(57)【要約】  安定化ＢＣＬ９ペプチドを用いて癌を処置するための方法が包含され、この安定化ペプチドは、α，α−二置換アミノ酸を使用して生成された炭化水素架橋剤を含有するＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインの一部分を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
７〜１４アミノ酸長を有するポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、ヒトＢ細胞ＣＬＬ／リンパ腫９（ＢＣＬ９）のＨＤ２ドメインに由来し、
ａ）前記ポリペプチドが、１つ以上の炭化水素架橋剤を形成する反応を受けることができ、少なくとも１つのα，α−二置換アミノ酸を場合により含み、かつ／または、
ｂ）前記ポリペプチドが、１つ以上の炭化水素架橋剤を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、１つ以上の炭化水素架橋剤を含み、前記ポリペプチドが、表１から選択される任意の配列またはその変異体を含み、
ａ）Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４が各々、アラニンであり、
ｂ）第１の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在し、かつ／または、
ｃ）第２の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、１つ以上の炭化水素架橋剤を形成する反応を受けることができ、前記ポリペプチドが、表１から選択される任意の配列またはその変異体を含み、
ａ）Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４が各々、α，α−二置換アミノ酸であるか、
ｂ）Ｘａａ１及びＸａａ２が各々、α，α−二置換アミノ酸であり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在するか、または、
ｃ）Ｘａａ３及びＸａａ４が各々、α，α−二置換アミノ酸であり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、１つ以上の炭化水素架橋剤を含み、前記ポリペプチドが、ＬＱＴＬＲＸａａ１ＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号３）、Ｘａａ１ＬＱＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＱＲＸａａ４Ｌ（配列番号４）、またはそれらの変異体を含み、
ａ）Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４が各々、アラニンであり、
ｂ）第１の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在し、かつ／または、
ｃ）第２の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、１つ以上の炭化水素架橋剤を形成する反応を受けることができ、前記ポリペプチドが、ＬＱＴＬＲＸａａ１ＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号３）、Ｘａａ１ＬＱＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＱＲＸａａ４Ｌ（配列番号４）、またはそれらの変異体を含み、
ａ）Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４が各々、α，α−二置換アミノ酸であるか、
ｂ）Ｘａａ１及びＸａａ２が各々、α，α−二置換アミノ酸であり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在するか、または、
ｃ）Ｘａａ３及びＸａａ４が各々、α，α−二置換アミノ酸であり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、
ａ）β−カテニンへのＢＣＬ９の結合を阻害すること、
ｂ）古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を阻害すること、
ｃ）制御性Ｔ細胞の生存期間を減少させること、
ｄ）腫瘍内のＶＥＧＦの発現を減少させること、
ｅ）腫瘍へのＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を増加させること、
ｆ）腫瘍内のＴヘルパー１７（Ｔｈ１７）細胞を増加させること、
ｇ）腫瘍内の樹状細胞を減少させること、
ｈ）対象に投与されたときに少なくとも２時間超の半減期（Ｔ１／２）を有すること、
ｉ）免疫反応に好ましい腫瘍微小環境を誘導すること、ならびに、
ｊ）腫瘍増殖、癌幹細胞増殖、及び／または腫瘍転移を阻害すること
から選択される、非ステープルド野生型ヒトＢＣＬ９  ＨＤ２ドメインと比較して改善された１つ以上の生物学的機能を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記α，α−二置換アミノ酸が、α−メチル，α−アルケニルアミノ酸である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記α−メチル，α−アルケニルアミノ酸が、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニン、（Ｒ）−２−（４´−ペンテニル）アラニン、（Ｓ）−２−（７´−オクテニル）アラニン、及び（Ｒ）−２−（７´−オクテニル）アラニンから選択される、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記炭化水素架橋剤が、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−及び−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記炭化水素架橋剤が、少なくとも一方の末端にＳ構成を有する、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記炭化水素架橋剤が、少なくとも一方の末端にＲ構成を有する、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記炭化水素架橋剤が、一方の末端にＳ構成を有し、他方の末端にＲ構成を有する、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
ＬＱＴＬＲＸａａ１ＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号３）、Ｘａａ１ＬＱＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＱＲＸａａ４Ｌ（配列番号４）、もしくはそれらの変異体を含むか、またはそれらからなり、かつ場合により１０〜１４アミノ長を有するポリペプチドであって、
ａ）前記ポリペプチドが、１つ以上の炭化水素架橋剤を形成する反応を受けることができ、かつ／または、
ｂ）前記ポリペプチドが、１つ以上の炭化水素架橋剤を含み、
前記ポリペプチドまたは変異体が、
ａ）β−カテニンへのＢＣＬ９の結合を阻害すること、
ｂ）古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を阻害すること、
ｃ）制御性Ｔ細胞の生存期間を減少させること、
ｄ）腫瘍内のＶＥＧＦの発現を減少させること、
ｅ）腫瘍へのＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を増加させること、
ｆ）腫瘍へのＴヘルパー１７（Ｔｈ１７）細胞を増加させること、
ｇ）腫瘍内の樹状細胞を減少させること、
ｈ）対象に投与されたときに少なくとも２時間超の半減期（Ｔ１／２）を有すること、
ｉ）免疫反応に好ましい腫瘍微小環境を誘導すること、ならびに、
ｊ）腫瘍増殖、癌幹細胞増殖、及び／または腫瘍転移を阻害すること
から選択される、非ステープルド野生型ヒトＢＣＬ９  ＨＤ２ドメインと比較して改善された１つ以上の生物学的機能を有する、ポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、１１または１２アミノ酸長を有する、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、１つ以上の炭化水素リンカーを含み、
ａ）Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４が各々、アラニンであり、
ｂ）第１の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在し、かつ／または、
ｃ）第２の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する、請求項１３または１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、１つ以上の炭化水素架橋剤を形成する反応を受けることができ、
ａ）Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４が各々、α，α−二置換アミノ酸であるか、
ｂ）Ｘａａ１及びＸａａ２が各々、α，α−二置換ｄアミノ酸であり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在するか、または、
ｃ）Ｘａａ３及びＸａａ４が各々、α，α−二置換ｄアミノ酸であり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する、請求項１３または１４に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記α，α−二置換アミノ酸が、α−メチル，α−アルケニルアミノ酸である、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記α，α−二置換アミノ酸が、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニン、（Ｒ）−２−（４´−ペンテニル）アラニン、（Ｓ）−２−（７´−オクテニル）アラニン、及び（Ｒ）−２−（７´−オクテニル）アラニンから選択される、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記炭化水素架橋剤が、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−及び−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−から選択される、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記炭化水素架橋剤が、少なくとも一方の末端にＳ構成を有する、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記炭化水素架橋剤が、少なくとも一方の末端にＲ構成を有する、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記炭化水素架橋剤が、一方の末端にＳ構成を有し、他方の末端にＲ構成を有する、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
ａ）前記ポリペプチドが、ＬＱＴＬＲＸａａ１ＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号３）のアミノ酸配列からなり、
ｂ）Ｘａａ１及びＸａａ２が各々、アラニンであり、
ｃ）炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在し、
ｄ）前記炭化水素架橋剤が、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、かつ／または、
ｅ）前記炭化水素架橋剤が、両方の末端にＳ構成を有する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
ａ）前記ポリペプチドが、Ｘａａ１ＬＱＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＱＲＸａａ４Ｌ（配列番号４）のアミノ酸配列からなり、
ｂ）Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４が各々、アラニンであり、
ｃ）第１の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在し、
ｄ）第２の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在し、
ｅ）前記第１の炭化水素架橋剤が、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、
ｆ）前記第２の炭化水素架橋剤が、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、
ｇ）前記第１の炭化水素架橋剤が、一方の末端にＳ構成を有し、他方の末端にＲ構成を有し、かつ／または、
ｈ）前記第２の炭化水素架橋剤が、両方の末端にＳ構成を有する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端がさらに修飾されている、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
Ｎ末端が、アセチル基で修飾されている、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
Ｃ末端が、２つのβ−アラニン単位、２−ナフチルアラニン、または２つのβ−アラニン単位に連結した２−ナフチルアラニンで修飾されており、Ｃ末端修飾のカルボキシル基が、ＮＨ２でさらに修飾されている、請求項２５または２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記ポリペプチドのＮ末端が、アセチル基で修飾されており、前記ポリペプチドのＣ末端が、２−ナフチルアラニンで修飾されており、２−ナフチルアラニンのカルボキシル基が、ＮＨ２でさらに修飾されている、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記ポリペプチドのＮ末端が、アセチル基で修飾されており、前記ポリペプチドのＣ末端が、２つのβ−アラニン単位に連結した２−ナフチルアラニンで修飾されており、第２のβ−アラニン単位のカルボキシル基が、ＮＨ２でさらに修飾されている、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記ポリペプチドが、塩形態または結晶として存在する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記塩形態がトリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、または塩酸塩である、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載のポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項３４】
少なくとも１つの追加の薬剤をさらに含む、請求項３３に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの追加の薬剤が、チェックポイント阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、化学療法剤、及びＶＥＧＦＲ阻害剤からなる群から選択される、請求項３４に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
前記チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、または抗ＣＴＬＡ４抗体である、請求項３５に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
前記チェックポイント阻害剤が、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ１３７からなる群から選択される刺激性チェックポイント分子を標的とする、請求項３５に記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
前記チェックポイント阻害剤が、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂリンパ球及びＴリンパ球のアテニュエーター（ＢＴＬＡ）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）、ＶＩＳＴＡ（Ｃ１０ｏｒｆ５４）、ならびにＴ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子からなる群から選択される阻害性チェックポイント分子を標的とする、請求項３５に記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、パニツムマブ、バンデタニブ、またはセツキシマブである、請求項３５に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
前記ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ阻害剤が、パゾパニブ、ベバシズマブ、ソラフェニブ、スニチニブ、アキシチニブ、ポナチニブ、レゴラフェニブ、バンデタニブ、カボザンチニブ、ラムシルマブ、レンバチニブ、またはｚｉｖ−アフリベルセプトである、請求項３５に記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
前記化学療法剤が、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ドキソルビシン、ムスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン、プレドニゾロン、ダカルバジン、ブレオマイシン、エトポシド、シスプラチン、エピルビシン、カペシタビン、フォリン酸、アクチノマイシン、全トランス型レチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、クロランブシル、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルカプトプリン、ミトキサントロン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、またはオキサリプラチンである、請求項３５に記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項３３〜４１のいずれか１項に記載の薬学的組成物を投与することを含む、対象におけるβ−カテニンへのＢＣＬ９の結合を阻害する方法。
【請求項４３】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項３３〜４１のいずれか１項に記載の薬学的組成物を投与することを含む、対象における古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を阻害する方法。
【請求項４４】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項３３〜４１のいずれか１項に記載の薬学的組成物を投与することを含む、対象の癌を処置する方法。
【請求項４５】
前記ポリペプチドまたは薬学的組成物が、２週間の投与後に、前記対象の腫瘍体積を、ビヒクルで処置された対象のものと比較して５０％超低減させることができる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記癌が、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）、眼癌、直腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、口腔癌、良性腫瘍及び悪性腫瘍、胃の癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、子宮体、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、腎癌、脳／ＣＮＳ癌、咽喉癌、多発性骨髄腫、皮膚黒色腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、基底細胞癌及び扁平上皮癌、小細胞肺癌、絨毛癌、横紋筋肉腫、血管肉腫、血管内皮腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、口／咽頭癌、食道癌、喉頭癌、リンパ腫、神経線維腫症、結節性硬化症、血管腫、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、またはリンパ脈管新生である、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記癌が結腸直腸癌である、請求項４４〜４６のいずれか１項に方法。
【請求項４８】
前記癌が胃癌である、請求項４４〜４６のいずれか１項に方法。
【請求項４９】
前記癌が卵巣癌である、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記癌が肝細胞癌である、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記癌が乳癌である、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記癌が前立腺癌である、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記癌が皮膚黒色腫である、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記癌が肺癌である、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
少なくとも１つの追加の薬剤を投与することをさらに含む、請求項４２〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記少なくとも１つの追加の薬剤が、チェックポイント阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、化学療法剤、及びＶＥＧＦＲ阻害剤からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、または抗ＣＴＬＡ４抗体である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記チェックポイント阻害剤が、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ１３７からなる群から選択される刺激性チェックポイント分子を標的とする、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記チェックポイント阻害剤が、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂリンパ球及びＴリンパ球のアテニュエーター（ＢＴＬＡ）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）、ＶＩＳＴＡ（Ｃ１０ｏｒｆ５４）、ならびにＴ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子からなる群から選択される阻害性チェックポイント分子を標的とする、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、パニツムマブ、バンデタニブ、またはセツキシマブである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＶＥＧＦ阻害剤またはＶＥＧＦＲ阻害剤が、パゾパニブ、ベバシズマブ、ソラフェニブ、スニチニブ、アキシチニブ、ポナチニブ、レゴラフェニブ、バンデタニブ、カボザンチニブ、ラムシルマブ、レンバチニブ、またはｚｉｖ−アフリベルセプトである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
前記化学療法剤が、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ドキソルビシン、ムスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン、プレドニゾロン、ダカルバジン、ブレオマイシン、エトポシド、シスプラチン、エピルビシン、カペシタビン、フォリン酸、アクチノマイシン、全トランス型レチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、クロランブシル、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルカプトプリン、ミトキサントロン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、またはオキサリプラチンである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６３】
前記対象を放射線療法及び／または化学療法で処置することをさらに含む、請求項４２〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
処置有効性を監視するため及び／または処置のための対象を選択するために、少なくとも１つのバイオマーカーを測定することをさらに含む、請求項４２〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記バイオマーカーが、ＢＣＬ９、ＣＤ４４、Ａｘｉｎ２、ｃＭｙｃ、ＬＧＲ５、ＶＥＧＦＡ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及び／または活性β−カテニンのうちの１つ以上である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
ＣＤ４４、Ａｘｉｎ２、ｃＭｙｃ、ＬＧＲ５、ＶＥＧＦＡ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及び／もしくは活性β−カテニンの遺伝子発現レベル及び／もしくはタンパク質レベルの低下が処置有効性を示し、かつ／または、ＣＤ４４、Ａｘｉｎ２、ｃＭｙｃ、ＬＧＲ５、ＶＥＧＦＡ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及び／もしくは活性β−カテニンの遺伝子発現レベル及び／もしくはタンパク質レベルが上昇している場合に対象が処置のために選択される、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
対象の癌を処置するための医薬の製造における、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは薬学的組成物の使用。
【請求項６８】
前記癌が、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）、眼癌、直腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、口腔癌、良性腫瘍及び悪性腫瘍、胃の癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、子宮体、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、腎癌、脳／ＣＮＳ癌、咽喉癌、多発性骨髄腫、皮膚黒色腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、基底細胞癌及び扁平上皮癌、小細胞肺癌、絨毛癌、横紋筋肉腫、血管肉腫、血管内皮腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、口／咽頭癌、食道癌、喉頭癌、リンパ腫、神経線維腫症、結節性硬化症、血管腫、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、またはリンパ脈管新生である、請求項６７に記載の使用。
【請求項６９】
前記対象が、少なくとも１つのバイオマーカーを測定することによって監視及び／または選択され、場合により前記バイオマーカーが、ＢＣＬ９、ＣＤ４４、Ａｘｉｎ２、ｃＭｙｃ、ＬＧＲ５、ＶＥＧＦＡ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及び／またはβ−カテニンのうちの１つ以上である、請求項６７または６８に記載の使用。
【請求項７０】
対象の癌を処置するのに使用するための請求項１〜４１のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは薬学的組成物。
【請求項７１】
前記癌が、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）、眼癌、直腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、口腔癌、良性腫瘍及び悪性腫瘍、胃の癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、子宮体、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、腎癌、脳／ＣＮＳ癌、咽喉癌、多発性骨髄腫、皮膚黒色腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、基底細胞癌及び扁平上皮癌、小細胞肺癌、絨毛癌、横紋筋肉腫、血管肉腫、血管内皮腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、口／咽頭癌、食道癌、喉頭癌、リンパ腫、神経線維腫症、結節性硬化症、血管腫、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、またはリンパ脈管新生である、請求項７０に記載のポリペプチドまたは薬学的組成物。
【請求項７２】
前記対象が、少なくとも１つのバイオマーカーを測定することによって監視及び／または選択され、場合により前記バイオマーカーが、ＢＣＬ９、ＣＤ４４、Ａｘｉｎ２、ｃＭｙｃ、ＬＧＲ５、ＶＥＧＦＡ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及び／またはβ−カテニンのうちの１つ以上である、請求項７０または７１に記載のポリペプチドまたは薬学的組成物。
【請求項７３】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載のポリペプチドを製造する方法であって、１つ以上の炭化水素架橋剤を形成する反応を受けることのできるポリペプチドを生成するために固相合成を使用することを含み、前記ポリペプチドが、表１から選択される任意の配列またはその変異体を含み、
（ａ）Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４が各々、α，α−二置換アミノ酸であるか、
（ｂ）Ｘａａ１及びＸａａ２が各々、α，α−二置換アミノ酸であり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在するか、または、
（ｃ）Ｘａａ３及びＸａａ４が各々、α，α−二置換アミノ酸であり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する、方法。
【請求項７４】
前記ポリペプチドが、ＬＱＴＬＲＸａａ１ＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号３）、Ｘａａ１ＬＱＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＱＲＸａａ４Ｌ（配列番号４）、またはそれらの変異体を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記α，α−二置換アミノ酸が、α−メチル，α−アルケニルアミノ酸である、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７６】
金属媒介性閉環オレフィンメタセシスによって前記１つ以上の炭化水素架橋剤を形成することをさらに含む、請求項７３〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって前記ポリペプチドを精製することをさらに含む、請求項７３〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記精製されたポリペプチドが、金属を実質的に含まない、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載のポリペプチドを製造するためのキット。
【請求項８０】
金属媒介性閉環オレフィンメタセシスを行うための金属触媒を含む、請求項７９に記載のキット。
【請求項８１】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項８２】
請求項８１に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項８３】
請求項８２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８４】
ポリペプチドを産生する方法であって、前記ポリペプチドを産生するのに十分な条件下の培養培地で請求項８３に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項８５】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは薬学的組成物を含む、対象の癌を処置するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本国際出願は、参照により全体が本明細書に組み込まれる２０１５年１０月５日に出願された米国仮出願第６２／２３７，４８９号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本明細書では、ヒトＢ細胞ＣＬＬ／リンパ腫９（ＢＣＬ９）タンパク質のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチド及びその変異体、ならびに疾患または障害の診断、防止、及び／または処置におけるそれらの使用が開示される。また、そのようなポリペプチド及びその変異体を生成する方法も開示される。
【背景技術】
【０００３】
簡単な説明
β−カテニンは、細胞恒常性、ならびに胚形成、上皮細胞増殖、及び臓器再生などのプロセスに非常に重要な多機能性タンパク質である。しかしながら、異常なβ−カテニンのシグナル伝達は、腫瘍の増殖及び発達を可能にし得る転写活性化の変化をもたらし得る。β−カテニンは、通常はリン酸化され、Ａｘｉｎ複合体による分解の標的となるが、Ｗｎｔシグナル伝達経路の刺激がある場合、リン酸化されていないβ−カテニンが蓄積し得る。Ｗｎｔシグナル伝達経路が活性化された条件下では、β−カテニンはリンパ系エンハンサー因子／Ｔ細胞因子（ＬＥＦ／ＴＣＦ）に結合し、核に移行して、腫瘍発生に関与するｃ−ｍｙｃ及びＣＤ４４などのＷｎｔ標的遺伝子の転写を刺激する（Ｃｌｅｖｅｒｓ  ａｎｄ  Ｎｕｓｓｅ，Ｃｅｌｌ  １４９：１１９２−１２０５（２０１２）を参照されたい）。
【０００４】
Ｗｎｔ／β−カテニン経路の異常な活性化は、様々なヒト癌において示されている（Ｔｈａｋｕｒ  ａｎｄ  Ｍｉｓｈｒａ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １７（４）：４４９−４５６（２０１３）を参照されたい）。過活動性のβ−カテニンシグナル伝達は、癌細胞の生存に影響を及ぼすだけでなく、腫瘍内の制御されない細胞増殖をもたらす場合もある。加えて、β−カテニンは、癌細胞の遊走能及び浸潤能を増加させることによって腫瘍転移を支え得る。散発性大腸癌の全症例のうち最大９０％が、Ｗｎｔシグナル伝達の恒常的活性化と関連している。
【０００５】
ＢＣＬ９は、哺乳動物細胞において効率的なβ−カテニン媒介性転写に必要とされることで知られるタンパク質である（ｄｅ  ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ８：１９９（２００８）を参照されたい）。ＢＣＬ９は、そのＨＤ２ドメインを介してβ−カテニンに結合し、ＨＤ２ドメインにおける変異は、β−カテニンとＢＣＬ９の会合を妨害する。
【０００６】
他のＷｎｔシグナル伝達経路に影響を与えることなくβ−カテニンを選択的に標的とする薬剤は、癌患者の処置のための魅力的な標的である。β−カテニン活性を阻害する薬剤を開発するための多数のアプローチが用いられてきた（Ｔｈａｋｕｒ  ａｎｄ  Ｍｉｓｈｒａ  ２０１３を参照されたい）。β−カテニンの阻害を目的とする多くの小分子化合物が動物モデルで有望な有効性を示しているが、β−カテニン活性化の阻害のためのより適合された選択的なアプローチが必要とされている。
【０００７】
β−カテニン活性を選択的に調節するための１つのアプローチは、β−カテニンと相互作用することで知られるタンパク質の一部分を含む安定化ペプチドの使用である。安定化ペプチドは、増加したヘリックス含量、タンパク質分解安定性、及び標的受容体に対する増加した結合親和性を含め、潜在的な治療薬として野生型ペプチドに勝る多数の利点を有する（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ６（６）：７６１−７７１（２０１１）を参照されたい）。安定化ペプチドで研究されているβ−カテニン相互作用物質の１つは、ＨＤ２ドメインを介してβ−カテニンに結合するＢＣＬ９である。しかしながら、ＢＣＬ９のＨＤ２ドメインの一部分を含む安定化ペプチドを生成するために炭化水素リンカー（すなわち「炭化水素ステープリング」）を使用する試みは、合成の費用及び低い収率によって妨げられてきた（Ｋａｗａｍｏｔｏ，ＰｈＤ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｕｎｉｖ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ（２０１０）を参照されたい）。他の研究者らは、ＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインのα−ヘリックスが、閉環メタセシス（ＲＣＭ）を介して生成された炭化水素架橋剤（複数可）によって安定化されている、ＢＣＬ９の安定化ペプチドを開発した（ＵＳ２０１４／０１１３８５７を参照されたい）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これらの安定化ペプチドは当該技術分野においていくらかの成功を収めているものの、免疫応答の調節能力がより高く、ひいては腫瘍の処置におけるインビボでの有効性が改善した安定化ペプチドが、依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書では、ヒトＢ細胞ＣＬＬ／リンパ腫９（ＢＣＬ９）タンパク質のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドが開示される。いくつかの実施形態では、本ポリペプチドは、７〜１４アミノ酸長を有する。様々な実施形態において、本ポリペプチドは、１つ以上の炭化水素架橋剤を介して安定化され、互換的に「安定化ポリペプチド」または「ステープルドポリペプチド」と称される構築物がもたらされる。様々な実施形態において、ＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドは、１つ以上の炭化水素架橋剤を形成する反応を受けることができ、「非ステープルドポリペプチド（ｕｎｓｔａｐｌｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」と称される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の炭化水素を形成する反応を受けることのできるポリペプチドは、表１から選択される任意の配列またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、表１に列記されるＸａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及び／またはＸａａ４は各々、α，α−二置換アミノ酸である。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。いくつかの実施形態では、Ｘａａ１とＸａａ２との間に炭化水素架橋剤が存在し、Ｘａａ３とＸａａ４との間に炭化水素架橋剤が存在する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本ポリペプチドは、表１から選択される任意の配列またはその変異体を含む１つ以上の炭化水素を含む。いくつかの実施形態では、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及び／またはＸａａ４は各々、アラニンもしくはα，α−二置換アラニンであり、第１の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在し、かつ／または、第２の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本ポリペプチドは、１つ以上の炭化水素架橋剤を形成する反応を受けることができ、ＬＱＴＬＲＸａａ１ＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号Ｘ）もしくはその変異体を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、α，α−二置換アミノ酸である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本ポリペプチドは、１つ以上の炭化水素架橋剤を形成する反応を受けることができ、Ｘａａ１ＬＱＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＱＲＸａａ４Ｌ（配列番号Ｘ）もしくはその変異体を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４は各々、α，α−二置換アミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、α，α−二置換アミノ酸であり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する。いくつかの実施形態では、Ｘａａ３及びＸａａ４は各々、α，α−二置換アミノ酸であり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本ポリペプチドは、炭化水素架橋剤を含み、ＬＱＴＬＲＸａａ１ＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号Ｘ）もしくはその変異体を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。
