ価を割り出した。１回の投与につき３０ｕｇのＤＮＡを接種したトリ（Ｔ０４及びＴ０６）のＨＡＩ価を、１回の投与につき６０ｕｇのＤＮＡを接種したトリ（Ｔ０５及びＴ０７）のＨＡＩ価と比較して、最小免疫量を割り出した。調製したての試験物質を接種したトリ（Ｔ０９）のＨＡＩ価を、保持サンプルを接種したトリ（Ｔ１０）のＨＡＩ価と比較して、ワクチンの安定性を割り出した。
【０１８４】
他の処置グループのトリのＨＡＩ価を互いに比較して、アジュバント（Ｔ０２対Ｔ０６及びＴ０４対Ｔ０８）、プラスミド（Ｔ０６対Ｔ０９）、経路（Ｔ０３対Ｔ０４）またはカルシウム沈殿（Ｔ０２対Ｔ０３）の有効性を割り出した。
【０１８５】
ネガティブコントロールと比べて、すべての処置グループの有効性を判断するのに適切なときには、記述統計学を使用した。両側スチューデントｔ検定またはその他の適切な方法を行うことによって、幾何平均と統計的有意性を割り出した。
【０１８６】
試験物質
ＡＩＶ  Ｈ５プラスミドＤＮＡ（ｂｂｌ）、純度と品質について試験済み
ＡＩＶ  Ｈ５プラスミドＤＮＡ（ｎｔ）、純度と品質について試験済み
ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）、Ｃｅｌｌｇｒｏ、カタログ：２１−０３１−ＣＶ
【０１８７】
表２７：アジュバントストックの識別
2018510874.tif 000029
３各アジュバント５．０×ストックの純度とｐＨを試験した。すべての試験物質は、調製中、無菌で取り扱う。最終的な試験物質には、さらなる試験は行わない。
【０１８８】
表２８：各処置グループの試験物質の配合
2018510874.tif 000030
１アジュバントストック濃度は、実施例１による５．０Ｘであった。ワクチンは、２×濃度のアジュバントで配合する。
３Ｔ０２、Ｔ０６、Ｔ０７、Ｔ０９、Ｔ１０（保持用）用に調製したワクチンは、カルシウム沈殿を使用し、残りは、カルシウム沈殿を使用しない。
４Ｔ０１には、ＰＢＳ０．４ｍＬをＳＣ投与する。
５Ｔ１０は、ＮＢＨＯ２５０２から得た保持サンプルＴ１２である
【０１８９】
結果と結論
表２９：１３日目及び２８日目における血清反応とＧＭＴデータ
2018510874.tif 000031
【０１９０】
この調査により、本開示のアジュバントが、当該技術分野における教示内容、すなわち、高量のＤＮＡが必要であり、反復投与が必要であり、製造するには、十分な収量が得られず、高レベルの純度が必要であるという教示に反することが示されている。さらに、当該技術分野においては、ＤＮＡワクチンには、Ｃａ＋＋が必要であるとともに、ＤＮＡワクチンには、陽イオン送達ビヒクルが必要であると考えられていた。本実施例の調査により、本開示のアジュバントには、有効性と保存安定性を得るためのＣａ＋＋または陽イオン送達ビヒクルは不要である証拠が示されている。さらに、本開示のアジュバントを用いたプラスミドＤＮＡの調製は、ｍｇ／Ｌ単位ではなく、グラム／Ｌ単位で行うことができ、製造能力を向上させる。本実施例で示されたように、精製方法も本開示によって効率化されている。本開示のアジュバントは、試験したすべての種において、マイクログラムレベルであることが示されている。用量及び収量の最適化により、ＣＯＧ（商品原価）が１０，０００〜１００，０００回低下している。
【０１９１】
実施例７
この実施例は、本開示のアジュバントにおけるＤＮＡの、少なくとも１８カ月にわたる安定性を示すものである。
【０１９２】
材料と方法
プラスミド、家禽アジュバント０１  Ｐ１／トリス−ＨＣＬ緩衝液を作製して、２〜７℃で保存した。このプラスミドＤＮＡは、ＣＣＣＳ  ＤＮＡであり、このＣＣＣＳ  ＤＮＡは、細菌発酵物から精製される。精製プロセスでは、調製剤中に、８５％超がＣＣＳＣ  ＤＮＡであるＤＮＡが得られるが、直鎖状ＤＮＡ（Ｌ  ＤＮＡ）とリラックス型環状ＤＮＡ（ＲＣ）が、この精製ＤＮＡの残部を占めている。０日、２カ月、６カ月、１２カ月及び１８カ月の時点に、いずれも定量的に、緩衝液のみかまたは本開示のアジュバントとともにインキュベートしたサンプル間のＡ２６０を測定することによって、安定性を測定した。アガロースゲル電気泳動によって、処置済みサンプルから抽出したＤＮＡサンプルを用いて、ＣＣＣＳ  ＤＮＡ、Ｌ  ＤＮＡ及びＲＣ  ＤＮＡについて、ＤＮＡを定性的に評価した。
【０１９３】
具体的には、ｐＨ８の１０ｍＭトリスＨＣｌを用いて、プラスミドＤＮＡを適切な濃度まで希釈した。緩衝液には、陽イオン塩（特に、マグネシウム、マンガンまたはカルシウム）が含まれていなかった。２ｍｇ／ｍｌのプラスミドストック４８０ｕｌと、１０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液１１２０ｕｌと、アジュバントストック（実施例１による４×アジュバント０１）４００ｕｌを加えることによって、この調査用のサンプルの調製は、２０００ｕｌの体積で行った。アジュバント成分を１０ｍＭトリスＨＣＬ緩衝液に置き換えた以外は、同様の形でコントロールサンプルを作製した。アジュバント試験混合物に加える前に、プラスミドＤＮＡをカルシウムまたは他の陽イオンで処置しなかった。プラスミドＤＮＡは、共有結合性スーパーコイル化（ＣＣＳＣ）ＤＮＡ調製剤であったが、この調製剤は、上記の方法、または類似もしくは同等の手順の方法によって作製されるプラスミド調製剤の標準的なものである。
【０１９４】
試験サンプルを２〜７℃で調査期間にわたって保存した。アジュバントを作製し、作製の６カ月後、プラスミドＤＮＡをアジュバントに加えた。将来的には、２年の安定性データを完成させる。
【０１９５】
０時点、２カ月、６カ月、１３カ月及び１８カ月の時点に、アジュバントを含むかまたは含まないインキュベート混合物からサンプルを取り出し、ＣＣＳＣ  ＤＮＡの安定性を評価した。
【０１９６】
このＤＮＡはアジュバントに結合しており、クロロホルムによる抽出なしでは回収できないが、ＤＮＡをアジュバントと緩衝液から抽出する手順は、当該技術分野において知られている。
【０１９７】
結果と結論
結果によって、大半のＤＮＡまたは遺伝子療法ワクチンの基礎となる共有結合性閉環状スーパーコイル化ＤＮＡ（ＣＣＳＣ−ＤＮＡ）が、本開示のアジュバント物において安定であることが示されている。この調査で用いたＣＣＳＣ−ＤＮＡは、２．７℃で保存したときに、１８カ月超にわたって安定していた。Ｃａ＋＋によって誘導体化したリポソーム調製剤は、安定しておらず、ＤＮＡとともに水溶液に懸濁した後は、長期間保存できない。本開示から調製したとともに、精製ＣＣＳＣ−ＤＮＡと組み合わせたアジュバントは、液体形態で懸濁したときに、１８カ月超にわたって安定していることができる。さらに、この調査で用いた調製剤は、精製調製剤の一部として、直鎖状ＤＮＡとリラックス型環状ＤＮＡも含むので、これらの形態のＤＮＡのアジュバント−ＤＮＡ調製剤も、本開示のアジュバントに配置したときに、安定している（図１及び２）。したがって、本開示のアジュバントを用いたときには、有効なワクチン投与またはＤＮＡの送達を行うために、Ｃａ＋＋で処置したＤＮＡもしくはＣａ＋＋で誘導体化したリポソームまたはその他のビヒクルの送達は不要であり、このことは、当該技術分野にとって、明らかな新規事項かつ利点である。
