(57)【要約】本発明は、ウイルスベクターを保存するための組成物および製剤、ならびにこれらの組成物および製剤の使用を提供する。特に、具体的な実施形態は、ウイルスベクターの長期保存ならびにインビトロおよびインビボの両方の用途に適した保護剤としての、トレハロースまたはその誘導体の組成物および製剤に関する。したがって、特定の実施形態において、（ａ）ウイルスベクターと、（ｂ）約３重量％〜約１５重量％のトレハロースまたはその誘導体と、（ｃ）薬学的に許容される希釈剤と、を含む水性組成物が提供される。一実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。別の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。さらに別の実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。【選択図】図２
2018510160.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ウイルスベクターと、
（ｂ）約３重量％〜約１５重量％のトレハロースまたはその誘導体と、
（ｃ）薬学的に許容される希釈剤と、
を含む、水性組成物。
【請求項２】
前記ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）から本質的になる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ−１である、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ−２である、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記ウイルスベクターは、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、ＦＩＶ、ＨＩＶ、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス（ＪＳＲＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、チャンディプラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、ネコ内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４）、エボラウイルス、狂犬病ウイルス、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、センダイウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、家禽ペストウイルス（ＦＰＶ）、インフルエンザウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、およびラゴスコウモリウイルスからなる群から選択されるウイルスのエンベロープポリペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ウイルスベクターは、ＶＳＶまたはＲＤ１１４由来のエンベロープポリペプチドを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ウイルスベクターは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド、改変Ｔ細胞受容体ポリペプチド、または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＣＡＲは、
ａ）葉酸受容体α、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソセリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメイン、
ｂ）ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ１５２からなる群から選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、
ｃ）ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０からなる群から選択される１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびに
ｄ）ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメイン、を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記細胞外ドメインは、前記抗原に結合する抗体または抗原結合断片を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＢＣＭＡポリペプチドに結合する前記抗体または抗原結合断片は、Ｃａｍｅｌ  Ｉｇ、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＢＣＭＡポリペプチドに結合する前記抗体または抗原結合断片は、ｓｃＦｖである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗体は、ヒト抗体、マウス抗体、またはヒト化抗体である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群から選択される２つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３４である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２２】
ヒンジ領域ポリペプチドをさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ヒンジ領域ポリペプチドは、ＣＤ８αのヒンジ領域を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
スペーサー領域ポリペプチドをさらに含む、請求項１１〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記スペーサー領域ポリペプチドは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３領域を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
シグナルペプチドをさらに含む、請求項１１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記シグナルペプチドは、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチドまたはＣＤ８αシグナルポリペプチドを含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ウイルスベクターは、ホーミングエンドヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＩＩ型クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ９）ヌクレアーゼ、または、ｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼ、をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ウイルスベクターは、βグロビンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ウイルスベクターは、ＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
前記組成物は、約３重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３２】
前記組成物は、約４重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記組成物は、約５重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記組成物は、約６重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３５】
前記組成物は、約７重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３６】
前記組成物は、約８重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３７】
前記組成物は、約９重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３８】
前記組成物は、約１０重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３９】
前記組成物は、約１１重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４０】
前記組成物は、約１２重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４１】
前記組成物は、約１３重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４２】
前記組成物は、約１４重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記組成物は、約１５重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４４】
前記組成物は、約５重量％〜約１５重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４５】
前記組成物は、約４重量％〜約１２重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４６】
前記組成物は、約５重量％〜約１０重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４７】
前記組成物は、約５重量％〜約９重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４８】
前記組成物は、約５重量％〜約８重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４９】
前記組成物は、約５重量％〜約７重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５０】
前記組成物は、約４重量％〜約６重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５１】
前記薬学的に許容される希釈剤は、生理学的に許容される緩衝液を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５２】
前記生理学的に許容される緩衝液は、ハンクス緩衝塩類溶液（ＨＢＳＳ）、リンゲル液、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、５％ブドウ糖液（Ｄ５Ｗ）、および生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）からなる群から選択される、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記薬学的に許容される希釈剤は、生理学的に許容される細胞培養培地を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５４】
前記薬学的に許容される細胞培養培地は、ＳｔｅｍＳｐａｎ−ＡＣＦ、ＳｔｅｍＳｐａｎ−Ｈ３０００、ＳｔｅｍＳｐａｎ−ＳＦＥＭ、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ、ＳｔｅｍＰｒｏ  ３４、ＳｔｅｍＸＶｉｖｏ、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）１６４０培地、マッコイ５Ａ培地、最小必須培地α培地（α−ＭＥＭ）、基本培地イーグル（ＢＭＥ）、フィッシャー培地、１９９培地、Ｆ−１２Ｋ栄養培地（Ｋａｉｇｈｎ改変培地、Ｆ−１２Ｋ）、およびＸ−ｖｉｖｏ２０からなる群から選択される、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記組成物が約２０℃で保存された場合、前記ウイルスベクターは、１ヶ月超の間、安定した力価を有する、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５６】
前記組成物が約２０℃で保存された場合、前記ウイルスベクターは、６ヶ月超の間、安定した力価を有する、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５７】
前記組成物が約２０℃で保存された場合、前記ウイルスベクターは、１年超の間、安定した力価を有する、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５８】
前記組成物が約１０℃で保存された場合、前記ウイルスベクターは、１ヶ月超の間、安定した力価を有する、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５９】
前記組成物が約１０℃で保存された場合、前記ウイルスベクターは、６ヶ月超の間、安定した力価を有する、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６０】
前記組成物が約１０℃で保存された場合、前記ウイルスベクターは、１年超の間、安定した力価を有する、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６１】
前記組成物が約４℃で保存された場合、前記ウイルスベクターは、１ヶ月超の間、安定した力価を有する、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６２】
前記組成物が約４℃で保存された場合、前記ウイルスベクターは、６ヶ月超の間、安定した力価を有する、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６３】
前記組成物が約４℃で保存された場合、前記ウイルスベクターは、１年超の間、安定した力価を有する、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６４】
前記組成物が約０℃で保存された場合、前記ウイルスベクターは、１年超の間、安定した力価を有する、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記組成物が約−２０℃で保存された場合、前記ウイルスベクターは、１年超の間、安定した力価を有する、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６６】
前記組成物が約−６０℃で保存された場合、前記ウイルスベクターは、１年超の間、安定した力価を有する、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６７】
前記組成物が約−７０℃で保存された場合、前記ウイルスベクターは、１年超の間、安定した力価を有する、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６８】
前記組成物が約−８０℃で保存された場合、前記ウイルスベクターは、１年超の間、安定した力価を有する、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６９】
前記ウイルスベクターの前記力価は、１回以上の凍結融解サイクルの間安定である、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７０】
前記ウイルスベクターの前記力価は、２回以上の凍結融解サイクルの間安定である、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７１】
前記ウイルスベクターの前記力価は、３回以上の凍結融解サイクルの間安定である、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７２】
前記組成物は、直接インビボ注射に適している、請求項１〜７１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７３】
前記組成物は、直接インビボ使用に適している、請求項１〜７１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７４】
前記組成物は、直接インビボ注射または直接インビボ使用の前に少なくとも１０倍希釈される、請求項７２または請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
前記組成物は、直接インビボ注射または直接インビボ使用の前に少なくとも５０倍希釈される、請求項７２または請求項７３に記載の組成物。
【請求項７６】
前記組成物は、直接インビボ注射または直接インビボ使用の前に少なくとも１００倍希釈される、請求項７２または請求項７３に記載の組成物。
【請求項７７】
前記組成物は、直接インビボ注射または直接インビボ使用の前に少なくとも２００倍希釈される、請求項７２または請求項７３に記載の組成物。
【請求項７８】
前記組成物は、直接インビボ注射または直接インビボ使用の前に少なくとも２５０倍希釈される、請求項７２または請求項７３に記載の組成物。
【請求項７９】
治療を必要とする対象における疾患を治療する方法であって、前記対象に請求項１に記載の組成物で形質導入された細胞集団を投与することを含む、方法。
【請求項８０】
請求項１〜７９のいずれか一項に記載の組成物を細胞集団に導入することを含む、請求項１に記載の組成物で細胞を形質導入する方法。
【請求項８１】
前記細胞は、哺乳動物細胞である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記細胞は、ヒト細胞である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記細胞は、幹細胞または前駆細胞である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
前記細胞は、造血細胞である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
前記造血細胞は、造血幹細胞もしくは前駆細胞、またはＣＤ３４を発現する細胞である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記造血細胞は、リンパ球である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
前記リンパ球は、Ｔリンパ球である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
（ａ）トレハロースまたはその誘導体を含む組成物を調製することと、
（ｂ）前記組成物にウイルスベクターを加えることと、を含む、
ウイルスベクターを安定化するための方法。
【請求項８９】
前記ウイルスベクターは、約−８０℃〜約２５℃の温度範囲で少なくとも１年間保存された場合に安定した力価を有する、請求項８１に記載の方法。
【請求項９０】
前記ウイルスベクターは、約−２０℃〜約１８℃の温度範囲で少なくとも１年間保存された場合に安定した力価を有する、請求項８１に記載の方法。
【請求項９１】
前記ウイルスベクターは、約−２０℃〜約４℃の温度範囲で少なくとも１年間保存された場合に安定した力価を有する、請求項８１に記載の方法。
【請求項９２】
前記ウイルスベクターは、約４℃〜約２５℃の温度範囲で少なくとも１年間保存された場合に安定した力価を有する、請求項８１に記載の方法。
【請求項９３】
前記ウイルスベクターは、約４℃〜約１８℃の温度範囲で少なくとも１年間保存された場合に安定した力価を有する、請求項８１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２０１５年３月２０日に出願された米国仮特許出願６２／１３６，３０９号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願に関連する配列表は、ペーパーコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み入れられる。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＢＬＢＤ＿０２５＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは３ＫＢであり、２０１６年３月１８日に作成され、本明細書の出願と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子形式で提出される。
