(57)【要約】がん免疫学は、がん処置に有望な新しい手段を提供するが、標的化し得る可能性があるネオアンチゲンの検証は、費用がかかり、高価である。ＭＨＣ結合親和性、抗原プロセシング、公知抗原との類似性、（ｍＲＮＡまたはタンパク質としての）予測発現レベル、自己類似性、および変異体アレル頻度の分析は、シーケンシングデータを使用して候補ネオアンチゲンを同定し、優先順位付けするためのスクリーニング方法を提供する。それにより、本発明の方法は、さらなる実験検証のための優先候補ネオアンチゲンを同定することにより時間と費用を節約する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者について候補ネオアンチゲンの優先順位を付けるための方法であって、
複数の候補ネオアンチゲンを得るステップ；
前記複数のメンバーの自己類似性を決定するステップ；
前記複数のメンバーの公知抗原との類似性を決定するステップ；
前記複数のメンバーの発現のレベルを決定するステップ；
前記複数のメンバーをコードするエクソンにおける変異体アレル頻度を同定するステップ；および
前記決定するステップおよび同定するステップの結果にルールを適用するステップであって、臨床的重要性の見込みに従って前記複数のメンバーをランキングするステップ、を含む、方法。
【請求項２】
前記複数の候補ネオアンチゲンのランキングされたメンバーを含むレポートを生成するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の候補ネオアンチゲンが患者腫瘍試料に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の候補ネオアンチゲンが、腫瘍試料から得られた候補ペプチドについてＨＬＡ遺伝子型およびＭＨＣ結合親和性を決定することにより得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
候補ペプチドについての前記ＨＬＡ遺伝子型および前記ＭＨＣ結合親和性が、ペプチド配列データからｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで決定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
候補ペプチドについての前記ＨＬＡ遺伝子型および前記ＭＨＣ結合親和性が、アッセイにより決定される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記候補ペプチドが、前記腫瘍試料由来のペプチドを、正常試料由来の対応するペプチドと比較することにより得られ、候補ペプチドが前記対応するペプチドに対して変異を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記適用するステップが、１０００ｎＭより高いＭＨＣ結合親和性を有する候補ネオアンチゲンを前記複数の候補ネオアンチゲンから除去することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記適用するステップが、７５０ｎＭより高いＭＨＣ結合親和性を有する候補ネオアンチゲンを前記複数の候補ネオアンチゲンから除去することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記適用するステップが、５００ｎＭより高いＭＨＣ結合親和性を有する候補ネオアンチゲンを前記複数の候補ネオアンチゲンから除去することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の候補ネオアンチゲンがそれぞれ、強い結合（ＳＢ）または弱い結合（ＷＢ）のＭＨＣ分類に割り当てられ、前記適用するステップが、ＳＢ候補ネオアンチゲンがＷＢ候補ネオアンチゲンより高くランキングされるように、前記複数をランキングすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数のメンバーの抗原ペプチドプロセシングの分類を決定するステップ
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数が、エピトープ（Ｅ）または非抗原（ＮＡ）の分類に割り当てられ、前記適用するステップが、Ｅ候補ネオアンチゲンがＮＡ候補ネオアンチゲンより高くランキングされるように、前記複数をランキングすることを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記適用するステップが、より低い自己類似性を有する候補ネオアンチゲンが、より高い自己類似性を有するネオアンチゲンより高くランキングされるように、前記複数をランキングすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記発現のレベルが、ＲＮＡｓｅｑ発現値を含み、前記適用するステップが、１０ＲＰＫＭ（マッピングされた１００万個のリード当たり１キロベース当たりのリード数）未満の発現値を有する候補ネオアンチゲンを前記複数の候補ネオアンチゲンから除去することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記適用するステップが、２５ＲＰＫＭ（マッピングされた１００万個のリード当たり１キロベース当たりのリード数）未満の発現値を有する候補ネオアンチゲンを前記複数の候補ネオアンチゲンから除去することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記適用するステップが、公知抗原のより長い部分とのアミノ酸同一性を有する候補ネオアンチゲンが、公知抗原のより短い部分とのアミノ酸同一性を有する候補ネオアンチゲンより高くランキングされるように、公知抗原の部分との１００パーセントアミノ酸同一性に基づいて前記複数をランキングすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗原ペプチドプロセシングの分類が、ペプチド切断予測または抗原ペプチドトランスポーター（ＴＡＰ）の親和性予測を使用して決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記得るステップ、決定するステップ、同定するステップ、または適用するステップの１つまたは複数が、有形の非一過性メモリおよびインプット／アウトプットデバイスと連結されたプロセッサーを含むコンピューターを使用して実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
アウトプットデバイスへレポートを送るステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
共通ネオアンチゲンを同定するための方法であって、
１つより多くの腫瘍型に存在する複数の再発性変異を選択するステップ；
予測ペプチド配列に基づいて、前記複数のいずれが、可能性のあるネオアンチゲンであるかを決定するステップ；および
ＨＬＡクラスＩアレルの普及率および複数の腫瘍型にわたる再発性変異の普及率に基づいて、前記可能性のあるネオアンチゲンを共通ネオアンチゲンとして同定するステップ
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１５年７月１４日に出願された米国仮出願番号第６２／１９２，３７３号に基づく利益および優先権を主張しており、この仮出願は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、ネオアンチゲン分析の分野に関係している。特に、それは、がんワクチンおよびＴ細胞治療の開発のための変異由来ネオアンチゲンの同定および優先順位付けに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
がんは、異常細胞の増殖によって特徴付けられる。従来の処置の成功は、がんの型およびそれが検出される病期に依存する。多くの処置は、費用がかかり、痛みを伴う手術および化学療法を含み、成功しない場合も多く、または患者の寿命をやや延ばすだけの場合が多い。開発中の有望な処置方法には、患者の免疫系が腫瘍細胞と健康な細胞を区別し、患者において免疫応答を誘発することを可能にする、腫瘍抗原を標的にする腫瘍ワクチンまたはＴ細胞治療が挙げられる。Chenら、Oncology  Meets  Immunology:  The  Cancer-Immunity  Cycle、Immunity  ３９巻、２０１３年７月２５日（その内容は全体として全ての目的のために本明細書に組み入れられている）を参照されたい。
【０００４】
