(57)【要約】  本発明は、概して、ワクチンを送達するための組成物および方法に関する。本明細書に記載の組成物および方法は、細菌ワクチンおよびウイルスワクチンの作製に特に有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i) 酵母細胞壁粒子、および(ii) 該酵母細胞壁粒子に充填された抗原、を含んでなるワクチン、ここで該ワクチンはヒトに投与されると免疫応答を刺激するものである、前記ワクチン。
【請求項２】
抗原が、ウイルス抗原および細菌抗原からなる群から選択される、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
抗原が細菌抗原である、請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
抗原が、髄膜炎菌（N. Meningitidis）に由来するタンパク質、またはその断片である、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
抗原が、髄膜炎菌由来の組換えタンパク質A05もしくはB01、またはそれらの組み合わせである、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
抗原がウイルス抗原である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項７】
抗原が、A型インフルエンザウイルスに由来するタンパク質、またはその断片である、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
抗原が、A型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン、またはその断片である、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
抗原が、HIVに由来するタンパク質、またはその断片である、請求項６に記載のワクチン。
【請求項１０】
抗原が、HIVのgp120、またはその断片である、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
酵母細胞壁粒子がさらにケイ酸エステルを含んでなる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１２】
酵母細胞壁粒子がケイ酸エステルによるキャッピングで修飾されている、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
ケイ酸エステルが、オルトケイ酸テトラエステルの4つの酸素化合物のそれぞれに結合した有機部分を含有する、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１４】
ケイ酸エステルが、オルトケイ酸テトラエチル、オルトケイ酸テトラメチル、オルトケイ酸テトラプロピル、およびオルトケイ酸テトラブチルからなる群から選択される、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１５】
1つもしくは複数のアジュバント、添加剤、および保存剤をさらに含有する、請求項１〜１４のいずれか１つに記載のワクチン。
【請求項１６】
アジュバントが酵母細胞壁粒子内に充填される、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
アジュバントが、モノホスホリルリピドAまたはCpGオリゴヌクレオチドである、請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１つに記載のワクチンを投与することを含む、被験体にワクチンを効果的に送達するための方法。
【請求項１９】
ワクチンが皮下、経口、または静脈内に投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ワクチンが被験体の真皮に直接投与される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、酵母細胞壁粒子を含有する組成物、ならびにワクチンを送達するための方法に関する。本明細書に記載の組成物および方法は、細菌ワクチンおよびウイルスワクチンの作製に特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
世界保健機関によれば、感染症は、特に低所得国において、いまだ主要な死亡原因である。ウイルスおよび細菌感染は重要な公衆衛生上の問題である。防御免疫を誘導するワクチンは、感染症の対策または撲滅に重要な役割を果たす。
【０００３】
従来のワクチンは、弱毒化された病原体、死滅させた病原体、または病原体の免疫原性成分で構成される。組換えタンパク質および合成ペプチドなどのサブユニットワクチンが、新規ワクチン候補として出現しつつある。サブユニットワクチンとして使用される一部の抗原は抗原性が高いが、多くの抗原は免疫応答を誘導できないか、または弱い免疫応答しか誘導しない。ワクチンの免疫応答を向上させる1つの方法は、樹状細胞などの単球由来の細胞への免疫原性物質の標的化デリバリーによる。最近、樹状細胞に生物学的物質を送達するための標的化デリバリーシステムが、多くの研究によって報告されている。たとえば、ミクロスフェア／微小粒子、リポソーム、ナノ粒子、デンドリマー、ニオソーム、およびカーボンナノチューブを、この目的のために使用できることが報告された。Jain et al., Expert Opin. Drug Deliv. 10(3): 353-367 (2013)。しかしながら、当技術分野において、細菌およびウイルス病原体に対するより有効なワクチン、たとえば徐放性で用量が低減され副作用のより少ないワクチン、を提供する必要性が残されている。本発明はこの必要を満たす新規ワクチン組成物を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Jain et al., Expert Opin. Drug Deliv. 10(3): 353-367 (2013)
【発明の概要】
【０００５】
ある態様において、本発明は、(i) 酵母細胞壁粒子、および(ii) 該酵母細胞壁粒子内に入れ込まれた抗原を含むワクチンに関するが、このワクチンはヒトへの投与で免疫応答を刺激するものである。
【０００６】
一部の実施形態において、抗原は、ウイルス抗原および細菌抗原からなる群から選択される。一部の具体的な実施形態において、抗原は細菌抗原である。好ましい実施形態において、抗原は、髄膜炎菌（N. meningitidis）由来のタンパク質、またはその断片である。別の好ましい実施形態において、抗原は、髄膜炎菌由来の組換えタンパク質A05もしくはB01、またはその断片である。また別の好ましい実施形態において、抗原は髄膜炎菌由来の組換えタンパク質A05もしくはB01の組み合わせである。
【０００７】
一部の実施形態において、抗原はウイルス抗原である。一部の実施形態において、抗原は、A型インフルエンザ由来のタンパク質である。好ましい実施形態において、抗原はA型インフルエンザのヘマグルチニンである。一部の実施形態において、抗原はHIV由来のタンパク質である。好ましい実施形態において、抗原はHIVのgp120である。
【０００８】
一部の実施形態において、本発明のワクチン中に存在する酵母細胞壁粒子は、ケイ酸エステル（シリケート）でコーティングされた粒子を含む。一部の実施形態において、酵母細胞壁粒子は、ケイ酸エステルによるキャッピングで修飾されている。好ましい実施形態において、ケイ酸エステルは、オルトケイ酸エステルの4つの酸素化合物のそれぞれに結合した有機部分を含む。別の好ましい実施形態において、ケイ酸エステルは、オルトケイ酸テトラエチル、オルトケイ酸テトラメチル、オルトケイ酸テトラプロピル、またはオルトケイ酸テトラブチルからなる群から選択される。好ましい実施形態において、ケイ酸エステルは、オルトケイ酸テトラエステルである。
【０００９】
一部の実施形態において、本発明のワクチンはさらに1つもしくは複数のアジュバント、添加剤、および保存剤を含有する。広く使用されるアジュバントには、タンパク質、ペプチド、核酸、および炭水化物があるがそれらに限定されない。代表的なアジュバントには、モノホスホリルリピドA、LPS、CpGオリゴヌクレオチド（CpG DNAなど）、Poly I:C、Poly ICLC、強力なMHC IIエピトープペプチド、ベータグルカン、および樹状細胞刺激サイトカイン、たとえばIL-12およびIFN-γなど、ならびにDC成熟サイトカイン、たとえばIL-4およびGM-CSFなど、があるが、これらに限らない。適当なアジュバントは、樹状細胞を活性化させ、さらに、CD4+ およびCD8+ T 細胞などのより強力なT細胞生成を刺激するために、DCを成熟させて、樹状細胞上の受容体と相互作用することが知られている分子である。一部の実施形態において、アジュバントは酵母細胞壁粒子内に入れ込まれる。好ましい実施形態において、アジュバントはモノホスホリルリピドA、またはCpGオリゴヌクレオチドである。
【００１０】
別の態様において、本発明は、本発明のワクチンを投与することを含む、効果的にワクチンを被験体に送達するための方法を提供する。一部の実施形態において、ワクチンは、皮下、経口、または静脈内に投与される。一部の実施形態において、ワクチンは、被験体の真皮に直接投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、酵母細胞壁粒子内に入れ込まれたA05によって、またはアラムアジュバント（Imject Alum, Thermo Scientific）と合わせたA05によってワクチン接種されたマウスにおける、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）血清型A05タンパク質に対する抗体価を示す。ワクチン接種を受けないマウス由来の血清を対照として使用した。結果によれば、組換えタンパク質A05を充填された酵母細胞壁粒子は、1：2000希釈より高い力価を有する強力な抗体反応を誘導するが、その力価はアラムアジュバントを伴う組換えタンパク質によって誘導される抗体反応より強いことがわかる。
【図２】図２は、酵母細胞壁粒子内に入れ込まれたB01によって、またはアラムアジュバント（Imject Alum, Thermo Scientific）と合わせたB01によってワクチン接種されたマウスにおける、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）血清型B01タンパク質に対する抗体価を示す。ワクチン接種を受けないマウス由来の血清を対照として使用した。結果によれば、組換えタンパク質は1：6000より高い力価を有する強力な抗体反応を誘導するが、その力価はアラムアジュバントを伴う組換えタンパク質によって誘導される抗体反応より強いことがわかる。
【図３】図３は、酵母細胞壁粒子内のヘマグルチニンによって、またはアラムアジュバント（Imject Alum, Thermo Scientific）と合わせたヘマグルチニンによってワクチン接種されたマウスにおける、インフルエンザウイルス由来のヘマグルチニンに対する抗体価を示す。ワクチン接種を受けないマウス由来の血清を対照として使用した。結果によれば、組換えタンパク質は、1：4000より高い力価を有する強力な抗体反応を誘導し、その力価はアラムアジュバントを伴うヘマグルチニンによって誘導される抗体反応より強いことがわかる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明は、本出願に記載の特定の実施形態の観点から限定されるべきでなく、そうした実施形態は本発明の個々の態様の単なる説明として意図されるものである。本発明のさまざまな実施形態がすべて、本明細書に記載されるわけではない。当業者には明白なことであるが、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに、本発明の多くの修正および変更を行うことができる。本明細書に列挙されたものに加えて、本発明の範囲に含まれる機能的に同等の方法および装置が、先行の記述から当業者に明白となるであろう。そのような修正および変更は、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。本発明は、添付の特許請求の範囲の条項によってのみ制限されるべきであり、それと同等の均等物の全範囲とともに、前記特許請求の範囲は権利付与される。
【００１３】
当業者に知られているさまざまな方法が本明細書に引用される。参照されるそのような既知の方法を記載する出版物および他の資料は、参照することにより、全文を記載しているかの如くその全体が本明細書に組み入れられる。
【００１４】
定義
数値および範囲を伴う「約」という用語は、理解される数字が、そこに記載された正確な数字に限定されず、本発明の範囲から逸脱しないが記載の範囲に実質的に含まれる範囲を指すものとする。本明細書で使用される「約」は、当業者には理解されるものであって、それが使用される文脈によってある程度変化するものである。たとえば「約」は、その語に続く個別の数値の+/- 10% を意味する。
【００１５】
本明細書で使用される、被験体への薬剤の「投与」には、意図した機能を果たすように薬剤を被験体に導入もしくは送達する任意の経路が含まれる。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下を含めて、任意の適当な経路で行うことができる。投与は、被験体の真皮への注射によって行うこともできる。投与には、自己投与および他者による投与がある。
【００１６】
本明細書で使用される「被験体」もしくは「患者」は、ワクチンによる治療を必要とする任意の動物を意味する。たとえば、被験体は、ワクチンで治療または予防することができる疾患に罹っているか、またはそうした疾患を発症するリスクがある可能性がある。本明細書で使用される「被験体」もしくは「患者」にはヒトを含める。
【００１７】
「含む」という用語は、本明細書に記載の組成物および方法が、記載された要素を含んでいるが他の要素を排除しないことを意味するものとする。組成物および方法を規定するために使用される「本質的に〜からなる（実質的に〜からなる）」）は、その組み合わせにとって何らかの本質的な意味のある他の要素を排除することを意味するものとする。たとえば、本質的に本明細書に記載の要素からなる組成物は、請求項に関わる発明の基本的かつ新規な特性に実質的に影響を及ぼさない他の要素を排除しないことになる。「からなる」は、ごくわずかの他の構成要素も排除することを意味し、記載された実在の方法ステップを意味するものとする。これらの連語のそれぞれによって定められる実施形態は、本発明の範囲に含まれる。
【００１８】
本明細書で使用される「対照」は、比較目的で実験において使用される別サンプルである。対照は、「陽性」もしくは「陰性」があると考えられる。たとえば、実験目的が、特定の種類の疾患を治療するための治療薬の有効性の相互関係を判定することである場合、陽性対照（望ましい治療効果を示すことが判明している組成物）および陰性対象（治療を受けないか、またはプラセボを投与される被験体またはサンプル）が通常、使用される。
【００１９】
本明細書で使用される「治療上有効な量」および「治療的レベル」という語句はそれぞれ、被験体における本明細書に記載の組成物の、ワクチン投与量、および血漿中濃度を意味するが、この組成物は特異的な反応をもたらすものであって、そのために生物学的物質もしくはワクチンが、そうした治療を必要とする被験体に投与される。単に便宜上、代表的投与量、送達量、治療上有効な量、および治療的レベルが、成人ヒト被験者を基準として以下に与えられる。当業者は、個別の被験体および／または病状／疾患を治療する必要に応じて、こうした量を、慣例にしたがって調整することができる。
【００２０】
