(57)【要約】治療上有効な量の配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをヒトに投与することを含む、状態または疾患のないヒトに比べて高いレベルのアルカリホスファターゼリガンド、特にＰＰｉ、ＰＬＰまたはＰＥＡと、低下したアルカリホスファターゼ活性との少なくとも１つを特徴とする骨欠損に関連する状態または疾患を有するヒトを治療する方法であって、該ポリペプチドは週に３回より少ない頻度で少なくとも１回の皮下注射を介して該ヒトに投与される、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨欠損に関連する状態または疾患を有するヒトを治療する方法であって、
前記骨欠損は
前記状態または疾患のないヒトに比べて
（ｉ）高いレベルのアルカリホスファターゼリガンド、特にＰＰｉ、ＰＬＰまたはＰＥＡと、
（ｉｉ）低下したアルカリホスファターゼ活性との少なくとも１つを特徴とし、
治療上有効な量の配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを前記ヒトに投与することを含み、前記ポリペプチドは８日ごとに１回より少ない頻度で少なくとも１回の皮下注射を介して前記ヒトに投与される、前記方法。
【請求項２】
前記ヒトが、機能的アルカリホスファターゼを欠いているまたは不十分な量の機能的アルカリホスファターゼを有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒトが、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ）を欠いているまたは不十分な量の組織非特異的アルカリホスファターゼを有する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記骨欠損が骨基質の石灰化不全である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
骨欠損に関連する前記状態または疾患が低ホスファターゼ血症（ＨＰＰ）である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）、ピリドキサール−５’−ホスフェート（ＰＬＰ）及びホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）の少なくとも１つの切断を触媒する請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、２４日ごとに１回よりも多い頻度で少なくとも１回の皮下注射を介して前記ヒトに投与される請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、１ヵ月に２回、３週ごとに１回、２２日ごとに１回、２３日ごとに１回、または２４日ごとに１回投与される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、１ヵ月に２回の約１８ｍｇ／ｋｇ、３週ごとに１回の約５０ｍｇ／ｋｇ、２２日ごとに１回の約５２ｍｇ／ｋｇ、２３日ごとに１回の約５５ｍｇ／ｋｇ、及び２４日ごとに１回の約５７ｍｇ／ｋｇから成る群から選択される投与量及び頻度で少なくとも１回の皮下注射を介して前記ヒトに投与される請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１回の皮下投与に先立って静脈内または皮下の経路を介して少なくとも１つの投与量で前記ポリペプチドを前記ヒトに投与することを含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１回の皮下投与の少なくとも１日前、３日前または１週間前に静脈内または皮下の経路を介して少なくとも１つの投与量で前記ポリペプチドを前記ヒトに投与することを含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリペプチドを投与することが、前記ヒトにおけるピリドキサール−５’−ホスフェート（ＰＬＰ）、無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）及びホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）の少なくとも１つのレベルを低下させる請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒトにおいて、Ｘ線所見の全般的な変化（ＲＧＩ−Ｃ）のスコア、くる病重症度（ＲＳＳ）のスコア及び類骨厚みの少なくとも１つを改善することを含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒトにおいて、運動熟練度のＢｒｕｉｎｉｎｋｓ−Ｏｓｅｒｅｔｓｋｙ試験、第２版（ＢＯＴ−２）、６分間歩行における予測歩行距離百分率試験（６ＭＷＴ）及び改変成績指向の運動評価−歩行（ＭＰＯＭＡ−Ｇ）から成る群から選択される機能的有効性の評価項目の少なくとも１つを改善することを含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチドを投与することが、同時に平均された投与量で、しかし、高い頻度にて前記ポリペプチドを投与することに匹敵する治療効果を生じる請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記匹敵する治療効果が、ピリドキサール−５’−ホスフェート（ＰＬＰ）のレベル、無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）のレベル、ホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）のレベル、ＲＧＩ−Ｃのスコア、ＲＳＳのスコア、類骨厚み、ＢＯＴ−２のスコア、６ＭＷＴのスコア及びＭＰＯＭＡ−Ｇのスコアから成る群から選択される少なくとも１つの評価項目の測定を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヒトが小児発症または成人発症のＨＰＰを有する請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヒトが成人または青年である請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は「低ホスファターゼ血症の組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）酵素補充療法に有効な投薬計画の特定」に関する。
【背景技術】
【０００２】
低ホスファターゼ血症（ＨＰＰ）は、機能的な組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰまたはＴＮＡＬＰ、双方の用語は本開示では相互交換可能に使用される）の産生不全を生じる、命を脅かす、遺伝性の極めて稀な代謝性疾病である。未治療のＨＰＰは、骨及び歯の低石灰化を特徴とする石灰化されない骨基質の蓄積（たとえば、くる病、骨軟化症）をもたらす。成長している骨が適正に石灰化しない場合、成長の損傷は関節及び骨の外観を損なうことになり、それは次に運動性能及び呼吸機能に影響を与え、重症な症例では最終的に死を招き得る。ＨＰＰの４つの異なる形態、すなわち、周産期、幼児期、小児期及び成人のＨＰＰが当初記載された。さらに最近、症状の発症の年齢に基づいて、周産期、良性出生前、幼児期、小児期、成人及び歯のＨＰＰを含む６つの臨床形態が明らかにされている。
【０００３】
アスホターゼアルファは、ヒトＴＮＳＡＬＰの触媒ドメインと、ヒト免疫グロブリンＧ１のＦｃドメインと、骨標的化ドメインとして使用されるデカアスパラギン酸ペプチド（すなわち、Ｄ１０）とで構成される可溶性の融合糖タンパク質である。アスホターゼアルファは、欠陥のある内在性のＴＮＳＡＬＰのレベルに対処するように企画された、認可された画期的医薬品が標的を定める酵素補充療法である（Ｗｈｙｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎ.Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６６：９０４−１３；ＳＴＲＥＮＳＩＱ（登録商標），Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書で開示されるのは、アスホターゼアルファで治療したＨＰＰ患者の臨床試験データに基づいた新規の投与量及びスケジュールである。患者のコンプライアンスを高め、複数回の注射部位からの患者の負担を減らす新しい投薬計画が本明細書に記載されているように検証されている。
【０００５】
態様の１つでは、本開示は、以下の少なくとも１つを特徴とする骨欠損に関連する状態または疾患を有するヒトを治療する方法を提供する。
【０００６】
前記状態または疾患のないヒトに比べて、
（ｉ）アルカリホスファターゼリガンド、特に、ＰＰｉ、ＰＬＰまたはＰＥＡの高いレベル、及び
【０００７】
（ｉｉ）低下したアルカリホスファターゼ活性、
【０００８】
治療上有効な量の配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをそのヒトに投与することを含み、その際、ポリペプチドは、週に３回未満の頻度で少なくとも１回の皮下注射を介してヒトに投与される。
【０００９】
第２の態様では、本開示は、以下の少なくとも１つを特徴とする骨欠損に関連する状態または疾患を有するヒトを治療する方法を提供する。
【００１０】
前記状態または疾患のないヒトに比べて、
（ｉ）アルカリホスファターゼリガンド、特に、ＰＰｉ、ＰＬＰまたはＰＥＡの高いレベル、及び
【００１１】
（ｉｉ）低下したアルカリホスファターゼ活性、
【００１２】
治療上有効な量の配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをそのヒトに投与することを含み、その際、ポリペプチドは、８日ごとに１回より少ない頻度で少なくとも１回の皮下注射を介してヒトに投与される。
【００１３】
一部の実施形態では、ヒトは機能的なアルカリホスファターゼの欠如または不十分な量の機能的なアルカリホスファターゼを有する。一部の実施形態では、ヒトは組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰまたはＴＮＳＡＬＰ）の欠如または不十分な量の組織非特異的アルカリホスファターゼを有する。
【００１４】
一部の実施形態では、本明細書で開示されている骨欠損は骨基質の石灰化不全である。一部の実施形態では、骨欠損に関連する状態または疾患は低ホスファターゼ血症（ＨＰＰ）である。
【００１５】
一部の実施形態では、本明細書で開示されているポリペプチドは無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）、ピリドキサール５’−ホスフェート（ＰＬＰ）及びホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）の少なくとも１つの切断を触媒する。
【００１６】
一部の実施形態では、本明細書で開示されているポリペプチドは２４日ごとに１回を超える頻度で少なくとも１回の皮下注射を介してヒトに投与される。
【００１７】
一部の実施形態では、本明細書で開示されているポリペプチドは毎週１回、毎月２回、３週ごとに１回、２２日ごとに１回、２３日ごとに１回、または２４日ごとに１回投与される。
【００１８】
一部の実施形態では、本明細書で開示されているポリペプチドは、毎週１回約６ｍｇ／ｋｇ、毎月２回約１８ｍｇ／ｋｇ、３週ごとに１回約５０ｍｇ／ｋｇ、２２日ごとに１回約５２ｍｇ／ｋｇ、２３日ごとに１回約５５ｍｇ／ｋｇ、及び２４日ごとに１回約５７ｍｇ／ｋｇから成る群から選択される投与量及び頻度で少なくとも１回の皮下注射を介してヒトに投与される。
【００１９】
一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法は、少なくとも１回の皮下投与に先立って、静脈内または皮下の経路を介して少なくとも１つの投与量でのポリペプチドをヒトに投与することを含む。一部の実施形態では、そのような方法は、少なくとも１回の皮下投与の少なくとも１日前、３日前、または１週間前に静脈内または皮下の経路を介して少なくとも１つの投与量でのポリペプチドをヒトに投与することを含む。
【００２０】
一部の実施形態では、本明細書で開示されているポリペプチドを投与することは、ヒトにおいてピリドキサール−５’−ホスフェート（ＰＬＰ）、無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）、及びホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）の少なくとも１つのレベルを低下させる。
【００２１】
一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法は、ヒトにてＸ線所見の全般的な変化（ＲＧＩ−Ｃ）のスコア、くる病重症度（ＲＳＳ）のスコア及び類骨厚みの少なくとも１つを改善することを含む。
【００２２】
一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法は、運動熟練度のＢｒｕｉｎｉｎｋｓ−Ｏｓｅｒｅｓｔｓｋｙ試験、第２版（ＢＯＴ−２）、６分間歩行における予測歩行距離百分率試験（６ＭＷＴ）及び改変成績指向の運動評価−歩行（ＭＰＯＭＡ−Ｇ）から成る群から選択される機能的有効性の評価項目の少なくとも１つをヒトで改善することを含む。
【００２３】
一部の実施形態では、本明細書で開示されているポリペプチドを投与することは、同時に平均した投与量にて、しかし、高い頻度でポリペプチドを投与することに匹敵する治療効果を生じる。
【００２４】
一部の実施形態では、匹敵する治療効果は、ヒトにおいてピリドキサール−５’−ホスフェート（ＰＬＰ）のレベル、無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）のレベル、ホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）のレベル、ＲＧＩ−Ｃのスコア、ＲＳＳのスコア、類骨厚み、ＢＯＴ−２のスコア、６ＭＷＴのスコア及びＭＰＯＭＡ−Ｇのスコアから成る群から選択される少なくとも１つの評価項目の測定を含む。
【００２５】
一部の実施形態では、ヒトは小児発症のＨＰＰまたは成人発症のＨＰＰを有する。ヒトは成人または青年であることができる。
【００２６】
一部の実施形態では、ヒトは頭蓋骨癒合症の症状を有さないもしくは示さない、またはヒトは頭蓋骨癒合症であると診断されていない。特に、ヒトは、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドの投与に先立って頭蓋骨癒合症の症状を有さないまたは示さない。
【００２７】
添付の図面は、以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】定常状態でのシミュレートした平均濃度（Ｃａｖｇ，ｓｓ）に対比した共変量の関係を示す図である。シミュレートしたＣａｖｇ，ｓｓの値は週３回与える２ｍｇ／ｋｇの投薬計画に基づく。投薬活性は９９０Ｕ／ｍｇであると想定する。共変量は、摂動の対象の場合を除いて以下の値に固定した。ＴＳＡＣは２．２に設定した；重量は２２．７ｋｇ；抗薬剤抗体及び中和抗体は陰性；バッチサイズは２０，０００Ｌだった。点線は、臨床効果について標的とされる曝露を定義した非臨床有効性試験に由来する有効曝露レベルを示す。
【図２−１】図２Ａ〜図２Ｂは、典型的な曝露−反応についての中央値（実線）及び９０％信頼区間（網掛け）を示す図である。表現型によってシミュレートした年齢と体重の中央値及び評価項目は、ＰＰｉ（図２Ａ）（幼児ベースライン３．１１歳及び１０．８ｋｇ；幼児７週３．２５歳及び１１．１ｋｇ；小児ベースライン１１．８歳及び３４．０ｋｇ；小児７週１１．０歳及び３４．５ｋｇ；成人ベースライン４０．２歳及び７６．１ｋｇ；成人７週４０．３歳及び７６．１ｋｇ）、及びＰＬＰ（図２Ｂ）（幼児ベースライン３．１１歳及び１０．８ｋｇ；幼児２４週３．５７歳及び１１．８ｋｇ；小児ベースライン１１．８歳及び３４．０ｋｇ；小児２４週１２．３歳及び３５．６ｋｇ）だった。示されるのはまた、観察されたデータのモデル化に基づいた、各投薬計画についてのシミュレートしたＣａｖｇ，ｓｓ値の中央値及びＣａｖｇ，ｓｔｕｄｙ値の対象に特有な推定値の範囲である。星印（*）は臨床開発プログラムで検討された投薬計画を示す。
【図２−２】図２−１の続きである。
【図３−１】図３Ａ〜図３Ｃは、典型的な曝露−反応についての中央値（実線）及び９０％信頼区間（網掛け）を表すＸ線写真有効性評価項目、シミュレートした７２週目の反応プロットを示す図である。表現型によってシミュレートした年齢と体重中央値は及び評価項目は、ＲＧＩ−Ｃ（幼児ベースライン６．８２歳及び１９．３ｋｇ；幼児７２週８．２０歳及び２３．０ｋｇ；小児ベースライン６．７８歳及び１９．２ｋｇ；小児７２週８．１６歳及び２２．９ｋｇ）及びＲＳＳ（幼児ベースライン６．８４歳及び１９．４ｋｇ；幼児７２週８．２１歳及び２３．０ｋｇ；小児ベースライン６．７５歳及び１９．１ｋｇ；小児７２週８．１７歳及び２２．９ｋｇ）だった。示されるのはまた、観察されたデータのモデル化に基づいた、各投薬計画についてのシミュレートしたＣａｖｇ，ｓｓ値の中央値及びＣａｖｇ，ｓｔｕｄｙ値の対象に特有な推定値の範囲である。星印（*）は臨床開発プログラムで検討された投薬計画を示す。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図３−３】図３−２の続きである。
【図４−１】図４Ａ〜図４Ｂは、典型的な曝露−反応についての中央値（実線）及び９０％信頼区間（網掛け）を表す機能的な評価項目、シミュレートした７２週目の反応を示す図である。評価項目によってシミュレートした年齢及び体重の中央値は、ＢＯＴ−２（ベースライン９．６７歳及び２７．２ｋｇ；７２週１１．０歳及び３１．５ｋｇ）及び６ＭＷＴ（ベースライン１８．２歳及び６０．０ｋｇ；７２週１９．５歳及び６６．９ｋｇ）だった。示されるのはまた、観察されたデータのモデル化に基づいた、各投薬計画についてのシミュレートしたＣａｖｇ，ｓｓ値の中央値及びＣａｖｇ，ｓｔｕｄｙ値の対象に特有な推定値の範囲である。星印（*）は臨床開発プログラムで検討された投薬計画を示す。
【図４−２】図４−１の続きである。
【図５】２種類のアスホターゼアルファ投薬計画についてのシミュレートした中央値の定常状態活性−時間プロファイルにおける薬物動態（ＰＫ）解析を示す図である。最終的なＰＫモデルを用いて、各ベースライン年齢での週６回与えた１ｍｇ／ｋｇ及び週３回与えた２ｍｇ／ｋｇのアスホターゼアルファ投薬計画について定常状態での時間に対比した予想される（中央値）曝露をシミュレートした。
【図６】体重＝１７．２９ｋｇの０〜７２週の時間での典型的な患者のシミュレートした薬物動態／薬物力学（ＰＫ−ＰＤ）の時間経過を示す図である。ＰＫ、ＰＰｉ、ＰＬＰ、ＲＧＩ−Ｃ、ＲＳＳ−膝、ＲＳＳ−手首、ＢＯＴ−２、及び６ＭＷＴについての最終的なＰＫ−ＰＤモデルを用いて、週３回与えた２ｍｇ／ｋｇのＳＣ用量に続く０〜７２週の時間での典型的な患者についての各観察の時間経過をシミュレートした。ここで、典型的な患者は、中和抗体の形成がないと想定され、活性＝９９０Ｕ／ｍｇのアスホターゼアルファの薬剤ロットと想定され、シアル酸含量＝２．２モル／タンパク質のモルと想定されたベースライン体重＝１７．２９ｇ、ベースライン年齢＝６歳の幼児及び小児の表現型を持つと定義された。最終的なＰＫモデルは表現型効果の推定値を含まなかったので、典型的な幼児及び小児の表現型の時間経過はこのシミュレーションでは同一だった。ＢＯＴ−２及び６ＭＷＴについての最終的なモデルは小児患者についてのみ開発された。７２週目での体重及び年齢はそれぞれ２０．７７ｋｇ及び７．３８歳だった。
【図７】観察された（白）及びモデルが予測した（網掛け）アスホターゼアルファのレベル間での一致を示すＰＫの観察値（ＳＣ）についてのモデルの実績を示す図である。
【図８−１】図８Ａ〜図８Ｂは、これらＰＤの評価項目についての観察されたもの（網掛け）とモデルが予測したもの（白）との間での一致を示すＰＤの評価項目（ＲＧＩ−Ｃ及び６ＭＷＴ）についてのモデルの実績を示す図である。
【図８−２】図８−１の続きである。
【図９】ＨＰＰの幼児での疾患発症についての反応に対比した曝露の関係（目盛りを付けた）を示す図である。
【図１０】ＨＰＰの小児での疾患発症についての反応に対比した曝露の関係（目盛りを付けた）を示す図である。
【図１１】７回の臨床試験でのＨＰＰ患者における週ごとの用量の分布を示す図である。
【図１２】６ＭＷＴ及びＢＯＴ−２の反応についての投薬計画（６ｍｇ／ｋｇ／週、週６回の１ｍｇ／ｋｇに対比した週３回の２ｍｇ／ｋｇとして投与された）にわたるシミュレートしたＰＤの反応を示す図である。
【図１３】時間プロファイルに対比したシミュレートした定常状態の活性を示す図である。
【図１４】時間プロファイルに対比したベースラインのＲＧＩ−Ｃからのシミュレートした変化を示す図である。
【図１５】時間プロファイルに対比したベースラインからのシミュレートしたＲＳＳ−膝の変化を示す図である。
【図１６】時間プロファイルに対比したベースラインからのシミュレートしたＲＳＳ−手首の変化を示す図である。
【図１７】時間プロファイルに対比したシミュレートしたＰＰｉの濃度を示す図である。
【図１８】時間プロファイルに対比したシミュレートしたＰＬＰの濃度を示す図である。
【図１９】時間プロファイルに対比したベースラインからのシミュレートした６ＭＷＴ（予測された正常の％）の変化を示す図である。
【図２０】時間プロファイルに対比したベースラインからのシミュレートしたＢＯＴ２（体力及び敏捷性比較試験スコア）の変化を示す図である。
【図２１】時間プロファイルに対比したベースラインからのシミュレートしたＭＰＯＭＡ−Ｇの変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
定義
「約」、「およそ」：本明細書で使用されるとき、用語「約」及び「およそ」は、１以上の特定の細胞培養条件に適用されるとき、その培養の条件（単数）または条件（複数）について述べられた参照値に類似する値の範囲を指す。特定の実施形態では、用語「約」は、その培養の条件（単数）または条件（複数）について述べられた参照値の２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１パーセント以下の範囲内に入る値の範囲を指す。たとえば、用語「約」は述べられた値の±１０％を指すことができる。
【００３０】
「アミノ酸」：用語「アミノ酸」は本明細書で使用されるとき、ポリペプチドの形成に正常で使用される２０の天然に存在するアミノ酸、またはそれらアミノ酸の類似体もしくは誘導体のいずれかを指す。本開示のアミノ酸は培地にて細胞培養物に提供され得る。培地で提供されるアミノ酸は塩または水和物の形態として提供されてもよい。
【００３１】
「培養物」及び「細胞培養物」：これらの用語は本明細書で使用されるとき、細胞集団の生存及び／または増殖に好適な条件下で培地（以下の「培地」の定義を参照のこと）に浮遊する細胞集団を指す。当業者に明らかなように、これらの用語は本明細書で使用されるとき、細胞集団と集団が浮遊する培地とを含む組み合わせを指してもよい。
【００３２】
「断片」：用語「断片」は本明細書で使用されるとき、ポリペプチドを指し、所与のポリペプチドに独特であるまたは特徴的であるそのポリペプチドの任意の個別の部分として定義される。その用語は本明細書で使用されるとき、所与の完全長のポリペプチドの活性の少なくともほんの一部を保持するそのポリペプチドの任意の個別の部分も指す。一部の実施形態では、保持される活性のほんの一部は完全長のポリペプチドの活性の少なくとも１０％である。種々の実施形態では、保持される活性のほんの一部は完全長のポリペプチドの活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％である。他の実施形態では、保持される活性のほんの一部は完全長のポリペプチドの活性の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。一実施形態では、保持される活性のほんの一部は完全長のポリペプチドの活性の１００％である。その用語は本明細書で使用されるとき、所与の完全長のポリペプチドで見いだされる少なくとも確立された配列要素を含むそのポリペプチドの任意の一部も指す。一部の実施形態では、配列要素は完全長のポリペプチドの少なくとも４〜５アミノ酸に及ぶ。一部の実施形態では、配列要素は完全長のポリペプチドの少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上のアミノ酸に及ぶ。
【００３３】
「ポリペプチド」：用語「ポリペプチド」は本明細書で使用されるとき、ペプチド結合を介して一緒に結合したアミノ酸の連続する鎖を指す。その用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を指すのに使用されるが、当業者は、その用語が非常に長い鎖に限定されず、ペプチド結合を介して一緒に結合した２つのアミノ酸を含む最小の鎖を指すことができることを理解するであろう。
【００３４】
「タンパク質」：用語「タンパク質」は本明細書で使用されるとき、別個の単位として機能する１以上のポリペプチドを指す。単一のポリペプチドが別個の機能単位であり、別個の機能単位を形成するために他のポリペプチドとの永続的な物理的会合を必要としないのであれば、用語「ポリペプチド」と「タンパク質」は本明細書で使用されるとき、相互交換可能に使用される。
【００３５】
「組換えで発現されたポリペプチド」及び「組換えポリペプチド」：これらの用語は本明細書で使用されるとき、ポリペプチドを発現するように遺伝子操作されている宿主細胞から発現されるそのポリペプチドを指す。組換えで発現されたポリペプチドは、哺乳類の宿主細胞で正常に発現されているポリペプチドと同一であるまたは類似することができる。組換えで発現されたポリペプチドは、宿主細胞に対して外来性であることもでき、すなわち、宿主細胞にて正常に発現されたペプチドに対して異種であることもできる。或いは、組換えで発現されたポリペプチドは、ポリペプチドの一部が哺乳類宿主細胞で正常に発現されたポリペプチドと同一であるまたは類似するアミノ酸配列を含有する一方で、他の部分は宿主細胞に対して外来性であるという点でキメラであることができる。
【００３６】
「ＴＮＡＬＰ」及び「ＴＮＳＡＬＰ」：これらの用語は本明細書で使用されるとき、相互交換可能に組織非特異的アルカリホスファターゼタンパク質を指す。
【００３７】
本開示は、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ）の欠如またはその不十分な量を有するヒト患者を本明細書に記載されているような特定の投薬計画で治療する方法を提供する。用語「（の）欠如」は日常の検出に十分ではないＴＮＡＬＰレベルを有するそのようなヒトの状態を指す。
【００３８】
タンパク質