ネオアンチゲンは、患者のがんに特有の腫瘍特異的変異に付随する免疫原のクラスである。ネオアンチゲンは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）での養子Ｔ細胞移入、がんワクチン、およびチェックポイント阻害剤を含む抗腫瘍免疫技術についての標的として有望である。Hacohenら、Getting  Personal  with  Neoantigen-Based  Therapeutic  Cancer  Vaccines、Cancer  Immunol  Res、２０１３年７月１巻１１頁；  Robbinsら、Mining  exomic  sequencing  data  to  identify  mutated  antigens  recognized  by  adoptively  transferred  tumor-reactive  T  cells、Nature  Medicine  １９巻、７４７〜７５２頁（２０１３年）（それぞれの内容は全体として全ての目的のために本明細書に組み入れられている）参照されたい。
シーケンシングされた腫瘍ＤＮＡおよびＨＬＡタイピングを使用する、候補ネオアンチゲンを同定し、優先順位付けするためのストラテジーは存在するが、従来の技術は、感度および特性を欠き、いくつかの候補ネオアンチゲンを同定できず、高価な検証手順をなお必要とする、焦点が絞られていない結果をもたらしている。Snyderら、Genetic  Basis  for  Clinical  Response  to  CTLA-4  Blockade  in  Melanoma、N  Engl  J  Med  ２０１４年；３７１巻：２１８９〜２１９９頁；Segalら、Epitope  landscape  in  breast  and  colorectal  cancer、Cancer  Res.  ２００８年２月１日；６８巻（３号）：８８９〜９２頁；Fritschら、２０１４年、HLA-Binding  Properties  of  Tumor  Neoepitopes  in  Humans、Cancer  Immunol  Res；２巻（６号）；１〜８頁（それぞれの内容は全体として全ての目的のために本明細書に組み入れられている）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Chenら、Oncology  Meets  Immunology:  The  Cancer-Immunity  Cycle、Immunity  ３９巻、２０１３年７月２５日
【非特許文献２】Hacohenら、Getting  Personal  with  Neoantigen-Based  Therapeutic  Cancer  Vaccines、Cancer  Immunol  Res、２０１３年７月１巻１１頁
【非特許文献３】Robbinsら、Mining  exomic  sequencing  data  to  identify  mutated  antigens  recognized  by  adoptively  transferred  tumor-reactive  T  cells、Nature  Medicine  １９巻、７４７〜７５２頁（２０１３年）
【非特許文献４】Snyderら、Genetic  Basis  for  Clinical  Response  to  CTLA-4  Blockade  in  Melanoma、N  Engl  J  Med  ２０１４年；３７１巻：２１８９〜２１９９頁
【非特許文献５】Segalら、Epitope  landscape  in  breast  and  colorectal  cancer、Cancer  Res.  ２００８年２月１日；６８巻（３号）：８８９〜９２頁
【非特許文献６】Fritschら、２０１４年、HLA-Binding  Properties  of  Tumor  Neoepitopes  in  Humans、Cancer  Immunol  Res；２巻（６号）；１〜８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、候補ネオアンチゲンを同定し、優先順付けするためのスクリーニング方法に関する。本発明は、効果的な処置のためにネオアンチゲンの優先順位を付けるために一緒に動作する重要な因子を認識している。この認識の結果として、本発明は、がん免疫療法における高度に個別化された効力のためにネオアンチゲンの優先順位を付けるために、ゲノム情報とタンパク質に基づいた情報の両方を使用する多変量オペレーションを提供する。特許請求の範囲に記載された方法の適用に基づいて、ネオアンチゲンの優先順位が、試料が採取された患者における臨床効果の可能性に基づいて候補ネオアンチゲンとしてペプチド配列をランキングするために使用される。
【０００７】
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、腫瘍における低い変異体アレル頻度においてでさえも、変異またはバリアントを同定することにおいて、高レベルの感度および陽性の的中率を達成するためにシーケンシングおよびマッチした正常対照を利用する。変異配列が一旦対応する候補ネオアンチゲンペプチド配列と共に、腫瘍組織において同定されれば、各候補ネオアンチゲンペプチド配列についてネオアンチゲンの優先順位スコアが、個体のＨＬＡ型、および以下の２つまたはそれ超を使用して生成される：ペプチド配列の公知抗原との類似性；ペプチド配列の自己類似性；ペプチド配列についての変異体アレル頻度；ペプチド配列と個体のＨＬＡアレルの１つまたは複数との間の予測される主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）結合親和性；ペプチド配列についての予測される抗原プロセシング；ならびにペプチド配列についてのｍＲＮＡまたはタンパク質発現分析。予測される抗原プロセシングは、ペプチド切断予測、または抗原ペプチドトランスポーター（ＴＡＰ）の親和性予測を含み得る。ネオアンチゲンの優先順位を計算するために使用される様々なインプットは、一部の実施形態において、重み付けされ得る。優先順位スコアは、シーケンシングデータに基づいて高確率の臨床的有用性を有する候補ネオアンチゲンを同定し、優先順位付けして、それにより、さらなる研究の焦点を最も有望な可能性がある抗原だけに合わせるために使用される。したがって、本発明の方法は、より少ない追加の実験で成果を挙げるネオアンチゲンを同定する見込みを増大させるのを助けるために研究者に優先順位レポートを提供することにより、ネオアンチゲンの費用のかかる実験検証への時間と費用の両方を節約することができるスクリーニングを提供する。
【０００８】
ある特定の態様では、本発明は、可能性のあるネオアンチゲンを予測し、優先順位付けするための方法を提供する。例示的な方法は、個体についての腫瘍核酸配列および正常核酸配列を得るステップを含む。腫瘍核酸配列は、正常核酸配列と比較されて、腫瘍特異的変異を有する複数の可能な翻訳ペプチド配列を決定する。その後、ＨＬＡ型が、個体について決定され、そのＨＬＡ型は１つまたは複数のＨＬＡアレルを含む。方法はまた、複数のペプチド配列のそれぞれとＨＬＡアレルとの間の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）結合親和性を予測するステップ、および複数のペプチド配列のそれぞれについての抗原ペプチドプロセシングスコアを予測するステップを含む。変異体アレル頻度が、複数のペプチド配列のそれぞれについて決定され、複数のペプチド配列のそれぞれが、公知抗原と比較されて、公知抗原類似性スコアが決定される。本発明の方法はさらに、複数のペプチド配列のそれぞれについての正常核酸配列との自己類似性スコアを決定するステップ、および複数のペプチド配列のそれぞれについてのｍＲＮＡ発現レベルまたはタンパク質発現レベルを決定するステップを含む。複数のペプチド配列のそれぞれについて、ＭＨＣ結合親和性、抗原ペプチドプロセシングスコア、公知抗原類似性スコア、自己類似性スコア、およびｍＲＮＡ発現レベルまたはタンパク質発現レベルを含む項を使用して多変量オペレーションが実施され、複数のペプチド配列のそれぞれにつきネオアンチゲンの優先順位スコアを生成する。その後、複数のペプチド配列のそれぞれにつきネオアンチゲンの優先順位スコアを含むレポートが生成される。
【０００９】