本明細書で使用される「タンパク質」という用語は、ポリペプチド（天然[すなわち天然に存在する]もしくは変異型）、ペプチド、または他のアミノ酸配列を意味する。本明細書で使用される「タンパク質」は、天然タンパク質もしくは全長タンパク質に限定されず、望ましい活性もしくは他の望ましい生物学的特性を有するタンパク質断片、ならびに、望ましい活性もしくは他の生物学的特性を保持する、上記タンパク質もしくはタンパク質断片の変異体または誘導体を含むものとされ、これらは窒素ベースの骨格を有するペプチドを含む。変異タンパク質には、その起源である天然タンパク質に対して変化したアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれるが、この変化には、アミノ酸置換（保存的または非保存的）、欠失、または付加（たとえば、融合タンパク質の場合のような）を含めることができる。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、いずれか一方の語の範囲を狭く限定する意図はなく、本明細書において区別せずに使用される。
【００２１】
本明細書で使用される「組換え型（体）」という用語は、本発明で使用されるタンパク質もしくはポリペプチドが組換え（たとえば微生物もしくは哺乳類）発現系から得られることを意味する。「微生物の」は、細菌もしくは真菌（たとえば酵母）発現系で作製された組換えタンパク質もしくはポリペプチドを表す。生成産物として、「組換え微生物の」は、微生物発現系で作製されたタンパク質もしくはポリペプチドを意味し、これは本質的に天然の内因性物質を含まない。ほとんどの細菌培養物（たとえば大腸菌（E. coli））で発現されるタンパク質もしくはポリペプチドは、グリカンを含まない。酵母で発現されるタンパク質もしくはポリペプチドは、哺乳類細胞で発現されるものとは異なるグリコシル化パターンを有する可能性がある。
【００２２】
本発明において、「ホモロジー／相同性」もしくは「相同な」は、2つのポリヌクレオチド部分の間の、または2つのポリペプチド部分の間の、パーセント相同性を表す。ある部分から別の部分への配列間の対応は、当技術分野で周知の技術によって判定される。2つのDNAまたは2つのポリペプチド配列は、当技術分野の方法を用いた測定により、少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約90%、もっとも好ましくは少なくとも約95%のヌクレオチドもしくはアミノ酸が、分子の所定の長さにわたってマッチするならば、互いに「実質的に相同」である。
【００２３】
アミノ酸配列相同性を判定するための技法は当技術分野で周知である。一般に、（アミノ酸配列に関する）「相同性」は、適当な部分における、2つ以上のポリペプチドの正確なアミノ酸とアミノ酸との比較であって、その部分においてアミノ酸配列が同一であるか、または電荷もしくは疎水性などの、類似した化学的および／または物理的性質を有することを意味する。そこで、いわゆる「パーセント相同性」を、比較されるポリペプチド配列間で判定することができる。Wisconsin Sequence Analysis Package （Genetics Computer Group, Madison, Wis.より入手可能）の中で利用可能なプログラム、たとえば GAPプログラムは、2つのポリペプチド間の相同性の計算を可能にする。それに加えて、ClustalWアルゴリズムは、同様の分析を行うことができる。ポリペプチド配列間の相同性を判定するための他のプログラムおよびアルゴリズムが当技術分野で知られている。
【００２４】
本明細書で使用される「抗原」もしくは「免疫原」という用語は、宿主動物において特異的な免疫応答を誘導する物質を意味する。抗原は、死滅させ、弱毒化し、もしくは生きたままの全生物体；生物の一部；免疫原性を有する挿入断片を含有する組換えベクター；宿主動物への提示によって免疫応答を誘導することができるDNAの小片もしくは断片；ポリペプチド、エピトープ、ハプテン、もしくはそれらの組み合わせを含むと考えられる。あるいはまた、免疫原もしくは抗原は毒素もしくは抗毒素を含むこともある。
【００２５】
本明細書で使用される「免疫原性もしくは抗原性ポリペプチド」という用語には、宿主に投与されると、そのタンパク質に対する液性および／または細胞性タイプの免疫応答を惹起することができるという意味で免疫学的に活性なポリペプチドが含まれる。好ましくは、タンパク質断片は、全体としてのタンパク質と、実質的に同じ免疫学的活性を有するものである。したがって、本発明のタンパク質断片は、少なくとも1つのエピトープもしくは抗原決定基を含む、または本質的にそれらからなる、またはそれらからなる。「免疫原性」タンパク質もしくはポリペプチドは、本明細書で使用される場合、タンパク質の全長配列、そのアナログ、またはその免疫原性断片を含む。「免疫原性断片」は、1つもしくは複数のエピトープを含有し、したがって上記の免疫応答を引き起こす、タンパク質の断片を意味する。このような断片は、当技術分野で周知の、任意のいくつかのエピトープマッピング技術をもちいて特定することができる。たとえば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996)を参照されたい。たとえば直線状エピトープは、たとえば、タンパク質分子の一部分に相当するペプチドである多数のペプチドを、固体担体上で同時に合成し、ペプチドは依然として担体に結合したままでそのペプチドを抗体と反応させることによって、判定することができる。このような技術は当業者に知られており、たとえば、米国特許第4,708,871号に記載されている。同様に、立体構造エピトープは、アミノ酸の空間的立体構造をたとえば、X線結晶構造解析および2次元核磁気共鳴で判定することによって容易に特定される。たとえば、Epitope Mapping Protocols、上記、を参照されたい。本発明に使用される抗原は、ウイルス抗原、寄生虫抗原、および／または細菌抗原とすることができる。本発明の抗原は、病気を引き起こさないが、効果的に被験体の免疫応答を引き起こすことができ、被験体を特定の疾患の将来の感染から守る、または特定の疾患の重症度を最小限にすることができる。
【００２６】
本明細書で使用される「粒子」という用語は、その中に活性物質を封入することができて、その活性物質がその構造の外に出ることも可能にする、任意の中空で多孔質の構造を表す。本発明で使用される粒子は、その細孔の構造が封入される活性物質の受け入れに適しているならば、たとえば球形、管状または棒状などの任意の形の粒子とすることができる。粒子は、粗い表面、滑らかな表面、角のある表面、または鋭いエッジを有していてもよく、その形が規則的でも不規則でもよい。粒子の材料は、生体適合性で生分解性の任意の材料を含むことができる。
【００２７】
本明細書で使用される「免疫学的応答」もしくは「免疫応答」という表現は、抗原がワクチン組成物中に存在する場合に、使用された抗原に対する液性および／または細胞性免疫応答が被験体において発現することを含むと考えられる。免疫応答で誘導される抗体は、感染性を中和すること、ならびに／または、抗体-補体または抗体依存性細胞毒性を介して免疫化された宿主を保護することができる。免疫学的応答性は、当技術分野で周知の、競合アッセイなどの標準的なイムノアッセイで測定することができる。使用に適したイムノアッセイは、本発明のワクチン中の個別の抗原によって決まる。
【００２８】
本明細書で使用される「キャッピング」または「キャッピングされた」という表現は、本発明の中空の粒子の空洞の、多孔性シェルの外側を覆う薄いポリマー構造を意味するが、この中空の粒子は、酵母細胞壁粒子などの、本発明で使用される粒子の内側の空洞から、封入された薬剤が放出されるのを遅らせる、または放出されないようにする役割を果たすものである。したがって、本明細書で使用される「キャッピング」もしくは「キャッピングされた」は、封入された薬剤の放出を遅らせるかまたは防止するように、穴の開口部を部分的もしくは完全に閉塞させることを含む。キャップは、さまざまな材料を含んでなることができるが、その材料は、充填された粒子の目的とする用途、ならびに粒子材料のサイズおよび反応性に基づいて選択することができる。キャッピングされた酵母細胞壁粒子は、「メッシュネット」のようなポリマー構造を含み、酵母細胞壁粒子内に入れ込まれた生物学的物質がその中に保持され、捕捉されるように、酵母細胞壁粒子を覆い、コーティングする。ポリマー構造は、オルトケイ酸エステルなどのケイ酸エステルによって形成することができる。
【００２９】
本明細書に記載の組成物および方法に有用なオルトケイ酸エステルは以下の式で表される：Si(OR)4、式中RはC1-C12アルキルである。たとえば、Rは、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基とすることができる。好ましい実施形態において、オルトケイ酸エステルは、オルトケイ酸テトラエステルである。
【００３０】
「添加剤」という用語は、ワクチン組成物の製剤に使用される希釈剤もしくは他の成分を意味する。添加剤は、希釈剤もしくは賦形剤、結合剤もしくは接着剤、溶解補助剤、滑沢剤、付着防止剤、流動促進剤、着色剤、香味剤、甘味剤、および吸着剤を含むことができる。
【００３１】
「保存剤」という用語は、基本的に再構成された製剤中の細菌の作用を減らすために希釈剤に添加することができる化合物を意味するので、たとえば、複数回使用の再構成製剤の製造を容易にすることができる。例としては、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物である塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物）および塩化ベンゼトニウムが挙げられる。他の種類の保存剤には、フェノールなどの芳香族アルコール、2-フェノキシエタノール、チメロサール、塩化ベンゼトニウム、ホルムアルデヒド、ブチルおよびベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベンなどのアリルパラベン類、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノール、およびm-クレゾールがある。本明細書においてもっとも好ましい保存剤は、2-フェノキシエタノールである。
【００３２】
「免疫化」という用語は、被験体が、通常はワクチンを受けることによって、特定の1つの病態、疾病もしくは複数の疾病から保護されるようになるプロセスを意味する。
【００３３】
「ワクチン」という用語は、たとえば、注射、経口投与、またはエアゾール投与によって、投与時に被験体の体内で免疫応答を誘導する生物学的物質もしくは製品である。ワクチンは少なくとも1つの活性成分、たとえば免疫応答を誘導する抗原など、ならびに少なくとも1つの追加成分、たとえばアジュバント、保存剤、または他の添加剤である希釈剤、安定化剤などを含んでなる。
【００３４】
ワクチン
本発明のワクチンは、粒子内に封入された薬剤を含有する。本発明に含まれる薬剤には、抗原、たとえば特定のタンパク質もしくはその断片、核酸、炭水化物、タンパク質、ペプチド、またはそれらの組み合わせがあるが、それらに限定されない。当業者には当然のことであろうが、投与によって被験体の免疫応答を生じさせる、タンパク質の断片、たとえば任意の長さのペプチド、エピトープ、もしくはタンパク質のサブユニットを使用することができる。
【００３５】
DNA、RNA、cDNAもしくはそれらの断片などの核酸も、薬剤として使用される。一般に、DNAは感染性病原体のDNAから抽出されたのち、被験体に投与される前に、エレクトロポレーション、遺伝子銃などによる遺伝子工学によって修飾／改良される。
【００３６】
本発明の抗原は、生きた野生型病原体、または不活化もしくは弱毒化型の、たとえば死滅ウイルス、細菌の破片、ならびにタンパク質、ポリペプチドもしくは核酸の、サブユニットまたは免疫原性機能断片とすることができる。より好ましくは、抗原は、病気を引き起こさないで、効果的に被験体の免疫応答を引き起こし、特定の疾病の将来の感染から被験体を保護し、または特定の病状の重症度を最小限にすることができる。
【００３７】
当然のことながら、酵母細胞壁粒子は、少なくとも約30 nmの孔径を有するので、30 nm以下の範囲の任意の分子／物体を酵母細胞壁粒子の中に入れ込むことができる。たとえば、細菌抗原などの他の抗原はもちろん、30 nm未満のサイズのウイルスもしくはウイルス粒子（たとえばタバコモザイクウイルス）を、酵母細胞壁粒子の中に入れ込むことができる。
【００３８】
細菌抗原
一部の実施形態において、本発明のワクチンは細菌抗原を含有する。細菌抗原とは、細菌に対する免疫応答を引き起こすことができるすべての物質、たとえば、不活化もしくは弱毒化細菌、細菌の破片、および細菌由来のタンパク質もしくはポリペプチドのサブユニットまたは免疫原性機能断片を包含する。
【００３９】
一部の実施形態において、細菌抗原は、ピロリ菌（ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pyloris））；ボレリア（Borrelia）属細菌、特にライム病ボレリア（ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi））；レジオネラ（Legionella）属細菌、特に在郷軍人病桿菌（レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）；マイコバクテリウム（ Mycobacterium）属細菌、特に結核菌（M. tuberculosis）、マイコバクテリウム・アビウム（M. avium）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（M. intracellulare）、マイコバクテリウム・カンサシ（M. kansasii）、マイコバクテリウム・ゴルドナエ（ M. gordonae）；ブドウ球菌（Staphylococcus）属細菌、特に黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）；ナイセリア（Neisseria）属細菌、特に淋菌（N. gonorrhoeae）、髄膜炎菌（N. meningitidis）；リステリア（Listeria）属細菌、特にリステリア菌（リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes））；連鎖球菌（Streptococcus）属細菌、特に化膿連鎖球菌（S. pyogenes）、ストレプトコッカス・アガラクチア（S. agalactiae）、フェカリス菌（S. faecalis）、ウシ連鎖球菌（S. bovis）、肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）；嫌気性連鎖球菌（Streptococcus）属細菌；病原性カンピロバクター（Campylobacter）属細菌； 腸球菌（Enterococcus）属細菌；ヘモフィルス（Haemophilus）属細菌、特にインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）；バチルス属細菌、特に炭疽菌（Bacillus anthracis）；コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌、特にジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）；エリシペロスリクス属細菌、特にブタ丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）；クロストリジウム（Clostridium）属細菌、特にウェルシュ菌（C. perfringens）、破傷風菌（C. tetani）；エンテロバクター（Enterobacter）属細菌、特にエンテロバクター・エロゲネス（Enterobacter aerogenes）、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌、特に肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）；パスツレラ（Pasteurella）属細菌、特にパスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）；バクテロイデス（Bacteroides）属細菌；フゾバクテリウム属細菌、特に壊死桿菌（Fusobacterium nucleatum）；ストレプトバチルス（Streptobacillus）属細菌、特にストレプトバチルス・モリホルム（Streptobacillus moniliformis）；トレポネーマ（Treponema）属細菌、特にトレポネーマ・ペルテニュ（Treponema pertenue）；レプトスピラ（Leptospira）属細菌；病原性大腸菌（Escherichia）属細菌；および放線菌（Actinomyces）属細菌、特にイスラエル放線菌（Actinomyces israelli）に由来する。細菌抗原もしくはその断片は、好ましくは、本発明の酵母細胞壁粒子の中に入れ込まれて、免疫応答を刺激することができる。