背景
【０００３】
本発明は、概して、ウイルスベクターを安定化するための組成物および製剤に関する。特に、本発明は、長期保存における使用、ならびにインビトロおよびインビボの両方の用途向けのウイルスベクターの安定化のための、トレハロースまたはその誘導体を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
近頃、多数の疾患と闘うための遺伝子治療が成功を収めている。宿主細胞ゲノム中に安定して組み込むことができるレトロウイルスの能力に起因して、哺乳動物細胞に遺伝子を送達するためのレトロウイルスの使用が広まっている。ガンマレトロウイルスおよびレンチウイルスを含む多数のレトロウイルスベクターが、遺伝子治療に使用されてきた。
【０００５】
レンチウイルスは、複雑なレトロウイルスであり、それらのより高度な複雑性に基づいて、潜伏感染中等に、非増殖性細胞のゲノムに組み込んでそれらの生活環を調節することができる。これらのウイルスは、中でも、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶを含む。他のレトロウイルスと同様に、レンチウイルスは、２つの長末端反復（ＬＴＲ）配列によって隣接されたｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を有する。これらの遺伝子の各々は、最初は１つの前駆体ポリタンパク質として発現される複数のタンパク質をコードする。これらのタンパク質は、ウイルスの構造およびそのＲＮＡゲノムの複製にとって重要である。５’および３’ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進する役割を果たす。
形質導入の可能性およびレンチウイルスの効力は、ベクターの産生および保存中の増殖培地および血清成分における温度、ｐＨ、凍結融解頻度、およびインキュベーション条件によって影響を受ける。レンチウイルスの力価は、凍結融解サイクルの増加およびより高い温度での保存に伴って、二相性に低下することが観察されている（Ｋｉｇａｓｈｉｋａｗａ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ  ２００１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８０，１２４−１３１）。遺伝子治療が最も効果的であるためには、効力を維持するレトロウイルスベクターを有することが望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｉｇａｓｈｉｋａｗａ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ  ２００１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８０，１２４−１３１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
当該技術分野には、広範囲の温度にわたって種々の期間保存されたときに感染力価および／または異種配列の発現を維持し、インビトロまたはインビボ用途に一層適した、レンチウイルスベクター等のウイルスベクターを含む安定な水性組成物の必要性が存在する。
【０００８】
本発明は、概して、ウイルスベクターの保存のための組成物および製剤を提供する。実施形態は、ウイルスベクターの長期保存に適した保護剤として、トレハロースまたはその誘導体の水性組成物を提供する。特定の濃度のトレハロースを含有する溶液中に保存されたウイルスベクターは、トレハロースまたはその誘導体中に保存されていないウイルスベクターと比較すると、複数の凍結融解サイクルを通して、また幅広い期間にわたって、約−８０℃〜約２０℃の広い温度範囲で感染力価および／または異種配列の発現を維持する。
【０００９】
したがって、特定の実施形態において、（ａ）ウイルスベクターと、（ｂ）約３重量％〜約１５重量％のトレハロースまたはその誘導体と、（ｃ）薬学的に許容される希釈剤と、を含む水性組成物が提供される。一実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。別の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。さらに別の実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。
【００１０】
一実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）から本質的になる群から選択される。一実施形態において、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ−１である。別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ−２である。
【００１１】
一実施形態において、ウイルスベクターは、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、ＦＩＶ、ＨＩＶ、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス（ＪＳＲＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、チャンディプラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス、ネコ内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４）、エボラウイルス、狂犬病ウイルス、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、センダイウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、家禽ペストウイルス（ＦＰＶ）、インフルエンザウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、およびラゴスコウモリウイルスからなる群から選択されるウイルスのエンベロープポリペプチドを含む。具体的な実施形態において、ウイルスベクターは、ＶＳＶまたはＲＤ１１４由来のエンベロープポリペプチドを含む。
【００１２】
一実施形態において、ウイルスベクターは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド、改変Ｔ細胞受容体ポリペプチド、または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
一実施形態において、ＣＡＲは、ａ）葉酸受容体α、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソセリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメイン、ｂ）ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ１５２からなる群から選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、ｃ）ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０からなる群から選択される１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにｄ）ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
【００１４】
一実施形態において、ＣＡＲの細胞外ドメインは、抗原に結合する抗体または抗原結合断片を含む。別の実施形態において、ＢＣＭＡポリペプチドに結合する抗体または抗原結合断片は、Ｃａｍｅｌ  Ｉｇ、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群から選択される。別の実施形態において、抗体は、ヒト抗体、マウス抗体、またはヒト化抗体である。
【００１５】
一実施形態において、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来する。
【００１６】
一実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群から選択される。別の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群から選択される２つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む。具体的な実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８である。具体的な実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３４である。具体的な実施形態において、ＣＡＲの１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７である。
【００１７】
一実施形態において、ＣＡＲは、ヒンジ領域ポリペプチドをさらに含む。別の実施形態において、ヒンジ領域ポリペプチドは、ＣＤ８αのヒンジ領域を含む。
【００１８】
一実施形態において、ＣＡＲは、スペーサー領域ポリペプチドをさらに含む。別の実施形態において、スペーサー領域ポリペプチドは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。
【００１９】
一実施形態において、ＣＡＲは、シグナルペプチドをさらに含む。別の実施形態において、シグナルペプチドは、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチドまたはＣＤ８αシグナルポリペプチドを含む。
【００２０】
一実施形態において、ウイルスベクターは、ホーミングエンドヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＩＩ型クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ９）ヌクレアーゼ、または、ｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
一実施形態において、ウイルスベクターは、βグロビンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
一実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
別の実施形態において、水性組成物は、約３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１３重量％、１４％、または１５重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む。一実施形態において、水性組成物は、約３重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む。一実施形態において、水性組成物は、約４重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む。一実施形態において、水性組成物は、約５重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む。一実施形態において、水性組成物は、約６重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む。一実施形態において、水性組成物は、約７重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む。一実施形態において、水性組成物は、約８重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む。一実施形態において、水性組成物は、約９重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む。一実施形態において、水性組成物は、約１０重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む。一実施形態において、水性組成物は、約１１重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む。一実施形態において、水性組成物は、約１２重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む。一実施形態において、水性組成物は、約１３重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む。一実施形態において、水性組成物は、約１４重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む。一実施形態において、水性組成物は、約１５重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む。一実施形態において、組成物は、約５％〜約１５重量％のトレハロースまたはその誘導体を含む。別の実施形態において、組成物は、約４％〜約１２％のトレハロースまたはその誘導体を含む。別の実施形態において、組成物は、約５％〜約１０％のトレハロースまたはその誘導体を含む。別の実施形態において、組成物は、約５％〜約９％のトレハロースまたはその誘導体を含む。別の実施形態において、組成物は、約５％〜約８％のトレハロースまたはその誘導体を含む。別の実施形態において、組成物は、約５％〜約７％のトレハロースまたはその誘導体を含む。別の実施形態において、組成物は、約４％〜約６％のトレハロースまたはその誘導体を含む。
【００２４】
一実施形態において、薬学的に許容される希釈剤は、生理学的に許容される緩衝液を含む。別の実施形態において、生理学的に許容される緩衝液は、ハンクス緩衝塩類溶液（ＨＢＳＳ）、リンゲル液、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、５％ブドウ糖液（Ｄ５Ｗ）、および生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）からなる群から選択される。一実施形態において、薬学的に許容される希釈剤は、生理学的に許容される細胞培養培地を含む。別の実施形態において、薬学的に許容される細胞培養培地は、ＳｔｅｍＳｐａｎ−ＡＣＦ、ＳｔｅｍＳｐａｎ−Ｈ３０００、ＳｔｅｍＳｐａｎ−ＳＦＥＭ、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ、ＳｔｅｍＰｒｏ  ３４、ＳｔｅｍＸＶｉｖｏ、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）１６４０培地、マッコイ５Ａ培地、最小必須培地α培地（α−ＭＥＭ）、基本培地イーグル（ＢＭＥ）、フィッシャー培地、１９９培地、Ｆ−１２Ｋ栄養培地（Ｋａｉｇｈｎ改変培地、Ｆ−１２Ｋ）、およびＸ−ｖｉｖｏ２０からなる群から選択される。
【００２５】
別の実施形態において、組成物が約２０℃で保存された場合、ウイルスベクターは、１ヶ月超の間、安定した力価を有する。一実施形態において、組成物が約２０℃で保存された場合、ウイルスベクターは、６ヶ月超の間、安定した力価を有する。別の実施形態において、組成物が約２０℃で保存された場合、ウイルスベクターは、１年超の間、安定した力価を有する。
【００２６】
一実施形態において、組成物が約１０℃で保存された場合、ウイルスベクターは、１ヶ月超の間、安定した力価を有する。別の実施形態において、組成物が約１０℃で保存された場合、ウイルスベクターは、６ヶ月超の間、安定した力価を有する。別の実施形態において、組成物が約１０℃で保存された場合、ウイルスベクターは、１年超の間、安定した力価を有する。
【００２７】
一実施形態において、組成物が約４℃で保存された場合、ウイルスベクターは、１ヶ月超の間、安定した力価を有する。別の実施形態において、組成物が約４℃で保存された場合、ウイルスベクターは、６ヶ月超の間、安定した力価を有する。別の実施形態において、組成物が約４℃で保存された場合、ウイルスベクターは、１年超の間、安定した力価を有する。
【００２８】
一実施形態において、組成物が約０℃で保存された場合、ウイルスベクターは、１年超の間、安定した力価を有する。別の実施形態において、組成物が約−２０℃で保存された場合、ウイルスベクターは、１年超の間、安定した力価を有する。別の実施形態において、組成物が約−６０℃で保存された場合、ウイルスベクターは、１年超の間、安定した力価を有する。別の実施形態において、組成物が約−７０℃で保存された場合、ウイルスベクターは、１年超の間、安定した力価を有する。別の実施形態において、組成物が約−８０℃で保存された場合、ウイルスベクターは、１年超の間、安定した力価を有する。
【００２９】
別の実施形態において、ウイルスベクターの力価は、１回以上の凍結融解サイクルの間安定である。別の実施形態において、ウイルスベクターの力価は、２回以上の凍結融解サイクルの間安定である。別の実施形態において、ウイルスベクターの力価は、３回以上の凍結融解サイクルの間安定である。
【００３０】
一実施形態において、組成物は、直接インビボ注射に適している。別の実施形態において、組成物は、直接インビボ使用に適している。
【００３１】
一実施形態において、組成物は、直接インビボ注射または直接インビボ使用の前に少なくとも１０倍希釈される。別の実施形態において、直接インビボ注射または直接インビボ使用の前に少なくとも５０倍希釈される。別の実施形態において、組成物は、直接インビボ注射または直接インビボ使用の前に少なくとも１００倍希釈される。別の実施形態において、組成物は、直接インビボ注射または直接インビボ使用の前に少なくとも２００倍希釈される。別の実施形態において、直接インビボ注射または直接インビボ使用の前に少なくとも２５０倍希釈される。
【００３２】
種々の実施形態において、治療を必要とする対象における疾患を治療する方法であって、前記対象に本明細書に記載される水性組成物を形質導入された細胞集団を投与することを含む方法が企図される。
【００３３】
一実施形態において、水性組成物を細胞集団に導入することを含む、本明細書に記載される水性組成物を細胞に形質導入する方法が企図される。一実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞である。別の実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。別の実施形態において、細胞は、幹細胞または前駆細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、造血細胞である。
【００３４】
一実施形態において、造血細胞は、造血幹細胞もしくは前駆細胞、またはＣＤ３４を発現する細胞である。別の実施形態において、造血細胞は、リンパ球である。さらに別の実施形態において、リンパ球は、Ｔリンパ球ある。
【００３５】
別の実施形態において、（ａ）トレハロースまたはその誘導体を含む組成物を調製することと、（ｂ）組成物にウイルスベクターを加えることと、を含む、ウイルスベクターを安定化するための方法が企図される。一実施形態において、ウイルスベクターは、約−８０℃〜約２５℃の温度範囲で少なくとも１年間保存された場合に安定した力価を有する。別の実施形態において、ウイルスベクターは、約−２０℃〜約１８℃の温度範囲で少なくとも１年間保存された場合に安定した力価を有する。別の実施形態において、ウイルスベクターは、約−２０℃〜約４℃の温度範囲で少なくとも１年間保存された場合に安定した力価を有する。さらなる実施形態において、ウイルスベクターは、約４℃〜約２５℃の温度範囲で少なくとも１年間保存された場合に安定した力価を有する。さらに別の実施形態において、ウイルスベクターは、約４℃〜約１８℃の温度範囲で少なくとも１年間保存された場合に安定した力価を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】４℃で２４時間保存した、および−８０℃で２４時間保存して１度融解した後の、未希釈のレンチウイルスベクター組成物中で調べたレンチウイルスベクターの力価に融解が与える影響を示す。図１は、４℃で保存した未希釈のレンチウイルスベクターと比較して、−８０℃で保存した未希釈のレンチウイルスベクター組成物において平均力価（ＴＵ／ｍＬ）が減少したことを示す。