【００１５】
いくつかの他の実施形態では、本ポリペプチドは、炭化水素架橋剤を含み、Ｘａａ１ＬＱＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＱＲＸａａ４Ｌ（配列番号Ｘ）もしくはその変異体を含むか、またはそれからなる。ある特定の実施形態では、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４は各々、アラニンであり、第１の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在し、第２の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、α，α−二置換アミノ酸は、α−メチル，α−アルケニルアミノ酸である。いくつかの実施形態では、α−メチル，α−アルケニルアミノ酸は、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニン、（Ｒ）−２−（４´−ペンテニル）アラニン、（Ｓ）−２−（７´−オクテニル）アラニン、及び（Ｒ）−２−（７´−オクテニル）アラニンから選択される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、炭化水素リンカーは、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−及び−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−から選択される。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、少なくとも一方の末端または両方の末端にＳ構成を有する。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、少なくとも一方の末端または両方の末端にＲ構成を有する。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、一方の末端にＳ構成を有し、他方の末端にＲ構成を有する。
【００１８】
さらなる実施形態において、本ポリペプチドまたは変異体のＮ末端及び／もしくはＣ末端はさらに修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｎ末端は、アセチル基で修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｃ末端は、１つ、２つ、もしくはそれ以上のβ−アラニン単位、２−ナフチルアラニン、及び／または２−ナフチルアラニンで修飾されており、場合により、１つ、２つ、もしくはそれ以上のβ−アラニン単位に連結しており、Ｃ末端修飾のカルボキシル基は、場合によりＮＨ２基でさらに修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｎ末端及び／またはＣ末端の修飾は、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基をさらに含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のステープルドポリペプチドまたは変異体は、非ステープルド野生型ヒトＢＬＣ９  ＨＤ２ドメインまたは野生型ヒトＢＬＣ９  ＨＤ２ドメインの断片と比較して改善された１つ以上の生物学的機能を有する。ステープルドポリペプチドまたは変異体が対象に投与され、かつ／または標的細胞と接触したとき、本ポリペプチドまたは変異体は、β−カテニンへのＢＣＬ９の結合を阻害すること、古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を阻害すること、制御性Ｔ細胞の生存期間を減少させること、腫瘍内のＶＥＧＦの発現を減少させること、腫瘍へのＣＤ４＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を増加させること、腫瘍へのＴヘルパー１７（Ｔｈ１７）細胞の浸潤を増加させること、腫瘍内の樹状細胞を減少させること、少なくとも２時間超の半減期（Ｔ１／２）を有すること、免疫反応に好ましい（ｆａｖｏｒｉｎｇ）腫瘍微小環境を誘導すること、ならびに、腫瘍増殖、癌幹細胞増殖、及び／または腫瘍転移を阻害することから選択される、改善された１つ以上の生物学的機能を呈することができる場合がある。
【００２０】
本明細書では、ヒトＢＬＣ９タンパク質のＨＤ２ドメインに由来するステープルドポリペプチドまたは変異体と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物も開示される。いくつかの実施形態では、本薬学的組成物は、チェックポイント阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、または抗癌薬といった少なくとも１つの追加の薬剤を含む。
【００２１】
本明細書では、例えば対象の癌の阻害、低減、防止、及び／または処置において、特許請求されるステープルドポリペプチドまたは変異体を作製及び使用する方法も開示される。いくつかの実施形態では、特許請求されるポリペプチドまたは変異体を使用する方法は、対象におけるβ−カテニンへのＢＣＬ９の結合を阻害すること、ならびに対象における古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を阻害することを包含する。
【００２２】
本明細書では、処置有効性の監視及び／または特許請求されるステープルドポリペプチドもしくは変異体で処置されるべき対象の選択において使用されるバイオマーカーも開示される。いくつかの実施形態では、特許請求されるポリペプチドまたは変異体を投与される対象は、追加の治療剤、放射線、及び／または化学療法でも処置される。特許請求されるステープルドポリペプチドまたは変異体を作製及び使用するためのキットも開示される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａ及び図１Ｂはそれぞれ配列番号Ｘ及び配列番号Ｘに対応する、ＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインに由来する安定化ペプチドの構造を示す。配列番号Ｘの安定化ポリペプチドは、本出願において「ＷＸ−０２４」と称される。配列番号Ｘの安定化ポリペプチドは、本出願において「ＷＸ−０３５」と称される。これらのペプチドは、ＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインのα−ヘリックスを安定化させるα−メチル，α−アルケニルアミノ酸の間に生成されたアルケニルリンカー（複数可）を有する。
【図２Ａ】図２ＡはヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインの体系的なウォークスルーを行うドメインマッピング方針を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは図２Ａに示されたドメインマッピング方針に基づいて生成された各ドメイン断片を漸増量で使用した細胞生存率アッセイの結果を示す。古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の既知の小分子阻害剤であるＩＣＧ００１を陽性対照として使用した。細胞生存率アッセイは、Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ細胞を用いたＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して行った。
【図２Ｃ】図２Ｃは図２Ａにおける、生成された各ドメイン断片を漸増量で使用したＷｎｔ転写アッセイの結果を示す。ＩＣＧ００１を陽性対照として使用した。Ｗｎｔ転写アッセイは、ＨＣＴ１１６細胞を用いたＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ  Ｗｎｔレポーターアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。
【図３】図３はＷＸ−０２０（配列番号Ｘ）とＳＡＨ−ＢＣＬ９＃１（配列番号Ｘ）とを比較する細胞生存率アッセイの結果を示す。細胞生存率アッセイは、Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ細胞を用いたＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して行った。
【図４Ａ】図４ＡはＷＸ−０２０と、ＷＸ−０２４を含めたＷＸ−０２０に由来する４つの異なる安定化ポリペプチドとを比較する細胞生存率アッセイの結果を示す。細胞生存率アッセイは、ＨＣＴ１１６細胞を用いたＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して行った。ＩＣＧ００１を陽性対照として使用した。
【図４Ｂ】図４Ｂは酢酸塩形態のＷＸ−０２４を細胞ベースのＷｎｔ転写阻害アッセイで試験した結果を示す（ＩＣ５０＝２９２ｎＭ）。
【図４Ｃ】図４Ｃは同じＷｎｔ転写阻害アッセイで同様に試験した塩酸塩の作用を示す（ＩＣ５０＝３１３ｎＭ）。
【図５Ａ−Ｂ】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、及び５ＤはＷＸ−０２１、ＷＸ−０２４、及びＩＣＧ００１を試験したＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ  Ｗｎｔレポーターアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の結果を示す。図５Ａは、β−カテニンへのＢＣＬ９の結合が、ＣｅｌｌＳｅｎｓｏｒ（商標）ＬＥＦ／ＴＣＦ−ｂｌａ  ＨＣＴ−１１６細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるベータ−ラクタマーゼ（ＢＬＡ）受容体遺伝子の発現を推進する、レポーターアッセイの概略図を提供する（略語：β−ｃａｔ、β−カテニン；ＴＦ、転写因子）。ＷＸ−０２４などのＨＤ２ドメイン内のアミノ酸に対応するペプチドは、β−カテニンへのＢＣＬ９の結合を阻害することができる。図５Ｂ、５Ｃ、及び５Ｄは、それぞれＷＸ−０２１、ＷＸ−０２４、及びＩＣＧ００１を使用したレポーターアッセイの結果を示す。このアッセイの結果から計算されたＷＸ−０２１、ＷＸ−０２４、及びＩＣＧ００１のＩＣ５０値は、それぞれ７６４ｎＭ、１９１ｎＭ、及び１０６０ｎＭであった。
【図５Ｃ−Ｅ】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、及び５ＤはＷＸ−０２１、ＷＸ−０２４、及びＩＣＧ００１を試験したＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ  Ｗｎｔレポーターアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の結果を示す。図５Ａは、β−カテニンへのＢＣＬ９の結合が、ＣｅｌｌＳｅｎｓｏｒ（商標）ＬＥＦ／ＴＣＦ−ｂｌａ  ＨＣＴ−１１６細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるベータ−ラクタマーゼ（ＢＬＡ）受容体遺伝子の発現を推進する、レポーターアッセイの概略図を提供する（略語：β−ｃａｔ、β−カテニン；ＴＦ、転写因子）。ＷＸ−０２４などのＨＤ２ドメイン内のアミノ酸に対応するペプチドは、β−カテニンへのＢＣＬ９の結合を阻害することができる。図５Ｂ、５Ｃ、及び５Ｄは、それぞれＷＸ−０２１、ＷＸ−０２４、及びＩＣＧ００１を使用したレポーターアッセイの結果を示す。このアッセイの結果から計算されたＷＸ−０２１、ＷＸ−０２４、及びＩＣＧ００１のＩＣ５０値は、それぞれ７６４ｎＭ、１９１ｎＭ、及び１０６０ｎＭであった。
【図６Ａ−Ｂ】図６Ａ及び図６Ｂはβ−カテニンへのＷＸ−０２４（ビオチンとコンジュゲートしたもの）の結合性を測定する均質時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ）の結果を示す。図６Ａは、ＨＴＲＦアッセイの概略図を提供するものであり、このアッセイが、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を評価することによって、ビオチン化ＢＣＬ９ペプチド（例えばビオチン化ＷＸ−０２４など）のβ−カテニンへの結合性を測定することを示す（略語：ａｂ、抗体；ＳＡ、ストレプトアビジン）。図６Ｂは、β−カテニンへのＷＸ−０２４の結合に関するＨＴＲＦアッセイに基づいたＫＤの定量を示す（ＫＤ＝４．２１ｎＭ）。
【図７】図７はＨＣＴ１１６細胞においてＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＩＣＧ００１（Ｗｎｔ／β−カテニン経路阻害剤）とＷＸ−０２４を比較した細胞生存率データを示す。このアッセイに基づいて計算されたＷＸ−０２４及びＩＣＧ００１のＩＣ５０値は、それぞれ１．９２μＭ及び２．１７μＭであった。
【図８Ａ】図８ＡはＷＸ−０２４、ＩＣＧ００１、及びＬＧＫ−９７４を試験した細胞生存率アッセイの結果を示す（＊Ｐ＜０．０５、ＷＸ−０２４対ＩＣＧ００１、ＬＧＫ−９７４）。この細胞生存率アッセイではＣｏｌｏ３２０ＤＭ細胞を使用した。
【図８Ｂ−Ｃ】図８Ｂは同じ細胞生存率アッセイでＷＸ−０２４及びエルロチニブを試験した結果を示す。図８Ｃは同じ細胞生存率アッセイで５−ＦＵ処置単独と５−ＦＵ及びＷＸ−０２４の組み合わせとを比較した結果を示す（＊Ｐ＜０．０５）。
【図９Ａ−Ｂ】図９Ａ及び図９Ｂは雄ＩＣＲマウス（非近交種）にＷＸ−０２４を１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇで静脈内（ｉ．ｖ．）投与した場合と５ｍｇ／ｋｇで腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した場合の薬物動態（ＰＫ）データを示す。投薬後１５分、１、２、４、６、８、１２、及び２４時間の時点で血液試料を収集し、図９Ａに示されるように、液体クロマトグラフィ−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）によって分析した。図９Ａに示される血漿濃度データから、最大観察濃度（Ｃｍａｘ）、終末相半減期（Ｔ１／２）、全身クリアランス（ＣＬ）、分布容積（Ｖｚ）、投薬時間から最後の観察可能な濃度までの曲線下面積（ＡＵＣ０−ｔ）、投薬時間から無限大まで外挿した曲線下面積（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）、及び生物学的利用率を計算した。これらの薬物動態パラメータが図９Ｂに要約されている。
【図１０Ａ】図１０Ａは雌Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて測定されたＷＸ−０２４のＰＫデータを示す。各データ点はＮ＝２を表す。マウスには、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、もしくは１５ｍｇ／ｋｇの静脈内投与、５ｍｇ／ｋｇの筋肉内投与、１０ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与、または１０ｍｇ／ｋｇの皮下投与を行った。投薬後１５分、１、２、４、６、８、１２、及び２４時間（ならびに筋肉内、皮下、及び腹腔内経路では投薬後３６及び４８時間）の時点で血液試料を収集し、液体クロマトグラフィ−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）によって分析した。
【図１０Ｂ】図１０Ｂ及び図１０Ｃはこの実験から計算された平均薬物動態パラメータの概要である。
【図１０Ｃ】図１０Ｂ及び図１０Ｃはこの実験から計算された平均薬物動態パラメータの概要である。
【図１１】図１１はＣｏｌｏ３２０ＤＭ腫瘍細胞を接種し、ビヒクルまたはＷＸ−０２４で処置した６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの体重データを示す。マウスにＣｏｌｏ３２０ＤＭ腫瘍細胞（５×１０６）を接種し、腫瘍を１４日間発達させ、その後処置を適用した。ビヒクル処置群及び５ｍｇ／ｋｇ処置群には研究全体を通じて静脈内注射によって投薬し、研究中に体重の明らかな変化はなかった。１５ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４の３日間の静脈内投薬の後、この群のマウスは体重減少を呈した。したがって、７日目に、１０ｍｇ／ｋｇ群及び１５ｍｇ／ｋｇ群を処置期間の残りに関して腹腔内投薬に切り替えた。この腹腔内投薬への切り替えの後、研究の残部における１５ｍｇ／ｋｇ群の体重が安定化した。
【図１２Ａ−Ｂ】図１２Ａ及び図１２Ｂは図１１に関して記載した実験中にビヒクルまたはＷＸ−０２４によってもたらされた腫瘍増殖の変化を示す。図１２Ａに示されるように、処置期間の０、３、５、７、９、１１、及び１４日目にキャリパーを使用して腫瘍体積（ｍｍ３で表される）を測定した（＊Ｐ＜０．０５、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ分析によってビヒクル群と比較）。図１２Ｂは、研究の終了時の各処置群の平均腫瘍量を示す（２２日目；＊Ｐ＜０．０５、ビヒクル群と比較）。
【図１３Ａ】図１３Ａは図１１に関して記載した２２日間の処置後のＣｏｌｏ３２０ＤＭ異種移植片モデルの終了時のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの腸管組織像を示す。ビヒクル処置群、１０ｍｇ／ｋｇ処置群、及び１５ｍｇ／ｋｇ  ＷＸ−０２４処置群からの試料が示されている。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは図１３Ａで収集された腸試料のＡｘｉｎ２染色を示す。
【図１４Ａ−Ｂ】図１４Ａは図１１に関して記載した実験から収集された腫瘍試料のＣＤ４４染色の４０倍拡大像を示す。各試料の免疫化学スコアが各画像の右上隅に示されている。図１４Ｂは各処置群の平均免疫化学スコアの概要である。
【図１５Ａ−Ｂ】図１５Ａは図１１に関して記載した実験から収集された腫瘍試料のＶＥＧＦＡ染色を示す。各試料の免疫化学スコアが各画像の右上隅に示されている。図１５Ｂは各処置群の平均免疫化学スコアの概要である。
【図１６Ａ】図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、及び１６ＤはＷＸ−０２４またはドキソルビシンで処置したときのインビトロでのＣＴ２６細胞（ＡＴＣＣ）の増殖を測定したＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の結果を示す。図１６Ａは、１日目（Ｄ１）から５日目（Ｄ５）の未処置の細胞の増殖率を示す。図１６Ｂ及び図１６Ｃは、それぞれ、このアッセイで測定されたＷＸ−０２４処置細胞またはドキソルビシン処置細胞における増殖阻害率を示す。図１６Ｄは、増殖の５０％阻害をもたらす薬剤の濃度（ＩＣ５０）、最小阻害、最大阻害、ならびに、図１６Ｂ及び図１６Ｃに示される各曲線に基づいて計算した中央値である相対ＩＣ５０の概要である。
【図１６Ｂ】図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、及び１６ＤはＷＸ−０２４またはドキソルビシンで処置したときのインビトロでのＣＴ２６細胞（ＡＴＣＣ）の増殖を測定したＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の結果を示す。図１６Ａは、１日目（Ｄ１）から５日目（Ｄ５）の未処置の細胞の増殖率を示す。図１６Ｂ及び図１６Ｃは、それぞれ、このアッセイで測定されたＷＸ−０２４処置細胞またはドキソルビシン処置細胞における増殖阻害率を示す。図１６Ｄは、増殖の５０％阻害をもたらす薬剤の濃度（ＩＣ５０）、最小阻害、最大阻害、ならびに、図１６Ｂ及び図１６Ｃに示される各曲線に基づいて計算した中央値である相対ＩＣ５０の概要である。
【図１６Ｃ】図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、及び１６ＤはＷＸ−０２４またはドキソルビシンで処置したときのインビトロでのＣＴ２６細胞（ＡＴＣＣ）の増殖を測定したＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の結果を示す。図１６Ａは、１日目（Ｄ１）から５日目（Ｄ５）の未処置の細胞の増殖率を示す。図１６Ｂ及び図１６Ｃは、それぞれ、このアッセイで測定されたＷＸ−０２４処置細胞またはドキソルビシン処置細胞における増殖阻害率を示す。図１６Ｄは、増殖の５０％阻害をもたらす薬剤の濃度（ＩＣ５０）、最小阻害、最大阻害、ならびに、図１６Ｂ及び図１６Ｃに示される各曲線に基づいて計算した中央値である相対ＩＣ５０の概要である。
【図１６Ｄ】図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、及び１６ＤはＷＸ−０２４またはドキソルビシンで処置したときのインビトロでのＣＴ２６細胞（ＡＴＣＣ）の増殖を測定したＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の結果を示す。図１６Ａは、１日目（Ｄ１）から５日目（Ｄ５）の未処置の細胞の増殖率を示す。図１６Ｂ及び図１６Ｃは、それぞれ、このアッセイで測定されたＷＸ−０２４処置細胞またはドキソルビシン処置細胞における増殖阻害率を示す。図１６Ｄは、増殖の５０％阻害をもたらす薬剤の濃度（ＩＣ５０）、最小阻害、最大阻害、ならびに、図１６Ｂ及び図１６Ｃに示される各曲線に基づいて計算した中央値である相対ＩＣ５０の概要である。
【図１７Ａ−Ｂ】図１７Ａはビヒクルまたは２０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４のいずれかで処置されたマウスの２つの群の平均腫瘍増殖を示す。各マウスには、それに割り当てられた処置を１４日間にわたり毎日腹腔内注射した。この実験では、ＣＴ２６結腸癌細胞を有するＢａｌｂ／ｃ同系マウスモデルを使用した。各データ点は、１群当たり８体のマウスの平均を表す。図１７ＢはＷＸ−０２４処置の平均腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）率を示す。３日目のＴＧＩは８９．２％であり、１２日目のＴＧＩは７０．０％であった。
【図１８Ａ−Ｂ】図１８Ａ及び図１８Ｂは図１７について記載した実験で監視された個々の動物の腫瘍増殖を示す。図１８Ａは、ビヒクルで処置した各マウスの腫瘍増殖を示し、図１８Ｂは、ＷＸ−０２４で処置した各マウスの腫瘍増殖を示す。
【図１９Ａ−Ｂ】図１９Ａ及び１９Ｂは図１７に示されたマウスから収集された血液試料におけるＣＤ４＋Ｔ細胞数を示す。血液試料は実験の終了時（１４日目）に収集した。図１９Ａは、各血液試料中の全細胞に対する割合として表されたＣＤ４＋Ｔ細胞数を示す。図１９Ｂは、各血液試料中の全細胞当たりの相対的なＴ細胞数を示す。
【図２０Ａ−Ｂ】図２０Ａ及び図２０Ｂは図１７に示されたマウスから収集された血液試料におけるＣＤ８＋Ｔ細胞数を示す。血液試料は実験の終了時（１４日目）に収集した。図２０Ａは、各血液試料中の全細胞に対する割合として表されたＣＤ８＋Ｔ細胞数を示す。図２０Ｂは、各血液試料中の全細胞当たりの相対的なＴ細胞数を示す。
【図２１Ａ−Ｂ】図２１Ａは図１７に記載の実験から収集された腫瘍試料におけるＣＤ４＋Ｔ細胞集団中の制御性Ｔ細胞の割合を示す。図２１Ｂは同じ腫瘍試料におけるＣＤ８＋Ｔ細胞と制御性Ｔ細胞との比を示す。
【図２１Ｃ】図２１Ｃ及び図２１Ｄは、この実験において試験した、それぞれ血液及び腫瘍から得られた試料の代表的なＦＡＣＳ分析を示す。
【図２１Ｄ】図２１Ｃ及び図２１Ｄは、この実験において試験した、それぞれ血液及び腫瘍から得られた試料の代表的なＦＡＣＳ分析を示す。
【図２２Ａ】図１７に記載の実験から収集された腫瘍試料の活性β−カテニン染色を示す。上部４つのパネルは、ビヒクル処置群から収集された４つの試料の染色画像を示し、下部４つのパネルは、ＷＸ−０２４処置群から収集された４つの試料の染色画像を示す。
【図２２Ｂ−Ｃ】図２２Ｂは各処置群の平均免疫組織化学スコアを表す。図２２Ｃは同じ実験から収集された腫瘍試料中のＣＤ４４の代表的な染色を示す。
【図２３Ａ】図２３Ａは図１７に記載の実験から収集された腫瘍試料のＰＤ−Ｌ１染色を示す。上部４つのパネルは、ビヒクル処置群から収集された４つの試料の染色画像を示し、下部４つのパネルは、ＷＸ−０２４処置群から収集された４つの試料の染色画像を示す。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは各処置群の平均免疫組織化学スコアを表す。
【図２４】図２４はＢ１６細胞（１×１０３）を接種したＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてビヒクルまたはＷＸ−０２４によって引き起こされた腫瘍増殖の変化を示す。マウスには、連続１４日間にわたって毎日、ビヒクルまたは２５ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４のいずれかを腹腔内投与した（ｎ＝６／群）。
【図２５Ａ−Ｃ】図２５Ａ、２５Ｂ、及び２５ＣはＷＸ−０２４処置によって引き起こされた腫瘍へのＴ細胞浸潤を示す。５週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６細胞（１×１０３）を接種した。接種したマウスの平均腫瘍体積が１００ｍｍ３に達したとき、マウスを２つの群に分割し、ビヒクルまたは２５ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４のいずれかを連続１２日間にわたって腹腔内投与した。実験の終了時に、腫瘍試料を収集し、ＣＤ４またはＣＤ８のいずれかで染色した。図２５Ａは、全腫瘍細胞に対する割合として表されたＣＤ４＋Ｔ細胞数を示す。図２５Ｂは、全腫瘍細胞に対する割合として表されたＣＤ８＋Ｔ細胞数を示す。図２５Ｃは、全腫瘍細胞に対する割合として表されたＣＤ４＋Ｔ細胞数またはＣＤ８＋Ｔ細胞数を表す。
【図２６Ａ−Ｂ】図２６Ａ及び図２６Ｂは腫瘍内に存在する樹状細胞に対するＷＸ−０２４及びＷＸ−０３９の効果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６細胞を接種した。接種したマウスの平均腫瘍体積が１００ｍｍ３に達したとき、マウスを２つの群に分割し、ビヒクル、２０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４、または６０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０３９を連続１２日間にわたって腹腔内投与した。実験の終了時に、腫瘍試料を収集し、樹状細胞マーカー及びＴヘルパー１７細胞マーカーについて染色した。図２６Ａは、骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）数を示し、図２６Ｂは、可塑性の樹状細胞（ｐＤＣ）数を示す。（＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．０００１、ビヒクル対照群と比較；一元配置ＡＮＯＶＡ）。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは全腫瘍細胞に対する割合として表されたＣＤ１９４＋Ｔ細胞またはＣＤ１９６＋Ｔ細胞を示す。
【図２６Ｄ】図２６Ｄはこの実験において試験した腫瘍試料の代表的なＦＡＣＳ分析を示す。
【図２７Ａ】図２７Ａはビヒクルまたは１５ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４のいずれかで処置された同所性マウスの平均全光束を示す。Ｂａｌｂ／ｃ雌ヌードマウスにＮＣＩ−Ｈ１２９９−Ｌｕｃ細胞（ＰＢＳにおいて５０μＬ中５×１０６個）を注射し、連続１０日間にわたってビヒクルまたはＷＸ−０２４で静脈内処置した。１群当たり３体のマウスを試験した。全光束は、マウスの腫瘍細胞によって生成される発光光子束シグナルを示す。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは同じ実験で監視された各マウスの全光束を示す。
【図２７Ｃ】図２７Ｃはこの実験で監視された各マウスの生物発光画像を示す。
【図２８Ａ】図２８Ａは結腸直腸癌患者から得られた４つの試料中の選択的バイオマーカーの免疫組織化学的染色を示す（スケールバー：１００μｍ）。各試料は、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン（Ｈａｅｍｔｏｘｙｌｉｎ）及びエオシン）、ＩｇＧ、β−カテニン、ＢＣＬ９、ｃ−Ｍｙｃ、及びＣＤ４４で染色した。結腸直腸癌試料番号８をさらに検査するために選択した。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは患者８番から得られた細胞を接種した患者由来異種移植片ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに対するＷＸ−０２４の効果を示す。２週間の接種後、マウスを２つの群（Ｎ＝８／群）に分割し、次の４週間にわたってビヒクルまたは１５ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４で静脈内処置した。ＷＸ−０２４による３１日目の平均腫瘍増殖阻害は７５．６％であった。
【図２９Ａ】図２９Ａは図２８に記載の実験から収集された腫瘍試料のβ−カテニン染色及びＢＣＬ９染色を示す。各画像の免疫組織化学スコアが画像の右上隅に示されている。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは図２８に記載の実験から収集された腫瘍試料のＣＤ４４染色を示す。
【図３０Ａ】図３０Ａ、３０Ｂ、及び３０Ｃは雌ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて評価されたＷＸ−０２４の安全性プロファイルを示す。マウスは、ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、または２０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４で連続１４日間にわたって静脈内処置した（ｎ＝６）。図３０Ａは、実験の終了時（１４日目）にビヒクルまたは１０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４のいずれかで処置したマウスから採取した主要臓器のＨ＆Ｅ染色を示す。図３０Ｂは、実験全体を通じた各処置群の平均体重を示す。図３０Ｃは、ビヒクル処置群及び２０ｍｇ／ｋｇ  ＷＸ−０２４処置群の全血球数プロファイルを示す。
【図３０Ｂ】図３０Ａ、３０Ｂ、及び３０Ｃは雌ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて評価されたＷＸ−０２４の安全性プロファイルを示す。マウスは、ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、または２０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４で連続１４日間にわたって静脈内処置した（ｎ＝６）。図３０Ａは、実験の終了時（１４日目）にビヒクルまたは１０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４のいずれかで処置したマウスから採取した主要臓器のＨ＆Ｅ染色を示す。図３０Ｂは、実験全体を通じた各処置群の平均体重を示す。図３０Ｃは、ビヒクル処置群及び２０ｍｇ／ｋｇ  ＷＸ−０２４処置群の全血球数プロファイルを示す。
【図３０Ｃ】図３０Ａ、３０Ｂ、及び３０Ｃは雌ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて評価されたＷＸ−０２４の安全性プロファイルを示す。マウスは、ビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、または２０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４で連続１４日間にわたって静脈内処置した（ｎ＝６）。図３０Ａは、実験の終了時（１４日目）にビヒクルまたは１０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４のいずれかで処置したマウスから採取した主要臓器のＨ＆Ｅ染色を示す。図３０Ｂは、実験全体を通じた各処置群の平均体重を示す。図３０Ｃは、ビヒクル処置群及び２０ｍｇ／ｋｇ  ＷＸ−０２４処置群の全血球数プロファイルを示す。
【図３１Ａ−Ｂ】図３１Ａ及び図３１Ｂはビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、または２０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４で腹腔内処置した雌ｂａｌｂ／ｃマウスの毒物動態分析を示す。図３１Ａは、１日目の投薬後の全血中の平均ＷＸ−０２４濃度を示す。図３１Ｂは、１４日目の投薬後の全血中の平均ＷＸ−０２４濃度を示す。
【図３２】図３２はＷＸ−０２４及びＷＸ−０３５を試験した細胞生存率アッセイの結果を示す。この実験ではＣｏｌｏ３２０ＤＭ細胞を使用した。
【図３３Ａ−Ｂ】図３３Ａ及び図３３Ｂは雄ＩＣＲマウス（非近交種）に投与したＷＸ−０３５のＰＫデータを示す。マウスには、１ｍｇ／ｋｇもしくは５ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０３５の静脈内処置、または５ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０３５の腹腔内処置のいずれかを行った。投与後１５分、１、２、４、６、８、１２、及び２４時間の時点で各マウスから血液試料を収集した。図３３Ａは、液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって分析された試料中のＷＸ−０３５の濃度を示す。図３３Ｂに示されるように、濃度データから、最大観察濃度（Ｃｍａｘ）、終末相半減期（Ｔ１／２）、全身クリアランス（ＣＬ）、分布容積（Ｖｚ）、投薬時間から最後の観察可能な濃度までの曲線下面積（ＡＵＣ０−ｔ）、投薬時間から無限大まで外挿した曲線下面積（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）、及び生物学的利用率を計算した。
【図３４Ａ−Ｂ】図３４Ａ及び図３４Ｂは雌ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）に投与したＷＸ−０３５のＰＫデータを示す。マウスには、３０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０３５を静脈内または腹腔内のいずれかに投与した。投与後５分、１５分、３０分、１、２、４、６、８、１２、２４、３６、４８、及び７２時間の時点で各マウスから血液試料を収集した。図３４Ａは、液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって分析された試料中のＷＸ−０３５の濃度を示す。図３４Ｂに示されるように、濃度データから、最大濃度到達時間（Ｔｍａｘ）、最大観察濃度（Ｃｍａｘ）、終末相半減期（Ｔ１／２）、投薬時間から最後の観察可能な濃度までの曲線下面積（ＡＵＣｌａｓｔ）、投薬時間から無限大まで外挿した曲線下面積（ＡＵＣＩＮＦ）、及び生物学的利用率（Ｆ）を計算した。
【図３５Ａ】図３５Ａは雄ｂａｌｂ／ｃ同系動物モデルにおいて試験された腫瘍増殖阻害に対するＷＸ−０３５の効果を示す。マウスにはＣＴ２６細胞（１×１０３）を接種した。平均腫瘍体積が１００ｍｍ３に達したとき、マウスを３つの群に分割し、ビヒクル、２０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０３５、または１ｍｇ／ｋｇのトラメチニブで連続７日間にわたって腹腔内処置した（ｎ＝７）。
【図３５Ｂ】図３５Ｂはこの実験におけるＷＸ−０３５及びトラメチニブによる平均腫瘍増殖阻害を比較する。７日目のＷＸ−０３５による平均腫瘍増殖阻害は８８．４４％であった。
【図３６Ａ−Ｂ】図３６Ａ、３６Ｂ、３６Ｃ、及び３６ＤはＴｒｅｇ細胞及び他の種類のＴ細胞集団に対するＷＸ−０３５のインビボでの効果を示す。図３５に示される実験の終了時に、ビヒクル処置群及びＷＸ−０３５処置群から腫瘍試料を収集した。図３６Ａは、全腫瘍細胞に対する割合としての全ＣＤ４５＋Ｔ細胞を示す。図３６Ｂは、全腫瘍細胞に対する割合としての全ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。図３６Ｃは、全ＣＤ２５＋／Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞を示す。図３６Ｄは、両処置群におけるＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ２５＋／Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞との比を示す。
【図３６Ｃ−Ｄ】図３６Ａ、３６Ｂ、３６Ｃ、及び３６ＤはＴｒｅｇ細胞及び他の種類のＴ細胞集団に対するＷＸ−０３５のインビボでの効果を示す。図３５に示される実験の終了時に、ビヒクル処置群及びＷＸ−０３５処置群から腫瘍試料を収集した。図３６Ａは、全腫瘍細胞に対する割合としての全ＣＤ４５＋Ｔ細胞を示す。図３６Ｂは、全腫瘍細胞に対する割合としての全ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。図３６Ｃは、全ＣＤ２５＋／Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞を示す。図３６Ｄは、両処置群におけるＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ２５＋／Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞との比を示す。
【図３６Ｅ】図３６Ｅはこの実験で収集された腸試料のＬＧＲ５染色を示す。
【図３７】ビヒクル、３０ｍｇ／ｋｇ、または４０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０３５で連続７日間にわたって静脈内処置した６週齢の雌ｂａｌｂ／ｃヌードマウスから採取した主要臓器のＨ＆Ｅ染色を示す（スケールバー：１００μｍ）。
【図３８Ａ−Ｃ】図３８Ａ及び図３８ＢはＣＴ２６．ＷＴ細胞を使用した細胞生存率アッセイにおけるＷＸ−０３５及びＷＸ−０３７の効果を示す。図３８Ｃは各ポリペプチドのインビトロプロファイルの概要である。Ａｂ  ＩＣ５０は、細胞生存率が半分に低減するときの阻害剤の絶対濃度を示す。
【図３９Ａ−Ｂ】図３９Ａ及び図３９Ｂは雌ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（Ｎ＝２）に投与したＷＸ−０２９のＰＫデータを示す。各マウスに１ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２９を静脈内投与した。図３９Ａは、投与の１５分、１、２、または４時間後に測定した血漿濃度を示す。図３９Ｂは、図３９Ａに示される血漿濃度の結果を使用して計算された薬物動態プロファイルの概要である。
