(57)【要約】  本発明は、式4R（I）の（4R）−4−（4−シアノ−2−メトキシフェニル）−5−エトキシ−2，8−ジメチル−1，4−ジヒドロ−1，6−ナフチリジン−3−カルボキサミドならびに式（I）の（4S）−および（4R）−4−（4−シアノ−2−メトキシフェニル）−5−エトキシ−2，8−ジメチル−1，4−ジヒドロ−1，6−ナフチリジン−3−カルボキサミドの代謝産物、式M1a（S）、M1b（R）、M2a（S）、M2b（R）、M3a（S）およびM3b（R）を調製する新規な方法ならびにそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式の化合物。
【表１】
2018523698.tif 000023
【請求項２】
式M1a（S）およびM1b（R）の化合物
【化１】
2018523698.tif 000024
を調製する方法であって、
式rac M1の化合物
【化２】
2018523698.tif 000025
を、式rac（I）の化合物
【化３】
2018523698.tif 000026
の酸化によって調製し、ラセミ体をキラル相でのクロマトグラフィー法により前記式M1a（S）およびM1b（R）のエナンチオマーに分離することを特徴とする方法。
【請求項３】
式M2a（S）およびM2b（R）の化合物
【化４】
2018523698.tif 000027
を調製する方法であって、
式rac M2の化合物
【化５】
2018523698.tif 000028
を、式rac M1の化合物
【化６】
2018523698.tif 000029
のメチル基の選択的ヒドロキシル化によって調製し、ラセミ体をキラル相でのクロマトグラフィー法により前記式M2a（S）およびM2b（R）のエナンチオマーに分離することを特徴とする方法。
【請求項４】
式M3a（S）およびM3b（R）の化合物
【化７】
2018523698.tif 000030
を調製する方法であって、
式rac M3の化合物
【化８】
2018523698.tif 000031
を、式rac M2の化合物
【化９】
2018523698.tif 000032
のベンジル型アルコールの酸化によって調製し、ラセミ体をキラル相でのクロマトグラフィー法により前記式M3a（S）およびM3b（R）のエナンチオマーに分離することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式4R（I）の（4R）−4−（4−シアノ−2−メトキシフェニル）−5−エトキシ−2，8−ジメチル−1，4−ジヒドロ−1，6−ナフチリジン−3−カルボキサミドならびに式（I）の（4S）−および（4R）−4−（4−シアノ−2−メトキシフェニル）−5−エトキシ−2，8−ジメチル−1，4−ジヒドロ−1，6−ナフチリジン−3−カルボキサミドの代謝産物、式M1a（S）、M1b（R）、M2a（S）、M2b（R）、M3a（S）、M3b（R）を調製する新規な方法ならびにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
式4S（I）の化合物は、ミネラルコルチコイド受容体の非ステロイドアンタゴニストとして作用し、例えば、心不全および慢性腎障害などの心血管および腎障害を予防および／または治療するための薬剤として使用され得る。
【化１】
2018523698.tif 000002
【０００３】
式4S（I）の化合物およびその調製方法は、国際公開第2008／104306号パンフレットおよびChemMedChem 2012、7、1385に記載されており、両刊行物は研究規模の合成の詳細な議論を開示している。
【０００４】
式（I）の化合物の研究規模の合成を開示する刊行物ChemMedChem 2012、7、1385において、式（I）の化合物はバニリンから出発して10段階で調製され、全体収率は理論値の3．76％である。
【０００５】
（4S）−4−（4−シアノ−2−メトキシフェニル）−5−エトキシ−2，8−ジメチル−1，4−ジヒドロ−1，6−ナフチリジン−3−カルボキサミド（I）の臨床開発の文脈において、
a）その有効性を試験し、
b）試験している対象の血清中のその存在を定量化する
ために、式4S（I）の化合物の主な代謝産物を調製する方法が必要とされていた。
【０００６】
薬物動態測定のため、信頼性の高い定量化を行うことができるようにするために、非常に高品質の標準を調製しなければならなかった。式4S（I）の（4S）−4−（4−シアノ−2−メトキシフェニル）−5−エトキシ−2，8−ジメチル−1，4−ジヒドロ−1，6−ナフチリジン−3−カルボキサミドの投与後に得られた代謝産物の構造解明（種々の動物種およびヒトの血清のMSを介した）から、以下の6つの主な代謝産物が見出された（アトロプ異性体の絶対立体化学は、カーン・インゴルド・プレローグの慣例によってアサインされることができ、括弧内に指定する）。
【０００７】
【表１】
2018523698.tif 000003
【０００８】
以前の研究（A．Straub、Tetrahedron Asymmetry 12（2001）341〜345）は、酸化ジヒドロピリジン、すなわちピリジルアリールが束縛回転を示すという兆候を示した。束縛回転は極めて高いので、室温で対掌体を分離することができる（軸不斉→アトロプ異性）。そのため、ラセミ体から出発して、これらを対掌体に分離するために分取キラルクロマトグラフィー法を開発した。これは、驚くことに、本件でも可能であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第2008／104306号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ChemMedChem 2012、7、1385
【非特許文献２】A．Straub、Tetrahedron Asymmetry 12（2001）341〜345
【非特許文献３】Pyridines：From Lab to Production；Eric F．V．Scriven編、Elsevier Verlag 2013、第8章、116〜144頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
6つの代謝産物全てが哺乳類およびヒト生物において産生されるので、比較的大量の式M1a（S）、M2a（S）、M3a（S）、M1b（R）、M2b（R）およびM3b（R）の化合物の提供を可能にする効率的な合成が必要であった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
合成が上記刊行物に記載されている式rac（I）のラセミ化合物から出発して、
【化２】
2018523698.tif 000004
ラセミ混合物rac M1が酸化後に得られる。
【化３】
2018523698.tif 000005
【００１３】
使用され得る酸化剤は、ピペリジンおよびジヒドロピリジンの芳香族化のための当業者によく知られている酸化剤であり、これらは、例えば、書籍Pyridines：From Lab to Production；Eric F．V．Scriven編、Elsevier Verlag 2013、第8章、116〜144頁に記載されている。挙げられる例には、ジクロロメタン中DDQ、ジクロロメタン中クロラニル、ジクロロメタン中二酸化マンガン、アセトン中過マンガン酸カリウム、氷酢酸中酢酸マンガン（III）、アセトニトリル中酢酸セリウムアンモニウム、ジクロロメタン中クロロクロム酸ピリジニウム、ジクロロメタン中濃硝酸、メタノール中ヨウ素が含まれる。ジクロロメタン中DDQまたは濃硝酸が特に好ましい。収率は一般に非常に高く、一般に理論値の86％超である。