【図２】長期保存期間の間に種々の温度にわたって調べた、ＰＢＳ中に未希釈で保存した、または５％トレハロース／ＰＢＳ中に希釈して保存したレンチウイルスベクターの長期安定性を示す。４、１４、２８、４２、および７３日間、４℃で保存した、ならびに−２０℃および−８０℃で保存して１度融解した後のレンチウイルスベクターについて力価を測定した。図２は、５％トレハロースに配合されたレンチウイルスベクターが、少なくとも７３日間、試験温度にわたって安定なレンチウイルス力価を示すことを示している。
【図３】種々の濃度のトレハロースに配合された１．０Ｅ＋０８ＴＵ／ｍＬで形質導入した細胞において、フローサイトメトリーによって調べたレンチウイルスベクターの発現（ＲＦＰ発現）を示す。トレハロース／ＰＢＳ中に、４℃で２４時間保存した場合、および−８０℃で２４時間保存して１度融解した後、ＰＢＳ中に未希釈で保存したレンチウイルスベクターを含有する細胞と比較して、レンチウイルスベクターを含有するより多くの割合の細胞がＲＦＰを発現した。
【図４】４℃で保存した場合と比較して、より低い温度である−８０℃で保存した場合に、どの保存条件がレンチウイルスベクターに最も保護を提供したかを決定するために調べた図３の細胞試料の平均力価（ＴＵ／ｍＬ）における変化を示す。ＰＢＳ中に未希釈で保存したレンチウイルスベクターを含有する細胞が大きな負のΔＴＵ／ｍＬ値を有していたことから、レンチウイルスベクターは、一旦、−８０℃で２４時間保存し、その後融解した場合、４℃での保存と比較して安定性を保持しなかったことが示唆される。約１５％のトレハロース／ＰＢＳ中に保存したレンチウイルスベクターを含有する細胞が最大の正のΔＴＵ／ｍＬ値を示したことから、−８０℃で２４時間保存し、その後融解した場合、４℃での保存と比較して、レンチウイルスベクターの平均力価が実際に増加したことが示唆される。
【図５】保存組成物のトレハロース濃度（重量％、Ｘ軸）に対してプロットしたレンチウイルスベクターの力価（Ｙ軸）を示す。４℃および−８０℃の両方で最も低い希釈率でレンチウイルスベクターの最も高い保存率をもたらしたトレハロースの割合は、約１５％であった。
【図６】種々の濃度のトレハロース／ＰＢＳ中に−８０℃で保存した試料について調べたレンチウイルスベクターの力価を示す。ＰＢＳ中の未希釈の濃縮生成物も１：２で希釈した濃縮生成物も、試験したより低いトレハロース濃度でのトレハロースの保存効果は線形であった。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
Ａ．概要
遺伝子治療は、典型的にはウイルスベクターを使用して、標的細胞集団に対象とする修正遺伝子を導入することに関与する。レンチウイルス等のウイルスベクターは、４℃での長期間の保存、または−８０℃等のより低い温度で保存した後に複数の凍結融解サイクルを経る等の保存条件によって有害な影響を受ける。レンチウイルスの力価は、凍結融解サイクルの増加および温度の上昇に伴って低下することが観察されている。本発明者は、これらの水性組成物中に保存されていないウイルスベクターと比較して、種々の温度下および期間でウイルスベクターの効力を維持する水性組成物を同定した。
【００３８】
具体的な実施形態の実施は、そうではないと明示的に指示されない限り、当該技術分野の技術の範囲内である化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来の方法を用い、それらの多くは例示のために後述される。そのような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ  Ｊｕｌｙ  ２００８）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）；Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；およびＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）を参照されたい。
【００３９】
本明細書において引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４０】
Ｂ．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学的用語および技術的用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料はいずれも、具体的な実施形態の実施または試験において使用され得るが、好ましい組成物、方法、および材料の実施形態が、本明細書に記載される。本開示の目的のために、以下の用語を下記に定義する。
【００４１】
冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その冠詞の文法上の対象となる１つのまたは１つより多くの（すなわち、少なくとも１つ）ものを指すために本明細書で使用される。例として「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つの要素または１つより多くの要素を意味する。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、基準となる量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％だけことなる量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。具体的な実施形態において、「約」または「およそ」という用語が数値の前に記載される場合、その値±１５％、１０％、５％、または１％の範囲を示唆する。
【００４３】
「実質的に」または「本質的に」は、基準となる量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、長さ、もしくは力価、または他の測定値と比較して、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれ以上高い量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、長さ、もしくは力価、または他の測定値を指す。
【００４４】
本明細書全体を通して、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除いて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、記載されるステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群の包含を暗示するが、任意の他のステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群の除外を暗示するものではないことを理解されたい。「〜からなる」は、「〜からなる」という句に続くあらゆるものを含み、それに限定されることを意味する。したがって、「〜からなる」という句は、列挙される要素が必要または必須であり、他の要素はしなくてもよいことを示す。「〜から本質的になる」は、この句の後に列挙される任意の要素を含み、列挙される要素に関して本開示に明記されている活性または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「〜から本質的になる」という句は、列挙される要素は必要または必須であるが、他の要素は任意選択的ではなく、それらが列挙される活性または作用に影響を及ぼすかどうかに応じて存在してもまたはしなくてもよいことを示す。
【００４５】
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「別の実施形態」、「具体的な実施形態」、「関連する実施形態」、「特定の実施形態」、「追加の実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して記載されている特定の特徴、構造、または特性が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して種々の箇所に出現する上記の句は、必ずしも全てが同じ実施形態について言及しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性が、１つ以上の実施形態において任意の適切な様式で組み合わされてもよい。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「薬剤」または「化合物」という用語は、それらの全ての類似体および誘導体を制限なく含む、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ならびに他の有機および無機の化学物質を包含する。
【００４７】
有機化学物質等の化学物質に関連して、「類似体」または「誘導体」は、構造および機能において別の化学物質に類似しており、しばしば単一の元素または基が構造的に異なるが、それが親化学物質と同じ機能を保持する場合、１つより多くの基（例えば２、３、または４つの基）の修飾によって異なり得る化学分子に関する。そのような修飾は、当業者にはルーチン的であり、例えば、追加のまたは置換された化学部分、例えば、酸のエステルまたはアミド、アルコールまたはチオールのベンジル基等の保護基、およびアミンのｔｅｒｔ−ブトキシルカルボニル基を含む。また、アルキル側鎖に対する修飾、例えばアルキル置換（例えば、メチル、ジメチル、エチル等）、側鎖の飽和または不飽和のレベルに対する修飾、ならびに置換フェニルおよびフェノキシ等の修飾基の付加も含まれる。誘導体はまた、コンジュゲート、例えば、ビオチンまたはアビジン部分、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素も含み、放射標識部分、生物発光部分、化学発光部分、または蛍光部分も含まれる。さらに、本明細書に記載される薬剤に、それらの薬物動態特性を変化させるため、例えば、望ましい特性の中でもとりわけ、インビボもしくはエクスビボでの半減期を増加させるため、またはそれらの細胞浸透特性を高めるための部分が付加されてもよい。また、医薬品の数多くの望ましい品質（例えば、可溶性、生物学的利用能、製造等）を向上させることが分かっているプロドラッグも含まれる（例えば、例示的なＥＰアゴニストプロドラッグに関しては、ＷＯ／２００６／０４７４７６（参照によりそのようなアゴニストの開示について本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【００４８】
「保存する」は、生物学的物質の生物活性または完全性を本質的に維持するために組成物または製剤に含まれ得る「保護剤」または化合物の使用を指す。例えば、ウイルスベクターの感染力価および／またはウイルスベクターにおける異種配列の発現は、トレハロースによって保護され得る。生物学的物質を保護するための化合物の例として、トレハロース、トレハロースの誘導体、グリセロール、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、グルコース、スクロース、およびマルトースが挙げられる。同様に、「維持する」または「保存する」または「維持」または「変化なし」または「実質的な変化なし」または「実質的な減少なし」は、ビヒクル、対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答、または特定の細胞系列における応答と同等の生理学的応答を指す。同等の応答は、基準応答と有意に異ならないまたは測定可能なほど異ならない応答である。具体的な実施形態において、ウイルスベクターは、その力価がある温度で一定期間維持される場合、または力価が、約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、約５％未満、約１０％未満、約１２％未満、約１５％未満、約１８％未満、約２０％未満、約２２％未満、もしくは約２５％未満、または任意の中間値だけ減少する場合に、その温度で保存される。
【００４９】
「安定な」組成物は、その中のウイルスベクターが、ある温度で一定期間保存された場合に、その感染力価、ベクター粒子対感染性比、および／または異種配列の発現を実質的に保持する組成物である。ウイルスベクターの安定性を測定するための技術は、実施例に記載されており、また当該技術分野で既知である。安定性は、選択された期間の間、選択された温度で測定することができる。また安定性は、乖離度に加えて測定され得、具体的な実施形態において、約２０％、約２５％、約３０％、または約３５％である。好ましくは、組成物は、所与の期間、約２０℃、約１０℃、約４℃、約０℃、約−５℃、約−１０℃、約−２０℃、約−３０℃、約−４０℃、約−５０℃、約−６０℃、約−７０℃、約−８０℃で、またはその間の任意の温度で安定である。好ましくは、組成物は、所与の温度で、少なくとも約２４時間、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約６ヶ月、少なくとも約１年、少なくとも約２年、またはその間の任意の期間安定である。
【００５０】
具体的な実施形態において、ウイルスベクターは、その感染力価がある温度で一定期間（例えば、時間、日、週、月、年）維持される場合、または力価が、最初に測定された力価と比較して約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、約５％未満、約１０％未満、約１２％未満、約１３％未満、約１４％，約１５％未満、約１６％未満、約１７％未満、約１８％未満、約１９％、約２０％未満、約２１％未満、約２２％未満、約２３％未満、約２４％未満、約２５％未満、約２６％未満、約２７％未満、約２８％未満、約２９％未満、約３０％未満、約３１％未満、約３２％未満、約３３％未満、約３４％未満、もしくは約３５％未満、または任意の中間値だけ減少する場合に、その温度で安定である。一実施形態において、ウイルスベクターは、その感染力価が、最初に測定された力価と比較して約１５％未満〜約２５％未満、または任意の中間値だけ減少した場合に安定である。
【００５１】
具体的な実施形態において、ウイルスベクターは、ある温度で一定期間（例えば、時間、日、週、月、年）測定したときに、感染力価が最初の力価の約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９２％、約９０％、約８９％、約８８％、約８７％、約８６％、約８５％、約８４％、約８３％、約８２％、約８１％、約８０％、約７９％、約７８％、約７７％、約７６％、約７５％、約７４％、約７３％、約７２％、約７１％、約７０％、約６９％、約６８％、約６７％、約６６％、または約６５％である場合に、その温度で安定である。一実施形態において、ウイルスベクターの力価は、ある温度で一定期間測定したときに、感染力価が最初の力価の約８５％〜約７５％、または任意の中間値である場合に、その温度で安定である。
【００５２】
具体的な実施形態において、ウイルスベクターは、ウイルスのベクター粒子対感染性（Ｐ：Ｉ）比が、最初のまたは最初に測定されたウイルスの（Ｐ：Ｉ）の約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または任意の中間値以内であるとき、ある温度で安定である。一実施形態において、ウイルスベクターは、ウイルスのベクター粒子対感染性（Ｐ：Ｉ）比が、最初のまたは最初に測定されたウイルスの（Ｐ：Ｉ）の約５０％以内またはそれ以上である場合に、ある温度で安定である。
【００５３】
当業者は、組成物の安定性を測定する場合、列挙される温度を上回るおよび下回る温度、ならびに列挙される期間より短いおよび長い期間が適用され得ることを理解するであろう。さらに、組成物は、好ましくは、例えば、１、２、３、４、５回、またはそれ以上の凍結融解サイクルの間、組成物の凍結（例えば、−８０℃まで）および融解後に安定である。
【００５４】
Ｃ．トレハロースおよび誘導体
種々の実施形態において、本明細書において企図される組成物および製剤は、ウイルスベクターおよびトレハロースまたはその誘導体を含む。
【００５５】
トレハロース（α，α−トレハロース、α−Ｄ−グルコピラシノールα−Ｄ−グルコピラノシド、マッシュルーム糖、ミコースとしても知られる）は、α，α−１，１結合した２つのＤ−グルコース単位を含有する、天然に存在する二糖である。
【化１】
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【００５６】
トレハロースは、植物、藻、真菌、酵母、細菌、昆虫、および他の無脊椎動物に見出すことができる。トレハロースは、トレハロースを含有する生物に複数の形態で見られる高度に特異的な酵素であるトレハラーゼによって切断される。トレハロースは、酸によって容易に加水分解されず、グリコシド結合は、α−グルコシダーゼによって切断されない。この非還元性の糖は、その高度な旋光性および溶解挙動によって特徴付けられる。これは、非常に安定な二糖であると見なされる。トレハロースの異性体は、α，β（ネオトレハロース）およびβ，β（イソトレハロース）を含むが、これらの異性体が天然で見られることは稀である。
【００５７】
トレハロースを含有する現代の食料源は、ハチミツ、味醂、シェリー酒、酵母を使用して作製される多くの商品、商業用に栽培されるキノコ、およびロブスター、カニ、およびエビ等の無脊椎動物を含む。トレハロースは、ヒマワリ等の種子植物から単離することができる。
【００５８】
トレハロースは、発達中のエネルギー源として、構造成分として、または代謝中間体としての役割を果たすことを含む、自然界において多くの役割を有し得る。昆虫において、トレハロースは、飛翔のエネルギー源を提供すると考えられる。
【００５９】
「トレハロース誘導体」または「トレハロースの誘導体」は、化学的または物理的プロセスによってトレハロースから抽出した化合物を含み、前記化合物は、グリコシド結合に関与するアルデヒド基またはケトン基に由来するカルボニル炭素である遊離カルボニル炭素またはアノマー炭素を含有しない。トレハロースの誘導体のいくつかの例は、２，３，２’，３’−テトラ−Ｏ−ベンジル−６，６’−ジ−Ｏ−デカノイル−４，４’−ビス−Ｏ（ジフェニルホスフォノ）−α，αトレハロース、６，６’−ジ−Ｏ−デカノイル−４，４’−ジ−Ｏ−ホスフォノα，αトレハロース、２，３，２’，３’−テトラ−Ｏ−ベンジル−４，４’−ビス−Ｏ（ジフェニルホスフォノ）α，αトレハロース６，６’、脂肪酸エステルである。
【００６０】
Ｄ．組成物および製剤
本明細書において企図される組成物は、トレハロースまたはその誘導体および本明細書において企図されるウイルスベクターを含み得る。具体的な実施形態において、ウイルスベクターを保存および／または安定化するための組成物は、以下のように調製することができる：生理学的に許容される緩衝液に適量の無水トレハロースを溶解させ、トレハロースのストック溶液、例えば、約１Ｍ〜約２Ｍのトレハロースのストック溶液を得ることによりトレハロースまたはその誘導体のストック溶液を作製する；次いで、トレハロースのストック溶液を用いて種々の比率に希釈することにより、同じかまたは異なる生理学的に許容される緩衝液中にウイルスベクターを配合し、組成物、例えば、特定のトレハロースの最終重量パーセントでウイルスベクターを含む水溶液を得ることができる。
【００６１】
組成物は、限定されないが、薬学的組成物を含む。「薬学的組成物」は、単独でまたは１つ以上の外の治療様式と組み合わせて細胞または動物に投与するために、薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液または緩衝液中に配合された組成物を指す。また、所望の場合、組成物は、例えば、サイトカイン、増殖因子、小分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬物、抗体、または他の種々の薬学的に活性な物質と組み合わせて投与され得ることも理解されたい。追加の物質が、意図される治療を送達する組成物の能力に有害な影響を与えない限り、組成物中に含まれ得る他の成分に対する制限は実質的に存在しない。
【００６２】
