(57)【要約】  本発明は、立体的（３Ｄ）で多孔性であり、生分解性および生体適合性を有する、組織工学用足場であって、足場の少なくとも２５％ｗ／ｗは、足場に実質的に一様に分布した粒子状卵殻膜（ＥＳＭ）であり、また、足場は、本質的には乾燥している、組織工学用足場を提供する。フリーズドライおよび低温ゲル化によって、組織工学用足場を調製する方法、および創傷の治癒を促進するための、組織工学的方法における組織工学用足場の使用も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
立体的（３Ｄ）で多孔性であり、生分解性および生体適合性を有する、組織工学用足場であって、前記足場の少なくとも２５％ｗ／ｗは、足場に実質的に一様に分布した粒子状卵殻膜（ＥＳＭ）であり、また、前記足場は、本質的には乾燥している、組織工学用足場。
【請求項２】
前記足場の水の含有量は、５％ｗ／ｗ未満であって、例えば４．５％ｗ／ｗ未満、４％ｗ／ｗ未満、３．５％ｗ／ｗ未満、３％ｗ／ｗ未満、２．５％ｗ／ｗ未満、２％ｗ／ｗ未満、１．５％ｗ／ｗ未満、または１％ｗ／ｗ未満である、請求項１に記載の組織工学用足場。
【請求項３】
前記粒子状ＥＳＭは、平均粒子径が５００μｍ以下である、例えば４５０μｍ以下、４００μｍ以下、３５０μｍ以下、３００μｍ以下、２５０μｍ以下、２００μｍ以下、１５０μｍ以下、１２５μｍ以下、または１００μｍ以下である、ＥＳＭ粒子であるか、または、そのようなＥＳＭ粒子から形成され得る、請求項１または２に記載の組織工学用足場。
【請求項４】
前記粒子状ＥＳＭは、平均粒子径が１ｎｍ以上である、例えば５ｎｍ以上、１０ｎｍ以上、５０ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、１５０ｎｍ以上、２００ｎｍ以上、２５０ｎｍ以上、３００ｎｍ以上、３５０ｎｍ以上、４００ｎｍ以上、４５０ｎｍ以上、５００ｎｍ以上、５５０ｎｍ以上、６００ｎｍ以上、６５０ｎｍ以上、７００ｎｍ以上、７５０ｎｍ以上、８００ｎｍ以上、８５０ｎｍ以上、９００ｎｍ以上、または９５０ｎｍ以上であるか、あるいは平均粒子径が１μｍ以上である、例えば５μｍ以上、１０μｍ以上、１５μｍ以上、２０μｍ以上、２５μｍ以上、３０μｍ以上、３５μｍ以上、４０μｍ以上、４５μｍ以上、５０μｍ以上、５５μｍ以上、６０μｍ以上、６５μｍ以上、７０μｍ以上、７５μｍ以上、８０μｍ以上、８５μｍ以上、９０μｍ以上、９５μｍ以上、１００μｍ以上、１２５μｍ以上、１５０μｍ以上、２００μｍ以上、２５０μｍ以上、３００μｍ以上、３５０μｍ以上、４００μｍ以上、または４５０μｍ以上である、ＥＳＭ粒子であるか、または、そのようなＥＳＭ粒子から形成され得る、請求項３に記載の組織工学用足場。
【請求項５】
前記粒子状ＥＳＭは、本質的に、球状、擬角柱状、円筒状、棒状、針状、または繊維状である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組織工学用足場。
【請求項６】
前記粒子状ＥＳＭは、第１の長さ寸法と、これに垂直に配される第２の長さ寸法とのアスペクト比が、少なくとも１．５（第１の長さ寸法：第２の長さ寸法）であって、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００である、請求項５に記載の組織工学用足場。
【請求項７】
前記足場は、粒子状ＥＳＭを少なくとも３０％ｗ／ｗ含み、例えば少なくとも３５％ｗ／ｗ、少なくとも４０％ｗ／ｗ、少なくとも４５％ｗ／ｗ、少なくとも５０％ｗ／ｗ、少なくとも５５％ｗ／ｗ、少なくとも６０％ｗ／ｗ、少なくとも６５％ｗ／ｗ、少なくとも７０％ｗ／ｗ、少なくとも７５％ｗ／ｗ、少なくとも８０％ｗ／ｗ、少なくとも８５％ｗ／ｗ、少なくとも９０％ｗ／ｗ、少なくとも９５％ｗ／ｗ、または少なくとも１００％ｗ／ｗ含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組織工学用足場。
【請求項８】
前記足場は、さらなる足場材料を少なくとも１つ含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組織工学用足場。
【請求項９】
前記粒子状ＥＳＭと、さらなる足場材料とは、前記足場において、１：３〜２０：１の比で存在し、例えば、１：３〜１５：１、１：３〜１０：１、１：３〜６：１、１：３〜５：１、１：３〜３：１、１：３〜２：１、１：１〜２０：１、１：１〜１５：１、１：１〜１０：１、１：１〜６：１、１：１〜５：１、１：１〜３：１、１：１〜２：１、または約１：１（ＥＳＭ：さらなる足場材料）の比で存在している、請求項８に記載の組織工学用足場。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの足場材料は、コラーゲン（コラーゲンＩおよびゼラチンなど）、フィブリン、ケラチン、エラスチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン、アルギン酸塩、ペクチン、キトサン、セルロース（酸化再生セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなど）、フィブロネクチン、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリジオキサノン（ＰＤＳ）、ポリ（エチレンオキサイドテレフタレート）（ＰＥＯＴ）、ポリ（ブチレンテレフタレート）（ＰＢＴ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、窒化ケイ素、およびこれらの共重合体（ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＡＧＡ）、およびＰＥＯＴ／ＰＢＴなど）、ヒドロキシアパタイト、ならびに、リン酸カルシウム（Ｃａ−Ｐ）およびその誘導体（シリカ被覆リン酸カルシウム、ベータ−トリリン酸カルシウム（β−ＴＣＰ）など）、またはこれらの混合物からなる群から選択される、請求項８または９に記載の組織工学用足場。
【請求項１１】
前記足場は、足場材料として働くのに十分な量のアルギン酸塩を含有していない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組織工学用足場。
【請求項１２】
前記足場は、コラーゲン（コラーゲンＩおよびゼラチンなど）、フィブリン、ケラチン、エラスチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン、ペクチン、キトサン、セルロース（酸化再生セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなど）、フィブロネクチン、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリジオキサノン（ＰＤＳ）、ポリ（エチレンオキサイドテレフタレート）（ＰＥＯＴ）、ポリ（ブチレンテレフタレート）（ＰＢＴ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、窒化ケイ素、およびこれらの共重合体（ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＡＧＡ）、およびＰＥＯＴ／ＰＢＴなど）、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム（Ｃａ−Ｐ）およびその誘導体（シリカ被覆リン酸カルシウム、ならびにベータ−トリリン酸カルシウム（β−ＴＣＰ）など）、またはこれらの混合物からなる群から選択されるさらなる足場材料を少なくとも１つ含む、請求項１１に記載の組織工学用足場。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのさらなる足場材料は、コラーゲン、ゼラチン、酸化再生セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ヒドロキシアパタイト、シリカ被覆リン酸カルシウムおよびベータ−トリリン酸カルシウム（β−ＴＣＰ）、またはこれらの混合物から選択される、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の組織工学用足場。
【請求項１４】
前記さらなる足場材料の個々の分子は、互いに架橋または重合していてもよく、場合によっては、前記粒子状ＥＳＭと架橋または重合していてもよい、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の組織工学用足場。
【請求項１５】
前記足場は、臨床的に有効な抗菌剤、成長因子、または抗炎症剤をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組織工学用足場。
【請求項１６】
前記足場には、幹細胞（万能性幹細胞、全能性幹細胞、多能性幹細胞、または単能性幹細胞）、人工万能性幹細胞、線維芽細胞、骨格筋、平滑筋、心筋、上皮細胞、ケラチン生成表皮細胞、破骨細胞、骨芽細胞、および基底膜細胞などの細胞が播種される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組織工学用足場。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の、スポンジ状の足場を調製する方法であって、該方法は、
（ｉ）粒子状ＥＳＭと、存在する場合はその他の足場成分とを、前記足場において粒子状ＥＳＭが少なくとも２５％ｗ／ｗとなるのに十分な量で、水懸濁液として提供することと、
（ｉｉ）前記懸濁液をフリーズドライして、場合によっては鋳型中で前記懸濁液をフリーズドライして、該足場を得ることと、
を含む、方法。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の、スポンジ状の足場を調製する方法であって、該方法は、
（ｉ）（ａ）粒子状ＥＳＭを、前記足場において粒子状ＥＳＭが少なくとも２５％ｗ／ｗとなるのに十分な量で、重合可能または架橋可能な足場成分である、１つ以上の他の足場成分と、適切な重合開始剤または架橋開始剤と共に、水懸濁液として提供することと、
（ｉ）（ｂ）重合または架橋が起こるのに十分な条件下で、十分な時間、前記粒子状ＥＳＭの懸濁液の温度を、前記懸濁液の凝固点よりも低い温度に保つこと、場合によっては鋳型中で低い温度に保つことと、
（ｉ）（ｃ）ステップ（ｉ）（ｂ）の重合産物または架橋産物を乾燥させて、該足場を得ることと、を含む方法、または、該方法は、
（ｉｉ）（ａ）粒子状ＥＳＭを、前記足場において粒子状ＥＳＭが少なくとも２５％ｗ／ｗとなるのに十分な量で、重合可能または架橋可能な足場成分である、１つ以上の他の足場成分と共に、水懸濁液として提供することと、
（ｉｉ）（ｂ）該粒子状ＥＳＭの懸濁液を、適切な重合開始剤または架橋開始剤と混合することと、
（ｉｉ）（ｃ）重合または架橋が起こるのに十分な条件下で、十分な時間、前記懸濁液の温度を、前記懸濁液の凝固点よりも低い温度に保つこと、場合によっては鋳型中で低い温度で保つことと、
（ｉｉ）（ｄ）ステップ（ｉｉ）（ｃ）の重合産物または架橋産物を乾燥させて、該足場を得ることと、を含む方法、または、該方法は、
（ｉｉｉ）（ａ）粒子状ＥＳＭを、前記足場において粒子状ＥＳＭが少なくとも２５％ｗ／ｗとなるのに十分な量で、重合可能または架橋可能な足場成分である、１つ以上の他の足場成分と共に、水懸濁液として提供することと、
（ｉｉｉ）（ｂ）前記懸濁液の温度を、前記懸濁液の凝固点よりも低い温度に保つこと、場合によっては鋳型中で低い温度に保つことと、
（ｉｉｉ）（ｃ）該ＥＳＭ懸濁液を、重合または架橋が起こるのに十分な条件下で、十分な時間、適切な重合開始剤または架橋開始剤と混合することと、
（ｉｉｉ）（ｄ）ステップ（ｉｉｉ）（ｃ）の重合産物または架橋産物を乾燥させて、該足場を得ることと、を含む方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法または請求項１８に記載の方法によって得られた、または得ることができる、組織工学用足場。
【請求項２０】
インビボにおける組織工学的方法であって、該方法は、請求項１〜１６または１９のいずれか１項に記載の組織工学用足場を提供することと、十分量の該足場を、被験者に対して、再生、修復、または再構成を必要とする組織中または組織上、あるいは組織の置換または新規組織の構成を必要とする部位に適用することとを含む、方法。
【請求項２１】
エキソビボにおける組織工学的方法であって、該方法は、請求項１〜１６または１９のいずれか１項に記載の組織工学用足場を提供することと、十分量の該足場を、再生、修復、または再構成を必要とする、被験者から単離された組織、あるいは組織の置換または新規組織の構成を必要とする、該単離された組織中または組織上の部位に適用することとを含む、方法。
【請求項２２】
インビトロにおける組織工学的方法であって、該方法は、請求項１〜１６または１９のいずれか１項に記載の組織工学用足場を十分量提供することと、該足場に、該組織を形成できる細胞を播種することと、前記足場および細胞を、組織形成が誘導される条件下で培養することとを含む、方法。
【請求項２３】
前記組織は、副腎組織、肝組織、心組織、腎組織、膵組織、脳下垂体組織、甲状腺組織、免疫組織、卵巣組織、精巣組織、前立腺組織、子宮内膜組織、眼組織、乳房組織、脂肪組織、上皮組織、内覆組織、神経組織、筋肉組織、結合組織（靱帯および軟骨など）、肺組織、内皮組織、表皮組織、および骨組織から選択され、好ましくは、筋肉組織、結合組織（軟骨など）、骨組織、および神経組織から選択される、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
創傷の治癒を促進する方法であって、請求項１〜１６または１９のいずれか１項に記載の組織工学用足場が、創傷の治癒を促進するのに十分な量で、該創傷に適用される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、立体的（３Ｄ）で多孔性であり、生分解性および生体適合性を有する、粒子状卵殻膜（egg shell membrane：ＥＳＭ）含有組織工学用足場を提供する。より具体的には、足場の少なくとも２５％ｗ／ｗは、足場に実質的に一様に分布した粒子状ＥＳＭであり、また、足場は、本質的には乾燥している。驚くべきことであるが、このような足場は、既存の足場と比較すると、構造的かつ機能的に働くが、主に、コラーゲン、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、ケラチン様タンパク質、およびエラスチン様タンパク質などの構造タンパク質および細胞外基質成分からなり、卵を用いる産業において豊富に生じる副生物である粒子状ＥＳＭを用いることによって、病原体のリスクが減少し、かつ免疫または毒性に関する問題が減少した、大幅に費用対効果が高い製品が得られるということがわかっている。創傷管理、骨修復、神経再生、組織および臓器の再構築、ならびに組織および臓器の構築などの組織工学的方法におけるこのような足場の使用も提供される。このような方法は、インビボのみならず、インビトロまたはエキソビボにおいて行われるものであってもよい。特定の足場を作製するための、簡易で費用対効果の高い方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
当該技術分野においては、組織工学用足場を調製するのに、天然材料および合成材料の両方が用いられる。典型的には、このような材料は、立体的に配置することができ、また、適切かつ十分なリガンドを提供して、細胞移動、細胞接着、細胞増殖、および／または新規の細胞外基質の生産を促進することができる、ポリマーである。より具体的には、例えば、細胞外基質のタンパク質および多糖類（コラーゲン、フィブリン、ケラチン、エラスチン、およびグリコサミノグリカン（ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびヒアルロナンなど））や、アルギン酸塩、ペクチン、キトサン、セルロース（酸化再生セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびヒドロキシエチルセルロースを含む）、フィブロネクチンなどの、天然（繊維状）タンパク質および多糖類が挙げられる。人工的な足場材料としては、例えば、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリジオキサノン（ＰＤＳ）、ポリ（エチレンオキサイドテレフタレート）（ＰＥＯＴ）、ポリ（ブチレンテレフタレート）（ＰＢＴ）、窒化ケイ素、およびこれらの共重合体（ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＡＧＡ）およびＰＥＯＴ／ＰＢＴなど）や、ヒドロキシアパタイト、ならびにリン酸カルシウム（Ｃａ−Ｐ）およびその誘導体（シリカ被覆リン酸カルシウムおよびβ−トリリン酸カルシウム（β−ＴＣＰ）など）などが挙げられる。
【０００３】
タンパク質系の立体構造体または立体基質は、損傷を受けた皮膚における組織再生の助けとなり、また、潰瘍などの慢性創傷における創傷治癒の促進も可能であるということが知られている。市販の基質の製品例としては、インテグラ皮膚再生テンプレート（Integra Dermal Regeneration Template）（インテグラ・バイオサイエンス社（Integra Biosciences））およびオアシス（Oasis）（ヘルスポイント・スミス＆ネフュー社（Healthpoint, Smith & Nephew））が挙げられる。
【発明の概要】
【０００４】
インテグラは、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンから製造された連続気泡スポンジであり、皮膚全層の修復に適応する。細胞は、インテグラの構造を通して移動可能であって、その後、組織の再生過程の間、吸収が促進される。インテグラは、空間充填性を有しており、火傷および慢性創傷の治療に特に役立つ。この製品は、組成が比較的単純であり、コラーゲンおよびＧＡＧの水懸濁液を凍結乾燥して、乾燥し安定したスポンジを作ることによって、比較的容易に製造される。
【０００５】
オアシスは、ブタ小腸粘膜下組織由来の、層状構造体またはラメラ様構造体である。細胞は、オアシスの表面に付着可能であり、創傷治癒プロセスを通して、オアシスは吸収される。オアシスは、創傷治癒プロセスの間、組織の代謝回転によって入れ替わるが、空間を充填するというよりも、局所用である。しかしながら、連続気泡スポンジではない。オアシスは、脱細胞化されたＥＣＭからなる、比較的複雑な製品である。製造にも比較的費用がかかる。
【０００６】
最近、無処置の雌鶏卵殻膜（ＥＳＭ）を用い、無処置フィルムとして損傷を受けた肌に被せた場合に、創傷治癒が促進されることが示された（Ｙａｎｇ，Ｊ−Ｙら，２００３．Ｃｈａｎｇ Ｇｕｎｇ Ｍｅｄ Ｊ）。
【０００７】
ＥＳＭは、鳥類の卵において卵白と卵殻との間に見出される、タンパク質に富んだ繊維状の複合二層構造である。このような膜は、約９０重量％のタンパク質（コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチンペプチド成長因子、オボトランスフェリン、リジルオキシダーゼ、およびリゾチームなど）ならびにデスモシン、イソデスモシン、およびグリコサミノグリカン（デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびヒアルロン酸など）を含有することが研究によって明らかにされている。これらのタンパク質は、脊椎動物の細胞外基質成分を厳密に反映している。様々な機械的手段によって、卵殻および卵の内部成分からＥＳＭを容易に分離して、本質的に純粋なＥＳＭ製剤を作製することができる。この手順は、直接的で低コストであり、低価格な製品が十分に提供される。
【０００８】
ＥＳＭを無処置シートとして皮膚創傷に被せると、半透過性膜として機能して、水蒸気の透過を可能にし、創傷床内の湿度を管理する。その特性は、バイオブレイン（Biobrane）（商標）などの合成材料と同様である。しかしながら、創傷治癒に用いるのに適切なサイズの無処置ＥＳＭを、商業的に実現可能な量で調製するのは困難である。無処置ＥＳＭは、使用可能なサイズを維持するために、手作業での調製を必要とし、それでも、個々の膜を寄せ集めて用いる必要がある。処理中、このもろい材料は、残留結合カルシウムおよび付随している卵白成分からの分離と、無菌的な処理または最終的な滅菌のいずれかとを必要とする。その結果、上述のような医薬製品の製造に足るプロセスおよび品質管理は、技術的または経済的に実現不可能である。
【０００９】
局所的な投与経路を介する特定の創傷の治療に対して、１００〜５００μｍのＥＳＭ粉末もまた提案されている（ＷＯ２００４/０８０４２８）。この提案の根拠は不明であり、また、治療が成功したことの証拠も提供されていない。
【００１０】
全身投与経路、特に経口投与経路を介する、関節炎および他の炎症性疾患の痛みおよび炎症の治療に対して、１００〜５００μｍのＥＳＭ粉末もまた提案されている（ＵＳ８５８０３１５）。
【００１１】
また、ＵＳ３１９６０７５およびＵＳ３１９４７３２には、寸法がマイクロメートルの範囲であるＥＳＭ粒子（繊維状および非繊維状）について、また、この粒子を、皮膚移植片の代わりに創傷に投与することについての記載もある。
【００１２】
驚くべきことであるが、現時点で、粒子状ＥＳＭを用いることによって、既存の乾燥した足場と比較して、例えば強度および柔軟性の点で構造的に、かつ例えば細胞移動および細胞増殖、ならびに立体的な組織の形成のための表面として機能的に、働く、費用対効果の高い乾燥した組織工学用足場の基盤を形成できるということがわかっている。このような足場は、止血性および創傷滲出物管理能も有している。
【００１３】
