(57)【要約】本開示は、腫瘍細胞溶解を達成するために生体内でナチュラルキラー細胞をプライミングおよび活性化することによる癌治療方法に関する。この方法は、第１の腫瘍細胞株に由来するプライミング腫瘍細胞調製物（ＰＴＣＰ）を患者に導入することを含む。このＰＴＣＰは第１の腫瘍細胞またはその膜調製物を不活性化するために放射線を照射されており、第１の腫瘍細胞はその膜表面に既知のプライミングリガンドを有する。患者の休止ＮＫ細胞を生体内でこのＰＴＣＰと接触させることにより、プライミングされたＮＫ細胞を生じさせる。このＮＫ細胞は、ＣＤ６９のアップレギュレーション、ＣＤ１６のシェディング、またはＣＤ６９＋およびＣＤ１６−の組み合わせを特徴とする。次に、これらのプライミングされたＮＫ細胞は、癌である第２の腫瘍細胞と接触し、この第２の腫瘍細胞を溶解して死滅させるように構成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内でＮＫ細胞をプライミング腫瘍細胞調製物（ＰＴＣＰ）と接触させるステップを含むＮＫ細胞をプライミングする方法。
【請求項２】
前記ＰＴＣＰが無傷腫瘍細胞を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記無傷腫瘍細胞が、その表面に、ＣＤ１５、ＬＦＡ−１、ＮＫｐ４６、２Ｂ４およびＤＮＡＭからなる群からの少なくとも１つのプライミングリガンドを含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＴＣＰが、不活性化を達成するために放射線照射される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＴＣＰが細胞膜調製物を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞膜調製物が、ＣＤ１５、ＬＦＡ−１、ＮＫｐ４６、２Ｂ４およびＤＮＡＭからなる群からの少なくとも１つのリガンドを含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＴＣＰが、照射されたＣＴＶ−１骨髄性白血病細胞またはその膜調製物を含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
プライミング中に、ＣＤ６９の発現が前記ＮＫ細胞でアップレギュレートされる請求項１に記載の方法。
【請求項９】
プライミング中に、ＣＤ１６の発現が前記ＮＫ細胞の表面からシェディングされる請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＮＫ細胞を生体内でプライミングする方法であって、
膜表面に付着した１つ以上のプライミングリガンドを有する、放射線照射後の腫瘍細胞またはその膜調製物を含むプライミング腫瘍細胞調製物（ＰＴＣＰ）を患者に導入するステップであって、前記１つ以上のプライミングリガンドのそれぞれが、ＣＤ１５、ＬＦＡ−１、ＮＫｐ４６、２Ｂ４およびＤＮＡＭからなる群から別々に選択されるステップと、
前記ＮＫ細胞を生体内で前記ＰＴＣＰと接触させるステップとを含む方法。
【請求項１１】
放射線照射前に、非晶質炭水化物−ガラスマトリックス中に前記腫瘍細胞または膜調製物を固定化し、前記腫瘍細胞または膜調製物を中に固定化して含む炭水化物ガラスマトリックスに放射線を照射するステップをさらに含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍細胞または膜調製物を中に固定化して含む炭水化物ガラスマトリックスを、溶媒を用いて溶解するステップをさらに含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記溶媒は水である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
放射線照射前に、前記腫瘍細胞または膜調製物を凍結乾燥してから、前記凍結乾燥した腫瘍細胞または膜調製物に放射線を照射するステップをさらに含む請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌治療のための方法に関し、より具体的には、癌および他の疾患治療のためのナチュラルキラー細胞の生体内プライミングに関する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、抗原の刺激なしに特定の腫瘍細胞およびウイルス感染細胞に結合し、パーフォリンを含む顆粒の挿入によってそれらを殺傷させることができるリンパ球である。
