(57)【要約】  本発明は、ゴナドトロピンの分野に関する。具体的には、組み換え卵胞刺激ホルモン及びクロロクレゾールを含む改善された組成物が提供される。この改善された組成物は、増大した高温安定性を有し、そして、特にヒト患者における不妊症の処置において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換えFSH及びクロロクレゾールを含む組成物であって、該組み換えFSHがヒトグリコシル化パターンを有する組成物。
【請求項２】
前記組み換えFSHが、クロロクレゾールを含まない組成物に含まれる哺乳類グリコシル化パターンを有する組み換えFSHに比べて増大した高温安定性を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記高温が、３７℃以上である請求項２記載の組成物。
【請求項４】
界面活性剤を更に含む請求項１〜３のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５】
前記界面活性剤が、Poloxamer 188である請求項４記載の組成物。
【請求項６】
浸透圧調整剤を更に含む請求項１〜５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
緩衝剤を更に含む請求項１〜６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
安定剤を更に含む請求項１〜７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
前記安定剤が、Ｌ−メチオニンである請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
賦形剤を更に含む請求項１〜９のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物中の前記組み換えFSHが、以下の特徴のうちの１つ以上を含むグリコシル化パターンを有する請求項１〜１０のいずれか一項記載の組成物：
（ｉ）バイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（bisGlcNAc）を保有しているグリカンの相対量が少なくとも２０％である；及び／又は
（ii）フコースを保有しているグリカンの相対量が少なくとも３０％である；及び／又は
（iii）２，６結合シアル酸の相対量が少なくとも３０％である；及び／又は
（iv）多様なグリコシル化パターンである。
【請求項１２】
前記グリコシル化パターンが、前記特徴（ｉ）、（ii）、及び（iii）のうちの少なくとも２つ、そして、好ましくは前記特徴（ｉ）、（ii）、及び（iii）の全てを含む請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
前記組み換えFSHが、
（ｉ）ヒト細胞株GT-5s若しくはそれに由来する細胞株若しくはそれと相同な細胞株；又は
（ii）ヒト細胞株PerC6
において生成させることによって入手可能である請求項１〜１２のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物中の前記組み換えFSHが、以下の特徴のうちの１つ以上を含む請求項１〜１３のいずれか一項記載の組成物：
（ａ）前記グリコシル化パターンが、少なくとも８５％の相対量の１つ以上のシアル酸残基を保有しているグリカンを含む；
（ｂ）前記グリコシル化パターンが、少なくとも１８％の相対量の少なくとも四アンテナ型のグリカンを含む；
（ｃ）Ｚ数が少なくとも２００である；
（ｄ）ヒト組み換えFSHである；及び／又は
（ｅ）ヒト細胞株若しくはヒト細胞によって生成される。
【請求項１５】
前記組成物中の前記組み換えFSHが、以下の特徴のうちの１つ以上を含むグリコシル化パターンを有する請求項１〜１４のいずれか一項記載の組成物：
（ｉ）バイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（bisGlcNAc）を保有しているグリカンの相対量が約２５％〜約５０％の範囲である；
（ii）少なくとも四アンテナ型のグリカンの相対量が少なくとも１６％である；
（iii）フコースを保有しているグリカンの相対量が少なくとも３５％である；
（iv）２，６結合シアル酸の相対量が少なくとも５３％である；
（ｖ）１つ以上のシアル酸残基を保有しているグリカンの相対量が少なくとも８８％である；
（vi）Ｚ数が少なくとも２２０である；
（vii）ガラクトースを保有しているグリカンの相対量が少なくとも９５％である；
（viii）場合によりシアル酸残基によって修飾されている末端ガラクトース単位を保有しているグリカン分枝の相対量が少なくとも６０％である；
（ix）硫酸基を保有しているグリカンの相対量が少なくとも３％である；
（ｘ）少なくとも４５種の異なるグリカン構造を含み、該異なるグリカン構造のそれぞれ１つが、前記組成物中の前記FSHのグリカン構造の合計量の少なくとも０．０５％の相対量を有する；
（xi）少なくとも３５種の異なるグリカン構造を含み、該異なるグリカン構造のそれぞれ１つが、前記組成物中の前記FSHのグリカン構造の合計量の少なくとも０．１％の相対量を有する；
（xii）少なくとも２０種の異なるグリカン構造を含み、該異なるグリカン構造のそれぞれ１つが、前記組成物中の前記FSHのグリカン構造の合計量の少なくとも０．５％の相対量を有する；及び／又は
（xiii）対応する組成物中のCHO細胞から得られたFSHよりも少なくとも４０％多い異なるグリカン構造を含み、前記異なるグリカン構造のそれぞれ１つが、それぞれの組成物中の前記FSHのグリカン構造の合計量の少なくとも０．０５％の相対量を有する。
【請求項１６】
前記組成物中の前記組み換えFSHが、以下の特徴を含むグリコシル化パターンを有する請求項１〜１５のいずれか一項記載の組成物：
（ｉ）バイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（bisGlcNAc）を保有しているグリカンの相対量が約２５％〜約５０％の範囲である；
（ii）少なくとも四アンテナ型のグリカンの相対量が少なくとも１６％である；
（iii）フコースを保有しているグリカンの相対量が少なくとも３５％である；
（iv）２，６結合シアル酸の相対量が約５３％〜約９９％の範囲である；及び
（ｖ）１つ以上のシアル酸残基を保有しているグリカンの相対量が少なくとも８８％である。
【請求項１７】
前記組成物中の前記組み換えFSHが、
（ａ）著しい量のcAMPが放出されない濃度で；及び／又は
（ｂ）cAMPシグナル伝達とは独立したシグナル伝達経路を誘導することによって、
顆粒膜細胞におけるプロゲステロンの放出を刺激することができる請求項１〜１６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物中の前記組み換えFSHが、cAMPシグナル伝達とは独立した生物学的プロセスによって生殖細胞の成熟を刺激又は共刺激することができる請求項１〜１７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物中の前記組み換えFSHが、顆粒膜細胞アッセイにおいて判定できる以下の特徴のうちの１つ以上を有する請求項１〜１８のいずれか一項記載の組成物：
（ａ）顆粒膜細胞によるcAMPの放出を誘導するために必要な最低濃度を下回る濃度で、該顆粒膜細胞におけるプロゲステロンの放出を刺激することができる；
（ｂ）cAMPの放出を誘導しないか若しくは１０pmol/mL未満のcAMP放出を誘導するFSH濃度で、１mL当たり約５×１０４〜約１×１０５個の顆粒膜細胞において少なくとも２００ng/mL プロゲステロンの放出を刺激することができる；
（ｃ）ヒト尿FSH若しくはCHO細胞において生成される組み換えFSH（Gonal F）によって必要とされる濃度よりも低い濃度で、１mL当たり約５×１０４〜約１×１０５個の顆粒膜細胞において少なくとも１００ng/mL プロゲステロンの放出を刺激することができる；及び／又は
（ｄ）ヒト尿FSH若しくはCHO細胞において生成される組み換えFSH（Gonal F）によって対応するプロゲステロン放出が生じない濃度で、１mL当たり約５×１０４〜約１×１０５個の顆粒膜細胞において少なくとも１００ng/mL プロゲステロンの放出を刺激することができる。
【請求項２０】
前記組成物中の前記組み換えFSHが、単一用量の投与後にヒト女性において卵胞の成長を誘導することができ、該単一用量が、好ましくはFSH ２５〜５００IUを含み、そして、好ましくは、非経口的に、特に皮下注射によって投与される、請求項１〜１９のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２１】
前記組み換えFSHが、FSH-GEXである、請求項１〜２０のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２２】
医薬組成物である、請求項１〜２１のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２３】
不妊症の処置において使用するための、請求項１〜２１のいずれか一項記載の組成物又は請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２４】
患者に投与される用量によって、該患者の循環血液中のFSH濃度が約０．２〜約１０IU/L、好ましくは約０．４〜約７IU/Lの範囲になる、請求項２３記載の組成物又は医薬組成物。
【請求項２５】
同様にcAMPとは独立に性ステロイドの分泌を誘導及び／又は刺激するための、請求項１〜２１のいずれか一項記載の組成物又は請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２６】
cAMPシグナル伝達とは独立した生物学的プロセスによって生殖細胞の成熟を刺激又は共刺激するための、請求項１〜２１のいずれか一項記載の組成物又は請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２７】
著しいcAMP放出を誘導しないFSH濃度で性ステロイドの分泌を誘導及び／又は刺激するための、請求項１〜２１のいずれか一項記載の組成物又は請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２８】
不妊症の処置において使用するための請求項２３〜２６のいずれか一項記載の組成物又は医薬組成物であって、該不妊症の処置が、補助生殖医療、排卵誘発、体外受精、例えば、卵細胞質内精子注入法による体外受精、配偶子卵管内移植、子宮内受精、女性における無排卵障害の処置、女性における卵を成熟させるための重篤なホルモン欠乏障害の処置、男性における精子生成欠損の処置、並びに／又は例えば、体外受精刺激プロトコル中及び／若しくは無排卵障害の処置における生殖細胞の成熟、例えば、卵胞形成及び精子形成、特に女性における卵胞の成熟の可能化若しくは改善を含む組成物又は医薬組成物。
【請求項２９】
前記組み換えFSH組成物又は前記医薬組成物が、以下の特徴のうちの１つ以上を有する請求項２３〜２８のいずれか一項記載の組成物又は医薬組成物：
（ｉ）単一用量のみを投与した後、卵胞の成長及び／若しくは卵子の成熟を誘導することができる；並びに／又は
（ii）ヒト、カニクイザル、ラット、及び／若しくはマウスのうちの１つ以上においてヒト尿から入手した及び／若しくはCHO細胞で発現したFSH調製品よりも短い循環半減期を有する；並びに／又は
（iii）ヒト、カニクイザル、ラット、及び／若しくはマウスのうちの１つ以上においてヒト尿から入手した及び／若しくはCHO細胞で発現したFSH調製品よりも低いバイオアベイラビリティを有する；並びに／又は
（iv）ヒト、カニクイザル、ラット、及び／若しくはマウスのうちの１つ以上においてヒト尿から入手した及び／若しくはCHO細胞で発現したFSH調製品と同様又はより高い治療効果を有する。
【請求項３０】
卵胞の成長及び／若しくは卵子の成熟を誘導するための医薬組成物を調製するため並びに／又は請求項２３〜２９のいずれか一項記載の通り使用するための、請求項１〜２１のいずれか一項記載の組成物又は請求項２２記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景技術
本発明は、ゴナドトロピンの分野に関する。具体的には、組み換えヒト卵胞刺激ホルモン及びクロロクレゾールを含む改善された組成物が提供される。この改善された組成物は、増大した高温安定性を有し、そして、特にヒト患者における不妊症の処置において有用である。
【０００２】
ゴナドトロピンは、男性及び女性における生殖腺の機能を制御し、そして、それによって、ヒトの不妊症において重要な役割を果たすタンパク質ホルモンの群である。ゴナドトロピンは、ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）による刺激後、脊椎動物の下垂体のゴナドトロピン産生細胞によって分泌される。ゴナドトロピンは、卵胞刺激ホルモン（FSH）、黄体形成ホルモン（LH）、及び絨毛性ゴナドトロピン（CG）を含むヘテロ二量体糖タンパク質である。ゴナドトロピンは、同一のアルファサブユニットを共有しているが、様々なベータサブユニットを含み、これによって、受容体結合特異性が確保される。
【０００３】
FSHは、９２アミノ酸のアルファサブユニット及び１１１アミノ酸のベータサブユニットを含み、これによって、FSH受容体に対する特異的結合が付与される。天然タンパク質の両サブユニットは、グリコシル化によって修飾される。自然界では、アルファサブユニットはAsn52及びAsn78で、そして、ベータサブユニットはAsn7及びAsn24でグリコシル化される。両サブユニットは、前駆体タンパク質として細胞で生成され、次いで、加工及び分泌される。FSHは、身体の発達、成長、思春期の成熟、及び生殖プロセスを制御する。具体的には、FSHは生殖細胞の成熟を刺激するので、精子形成及び卵胞形成に関与している。