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、個体の腫瘍組織から抽出された腫瘍核酸の全エクソームシーケンシングを通して腫瘍核酸配列を決定するステップを含み得る。全エクソームシーケンシングは、次世代シーケンシングもしくはサンガーシーケンシングまたは両方を含み得る。一部の実施形態では、正常参照核酸配列は、コンセンサス配列のデータベースから得られる。代替の実施形態では、正常核酸配列は、試料が採取されている同じ個体の非腫瘍組織からであり得る。本発明の方法は、個体の非腫瘍組織から得られた正常核酸の全エクソームシーケンシングを通して正常核酸配列を決定するステップを含み得る。
【００１０】
様々な実施形態では、抗原ペプチドプロセシングスコアは、ペプチド切断予測または抗原ペプチドトランスポーター（ＴＡＰ）の親和性予測を含み得る。ＨＬＡ型は、腫瘍核酸配列もしくは正常核酸配列から決定され得、または血清型分類を通して、もしくは細胞アッセイにより決定され得る。ある特定の実施形態では、本方法の１つまたは複数のステップは、有形の非一過性のメモリおよびインプット／アウトプットデバイスに連結されたプロセッサーを含むコンピューターを使用して実施され得る。本発明の方法はさらに、アウトプットデバイスにレポートを送るステップを含み得る。本発明の様々な方法において、複数のペプチド配列のそれぞれは、５００ｎＭ未満の、ＩＣ５０における予測ＭＨＣ結合親和性を有し得る。ある特定の実施形態では、公知抗原配列は、公知抗原配列のデータベースから得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、候補ネオアンチゲンを同定し、優先順位付けするための方法を図示する。
【図２】図２は、候補ネオアンチゲンを同定し、その後、優先順位付けするための別の方法を図示する。
【図３】図３は、一連の症例において検出された生殖系列および体細胞の変化、ならびに腫瘍特異的変異を同定するためにマッチした正常なものを使用することの重要性を例証するグラフを示す。
【図４】図４は、本発明の見本のレポートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、がんの免疫療法的処置のための候補ネオアンチゲンを同定し、優先順位付けするための方法を提供する。本発明の方法は、どの候補ネオアンチゲンが、がん免疫療法としての開発のために成果を挙げる可能性が最も高いかを決定するための優先順位スコアを提供するために多変量分析を利用する。本発明の方法は、特定の患者における特定の腫瘍に対して処置効力を最大にするために個別化されたネオアンチゲンの優先順位を決定するために特に有用である。本発明の方法の結果として、臨床医は、効果的な免疫調節療法を生み出すために、どのネオアンチゲン処置モダリティーが、臨床試験へと導き、または臨床試験で進展するかという、より良い考えをもつ可能性が高い。
【００１３】
ＨＬＡタイピング、ペプチド類似性分析、および本明細書で記載されているような他の徴候と共に腫瘍核酸から取得されたデータは、可能性のある治療効力候補ネオアンチゲンを反映するスコアを生じる。特許請求された多変量分析における重要なインプットが本明細書に提供される。それらのインプットは、組み合わさって、さらなる開発のために候補ネオアンチゲンの優先順位を付ける。ある特定の実施形態では、本発明の方法は、低い変異体アレル頻度においてさえも、変異またはバリアントを同定することにおいて高レベルの感度および陽性の的中率を達成するために全エクソームシーケンシングおよびマッチした正常対照に頼る。変異配列が個体について対応する候補ネオアンチゲンペプチド配列と共に一旦同定されれば、加重多変量オペレーションが、個体のＨＬＡ型、ならびに以下：ペプチド配列の公知抗原との類似性；ペプチド配列の自己類似性；ペプチド配列についての変異体アレル頻度；ペプチド配列と個体のＨＬＡアレルの１つまたは複数との間の予測される主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）結合親和性；ペプチド配列についての予測される抗原プロセシング；およびペプチド配列についてのｍＲＮＡまたはタンパク質発現分析の２つまたはそれ超を使用して、各候補ネオアンチゲンペプチド配列についてネオアンチゲンの優先順位スコアを生じる。予測される抗原プロセシングは、ペプチド切断予測、または抗原ペプチドトランスポーター（ＴＡＰ）の親和性予測を含み得る。したがって、本発明の方法は、より少ない追加の実験で成果を挙げるネオアンチゲンを同定する見込みを増大させるのを助けるために研究者に優先順位レポートを提供することにより、ネオアンチゲンの費用のかかる実験検証への時間と費用の両方を節約することができる予備的スクリーニングを提供する。本明細書で用いられる場合、候補ネオアンチゲンは、ペプチド配列として示され得る。
【００１４】
図１および２は、個体の腫瘍についての腫瘍核酸シーケンシングデータおよび正常核酸シーケンシングデータを得るステップを含む本発明の例示的な方法を示す。変異は、典型的には８〜１１アミノ酸長である、野生型および体細胞のペプチドペアのＦＡＳＴＡ形式データに沿って同定される。様々な実施形態では、野生型および体細胞のペプチドペアは、１１〜２０アミノ酸長であり得る。ＦＡＳＴＱ形式核酸シーケンシングデータは、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでのＨＬＡタイピングに使用され、または代替として、伝統的な実験で検証されたＨＬＡタイピング情報が、手作業で本方法に提供され得る（例えば、ＨＬＡ−Ａ０１：０１  ＨＬＡ−Ａ２６：０１）。
【００１５】
個体についての決定されたＨＬＡアレルは、野生型および体細胞のペプチドペアのＦＡＳＴＡ形式データと共に使用されて、例えばＮｅｔＭＨＣｐａｎを使用して、そのペプチドと各ＨＬＡアレルについてのＭＨＣ結合親和性を予測する。腫瘍核酸シーケンシングデータは、ペプチド切断およびＴＡＰトランスポーターの親和性などの抗原プロセシングを予測するために使用される。その後、抗原プロセシングおよびＭＨＣ結合親和性予測は、例えば、（ＩＣ５０における）予測ＭＨＣ結合親和性が５００ｎＭ未満である候補ネオアンチゲンまたはペプチド配列を選択するために使用される。その後、腫瘍核酸配列および正常核酸配列は、自己類似性を評価するために使用される。候補ネオアンチゲンはまた、公知抗原と比較されて、類似性が決定され、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現は、そのペプチドを有する遺伝子について獲得される。その後、変異体アレル頻度、発現、公知抗原との類似性、自己類似性、および予測ＭＨＣ結合親和性が、加重多変量オペレーションに使用され、各候補ネオアンチゲンについてネオアンチゲンの優先順位スコアが生じる。このスコアは、実験的フォローアップのためにネオアンチゲンの優先順位を付けるために使用することができる。
【００１６】
試料調製、シーケンシング、および変異同定
本発明の方法は、候補ネオアンチゲン、もしくは提供された核酸配列由来のペプチド配列を同定し、優先順位付けするステップを含み得、またはある特定の実施形態において、核酸配列を生成するための試料調製およびシーケンシング技術を含み得る。ある特定の実施形態では、個体または患者由来の試料は、凍結組織、ＦＦＰＥブロックもしくはスライド、胸水、細胞、ＤＮＡ、細胞株、血液、唾液、または異種移植片などの形で入手され得る。試料は、腫瘍組織から採取され得、ある特定の実施形態において、正常な、またはマッチした正常な核酸の供給源を提供するために、正常組織から採取される場合もある。正常核酸は、任意の非腫瘍組織から、または唾液もしくは全血などの供給源から採取され得る。腫瘍核酸および正常核酸は、公知方法を使用して試料から抽出され得る。好ましい実施形態では、少なくとも５０ｎｇのＤＮＡが、シーケンシングのために獲得されるべきである。
【００１７】
核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含み得る。核酸試料は、任意の公知方法を使用してシーケンシングされ得る。核酸試料は、標識ターミネーターまたはプライマー、およびスラブまたはキャピラリーにおけるゲル分離を使用する古典的ジデオキシシーケンシング反応（サンガー方法）を使用して、シーケンシングされ得る。本発明の方法と共に使用され得る他の技術には、可逆的に終結する標識ヌクレオチドを使用する合成によるシーケンシング、ピロシーケンシング、４５４シーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａシーケンシング、標識オリゴヌクレオチドプローブのライブラリーとのアレル特異的ハイブリダイゼーション、標識クローンのライブラリーとのアレル特異的ハイブリダイゼーション、続いてライゲーションを使用する合成によるシーケンシング、重合ステップ中の標識ヌクレオチドの取り込みのリアルタイムモニタリング、ポロニーシーケンシング、ナノポアまたはナノチャネルを通しての転位置、ナノポアまたはナノチャネルにおけるヌクレオチドの検出と組み合わされたＤＮＡの消化または重合、ナノポアまたはナノチャネルと共に局在化した鎖におけるヌクレオチドの光学的検出、およびＳＯＬｉＤシーケンシングが挙げられる。分離した分子は、ポリメラーゼまたはリガーゼを使用する連続的または単一的伸長反応により、加えて、プローブのライブラリーとの単一的または連続的ディファレンシャルハイブリダイゼーションにより、シーケンシングされ得る。