【０００３】
ＮＫ細胞は癌を認識すること、および係り合って溶解することができないので、多くの癌が体内で発生し増殖する。前者は免疫監視の失敗である。後者は、ＮＫ細胞による殺傷を回避することができる腫瘍の変化によるものである。
【０００４】
２０１２年９月４日に発行された米国特許第８，２５７，９７０号は、生体外での腫瘍細胞調製によってナチュラルキラー細胞を活性化する方法を記載している。この内容を参照により本明細書に組み込むものとする。この９７０特許の実施形態は有望に見えるが、とりわけスケーラビリティ、および特有な患者および疾患への広範な適用など、商業用プラットフォームにこの技術を適用するには多くの問題がある。
【０００５】
事実、癌を治療するための効果的な方法を見出すという問題は、長い間手探りで進められているが殆ど解決されていない。このため、米国政府は、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｏｏｎｓｈｏｔ」なるプログラムを立ち上げ、内実には治療法へ向けて進歩率を２倍にする、すなわち５年間で１０年分の進展を目指している。
【０００６】
癌および他の疾患を治療する目的で、免疫応答を刺激する新規な方法が引き続き必要とされている。 
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
多くの癌に対する問題は、癌細胞が、その膜表面にある特定のシグナルをダウンレギュレートして、ＮＫ細胞による殺傷を効果的に回避してしまうことである。従って、癌はＮＫ細胞による殺傷を回避し、その癌に冒された患者内で増殖することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ヒトおよび動物の患者の様々な癌を治療するための方法を開示する。本明細書内に開示するのは、腫瘍細胞でしばしばダウンレギュレートされるシグナルにＮＫ細胞を暴露し、このプライミングに続いてＮＫ細胞を腫瘍細胞に接触させると、そのＮＫ細胞が腫瘍細胞表面でダウンレギュレーションされていない残りのシグナルと接触することによって活性化することができ、それによって腫瘍細胞の溶解を促進するように、ＮＫ細胞を生体内で「プライミング」する戦略および方法である。要するに、この方法は、生体内でのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の「プライミング」を達成するものであり、休止ＮＫ（ｒＮＫ）細胞がプライミング腫瘍細胞調製物（ＰＴＣＰ）と接触して、プライミングされたＮＫ（ｐＮＫ）細胞になる。このプライミングされたＮＫ細胞が腫瘍細胞および残りのシグナルと接触すると、その完全な活性化および腫瘍細胞の溶解ができる。
【０００９】
発明の有利な効果
プライミング腫瘍細胞調製物は、休止ＮＫ細胞に第１のシグナルを効果的に提供するタンパク質および／またはリガンドの生物学的製物である。第１のシグナルは、各癌変異体に特異ではないため、このようにＰＴＣＰに曝させることによってＮＫ細胞にまず「プライミング」をすると、ＮＫ細胞は、複数の癌細胞変異体の位置を突き止め、その溶解を実行する。したがって、この提案の方法は、多くの癌のタイプを治療するための戦略を提供し、単一の変異体に限定されるものではない。
【００１０】
さらに、本明細書に記載の方法は自己由来ではないため、それ故に、大きな商業規模での利用が可能である。１種のＰＴＣＰを調整して生産すれば、これを用いて様々な癌の変異体および他の感染症に患う多くの患者を治療することができる。
【００１１】
この他の利点は、本明細書および図面の完全に見直せば当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図示の一実施形態によるＮＫ細胞の生体内プライミングの方法を示す。
【図２Ａ】シグナル１を発現し、ＮＫ細胞をプライミングすることができる腫瘍細胞株であるＣＴＶ１細胞の添加のみが、ヒトＰＢＭＣ培養物中のＲＡＪＩ細胞（ＮＫ耐性細胞株）の増殖を減少させることができることを示す。
