(57)【要約】  本開示は、サイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子を再活性化するための方法および組成物に関する。いくつかの側面において、本開示によって記載される方法は、ＦＭＲ１不活性化に関連する異常（例えば脆弱Ｘ症候群）を処置することにとって有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
方法が、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの治療有効量を対象に投与することを含み、エピジェネティックなモジュレーターが対象のＦＭＲ１を再活性化する、
その必要がある対象のＦＭＲ１不活性化に関連する異常を処置するための方法。
【請求項２】
ＦＭＲ１不活性化に関連する異常が、脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群、早発性の卵巣老化、または多嚢胞性卵巣症候群である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＦＭＲ１不活性化に関連する異常が、脆弱Ｘ症候群である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターが、メチルトランスフェラーゼの阻害剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
メチルトランスフェラーゼが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼが、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、およびＤＮＭＴ３Ｂからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼがＤＮＭＴ１であり、エピジェネティックなモジュレーターがＤＮＭＴ１を選択的に阻害する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
エピジェネティックなモジュレーターが、５−アザシチジンである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
メチルトランスフェラーゼが、ヒストンメチルトランスフェラーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
ヒストンメチルトランスフェラーゼが、ＥＺＨ２、ＳＥＴＤＢ１、ＥＨＭＴ１／ＧＬＰ、ＥＨＭＴ２／Ｇ９ａ、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ１、およびＳＵＶ４２０Ｈ２からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ヒストンメチルトランスフェラーゼがＳＵＶ３９Ｈ１であり、エピジェネティックなモジュレーターがＳＵＶ３９Ｈ１を選択的に阻害する、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
エピジェネティックなモジュレーターがケトシンである、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
ヒストンメチルトランスフェラーゼがＥＺＨ２であり、エピジェネティックなモジュレーターがＥＺＨ２を選択的に阻害する、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
エピジェネティックなモジュレーターが、ＥＰＺ６４３８またはＧＳＫ１２６である、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターが、ヒストンユビキチンリガーゼの阻害剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ヒストンユビキチンリガーゼが、ヒストンＨ２Ａをユビキチン化するユビキチンリガーゼである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ヒストンユビキチンリガーゼが、ＲＩＮＧ１Ｂ／ＲＮＦ２である、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
エピジェネティックなモジュレーターが、ＲＩＮＧ１／ＲＮＦ２を選択的に阻害する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターが、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
エピジェネティックなモジュレーターが、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ１０、またはＳＩＲＴ５を選択的に阻害する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターが、ヒストンデメチラーゼの阻害剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
エピジェネティックなモジュレーターが、ＫＤＭ５Ｄを選択的に阻害する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターが、活性なマークの阻害因子を標的化する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
活性なマークが、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４からなる群から選択される少なくとも１つのヒストンのアセチル化である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
活性なマークが、ヒストンＨ３リジン４のトリメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターが次：
ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、またはＫＤＭ５Ｄ
の少なくとも１つを標的化する、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターが、核酸、ポリペプチド、または小分子である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターが核酸である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
核酸が、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）からなる群から選択される干渉核酸である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターが、表２に定められている配列（例えばガイド配列）を含む干渉核酸である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターがポリペプチドである、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ポリペプチドが抗体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターが小分子である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
小分子が表１にリスト化された小分子である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
対象が、転写不活性なＦＭＲ１遺伝子の存在に基づいて、必要があるとして同定される、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
転写不活性なＦＭＲ１遺伝子が、エピジェネティックにサイレンシングされている、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
転写不活性なＦＭＲ１遺伝子が、サイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子と結びついた少なくとも１つのエピジェネティックマークを含む、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも１つのエピジェネティックマークが、ＤＮＡメチル化（ＤＮＡｍｅ）、ヒストンＨ３リジン２７トリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）、ヒストンＨ３リジン９トリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）、ヒストン４リジン２０トリメチル化（Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３）、ヒストンＨ２Ａユビキチン化（Ｈ２Ａｕｂ）、ヒストンＨ２ａアセチル化、ヒストンＨ２Ｂアセチル化、ヒストンＨ３アセチル化、ヒストンＨ４アセチル化、およびヒストンＨ３リジン４トリメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
対象が、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲ内の多型ＣＧＧリピートの増幅の存在に基づいて、必要があるとして同定される、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
増幅が、約５５個のＣＧＧリピートおよび約２００個のＣＧＧリピートの間を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
増幅が、２００個よりも多くのＣＧＧリピートを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
有効量が、対象のＣＮＳ、精巣、卵巣、食道上皮、胸腺、眼、または脾臓に送達される、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
有効量が対象のＣＮＳに送達される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
有効量がニューロン細胞に送達される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ニューロン細胞が分化したニューロン細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
エピジェネティックなモジュレーターが、ＦＭＲ１とＦＭＲ１をコードするｍＲＮＡとの間のＲループの形成を阻害する、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
投与前および／または後の対象のＦＭＲ１のエピジェネティックなプロファイルを評価することをさらに含み、ＦＭＲ１のエピジェネティックなプロファイルの変化が処置の有効性を示す、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
方法が、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの有効量と細胞を接触させることを含み、エピジェネティックなモジュレーターが細胞のＦＭＲ１を再活性化する、
細胞の転写不活性なＦＭＲ１遺伝子を再活性化するための方法。
【請求項４９】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターがメチルトランスフェラーゼの阻害剤である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
メチルトランスフェラーゼがＤＮＡメチルトランスフェラーゼである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼが、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、およびＤＮＭＴ３Ｂからなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼがＤＮＭＴ１であり、エピジェネティックなモジュレーターがＤＮＭＴ１を特異的に阻害する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
エピジェネティックなモジュレーターが５−アザシチジンである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
メチルトランスフェラーゼがヒストンメチルトランスフェラーゼである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
ヒストンメチルトランスフェラーゼが、ＥＺＨ２、ＳＥＴＤＢ１、ＥＨＭＴｌ／ＧＬＰ、ＥＨＭＴ２／Ｇ９ａ、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ１、およびＳＵＶ４２０Ｈ２からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ヒストンメチルトランスフェラーゼがＳＵＶ３９Ｈ１であり、エピジェネティックなモジュレーターがＳＵＶ３９Ｈ１を特異的に阻害する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
エピジェネティックなモジュレーターがケトシンである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
ヒストンメチルトランスフェラーゼがＥＺＨ２であり、エピジェネティックなモジュレーターがＥＺＨ２を特異的に阻害する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
エピジェネティックなモジュレーターが、ＥＰＺ６４３８またはＧＳＫ１２６である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターが、ヒストンユビキチンリガーゼの阻害剤である、請求項４８に記載の方法。
【請求項６１】
ヒストンユビキチンリガーゼが、ヒストンＨ２Ａをユビキチン化するユビキチンリガーゼである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ヒストンユビキチンリガーゼが、ＲＩＮＧ１Ｂ／ＲＮＦ２である、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６３】
エピジェネティックなモジュレーターが、ＲＩＮＧ１／ＲＮＦ２を選択的に阻害する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターが、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害剤である、請求項４８に記載の方法。
【請求項６５】
エピジェネティックなモジュレーターが、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ１０、ＳＩＲＴ５を選択的に阻害する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターが、ヒストンデメチラーゼの阻害剤である、請求項４８に記載の方法。
【請求項６７】
エピジェネティックなモジュレーターが、ＫＤＭ５ＤまたはＫＤＭ５Ｃを選択的に阻害する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターが、活性なマークの阻害因子を標的化する、請求項４８に記載の方法。
【請求項６９】
活性なマークが、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４からなる群から選択される少なくとも１つのヒストンのアセチル化である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
活性なマークが、ヒストンＨ３リジン４のトリメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターが、次：
ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、またはＫＤＭ５Ｄ
の少なくとも１つを標的化する、請求項６８〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターが、核酸、ポリペプチド、または小分子である、請求項４８〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターが核酸である、請求項４８〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
核酸が、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）からなる群から選択される干渉核酸である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターが、表２にリスト化された干渉核酸である、請求項４８〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターがポリペプチドである、請求項４８〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
ポリペプチドが抗体である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターが小分子である、請求項４８〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
小分子が、表１にリスト化された小分子である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
細胞が、ニューロン細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項４８〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
細胞がインビトロである、請求項４８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
細胞が、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲ内の多型ＣＧＧリピートの増幅を含む、請求項４８〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
増幅が、約５５および約２００個のＣＧＧリピートの間を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
増幅が、２００個よりも多くのＣＧＧリピートを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの有効量との接触に先立って、転写不活性なＦＭＲ１遺伝子が、サイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子と結びついた少なくとも１つのエピジェネティックマークを含む、請求項４８〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
少なくとも１つのエピジェネティックマークが、ＤＮＡメチル化（ＤＮＡｍｅ）、ヒストンＨ３リジン２７トリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）、ヒストンＨ３リジン９トリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）、ヒストン４リジン２０トリメチル化（Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３）、ヒストンＨ２Ａユビキチン化（Ｈ２Ａｕｂ）、ヒストンＨ２ａアセチル化、ヒストンＨ２Ｂアセチル化、ヒストンＨ３アセチル化、ヒストンＨ４アセチル化、およびヒストンＨ３リジン４トリメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）からなる群から選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
エピジェネティックなモジュレーターが、ＦＭＲ１とＦＭＲ１から転写されたｍＲＮＡとの間のＲループの形成を阻害する、請求項４８〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
方法が、
（ｉ）不活性化したＦＭＲ１遺伝子を含む細胞を候補薬と接触させることと、
（ｉｉ）細胞のＦＭＲ１発現レベルを検出することと、
（ｉｉｉ）ＦＭＲ１の発現レベルが候補薬との接触後にコントロール細胞に対して増大するときに、候補薬をＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターとして同定することと、
を含む、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターを同定するための方法。