【０１９８】
実施例８
この調査は、冷蔵温度または周囲温度で、少なくとも１８カ月インキュベートしたときのアジュバント／タンパク質配合物（ウシ血清アルブミン−ＢＳＡ）の安定性を例示するものである。
【０１９９】
材料と方法
この調査の目的は、本開示のアジュバントの２つの異なる実施形態と組み合わせたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の長期安定性の評価（１２カ月）を行うことであった。保存した試験物質（２〜７℃または１８〜２７℃で１２カ月±４週間保存）の安定性を、ＣＦ−１マウスにおけるセロコンバージョンによって測定した。保存した試験物質によって生じた、マウスにおけるセロコンバージョンのレベルを、この調査用に０日目と１８カ月の終わりに調製した新鮮な試験物質によって生じたレベルと比較した。新鮮な試験物質は、−８０±１０℃で保存したＢＳＡと、１８〜２７℃で保存したＰＢＳと、２〜７℃または１８〜２７℃のいずれかで保存した２つのアジュバント調合物を用いて調製した。
【０２００】
保存した試験物質を最初に調製し、この安定性調査の０時点の同じ日に、マウスに接種した。保存したこれらの試験物質を約６カ月保存後に、再度マウスに接種した。この安定性調査の続きとして、このプロコールで説明した方式で、保存したこれらの試験物質を１２カ月保存後、１８カ月保存後及び２４カ月保存後に、再度マウスに接種した。しかしながら、１８カ月の時点以降の試験の頻度と持続時間は、この調査で得られた結果次第とした。
【０２０１】
この調査の主な目的は、本開示の２つの異なるアジュバント調合物と組み合わせたＢＳＡを冷蔵温度または周囲温度のいずれかで約１８カ月保存後に、マウスに接種することによって、そのＢＳＡの安定性を評価することであった。この調査において接種したマウスの血清応答を、この１２カ月の時点用に新たに調製した試験物質を接種したマウスにおいて得られた応答と比較した。この調査で得られた血清応答を、０時点と６カ月という、前の２つの安定性時点で得られた応答とも比較した。
【０２０２】
このプロトコールは、２つの主な部分に分けられる。第１の部分は、安定性用に保存する試験物質の説明と、この調査で試験する新鮮な試験物質の調製と、２年の安定性試験のスケジュールの概要を含む。第２の部分は、このプロトコールの臨床フェーズを説明するものであり、将来の試験日程は、臨床フェーズ用の別のプロトコールを有することになる。第１の部分は、試験日程間で共通することになる。
【０２０３】
１回の投与につきＢＳＡ５０ｕｇという標的濃度になるように、２つの異なるアジュバント調合物をＢＳＡと混合した。ゴム栓の付いた滅菌ガラスバイアルに、調製したすべての試験物質を無菌分注して、圧着して閉じた。
【０２０４】
市販のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を上記のようなバイアルに分注することによって、試験物質ＰＢＯ／冷温を調製し、冷蔵温度で保存した。５００ｕｇ／ｍｌ（０．１ｍＬの用量当たり５０ｕｇ）という標的濃度になるように、０．２５部のＢＳＡと１部のＰＢＳを加えることによって、試験物質ＢＳＡ／ＰＢＳ／室温とＢＳＡ／ＰＢＳ／冷温を調製し、周囲温度または冷蔵温度で保存した。５００ｕｇ／ｍｌ（０．１ｍＬの用量当たり５０ｕｇ）という標的濃度になるように、０．２５部のＢＳＡと１部の５×アジュバント０１（実施例１）を加えることによって、試験物質ＢＳＡ／Ａｄｊ０１／室温とＢＳＡ／Ａｄｊ０１／冷温を調製し、周囲温度または冷蔵温度で保存した。５００ｕｇ／ｍｌ（０．１ｍＬの用量当たり５０ｕｇ）という標的濃度になるように、０．２５部のＢＳＡと１部の５×アジュバント０６（実施例１）を加えることによって、試験物質ＢＳＡ／Ａｄｊ０６／室温とＢＳＡ／Ａｄｊ０６／冷温を調製し、周囲温度または冷蔵温度で保存した。安定性試験物質の調製は、以下にまとめられている。
【０２０５】
表３０：安定性試験物質の概要
2018510874.tif 000032
１この１２カ月の調査の０日目と１４日目に接種するのに用いた各アリコートの残りの体積分は、使用日に破棄する。残りの保持アリコートは、保持する。
２４×アジュバントサンプルは、実施例１による５×ストックアジュバントから調製した。
【０２０６】
新鮮な試験物質
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）６２５ｕｇ／ｍｌフリーザーストック、ＢＢＬ
ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）、Ｃｅｌｌｇｒｏ、カタログ：２１−０３１−ＣＶ、ロット：２１０３１４２４
【０２０７】
表３１：調査設計
2018510874.tif 000033
１５００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡストック、１回の投与につきＢＳＡ５０ｕｇ
２各処置グループの略称
【０２０８】
表３２：新鮮な試験物質の明細
2018510874.tif 000034
１５００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡストック、１回の投与につきＢＳＡ５０ｕｇ
２各処置グループの略称
３新鮮な試験物質の調製に用いた成分の保存温度
４５．０×アジュバントストックは、１８〜２７℃で保存した安定性サンプルと同じ保存場所と保存温度で保存した。
【０２０９】
表３３：臨床調査設計
2018510874.tif 000035
１この調査では、処置グループ（ＴＧ）の明示によって、マウスと試験物質が定められる。すべてのアジュバントは、実施例１で説明したような４×濃度である。
２マウスには、皮下注射で、肩の間の背部に接種する。
３試験物質を接種しなかった追加のマウスを用いて、ベースライン血液サンプルを得る。
＊＊必要に応じて、血液をベースラインマウスから採取して、ＥＬＩＳＡで使用するためのプレスクリーニング血清を得る。３〜４週間の期間内に、マウスの平均体重に基づき、総血液体積の１０％以下を採取する。Ｆ＝調製したて、Ｓ＝安定性サンプル
【０２１０】
表３４：調査のタイムライン
2018510874.tif 000036
【０２１１】
投与経路
すべてのマウスに、試験物質を皮下注射によって、肩の間の背部に投与する。
【０２１２】
プレスクリーニングサンプルの採取−−４日目〜０日目（ベースラインマウスのみ）
調査の０日目よりも前に１回、ベースラインマウス（調査で使用しないマウス）から血液を採取し、プールして、プレスクリーニング血清を得た。マウスの平均体重に基づき、総血液体積の１０％以下を採取した。採血を文書化した。血液を凝固させてから、遠心分離して、血清を回収した。続いて、その血清をプールし、調査で用いるマウスのＢＳＡ血清反応が陰性であることを確認するために、ＥＬＩＳＡによって試験するまで、２〜７℃または−１８±５℃で保存した。
【０２１３】
投与処置−０日目