【００４０】
髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）
一部の実施形態において、細菌抗原は、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）に由来する。髄膜炎菌は、髄膜炎および他の髄膜炎菌性疾患、たとえば生命を脅かす敗血症である髄膜炎菌血症を引き起こすグラム陰性球菌である。髄膜炎菌は、化学的性質および抗原性で区別される莢膜多糖体に基づいて、約13の血清型に分類することができる。血清型のうち5つ（A、B、C、Y、およびW135）が、疾病の大部分の原因となる。本発明は、使用される髄膜炎菌もしくはそれに由来する免疫原性タンパク質の血清型によって限定されない。
【００４１】
一部の実施形態において、髄膜炎菌に由来する細菌抗原は、ORF2086タンパク質として同定されたタンパク質、その免疫原性部分、および／または生物学的にそれと同等のものである。本明細書で使用される「ORF2086」という用語は、ナイセリア属細菌由来のオープンリーディングフレーム2086を意味する。ナイセリアORF2086、そこからコードされるタンパク質、そうしたタンパク質の断片、およびそれらのタンパク質を含んでなる免疫原性組成物は、当技術分野で知られており、たとえば、米国特許出願公開番号US 20060257413 およびUS 20090202593に記載され、これらはいずれも参考としてその全体が本明細書に組み入れられる。「P2086」という用語は通常、ORF2086でコードされたタンパク質を指す。本発明のP2086は、脂質付加されていることも脂質付加されていないこともある。「LP2086」および「P2086」は典型的には、それぞれ2086タンパク質の脂質付加型および非脂質付加型を表す。LP2086は、血清学的に区別される2つのサブファミリー（AおよびB）に分けることができる。本発明は、使用された髄膜炎菌もしくはそれに由来する免疫原性タンパク質のサブファミリーによって限定されない。
【００４２】
一部の実施形態において、細菌抗原はさらに、他のナイセリア属細菌の免疫原性ペプチド、タンパク質、もしくはその断片を含む。一部の実施形態において、細菌抗原は、1つもしくは複数のORF2086タンパク質の組み合わせ、ORF2086タンパク質と、髄膜炎菌血清型A、C、Y、およびW135に由来する1つもしくは複数のタンパク質、または髄膜炎菌血清型A、C、Y、およびW135に由来する多糖および／または多糖複合体との組み合わせ、あるいは前記のいずれかの組み合わせを、望ましい投与、たとえば粘膜投与、に適した形で含むことができる。当業者は、このような複数抗原組成物を容易に調製することができるであろう。
【００４３】
好ましい実施形態において、細菌抗原は、LP2086サブファミリーAタンパク質もしくはLP2086サブファミリーBタンパク質、またはその免疫原性部分である。一部の実施形態において、細菌抗原は、LP2086サブファミリーAタンパク質のA05バリアントである。他の実施形態において、細菌抗原は、LP2086サブファミリーBタンパク質のB01バリアントである。好ましい実施形態において、細菌抗原は、サブファミリーAタンパク質とサブファミリーBタンパク質の1：1混合物を含む。別の好ましい実施形態において、細菌抗原は、LP2086サブファミリーAタンパク質のA05バリアント、およびB01バリアントの等量混合物を含む。
【００４４】
一部の実施形態において、LP2086サブファミリーAタンパク質もしくはLP2086サブファミリーBタンパク質のバリアントは、本発明のワクチンにおいて抗原として使用することができる。バリアントは、基準の配列に対して類似しているが同一ではない配列を有するタンパク質を表し、このバリアントタンパク質（またはバリアント核酸分子によりコードされるタンパク質）の活性は、有意に変化していない。配列におけるこれらの多様性は、自然に発生する多様性であることもあるが、当業者に周知の遺伝子工学技術を用いて操作することもできる。このような技術の例は、Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 9.31-9.57、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見いだされ、この2つは参考としてその全体を本明細書に組み入れる。
【００４５】
バリアントに関して、結果として得られたバリアントタンパク質が、髄膜炎菌に対する免疫応答を引き起こす能力を保持している限り、アミノ酸もしくは核酸配列におけるいかなるタイプの変化も受け入れられる。このような多様性の例には、欠失、挿入、置換、およびそれらの組み合わせがあるが、これに限定されない。たとえば、タンパク質に関して、当業者にはよく理解されるように、1つもしくは複数（たとえば2、3、4、5、6、7、8、9または10）のアミノ酸を、タンパク質の活性に有意な影響を及ぼすことなくそのタンパク質のアミノ末端および／またはカルボキシ末端から除去できることが多い。同様に、1つもしくは複数（たとえば2、3、4、5、6、7、8、9または10）のアミノ酸を、タンパク質の活性に有意な影響を及ぼすことなくそのタンパク質に挿入できることが多い。記載されるように、本発明のバリアントタンパク質は、本明細書に記載のLP2086サブファミリーAタンパク質もしくはLP2086サブファミリーBタンパク質に対してアミノ酸置換を含有することができる。タンパク質の活性が有意に影響されない限り任意のアミノ酸置換が許容される。これに関連して、当然のことながら、アミノ酸は、その物理的性質に基づいてグループに分類することができる。このようなグループの例には、荷電アミノ酸、非荷電アミノ酸、極性非荷電アミノ酸、および疎水性アミノ酸があるがそれに限定されない。置換を含有する好ましいバリアントは、アミノ酸が同一グループに属するアミノ酸で置換されたバリアントである。このような置換は、保存的置換と呼ばれる。当業者は、このようなアミノ酸置換が望ましい時に、望ましいアミノ酸置換を（保存的であるか否かにかかわらず）決定することができる。たとえば、LP2086サブファミリーAタンパク質もしくはLP2086サブファミリーBタンパク質の重要な残基を特定するために、または本明細書に記載のタンパク質の免疫原性、溶解性、もしくは安定性を高める、もしくは低下させるために、アミノ酸置換を使用することができる。
【００４６】
LP2086タンパク質およびそのバリアントを作製するための方法は当技術分野で知られている。たとえば、米国特許第8,568,743号を参照されたい。本発明は、本明細書のポリペプチド、ならびに前記ポリペプチドをコードする核酸配列の構造に対するあらゆる変化を検討するが、そのポリペプチドは免疫原性を保持している。
【００４７】
髄膜炎菌に由来するLP2086サブファミリーAタンパク質もしくはサブファミリーBタンパク質をワクチンに使用するために断片に切断できることも本発明で考慮されるが、この場合、その断片は依然として髄膜炎菌の免疫原性を有する。これは、エンドプロテイナーゼglu-C（Boehringer, Indianapolis, Ind.）などのペプチダーゼで、精製もしくは未精製髄膜炎菌タンパク質を処理することによって達成することができる。もう1つの方法がCNBrによる処理であるが、それによって、天然の髄膜炎菌2086ポリペプチドからペプチド断片を作製することができる。米国特許第8,568,743号を参照されたい。
【００４８】
LP2086タンパク質およびその断片を、本明細書で与えられる指針に基づいて、当業者に周知のように組換えによって調製することができるが、当技術分野で周知の他の任意の合成法で作製することもできる。LP2086 A05およびB01タンパク質の配列を以下に示す。
【００４９】
LP2086 A05_001 アミノ酸配列（配列番号１）
MCSSGSGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAEKTFKVGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPSGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ(HHHHHH) (追加の6 x hisタグ)
【００５０】
LP2086 B01_001 アミノ酸配列（配列番号２）
MCSSGGGGSGGGGVTADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQEQDPEHSEKMVAKRRFRIGDIAGEHTSFDKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAVAYIKPDEKHHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGEKAQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ(HHHHHH)(追加の6 x hisタグ)
【００５１】
LP2086サブファミリーAタンパク質、LP2086サブファミリーBタンパク質、またはそのバリアントの免疫原性を、このようなタンパク質を含有するワクチンが髄膜炎菌に対する殺菌抗体力価を生じさせることができる能力として測定することができる。抗体力価を測定する方法、および抗体力価アッセイを行う方法も、当業者に周知である。Fletcher et al., Infection & Immunity. 72(4):2088-2100 (2004)を参照されたい。当業者に広く知られている他の方法も、髄膜炎菌に対するワクチンの免疫原性を測定するために使用することができる。
【００５２】
ウイルス抗原
一部の実施形態において、本発明のワクチンはウイルス抗原を含有する。ウイルス抗原は、ウイルスに対する免疫応答を引き起こすことができるあらゆる物質、不活化もしくは弱毒化ウイルス、ウイルスの破片、およびウイルスに由来するタンパク質もしくはポリペプチドのサブユニットまたは免疫原性機能断片を含む。
【００５３】
インフルエンザ
一部の実施形態において、本発明は、インフルエンザウイルスに由来するウイルス抗原を含む。インフルエンザウイルスは、A、B、およびC型に分類することができる。本発明は使用されるインフルエンザウイルスの型もしくはそれに由来する免疫原性タンパク質によって限定されない。一部の実施形態において、本発明のワクチンは、A型インフルエンザウイルス用である。A型インフルエンザウイルスは、ウイルス上に提示されるヘマグルチニン（HA）およびノイラミニダーゼ（NA）表面糖タンパク質の組み合わせにしたがって、さらにサブタイプに分けることができる。現在16種類のHA（H1-H16）サブタイプ、および9種類のNA（N1-N9）サブタイプが報告されている。それぞれのA型インフルエンザウイルスは、1種類のHAおよび1種類のNA糖タンパク質を示す。一部の実施形態において、本発明は、ヒトから分離されたインフルエンザウイルスサブタイプH1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H8N2、H7N7、およびH7N9に対するワクチンを検討する。
【００５４】
一部の実施形態において、ウイルス抗原は、インフルエンザウイルス由来の膜糖タンパク質であるインフルエンザヘマグルチニンタンパク質である。ヘマグルチニンポリペプチドは、任意のインフルエンザウイルス型、サブタイプ、株、もしくは亜株、たとえば、H1、H2、H3、H5、H7およびH9ヘマグルチニンから得られる。一部の実施形態において、本発明で使用されるウイルス抗原は、免疫応答を引き起こすことができるアミノ酸配列であって、A/New Caledonia/20/1999 (1999 NC, HI)、A/California/04/2009 (2009 CA, HI)、 A/Singapore/1/1957 (1957 Sing, H2)、A/Hong Kong/1/1968 (1968 HK, H3)、A/Brisbane/10/2007 (2007 Bris, H3)、A/Indonesia/05/2005 (2005 Indo, H5)、B/Florida/4/2006 (2006 Flo, B)、A/Perth/ 16/2009 (2009 Per, H3)、A/Brisbane/59/2007 (2007 Bris, HI)、B/Brisbane/60/2008 (2008 Bris, B)から選択されるインフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質に由来するアミノ酸配列を含有する。それに加えて、ヘマグルチニンポリペプチドは、異なるインフルエンザヘマグルチニンのキメラであってもよい。好ましい実施形態において、ウイルス抗原は、A型インフルエンザウイルスサブタイプH5N1（A/Hong kong/483/97）に由来するヘマグルチニンのアミノ酸配列もしくは断片を含有するが、その配列を以下に示す。
【００５５】
インフルエンザA 型ウイルス由来ヘマグルチニン(A/Hong Kong/483/97 (H5N1) （配列番号３）
MEKIVLLLAT VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE RTHNGKLCDL NGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFINVP EWSYIVEKAS PANDLCYPGN FNDYEELKHL LSRINHFEKI QIIPKSSWSN HDASSGVSSA CPYLGKSSFF RNVVWLIKKN STYPTIKRSY NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTKLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPEIA TRPKVNGQSG RIEFFWTILK PNDAINFESN GNFIAPEYAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPMGA INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNAPQRE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADQESTQKA IDGVTNKVNS IINKMNTQFE AVGREFNNLE RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG NGCFEFYHKC DNECMESVKN GTYDYPQYSE EARLNREEIS GVKLESMGTY QILSLYSTVA SSLALAIMVA GLSLW
【００５６】
本発明のワクチンに使用されるヘマグルチニンは、インフルエンザビリオンから調製するか、または組換え宿主において発現させて（たとえば、昆虫細胞株においてバキュロウイルスベクターを用いて）、精製された形で使用することができる。ヘマグルチニンを作製する方法は、当技術分野でよく知られている。Andrianov et al. Biomaterials 19:109-115 (1998)、 Banzhoff Immunology Letters 71:91-96 (2000)、およびBeignon et al. Infect Immun. 70:3012-3019 (2002)を参照されたい。
【００５７】