したがって、第１の態様においては、本発明は、立体的（３Ｄ）で多孔性であり、生分解性および生体適合性を有する、組織工学用足場を提供するものであって、前記足場の少なくとも約２５％ｗ／ｗは、実質的に一様に分布した粒子状卵殻膜（ＥＳＭ）であり、また、前記足場は、本質的には乾燥している。
【００１４】
あるいは、生細胞の播種および／または宿主生物への移植後に、立体的な組織の形成を助けることができる人工的な構造体として、より具体的には細胞外基質として、組織工学用足場を説明し得る。本発明の足場は、乾燥したスポンジまたは発泡体であってもよい。本発明の足場は、ゲル、特にヒドロゲルまたはヒドロコロイドゲルではなく、また織って作った、または織らずに作った、または編んで作った、例えばフェルトのような繊維シート構造体でもない。
【００１５】
本発明に係る「立体的な」（３Ｄ）物体とは、高さ／奥行き、幅、および長さを有する物体であり、これらの寸法のうちのどれもが、最大寸法の５％未満、例えば１０％未満、１５％未満、２０％未満、または２５％未満ではない。この立体的な物体は、空間充填的な（あるいは、空隙充填的または空洞充填的な）存在物と説明されてもよい。本発明に係るこれらの用語は、組織工学における空間、空隙、および空洞と解釈されるべきである。換言すると、立体的な構造体は、シートでも、フィルムでも、膜でも、層でも、被膜でもない。ある実施形態においては、３つの寸法は全て、裸眼で容易に見ることができる。例えば、最短寸法は、少なくとも２ｍｍであり、例えば、少なくとも３ｍｍ、少なくとも４ｍｍ、少なくとも５ｍｍ、少なくとも６ｍｍ、少なくとも７ｍｍ、少なくとも８ｍｍ、少なくとも９ｍｍ、少なくとも１０ｍｍ、少なくとも１２ｍｍ、少なくとも１５ｍｍ、少なくとも２０ｍｍ、少なくとも２５ｍｍ、または少なくとも３０ｍｍである。
【００１６】
本明細書において、「生分解性」とは、インビボであってもよいしインビトロであってもよい使用位置において、足場が分解されることをいう。典型的には、足場は、分解速度がその用途に好適なものとなるように設計される。この速度は、組織の形成速度、または少なくともインサイチュにおける細胞外基質の形成速度に一致した速度であってもよい。
【００１７】
本明細書において、「生体適合性」とは、足場の使用位置および宿主生物内における、足場およびその分解産物の生理学的許容性、例えば毒物学上および／または免疫学上の許容性のことをいう。換言すると、悪影響を生じずに、生命システムと接触する能力のことである。ＥＳＭおよび本発明の足場は、実質的に、例えば本質的に、無毒であり、実質的に、例えば本質的に、非免疫原性であると予想される。特に、身体に接触する医療機器に対する、生体適合性および毒性についての標準的なアッセイおよび許容できる閾値は、国際標準化機構の基準であるＩＳＯ１０９９３（医療機器の生物学的評価）およびその付帯的な基準に定められている。本発明の足場は、ＩＳＯ１０９９３に本質的に準拠していることが好ましい。
【００１８】
本明細書において、「多孔性」とは、足場内に、液体および気体が浸透可能な不連続な小孔、空隙、または小空洞（これらの用語は交換可能に用いられる）が存在していることをいい、すなわち不連続な小孔の少なくとも一部は、相互に接続している。足場の小孔は、そのサイズ、表面積および／または構造が実質的に同じであってもよいし、このような計量値が不均一であってもよい。例えば、足場の物性（強度、柔軟性、生分解速度）および／または機能性（細胞増殖、細胞移動、および／またはＥＣＭ産生）を最適化することによって、このような計量値を制御し、足場をその用途に最適化することは、有利であろう。このことは、例えば、生産条件および構成材料を制御することによって実現されてもよい。
【００１９】
小孔のサイズ（または、適切な場合は、小孔サイズの平均値もしくは最頻値）は、１μｍ〜１０００μｍにわたっていてもよく、例えば、１〜９５０μｍ、１〜９００μｍ、１〜８５０μｍ、１〜８００μｍ、１〜７５０μｍ、１〜７００μｍ、１〜６５０μｍ、１〜６００μｍ、１〜５５０μｍ、１〜５００μｍ、１〜４５０μｍ、１〜４００μｍ、１〜３５０μｍ、１〜３００μｍ、１〜２５０μｍ、１〜２００μｍ、１〜１５０μｍ、１〜１００μｍ、１〜５０μｍ、１〜２５μｍ、１〜１０μｍ、２〜１０００μｍ、２〜９５０μｍ、２〜９００μｍ、２〜８５０μｍ、２〜８００μｍ、２〜７５０μｍ、２〜７００μｍ、２〜６５０μｍ、２〜６００μｍ、２〜５５０μｍ、２〜５００μｍ、２〜４５０μｍ、２〜４００μｍ、２〜３５０μｍ、２〜３００μｍ、２〜２５０μｍ、２〜２００μｍ、２〜１５０μｍ、２〜１００μｍ、２〜５０μｍ、２〜２５μｍ、２〜１０μｍ、５〜１０００μｍ、５〜９５０μｍ、５〜９００μｍ、５〜８５０μｍ、５〜８００μｍ、５〜７５０μｍ、５〜７００μｍ、５〜６５０μｍ、５〜６００μｍ、５〜５５０μｍ、５〜５００μｍ、５〜４５０μｍ、５〜４００μｍ、５〜３５０μｍ、５〜３００μｍ、５〜２５０μｍ、５〜２００μｍ、５〜１５０μｍ、５〜１００μｍ、５〜５０μｍ、５〜２５μｍ、５〜１０μｍ、５０μｍ〜１０００μｍ、５０〜９５０μｍ、５０〜９００μｍ、５０〜８５０μｍ、５０〜８００μｍ、５０〜７５０μｍ、５０〜７００μｍ、５０〜６５０μｍ、５０〜６００μｍ、５０〜５５０μｍ、５０〜５００μｍ、５０〜４５０μｍ、５０〜４００μｍ、５０〜３５０μｍ、５０〜３００μｍ、５０〜２５０μｍ、５０〜２００μｍ、５０〜１５０μｍ、５０〜１００μｍ、１００μｍ〜１０００μｍ、１００〜９５０μｍ、１００〜９００μｍ、１００〜８５０μｍ、１００〜８００μｍ、１００〜７５０μｍ、１００〜７００μｍ、１００〜６５０μｍ、１００〜６００μｍ、１００〜５５０μｍ、１００〜５００μｍ、１００〜４５０μｍ、１００〜４００μｍ、１００〜３５０μｍ、１００〜３００μｍ、１００〜２５０μｍ、１００〜２００μｍ、１００〜１５０μｍ、２００μｍ〜１０００μｍ、２００〜９５０μｍ、２００〜９００μｍ、２００〜８５０μｍ、２００〜８００μｍ、２００〜７５０μｍ、２００〜７００μｍ、２００〜６５０μｍ、２００〜６００μｍ、２００〜５５０μｍ、２００〜５００μｍ、２００〜４５０μｍ、２００〜４００μｍ、２００〜３５０μｍ、２００〜３００μｍ、２００〜２５０μｍ、３００μｍ〜１０００μｍ、３００〜９５０μｍ、３００〜９００μｍ、３００〜８５０μｍ、３００〜８００μｍ、３００〜７５０μｍ、３００〜７００μｍ、３００〜６５０μｍ、３００〜６００μｍ、３００〜５５０μｍ、３００〜５００μｍ、３００〜４５０μｍ、３００〜４００μｍ、３００〜３５０μｍ、４００μｍ〜１０００μｍ、４００〜９５０μｍ、４００〜９００μｍ、４００〜８５０μｍ、４００〜８００μｍ、４００〜７５０μｍ、４００〜７００μｍ、４００〜６５０μｍ、４００〜６００μｍ、４００〜５５０μｍ、４００〜５００μｍ、４００〜４５０μｍ、５００μｍ〜１０００μｍ、５００〜９５０μｍ、５００〜９００μｍ、５００〜８５０μｍ、５００〜８００μｍ、５００���７５０μｍ、５００〜７００μｍ、５００〜６５０μｍ、５００〜６００μｍ、５００〜５５０μｍ、６００μｍ〜１０００μｍ、６００〜９５０μｍ、６００〜９００μｍ、６００〜８５０μｍ、６００〜８００μｍ、６００〜７５０μｍ、６００〜７００μｍ、６００〜６５０μｍ、７００μｍ〜１０００μｍ、７００〜９５０μｍ、７００〜９００μｍ、７００〜８５０μｍ、７００〜８００μｍ、７００〜７５０μｍ、８００μｍ〜１０００μｍ、８００〜９５０μｍ、８００〜９００μｍ、８００〜８５０μｍ、９００μｍ〜１０００μｍ、または９００〜９５０μｍであってもよい。これらの値の組み合わせに由来するあらゆる範囲の端点が、具体的に企図される。
【００２０】
組織工学的な用途が異なる場合は、それぞれに特有の小孔サイズが必要となる場合があるが、当業者であれば、特定の組織工学的な用途に合った小孔サイズを選択するであろう。例えば、コラーゲン系の足場を用いた皮膚の再生の場合は、小孔サイズは、１０μｍ〜１２５μｍが最適であることが示されている（Ｙａｎｎａｓら，１９８９，ＰＮＡＳ，８６巻，９３３〜９３７）。骨の修復の場合は、８５μｍ〜３２５μｍのサイズの小孔を有する立体的な足場が機能的であることが示されている（ＭｕｒｐｈｙおよびＯ’Ｂｒｉｅｎ，Ｃｅｌｌ Ａｄｈ Ｍｉｇｒ ４，３７７〜３８１；２０１０）。小孔サイズが異なる範囲にある場合に、他の組織が最適に再生されることがあり、最近、ＬｏｈおよびＣｈｏｏｎｇによって、小孔サイズに関する文献が概説されている（Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １９，４８５〜５０２，特に表１）。この文献は参照により本明細書に援用される。
【００２１】
本発明の立体的な足場の小孔は、そのサイズが実質的に同じであってもよい。例えば、足場の小孔のうち２５％未満、例えば２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満または１％未満のサイズが、選択されたサイズ範囲、例えば上記の範囲から、外れている。換言すると、足場の小孔のうち少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の小孔サイズが、小孔サイズの平均値もしくは最頻値から、２５％だけ、例えば２０％だけ、１５％だけ、１０％だけ、５％だけ、または１％だけ、異なっている。
【００２２】
足場の多孔度（または空隙率）、すなわち足場の体積に対する空所の割合は、足場が用いられる組織工学的な用途に応じて異なっていてもよい（ＬｏｈおよびＣｈｏｏｎｇ、特に表１（上掲））。ある実施形態においては、本発明の足場の多孔度は、３０％〜９９％であってもよく、例えば、３０％〜９５％、３０％〜９０％、３０％〜８５％、３０％〜８０％、３０％〜７５％、３０％〜７０％、３０％〜６５％、３０％〜６０％、３０％〜５５％、３０％〜５０％、３０％〜４５％、３０％〜４０％、３０％〜３５％、４０％〜９９％、４０％〜９５％、４０％〜９０％、４０％〜８５％、４０％〜８０％、４０％〜７５％、４０％〜７０％、４０％〜６５％、４０％〜６０％、４０％〜５５％、４０％〜５０％、４０％〜４５％、５０％〜９９％、５０％〜９５％、５０％〜９０％、５０％〜８５％、５０％〜８０％、５０％〜７５％、５０％〜５０％、５０％〜６５％、５０％〜６０％、５０％〜５５％、６０％〜９９％、６０％〜９５％、６０％〜９０％、６０％〜８５％、６０％〜８０％、６０％〜７５％、６０％〜７０％、６０％〜６５％、７０％〜９９％、７０％〜９５％、７０％〜９０％、７０％〜８５％、７０％〜８０％、７０％〜７５％、８０％〜９９％、８０％〜９５％、８０％〜９０％、８０％〜８５％、９０％〜９９％、９０％〜９５％、または９５％〜９９％であってもよい。これらの値の組み合わせに由来するあらゆる範囲の端点が、具体的に企図される。
【００２３】
小孔サイズは、走査電子顕微鏡法で測定されてもよいし、マイクロコンピュータ断層撮影法で測定されてもよいし、水銀多孔度測定法で測定されてもよいし、浸透性に基づく方法で測定されてもよいし、毛細管流動細孔測定法で測定されてもよい。多孔度は、重量法で測定されてもよいし、水銀多孔度測定法で測定されてもよいし、液体置換法で測定されてもよい。これらの測定技術は常法であり、ＬｏｈおよびＣｈｏｏｎｇ（上掲）において詳細に説明されている。
【００２４】
本発明の足場は乾燥している。すなわち、実質的に、例えば本質的に、水を含まない（水分を含まない）。これは、乾燥時の重量減少分として測定された水の含有量、またはカールフィッシャー法（米国薬局方；欧州薬局方）によって化学的に測定された水の含有量が、５％ｗ／ｗ未満であること、例えば４．５％ｗ／ｗ未満、４％ｗ／ｗ未満、３．５％ｗ／ｗ未満、３％ｗ／ｗ未満、２．５％ｗ／ｗ未満、２％ｗ／ｗ未満、１．５％ｗ／ｗ未満、または１％ｗ／ｗ未満であることを意味してもよい。本発明の足場は、フリーズドライ（凍結乾燥）または真空乾燥によって乾燥させることが好ましい。
【００２５】
本発明に係る「粒子状ＥＳＭ」なる語は、平均粒子径が５００μｍ以下である、例えば４５０μｍ以下、４００μｍ以下、３５０μｍ以下、３００μｍ以下、２５０μｍ以下、２００μｍ以下、１５０μｍ以下、１２５μｍ以下、または１００μｍ以下である、ＥＳＭ粒子であってもよいし、このようなＥＳＭ粒子の少なくとも１つから形成されてもよい。ある実施形態においては、粒子状ＥＳＭは、平均粒子径が１００μｍ未満である、例えば９５μｍ未満、９０μｍ未満、８５μｍ未満、８０μｍ未満、７５μｍ未満、７０μｍ未満、６５μｍ未満、６０μｍ未満、５５μｍ未満、５０μｍ未満、４５μｍ未満、４０μｍ未満、３５μｍ未満、３０μｍ未満、２５μｍ未満、２０μｍ未満、１５μｍ未満、１０μｍ未満、５μｍ未満、または１μｍ未満であり、例えば９００ｎｍ未満、８５０ｎｍ未満、８００ｎｍ未満、７５０ｎｍ未満、７００ｎｍ未満、６５０ｎｍ未満、６００ｎｍ未満、５５０ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、４５０ｎｍ未満、４００ｎｍ未満、３５０ｎｍ未満、３００ｎｍ未満、２５０ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、１０ｎｍ未満、５ｎｍ未満、または１ｎｍ未満である、ＥＳＭ粒子であってもよいし、このようなＥＳＭ粒子の少なくとも１つから形成されてもよい。
【００２６】
また別のある実施形態においては、粒子状ＥＳＭは、平均粒子径が１ｎｍ以上である、例えば５ｎｍ以上、１０ｎｍ以上、５０ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、１５０ｎｍ以上、２００ｎｍ以上、２５０ｎｍ以上、３００ｎｍ以上、３５０ｎｍ以上、４００ｎｍ以上、４５０ｎｍ以上、５００ｎｍ以上、５５０ｎｍ以上、６００ｎｍ以上、６５０ｎｍ以上、７００ｎｍ以上、７５０ｎｍ以上、８００ｎｍ以上、８５０ｎｍ以上、９００ｎｍ以上、または９５０ｎｍ以上であるか、あるいは平均粒子径が１μｍ以上である、例えば５μｍ以上、１０μｍ以上、１５μｍ以上、２０μｍ以上、２５μｍ以上、３０μｍ以上、３５μｍ以上、４０μｍ以上、４５μｍ以上、５０μｍ以上、５５μｍ以上、６０μｍ以上、６５μｍ以上、７０μｍ以上、７５μｍ以上、８０μｍ以上、８５μｍ以上、９０μｍ以上、９５μｍ以上、１００μｍ以上、１２５μｍ以上、１５０μｍ以上、２００μｍ以上、２５０μｍ以上、３００μｍ以上、３５０μｍ以上、４００μｍ以上、または４５０μｍ以上である、ＥＳＭ粒子であってもよいし、このようなＥＳＭ粒子の少なくとも１つから形成されてもよい。
【００２７】
上記したこれらの値の組み合わせに由来するあらゆる範囲の端点が、具体的に企図される。
【００２８】
ＥＳＭ粒子は、どのような立体形状であってもよい。ＥＳＭ粒子は、本質的に、対称であっても非対称であってもよい。ＥＳＭ粒子は、本質的に、球状であっても、擬角柱であっても、円筒状であってもよい。ＥＳＭ粒子は、本質的に、不規則であっても、規則的であっても、その両方の領域があってもよい。ＥＳＭ粒子は、角形でも、丸くても、先細でもあってもよく、それらの領域を含んでいてもよい。ある実施形態において、ＥＳＭ粒子は、長さ寸法の１つが他の長さ寸法よりも有意に大きくてもよい。したがって、例えば、棒状、針状、または繊維状（ロッド、ニードル、または繊維）と呼ばれてもよく、有意に大きい長さ寸法に対して実質的に垂直な断面に応じて円筒状または擬角柱（立方体など）と称されてもよい。
【００２９】
ある実施形態においては、ＥＳＭ粒子は、第１の長さ寸法と、これに垂直に配される第２の長さ寸法とのアスペクト比が、少なくとも１．５（第１の長さ寸法：第２の長さ寸法）であってもよく、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００であってもよい。他の実施形態においては、ＥＳＭ粒子は、第１の長さ寸法と、これに実質的に垂直に配される第２の長さ寸法とのアスペクト比が、２以下（第１の長さ寸法：第２の長さ寸法）であってもよく、例えば３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１２以下、１４以下、１６以下、１８以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、６０以下、６５以下、７０以下、８０以下、９０以下、または１００以下であってもよい。これらの値の組み合わせに由来するあらゆる範囲の端点が、具体的に企図され、例えば、ＥＳＭ粒子は、アスペクト比が、５、６、７、８、９、または１０のうちのいずれかの値と２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０のうちのいずれかの値との比であってもよい。
【００３０】
これらの実施形態においては、第１の長さ寸法は、粒子において最長の長さ寸法であり、長手方向寸法と呼ばれてもよい。したがって、第２の長さ寸法は、横方向寸法と呼ばれてもよい。第２の長さ寸法は、最長の横方向寸法、または粒子の横方向寸法の平均値である。
【００３１】
ある実施形態においては、長手方向寸法は、０．１μｍ〜５００μｍであって、例えば０．１μｍ〜４００μｍ、０．１μｍ〜３００μｍ、０．１μｍ〜２００μｍ、０．１μｍ〜１００μｍ、０．１μｍ〜８０μｍ、０．１μｍ〜６０μｍ、０．１μｍ〜４０μｍ、０．１μｍ〜２０μｍ、０．１μｍ〜１０μｍ、０．１μｍ〜１μｍ、０．１μｍ〜０．５μｍ、０．５μｍ〜５００μｍ、０．５μｍ〜４００μｍ、０．５μｍ〜３００μｍ、０．５μｍ〜２００μｍ、０．５μｍ〜１００μｍ、０．５μｍ〜８０μｍ、０．５μｍ〜６０μｍ、０．５μｍ〜４０μｍ、０．５μｍ〜２０μｍ、０．５μｍ〜１０μｍ、０．５μｍ〜１μｍ、１μｍ〜５００μｍ、１μｍ〜４００μｍ、１μｍ〜３００μｍ、１μｍ〜２００μｍ、１μｍ〜１００μｍ、１μｍ〜８０μｍ、１μｍ〜６０μｍ、１μｍ〜４０μｍ、１μｍ〜２０μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜５００μｍ、１０μｍ〜４００μｍ、１０μｍ〜３００μｍ、１０μｍ〜２００μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１０μｍ〜８０μｍ、１０μｍ〜６０μｍ、１０μｍ〜４０μｍ、１０μｍ〜２０μｍ、２０μｍ〜５００μｍ、２０μｍ〜４００μｍ、２０μｍ〜３００μｍ、２０μｍ〜２００μｍ、２０μｍ〜１００μｍ、２０μｍ〜８０μｍ、２０μｍ〜６０μｍ、２０μｍ〜４０μｍ、４０μｍ〜５００μｍ、４０μｍ〜４００μｍ、４０μｍ〜３００μｍ、４０μｍ〜２００μｍ、４０μｍ〜１００μｍ、４０μｍ〜８０μｍ、４０μｍ〜６０μｍ、６０μｍ〜５００μｍ、６０μｍ〜４００μｍ、６０μｍ〜３００μｍ、６０μｍ〜２００μｍ、６０μｍ〜１００μｍ、６０μｍ〜８０μｍ、８０μｍ〜５００μｍ、８０μｍ〜４００μｍ、８０μｍ〜３００μｍ、８０μｍ〜２００μｍ、８０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜５００μｍ、１００μｍ〜４００μｍ、１００μｍ〜３００μｍ、１００μｍ〜２００μｍ、２００μｍ〜５００μｍ、２００μｍ〜４００μｍ、２００μｍ〜３００μｍ、３００μｍ〜５００μｍ、３００μｍ〜４００μｍ、または４００μｍ〜５００μｍである。
【００３２】
ある実施形態においては、横方向寸法またはその平均値は、０．０１μｍ〜２０μｍであって、例えば０．０１μｍ〜１６μｍ、０．０１μｍ〜１２μｍ、０．０１μｍ〜８μｍ、０．０１μｍ〜４μｍ、０．０１μｍ〜２μｍ、０．０１μｍ〜１．６μｍ、０．０１μｍ〜１．２μｍ、０．０１μｍ〜０．８μｍ、０．０１μｍ〜０．４μｍ、０．０１μｍ〜０．２μｍ、０．０１μｍ〜０．１μｍ、０．０１μｍ〜０．０５ μm， ０．０５μｍ〜２０μｍ、０．０５μｍ〜１６μｍ、０．０５μｍ〜１２μｍ、０．０５μｍ〜８μｍ、０．０５μｍ〜４μｍ、０．０５μｍ〜２μｍ、０．０５μｍ〜１．６μｍ、０．０５μｍ〜１．２μｍ、０．０５μｍ〜０．８μｍ、０．０５μｍ〜０．４μｍ、０．０５μｍ〜０．２μｍ、０．０５μｍ〜０．１μｍ、０．１μｍ〜２０μｍ、０．１μｍ〜１６μｍ、０．１μｍ〜１２μｍ、０．１μｍ〜８μｍ、０．１μｍ〜４μｍ、０．１μｍ〜２μｍ、０．１μｍ〜１．６μｍ、０．１μｍ〜１．２μｍ、０．１μｍ〜０．８μｍ、０．１μｍ〜０．４μｍ、０．１μｍ〜０．２μｍ、０．２μｍ〜２０μｍ、０．２μｍ〜１６μｍ、０．２μｍ〜１２μｍ、０．２μｍ〜８μｍ、０．２μｍ〜４μｍ、０．２μｍ〜２μｍ、０．２μｍ〜１．６μｍ、０．２μｍ〜１．２μｍ、０．２μｍ〜０．８μｍ、０．２μｍ〜０．４μｍ、０．４μｍ〜２０μｍ、０．４μｍ〜１６μｍ、０．４μｍ〜１２μｍ、０．４μｍ〜８μｍ、０．４μｍ〜４μｍ、０．４μｍ〜２μｍ、０．４μｍ〜１．６μｍ、０．４μｍ〜１．２μｍ、０．４μｍ〜０．８μｍ、０．８μｍ〜２０μｍ、０．８μｍ〜１６μｍ、０．８μｍ〜１２μｍ、０．８μｍ〜８μｍ、０．８μｍ〜４μｍ、０．８μｍ〜２μｍ、０．８μｍ〜１．６μｍ、０．８μｍ〜１．２μｍ、１．２μｍ〜２０μｍ、１．２μｍ〜１６μｍ、１．２μｍ〜１２μｍ、１．２μｍ〜８μｍ、１．２μｍ〜４μｍ、１．２μｍ〜２μｍ、１．２μｍ〜１．６μｍ、１．６μｍ〜２０μｍ、１．６μｍ〜１６μｍ、１．６μｍ〜１２μｍ、１．６μｍ〜８μｍ、１．６μｍ〜４μｍ、１．６μｍ〜２μｍ、２μｍ〜２０μｍ、２μｍ〜１６μｍ、２μｍ〜１２μｍ、２μｍ〜８μｍ、２μｍ〜４μｍ、４μｍ〜２０μｍ、４μｍ〜１６μｍ、４μｍ〜１２μｍ、または４μｍ〜８μｍである。
【００３３】
上述した長手方向寸法と横方向寸法とのあらゆる組み合わせ、およびその範囲が、特に、あらゆるアスペクト比およびその範囲において、具体的に企図される。前述のことに鑑みると、本発明で用いるある特定のＥＳＭ粒子は、ロッド、ニードル、または繊維である。
【００３４】
したがって、実質的に、例えば本質的に、球状でないＥＳＭ粒子について、ＥＳＭの粒子形に関する本発明の一般性に鑑みると、ＥＳＭの粒子径に関する言及は、同等の球径に関する言及である。これらの実施形態において、ＥＳＭ粒子は、用いた粒子サイズ測定技術において該直径を有する同物質の組成物の球体と同じサイズ示度となるサイズ寸法で定められた形状を有する。ある実施形態において、用いるサイズ寸法は、体積または表面積であり、好ましくは体積である。