マウスの健康状態と外観が正常か調べ、調査に参加させた。各ケージが、１つの処置グループを表していたとともに、識別目的で、各ケージ内の個々のマウスの耳に切れ込みを入れる。
【０２１４】
この調査の０日目に、各処置グループ調製剤の１つのバイアルを無菌で３つのアリコートに分けた。１つのアリコートをすぐに（０日目に）マウスに投与した。１４日目にマウスに投与するまで、１つのアリコートを２〜７℃で保存した。最後のアリコートを保持サンプルとして２〜７℃で保持した。すべての処置グループ調製剤（ＴＧごとの調製剤）をマウスに、肩の間の背部に皮下投与した。投与処置を文書化した。
【０２１５】
サンプルの採取−１〜２８日目（ベースラインマウスのみ）
必要に応じて、１〜２８日目に、ベースラインマウス（調査で使用しないマウス）から血液を採取し、プールした。３〜４週間の期間内に、マウスの平均体重に基づき、総血液体積の１０％以下を採取した。採血を文書化した。血液を凝固させてから、遠心分離して、血清を回収した。続いて、その血清をプールし、ネガティブコントロールとしてＥＬＩＳＡで使用するまで、２〜７℃または−１８±５℃で保存した。
【０２１６】
サンプルの採取と試験
１３日目と２８日目に、各接種済みマウスから血液を採取した。３〜４週間の期間内に、マウスの平均体重に基づき、総血液体積の１０％以下を採取した。採血を文書化した。血液を凝固させてから、遠心分離して、血清を回収した。続いて、試験するまで、その血清を２〜７℃または−１８±５℃で保存した。血清のセロコンバージョンレベルをＥＬＩＳＡによってアッセイした。
【０２１７】
組織学的観察用に、安楽死させた動物から組織サンプルを回収した。組織を１０％中性緩衝ホルマリンに固定するか、または直接冷凍した。
【０２１８】
健康状態の観察と有害事象
調査のタイムラインに示されているように、試験物質の投与後、臨床観察を毎日記録した。
【０２１９】
解析の評価／データ解析
血清サンプルのセロコンバージョンをＥＬＩＳＡによってアッセイした。各処置グループの各血清サンプルにおける抗体産生レベルを割り出した。アジュバント＋ＢＳＡを投与したマウスにおける抗体産生量を、ＢＳＡ＋ＰＢＳを投与したマウスにおける抗体産生量と比較した。各種アジュバント調合物を投与したマウスにおける抗体産生量を互いに比較した。安定性解析のために保存した試験物質を投与したマウスにおける抗体産生量を、この調査の０日目に新たに調製した試験物質を投与したマウスと比較した。
【０２２０】
この調査で接種したマウスにおける抗体産生レベルを、産生された抗体レベルと比較した。
【０２２１】
ネガティブコントロール（ＰＢＳのみ）と比べて、すべての処置グループの有効性を判断するのに適切なときには、記述統計学を使用した。両側スチューデントｔ検定またはその他の適切な方法を行うことによって、幾何平均と統計的有意性を割り出した。
【０２２２】
試験物質の調製
表３５：０日目に調製する新たな処置グループの調製の概要
2018510874.tif 000037
１試験物質は、この調査で試験したのみであった。次の安定性調査用に保存したものはなかった。すべてのアジュバントは、実施例１の説明による５×ストックに由来する４×濃度のものであった。
２−８０±１０℃で保存したＢＳＡ（６２５ｕｇ／ｍｌ）フリーザーストック
【０２２３】
結果と結論
表３６：保存から１２カ月後のＥＬＩＳＡ測定によるＢＳＡに対する免疫応答
2018510874.tif 000038
すべてのアジュバントは、実施例１の説明による４×濃度のものであった。
【０２２４】
結果によって、本開示のアジュバントが、タンパク質サンプル（このケースではＢＳＡ）とともに、またはタンパク質サンプルなしでインキュベートしたときに、１２カ月の期間にわたって安定していたことが示されている。データから分かるように、アジュバント０６の全サンプルは、免疫応答の有効性によって測定したところ、１２カ月時点にマウスに接種したときに、室温または周囲条件下で保存したかに関わらず、安定していた。このデータによって、アジュバントを出荷したり、保存したり、かつ抗原と組み合わせないか、または組み合わせるかのいずれかでアジュバントを使用したりやすくする有効性を失うことなく、アジュバントを抗原とともに液体形態でインキュベートできることが示唆されている。このデータによって、アジュバントの安定性が高温で向上し、このことは、動物の免疫応答性の寄与要因となる可能性が最も高いことがさらに示されている。
【０２２５】
実施例９
この実施例は、本開示のアジュバント調合物が室温においても、冷蔵したときにも安定しているといった、本開示のアジュバント調合物の特徴を示するものである。具体的には、この安定性調査は、周囲温度または２〜７℃のいずれかで、最長で２４カ月間保存した本開示のアジュバントの安定性を割り出すように設計した。この調査は、冷蔵温度または周囲温度で少なくとも１２カ月インキュベートしたアジュバント調合物の安定性を示すものである。
【０２２６】
材料と方法
滅菌プラスチック製の蓋が付いた滅菌ＰＥＴＧボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｗｈｅａｔｏｎまたは同等のメーカー）にアジュバントを入れた。
【０２２７】
この安定性に採用したアジュバントを周囲温度または２〜７℃のいずれかで、最長２４カ月保存した。各時点に、解析のために、２つのアリコートを取り出した。試験は、スケジュールした時点の±１週間以内に開始しなければならない。すべてのアリコートは、取り出したら、試験が完了するまで２〜７℃で保存した。
【０２２８】
外観試験
ＳＯＰ  ＸＱＣ−０８７に従って、アジュバントサンプルの外観を試験した。加えて、各サンプルにおける乳剤の目に見える分離を調べ、存在する分離の量を測定し、各時点に文書化する。
【０２２９】
粒径解析
アジュバントサンプルの粒径解析を行った。
【０２３０】
ｐＨ試験
アジュバントサンプルのｐＨを試験した。
【０２３１】
粘度試験
アジュバントサンプルの粘度を試験する。
【０２３２】
表３７：安定性プラン
2018510874.tif 000039
１０時点は、実施した最初のＱＣ試験時を表している。
２他の試験によって予測値が得られる場合には、所定の時点に行っても行わなくてもよい。
【０２３３】
結果と結論
表３８：アジュバント０６  ４×のインビトロでのアジュバント安定性調査の結果
2018510874.tif 000040
【０２３４】
表３９：アジュバント０３  ４×のインビトロでのアジュバント安定性調査の結果
2018510874.tif 000041
【０２３５】
この調査によって、液体形態で保存すると、本開示のアジュバントが少なくとも１２カ月、冷温及び室温で安定しているという生物物理学的な特性が示されている。
【０２３６】
表４０：ｐＨ、粘度及び粒径のデータ（凍結乾燥サンプルと非凍結乾燥サンプルの比較）
2018510874.tif 000042
【０２３７】