【０００４】
卵胞形成は、例えば、顆粒膜細胞の表面においてFSHがFSH受容体に結合することによって、FSHによって誘導される。FSH受容体は、FSHの結合時に共役Ｇタンパク質を活性化するＧタンパク質共役受容体である。次に、Ｇタンパク質がアデニリルシクラーゼを活性化し、その結果、二次メッセンジャー分子であるcAMPが生成される。細胞中のcAMP濃度の増大によって、幾つかの下流の標的、特に、cAMP依存性タンパク質キナーゼが活性化され、これは、次いで、プロゲステロン及びエストラジオールの合成につながる。プロゲステロン及びエストラジオールは、顆粒膜細胞によって分泌され、卵胞形成を誘導する。FSHによって顆粒膜細胞が刺激されると、該顆粒膜細胞はインヒビン−Ｂも放出し、これは、ネガティブフィードバックループを形成して、下垂体におけるFSHの生成及び分泌を阻害する。インヒビン−Ｂは、FSHによる卵巣刺激についての優れた代用マーカーであることが示されている。
【０００５】
FSHは、単独で又は他の剤、特にLHと組み合わせて、不妊症の処置において広く使用されている。当技術分野では、一般的に、閉経後のヒト尿から精製されたFSH（尿FSH）又はチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞によって組み換えで生成されたFSHがヒトの処置に用いられている。しかし、様々なアイソフォームが存在することから、FSH調製品に付随する顕著な不均一性が存在する。個々のFSHアイソフォームは、同一のアミノ酸配列を呈するが、そのグリコシル化の程度及び性質が異なる。特定のアイソフォームは、炭水化物分岐構造の不均一性及び異なる量のシアル酸（負に帯電している末端単糖単位）組み込みによって特徴付けられ、これらはいずれもアイソフォームの特異的生物活性に影響を与える。したがって、FSHのグリコシル化パターンは、その生物活性に対して著しい影響を有する。
【０００６】
しかし、異なるドナー及び異なる調製品に由来する尿FSHは、その炭水化物構造が著しい変動し得るので、その結果、バッチ間のばらつきが大きくなる。また、尿生成物中のウイルスの存在に関する安全性の問題も存在する。更に、CHO細胞から得られたFSHは、ヒトグリコシル化パターンと同一ではないこれらハムスター細胞に特異的なグリコシル化パターンを呈する。これら違いの結果、得られたFSH、ひいては、患者に投与される医薬調製品の生物活性及び有害効果がばらつく。したがって、当技術分野では、組み換えFSHは、好ましくは、好適な哺乳類又はヒトの細胞株を用いて生成される。このような組み換えFSHは、最適化された均質なグリコシル化パターンを含むので、患者に投与されたときに高い生物活性を示す。
【０００７】
簡便かつ安全な投与を促進するために、安定な無菌FSH製剤が必要とされている。当技術分野では、該製剤への微生物の混入を避けるために保存剤が使用されている。しかし、このような保存剤は、タンパク質の安定性にとって有害である可能性があることが知られているので、FSH調製品に対して有害効果を有することがある。
【０００８】
当技術分野では、FSHを用いて不妊症を処置する様々な方法が存在する。幾つかのプロトコルは、最高１４日間及びそれ以上、患者にFSH用量を毎日投与することを必要とする。理想的には１回超使用することができる安定なFSH溶液が、投与のために毎日FSH調製品を調製する必要がなくなるので、望ましい。
【０００９】
その結果、FSH調製品であって、FSHが最適化された均質なグリコシル化パターンを含み、該調製品が、好ましくは、増大した安定性を有するFSH調製品を利用可能にし、そして、ひいては提供するという満たされていない必要性が存在する。
【００１０】
本発明は、１回超用いることもできる安定なFSH調製品を提供することによってこの必要性を満たす。
【００１１】
驚くべきことに、本発明者らは、保存剤であるクロロクレゾールが、哺乳類グリコシル化パターンを有するFSHペプチドの高温における安定性を増大させることを見出した。クロロクレゾールが属する保存剤の群がタンパク質の安定性に対して有害である傾向があることを考慮すると、この知見は予想外であり、そして、当技術分野の現状に反している。
【００１２】
本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「発現カセット」に対する言及は、本明細書に開示される発現カセットのうちの１つ以上を含み、そして、「方法」に対する言及は、変更され得るか又は本明細書に記載される方法に置換し得る当業者に公知の等価な工程及び方法に対する言及を含む。
【００１３】
本開示に引用される全ての刊行物及び特許は、その全体が参照により組み入れられる。参照により組み入れられる材料が本明細書と矛盾するか又は不整合である限り、本明細書は任意のこのような材料に優先する。
【００１４】
特に指定しない限り、一連の要素の前に記載される用語「少なくとも」は、該一連の要素の全てを指すと理解すべきである。当業者は、単なるルーチンな実験を用いて、本明細書に記載する本発明の特定の実施態様に対する多くの等価物を認識するか又は解明することができる。このような等価物は、本発明に包含されることを意図する。
【００１５】
以下の本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、文脈上特に必要としない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）等の変形は、指定の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を含むことを意味するが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外することを意味するものではないと理解される。本明細書で使用するとき、用語「含む」は、用語「含有する」に又は時に、本明細書で使用するとき、用語「有する」に置換され得る。
【００１６】
本明細書で使用するとき、「からなる」は、特許請求の範囲の構成要素に指定されていない任意の要素、工程、又は成分を除外する。本明細書で使用するとき、「から本質的になる」とは、特許請求の範囲の基本的及び新規の特徴に著しい影響を与えない材料又は工程は除外しない。本明細書における各場合において、用語「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」のいずれも、他の２つの用語のいずれかで置換され得る。
【００１７】
用語「約」又は「およそ」は、本明細書で使用するとき、所与の値又は範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、そして、より好ましくは５％以内を意味する。また、該用語は名数も含む、例えば、約２０は、２０も含む。
【００１８】
本明細書で特に定義しない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者に一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈上特に必要としない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、そして、複数形の用語は単数を含むものとする。本発明の方法及び技術は、一般的に、当技術分野において周知の従来の方法に従って実施される。一般的に、本明細書に記載される生化学、酵素学、分子及び細胞生物学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸化学、並びにハイブリダイゼーションの技術に関連して使用される命名法は、当技術分野において周知であり、そして、一般的に用いられているものである。
【００１９】
特に指定しない限り、本発明の方法及び技術は、一般的に、当技術分野において周知である従来の方法に従って、そして、本明細書全体を通して引用及び議論される様々な概略的な及びより具体的な参照文献に記載の通り実施される。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)；Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to 2002)；Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I 1976 CRC Press；Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II 1976 CRC Pressを参照。本明細書に記載される分子及び細胞生物学、タンパク質生化学、酵素学、並びに医薬品及び製薬化学に関連して使用される命名法、並びに検査手技及び技術は、当技術分野において周知であり、そして、一般的に用いられているものである。
【００２０】
この明細書の本文全体を通して幾つかの文書が引用される。上記であろうと下記であろうと、本明細書に引用される各文書（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書等を含む）は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。具体的には、国際公開公報第２０１２／０１７０５８号に開示される教示は、本発明に準用される。本明細書におけるいずれも、本発明が先行発明によるこのような開示に先行する権利を与えるものではないと認めると解釈すべきではない。
【００２１】
概要
本発明者らは、哺乳類グリコシル化パターンを有する組み換えFSHと保存剤であるクロロクレゾールとを含む組成物が、該組み換えFSHの安定性に関して有利な特性を有することを見出した。したがって、本発明は、組み換えFSH及びクロロクレゾールを含む組成物であって、該組み換えFSHが哺乳類グリコシル化パターンを有する組成物に関する。より正確には、本発明者らは、保存剤であるクロロクレゾールが哺乳類グリコシル化パターンを有する組み換えFSHの高温における安定性を増大させることを見出し、該高温という用語は、６０℃超の温度に関する。更に、該組み換えFSHの哺乳類グリコシル化パターンは、ヒトグリコシル化パターンであり得ることが企図される。本発明の組成物は、界面活性剤（例えば、Poloxamer 188）、浸透圧調整剤、緩衝剤、安定剤（例えば、Ｌ−メチオニン）、及び賦形剤を更に含み得る。本発明の組み換えFSHは、ヒト細胞株GT-5s又はそれに由来する細胞株若しくはそれと相同な細胞株、あるいはPerC6、HT-1080、又はHEK293等の他のヒト細胞株において生成させることによって得ることができる。更に、本発明の組成物は、単一用量の投与後にヒト女性において卵胞の成長を誘導することができ、該単一用量は、好ましくは、FSH ２５〜５００iUを含み、そして、好ましくは、非経口的に、特に皮下注射によって投与される。好ましくは、本発明の組み換えFSHは、FSH-GEXである。本発明の組成物は、医薬組成物であってよい。本発明の組成物及び医薬組成物はいずれも、不妊症の処置において使用することができる。本発明の組成物又は医薬組成物は、卵胞の成長及び／若しくは卵子の成熟を誘導するための医薬組成物を調製するため、並びに本明細書に記載される更なる用途に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】２４ヶ月間にわたるクロロクレゾールを含まない製剤に対するインビトロHEKアッセイによって測定されたFSH-GEXの効力
【図２】クロロクレゾールの存在下又は対照としてクロロクレゾールの非存在下における、４℃及び３７℃において１２ヶ月間保存した後のFSHの用量応答曲線
【図３】クロロクレゾール（CC）、ベンズアルコニウムクロリド（BAK）を含むか、又は対照として保存剤を含まずに（対照（FB））製剤化されたFSH-GEXの動的光散乱分析（Ｚ−平均）。
【００２３】
詳細な説明
本発明者らは、哺乳類グリコシル化パターンを有する組み換えFSHと保存剤であるクロロクレゾールとを含む組成物が、該組み換えFSHの安定性に関して有利な特性を有することを見出した。したがって、本発明は、組み換えFSH及びクロロクレゾールを含む組成物であって、該組み換えFSHが哺乳類グリコシル化パターンを有する組成物に関する。
【００２４】
「FSH組成物」は、FSHを含むか又はからなる任意の組成物又は物質であり得る。該FSH組成物は、固体又は流体の形態であってよく、そして、FSHに加えて更なる成分を含み得る。特に、FSH調製品は、FSHと水及び／又はアルコール等の好適な溶媒とを含む溶液であってもよく、例えば、FSHを含有する溶液の凍結乾燥後に得られる粉末であってもよい。FSH調製品の好適な例は、細胞におけるFSHの発現後、特に、FSHの精製後に得られる組成物、又はFSHを含む医薬組成物である。FSH調製品は、FSHに加えて、例えば、本明細書に記載される溶媒、希釈剤、賦形剤、安定剤、保存剤、塩、補助剤、及び／又は界面活性剤を含有し得る。用語「FSH調製品」は、特に、「FSHを含む組成物」の意味で本明細書において使用される。これら用語は、好ましくは、本明細書では同義語として用いられる。
【００２５】