【００１４】
化合物rac M1から出発して、化合物rac M2は、
【化４】
2018523698.tif 000006
メチル基の選択的ヒドロキシル化によって得ることができる。これは、大腸菌で発現されるCYP P450を使用して可能であり、例えば、大腸菌JM109 P450 3A4は、Oxford Biomedical Researchから得られた（反応は、S．P．Hanlon、T．Friedberg、C．R．Wolf、O．Ghisalba、M．Kittelmann in Modern Biooxidation：Enzymes，Reactions and Applications（編者：R．D．Schmid、V．B．Urlacher）、Wiley−VCH、Weinheim、2007、233〜252頁；J．A．R．Blake、M．Pritchard、S．Ding、G．C．M．Smith、B．Burchell、C．R．Wolf、T．Friedberg、FEBS Lett． 1996、397、210〜214；A．Parikh、E．M．J．Gillam、F．P．Guengerich、Nat．Biotechnol．1997、15、784〜788；Gottfried，K．；Klar，U．；Platzek，J．；Zorn，L．、ChemMedChem、2015、10、1240〜1248；A．Parikh、E．M．J．Gillam、F．P．Guengerich、Nat．Biotechnol．1997、15、784〜788に記載されている）。選択性は非常に高く、達成される収率（理論値89％超）は満足できるものである。
【００１５】
化合物rac M2から出発して、化合物rac M3は、
【化５】
2018523698.tif 000007
ベンジルアルコールを酸に穏やかに酸化することによって調製することができる。この目的のために、例えばジョーンズ試薬などの当業者によく知られている酸化剤を使用することが可能である。ジョーンズ試薬（硫酸水溶液中CrO3）を使用することが好ましい。反応の完了後、rac M3は非常に容易に脱炭酸して化合物（III）：
【化６】
2018523698.tif 000008
を与えるので、過剰の酸化剤を除去するために、例えばイソプロパノールで混合物をクエンチしなければならない。
【００１６】
キラル代謝産物を調製するために、いずれの場合もキラル相でのクロマトグラフィーによって、rac M1のラセミ混合物をM1aおよびM1b、rac M2のラセミ混合物をM2aおよびM2b、ならびにrac M3のラセミ混合物をM3aおよびM3bに分離する。例えば、エナンチオマー分離のために以下の条件を使用する：
【００１７】
【表２】
2018523698.tif 000009
【００１８】
それぞれのエナンチオマーの主分画を慎重に濃縮し（ラセミ化が起こらないように熱応力を最小にする）、単離する。
【００１９】
驚くべきことに、S配置を有する式（4S）（I）の光学活性化合物は、げっ歯類および他の哺乳動物（イヌ、ラット、マウス）、およびヒトにおいても、主にM1a（S）ならびにその後の代謝産物M2a（S）およびM3a（S）に代謝される。Rエナンチオマー4R（I）を使用する場合、
【化７】
2018523698.tif 000010
b系列の代謝産物、すなわちM1b（R）、M2b（R）およびM3b（R）が主に形成される。
【００２０】
絶対配置は、X線構造解析およびCD分光法（実施例参照）によって決定した。
【００２１】
例えば、化学的酸化剤による酸化を行う場合、形成されるのは主に他の系列の代謝産物である；式4S（I）（S配置）の化合物は主にM1b（R）を生じ、式4R（I）（R配置）の化合物は主にM1a（S）を生じる。
【００２２】
その薬理学的有効性に関して、代謝産物は、式（I）の化合物より数桁低い。
【００２３】
式（I）の化合物およびその代謝産物（以下、代謝産物と称されるM1a、b、M2a、bおよびM3a、b）は、ミネラルコルチコイド受容体のアンタゴニストとして作用し、予測できない価値のある薬理活性スペクトルを示す。そのため、これらの化合物は、ヒトおよび動物の疾患を治療および／または予防するための医薬品として使用するのに適している。
【００２４】
式（I）の化合物およびその代謝産物は、種々の障害および疾患関連状態、特に血漿中のアルドステロン濃度の増加もしくはレニン血漿濃度に対するアルドステロン血漿濃度の変化を特徴とする、またはこれらの変化に関連する障害の予防および／または治療に適している。例としては、特発性原発性アルドステロン症、副腎過形成、副腎腺腫および／または副腎癌に伴う高アルドステロン症、肝硬変に伴う高アルドステロン症、心不全に伴う高アルドステロン症ならびに本態性高血圧に伴う（相対的）高アルドステロン症が挙げられる。
【００２５】
化合物（I）およびその代謝産物はまた、その作用機序のために、心臓突然死の死亡のリスクが高い患者における心臓突然死の予防に適している。特に、これらは、例えば、以下の障害のいずれかを患っている患者である：一次および二次高血圧、うっ血性心不全を伴うまたは伴わない高血圧性心臓病、治療抵抗性高血圧、急性および慢性心不全、冠動脈心臓病、安定および不安定狭心症、心筋虚血、心筋梗塞、拡張型心筋症、遺伝性原発性心筋症、例えばブルガダ症候群、シャーガス病によって引き起こされる心筋症、ショック、動脈硬化、心房および心室性不整脈、一過性および虚血性発作、脳卒中、炎症性心血管障害、末梢および心血管障害、末梢血流障害、動脈閉塞障害、例えば間欠性跛行、無症候性左室機能不全、心筋炎、心臓に対する肥大性変化、肺高血圧、冠状動脈および末梢動脈の攣縮、血栓症、血栓塞栓症および脈管炎。
【００２６】
化合物（I）およびその代謝産物を、浮腫形成、例えば、肺水腫、腎浮腫または心不全関連浮腫、ならびに血栓溶解療法、経皮的血管形成術（PTA）および経皮的冠動脈形成術（PTCA）後の再狭窄、心臓移植およびバイパス手術の予防および／または治療に使用することもできる。
【００２７】
化合物（I）およびその代謝産物はさらに、カリウム節約利尿剤としての、および電解質障害、例えば高カルシウム血症、高ナトリウム血症または低カリウム血症のための使用に適している。
【００２８】
化合物（I）およびその代謝産物は、腎障害、例えば急性および慢性腎不全、高血圧性腎疾患、動脈硬化性腎炎（慢性および間質性）、腎硬化症、慢性腎不全および嚢胞性腎障害の治療、例えば、臓器移植の場合にシクロスポリンAなどの免疫抑制剤によって引き起こされ得る腎損傷の予防、ならびに腎がんに等しく適している。
【００２９】
化合物（I）およびその代謝産物はさらに、真性糖尿病および糖尿病性続発症、例えば神経障害および腎症の予防および／または治療に使用することができる。
【００３０】
化合物（I）およびその代謝産物はまた、例えば真性糖尿病または高血圧によって引き起こされる微量アルブミン尿およびタンパク尿の予防および／または治療に使用することもできる。