【００１８】
一部の実施形態では、シーケンシング技術（例えば、次世代シーケンシング技術）が、１つまたは複数の捕獲標的（例えば、またはその単位複製配列）の一部をシーケンシングするために使用され、その配列は、存在する異なるバーコードの数を数えるために使用される。したがって、一部の実施形態では、本発明の態様は、高度に多重化されたｑＰＣＲ反応に関する。
【００１９】
使用することができるシーケンシング技術には、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングが挙げられる。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングは、フォールドバックＰＣＲおよび固着したプライマーを使用する固体表面上でのＤＮＡの増幅に基づいている。ＤＮＡが断片化され、アダプターが、その断片の５’末端および３’末端に付加される。フローセルチャネルの表面に付着しているＤＮＡ断片は、伸長され、架橋増幅される。その断片は、二本鎖になり、その二本鎖分子は変性される。固相増幅、続いて、変性の複数サイクルにより、フローセルの各チャネルにおいて同じ鋳型の一本鎖ＤＮＡ分子のおよそ１，０００個のコピーの数百万個のクラスターが形成され得る。プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および４個のフルオロフォア標識された可逆的に終結するヌクレオチドが使用されて、連続的シーケンシングが実施される。ヌクレオチド取り込み後、レーザーが使用されて、フルオロフォアを励起し、画像がキャプチャされ、最初の塩基のアイデンティティが記録される。それぞれの取り込まれた塩基由来の３’ターミネーターおよびフルオロフォアが除去され、取り込み、検出、および同定のステップが繰り返される。このテクノロジーによるシーケンシングは、米国特許第７，９６０，１２０号；米国特許第７，８３５，８７１号；米国特許第７，２３２，６５６号；米国特許第７，５９８，０３５号；米国特許第６，９１１，３４５号；米国特許第６，８３３，２４６号；米国特許第６，８２８，１００号；米国特許第６，３０６，５９７号；米国特許第６，２１０，８９１号；米国公開特許第２０１１／０００９２７８号；米国公開特許第２００７／０１１４３６２号；米国公開特許第２００６／０２９２６１１号；および米国公開特許第２００６／００２４６８１号（それぞれ、全体として参照により組み入れられている）に記載されている。
【００２０】
シーケンシングは、複数のリードを生じる。リードは一般的に、約１５０塩基長未満または約９０塩基長未満のヌクレオチドデータの配列を含む。ある特定の実施形態では、リードは、約８０塩基から約９０塩基の間、例えば、８５塩基長である。一部の実施形態では、これらは非常に短いリードであり、すなわち、約５０塩基長未満または約３０塩基長未満である。
【００２１】
提供された発明の方法において使用することができるシーケンシング技術には、例えば、４５４シーケンシング（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｒｏｃｈｅ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）（Margulies,  Mら、Nature、４３７巻：３７６〜３８０頁（２００５年）；米国特許第５，５８３，０２４号；米国特許第５，６７４，７１３号；および米国特許第５，７００，６７３号）が挙げられる。４５４シーケンシングは２つのステップを含む。第１のステップにおいて、ＤＮＡがおよそ３００〜８００塩基対の断片へ剪断され、その断片は、平滑末端化される。その後、オリゴヌクレオチドアダプターが、その断片の末端にライゲーションされる。アダプターは、断片の増幅およびシーケンシングのためのプライマーとしての役割を果たす。断片は、例えば５’−ビオチンタグを含有するＡｄａｐｔｏｒ  Ｂを使用して、ＤＮＡ捕獲ビーズ、例えば、ストレプトアビジンコーティング化ビーズに付着することができる。ビーズに付着した断片は、油水エマルジョンの液滴内でＰＣＲ増幅される。その結果は、各ビーズ上のクローン的に増幅したＤＮＡ断片の複数コピーである。第２のステップにおいて、ビーズは、（ピコリットルサイズの）ウェル内に捕獲される。各ＤＮＡ断片上で並行して、ピロシーケンシングが実施される。１個または複数のヌクレオチドの付加により、シーケンシング機器におけるＣＣＤカメラにより記録される光シグナルが生じる。シグナル強度は、取り込まれたヌクレオチドの数と比例する。ピロシーケンシングは、ヌクレオチド付加で放出されるピロリン酸塩（ＰＰｉ）を使用する。ＰＰｉは、アデノシン５’ホスホ硫酸の存在下でＡＴＰスルフリラーゼによりＡＴＰへ変換される。ルシフェラーゼは、ＡＴＰを使用して、ルシフェリンをオキシルシフェリンへ変換し、この反応は、検出および分析される光を発生する。
【００２２】
提供された発明の方法において使用することができるＤＮＡシーケンシング技術の別の例は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）からのＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓによるＳＯＬｉＤテクノロジーである。ＳＯＬｉＤシーケンシングにおいて、ＤＮＡは断片へ剪断され、アダプターがその断片の５’末端および３’末端に付着して、断片ライブラリーが生じる。あるいは、その断片の５’末端および３’末端にアダプターをライゲーションし、その断片を環状化し、環状化断片を消化して内部アダプターを生じ、生じた断片の５’末端および３’末端にアダプターを付着させて、メイトペアライブラリーを生じることにより、内部アダプターを導入することができる。次に、ビーズ、プライマー、鋳型、およびＰＣＲ成分を含有するマイクロリアクターにおいて、クローンビーズ集団が調製される。ＰＣＲ後、鋳型が変性され、ビーズが濃縮されて、伸長した鋳型を有するビーズが分離される。選択されたビーズ上の鋳型は、スライドグラスへの結合を可能にする３’修飾に供される。特定のフルオロフォアにより同定される中央の決定された塩基（または塩基対）との部分的ランダムなオリゴヌクレオチドの連続的ハイブリダイゼーションおよびライゲーションにより配列を決定することができる。色が記録された後、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドは切断されて、除去され、その後、その過程が繰り返される。
【００２３】
提供された発明の方法において使用することができるＤＮＡシーケンシング技術の別の例は、例えば、米国公開特許第２００９／００２６０８２号、第２００９／０１２７５８９号、第２０１０／００３５２５２号、第２０１０／０１３７１４３号、第２０１０／０１８８０７３号、第２０１０／０１９７５０７号、第２０１０／０２８２６１７号、第２０１０／０３００５５９号、第２０１０／０３００８９５号、第２０１０／０３０１３９８号、および第２０１０／０３０４９８２号（それらのそれぞれの内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられている）に記載されたＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシングである。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシングにおいて、ＤＮＡは、およそ３００〜８００塩基対の断片へ剪断され、その断片は平滑末端化される。その後、オリゴヌクレオチドアダプターが、その断片の末端にライゲーションされる。アダプターは、断片の増幅およびシーケンシングのためのプライマーとしての役割を果たす。その断片は、表面に付着することができ、断片が個々に分離可能であるような分離能で付着する。１個または複数のヌクレオチドの付加は陽子（Ｈ＋）を放出し、そのシグナルは、シーケンシング機器において検出および記録される。シグナル強度は、取り込まれたヌクレオチドの数と比例する。
【００２４】