【００３５】
平均径、または同等の球径は、抵抗パルス／コールター法、沈降分離（重力または遠心分離）、光学イメージング（ＳＥＭ、静止画像解析、動画像解析など）、レーザー回折、または光散乱などの簡便な手段で評価され得るが、本発明の目的では、波長可変抵抗パルスセンシングの形態でコールター法を用いるか、または光学手段を用いて粒子サイズを決定するものとする。
【００３６】
例えば繊維、ロッド、またはニードルのように、アスペクト比が高く、また上述したサイズを有するＥＳＭ粒子（本明細書において、区別なく、サイズに応じて、マイクロ繊維、マイクロロッドおよびマイクロニードル、あるいはナノ繊維、ナノロッド、およびナノニードルと呼んでもよい）は、少なくとも本明細書に記載の創傷治癒のための治療に関しては、ＥＳＭの他の形態（ＷＯ２００４/０８０４２８の形態など）よりも、ある特定の物理的優位性を有すると考えられる。特に、このような配合により、表面積、代謝回転速度、湿潤性、水分保持、適用性、および、特にＭＭＰ阻害のレベルが理想的なものとなると考えられる。
【００３７】
典型的には、上述した粒子状ＥＳＭは、複数の該ＥＳＭ粒子からなるものであって、該複数の粒子の粒子径の最頻値は、５００μｍ以下であって、例えば４５０μｍ以下、４００μｍ以下、３５０μｍ以下、３００μｍ以下、２５０μｍ以下、２００μｍ以下、１５０μｍ以下、１２５μｍ以下、または１００μｍ以下である。ある実施形態においては、複数の粒子の粒子径の最頻値は、１００μｍ未満であって、例えば９５μｍ未満、９０μｍ未満、８５μｍ未満、８０μｍ未満、７５μｍ未満、７０μｍ未満、６５μｍ未満、６０μｍ未満、５５μｍ未満、５０μｍ未満、４５μｍ未満、４０μｍ未満、３５μｍ未満、３０μｍ未満、２５μｍ未満、２０μｍ未満、１５μｍ未満、１０μｍ未満、５μｍ未満、または１μｍ未満であり、例えば９００ｎｍ未満、８５０ｎｍ未満、８００ｎｍ未満、７５０ｎｍ未満、７００ｎｍ未満、６５０ｎｍ未満、６００ｎｍ未満、５５０ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、４５０ｎｍ未満、４００ｎｍ未満、３５０ｎｍ未満、３００ｎｍ未満、２５０ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、１０ｎｍ未満、５ｎｍ未満、または１ｎｍ未満である。
【００３８】
また、ある実施形態においては、複数の粒子の粒子径の最頻値は、１ｎｍ以上であって、例えば５ｎｍ以上、１０ｎｍ以上、５０ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、１５０ｎｍ以上、２００ｎｍ以上、２５０ｎｍ以上、３００ｎｍ以上、３５０ｎｍ以上、４００ｎｍ以上、４５０ｎｍ以上、５００ｎｍ以上、５５０ｎｍ以上、６００ｎｍ以上、６５０ｎｍ以上、７００ｎｍ以上、７５０ｎｍ以上、８００ｎｍ以上、８５０ｎｍ以上、９００ｎｍ以上、または９５０ｎｍ以上であり、あるいは１μｍ以上であって、例えば５μｍ以上、１０μｍ以上、１５μｍ以上、２０μｍ以上、２５μｍ以上、３０μｍ以上、３５μｍ以上、４０μｍ以上、４５μｍ以上、５０μｍ以上、５５μｍ以上、６０μｍ以上、６５μｍ以上、７０μｍ以上、７５μｍ以上、８０μｍ以上、８５μｍ以上、９０μｍ以上、９５μｍ以上、１００μｍ以上、１２５μｍ以上、１５０μｍ以上、２００μｍ以上、２５０μｍ以上、３００μｍ以上、３５０μｍ以上、４００μｍ以上、または４５０μｍ以上である。
【００３９】
上記したこれらの値の組み合わせに由来するあらゆる範囲の端点が、具体的に企図される。
【００４０】
ある実施形態においては、該複数の粒子中の粒子数の２５％未満、例えば２０％未満、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、または０．１％未満は、その粒子径の平均値が、前記粒子径の最頻値以上であって、例えば粒子径の平均値は、５００μｍ以上、４５０μｍ以上、４００μｍ以上、３５０μｍ以上、３００μｍ以上、２５０μｍ以上、２００μｍ以上、１５０μｍ以上、１２５μｍ以上、１００μｍ以上、９５μｍ以上、９０μｍ以上、８５μｍ以上、８０μｍ以上、７５μｍ以上、７０μｍ以上、６５μｍ以上、６０μｍ以上、５５μｍ以上、５０μｍ以上、４５μｍ以上、４０μｍ以上、３５μｍ以上、３０μｍ以上、２５μｍ以上、２０μｍ以上、１５μｍ以上、１０μｍ以上、５μｍ以上、または１μｍ以上であり、例えば、９００ｎｍ以上、８５０ｎｍ以上、８００ｎｍ以上、７５０ｎｍ以上、７００ｎｍ以上、６５０ｎｍ以上、６００ｎｍ以上、５５０ｎｍ以上、５００ｎｍ以上、４５０ｎｍ以上、４００ｎｍ以上、３５０ｎｍ以上、３００ｎｍ以上、２５０ｎｍ以上、２００ｎｍ以上、１５０ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、５０ｎｍ以上、１０ｎｍ以上、５ｎｍ以上、または１ｎｍ以上である。
【００４１】
ある実施形態においては、分散度が低い複数のＥＳＭ粒子を用いることが、有利な場合がある。他の実施形態においては、複数のＥＳＭ粒子は、本質的に単分散である。他方、また別のある実施形態においては、広範囲のＥＳＭ粒子サイズ、または複数のより狭い粒子サイズ範囲が選択されて、本明細書に記載されている種々の生理学的効果の１つ以上が実現されてもよい。理論に拘束されることを望むものではないが、本発明で用いるＥＳＭ粒子の平均粒子径がサイズ範囲の上端であると、足場形成効果をより大きくすることで創傷細胞の移動が容易になり得、本発明で用いるＥＳＭ粒子の平均粒子径がサイズ範囲の下端であると、ＭＭＰおよび炎症に対する阻害効果がより大きくなり得る。本発明で用いるＥＳＭ粒子の生理学的効果を調整するために、異なるサイズ範囲を選択することが有利な場合がある。
【００４２】
ＥＳＭは、鳥類の卵、例えば、野鶏（猟鳥／陸鳥（キジ目）および水鳥（カモ目））および家禽、特に、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、ダチョウ、ハト、キジ、ウズラ、ライチョウ、またはカモメの卵の卵白と卵殻との間に見出される、繊維状の二重層である。ガルス・ガルス・ドメスティクス（Gallus gallus domesticus）、すなわち飼い鶏の卵が特に好ましい。二重層のうちのどちらか一層、またはその両方が、本発明に基づいて用いられてもよい。
【００４３】
好ましくは、粒子状ＥＳＭおよび足場は、全体として、本質的に、卵白、卵黄、および／または卵殻（炭酸カルシウム）などの他の（非ＥＳＭである）卵成分（これは、ＥＳＭに対して「不純」物質と見なしてよい）を含まない。「本質的に含まない」とは、本発明に基づいて用いられる粒子状ＥＳＭ（およびそれらが含むＥＳＭ粒子）が、５％ｗ／ｗ以下の非ＥＳＭ卵成分、例えば４％ｗ／ｗ以下、３％ｗ／ｗ以下、２％ｗ／ｗ以下、１％ｗ／ｗ以下、０．５％ｗ／ｗ以下、０．１％ｗ／ｗ以下、０．０５％ｗ／ｗ以下、または０．０１％ｗ／ｗ以下の非ＥＳＭ卵成分を、含有することを意味する。
【００４４】
本発明の粒子状ＥＳＭのＥＳＭは、簡便な手段によって、他の卵成分から分離され得る。ＥＳＭが分離され得る卵は、有精卵であってもよいし、無精卵であってもよい。卵は、無処置のもの、すなわち孵化前のものであってもよいし、空のもの、すなわち孵化後または卵の内容物（卵白および卵黄）抽出後の残部であってもよい。適切な手段は、例えば、内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２００４/０８０４２８およびＵＳ８５８０３１５に記載のものである。好ましくは、ＥＳＭは、その内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１５/０５８７９０に開示されている商業用卵処理施設の生産ライン中で卵殻膜を採取する方法によって調製される。端的に言うと、ＷＯ２０１５/０５８７９０は、割卵ユニットにおいて生じ、卵殻部分および膜部分を含む卵殻残部を処理する方法であって、卵殻残部（例えば、粒子サイズが約０．５ｍｍ〜約４０ｍｍで、湿量基準の水分含量が約３％〜約４０％である）を、割卵ユニットから、温度が約８５℃未満（好ましくは約６０℃未満）で速度が約６０ｍ／ｓを越える（好ましくは約７０ｍ／ｓ〜約３４０ｍ／ｓ）処理ガスで駆動するサイクロンへ供給することを含む、方法、を提供する。該サイクロン内では、卵殻残部を処理する渦によって、粒子サイズが減少し、該膜部が該卵殻部からはがされて、該卵殻部が該膜部から分離される。該サイクロンの上部排出口からは、主に、処理ガス、水蒸気、および水滴の混合物が放出され、サイクロンの底部排出口からは、主に、分離された卵殻部および膜部の混合物が放出される。次いで、放出された該混合物は、選別デバイスにおいて、卵殻部部分と膜部部分とに分離される。結果として得られるＥＳＭ部は、本明細書に記載されているように、好ましくはステップを挟まずに、本発明のＥＳＭ粒子へとさらに処理されてもよい。
【００４５】
ある実施形態においては、ＥＳＭを調製する方法は、全体の処理ガス供給速度に対する卵殻残部供給速度を、例えば約０．５秒〜約２０秒おき、好ましくは約１秒〜約５秒おきに調整することで、卵殻残部を該サイクロンに供給してから該混合物が放出されるまでの時間を制御するさらなるステップを含む。ある実施形態においては、本方法は、卵殻残部を該サイクロンに供給する前に、遠心分離するステップをさらに含む。ある実施形態においては、供給ステップは連続的である。他の実施形態においては、選別ステップは、圧搾空気によって膜部部分を選別スクリーンから取り外し、選別デバイスから排出することを含んでいる。本方法は、膜部部分を乾燥する最終ステップを含んでいてもよい。
【００４６】
大きさが約１ｍｍ2〜約１０ｍｍ2の範囲内にあるフレーク状のＥＳＭ材料は、再編または処理を行って、無処置のＥＳＭと同じ構造的特性を有するシートにすることはできない。
【００４７】
ある実施形態においては、本発明で用いる粒子状ＥＳＭ（または少なくともそのタンパク質成分）は、実質的に、殻−膜分離プロセスで得られるものである。換言すると、本発明で用いる粒子状ＥＳＭは、相当する鳥類源由来の天然ＥＳＭと比較すると、実質的に化学変性されていない。
【００４８】
より具体的には、本発明で用いる粒子状ＥＳＭは、相当する鳥類源由来の天然ＥＳＭと比較すると、化学的には、実質的に未分解、未消化（例えば、化学的に、または酵素学的に）、および／または未変性である。「実質的に未分解」とは、相当する鳥類源由来の天然ＥＳＭと比較すると、ＥＳＭ成分のうち２０％未満、例えば１５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満が分解の兆候を示すことを意味する。未消化および未変性については、それに応じて解釈されるべきである。ＥＳＭの分解／消化／変性の程度は、ＥＳＭの相対的溶解度および／またはＥＳＭ中のコラーゲン繊維の相対的なサイズまたは構造を測定することで評価することができる。これは、免疫組織化学法／免疫細胞化学法、および／または生体分子（タンパク質など）染色などの常用の技術によって実現されてもよい。
【００４９】
特に、ある実施形態においては、本発明で用いる粒子状ＥＳＭは、例えば化学的または酵素学的な加水分解反応またはジスルフィド結合還元反応、特にアルカリ加水分解反応にさらされていない。換言すると、本発明で用いる粒子状ＥＳＭは、実質的に加水分解されておらず、これは、相当する鳥類源由来の天然ＥＳＭと比較すると、ＥＳＭ成分のうち２０％未満、例えば１５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満が加水分解の兆候を示すことを意味する。ＥＳＭの加水分解の程度は、ＥＳＭの相対的溶解度、および／またはコラーゲン繊維の相対的な大きさ、および／またはＥＳＭ中のコラーゲンの架橋の程度を測定することで評価することができる。これは、免疫組織化学法／免疫細胞化学法、および／またはタンパク質染色などの常用の技術によって実現されてもよい。
【００５０】
他の実施形態において、本発明で用いる粒子状ＥＳＭは、実質的に、例えば本質的に、ｐＨ６．８〜７．２などの中性ｐＨにおいて、水に不溶である。本発明の目的では、不溶性材料は、１ｇの溶質を溶解するのに、１０Ｌを越える溶媒を必要とする。
【００５１】
本発明で用いる粒子状ＥＳＭは、ボールミル粉砕、ビーズミル粉砕、ジェットミル粉砕、ボルテックスミル粉砕、ブレードミル粉砕、回転子−固定子分散などの、簡便な粒子サイズ低減技術手段、微粉化技術手段、研磨技術手段、粉末化技術手段、または粉砕技術手段によってＥＳＭから調製され得、好ましくは、その後、篩い分けおよびスクリーニングなどのサイズ選別を行う。選択された粒子サイズ低減法は、乾燥状態で行われても、他の足場成分を含んでいても含んでいなくてもよい液状媒体を用いて行われてもよい。凍結粉砕が用いられてもよい。ある実施形態における粒子サイズ低減プロセス、およびある実施形態における先行するＥＳＭ調製プロセスは、必要なサイズ（例えば上述したような）のＥＳＭ繊維を生成するという点に基づいて、選択される。とりわけ、ブレードミル粉砕で乾燥ＥＳＭを粉末化すること、およびフレーク状ＥＳＭの懸濁液の回転子−固定子分散を行うことが、この点で有効であることが示されている。
【００５２】
したがって、本発明によると、本発明で用いる粒子状ＥＳＭを調製する方法は、例えば本明細書に記載されているような、ＥＳＭを提供することと、ＥＳＭを微粉化プロセスに供することと、を含んでいてもよい。好ましくは、ＥＳＭは、非ＥＳＭ卵成分を本質的に含まない状態で提供され、より好ましくは、非ＥＳＭ卵成分を本質的に含まないＥＳＭを提供することは、ＷＯ２０１５/０５８７９０および上記に記載の通り、非ＥＳＭ卵成分からＥＳＭを分離することと、約０．１％の塩酸または酢酸の水溶液などの弱酸溶液（この語は、弱酸性溶液を含む）を用いてそのようにして得られたＥＳＭを洗浄し、これによってＥＳＭ中の残存炭酸カルシウムを除去することと、を含む。他の実施形態においては、微粉化ＥＳＭは、該弱酸溶液で洗浄される。この弱酸による洗浄、特に約０．１％のＨＣｌ溶液での処理によって、ＥＳＭが脱塩されてＥＳＭ中の無機塩の量が最小化されるだけでなく、微生物（本明細書に記載のものなど）、プリオン、およびウイルスなどの感染源が除去され、かつ／または不活性化される。
【００５３】
この方法で調製されたＥＳＭの微粉化によって、長さ１０〜１００μｍ、厚さ１〜５μｍのＥＳＭ繊維（すなわち、マイクロ繊維およびナノ繊維）を作成する。本発明の足場に追加的な成分を含有させるのは、微粉化プロセスの前であってもよいし、その途中であってもよいし、その後であってもよい。該方法によって得られた、または得ることができる粒子を含有する微粉化ＥＳＭを、本発明の足場において用いることは、本発明のさらなる態様である。
【００５４】
本発明の足場のうちの少なくとも約２５％ｗ／ｗは、粒子状卵殻膜（ＥＳＭ）である。足場の含有物の残部、すなわち１００％ｗ／ｗに達するまでの残部％ｗ／ｗは、さらなる足場材料、本質的に不活性な賦形剤、および／または治療活性を有するさらなる薬剤によって占められ、好ましくはさらなる足場材料および／または不活性な賦形剤によって占められ、より好ましくはさらなる足場材料によって占められる。ある実施形態においては、実施例において示されるように、足場は、本質的に粒子状ＥＳＭからなるものであってもよい。
【００５５】
ある実施形態においては、足場に含まれる粒子状ＥＳＭは、少なくとも３０％ｗ／ｗであって、例えば少なくとも３５％ｗ／ｗ、少なくとも４０％ｗ／ｗ、少なくとも４５％ｗ／ｗ、少なくとも５０％ｗ／ｗ、少なくとも５５％ｗ／ｗ、少なくとも６０％ｗ／ｗ、少なくとも６５％ｗ／ｗ、少なくとも７０％ｗ／ｗ、少なくとも７５％ｗ／ｗ、少なくとも８０％ｗ／ｗ、少なくとも８５％ｗ／ｗ、少なくとも９０％ｗ／ｗ、少なくとも９５％ｗ／ｗ、または少なくとも１００％ｗ／ｗである。
【００５６】
他の実施形態においては、足場に含まれる粒子状ＥＳＭは、１００％ｗ／ｗ未満、例えば９５％ｗ／ｗ以下であって、例えば９０％ｗ／ｗ以下、８５％ｗ／ｗ以下、８０％ｗ／ｗ以下、７５％ｗ／ｗ以下、７０％ｗ／ｗ以下、６５％ｗ／ｗ以下、６０％ｗ／ｗ以下、５５％ｗ／ｗ以下、５０％ｗ／ｗ以下、４５％ｗ／ｗ以下、４０％ｗ／ｗ以下、３５％ｗ／ｗ以下、または３０％ｗ／ｗ以下である。
【００５７】
上記したこれらの値の組み合わせに由来するあらゆる範囲の端点が、具体的に企図される。
【００５８】
「％ｗ／ｗ」（すなわち「重量対重量百分率」）は、固体における配合物の量を表す表現として、一般的に用いられている。例えば、１％ｗ／ｗは、固体１００ｇあたりに配合物が１グラム含まれることに相当し、２％ｗ／ｗは、固体１００ｇあたりに配合物が２グラム含まれることに相当する。したがって、％ｗ／ｗは、ｇ／１００ｇ、１００グラムあたりのグラム、およびｇ １００ｇ-1と表され得る。１％ｗ／ｗは、固体１キログラムあたりに配合物が１０グラム含まれることにも相当する。当業者であれば、％ｗ／ｗは、適切な変倍計算によって、質量のＳＩ単位のいずれによっても表せるということを理解するであろう。非標準的な濃度単位への変換も可能であり、これは、当業者にとっては日常的なものである。本発明の足場の含有物に注目すると、これは、足場の乾燥重量を基準としており、すなわち、足場は本質的に乾燥した形態である。
【００５９】
ある実施形態においては、足場は、粒子状ＥＳＭおよび少なくとも１つのさらなる足場材料を含む（または、これらからなるか、もしくは本質的にこれらからなる）。これらの実施形態においては、粒子状ＥＳＭと、さらなる足場材料との比を、１：３〜２０：１、例えば１：３〜１５：１、１：３〜１０：１、１：３〜６：１、１：３〜５：１、１：３〜３：１、１：３〜２：１、約１：１、１：１〜２０：１、１：１〜１５：１、１：１〜１０：１、１：１〜６：１、１：１〜５：１、１：１〜３：１、１：１〜２：１、２：１〜２０：１、２：１〜１５：１、２：１〜１０：１、２：１〜６：１、２：１〜５：１、２：１〜３：１、３：１〜２０：１、３：１〜１５：１、３：１〜１０：１、３：１〜６：１、３：１〜５：１、５：１〜２０：１、５：１〜１５：１、５：１〜１０：１、５：１〜６：１、６：１〜２０：１、６：１〜１５：１、６：１〜１０：１、１０：１〜２０：１、１０：１〜１５：１、または１５：１〜２０：１（ＥＳＭ：さらなる足場材料）とすることが有利な場合がある。これらの値の組み合わせに由来するあらゆる範囲の端点が、具体的に企図される。
【００６０】
正確な比は、とりわけ、粒子状ＥＳＭの粒子サイズ、さらなる足場材料の特性、足場の用途、および／または足場の形態によって規定される。例えば、実施例に示すように、粒子状ＥＳＭとコラーゲンとからなるスポンジ状の足場は、ＥＳＭのコラーゲンに対する比を１：１および３：１として、形成されてもよい。
【００６１】
さらなる足場材料は、粒子状ＥＳＭ以外の適切な足場材料であれば、いかなるものであってもよい。ある実施形態においては、さらなる足場材料は、シート状またはフレーク状のＥＳＭではなく、実際にはあらゆる形態の固体ＥＳＭではなく、ＥＳＭ由来の材料または成分（ＥＳＭの加水分解物あるいはＥＳＭから単離されたタンパク質および／または多糖など）から調製されたものでもない。本発明の足場の生分解性とは、足場が、不可欠の要素として、肉眼で見える金属成分を含まないということを意味する。
【００６２】
適切な足場材料は、天然材料であってもよいし合成材料であってもよい。典型的には、立体的に配置することができ、また、適切かつ十分なリガンドを提供して、細胞移動、細胞接着、細胞増殖、および／または新規の細胞外基質の生産を促進することができる、ポリマーである。より具体的には、例えば、細胞外基質のタンパク質および多糖類（コラーゲン（あらゆる種類および形態を含む。好ましくはコラーゲンＩまたはゼラチンである）、フィブリン、ケラチン、エラスチン、およびグリコサミノグリカン（ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびヒアルロナンなど））や、アルギン酸塩、ペクチン、キトサン、セルロース（酸化再生セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどの全ての形態を含む）、フィブロネクチンなどの、天然（繊維状）タンパク質および多糖類が挙げられる。人工的な足場材料としては、例えば、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリジオキサノン（ＰＤＳ）、ポリ（エチレンオキサイドテレフタレート）（ＰＥＯＴ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（交換可能にＰＶＡ、ＰＶＯＨ、またはＰＶＡＩと称する）、ポリ（ブチレンテレフタレート）（ＰＢＴ）、窒化ケイ素、ならびにポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＡＧＡ）およびＰＥＯＴ／ＰＢＴなどのこれらの共重合体や、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム（Ｃａ−Ｐ）、ならびにシリカ被覆リン酸カルシウムおよびβ−トリリン酸カルシウム（β−ＴＣＰ）などのこれらの誘導体などが挙げられる。コラーゲン（あらゆる種類および形態を含む。好ましくはコラーゲンＩまたはゼラチンである）およびセルロース（酸化再生セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどの全ての形態を含む）が重要である。コラーゲンと酸化再生セルロースとの組み合わせが、さらなる足場材料として特に有効な場合がある。このような実施形態においては、酸化再生セルロースに対するコラーゲンの比は、７０：３０〜３０：７０であって、例えば６５：３５〜３５：６５、６０：４０〜４０：６０、５５：４５〜４５：５５であり、好ましくは５５：４５である。骨工学においては、ヒドロキシアパタイト、ならびにリン酸カルシウム（Ｃａ−Ｐ）およびその誘導体（シリカ被覆リン酸カルシウムやβ−トリリン酸カルシウム（β−ＴＣＰ）など）を、特にコラーゲンと組み合わせて、本発明の足場に混合することが有利な場合がある。