このデータによって、本開示の３つの異なるアジュバント組成物のいずれも、凍結乾燥したときにも、凍結乾燥後に再懸濁したときにも、少なくとも２４カ月、周囲温度において安定性を示すことが明らかになる。０１のアジュバント調合物では、２年が経過して、ｐＨは７．１１から７．０９になり、粘度は１６のままで、粒径は０．８６から０．８２になった。０２のアジュバント調合物では、２年が経過して、ｐＨが７．１１から７．１０になった。０３のアジュバント調合物では、２年が経過して、ｐＨが７．１１から７．０９になり、粘度は１６のままであった。このことにより、異なる条件における本開示のアジュバントの長期安定性が示され、この長期安定性は、従来から知られているアジュバント調合物と比べると、当該技術分野における進歩を示すものである。
【０２３８】
実施例１０
材料と方法
７１日齢のヒナに、ＤＮＡワクチン０．２ｍＬを皮下接種したかまたはＰＢＳ０．２ｍＬを接種した。このＤＮＡワクチンは、ＧｙｒＦａｌｃｏｎ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／４１０８８−６／２０１４由来のＨＡ遺伝子を含む真核ＤＮＡワクチンプラスミド骨格であった。合計６０羽のヒナにＤＮＡワクチンを投与し、１０羽のヒナをコントロールとして用いた。最初のワクチン投与から２週間後、２０羽のヒナに、ＤＮＡワクチン０．２ｍＬで追加免疫を行い、２０羽のヒナに、ＧｙｒＦａｌｃｏｎ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／４１０８８−６／２０１４リバースジェネティクス死菌ワクチン０．２ｍＬをアジュバントとともに接種した。トリが４週齢になったときに（最後のワクチン投与から２〜４週間後）、１０６．５／ＥＩＤ５０の用量でＡ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／１２５８２／２０１５（Ｈ５Ｎ２）を０．５ｍＬの用量で後鼻孔接種経路によって投与して、攻撃を行った。この攻撃ウイルスは、最近流行したものに由来し、攻撃用量は、ストリンジェントな攻撃として、ニワトリ半数致死量が１０００となるように設計した。各処置グループに、実施例１に従って算出した２×のアジュバント０５を投与した。
【０２３９】
ウイルス排出の測定：１×抗生物質／抗真菌剤（バージニア州ハーンドンのＭｅｄｉａｔｅｃｈ）を含む滅菌ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）ブロス２ｍｌ（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に、ニワトリから得た口腔咽頭拭い液サンプルを懸濁し、ＲＮＡの抽出まで、−７０℃で冷凍した。サンプル２５０ｕｌから得た全ウイルスＲＮＡをＴｒｉｚｏｌに加え、クロロホルムを加えた後、水相をＭａｇＭＡＸ−９６  ＡＩ／ＮＤ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（テキサス州オースティンのＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）とともに用いた。ＲＮＡの単離手順は、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒという磁気粒子処理系（マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。
【０２４０】
Ａ型鳥インフルエンザマトリックス遺伝子（２）に特異的なプライマーとプローブを用いて、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＲＲＴ−ＰＣＲ）を行った。ＲＮＡサンプル８μｌとともに、ＡｇＰａｔｈ−ＩＤ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、ヌクレアーゼフリー水を加えて、２５μｌの最終体積にした。逆転写反応は、５０℃で３０分の１サイクル後、９５℃で１５分という構成にした。ＰＣＲ反応では、９４℃で１秒の変性を４０サイクル後、２０秒、６０℃でアニーリングを行った。いずれの反応も、リアルタイムＰＣＲ装置のＳｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＩＩ（カリフォルニア州サニーベールのＣｅｐｈｅｉｄ）で行った。用いた攻撃ウイルスの既知量のＲＮＡから作成した標準曲線を用いることによって、拭い液サンプルから得たウイルスのＥＩＤ５０Ｓをサイクル閾値から推定した（１）。サイクル実行数に等しいサイクル閾値を設定することによって、標準曲線に基づき、各ＲＲＴ−ＰＣＲランの検出限界を算出した。統計上の目的のために、この調査においてＲＲＴ−ＰＣＲ陰性であったサンプルには、標準曲線における最低検出ポイントを下回る１サイクルというサイクル閾値値を割り当てた。
【０２４１】
続いて、赤血球凝集抑制（ＨＩ）試験を行った。ＨＩ試験を用いることによって、ＡＩＶに対する赤血球凝集抑制抗体価を割り出した（３）。同種のβ−プロピオラクトン不活化抗原（Ａｇ）をＰＢＳで希釈して、ある濃度のＨＡユニットを４つ作製した。同種Ａｇとは、ＲＰ遺伝子を改変して、ウイルスの抗原性に影響を及ぼさない低病原性切断部位を有するようにした以外は、ＲＰワクチンで用いたのと同じヘマグルチニン遺伝子であるＡ／ｇｙｒｆａｌｃｏｎ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／４１０８８−６／２０１４  Ｈ５Ｎ８ウイルスを指す。９６ウェルプレートの１ウェル当たり５０マイクロリットルのＡｇを加え、このプレートで、試験血清を２倍に段階希釈した。プレートを１５分、室温でインキュベートしてから、０．５％ニワトリ赤血球を各ウェルに加えた。プレートを１５秒振盪し、４５分、室温でインキュベートした。結果は、赤血球凝集活性が完全に阻害された最後のウェルの逆数として解釈した。統計上の目的のために、逆数抗体価４を最も低い陽性結果とみなした。
【０２４２】
結果と結論
最後のワクチン投与から２または４週間後に、ワクチンを投与したトリとコントロールのトリをＡ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／１２５８２／２０１５（Ｈ５Ｎ２）で攻撃した。すべてのコントロールのトリでは、攻撃から３日後までに、重篤な臨床疾患が見られたか、または死亡し、平均死亡時（ＭＤＴ）は２．１日であったとともに、ＩＡＣＵＣプロトコールで義務付けられているように、重篤な臨床疾患を罹患したトリは、安楽死させて、翌日に死亡したものとして記録した（図１）。
【０２４３】
攻撃日、４週齢時、及びワクチン投与の２または４週間後に採取した血液で血清反応を行った。いずれのコントロールのトリも、１回ＤＮＡワクチンを投与したトリも、ＨＩ抗体価は検出不可能であった。ワクチンを投与したトリでは、２０羽のトリのうち、７羽の抗体価が検出可能であったとともに、２回ＤＮＡワクチンを投与したグループでは、その範囲は４〜３２であったとともに、ＤＮＡ／ＲＧグループでは、２０羽のトリのうち、１９羽が抗体価を有していた。セロコンバージョンしたトリの幾何平均抗体価は、それぞれ８．８（２３．１４）及び１６．６（２４．０５）であった（表２６）。
【０２４４】