【請求項８９】
細胞が人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはニューロン細胞である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
不活性化したＦＭＲ１遺伝子が、エピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子である、請求項８８または８９に記載の方法。
【請求項９１】
細胞が、サイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子と結びついた少なくとも１つのエピジェネティックマークを含む、請求項８８〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
少なくとも１つのエピジェネティックマークが、ＤＮＡメチル化（ＤＮＡｍｅ）、ヒストンＨ３リジン２７トリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）、ヒストンＨ３リジン９トリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）、ヒストン４リジン２０トリメチル化（Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３）、ヒストンＨ２Ａユビキチン化（Ｈ２Ａｕｂ）、ヒストンＨ２ａアセチル化、ヒストンＨ２Ｂアセチル化、ヒストンＨ３アセチル化、ヒストンＨ４アセチル化、およびヒストンＨ３リジン４トリメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）からなる群から選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
細胞が、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲ内の多型ＣＧＧリピートの増幅を含む、請求項８８〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
候補薬が、化合物ライブラリーから選択される、請求項８８〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
ライブラリーがメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
ライブラリーがメチルトランスフェラーゼ阻害剤からなる、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
メチルトランスフェラーゼ阻害剤が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項９５または９６に記載の方法。
【請求項９８】
メチルトランスフェラーゼ阻害剤が、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項９５または９６に記載の方法。
【請求項９９】
ライブラリーがヒストンユビキチンリガーゼ阻害剤を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項１００】
ライブラリーがヒストンユビキチンリガーゼ阻害剤からなる、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０１】
ヒストンユビキチンリガーゼが、ヒストンＨ２Ａをユビキチン化するユビキチンリガーゼである、請求項９９または１００に記載の方法。
【請求項１０２】
候補薬が、活性なマークの阻害因子を標的化する、請求項８８〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
活性なマークが、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４からなる群から選択される少なくとも１つのヒストンのアセチル化である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
活性なマークが、ヒストンＨ３リジン４のトリメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
候補薬が、次：
ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、またはＫＤＭ５Ｄ
の少なくとも１つを標的化する、請求項１０２〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
候補薬が、核酸、ポリペプチド、または小分子である、請求項８８〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
候補薬が核酸である、請求項８８〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
核酸が、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）からなる群から選択される干渉核酸である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
候補薬がポリペプチドである、請求項８８〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
ポリペプチドが抗体である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
候補薬が小分子である、請求項８８〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
検出が、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイ、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）またはＦＡＣＳによって実行される、請求項８８〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
エピジェネティックなモジュレーターが、図９Ｃに示されている化合物またはそれらのいずれか１つの誘導体である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、「COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING FMR1 EXPRESSION」と題する２０１５年９月１７日出願のU.S.仮特許出願No.62/220,202の米国特許法第１１９条（ｅ）の下における優先権を請求し、その内容はそれらの全体が本願に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、遺伝子発現を調節するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）は、学習障害および認知障害を包含する広範な発達問題を引き起こす遺伝学的状態である。ＦＸＳは精神遅滞の最もよくある遺伝学的形態であり、４，０００人の男性中およそ１人に、８，０００人の女性中１人に起こる。通常は、男性はこの異常によって女性よりも重度に冒される。ＦＸＳの大多数の男性は軽度から中程度の知的障害を有し、一方で、冒された女性の約３分の１は知的障害である。
【０００４】
ＦＸＳは、Ｘ連鎖したＦＭＲ１遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内の多型ＣＧＧ配列の増幅（＞２００リピート）によって引き起こされる。増幅したＣＧＧリピートを負ったＦＭＲ１遺伝子は転写サイレンシングされるようになり、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）の欠如をもたらす。ＦＭＲＰはＲＮＡ結合タンパク質であり、多数のシナプスタンパク質の翻訳を調節する翻訳リプレッサーであり、シナプス可塑性に重要な役割を果たす。
【０００５】
ＦＸＳの底にあるメカニズムを標的化するいくつかの治療薬が開発されてきた。それらの指向性の処置のいくつかは、ノックアウトマウスモデルにおいてはＦＸＳの複数の特徴について効能を実証している。しかしながら、有効なヒトの処置は未だ必要とされている。現在までに、ＦＸＳに特異的な治療は存在せず、現行の処置は行動症状を改善することのみを対象にしている。それゆえに、ＦＸＳを処置するための新規の組成物および方法の開発の一般的必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
いくつかの側面において、本開示は、ＦＭＲ１不活性化に関連する異常と結びついた疾患（例えばＦＸＳ）の処置にとって有用なエピジェネティックなモジュレーターに関する。いくつかの態様において、ここで開示されるエピジェネティックなモジュレーターは、エピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子のより許容的なクロマチン状態を誘導するので有用である。いずれかの特定の理論によって拘束されようとするものではないが、ＦＭＲ１不活性化に関連する異常（例えばＦＸＳ）を有する対象のエピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子に、より許容的なクロマチン状態を誘導することは、増大したＦＭＲ１発現（例えばＦＭＲ１の再活性化）をもたらし、それによって疾患症候を減少または疾患症状を後退させると予想される。いくつかの態様において、サイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子の再活性化は疾患症状を後退させると予想される。その上に、いくつかの態様において、前変異の無症候性キャリア、および全変異を有するがＦＭＲ１がサイレンシングされていない稀な無症候性個人は、正常な個人のものよりも低い脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）レベルを有する。それゆえに、いくつかの態様においては、ここで提供される方法に従うサイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子の控え目な再活性化でさえも、実質的な治療利益を有し得る。
【０００７】
本発明の側面は、エピジェネティックなモジュレーター（例えば、選択的阻害剤）によるＦＭＲ１遺伝子のある種の制御因子の阻害が、エピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子の再活性化をもたらすという発見に関する。例えば、ＤＮＭＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＨＺ２、ＲＩＮＧ１Ｂ／ＲＮＦ２、ある種のヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ１０、ＳＩＲＴ５）、および／またはある種のヒストンデメチラーゼ（例えば、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ）の選択的阻害は、転写不活性なＦＭＲ１遺伝子の再活性化をもたらす。それゆえに、いくつかの態様において、ＦＭＲ１遺伝子のエピジェネティックな制御因子の選択的阻害は、転写サイレンシングされたＦＭＲ１を再活性化し、それゆえに、ＦＭＲ１不活性化に関連する異常、例えば脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）を処置するために有用である。
【０００８】
従って、本開示の側面は、対象のエピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子を再活性化する方法に関する。いくつかの態様において、方法は、次の１つのエピジェネティックなモジュレーターを対象に投与することを包含する：ＤＮＭＴ１、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＨＺ２、ＲＩＮＧ１Ｂ／ＲＮＦ２、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ１０、ＳＩＲＴ５、ＫＤＭ５Ｃ、およびＫＤＭ５Ｄ。
いくつかの態様において、エピジェネティックなモジュレーターはＤＮＭＴ１を選択的に阻害する（例えば、５−アザシチジン、Ｆ６３６３−１０１５）。
いくつかの態様において、エピジェネティックなモジュレーターはＳＵＶ３９Ｈ１を選択的に阻害する（例えば、ケトシン（chaetocin）、Ｆ２７４０−００９９、Ｆ６４０３−３０９５、Ｆ５５９９−０５３３）。
【０００９】
いくつかの態様において、エピジェネティックなモジュレーターはＥＺＨ２を選択的に阻害する（例えば、ＥＰＺ６４３８、ＧＳＫ１２６、Ｆ２８８０−２５６０）。
いくつかの態様において、エピジェネティックなモジュレーターはＲＩＮＧ１Ｂ／ＲＮＦ２を選択的に阻害する（例えば、ＰＲＴ４１６５）。
いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターはヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害剤である。いくつかの態様において、エピジェネティックなモジュレーターはＨＤＡＣ５（例えばＦ６１９６−０９７６）、ＨＤＡＣ１０（例えばＦ６１９６−０９７６）、ＳＩＲＴ５を選択的に阻害する。
いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターはヒストンデメチラーゼの阻害剤である。いくつかの態様において、エピジェネティックなモジュレーターはＫＤＭ５ＣまたはＫＤＭ５Ｄを選択的に阻害する。
【００１０】
いくつかの側面において、本開示は、その必要がある対象のＦＭＲ１不活性化に関連する異常を処置するための方法を提供し、方法はＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの治療有効量を対象に投与することを含み、エピジェネティックなモジュレーターは対象のＦＭＲ１を再活性化する。
いくつかの態様において、ＦＭＲ１不活性化に関連する異常はＦＸＳである。
【００１１】
いくつかの側面において、本開示は、細胞の転写不活性なＦＭＲ１遺伝子を再活性化するための方法を提供し、方法はＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの有効量と細胞を接触させることを含み、エピジェネティックなモジュレーターは細胞のＦＭＲ１を再活性化する。
いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターはメチルトランスフェラーゼの阻害剤である。いくつかの態様において、メチルトランスフェラーゼはＤＮＡメチルトランスフェラーゼである。いくつかの態様において、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼはＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、およびＤＮＭＴ３Ｂからなる群から選択される。いくつかの態様において、メチルトランスフェラーゼはヒストンメチルトランスフェラーゼである。いくつかの態様において、ヒストンメチルトランスフェラーゼはＥＺＨ２、ＳＥＴＤＢ１、ＥＨＭＴ１／ＧＬＰ、ＥＨＭＴ２／Ｇ９ａ、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ１、およびＳＵＶ４２０Ｈ２からなる群から選択される。
【００１２】
いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターはヒストンユビキチンリガーゼの阻害剤である。いくつかの態様において、ヒストンユビキチンリガーゼは、ヒストンＨ２Ａをユビキチン化するユビキチンリガーゼである。いくつかの態様において、ヒストンユビキチンリガーゼはＲＩＮＧ１Ｂ／ＲＮＦ２である。
いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターは、ＦＭＲ１遺伝子における活性なクロマチンの指標であるヒストン修飾の喪失または不在と結びついたヒストン修飾因子の阻害剤である。従って、いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの使用は、ＦＭＲ１遺伝子における活性なクロマチンの指標であるヒストン修飾の存在をもたらす。いくつかの態様において、活性なクロマチンの指標であるヒストン修飾は、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４からなる群から選択される少なくとも１つのヒストンのアセチル化である。いくつかの態様において、ヒストン修飾はヒストンＨ３リジン４のトリメチル化である（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）。いくつかの態様において、ヒストン修飾はヒストンＨ２Ａアセチル化（例えば、リジン５における）、ヒストンＨ２Ｂアセチル化（例えば、リジン５、１２、１５、または２０における）、ヒストンＨ３アセチル化（例えば、リジン４における）、ヒストンＨ４アセチル化（例えば、リジン８における）である。
【００１３】
いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターは次の少なくとも１つを標的化する：ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７）およびデメチラーゼ（例えば、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、またはＫＤＭ５Ｄ）。
いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターは核酸、ポリペプチド、または小分子（small molecule）である。
いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターは核酸である。いくつかの態様において、核酸は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）からなる群から選択される干渉核酸である。いくつかの態様において、干渉核酸は表２にリスト化されたｓｈＲＮＡである。いくつかの態様において、干渉核酸は表２にリスト化された配列を有するＡＳＯである。
【００１４】
いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターはポリペプチド、例えば抗体である。
いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターは小分子、例えば表１にリスト化された小分子である。
いくつかの態様において、対象は、転写不活性なＦＭＲ１遺伝子の存在に基づいて、エピジェネティックなモジュレーターによる処置の必要があるとして同定される。いくつかの態様において、転写不活性なＦＭＲ１遺伝子はエピジェネティックにサイレンシングされている。
いくつかの態様において、転写不活性なＦＭＲ１遺伝子は、サイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子と結びついた少なくとも１つのエピジェネティックマークを含む。いくつかの態様において、少なくとも１つのエピジェネティックマークは、ＤＮＡメチル化（ＤＮＡｍｅ）、ヒストンＨ３リジン２７トリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）、ヒストンＨ３リジン９トリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）、ヒストン４リジン２０トリメチル化（Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３）、ヒストンＨ２Ａユビキチン化（Ｈ２Ａｕｂ）からなる群から選択される。
【００１５】
いくつかの態様において、対象は、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲ内の多型ＣＧＧリピートの増幅の存在に基づいて、処置の必要があるとして同定される。いくつかの態様において、増幅は、約５５個のＣＧＧリピートおよび約２００個のＣＧＧリピートの間を含む。いくつかの態様において、増幅は２００個よりも多くのＣＧＧリピートを含む。
いくつかの態様においては、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの有効量が対象のＣＮＳ、精巣、卵巣、食道上皮、胸腺、眼、または脾臓に送達される。いくつかの態様においては、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの有効量が対象のＣＮＳに送達される。いくつかの態様においては、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの有効量がニューロン細胞に送達される。いくつかの態様において、ニューロン細胞は分化したニューロン細胞である。
【００１６】
いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの有効量は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に送達される。いくつかの態様において、細胞（例えば、ニューロン細胞、ｉＰＳＣ、神経前駆細胞（ＮＰＣ））はインビトロである。いくつかの態様において、細胞は、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲ内の多型ＣＧＧリピートの増幅、例えば約５５および約２００個の間のＣＧＧリピートを含む増幅を含む。いくつかの態様において、細胞は、２００個よりも多くのＣＧＧリピートを含む増幅を含む。
いくつかの態様において、エピジェネティックなモジュレーターは、ＦＭＲ１遺伝子とＦＭＲ１をコードするｍＲＮＡとの間のＲループの形成を阻害する。
いくつかの態様において、本開示によって記載される方法は、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターを投与する前および／または後の対象のＦＭＲ１のエピジェネティックなプロファイルを評価することをさらに含み、ＦＭＲ１のエピジェネティックなプロファイルの変化は処置の有効性を示す。
【００１７】
いくつかの側面において、本開示は、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターを同定するための方法を提供し、方法は、不活性化したＦＭＲ１遺伝子を含む細胞を候補薬と接触させることと、細胞のＦＭＲ１の発現レベルを検出することと、ＦＭＲ１の発現レベルが候補薬との接触後にコントロール細胞に対して増大するときに、候補薬をＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターとして同定することとを含む。
いくつかの態様において、方法は、インビトロで、例えば細胞（例えば、ニューロン細胞、ｉＰＳＣ、神経前駆細胞（ＮＰＣ））によって実行される。いくつかの態様において、細胞はエピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子を有する。いくつかの態様において、細胞は、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲ内の多型ＣＧＧリピートの増幅、例えば約５５および約２００個の間のＣＧＧリピートを含む増幅を含む。いくつかの態様において、細胞は、２００個よりも多くのＣＧＧリピートを含む増幅を含む。いくつかの態様において、細胞は、サイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子と結びついた少なくとも１つのエピジェネティックマークを含む。
【００１８】
いくつかの態様において、候補薬は核酸、ポリペプチド、または小分子である。いくつかの態様において、候補薬は核酸である。いくつかの態様において、核酸は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）からなる群から選択される干渉核酸である。いくつかの態様において、候補薬は小分子である。いくつかの態様において、候補薬はポリペプチドである。いくつかの態様において、ポリペプチドは抗体である。
いくつかの態様において、候補薬は化合物ライブラリーから選択される。いくつかの態様において、ライブラリーはメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む。いくつかの態様において、ライブラリーはメチルトランスフェラーゼ阻害剤からなる。いくつかの態様において、メチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤である。いくつかの態様において、メチルトランスフェラーゼ阻害剤はヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤である。
【００１９】
いくつかの態様において、ライブラリーはヒストンユビキチンリガーゼ阻害剤を含む。いくつかの態様において、ライブラリーはヒストンユビキチンリガーゼ阻害剤からなる。いくつかの態様において、ヒストンユビキチンリガーゼはヒストンＨ２Ａをユビキチン化するユビキチンリガーゼである。
いくつかの態様において、候補薬は、ＦＭＲ１遺伝子における活性なクロマチンの指標であるヒストン修飾の喪失または不在と結びついたヒストン修飾因子の阻害剤である。いくつかの態様において、活性なクロマチンの指標であるヒストン修飾は、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４からなる群から選択される少なくとも１つのヒストンのアセチル化である。いくつかの態様において、ヒストン修飾はヒストンＨ３リジン４のトリメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）である。
【００２０】
いくつかの態様において、候補薬は、次の少なくとも１つを標的化する（例えば、阻害する）：ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、またはＫＤＭ５Ｄ。
いくつかの態様において、検出は、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイ、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）、ＦＡＣＳ、バイサルファイトシーケンシング、免疫蛍光などによって実行される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、サイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子と結びついたエピジェネティックマークを示している。
【図２】図２は、サイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子と結びついたエピジェネティックマークの潜在的な標的を示している。
【図３】図３は、サイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子のクロマチン修飾因子の阻害剤の候補に基づくスクリーニングの概略図を示している。
【図４】図４は、ＦＸＳ−ｉＰＳＣのＦＭＲ１発現を再活性化するｓｈＲＮＡおよび小分子阻害剤の同定を示している。上パネルは、示されているようにクロマチン修飾因子を対象とする２つの独立のｓｈＲＮＡによって処置されたＦＸＳ−ｉＰＳＣのＦＭＲ１の発現をモニターするｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。ＦＭＲ１発現は、１にセットされたコントロールの非サイレンシング（ＮＳ）ｓｈＲＮＡの発現によって得られたものに対して正規化された。下パネルは、ＥＰＺ６４３８またはＧＳＫ１２６（ＥＺＨ２の阻害剤）、ＵＮＣ０６３８（ＥＨＭＴ２／Ｇ９ａ阻害剤）、およびケトシン（ＳＵＶ３９Ｈ１阻害剤）によって処置されたｉＰＳＣのＦＭＲ１の発現をモニターするｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。ＦＭＲ１発現は、１にセットされた基剤ＤＭＳＯによる処置によって得られたものに対して正規化された。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５】図５は、ＦＭＲ１遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを媒介する因子のバイアスがない大スケールスクリーニングの概略図を示している。
【図６ＡＢ】図６Ａ〜６Ｅは、小スケールの候補に基づくスクリーニングが、患者由来ｉＰＳＣにおいてＦＭＲ１のサイレンシングを媒介するエピジェネティックな制御因子を同定するということを示している。図６Ａは、ＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡを発現するＦＸＳ−ｉＰＳＣにおいてＦＭＲ１の発現をモニターするｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。結果は、１にセットされた野生型ｉＰＳＣ（ＢＪ１−ｉＰＳ４細胞）によって得られたものに対して正規化された。図６Ｂは、ＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡを発現するＦＸＳ−ｉＰＳＣのＦＭＲＰタンパク質レベルを示すイムノブロット分析を示している。２倍（野生型の５０％のＦＭＲＰのレベルを表す）、４倍（２５％）、および８倍（１２．５％）希釈された野生型ｉＰＳＣのＦＭＲＰのレベルが示されている。チューブリンはローディングコントロールとしてモニターされた。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡを発現するＦＸＳ−ＳＣ１３５−ｉＰＳＣにおいてＦＭＲ１の発現をモニターするｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。結果は、１にセットされたコントロールの非サイレンシング（ＮＳ）ｓｈＲＮＡによって得られたものに対して正規化された。
【図６ＤＥ】図６Ｄは、ＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡを発現するＦＸＳ−ＳＣ１３５−ｉＰＳＣのＦＭＲＰタンパク質レベルを示すイムノブロット分析を示している。８倍（１２．５％）および１６倍（６．２５％）希釈された野生型ｉＰＳＣのＦＭＲＰのレベルが示されている。図６Ｅは、ＤＭＳＯもしくは５−アザシチジン（azacytine）（５−ａｚａ）またはＮＳもしくはＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡによって処置されたＦＸＳ−ｉＰＳＣ（ＦＸＳ８４８−ｉＰＳ３細胞）のＦＭＲ１プロモーターのバイサルファイトシーケンシング分析を示している。（上）ＦＭＲ１プロモーターの概略図。ＣｐＧの位置が垂直線によって一定の縮尺で示されている。（下）それぞれの丸はメチル化（黒色）または非メチル化（白色）ＣｐＧジヌクレオチドを表している。それぞれの行は単一のクローンを表している。データは平均±ＳＤで表されている。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｇは、ＦＭＲ１−ＳＦが順序立った経路によってエピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１と安定に結びつくということを示している。図７Ａは、野生型（ＷＴ）およびＦＸＳ−ｉＰＳＣ（ＦＸＳ８４８−ｉＰＳ３細胞）においてＦＭＲ１プロモーターへのＦＭＲ１−ＳＦの結合をモニターするＣｈＩＰ分析を示している。ネガティブコントロールとして、結合は恒常発現したＡＰＲＴプロモーターでもまたモニターされた。結果は、１にセットされたＩｇＧによって得られたものに対して正規化された。
【図７Ｂ】図７Ｂは、それぞれのＦＭＲ１−ＳＦを標的化するｓｈＲＮＡを発現するＦＸＳ−ｉＰＳＣにおいてＦＭＲ１−ＳＦの結合をモニターするＣｈＩＰ分析を示している。
【図７ＣＤ】図７Ｃは、ＦＭＲ１−ＳＦがＦＭＲ１プロモーターに結合する順序立った経路の概要を示している。コファクターの順序が見分けられ得ないステップについては、コファクターは水平に並べられている。図７Ｄは、ＦＸＳ−ｉＰＳＣにおいてサイレンシングされたＦＭＲ１プロモーター上のＨ３Ｋ９ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３のレベルをモニターするＣｈＩＰ分析を示している。
【図７ＥＦ】図７Ｅは、ＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡを発現するＦＸＳ−ｉＰＳＣのＨ３Ｋ２７ｍｅ３のＣｈＩＰ分析を示している。図７Ｆは、ＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡを発現するＦＸＳ−ｉＰＳＣのＨ３Ｋ９ｍｅ３のＣｈＩＰ分析を示している。データは平均±ＳＤで表されている。
【図８ＡＢ】図８Ａ〜８Ｆは、ＦＭＲ１−ＳＦの小分子阻害剤によるエピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１の再活性化を示している。図８Ａは、５−ａｚａ、ケトシン、ＥＰＺ６４３８、ＧＳＫ１２６、ＰＲＴ４１６５、またはコントロールとしてのＤＭＳＯによって処置されたＦＸＳ−ｉＰＳＣにおいてＦＭＲ１の発現をモニターするｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。結果は、１にセットされた野生型ｉＰＳＣ（ＢＪ１−ｉＰＳ４細胞）で得られたものに対して正規化された。図８Ｂは、５−ａｚａ、ケトシン（chaetoxin）、ＥＰＺ６４３８、ＧＳＫ１２６、またはＰＲＴ４１６５によって処置されたＦＸＳ−ｉＰＳＣにおいてＦＭＲＰタンパク質レベルを示すイムノブロット分析である。野生型ｉＰＳＣのＦＭＲＰのレベルが示されている。チューブリンはローディングコントロールとしてモニターされた。
【図８ＣＤ】図８Ｃは、ケトシン（chaetoxin）、ＥＰＺ６４３８、またはＰＲＴ４１６５によって、単独または対の組み合わせどちらかで処置されたＦＸＳ−ｉＰＳＣにおいてＦＭＲ１の発現をモニターするｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。結果は、１にセットされたＤＭＳＯによって得られたものに対して正規化された。図８Ｄは、ＥＰＺ６４３８の増大して行く濃度によって処置されたＦＸＳ−ｉＰＳＣにおいてＦＭＲ１発現をモニターするｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。
【図８Ｅ】図８Ｅは、ＥＰＺ６４３８追加（上）または休薬（下）に引き続いてＦＸＳ−ｉＰＳＣにおいてＦＭＲ１発現をモニターするｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。
【図８Ｆ】図８Ｆは、ＥＰＺ６４３８追加（上）または休薬（下）に引き続いてＦＸＳ−ｉＰＳＣにおいてＦＭＲ１プロモーターへのＤＮＭＴ１結合をモニターするＣｈＩＰ分析を示している。データは平均±ＳＤで表されている。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｄは、エピジェネティクス指向性ライブラリー（Life Chemicals）から、ＦＭＲ１を再活性化する追加の小分子阻害剤の同定を示している。図９Ａは、エピジェネティクス指向性ライブラリー（Life Chemicals）から得られたＦＭＲ１−ＳＦ阻害剤によって処置されたＦＸＳ−ｉＰＳＣにおいてＦＭＲ１発現をモニターするｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。
【図９ＢＣ】図９Ｂは、６つのポジティブな化合物のそれぞれについて再活性化曲線を示している。図９Ｃはポジティブな化合物の構造を示している。
【図９Ｄ】図９Ｄは、サイレンシングされたＦＭＲ１を再活性化する現在までに同定された全ての小分子阻害剤の概要を示している。データは平均±ＳＤで表されている。
【図１０ＡＢ】図１０Ａ〜１０Ｄは、ＦＭＲ１−ＳＦがＦＸＳ神経前駆細胞（ＮＰＣ）においてもまたＦＭＲ１のエピジェネティックなサイレンシングを媒介するということを示している。図１０Ａは、ＮＳまたはＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡを発現するＦＸＳ−ＮＰＣにおいてＦＭＲ１発現をモニターするｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。図１０Ｂは、ＮＳまたはＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡを発現するＦＸＳ−ＮＰＣにおけるＦＭＲＰレベルを示すイムノブロット分析を示している。２倍（５０％）、４倍（２５％）、および８倍（１２．５％）希釈された野生型ｉＰＳＣにおけるＦＭＲＰのレベルが示されている。チューブリンはローディングコントロールとしてモニターされた。
【図１０ＣＤ】図１０Ｃは、５−ａｚａ、ケトシン、ＥＰＺ６４３８、ＧＳＫ１２６、ＰＲＴ４１６５、またはコントロールとしてのＤＭＳＯによって処置されたＦＸＳ−ＮＰＣにおいてＦＭＲ１発現をモニターするｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。図１０Ｄは、５−ａｚａ、ケトシン、ＥＰＺ６４３８、ＧＳＫ１２６、またはＰＲＴ４１６５によって処置されたＦＸＳ−ＮＰＣにおけるＦＭＲＰレベルを示すイムノブロット分析を示している。野生型ｉＰＳＣのＦＭＲＰのレベルが示されている。データは平均±ＳＤで表されている。
【図１１ＡＢ】図１１Ａ〜１１Ｇは、ＦＭＲ１−ＳＦが有糸分裂後ＦＸＳニューロンにおいてもまたＦＭＲ１のエピジェネティックなサイレンシングを媒介するということを示している。図１１Ａは、ＦＸＳ８４８−ＮＰＣに由来する有糸分裂後ニューロンにおけるニューロンマーカーＭＡＰ２およびＮｅｕＮの発現を示す免疫蛍光を図示している。図１１Ｂは、有糸分裂後ニューロンにおける有糸分裂マーカーリン酸化Ｈ３を対象とする抗体による染色の欠如を示す画像を与えている。
【図１１ＣＤ】図１１Ｃは、ＮＳまたはＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡを発現するＦＸＳニューロンにおいてＦＭＲ１発現をモニターするｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。図１１Ｄは、ＮＳまたはＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡを発現するＦＸＳニューロンにおけるＦＭＲＰレベルを示すイムノブロット分析を示している。野生型ｉＰＳＣのＦＭＲＰのレベルが示されている。
【図１１ＥＦ】図１１Ｅは、５−ａｚａ、ケトシン、ＥＰＺ６４３８、ＧＳＫ１２６、ＰＲＴ４１６５、またはコントロールとしてのＤＭＳＯによって処置されたＦＸＳニューロンにおいてＦＭＲ１発現をモニターするｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。図１１Ｆは、５−ａｚａ、ケトシン、ＥＰＺ６４３８、ＧＳＫ１２６、またはＰＲＴ４１６５によって処置されたＦＸＳニューロンにおけるＦＭＲＰレベルを示すイムノブロット分析を示している。野生型ｉＰＳＣのＦＭＲＰのレベルが示されている。
【図１１Ｇ】図１１Ｇは、ＥＰＺ６４３８追加（上）または休薬（下）に引き続いてＦＸＳニューロンにおいてＦＭＲ１発現をモニターするｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。データは平均±ＳＤで表されている。
【図１２ＡＢ】図１２Ａ〜１２Ｆは、ＦＭＲ１再活性化が機能異常ＦＸＳニューロン表現型を正常化し得るということを示している。図１２Ａは、ＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡを発現するかまたはＦＭＲ１−ＳＦ阻害剤によって処置されたＦＸＳニューロンにおいてＲＥＳＴ発現をモニターするｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。野生型ニューロンのＦＭＲ１の発現が示されている。図１２Ｂは、ＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡを発現するかまたはＦＭＲ１−ＳＦ阻害剤によって処置されたＦＸＳニューロンにおいてＲＥＳＴ標的遺伝子ＲＯＢＯ３、ＳＬＩＴ１、およびＤＣＣの発現をモニターするｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。野生型ニューロンのそれぞれの遺伝子の発現が示されている。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡを発現するかまたはＦＭＲ１−ＳＦ阻害剤によるＦＸＳニューロンにおけるＦＭＲＰレベルを示すイムノブロット分析を示している。野生型ニューロンのＦＭＲＰのレベルが示されている。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、ＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡを発現するＦＸＳニューロンにおけるＴＵＪ１およびＦＭＲＰ染色を示す免疫蛍光を図示している。ＤＡＰＩ染色は青色で示されている。マージ画像が示されている。ＴＵＪ１染色の拡大画像が右に示されている。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、ＦＭＲ１−ＳＦ阻害剤によって処置されたＦＸＳニューロンにおけるＴＵＪ１およびＦＭＲＰ染色を示す免疫蛍光を図示している。ＤＡＰＩ染色が示されている。マージ画像が示されている。ＴＵＪ１染色の拡大画像が右に示されている。
【図１２Ｆ】図１２Ｆは、ＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡを発現するかまたはＦＭＲ１−ＳＦ阻害剤によって処置されたＦＸＳニューロンにおける神経突起の突起長の定量を示している。結果は、１にセットされた野生型ニューロンの神経突起の突起長に対して正規化された。データは平均±ＳＤで表されている。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