【図４０Ａ−Ｂ】図４０Ａ及び図４０Ｂは雌ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（Ｎ＝２）に投与したＷＸ−０３６のＰＫデータを示す。各マウスに１ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０３６を静脈内投与した。図４０Ａは、投与の１５分、１、２、または４時間後に測定した血漿濃度を示す。図４０Ｂは、図４０Ａに示される血漿濃度の結果を使用して計算された薬物動態プロファイルの概要である。
【図４１Ａ】図４１Ａ及び図４１Ｂは雌ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（Ｎ＝２）に投与したＷＸ−０３９のＰＫデータを示す。ＷＸ−０３９は、静脈内に５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内に５ｍｇ／ｋｇ、または皮下に１０ｍｇ／ｋｇで各マウスに投与した。図４１Ａは、投与の１５分、１、２、４、８、２４、３６、４８、及び７２時間後に測定した血漿濃度を示す。図４１Ｂは、図４１Ａに示される血漿濃度の結果を使用して計算された薬物動態プロファイルの概要である。
【図４１Ｂ】図４１Ａ及び図４１Ｂは雌ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（Ｎ＝２）に投与したＷＸ−０３９のＰＫデータを示す。ＷＸ−０３９は、静脈内に５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内に５ｍｇ／ｋｇ、または皮下に１０ｍｇ／ｋｇで各マウスに投与した。図４１Ａは、投与の１５分、１、２、４、８、２４、３６、４８、及び７２時間後に測定した血漿濃度を示す。図４１Ｂは、図４１Ａに示される血漿濃度の結果を使用して計算された薬物動態プロファイルの概要である。
【図４２Ａ】図４２Ａ及び図４２Ｂは雌ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（Ｎ＝２）に投与したＷＸ−０３６のＰＫデータを示す。ＷＸ−０４０は、静脈内に３０ｍｇ／ｋｇまたは腹腔内に４０ｍｇ／ｋｇで各マウスに投与した。図４２Ａは、投与の１５分、１、２、４、８、２４、３６、４８、及び７２時間後に測定した血漿濃度を示す。図４２Ｂは、図４２Ａに示される血漿濃度の結果を使用して計算された薬物動態プロファイルの概要である。
【図４２Ｂ】図４２Ａ及び図４２Ｂは雌ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（Ｎ＝２）に投与したＷＸ−０３６のＰＫデータを示す。ＷＸ−０４０は、静脈内に３０ｍｇ／ｋｇまたは腹腔内に４０ｍｇ／ｋｇで各マウスに投与した。図４２Ａは、投与の１５分、１、２、４、８、２４、３６、４８、及び７２時間後に測定した血漿濃度を示す。図４２Ｂは、図４２Ａに示される血漿濃度の結果を使用して計算された薬物動態プロファイルの概要である。
【図４３Ａ−Ｃ】図４３ＡはＢ１６Ｆ１０細胞を接種した５週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝３）で試験した腫瘍増殖阻害に対するＷＸ−０３９の効果を示す。図４３Ｂは実験中に評価した腫瘍増殖阻害率を示す。図４３Ｃは図４３Ａに示された実験中の体重変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
Ａ．  ＢＣＬ−９、β−カテニン、及びＷｎｔシグナル伝達
Ｗｎｔシグナル伝達の異常活性化は様々な癌に関与しているが、これは、腫瘍が増殖及び生存のためにＷｎｔシグナル伝達に依存するようになる場合があるためである（Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ．１０９（４４）：１７９４２−１７９４７（２０１２）を参照されたい）。散発性大腸癌の全症例のうち最大９０％が、Ｗｎｔシグナル伝達の恒常的活性化と関連している。
【００２５】
β−カテニンは、腫瘍の増殖及び発達を可能にし得る転写活性化の変化をもたらすＷｎｔシグナル伝達を刺激するタンパク質−タンパク質の相互作用に関与し得るタンパク質である。β−カテニンは、通常はリン酸化され、Ａｘｉｎ複合体による分解の標的となる。Ｗｎｔシグナル伝達経路の刺激がある場合、リン酸化されていないβ−カテニンが蓄積し、リンパ系エンハンサー因子／Ｔ細胞因子（ＬＥＦ／ＴＣＦ）に結合し、核に移行して、Ｗｎｔ標的遺伝子の転写を刺激する（Ｔｈａｋｕｒ  ２０１３を参照されたい）。Ｗｎｔ標的遺伝子としては、腫瘍モデルにおいて上方制御されている遺伝子であるｃ−ｍｙｃ及びＣＤ４４が挙げられる。ＢＣＬ９は、哺乳動物細胞において効率的なβ−カテニン媒介性転写に必要とされるタンパク質である（ｄｅ  ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ８：１９９（２００８）を参照されたい）。
【００２６】
「古典的」Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、細胞表面受容体のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーに結合するＷｎｔリガンドによって活性化される経路であり、細胞表面受容体は次いで、β−カテニンの発現及び細胞内局在化を制御する。Ｗｎｔリガンドの非存在下において、β−カテニンは、大腸ポリポーシス（ＡＰＣ）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）、カゼインキナーゼ１（ＣＫ１）、及びＡｘｉｎから構成された破壊複合体（ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）内でリン酸化及びユビキチン化され、プロテアソーム依存様式における分解の標的とされる。Ｗｎｔリガンドの存在下では、この複合体におけるβ−カテニンのユビキチン化が抑制され、リン酸化β−カテニンを飽和させ、これは次いで安定化して核に移行する。核内で、リン酸化β−カテニンは、リンパ系エンハンサー因子／３（ＬＥＦ／ＴＣＦ）などの核Ｔ細胞因子（ＴＣＦ）転写因子を動員して、細胞の増殖、遊走、及び生存を促進するｃ−Ｍｙｃ２８及びサイクリンＤを含む遺伝子の発現を誘導する。
【００２７】
ＢＣＬ９及びその相同体であるＢ細胞リンパ腫９様（Ｂ９Ｌ）を含むいくつかの分子は、Ｗｎｔ／β−カテニン転写のためのコアクチベーターであることが示されている。ＴＣＦ、β−カテニン、及びＢＣＬ９（またはＢ９Ｌ）からなる複合体の形成は、β−カテニン依存性Ｗｎｔ転写活性を向上させる。正常細胞においては、この転写経路は、Ｗｎｔリガンドがそれらの受容体から離れると遮断される。しかしながら、ＡＰＣ及びＡｘｉｎにおける様々な機能欠損変異、ならびにβ−カテニン自体における活性化変異は、β−カテニンが破壊複合体を回避し、核内に蓄積することを可能にする。このような不適切なβ−カテニンの残留は、肝細胞、乳房、結腸直腸、及び血液の悪性腫瘍、例えば多発性骨髄腫を含む、幅広い一般的なヒト上皮癌の発癌を促進する。加えて、活性なβ−カテニンシグナル伝達は、Ｔ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞の排除をもたらし、これは、治療抵抗性及び患者の生存期間の短縮につながる。したがって、β−カテニン（β−ｃａｔ）を標的とすることによるＷｎｔシグナル伝達の遮断は、腫瘍の開始と転移との両方を防止する可能性のある強力なＣＲＣ治療法を提示し得る。Ｓｐｒａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５２３：２３１−２３５（２０１５）を参照されたい。
【００２８】
他の転写因子と同様に、選択的な非毒性β−カテニン阻害剤の開発、及びそれらの臨床への移行は、β−カテニンがそのタンパク質パートナーの大部分と同じ結合表面を介して相互作用することから、相当な難題であることが証明されている。したがって、この共通の結合表面を標的とするＷｎｔ経路阻害剤は、動物試験及び臨床治験において著しい有害作用を呈している。臨床治験においてβ−カテニンを標的とする薬物は、ＰＲＩ−７２４（Ｅｉｓａｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；第ＩＩ相）、ＬＧＫ９７４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ；第Ｉ相）、ならびにＯＭＰ−５４Ｆ２８及びＯＭＰ−１８Ｒ５（ＯｎｃｏＭｅｄ／Ｂａｙｅｒ；第Ｉ相）を含め少数しか存在しない。加えて、β−ｃａｔの小分子及びペプチド阻害剤によるＬＥＦ／ＴＣＦ相互作用の妨害は、おそらく正常な造血性及び腸管の幹細胞における恒常性Ｗｎｔシグナル伝達の妨害の結果である、処置マウスの重度の骨髄低形成、貧血、及び全身性消耗を含む深刻な副作用を及ぼし得る。そのような治療的な制限は、β−カテニンとＴＣＦ及びβ−カテニンとＥ−カドヘリンの相互作用の妨害に由来し得、これは上皮組織の完全性に影響を及ぼし得る。さらに、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体を標的とする生物学的薬剤（ＯＭＰ−５４Ｆ２８及びＯＭＰ−１８Ｒ５）は、臨床治験中に著しい骨髄毒性を示している。ＷｎｔリガンドはＷｎｔ／β−ｃａｔ活性化に必須であるが、癌細胞におけるＡＰＣ及びβ−カテニンの変異は、Ｗｎｔリガンドの活性化なしに下流転写を誘導し得るため、Ｗｎｔ分泌を遮断しても、ＡＰＣ及びβ−カテニンの変異により誘導された下流遺伝子転写に起因して、内因的な発癌性Ｗｎｔ活性を阻害することができない。ＬＧＫ９７４は、ある特定のバイオマーカーによって特定されるように、小さな患者集団しか標的としない。小分子阻害剤であるＰＲＩ−７２４は、毎日の注入を用いた第ＩＩ相治験下にあるが、１週間に１回より多くの静脈内（ＩＶ）投薬は、臨床開発には望ましくなく支持されない特徴を呈する。
【００２９】
従来、Ｗｎｔシグナル伝達経路は、Ｗｎｔがβ−カテニン依存様式により様々な転写標的遺伝子を制御する古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路、Ｗｎｔがβ−カテニンから独立して機能し得る平面細胞極性に主に関与する非古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路、及び細胞内カルシウムレベルを制御する非古典的Ｗｎｔ／カルシウム経路という、３つの異なる種類のシグナル伝達を含む。本出願において、「古典的Ｗｎｔシグナル伝達」は、互換的に「古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達」または「Ｗｎｔシグナル伝達」と称される。本明細書に記載されるように、古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、例えばβ−カテニンの安定性を調節することによって患者または試料におけるβ−カテニンの量を制御する経路成分を指す場合がある。いくつかの実施形態では、古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、ｃ−ｍｙｃ、ｃｃｎｄ１、ｃｄ４４、ＬＧＲ５、ＶＥＧＦＡ、ＡＸＩＮ２、及びＬＥＦ１などの１つ以上の遺伝子を転写的に調節する経路成分を含む。いくつかの実施形態では、古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、β−カテニンとＢＣＬ９との相互作用によって調節される経路成分を含む。いくつかの実施形態では、古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、β−カテニンとＢＣＬ９との相互作用によって転写的に制御される１つ以上の遺伝子を含む。β−カテニンとＢＣＬ９との相互作用によって制御される１つ以上の遺伝子は、ｃ−ｍｙｃ、ｃｃｎｄ１、ｃｄ４４、ＬＧＲ５、ＶＥＧＦＡ、ＡＸＩＮ２、及びＬＥＦ１を含み得る。いくつかの実施形態では、古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、β−カテニンとＢＣＬ９との相互作用によって転写発現が調節される１つ以上のタンパク質を含む。これらの成分は、例えば、ｃ−Ｍｙｃ、サイクリンＤ１、ＣＤ４４、ＬＧＲ５、ＶＥＧＦＡ、ＡＸＩＮ２、及びＬＥＦ１を含み得る。
【００３０】
Ｂ．  安定化ＢＣＬ−９ペプチド
安定化ペプチドは、増加したヘリックス含量、タンパク質分解安定性、及び標的受容体に対する増加した結合親和性などの利点をもたらすことが示されている（Ｋｉｍ  ２０１１を参照されたい）。特に、α−ヘリックスドメインは安定化しやすいことで知られている。
【００３１】
１．  ＢＣＬ９  ＨＤ２ドメインに由来するポリペプチド
ＢＣＬ９のＨＤ２ドメインは、β−カテニンへのＢＣＬ９の結合を媒介し、今までのところ、ＨＤ２ドメインは、ＢＬＣ９のうち細胞内のβ−カテニンに結合することが示されている唯一のドメインである（ｄｅ  ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  ２００８を参照されたい）。ＨＤ２ドメインはα−ヘリックスを形成し、したがって、α−ヘリックスが安定化されているＢＣＬ９のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドは、β−カテニンとＢＣＬ９の相互作用を阻害するために適切であり得る（Ｓａｍｐｉｅｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，２４，２９３−３００（２００６））。
【００３２】
一実施形態において、ＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインの一部分の活性のマッピングが、互換的にコア機能ドメインと称される活性領域を決定するために行われる。一実施形態において、ＢＣＬ９のＨＤ２ドメインの一部分を含有するペプチドは構造的に制約されている。ある特定の実施形態では、この構造的制約は、ＢＣＬ９ペプチドのα−ヘリックスを安定化させる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインに由来する。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は互換的に使用され、結合して鎖を形成する２つ以上のアミノ酸を含むポリマーを指す。「ヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチド」という用語は、ヒトＢＣＬ９タンパク質の完全長ＨＤ２ドメイン及びそのようなＨＤ２ドメインの断片を包含する。これには、完全長ＨＤ２ドメインまたは断片の変異体も包含される。ヒトＢＣＬ９タンパク質の完全長ＨＤ２ドメインの配列（配列番号Ｘ）は、表１に示されている。ヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチド、またはその変異体は、本明細書に開示されるように、ステープルまたは安定化することができる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ヒトＢＣＬ９タンパク質の完全長ＨＤ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインの断片及び／または変異体を含む。ある特定の実施形態において、ヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸を他の天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸で置換することによってさらに修飾されている、ヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインの断片を含む。ある実施形態では、ヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドは、１つ以上の炭化水素架橋剤を形成する反応を受けることができる。本明細書で使用される場合、１つ以上の炭化水素架橋剤を形成する反応を受けることのできるポリペプチドは、「非ステープルドポリペプチド」と称されることがある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、天然に存在しないアミノ酸は、ノルロイシンである。いくつかの実施形態では、天然に存在しないアミノ酸は、α，α−二置換アミノ酸である。いくつかの実施形態では、天然に存在しないアミノ酸は、α−メチル，α−アルケニルアミノ酸である。ある実施形態では、天然に存在しないアミノ酸は、Ｓ構成またはＲ構成のいずれかを有するキラル中心を含むキラル分子である。ある実施形態では、天然に存在しないアミノ酸は、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニン、（Ｒ）−２−（４´−ペンテニル）アラニン、（Ｓ）−２−（７´−オクテニル）アラニン、及び（Ｒ）−２−（７´−オクテニル）アラニンから選択される。
【００３５】
本明細書で使用される場合、ヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドは、１つ以上の炭化水素架橋剤を形成する反応を受け、したがって１つ以上の炭化水素架橋剤を含むポリペプチドも包含する。本明細書で使用される場合、１つ以上の炭化水素架橋剤を含むポリペプチドは、「安定化ポリペプチド」または「ステープルドポリペプチド」と称されることがある。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、２〜１５の炭素長を有する。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、５〜１１の炭素長を有する。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、７〜１１の炭素長を有する。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、７〜１５の炭素長を有する。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、８〜１１の炭素長を有する。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、７もしくは８もしくは９もしくは１０もしくは１１またはそれ以上の炭素長を有する。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−及び−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−から選択される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるステープルドポリペプチドは、インビトロ及び／またはインビボでβ−カテニンへのＢＣＬ９の結合を阻害することができる。いくつかの実施形態では、ヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドは、ヒトＢＣＬ９タンパク質の非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインと比較した場合、または非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインの断片と比較した場合に、改善された１つ以上の生物学的機能を有する。この１つ以上の生物学的機能は、（１）β−カテニンへのＢＣＬ９の結合を阻害すること、（２）古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を阻害すること、（３）制御性Ｔ細胞の生存期間を減少させること、（４）腫瘍内のＶＥＧＦの発現を減少させること、（５）腫瘍へのＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を増加させること、（６）腫瘍内のＴヘルパー１７（Ｔｈ１７）細胞を増加させること、（７）腫瘍内の樹状細胞を減少させること、（８）対象に投与されたときに少なくとも２時間超の半減期（Ｔ１／２）を有すること、（９）免疫反応に好ましい腫瘍微小環境を誘導すること、ならびに、（１０）腫瘍増殖、癌幹細胞増殖、及び／または腫瘍転移を阻害することのうちの１つ以上から選択され得る。
【００３７】
本開示は、野生型ポリペプチドの１つ以上の生物学的機能を保持する、ヒトＢＣＬ９タンパク質の野生型ＨＤ２ドメインの変異体、または非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインの断片の変異体を含む、ステープルドペプチドを包含する。本明細書に記載されるポリペプチドとの関連で使用される「変異体」とは、アミノ酸配列及び／または化学構造において所与のポリペプチドと異なるが、所与のポリペプチド（すなわち、本明細書に記載されるポリペプチド）の１つ以上の生物学的機能を保持するポリペプチドを指す。例えば、変異体は、ヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドの１つ以上の生物学的機能、例えば、β−カテニンに結合する能力、古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害、及び／またはβ−カテニンへのＢＣＬ９の結合の阻害などを保持することができる。
【００３８】
本明細書に記載される変異体ポリペプチドは、上で言及した機能的特性を保持する限り、所与のポリペプチドと比べて１つ以上のアミノ酸付加（例えば挿入）、欠失、及び／または置換を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される変異体ポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比べて１〜３０、１〜２０、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜４、１〜３、もしくは１〜２、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、もしくは３０個（これらの範囲間の全ての整数を含む）のアミノ酸付加（例えば挿入）、欠失、及び／または置換を有し得る。
【００３９】
いくつかの実施形態では、変異体は、所与のポリペプチドの１つ以上のアミノ酸の保存的置換を含む。アミノ酸の保存的置換、すなわち、あるアミノ酸を特性（例えば親水性ならびに荷電領域の程度及び分布）が同様の異なるアミノ酸で置き換えることは、通常は、それに伴う変化が軽微であるため、ポリペプチドの生物学的活性を著しく変更しない。こうした軽微な変化は、アミノ酸の疎水性及び電荷の考慮に基づいてアミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することによって特定され得る。疎水性親水性指標及び親水性値が同様のアミノ酸は、置換されてもタンパク質機能を保持することができる。アミノ酸の疎水性指数及び親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響される。この観察に則せば、生物学的機能と適合性のあるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、及び他の特性によって明らかになる、アミノ酸の相対的類似性、そして特にこれらのアミノ酸の側鎖に左右される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、変異体は、野生型ポリペプチドまたは断片の１つ以上のアミノ酸の、天然に存在しないアミノ酸による置換を含む。いくつかの実施形態では、天然に存在しないアミノ酸は、ノルロイシンである。いくつかの実施形態では、天然に存在しないアミノ酸は、α，α−二置換アミノ酸である。いくつかの実施形態では、天然に存在しないアミノ酸は、α−メチル，α−アルケニルアミノ酸である。ある実施形態では、天然に存在しないアミノ酸は、Ｓ構成またはＲ構成のいずれかを有するキラル中心を含むキラル分子である。ある実施形態では、天然に存在しないアミノ酸は、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニン、（Ｒ）−２−（４´−ペンテニル）アラニン、（Ｓ）−２−（７´−オクテニル）アラニン、及び（Ｒ）−２−（７´−オクテニル）アラニンから選択される。
【００４１】
「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語には、野生型ポリペプチドまたは断片に対して、例えば少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％（またはこれらの間の任意の割合）などのある特定の相同性パーセントを有するポリペプチドが含まれる。本明細書で使用される場合、相同性パーセント（％）という用語は、変異体及び所与のポリペプチドのアミノ酸配列において、例えばＢＬＡＳＴアライメントソフトウェアを使用して配列及び他の空間配置をアラインした後に同一である残基の割合を定義する。
【００４２】
いくつかの実施形態では、変異体には、野生型ポリペプチドまたは断片と異なる様式で化学的及び／または翻訳後に修飾されているが上述の１つ以上の生物学的機能を保持するポリペプチドが含まれる。例えば、変異体は、例えばリン酸化、アセチル化、メチル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、または当該技術分野で知られる他の翻訳後修飾によって移行後（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ）に修飾されている１つ以上のアミノ酸を含み得る。変異体は、１つ以上の化学修飾、例えば、異なる化学部分で修飾または置換されている１つ以上のアミノ酸側鎖を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「変異体」という用語には、所与のポリペプチドとアミノ酸配列が同一であるが異なる炭化水素架橋剤を有するポリペプチドも包含される。「変異体」という用語は、所与のポリペプチドとアミノ酸配列及び化学構造が同一であるが異なるキラリティを有するポリペプチドを指す場合もある。
【００４３】
２．  ＢＣＬ９  ＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドの構造
いくつかの実施形態では、ヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドは、７〜２２アミノ酸長を有する。いくつかの実施形態では、本ポリペプチドは、７〜１４アミノ酸長を有する。いくつかの実施形態では、本ポリペプチドは、７または８アミノ酸長を有する。いくつかの実施形態では、本ポリペプチドは、１０〜１４アミノ酸長を有する。いくつかの実施形態では、本ポリペプチドは、１１または１２アミノ酸長を有する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドは、７〜１４アミノ酸長を有し、表１から選択される任意の配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドは、７または８アミノ酸長を有し、表１から選択される任意の配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドは、１０〜１４アミノ酸長を有し、表１から選択される任意の配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドは、１０または１１アミノ酸長を有し、表１から選択される任意の配列を含む。本明細書に記載されるポリペプチドには、表１から選択されるポリペプチドの変異体で、このポリペプチドの１つ以上の生物学的機能を保持するものも包含される。様々な実施形態において、選択されたポリペプチドは、例えば、１つ以上の炭化水素架橋を含むことによって安定化される。表１において、Ｂはノルロイシンを示す。
【００４５】
【表１】
2018537120.tif 000002
2018537120.tif 000003
2018537120.tif 000004
【００４６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、１つ以上の炭化水素架橋剤を形成する反応を受けることができる。いくつかの実施形態では、本ポリペプチドは、表１から選択される任意の配列またはその変異体を含み、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４は各々、α，α−二置換アミノ酸である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、表１から選択される任意の配列を含み、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、α，α−二置換アミノ酸であり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、表１から選択される任意の配列を含み、Ｘａａ３及びＸａａ４は各々、α，α−二置換アミノ酸であり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。いくつかの実施形態では、α，α−二置換アミノ酸は、α−メチル，α−アルケニルアミノ酸である。いくつかの実施形態では、α−メチル，α−アルケニルアミノ酸は、α−メチル，α−アルケニルアラニンである。いくつかの実施形態では、α−メチル，α−アルケニルアラニンは、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニン、（Ｒ）−２−（４´−ペンテニル）アラニン、（Ｓ）−２−（７´−オクテニル）アラニン、及び（Ｒ）−２−（７´−オクテニル）アラニンから選択される。
【００４７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドまたは変異体は、１つ以上の炭化水素架橋剤を含むステープルドポリペプチドであり、表１から選択される任意の配列またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、本ポリペプチドは、１つの炭化水素架橋剤を含むステープルドポリペプチドであり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。他の実施形態では、本ポリペプチドは、２つの炭化水素架橋剤を含むステープルドポリペプチドであり、（１）Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４は各々、アラニンであり、（２）第１の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在し、（３）第２の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＲ構成を有する。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、一方の末端にＳ構成を有し、他方の末端にＲ構成を有する。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＬＸａａ１ＱＥＱＸａａ２Ｅ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＳＸａａ１ＥＱＬＸａａ２Ｈ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＱＸａａ１ＱＬＥＸａａ２Ｒ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＥＸａａ１ＬＥＨＸａａ２Ｅ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＱＸａａ１ＥＨＲＸａａ２Ｒ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＬＸａａ１ＨＲＥＸａａ２Ｓ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＥＸａａ１ＲＥＲＸａａ２Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＨＸａａ１ＥＲＳＸａａ２Ｑ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＲＸａａ１ＲＳＬＸａａ２Ｔ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＥＸａａ１ＳＬＱＸａａ２Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＲＸａａ１ＬＱＴＸａａ２Ｒ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＳＸａａ１ＱＴＬＸａａ２Ｄ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＬＸａａ１ＴＬＲＸａａ２Ｉ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＱＸａａ１ＬＲＤＸａａ２Ｑ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＴＸａａ１ＲＤＩＸａａ２Ｒ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＬＸａａ１ＤＩＱＸａａ２Ｂ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＲＸａａ１ＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＤＸａａ１ＱＲＢＸａａ２Ｆ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＬＲＸａａ１ＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＬＱＴＬＲＸａａ１ＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、Ｘａａ１ＬＱＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＱＲＸａａ４Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンであり、一方でＸａａ１は、（Ｒ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、Ｘａａ１ＤＱＸａａ２ＤＲＸａａ３ＤＱＲＸａａ４ＤＨ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンであり、一方でＸａａ１は、（Ｒ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、Ｘａａ１ＬＥＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＥＲＸａａ４Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンであり、一方でＸａａ１は、（Ｒ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＲＸａａ１ＬＱＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＱＲＸａａ４Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンであり、一方でＸａａ１は、（Ｒ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＬＱＸａａ１ＬＲＤＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１は、（Ｒ）−２−（７´−オクテニル）アラニンであり、Ｘａａ２は、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンである。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＬＸａａ１ＱＥＱＸａａ２Ｅ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＳＸａａ１ＥＱＬＸａａ２Ｈ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＱＸａａ１ＱＬＥＸａａ２Ｒ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＥＸａａ１ＬＥＨＸａａ２Ｅ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＱＸａａ１ＥＨＲＸａａ２Ｒ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＬＸａａ１ＨＲＥＸａａ２Ｓ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＥＸａａ１ＲＥＲＸａａ２Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＨＸａａ１ＥＲＳＸａａ２Ｑ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＲＸａａ１ＲＳＬＸａａ２Ｔ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＥＸａａ１ＳＬＱＸａａ２Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＲＸａａ１ＬＱＴＸａａ２Ｒ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＳＸａａ１ＱＴＬＸａａ２Ｄ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＬＸａａ１ＴＬＲＸａａ２Ｉ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＱＸａａ１ＬＲＤＸａａ２Ｑ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＴＸａａ１ＲＤＩＸａａ２Ｒ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＬＸａａ１ＤＩＱＸａａ２Ｂ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＲＸａａ１ＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＤＸａａ１ＱＲＢＸａａ２Ｆ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＬＲＸａａ１ＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＬＱＴＬＲＸａａ１ＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含み、かつ／またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドポリペプチドは、Ｘａａ１ＬＱＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＱＲＸａａ４Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、（１）Ｘａａ３及びＸａａ４は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンであり、（２）Ｘａａ１及びＸａａ２は、アラニンであり、（３）炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、一方の末端にＳ構成を有し、他方の末端にＲ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、Ｘａａ１ＬＱＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＱＲＸａａ４Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、（１）Ｘａａ１は、（Ｒ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンであり、Ｘａａ２は、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンであり、（２）Ｘａａ３及びＸａａ４は、アラニンであり、（３）炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、Ｘａａ１ＬＱＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＱＲＸａａ４Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４は各々、アラニンであり、第１の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在し、第２の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する。