本開示は、低下した及び／または機能不全の内在性アルカリホスファターゼを有するまたは過剰発現した（たとえば、正常レベルを上回る）アルカリホスファターゼ基質を有する対象にアルカリホスファターゼタンパク質を投与することを提供する。一部の実施形態では、本開示のアルカリホスファターゼタンパク質は組換えタンパク質である。一部の実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は融合タンパク質である。一部の実施形態では、本開示のアルカリホスファターゼタンパク質は、細胞型、組織（たとえば、結合組織、筋肉組織、神経組織または上皮組織）または臓器（たとえば、肝臓、心臓、腎臓、筋肉、骨、軟骨、靭帯、腱等）を特異的に標的とする。たとえば、そのようなアルカリホスファターゼタンパク質は完全長アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）または少なくとも１つのアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の断片を含んでもよい。一部の実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、骨標的指向化部分（たとえば、以下に記載されているような負に荷電したペプチド）に連結された可溶性ＡＬＰ（ｓＡＬＰ）を含む。一部の実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は免疫グロブリン部分（完全長または断片）に連結された可溶性ＡＬＰ（ｓＡＬＰ）を含む。たとえば、そのような免疫グロブリン部分は結晶化可能断片領域（Ｆｃ）を含んでもよい。一部の実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は骨標的指向化部分及び免疫グロブリン部分（完全長または断片）の双方に連結された可溶性ＡＬＰ（ｓＡＬＰ）を含む。一部の実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、ｓＡＬＰ−Ｘ、Ｘ−ｓＡＬＰ、ｓＡＬＰ−Ｙ、Ｙ−ｓＡＬＰ、ｓＡＬＰ−Ｘ−Ｙ、ｓＡＬＰ−Ｙ−Ｘ、Ｘ−ｓＡＬＰ−Ｙ、Ｘ−Ｙ−ｓＡＬＰ、Ｙ−ｓＡＬＰ−Ｘ、及びＹ−Ｘ−ｓＡＬＰから成る群から選択される構造のいずれか１つを含み、その際、Ｘは本明細書に記載されているような骨標的指向化部分を含み、Ｙは本明細書に記載されているような免疫グロブリン部分を含む。一実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、Ｗ−ｓＡＬＰ−Ｘ−Ｆｃ−Ｙ−Ｄｎ／Ｅｎ−Ｚの構造を含み、その際、Ｗは非存在であるまたは少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｘは非存在であるまたは少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｙは非存在であるまたは少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｚは非存在であるまたは少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｆｃは結晶化可能断片領域であり、Ｄｎ／Ｅｎはポリアスパラギン酸塩、ポリグルタミン酸塩またはそれらの組み合わせであり、ｎ＝８〜２０であり、ｓＡＬＰは可溶性アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）である。一部の実施形態では、Ｄｎ／Ｅｎはポリアスパラギン酸塩配列である。たとえば、Ｄｎはｎが８〜２０（双方を含む）の間の任意の数である（たとえば、ｎは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０であってもよい）ポリアスパラギン酸塩配列であってもよい。一実施形態では、ＤｎはＤ１０またはＤ１６である。一部の実施形態では、Ｄｎ／Ｅｎはポリグルタミン酸塩配列である。たとえば、Ｅｎはｎが８〜２０（双方を含む）の間の任意の数である（たとえば、ｎは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０であってもよい）ポリグルタミン酸塩配列であってもよい。一実施形態では、ＥｎはＥ１０またはＥ１６である。一実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質はＴＮＡＬＰ−Ｆｃ−Ｄ１０（以下でリストにされているような配列番号１）の構造を含む。下線を引いたアスパラギン（Ｎ）残基はグリコシル化の可能性がある部位（すなわち、Ｎ１２３、２１３、２５４、２８６、４１３及び５６４））に相当する。太字下線のアミノ酸残基（Ｌ４８６−Ｋ４８７及びＤ７１５−Ｉ７１６）はそれぞれｓＡＬＰドメインとＦｃドメイン及びＦｃドメインとＤ１０ドメインの間でのリンカーに相当する。
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【００３９】
アスホターゼアルファは、それぞれ配列番号１で示されたような７２６アミノ酸を伴った２つのＴＮＡＬＰ−Ｆｃ−Ｄ１０ポリペプチドから成る可溶性のＦｃ融合タンパク質である。各ポリペプチドまたはモノマーは５つの部分で構成される。アミノ酸Ｌ１〜Ｓ４８５を含有する第１の部分（ｓＡＬＰ）はヒト組織非特異的アルカリホスファターゼ酵素の可溶性部分であり、それは触媒機能を含有する。第２の部分はリンカーとしてアミノ酸Ｌ４８６〜Ｋ４８７を含有する。アミノ酸Ｄ４８８〜Ｋ７１４を含有する第３の部分（Ｆｃ）はヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３のドメインを含有するヒト免疫グロブリンガンマ１（ＩｇＧ１）のＦｃ部分である。第４の部分はリンカーとしてＤ７１５〜Ｉ７１６を含有する。第５の部分はアミノ酸Ｄ７１７〜Ｄ７２６（Ｄ１０）を含有し、それはアスホターゼアルファを骨の無機相に結合させる骨標的指向化部分である。加えて、各ポリペプチド鎖は６つのグリコシル化が可能な部位及び１１のシステイン（Ｃｙｓ）残基を含有する。Ｃｙｓ１０２は遊離のシステインとして存在する。各ポリペプチド鎖は、Ｃｙｓ１２２とＣｙｓ１８４、Ｃｙｓ４７２とＣｙｓ４８０、Ｃｙｓ５２８とＣｙｓ５８８、及びＣｙｓ６３４とＣｙｓ６９２の間で４つの鎖内ジスルフィド結合を含有する。２つのポリペプチド鎖は、双方の鎖のＣｙｓ４９３の間及び双方の鎖のＣｙｓ４９６の間での２つの鎖間ジスルフィド結合によって接続される。これらの共有結合の構造的特徴に加えて、哺乳類のアルカリホスファターゼは、亜鉛のための２部位とマグネシウムのための１部位とカルシウムのための１部位を含む４つの金属結合部位を各ポリペプチド鎖で有すると考えられている。
【００４０】
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）
ＡＬＰには４つの既知のアイソザイム、すなわち、以下でさらに記載されている組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＡＬＰ）（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿１１２６０３及びＮＰ＿００１６２３にて記載されているような）、生殖細胞アルカリホスファターゼ（ＧＣＡＬＰ）（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ１０６９６にて記載されているような）及び腸管アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１６２２にて記載されているような）がある。これらの酵素は非常に類似した三次元構造を持つ。その触媒部位のそれぞれは、２つのＺｎと１つのＭｇを含む、酵素活性に必要である金属イオンのための４つの金属結合ドメインを含有する。これらの酵素は、リン酸のモノエステルの加水分解を触媒し、高濃度のリン酸アクセプターの存在下でリン酸転移反応も触媒する。ＡＬＰ（たとえば、ＴＮＡＬＰ）のための３つの既知の天然の基質には、ホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）、無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）、及びピリドキサール５’−ホスフェート（ＰＬＰ）が挙げられる（Ｗｈｙｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１４４０−１４４５）。これらのアイソザイムの間での配列比較は、その教示全体が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ２００８／１３８１３１の図３０にて示されている。
【００４１】
本開示のアルカリホスファターゼタンパク質は、ＡＬＰタンパク質の二量体または多量体を単独でまたは組み合わせで含んでもよい。その教示全体が全体として参照によって本明細書に組み入れられるＫｉｆｆｅｒ−Ｍｏｒｅｉｒａ，ｅｔ  ａｌ．２０１４，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，９：ｅ８９３７４にて記載されているキメラＡＬＰタンパク質のような、キメラＡＬＰタンパク質または融合タンパク質も製造されてもよい。
【００４２】
ＴＮＡＬＰ
上記で記載されているように、ＴＮＡＬＰは、糖脂質を介してそのＣ末端に係留される膜結合タンパク質である（ヒトＴＮＡＬＰについては、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０５１８６を参照のこと）。この糖脂質アンカー（ＧＰＩ）は、一時的な膜アンカーとして及びＧＰＩの付加のためのシグナルとしての双方で役立つ疎水性のＣ末端の取り外しの後、翻訳後に付加される。従って、一実施形態では、可溶性のヒトＴＮＡＬＰは、疎水性Ｃ末端配列の最初のアミノ酸、すなわち、アラニンが停止コドンで置き換えられているＴＮＡＬＰを含む。そのように形成された可溶性ＴＮＡＬＰ（本明細書ではｓＴＮＡＬＰと呼ぶ）は、触媒部位の形成に必要であるＴＮＡＬＰのネイティブの係留形態のアミノ酸すべてを含有するが、ＧＰＩ膜アンカーを欠いている。既知のＴＮＡＬＰには、たとえば、ヒトＴＮＡＬＰ［ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ−０００４６９、ＡＡＩ１０９１０、ＡＡＨ９０８６１、ＡＡＨ６６１１６、ＡＡＨ２１２８９、及びＡＡＩ２６１６６］；アカゲザルＴＮＡＬＰ［ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＸＰ−００１１０９７１７］；ラットＴＮＡＬＰ［ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３７１９１］；イヌＴＮＡＬＰ［ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＦ６４５１６］；ブタＴＮＡＬＰ［ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＮ６４２７３］、マウスＴＮＡＬＰ［ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３１４５７］、ウシＴＮＡＬＰ［ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿７８９８２８、ＮＰ＿７７６４１２、ＡＡＭ８２０９、及びＡＡＣ３３８５８］、及びネコＴＮＡＬＰ［ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１０３６０２８］が挙げられる。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、専門用語「細胞外ドメイン」は、ネイティブなタンパク質（たとえば、ペプチドシグナルがない）機能的な細胞外部分を指すことにする。元々のアミノ酸１〜５０１（分泌されると１８〜５０１）（Ｏｄａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２６：６９４−６９９）、アミノ酸１〜５０４（分泌されると１８〜５０４）及びアミノ酸１〜５０５（分泌されると１８〜５０５）を保持する組換えｓＴＮＡＬＰは酵素活性があることが示されている。本明細書で提示されている実施例はまた、元々のＴＮＡＬＰのアミノ酸１〜５０２（分泌されると１８〜５０２）含む組換えｓＴＮＡＬＰは酵素活性があることも示している。このことは、その酵素活性に影響を与えることなく、ネイティブタンパク質のＣ末端からアミノ酸残基を取り除くことができることを示している。さらに、可溶性のヒトＴＮＡＬＰは１以上のアミノ酸の置換を含んでもよく、その際、そのような置換（複数可）はｓＴＮＡＬＰの酵素活性を低下させない、または少なくとも完全には阻害しない。たとえば、低アルカリホスファターゼ血症（ＨＰＰ）を引き起こすことが知られている特定の変異は国際公開番号ＷＯ２００８／１３８１３１にてリストにされており、機能的なｓＴＮＡＬＰを維持するために回避されるべきである。
【００４４】
負に荷電したペプチド
本開示のアルカリホスファターゼタンパク質は、アルカリホスファターゼタンパク質の的を所定の細胞型、組織または臓器に特異的に絞ってもよい標的部分を含んでもよい。一部の実施形態では、そのような所定の細胞型、組織または臓器は骨組織である。そのような骨標的指向化部分には、既知のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは当該技術で既知の小分子が含まれてもよい。たとえば、負に荷電したペプチドは骨標的指向化部分として使用されてもよい。一部の実施形態では、そのような負に荷電したペプチドはポリアスパラギン酸塩、ポリグルタミン酸塩、またはそれらの組み合わせ（たとえば、アスパラギン酸残基とグルタミン酸残基の組み合わせを含む負に荷電したペプチドのような少なくとも１つのアスパラギン酸塩と少なくとも１つのグルタミン酸塩を含むポリペプチド）であってもよい。一部の実施形態では、そのような負に荷電したペプチドは、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１５、Ｄ１６、Ｄ１７、Ｄ１８、Ｄ１９、Ｄ２０または２０を超えるアスパラギン酸塩を有するポリアスパラギン酸塩であってもよい。一部の実施形態では、そのような負に荷電したペプチドは、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５、Ｅ１６、Ｅ１７、Ｅ１８、Ｅ１９、Ｅ２０または２０を超えるグルタミン酸塩を有するポリグルタミン酸塩であってもよい。一実施形態では、そのような負に荷電したペプチドはＤ１０〜Ｄ１６またはＥ１０〜Ｅ１６から成る群から選択される少なくとも１つを含んでもよい。
【００４５】
スペーサー
一部の実施形態では、本開示のアルカリホスファターゼタンパク質は、ＡＬＰの部分と標的指向化部分の部分との間でスペーサー配列を含む。一実施形態では、そのようなアルカリホスファターゼタンパク質は、ＡＬＰ（たとえば、ＴＮＡＬＰ）部分と負に荷電したペプチド標的指向化部分との間でスペーサー配列を含む。そのようなスペーサーはポリペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子化合物であってもよい。一部の実施形態では、そのようなスペーサーは結晶化可能断片領域（Ｆｃ）の断片を含んでもよい。有用なＦｃ断片には、ヒンジ、及びＣＨ２及びＣＨ３のドメインを含むＩｇＧのＦｃ断片が挙げられる。そのようなＩｇＧは、ｌｇＧ−１、ｌｇＧ−２、ｌｇＧ−３、ｌｇＧ−３及びｌｇＧ−４、またはそれらの組み合わせのいずれかであってもよい。
【００４６】
この理論に限定されないで、骨を標的とするｓＡＬＰ融合タンパク質（たとえば、アスホターゼアルファ）で使用されるＦｃ断片はスペーサーとして作用し、ｓＴＮＡＬＰ−Ｆｃ−Ｄ１０の発現がｓＴＮＡＬＰ−Ｄ１０よりも高かった（以下の実施例２を参照）ことを考えると、それはタンパク質を効率よく折り畳ませると考えられている。考えられる説明の１つは、Ｆｃ断片の導入が、本明細書で例示されているｓＡＬＰのＣ末端に付加された高度に負に荷電したＤ１０配列の存在が原因で生じる反発力を和らげることである。一部の実施形態では、本明細書に記載されているアルカリホスファターゼタンパク質は、ｓＡＬＰ−Ｆｃ−Ｄ１０、ｓＡＬＰ−Ｄ１０−Ｆｃ、Ｄ１０−ｓＡＬＰ−Ｆｃ、Ｄ１０−Ｆｃ−ｓＡＬＰ、Ｆｃ−ｓＡＬＰ−Ｄ１０、及びＦｃ−Ｄ１０−ｓＡＬＰから成る群から選択される構造を含む。他の実施形態では、上記の構造におけるＤ１０は他の負に荷電したポリペプチド（たとえば、Ｄ８、Ｄ１６、Ｅ１０、Ｅ８、Ｅ１６、等）によって置換される。
【００４７】
本開示の有用なスペーサーには、たとえば、ｓＡＬＰ配列のＣ末端で付加された高度に負に荷電した骨標的指向化配列（たとえば、Ｄ１０）の存在が原因で生じる反発力を和らげることができる、Ｆｃを含むポリペプチド、及び疎水性ポリペプチド及び柔軟なポリペプチドが挙げられる。
【００４８】
二量体／四量体
具体的な実施形態では、本開示の骨を標的とするｓＡＬＰ融合タンパク質は二量体または四量体を形成するように結合される。
【００４９】
二量体の構成では、鎖間ジスルフィド結合の形成によって強いられた立体障害が、正常細胞に存在する二量体の最少限に触媒活性があるタンパク質に結合するｓＡＬＰドメインの結合をたぶん妨げている。
【００５０】
この特定の理論に限定されないで、四量体の構造では、融合タンパク質の結合には、異なる二量体に由来する別のｓＡＬＰドメインに連結している一方の二量体に由来する一方のｓＡＬＰドメインが関与する。
【００５１】
骨を標的とするｓＡＬＰはさらに任意で、（１）負に荷電したペプチド（たとえば、骨タグ）から下流に、及び／または（２）負に荷電したペプチド（たとえば、骨タグ）とＦｃ断片の間で、及び／または（３）スペーサー（たとえば、Ｆｃ断片）とｓＡＬＰ断片の間で、１以上の追加のアミノ酸を含む。これは、たとえば、骨標的指向化コンジュゲートを作出するのに使用されるクローニング戦略がこれらに位置で外来性のアミノ酸を導入する場合に生じてもよい。しかしながら、外来性のアミノ酸は追加のＧＰＩ係留シグナルを提供しないように選択されるべきである。宿主細胞のトランスアミダーゼによって切断される設計された配列の可能性は、Ｉｋｅｚａｗａ，２００２，Ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  （ＧＰＩ）−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２５：４０９−１７によって記載されたように予測することができる。
【００５２】
本開示はまた、たとえば、本明細書で明瞭に言及されているものを含むグリコシル化、アセチル化、アミド化、遮断、ホルミル化、ガンマ−カルボキシグルタミン酸の水酸化、メチル化、リン酸化、ピロリドンカルボン酸、及び硫酸化によって翻訳後修飾される融合タンパク質も包含する。
【００５３】
アスホターゼアルファ
本明細書に記載されているアルカリホスファターゼタンパク質には、たとえば、アスホターゼアルファ（すなわち、ＴＮＡＬＰ−Ｆｃ−Ｄ１０；配列番号１；ＳＴＲＥＮＳＩＱ（登録商標），Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ）のような、たとえば、骨を標的とするｓＡＬＰ融合タンパク質が含まれる。具体的には、アスホターゼアルファは７２６アミノ酸のポリペプチド長を持つ複合可溶性糖タンパク質である。アスホターゼアルファは、３つのドメインで構成されるＦｃ融合タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端までにアスホターゼアルファは、（１）ヒト組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）(ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０５１８６）の可溶性触媒ドメインと、（２）ヒト免疫グロブリンＧ１のＦｃドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０１８５７）と、（３）骨標的指向化ドメイン（Ｎｉｓｈｉｏｋａ，ｅｔ  ａｌ．２００６，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．８８：２４４−２５５）として使用されるデカアスパラギン酸ペプチド（Ｄ１０）とを含む。タンパク質は２つの一次タンパク質配列からホモ二量体に結合する。この融合タンパク質は、６つの確認された複合Ｎグリコシル化部位を含有する。これらＮグリコシル化部位のうち５つはｓＡＬＰドメインに位置し、１つはＦｃドメインに位置する。アスホターゼアルファに存在するもう１つの重要な翻訳後修飾は、酵素及びＦｃドメインの構造を安定化するジスルフィド結合の存在である。合計４つの分子内ジスルフィド結合が単量体当たり存在し、二量体では２つの分子間ジスルフィド結合が存在する。アルカリホスファターゼドメインのシステインの１つは遊離である。
【００５４】
アスホターゼアルファは、低ホスファターゼ血症（ＨＰＰ）の治療について認可された酵素補充療法である。ＨＰＰの患者では、ＴＮＳＡＬＰをコードする遺伝子における機能喪失型変異がＴＮＳＡＬＰ酵素活性の欠乏の原因となり、それは、無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）及びピリドキサール−５’−ホスフェート（ＰＬＰ）のような基質の高い循環レベルをもたらす。ＨＰＰ患者へのアスホターゼアルファの投与はＰＰｉを切断し、カルシウムとの結合にための無機ホスフェートを放出し、それによってヒドロキシアパタイト結晶の形成及び骨石灰化を促進し、正常な骨格表現型を回復する。アスホターゼアルファ及び治療におけるその使用のさらに詳細については、その教示が全体として参照によって本明細書に組み入れられるＰＣＴ公開番号ＷＯ２００５／１０３２６３及びＷＯ２００８／１３８１３１を参照のこと。別の実施形態では、アスホターゼアルファは、神経線維腫症Ｉ型（ＮＦ１）の治療のための酵素補充療法として使用されてもよい。神経線維腫症Ｉ型（ＮＦ１）の治療におけるアスホターゼアルファ及びその使用（他のアルカリホスファターゼの使用と合わせた）のさらに詳細については、その教示が全体として参照によって本明細書に組み入れられるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１３／０５８８３３を参照のこと。
【００５５】
本明細書で引用されている参考文献はすべてその全体として参照によって組み入れられる。
【００５６】
前述の開示は理解の明瞭さを目的で説明及び例示を手段としてある程度詳細に記載されているが、特定の軽微な変更及び改変が実践されるであろうことは当業者に明らかである。従って、記載及び実施例は、クレームによって適宜定義されている本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５７】
実施例１：低ホスファターゼ血症患者におけるアスホターゼアルファの母集団薬物動態と薬物力学のモデル化及びシミュレーション
低ホスファターゼ血症（ＨＰＰ）の患者のアスホターゼアルファ治療について複数の臨床試験が実施された。特定の日付までの進行中の臨床試験のデータを回収し、解析した。目的は、生体マーカー、有効性及び安全性の評価項目についての基本的な薬物動態（ＰＫ）と曝露−反応の関係の理解を前提として、ＨＰＰ治療のためのアスホターゼアルファの用量及び投薬計画の選択についての基礎を確立することだった。
【００５８】
臨床試験＃１の企画：これは、アスホターゼアルファの多施設多国非盲検用量漸増試験だった。６名のＨＰＰ成人患者が３ｍｇ／ｋｇの単回静脈内（ＩＶ）点滴を受け、その後３回の皮下（ＳＣ）注射（コホート１［ｎ＝３］は１ｍｇ／ｋｇ／週を受け入れ、コホート２［ｎ＝３］は２ｍｇ／ｋｇ／週を受け入れた）を毎週３週間受けた。
【００５９】
臨床試験＃２の企画：これは、アスホターゼアルファの多施設多国非盲検単一群評価試験だった。幼児発症ＨＰＰである３６カ月齢以下の幼児及び小児が２ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ点滴を受けた。１週間後、患者は１ｍｇ／ｋｇのＳＣ注射を週に３回受けた。１ヵ月後、用量調整を週３回の２ｍｇ／ｋｇにすることができた。３ヵ月後、用量調整を週３回の３ｍｇ／ｋｇにすることができた。
【００６０】
臨床試験＃３の企画：これは、臨床試験＃２の多施設多国非盲検単一群評価の拡大試験だった。幼児及び小児は、６０ヵ月までの治療のために臨床試験＃２で受けた最終用量にて週３回アスホターゼアルファのＳＣ注射を受けた。注射当たり４０ｍｇの最大用量で用量調整が許された。
【００６１】
臨床試験＃４の企画：これは、多施設多国非盲検用量比較平行割当履歴対照試験だった。小児及び早期青年は週３回の２ｍｇ/ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇのアスホターゼアルファのＳＣ注射（合計６ｍｇ／ｋｇ／週または９ｍｇ／ｋｇ／週）を２４週間受けた。
【００６２】
臨床試験＃５の企画：これは、臨床試験＃４の多施設多国非盲検用量比較平行割当拡大試験だった。小児及び早期青年は週６回の１ｍｇ／ｋｇまたは週３回の２ｍｇ／ｋｇ（合計６ｍｇ／ｋｇ／週）のアスホターゼアルファのＳＣ注射を４２ヵ月または薬剤の規制当局による承認まで受けた。
【００６３】
臨床試験＃６の企画：これは、ＨＰＰの青年及び成人の患者における無作為非盲検多施設多国用量範囲及び同時対照試験である。患者が登録され、最初の２４週間、以下の３つのコホート；（１）０．３ｍｇ／ｋｇのアスホターゼアルファの毎日のＳＣ注射（合計２．１ｍｇ／ｋｇ／週）、（２）０．５ｍｇ／ｋｇのアスホターゼアルファの毎日のＳＣ注射（合計３．５ｍｇ／ｋｇ／週）、または（３）無治療の１つに無作為で分けた。患者はすべて、彼らが０．５ｍｇ／ｋｇのアスホターゼアルファの毎日のＳＣ注射（合計３．５ｍｇ／ｋｇ／週）で２４週間治療され、次いで週当たり６日の１ｍｇ／ｋｇ／日をほぼ４８週間または薬剤の規制当局による承認まで受け入れる拡大フェーズで継続する資格があった。
【００６４】
臨床試験＃７の企画：これは、幼児発症ＨＰＰの５歳以下の幼児及び小児におけるアスホターゼアルファの非盲検多施設多国試験である。患者は、注射当たり４０ｍｇの最大用量で週当たり６日の１ｍｇ／ｋｇのアスホターゼアルファまたは週当たり３日の２ｍｇ／ｋｇのアスホターゼアルファのＳＣ注射を受けた。治療の総持続期間は２４ヵ月だった。
【００６５】
方法
反復測定の薬物動態（ＰＫ）及び薬物力学（ＰＤ）の評価項目に関する個人すべてについての完全な臨床経過を表すデータを解析のために構築した。ＰＫ及びＰＤの評価項目に加えて、たとえば、年齢、体重、臨床検査値、中和抗体の状況及び疾患の表現型のような共変量因子と共に、ロットのシアル酸含量（ＴＳＡＣ）及びロット濃度を含む投薬歴（量及び頻度）全体を表した。評価項目の選択の論理的根拠を表１にてリストにする。
【表１】
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【００６６】
反復測定の評価項目についての母集団ＰＫ及び薬物動態−薬物力学（ＰＫ−ＰＤ）の解析を非線形混合効果モデルを介して実施した。母集団ＰＫのデータは線形２コンパートメントモデルで記述し、母集団ＰＤのデータ（有効性の評価項目すべてについて）は、時間連続性の患者特有の予測された血清アスホターゼアルファ活性を用いた間接的ＰＤ反応モデルで記述した。予測因子における相関または共線性を回避するように注意して事前に指示した共変量及び一部の探索的変数を考えて、完全な共変量モデルを構築した。得られたモデルを適合の良好性について評価し、適格とした。モデルに基づくシミュレーションを行って評価項目すべてについて用量−曝露−反応の関係を検証した。投薬計画及び治療効果の時間経過の比較も、ＰＫ及びＰＤの評価項目の背景でシミュレーションを介して行った。
【００６７】
初回投与以来の平均濃度（Ｃａｖｇ，ｓｔｕｄｙ）の四分位数間の関係はＡＵＣｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ／初回投与後の時間（「ＴＡＦＤ」）として算出し、有害事象（ＡＥ）の発生率を異所性の石灰質沈着、注射／点滴に関連した反応、及び注射部位の反応について調べた。
【００６８】
Ｘ線写真
２つの評価であるＲＧＩ−Ｃ及びＲＳＳを用いてＸ線写真の評価を報告した。ＲＧＩ−Ｃの尺度のスコアは以下のように記載されている：
・非常に良好（すなわち、ＨＰＰが関連したくる病の完全なまたは完全に近い治癒；＋３）
・はるかに良好（すなわち、ＨＰＰが関連したくる病の実質的な治癒；＋２）
・最小限に良好（すなわち、ＨＰＰが関連したくる病の最少限の治癒；＋１）
・不変（０）
・最小限の悪化（すなわち、ＨＰＰが関連したくる病の最少限の悪化；−１）
・はるかに悪化（すなわち、ＨＰＰが関連したくる病の中程度の悪化；−２）
・非常に悪化（すなわち、ＨＰＰが関連したくる病の重篤な悪化；−３）
【００６９】