【００６３】
アルギン酸塩に関する言及は、指示がなければ、アルギン酸を含む。アルギン酸塩は、アルギン酸であってもよいし、例えば上記引用した塩であり、特にそれぞれアルギン酸Ｃａ2+および／またはアルギン酸Ｎａ+である、アルギン酸の二価の金属イオンの塩、アルギン酸の三価の金属イオンの塩、および／またはアルギン酸の一価の金属イオンの塩であってもよい。典型的には、アルギン酸塩は、例えば少なくとも３５ｋＤａのポリマー、または大きさの異なる複数のポリマーであるが、そのポリマーの代わりに、またはそのポリマーと組み合わせて、より小さなオリゴマーを用いてもよい。ある実施形態においては、さらなる足場材料は、アルギン酸塩ではなく、したがって、本発明の足場は、足場材料として働くのに十分な量で、アルギン酸塩を含有することはない。ある実施形態においては、本発明の足場は、アルギン酸塩を含有しない。
【００６４】
さらなる足場材料として、コラーゲンおよび／またはゼラチンのみを用いることは、特に好ましい。上記した様々な比率は、必要な変更を加えて、このような実施形態に適用される。ある実施形態においては、本発明の足場は、粒子状ＥＳＭと、コラーゲンおよび／またはゼラチンとからなり、好ましくは、粒子状ＥＳＭとコラーゲンとからなるか、または本質的にこれらからなる。これらの実施形態においては、ＥＳＭとコラーゲンおよび／またはゼラチンとは、例えば上記のように、１：３〜２０：１の比で、好ましくは約１：３、約１：１、または約３：１の比、すなわち、コラーゲンおよび／またはゼラチン７５％ｗ／ｗに対してＥＳＭが２５％ｗ／ｗ、コラーゲンおよび／またはゼラチン５０％に対してＥＳＭが５０％、およびコラーゲンおよび／またはゼラチン２５％に対してＥＳＭが７５％の比で、存在している。
【００６５】
さらなる足場材料として、ＰＥＧ、特に架橋ＰＥＧまたは重合化ＰＥＧのみを用いることは、特に好ましい。上記した様々な比率は、必要な変更を加えて、このような実施形態に適用される。ある実施形態においては、本発明の足場は、粒子状ＥＳＭと、１つ以上のＰＥＧとからなるか、または本質的にこれらからなる。これらの実施形態においては、ＥＳＭとＰＥＧとは、好ましくは、例えば上記のように、１：３〜２０：１の比で、好ましくは約１：３、約１：２、約１：１、または約３：１の比、すなわち、ＰＥＧ７５％ｗ／ｗに対してＥＳＭが２５％ｗ／ｗ、ＰＥＧ６７％に対してＥＳＭが３３％ｗ／ｗ、ＰＥＧ５０％に対してＥＳＭが５０％、およびＰＥＧ２５％に対してＥＳＭが７５％の比で、存在している。以下で述べるように、用いるＰＥＧは、非架橋前駆体の形態、または非重合化前駆体の形態で提供されてもよく、架橋または重合を行う前に、ＥＳＭと合わせてもよい。
【００６６】
さらなる足場材料として、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）のみを用いることは、特に好ましい。上記した様々な比率は、必要な変更を加えて、このような実施形態に適用される。ある実施形態においては、本発明の足場は、粒子状ＥＳＭとＰＶＡとからなるか、または本質的にこれらからなる。これらの実施形態においては、ＥＳＭとＰＶＡとは、好ましくは、例えば上記のように、１：３〜２０：１の比で、好ましくは約１：３、約１：２、約１：１、または約３：１の比、すなわち、ＰＥＧ７５％ｗ／ｗに対してＥＳＭが２５％ｗ／ｗ、ＰＥＧ６７％に対してＥＳＭが３３％ｗ／ｗ、ＰＥＧ５０％に対してＥＳＭが５０％、およびＰＥＧ２５％に対してＥＳＭが７５％の比で、存在している。
【００６７】
ある実施形態においては、さらなる足場材料の個々の分子は、互いに架橋していてもよく、また、さらなる実施形態においては、ＥＳＭの粒子と架橋していてもよい。さらなる足場材料の形成に適した簡便な架橋手段が用いられ得る。架橋剤の具体例としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などの水溶性カルボジイミド架橋剤およびグルタルアルデヒドなどが挙げられるが、特定の足場材料（コラーゲンなど）は、特定の物理条件（熱脱水法など）および／または適切な触媒（例えば、酸化還元開始剤（過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）またはＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）など）および光開始剤（フェニル（２，４，６−トリメチルベンゾイル）ホスフィン酸リチウム（ＬＡＰ）など））に曝露することによって、架橋されてもよい。
【００６８】
本発明の足場に混合されてもよい、治療活性を有するさらなる薬剤としては、臨床的に有効な抗菌剤（抗生物質、消毒剤、抗菌性界面活性剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤）、成長因子、または抗炎症剤（用いるＥＳＭ粒子がすでにこのような特性を有している場合は、これらを「さらなる抗菌剤」、「さらなる成長因子」、または「さらなる抗炎症剤」と呼んでもよい）が挙げられるが、これらに限定されない。足場に含まれるこのような薬剤の量は、２５％ｗ／ｗ未満であってもよく、例えば２０％ｗ／ｗ未満、１５％ｗ／ｗ未満、１０％ｗ／ｗ未満、５％ｗ／ｗ未満、または１％ｗ／ｗ未満であってもよい。
【００６９】
代表的な抗生物質としては、アミノグリコシド（アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシンなど）；カルベセフェム（ロラカルベフなど）；第１世代のセファロスポリン（セファドロキシル、セファゾリン、セファレキシンなど）；第２世代のセファロスポリン（セファクロル、セファマンドール、セファレキシン、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシムなど）；第３世代のセファロスポリン（セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソンなど）；第４世代のセファロスポリン（セフェピムなど）；マクロライド（アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、トロレアンドマイシンなど）；モノバクタム（アズトレオナムなど）；ペニシリン（アモキシシリン、アンピシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、チカルシリンなど）；ポリペプチド抗生物質（バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢなど）；キノロン（シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシンなど）；スルホンアミド（マフェニド、スルファセタミド、スルファメチゾール、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾールなど）；テトラサイクリン（デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリンなど）；カルバペネム（イミペネム、メロペネム、エルタペネム、ドリペネム、パニペネム／ベタミプロン、ビアペネム、ＰＺ−６０１など）；クロラムフェニコール；クリンダマイシン、エタンブトール；ホスホマイシン；イソニアジド；リネゾリド；メトロニダゾール；ニトロフラントイン；ピラジンアミド；キヌプリスチン／ダルホプリスチン；リファムピン；スペクチノマイシン；およびバンコマイシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
代表的な消毒剤としては、塩素系漂白剤（次亜塩素酸ナトリウム）、四級アンモニウム化合物（塩化ベンズアルコニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウムなど）、過酸化水素、フェノール化合物（ＴＣＰ トリクロサンなど）、アルコール（エタノールなど）、ビルコン（Virkon）（商標）、ヨウ素化合物（ポビドンヨウ素など）、ならびに銀化合物、銅化合物、鉄化合物、鉛化合物、亜鉛化合物、ビスマス化合物、金化合物、およびアルミニウム化合物（銀元素ナノ粒子／マイクロ粒子、銅元素ナノ粒子／マイクロ粒子、鉄元素ナノ粒子／マイクロ粒子、鉛元素ナノ粒子／マイクロ粒子、亜鉛元素ナノ粒子／マイクロ粒子、ビスマス元素ナノ粒子／マイクロ粒子、金元素ナノ粒子／マイクロ粒子、およびアルミニウム元素ナノ粒子／マイクロ粒子）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
抗菌性界面活性剤は、消毒剤の別種である。これらは、微生物の細胞膜および他の構成要素を破壊し、その結果、微生物の成長および／または生存能力を阻害する化合物である。抗菌性界面活性剤、および抗菌性組成物における抗菌性界面活性剤の使用は、当該技術分野においてよく知られており、さらなる手引きが必要であれば、“Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ−ｆｒｅｅ ａｎｄ ｓｅｌｆ−ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｄｒｕｇｓ − Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ”，Ｋａｂａｒａ ａｎｄ Ｏｒｔｈ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，ＮＹ，１９９７の抗菌性界面活性剤についての概説の全内容が、参照により明示的に援用される。抗菌性界面活性剤は、アニオン性であってもよいし、カチオン性であってもよいし、ノニオン性であってもよいし、両性であってもよい。アニオン性の抗菌性界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ラウリル硫酸ナトリウム）、ドデシルアミノプロピオン酸ナトリウム、リシノール酸ナトリウム、胆汁酸、アルキルアリルスルホン酸、グリロサン（Grillosan）ＤＳ７９１１、ウンデシレン酸モノエタノールアミドスルホコハク酸二ナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。カチオン性の抗菌性界面活性剤としては、例えば、四級アンモニウム化合物、アミンイミド、およびクロルヘキシジン化合物などが挙げられるが、これらに限定されない。ノニオン性の抗菌性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸モノエステル、アルキルジヒドロキシ安息香酸のポリエチレングリコモノエステル、グルコサミン誘導体、およびＮ−ラウロイルジペプチドのジエタノールアミドなどが挙げられるが、これらに限定されない。両性の抗菌性界面活性剤としては、例えば、アルキルベタイン、アルキルアミドプロピルベタイン、アルキルアミノプロピオン酸、アルキルイミノジプロピオン酸、およびアルキルイミダゾリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
代表的な抗真菌剤としては、ポリエン（ナタマイシン、リモシジン、フィリピン、ニスタチン、アンホテリシンＢ、カンジシンなど；イミダゾール（ミコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、ビホナゾール、ブトコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾールなど）；トリアゾール（フルコナゾール、イトラコナゾール、イサブコナゾール、ラブコナゾール、ポサコナゾール、ボリコナゾール、テルコナゾールなど）；アリルアミン（テルビナフィン、アモロルフィン、ナフチフィン、ブテナフィンなど）；およびエキノカンジン（アニデュラフンジン、カスポフンジン、ミカフンジンなど）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
代表的な抗ウイルス剤としては、アバカビル、アシクロビル、アデホビル、アマンタジン、アンプレナビル、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、ボセプレビル、シドホビル、コンビビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドクスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、ファムシクロビル、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、ガンシクロビル、イバシタビン 、イムノビル、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、ＩＩＩ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、Ｉ型インターフェロン、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド、マラビロク、モロキシジン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネクサビル、オセルタミビル、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、ラルテグラビル、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、テノホビル、テノホビル ジイソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビクリビロク、ビダラビン、ビラミジン、ザルシタビン、ザナミビル、およびジドブジンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
代表的な成長因子としては、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、塩基性および酸性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、成長ホルモン（ＧＨ）、骨形態形成タンパク質２および７（ＢＭＰ２およびＢＭＰ７）、インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２）、ケラチン生成表皮細胞成長因子（ＫＧＦ）、移動刺激因子（ＭＳＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
代表的な抗炎症剤としては、抗炎症性ステロイド（コルチコステロイドなど）、ＮＳＡＩＤ、または抗炎症性サイトカインなどが挙げられるが、これらに限定されない。代表的なＮＳＡＩＤとしては、サリチル酸塩（アスピリン（アセチルサリチル酸）、トリサリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サルサラートなど）、プロピオン酸誘導体（イブプロフェン、デクスイブプロフェン、デクスケトプロフェン、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン ナプロキセン、オキサプロジンなど）、酢酸誘導体（アセクロフェナク、ジクロフェナク、エトドラク、インドメタシン、ケトロラク、ナブメトン、トルメチン、スリンダクなど）、エノール酸誘導体（ドロキシカム、イソキシカム、ロルノキシカム、メロキシカム、ピロキシカム、テノキシカムなど）、アントラニル酸誘導体（フルフェナム酸、メクロフェナム酸、メフェナム酸、トルフェノム酸など）および選択的ＣＯＸ−２阻害剤（コキシブ（Coxibs）；セレコキシブ、エトリコキシブ、ルミラコキシブ、パレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブなど）などが挙げられるが、これらに限定されない。プロピオン酸誘導体（イブプロフェン、デクスイブプロフェン、デクスケトプロフェン、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン ナプロキセン、オキサプロジンなど）が好ましく、イブプロフェンが最も好ましい。代表的な抗炎症性サイトカインとしては、（ＩＬ）−１受容体拮抗薬、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、およびＩＬ−１３などが挙げられる。
【００７６】
適切な賦形剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、トラガカントゴム、ケイ酸カルシウム、ポリビニルピロリドン、プロピレングリコール、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイル、または硬質脂肪などの脂肪分、あるいはこれらの適切な混合物などが挙げられる。賦形剤は、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加的に含んでいてもよい。ある実施形態においては、賦形剤は、シート状またはフレーク状のＥＳＭではなく、実際にはあらゆる形態の固体ＥＳＭではなく、ＥＳＭ由来の材料または成分（ＥＳＭの加水分解物あるいはＥＳＭから単離されたタンパク質および／または多糖など）から調製されたものでもない。
【００７７】
「一様に分布している」とは、本発明の足場の粒子状ＥＳＭが、足場の一部に、それほどは蓄積されていないということを意味する。すなわち、本発明の足場から調製されたあるサイズのサンプルは、足場の別の部分から調製された同じサイズの第２のサンプルと、本質的に同じ量の粒子状ＥＳＭ（例えば％ｗ／ｗで測定）を有する。異なる表現をすると、足場において、肉眼で見ることができる複数（例えば１０個）の部分（例えば、体積が約５ｍｍ3の部分）には、平均すると、足場全体と本質的に同じ割合の粒子状ＥＳＭが含有されている。
【００７８】
さらなる実施形態においては、本発明は、細胞が播種された本明細書に記載の足場を提供し、この細胞は、足場の標的宿主から採取された細胞、または提供者の細胞もしくは提供者由来の細胞であってもよい。本発明の足場に播種される典型的な細胞としては、幹細胞（万能性幹細胞、全能性幹細胞、多能性幹細胞、または単能性幹細胞）、人工万能性幹細胞、線維芽細胞、骨格筋、平滑筋、心筋、上皮細胞、ケラチン生成表皮細胞、破骨細胞、骨芽細胞、基底膜細胞が挙げられる。
【００７９】
さらなる実施形態においては、本発明は、創傷治癒用に適合させた本明細書に記載の足場を提供し、この足場は、片面が、蒸気を透過するバリアまたは蒸気を透過しないバリアで覆われることによって、創傷内部の水分を管理し、また創傷を保護し、かつ抗菌バリアを提供する。
【００８０】
さらなる実施形態においては、本発明は、様々な小孔／繊維傾斜構造を有する複数の足場層の１つとして、骨軟骨欠損の再生および修復（軟骨の修復）に用いる本明細書に記載の足場を提供する。この配置は、例えば、関節の軟骨の表面から深部にわたる部位やその下の軟骨下骨などの、骨軟骨組織の生理学的な組成および／または構造を模倣して設計されることが好ましい。骨の修復については、小孔のサイズが８５μｍ〜３２５μｍである足場が機能的であることが示されている（ＭｕｒｐｈｙおよびＯ’Ｂｒｉｅｎ，Ｃｅｌｌ Ａｄｈ Ｍｉｇｒ ４，３７７〜３８１；２０１０）。
【００８１】
本発明の足場は、解剖学的構造中の特定の種類の組織を修復するのに最適化された二層構造または多層構造のうちの少なくとも一層として、提供されてもよい。その例としては、ＵＳ７７８０９９４“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ， ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｎｄ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ”に記載の二層コラーゲン足場が挙げられる。このような足場は、片側は主として石灰化されていない多孔性構造であり、反対側は主として石灰化されている多孔性構造であって、これを用いることによって、関節の軟骨と骨とをつなぎ得る。したがって、足場は、片側においては骨が内部成長し、反対側においては軟骨が再生するように最適化されている。
【００８２】
本発明の足場は、簡便な手段によって調製され得る。一様な分布を実現するためには、粒子状ＥＳＭと他の足場成分（存在する場合）とを混合した後に、例えば混合物をフリーズドライ（凍結乾燥）、低温ゲル化、または脱水することによって足場を形成することが有利な場合がある。足場成分に応じて、溶融堆積、電界紡糸、光造形、相分離、発泡、選択的レーザー焼結、塩浸出、３Ｄプリント、低温ゲル化、およびフリーズドライから、最適な製造方法が選択されてもよい。これらの方法は、常法であり、ＬｏｈおよびＣｈｏｏｎｇ（上掲）およびＨｗａｎｇ，Ｈ．ら（Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，２０，３４５〜３５１）にさらなる記載がある。
【００８３】
特定の実施形態においては、スポンジ状の本明細書に記載の本発明の足場を調製する方法が提供され、該方法は、
（ｉ）粒子状ＥＳＭと、存在する場合はその他の足場成分とを、前記足場において粒子状ＥＳＭが少なくとも２５％ｗ／ｗとなるのに十分な量で、水懸濁液として提供することと、
（ｉｉ）場合によっては鋳型中で、前記懸濁液をフリーズドライし、これによって該足場を得ることと、
を含む、方法である。
【００８４】
その他の足場成分は、粒子状ＥＳＭの懸濁液に懸濁していてもよく、かつ／または溶解していてもよい。
【００８５】