【００３１】
化合物（I）およびその代謝産物はまた、血漿グルココルチコイド濃度の増加または組織（例えば心臓）中のグルココルチコイド濃度の局所的増加と関連する障害の予防および／または治療にも適している。例としては、グルココルチコイドの過剰産生をもたらす副腎機能不全（クッシング症候群）、結果としてのグルココルチコイドの過剰産生を伴う副腎皮質腫瘍、およびACTH（副腎皮質刺激ホルモン）を自律的に産生し、よって結果として生じるクッシング病を伴う副腎過形成をもたらす下垂体腫瘍が挙げられる。
【００３２】
化合物（I）およびその代謝産物はさらに、肥満、メタボリックシンドロームおよび閉塞性睡眠時無呼吸症候群の予防および／または治療に使用することができる。
【００３３】
化合物（I）およびその代謝産物はまた、例えばウイルス、スピロヘータ、真菌、細菌またはマイコバクテリアによって引き起こされる炎症性障害、および病因が未知の炎症性障害、例えば多発性関節炎、エリテマトーデス、動脈周囲炎または多発性動脈炎、皮膚筋炎、強皮症およびサルコイドーシスの予防および／または治療に使用することもできる。
【００３４】
化合物（I）およびその代謝産物はさらに、中枢神経障害、例えばうつ病、不安状態および慢性疼痛、特に偏頭痛、ならびに神経変性障害、例えばアルツハイマー病およびパーキンソン症候群の治療に使用することができる。
【００３５】
化合物（I）およびその代謝産物はまた、例えば、経皮的冠動脈形成術（PTCA）、ステントの埋め込み、冠血管内視鏡などの処置後の血管損傷、バイパス手術後の再閉塞または再狭窄、および内皮障害、レイノー病、閉塞性血栓血管炎（バージャー症候群）および耳鳴症候群の予防および／または治療にも適している。
【００３６】
本発明はさらに、障害、特に上記障害を治療および／または予防するための化合物（I）およびその代謝産物の使用に関する。
【００３７】
本発明はさらに、障害、特に上記障害を治療および／または予防するための医薬品を調製するための化合物（I）およびその代謝産物の使用に関する。
【００３８】
さらなる主題は、有効量の本発明による化合物の少なくとも1種を使用して、障害、特に上記障害を治療および／または予防する方法である。
【００３９】
化合物（I）は、単独で、または必要に応じて他の有効成分と組み合わせて使用することができる。さらなる主題は、特に上記障害を治療および／または予防するための、化合物（I）および／または1種もしくは複数の代謝産物と、1種または複数のさらなる有効成分とを含む医薬品である。適当な組み合わせ有効成分の好ましい例には、
・例えばおよび好ましくは、カルシウム拮抗薬、アンジオテンシンAII拮抗薬、ACE阻害剤、エンドセリン拮抗薬、レニン阻害剤、α受容体遮断薬、β受容体遮断薬およびRhoキナーゼ阻害剤の群の血圧を降下させる有効成分；
・利尿薬、特にループ利尿薬、ならびにチアジドおよびチアジド様利尿薬；
・例としておよび好ましくは、血小板凝集阻害剤、抗凝固薬または線維素溶解促進物質の群の抗血栓薬；
・例えばおよび好ましくは、甲状腺受容体アゴニスト、コレステロール合成阻害剤（好ましい例はHMG−CoAレダクダーゼ阻害剤またはスクアレン合成阻害剤である）、ACAT阻害剤、CETP阻害剤、MTP阻害剤、PPAR−α、PPAR−γおよび／PPAR−δアゴニスト、コレステロール吸収阻害剤、リパーゼ阻害剤、重合胆汁酸吸着剤、胆汁酸再吸収阻害剤およびリパタンパク質（a）アンタゴニストの群の脂質代謝を変化させる有効成分；
・有機硝酸塩およびNO供与体、例えばニトロプルシドナトリウム、ニトログリセリン、一硝酸イソソルビド、二硝酸イソソルビド、モルシドミンまたはSIN−1、および吸入NO；
・陽性変力効果を有する化合物、例えば強心性配糖体（ジゴキシン）、β−アドレナリンおよびドーパミン作動薬、例えばイソプロテレノール、アドレナリン、ノルアドレナリン、ドーパミンおよびドブタミン；
・環状グアノシン一リン酸（cGMP）および／または環状アデノシン一リン酸（cAMP）の分解を阻害する化合物、例えばホスホジエステラーゼ（PDE）1、2、3、4および／または5の阻害剤、特にPDE5阻害剤、例えばシルデナフィル、バルデナフィルおよびタダラフィル、ならびにPDE3阻害剤、例えばアムリノンおよびミルリノン；
・ナトリウム利尿ペプチド、例えば心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP、アナリチド）、B型ナトリウム利尿ペプチドまたは脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP、ネシリチド）、C型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）およびウロジラチン；
・カルシウム増感剤、好ましい例はレボシメンダンである；
・特に国際公開第00／06568号パンフレット、国際公開第00／06569号パンフレット、国際公開第02／42301号パンフレットおよび国際公開第03／095451号パンフレットに記載されている化合物などの、NO非依存性であるがヘム依存性のグアニル酸シクラーゼの刺激剤；
・特に国際公開第01／19355号パンフレット、国際公開第01／19776号パンフレット、国際公開第01／19778号パンフレット、国際公開第01／19780号パンフレット、国際公開第02／070462号パンフレットおよび国際公開第02／070510号パンフレットに記載されている化合物などの、NOおよびヘム非依存性のグアニル酸シクラーゼの活性化剤；
・ヒト好中球エラスターゼ（HNE）の阻害剤、例えばシベレスタットまたはDX−890（Reltran）；
・シグナル伝達カスケードを阻害する化合物、例えばチロシンキナーゼ阻害剤、特にソラフェニブ、イマチニブ、ゲフィチニブおよびエルロチニブ；および／または
・心臓のエネルギー代謝に影響を及ぼす化合物、好ましい例はエトモキシル、ジクロロ酢酸塩、ラノラジンまたはトリメタジジンである
が含まれる。
【００４０】
好ましい実施形態では、化合物（I）およびその代謝産物を、利尿剤、例としておよび好ましくは、フロセミド、ブメタニド、トルセミド、ベンドロフルメチアジド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、トリクロルメチアジド、クロルタリドン、インダパミド、メトラゾン、キネタゾン、アセタゾラミド、ジクロフェナミド、メタゾラミド、グリセロール、イソソルビド、マンニトール、アミロリドまたはトリアムテレンと組み合わせて投与する。
【００４１】
血圧を低下させる薬剤は、好ましくは、カルシウム拮抗剤、アンジオテンシンAII拮抗剤、ACE阻害剤、エンドセリン拮抗剤、レニン阻害剤、α受容体遮断薬、β受容体遮断薬、Rhoキナーゼ阻害剤および利尿剤の群の化合物を意味すると理解される。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、カルシウム拮抗剤、例としておよび好ましくは、ニフェジピン、アムロジピン、ベラパミルまたはジルチアゼムと組み合わせて投与する。
【００４３】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、アンジオテンシンAII拮抗剤（好ましい例はロサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、テルミサルタンまたはエンブルサルタンである）と組み合わせて投与する。