これらの実施形態では、第１の炭化水素架橋剤は、一方の末端にＳ構成を有し、他方の末端にＲ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、一方で、第２の炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、Ｘａａ１ＤＱＸａａ２ＤＲＸａａ３ＤＱＲＸａａ４ＤＨ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、（１）Ｘａａ３及びＸａａ４は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンであり、（２）Ｘａａ１及びＸａａ２は、アラニンであり、（３）炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、一方の末端にＳ構成を有し、他方の末端にＲ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、Ｘａａ１ＤＱＸａａ２ＤＲＸａａ３ＤＱＲＸａａ４ＤＨ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、（１）Ｘａａ１は、（Ｒ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンであり、Ｘａａ２は、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンであり、（２）Ｘａａ３及びＸａａ４は、アラニンであり、（３）炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、Ｘａａ１ＤＱＸａａ２ＤＲＸａａ３ＤＱＲＸａａ４ＤＨ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４は各々、アラニンであり、第１の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在し、第２の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する。これらの実施形態では、第１の炭化水素架橋剤は、一方の末端にＳ構成を有し、他方の末端にＲ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、一方で、第２の炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、Ｘａａ１ＬＥＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＥＲＸａａ４Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、（１）Ｘａａ３及びＸａａ４は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンであり、（２）Ｘａａ１及びＸａａ２は、アラニンであり、（３）炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、一方の末端にＳ構成を有し、他方の末端にＲ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、Ｘａａ１ＬＥＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＥＲＸａａ４Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、（１）Ｘａａ１は、（Ｒ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンであり、Ｘａａ２は、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンであり、（２）Ｘａａ３及びＸａａ４は、アラニンであり、（３）炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、Ｘａａ１ＬＥＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＥＲＸａａ４Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４は各々、アラニンであり、第１の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在し、第２の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する。これらの実施形態では、第１の炭化水素架橋剤は、一方の末端にＳ構成を有し、他方の末端にＲ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、一方で、第２の炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＲＸａａ１ＬＱＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＱＲＸａａ４Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、（１）Ｘａａ３及びＸａａ４は各々、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンであり、（２）Ｘａａ１及びＸａａ２は、アラニンであり、（３）炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、一方の末端にＳ構成を有し、他方の末端にＲ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＲＸａａ１ＬＱＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＱＲＸａａ４Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、（１）Ｘａａ１は、（Ｒ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンであり、Ｘａａ２は、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニンであり、（２）Ｘａａ３及びＸａａ４は、アラニンであり、（３）炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＲＸａａ１ＬＱＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＱＲＸａａ４Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４は各々、アラニンであり、第１の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在し、第２の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する。これらの実施形態では、第１の炭化水素架橋剤は、一方の末端にＳ構成を有し、他方の末端にＲ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、一方で、第２の炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＬＱＸａａ１ＬＲＤＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含み、かつ／またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、一方の末端にＲ構成を有し、他方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドまたは変異体は、Ｎ末端及び／またはＣ末端における化学修飾をさらに含む。ある実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドまたは変異体のＮ末端は、さらに修飾されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドまたは変異体のＮ末端は、アセチル基へと修飾されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドまたは変異体のＣ末端は、さらに修飾されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドまたは変異体のＣ末端は、ＮＨ２で修飾されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドまたは変異体のＣ末端は、１つ、２つ、もしくはそれ以上のβ−アラニン単位、２−ナフチルアラニン、及び／または１つ、２つ、もしくはそれ以上のβ−アラニン単位に場合により連結した２−ナフチルアラニンで修飾されており、Ｃ末端修飾のカルボキシル基は、場合によりＮＨ２でさらに修飾されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドまたは変異体のＮ末端及び／またはＣ末端は、フルオレニルメチルオキシカルボニル（ｆｒｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）基（Ｆｍｏｃ）によってさらに保護されている。いくつかの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体は、例えばポリペプチドの細胞透過性、溶解性、及び安定性を改善させる１つ以上の化学部分にさらにコンジュゲートされている。ある実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体は、ＴＡＴポリペプチド（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ）にコンジュゲートされている。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体は、表１から選択されるアミノ酸配列からなり、本ポリペプチドまたは変異体のＮ末端は、アセチル基でさらに修飾されており、本ポリペプチドまたは変異体のＣ末端は、ＮＨ２で修飾されている。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体は、ＬＲＸａａ１ＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列からなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＮ末端は、アセチル基でさらに修飾されていてもよい。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＣ末端が、２つのβ−アラニン単位に連結した２−ナフチルアラニンでさらに修飾されており、第２のβ−アラニン単位のカルボキシル基が、ＮＨ２で修飾されていてもよい（２−Ｎａｌ−β−Ａｌａ−β−Ａｌａ−ＮＨ２）。このポリペプチドは、本出願において「ＷＸ−０２１」と称される場合がある。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体は、ＬＲＸａａ１ＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列からなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＮ末端は、アセチル基でさらに修飾されていてもよい。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＣ末端が、２つのβ−アラニン単位でさらに修飾されており、第２のβ−アラニン単位のカルボキシル基が、ＮＨ２で修飾されていてもよい（β−Ａｌａ−β−Ａｌａ−ＮＨ２）。このポリペプチドは、本出願において「ＷＸ−０２２」と称される場合がある。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体は、ＬＲＸａａ１ＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列からなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＮ末端は、アセチル基でさらに修飾されていてもよい。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＣ末端が、２−ナフチルアラニンでさらに修飾されており、２−ナフチルアラニンのカルボキシル基が、ＮＨ２で修飾されていてもよい（２−Ｎａｌ−ＮＨ２）。このポリペプチドは、本出願において「ＷＸ−０２３」と称される場合がある。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体は、ＬＱＴＬＲＸａａ１ＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列からなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＮ末端は、アセチル基でさらに修飾されていてもよい。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＣ末端は、２つのβ−アラニン単位に連結した２−ナフチルアラニンでさらに修飾されていてもよい。これらの実施形態では、本ポリペプチドは、ＴＡＴペプチド（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ）にさらにコンジュゲートされていてもよい。このポリペプチドは、本出願において「ＷＸ−０２９」と称される場合がある。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体は、Ｘａａ１ＬＱＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＱＲＸａａ４Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列からなり、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４は各々、アラニンであり、第１の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在し、第２の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する。これらの実施形態では、第１の炭化水素架橋剤は、一方の末端にＳ構成を有し、他方の末端にＲ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、一方で、第２の炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＮ末端は、アセチル基でさらに修飾されていてもよい。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＣ末端は、２つのβ−アラニン単位に連結した２−ナフチルアラニンでさらに修飾されていてもよい。これらの実施形態では、本ポリペプチドは、ＴＡＴペプチド（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ）にさらにコンジュゲートされていてもよい。このポリペプチドは、本出願において「ＷＸ−０３６」と称される場合がある。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、Ｘａａ１ＤＱＸａａ２ＤＲＸａａ３ＤＱＲＸａａ４ＤＨ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列からなり、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４は各々、アラニンであり、第１の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在し、第２の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する。これらの実施形態では、第１の炭化水素架橋剤は、一方の末端にＳ構成を有し、他方の末端にＲ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、一方で、第２の炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＮ末端は、アセチル基でさらに修飾されていてもよい。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＣ末端が、２つのβ−アラニン単位でさらに修飾されており、第２のβ−アラニン単位のカルボキシル基が、ＮＨ２で修飾されていてもよい（β−Ａｌａ−β−Ａｌａ−ＮＨ２）。このポリペプチドは、本出願において「ＷＸ−０３７」と称される場合がある。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、Ｘａａ１ＬＥＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＥＲＸａａ４Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４は各々、アラニンであり、第１の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在し、第２の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する。これらの実施形態では、第１の炭化水素架橋剤は、一方の末端にＳ構成を有し、他方の末端にＲ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、一方で、第２の炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＮ末端は、アセチル基でさらに修飾されていてもよい。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＣ末端が、２つのβ−アラニン単位に連結した２−ナフチルアラニンでさらに修飾されており、第２のβ−アラニン単位のカルボキシル基が、ＮＨ２で修飾されていてもよい（２−Ｎａｌ−β−Ａｌａ−β−Ａｌａ−ＮＨ２）。このポリペプチドは、本出願において「ＷＸ−０３８」と称される場合がある。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＲＸａａ１ＬＱＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＱＲＸａａ４Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４は各々、アラニンであり、第１の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在し、第２の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する。これらの実施形態では、第１の炭化水素架橋剤は、一方の末端にＳ構成を有し、他方の末端にＲ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、一方で、第２の炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＮ末端は、アセチル基でさらに修飾されていてもよい。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＣ末端が、２つのβ−アラニン単位に連結した２−ナフチルアラニンでさらに修飾されており、第２のβ−アラニン単位のカルボキシル基が、ＮＨ２で修飾されていてもよい（２−Ｎａｌ−β−Ａｌａ−β−Ａｌａ−ＮＨ２）。このポリペプチドは、本出願において「ＷＸ−０３９」と称される場合がある。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＬＱＸａａ１ＬＲＤＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列を含み、かつ／またはそれからなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、一方の末端にＲ構成を有し、他方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＮ末端は、アセチル基でさらに修飾されていてもよい。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＣ末端が、２つのβ−アラニン単位に連結した２−ナフチルアラニンでさらに修飾されており、第２のβ−アラニン単位のカルボキシル基が、ＮＨ２で修飾されていてもよい（２−Ｎａｌ−β−Ａｌａ−β−Ａｌａ−ＮＨ２）。このポリペプチドは、本出願において「ＷＸ−０４０」と称される場合がある。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体は、ＬＱＴＬＲＸａａ１ＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列からなり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、アラニンであり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。これらの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＮ末端は、アセチル基でさらに修飾されていてもよい。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＣ末端が、２−ナフチルアラニンでさらに修飾されており、２−ナフチルアラニンのカルボキシル基が、ＮＨ２で修飾されていてもよい（２−Ｎａｌ−ＮＨ２）。このポリペプチドは、本出願において「ＷＸ−０２４」と称される場合がある。ＷＸ−０２４の化学構造は図１Ａに示されている。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体は、Ｘａａ１ＬＱＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＱＲＸａａ４Ｌ（配列番号Ｘ）のアミノ酸配列からなり、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４は各々、アラニンであり、第１の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在し、第２の炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在する。これらの実施形態では、第１の炭化水素架橋剤は、一方の末端にＳ構成を有し、他方の末端にＲ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、一方で、第２の炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＮ末端は、アセチル基でさらに修飾されていてもよい。これらの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体のＣ末端が、２つのβ−アラニン単位に連結した２−ナフチルアラニンでさらに修飾されており、第２のβ−アラニン単位のカルボキシル基が、ＮＨ２で修飾されていてもよい（２−Ｎａｌ−β−Ａｌａ−β−Ａｌａ−ＮＨ２）。このポリペプチドは、本出願において「ＷＸ−０３５」と称される場合がある。ＷＸ−０３５の化学構造は図１Ｂに示されている。
【０１１８】
３．  炭化水素架橋剤
本明細書に記載されるポリペプチドは、１つ以上の炭化水素架橋剤を有する安定化ポリペプチドを包含し得る。炭化水素架橋剤は、ＢＣＬ９のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドのα−ヘリックスの構造的制約（複数可）をもたらし得る。一実施形態において、ＢＣＬ９ペプチドのＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドのα−ヘリックスは、１つ以上の炭化水素架橋剤によって安定化される。本明細書で使用される場合、「炭化水素架橋剤」及び「架橋剤」（別名、炭化水素ステープル、炭化水素リンカー、またはメタセシスした架橋剤（ｍｅｔａｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ））という用語は、互換的に使用され、所与のポリペプチドの二次構造を著しく増強及び／または強化する２つのアミノ酸間の化学リンカーを指す。本明細書に記載される炭化水素架橋剤は、ポリペプチドの構造的可撓性を野生型の（すなわち、架橋していない）ペプチドと比較して制限する天然または非天然のアミノ酸の組み込みに基づいていてもよい。
【０１１９】
例えば、本明細書で使用される炭化水素架橋剤は、ヒトＢＣＬ９のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドのα−ヘリックス構造の安定性を向上させることができる。炭化水素架橋剤は、１つ以上のα−ヘリックスターンの長さにわたって延びることができる。１つのα−ヘリックスターンが約３〜４個のアミノ酸を含むことが一般に理解されているように、例えば、ｉ及びｉ＋３；ｉ及びｉ＋４；またはｉ及びｉ＋７に位置するアミノ酸が、炭化水素架橋剤を導入するのに理想的な位置となることも理解されよう。例えば、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０の配列を有するポリペプチドは、例えば、Ｘ１とＸ４との間、Ｘ１とＸ５との間、またはＸ１とＸ８との間の炭化水素架橋剤によって架橋されていてもよい。しかしながら、α−ヘリックス構造もしくは他の既知の構造（例えば、β−シート構造）の安定性を向上させるため、及び／または、例えばヘリックスターン１つ当たりのアミノ酸の数を変更することによって二次構造に変異を導入するために、代替的な間隔を有する他の位置を考慮してもよい。したがって、本明細書に詳解されるヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドのいずれも、任意の好適な位置で架橋されていてよい。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される安定化ポリペプチドは、ｉ及びｉ＋３、ｉ及びｉ＋４、またはｉ及びｉ＋７の位置に炭化水素架橋を含む。ある特定の実施形態において、この架橋は、第１のアミノ酸（ｉ）と、第１のアミノ酸の３アミノ酸下流で生じる第２のアミノ酸（ｉ＋３）とを連結させる。ある特定の実施形態において、この架橋は、第１のアミノ酸（ｉ）と、第１のアミノ酸から４アミノ酸下流で生じる第２のアミノ酸（ｉ＋４）とを連結させる。ある特定の実施形態において、この架橋は、第１のアミノ酸（ｉ）と、第１のアミノ酸から７アミノ酸下流で生じる第２のアミノ酸（ｉ＋７）とを連結させる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、２つ以上の炭化水素架橋剤を含む。いくつかの実施形態では、本ペプチドは、２つの炭化水素架橋剤で安定化されている。いくつかの実施形態では、本ペプチドは、３つの架橋剤で安定化されている。例えば、３つの架橋剤は、より長い構造、例えば２４アミノ酸を有する構造に使用され得る。２つ以上の炭化水素架橋剤の使用は、炭化水素架橋剤を含まないポリペプチドまたは１つの炭化水素架橋剤を含むポリペプチドと比較して、所与のポリペプチドの二次構造を増強及び／または強化するために有益となり得る。単一のペプチド内にある複数の炭化水素架橋は、より良好な安定性及び改善された薬物動態プロファイルなど、さらなる安定性をアルファヘリックスに与え得る。いくつかの実施形態では、複数の架橋は、単一のポリペプチド内に存在する。ある特定の実施形態では、これらの架橋は、架橋のアミノ酸間に同じ距離で連続していてもよい。一実施形態において、２つの架橋がｉ位及びｉ＋３位、ならびにｉ´位及びｉ´＋３位で存在する。ｉ´位はｉとｉ＋３との間に存在してもよいし、またはｉ＋３位の後に存在してもよい。一実施形態において、２つの架橋は、ｉ位及びｉ＋４位ならびにｉ´位及びｉ´＋４位にある。ｉ´位はｉとｉ＋４との間に存在してもよいし、またはｉ＋４位の後に存在してもよい。一実施形態において、２つの架橋は、ｉ位及びｉ＋７位ならびにｉ´位及びｉ´＋７位にある。ｉ´位はｉとｉ＋７との間に存在してもよいし、またはｉ＋７位の後に存在してもよい。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、単一のペプチド内にある２つの架橋は、一方の架橋がｉ位及びｉ＋３位、ｉ位及びｉ＋４位、またはｉ位及びｉ＋７位にあり、他方の架橋が連結したアミノ酸間で異なる空間配置を有する、混合位置にある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、２つの炭化水素架橋剤を有し、一方の架橋剤がｉ位及びｉ＋３位にあり、他方の架橋剤がｉ´位及びｉ´＋４位にある。いくつかの実施形態では、ｉ´位はｉとｉ＋３との間に存在してもよいし、またはｉ＋３位の後に存在してもよい。いくつかの実施形態では、ｉ位は、ｉ´とｉ´＋４との間に存在してもよいし、またはｉ´＋４位の後に存在してもよい。
【０１２３】
様々な炭化水素架橋剤が当該技術分野において公知である。（Ａｚｚａｒｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：１６１−１７３（２０１３））。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される炭化水素架橋剤は、単一のポリペプチドに組み込まれた２つのα，α−二置換アミノ酸を接続することによって生成される。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、２つのα，α−二置換アミノ酸を接続する閉環メタセシス反応によって生成される。閉環メタセシス（別称、閉環オレフィンメタセシス）は、当該技術分野において公知である（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ６：７６１−７７１（２０１１））。
【０１２４】
本明細書に記載される炭化水素架橋剤の長さは、α，α−二置換アミノ酸の置換基の長さに応じて様々であり得る。例えば、好適なα，α−二置換アミノ酸を使用することにより、閉環メタセシス反応によって生成される炭化水素架橋剤は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の炭素長を有し得る。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、８〜１２の炭素長を有する。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、８または１１の炭素長を有する。ある特定の実施形態では、炭化水素リンカーは、８炭素長である。ある特定の実施形態では、炭化水素リンカーは、１１炭素長である。炭化水素架橋剤の長さは、炭化水素架橋剤が１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のヘリックスターンにわたって延びるかどうかに応じて調整され得る。例えば、８炭素長を有する炭化水素架橋剤は、ｉ位及びｉ＋３位またはｉ位及びｉ＋４位の接続に使用され得る。１１炭素長を有する炭化水素架橋剤は、ｉ位及びｉ＋７位の接続に使用され得る。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、アルケニル架橋剤である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される炭化水素架橋剤は、２つのα−アルキル，α−アルケニルアミノ酸を接続することによって生成される。いくつかの実施形態では、α−アルキル，α−アルケニルアミノ酸は、α−メチル，α−アルケニルアミノ酸である。いくつかの実施形態では、α−メチル，α−アルケニルアミノ酸は、α−メチル，α−アルケニルアラニンである。いくつかの実施形態では、α−メチル，α−アルケニルアラニンは、（Ｓ）−２−（４´−ペンテニル）アラニン、（Ｒ）−２−（４´−ペンテニル）アラニン、（Ｓ）−２−（７´−オクテニル）アラニン、及び（Ｒ）−２−（７´−オクテニル）アラニンから選択される。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される炭化水素架橋剤は、架橋剤のいずれかの末端にキラリティを有し得る。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＲ構成を有する。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、一方の末端にＳ構成を有し、他方の末端にＲ構成を有する。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＲ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、一方の末端にＳ構成を有し、他方の末端にＲ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＳ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、両方の末端にＲ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。いくつかの実施形態では、炭化水素架橋剤は、一方の末端にＳ構成を有し、他方の末端にＲ構成を有する、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【０１２７】
様々な非炭化水素リンカーが、文献において公知である（Ａｚｚａｒｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  ５：１６１−１７３（２０１３）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本ペプチドは、ジスルフィド架橋、ラクタム架橋、水素結合サロゲート、またはトリアゾールステープルである架橋剤によって安定化されている。
【０１２８】
４．  炭化水素架橋剤を有するペプチドの調製及び精製
本開示はまた、本明細書に記載されるポリペプチドを製造する方法を提供する。かかる方法は、１つ以上の炭化水素架橋剤を形成する反応を受けることのできるポリペプチドを生成することを含み、このポリペプチドは、表１から選択される任意の配列またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＬＱＴＬＲＸａａ１ＩＱＲＸａａ２Ｌ（配列番号Ｘ）、Ｘａａ１ＬＱＸａａ２ＬＲＸａａ３ＩＱＲＸａａ４Ｌ（配列番号Ｘ）、またはそれらの変異体を含む、ポリペプチドを生成することを含む。いくつかの実施形態では、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、及びＸａａ４は各々、α，α−二置換アミノ酸であり、Ｘａａ１及びＸａａ２は各々、α，α−二置換アミノ酸であり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ３とＸａａ４との間に存在するか、または、Ｘａａ３及びＸａａ４は各々、α，α−二置換アミノ酸であり、炭化水素架橋剤が、Ｘａａ１とＸａａ２との間に存在する。いくつかの実施形態では、α，α−二置換アミノ酸は、α−メチル，α−アルケニルアミノ酸である。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドを製造するための方法は、当業者に公知であり本明細書に記載される１つ以上の化学合成法を行うことを含む。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３  ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ´ｓ  Ｇｕｉｄｅ，ｅｄ．Ｇｒａｎｔ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９２，ｐ．７７、及びＢｉｒｄ，Ｇ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ４４６，３６９−８６（２００８）を参照されたい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドを製造するための方法は、固相合成を使用してポリペプチドを生成することを含む。例えば、本明細書に記載されるポリペプチドは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのペプチドシンセサイザーモデル４３０Ａもしくは４３１またはＡＡＰＰＴＥＣのマルチチャネルシンセサイザーＡＰＥＸ  ３９６で、側鎖保護アミノ酸を使用し、ｔ−ＢｏｃまたはＦｍｏｃのいずれかの化学によって保護されたアルファ−ＮＨ２を用いた、固相合成の自動化されたＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ技術によって製造することができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、高スループットのコンビナトリアル様式で、例えば高スループットのマルチチャネルコンビナトリアルシンセサイザーを使用して製造され得る。当該技術分野では、ペプチドを合成する他の方法も公知である。
【０１３１】
本明細書に記載されるポリペプチドを製造する方法は、１つ以上の炭化水素架橋剤を形成することをさらに含み得る。この１つ以上の炭化水素架橋剤は、本明細書に記載されるポリペプチドを金属媒介性閉環オレフィンメタシセスに供することによって形成されてもよい。例えば、修飾されたＡｌａ残基（α−メチル，α−アルケニルアミノ酸）に基づいて炭化水素架橋剤を生成するための合成方針は、当業者には公知であろう。炭化水素架橋剤は、各末端にα−メチル基が位置しているα−ヘリックスの隣接するターンを接続する。この炭化水素架橋剤を生成する化学の基礎は、ペプチドの合成中の２つのα−メチル，α−アルケニルアミノ酸の組み込みである（Ｋｉｍ  ２０１１を参照されたい）。次いで、ルテニウム媒介性閉環オレフィンメタセシスの使用により、これらの修飾アミノ酸間に炭化水素架橋剤が生成される。閉環後、ポリペプチドは脱保護され、かかる反応から解放され、１つ以上の炭化水素架橋剤を含むポリペプチドがもたらされ得る。
【０１３２】
本開示は、本明細書に記載される方法に従って製造されたポリペプチドを精製する方法も包含する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）によって精製される。いくつかの実施形態では、精製されたポリペプチドは、金属を実質的に含まない。本明細書で使用される場合、「金属を実質的に含まない」という用語は、本明細書に記載されるポリペプチド及び金属を約０．５、１、２．５、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｐｐｍ未満の濃度で含む組成物を指す。いくつかの実施形態では、精製されたポリペプチドは、金属を実質的に含まず、約０．５ｐｐｍ未満を含む。いくつかの実施形態では、精製されたポリペプチドは、約５ｐｐｍ未満を含む。いくつかの実施形態では、精製されたポリペプチドは、約２０ｐｐｍ未満を含む。
【０１３３】
本明細書に開示される方法に従って製造されたポリペプチドは、溶媒の存在下または非存在下で様々な形態で存在し得る。例えば、本ポリペプチドは、粉末、塩、液体、結晶、または凍結乾燥組成物として存在し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、塩形態または結晶として存在する。好適な塩形態の例としては、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、パルモ酸塩（ｐａｌｍｏａｔｅ）、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、及びウンデカン酸塩が挙げられる。「結晶」及び「結晶化」という用語は、結晶の形態で存在するポリペプチドを指す。結晶は、固体状態の物質の一形態であり、無定形固体状態または液晶状態などの他の形態とは明確に異なる。本明細書に記載されるポリペプチドの塩形態または結晶は、異なる形態（例えば粉末形態）で製造されているポリペプチドの１つ以上の生物学的機能を保持する。いくつかの実施形態では、塩形態はトリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、または塩酸塩である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、塩形態で存在し、室温で少なくとも１か月にわたって安定である。ある実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、２〜８℃で少なくとも１か月にわたって安定である。
【０１３４】
