(57)【要約】  ＴＬ１Ａに対する親和性が増強され、それらの由来元の親抗体に比べて高い力価を有する組換え発現変異型抗体を提供する。この抗体は、ＴＬ１Ａと細胞死受容体３（ＤＲ３）との間の相互作用を阻害する。前記抗体またはその組成物を使用して、喘息、ＣＯＰＤ、肺線維症、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患、嚢胞性線維症に関連する胃腸疾患、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、好酸球性食道炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、強皮症、関節炎、または関節リウマチの１つ以上を治療し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号２９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む組換え抗体であって、前記重鎖可変領域が配列番号１のアミノ酸配列を有する場合、前記軽鎖可変領域が配列番号２のアミノ酸配列を有さず、そこにおいて前記抗体がＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１Ａ）に特異的に結合し、ＴＬ１Ａと細胞死受容体３（ＤＲ３）との相互作用を阻害可能な、前記組換え抗体。
【請求項２】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ２が配列番号１６のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３が配列番号２２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組換え抗体。
【請求項３】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ２が配列番号２１のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３が配列番号２０のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組換え抗体。
【請求項４】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ２が配列番号１６のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域ＣＤＲ１が配列番号２３のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３が配列番号２２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組換え抗体。
【請求項５】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ２が配列番号１６のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域ＣＤＲ１が配列番号２４のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３が配列番号２２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組換え抗体。
【請求項６】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ２が配列番号１６のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域ＣＤＲ１が配列番号２５のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３が配列番号２２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組換え抗体。
【請求項７】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ２が配列番号１６のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域ＣＤＲ１が配列番号２６のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３が配列番号２２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組換え抗体。
【請求項８】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ２が配列番号２１のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３が配列番号２２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組換え抗体。
【請求項９】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ２が配列番号２１のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域ＣＤＲ１が配列番号２４のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３が配列番号２２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組換え抗体。
【請求項１０】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ２が配列番号２１のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域ＣＤＲ１が配列番号２５のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３が配列番号２２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組換え抗体。
【請求項１１】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ２が配列番号２１のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域ＣＤＲ１が、配列番号２６のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３が、配列番号２２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組換え抗体。
【請求項１２】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ２が配列番号２１のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３が配列番号２７のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組換え抗体。
【請求項１３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１４】
前記抗体がヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１５】
前記ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域が、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、または配列番号６６を有する、請求項１４に記載の組換え抗体。
【請求項１６】
前記抗体がヒト重鎖ＩｇＧ４定常領域を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１７】
前記ヒト重鎖ＩｇＧ４定常領域が、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、または配列番号６９を有する、請求項１６に記載の組換え抗体。
【請求項１８】
前記抗体がヒト重鎖ＩｇＧ２定常領域を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１９】
前記ヒト重鎖ＩｇＧ２定常領域が、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、または配列番号７１を有する、請求項１８に記載の組換え抗体。
【請求項２０】
前記抗体が、ヒト軽鎖λ定常領域を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項２１】
前記ヒト軽鎖λ定常領域が、配列番号４８を有する、請求項２０に記載の組換え抗体。
【請求項２２】
前記抗体が、配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項２０に記載の組換え抗体。
【請求項２３】
結合平衡除外法によって測定する前記ＴＬ１ＡのＫＤが、約３０ｐＭ〜約６０ｐＭである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項２４】
結合平衡除外法によって測定する前記ＴＬ１ＡのＫＤが、約３５ｐＭ〜約５０ｐＭである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項２５】
結合平衡除外法によって測定する前記ＴＬ１ＡのＫＤが、約３５ｐＭ〜約４２ｐＭである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項２６】
前記ＴＬ１Ａが非ヒト霊長類ＴＬ１Ａである、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項２７】
前記非ヒト霊長類がカニクイザルである、請求項２６に記載の組換え抗体。
【請求項２８】
前記ＴＬ１Ａが非ヒト哺乳類ＴＬ１Ａである、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項２９】
前記非ヒト哺乳類が、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ネコ、イヌ、またはブタである、請求項２８に記載の組換え抗体。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の組換え抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物。
【請求項３１】
呼吸器疾患の治療方法であって、呼吸器疾患の治療を必要とする被験体に、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、前記治療方法。
【請求項３２】
前記呼吸器疾患が、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、肺サルコイドーシス、アレルギー性鼻炎、肺線維症、または嚢胞性線維症である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
胃腸疾患の治療方法であって、胃腸疾患の治療を必要とする被験体に、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、前記治療方法。
【請求項３４】
前記胃腸疾患が、炎症性腸疾患、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、好酸球性食道炎、過敏性腸症候群、または嚢胞性線維症に関連する胃腸疾患である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
関節炎の治療方法であって、関節炎の治療を必要とする被験体に、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、前記治療方法。
【請求項３６】
前記関節炎が関節リウマチである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
皮膚疾患の治療方法であって、皮膚疾患の治療を必要とする被験体に、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、前記治療方法。
【請求項３８】
前記皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎、湿疹または強皮症である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記投与が、静脈内投与または皮下投与を含む、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記被験体がヒトである、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記呼吸器疾患の治療に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項４２】
前記喘息の治療に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項４３】
前記ＣＯＰＤの治療に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項４４】
前記肺サルコイドーシスの治療に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項４５】
前記アレルギー性鼻炎の治療に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項４６】
前記肺線維症の治療に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項４７】
前記嚢胞性線維症の治療に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項４８】
前記胃腸疾患の治療に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項４９】
前記炎症性腸疾患の治療に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項５０】
前記大腸炎の治療に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項５１】
前記潰瘍性大腸炎の治療に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項５２】
前記好酸球性食道炎の治療に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項５３】
前記嚢胞性線維症に関連する胃腸疾患の治療に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項５４】
前記過敏性腸症候群の治療に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項５５】
前記クローン病の治療に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項５６】
前記関節炎の治療に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項５７】
前記関節リウマチの治療に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項５８】
前記皮膚疾患の治療に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項５９】
前記アトピー性皮膚炎の治療に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項６０】
前記湿疹の治療に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項６１】
前記強皮症の治療に使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項６２】
喘息、ＣＯＰＤ、肺線維症、肺サルコイドーシス、アレルギー性鼻炎、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患、大腸炎、潰瘍性大腸炎、好酸球性食道炎、嚢胞性線維症に関連する胃腸疾患、クローン病、過敏性腸症候群、関節炎、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、湿疹、または強皮症のいずれか１つの前記治療に使用するための薬剤の調製における、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え抗体の使用。
【請求項６３】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の表面上のＴＬ１Ａのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法であって、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体と、被験体から単離したＰＢＭＣとを接触させ、前記ＰＢＭＣの表面上のＴＬ１Ａに結合した前記抗体を検出し、場合により前記ＰＢＭＣ上のＴＬ１Ａのレベルを定量することを含む、前記検出方法。
【請求項６４】
血清中のＴＬ１Ａのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法であって、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体と、被験体から採取した血清とを接触させ、前記血清中のＴＬ１Ａに結合した前記抗体を検出し、場合により前記血清中の前記ＴＬ１Ａのレベルを定量することを含む、前記検出方法。
【請求項６５】
被験体から単離した組織試料中のＴＬ１Ａのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法であって、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体と、被験体から単離した組織とを接触させて抗体‐ＴＬ１Ａ複合体を形成し、前記組織内の前記複合体を検出することを含む、前記検出方法。
【請求項６６】
前記組織が呼吸器組織を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記組織が、痰または気管支肺胞洗浄液を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記組織が胃腸組織を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記組織が関節組織を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
前記組織が皮膚組織を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
前記組織が血液を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７２】
前記被験体から前記組織試料を単離することをさらに含む、請求項６５〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記被験体がヒトである、請求項６３〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体を発現する形質転換細胞。
【請求項７５】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項７４に記載の形質転換細胞。
【請求項７６】
前記哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項７５に記載の形質転換細胞。
【請求項７７】
前記哺乳類細胞がＨＥＫ２９３細胞である、請求項７５に記載の形質転換細胞。
【請求項７８】
配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、組換え抗体。
【請求項７９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項７８に記載の組換え抗体。
【請求項８０】
前記抗体がヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、請求項７８または７９に記載の組換え抗体。
【請求項８１】
前記ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域が、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、または配列番号６６を有する、請求項８０に記載の組換え抗体。
【請求項８２】
前記抗体がヒトＩｇＧ４重鎖定常領域を含む、請求項７８または７９に記載の組換え抗体。
【請求項８３】
前記ヒト重鎖ＩｇＧ４定常領域が、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、または配列番号６９を有する、請求項８２に記載の組換え抗体。
【請求項８４】
前記抗体がヒト重鎖ＩｇＧ２定常領域を含む、請求項７８または７９に記載の組換え抗体。
【請求項８５】
前記ヒト重鎖ＩｇＧ２定常領域が、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、または配列番号７１を有する、請求項８４に記載の組換え抗体。
【請求項８６】
前記抗体が、ヒト軽鎖λ定常領域を含む、請求項７８〜８５のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項８７】
前記ヒト軽鎖λ定常領域が配列番号４８を有する、請求項８６に記載の組換え抗体。
【請求項８８】
前記組換え抗体が、配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項８６に記載の組換え抗体。
【請求項８９】
前記組換え抗体が、配列番号６０のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、請求項８０または８８に記載の組換え抗体。
【請求項９０】
前記ＴＬ１Ａが非ヒト霊長類ＴＬ１Ａである、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項９１】
前記非ヒト霊長類がカニクイザルである、請求項９０に記載の組換え抗体。
【請求項９２】
前記ＴＬ１Ａが非ヒト哺乳類ＴＬ１Ａである、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項９３】
前記非ヒト哺乳類が、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ネコ、イヌ、またはブタである、請求項９２に記載の組換え抗体。
【請求項９４】