【００４４】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、ACE阻害剤、例としておよび好ましくは、エナラプリル、カプトプリル、リシノプリル、ラミプリル、デラプリル、フォシノプリル、キノプリル、ペリンドプリルまたはトランドプリルと組み合わせて投与する。
【００４５】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、エンドセリン拮抗剤、例としておよび好ましくは、ボセンタン、ダルセンタン、アンブリセンタンまたはシタクスセンタンと組み合わせて投与する。
【００４６】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、レニン阻害剤、例としておよび好ましくは、アリスキレン、SPP−600、SPP−635、SPP−676、SPP−800またはSPP−1148と組み合わせて投与する。
【００４７】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、α1受容体遮断薬、例としておよび好ましくは、プラゾシンと組み合わせて投与する。
【００４８】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、β受容体遮断薬、例としておよび好ましくは、プロプラノロール、アテノロール、チモロール、ピンドロール、アルプレノロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ブプラノロール、メチプラノロール、ナドロール、メピンドロール、カラザロール、ソタロール、メトプロロール、ベタキソロール、セリプロロール、ビソプロロール、カルテオロール、エスモロール、ラベタロール、カルベジロール、アダプロロール、ランジオロール、ネビボロール、エパノロールまたはブシンドロールと組み合わせて投与する。
【００４９】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、Rhoキナーゼ阻害剤、例としておよび好ましくは、ファスジル、Y−27632、SLx−2119、BF−66851、BF−66852、BF−66853、KI−23095またはBA−1049と組み合わせて投与する。
【００５０】
抗血栓活性を有する薬剤（抗血栓薬）は、好ましくは、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤および線維素溶解促進性物質の群の化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を意味すると理解される。
【００５１】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、血小板凝集阻害剤、例としておよび好ましくは、アスピリン、クロピドグレル、チクロピジンまたはジピリダモールと組み合わせて投与する。
【００５２】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、トロンビン阻害剤、例としておよび好ましくは、キシメラガトラン、メラガトラン、ビバリルジンまたはクレキサンと組み合わせて投与する。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態では、化合物（I）を、GPIIb／IIIa拮抗剤、例としておよび好ましくは、チロフィバンまたはアブシキシマブと組み合わせて投与する。
【００５４】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、第Xa因子阻害剤、例としておよび好ましくは、リバロキサバン（BAY59−7939）、DU−176b、アピキサバン、オタミキサバン、フィデキサバン、ラザキサバン、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、PMD−3112、YM−150、KFA−1982、EMD−503982、MCM−17、MLN−1021、DX9065a、DPC906、JTV803、SSR−126512またはSSR−128428と組み合わせて投与する。
【００５５】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、ヘパリンまたは低分子量（LMW）ヘパリン誘導体と組み合わせて投与する。
【００５６】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、ビタミンK拮抗剤、例としておよび好ましくは、クマリンと組み合わせて投与する。
【００５７】
脂肪代謝調節剤は、好ましくは、CETP阻害剤、甲状腺受容体作動薬、コレステロール合成阻害剤、例えば、HMG−CoA還元酵素阻害剤またはスクアレン合成阻害剤、ACAT阻害剤、MTP阻害剤、PPARα、PPARγおよび／またはPPARδ作動薬、コレステロール吸収阻害剤、重合胆汁酸吸着剤、胆汁酸再吸収阻害剤、リパーゼ阻害剤およびリポタンパク質拮抗剤の群の化合物を意味すると理解される。
【００５８】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、CETP阻害剤、例としておよび好ましくは、トルセトラピブ（CP−529 414）、JJT−705、BAY60−5521、BAY78−7499またはCETPワクチン（Avant）と組み合わせて投与する。
【００５９】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、甲状腺受容体作動薬、例としておよび好ましくは、D−チロキシン、3，5，3’−トリヨードチロニン（T3）、CGS23425またはアキシチロム（CGS26214）と組み合わせて投与する。
【００６０】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、スタチンのクラスのHMG−CoA還元酵素阻害剤、例としておよび好ましくは、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フラバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、セリバスタチンまたはピタバスタチンと組み合わせて投与する。
【００６１】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、スクアレン合成阻害剤、例としておよび好ましくは、BMS−188494またはTAK−475と組み合わせて投与する。
【００６２】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、ACAT阻害剤、例としておよび好ましくは、アバシミブ、メリナミド、パクチミブ、エフルチミブまたはSMP−797と組み合わせて投与する。
【００６３】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、MTP阻害剤、例としておよび好ましくは、インプリタピド、BMS−201038、R−103757またはJTT−130と組み合わせて投与する。