本明細書に記載されるポリペプチドは、例えば所与のポリペプチドの細胞透過性、溶解性、及び安定性を改善することで知られている１つ以上の化学部分にコンジュゲートされていてもよい。「コンジュゲート」という用語は、第２の化学部分に化学的に連結しているポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、本ポリペプチドは、１つ以上の修飾、例えば、細胞透過性増加部分及び細胞標的化部分にコンジュゲートされている。これらの分類における様々な修飾が当該技術分野において公知である。例えば、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＰＥＧ化されていてもよく、これは、細胞取り込みを促進し、生物学的利用率を増加させ、血液循環及び半減期を増加させ、薬物動態を変化させ、免疫原性を減少させ、かつ／または必要な投与頻度を減少させることで知られる修飾である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、Ａｎｔ８（アンテナペディア８マーペプチド）、ＴＡＴペプチド（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ）、または１つ以上のβ−アラニン単位にコンジュゲートされている。
【０１３５】
様々な実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドは、薬剤にコンジュゲートされていてもよい。ある実施形態では、この薬剤は、イムノアドヘシン分子、造影剤、治療剤、または細胞傷害剤である。一実施形態において、造影剤は、放射標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、またはビオチンである。別の実施形態では、放射標識は、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、または１５３Ｓｍである。さらに別の実施形態では、治療剤または細胞傷害剤は、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、抗血管新生薬、有糸分裂阻害剤、アントラサイクリン、毒素、またはアポトーシス剤、抗癌剤、免疫抑制剤、または免疫反応刺激剤である。
【０１３６】
様々な実施形態において、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする単離された核酸も提供される。また、本明細書に開示される単離された核酸を含むベクター（例えば発現ベクター）も提供される。
【０１３７】
別の態様では、本明細書に開示されるベクターで宿主細胞が形質転換される。一実施形態において、宿主細胞は、原核細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉである。別の実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、例えば、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、または真菌細胞である。一実施形態において、宿主細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳ０、ＳＰ２、ＰＥＲ．Ｃ６を含むがこれらに限定されない哺乳動物細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの真菌細胞、またはＳｆ９などの昆虫細胞である。
【０１３８】
様々な実施形態において、本明細書に開示されるポリペプチドは、本ポリペプチドを産生するのに十分な条件下の培養培地で本明細書に開示される宿主細胞のうちのいずれか１つを培養することによって調製することができる。
【０１３９】
５．  薬学的組成物
様々な実施形態において、本明細書に開示されるポリペプチドのうちの１つ以上を、単独で、あるいは他の予防薬、治療剤、及び／または薬学的に許容される担体と組み合わせて含む、薬学的組成物が提供される。いくつかの実施形態では、本薬学的組成物は、本明細書に記載される１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のポリペプチドを含み得る。本明細書に提供されるポリペプチドを含む薬学的組成物は、限定されないが、障害の診断、検出、もしくは監視、障害もしくはその１つ以上の症状の防止、処置、もしくは寛解、及び／または研究において使用するためのものである。
【０１４０】
「薬学的に許容される担体」とは、例えば、対象への投与に好適な「薬学的組成物」を構成するために本明細書に記載されるポリペプチドと併用される、ありとあらゆる溶媒、固体、半固体、液体充填剤、希釈剤、被包材料、製剤化補助剤、媒体、等張剤、及び吸収遅延剤を指す。薬学的に活性な物質にそのような媒体及び薬剤を使用することは、当該技術分野において周知である。補足的な活性化合物を組成物に組み込むこともできる。薬学的に許容される担体は、組成物の使用及び／または投与経路に基づいて選択され得る。
【０１４１】
本薬学的組成物は、例えば、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、粉末、または顆粒などの、多くの可能な剤形のうちのいずれに製剤化されてもよい。本薬学的組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、または混合媒体として製剤化されてもよい。いくつかの実施形態では、本薬学的組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液として製剤化されてもよい。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本薬学的組成物は、溶液として製剤化されてもよい。例えば、本明細書に記載されるポリペプチドは、非緩衝溶液中、例えば、食塩水中、水中、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、本ポリペプチドは、好適な緩衝溶液中で投与されてもよい。例えば、緩衝溶液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。いくつかの実施形態では、緩衝溶液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）であってもよい。本ポリペプチドを含有する緩衝溶液のｐＨ及び重量オスモル濃度は、対象への投与に好適となるように調整され得る。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本薬学的組成物は、水性媒体、非水性媒体、または混合媒体中の懸濁液として製剤化されてもよい。いくつかの実施形態では、本薬学的組成物は、水及びＤＭＳＯを含む混合媒体で製剤化される。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロース、ソルビトール、及び／またはデキストランといった、懸濁液の粘度を増加させる物質をさらに含有してもよい。懸濁液は、安定剤を含有してもよい。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本薬学的組成物は、インビボ投与のために使用され、無菌であってもよい。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成され得る。
【０１４５】
様々な実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドを含む薬学的組成物は、少なくとも１つの追加の薬剤をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の薬剤は、チェックポイント阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、及び抗癌薬のうちの１つ以上から選択される。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬学的組成物は、チェックポイント阻害剤を含む。一実施形態において、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、または抗ＣＴＬＡ４抗体である。一実施形態において、チェックポイント阻害剤は、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、またはＣＤ１３８などの刺激性チェックポイント分子を標的とする。さらに別の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、例えば、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂリンパ球及びＴリンパ球のアテニュエーター（ＢＴＬＡ）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）、ＶＩＳＴＡ（Ｃ１０ｏｒｆ５４）、またはＴ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子などの阻害性チェックポイント分子を標的とする。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、ＥＧＦＲ阻害剤を含む。一実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、パニツムマブ、バンデタニブ、またはセツキシマブである。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬学的組成物は、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ阻害剤を含む。一実施形態において、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ阻害剤は、パゾパニブ、ベバシズマブ、ソラフェニブ、スニチニブ、アキシチニブ、ポナチニブ、レゴラフェニブ、バンデタニブ、カボザンチニブ、ラムシルマブ、レンバチニブ、またはｚｉｖ−アフリベルセプトである。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬学的組成物は、抗癌薬を含む。抗癌薬は、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ドキソルビシン、ムスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン、プレドニゾロン、ダカルバジン、ブレオマイシン、エトポシド、シスプラチン、エピルビシン、カペシタビン、フォリン酸、アクチノマイシン、全トランス型レチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、クロランブシル、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルカプトプリン、ミトキサントロン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、及びオキサリプラチンから選択され得る。
【０１５０】
Ｃ．  ＢＣＬ９のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドの生物学的機能
本開示は、安定化ペプチドを含む、ヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドまたはその変異体を包含し、このポリペプチドは、次の分類のうちの１つ以上における好ましい生物学的機能を呈する：（ａ）ＢＣＬ９に対するポリペプチドの結合動態（オン速度、オフ速度、及び親和性）、（ｂ）様々な生化学アッセイ及び細胞バイオアッセイにおける効力、（ｃ）関連性のある腫瘍モデルにおけるインビボでの有効性、（ｄ）薬物動態及び薬物動力の特性、ならびに（ｅ）毒性学的特性。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、上記に列記した分類のうちのいくつかまたは各々における好ましい生物学的機能、例えば、細胞ベースのＷｎｔ及び／またはβ−カテニン転写アッセイを含む様々な生化学アッセイ及び細胞バイオアッセイにおける効力を呈する。「生物学的機能」という用語は、インビトロまたはインビボで測定される本明細書に記載のポリペプチドの作用を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、（１）β−カテニンへのＢＣＬ９の結合を阻害すること、（２）古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を阻害すること、（３）制御性Ｔ細胞の生存期間を減少させること、（４）腫瘍内のＶＥＧＦの発現を減少させること、（５）腫瘍へのＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を増加させること、（６）腫瘍内のＴヘルパー１７（Ｔｈ１７）細胞数を増加させること、（７）腫瘍内の樹状細胞を調節すること、（８）対象に投与されたときに少なくとも２時間超の半減期（Ｔ１／２）を有すること、（９）免疫反応に好ましい腫瘍微小環境を誘導すること、ならびに（１０）腫瘍増殖、癌幹細胞増殖、及び／または腫瘍転移を阻害することから選択される、非ステープルド野生型ヒトＢＣＬ９のＨＤ２ドメインまたは野生型断片と比較して改善された１つ以上の生物学的機能を有する。これらの特性を測定するための様々なアッセイが当該技術分野において公知であり、本明細書で使用され得る。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ＷＸ−０２４は、別のステープルドペプチド、非ステープルド野生型ヒトＢＣＬ９のＨＤ２ドメイン、または野生型断片と比較して改善された、１つ以上の生物学的機能を有し、この生物学的機能は、本明細書に記載の生物学的機能から選択される。いくつかの実施形態では、改善された生物学的機能は、活性（例えばインビトロ及び／またはインビボで測定されるもの）及び薬物動態のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、ＷＸ−０３５は、別のステープルドペプチド、非ステープルド野生型ヒトＢＣＬ９のＨＤ２ドメイン、または野生型断片と比較して改善された、１つ以上の生物学的機能を有し、この生物学的機能は、本明細書に記載の生物学的機能から選択される。いくつかの実施形態では、改善された生物学的機能は、活性（例えばインビトロ及び／またはインビボで測定されるもの）及び薬物動態のうちの１つ以上である。
【０１５３】
本開示は、本ポリペプチドの変異体も包含し、この変異体は、アミノ酸配列及び／または化学構造において野生型ポリペプチドと異なるが、本ポリペプチドの１つ以上の生物学的機能を保持するものである。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、１つ以上の生物学的機能を「改善する」、「増加させる」、「向上させる」、「上昇させる」、「上方制御する」、及び「促進する」という用語は、全て互換的に使用され、１つ以上の生物学的機能のレベルもしくは活性、またはインビトロ及び／もしくはインビボアッセイでのこれらの機能の計測値が、本明細書に記載されるポリペプチドの非存在下で観察されるレベルもしくは活性を超えて増加すること、ならびに／あるいは、ビヒクルもしくは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ヒトＢＣＬ９のＨＤ２ドメイン、ＢＣＬ９とβ−カテニンとの相互作用を媒介するコア機能ドメインを含まないポリペプチド、またはヒトＢＣＬ９のＨＤ２ドメインに由来しない配列を含む対照ポリペプチドなど）よりも高いことを意味する。例えば、いずれの理論にも束縛されるものではないが、本明細書に記載されるポリペプチドは、様々なインビトロアッセイで評価した場合に、例えば、均質時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイにおいて、対照ポリペプチド、例えば非ステープルド野生型ヒトＢＣＬ９のＨＤ２ドメインと比較した場合に、β−カテニンへのＢＣＬ９の結合を阻害することにおいて改善された生物学的機能を有し得る。この文脈において、本明細書に記載されるポリペプチドは、対照ポリペプチドのものと比較して改善されたＫＤ値を有し得るか、または、本明細書に記載されるポリペプチドは、対照ポリペプチドの存在下でβ−カテニンに結合し得、これは、本明細書に記載されるポリペプチドが、対照ポリペプチドと比較して改善された、β−カテニンへのＢＣＬ９の結合を阻害する能力を有することを示す。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドの生物学的機能を評価するために使用されるアッセイは、定量的計測値（複数可）を提供し、開示されるポリペプチドで観察される計測値は、ビヒクル対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ヒトＢＣＬ９のＨＤ２ドメイン）で観察されるものと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、またはそれ以上変化／改善したものである。
【０１５６】
生物学的活性／機能を測定するための様々なアッセイが当該技術分野において公知であり、そのいくつかは、例示のみを目的とした非限定的な例として本明細書に記載されている。
【０１５７】
１．  β−カテニンへのＢＣＬ９の結合
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドまたは変異体は、インビトロ及び／またはインビボでβ−カテニンへのＢＣＬ９の結合を阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドまたは変異体は、ＰｙｇｏとＢＣＬ９との相互作用またはＰｙｇｏ／ＢＣＬ９／β−カテニン複合体の形成を阻害する。Ｐｙｇｏｐｕｓ（Ｐｙｇｏ）及びＬｅｇｌｅｓｓ（Ｌｇｓ）は、正常な発達中のＡｒｍａｄｉｌｌｏ媒介性転写に必須である新たなＷｎｔシグナル伝達成分としてショウジョウバエにおいて発見された（Ｂｅｌｅｎｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２００２）１２９（１７）：４０８９−４１０１）。Ｐｙｇｏ及びＢＣＬ９／Ｌｅｇｌｅｓｓは、正常細胞及び悪性細胞におけるベータ−カテニン／Ａｒｍａｄｉｌｌｏの転写活性を促進することにより、Ｗｎｔシグナルを伝達する。β−カテニンへのＢＣＬ９の結合を阻害するポリペプチドの能力は、当該技術分野において公知の様々なアッセイで評価され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、均質時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）結合アッセイで評価したとき、β−カテニンへのＢＣＬ９の結合を阻害する。このアッセイでは、ポリペプチドが、その標的タンパク質（すなわちβ−カテニン）に結合した別のタグを認識することのできるタグにコンジュゲートされる。ポリペプチドが標的タンパク質に結合し、したがって２つのタグが近接しているとき、シグナルが生成され、これを定量的に読み取ると、ポリペプチドの結合親和性を計算することができる。いくつかの実施形態では、このアッセイにおけるポリペプチドの結合親和性を、対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）の結合親和性と比較することで、対照ポリペプチドの結合親和性と比較して改善された結合親和性が検出され、これは、このポリペプチドがβ−カテニンへのＢＣＬ９の結合を対照ポリペプチドよりも効率的に阻害する可能性が高いことを示す。このアッセイは、タグなしの対照ポリペプチドの存在下または非存在下で行われてもよい。このアッセイは、本明細書に記載されるタグなしポリペプチド（例えばＷＸ−０２４）の存在下または非存在下で、対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）をタグ付けすることによって行われてもよい。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ａｓｓａｙ、ＡＬＰＨＡ）で評価したとき、β−カテニンへのＢＣＬ９の結合を阻害する。このアッセイでは、ポリペプチドをドナービーズにコンジュゲートし、その標的タンパク質（すなわちβ−カテニン）をアクセプタービーズに結合させる。ポリペプチドが標的タンパク質に結合することにより２種のビーズが近接するとシグナルが生成され、ポリペプチドの結合親和性を定量的に計算することができる。いくつかの実施形態では、このアッセイにおけるポリペプチドの結合親和性を、ビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）の結合親和性と比較することで、ビヒクルまたは対照ポリペプチドの結合親和性と比較して改善された結合親和性が検出され、これは、このポリペプチドがβ−カテニンへのＢＣＬ９の結合を対照ポリペプチドよりも効率的に阻害する可能性が高いことを示す。このアッセイは、コンジュゲートされていない対照ポリペプチドの存在下または非存在下で行われてもよい。このアッセイは、本明細書に記載されるコンジュゲートされていないポリペプチド（例えばＷＸ−０２４）の存在下または非存在下で、対照ポリペプチドをコンジュゲートすることによって行われてもよい。
【０１５９】
様々な実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドは、Ｗｎｔ転写アッセイで評価したとき、β−カテニンへのＢＬＣ９の結合を阻害する。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ転写アッセイは、細胞ベースのアッセイである。いくつかの実施形態では、細胞ベースのＷｎｔ転写アッセイは、ＧｅｎｅＢＬＡｚｅｒ（登録商標）ベータ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）レポーターアッセイである。様々な細胞株、形質転換細胞株、または健常な対象もしくは疾患を患う対象に由来する初代細胞をこのアッセイで使用することができる。生存のために古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達に依存することで知られる細胞株を使用してもよい。いくつかの実施形態では、ＣｅｌｌＳｅｎｓｏｒ（商標）ＬＥＦ／ＴＣＦ−ｂｌａ  ＨＣＴ−１１６細胞がこのレポーターアッセイで使用される。これらの細胞は、ＨＣＴ−１１６細胞に安定に組み込まれたβ−カテニン／ＬＥＦ／ＴＣＦ応答エレメントの制御下にあるベータ−ラクタマーゼ（ＢＬＡ）レポーター遺伝子を含有する。これらの細胞は恒常的にベータ−ラクタマーゼを発現するため、このアッセイにおいてβ−カテニンへのＢＣＬ９の結合を阻害するポリペプチドを付加することは、ベータ−ラクタマーゼの産生の低減につながる。したがって、ポリペプチドがＷｎｔ転写を抑制する効率は、このアッセイにおいて定量的に計算され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＧｅｎｅＢＬＡｚｅｒ（登録商標）ベータ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）レポーターアッセイで測定した場合にＷｎｔ転写を抑制し、これは、β−カテニンへのＢＣＬ９の結合を阻害するポリペプチドの能力を示す。いくつかの実施形態では、このアッセイで試験されたポリペプチドは、Ｗｎｔ転写の抑制において、ビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）のものと比較して改善されたＩＣ５０を示し、これは、開示されるポリペプチドがβ−カテニンへのＢＣＬ９の結合をビヒクルまたは対照ポリペプチドよりも効率的に阻害する可能性が高いことを示す。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、細胞生存率アッセイで評価したとき、β−カテニンへのＢＬＣ９の結合を阻害する。いくつかの実施形態では、細胞生存率アッセイは、細胞の生存率が定量的に測定されるＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ発光アッセイである。様々な細胞株、形質転換細胞株、または健常な対象もしくは疾患を患う対象に由来する初代細胞をこのアッセイで使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、このアッセイにおいてビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）よりも効率的に細胞増殖を抑制し、これは、開示されるポリペプチドがβ−カテニンへのＢＣＬ９の結合をビヒクルまたは対照ポリペプチドよりも効率的に阻害する可能性が高いことを示す。
【０１６１】
２．  古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドは、古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を阻害することができる。古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、インビトロアッセイ及び／またはインビボアッセイで評価することができる。いくつかの実施形態では、古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達に対する本明細書に記載のポリペプチドの効果は、細胞ベースのＷｎｔ転写アッセイ、例えばＧｅｎｅＢＬＡｚｅｒ（登録商標）ベータ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）レポーターアッセイにおいて評価される。ＧｅｎｅＢＬＡｚｅｒ（登録商標）ベータ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）レポーターアッセイは、古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の強度を、β−カテニン／ＬＥＦ／ＴＣＦ応答エレメントを制御するその能力によって測定するものであり、したがって、試験薬剤がその転写標的の古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達制御の強度を減衰または増加させることができるかどうかを評価するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＧｅｎｅＢＬＡｚｅｒ（登録商標）ベータ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）レポーターアッセイで測定した場合にＷｎｔ転写を抑制し、これは、このポリペプチドが古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を阻害し得ることを示す。いくつかの実施形態では、このアッセイにおけるポリペプチドは、Ｗｎｔ転写の抑制において、ビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）のものと比較して改善されたＩＣ５０を示し、これは、本明細書に記載のポリペプチドが、ビヒクルまたは対照ポリペプチドと比較して改善された、古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を阻害する能力を有することを示す。
【０１６２】
本明細書に記載されるポリペプチドが古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を阻害する能力は、古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達によって転写的に制御される標的遺伝子の遺伝子発現及び／またはタンパク質発現を測定することによって評価することもできる。標的遺伝子の発現は、本明細書に記載されるポリペプチドと接触した形質転換細胞またはそのようなポリペプチドを投与された対象において評価され得る。標的遺伝子としては、例えば、ｃ−ｍｙｃ、ｃｃｎｄ１、ｃｄ４４、ＬＧＲ５、ＶＥＧＦＡ、ＡＸＩＮ２、及びＬＥＦ１が挙げられる。古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達に関連する１つ以上の標的遺伝子の発現レベルは、当該技術分野において公知の方法、例えば、細胞染色、フローサイトメトリ、ウエスタンブロッティング、及び／またはリアルタイム定量ＰＣＲ（ｒｔ−ｑＰＣＲ）分析を使用して分析することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、細胞における１つ以上の標的遺伝子の発現を低減させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）よりも効率的に１つ以上の標的遺伝子の発現を低減させる。
【０１６３】
３．  制御性Ｔ細胞の生存
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、制御性Ｔ細胞の生存期間を減少させる。いくつかの実施形態では、対象に投与されると、本ポリペプチドは、制御性Ｔ細胞の生存期間を局所的に（例えば腫瘍内で）かつ／または全身的に（例えば血液中で）減少させる。いくつかの実施形態では、対象に投与されると、本ポリペプチドは、制御性Ｔ細胞の生存期間を対照ポリペプチドと比較して減少させる。様々なマーカー、例えばＣＤ４、ＦＯＸＰ３、及びＣＤ２５が、制御性Ｔ細胞で発現することで知られている。本明細書に開示されるポリペプチドが制御性Ｔ細胞の生存期間を減少させる能力は、血液及び／または腫瘍などの特定の組織において存在する制御性Ｔ細胞の総数を計数することによって評価され得る。例えば、本明細書に記載されるポリペプチドと接触した対象から得られた試料を、制御性Ｔ細胞に関連するマーカーを検出する抗体で染色してもよい。そのようなマーカーを検出する抗体で試料を処理及び標識し、フローサイトメトリによって分析してもよい。そのようなマーカーの遺伝子及び／またはタンパク質の発現は、試料中で判定し、ウエスタンブロッティング及び／またはｒｔ−ｑＰＣＲによって分析することができる。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、対象に投与されると、血液及び／または腫瘍における制御性Ｔ細胞の数を低減させる。いくつかの実施形態では、本ポリペプチドは、本ポリペプチドを投与された対象から得られた１つ以上の試料中で、制御性Ｔ細胞に関連する１つ以上のマーカーの発現を低減させる。いくつかの実施形態では、本ポリペプチドは、インビボで評価したとき、１つ以上のマーカーの発現をビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）と比較してさらに低減させる。
【０１６５】
４．  腫瘍内のＶＥＧＦ発現
ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドは、腫瘍を有する対象に投与されると、腫瘍内のＶＥＧＦの発現を減少させる。腫瘍試料中のＶＥＧＦの遺伝子発現及び／またはタンパク質発現を測定するためには様々なアッセイを用いることができる。例えば、対象を本ポリペプチドに接触させた後、腫瘍細胞を収集し、抗ＶＥＧＦ抗体で染色してＶＥＧＦタンパク質を検出してもよい。また、例えばｒｔ−ｑＰＣＲによって細胞を分析して、ＶＥＧＦの遺伝子発現を判定してもよい。ＶＥＧＦ発現の変化を示す他のアッセイを用いてもよい。例えば、本明細書に記載されるポリペプチドと接触した対象からの腫瘍試料を分析して、ＶＥＧＦによって制御される様々な血管新生マーカーを検出してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）よりも効果的にＶＥＧＦの発現を減少させる。
【０１６６】
５．  腫瘍へのＣＤ４＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、腫瘍を有する対象に投与されると、腫瘍へのＣＤ４＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を増加させる。腫瘍へのＣＤ４＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤は、腫瘍または腫瘍からの試料（例えば生検）中に存在するＣＤ４＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の総数を計数することによって評価することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、腫瘍を有する対象に投与されると、腫瘍へのＣＤ４＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を、ビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）よりも効果的に増加させる。様々なマーカー、例えばＣＤ４及びＣＤ４５が、ＣＤ４＋Ｔ細胞（別称、ヘルパーＴ細胞）で発現することで知られている。様々なマーカー、例えばＣＤ８及びＣＤ４５が、ＣＤ８＋Ｔ細胞（別称、細胞傷害性Ｔ細胞）で発現することで知られている。腫瘍へのＣＤ４＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を増加させるポリペプチドの能力は、腫瘍を有する対象にポリペプチドを投与することによって、インビボで評価することができる。対象から腫瘍試料を収集し、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞に関連するマーカーを検出する抗体で染色してもよい。例えばそのようなマーカーを検出する抗体で試料を処理及び標識し、例えばフローサイトメトリによって分析してもよい。そのようなマーカーの遺伝子及び／またはタンパク質の発現は、試料中で判定し、ウエスタンブロッティング及び／またはｒｔ−ｑＰＣＲによって分析することもできる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）と比較して、腫瘍内のＣＤ４＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の総量を増加させる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、対象に投与されると、血液中のＣＤ４＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の総数を増加させる。ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の全身的な増加は、特定の組織、例えば腫瘍へのＣＤ４＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤の増加も示し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）と比較して、インビボでの循環ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の量を増加させる。
【０１６８】
６．  腫瘍へのＴヘルパー１７細胞の浸潤
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、腫瘍を有する対象に投与されると、腫瘍へのＴヘルパー１７細胞の浸潤を増加させる。腫瘍へのＴヘルパー１７細胞の浸潤は、腫瘍内に存在するＴヘルパー１７細胞の総数を計数することによって評価することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、腫瘍を有する対象に投与されると、腫瘍へのＴヘルパー１７細胞の浸潤を、ビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）と比較して増加させる。様々なマーカー、例えばＩＬ−１７が、Ｔヘルパー１７細胞で発現することで知られている。腫瘍へのＴヘルパー１７細胞の浸潤を増加させるポリペプチドの能力は、腫瘍を有する対象にポリペプチドを投与することによって、インビボで評価することができる。対象から腫瘍試料を収集し、例えば、Ｔヘルパー１７細胞に関連するマーカーを検出する抗体で染色してもよい。そのようなマーカーを検出する抗体で試料を処理及び標識し、フローサイトメトリによって分析してもよい。そのようなマーカーの遺伝子及び／またはタンパク質の発現は、試料中で判定し、ウエスタンブロッティング及び／またはｒｔ−ｑＰＣＲによって分析することもできる。試料を分析して、試料中に存在するＩＬ−１７の量を検出してもよい。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、対象に投与されると、血液中のＴヘルパー１７細胞の総量を増加させる。Ｔヘルパー１７細胞の全身的な増加は、特定の組織、例えば腫瘍へのＴヘルパー１７細胞の浸潤の増加を示し得る。Ｔヘルパー１７細胞の全身的な増加は、対象から収集された血液試料中に存在するＩＬ−１７の量を測定することによって評価することができる。いくつかの実施形態では、本ポリペプチドは、ビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）と比較して、対象の循環Ｔヘルパー１７細胞の量を増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、対照ポリペプチドと比較して、対象の循環ＩＬ−１７の量を増加させる。
【０１７０】
７．  腫瘍内の樹状細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、腫瘍を有する対象に投与されると、腫瘍内に存在する樹状細胞を調節する。腫瘍内に存在する樹状細胞の数は、例えば、樹状細胞に関連する１つ以上のマーカーを認識する抗体で腫瘍を染色することによって評価することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、腫瘍を有する対象に投与されると、腫瘍内に存在する樹状細胞を、ビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）よりも効果的に減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、腫瘍を有する対象に投与されると、腫瘍内に存在する樹状細胞を、ビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）よりも効果的に増加させる。様々なマーカー、例えばＣＤ１１ｃが、樹状細胞で発現することで知られている。腫瘍内の樹状細胞を減少させるポリペプチドの能力は、対象にポリペプチドを投与することによって、インビボで評価することができる。対象から腫瘍試料を収集し、樹状細胞に関連するマーカーを検出する抗体で染色してもよい。例えばそのようなマーカーを検出する抗体で試料を処理及び標識し、例えばフローサイトメトリによって分析してもよい。そのようなマーカーの遺伝子及び／またはタンパク質の発現は、例えばウエスタンブロッティング及びｒｔ−ｑＰＣＲによって分析される。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、対象に投与されると、血液中の樹状細胞の総量を減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、対象に投与されると、血液中の樹状細胞の総量を増加させる。樹状細胞の全身的な減少は、特定の組織、例えば腫瘍内の樹状細胞の量も減少していることを示し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）と比較して、対象の循環樹状細胞の量を減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）と比較して、対象の循環樹状細胞の量を増加させる。
【０１７２】
８．  対象における半減期
様々な実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドは、ビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）と比較して改善された１つ以上の薬物動態パラメータを有する。そのような薬物動態パラメータとしては、例えば、最大観察濃度（Ｃｍａｘ）、最大濃度到達時間（Ｔｍａｘ）、終末相半減期（Ｔ１／２）、全身クリアランス（ＣＬ）、分布容積（Ｖｚ）、投薬時間から最後の観察可能な濃度までの曲線下面積（ＡＵＣ０−ｔ）、投薬時間から無限大まで外挿した曲線下面積（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）、及び生物学的利用率を挙げることができる。
【０１７３】