試験の遂行に所属しなかった３名の小児放射線医が骨格形成異常で専門知識がある小児放射線医によって実施される訓練セッションに参加した。訓練には、ＨＰＰが関連する骨格異常を特定する放射線医の能力を確認する試験が続いた。訓練の完了の後、放射線医は、各患者について単一のＲＧＩ−Ｃスコアを割り当ててベースラインからベースライン後の時点までの胸部及び上肢及び下肢の放射線画像の所見における気付いた変化を反映するよう依頼された。このＰＫ−ＰＤの解析では３つのＲＧＩ−Ｃスコアの平均を使用した。
【００７０】
骨幹端の摩耗及び吸角の程度ならびに冒された成長板の比率に基づいて栄養性くる病の重症度を評価するために開発されたＲＳＳを用いて放射線画像の変化も評価した。ＲＳＳの最大総スコアは１０点であり、手首についての最大スコアは４点及び膝については６点である（高いスコアはさらに重度のくる病に関係する）。手首及び膝の個々の放射線画像をスコア化のために無作為な順序でこの機器の開発者に提示した。評価者は患者識別子及びＸ線写真が利用される時点に対して盲検化された。
【００７１】
６ＭＷＴ
特定の試験で選択された時間に６ＭＷＴを施行して歩行能力を評価した。患者は事前に測定された廊下の範囲を６分間歩行するように指導された。一番の目安は歩行した距離（メートルで）だった。次いでこの距離を参照集団の予測百分率に変換した。予測された６ＭＷＴの値の百分率は以下の参照年齢群：１３〜１９歳の参照、２０〜３９歳の参照及び４０〜６５歳の参照に基づいて算出された。
【００７２】
ＢＯＴ−２（体力と敏捷性の複合標準スコア）
粗大運動機能の測定として特定の試験にてＢＯＴ−２試験を施行した。ＢＯＴ−２は、正常に発達している個人と同様に含まれる４歳から２１歳までの中程度の運動欠損をもつものにおいて運動の上達を評価する。２つの粗大運動の下位試験（走行速度／敏捷性と体力）を施行し、体力と敏捷性の複合スコア（標準のスコア及びパーセンタイル順位）を算出するのに使用した。ＢＯＴ−２の体力と敏捷性の複合スコアは、Ｂｒｕｉｎｉｎｋｓ及びＢｒｕｉｎｉｎｋｓ（運動の上達のＢｒｕｉｎｉｎｋｓ−Ｏｓｅｒｅｓｔｓｋｙ検定，第２版（ＢＯＴ−２）（２００５）．ＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅａｒｓｏｎａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ．ｃｏｍ／ＨＡＩＷＥＢ／Ｃｕｌｔｕｒｅｓ／ｅｎ−ｕｓ／Ｐｒｏｄｕｃｔｄｅｔａｉｌ．ｈｔｍ？Ｐｉｄ＝ＰＡａ５８０００）に従って算出した。手短には、走行速度及び敏捷性と体力の基準化したサブスコア（スケール／スコアと呼ばれる）は参照の年齢が一致した群のスコアに対して基準化した。ＢＯＴ−２については、基準スコアは２０から８０までに及び、５０の平均値と１０の標準偏差を有する。
【００７３】
薬物動態（ＰＫ）
ＨＰＰの小児患者及び成人患者にて静脈内（ＩＶ）及び皮下（ＳＣ）のアスホターゼアルファの薬物動態（ＰＫ）特性を検討している。ＳＣアスホターゼアルファの絶対的な生体利用効率は４６％から９８％までに及ぶ。Ｌ／日での平均クリアランス（ＣＬ）及び分布容積（Ｖ）の値はそれぞれ、７．９０ｍＬ／分から１１．４ｍＬ／分まで（１１．４〜１６．４Ｌ／日）及び３９．７Ｌから７１．０Ｌまでに及んだ。投薬間隔における最大濃度（Ｔｍａｘ）の中央値時間はＳＣ注射ののち２４〜４８時間だった。アスホターゼアルファの投薬間隔における最大濃度（質量単位／容積）（Ｃｍａｘ）（Ｕ／Ｌ）及びＡＵＣ０−１６８（Ｕ＊時間／Ｌ）は、ＳＣ注射に続いて１ｍｇ／ｋｇから２ｍｇ／ｋｇまでの用量に比例して増加した。ＳＣ投薬の後、アスホターゼアルファはフリップ・フロップ動態を示し、その際、有効な半減期（ｔ１／２）は相対的に遅い吸収動態によって律速される。ＩＶ投薬後の消失ｔ１／２は５９〜７３時間であり、用量に無関係であった一方で、ＳＣ投薬後の有効なｔ１／２は１１２〜１３５時間であり、これも用量に無関係であった。
【００７４】
アスホターゼアルファの安全性及び有効性に関する本明細書で開示されているような複数の多施設試験については、完了した安全性／有効性試験と同様に定義された「データの切り取り」を伴う進行中の試験に由来するデータを用いて解析を行って、アスホターゼアルファのＨＰＰ母集団のＰＫ及び曝露−反応の関係のモデルに基づく記述を更新したが、解析は従来の解析で使用され、報告されたデータセットを拡大する。
【００７５】
薬物力学（ＰＤ）
アスホターゼアルファの種々の効果について曝露−反応を理解するためのアスホターゼアルファの開発プログラムにおいて、作用のメカニズム、画像に基づく及び機能的な有効性及び安全性／忍容性に関する多数の薬物力学（ＰＤ）の評価項目を収集した。調べられた２つの生体マーカーはＴＮＳＡＬＰの基質であるＰＬＰ及びＰＰｉである。ＴＮＳＡＬＰ基質の高いレベルはＨＰＰに特徴的である。同様に、これらの基質の低下は薬理学的な反応を示す。双方ともアスホターゼアルファ療法によって改善することが予想されるＸ線画像所見の全般的変化（ＲＧＩ−Ｃ）及びくる病重症度（ＲＳＳ）を用いて、手首及び膝のＸ線写真からの証拠を記載した。これら２つの特定の評価項目は、自然経過のデータが利用できるという点でも有用であり、治療の非存在下での疾患の進行の定量的評価を可能にするであろう。類骨厚み（ＯＴ）は骨疾患の組織形態的測定であり、それは有効性に関連する薬理学的反応も反映するはずである。機能的な観点から、曝露−反応の目的で有用な評価項目には、運動熟練度のＢｒｕｉｎｉｎｋｓ−Ｏｓｅｒｅｓｔｓｋｙ試験、第２版（ＢＯＴ−２、体力及び敏捷性の複合標準スコア）及び６分間歩行試験（６ＭＷＴ）が挙げられる。曝露−反応の評価に重要な安全性の評価項目には、異所性石灰質沈着（ＥＣ）、注射／点滴関連の反応（ＩＡＲ）、及び注射部位の反応（ＩＳＲ）が挙げられる。
【００７６】
データの集積
母集団ＰＫ−ＰＤ解析のデータを集積し、本明細書で開示されている一般規則に従って形式化した。母集団ＰＫ及び曝露−反応のデータのセットは試験全体にわたってプールしたデータから進展させた。投薬、共変量、実験室、薬物力学（ＰＤ）及びＰＫのデータは、調節された環境での使用に好適なデータ解析言語（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｄｏｃ／Ｒ−ＦＤＡ．ｐｄｆ））であるＲ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇでの「統計的コンピュータ計算のためのＲプロジェクトのウェブサイトを参照のこと）のバージョン３．０.２以上を用いてＮＭＴＲＡＮ用に形式化し、ＡＳＣＩＩテキストとして保存した。オーディット・トレールを維持するためにデータ操作プログラム及びデータファイルはすべて文書化し、アーカイブに保管した。データ集積過程の品質管理チェックも行った。
【００７７】
解析アッセイの定量限界を下回る評価項目の観察またはさもなければ欠けている値は推定解析から除外したが、それらの時点は予測目的に含まれてもよい。個々の、臨床の及び人口動態の共変量因子も含まれてもよい。１０％を超える共変量値が欠けているのであれば、その共変量は解析に含めなかった。さもなければ、欠けている共変量は、残っている利用可能なデータ（通常、残っている値の中央値で）に基づいて単一帰属法を用いて帰属させた。欠けている観察または投薬時間を伴う評価項目の観察は該当する場合、プロトコール企画ごとに帰属させ、またはさもなければ解析から除外した。
【００７８】
データ解析
これらの解析の全体的な目標に対処するために、母集団ＰＫ及び曝露−反応の評価を行った。アスホターゼアルファの開発プログラムにおける従来の臨床薬理学の欠如及び用量範囲試験の企画は、曝露、用量及び投薬計画についての推論を支援するためにプールしたデータ及びモデルに基づいたアプローチを必要とした。反復測定データ（利用できる場合）についての曝露−反応のモデルは曝露及び反応における個人内変化を探索する追加の利点を提供するのに対して非反復測定の評価項目は典型的な母集団の曝露−反応の関係を解明するのにＰＫの変動性を頼らなければならないことに留意のこと。
【００７９】
母集団ＰＫのデータセットに含まれる個人、臨床及び人口動態の因子は、性別、身長、体重、年齢、疾患症状の発症の年齢、表現型、付随する薬物、タナー分類及び人種だった。免疫原性の状態、体重及び年齢のような時間で変化する因子はデータの集積で特殊な注意を要した。これらの試験における幼児及び小児の登録は、年齢及び体重の相対的に厳しい帰属を必要とした。年で算出される年齢は、患者の誕生日を用いた投薬及び観察記録で明白に算出された。患者の誕生日から特定の日が欠けていたら、患者が生まれた月の最初の日を想定した。記録された体重記録の間で線形の内挿を想定する投薬及び観察記録のすべてで体重を内挿した。
【００８０】
表現型は最初の兆候の年齢を用いて割り当て、記号は以下の通りである：＜６ヵ月＝周産期／幼児；≧６ヵ月及び＜１８歳＝小児；ならびに≧１８歳＝成人。最初の兆候及び症状の年齢が欠けていれば、そのときは表現型も欠け、不明として特徴付けられた。
【００８１】
完全な投薬歴はデータ集積の間に再構築されなければならなかった。幾人かの患者における不完全な投薬情報は明白な記録間の投薬記録の帰属を必要とした。次の記録された用量まで記録された用量の量（ｍｇ／ｋｇ）及び投薬計画（回数／週）を進めることによって用量を帰属させた。これは最後の記録された用量まで続いた。さらに、薬剤のロット情報は投薬記録のすべてで記録されなかった。たとえば、シアル酸含量及びアスホターゼアルファの比活性のような薬剤のロット情報はロット全体にわたって変化し、この情報はＰＫモデルの開発で使用されたので、ロット出荷日はロットが特定されなければ所与の患者に所与のロットを投与するための出発日であると想定された。この方法で、ロット番号、シアル酸含量及びアスホターゼアルファの比活性はすべての投与された用量について定義された。場合によっては、ロットの割り当ては未知であり、アスホターゼアルファ活性及びシアル酸含量についての値は全ロットのこれらの特徴の平均を考えて帰属させた。
【００８２】
幾人かの患者は１を超える試験に登録され、データセットに一部の修正を必要とした。これらの症例のほとんどでは、患者は最初の試験から拡大試験に登録した（たとえば、試験＃２と拡大試験＃３、及び試験＃４と拡大試験＃５）。一部の重複する投薬記録はこれらの試験の共通部分で気付かれ、そのような症例では一方の記録のみが保持された。また、試験＃６の４名の患者は以前試験＃１に登録された。１を超える試験に登録したこれらの患者についての初回投薬後の時間（日数）は元々の試験の初回投薬の投与の時間から算出した。
【００８３】
一般に、対象とする対象、時間及び量が以前の記録と同一である場合はいつも記録は重複として破棄した。例外に近いのはスポンサーとの共同研究で解消した。
【００８４】
定量限界を下回る（ＢＬＱ）として記録された血清アスホターゼアルファ及び血漿ＰＬＰとＰＰｉの濃度はすべてＮＯＮＭＥＭデータ項目の０のＥＶＩＤ値に設定し、フラグ付きのデータセット（ＢＬＱ＝１）にて特定された。ＢＬＱデータの比率が小さければ（＜１５％）、これらの値は解析から除外した。
【００８５】
２つの生体分析アッセイを用いて血漿ＰＬＰデータを解析した。場合によっては、双方のアッセイを用いて試料を解析し、ＡＲＵＰ値をバイオトライアル値に変換するアルゴリズムの開発を可能にした。対応するバイオトライアルアッセイの値がなくてもこのアルゴリズムをＡＲＵＰアッセイ値に適用し、カラム適合でのデータセットにてこれらの値にフラグを付けた。
【００８６】
ＰＤ評価項目のモデルに基づく解析については、ＣＬ、分布の中央容積（Ｖ２）、分布の末梢容積（Ｖ３）、コンパートメント間クリアランス（Ｑ）、絶対的な生体利用効率（Ｆ）、吸収速度定数（ｋａ）、及び吸収遅延時間（ＡＬＡＧ）についての個々の無作為効果の事後確率最大化（ＭＡＰ）Ｂａｙｅｓ法による推定値を、逐次ＰＫ−ＰＤ解析のための元々のＰＫ−ＰＤデータセットを持つ対象のＩＤによってその後、統合される最終的なＰＫモデルから推定した。ＰＤの観察を伴うが、ＰＫの観察を伴わない患者については、個々のＰＫ無作為効果の推定値は、典型的な母集団値にデフォルトした。
【００８７】
推定される糸球体濾過率の導出
１８歳以上の患者について、方程式１で示すような標準のＭＤＲＤ式を用いて算出されたｅＧＦＲによって腎機能を表した。
ｅＧＦＲＭＤＲＤ＝１７５×ＳＣＲ−１．１５４×ＡＧＥ−０．２０３×０．７４２ｆｅｍａｌｅ×１．２１２Ａｆｒ．Ａｍｅｒ．            （１）
【００８８】
１８歳未満の患者については、方程式２で示すようなＳｃｈｗａｒｚの式を用いてｅＧＦＲを算出し、
ｅＧＦＲＳｃｈｗａｒｔｚ＝ＨＥＩＧＨＴ×ｋ／ＳＣＲ        （２）
式中、１歳までの小児についてはｋ＝０．４５、１〜１３歳の小児及び青年女性（１３〜１８歳）についてはｋ＝０．５５、ならびに青年男性（１３〜１８歳）についてはｋ＝０．７だった。
【００８９】
ｅＧＦＲの単位はｍＬ／分／１．７３ｍ２である。これらの式の使用は糸球体濾過率の若干の非生理的推定値を生じた。１５０ｍＬ／分／１．７３ｍ２を超える計算値はモデル化の目的で１５０ｍＬ／分／１．７３ｍ２によって置き換えた。１５０という値は、ＮＨＡＮＥＳデータベース及びＭＤＲＤの式（Ｌｅｖｅｙ，ｅｔ  ａｌ．２００９，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１５０：６０４−１２）を用いて導出したｅＧＦＲ値の平均値プラス１標準偏差を近似で表す。
【００９０】
コンピュータ環境及びバージョン制御
一般に、反復測定の評価項目についての母集団解析は、Ｌｉｎｕｘ(登録商標)コンピューティンググリッドにおけるＮＯＮＭＥＭソフトウエア、バージョン７．２以上（ＩＣＯＮ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｈａｎｏｖｅｒ，ＭＤ）及びＩｎｔｅｌ  Ｆｏｒｔｒａｎ  Ｃｏｍｐｉｌｅｒ、バージョン１２．０．４の適格なインストールによる非線形の混合効果モデルを介して行った。ＮＭＱｕａｌ８．２.７以上を用いてコードのパッチ／オプションをすべて追跡し、ＮＯＮＭＥＭソフトウエアをインストールした。η−ε相互作用（ＦＯＣＥＩ）による一次条件付き推定をすべてのモデルの実行で採用した。モデルの適切性の評価及びモデルの高い複雑性の決定はデータによって行い、（１）診断上の散布図の目視検査（たとえば、予想された濃度に対比した観察された濃度、予測された濃度または時間に対比した残差／加重残差、及び個々の無作為効果のヒストグラム）、（２）パラメータ推定値における少なくとも３つの有意な数字による最小化ルーティーンの成功した収束、（３）パラメータ推定値のもっともらしさ、（４）パラメータ推定値の精度、（５）モデルのパラメータ推定値の誤差間の相関＜０．９５、及び（６）最少限の目的機能値と推定されるパラメータの数を考えたＡｋａｉｋｅ情報基準（ＡＩＣ）を含む、適合度基準によって導いた。パラメータ推定値はすべて、たとえば、推定値の標準誤差（ＮＯＮＭＥＭ  ＄ＣＯＶＡＲＩＡＮＣＥ工程から得られる）のような推定不確定性の測定と共に報告された。Ｒを用いて、記述統計学及び単純プール化モデルアプローチを非反復測定データに適用してもよい。バージョン制御方式サブバージョン（ｈｔｔｐ：／／ｓｕｂｖｅｒｓｉｏｎ．ｔｉｇｒｉｓ．ｏｒｇ／）を用いてコードすべてを維持した。具体的な解析方法は評価項目によって以下に記載されている。
【００９１】
母集団ＰＫのモデル化及びシミュレーション
ＩＶ及びＳＣでのＰＫデータの当初のモデル化は、ＣＬという点でパラメータ化した一次吸収、ＣＬという点でパラメータ化した一次吸収を伴う分布モデルの中央容積、分布の中央容積（Ｖ２）、分布の末梢容積（Ｖ３）、コンパートメント間クリアランス（Ｑ）、旧収率定数（ｋａ）及びデータによって支持できる個人間の無作為効果のパラメータによる絶対的な生体利用効率（Ｆ）を伴った２コンパートメント体内動態モデルを用いて行った。パラメータＣＬ、Ｖ２、Ｖ３、及びＱは患者の体重との非比例的な関係を最初に用いて記載した。アスホターゼアルファのＣＬに関する以下の共変量：抗薬剤抗体の存在、中和抗体の存在及びロットのシアル酸含量の効果に関するモデルに基づく推測を事前に指示した。Ｆ及びｋａに対するバッチサイズ（２，０００Ｌまたは２０，０００Ｌ）の影響も特徴付けた。アスホターゼアルファのロットの比活性は投与される投与量で説明された。さらに、推定された糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）の影響を事後背景で評価した。これは、体重とｅＧＦＲ測定との間の相関による。Ｕ／Ｌでの血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）及びＵ／Ｌでの血清アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）を含む探索的共変量がＣＬに対する影響について事後に検討されてもよい。
【００９２】
共変量−パラメータの関係も母集団ＰＫ及びＰＫ−ＰＤの解析の一部として検討し始めた。母集団ＰＫ及びＰＫ−ＰＤのモデルのための共変量モデルの組み立ては通常、潜在的予測因子の変数の包含についての従来の科学的思考の程度を変えることを特徴とする探索的段階的回帰分析として行った。尤度比検定及び事前に指示したアルファレベルに基づいた段階的な前向き及び後向きの比較を、それぞれ異なる共変量のパラメータ関係を表現する複数のモデルにわたって行った（Ｊｏｎｓｓｏｎ及びＫａｒｌｓｓｏｎ，１９９８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：１４６３−１４６８ならびにＭａｎｄｅｍａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０：５１１−５２８）。尤度比検定に従って、枝分かれモデルに由来する２＊対数−尤度における差異は、モデルのパラメータの数の差異に等しい自由度（ｄｆ）で漸近的に２分布すると想定される（Ｂｅａｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９−２００６，ＮＯＮＭＥＭ  Ｕｓｅｒｓ  Ｇｕｉｄｅ：Ｐａｒｔ  Ｉ−ＶＩＩ，（Ｉｃｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｅｌｌｉｃｏｔｔ  Ｃｉｔｙ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）。しかしながら、非線形混合効果モデルから得られる実際の有意レベルは、推定ルーティーンにて尤度の近似値に敏感であり、モデルが既知である場合でさえ、想定される２分布のもとでは名目上の有意レベルとは全く異なり得ることが示されている（Ｇｏｂｂｕｒｕ及びＬａｗｒｅｎｃｅ，２００２，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：９２−９８；Ｗａｈｌｂｙ，ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ，２８：２３１−２５２；ならびにＷａｈｌｂｙ，ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ，２９：４１１−４１２）。線形混合効果モデルにおける尤度比検定に関連する課題に加えて、相関するまたは共線性の予測因子、複数の比較、人工的に楽観的なパラメータの精度、選択の偏り、及び有意な予測因子のための生物学的な論理的根拠の欠如による課題を含む他の課題が一般に段階的回帰法と関連する（Ｈａｒｒｅｌｌ，２００１，Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ：Ｗｉｔｈ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｌｉｎｅａｒ  ｍｏｄｅｌｓ，  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ，  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｕｒｎｈａｍ，２００２，Ｍｏｄｅｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｍｏｄｅｌ  ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ｔｈｅｏｒｅｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ））。これらの性能の限界は小さなデータセットによってさらに増幅される（Ｒｉｂｂｉｎｇ  ａｎｄ  Ｊｏｎｓｓｏｎ，２００４，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍ��ｃｓ，３１：１０９−１３４）。母集団ＰＫにおける共変量モデルの組み立てのための段階的方法を用いた解析者も、臨床的に関連するこれらの効果に由来する統計的に有意な共変量効果を調整する困難さに直面する（Ｂｕｒｎｈａｍ，２００２；Ｇａｓｔｏｎｇｕａｙ，２０１１，Ｆｕｌｌ  Ｃｏｖａｒｉａｔｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ａｓ  ａｎ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｒｅｌｙｉｎｇ  ｏｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅｓ  ａｂｏｕｔ  Ｃｏｖａｒｉａｔｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ４２  Ｃａｓｅ  Ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｉｎ  ＰＡＧＥ  ２０，Ａｂｓｔｒ，２２９９，ｐａｇｅ，Ａ１６）。
【００９３】
これらの課題及び解析にデータを提供するのに対応できる相対的に少数の個人を考えると、段階的な仮説試験ではなくパラメータの推定を強調する共変量モデルのアプローチをこれらの母集団ＰＫ及びＰＫ−ＰＤの解析にために実施した。共変量−パラメータの関係は、科学的な興味、メカニズムのもっともらしさ、または従来の知識に基づいて事前に定義され、予測因子における相関及び共線性を回避するように注意して完全なモデルを構築した（＞０．３５の相関係数を持つ共変量は潜在的予測因子として同時には含まれなかった）（Ｈａｒｒｅｌｌ，２００１；Ｂｕｒｎｈａｍ，２００２；Ｅｔｔｅ 及びＬｕｄｄｅｎ，１９９５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：１８４５−１８５５；ならびにＧａｓｔｏｎｇｕａｙ，２０１１）。この完全なモデルの概念はＢｕｒｎｈａｍ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ（Ｂｕｒｎｈａｍ，２００２）によって記載された大域モデルアプローチの簡略化である。固定効果のパラメータ（共変量係数及び構造モデルパラメータ）及び無作為効果パラメータを含む母集団パラメータを推定した。共変量の効果（個々の無作為効果（ηｉ）の事後確率最大化（ＭＡＰ）Ｂａｙｅｓ法による推定値及び／または共変量に対比した完全モデルに由来する加重残差（ＷＲＥＳ）のプロット）すべてのグラフ上の検査によって残りの傾向の探索的評価を行った。パラメータの臨床的関連性の推測は、完全モデルの得られたパラメータの推定値及び推定精度（漸近標準誤差）の測定に基づいた。仮説試験は実施しなかった。このアプローチは共変量効果の臨床的関連性の直接的な評価を可能にし、共変量効果の明らかな非存在についての一部の説明を提供した（その効果についての情報の欠如に対比した効果の真の欠如）。事前に指示されていない追加の共変量の影響を同様に、しかし、事後探索法で評価した。
【００９４】
母集団の薬物動態に関する規制手引きの文書は、モデル評価の工程が意図される目的についての母集団ＰＫモデルの適切性を評価するために実施されるべきであることを提案している（産業のための手引き：母集団薬物動態．技術報告，Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９））。シミュレーションに基づいた予測チェック法を用いて最終的なアスホターゼアルファの母集団ＰＫ及びＰＫ−ＰＤモデルを評価した。この方法は、事後予測チェック法に由来するが、パラメータの不確定性は個人間及び残差の分散に対して無視できることを想定する（Ｇｅｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｂａｙｅｓｉａｎ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ，（Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ／ＣＲＣ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｙａｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２８：１７１−１９２）。基本的な前提は、観察されたデータセットに由来するモデル及びパラメータが元々の観察されたデータに類似するシミュレートしたデータを生じるはずであるということである。予測チェックは無作為効果のパラメータ推定値の性能についての情報を提供するのに対して典型的な診断プロットは固定した効果のパラメータ推定値についての主要な情報であるという点で予測チェックは典型的な診断プロットを有用に補助するものである。最終的な母集団ＰＫ及びＰＫ−ＰＤのモデルを用いて元々のデータセットの５００のモンテカルロシミュレーションの複製を生成した。ＰＫの予測チェックについては、定量化可能限界を下回る観察値または予測値は除外した。探索的グラフ（分位点−分位点のプロット、ヒストグラム、及び視覚的予測チェック）を用いて、シミュレートしたデータの特徴の分布を観察されたアスホターゼアルファのデータセットの同じ特徴の分布と比較した。探索的グラフの視覚検査によって明らかな問題を検討し、必要に応じてさらなるモデル開発を行った。
【００９５】
モデルのパラメータ化及び分布の想定
推定された集団のパラメータの近似接合事後分布（たとえば、推定値の共変量行列）は多変量正規（ＭＶＮ）分布に従う。ＰＫ及びＰＤのモデルのパラメータを対数−ドメインでモデル化してこの分布想定との一貫性を維持した（Ｅｑ．３）。
【００９６】
パラメータの非線形混合効果モデルについては、無作為効果についてのパラメータ分布を想定することが必要である。この解析の出発点として、指数誤差モデルまたは対数正規パラメータ分布によって個人間誤差項すべてを記載した（Ｅｑ.３）。可能であれば、個人間の無作為効果（Ω）について完全な共変量行列を定義する試みを行った。
2018528252.tif 000004
式中
・θはパラメータの対数変換された典型的な集団値であり；
・Ｐｉは個人Ｉの推定されたパラメータ値であり；
2018528252.tif 000005
・ηＰｉは個人ｉとパラメータＰについての個人に特有の個人間の無作為効果であり、
η〜Ｎ（０，Ω）で分布すると想定される。
【００９７】
これらの解析における観察については、非変換の観察による評価項目についての付加及び比例的な誤差のモデル（Ｅｑ.４）または変換された観察による評価項目についての付加的な誤差のモデル（Ｅｑ.５）、たとえば、対数またはロジット変換によって残余誤差モデルが最初に記載された。
2018528252.tif 000006
式中
・Ｃｉｊは個人ｉにてｊ番目に測定された観察（血漿アスホターゼアルファの曝露）であり；
2018528252.tif 000007
・εｐｉｊ及びεａｉｊは個人ｉ及び測定ｊについてそれぞれ比例的及び付加の残余無作為誤差であり、それぞれ独立して及び同等にε〜Ｎ（０，σ２）で分布すると想定される。
【００９８】
既知の生理的な関係を共変量−パラメータモデルに組み込む試みを行った。たとえば、体の大きさの関数としての生理的パラメータの変化を非比例的なモデルによって理論的に及び経験的に双方で記載する（Ｅｑ.６）
2018528252.tif 000008
式中、
・モデルパラメータ（ＴＶＰ）の典型値が、参照体重（ＷＴｒｅｆ）によって正規化された個人の体重（ＷＴｉ）の関数として記載される。
・θＴＶＰは参照体重と等しい体重を持つ個人についての典型的なＰＫパラメータを記載する推定されたパラメータであり、
・θａｌｌｏは非比例的な力のパラメータであり、それは、クリアランスのような生理的な過程については０．７５の値が推定され、または割り当てられ、解剖学的な容積については１の値に固定される。