【図２Ｂ】ＮＫ耐性腫瘍株であるＲＡＪＩ細胞がヒトＰＢＭＣの集団に添加された場合、ＣＴＶ１細胞をこの培養物に添加すると、ＲＡＪＩ細胞の増殖が大幅に減少することを示す。
【図３】混合培養物中のＲＡＪＩ細胞増殖の減少が、ＣＴＶ１によってプライミングされたＮＫ細胞による特定ＲＡＪＩの溶解に関連することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を用いて腫瘍を死滅させることは、プライミングおよびトリガーを含む２段階のプロセスである。すなわち、ＮＫ細胞は、腫瘍細胞を殺傷するためにプライミングされトリガーされなければならない。プライミングおよびトリガーはそれぞれ、ＮＫ細胞および腫瘍細胞の異なるセットのリガンドによって制御される。自然に発生するヒト癌の大部分は、細胞表面にプライミングリガンド（priming ligands）がないため、ＮＫ殺傷に対して抵抗性がある。すなわち、トリガーリガンドは腫瘍細胞表面に残るが、ＮＫ細胞はプライミングされていない（すなわち、腫瘍細胞表面にプライミングリガンドは存在しない）ため、腫瘍細胞致死を引き起こさない。ヒト癌の大半で、腫瘍細胞表面にプライミングリガンド（シグナル１）が欠如しているため、ＮＫ細胞は患者の癌増殖の制御に関与しないし、関与することができない。そこで、ＮＫ細胞を人為的に「プライミング」して、腫瘍細胞の表面にあるトリガーシグナル（シグナル２）に接触させると腫瘍細胞を死滅させる（溶解する）ことができるようにする戦略をここに開示する。本明細書中に開示する技術は、ＮＫ細胞がヒト癌の制御において果たす役割、予防と治療との両方の役割を拡大させるものとなる。
【００１４】
癌の制御におけるＮＫ細胞の役割は、ＮＫ細胞をプライミングするサイトカインを用いて最初に説明された。１９８０年代にインターロイキン−２（ＩＬ−２）およびＮＫ細胞活性化におけるその役割が発見されたことにより、腫瘍免疫療法でのリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の使用に関心が高まった。しかし、これらの試験結果は殆どが期待はずれのものであった。ＩＬ−２と共に患者に自己ＬＡＫ細胞を投与する効果を調べた研究では、２０％未満の患者しか反応しなかった（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ他）。その後の研究によれば、ＩＬ−２は、生体内で循環ＮＫ細胞の数を大きく増大させるが、この細胞は最大限の傷害性を有するものではない（Ｍｉｌｌｅｒ他）。
【００１５】
もっと最近では、プライミングリガンドを保持するがトリガーリガンドを欠く腫瘍細胞を注意深く選択して使用するサイトカインフリープライミング技術が開発されている（Ｎｏｒｔｈ他）。休止ＮＫ細胞（ｒＮＫ細胞はＣＤ６９−）がプライミング腫瘍細胞（ＰＴＣ）、例えばＣＴＶ−１細胞と共に置かれた場合、ＮＫ細胞は、活性化された表現型（ｐＮＫ細胞はＣＤ６９＋）およびシェディングＣＤ１６よって規定されるようにプライミングされる。ｐＮＫ細胞は、トリガーリガンドを表面に有する腫瘍細胞を死滅させる。これは、骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、乳房、卵巣、肺、腎臓、前立腺および他のＧＩ並びにＧＹＮ悪性腫瘍を含み、これに限定されない多くのヒト腫瘍タイプにおいて事実であると信じられており、いくつかの例においては確認もされている。すなわち、大多数の患者において、彼らの腫瘍は、その細胞表面からプライミングリガンドを排除することによってＮＫ細胞の死滅を回避するが、細胞表面にトリガーリガンドを保持しているため、プライミングされたＮＫ細胞による殺傷を依然として受けやすい状態である。
【００１６】