ある実施形態においては、粒子状ＥＳＭと、存在する場合はその他の足場成分とを、水懸濁液として提供するステップ（ｉ）は、シート状またはフレーク状のＥＳＭと、存在する場合は、その他の足場成分とを、水懸濁液として提供することと、例えば本明細書に記載されているＥＳＭサイズ低減技術を該懸濁液に適用することとを含む。回転子−固定子分散機を用いることが有利な場合がある。
【００８６】
他の実施形態においては、粒子状ＥＳＭと、存在する場合はその他の足場成分とを、水懸濁液として提供するステップ（ｉ）は、粒子状ＥＳＭと、該他の足場成分とを提供することと、水性液と混合して該懸濁液を形成することとを含む。これは、１つ以上の他の足場成分を、該粒子状ＥＳＭの水懸濁液と混合することを含んでいてもよいし、該粒子状ＥＳＭを、１つ以上の他の足場成分の水溶液もしくは水懸濁液と混合することを含んでいてもよいし、該粒子状ＥＳＭの水懸濁液を、１つ以上の他の足場成分の水溶液もしくは水懸濁液と混合することを含んでいてもよい。さらなるサイズ低減は、どの時点で行われてもよい。
【００８７】
鋳型は、例えば、足場が適用される部位（創傷、関節、骨欠損部など）のサイズおよび形状、または足場の基盤を成す臓器、組織、もしくはこれらの一部分のサイズおよび形状など、用途に適したサイズおよび形状（または近似的な形状）を有するものであってもよい。他の実施形態においては、鋳型のサイズおよび形状は、適当なサイズに切断し得る製品を形成するように選択されてもよい。
【００８８】
鋳型は、懸濁液を完全に密封するものであってもよいし、少なくとも一面が開放されていてもよい。懸濁液を完全に密封することによって、フリーズドライを行っている間のスポンジの膨張が制限され、それによって、多孔度や小孔のサイズ、その他の構造的特徴が制御され得る。
【００８９】
これらの態様においては、その他の足場成分は、本明細書に開示された足場成分のいずれであってもよく、好ましい特徴などについての添付の記述は、必要な変更を加えて、これらの態様に適用される。
【００９０】
ある実施形態においては、粒子状ＥＳＭと、存在する場合はその他の足場成分とを、足場において粒子状ＥＳＭが少なくとも３０％ｗ／ｗとなるのに十分な量で、例えば少なくとも３５％ｗ／ｗ、少なくとも４０％ｗ／ｗ、少なくとも４５％ｗ／ｗ、少なくとも５０％ｗ／ｗ、少なくとも５５％ｗ／ｗ、少なくとも６０％ｗ／ｗ、少なくとも６５％ｗ／ｗ、少なくとも７０％ｗ／ｗ、少なくとも７５％ｗ／ｗ、少なくとも８０％ｗ／ｗ、少なくとも８５％ｗ／ｗ、少なくとも９０％ｗ／ｗ、少なくとも９５％ｗ／ｗ、または少なくとも１００％ｗ／ｗとなるのに十分な量で、水懸濁液として提供する。
【００９１】
他の実施形態においては、粒子状ＥＳＭと、存在する場合はその他の足場成分とを、足場において粒子状ＥＳＭが１００％ｗ／ｗ未満、例えば９５％ｗ／ｗ以下となるのに十分な量で、例えば９０％以下ｗ／ｗ、８５％以下ｗ／ｗ、８０％以下ｗ／ｗ、７５％以下ｗ／ｗ、７０％以下ｗ／ｗ、６５％以下ｗ／ｗ、６０％以下ｗ／ｗ、５５％以下ｗ／ｗ、５０％以下ｗ／ｗ、４５％以下ｗ／ｗ、４０％以下ｗ／ｗ、３５％以下ｗ／ｗ、または３０％以下ｗ／ｗとなるのに十分な量で、水懸濁液として提供する。
【００９２】
上記したこれらの値の組み合わせに由来するあらゆる範囲の端点が、具体的に企図される。
【００９３】
ある実施形態においては、その他の足場成分は、コラーゲンおよび／またはゼラチン、好ましくはコラーゲンを含み、例えば、本質的にこれらからなるものであるか、またはこれらからなるものである。これらの実施形態においては、コラーゲンおよび／またはゼラチン成分に対する粒子状ＥＳＭの重量比は、１：３〜２０：１であって、例えば、１：３〜１５：１、１：３〜１０：１、１：３〜６：１、１：３〜５：１、１：３〜３：１、１：３〜２：１、または約１：１である。さらなる比が、本明細書に記載されている。
【００９４】
ある実施形態においては、その他の足場成分は、ＰＶＡを含み、例えば、本質的にこれからなるものであるか、またはこれからなるものである。これらの実施形態においては、ＰＶＡ成分に対する粒子状ＥＳＭの重量比は、１：３〜２０：１であって、例えば、１：３〜１５：１、１：３〜１０：１、１：３〜６：１、１：３〜５：１、１：３〜３：１、１：３〜２：１、または約２：１、または約１：１である。さらなる比が、本明細書に記載されている。
【００９５】
ある実施形態においては、本方法は、ステップ（ｉ）において提供される粒子状ＥＳＭのＥＳＭを、例えば濃度が約０．５Ｍ（例えば、０．１〜１Ｍ、０．３〜０．７Ｍ、または０．４〜０．６Ｍ）の酢酸などの、ＥＳＭを水和させる（かつ、好ましくは、存在しているコラーゲンおよび／またはゼラチンを可溶化する）のに十分な濃度の酸に、十分な時間接触させたか、または接触させる、ステップを含む。別の酸を用いてもよいが、選択された酸によっては、足場の小孔サイズおよび機械的特性に影響をおよぼす場合がある（Ｒａｔａｎａｖａｒａｐｏｒｎ Ｊら，Ｊ Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｐｏｌｙｍ Ｅｄ １９，９４５〜９５２；２００８）。酢酸は、コラーゲン足場の調製に好ましく、最適である。
【００９６】
フリーズドライ（凍結乾燥）は、簡便な手段によって行われ得、そのパラメーターを調整して、乾燥足場の特性を制御し得る。例えば、フリーズドライは、懸濁液を、約１℃／分の速度で約−４０℃まで冷却することと、少なくとも約１時間、−４０℃で維持することと、約１℃／分の速度で０℃まで加熱することと、少なくとも約１７時間、約２００ｍＴｏｒｒ（０．２６６ｍｂａｒ）の真空とすることと、を含む。
【００９７】
別の特定の実施形態においては、スポンジ状の本明細書に記載の本発明の足場を調製する別の方法が提供され、該方法は、
（ｉ）（ａ）粒子状ＥＳＭを、前記足場において粒子状ＥＳＭが少なくとも２５％ｗ／ｗとなるのに十分な量で、重合可能または架橋可能な足場成分である、１つ以上の他の足場成分と、適切な重合開始剤または架橋開始剤と共に、水懸濁液として提供することと、
（ｉ）（ｂ）場合によっては鋳型中で、重合または架橋が起こるのに十分な条件下で、十分な時間、前記粒子状ＥＳＭの懸濁液の温度を、前記懸濁液の凝固点よりも低い温度に保つことと、
（ｉ）（ｃ）ステップ（ｉ）（ｂ）の重合産物または架橋産物を乾燥させて、該足場を得ることと、を含む方法、または、
（ｉｉ）（ａ）粒子状ＥＳＭを、前記足場において粒子状ＥＳＭが少なくとも２５％ｗ／ｗとなるのに十分な量で、重合可能または架橋可能な足場成分である、１つ以上の他の足場成分と共に、水懸濁液として提供することと、
（ｉｉ）（ｂ）該粒子状ＥＳＭの懸濁液を、適切な重合開始剤または架橋開始剤と混合することと、
（ｉｉ）（ｃ）場合によっては鋳型中で、重合または架橋が起こるのに十分な条件下で、十分な時間、前記懸濁液の温度を、前記懸濁液の凝固点よりも低い温度に保つことと、
（ｉｉ）（ｄ）ステップ（ｉｉ）（ｃ）の重合産物または架橋産物を乾燥させて、該足場を得ることと、を含む方法、または、
（ｉｉｉ）（ａ）粒子状ＥＳＭを、前記足場において粒子状ＥＳＭが少なくとも２５％ｗ／ｗとなるのに十分な量で、重合可能または架橋可能な足場成分である、１つ以上の他の足場成分と共に、水懸濁液として提供することと、
（ｉｉｉ）（ｂ）場合によっては鋳型中で、前記懸濁液の温度を、前記懸濁液の凝固点よりも低い温度に保つことと、
（ｉｉｉ）（ｃ）該ＥＳＭ懸濁液を、重合または架橋が起こるのに十分な条件下で、十分な時間、適切な重合開始剤または架橋開始剤と混合することと、
（ｉｉｉ）（ｄ）ステップ（ｉｉｉ）（ｃ）の重合産物または架橋産物を乾燥させて、該足場を得ることと、を含む方法である。
【００９８】
その他の足場成分および／または適切な開始剤は、粒子状ＥＳＭの懸濁液に懸濁していてもよく、かつ／または溶解していてもよい。
【００９９】
ある実施形態においては、粒子状ＥＳＭを、重合可能または架橋可能な足場成分である、１つ以上の他の足場成分と、適切な重合開始剤または架橋開始剤と共に、水懸濁液として提供するステップ（ｉ）（ａ）は、シート状またはフレーク状のＥＳＭを、１つ以上の他の足場成分と、開始剤と共に、水懸濁液として提供することと、例えば本明細書に記載されているＥＳＭサイズ低減技術を該懸濁液に適用することとを含む。回転子−固定子分散機を用いることが有利な場合がある。
【０１００】
他の実施形態においては、粒子状ＥＳＭを、１つ以上の他の足場成分と、開始剤と共に、水懸濁液として提供するステップ（ｉ）（ａ）は、粒子状ＥＳＭと、該１つ以上の他の足場成分と、該開始剤とを、そのままの状態か、または水溶液もしくは水懸濁液として提供することと、これらの形態を任意の順番で、または同時に、混合することとを含む。例えば、これは、１つ以上の他の足場成分を、開始剤を含有する該粒子状ＥＳＭの水懸濁液と混合することを含んでいてもよいし、該粒子状ＥＳＭを、１つ以上の他の足場成分と開始剤とを含む水溶液もしくは水懸濁液と混合することを含んでいてもよいし、該粒子状ＥＳＭの水懸濁液を、１つ以上の他の足場成分の水溶液もしくは水懸濁液および開始剤の水溶液もしくは水懸濁液と混合することを含んでいてもよい。さらなるサイズ低減は、どの時点で行われてもよい。
【０１０１】
ある実施形態においては、１つ以上の他の足場成分と共に水懸濁液として粒子状ＥＳＭを提供するステップ（ｉｉ）（ａ）およびステップ（ｉｉｉ）（ａ）は、シート状またはフレーク状のＥＳＭを、１つ以上の他の足場成分と共に、水懸濁液として提供することと、例えば本明細書に記載されているＥＳＭサイズ低減技術を該懸濁液に適用することとを含む。回転子−固定子分散機を用いることが有利な場合がある。
【０１０２】
他の実施形態においては、１つ以上の他の足場成分と共に水懸濁液として粒子状ＥＳＭを提供するステップ（ｉｉ）（ａ）およびステップ（ｉｉｉ）（ａ）は、粒子状ＥＳＭと該１つ以上の他の足場成分とを提供することと、水性液と混合して該懸濁液を形成することとを含む。これは、１つ以上の他の足場成分を、該粒子状ＥＳＭの水懸濁液と混合することを含んでいてもよいし、該粒子状ＥＳＭを、１つ以上の他の足場成分の水溶液もしくは水懸濁液と混合することを含んでいてもよいし、該粒子状ＥＳＭの水懸濁液を、１つ以上の他の足場成分の水溶液もしくは水懸濁液と混合することを含んでいてもよい。さらなるサイズ低減は、どの時点で行われてもよい。
【０１０３】
鋳型は、例えば、足場が適用される部位（創傷、関節、骨欠損部など）のサイズおよび形状、または足場の基盤を成す臓器、組織、もしくはこれらの一部分のサイズおよび形状など、用途に適したサイズおよび形状（または近似的な形状）を有するものであってもよい。他の実施形態においては、鋳型のサイズおよび形状は、適当なサイズに切断し得る製品を形成するように選択されてもよい。
【０１０４】
鋳型は、懸濁液を完全に密封するものであってもよいし、少なくとも一面が開放されていてもよい。懸濁液を完全に密封することによって、凍結を行っている間のスポンジの膨張が制限され、それによって、多孔度や小孔のサイズ、その他の構造的特徴が制御され得る。
【０１０５】
ある実施形態においては、粒子状ＥＳＭを、足場において粒子状ＥＳＭが少なくとも３０％ｗ／ｗとなるのに十分な量で、例えば少なくとも３５％ｗ／ｗ、少なくとも４０％ｗ／ｗ、少なくとも４５％ｗ／ｗ、少なくとも５０％ｗ／ｗ、少なくとも５５％ｗ／ｗ、少なくとも６０％ｗ／ｗ、少なくとも６５％ｗ／ｗ、少なくとも７０％ｗ／ｗ、少なくとも７５％ｗ／ｗ、少なくとも８０％ｗ／ｗ、少なくとも８５％ｗ／ｗ、少なくとも９０％ｗ／ｗ、少なくとも９５％ｗ／ｗ、または少なくとも１００％ｗ／ｗとなるのに十分な量で、水懸濁液として提供する。
【０１０６】
他の実施形態においては、粒子状ＥＳＭを、足場において粒子状ＥＳＭが１００％ｗ／ｗ未満、例えば９５％ｗ／ｗ以下となるのに十分な量で、例えば９０％以下ｗ／ｗ、８５％以下ｗ／ｗ、８０％以下ｗ／ｗ、７５％以下ｗ／ｗ、７０％以下ｗ／ｗ、６５％以下ｗ／ｗ、６０％以下ｗ／ｗ、５５％以下ｗ／ｗ、５０％以下ｗ／ｗ、４５％以下ｗ／ｗ、４０％以下ｗ／ｗ、３５％以下ｗ／ｗ、または３０％以下ｗ／ｗとなるのに十分な量で、水懸濁液として提供する。
【０１０７】
上記したこれらの値の組み合わせに由来するあらゆる範囲の端点が、具体的に企図される。
【０１０８】
ある実施形態においては、その他の足場成分は、ＰＥＧを含み、例えば、本質的にこれからなるものであるか、またはこれからなるものである。これらの実施形態においては、ＰＥＧ成分に対する粒子状ＥＳＭの重量比は、１：３〜２０：１であって、例えば、１：３〜１５：１、１：３〜１０：１、１：３〜６：１、１：３〜５：１、１：３〜３：１、１：３〜２：１、または約１：２、または約１：１である。さらなる比が、本明細書に記載されている。
【０１０９】
上述したように、ある実施形態においては、本方法は、ステップ（ｉ）（ａ）、ステップ（ｉｉ）（ａ）、および／またはステップ（ｉｉｉ）（ａ）において提供される粒子状ＥＳＭのＥＳＭを、ＥＳＭを水和させるのに十分な濃度の酸に、十分な時間接触させたか、または接触させる、ステップを含む。
【０１１０】
本発明の方法によって得られた、または得ることできる組織工学用足場は、本発明のさらなる態様である。
【０１１１】
本発明の組織工学用足場は、生分解性および生体適合性を有する足場を必要とするあらゆる組織工学的な用途において、足場として働く性質を有すると予想される。
【０１１２】
したがって、本発明は、インビボにおける組織工学的方法を提供し、該方法は、本発明の組織工学用足場を提供することと、十分量の該足場を、被験者に対して、再生、修復、または再構成を必要とする組織中または組織上、あるいは組織の置換または新規組織の構成を必要とする部位に適用することとを含む。足場には、適用前に、該組織を形成できる細胞を播種してもよく、より好ましくは、播種された足場を、適用前に、組織形成が誘導される条件下で培養する。
【０１１３】
本発明は、さらに、インビボにおける組織工学的方法で用いる、例えば本明細書に記載の、本発明の組織工学用足場を提供する。
【０１１４】
本発明は、さらに、インビボにおける組織工学的方法で用いる薬品の製造における、例えば本明細書に記載の、本発明の組織工学用足場の使用を提供する。
【０１１５】
本発明のこれらの態様においては、足場は、粒子状卵殻膜（ＥＳＭ）を少なくとも約２５％ｗ／ｗ含み、該粒子状ＥＳＭが実質的に一様に分布し、本質的に乾燥し、立体的（３Ｄ）で多孔性であり、生分解性および生体適合性を有する組織工学用足場の形態の、医薬組成物（または薬品）と見なし得る。
【０１１６】
また、本発明は、エキソビボにおける組織工学的方法も提供し、該方法は、本発明の組織工学用足場を提供することと、十分量の該足場を、再生、修復、または再構成を必要とする、被験者から単離された組織、あるいは組織の置換または新規組織の構成を必要とする、該単離された組織中または組織上の部位に適用することとを含む。足場には、適用前に、該組織を形成できる細胞を播種してもよく、より好ましくは、播種された足場を、適用前に、組織形成が誘導される条件下で培養する。
【０１１７】
また、本発明は、インビトロにおける組織工学的方法も提供し、該方法は、本発明の組織工学用足場を十分量提供することと、該足場に、該組織を形成できる細胞を播種することと、足場および細胞を、組織形成が誘導される条件下で培養することとを含む。そのようにして形成された組織は、被験者に移植され得る。
【０１１８】
組織は、副腎組織、肝組織、心組織、腎組織、膵組織、脳下垂体組織、甲状腺組織、免疫組織、卵巣組織、精巣組織、前立腺組織、子宮内膜組織、眼組織、乳房組織、脂肪組織、上皮組織、内覆組織、神経組織、筋肉組織、結合組織（靱帯および軟骨など）、肺組織、内皮組織、表皮組織、および骨組織から選択され得、好ましくは、筋肉組織、結合組織（軟骨など）、骨組織、および神経組織から選択され得る。
【０１１９】
組織工学に関する言及は、例えば、副腎、肝臓、心臓、腎臓、膵臓、脳下垂体、甲状腺、骨髄、卵巣、精巣、前立腺、子宮内膜、眼、乳房、脂肪層、上皮、内覆組織、神経、脳、筋肉、靱帯、軟骨、肺、内皮、表皮、および骨などであり、好ましくは表皮、筋肉、軟骨、骨、および神経などである臓器、四肢、および胴体部、またはこれらの部分、一部、もしくは成分を包含する。
【０１２０】
したがって、ある実施形態においては、本発明のインビボにおける方法は、表皮、筋肉、骨、軟骨または神経を、再生、修復、再構成、置換、または新規に形成する方法であってもよい。これらの実施形態においては、本発明の足場は、それらを必要とする臓器／組織に適用される。これらの実施形態においては、播種される細胞は、それらを必要とする臓器／組織に適した細胞である。
【０１２１】
したがって、他の実施形態においては、本発明のインビトロにおける方法は、組織または臓器を構築する方法であってもよく、特に、表皮、筋肉、骨、軟骨または神経、ならびに臓器、四肢、および胴体部、またはこれらの部分、一部、もしくは成分を構築するためのインビトロにおける方法であってもよい。
【０１２２】
粒子状ＥＳＭ、および該粒子状ＥＳＭを含む本発明の足場は、本発明の足場が、創傷、特に慢性創傷の管理に特に役立つような性質を有する。本発明の足場は、その立体的かつ多孔性の構造のために、止血性と、特に乾燥状態で適用される場合には、創傷滲出物管理能を有していることが期待される。また、足場は、創傷において、空間充填効果を提供し、適切な組織の成長を補助することができるが、一方で、その立体的かつ多孔性の構造のために、外科的接着などの不適切な組織の成長を阻害する。粒子状ＥＳＭの化学的性質および物理的性質によって、創傷に関しては、ＭＭＰ阻害や、創傷への細胞移動の促進、および／または創傷組織細胞の増殖または分化の促進、および／または新規組織形成の促進、抗菌作用、および抗炎症作用などの機能的利点が得られる。
【０１２３】
したがって、ある特定の実施形態においては、本発明は、創傷の治癒を促進する方法を提供し、該方法では、本明細書に記載の本発明の組織工学用足場が、創傷の治癒を促進するのに十分な量で、該創傷に適用される。
【０１２４】
あるいは、本発明のこの態様は、創傷治癒の促進に用いる、本明細書に記載の本発明の組織工学用足場を提供する。
またあるいは、本発明のこの態様は、創傷治癒の促進に用いる薬品の製造における、本明細書に記載の本発明の組織工学用足場の使用を提供する。
【０１２５】
創傷組織由来の細胞、あるいは創傷への細胞移動、および／または創傷組織細胞の増殖もしくは分化、および／または新規組織形成を促進する細胞を播種した足場は、特に有利な場合がある。
【０１２６】
本発明のこれらの態様においては、足場は、粒子状卵殻膜（ＥＳＭ）を少なくとも約２５％ｗ／ｗ含み、該粒子状ＥＳＭが実質的に一様に分布し、本質的に乾燥し、立体的（３Ｄ）で多孔性であり、生分解性および生体適合性を有する組織工学用足場の形態の、医薬組成物（または薬品）と見なし得る。
【０１２７】
本発明の足場は、（創傷と接触させる時点において少なくとも最初は）単独で用いられても（創傷に適用または投与されても）よいし、複合被覆材、または足場で覆われた埋め込み型医療用デバイスの一部として用いられても（創傷に適用または投与されても）よい。埋め込み型医療用デバイスとしては、創傷をもたらす経皮デバイスおよび／または経皮管路（ダクロン（Dacron）またはコラーゲンカフなどのカフ付きカテーテルなど）や、心臓弁、人工関節、および軟組織インプラント（胸部インプラント、臀部インプラント、口唇インプラントなど）などの補綴具、ステント、ペースメーカーなどのあらゆる種類のデバイスが挙げられるが、これらに限定されない。「埋め込み型」医療用デバイスは、その一部分が体内に入っているデバイスを含んでいてもよく、すなわち、デバイスは、全体が埋め込まれていてもよいし、部分的に埋め込まれていてもよい。以下では、本発明の足場に関する言及は、指示がなければ、本明細書に記載の複合被覆材、または足場で覆われた埋め込み型医療用デバイスに関する言及でもある。
【０１２８】
創傷治癒の促進とは、本明細書に記載の本発明の組織工学用足場を用いて創傷を治療すると、当該創傷の治癒プロセス（すなわち、創傷が、その治癒プロセスにおいて広く認められている３つの段階（すなわち、炎症期、増殖期、および／または再構築期）を進行すること）が加速されることを意味する。治癒プロセスの加速は、治癒段階のうち、１つ、２つ、またはすべてを通じて進行速度が増加することとして現れてもよい。創傷が、治癒段階のうちの１つにおいて停止する慢性創傷である場合、加速は、停止後の線型的で連続的な治癒プロセスの再開として現れてもよい。換言すると、治療は、創傷を、非治癒状態から治癒段階を進行し始める状態に転換する。再開後の進行は、標準的な速度で進んでもよいし、標準的な急性創傷が治癒する速度と比較して、遅い速度で進んでもよい。創傷治癒を促進することで、当該創傷の治癒プロセスの減速が防止されると考えてもよい。治癒プロセスの減速は、治癒段階のうち、１つ、２つ、またはすべてを通じて進行速度が減少することとして現れてもよい。創傷が、停止後の線型的で連続的な治癒プロセスを創傷が再開している慢性創傷である場合、減速は、治癒段階のうちの１つにおいて再度停止することとして現れてもよい。換言すると、治療は、創傷が、治癒状態から非治癒状態に転換するのを防止する。さらに、創傷治癒を促進することで、既存の創傷が治療され、かつ既存の創傷が成長すること、および／または既存の治癒中の創傷が、治癒が不十分な創傷もしくは慢性創傷になることが防止されると考えてもよい。
【０１２９】
この態様においては、治癒を促進するために、本明細書に記載の本発明の組織工学用足場を用いて創傷を治療すると、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対する、創傷におけるＭＭＰの活性が、低減され得るか、または、少なくとも、全体的なＭＭＰ活性レベルが低減され得るか、または、少なくとも、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の分解レベルが低減され得る。したがって、本発明は、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対する、創傷におけるＭＭＰの活性を低減または制限する、創傷の治癒を促進する方法であって、本明細書に記載の本発明の組織工学用足場が、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対する、創傷におけるＭＭＰの活性を低減または制限するのに十分な量で、該創傷に適用される、方法を包含するものと見なすことができる。