請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む、組成物。
【請求項９５】
呼吸器疾患の治療方法であって、呼吸器疾患の治療を必要とする被験体に、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、前記治療方法。
【請求項９６】
前記呼吸器疾患が、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、肺サルコイドーシス、アレルギー性鼻炎、または嚢胞性線維症である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
胃腸疾患の治療方法であって、胃腸疾患の治療を必要とする被験体に、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、前記治療方法。
【請求項９８】
前記胃腸疾患が、炎症性腸疾患、大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、好酸球性食道炎、過敏性腸症候群、または嚢胞性線維症に関連する胃腸疾患である、請求項８０に記載の方法。
【請求項９９】
関節炎の治療方法であって、関節炎の治療を必要とする被験体に、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１００】
前記関節炎が関節リウマチである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
皮膚疾患の治療方法であって、皮膚疾患の治療を必要とする被験体に、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１０２】
前記皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎、湿疹または強皮症である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記投与が、静脈内投与または皮下投与を含む、請求項９５〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記呼吸器疾患の治療に使用するための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１０５】
前記喘息の治療に使用するための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１０６】
前記ＣＯＰＤの治療に使用するための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１０７】
前記肺サルコイドーシスの治療に使用するための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１０８】
前記アレルギー性鼻炎の治療に使用するための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１０９】
前記肺線維症の治療に使用するための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１１０】
前記嚢胞性線維症の治療に使用するための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１１１】
前記胃腸疾患の治療に使用するための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１１２】
前記炎症性腸疾患の治療に使用するための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１１３】
前記大腸炎の治療に使用するための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１１４】
前記潰瘍性大腸炎の治療に使用するための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１１５】
前記好酸球性食道炎の治療に使用するための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１１６】
前記嚢胞性線維症に関連する胃腸疾患の治療に使用するための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１１７】
前記過敏性腸症候群の治療に使用するための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１１８】
前記クローン病の治療に使用するための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１１９】
前記関節炎の治療に使用するための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１２０】
前記関節リウマチの治療に使用するための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１２１】
前記皮膚疾患の治療に使用するための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１２２】
前記アトピー性皮膚炎の治療に使用するための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１２３】
前記湿疹の治療に使用するための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１２４】
前記強皮症の治療に使用するための、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１２５】
喘息、ＣＯＰＤ、肺線維症、肺サルコイドーシス、アレルギー性鼻炎、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患、大腸炎、潰瘍性大腸炎、好酸球性食道炎、嚢胞性線維症に関連する胃腸疾患、クローン病、過敏性腸症候群、関節炎、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、湿疹または強皮症のいずれか１つの治療に使用するための薬剤の調製における、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の組換え抗体の使用。
【請求項１２６】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の表面上のＴＬ１Ａのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法であって、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の抗体と、被験体から単離したＰＢＭＣとを接触させ、前記ＰＢＭＣの表面上のＴＬ１Ａに結合した前記抗体を検出し、場合により前記ＰＢＭＣ上のＴＬ１Ａのレベルを定量することを含む、前記検出方法。
【請求項１２７】
血清中のＴＬ１Ａのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法であって、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の抗体と、被験体から採取した血清とを接触させ、前記血清中のＴＬ１Ａに結合した前記抗体を検出し、場合により前記血清中のＴＬ１Ａのレベルを定量することを含む、前記検出方法。
【請求項１２８】
被験体から単離した組織試料中のＴＬ１Ａのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法であって、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の抗体と、被験体から単離した組織とを接触させて抗体‐ＴＬ１Ａ複合体を形成し、組織内の前記複合体を検出することを含む、前記検出方法。
【請求項１２９】
前記組織が、呼吸器組織、痰または気管支肺胞洗浄液を含む、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記組織が胃腸組織を含む、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３１】
前記組織が関節組織を含む、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３２】
前記組織が皮膚組織を含む、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３３】
前記組織が血液を含む、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３４】
前記被験体から前記組織試料を単離することをさらに含む、請求項１２８〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記被験体がヒトである、請求項１２６〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の抗体を発現する形質転換細胞。
【請求項１３７】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項１３６に記載の形質転換細胞。
【請求項１３８】
前記哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１３７に記載の形質転換細胞。
【請求項１３９】
前記哺乳類細胞がＨＥＫ２９３細胞である、請求項１３７に記載の形質転換細胞。
【請求項１４０】
配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む組換え抗体であって、前記重鎖可変領域が配列番号１のアミノ酸配列を有する場合、前記軽鎖可変領域が配列番号２のアミノ酸配列を有さず、そこにおいて前記抗体がＴＮＦ様リガンド１ａ（ＴＬ１Ａ）に特異的に結合し、前記抗体が、ＴＬ１Ａと細胞死受容体３（ＤＲ３）との相互作用を阻害可能な、前記組換え抗体。
【請求項１４１】
前記重鎖可変領域が配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項１４０に記載の組換え抗体。
【請求項１４２】
前記重鎖可変領域が配列番号３のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１４０に記載の組換え抗体。
【請求項１４３】
前記重鎖可変領域が配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が配列番号５のアミノ酸配列を有する、請求項１４０に記載の組換え抗体。
【請求項１４４】
前記重鎖可変領域が配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が配列番号６のアミノ酸配列を有する、請求項１４０に記載の組換え抗体。
【請求項１４５】
前記重鎖可変領域が配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を有する、請求項１４０に記載の組換え抗体。
【請求項１４６】
前記重鎖可変領域が配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を有する、請求項１４０に記載の組換え抗体。
【請求項１４７】
前記重鎖可変領域が配列番号３のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項１４０に記載の組換え抗体。
【請求項１４８】
前記重鎖可変領域が配列番号３のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が配列番号６のアミノ酸配列を有する、請求項１４０に記載の組換え抗体。
【請求項１４９】
前記重鎖可変領域が配列番号３のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を有する、請求項１４０に記載の組換え抗体。
【請求項１５０】
前記重鎖可変領域が配列番号３のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を有する、請求項１４０に記載の組換え抗体。
【請求項１５１】
前記重鎖可変領域が配列番号３のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が配列番号１０のアミノ酸配列を有する、請求項１４０に記載の組換え抗体。
【請求項１５２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１４０〜１５１のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１５３】
前記抗体がヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、請求項１４０〜１５２のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１５４】
前記ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域が、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、または配列番号６６を有する、請求項１５３に記載の組換え抗体。
【請求項１５５】
前記抗体がヒト重鎖ＩｇＧ４定常領域を含む、請求項１４０〜１５２のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１５６】
前記ヒト重鎖ＩｇＧ４定常領域が、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、または配列番号６９を有する、請求項１５５に記載の組換え抗体。
【請求項１５７】
前記抗体がヒト重鎖ＩｇＧ２定常領域を含む、請求項１４０〜１５２のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１５８】
前記ヒト重鎖ＩｇＧ２定常領域が、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、または配列番号７１を有する、請求項１５７に記載の組換え抗体。
【請求項１５９】
前記抗体がヒト軽鎖λ定常領域を含む、請求項１４０〜１５８のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１６０】
前記ヒト軽鎖λ定常領域が配列番号４８を有する、請求項１５９に記載の組換え抗体。
【請求項１６１】
前記抗体が、配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項１５９に記載の組換え抗体。
【請求項１６２】
結合平衡除外法によって測定するＴＬ１ＡのＫＤが、約３０ｐＭ〜約６０ｐＭである、請求項１４０〜１６１のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１６３】
結合平衡除外法によって測定するＴＬ１ＡのＫＤが、約３５ｐＭ〜約５０ｐＭである、請求項１４０〜１６２のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１６４】
結合平衡除外法によって測定するＴＬ１ＡのＫＤが、約３５ｐＭ〜約４２ｐＭである、請求項１４０〜１６３のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１６５】
前記ＴＬ１Ａが非ヒト哺乳類ＴＬ１Ａである、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１６６】
前記非ヒト哺乳類が、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ネコ、イヌ、またはブタである、請求項１６５に記載の組換え抗体。
【請求項１６７】
請求項１４０〜１６６のいずれか一項に記載の組換え抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む、組成物。
【請求項１６８】
呼吸器疾患の治療方法であって、呼吸器疾患の治療を必要とする被験体に、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１６９】
前記呼吸器系疾患が、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、肺サルコイドーシス、アレルギー性鼻炎、または嚢胞性線維症である、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
胃腸疾患の治療方法であって、胃腸疾患の治療を必要とする被験体に、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１７１】
前記胃腸疾患が、炎症性腸疾患、大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、好酸球性食道炎、過敏性腸症候群、または嚢胞性線維症に関連する胃腸疾患である、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
関節炎の治療方法であって、関節炎の治療を必要とする被験体に、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１７３】
前記関節炎が関節リウマチである、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
皮膚疾患の治療方法であって、皮膚疾患の治療を必要とする被験体に、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１７５】
前記皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎、湿疹または強皮症である、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
前記投与が、静脈内投与または皮下投与を含む、請求項１６８〜１７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７７】
前記呼吸器疾患の治療に使用するための、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１７８】
前記喘息の治療に使用するための、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１７９】
前記ＣＯＰＤの治療に使用するための、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１８０】
前記肺サルコイドーシスの治療に使用するための、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１８１】
前記アレルギー性鼻炎の治療に使用するための、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１８２】
前記肺線維症の治療に使用するための、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１８３】
前記嚢胞性線維症の治療に使用するための、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１８４】
前記胃腸疾患の治療に使用するための、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１８５】
前記炎症性腸疾患の治療に使用するための、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１８６】
前記大腸炎の治療に使用するための、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１８７】
前記潰瘍性大腸炎の治療に使用するための、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１８８】
前記好酸球性食道炎の治療に使用するための、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１８９】
前記嚢胞性線維症に関連する胃腸疾患の治療に使用するための、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１９０】
前記過敏性腸症候群の治療に使用するための、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１９１】
前記クローン病の治療に使用するための、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１９２】
前記関節炎の治療に使用するための、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１９３】
前記関節リウマチの治療に使用するための、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１９４】
前記皮膚疾患の治療に使用するための、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１９５】
前記アトピー性皮膚炎の治療に使用するための、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１９６】
前記湿疹の治療に使用するための、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１９７】
前記強皮症の治療に使用するための、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体。
【請求項１９８】
喘息、ＣＯＰＤ、肺線維症、肺サルコイドーシス、アレルギー性鼻炎、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患、大腸炎、潰瘍性大腸炎、好酸球性食道炎、嚢胞性線維症に関連する胃腸疾患、クローン病、過敏性腸症候群、関節炎、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、湿疹、または強皮症のいずれか１つの治療に使用するための薬剤の調製における、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の組換え抗体の使用。
【請求項１９９】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の表面上のＴＬ１Ａのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法であって、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の抗体と、被験体から単離したＰＢＭＣとを接触させ、前記ＰＢＭＣの表面上のＴＬ１Ａに結合した前記抗体を検出し、場合により前記ＰＢＭＣ上のＴＬ１Ａのレベルを定量することを含む、前記検出方法。