腫瘍は、ＮＫ細胞の殺傷に対して抵抗性（ＮＫ耐性）がある、またはＮＫ細胞によって死滅する（ＮＫ感受性）。大多数の腫瘍および腫瘍細胞株はＮＫ耐性である。ほとんどのＮＫ耐性腫瘍および細胞系は、その細胞表面にプライミングリガンドを有さない。これは、ＮＫ細胞が腫瘍細胞を殺傷するのに必要な２つのシグナルのうちの１つを得られないことを意味する。プライミングシグナルを提供するＩＬ−２によってプライミングされたＮＫ細胞に対するＮＫ耐性株の感受性によって証明されるように、ＮＫ耐性腫瘍は依然としてそれらの細胞表面にトリガーリガンドを有するので、プライミングシグナルを受けたＮＫ細胞によって殺傷される。ＩＬ−２は、全身性ＮＫ細胞プライミングを誘発するには高用量が必要であるが、これが制御不能な副作用を引き起こすため、臨床的に使用することが困難であることが判明した非常に強力なサイトカインである。したがって、生体内でプライミングシグナルを人為的に提供して、サイトカインの毒性レベルの投与をせずとも腫瘍細胞と相互作用して死滅させることができるであろうｐＮＫ細胞にＮＫ細胞を変換することが見いだされ、これこそが本明細書に開示する戦略である。
【００１７】
治療の一部としてプライミングシグナル（ＳＩ）を受けた休止ＮＫ細胞は、腫瘍活性化ＮＫ細胞（ＴａＮＫ）と呼ばれる。ＴａＮＫ感受性腫瘍は、血液腫瘍および固形腫瘍の大部分である。ＴａＮＫ耐性癌があり、例えばＣＬＬ（慢性リンパ球性白血病）である。ＴａＮＫ耐性腫瘍は、この治療戦略による治療には適格ではないであろう。
【００１８】
プライミングリガンド（ＳＩ）を細胞表面に保持する稀な癌および癌細胞株は、ＮＫプライミング腫瘍細胞（ＰＴＣ）と呼ばれる。ＰＴＣは、その細胞表面からトリガーリガンド（Ｓ２）をダウンレギュレートすることにより、ＮＫ細胞による死滅を回避する。これらは、細胞表面のプライミングリガンド（ＳＩ）を除去することによってＮＫ細胞による死滅を回避する大多数の癌の鏡像である。ＰＴＣは小さいが、細胞表面に発現する少なくとも３つのプライミングリガンドＣＤ１５、ＬＦＡ−１、ＮＫｐ４６、２Ｂ４およびＤＮＡＭの何らかの組み合わせを有する、腫瘍細胞の同定可能なサブセットである。ＣＤ１５、ＮＫｐ４６、ＬＦＡ−１をその細胞表面に発現する、急性リンパ芽球性白血病患者由来の細胞株であるＣＴＶ−１細胞およびその溶解物は、ヒト休止ＮＫ細胞をプライミングする。ＮＫｐ４６、２Ｂ４およびＤＮＡＭをその細胞表面に発現する腫瘍細胞が、休止中のヒトＮＫ細胞をプライミングするために使用可能であることはすでにわかっている。ＣＤ１５、ＬＦＡ−１、ＮＫｐ４６、２Ｂ４およびＤＮＡＭの他の組み合わせを用いて、ヒトＮＫ細胞をプライミングすることができるとさらに考えられる。
【００１９】
休止ＮＫ細胞のプライミングは、生体外および／または生体内で起こり得る。生体内プライミングは効果的ではあるが、記号論理学的（logistically）に複雑で、費用がかかり、癌の治療法としての制限がある。この文書では、ＮＫ細胞の生体内プライミングが開示されており、ここでは患者の休止ＮＫ細胞が、循環（circulation）を離れずにプライミングされる。
【００２０】
トリガーリガンド（Ｓ２）を細胞表面からダウンレギュレートしている癌には、ＴａＮＫに対して耐性を持つものがある。ＴａＮＫがＴａＮＫ耐性腫瘍（ＴＲＴ）と接触すると、プライミングシグナル（ＳＩ）のみが提供され、シグナル（Ｓ２）がトリガーされないため、ＴａＮＫ細胞がトリガーされず、この腫瘍は死滅しない（溶解しない）。ＴＲＴに対しては異なる治療戦略を必要である。
【００２１】
ＮＫ細胞の生体内プライミングのためのＰＴＣＰ
プライミング腫瘍細胞調製物（ＰＴＣＰ）を患者に導入し、ここでＰＴＣＰはＮＫ細胞を休止状態のｒＮＫ細胞（ＣＤ６９−）から生体内でプライミングされた状態のｐＮＫ細胞に変化させるように構成される。プライミングされたＮＫ（ｐＮＫ）細胞は、一般に、ＣＤ６９＋、ＣＤ１６−、またはＣＤ６９＋およびＣＤ１６−の組み合わせとして特徴付けられる。ＰＴＣＰは、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、くも膜下腔内注入によって、または鼻腔内、経気管支もしくは結膜点滴として投与することができる。ＰＴＣＰは、溶解物、溶解物の一部、エキソソームまたは微小胞を含む細胞またはその一部とすることができる。この細胞またはその一部は、プライミングリガンドＣＤ１５、ＬＦＡ−１、ＮＫｐ４６、２Ｂ４およびＤＮＡＭの少なくとも３つを含む細胞株由来とすることができる。この細胞またはその一部は、生きている状態、放射線照射された状態、凍結された状態、凍結乾燥された状態、固定された状態、化学的改変された状態または遺伝子改変された状態、または他の状態で提供することができる。一実施形態は、上記のプライミングリガンドの３つ以上を含む照射腫瘍細胞株の直接注入を含む。