用語「FSH」は、卵胞刺激ホルモンであるゴナドトロピンを指し、FSHは、アルファサブユニット及びベータサブユニットと命名された２つのサブユニットで構成される糖タンパク質である。好ましくは、FSHは、ヒトFSH、特に、配列番号１のアミノ酸配列を有するアルファサブユニット及び配列番号２のアミノ酸配列を有するベータサブユニットで構成されるヒトFSHである。しかし、１個以上、例えば、１個、１若しくは２個、３個以下、５個以下、１０個以下、又は２０個以下のアミノ酸の置換、付加、及び／又は欠失が、一方又は両方のサブユニットに存在し得る。好ましくは、アルファサブユニットのアミノ酸配列は、配列番号１に係るアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の相同性又は同一性を全体的に共有している。更に、ベータサブユニットのアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号２に係るアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の相同性又は同一性を全体的に共有している。FSHのサブユニットは、好ましくは、２本の別々のポリペプチド鎖であるが、用語「FSH」は、本明細書で使用するとき、２つのサブユニットが、例えば、架橋剤又は連結ポリペプチド鎖によって互いに共有結合している実施態様、及び一方又は両方のサブユニットが、数本のポリペプチド鎖に更に分割されている実施態様も包含する。好ましくは、本発明に係るFSHは、FSH受容体、好ましくはヒトFSH受容体に結合及び／又は活性化することができる。用語「FSH」は、本明細書で使用するとき、特に、調製品中の全てのFSHタンパク質を指す。したがって、用語「FSH」は、特に、FSHの調製品又は組成物中の全てのFSHタンパク質全体を指す。
【００２６】
好ましくは、FSHタンパク質の両サブユニットは、ポリペプチド鎖に結合している１つ以上の炭水化物構造を含む。より好ましくは、炭水化物構造は、サブユニットのアスパラギン残基に結合している。特に好ましい実施態様では、アルファサブユニットは、Asn52及びAsn78に結合している２つの炭水化物構造を含み、及び／又はベータサブユニットは、Asn7及びAsn24に結合している２つの炭水化物構造を含む。炭水化物構造を保有しているアミノ酸残基は、それぞれ、配列番号１及び２に係るアルファ及びベータサブユニットのヒトアミノ酸配列に関して指定される。ヒトFSHの糖部分は、好ましくは、フコース、ガラクトース、マンノース、ガラクトサミン、グルコサミン、及び／又はシアル酸で構成される。
【００２７】
本発明に従って使用するとき、FSHは、好ましくは組み換えFSH、より好ましくは組み換えヒトFSHである。用語「組み換えFSH」とは、生存しているヒト又は動物の身体によって天然では生成されるものではなく、更に、該身体に由来するサンプル、例えば、尿、血液、若しくは他の体液、糞便、又はヒト若しくは動物の身体の組織等から得られるものではないFSHを指す。好ましくは、組み換えFSHは、バイオテクノロジーによって操作されている細胞、特に、FSH又はFSHのアルファ若しくはベータサブユニットをコードしている核酸で形質転換又はトランスフェクトされている細胞から得られる。好ましい実施態様によれば、組み換えFSHは、FSHをコードしている外因性核酸を含むヒト細胞から得られる。それぞれの外因性核酸は、例えばトランスフェクションを介して宿主細胞に導入することができる１つ以上の発現ベクターを使用することによって、導入することができる。タンパク質及びFSHを組み換えで生成するそれぞれの方法は、先行技術において周知であり、したがって、更に説明する必要はない。
【００２８】
用語「核酸」は、一本鎖及び二本鎖の核酸、並びにリボ核酸に加えて、デオキシリボ核酸を含む。該核酸は、天然及び合成のヌクレオチドを含み得、そして、例えば、メチル化、５’及び／又は３’キャッピングによって天然又は合成で修飾され得る。
【００２９】
用語「ベクター」は、その最も広い意味で本明細書において使用され、そして、核酸を、例えば原核及び／又は真核の宿主細胞に導入し、そして、必要に応じて、宿主細胞のゲノムに組み込むことができるようにする、該核酸のための任意の中間ビヒクルを含む。この種のベクターは、好ましくは、宿主細胞で複製及び／又は発現する。ベクターは、好ましくは、該ベクターを含む宿主細胞を選択するための１つ以上の選択マーカーを含む。好適な選択マーカーは、例えば、特定の抗生物質に対する抵抗性を有する宿主細胞を提供する抵抗性遺伝子である。更に好適な選択マーカーは、例えば、DHFR又はGS等の酵素の遺伝子である。FSHを含む組み換えタンパク質の発現を可能にするベクター、並びに宿主細胞において高収量で組み換えタンパク質を発現させることを可能にする好適な発現カセット及び発現エレメントは、先行技術において周知であり、そして、市販されてもいるので、本明細書に詳細に説明する必要はない。
【００３０】
本発明に係るFSHは、グリコシル化される、すなわち、ポリペプチド鎖に結合している１つ以上、好ましくは４つのオリゴ糖によって修飾される。グリカン又は炭水化物とも呼ばれるこれらオリゴ糖は、直鎖状又は分枝鎖状の糖鎖であってよく、そして、好ましくは、複合型Ｎ結合オリゴ糖鎖である。分枝数に応じて、オリゴ糖は、一、二、三、又は四アンテナ型（又は更には五アンテナ型）と呼ばれる。一アンテナ型オリゴ糖は、分枝がないが、二、三、又は四アンテナ型のオリゴ糖は、それぞれ、１、２、又は３つの分枝を有する。したがって、より高いアンテナリティ（antennarity）を有する糖タンパク質は、より多くのオリゴ糖終点を有し、そして、例えばシアル酸等のより多くの機能性末端糖単位を保有し得る。「少なくとも三アンテナ型」とは、本明細書で使用するとき、三アンテナ型、四アンテナ型、及び五アンテナ型のオリゴ糖を含む、少なくとも３のアンテナリティを有するオリゴ糖を指す。「少なくとも四アンテナ型」とは、本明細書で使用するとき、四アンテナ型、及び五アンテナ型のオリゴ糖を含む、少なくとも４のアンテナリティを有するオリゴ糖を指す。複合型Ｎ−グリカンに関して、バイセクティングGlcNAc残基は、好ましくは、分枝又はアンテナとはみなされないので、FSHのアンテナリティには付加されない。
【００３１】
本明細書で言及されるFSHのグリコシル化パターンは、特に、本発明に係るFSH調製品中の全てのFSHタンパク質のグリコシル化パターン全体を指す。特に、FSHタンパク質に含まれ、したがって、FSH調製品におけるFSHポリペプチド鎖に結合している任意のグリカン構造が考慮され、そして、グリコシル化パターンに反映される。
【００３２】
好ましくは、本発明のFSHの哺乳類グリコシル化パターンは、ヒトグリコシル化パターンである。
【００３３】
本発明の組成物は、更に、保存剤であるクロロクレゾールを含む。用語「保存剤」とは、製剤に添加されて、抗微生物剤、抗真菌剤、抗マイコプラズマ剤、抗ウイルス剤、抗プリオン剤、及び／又は抗菌剤として作用する化合物又は組成物を指す。クロロクレゾールは、好ましくは、製剤が本質的に夾雑物を含まないように維持する（注射に好適）のに有効な濃度が得られる量で使用される。保存剤であるクロロクレゾールは、好ましくは、０．００５％又は約０．００５％（静菌剤の質量／溶媒の質量）〜１．００％又は約１．００％、より好ましくは０．０２％又は約０．０２％（静菌剤の質量／溶媒の質量）〜０．１５％又は約０．１５％、最も好ましくは０．０５％又は約０．０５％〜０．１％又は約０．１％の濃度で存在する。
【００３４】
驚くべきことに、本願で請求される組成物で使用される保存剤であるクロロクレゾールは、タンパク質を変性させることによって、例えば、FSHのヘテロ二量体構造に影響を与えることによって、FSHの生物活性に悪影響を与えることはない。更に、保存剤であるクロロクレゾールは、驚くべきことに、クロロクレゾールを含まない組成物に含まれる哺乳類グリコシル化パターンを有する組み換えFSHに比べて、哺乳類グリコシル化パターンを有する組み換えFSHの高温における安定性を増大させる。組成物に添加されたとき、保存剤が該組成物に含まれるFSHの安定性を増大させることは知られていなかったので、この知見は特に驚くべきである。更に、この効果は、保存剤であるクロロクレゾールと哺乳類グリコシル化パターンを有するFSHとの組合せに関する。本発明者らは、FSHを含む組成物中で保存剤であるベンズアルコニウムクロリドを使用したとき、安定性の増大を観察しなかった（図２を参照）。
【００３５】
安定性の増大が観察され得る前記高温は、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、４０℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃、少なくとも８５℃、又は少なくとも９０℃である。好ましい実施態様では、高温は、３７℃以上である。
【００３６】
用語「安定性」は、（生物学的効力の維持を含む）本発明の組成物中のFSHの物理的、化学的、及び立体配座的な安定性を指す。タンパク質製剤の不安定性は、ヘテロ二量体の単量体への解離、脱グリコシル化、グリコシル化の変化、酸化（特にａ−サブユニットの）、又は本発明の組成物に含まれるFSHポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を低減する任意の他の構造的変化によって、より高次のポリマーを形成するためのタンパク質分子の化学的な分解又は凝集によって引き起こされ得る。安定性の増大に起因して、本発明のFSH組成物は、より長い貯蔵期間を有する。
【００３７】
本発明の組成物は、凝集を低減するために界面活性剤を更に含み得る。これら添加剤は、バイアル及び／又は送達装置（例えば、シリンジ、ポンプ、カテーテル等）の表面への吸着によって引き起こされる生物学的効力の喪失を最小化することにより、ポンプ又はプラスチック容器を用いて製剤を投与する場合、特に有用である。薬学的に許容し得る界面活性剤の存在は、タンパク質が凝集する性質を緩和し、それによって、生物学的効力の喪失を低減する。好適な界面活性剤は、エチレンオキシド及びプロピレンオキシドのブロックコポリマーから選択してよく、好ましくは、Pluronic F77、Pluronic F87、Pluronic F88、及びPluroniclD F68である。本発明の好ましい実施態様では、本発明の組成物に添加される界面活性剤は、Poloxamer 188である。
【００３８】
本発明の組成物は、浸透圧調整剤を更に含み得る。「浸透圧調整剤」は、生理学的に耐容性であり、そして、製剤と接触している細胞膜を貫通する水の正味流動を防ぐために該製剤に好適な浸透圧を付与する化合物である。グリセリン等の化合物が、公知の濃度でこのような目的のために一般的に使用される。他の好適な浸透圧調整剤は、アミノ酸若しくはタンパク質（例えば、メチオニン又はアルブミン）、塩（例えば、塩化ナトリウム）、及び糖（例えば、デキストロース、スクロース、及びラクトース）、並びに／又は当技術分野において周知の他の多くのものを含むが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明の組成物は、緩衝剤を更に含み得る。用語「緩衝剤」は、製剤中で薬学的又は獣医学的に使用するのに安全であることが知られており、そして、製剤のpHを該製剤に望ましいpH範囲で維持又は制御する効果を有する化合物の溶液を指す。中等度に酸性のpH〜中等度に塩基性のpHでpHを制御するための許容可能なバッファは、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、アルギニン、TRIS、及びヒスチジン等の化合物を含むが、これらに限定されない。「TRIS」は、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３，−プロパンジオール及びその任意の薬理学的に許容し得る塩を指す。本発明の組成物に含まれる好ましいバッファは、リン酸バッファ、最も好ましくは、リン酸ナトリウム、特に、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む。
【００４０】
組成物は、例えば、約pH４〜約pH１０等の広範囲のpHを網羅し得る。好ましくは、本発明のFSHの組成物は、５．５又は約５．５〜９．０又は約９．０、より好ましくは約pH７．０、pH８．０、及び８．２を含む６．０又は約６．０〜８．５又は約８．５、最も好ましくは、pH７．０又は約７．０のpHを有する。
【００４１】
本発明の組成物は、安定剤を更に含み得る。用語「安定剤」は、凝集、不活化、及び酸化を含むタンパク質の分解を最小化するために本発明の組成物に添加される化合物を指す。このような分解は、熱及び光等の外因によって、又はアルブミン等のヒト血液生成物を含まない製剤において、又は保存剤を含有する多用量製剤において加速され得る。
【００４２】
また、安定剤がＬ−メチオニンであることも本明細書で企図される。米国特許第５２７２１３５号には、組成物に遊離Ｌ−メチオニンを添加すると、少なくとも１つのメチオニン残基を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドにおけるメチオニン残基の酸化が阻害されることが記載されている。メチオニン残基の酸化は、容易に酸素が透過することができ、そして、調製品が保存されるプラスチック容器、例えば、ポリプロピレン又は低密度ポリエチレン（LDPE）に関連すると言われている。
【００４３】
組成物が賦形剤を含み得ることも本明細書で更に企図される。賦形剤の例は、本明細書に記載され、そして、更なる例は、当業者に公知である。
【００４４】
更に、本発明の組成物中のFSHは、好ましくは、改善されたグリコシル化パターンを有する。特に、多量のバイセクティングGlcNAc残基及び／又は多量の２，６−結合シアル酸、並びに多量の硫酸化グリカンが、FSHの高活性に関与し得る。更に、本発明に係るFSH組成物は、更に多くの多様かつ複雑なグリコシル化パターンも示し、すなわち、例えばCHO細胞から得られた従来のFSH調製品と比べてより様々なグリカン構造が調製品中に存在する。CHO由来のFSHは、標的細胞において単一の経路しか活性化することができないが、本発明に係る改善されたFSHは、その独特のグリコシル化パターンに起因して、恐らく複数の異なる経路を介してその生物活性を発揮し、その結果、生物学的応答が増大すると考えられる。これら経路の一部は、cAMPシグナル伝達を含むが、他の新規の経路は、cAMP非依存性である。