【００６４】
本発明の好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、PPARγ作動薬、例としておよび好ましくは、ピオグリタゾンまたはロシグリタゾンと組み合わせて投与する。
【００６５】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、PPARδ作動薬、例としておよび好ましくは、GW501516またはBAY68−5042と組み合わせて投与する。
【００６６】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、コレステロール吸収阻害剤、例としておよび好ましくは、エゼチミブ、チクエシドまたはパマクエシドと組み合わせて投与する。
【００６７】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、リパーゼ阻害剤、例としておよび好ましくは、オルリスタットと組み合わせて投与する。
【００６８】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、胆汁酸吸着剤、例としておよび好ましくは、コレスチラミン、コレスチポール、コレソルバム、コレスタゲルまたはコレスチミドと組み合わせて投与する。
【００６９】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、胆汁酸再吸収阻害剤、例としておよび好ましくは、ASBT（＝IBAT）阻害剤、例えば、AZD−7806、S−8921、AK−105、BARI−1741、SC−435またはSC−635と組み合わせて投与する。
【００７０】
好ましい実施形態では、化合物（I）および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を、リポタンパク質（a）拮抗剤、例としておよび好ましくは、ゲムカベンカルシウム（CI−1027）またはニコチン酸と組み合わせて投与する。
【００７１】
さらなる主題は、典型的には1種または複数の不活性で、非毒性の、薬学的に適当な賦形剤と共に式（I）の化合物および／またはその1種もしくは複数の代謝産物を含む医薬品、および上記目的のためのその使用である。
【００７２】
化合物（I）およびその代謝産物は全身的におよび／または局所的に作用することができる。この目的のために、これらを適当な様式で、例えば、経口、非経口、肺、経鼻、舌下、舌、頬側、直腸、真皮、経皮、結膜もしくは耳経路により、またはインプラントもしくはステントとして投与することができる。
【００７３】
化合物（I）およびその代謝産物をこれらの投与経路に適した投与形態で投与することができる。
【００７４】
経口投与に適した投与形態は、先行技術により作用し、化合物（I）およびその代謝産物を速効性のおよび／または修正された様式で放出し、本発明による化合物を結晶および／または非晶質および／または溶解形態で含むもの、例えば、錠剤（非コーティングあるいは例えば、本発明による化合物の放出を制御する、胃液抵抗性または遅延溶解または不溶性コーティングによるコーティング錠）、口腔で急速に崩壊する錠剤またはフィルム／オブラート、フィルム／凍結乾燥物、カプセル剤（例えば、硬質または軟質ゼラチンカプセル）、糖衣錠、顆粒剤、ペレット剤、散剤、乳剤、懸濁剤、エアゾール剤または液剤である。
【００７５】
非経口投与は、（例えば、静脈内、動脈内、心臓内、髄腔内もしくは腰椎内経路により）吸収ステップを回避して、または（例えば、筋肉内、皮下、皮内、経皮もしくは腹腔内経路により）吸収を含めて達成することができる。非経口投与に適した投与形態には、特に、液剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥物または滅菌散剤の形態の注射および注入用製剤が含まれる。
【００７６】
他の投与経路については、適当な例に、吸入医薬形態（粉末吸入器、ネブライザーを含む）、点鼻薬、液またはスプレー、舌、舌下または頬側投与のための錠剤、フィルム／ウエハーまたはカプセル剤、坐剤、耳または眼製剤、膣カプセル剤、水性懸濁剤（ローション、振盪混合物）、親油性懸濁剤、軟膏、クリーム、経皮治療システム（例えば、パッチ）、ミルク、ペースト、フォーム、粉剤、インプラントまたはステントがある。
【００７７】
経口および非経口投与、特に経口および静脈内投与が好ましい。
【００７８】
化合物（I）およびその代謝産物を言及する投与形態に変換することができる。これは、不活性で、非毒性の、薬学的に適当な賦形剤と混合することによって、それ自体は既知の様式で達成することができる。これらの賦形剤には、特に、担体（例えば、微結晶セルロース、乳糖、マンニトール）、溶媒（例えば、液体ポリエチレングリコール）、乳化剤および分散剤または湿潤剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシソルビタンオレエート）、結合剤（例えば、ポリビニルピロリドン）、合成および天然ポリマー（例えば、アルブミン）、安定剤（例えば、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸）、着色剤（例えば、無機顔料、例えば、酸化鉄）ならびに香味および／または臭気修正剤が含まれる。
【００７９】
一般に、非経口投与の場合、有効な結果を達成するために、約0．001〜1mg／kg、好ましくは約0．01〜0．5mg／kg体重の量を投与することが有利であることが分かった。経口投与の場合、投与量は約0．01〜100mg／kg、好ましくは約0．01〜20mg／kg、最も好ましくは0．1〜10mg／kg体重である。
【００８０】
それにもかかわらず、具体的には体重、投与経路、有効成分に対する個体の反応、製剤の性質および投与が行われる時間または間隔の関数として言及する量から逸脱することが必要となり得る場合もある。したがって、上記最小量未満で間に合わせることで十分となり得る場合がある一方で、言及する上限を超過しなければならない場合がある。より多量を投与する場合、これらを1日数回の個々の用量に分割することが賢明となり得る。
【００８１】
以下の実施例は本発明を説明する。本発明はこれらの実施例に制限されない。
【００８２】
特に明言しない限り、以下の試験および実施例中の百分率は、重量百分率であり、部は重量部である。液体／液体溶液の溶媒比、希釈比および濃度データは各場合において体積に基づく。
【００８３】
そのため、本発明は、以下の式の化合物に関する：
【００８４】
【表３】
2018523698.tif 000011
【００８５】
本発明はさらに、式M1a（S）およびM1b（R）の化合物
【化８】
2018523698.tif 000012
を調製する方法であって、
式rac M1の化合物
【化９】
2018523698.tif 000013
を、式rac（I）の化合物
【化１０】
2018523698.tif 000014
の酸化によって調製し、ラセミ体をキラル相でのクロマトグラフィー法により式M1a（S）およびM1b（R）のエナンチオマーに分離することを特徴とする方法に関する。
【００８６】
本発明はさらに、式M2a（S）およびM2b（R）の化合物