【請求項２００】
血清中のＴＬ１Ａのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法であって、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の抗体と、被験体から採取した血清とを接触させ、血清中のＴＬ１Ａに結合した抗体を検出し、場合により前記血清中のＴＬ１Ａレベルを定量することを含む、前記検出方法。
【請求項２０１】
被験体から単離した組織試料中のＴＬ１Ａのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法であって、請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の抗体を、被験体から単離した組織と接触させて抗体‐ＴＬ１Ａ複合体を形成し、前記組織内の前記複合体を検出することを含む、前記検出方法。
【請求項２０２】
前記組織が、呼吸器組織、痰または気管支肺胞洗浄液を含む、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０３】
前記組織が胃腸組織を含む、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０４】
前記組織が関節組織を含む、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０５】
前記組織が皮膚組織を含む、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０６】
前記組織が血液を含む、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０７】
前記被験体から前記組織試料を単離することをさらに含む、請求項２０１〜２０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０８】
請求項１４０〜１６４のいずれか一項に記載の抗体を発現する形質転換細胞。
【請求項２０９】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項２０８に記載の形質転換細胞。
【請求項２１０】
前記哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項２０９に記載の形質転換細胞。
【請求項２１１】
前記哺乳類細胞がＨＥＫ２９３細胞である、請求項２０９に記載の形質転換細胞。
【請求項２１２】
配列番号３のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域をコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項２１３】
前記核酸配列が配列番号５１を有する、請求項２１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１４】
前記核酸配列が配列番号５８を有する、請求項２１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１５】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする第二の核酸配列をさらに有する、請求項２１２または２１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１６】
前記第二の核酸配列が配列番号５０を有する、請求項２１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする第二の核酸配列をさらに有する、請求項２１２〜２１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１８】
前記第二の核酸配列が配列番号５２を有する、請求項２１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１９】
前記第二の核酸配列が配列番号５９を有する、請求項２１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２０】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号６のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする第二の核酸配列をさらに有する、請求項２１２または２１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２１】
前記第二の核酸配列が配列番号５４を有する、請求項２２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号７のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする第二の核酸配列をさらに有する、請求項２１２または２１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２３】
前記第二の核酸配列が配列番号５５を有する、請求項２２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号８のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする第二の核酸配列をさらに有する、請求項２１２または２１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２５】
前記第二の核酸配列が配列番号５６を有する、請求項２２４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１０のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする第二の核酸配列をさらに有する、請求項２１２または２１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２７】
前記第二の核酸配列が配列番号５７を有する、請求項２２６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２８】
配列番号１のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域をコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項２２９】
前記核酸配列が配列番号４９を有する、請求項２２８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３０】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする第二の核酸配列をさらに有する、請求項２２８または２２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３１】
前記第二の核酸配列が配列番号５２を有する、請求項２３０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号５のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする第二の核酸配列をさらに有する、請求項２２８または２２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３３】
前記第二の核酸配列が配列番号５３を有する、請求項２３２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号６のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする第二の核酸配列をさらに有する、請求項２２８または２２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３５】
前記第二の核酸配列が配列番号５４を有する、請求項２３４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号７のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする第二の核酸配列をさらに有する、請求項２２８または２２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３７】
前記第二の核酸配列が配列番号５５を有する、請求項２３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号８のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする第二の核酸配列をさらに有する、請求項２２８または２２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３９】
前記第二の核酸配列が配列番号５６を有する、請求項２３８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４０】
請求項２１２〜２３９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２４１】
請求項２４０に記載のベクターを含む形質転換細胞。
【請求項２４２】
前記形質転換細胞が哺乳類細胞である、請求項２４１に記載の形質転換細胞。
【請求項２４３】
前記哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項２４２に記載の形質転換細胞。
【請求項２４４】
前記哺乳類細胞がＨＥＫ２９３細胞である、請求項２４２に記載の形質転換細胞。
【請求項２４５】
前記哺乳類細胞がＮＳ０細胞である、請求項７５、２０９、または２４２のいずれか一項に記載の形質転換細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１５年９月１８日に出願された米国仮出願第６２／２２０，４４２号の優先権を主張し、その内容は、あらゆる目的のためにその全体を参照として本明細書に援用する。
【０００２】
配列表への参照
本願は、２０１５年９月１８日に８９，０００バイトのサイズで作成したファイル名ＴＬ１Ａ＿ＳＴ２５のテキストファイルとして電子的に提出した配列表を含む。この配列表は参照として本明細書に援用する。
【０００３】
発明の分野
本開示は、一般に、抗体工学の分野に関する。より具体的には、本開示は、ＴＬ１Ａに特異的に結合し、ＴＬ１Ａと細胞死受容体３（ＤＲ３）との間の相互作用を阻害する変異型抗体に関する。いくつかの態様では、抗体はまた、ＴＬ１Ａとデコイ受容体３（ＤｃＲ３）との間の相互作用を阻害する。抗体は、変異体の由来元の親抗体に比べて力価が向上している。
【背景技術】
【０００４】
特許、公開出願、受託番号、技術論文及び学術論文を含む様々な刊行物を、本明細書を通して引用する。引用するこれらの各刊行物は、あらゆる目的のためにその全体を参照として本明細書に援用する。
ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１Ａ、ｓｙｎ．ＴＮＦスーパーファミリーメンバー１５（ＴＮＦＳＦ１５）；ＴＬ１及びＶＥＧＩ）は、抗原提示細胞（樹状細胞、Ｂ細胞及びマクロファージを含む）、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびに内皮細胞が発現する腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーである。ＴＬ１Ａは、細胞表面上に発現するか、または可溶性サイトカインとして分泌され得る。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞及びＦＯＸＰ３＋調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞ならびに２型及び３型自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ２及びＩＬＣ３）を含む様々な細胞が、ＴＬ１Ａの受容体である細胞死受容体３（ＤＲ３）を発現する。
【０００５】
ＴＬ１Ａは、ＤＲ３の競合阻害剤であるデコイ受容体（ＤｃＲ３）にも結合可能である。ＤｃＲ３はまた、Ｆａｓリガンド（Ｆａｓ‐Ｌ）及びリンホトキシン様誘導性タンパク質（ＬＩＧＨＴ）のデコイ受容体としても作用し、Ｔ細胞上のヘルペスウイルス侵入メディエーターへの結合に対してグリコプロテインＤと競合する。したがって、ＤｃＲ３はいくつかのシグナル伝達経路の重要な調節因子である。
【０００６】
ＴＬ１Ａ／ＤＲ３シグナル伝達経路は、ヒトの疾患に関連するいくつかの生物学的システムに関与している。例えば、ＴＬ１Ａは、関門組織の免疫、血管新生、及びホメオスタシスにおいて役割を果たすことが示されている。実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ；多発性硬化症のモデル）、大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、皮膚病、喘息及び関節炎などのいくつかの免疫介在性の病態において、ＴＬ１ＡとＤＲ３との相互作用を阻害することが治療効果を促進することも示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第７，０８３，７８４号
【特許文献２】米国特許第７，２１７，７９７号
【特許文献３】国際特許公開第ＷＯ００／０４２０７２号
【特許文献４】米国特許公開第２００９／０１４２３４０号
【特許文献５】米国特許公開第２００９／００６８１７５号
【特許文献６】米国特許公開第２００９／００９２５９９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、ＴＬ１Ａ活性を阻害する化合物は、例えば、それらの治療的、予防的、診断的及び予後的使用にとって望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書において、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号２９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む組換え抗体であって、但し、重鎖可変領域が配列番号１のアミノ酸配列を有する場合、軽鎖可変領域が配列番号２のアミノ酸配列を有さない組換え抗体を提供する。
【００１０】
いくつかの態様では、抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００１１】
本発明はまた、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む組換え抗体であって、但し、重鎖可変領域が配列番号１のアミノ酸配列を有する場合、軽鎖可変領域が配列番号２のアミノ酸配列を有さない組換え抗体も提供する。いくつかの態様では、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００１２】
いくつかの態様では、抗体は、配列番号６０のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。いくつかの態様では、抗体は、配列番号６０のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【００１３】
そのような組換え抗体は完全長であることが好ましく、モノクローナル抗体であることが好ましい。そのような組換え抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体に比べて高い親和性でＴＬ１Ａに結合する。そのような組換え抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体に比べて高い力価を有する。高い力価は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体に比べて、少なくとも約１０倍高い力価であり得る。高い力価は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体に比べて、少なくとも約１２倍高い力価であり得る。高い力価は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体に比べて、少なくとも約１３倍高い力価であり得る。高い力価は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体に比べて、少なくとも約１５倍高い力価であり得る。高い力価は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体に比べて、少なくとも約２０倍高い力価であり得る。高い力価は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体に比べて、少なくとも約２５倍高い力価であり得る。高い力価は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体に比べて、少なくとも約２７倍高い力価であり得る。高い力価は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体に比べて、少なくとも約４０倍高い力価であり得る。力価の倍増率は、ＴＦ‐１細胞におけるＴＬ１Ａ誘導性カスパーゼ力価アッセイによって測定し得る。
【００１４】
そのような組換え抗体は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域、ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域、またはヒトＩｇＧ４重鎖定常領域、またはそれらの任意のアロタイプを有する場合がある。ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、配列番号４２、または配列番号４３（ヒトＩｇＧ１ΔＫ）、または配列番号４４（ヒトＩｇＧ１  ＹＴＥ）、または配列番号６４（ヒトＩｇＧ１  ＹＴＥ及びΔＫ）または配列番号６３（ヒトＩｇＧ１  Ｌ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ，Ｇ２３７Ａ）または配列番号６２（ヒトＩｇＧ１  Ｌ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ，Ｇ２３７Ａ及びΔＫ）または配列番号６５（ヒトＩｇＧ１  Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ）または配列番号６６（ヒトＩｇＧ１  Ｌ２３５Ａ，Ｇ２３７Ａ及びΔＫ）を有する場合がある。ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域は、配列番号６７、または配列番号７０（ヒトＩｇＧ２ΔＫ）、または配列番号７１（ヒトＩｇＧ２  Ａ３３０Ｓ，Ｐ３３１Ｓ）または配列番号６８（ヒトＩｇＧ２  Ａ３３０Ｓ，Ｐ３３１Ｓ及びΔＫ）を有する場合がある。ヒトＩｇＧ４重鎖ＩｇＧ４定常領域は、配列番号４５、または配列番号４６（ヒトＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ及びΔＫ）、または配列番号４７（ヒトＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ及びＹＴＥ）、または配列番号６９（ヒトＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ，ＹＴＥ及びΔＫ）を有する場合がある。ＩｇＧ４重鎖は、安定化置換Ｓ２２８Ｐ（例えば、ＩｇＧ４  ＹＴＥのみ、またはＩｇＧ４  ＹＴＥ及びΔＫ、またはＩｇＧ４  ΔＫのみ）を必要とせずに使用できることが理解されるだろう。
【００１５】
組換え抗体は、ヒトλ軽鎖定常領域またはそのアロタイプを有する場合がある。ヒト軽鎖λ定常領域は、配列番号４８を有する場合がある。
【００１６】
そのような組換え抗体は、ヒトＴＬ１Ａに結合し、ヒト以外の霊長類のＴＬ１Ａ、またはマウス、ラット、モルモット、ネコ、イヌ、ウサギ、もしくはブタなどの非ヒト哺乳類のＴＬ１Ａに結合する可能性がある。
【００１７】
そのような組換え抗体は、呼吸器疾患の治療方法、胃腸疾患の治療方法、皮膚疾患の治療方法、または関節炎の治療方法に用いてもよく、または、呼吸器疾患、胃腸疾患、皮膚疾患、または関節炎の治療に用いてもよく、または呼吸器疾患、胃腸疾患、皮膚疾患、または関節炎の治療用薬剤の製造に使用してもよい。呼吸器疾患として、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、肺サルコイドーシス、アレルギー性鼻炎、または嚢胞性線維症のうちの１つ以上が挙げられ得る。胃腸疾患として、炎症性腸疾患、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、好酸球性食道炎、または過敏性腸症候群、または嚢胞性線維症に関連する胃腸疾患または病態の１つ以上が挙げられ得る。関節炎として、関節リウマチが挙げられ得る。皮膚疾患として、アトピー性皮膚炎、湿疹、及び強皮症の１つ以上が挙げられ得る。
【００１８】
そのような治療を必要とするヒト被験体、非ヒト霊長類被験体、または非ヒト哺乳類被験体を、抗体または抗体を含む組成物を用いて、例えば抗体またはその組成物を被験体に投与することによって、治療してもよい。投与は、非経口、例えば、皮下及び／または静脈内であってもよい。
【００１９】
そのような組換え抗体を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）表面上のＴＬ１Ａを検出する方法に用いてもよい。この方法は、本明細書に記載または例示するようなＴＬ１Ａに結合する抗体を、被験体から採取したＰＢＭＣに接触させ、ＰＢＭＣ表面上のＴＬ１Ａに結合した抗体を検出することを含む。この方法は、ＰＢＭＣ上のＴＬ１Ａのレベルを定量することをさらに含む場合がある。この方法は、被験体からＰＢＭＣを採取することをさらに含む場合がある。
【００２０】
そのような組換え抗体を、血清中のＴＬ１Ａを検出する方法に用いてもよい。この方法は、本明細書に記載または例示するようなＴＬ１Ａに結合する抗体を、被験体から採取した血清と接触させ、血清中のＴＬ１Ａに結合した抗体を検出することを含む。この方法は、血清中のＴＬ１Ａのレベルを定量化することをさらに含む場合がある。この方法は、被験体から採取した血液から血清を採取することをさらに含む場合がある。この方法は、被験体から血液を採取することをさらに含む場合がある。
【００２１】