一部の実施形態において、ヘマグルチニンのバリアントは、本発明のワクチンにおいて抗原として使用することができる。バリアントは、基準配列に類似しているが同一ではない配列を有するタンパク質を意味し、この場合バリアントタンパク質（またはバリアント核酸分子によりコードされるタンパク質）の活性は有意に変化していない。配列におけるこうした多様性は、自然に発生する多様性であることもあるが、当業者に周知の遺伝子工学の技術を用いて操作することもできる。そうした技術の例は、Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 9.31-9.57、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見いだされ、この2つは参考としてその全体が本明細書に組み入れられる。
【００５８】
バリアントに関して、結果として得られたバリアントタンパク質が、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を引き起こす能力を保持している限り、アミノ酸もしくは核酸配列におけるいかなるタイプの変化も受け入れられる。このような多様性の例には、欠失、挿入、置換、およびそれらの組み合わせがあるが、これらに限定されない。たとえば、タンパク質に関して、当業者にはよく理解されるように、1つもしくは複数（たとえば2、3、4、5、6、7、8、9または10）のアミノ酸を、タンパク質の活性に有意な影響を及ぼすことなくそのタンパク質のアミノ末端および／またはカルボキシ末端から除去できることが多い。同様に、1つもしくは複数（たとえば2、3、4、5、6、7、8、9または10）のアミノ酸を、タンパク質の活性に有意な影響を及ぼすことなくそのタンパク質に挿入できることが多い。記載されるように、本発明のバリアントタンパク質は、本明細書に記載のインフルエンザHAタンパク質に対してアミノ酸置換を含有することができる。タンパク質の活性が有意に影響されない限り任意のアミノ酸置換が許容される。これに関連して、当然のことながら、アミノ酸は、その物理的性質に基づいてグループに分類することができる。このようなグループの例には、荷電アミノ酸、非荷電アミノ酸、極性非荷電アミノ酸、および疎水性アミノ酸があるがそれに限定されない。置換を含有する好ましいバリアントは、アミノ酸が同一グループに属するアミノ酸で置換されたバリアントである。このような置換は、保存的置換と呼ばれる。当業者は、このようなアミノ酸置換が望ましい時に、望ましいアミノ酸置換を（保存的であるか否かにかかわらず）決定することができる。たとえば、HAタンパク質の重要な残基を特定するために、または本明細書に記載のHAタンパク質の免疫原性、溶解性、もしくは安定性を高める、もしくは低下させるために、アミノ酸置換を使用することができる。
【００５９】
ヘマグルチニンタンパク質およびそのバリアントを作製するための方法は当技術分野で知られている。Wei et al., J Virol 82: 6200-6208 (2008), and Wei et al., Science 329: 1060-1064 (2010)を参照されたい。A型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに由来する抗原を含んでなるワクチンの免疫原性は、タンパク質がT細胞応答を活性化することができる能力として測定することができる。たとえば、混合リンパ球反応を使用する、抗原に対するT細胞応答を測定する方法は、当業者によく知られている。Mason, et al. Immunology, 44(1):75-87 (1981)、およびSteinmanら、米国特許第6,300,090号を参照されたい。当業者に広く知られている他の方法も、インフルエンザウイルスに対するワクチンの免疫原性を測定するために使用することができる。
【００６０】
HIV
一部の実施形態において、本発明のウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）に由来する。本発明は、使用されるHIVの型によっても、それに由来する免疫原性タンパク質によっても、限定されない。たとえば2種類のHIV、HIV-1およびHIV-2はいずれも考慮される。一部の実施形態において、ウイルス抗原は、HIV糖タンパク質（gp120、gp160、およびgp41）、HIV非構造タンパク質（Rev、Tat、NifおよびNef）、またはそれらの組み合わせから選択される免疫原性タンパク質である。一部の実施形態において、ウイルス抗原は、全長HIVタンパク質の断片で、免疫応答を引き起こすことができる断片とすることができる。好ましい実施形態において、ウイルス抗原はHIV-1のgp120である。
【００６１】
さらに、HIV糖タンパク質は、本明細書に記載の正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際、HIVゲノムは、常に変化している状態にあり、分離株間で比較的高度の可変性を示すいくつかの可変領域を含有する。本発明のHIV糖タンパク質が、同定されたHIV分離株、新たに同定された分離株、およびこれらの分離株のサブタイプのいずれかに由来するポリペプチドを包含することは、ただちに明白である。本明細書および当技術分野の教示からみて、当業者は他のHIVバリアント（たとえば、分離株HIVIIIb、HIVSF2、HIV-1SF162、HIV-1SF170、HIVLAV、HIVLAI、HIVMN、HIV-1CM4235、HIV-1US4、多様なサブタイプの他のHIV-1株（たとえば、サブタイプAからGまで、およびO）、HIV-2株および多様なサブタイプ（たとえば、HIV-2UC1 およびHIV-2UC2）、ならびにサル免疫不全ウイルス（SIV））において対応する領域を、たとえば配列比較プログラム（たとえばBLASTおよび本明細書に記載のその他のもの）または構造的特徴の同定およびアラインメント（たとえば、n-sheet領域を特定することができる、本明細書に記載の「ALB」プログラムなどのプログラム）を用いて判定することができる。たとえば、Virology, 3rd Edition (W. K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2nd Edition (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds. 1991); Virology, 3rd Edition (Fields, B N, D M Knipe, P M Howley, Editors, 1996, Lippincott-Raven, Philadelphia, Pa.)を参照されたい。
【００６２】
一部の実施形態において、HIV糖タンパク質のバリアントを本発明に使用することができる。バリアントは、基準配列に類似しているが同一ではない配列を有するタンパク質を意味し、この場合バリアントタンパク質（またはバリアント核酸分子によりコードされるタンパク質）の活性は有意に変化していない。配列におけるこうした多様性は、自然に発生する多様性であることもあるが、当業者に周知の遺伝子工学の技術を用いて操作することもできる。そうした技術の例は、Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 9.31-9.57、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見いだされ、この2つは参考としてその全体が本明細書に組み入れられる。
【００６３】
バリアントに関して、結果として得られたバリアントタンパク質が、HIVに対する免疫応答を引き起こす能力を保持している限り、アミノ酸もしくは核酸配列におけるいかなるタイプの変化も受け入れられる。このような多様性の例には、欠失、挿入、置換、およびそれらの組み合わせがあるが、これに限定されない。たとえば、タンパク質に関して、当業者にはよく理解されるように、1つもしくは複数（たとえば2、3、4、5、6、7、8、9または10）のアミノ酸を、タンパク質の活性に有意な影響を及ぼすことなくそのタンパク質のアミノ末端および／またはカルボキシ末端から除去できることが多い。同様に、1つもしくは複数（たとえば2、3、4、5、6、7、8、9または10）のアミノ酸を、タンパク質の活性に有意な影響を及ぼすことなくそのタンパク質に挿入できることが多い。記載されるように、本発明のバリアントタンパク質は、本明細書に記載のHIV糖タンパク質に対してアミノ酸置換を含有することができる。タンパク質の活性が有意に影響されない限り任意のアミノ酸置換が許容される。これに関連して、当然のことながら、アミノ酸は、その物理的性質に基づいてグループに分類することができる。このようなグループの例には、荷電アミノ酸、非荷電アミノ酸、極性非荷電アミノ酸、および疎水性アミノ酸があるがそれに限定されない。置換を含有する好ましいバリアントは、アミノ酸が同一グループに属するアミノ酸で置換されたバリアントである。このような置換は、保存的置換と呼ばれる。当業者は、このようなアミノ酸置換が望ましい時に、望ましいアミノ酸置換を（保存的であるか否かにかかわらず）決定することができる。たとえば、HIV糖タンパク質の重要な残基を特定するために、または本明細書に記載のHIV糖タンパク質の免疫原性、溶解性、もしくは安定性を高める、もしくは低下させるために、アミノ酸置換を使用することができる。
【００６４】
HIV糖タンパク質およびそのバリアントを作製する方法は当技術分野で知られている。たとえば、さまざまなクローニングベクターおよび発現系が一般に、DNA Cloning: Vols. I & II; 米国特許第5,340,740号; Yeast Genetic Engineering (Barr et al., eds., 1989) Butterworths; Tomei et al., J. Virol. 67:4017-4026 (1993); および Selby et al., J. Gen. Virol. 74:1103-1113 (1993)に記載されている。
【００６５】
HIV糖タンパク質に由来する抗原を含んでなるワクチンの免疫原性は、タンパク質がT細胞応答を活性化することができる能力として測定することができる。たとえば、混合リンパ球反応を使用する、抗原に対するT細胞応答を測定する方法は、当業者によく知られている。米国特許第7,566,568号を参照されたい。当業者に広く知られている他の方法も、HIVに対するワクチンの免疫原性を測定するために使用することができる。
【００６６】
HPV
一部の実施形態において、本発明のウイルス抗原はヒトパピローマウイルス（HPV）に由来する。本発明は、使用されるHPVの型によっても、それに由来する免疫原性タンパク質によっても、限定されない。たとえば、ウイルス抗原は、HPV-1、HPV-2、HPV-5、HPV-6、 HPV-11、 HPV-18、HPV-31、HPV-45、HPV-52、およびHPV-58、ウシパピローマウイルス-1、ウシパピローマウイルス-2、ウシパピローマウイルス-4、ワタオウサギパピローマウイルス、またはアカゲザルパピローマウイルスに由来する可能性がある。一部の実施形態において、ウイルス抗原は、パピローマウイルスカプシドタンパク質L1および／またはL2に由来するアミノ酸配列を含有する。一部の実施形態において、ウイルス抗原は、パピローマウイルス早期抗原タンパク質E1、E2、E3、E4、E5、E6、およびE7、またはそれらの組み合わせに由来するアミノ酸配列を含有する。一部の実施形態において、ウイルス抗原は、免疫応答を引き起こすことができる、上記HPVタンパク質の1つもしくは複数の断片を含む。
【００６７】
一部の実施形態において、本発明のワクチン組成物は、少なくとも1種類のHPVのHPV L1、もしくはHPV L2、またはL1 + L2タンパク質を含んでなる。HPV L1、HPV L2、もしくはHPV L1 + L2タンパク質は、適当なプロモーターおよび他の適当な転写調節エレメントを含有する発現ベクターにL1、L2、もしくはL1 + L2 DNAを分子クローニングすることによって組換えにより発現させて、宿主の原核細胞もしくは真核細胞に移し、組換えタンパク質を生成させることができる。このような操作の技術は、Sambrookら (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989)) により詳述されており、これは参考として本明細書に含められる。
【００６８】
一部の実施形態において、HPV L1もしくはL2タンパク質のバリアントを本発明に使用することができる。バリアントは、基準配列に類似しているが同一ではない配列を有するタンパク質を意味し、この場合バリアントタンパク質（またはバリアント核酸分子によりコードされるタンパク質）の活性は有意に変化していない。配列におけるこうした多様性は、自然に発生する多様性であることもあるが、当業者に周知の遺伝子工学の技術を用いて操作することもできる。そうした技術の例は、Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 9.31-9.57、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見いだされ、この2つは参考としてその全体が本明細書に組み入れられる。
【００６９】
バリアントに関して、結果として得られたバリアントタンパク質が、HPVに対する免疫応答を引き起こす能力を保持している限り、アミノ酸もしくは核酸配列におけるいかなるタイプの変化も受け入れられる。このような多様性の例には、欠失、挿入、置換、およびそれらの組み合わせがあるが、これに限定されない。たとえば、タンパク質に関して、当業者にはよく理解されるように、1つもしくは複数（たとえば2、3、4、5、6、7、8、9または10）のアミノ酸を、タンパク質の活性に有意な影響を及ぼすことなくそのタンパク質のアミノ末端および／またはカルボキシ末端から除去できることが多い。同様に、1つもしくは複数（たとえば2、3、4、5、6、7、8、9または10）のアミノ酸を、タンパク質の活性に有意な影響を及ぼすことなくそのタンパク質に挿入できることが多い。記載されるように、本発明のバリアントタンパク質は、本明細書に記載のHPV L1もしくはL2タンパク質に対してアミノ酸置換を含有することができる。タンパク質の活性が有意に影響されない限り任意のアミノ酸置換が許容される。これに関連して、当然のことながら、アミノ酸は、その物理的性質に基づいてグループに分類することができる。このようなグループの例には、荷電アミノ酸、非荷電アミノ酸、極性非荷電アミノ酸、および疎水性アミノ酸があるがそれに限定されない。置換を含有する好ましいバリアントは、アミノ酸が同一グループに属するアミノ酸で置換されたバリアントである。このような置換は、保存的置換と呼ばれる。当業者は、このようなアミノ酸置換が望ましい時に、望ましいアミノ酸置換を（保存的であるか否かにかかわらず）決定することができる。たとえば、HPV L1もしくはL2タンパク質の重要な残基を特定するために、または本明細書に記載のHPV L1もしくはL2タンパク質の免疫原性、溶解性、もしくは安定性を高める、もしくは低下させるために、アミノ酸置換を使用することができる。
【００７０】
HPV L1およびL2タンパク質、ならびにそのバリアントを作製する方法は当技術分野で知られている。たとえば、米国特許第5,820,870号、およびKirii et al. Virology 185(1): 424-427 (1991)を参照されたい。
【００７１】
HPV抗原を含有するワクチンの免疫原性は、たとえば、中和抗体結合アッセイ（Surface Plasmon Resonance, Biacore）によって測定することができる。使用されるBiacoreの条件は、Mach et al. J. Pharm. Sci. 95: 2195-2206 (2006)に記載された通りとした。当業者に広く知られている他の方法も、HPVに対するワクチンの免疫原性を測定するために使用することができる。
【００７２】
単純ヘルペスウイルス