薬物動態を評価するための方法は、当該技術分野において公知である。例えば、本明細書に記載されるポリペプチドを投与された対象からの血液試料は、投与後、１、２、４、６、８、１２、及び２４時間の時点で得ることができる。血液試料中のポリペプチドの濃度は、様々な分析ツール、例えばＬＣ／ＭＳによって分析することができる。各時点でのポリペプチドの濃度に基づいて、薬物動態パラメータが計算される。本明細書で使用される場合、「最大観察濃度（Ｃｍａｘ）」という用語は、ポリペプチドが投与後に達成する最大の血清濃度を指す。Ｃｍａｘの概念に関連して、最大濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は、ポリペプチドが最大血清濃度に達するまでにかかる時間である。「終末相半減期（Ｔ１／２）」及び「半減期（Ｔ１／２）」という用語は互換的に使用され、ポリペプチドがその血清濃度の半分を喪失するまでにかかる時間を指す。全身クリアランス（ＣＬ）とは、ポリペプチドが完全に排除された血液の単位時間当たりの体積を表す。「分布容積」という用語は、血液中で観察されるものと同じ濃度で対象に投与されるポリペプチドの総量を含有するために必要とされる、理論的に計算される容積を指す。「生物学的利用率」という用語は、薬物が生体系に吸収される程度及び速度または生理学的活性部位で利用可能になる程度及び速度を指す。生物学的利用率は、安定性、溶解性、免疫原性、及び薬物動態を含む上述の特性のうちのいくつかの機能であり得、当業者に公知の方法を使用して評価することができる。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、対照ポリペプチドと比較して改善された対象の半減期を有する。いくつかの実施形態では、本ポリペプチドは、対象に投与されると、少なくとも０．５、１、２、３、５、もしくは８時間超の、またはこれらの間の任意の期間の半減期を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、対象に投与されると、少なくとも２時間超の半減期を有する。ポリペプチドの薬物動態パラメータは、例えばマウス、ラット、またはヒトを含む哺乳動物において評価することができる。このパラメータは、様々な投与経路、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、及び筋肉内の投与経路を使用して評価することもできる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドの薬物動態パラメータは、マウスにおいて評価される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドの薬物動態パラメータは、本ポリペプチドを皮下投与したマウスにおいて評価される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドの薬物動態パラメータは、ヒトにおいて評価される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドの薬物動態パラメータは、ヒトにおいて皮下投与後に評価される。
【０１７５】
９．  免疫反応に好ましい腫瘍微小環境
様々な実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドは、免疫反応に好ましい腫瘍微小環境を誘導する。様々な実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドは、ビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）よりも免疫反応に好ましい腫瘍微小環境を誘導する。
【０１７６】
本明細書で使用される場合、「腫瘍微小環境」という用語は、腫瘍、血管、免疫細胞、シグナル伝達分子、及び細胞外マトリックスに動員される様々な細胞を含む、腫瘍内及び／またはその周囲の細胞微小環境を意味する。例えば、Ｂａｌｋｗｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ（２０１２）１２５：５５９１−５５９６を参照されたい。本明細書に記載されるポリペプチドは、腫瘍内及び／またはその周囲の免疫細胞及び／またはシグナル伝達分子の組成を変化させ、それによって腫瘍周囲の微小環境における免疫反応を誘発し得る。
【０１７７】
腫瘍微小環境を評価するためには様々なパラメータを使用することができる。例えば、腫瘍組織内及び／またはその周囲の細胞傷害性Ｔ細胞と制御性Ｔ細胞との比の増加は、腫瘍微小環境が免疫反応に好ましいことを示し得る。腫瘍組織内及び／またはその周囲の樹状細胞及び／または制御性Ｔ細胞の量の減少も、腫瘍微小環境が免疫反応に好ましいことを示し得る。他のパラメータには、末梢血中の循環Ｔ細胞の増加、ならびに腫瘍組織内及び／またはその周囲のＴヘルパー１７細胞と制御性Ｔ細胞との比の増加が含まれる。これらのパラメータは、腫瘍微小環境が免疫反応に好ましいことを示し得る。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、腫瘍微小環境における細胞傷害性Ｔ細胞の量と制御性Ｔ細胞の量との比を増加させることができる。いくつかの実施形態では、本ポリペプチドによって引き起こされる比の変化は、ビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）によって引き起こされるものを上回る。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、腫瘍微小環境におけるＴヘルパー１７細胞と制御性Ｔ細胞との比を増加させることができる。ある実施形態では、本ポリペプチドによって引き起こされる比の変化は、ビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）によって引き起こされるものを上回る。
【０１８０】
１０．  腫瘍増殖、癌幹細胞増殖、及び／または腫瘍転移
Ｗｎｔシグナル伝達は腫瘍増殖の制御因子であるため、β−カテニンへのＢＣＬ９の結合に影響を及ぼす処置、例えば本明細書に記載のＢＣＬ９ペプチドのＨＤ２ドメインの安定化ペプチドなどの有効性は、動物モデルにおいて評価することができる。
【０１８１】
安定化ＢＣＬ９ペプチドのインビボでの有効性は、例えばＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを使用したヒト癌モデルにおいて評価することができ、これは、ヒト癌細胞の異種移植片がこのマウスにおいて増殖して腫瘍になるためである。例えば、ヒト結腸癌組織に由来する市販の細胞株であるＣｏｌｏ３２０ＤＭ腫瘍細胞の皮下接種を使用して、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて腫瘍を形成することができる。本明細書に開示されるポリペプチドのインビボでの有効性を評価するためには、さらなるインビボモデルも利用可能である。例えば、ヒトＤＬＤ−１結腸癌細胞をヌードマウスに移植して腫瘍増殖を評価することができる。結腸癌のＣＴ２６同系マウスモデルは、インタクトな免疫系の背景における腫瘍増殖の評価を可能にするため、これを使用することもできる。他の種類の癌細胞、例えばＢ１６黒色腫、４Ｔ１乳癌、Ｒｅｎｃａ腎癌、及びＬｅｗｉｓ肺細胞肺癌細胞をこれらの公知の動物モデルで使用して、本明細書に開示されるポリペプチドのインビボでの有効性を評価することもできる。
【０１８２】
本明細書に記載されるポリペプチドを１つ以上の動物モデルに投与することにより、腫瘍増殖をインビボで減少させることにおける本ポリペプチドの効果を評価することができる。いくつかの実施形態では、本ポリペプチドは、ビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）よりも効果的にインビボでの腫瘍増殖を阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドを投与された対象の腫瘍量／体積は、対照ポリペプチドを投与された対象のものより、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％小さい。安定化ＢＣＬ９ペプチドでの処置に関する動物データから、例えば、Ｗｎｔシグナル伝達のマーカーを有する組織試料の染色によって、このペプチドがＷｎｔシグナル伝達を阻害する能力を評価することができる。こうしたＷｎｔシグナル伝達の下流マーカーとしては、例えば、Ａｘｉｎ２及びＣＤ４４が挙げられる。
【０１８３】
同所性マウスモデルを使用して、本明細書に記載されるポリペプチドが腫瘍転移に及ぼす影響を評価してもよい。例えば、ルシフェラーゼ構築物を保有する細胞を同所性動物モデルに注射し、次いでそれに割り当てられた処置を施してもよい。注射された細胞の存在は、処置された動物それぞれにルシフェリン基質を投与することによって検出され得る。生物発光シグナルの強度を定量的に測定し、細胞増殖の指標として使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、同所性マウスモデルで評価したとき、対照ポリペプチドよりも効果的に腫瘍転移を抑制する。いくつかの実施形態では、本ポリペプチドは、ビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、非ステープルド野生型ＨＤ２ドメインヒトＢＣＬ９）と比較して、同所性マウスモデルにおける腫瘍増殖を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％低減させる。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドが癌幹細胞の増殖に及ぼす影響は、様々な癌幹細胞のバイオマーカーを測定することによって評価され得る。例えば、ＣＤ４４及び／またはＬＧＲ５の発現レベルは、試料中に存在する癌幹細胞の量を示し得る。対象から腫瘍試料を収集し、癌幹細胞に関連するマーカーを検出する抗体で染色してもよい。例えばそのようなマーカーを検出する抗体で試料を処理及び標識し、例えばフローサイトメトリによって分析してもよい。そのようなマーカーの遺伝子及び／またはタンパク質の発現は、例えばウエスタンブロッティング及びｒｔ−ｑＰＣＲによって検出及び分析することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、腫瘍を有する対象に投与されると、腫瘍内のＣＤ４４及び／またはＬＧＲ５の発現レベルを低減させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドは、ＣＤ４４及び／またはＬＧＲ５の発現レベルを、ビヒクルまたは対照ポリペプチド（例えば、ヒトＢＣＬ９タンパク質の非ステープルド野生型ＨＤ２ドメイン）のものよりも効果的に低減させる。
【０１８５】
Ｄ．  安定化ＢＣＬ９ペプチドを用いた処置方法
１．  異常Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を伴う疾患
異常Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、正常細胞の癌性細胞への悪性形質転換に関係付けられてきた（Ｔｈａｋｕｒ  ２０１３を参照されたい）。Ｗｎｔシグナル伝達の活性化及びβ−カテニンの核局在化は、複数のモデルにおいて腫瘍表現型に結び付けられている。
【０１８６】
本開示は、本明細書に開示されるステープルドポリペプチドまたは本ポリペプチドを含む薬学的組成物を対象に投与することによって対象におけるβ−カテニンへのＢＣＬ９の結合を阻害するために使用するための組成物、及びその使用方法を包含する。本開示は、本明細書に開示されるポリペプチドまたは薬学的組成物を投与することによって対象における古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を阻害することも包含する。本開示は、本明細書に記載されるポリペプチドまたは薬学的組成物を対象に投与することによって対象の疾患を処置する方法をさらに包含する。この疾患は、癌、または異常な古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達に関連する他の腫瘍性疾患であり得る。
【０１８７】
本明細書で使用される場合、「患者」及び「対象」は、疾患、障害、もしくは病態について処置もしくは評価されているか、疾患、障害、もしくは病態を発症するリスクがあるか、または疾患、障害、もしくは病態を有するもしくは患っている、哺乳動物またはヒトなどの動物を互換的に指す場合がある。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、そのような疾患、障害、または病態は、異常な古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達に関連し、かつ／または古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害から利益を受けることのある疾患であり得る。いくつかの実施形態では、そのような疾患、障害、または病態は、癌である。いくつかの実施形態では、癌は、ＢＣＬ９及び／またはβ−カテニンが高度に発現する癌である。いくつかの実施形態では、癌は、ＢＣＬ９及びβ−カテニンが癌細胞の核内に共局在化する癌である。いくつかの実施形態では、癌は、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）、眼癌、直腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、口腔癌、良性腫瘍及び悪性腫瘍、胃の癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、子宮体、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、腎癌、脳／ＣＮＳ癌、咽喉癌、多発性骨髄腫、皮膚黒色腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、基底細胞癌及び扁平上皮癌、小細胞肺癌、絨毛癌、横紋筋肉腫、血管肉腫、血管内皮腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、口／咽頭癌、食道癌、喉頭癌、リンパ腫、神経線維腫症、結節性硬化症、血管腫、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、及びリンパ脈管新生から選択される。いくつかの実施形態では、癌は、結腸直腸癌である。いくつかの実施形態では、癌は、胃癌である。いくつかの実施形態では、癌は、卵巣癌である。いくつかの実施形態では、癌は、肝細胞癌である。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌である。いくつかの実施形態では、癌は、前立腺癌である。いくつかの実施形態では、癌は、皮膚黒色腫である。いくつかの実施形態では、癌は、肺癌である。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドもしくは変異体、またはそのようなポリペプチドを含む薬学的組成物のいずれも、疾患、例えば上に列記した癌の処置のために使用され得る。ある実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体は、ＷＸ−０２４である。いくつかの実施形態では、本ポリペプチドまたは変異体は、ＷＸ−０３５である。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、対象における腫瘍体積は、本明細書に記載されるポリペプチドまたは本ポリペプチドを含む薬学的組成物の１つ以上の投与量の投与の後に、ビヒクルまたは非ステープルドペプチドで処置された対象のものと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％超（またはこれらの間の任意の割合）低減する。ある特定の実施形態において、この低減は、１週間、２週間、３週間、またはそれ以上（またはこれらの間の任意の期間）の投与の後に達成される。いくつかの実施形態では、対象の腫瘍体積は、２週間の投与後に、ビヒクルまたは非ステープルドペプチドで処置された対象のものと比較して、５０％超低減する。様々な投与方法に必要な材料及び技術が当該技術分野で利用可能かつ公知であるため、対象に投与するための薬学的組成物の好適な投与量及び／または処方は、当業者によって決定され得る。例えば、Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＡＣＳ，ｐｐ．２２−４５及びＰｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．２４７−３０１を参照されたい。ある実施形態では、ＷＸ−０２４または本ポリペプチドを含む薬学的組成物を投与された対象の腫瘍体積は、２週間の投与後に、ビヒクルまたは非ステープルドポリペプチドで処置された対象のものと比較して、５０％超低減する。ある実施形態では、ＷＸ−０３５または本ポリペプチドを含む薬学的組成物を投与された対象の腫瘍体積は、２週間の投与後に、ビヒクルまたは非ステープルドポリペプチドで処置された対象のものと比較して、１０％〜５０％超低減する。
【０１９１】
様々な実施形態において、「処置」という用語は、対象または細胞の現在の過程を変化させるための対象（例えばヒトなどの哺乳動物）または細胞の処置を含む。処置は、１つ以上の疾患パラメータの変化、例えば、腫瘍体積または当業者に知られる任意の他の腫瘍学的測定値の低減を含む。処置は、例えば、本明細書に記載されるポリペプチドまたはそのようなポリペプチドを含む薬学的組成物の投与を含み、予防的に行われてもよいし、または病理的事象の開始もしくは病原体との接触の後に行われてもよい。また、処置されている疾患もしくは病態の進行速度を低減させること、その疾患もしくは病態の発症を遅延させること、またはその発症の重症度を低減させることを対象とし得る「予防的」処置も含まれる。「処置」または「予防」は、必ずしも疾患もしくは病態または関連症状の完全な根絶、治癒、または防止を示すものではない。様々な実施形態において、「処置」という用語は、癌を患う対象における病理学的プロセスまたは症状を緩和すること、減速させること、または逆転させることを含み得る。いくつかの実施形態では、「処置」という用語は、癌を患う対象における腫瘍負荷を減少させることを含み得る。いくつかの実施形態では、「処置」という用語は、癌の少なくとも１つの症状または測定可能なパラメータを改善させることを含み得る。生物学的及び／または生理学的パラメータが、悪性疾患の病理学的プロセスを利用するために使用され得ることは、当業者には明らかであろう。
【０１９２】
処置及び処置の測定パラメータは、本ポリペプチドもしくは薬学的組成物の単独投与、または１つ以上の追加の治療剤との併用投与、例えば単一のボーラスまたは別々の連続投与の後に評価され得る。追加の薬剤は、本明細書で言及されているかまたは当業者に公知である追加の治療剤のうちのいずれであってもよい。本ポリペプチド及び／または本ポリペプチドを含む薬学的組成物、及び／または追加の薬剤は、選択されたレジメンに応じて、１回または複数回投与されてもよい。
【０１９３】
本開示はまた、対象の疾患の処置に使用するための、本明細書に開示されるポリペプチドまたは薬学的組成物を包含する。ある実施形態では、この疾患は、古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の抑制から利益を受ける場合がある。いくつかの実施形態では、この疾患は癌である。
【０１９４】
本開示は、対象の疾患を処置するための医薬の製造における、本明細書に開示されるポリペプチドまたは薬学的組成物の使用をさらに包含する。ある実施形態では、この疾患は、古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の抑制から利益を受ける場合がある。ある実施形態では、この疾患は癌である。
【０１９５】
別の実施形態では、処置される疾患は癌ではない。ある特定の実施形態において、この疾患は、骨密度異常、眼の血管障害、家族性滲出性硝子体網膜症、早期冠疾患、アルツハイマー病、常染色体優性部分的無歯症、網膜血管新生、骨形成不全症、Ｔｅｔｒａ−Ａｍｅｌｉａ症候群、ミュラー管退縮及び男性化、ＳＥＲＫＡＬ症候群、糖尿病ＩＩ型、Ｆｕｈｒｍａｎｎ症候群、歯・爪・皮膚異形成（ｏｄｏｎｔｏ−ｏｎｙｃｈｏ−ｄｅｒｍａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、肥満、裂手／足形成異常、尾部重複（ｃａｕｄａｌ  ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、歯非形成、骨格形成異常、部分皮膚低形成、常染色体劣性無爪症、神経管欠損、または硬結性骨化症及びＶａｎ  Ｂｕｃｈｅｍ病である。
【０１９６】
２．  安定化ＢＣＬ９ペプチドの投与
非架橋（すなわち野生型）ペプチドは通常インビボで非常に急速に代謝されるため、ペプチド安定化は対象に投与されたときのこれらのペプチドの薬物動態プロファイルを改善させ得る。本明細書で使用される場合、「投与すること」または「投与」という用語は、局所投与または全身投与のいずれかによる本明細書に記載されるポリペプチドの送達を含む。投与は、局所（眼部ならびに膣及び直腸送達を含む粘膜を含む）、肺（例えば、ネブライザー、気管内、鼻腔内を含む粉末またはエアロゾルの吸入または吹込によるもの）、上皮、経皮、経口、または非経口によるものであり得る。非経口投与には、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内注射もしくは注入、または頭蓋内、例えばくも膜下腔内または脳室内の投与が含まれる。投与経路の組み合わせも想定される。ステープルドペプチドは、治療有効量で投与され得る。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドまたは薬学的組成物は、静脈内投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドまたは薬学的組成物は、腹腔内投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドまたは薬学的組成物は、毎日、毎週、毎月、または対象の疾患を処置するために使用され得る任意の好適な間隔で投与される。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、安定化ペプチドの投与は、対象におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施形態では、安定化ＢＣＬ９ペプチドの投与は、β−カテニンへのＢＣＬ９の結合を阻害する。いくつかの実施形態では、安定化ＢＣＬ９ペプチドの投与は、古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施形態では、安定化ＢＣＬ９ペプチドの投与は、対象の疾患を処置する。
【０１９９】
３．  安定化ＢＣＬ９ペプチドを用いた併用療法
ある特定の実施形態において、本明細書に開示されるポリペプチドまたは薬学的組成物は、少なくとも１つの追加の薬剤と共に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の薬剤は、チェックポイント阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、抗癌薬から選択される。追加の薬剤は、ステープルドペプチドと同じ薬学的組成物で投与されてもよく、またはそれらは順次投与されてもよい。ステープルドペプチド及び追加の薬剤は、治療有効量で投与され得る。
【０２００】
ある特定の実施形態において、追加の薬剤は、チェックポイント阻害剤である。チェックポイント遮断抗体などのチェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞免疫の正常な負の制御因子を遮断し、それにより、癌を制御する免疫系の能力を一部の患者において増加させる（Ｋｙｉ  ａｎｄ  Ｐｏｓｔｏｗ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８８：３６８−３７６（２０１３）を参照されたい）。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドまたは薬学的組成物と共に投与されるチェックポイント阻害剤は、ＰＤ１、ＰＤＬ−１、及び／またはＣＴＬＡ−４を阻害する。一実施形態において、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、及び／または抗ＣＴＬＡ４抗体である。ある特定の実施形態において、チェックポイント阻害剤は、チェックポイント遮断抗体、例えばイピリムマブ、ニボルマブ、またはＭＫ−３４７５である。一実施形態において、チェックポイント阻害剤は、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、またはＣＤ１３８などの刺激性チェックポイント分子を標的とする。さらに別の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、例えば、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂリンパ球及びＴリンパ球のアテニュエーター（ＢＴＬＡ）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）、ＶＩＳＴＡ（Ｃ１０ｏｒｆ５４）、またはＴ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子などの阻害性チェックポイント分子を標的とする。
【０２０１】
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤は、非小細胞肺癌ならびに他の種類の癌において、特に、ＥＧＦＲまたはＡＬＫ（未分化リンパ腫受容体チロシンキナーゼ）遺伝子に遺伝子変異を有する患者において有効性を示している。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドまたは薬学的組成物と共に投与される追加の治療剤は、ＥＧＦＲ阻害剤である。ある特定の実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、パニツムマブ、バンデタニブ、またはセツキシマブである。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドまたは薬学的組成物は、ＥＧＦＲまたはＡＬＫ遺伝子の分子異常を有することが判定されている患者において、ＥＧＦＲ阻害剤と一緒に投与される。
【０２０２】
一実施形態において、ＶＥＧＦ及び／またはＶＥＧＦＲ阻害剤は、第２の薬剤として投与される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ及び／またはＶＥＧＦＲ阻害剤は、パゾパニブ、ベバシズマブ、ソラフェニブ、スニチニブ、アキシチニブ、ポナチニブ、レゴラフェニブ、バンデタニブ、カボザンチニブ、ラムシルマブ、レンバチニブ、及びｚｉｖ−アフリベルセプトのうちの１つ以上である。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、抗癌薬は、第２の薬剤として投与される。いくつかの実施形態では、抗癌薬は、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ドキソルビシン、ムスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン、プレドニゾロン、ダカルバジン、ブレオマイシン、エトポシド、シスプラチン、エピルビシン、カペシタビン、フォリン酸、アクチノマイシン、全トランス型レチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、クロランブシル、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルカプトプリン、ミトキサントロン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、及びオキサリプラチンのうちの１つ以上から選択される。
【０２０４】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドまたは薬学的組成物を投与された対象は、本ポリペプチドまたは薬学的組成物の投与の前、その後、またはそれと同時に、放射線療法及び／または化学療法でも処置される。本明細書に開示される追加の薬剤を用いたさらなる併用療法も想定される。
【０２０５】
４．  バイオマーカー
本開示はまた、本明細書に記載されるポリペプチドもしくは薬学的組成物の処置有効性を監視するため、またはそのようなポリペプチドもしくは薬学的組成物を用いた処置のための対象を選択するために、少なくとも１つのバイオマーカーを測定する方法を包含する。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、ＢＣＬ９、ＣＤ４４、Ａｘｉｎ２、ｃＭｙｃ、ＬＧＲ５、ＶＥＧＦＡ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及び／または活性β−カテニンのうちの１つ以上である。本明細書で使用される場合、活性β−カテニンは、リン酸化されていない形態のβ−カテニンを指す。
【０２０６】
様々な公知の方法を使用して、そのようなバイオマーカーの遺伝子発現レベル及び／またはタンパク質レベルを測定することができる。例えば、本ポリペプチドまたは薬学的組成物で処置された対象から、腫瘍の生検、血液、血漿、血清、尿、羊膜液、滑液、内皮細胞、白血球、単球、他の細胞、臓器、組織、骨髄、リンパ節、または脾臓などの試料を得ることができる。いくつかの実施形態では、試料は、対象における腫瘍の生検である。対象から得られた試料は、そのようなバイオマーカーを検出する１つ以上の抗体または他の検出剤で染色され得る。試料はまた、または代替的に、バイオマーカーをコードするｍＲＮＡなどの核酸の存在を、例えばｒｔ−ｑＰＣＲ法によって検出するために処理されてもよい。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、ＢＣＬ９、ＣＤ４４、Ａｘｉｎ２、ｃＭｙｃ、ＬＧＲ５、ＶＥＧＦＡ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及び／または活性β−カテニンの遺伝子発現レベル及び／またはタンパク質レベルの低減は、本明細書に記載されるポリペプチドまたは薬学的組成物の処置有効性を示す。そのようなバイオマーカーの発現レベルは、例えば、本ポリペプチドまたは薬学的組成物の、１日、２日、３日、４日、５日、１週間、もしくは２週間、またはこれらの間の任意の期間の投与の後に測定され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドまたは薬学的組成物の１回以上の投与の後にバイオマーカーのうちの１つ以上のレベルを測定することを含む方法が開示される。いくつかの実施形態では、本方法は、バイオマーカーレベルが低減した場合には本ポリペプチドまたは薬学的組成物の投与を継続することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、バイオマーカーレベルが低減しない場合には本明細書に記載されるポリペプチドまたは薬学的組成物を増加した投与量で投与すること、またはその後の投与の頻度を増加させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、バイオマーカーレベルが初期投与後に低減しない場合、処置が中止される。様々な実施形態において、バイオマーカーレベルはまた、本明細書に記載されるポリペプチドまたは薬学的組成物の第１の投与前に測定され、１回以上の投与後のレベルと比較され、投与前のレベル（複数可）からのバイオマーカーレベル（複数可）の変化に基づいて、処置有効性及び継続処置ステップが決定される。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、ＢＣＬ９、ＣＤ４４、Ａｘｉｎ２、ｃＭｙｃ、ＬＧＲ５、ＶＥＧＦＡ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及び／または活性β−カテニンの遺伝子発現レベル及び／またはタンパク質レベルの上昇は、対象が、遺伝子発現レベル及び／またはタンパク質レベルが上昇していない対象よりも、本明細書に記載されるポリペプチドまたは薬学的組成物での処置から利益を受けるであろうことを示す。いくつかの実施形態では、上昇したバイオマーカーレベルを有する患者を選択し、本明細書に記載されるポリペプチドまたは薬学的組成物を投与することを含む、処置の方法が開示される。
【０２０９】
ある特定の実施形態では、ＢＣＬ９、ＣＤ４４、Ａｘｉｎ２、ｃＭｙｃ、ＬＧＲ５、ＶＥＧＦＡ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及び／または活性β−カテニンの遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルの上昇した対象が、本明細書に記載されるポリペプチドまたは薬学的組成物での処置のために選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍を患う対象は、対象から腫瘍試料を取得し、ＢＣＬ９、ＣＤ４４、Ａｘｉｎ２、ｃＭｙｃ、ＬＧＲ５、ＶＥＧＦＡ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及び／または活性β−カテニンの遺伝子及び／またはタンパク質の発現の上昇を特定した後に、処置のために選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍を患う対象は、対象から腫瘍試料を取得し、ＢＣＬ９の遺伝子及び／またはタンパク質レベルの上昇を特定した後に、処置のために選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍を患う対象は、対象から腫瘍試料を取得し、ＣＤ４４の遺伝子及び／またはタンパク質レベルの上昇を特定した後に、処置のために選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍を患う対象は、対象から腫瘍試料を取得し、活性β−カテニンの遺伝子及び／またはタンパク質レベルの上昇を特定した後に、処置のために選択される。
【０２１０】
５．  投与量
投与量レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療的または予防的な応答）をもたらすように調整され得る。例えば、単一のボーラスを投与してもよいし、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよいし、または治療状況の必要性により示される場合に用量を比例的に低減もしくは増加させてもよい。投与しやすさ及び投与量の均一性のために、単位剤形の非経口組成物を処方することが特に有利である。
【０２１１】
「単位剤形」という用語は、処置すべき哺乳動物対象のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体との関連で所望の治療効果をもたらすように計算された所定分量の活性化合物を含有する。本明細書に提供される単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物特有の特徴、及び達成すべき特定の治療効果または予防効果、ならびに（ｂ）個体の感応性の処置に関するかかる活性化合物の調合の技術分野に固有の制限事項に左右され、かつそれらに直接的に依存する。本明細書に提供される結合タンパク質の治療有効量または予防有効量の例示的な非限定的な範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、例えば、１〜１０ｍｇ／ｋｇである。投与量の値は、軽減すべき病態の種類及び重症度によって異なり得ることに留意されたい。いずれの特定の対象についても、具体的な投与量レジメンが、個々の必要性及び組成物の投与の管理者または監督者による専門家としての判断に従って時間と共に調整され得ること、また、本明細書に規定される投与量範囲が例示に過ぎず、特許請求される組成物の範囲または実践の限定を意図するものではないことをさらに理解されたい。
【０２１２】
６．  キット
本明細書では、本明細書に記載の方法を行うためのキットも開示される。様々な実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドを製造するためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、本キットは、１つ以上の炭化水素架橋剤を形成する反応を受けることのできるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本キットは、金属媒介性閉環オレフィンメタセシスを行うための金属触媒を含む。
【０２１３】
様々な実施形態において、対象の疾患を処置するためのキットも提供される。いくつかの実施形態では、本キットは、対象の癌を処置するためのものである。いくつかの実施形態では、本キットは、本明細書に開示されるポリペプチドまたは薬学的組成物を含む。いくつかの実施形態では、本キット内のポリペプチドは、１つ以上の炭化水素架橋剤を形成する反応を受けることができる。いくつかの実施形態では、本キット内のポリペプチドは、１つ以上の炭化水素架橋剤を有する。いくつかの実施形態では、本キットは、対象に投与され得る少なくとも１つの追加の薬剤をさらに含む。
【０２１４】
様々な実施形態において、対象におけるＢＣＬ９、ＣＤ４４、Ａｘｉｎ２、ｃＭｙｃ、ＬＧＲ５、ＶＥＧＦＡ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及び／または活性β−カテニンの遺伝子及び／またはタンパク質の発現の上昇を呈する腫瘍を有する対象を検出及び／または処置するためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、本キットは、ＢＣＬ９、ＣＤ４４、Ａｘｉｎ２、ｃＭｙｃ、ＬＧＲ５、ＶＥＧＦＡ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及び／または活性β−カテニンの遺伝子及び／またはタンパク質の発現を検出するための薬剤を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、本明細書に開示されるポリペプチドまたは薬学的組成物をさらに含む。いくつかの実施形態では、本キット内のポリペプチドは、１つ以上の炭化水素架橋剤を形成する反応を受けることができる。いくつかの実施形態では、本キット内のポリペプチドは、１つ以上の炭化水素架橋剤を有する。いくつかの実施形態では、本キットは、対象に投与され得る少なくとも１つの追加の薬剤をさらに含む。
【０２１５】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【０２１６】
「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、その冠詞の文法上の目的語１つ（ｏｎｅ）または２つ以上（ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ）（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例えば、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ（１つの要素）」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【０２１７】
「または」という用語は、文脈による別段の指示が明確にない限り、「及び／または」という用語を意味し、かつこれと互換的に使用される。本出願では、特に明記されない限り、単数形の使用は複数形を含む。さらに、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」という用語ならびに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」及び「ｉｎｃｌｕｄｅｄ」などの他の形態の使用は限定的ではない。本明細書に記載されるあらゆる範囲は、両端点及び両端点間の全ての値を含むと理解されるものとする。
【０２１８】
「ｃｏｎｔａｉｎ（含有する）」、「ｉｎｃｌｕｄｅ（含む）」、「ｈａｖｅ（有する）」という用語、またはそのような用語の文法上の変化形が、本開示または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される場合は、そのような用語は、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という用語が請求項において移行語として用いられるときの「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」の解釈と同様に包括的なものである。「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」という用語またはその文法上の変化形は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ（を含むがこれらに限定されない）」という表現を意味し、かつこれと互換的に使用される。
【０２１９】
「約」という用語は、基準の分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％だけ異なる分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さを意味する。「約」という用語が数値範囲と併せて使用されるとき、この用語は、規定される数値の上下に両境界を広げることにより、その範囲を修飾する。一般に、「約」という用語は、記載される値から上下に≦１０％異なる数値を修飾するよう意図される。
【０２２０】
本明細書に記載される方法の他の好適な修正形態及び適応形態が明白であり、本明細書に開示される実施形態の範囲を逸脱することなく好適な均等物を使用することによって行われ得ることは、当業者には容易に明らかとなろう。ここまで、ある特定の実施形態を詳細に説明してきたが、これは以下の実施例を参照することによってより明確に理解されるであろう。実施例は例示のみを目的として含まれるものであり、限定を意図するものではない。
【実施例】
【０２２１】
実施例１．  安定化ＢＣＬ９ペプチドの生成