そのような抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の１つ以上をコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、さらに重鎖定常領域及び／または軽鎖定常領域をコードする場合がある。
【００２２】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号３のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域をコードする核酸配列、例えば配列番号５１または配列番号５８を有する核酸配列を有する。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする核酸配列、例えば配列番号５０を有する核酸配列を有する。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号４のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする核酸配列、例えば、配列番号５２または配列番号５９を有する核酸配列を有する。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号６のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする核酸配列、例えば配列番号５４を有する核酸配列を有する。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号７のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする核酸配列、例えば配列番号５５を有する核酸配列を有する。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号８のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする核酸配列、例えば配列番号５６を有する核酸配列を有する。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする核酸配列、例えば配列番号５７を有する核酸配列を有する。
【００２３】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域をコードする核酸配列、例えば配列番号４９を有する核酸配列を有する。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号４のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする核酸配列、例えば配列番号５２を有する核酸配列を有する。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号５のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする核酸配列、例えば配列番号５３を有する核酸配列を有する。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号６のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする核酸配列、例えば配列番号５４を有する核酸配列を有する。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号７のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする核酸配列、例えば配列番号５５を有する核酸配列を有する。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号８のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする核酸配列、例えば配列番号５６を有する核酸配列を有する。
【００２４】
１つ以上のそのようなポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。１つ以上のそのようなポリヌクレオチドまたはそのようなベクターで形質転換した細胞を提供する。形質転換細胞は哺乳類であってもよく、好ましくは哺乳類発現宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、またはＨＥＫ２９３細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＣＤＲ１もしくはＣＤＲ２領域または親抗体（３２０‐１７９）可変重鎖のＣＤＲ２に隣接する選択したアミノ酸残基に対して行ったそれぞれの単一アミノ酸置換の位置及び同一性を示す。四角で囲んだ領域は、ＡｂＭナンバリングシステムによるＣＤＲを表す。
【図２】親抗体（３２０‐１７９）可変軽鎖のＣＤＲ１またはＣＤＲ３領域に対して行った単一のアミノ酸置換のそれぞれの位置及び同一性を示す。四角で囲んだ領域は、ＡｂＭナンバリングシステムによるＣＤＲを表す。
【図３】変異型抗ＴＬ１Ａ抗体重鎖のアライメントを示す。
【図４】変異型抗ＴＬ１Ａ結合抗体軽鎖のアライメントを示す。
【図５】ＳＰＲによって測定した変異型抗ＴＬ１Ａ抗体のＴＬ１Ａ解離フェーズの比較を示す。
【図６】変異型ＴＬ１Ａ抗体を用いたＴＦ‐１細胞カスパーゼ力価アッセイの結果を示す。
【図７】様々なＴＬ１Ａ抗体を用いたＴＦ‐１細胞カスパーゼ力価アッセイの結果を、親抗体３２０‐１７９と比較して示す。
【図８】抗体３２０‐５８７が、ＴＦ‐１細胞カスパーゼ力価アッセイにおいて、いくつかの異なる実験にわたって他の公表されている抗ＴＬ１Ａ抗体に比べて優れたＴＬ１Ａ力価を有することを示す。
【図９】ＥＬＩＳＡフォーマットで測定したアイソタイプ対照に比べて、ＤＲ３へのＴＬ１Ａの結合を阻害する様々な抗ＴＬ１Ａ抗体を示す。
【図１０】親抗体３２０‐１７９がＤｃＲ３へのＴＬ１Ａの結合を阻害しないのに対し、変異型抗ＴＬ１Ａ抗体がＴＬ１Ａ‐ＤｃＲ３相互作用を阻害することを示す。
【図１１】抗体３２０‐５８７が異なる種のＴＬ１Ａに交差反応して結合することを示しており；抗体は、試験したすべての種に由来するＴＬ１Ａに結合した。
【図１２】ラットＴＮＢＳ誘発性大腸炎モデルにおける抗体３２０‐５８７の投与の結果を示しており、抗体が大腸炎の症状を有意に寛解することを示す。
【図１３】免疫複合体で刺激したヒトＰＢＭＣから分泌されたヒトＴＬ１Ａを、抗体３２０‐５８７がＥＬＩＳＡ試験において検出することを示す。
【図１４】表面に膜ＴＬ１Ａを発現するヒトＰＢＭＣの集団を、抗体３２０‐５８７がフローサイトメトリー試験において検出することを示す。
【図１５】急性ＯＶＡ誘発性喘息に罹患しているラットに抗体３２０‐５８７を処置した結果、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の好酸球が有意に減少したことを示す。
【図１６Ａ】抗体３２０‐５８７を処置した急性ＯＶＡ誘発性喘息に罹患しているモルモットの処置結果を示しており、ＢＡＬＦ好酸球に改善が認められた。
【図１６Ｂ】抗体３２０‐５８７を処置した急性ＯＶＡ誘発性喘息に罹患しているモルモットの処置結果を示しており、ＢＡＬＦマクロファージに改善が認められた。
【図１６Ｃ】抗体３２０‐５８７を処置した急性ＯＶＡ誘発性喘息に罹患しているモルモットの処置結果を示しており、早期喘息反応後の気道過敏症に改善が認められた。
【図１６Ｄ】抗体３２０‐５８７を処置した急性ＯＶＡ誘発性喘息に罹患しているモルモットの処置結果を示しており、早期喘息反応の重篤度に改善が認められた。
【図１７Ａ】抗体３２０‐５８７を処置した急性ＯＶＡ誘発性喘息に罹患しているラットの処置結果を示しており、ＢＡＬＦの好酸球に改善が認められた。
【図１７Ｂ】抗体３２０‐５８７を処置した急性ＯＶＡ誘発性喘息に罹患しているラットの処置結果を示しており、ＢＡＬＦのマクロファージに改善が認められた。
【図１７Ｃ】抗体３２０‐５８７を処置した急性ＯＶＡ誘発性喘息に罹患しているラットの処置結果を示しており、ＢＡＬＦのＩＬ‐１３に改善が認められた。
【図１７Ｄ】抗体３２０‐５８７を処置した急性ＯＶＡ誘発性喘息に罹患しているラットの処置結果を示しており、ＰＡＳ反応性によって評価した杯細胞過形成に改善が認められた。
【図１７Ｅ】抗体３２０‐５８７を処置した急性ＯＶＡ誘発性喘息に罹患しているラットの処置結果を示しており、Ｈ＆Ｅ染色切片をもとに評価した粘膜肥厚に改善が認められた。
【図１８】気道閉塞を２倍にするのに必要なオボアルブミンの用量を示す。
【図１９】抗体３２０‐５８７で処置したＴＮＢＳ誘発性大腸炎に罹患しているラットの処置結果を示しており、潰瘍領域線維症に改善が認められた。
【図２０Ａ】抗体３２０‐５８７で処置したＴＮＢＳ誘発性大腸炎ならびにＤＮＢＳ誘発性大腸炎に罹患しているラットの比較、及び７日目及び１４日目における結腸重量／長さ比への効果を示す。
【図２０Ｂ】抗体３２０‐５８７で処置したＴＮＢＳ誘発性大腸炎ならびにＤＮＢＳ誘発性大腸炎に罹患しているラットの比較、及び７日目及び１４日目における結腸線維症への効果を示す。
【図２０Ｃ】抗体３２０‐５８７で処置したＴＮＢＳ誘発性大腸炎ならびにＤＮＢＳ誘発性大腸炎に罹患しているラットの比較、及び７日目及び１４日目における結腸浸潤への効果を示す。
【図２０Ｄ】抗体３２０‐５８７で処置したＴＮＢＳ誘発性大腸炎ならびにＤＮＢＳ誘発性大腸炎に罹患しているラットの比較、及び７日目及び１４日目における結腸損傷への効果を示す。
【図２０Ｅ】７及び１４日における潰瘍領域の代表的な切片を示す。
【図２１Ａ】抗体３２０‐５８７で処置したＤＮＢＳ誘発性大腸炎に罹患しているラットの治療結果を示しており、ＤＳＳ投与中の体重変化に改善が認められた。
【図２１Ｂ】抗体３２０‐５８７で処置したＤＮＢＳ誘発性大腸炎に罹患しているラットの治療結果を示しており、ＤＳＳ投与中の臨床スコアに改善が認められた。
【図２１Ｃ】抗体３２０‐５８７で処置したＤＮＢＳ誘発性大腸炎に罹患しているラットの治療結果を示しており、結腸重量／長さ比に改善が認められた。
【図２２】３２０‐５８７処置に応答したＴＬ１Ａ誘発性腹腔内サイトカインの変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本明細書及び特許請求の範囲全体を通じて、開示の態様に関する様々な用語を使用する。そのような用語は、他に特段の指示がない限り、当該分野における通常の意味を有するものとする。他の特別に定義する用語は、本明細書で提供する定義と一致するように解釈すべきである。
【００２７】
用語「被験体」及び「患者」は同じ意味で使用し、任意の動物を含む。哺乳類が好ましく、これには、伴侶動物（例えば、ネコ、イヌ）及び家畜哺乳類（例えば、ブタ、ウマ、ウシ）、ならびにマウス、ウサギ、及びラットを含むげっ歯類、モルモット、ならびに他のげっ歯類が含まれる。カニクイザルなどの非ヒト霊長類がより好ましく、ヒトが非常に好ましい。
【００２８】
抗体などの分子は、人間の手によって自然環境から改変及び／または除去される場合、「単離」されている。
【００２９】
本明細書中で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、他に明記されていない限り、複数の指示対象を含む。
【００３０】
抗体‐抗原相互作用の文脈における「特異性」とは、必ずしも絶対的な指定ではなく、抗原陰性細胞と比較した抗原陽性細胞に対する抗体の選択性の程度を示す相対的な用語を構成する場合がある。抗原陽性細胞に対する抗体の特異性は、抗体の可変領域によって、そして通常は抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）によって媒介される。構築物は、抗原陰性細胞と比較して抗原陽性細胞に対して約１００〜約１０００倍の特異性を有する場合がある。
【００３１】
本明細書中で使用する場合、用語「組換え」は、遺伝子改変または別の方法で実験室操作によって作製する遺伝子からの発現を含む。
【００３２】
本開示は、ＴＬ１Ａに特異的に結合する抗体３２０‐１７９の組換え改変した重鎖及び／または軽鎖可変領域を含む変異型抗ＴＬ１Ａ抗体を提供する。これらの３２０‐１７９変異型抗体は、ＴＬ１ＡがＤＲ３と相互作用する能力を阻害し、いくつかの態様ではＤｃＲ３との相互作用も阻害し、さらにＴＬ１ＡとＤＲ３との相互作用によって誘導されるシグナル伝達を阻害する。これらの抗体は、抗体３２０‐１７９に比べて高い力価を有する。これらの抗体は、抗体３２０‐１７９に比べてＴＬ１Ａに対して高い親和性を有する。
【００３３】
高い力価は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体に比べて、少なくとも約１０倍高い力価であり得る。高い力価は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体に比べて、少なくとも約１２倍高い力価であり得る。高い力価は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体に比べて、少なくとも約１３倍高い力価であり得る。高い力価は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体に比べて少なくとも約１５倍高い力価であり得る。高い力価は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体に比べて、少なくとも約２０倍高い力価であり得る。高い力価は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体に比べて、少なくとも約２５倍高い力価であり得る。高い力価は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体に比べて、少なくとも約２７倍高い力価であり得る。高い力価は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体に比べて、少なくとも約４０倍高い力価であり得る。力価の倍増率は、例えば、ＴＦ‐１細胞アッセイにおけるＴＬ１Ａ誘発性アポトーシスでのカスパーゼ放出を測定することによって決定してもよい。
【００３４】
３２０‐１７９変異型抗体を組換え発現させ、ＴＬ１Ａに特異的に結合させる。親抗体３２０‐１７９は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、３２０‐１７９変異型抗体は、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むが、但し、重鎖可変領域が配列番号１のアミノ酸配列を有する場合、軽鎖可変領域が配列番号２のアミノ酸配列を有さない。３２０‐１７９変異型抗体は、ＴＬ１ＡとＤＲ３との相互作用を阻害することができる。３２０‐１７９変異型抗体は、抗体３２０‐１７９に比べて高い力価を有し、及び／または抗体３２０‐１７９に比べてＴＬ１Ａに対する高い親和性を有する。
【００３５】
いくつかの態様では、重鎖可変領域は配列番号１のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は配列番号４のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、重鎖可変領域は配列番号３のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は配列番号２のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、重鎖可変領域は配列番号１のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は配列番号５のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、重鎖可変領域は配列番号１のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は配列番号６のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、重鎖可変領域は配列番号１のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は配列番号７のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、重鎖可変領域は配列番号１のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は配列番号８のアミノ酸配列を有する。いくつかの非常に好ましい態様では、重鎖可変領域は配列番号３のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は配列番号４のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、重鎖可変領域は配列番号３のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は配列番号６のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、重鎖可変領域は配列番号３のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は配列番号７のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、重鎖可変領域は配列番号３のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は配列番号８のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、重鎖可変領域は配列番号３のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は配列番号１０のアミノ酸配列を有する。
【００３６】
非常に好ましい態様では、３２０‐１７９変異型抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み、ＴＬ１Ａに特異的に結合する。いくつかの態様では、重鎖が配列番号６０を有するようにするために、配列番号３の重鎖可変領域をヒトＩｇＧ１（ΔＫ）重鎖定常領域（例えば、配列番号４３）に連結する。いくつかの態様では、軽鎖が配列番号６１を有するようにするために、配列番号４の軽鎖可変領域をλヒト軽鎖定常領域（例えば、配列番号４８）に連結する。３２０‐１７９変異型抗体は、ＴＬ１ＡとＤＲ３との相互作用を阻害することができる。変異型抗体は、抗体３２０‐１７９に比べて高い力価を有し、及び／または抗体３２０‐１７９に比べてＴＬ１Ａに対する高い親和性を有する。
【００３７】
いくつかの態様では、３２０‐１７９変異型抗体を組換え発現させ、前記抗体は、ＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。前記抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む場合がある。重鎖可変領域が配列番号１のアミノ酸配列を有する態様では、軽鎖可変領域は好ましくは配列番号２のアミノ酸配列を有さない。これらの３２０‐１７９変異型抗体は、ＴＬ１ＡとＤＲ３との相互作用を阻害することができる。これらの３２０‐１７９変異型抗体は、抗体３２０‐１７９に比べて高い力価を有し、及び／または抗体３２０‐１７９に比べてＴＬ１Ａに対する高い親和性を有する。
【００３８】
いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００３９】
いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号２３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００４０】
いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００４１】
いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００４２】
いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００４３】
いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００４４】
いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００４５】
いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００４６】
いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００４７】
いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００４８】
いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００４９】
いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域を含むが、但し、軽鎖可変領域は配列番号２のアミノ酸配列を有さない。いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域または軽鎖を含む。軽鎖可変領域は、さらにλ定常領域を含む場合がある。
【００５０】
いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び重鎖可変領域を含むが、但し、重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含まない。いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び重鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び重鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び重鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び重鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び重鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び重鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び重鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び重鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び重鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び重鎖可変領域を含む。いくつかの態様では、抗体はＴＬ１Ａに特異的に結合し、また、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び重鎖可変領域を含むが、但し、軽鎖可変領域が配列番号２のアミノ酸配列を有する場合、重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を有さない。重鎖可変領域は、さらに、本明細書に記載または例示する任意のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４重鎖定常領域アミノ酸配列を有する重鎖定常領域を含む場合がある。