一部の実施形態において、本発明のウイルス抗原は、単純ヘルペスウイルス（HSV）、たとえば、HSV-1もしくはHSV-2に由来する。本発明は、使用されるHSVの型によっても、それに由来する免疫原性タンパク質によっても、限定されない。任意の既知のHSV株を本発明のワクチンに使用することができる。有用なHSV株の例としては、ATCCに寄託されたHSV株、たとえば、(1) HSV HF株 (ATCC VR-260; ヒトヘルペスウイルス1 ); (2) HSV  Maclntyre株 (ATCC VR-539; ヒトヘルペスウイルス1 ); (3) HSV MS株 (ATCC VR-540; ヒトヘルペスウイルス2); (4) HSV F株 (ATCC VR- 733; ヒトヘルペスウイルス1 ); (5) HSV G株 (ATCC VR-734; ヒトヘルペスウイルス2); (6) HSV MP株 (ATCC VR-735; ヒトヘルペスウイルス1、 単純ヘルペスウイルス1型の変異株); (7) HSVの変異株 (ATCC VR-1383; ヒトヘルペスウイルス1、単純ヘルペスウイルス1型の変異株); (8) HSV KOS株 (ATCC VR- 1493; ヒトヘルペスウイルス1 ; マイコプラズマ混入物を除去するためにMRA存在下で継代することによってATCC VR-1487から誘導された); (9) HSV ATCC- 201 1 -1株 (ATCC VR-1778; ヒトヘルペスウイルス1 ); (10) HSV ATCC-201 1 -2株 (ATCC VR-1779; ヒトヘルペスウイルス2); (11) HSV ATCC-201 1 -4株 (ATCC VR- 1781 ; ヒトヘルペスウイルス2); (12) HSV A5C株 (ATCC VR-2019; ヒトヘルペスウイルス1 x 2 (組換え体); 起源: 親株であるHSV-1 (17ts) およびHSV-2 (GPG)の交雑); (13) HSV D4E3株 (ATCC VR-2021 ; ヒトヘルペスウイルス1 x 2 (組換え体); 起源: 親株であるHSV-1 (KOStsE6) および HSV-2 (186tsB5)の交雑); (14) HSV C7D株 (ATCC VR-2022; ヒトヘルペスウイルス1 x 2 (組換え体); 起源: 親株であるHSV-1 (HFEMtsN102) およびHSV-2 (186)の交雑); (15) HSV D3E2株 (ATCC VR-2023; ヒトヘルペスウイルス1 x 2 (組換え体); 起源: 親株であるHSV-1 (KOStsE6) およびHSV-2 (186tsB5)の交雑); (16) HSV C5D株 (ATCC VR-2024; ヒトヘルペスウイルス1 x 2 (組換え体); 起源: 親株であるHSV-1 (HFEMtsN102) およびHSV-2 (186)の交雑; (17) HSV D5E1株 (ATCC VR-2025; ヒトヘルペスウイルス1 x 2 (組換え体); 起源: 親株であるHSV-1 (KOStsE6) およびHSV-2 (186tsB5)の交雑; ならびに(18) HSV D1 E1株 (ATCC VR-2026; ヒトヘルペスウイルス1 x 2 (組換え体); 起源: 親株であるHSV-1 (KOStsE6) およびHSV-2 (186tsB5)の交雑)があるがそれらに限定されない。
【００７３】
さらに、一部の実施形態において、本発明のワクチン中に含まれるウイルス抗原は、単純ヘルペスウイルス抗原gB、gC、gD、もしくはgE、またはそれらの組み合わせに基づくアミノ酸配列を含有する。HSVタンパク質もしくはポリペプチドのアミノ酸に対する言及は、McGeoch et al., J. Gen. Virol. 69:1531-1574 (1988)に記載の遺伝子配列情報に基づく。一部の実施形態において、HSV抗原は、これらのタンパク質の１つもしくは複数の断片を含む。HSV抗原は一般に、感染した細胞培養物から得られるウイルス分離株から抽出されるか、または合成もしくは組換えDNA法により作製される。HSV表面抗原は、化学的、遺伝学的、または酵素的方法によって修飾することが可能で、その結果、融合タンパク質、ペプチド、もしくは断片を生じる。米国特許第6,375,952号を参照されたい。HSV表面抗原は、任意の既知のHSV株から得られ、それらは上記の株を含むがそれらに限定されない。
【００７４】
本発明のHSV抗原は、断片が免疫原性であるならば、HSV gB、gC、gD、もしくはgEタンパク質の断片、たとえば欠失変異体、トランケーション変異体、オリゴヌクレオチド、およびペプチド断片を含むことができる。一部の実施形態において、本発明は、HSV gB、gC、gD、もしくはgEタンパク質の少なくとも1つに由来する複数の断片を含むことができる。当業者に理解され、さまざまな長さの断片を用いて実施されるアッセイで確認される通り、本発明の断片は、全長タンパク質の10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または95%を含むことができるが、ただしその断片は免疫応答を引き起こす能力を有することが条件である。
【００７５】
一部の実施形態において、HSV糖タンパク質のバリアントを本発明に使用することができる。バリアントは、基準配列に類似しているが同一ではない配列を有するタンパク質を意味し、この場合バリアントタンパク質（またはバリアント核酸分子によりコードされるタンパク質）の活性は有意に変化していない。配列におけるこうした多様性は、自然に発生する多様性であることもあるが、当業者に周知の遺伝子工学の技術を用いて操作することもできる。そうした技術の例は、Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 9.31-9.57、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見いだされ、この2つは参考としてその全体が本明細書に組み入れられる。
【００７６】
バリアントに関して、結果として得られたバリアントタンパク質が、HSVに対する免疫応答を引き起こす能力を保持している限り、アミノ酸もしくは核酸配列におけるいかなるタイプの変化も受け入れられる。このような多様性の例には、欠失、挿入、置換、およびそれらの組み合わせがあるが、これに限定されない。たとえば、タンパク質に関して、当業者にはよく理解されるように、1つもしくは複数（たとえば2、3、4、5、6、7、8、9または10）のアミノ酸を、タンパク質の活性に有意な影響を及ぼすことなくそのタンパク質のアミノ末端および／またはカルボキシ末端から除去できることが多い。同様に、1つもしくは複数（たとえば2、3、4、5、6、7、8、9または10）のアミノ酸を、タンパク質の活性に有意な影響を及ぼすことなくそのタンパク質に挿入できることが多い。記載されるように、本発明のバリアントタンパク質は、本明細書に記載のHSV糖タンパク質に対してアミノ酸置換を含有することができる。タンパク質の活性が有意に影響されない限り任意のアミノ酸置換が許容される。これに関連して、当然のことながら、アミノ酸は、その物理的性質に基づいてグループに分類することができる。このようなグループの例には、荷電アミノ酸、非荷電アミノ酸、極性非荷電アミノ酸、および疎水性アミノ酸があるがそれに限定されない。置換を含有する好ましいバリアントは、アミノ酸が同一グループに属するアミノ酸で置換されたバリアントである。このような置換は、保存的置換と呼ばれる。当業者は、このようなアミノ酸置換が望ましい時に、望ましいアミノ酸置換を（保存的であるか否かにかかわらず）決定することができる。たとえば、HSV糖タンパク質の重要な残基を特定するために、または本明細書に記載のHSV糖タンパク質の免疫原性、溶解性、もしくは安定性を高める、もしくは低下させるために、アミノ酸置換を使用することができる。
【００７７】
約100個未満のアミノ酸を有し、通常約50個未満のアミノ酸を有する、断片および他のバリアントを、当業者に周知の技術を用いて、合成法により作製することもできる。たとえば、このようなポリペプチドは、成長アミノ酸鎖にアミノ酸が順次付加される、Merrifield固相合成法などの市販の固相技術のいずれかを用いて合成することができる。Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2146-2149 (1963)を参照されたい。ポリペプチドの自動合成装置は、Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, Calif.)などのメーカーから発売されており、メーカーの説明書にしたがって稼働させることができる。
【００７８】
HSV糖タンパク質およびそのバリアントを作製する方法は、当技術分野で周知である。米国特許第8617564号を参照されたい。HSV抗原を含有するワクチンの免疫原性は、タンパク質マイクロアレイおよびELISPOT/ELISA技術などを含めて、さまざまな方法で測定することができる。米国特許第8617564号を参照されたい。手短に述べると、抗原もしくは抗原バリアントに結合する抗体の一連の希釈を、繰り返しサンプルにおいて行う。次に抗体に対する抗原の結合親和性をさまざまな濃度で測定する。その後、同じプロセスを、抗原を抗原バリアントに置き換えて実施する。二元分散分析（すなわち統計的検定）を行って、抗原と抗原性バリアントとの結果の差異の有意性を評価する。当業者に広く知られている他の方法も、HSVに対するワクチンの免疫原性を測定するために使用することができる。
【００７９】
ポックスウイルス
一部の実施形態において、本発明のウイルス抗原はポックスウイルスに由来する。本発明は、ポックスウイルスの型によっても、それに由来する免疫原性タンパク質によっても限定されない。任意の既知のポックスウイルス株を、本発明のワクチンに使用することができる。有用なポックスウイルス株の例としては、天然痘ウイルス（smallpox virus）、牛痘ウイルス、水牛痘ウイルス、ラクダ痘ウイルス、エクトロメリアウイルス、ゾウ痘ウイルス、ウマ痘ウイルス、サル痘ウイルス、ウサギ痘ウイルス、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、オオアレチネズミ痘ウイルス、ウアシン・ギシュー病ウイルス、ハタネズミ痘ウイルス、ワクシニアウイルス、および痘瘡ウイルス（variola virus）があるがそれらに限定されることはなく、これらのうち、ラクダ痘ウイルスは、ラクダ痘ウイルス 903株、ラクダ痘ウイルスCMG株、ラクダ痘ウイルスCMS株、ラクダ痘ウイルスCPl株、ラクダ痘ウイルスCP5株、ラクダ痘ウイルスM-96株のものがより好ましく、 牛痘ウイルスは、ブライトン・レッド（Brighton Red）株、GRI-90株、ハンブルク（Hamburg）-1985株もしくはトルクメニア（Turkmenia）-1974株のものがより好ましく、エクトロメリアウイルスは、ベロオリゾンテ（Belo Horizonte）ウイルス株もしくはモスクワ（Moscow）株のものがより好ましく、サル痘ウイルスは、コモンマーモセット（Callithrix jacchus）オルトポックスウイルス株、シエラレオネ（Sierra Leone） 70-0266株、ザイール（Zaire）-77-0666株のものがより好ましく、ウサギ痘ウイルスは、ユトレヒト（Utrecht）株のものがより好ましく、ワクシニアウイルスはアンカラ（Ankara）株、コペンハーゲン（Copenhagen）株、Dairen I株、IHD-J株、L-IPV株、LC16M8株、LCl 6MO株、Lister株、LIVP株、タシケント（Tashkent）株、Tian Tan株、WR 65-16株、WR株、Wyeth株のものがより好ましく、痘瘡ウイルスは、大痘瘡ウイルスもしくは小痘瘡ウイルスであることがより好ましく、またはそれらの抗原性アナログである。
【００８０】
一部の実施形態において、ウイルス抗原は、上記の任意の株に由来するポックスウイルスタンパク質IMVもしくはポックスウイルスタンパク質EEVのアミノ酸配列を含有する。細胞内成熟ウイルス（IMV）は、細胞に付着して感染するのに有効であるのに対して、ウイルスの細胞外（EEV）型は、細胞から盛んに分泌され、in vitroおよびin vivoでのウイルスの効率的な播種に役立つ。一部の実施形態において、ウイルス抗原は、L1R、A27L、A3L、A10L、A12L、A13L、A14L、A17L、D8L、H3L、L4R、G7L、および15Lからなる群から選択されるIMV抗原である。一部の実施形態において、ウイルス抗原は、A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、およびF13Lからなる群から選択されるEEV抗原である。タンパク質の配列は、Parkinson, et. al, Virology, 204: 376-90 (1994)、およびSalmons, et al. Virology, 71:7404-7420 (1997)、ならびに米国特許出願2010/0119524に記載されている。一部の実施形態において、ウイルス抗原はこれらのタンパク質のいずれかの組み合わせを含む。一部の実施形態において、ウイルス抗原はこれらのタンパク質のいずれかの断片を含むが、ただし断片は免疫応答を引き起こすことができることが条件である。
【００８１】
一部の実施形態において、ポックスウイルス抗原のバリアントを本発明に使用することができる。バリアントは、基準配列に類似しているが同一ではない配列を有するタンパク質を意味し、この場合バリアントタンパク質（またはバリアント核酸分子によりコードされるタンパク質）の活性は有意に変化していない。配列におけるこうした多様性は、自然に発生する多様性であることもあるが、当業者に周知の遺伝子工学の技術を用いて操作することもできる。そうした技術の例は、Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 9.31-9.57、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見いだされ、この2つは参考としてその全体が本明細書に組み入れられる。
【００８２】
バリアントに関して、結果として得られたバリアントタンパク質が、ポックスウイルスに対する免疫応答を引き起こす能力を保持している限り、アミノ酸もしくは核酸配列におけるいかなるタイプの変化も受け入れられる。このような多様性の例には、欠失、挿入、置換、およびそれらの組み合わせがあるが、これに限定されない。たとえば、タンパク質に関して、当業者にはよく理解されるように、1つもしくは複数（たとえば2、3、4、5、6、7、8、9または10）のアミノ酸を、タンパク質の活性に有意な影響を及ぼすことなくそのタンパク質のアミノ末端および／またはカルボキシ末端から除去できることが多い。同様に、1つもしくは複数（たとえば2、3、4、5、6、7、8、9または10）のアミノ酸を、タンパク質の活性に有意な影響を及ぼすことなくそのタンパク質に挿入できることが多い。記載されるように、本発明のバリアントタンパク質は、本明細書に記載のポックスウイルス抗原に対してアミノ酸置換を含有することができる。タンパク質の活性が有意に影響されない限り任意のアミノ酸置換が許容される。これに関連して、当然のことながら、アミノ酸は、その物理的性質に基づいてグループに分類することができる。このようなグループの例には、荷電アミノ酸、非荷電アミノ酸、極性非荷電アミノ酸、および疎水性アミノ酸があるがそれに限定されない。置換を含有する好ましいバリアントは、アミノ酸が同一グループに属するアミノ酸で置換されたバリアントである。このような置換は、保存的置換と呼ばれる。当業者は、このようなアミノ酸置換が望ましい時に、望ましいアミノ酸置換を（保存的であるか否かにかかわらず）決定することができる。たとえば、ポックスウイルス抗原の重要な残基を特定するために、または本明細書に記載のポックスウイルス抗原の免疫原性、溶解性、もしくは安定性を高める、もしくは低下させるために、アミノ酸置換を使用することができる。
【００８３】
ポックスウイルス抗原およびそのバリアントを作製する方法は当業者に知られている。米国特許出願2010/0119524を参照されたい。ポックスウイルス抗原を含有するワクチンの免疫原性は、ELISAを含めて、さまざまな方法で測定することができる。米国特許出願公開番号2010/0119524を参照されたい。簡単に述べると、抗原もしくは抗原バリアントに結合する抗体の一連の希釈を、繰り返しサンプルにおいて行う。次に抗体に対する抗原の結合親和性をさまざまな濃度で測定する。その後、同じプロセスを、抗原を抗原バリアントに置き換えて実施する。二元分散分析（すなわち統計的検定）を行って、抗原と抗原バリアントとの結果の差異の有意性を評価する。当業者に広く知られている他の方法も、ポックスウイルスに対するワクチンの免疫原性を測定するために使用することができる。