【００９９】
生理的な関係が推測的に知られていない症例では、連続する共変量の効果は正規化された力のモデルを用いてモデル化されるであろう一方で、カテゴリー共変量の効果は類似して記載された（Ｅｑ．７）。
2018528252.tif 000009
式中、
モデルパラメータ（ＴＶＰ）の典型値は個人の連続する共変量（ｃｏｖｍｉ）とｐ個人のカテゴリー（０〜１）共変量（ｃｏｖｐｉ）の関数として記載されるので、θｎは参照共変量値と等しい共変量を持つ個人についての典型的なＰＫパラメータ値を記載する推定されたパラメータ（ｃｏｖｍｉ＝ｒｅｆｍ，ｃｏｖｐｉ＝０）であり、θ（ｍ＋ｎ）及びθ（ｐ＋ｍ＋ｎ）は共変量−パラメータの関係の大きさを記載する推定されたパラメータである。
【０１００】
これらのモデル化の想定はモデルの出力に基づく標準の診断を用いて評価された。
【０１０１】
母集団ＰＫ／ＰＤのモデル化
母集団ＰＫ／ＰＤのモデル化についての対象とする反応の評価項目には、生体マーカーである血清ＰＰｉ及びＰＬＰ、放射線評価項目であるＲＳＳ及びＲＧＩ−Ｃ、及び機能的な評価項目である６ＭＷＴ及びＢＯＴ−２が挙げられる。
【０１０２】
現在のデータのサブセットによるこれらの評価項目の以前の解析は、アスホターゼアルファが間接的なＰＫ／ＰＤの関係に従って反応に影響を与えることを実証している。アスホターゼアルファについてのＰＫ時間経過と臨床反応との間の間接的な関係の知識を考えると、モデルの開発は間接的なＰＤの反応のモデルに焦点を当てるであろう。最終的に、モデル開発の複雑さはデータで利用できる情報に依存するであろう。
【０１０３】
間接的なＰＤ反応のモデルは、一部のゼロ次の生産過程と一次の分解過程によって支配される薬剤治療に先立って反応変数の恒常性を想定する。プラセボ効果のない時間を一定にしたベースライン反応の想定は評価項目すべてで実施されるであろう。この想定の妥当性は履歴対照データを用いて画像化評価項目（ＲＳＳ、ＲＧＩ−Ｃ）について評価されるであろう。他の評価項目については対照データまたは履歴データは利用できない。
【０１０４】
基本的な間接的ＰＤ反応の多重変形が記載され、以下の一般的なメカニズムを介して薬物効果に介在するのを可能にしている：
・反応の分解を阻害するまたは反応の生成を刺激することによって反応を高める。
・反応の分解を刺激するまたは反応の生成を阻害することによって反応を低下させる。
以前の解析に一致して、当初のモデル化計画は、反応評価項目に対する総効果を記載するＥｍａｘモデルを用いて間接的ＰＤ反応モデルにアスホターゼアルファの濃度を組み込むことである（方程式８）
2018528252.tif 000010
式中、
・ＰＤ（Ｃａｓｆｏｔａｓｅ  ａｌｆａ）はアスホターゼアルファの活性に基づく薬物力学効果であり、
・Ｅｍａｘ，ａｓｆｏｔａｓｅ  ａｌｆａはアスホターゼアルファの最大効果であり、
・ＥＣ５０，ａｓｆｏｔａｓｅ  ａｌｆａは最大半分効果を生じるアスホターゼアルファの活性であり、
・Ｃａｓｆｏｔａｓｅ  ａｌｆａはアスホターゼアルファの血清活性である。
【０１０５】
提案された当初の間接的効果のモデルは方程式９及び１０によって表される
2018528252.tif 000011
式中、
・Ｒは反応の評価項目であり、
・Ｒ０はベースラインの反応の評価項目であり、
・Ｋｉｎは反応のゼロ次入力（合成）速度であり、
・Ｋｏｕｔは反応の一次出力（代謝回転）速度定数であり、
・ＰＤ（Ｃａｓｆｏｔａｓｅ  ａｌｆａ）はアスホターゼアルファの濃度に基づく薬物力学効果である。
【０１０６】
ＰＤ（Ｃａｓｆｏｔａｓｅ  ａｌｆａ）がＫｏｕｔについて記載されたような方法でＫｉｎに影響を与えるモデルも適宜考慮されるであろう。各評価項目については、ヌルモデル、すなわち、薬物力学反応に対するアスホターゼアルファの効果を除外するモデルのパラメータはアスホターゼアルファの影響の程度をさらに理解する基礎として推定された。
反応は表２で示されるように変換されるであろう（またはモデルの予測は変換されるであろう）。
【表２】
2018528252.tif 000012
【０１０７】
曝露−反応を評価し、投薬計画を比較するためのシミュレーション
シミュレーション法を用いてアスホターゼアルファ及び生体マーカー、Ｘ線写真の評価項目及び機能的な評価項目についての曝露−反応の関係をさらに完全に詳述した。さらに、アスホターゼアルファの２つの投薬計画、週当たり６回与える１ｍｇ／ｋｇ及び週当たり３回与える２ｍｇ／ｋｇの効果を比較するための基礎としてシミュレーションを使用した。
【０１０８】
曝露−反応のシミュレーションについては、週当たり７回与える０．０２、０．１、０．２５、０．３、０．５、０．７５、１、及び２ｍｇ／ｋｇ、週当たり６回与える１ｍｇ／ｋｇ及び週当たり３回与える２ｍｇ／ｋｇの皮下投与を含有するテンプレートデータセットを作り出した。テンプレートでは、評価項目の観察時間まで１つの投薬計画を１名の患者に繰り返し与えた。これらの投薬計画の半分は臨床的な検討で研究され、半分は曝露データを内挿してまたは外挿して曝露−反応のさらに広範な理解を提供するために選択された。
【０１０９】
シミュレートした評価項目についての観察時間は以下のとおりである：ＰＰｉ、７及び２４週；ＰＬＰ、２４週；ＲＳＳ、ＲＧＩ−Ｃ、ＢＯＴ−２、及び６ＭＷＴ、７２週。これらの時点は評価項目についての関連する時点で曝露−反応を実証するように選択された。たとえば、７２週目は、実証でき、且つ臨床的に意味のある反応はＰＰｉまたはＰＬＰのような生体マーカーよりも達成するのにさらに時間がかかると予想されるので放射線の評価項目について選択された。
【０１１０】
各評価項目について、５００の反復を行った。従って、各投薬計画は５００回表現された。シミュレーションにおけるアスホターゼアルファ製品の特徴は、２．２（モル／−モル）のシアル酸レベル、２０，０００Ｌのバッチサイズ及び９９０Ｕ／ｍｇの薬剤活性だった。
【０１１１】
シミュレーションを構成する患者の集団はシミュレーションの背景で構築した。患者は抗薬剤抗体または中和抗体が現れないと想定された。シミュレートした患者の体重の忠実な表現を時間をかけて得るために、解析データセットにおける年齢の頻度及び患者の年齢と体重の間の相関を利用して体重経時変化を作り出した。四部分からなる方法を使用した。最初の３つの部分は患者についてのベースライン年齢をシミュレートし、目標は解析データセットにて年齢の分布を近似で表すことである。最後の部分は患者の年齢を体重に変換した。
【０１１２】
第１に、解析データセットを用いて、ビンのそれぞれについてのビンの数及び年齢のカットオフがシミュレートされる評価項目に依存する多数の定義済みのビンのそれぞれにおけるベースライン年齢の比率を明らかにした。第２に、第１の工程で明らかにされたような解析データセットでの年齢ビンにおける対象の観察される頻度に一致する確率でその年齢ビンにシミュレートした患者を無作為に割り当てた。第３に、シミュレートした患者をいったん年齢ビンに割り当てると、そのビンを定義する年齢のカットオフ間での年齢の均一な分布から患者の実際のベースライン年齢を試料採取した。その後、シミュレーションの根底にある時間経過、たとえば、放射線評価項目の場合７２週、全体を通して患者の年齢を増やした。最終工程は、解析データセットにおけるデータを用いて、モデル化された年齢−体重の関係を用い、患者の年齢を体重に変換することだった。
【０１１３】
曝露−反応のシミュレーションについては、対象とする変数は、各投薬計画の反応についての反応の中央値及び９０％信頼区間であり、その際、信頼区間は薬物力学パラメータの推定値に固有の不確実性を特徴付けた。従って、シミュレーションは、患者に特有の共変量の組込みを介して導入されるものを超える無作為な個人間の変動性を含まなかった。薬物力学パラメータは、モデル化工程で得られた推定値に等しい平均値及び推定された分散−共分散行列に等しい分散−共分散を有すると想定された。この多重変量の正規分布が集団のパラメータの推定値における不確定性を表すが、患者レベルの薬物力学パラメータにおける変動性を表さないこと気付くことは重要である。シミュレーションのための代表的な患者としての各評価項目について年齢及び体重の中央値を算出した。週当たり６日与える１ｍｇ／ｋｇの投薬計画と週当たり３日与える２ｍｇ／ｋｇの投薬計画を比較するのに使用されたシミュレーションでは、対象とする変数は患者レベルの反応の分布だった。従って、変動性は患者に特有の共変量及び無作為な個人間の薬物動態及び薬物力学の変動性のせいだった。薬物動態及び薬物力学のパラメータの推定値は、不正確がなければ既知であると想定された。シミュレーションの成分として、アスホターゼアルファ活性−時間プロファイルの経時変化を構築し、報告した。
【０１１４】
生体マーカー（ＰＬＰ、ＰＰｉ）の曝露−反応
反復測定の生体マーカーのデータのための母集団非線形混合効果の曝露−反応のモデルがＰＬＰ及びＰＰｉ生体マーカーのために別々に開発されるであろう。データは試験にわたってプールされ、表現型は曝露−反応のモデルにおける共変量効果として含められる。これらの評価項目については対照またはプラセボのデータは利用できないが、双方の生体マーカーが定常状態の疾患の重症度に達している、及び未治療の反応は時間に依存せずに継続している（たとえば、傾き＝０での線形の疾患の進行）という前提のもとで曝露−反応のモデル化は進行するであろう。従来の探索的モデル化及び探索的グラフは、血漿アスホターゼアルファ曝露の経時変化と生体マーカー反応の経時変化との間での間接的な関係を明らかにした。そのようなものとして、連続的なアスホターゼアルファ曝露の経時変化のモデルに基づく予測は間接的な薬物力学反応のモデルに関連付けされるであろうし、薬物効果は生体マーカー効果の動態のための一次オフセットのシミュレーションとして実施される。予測チェックを用いて最終的なモデル及びパラメータの推測値が適格とされるであろう。標準誤差、またはパラメータ推定精度の他の測定は推定値の漸近の共分散行列から得られるであろう。
【０１１５】
得られた生体マーカーの曝露−反応モデルを用いて用量選択を支援し、それをシミュレーションのツールとして用いて、定常状態のＰＬＰ及びＰＰｉの反応に対する投薬計画（週当たり３回の２ｍｇ／ｋｇに対比させた週当たり６回の１ｍｇ／ｋｇ）の影響を説明するであろう。
【０１１６】
放射線の評価項目の曝露−反応
ＲＧＩ−Ｃの評価項目は、各時点での３名の読み手の平均値であろう。ＲＳＳの評価項目は、別々の曝露−反応の解析のために手首及び膝の副成分に分けられるであろう。
【０１１７】
治療された患者における放射線の評価項目の解析には、幼児及び小児双方の表現型で構成される履歴対照データセットの解析が先行するであろう。この解析は、基礎疾患の進行及び改善がないという想定を調べるために実施されるであろう。疾患の基本的な経時変化に関する結論付けが特定の年齢範囲でのデータセットで行われるので、治療された患者のその後の解析は、ほぼ同じ年齢範囲に制約されるであろう。履歴対照データは以下のように解析されるであろう。
【０１１８】
・ＲＧＩ−Ｃ自然歴
自然歴のデータは、各個人内での長年にわたるＸ線所見の対応ペアとして利用可能である。これらのデータでは、各ペアについてのベースラインまたは参照のＸ線写真は異なる。このことが反復測定データについての単一モデルによる解析を禁じている。代わりに、各ペアを用いてＲＧＩ−Ｃの変化の比率（または傾き）を定義するが、得られる平均ＲＧＩ−Ｃスコアをペアにおける２つのＸ線写真間にて経過した時間で割る。このコホートにおける各個人は複数の機会で検討され、複数のＸ線写真のペアが評価されるので、各個人は複数のＲＧＩ−Ｃの傾きに寄与するであろう。導出されたＲＧＩ−Ｃの傾きを考えて、母集団混合効果モデルを導出して平均（及び９５％ＣＩ）の傾きを推定するであろう。得られる傾きの推定値は、アスホターゼアルファで治療したコホートのその後の解析のための疾患の進行速度として使用されるであろう。ＲＧＩ−Ｃの傾きについての９５％ＣＩがゼロのヌル値を含むのであれば、傾きゼロの疾患の進行がその後の曝露−反応のモデル化のために想定されるであろう。
【０１１９】
・ＲＳＳ自然歴
自然歴のデータはＲＳＳ−手首及びＲＳＳ−膝のサブスコアの双方について利用できる。探索的尽力として、母集団混合効果モデルを導出して手首と膝の双方の評価項目のための疾患の進行の速度を推定するであろう。線形モデルを外挿するが、適合度診断の結果を考えて、代替の構造を実施してもよい。アスホターゼアルファで治療したコホートのその後の曝露−反応解析のために、得られた疾患進行のモデルを用いて疾患の進行速度を固定するであろう。膝または手首の疾患の進行についての９５％ＣＩがヌル値を含むのであれば、傾きゼロの疾患の進行がその後の曝露−反応のモデル化のために想定されるであろう。
【０１２０】
アスホターゼアルファの積極的な治療群に由来する曝露−反応のデータを解析し、上述の探索的自然歴解析にて条件付けするであろう。
【０１２１】
・ＲＧＩ−Ｃ積極的治療
連続的な反復測定のＲＧＩ−Ｃデータのための母集団非線形混合効果の曝露−反応モデルが開発されるであろう。試験にわたってデータがプールされるであろう。このモデルの疾患進行の成分は上述の自然歴解析に由来する固定パラメータに固定されるであろう。ＲＧＩ−Ｃに対するアスホターゼアルファの効果は血漿アスホターゼアルファ曝露の経時変化と有効性反応の経時変化との間の間接的な関係に従うであろうことが期待される。そのようなものとして、連続アスホターゼアルファ曝露の経時変化の予測に基づくモデルを用いて間接的な薬物力学反応モデルを動かすであろうし、薬物効果はＲＧＩ−Ｃ反応のゼロ次形成速度のシミュレーションとして実施される。最初に、血清アスホターゼアルファ活性がＥｍａｘモデルを用いた間接効果モデルに入り、反応の評価項目に対する総効果を記載するであろう。
【０１２２】
・ＲＳＳ積極的治療
連続的な反復測定のＲＳＳ−手首及びＲＳＳ−膝のデータのための母集団非線形混合効果の曝露−反応モデルが開発されるであろう。手首及び膝のサブスコアデータのためのモデルは別々に開発されるであろう。試験にわたってデータがプールされるであろう。このモデルの疾患進行の成分は上述の自然歴解析に由来する固定パラメータに固定されるであろう。ＲＳＳに対するアスホターゼアルファの効果は血漿アスホターゼアルファ曝露の経時変化と有効性反応の経時変化との間の間接的な関係に従うであろうことが期待される。連続アスホターゼアルファ曝露の経時変化のモデルに基づく予測を用いて間接的な薬物力学反応モデルを動かすであろうし、薬物効果はＲＳＳ−手首及びＲＳＳ−膝の反応についてのゼロ次形成速度の阻害として実施される。最初に、血清アスホターゼアルファ活性がＥｍａｘモデルを用いた間接効果モデルに入り、反応の評価項目（ＲＳＳ）に対する総効果を記載するであろう。
【０１２３】
予測チェックを用いて最終的なモデル及びパラメータの推測値が適格とされるであろう。標準誤差、またはパラメータ推定精度の他の測定は推定値の漸近の共分散行列から得られるであろう。得られたＲＧＩ−Ｃ及びＲＳＳの曝露反応モデルを用いて用量選択を支援し、シミュレーションを介してそれを用いて、定常状態のＲＧＩ−Ｃ及びＲＳＳの反応に対する投薬計画（たとえば、週当たり３回の２ｍｇ／ｋｇに対比した週当たり６回の１ｍｇ／ｋｇ）の影響を説明するであろう。
【０１２４】
連続的な反復測定のＢＯＴ−２の体力及び敏捷性の複合標準スコアならびに予測された６ＭＷＴの百分率のための母集団非線形混合効果の曝露−反応モデルが別々に開発されるであろう。小児の表現型についてのみ、試験にわたってデータがプールされるであろう。これらの評価項目については対照コホートまたは自然歴コホートが利用できないけれども、スコアを内部較正して類似の年齢の正常な個人に比べて反応を反映する。追加の疾患の進行の修正は計画されていない。ＢＯＴ−２の体力及び敏捷性の複合標準スコアならびに予測された６ＭＷＴの百分率に対するアスホターゼアルファの効果は、血漿アスホターゼアルファ曝露の経時変化と有効性反応の経時変化との間の間接的な関係に従うであろうことが期待される。連続アスホターゼアルファ曝露の経時変化のモデルに基づく予測を用いて間接的な薬物力学反応モデルを動かすであろうし、薬物効果は双方の反応のゼロ次発症率のシミュレーションとして実施される。
【０１２５】
得られたＢＯＴ−２の体力及び敏捷性の複合標準スコアならびに予測された６ＭＷＴの百分率の曝露反応モデルを用いて用量選択を支援し、シミュレーションを介してそれを用いて、定常状態の反応に対する投薬計画（たとえば、週当たり３回の２ｍｇ／ｋｇに対比した週当たり６回の１ｍｇ／ｋｇ）の影響を説明するであろう。
【０１２６】
類骨厚みのデータをベースライン及びベースライン後の評価時間で収集した。その結果、個人ごとに、ベースライン評価項目からの単一の変化が利用可能である。反復測定データの解析は実施しないであろう。加えて、この評価項目では、対照コホートまたは自然歴コホートのデータは利用できない。このことは疾患の進行と薬物効果の混同を生じ、ひいき目に見ても曝露−反応モデルの定量的解釈を難しくしている。このデータの限界を考えると、結果は反応に対比させた曝露の四分位数として記述表に提示されるであろう。反応はＣａｖｇ，ｓｔｕｄｙの四分位数によるベースライン観察からの平均値（及び９５％ＣＩ）の変化として定義され、小児の表現型についてのみ提示されるであろう。
【０１２７】
安全性の評価項目曝露−反応
試験全体にわたって安全性データを解析し、それは以下の対象とする評価項目を含むであろう。
・異所性の石灰質沈着
・注射または点滴に関連する反応
・注射部位の反応
【０１２８】
曝露−反応の関係は記述統計学を介して検討されるであろう。試験母集団の事象頻度及び個々の患者の事象率は、Ｃａｖｇ，ｓｔｕｄｙの曝露四分位数によって要約され、試験母集団全体について、及び表現型によって表にされるであろう。反応は、（１）所与の事象発生を伴う個人全体の比率（事象頻度）及び（２）個々の事象率の平均値（及び９５％ＣＩ）として定義されるであろうが、それは試験持続期間全体で割った個人内での事象に総数として定義される。単純なプールされたロジスティック回帰モデルまたは非線形回帰モデルは記述解析において曝露−反応の関係を示す評価項目のために開発されてもよい。最終的なモデル及びパラメータの推定値はシミュレーションに基づいた診断または予測チェックを用いて適格とされるであろう。標準誤差またはパラメータ推定精度の他の測定は推定値の漸近の共分散行列から得られるであろう。
【０１２９】
結果
合計７３名のＨＰＰ患者（試験登録にて１日〜６６．８歳の年齢範囲に及ぶ３８名の女性及び３５名の男性）のデータがマスター集団のＰＫ−ＰＤデータセットに含まれた。これには、薬剤製品の複数のロットに由来するＩＶ及びＳＣ双方のアスホターゼアルファを受け取っている患者が含まれた。その群のうちで、６８名がＰＫ解析に向かう合計１３７０のＰＫの観察記録に寄与した。７３名のうち５名はＰＫの観察を有さなかった（定量の下限を下回る（ＢＬＱ）またはその他）が、投薬記録、共変量の情報及びＰＤの観察をデータセットに提供した。
【０１３０】
複数のロットのアスホターゼアルファの原薬及び薬剤製品が臨床試験の供給に使用された。これらのロットは、アスホターゼアルファ活性（効能）、シアル酸含量（ＴＳＡＣ）、バッチサイズにおける差異及び臨床プログラム全体にわたって投与された用量の数に基づく使用量の差異を特徴とした。ロットに特有な因子はＰＫに対する考えられる影響に関して関心があり、各異なるロット供給が投与されていることが予想された用量にそれらを関連付けることによって解析データセットに含めた。一部の薬剤製品バッチの酵素活性は利用できなかったので、原薬バッチに由来する酵素活性（及びＴＳＡＣ）を採用した。
【０１３１】
長期的な反復測定のＰＤ生体マーカー及び有効性の評価項目のデータも母集団ＰＫ−ＰＤデータセットに含まれた。ＰＫ−ＰＤモデルに基づく解析のためのデータは、本明細書に記載されているようなＣＬ２、Ｖ２、Ｖ３及びｋａについての個々の無作為効果のＭＡＰ  Ｂａｙｅｓの推定値との統合の後のマスターＰＫ−ＰＤデータセットに由来した。導出したデータセットをその後のＰＫ−ＰＤの解析に使用した。
【０１３２】
生体マーカーの評価項目はＨＰＰの表現型すべてに由来するデータを含んだ一方で、機能的な評価項目の解析はすべて小児の表現型に限定された。データセットにおける患者の大半は幼児または小児の表現型であった一方で、未知（ＰＰｉ、Ｎ＝１及びＰＬＰ、Ｎ＝３）または成人（ＰＰｉ、Ｎ＝２及びＰＬＰ、Ｎ＝１）の表現型を持つ患者は少数の患者を表すにすぎなかった。ＢＯＴ−２のデータは、これがこの測定について臨床的に関連する集団であるので、４歳から２２歳未満までの対象にさらに制約された。
【０１３３】
小児発症のＨＰＰ患者については、プールしたＰＫ及びＰＫ／ＰＤの解析を実施するための対象とする評価項目には以下が挙げられた：
−ＴＮＳＡＬＰの基質（血漿の無機ピロホスフェート［ＰＰｉ］及びピリドキサール−５’−ホスフェート［ＰＬＰ］）；
−放射線画像測定（Ｘ線所見の全般的な変化［ＲＧＩ−Ｃ］、及びくる病重症度［ＲＳＳ］）；
−機能的な評価項目（％予測される６分歩行試験［６ＭＷＴ］及び運動熟練度のＢｒｕｉｎｉｎｋｓ−Ｏｓｅｒｅｓｔｓｋｙ試験、第２版［ＢＯＴ−２］）。
【０１３４】
Ｘ線写真の評価項目については、参照の自然進行の履歴対照データセットが利用可能だった。幼児及び小児の表現型の双方を持ち、４歳から１３歳未満までの対象がＲＧＩ−Ｃ及びＲＳＳの評価項目双方のための履歴対照データにて説明された。履歴対照データセットにおける集団の特徴に一致させるために治療されたＨＰＰ患者のデータのサブセットが選択された。
【表３】
2018528252.tif 000013
【表４】
2018528252.tif 000014
【０１３５】
類骨厚みのデータの探索的母集団の曝露−反応の解析のためにもデータを回収し、集積した。類骨厚みのデータのベースラインから２４週目までの変化は、幼児表現型の５名及び小児表現型の１３名から利用可能だった。４８週目にて、ベースラインデータからの変化は、幼児表現型の３名及び小児表現型の６名から利用可能だった（表３及び４）。
【０１３６】
追加の探索的曝露−反応の解析のために有害事象のデータを集積した。データベースにおける６８名すべてがこれらの解析に含まれた。異所性石灰質沈着、注射／点滴に関連する反応、及び注射部位の反応を含む複数の評価項目にわたって合計８９７の事象が観察された。
【０１３７】
集団のデータセットは、たとえば、時間依存性の変数：年齢、体重（ＷＴ）、タナー分類、ＡＬＴ、ＡＳＴ、血清クレアチニン（ＳＣＲ）等のような複数の共変量効果を含んだ（表５）。
【０１３８】
たとえば、アスホターゼアルファ物質のロットＴＳＡＣ（モル／モル）及びバッチサイズ（ＳＩＺＥ）のような製剤に特有の共変量も各投薬で投与されるロットの具体的な特徴に関連する時間依存性の共変量に含まれた。ベースラインの共変量値の検討は、たとえば、ＷＴ、身長（ＨＴ）、ＳＣＲ及び年齢、と同様にＡＬＴ及びＡＳＴのような強い相関のクラスターを示した。一部の相関は連続共変量とカテゴリー共変量の間でも認められた。年齢、身長、体重、及びＳＣＲの群はすべてタナー分類、表現型、ビタミンＤ及びＢ６の補完と相関した。一方、連続共変量と他のカテゴリーの変数の間では最少限の相関が観察された。
【０１３９】
母集団ＰＫモデル化
生体外アッセイにて血清アスホターゼアルファの酵素活性を測定することによってアスホターゼアルファへの曝露を評価した。ＰＫ試料は各患者についての少量試料採取法にて長期にわたって得た。観察されたデータは、個人に特有のＰＫパラメータにおける変動性の固定された及び無作為の起源だけでなく、患者内で及び患者間で使用される種々の投薬計画及び薬剤ロットのせいで、かなりの患者間の変動性を示した。アスホターゼアルファ活性は投薬間隔全体を通して種々の時間に試料採取したが、治療歴の早期に高密度の時点があった。
【表５】
2018528252.tif 000015
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【０１４０】
ＩＶデータの包含に伴って、データを記載するのに多コンパートメント体内動態モデルが必要とされるのは明らかだった。ＩＶ投与及び皮下投与に続くプロファイルの比較はまた、薬物動態の「フリップ・フロップ」の存在、すなわち、血管外コンパートメントからの吸収が薬剤の体内動態における律速段階になる場合も示唆した。比較の目的で、１−、２−または３−コンパートメントの体内動態を伴う構造的ＰＫモデルを評価した。モデルはすべてデポー型コンパートメント及び中央コンパートメントに投薬し、それぞれ投与のＳＣ経路及びＩＶ経路に対応するのを可能にした。ＰＲＥＤＰＰライブラリを用いてモデルを実施したが、それは再帰的な重ね合わせを用いて複数の投薬条件を説明する。対数変換ドメインにてＰＫパラメータを推定し、パラメータ不確実性のＭＶＮ分布（たとえば、推定値のＭＶＮ共分散行列）との一貫性を確保した。標準の診断によって導かれるように、種々のコンパートメントモデル及び無作為効果モデルの構造を評価した。１コンパートメントモデルは完全なＩＶのＰＫプロファイルを捕捉するのに適さなかった。一方、３コンパートメントモデルはデータに対する良好な適合性を生じると思われたが、推定値の相関行列で見られるようにパラメータ推定値における不安定性と強い相関を特徴とし、過剰パラメータ化の可能性を示した。ＣＬ、Ｖ２、Ｖ３、Ｑ、Ｆ、ｋａ、及びＡＬＡＧという点でパラメータ化した２コンパートメント構造モデルは、アスホターゼアルファのＰＫデータの良好な記述を提供した。このモデルはＰＲＥＤＰＰのサブルーチンＡＤＶＡＮ４  ＴＲＡＮＳ４を用いて実施した。アスホターゼアルファのロット効能（Ｕ／ｍｇ）に直接投与された用量（ｍｇ）を乗じて用量を単位に変換した。従属変数を対数変換し、真の指数残差分散構造を可能にした。ＣＬ、Ｖ２、Ｖ３及びｋａについての独立無作為効果と共に指数分散モデルを用いて個人間無作為効果分布をモデル化した。
【０１４１】
共変量モデル化工程は、２つの成分である、推測目的のための事前に指示される共変量モデルと、事後に評価される探索的な仮説生成共変量モデルとを含んだ。完全な共変量モデルは、ＣＬに対する非比例的に調整されたＷＴ、ＴＳＡＣ、抗薬剤抗体及び中和抗体の、Ｖ２、Ｖ３、及びＱに対する非比例的に調整されたＷＴの、ならびに相対的な生体利用効率における及びｋａに対するバッチサイズの事前に指示された効果を含んだ。当然、各ロットの観察された原薬活性も投薬の直接因子としてモデルに含まれたが、これは推定された共変量効果ではなかった。現在のデータのサブセットの以前の解析では、対象の年齢もＣＬ用の事前に指示された共変量だった。このデータセットにおける年齢と体重の間の強い相関及び年齢−ＣＬのパラメータ推定値における実質的な不正確さを前提として、年齢効果を除外するが、ＣＬにおける推定された非比例的な指数を許容する代替の完全モデルを実施した。事前に指示された共変量モデルは本質的に、現在の解析に利用できる拡大されたデータセットを説明する以前報告されたモデル（モデル５２２００８）に対する更新だった。探索的共変量モデルをモデル５２２００８の背景で実施して事前に指示された共変量を説明した後、潜在的な関係を調べた。アスホターゼアルファのＣＬとｅＧＦＲによって測定されるような腎機能との、ＡＬＴやＡＳＴによって測定されるような肝機能との、及び人種との関係性を評価した。共変量の評価の後、以前使用した個人間の分散行列を対角線（分散）項のみから完全な分散−共分散の構造（すべての非対角線項を含む）に更新した。現在の解析で使用した拡大したデータセットはさらに包括的な分散−共分散のモデルの推定を支持した。従って、モデル５２２００８２０に含有される最終的なモデルは完全な分散−共分散のモデルと同様に事前に指示された共変量のモデルを含む。
【０１４２】