【００５１】
３２０‐１７９変異型抗体は、ＴＬ１Ａに特異的に結合する。抗体は、ヒトＴＬ１Ａに結合し、カニクイザルＴＬ１Ａ、マウスＴＬ１Ａ、ラットＴＬ１Ａ、モルモットＴＬ１Ａ、ネコＴＬ１Ａ、イヌＴＬ１Ａ、ブタＴＬ１Ａ、またはウサギＴＬ１Ａの１つ以上に結合する場合がある。いくつかの態様では、抗体は、例えば、エピトープが共通の場合、複数の異なる種のＴＬ１Ａに結合し得る。いくつかの態様では、ヒトＴＬ１Ａは、配列番号３１、配列番号３２、または配列番号３３のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、カニクイザルＴＬ１Ａは、配列番号３４のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、マウスＴＬ１Ａは、配列番号３５のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、ラットＴＬ１Ａは、配列番号３６のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、モルモットＴＬ１Ａは、配列番号３７のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、ネコＴＬ１Ａは、配列番号３８のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、ブタＴＬ１Ａは、配列番号３９のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、ウサギＴＬ１Ａは、配列番号４０のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、イヌＴＬ１Ａは、配列番号４１のアミノ酸配列を有する。
【００５２】
３２０‐１７９変異型抗体は、ＴＬ１Ａ上のエピトープに対して結合親和性を有しており、平衡解離定数（ＫＤ）を有し、これは、ＫＩＮＥＸＡ（登録商標）アッセイ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ、ボイシ、アイダホ）などの結合平衡除外法によって測定可能である。
【００５３】
結合平衡除外法により測定するＴＬ１Ａ結合のＫＤは、好ましくは約１０００ｐＭ未満である。いくつかの態様では、結合平衡除外法により測定するＴＬ１Ａ結合のＫＤは、約５００ｐＭ未満、または約４００ｐＭ未満、または約３００ｐＭ未満、または約２００ｐＭ未満である。いくつかの好ましい態様では、結合平衡除外法により測定するＴＬ１Ａ結合のＫＤは、約１００ｐＭ未満である。
【００５４】
結合平衡除外法により測定するＴＬ１Ａ結合のＫＤは、約１０ｐＭ〜約１００ｐＭである場合がある。結合平衡除外法により測定するＴＬ１Ａ結合のＫＤは、約２５ｐＭ〜約７５ｐＭである場合がある。結合平衡除外法により測定するＴＬ１Ａ結合のＫＤは、約３０ｐＭ〜約６０ｐＭである場合がある。結合平衡除外法により測定するＴＬ１Ａ結合のＫＤは、約３０ｐＭ〜約５０ｐＭである場合がある。結合平衡除外法により測定するＴＬ１Ａ結合のＫＤは、約３５ｐＭ〜約５０ｐＭである場合がある。結合平衡除外法により測定するＴＬ１Ａ結合のＫＤは、約３６ｐＭ〜約４６ｐＭである場合がある。結合平衡除外法により測定するＴＬ１Ａ結合のＫＤは、約３８ｐＭ〜約４４ｐＭである場合がある。結合平衡除外法により測定するＴＬ１Ａ結合のＫＤは、約３９ｐＭ〜約４３ｐＭである場合がある。結合平衡除外法により測定するＴＬ１Ａ結合のＫＤは、約４０ｐＭ〜約４５ｐＭである場合がある。結合平衡除外法により測定するＴＬ１Ａ結合のＫＤは、約３５ｐＭ〜約４２ｐＭである場合がある。結合平衡除外法により測定するＴＬ１Ａ結合のＫＤは、約４０ｐＭである場合がある。結合平衡除外法により測定するＴＬ１Ａ結合のＫＤは、約４１ｐＭである場合がある。結合平衡除外法により測定するＴＬ１Ａ結合のＫＤは、約４２ｐＭである場合がある。結合平衡除外法において、抗体分子またはＴＬ１Ａ分子を定常結合パートナーとして用い、他の分子を滴定剤として用いてもよい。
【００５５】
３２０‐１７９変異型抗ＴＬ１Ａ抗体は、好ましくはＴＬ１Ａ陽性細胞に結合することができる。抗体は、約１００ｎＭ未満のＥＣ５０値でＴＬ１Ａ陽性細胞に結合する場合がある。抗体は、約７５ｎＭ未満のＥＣ５０値でＴＬ１Ａ陽性細胞に結合する場合がある。抗体は、約５０ｎＭ未満のＥＣ５０値でＴＬ１Ａ陽性細胞に結合する場合がある。抗体は、約３０ｎＭ未満のＥＣ５０値でＴＬ１Ａ陽性細胞に結合する場合がある。抗体は、約２５ｎＭ未満のＥＣ５０値でＴＬ１Ａ陽性細胞に結合する場合がある。抗体は、約２０ｎＭ未満のＥＣ５０値でＴＬ１Ａ陽性細胞に結合する場合がある。抗体は、約１８ｎＭ未満のＥＣ５０値でＴＬ１Ａ陽性細胞に結合する場合がある。抗体は、約１５ｎＭ未満のＥＣ５０値でＴＬ１Ａ陽性細胞に結合する場合がある。抗体は、約１３ｎＭ未満のＥＣ５０値でＴＬ１Ａ陽性細胞に結合する場合がある。抗体は、約１０ｎＭ未満のＥＣ５０値でＴＬ１Ａ陽性細胞に結合する場合がある。
【００５６】
３２０‐１７９変異型抗体は、好ましくはモノクローナルであり、より好ましくは、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む完全長抗体である。いくつかの態様では、抗体は、抗原結合特異性を保持するとともに好ましくは（例えば、ＴＬ１Ａに対する）３２０‐１７９親抗体分子の親和性の大部分またはすべてを保持する抗体の誘導体または断片または部分を含む。例えば、誘導体は、少なくとも１つの可変領域（重鎖または軽鎖可変領域のいずれか）を含む場合がある。適切な抗体誘導体及び断片の他の例としては、ポリエピトープ特異性を有する抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、二特異性抗体、一本鎖分子、ならびにＦＡｂ、Ｆ（Ａｂ′）２、Ｆｄ、Ｆａｂｃ、及びＦｖ分子、一本鎖（Ｓｃ）抗体、一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、個別の抗体軽鎖、個別の抗体重鎖、抗体鎖と他の分子との間の融合体、重鎖単量体または二量体、軽鎖単量体または二量体、１つの重鎖及び１つの軽鎖からなる二量体、ならびに他の多量体が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。一本鎖Ｆｖ抗体は、多価であってもよい。すべての抗体アイソタイプは、抗体誘導体、断片及び部分を産生するために使用してもよい。抗体の誘導体、断片、及び／または部分を、組換えにより産生し、任意の細胞型、原核生物または真核生物によって発現させてもよい。
【００５７】
完全長抗体では、各重鎖は重鎖可変領域（本明細書中ではＨＣＶＲまたはＶＨと略記する）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中ではＬＣＶＲまたはＶＬと略記する）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、より保存性の高いフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域と、そこに散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域とに、さらに細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。通常、抗体の抗原結合特性は、ＦＲ配列の変化よりも、ＣＤＲ配列の変化により妨げられる可能性が高い。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。
【００５８】
３２０‐１７９変異型抗体は完全にヒト型である。完全ヒト抗体は、分子全体がヒト型であるか、またはヒト由来であるか、またはヒト形態の抗体と同一のアミノ酸配列を有する抗体である。完全ヒト抗体は、ヒトＶ遺伝子ライブラリーから取得した抗体を含み、そこでは、例えば、抗体の可変領域をコードするヒト遺伝子を組換えにより発現させる。ヒト抗体をコードする遺伝子で形質転換した他の生物（例えば、マウス及びゼノマウス技術）または他の生物由来の細胞中で、完全ヒト抗体を発現させてもよい。それにもかかわらず、完全なヒト抗体は、ヒト配列によってコードされていないアミノ酸残基、例えば、ランダムまたは部位特異的突然変異によって導入した突然変異を含む場合がある。
【００５９】
いくつかの態様では、３２０‐１７９変異型抗体は、非免疫グロブリン由来タンパク質骨格を含む場合がある。例えば、（Ｋｕ＆Ｓｃｈｕｔｚ，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６５５２‐６５５６）を参照してもよく、前記文献は、２つのループをランダム化してＣＤＲを作製し、それらを抗原結合に関して選択した４ヘリックスバンドルタンパク質チトクロムｂ５６２について記載している。
【００６０】
３２０‐１７９変異型抗体は、抗体活性または安定性に影響を与え得る翻訳後修飾または部分を含む場合がある。これらの修飾または部分として、メチル化、アセチル化、グリコシル化、硫酸化、リン酸化、カルボキシル化、及びアミド化部分ならびに当該技術分野で周知の他の部分が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。部分は、本質的に免疫グロブリン分子上に一般に見出されるか、または原核及び真核発現系を含む組換え発現系によって抗体に付加する任意の化学基または基の組合せを含む。
【００６１】
本開示によって企図する側鎖修飾の例として、アミノ基の修飾、例えば、アルデヒドとの反応による還元的アルキル化とその後のＮａＢＨ４での還元；アセトイミド酸メチルによるアミド化；無水酢酸によるアシル化；シアン酸によるアミノ基のカルバモイル化；２，４，６‐トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸及び無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化；ならびにピリドキサール‐５‐リン酸によるリジンのピリドキシル化とその後のＮａＢＨ４による還元が挙げられる。
【００６２】
アルギニン残基のグアニジン基は、２，３‐ブタンジオン、フェニルグリオキサール及びグリオキサールなどの試薬を用いた複素環式縮合生成物の形成によって修飾してもよい。カルボキシル基は、Ｏ‐アシルイソウレア形成を介したカルボジイミド活性化とその後の、例えば対応するアミドへの誘導によって修飾してもよい。スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；過蟻酸からシステイン酸への酸化；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応；４‐クロロメルクリ安息香酸、４‐クロロメルクリフェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、２‐クロルメルクリ‐４‐ニトロフェノール及び他の水銀を用いた水銀誘導体の形成；アルカリ性ｐＨでのシアン酸を用いたカルバモイル化などの方法によって修飾してもよい。トリプトファン残基は、例えば、Ｎ‐ブロモスクシンイミドによる酸化、または２‐ヒドロキシ‐５‐ニトロベンジルブロミドまたはスルフェニルハライドによるインドール環のアルキル化によって修飾してもよい。一方、チロシン残基は、テトラニトロメタンによるニトロ化によって改変し、３‐ニトロチロシン誘導体を形成してもよい。ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化またはジエチルピロカルボネートによるＮ‐カルベトキシル化によって達成してもよい。
【００６３】
３２０‐１７９変異型抗体は、血清半減期及び生体内分布を調節する修飾を含む場合があり、これには、必ずしも限定するものではないが、異化作用からのＩｇＧの保護及び高い血清抗体濃度の維持に重要な役割を果たす受容体である新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）と抗体との相互作用を調節する修飾が含まれる。血清半減期を調節する修飾は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４のＦｃ領域で生じる場合があり、米国特許第７，０８３，７８４号に記載されているように、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅの三重置換（「ＹＴＥ」置換、ナンバリングは、ＥＵナンバリングシステム（Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９６９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ  ６３，７８‐８５）による）を含む。他の置換は、２５０位及び４２８位で生じる場合があり、例えば、米国特許第７，２１７，７９７号を参照されたく、ならびに３０７位、３８０位及び４３４位で生じる場合があり、例えば、国際特許公開第ＷＯ００／０４２０７２号を参照されたい。ＦｃＲｎ結合及び血清半減期を含む、Ｆｃ受容体への結合及びその後のこれらの受容体によって媒介される機能を調節する定常領域アミノ酸置換の例は、米国特許公開第２００９／０１４２３４０号、第２００９／００６８１７５号、及び第２００９／００９２５９９号に記載されている。任意のクラスの抗体の重鎖Ｃ末端リジンを省略または除去し、異種性（ΔＫ）を減少させてもよい。ヒトＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ（ＥＵナンバリング）置換は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体のＦａｂアーム交換を安定化させることができ（Ｌａｂｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７：８；７６７‐７７３）、この置換はＹＴＥ及び／またはΔＫの修飾と同時に存在させてもよい。
【００６４】
３２０‐１７９変異型抗体は、ヒト定常ドメインを含む。重鎖定常ドメインは、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４定常ドメインである。軽鎖定常ドメインは、好ましくはヒトλ定常ドメインである。適切なヒトλドメインは、配列番号４８を有する。
【００６５】
３２０‐１７９変異型抗体と共に使用してもよいヒト重鎖ＩｇＧ１定常領域は、ヒトＩｇＧ１（配列番号４２）、ヒトＩｇＧ１（ΔＫ）（配列番号４３）、ヒトＩｇＧ１  ２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ（配列番号４４）、ヒトＩｇＧ１  ２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ（ΔＫ）（配列番号６４）、ヒトＩｇＧ１  Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ（配列番号６３）、ヒトＩｇＧ１  Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ（ΔＫ）（配列番号６２）、ヒトＩｇＧ１  Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ（配列番号６５）、及びヒトＩｇＧ１  Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ（ΔＫ）（配列番号６６）から選択してもよい。３２０‐１７９変異型抗体と共に使用してもよいヒト重鎖ＩｇＧ２定常領域は、ΔＫを有するかまたは有さないヒトＩｇＧ２（配列番号６７及び配列番号７０）、及び（ΔＫ）を有するかまたは有さないヒトＩｇＧ２  Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ（配列番号７１及び配列番号６８）から選択してもよい。３２０‐１７９変異型抗体とともに使用してもよいヒト重鎖ＩｇＧ４定常領域は、ヒトＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ（配列番号４５）、ヒトＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ（ΔＫ）（配列番号４６）、ヒトＩｇＧ４  ２２８Ｐ／２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ（配列番号４７）、及びヒトＩｇＧ４  ２２８Ｐ／２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ（ΔＫ）（配列番号６９）から選択してもよい。
【００６６】
３２０‐１７９変異型抗体は、任意の化学的または生体分子部分に標識し、結合させ、または複合体化してもよい。標識した抗体は、治療的、診断的、または基礎研究用途に用いてもよい。そのような標識／複合体は、検出可能な、蛍光色素、電気化学発光プローブ、量子ドット、放射性標識、酵素、蛍光タンパク質、発光タンパク質、及びビオチンなどであり得る。標識／複合体は、化学療法剤、毒素、同位体、及び例えば癌細胞の死滅など、病態を治療するために使用する他の薬剤であってもよい。化学療法剤は、抗体の使用目的に適したものであれば、いずれであってもよい。
【００６７】
抗体を、公知の保護／遮断基によって誘導体化し、タンパク質分解切断を防止するか、または活性または安定性を促進してもよい。
【００６８】
本開示において、抗体及びそのサブドメイン（例えば、ＦＲ及びＣＤＲ）をコードするポリヌクレオチド配列を特徴付ける。ポリヌクレオチドとして、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡのハイブリッド、ならびに一本鎖、二本鎖、または三本鎖のＲＮＡ鎖、ＤＮＡ鎖またはそれらのハイブリッドが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。本明細書に記載または例示するように、ポリヌクレオチドは、３２０‐１７９変異型抗体の重鎖可変領域及び／または軽鎖可変領域をコードする核酸配列を有する場合がある。ポリヌクレオチド配列の相補配列もまた、本開示の範囲内である。
【００６９】
ポリヌクレオチドは、配列番号３のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域をコードする核酸配列を有する場合がある。配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５１のヌクレオチド配列を有する場合がある。
【００７０】
ポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域をコードする核酸配列を有する場合がある。配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４９のヌクレオチド配列を有する場合がある。
【００７１】
ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする核酸配列を有する場合がある。配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５０をコードする核酸配列を有する場合がある。
【００７２】
ポリヌクレオチドは、配列番号４のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする核酸配列を有する場合がある。配列番号４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５２をコードする核酸配列を有する場合がある。
【００７３】
ポリヌクレオチドは、配列番号５のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする核酸配列を有する場合がある。配列番号５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５３をコードする核酸配列を有する場合がある。
【００７４】
ポリヌクレオチドは、配列番号６のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする核酸配列を有する場合がある。配列番号６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５４をコードする核酸配列を有する場合がある。
【００７５】
ポリヌクレオチドは、配列番号７のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする核酸配列を有する場合がある。配列番号７のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５５をコードする核酸配列を有する場合がある。
【００７６】
ポリヌクレオチドは、配列番号８のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする核酸配列を有する場合がある。配列番号８のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５６をコードする核酸配列を有する場合がある。
【００７７】
ポリヌクレオチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする核酸配列を有する場合がある。配列番号１０のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５７をコードする核酸配列を有する場合がある。
【００７８】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、抗体重鎖可変領域をコードする第一の核酸配列及び抗体軽鎖可変領域をコードする第二の核酸配列を有する。第一の核酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をコードする場合がある。配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５１の核酸配列を有する場合があり、配列番号２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５０の核酸配列を有する場合がある。
【００７９】