提供された発明の方法において使用することができるシーケンシングテクノロジーの別の例は、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングである。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングは、フォールドバックＰＣＲおよび固着したプライマーを使用する固体表面上でのＤＮＡの増幅に基づいている。ＤＮＡが断片化され、アダプターが、その断片の５’末端および３’末端に付加される。フローセルチャネルの表面に付着しているＤＮＡ断片は、伸長され、架橋増幅される。その断片は、二本鎖になり、その二本鎖分子は変性される。固相増幅、続いて、変性の複数サイクルにより、フローセルの各チャネルにおいて同じ鋳型の一本鎖ＤＮＡ分子のおよそ１，０００個のコピーの数百万個のクラスターが形成され得る。プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および４個のフルオロフォア標識された可逆的に終結するヌクレオチドが使用されて、連続的シーケンシングが実施される。ヌクレオチド取り込み後、レーザーが使用されて、フルオロフォアを励起し、画像がキャプチャされ、最初の塩基のアイデンティティが記録される。それぞれの取り込まれた塩基由来の３’ターミネーターおよびフルオロフォアが除去され、取り込み、検出、および同定のステップが繰り返される。このテクノロジーによるシーケンシングは、米国公開特許第２０１１／０００９２７８号、米国公開特許第２００７／０１１４３６２号、米国公開特許第２００６／００２４６８１号、米国公開特許第２００６／０２９２６１１号、米国特許第７，９６０，１２０号、米国特許第７，８３５，８７１号、米国特許第７，２３２，６５６号、米国特許第７，５９８，０３５号、米国特許第６，３０６，５９７号、米国特許第６，２１０，８９１号、米国特許第６，８２８，１００号、米国特許第６，８３３，２４６号、および米国特許第６，９１１，３４５号（それらのそれぞれは、全体として参照により本明細書に組み入れられている）に記載されている。
【００２５】
提供された発明の方法において使用することができるシーケンシングテクノロジーの別の例には、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．）の単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）テクノロジーが挙げられる。ＳＭＲＴにおいて、４個のＤＮＡ塩基のそれぞれが、４つの異なる蛍光色素の１つに付着している。これらの色素はホスホ連結されている。単一のＤＮＡポリメラーゼが、ゼロモード導波管（ＺＭＷ）の底部に鋳型一本鎖ＤＮＡの単一分子で固定化されている。ＺＭＷは、ＺＭＷの内外で急速に（マイクロ秒で）拡散する蛍光ヌクレオチドのバックグラウンドに対してＤＮＡポリメラーゼによる単一ヌクレオチドの取り込みの観察を可能にする閉じ込め構造である。ヌクレオチドを、成長する鎖へ取り込むのに数ミリ秒かかる。この時間の間、蛍光標識が励起され、蛍光シグナルを生じ、蛍光タグが切断される。色素の対応する蛍光の検出は、どの塩基が取り込まれたかを示す。その過程が繰り返される。
【００２６】
提供された発明の方法において使用することができるシーケンシング技術の別の例は、ナノポアシーケンシングである（Soni,  G.  V.およびMeller,  A.、Clin  Chem  ５３巻：１９９６〜２００１頁（２００７年））。ナノポアは、直径が１ナノメートルのオーダーの小さい孔である。導電性流体におけるナノポアの浸漬、およびそれにわたる電位の印加により、ナノポアを通ってのイオンの伝導によるわずかな電流が生じる。流れる電流量は、ナノポアのサイズに敏感である。ＤＮＡ分子がナノポアを通過する時、ＤＮＡ分子上の各ヌクレオチドは、ナノポアを異なる程度で塞ぐ。したがって、ＤＮＡ分子がナノポアを通過する時のナノポアを通過する電流の変化は、ＤＮＡ配列のリードを表す。
【００２７】
提供された発明の方法において使用することができるシーケンシング技術の別の例は、（例えば、米国公開特許第２００９／００２６０８２号に記載されているような）ＤＮＡをシーケンシングするために化学物質感受性電界効果トランジスタ（ｃｈｅｍＦＥＴ）アレイを使用することを含む。その技術の一例において、ＤＮＡ分子を反応チャンバーへ置くことができ、鋳型分子を、ポリメラーゼに結合したシーケンシングプライマーにハイブリダイズさせることができる。シーケンシングプライマーの３’末端での、１個または複数のトリホスフェートの新しい核酸鎖への取り込みを、ｃｈｅｍＦＥＴによる電流の変化により検出することができる。アレイは、複数のｃｈｅｍＦＥＴセンサーを有し得る。別の例において、単一核酸をビーズに付着させることができ、その核酸を、ビーズ上で増幅させることができ、個々のビーズを、ｃｈｅｍＦＥＴアレイ上の個々の反応チャンバーへ移動させることができ、各チャンバーはｃｈｅｍＦＥＴセンサーを有し、核酸をシーケンシングすることができる。
【００２８】
提供された発明の方法において使用することができるシーケンシング技術の別の例は、電子顕微鏡を使用することを含む（Moudrianakis  E.  N.およびBeer  M.、PNAS、５３巻：５６４〜７１頁（１９６５年））。その技術の一例において、個々のＤＮＡ分子が、電子顕微鏡を使用して区別可能である金属標識を使用して標識される。その後、これらの分子は、平面で引き伸ばされ、配列を測定するために電子顕微鏡を使用して画像化される。
【００２９】
提供された発明の方法において使用することができるシーケンシング技術の別の例は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３３４５１（参照により組み入れられている）に記載されているような、高速異数性スクリーニング試験−シーケンシングシステム（ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳ）を含む。Kindeら、「FAST-SeqS:  A  Simple  and  Efficient  Method  for  the  Detection  of  Aneuploidy  by  Massively  Parallel  Sequencing」、DOI:  10.1371/journal.pone.0041162（参照により組み入れられている）も参照されたい。ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳは、特異的なプライマー、具体的には、ゲノムにわたって分散している配列の部分集合にアニールする１ペアのプライマーを使用する。その領域は、それらが、１ペアのプライマーで増幅することができるような類似性により選択されるが、増幅された遺伝子座の大部分が区別されるのを可能にするのに十分独特である。各タグが非依存的に整列されなければならない伝統的な全ゲノム増幅ライブラリーとは対照的に、ＦＡＳＴ−ＳｅｑＳにより生じた配列は、より少数の位置に整列する。
【００３０】
配列アセンブリは、参照に基づいたアセンブリ、デノボアセンブリ、アラインメントによるアセンブリ、または組合せ方法を含む当技術分野において公知の方法により達成することができる。一部の実施形態では、配列アセンブリは、Kleinら、「LOCAS-A  low  coverage  sequence  assembly  tool  for  re-sequencing  projects」、PLoS  One  ６巻（８号）論文２３４５５（２０１１年）（その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられている）に記載された低カバレッジ配列アセンブリソフトウェア（ＬＯＣＡＳ）ツールを使用する。配列アセンブリは、米国特許第８，１６５，８２１号；米国特許第７，８０９，５０９号；米国特許第６，２２３，１２８号；米国公開特許第２０１１／０２５７８８９号；および米国公開特許第２００９／０３１８３１０号に記載されており、それらのそれぞれの内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【００３１】
腫瘍核酸配列は、一旦得られれば、正常核酸配列と比較されて、腫瘍核酸配列における変異が決定され得る。ある特定の実施形態では、正常核酸は、ＨＧ１８もしくはＨＧ１９などの参照ゲノム、またはＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍもしくは１０００ゲノムプロジェクトにより編纂された任意のヒト参照配列であり得る。好ましい実施形態では、正常核酸配列は、個体の非腫瘍組織から、または関連した個体から入手され得るマッチした正常核酸である。バリアントまたは変異体を判定するためにマッチした正常組織を参照配列として使用することは、その個体の腫瘍細胞と非腫瘍細胞の両方に存在する生殖細胞系列変異を同定する助けとなり得、腫瘍特異的バリアントまたは変異体の偽陽性の排除およびより正確な同定を可能にすることができる。図２は、腫瘍特異的変異を同定するためにマッチした正常なものを使用することの重要性を示す、一連の症例において検出された生殖系列および体細胞の変化を図解する棒グラフを示す。本明細書で用いられる場合、変異には、例えば、修飾、染色体変化、置換、インデル、一塩基多型、転位置、反転、重複、およびコピー数変動を挙げることができる。