【００８４】
本発明で検討された抗原を表1にまとめる。
【表１】
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【００８５】
粒子
本明細書に記載される「粒子」は、その中に薬剤を含有することができて、その薬剤がその構造から外に出ることも可能にする任意の中空で多孔質の構造を表す。本発明の粒子は、粗い表面、滑らかな表面、角のある表面、または鋭いエッジを有していてもよく、その形が規則的でも不規則でもよい。粒子の形はたとえば、微小球体、棒状、または管状などであるが、それに限定されない。粒子材料は、米国特許第5,407,609号に記載されるような具体例の材料を含めて、さまざまな粒子のいずれかを含むことができる。生体適合性材料が、患者への投与を含む使用には好ましい。生分解性材料も好ましく、これはたとえば、ポリ(ラクト-co-グリコリド) (PLG)、ポリ(ラクチド)、ポリ(グリコリド)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ヒドロキシ酪酸)および／またはその共重合体などである。あるいはまた、粒子は別の材料を含有することもできる。適切な他の材料には、ポリ(ジエン)、たとえばポリ(ブタジエン)など；ポリ(アルケン)、たとえばポリエチレン、ポリプロピレンなど；ポリ(アクリル)、たとえばポリ(アクリル酸)など；ポリ(メタクリル)、たとえばポリ (メタクリル酸メチル)、ポリ(メタクリル酸ヒドロキシエチル)など；ポリ(ビニルエーテル)；ポリ(ビニルアルコール)；ポリ(ビニルケトン)；ポリ(ハロゲン化ビニル)、たとえばポリ(塩化ビニル)など；ポリ(ビニルニトリル)、ポリ(ビニルエステル)、たとえば ポリ(酢酸ビニル)など；ポリ(ビニルピリジン)、たとえばポリ(2-ビニルピリジン)、ポリ(5-メチル-2-ビニルピリジン)など；ポリ(カーボネート)；ポリ(エステル)；ポリ(オルトエステル)；ポリ(エステルアミド)；ポリ(酸無水物)；ポリ(ウレタン)；ポリ(アミド)；セルロースエーテル、たとえばメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど；セルロースエステル、たとえば酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、酢酸酪酸セルロースなど；多糖、タンパク質、 ゼラチン、デンプン、ゴム、樹脂などがあるが、これらに限定されない。これらの材料は単独で使用することができるが、物理的な混合物（ブレンド）として、または共重合体として使用することもできる。好ましい実施形態において、粒子材料は、樹状細胞を含めた単球によって粒子が貪食されうるような、中空または多孔質の構造を有する。
【００８６】
一部の実施形態において、本発明の粒子のサイズは、1-25μm、好ましくは1-5μm、5-10μm、10-15μm、15-20μm、15-25μm、または20-25μmである。一部の実施形態において、本発明の粒子のサイズは約0.5〜約5μmであって、細菌の大きさに近いので、粒子が樹状細胞などの単球に取り込まれることが可能となる。具体的な実施形態において、粒子のサイズは約0.5〜約1μmである。特定の実施形態において、粒子のサイズは約0.5〜約2.5μmである。一部の実施形態において、粒子は、そのサイズが約0.5〜約5μmである限り、グリカンネットワークを有する任意の粒子とすることができる。
【００８７】
酵母細胞壁粒子
好ましい実施形態において、本発明の粒子は酵母細胞壁粒子YCWPであって、これは、粒子がその中に抗原を封入できる中空もしくは多孔質の構造を有するように、酵母細胞壁から調製される。ある実施形態において、YCWPは出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）から調製される。別の実施形態において、YCWPは、単核食細胞系の細胞および他の食細胞が通常取り込む微生物構造の大きさに近い。個別の実施形態において、YCWPは約1-25μm、好ましくは1-5μm、5-10μm、10-15μm、15-20μm、15-25μmまたは20-25μmである。たとえば、YCWPは約20μmである。
【００８８】
ある実施形態において、YCWPは、(a) 酵母を懸濁して懸濁液を作製すること、(b) 懸濁液をインキュベートすること、(c) 懸濁液を遠心分離して上清を除去すること、ならびに(d) 得られたYCWPを回収することによって調製される。別の実施形態において、ステップ(a)-(d)を少なくとも1、2、3、もしくは4回繰り返す。
【００８９】
もう1つの実施形態において、YCWPは、(a) 酵母を溶液中に懸濁して、第1の懸濁液を作製すること、(b) 第1の懸濁液をインキュベートすること、(c) 第1の懸濁液を遠心分離して上清を除去すること、(d) 得られたペレットを懸濁して、第2の懸濁液を作製すること、(e) 第2の懸濁液をインキュベートすること、(f) 第2の懸濁液を遠心分離して上清を除去すること、ならびに(g) 得られたペレットを洗浄してYCWPを回収することによって調製される。別の実施形態において、YCWPは滅菌される。
【００９０】
具体的な実施形態において、酵母は1M NaOHなどのNaOH中に懸濁される。具体的な実施形態において、第1の懸濁液は、約80℃において約1時間もしくは1時間インキュベートされる。具体的な実施形態において、遠心分離は、約2000×gで約10分間、または2000×gで10分間行われる。具体的な実施形態において、ペレットは、約pH 4.5もしくはpH 4.5の水などの、水中に懸濁される。具体的な実施形態において、第2の懸濁液は、約55℃で約1時間、または55℃で1時間インキュベートされる。具体的な実施形態において、ペレットは、水で少なくとも1、2、3、もしくは4回洗浄される。具体的な実施形態において、ペレットは1回洗浄される。
【００９１】
別の実施形態において、YCWPは、ペレットの洗浄後イソプロパノールおよび／またはアセトンを用いて滅菌される。具体的な実施形態において、他の既知のアルコールも適している。具体的な実施形態において、YCWPは、滅菌後に完全に乾燥してもよい。別の実施形態において、YCWPは、乾燥させたのち再懸濁される。具体的な実施形態において、YCWPは1X PBSなどのPBS中に再懸濁される。
【００９２】
別の実施形態において、YCWPは、抗原をYCWP内に入れ込む前に、ならびに／または、ケイ酸エステルでキャッピングする前に、YCWPを使用前に保存しておくために、乾燥させて、その後凍結してもよい。具体的な実施形態において、YCWPは凍結乾燥され、約4℃以下で保存される。具体的な実施形態において、YCWPは凍結乾燥され、4℃で保存される。
【００９３】
別の実施形態において、充填された酵母細胞壁粒子は、ケイ酸エステルでキャッピングされる。具体的には、一部の実施形態において、充填されたYCWPは、YCWLをオルトケイ酸テトラアルキルなどのケイ酸エステルと、アンモニアの存在下で接触させることによってキャッピングされ、充填されたYCWPはケイ酸エステルで覆われる。好ましい実施形態において、充填されたYCWPは、約60分、約45分、約30分、約15分、約10分、約5分または約2分以内にケイ酸エステルでキャッピングされる。オルトケイ酸テトラアルキルの反応性は、アンモニアによる加水分解条件下で、オルトケイ酸テトラアルキルがYCWPのβグルカン構造の第1級ヒドロキシル基と反応する反応性である。オルトケイ酸テトラアルキルはまた、上記の細胞壁ケイ酸エステルの末端と自己反応して、-O-Si(OH)2-O-のような、または -O-Si(-O-Si-O-)(OH)-O- もしくは -Si(-O-Si-O-)2-O-のような3次元の、「ブリッジ」を形成する。これらのブリッジは、YCWPの細孔を横切って生じ、入れ込まれた薬物もしくは抗原の内部保持が高められる可能性がある。このような、キャッピングされ充填されたYCWPを凍結乾燥することができる。
【００９４】
本出願の発明者らは、思いがけず、ケイ酸エステルでキャッピングされた充填YCWPが有効なワクチンデリバリーシステムであることを発見した。より詳細には、キャッピングされたYCWPは、キャッピングされないYCWPより多くの充填物質を保持する。さらに驚くべきことには、キャッピングされたYCWPは、キャッピングされないYCWPよりも、有意に多くの放出された抗原を食細胞の細胞質内に送達するだけでなく、有意に多くの充填粒子を食細胞内に送達する。
【００９５】
抗原を充填された酵母細胞壁粒子
ある実施形態において、抗原、および粒子懸濁液、たとえば酵母細胞壁粒子懸濁液を合わせてインキュベートして、抗原を粒子内部の中空に浸透させることによって、抗原は粒子内に充填される。
【００９６】
別の実施形態において、粒子もしくは酵母細胞壁粒子が抗原とともにインキュベートされ、または抗原で充填された後、その組み合わされたものを凍結乾燥して、粒子内の無水ワクチンを作製する。凍結乾燥によって、抗原は粒子内に捕捉され、樹状細胞などの単球によっていつでも貪食される準備が整う。具体的な実施形態において、凍結乾燥は、抗原を粒子内に捕捉するために使用される唯一のメカニズムである。具体的な実施形態において、捕捉は、抗原が粒子から出るのを阻止する別の要素、たとえば、物理的な捕捉、疎水結合、任意の他の結合によるものではない。具体的な実施形態において、捕捉は、架橋結合によるものではなく、凍結乾燥によって生じる可能性のあるあらゆる結合を除いて、抗原と粒子とのその他の結合によるものでもない。具体的な実施形態において、本発明の組成物は、リソソームを避けるのを特に助けるような追加の成分を含まない。抗原は、たとえば、特定のタンパク質もしくはその断片、核酸、炭水化物、腫瘍溶解物、またはそれらの組み合わせを含む。
【００９７】
別の実施形態において、抗原は、酵母細胞壁粒子内に組み込まれる。具体的な実施形態において、YCWPの数は約1 x 109個であり、抗原の体積は約50μLである。具体的な実施形態において、インキュベーションは約4℃にて約1時間、もしくは1時間未満である。一部の実施形態において、YCWPと抗原とを組み合わせたのものを、約2時間もしくは2時間未満の間にわたって凍結乾燥する。
【００９８】
別の実施形態において、充填された粒子は、凍結乾燥後、希釈液もしくは溶液中に再懸濁される。具体的な実施形態において、希釈液もしくは溶液は水である。具体的な実施形態において、充填された粒子は、追加の抗原、たとえばワクチンとともに再懸濁および／またはインキュベートされ、粒子に浸透するようにして、その組み合わされたものを再度凍結乾燥する。他の実施形態において、組み合わされたものは、複数回の凍結乾燥および再懸濁に供される。他の実施形態において、抗原充填粒子は、凍結乾燥後、使用の前に、エタノール中で滅菌される。
【００９９】
具体的な実施形態において、抗原は、(a) 抗原および粒子懸濁液をインキュベートし、生物学的粒子が粒子内部の隙間に浸透できるようにして、充填された粒子の懸濁液を凍結乾燥すること、ならびに(b) 適宜、粒子を再懸濁し、再懸濁された粒子をインキュベートして、再懸濁された粒子、およびまだ粒子内に入っていないワクチンを凍結乾燥すること、によって粒子内に充填される。
【０１００】
YCWPを使用する具体的な実施形態において、YCWPの数は約1 x 109個、抗原の体積は約50μLである。具体的な実施形態において、YCWPの数は1 x 109個、抗原の体積は50μLである。具体的な実施形態において、ステップ(a)のインキュベーションは、約4℃にて1時間未満である。具体的な実施形態において、ステップ(a)のインキュベーションは、4℃にて約1時間である。一部の実施形態において、前記懸濁液は、ステップ(a)において、2時間未満もしくは約2時間にわたって凍結乾燥される。一部の実施形態において、YCWPは、ステップ(b)において、約50μLの水もしくは50μLの水などの、水中に再懸濁される。一部の実施形態において、再懸濁されたYCWPはステップ(b)において、1時間未満もしくは約1時間のあいだ約4℃にて、または2時間未満もしくは約2時間のあいだ4℃にて、インキュベートされる。
【０１０１】
投与の前に、キャッピングされた充填酵母細胞壁粒子は、製薬上許容される添加剤、たとえばPBSもしくは生理食塩水など、に再懸濁される。
【０１０２】
YCWP充填粒子を作製する方法
(1) 抗原の調製
ペプチドなどの合成抗原は、商業的に容易に製造され、凍結乾燥状態で提供される。こうしたペプチドを再構成して、充填するために、調製された酵母細胞壁粒子（YCWP）とともに同時にインキュベートすることができる。同様に、組換えタンパク質および／または分離されたタンパク質を溶液中に懸濁し、以下に検討するように、充填のためにYCWPとともに同時にインキュベートすることができる。
【０１０３】
(2) 酵母細胞壁粒子の調製
YCWPは、Fleishmansパン酵母または同等のものから調製することができる。簡単に述べると、Fleishmansパン酵母10 gを100 mlの1 M NaOH中に懸濁し、1時間80℃に加熱した。未溶解の酵母細胞壁を2000 x gにて10分間の遠心分離により回収した。回収された酵母細胞壁を次に、HClでpHを4.5に調整した水100 mlに再懸濁し、さらに1時間55℃にてインキュベートした後、遠心分離により回収した。回収されたYCWPを次に、水で1回洗浄し、イソプロパノールで4回、最後にアセトンで2回洗浄した。YCWPを完全に乾燥させたら、それをPBSに再懸濁し、計数して、粒子1 x 109個の集団に分割し、ワクチン製造に使用するために凍結乾燥した。
【０１０４】
(3) 抗原のYCWPへの充填
完全に無水のYCWP（1 x 109）の懸濁液を、4℃にて2時間、PBS中のペプチド50μLと接触させて、ペプチドがYCWP内部の隙間に浸透できるようにしておき、充填されたYCWPを作製する。その後、懸濁液を2時間凍結乾燥する。凍結乾燥後、水50μLを充填されたYCWPに添加し、さらに2時間4℃にてインキュベートして、再度凍結乾燥し、粒子内部の空隙に乾燥抗原を有するYCWPを得る。充填されたYCWPを次に、エタノールで洗浄することによって滅菌し、エタノール中に保存する。
【０１０５】
(4) ケイ酸でキャッピングされたYCWPの調製
関連する態様において、本発明は、ワクチンを効果的に被験体に送達するための方法に関するが、その方法は、被験体の真皮に直接、(i) 粒子、および(ii) 抗原を含有する組成物を投与することを含み、その抗原はタンパク質、ペプチド、エピトープ、またはそれらの免疫原性断片、もしくはサブユニットから選択され、上記のように粒子内に充填されている。真皮樹状細胞は、充填された粒子を貪食し、それによってワクチンに対する免疫応答の引き金を引く。
【０１０６】
具体的な実施形態において、前記の方法はさらに、(a) 抗原充填粒子を溶液中に再懸濁すること、ならびに(b) ステップ(iii)の前に再懸濁溶液を凍結乾燥することを含む。抗原は、タンパク質、ペプチド、エピトープ、またはその免疫原性断片もしくはサブユニットを含む。
【０１０７】
具体的な実施形態において、ステップ(iii)は、(a) 抗原を酵母細胞壁粒子に加えること、(b) その酵母細胞壁粒子をインキュベートすること、(c) 酵母細胞壁粒子を凍結乾燥すること、ならびに(d) 酵母細胞壁を洗浄することを含むが、この抗原は、タンパク質、ペプチド、エピトープ、またはその免疫原性断片もしくはサブユニットを含み、ステップ(b)-(c)は、ステップ (b)を繰り返す前に、酵母細胞壁粒子に水を加えるステップを伴って、少なくとも1回繰り返して行われる。
【０１０８】
酵母細胞壁粒子（YCWP）は、上記の例に記載のように調製され、ペプチドを充填された。YCWP 1 mgにペプチド500μgを充填した。その後、凍結乾燥された充填YCWPを無水エタノール1 mlに懸濁し、その懸濁液に、オルトケイ酸テトラエチル100μlおよび10%アンモニア水100μlを添加した。混合物を室温にて15分間緩やかに振盪した。次にYCWPを無水エタノールで十分に洗浄し、使用するまで4℃にてエタノール中で保存した。
【０１０９】
(5) 充填YCWPの被験体への投与