攻撃後のウイルス排出：攻撃の３日後に、すべてのコントロールのトリは死亡したか、安楽死させたが、すべてのトリにおいて、死亡か生存かに関わらず、２日目に口腔咽頭を拭った。ワクチンを投与したすべてのトリでは、２日目に拭い、残りのすべてのトリで、攻撃の４日目後にサンプルを採取した。２日目のコントロールのトリは、１０７．１／ＥＩＤ５０を排出していたとともに、すべてのトリは、同様の抗体価のウイルスを排出していた。それぞれ、１回ＤＮＡワクチンを投与したトリは、２日目に、１０６．６／ＥＩＤ５０を排出し、２回ＤＮＡワクチンを投与したグループは、１０５．４／ＥＩＤ５０  ｌｏｇのウイルスを排出し、ＤＮＡ／ＲＧワクチンを投与したグループは、１０２．９／ＥＩＤ５０  ｌｏｇのウイルスを排出していた（図１）。マンホイットニー順位和検定を用いたところ、ウイルス排出量は、２日目時点に、コントロールと、２回ＤＮＡワクチンを投与したグループと、ＤＮＡ／ＲＧワクチンを投与したトリとの間で、統計的に異なっていた（Ｐ＝＜０．００１）。
【０２４５】
１日齢におけるＤＮＡワクチンのプライムブーストワクチンのアプローチと、２週間時点の追加免疫は、攻撃に対して９５％有効であった一方で、２回ＤＮＡワクチンを投与した処置グループでは、ワクチンを投与したトリの５５％において、防御効果があった。その相関性は非常に高く、ＨＩ試験でセロコンバージョンしたトリであって、少なくとも抗体価が４であったトリは、攻撃に耐えたとともに、排出量が低かった。これらの結果によって、ＤＮＡワクチンを単独または混合ワクチン投与試験で使用できることが示されている。
【０２４６】
表４１：ワクチンを投与した個々のトリによる赤血球凝集抑制価
2018510874.tif 000043
【０２４７】
ワクチンを投与した個々のトリによる赤血球凝集抑制価：最も低い陽性ＨＩ抗体価は４であるので、演算のために、測定抗体価２は、０に変換した。幾何平均抗体価では、陰性抗体価のトリは、演算には含めなかった。
【０２４８】
実施例１１
本開示のアジュバントと組み合わせたＤＮＡワクチンのシチメンチョウにおける血清学的評価の有効性調査
【０２４９】
この調査の目的は、本開示のアジュバントを用いた高病原性鳥インフルエンザ（ＨＰＡＩ）ＤＮＡワクチンの有効性の合理的な見込みを立てることであった。これは、ワクチンがシチメンチョウにおいて免疫応答を惹起する能力を評価することによって行った。この目的のために、高病原性鳥インフルエンザウイルスＡ／ｇｒｙｆａｌｃｏｎ／ＷＡ／４１０８８−６／２０１４  Ｈ５Ｎ８の改変遺伝子と、ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質を含むプラスミドＤＮＡをＶａｘＬｉａｎｔ  アジュバントと組み合わせて、皮下及び鼻腔内経路によって投与した。
【０２５０】
改変プラスミドＮＴＣ８６８５−ｅＲＮＡ４１Ｈ−ＫＰ３０７９８４．１−ＨＡ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄは、高病原性（ＨＰ）鳥インフルエンザウイルス（ＡＩＶ）株Ａ／ｇｙｒｆａｌｃｏｎ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／４１０８８−６／２０１４（Ｈ５Ｎ８）由来のＨＡ遺伝子をコードする。Ｈ５配列を改変して、ＨＰ多塩基性切断部位（ＰＬＲＥＲＲＲＫＲＧＬＦ）（配列番号１）を一塩基性切断部位に変更した。この改変Ｈ５遺伝子は、合成によって作製し、ＮＴＣ８６８５−ｅＲＮＡ４１Ｈ最適化真核発現ベクターにクローニングし、そのコンストラクトをＥ．ｃｏｌｉ株ＮＴＣ４８６２にトランスフォーメーションした。
【０２５１】
赤血球凝集抑制アッセイを用いて、非改変ＨＡ遺伝子を含む不活化ウイルスに対するセロコンバージョンを試験することによって有効性を測定した。
【０２５２】
材料と方法
ＥＮＡＢＬ  １と０．５×  ＥＮＡＢＬ（商標）５をｐＨＡ  ＤＮＡとともに（ＩＶＰ１及び２）、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）をｐＨＡ  ＤＮＡとともに（ＭＰＣ）、各トリに皮下（ＳＣ）投与した。各ＩＶＰ処置グループには、少なくとも２２羽のトリが含まれていたとともに、ＭＰＣグループの１０羽のトリには、０日目に接種した。調査全体にわたって、トリの全身の健康状態を観察した。すべてのトリに、調査０日目に接種した。各接種から約２週間後、血液を採取し、セロコンバージョンを試験した。
【０２５３】
表４２：調査の明細
2018510874.tif 000044
１ＳＣ−頸部根部皮下、ＩＮ−鼻腔内
【０２５４】
表４３：試験物質
2018510874.tif 000045
【０２５５】
表４４：調査のタイムライン
2018510874.tif 000046
【０２５６】
投与経路：後頸部に皮下注射するか、または鼻孔に鼻腔内点鼻するかのいずれかによって、トリに試験物質を投与した。０日目と１４日目に試験物質を投与した。Ｔ０１のトリに、ＰＢＳをＳＣ経路によって投与したが、Ｔ０１は、ＭＰＣ−１を表している。残りのトリには、調査設計に記載されているように接種した。１４日目に、グループＴ０１、０２のトリに製品を投与し、これは、ブーストであった。グループＴ０３のトリには、ブーストを投与しなかった。
【０２５７】
サンプルの採取と試験：グループＴ０１、０２において、試験物質のブースター投与日の前と、調査の最後に、現場の手順に従って、各トリから血液を採取した。グループＴ０３のトリでは、２１日目と調査の最後に採血した。血液を凝固させてから、遠心分離して、血清を回収した。血清を２〜７℃または−１８±５℃で保存した。ＢＢＬ  ＳＯＰ  ＬＰ−０５４に従って、ウイルスＡ／ｇｙｒｆａｌｃｏｎ／ＷＡ／４１０８８−６／２０１４  Ｈ５Ｎ８  ＢＥＩの４〜８赤血球凝集ユニットの阻害によって、血清のセロコンバージョンレベルをアッセイした。
【０２５８】
結果と結論
ＢＢＬ  ＳＯＰ  ＬＰ−０５４に従って、不活化ウイルスＡ／ｇｙｒｆａｌｃｏｎ／ＷＡ／４１０８８−６／２０１４  Ｈ５Ｎ８  ＢＥＩ（非改変ＨＡ遺伝子を含んでいた）の赤血球凝集の阻害によって、血清のセロコンバージョンレベルをアッセイした。各処置グループの各血清サンプルの赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）価を割り出した。簡潔には、血清の段階希釈液を４〜８ヘマグルチニンユニットとともにインキュベートし、最後に、ニワトリ赤血球に加えた。ＨＡＩ価は、すべての複製物においてウイルス特異的な赤血球凝集の１００％の阻害が見られる最後の希釈液の逆数ｌｏｇとして記録した。各種アジュバント調合物を投与したトリにおけるＨＡＩ価を比較した。
【０２５９】
表４５：シチメンチョウにおける有効性の結果
2018510874.tif 000047
ＥＮＡＢＬ  ＬＰ７（商標）またはＬＰ７（商標）は、アジュバント０５の２×濃度の商品名である。
【０２６０】
結果によって、シチメンチョウに、１日齢において、ＨＰＡＩ  ＤＮＡ／アジュバントの組み合わせを接種できることが示されている。さらに、セロコンバージョンするトリは、この調査で使用した製剤をＳＣ投与すると、２回投与レジメンによって、同種の攻撃から保護されることになる。