別の実施形態は、ｒＮＫ細胞をｐＮＫ細胞に変換するための腫瘍細胞溶解物またはその一部の注入である。ＰＴＣＰは、ｒＮＫ細胞にプライミングリガンドを提示し、それらをｐＮＫ細胞に変換する抗体（モノクローナル、二重特異性および三特異性抗体およびミニボディ）、タンパク質、アプタマー、小分子またはこの組み合わせを含む人工生産物とすることができる。一実施形態は、プライミングリガンドの標的を結合する２種の二重特異性抗体の注入である。別の実施形態は、プライミングリガンドの標的を結合する三重特異的抗体を注入することである。ＰＴＣＰは、細胞と人工生産物との組み合わせ産生物とすることができる。例えば、人工の球体を腫瘍細胞株の溶解物でコーティングしてＰＴＣＰを産生することができる。このＰＴＣＰを、人工的な産生物の組み合わせとすることができる。一実施形態では、脂質、金属、ポリマーまたはこの組み合わせのナノスフェアが、プライミングリガンドの標的を結合する抗体でコーティングされる。別の実施形態では、脂質、シラン、ポリマーまたはこの組み合わせのナノスフェアが、プライミングリガンドの標的を結合する合成プライミングリガンド、アプタマーまたはタンパク質でコーティングされる。
【００２２】
プライミング腫瘍細胞調製物（ＰＴＣＰ）は、単剤療法、連続療法または単剤および連続療法の組み合わせとして投与することができる。ＰＴＣＰは、１日１回または毎日投与し得る。ＰＴＣＰは１回または複数回使用することができる。ＰＴＣＰは、他の薬物、放射線および外科療法との併用療法の一部として投与することができる。
【００２３】
ＰＴＣＰが全細胞であるいくつかの実施形態では、とりわけジンクフィンガー、ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮを始めとする遺伝子編集ＤＮＡヌクレアーゼに基づく技術、ｒＡＡＶまたは他のウイルスベクターを伴うウイルスベクターを基礎にした遺伝子編集、及び他の遺伝子工学方法など、これに限定されない遺伝子工学技術を使用して、個々の独特な特性をＰＴＣＰに入れ込むことができる。全細胞ＰＴＣＰは患者の免疫応答を刺激するので、同種異系細胞に対する患者の免疫応答を低下させるために全細胞ベースでＰＴＣＰの遺伝子改変を行うことができる。一実施形態では、細胞表面からのＨＬＡクラスＩ抗原の発現が排除される。別の実施形態では、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ抗原がその細胞の表面から排除される。別の実施形態では、ＨＬＡ−Ｅ発現の増加および／またはＨＬＡ−Ｇ発現の増加などの免疫攻撃から細胞を保護する表面タンパク質発現の増加がある。ＰＴＣＰに対してこのように遺伝子改変すると、患者に同時免疫抑制を使用する必要性を低減および／または排除することにより、全細胞ベースのＰＴＣＰの有用性が増加し、細胞ベースのＰＴＣＰを使用して患者に複数の治療を施すことが容易になる。
【００２４】
ＰＴＣＰが全生細胞（live whole cell）である実施形態では、細胞が増殖または生着する（患者に半永久的または永続的に滞留）可能性がある。増殖または生着が望ましくない場合、生細胞増殖を防ぐための技術を治療プロトコールまたは細胞内に設計することができる。一実施形態では、全生細胞ＰＴＣＰは、患者に注入される前に放射線照射されるので、この細胞は増殖しない。放射線照射はまた、生存する全生細胞ＰＴＣＰの生着を妨げる。別の実施形態において、この細胞を、患者への注入または患者の被爆前に、細胞傷害剤で処置する。別の実施形態では、この細胞を、患者に注入する前に凍結乾燥する。凍結乾燥することで、さらなる細胞分裂を防止する。別の実施形態では、チミジンキナーゼなどの、これに限定されないが自殺遺伝子を含むようにこの細胞を遺伝子改変する。自殺遺伝子を含むように遺伝子操作された全生細胞ＰＴＣＰにおいて、患者の体中で全生細胞ＰＴＣＰのＮＫ細胞プライミング効果を排除したい場合、全生細胞ＰＴＣＰを殺傷するために自殺遺伝子をトリガーする薬剤が患者に投与される。例えば、チミジンキナーゼ自殺遺伝子の場合、遺伝子操作された全生細胞ＰＴＣＰの自殺をトリガーする薬物はガンシクロビルである。この自殺誘導剤は、所望の治療効果、疾患の負担、患者の健康状態および他の要因に依存して、数時間、数週間、数ヶ月の投与が可能、または投与が不可能な場合がある。