第一の核酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をコードする場合がある。配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５１の核酸配列を有する場合があり、配列番号４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５２の核酸配列を有する場合がある。
【００８０】
第一の核酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域及び配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をコードする場合がある。配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５１の核酸配列を有する場合があり、配列番号６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５４の核酸配列を有する場合がある。
【００８１】
第一の核酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域及び配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をコードする場合がある。配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５１の核酸配列を有する場合があり、配列番号７のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５５の核酸配列を有する場合がある。
【００８２】
第一の核酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域及び配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をコードする場合がある。配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５１の核酸配列を有する場合があり、配列番号８のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５６の核酸配列を有する場合がある。
【００８３】
第一の核酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域及び配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をコードする場合がある。配列番号３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５１の核酸配列を有する場合があり、配列番号１０のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５７の核酸配列を有する場合がある。
【００８４】
第一の核酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をコードする場合がある。配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４９の核酸配列を有する場合があり、配列番号４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５２の核酸配列を有する場合がある。
【００８５】
第一の核酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域及び配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をコードする場合がある。配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４９の核酸配列を有する場合があり、配列番号５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５３の核酸配列を有する場合がある。
【００８６】
第一の核酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域及び配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をコードする場合がある。配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４９の核酸配列を有する場合があり、配列番号６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５４の核酸配列を有する場合がある。
【００８７】
第一の核酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域及び配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をコードする場合がある。配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４９の核酸配列を有する場合があり、配列番号７のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５５の核酸配列を有する場合がある。
【００８８】
第一の核酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域及び配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をコードする場合がある。配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４９の核酸配列を有する場合があり、配列番号８のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５６の核酸配列を有する場合がある。
【００８９】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、抗体重鎖可変領域をコードする第一の核酸配列及び重鎖定常領域をコードする第二の核酸配列を有する。好ましい態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号３のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域をコードする第一の核酸配列、及び配列番号４３のＩｇＧ１（ΔＫ）重鎖定常領域をコードする第二の核酸配列を有する、例えば、配列番号５８の核酸配列を有するポリヌクレオチドである。
【００９０】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、抗体軽鎖可変領域をコードする第一の核酸配列及び軽鎖定常領域をコードする第二の核酸配列を有する。好ましい態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号４のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードする第一の核酸配列、及び配列番号４８のλ軽鎖定常領域をコードする第二の核酸配列を有する、例えば、配列番号５９の核酸配列を有するポリヌクレオチドである。
【００９１】
本明細書に記載または例示する任意のポリヌクレオチドを、ベクター内に組み込んでもよい。したがって、ポリヌクレオチドを組み込んだベクターを、本開示の一部として提供する。ベクターは発現ベクターであってもよい。したがって、関心対象のポリペプチドをコードする配列を含む組換え発現ベクターを提供する。発現ベクターには、必ずしも限定するものではないが、調節配列、選択マーカー、精製タグ、またはポリアデニル化シグナルなどの１つ以上のさらなる配列を組み込んでもよい。そのような調節エレメントとして、転写プロモーター、エンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、または転写及び翻訳の終結を調節する配列が挙げられ得る。
【００９２】
発現ベクター、特に哺乳類の発現ベクターは、複製起点、発現させる遺伝子に連結させた適切なプロモーター及びエンハンサー、他の５′もしくは３′隣接非転写配列、５′もしくは３′非翻訳配列（必要なリボソーム結合部位など）、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、または転写終結配列などの１つ以上の非転写エレメントを含む場合がある。特定の宿主内で複製する能力を付与する複製起点もまた、組み込んでもよい。
【００９３】
ベクターを使用して、当業者に周知の広範な宿主細胞のいずれか、及び好ましくは抗体を発現可能な宿主細胞のいずれかを形質転換してもよい。ベクターとして、限定するものではないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、バクミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、及びバキュロウイルス、ならびに他の細菌、真核生物、酵母及びウイルスベクターが挙げられる。適切な宿主細胞として、限定するものではないが、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、または公知のまたは製造された任意の真核生物安定細胞株が挙げられ、また、細菌、酵母、及び昆虫細胞も含まれる。
【００９４】
抗体は、ハイブリドーマ細胞によって産生してもよい。ハイブリドーマの産生方法は当該分野で周知であり、確立されている。
【００９５】
本開示はまた、３２０‐１７９変異型抗体を含む組成物も提供する。組成物は、本明細書に記載及び／または例示する抗体のいずれか、ならびに許容可能な担体、例えば薬学的に許容可能な担体を含み得る。適切な担体としては、抗体の生物学的活性を妨害せず、好ましくは、それを投与する宿主に対して毒性を有さない任意の媒質が挙げられる。任意の適切な剤形で被験体に投与するために、組成物を製剤化してもよい。
【００９６】
３２０‐１７９変異型抗体を用いて、被験体の呼吸器疾患、胃腸疾患、関節炎、または皮膚疾患を治療してもよい。したがって、本開示は治療方法を特徴とする。一般的に、方法は、呼吸器疾患、胃腸疾患、関節炎、または皮膚疾患の治療を必要とする被験体に、３２０‐１７９変異型抗体またはその組成物を投与することを含み、それによって、呼吸器疾患、胃腸疾患  、関節炎、または皮膚疾患を治療する。３２０‐１７９変異型抗体は、本明細書に記載または例示する任意の抗体を含み得る。投与は、抗体を皮下投与することを含み得る。投与は、抗体を静脈内投与することを含み得る。被験体は好ましくはヒトである。被験体は、カニクイザルなどの非ヒト霊長類であってもよく、またはマウス、ラット、モルモット、ネコ、ブタ、ウサギ、またはイヌなどの哺乳類であってもよい。
【００９７】
呼吸器疾患を治療する態様では、本方法は、呼吸器疾患の治療を必要とする被験体に、３２０‐１７９変異型抗体またはその組成物を投与することを含む。呼吸器疾患として、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、肺サルコイドーシス、アレルギー性鼻炎、または嚢胞性線維症のうちの１つ以上が挙げられ得る。したがって、例えば、いくつかの態様では、本方法は、喘息の治療を必要とする被験体に３２０‐１７９変異型抗体、またはその組成物を投与し、それによって被験体における喘息を治療することを含む。いくつかの態様では、本方法は、ＣＯＰＤの治療を必要とする被験体に、３２０‐１７９変異型抗体またはその組成物を投与し、それによって被験体におけるＣＯＰＤを治療することを含む。いくつかの態様では、本方法は、肺線維症の治療を必要とする被験体に３２０‐１７９変異型抗体またはその組成物を投与し、それによって被験体における肺線維症を治療することを含む。いくつかの態様では、本方法は、肺サルコイドーシスの治療を必要とする被験体に３２０‐１７９変異型抗体またはその組成物を投与し、それによって被験体における肺サルコイドーシスを治療することを含む。いくつかの態様では、本方法は、アレルギー性鼻炎の治療を必要とする被験体に３２０‐１７９変異型抗体またはその組成物を投与し、それによって被験体におけるアレルギー性鼻炎を治療することを含む。いくつかの態様では、本方法は、嚢胞性線維症の治療を必要とする被験体に３２０‐１７９変異型抗体またはその組成物を投与し、それによって被験体における嚢胞性線維症を治療することを含む。
【００９８】
胃腸疾患を治療する態様では、本方法は、胃腸疾患の治療を必要とする被験体に、３２０‐１７９変異型抗体またはその組成物を投与することを含む。胃腸疾患として、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、好酸球性食道炎、または嚢胞性線維症に関連する胃腸疾患もしくは病態の１つ以上が挙げられ得る。したがって、例えば、いくつかの態様では、本方法は、ＩＢＤの治療を必要とする被験体に３２０‐１７９変異型抗体またはその組成物を投与し、それによって被験体におけるＩＢＤを治療することを含む。いくつかの態様では、本方法は、クローン病の治療を必要とする被験体に３２０‐１７９変異型抗体またはその組成物を投与し、それによって被験体におけるクローン病を治療することを含む。いくつかの態様では、本方法は、大腸炎の治療を必要とする被験体に３２０‐１７９変異型抗体またはその組成物を投与し、それによって被験体における大腸炎を治療することを含む。いくつかの態様では、本方法は、潰瘍性大腸炎の治療を必要とする被験体に３２０‐１７９変異型抗体またはその組成物を投与し、それによって被験体における潰瘍性大腸炎を治療することを含む。いくつかの態様では、本方法は、ＩＢＳの治療を必要とする被験体に３２０‐１７９変異型抗体またはその組成物を投与し、それによって被験体におけるＩＢＳを治療することを含む。いくつかの態様では、本方法は、好酸球性食道炎の治療を必要とする被験体に３２０‐１７９変異型抗体またはその組成物を投与し、それによって被験体における好酸球性食道炎を治療することを含む。いくつかの態様では、本方法は、嚢胞性線維症に関連する胃腸疾患もしくは病態の治療を必要とする被験体に３２０‐１７９変異型抗体またはその組成物を投与し、それによって被験体における嚢胞性線維症に関連する胃腸疾患もしくは病態を治療することを含む。
【００９９】
関節炎を治療する態様では、本方法は、関節炎の治療を必要とする被験体に３２０‐１７９変異型抗体またはその組成物を投与することを含む。関節炎は、関節リウマチを含み得る。したがって、例えば、いくつかの態様では、本方法は、関節リウマチの治療を必要とする被験体に３２０‐１７９変異型抗体またはその組成物を投与し、それによって被験体における関節リウマチを治療することを含む。
【０１００】
皮膚疾患を治療する態様では、本方法は、皮膚疾患の治療を必要とする被験体に３２０‐１７９変異型抗体またはその組成物を投与することを含む。皮膚疾患は、アトピー性皮膚炎、湿疹、または強皮症の１つ以上を含み得る。したがって、例えば、いくつかの態様では、本方法は、アトピー性皮膚炎の治療を必要とする被験体に３２０‐１７９変異体抗体またはその組成物を投与し、それによって被験体におけるアトピー性皮膚炎を治療することを含む。いくつかの態様では、本方法は、湿疹の治療を必要とする被験体に３２０‐１７９変異体抗体またはその組成物を投与し、それによって被験体における湿疹を治療することを含む。いくつかの態様では、本方法は、強皮症の治療を必要とする被験体に３２０‐１７９変異体抗体またはその組成物を投与し、それによって被験体における強皮症を治療することを含む。
【０１０１】
本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、呼吸器疾患の治療に使用するための医薬品の調製に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、胃腸疾患の治療に使用するための医薬品の調製に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、関節炎の治療に使用するための医薬品の調製に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、皮膚疾患の治療に使用するための医薬品の調製に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、喘息、ＣＯＰＤ、肺線維症、肺サルコイドーシス、アレルギー性鼻炎、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、好酸球性食道炎、嚢胞性線維症、関節炎、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、湿疹または強皮症に関連する胃腸疾患もしくは病態のいずれか１つの治療に使用するための薬剤の調製に使用してもよい。
【０１０２】
本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、呼吸器疾患の治療に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、胃腸疾患の治療に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、喘息の治療に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、皮膚疾患の治療に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、ＣＯＰＤの治療に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、肺線維症の治療に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、肺サルコイドーシスの治療に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、アレルギー性鼻炎の治療に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、嚢胞性線維症の治療に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、炎症性腸疾患の治療に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、クローン病の治療に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、大腸炎の治療に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、潰瘍性大腸炎の治療に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、好酸球性食道炎の治療に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、嚢胞性線維症に関連する胃腸疾患または病態の治療に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、過敏性腸症候群の治療に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、関節リウマチの治療に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、アトピー性皮膚炎の治療に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、湿疹の治療に使用してもよい。本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体を、強皮症の治療に使用してもよい。
【０１０３】
また、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体を、被験体から単離した組織試料に接触させて抗体‐ＴＬ１Ａ複合体を形成し、組織試料中の複合体を検出することを含む、被験体から単離した組織試料中のＴＬ１Ａのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法も提供する。
【０１０４】
例えば、３２０‐１７９変異型抗体を用いて、被験体から採取した組織試料中のＴＬ１Ａ陽性細胞を検出してもよい。抗体を用いて、ＴＬ１Ａ陽性末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、例えば被験体から採取したＰＢＭＣを検出してもよい。抗体を用いて、血清中のＴＬ１Ａを検出してもよい。そのような方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、またはｉｎ  ｓｉｔｕで行ってもよい。一般的に、本方法は、本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体のいずれかを、被験体から単離した組織または細胞、例えばＰＢＭＣに接触させて抗体‐ＴＬ１Ａ複合体を形成し、組織中または細胞上の複合体を検出することを含む。抗体を、検出可能な標識で標識してもよい。抗体を、検出可能な標識で標識した二次抗体で検出してもよい。組織は、血液または血清などの生物学的液体を含んでいてもよく、またはそのような生物学的液体であってもよい。組織は、肺組織などの呼吸器系組織、痰、気管支肺胞洗浄液、胃腸組織、または胃腸洗浄液を含んでいてもよく、またはそれらであってもよい。組織は、皮膚または真皮組織を含んでいてもよく、またはそれらであってもよい。組織は、体内の任意の関節を含んでいてもよく、またはそれらであってもよい。本方法は、被験体から組織を単離することをさらに含んでいてもよい。そのような方法は、例えば、組織中のＴＬ１Ａのレベルを定量すること、ＴＬ１Ａ陽性細胞のレベルを定量すること、または細胞上のＴＬ１Ａのレベルを定量すること、または血清中のＴＬ１Ａのレベルを定量することにより、定量的であり得る。
【０１０５】
本開示はまた、本明細書に記載及び例示する３２０‐１７９変異型抗体のいずれかを含むキットを特徴とする。本キットを用いて、とりわけ、診断、基礎研究、または治療法で使用するための抗体及び他の薬剤を供給してもよい。いくつかの態様では、キットは、本明細書に記載または例示する３２０‐１７９変異型抗体のいずれか１つ以上、及び呼吸器疾患の治療方法において、胃腸疾患の治療方法において、または関節炎の治療方法において１つ以上の抗体を使用するための指示書を含む。
【０１０６】
以下の実施例を、本開示をより詳細に説明するために提供する。それらは、本開示を例示することを意図するものであって、限定するものではない。
【実施例】
【０１０７】
実施例１
材料及び方法
これらの実施例のアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って番号付けしている。ＣＤＲは、本明細書を通してＣＤＲ定義システムのＡｂＭ法に従って定義している。
【０１０８】