いくつかの側面において、本発明は、ＦＭＲ１不活性化に関連する異常（例えばＦＸＳ）を有する患者のエピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子に、より許容的なクロマチン状態を誘導することが、ＦＭＲ１の増大した発現と減少または後退した疾患症候とをもたらし得るという驚くべき発見に関する。いくつかの態様において、本開示によって記載される方法および組成物は、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって媒介されるノックダウンまたは小分子阻害剤によって、ＦＭＲ１遺伝子のエピジェネティックなサイレンシング因子を阻害する。いくつかの態様において、サイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子の再活性化は疾患症状を後退させると予想される。その上に、いくつかの態様において、前変異（５５〜２００個のＣＧＧリピート）の無症候性キャリア、および全変異を有するがＦＭＲ１がサイレンシングされていない稀な無症候性の個人は、正常な個人のものの〜２０％であるＦＭＲＰレベルを有する。それゆえに、いくつかの態様においては、ここで提供される方法に従うサイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子の控え目な再活性化でさえも、実質的な治療利益を有し得る。第２に、いくつかの態様において、ここで提供される方法を用いて脳の翻訳ホメオスタシスを回復または改善することは、ＦＸＳに関連する主症状を好転させ得る。いくつかの態様において、Ｆｍｒ１ＫＯマウスの脳における単なる１５％のタンパク質合成の上昇は疾患の表現型を促進し、総体的な翻訳を比較的小量低減することが臨床的に有益であろうということを示している。この観察と一致して、原核生物リボソームと、それ程ではないものの真核生物リボソームとに結合し、阻害するテトラサイクリン群の抗生物質、ミノサイクリンは、化合物によって処置されたＦＸＳ患者において控え目だがポジティブなアウトカムをもたらした。
【００２３】
従って、いくつかの側面において、本開示は、その必要がある対象のＦＭＲ１不活性化に関連する異常を処置するための方法を提供し、方法は、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの治療有効量を対象に投与することを含み、エピジェネティックなモジュレーターは対象のＦＭＲ１を再活性化する。
【００２４】
ＦＭＲ１不活性化に関連する異常
ここで用いられる用語「ＦＭＲ１不活性化に関連する異常」は、ＦＭＲ１遺伝子の転写不活性化からもたらされる疾患または異常を言う。一般的に、ＦＭＲ１遺伝子の不活性化は脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）の産生の喪失をもたらし、学習障害および認知障害、中程度から重度の精神遅滞、運動失調（例えば、協調の喪失）、振戦、記憶喪失、下肢の感覚の喪失（例えば、末梢ニューロパチー）、精神的および行動的変化、ならびに多嚢胞性卵巣症候群を包含する広範な発達問題を引き起こす。いくつかの態様において、ＦＭＲ１不活性化に関連する異常は脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）である。
【００２５】
ＦＸＳは、Ｘ連鎖したＦＭＲ１遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）内の多型ＣＧＧ配列の増幅によって引き起こされる。いずれかの特定の理論によって拘束されようとするものではないが、増幅したＣＧＧリピートを負ったＦＭＲ１遺伝子は、阻害性のヒストン修飾およびＤＮＡ過剰メチル化が原因で転写サイレンシングされるようになり、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）の欠如をもたらす。いくつかの態様において、ＦＭＲ１遺伝子は、ＦＭＲ１のｍＲＮＡの増幅したＣＧＧリピートとＦＭＲ１遺伝子の相補的なＣＧＧリピートとの間のｍＲＮＡ−ＤＮＡ二重螺旋（例えば「Ｒループ」）の形成が原因で、転写サイレンシングされるようになる。
【００２６】
ＦＸＳは精神的不全の最もよくある遺伝性の形態であり、自閉症の最も優勢な単因子性の原因であり、４，０００人の男性中〜１人、８，０００人の女性中１人に起こる。ＦＸＳの個人は、低いＩＱ、言語および発達遅延、注意欠陥異常、手のフラッピング、ならびに発作を包含する広範な症状を見せる。いくつかの態様において、症候群はＸ連鎖したＦＭＲ１遺伝子の５’非翻訳領域内のＣＧＧリピート増幅によって引き起こされる。増幅が２００リピート以上に達するときに、ＦＭＲ１は転写サイレンシングされる。いくつかの態様においては、帰結として、ＦＭＲ１の産物の脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）が産生されない。ＦＭＲＰは、正常では脳および他の組織におけるｍＲＮＡ翻訳を抑制するＲＮＡ結合タンパク質である。その不在下においてはタンパク質合成が過剰であり、これは疾患病理をもたらす。いくつかの態様において、ＦＭＲＰの欠如および上昇したタンパク質合成は原因としてシナプス弱化にリンクしており、これは長期抑圧（ＬＴＤ）として電気生理学的に測定される。いくつかの態様において、抑圧されたシナプス接続性は、神経回路機能異常ならびに学習および記憶などの高次認知機能の障害を引き起こす。
【００２７】
一般的に、ＦＭＲ１不活性化に関連する異常の重さは、対象のＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲ内に存在する多型ＣＧＧリピートの数によって分類され得る。増幅中のリピートの数は様々であり得る。いくつかの態様において、増幅中のＣＧＧリピートの数は約５５から約５００リピートの範囲である。いくつかの態様において、対象は「前変異」と言われ、ＣＧＧリピートの数は約５５リピートから約２００リピートの範囲である。前変異の対象は全変異状態への転換を受けやすく、それゆえに、正常アレルを有する（例えば６および５４個の間のＣＧＧリピートを有する）対象と比較してＦＸＳを発生する増大したリスクがある。いくつかの態様において、ＣＧＧリピートの数は２００リピート超であり、対象は「全変異」を有すると言われる。全変異の対象はＦＸＳを有する。いくつかの態様において、ＦＸＳを有する対象におけるＣＧＧリピートの数は約２０１から約５００リピートの範囲である。いくつかの態様において、ＣＧＧリピートの数は５００リピート超である。
【００２８】
典型的には、転写不活性な（例えば、サイレンシングされた）ＦＭＲ１遺伝子と結びついたいくつかのエピジェネティックマークがある（図１）。ここで用いられる用語「エピジェネティックマーク」は、遺伝暗号によって直接的には支配されない遺伝子の特徴または特質、例えばＤＮＡのメチル化およびヒストンタンパク質の共有結合的修飾を言う。一般的に、エピジェネティックマークはクロマチン状態を改変することによって遺伝子の発現に影響を及ぼす。エピジェネティックマークは活性化のマーク（例えば、遺伝子の発現を促進する）または抑制性のマーク（例えば、遺伝子の発現を阻害する）であり得る。
【００２９】
いくつかの側面において、本発明は、サイレンシングされたＦＭＲ１上にはいくつかの抑制性のマークの増大があるという発見に関する。サイレンシングされたＦＭＲ１上に検出される抑制性のマークの例は、ＤＮＡメチル化、ヒストンＨ３リジン２７トリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）、ヒストンＨ３リジン９トリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）、およびヒストンＨ４リジン２０トリメチル化（Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３）を包含するが、これに限定されない。いくつかの態様において、サイレンシングされたＦＭＲ１上にはヒストンＨ２Ａユビキチン化（Ｈ２Ａｕｂ）の増大がある。
【００３０】
いくつかの側面において、本発明は、サイレンシングされたＦＭＲ１においては活性化のマークの減少があるという発見に関する。サイレンシングされたＦＭＲ１上に一般的に検出されない活性化のマークの例は、ヒストン（Ｈ２Ａ／２Ｂ／３／４）アセチル化およびヒストンＨ３リジン４トリメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）を包含するが、これに限定されない。
【００３１】
いくつかの側面において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの有効量の投与は、対象のＦＭＲ１の再活性化をもたらす。ここで用いられる用語「ＦＭＲ１の再活性化」は、転写不活性な（例えば、サイレンシングされた）状態から転写活性な（例えば、発現された）状態へのＦＭＲ１遺伝子の状態の変化を言う。例えば、転写不活性な（例えば、サイレンシングされた）ＦＭＲ１遺伝子を有する対象（例えば、対象の細胞）は、ＦＭＲＰを欠く。対象（例えば、対象の細胞）のＦＭＲ１の再活性化はＦＭＲＰの発現および産生に至る。ＦＭＲ１の再活性化は、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターによる処置に先立つ検体におけるＦＭＲ１の発現レベルに対して、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターによる処置後の検体（例えば、細胞または対象）におけるＦＭＲ１の発現レベルとして測定され得る。ＦＭＲ１の再活性化は、当分野において公知のいずれかの好適な方法によって、例えばハイブリダイゼーションに基づくアッセイ（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット）、タンパク質に基づく方法（例えばウエスタンブロット）、分光法的方法（例えば質量分析）、核酸に基づく方法（例えば、バイサルファイトシーケンシング）、および細胞に基づく方法（例えば、フローサイトメトリー、蛍光セルソーティング（ＦＡＣＳ）、免疫蛍光）によって測定され得る。
【００３２】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーター
ここで用いられる用語「ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーター」は、ＦＭＲ１の転写活性を改変する薬を言う。例えば、いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターはＦＭＲ１の転写活性を増大させる。増大した転写活性は一般的に、ｍＲＮＡの増大した産生および／または増大したタンパク質翻訳（例えば、ＦＭＲＰの翻訳）をもたらす。いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターはＦＭＲ１のクロマチン状態を変化させる。エピジェネティックなモジュレーターはＦＭＲ１の転写活性を直接的に改変し得るか、またはＦＭＲ１遺伝子の発現および／もしくはエピジェネティックな状態を調節する別の因子（例えばタンパク質）と相互作用することによってＦＭＲ１転写活性を間接的に改変し得る。いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターは、ＦＭＲ１の転写活性を調節する別のタンパク質の発現レベルまたは活性（例えば機能）を阻害する。例えば、いくつかの態様において、サイレンシングされたＦＭＲ１はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）による増大したＤＮＡメチル化を有する。それゆえに、いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターはＤＮＭＴ１活性または発現を阻害する薬である。いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターは、核酸、ポリペプチド、小分子、または前述のいずれかの組み合わせであり得る。エピジェネティックなモジュレーターは、ここではエピジェネティックな修飾因子ともまた言われる。
【００３３】
細胞のクロマチン状態（例えば、ヒストンおよび非ヒストンタンパク質によるＤＮＡのパッケージング）は遺伝子発現に及ぼす有意な効果を有する。いくつかの態様において、本開示は、ノックダウンまたは阻害されたときに細胞（例えば、ニューロン細胞またはｉＰＳＣ）のＦＭＲ１遺伝子の発現を活性化するクロマチン修飾因子に関する。いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターはかかるクロマチン修飾因子を標的化する。ここで用いられる用語「クロマチン修飾因子」は、ＤＮＡを修飾するか（例えば、メチル化による）またはヒストンタンパク質を翻訳後修飾し（例えば、リン酸化、アセチル化、メチル化、もしくはユビキチン化による）、クロマチン構造の改変と、それゆえに改変された遺伝子発現とをもたらす物質（例えば、酵素または転写因子）を言う。クロマチン修飾因子の例は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンユビキチンリガーゼ、およびヒストンアセチルトランスフェラーゼを包含するが、これに限定されない。クロマチン修飾因子のさらなる例が図２に示されている。
【００３４】
ここで用いられる用語「ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ」は、ＤＮＡへのメチル基の転移を触媒する酵素を言う。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの例はＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、およびＤＮＭＴ３Ｂを包含するが、これに限定されない（図２）。いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤である。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの小分子阻害剤の例が表１に示されている。
【００３５】
ここで用いられる用語「ヒストンメチルトランスフェラーゼ」は、ヒストンタンパク質へのメチル基の転移を触媒する酵素を言う。ヒストンメチルトランスフェラーゼの例は、ＥＺＨ２、ＳＥＴＤＢ１、ＥＨＭＴ１／ＧＬＰ、ＥＨＭＴ２／Ｇ９ａ、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ１、およびＳＵＶ４２０Ｈ２を包含するが、これに限定されない（図２）。いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターはヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤である。ヒストンメチルトランスフェラーゼの小分子阻害剤の例が表１に示されている。
【００３６】
ここで用いられる用語「ヒストンユビキチンリガーゼ」は、ユビキチンをローディングされたＥ２ユビキチン結合酵素をリクルートメントし、タンパク質基質（例えば、ヒストンタンパク質）を認識し、Ｅ２からタンパク質基質（例えばヒストンタンパク質）へのユビキチンの転移を助けるかまたは直接的に触媒する酵素を言う。いくつかの態様において、本開示はＥ３ユビキチンリガーゼ酵素の阻害剤に関する。Ｅ３ユビキチンリガーゼは一般的に４つのファミリーに分けられる（ＨＥＣＴ、ＲＩＮＧフィンガー、Ｕボックス、およびＰＨＤフィンガー）。いくつかの態様において、本開示はＲＩＮＧユビキチンリガーゼ酵素の阻害剤に関する。いくつかの態様において、本開示はヒストン２Ａ（Ｈ２Ａ）ユビキチンリガーゼ酵素（例えばＲＩＮＧ１Ｂ／ＲＮＦ２）の阻害剤に関する。ユビキチンリガーゼ酵素の小分子阻害剤の例が表１に示されている。
【００３７】
【表１】
2018528968.tif 000003
【００３８】
ここで用いられる用語「ヒストンアセチルトランスフェラーゼ」は、ヒストンタンパク質上の保存されたリジン残基へのアセチル基の転移を触媒する酵素を言う。一般的に、ヒストンアセチル化は活性なエピジェネティックマーカーとして機能する。いくつかの側面において、本発明は、ヒストンアセチル化が、サイレンシングされたＦＭＲ１では低減されているという発見に関する。それゆえに、いくつかの側面において、本発明は、ヒストンアセチル化の阻害因子を阻害するＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターに関する。例えば、ヒストンデアセチラーゼはヒストンタンパク質からアセチル基を除去する。ヒストンデアセチラーゼの例は、ヒストンデアセチラーゼ１〜１０（ＨＤＡＣ１〜ＨＤＡＣ１０）、サーチュイン１〜７（ＳＩＲＴ１〜７）、およびリジン特異的デメチラーゼ５Ａ〜５Ｄ（ＫＤＭ５Ａ〜Ｄ）を包含するが、これに限定されない（図２）。いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターはヒストンデアセチラーゼの阻害剤である。ヒストンデアセチラーゼの小分子阻害剤の例は表１に示されている。
【００３９】
いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターは選択的阻害剤である。ここで用いられる「選択的阻害剤」または「選択的に阻害する」と言われる阻害剤は、特定のクラスの標的分子の活性または発現を、クラスの他の分子と比較して選好的に阻害する阻害剤を言う。いくつかの態様において、特定のクラスの標的分子の選択的阻害剤は、クラスの１つ以上の他のメンバーに対するＩＣ５０よりも少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い標的分子に対する半数阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。選択的阻害剤は、メチルトランスフェラーゼ（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼもしくはヒストンメチルトランスフェラーゼ）、ヒストンユビキチンリガーゼ（例えば、ヒストンＨ２Ａをユビキチン化するユビキチンリガーゼ）、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ、ＳＩＲＴ５）、またはヒストンデメチラーゼ（例えば、ＫＤＭ５Ｄ）の阻害剤であり得る。
【００４０】
いくつかの態様において、選択的阻害剤はＤＮＡメチルトランスフェラーゼを選択的に阻害する。いくつかの態様において、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼであるＤＮＭＴ１の選択的阻害剤は、１つ以上の他のＤＮＡメチルトランスフェラーゼに対するＩＣ５０よりも少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低いＤＮＭＴ１に対する半数阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。しかしながら、いくつかの態様において、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害剤はクラスのいずれか１つの特定のメンバーに選択的ではなく、むしろ１つよりも多くのメンバーを標的化、例えばＤＮＡメチルトランスフェラーゼの汎阻害剤として機能する。
【００４１】
いくつかの態様において、選択的阻害剤はヒストンメチルトランスフェラーゼを選択的に阻害する。いくつかの態様において、ヒストンメチルトランスフェラーゼはＳＵＶ３９Ｈ１である。いくつかの態様において、ヒストンメチルトランスフェラーゼはＥＰＺ２である。いくつかの態様において、ＳＵＶ３９Ｈ１の選択的阻害剤は、１つ以上の他のヒストンメチルトランスフェラーゼに対するＩＣ５０よりも少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低いＳＵＶ３９Ｈ１に対する半数阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。いくつかの態様において、ＥＰＺ２の選択的阻害剤は、１つ以上の他のヒストンメチルトランスフェラーゼに対するＩＣ５０よりも少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低いＥＰＺ２に対する半数阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。しかしながら、いくつかの態様において、ヒストンメチルトランスフェラーゼの阻害剤はクラスのいずれか１つの特定のメンバーに選択的ではなく、むしろ１つよりも多くのメンバーを標的化、例えばヒストンメチルトランスフェラーゼの汎阻害剤として機能する。
【００４２】
いくつかの態様において、選択的阻害剤はヒストンユビキチンリガーゼを選択的に阻害する。いくつかの態様において、ヒストンユビキチンリガーゼであるＲＩＮＧ１Ｂ／ＲＮＦ２の選択的阻害剤は、１つ以上のヒストンユビキチンリガーゼに対するＩＣ５０よりも少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低いＲＩＮＧ１Ｂ／ＲＮＦ２に対する半数阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。しかしながら、いくつかの態様において、ヒストンユビキチンリガーゼの阻害剤はクラスのいずれか１つの特定のメンバーに選択的ではなく、むしろ１つよりも多くのメンバーを標的化、例えばヒストンユビキチンリガーゼの汎阻害剤として機能する。