【化１１】
2018523698.tif 000015
を調製する方法であって、
式rac M2の化合物
【化１２】
2018523698.tif 000016
を、式rac M1の化合物
【化１３】
2018523698.tif 000017
のメチル基の選択的ヒドロキシル化によって調製し、ラセミ体をキラル相でのクロマトグラフィー法により式M2a（S）およびM2b（R）のエナンチオマーに分離することを特徴とする方法に関する。
【００８７】
本発明はさらに、式M3a（S）およびM3b（R）の化合物
【化１４】
2018523698.tif 000018
を調製する方法であって、
式rac M3の化合物
【化１５】
2018523698.tif 000019
を、式rac M2の化合物
【化１６】
2018523698.tif 000020
のベンジル型アルコールの酸化によって調製し、ラセミ体をキラル相でのクロマトグラフィー法により式M3a（S）およびM3b（R）のエナンチオマーに分離することを特徴とする方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】式M1b（R）の化合物：（R）−4−（4−シアノ−2−メトキシフェニル）−5−エトキシ−2，8−ジメチル−1，6−ナフチリジン−3−カルボキサミドの結晶構造を示す図である。
【図２】式M1b（R）の化合物：（R）−4−（4−シアノ−2−メトキシフェニル）−5−エトキシ−2，8−ジメチル−1，6−ナフチリジン−3−カルボキサミドの結晶構造を示す図である。
【図３】式M1b（R）の化合物（アセトニトリル中）のCDスペクトルを示す図である。
【図４】式M2b（R）の化合物（アセトニトリル中）のCDスペクトルを示す図である。
【図５】式M3b（R）の化合物（アセトニトリル中）のCDスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
［実験セクション］
略語および頭字語：
MS：質量分析からの質量
HPLC：高速液体クロマトグラフィー
【実施例】
【００９０】
［実施例1］
［式rac M1の化合物の調製］
［rac 4−（4−シアノ−2−メトキシフェニル）−5−エトキシ−2，8−ジメチル−1，6−ナフチリジン−3−カルボキサミド］
4（R，S）−4−（4−シアノ−2−メトキシフェニル）−5−エトキシ−2，8−ジメチル−1，4−ジヒドロ−1，6−ナフチリジン−3−カルボキサミド（rac I）100．00g（264．25mmol）を最初にジクロロメタン4kgに装入し、2，3−ジクロロ−5，6−ジシアノ−1，4−ベンゾキノン（DDQ）68．98g（303．88mmol）を20℃で添加した。混合物を20℃で1時間撹拌した。沈殿した固体を濾別し、それぞれジクロロメタン400gで2回洗浄した。混合物を減圧下で濃縮乾固し、残渣をエタノール1200gに溶解した。混合物を加熱還流し、エタノール約800gを留去した。混合物を室温に冷却させ、20℃でさらに1時間撹拌した。生成物を濾別し、少量のエタノール（約80g）で洗浄し、減圧下で一晩（50℃）乾燥させた。
収量：ベージュ色固体85．80g（理論値の86．04％）。
MS（EIpos）：m／z＝378［M＋H］＋
1H NMR（500 MHz，DMSO−d6）：δ＝0．72（t，3H），2．50（s，3H），2．70（s，3H），3．65（s，1H），4．00（m（broad），2H），7．30（d，1H），7．45（d，1H），7．50（s，2H），7．69（s，1H），8．05（s，1H）
【００９１】
［キラル相でのエナンチオマー分離］
式rac−M1の化合物2．00gをキラル相で分離した。
キラル相：Chiralpak AS−H（250×4mm）
溶離液：イソヘキサン：エタノール＝50：50
式M1a（S）の化合物の収量：（S）−4−（4−シアノ−2−メトキシフェニル）−5−エトキシ−2，8−ジメチル−1，6−ナフチリジン−3−カルボキサミド0．91g
HPLC−方法：室温約6．08分。
MS（EIpos）：m／z＝378［M＋H］＋
1H NMR（500MHz，DMSO−d6）：δ＝0．72（t，3H），2．50（s，3H），2．70（s，3H），3．65（s，1H），4．00（m（broad），2H），7．30（d，1H），7．45（d，1H），7．50（s，2H），7．69（s，1H），8．05（s，1H）
式M1b（R）の化合物の収量：（R）−4−（4−シアノ−2−メトキシフェニル）−5−エトキシ−2，8−ジメチル−1，6−ナフチリジン−3−カルボキサミド0．90g
HPLC−方法：室温約9．03分。
MS（EIpos）：m／z＝378［M＋H］＋
1H NMR（500MHz，DMSO−d6）：δ＝0．72（t，3H），2．50（s，3H），2．70（s，3H），3．65（s，1H），4．00（m（broad），2H），7．30（d，1H），7．45（d，1H），7．50（s，2H），7．69（s，1H），8．05（s，1H）
【００９２】
［実施例2］
［式rac M2の化合物の調製］
［rac 4−（4−シアノ−2−メトキシフェニル）−5−エトキシ−8−（ヒドロキシメチル）−2−メチル−1，6−ナフチリジン−3−カルボキサミド］
大腸菌JM109 P450 3A4をOxford Biomedical Researchから得た。
最終体積1lのOxford微量元素溶液：三塩化鉄六水和物（27gl−1）、二塩化亜鉛（1．31gl−1）、二塩化コバルト六水和物（2．87gl−1）、二塩化銅二水和物（1．27gl−1）、ホウ酸（0．5gl−1）、二塩化カルシウム二水和物（1．32gl−1）、モリブデン酸二ナトリウム二水和物（2．35gl−1）および水中37％塩酸（100ml）。
2つの500mlエルレンマイヤーフラスコを121℃のオートクレーブ中で栄養溶液（各100ml）と共に20分間滅菌した。栄養溶液は、トリプトン（16gl−1）、塩化ナトリウム（10gl−1）および酵母エキス（10gl−1）からなり、これを16％水酸化ナトリウム溶液でpH7．2〜7．4に調整した。滅菌工程の後、冷却したフラスコにアンピシリン（100mgl−1）を添加した。両500mlエルレンマイヤーフラスコに、それぞれ大腸菌株JM109P450 3A4のグリセロール凍結培養物（cryoculture）（50μl）を接種した。フラスコを37℃および165rpmで17時間振盪した。