【０１３０】
より一般的には、本発明は、創傷において、全体的なＭＭＰ活性レベルを低減または制限する、創傷の治癒を促進する方法であって、本明細書に記載の本発明の組織工学用足場が、創傷における全体的なＭＭＰ活性レベルを低減または制限するのに十分な量で、該創傷に適用される、方法を包含するものと見なすことができる。
【０１３１】
また、より一般的には、本発明は、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の、創傷における分解を低減または制限する、創傷の治癒を促進する方法であって、本明細書に記載の本発明の組織工学用足場が、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の、創傷における分解を低減または制限するのに十分な量で、該創傷に適用される、方法を包含するものと見なすこともできる。
【０１３２】
ＭＭＰ−２（７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼまたはゼラチナーゼＡともいう）、ＭＭＰ−８（好中球コラゲナーゼまたはＰＭＮＬコラゲナーゼともいう）、および／またはＭＭＰ−９（９２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ、９２ｋＤａ ゼラチナーゼ、またはゼラチナーゼＢともいう）は、通常、創傷、特に慢性創傷において見出され、好ましい実施形態において、具体的には、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するこれらのＭＰＰの活性が低減される。
【０１３３】
ある実施形態においては、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対する、創傷におけるＭＭＰの活性は、治療中の創傷の治癒プロセスに不利益にならないレベルまで低減または制限される。この低減は、ＥＣＭタンパク質（コラーゲンおよびエラスチンなど）および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の断片の、創傷（または創傷液）における減少として観察されてもよい。これらの断片は、ひいてはこれらのタンパク質の分解を示すものであり、免疫組織化学法／免疫細胞化学法、および／または生体分子（タンパク質など）染色などの常用の技術によって、あるいはクロマトグラフ法を用いて創傷液を解析することによって、検出されてもよい。制限は、このようなレベルが維持されていることとして観察されてもよい。
【０１３４】
創傷は、それぞれ、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性として、異なる（例えば、低減された）レベルを必要とするものであり、この点で同じ創傷でも、時間がたてば必要とするものが異なる場合もある。これは、必要であれば、過度の負担なく、当業者によって決定されてもよいが、本明細書で開示される粒子状ＥＳＭ含有組織工学用足場の重要な利点は、効果的なレベルでＭＭＰを阻害することが比較的容易であるので、煩わしい投与量の最適化を、日常的に行う必要がないということである。実際、たいていの場合、本明細書に記載の粒子状ＥＳＭ含有組織工学用足場によるＭＭＰ活性の低減は、創傷治癒の促進に効果的であろう。
【０１３５】
数値的に表すと、本発明の足場を、治療中の創傷に適用した後、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対する、創傷におけるＭＭＰ活性（または、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の全体的な分解）は、好ましくは、少なくとも５％低減され、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％低減される。ある実施形態においては、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性（または、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の全体的な分解）は、あるレベルで維持される必要があってもよく、このような実施形態においては、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性（または、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の全体的な分解）において、低減されるのは９０％以下であり、例えば、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下が低減される。これらの値の組み合わせに由来するあらゆる範囲の端点が、具体的に企図される。
【０１３６】
理論に拘束されることを望むものではないが、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性（または、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の全体的な分解、または全体的なＭＭＰ活性レベル）は、多くの機構によって低減または制限され得る。これは、創傷ＭＭＰの直接阻害、創傷ＭＭＰの吸収および不活性化、別の基質または過剰な基質を加えることによる創傷ＭＭＰの滴定、創傷ＭＭＰの活性化に関わる酵素（プラスミン、好中球エラスターゼおよび肥満細胞キマーゼを含むセリンプロテアーゼなど）の阻害、ならびに、創傷の細胞および／または単球、マクロファージ、好中球、肥満細胞などの炎症細胞によるＭＭＰの発現および／または分泌を阻害する内在性ＭＭＰ阻害物質（ＴＩＭＰ（組織性メタロプロテアーゼ阻害物質）など）の創傷における上方制御を含み得るが、これらに限定されるものではない。当業者であれば、市販されているものもある常用の解析技術を用いて、過度の負担なく、創傷におけるこのような効果を測定することができるであろう。上記低減の割合は、ここでも適用される。
【０１３７】
ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性の低減または制限は、治療中の創傷における全体的なＭＭＰ活性の低減または維持に反映されてもよい。全体的なＭＭＰ活性は、すべてのＭＭＰの、すべての創傷基質に対する活性の目安である。全体的なＭＭＰ活性は、市販されているものもある常用の解析技術を用いて、過度の負担なく、測定することができる。数値的に表すと、本発明の足場を、治療中の創傷に適用した後、創傷における全体的なＭＭＰ活性は、好ましくは、少なくとも約５％低減され、例えば、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％低減される。
【０１３８】
ある実施形態においては、全体的なＭＭＰ活性、および、特に、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性は、あるレベルで維持される必要があってもよく、このような実施形態においては、全体的なＭＭＰ活性、特にＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性において、低減されるのは約９０％以下であり、例えば、約８０％以下、約７０％以下、約６０％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、または約５％以下が低減される。これらの値に由来するあらゆる範囲の端点の組み合わせが、具体的に企図される。
【０１３９】
他の実施形態においては、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−８および／またはＭＭＰ−９などの特定のＭＭＰの全体的な活性が考慮される。これらの実施形態においては、全体的なＭＭＰ活性は、すべての創傷基質に対する当該特定ＭＭＰの活性である。
【０１４０】
一実施形態においては、本発明のこの態様の方法は、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性（または、ＭＭＰ活性の全体的なレベル）が、適切でないレベル、すなわち過剰なレベルである恐れがあるか、あるいはＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性（または、ＭＭＰ活性の全体的なレベル）が低減または制限（例えば、維持）されることで恩恵を受ける創傷を有していると被験体が診断されるステップを含んでいてもよい。他の実施形態においては、本発明のこの態様の方法は、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の分解レベルが、適切でないレベル、すなわち過剰なレベルである恐れがある創傷を有すると被験体が診断されるステップを含んでいてもよい。
【０１４１】
さらなる実施形態においては、本発明のこの態様の方法は、本発明の足場を創傷に適用した後、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の分解を測定する、かつ／あるいはＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性を測定する、かつ／あるいは全体的なＭＭＰ活性を測定するステップを含んでいてもよい。他の実施形態においては、ＭＭＰ全般の代わりに、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−８および／またはＭＭＰ−９が考えられる。
【０１４２】
あるいは、または、さらに、本発明の方法は、本発明の粒子状ＥＳＭ含有組織工学用足場を創傷に適用した後、創傷の臨床指標（例えば、創傷のサイズ（深さおよび／または面積）、治癒時間、創傷もしくは周囲組織全体の不快感または痛み）を測定するステップを含んでいてもよい。これらの測定ステップは、足場を創傷に適用する直前に、または被験体の治療初期の別の時点に、同じ測定基準と比較することを含んでいてもよい。
【０１４３】
この態様においては、本発明の足場の「十分量（または、有効量）」とは、上述したＭＭＰ活性ならびにＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の分解に影響を及ぼし、それによって創傷の治癒を促進する、本明細書に記載の足場の量である。当業者であれば、常用の投与反応プロトコールと、好都合なことには、上述したＭＭＰ活性ならびにＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の分解を評価する常用の技術とに基づいて、本発明の足場の有効量（十分量）がどれだけであるかを容易に決定することができるであろう。他の実施形態においては、本発明の足場の「十分量（または、有効量）」とは、上述した創傷の臨床指標に良い影響を及ぼす、本明細書に記載の足場の量である。
【０１４４】
通常の創傷治癒プロセスは、創傷組織細胞が創傷へと移動し、かつ／または増殖して新規組織を形成する増殖期を含むが、治癒プロセスは、先行する段階で停止する場合もある。
【０１４５】
したがって、創傷組織細胞の生存能力および／または成長を促進し得る創傷治癒のための治療は、特に有利であろう。
【０１４６】
この態様においては、治癒を促進するために、本明細書に記載の本発明の組織工学用足場を用いて創傷を治療することは、創傷組織細胞の生存能力および／または成長を促進し得る。したがって、本発明は、創傷組織細胞の生存能力および／または成長を促進する、創傷治癒を促進する方法であって、本明細書に記載の本発明の足場が、創傷組織細胞の生存能力および／または成長を促進するのに十分な量で該創傷に適用される、方法を包含するものと見なすことができる。
【０１４７】
「生存能力および／または成長」なる語は、微生物（下記）についての上記議論と矛盾がないように解釈されるべきであるが、この場合、成長は、創傷組織細胞の分化を含んでいてもよい。
【０１４８】
「創傷組織細胞の成長を促進する」とは、創傷組織細胞の測定可能な成長（複製および／または分化など）またはその速度が増大すること、あるいは少なくとも維持されるかまたはその減少が防止されるということを意味する。創傷組織細胞の測定可能な成長（複製および／または分化など）またはその速度は、好ましくは少なくとも５％増大され、より好ましくは少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％増大され、例えば少なくとも５０％増大される。
【０１４９】
一実施形態においては、本発明のこの態様の方法は、創傷組織細胞の生存能力および／または成長が促進されることで恩恵を受ける創傷を有すると被験体が診断されるステップを含んでいてもよい。
【０１５０】
さらなる実施形態においては、本発明のこの態様の方法は、本発明の足場を創傷に適用した後、創傷組織細胞の生存能力および／または成長、ならびに／あるいは新規組織の形成を測定するステップを含んでいてもよい。これらの測定ステップは、本発明の足場を創傷に適用する直前に、または被験体の治療初期の別の時点に、同じ測定基準と比較することを含んでいてもよい。
【０１５１】
したがって、創傷組織細胞の創傷への移動も促進し得る創傷治癒のための治療は、特に有利であろう。
【０１５２】
この態様においては、治癒を促進するために、本明細書に記載の本発明の足場を用いて創傷を治療することは、創傷組織細胞の創傷への移動を促進し得る。したがって、本発明は、創傷組織細胞の創傷への移動を促進する、創傷治癒を促進する方法であって、本明細書に記載の本発明の足場が、創傷組織細胞の創傷への移動を促進するのに十分な量で該創傷に適用される、方法を包含するものと見なすことができる。
【０１５３】
「移動を促進する」とは、創傷組織細胞の創傷への測定可能な移動またはその速度が増大すること、あるいは少なくとも維持されるかまたはその減少が防止されるということを意味する。創傷組織細胞の創傷への測定可能な移動またはその速度は、好ましくは、少なくとも５％増大され、より好ましくは少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％増大され、例えば少なくとも５０％増大される。
【０１５４】
一実施形態においては、本発明のこの態様の方法は、創傷組織細胞の創傷への移動が促進されることで恩恵を受ける創傷を有すると被験体が診断されるステップを含んでいてもよい。
【０１５５】
さらなる実施形態においては、本発明のこの態様の方法は、本発明の足場を創傷に適用した後、創傷組織細胞の創傷への移動、および／または新規組織の形成の程度を測定するステップを含んでいてもよい。これらの測定ステップは、本発明の足場を創傷に適用する直前に、または被験体の治療初期の別の時点に、同じ測定基準と比較することを含んでいてもよい。
【０１５６】
移動および／または増殖および／または分化が促進されることによって、新規組織の形成が促進されてもよい。創傷組織細胞の創傷への移動、創傷細胞の増殖および分化、ならびに創傷における新規組織の形成は、創傷またはそのサンプルを顕微鏡解析することによって、測定および定量化されてもよい。このような解析は、創傷組織細胞上の分子マーカーおよび／または創傷における新規組織上の分子マーカーを検出する化学染色および／または免疫化学染色を含んでいてもよい。
【０１５７】
これらの実施形態において、本発明の足場を創傷に適用した後、創傷細胞は足場と接触する。より具体的には、創傷細胞は、創傷組織細胞の生存能力および／または成長を促進するか、または創傷組織細胞の創傷への移動を促進するか、または新規組織の形成を促進するのに有効な、本発明の足場の有効量と接触する。
【０１５８】
これらの実施形態においては、本明細書に記載の足場の「有効量」とは、上述した増殖促進効果または移動促進効果をもたらす足場の量、あるいは新規組織の形成を促進することによって、創傷の治癒をさらに促進する足場の量である。当業者であれば、常用の投与反応プロトコールと、好都合なことには、上述した創傷細胞の生存能力、成長、および移動を評価する常用の技術とに基づいて、足場の有効量（十分量）がどれだけであるかを容易に決定することができるであろう。
【０１５９】
創傷は、上皮性関門に欠け、微生物の付着およびコロニー形成のための基質および表面として有用であることから、感染、特に慢性感染にとって理想的な環境である。問題としては、創傷の感染によって、創傷および創傷の周囲組織において炎症およびネクローシスが増加するため、治癒が遅れることがよくあり、そのため、創傷が、確立された（慢性の）感染をより起こしやすくなる。治癒しようとしている創傷の多くで感染が起こっているので、創傷における感染（いわゆる創傷の生物負荷）にも対処し得る創傷治癒のための治療は、特に有利であろう。
【０１６０】
この態様においては、治癒を促進するために、本明細書に記載の本発明の組織工学用足場を用いて創傷を治療することによって、創傷に存在する微生物の生存能力および／または成長を阻害し得、これによって、創傷に存在する微生物感染を抑制し得る。したがって、本発明は、創傷に存在する微生物の生存能力および／または成長を阻害する、あるいは創傷における微生物感染を抑制する、創傷治癒を促進する方法であって、本明細書に記載の本発明の組織工学用足場が、微生物の生存能力および／または成長を阻害する、あるいは微生物感染を抑制するのに十分な量で該創傷に適用される、方法を包含するものと見なすことができる。
【０１６１】
本明細書における「微生物」なる語は、あらゆる微小生物、すなわち、顕微鏡的である、つまり小さすぎて裸眼では見ることができない、あらゆる生物を含む。特に、本明細書におけるこの語は、典型的に微生物であると考えられる細胞性生物、特に、細菌、真菌、古細菌、藻類、および原生生物を含む。微生物は、原核生物であってもよいし、真核生物であってもよく、微生物のどの綱、属、または種に属していてもよい。微生物は、好気性であってもよいし、嫌気性であってもよい。微生物は、病原性であってもよいし、非病原性であってもよく、または、腐敗性微生物であってもよいし、指標性微生物であってもよい。微生物は、薬剤（すなわち、抗生物質または抗真菌剤などの抗菌剤）耐性であってもよいし、多剤耐性であってもよい。特に好ましい実施形態において、微生物は、創傷にコロニーを形成し、創傷治癒を遅らせ得る。
【０１６２】
細菌または真菌は、微生物の好ましい分類を代表しているので、本発明の足場は、好ましくは、抗菌活性または抗真菌活性（例えば、殺菌性があるか、静菌性である、または殺真菌性があるか、静真菌性である）を有するものと考えてもよい。
【０１６３】
本発明の足場は、その殺菌作用または静菌作用（細胞毒性または細胞分裂抑制性）を付与するために、生理学的システムまたは生理学的機構（免疫システムなど）を用いる必要はないと考えられる。むしろ、本発明の足場（または、少なくとも足場の粒子状ＥＳＭ）は、微生物に直接作用する。
【０１６４】
細菌は、好ましくは、以下の属から選択される：アクロモバクター属（Achromobacter）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、アクチノバシルス属（Actinobacillus）、アエロモナス属（Aeromonas）、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、アルテロモナス属（Alteromonas）、バクテロイデス属（Bacteroides）、バルトネラ属（Bartonella）、ボレリア属（Borrelia）、ボルデテラ属（Bordetella）、ブルセラ属（Brucella）、バークホルデリア属（Burkholderia）、カンピロバクター属（Campylobacter）、カルジオバクテリウム属（Cardiobacterium）、クラミジア属（Chlamydia）、クラミドフィラ属（Chlamydophila）、クロモバクテリウム属（Chromobacterium）、カイセオバクテリウム（Chyseobacterium）、クリセオモナス属（Chryseomonas）、シトロバクター属（Citrobacter）、クロストリジウム属（Clostridium）、コマモナス属（Comamonas）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、コキシエラ属（Coxiella）、クリプトバクテリウム属（Cryptobacterium）、エドワードシエラ属（Edwardsiella）、エイケネラ属（Eikenella）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、エルビニア属（Erwinia）、キンゲラ属（Kingella）、クレブシエラ属（Klebsiella）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、レジオネラ属（Legionella）、レプトスピラ属（Leptospira）、レプトトリキア属（Leptotrichia）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、リステリア属（Listeria）、リストネラ属（Listonella）、モビルンカス属（Mobiluncus）、モラクセラ属（Moraxella）、モルガネラ属（Morganella）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、ナイセリア属（Neisseria）、ノカルジア属（Nocardia）、ノカルジオプシス属（Nocardiopsis）、パントエア属（Pantoea）、パラクラミジア属（Parachlamydia）、パスツレラ属（Pasteurella）、ペプトコッカス属（Peptococcus）、ペプトストレプトコッカス属（Peptostreptococcus）、プレボテラ属（Prevotella）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、プロテウス属（Proteus）、プロビデンシア属（Providencia）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ラルストニア属（Ralstonia）、リケッチア属（Rickettsia）、サルモネラ属（Salmonella）、シェウェネラ属（Shewenella）、シゲラ属（Shigella）、スフィンゴバクテリウム属（Sphingobacterium）、スフィンゴモナス属（Sphingomonas）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ステノトロホモナス属（Stenotrophomonas）、ストレプトバチルス属（Streptobacillus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ストレプトミセス属（Streptomyces）、トレポネム属（Treponem）、およびエルシニア属（Yersinia）。