最終的な事前に指示された完全な共変量モデルに由来するパラメータの推定値から及びそのモデルを用いたシミュレーションから共変量効果についての推測を行った。このモデルは探索的な仮説生成の共変量を除外した。定常状態の曝露を予測するように意図されたモデルの適用のために、ＣＬに対する効果に一番関心があった。パラメータの推定値は、ＣＬが上昇する体重、抗薬剤抗体の存在、及び中和抗体の存在に伴って上昇するが、上昇するＴＳＡＣに伴って低下すること示した。体重はＣＬにおける変動性の決定因子であり、０．７７６（０．７０２、０．８５１）の推定された非比例的指数（９５％ＣＩ）を伴う。この推定値は、０．７５ｍの通常予想される値に極めて近く、それから統計的に区別できない。モデルパラメータにおける近似の事後分布（または不確実性）及び週３回２ｍｇ／ｋｇのＳＣの投薬計画を前提として、定常状態（Ｃａｖｇ．ｓｓ）での投薬間隔の間に予想されたアスホターゼアルファの平均濃度のシミュレーションを介して共変量効果のさらなる評価を行った。ＷＴとシミュレートしたＣａｖｇ．ｓｓの間の関係は臨床的に関連した方法でのＣＬに対するＷＴの影響を説明した。この関係は、同じｍｇ／ｋｇ用量ではＣａｖｇ．ｓｓは完全に成長した成人に比べてさらに若くさらに小さい個人でさらに低いこと、非比例的に調整されたＣＬと全体的に一致する知見を明瞭に示した。年齢関連の効果と混同されるけれども、ＣＬに対する推定されたＷＴの効果は体の大きさに関連する変化を反映している可能性が最も高い。ＴＳＡＣ含量における変動性もＣＬ及びＣａｖｇ．ｓｓにおける変化に高度に関係し、ＴＳＡＣが増えるにつれてＣＬは低下し、逆にＣａｖｇ．ｓｓは上昇した。ＣＬに対する抗薬剤抗体の影響は小さく、９５％ＣＩと共に正確に推定され、１．０６〜１．１７の倍率でのＣＬの上昇を示した。中和抗体の存在の追加はやや大きなＣＬの上昇を生じた（１．０８〜１．３７の９５％ＣＩ）。これらの効果の双方はシミュレートしたＣａｖｇ．ｓｓにて説明され、個々のＣＬ推定値の長い時間をかけた背景でのこれらの免疫原性効果の時間的な、一過性の性質も評価した。個々のＣＬ推定値のこれらの時間的な表現はすべての共変量効果及び無作為個人間変動性を含んだことに留意のこと。図１及び７は、現在のデータについてアスホターゼアルファのクリアランスと抗体レベルとの間の関係性が十分に特徴付けられていることを示している。
【０１４３】
Ｃａｖｇ．ｓｓとｅＧＦＲの極めて重要なレベルとの間の関係は、現在のモデル及び利用できるデータのもとでは、算出されたｅＧＦＲがアスホターゼアルファのＣＬに対して最少限の影響を有することを見いだした。同様に、ＡＬＴ及びＡＳＴはアスホターゼアルファのＣＬに対して影響を示した。しかしながら、ＡＬＴ及びＡＳＴの値は双方とも大部分、予想された正常範囲にあったことに気付くことは重要である。アジア系人種（５名の日本人アジア系及び１名の非日本人アジア系で構成された）の患者は非アジア系よりも高いＣａｖｇ．ｓｓを有すると思われたが、典型的なＣａｖｇ．ｓｓの予測は不正確だった。加えて、完全なモデル（人種の共変量を含まない）の予測能力はアジア系の群における個人にわたって一貫性のあるものではなかった。患者レベルの視覚的な予測チェックに基づいて、アジア系患者の半分はこのモデルによって上手く記述される一方で、アジア系患者の他の半分についてのモデルの予想は、同じ対象の中での上手く記述された観察の流れと、体系的に偏った予測の流れを特徴とした。この偏りの明らかな予測因子は原始データからは明らかではなかった。
【０１４４】
他のＰＫパラメータに対する共変量効果も観察した。Ｖ２、Ｖ３及びＱはすべて固定された非比例的な関係に従って体重と共に上昇した。ロットのバッチサイズはｋａに対する不十分に定義された効果を有したが、２０００Ｌサイズのほぼ９３．０％（７２．５％、１１９％）の２０，０００Ｌバッチについて速度定数（９０％ＣＩ）を伴った。この間隔はヌル効果と区別できなかったことに留意のこと。２０００Ｌに比べた２０，０００Ｌの生体利用効率に対するバッチサイズの効果は、８５．６％〜９６．８％の９０％ＣＩで小さな効果を示し、予想されたＣａｖｇ．ｓｓに対して臨床的に重要ではない影響を示した。
【０１４５】
Ｃａｖｇ．ｓｓに対する共変量すべての効果も単一プロットで説明された（図１）。すでに記載されている効果に加えて、このシミュレーションはアスホターゼアルファ曝露の極致を生じる可能性がある共変量効果の組み合わせを含んだ。これらは図１における最初の２つの登録で示されている。これら２つのシナリオ（シナリオ１：ＷＴ，４．５ｋｇ；ＴＳＡＣ，１．０モル／モル；ＡＤＡ＋／ＮＡｂ＋；及び２０ＫＬのバッチサイズならびにシナリオ２：ＷＴ，７５ｋｇ；ＴＳＡＣ，３．０モル／モル，ＡＤＡ−，及び２０ＫＬのバッチサイズ）について選択される共変量の組み合わせは、低い極致（シナリオ１）及び高い極致（シナリオ２）のＣａｖｇ．ｓｓを生じることが予想されることになる一連の条件を示すように選択された。ほぼすべてのシナリオが、非臨床実験（縦の参照点線）から確かめられたように、臨床効果について標的とされた曝露範囲を超えるＣａｖｇ．ｓｓを生じた。
【０１４６】
追加の探索的解析を実施してアスホターゼアルファのＰＫに対する解析アッセイ（ＷＩＬの研究に対比したＣＢＲＧ）の影響を評価した。スパイクのある試料のアッセイ及びアッセイ交差検証試験における再アッセイした臨床試料から得られた結果は、グラフで比較し、探索的解析を知らせる線形回帰を用いて解析した。結果は、２つのアッセイ方法間で程度の高い相関を示す。線形回帰解析は対数変換したＣＢＲＧのデータ及び対数変換したＷＩＬ研究データの傾き及び切片を推定した。
【０１４７】
最終的な母集団ＰＫモデルの背景では、以下の残差誤差モデルがＥｑ.１１にて評価された。
2018528252.tif 000017
式中、
ＡＳＳＡＹＩＮＤはＷＩＬ研究アッセイについては０の値を及びＣＢＲＧアッセイについては１の値を想定し；Ｉｎ（Ｃｉｊ）はＵ／Ｌでの観察されたアスホターゼアルファ活性であり；Ｉｎ（Ｃ＾ｉｊ）はモデルが予測したアスホターゼアルファ活性であり；θ１４及びθ１５はＷＩＬ研究の結果からＣＢＲＧの結果までの予測された濃度を縮尺で描く切片及び傾きである。これらのパラメータは、それらが２つの異なるアッセイ方法を用いて回収したデータ間の持続する差異を記載することになるので、「偏り」パラメータと呼ばれる。εａｉｊは平均値０及び分散σ２で対称的に分布すると想定される対数スケールでの付加残差誤差項であり、θ１６はＷＩＬ法からＣＢＲＧまでの誤差を調整する。この調整パラメータは「精度」パラメータと名付けられている。
【０１４８】
残差誤差モデルが一見したところ、結果をＷＩＬ研究アッセイ法及びＣＢＲＧアッセイ法に分けている一方で、他の多くの分散源がアッセイのせいで単に変動性ではなく、σ２を含むことに気付くのは重要である。母集団ＰＫモデルをＥｑ８で示される残差誤差モデルに適合させた後、各適合させた効果及び関連する９５％信頼区間の推定値をプロットした。得られた母集団ＰＫパラメータの推定値は全症例でアッセイの影響をほとんどまたは全く示さなかった。従って、最終モデル（モデル番号５２２００８、双方とも０で固定されたθ１４及びθ１６、及び１で固定されたθ１５を伴い、アッセイの差異についての調整なし）をさらなるモデルに基づく適用のために選択した。
【０１４９】
完全なモデル（実行５２２００８２０）は個々の適合及び集団モデルの診断プロットによって示されるようにデータの良好な記述を提供した。ＦＯＣＥＩ法を用いて集団及び個々のモデルのパラメータを推定した。パラメータ推定値の９５％信頼区間は推定値の共分散行列（ＮＯＮＭＥＭ  ＄ＣＯＶ工程）に由来し；階層化された非パラメータのブート処理はこの小さなサイズのデータセット及び必要とされている複数の加重が関連する階層では実現可能ではなかった。全体的に見て、固定効果のパラメータは正確に推定された。個々の無作為効果のゼロの平均値への推定縮小は最少限であり、５．１９％でのＣＬは定常状態の曝露の個々の推定値が前集団によって偏らない可能性があることを示した。ｋａの無作為効果についての推定縮小が１５．３％で中程度であった一方で、Ｖ２及びＶ３の無作為効果についてははるかに高かった（３３．８％及び３８．１％）。シミュレーションに基づいたモデルの診断（目視の予測チェック）も実施した。このチェックが、観察されたデータとモデルでシミュレートした中央値及び変動性との間で一貫性を示したということは、一般的なモンテカルロシミュレーションの目的でのモデルの許容できる性能を示している。
【０１５０】
２０，０００Ｌのバッチサイズから生じる薬剤製品は市販製剤を表すように意図されたので、目視の予測チェックは２０，０００Ｌのバッチを伴う投薬に関連する観察についてのみ行った。さらに、２０，０００Ｌバッチに関連する観察についての観察された及び予測されたアスホターゼアルファ活性を２０，０００Ｌバッチと関連する薬物動態の理に適った特徴付けを示す結果と比較した。解析に利用できる１３７０のうち合計１８５の観察結果は２０，０００Ｌのバッチサイズのロットに由来した。３２名の患者が２０００Ｌ及び２０，０００Ｌ双方のバッチサイズのロットに由来するアスホターゼアルファを受け取った。３６名の患者は一方のバッチサイズだけに由来するアスホターゼアルファを受け取り、７名が２０，０００Ｌバッチであり、２９名が２，０００Ｌバッチだった。
【０１５１】
最終的なＰＫモデルは患者のＰＫパラメータの個々のＭＡＰ  Ｂａｙｅｓの推定値を提供し、これらの値も用いて各個々の患者のための二次ＰＫパラメータを導出した。（ＡＵＣｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ／ＴＡＦＤ（すなわち、Ｃａｖｇ，ｓｔｕｄｙ））値として算出される初回投与以来の予測された患者に特有の平均濃度の要約統計量を算出した。表６は、年齢及び関連する体重の重要なカテゴリーのためのＣａｖｇ．ｓｓの典型的な値、血管外投薬後の見かけのクリアランス（ＣＬ／Ｆ）、及び血管外投薬後の分布の見かけの定常状態の容積（Ｖｓｓ／Ｆ）（血管外投薬後の分布の見かけの中央容積（Ｖ２／Ｆ）と血管外投薬後の分布の見かけの末梢容積の総和（Ｖ３／Ｆ））を提供する。
【０１５２】
表７は、定常状態での投薬間隔についての濃度−時間の算出された曲線下面積（ＡＵＳｓｓ）及び活性アッセイに単位に基づく単位とは対照的な、薬剤質量に基づく単位でのＣａｖｇ．ｓｓを示す。計算は、週当たり３回与えられる２ｍｇ／ｋｇの投薬計画を想定し、抗薬剤抗体及び中和抗体がなく、２．２モル／タンパク質のモルのシアリルのレベルの想定でのクリアランスモデルを用いて導出される。ＡＵＣｓｓは定常状態での７日の期間のＡＵＣである。活性単位における累積ＡＵＣ及びＣａｖｇ，ｓｔｕｄｙはモデルの推定の間に母集団ＰＫモデルを用いて得た。これらは、患者に与えられた用量すべてにわたる患者内でのアスホターゼアルファ活性（Ｕ／ｍｇでの）の中央値で結果を割ることによって質量単位に変換した。質量単位における週ごとのＡＵＣｓｓは７を乗じた質量単位におけるＣａｖｇ．ｓｓとして算出した。
【０１５３】
表８は、ＴＳＡＣ２．２モル／モル、抗薬剤抗体または中和抗体なし、２０，０００Ｌのバッチサイズ、９９０Ｕ／ｋｇの薬剤製品の活性、及び表にて示される体重の想定のもとでの、母集団ＰＫモデル及び週３回から定常状態まで投与された２ｍｇ／ｋｇを用いてシミュレートした定常状態での曝露の計量、定常状態における投薬間隔での最高濃度（Ｃｍａｘ，ｓｓ）、Ｃａｖｇ．ｓｓ、及びＡＵＣｓｓを要約する。
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【０１５４】
母集団の曝露−反応
解析評価項目についての母集団の曝露−反応の関係の最初の探索的評価を実施した。対象に特有のＣａｖｇ，ｓｔｕｄｙの推定値を考えて、２４週目及び７２週目でのベースライン反応からの観察された変化について曝露の四分位数に対比した反応の要約の表を構築した（表３及び４）。ベースラインの類骨厚みのデータからの変化は２４週目及び４８週目でのみ利用でき、追加の長期の反復測定はなかった。曝露の関数として見ると、これらの母集団の反応の要約（平均値または中央値）は評価項目のいずれにわたっても曝露−反応の関係を示さなかった。この知見は、この表示がデータを個人ごとの単一点に減らし、本質的に単純なプール化データの解析であるという点で全体的には驚くべきことではない。アスホターゼアルファの臨床試験の経験における限定された用量−範囲の企画を考えて、この種の母集団の曝露−反応の関係の全体像は誤解されやすい可能性がある（Ｎｅｄｅｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００７，ＳｔａｔＭｅｄ，２６：２９０−３０８）。母集団レベルの要約も、反復測定、個々の用量調整が原因で生じる個人内での曝露−反応の関係についての長期的なデータ、ロット変化、中和抗体における変化、及び時間をかけた体重の変化に含有される情報を無視する。それにもかかわらず、たとえば、類骨厚み及び有害事象（ＡＥ）の要約評価項目のすべてのような反復測定が利用できない評価項目については、この型の母集団レベルでの曝露−反応は探索的ツールとして依然として有用だった。以下のモデルに基づく解析は反復測定の混合効果のモデル化解析を介して対象内での曝露−反応の情報を適宜説明している。
【０１５５】
ＰＰｉのモデル化
ＰＰｉ生体マーカーは、ベースラインからの濃度の鋭い低下を伴うアスホターゼアルファ療法の開始に対する強い反応を示した。反応−時間プロファイルは、ほぼ６〜８週間の治療に続いて生じる最下点を伴った迅速な発現を特徴とした。ほぼベースラインに戻る一部の症例では、連続療法はＰＰｉ濃度の逆戻りにも関連した。この逆戻り効果の大きさ及びタイミングには相当の個人間の変動性が存在した。この観察結果を考えると、単純な間接ＰＤ反応モデルは観察されたデータの適正な記述を提供することができなかった。前駆体−プール及びＰＤフィードバックのモデルを含む代わりのモデルを、適合度によって導かれる以前のデータセットを用いて探索した。最終的に、仮説的間接フィードバック反応を伴うモデル（現在のフィードバック反応及びＰＰｉベースラインに対するＰＰｉ反応の比の双方に応じたフィードバックのゼロ次生成と二次分解）を選択した。フィードバック効果はＰＰｉのゼロ次産生を調節した一方で、アスホターゼアルファの効果はＰＰｉ分解の刺激として仲裁された。
【０１５６】
最終的なモデルはＫｏｕｔ及びＥｍａｘに対する個人間の無作為効果ならびに比例的な残差誤差モデルを含んだ。表現型の事前に定義された共変量効果はＫｏｕｔの調節因子としてモデルに入り、未知の、幼児の及び成人の表現型Ｋｏｕｔはそれぞれ参照小児の表現型の９１．９％、７８．３％及び１２．３％であると推定された。最終的なモデルは、基本モデルに適合したモデル（実行７）及び薬物効果がないと想定されたモデル（実行６）において改善を示した。最終モデル（実行５）は個々のデータに良好な適合を提供し、典型的な診断に関して偏りはなかった。個々の無作為効果のゼロの平均値への推定された縮小は適度であったが、解析における推測または決定はこれらのＰＰｉの無作為効果に基づかなかった。シミュレーションに基づくモデルの診断（目視の予測チェック）も実施した。このチェックが観察されたデータとモデルでシミュレートした中央値及び変動性との間で一貫性を示すということは、一般的なモンテカルロシミュレーションの目的でモデルの許容できる性能を示している。
【０１５７】
ＰＬＰのモデル化
アスホターゼアルファ治療に続く血漿ＰＬＰ濃度はＢ６の同時投与によって混乱した。試験中の任意の時にＢ６を受け取った患者は別々に見直され、モデルにおける共変量として考慮するためにデータセットにてフラグを付けた。ＰＬＰ生体マーカーについての反復測定データはアスホターゼアルファ療法の開始に対して強い反応を示し、ほとんどのＢ６治療及び未治療の患者でベースラインからの濃度の迅速な低下があった。ベースラインＰＬＰのレベルは患者にわたってかなり変化した。一般に、高いＰＬＰ濃度はＢ６治療患者で観察された。反応−時間プロファイルは、一般に治療の６〜８週後にその最低値に低下し、試験期間の全体を通して低いままであるＰＬＰ濃度を伴った迅速な発現を特徴とした。本明細書に記載されている単純な間接ＰＤ反応モデルは観察されたデータの適正な記述を提供した。Ｂ６を受け取っている患者を含める試みがモデル開発の間に行われた。これらの患者の包含はモデルにおける不安定性及び典型的な値のモデルパラメータの推定値における矛盾をもたらした。従って、Ｂ６を受け取っている患者は最終的なモデルである実行＃５から除外した。最終的に、ＰＬＰの一次分解に対するアスホターゼアルファの刺激効果と共にＰＬＰのゼロ次産生を伴う間接反応モデルを最終的なモデルとして選択した。
【０１５８】
最終的なモデルには、Ｒｏ（ベースラインの反応）における無作為の、個々の分散、Ｂｉｏｔｒｉａｌ研究室（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって解析されたデータについての比例的な残差誤差モデル、及びＡＲＵＰ研究室（ＲＥＡ）によって解析され、Ｂｉｏｔｒｉａｌ同等物に変換されたデータについての別の比例的な残差誤差モデルが含まれた。表現型の事前に定義された共変量効果はＲｏの調節因子としてモデルに入り、未知の、幼児の及び成人の表現型Ｒｏはそれぞれ参照小児の表現型の４１．４％、１７７％及び１４．７％であると推定された。このモデルは個々のデータに良好な適合を提供し、典型的な診断に関して偏りはなかった。最終的なモデルは基本モデルに適合するモデル実行１）及び薬物効果がないと想定されたモデル（実行３）において改善を示した。個々の無作為効果のゼロの平均値への推定された縮小は最終的なモデルでは軽微であったが、解析における推測及び決定はこのＰＬＰ無作為効果に基づかなかった。シミュレーションに基づくモデルの診断（目視の予測チェック）も実施した。このチェックが観察されたデータとモデルでシミュレートした中央値及び変動性との間で一貫性を示すということは、一般的なモンテカルロシミュレーションの目的でモデルの許容できる性能を示している。
【０１５９】
ＲＧＩ−Ｃのモデル化
例外１つと共に記載されている方法に従って放射線画像の評価項目であるＲＧＩ−ＣのＰＫ−ＰＤの解析を行った。小児表現型への単一の焦点ではなく、幼児と小児の表現型双方の患者を解析に含めた。当初、履歴対照データセットが双方の表現型を含むことは知られていなかった。
【０１６０】
履歴対照群に由来するＲＧＩ−Ｃデータの可用性は選択したＨＰＰの年齢範囲及び表現型における自然の疾患進行の評価を可能にした。履歴対照群の反復測定データを個人の中で対合させ、ベースラインの値をベースライン後の値に対応させた。値を再利用し、個人内で複数のペアを生じることができた。スコア化したＸ線写真とベースラインのＸ線写真との間の持続期間で割ったベースラインＲＧＩ−Ｃからの変化を表す傾きを各ペアについて算出した。これらの傾きのグラフモデル化及び混合効果モデル化は履歴対照群について時間かけたＲＧＩ−Ｃ値における変化がないことを示唆した。その結果、ＲＧＩ−Ｃにおける変化の自然の疾患進行は幼児及び小児の表現型双方の患者についてのＲＧＩ−ＣのＰＫ−ＰＤモデルの一部として含まれなかった。
【０１６１】
２名の患者の例外と共に、有効性評価項目についての反復測定データは、ベースラインを超える当初の時間依存性の改善とその後のアスホターゼアルファ療法の経過にわたるプラトーを示した。２名の対象は直ちにまたはほぼ直ちに治療の全経過にわたって最大の反応を示した（ＮＯＮＭＥＭ  ＩＤ５１及び５２）。
【０１６２】
本明細書に記載されている単純な間接ＰＤ反応モデルは観察されたデータの適正な記述を提供した。治療の開始後ほぼ直ちに最大の反応を達成した２名の患者を含める試みがモデル開発の間に行われた。これらの患者の包含はモデルにおける不安定性及び典型的な値のモデルパラメータの推定値にて矛盾をもたらした。従って、これらの患者は最終的なモデルの実行＃４から除外した。最終的に、Ｋｉｎに対するアスホターゼアルファの刺激効果と共にＲＧＩ−Ｃにおけるゼロ次の上昇を伴った間接反応モデルをデータに適合させた。モデルの予測はロジット変換を用いて観察されたスケール範囲内に制約された。
【０１６３】
最終的なモデルはＫｉｎ及びＥｍａｘに対する個人間の無作為効果及び付加残差誤差モデルを含んだ。Ｋｏｕｔはベースラインの反応に反比例した。最終的なモデルは基本モデルに適合するモデル（実行５）及び薬物効果がないと想定されたモデル（実行６）において改善を示した。表現型の事前に定義された共変量効果はＫｉｎの調節因子としてモデルに入り、幼児の表現型Ｋｉｎは参照小児の表現型の５９．７％であると推定された。このモデルは個々のデータへの良好な適合を提供し、典型的な診断に関して偏りはなかった。個々の無作為効果のゼロの平均値への推定された縮小はＩＩＶ  Ｋｉｎについては適度（１９．５％）であり、ＩＩＶ  Ｅｍａｘについては無視できるほど（７．７７％）であったが、解析における推測及び決定はこれらの無作為効果に基づかなかった。シミュレーションに基づくモデルの診断（目視の予測チェック）も実施した。このチェックが観察されたデータとモデルでシミュレートした中央値及び変動性との間で一貫性を示すということは、一般的なモンテカルロシミュレーションの目的でモデルの許容できる性能を示している。
【０１６４】
ＲＳＳのモデル化
反復測定ＲＳＳのデータの解析は個々のＲＳＳ成分であるＲＳＳｗｒｉｓｔ及びＲＳＳｋｎｅｅに基づいた。この解析戦略は時間経過における差異及びこれら２つの部位間における薬剤反応の強度を考慮に入れた。小児表現型への単一の焦点ではなく、幼児と小児の表現型双方の患者を含めた。
【０１６５】
当初の尽力は、履歴対照データセットを用いて、試験時間の期間にわたって時間依存性の疾患の進行を推定することに焦点を置いた。観察されたデータは、時間をかけた反応の軌跡における変動性を示したが、体系的な傾向は明らかではなかった。線形の混合効果モデルを反復測定の手首及び膝の履歴対照データセットに適用した。結果は、手首及び膝についての時間依存性の疾患の進行の傾きがゼロから有意に異ならないことを示した。この知見を考えて、積極的なアスホターゼアルファ治療のデータの解析には時間依存性の疾患の進行は必要とされなかった。
【０１６６】
積極的治療のデータについては、観察されたＲＳＳの手首及び膝の評価項目は時間をかけたスコアの整然とした低下を示した。間接ＰＤ反応モデルを双方の評価項目について、反応の生成を阻害するアスホターゼアルファの濃度（Ｋｉｎにおける阻害性Ｅｍａｘ）と共に実施した。予測のロジット変換を用いて、モデルの予測は観察されたスケール範囲（手首にスコアについては０〜４及び膝のスコアについては０〜６）内に制約された。間接的モデルの結果をアスホターゼアルファの任意の効果を除外するヌルモデルと比べた。双方の評価項目について、最大の阻害効果はほぼ１００％と推定され、その後Ｅｍａｘは１の値に固定された。最終的なモデルは、ベースライン（Ｒ０）及びＥＣ５０に対する個々の無作為効果と同様に組み合わせた付加の及び比例的な残差誤差モデルを含んだ。Ｋｉｎ及び最大効果の５０％（ＥＣ５０）を生じる濃度は一般に膝モデルに比べて手首モデルで大きかった。小児に比べたＲ０に対する幼児表現型の相加効果は小さく、９５％ＣＩがゼロを含んだということは、ＲＳＳデータセットにおける表現型間での最少限の差異を示している。個人間の無作為効果は膝及び手首のモデル双方について相対的に高かった。個々の無作為効果のゼロの平均値への縮小はほとんどのパラメータで最小であり、ＲＳＳ−膝についてのＩＩＶ  ＥＣ５０で適度な縮小が言及された。解析における推測及び決定はこれらの無作為効果に基づかなかった。
【０１６７】
双方のモデルについての診断は観察されたデータの正確な記述を示した。目視の予測チェックは観察されたデータとモデルでシミュレートした中央値及び変動性との間で一貫性を明らかにしたということは、一般的なモンテカルロシミュレーションの目的でモデルの許容できる性能を示している。
【０１６８】
６ＭＷＴのモデル化
機能的な有効性の評価項目である６ＭＷＴについての反復測定データはアスホターゼアルファ療法の持続時間の全体にわたって正常な反応の百分率で時間依存性の上昇を示した。６ＭＷＴにおける改善の比率は個人にわたって相対的に一貫したが、ベースラインの反応は２群に分かれた。治療集団の大半は予測された正常のほぼ６０％のベースライン６ＭＷＴを示した一方で、２名（ＩＤ２９及び３４）はゼロに近いベースライン値を有した。これは、試験にわたるベースラインの包含基準の差異によって説明された。間接ＰＤ反応モデルにおける変動を評価した。機能的改善をもたらす改善された骨形成の概念的メカニズムに一致して、６ＭＷＴについてのＫｉｎをシミュレートするアスホターゼアルファでモデルを実施した。ベースラインの反応値の明瞭なクラスタリングを調整するために、ベースラインでゼロに近い関数を持つ２名について別の固定効果のパラメータが割り当てられた。
【０１６９】
最終的なモデルは、ベースライン（Ｒ０）及びＥｍａｘに対する無作為効果についての個人間の共変量行列、ならびに付加残差誤差モデルを含んだ。Ｅｍａｘはベースラインの反応に反比例した。解析データが小児表現型のみに限定されていたので、共変量効果は推定されなかった。このモデルは個々のデータに良好な適合を提供し、典型的な診断に関して偏りはなかった。個々の無作為効果のゼロの平均値への推定縮小は１３％未満だった。シミュレーションに基づく診断（目視の予測チェック）も実施した。このチェックが観察されたデータとモデルでシミュレートした中央値及び変動性との間で一貫性を示したということは、一般的なモンテカルロシミュレーションの目的でモデルの許容できる性能を示している。
【０１７０】
ＢＯＴ−２のモデル化
機能的有効性の評価項目であるＢＯＴ−２についての反復測定データは、アスホターゼアルファ療法の持続期間全体にわたって体力と敏捷性の複合標準スコアにて時間依存性の上昇を示した。ＢＯＴ−２における改善の比率は、２名（ＩＤ３３及び３８）を除いて個人にわたって相対的に一貫していた。対象３３は試験の終了に至るまででベースラインからのほぼ６０単位のスコアを示した。６０のスコアがこの検査の正常範囲に一致したということは、試験の開始時でのこの特定の個人についての疾患に関連するＢＯＴ−２損傷の欠如を示している。対象３８はベースラインからの改善に続いて反応で有意な突然の低下を示す異型性のプロファイル（合計３回の観察）を有した。これらの理由で、個人３３及び３８はＰＫ−ＰＤの解析から除外した。個人３４は初回投与のほぼ６５０日後に発生したたった１回の観察されたＢＯＴ−２スコアを有した。ベースラインの観察がなくては、この個人ではＢＯＴ−２における時間依存性の変化を適正に記述することはできなかった。その理由で、個人３４はＰＫ−ＰＤの解析から除外した。以前の予備的なデータセットに比べて、現在の拡張したデータセットにはＩＤ３４の追加及びＩＤ３８に由来する初回投与後の２回の観察結果が含まれた。ＩＤ３４及びＩＤ３８の包含は予備的データセットから開発した以前のＢＯＴ−２モデルと矛盾するパラメータ推定値を生じた；この矛盾は、双方の個人が解析から除外されると観察されなかった。さらに、典型的な診断プロットは、ＩＤ３４及び３８を含むモデルはデータの適正な記述を提供せず、体系的な偏りは明らかだった。
【０１７１】
間接ＰＤ反応モデルは６ＭＷＴデータの解析に使用されるものに類似し、その際、アスホターゼアルファの効果はＫｉｎの刺激として実施された。ロジスティック変換を用いて、ベースラインのスコアはスケール値の妥当な範囲内に制約された。最終的なモデルは、ベースライン（Ｒ０）及びＥｍａｘに対する個人間の無作為効果、及び付加残差誤差モデルを含んだ。表現型の共変量は、解析データセットが小児の表現型のみに限定されたので評価されなかった。このモデルは個々のデータに良好な適合を提供し、典型的な診断に関して偏りはなかった。個々の無作為効果の推定縮小は３５％に近づいたが、解析における推測及び決定はこれらのＢＯＴ−２無作為効果に基づかなかった。シミュレーションに基づくモデルの診断（目視の予測チェック）も実施した。このチェックが観察されたデータとモデルでシミュレートした中央値及び変動性との間で一貫性を示したということは、一般的なモンテカルロシミュレーションの目的でモデルの許容できる性能を示している。
【０１７２】
有害事象：探索的な曝露−反応
特定のＡＥについての母集団の曝露−反応の関係の探索的な評価を実施した。これらには、ＰＫ−ＰＤの解析のデータセットにおける試験すべてについての治療期間全体の間での異所性石灰質沈着、注射／点滴に関連する反応、及び注射部位の反応の事象が含まれた。３つの評価項目にわたって合計８９７の事象が発生した。対象に特有のＣａｖｇ，ｓｔｕｄｙの推定値を考えて、曝露の四分位数に対比させたＡＥ発生及び比率（事象の数／回数）の表を構築した。曝露の四分位数の関数として見ると、ＡＥの要約は曝露への依存を示さなかった。
【０１７３】
曝露−反応のシミュレーション
反応の評価項目すべてについての最終的なＰＫ−ＰＤモデルを用いて、本明細書に記載されているように、幾つかのアスホターゼアルファの投薬計画にわたって予想される（中央値）曝露反応の関係をシミュレートした。結果は、典型的なＨＰＰ患者のためのモデルに由来する曝露反応の関係のシミュレーションに基づく外挿である。評価項目すべてのシミュレーションは曝露の上昇と共に改善し、曝露−反応の関係にてプラトーを確立する反応を生じた。
【０１７４】