【００３２】
例示的な実施形態では、腫瘍特異的変異は、Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手できるＣＡＮＣＥＲＸＯＭＥなどの市販の技術を使用して同定される。
【００３３】
ＨＬＡタイピング
個体または患者のＨＬＡタイピングは、細胞アッセイ、血清型分類、遺伝子タイピング、または配列データからのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏを含む様々な公知の手段を使用して行われ得る。
【００３４】
好ましい実施形態では、ＨＬＡタイピングは、コンピューティングデバイス上で実行されるＯｐｔｉＴｙｐｅなどの１つまたは複数の技術を使用してｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで行われる。全ての目的のために全体として本明細書に組み入れられた、Szolekら、OptiType:  precision  HLA  typing  from  next-generation  sequencing  data、Bioinformatics  ２０１４年１２月１日；３０巻（２３号）参照されたい。様々な他のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ技術もまた使用され得る。Majorら、HLA  typing  from  1000  genomes  whole  genome  and  whole  exome  illumina  data、PLoS  One  ２０１３年１１月６日；８巻（１１号）：ｅ７８４１０；Wittigら、Development  of  a  high-resolution  NGS-based  HLA-typing  and  analysis  pipeline、Nucl.  Acids  Res.（２０１５年）（最初は２０１５年３月９日にオンラインで出版されたｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ１８４）参照されたい。
【００３５】
ある特定の実施形態では、ＨＬＡアレルは、他の手段により決定され得（例えば、ＨＬＡ−Ａ０１：０１、ＨＬＡ−Ａ２６：０１）、その結果もまた、本方法により利用することができ、それによりｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測の必要性を避けることができる。
【００３６】
候補ネオアンチゲンの同定および候補ネオアンチゲンの優先順位付け
個体についてのＨＬＡタイピング情報、および同定された変異を有するペプチド配列を使用して、ＭＨＣ結合親和性は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣｐａｎ／で利用できるＮｅｔＭＨＣｐａｎのバージョン（例えば、バージョン２．８）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｐｉｉｂ−ｂｅｒｌｉｎ．ｍｐｇ．ｄｅ／ＭＡＰＰＰ／で利用できるＭＨＣ−Ｉ抗原ペプチドプロセシング予測（ＭＨＣ−Ｉ  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）（ＭＡＰＰＰ）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｍａｓ．ｃｉｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／で利用できるＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ）ＨＬＡペプチド結合予測（ＨＬＡ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ）、ｈｔｔｐ：／／ｉｍｅｄ．ｍｅｄ．ｕｃｍ．ｅｓ／Ｔｏｏｌｓ／ｒａｎｋｐｅｐ．ｈｔｍｌで利用できるＲａｎｋｐｅｐ  ＭＨＣ−ペプチド結合予測、またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ／ｂｉｎ／ＭＨＣＳｅｒｖｅｒ．ｄｌｌ／ＥｐｉｔｏｐｅＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．ｈｔｍで利用できるＳＹＦＰＥＩＴＨＩエピトープ予測器などの様々なｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ技術およびコンピュータープログラムを使用して、各ペプチド配列について予測することができる。
【００３７】
ＭＨＣ提示および結合の前に、ペプチド切断および抗原ペプチドトランスポーター（ＴＡＰ）を含む正しいペプチドプロセシングが起きなければならない。本発明の方法によれば、候補ネオアンチゲンは、一つには、抗原ペプチドプロセシングスコアを含み得る抗原ペプチドプロセシング予測を使用して、同定され得る。ある特定の実施形態では、抗原ペプチドプロセシングスコアは、ペプチド切断予測およびＴＡＰ結合親和性予測を含み得る。ペプチド切断は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｐｉｉｂ−ｂｅｒｌｉｎ．ｍｐｇ．ｄｅ／ＭＡＰＰＰ／ｃｌｅａｖａｇｅ．ｈｔｍｌで利用できるＭＡＰＰＰプロテアソーム切断予測器、またはｈｔｔｐ：／／ｉｍｅｄ．ｍｅｄ．ｕｃｍ．ｅｓ／Ｔｏｏｌｓ／ｒａｎｋｐｅｐ．ｈｔｍｌで利用できるＲａｎｋｐｅｐ切断予測器などのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ技術またはコンピュータープログラムを使用して、ペプチド配列から予測され得る。同様に、ＴＡＰ結合親和性は、Doytchinovaら、Transporter  associated  with  antigen  processing  preselection  of  peptides  binding  to  the  MHC:  a  bioinformatic  evaluation、J  Immunol．２００４年１２月１日；１７３巻（１１号）；Tenzerら、Modeling  the  MHC  class  I  pathway  by  combining  predictions  of  proteasomal  cleavage、TAP  transport  and  MHC  class  I  binding、Cell  Mol  Life  Sci.２００５年５月；６２巻（９号）：１０２５〜３７頁；Zhangら、PREDTAP  :  a  system  for  prediction  of  peptide  binding  to  the  human  transporter  associated  with  antigen  processing、Immunome  Research  ２００６年５月、２巻：３頁（それらの内容は全体として、全ての目的のために参照により本明細書に組み入れられている）に記載された方法などの公知方法を使用して、ペプチド配列から予測され得る。
【００３８】
抗原ペプチドプロセシング予測またはスコアに基づいて、候補ネオアンチゲンは、エピトープ（Ｅ）または非抗原（ＮＡ）の抗原ペプチドプロセシングの分類が与えられてもよく、Ｅ分類がＮＡ分類より優先される。
【００３９】
例えば、１００ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、３００ｎＭ未満、４００ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、６００ｎＭ未満、７００ｎＭ未満、８００ｎＭ未満、９００ｎＭ未満、１０００ｎＭ未満などのＩＣ５０値などのＭＨＣ結合親和性カットオフを使用して、カットオフより上の予測ＭＨＣ結合親和性を有する候補ネオアンチゲンまたはペプチド配列は、さらなる分析または考慮から排除され得る。
【００４０】