【００４５】
したがって、組成物中のFSHは、好ましくは、以下の特徴のうちの１つ以上を含むグリコシル化パターンを有する：
（ｉ）バイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（bisGlcNAc）を保有しているグリカンの相対量が少なくとも２０％である；及び／又は
（ii）フコースを保有しているグリカンの相対量が少なくとも３０％である；及び／又は
（iii）２，６結合シアル酸の相対量が少なくとも３０％である；及び／又は
（iv）多様なグリコシル化パターンである。
グリコシル化パターンが、該特徴（ｉ）、（ii）、及び（iii）のうちの少なくとも２つ、そして、好ましくは該特徴（ｉ）、（ii）、及び（iii）の全てを含むことも本明細書で企図される。
【００４６】
用語「シアル酸」は、特に、ノイラミン酸の任意のＮ−又はＯ−置換誘導体を指す。シアル酸は、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸及び５−Ｎ−グリコリルノイラミン酸の両方を指し得るが、好ましくは、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸のみを指す。シアル酸、特に、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸は、好ましくは、２，３−又は２，６−結合を介して炭水化物鎖に結合する。好ましくは、本明細書に記載されるFSH組成物には、２，３−及び２，６−結合シアル酸の両方が存在する。
【００４７】
本発明に係る「グリカンの相対量」とは、FSHを含む組成物中のFSH糖タンパク質に結合しているグリカンのうちの具体的な百分率又は百分率範囲を指す。特に、グリカンの相対量とは、FSHタンパク質中に含まれ、したがって、FSHを含む組成物中のFSHポリペプチド鎖に結合している全てのグリカンのうちの具体的な百分率又は百分率範囲を指す。グリカンの１００％とは、それぞれ、FSH調製品のFSH糖タンパク質に結合しているか又はFSHを含む組成物中の全てのグリカンを指す。例えば、バイセクティングGlcNAcを保有しているグリカンの相対量が６０％とは、FSHタンパク質に含まれ、したがって、FSH調製品中のFSHポリペプチド鎖に結合している全てのグリカンのうちの６０％がバイセクティングGlcNAc残基を含むが、FSHタンパク質に含まれ、したがって、FSH調製品中のFSHポリペプチド鎖に結合している全てのグリカンのうちの４０％がバイセクティングGlcNAc残基を含まないFSH調製品を指す。
【００４８】
本明細書に与えられる数、特に特定のグリコシル化特性の相対量は、好ましくは、概数として理解されるべきである。特に、前記数は、最高１０％高い及び／又は低くてよい、特に、最高９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％高い及び／又は低くてよい。
【００４９】
「２，６−結合シアル酸の相対量」とは、２，６−結合シアル酸であるシアル酸の合計量のうちの特定の百分率又は百分率範囲を指す。したがって、２，６−結合シアル酸の相対量が１００％とは、全てのシアル酸が２，６−結合シアル酸であることを意味する。例えば、２，６−結合シアル酸の相対量が６０％とは、FSHタンパク質に含まれ、したがって、FSH調製品中のFSHタンパク質のオリゴ糖鎖に結合している全てのシアル酸のうちの６０％が２，６−結合を介して結合しているが、FSHタンパク質に含まれ、したがって、FSH調製品中のFSHタンパク質のオリゴ糖鎖に結合している全てのシアル酸のうちの４０％が２，６−結合を介して結合しておらず、例えば、２，３−結合又は２，８−結合を介して結合しているFSH調製品を指す。
【００５０】
用語「多様なグリコシル化パターン」とは、特に、グリコシル化パターンが複数の異なるグリカン構造を含む調製品又は組成物中のFSHタンパク質のグリコシル化パターンを指す。異なるグリカン構造は、少なくとも１つの単糖単位及び／又は例えば硫酸残基、アセチル残基等の少なくとも１つの化学修飾の存在／非存在、量、及び／又は位置が異なるオリゴ糖構造である。特定の「異なるグリカン構造」は、好ましくは、その相対量が、グリコシル化パターン中のグリカン構造の合計量の少なくとも０．０２％、より好ましくは少なくとも０．０３％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．０７％、少なくとも０．１％、少なくとも０．１５％、少なくとも０．２％、少なくとも０．２５％、少なくとも０．３％、又は少なくとも０．５％である場合にのみこれに関して考慮される。具体的には、多様なグリコシル化パターンは、少なくとも５種の異なるグリカン構造を含むグリコシル化パターンである。好ましくは、多様なグリコシル化パターンは、少なくとも７種、より好ましくは少なくとも１０種、少なくとも１５種、少なくとも２０種、少なくとも２５種、少なくとも３０種、少なくとも３５種、少なくとも４０種、少なくとも４５種、少なくとも５０種、少なくとも５５種、そして、最も好ましくは少なくとも６０種の異なるグリカン構造を含む。多様なグリコシル化パターンは、特に、グリコシル化パターンが、それぞれの調製品又は組成物中のCHO細胞から得られるFSHよりも多くの異なるグリカン構造を含む調製品又は組成物中のFSHのグリコシル化パターンも指し、特に、グリコシル化パターンは、CHO細胞から得られるFSHよりも少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、そして、最も好ましくは少なくとも１００％多い異なるグリカン構造を含む。
【００５１】
FSHのシアリル化度は、通常、Ｚ数として表される。Ｚ数は、糖タンパク質のグリカン構造の相対負電荷を示す。Ｚ数は、以下の式によって計算される：
Ｚ＝Ａ１％×１＋Ａ２％×２＋Ａ３％×３＋Ａ４％×４
（式中、Ａ１％は、−１の電荷を有するグリカンの百分率であり、Ａ２％は、−２の電荷を有するグリカンの百分率であり、Ａ３％は、−３の電荷を有するグリカンの百分率であり、そして、Ａ４％は、−４の電荷を有するグリカンの百分率である）。これら百分率は、荷電及び無電荷のグリカンを含む、FSHに結合している全てのグリカンに関して計算される。グリカンの電荷は、グリカンに含まれる任意の荷電単糖単位又は置換基によって、特に、シアル酸残基及び／又は硫酸基及び／又はリン酸基によって提供され得る。FSHのグリカンの電荷は、一般的に、そのシアル酸残基によってのみ決定され、そして、FSHは、一般的に、４つのグリカン構造を有するので、Ｚ数は、FSHにおけるシアル酸の量又はFSHの酸性度（acidify）の指標である。しかし、FSHが著しい量の硫酸化グリカンも含むとき、Ｚ数は、シアル酸及び硫酸基の合計量の指標である。
【００５２】
特定の実施態様では、本発明は、調製品中のFSHが、以下の特徴のうちの１つ以上を含むグリコシル化パターンを有するFSH調製品を提供する：
（ｉ）バイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（bisGlcNAc）を保有しているグリカンの相対量が少なくとも３５％である；
（ii）フコースを保有しているグリカンの相対量が少なくとも６０％である；及び
（iii）２，６結合シアル酸の相対量が少なくとも３０％である。
【００５３】
好ましくは、前記FSHは組み換えFSHであり、したがって、好ましくはヒト宿主細胞である宿主細胞における組み換え生成によって得られる。それぞれのグリコシル化パターンを提供する好適なヒト宿主細胞を以下に記載する。
【００５４】
好ましくは、前記グリコシル化パターンは、前記特徴（ｉ）、（ii）、及び（iii）のうちの少なくとも２つ（特に、特徴（ｉ）及び（ii）、（ｉ）及び（iii）、又は（ii）及び（iii））、そして、より好ましくは、特徴（ｉ）、（ii）、及び（iii）の全てを含む。更に、前記グリコシル化パターンは、少なくとも１５％の相対量の少なくとも四アンテナ型グリカン、及び／又は少なくとも８０％の相対量の１つ以上のシアル酸残基を保有しているグリカン、及び／又は少なくとも９５％の相対量のガラクトースを保有しているグリカン、及び／又は少なくとも６０％の相対量の末端ガラクトース単位を保有しているグリカン分枝、及び／又は少なくとも１％、好ましくは少なくとも２．５％の相対量の硫酸基を保有しているグリカンを更に含み得る。末端ガラクトース単位は、場合により、シアル酸残基を更に保有し得る。組成物中の組み換えFSHは、好ましくは、少なくとも２００のＺ数を有する。
【００５５】
bisGlcNAcを保有しているグリカンの相対量は、好ましくは、少なくとも２５％、少なくとも２７％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも３８％、又は少なくとも４０％である。より好ましくは、約２５％〜約６０％の範囲内、特に、約３５％〜約６０％の範囲内、又は約３８％〜約５０％の範囲内、又は約４０％〜約４５％の範囲内である。一実施態様によれば、約４２％である。１つ以上のシアル酸残基を保有しているグリカンの相対量は、好ましくは、少なくとも８３％、少なくとも８５％、又は少なくとも８８％、そして、より好ましくは、約８５％〜約９８％の範囲、又は約８８％〜約９５％の範囲、最も好ましくは約９０％である。Ｚ数は、好ましくは、少なくとも２１０、より好ましくは、少なくとも２１５、少なくとも２２０、少なくとも２３０、又は少なくとも２４０である。例えば、FSH調製品に酸性及び／又は負に帯電しているFSHタンパク質を多く含めることによって、より高いＺ数を得ることができる。好ましくは、少なくとも四アンテナ型のグリカンの相対量は、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、又は少なくとも１９％、より好ましくは少なくとも２０％又は少なくとも２１％である。少なくとも三アンテナ型のグリカン、特に三及び四アンテナ型のグリカンの相対量は、好ましくは、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも４５％、少なくとも５０％、又は少なくとも５５％である。好ましくは、フコースを保有しているグリカンの相対量は、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも７５％又は少なくとも７８％である。約７０％〜約９０％の範囲内、特に、約７５％〜約８５％の範囲内であってよい。好ましくは、２，６−結合シアル酸の相対量は、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５３％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、特に、約４０％〜約９９％の範囲内、好ましくは、約４０％〜約８０％、約５０％〜約６０％、又は約５３％〜約７０％である。好ましくは、２，３−結合シアル酸の２，６−結合シアル酸に対する比は、約１：１０〜約７：３、より好ましくは、約１：５〜約３：２、又は約１：２〜約１：１、最も好ましくは、約２：３〜約１：１の範囲内である。好ましい実施態様では、２，６−結合シアル酸の相対量は、２，３−結合シアル酸の相対量を超える。ガラクトースを保有しているグリカンの相対量は、好ましくは、少なくとも９７％であり、そして、最も好ましくは、約９８％である。好ましくは、場合によりシアル酸残基によって修飾されているガラクトース単位を保有しているグリカン分枝の相対量は、少なくとも６５％、より好ましくは、少なくとも７０％、又は少なくとも７３％である。好ましくは、約６０％〜約９５％の範囲内、そして、より好ましくは、約７０％〜約８０％の範囲内である。好ましくは、硫酸基を保有しているグリカン（硫酸化グリカン）の相対量は、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも２．５％、少なくとも３％、又は少なくとも５％、より好ましくは、少なくとも７％、少なくとも１０％、又は少なくとも１２％である。一実施態様によれば、硫酸基を保有しているグリカンの相対量は、５０％、好ましくは、４０％、３５％、３０％、２５％、又は２０％を超えない。
【００５６】
好ましい実施態様では、調製品中のFSHは、該調製品中のFSHが少なくとも４５種、又は好ましくは少なくとも５０種の異なるグリカン構造を含み、該異なるグリカン構造のそれぞれ１つが該調製品中のFSHのグリカン構造の合計量の少なくとも０．０５％の相対量を有する多様なグリコシル化パターンを有する。一実施態様によれば、前記調製品中のFSHは、少なくとも３５種、又は好ましくは少なくとも４０種の異なるグリカン構造を含み、該異なるグリカン構造のそれぞれ１つは、該調製品中のFSHのグリカン構造の合計量の少なくとも０．１％の相対量を有する；及び／又は該調製品中のFSHは、少なくとも２０種、又は好ましくは少なくとも２５種の異なるグリカン構造を含み、該異なるグリカン構造のそれぞれ１つは、該調製品中のFSHのグリカン構造の合計量の少なくとも０．５％の相対量を有する。更なる実施態様では、該調製品中のFSHは、対応する調製品中のCHO細胞から得られるFSHよりも少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％多い異なるグリカン構造を含み、該異なるグリカン構造のそれぞれ１つは、それぞれの調製品中のFSHのグリカン構造の合計量の少なくとも０．０５％、０．１％、又は０．５％の相対量を有する。