生体マーカーの評価項目：曝露−反応
血漿生体マーカーの評価項目についての曝露−反応の関係を、０〜＜８０歳の年齢の幼児と小児（ＰＰｉとＰＬＰ）及び成人の（ＰＰｉ）の表現型のＨＰＰ患者においてＰＰｉについては７及び２４週目にてならびにＰＬＰについては２４週目にてシミュレートした。モデルのパラメータの推定値がＰＫＰＤのデータセットにてｎ＝１に基づいていたので、成人の表現型でのＰＬＰの曝露−反応の関係はシミュレートしなかった。幼児及び小児の表現型についてのＰＰｉ及びＰＬＰ双方の曝露反応の関係の要約を行った。アスホターゼアルファ治療によって血漿ＰＰｉで観察される逆戻りの関係に起因する曝露反応の関係の経時変化をさらに良好に記述するために、ＰＰｉについてのシミュレーションは７週目と２４週目に行った（図２Ａ−２Ｂ）。双方の生体マーカーの評価項目についてのＣａｖｇ．ｓｓに対比させた反応のプロットは、用量の上昇に伴って低下する血漿濃度及びさらに高い投薬計画での表現型すべてにおける関係性がプラトーになることを示している。広い９０％信頼区間（ＣＩ）は集団の推定値の一部、特にＥＣ５０及びＥｍａｘにおける相対的に乏しい精度を反映する。
【０１７５】
シミュレートした血漿ＰＰｉ濃度は一般に２４週目よりも７週目の方が低かった。これは、正常な血漿ＰＰｉ（１．３３μＭ）の参照下限を下回るシミュレートした血漿ＰＰｉ値の確率で反映される。
【０１７６】
Ｘ線写真有効性の評価項目：曝露−反応
Ｘ線写真有効性の評価項目、ＲＧＩ−Ｃ、ＲＳＳｗｒｉｓｔ及びＲＳＳｋｎｅｅの曝露−反応の関係を、４歳〜＜１３歳の幼児及び小児の表現型のＨＰＰ患者にて７２週目でシミュレートした。幼児及び小児の表現型のためのＸ線写真曝露−反応のシミュレーションの要約を図３に示す。ＲＳＳについてのモデルで推定された表現型の共変量効果は無視できた。このために、及びシミュレーションの結果がベースラインからの変化として示されるので、小児表現型に対比させた幼児表現型についてのＲＳＳのプロットにて区別を行わなかった。
【０１７７】
有効性評価項目すべてについてのＣａｖｇ．ｓｓに対比させたベースラインの反応からの変化のプロットはさらに高い投薬計画でプラトーに近づく上昇する用量に伴って改善する有効性を示した。シミュレートした用量範囲にわたる幼児患者におけるベースラインＲＧＩ−Ｃスコアからの変化の中央値（９０％ＣＩ）は０．３４８（０．２０１，０．５４７）から２．３８（２．０３，２．７６）までに及んだ（表９）。ＲＧＩ−Ｃについての小児患者の類似のスコアは用量範囲にわたって０．３６（０．２２６，０．５２６）から２．３７（２．０４，２．８４）までに及んだ（表１０）。ベースラインのＲＳＳ−手首及びＲＳＳ−膝のスコアからの変化の中央値（９０％ＣＩ）はそれぞれ、−０．１１６（−０．３２３，−０．０３６７）から−１．０３（−１．４８，−０．６４０）までに及び−０．２５４（−０．５２１，−０．０８８５）から−１．２７（−２．０２，−０．４４６）までに及んだ（表１０）。推定データセットに含まれたＨＰＰ臨床試験の患者についての予測Ｃａｖｇ，ｓｔｕｄｙの範囲は、ＲＧＩ−Ｃ、ＲＳＳ−手首及びＲＳＳ−膝についての曝露−反応の関係においてシミュレートしたＣａｖｇ．ｓｓ値のミッドレンジを表した。
【０１７８】
機能的有効性の評価項目：曝露−反応
ＢＯＴ−２体力と敏捷性の複合標準スコア及び予測６ＭＷＴの百分率の機能的評価項目についての曝露−反応の関係を小児表現型のＨＰＰ患者（図４）にて７２週目でシミュレートした。ＢＯＴ−２及び６ＭＷＴ双方の曝露−反応のシミュレーションの要約は図４Ａ及び図４Ｂにて提供されている。双方の機能的な評価項目についてのＣａｖｇ．ｓｓに対比させたベースライン反応からの変化のプロットは、６ＭＷＴが週当たり７回の１ｍｇ／ｋｇの投薬計画の後プラトーに近づく一方で、ＢＯＴ−２スコアは上昇し続ける（図４Ｂ）けれども、用量の上昇に伴って上昇する機能的な反応を示している。表１０で要約されているように、ベースラインのＢＯＴ−２スコアからの変化の中央値（９０％ＣＩ）はシミュレートした用量範囲にわたって１．５３（１．０１，２．２３）から２４．５（１９．７，２８．９）までに及んだ。ベースラインの予測された６ＭＷＴの百分率からの変化の中央値（９０％ＣＩ）は３．６２（１．８４，６．２１）から１９（１４．６，２５．１）までに及んだ。推定データセットに含まれたＨＰＰ臨床試験患者についての予測されたＣａｖｇ，ｓｔｕｄｙの範囲は、ＢＯＴ−２及び６ＭＷＴについての曝露−反応の関係においてシミュレートしたＣａｖｇ．ｓｓ値の半ばから低い範囲を表した。機能的有効性の評価項目については、シミュレーションも行って、９０％の集団の変動性区間によって示されたように、反応の範囲に対する推定された個人間の薬物動態変動性の影響を視覚化した。説明のつかない変動性はＰＫにはないと想定するが、推定された個人間の分散−共分散行列を用いたＰＤパラメータに説明のつかない変動性を組み込んで、以前記載されたように患者をシミュレートした。モデルのパラメータは不確実性を伴わずに推定されると想定された。
【表９】
2018528252.tif 000021
【表１０】
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【表１１】
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【０１７９】
用量にわたって統合した曝露−反応
評価項目すべてについてのシミュレーション結果をアスホターゼアルファ及び投薬計画にわたって表９（幼児表現型）、表１０（小児表現型）及び表１１（成人表現型）にて要約した。用量−投薬計画の曝露−反応のこの統合された見識は幾つかの一貫した傾向を示した。有効性の反応はすべて、さらに高い投薬計画で応答した最小の増加を伴って６ｍｇ／ｋｇの週ごとの用量付近でプラトーに近づいた。ＰＰｉが正常の下限（１．３３μＭ；考えられる安全性懸念についての保存的な参照点）を下回る確率はほとんどの投薬計画及び表現型について無視できた。成人表現型における正常の下限を下回るＰＰｉの確率が高くなる傾向があったが、７週目と２４週目の結果を比べると、効果は明らかに一時的であり、時間をかけて正常値に逆戻りした。
【０１８０】
投薬計画のシミュレーション
本明細書に記載されているような最終的なモデルの典型的なパラメータ測定値及び個人間の変動性の推定値を用いて、アスホターゼアルファ投薬計画（週６回の１ｍｇ／ｋｇ及び週３回の２ｍｇ／ｋｇ）のＰＫ及びＰＤの効果をシミュレートした。時間をかけた及び年齢にわたるアスホターゼアルファ活性の予想された変動は別にして、２つの投薬計画の間で、任意の評価項目についてシミュレートしたＰＫまたはＰＤの反応で顕著な差異は指摘されなかった。
【０１８１】
ＰＫに対する投薬計画の効果
ＰＫのシミュレーションは、実行＃５２２００８２０に由来する最終モデルのパラメータ測定値を使用した。定常状態での時間に対比させた得られたシミュレートしたアスホターゼアルファ活性の中央値のプロットは０〜２歳、２〜６歳、６〜１２歳、１２〜２０歳及び２０を超える歳の年齢について示されている（図５）。長い時間をかけたアスホターゼアルファ活性における予想される変動は、すべての年齢範囲についての２つの投薬計画でのシミュレートした集団の週ごとの曝露にて相当な重複を伴って、投薬計画にわたって観察された。年齢群にわたる時間関係に対比させたアスホターゼアルファ活性の相対的な形状における差異は、非比例的な関係がＰＫ体内動態パラメータをさらに良好に記述する場合、固定したｍｇ／ｋｇ投薬を使用する効果に起因し得る。
【０１８２】
ＰＤの評価項目に対する投薬計画の効果
ＰＰｉ、ＰＬＰ、ＲＧＩ−Ｃ、ＲＳＳ−手首、ＲＳＳ−膝、予測された６ＭＷＴの百分率、及びＢＯＴ−２について投薬計画（週当たり６回与える１ｍｇ／ｋｇ及び週当たり３回与える２ｍｇ／ｋｇ）の間でのシミュレートしたＰＤ反応にて識別可能な差異は指摘されなかった。
【０１８３】
薬物力学反応に対する体重依存性の薬物動態の影響を評価するシミュレーション
本明細書で述べられているように、最終的なＰＫ母集団モデルは、固定されたｍｇ／ｋｇのアスホターゼアルファの用量を前提として様々な年齢群にわたって曝露における範囲を予測する。ＰＫにおける体重に関連する差異の影響をＰＤにおける予測された差異に変換するためにシミュレーションを行った。患者の年齢と体重の相関のせいで、ＰＫ及びその後のＰＤにおける体重関連の差異は、ＰＫのモデル化において独立して解決するのが難しい年齢依存性の成分も有してもよい。これらはモデル開発で使用されるデータが０〜７０歳の年齢範囲全体にわたって利用可能である最適の評価項目なのでので、この評価における対象とする評価項目としてＰＰｉ及びＰＬＰを使用した。
【０１８４】
曝露−反応の解析のために本明細書に記載されているようにシミュレーションを実施し、それには最終的なＰＰｉ及びＰＬＰのモデルに由来する母集団パラメータの不確実性の測定が含まれた。定義された年齢群についてのＣａｖｇ．ｓｓの９０％ＣＩは、各評価項目についての曝露−反応のプロットに重ね合わせた。各ＨＰＰ表現型について別々のプロットが示され、結果的に年齢群が対応させた。予想された反応は様々な年齢群についての曝露の範囲にわたって相当に重複した。ＰＬＰパラメータ測定値の一部における不十分な精度は、この曝露−反応の関係における相対的に広い９０％ＣＩで反映されている。ＰＬＰ及びＰＰｉの曝露−反応についての幼児表現型のプロットは、年齢を超えた予想された血清アスホターゼアルファの最大範囲を示した。ＨＰＰの幼児表現型については、血清アスホターゼアルファのＣａｖｇ．ｓｓの範囲では曝露−反応の関係は相対的に浅く、最年少の群（新生児）と最年長の群（約６０歳）の間での予想される反応ではかなりの重複が指摘されたけれども、ＰＰｉ及びＰＬＰの血漿濃度はこの範囲にわたって完全には最大阻害とはいえなかった。ＨＰＰの小児表現型については、予想されたＰＰｉ及びＰＬＰの濃度は血清アスホターゼアルファのＣａｖｇ．ｓｓの範囲にわたって最大阻害に近く、年齢範囲にわたって予想された反応にて重複が指摘された。ＨＰＰの成人表現型の約６０歳の患者については、ＰＰｉ濃度の予想された範囲は曝露−反応の関係の相対的に平らな部分をカバーした。
【０１８５】
選択した年齢／体重の組み合わせでの典型的なＰＫ−ＰＤの経時変化のシミュレーション
最終的なモデルの典型的なパラメータ推定値を用いて典型的な患者におけるアスホターゼアルファ活性、ならびに生体マーカー、機能及び有効性の評価項目の経時変化をシミュレートした。シミュレーションは患者が、２．２モル／モルのシアル酸含量と９９０Ｕ／ｍｇの効能を持つ２０，０００ＬのバッチロットのアスホターゼアルファのＳＣ投薬を週３回２ｍｇ／ｋｇで受けると想定した。抗薬剤抗体及び中和抗体の存在はシミュレーションでは想定されなかった。体重はアスホターゼアルファの体内動態の重要な決定因子であるけれども、シミュレーションは、先ず意味のあるベースライン年齢を選択し、次いで、解析データセットにおける患者の年齢−体重の関係から開発されたアルゴリズムを用いて年齢から体重を算出することによって実施された。典型的な患者について選択されたベースライン年齢は、０．０４２、０．５、２、６及び１８歳であり、適宜、幼児及び小児の表現型が含まれた。各シミュレーションにおける患者の代表的な年齢及び表現型は関連する推定データセットにおけるその範囲及び包含に基づいた。ＰＫ−ＰＤの値は０（投薬前）から７２週目まで毎週シミュレートした。
【０１８６】
選択した年齢／体重の組み合わせでの典型的なＰＫ−ＰＤの経時変化のシミュレーション：結果
体重１７．２９ｋｇの６歳の典型的なＨＰＰ患者では、アスホターゼアルファ投与の最大効果までの時間は評価項目にわたって異なると予想される（図６）。アスホターゼアルファ活性は治療の最初の数週間の間、迅速に上昇し、次いでほぼ３週後にプラトーになると予想される。同様に、血漿ＰＬＰ濃度は低下し、治療の最初の数週間以内にプラトーを達成すると予想される。血漿ＰＰｉ濃度は治療の最初の数週間以内に低下し、次いでわずかに逆戻りし、ほぼ２０週後にプラトーを達成すると予想される。ＲＧＩ−Ｃの最大変化は約３０週後に発生するとも予想される一方で、ＲＳＳ−手首及びＲＳＳ−膝のスコアにおける変化はその後発生すると予想される。６ＭＷＴのベースライン値からの予測される変化の予想される百分率は約５０週の治療ののちプラトーであると思われる一方で、ＢＯＴ−２のベースライン値からの最大変化は７２週より長く要すると予想される。一般に、時間をかけたこれら評価項目における変化は、幼児及び小児のＨＰＰ患者にわたって及び典型的な年齢／体重の組み合わせの広い範囲にわたって類似すると予想される。
【０１８７】
考察
データを最良に記述する最終的なＰＫモデルは、たとえば、体重、抗薬剤抗体及び中和抗体の状況、及びアスホターゼアルファの薬剤ロットの特徴のような対象とする共変量を組み込んでいる線形の２コンパートメント構造モデルだった。ＰＫ及び全てのＰＫ−ＰＤのモデルは無作為個人間の変動性及び残差変動性の測定を含んだ。目視の予測チェック（図７）を用いてＰＫモデルの適切性を評価したが、それは観察された（白）及びモデルで予測した（網掛け）アスホターゼアルファのレベル間での一致を示した。加えて、観察されたデータの大半は９０％予測区間（ＰＩ）を表す領域の範囲内に入った。
【０１８８】
ＰＫ−ＰＤモデルの適切性も目視の予測チェックを用いて評価した。図８は、ＰＤ評価項目の２つ（ＲＧＩ−Ｃ、６ＭＷＴ）についての観察（白）とモデルの予測（網掛け）の間での一致を示したが、観察されたデータの中心傾向を予測するＰＫ−ＰＤモデルの能力を強調している（図８Ａ〜８Ｂ）。加えて、観察されたデータの大半は９０％予測区間（ＰＩ）を表す領域の範囲内に入った。
【０１８９】
生体マーカーの評価項目であるＰＰｉ及びＰＬＰは幼児、小児及び成人の表現型のＨＰＰ患者にわたってアスホターゼアルファ療法の開始に続いて濃度での迅速な低下を示した。有効性の評価項目であるＲＧＩ−Ｃ（すなわち、Ｘ線所見の全般的な変化）、ＲＳＳ−膝（ＲＳＳはくる病重症度を表す）及びＲＳＳ−手首は≧４〜＜１３歳のベースライン年齢の幼児及び小児の表現型のＨＰＰ患者のサブセットにてモデル化した。年齢と表現型が一致したＨＰＰデータセットに由来する履歴対照のＸ線写真データはこれらの評価項目には疾患の進行がないことを示唆した。有効性評価項目はすべてアスホターゼアルファ療法の開始に続いて改善されたＸ線写真スコアを示した。機能的な評価項目であるＢＯＴ−２（すなわち、運動熟練度のＢｒｕｉｎｉｎｋｓ−Ｏｓｅｒｅｓｔｓｋｙ試験、第２版）体力と敏捷性の複合標準スコア及び６分間歩行試験（６ＭＷＴ；予測された正常の％）は、小児表現型のＨＰＰ患者のサブセットでモデル化した。双方の機能的な評価項目は、アスホターゼアルファ療法の持続期間の全体を通して反応における時間依存性の上昇を示した。これらの生体マーカーの、有効性の及び機能的な評価項目に対するアスホターゼアルファの影響は間接−反応モデルによって最良に記述された。生体マーカー及びＸ線写真の評価項目についてのモデルはモデルにおける共変量としてＨＰＰの表現型を含んだ。
【０１９０】
曝露四分位数の関数として見られると、類骨厚みの２４週目と４８週目での測定及び具体的な有害事象（ＡＥ）の要約の探索的解析は曝露への依存性がないことを明らかにした。
【０１９１】
それぞれの最終的なＰＫ-ＰＤモデルを用いた週７回の０．０２ｍｇ／ｋｇ（すなわち、０．１４ｍｇ／ｋｇ／週）から週７回の２ｍｇ／ｋｇ（すなわち、１４ｍｇ／ｋｇ／週）までに及ぶ週ごとのＳＣ投薬計画にわたる評価項目すべてのシミュレーションは、薬物反応は用量／薬物曝露の上昇に伴って上昇し、曝露−反応の関係でプラトーを確立することを示した。用量−投薬計画−反応の総合的見解は、有効性の反応が６ｍｇ／ｋｇの週ごとの用量付近でプラトーに近づくことを明らかにした。体重とアスホターゼアルファ曝露の間の関係を考えて、シミュレーションのやり方を用いて患者の体重における広い範囲にわたって予想される生体マーカーの反応を比較した。体重にわたる反応は大幅に重複し、低い曝露が依然として最大に近い生体マーカーの反応に関連した。
【０１９２】
週当たり６回の１ｍｇ／ｋｇ及び週当たり３回の２ｍｇ／ｋｇの投薬計画のシミュレーションは任意の評価項目についての反応で顕著な差異を明らかにしなかった。
【０１９３】
疾患の発症の亜型（たとえば、小児［６ヵ月〜１７歳での発症を含む］に対比させた幼児［＜生後６ヵ月での発症］）は対象とする評価項目についての反応の関係に対比させた用量に影響を与えないことも見いだされた。
【０１９４】
対象とするシミュレートしたＰＤの反応は、幼児（図９）及び小児（図１０）の疾患発症について提案された６ｍｇ／ｋｇ／週のアスホターゼアルファの用量によって達成されるＰＫ曝露の付近で一貫してプラトーに達した。縦の点線は、週６回の１ｍｇ／ｋｇまたは週３回の２ｍｇ／ｋｇの投薬に続く典型的な幼児疾患発症の対象（年齢＝２．７歳、体重＝９．９８ｋｇ）（図９）または典型的な小児疾患発症の対象（年齢＝１６．６歳、体重＝５４．２ｋｇ）（図１０）についての予測されるＣａｖｇ．ｓｓを表す。元々のＰＤの評価項目の値は、評価項目すべてが比較のために同じプロットにあるようにスケール因子で調整する。
【０１９５】
図１１は、すべての試験について一緒に及び各試験（５試験）を別々に、総用量の比率（上のパネル）及び週ごとの総用量の数の分布を示す。投与された用量は、６ｍｇ／ｋｇ／週に近い用量中央値で１〜２８ｍｇ／ｋｇ／週に及ぶ。試験で投与された用量の中央値である６ｍｇ／ｋｇ／週の用量は用量−曝露−反応のシミュレーションでの知見に一致した。
【０１９６】
図１２は、予測された６ＭＷＴの百分率及びＢＯＴ−２の評価項目についての投薬計画（週６回の１ｍｇ／ｋｇに対比させた週３回の２ｍｇ／ｋｇとして投与された６ｍｇ／ｋｇ／週）にわたるシミュレートしたＰＤの反応において認識できる差異がないことを示す。真ん中のボックスを交差する上と下の縦線は最大値と最小値を示す。ボックスの上の横線は第３四分位数であり、ボックスの下の横線は第１四分位数である。ボックスを２つに分ける真ん中の横線は５０番目の百分位数である。横点線は母集団反応のための９０％予測区間である。疾患発症亜群は表現型と呼ばれることがある。
【０１９７】
ＡＵＣｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ／ＴＡＦＤ（Ｃａｖｇ，ｓｔｕｄｙ）として算出される試験治療に関する平均濃度の四分位数と有害事象の発生率との間の関係を異所性石灰質沈着、注射／点滴に関連する反応、及び注射部位の反応について調べた。曝露四分位数の関数として見ると、有害事象の要約は曝露への依存性を示さなかった。表１２は曝露の四分位数及び安全性解析を比較する。
【表１２】
2018528252.tif 000024
【０１９８】
これらの解析の結果は、アスホターゼアルファ曝露に対する内在性因子及び外因性因子の影響、ならびに関連する生体マーカー、機能的な及び画像の評価項目にわたるアスホターゼアルファについての一貫性のある曝露−反応の関係を説明している。モデルに基づく解析は、用量及び投薬計画の評価に関して有用な指針を提供し、解析された臨床的な評価項目に関する有効性の裏付けになる証拠を提供している。にもかかわらず、解析及び基礎資料の限界が考慮されるべきである。
【０１９９】
母集団薬物動態解析は、薬剤の特徴及び臨床的に関心のある潜在的な共変量双方の影響の程度と同様に体内動態パラメータの理に適って正確な推定値を提供した。予想される定常状態での曝露に対するこれら変数の影響の大きさを図１に示したが、以下の曝露−反応の文脈で議論されるであろう。共変量として具体的に検討されていない一方で、原薬／薬剤製品の効能も予想される曝露レベルと直接的な相関を有する。この解析では、原薬の活性を用いてｍｇでの用量を活性単位（Ｕ）での用量にスケール調整した。
【０２００】
事前に指示された共変量の解析に基づいて、Ｃａｖｇ．ｓｓは、体重、シアル酸含量、及び抗薬剤抗体や中和抗体の存在によって影響を受ける。これらの知見は予想及び従来の解析に一致する。仮説が生成する課題として、探索的共変量、腎機能の測定としてのｅＧＦＲ、ＡＬＴ、ＡＳＴ及び人種を事後に評価した。ｅＧＦＲも肝臓酵素もアスホターゼアルファのＣＬに対する物質的な影響を示さなかった。人種は２つの群、アジア系（主として日本人だった）及び非アジア系（主として白人だった）に区分した。予想されたＣａｖｇ．ｓｓは２群間での差異を示すと思われた。アジア系は非アジア系の推定値のクリアランス６８．８％を有すると推定された。しかしながら、９５％信頼区間はむしろ広く（５２．６％から９０．０％）、この推定値の不正確を示した。データセットには６名のアジア系対象しかいないことを考えると、これは驚くべきことではない。対象レベルのＶＰＣは一般に解析データセットにわたる個人基準で良好なモデル性能を示す一方で、アジア系対象にとってのＶＰＣは対象にわたって且つ対象の中で矛盾する性能を示す。探索的共変量の解析では、人種効果は６名の対象のアジア系の群全体にとってのカテゴリー効果として推定されたが、完全なモデルに由来する個々のＶＰＣは全体として偏りはアジア系の群で明らかではないことを示している。矛盾はアジア系対象のサブセットで現れ、時間をかけて対象内で実行として体系的に生じるとも思われる。元データでこの偏りの明らかな予測因子が観察されなかったので、これは、さらにそのような小さな試料サイズについてのアスホターゼアルファの体内動態における人種に基づく差異の知見の解釈性での信頼を低下させる。
【０２０１】
アスホターゼアルファ活性の定量に２つの異なるアッセイを採用したので、ＰＫパラメータ測定値に対する生物解析アッセイ（ＣＢＲＧ対ＷＩＬ）の影響を評価し、無視できることが示された。この知見は、アッセイの偏りが母集団ＰＫモデルの背景で推定されるまたはアッセイの交差検証試験の結果の解析に基づくモデルで固定されるかどうかで一貫していた。投与の経路によるアッセイの混同のせいで、すなわち、ＩＶ投与から生じる本質的にすべての試料がＣＢＲＧ法で解析されたので、ＣＢＲＧデータの有無にかかわらずデータの別々の解析は妥当な知見の予想で実施することはできなかった。従って、アッセイの交差検証の結果は生物分析法の混同されない比較を提供し、母集団ＰＫモデルは交差検証試験の知見を支持した。
【０２０２】
様々な臨床的に意味のある評価項目に対するアスホターゼアルファ曝露の効果は包括的に特徴付けられ、定量されている。アスホターゼアルファの開発プログラムにおける予測制御のアームによる正式な投与量決定試験の欠如のせいで、この特徴付けへのモデルに基づくアプローチが正当化された。しかしながら、治療の非存在下での基礎疾患の軌跡についての想定は必要だった。画像化の評価項目ＲＳＳ及びＲＧＩ−Ｃについての利用可能な履歴対照データの解析は、アスホターゼアルファ試験の持続時間の期間にわたるゼロの大きさの傾きによって証拠付けられるように、疾患の進行を想定しないことを支持した。この知見は専門的な臨床上の意見と共に他の評価項目への外挿の基礎として役立った。
【０２０３】
長期にわたる反復測定の反応データがベースラインのデータ及びゼロの傾きの疾患の進行で支えられると、評価項目すべてについて明瞭な曝露−反応の関係が明らかだった。間接的な薬物動態反応の構造の範囲内で実施される薬物効果についてのＥｍａｘモデルに一致して、曝露−反応の関係はさらに高いアスホターゼアルファの曝露でプラトーに近づくことも示された。限定された用量範囲のデータは、特に生体マーカー評価項目についてのＥＣ５０の推定の精度に悪影響を与えたので、このパラメータのみに直接基づいて推測が行われるべきではない。ＥＣ５０の精度が最適に満たないにもかかわらず、曝露−反応のモデルに基づいて反応の予測にて理に適った精度があった。これは、ＥＣ５０とさらに正確に推定されたＥｍａｘとの間での推定誤差における一部の適度な相関のせいだった。これらの結果を考えると、予測される曝露−反応の関係に基づく推測は解析によって十分に支持された。
【０２０４】
用量及び投薬計画の選択の妥当性についての推測は試験の結果及びモデルに基づく曝露反応の関係によって支持された。特定の臨床標的曝露の範囲はアスホターゼアルファについて定義されていなかったが、週当たり３回投与される２ｍｇ／ｋｇのＳＣ投薬計画が、非臨床試験での有効性に関連する濃度を上回る平均定常状態での濃度を達成することは明らかだった。さらに、曝露−反応の関係の文脈で見ると、この投薬計画は最大に近い有効性と一致する反応を達成した。
【０２０５】
年少の小児では、ｍｇ／ｋｇの投薬計画が青年及び成人よりもやや低い定常状態の曝露をもたらす場合、予測された反応は依然として最大に近い有効性であり、試験の結果に基づく知見に一致する。これらの年少の個人ではｍｇ／ｋｇの投薬を超えるさらなる用量調整は必要ではないと思われる。この超稀な疾病によって余儀なくされた小さな試料サイズのせいで、非常に年少の患者のさらなる評価が正当化されてもよい。
【０２０６】
時間的に変化する共変量として解析された場合、アスホターゼアルファのクリアランスに対する免疫原性の影響が正確に推定され、ＡＤＡ−の状態に比べて、それぞれＡＤＡ＋／Ｎａｂ−及びＡＤＡ＋／ＮＡｂ＋のカテゴリーについておよそ１．１１及び１．２１の倍率によってＣＬの上昇を示した。曝露−反応の関係の文脈で見ると、定常状態の曝露における結果的な低下は反応における意味のある変化に変換できることにならない。そのようなものとして、免疫原性の状況に基づいて用量調整することは推奨されない。ＡＤＡの報告された力価の範囲は幾分狭い（２０４８まで）ことが指摘されるべきである。従って、これらの知見は現在のデータセットにて観察される力価のレベルに適用可能である。
【０２０７】
臨床試験では、薬剤のＴＳＡＣまたは効能について用量を調整しなかった。母集団ＰＫモデルの背景では、ＴＳＡＣの影響は定常状態の曝露に明確に影響を与えた。モデルのパラメータとして特に評価されなかった一方で、原薬の効能も、用量が効能の関数として表現されるので、曝露及び薬物動態の反応に直接影響を与える。シミュレーションに基づいた推測は、低いＴＳＡＣが曝露の低下をもたらし、非臨床試験で確立された治療用の曝露標的範囲に近づくことを示した。結果は最大の有効性プラトーから下向きに反応を移動さることになる。同様に、高い効能の原薬と合わせた高いＴＳＡＣ含量はアスホターゼアルファの安全性及び忍容性に対して影響があり得る。従って、良好な製剤対照はアスホターゼアルファの上手な臨床用途について重要な因子である。
【０２０８】
結論
モデル診断及びパラメータ測定値によって評価されるような一次の吸収と消失を伴う２コンパートメントモデルを用いて、ＩＶ及びＳＣ投与に続くアスホターゼアルファのＰＫを適正に記述した。活性−時間プロファイルのグラフ上の評価に基づく薬物動態的なフリップ・フロップの証拠があったけれども、ＩＶ及びＳＣ双方のデータの同時モデル化はアスホターゼアルファの体内動態の適正な特徴付けを可能にした。加えて、モデル診断は線形性及び重ね合わせのモデル想定を支持した。
【０２０９】
母集団ＰＫモデル化の結果に基づいて、異なる年齢カテゴリーにおける平均体重についての見かけのクリアランスの典型的な値は、１．７２Ｌ／日（０〜１ヵ月齢）；３．３３Ｌ／日（１ヵ月齢〜２歳）；７．５３Ｌ／日（２〜１２歳）；１５．３Ｌ／日（１２〜１６歳）；及び２０．８Ｌ／日（≧１６歳）だった。同様に、定常状態での分布の見かけの容積の典型的な値は、３．９８Ｌ（０〜１ヵ月齢）；９．３２Ｌ（１ヵ月齢〜２歳）；２６．６Ｌ（２〜１２歳）；６６．２Ｌ（１２〜１６歳）；及び９８．９Ｌ（≧１６歳）だった。推定された絶対的な生体利用効率は２０００Ｌのバッチサイズから生じる薬剤製品については０．５７１であり、２０，０００Ｌのバッチサイズから生じる薬剤製品について０．５２０だった。
【０２１０】
分布半減期及び消失半減期の個々の推定値の平均値（ＳＤ）はそれぞれ０．０３１８（０．０２６５）日及び２．５１（１．２３）日だった。
【０２１１】
アスホターゼアルファのクリアランスに対する体重、シアル酸含量、及び免疫原性の影響は十分に特徴付けられ、正確に推定された。週３回の２ｍｇ／ｋｇの投薬計画に続く定常状態での投与間隔の間でシミュレートした平均濃度（Ｃａｖｇ．ｓｓ）の推定に基づいて、これら３つの時間で変化する共変量のうちでシアル酸含量が最も影響力が大きかった。体重のような他の共変量についての固定した想定の範囲内で、１．０〜３．０モル／モルのＴＳＡＣの範囲にわたって、Ｃａｖｇ．ｓｓは９７１Ｕ／Ｌから３１６６Ｕ／Ｌにまで及ぶと予想される。抗薬剤抗体の存在は１．１１（９５％信頼区間（ＣＩ）：１．０６〜１．１７）の倍率でアスホターゼアルファのクリアランスを高めた。中和抗体の存在は抗薬剤抗体陰性の状態に比べて１．２１（９５％ＣＩ：１．０８〜１．３７）の倍率でクリアランスを高めた。クリアランス変化のこの大きさはアスホターゼアルファの臨床活性に対して臨床的に意味のある影響を有する可能性は低い。