例えば、最小限の残存疾患を有する患者においては、全生細胞ＰＴＣＰが、短期間の治療、例えば月に１回の投与を１ヶ月、２ヶ月または３ヶ月間の治療に求められる場合がある。肺または脳への転移などより大きな疾患負荷を有する患者については、より長期のＮＫプライミング療法が、例えば、６，１２または１８ヶ月などの長期間に亘って、毎週、隔週または毎月の治療でその疾患を制御することが望ましい場合がある。制御されているが根絶されていない病気の患者では、病気をコントロールし延命させるために、毎週、２週間に1回、毎月、２ヶ月に１回、年４回、半年に１回、または毎年などの長期治療が必要となる可能性がある。前述のシナリオのいずれにおいても、ＰＴＣＰの投与量（あるいは「プライミング腫瘍細胞調製剤（ＰＴＣＰ）」）およびその治療間隔は、腫瘍のタイプ、疾患の重症度または応答のタイプに基づいて異なり得る。例えば、治療において３ヶ月間は毎月１回投与し、次いで維持療法として患者が生きている限り２ヶ月ごとに半量を投与することができる。
【００２５】
ＰＴＣＰはｐＮＫ細胞を産生するが、この細胞は非天然型であってヒトまたは動物には見られない。ＮＫ細胞は、ＳＩまたはＳ２の結紮なしに癌細胞またはウイルス感染細胞を死滅させることができない休止ＮＫ細胞、またはＳＩおよびＳ２の双方が結紮した後に癌またはウイルス感染細胞を死滅させることができる活性化ＮＫ細胞のいずれかにのみ存在する。本発明は、ＳＩのみに結紮を有する非天然型のプライミングされたｐＮＫ細胞を産生する。ＳＩの結紮により、ｐＮＫは、ゲノム、プロテオーム、リピドーム、メタボロミクス、セクレミズム、表現型および機能アッセイを含み、これに限定されない１つまたはそれ以上の複雑なアッセイの組み合わせで測定することができる休止ＮＫ細胞および活性化ＮＫ細胞とは異なるバイオロジーを有する。
【００２６】
したがって、一般的な一実施形態では、ＮＫ細胞をプライミングする方法は、ＮＫ細胞を生体内でプライミング腫瘍細胞調製物（ＰＴＣＰ）と接触させるステップを含む。
【００２７】
一実施形態では、ＰＴＣＰは、放射線照射後の無傷な腫瘍細胞を含む。この無傷な腫瘍細胞は、その表面に、ＣＤ１５、ＬＦＡ−１、ＮＫｐ４６、２Ｂ４およびＤＮＡＭからなる群からの少なくとも１つのプライミングリガンドを含むことができる。
【００２８】
別の実施形態では、ＰＴＣＰは、放射線照射後の細胞膜調製物を含む。細胞膜調製物の膜は、ＣＤ１５、ＬＦＡ−１、ＮＫｐ４６，２Ｂ４およびＤＮＡＭからなる群からの少なくとも１つのリガンドを含むことができる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ＰＴＣＰは、放射線照射後のＣＴＶ−１骨髄性白血病細胞またはその膜調製物を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、プライミング中に、ＣＤ６９の発現がＮＫ細胞上でアップレギュレートされる。他の実施形態では、プライミングされるＮＫ細胞がＣＤ１６−となるように、ＣＤ１６をＮＫ細胞表面でシェディング（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）する。
【００３１】
別の実施形態では、生体内でＮＫ細胞をプライミングする方法は、
（ｉ）１つ以上のプライミングリガンドを膜表面に付着して有する放射線照射後の腫瘍細胞またはその膜調製物を含むＰＴＣＰを患者に導入することであって、その１つ以上のプライミングリガンドのそれぞれが、ＣＤ１５、ＬＦＡ−１、ＮＫｐ４６、２Ｂ４およびＤＮＡＭからなる群からそれぞれ独立して選択される、導入と（ｉｉ）生体内におけるＮＫ細胞のＰＴＣＰとの接触とを含む。この方法はさらに、放射線照射前に、腫瘍細胞または膜調製物を非晶質炭水化物−ガラスマトリックス中に固定化し、腫瘍細胞または膜調製物をその中に固定化した炭水化物ガラスマトリックスに放射線を照射するステップを含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、例えば水などの溶媒を用いて、腫瘍細胞または膜調製物をその中に固定化した炭水化物ガラスマトリックスを溶解することをさらに含む。他の実施形態では、この方法は、放射線照射前に、腫瘍細胞または膜調製物を凍結乾燥し、続いてこの凍結乾燥した腫瘍細胞または膜調製物に放射線を照射するステップをさらに含む。