【００５７】
好ましい実施態様では、本発明に係る組み換えFSH調製品は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（NeuGc）を含まないか又は検出可能な量のNeuGcを含まない。更に、本発明に係る組み換えFSH調製品は、好ましくは、Galiliエピトープ（Galα１，３−Gal構造）も含まないか又は検出可能な量のGaliliエピトープも含まない。
【００５８】
本発明は、特に、ヒトグリコシル化パターンを有するFSHを提供する。これらグリコシル化特性により、副作用を誘導する外来免疫原性非ヒト構造は存在しない、すなわち、免疫原性非ヒトシアル酸（NeuGc）若しくはGaliliエピトープ（Gal-Gal構造）（いずれもげっ歯類生成系について知られている）等の特定の外来糖構造、又は例えば酵母系から公知である免疫原性高マンノース構造等の他の構造によって引き起こされることが知られている望ましくない副作用又は問題点が回避されることを意味する。
【００５９】
したがって、組成物中の組み換えFSHが、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことが企図される：
（ａ）グリコシル化パターンが、少なくとも８５％の相対量の１つ以上のシアル酸残基を保有しているグリカンを含む；
（ｂ）グリコシル化パターンが、少なくとも１８％の相対量の少なくとも四アンテナ型のグリカンを含む；
（ｃ）Ｚ数が少なくとも２００である；
（ｄ）ヒト組み換えFSHである；及び／又は
（ｅ）ヒト細胞株若しくはヒト細胞によって生成される。
【００６０】
本発明の更なる好ましい実施態様では、組成物中の組み換えFSHは、以下の特徴のうちの１つ以上を含むグリコシル化パターンを有する：
（ｉ）バイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（bisGlcNAc）を保有しているグリカンの相対量が約２５％〜約５０％の範囲である；
（ii）少なくとも四アンテナ型のグリカンの相対量が少なくとも１６％である；
（iii）フコースを保有しているグリカンの相対量が少なくとも３５％である；
（iv）２，６結合シアル酸の相対量が少なくとも５３％である；
（ｖ）１つ以上のシアル酸残基を保有しているグリカンの相対量が少なくとも８８％である；
（vi）Ｚ数が少なくとも２２０である；
（vii）ガラクトースを保有しているグリカンの相対量が少なくとも９５％である；
（viii）場合によりシアル酸残基によって修飾されている末端ガラクトース単位を保有しているグリカン分枝の相対量が少なくとも６０％である；
（ix）硫酸基を保有しているグリカンの相対量が少なくとも３％である；
（ｘ）少なくとも４５種の異なるグリカン構造を含み、該異なるグリカン構造のそれぞれ１つが、調製品中のFSHのグリカン構造の合計量の少なくとも０．０５％の相対量を有する；
（xi）少なくとも３５種の異なるグリカン構造を含み、該異なるグリカン構造のそれぞれ１つが、調製品中のFSHのグリカン構造の合計量の少なくとも０．１％の相対量を有する；
（xiii）少なくとも２０種の異なるグリカン構造を含み、該異なるグリカン構造のそれぞれ１つが、調製品中のFSHのグリカン構造の合計量の少なくとも０．５％の相対量を有する；及び／又は
（xiv）対応する調製品中のCHO細胞から得られたFSHよりも少なくとも４０％多い異なるグリカン構造を含み、該異なるグリカン構造のそれぞれ１つが、それぞれの調製品中のFSHのグリカン構造の合計量の少なくとも０．０５％の相対量を有する。
【００６１】
また、組成物中の組み換えFSHが、以下の特徴を含むグリコシル化パターンを有することも本明細書において企図される：
（ｉ）バイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（bisGlcNAc）を保有しているグリカンの相対量が約２５％〜約５０％の範囲である；
（ii）少なくとも四アンテナ型のグリカンの相対量が少なくとも１６％である；
（iii）フコースを保有しているグリカンの相対量が少なくとも３５％である；
（iv）２，６結合シアル酸の相対量が約５３％〜約９９％の範囲である；及び
（ｖ）１つ以上のシアル酸残基を保有しているグリカンの相対量が少なくとも８８％である。
【００６２】
特定の好ましい実施態様では、本発明に係る組み換えFSH組成物は、以下の表１に列挙されるグリコシル化パターンのうちの１つを有する：
【表１】
2018528224.tif 000002
【００６３】
表１に列挙される実施態様１〜１２では、好ましくは、バイセクティングGlcNAcの相対量は、少なくとも２０％ではなく、少なくとも２５％である；及び／又は２，６−結合シアル酸の相対量は、少なくとも５３％ではなく、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％である；及び／又は硫酸化グリカンの相対量は、少なくとも２．５％ではなく、好ましくは少なくとも３％、より好ましくは少なくとも１０％である。表１に列挙されるグリコシル化パターンは、好ましくは、ヒトグリコシル化パターンである、及び／又はNeuGc及びGaliliエピトープを含まない。
【００６４】
本発明に係るFSHは、好ましくは、ヒト細胞、好ましくはヒト細胞株における生成によって得ることができるヒトFSHである。ヒト細胞株は、好ましくは、ヒト血液細胞に由来し、特に、骨髄細胞株、好ましくは、骨髄性白血病細胞株である。細胞株は、好ましくは、不死化されている。好ましい実施態様では、本発明に係るFSHを生成するための細胞株は、Glycotope GmbH（Robert-Rossle-Str, 10, 13125 Berlin (DE)）によって、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)（Ιnhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig (DE)）においてブダペスト条約の要件に従ってアクセッション番号DS ACC3078として２０１０年７月２８日に寄託された細胞株GT-5sであるか、又はこれに由来する細胞株若しくは相同な細胞株である。GT-5sは、不死化ヒト骨髄性白血病細胞株であり、本明細書に記載される特定のグリコシル化パターンを提供することができる。本発明によれば、用語「GT-5s」及び「GT-5s細胞株」は、GT-5sに由来する細胞又は細胞株も含む。GT-5sに由来する細胞株は、例えば、場合によりその突然変異率を高めるためにGT-5s細胞を処理した後、GT-5s培養物から単一クローン若しくは細胞群を無作為に若しくは特異的に選択することによって、又はGT-5s細胞株を遺伝子操作することによって得ることができる。選択されたクローン又は細胞群は、更に上記の通り処理してよい、及び／又は更なる選択ラウンドを実施してよい。GT-5sに相同な細胞株は、特に、不死化ヒト骨髄細胞株である。好ましくは、GT-5sに由来するか又は相同な細胞株は、GT-5sから得られるものと同様のグリコシル化パターンを有するFSHを提供することができる。好ましくは、GT-5sに由来するか又は相同な細胞株によって生成されるFSHは、本明細書に記載されるグリコシル化特徴のうちの１つ以上を有し、特に、少なくとも２０％の相対量のバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（bisGlcNAc）を保有しているグリカン；及び／又は少なくとも３０％の相対量のフコースを保有しているグリカン；及び／又は少なくとも３０％の相対量の２，６−結合シアル酸；及び／又は多様なグリコシル化パターンを有する。GT-5sに由来するか又は相同な細胞株は、本明細書において好ましいと記載されているのに類似するグリコシル化パターン、特に、表１から選択されるグリコシル化パターンを有するFSHを発現することができる。GT-5sに由来するか又は相同な細胞株によって生成されるFSHの類似のグリコシル化パターンは、好ましくは、特にbisGlcNAcの相対量、シアリル化グリカンの相対量、硫酸化グリカンの相対量、２，６結合シアル酸の相対量、フコースの相対量、四アンテナ型のグリカンの相対量、ガラクトースを保有しているグリカン分枝の相対量、及びＺ数からなる群から選択されるグリコシル化特性のうちの１つ以上、好ましくは全てにおいて、GT-5sから得られるFSHのグリコシル化パターンとは２０％以下、より好ましくは１５％以下、１０％以下、又は５％以下異なる。更に、本発明に係るFSHは、好ましくは、本明細書に開示される１つ以上の特定のグリコシル化特徴、好ましくは、表１から選択されるグリコシル化パターンを有するヒトFSHである。細胞株GT-5sに加えてそれに由来する細胞株若しくはそれと相同な細胞株は、特にFSHタンパク質に関して、非常に安定かつ均質なタンパク質生成を提供するので、特���有利である。これらは、非常に良好なバッチ間の一貫性を有し、すなわち、異なる生成ランから得られたとき、又は異なるスケール及び／若しくは異なる培養手順で生成されたとき、生成されたタンパク質及びそのグリコシル化パターンが類似している。特に、本明細書に記載される多様なグリコシル化パターンは、FSHを発現させるためにこれら細胞株を使用する異なる生成ランで高度に再現可能である。
【００６５】
用語「細胞」及び「細胞株」は、互換的に使用され、好ましくは、１つ以上の哺乳類細胞、特にヒト細胞を指す。この用語は、細胞又は細胞集団の後代を含む。当業者は、「細胞」が単一細胞の後代を含むことを理解し、そして、後代は、天然、偶発的、又は意図的な突然変異及び／又は変化に起因して元の親細胞と必ずしも完全に同一（形態又は全DNA補体）である訳ではない。「細胞」は、好ましくは、生存しているヒト又は動物の身体に組み込まれていない単離細胞及び／又は培養細胞を指す。
【００６６】
したがって、本発明は、ヒト宿主細胞又はヒト細胞株における生成によって得ることができる組み換えFSH組成物を提供する。好ましくは、組み換えFSHは、ヒト骨髄細胞株、好ましくは、不死化ヒト骨髄性白血病細胞株、特に、細胞株GT-5s又はそれに由来する細胞株若しくはGT-5sと相同な細胞株から得ることができる。前記細胞株において生成されるFSHは、上記グリコシル化パターンを呈し、そして、特に、本明細書に記載する有利な処置効果及び薬理学的効果を呈することが見出された。したがって、本発明は、また、好適な細胞株、特に上記細胞株、好ましくは、細胞株GT-5s、GT-5sに由来する細胞株、又はGT-5sと相同な細胞株において組み換えでFSHを発現させることによって組み換えFSH調製品を生成する方法に関する。組み換えFSHは、更に、PerC6、HT-1080、若しくはHEK293等の他のヒト細胞株、又はPerC6、HT-1080、若しくはHEK293に由来する細胞株、又はPerC6、HT-1080、若しくはHEK293と相同な細胞株において発現し得る。それぞれ生成される組み換えFSHは、単離することができ、そして、場合により精製することができる。
【００６７】
したがって、組み換えFSH組成物は、好ましくは、以下の工程を含むプロセスによって得ることができる：
（ｉ）FSHを発現するのに好適な条件下でFSHのアルファ及びベータサブユニットをコードしている核酸を含む、好ましくは細胞株GT-5s若しくは相同な細胞株に由来する、又はPerC6、HT-1080、若しくはHEK293等の細胞株又は相同細胞株に由来するヒト細胞株を培養する工程と；
（ii）FSHを単離する工程。
【００６８】
発現のために使用されるヒト宿主細胞は、好ましくは、骨髄細胞、特に不死化ヒト骨髄性白血病細胞であり、そして、好ましくは、細胞株GT-5sであるか若しくはそれに由来し、あるいはそれと相同な細胞株、又はPerC6、HT-1080、若しくはHEK293等の細胞株、又はPerC6、HT-1080、若しくはHEK293等の細胞株に由来する細胞株、又はそれと相同な細胞株である。ヒト宿主細胞は、FSHを発現するように培養する。好適な培養条件は、当業者に公知である。
【００６９】
FSHの単離は、好ましくは、以下の更なる工程を含む：
（ａ）FSHがヒト細胞によって分泌される場合、培養上清を得るか、又はFSHが分泌されない場合、ヒト細胞を溶解させる工程と；
（ｂ）逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー工程を使用して、該培養上清又は細胞溶解物からFSHを単離する工程と；
（ｃ）場合により、好ましくは塩基性のFSHアイソフォームを除去する洗浄工程、例えば、約pH５．０又は約pH４．５又は約pH４．０の洗浄工程を含むアニオン交換クロマトグラフィーを使用することによって、塩基性FSHアイソフォームを除去することによりFSHの酸性画分を得る工程。
【００７０】
組み換えFSHに好適な精製プロセスは、例えば、米国特許出願第６１／２６３，９３１号、欧州特許出願第０９  ０１４  ５８５．５号、及び国際公開公報第２０１１／０６３９４３号に記載されている。
【００７１】
好ましくは、FSHアルファサブユニットをコードしている核酸及びFSHベータサブユニットをコードしている核酸は、ヒト宿主細胞における発現を可能にする好適な発現ベクターに含まれる発現カセットに含まれる。FSHアルファサブユニットをコードしている核酸及びFSHベータサブユニットをコードしている核酸は、同じベクターに含まれていてもよいが、好ましくは、別々のベクターに含まれる。更に、IRESエレメント等の適切なエレメントを使用して１つの発現カセットから発現させることもできる。好ましくは、FSHは、ヒト細胞によって分泌される。好ましい実施態様では、ヒト細胞の培養は、発酵槽内及び／又は無血清条件下で実施される。