１．１．  変異体集団の生成。抗体３２０‐１７９（それぞれ配列番号１及び２）の重鎖及び軽鎖の可変領域アミノ酸配列を、点突然変異体の設計のための鋳型として用いた。３２０‐１７９は、以前に、米国特許出願公開第２０１４／０２５５３０２号（その刊行物中、ＶＨは配列番号１８６であり、ＶＬは配列番号１９９である）において、３２０‐１７９として記載されている（Ｃ３２０‐１７９としても記載されている）。この抗体は、好ましい生物物理学的特性を有し、ＴＬ１Ａの強力な阻害剤であり、予測される低い免疫原性特性を有していた。
【０１０９】
３２０‐１７９の抗体変異体は、９つの代表的アミノ酸である、Ａ、Ｓ、Ｑ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｗ、Ｙのグループの１つを、軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ‐Ｌ１）、軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ‐Ｌ３）、重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ‐Ｈ１）及び重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ‐Ｈ２）における各ＣＤＲアミノ酸位置（ＡｂＭ命名法で定義するような）の１か所に対し、一回につき１残基を置換することによって作製した。Ａ、Ｓ、Ｑ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｗ、Ｙを組み込んだ抗体変異体は、可変重鎖の位置５９及び６０ならびに可変軽鎖の位置７９においても作製した。生成したすべての単一置換抗体変異体の完全なリストを図１（可変重鎖）及び２（可変軽鎖）にそれぞれ示す。
【０１１０】
１．２．  抗体発現ベクターの構築。アミノ酸配列からＤＮＡ配列への逆翻訳によって可変領域変異体を生成し、その後、合成オリゴヌクレオチドを組み立てることによって新規合成した。ＶＨ変異体を、ヒト定常領域を含む哺乳類発現ベクターにサブクローニングして、完全長抗体重鎖（ヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）を作製した（例えばＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０１８５７）。同様に、ＶＬ変異体を、ヒトλ軽鎖定常領域を含む哺乳類発現ベクターにサブクローニングして、完全長抗体λ鎖を作製した（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０ＣＧ０５．１）。いくつかの例では、完全長重鎖、及び別個に軽鎖をＤＮＡ配列に逆翻訳し、その後、合成オリゴヌクレオチドを組み立てることによって新規合成した。
【０１１１】
１．３．  抗体変異体の発現。抗体重鎖及び軽鎖をＥＸＰＩ２９３（登録商標）細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、カリフォルニア）に同時形質移入することにより、抗体を産生した。形質移入の前日に、実験に必要な細胞数を決定した。各２０ｍＬの形質移入に対し、２０ｍＬのＥＸＰＩ２９３（登録商標）発現培地中に３．６×１０７個の細胞が必要であった。形質移入の前の日に、細胞を０．９×１０６生存細胞／ｍＬの密度で播種し、２００ｒｐｍで回転するオービタルシェーカー上で、空気中８％ＣＯ２の加湿雰囲気下で３７℃、一晩インキュベートした。形質移入の日に、細胞数及び生存率を、自動細胞カウンターを用いて測定した。９８％を上回る生存細胞を含む培養物のみを使用した。各２０ｍＬの形質移入に対し、ＯＰＴＩ‐ＭＥＭ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、カリフォルニア）Ｉ還元血清培地（カタログ番号３１９８５‐０６２）中の１０μｇの重鎖ＤＮＡ及び１０μｇの軽鎖ＤＮＡを全量１．０ｍＬになるまで希釈することにより、脂質‐ＤＮＡ複合体を調製した。５４μＬのＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２９３試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、カリフォルニア）をＯＰＴＩ‐ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地中で全量１．０ｍＬに希釈した。両方のバイアルを穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートした。インキュベーション後、希釈したＤＮＡを希釈したＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２９３試薬及びＤＮＡ‐ＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２９３試薬混合物と混合し、室温でさらに２０分間インキュベートしてＤＮＡ‐ＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２９３試薬複合体を形成できるようにした。インキュベーション後、２ｍＬのＤＮＡ‐ＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２９３試薬複合体を、各５０ｍＬのバイオリアクターチューブ（ＴＰＰ  Ｔｅｃｈｎｏ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＡＧ）に添加した。陰性対照チューブに、ＤＮＡ‐ＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２９３試薬複合体の代わりに２ｍＬのＯＰＴＩ‐ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、カリフォルニア）Ｉ培地を加えた。細胞を、３７℃インキュベーター内において、空気中８％ＣＯ２の加湿雰囲気下、２００ｒｐｍで回転するオービタルシェーカー上でインキュベートした。形質移入のおよそ１６〜１８時間後、１００μＬのＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２９３  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  １及び１．０ｍＬのＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２９３  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ２を各バイオリアクターに加えた。形質移入のおよそ７２時間後に抗体を回収した。
【０１１２】
１．４．  抗体変異体の精製。各抗体変異体を、２０ｍＬの細胞培養物中のＥＸＰＩ２９３（登録商標）細胞で発現させた。培養物を５０ｍＬのファルコンチューブ中で３０００×ｇで２０分間スピンダウンし、上清を、０．２２μｍフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて濾過した。Ｇｉｌｓｏｎ  ＡＳＰＥＣ  ＧＸ２７４ロボットを用いて上清を精製した。簡潔に述べると、１．２ｍＬのＭＡＢＳＥＬＥＣＴ  ＳＵＲＥ（登録商標）プロテインＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ‐Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ  ウプサラ、スウェーデン）樹脂を充填したＳＰＥカートリッジ（Ａｇｉｌｅｎｔ、１２１３１０１４）を３カラム容量の１×ＰＢＳで予め平衡化した。１８ｍＬの上清をカラム上に流し、続いて４ｍＬの１×ＰＢＳ洗浄を行った。各カラムを０．９ｍＬの０．１Ｍクエン酸（ｐＨ２．９）で予備溶出した。精製した抗体を２ｍＬの０．１Ｍクエン酸（ｐＨ２．９）で溶出した。ＰＤ‐１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、抗体をＳｏｒｅｎｓｅｎｓ  ＰＢＳ（５９．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７．３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１４５．４ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ約５．８））中へ脱塩した。
【０１１３】
１．５．  ＳＰＲによって測定する抗体の発現及び抗原結合。ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してチップ表面にプロテインＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）をカップリングさせた。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００を用いて、プロテインＡをフローセル１及び２（あるいは、３及び４）に結合させた。抗体、あるいは（１．４に記載するように）精製抗体を含むＥＸＰＩ‐２９３（登録商標）細胞由来の上清をフローセル２の表面に通し、一方、フローセル１には緩衝液（ＨＢＳ‐ＥＰ）を通過させた。捕捉段階中に注入した上清または精製タンパク質の量（ならびに濃度）は、試行ごとに様々に異なり、それらは表３〜１１の見出しに記載されている。上清または精製抗体の注入終了時に、応答単位の変化を測定した。この値は、表３〜１１中に捕捉レベルとして報告した。抗体がＴＬ１Ａに結合したかどうかを判定するために、次いでＴＬ１Ａをフローセル１及び２に通し、応答単位をＴＬ１Ａの注射終了前に測定した（会合フェーズ）。この値は、表３〜１１中にＴＬ１Ａ結合レベル（早期）としてラベル付けしている。応答単位は、解離段階の終了前に測定した。この値は、表３〜１１中にＴＬ１Ａ結合レベル（後期）としてラベル付けしており、これはＴＬ１Ａ‐抗体複合体の解離の結果としてチップの表面から失われた抗体の量の尺度である。センサーグラムは二重に参照した（フローセル２をフローセル１及び緩衝液ブランクから差し引く）。スクリーニングする抗体変異体が多数存在するため、異なる実験でこれらをスクリーニングした（表３〜１１）。いずれの場合においても（実験３を除く）、比較のために親抗体３２０‐１７９を実験に含めた。各実験で使用する条件の概要は下記のとおりである：
【表１】
2018528773.tif 000002
【０１１４】
異なる種のＴＬ１Ａに対する抗ＴＬ１Ａの結合も、ＳＰＲを用いて測定した。抗ＴＬ１Ａ抗体をプロテインＡの表面に捕捉した。ヒト、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ブタ、イヌ、ネコまたはカニクイザルのいずれか由来のＴＬ１Ａを表面に流し、応答単位を測定した。
【０１１５】
１．６．  ＴＬ１Ａの産生。ヒトＴＬ１Ａは、Ｎ末端に位置するＨＩＳ及びＦＬＡＧタグを有するヒトＴＬ１Ａの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするＤＮＡ発現構築物を用いて、哺乳類ＥＸＰＩ２９３（登録商標）発現系で産生した。ＴＬ１Ａの他の種の形態は、公表されているデータベースの配列表に基づいて生成した。これらを以下にまとめる：
【表２】
2018528773.tif 000003
【０１１６】
分泌したＴＬ１Ａタンパク質を含有する培養上清を、２０００×ｇ、１０分間の遠心分離によって回収し、細胞を除去した。ＴＬ１Ａタンパク質を、ＨＩＳＴＲＡＰ（登録商標）ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて上清から精製した。溶出したタンパク質を、ＨＩＬＯＡＤ（登録商標）１６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｒｅｐグレードカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＰＢＳにバッファー交換し、約７０ｋＤａの画分をＨＩＬＯＡＤ（登録商標）２６／６０  ＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）２００プレップグレードカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのゲル濾過によって分離した。
【０１１７】
１．７．  ＴＦ‐１細胞株力価アッセイ。どの抗ＴＬ１Ａ抗体がＴＬ１Ａの生物学的活性を機能的に中和するかを判定するために、ＴＦ‐１細胞株におけるＴＬ１Ａ誘発アポトーシスを中和する能力について、抗体を試験した。ＴＦ‐１ヒト赤白血病細胞株（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ‐２００３）を標準条件下で培養した。ＴＦ‐１細胞（７．５×１０４個／ウェル）を、黒側面の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中、１００ｎｇ／ｍｌのヒトＴＬ１Ａ及び１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドの存在下でインキュベートして、アポトーシスを誘導した。１０μｇ／ｍＬ（６６．７ｎＭ）以下の濃度の試験抗体をプレートに添加し、４〜５時間インキュベートした。その後、アポトーシスの誘導を、Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｃａｓｐａｓｅｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、製造元の指示書に従って評価した。
【０１１８】
データを、最大アポトーシス（抗ＴＬ１Ａ抗体の非存在下で、ヒトＴＬ１Ａ＋シクロヘキシミドにより達成するアポトーシスレベル）に対する割合として表現することによって正規化した。
【０１１９】
１．８．  鉛抗体の受容体選択性。ＴＬ１Ａは、同族のシグナル伝達受容体ＤＲ３と、ＴＮＦファミリーメンバーＦａｓ‐Ｌ及びＬＩＧＨＴのデコイ受容体としても働くデコイ受容体ＤｃＲ３の両方に結合する。競合ＥＬＩＳＡにおいてその受容体へのＴＬ１Ａの結合を阻害する能力について、抗体を評価した。９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）上にＤＲ３／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＤｃＲ３／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を２μｇ／ｍｌの濃度でコーティングした。系列希釈した試験抗体を、１μｇ／ｍｌの単一部位ビオチン化ヒトＴＬ１Ａとともに３０分間プレインキュベートし、次いで、ＤＲ３／ＦｃまたはＤｃＲ３／Ｆｃをコーティングしたウェルにこれらを添加した。結合したＴＬ１Ａを、１：２０００希釈したストレプトアビジン‐西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて検出した。データは、抗ＴＬ１Ａ抗体の非存在下でのＴＬ１Ａの受容体への最大結合の割合として表現することによって正規化した。
【０１２０】
１．９．  結合平衡除外法。本アッセイは、平衡を摂動させることなく、結合パートナーの１つの遊離濃度を測定する。溶液は、溶液中の未修飾タンパク質を用いてオフラインで調製することができ、混合してから後日、親和性測定値を読み取って、平衡に到達したことを確定できる。結合平衡除外法では、一方の相互作用物質（定常結合パートナー、またはＣＢＰと呼ばれる）を一定の濃度に保持し、他方（滴定剤と呼ばれる）を系列希釈する。結合平衡除外法を用いて、抗体‐抗原相互作用の解離定数（ＫＤ）及び親和性を測定し得る。一般的な結合平衡除外法では、滴定剤をビーズ（例えば、セファロースまたはＰＭＭＡビーズ）に固定化し、これを用いて溶液中の遊離ＣＢＰを捕捉する。捕捉したＣＢＰの量を、二次標識プローブを用いて定量する。結合平衡除外法は、Ｄａｒｌｉｎｇ，ＲＫ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）ＡＳＳＡＹ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．２（６）：６４７‐５７に概説されている。
【０１２１】
成分を混合し、平衡へ到達可能にした。次に、結合平衡除外法を用いて、ＣＢＰの遊離画分を測定した。複数のＣＢＰ濃度を有する平衡曲線を、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）Ｐｒｏソフトウェア（バージョン４．１．１１、Ｓａｐｉｄｙｎｅ）内のｎ曲線解析ツールを用いて解析して、ロバスト性の高いＫＤ測定結果を得た。３２０‐５８７のヒトＴＬ１Ａに対する相互作用を、以下の２つの方向性から検討した：（１）ＣＢＰが３２０‐５８７であり、滴定剤がＴＬ１Ａである、及び（２）ＣＢＰがＴＬ１Ａであり、滴定剤が３２０‐５８７である。
【０１２２】
実施例２
実験結果
２．１．  Ｃ３２０‐１７９に比べて解離速度が同等または向上したＴＬ１Ａ結合変異体の選択。抗体３２０‐１７９の変異体を構築し、上記のように発現させた。各変異体のＥＸＰＩ２９３（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）上清をＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により評価し、得られたデータを親抗体３２０‐１７９のデータと比較した。いくつかの実験では、抗体を、プロテインＡクロマトグラフィー（１．４参照）を用いて精製し、精製抗体をＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）実験で使用した。表３〜１１は、各変異体の発現レベルを、早期及び後期の時点でのＴＬ１Ａへの結合とともに示す。後の実験（表１０及び１１）では、２つ以上のアミノ酸置換を含む抗体変異体を試験した。
【表３】
2018528773.tif 000004
【表４Ａ】
2018528773.tif 000005
【表４Ｂ】
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【表５Ａ】
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【表５Ｂ】
2018528773.tif 000008
【表６Ａ】
2018528773.tif 000009
【表６Ｂ】
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【表７Ａ】
2018528773.tif 000011
【表７Ｂ】
2018528773.tif 000012
【表８Ａ】
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【表８Ｂ】
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【表９Ａ】
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【表９Ｂ】
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【表９Ｃ】
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【表１０】
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【表１１】
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【０１２３】
３２０‐１７９と同等か、またはより優れた捕捉レベル、ならびに同等範囲のＴＬ１Ａ結合レベル（早期）及びＴＬ１Ａ結合レベル（後期）値を有する抗体を、力価アッセイに進行させた。これらの変異体は、表３〜１１に陰影表示で示す。いくつかの抗体についてＳＰＲによって測定した解離速度の比較を図５に示す。抗体のいくつかは、親抗体３２０‐１７９の解離速度よりも遅い速度で解離した。
【０１２４】
２．２  細胞ベースのアッセイで力価が向上した抗ＴＬ１Ａ抗体。解離速度の向上が、力価の向上した精製抗体と相関するかどうかを評価するために、変異体をＴＦ‐１細胞におけるＴＬ１Ａ誘導カスパーゼ活性アッセイで試験した。強力な抗体は、ＴＬ１Ａに結合し、ＤＲ３受容体のＴＬ１Ａ活性化を阻害することによって作用する。この受容体は、カスパーゼを活性化し、市販の試薬を用いて検出することができるアポトーシス経路を誘発する。各実験において、力価の倍増率について抗体変異体を３２０‐１７９と比較した。結果を表１２に示す。
【表１２Ａ】
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【表１２Ｂ】
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【０１２５】
＊＊１０倍以上の力価の倍増率を有する抗体のいくつかを、最大ｎ＝７のアッセイで実施した。結果はこの表に示すデータと一致した。図７は、３２０‐１７９に比べて力価が向上したいくつかの抗体のｎ＝４反復を示す。
【０１２６】
表１２及び図６に示すように、試験した単一置換抗体のいくつかは、３２０‐１７９に比べて優れた力価を有していた。試験したすべての単一置換抗体変異体のうち、２つは、３２０‐１７９と比較した場合に１０倍を超える力価の向上を示した。これらの変異体は３２０‐３３１（可変軽鎖にＹ９１Ｗ置換を含む）及び３２０‐５４７（可変重鎖にＮ５６Ｙ置換を含む）であった（図６）。通常、抗体ＶＨのＣＤＲ３は主に抗体結合に関与し、一方、対照的に、同定したＮ５６Ｙ置換は、抗体ＶＨのＣＤＲ２に存在する結合に実質的な影響を及ぼすことから、この結果は予想外なものである。変異体が、ＶＬ由来のＹ９１Ｗ、または別個のＶＨ中のＮ５６Ｙのいずれかを、力価を向上させる他の置換とともに組み入れて作製した場合、非常に強力な抗体が得られた。Ｙ９１Ｗ  ＶＬ置換をＮ５６Ｙ  ＶＨ置換と組み合わせて１つの抗体３２０‐５８７にした場合、３２０‐１７９に比べての向上した力価の倍増率は４０であった。図７は、４つの異なる反復実験を示し、４つの抗体３２０‐５８７、３２０‐５９１、３２０‐５９２、及び３２０‐６０１が３２０‐１７９に比べて力価が向上していることを示す。３２０‐１７９に比べて力価が向上したこれらの抗体の配列を図３（可変重鎖）及び図４（可変軽鎖）に示す。
【０１２７】
以前に記載した他の抗ＴＬ１Ａ抗体に対する３２０‐５８７の力価の比較を行った。これらの以前に記載した抗体として、米国特許第８，６４２，７４１号に記載される抗体１６８１Ｎ（ＶＨは配列番号１８；ＶＬは配列番号２６）、米国特許公開第２０１４／０３０８２７１号の抗体ＶＨ５／ＶＬ１（ＶＨは配列番号２４；ＶＬは配列番号１７）、米国特許第８，２６３，７４３号に記載されるヒト化１Ｂ４（ＶＨは配列番号７４；ＶＬは配列番号７５）、及び米国特許公開第２０１４／０２５５３０２Ａ１号に記載される３２０‐１６８（Ｃ３２０‐１６８とも呼ばれる）（ＶＨは配列番号１８１；ＶＬは配列番号１９４）が挙げられる。図８は、細胞ベースのアッセイにおいて３２０．５８７が前述の抗体に比べて優れた力価を有し、最も強力な抗ＴＬ１Ａ抗体であることを示している。
【０１２８】