修飾されたＡｌａ残基（α−メチル，α−アルケニルアミノ酸などのα，α−二置換アミノ酸）を使用して炭化水素架橋剤を合成する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、ＵＳ２０１４／０１１３８５７及びＫｉｍ  ２０１１を参照されたい。以下の実施例で使用した各安定化ペプチドは、１つの樹脂上（ｏｎ−ｒｅｓｉｎ）合成法によって生成した。樹脂上でペプチド伸長を行って各ポリペプチドを生成し、続いて閉環メタセシスを行った。
【０２２２】
炭素数８の架橋剤及び炭素数１１の架橋剤など、長さの異なる炭化水素架橋剤は、好適な長さのアルケニル鎖を有するα−メチル，α−アルケニルアミノ酸を使用して生成することができる。例えば、（Ｓ）２−（４´ペンテニル）Ａｌａをポリペプチドに組み込んで、両方の末端にＳ構成をもつ炭素数８の架橋剤を有する安定化ポリペプチドを構築した。（Ｒ）２−（４´−ペンテニル）Ａｌａをポリペプチドに組み込んで、両方の末端にＲ構成をもつ炭素数８の架橋剤を有する安定化ポリペプチドを構築した。一方の末端にＳ構成をもち他方の末端にＲ構成をもつ、炭素数８の架橋剤を有する安定化ポリペプチドのためには、それぞれ、（Ｓ）２−（４´−ペンテニル）Ａｌａ及び（Ｒ）２−（４´−ペンテニル）Ａｌａを使用した。一方の末端にＳ構成をもち他方の末端にＲ構成をもつ、炭素数１１の架橋剤を有する安定化ポリペプチドを構築するためには、それぞれ、（Ｒ）２−（７´−オクテニル）Ａｌａ及び（Ｓ）２−（４´−ペンテニル）Ａｌａを使用した。
【０２２３】
各ポリペプチドは、標準的な高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）プロトコルを使用して精製した。Ｚｏｒｂａｘ  Ｃ１８逆相カラム、９．４×２５０ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ、孔径８０Å、粒径３．５μｍ）を使用した。使用した溶媒は、Ａ：水、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＴＦＡ；Ｂ：アセトニトリル、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＴＦＡであった。流速は４ｍｌ／分であった。勾配は、３０分間にわたり１０−１００％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｂ、５分間にわたり１００％  Ｂ、４分間にわたり１００−１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｂ、１分間にわたり１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｂであった。注入量は１００〜４００μｌであった。波長（ｎｍ）は、２８０（Ｆｍｏｃ含有ペプチド、Ｔｒｐ含有ペプチド、またはＴｙｒ含有ペプチドの場合）、または２２０（その他の場合）であった。
【０２２４】
実施例２．  ＢＣＬ９のＨＤ２ドメインの機能ドメインのマッピング
Ｗｎｔシグナル伝達経路は癌及び他の疾患においてシグナル伝達に影響を与えるため、ＢＣＬ９ペプチドのＨＤ２ドメインを含有するペプチドを調査した。ＢＬＡＳＴ検索は、ヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインが独特であり、したがって、このドメインに由来するペプチドがＢＣＬ９の作用を阻害するのに特異的であるはずだということを示した。
【０２２５】
β−カテニンに結合するＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインのコア機能ドメインをさらに特定するために、複数のリード最適化研究を、（ｉ）ヒトＢＣＬ９タンパク質の完全長ＨＤ２ドメインのドメインマッピング、（ｉｉ）潜在的なコア機能ドメイン内での点変異、ならびに（ｉｉｉ）末端修飾及びステープル部位最適化という一連の３ステップで行った。ポリペプチドとβ−カテニンとの結合を検出するための２つの生化学アッセイを展開した。第１のアッセイは、ストレプトアビジン−ＸＬ６５５蛍光とビオチン化ポリペプチドをコンジュゲートし、Ｅｕ標識モノクローナル抗体（ｍＡｂ）とβ−カテニンタンパク質のヒスチジンタグをコンジュゲートした、均質時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）結合アッセイ（Ｃｉｓｃｏ）であった。第２のアッセイは、ストレプトアビジンでコーティングしたドナービーズとビオチン化ポリペプチドをコンジュゲートし、プロテインＡでコーティングしたアクセプタービーズに抗β−カテニン抗体を通してβ−カテニンタンパク質をコンジュゲートした、増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイ（ＡＬＰＨＡ）スクリーニングアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）であった。この結合アッセイでは、ビオチン化ペプチドをビーズにコンジュゲートするためにＰＥＧリンカーを使用し、ＢＣＬ９由来ポリペプチドがβ−カテニンに結合するさらなる余地を与えた。ＡＬＰＨＡスクリーンアッセイで評価したところ、β−カテニンに対するヒトＢＣＬ９タンパク質の完全長ＨＤ２ドメインのＫＤは２０ｎＭであり、シグナル対バックグラウンド比は１８０倍であり、結合親和性を検出する他の既知の方法と比べて著しい改善がもたらされた。例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６９：４３−５３（２０１５）及びＫａｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４８（４０）：９５３４−９５４１（２００９）を参照されたい。
【０２２６】
ドメインマッピングは、ヒトＢＣＬ９のＨＤ２ドメインにひろがる２０個の重複するステープルドポリペプチド（７マーまたは８マー）を構築することによって行った。８〜２０アミノ酸長を有するポリペプチドは、低コストであるという追加の利点を有するため、通常、タンパク質相互作用の阻害剤として使用される。図２Ａに示されるように、このプロセスは、ＨＤ２ドメインの最小の機能ドメインを検証するために、小さな安定化ポリペプチドの生成及びＨＤ２ドメインの選択されたアミノ酸の点変異の使用を含んだ。７つのアミノ酸が単一のｉ，ｉ＋４ステープルを形成するための最短の配列であるため、ヒトＢＣＬ９タンパク質のアミノ酸３５１〜３７４から７または８アミノ酸長を有する連続した安定化ペプチドを生成した。以下の表２は、ドメインマッピングのために生成した各ポリペプチドの概要であり、炭素数８の架橋剤をさらに生成するためにどのアミノ酸残基を（Ｓ）２−（４´ペンテニル）Ａｌａで置換したかを示す。表２中、Ｘａａ１及びＸａａ２は（Ｓ）２−（４´ペンテニル）Ａｌａを表す。表２に列記される各ポリペプチドは、実施例１に従って構築及び架橋した。全てのポリペプチドは、両方の末端にＳ構成をもつ炭素数８の架橋剤（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）を有する。各ポリペプチドのＮ末端はアセチル基で修飾されており、ポリペプチドのＣ末端はＮＨ２基で修飾されている。表２中、Ｂはノルロイシンを表す。
【０２２７】
【表２】
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【０２２８】
図２Ｂに示されるように、表２に列記した全ての安定化ポリペプチドを、細胞生存率アッセイにおいて同時に試験した。このアッセイにはＣｏｌｏ３２０ＤＭ細胞を選択した。これは、この特定の細胞株の増殖がＢＣＬ９及びβ−カテニンに依存するためである。既知のＷｎｔ／β−カテニン小分子阻害剤であるＩＣＧ００１を陽性対照として使用した。各処置条件における細胞生存率は、製造元のプロトコルに従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して分析した。
【０２２９】
図２Ｂに示されるように、ＩＣＧ００１は、用量依存様式で細胞死を誘導することができた。ＨＤ２ドメインの遠位部分を備えるＷＸ−０２０も、細胞増殖の阻害に効率的であり、ＩＣＧ００１に匹敵した。このアッセイにおけるＷＸ−０２０のＩＣ５０値は１２．４μＭであった。ＷＸ−０２０（ＬＲＤＩＱＲＢＬを含む）の作用は、Ｎ末端にＬｅｕを有しないＷＸ−０１８（ＲＤＩＱＲＢＬを含む）よりも優れており、β−カテニンに結合するコア機能ドメインが、ＷＸ−０２０に包含されている一続きの８アミノ酸残基を含むことが示唆された。また、このＷＸ−０２０の改善された効力は、ＨＤ２ドメインの遠位部分に由来する短い安定化ポリペプチドでは、β−カテニンに結合し、したがってＢＣＬ９とβ−カテニンとの相互作用を遮断する能力を保持するには不十分であることを示す。これらのポリペプチドは、実施例４．１に記載のＧｅｎｅＢＬＡｚｅｒ（登録商標）ベータ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）レポーターアッセイ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した細胞ベースのＷｎｔ転写阻害アッセイでも試験した。このアッセイでは、ＨＣＴ１１６細胞を選択した。これは、この細胞がβ−カテニン変異の存在に起因する異常なＷｎｔシグナル伝達の活性化を有することで知られているためである。細胞生存率アッセイの結果と一致して、ＷＸ−０２０は、Ｗｎｔ転写の阻害において最も効果的なポリペプチドであった（図２Ｃ）。
【０２３０】
さらに、図３に示されるように、同じ細胞生存率アッセイにおいて試験したとき、ＷＸ−０２０の作用は完全長ＨＤ２ドメイン（ＷＸ−００１、「ＳＡＨ−ＢＣＬ９＃１」）のものを超過し、他の配列エレメントまたは鎖修飾の存在に依存して、コア機能ドメインを含む全てのポリペプチドが必ずしもＢＣＬ９とβ−カテニンとの相互作用の遮断において等しく効果的であるとは限らないことが示された。ＷＸ−０２０を上述のＡＬＰＨＡスクリーンでも試験したところ、８０ｎＭのＫＤ値を有することが示された。実施例４．１に記載の手順に従い、ＷＸ−０２０をＷｎｔ転写アッセイで試験すると、１５８０ｎＭのＩＣ５０値を有することが示された。
【０２３１】
ＨＤ２ドメインの遠位部分のアミノ酸を変化させる点変異も、安定化ペプチドの有効性を低減させ、ＨＤ２ドメインの遠位領域が、β−カテニンへの結合に関与するＢＣＬ９のモチーフを含有することが示された。特に、ＷＸポリペプチドの構造活性相関（ＳＡＲ）評価は、ＷＸポリペプチドの疎水性アミノ酸がβ−カテニンへの結合を媒介することを示した。
【０２３２】
実施例３．  コア機能ドメインを含む安定化ポリペプチド
実施例２で特定したコア機能ドメインを含む、様々なアミノ酸長を有する４つの追加のステープルドポリペプチドを生成した。これらのステープルドポリペプチドは、透過性及び溶解性を改善させるための既知のペプチドタグまたは末端修飾、例えばＡｎｔ８、ＴＡＴ、（βＡｌａ）−（βＡｌａ）を付加することによってさらに修飾した。実施例１に規定の標準的なペプチド合成プロトコルを使用して，配列番号ＸＸ〜ＸＸに対応する４つの追加の安定化ポリペプチドを生成した（表３；表１も参照されたい）。Ｋｉｍ  ２０１１も参照されたい。例えば、図１Ａに示されるＷＸ−０２４を構築するために、ルテニウム媒介性閉環オレフィンメタセシスを使用して、配列番号Ｘの２つのＸａａアミノ酸間に炭化水素架橋剤を生成した。閉環メタセシスの後、ポリペプチドを脱保護し、解放した。結果として得られる安定化ポリペプチドは、両方の末端にＳ構成をもつ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−の炭化水素架橋剤を含む。ＷＸ−０２４は、Ｎ末端にアセチル基を含有し、Ｃ末端に２−ナフチルアラニンを含有する。Ｃ末端における２−ナフチルアラニンのカルボキシル基は、ＮＨ２でさらに修飾されている。ＷＸ−０２１、ＷＸ−０２２、及びＷＸ−０２３はＷＸ−０２０と同じ配列を共有するが、Ｃ末端における異なる化学部分（それぞれ、Ｃ末端における２−ナフチルアラニン及びＮＨ２を有する２つのβ−アラニン単位、Ｃ末端におけるＮＨ２を有する２つのβ−アラニン単位、及びＣ末端におけるＮＨ２を有する２−ナフチルアラニン）で修飾されている。全てのポリペプチドは、実施例１に記載のプロトコルに従ってさらに精製した。
【０２３３】
表３は、コア機能ドメインを含む４つのポリペプチドの概要であり、炭素数８の架橋剤をさらに生成するためにどのアミノ酸残基を（Ｓ）２−（４´ペンテニル）Ａｌａで置換したかを示す（Ｘａａ１及びＸａａ２は（Ｓ）２−（４´ペンテニル）Ａｌａである）。
【０２３４】
【表３】
2018537120.tif 000006
【０２３５】
これらの追加のポリペプチドを、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で試験した。このアッセイではＩＣＧ００１を陽性対照として使用した。図４Ａに示されるように、ＷＸ−０２０を含め全ての試験したポリペプチドが用量依存様式で細胞増殖を阻害することができたが、このアッセイではＷＸ−０２４（及びＷＸ−０２１）が特に効果的であった。特に、このアッセイにおけるＷＸ−０２４のＩＣ５０値はＷＸ−０２０と比較して大幅に改善され、コア機能ドメインを含むＷＸ−０２４が、同じコア機能ドメインを含む他のポリペプチドと比較して細胞生存及びＷｎｔ転写の阻害に特に効果的であることが実証された。
【０２３６】
溶解性、安定性、及び塩の選択に関するいくつかの予備研究を、ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒと共同し、ＷＸ−０２４を用いて行った。図４Ｂに示されるように、酢酸塩形態のＷＸ−０２４を細胞ベースのＷｎｔ転写阻害アッセイで試験したところ、Ｗｎｔ転写が効果的に阻害された（ＩＣ５０＝２９２ｎＭ）。同様に、図４Ｃは、同じアッセイにおいて塩酸塩もＷｎｔ転写を効果的に阻害したことを示す（ＩＣ５０＝３１３ｎＭ）。ＷＸ−０２４は、水、ＤＭＳＯ、及びＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍＬで可溶性であり、トリフルオロ酢酸塩形態のＷＸ−０２４は、２〜８℃及び室温で少なくとも１か月にわたって安定であった。加えて、塩形態のＷＸ−０２４は、様々なインビトロ細胞生存率アッセイにおいて活性であった。
【０２３７】
実施例４．  安定化ポリペプチドのインビトロプロファイル
β−カテニンへのＢＣＬ９の結合は、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化させることが知られている。Ｗｎｔ／β−カテニン活性は広範囲の細胞シグナルを制御するため、この経路の活性を測定するためには様々なアッセイを使用することができる。ＷＸ−０２１及びＷＸ−０２４を様々な細胞アッセイで評価し、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達をインビトロで調節するその能力を評価した。
【０２３８】
実施例４．１．  安定化ポリペプチドの細胞活性
ＧｅｎｅＢＬＡｚｅｒ（登録商標）ベータ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）レポーターアッセイ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、ＷＸ−０２１及びＷＸ−０２４の細胞活性を測定した。ＩＣＧ００１を比較として使用した。ＧｅｎｅＢＬＡｚｅｒは、図５Ａに示されるように、ＨＣＴ−１１６細胞に安定に組み込まれたβ−カテニン／ＬＥＦ／ＴＣＦ応答エレメントの制御下にあるベータ−ラクタマーゼ（ＢＬＡ）レポーター遺伝子を含有するＣｅｌｌＳｅｎｓｏｒ（商標）ＬＥＦ／ＴＣＦ−ｂｌａ  ＨＣＴ−１１６細胞を使用する。これらの細胞はベータ−ラクタマーゼを恒常的に発現し、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路のアゴニスト及びアンタゴニストを検出するために使用することができる。ＧｅｎｅＢＬＡｚｅｒアッセイは、刺激された細胞と刺激されていない細胞との２色（青色／緑色）の計測値を用いるレポーター応答の比率計測を提供する。
【０２３９】
ＬＥＦ／ＴＣＦ−ｂｌａ  ＨＣＴ−１１６細胞を透明底プレート上のアッセイ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。次いでこれらの細胞を、ビヒクル対照（０．０５％  ＤＭＳＯ水溶液）または最大１０μＭの範囲の用量のＷＸ−０２１、ＷＸ−０２４、もしくはＩＣＧ００１で５時間処置した。次にこれらの細胞を、ＷｎｔアゴニストであるｍＷｎｔ３ａ（ＧｅｎｅＢＬＡｚｅｒキットに提供されているもの）と共に３７℃で５時間インキュベートした。基質混合物（ベータ−ラクタマーゼのＦＲＥＴ基質であるＣＣＦ４−ＡＭを用いるＬｉｖｅＢＬＡｚｅｒ（商標）Ｂ／Ｇ基質を含有するもの）をウェルに加え、プレートを室温で２．５時間にわたり暗所でインキュベートした。黒壁透明底３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）を使用し、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ２を用いてスキャニングを行った。プレートはまず、励起フィルタ４０９／２０ｎｍ及び発光フィルタ４６０／４０ｎｍでスキャニングした（青色のチャネルのスキャン１）。次いでプレートを励起ファイラ４０９／２０ｎｍ及び発光フィルタ５３０／３０ｎｍでスキャニングした（緑色のチャネルのスキャン２）。４６０ｎｍ及び５３０ｎｍにおける蛍光発光値を取得し、４６０／５３０の阻害比を使用して、製造元（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のデータ分析プロトコルを使用することにより、ＷＸ−０２４によるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害率（阻害％）を判定した。
【０２４０】
図５Ｂ〜５Ｄに示されるように、このレポーターアッセイにおいて、漸増濃度のＷＸ−０２１及びＷＸ−０２４は、ＩＣＧ００１と比較して高いＷｎｔシグナル伝達の阻害率をもたらした。このアッセイから計算されたＷＸ−０２１及びＷＸ−０２４のＩＣ５０は、それぞれ７６４ｎＭ及び１９１ｎＭであった。これらの安定化ポリペプチドは、既知のＷｎｔ阻害剤であるＩＣＧ００１（ＩＣ５０＝１０６０ｎＭ）よりも強力なＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害剤であった。別のＷｎｔ阻害剤であるＬＧＫ−９７４（別名、Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ阻害剤）を同じアッセイにおいて試験した。ＬＧＫ−９７４は、Ｗｎｔタンパク質の分泌及び機能的活性化に必要とされるＷｎｔファミリータンパク質のパルミトイル化を媒介する膜結合Ｏ−アシルトランスフェラーゼであるＰｏｒｃｕｐｉｎｅを阻害する。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２０１３）１１０：２０２２４−２０２２９。ＷＸ−０２４はまた、Ｗｎｔ／β−カテニン転写の標的化においてＬＧＫ−９７４（ＩＣ５０＞１０μＭ）よりも良好なインビトロ効力を示したが、ＬＧＫ−９７４は細胞外Ｗｎｔシグナル伝達を標的とし、β−ｃａｔ転写を直接阻害しないため、これは予想通りであった（図５Ｅ）。
【０２４１】
全体として、ＷＸ−０２１及びＷＸ−０２４の両方がＷｎｔシグナル伝達経路の抑制において効果的であったが、ＷＸ−０２４の作用は、細胞生存率アッセイ（図４）とＷｎｔ転写アッセイ（図５）との両方において、ＷＸ−０２１と比較して改善された機能特性を示した。したがって、その後のインビトロ研究及びインビボ研究におけるさらなる特性評価のためにＷＸ−０２４を選択した。
【０２４２】
実施例４．２．  Β−カテニンへのＷＸ−０２４の結合親和性
β−カテニンに結合するＷＸ−０２４の能力を、均質時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ）において評価した。ＨＴＲＦアッセイは、Ｄｅｇｏｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｇｅｎｏｍ．３，２２−３２（２００９）に詳解されているように、高スループット形式でタンパク質−タンパク質の相互作用をアッセイする手段を提供する。タンパク質−タンパク質の相互作用を測定するＨＴＲＦアッセイでは、２つのタンパク質の結合がＨＴＲＦドナー及びアクセプターのフルオロフォアを近接させ、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）シグナルを生成する。この相互作用の各タンパク質は、抗体反応によってドナーまたはアクセプターと関連付けられる。
【０２４３】
図６Ａは、ＨＴＲＦアッセイの基礎を示す概略図を提供する。このβ−カテニンのＨＴＲＦアッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ）において、β−カテニンは、β−カテニンに対するＸＬ６６５結合抗体（ａｂ）により結合される。Ｄｅｇｏｒｃｅ（２００９）を参照されたい。ＸＬ６６５結合抗体に結合したβ−カテニンは、その結合パートナー、例えばＢＣＬ９またはＢＣＬ９ペプチドと相互作用することができる。
【０２４４】
このＨＴＲＦアッセイでは、β−カテニン結合パートナーであるＷＸ−０２４をビオチンに結合させた。β−カテニン及びＷＸ−０２４のインキュベーションの後、次いでこの反応物を、ストレプトアビジン（ＳＡ）をユーロピウムクリプテートに結合させたもの（ＳＡ−ユーロピウムクリプテート）と共にインキュベートした。ＳＡは、ビオチンの高親和性結合パートナーであり、ビオチン化した安定化ポリペプチドにＳＡ−ユーロピウムクリプテートを緊密に結合させる。ユーロピウムクリプテートは、ＨＴＲＦ反応のためのエネルギードナーである。密接に結合していないとき、ユーロピウムクリプテートとＸＬ６６５との間にエネルギー移動はない。しかしながら、ユーロピウムクリプテート及びＸＬ−６６が近接している場合、例えばＸＬ６６５抗体が結合したβ−カテニンへのビオチン化ＷＸ−０２４の結合が成功している場合は、測定され得るエネルギー移動が存在する。
【０２４５】
ヒスチジンタグ付きβ−カテニン、ビオチン標識したＢＣＬ９ペプチド、ヒスチジンタグのためにユーロピウム（Ｅｕ）標識したモノクローナル抗体、及びＳＡ−ＸＬ６６５を、ＨＴＲＦアッセイに使用した。アッセイ用緩衝液は、５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ、及び０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０を含有した。５μＬのＨｉｓタグタンパク質をプレートに加えた。５μＬのビオチン標識ペプチドを様々な濃度で同じウェルに加えた。１０μＬのＥｕ標識モノクローナル抗体及びＳＡ−ＸＬ６４４検出混合物を添加した。この反応物を室温で１時間インキュベートし、次いでプレートを読み取った。
【０２４６】
ＷＸ−０２４から得られた結果が図６Ｂに示されている。この結果から計算されたＷＸ−０２４のＫＤ値は４．２１ｎＭであった。
【０２４７】
実施例４．３．  細胞生存率アッセイにおけるＷＸ−０２４及びＩＣＧ００１の比較
図７は、製造元の標準的な手順を用いてＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した、漸増濃度のＷＸ−０２４またはＩＣＧ００１のいずれかで処置したＨＣＴ１１６細胞の生存率に関するデータを提示する。ＷＸ−０２４及びＩＣＧ００１の両方が、生存率アッセイによって測定した場合に細胞増殖を阻害することができた。特に、このアッセイから計算されたＷＸ−０２４のＩＣ５０値は１．９２μＭであり、ＩＣＧ００１のもの（ＩＣ５０＝２．１７μＭ）より低かった。
【０２４８】
全体として、このデータは、ＷＸ−０２４がＷｎｔシグナル伝達経路の阻害と一致する堅実なインビトロプロファイルを有することを示す。
【０２４９】
実施例４．４．  ＷＸ−０２４と他の既知の化学療法剤との比較
ＷＸ−０２４をＣｏｌｏ３２０ＤＭ細胞生存率アッセイでも試験し、他の化学療法剤と比較した。ＷＸ−０２４は、ＢＣＬ９／β−カテニン依存性細胞株の細胞増殖の阻害において、ＩＣＧ００１、ＬＧＫ−９７４（図８Ａ）、またはエルロチニブ（図８Ｂ）よりもおよそ１２倍効果的であった。
【０２５０】
ＷＸ−０２４はまた、他の既知の化学療法剤と組み合わせて使用したとき、利益及び改善をもたらした。特に、図８Ｃに示されるように、ＷＸ−０２４を結腸直腸癌で広く使用されている化学療法薬である５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）と組み合わせて試験したところ、この併用療法が５−ＦＵ処置単独（ＩＣ５０＝１２．１μＭ）と比較して著しく改善された細胞増殖阻害能力（ＩＣ５０＝１μＭ）を示したことが示された。
【０２５１】
実施例４．５．  ＷＸ−０２４の特異性
実施例４．１において詳述したように、ＷＸ−０２４は、細胞ベースのアッセイにおいてＷｎｔ転写を阻害した。しかしながら、ＷＸ−０２４は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ（ＳＩＥ−ｂｌａ  ＭＥ−１８０細胞株）、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＦＯＸＯ（ＴＲＥｘ  ＦＯＸＯ３−ＤＢＥ−ｂｌａ  ＨｅＬａ細胞株）、ＴＧＦ−ベータ（ＳＢＥ−ｂｌａ  ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞株）、またはＴＮＦ−アルファ／ＪＮＫ（ＡＰ１−ｂｌａ  ＭＥ−１８０細胞株）経路（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの他の転写アッセイにおいて著しい阻害を一切もたらさず、これらの転写アッセイ全てにおいて１０μＭ超のＩＣ５０値を示した。これらのアッセイでは、トリフルオロ酢酸塩形態のＷＸ−０２４を使用した。以下の表４に要約されるデータは、ＷＸ−０２４が、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を特異的に標的とする阻害剤であることを実証する。
【０２５２】
【表４】
2018537120.tif 000007
【０２５３】
実施例５．  安定化ポリペプチドのインビボプロファイル
ＷＸ−０２４の堅実なインビトロプロファイルに基づいて、マウス実験を行って血漿薬物動態パラメータを判定した。加えて、マウス異種移植片モデルにおいてＷＸ−０２４を評価して、腫瘍増殖の阻害における有効性を試験した。
【０２５４】
実施例５．１．  マウスにおけるＷＸ−０２４の薬物動態プロファイル
雄ＩＣＲマウス（非近交種）における静脈内（ｉ．ｖ．）注射及び腹腔内（ｉ．ｐ．）注射の後、ＷＸ−０２４の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを評価した。静脈内注射には尾静脈を使用した。ＷＸ−０２４の用量は、１ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）及び５ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．及びｉ．ｖ．）で評価した。注射後、投薬後５分、１、２、４、６、８、１２、及び２４時間の時点で、後眼窩静脈を介して血液試料を得た。ヘパリンナトリウムとの混合及び遠心分離の後、血液試料から血漿を得た。
【０２５５】
ＬＣ／ＭＳを使用して、ＷＸ−０２４の濃度（ｎｇ／ｍｌ）を判定した。ＬＣ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １００  ＨＰＬＣを使用して行った。ＭＳ分析は、ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ４０００を使用して行った。段階希釈によって較正標準を調製した。経時的なＷＸ−０２４の濃度（ｎｇ／ｍｌ）が図９Ａに示されている。
【０２５６】
ＦＤＡ認可薬物動態プログラムであるＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ｖ５．２（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）のノンコンパートメント分析モジュールを使用して、最大観察濃度（Ｃｍａｘ）、終末相半減期（Ｔ１／２）、全身クリアランス（ＣＬ）、分布容積（Ｖｚ）、投薬時間から最後の観察可能な濃度までの曲線下面積（ＡＵＣ０−ｔ）、投薬時間から無限大まで外挿した曲線下面積（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）、及び生物学的利用率を計算した。これらの値は図９Ｂに要約されている。なお、５ｍｇ／ｋｇの静脈内投与は、４７３５４ｎｇ／ｍｌの値で最大のＷＸ−０２４のＣｍａｘをもたらした。これは、実施例４で計算されたインビトロのＩＣ５０より１５倍高い、３０μＭ超と同等であり、ＷＸ−０２４の生理的に適切な濃度が血漿中で達成され得ることを示している。
【０２５７】
全ての投薬レジメンでのＷＸ−０２４のＴ１／２は２．４〜２．５時間であった。これは、活性ＷＸ−０２４が血漿中に存在する実質的な期間が存在することを示す。腹腔内投薬後のＷＸ−０２４の生物学的利用率は７３．６％である。静脈内投薬については、化合物の全てが血漿に入るため生物学的利用率が１００％であることから、この値は提供されていない。Ｃｍａｘ、Ｃｌ、Ｖｚ、ＡＵＣ０−ｔ、及びＡＵＣ０−ｉｎｆの値は全て、腹腔内及び静脈内投薬後のＷｎｔシグナル伝達を潜在的に調節するのに十分なＷＸ−０２４への曝露を示すプロファイルとも一致する。
【０２５８】
異なるマウス系統（雌ｂａｌｂ／ｃマウス、処置毎にｎ＝２）ならびに筋肉内経路及び皮下経路を含む追加の投与経路を用い、ＷＸ−０２４の同様の薬物動態研究を行った。簡潔に述べると、１０％のＤＭＳＯと９０％の脱イオンＨ２Ｏとの混合溶媒を使用してＷＸ−０２４を溶解させた。０．５ｍｇ／ｍｌの一定濃度でペプチド溶液を調製し、次いで用量に従って好適な量を投与した。同じ混合溶媒をビヒクル処置として使用した。投薬後０．２５、１、２、４、６、７、１２、及び２４時間（ならびに筋肉内、皮下、及び腹腔内経路では投薬後３６及び４８時間）の時点で後眼窩静脈から定期的に血液試料（３００μＬ）を収集し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる目下の生体分析のための血漿分離を行った。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（ｖ５．２、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、ＦＤＡ認可済）のノンコンパートメント分析モジュールによって標準ＰＫパラメータを計算した。図１０Ａに示されるように、ＷＸ−０２４の血漿濃度は、図９Ａに示されたものと同様の傾向をたどった。この実験から計算された平均薬物動態パラメータは、図１０Ｂ及び図１０Ｃに示されている。良好な生物学的利用率及び長い半減期がＷＸ−０２４で観察され、ＷＸ−０２４の毎日の投薬が実行可能であることを示している。なお、ＷＸ−０２４の血漿濃度は、腹腔内、筋肉内、皮下経路によって投与したとき、長期間にわたって安定した状態を保ち、ＷＸ−０２４は様々な経路で投与したときにインビボで生理的に適切な濃度を達成し得ることが実証された。
【０２５９】
全体として、これらのデータは、ＷＸ−０２４がＢＣＬ９とβ−カテニンとの相互作用の阻害におけるインビボ効果の研究に好適なＰＫプロファイルを有することを示す。
【０２６０】
実施例５．２．  癌のマウス異種移植片モデルにおけるＷＸ−０２４の有効性
上述のように、マウスにおけるＷＸ−０２４の好ましいＰＫプロファイルに基づき、マウス異種移植片結腸癌モデルにおいてＷＸ−０２４の有効性を調査した。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスのＣｏｌｏ３２０ＤＭ結腸癌モデルを用いた。このモデルでは、Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ細胞がＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに皮下注射される。ヌードマウスは腫瘍を排除するのに十分な免疫応答を起こさないため、Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ細胞から腫瘍が形成される。
【０２６１】
１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号３１８０００２２）において３７℃でＣｏｌｏ３２０ＤＭ腫瘍細胞（ＡＴＣＣ）を培養した。指数増殖期に細胞が増殖しているときにＣｏｌｏ３２０ＤＭ細胞の採取を行った。６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）を研究のために使用した。動物は、研究期間全体を通じて、水及び照射滅菌した食物を自由に利用することができた。各マウス（ｎ＝１６）には、０．１ｍＬのＰＢＳ中の５×１０６個のＣｏｌｏ３２０ＤＭ腫瘍細胞を右側腹部領域に皮下接種した。腫瘍を接種後１４日間にわたって発達させ、このとき、平均腫瘍サイズは１５６．７８ｍｍ３であった。研究中、動物のケア及び使用は、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）に従って行った。腫瘍細胞の接種後、動物の罹患率及び死亡率を毎日検査した。各動物の体重を研究全体を通じて監視した。
【０２６２】
１４日間の腫瘍発達期間の後、５ｍｇ／ｋｇ  ＷＸ−０２４群、１０ｍｇ／ｋｇ  ＷＸ−０２４群、及び１５ｍｇ／ｋｇ  ＷＸ−０２４群、ならびにビヒクル対照群の４つの処置群にマウスを分割した。エタノール４％＋Ｔｗｅｅｎ  ８０  ８％＋１０ｍＭ  ＰＢＳ  ８８％を、ビヒクルとして使用した。全ての処置を１日１回施した。ＷＸ−０２４溶液を純粋なＤＭＳＯに溶解させ、次いで滅菌水で希釈した。静脈内投薬での各動物に対する投薬容量が０．０５ｍＬ／体重１０ｇになるように、体重に合わせて投薬容量を調整した。処置期間は１４日間であった。
【０２６３】
全ての処置を毎日の静脈内投薬として開始した。研究中、１５ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４の静脈内投与は、３日間の処置後のビヒクル処置群と比較して、およそ１１％の平均体重減少の体重減少をもたらしたことが見出された。１０ｍｇ／ｋｇ群及び１５ｍｇ／ｋｇ群については、注射方法を７日目に腹腔内注射に変更した。処置期間の７日目以降、１０ｍｇ／ｋｇ群及び１５ｍｇ／ｋｇ群には腹腔内注射による投薬（０．１ｍｌ／１０ｇに調整した投薬容量）を維持したところ、これらの動物の体重は安定化した。ビヒクル対照または５ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４で処置したマウスには、研究全体を通じて静脈内注射を与え、体重に明らかな影響はなかった。処置期間中のマウスの体重変化は図１１に示されている。
【０２６４】
処置期間の０、３、５、７、９、１１、１４日目にキャリパーを使用して腫瘍体積を二次元で測定した（全ての投薬は１４日間の腫瘍発達の後に開始する）。腫瘍の体積は、方程式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（式中、ａ及びｂはそれぞれ、腫瘍の長径及び短径である）を使用して測定した。腫瘍体積はｍｍ３で表される。研究の最後（すなわち、２２日間の処置の後）に、腫瘍塊の重量を測定した。
【０２６５】
図１２Ａは、異なる処置群における経時的な腫瘍体積を示す。１４日目に、ビヒクル対照処置マウスの腫瘍体積（平均±標準誤差値）は２５７５±３８２．８６ｍｍ３であった。ＷＸ−０２４処置マウスの腫瘍体積は、５ｍｇ／ｋｇ処置群、１０ｍｇ／ｋｇ処置群、及び１５ｍｇ／ｋｇ処置群で、それぞれ２０３９±３７３．２９、１３７０±１１４．３９、及び１１５７．６±９９．０４ｍｍ３であった。１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４で処置したマウスの腫瘍体積は、処置の１４日目においてビヒクル処置動物と比較して著しく小さかった（Ｐ＜０．０５、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ分析）。ビヒクル処置群と比較して、処置期間の１４日目における腫瘍体積は、１５ｍｇ／ｋｇ  ＷＸ−０２４群では５３．２％小さく、１０ｍｇ／ｋｇ  ＷＸ−０２４群では４４．９％小さかった。ビヒクル対照群と比較して著しく小さい１０ｍｇ／ｋｇ群及び１５ｍｇ／ｋｇ群の腫瘍体積は、処置の１１日目にも見られた。ＷＸ−０２４と予想される腫瘍サイズの用量−応答の予備相関は、１２．６９ｍｇ／ｋｇのＩＣ５０値をもたらした。
【０２６６】
図１２Ｂは、ビヒクルまたはＷＸ−０２４で２２日間処置した後の研究の最後における腫瘍塊の重量（グラムで測定）を示す。１０または１５ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４で（上述の静脈内／腹腔内プロトコルを使用して）処置したマウスの腫瘍量は、ビヒクル処置マウスの腫瘍量よりも著しく少なかった。これらのデータは、１０または１５ｍｇ／ｋｇのいずれかでの処置が、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスのＣｏｌｏ３２０ＤＭ結腸癌モデルにおいて腫瘍増殖を阻害したことを裏付けた。
【０２６７】
Ｃｏｌｏ３２０ＤＭモデルの終了時に、標準的な技術を使用して腫瘍及び腸管の試料を収集し、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した。免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のために、４μｍ厚の組織切片を調製した。キシレン、段階的なエタノール、及びリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を順に用いた洗浄により、組織切片を脱パラフィン及び再水和した。脱パラフィン及び再水和の後、組織切片を標的回収溶液（１０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０）中での高温誘導性エピトープ回収に供した。
【０２６８】
製造元の指示に従って、ＵｌｔｒａＶｉｓｉｏｎ  Ｑｕａｎｔｏ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号ＴＬ−０６０−ＱＨＤ）キットを使用して、抗体結合を検出した。切片をＨｙｄｒｏｇｅｎ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｂｌｏｃｋ及びＵｌｔｒａ  Ｖ  Ｂｌｏｃｋ（キットに提供されているもの）で処置し、一次抗体：ＣＤ４４（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１５７１０７、希釈度１：５００）、Ａｘｉｎ（ＬＳＢｉｏ、ウサギＩｇＧ、カタログ番号ＬＳ−Ｂ７０２９、ロット番号５１９０７、原液濃度：１０００ｕｇ／ｍｌ）、またはＶＥＧＦＡ（ＶＥＧＦＡ：ＬＳ  Ｂｉｏ、ウサギＩｇＧ、カタログ番号ＬＳ−Ｂ１０２６３、ロット番号６５３２３、原液濃度：１０００ｕｇ／ｍｌ）と共に４℃で一晩インキュベートした。ウサギＩｇＧは陰性対照中の一次抗体の代わりとした。全ての切片をヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、装着した。ＩＨＣ画像はＯｌｙｍｐｕｓ  ＣＫＸ３１ＳＦ逆顕微鏡で撮影した。
【０２６９】
図１３Ａは、２２日間にわたってビヒクル、１０ｍｇ／ｋｇ、または１５ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４で処置したマウスにおいて腸管の形態が維持されたことを示す。図１３Ｂは、Ｗｎｔシグナル伝達経路における下流タンパク質であるＡｘｉｎ２の染色を示し、１５ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４を用いた２２日間の処置がビヒクル処置と比較してＡｘｉｎ２染色を減少させたことを示している。
【０２７０】
図１４Ａは、ビヒクルまたは１５ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４のいずれかで２２日間処置した後の、Ｗｎｔシグナル伝達経路における別の下流タンパク質であるＣＤ４４の染色を示す。免疫組織化学スコアは各ＣＤ４４画像の右上に示されている。図１４Ｂは、ＣＤ４４染色画像から計算された平均染色スコアの定量的比較を示す。これらのデータは、ＷＸ−０２４での処置後のＣＤ４４染色にも減少があったことを示す。
【０２７１】
同様に、腫瘍試料のＶＥＧＦＡを染色し、ＷＸ−０２４が腫瘍でのＶＥＧＦＡ発現を抑制することができたことを確認した。図１５Ａは、２体のビヒクル処置動物及び２体のＷＸ−０２４処置動物からの代表的な画像を示す。染色画像から計算された平均免疫組織化学スコアは１５Ｂに要約されている。
【０２７２】
このように、Ｃｏｌｏ３２０ＤＭモデルからのデータは、ビヒクル処置と比較してＷＸ−０２４は腫瘍増殖の抑制及びＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害が可能であることを示す。ＶＥＧＦＡに対するＷＸ−０２４の効果は、ＷＸ−０２４が腫瘍でのＶＥＧＦ発現を低減させることにより免疫応答を調節し得ることも示す。
【０２７３】