候補ネオアンチゲンは、それらの公知抗原との類似性、（ｍＲＮＡまたはタンパク質としての）予測発現レベル、自己類似性測定、および変異体アレル頻度の分析を通してさらに特徴付けられ得る。変異体アレル頻度は、対象変異体アレルが、シーケンシングされた核酸において、その核酸または遺伝子の他のアレルと比較して、出現する頻度を決定するように、腫瘍核酸シーケンシングデータの分析を通して決定することができる。変異体アレル頻度は、例えば、腫瘍核酸における平均発現として、決定され得る。一般的に、変異体アレル頻度の増加は、ペプチド配列または候補ネオアンチゲンについての臨床的有用性の見込みの増加を示している。
【００４１】
自己類似性は、類似性スコアを確立するために、変異ペプチド配列を等価の正常ペプチド配列と比較することにより決定され得る。ある特定の実施形態では、自己類似性は、ペプチド配列に沿って１アミノ酸ずつ、決定され得る。自己類似性は、パーセンテージ値として決定され得る。一般的に、より低いレベルの自己類似性は、ペプチド配列または候補ネオアンチゲンについての臨床的有用性の見込みの増加を示している。好ましい実施形態では、アミノ酸置換のＰＭＢＥＣマトリックスが、類似性スコアを計算するために使用され、０．０５未満のスコアが、その変異ペプチドにおける親の野生型ペプチドとの類似性の喪失を反映している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｍｅｄｃｅｎｔｒａｌ．ｃｏｍ／１４７１−２１０５／１０／３９４参照）。
【００４２】
公知抗原類似性は、そのペプチド配列を公知抗原のペプチド配列と比較することにより決定され得る。ある特定の実施形態では、公知抗原類似性は、ペプチド配列に沿って１アミノ酸ずつ、決定され得る。公知抗原は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ＿ｖ３．ｐｈｐで利用できる免疫エピトープデータベースおよび分析供給源（Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）（ｉｅｄｂ）などのデータベースから入手され得る。ペプチド配列または候補ネオアンチゲンは、例えば、様々な公知抗原との一連の比較から最も高く決定された値であり得るパーセンテージ類似性値を含み得るスコアを与えられ得る。一般的に、公知抗原とのより高いレベルの類似性は、ペプチド配列または候補ネオアンチゲンについての臨床的有用性の見込みの増加を示している。公知抗原類似性は、例えば、公知抗原との配列相同性を求めるＩＥＤＢに対するネオアンチゲン候補の配列類似性検索により、または新規の抗原を反映し得る細菌タンパク質の他のデータベースに対する検索を通して、決定され得る。
【００４３】
タンパク質またはｍＲＮＡ発現レベルは、例えば、ＲＮＡｓｅｑ分析もしくはマイクロアレイを使用する、腫瘍試料において関連遺伝子の発現を測定することにより、または特定の腫瘍型に関連した公知の発現データのデータベース（例えば、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）を参照することにより、ペプチド配列について予測され得る。
【００４４】
様々な実施形態では、複数のペプチド配列のそれぞれについてのネオアンチゲンの優先順位スコアを生成するために、多変量オペレーションは、ＭＨＣ結合親和性、抗原ペプチドプロセシングスコア、公知抗原類似性スコア、自己類似性スコア、およびｍＲＮＡ発現レベルまたはタンパク質発現レベルの２つまたはそれ超を表す項に関して実施され得る。様々な実施形態では、その項の１つまたは複数が、ネオアンチゲンの優先順位スコアへのその影響をその他の項に対して増加または減少させるために重み値を使用して重み付けされ得る。
【００４５】
例示的な実施形態では、ネオアンチゲンの優先順位は、複数の候補ネオアンチゲンのそれぞれについて決定または同定された１つまたは複数の特性へのルールまたは一連のルールの適用を通して決定され得る。ルールは、ＭＨＣ結合親和性、抗原ペプチドプロセシングスコアまたは分類、公知抗原類似性、自己類似性スコア、およびｍＲＮＡ発現レベルまたはタンパク質発現レベルなどのネオアンチゲン候補特性の優先順位を付ける、排他的規定および多因子ソーティングパラメータを含み得る。そのような実施形態の例は、下記に見出され得る。
【００４６】
ある特定の実施形態では、ネオアンチゲンの優先順位ランキングが、本発明の方法に従って調製されたレポートに含まれ得る。見本のレポートは、図４に示されている。レポートは、いくつかの同定された候補ネオアンチゲンまたはペプチド配列の任意の組合せ、関連したネオアンチゲンの優先順位スコア、決定項の任意の組合せについての値からなり得る。ある特定の実施形態では、候補ネオアンチゲンは、例えば、最高から最低への優先順位により順序づけられ得る。レポートは、事実上物理的であってもよく、下に記載されているようなアウトプットデバイスを使用して紙に印刷または記述されたものでもよく、あるいは電子的であってもよく、コンピューティングデバイスで調製されそれらに記憶されてもよい。レポートは、試験された個体もしくは患者、注文した、もしくは他の医師もしくは研究所、または他の団体などの関心を有する関係者に送ってもよい。レポートは、物理的な形態で送達してもよいし、または例えば電子メールにより電子的に送信してもよい。
【００４７】
コンピューティングデバイス
本発明の方法の実施に必要または最適であると当業者が認識しているように、プロセッサー（例えば、中央プロセシング装置（ＣＰＵ）、グラフィックプロセシング装置（ＧＰＵ）など）、コンピューター可読記憶デバイス（例えば、メインメモリ、スタティックメモリなど）、またはバスを介してお互いに通信するそれらの組合せの１つまたは複数を含む、１つまたは複数のコンピューティングデバイス、コンピューティングシステム、またはコンピューターを含み得る。
【００４８】
プロセッサーには、Ｉｎｔｅｌ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）により商標ＸＥＯＮ  Ｅ７として販売されているプロセッサー、またはＡＭＤ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）により商標ＯＰＴＥＲＯＮ  ６２００として販売されているプロセッサーなど、当技術分野において公知の任意の適切なプロセッサーが挙げられ得る。
【００４９】
メモリは、好ましくは、システムに、本明細書に記載された機能を実施させるように実行可能な１つまたは複数の命令セット（例えば、本明細書に見出される任意の方法論もしくは機能を具体化するソフトウェア、または上記で言及されたコンピュータープログラム）；データ（例えば、薬物データの源の画像、個人データ、または薬物のデータベース）；または両方を記憶することができる少なくとも１つの有形の非一過性媒体を含む。コンピューター可読記憶デバイスは、例示的な実施形態において、単一の媒体であり得るが、用語「コンピューター可読記憶デバイス」は、命令またはデータを記憶する、単一の媒体または複数の媒体（例えば、集中型もしくは分散型データベース、ならびに／または関連したキャッシュおよびサーバー）を含むように解釈されるべきである。したがって、用語「コンピューター可読記憶デバイス」は、非限定的に、ソリッドステートメモリ（例えば、加入者識別モジュール（ＳＩＭ）カード、セキュアデジタルカード（ＳＤカード）、マイクロＳＤカード、またはソリッドステートドライブ（ＳＳＤ））、光学および磁気媒体、ならびに任意の他の有形の記憶媒体を含むように解釈されるべきである。
【００５０】
例えば、Ａｍａｚｏｎ  Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、コンピューティングシステムのメモリ、クラウドストレージ、サーバー、または他のコンピューター可読ストレージなどの任意の適切なサービスが記憶に使用することができる。
【００５１】
本発明によるインプット／アウトプットデバイスは、ディスプレイユニット（例えば、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）またはブラウン管（ＣＲＴ）モニター）、英数字インプットデバイス（例えば、キーボード）、カーソル制御デバイス（例えば、マウスまたはトラックパッド）、ディスクドライブユニット、プリンター、信号発生デバイス（例えば、スピーカー）、タッチスクリーン、ボタン、加速度計、マイクロホン、セルラー無線周波数アンテナ、ネットワークインターフェイスデバイス（例えば、ネットワークインターフェイスカード（ＮＩＣ）、Ｗｉ−Ｆｉカード、またはセルラーモデムであり得る）、またはそれらの任意の組合せの１つまたは複数を含み得る。
【００５２】