20l発酵槽にトリプトン（12gl−1）、酵母エキス（24gl−1）、肉由来のペプトン（2gl−1）［トリプシン消化物］、リン酸二水素カリウム（2．2gl−1）、リン酸水素二カリウム（9．4gl−1）、および87％グリセロール（4．6gl−1）を装入した。培地を発酵槽中121℃で40分間滅菌した。以下の溶液を37℃で添加した：水（20ml）中アンピシリン（2．0g）、水（20ml）中リボフラビン（20mg）、水（10ml）中チアミン塩酸塩（6．74g）およびOxford微量元素溶液（5ml）。2時間後、発酵槽に2つの500mlエルレンマイヤーフラスコからの前培養物を接種した。発酵槽を、250rpmおよび6．6l分−1の空気、pH6．6で撹拌した。16％水酸化ナトリウム溶液および16％リン酸を用いてpHを調整した。2時間15分後、光学濃度（OD550）0．89が達成されたので、温度を25℃に下げた。10分後、水（40ml）中IPTG（4．76g、イソプロピルβ−D−チオガラクトピラノシド）および水（40ml）中5−アミノレブリン酸（1．676g）を添加した。さらに6時間35分後、pHが低下し、リン酸溶液をグルコース水溶液（50％グルコース、滅菌濾過）で置き換えた。次いで、pHを6．6に維持するために、グルコース水溶液を計量供給した。120時間後、遠心分離によって細胞培養物を収穫した。収穫した細胞（1312．5g）をクライオバッファー（cryobuffer）（クライオバッファー：リン酸水素二カリウム）（12．3gl−1）、リン酸二水素カリウム（4gl−1）、グルコース（100ml l−1、50％水溶液）、0．5M EDTA、グリセロール（40ml l−1、87％、1313ml）に再懸濁し、−80℃で保存した。
100l発酵槽に、水（94l）、リン酸水素二カリウム（1．23kg）、リン酸二水素カリウム（400g）およびSynperonic（登録商標）（2．5ml）を装入した。この場合の緩衝塩の量を、体積100lで0．1Mで計算した。その後、発酵槽を121℃で40分間滅菌した。滅菌後の体積は97lであった。グルコース水溶液（2l、50％グルコース、滅菌濾過）およびEDTA溶液（0．5M溶液100ml；体積100lで最終濃度0．5mM）を添加した。その後、反応物質（5g、13．28mmol）をDMF（200ml）に溶解し、発酵槽に添加した。発酵槽を70rpmおよび33．3l分−1の空気で撹拌した。16％水酸化ナトリウム水溶液の添加によってpHを7．4に維持した。それぞれ15分間隔で、凍結保存された細胞（それぞれ50％グリセロール中1200ml）を3回添加した。撹拌速度によって酸素分圧を50％に維持した。3時間後、培養液を収穫した。
培養液をメチルイソブチルケトン（50l）と18時間撹拌した。相を分離し、水相をメチルイソブチルケトン（15l）と19時間再び撹拌した（32rpm）。有機相を別々に濃縮した。濃縮物を合わせ、濃縮乾固した。固体残渣をメタノール（200ml）中で加熱還流した。混合物を冷却し、冷蔵庫に一晩保存した。残渣を吸引濾別し、少量のメタノールで洗浄し、減圧下室温で乾燥させた。
収量：ベージュ−白色固体4．79g（理論値の89％）。
MS（EIpos）：m／z＝393［M＋H］＋
1H NMR（400 MHz，DMSO−d6）δppm＝0．71（t，3H）2．68（s，3H）3．65（s，3H）3．91−4．01（m，1H）4．01−4．10（m，1H）4．96（m，2H）5．02−5．14（s−br，1H）7．31（d，1H）7．44（dd，1H）7．47−7．52（m，2H）7．70（s，1H）8．15（s，1H）．
【００９３】
［キラル相でのエナンチオマー分離］
式rac−M2の化合物2．00gをキラル相で分離した。
キラル相：Chiralpak AD−H（250×4mm）
溶離液：イソヘキサン：2−プロパノール＝65：35（＋0．2％トリフルオロ酢酸）
式M2a（S）の化合物の収量：（S）−4−（4−シアノ−2−メトキシフェニル）−5−エトキシ−8−（ヒドロキシメチル）−2−メチル−1，6−ナフチリジン−3−カルボキサミド0．87g
HPLC−方法：室温約4．33分。
MS（EIpos）：m／z＝393［M＋H］＋
1H NMR（400 MHz，DMSO−d6）δppm＝0．71（t，3H）2．68（s，3H）3．65（s，3H）3．91−4．01（m，1H）4．01−4．10（m，1H）4．96（m，2H）5．02−5．14（s−br，1H）7．31（d，1H）7．44（dd，1H）7．47−7．52（m，2H）7．70（s，1H）8．15（s，1H）．
式M2b（R）の化合物の収量：（R）−4−（4−シアノ−2−メトキシフェニル）−5−エトキシ−8−（ヒドロキシメチル）−2−メチル−1，6−ナフチリジン−3−カルボキサミド0．85g
HPLC−方法：室温約6．55分。
MS（EIpos）：m／z＝393［M＋H］＋
1H NMR（400 MHz，DMSO−d6）δppm＝0．71（t，3H）2．68（s，3H）3．65（s，3H）3．91−4．01（m，1H）4．01−4．10（m，1H）4．96（m，2H）5．02−5．14（s−br，1H）7．31（d，1H）7．44（dd，1H）7．47−7．52（m，2H）7．70（s，1H）8．15（s，1H）．
【００９４】
［実施例3］
［式rac M3の化合物の調製］
［rac 3−カルバモイル−4−（4−シアノ−2−メトキシフェニル）−5−エトキシ−2−メチル−1，6−ナフチリジン−8−カルボン酸］
式M2の化合物2．50g（6．371mmol）をアセトン75mlに懸濁し、混合物を0℃に冷却した。ジョーンズ試薬5mlを添加した（濃硫酸2．3ml中三酸化クロム（VI）2．30gから調製し、水5mlに溶解した）。反応をHPLCによって監視した（下記参照）。出発材料が1％未満になったらすぐに、イソプロパノール25mlを添加し、混合物を一晩撹拌した。ジクロロメタン500mlおよびメタノール100mlを添加し、緑色がかった沈殿（クロム塩）を濾別した。濾液を減圧下で濃縮乾固した。
収量：黄色がかった固体2．20g（理論値の84．94％）。
HPLC−方法：室温約5．1分。
HPLC条件／方法
方法A
YMC Hydrosphere C18
150＊4．6mm、3．0μm
25℃、1ml／分、270nm、4nm
0’：70％TFA 0．1％＊；30％アセトニトリル
17’：20％TFA 0．1％＊；80％アセトニトリル
18’：70％TFA 0．1％＊；30％アセトニトリル
＊：水中TFA
MS（EIpos）：m／z＝407［M＋H］＋
1H−NMR（500 MHz，DMSO−d6）：δ＝0．75（t，3H），2．80（s，3H），3．67（s，3H），4．17（m（broad），2H），7．36（d，1H），7．50（d，1H），7，60（s，1H），7．71（s，1H），7．85（s，1H），8．95（s，1H），15．40（s（broad），1H）
【００９５】
［キラル相でのエナンチオマー分離］
式rac−M3の化合物2．00gをキラル相で分離した
キラル相：Chiralpak AD−H（250×4mm）
溶離液：イソヘキサン：エタノール＝80：20（＋0．2％トリフルオロ酢酸、＋1％水）
収量M3a：（S）−3−カルバモイル−4−（4−シアノ−2−メトキシフェニル）−5−エトキシ−2−メチル−1，6−ナフチリジン−8−カルボン酸0．85g
HPLC−方法：室温約6．97分。
MS（EIpos）：m／z＝407［M＋H］＋
1H−NMR（500 MHz，DMSO−d6）：δ＝0．75（t，3H），2．80（s，3H），3．67（s，3H），4．17（m（broad），2H），7．36（d，1H），7．50（d，1H），7，60（s，1H），7．71（s，1H），7．85（s，1H），8．95（s，1H），15．40（s（broad），1H）
式M3b（R）の化合物の収量：（R）−3−カルバモイル−4−（4−シアノ−2−メトキシフェニル）−5−エトキシ−2−メチル−1，6−ナフチリジン−8−カルボン酸0．83g
HPLC−方法：室温約8．63分。
MS（EIpos）：m／z＝407［M＋H］＋