実施例５．３．  癌のマウス同系モデル（ＣＴ２６）におけるＷＸ−０２４の有効性
インタクトな免疫系を有するマウスにおける腫瘍増殖を調査するためのモデルとして、結腸癌のＣＴ２６モデルを使用した。
【０２７４】
ＣＴ２６細胞増殖に対するＷＸ−０２４の効果を、まずインビトロで調査した。ＣＴ２６細胞をＦ底プレートで５日間にわたって増殖させた。図１６Ａに示されるように、１日目（Ｄ１）から５日目（Ｄ５）まで、発光細胞生存率アッセイにより測定したとき、ＣＴ２６細胞は実質的に増殖した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）細胞生存率アッセイ。ＣＴ２６細胞増殖を阻害するＷＸ−０２４（図１６Ｂ）及びドキソルビシン（図１６Ｃ）の能力を測定した。ドキソルビシンは既知の細胞増殖阻害剤であり、対照として含まれた。図１６ＤはＣＴ２６細胞におけるインビトロデータの概要であり、ＷＸ−０２４及びドキソルビシンの両方がＣＴ２６細胞の増殖を阻害することができ、ＷＸ−０２４がより強力な活性を示したことを示す。ＷＸ−０２４のＩＣ５０値は１．７５３μＭで、ドキソルビシンの７．５２０μＭより大幅に低かった。ＥＧＦＲ受容体アンタゴニストであるエルロチニブは、２μＭ超のＩＣ５０を有した。
【０２７５】
次いで、ＣＴ２６を使用した結腸癌の同系マウスモデルを評価した。それぞれおよそ５週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃマウスの右側腹部に、５×１０４個のＣＴ２６細胞を皮下注射した。次いで、ビヒクルまたは２０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４のいずれかをマウスの腹腔内に毎日投薬した。８体のマウスが各処置群に含まれた。次いで、図１７Ａに示されるように投薬１４日間にわたって腫瘍増殖を評価した。経時的な腫瘍体積は、ビヒクルと比較してＷＸ−０２４で処置したマウスにおいて実質的に低かった（Ｐ＜０．００１）。図１７Ｂは、実験全体を通じたＷＸ−０２４の平均腫瘍増殖阻害率の概要である。３日間の投薬後のＴＧＩは８９．２％であり、１２日間の投薬後のＴＧＩは７０．０％であった。図１８Ａは、ビヒクルの投薬１４日間にわたる個々の動物の腫瘍増殖率を示す。図１８Ｂは、２０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４の投薬１４日間にわたる個々の動物の腫瘍増殖率を示す。これらのデータは、ＣＴ２６モデルで見られた腫瘍増殖の阻害が動物間で一貫していたことを示す。
【０２７６】
ビヒクルまたは２０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４のいずれかを２週間毎日投薬した後の血液中のＣＤ４＋Ｔ細胞数も評価した。各マウスから全血を採取した。リンパ球をＦｉｃｏｌｌによって血液試料から精製し、細胞を蛍光抗ＣＤ４抗体で染色した。データをフローサイトメトリによって測定した。図１９Ａは、全細胞に対する割合として表されたＣＤ４＋Ｔ細胞数を示し、ＷＸ−０２４の投薬に伴う増加を示している。図１９Ｂは、１つの検体の血液試料中の全細胞当たりの相対的なＴ細胞数を示し、ＷＸ−０２４の投薬に伴う増加を示している。これらのデータは、ＷＸ−０２４での処置後のＴヘルパー細胞の増加及び免疫系の活性化を示す。これらのデータはまた、免疫療法とＷＸ−０２４の併用療法が、ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４に対する抗体での処置などの免疫療法単独に応答しない癌において適切であり得ることを示す。
【０２７７】
ビヒクルまたは２０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４のいずれかを２週間毎日投薬した後の血液中のＣＤ８＋Ｔ細胞数も評価した。上述のように、各マウスから全血を採取した。リンパ球をＦｉｃｏｌｌによって血液から精製し、細胞を蛍光抗ＣＤ８抗体で染色した。データをフローサイトメトリによって測定した。図２０Ａは、全細胞に対する割合として表されたＣＤ８＋Ｔ細胞数を示し、ＷＸ−０２４の投薬に伴う増加を示している。図２０Ｂは、血液試料中の全細胞当たりの相対的なＴ細胞数を示し、ＷＸ−０２４の投薬に伴う増加を示している。これらのデータは、ＷＸ−０２４での処置後の細胞傷害性Ｔ細胞の増加及び免疫系の活性化を示し、ＷＸ−０２４を免疫療法と一緒に使用することをさらに支持する。
【０２７８】
ＷＸ−０２４が腫瘍微小環境を調節することができるかどうかをさらに評価するために、研究の最後に腫瘍及び血液試料を抗凝固管に収集した。単一細胞分離を行い、次いでＦＡＣＳ分析のために細胞を染色した。細胞表面染色には、ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ７、及びＣＤ２５−ＰＥを使用した。核内染色では、細胞を一晩透過処理し、次いでＦｏｘｐ３−ＡＰＣで６０分間染色した。図２１Ａに示されるように、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団内の制御性Ｔ細胞は腫瘍試料中で著しく低減したが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞と制御性Ｔ細胞との比は著しく増加した（図２１Ｂ）。この実験における腫瘍試料の代表的なＦＡＣＳ分析が図２１Ｃ及び図２１Ｄに示されている。
【０２７９】
図２２Ａは、ビヒクルまたは２０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４のいずれかで１４日間処置した後の活性β−カテニンの染色を示す。これらの染色画像に基づいて平均免疫組織化学スコアを計算した。図２２Ｂは、ビヒクル処置群とＷＸ−０２４処置群との平均染色スコアの定量的比較を示す。図２２Ｃは、ビヒクルまたは２０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４のいずれかで１４日間処置した後のＣＤ４４の染色を示す。これらのデータは、ＷＸ−０２４が腫瘍での活性β−カテニン発現を抑制することができたことを示す。
【０２８０】
ＰＤ−Ｌ１についても腫瘍試料を染色した。４体のビヒクル処置マウス及び４体のＷＸ−０２４処置マウスからの代表的な画像が図２３Ａに示されている。各処置群の平均免疫組織化学スコアの定量的な比較が図２３Ｂに示されている。
【０２８１】
全体として、これらのデータは、ＷＸ−０２４が腫瘍へのＴ細胞の浸潤を刺激し、腫瘍に対する免疫反応を刺激することを示す。これらのデータはまた、ＷＸ−０２４が、腫瘍微小環境をそのような免疫反応に好ましくなるように調節することを示す。したがって、ＷＸ−０２４とチェックポイント遮断剤との併用療法は、腫瘍内に存在する制御性Ｔ細胞または樹状細胞の低減によって腫瘍に対する免疫反応を刺激することにおける相乗効果をもたらし得る。さらに、ＷＸ−０２４は血液中のＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させることができたため、ＷＸ−０２４が腫瘍内のＴ細胞浸潤及び腫瘍に対する免疫原性を増加させる可能性が高いことがさらに示される。
【０２８２】
実施例５．４．  癌のマウス同系モデル（Ｂ１６Ｆ１０）におけるＷＸ−０２４の有効性
他の種類の腫瘍を抑制するＷＸ−０２４の能力も評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６Ｆ１０細胞を接種した。４〜５週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部にＢ１６Ｆ１０細胞（マウス１体当たり０．０５ｍｌ中２×１０５個の細胞）を接種した。マウスの平均腫瘍サイズが１００ｍｍ３に達したとき、マウスを２つの群（Ｎ＝６）に分割した。第１の群には２５ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４を投与し、第２の群はビヒクルで処置した。処置は１４日間連続して腹腔内に施した。図２４に示されるように、ＷＸ−０２４は、ビヒクル処置と比較して腫瘍増殖を効果的に低減させ、ＷＸ−０２４がインビボで腫瘍増殖を抑制する堅実な有効性を有することがあらためて裏付けられた。
【０２８３】
ＷＸ−０２４が腫瘍へのＴ細胞の浸潤を誘導し、腫瘍微小環境を調節することができるかどうかをさらに評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６Ｆ１０細胞を接種した。マウスの平均腫瘍サイズが１００ｍｍ３に達したとき、マウスを２つの群（Ｎ＝３）に分割し、ビヒクルまたは２５ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４で処置した。処置は１２日間連続して腹腔内に施した。処置の最後にマウスを屠殺し、腫瘍及び血液試料を抗凝固管に収集した。各試料について単一細胞分離を行い、次いでＦＡＣＳ分析のために染色した。細胞表面染色には、ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ７、及びＣＤ２５−ＰＥを使用した。次いで、腫瘍試料を抗ＣＤ４抗体または抗ＣＤ８抗体のいずれかで染色して、腫瘍試料中のＴ細胞の存在を評価した。腫瘍試料を抗ＣＤ１９４抗体及び抗ＣＤ１９６抗体でも染色し、腫瘍試料中のＴヘルパー１７細胞の存在を評価した。
【０２８４】
図２５Ａに示されるように、ＷＸ−０２４は、腫瘍試料中に存在するＣＤ４＋陽性細胞をビヒクルと比較して増加させ、ＷＸ−０２４が腫瘍へのＴヘルパー細胞の浸潤を誘導することが示された。同様に、図２５Ｂは、ＷＸ−０２４が腫瘍試料中に存在するＣＤ８＋陽性細胞を増加させたことを示し、ＷＸ−０２４が腫瘍への細胞傷害性Ｔ細胞の浸潤を誘導することが示された。図２５Ｃに要約されているように、これらの結果は、全体として、ＷＸ−０２４が腫瘍へのＴ細胞の浸潤を誘導することができ、それによって腫瘍塊を特異的に標的とする有益な免疫反応をさらに誘発することを示す。全体として、このデータは、腫瘍におけるＣＤ８＋及びＣＤ４＋リンパ球の浸潤を増加させるＷＸ−０２４の傾向を示し、ＷＸ−０２４が、腫瘍内及び／またはその周囲のＴ細胞の組成を変化させることにより、免疫反応に好ましくなるように腫瘍微小環境を誘導することを示している。
【０２８５】
腫瘍微小環境に対するＷＸ−０２４の効果を、ＷＸ−０２４の変異体であるＷＸ−０３９のものと比較した。ＷＸ−０３９の構築プロセスは実施例１０に記載されている。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６Ｆ１０細胞を接種した。マウスの平均腫瘍サイズが１００ｍｍ３に達したとき、マウスを３つの群（Ｎ＝３）に分割し、ビヒクル、２０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４、または６０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０３９で処置した。処置は１２日間連続して腹腔内に施した。処置の最後にマウスを屠殺し、腫瘍及び血液試料を抗凝固管に収集した。実験から収集した腫瘍細胞を上述のように染色し、また抗ＣＤ２０５抗体も用いて、ＷＸ化合物が樹状細胞を調節することができるかどうかを評価した。図２６Ａ及び２６Ｂに示されるように、ＷＸ−０２４はＣＤ２０５＋細胞を著しく低減させ、ＷＸ−０２４に腫瘍内の樹状細胞を抑制する能力があることが裏付けられた。ＷＸ−０３９も腫瘍内に存在する樹状細胞を抑制することができたが、ＷＸ−０２４の効果はＷＸ−０３９よりも顕著であった。図２６Ｃもまた、ＷＸ−０３９は腫瘍内のＴヘルパー１７細胞を増加させたものの、ＷＸ−０２４がＷＸ−０３９よりも効果的であるようだったことを示す。ＣＴ２６動物モデル研究と一致して、これらのデータは、ＷＸ−０２４が腫瘍に対する免疫反応を刺激し、このような免疫反応に好ましくなるように腫瘍微小環境を調節することができることを示す。この実験における腫瘍試料の代表的なＦＡＣＳ分析が図２６Ｄに示されている。
【０２８６】
他の免疫療法剤、例えば抗ＰＤ−Ｌ１抗体、またはＴ細胞活性化を調節することのできる他の抗体と組み合わせると、ＷＸ−０２４は、制御性Ｔ細胞を調節し、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞と制御性Ｔ細胞との比を増加させることができる。これらの免疫療法剤と組み合わせたＷＸ−０２４はさらに、腫瘍内の骨髄樹状細胞を相乗的に減少させ、それにより、腫瘍に対する免疫反応に好ましい腫瘍微小環境を誘導することもできる。
【０２８７】
実施例５．５．  癌のマウス同所性モデルにおけるＷＸ−０２４の有効性
同所性マウスモデルは、マウスに移植された腫瘍に対する抗腫瘍化合物の効果を可視化ため、及び腫瘍転移に対する化合物の効果を評価するために有用である。この実験では、ＮＣＩ−Ｈ１２９９−Ｌｕｃ細胞株（ルシフェラーゼを発現する非小細胞肺癌細胞株）を利用する同所性モデルを選択した。ルシフェリン基質を取り込むと、これらの細胞は生物発光を行うことができる。ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞株の増殖は、ＴＣＦ−１転写因子（ＢＣＬ９、β−ｃａｔ、及びＰｙｇｏ）が転写を開始するために転写複合体を形成するＰｙｇｏｐｕｓ（Ｐｙｇｏ）２／β−カテニン転写活性に依存する。
【０２８８】
同所性動物腫瘍モデルにおけるＷＸ−０２４の効果を評価するために、雌ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにＮＣＩ−Ｈ１２９９−Ｌｕｃ細胞を注射した。マウスは約５週齢であった。シリンジを用い、ＰＢＳ中の５０μＬのＮＣＩ−Ｈ１２９９−Ｌｕｃ細胞（５×１０６）を各マウスの肺に注射した。細胞をマウスに投与した後、マウスを２つの群（それぞれｎ＝３）に分割し、連続１０日間にわたって毎日、ビヒクルまたは１５ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４を静脈内投与した。
【０２８９】
製造元のプロトコル（Ｘｅｎｏｇｅｎ  ｉｖｉｓ造影システム、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に従い、研究全体を通じて定期的に、各マウスの生物発光強度（全光束［ｐ／ｓ］）を測定した。図２７Ａに示される平均全光束は、ビヒクルまたはＷＸ−０２４で処置されたマウスの腫瘍細胞によって生成された平均生物発光光子束シグナルを示す。図２７Ａに示されるように、ＷＸ−０２４は、腫瘍の形成及び増殖をインビボでほぼ完全に遮断し、ＷＸ−０２４のインビボ有効性が実証された。図２７Ｂは、この実験で監視された各マウスの全光束を示す。このデータは、腫瘍の形成及び増殖に対するＷＸ−０２４の阻害効果がマウス間で一貫していたことを示す。このデータはまた、ＷＸ−０２４が腫瘍転移を抑制することができることを示す。図２７Ｃは、研究全体を通じて撮影された各マウスの生物発光画像を示す。マウス１〜３番はビヒクル処置群のものであり、マウス４〜６番はＷＸ−０２４処置群のものであった。
【０２９０】
実施例５．５．  患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）動物モデルにおけるＷＸ−０２４の有効性
ＷＸ−０２４がヒト患者に由来する腫瘍にも適用可能かどうかを評価するために、患者由来の結腸癌細胞を接種した異種移植片動物モデルをＷＸ−０２４に曝露した。４人の異なる結腸癌患者に由来する試料を、古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の上昇したレベルを示すバイオマーカーについてスクリーニングした。図２８Ａに示されるように、試料（５番〜８番）を、β−カテニン、ＢＣＬ９、ｃ−Ｍｙｃ、及びＣＤ４４の発現について染色し、対照としてＩｇＧについても染色した。ＢＣＬ９及びβ−カテニンの核共局在化についても試料を染色した。患者８番に由来する試料は、この実験で試験した全てのバイオマーカーの上昇したレベルを示し、したがって、これを患者由来の異種移植片動物研究のために選択した。
【０２９１】
患者８番に由来する結腸癌細胞を、約５週齢の雄ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに静脈内注射した。簡潔に述べると、図２８Ａから選択されたＣＲＣ腫瘍試料を３ｍｍ３の断片にスライスし、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右側腹部の皮下に移植した。平均腫瘍サイズが約１３５ｍｍ３に達したとき（移植の約１８日後）、マウスを２つの群（それぞれｎ＝８）に分割し、ビヒクルまたは１５ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４のいずれかを投与した。各マウスには、３１日を超える期間にわたって毎日静脈内投与を与えた。
【０２９２】
図２８Ｂに示されるように、ＷＸ−０２４は、ビヒクルと比較して、腫瘍増殖を効果的に阻害した。ＷＸ−０２４の平均腫瘍増殖阻害率は、３１日間の投薬後に７５．６％であった。試験の最後にマウスを屠殺し、腫瘍試料を収集した。組織試料を１０％のホルマリンで固定し、７０％のエタノールに移し、次いで、脱パラフィン、抗原回収（１９０℃、５分）、内因性ペルオキシダーゼクエンチング（３％  Ｈ２Ｏ２、室温、５分）、室温で１５分間にわたる５％  ＦＢＳでのブロッキング、一次抗体インキュベーション（室温、１時間）、二次抗体インキュベーション（室温、３０分）、ＤＡＢでの発色（室温、５分）、ならびに脱水及び装着の後に処理した。各腫瘍試料をＢＣＬ９、β−カテニン、及びＣＤ４４の発現について染色した結果が図２９Ａ及び２９Ｂに示されている。なお、ＷＸ−０２４は、これらの腫瘍試料中でＣＤ４４発現を低減させることができ、ＷＸ−０２４にＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を阻害する能力があることが裏付けられた。
【０２９３】
これらのデータは、ＷＸ−０２４がヒト患者に有効な療法であることを示す。このデータはまた、β−カテニン、ＢＣＬ９、ｃ−Ｍｙｃ、及びＣＤ４４などの様々なバイオマーカーが、所与の患者がＷＸ−０２４処置に特に好適であるかどうかを判定するために有用であり得ることを示唆する。
【０２９４】
実施例５．６．  ＷＸ−０２４の毒性研究
ＷＸ−０２４の毒性効果を評価するために、約５週齢の雌ｂａｌｂ／ｃマウスを、１４日連続してＷＸ−０２４で処置した。ビヒクル、または１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４の一日用量で静脈内処置した４つの群（それぞれｎ＝６）にマウスを分割した。試験の最後にマウスを屠殺し、様々な主要臓器を収集した。この組織試料を、実施例５．５に記載されるように処置及び処理した。包埋組織試料を切開し、Ｈ＆Ｅで染色した。ビヒクル処置群及び１０ｍｇ／ｋｇ  ＷＸ−０２４処置群の代表的なＨ＆Ｅ染色画像が図３０Ａに示されている。研究全体を通じて各マウスの体重を監視した。各処置群の平均体重が図３０Ｂに示されている。研究初期にはわずかに減少したが、３つのＷＸ−０２４処置群全ての平均体重は安定化し、研究全体を通じて維持された。同様に、全てのＷＸ−０２４処置群の食物消費量は、研究初期にはわずかに減少したものの、継続的な処置によってベースラインレベル近くまで回復した。試験の最後に、血清化学及び血液学的分析（全血球数分析）のために各マウスから血液を収集した。図３０Ｃは、ビヒクル処置群及び２０ｍｇ／ｋｇ  ＷＸ−０２４処置群の血球数プロファイルを示す。これら２つの群のプロファイルは著しく異なっておらず、ＷＸ−０２４がこの実験条件下で著しい毒性を誘導しなかったことが示された。
【０２９５】
ＷＸ−０２４の毒物動態を約５週齢の雌ｂａｌｂ／ｃマウスで分析した。マウスは、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、または２０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０２４で連続１４日間にわたって腹腔内処置した。マウスには毎日ＷＸ−０２４を投与した。図３１Ａは、実験の１日目における第１の投薬後２４時間にわたる血漿濃度の変化を示す（各群でｎ＝２）。１日目に計算された平均毒物動態パラメータは以下の表５に要約されている。
【０２９６】
【表５】
2018537120.tif 000008
【０２９７】
図３１Ｂは、実験の１４日目における最後の投薬後２４時間にわたる血漿濃度の変化を示す。表６は、１４日目に計算された平均毒物動態パラメータの概要である。ＩＰ投薬（１５及び２０ｍｇ／ｋｇ）を使用した毒物動態研究は、１日目（それぞれ１１８，０３３及び１６２，３３３時間＊ｎｇ／ｍＬ）と１４日目（それぞれ１０７，４２０及び１５９，９７６時間＊ｎｇ／ｍ）とで匹敵するＡＵＣ値を示し、ＷＸ−０２４により引き起こされる薬物誘導性免疫原性は可能性が低いことを示している。
【０２９８】
【表６】
2018537120.tif 000009
【０２９９】
実施例６．  ＷＸ−０２４前臨床研究概要
全体として、ＷＸ−０２４は、他の既知のＷｎｔ阻害剤と比較して改善されたインビトロ有効性を示した。例えば、ＨＣＴ１６６細胞を使用した細胞ベースのＷｎｔ転写アッセイで試験したとき、ＷＸ−０２４は、約２００ｎＭのＩＣ５０値を呈した。ＷＸ−０２４はまた、Ｗｎｔ転写を特異的に阻害し、このステープルドポリペプチドは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＴＧＦ−β、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＦＯＸＯ３、及びＴＮＦ−α／ＪＮＫレポーターアッセイなどの他の転写アッセイにおいて１００μＭ超のＩＣ５０値を示した。
【０３００】
ＷＸ−０２４の全体的な薬物動態プロファイルは、インビボで生理的に適切な血漿濃度をもたらすためにも許容可能であった。例えば、皮下投与経路によって１０ｍｇ／ｋｇで試験したとき、生物学的利用率は約７０％であった。この条件では、Ｔｍａｘは８時間であり、Ｔ１／２は１３時間であり、一方でＣｍａｘは７．７μＭであった。
【０３０１】
ＷＸ−０２４のインビボ有効性を複数の動物モデルで確認した。例えば、ＷＸ−０２４の平均腫瘍増殖阻害率は、３〜６週間投与したとき、これらの動物モデルにおいて約７０〜８０％であった。動物にＷＸ−０２４を慢性的に投薬したとき、特定の薬物に関連した毒性は観察されなかった。
【０３０２】
実施例７．  コア機能ドメインを含む追加の安定化ポリペプチド
実施例１に記載のプロトコルに従い、コアＨＤ２機能ドメインを含むＷＸ−０３５を構築した。簡潔に述べると、Ｋｉｍ  ２０１１に概説されているルテニウム媒介性閉環オレフィンメタセシスを使用して、第１の炭化水素架橋剤を配列番号ＸのＸａａ１アミノ酸とＸａａ２アミノ酸との間に生成し、第２の炭化水素架橋剤を配列番号ＸのＸａａ３アミノ酸とＸａａ４アミノ酸との間に生成した。閉環メタセシスの後、ポリペプチドを脱保護し、解放した。結果として得られる安定化ポリペプチドは、一方の末端にＳ構成をもち他方の末端にＲ構成をもつ、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−の第１の炭化水素架橋剤と、両方の末端にＳ構成をもつ、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−の第２の炭化水素架橋剤とを含む。ＷＸ−０３５の化学構造は図１Ｂに示されている。このポリペプチドは、実施例１に記載のプロトコルに従ってさらに精製した。
【０３０３】
実施例８．  安定化ポリペプチドのインビトロプロファイル
実施例２に記載の手順に従い、Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ細胞を使用した細胞生存率アッセイにおいて、細胞増殖を阻害するＷＸ−０３５の能力を試験した。図３２に示されるように、ＷＸ−０３５は、ＷＸ−０２４と比較して改善されたＩＣ５０値を呈した。
【０３０４】
実施例９．  安定化ポリペプチドのインビボプロファイル
実施例９．１．  マウスにおけるＷＸ−０３５の薬物動態プロファイル
実施例５．１に記載の手順に従い、ＷＸ−０３５の薬物動態プロファイルを評価した。簡潔に述べると、１ｍｇ／ｋｇもしくは５ｍｇ／ｋｇの静脈内投与または５ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与をマウスに行った。投与後１５分、１、２、３、６、８、１２、及び２４時間の時点で血液試料を収集した。図３３Ａは、雄ＩＣＲマウスにおけるＷＸ−０３５の血漿濃度を示す。最大観察濃度（Ｃｍａｘ）、終末相半減期（Ｔ１／２）、全身クリアランス（ＣＬ）、分布容積（Ｖｚ）、投薬時間から最後の観察可能な濃度までの曲線下面積（ＡＵＣ０−ｔ）、投薬時間から無限大まで外挿した曲線下面積（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）、及び生物学的利用率を判定したものが、図３３Ｂに要約されている。なお、ＷＸ−０３５の半減期測定値は、４時間超のＴ１／２値で、改善された血液中の安定性を示す。
【０３０５】
ＷＸ−０２４で行ったように、ＷＸ−０３５の薬物動態プロファイルを雌ｂａｌｂ／ｃマウス（処置毎にｎ＝３）において再び分析した。３０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０３５を使用し、静脈内または腹腔内の２つの異なる投与経路を比較した。図３４Ａに示されるように、ＷＸ−０３５の薬物動態プロファイルは、雄ＩＣＲマウスで観察されたものと同様であった。実施例５．１の手順に従って平均薬物動態パラメータを計算したものが図３４Ｂに要約されている。雄ＩＣＲマウスで観察されたように、この実験におけるＷＸ−０３５の半減期は９時間超であった。
【０３０６】
これらのデータは、複数の架橋剤を用いたＢＣＬ９ペプチドの安定化がＰＫパラメータを改善させ得るという仮説と一致している。
【０３０７】
実施例９．２．  癌のマウス同系モデルにおけるＷＸ−０３５の有効性
実施例５．３に記載の手順に従い、癌の処置におけるＷＸ−０３５のインビボ有効性を同系マウスモデルにおいて評価した。既知のＭＥＫ阻害剤であるトラメチニブを比較として使用した。簡潔に述べると、ｂａｌｂ／ｃマウスにＣＴ２６を接種し、腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達したときに処置を開始した。次いでマウスを３つの群に分割し、連続７日間にわたるビヒクル、４０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０３５、または１ｍｇ／ｋｇのトラメチニブの投与を開始した。
【０３０８】
図３５Ａ及び３５Ｂに示されるように、ＷＸ−０３５は、トラメチニブ及びビヒクル処置と比較して、腫瘍増殖を堅実に抑制することができた。ＷＸ−０３５の平均腫瘍増殖阻害率は、研究の最後で８８．４４％であった。
【０３０９】
実施例９．３．  Ｔ細胞活性化におけるＷＸ−０３５の効果
実施例９．２に記載した研究の最後に、各マウスから腫瘍試料を収集して、Ｔ細胞活性化の調節におけるＷＸ−０３５の効果を評価した。実施例５に記載の手順に従い、各腫瘍試料のＦＡＣＳ分析を行った。図３６Ａに示されるように、ＷＸ−０３５での処置は、ＣＤ４５＋細胞の総量を低減させた。血液リンパ細胞の総量が低減したため、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞の総量も低減した（図３６Ｂ）。同様に、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞がＷＸ−０３５処置によって低減した（図３６Ｃ）。しかしながら、図３６Ｄに示されるように、ＷＸ−０３５は、ビヒクル処置と比較して、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）とＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞（制御性Ｔ細胞）との比を増加させた。したがって、これらのデータは、ＷＸ−０３５が、同系動物モデルにおいて制御性Ｔ細胞を低減させることができることを示唆する。さらに、制御性Ｔ細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞の比を増加させることによって、ＷＸ−０３５は、腫瘍の処置に有益な免疫反応に好ましい微小環境を誘導し得る。なお、この実験から収集した試料は、ＬＧＲ５発現についても評価した。図３６Ｅに示されるように、ＷＸ−０３５は、この実験から収集した腸管試料におけるＬＧＲ５の発現を低減させ、ＷＸ−０３５にＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達をインビボで阻害する能力があることが裏付けられた。
【０３１０】
実施例９．４．  ＷＸ−０３５の毒性効果
ＷＸ−０３５の毒性効果を評価するために、実施例５．６に記載の手順に従い、ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに、ビヒクル、または３０ｍｇ／ｋｇもしくは４０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０３５を投与した。研究の最後にマウスを屠殺し、主要臓器をＨ＆Ｅ染色のために採取した。図３７に示されるように、ＷＸ−０３５を用いた処置は、主要臓器に対して著しい異常を引き起こさず、ＷＸ−０３５が著しい毒性効果をもたらさなかったことが示された。
【０３１１】
実施例１０．  追加の安定化ポリペプチド
ヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインに由来する追加のポリペプチドも構築した。これらのポリペプチドの配列は以下の表７に示されている。これらのポリペプチドは、実施例１に記載のプロトコルに従って構築し、精製した。ＷＸ−０２９は、アミノ酸Ｘａａ１とＸａａ２との間に炭素数８の炭化水素架橋剤を含む。ＷＸ−０３７、ＷＸ−０３８、及びＷＸ−０３９は各々、２つの炭化水素架橋剤を含む。各ポリペプチドにおいて、第１の炭素数８の架橋剤は、そのそれぞれの配列のＸａａ１アミノ酸とＸａａ２アミノ酸との間に生成し、第２の炭素数８の架橋剤は、そのそれぞれの配列のＸａａ３アミノ酸とＸａａ４アミノ酸との間に生成した。ＷＸ−０３７は、疎水性ロイシン（Ｌ）残基が荷電したアスパラギン酸（Ｄ）に変異している、ヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドである。ＷＸ−０４０は、アミノ酸Ｘａａ１とＸａａ２との間に炭素数１１の架橋剤を含む。
【０３１２】
【表７】
2018537120.tif 000010
【０３１３】
実施例１１．  安定化ポリペプチドのインビトロプロファイル
実施例１０で生成した安定化ポリペプチドのうちの１つを細胞生存率アッセイにおいて試験し、ＷＸ−０３５と比較した。この比較研究ではＷＸ−０３７を選択した。実施例２に記載の手順に従い、ＣＴ２６．ＷＴ細胞（ＡＴＣＣ）を用いて細胞生存率アッセイを行った。簡潔に述べると、各プレートの１ウェル当たり４０００個の細胞を５０μＬのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地に播種した。２％のＦＢＳを含有するｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地で、培地９９μＬ中１μＬの２００倍濃縮ポリペプチドを使用し、ＷＸ−０３５またはＷＸ−０３７の各ポリペプチドを希釈した。幅広い濃度を試験するために各原液を希釈した。２倍濃縮ポリペプチド５０μＬをプレートの各ウェルに加えた。ポリペプチド添加の３日後、製造元のプロトコルに従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏを使用し、細胞の生存率を測定した。
【０３１４】
図３８Ａ及び３８Ｂに示されるように、ＷＸ−０３５は、この条件における細胞生存率（Ａｂ  ＩＣ５０＝１．８５８μＭ）をＷＸ−０３７（Ａｂ  ＩＣ５０＞３２μＭ）よりも効果的に阻害した。このデータは、疎水性ロイシン残基が、ヒトＢＣＬ９タンパク質のＨＤ２ドメインに由来するポリペプチドの有効性をさらに増加させることを示す。図３８Ｃは、各ポリペプチドのインビトロプロファイルの概要である。
【０３１５】
実施例１２．  安定化ポリペプチドのインビボプロファイル
実施例１２．１．  マウスにおける安定化ポリペプチドの薬物動態プロファイル
実施例１０で構築した４つの追加のポリペプチドの薬物動態プロファイルを、実施例５．１に記載の手順に従って評価した。ＷＸ−０２９及びＷＸ−０３６を雌ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに１ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。投与後１５分、１、２、及び４時間の時点で血液試料を収集した。図３９Ａ及び図３９Ｂは、ＷＸ−０２９について計算された血漿濃度及び薬物動態プロファイルの概要である。図４０Ａ及び図４０Ｂは、ＷＸ−０３６について計算された血漿濃度及び薬物動態プロファイルの概要である。
【０３１６】
同様に、ＷＸ−０３９及びＷＸ−０４０も雌ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおいて試験し、それらの薬物動態プロファイルを評価した。ＷＸ−０３９は、静脈内に５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内に５ｍｇ／ｋｇ、または皮下に１０ｍｇ／ｋｇで投与した。ＷＸ−０４０は、静脈内に３０ｍｇ／ｋｇまたは腹腔内に３０ｍｇ／ｋｇで投与した。投与後１５分、１、２、４、８、２４、３６、４８、及び７２時間の時点で血液試料を収集した。図４１Ａ及び図４１Ｂは、ＷＸ−０３９について計算された血漿濃度及び薬物動態プロファイルの概要である。図４２Ａ及び図４２Ｂは、ＷＸ−０４０について計算された血漿濃度及び薬物動態プロファイルの概要である。なお、この実験において計算されたＷＸ−０３９の半減期は、皮下投与したとき約５２時間であった。
【０３１７】
実施例１２．２．  癌のマウス同系モデル（Ｂ１６Ｆ１０）におけるＷＸ−０３９の有効性
実施例５．４に記載した動物モデルにおいて、腫瘍増殖を抑制するＷＸ−０３９の能力を評価した。簡潔に述べると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６細胞を接種した。５週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部にＢ１６Ｆ１０細胞（マウス一体当たり０．０５ｍｌ中２×１０５個の細胞）を接種した。マウスの平均腫瘍サイズが１００ｍｍ３に達したとき、マウスを２つの群（Ｎ＝３）に分割した。第１の群には６０ｍｇ／ｋｇのＷＸ−０３９を投与し、第２の群はビヒクルで処置した。処置は１２日間連続して腹腔内に施した。図４３Ａに示されるように、ＷＸ−０３９は、ビヒクル処置と比較して腫瘍増殖を低減させ、ＷＸ−０３９のインビボ有効性が裏付けられた。図４３Ｂには、実験中に評価した腫瘍増殖阻害率が示されている。図４３Ｃに示されるように、実験中にＷＸ−０３９によってもたらされた実質的な体重変化はなく、ＷＸ−０３９が耐容可能な毒性を有することが示された。
【０３１８】
参照による組み込み
本出願全体にわたって引用され得る、全ての引用される参考文献（文献参照、特許、特許出願、及びウェブサイトを含む）の内容は、それらの全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれるものとし、その中に引用されている参考文献も同様とする。これらの参考文献が本出願中のいずれかの記述と矛盾する、すなわち一致しない場合は、本出願の文言が優先するものとする。本開示は、特に指示されない限り、全て当該技術分野において周知である、免疫学、分子生物学、及び細胞生物学、及び病理学の従来の技法を用いる。
【０３１９】
均等物
本発明は、その趣旨または本質的な特性を逸脱することなく他の特定の形態で具現することができる。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載される発明を限定するのではなく、全ての点において例示的であると見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の説明によってではなく添付の特許請求の範囲によって示されるものであり、特許請求の範囲の意味及び均等物の範囲に含まれる全ての変更が本明細書に包含されることが意図される。
【図１Ａ−Ｂ】
2018537120.tif 000011
【図２Ａ】
2018537120.tif 000012
【図２Ｂ】
2018537120.tif 000013
【図２Ｃ】
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【図３】
2018537120.tif 000015
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
2018537120.tif 000018
【図５Ａ−Ｂ】
2018537120.tif 000019
【図５Ｃ−Ｅ】
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【図６Ａ−Ｂ】
2018537120.tif 000021
【図７】
2018537120.tif 000022
【図８Ａ】
2018537120.tif 000023
【図８Ｂ−Ｃ】
2018537120.tif 000024
【図９Ａ−Ｂ】
2018537120.tif 000025
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
2018537120.tif 000028
【図１１】
2018537120.tif 000029
【図１２Ａ−Ｂ】
2018537120.tif 000030
【図１３Ａ】
2018537120.tif 000031
【図１３Ｂ】
2018537120.tif 000032
【図１４Ａ−Ｂ】
2018537120.tif 000033
【図１５Ａ−Ｂ】
2018537120.tif 000034
【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
2018537120.tif 000038
【図１７Ａ−Ｂ】
2018537120.tif 000039
【図１８Ａ−Ｂ】
2018537120.tif 000040
【図１９Ａ−Ｂ】
2018537120.tif 000041
【図２０Ａ−Ｂ】
2018537120.tif 000042
【図２１Ａ−Ｂ】
2018537120.tif 000043
【図２１Ｃ】
2018537120.tif 000044
【図２１Ｄ】
2018537120.tif 000045
【図２２Ａ】
2018537120.tif 000046
【図２２Ｂ−Ｃ】
2018537120.tif 000047
【図２３Ａ】
2018537120.tif 000048
【図２３Ｂ】
2018537120.tif 000049
【図２４】
2018537120.tif 000050
【図２５Ａ−Ｃ】
2018537120.tif 000051
【図２６Ａ−Ｂ】
2018537120.tif 000052
【図２６Ｃ】
2018537120.tif 000053
【図２６Ｄ】
2018537120.tif 000054
【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
2018537120.tif 000056
【図２７Ｃ】
2018537120.tif 000057
【図２８Ａ】
2018537120.tif 000058
【図２８Ｂ】
2018537120.tif 000059
【図２９Ａ】
2018537120.tif 000060
【図２９Ｂ】
2018537120.tif 000061
【図３０Ａ】
2018537120.tif 000062
【図３０Ｂ】
2018537120.tif 000063
【図３０Ｃ】
2018537120.tif 000064
【図３１Ａ−Ｂ】
2018537120.tif 000065
【図３２】
2018537120.tif 000066
【図３３Ａ−Ｂ】
2018537120.tif 000067
【図３４Ａ−Ｂ】
2018537120.tif 000068
【図３５Ａ】
2018537120.tif 000069
【図３５Ｂ】
2018537120.tif 000070
【図３６Ａ−Ｂ】
2018537120.tif 000071
【図３６Ｃ−Ｄ】
2018537120.tif 000072
【図３６Ｅ】
2018537120.tif 000073
【図３７】
2018537120.tif 000074
【図３８Ａ−Ｃ】
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【図３９Ａ−Ｂ】
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【図４０Ａ−Ｂ】
2018537120.tif 000077
【図４１Ａ】
2018537120.tif 000078
【図４１Ｂ】
2018537120.tif 000079
【図４２Ａ】
2018537120.tif 000080
【図４２Ｂ】
2018537120.tif 000081
【図４３Ａ−Ｃ】
2018537120.tif 000082
【配列表】
2018537120000001.app
【国際調査報告】
2018537120.tif 000083
2018537120.tif 000084
2018537120.tif 000085