「薬学的に許容される」という句は、妥当な利益／危険比に見合った、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を呈することなく、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適した、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために本明細書において用いられる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤」は、限定されないが、ヒトまたは飼育動物における使用が許可されるものとしてＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって承認されている、任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、色素／着色剤、香味強化剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、または乳化剤を含む。例示的な薬学的に許容される担体として、限定されないが、糖類、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース；デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース；トラガント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバター、ワックス、動物性および植物性脂肪、パラフィン、ケイ素、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；油類、例えば、落花生油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油；グリコール類、例えば、プロピレングリコール；ポリオール類、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；パイロジェン不含水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；ならびに薬学的製剤に使用される任意の他の適合性物質が挙げられる。
【００６４】
「生理学的に許容される溶液」または「生理学的に許容される緩衝液」は、ヒトまたは飼育動物における使用が許可される水溶液を指す。例示的な生理学的に許容される緩衝液として、限定されないが、パイロジェン不含水、等張食塩水（０．９％ＮａＣｌ）、ハンクス緩衝塩類溶液（ＨＢＳＳ）、リンゲル液、５％ブドウ糖液（Ｄ５Ｗ）、および生理的緩衝塩、例えば、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。
【００６５】
具体的な実施形態において、本明細書において企図される組成物は、培地のｐＨをウイルスベクターに最適な値に維持するための緩衝液を含む。例えば、緩衝液は、リン酸緩衝液、または約７の生理的ｐＨを可能にする別の緩衝液であってもよい。具体的な実施形態において、組成物は、約７、約７．１、約７．２、約７．３、または約７．４のｐＨを有する。一実施形態において、組成物は、約７．４のｐＨを有する。
【００６６】
具体的な実施形態において、ウイルスベクターを保存および／または安定化するための水性組成物は、以下のように調製することができる：リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に適量の無水トレハロースを溶解させ、例えば、約１Ｍ〜約２Ｍのトレハロース／ＰＢＳのストック溶液を得ることによりトレハロースまたはその誘導体のストック溶液を作製する；次いで、トレハロース／ＰＢＳのストック溶液を用いて種々の比率に希釈されたＰＢＳ中にウイルスベクターを配合し、特定のトレハロースの最終重量パーセントでウイルスベクターを含む水性組成物を得ることができる。
【００６７】
一実施形態において、ウイルスベクターは、約３％トレハロース、約４％トレハロース、約５％トレハロース、約６％トレハロース、約７％トレハロース、約８％トレハロース、約９％トレハロース、約１０％トレハロース、約１１％トレハロース、約１２％トレハロース、約１３％トレハロース、約１４％トレハロース、約１５％トレハロース、約１６％トレハロース、約１７％トレハロース、約１％トレハロース、約１９％トレハロース、もしくは約２０％トレハロース、または任意の中間濃度のトレハロースを含む水性組成物に配合される。具体的な実施形態において、当業者は、所望の総体積に応じて、ウイルスベクター、トレハロースストック、および生理学的に許容される緩衝液の体積を調整することができる。
【００６８】
本明細書において企図される組成物は、長期間、幅広い温度でウイルスベクターを安定化する。具体的な実施形態において、組成物は、ウイルスベクターと、約２０℃で、約１０℃で、約４℃で、約０℃で、約−５℃で、約−１０℃で、約−２０℃で、約−３０℃で、約−４０℃で、約−５０℃で、約−６０℃で、約−７０℃で、約−８０℃、またはその間の任意の温度で長期間ウイルスベクターを安定化するのに有効な量のトレハロースとを含む。特定の実施形態において、ウイルスベクターは、少なくとも約２４時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約９６時間、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月、少なくとも約６ヶ月、少なくとも約１年、少なくとも約２年、またはそれ以上の任意の期間、安定である。当業者は、具体的な実施形態において組成物の安定性を測定する場合、列挙される温度を上回るおよび下回る温度、ならびに列挙される期間より短いおよび長い期間が、適用され得ることを理解するであろう。
【００６９】
本明細書において企図される組成物は、ベクターを凍結および融解した後にウイルスベクターを安定化する。一実施形態において、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれ以上の凍結融解サイクルの間、本明細書に開示される種々の温度、例えば、−２０℃、−６０℃、−７０℃、−８０℃等で、ウイルスベクターを安定化する。別の実施形態において、組成物は、１１回を超える凍結融解サイクルの間ウイルスベクターを安定化する。  別の実施形態において、組成物は、２０回を超える凍結融解サイクルの間ウイルスベクターを安定化する。
【００７０】
種々の実施形態において、組成物は、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、クエン酸、およびクエン酸ナトリウム等の１つ以上の抗酸化剤を含む。抗酸化剤が使用される場合、それは、当該技術分野で有用であることが分かっている量で存在し得る。
【００７１】
いくつかの実施形態において、組成物は、乾燥剤および／または浸透圧保護剤として作用し得る他の成分、例えば、メタノール、エタノール、グリセロール、およびＤＭＳＯ等を含む。これらの成分は、保存されたウイルスベクター組成物において残留水分を低減するかまたは浸透圧ストレスの平衡を保つ傾向があり、場合によっては、より良好な保存能力をもたらし得る。特定の実施形態において、組成物は、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミン等のタンパク質を含む。
【００７２】
具体的な実施形態において、組成物は、ウイルスベクターを安定化するのに有効な量のトレハロースを含む。本明細書で使用される場合、「量」という用語は、ある結果を達成するための、トレハロースまたはその誘導体の「有効な量」または「有効量」を指す。
【００７３】
特定の実施形態において、薬学的組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水等；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント、例えば、水酸化アルミニウム；および保存剤を含んでもよい。本明細書において企図される組成物はまた、非経口投与、例えば、血管内（静脈内もしくは動脈内）、腹腔内、または筋肉内投与のために配合されてもよい。注射用の薬学的組成物は、好ましくは無菌である。
【００７４】
ウイルスベクターを含む水性組成物は、インビボでの遺伝子治療を必要とする対象の細胞、組織、または器官への直接注射によって投与することができる。種々の他の実施形態において、細胞は、安定なウイルスベクターを含む本明細書において企図される組成物をインビトロまたはエクスビボで形質導入され、任意選択的にエクスビボで増殖される。形質導入された多細胞は、次いで、遺伝子治療を必要とする対象に投与される。
【００７５】
Ｅ．ウイルスベクター
種々の実施形態において、本明細書において企図される組成物は、ウイルスベクターを保存または安定化するのに有効な量のトレハロースまたはその誘導体を含む。本明細書において企図される組成物によって安定化され得るベクターの例示的な種類として、限定されないが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス等が挙げられる。
【００７６】
１．アデノウイルス
「アデノウイルスベクター」は、（ａ）構築物のパッケージングを支持し、（ｂ）その中にクローニングされたポリヌクレオチドを発現するのに十分なアデノウイルス配列をセンスまたはアンチセンス配向で含有する構築物を指す。組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルスの遺伝子組操作された形態を含む。３６ｋＢの線状２本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスの遺伝的構成の知識は、アデノウイルスＤＮＡの大きな欠片を最大７ｋＢまでの外来配列で置換することを可能にする（Ｇｒｕｎｈａｕｓ＆Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２）。レトロウイルスとは対照的に、アデノウイルスＤＮＡは、潜在的な遺伝毒性を示すことなくエピソーム様式で複製し得るため、宿主細胞のアデノウイルス感染は染色体組み込みを引き起こさない。また、アデノウイルスは、構造的に安定であり、大規模な増幅後にゲノム再編成は検出されていない。アデノウイルスは、それらの細胞周期の段階にかかわらず実質的に全ての上皮細胞に感染し得る。これまでのところ、アデノウイルス感染は、例えば、ヒトにおける急性呼吸疾患等の軽度の疾患にのみ関連すると考えられている。
【００７７】
アデノウイルスは、そのゲノムが中程度のサイズであること、操作し易さ、高い力価、広い標的細胞範囲、および高い感染力のために、遺伝子導入ベクターとしての使用に特に適している。ウイルスゲノムの両端は、ウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである１００〜２００塩基対の逆方向反復（ＩＴＲ）を含有する。ゲノムの初期（Ｅ）および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分割される異なる転写ユニットを含有する。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよび少数の細胞遺伝子の転写の調節に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成をもたらす。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞シャットオフに関与する（Ｒｅｎａｎ，１９９０）。ウイルスカプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子の産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によって生じる単一の初期転写物の相当なプロセシング後にのみ発現される。ＭＬＰ（地図単位１６．８に位置する）は、感染の後期段階の間に特に効率がよく、このプロモーターから生じる全てのｍＲＮＡは、それらを翻訳にとって好ましいｍＲＮＡにする５´トリパータイトリーダー（ＴＰＬ）配列を有する。
【００７８】
現在のシステムにおいて、組換えアデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの間の相同的組換えから作製される。２つのプロウイルスベクター間の可能な組換えに起因して、このプロセスから野生型アデノウイルスが生成され得る。したがって、個々のプラークからウイルスの単一クローンを単離し、そのゲノム構造を調べることが非常に重要である。
【００７９】
複製欠損性である本発明のアデノウイルスベクターの作製および増殖は、Ａｄ５ＤＮＡ断片によってヒト胚腎細胞から形質転換され、構成的にＥ１タンパク質を発現する、２９３と称される特有のヘルパー細胞系に依存する（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムには重要でないため（Ｊｏｎｅｓ＆Ｓｈｅｎｋ，１９７８）、本発明のアデノウイルスベクターは、２９３細胞の助けによって、Ｅ１領域、Ｄ３領域、またはその両方の領域のいずれかに外来ＤＮＡを担持する（Ｇｒａｈａｍ＆Ｐｒｅｖｅｃ，１９９１）。天然において、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％をパッケージすることができ（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）、約２ｋＢの余分なＤＮＡの容量を提供する。Ｅ１領域およびＥ３領域で置き換え可能な約５．５ｋＢのＤＮＡと組み合わせて、本発明のアデノウイルスベクターの最大容量は、７．５ｋＢ未満であるか、またはベクターの全長の約１５％である。アデノウイルスウイルスゲノムの８０％超が、ベクター骨格に残り、ベクター媒介性細胞毒性の源となる。また、Ｅ１欠失ウイルスの複製欠損性は不完全である。例えば、高い感染多重度（ＭＯＩ）で現在使用可能なベクターにウイルス遺伝子発現の漏れが観察されている（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３）。
【００８０】
ヘルパー細胞系は、ヒト胚腎細胞、筋細胞、造血細胞、または他のヒト胚間葉細胞もしくは上皮細胞等のヒト細胞に由来してもよい。代替として、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスを許容する他の哺乳動物種の細胞に由来してもよい。そのような細胞として、例えば、Ｖｅｒｏ細胞、または他のサル胚間葉細胞または上皮細胞が挙げられる。上述のように、本明細書において好ましいヘルパー細胞系は２９３である。
【００８１】
最近、Ｒａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）は、２９３細胞を培養してアデノウイルスを増殖させるための改善された方法を開示した。ある形式では、１００〜２００ｍＬの培地を含有するシリコン処理した１リットルのスピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）中に個々の細胞を接種することによって、天然の細胞凝集体を成長させる。４０ｒｐｍで撹拌した後、トリパンブルーを用いて細胞生存率を予測する。別の形式では、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌミクロ担体（Ｂｉｂｂｙ  Ｓｔｅｒｌｉｎ、Ｓｔｏｎｅ，ＵＫ）（５ｇ／ｌ）が以下の通りに用いられる。５ｍＬの培地（５ｍｌ）に再懸濁した細胞接種材料を、２５０ｍＬエーレンマイヤーフラスコ中の担体（５０ｍＬ）に加え、時折撹拌しながら１〜４時間静置する。次いで、培地を５０ｍＬの新しい培地と交換し、振盪を開始する。ウイルスの産生のために、細胞を約８０％コンフルエンスまで増殖させ、その後、培地を交換し（最終容積２５％まで）、０．０５のＭＯＩでアデノウイルスを加える。培養を一晩静置し、体積が１００％に増加した後、さらに７２時間振盪を開始した。
【００８２】
アデノウイルスベクターが複製欠損性であるか、または少なくとも条件付きで欠損性であるという要件以外は、具体的な実施形態を成功裡に実施する上で、アデノウイルスベクターの性質が極めて重要であるとは考えられない。アデノウイルスは、既知の４２の異なるセロタイプまたはサブグループＡ〜Ｆのいずれかであり得る。アデノウイルス５型は、多くの生化学的情報および遺伝情報が分かっているヒトアデノウイルスであり、歴史的にも、アデノウイルスをベクターとして用いるほとんどの構築物に使用されてきているため、具体的な実施形態において使用される条件付きの複製欠損性アデノウイルスベクターを得るためには、サブグループＣのアデノウイルス５型が好ましい出発材料である。
【００８３】
上述のように、典型的なベクターは、複製欠損性であり、アデノウイルスＥ１領域を有しない。したがって、Ｅ１をコードする配列が除去された位置に、対象とする遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入することが最も都合がよいであろう。しかしながら、アデノウイルス配列内の構築物の挿入位置は重要ではない。対象とする遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）によって記載されるように、Ｅ３置換ベクターの欠失するＥ３領域の代わりに挿入されてもよいか、または、ヘルパー細胞系もしくはヘルパーウイルスがＥ４の欠損を補完するＥ４領域に挿入されてもよい。
【００８４】
アデノウイルスは、増殖および操作が容易であり、インビトロおよびインビボで広範な宿主範囲を示す。このグループのウイルスは、高い力価、例えば、１ｍＬ当たり１０９〜１０１１のプラーク形成単位で得ることができ、それらは高度に感染性である。アデノウイルスの生活環は、宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。アデノウイルスベクターによって送達される外来遺伝子はエピソームであり、したがって、宿主細胞に対して低い遺伝毒性を有する。野生型アデノウイルスを用いたワクチン接種の試験において副作用は報告されておらず（Ｃｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９６３；Ｔｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９７１）、インビボでの遺伝子導入ベクターとしてのそれらの安全性および治療可能性が実証されている。
【００８５】
アデノウイルスベクターは、真核生物の遺伝子発現において使用されてきた（Ｌｅｖｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）およびワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ＆Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２；Ｇｒａｈａｍ＆Ｐｒｅｖｅｃ，１９９２）。最近、動物試験によって、組換えアデノウイルスが遺伝子治療に使用され得ることが示唆された（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。組換えアデノウイルスを異なる組織に投与する試験は、気管点滴注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、末梢静脈内注射（Ｈｅｒｚ＆Ｇｅｒａｒｄ，１９９３）、および脳内への定位接種（Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）を含む。
【００８６】
２．アデノ随伴ウイルス
ＡＡＶ（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｓｋａ，１９８４）は、アデノウイルスストックの汚染物質として発見されたパルボウイルスである。これは、いずれの疾患とも関連付けられていない遍在性ウイルスである（米国のヒト集団の８５％に抗体が存在する）。これはまた、その複製がアデノウイルス等のヘルパーウイルスの存在に依存するため、ディペンドウイルスとしても分類される。種々のセロタイプが単離されているが、その中でもＡＡＶ−２が最もよく特徴付けられている。ＡＡＶは、直径２０〜２４ｎｍの正二十面体のビリオンを形成するようにカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３内に封入された一本鎖線状ＤＮＡを有する（Ｍｕｚｙｃｚｋａ＆ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，１９８８）。
【００８７】
ＡＡＶのＤＮＡは、約４．７キロベース長である。それは、２つのオープンリーディングフレームを含有し、２つのＩＴＲによって隣接される。ＡＡＶゲノムには２つの主要な遺伝子であるｒｅｐおよびｃａｐが存在する。ｒｅｐ遺伝子は、ウイルスの複製に関与するタンパク質をコードするのに対し、ｃａｐは、カプシドタンパク質ＶＰ１〜３をコードする。各ＩＴＲは、Ｔ型のヘアピン構造を形成する。これらの末端反復は、染色体組み込みに不可欠な唯一のＡＡＶのｃｉｓ成分である。したがって、ＡＡＶは、全てのウイルスコード配列が除去され、かつ送達用遺伝子のカセットによって置き換えられたベクターとして使用することができる。３つのウイルスプロモーターが同定され、それらの地図位置に従ってｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と命名された。ｐ５およびｐ１９からの転写によってｒｅｐタンパク質の産生がもたらされ、ｐ４０からの転写がカプシドタンパク質の産生がもたらされる（Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９８４）。