【００４３】
いくつかの態様において、選択的阻害剤はヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣまたはＳＩＲＴ５）を選択的に阻害する。いくつかの態様において、ヒストンデアセチラーゼであるＨＤＡＣ５の選択的阻害剤は、１つ以上のヒストンデアセチラーゼに対するＩＣ５０よりも少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低いＨＤＡＣ５に対する半数阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。いくつかの態様において、ヒストンデアセチラーゼであるＨＤＡＣ１０の選択的阻害剤は、１つ以上のヒストンデアセチラーゼに対するＩＣ５０よりも少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低いＨＤＡＣ１０に対する半数阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。いくつかの態様において、ヒストンデアセチラーゼであるＳＩＲＴ５の選択的阻害剤は、１つ以上のヒストンデアセチラーゼに対するＩＣ５０よりも少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低いＳＩＲＴ５に対する半数阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。しかしながら、いくつかの態様において、ヒストンデアセチラーゼの阻害剤はクラスのいずれか１つの特定のメンバーに選択的ではなく、むしろ１つよりも多くのメンバーを標的化、例えばヒストンデアセチラーゼの汎阻害剤として機能する。
【００４４】
いくつかの態様において、選択的阻害剤はヒストンデメチラーゼを選択的に阻害する。いくつかの態様において、ヒストンデメチラーゼであるＫＤＭ５ＤまたはＫＤＭ５Ｃの選択的阻害剤は、１つ以上の他のヒストンデメチラーゼに対するＩＣ５０よりも少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低いＫＤＭ５ＤまたはＫＤＭ５Ｃに対する半数阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。しかしながら、いくつかの態様において、ヒストンデメチラーゼの阻害剤はクラスのいずれか１つの特定のメンバーに選択的ではなく、むしろ１つよりも多くのメンバーを標的化、例えばヒストンデメチラーゼの汎阻害剤として機能する。
【００４５】
いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターは干渉ＲＮＡである。干渉ＲＮＡの例は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を包含するが、これに限定されない。阻害性オリゴヌクレオチドは遺伝子発現、転写、および／または翻訳に干渉し得る。一般的に、阻害性オリゴヌクレオチドは相補性の領域によって標的ポリヌクレオチドに結合する。例えば、標的ポリヌクレオチドへの阻害性オリゴヌクレオチドの結合は、（ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどのケースにおいては）標的ポリヌクレオチドのＲＮＡｉ経路によって媒介される分解の引き金になり得るか、または翻訳機構をブロックし得る（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）。阻害性オリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であり得る。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡからなる群から選択される。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは修飾核酸である。
【００４６】
用語「ヌクレオチドアナログ」または「改変ヌクレオチド」または「修飾ヌクレオチド」は、天然に存在しないリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを包含する非標準的なヌクレオチドを言う。いくつかの態様において、ヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドのある種の化学特性を改変しながらも、その意図される機能を実行するヌクレオチドアナログの能力を保持するように、いずれかの位置において修飾されている。誘導体化され得るヌクレオチドの位置の例は、５位、例えば５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン、５−プロピンウリジン、５−プロペニルウリジンなど；６位、例えば６−（２−アミノ）プロピルウリジン；アデノシンおよび／またはグアノシンの８位、例えば８−ブロモグアノシン、８−クロログアノシン、８−フルオログアノシンなどを包含する。ヌクレオチドアナログは、デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシン；ＯおよびＮ修飾（例えばアルキル化、例えばＮ６−メチルアデノシン、または当分野において別様に公知の）ヌクレオチド；ならびに他のヘテロ環修飾されたヌクレオチドアナログ、例えばHerdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug. 10(4):297-310に記載されているものをもまた包含する。
【００４７】
ヌクレオチドアナログはヌクレオチドの糖部分の修飾をもまた含み得る。例えば、２’ＯＨ基はＨ、ＯＲ、Ｒ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＯＯＲ、またはＯＲから選択される基によって置き換えられ得、式中、Ｒは置換または無置換Ｃ．ｓｕｂ．１−Ｃ．ｓｕｂ．６アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールなどである。他の可能な修飾は、U.S.Pat.No.5,858,988および6,291,438に記載されているものを包含する。多くの場合にインアクセシブルＲＮＡと言われるロックド核酸（ＬＮＡ）は修飾ＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は２’酸素および４’炭素を接続する余分の架橋によって修飾されている。
【００４８】
ヌクレオチドのリン酸基もまた、例えばリン酸基の酸素の１つ以上を硫黄によって置換することによって（例えば、ホスホロチオエート）、またはヌクレオチドがその意図される機能を実行することを許す他の置換をすることによって修飾され得、例えば、例えばEckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Apr. 10(2): 117-21、Rusckowski et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Oct. 10(5): 333-45、Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Oct. 11(5): 317-25、Vorobjev et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Apr. 11(2): 77-85、およびU.S.Pat.No.5,684,143に記載されている。上で参照されている修飾のある種のもの（例えば、リン酸基修飾）は、好ましくは、インビボまたはインビトロにおいて例えば前記アナログを含むポリヌクレオチドの加水分解の速度を減少させる。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは阻害性の修飾オリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、阻害性の修飾オリゴヌクレオチドはロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエートバックボーン、および／または２’−ＯＭｅ修飾を含む。下の表２は、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターである干渉ＲＮＡの例を提供している。
【００４９】
【表２】
2018528968.tif 000004
【００５０】
処置の方法
いくつかの側面において、本開示は、ＦＭＲ１不活性化に関連する異常を有する対象を処置するための方法を提供する。例えば、ＦＭＲ１遺伝子の転写不活性化は対象のＦＸＳに至り得る。ここで用いられる「対象」は「その必要がある対象」と交換可能であり、この両方は、ＦＭＲ１不活性化に関連する異常を有する対象、または母集団全般に対してかかる異常を発生する増大したリスクを有する対象を言い得る。その必要がある対象は、不活性なＦＭＲ１遺伝子を有する対象であり得る。対象はヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、猫、犬、または他の哺乳動物であり得る。いくつかの態様において、ＦＭＲ１不活性化に関連する異常は脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群、早発性の卵巣老化、または多嚢胞性卵巣症候群である。
【００５１】
ここで用いられる用語「処置」、「処置する」、および「治療」は、治療処置および予防的もしくは防止的操作を言う。用語は、さらに、既存の症状を好転させること、追加の症状を防止すること、症状の底にある原因を好転させるかまたは防止すること、症状、例えばＦＭＲ１不活性化に関連する異常に関連する症状の原因を防止するかまたは後退させることを包含する。それゆえに、用語は、有益な結果が、異常（例えば、ＦＭＲ１不活性化に関連する異常）を有するかまたはかかる異常を発生するポテンシャルを有する対象に授けられたということを意味する。さらにその上に、用語「処置」は、疾患、疾患の症状、または疾患に対する易罹患性を治癒する、癒す、緩和する、軽減する、改変する、治す、好転させる、改善する、またはそれに影響する目的による、疾患、疾患の症状、または疾患に対する易罹患性を有し得る対象または対象からの単離された組織もしくは細胞株への薬（例えば、治療薬または治療組成物）の適用または投与として定義される。
【００５２】
治療薬または治療組成物は、特定の疾患（例えば、ＦＭＲ１不活性化に関連する異常）の症状を防止および／または低減する医薬的に許容される形態の化合物を包含し得る。例えば、治療組成物は、ＦＭＲ１不活性化に関連する異常の症状を防止および／または低減する医薬組成物であり得る。本発明の治療組成物はいずれかの好適な形態で提供されるであろうということが企図される。治療組成物の形態は、本願に記載される投与モードを包含するいくつもの因子に依存するであろう。治療組成物は本願に記載される他の成分のなかでも希釈剤、アジュバント、および賦形剤を含有し得る。
【００５３】
いくつかの側面において、本開示は、細胞の転写不活性なＦＭＲ１遺伝子を再活性化ための方法を提供し、方法は、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの有効量と細胞を接触させることを含み、エピジェネティックなモジュレーターは細胞のＦＭＲ１を再活性化する。いくつかの態様において、細胞はインビトロである。
【００５４】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの有効量と接触させられる細胞は、転写不活性なＦＭＲ１遺伝子を有するいずれかの細胞であり得る。例えば、細胞は脳細胞、精巣細胞、卵巣細胞、脾臓細胞、胸腺細胞、または眼細胞であり得る。いくつかの態様において、細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。転写不活性なＦＭＲ１遺伝子を有する細胞は、一般的には、転写不活性な（例えば、エピジェネティックにサイレンシングされた）ＦＭＲ１遺伝子を有することの指標である１つ以上のエピジェネティックマークを負っている。エピジェネティックマークは、活性化のマーク、抑制性のマーク、または活性化のマークおよび抑制性のマークであり得る。転写不活性なＦＭＲ１遺伝子と結びついたエピジェネティックな抑制性のマークの例は、ＤＮＡメチル化（ＤＮＡｍｅ）、ヒストンＨ３リジン２７トリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）、ヒストンＨ３リジン９トリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）、ヒストン４リジン２０トリメチル化（Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３）、ヒストンＨ２Ａユビキチン化（Ｈ２Ａｕｂ）を包含する。転写不活性なＦＭＲ１上において低減されたレベルで見出される活性化のエピジェネティックマークの例は、ヒストンＨ２ａアセチル化、ヒストンＨ２Ｂアセチル化、ヒストンＨ３アセチル化、ヒストンＨ４アセチル化、およびヒストンＨ３リジン４トリメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）を包含する。
【００５５】
転写不活性なＦＭＲ１遺伝子を有する細胞は、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲ内の多型ＣＧＧリピートの増幅をもまた含み得る。増幅中のリピートの数は様々であり得る。いくつかの態様において、増幅中のＣＧＧリピートの数は約５５から約５００リピートの範囲である。いくつかの態様において、ＣＧＧリピートの数は約５５リピートから約２００リピートの範囲である。いくつかの態様において、ＣＧＧリピートの数は約１００から約５００リピートの範囲である。いくつかの態様において、ＣＧＧリピートの数は２００リピート超である。いくつかの態様において、ＣＧＧリピートの数は５００リピート超である。
【００５６】
医薬組成物
いくつかの側面において、本開示は、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターを含む医薬組成物に関する。いくつかの態様において、組成物はＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターと医薬的に許容されるキャリアとを含む。ここで用いられる用語「医薬的に許容されるキャリア」は、医薬投与と適合性のいずれかおよび全ての溶媒、分散媒質、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤、ならびに同類を包含することが意図される。医薬活性物質へのかかる媒質および薬剤の使用は当分野において周知である。いずれかの従来の媒質または薬剤が活性化合物と非適合性である限りを除いて、組成物へのその使用は企図される。補足の活性化合物もまた組成物中に組み込まれ得る。医薬組成物は下に記載されているように調製され得る。活性成分は、いずれかの従来の医薬的に許容されるキャリアまたは賦形剤に混ぜられるかまたはそれと調合され得る。組成物は無菌であり得る。
【００５７】
典型的には、医薬組成物は、薬（例えば、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーター）の有効量を送達するために製剤される。一般的に、活性薬の「有効量」は、所望の生物学的応答（例えば、不活性なＦＭＲ１遺伝子の再活性化）を誘発するために十分な量を言う。薬の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、化合物の薬物動態、処置されようとする疾患（例えば、ＦＭＲ１不活性化に関連する異常）、投与モード、および患者などの因子に依存して様々であり得る。
【００５８】
組成物は、その投与がレシピエントの患者によって忍容され得る場合には「医薬的に許容されるキャリア」であると言われる。無菌のリン酸緩衝食塩水は医薬的に許容されるキャリアの１つの例である。他の好適なキャリアは当分野において周知である。例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Ed. (1990)参照。
【００５９】
活性薬に対して不活性であり、かつ従来使用されているいずれかの投与モード、基剤、またはキャリアが、本開示の医薬組成物を調製および投与するために利用され得るということは当業者によって理解されるであろう。例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 4th ed. (1970)に記載されているものはかかる方法、基剤、およびキャリアの実例であり、その開示は参照によって本願に組み込まれる。本開示の原理に触れた当業者は、好適および適切な基剤、賦形剤、およびキャリアを決定する上で、またはそれを活性成分と調合して本開示の医薬組成物を形成する上で困難を感じないであろう。
【００６０】
化合物（例えば、アンチセンス核酸（例えばオリゴヌクレオチド）または小分子のＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーター）の有効量は、治療有効量ともまた言われ、かかる調節の必要がある細胞または個人において遺伝子の不活性化（例えば転写不活性化）または低減された発現に関連する少なくとも１つの有害な効果を好転させるために十分な量である。いくつかの態様において、有効量は、ＦＭＲ１再活性化の必要がある細胞または個人のＦＭＲ１遺伝子を再活性化するために十分な量である。医薬組成物中に包含されるべき治療有効量は、それぞれのケースにおいて、いくつかの因子、例えば、処置されようとする患者の型、サイズ、および状態、意図される投与モード、意図される剤形を組み込む患者の受容能力などに依存する。一般的に、活性薬の量は、約０．１から約２５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１から約１００ｍｇ／ｋｇを提供するようにそれぞれの剤形中に包含される。当業者は、適切な治療有効量を経験的に決定する能力があるであろう。
【００６１】
ここで提供される教示と組み合わせて、種々の活性化合物および検討因子、例えば力価、相対的なバイオアベイラビリティー、患者体重、有害な副作用の重さ、および選択される投与モードから選ぶことによって、実質的な毒性を引き起こさず、それでも特定の対象を処置するために全く有効である有効な予防または治療処置レジメンが計画され得る。いずれかの特定の適用のための有効量は、処置されようとする疾患もしくは状態、投与されようとする特定の治療薬、対象のサイズ、または疾患もしくは状態の重さなどの因子に依存して様々であり得る。当業者は、過度の実験作業を要することなしに、特定の核酸および／または他の治療薬の有効量を経験的に決定し得る。
【００６２】
いくつかのケースにおいて、本開示の化合物はコロイド分散系に調製される。コロイド分散系は、水中油滴エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを包含する脂質に基づく系を包含する。いくつかの態様において、本開示のコロイド系はリポソームである。リポソームは人工の膜ベッセルであり、それらはインビボまたはインビトロの送達ベクターとして有用である。サイズが０．２〜４．０μｍの範囲である大型一枚膜ベシクル（ＬＵＶ）が大きい高分子をカプセル化し得るということが示されている。ＲＮＡ、ＤＮＡ、および完全なビリオンは水系の内部にカプセル化され、生物学的に活性な形態で細胞に送達され得る。Fraley et al. (1981) Trends Biochem Sci 6:77.
【００６３】
リポソームは、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、またはタンパク質などの特異的リガンドにリポソームをカップリングすることによって、特定の組織に標的化され得る。リポソームを例えば平滑筋細胞に標的化することにとって有用であり得るリガンドは、癌細胞の細胞表面マーカーと相互作用する抗体などの、平滑筋細胞特異的受容体および分子と相互作用する完全な分子または断片を包含するが、これに限定されない。かかるリガンドは当業者に周知の結合アッセイによって容易に同定され得る。尚他の態様において、リポソームは、当分野において公知の抗体にそれをカップリングすることによって組織に標的化され得る。
【００６４】
トランスフェクションのための脂質製剤はQIAGENから例えばEFFECTENE（商標）（特殊なＤＮＡ凝縮エンハンサーを有する非リポソーム系脂質）およびSUPERFECT（商標）（新規作用のデンドリマーテクノロジー）として市販されている。
リポソームはGibco BRLから例えばLIPOFECTIN（商標）およびLIPOFECTACE（商標）として市販されており、それらはＮ−［１−（２，３ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）などのカチオン性脂質から形成されている。リポソームを作るための方法は当分野において周知であり、多くの刊行物に記載されている。リポソームはGregoriadis G (1985) Trends Biotechnol 3:235-241によってもまた概説されている。