【０１６５】
したがって、細菌は、グラム陽性細菌であってもよいし、グラム陰性細菌であってもよいし、実際はグラム陽性かグラム陰性かが不確かな細菌であってもよい。グラム陰性細菌が重要である。グラム陰性細菌の中で、腸内細菌科およびグラム陰性非発酵細菌が、特に重要である。
【０１６６】
細菌は、好ましくは、シュードモナス属（Pseudomonas）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、バークホルデリア属（Burkholderia）、エシェリヒア属（Escherichia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、プロビデンシア属（Providencia）、モラクサラ属（Moraxalla）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）から選択され、例えば緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）、バークホルデリア属の一種（Burkholderia spp.）、大腸菌（E. coli）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、バークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）、鼻疽菌（Burkholderia mallei）、類鼻疽菌（Burkholderia pseudomallei）、アシネトバクター・ルオフィイ（Acinetobacter lwoffii）、プロビデンシア・スチュアルティイ（Providencia stuartii）、プロビデンシア・レットゲリ（Providencia rettgeri）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Providencia alcalifaciens）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、シュードモナス・アンギリセプチカ（Pseudomonas anguilliseptica）、シュードモナス・オリジハビタンス（Pseudomonas oryzihabitans）、シュードモナス・プレコグロッシシダ（Pseudomonas plecoglossicida）、シュードモナス・ルテオラ（Pseudomonas luteola）、モラクサラ・カタラーリス （Moraxalla catarrhalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡなど）などである。
【０１６７】
微生物は、真菌または真菌由来であってもよく、その例として、原生生物として分類されているかもしれない、または分類されていたかもしれない真菌、例えば、カンジダ属（Candida）、アスペルギルス属（Aspergillus）、ニューモシスチス属（Pneumocystis）、ペニシリウム属（Penicillium）、およびフザリウム属（Fusarium）に属する真菌が挙げられる。代表的な真菌の種としては、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・デュブリニエンシス（Candida dubliniensis）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラマ・カプスラーツム（Histoplama capsulatum）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、コクシジオデス・イミティス（Coccidiodes immitis）、パラコクシジオデス・ブラジリエンシス（Paracoccidiodes brasiliensis）、ブラストミセス・デルミティディス（Blastomyces dermitidis）、ネオモシスチス・カリニ（Pneomocystis carnii）、ペニシリウム・マルネッフィ（Penicillium marneffi）、アルテルナリア・アルテルナーテ（Alternaria alternate）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６８】
微生物は、バイオフィルム中に存在していてもよく、換言すると、微生物は、バイオフィルム形態で成長していてもよい。「バイオフィルム」とは、基層もしくは界面に付着するか、または細胞同士が付着して、細胞外ポリマー（より具体的には、細胞が産生する細胞外ポリマー）のマトリクスに埋まる付着性細胞が優勢である（運動性細胞がいくらか存在していてもよい）という特徴がある微生物の群衆であって、このコロニーの微生物は、成長速度および遺伝子の転写に関して、異なる表現型を示す（例えば、「非バイオフィルム」性または浮標性または浮遊性の同等物と比較した場合）ことで特徴付けられる微生物の群衆を意味する。「バイオフィルム中」とは、微生物が、（完全に、または部分的に）バイオフィルムのポリマーマトリクス内にあるか、その上にあるか、またはそれと結合していることを意味する。見方を変えると、「バイオフィルム中に存在していない」微生物は、遊離している、例えば浮遊しているか、または、複数の微生物の凝集物中に存在している場合は、その凝集物が有機的構造を持たない、かつ／またはバイオフィルムのマトリクス特性を持たないかのいずれかである。それぞれの場合において、個々の微生物は、バイオフィルムに存在する同等物で観察される異なる表現型は示さない。
【０１６９】
「微生物の生存能力」なる語は、創傷などの所与の条件下において、微生物が生き延びる能力を意味する。生き延びるとは、生き続けることと同等と見なすことができる。本発明の足場は、殺菌作用によって、微生物の生存能力を低減し得る。微生物の生存能力は、以下で詳述する微生物の細胞死（および生存能力）を測定する技術を用いて決定することができる。
【０１７０】
したがって、微生物の「生存能力を阻害すること」は、微生物の生存能力を低減する効果、または微生物が生き延びにくくする効果、もしくは生存不能にする効果を含み得る。特に、この語は、微生物を殺すこと、または破壊することを包含する。
【０１７１】
「微生物を殺す」なる語は、微生物が生きた状態でいることを停止させる、すなわち、死んだ状態にする行為をいう。通常、微生物の成長を援助する培地中に入れた際に、複製および／もしくは成長を誘導することができれば、または少なくとも形態学的変化を呈することができれば、ならびに／あるいは微生物が、栄養素を代謝して、細胞機能を援助するためのエネルギーを放出していれば、微生物は生きていると見なされる。微生物は、典型的には、細胞膜の完全性が失われた場合に、死んでいると見なされる。
【０１７２】
微生物が生きている（生存可能である）か死んでいるかを決定するために、多くの常用のアッセイを利用することができる。選択肢の１つは、通常、微生物の成長を援助する条件下に微生物をおき、例えば、微生物の大きさ、微生物の形態、コロニー中の微生物の経時的な数、培地中の栄養素の消費などを測定することなどの、適切な標準的手段によって、微生物の成長を測定することである。別の選択肢は、ネクローシスまたはアポトーシス小体、膜泡状突起、核凝縮および一定の大きさの断片へのＤＮＡの切断、破壊された細胞壁または細胞膜および細胞外環境への細胞内容物の漏洩などの、細胞死に特徴的な形態に関して、微生物を評価することである。他の方法は、死んだ微生物における細胞膜の完全性の特徴的な喪失を利用する。膜不透過性染料（トリパンブルーおよびヨウ化プロピジウムなど）を慣行的に用いて、膜の完全性を評価する。さらなる選択肢は、微生物の代謝を測定することである。これは、慣行的に、多くの方法で行うことができる。例えば、ＡＴＰレベルを測定することができる。
【０１７３】
「微生物の成長」とは、微生物の大型化、または微生物成分の量および／もしくは体積（核酸の量、タンパク質の量、核の数、細胞小器官の数または大きさ、細胞質の体積など）の増加と、微生物数の増加、すなわち微生物の複製回数の増加との両方を意味する。
【０１７４】
「微生物の成長を阻害すること」とは、微生物の測定可能な成長（複製など）またはその速度を低減することを意味する。微生物の測定可能な成長（複製など）またはその速度は、好ましくは少なくとも５０％低減され、より好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％低減され、例えば少なくとも９５％低減される。測定可能な成長（複製など）は、好ましくは、停止される。微生物の大型化または拡大などの観点から見た成長は、複製とは関係なく阻害されてもよく、逆の場合も同じである。本発明の足場は、静菌作用および／または殺菌作用によって、微生物の生存能力を阻害し得る。
【０１７５】
本発明のこれらの態様は、創傷における微生物感染を抑制するのに用いる、特に創傷における微生物感染を治療するのに用いる本明細書に記載の本発明の組織工学用足場、または、創傷における微生物感染を抑制するのに用いる、特に創傷における微生物感染を治療するのに用いる薬品の製造における、本明細書に記載の本発明の組織工学用足場の使用、を提供するものと見なすこともできる。この態様では、感染は、被験体において、微生物の成長および／または生存能力を阻害することによって抑制されてもよいということがわかるであろう。感染は、バイオフィルム感染であってもよい。
【０１７６】
「感染を抑制すること」は、例えば、感染の形成を防止または阻害すること、感染を低減または除去すること、感染を成すコロニー中の微生物数を低減すること、感染および／またはそこにいる微生物の成長速度を低減または停止すること、感染中の微生物数の拡大速度を低減または停止することを含む、感染の治療または防止と見なすことができる。「バイオフィルムを抑制すること」は、防止的手段および保守的手段の両方、または防止的治療および保守的治療の両方を含む。したがって、バイオフィルムを抑制することは、バイオフィルムの形成を防止または阻害すること、バイオフィルムを除去または低減すること、バイオフィルムを小型化すること、バイオフィルムコロニー中の微生物数を低減すること、バイオフィルムの成長速度を低減または停止すること、バイオフィルムコロニー中の微生物数の拡大速度を低減または停止すること、バイオフィルムの物理的な完全性を低減すること、抗菌剤または宿主の免疫防御機構に対するバイオフィルムコロニー中の微生物の感受性を増大すること、および抗菌剤に対するバイオフィルムの透過性または宿主の免疫防御機構を増大することを包含する。
【０１７７】
これらの実施形態においては、本明細書に記載の本発明の組織工学用足場を創傷に適用した後、微生物は足場と接触する。「接触する」なる語は、創傷中もしくは創傷上に既に存在している微生物に足場を直接適用すること、または微生物が後で接触する創傷に足場を適用することを包含する。
【０１７８】
これらの実施形態においては、本発明の足場の「十分量（または有効量）」とは、上述した殺菌作用または静菌作用をもたらすか、または感染を効果的に抑制し、これによって創傷の治癒を促進する、足場の量である。当業者であれば、常用の投与反応プロトコールと、好都合なことには、上述した微生物の死または成長阻害などを評価する常用の技術とに基づいて、足場の有効量（十分量）がどれだけであるかを容易に決定することができるであろう。本発明の足場（より具体的には、そこに含有された粒子状ＥＳＭ）の直接的な効果は、殺菌作用または静菌作用の評価を妨げ得る完全な生理学的システムまたは生理学的機構を欠く、当業者であればよく知っている常用のインビトロのシステム（例えば、簡便な細胞培養システム、遊離細胞／ウイルスシステムなど）を用いて、評価することができる。
【０１７９】
一実施形態においては、本発明のこの態様の方法は、感染症を発症する恐れがある創傷、または感染症が治療されることで恩恵を受ける創傷を有していると被験体が診断されるステップを含んでいてもよい。
【０１８０】
さらなる実施形態において、本発明のこの態様の方法は、本明細書に記載の本発明の組織工学用足場を創傷に適用した後、創傷における微生物の成長および／または生存能力、あるいは感染の程度を測定するステップを含んでいてもよい。これらの測定ステップは、本発明の足場を創傷に適用する直前に、または被験体の治療初期の別の時点に、同じ測定基準と比較することを含んでいてもよい。
【０１８１】
通常の創傷治癒プロセスは、炎症期を含むが、治癒プロセスが炎症期で停止して、炎症反応が過度になる場合がある。したがって、創傷における過度の炎症反応に対処することもできる創傷治癒のための治療が、特に有利となる。
【０１８２】
この態様においては、治癒を促進するために、本明細書に記載の本発明の組織工学用足場を用いて創傷を治療することによって、創傷における炎症が低減または制限され得る。したがって、本発明は、創傷における炎症を低減または制限する、創傷の治癒を促進する方法であって、本明細書に記載の本発明の組織工学用足場が、炎症を低減または制限するのに十分な量で該創傷に適用される、方法を包含するものと見なすことができる。
【０１８３】
創傷における炎症は、紅斑、腫脹、局所熱感、浮腫、および／または膿として認識され得る。これらの炎症の兆候の１つ以上について、解剖学的範囲および／または強度を低減することによって、炎症が低減される。これらの炎症の兆候の１つ以上について、解剖学的範囲および／または強度を維持すること、またはこれらが増加することを防止することによって、炎症が制限される。
【０１８４】
あるいは、または、さらに、炎症促進マーカー、および／またはサイトカインやケモカインなどの抗炎症マーカー、および／または免疫細胞の、創傷におけるレベルを、創傷組織サンプルおよび／または創傷内部由来のサンプルなどにおいて測定してもよい。より具体的には、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＮＦ−κＢ、ＲＯＳ、ヒスタミン、マクロファージ、単球、肥満細胞、および／または好中球のレベルを測定してもよい。これは、例えば、創傷サンプルの免疫アッセイまたはフローサイトメトリー、あるいは適切な活性測定法によって行われてもよい。
【０１８５】
創傷サンプルにおいて、炎症促進マーカーおよび／または免疫細胞のうち１つ以上のレベルを低減することで、創傷における炎症が低減されてもよい。同様に、創傷サンプルにおいて、抗炎症マーカーのうちの１つ以上を増加させることで、創傷における炎症が低減されてもよい。創傷サンプルにおいて、炎症促進マーカーおよび／または免疫細胞のうち１つ以上のレベルを維持すること、またはこれらが増加することを防止することで、あるいは、創傷サンプルにおいて、抗炎症マーカーのうちの１つ以上のレベルまたは活性を維持すること、またはこれらが低減されるのを防止することで、創傷における炎症が制限されてもよい。
【０１８６】
この態様においては、本発明の足場の「十分量（または、有効量）」とは、上述の創傷における炎症に影響を及ぼし、特に、炎症促進マーカーおよび／もしくは抗炎症マーカーのレベルまたは活性、ならびに／あるいは免疫細胞のレベルまたは活性に影響を及ぼし、それによって創傷の治癒をさらに促進する、足場の量である。当業者であれば、常用の投与反応プロトコールと、好都合なことには、上述した創傷の炎症を評価する常用の技術とに基づいて、足場の有効量（十分量）がどれだけであるかを容易に決定することができるであろう。
【０１８７】
一実施形態においては、本発明のこの態様の方法は、炎症を発症する恐れがある創傷、あるいは炎症が治療される（すなわち、低減されるか制限される）ことで恩恵を受ける創傷を有していると被験体が診断されるステップを含んでいてもよい。
【０１８８】
さらなる実施形態においては、本発明のこの態様の方法は、本発明の足場を創傷に適用した後、創傷における炎症の程度を測定するステップを含んでいてもよい。これらの測定ステップは、本発明の足場を創傷に適用する直前に、または被験体の治療初期の別の時点に、同じ測定基準と比較することを含んでいてもよい。
【０１８９】
ある実施形態においては、本発明の方法は、上述した創傷への作用のうちの２つ以上または全てによって創傷治癒を促進するものであり、例えば、ＥＣＭおよび／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の分解阻害（特に、ＥＣＭおよび／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性の阻害）と、上述した創傷への作用、特に、抗菌作用および／または抗炎症作用のほか、創傷組織細胞の増殖、移動、および／または分化の促進、ならびに／あるいは新規組織の形成の促進といった作用のうちの１つ以上と、によって、創傷治癒を促進する。
【０１９０】
ある実施形態においては、本発明の方法は、（ｉ）ＥＣＭおよび／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の分解阻害（特に、ＥＣＭおよび／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰ活性の阻害）、ならびに上述した追加的な創傷への作用、特に、抗菌作用および／または抗炎症作用といった作用のうちの１つ以上または全て；あるいは、（ｉｉ）創傷における炎症の低減、ならびに上述した追加的な創傷への作用、特に、抗菌作用および／または抗ＭＭＰ阻害作用といった作用のうちの１つ以上または全て、のいずれかによって、創傷治癒を促進する。
【０１９１】
創傷は、被験体内に見出されてもよいし、被験体上に見出されてもよい。「被験体内」なる語は、本明細書において、被験体の体内にある部位または位置、あるいは被験体上、例えば外部体表面などの部位または位置を含んで広く用いられ、また、特に、埋め込み型医療用デバイスを含有する創傷を含んでいてもよい。
【０１９２】
したがって、創傷は、皮膚の中または上、あるいは口腔（歯肉、歯肉溝、歯周ポケットなど）、生殖管（子宮頸管、子宮、卵管など）、腹膜、消化管、耳、眼、前立腺、尿路、脈管系、気道、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、神経系、もしくは脳の感染しやすい表面の中または上に見出されてもよい。「創傷組織細胞」は、これに応じて解釈されるべきである。好ましくは、創傷は、皮膚（真皮）の創傷であり、換言すると、真皮創傷または皮膚科学的創傷であって、これは、表皮および／または真皮、ならびにその下にある組織の、あらゆる深さにある創傷を含む。
【０１９３】
埋め込み型医療用デバイスとしては、創傷をもたらす経皮デバイスおよび／または経皮管路（中心静脈カテーテル、特に、ダクロン（Dacron）またはコラーゲンカフなどのカフ付きカテーテルなど）や、心臓弁、人工関節、歯科インプラントおよび軟組織インプラント（胸部インプラント、臀部インプラント、口唇インプラントなど）などの補綴具、ステント、ペースメーカー、気管切開チューブなどのあらゆる種類のデバイスが挙げられるが、これらに限定されない。「埋め込み型」医療用デバイスは、その一部分が体内に入っているデバイスを含んでいてもよく、すなわち、デバイスは、全体が埋め込まれていてもよいし、部分的に埋め込まれていてもよい。
【０１９４】
創傷は、物理的障害（機械的損傷；過度の加熱または冷却などの結果生じる熱損傷；電位源との接触などによる電気的損傷；および赤外線、紫外線、または電離放射線に長期にわたり過度に曝露されることなどによる放射線損傷など）により、または皮膚潰瘍（静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、または褥瘡など）、肛門裂傷、口腔内潰瘍、および尋常性座瘡などの自然発生的な損傷により、外科的に生じ得る。外科的に移植された組織は、創傷と見なされる。
【０１９５】
創傷は、典型的には急性創傷または慢性創傷のいずれかとして定義される。急性創傷とは、止血後、長引くことなく、その治癒プロセスにおいて広く認められている３つの段階（すなわち、炎症期、増殖期、および再構築期）が順に進行する創傷である。慢性創傷とは、治癒することがない創傷、または火傷などによって過度に皮膚が欠損している創傷と定義される。このような創傷は、治癒段階のうちの１つにおいて停止してしまうため、治癒プロセスの生化学的事象を順に完遂することはない。慢性創傷は、一般的に、炎症期で停止する。慢性創傷は、患者の死亡の主要な原因である。
【０１９６】