【００８８】
ｒＡＡＶを発現ベクターとして使用する可能性を研究するよう研究者に促した要因がいくつか存在する。１つは、宿主染色体に組み込むための遺伝子の送達に関する要件が驚くほど少ないということである。ＡＡＶゲノムのわずか６％である１４５ｂｐのＩＴＲを有することが必要である。これは、ベクター内に４．５ｋｂのＤＮＡ挿入を構成する余地を残す。この担持能力は、ＡＡＶが大きな遺伝子を送達するのを妨げ得るが、アンチセンス構築物の送達には十分に適している。
【００８９】
ＡＡＶはまた、その安全性、すなわち、遺伝子操作（組換え）が宿主ゲノム内に組み込まれていないことに起因して、送達ビヒクルの良好な選択肢でもある。比較的複雑なレスキュー機構が存在する：ｒＡＡＶを起動させるためには、野生型アデノウイルスだけではなく、ＡＡＶ遺伝子も必要である。同様に、ＡＡＶは、病原性ではなく、いかなる疾患にも関連していない。ウイルスコード配列の除去によって、ウイルス遺伝子発現に対する免疫反応が最小限に抑えられ、したがってｒＡＡＶは炎症反応を誘発しない。
【００９０】
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を宿主細胞に送達するための発現構築物として、他のウイルスベクターが用いられてもよい。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｃｏｕｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、ポリオウイルス、およびヘルペスウイルス等のウイルスに由来するベクターが用いられてもよい。それらは、種々の哺乳動物細胞にいくつかの魅力的な特徴を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｃｏｕｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。
【００９１】
欠損Ｂ型肝炎ウイルスが認識されたことにより、異なるウイルス配列の構造と機能との関係に新たな知見が得られた。インビトロ試験により、ウイルスが、そのゲノムの最大８０％の欠失にもかかわらず、ヘルパー依存性のパッケージングおよび逆転写のための能力を保持できることが示された（Ｈｏｒｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。このことは、ゲノムの大部分を、外来遺伝物質で置き換えることができることを示唆するものであった。肝臓指向性および残存性（組み込み）は、肝臓特異的な遺伝子導入にとって特に魅力的な特性であった。Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）は、ポリメラーゼ、表面および前表面コード配列の代わりに、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子をアヒルＢ型肝炎ウイルスゲノムに導入した。それは、野生型ウイルスとともにトリヘパトーマ細胞株にコトランスフェクトされた。初代子ガモ肝細胞を感染させるために、高力価の組換えウイルスを含有する培養培地が使用された。トランスフェクション後の少なくとも２４日間は、安定なＣＡＴ遺伝子発現が検出された（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。
【００９２】
３．レトロウイルス
レトロウイルスは、遺伝子送達のための一般的なツールである（Ｍｉｌｌｅｒ，２０００，Ｎａｔｕｒｅ．３５７：４５５−４６０）。具体的な実施形態において、レトロウイルスは、細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを送達するために使用される。本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖状の二本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、続いてそのゲノムＤＮＡを共有結合により宿主ゲノム内に組み込むＲＮＡウイルスを指す。一旦、ウイルスが宿主ゲノムに組み込まれると、それは「プロウイルス」と称される。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型としての役割を果たし、新しいウイルス粒子を産生するために必要な構造タンパク質および酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を誘導する。
【００９３】
具体的な実施形態において使用されるのに適した例示的なレトロウイルスとして、限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））、ならびにレンチウイルスが挙げられる。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群（または属）を指す。例示的なレトロウイルスとして、限定されないが、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型、およびＨＩＶ２型を含むヒト免疫不全ウイルス）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。一実施形態において、ＨＩＶに基づくベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列エレメント）が好ましい。具体的な実施形態において、レンチウイルスは、ＭＮＤプロモーターを含み、かつ細胞にＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを送達するために使用される。
【００９５】
レトロウイルスベクター、より具体的にはレンチウイルスベクターが、具体的な実施形態の実施において使用され得る。したがって、「レトロウイルス」または「レトロウイルスベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、それぞれ「レンチウイルス」および「レンチウイルスベクター」を含むことが意図される。
【００９６】
「ベクター」という用語は、別の核酸分子を導入または輸送することができる核酸分子を指すために本明細書で使用される。導入される核酸は、一般に、ベクター核酸分子と連結しており、例えば、その中に挿入されている。ベクターは、細胞における自律複製を誘導する配列を含んでもよいか、または宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするために十分な配列を含んでもよい。有用なベクターとして、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌性人工染色体、およびウイルスベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとして、例えば、複製欠損性のレトロウイルスおよびレンチウイルスが挙げられる。
【００９７】
当業者には明らかであるように、「ウイルスベクター」という用語は、典型的には、核酸分子の導入もしくは細胞のゲノムへの組み込みを容易にするウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子（例えば、導入プラスミド）、または核酸の導入を媒介するウイルス粒子のいずれかを指して広く使用されている。ウイルス粒子は、典型的には、種々のウイルス成分を含み、時には核酸（複数可）に加えて宿主細胞成分も含む。
【００９８】
ウイルスベクターという用語は、核酸を細胞内に導入することができるウイルスもしくはウイルス粒子、または導入された核酸自体のいずれかを指す場合がある。ウイルスベクターおよび導入プラスミドは、主としてウイルスに由来する構造的および／または機能的遺伝エレメントを含有する。「レトロウイルスベクター」という用語は、主としてレトロウイルスに由来する構造的および機能的遺伝エレメントを含有するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「レンチウイルスベクター」という用語は、主としてレンチウイルスに由来するＬＴＲを含む、構造的および機能的遺伝エレメントまたはその一部分を含有するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「ハイブリッドベクター」という用語は、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスの配列と非レンチウイルスのウイルス配列の両方を含有する、ベクター、ＬＴＲ、または他の核酸を指す。一実施形態において、ハイブリッドベクターは、逆転写、複製、組み込み、および／またはパッケージングのためのレトロウイルス、例えば、レンチウイルスの配列を含むベクターまたは導入プラスミドを指す。
【００９９】
具体的な実施形態において、「レンチウイルスベクター」、「レンチウイルス発現ベクター」という用語は、レンチウイルス導入プラスミドおよび／または感染性レンチウイルス粒子を指すために使用され得る。本明細書において、クローニング部位、プロモーター、調節エレメント、異種核酸などのエレメントに言及がなされる場合、これらのエレメントの配列は、レンチウイルス粒子ではＲＮＡ形態で存在し、ＤＮＡプラスミドではＤＮＡ形態で存在することを理解されたい。
【０１００】
プロウイルスの各末端は、「長末端反復」または「ＬＴＲ」と称される構造である。「長末端反復（ＬＴＲ）」という用語は、それらの天然の配列の状況において、直接反復であり、Ｕ３領域、Ｒ領域、およびＵ５領域を含有する、レトロウイルスＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指す。ＬＴＲは、一般に、レトロウイルス遺伝子の発現（例えば、遺伝子転写物の促進、開始、およびポリアデニル化）およびウイルス複製の基盤となる機能を提供する。ＬＴＲは、転写制御エレメント、ポリアデニル化シグナル、ならびにウイルスゲノムの複製および組み込みのために必要な配列を含む、多数の調節シグナルを含有する。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５と称される３つの領域に分割される。Ｕ３領域は、エンハンサーエレメントおよびプロモーターエレメントを含有する。Ｕ５領域は、プライマー結合部位とＲ領域との間の配列であり、ポリアデニル化配列を含有する。Ｒ（反復）領域は、Ｕ３領域およびＵ５領域によって隣接されている。ＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５領域で構成され、ウイルスのゲノムの５’末端および３’末端の両方に出現する。５’ＬＴＲには、ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）、および粒子へのウイルスＲＮＡの効率的なパッケージングに必要な配列（プサイ部位）が隣接している。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスカプシドまたは粒子内へのウイルスＲＮＡの挿入のために必要なレトロウイルスゲノム内に位置する配列を指す。例えば、Ｃｌｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１−２１０９を参照されたい。いくつかのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのカプシド形成に必要な最小のパッケージングシグナル（プサイ［Ψ］配列とも称される）を使用する。したがって、本明細書で使用される場合、「パッケージング配列」、「パッケージングシグナル」、「プサイ」という用語、および「Ψ」という記号は、ウイルス粒子形成の間のレトロウイルスＲＮＡ鎖のカプシド形成のために必要な非コード配列への言及において使用される。
【０１０２】
種々の実施形態において、ベクターは、修飾された５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲを含む。ＬＴＲのいずれかまたは両方が、限定されないが、１つ以上の欠失、挿入、または置換を含む、１つ以上の修飾を含んでもよい。３’ＬＴＲの修飾は、ウイルスを複製欠損性にすることによってレンチウイルス系またはレトロウイルス系の安全性を向上するために行われることが多い。本明細書で使用される場合、「複製欠損性」という用語は、有効な複製を終了することができず、そのため、感染性ビリオンが産生されないウイルス（例えば、複製欠損性レンチウイルス後代）を指す。「複製コンピテント」という用語は、複製することができ、そのためウイルスのウイルス複製により感染性ビリオン（例えば、複製コンピテントなレンチウイルス後代）を産生することができる、野生型ウイルスまたは変異体ウイルスを指す。
【０１０３】
「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターは、１回目のウイルス複製を越えるウイルス転写を防ぐために、Ｕ３領域として知られる右側の（３’）ＬＴＲのエンハンサー−プロモーター領域が修飾された（例えば、欠失または置換によって）複製欠損性ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを指す。これは、ウイルス複製の間に右側の（３’）ＬＴＲのＵ３領域が左側の（５’）ＬＴＲのＵ３領域の鋳型として使用され、したがって、ウイルスの転写物がＵ３エンハンサー−プロモーターなしでは形成されないためである。さらなる実施形態において、３’ＬＴＲは、Ｕ５領域が、例えば、理想的なポリ（Ａ）配列で置き換えられるように修飾される。ＬＴＲに対する修飾、例えば、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、または３’ＬＴＲおよび５’ＬＴＲの両方に対する修飾も、具体的な実施形態に含まれることに留意されたい。
【０１０４】
ウイルス粒子の産生の間にウイルスゲノムの転写を駆動するために、５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターで置き換えることによって、さらなる安全性の強化がもたらされる。使用され得る異種プロモーターの例として、例えば、ウイルス性のシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。典型的なプロモーターは、Ｔａｔ非依存性様式で高レベルの転写を駆動することができる。ウイルス産生系に完全なＵ３配列が存在しないため、この置き換えは、複製コンピテントウイルスを形成する組換えの可能性を低下させる。特定の実施形態において、異種プロモーターは、ウイルスゲノムが転写される様式を制御する上でさらなる利点を有する。例えば、異種プロモーターは、誘導因子が存在する場合にのみ、全てまたは一部のウイルスゲノムの転写が起こるように、誘導性であり得る。誘導因子は、限定されないが、１つ以上の化合物または宿主細胞が培養される温度もしくはｐＨ等の生理学的条件を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、ＴＡＲエレメントを含む。「ＴＡＲ」という用語は、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）のＬＴＲのＲ領域に位置する「トランス活性化反応」遺伝エレメントを指す。このエレメントは、レンチウイルスのトランス活性化因子（ｔａｔ）遺伝子エレメントと相互作用してウイルス複製を増強する。しかしながら、５’ＬＴＲのＵ３領域が異種プロモーターによって置き換えられた実施形態では、このエレメントは必要ない。
【０１０６】
「Ｒ領域」は、キャッピング基の開始点（すなわち、転写の開始点）で始まり、ポリ（Ａ）トラクトの開始点の直前で終わる、レトロウイルスＬＴＲ内の領域を指す。Ｒ領域はまた、Ｕ３およびＵ５領域によって隣接されているとも定義される。Ｒ領域は、逆転写の間に、ゲノムの一方の末端から他方の末端まで新生ＤＮＡの導入を可能にすることにおいて役割を果たす。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「ＦＬＡＰエレメント」という用語は、その配列が、レトロウイルス、例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のセントラルポリプリン配列およびセントラルターミネーション配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む核酸を指す。適切なＦＬＡＰエレメントは、米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。ＨＩＶ−１の逆転写の間、セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）におけるプラス鎖ＤＮＡの中心開始点、およびセントラルターミネーション配列（ＣＴＳ）における中心終結点が、三本鎖ＤＮＡ構造であるＨＩＶ−１中心ＤＮＡフラップの形成をもたらす。いずれかの理論に束縛されることを望むものではないが、ＤＮＡフラップは、レンチウイルスゲノムの核内移行のシス作用決定基として作用することができ、かつ／または、ウイルスの力価を高めることができる。具体的な実施形態において、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの骨格は、ベクター内の対象とする異種遺伝子の上流または下流に１つ以上のＦＬＡＰエレメントを含む。例えば、具体的な実施形態において、導入プラスミドは、ＦＬＡＰエレメントを含む。一実施形態において、ベクターは、ＨＩＶ−１から単離されたＦＬＡＰエレメントを含む。
【０１０８】
一実施形態において、レトロウイルスまたはレンチウイルス導入ベクターは、１つ以上の輸送エレメントを含む。「輸送エレメント」という用語は、核から細胞の細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節エレメントを指す。ＲＮＡ輸送エレメントの例として、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３；およびＣｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ  ５８：４２３を参照のこと）およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が挙げられる。一般に、ＲＮＡ輸送エレメントは、遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、１つまたは複数のコピーとして挿入され得る。
【０１０９】
具体的な実施形態において、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節エレメント、効率的なポリアデニル化部位、および任意選択的に転写終結シグナルをベクターに組み込むことによって増加する。様々な転写後調節エレメント、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）、Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）等（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，９：１７６６）等（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，９：１７６６）により、タンパク質における異種核酸の発現を増加させることができる。具体的な実施形態において、ベクターは、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥ等の転写後調節エレメントを含む。
【０１１０】
具体的な実施形態において、場合によっては、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥ等の転写後調節エレメントが、細胞の形質転換のリスクを高めるため、かつ／あるいは、ｍＲＮＡ転写物の量を実質的にもしくは有意に増加させないか、またはｍＲＮＡの安定性を高めないため、ベクターは、これらのエレメントを欠くかまたは含まない。したがって、いくつかの実施形態において、ベクターは、さらなる安全対策としてＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを欠くかまたは含まない。
【０１１１】