特にＮ−［１−（２，３ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート（ＤＯＴＡＰ）を包含するある種のカチオン性脂質は、本開示のＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーター（例えば干渉ＲＮＡ）と組み合わされるときに有利であり得る。
【００６５】
本開示のいくつかの側面においては、コンパクション剤の使用もまた望ましくあり得る。コンパクション剤は、単独で、または生物学的もしくは化学的／物理的ベクターとの組み合わせでもまた用いられ得る。ここで用いられる「コンパクション剤」は、核酸上の負電荷を中和し、それによって微粒子への核酸のコンパクションを可能にするヒストンなどの物質を言う。核酸のコンパクションは標的細胞による核酸の取り込みを容易化する。コンパクション剤は、例えば細胞によってより効率的に取り込まれる形態のＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターを送達するために単独で、または上に記載されているキャリアの１つ以上との組み合わせで用いられ得る。
【００６６】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの取り込みを容易化するために用いられ得る他の例示的な組成物は、リン酸カルシウムおよび細胞内輸送の他の化学的メディエータ、マイクロインジェクション組成物、エレクトロポレーションおよび相同組換え組成物（例えば、標的細胞の染色体内の予め選択された場所に核酸をインテグレーションするため）を包含する。
化合物は、単独で（例えば、食塩水もしくは緩衝液中で）、または当分野において公知のいずれかの送達基剤を用いて投与され得る。例えば、次の送達基剤が記載されている：コクリエート（cochleate）、Emulsome、ＩＳＣＯＭ、リポソーム、生菌ベクター（例えば、サルモネラ、大腸菌、カルメット・ゲラン桿菌、赤痢菌、ラクトバシラス）、生ウイルスベクター（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、単純ヘルペス）、マイクロスフェア、核酸ワクチン、ポリマー（例えば、カルボキシメチルセルロース、キトサン）、ポリマーリング、プロテアソーム（proteosome）、フッ化ナトリウム、トランスジェニック植物、ビロソーム、およびウイルス様粒子。
【００６７】
本開示の製剤は医薬的に許容される溶液中で投与され、これは慣例的には塩、緩衝剤、保存料、適合性のキャリア、アジュバント、および任意に他の治療成分の医薬的に許容される濃度を含有し得る。
用語医薬的に許容されるキャリアは、ヒトまたは他の脊椎動物への投与にとって好適である１つ以上の適合性の固体もしくは液体フィラー、希釈剤、またはカプセル化物質を意味する。用語キャリアは、適用を容易化するために活性成分が組み合わされる天然または合成の有機または無機成分を意味する。医薬組成物の成分は、所望の医薬効率を実質的に損なうであろう相互作用がないような様式で、本開示の化合物とおよび互いと混ぜ合わせられることもまたできる。
【００６８】
糖衣錠コアは好適なコーティングを備える。この目的のためには、濃縮糖溶液が用いられ得、これは任意にアラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。同定のために、または活性化合物の用量の異なる組み合わせをキャラクタリゼーションするために、染料または顔料が錠剤または糖衣錠コーティングに追加され得る。
本願に記載される製剤に加えて、化合物はデポ剤調製物としてもまた製剤され得る。かかる持続性製剤は、好適なポリマー性または疎水性材料（例えば、許容される油中エマルションとして）もしくはイオン交換樹脂によって、または難溶解性の誘導体として、例えば難溶解性の塩として製剤され得る。
【００６９】
医薬組成物は、好適な固体またはゲル相キャリアまたは賦形剤をもまた含み得る。かかるキャリアまたは賦形剤の例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーを包含するが、これに限定されない。
例えば、好適な液体または固体医薬調製物形態は、吸入のための水系もしくは食塩水溶液であるか、マイクロカプセル化されるか、コクリエート化（encochleate）されるか、微視的な金粒子上にコーティングされるか、リポソーム中に含有されるか、ネブライゼーションされるか、エアロゾルであるか、皮膚へのインプラントのためのペレットであるか、または鋭利な物体上に乾燥されて皮膚に刻み込まれる。医薬組成物は、顆粒、粉末、錠剤、コーティング錠剤、（マイクロ）カプセル、座薬、シロップ、エマルション、懸濁液、クリーム、点薬、または活性化合物の長引く放出を有する調製物をもまた包含し、その調製においては、賦形剤ならびに添加剤および／または助剤、例えば崩壊剤、バインダー、コーティング剤、膨潤剤、滑剤、香料、甘味料、もしくは可溶化剤が上に記載されているように習慣的に用いられる。医薬組成物は種々の薬物送達系への使用にとって好適である。薬物送達のための方法の簡略な総説は、Langer R (1990) Science 249: 1527-1533参照。これは参照によって本願に組み込まれる。
【００７０】
化合物は、そのまま（per se）で（ニート（neat）で）または医薬的に許容される塩の形態で投与され得る。医薬品に用いられるときに、塩は医薬的に許容されるべきであるが、便利には、医薬的に許容されない塩はその医薬的に許容される塩を調製するために用いられ得る。かかる塩は次の酸から調製されるものを包含するが、これに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。かかる塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、例えばカルボン酸基のナトリウム、カリウム、またはカルシウム塩としてもまた調製され得る。
好適な緩衝剤は、酢酸および塩（１〜２％ｗ／ｖ）、クエン酸および塩（１〜３％ｗ／ｖ）、ホウ酸および塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）、ならびにリン酸および塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）を包含する。好適な保存料は、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）、クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）、パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）、およびチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）を包含する。
【００７１】
組成物は、便利には単位剤形で与えられ得、薬学の分野において周知の方法のいずれかによって調製され得る。全ての方法は、１つ以上の補助的成分を構成するキャリアと化合物を結びつけるステップを包含する。一般的に、組成物は、液体キャリア、細分された固体キャリア、または両方と化合物を均一かつ密接に結びつけることと、それから、必要な場合には産物を成形することとによって調製される。液体剤形はバイアルまたはアンプルである。固体剤形は錠剤、カプセル、および座薬である。
【００７２】
投与モード
好ましくは、本開示の医薬組成物は、化合物または混合物を錠剤、カプセル、もしくは丸薬として経口で、または非経口で、静脈内で、皮内で、筋肉内で、もしくは皮下で、もしくは経皮で投与可能にすることにとって好適な医薬的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含有する。
いくつかの態様においては、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの治療有効量が標的組織または標的細胞に送達される。一般的に、ＦＭＲ１はヒト胚において広く発現している。それゆえに、いくつかの態様においては、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの治療有効量が対象の脳、精巣、卵巣、食道、上皮、胸腺、眼、および／または脾臓に送達される。いくつかの態様においては、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの有効量が対象の中枢神経系（ＣＮＳ）に送達される。いくつかの態様においては、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの有効量が対象のニューロン細胞、例えば分化したニューロン細胞に送達される。分化したニューロン細胞の例は、運動ニューロン、感覚ニューロン、末梢ニューロン、介在ニューロン、プルキンエ細胞、顆粒細胞、三極性ニューロン、ピラミッド型細胞、シャンデリア細胞、スピンドルニューロン、星状細胞、バスケット細胞、神経節細胞、および有毛細胞を包含するが、これに限定されない。
【００７３】
ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターおよび／または他の化合物を含有する医薬組成物は、薬物を投与するためのいずれかの好適な経路によって投与され得る。種々の投与経路が利用可能である。選択される特定のモードは、当然のことながら、選択される特定の薬（単数または複数）、処置されようとする特定の状態、および治療効能のために要求される薬量に依存するであろう。本開示の方法は、一般的な話として、医学的に許容されるいずれかの投与モード（臨床的に許容されない有害な効果を引き起こすことなしに治療効果を生ずるいずれかのモードを意味する）を用いて実施され得る。種々の投与モードがここで論じられる。治療への使用のためには、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターおよび／または他の治療薬の有効量は、薬を所望の表面に送達するいずれかのモード、例えば粘膜、全身によって対象に投与され得る。
【００７４】
本開示の医薬組成物を投与することは、当業者に公知のいずれかの手段によって達成され得る。投与の経路は経口、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、皮下、経眼、膣内、および直腸を包含するが、これに限定されない。全身経路は経口および非経口を包含する。デバイスのいくつかの型は吸入による投与のために通例用いられている。デバイスのそれらの型は、定量噴霧式吸入器（ＭＤＩ）、吸気作動式ＭＤＩ、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、ＭＤＩとの組み合わせでのスペーサー／ホールディングチャンバー、およびネブライザーを包含する。
【００７５】
経口投与のためには、化合物は、活性化合物（単数または複数）を当分野において周知の医薬的に許容されるキャリアと組み合わせることによってすぐに製剤され得る。かかるキャリアは、本開示の化合物が処置されるべき対象による経口摂取のための錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液、および同類として製剤されることを可能にする。経口使用のための医薬調製物は固体賦形剤として得られ得、任意に、所望の場合には錠剤または糖衣錠コアを得るために、好適な助剤を追加した後に、もたらされる混合物を砕き、顆粒の混合物を加工する。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、もしくはソルビトールを包含する糖などのフィラー；例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、馬鈴薯デンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース調製物、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望の場合には、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムが追加され得る。任意に、経口製剤は、食塩水もしくは体内の酸性条件を中和するための緩衝液中でもまた製剤され得るか、またはいずれかのキャリアなしで投与され得る。
【００７６】
経口的に用いられ得る医薬調製物は、ゼラチンから作られたプッシュフィットカプセル、およびゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤とから作られた密封ソフトカプセルを包含する。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどのフィラー、デンプンなどのバインダー、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、ならびに任意に安定化剤と混ざった活性成分を含有し得る。ソフトカプセルにおいては、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解または懸濁され得る。加えて、安定化剤が追加され得る。経口投与のために製剤されたマイクロスフェアもまた用いられ得る。かかるマイクロスフェアは当分野において良く定義されている。経口投与のための全ての製剤はかかる投与にとって好適な薬量であるべきである。
バッカル投与のためには、組成物は従来の様式で製剤された錠剤またはトローチの形態をとり得る。
【００７７】
吸入による投与のためには、本開示に従う使用のための化合物は、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー形式の形態で、好適なプロペラント、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適な気体の使用によって便利に送達され得る。加圧エアロゾルのケースにおいては、薬量単位は、定量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。化合物と好適な粉末基剤、例えばラクトースまたはデンプンとの粉末ミックスを含有する、吸入器またはインサフレーターへの使用のための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジが製剤され得る。
【００７８】
化合物は、それらを全身送達することが望ましい場合には、注射による、例えばボーラス注射または連続輸液による非経口投与のために製剤され得る。注射のための製剤は、追加される保存料を有する単位剤形で、例えばアンプルで、またはマルチドーズ容器で与えられ得る。組成物は、油系または水系基剤中の懸濁液、溶液、またはエマルションなどの形態をとり得、懸濁、安定化、および／または分散剤などの製剤用薬剤を含有し得る。
【００７９】
非経口投与のための医薬製剤は、水溶性の形態の活性化合物の水系溶液を包含する。加えて、活性化合物の懸濁液は適切な油系注射懸濁液として調製され得る。好適な親油性溶媒または基剤は、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームを包含する。水系注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有し得る。任意に、懸濁液は、好適な安定化剤、または化合物の溶解性を増大させて高濃縮溶液の調製を許す薬剤をもまた含有し得る。
代替的に、活性化合物は、使用前の好適な基剤、例えば無菌のパイロジェン不含水による戻しのための粉末形態であり得る。
【００８０】
化合物は、例えばココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を含有する座薬または停留浣腸などの直腸または膣内組成物にもまた製剤され得る。
他の送達系は、時間放出、遅延放出、または持続放出送達系を包含し得る。かかる系は化合物の繰り返しの投与を回避し得、対象および医師の便宜を増大させる。放出送達系の多くの型が利用可能であり、当業者に公知である。それらは、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ酸無水物などのポリマーベース系を包含する。薬物を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルは例えばU.S.Pat.No.5,075,109に記載されている。送達系は非ポリマー系をもまた包含し、それらは、ステロール、例えばコレステロール、コレステロールエステル、および脂肪酸、または中性脂肪、例えばモノ、ジ、およびトリグリセリドを包含する脂質；ハイドロゲル放出系；シラスティック系；ペプチドに基づく系；ワックスコーティング；従来のバインダーおよび賦形剤を用いる圧縮錠剤；部分癒合インプラント；ならびに同類である。具体的な例は、（ａ）本開示の薬がマトリックス中の形態で含有される浸食型の系、例えばU.S.Pat.No.4,452,775、4,675,189、および5,736,152に記載されているもの、ならびに（ｂ）活性成分がコントロールされた速度でポリマーから透過する拡散型の系、例えばU.S.Pat.No.3,854,480、5,133,974、および5,407,686に記載されているものを包含するが、これに限定されない。加えて、ポンプに基づくハードウェア送達系が用いられ得、それらのいくつかはインプラントのために適用される。
【００８１】
いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチド（例えば干渉ＲＮＡ）は、阻害剤オリゴヌクレオチドを発現するように操作された発現ベクターによって細胞に送達され得る。発現ベクターは、所望の配列が例えば制限処理およびライゲーションによって挿入され得、その結果、それが作動可能に制御配列に連結され、ＲＮＡ転写物として発現され得るものである。典型的には、発現ベクターは、タンパク質の、またはｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡなどの阻害性オリゴヌクレオチドのコード配列である挿入物を含有する。ベクターは、さらに、ベクターによって形質転換もしくはトランスフェクションされたかまたはされなかった細胞の同定への使用にとって好適な１つ以上のマーカー配列を含有し得る。例えば、マーカーは、抗生物質または他の化合物に対する耐性または感受性を増大または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、活性が標準的なアッセイによって検出可能である酵素または蛍光タンパク質をコードする遺伝子などを包含する。
【００８２】
ここで用いられるコード配列（例えば、タンパク質コード配列、ｍｉＲＮＡ配列、ｓｈＲＮＡ配列）および制御配列は、コード配列の発現または転写を制御配列の影響またはコントロール下に置くようなやり方でそれらが共有結合的にリンクされているときに、「作動可能に」連結されていると言われる。コード配列が機能的なタンパク質に翻訳されることが所望である場合には、２つのＤＮＡ配列は、５’制御配列中のプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合に、かつ２つのＤＮＡ配列間のリンク部分の性質が（１）フレームシフト変異の導入をもたらさず、（２）コード配列の転写を命令するプロモーター領域の能力に干渉せず、（３）タンパク質に翻訳される対応するＲＮＡ転写物の能力に干渉しない場合には、作動可能に連結されていると言われる。それゆえに、プロモーター領域は、プロモーター領域がそのＤＮＡ配列の転写をもたらすことができ、その結果、もたらされる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得る場合には、作動可能にコード配列に連結されている。コード配列がｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡをコードし得るということは理解されるであろう。
【００８３】
遺伝子発現のために必要とされる制御配列の厳密な性質は、生物種または細胞型間において様々であり得るが、一般的には、必要に応じて、それぞれ転写および翻訳の開始に関わる５’非転写および５’非翻訳配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、および同類を包含する。かかる５’非転写制御配列は、作動可能に連結された遺伝子の転写コントロールのためのプロモーター配列を包含するプロモーター領域を包含するであろう。制御配列は、所望に応じてエンハンサー配列または上流アクティベーター配列をもまた包含し得る。本開示のベクターは任意に５’リーダーまたはシグナル配列を包含し得る。
【００８４】