【００３２】
放射線照射により、プライミング腫瘍細胞調製物を十分に不活性化して人体内でのその増殖を防止することができるが、このような増殖の防止には、本明細書に記載のおよび／または当該技術分野で一般に周知の他の手段を実行することができる。
【００３３】
ＮＫ細胞を生体内でプライミングするための、放射線照射後のＣＴＶ−１細胞
ここで、第１の好ましい実施形態では、ＣＴＶ−１細胞に放射線を照射して、ＮＫ細胞の生体内プライミングのためのプライミング腫瘍細胞調製物（ＰＴＣＰ）を形成する。必要に応じて、上記のように遺伝子改変を実行してＰＴＣＰを得ることができる。
【００３４】
放射線の照射は、体内の増殖防止を目的として腫瘍細胞を一般に不活性化するが、同じ照射は、特に腫瘍細胞が水溶液中に懸濁している間に照射された場合、腫瘍細胞に関連するタンパク質および他の生体分子に害を及ぼしかねない。細胞副成分を保護するためには、当該技術分野で知られている方法を用いて腫瘍細胞調製物を非晶質炭水化物−ガラス状態で最初に固定化してから、その固定化調製物を照射することが好ましい。その後、水を用いて炭水化物を溶解させて、放射線を照射した腫瘍細胞またはその一部を分離することができる。
【００３５】
あるいは、腫瘍細胞調製物を凍結乾燥し、続いて放射線の照射をすることができる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、放射線照射は必要ではない。すなわち、ＰＴＣＰを導入した患者の体内でＰＴＣＰを増殖させることができないように他の手段を実行する。
【００３７】
ＣＴＶ−１細胞は、その表面にＣＤ１５、ＮＫｐ４６、ＬＦＡ−１リガンドを発現する。これらは、ＮＫ細胞の特定シグナルをプライミングするのに有用である。したがって、適切に不活性化したＣＴＶ−１細胞であれば、ヒト患者内に導入しても安全であり、その体内でＮＫ細胞をプライミングするように機能する。
【００３８】
実施例１：共培養におけるＲＡＪ１溶解
ＲＡＪＩ細胞は、ＮＫ細胞耐性腫瘍細胞株であることが知られている。
【００３９】
第１の実験では、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を正常な志願者から単離し、ＲＡＪＩ細胞と共に培養した。ＰＢＭＣとＲＡＪＩ細胞との共培養にＮＫ細胞プライミング用のＰＴＣＰを添加して、生体内でのヒト血液の自然発生状態を模倣する系においてＲＡＪＩ細胞に対するＰＢＭＣ中のＮＫ細胞の応答を修正する。共インキュベーションの間、ＲＡＪＩ細胞数が増加すれば、培養中のＲＡＪＩ細胞が正常な増殖特性を示していることになる。ＲＡＪＩ細胞のみに対するＮＫ細胞の存在下でＲＡＪＩ細胞が減少すれば、ＰＢＭＣ培養においてＮＫ細胞によりＲＡＪＩ細胞が死滅（溶解）していることになる。プライミング組成物の存在は、ＰＢＭＣ集団内のＮＫ細胞によるＲＡＪＩ細胞死滅の程度を増加させると予測される。
【００４０】
第１の単離において、ＰＢＭＣの量を既知の量のＲＡＪＩ細胞でスパイクした。第２の単離では、同量のＰＢＭＣを同じ量のＲＡＪＩ細胞およびＳＥＭ１５＋＋でスパイクした。第３の単離では、同量のＰＢＭＣを同じ量のＲＡＪＩ細胞およびＣＴＶ−１でスパイクした。第４の単離では、同量のＰＢＭＣをＲＡＪＩ細胞およびＳＥＭ１５＋＋およびＣＴＶ−１でスパイクした。図２Ａのチャートおよび図２Ｂのプロットに示すように、２４時間および４８時間の時間間隔で、体積あたりの死滅ＲＡＪＩの数を判定した。この結果によれば、ＳＥＭ１５＋＋がＲＡＪＩの増殖を減少させず、ＣＴＶ−１単独およびＳＥＭ１５＋＋と組み合わせて、ＲＡＪＩ細胞の増殖を減少させた。この実験を異なるＰＢＭＣドナーで繰り返し、結果を確認した。この実験から、我々は、ＣＴＶ−１がＲＡＪＩ細胞の増殖を減少させるように機能することを示す。我々の仮説は、ＣＴＶ−１細胞表面機能に発現したリガンドが、末梢血からＮＫ細胞をプライミングするシグナル１を提供して、これによってＮＫ細胞はプライミングされた状態となるため、ＲＡＪＩ細胞を死滅させることができるというものである。このプライミングは、他の単核細胞の存在下および存在する全ての腫瘍細胞の存在下で発生する。
【００４１】