【０２６１】
実施例１２
このシチメンチョウ調査において動物用治験製品（ＩＶＰ）として試験した本開示のアジュバント調合物は、高病原性（ＨＰ）鳥インフルエンザウイルス（ＡＩＶ）株Ａ／ｇｙｒｆａｌｃｏｎ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／４１０８８−６／２０１４（Ｈ５Ｎ８）由来の改変ヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ（ｐＨＡ）とともに調合したＥＮＡＢＬ（登録商標）１及び６であった。Ｈ５配列を改変して、ＨＰ多塩基性切断部位（ＰＬＲＥＲＲＲＫＲＧＬＦ）（配列番号１）を一塩基性切断部位に変更した。改変Ｈ５遺伝子は、合成によって作製し、ＮＴＣ８６８５−ｅＲＮＡ４１Ｈ最適化真核発現ベクターにクローニングした。同じｐＨＡをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）と混合して、調査の対応するプラセボコントロール（ＭＰＣ）として機能させた。
【０２６２】
この調査の目的は、ＥＮＡＢＬ（登録商標）１及びＥＮＡＢＬ（登録商標）６を接種したシチメンチョウにおける２１日間のＤＮＡワクチン休薬時間を確立することであった。
【０２６３】
材料と方法
調査設計
ｐＨＡ  ＤＮＡ（ＩＶＰ１及び２）と組み合わせたＥＮＡＢＬ１及びＥＮＡＢＬ（商標）６、またはｐＨＡ  ＤＮＡと組み合わせたリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ＭＰＣ）を各トリに皮下（ＳＣ）投与した。各処置グループは、０日目に接種した少なくとも１０羽のトリから構成させた。２１日間、トリの全身の健康状態を観察した。１日目〜７日目、１４日目及び２１日目に、部位特異的な観察を行った。調査の０日目以降かつ２１日目以前に、病的状態のために安楽死させたか、または死亡が確認されたすべてのトリを検死して、死亡の原因がＩＶＰであるか、ＭＰＣであるかを割り出した。２１日目における残りのすべてのトリに、肉眼的病理検査と組織学的検査を行った。調査設計は、表４６にまとめられている。
【０２６４】
表４６：調査の明細
2018510874.tif 000048
すべてのアジュバントは、実施例１の記載による４×濃度のものであった。ＥＮＡＢＬ（商標）１は、４×のアジュバント０１であり、ＥＮＡＢＬ（商標）６は、実施例１による４×のアジュバント０６である。
【０２６５】
＊各製品は、割り当てられたロット番号によって識別する。用量０．２ｍＬの最終生成物を頸部に皮下投与する。
【０２６６】
試験物質は、以下に記載されている。試験物質は、調査で使用する前に、試験物質Ａ〜Ｃとして割り当て、調査中、試験物質Ａ〜Ｃとして識別して、適切な盲検を維持した。
【０２６７】
表４７：ＥＮＡＢＬ（登録商標）１（動物用治験製品＃１）を含むｐＨＡ  ＤＮＡ
2018510874.tif 000049
ＥＮＡＢＬ（商標）１は、実施例１におけるアジュバントの５×の市販のアジュバントの商品名である。
【０２６８】
表４８：ＥＮＡＢＬ（登録商標）６（動物用治験製品＃２）を含むｐＨＡ  ＤＮＡ
2018510874.tif 000050
ＥＮＡＢＬ（商標）６は、アジュバント０６の５×の市販のアジュバントの商品名である。
【０２６９】
表４９：ｐＨＡ  ＤＮＡ＋ＰＢＳ（対応するプラセボコントロール）
2018510874.tif 000051
【０２７０】
表５０：調査のタイムライン
2018510874.tif 000052
【０２７１】
投与処置−０日目
健康状態の評価、臨床観察及び注射部位観察案を処置日に記録した。各トリの後頸部中央部の皮下空間に、指定の製品を１回注射した。用量は、部位当たり０．２ｍＬであった。
【０２７２】
臨床観察、注射部位観察及び有害事象
調査のタイムラインに示されているように、試験物質の投与後、すべてのトリの全身健康状態を毎日観察した。Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ（ＶＥＤＤＲＡ）の作成した標準下層語に従って、臨床徴候を分類した。
【０２７３】
１〜７日目及び１４日目に、注射部位を触診し、観察し、記録した。２１日目、安楽死と検死の直前に、すべての注射部位の最後の触診と検査を行った。
【０２７４】
サンプルの採取
組織学的データの収集のために、組織サンプルを注射部位と組織周辺から摘出した。病理学者が、注射部位の異常に関連する、注射部位の肉眼的病理を調べた。
【０２７５】
注射部位の検査とスコア化
注射部位を触診し、所見を記録した。皮膚を切開し、下の組織を調べた。検死中に、病理学者が、いずれかの排膿孔、膿瘍、浮腫、出血または壊死の存在に基づき、注射部位のスコアを付けた。いずれかの所定の注射部位における最も深刻な徴候によって、病理学者が注射部位に付けた、１つの注射部位のスコアを定めた。１つの注射部位で、２つ以上の徴候が観察される場合には、他方の徴候（スコアが低い徴候と、スコアが付けられなかった徴候）を記録したが、重篤度の低いこれらの所見によって、最も重篤な徴候に基づいて付けられたスコアは下げなかった。
【０２７６】
注射部位の組織学的スコア化
回収した各組織の部位反応の組織学的エビデンスを調べた。肉眼的検死所見に関して、注射部位に、最も重篤な等級を付けて、その部位の組織学的スコアとして使用した。
【０２７７】
結果と結論
各処置グループにおいて、最初のふるい分けと調査期間で、馴化時点の健康状態により、この調査における組み入れ基準を満たした１４羽のトリが残った。検死時の部位の観察と、肉眼的／組織的病理の結果は、下記の表に示されている。
【０２７８】
表５１：観察と肉眼的／組織的病理の結果
2018510874.tif 000053
１２１日の観察期間の終わりまでに可視的腫脹が認められた動物の数
２検死時に、認識可能な炎症応答（軽度から中程度）が認められた動物の数
３検死時に、顕微鏡でのみ観察可能な生理応答が認められた動物の数
ＥＮＡＢＬ（商標）１は、実施例１におけるアジュバントの５×の市販のアジュバントの商品名である。
【０２７９】
部位の観察：プラセボを接種したトリはいずれも、部位観察または検死レベルのいずれにおいても、いずれの異常な応答に関するスコア付けはされず、すべてのトリは、いずれのタイプの臨床徴候に関しても、ワクチンまたは損傷関連の病状について、陰性にスコア付けされた。処置グループＴ０１及びＴ０２では、１４羽のトリのうち３羽のみ（合わせて６羽のトリ）で、２１日の期間の最後に、触診できた接種部位で、多少の腫脹が見られた。残りのトリ（２２羽のトリ）は正常であった。
【０２８０】
検死：検死時には、Ｔ０１グループの全体的な肉眼的病理観察によって、１４羽のトリのうち、６羽には、２１日目には、注射部位に関連するいずれのタイプの病変も病状も見られず、残りの８羽のトリのうち、２羽のトリのみに、より重篤な炎症応答が見られ、残りは、中度から軽度であったことが示された。全体的な組織学的結果によっては、１４羽のトリのうち、７羽では、２１日目に、炎症または免疫応答を示す可視的浸潤は見られなかったことが示された。残りの７羽のトリでは、観察結果は中度であった。注射部位で可視的なあざまたは出血に関連する損傷が見られたトリはいなかった。