【００７２】
ヒト宿主細胞又はヒト細胞株における生成によって得ることができる組み換えFSH組成物は、好ましくは、本発明に係る組み換えFSH調製品に関して本明細書に記載される特徴を呈し、特に、そのグリコシル化パターンは、上記特徴のうちの１つ以上、好ましくは、表１及び／又は請求項１２〜１７記載の少なくとも１つのグリコシル化パターンを含む。
【００７３】
好ましい実施態様では、本発明に係る組み換えFSHは、例えば、宿主細胞において１つ以上の核酸を発現させるためのヒトFSHサブユニット及びエレメントをコードしている該１つ以上の核酸を含む細胞株GT-5s、PerC6、HT-10-80、又はHEK293等のヒト細胞株における生成によって好ましくは得ることができる、組み換えヒトFSH（rhFSH）である。好ましくは、rhFSHのアルファサブユニットは、配列番号１に係るアミノ酸配列又は配列番号１とその全長にわたって少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の相同性若しくは好ましくは同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましい実施態様では、rhFSHのアルファサブユニットは、５２位及び７８位にアスパラギン残基を含み、そして、アミノ酸Asn52及びAsn78でグリコシル化されている。rhFSHのベータサブユニットは、好ましくは、配列番号２に係るアミノ酸配列又は配列番号２とその全長にわたって少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の相同性若しくは好ましくは同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましい実施態様では、rhFSHのベータサブユニットは、７位及び２４位にアスパラギン残基を含み、そして、アミノ酸Asn7及びAsn24でグリコシル化されている。
【００７４】
本発明の更に好ましい実施態様では、本発明に係る組み換えFSH組成物は、
（ａ）著しい量のcAMPが放出されない濃度で；及び／又は
（ｂ）cAMPシグナル伝達とは独立したシグナル伝達経路を誘導することによって、
顆粒膜細胞におけるプロゲステロンの放出を刺激することができる。
【００７５】
本発明によれば、用語「著しい量のcAMPが放出されない」又は類似の表現は、それぞれ、特に、細胞又は組織によるcAMPの放出が、cAMPを最大限放出させる濃度のFSHで刺激した後の細胞又は組織によって得られるcAMP放出の量の２５％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満、１０％未満、７．５％未満、５％未満、又は２．５％未満であることを指す。これら細胞又は組織は、顆粒膜細胞又はセルトリ細胞等、FSHによる刺激を受けやすいか又は該刺激に対して応答性である。FSHとは独立したcAMP放出、すなわち、FSHの非存在下でも生じるcAMP放出は、これに関して考慮すべきではない。
【００７６】
好ましくは、「著しい量のcAMPの放出」又は「著しいcAMPの放出」は、FSHの非存在下におけるcAMP放出を上回るcAMPの任意の放出、特に、測定の不正確さを上回るcAMPの任意の検出可能な放出である。cAMP放出を測定するための標準的な手順は、実施例に記載され、そして、cAMPの著しい放出又は著しくない放出を判定するために使用することができる。「cAMPの放出」とは、cAMPの核内放出及び／又はcAMPの細胞外放出若しくは分泌を指し、好ましくは、cAMPの分泌のみを指す。cAMPは、細胞シグナル伝達において二次メッセンジャー分子として作用する環状アデノシン一リン酸を指す。cAMPは、アデニリルシクラーゼによってATPから細胞において合成される。「cAMPシグナル伝達とは独立した」生物学的プロセス又はシグナル伝達経路は、好ましくは、アデニリルシクラーゼの活性化を含まない。
【００７７】
更なる実施態様によれば、本発明に係る組み換えFSH調製品は、cAMPシグナル伝達とは独立した生物学的プロセスによって生殖細胞の成熟を刺激又は共刺激することができる。驚くべきことに、上記グリコシル化パターンによって、本明細書に記載される薬理学的及び処置的な利点を呈する組み換えFSHのそれぞれの新規薬理学的プロファイルが得られることが実験で見出された。
【００７８】
一実施態様に係る組み換えFSH組成物は、顆粒膜細胞によるcAMPの放出を誘導するために必要な最低濃度を下回る濃度で、該顆粒膜細胞におけるプロゲステロンの放出を刺激することができる。下記プロゲステロン、エストラジオール、及び／又はcAMPの放出は、特に、以下の実施例２に記載される条件下における、１mL当たり約１×１０４〜約１×１０６個の顆粒膜細胞、好ましくは、１mL当たり約５×１０４〜約１×１０５個の顆粒膜細胞におけるインビトロ放出を指す。
【００７９】
好ましくは、本発明に係る組み換えFSH調製品は、cAMPの放出を誘導しないか又は２０pmol/mL未満、１５pmol/mL未満、１０pmol/mL未満、５pmol/mL未満のcAMP放出を誘導する濃度で、少なくとも１００ng/mL、少なくとも１５０ng/mL、少なくとも２００ng/mL、好ましくは、少なくとも２５０ng/mL、少なくとも３００ng/mL、又は少なくとも４００ng/mL プロゲステロンを放出させることができる。
【００８０】
更に、本発明に係る組み換えFSH組成物は、好ましくは、ヒト尿FSH又はCHO細胞において生成される組み換えFSH（Gonal F）に必要な濃度よりも低いFSH濃度で、少なくとも１００ng/mL、少なくとも２００ng/mL、好ましくは少なくとも３００ng/mL、又は少なくとも４００ng/mL プロゲステロンを放出させることができる。したがって、好ましくは、ヒト尿FSH又はCHO細胞において生成される組み換えFSH（Gonal F）が対応するそれぞれ等しく高いプロゲステロン放出を生じさせない濃度で、少なくとも１００ng/mL、少なくとも２００ng/mL、好ましくは少なくとも３００ng/mL、又は少なくとも４００ng/mL プロゲステロンを放出させることができる。実施例によって証明される通り、本発明に係る組み換えFSHは、ヒト尿FSH又はCHO細胞において生成される組み換えFSH（Gonal F）よりも強くプロゲステロンの生成を誘導、それぞれ、刺激する。
【００８１】
本発明に係る組み換えFSH組成物は、国際公開公報第２０１２／０１７０５８号に記載の通り顆粒膜細胞アッセイにおいて測定できる下記特徴のうちの１つ以上を有し得る。
【００８２】
更に、本発明に係る組み換えFSH組成物は、好ましくは、cAMPの放出を誘導しないか又は２０pmol/mL未満、１５pmol/mL未満、１０pmol/mL未満、５pmol/mL未満のcAMP放出を誘導するFSH濃度で、少なくとも５０nmol/L、少なくとも７５nmol/L、少なくとも１００nmol/L、好ましくは、少なくとも１２５nmol/L、又は少なくとも１５０nmol/L エストラジオールを放出させることができる。
【００８３】
更に、本発明に係る組み換えFSH組成物は、好ましくは、ヒト尿FSH又はCHO細胞において生成される組み換えFSH（Gonal F）に必要な濃度よりも低いFSH濃度で、少なくとも５０nmol/L、少なくとも７５nmol/L、少なくとも１００nmol/L、少なくとも１２５nmol/L、少なくとも１５０nmol/L、少なくとも２００nmol/L、少なくとも２５０nmol/L、少なくとも３００nmol/L、又は少なくとも３５０nmol/L エストラジオールを放出させることができる。したがって、好ましくは、ヒト尿FSH又はCHO細胞において生成される組み換えFSH（Gonal F）が対応するそれぞれ等しく高いエストラジオール放出を生じさせない濃度で、少なくとも５０nmol/L、少なくとも７５nmol/L、好ましくは少なくとも１００nmol/L、少なくとも１２５nmol/L、少なくとも少なくとも１５０nmol/L、少なくとも２００nmol/L、少なくとも２５０nmol/L、３００nmol/L、又は少なくとも３５０nmol/L エストラジオールを放出させることができる。実施例によって証明される通り、本発明に係る組み換えFSH調製品は、それぞれ、ヒト尿FSH又はCHO細胞において生成される組み換えFSH（Gonal F）よりも強くエストラジオールの生成を誘導、それぞれ、刺激する。
【００８４】
したがって、組成物中の組み換えFSHは、顆粒膜細胞アッセイにおいて判定できる以下の特徴のうちの１つ以上を有する：
（ａ）顆粒膜細胞によるcAMPの放出を誘導するために必要な最低濃度を下回る濃度で、該顆粒膜細胞におけるプロゲステロンの放出を刺激することができる；
（ｂ）cAMPの放出を誘導しないか若しくは１０pmol/mL未満のcAMP放出を誘導するFSH濃度で、１mL当たり約５×１０4〜約１×１０５個の顆粒膜細胞において少なくとも２００ng/mL プロゲステロンの放出を刺激することができる；
（ｃ）ヒト尿FSH若しくはCHO細胞において生成される組み換えFSH（Gonal F）によって必要とされる濃度よりも低い濃度で、１mL当たり約５×１０4〜約１×１０５個の顆粒膜細胞において少なくとも１００ng/mL プロゲステロンの放出を刺激することができる；及び／又は
（ｄ）ヒト尿FSH若しくはCHO細胞において生成される組み換えFSH（Gonal F）によって対応するプロゲステロン放出が生じない濃度で、１mL当たり約５×１０4〜約１×１０５個の顆粒膜細胞において少なくとも１００ng/mL プロゲステロンの放出を刺激することができる。
【００８５】
cAMP放出及び性ステロイドの発現における本明細書に記載されるそれぞれの特徴は、例えば、国際公開公報第２０１２／０１７０５８号に記載の通り、顆粒膜細胞アッセイを使用することによって分析及び測定することができる。
【００８６】
本明細書で論じる通り、本発明に係る組み換えFSH調製品では、既に著しい量のcAMPが放出されない濃度で、性ステロイド、例えば、プロゲステロンの放出、特に、顆粒膜細胞におけるプロゲステロンの放出を刺激又は共刺激することができ得、特に、本発明に係る組み換えFSHは、顆粒膜細胞によるcAMP放出の誘導に必要な最低濃度を下回る濃度で、顆粒膜細胞における性ステロイド、例えば、プロゲステロンの放出を刺激することができ得る。更に、特定の実施態様では、本発明に係る組み換えFSH調製品は、cAMPシグナル伝達とは独立したシグナル伝達経路を誘導することによって、プロゲステロン、特に顆粒膜細胞におけるプロゲステロンの放出を刺激することができる。好ましくは、不妊症の処置は、本発明に係る組み換えFSHによるcAMPシグナル伝達とは独立したシグナル伝達経路を誘導して、プロゲステロンの放出を刺激することを含む。しかし、組み換えFSHによってcAMPシグナル伝達を含む他のシグナル伝達経路が更に活性化される場合もある。他の実施態様では、不妊症の処置は、本発明に係る組み換えFSHによる著しい量のcAMPの誘導を含まない。
【００８７】
本発明に係る「不妊症の処置」という用語は、ヒト又は動物の被験体の生殖又は繁殖能に関連する機能不全又は疾患の処置を意味し、特に、不妊症の処置は、補助生殖医療、排卵誘発、体外受精、子宮内受精、並びに例えば卵胞形成及び精子形成等の生殖細胞の成熟の可能化又は改善を含む。
【００８８】
本発明の好ましい実施態様では、組成物中の組み換えFSHは、単一用量の投与後にヒト女性において卵胞の成長を誘導することができ、該単一用量は、好ましくはFSH ２５〜５００IUを含み、そして、好ましくは、非経口的に、特に皮下注射によって投与される。
【００８９】
本発明の更に好ましい実施態様では、組み換えFSHは、FSH-GEXである。
【００９０】
本発明に係る組み換えFSH組成物は、好ましくは、医薬組成物中に存在する。したがって、本発明の更なる実施態様では、本発明に係る組み換えFSH組成物を含む医薬組成物である。医薬組成物は、本明細書に定義される不妊症の処置において使用することができる。医薬組成物は、更なる薬学的活性剤、特に、他のゴナドトロピン、特にLH及び／又はCG、好ましくは組み換え及び／又はヒトのLH又はCG等の不妊症の処置において有用な更なる剤を含み得る。あるいは、組み換えFSHを含む医薬組成物は、このような更なる薬学的活性剤と組み合わせて使用するために設計され得る。
【００９１】
用語「医薬組成物」とは、特に、ヒト又は動物に投与するのに好適な組成物、すなわち、薬学的に許容し得る成分を含有する組成物を指す。好ましくは、医薬組成物は、バッファ、保存剤、及び浸透圧調整剤等の担体、希釈剤、又は医薬賦形剤と共に、活性化合物又はその塩若しくはプロドラッグを含む。FSHの国際単位（IU）は、first international standard for urinary FSH WHO 92/512 (WHO Tech Rep. Series No.872, 1988)を指し、そして、拡張卵巣増量法（Steelman, S.L. & Pohley, F.M, (1953) Endocrinology 53, 604- 616）に従って測定される。
【００９２】
更に、本発明は、不妊症の処置において使用するための本発明に係る組み換えFSH調製品又は本発明に係る医薬組成物、並びに本発明に係る組み換えFSH調製品又は本発明に係る医薬組成物を患者に投与することを含む不妊症の処置方法を提供する。
【００９３】
用語「患者」は、本発明によれば、ヒト、非ヒト霊長類、又は別の動物、特に、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、若しくはマウス及びラット等のげっ歯類等の哺乳類を意味する。特に好ましい実施態様では、患者はヒトである。ヒト患者の場合、FSHは、好ましくは、ヒトFSHである。患者は、男性であっても女性であってもよく、そして、好ましくは女性である。