異種核酸転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を誘導するエレメントは、異種性の遺伝子発現を増加させる。転写終結シグナルは、一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見られる。具体的な実施形態において、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３’を含む。「ポリ（Ａ）部位」または「ポリ（Ａ）配列」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写物の終結およびポリアデニル化の両方を誘導するＤＮＡ配列を意味する。ポリアデニル化配列は、コード配列の３’末端にポリ（Ａ）尾部を加えることによりｍＲＮＡの安定性を促進することができ、したがって翻訳効率の増大に寄与する。ポリ（Ａ）尾部を欠く転写物は不安定であり、急速に分解されるため、組換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましい。ベクターに使用することができるポリ（Ａ）シグナルの実例として、理想的なポリ（Ａ）配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリ（Ａ）配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβグロビンポリ（Ａ）配列（ｒβｇｐＡ）、または当該技術分野で既知の別の適切な異種性または内在性のポリ（Ａ）配列が挙げられる。
【０１１２】
特定の実施形態において、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターは、１つ以上のインスレーターエレメントをさらに含む。インスレーターエレメントは、レンチウイルスを発現させた配列、例えば、治療用ポリペプチドを、ゲノムＤＮＡに存在するシス作用性エレメントによって媒介され得、導入した配列の調節解除された発現をもたらし得る組み込み部位の影響から保護することに貢献し得る（すなわち、位置効果、例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ−Ｂｅｕｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９９：１６４３３；およびＺｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１０９：４７１を参照のこと）。いくつかの実施形態において、導入ベクターは、３’ＬＴＲに１つ以上のインスレーターエレメントを含み、プロウイルスが宿主ゲノムに組み込まれると、プロウイルスは、３’ＬＴＲを複製することにより、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの両方に１つ以上のインスレーターを含む。具体的な実施形態において使用するのに適したインスレーターは、限定されないが、ニワトリβグロビンインスレーターを含む（参照により本明細書に組み込まれるＣｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３．Ｃｅｌｌ  ７４：５０５、Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７．ＰＮＡＳ  ９４：５７５；およびＢｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｃｅｌｌ  ９８：３８７を参照のこと）。インスレーターエレメントの例として、限定されないが、ニワトリＨＳ４等のβグロビン遺伝子座に由来するインスレーターが挙げられる。
【０１１３】
ある特定の実施形態によれば、ウイルスベクター骨格配列のほとんどまたは全部が、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１に由来する。しかしながら、多くの異なる源のレトロウイルスおよび／またはレンチウイルス配列が、使用されてもよいかまたは組み合わされてもよく、特定のレンチウイルス配列における多数の置換および変更が、導入ベクターが本明細書に記載される機能を実行する能力を損なうことなく受け入れられることを理解されたい。さらに、様々なレンチウイルスベクターが当該技術分野で既知であり（Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６ａ、１９９６ｂ、および１９９８）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）、Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号、および５，９９４，１３６を参照のこと）、これらの多くは、ウイルスベクターまたは導入プラスミドを産生するように適合させることができる。
【０１１４】
一実施形態において、ベクターは、例えば、グロビンポリペプチドをコードする、対象とするポリヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも１つの修飾または未修飾レトロウイルスＬＴＲ、例えば、レンチウイルスＬＴＲ、βグロビンプロモーター、およびβグロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）を含む。ＬＴＲの適切な修飾は、限定されないが、５’ＬＴＲの、異種プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、またはサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターによる置き換え、ならびに本明細書の他の箇所で論じられているような３’ＬＴＲの１つ以上の修飾、付加、および／または欠失を含む。
【０１１５】
具体的な実施形態において、ポリヌクレオチドの赤血球特異的な発現は、ヒトβグロビンプロモーター、ヒトβグロビンＬＣＲ由来のＤＮＡａｓｅ  Ｉ高感受性部位２、３、および４のうちの１つ以上を含むβグロビンＬＣＲ、ならびに／またはヒトβグロビン３’エンハンサーエレメントを使用して達成される。
【０１１６】
種々の実施形態において、ベクターは、本明細書の他の箇所で論じられているように、プサイパッケージング配列（Ψ＋）、セントラルポリプリン配列／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルス輸送エレメント、転写後調節エレメント、１つ以上のインスレーターエレメント、ポリアデニル化配列、選択可能マーカー、および細胞自殺遺伝子からなる群から選択される１つ以上のエレメントを含む。
【０１１７】
種々の実施形態において、ベクターは、異常ヘモグロビン症の遺伝子治療を提供するポリペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結された造血細胞中に作動可能にプロモーターを含む。ベクターは、１つ以上のＬＴＲを有してもよく、いずれかのＬＴＲが、１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失等の１つ以上の修飾を含む。ベクターは、形質導入の効率を高めるための１つ以上のアクセサリーエレメント（例えば、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、ウイルスパッケージング（例えば、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、ＲＲＥ）、および／または治療遺伝子の発現を増加させる他のエレメント（例えば、ポリ（Ａ）配列）をさらに含んでもよい。
【０１１８】
一実施形態において、ベクターは、左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲ、プサイパッケージング配列（Ψ＋）、セントラルポリプリン配列／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルス輸送エレメント、βグロビンプロモーター、βグロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）、および任意選択的に、対象とするポリヌクレオチドに作動可能に連結した３’βグロビンエンハンサー、ならびに１つ以上のインスレーターエレメントまたはポリアデニル化配列を含む右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲを含む。
【０１１９】
具体的な実施形態において、ベクターは、左側の（５’）ＨＩＶ−１  ＬＴＲ、プサイパッケージング配列（Ψ＋）、ＨＩＶ−１セントラルポリプリン配列／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、βグロビンプロモーター、βグロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）、および任意選択的に、対象とするポリヌクレオチドに作動可能に連結した３’βグロビンエンハンサー、ならびに１つ以上のインスレーターエレメント、およびウサギβグロビンポリ（Ａ）配列（ｒβｇｐＡ）を含む右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲを含むレンチウイルスベクターである。
【０１２０】
種々の実施形態において、ベクターは、副腎白質ジストロフィーおよび／または副腎脊髄神経障害の治療を提供するポリペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結した小膠細胞において作動可能なプロモーターを含む。ベクターは、１つ以上のＬＴＲを有してもよく、いずれかのＬＴＲが、１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失等の１つ以上の修飾を含む。ベクターは、形質導入の効率を高めるための１つ以上のアクセサリーエレメント（例えば、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、ウイルスパッケージング（例えば、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、ＲＲＥ）、および／または治療遺伝子の発現を増加させる他のエレメント（例えば、ポリ（Ａ）配列）をさらに含んでもよい。
【０１２１】
具体的な実施形態において、ベクターは、左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲ；セントラルポリプリン配列／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）；レトロウイルス輸送エレメント；ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＤ、メンバー１（ＡＢＣＤ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した小膠細胞において活性なプロモーター；および右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲを含む。
【０１２２】
特定の実施形態において、ベクターは、左側の（５’）ＨＩＶ−１  ＬＴＲ；プサイ（Ψ）パッケージングシグナル；ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ；ＲＲＥ；ヒトＡＢＣＤ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したＭＮＤプロモーター；右側の（３’）自己不活化（ＳＩＮ）ＨＩＶ−１  ＬＴＲ；およびウサギβグロビンポリアデニル化配列を含むレンチウイルスベクターである。
【０１２３】
種々の実施形態において、ベクターは、ＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターを含む。ベクターは、１つ以上のＬＴＲを有してもよく、いずれかのＬＴＲが、１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失等の１つ以上の修飾を含む。ベクターは、形質導入の効率を高めるための１つ以上のアクセサリーエレメント（例えば、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、ウイルスパッケージング（例えば、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、ＲＲＥ）、および／または治療遺伝子の発現を増加させる他のエレメント（例えば、ポリ（Ａ）配列）をさらに含んでもよく、任意選択的に、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含んでもよい。
【０１２４】
具体的な実施形態において、導入ベクターは、左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲ；セントラルポリプリン配列／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）；レトロウイルス輸送エレメント；本明細書において企図されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したＭＮＤプロモーター；および右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲ；ならびに任意選択的に、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。
【０１２５】
具体的な実施形態において、導入ベクターは、左側の（５’）レトロウイルスＬＴＲ；レトロウイルス輸送エレメント；本明細書において企図されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したＭＮＤプロモーター；右側の（３’）レトロウイルスＬＴＲ；およびポリ（Ａ）配列；ならびに、任意選択的にＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。別の具体的な実施形態において、レンチウイルスベクターは、左側の（５’）ＬＴＲ；ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ；ＲＲＥ；本明細書において企図されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したＭＮＤプロモーター；右側の（３’）ＬＴＲ；およびポリアデニル化配列；ならびに任意選択的に、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。
【０１２６】
特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、左側の（５’）ＨＩＶ−１  ＬＴＲ；プサイ（Ψ）パッケージングシグナル；ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ；ＲＲＥ；本明細書において企図されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したＭＮＤプロモーター；右側の（３’）自己不活化（ＳＩＮ）ＨＩＶ−１  ＬＴＲ；およびウサギβグロビンポリアデニル化配列；ならびに任意選択的に、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。
【０１２７】
別の実施形態において、ベクターは、少なくとも１つのＬＴＲ；セントラルポリプリン配列／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）；レトロウイルス輸送エレメント；および本明細書において企図されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したＭＮＤプロモーター；ならびに任意選択的に、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。
【０１２８】
具体的な実施形態において、ベクターは、少なくとも１つのＬＴＲ；ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ；ＲＲＥ；本明細書において企図されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したＭＮＤプロモーター；およびポリアデニル化配列；ならびに任意選択的に、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。
【０１２９】
特定の実施形態において、ベクターは、少なくとも１つのＳＩＮ  ＨＩＶ−１  ＬＴＲ；プサイ（Ψ）パッケージングシグナル；ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ；ＲＲＥ；本明細書において企図されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したＭＮＤプロモーター；およびウサギβグロビンポリアデニル化配列；ならびに任意選択的に、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。
【０１３０】
具体的な実施形態において、ベクターは、ホーミングエンドヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＩＩ型クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ９）ヌクレアーゼ、またはｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【０１３１】
当業者は、既存の実施形態から他の多くの異なる実施形態を作り出すことができることを認識するであろう。
【０１３２】
数百万の１ミリリットル当たりの形質導入単位（ＴＵ／ｍＬ）の力価を有する組換えウイルスは、当該技術分野で既知の技術によって作製することができる。超遠心分離後に約１０８ＴＵ／ｍＬ、１０９ＴＵ／ｍＬ、１０１０ＴＵ／ｍＬ、１０１１ＴＵ／ｍＬ、１０１２ＴＵ／ｍＬ、または約１０１３ＴＵ／ｍＬに濃縮されたストック溶液を得ることができる。
【０１３３】
ウイルスは、当該技術分野で既知の技術を使用して、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで細胞を感染させるために用いられ得る。例えば、細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞、樹状細胞、末梢血細胞、または幹細胞が、エクスビボで形質導入される場合、ベクター粒子は、１０５細胞当たり１×１０５〜５０×１０５のウイルスベクターの形質導入単位にも相当する、一般にほぼ１〜５０の感染多重度（ＭＯＩ）の用量を用いて、その細胞とともにインキュベートされてもよい。当然のことながら、これは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、および５０ＭＯＩに相当するベクターの量を含む。
【０１３４】
ウイルスはまた、治療を必要とする細胞、組織、または器官への直接注射によって、インビボで対象に挿入されてもよい。直接注射は、１０５細胞当たり１×１０５〜５０×１０５のウイルスベクターの形質導入単位にも相当する約１〜５０の感染多重度（ＭＯＩ）を必要とする。
【０１３５】
ウイルスはまた、ウイルス力価（ＴＵ／ｍＬ）に応じて送達されてもよく、力価は、例えば、ｐ２４ウイルスコートタンパク質に対するＥＬＩＳＡである市販のｐ２４力価アッセイを使用することによって測定することができる。以下の式を使用してｐ２４のｐｇ／ｍＬを算出することができる：レンチウイルスの物理的粒子（ＰＰ）当たり約２０００分子のｐ２４が存在する：（２×１０３）×（ＰＰ当たり２４×１０３Ｄａのｐ２４）、４８×１０６／アボガドロ＝（４８×１０６）／（６×１０２３）＝ＰＰ当たり８×１０−１７ｇのｐ２４、１×１０−１６ｇのｐ２４当たり約１ＰＰ、１ｐｇのｐ２４当たり１×１０４ＰＰ。合理的に良好にパッケージされたＶＳＶ−Ｇシュードタイプ化レンチウイルスベクターは、１０００物理的粒子（ＰＰ）当たり１ＴＵ〜１００ＰＰ当たり１ＴＵ（またはそれより少ない）の範囲の感染指数を有する。したがって、範囲は、約１０〜１００ＴＵ／ｐｇのｐ２４である。この変換によってＴＵ／ｍＬが得られる。
【０１３６】
以前の経験に基づいて、直接注射されるウイルスの量は、合計ＴＵによって決定され、その部位に都合よく注射できる体積、および注射される組織の種類の両方によって異なり得る。例えば、脳の注射部位には、微量のウイルスしか注射できないため、高力価調製物が好ましく、注射当たり約１×１０６〜１×１０７、約１×１０６〜１×１０８、１×１０６〜１×１０９、約１×１０７〜１×１０１０、１×１０８〜１×１０１１、約１×１０８〜１×１０１２、もしくは約１×１０１０〜１×１０１２、またはそれ以上のＴＵを用いることができる。しかしながら、全身送達は、はるかに高いＴＵに対応することができ、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、または１×１０１５の負荷を送達することができる。
【０１３７】
Ｆ．改変Ｔ細胞受容体