図２Ａは、シグナル１を発現し、ＮＫ細胞をプライミングすることができる（ｒＮＫをｐＮＫに変換する）腫瘍細胞株であるＣＴＶ１細胞のみの添加で、ヒト（ＰＢＭＣ）にいてＲＡＪＩ細胞、ＮＫ耐性細胞株の増殖を減少させることが可能であることを示す。ＣＤ１５陽性ＳＥＭ細胞をＰＢＭＣ培養物（負の対照として）に添加すると、ＲＡＪＩ細胞の増殖は変化せず、培地単独と比較して増加する可能性がある。ＣＴＶ１およびＣＤ１５陽性ＳＥＭ細胞の双方を培養物に添加すると、その応答はＣＴＶ１細胞の単独の添加と同等である。
【００４２】
これと比較して、図２Ｂに示すように、ＣＤ１５陽性ＳＥＭ細胞を培養物に添加すると、ＲＡＪＩ細胞の増殖が高まる。ＣＴＶ１もＳＥＭ細胞も癌細胞株である。ＣＴＶ１細胞とＳＥＭ細胞とは、ＣＴＶ１細胞はシグナル１（プライミングシグナル）を発現するＮＫ耐性細胞株であるが、信号２（トリガーシグナル）を有していない点で異なる。ＳＥＭ細胞は、シグナル１およびシグナル２の両方を発現するＮＫ感受性細胞である。ＣＴＶ１細胞をＰＢＭＣに添加すると、ＮＫ細胞はプライミングされ、ＲＡＪＩ細胞が接触するとそれらを殺傷する。ＲＡＪＩ細胞の死滅は、ＲＡＪＩ細胞数の減少（増殖の低下）によって論証される。ＳＥＭを培養系に添加すると、そのＮＫ細胞はＳＥＭ細胞を死滅させる。この系にはプライミングされたＮＫ細胞がないので、ＲＡＪＩ細胞の死滅はない。ＲＡＪＩ細胞の増殖の高まりは、「低温標的阻害」現象によるものと思われる。この現象ではＲＡＪＩ細胞を自発的に溶解することができるＰＢＭＣ混合物内のＮＫ細胞のうち僅かな割合の細胞がＳＥＭ細胞を優先的に標的とし、ＲＡＪＩ細胞を標的とすることができる細胞の数を減少させている。
【００４３】
実施例２：共培養部分ＩＩにおけるＲＡＪＩ溶解
第２の実験において、我々は、ＲＡＪＩ細胞の増殖に対する効果を、（ｉ）ＰＭＢＣ単独、（ｉｉ）ＰＢＭＣおよびＣＴＶ−１、（ｉｉ）ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含むＰＢＭＣ、並びに（ｉｖ）ＣＴＶ−１、ＩＬ−２およびＩＬ−１５の組み合わせを含むＰＢＭＣのそれぞれについて調査した。結果を図３に示す。ここでは、上記の組み合わせに加えて、ＲＡＪＩ細胞に対するＮＫ細胞比率を変えて調べた。我々は、４８時間後、ＲＡＪＩ細胞に対する約１２：１のＰＢＭＣの比にて、ＰＭＢＣとＣＴＶ−１との組み合わせの方がＰＢＭＣ単独よりもＲＡＪＩ殺傷にはるかに有効であることを発見した。ＲＡＪＩ細胞に対するＰＢＭＣの比が２：１であっても、ＰＢＭＣ＋ＣＴＶ−１の組み合わせは、ＰＢＭＣ単独よりも明らかに良好であった。さらに、ＣＴＶ−１を有するＰＢＭＣは、低用量のＩＬ−２およびＩＬ−１５を組み合わせたＰＢＭＣよりも高い溶解を示した。ただしこのデータは、ＰＢＭＣとＣＴＶ−１の組み合わせと低用量のＩＬ−２及びＩＬ−１５とであれば、ＲＡＪＩ細胞致死を最大にしたことを示している。この実験は生体外で行ったが、我々は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５の有無にかかわらず、ＣＴＶ−１がＮＫ細胞の生体内プライミングに有効であると考えている。
【００４４】
さらに、ＮＫ細胞の機能／健康（ＩＬ２およびＩＬ１５）を促進する微量の炎症性サイトカインの添加により、ＲＡＪＩ細胞の死滅は、ＣＴＶ１細胞単独またはサイトカイン単独よりも著しく多くなる。
【００４５】
本開示の全体に亘ってＣＴＶ−１腫瘍細胞が使用してきたが、本発明はＣＴＶ−１細胞に限定されることを意図するものではない。この方法は、いかなる腫瘍細胞またはその一部で実施してもＮＫ細胞のプライミングを得ることができる。したがって、第１の腫瘍細胞を照射し、ＮＫ細胞を生体内プライミングするために患者に導入し、このプライミングされたＮＫ細胞を第２の腫瘍細胞に接触させることにより、これを溶解させることができる。本発明の上記および他の態様は、当業者には理解されるであろう。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本開示は、癌および他の感染症の治療方法に関する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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