1H−NMR（500 MHz，DMSO−d6）：δ＝0．75（t，3H），2．80（s，3H），3．67（s，3H），4．17（m（broad），2H），7．36（d，1H），7．50（d，1H），7，60（s，1H），7．71（s，1H），7．85（s，1H），8．95（s，1H），15．40（s（broad），1H）
【００９６】
［実施例4］
［式M1b（R）の化合物：（R）−4−（4−シアノ−2−メトキシフェニル）−5−エトキシ−2，8−ジメチル−1，6−ナフチリジン−3−カルボキサミドの単結晶X線構造解析］
解析方法：単結晶X線構造解析
解析した結晶：無色ブロック、0．40×0．20×0．20mm3
実験：
結晶構造決定を、CCDエリア検出器（Rubyモデル）、CuKα放射線を封入したX線管、モノクロメーターとしてのオスミウムリフレクターおよび低温測定（T＝100K）用のcryojet（登録商標）冷却装置を備えた回折計（Oxford Diffraction、Xcaliburシリーズ）で行った。
360°データ収集、ωおよびφスキャン。使用したプログラム：Crysalis（Oxford Diffraction 2007）によるデータ記録および削減。結晶構造解明を、SHELXTLバージョン6．10（Sheldrick、University of Gottingen（ドイツ）、2000）で実施される直接法によって実施し、XPプログラムによって可視化した。その後、欠落している原子を、差分フーリエ合成を用いて局在化し、原子リストに追加した。F2に対する最小二乗平均法による精密化を、全ての測定強度で行い、SHELXTLバージョン6．10（Sheldrick、Gottingen大学（ドイツ）、2000）のプログラムで行った。異方性偏向パラメータを含む、全ての非水素原子を精密化した。
式M1b（R）の化合物：（R）−4−（4−シアノ−2−メトキシフェニル）−5−エトキシ−2，8−ジメチル−1，6−ナフチリジン−3−カルボキサミドの結晶データおよび構造精密化
識別コード：M1b
実験式：C21H20N4O3
分子質量：376．41
温度：100K
波長：1．54178Å
結晶系：斜方晶系
空間群：P2（1）2（1）2（1）
格子定数：a＝9．70950（10）Å
b＝10．67390（10）Å
c＝18．9480（2）Å
体積＝1963．74（3）Å3
Z4
比重（計算値）：1．273Mg／m3
吸収係数：0．714mm−1
F（000）792
結晶寸法：0．40×0．20×0．20mm3
データ記録のためのθ範囲：4．67〜65．66°。
指数範囲：−11≦h≦9、−12≦k≦12、−19≦l≦22
記録した反射：15493
独立反射：3367［R（int）＝0．0230］
θでの完全性＝65．66° 99．5％
吸収補正：crysalis
精密化方法：F2に対する最小平均二乗の完全行列法
データ／制限／パラメータ：3367／0／257
F2への適合度：1．048
最終R値：［I＞2σ（I）］R1＝0．0242、wR2＝0．0636
R値（全てのデータ）：R1＝0．0249、wR2＝0．0641
絶対構造パラメータ：−0．18（13）
最大および最小差分密度：0．142および−0．139e．Å−3
【００９７】
X線構造解析：
X線構造解析は、1，6−ナフチリジン−3−カルボキサミド環系が紙面にある場合、4−シアノ−2−メトキシフェニル置換基がそれに対して直角であり、その場合メトキシ基は紙面の後ろにあることを示した。
【００９８】
【表４】
2018523698.tif 000021
【００９９】
したがって、式M1b（R）の化合物は絶対配置R（Ra）を有する。
【０１００】
絶対配置の命名は、軸不斉を有する化合物についてのカーン・インゴルド・プレローグ則に従う。
【化１７】
2018523698.tif 000022
【０１０１】
［実施例5］
［CDスペクトルの相関によるMb（R）系列の絶対配置の決定］
図3〜図5は、式M1b（R）、M2b（R）およびM3b（R）の化合物のCDスペクトルを示す。
結論：コットン効果と同一のパターンシーケンスのため、Mb（R）系列の代謝産物は同じ絶対配置を有する。逆のことがMa（S）系列に等しく当てはまる。
【０１０２】
［B−1．他のステロイドホルモン受容体と比較した阻害性MR活性およびMR選択性を決定するための細胞インビトロアッセイ］
ヒトミネラルコルチコイド受容体（MR）のアンタゴニストを同定し、本明細書に記載される化合物の有効性を組換え細胞株の助けにより定量化する。細胞は、元来、ハムスター卵巣上皮細胞（チャイニーズハムスター卵巣、CHO K1、ATCC：アメリカ培養細胞系統保存機関、VA20108、米国）に由来する。
ヒトステロイドホルモン受容体のリガンド結合ドメインが酵母転写因子GAL4のDNA結合ドメインに融合している確立されたキメラ系を、このCHO K1細胞株で使用する。このようにして産生されたGAL4−ステロイドホルモン受容体キメラを、受容体構築物とCHO細胞に同時導入し、安定に発現させる。
【０１０３】
クローニング：
GAL4ステロイドホルモン受容体キメラを生成するために、ベクターpFC2dbd（Stratagene製）由来のGAL4 DNA結合ドメイン（アミノ酸1〜147）を、ミネラロコルチコイド受容体（MR、アミノ酸734〜985）、グルココルチコイド受容体（GR、アミノ酸443〜777）、プロゲステロン受容体（PR、アミノ酸680〜933）およびアンドロゲン受容体（AR、アミノ酸667〜919）のPCR増幅リガンド結合ドメインと共にベクターpIRES2（Clontech製）にクローニングする。チミジンキナーゼプロモーターの上流にGAL4結合部位の5つのコピーを含むレポーター構築物は、それぞれの特異的アゴニストであるアルドステロン（MR）、デキサメタゾン（GR）、プロゲステロン（PR）およびジヒドロテストステロン（AR）によるGAL4ステロイドホルモン受容体キメラの活性化および結合後にホタルルシフェラーゼ（フォチヌス・ピラリス（Photinus pyralis））の発現をもたらす。
【０１０４】
アッセイ手順：
アッセイの前日、96ウェル（または384−または1536ウェル）マイクロタイタープレート中の培地（Optimem、2．5％FCS、2mMグルタミン、10mM HEPES）にMR細胞を播種し、細胞インキュベーター（96％空気湿度、5％v／v CO2、37℃）中に保持する。アッセイ当日、試験する物質を上記の培地に取り入れ、細胞に添加する。試験物質添加の約10〜30分後に、ステロイドホルモン受容体のそれぞれの特異的アゴニストを添加する。さらに5〜6時間のインキュベート時間の後、ビデオカメラを用いてルシフェラーゼ活性を測定する。測定された相対光単位は、物質濃度の関数としてシグモイド刺激曲線を与える。IC50値（mol）を、コンピュータプログラムGraphPad PRISM（バージョン3．02）の助けを借りて計算する。
式（I）の化合物：IC50：2．77e−008
M1a（S）：IC50：9．33e−006
M1b（R）：IC50：＞1．00e−005
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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