【０２１２】
投与された用量の直接単位変換として説明されるロット原薬活性（効能）の効果は、用量の直接因子としてのアスホターゼアルファ曝露をスケール調整するので、Ｃａｖｇ．ｓｓの直接因子である。
【０２１３】
仮説生成の目的での探索的共変量の評価は、腎機能（推定された糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）によって測定されるような）及び肝酵素指標、すなわち、Ｕ／Ｌでの血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）及びＵ／Ｌでの血清アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）はアスホターゼアルファのクリアランス（ＣＬ）に関連しないことを示唆している。結果は、アスホターゼアルファの体内動態におけるアジア系人種の考えられる関連を指摘している。しかしながら、他の課題の中でのアジア系人種の対象に由来する限定されたデータの可用性はアジア系人種の効果を解釈する上での注意を示唆している。
【０２１４】
生体マーカー及び有効性の評価項目（ＰＰｉ、ＰＬＰ、ＲＳＳ−手首、ＲＳＳ−膝、ＲＧＩ−Ｃ、ＢＯＴ−２、及び６ＭＷＴ）についての反復測定データのための非線形混合効果モデルを用いて、臨床的に関連する曝露−反応の関係を特定し、定量した。
【０２１５】
これらの曝露−反応の関係を用いて、検討されていない投薬計画の範囲の関数としての反応における臨床的に意味のある変化を定量した。投薬計画は、治療に先立つ高いレベルからのＴＮＳＡＬＰ基質の正規化、骨石灰化における臨床的に意味のある改善、及び骨格形態及び筋骨格機能における実質的な改善を示した。
【０２１６】
３つの有害事象（ＡＥ）の評価項目（異所性石灰質沈着、注射／点滴に関連する反応、及び注射部位の反応）及び８９７の合計事象を考えて、ＡＥの評価項目については曝露−反応の関係を特定しなかった。従って、ＰＫと対象とする安全性変数との間には明確な関係がないという事実は、約６ｍｇ／ｋｇ／週以上の用量はＨＰＰ患者にて最小のリスクで最大の利益を提供するであろうことを示唆している。
【０２１７】
たぶん、この評価項目のデータの不測のせいで、類骨厚みについては母集団の曝露−反応の傾向は観察されなかった。
【０２１８】
用量／投薬計画／反応の関係は週当たり６ｍｇ／ｋｇの選択を支持したが、それは最初の臨床試験で使用された主要な用量だった。
【０２１９】
週当たり６ｍｇ／ｋｇの用量を考えて、投薬計画（週当たり３回の投薬（２ｍｇ／ｋｇ）に対比させた週当たり６回の投薬（１ｍｇ／ｋｇ）の影響は、モデルに基づくシミュレーションによって探索すると臨床的に意味のある影響を有さないことが示された：
−ＰＫのピークからトラフまでの変動で一部の予想された差異は観察されたが、平均のＰＫ曝露は投薬計画によって影響を受けなかった。
−定常状態でのＰＤ及び有効性の反応は投薬計画間で同等だった。
【０２２０】
体重の関数としての曝露における差異が特定されたが、曝露は一般に同一ｍｇ／ｋｇ用量では体の大きさの低下に伴って低下した。これらの低い曝露は強い臨床有効性（生存データ）及び最大に近い生体マーカーの反応に依然として関連していた。
【０２２１】
図１３は、ＨＰＰ患者における様々な用量の投薬計画についての経時的なアスホターゼアルファの活性及び反応を示す。この証拠は２４日ごとに１回までの投薬が有効な利益を提供するであろうということを示している。２４日ごとに１回より少ない頻度の投薬は無毒性量（ＮＯＡＥＬ）を超えるレベルに用量を増やす必要がある。これらの結果は、アスホターゼアルファが、１日１回から２４日ごとに１回までの投薬計画の範囲にわたって患者の遺伝子型または表現型にかかわらずＨＰＰ患者における酵素補充療法について安全であり且つ有効であるという主張を支持している。ＴＮＳＡＬＰ−ＥＲＴは１日１回から隔週で１回までの投薬計画の範囲にわたって遺伝子型または表現型にかかわらずＨＰＰ患者にて安全であり且つ有効であることが発見された。以下のアスホターゼアルファの投薬計画が提案されている：週に１回として、１日の１回として、週に２回として、週に３回として、週に４回として、週に５回として、週に６回として、隔週で１回として、８日ごとに１回として、９日ごとに１回として、１０日ごとに１回として、１１日ごとに１回として、１２日ごとに１回として、１３日ごとに１回として、３週ごとに１回として、１５日ごとに１回として、１６日ごとに１回として、１７日ごとに１回として、１８日ごとに１回として、１９日ごとに１回として、２０日ごとに１回として、２２日ごとに１回として、２３日ごとに１回として、及び２４日ごとに１回として投与される薬剤。
【０２２２】
図１４〜２１はさらに、本明細書で議論されているような複数の生体マーカー及び評価項目を考慮して様々な投薬計画についての類似の治療効果を示す。
【０２２３】
実施例２：低ホスファターゼ血症患者におけるアスホターゼアルファの使用
アスホターゼアルファは、ヒト組換え組織非特異的アルカリホスファターゼ−Ｆｃ−デカ−アスパラギン酸塩の融合タンパク質である。それは、ヒト組織非特異的アルカリホスファターゼの触媒ドメインとヒト免疫グロブリンＧ１のＦｃドメインとデカ−アスパラギン酸ペプチドドメインとから作製された１４５２アミノ酸の可溶性糖タンパク質である。
【０２２４】
アスホターゼアルファは低ホスファターゼ血症の患者に投与されて無機ピロホスフェートを切断し、無機ホスフェートを放出して、骨を石灰化するので骨格の完全性を回復するヒドロキシアパタイト結晶を形成する。酵素の活性はまた、ピリドキサールが細胞に入り多数の酵素反応について補因子として作用するのを可能にする。
【０２２５】
製品は、単回使用のＩ型ガラス製バイアルにて２種類の濃度：単一調製物（０．８ｍＬ中に８０ｍｇ）で１００ｍｇ／ｍＬ及び４つの調製物（０．３ｍＬ中に１２ｍｇ、０．４５ｍＬ中に１８ｍｇ、０．７ｍＬ中に２８ｍｇ、及び１ｍＬ中に４０ｍｇ）で４０ｍｇ／ｍＬでの無菌の水溶液として皮下投与のために提示される。バイアルはシリコン処理したゴムストッパーで栓をし、ポリプロピレンのフリップオフキャップの付いたアルミニウムシールで密封する。
【０２２６】
実施例３：非臨床的な態様
薬理学
一次薬物動態試験
試験管内でアスホターゼアルファは、デカ−アスパラギン酸ペプチドを欠いている腎臓ＴＮＳＡＬＰよりも３２倍大きな精製ヒドロキシアパタイトへの親和性を有することが示された。
【０２２７】
５日間のアスコルビン酸とβ−ＧＰで誘導した細胞外マトリクスの堆積と石灰化に続いて、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞培養物をアスホターゼアルファ（１３２Ｕ／Ｌ）の存在下または非存在下でＰＰｉの種々の処理（±５μＭ）に１週間曝露した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞培養物では、アスホターゼアルファはＰＰｉが誘導したカルシウム濃度の低下を無効にした。どの処理もコラーゲンマトリクスの堆積には影響しなかった。
【０２２８】
生体内にて、ヒトＨＰＰのマウスノックアウトモデル（Ａｋｐ２−/−と名付けられた）でアスホターゼアルファによる前臨床有効性試験を行った。Ａｋｐ２−/−マウスは血漿におけるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の基質であるＰＰｉ及びピリドキサール−５’−ホスフェート（ＰＬＰ）の内在性の蓄積、過剰な石灰化されていない骨基質及び損傷された成長を含む多数の特徴によって特徴付けられた。彼らはまたＡｃｈｉｌｌｅｓ腱靭帯付着部での石灰化の欠損及び頭蓋骨の発達と形態の異常も示す。無呼吸及びてんかん性発作の症状の発現も明らかであり、報告では早期の死亡に寄与した。Ａｋｐ２−/−マウスの臨床的特徴はヒトＨＰＰの幼児形態のものに類似した。従って、Ａｋｐ２−/−マウスはＨＰＰの治療についてアスホターゼアルファを評価する関連モデルであると報告された。実際、新生児で開始したＴＮＳＡＬＰ酵素置換はＡｌｐｌ−/−マウスで見られる頭蓋顔面の骨格異常すべてを救済することが実証された。マイクロＣＴ、組織学的な及びデジタルのキャリパーに基づく解析は、処理されたＰ１５Ａｌｐｌ−/−マウスの頭蓋骨（ｎ＝４４）は未処理のＡｌｐｌ−/−マウスのそれ（ｎ＝４４）とは有意に異なるが、野生型マウス（ｎ＝４５）のそれとは有意に異ならないことを示している。これらの知見は、生後のＴＮＳＡＬＰ酵素補充療法は、マウスにて出生直後に開始した場合、ＨＰＰに関連する頭蓋顔面の骨格の異常を防ぐのに有効であることを示唆している。
【０２２９】
Ａｋｐ２−/−マウスでは、０．５〜８．２ｍｇ／ｋｇ／日（３０３〜８２４１単位のアルカリホスファターゼ活性／ｋｇ／日に相当する）の用量でのアスホターゼアルファによる皮下（ＳＣ）の予防的処理は用量依存性に後足の骨石灰化に関連する欠損を防ぐ。溶媒処理したＡｋｐ２−/−マウスでは、生存期間の中央値は１９．５日であると報告された。アスホターゼアルファによるＡｋｐ２−/−マウスの予防的処理は調べた用量すべてにて生存を有意に延ばした。アスホターゼアルファの正規化した１日用量（０．５〜８．２ｍｇ／ｋｇ／日）と生存との間に用量−反応の関係性が観察された。
【０２３０】
Ａｋｐ２−/−マウスの予防的処理は、アスホターゼアルファが血漿におけるＰＰｉ及びＰＬＰの蓄積を妨げ、靭帯付着部の石灰化欠損を減らし、体重増加や骨成長の抑制を反転することも実証した。８．２ｍｇ／ｋｇ／日のアスホターゼアルファで４３日間処理したＡｋｐ２−/−マウスの左の脛骨及び大腿骨の長さは１つの試験ではＷＴに類似したが、別の試験ではＷＴよりも短かった（６％まで）。２つの試験間での骨の長さの差異はさらに高い用量での有効性評価のためのさらに感受性のパラメータを表してもよい。投薬の中止が体重増加及び生存に対するアスホターゼアルファの予防的処理の効果を反転したということは、アスホターゼアルファによる連続した治療法が持続する利益のために必要とされることを示唆した。ＰＬＰレベルに対するアスホターゼアルファの効果に関して、ビタミンＢ６の補完のない認定された市販の実験用齧歯類の餌を用いて試験を行った。この方法によってＰＬＰ（主要なビタミンＢ６補酵素形態）の測定は餌の摂取に影響されないことになる。計画的試験ＡＬＰ−ＰＴ−２６に対する予備試験として評価を行い、それは以前の結果を裏付けた。試験の完全な持続期間（４７日）にわたるアスホターゼアルファによるＡｋｐ２−/−マウスの連続的な処理は、３５日間のアスホターゼアルファ投与に続く１２日間の溶媒注射に比べて、前肢の握力を部分的に改善し、血漿ＰＬＰ及び肝臓グリコーゲン双方のレベルの上昇を完全に防ぎ、骨長さの減少を部分的に反転し、体重増加の抑制を完全に反転したことを示している。
【０２３１】
治療的な前臨床試験では、アスホターゼアルファによる処理を、有意な石灰化関連の欠損がＡｋｐ２−/−マウスで観察される時点である生後１２日または１５日に開始した。アスホターゼアルファによるＡｋｐ２−/−マウスの処理は骨の石灰化欠損を減らし、体重増加の抑制を反転した。アスホターゼアルファによる治療的処理は、種々の用量及びＳＣ投薬計画を用いてＡｋｐ２−/−マウスの生存を有意に高めた。毎日の投薬計画が一般に最も有効だった。これらの治療効果は予防的処理に続いて観察されるものに類似していた。
【０２３２】
安全性の薬理学プログラム
１２日目に開始した８．２ｍｇ／ｋｇ／日でのアスホターゼアルファの１回または４回ＳＣ用量を投与されたＡｋｐ２−/−マウスにおける試験では、低カルシウム血症または低リン酸血症の誘導はなかった。
【０２３３】
１８０ｍｇ／ｋｇのアスホターゼアルファのボーラス静脈内（ＩＶ）投与はラットにて急性反応を生じた。時間をかけたＩＶ点滴またはジフェンヒドラミンまたはデキサメタゾンのＳＣの予備処理によるアスホターゼアルファの投与は反応を減らしたが、急性反応を完全には緩和しなかった。補体に基づく病因の検出された証拠はなかった。
【０２３４】
３０及び８８ｍｇ／ｋｇの用量レベルでのアスホターゼアルファの単回ＩＶ注射は、オスラットの一般的行動に対する即時の、しかし、一時的で反転可能な影響（異常歩行及び低下した運動性、低下した伸筋突伸反射、変化した着陸開脚及び低い握力）を生じた。手足の腫脹及び発赤、体温の低下及び不規則な／苦しい呼吸も３０及び８８ｍｇ／ｋｇ用量の群で見られた。３ｍｇ／ｋｇでのアスホターゼアルファのＩＶ投与は測定可能な行動上の影響を生じなかった。
【０２３５】
ラットにおける呼吸試験では、アスホターゼアルファは呼吸機能に対して用量依存性の抑制効果を誘導した。これらの効果は投薬後最初の２時間の間で最も顕著だった。これらの効果は他のラットにＩＶ毒性試験で観察された一時的な急性の点滴反応に一致し、ＳＣ投与によってアスホターゼアルファを投与されたラットでは観察されなかった。
【０２３６】
１０ｍｇ／ｋｇ／日までのアスホターゼアルファを６ヵ月間ＳＣ投与で投与された幼若サルではＥＣＧに対する有意な影響は見られなかった。
【０２３７】
薬物動態
アスホターゼアルファの薬物動態のパラメータがマウス、ラット、ウサギ及びサルにて検討されている。
【０２３８】
吸収：単回ＩＶ投与に続いて、アスホターゼアルファのクリアランス（ＣＬ）は、約３０〜４０時間の範囲の見かけの終末ｔ１／２を伴ってマウス、ラット、ウサギ及びサルにて０．００５０４〜０．０５４０Ｌ／時間／ｋｇに及んだ。これらの種で観察されたＶｄｓｓはアスホターゼアルファの末梢組織への分布を示唆した。５〜１８０ｍｇ／ｋｇの用量範囲にわたるほぼ一定のＣＬを伴った線形の動態が成熟サルで観察された一方で、単一用量のＰＫ試験でたった１つの用量レベルしか評価されなかったので動態の線形性はマウス、ラット及びウサギでは評価されなかった。
【０２３９】
４週間または２６週間のアスホターゼアルファの反復したＩＶまたはＳＣ投与に続いて、ＡＵＣ及び／またはＣｍａｘの値は試験にわたって上昇する用量と比例して（線形の相対を示唆する）または比例しないで（高くまたは低く、非線形の動態を示唆する）上昇した。たとえば、試験の企画、薬剤ロット、免疫原性プロファイル及び／または動物の年齢のような複数の因子が特に試験間の用量の比例性評価に影響を与えたかもしれない。推定された半減期の値に基づいて、幼若なラット及びサルにおける薬剤蓄積の程度は投薬の頻度に依存した。毎週投薬のスケジュールでは薬剤の蓄積は観察されなかった。毎日投薬の投薬計画によって薬剤の蓄積は明らかだった。ＴＫパラメータにおける性別差は幼若ラット及び幼若サルでは観察されなかった。
【０２４０】
妊娠マウス（ＣＤ−１）及び非妊娠マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に妊娠１３〜１７日で５日間、０（溶媒）、０．５、２または８．２ｍｇ／ｋｇ／日のアスホターゼアルファの毎日ＳＣ用量を投与した（ＡＬＰ−ＰＴ−１５）。アスホターゼアルファの濃度は非妊娠マウスの方が高いと報告された。しかしながら、これは系統差のよるものであり得る。０．５〜８．２ｍｇ／ｋｇの用量範囲で妊娠マウスに繰り返しＳＣ投与を行った後、調べた用量すべてにてアスホターゼアルファのレベルが胎児において定量可能だったということは、アスホターゼアルファの胎盤透過性の輸送を示唆している。
【０２４１】
アスホターゼアルファはヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃドメインを含有するので、非ヒト動物における免疫原性反応が予想された。５回の反復投与試験のうち４回で抗薬剤抗体（ＡＤＡ）の発生が観察された。群当たり時点当たりの抗薬剤抗体（ＡＤＡ）の発生率はラット及びサルの双方で０〜１００％だった。ラット及びサルにおける全身性曝露に対するＡＤＡの影響はＡＵＣにおける（相当する群の平均ＡＵＣ値に比べて）無視できる低下から約８５％の低下まで様々だった。
【０２４２】
１、３または１３ｍｇ／ｋｇ／日のアスホターゼアルファのＩＶ用量を２６週間投与した幼若ラットにてアスホターゼアルファの毒性動態試験を行った。２６週目における全身性の曝露が用量に比例したものより大きく上昇したということは、非線形の動態を示唆している。ＴＳＡＣレベルの異なる（１．９及び１．０）アスホターゼアルファの薬剤ロットが１〜１９週及び２０〜２６週で使用されたことが言及された。一日の薬剤ロットは高い薬剤曝露を示すと予想されたが、試験の早い方のフェーズ、すなわち、１週〜１９週目で達成された曝露に比べて２６週目で報告された曝露は保存的であると予想された。
【０２４３】
０、０．８４、８．４または２５．２ｍｇ／ｋｇ／日のアスホターゼアルファのＳＣ用量を投与したオス幼若ラットを用いた局所忍容性試験では、対照動物を含むすべての用量群の血液試料でＡＤＡが検出された。
【０２４４】
妊娠６〜１９日での１３、２５または５０ｍｇ／ｋｇでのアスホターゼアルファの毎日ＩＶ用量を投与した妊娠ラットにおける胚／胎児発生試験では、Ｃｍａｘが用量に比例したものより大きく上昇したということは非線形の動態を示唆している。他の試験とは対照的に、薬剤蓄積は観察されなかった。これついての理由は不明瞭のままだった。
【０２４５】
妊娠６〜１９日に１０、２５、または５０ｍｇ／ｋｇ／日でのアスホターゼアルファの毎日ＩＶ用量を妊娠ラットに投与した出生前及び出生後の毒性試験では、全身性曝露の上昇は用量に比例するものより大きかった。この試験におけるＡＵＣの値は別の試験の妊娠ラットで検出されたものより高かった。
【０２４６】
性交後７〜１９日に１０、２５、または５０ｍｇ／ｋｇ／日でのアスホターゼアルファ（２．７のＴＳＡＣを伴う）のＩＶ用量を妊娠ウサギに投与した胚／胎児発生試験では、全身性曝露は用量に比例するもの以上に上昇した。この試験におけるＡＵＣの値は用量範囲試験の妊娠ウサギで検出されたものより高かった。アスホターゼアルファの血清にて動物間の高い変動性があり、これはＡＤＡの見込まれる発生に起因した。１０、２５、または５０ｍｇ／ｋｇ／日でのアスホターゼアルファのＩＶ用量を投与した妊娠ウサギでは、ＡＤＡはそれぞれ、動物の７０、６５及び７５％で検出された。
【０２４７】
０、５、１５または４５ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶ用量を週１回４週間投与された幼若カニクイザルでは、全身性曝露の上昇は用量に比例するもの以上だった。ＡＤＡは用量群すべてで観察された。しかしながら、発生率は４５ｍｇ／ｋｇ用量群でさらに高かった。
【０２４８】
０．４３、２．１４または１０ｍｇ／ｋｇ／日のＳＣ用量を６ヵ月間投与された幼若カニクイザルでは、全身性曝露の上昇は用量に比例するもの等しいか、またはやや大きかった。曝露は２．１４ｍｇ／ｋｇ／日の用量群での４週目及び２６週目にて低かったが、これについての理由は不明瞭だった。薬剤の蓄積はすべての用量で見られた。３０週目では、ＡＤＡは０．４３及び２．１４ｍｇ／ｋｇ／日の用量群で検出された（それぞれ調べた動物の２５及び７５％）が、１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量群では検出されなかった。
【０２４９】
分布：５ｍｇ／ｋｇの１２５Ｉ−アスホターゼアルファの単回ＩＶ用量を投与した幼若マウス及び４．３ｍｇ／ｋｇの１２５Ｉ−アスホターゼアルファの反復ＳＣ用量を１４日間受け取った新生仔マウスにてアスホターゼアルファの組織分布を特徴付けた。
【０２５０】
長骨に対する１２５Ｉ−アスホターゼアルファの分布を観察した。ＡＵＣ及びＣｍａｘは、たとえば、肝臓、腎臓、肺及び筋肉のような軟組織よりも骨組織、大腿骨で高かった。放射性活性は試験期間の９６〜１６８時間にわたって顕著に低下することなく少なくとも６４時間長骨に残ったということは骨での滞留を示唆している。血液／血清における放射性活性は骨組織よりも迅速に排除された。
【０２５１】
分布試験では、頭蓋冠、脛骨及び大腿骨における１２５Ｉ−アスホターゼアルファの持続する存在は蓄積、滞留またはこれらの組織からの成分の緩慢なクリアランスを示してもよい。
【０２５２】
他の薬物動態試験：アスホターゼアルファの新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合親和性は２つの他の陽性対照であるアバタセプト及びエタネルセプト（Ｆｃドメイン含有融合タンパク質）に類似すると報告された。ＦｃＲｎへの結合親和性と臨床的な半減期との間の相関解析は、アスホターゼアルファの臨床的な半減期がアバタセプト及びエタネルセプトに匹敵することを示したということは、ＦｃＲｎが介在する再利用のアスホターゼアルファのクリアランスへの寄与は他のＦｃ融合タンパク質に類似することを示唆している。
【０２５３】
毒性学
アスホターゼアルファの開発プログラムを支援して多数の非臨床試験が実施された。これらの試験には、単回用量及び反復用量の毒性試験、繁殖及び発生の毒性試験が含まれた。反復用量試験のほとんどで毒性動態評価が実施された。抗薬剤抗体（ＡＤＡ）の評価も行った。加えて、反復用量試験の一部として局所忍容性も評価した。
【０２５４】
アスホターゼアルファの非臨床的安全性を評価するために適当な齧歯類及び非齧歯類の種としてそれぞれ、幼若スプラーグドーリーラット及び幼若カニクイザルを選択した。
【０２５５】
単回用量の毒性：幼若カニクイザルにおける単回用量試験では、１８０ｍｇ／ｋｇまでのＩＶ投与は上手く忍容されると見なされた。循環する被験物質の存在のせいで、試験全体を通して動物すべてにおいてＡＬＰ活性の顕著な用量比例性の上昇が観察された。血清ＡＬＴ及びＡＳＴの活性の一時的な上昇は３匹の動物で観察された。
【０２５６】
反復用量の毒性：０、２．６、２６、７７ｍｇ／ｋｇの名目用量での４週間の幼若ラットへのＩＶ経路によるアスホターゼアルファの毎週投与は限定された数の影響に関連した。最も一貫した言及される影響は、投薬後６０分までで観察された一時的な注射の反応（部分的に閉じた眼、低下した筋緊張、横向きに横たわること、猫背の姿勢、触れると冷たい、調和の取れない動き、低下した活動、異常歩行及び／または青い、赤い及び／または硬い腫脹した前足及び後足）だった。付属肢骨格（大腿骨及び脛骨）の減少も検出された。しかしながら、軸骨格に対する一貫した影響及び頭頂から尻までの長さにおける影響は指摘されなかった。
【０２５７】
７７ｍｇ／ｋｇ／週を４週間投与した幼若ラットでは高いレベルの血清リン及び血清総カルシウム及び低下したＣ−テロペプチド値が観察された。骨構築に対する影響は観察されなかった。
【０２５８】
１、３、または１３ｍｇ／ｋｇ／日のアスホターゼアルファの幼若ラットへの２６週間の毎日ＩＶ注射は、投薬期間全体を通して投薬後１時間までの赤い及び時には腫脹した鼻口部、前足及び後足を含む一時的な臨床兆候に関連した。試験の間に評価したパラメータのほとんどで毒性学的に意味のある変化は見られなかった。
【０２５９】
観察された血清ＡＬＰの高い活性はアスホターゼアルファの循環するレベルに起因した。完全に可逆性であり、１、３または１３ｍｇ／ｋｇ／日の用量レベルで毒性を評価するのに使用したパラメータに対してどんな影響も生じなかった処理期間の間での一時的な臨床的兆候の観察に基づいて、無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は１３ｍｇ／ｋｇ／日であると見なされた。
【０２６０】
緩徐ＩＶ注入によって幼若カニクイザルに週１回アスホターゼアルファを４週間投与し、その後２８日間の回復期間を置いた影響を調べるために試験を実施した。見られたたった１つの影響は用量に関連したＡＬＰ活性の上昇だった。これは、各用量投与の後、動物における循環する組換えＡＬＰ被験物質の存在が原因で生じると考えられている。ＡＬＰのレベルは一般に回復期間の終了までに対照値に類似した。骨の発達に対する影響は観察されなかった。他の毒性学的に有意な影響は報告されなかった。
【０２６１】
この試験の結果に基づいて、０、５、１５及び４５ｍｇ／ｋｇの用量レベルでのオス及びメスのカニクイザルへのアスホターゼアルファの４週間の毎週ＩＶ注射と、その後の４週間の回復期間はどの用量レベルでも毒性をもたらさなかった。従って、調べた高い用量レベルである４５ｍｇ／ｋｇ／週をＮＯＡＥＬであると見なした。
【０２６２】
血清アルカリホスファターゼの高い活性レベルはアスホターゼアルファの循環するレベルに起因した。骨量の上昇（脛骨骨幹端及び／または腰椎での）及び皮質厚の上昇（脛骨骨幹での）の傾向があったが、処理に関連する明瞭な効果はなかった。骨成長が治療によって遅くなったまたは多少なりとも有害に影響を受けたという指摘はなかったし、またはどの組織における異所性石灰質沈着の証拠もなかった。冠状縫合及びラムダ縫合を含有する２つの部位で頭蓋冠を調べた。使用した幼若サルの年齢で異常（早すぎる縫合閉鎖）はなかった。石灰化（異所性石灰質沈着）による病巣の肉芽腫の炎症及び注射部位の単核細胞の浸潤がすべての処理群に由来する動物で観察され、４週間の回復に続いて部分的にから完全に反転した。病巣の最少限の持続する炎症は高用量群に由来する一部の注射部位でそのままだった。処理期間の間での注射部位での臨床的な兆候（異所性の石灰質沈着または石灰化）は部分的から完全に可逆的であり、注射は上手く忍容された。従って、ＮＯＡＥＬのレベルは１０ｍｇ／ｋｇ／日であると見なされた。
【０２６３】
試験６７０３１４（ラット）及び６７０３８８（サル）で使用されたラット（２１日齢）及びサル（１歳）は＞０．１ヵ月齢からおよそ２４ヵ月齢の小児科集団をカバーするが、双方の種の使用された動物は２°の骨化中心の融合が完了する年齢（ラットでは１５〜１６２週及びサルでは３〜６歳に達していなかった（Ｚｏｅｔｉｓ，２００３，Ｂｉｒｔｈ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  Ｒｅｓ．Ｂ．Ｄｅｖ．Ｒｅｐｒｏｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．６８：８６−１１０）。
【０２６４】
骨化は２つの反復用量のサルでの試験では調べられなかったが、それらの動物における骨化中心の融合の２〜１８歳の小児科患者との関連性はラットにおける２６週の試験（６７０３１５）にて考慮に入れられた。
【０２６５】
毒性動態：アスホターゼアルファの毒性動態は、ラット、ウサギ及びサルにおける２６週までの持続時間での一連の反復用量ＩＶ及びＳＣの毒性試験において調べられている。４週または２６週のアスホターゼアルファの反復ＩＶまたはＳＣの投与に続いて、ＡＵＣ及び／またはＣｍａｘの値は試験にわたって上昇する用量と比例して（線形の動態を示唆している）または比例しないで（さらに高いまたは低い、非線形の動態を示唆している）上昇した。試験の企画、薬剤ロット、免疫原性プロファイル及び／または動物の年齢のような複数の因子が特に試験間の用量の比例性の評価に影響を与えたかもしれない。推定された半減期の値に基づいて、幼若なラット及びサルにおける薬剤蓄積の程度は投薬の頻度に左右された。週ごとの投薬スケジュールでは薬剤蓄積は観察されなかった。毎日の投薬計画によって薬剤蓄積は明らかだった。ＴＫパラメータにおける性別差は幼若ラット及び幼若サルにおいて観察されなかった。
【０２６６】
安全域の推定については、観察されたデータが採用されたので、ＡＵＣの算出の間に外挿を使用しなかった。また、安全域の算出は２６週目での曝露と酵素活性双方のデータに基づいて適宜実施した。非臨床的なアスホターゼアルファのＰＫに対するＡＤＡの影響はなくてもよい。しかしながら、薬剤の半減期に関連する適当なモニタリング法として蓄積因子（ＡＦ）を用いて、手順のＤ１５０工程でのアスホターゼアルファのクリアランスに対するＡＤＡの影響を調べたが、その際、ＡＦは処理終了時のＡＵＣ（ＡＤＡが発生している）の処理開始時のＡＵＣ（ＡＤＡはたぶんゼロに近い）に対する比として算出する。
【０２６７】
繁殖上及び発生上の毒性：ラットにおける繁殖能力及び初期胚発生の試験にて、１日１回ＩＶ注射による１０、２５または５０ｍｇ／ｋｇ／日でのアスホターゼアルファの投与は、ラットにおけるアスホターゼアルファのＩＶ投与を利用した以前の試験の後に観察されたものに典型的な急性注射反応に関連した。５０ｍｇ／ｋｇ／日を投与したオスはやや低下した体重を有した。≦５０ｍｇ／ｋｇ／日用量での繁殖能力及び初期胚発生は溶媒処理ラットに比べて差異はなかった。これらの結果に基づいて、ＮＯＡＥＬはオスについて２５ｍｇ／ｋｇ／日及びメスについて５０ｍｇ／ｋｇ／日であると見なされた。繁殖能力及び初期胚胎児発生についてのＮＯＡＥＬは５０ｍｇ／ｋｇ／日であると見なされた。