種々の実施形態において、本明細書において企図される組成物は、遺伝子改変ＴＣＲをコードするウイルスベクターを保存または安定化するのに有効な量のトレハロースまたはその誘導体を含む。
【０１３８】
天然に存在するＴ細胞受容体は、α−サブユニットおよびβ−サブユニットの２つのサブユニットを含み、それらの各々が、各Ｔ細胞のゲノムにおける組換え事象によって産生される特有のタンパク質である。ＴＣＲのライブラリーを、特定の標的抗原に対するそれらの選択性についてスクリーニングすることができる。このようにして、標的抗原に対して高い結合活性および反応性を有する天然のＴＣＲを選択し、クローニングし、続いて養子免疫療法のために用いられるＴ細胞の集団に導入することができる。
【０１３９】
改変ＴＣＲをコードする核酸は、好ましくは、Ｔ細胞の（天然に存在する）染色体におけるそれらの天然の状況から単離され、本明細書の他の箇所に記載される適切なベクターに込み込むことができる。核酸、およびそれらを含むベクターは、両方とも有用に細胞に導入することができ、その細胞は好ましくはＴ細胞である。改変ＴＣＲの本質的な実施形態は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）または同様の免疫学的成分によって提示される腫瘍抗原に対して高い結合活性を有することである。改変ＴＣＲとは対照的に、ＣＡＲは、標的抗原にＭＨＣ非依存的に結合するように改変される。
【０１４０】
本発明の核酸によってコードされるタンパク質は、ＴＣＲのα鎖またはβ鎖のアミノ末端部分またはカルボキシル末端部分に付着した追加のポリペプチドとともに発現させることができるが、但し、付着した追加のポリペプチドが、α鎖またはβ鎖が機能的なＴ細胞受容体を形成する能力、およびＭＨＣ依存性抗原認識に干渉しないものとする。
【０１４１】
本明細書において企図される改変ＴＣＲによって認識される抗原は、限定されないが、血液癌および固形腫瘍の両方に対する抗原を含む癌抗原を含む。例示的な抗原としては、限定されないが、葉酸受容体α、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２  （ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソセリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１が挙げられる。
【０１４２】
Ｇ．キメラ抗原受容体
種々の実施形態において、本明細書において企図される組成物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするウイルスベクターを保存または安定化するのに有効な量のトレハロースまたはその誘導体を含む。ＣＡＲは、標的抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体に基づく特異性と、Ｔ細胞受容体活性化細胞内ドメインとを組み合わせて、特異的な抗腫瘍細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を産生する分子である。本明細書で使用される場合、「キメラ」という用語は、異なる起源に由来する異なるタンパク質またはＤＮＡの部分からなっていることを説明している。
【０１４３】
本明細書において企図されるベクターは、プロモーターと、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドとを含む。本明細書において企図されるＣＡＲは、特異的な標的抗原に結合する細胞外ドメイン（結合性ドメインまたは抗原特異的結合性ドメインとも称される）、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲの抗原結合ドメインと、標的細胞の表面上にあるその標的抗原との結合は、ＣＡＲのクラスター形成をもたらし、ＣＡＲ含有細胞に対して活性化刺激を送達する。ＣＡＲの主な特性は、免疫エフェクター細胞特異性を再誘導し、それによって、増殖、サイトカイン産生、食作用、またはモノクローナル抗体、可溶性リガンド、もしくは細胞特異的共受容体の細胞特異的標的化能力を活用して、標的抗原発現細胞の細胞死を主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に非依存的に媒介することができる分子の産生を誘発する能力である。
【０１４４】
具体的な実施形態において、ＣＡＲは、限定されないが、抗体またはその抗原結合断片、テザーリガンド、または、葉酸受容体α、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソセリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄ  リガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１からなる群から選択される標的抗原に特異的に結合する共受容体の細胞外ドメインを含む細胞外結合ドメイン：１つ以上のヒンジドメインまたはスペーサードメイン；膜貫通ドメイン、例えば、限定されないが、Ｔ細胞受容体のα鎖またはβ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、およびＰＤ−１由来の膜貫通ドメイン；１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、限定されないが、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０由来の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＣＤ３ζまたはＦｃＲγ由来の一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０１４５】
例示的な結合ドメインとして、限定されないが、標的抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。「抗体」は、免疫細胞によって認識されるもの等の抗原決定基を含有する、ペプチド、脂質、多糖類、または核酸等の抗原のエピトープを特異的に認識して結合する少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドである結合剤を指す。抗体は、その抗原結合断片、例えば、Ｃａｍｅｌ  Ｉｇ、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、ならびに抗原結合に関与する全長抗体の一部分を含む。この用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（二重特異性抗体等）、およびその抗原結合断片等の遺伝子操作された形態も含む。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）；Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７も参照されたい。
【０１４６】
「標的抗原」または「対象とする対象と」は、本明細書において企図されるＣＡＲの結合ドメインが結合するように設計された抗原である。具体的な実施形態において、標的抗原は、結合ドメインが特異的に結合するペプチド、脂質、多糖類、または核酸のエピトープである。好ましい実施形態において、抗原は、葉酸受容体α、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソセリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１ポリペプチドのエピトープである。
【０１４７】
特定の好ましい実施形態において、抗体または断片は、腫瘍細胞上の表面タンパク質に特異的に結合するヒト化抗体（ヒト化モノクローナル抗体等）である。「ヒト化」抗体は、ヒトフレームワーク領域を含む免疫グロブリンおよび非ヒト（例えば、マウス、ラット、または合成の）免疫グロブリン由来の１つ以上のＣＤＲである。
【０１４８】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるＣＡＲは、種々のドメインの間に、例えば、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、適切な空間および分子立体構造のために追加されるリンカー残基を含んでもよい。本明細書において企図されるＣＡＲは、１、２、３、４、もしくは５つ、またはそれより多くのリンカーを含んでもよい。具体的な実施形態において、リンカーの長さは、約１〜約２５アミノ酸、約５〜約２０アミノ酸、もしくは約１０〜約２０アミノ酸、またはそれらの中間のアミノ酸の長さである。いくつかの実施形態において、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上のアミノ酸長である。
【０１４９】
リンカーの実例として、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ；グリシン−セリンポリマー（Ｇ１−５Ｓ１−５）ｎ（式中、ｎは、少なくとも１、２、３、４、または５の整数である）；グリシン−アラニンポリマー；アラニン−セリンポリマー；および当該技術分野で既知の他の可撓性リンカーが挙げられる。グリシンポリマーおよびグリシン−セリンポリマーは、比較的構造化されていないため、本明細書に記載されるＣＡＲ等の融合タンパク質のドメイン間の中性テザーとして機能できる可能性がある。グリシンは、アラニンよりも有意にファイ−プサイ空間に接近し、より長い側鎖を有する残基よりも制限されない（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１１１７３−１４２（１９９２）を参照のこと）。当業者は、具体的な実施形態におけるＣＡＲの設計は、リンカーが、可撓性リンカーだけでなく、所望のＣＡＲ構造に提供されるより低い可撓性の構造を付与する１つ以上の部分を含むことができるように、全体的にまたは部分的に可撓性のリンカーを含むことができることを認識するだろう。
【０１５０】
他の例示的なリンカーとして、限定されないが、以下のアミノ酸配列が挙げられる：ＧＧＧ；ＤＧＧＧＳ（配列番号１）；ＴＧＥＫＰ（配列番号２）（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ５５２５−５５３０（１９９７）を参照のこと）；ＧＧＲＲ（配列番号３）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９５、上記を参照）；（ＧＧＧＧＳ）ｎ（＝１、２、３、４、または５（配列番号４）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９３，１１５６−１１６０（１９９６．）；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号５）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号６）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号７）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号８）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号９）；ＬＲＱＫｄ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号１０）。代替として、可撓性リンカーは、ＤＮＡ結合部位およびペプチド自体の両方をモデル化することが可能なコンピュータプログラム（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３）、ＰＮＡＳ  ９１：１１０９９−１１１０３（１９９４）を使用して、またはファージディスプレイ法によって合理的に設計することができる。
【０１５１】
具体的な実施形態において、ＣＡＲは、可変領域連結配列をさらに含むｓｃＦＶを含む。「可変領域連結配列」は、重鎖可変領域を軽鎖可変領域に接続するアミノ酸配列であり、結果として得られるポリペプチドが、同じ軽鎖および重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対して特異的な結合親和性を保持するように、２つのサブ結合ドメインの相互作用に適合するスペーサー機能を提供する。一実施形態において、可変領域連結配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上のアミノ酸長である。具体的な実施形態において、可変領域連結配列は、グリシン−セリンポリマー（Ｇ１−５Ｓ１−５）ｎを含み、式中、ｎは、少なくとも１、２、３、４、または５の整数である。別の実施形態において、可変領域連結配列は、（Ｇ４Ｓ）３アミノ酸リンカーを含む。
【０１５２】
具体的な実施形態において、ＣＡＲの結合ドメインの後に１つ以上の「スペーサードメイン」が続くが、これは、適切な細胞間接着、抗原の結合および活性化を可能にするように、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離して移動させる領域を指す（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９９；６：４１２−４１９）。スペーサードメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。特定の実施形態において、スペーサードメインは、限定されないが、１つ以上の重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２およびＣＨ３を含む、免疫グロブリンの一部分である。スペーサードメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含むことができる。
【０１５３】
一実施形態において、スペーサードメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３を含む。
【０１５４】
ＣＡＲの結合ドメインの後には、通常、１つ以上の「ヒンジドメイン」が続くが、これは、適切な細胞間接着、抗原の結合および活性化を可能にするように、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離して位置付ける際に役割を果たす領域を指す。ＣＡＲは、通常、結合ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）との間に１つ以上のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含むことができる。
【０１５５】
「変更されたヒンジ領域」は、（ａ）最大３０％のアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のアミノ酸置換または欠失）を有する天然に存在するヒンジ領域、（ｂ）最大３０％のアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のアミノ酸置換または欠失）を有する少なくとも１０アミノ酸長（例えば、少なくとも１２、１３、１４、または１５アミノ酸）の天然に存在するヒンジ領域の一部分、または（ｃ）コアヒンジ領域（４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５、または少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５アミノ酸長であり得る）を含む天然に存在するヒンジ領域の一部分を指す。特定の実施形態において、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域の１つ以上のシステイン残基が、１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、１つ以上のセリン残基）で置換されてもよい。変更された免疫グロブリンヒンジ領域は、代替としてまたはそれに加えて、別のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）によって置換された野生型免疫グロブリンヒンジ領域のプロリン残基を有してもよい。
【０１５６】
本明細書に記載されるＣＡＲにおける使用に適した他の例示的なヒンジドメインは、１型膜タンパク質、例えば、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、およびＣＤ７の細胞外領域に由来するヒンジ領域を含み、これは、それらの分子からの野生型ヒンジ領域であってもよいか、または変更されてもよい。別の実施形態において、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域を含む。
【０１５７】
「膜貫通ドメイン」は、細胞外結合部分および細胞内シグナル伝達ドメインを融合し、免疫エフェクター細胞の細胞膜にＣＡＲを繋留する、ＣＡＲの一部分である。ＴＭドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ＴＭドメインは、Ｔ細胞受容体のα鎖またはβ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、およびＰＤ−１に由来し得る、すなわち、少なくともそれらの膜貫通領域（複数化）を含み得る。ある具体的な実施形態において、ＴＭドメインは、合成であり、主としてロイシンおよびバリン等の疎水性残基を含む。
【０１５８】
一実施形態において、本明細書において企図されるＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴＭドメインを含む。別の実施形態において、本明細書において企図されるＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴＭドメインと、ＣＡＲのＴＭドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを連結する、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーとを含む。グリシン−セリンリンカーは、特に適切なリンカーを提供する。
【０１５９】
具体的な実施形態において、本明細書において企図されるＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター細胞機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖、およびＣＡＲが結合した標的細胞への細胞傷害性因子の放出を含む細胞傷害活性、または細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合によって誘発される他の細胞応答を引き起こすために、標的抗原への有効なＣＡＲ結合のメッセージを免疫エフェクター細胞の内部に伝達することに関与するＣＡＲの部分指す。
【０１６０】
「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含む活性の補助であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊な機能を遂行するように細胞を誘導するタンパク質の一部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができる一方で、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分が使用される程度については、該短縮部分がエフェクター機能シグナルを伝達する限り、ドメイン全体の代わりにそのような短縮部分が使用され得る。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な、胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むことを意味する。
【０１６１】
ＴＣＲ単独によって生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であること、および二次または共刺激シグナルも必要であることが分かっている。したがって、Ｔ細胞の活性化は、２つの異なるクラスの細胞内シグナル伝達ドメインである、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）によって抗原依存性の一次活性化を開始する一次シグナル伝達ドメインと、二次または共刺激シグナルを提供するように抗原非依存性に作用する共刺激シグナル伝達ドメインとによって媒介されるということができる。好ましい実施形態において、本明細書において企図されるＣＡＲは、１つ以上の「共刺激シグナル伝達ドメイン」および「一次シグナル伝達ドメイン」を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０１６２】