本発明の特定の態様にしたがって、慢性創傷は、期待された期間で治癒しなかった、例えば治癒するのに期待したよりも少なくとも５日、少なくとも１０日、少なくとも１５日、少なくとも２０日、または少なくとも３０日長くかかった、創傷であると見なし得る。慢性創傷は、少なくとも３０日以内、少なくとも４０日以内、具体的には少なくとも５０日以内、より具体的には少なくとも６０日以内、更に具体的には少なくとも７０日以内に治癒しなかった創傷としてもよい。
【０１９７】
慢性創傷となった火傷による創傷も、特に重要である。あらゆる火傷、特に、重篤な火傷は、被験体の上皮性関門および／または内皮性関門の完全性に著しい衝撃を与え、このような外傷の治療は、非常に時間のかかるプロセスとなることが多い。したがって、本発明の方法は、火傷の治癒を促進する方法と見なし得る。
【０１９８】
火傷を起こす典型的な原因は、極端な温度（過度な温度の火、液体、気体など）、電気、腐食性薬品、摩擦、および放射である。この原因の強度／強さとともに、曝露の程度および期間によって、火傷のひどさが変化する。熱湯熱傷（すなわち、高温の液体および／または気体に関連した外傷）は火傷と見なされる。
【０１９９】
ある実施形態においては、創傷は、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子に対するＭＭＰの活性レベル、例えばＭＭＰ−２、ＭＭＰ−８および／またはＭＭＰ−９の活性レベルが不適切、すなわち過剰となる恐れがあるかまたは現にそうである創傷である。他の実施形態においては、創傷は、全体的なＭＭＰ活性レベルが不適切、すなわち過剰となる恐れがあるかまたは現にそうである創傷である。他の実施形態においては、創傷は、ＥＣＭおよび／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の分解レベルが不適切、すなわち過剰となる恐れがあるかまたは現にそうである創傷である。これらの特徴を有する創傷は、ＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子の分解を測定する上述した方法、またはＥＣＭタンパク質および／またはペプチド成長因子もしくはペプチド分化因子、あるいは創傷基質全般に対する全体的なＭＭＰ活性または特定のＭＭＰ活性を測定する上述した方法を用いて、同定され得る。
【０２００】
ある実施形態においては、創傷は、創傷組織細胞の創傷への移動レベルおよび／または創傷組織細胞の増殖レベルもしくは分化レベル、および／または新規組織の形成レベルが不適切、すなわち不十分となる恐れがあるかまたは現にそうである創傷である。
【０２０１】
ある実施形態においては、創傷は、例えば本明細書に開示されているような、微生物感染の恐れがあるか、現に感染している、創傷である。感染は、急性でも、あるいは慢性でもよく、例えば、少なくとも５日間、または少なくとも１０日間、具体的には少なくとも２０日間、より具体的には少なくとも３０日間、さらに具体的には少なくとも４０日間、持続する感染である。
【０２０２】
ある実施形態においては、創傷は、免疫細胞（マクロファージ、単球、肥満細胞および／または好中球など）、および／または適切でないレベル、すなわち過剰なレベルの炎症促進マーカー（本明細書で開示されるものなど）、および／または適切でないレベル、すなわち不十分なレベルの抗炎症マーカー（本明細書で開示されるものなど）を含有する創傷などの、炎症を起こす恐れがあるかまたは現に炎症を起こしている創傷である。
【０２０３】
またさらなる実施形態においては、創傷は、上述した創傷の特徴のうちの２つ以上または全てを有しており、例えば、ＭＭＰが過活性化（特に、ＥＣＭおよび成長因子に対して）している、またはＥＣＭおよび成長因子が過剰に分解されているという特徴と、他の上述した創傷の特徴、特に、抗菌作用および／または抗炎症作用のほかに、創傷組織細胞の創傷への移動や、創傷組織細胞の増殖もしくは分化、および／または新規組織の形成が不十分であるという特徴のうちの１つ以上の特徴と、を有する。
【０２０４】
またさらなる実施形態においては、対象の創傷では、（ｉ）ＭＭＰが過活性化（特に、ＥＣＭおよび成長因子に対して）している、またはＥＣＭおよび成長因子が過剰に分解されており、他の上述した創傷の特徴、特に、微生物感染および炎症といった特徴のうちの１つ以上の特徴が見られる、；あるいは（ｉｉ）炎症が過剰に起こっており、他の上述した創傷の特徴、特に、微生物感染およびＭＭＰの過活性化（特に、ＥＣＭおよび成長因子に対して）またはＥＣＭおよび成長因子の過剰な分解といった特徴のうちの１つ以上の特徴が見られる。
【０２０５】
被験体は、ヒト被験体であってもよいし、ヒト以外の動物被験体であってもよいが、より具体的には、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物、例えば、哺乳類、鳥類、両生類、魚類、および爬虫類から選択されるヒト以外の動物であってもよい。哺乳類の被験体が好ましい。ヒト以外の動物は、実験動物または動物園もしくは動物保護区域の動物を含む、家畜であってもよいし、飼育された動物であってもよいし、商品価値のある動物であってもよい。したがって、代表的なヒト以外の動物としては、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、モルモット、ハムスター、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ニワトリ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、アヒル、ガチョウ、オウム、セキセイインコ、ハト、サケ、マス、ティラピア、ナマズ、ブリーム、バラマンディ、ハタ、ボラ、カンパチ、ニベ、ローフー、ハゼ、タラ、ハドック、シーバス、およびコイが挙げられる。よって、本発明の獣医学的な使用が含まれる。被験体は、患者と見なしてもよい。被験体は、好ましくはヒトである。
【０２０６】
本発明にしたがって、被験体における医学的状態（創傷など）の治療または感染の治療に関連して用いられる場合の「治療」は、本明細書において、症状に対する、または感染に関連する、あらゆる治療効果、すなわち有利な効果を含んで、広く用いられる。したがって、症状／感染の根絶または排除、あるいはその症状／感染被験体の治療だけでなく、被験体の症状／感染の改善も含まれる。よって、例えば、症状／感染の自覚的兆候または客観的兆候の改善、あるいは症状／感染の臨床的に許容される指標の改善（例えば、創傷のサイズ（深さおよび／または面積）の低減、治癒時間の加速、本明細書に記載の創傷効果のうちの１つ以上、あるいは、創傷もしくは周囲組織全体の不快感または痛みの低減）が含まれる。よって、治療は、例えば、既往のまたは診断された感染／症状の、治癒的療法および緩和療法の両方、すなわち保守的治療を含む。
【０２０７】
本明細書で用いられる「防止」とは、予防効果または防止効果のことをいう。したがって、症状（創傷サイズの増大または慢性創傷もしくは治癒が不十分な創傷の進展など）または感染、あるいは症状／感染または１つ以上のそれらの兆候もしくは指標の発症を、予防的治療を行う前の症状／感染または兆候もしくは指標と比べて、相対的に遅延、制限、低減、または防止することを含む。よって、予防は、症状／感染またはそれらの兆候もしくは指標の発生または発症の完全な防止と、症状／感染または兆候もしくは指標の発症または進展の遅延、あるいは症状／感染または兆候もしくは指標の進展または進行の低減または制限との両方を、明確に含む。
【０２０８】
具体的には、本明細書に記載の本発明の組織工学用足場は、例えば、創傷感染を防止するか、またはその恐れを少なくとも最小化する、あるいは創傷サイズの増大または治癒が不十分な創傷もしくは慢性創傷の進展を防止するか、またはその恐れを少なくとも最小化する、予防的治療薬として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０２０９】
本発明を、以下の限定されない実施例を参照してさらに説明する。実施例において、
【図１】図１は、実施例３のコラーゲン：粒子状ＥＳＭからなる足場の、圧縮試験の結果を示す。
【図２】図２は、実施例７の７００−ＰＥＧ／ＥＳＭ（３０／１０）クリオゲルのＳＥＭ像を示す。（Ａ）は、内側から見たものであり、（Ｂ）は表面から見たものである。相互に接続した２〜２０μｍの小孔を観察可能である。
【実施例】
【０２１０】
実施例１：粒子状ＥＳＭ１００％ｗ／ｗからなる足場
酸抽出（０．１Ｍ ＨＣＬ）を行った後、続けて水洗浄によりｐＨをほぼ中性に戻すことによって、未精製のフレーク状ＥＳＭを精製した。その後、この材料を乾燥させると、外観が固化したフレーク状になった。
【０２１１】
次いで、精製したＥＳＭ材料を２％ｗ／ｖで０．５Ｍの酢酸に懸濁した。酢酸は、コラーゲンを部分的に可溶化し、ＥＳＭを水和するので、懸濁液をより容易に作成することができる。次いで、混合物を、ツラックス（Turrax）ホモジナイザーを用いて、１４，０００ＲＰＭで剪断した。この剪断によって、細断および粒子サイズの低減が行われ、安定な懸濁液が作成された。次いで、これを１２ｃｍ×１２ｃｍのトレイに入れ、フリーズドライした。このプロセスの間、氷晶が形成され、その後ＥＳＭが濃縮されて、氷晶の周囲に析出する。次いで、乾燥過程において氷晶を昇華させ、連続気泡構造を有する安定なスポンジを作成した。
【０２１２】
実施例２：粒子状ＥＳＭ８０％ｗ／ｗとコラーゲン２０％ｗ／ｗとからなる足場
酸抽出（０．１Ｍ ＨＣＬ）を行った後、続けて水洗浄によりｐＨをほぼ中性に戻すことによって、未精製のフレーク状ＥＳＭを精製した。その後、この材料を乾燥させると、外観が固化したフレーク状になった。
【０２１３】
次いで、精製したＥＳＭ材料を、コラーゲン濃度が２％ｗ／ｖである０．５Ｍの酢酸溶液に懸濁し、相対的な固体含量をＥＳＭ８０％、コラーゲン２０％とした。次いで、混合物を、ツラックスホモジナイザーを用いて、１４，０００ＲＰＭで剪断した。得られた懸濁液を、１２ｃｍ×１２ｃｍのトレイに入れてフリーズドライし、粒子状ＥＳＭ８０％ｗ／ｗおよびコラーゲン２０％ｗ／ｗからなり、連続気泡構造を有する、安定なスポンジを作成した。
【０２１４】
このスポンジは、純粋なＥＳＭスポンジよりも柔軟性があり、例えば、表面が複雑な輪郭を有するより大きな創傷などの、より柔軟性の高いスポンジが有利な場所に適用することができた。
【０２１５】
実施例３：粒子状ＥＳＭとコラーゲンとからなる足場および粒子状ＥＳＭとゼラチンとからなる足場
足場は、ＥＳＭの担体としてのコラーゲンおよびゼラチンを、フリーズドライすることによって作製した。ＥＳＭは、フリーズドライ前に、様々な重量比（１：１〜１：３ コラーゲン：ＥＳＭ、１０：３ ゼラチン：ＥＳＭ）でタンパク質溶液に添加された。フリーズドライ後に熱脱水処理（１０５℃、２４時間）を用いて架橋させた足場と、架橋させなかった足場とを比較した。得られた架橋足場は、水和させた場合に、圧縮弾性率が２０６〜２３２Ｐａとなり、構造的に安定であることがわかった。これらの性質は、インテグラ皮膚再生テンプレートの基礎を成すコラーゲン系スポンジの性質と類似している。
【０２１６】
コラーゲン−粒子状ＥＳＭ懸濁液の調製：まず、ブレードミルを用いて卵殻膜を粉砕し、微細粒子とした。１ｇまたは２ｇのコラーゲンを２００ｍＬの０．５Ｍ酢酸に添加することによって、コラーゲン懸濁液を調製した（すなわち、０．５ｗｔ％または１ｗｔ％の懸濁液）。これらの懸濁液を、オーバーヘッドブレンダー（設定３、ウルトラツラックス（Ultra Turrax）、ＩＫＡワークス社（IKA Works））を用いて、冷却した（７℃）反応容器中で混合した。次いで、ＥＳＭ粉末（２〜１２ｇ、すなわち０．５〜６ｗｔ％）を懸濁液に添加し、さらに１５分間混合した。
【０２１７】
ゼラチン−粒子状ＥＳＭ懸濁液の調製：上述したように、卵殻膜を調製した。２０ｇのゼラチンを２００ｍＬの０．５Ｍ酢酸に添加することによってゼラチン懸濁液を調製し（１０ｗｔ％の懸濁液）、これをホットプレート上で４０℃まで加熱し、マグネティックスターラーを用いて２０分間攪拌した。ＥＳＭ粉末（６ｇ、すなわち３ｗｔ％）を懸濁液に添加し、さらに１５分間混合した。
【０２１８】
フリーズドライ：４ｍＬ、７．５ｍＬ、および１５ｍＬのコラーゲン−ＥＳＭ懸濁液／ゼラチン−ＥＳＭ懸濁液を、６１×６１ｍｍのステンレス製の鋳型に、ピペットを用いて分注した（得られた足場の高さは、約１ｍｍ、約２ｍｍ、および約４ｍｍ）。次いで、鋳型を凍結乾燥機（ジェネシス（Genesis）、ヴィルティス社（VirTis））に入れ、１℃／分で２０℃から−４０℃まで冷却し、１時間この温度で維持することによって、凍結させた。この後、温度を０度まで上昇させ、２００ｍＴｏｒｒ（０．２６６ｍｂａｒ）で真空引きして、１７時間、サンプルを乾燥させた。次いで、足場に水分が凝縮するのを防ぐために、凍結乾燥室を開く前に、棚を２０度とした。
【０２１９】
熱脱水架橋：足場を、アルミホイルの包みに入れ、真空引きした（０．０５ｂａｒ）。次いで、温度を１０５度まで上昇させ、２４時間維持し、その後室温まで冷却した。
【０２２０】
機械的試験：レザーパンチを用いて、フリーズドライしたシートから、直径が９．５ｍｍのサンプルを打ち抜いた。次いで、これらのサンプルを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１時間、水和させた。次いで、５−Ｎ荷重計を取り付けた機械試験機（Ｚ０５０、ツウィック／ローエル社（Zwick/Roell）、ドイツ）を用いて、自由圧縮試験を行った。試験は、不浸透性で無給油の定盤を用いて行った。試験は、ひずみ速度を１０％／分として行った。係数は、ひずみが２〜５％の範囲の応力ひずみ曲線に対する直線近似の傾きとして定義され、応力ひずみ曲線の曲線範囲は避けた。
【０２２１】
播種されたコラーゲン−ＥＳＭ足場からの細胞の移動：３Ｔ３線維芽細胞系細胞（初期細胞密度：２５，０００個／ｃｍ2、培地：ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）を、コラーゲン−ＥＳＭ足場の上端に加え、１日目および７日目に、核特異的蛍光プローブを用いて染色した。蛍光顕微鏡（アクシオテック（Axiotech）顕微鏡；ツァイス社（ZEISS））を用いて、これらの時点における足場上および足場内部の細胞を可視化した。
【０２２２】
結果
コラーゲン−ＥＳＭ懸濁液をフリーズドライすると、異なるコラーゲン：ＥＳＭの重量比において、均一さに変化は観察されず、非常に均一な足場が得られた。ＤＨＴ架橋処理によって、リン酸緩衝生理食塩水中で水和させる際の安定性が向上した。
【０２２３】
４ｍｍ厚のサンプルを用いた機械的試験によって、コラーゲン：ＥＳＭの重量比が１：１および１：３である足場の圧縮係数は、２３２〜２０６ｋＰａにわたることが明らかになった。これらの値は、圧縮係数が約５００ｋＰａである、創傷治癒に用いる市販のコラーゲン系スポンジの係数と一致している。ゼラチン：ＥＳＭ懸濁液をフリーズドライすると、足場はより脆くなった。ゼラチン：ＥＳＭ足場の柔軟性は、製造条件を変化させることによって、調整され得る。ゼラチンは、コラーゲンに対してコストの面で有利であり、コストがより重視される用途に、より適している場合がある。
【０２２４】
１日目および７日目に、足場内部および足場上において、細胞が検出され（データは示さず）、これは、細胞が足場に残っていて、足場外部に移動していないということを示す。
【０２２５】
実施例４：ＥＤＣ架橋のプロトコール
１．冷凍庫からＥＤＣのボトルを取り出し、ボトル内に水分が凝縮するのを防ぐために、室温で３０分間放置する。２．滅菌した培養フードにおいて、円形パンチ（直径１２．７ｍｍ）を用いて足場サンプルを切り出し、各ウェルにＰＢＳを１ｍＬ入れた２４穴プレートに入れ、足場を水和させる（皮膚側を上にしてＰＢＳに入れる）。３．サンプル中のコラーゲンの質量を求める。直径１２．７ｍｍの足場の場合、標準コラーゲンの濃度１％は８ｍｇである。４．以下の式を用いて、コラーゲン／足場１ｇあたりのＥＤＣを６ｍｍｏｌとするのに必要なＥＤＣの量を算出し計量する：ＥＤＣ（ｇ）＝コラーゲンの重量（ｇ）×０．００６ｍｏｌ ＥＤＣ／ｇ コラーゲン×１９１．７ｇ ＥＤＣ／ｍｏｌ ＥＤＣ。５．Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を、ＥＤＣ：ＮＨＳのモル比が５：２となるように、算出し計量する。６．５０ｍＬの遠沈管に、１つの足場あたり２ｍＬのｄｄＨ2Ｏを加える。７．遠沈管にＥＤＣおよびＮＨＳを加え、渦流によって混合する。８．滅菌した培養フードにおいて、シリンジフィルターを用いて、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を滅菌ろ過する。９．２４穴プレートの新しいウェルに、２ｍＬのＥＤＣ溶液を加える。１０．足場を、ＰＢＳからＥＤＡＣ溶液に移し、室温で２時間インキュベートする。１１．ＰＢＳを用いて足場をよく洗浄し、５０ｍＬチューブに移す。１２．容器に２５〜３０ｍＬのＰＢＳを加える。１３．オービタルシェーカーを用いて、室温で３０分間、３０ｒｐｍでインキュベートする。１４．ＰＢＳを交換し、洗浄ステップをさらに３０分間繰り返す。１５．すぐに使用するか、容器を冷蔵庫（４℃）に保管して、１週間以内に使用する。
【０２２６】
実施例５：滅菌および細胞播種のプロトコール
７０％エタノールを入れた５０ｍＬチューブに足場を入れる（チューブ１本あたり足場１０〜１５個）。チューブをオービタルロッカーにしっかりと取り付け、穏やかに（３０ｒｐｍ）１時間振盪する。チューブ内のエタノールを交換し、このステップをもう一度繰り返す。２．足場を入れたチューブを、滅菌した培養フードに入れ、もう一度エタノール溶液を交換する。チューブのキャップを閉じ、さらに１時間、オービタルロッカーを用いて穏やかに振盪する。これで足場が滅菌され、滅菌したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で水和させることができる。３．足場を入れたチューブを、滅菌した培養フードに入れ、エタノール溶液をＰＢＳと交換し、キャップを閉じて、１０分間振盪する。確実に、ヒドロゲルからエタノールを完全に除去するために、ヒドロゲルを、全部で３回、滅菌したＰＢＳで洗浄する。滅菌した６穴プレートに足場を入れる（足場１〜３個／ウェル）。５．溶液１ｍＬあたり１０7個の細胞を調製する。足場の上面に１００μＬを播種し、２０分間放置する。この播種密度は、直径が１２．７ｍｍの４ｍｍ厚のサンプルに最適化されている。６．足場を裏返し、底面であった箇所に１００μＬを播種し、インキュベーター内で２０分間放置する（合計２×１０6個の細胞／足場）。７．各ウェルに５ｍＬの培地を加える。
【０２２７】
実施例６：ＰＶＡ／ＥＳＭ足場−ＰＶＡ／ＥＳＭ懸濁液の凍結乾燥
７５ｍｌの１０％ｗ／ｖの医薬品グレードのポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（７．５ｇ）を、ＨＣｌ洗浄した１００μｍより小さいＥＳＭ粒子（ｐＨ４．８）３．７５ｇと混合した。この混合物を鋳型に入れ、上述したようにフリーズドライした。
【０２２８】
ＰＶＡ／ＥＳＭ混合物をフリーズドライすることによって、小孔構造が密閉された軟パッドが得られた。
【０２２９】
実施例７：低温ゲル化によって調製されたＰＥＧ／ＥＳＭ足場
７００−ポリエチレングリコール−ジアクリル酸塩（７００−ＰＥＧ−ＤＡ）溶液と、ＨＣｌ洗浄した１００μｍより小さいＥＳＭ粒子の溶液（ｐＨ４．８）と、光開始剤であるＬＡＰ（リチウムフェニル（２，４，６−トリメチルベンゾイル）ホスフィネート）の様々な濃度の溶液とを、表１で示すように混合した。直径が異なるシリコン製の鋳型中で、−２０℃で３〜２４時間、混合物を凍結させた。凍結後、すぐに、室温で５〜１５分間、サンプルに３６５ｎｍの紫外線を照射し、それによって、ＰＥＧ−ＤＡのマクロマーのメタクリル化された末端基を架橋した。氷晶を溶解させ、クリオゲルを蒸留水を用いて数回洗浄し、真空中で一晩乾燥させた。表１に結果を示す。
【０２３０】
【表１】
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【０２３１】
２０〜３０％ｗ／ｖの７００−ＰＥＧ−ＤＡと１０％ｗ／ｖのＥＳＭを含有する水との混合物（これらの混合物からは、３３％のＥＳＭと６７％のＰＥＧｗ／ｗを含む足場、または２５％のＥＳＭと７５％のＰＥＧｗ／ｗを含む足場がそれぞれ得られる）は、深い創傷の治療用足場として好適である。なぜなら、安定で、発泡ゴムのように可撓性を有しており、サンプル中でＥＳＭ粒子が均質に分布しているからである。足場中の粒子状ＥＳＭの量が少なくなると、足場における粒子の分布が一様でなくなる。図２は、相互に接続した２〜２０μｍの小孔を有する７００−ＰＥＧ／ＥＳＭ（３０／１０）クリオゲルのＳＥＭ像を示す。用いたＥＳＭ粒子のサイズが、１０〜１００μｍの範囲であったので、クリオゲルの小孔と重なる場合がある。
【０２３２】
上記のように調製したＰＥＧ／ＥＳＭ足場および遊離の粒子状ＥＳＭの、接着性３Ｔ３細胞に対する細胞毒性を調べた。３Ｔ３細胞（初期細胞密度：２５，０００個／ｃｍ2、培地：ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）を、注意深くサンプルに滴下した。１日後および４日後に、培地を注意深く除去し、ライブ／デッド（Live/Dead）染色溶液（ＰＢＳ中、３０μｇ／ｍｌの二酢酸フルオレセイン（ＦＤＡ）および２×ゲルレッド（GelRed））に置換した。ツァイス社のアクシオテック顕微鏡によって、蛍光染色を記録した。
【０２３３】
いずれの処理群においても死細胞は観察されず（データは示さず）、このことは、ＰＥＧ／ＥＳＭ足場は、３Ｔ３細胞に対して細胞毒性を有していないことを示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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