上記の例にしたがって調製された充填YCWPは、滅菌条件下で、注射に適した溶液1 mlに再懸濁されるが、この溶液は例えば、注射用滅菌水もしくは注射用滅菌生理食塩水であって、これは場合によっては、5%ヒト血清アルブミンを含有する。充填されたYCWPを慎重に再懸濁したら、注射器を用いて全量を吸引し、患者の真皮に注射する。
【０１１０】
ワクチン組成物の他の成分
アジュバント
本発明はまた、免疫応答を増強するために1つもしくは複数のアジュバントを含んでいてもよい。アジュバントの例には、ヘルパーペプチド；アルミニウム塩、たとえば水酸化アルミニウムゲル（アラム）もしくはリン酸アルミニウム；フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Difco Laboratories, Detroit, Mich.）；Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.)；AS-2 (Smith-Kline Beecham)；QS-21 (Aquilla)；MPL（登録商標）免疫賦活薬もしくは3d-MPL (Corixa Corporation)；LEIF；カルシウム、鉄、もしくは亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオンもしくはアニオンで誘導体化された多糖；ポリホスファゼン；アミノアルキルグルコサミニドホスフェート(ACP)；イソツカレソール；モノホスホリルリピドAおよびQuil A；ムラミルトリペプチドホスファチジルエタノールアミンもしくは免疫賦活複合体、たとえばサイトカイン（たとえば、GM-CSFまたはインターロイキン-2、-7もしくは-12)、および免疫賦活性DNA配列などがあるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、アジュバントは、モノホスホリルリピドA、CpGオリゴヌクレオチド、ポリI:C、ポリICLC、強力なMHC IIエピトープペプチド、ならびに樹状細胞刺激サイトカイン、たとえばIL-12、IL-2、およびGM-CSFなど、からなる群から選択される。
【０１１１】
製薬上許容される塩
本発明は、1つもしくは複数の製薬上許容される塩を含むことができる。「製薬上許容される塩」は、親化合物の望ましい生物学的活性を保持し、望ましくない毒性効果を与えない塩を意味する。こうした塩の例としては、(a) たとえば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などの、無機酸で形成される酸付加塩；および、たとえば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などの、有機酸で形成される塩；(b) たとえば、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどの、多価金属カチオンとの塩；もしくは(c) N,N’-ジベンジルエチレンジアミンもしくはエチレンジアミンから形成される有機カチオンで形成される塩；または(d) (a)および(b)または(c)の組み合わせ、たとえばタンニン酸亜鉛などがあるがそれに限定されない。好ましい酸付加塩は、トリフルオロ酢酸塩および酢酸塩である。
【０１１２】
製薬上許容される基剤
本発明はまた、1つもしくは複数の製薬上許容される基剤を含むことができる。「製薬上許容される基剤」には、活性成分と混合したときに、その成分が生物学的活性を保持できるようにし、被験体の免疫系と反応しない、任意の物質が含められる。例としては、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルションなどのエマルション、およびさまざまなタイプの湿潤剤などの標準的な医薬基剤がいずれも挙げられるがそれらに限定されない。エアゾール剤もしくは非経口投与に好ましい希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水または生理的（0.90%）食塩水である。このような基剤を含有する組成物は、よく知られた従来の方法で調剤される（たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Chapter 43, 14th Ed., Mack Publishing Co, Easton Pa. 18042, USAを参照されたい。）。
【０１１３】
治療の方法
本発明は、これまでワクチン戦略の標的となったウイルス性、細菌性、および寄生虫性疾患などの感染性疾患、または現在のワクチン技術の限界によりわずかに感染しやすい疾患のために、本明細書に記載の組成物を予防にも治療にも使用することを検討する。本発明は、患者への投与によって、特定の抗原に対する有効な免疫応答を引き起こすこと、ならびに／または、疾患もしくは感染による症状および／もしくは合併症を、緩和し、軽減し、治癒させ、または少なくとも一部を抑えることができる。治療される疾患は特に限定しないが、粒子に充填された抗原によって決まる。
【０１１４】
本発明の組成物は食細胞を誘引するが、これはたとえば単核食細胞系の細胞であって、単球、マクロファージ、樹状細胞、または未成熟樹状細胞などを含んでおり、したがってワクチンとして使用することができる。ワクチン接種の分野で、単核食細胞系の細胞は「プロフェッショナルな」抗原提示細胞とみなされるので、ワクチンデリバリーの理想的な標的である。APCにおける抗原の提示は、強い細胞性免疫応答を生じさせることに関して、ほかのどの細胞型におけるこの同一抗原の発現よりも大いに有効であることは周知である。したがって、本発明の組成物がクラスIおよびクラスIIのMHC分子を介して抗原提示細胞上に抗原を提示することができることは、このようなワクチンの有効性を劇的に高める。
【０１１５】
本発明の組成物は、in vivoもしくはin vitroで食細胞と接触する。したがって、in vivo法もin vitro法も検討される。In vivo法については、本発明の組成物は概して非経口で、通常は静脈内、筋肉内、皮下、皮内下、もしくは皮内に投与される。組成物は、たとえば、ボーラス注射または持続注入で投与することができる。In vitro法では、単核球細胞を体外で接触させてから、その接触させた細胞を患者に非経口投与する。
【０１１６】
製剤
本発明の組成物は、粘膜投与（たとえば、鼻内および吸入投与）用に、または経皮投与用に製剤することができる。本発明の組成物は、非経口投与（たとえば、筋肉内、静脈内、または皮下注射）用に製剤して、直接、患者に注入し、マクロファージおよび樹状細胞のような単球起源の細胞を標的とすることもできる。具体的な実施形態において、キャッピングされた充填粒子は、樹状細胞とともに事前にインキュベートすることなしに、直接患者の真皮に注入される。したがって、本発明の組成物は、まさに従来のワクチンのように投与することができる。また、これは要求される技術レベルが低いのでコストを減少させる。他の実施形態において、キャッピングされた充填粒子は最初に、患者に投与する前に、樹状細胞などの単球起源の細胞とともにインキュベートされる。
【０１１７】
注射用製剤は、たとえばアンプルなどの単回投与剤形として、または複数回投与容器として、適宜、添加される保存剤とともに、提供することができる。組成物は、油性もしくは水性溶媒中の懸濁液、溶液またはエマルションなどの形をとることができるが、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの調合剤を含有してもよい。本発明の組成物はまた、製薬上許容される添加剤を用いて製剤することができる。このような添加剤は当技術分野で周知であるが、典型的には、生理的に許容される水溶液ということになる。生理的に許容される溶液とは、本質的に毒性のない溶液である。好ましい添加剤は、不活性であるかまたは増強的であるが、免疫寛容誘発反応を達成するために抑制的な化合物が使用されることもある。
【０１１８】
投与量
患者に投与される用量は、本発明の文脈において、患者において長期的に有益な治療反応を生じさせ、または感染による感染症もしくは疾患を抑制するのに十分となるべきである。したがって、組成物は、特定の抗原に対する有効な免疫応答を引き起こすのに十分な量で、ならびに／または、疾患もしくは感染による症状および／もしくは合併症を緩和し、軽減し、治癒させ、または少なくとも一部を抑えるのに十分な量で、患者に投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療上有効な用量」と定義される。
【０１１９】
一部の実施形態において、有効な用量もしくは単回投与量は、被験体の体重kg当り、たとえば、約103〜約1013、104〜約108、105〜約5 x 107、または約108〜約1012個の酵母細胞壁粒子を含有することができる。1回用量は、約1〜500μg、約500〜1,000μg、約1 mg〜500 mg、約500 mg〜1,000 mg、または約1〜10 gの抗原を含有することができる。望ましい防御もしくは治療のレベルをもたらす必要に応じて、複数回投与を用いることができる。たとえば、真核生物の防御を維持するために、時間が経つにつれて1回もしくは複数回のブースターが必要となることがある。ブースターは、たとえば、5-20、5-10日ごとに、1週間おき、2週間おき、3週間おき、毎月もしくは数か月ごとに、投与することができる。ブースターは、数回、たとえば、2、3、4、5、1、9、10回以上投与することができる。ブースターは、初回投与の1月もしくは数か月後、または数年後に投与することもできる。
【０１２０】
一部の実施形態において、充填粒子もしくはキャッピングされ充填酵母細胞壁粒子を含有する10 x 106濃度の樹状細胞約200μLが、1回分の治療用量となる。別の実施形態において、用量は、その用量を被験体に投与する前に分量200μLを最終容量1 mlに希釈することによって投与される。具体的な実施形態において、その分量は、5%ヒト血清アルブミンを含有する滅菌生理食塩水で希釈される。具体的な実施形態において、分量200μLは希釈前に解凍するために必要となる。このような状況において、解凍から1回分の被験体への投与までの時間の長さは2時間を超えない。一部の実施形態において、希釈された分量は、3cc注射器で投与される。一部の実施形態において、23ゲージ程度の注射針が使用される。
【０１２１】
アジュバントの量に関して、ある実施形態では、1つもしくは複数の免疫応答増強アジュバントの量は、少なくとも約10 ng、少なくとも約50 ng、少なくとも約100 ng、少なくとも約200 ng、少なくとも約300 ng、少なくとも約400 ng、少なくとも約500 ng、少なくとも約600 ng、少なくとも約700 ng、少なくとも約800 ng、少なくとも約900 ng、少なくとも約1μg、少なくとも約5μg、少なくとも約10μg、少なくとも約15μg、少なくとも約20μg、少なくとも約25μg、少なくとも約30μg、少なくとも約35μg、少なくとも約40μg、少なくとも約45μg、少なくとも約50μg、少なくとも約60μg、少なくとも約70μg、少なくとも約80μg、少なくとも約90μg、または少なくとも約100μgである。ある実施形態において、アジュバントの量は組成物の1-10%の間に相当する。アジュバントの量は、樹状細胞上の、Toll様受容体などの受容体を刺激するのに十分である。
【０１２２】
投与
本発明のワクチンは、典型的には、非経口（たとえば、静脈内、皮下、および筋肉内）または他の従来の直接経路、たとえば、口腔／舌下、直腸、経口、経鼻、局所（経皮および眼）、膣内、経肺、動脈内、腹腔内、眼内、もしくは鼻内経路で、または個別の組織内に直接、in vivo投与される。本明細書に記載の、またはそれ他の当技術分野で周知の、投与経路の多くによる投与は、一回または複数回の時点において、針、カテーテルもしくは関連デバイスを用いた直接投与によって簡単に遂行することができる。一部の実施形態において、被験体は、本発明の組成物の少なくとも1、2、3、もしくは4回投与量を投与される。具体的な実施形態において、被験体は、4週間に1回、再接種される。一部の実施形態において、充填粒子を含有する組成物は、最初に樹状細胞に融合することなく、被験体に投与される。具体的な実施形態において、被験体は4週間に1回、組成物の再投与を受ける。具体的な実施形態において、充填粒子、もしくはキャッピングされた充填粒子を含有する約1-2百万個の樹状細胞が、各回のワクチン接種において適宜注射により投与される。具体的な実施形態において、充填粒子、もしくはキャッピングされた充填粒子は、(1)感染もしくは疾患部位または(2)リンパ節において、またはその近傍において、被験体に注入される。
【０１２３】
ワクチン接種有効性のアッセイ
本明細書に記載のワクチンによる予防接種の有効性は、いくつかの方法で判定することができる。
【０１２４】
ワクチンの有効性は、さまざまなモデル系でアッセイすることができる。適当なモデル系には、以下の実施例に記載のように、モルモットモデルおよびマウスモデルなどがある。簡単に述べると、動物は、ワクチン接種を受けたのち、ウイルスもしくは細菌に暴露される。すでに感染した動物にワクチンを投与してもよい。その後、動物の反応を対照動物と比較する。同様のアッセイを、ヒトの臨床試験のために用いることができる。本出願に記載の治療および予防効果は、ワクチンの有効性を判定するさらにほかの方法を示す。
【０１２５】
ワクチン有効性はさらに、in vitroでウイルス中和アッセイによって判定することができる。簡単に述べると、動物を免疫化し、血清を免疫化後さまざまな日に採取する。血清の段階希釈物をウイルスとともにプレインキュベートし、その間に、ウイルスに特異的な血清中の抗体がウイルスと結合する。次に、ウイルス／血清混合物を許容細胞に添加し、プラークアッセイによって感染性を判定する。血清中の抗体がウイルスを中和したならば、対照群よりプラークが少なくなる。
【０１２６】
（実施例）
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、この実施例はけっして制限的に解釈されるべきでない。
【実施例１】
【０１２７】
髄膜炎菌（N. meningitidis）由来組換えタンパク質を充填した酵母細胞壁粒子によるマウスの免疫化
髄膜炎菌血清型AおよびBに由来する、脂質付加されたタンパク質LP2086の2つのバリアント、A05およびB01を、YCWPに充填する細菌抗原として使用した。具体的には、等量の組換えタンパク質A05およびB01（それぞれ10μg）を混合した後、酵母細胞壁粒子に入れ込んで、C57マウスに皮下注射した。10μg A05タンパク質 + 10μg B01タンパク質に相当する投与量を、免疫化のために各マウスに注射した。14日後、同じ用量の2回目の注射をそれぞれのマウスに行った。2回目の注射の14日後に、各マウスの尾部から血清を採取した。通常の免疫化対照として、10μg A05タンパク質および10μg B01タンパク質および同量の市販のアラムアジュバント（Imject Alum, Thermo scientific）を、充填された酵母細胞壁粒子で免疫化されたマウスと同じスケジュールで、別の一群のC57マウスに注射した。ワクチン接種なしのマウスから得られた血清を対照として使用した。
【０１２８】
酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）を行って、A05タンパク質およびB01タンパク質に対する抗体価を測定した。具体的には、96ウェルCosterプレートを、100μl組換えタンパク質A05およびB01を用いて、それぞれ10μg/mlの濃度で4℃にて一晩インキュベートすることによりコーティングした。洗浄およびブロッキング後、さまざまな希釈度のマウス由来血清100μlを各ウェルに添加した。アルカリホスファターゼ結合二次抗体およびTMB基質を発色のために使用した。450 nmにおけるODをELISAリーダーで記録した。
【０１２９】
図1および2に示す結果は、組換えタンパク質A05およびB01を充填したYCWPが、アジュバントとともに用いた組換えタンパク質よりも強い抗体反応を誘導することを示した。詳細には、タンパク質A05は1:2000希釈より高い力価で抗体反応を誘導する。タンパク質B01は1:6000希釈より高い力価でいっそう強い抗体反応を誘導する。
【実施例２】
【０１３０】
インフルエンザウイルスの組換えタンパク質ヘマグルチニンを充填した酵母細胞壁粒子によるマウスの免疫化