一次シグナル伝達ドメインは、刺激様式または阻害様式のいずれかでＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激様式で作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。
【０１６３】
具体的な実施形態において具体的に使用される一次シグナル伝達ドメインを含有するＩＴＡＭの実例として、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。特定の好ましい実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインおよび１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。細胞内一次シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインのカルボキシル末端に任意の順序でタンデムに連結され得る。
【０１６４】
本明細書において企図されるＣＡＲは、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性および増殖を高めるために、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。共刺激分子は、抗原に結合したときにＴリンパ球の効率的な活性化および機能に必要とされる第２のシグナルを提供する、抗原受容体またはＦｃ受容体以外の細胞表面分子である。そのような共刺激ドメインの実例として、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０から単離されたものが挙げられる。一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ１３４からなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１６５】
別の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８およびＣＤ１３７共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１６６】
さらに別の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８およびＣＤ１３４共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１６７】
一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ１３７およびＣＤ１３４共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１６８】
別の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ  一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１６９】
さらに別の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ１３４共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１７０】
一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ１３７共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
Ｇ．使用方法
【０１７１】
トレハロースおよび本明細書において企図される安定化したウイルスベクターを含む組成物は、遺伝子治療を提供するために使用され得る。本明細書で使用される場合、「遺伝子治療」という用語は、細胞のゲノム内への遺伝子の導入を指す。種々の実施形態において、安定なウイルスベクターを含む組成物は、真核細胞内への異種ＤＮＡ（例えば、治療用導入遺伝子）の導入（および効率的な組み込み）のために使用することができる。すなわち、本明細書において企図される組成物を含有するトレハロース中で安定化した組換えウイルスベクターは、培養中またはインビボでレシピエントを感染させるためのウイルスストックとして使用することができる。分泌タンパク質または造血細胞において発現されるタンパク質の場合、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット等の感受性アッセイを使用して遺伝子導入効率を評価することができる。
【０１７２】
具体的には、トレハロースで安定化したウイルスベクターを含む組成物は、様々な分裂細胞の種類だけでなく、非分裂細胞の種類も形質転換するために安全に使用することができ、遺伝子治療によって治療可能な疾患の範囲を増大させる。
【０１７３】
特定の実施形態において、「標的細胞」という用語は、宿主細胞と交換可能に使用され、トランスフェクトされる、感染させられる、または形質導入される、所望の細胞の種類の細胞を指す。
【０１７４】
具体的な実施形態における使用に適した出発細胞集団は、本質的に任意の適切な源に由来してもよく、細胞の種類に関して異種または同種であってもよい。「自家性」は、本明細書で使用される場合、同じ対象からの細胞を指す。「同種異系」は、本明細書で使用される場合、比較される細胞とは遺伝的に異なる同種の細胞を指す。「同系」は、本明細書で使用される場合、比較される細胞と遺伝的に同一である異なる対象の細胞を指す。「異種間」は、本明細書で使用される場合、比較される細胞と異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態において、細胞は、同種異系または自家性である。適切な細胞は、胎児細胞および成人細胞を含む。さらに、適切な細胞は、哺乳動物起源であってもよく、例えば、げっ歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、または霊長類に由来してもよい。一実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。
【０１７５】
例示的な宿主細胞または標的細胞として、限定されないが、幹細胞、前駆細胞、および分化細胞が挙げられる。他の適切な細胞として、限定されないが、幹細胞、前駆細胞、および分化細胞が挙げられる。特定の実施形態において、形質導入される細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、骨髄幹細胞、臍帯幹細胞、胎盤幹細胞、間葉幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、膵臓内胚葉、心臓幹細胞、腎幹細胞、および造血幹細胞である。
【０１７６】
他の例示的な宿主細胞または標的細胞として、限定されないが、膵島細胞、ＣＮＳ細胞、ＰＮＳ細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、造血細胞、骨細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、肺細胞、軟骨細胞、皮膚細胞、瀘胞細胞、血管細胞、上皮細胞、免疫細胞、内皮細胞等からなる群から選択される、異種または同種集団が挙げられる。
【０１７７】
具体的な実施形態において、細胞は、造血細胞であり、例えば、限定されないが、造血幹細胞、ＣＤ３４発現細胞、造血前駆細胞、骨髄系細胞、リンパ球系細胞、ＢおよびＴリンパ球等である。
【０１７８】
本明細書において企図されるウイルスベクターは、異常ヘモグロビン症の治療を含む遺伝子治療に使用することができる。具体的な実施形態において、例えば、赤血球特異的疾患を治療するために、上記ベクターを使用して赤血球における安定した高レベルの遺伝子発現を達成するための方法が提供される。具体的な実施形態において、遺伝子治療ベクターは、例えば、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）を含む異常ヘモグロビン症を治療するために使用される。別の好ましい実施形態において、遺伝子治療ベクターは、限定されないが、βサラセミアを含むサラセミアを処置するために使用される。
【０１７９】
別の実施形態において、副腎白質ジストロフィーおよび／または副腎脊髄神経障害の治療のために、ＡＢＣＤ１遺伝子を含む本明細書において企図されるベクターを造血幹細胞に形質導入する。
【０１８０】
他の実施形態において、本明細書において企図されるウイルスベクターは、限定されないが、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、膠芽腫、神経芽細胞腫、メラノーマ、皮膚癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肝臓癌、腎癌、膵癌、肺癌、胆管癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および膀胱癌を含む癌の治療にも有用である。
【０１８１】
種々の実施形態において、安定なウイルスベクターを含む水性組成物は、インビボの遺伝子治療を必要とする細胞、組織、または器官への直接注射、例えば、遺伝子改変ＨＳＣの骨内投与によって投与される。種々の他の実施形態において、細胞は、安定なウイルスベクターを含む組成物でインビトロまたはエクスビボで形質導入され、任意選択的に、エクスビボで増殖させられる。形質導入された細胞は、次いで、遺伝子治療を必要とする対象に投与される。
【０１８２】
さらに、安定なウイルスベクターを含む水性組成物は、対象とするＤＮＡまたは遺伝子を、ヒト細胞等の哺乳動物細胞に導入するためにも使用することができ、細胞はその後、体の局所的な領域に投与される（例えば、体の局所的な領域にタンパク質を送達するための自己白血球のエクスビボ感染、例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと）。
【０１８３】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許出願、および発行された特許は、個々の刊行物、特許出願、または発行された特許が、あたかも具体的にかつ個別に参照によって組み込まれることが示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８４】
上記の実施形態は、理解を明確にする目的で、例示および実施例によってある程度詳細に記載されてきたが、本明細書において企図される教示に照らして、当業者は、添付の特許請求の範囲の主旨または範囲から逸脱することなく、特定の変更および修正が行われ得ることを容易に理解するであろう。以下の実施例は、例として提供されるに過ぎず、制限のために提供されるものではない。当業者は、本質的に同様の結果を得るために変更または修正され得る重要性の低い様々なパラメータを容易に認識するであろう。
【実施例】
【０１８５】
以下の実施例は、トレハロースおよびその誘導体がウイルスベクターに適した保存剤であることを示す。特定濃度のトレハロースまたはトレハロースの誘導体を含有する溶液中に保存されたウイルスベクターは、トレハロースまたはトレハロースの誘導体に保存されなかったウイルスベクターと比較して、広範囲の温度で複数の凍結融解サイクルを通して感染力価を維持する。
実施例１
材料および方法
材料および設備
・ヒト骨肉腫（ＨＯＳ）細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ−１５４３）
・ＤＭＥＭ高グルコース（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１１９９５）
・熱失活ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号２６１４０−０７９）
・Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号３５０５０）
・６ウェル細胞培養プレート
・ポリスチレン製丸底試験管（５ｍＬ、１２ｍｍ×７５ｍｍ）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号３５２００５）
・フローサイトメトリー用ハンクス平衡塩溶液。２０ｍＬの１０倍ハンクス平衡塩溶液を４ｍＬのＦＢＳおよび１７６ｍＬの蒸留水と混合する。この溶液は、４℃で少なくとも２か月保存することができる。
・組織培養フード
・組織培養インキュベーター
・ＦＡＣＳ機
【０１８６】
方法
形質導入の１日前に、６ウェルプレートにウェル当たり５×１０４細胞の密度でＨＯＳ細胞をプレーティングした。
【０１８７】
播種から２４時間後、ヘマサイトメータを使用してウェルのうち２つの細胞数をカウントした。他のウェルの培地を除去し、８ｍｇ／ｍＬのポリブレンを含有する０．５ｍＬの新しい培地と交換した。細胞培養培地で１００倍に希釈した濃縮ベクターストックの０．５、５、および５０ｍＬアリコートを加えることによって細胞に形質導入した（すなわち、１μＬの濃縮ベクターストックをウェル当たり９９μＬの培地とそれぞれ混合した）。希釈したベクター懸濁液の０．５、５、および５０ｍＬアリコートをウェル当たりそれぞれ加えることによってＨＯＳ細胞に形質導入した。
【０１８８】
形質導入の開始から２０時間後、培地を２ｍＬの新しい培地と交換し、細胞をインキュベートし続けた。
【０１８９】
２日後、培地を除去し、１ｍＬのＰＢＳで細胞を洗浄した。ウェル当たり０．５ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡを加え、３７℃で２分間インキュベートした。
【０１９０】
１ｍＬの培地を各ウェルに加え、内容物を混合した。各ウェルからの細胞懸濁液を５ｍＬ丸底試験管に移し、１，５００ｒｐｍ（５００ｇ）で５分間２０℃で遠心分離して細胞をペレット化した。
【０１９１】
吸引により培地を除去し、２ｍＬのハンクス平衡塩溶液に細胞ペレットを再懸濁し、１，５００ｒｐｍ（５００ｇ）で５分間２０℃で遠心分離して細胞をペレット化した。
【０１９２】
吸引によりハンクス平衡塩溶液を除去し、３００ｍＬのハンクス平衡塩溶液に細胞ペレットを再懸濁した。
【０１９３】
次いで、ＦＡＣＳにより細胞を分析した。
【０１９４】
以下の式に従って力価（形質導入単位（ＴＵ）／ｍＬ）を算出した：ＴＵ／ｍＬ＝（Ｆ×Ｎ×Ｄ×１，０００）／Ｖ、式中、Ｆ＝蛍光細胞の割合（ＥＧＦＰ）、Ｎ＝形質導入時の細胞数（ウェル当たり約１Ｅ＋０５ＨＯＳ細胞に相当する）、Ｄ＝形質導入に使用したベクター試料の希釈倍数、およびＶ＝形質導入のために各ウェルに加えた希釈ベクター試料の体積（ｍＬ）。異なる量のベクターを用いて形質導入したＨＯＳ細胞から得られたベクター力価を合計し、平均力価を算出した。正確な力価決定のために、使用されるベクターの量は、ＥＧＦＰ陽性細胞の割合と加えられるベクターの量との間に線形関係が存在する範囲内に属するべきである。蛍光細胞の割合が４０％を超過した場合、さらなるベクター希釈液を使用して滴定を繰り返す。
【０１９５】
実施例２
トレハロース中に保存されたウイルスベクターの長期安定性
レンチウイルスベクターを生成し、標準的な方法を用いて精製した。最終ベクター生成物をサイズ排除クロマトグラフィーにより生成し、リン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４（ＰＢＳ）中に未希釈で保存するか、または５％トレハロース／ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号９０２１０）中に希釈して保存した。
【０１９６】
４℃で２４時間保存した、および−８０℃で２４時間保存して１度融解した後の、未希釈のレンチウイルスベクター組成物中で調べたレンチウイルスベクターの力価に融解が与える影響を調べた。図１は、４℃で保存した未希釈のレンチウイルスベクターと比較して、−８０℃で保存した未希釈のレンチウイルスベクター組成物において平均力価（ＴＵ／ｍＬ）が減少したことを示す。
【０１９７】
次に、ＰＢＳ中に未希釈で保存した、または５％トレハロース／ＰＢＳ中に希釈して保存したレンチウイルスベクターの長期安定性を、長期保存期間の間に種々の温度にわたって調べた。４、１４、２８、４２、および７３日間、４℃で保存した、ならびに−２０℃および−８０℃で保存して１度融解した後のレンチウイルスベクターについて力価を測定した。図２は、５％トレハロースに配合されたレンチウイルスベクターが、少なくとも７３日間、試験温度にわたって安定なレンチウイルス力価を示すことを示している。
【０１９８】
実施例３
トレハロース中におけるウイルスベクターの安定化
赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現するレンチウイルスベクターを生成し、標準的な方法を用いて精製した。最終ベクター生成物をサイズ排除クロマトグラフィーにより生成し、ＰＢＳ中に未希釈で保存するか、または約７．５％トレハロース／ＰＢＳ、約１５％トレハロース／ＰＢＳ、約１８．７５％トレハロース／ＰＢＳ、および約２２．７％トレハロース／ＰＢＳ中に希釈して保存した。
【０１９９】
レンチウイルスベクターの発現（ＲＦＰ発現）を、種々の濃度のトレハロースに配合された１Ｅ＋０８ＴＵ／ｍＬで形質導入した細胞中でフローサイトメトリーにより調べた。図３は、トレハロース／ＰＢＳ中に、４℃で２４時間保存した場合、および−８０℃で２４時間保存して１度融解した後、ＰＢＳ中に未希釈で保存したレンチウイルスベクターを含有する細胞と比較して、レンチウイルスベクターを含有するより多くの割合の細胞がＲＦＰを発現したことを示す。ＲＦＰを発現する細胞の最も高い割合は、細胞を約１５％トレハロース／ＰＢＳ中に保存したときに見られ、４℃および−８０℃の両方でＲＦＰを発現する細胞が約９８％〜約９９％に達した。
【０２００】
４℃で保存した場合と比較して、より低い温度である−８０℃で保存した場合に、どの保存条件がレンチウイルスベクターに最も保護を提供したかを決定するために、これらの同じ細胞試料の平均力価（ＴＵ／ｍＬ）における変化を調べた。図４に見られるように、ＰＢＳ中に未希釈で保存したレンチウイルスベクターを含有する細胞が大きな負のΔＴＵ／ｍＬ値を有していたことから、レンチウイルスベクターは、一旦、−８０℃で２４時間保存し、その後融解した場合、４℃での保存と比較して安定性を保持しなかったことが示唆される。フローサイトメトリーのデータと一致して、約１５％のトレハロース／ＰＢＳ中に保存したレンチウイルスベクターを含有する細胞が最大の正のΔＴＵ／ｍＬ値を示したことから、−８０℃で２４時間保存し、その後融解した場合、４℃での保存と比較して、レンチウイルスベクターの平均力価が実際に増加したことが示される。
【０２０１】
レンチウイルスベクターの力価を保存組成物のトレハロース濃度（重量％）に対してプロットした場合（図５）、４℃および−８０℃の両方で最も低い希釈率でレンチウイルスベクターの最も高い保存率をもたらしたトレハロースの割合は、約１５％であり、この場合も同様に、フローサイトメトリー実験および４℃〜−８０℃で保存したΔＴＵ／ｍＬ値の算出においてベクターについて得られた結果と一致していた。
【０２０２】
実施例４
少量のトレハロース中におけるウイルスベクターの安定化
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するレンチウイルスベクターを生成し、標準的な方法を用いて精製した。最終ベクター生成物をサイズ排除クロマトグラフィーにより生成し、ＰＢＳ中に未希釈で保存するか、ｄＰＢＳ中に５０％希釈して保存するか、または約５．６７％トレハロース／ＰＢＳ、約６．６１５％トレハロース／ＰＢＳ、および約７．５６％トレハロース／ＰＢＳ中に希釈して保存した。
【０２０３】
種々の濃度のトレハロース／ＰＢＳ中に−８０℃で保存した試料について、レンチウイルスベクターの力価を調べた。ｄＰＢＳの未希釈の濃縮生成物も１：２で希釈した濃縮生成物も、試験したより低いトレハロース濃度でのトレハロースの保存効果は線形であった（図６）。このことは、トレハロースが、たとえ少量であっても、線形の保存効果を示す可能性を示唆するものである。
【０２０４】
一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、請求項を本明細書および特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に制限すると解釈されるべきではなく、そのような請求項が権利を有する均等物の全範囲とともに全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって制限されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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