【０２８１】
Ｔ０３処置グループの全体的な肉眼的病理観察では、１４羽のトリのうち、７羽で、２１日目に、注射部位に関連するいずれのタイプの病変も病状も見られず、残りの７羽のトリは、ほぼ軽度の応答であった。全体的な組織学的結果によって、１４羽のトリのうち、３羽で、２１日目に、炎症または免疫応答を示す可視的浸潤が見られなかった一方で、残りの１１羽のトリでは、免疫応答または炎症を示す、軽度から中度の浸潤が多少見られたことが示された。
【０２８２】
この調査で試験したアジュバントでは、２１日の観察中、可視的な部位反応はほとんど見られず、トリは、健康な状態を維持し、いずれの不快な様子も見られなかった。検死時のみ、熟練の病理学者が、いずれかの病状を認めることができたとともに、この病状は、顕微鏡による検査によって、組織切片でも明らかであった。２１日目（調査終了時）に、検死で、肉眼的病理によって観察されたいずれの反応も、家禽処理の殺処分ラインを越えるほど重篤とはみなされなかった。検死時にスコア化できたすべての病変は、軽度から中度であったとともに、自然に消散するように見え、ある期間（数日）内に、組織が正常な外観に戻るように示されていた。これらの結果によって、アジュバントは、２１日間（アジュバントをワクチン製剤とともに使用する際に、ＵＳＤＡによって認められた最短期間）の休薬の安全性認可を得られるとみなされることが示されている。
【０２８３】
実施例１３
この調査によって、本開示の製品と方法の有効性の合理的な見込みを立てた。高病原性インフルエンザウイルス、すなわち、トリワクチンＨ５サブタイプＤＮＡを用いた。本開示のアジュバント組成物を使用して、このワクチンを用いたニワトリにおける血清試験を行った。すべての処置グループは、２×アジュバント０５のＥＮＡＢＬ（商標）ＬＰ７を含むものであった。
【０２８４】
材料と方法
ＤＮＡ骨格プラスミドＮＴＣ８６８５ｅＲＮＡ４１Ｈ−ＫＰ３０７９８４．１を用いて、ＤＮＡワクチンを作製した。このプラスミド骨格を用いて、高病原性（ＨＰ）鳥インフルエンザウイルスＡ／ｇｙｒｆａｌｃｏｎ／ＷＡ／４１０８８−６／２０１４（Ｈ５Ｎ８）のＨＶ抗原をコードする改変合成ヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を有していた。合成前に、公知のＨ５配列を、その多塩基性切断部位において改変して、低病原性鳥インフルエンザウイルスの一塩基性部位に特徴的なＨ５タンパク質を発現する配列を形成し、この改変によって、識別のための特有の制限部位も組み込んだ。改変Ｈ５遺伝子は、合成によって作製し、ＮＴＣ８６８５−ｅＲＮＡ４１Ｈ最適化真核発現ベクターにクローニングし、このコンストラクトをＥ．ｃｏｌｉ株ＮＴＣ４８６２にトランスフォーメーションして、この改変プラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉマスターシード候補を得た。このＥ．ｃｏｌｉを用いて、マスターシードＭａｓｔｅｒ  Ｓｅｅｄ  ＡＩＶ  Ｈ５  Ｍｏｄ、ロット＃ＭＳ１６Ｊｕｎ１５ＨＰＡＩＶ（ＭＬ＃１７１７１３）を作製した。
【０２８５】
マスターシード、ロット＃ＭＳ１６Ｊｕｎ１５ＨＰＡＩＶの純度と同一性に関する試験を終わらせて、ＣＶＢから、ワクチンの製造に、このシードを使用する認可を得た（ＭＬ＃１７１８００）。加えて、認可のために、ワクチンの製造と試験に用いる方法をＵＳＤＡ  ＡＰＨＩＳ  ＣＶＢに提出した。ＣＶＢは、Ａｎｔｅｌｏｐｅ  Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｓ（登録番号４１９）に対して、Ａｖｉａｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｈ５  Ｓｕｂｔｙｐｅ，ＤＮＡ，Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃｏｄｅ  １０５７．Ｄ０という正式名称の新製品に、製品コード１０５７．Ｄ０を割り当てた。
【０２８６】
したがって、この調査では、十分なセロコンバージョン発生率を確保できる最小用量を割り出すために、Ｃｏｄｅ  １０５７．Ｄ０シリアルにおけるＤＮＡを３段階の用量レベルで調製し、ＳＰＦのニワトリのグループにおいて、ＨＡＩ応答を試験した。この調査では、２つの異なるワクチン投与スケジュールで調査を行い、孵化日または１４日齢時に、プライミング用量を投与した。
【０２８７】
調査設計
１８５羽のニワトリ（ロット＃ＡＶＢ１８Ｎｏｖ１５）をＶａｌｏのＳＰＦ卵から孵化させて、この調査に参加させた。参加させるために、孵化日に、健康なトリを臨床現場に移した。
【０２８８】
１日齢時（孵化日）に、１３７羽のこれらの健康なトリを試験に参加させた。０日齢のトリ（０ＤＡ）を、６羽のトリからなる１つのグループ（グループ１、ＭＰＣグループ）と、２１羽からなる１つのグループ［グループ２（２２羽のトリを割り当てたが、１羽は、ワクチン投与の直前に殺処分した）］と、それぞれ２２羽のトリからなる５つのグループ（グループ３〜７）に分けた。グループ１〜７は、合わせて１３個のケージで飼育した（１グループ当たり２つのケージ。ただし、グループ１のトリは、１つのケージで飼育した）。
【０２８９】
残りの４７羽のトリは、２週齢まで、１つの育雛室に収容しておき、２週齢時に、９羽のトリからなる１つのグループ（グループ９、ＰＣグループ）と、それぞれ１８羽のトリからなる２つのグループ（グループ１０及び１１、ＩＶＰ１またはＩＶＰ２、１４ＤＡ）に分けた。調査の開始前に、２羽のトリを殺処分したので、合わせて４５羽のトリを試験に参加させた。これらのトリは、５つのケージで飼育した（グループ１０及び１１では、１グループ当たり２ケージ、グループ９では、１ケージ）。
【０２９０】
投与経路
上頸部にＳＱ注射または胸部筋肉におけるＩＭのいずれかによって、トリに試験物質を投与した。
【０２９１】
試験物質の投与のタイミング
０ＤＡワクチン投与グループ１〜７には、孵化日（調査０日目）に、１回目の試験物質の投与を行った。同じトリに、調査１４日目に、それぞれの試験物質で追加免疫を行った（表５２参照）。
【０２９２】
１４ＤＡワクチン投与グループ（グループ９〜１１）には、調査１４日目に試験物質を投与し、試験２８日目に、同様の処置を行った（表５３参照）。
【０２９３】
表５２：０日齢の（０ＤＡ）トリの処置の明細
2018510874.tif 000054
１ＭＰＣ−モックプラセボコントロール、ＩＶＰ−動物用治験製品
０ＤＡ−孵化日に、１回目のワクチン投与を行ったトリ
【０２９４】
表５３：２週齢（１４ＤＡ）のトリの処置の明細
2018510874.tif 000055
１ＰＣ−ポジティブコントロール、ＩＶＰ−動物用治験製品
【０２９５】
１４ＤＡ−孵化から１４日後に１回目のワクチン投与を行った第２のトリ群
【０２９６】
結果と結論