【０２６８】
ラットにおける胚胎児発生の試験では、妊娠６〜１９日での１３、２５または３０ｍｇ／ｋｇ／日の用量レベルのＩＶ注射による１日１回のアスホターゼアルファの投与は一時的な臨床的兆候に関連した。これらの臨床的兆候はアスホターゼアルファのＩＶ投与の後のラットで見られるものに典型的だった。
【０２６９】
調べたどの胎児試料にも異所性の石灰質沈着の証拠はなかった。これらの結果に基づいて、母体のＮＯＡＥＬは１３ｍｇ／ｋｇ／日（妊娠６及び１９日目でのＡＵＣはそれぞれ１６７及び１０４ｍｇ.時間／Ｌ）であると見なされた。この試験にてアスホターゼアルファに関連する胎児毒性、胎児致死性または催奇形性の証拠はなかったので、胚胎児発生のためのＮＯＡＥＬは５０ｍｇ／ｋｇ／日（妊娠６及び１９日目でのＡＵＣはそれぞれ１０９６及び１１４６ｍｇ.時間／Ｌ）であると見なされた。
【０２７０】
妊娠７〜１９日を含む１０、２５、または５０ｍｇ／ｋｇ／日のアスホターゼアルファのＩＶ用量を投与した妊娠ニュージーランドホワイトのメスウサギにおける胚胎児発生の試験では、胎児毒性、催奇形性または胎児致死性の証拠はなかった。従って、胚胎児発生のためのＮＯＡＥＬは５０ｍｇ／ｋｇ／日であると見なされた。５０ｍｇ／ｋｇ／日を投与した２匹の妊娠動物にて尿細管の石灰化が検出された。母体のＮＯＡＥＬは２５ｍｇ／ｋｇ／日であると見なされた。胎児毒性、催奇形性または胎児致死性の証拠はなかったので、胚胎児発生のためのＮＯＡＥＬは５０ｍｇ／ｋｇ／日であると見なされた。５０ｍｇ／ｋｇ／日を投与した２匹の妊娠動物にて尿細管の石灰化が検出された。母体のＮＯＡＥＬは２５ｍｇ／ｋｇ／日（妊娠７及び１９日でのＡＵＣはそれぞれ１９７８及び１５７３ｍｇ.時間／Ｌ）であると見なされた。妊娠７〜１９日にて１０、２５、または５０ｍｇ／ｋｇ／日のアスホターゼアルファのＩＶ用量を投与した妊娠ウサギでは、抗薬剤抗体は動物のそれぞれ、７０、６５及び７５％で検出された。これは胚胎児発生の毒性の検出に影響を与え得る。
【０２７１】
妊娠６日目から２１日目の分娩後までにＩＶ注射によって１０、２５または５０ｍｇ／ｋｇ／日のアスホターゼアルファを投与したメスラットにて出生前及び出生後の発生試験を行った。Ｆ０世代の母親について、アスホターゼアルファのＩＶ注射に続いて通常観察された一時的な臨床的兆候は投薬の４時間以内に処理群すべてで指摘された。中間用量及び高用量の群ではＦ０の母親について低発生率での仔の食殺が指摘された。食殺が処理に関連するのかどうかは不明確であり、その臨床的関連性も不明瞭である。５０ｍｇ／ｋｇ／日でのＦ１世代の成熟オスについては、離乳後期間の間で指摘された体重及び食物摂取値の軽い低下があった。子孫（Ｆ１及びＦ２世代）については、生存、身体的発達、行動または繁殖能力に対する影響はなかった。処理に関連した異所性の石灰質沈着の証拠はなかった。これらの結果に基づいて、Ｆ０、Ｆ１及びＦ２世代についてのＮＯＡＥＬは５０ｍｇ／ｋｇ／日（ＡＵＣ＝１３３９ｍｇ.時間／Ｌ）であると見なされた。
【０２７２】
局所忍容性：ほとんどの試験では、ＳＣ注射の後、軽度の局所刺激が指摘された。しかしながら、これらの感覚は一般に可逆的だった。局所忍容性試験では、週１回２８日間の幼若ラットへのアスホターゼアルファのＩＶ注射が２４時間以内に逆戻りする一時的な有害臨床的兆候を≧３０ｍｇ／ｋｇで引き起こした。１日１回４週間の幼若ラットへのアスホターゼアルファのＳＣ注射は一般に上手く忍容された。処理に関連する知見には、≧０．８４ｍｇ／ｋｇ／日の用量にて限局性の最少から軽度の血管周囲／皮下への単核細胞の浸潤、及び腋窩リンパ節の肥大が含まれたが、それは≧８．４ｍｇ／ｋｇ／日を投与した動物における腋窩リンパ節の最少のリンパ過形成と相関した。
【０２７３】
非臨床的な態様における考察
アスホターゼアルファの非臨床的開発プログラムは、アスホターゼアルファの活性が試験管内及び生体内で検討された様々な薬物力学、薬物動態及び毒性の試験から成った。薬物動態試験はアスホターゼアルファの吸収及び分布のプロファイルを調べた。単回及び反復の用量の毒性試験では、アスホターゼアルファを静脈内に及び皮下（臨床的に使用される投与の同じ経路である）に与えた。アスホターゼアルファで局所忍容性試験も行った。
【０２７４】
アスホターゼアルファは、低ホスファターゼ血症のマウス遺伝子ノックアウトモデルであるＡｋｐ２−／−マウスモデルにおける予防的な及び治療上の実例の双方にて前臨床の有効性を実証した。予防的試験では、アスホターゼアルファは、循環する無機ピロホスフェート及びピリドキサール−５’−ホスフェートの蓄積を防ぎ、骨の石灰化欠損を減らし、骨長及び体重増加の抑制に対する有益な効果を有した。生存時間も増えた。
【０２７５】
アスホターゼアルファの成長及び生存に対するプラス効果が投薬を中止したのち喪失したことは、持続した利益のためにはアスホターゼアルファによる持続的療法が必要とされることを示唆している。アスホターゼアルファによる治療上の処置は骨の石灰化を促進し、生存を改善し、Ａｋｐ２−／−マウスで観察された体重増加の抑制を反転させた。
【０２７６】
ラット、ウサギ及びカニクイザルにて安全性の薬理学及び毒性の試験を行った。ラットにて用量比例性の一時的なＩＶ点滴に関連する反応を測定することによって幾つかの試験にて毒性動態及び対症的なＡＤＡの評価を行った。これらの反応には、呼吸抑制、自発運動量の低下及び四肢の腫脹が含まれた。注射反応は、サル（ＩＶまたはＳＣのいずれかで投与した）、ウサギ（ＩＶまたはＳＣで投与した）または同等のＳＣ投与で処理したラットでは観察されなかった。注射部位での刺激はＳＣ注射によって投与したサルで観察された。これらの変化は軽度であり、大部分可逆性であった。これらの注射に関連した反応は有害ではないと見なされ、長期試験のそれぞれについてのＮＯＡＥＬは試験のそれぞれで調べられた最高用量であると一般に見なされたので、毒性試験に由来する合わせた結果はアスホターゼアルファの臨床使用に対する支持を提供する。
【０２７７】
臨床的態様
薬物動態
吸収
ＳＣ投薬の後のアスホターゼアルファの生体利用効率は、１ｍｇ／ｋｇの初回投与ののち６２．９％から９８．４％に及び、２ｍｇ／ｋｇの初回投与ののち５４．２％から７１．３％に及んだ。
【０２７８】
用量の比例性及び時間依存性
ＳＣ投薬の後、Ｔｍａｘの中央値は２４〜４８時間であり、コホート間での平均Ｃｍａｘ及びＡＵＣ０〜１６８ｈで用量比例性の上昇を伴った。
【０２７９】
変動性及び小さな患者数の限界の範囲内で、Ｃｍａｘはコホート２についてのＡＵＣ０〜１６８ｈであったように、双方のコホートについて初回と３回目のＳＣ投薬ののち同等であった。ＡＵＣ０〜１６８ｈはコホート１ではたった１名の患者について４週で推定することができた。
【０２８０】
ＳＣ投薬の後の平均半減期（ｔ１／２）はコホート間及び２週目と４週目の間で相対的に一貫していた。個々の患者の値は１１１から１６６時間に及んだ。ＳＣ投薬の後のさらに長いｔ１／２はＳＣ注射部位からの緩慢な吸収の結果である可能性が最も高い。
【０２８１】
薬物動態試験
低カルシウム血症の成人における１ヵ月の多施設非盲検用量上昇試験にてアスホターゼアルファの薬物動態を評価した。
―試験のコホート１（ｎ＝３）は最初の週、３ｍｇ／ｋｇのアスホターゼアルファを静脈内（ＩＶ）で、その後１週間間隔で２〜４週間１ｍｇ／ｋｇの皮下（ＳＣ）での３回投与を受けた。
―コホート２（ｎ＝３）は最初の週、３ｍｇ／ｋｇのアスホターゼアルファをＩＶで、その後毎週２〜４週間２ｍｇ／ｋｇの皮下での３回投与を受けた。
―３ｍｇ／ｋｇの１．０８時間の静脈内点滴の後、中央値時間（Ｔｍａｘ）は１．２５から１．５０時間に及び、平均Ｃｍａｘ（ＳＤと共に）は調べたコホートにわたって４２６９４（８４４３）と４６８９０（６６３５）Ｕ／Ｌの間の範囲だった。
―初回と３回目の皮下投与の後の絶対的な生体利用効率は４５．８％から９８．４％に及び、平均Ｔｍａｘは２４．２から４８．１時間に及んだ。
―コホート１における１ｍｇ／ｋｇの毎週の皮下投与の後、投薬間隔（ＡＵＣτ）にわたる平均ＡＵＣ（ＳＤを伴う）は、初回投与及び３回目投与に続いてそれぞれ６６０３４（１９２４１）及び４０４４４（Ｎ＝１）Ｕ＊時間／Ｌだった。
―コホート２における２ｍｇ／ｋｇの毎週の皮下投与の後、平均ＡＵＣτ（ＳＤを伴う）は、初回投与及び３回目投与に続いてそれぞれ１３８５９５（６９５８）及び１３６１０９（４１８７５）であった。
【０２８２】
母集団薬物動態
母集団ＰＫ法を用いてアスホターゼアルファの臨床試験すべてに由来する薬物動態のデータを解析した。母集団ＰＫ解析によって特徴付けられる薬物動態変数は、１日齢から６６歳までに及ぶ年齢及び２８ｍｇ／ｋｇ／週までの皮下用量の低ホスファターゼ血症患者の集団全体を表す。
【０２８３】
母集団薬物動態解析の結果に基づいて、アスホターゼアルファは２８ｍｇ／ｋｇ／週の皮下用量までの線形の薬物動態を示すと結論付けられた。
【０２８４】
モデルは、アスホターゼアルファのクリアランス及び分布パラメータの容積に影響を及ぼす体重を特定した。ＰＫ曝露は体重と共に増加するであろうことが予想される。
【０２８５】
免疫原性のアスホターゼアルファのＰＫ全体に対する影響はＰＫ曝露を２０％未満減らすと推定された。
【０２８６】
薬物力学
一次及び二次の薬理学
以下の臨床試験にて薬物力学を評価した。
試験＃４＃５
試験＃４＃５は非盲検非無作為試験だった。１３名の患者が登録されたが、１２名が試験継続中である。５名の患者は６ヵ月未満で低ホスファターゼ血症の症状が見つかり、８名の患者は６ヵ月と１８歳の間で症状が見つかった。この試験に含められた年齢は５歳と１２歳の間であった。試験は、アスホターゼアルファを受け取り、臨床管理の類似のプロトコールの対象とされていた患者と同じ施設に由来する履歴対照を採用した。
【０２８７】
Ｘ線像に対するアスホターゼアルファの影響
訓練を受けた放射線医が、以下の兆候：明らかな骨端軟骨の拡張、骨幹端部の広がり、石灰質沈着の暫定ゾーンの不規則性、骨幹端部の放射線透過性、骨幹端骨幹の硬化、骨減少、骨幹端骨幹における「ポップコーン」石灰質沈着、遠位骨幹端の脱石灰化、放射線透過性の低吸域及び舌鋒の横向きの骨端軟骨下のバンドについて患者の手首及び膝のベースライン前後のＸ線写真を評価した。次いで以下のようなＸ線所見の全般的な変化の評定尺度：−３＝重度の悪化、−２＝中程度の悪化、−１＝最低限の悪化、０＝変化なし、＋１＝最少限の治癒、＋２＝実質的な治癒、＋３＝完全に近いまたは完全な治癒を用いてベースラインからのＸ線写真の変化を格付けした。アスホターゼアルファを受け取った患者は曝露の最初の６ヵ月間にわたって＋２及び＋３のスコアに移動し、これは継続治療と共に持続した。履歴対照は時間をかけた変化を示さなかった。
【０２８８】
骨生検
骨生検の取得に先立って３日間の経過（１４日間の間隔によって分離された）にて骨標識のためのテトラサイクリンを投与した。標準の手順によって腸骨稜の骨を横切る生検を得た。生検の組織学的分析は骨測定ソフトウエア（Ｏｓｔｅｏｍｅｔｒｉｃｓ，ＵＳＡ）を使用した。命名法、記号及び単位は全米骨代謝学会の推奨に従った。アスホターゼアルファを受け取る前後で腸骨稜の骨を横切る生検を受けた、プロトコールごとの設定（ベースラインと２４週目の間で経口ビタミンＤを服用した患者を除外する）における１０名の患者について：
【０２８９】
・類骨厚みの平均値（ＳＤ）はベースラインでは１２．８（３．５）μｍであり、２４週目では９．５（５．１）μｍであった
【０２９０】
・類骨容積／骨容積の平均値（ＳＤ）はベースラインでは１１．８（５．９）％であり、２４週目では８．６（７．２）％であった
【０２９１】
・石灰化の遅延時間の平均値（ＳＤ）はベースラインでは９３（７０）日であり、２４週目では１１９（２２５）であった。
【０２９２】
成長
米国疾病対策センターから利用可能な成長チャート（分布を説明する百分位数曲線のシリーズ）にて身長、体重及び頭囲をプロットした。これらの参照データは健常な小児の代表的な試料から引き出し、特定の健康管理を必要とする小児に特有のものではなく；それらは低ホスファターゼ血症の小児についての成長チャートの非存在下で使用されている。
【０２９３】
アスホターゼアルファを受け取った患者について：９/１３名の患者は、ＣＤＣ成長チャートにおける高い百分位数への時間をかけた移動によって示されるように持続する明らかな巻き返しの身長の伸びを示した。３/１３名の患者は明らかな巻き返しの身長の伸びを示さず、１名は判断できる十分なデータを有さなかった。タナー分類を介した成長は適当であると思われた。
【０２９４】
履歴対照の観察の期間について：１/１６名の患者が明らかな巻き返しの身長の伸びを示し、１２／１６名の患者は巻き返しの身長の伸びを示さなかったが、データは３／１６名の患者にて結論に至らなかった。
【０２９５】
試験＃２＃３
試験＃２＃３は非盲検非無作為非対照試験だった。１１名の患者が登録し、９名の患者が試験の継続中である。低ホスファターゼ血症の発症は全患者で６ヵ月齢未満だった。試験に含まれた年齢は０．５〜３５カ月齢の間だった。
【０２９６】
Ｘ線像に対するアスホターゼアルファの影響
完全解析の設定において７／１１名の患者が、ベースラインのＸ線写真に比べて２４週目で＋２のＸ線所見の全般的な変化のスコアを達成した。
【０２９７】
成長
５／１１名の対象は明らかな巻き返しの身長の伸びを示した。身長の伸びにおける変動は明らかだったが、さらにこれらの年少の患者における重篤な疾患及び高い比率の病的状態を反映してもよい。
【０２９８】
試験＃６
試験＃６は非盲検の無作為試験だった。１９名の患者が登録され、１８名の患者が試験を継続している。低ホスファターゼ血症の発症は１６名の患者で６ヵ月齢未満であり、４名で６ヵ月〜１８歳の間であり、２名で１８歳を超えていた。１名の患者では発症の年齢は不明だった。含まれた年齢は１３〜６６歳だった。
【０２９９】
成長
この試験における青年期（及び成人）の患者は明らかな身長の伸びを示さなかった。
【０３００】
骨生検
患者は対照群の一部として、またはアスホターゼアルファへの曝露の前後に腸骨稜の骨を横切る生検を受けた。
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【０３０１】
モデリング演習
予定表までに収集した臨床的な薬理学データ（薬物動態、薬物力学及び免疫原性のデータ）を解析した。
【０３０２】
最終的なＰｏｐ−ＰＫモデルはＩＶとＳＣのデータを同時に解析し、ＳＣ投与に続く一次吸収と中心コンパートメントからの消失を伴う２コンパートメント体内動態を伴う最終的な薬物動態モデルを生じた。
【０３０３】
Ｐｏｐ−ＰＫモデルの解析に基づいて２８.０ｍｇ／ｋｇ／週の検討されたＳＣ用量まで用量比例性を推測した。
【０３０４】
共変量効果
（ｉ）生体利用効率における製剤因子、（ｉｉ）クリアランス及び分布の容積における人口統計データ、及び（ｉｉｉ）クリアランスに対する免疫原性効果の影響を調べるのにモデルを使用した。
【０３０５】
推定されたＰｏｐ−ＰＫモデルのパラメータに対するアッセイの影響のモデルに基づく評価を行った。モデルはすべての症例でアッセイの最少限の影響を示す。
【０３０６】
Ｐｏｐ−ＰＫモデル及び変数の推定値を用いたモンテカルロシミュレーションを行ってアスホターゼアルファのＰＫに対する共変量の効果を評価した。バッチサイズ、免疫原性、及び体重内容のようなパラメータを変えるシミュレーションを行った。活性としてのアスホターゼアルファのＰＫを測定するための生物分析法と共にたとえば、年齢、性別、腎機能、及び肝機能の検査（ＡＳＴ及びＡＬＴ）のような共変量は有意であるとは見いだされなかった。
【０３０７】
母集団薬物動態及びプールした薬物動態−薬物力学の解析を行って、たとえば、血漿ピリドキサールホスフェート及び無機ピロホスフェートのような生体マーカー、たとえば、Ｘ線所見の全般的な変化、くる病重症度のような放射性の薬物動態評価項目、ならびに、たとえば、運動熟練度のＢｒｕｉｎｉｎｋｓ−Ｏｓｅｒｅｓｔｓｋｙ試験及び６分間歩行試験のような機能的有効性の評価項目における変化についての反応の関係性に対比させた独立した曝露を特徴付けた。
【０３０８】
ＰＫ-ＰＤ解析データセットにおける試験すべてについての治療期間全体の間での異所性の石灰質沈着、注射／点滴に関連する反応、及び注射部位の反応の事象の有害事象に関する母集団曝露−反応の関係の評価。３種の評価項目にわたって５５２の事象が発生した。
【０３０９】
試験全体にわたる対象に特有のＣａｖｇを考えて、曝露の四分位数に対比させた有害事象発生の比率（事象の数／時間）を構築した。曝露の四分位数の関数として見ると、有害事象の要約は曝露への依存性を示さなかった。
【０３１０】
製品規格の正当化
曝露−反応の関係に影響を与えるアスホターゼアルファの製造のための製品規格の１つは比活性（Ｕ／ｍｇ、薬剤の効能）である。
【０３１１】
開発されたＰｏｐ−ＰＫを用いて実施した共変量感受性解析に基づいて、１つのパラメータを低ホスファターゼ血症における曝露に対して影響を有するとして特定した。
【０３１２】
このパラメータ及び比活性は規定の製剤規格の範囲内でロットごとに異なるので、モデルに基づいたシミュレーション解析を行って薬物動態の曝露の変化の大きさ及び製剤因子の結果としての有効性に対するその後のその影響を評価した。
モデリング演習から
―アスホターゼアルファのためのＣＭＣ規格は、６ｍｇ／ｋｇ／週の用量で有効性を見るのに十分な曝露を提供するはずである。
―アスホターゼアルファのＣＭＣ規格について特定された最大比活性値を用いて予測された約４０００Ｕ／Ｌの最大曝露は、サルにおける２６週目のＧＬＰ毒性試験に由来するＮＯＡＥＬ用量から生じる＞５０００Ｕ／Ｌの曝露を十分に下回る。
【０３１３】
臨床薬理学における考察
薬物力学の結果は、アスホターゼアルファの曝露が、骨生検にて低下した石灰化遅延時間に関連する手首及び膝のＸ線像の改善を生じること示唆している。多数の患者が明らかな巻き返しの身長の伸びを示している。
【０３１４】
長年にわたる低ホスファターゼ血症の患者は根底にある骨軟化症の状態に重ね合わせた変形性関節症を有する。骨端は「閉鎖」し、骨幹端の変化は存在しないまたは最少限である。これらの理由で、潜在的にＲＧＩ−Ｃのスコアは低ホスファターゼ血症の成人では混同されるであろう、すなわち、ＲＧＩ−Ｃスコアは成人集団では完全に情報が提供されているとは限らない。低ホスファターゼ血症の成人集団における骨生検の解釈は、ビスホスホネートのような薬物に対する以前の曝露によって、及び生活上獲得している且つ骨の組織学に影響を与える共存する病的状態によって妨害され得る。同じヒトにおいて１回の生検から次回の生検までに大きな変動性があってもよい。骨構築の変化は達成するのに週単位ではなく何年もかかり得る。さらに、低ホスファターゼ血症の患者における骨組織学の自然経過は確立されていない（ビタミンＤ感受性の骨軟化症のものとは異なり得る）。測定が細胞活性の力学的測定であり、三次元単位への変換を必要としない（すなわち、腸骨稜の等方性を想定する必要がない）ので、潜在的に、成人集団にてさらに情報を与える測定は石灰化の遅延時間である。
【０３１５】
臨床有効性
解析の設定全体には、アスホターゼアルファで治療されている合計７１名の患者（小児発症の低ホスファターゼ血症が６８名［４８名は周産期／幼児発症の低ホスファターゼ血症、２０名は小児発症の低ホスファターゼ血症］が含まれ、２名は成人発症であり、１名は不明形態の低ホスファターゼ血症だった。
【０３１６】
患者は治療開始年齢が１日齢から６６歳に及んだ。低ホスファターゼ血症の発症年齢による統合的有効性の解析については、集団には４４名の周産期／幼児発症の低ホスファターゼ血症患者及び８名の小児発症の低ホスファターゼ血症患者が含まれた。
【０３１７】
臨床的有効性における考察
臨床試験の企画及び実施
「フェーズ２」試験の企画に対して提出された論理的根拠は、低ホスファターゼ血症が、
―稀である
―満たされていない高い医療ニーズを有する
―重篤な病的状態及び死亡のリスクに関連する
―取り返しのつかない損傷についての潜在性を持つ
―代替治療を有さない
ことである。
【０３１８】
あまり重篤ではないまたは中程度の形態の低ホスファターゼ血症の有病率は立証されていないが、欧州人口にて（約）１／５０００であると推定されている（Ｍｏｒｎｅｔ，ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７５：４３９−４５）。有病率はあらゆる形態が過剰表現されることが知られるメノナイト社会においてさらに高い可能性がある。
【０３１９】
有効性データ及び追加の解析
検討された患者集団は低ホスファターゼ血症の対象の代表的なものである。主要な臨床的な有効性転帰は、（ｉ）時間をかけてＸ線像の変化を評価する技法である、Ｘ線所見の全般的な変化、（ｉｉ）身長、体重及び頭囲の連続測定によって評価されるような成長、及び（ｉｉｉ）骨組織学における時間をかけた変化である。
【０３２０】
Ｘ線所見の全般的な変化のツール
訓練を受けた放射線医が、以下の兆候：明らかな骨端軟骨の拡張、骨幹端部の広がり、石灰質沈着の暫定ゾーンの不規則性、骨幹端部の放射線透過性、骨幹端骨幹の硬化、骨減少、骨幹端骨幹における「ポップコーン」石灰質沈着、遠位骨幹端の脱石灰化、放射線透過性の低吸域及び舌鋒の横向きの骨端軟骨下のバンドについて患者の手首及び膝のベースライン前後のＸ線写真を評価した。次いで以下のようなＸ線所見の全般的な変化（ＲＧＩ−Ｃ）の評定尺−３＝重度の悪化、−２＝中程度の悪化、−１＝最低限の悪化、０＝変化なし、＋１＝最少限の治癒、＋２＝実質的な治癒、＋３＝完全に近いまたは完全な治癒を用いてベースラインからのＸ線写真の変化を格付けした。
【０３２１】
試験＃４＃５
試験＃４＃５は継続中の拡張を伴う２４週持続期間の非盲検試験だった。５歳〜１２歳の１３名の患者が登録し、出現日に基づいて６ｍｇ／ｋｇ／週の試験薬に曝露された。この試験は１６の履歴対照も登録した。
【０３２２】
ＲＧＩ−Ｃのツールによって評価した手首及び膝のＸ線像
試験＃４のデータは対象が手首及び膝のＸ線像で改善を示す（Ｘ線所見の全般的な変化のツールによって評価されるように）ことを示唆している。アスホターゼアルファを受け取った患者は曝露の最初の６ヵ月にわたって＋２及び＋３のスコアに移動し、これは継続中の治療と共に持続した。対照的に、履歴対照では、同等の期間にわたるＲＧＩ−Ｃスコアの変化は明らかではなかった。
【０３２３】
骨生検
以下の結果は、アスホターゼアルファを受け取る前後に腸骨稜を横切る生検を受けた、プロトコールごとの設定での（ベースラインと２４週の間で経口ビタミンＤを服用した患者を除外する）１０名の患者から得られた。
・類骨厚みの平均値（ＳＤ）はベースラインで１２．８（３．５）μｍであり、２４週目では９．５（５．１）μｍだった。
・類骨容積／骨容積の平均値（ＳＤ）はベースラインで１１．８（５．９）％であり、２４週目では８．６（７．２）％だった。
・石灰化の遅延時間の平均値（ＳＤ）はベースラインで９３（７０）日であり、２４週目では１１９（２２５）日だった。
【０３２４】
試験薬への曝露に反応した明らかな「巻き返しの成長」
アスホターゼアルファを受け取った患者について：９／１３名の患者が、ＣＤＣの成長チャートにおける高い百分位数への時間をかけた移動によって示されたように持続する明らかな巻き返しの身長の伸びを示した。３／１３名の患者は明らかな巻き返しの身長の伸びを示さず、１名の患者は判断できるのに十分なデータを有さなかった。
【０３２５】
対照的に、履歴対照の観察の期間について：１／１６名の患者は明らかな巻き返しの身長の伸びを示し、１２／１６名の患者は明らかな巻き返しの身長の伸びを示さず、３／１６名の患者ではデータが結論に至らなかった。
【０３２６】
試験＃２＃３及び＃７
試験０２−０８／０３−０８及び１０／１０（ベースラインにて０．１〜２７０週齢の患者）にて人工呼吸補助の必要性には、
人工呼吸補助を必要とした２１名の患者が含まれ、
―１４名の患者はベースラインにて侵襲性の人工呼吸補助（挿管または気管切開）を必要とした（１名は移行前のベースラインにて短い期間の非侵襲性の人工呼吸を有した）；
・７名の患者は人工呼吸をやめた（２４〜１６８週の人工呼吸での時間）、すべて≧２のＲＧＩ−Ｃスコアを達成した。
・３名の患者は人工呼吸補助を継続した、ＲＧＩ−Ｃスコアは≦２。
・３名の患者は人工呼吸補助の間に死亡した。
・１名の患者は同意を撤回した。
―７名の患者はベースラインののち非侵襲性の人工呼吸（ＢｉＰＡＰまたはＣＰＡＰ）を開始した（２名の患者は侵襲性の人工呼吸による短期の補助を必要とした）；
・５名の患者は人工呼吸をやめた（４週から４８週までの人工呼吸での時間）
・２名の患者は死亡した。
が含まれた。
【０３２７】
試験１１−１０に記載されている未治療の幼児低ホスファターゼ血症患者の自然経過は人工呼吸が必要であれば、高い死亡率を示唆している。
【０３２８】
試験＃６
試験＃６に由来する臨床有効性の結果は成人対象の限定されている。成人対象におけるさらなるデータは承認後の約束として生成されるであろう。
【０３２９】
臨床有効性における考察
低ホスファターゼ血症は骨の石灰化不全を特徴とする。Ｘ線所見の全般的な変化のツールは、アスホターゼアルファの治療に反応した低ホスファターゼ血症患者における骨格の石灰化での時間をかけた変化を評価するために開発され、小児発症の低ホスファターゼ血症の主な臨床試験のための主要な評価項目として選択された。骨の石灰化を評価するツールの能力は、アスホターゼアルファへの曝露に対する低ホスファターゼ血症患者の反応の評価にてそれを臨床的に関係付けた。
【０３３０】
Ｘ線所見の全般的な変化のツールの検証には以下が含まれる：
―ＲＧＩ−Ｃツールを用いて得られた結果は評定者間及び評定者内のスコアで許容できるレベルの同意を実証した。
―Ｘ線所見の全般的な変化のツールの変化に対する感受性は、曝露の最初の６ヵ月にわたって「０」のスコアから「＋２」〜「＋３」の間に移動し、その後、継続する曝露の際、「＋２」〜「＋３」の間で変動するアスホターゼアルファに対する対象の反応のパターンから推測されてもよい（ツールに対して内側）。
―Ｘ線所見の全般的な変化のツールの変化に対する感受性は、曝露の最初の６ヵ月にわたる（ｉ）明らかな巻き返しの身長の伸び、及び（ｉｉ）骨生検の組織像での明らかな改善の同時の表示によって推測されてもよい（ツールに対して外側）。
【０３３１】
（１）Ｘ線所見の全般的な変化のツールによって評価されるようなＸ線像における改善、（２）骨生検材料の組織像、及び（３）患者によって実証される明らかな巻き返しの身長の伸びに関して、これらの臨床的効果は以下を示した：
―生物学的な妥当性：骨の石灰化に関与する不足した酵素を補完することは骨の組織学の改善された像及び骨や関節の改善されたＸ線像をもたらす可能性が高い。従って、身長における結果的な伸びがあり、改善された呼吸能を有してもよいことは妥当であることが見いだされた。
―生物学的な一貫性：前臨床試験は臨床的な有効性についての主張をさらに支持した。
―時間的関係：効果は曝露に続いて明らかになり、継続する曝露と共に持続した。
―効果の方向：Ｘ線像及び骨組織学における変化は期待した方向だった。
―整合性：効果はほとんど（すべてではないが）の患者で生じ、類似の状況下で１を超える試験で見いだされた。
―成果の特異性：骨以外の臓器が冒されることは明らかではなかった。筋強度に対する間接的な効果があり得たが、試験（たとえば、６分間歩行試験）はこれを結論的に示すことはできなかった。
【０３３２】
臨床有効性の裏付けとしての証拠の大部分は１３歳未満（試験に含まれる時点で０．５ヵ月齢〜１２歳の間）の対象にある。試験＃５及び＃６の拡張は、１３〜１８歳の患者にてさらなるデータ（たとえば、ＲＧＩ−Ｃスコア、身長及び体重の変化、生体マーカーの測定等）を提供することが予想される。低ホスファターゼ血症（ＨＰＰ）の成人患者におけるアスホターゼアルファの多施設無作為非盲検のフェーズ２ａ試験は以下のために企画された：
（ｉ）小児にて助言された用量の投与に続く成人でのアスホターゼアルファの薬物動態（ＰＫ）を評価すること、及び
（ｉｉ）血漿の無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）及びピリドキサール−５’−ホスフェート（ＰＬＰ）における用量反応データを提供し、臨床利益の証拠を検証すること。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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