いくつかの態様において、核酸分子を送達するためのウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスおよび弱毒化ポックスウイルスを包含するポックスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス、およびＴｙウイルス様粒子からなる群から選択される。外因性核酸を送達するために用いられているウイルスおよびウイルス様粒子の例は、複製不能アデノウイルス、改変レトロウイルス、非複製レトロウイルス、複製不能セムリキ森林ウイルス、カナリア痘ウイルス、および高度弱毒化ワクシニアウイルス誘導体、非複製型ワクシニアウイルス、複製型ワクシニアウイルス、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、レンチウイルスベクター、およびＴｙウイルス様粒子を包含する。ある種の適用にとって有用な別のウイルスはアデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは細胞型および生物種の広範囲に感染することができ、複製欠損であるように操作され得る。さらに、これは熱および脂質溶媒安定性、造血細胞を包含する多様な系列の細胞への高い形質導入頻度、ならびに重複感染阻害の欠如などの利点を有し、それゆえに複数の一連の形質導入を許す。アデノ随伴ウイルスは部位特異的な様式でヒト細胞ＤＮＡ中にインテグレーションし得、それによって、挿入変異導入の可能性と挿入遺伝子の発現の変動性とを最小化する。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は組織培養において選択圧の不在下において１００継代超に渡って追跡されており、アデノ随伴ウイルスのゲノムインテグレーションが比較的安定なイベントであるということを暗示している。アデノ随伴ウイルスは染色体外的な様式でもまた機能し得る。
【００８５】
一般的に、他の有用なウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子によって置き換えられた非細胞変性性の真核生物ウイルスに基づく。非細胞変性性のウイルスはある種のレトロウイルスを包含し、そのライフサイクルは、ウイルスゲノムＲＮＡからＤＮＡへの逆転写と、宿主細胞ＤＮＡ中への爾後のプロウイルスインテグレーションを包含する。一般的に、レトロウイルスは複製欠損である（例えば、所望の転写物の合成を命令することができるが、感染性粒子を生産することができない）。かかる遺伝子改変されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボの遺伝子の高効率形質導入にとって一般的な実用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的なプロトコール（プラスミド中への外因性遺伝子材料の組み込み、プラスミドによるパッケージング細胞株のトランスフェクション、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の収集、およびウイルス粒子による標的細胞の感染のステップを包含する）はKriegler, M., "Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual," W.H. Freeman Co., New York (1990)およびMurry, E.J. Ed. "Methods in Molecular Biology," vol. 7, Humana Press, Inc., Clifton, New Jersey (1991)において提供されている。
【００８６】
核酸分子が宿主にインビトロでまたはインビボで導入されるかどうかに依存して、種々の技術が、本開示の核酸分子を細胞内に導入するために使用され得る。かかる技術は、核酸分子−リン酸カルシウム沈殿物のトランスフェクション、ＤＥＡＥと結びついた核酸分子のトランスフェクション、目的の核酸分子を包含する前述のウイルスによるトランスフェクションまたは感染、リポソームによって媒介されるトランスフェクション、および同類を包含する。他の例は、Sigma-AldrichによるN-TER（商標）ナノ粒子トランスフェクション系、Polyplus Transfectionによる昆虫細胞のためのFectoFly（商標）トランスフェクション試薬、Polysciences, Inc.によるポリエチレンイミン「Max」、Cosmo Bio Co., Ltd.による独自の非ウイルス系トランスフェクションツール、InvitrogenによるLipofectamine（商標）LTXトランスフェクション試薬、StratageneによるSatisFection（商標）トランスフェクション試薬、InvitrogenによるLipofectamine（商標）トランスフェクション試薬、Roche Applied ScienceによるFuGENE（登録商標）HDトランスフェクション試薬、Polyplus TransfectionによるＧＭＰ準拠のin vivo-jetPEI（商標）トランスフェクション試薬、およびNovagenによるInsect GeneJuice（登録商標）トランスフェクション試薬を包含する。
【００８７】
スクリーニング方法
いくつかの側面において、本開示は、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターとして機能する薬を同定する方法に関する。従って、いくつかの態様において、本開示はＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターを同定するための方法を提供し、方法は、不活性化したＦＭＲ１遺伝子を含む細胞を候補薬と接触させることと、細胞のＦＭＲ１発現レベルを検出することと、ＦＭＲ１の発現レベルが候補薬との接触後にコントロール細胞に対して増大するときに、候補薬をＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターとして同定することとを含む。
【００８８】
ここで用いられる用語「候補薬」は、サイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子を再活性化する化合物の能力のキャラクタリゼーションが望ましい、いずれかの薬（例えば化合物）を言う。例示的な候補薬は、小分子、抗体、抗体コンジュゲート、ペプチド、タンパク質、および／またはアンチセンス分子（例えば、干渉ＲＮＡ）を包含するが、これに限定されない。いくつかの態様において、本開示によって記載される方法は、候補化合物の大きいライブラリー（例えば、化合物ライブラリー）をスクリーニングしてＦＭＲ１の新たなエピジェネティックなモジュレーターを同定するために有用である。いくつかの態様において、化合物ライブラリーは、特定の標的、例えば活性化のマーク、抑制性のマーク、またはユビキチンリガーゼに特異的な候補薬からなる。化合物ライブラリーは、特定のタンパク質標的、例えばＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ユビキチンリガーゼ、および／またはヒストンアセチルトランスフェラーゼに特異的である候補薬からもまたなり得る。いくつかの態様において、候補薬はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ユビキチンリガーゼ、および／またはヒストンアセチルトランスフェラーゼの阻害剤である。
【００８９】
当業者は、不活性化したＦＭＲ１遺伝子を有する細胞を候補化合物と接触させるためのいくつかの方法を認識する。例えば、自動液体ハンドリング系は、ハイスループット薬物スクリーニングのために一般的に利用されている。自動液体ハンドリング系は、ロボットアームによってコントロールされる液体分注ベッセルのアレイを利用して、液体の一定体積をアッセイプレートのウェルに分配する。一般的に、アレイは９６、３８４、または１５３６個の液体分注チップを含む。自動液体ハンドリング系の限定しない例は、デジタルディスペンサー（例えば、ＨＰ−Ｄ３００デジタルディスペンサー）およびピンニング装置（例えば、MULTI-BLOT（商標）レプリケータ系、CyBio、Perkin Elmer Janus）を包含する。非自動の方法もまた本開示によって企図され、マニュアルデジタル連続分注マルチチャンネルピペットを包含するが、これに限定されない。
【００９０】
いくつかの態様において、本開示によって記載されるスクリーニング方法はハイスループットモードで実施される。いくつかの態様において、ハイスループットスクリーニングはマルチウェル細胞培養プレートで実施される。いくつかの態様において、マルチウェルプレートはプラスチックまたはガラスである。いくつかの態様において、マルチウェルプレートは６、２４、９６、３８４、または１５３６ウェルのアレイを含む。しかしながら、当業者は、マルチウェルプレートが、６、２４、９６、３８４、または１５３６の倍数であるウェルの数を有するマルチウェルプレートなどの種々の他の許容される構成で組み立てられ得るということを認識する。例えば、いくつかの態様において、マルチウェルプレートは３０７２ウェル（これは１５３６の倍数である）のアレイを含む。
【００９１】
細胞のＦＭＲ１発現レベルは当分野において公知のいずれかの好適な手段によって測定され得る。例えば、細胞のＦＭＲ１の発現レベルはハイブリダイゼーションに基づく方法によって測定され得る。ハイブリダイゼーションに基づくアッセイの例は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット、およびサザンブロットを包含する。いくつかの態様において、細胞のＦＭＲ１発現レベルはタンパク質に基づく方法によって測定される。タンパク質に基づくアッセイの例は、ウエスタンブロット、ブラッドフォードアッセイ、ローリータンパク質アッセイ、および分光法的方法（例えば、質量分析、高圧液体クロマトグラフィーなど）を包含するが、これに限定されない。いくつかの態様において、細胞のＦＭＲ１発現レベルは細胞に基づく方法によって決定される。細胞に基づくアッセイの例は、免疫蛍光、フローサイトメトリー、蛍光セルソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気セルソーティング（ＭＡＣＳ）を包含する。いくつかの態様において、細胞は、ＦＭＲ１活性化が作動可能に耐性遺伝子の発現にリンクされるように改変され、それゆえに、サイレンシングされたＦＭＲ１の再活性化は選択培地の存在下における細胞の生育および選択を許す（図５参照）。いくつかの態様において、細胞は、ＦＭＲ１活性化が作動可能に蛍光タンパク質の発現にリンクされるように改変され、それゆえに、サイレンシングされたＦＭＲ１の再活性化は蛍光タンパク質の発現を許し、これは免疫蛍光またはＦＡＣＳによって検出され得る。細胞のＦＭＲ１発現レベルを定量する追加の方法は、当業者にはすぐに明らかであろう。
【００９２】
候補化合物は、候補化合物の存在下において発言されるＦＭＲ１の量が候補化合物の不在下において発現される量よりも多い場合に、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターとして同定され得る。ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの存在下において発現されるＦＭＲ１の量は、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの不在下において発現されるＦＭＲ１の量よりも約２倍多くから約５００倍多く、５倍多くから約２５０倍多く、１０倍多くから約１５０倍多く、または約２０倍多くから約１００倍多くの範囲であり得る。いくつかの態様において、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの存在下において発現されるＦＭＲ１の量は、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの不在下において発現されるＦＭＲ１の量よりも約１％から約１０００％多く、約１０％から約５００％多く、約２０％から約２５０％多く、約５０％から約５００％多く、約１００％から約７５０％多くの範囲であり得る。いくつかの態様において、ＦＭＲ１はＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの存在下において発現され、ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターの不在下においては発現されない（例えば、転写不活性であるかまたはサイレンシングされている）。
【実施例】
【００９３】
例１．
抑制性のマークを蓄積することまたは活性化のマークを除去することを担う因子は、エピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子を再活性化するための潜在的な標的である（図２）。次の表（表３）は、サイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子上のエピジェネティックマークを蓄積または除去することを担う因子の非網羅的なリストである。
【００９４】
【表３】
2018528968.tif 000005
【００９５】
上の表において挙げられたエピジェネティックマークを蓄積または除去するために要求される因子の全てを、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を用いて体系的にノックダウンした（図３）。これらの実験はＦＸＳ患者に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）において実行した。ＦＸＳ−ｉＰＳＣは抑制されたＦＭＲ１遺伝子を宿し、ゆえに、疾患メカニズムを研究することおよび薬物スクリーニングアプローチにとって有用なモデル系としての用をなす。
【００９６】
この指向性アプローチを用いて、ノックダウンされたときにｉＰＳＣ細胞におけるＦＭＲ１遺伝子の発現を活性化する９つのクロマチン修飾因子を同定した。９つの修飾因子はＤＮＭＴ１、ＥＺＨ２、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＲＩＮＧ１Ｂ／ＲＮＦ２、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ１０、ＳＩＲＴ５、ＫＤＭ５Ｃ、およびＫＤＭ５Ｄである（図４上）。これらの因子の多く（ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２を除く全て）では、小分子阻害剤が利用可能である（表１）。ゆえに、小分子阻害剤がＲＮＡｉノックダウンと同様にＦＭＲ１遺伝子を脱抑制し得るかどうかを試験した。４つの化合物、ＥＺＨ２阻害剤ＥＰＺ６４３８（Cayman Chemical）およびＧＳＫ１２６（Apexbio Technology）、Ｇ９ａ（ＥＨＭＴ２としてもまた公知）阻害剤ＵＮＣ０６３８（Sigma-Aldrich）、ならびにＳＵＶ３９Ｈ１阻害剤ケトシン（Tocris Bioscience）を試験した。加えて、ＤＮＭＴ阻害剤５−アザシチジンをポジティブコントロールとして分析した。５−アザシチジン、ＥＰＺ６４３８、ＧＳＫ１２６、およびケトシンはＦＭＲ１を再活性化するが、一方でＵＮＣ０６３８はせず（図４下）、対応する遺伝子のｓｈＲＮＡによって媒介されるノックダウンの結果と一致している（図４上参照）。Ｇ９ａは、Ｒループによって開始されるエピジェネティックなサイレンシングに関わるＨ３Ｋ９メチルトランスフェラーゼであるということが以前に示唆されているので、これは重要な結果である。］
【００９７】
ＦＭＲ１遺伝子を脱抑制することは、ＦＸＳ症状を後退させるための新規の治療アプローチを表す。サイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子を再活性化するであろう生物学的または小分子阻害剤の発見のための標的であるいくつもの因子が同定された。加えて、以前に記載された小分子阻害剤のケトシンでは、ＦＭＲ１遺伝子の発現を脱抑制することに果たす新規の生物学的役割が発見された。
【００９８】
例２．
ゲノムワイドなライブラリーおよび／またはキナーゼもしくは転写因子サブライブラリーを用いる大スケールＲＮＡｉスクリーニングを実行して、ＦＭＲ１のエピジェネティックなサイレンシングを媒介する新たな因子を同定する（図５）。このスクリーニングのために、不活性化したＦＭＲ１遺伝子の下流に位置するブラストサイジン（blasticidine）レポーター遺伝子（ＢｌａｓｔＲ）を含有するレポーター細胞株を作製する。ＦＭＲ１のエピジェネティックなモジュレーターによるＦＭＲ１遺伝子の再活性化は、ＢｌａｓｔＲ遺伝子の発現を誘導し、薬物選択によるポジティブな候補の単離を可能にする。図５に示されているように、ＢｌａｓｔＲ遺伝子はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いてＦＭＲ１遺伝子に挿入され得る。
【００９９】
例３．候補に基づくスクリーニングは、患者由来人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）においてＦＭＲ１のサイレンシングを媒介するエピジェネティックな制御因子を同定する
ＦＭＲ１のサイレンシングを媒介するエピジェネティックな制御因子を同定するために、転写抑制を媒介する３３個の良くキャラクタリゼーションされたエピジェネティックな制御因子を対象とする１６２個のｓｈＲＮＡを含む小スケール短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）ライブラリーを構築した。それぞれのｓｈＲＮＡをレンチウイルスにパッケージングし、未分化のＦＸＳ−ｉＰＳＣ株（ＦＸＳ８４８−ｉＰＳ３細胞）に形質導入した。トランスフェクションの２０日後に、ｍＲＮＡを調製し、ＦＭＲ１発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって分析した。ポジティブな結果は、コントロールの非サイレンシング（ＮＳ）ｓｈＲＮＡによって得られたものと比較して、同じ標的を対象とする少なくとも２つの無関係なｓｈＲＮＡによるＦＭＲ１発現の統計的に有意な増大であると考えられる。図４Ａの結果は、サイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子の９つのエピジェネティックな制御因子を同定した：ＤＮＭＴ１、ＥＺＨ２、ＲＮＦ２（ＲＩＮＧ１Ｂともまた呼ばれる）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ１０、およびＳＩＲＴ５。これらの機能は表４に簡略に記載されている。便宜のために、ＦＭＲ１サイレンシングを促進する下の因子はＦＭＲ１サイレンシング因子（ＦＭＲ１−ＳＦ）と言う。
【０１００】
【表４】
2018528968.tif 000006
【０１０１】
ＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡによって媒介されるノックダウンに引き続いて得られるＦＭＲ１再活性化のレベルを決定するために、正常な個人に由来するｉＰＳＣ株（ＢＪ１−ｉＰＳ４）を平行して分析した。図６ＡのｑＲＴ−ＰＣＲ結果は、ＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡによって媒介されるノックダウンがエピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子を正常レベルの〜２０％に再活性化したということを示しており、これは臨床的な利益を有すると予測される範囲内である。図６Ｂのイムノブロットの結果は、ＦＸＳ８４８−ｉＰＳ３細胞におけるＦＭＲ１−ＳＦのノックダウンがＦＭＲＰタンパク質をもまた正常レベルの１５〜２０％に回復したということを示している。９つのＦＭＲ１−ＳＦのノックダウンに引き続いてのエピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１の再活性化は、第２の無関係なＦＸＳ−ｉＰＳＣ細胞株、ＳＣ１３５細胞におけるｑＲＴ−ＰＣＲおよびイムノブロッティングによって確認した（図６Ｃ〜６Ｄ）。
【０１０２】
上に記載されているように、エピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１の特質的な特徴はＤＮＡ過剰メチル化の存在である。図６Ｅのバイサルファイトシーケンシング実験は、ＦＸＳ−ｉＰＳＣ細胞株ＦＸＳ８４８−ｉＰＳ３においてＦＭＲ１プロモーターのＤＮＡ過剰メチル化を確認している。以前の研究と一致して、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤５−アザシチジンによるＦＸＳ８４８−ｉＰＳ３細胞の処置はＤＮＡ過剰メチル化の実質的な減少に至った。特に、９つのＦＭＲ１−ＳＦの１つのノックダウンに引き続いて、ＤＮＡ過剰メチル化の類似の減少があった。
【０１０３】
例４．ＦＭＲ１−ＳＦは、順序立った経路によってエピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１と安定に結びつく
典型的には、エピジェネティックな制御因子は、それらが作用するプロモーターおよび／または遺伝子と安定に結びついている。９つのＦＭＲ１−ＳＦがエピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１プロモーターと安定に結びついているかどうかを決定するために、一連のクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）実験を実行した。図７ＡのＣｈＩＰ実験は、９つのＦＭＲ１−ＳＦの８つがＦＸＳ−ｉＰＳＣにおいてはエピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１プロモーターに結合しているが、正常ｉＰＳＣにおいてはしていないということを示している。ＦＭＲ１−ＳＦは恒常的に活性な遺伝子ＡＰＲＴのネガティブコントロールのプロモーターには結合していなかった。エピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１プロモーターに結びついていない単一のＦＭＲ１−ＳＦはＳＩＲＴ５であり、これはミトコンドリアに局在することが公知である。それゆえに、ＳＩＲＴ５はＦＭＲ１サイレンシングを促進するが、他のＦＭＲ１−ＳＦとは違って、間接的に機能する。