【００９４】
また、本発明に係る組み換えFSH調製品が、単一用量しか投与していない後でさえも生物学的効果を誘発できることも企図される。特に、本発明に係る組み換えFSH調製品又は本発明に係る医薬組成物は、単一用量のFSH調製品又は医薬組成物のみを投与した後、患者、特にヒト患者における卵胞の成長及び／又は卵子の成熟を誘導することができる。好ましくは、単一用量のみを投与した後に得られる生物学的効果は、ヒト尿から入手した及び／又はCHO細胞で発現したFSH調製品と比べて、特に卵胞の成長及び／又は卵子の成熟においてより高く、より顕著であり、及び／又はより高い比の処置された患者で達成される。前記単一用量は、特に、FSH 少なくとも１０IU、好ましくはFSH 少なくとも１５IU、FSH 少なくとも２０IU、又はFSH 少なくとも２５IU、及び／又はFSH １０００IU以下、好ましくはFSH ７５０IU以下、FSH ５００IU以下、FSH ３００IU以下、FSH ２００IU以下、FSH １５０IU以下、FSH １００IU以下、又はFSH ５０IU以下を含む。好ましくは、前記単一用量は、FSH 約１０IU〜約５００IU、より好ましくはFSH 約２０IU〜約３００IU、例えば、FSH 約２５IU、FSH 約７５IU、又はFSH 約１００IUを含む。
【００９５】
患者の循環血液中のFSH濃度が１０IU/L未満になる用量で本発明に係る組み換えFSH調製品を患者に投与することが本明細書において企図される。特定の実施態様では、患者に投与される用量によって、患者の循環血液中のFSH濃度は、約８IU/L未満、又は約６IU/L未満、特に約５IU/L未満、約４IU/L未満、約３IU/L未満、又は約２IU/L未満になる。患者の循環血液中のFSHの濃度は、例えば、約０．２〜約１０IU/L、特に、約０．３〜約８IU/L、約０．４〜約７IU/L、又は約０．５〜約１IU/Lの範囲内である。特に、FSHは、cAMPの著しい放出を誘導しない用量で患者に投与される。しかし、本発明に係る組み換えFSH調製品は、患者の循環血液中のFSH濃度がより高くなる用量で投与してもよい。これは、FSH調製品を数日間投与する場合にも当てはまり得る。例えば、本発明のFSH調製品は、２〜２０日間、好ましくは４〜１８日間、そして、更により好ましくは６〜１５日間投与され得る。FSHを数日間投与する場合、単一用量は、約１５０IU以下、又は約１２５IU以下、好ましくは約１００IU以下、更により好ましくは約７５IU以下であってよい。また、このような単一用量が、約５０IU以下、又は更には２５IU以下であり得ることも企図される。本発明のFSHの投与によって、例えば、患者の循環血液中のFSH濃度が約１８IU/L未満、又は約１５IU/L未満、又は約１２IU/L未満、特に約１０IU/L未満、約８IU/L未満、又は約５IU/L未満になり得る。
【００９６】
更なる実施態様では、本明細書に記載される通り、本発明に係る組み換えFSH調製品は、cAMPシグナル伝達とは独立した生物学的プロセスによって生殖細胞の成熟を刺激又は共刺激することができる。
【００９７】
したがって、本発明は、また、同様にcAMPとは独立に性ステロイドの分泌を誘導及び／又は刺激するための本明細書に記載される組み換えFSH組成物又は医薬組成物に関する。更に、本発明は、また、cAMPシグナル伝達とは独立した生物学的プロセスによって生殖細胞の成熟を刺激又は共刺激するための上記組み換えFSH組成物又は医薬組成物に関する。更に、本発明は、また、著しいcAMP放出を誘導しないFSH濃度で性ステロイドの分泌を誘導及び／又は刺激するための本明細書に記載される組み換えFSH組成物又は医薬組成物に関する。更に、本発明は、また、一般的に使用される尿FSH又はCHO細胞から得られる組み換えFSHよりもはるかに低い濃度で性ステロイドの分泌を誘導するための本明細書に記載される組み換えFSH組成物又は医薬組成物に関する。特に不妊症を処置するためにそれぞれを使用することの薬理学的及び処置的な利点は、本明細書において詳細に論じられる。
【００９８】
性腺ステロイド又は性ホルモンとしても知られている「性ステロイド」は、特に、脊椎動物のアンドロゲン又はエストロゲンの受容体と相互作用するステロイドホルモンを指す。用語「性ステロイド」は、タンパク質同化ステロイド、アンドロステンジオン、デヒドロエピアンドロステロン、ジヒドロテストステロン、及びテストステロン等のアンドロゲン；エストラジオール、エストリオール、及びエストロン等のエストロゲン；並びにプロゲステロンを含む。好ましくは、性ステロイドは、天然の性ステロイド、より好ましくは、天然のヒト性ステロイドを指す。本発明に係る好ましい性ステロイドは、エストラジオール及びプロゲステロン、特に、プロゲステロンである。
【００９９】
特に、不妊症の処置は、cAMPシグナル伝達とは独立した生物学的プロセスによる生殖細胞の成熟の刺激又は共刺激を含み得る。しかし、不妊症の処置は、更に、cAMPシグナル伝達を含む１つ以上の他の生物学的プロセスによる生殖細胞の成熟の刺激を含み得、他の実施態様では、不妊症の処置は、このような他の生物学的プロセスによる生殖細胞の成熟の刺激を含まない。
【０１００】
生殖細胞の成熟は、好ましくは、卵胞の成長及び／又は精子形成を含む。更に、FSHが生殖細胞の成熟を刺激する生物学的プロセスは、好ましくは顆粒膜細胞による性ステロイド、特にプロゲステロンの分泌を含み得る。好ましくは、cAMPシグナル伝達とは独立した生物学的プロセスとは、メッセンジャー分子としてcAMPを含まないシグナル伝達経路によって誘導される、好ましくは顆粒膜細胞による性ステロイド、特にプロゲステロンの分泌を指す。
【０１０１】
好ましい実施態様では、不妊症の処置は、補助生殖医療、排卵誘発、体外受精、例えば、卵細胞質内精子注入法による体外受精、配偶子卵管内移植、子宮内受精、女性における無排卵障害の処置、女性における卵を成熟させるための重篤なホルモン欠乏障害の処置、男性における精子生成欠損の処置、並びに／又は例えば、体外受精刺激プロトコル中及び／若しくは無排卵障害の処置における生殖細胞の成熟、例えば、卵胞形成及び精子形成、特に女性における卵胞の成熟の可能化若しくは改善を含む。
【０１０２】
本発明の更なる好ましい実施態様では、組み換えFSH組成物又は医薬組成物は、以下の特徴のうちの１つ以上を有する：
（ｉ）単一用量のみを投与した後、卵胞の成長及び／若しくは卵子の成熟を誘導することができる；並びに／又は
（ii）ヒト、カニクイザル、ラット、及び／若しくはマウスのうちの１つ以上においてヒト尿から入手した及び／若しくはCHO細胞で発現したFSH調製品よりも短い循環半減期を有する；並びに／又は
（iii）ヒト、カニクイザル、ラット、及び／若しくはマウスのうちの１つ以上においてヒト尿から入手した及び／若しくはCHO細胞で発現したFSH調製品よりも低いバイオアベイラビリティを有する；並びに／又は
（iv）ヒト、カニクイザル、ラット、及び／若しくはマウスのうちの１つ以上においてヒト尿から入手した及び／若しくはCHO細胞で発現したFSH調製品と同様又はより高い治療効果を有する。
【０１０３】
更なる実施態様では、本発明に係る組み換えFSH調製品は、ヒト尿から入手した及び／又はCHO細胞で発現したFSH調製品よりも短い循環半減期を有する。特に、ヒト、カニクイザル、ラット、及び／又はマウスのうちの１つ以上において、より短い循環半減期を有する。好ましくは、循環半減期は、ヒト尿から入手した及び／又はCHO細胞で発現したFSH調製品よりも少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、又は少なくとも２０％低い。特定の実施態様では、本発明に係る組み換えFSH調製品は、特に、ヒト、カニクイザル、ラット、及び／又はマウスのうちの１つ以上において、ヒト尿から入手した及び／又はCHO細胞で発現したFSH調製品よりも低いバイオアベイラビリティを有する。好ましくは、バイオアベイラビリティは、ヒト尿から入手した及び／又はCHO細胞で発現したFSH調製品よりも少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、又は少なくとも２０％低い。これに関して、バイオアベイラビリティは、好ましくは、薬物動態試験において得られる曲線下面積（AUG）値を指し、血清FSH濃度は、所定の量のFSHの投与後の様々な時点で測定される。循環半減期及びバイオアベイラビリティは、好ましくは、皮下注射によってFSHを投与した後、特に単一用量投与後に測定され、該単一用量は、好ましくは、FSH 約１０〜約１０００IU、より好ましくは、FSH 約２５IU〜約５００IU、又はFSH 約５０IU〜約３００IU、特に、FSH 約１００IUを含む。特に、循環半減期及びバイオアベイラビリティは、国際公開公報第２０１２／０１７０５８号に開示されている通り測定される。
【０１０４】
好ましい実施態様では、本発明に係る組み換えFSH組成物又は医薬組成物は、特に、ヒト、カニクイザル、ラット、及び／又はマウスのうちの１つ以上において、ヒト尿から入手した及び／又はCHO細胞で発現したFSH組成物又は医薬組成物と同様であるか又は更にはより高い処置効果を有する。用語「処置効果」は、好ましくは、被験体に投与されたときにエストラジオール及び／又はインヒビン−Ｂの放出を刺激する能力を指す。処置効果は、好ましくは、皮下注射によってFSHを投与した後、特に単一用量投与後に１以上の被験体の血液又は血清中のエストラジオール及び／又はインヒビン−Ｂの濃度を測定することによって判定され、該単一用量は、好ましくは、FSH 約１０〜約１０００IU、好ましくは、FSH 約２５IU〜約５００IU、又はFSH 約５０IU〜約３００IU、特に、FSH 約１００IUを含む。特に、処置効果は、国際公開公報第２０１２／０１７０５８号に開示されている通り判定される。同様の処置効果は、特に、エストラジオール及び／又はインヒビン−Ｂの血清濃度が互いに２５％以下、好ましくは２０％以下、１５％以下、又は１０％以下異なるそれぞれのFSH調製品によるエストラジオール及び／又はインヒビン−Ｂの刺激を指す。
【０１０５】
本発明に係る医薬組成物は、単一単位用量又は複数単位用量の形態であってよい。好ましくは、医薬組成物は、本発明に係る組み換えFSHを含み、更に、水等の溶媒、緩衝物質、安定剤、保存剤、賦形剤、界面活性剤、及び塩からなる群から選択される１つ以上の成分を含む滅菌溶液である。単一単位用量は、好ましくはFSH 約１０IU〜約７５０IU、より好ましくはFSH 約２５IU〜約５００IU、FSH 約５０IU〜約４００IU、又はFSH 約１００IU〜約３００IUを含む。複数単位用量は、複数単位用量につき、特に少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、又は少なくとも５０の単一用量を提供するのに十分なFSHを含む。医薬組成物は、例えば、注射ペンの形態であってよい。
【０１０６】
好ましくは、本発明に係る組み換えFSH調製品は、患者に非経口投与するためのものである。特に、組み換えFSHは、例えば、静脈内、筋肉内、又は皮下に注射又は注入することによって投与すべきである。本発明の特定の実施態様では、組み換えFSHは、医薬組成物中に存在する。好適な投薬レジメンは、当業者によって決定され得、そして、当技術分野における一般知識から導くことができる。
【０１０７】
ヒト尿から入手されるFSH組成物は、特に、閉経後の女性の尿から得られる。CHO細胞で発現するFSH調製品は、例えば、CHO細胞株CHOdhfr-［ATCC No. CRL-9096］で発現する。ヒト尿から入手されるFSH組成物及びCHO細胞で発現するFSH調製品は、好ましくは、市販されており、そして、医薬調製品、特に、それぞれBravelle及びGonal-fとして承認されている。異なるFSH調製品の効果、特に、その循環半減期、バイオアベイラビリティ、及び処置効果を比較するとき、同じ投与経路を使用し、そして、類似又は同じ更なる条件を使用して、同じ投薬レジメンで類似の被験体群にFSH調製品を投与することによって、該FSH調製品を分析する。
【０１０８】
更に、本発明に係るFSH組成物又は医薬組成物は、卵胞の成長及び／若しくは卵子の成熟を誘導するための医薬組成物を調製するため並びに／又は請求項２４〜３０のいずれか一項記載の通り使用するために使用することができる。
【０１０９】
実施例
以下の実施例は、本発明を説明するが、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【０１１０】
実施例１：クロロクレゾールの存在下及び非存在下におけるFSHの活性測定
FSH-GEX（商標）は、安定的にトランスフェクトされたHEK293細胞において発現しているhFSHRに結合し、そして、cAMPの生成を誘発する。刺激アッセイのために、HEK293-FSH-R細胞を収集し、そして、５×１０４細胞/mL（５００μL/ウェル）の密度で２４ウェルプレートに播種した。１０％ FCS、２％ Ｌ−グルタミン、及び１μM アンドロステンジオンを含有するDMEM中、８％ ＣＯ２及び３７℃で一晩細胞を培養した。続いて、上清を除去し、接着細胞をDMEMで洗浄し、そして、１５００〜１．４６ng/mLの範囲の濃度のFSH-GEX（商標）を添加した。１０％ FCS、２％ Ｌ−グルタミン、及び１μM アンドロステンジオンを含有するDMEMでFSH-GEX（商標）の連続希釈を行った。全てのサンプルをデュープリケートで実験した。８％ ＣＯ２及び３７℃で３時間インキュベートした後、上清 ３００μLを回収し、そして、更に分析するまで−８０℃で保存した。残りの細胞を８％ ＣＯ２及び３７℃で更に２１時間インキュベートした。合計２４時間後、プレートを−８０℃で冷凍した。解凍し、そして、残りの上清中で上下にピペッティングすることによって細胞溶解物を調製した。デュープリケートサンプルから得られた溶解物をプールし、そして、遠心分離（１２００tpm（３１１xg）、５分間）によって清澄化した。