０ＤＡワクチン投与グループ１〜７に、孵化日（調査０日目）に、１回目の試験物質の投与を行った。同じトリに、調査１４日目に、それぞれの試験物質で追加免疫を行った（表５２参照）。
【０２９７】
１４ＤＡワクチン投与グループ（グループ９〜１１）には、調査１４日目に試験物質を投与し、調査２８日目に、同様の処置を行った（表５３参照）。
【０２９８】
表５２：０日齢の（０ＤＡ）トリの処置の明細
2018510874.tif 000056
１ＭＰＣ−モックプラセボコントロール、ＩＶＰ−動物用治験製品
０ＤＡ−孵化日に１回目のワクチン投与を行ったトリ
【０２９９】
表５３：２週齢（１４ＤＡ）のトリの処置の明細
2018510874.tif 000057
１ＰＣ−ポジティブコントロール、ＩＶＰ−動物用治験製品
１４ＤＡ−孵化から１４日後に１回目のワクチン投与を行った第２のトリ群
【０３００】
調査２７日目（一次ワクチン投与から１３日後）に、ＳＱ経路によって３０μｇの用量を投与した１４ＤＡトリ（グループ１０、ＩＶＰ−１  ３０μｇ、ＳＱ）から血清を採取したところ、セロコンバージョン率は１１％（ＨＡＩ≧２）で、ＧＭＴは１．１であった（表５８）。３０μｇのｐＤＮＡ  Ｈ５ｍｏｄをＩＭ経路によって投与したトリ（グループ１１、ＩＶＰ−２  ３０μｇ、ＩＭ）からは、４５％のセロコンバージョン率（ＨＡＩ≧２）と、１．５のＧＭＴが観察された（表５８）。
【０３０１】
調査４２日目（ブーストワクチン投与から１４日後）に、３０μｇの用量をＳＱ経路によって投与した１４ＤＡトリ（グループ１０、ＩＶＰ−１  ３０μｇ、ＳＱ）から血清を採取したところ、セロコンバージョン率は８９％（ＨＡＩ≧２）で、ＧＭＴは３２．０であった（表５８）。３０μｇのｐＤＮＡ  Ｈ５ｍｏｄをＩＭ経路によって投与したトリ（グループ１１、ＩＶＰ−２  ３０μｇ、ＩＭ）からは、１００％のセロコンバージョン率（ＨＡＩ≧２）と、６０．１のＧＭＴが観察された（表５８）。
【０３０２】
表５８：１４ＤＡ−Ｔ１０、３０μｇ、ＳＱ（ＩＶＰ−１）及びＴ１１、３０ｕｇ、ＩＭ（ＩＶＰ−２）
2018510874.tif 000058
【０３０３】
考察
孵化日（０ＤＡ）及び１４日齢（１４ＤＡ）のトリでワクチンを試験した。０ＤＡトリで、１０μｇ、３０μｇ、６０μｇという用量レベルのプラスミドＤＮＡをＩＭまたはＳＱのいずれかで試験した。１回のワクチン投与後、ＨＡＩアッセイによって測定したところ、０ＤＡグループでは、検出可能なレベルの抗体は見られなかった。２回目のワクチン投与後は、用量レベルにかかわらず、プラスミドを投与したすべてのグループにおいて、検出可能なレベルのセロコンバージョンを示したトリが見られた。低い方の２つの用量（１０μｇ及び３０μｇ）で投与した０ＤＡトリでは、ＳＱ投与した場合に、すべての採取時点において、セロコンバージョン率は低く、ＧＭＴも低かった（表５７及び５８）。しかしながら、同じ用量レベルをＩＭ投与した場合には、特にブーストワクチン投与から特に２１日後に、セロコンバージョン率がＳＱ投与よりも高くなった。１０μｇの用量では、５９％のトリがセロポジティブであったとともに、ＧＭＴは５．８であった（４〜３２の範囲、表５６）。３０μｇの用量では、７７％のトリがセロポジティブであったとともに、ＧＭＴは８．８であった（４〜６４の範囲、表５５）。ＨＡＩアッセイにおいて、すべての試験日に、開始時の希釈倍率を４ではなく、２にすれば、セロポジティブ率は高くなり得ることに留意されたい。それぞれ、６０μｇのｐＤＮＡＨ５ｍｏｄ（ＩＶＰ−５  ６０μｇ）をＳＱ投与したグループ６のトリから血清を採取したところ、セロコンバージョン率は３８％で、ＧＭＴは４．１であった（ブーストワクチン投与から３４日後）とともに、ＩＶＰ−６  ６０μｇをＩＭ投与したグループ７のトリから血清を採取したところ、セロコンバージョン率は１００％であったとともに、ＧＭＴは１４．１であった（ブーストワクチン投与から１４日後）（表５７）。
【０３０４】
調査２７日目（一次ワクチン投与から１３日後）に、グループ１０及び１１の１４ＤＡトリ（一次ワクチン投与時、１４ＤＡにおいて、用量３０μｇ）から血清を採取したところ、指標ウイルスＡ／ｇｙｒｆａｌｃｏｎ／ＷＡ／４１０８８−６／２０１４  Ｈ５Ｎ８に対する抗体レベルは、検出可能であったが低かったとともに、セロコンバージョン率は、ＳＱ経路では１１％、ＩＭ経路では４５％であった（表５８）。
【０３０５】
調査４２日目（ブーストワクチン投与から１４日後）に、３０μｇのｐＤＮＡＨ５ｍｏｄをＳＱ経路によって投与した１４ＤＡトリ（グループ１０）から血清を採取したところ、セロコンバージョン率は８９％で（ＨＡＩ≧２）、ＧＭＴは３２．０であった（表５８）。３０μｇのｐＤＮＡＨ５ｍｏｄをＩＭ経路によって投与したトリ（グループ１１）から得たサンプルでは、セロコンバージョン率は１００％で（ＨＡＩ≧２）、ＧＭＴは６０．１であった（表５８）。
【０３０６】
ＡＩＶ  ＤＮＡワクチンは、６０μｇ／０．２ｍＬの用量でＥＮＡＢＬ（登録商標）ＬＰ７と調合して、ＩＭ投与したときには、０ＤＡトリに２回投与後のセロコンバージョン率は１００％（２２／２２）で（２〜６４の範囲のＨＡＩ）、ＧＭＴは１４．１であった。このグループでは、２２羽のうち、１９羽のトリは、ＨＡＩ価≧８でセロコンバージョンし、１５／２２羽は、ＨＡＩ≧１６でセロコンバージョンした（表５７）。
【０３０７】
高齢の方（１４ＤＡ）のトリにおいては、３０μｇ／０．２ｍＬの用量のＣｏｄｅ  １０５７．Ｄ０（ＩＭまたはＳＱのいずれかで投与）によって、高いセロコンバージョン率が得られた（すなわち、１４ＤＡトリに２回投与後、ＩＭでは１００％（１１／１１、ＧＭＴ６０．１、表７）、ＳＱでは８９％（１６／１８、ＧＭＴ３２、表５８）のセロコンバージョン率）。ワクチンをＳＱ投与した１８羽のトリのうち１５羽（８３％）では、ＨＡＩ価は≧３２であり、範囲は３２〜２５６であった。ワクチンをＩＭ投与した１１羽のトリのうち１０羽（９１％）では、ＨＡＩ価は≧１６で、範囲は１６〜２５６であった。３０μｇの用量レベルでは、Ｃｏｄｅ  １０５７．Ｄ０は、１４日齢のトリにＩＭ投与したときに、≧９０％のトリのＨＡＩ価が≧１６という、ＣＶＢの定めた要件を満たす。３０μｇをＳＱ投与したときには、８３％のＳＱトリのＨＡＩ価が≧３２であった。
【０３０８】
この調査の血清データによって、Ｏｕｔｌｉｎｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎに従って調製したとともに、下記のように投与したときのＣｏｄｅ  １０５７．Ｄ０の有効性の合理的な見込みが裏付けられている。
【０３０９】
１回の投与につき６０μｇのプラスミドＤＮＡを０日齢のヒナにＩＭ投与し、２週間後に追加免疫を行った。
【０３１０】
１回の投与につき３０μｇのプラスミドＤＮＡを１４日齢のヒナにＩＭまたはＳＱ投与し、２週間後に追加免疫を行った。
【図１】
2018510874.tif 000059
【図２Ａ】
2018510874.tif 000060
【図２Ｂ】
2018510874.tif 000061
【配列表】
2018510874000001.app
【国際調査報告】
2018510874.tif 000062