【０１０４】
抑制性のエピジェネティックな制御因子は順序立った経路でプロモーターにリクルートメントされるということが以前に示されている。ＦＭＲ１−ＳＦがある経路でＦＭＲ１にリクルートメントされるかどうかを決定するために、単一の各ＦＭＲ１−ＳＦをノックダウンし、それから全てのＦＭＲ１−ＳＦ（ＳＩＲＴ５を除く）の結合をＣｈＩＰアッセイによって分析した。図７Ｂに与えられているこれらの結果は、ＦＭＲ１−ＳＦが図７Ｃに要約されている経路でＦＭＲ１プロモーターに順次リクルートメントされるということを示している。例えば、ＦＭＲ１と結びつく第１のＦＭＲ１−ＳＦ、ＥＺＨ２のノックダウンは、全ての他のＦＭＲ１−ＳＦのリクルートメントの喪失をもたらす。対照的に、ＦＭＲ１に結びつく最後のＦＭＲ１−ＳＦ、ＤＮＭＴ１のノックダウンは、他のＦＭＲ１−ＳＦのリクルートメントに影響しない。特に、他のエピジェネティックにサイレンシングされた遺伝子の以前の研究の全てにおいて、ＤＮＭＴは、リクルートメントされる最後の抑制性のエピジェネティックな制御因子であるということが見出されている。
【０１０５】
ＦＭＲ１サイレンシングがＦＭＲ１プロモーター上のヒストンＨ３リジン９トリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）およびヒストンＨ３リジン２７トリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）の蓄積を伴うということが以前に示されている。図７Ｄは、ＦＸＳ−ｉＰＳＣにおいて、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３はＦＭＲ１プロモーター上に検出され得たが、コントロールのプロモーター（ＡＰＲＴ）上にはされなかったということを示している。図７Ｅは、予想されたように、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３を触媒するＥＺＨ２のノックダウンがＦＭＲ１プロモーターにおけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３の減少したレベルをもたらしたということを示している。対照的に、他のＦＭＲ１−ＳＦのいずれか１つのノックダウンはＨ３Ｋ２７ｍｅ３に影響しなかった。図７Ｆは、予想されたように、Ｈ３Ｋ９メチルトランスフェラーゼのＳＵＶ３９Ｈ１のノックダウンがＦＭＲ１プロモーターにおけるＨ３Ｋ９ｍｅ３の減少したレベルをもたらしたということを示している。加えて、ＥＺＨ２のノックダウンもまた低減されたＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルをもたらしており、ＥＺＨ２リクルートメントがＳＵＶ３９Ｈ１結合のために要求されるという知見と一致する（図７Ｃ参照）。
【０１０６】
例５．ＦＭＲ１−ＳＦの小分子阻害剤によるエピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１の再活性化
ＦＭＲ１−ＳＦのいくつかには、良く記載された小分子阻害剤がある。図８Ａは、エピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤５−アザシチジンによる処置によってＦＸＳ８４８−ｉＰＳ３細胞において再活性化され得たということを示しており、いくつかの以前の研究の結果と一致する。特に、エピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１は、ＥＺＨ２（ＥＰＺ６４３８、ＧＳＫ１２６）、ＳＵＶ３９Ｈ１（ケトシン（chaeotocin））、およびＲＮＦ２（ＰＲＴ４１６５）の小分子阻害剤による処置に引き続いてもまた再活性化された。再活性化はＦＭＲ１のｍＲＮＡ（図８Ａ）およびタンパク質（図８Ｂ）レベル両方の分析によって観察され、再び野生型レベルの〜１５〜２０％であった。興味深いことに、ケトシン（chaeotocin）およびＥＰＺ６４３８、ケトシン（chaeotocin）およびＰＲＴ４１６５、またはＥＰＺ６４３８およびＰＲＴ４１６５などの２つの阻害剤による同時処置は、単一の阻害剤単独による処置と比較して、ＦＭＲ１の増強された再活性化をもたらすということが見出された（図８Ｃ）。
【０１０７】
現在いくつかの治験中であるＥＺＨ２阻害剤ＥＰＺ６４８３によるいくつかの追加の実験．図８ＤのＥＰＺ６４８３タイトレーション実験は、ＥＺＨ２酵素活性の喪失とＦＭＲ１再活性化との間には非常に良好な相関があるということを示している。図８Ｅのタイムコース実験は、ＥＰＺ６４８３の追加に引き続いて、ＦＭＲ１再活性化は９６時間に渡って増大し、この時点でプラトーになり始めたということを示している。ＥＰＺ６４８３の休薬はＦＭＲ１の再サイレンシングをもたらし、これは再び〜９６時間のタイムコースに渡って起こった。まとめると、これらの結果は、ＦＭＲ１のサイレンシングおよび再活性化両方が可逆的なプロセスであるということを示している。最後に、図８ＦのＣｈＩＰ実験は、ＦＭＲ１プロモーターとのＤＮＭＴ１の結びつきが、ＥＰＺ６４８３追加に引き続いてのＦＭＲ１サイレンシングおよびＥＰＺ６４８３休薬に引き続いてのＦＭＲ１再活性化の動態と良く相関しているということを示している。
【０１０８】
ＦＭＲ１を再活性化する追加の小分子阻害剤を同定するために、バーチャルドッキングおよび類似性検索に基づいて選ばれたエピジェネティクス指向性ライブラリー（Life Chemicals）からの化合物のパネルをスクリーニングした。図９Ａは、ＥＺＨ２（Ｆ２８８０−２５６０）、ＳＵＶ３９Ｈ１（Ｆ２７４０−００９９、Ｆ６４０３−３０９５、Ｆ５５９９−０５３３）、ＨＤＡＣ１０（Ｆ６１９６−０９７６）、およびＤＮＭＴ１（Ｆ６３６３−１０１５）を標的化する合計６つの化合物が、エピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１遺伝子を再活性化したということを示している。図９ＢのタイトレーションアッセイはＦＭＲ１の再活性化が用量依存的であるということを示している。同定された化合物の構造は互いに近くはない（図９Ｃ）。サイレンシングされたＦＭＲ１を再活性化し得る小分子の例が図９Ｄに示されている。
【０１０９】
例６．ＦＭＲ１−ＳＦは、ＦＸＳ神経前駆細胞（ＮＰＣ）および有糸分裂後ニューロンにおいてもまたＦＭＲ１のエピジェネティックなサイレンシングを媒介する
上に記載されている実験は未分化のＦＸＳ−ｉＰＳＣにおいて実行した。次に、ＦＭＲ１−ＳＦの同じセットの拮抗作用が、エピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１をＦＸＳ−ＮＰＣおよび有糸分裂後ニューロンにおいてもまた再活性化するかどうかを調べた。これらの後者は、ＦＸＳの特に妥当な細胞型である。それらの実験のために、上に記載されているＦＸＳ８４８−ｉＰＳ３細胞に由来するＦＸＳ−ＮＰＣ細胞株を用いた。９つのＦＭＲ１−ＳＦのいずれか１つのノックダウンは、ｍＲＮＡ（図１０Ａ）およびタンパク質（図１０Ｂ）レベル両方で、ＦＸＳ８４８−ＮＰＣにおいてエピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１を再活性化した。エピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１は、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルで、ＦＸＳ８４８−ＮＰＣにおいて、５−アザシチジン、ケトシン、ＥＰＺ６４８３、ＧＳＫ１２６、およびＰＲＴ４１６５を包含するＦＭＲ１−ＳＦの小分子阻害剤によってもまた再活性化された（図１０Ｃ〜１０Ｄ）。
【０１１０】
有糸分裂後ＦＸＳニューロンを作製するために、ＦＸＳ８４８−ＮＰＣをマイトジェンＥＧＦおよびｂＦＧＦの不在下において培養した。ニューロン分化は、ニューロンマーカーＭＡＰ２およびＮｅｕＮによる染色によって確認された（図１１Ａ）。予想されたように、ＦＸＳ８４８−ＮＰＣ由来ニューロンは、有糸分裂マーカーリン酸化Ｈ３を対象とする抗体による染色の欠如によって証明されるように、有糸分裂後であった（図１１Ｂ）。９つのＦＭＲ１−ＳＦのノックダウンは、ＦＸＳ８４８−ＮＰＣ由来の有糸分裂後ニューロンにおいて、エピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１をｍＲＮＡ（図１１Ｃ）およびタンパク質（図１１Ｄ）レベル両方で再活性化した。エピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１は、ＦＸＳ８４８−ＮＰＣ由来の有糸分裂後ニューロンにおいて、５−アザシチジン、ケトシン、ＥＰＺ６４８３、ＧＳＫ１２６、およびＰＲＴ４１６５を包含するＦＭＲ１−ＳＦの小分子阻害剤によってもまた、ｍＲＮＡ（図１１Ｅ）およびタンパク質（図１１Ｆ）レベルで再活性化された。ＦＸＳ−ｉＰＳＣにおいて見出されたものと類似に、ＦＸＳ８４８−ＮＰＣ由来の有糸分裂後ニューロンにおいて、ＥＺＨ２阻害剤ＥＰＺ６４８３によるエピジェネティックにサイレンシングされたＦＭＲ１の再活性化は〜９６時間のタイムコースに渡って起こり、可逆的であった（図１１Ｇ）。
【０１１１】
例７．ＦＭＲ１再活性化は機能異常ＦＸＳニューロン表現型を正常化し得る
次に、ｓｈＲＮＡまたは小分子阻害剤によるＦＭＲ１の部分的な再活性化が、機能異常ＦＸＳニューロン表現型を「正常化する」ために十分であるかどうかを調べた。結果の生理的妥当性は、ＦＸＳ−ｉＰＳＣ由来ニューロンにおけるＦＸＳニューロン表現型のいくつかの定量可能な尺度を用いて決定した。
【０１１２】
第１に、神経転写リプレッサーＲＥＳＴおよびその標的軸索誘導遺伝子の遺伝子発現の改変を測定した。ＲＥＳＴは神経発生の負のマスター制御因子であり、異なる神経系列のプールサイズおよび分化のタイミングを制御する。ＲＥＳＴは胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＮＰＣ、および非ニューロン細胞において発現し、そこでは、それがサイレンシングされる分化したニューロンとは対照的に、ニューロン特異的遺伝子を抑制する。しかしながら、ＦＸＳ由来ニューロンにおいてはＲＥＳＴレベルが高く、軸索誘導遺伝子および正しい軸索発達にとって重要な他の遺伝子の抑制をもたらす。ＦＸＳ−ｉＰＳＣ由来ニューロンにおいては、ＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡまたは阻害剤による処置は、コントロール処置に対してＲＥＳＴ発現の減少（図１２Ａ）およびＲＥＳＴ標的軸索誘導遺伝子ＲＯＢＯ３、ＳＬＩＴ１、およびＤＣＣの増大（図１２Ｂ）をもたらした。
【０１１３】
第２に、ジアシルグリセロールおよびホスファチジン酸シグナル伝達経路の間の切り替えをコントロールするマスター制御因子、ジアシルグリセロールキナーゼカッパ（ＤＧＫκ）のタンパク質レベルを測定した。ＦＸＳニューロンにおけるＦＭＲＰの不在はＤＧＫκの減少したレベルをもたらし、これはＦＸＳマウスモデルにおいて観察されるものに類似の樹状突起スパイン異常、シナプス可塑性改変、および行動異常を引き起こすために十分である。その上に、ＤＧＫκの異所発現はＦＭＲ１ＫＯニューロンの樹状突起スパイン欠陥を救済する。図１２Ｃは、ＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡまたは阻害剤によるＦＸＳ−ｉＰＳＣ由来ニューロンの処置が、野生型ニューロンにおいて見出されるものに匹敵するレベルへのＤＧＫκの増大をもたらしたということを示している。
【０１１４】
最後に、ＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡおよび阻害剤が、ＦＸＳニューロンにおいて異常であるニューロンの形態の各側面（細胞体面積、細胞体周長、神経突起の突起長、神経突起の分岐点、二次突起）を救済し得るかどうかを決定するための研究を実行した。第１のステップとして、細胞をニューロンマーカーＴＵＪ１によって染色し、これは神経突起の突起長の測定を許した。免疫蛍光分析は、ＴＵＪ１およびＦＭＲＰ染色がＦＸＳ−ｉＰＳＣ由来ニューロンにおいてＦＭＲ１−ＳＦのノックダウン（図１２Ｄ）またはＦＭＲ１−ＳＦ阻害剤による処置（図１２Ｅ）によって回復したということを示している。さらにその上に、ＦＭＲ１−ＳＦのｓｈＲＮＡまたは阻害剤による処置は、野生型ｉＰＳＣ由来ニューロンのもののおよそ２５〜４５％のレベルへの神経突起の突起長の増大をもたらした（図１２Ｆ）。
【０１１５】
本開示のいくつかの態様をここで記載および例解してきたが、当業者は、本願に記載される機能を実行し、ならびに／または結果および／もしくは利点の１つ以上を得るための、種々の他の手段および／または構造をすぐに想像するであろう。かかる変形および／または改変のそれぞれは本開示の範囲内であると見なされる。より一般的に、当業者は、本願に記載される全てのパラメータ、寸法、材料、および構成は例示的であることが意味されているということと、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は本開示の教示が用いられる具体的な適用（単数または複数）に依存するであろうということとをすぐに理解するであろう。当業者は、本願に記載される本開示の具体的な態様の多くの均等物を認識するか、またはせいぜい慣例的な実験作業を用いて確かめる能力があるであろう。ゆえに、前述の態様が例としてのみ与えられているということと、添付の請求項およびその均等物の範囲内で、本開示は具体的に記載および請求されるものとは別様に実施され得るということとは理解されるべきである。本開示は、本願に記載されるそれぞれの個々の特徴、系、成形品、材料、および／または方法を対象とする。加えて、２つ以上のかかる特徴、系、成形品、材料、および／または方法のいずれかの組み合わせは、かかる特徴、系、成形品、材料、および／または方法同士が相反しない場合には、本開示の範囲内に包含される。
【０１１６】
ここで明細書および請求項において用いられる不定冠詞「a」および「an」は、明瞭に反対に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
ここで明細書および請求項において用いられる句「および／または」は、そのように接続された要素の「どちらかまたは両方」、すなわち、いくつかのケースにおいては連接的に存在し他のケースにおいては離接的に存在する要素を意味すると理解されるべきである。明瞭に反対に示されない限り、具体的に同定されているそれらの要素と関係があるかまたは無関係であるかにかかわらず、任意に、「および／または」節によって具体的に同定されている要素以外の他の要素が存在し得る。それゆえに、限定しない例として、「含む」などの開放的な言葉と連接して用いられるときの「Ａおよび／またはＢ」と言うことは、１つの態様においてはＢなしのＡ（任意にＢ以外の要素を包含する）を、別の態様においてはＡなしのＢ（任意にＡ以外の要素を包含する）を、尚も別の態様においてはＡおよびＢ両方（任意に他の要素を包含する）などを言い得る。
【０１１７】
ここで明細書および請求項において用いられる「または」は、上で定義されている「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト中の項目同士を分離するときに、「または」または「および／または」は、包括的であるとして、すなわちいくつもの要素または要素のリストの少なくとも１つ（しかし、１つよりも多くをもまた包含する）と任意に追加のリスト化されていない項目との包含として解釈される。明瞭に反対に示されている用語、例えば「の１つのみ」もしくは「の正確に１つ」または請求項に用いられるときの「からなる」のみが、いくつもの要素または要素のリストの正確に１つの要素の包含を言う。一般的に、ここで用いられる用語「または」は、「どちらか」、「の１つ」、「の１つのみ」、または「の正確に１つ」などの排他性の用語によって先行されるときにのみ、排他的な代替物（すなわち「両方ではなく１つまたは他方」）を示すと解釈される。「から本質的になる」は、請求項において用いられるときには、特許法の分野において用いられるその普通の意味を有する。
【０１１８】
ここで明細書および請求項において用いられる句「少なくとも１つ」は、１つ以上の要素のリストの参照において、要素のリスト中の要素のいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、要素のリスト中の具体的にリスト化されているあらゆる要素の少なくとも１つを必ずしも包含せず、かつ要素のリスト中の要素のいずれかの組み合わせを排除しない。この定義は、具体的に同定されているそれらの要素と関係があるかまたは無関係であるかにかかわらず、句「少なくとも１つ」が言う要素のリスト中の具体的に同定されている要素以外の要素が任意に存在し得ることをもまた許す。それゆえに、限定しない例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または同義で「ＡまたはＢの少なくとも１つ」もしくは同義で「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、１つの態様においてはＢが存在しない（かつ任意にＢ以外の要素を包含する）少なくとも１つのＡ（任意に１つよりも多くを包含する）を、別の態様においてはＡが存在しない（かつ任意にＡ以外の要素を包含する）少なくとも１つのＢ（任意に１つよりも多くを包含する）を、尚も別の態様においては（任意に他の要素を包含する）少なくとも１つのＡ（任意に１つよりも多くを包含する）および少なくとも１つのＢ（任意に１つよりも多くを包含する）などを言い得る。
【０１１９】
請求項および上の明細書において、「含む」、「包含する」、「抱える」、「有する」、「含有する」、「関わる」、「持つ」および同類などの全ての移行句は、開放的であると、すなわち包含するが限定されないことを意味すると理解されるべきである。移行句「からなる」および「から本質的になる」のみが、米国特許庁特許審査便覧セクション２１１１．０３に定められるようにそれぞれ閉鎖的または半閉鎖的な移行句である。
【０１２０】
請求項の要素を修飾するための請求項における順序数用語、例えば「第１」、「第２」、「第３」などの使用は、別のものに対する１つの請求項の要素のいずれかの優先権、重要度、もしくは順序、または方法の各行為が実行される時間的順序をそれ自体で含意することはなく、単に、請求項の要素同士を見分けるためにある種の名を有する１つの請求項の要素を（順序数用語の使用を除けば）同じ名を有する別の要素から見分けるための標識として用いられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ＡＢ】
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【図６Ｃ】
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【図６ＤＥ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７ＣＤ】
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【図７ＥＦ】
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【図８ＡＢ】
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【図８ＣＤ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９ＢＣ】
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【図９Ｄ】
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【図１０ＡＢ】
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【図１０ＣＤ】
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【図１１ＡＢ】
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【図１１ＣＤ】
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【図１１ＥＦ】
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【図１１Ｇ】
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【図１２ＡＢ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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