【０１１１】
cAMP含量を測定するために、市販されている競合EIA（環状AMP−Enzyme Immunoassay Kit, Enzo life sciences）によって上清を分析した。製造業者のプロトコルに従ってアッセイを実施した。更に希釈することなく非アセチル化されたサンプルを使用した。刺激アッセイから得られたデュープリケートウェルをEIAにおいてシングレットとして測定した。４５０nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（infinite F200, TECAN）を用いて測定し、そして、ノイズ／シグナル比を計算して、細胞の刺激のマーカーとしてcAMP放出を評価した。１よりも大きいノイズ／シグナル比は、細胞のcAMP放出を示す。ノイズ／シグナル比がより高いほど、より多くのcAMPが放出された。用量応答曲線に基づいて、EC50を決定し、そして、試験サンプル（この場合、クロロクレゾールを含有するサンプル）のEC50を参照物質（この場合、クロロクレゾールを含まないサンプル）で除することによって効力を得る。試験サンプルは、それぞれの試験時点で０．８超１．２未満の効力が観察されたとき、十分に活性であるとみなされる。
【０１１２】
４℃で２４ヶ月間にわたって活性を測定した結果は、全試験期間にわたってクロロクレゾールの存在下においてFSHが十分な生物活性を有することを示す（図１を参照）。更に、保存温度を３７℃に上昇させたとき、対照サンプルの活性は、クロロクレゾールを含有するサンプルと比較して低下し、これは、後者の安定化効果を示す（図２を参照）。
【０１１３】
実施例２：動的光散乱（DLS）、融点
Zetasizer Nano ZS ZEN3600（Malvern Instruments）を使用して動的光散乱によって融点を測定した。サンプル ２０μLを１２μLのキュベット（低容積石英キュベットZEN2112、カタログ番号105.251.006-QS、Hellma）に充填した。DTS v5.1 Control Softwareにおける測定パラメータは、「Mark-Houwinkパラメータ」、物質「タンパク質」(RI 1.45)、バッファ「５０mg/mL スクロース」（計算粘度１．１６８５−０．４７５４cP、温度に依存）、「マルチプルナローモード」、「最適位置の探索」、「自動減衰選択」、ランタイム「自動」、ラン数１、測定数１であった。温度は、２０℃から２℃ずつ９０℃まで上昇させた。測定前、キュベットを各温度工程で２分間平衡化した。散乱光の検出角は、１７３°（後方散乱）であった。測定されたＺ平均（直径（nm））を、温度上昇に従って評価した。
【０１１４】
結果を図３に与える。保存剤、すなわち、ベンズアルコニウムクロリドも含まない製剤とは対照的に、保存剤であるクロロクレゾールは、温度と独立してＺ平均を最低限しか増加させないことによって分かる通り、FSH分子を安定化させる。
【０１１５】
項目
１．  組み換えFSH及びクロロクレゾールを含む組成物であって、該組み換えFSHが哺乳類グリコシル化パターンを有する組成物。
２．  前記組み換えFSHが、クロロクレゾールを含まない組成物に含まれる哺乳類グリコシル化パターンを有する組み換えFSHに比べて増大した高温安定性を有する、項目１記載の組成物。
３．  前記高温が、３７℃以上である項目２記載の組成物。
４．  前記哺乳類グリコシル化パターンが、ヒトグリコシル化パターンである項目１〜３のいずれか一項記載の組成物。
５．  界面活性剤を更に含む項目１〜４のいずれか一項記載の組成物。
６．  前記界面活性剤が、Poloxamer 188である項目５記載の組成物。
７．  浸透圧調整剤を更に含む項目１〜６のいずれか一項記載の組成物。
８．  緩衝剤を更に含む項目１〜７のいずれか一項記載の組成物。
９．  安定剤を更に含む項目１〜８のいずれか一項記載の組成物。
１０．  前記安定剤が、Ｌ−メチオニンである項目９記載の組成物。
１１．  賦形剤を更に含む項目１〜１０のいずれか一項記載の組成物。
１２．  前記組成物中の前記組み換えFSHが、以下の特徴のうちの１つ以上を含むグリコシル化パターンを有する項目１〜１１のいずれか一項記載の組成物：
（ｉ）バイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（bisGlcNAc）を保有しているグリカンの相対量が少なくとも２０％である；及び／又は
（ii）フコースを保有しているグリカンの相対量が少なくとも３０％である；及び／又は
（iii）２，６結合シアル酸の相対量が少なくとも３０％である；及び／又は
（iv）多様なグリコシル化パターンである。
１３．  前記グリコシル化パターンが、前記特徴（ｉ）、（ii）、及び（iii）のうちの少なくとも２つ、そして、好ましくは前記特徴（ｉ）、（ii）、及び（iii）の全てを含む項目１２記載の組成物。
１４．  前記組み換えFSHが、
（ｉ）ヒト細胞株GT-5s若しくはそれに由来する細胞株若しくはそれと相同な細胞株；又は
（ii）ヒト細胞株PerC6
において生成させることによって入手可能である項目１〜１３のいずれか一項記載の組成物。
１５．  前記組成物中の前記組み換えFSHが、以下の特徴のうちの１つ以上を含む項目１〜１４のいずれか一項記載の組成物：
（ａ）前記グリコシル化パターンが、少なくとも８５％の相対量の１つ以上のシアル酸残基を保有しているグリカンを含む；
（ｂ）前記グリコシル化パターンが、少なくとも１８％の相対量の少なくとも四アンテナ型のグリカンを含む；
（ｃ）Ｚ数が少なくとも２００である；
（ｄ）ヒト組み換えFSHである；及び／又は
（ｅ）ヒト細胞株若しくはヒト細胞によって生成される。
１６．  前記組成物中の前記組み換えFSHが、以下の特徴のうちの１つ以上を含むグリコシル化パターンを有する項目１〜１５のいずれか一項記載の組成物：
（ｉ）バイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（bisGlcNAc）を保有しているグリカンの相対量が約２５％〜約５０％の範囲である；
（ii）少なくとも四アンテナ型のグリカンの相対量が少なくとも１６％である；
（iii）フコースを保有しているグリカンの相対量が少なくとも３５％である；
（iv）２，６結合シアル酸の相対量が少なくとも５３％である；
（ｖ）１つ以上のシアル酸残基を保有しているグリカンの相対量が少なくとも８８％である；
（vi）Ｚ数が少なくとも２２０である；
（vii）ガラクトースを保有しているグリカンの相対量が少なくとも９５％である；
（viii）場合によりシアル酸残基によって修飾されている末端ガラクトース単位を保有しているグリカン分枝の相対量が少なくとも６０％である；
（ix）硫酸基を保有しているグリカンの相対量が少なくとも３％である；
（ｘ）少なくとも４５種の異なるグリカン構造を含み、該異なるグリカン構造のそれぞれ１つが、前記組成物中の前記FSHのグリカン構造の合計量の少なくとも０．０５％の相対量を有する；
（xi）少なくとも３５種の異なるグリカン構造を含み、該異なるグリカン構造のそれぞれ１つが、前記組成物中の前記FSHのグリカン構造の合計量の少なくとも０．１％の相対量を有する；
（xii）少なくとも２０種の異なるグリカン構造を含み、該異なるグリカン構造のそれぞれ１つが、前記組成物中の前記FSHのグリカン構造の合計量の少なくとも０．５％の相対量を有する；及び／又は
（xiii）対応する組成物中のCHO細胞から得られたFSHよりも少なくとも４０％多い異なるグリカン構造を含み、前記異なるグリカン構造のそれぞれ１つが、それぞれの組成物中の前記FSHのグリカン構造の合計量の少なくとも０．０５％の相対量を有する。
１７．  前記組成物中の前記組み換えFSHが、以下の特徴を含むグリコシル化パターンを有する項目１〜１６のいずれか一項記載の組成物：
（ｉ）バイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（bisGlcNAc）を保有しているグリカンの相対量が約２５％〜約５０％の範囲である；
（ii）少なくとも四アンテナ型のグリカンの相対量が少なくとも１６％である；
（iii）フコースを保有しているグリカンの相対量が少なくとも３５％である；
（iv）２，６結合シアル酸の相対量が約５３％〜約９９％の範囲である；及び
（ｖ）１つ以上のシアル酸残基を保有しているグリカンの相対量が少なくとも８８％である。
１８．  前記組成物中の前記組み換えFSHが、
（ａ）著しい量のcAMPが放出されない濃度で；及び／又は
（ｂ）cAMPシグナル伝達とは独立したシグナル伝達経路を誘導することによって
顆粒膜細胞におけるプロゲステロンの放出を刺激することができる項目１〜１７のいずれか一項記載の組成物。
１９．  前記組成物中の前記組み換えFSHが、cAMPシグナル伝達とは独立した生物学的プロセスによって生殖細胞の成熟を刺激又は共刺激することができる項目１〜１８のいずれか一項記載の組成物。
２０．  前記組成物中の前記組み換えFSHが、顆粒膜細胞アッセイにおいて判定できる以下の特徴のうちの１つ以上を有する項目１〜１９のいずれか一項記載の組成物：
（ａ）顆粒膜細胞によるcAMPの放出を誘導するために必要な最低濃度を下回る濃度で、該顆粒膜細胞におけるプロゲステロンの放出を刺激することができる；
（ｂ）cAMPの放出を誘導しないか若しくは１０pmol/mL未満のcAMP放出を誘導するFSH濃度で、１mL当たり約５×１０４〜約１×１０５個の顆粒膜細胞において少なくとも２００ng/mL プロゲステロンの放出を刺激することができる；
（ｃ）ヒト尿FSH若しくはCHO細胞において生成される組み換えFSH（Gonal F）によって必要とされる濃度よりも低い濃度で、１mL当たり約５×１０４〜約１×１０５個の顆粒膜細胞において少なくとも１００ng/mL プロゲステロンの放出を刺激することができる；及び／又は
（ｄ）ヒト尿FSH若しくはCHO細胞において生成される組み換えFSH（Gonal F）によって対応するプロゲステロン放出が生じない濃度で、１mL当たり約５×１０４〜約１×１０５個の顆粒膜細胞において少なくとも１００ng/mL プロゲステロンの放出を刺激することができる。
２１．  前記組成物中の前記組み換えFSHが、単一用量の投与後にヒト女性において卵胞の成長を誘導することができ、該単一用量が、好ましくはFSH ２５〜５００IUを含み、そして、好ましくは、非経口的に、特に皮下注射によって投与される、項目１〜２０のいずれか一項記載の組成物。
２２．  前記組み換えFSHが、FSH-GEXである、項目１〜２１のいずれか一項記載の組成物。
２３．  医薬組成物である、項目１〜２２のいずれか一項記載の組成物。
２４．  不妊症の処置において使用するための、項目１〜２２のいずれか一項記載の組成物又は項目２３記載の医薬組成物。
２５．  患者に投与される前記用量によって、該患者の循環血液中のFSH濃度が約０．２〜約１０IU/L、好ましくは約０．４〜約７IU/Lの範囲になる、項目２４記載の組成物又は医薬組成物。
２６．  同様にcAMPとは独立に性ステロイドの分泌を誘導及び／又は刺激するための、項目１〜２２のいずれか一項記載の組成物又は項目２３記載の医薬組成物。
２７．  cAMPシグナル伝達とは独立した生物学的プロセスによって生殖細胞の成熟を刺激又は共刺激するための、項目１〜２２のいずれか一項記載の組成物又は項目２３記載の医薬組成物。
２８．  著しいcAMP放出を誘導しないFSH濃度で性ステロイドの分泌を誘導及び／又は刺激するための、項目１〜２２のいずれか一項記載の組成物又は項目２３記載の医薬組成物。
２９．  不妊症の処置において使用するための項目２４〜２７のいずれか一項記載の組成物又は医薬組成物であって、該不妊症の処置が、補助生殖医療、排卵誘発、体外受精、例えば、卵細胞質内精子注入法による体外受精、配偶子卵管内移植、子宮内受精、女性における無排卵障害の処置、女性における卵を成熟させるための重篤なホルモン欠乏障害の処置、男性における精子生成欠損の処置、並びに／又は例えば、体外受精刺激プロトコル中及び／若しくは無排卵障害の処置における生殖細胞の成熟、例えば、卵胞形成及び精子形成、特に女性における卵胞の成熟の可能化若しくは改善を含む組成物又は医薬組成物。
３０．  前記組み換えFSH組成物又は前記医薬組成物が、以下の特徴のうちの１つ以上を有する項目２４〜２９のいずれか一項記載の組成物又は医薬組成物：
（ｉ）単一用量のみを投与した後、卵胞の成長及び／若しくは卵子の成熟を誘導することができる；並びに／又は
（ii）ヒト、カニクイザル、ラット、及び／若しくはマウスのうちの１つ以上においてヒト尿から入手した及び／若しくはCHO細胞で発現したFSH調製品よりも短い循環半減期を有する；並びに／又は
（iii）ヒト、カニクイザル、ラット、及び／若しくはマウスのうちの１つ以上においてヒト尿から入手した及び／若しくはCHO細胞で発現したFSH調製品よりも低いバイオアベイラビリティを有する；並びに／又は
（iv）ヒト、カニクイザル、ラット、及び／若しくはマウスのうちの１つ以上においてヒト尿から入手した及び／若しくはCHO細胞で発現したFSH調製品と同様又はより高い治療効果を有する。
３１．  卵胞の成長及び／若しくは卵子の成熟を誘導するための医薬組成物を調製するため並びに／又は項目２４〜３０のいずれか一項記載の通り使用するための、項目１〜２２のいずれか一項記載の組成物又は項目２３記載の医薬組成物の使用。
【図１】
2018528224.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018528224.tif 000008