A型インフルエンザウイルスH5N1亜型（A/香港/483/97）のヘマグルチニンタンパク質をYCWPに入れ込むウイルス抗原として使用した。具体的には、充填された酵母細胞壁粒子をC57マウスに皮下注射した。10μgに相当する投与量を免疫化のためにそれぞれのマウスに注射した。14日後、同じ用量の2回目の注射をそれぞれのマウスに行った。2回目の注射の14日後に、各マウスの尾部から血清を採取した。通常の免疫化対照として、10μgタンパク質および同量の市販のアラムアジュバント（Imject Alum, Thermo scientific）を、充填された酵母細胞壁粒子で免疫化されたマウスと同じスケジュールで、別の一群のC57マウスに注射した。ワクチン接種なしのマウスから得られた血清を対照として使用した。
【０１３１】
酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）を行って、ヘマグルチニンタンパク質に対する抗体価を測定した。具体的には、96ウェルCosterプレートを、100μlヘマグルチニンタンパク質を用いて10μg/mlの濃度で4℃にて一晩インキュベートすることにより、コーティングした。洗浄およびブロッキングの後、さまざまな希釈度のマウス由来血清100μlを各ウェルに添加した。アルカリホスファターゼ結合二次抗体およびTMB基質を発色のために使用した。450 nmにおけるODをELISAリーダーで記録した。
【０１３２】
図3に示す結果は、ヘマグルチニンタンパク質を充填したYCWPが、アジュバントとともに用いたヘマグルチニンよりも強い抗体反応を誘導することを示した。詳細には、ヘマグルチニン充填YCWLは1:4000希釈より高い力価で抗体反応を誘導する。
【実施例３】
【０１３３】
髄膜炎菌由来組換えタンパク質を充填した酵母細胞壁粒子によるT細胞応答
髄膜炎菌タンパク質A05およびB01を充填した酵母細胞壁粒子から生じるT細胞応答を混合リンパ球反応（MLR）によりモニターする。具体的には、腹腔マクロファージもしくは骨髄樹状細胞をC57マウス（免疫化のためのマウスと同じ系統）から分離し、96ウェルプレートで培養する。組換えタンパク質B01およびA05を充填したYCWPを次に、マクロファージもしくは樹状細胞の個数当り約10個の充填YCWPの割合で、細胞培養に添加する。一晩インキュベートしたのち、タンパク質A05およびB01充填YCWPで免疫化されたマウス由来の2x105個のリンパ球もしくは脾細胞を培養物に添加し、さらに72時間、共培養を維持する。培養終了時に、CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit (Promega)のMTT色素溶液を各ウェルに添加する。プレートを、加湿された5% CO2雰囲気において最大で4時間37℃にてインキュベートし、波長570 nmでの吸光度を記録する。対照として、培地のみ、マクロファージ／樹状細胞のみ、およびリンパ球のみを使用する。培地のみのウェルにおける吸光度の平均値（陰性対照）をブランク値として使用し、すべての吸光度値から差し引いて、補正された吸光度値を得る。
【０１３４】
このアッセイにおいて、YCWPを負荷されたマクロファージもしくは樹状細胞は抗原提示細胞として機能する。同じ粒子で免疫化されたマウス由来のリンパ球もしくは脾細胞をこの抗原提示細胞と接触させると、リンパ球もしくは脾細胞において標的タンパク質に対する細胞傷害性Tリンパ球が、これらの抗原提示細胞によって刺激されて増殖する。免疫化がうまくいっていないと、特異的細胞傷害性Tリンパ球の欠如により細胞増殖はみられない。組換えタンパク質A05およびB01を充填したYCWPは細胞増殖を刺激することが予想され、それが強いUV吸収を生じることになる。これに対して、対照（培地のみ、マクロファージ／樹状細胞のみ、およびリンパ球のみ）は最小限のUV吸収を生じ、細胞増殖がないことを示す。
【実施例４】
【０１３５】
A型インフルエンザのヘマグルチニンタンパク質を充填したYCWPに関するT細胞応答アッセイ
インフルエンザワクチンを作製するために、YCWPに、A 型インフルエンザウイルスH5N1亜型（A/香港/483/97）のヘマグルチニン（HA）組換えタンパク質を充填する。インフルエンザワクチンから生じるT細胞応答を、混合リンパ球反応（MLR）によりモニターする。具体的には、腹腔マクロファージもしくは骨髄樹状細胞をC57マウス（免疫化のためのマウスと同じ系統）から分離し、96ウェルプレートでin vitro培養する。充填されたYCWPを次に、マクロファージもしくは樹状細胞の個数当り約10個の充填YCWPの割合で、細胞培養に添加する。一晩培養したのち、免疫化されたマウス由来の2x105個のリンパ球もしくは脾細胞を培養物に添加し、さらに72時間、共培養を維持する。培養終了時に、CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit (Promega)のMTT色素溶液を各ウェルに添加する。細胞培養物を、加湿された5% CO2雰囲気において最大で4時間37℃にてインキュベートし、波長570 nmでの吸光度を記録する。対照として、培地のみ、マクロファージ／樹状細胞のみ、およびリンパ球のみを使用する。培地のみのウェルにおける吸光度の平均値（陰性対照）をブランク値として使用し、すべての吸光度値から差し引いて、補正された吸光度値を得る。
【０１３６】
A型インフルエンザウイルス由来の組換えタンパク質ヘマグルチニンを充填したYCWPは強い細胞増殖を示す、強いUV吸収を生じることが予想される。これに対して、対照（培地のみ、マクロファージ／樹状細胞のみ、およびリンパ球のみ）は最小限のUV吸収を生じ、細胞増殖がないことを示す。
【実施例５】
【０１３７】
HIV gp120タンパク質を充填したYCWPに関するT細胞応答アッセイ
HIVワクチンを作製するために、YCWPに、HIV由来のエンベロープ糖タンパク質gp120を充填する。gp120を充填したYCWPから生じるT細胞応答を、混合リンパ球反応（MLR）およびELISPOTアッセイにより測定する。具体的には、MLRを用いてCD4細胞応答を測定し、ELISPOTアッセイを用いてCD8応答を測定する。簡単に述べると、96ウェルニトロセルロースプレート（Millipore Corp., Bedford, Mass.）を、5μg/mlの抗マウスγインターフェロン（IFN-γ）モノクローナル抗体を含有するリン酸緩衝食塩水（PBS）100μlでコーティングする。4℃にて一晩インキュベートしたのち、ウェルを、10% FBS含有DMEM-高グルコース培地で8回洗浄し、37℃にて1時間を超えてインキュベートする。ウェル当り細胞5 x 105個から始まる、脾細胞の2倍希釈系列を、コーティングされたウェルに入れ、gp120を充填したYCWPを貪食させた腹腔マクロファージもしくは骨髄樹状細胞とともに共培養する。何も加えないマクロファージもしくは樹状細胞を陰性対照として使用する。プレートを5% CO2インキュベーター内で30時間インキュベートする。その後、プレートをPBS-Tween 20（0.05%）で十分に洗浄したのち、2.5 mg/mlビオチン化抗マウスIFN-γモノクローナル抗体0.1 mlを各ウェルに添加する。4℃にて一晩インキュベートしたのち、プレートを、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンとともに室温にて1時間インキュベートする。ウェルをPBS Tween-20およびPBSで洗浄し、1 mg/mlの濃度であって、50 mM Tris-HCl, pH 7.5中0.015%過酸化水素を含有する基質（3,3’-ジアミノベンジジン四塩酸塩）を添加する。スポットをカウントする。
【０１３８】
HIV gp120を充填したYCWPは強いUV吸収を生じ、強い細胞増殖およびT細胞応答を示すことが予想される。これに対して、対照（何も加えないマクロファージもしくは樹状細胞）は最小限のUV吸収を生じ、細胞増殖が見られず、T細胞応答もないことを示すであろう。
【実施例６】
【０１３９】
組換えHIV gp120タンパク質を充填した酵母細胞壁粒子によるマウスの免疫化
HIVエンベロープ糖タンパク質gp120をYCWPに充填する抗原として使用する。gp120を充填した酵母細胞壁粒子を、免疫応答を評価するためにマウスに皮下注射する。10μg gp120タンパク質に相当する投与量を免疫化のために各マウスに注射する。14日後、同じ用量の2回目の注射をそれぞれのマウスに行う。2回目の注射の14日後に、それぞれのマウスの尾部から血清を採取する。通常の免疫化対照については、10μg gp120タンパク質および同量の市販のアラムアジュバント（たとえば、Imject Alum, Thermo scientific）を、充填された酵母細胞壁粒子で免疫化されたマウスと同じスケジュールで、別の一群のマウスに注射する。ワクチン接種なしのマウスから得られた血清を対照として使用する。
【０１４０】
酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）を行って、gp120タンパク質に対する抗体価を測定する。具体的には、96ウェルCosterプレートを、100μl組換えタンパク質gp120を用いて、10μg/mlの濃度で4℃にて一晩インキュベートすることによりコーティングする。洗浄およびブロッキング後、さまざまな希釈度のマウス由来血清100μlを各ウェルに添加する。アルカリホスファターゼ結合二次抗体およびTMB基質を発色のために使用する。450 nmにおけるODをELISAリーダーで記録する。
【０１４１】
HIV gp120を充填したYCWPは、アジュバントともに用いた組換えタンパク質より強い抗体反応を誘導すると予想され、これを反映して高い力価が示されることになる。
【実施例７】
【０１４２】
組換えHIV gp120タンパク質を充填したYCWPのためのT細胞応答アッセイ
非放射性LDH細胞毒性アッセイ
HIV gp120を発現する標的細胞株を、B16メラノーマ細胞において樹立する。具体的には、合成gp120遺伝子配列をpcDNA3.1にクローニングして、DNA構築物pcDNA3.1/HIV gp120を得て、これを用いて次に、B16メラノーマ細胞をリポフェクタミン2000によりトランスフェクトする。G418選択後、クローンをRT-PCRおよびウェスタンブロット分析によりスクリーニングする。gp120高発現クローンを、非放射性LDH細胞毒性アッセイのための標的細胞株（B16/gp120）として選択する。
【０１４３】
次に、HIVワクチンで免疫化したマウス由来の脾細胞を標準的な方法により分離する。100 U/mLペニシリン、100 mg/mLストレプトマイシン、および10% 熱失活FBS、ならびに10 U/mLヒトインターロイキン2を添加した、Glutamax-I (Gibco)を有するRPMI 1640培地中、細胞4 x106個／ウェルの濃度で、脾細胞を24ウェルプレートに播く。次に、gp120タンパク質を、終濃度5 x10-7 Mとなるように培養物に添加する。培養は加湿5% CO2インキュベーター内で37℃にて7日間維持される。6日目に、B16/gp120標的細胞をウェル当り1.5 x 104個の濃度で96ウェルに播き、一晩培養する。7日目に、24ウェルの脾細胞を回収して洗浄する。脾細胞を再懸濁し、さまざまなエフェクター／標的（E:T）比で、B16/gp120標的細胞培養物に添加する。その手順は概して、CytoTox 96（登録商標） Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit (Promega)の推奨するプロトコールに従う。CytoTox 96（登録商標）アッセイは、標的細胞の溶解で放出される、安定な細胞質内酵素である乳酸脱水素酵素の濃度を定量的に測定する。対照として、培地のみ、エフェクターおよび標的細胞のみ（自然発生的なLDH放出）、ならびに界面活性剤により完全に融解した標的細胞（最大LDH放出）。CD8 T細胞の抗原特異的毒性は、下記の式で計算される細胞毒性パーセンテージで表される：
【０１４４】
【数１】
2018528188.tif 000004
【０１４５】
抗原特異的CD8+ T細胞を検出するためのフローサイトメトリー
このアッセイは細胞表面CD107aおよびCD107bを測定するものであるが、これらは通常、脱顆粒の結果として形成される細胞毒性顆粒の膜に存在する。
【０１４６】
gp120を充填したYCWPで免疫化されたマウスから分離された約1x106個の脾細胞を、それぞれ1μg/mlの抗CD28および抗CD49dならびに2μg/mlのgp120とともに総容量1 mlとしてインキュベートする。CD107aおよびCD107bに対するPEもしくはFITC複合抗体を、刺激前に細胞に添加する。培養物を1時間37℃にて5% CO2インキュベーター内でインキュベートし、それからさらに4−5時間のインキュベーションを分泌阻害剤モネンシン（BDPharmingen）の存在下で行う。刺激の直後に、脾細胞を1回洗浄し、CD8に対する複合抗体で染色する。細胞を洗浄したのち、固定して透過処理する。透過性にしたのち、細胞を2回洗浄し、細胞内マーカーIFN-γに特異的な複合抗体で直接染色する。次に細胞を最後にもう1回洗浄し、PBS中1%パラホルムアルデヒドに再懸濁する。CD8+/CD107a+/CD107b+ またはCD8+/CD107a+/CD107b+/IFNg+の細胞を、フローサイトメトリーで分析するが、その手順はたとえば、Betts et al., Journal of Immunological Methods (2003), 281:65-78に記載される。
【０１４７】
このアッセイは、活性化されないCD8 T細胞と比較した抗原活性化CD8 T細胞のパーセンテージを測定する。活性化CD8 T細胞はマーカーCD8+/CD107a+/CD107b+もしくはCD8+/CD107a+/CD107b+/IFNg+を有するので、フローサイトメトリーに基づいて分離される。
【０１４８】
in vitroリンパ球増殖アッセイ
このアッセイのために、gp120を充填したYCWPで免疫化されたマウスに由来する脾細胞を、標準的な手順で分離する。次に、分離された脾細胞を1μg/ml gp120で5日間刺激する。刺激された脾細胞は、メーカーのプロトコール（Promega）にしたがって、CellTiter 96（登録商標）Non-Radioactive Cell Proliferation Assayとともに使用される。
【０１４９】
詳細には、このアッセイは、代謝の活発な細胞に由来するデヒドロゲナーゼによる、([3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム, 分子内塩]) (MTS)からホルマザンへの変換を測定する。ホルマザン濃度は、490 nmにおける吸光度によって測定することができるが、これは培養物中の生細胞数に比例する。抗原特異的T細胞の増殖は、非刺激脾細胞と比較したgp120刺激脾細胞における490 nm吸光度の増加パーセントとして表される。
【０１５０】
細胞内サイトカイン染色
HIVワクチンで免疫化されたマウス由来の脾細胞を、標準的な手順で分離する。分離された脾細胞を、in vitroで、抗CD28および抗CD49d抗体の存在下でgp120タンパク質により刺激する。37℃にて2時間インキュベートしたのち、BrefeldinAを培養物に添加してサイトカインの分泌を阻害し、培養物をその後一晩インキュベートする。次に細胞を回収し、表面CD4+に対して染色してから固定する。固定された細胞をその後、透過性にして、IL-2およびIFN-γに対する標識抗体で染色する。CD4+/IL2+および／または IFNg+ 細胞をフローサイトメトリーで分析する。
【０１５１】
このアッセイは、非活性化CD4 T細胞と比較した抗原活性化CD4 T細胞のパーセンテージを測定する。活性化CD4 T細胞は、マーカーCD4+/IL2+、CD4+/ IFNg+ またはCD4+/IL2+/IFNg+を有するので、フローサイトメトリーに基づいて分離される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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