２．３．  ＤＲ３及びＤｃＲ３受容体競合アッセイ。３２０‐１７９に比べて向上した力価を示す抗体を、その同種シグナル伝達受容体ＤＲ３またはデコイ受容体ＤｃＲ３へのＴＬ１Ａ結合を阻害する能力についてスクリーニングした。試験したすべての抗ＴＬ１Ａ抗体は、アイソタイプ対照と比較した場合に、ＤＲ３へのＴＬ１Ａの結合の阻害を示した（図９）。このことは、抗体がＴＬ１Ａ‐ＤＲ３相互作用をブロックすることによってＴＬ１Ａ活性を阻害することを裏付けている。
【０１２９】
米国特許公開２０１４／０２５５３０２Ａ１号に記載される以前の実験（実施例４）では、受容体競合アッセイにおいて、抗体３２０‐１７９（３２０‐１７９）を試験し、ＤｃＲ３ではなくＤＲ３に対するＴＬ１Ａの結合を選択的に阻害することが示された（図１０）。本明細書の図１０に示す実験において、３２０‐１７９がＴＬ１Ａ‐ＤｃＲ３相互作用を阻害しないことが再度示されている。これは、試験した改良した抗ＴＬ１Ａ抗体とは対照的である。抗体３２０‐５８７を含む、ＴＦ‐１細胞アッセイ（２．２節に記載されるような）において力価の向上が認められた抗体は、一貫してＴＬ１Ａ‐ＤｃＲ３相互作用を阻害した。
【０１３０】
まとめると、親抗体３２０‐１７９は、ＴＬ１Ａ‐ＤＲ３相互作用を阻害することができたが、ＴＬ１Ａ‐ＤｃＲ３相互作用を阻害することはできなかった。３２０‐２６７（ＶＨは配列番号１；ＶＬは配列番号１１）、３２０‐２７７（ＶＨは配列番号１、ＶＬは配列番号１２）、３２０‐２７８（ＶＨは配列番号１；ＶＬは配列番号１３）及び３２０‐５９１（ＶＨは配列番号３、ＶＬは配列番号９）などの向上した力価を有するいくつかの抗体は、ＴＬ１ａ‐ＤＲ３相互作用を阻害したが、ＴＬ１Ａ‐ＤｃＲ３相互作用は阻害しなかった。３２０‐３３１、３２０‐５４７、３２０‐５８３、３２０‐５８４、３２０‐５８５、３２０‐５８６、３２０‐５８７及びこれらの抗体の変異体などの向上した力価を有するいくつかの抗体は、ＴＬ１Ａ‐ＤＲ３及びＴＬ１Ａ‐ＤｃＲ３相互作用の両方を阻害することができる。
【０１３１】
２．４．  ３２０‐５８７の種交差反応性を、異なる種から組換え産生したＴＬ１Ａに結合するその能力について試験した。抗体は、試験したすべての種由来のＴＬ１Ａに対して結合した（図１１）。ヒト、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、カニクイザルＴＬ１Ａへの３２０‐５８７の結合は、解離速度が遅く、高い親和性相互作用を示した。抗体は、マウス及びウサギＴＬ１Ａに結合し、速い解離速度を有していた。
【０１３２】
２．５．  以下の動物疾患モデルにおける抗ＴＬ１Ａ抗体の試験用の前臨床有効性モデル：
喘息：アレルゲン誘発喘息―げっ歯類（マウス、ラットまたはモルモット）をオボアルブミン（ＯＶＡ）、特にニワトリ卵由来のＯＶＡ、及びミョウバンを皮内注射により感作し、次いで少なくとも２週間後に、エアロゾル化したＯＶＡによりチャレンジし、気道過敏、好酸球の流入及びサイトカイン産生の増加を含む喘息様症状を引き起こす（例えば、Ｈｙｌｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９：３９０‐９６）。そのようなモデルは、チャレンジを反復することで改変することができ、気道リモデリング及び線維化誘導の増加を伴う、より慢性の疾患特性を提示する（例えば、Ｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．３０：６５３‐６６１）。チリダニのような別のアレルゲンもまた、使用してもよい（例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５７：１９９１‐９）。あるいは、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）を、Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍなどの環境抗原で感作し、チャレンジして、気道過敏、好酸球の流入及びサイトカイン産生の増加を誘導してもよい（例えば、Ｗｅｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８７：８３５‐４１）。
【０１３３】
ＣＯＰＤ：煙吸引誘発性気道炎症―げっ歯類（マウス、ラットまたはモルモット）を週３〜７回、タバコ煙に少なくとも４週間曝露させ、好中球の肺蓄積、炎症性サイトカイン産生の増大、肺線維症及び肺高血圧症を特徴とするＣＯＰＤと同様の肺疾患を引き起こす（例えば、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ３３３０４）。煙への曝露中に肺への反復的な細菌またはウイルス感染を含めることによって、より深刻な形態の疾患を誘導してもよい（例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３５：１７５２‐６０）。煙誘発性ＣＯＰＤを有するげっ歯類を抗ＴＬ１Ａ抗体で処置し、治療効果についてスクリーニングを行う。
【０１３４】
肺線維症：ブレオマイシン誘発性肺線維症―げっ歯類（マウス、ラットまたはモルモット）を、ブレオマイシンの気管内／鼻腔内点滴または静脈内注射のいずれかで週に１〜２回、少なくとも３週間処置する。この処置は、有意かつ安定な肺線維症を誘発する（例えば、Ｐｉｎａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｒｅｓｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１６６：４１‐４６）。ブレオマイシン誘発性肺線維症を有するげっ歯類を抗ＴＬ１Ａ抗体で処置し、治療効果についてスクリーニングを行う。
【０１３５】
嚢胞性繊維症：ＣＦＴＲノックアウトフェレットモデル―ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症の原因遺伝子）の遺伝子ノックアウト、または公知の疾患関連変異に関してホモ接合性のフェレットは、気道の粘液閉塞、無気肺、間質性肺炎及び進行性の肺細菌のコロニー形成による反復肺感染を特徴とする嚢胞性繊維症様の疾患を自然発症的に発症した（例えば、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５０：５０２‐１２）。ＣＦＴＲ−／−フェレットを抗ＴＬ１ａ抗体で処置し、治療効果についてスクリーニングを行う。
【０１３６】
過敏性腸症候群：ストレス誘発性内臓過敏症―新生児‐母系分離（例えば、Ｃｏｕｔｉｎｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８２：Ｇ３０７‐１６）または成体の拘束（例えば、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｍｏｔｉｌ．１６：２８１‐９０）のいずれによってラットにストレスを誘導する。これはＩＢＳ患者で観察されたものと同様の結腸運動性の変化及び内臓過敏性を生じると予想される。ストレスを与えたラットを抗ＴＬ１Ａ抗体で処置し、治療効果についてスクリーニングを行う。
【０１３７】
リウマチ様関節炎：コラーゲン誘発性関節炎―げっ歯類（マウス、ラットまたはモルモット）を免疫化し、アジュバント中のコラーゲンで追加免疫する。動物は、両側の足の腫脹及び紅斑、関節領域への炎症性浸潤、ならびに関節損壊を生じる（例えば、Ｂｅｎｄｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．２７：１３４‐４２）。コラーゲン誘発性関節炎を有するげっ歯類を、抗ＴＬ１Ａ抗体で処置し、治療効果についてスクリーニンを行う。
【０１３８】
好酸球性食道炎：鼻腔内Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ誘発性好酸球性食道炎。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｉｓの反復的な鼻腔内点滴に曝露したマウスは、顕著な食道好酸球増加症、上皮異形成及び過形成、ならびに遊離好酸性顆粒を生じる（例えば、Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０７：８３‐９０）。同様に、感作モルモットにおけるオボアルブミンへのエアロゾル曝露を２週間にわたり繰り返すことにより、好酸球及び肥満細胞の両方が上皮層に浸潤した食道好酸球増加症を引き起こす（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３０８：Ｇ４８２‐４８８）。好酸球性食道炎のマウスまたはモルモットを、抗ＴＬ１Ａ抗体で処置し、治療効果についてスクリーニングを行う。
【０１３９】
２．６．  本開示のＴＬ１Ａ抗体を含有する試料を検出する際に、ＴＬ１Ａ抗体を用いてヒト試料中のＴＬ１Ａを検出することができる。免疫複合体で刺激したヒトＰＢＭＣから分泌されたヒトＴＬ１Ａを、ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて３２０‐５８７を用いて検出した（図１３）。また、表面上に膜ＴＬ１Ａを発現するヒトＰＢＭＣの集団を、フローサイトメトリー実験において３２０‐５８７を用いて検出した（図１４）。
【０１４０】
２．７．  結合平衡除外法によるヒトＴＬ１Ａに結合する抗ＴＬ１Ａ抗体の親和性測定。ＣＢＰとして３２０‐５８７を用いた場合の平衡到達時間：まず、３２０‐５８７／ＴＬ１Ａ相互作用のＫｏｎ速度を測定した。簡潔に述べると、３２０‐５８７及びＴＬ１Ａを混合することによって溶液を調製し、３時間にわたって様々な時点でアリコートを除去した。２０μｇ／ｍＬのＴＬ１Ａでコーティングしたセファロースビーズを充填したカラムに溶液を通すことにより、遊離の３２０‐５８７を捕捉した。捕捉した３２０‐５８７を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７結合抗ヒト抗体（０．５μｇ／ｍＬ）で検出した。このアッセイを２回繰り返して、８．３５×１０５Ｍｓ‐１及び７．４５×１０５Ｍｓ‐１のＫｏｎ速度が得られ、平均Ｋｏｎ速度は７．９０×１０５Ｍｓ‐１であった。次いで、このＫｏｎ速度を使用して、Ｓａｐｉｄｙｎｅウェブサイト（www.Sapidyne.com）に提供される理論的結合曲線ツールを用いて、様々な濃度の３２０‐５８７が平衡に達するのに必要な時間量を推定した。
【０１４１】
ＣＢＰとして３２０‐５８７を用いたＫＤ測定。ＣＢＰである３２０‐５８７を、アッセイ緩衝液（１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを補充したＤＰＢＳ）中で、１５、５０及び１５０ｐＭの最終濃度に希釈した。滴定剤であるヒトＴＬ１Ａをアッセイ緩衝液中に希釈して、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００、１０００及び３０００ｐＭの濃度系列を作成した。上記で測定した平衡に到達するまでの時間を用いて、３２０‐５８７を５０または１５０ｐＭのいずれかの濃度で含む場合の曲線を、２５℃のインキュベーター内で２日間経過させることにより平衡化した。１５ｐＭの３２０‐５８７を含む場合の曲線は、２５℃のインキュベーター内に３日間で平衡に到達した。平衡化期間の後、各反応における３２０‐５８７の遊離画分を上記のように定量した。１５、５０及び１５０ｐＭの３２０‐５８７で生成した平衡曲線のｎ曲線解析を用いて、ＫＤ値を決定した。
【０１４２】
ＣＢＰとしてＴＬ１Ａを用いた場合の平衡到達時間：この方向での平衡に到達するまでの時間を、上記の２．８に記載のように測定した３２０‐５８７／ＴＬ１Ａ相互作用のＫｏｎを用いて推定した。このフォーマットにおいて、３０μｇ／ｍＬの３２０‐５８７でコーティングしたＰＭＭＡビーズを充填したカラムに溶液を通すことによって、ＴＬ１Ａの遊離画分を捕捉した。捕捉したＴＬ１Ａを、抗６×ｈｉｓ  ＤｙＬｉｇｈｔ６５０抗体（０．７５μｇ／ｍＬ）で検出した。このアッセイを２回繰り返し、Ｋｏｎ速度６．１１×１０５Ｍｓ‐１及び５．７４×１０５Ｍｓ‐１が得られ、平均Ｋｏｎ速度は５．９３×１０５Ｍｓ‐１であった。
【０１４３】
ＣＢＰとしてＴＬ１Ａを用いたＫＤ測定：ＣＢＰであるヒトＴＬ１Ａをアッセイ緩衝液中において、３０、１００及び３００ｐＭの最終濃度に希釈した。滴定剤３２０‐５８７をアッセイ緩衝液中で希釈して、０．０５、０．１５、０．５、１．５、５、１５、５０、１５０、５００、１５００及び５０００ｐＭの濃度系列を作成した。
【０１４４】
上記の平衡に到達するまでの時間を用いることにより、２５℃のインキュベーター内に３日間で、すべての曲線が平衡状態に到達することができた。平衡化期間後、各反応におけるＴＬ１Ａの遊離画分を上記のように定量した。３０、１００及び３００ｐＭのＴＬ１Ａを用いて生成した平衡曲線のｎ曲線解析を用いて、ＫＤ値を決定した。
【０１４５】
２つのＫｉｎＥｘＡ法の間に良好な一致が観察されただけでなく、相対的に低い誤差率も観察された。ＣＢＰとして３２０‐５８７を用いて測定したＴＬ１Ａと３２０‐５８７との相互作用のＫＤ値は４０．９７±８．３３ｐＭであり（表１３）、一方、ＴＬ１ＡをＣＢＰとして用いて得られたＫＤは４１．５２±１３．５ｐＭであった（表１４）。
【表１３】
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【表１４】
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【０１４６】
３．０．  抗ＴＬ１ａ抗体を試験するための前臨床効果モデル
３．０．１．  喘息
ラットの急性オボアルブミン誘発性喘息。Ｂｒｏｗｎ‐Ｎｏｒｗａｙラットを、ＯＶＡを用いて０日目に腹腔内注射で感作し、次いで３５〜４２日目にＯＶＡエアロゾルを用いて毎日チャレンジした。抗体３２０‐５８７またはビヒクルを用いて、１４、２１、２８及び３５日目にラットを静脈内注射で処置した。４３日目の全細胞及び差分の細胞について、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を評価した。処置により、ＢＡＬＦの好酸球が有意に減少することが判明した（図１５）。
【０１４７】
ラットの慢性卵白アルブミン誘発性喘息。ラットに、ＯＶＡ＋ミョウバンを０日目及び７日目に腹腔内注射で感作させ、次いで、１４日目〜３１日目に開始して３週間にわたって週２回、及び３７日目から４２日目まで５日間連続で、ＯＶＡエアロゾルでチャレンジした。２４、２９、３４及び３９日目に静脈内投与により、動物を抗体３２０‐５８７またはビヒクルで処置した。４３日目の全細胞及び差分の細胞、ならびにサイトカインのパネルについてＢＡＬＦを評価した。肺切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）、ならびに過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色し、病変の範囲について評価した。３２０‐５８７を用いた処置により、ＢＡＬＦ好酸球及びマクロファージ（図１７Ａ及び１７Ｂ）、ＢＡＬＦ  ＩＬ‐４及びＩＬ‐１３（図１７Ｃ）、杯細胞過形成（図１７Ｄ）ならびに気管支上皮層の厚さ（図１７Ｅ）が、ビヒクルに比べて有意に減少した。
【０１４８】
モルモットにおける急性オボアルブミン誘発性喘息。雄のＤｕｎｋｉｎ  Ｈａｒｔｌｅｙモルモットをオボアルブミンに感作させ、その後、バルーンカテーテルを設置する手術を施し、肺機能及び早期及び遅発型喘息反応を測定した。１６、２０、２４及び２８日目に、動物を抗体３２０‐５８７またはビヒクルを用いて腹腔内投与により処置した。最後の処置から３０分後に、オボアルブミン（０．０５〜０．１％）エアロゾルによるチャレンジを実施した。チャレンジの２４時間前、チャレンジの６時間後（早期喘息反応の直後）及びチャレンジの２４時間後（遅発型喘息の直後）に、ヒスタミンへの気道反応性（ＡＨＲ）を測定した。早期喘息反応及び遅発型喘息反応の性質及び大きさは、全２４時間にわたる肺機能のオンライン登録によっても記録した。チャレンジの２５時間後に動物を屠殺し、気管支肺胞洗浄を行った。全細胞及び差分の細胞についてＢＡＬＦを評価した。３２０‐５８７の処置により、ビヒクルに比べて、ＢＡＬＦ中の好酸球及びマクロファージの両方が有意に減少し（図１６Ａ及び１６Ｂ）、ならびに早期喘息反応後のＡＨＲ（図１６Ｃ）、及び早期喘息反応の全体的な強度が改善した（図１６Ｄ）。
【０１４９】
モルモットにおける慢性卵白アルブミン誘発性喘息。雄のＤｕｎｋｉｎ  Ｈａｒｔｌｅｙモルモットをオボアルブミンに感作させ、その４週間後に、オボアルブミンを１２週間にわたってチャレンジした。オボアルブミンによるチャレンジ（０．０５〜０．５％）は、エアロゾル化した溶液の吸入によって気道閉塞が観察されるまで実施した。オボアルブミン曝露から８週目に開始して５日ごとに、動物を、抗体３２０‐５８７またはビヒクルの腹腔内投与によって処置した。最初のチャレンジの前、最後のチャレンジの２４時間前、及び最後のチャレンジの６時間後に、気道機能を、ヒスタミンに対する気道応答性によって測定した。ヒスタミンチャレンジによって誘導したＡＨＲに対する効果は観察されなかったが、気道閉塞を誘発するために漸増用量のＯＶＡが必要であったため、抗体３２０‐５８７はＯＶＡに対するアレルギー応答を有意に減少させた（図１８）。
【０１５０】
モルモットにおける急性及び慢性喘息モデルで観察される抗体治療効果の相違は、モデル自体の機能であると考えられる。慢性モデルでは、ＡＨＲの程度は経時的に減少し、したがって、治療に対して応答性が低下すると考えられている。当該技術分野では、急性モデルは一般に気道反応性に対する化合物の影響を観察するために使用され、慢性モデルは一般に気道リモデリングに対する化合物の影響を観察するために使用される。リモデリングの評価は進行中である。それにもかかわらず、アレルゲンに対する応答に影響を及ぼす抗体を観察したことは驚くべきことであった―抗体は、この段階で絶対的なＡＨＲ（ヒスタミンに対する応答）に実質的に影響を与えなかったものの、抗原に対する直接アレルギー応答を有意に減少させた。
【０１５１】
３．０．２．  炎症性腸疾患
ラットにおけるＴＮＢＳ誘発性大腸炎：エタノール中のトリニトロベンゼンスルホン酸の直腸内注入量の単回投与により、ラットを処置した。対照動物には等量のエタノールのみを与えた。７日間の間隔にわたって、動物は、炎症性浸潤及び様々な程度の線維症を伴う結腸の潰瘍形成を特徴とする局所性大腸炎を発症した（例えばＷｉｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２：５４１‐５４６）。３２０‐５８７を投与することにより、結腸の厚さ（図１２Ａ）、癒着の数及び重症度（図１２Ｂ）、ならびに狭窄の数及び重症度（図１２Ｃ）を含む多発性疾患の指標が有意に低下し、ビヒクル、またはアイソタイプが一致する無関係の抗体のいずれかで処置した動物に比べて、疾患の発症は有意に軽度であった（図１２Ｄ）。結腸線維症の軽減（図１９）も、３２０．５８７処置動物において観察された。
【０１５２】
ラットのＤＮＢＳ誘発性大腸炎における７及び１４日後の疾患の比較。ＴＮＢＳの代わりにジニトロベンゼンスルホン酸（ＤＮＢＳ）を用いて上記のように大腸炎を誘導し、また、ＤＮＢＳ実験に用いたラットはＷｉｓｔａｒラットであった。１及び８日目に静脈内投与により、動物を抗体３２０‐５８７またはビヒクルで処置した。ＤＮＢＳ後７及び１４日目に大腸炎について群を評価し、疾患の重篤度について２つの時点の間で比較した。抗体３２０‐５８７による処置は、７日目においては限定された効果を示すに過ぎなかったが、１４日目までに、抗体３２０‐５８７で処置した動物は、結腸の重量及び長さ（図２０Ａ）、線維症（図２０Ｂ）、炎症浸潤物（図２０Ｃ）ならびに結腸の損傷（図２０Ｄ）において有意な改善を示した。潰瘍領域の結腸の代表的な切片（図２０Ｅ）は、損傷修復の程度及び１４日間における線維症の減少を示している。７及び１４日目の両方で、ビヒクル処置動物は広範な炎症性浸潤及び線維症を示し、腸構造の有意な喪失を示した。対照的に、３２０‐５８７処置動物は、７日間で有意な炎症性浸潤、線維症及び腸構造の喪失を示したが、これらの効果は、１４日目までに大きく逆転した。
【０１５３】
ＴＮＢＳ及びＤＮＢＳモデルで観察した抗体治療効果で観察した相違は、異なる系統のラットの使用から生じると考えられる（ＴＮＢＳについてはＳｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙ、それに対し、ＤＮＢＳについてはＷｉｓｔａｒ）。各ラット系統は、免疫学的チャレンジに対する応答において差異を有し、その結果、これらのモデルにおける応答の反応速度は異なると考えられる。同様に、ＴＮＢＳ及びＤＮＢＳは構造的に異なっており、異なる疾患状態を誘発すると考えられる。
【０１５４】
ラットにおける慢性（２１日）ＤＳＳ誘発大腸炎。デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を５％ｗ／ｖの濃度で含む飲料水をラットに７日間与え、次いで２％ｗ／ｖの濃度で含む飲料水をさらに１４日間与えた。動物は、下痢、びまん性結腸炎症、杯細胞過形成、ならびに陰窩上皮損傷及び潰瘍を発症した（例えば、Ｒａｎｄｈａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｋｏｒｅａｎ  Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１８：２７９‐８８）。５、１２及び１９日目に静脈注射により抗体３２０‐５８７またはビヒクルでラットを処置した。毎日、動物を秤量し、臨床的疾患（下痢及び潜血）について評価し、２１日目に結腸重量及び長さを評価した。抗体３２０‐５８７処置は、体重増加に対するＤＳＳ誘発性減速を有意に逆転させ（図２１Ａ）、疾患の臨床的徴候を有意に寛解し（図２１Ｂ）、結腸の重量及び長さを有意に改善した（図２１Ｃ）。
【０１５５】
組換えヒトＴＬ１Ａによる腹腔内サイトカインの誘導。組換えマウスＴＬ１Ａの腹腔内注射により、ＩＬ‐５などの炎症性サイトカインの産生を誘導することができる。この試験では、抗体３２０‐５８７またはビヒクルのいずれかを単回投与したマウスを、その１時間後に、４０μｇ／マウスの組換えヒトＴＬ１Ａ（ｒｈＴＬ１Ａ）で処置した。ｒｈＴＬ１Ａ投与の６時間後に、腹腔洗浄を行い、多重アッセイによってサイトカイン及びケモカインについて腹腔液を評価した。抗体３２０‐５８７による処置は、サイトカインＧ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐１ｂ、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１７、及びケモカインＩＰ‐１０、ＫＣ、ＭＣＰ‐１、ＭＩＰ‐１ａ、ＭＩＰ‐１ｂ、ＭＩＰ‐２の腹膜濃度を有意に低下させた（図２２）。
【０１５６】
本開示は、上記に記載及び例示する実施例に限定するものではなく、添付の特許請求の範囲内において、変形及び改変が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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