任意の適切な開発環境またはプログラミング言語が、本明細書に記載された方法を実行するために用いられ得ることを当業者は認識していると予想される。例えば、本明細書における方法は、Ｐｅｒｌ、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｊａｖａ（登録商標）、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ、Ｒｕｂｙ  ｏｎ  Ｒａｉｌｓ、ＧｒｏｏｖｙおよびＧｒａｉｌｓ、または任意の他の適切なツールを使用して実行することができる。モバイルデバイスについて、ネイティブなｘＣｏｄｅまたはＡｎｄｒｏｉｄ  Ｊａｖａ（登録商標）を使用することが好ましくあり得る。
【実施例】
【００５３】
（実施例１）
例示的な実施形態では、配列分析を通して決定された体細胞変異との関連により決定され得る１セットの候補ネオアンチゲンペプチドが与えられたならば、以下のルールのセットが適用され得る。ＭＨＣ結合親和性は、予測ＩＣ５０親和性を決定するように上記のように決定され得る。その後、例えば、５００ｎＭより高い予測ＩＣ５０親和性を有する全ての候補ネオアンチゲンは、さらなる実験から除去され得る。
【００５４】
その後、残りの候補ネオアンチゲンは、ＭＨＣ結合親和性分類から始まる多因子ソートに従ってソートされ得る。候補ネオアンチゲンは、上記のように、ＳＢまたはＷＢ（強い結合物質および弱い結合物質）として分類され得、ＳＢペプチドがＷＢペプチドより高い優先順位を与えられるようにソートされ得る。
【００５５】
その後、抗原ペプチドプロセシングが、上記のように候補ネオアンチゲンについて決定または予測され得る。その後、候補ネオアンチゲンは、ＥまたはＮＡとして分類され得、Ｅと分類されたＳＢペプチドが、ＮＡと分類されたＳＢペプチドより優先され、次に、ＮＡと分類されたＳＢペプチドが、Ｅと分類されたＷＢペプチドより優先されるように、それらのＭＨＣ結合親和性分類ランキング内でサブソートされ得る。
【００５６】
その後、参照遺伝子発現レベルを、上記の方法に従って候補ネオアンチゲンについて決定することができる。その後、候補ネオアンチゲンは、それらの既成のＭＨＣ結合親和性および抗原プロセシングの優先順位内で参照遺伝子発現レベルによりサブソートされ得、より高いレベルが、より低いレベルより高い優先順位を有する。
【００５７】
候補ネオアンチゲンの生じた順序づけられたリストは、優先順位を付けられた候補ネオアンチゲンセットを含み得、最も高い優先順位候補がリストの最上位にある。このリストは、本明細書の他で記載されているようなレポートの形をとって提示され、要求している個人または団体へ送達され得る。
【００５８】
ある特定の実施形態では、方法は、候補ネオアンチゲンをランキングした後、そのランキングに基づいたネオアンチゲンを標的にするワクチンまたはＴ細胞治療で患者を処置するステップを含み得る。方法は、それらのランキングに基づいた候補ネオアンチゲンを実験的に検証するステップを含み得る。方法はまた、そのランキングに基づいたネオアンチゲンを標的にするワクチンまたはＴ細胞治療での患者の処置を与えるステップを含み得る。
【００５９】
（実施例２）
第２の例示的な実施形態では、配列分析を通して決定された体細胞変異との関連により決定され得る１セットの候補ネオアンチゲンペプチドが与えられたならば、以下のルールのセットが適用され得る。ＭＨＣ結合親和性は、予測ＩＣ５０親和性を決定するように上記のように決定され得る。その後、例えば、１０００ｎＭより高い予測ＩＣ５０親和性を有する全ての候補ネオアンチゲンは、さらなる実験から除去され得る。
【００６０】
ＲＮＡｓｅｑ発現値が、残りの候補ネオアンチゲンについて決定され得、約１０ＲＰＫＭ（マッピングされた１００万個のリード当たり１キロベース当たりのリード数）の閾値未満の関連遺伝子ＲＮＡｓｅｑ発現値を有するペプチドがさらなる実験から除去され得る。
【００６１】
その後、残りの候補ネオアンチゲンは、ＭＨＣ結合親和性分類から始まる多因子ソートに従ってソートされ得る。候補ネオアンチゲンは、上記のように、ＳＢまたはＷＢとして分類され得、ＳＢペプチドがＷＢペプチドより高い優先順位を与えられるようにソートされ得る。
【００６２】
その後、抗原ペプチドプロセシングが、上記のように候補ネオアンチゲンについて決定または予測され得る。その後、候補ネオアンチゲンは、ＥまたはＮＡとして分類され得、Ｅと分類されたＳＢペプチドが、ＮＡと分類されたＳＢペプチドより優先され、次に、ＮＡと分類されたＳＢペプチドが、Ｅと分類されたＷＢペプチドより優先されるように、それらのＭＨＣ結合親和性分類ランキング内でサブソートされ得る。
【００６３】
その後、候補ネオアンチゲンについての自己類似性が、上記のようにＰＭＢＥＣ比較を使用して決定され得る。その後、候補ネオアンチゲンが、それらの既成のＭＨＣ結合親和性および抗原プロセシングの優先順位内で、自己類似性によりサブソートされ得、より低いスコアを有する自己類似性スコアが、より高いスコアより高い優先順位を有する。
【００６４】
候補ネオアンチゲンの生じた順序づけられたリストは、優先順位を付けられた候補ネオアンチゲンセットを含み得、最も高い優先順位候補がリストの最上位にある。このリストは、本明細書の他で記載されているようなレポートの形をとって提示され、要求している個人または団体へ送達され得る。
【００６５】
（実施例３）
第３の例示的な実施形態では、配列分析を通して決定された体細胞変異との関連により決定され得る１セットの候補ネオアンチゲンペプチドが与えられたならば、以下のルールのセットが適用され得る。ＭＨＣ結合親和性は、予測ＩＣ５０親和性を決定するように上記のように決定され得る。その後、例えば、７５０ｎＭより高い予測ＩＣ５０親和性を有する全ての候補ネオアンチゲンは、さらなる実験から除去され得る。
【００６６】
ＲＮＡｓｅｑ発現値が、残りの候補ネオアンチゲンについて決定され得、約２５ＲＰＫＭ（マッピングされた１００万個のリード当たり１キロベース当たりのリード数）の閾値未満の関連遺伝子ＲＮＡｓｅｑ発現値を有するペプチドがさらなる実験から除去され得る。
【００６７】
その後、残りの候補ネオアンチゲンは、ＭＨＣ結合親和性分類から始まる多因子ソートに従ってソートされ得る。候補ネオアンチゲンは、上記のように、ＳＢまたはＷＢとして分類され得、ＳＢペプチドがＷＢペプチドより高い優先順位を与えられるようにソートされ得る。
【００６８】
その後、抗原ペプチドプロセシングが、上記のように候補ネオアンチゲンについて決定または予測され得る。その後、候補ネオアンチゲンは、ＥまたはＮＡとして分類され得、Ｅと分類されたＳＢペプチドが、ＮＡと分類されたＳＢペプチドより優先され、次に、ＮＡと分類されたＳＢペプチドが、Ｅと分類されたＷＢペプチドより優先されるように、それらのＭＨＣ結合親和性分類ランキング内でサブソートされ得る。
【００６９】
その後、公知抗原との類似性が、例えば上記の方法に従って、候補ネオアンチゲンについて決定され得る。その後、候補ネオアンチゲンは、公知抗原との１００％同一性アミノ酸一致に基づいてサブソートされ得る（より長い完全な一致がより高い優先順位を反映する）。
【００７０】
候補ネオアンチゲンの生じた順序づけられたリストは、優先順位を付けられた候補ネオアンチゲンセットを含み得、最も高い優先順位候補がリストの最上位にある。このリストは、本明細書の他で記載されているようなレポートの形をとって提示され、要求している個人または団体へ送達され得る。このリストは、リストからの優先順位を付けられた候補ネオアンチゲンを実験的に検証もしくは選択し、それを標的にするワクチンもしくはＴ細胞治療を含む処置を施し、またはその処置を施されるように喚起するために使用され得る。
【００７１】
（実施例４）
シーケンシングデータ；Fritschら、Cancer  Immunol  Res  ２０１４年からの公知のネオアンチゲン；Robbinsら、Nat  Med  ２０１３年からの実験的に検証されたネオアンチゲン；およびSnyderら、NEJM  ２０１４年からの技術を使用して決定されたチェックポイント阻害剤についての予測的バイオマーカーを使用して、本発明の方法を、シーケンシングデータに適用し、優先順位を付けられたペプチド配列または候補ネオアンチゲンを、実施例１に記載されたルールセットの適用を使用して、検証されたネオアンチゲンと比較した。
【００７２】
Robbinsら、Nat  Med  ２０１３年からの実験的に検証されたネオアンチゲンのオペレーションおよびランクにより生じた優先順位を付けられた候補ネオアンチゲンの数は、下記の表１に示されている：
【表１】
2018524008.tif 000002
【００７３】
オペレーションは、実験的に検証されたネオアンチゲンを全候補ネオアンチゲンの上位２０％内にランキングした。
【００７４】
オペレーションで同定された候補ネオアンチゲンの、Fritschら、Cancer  Immunol  Res  ２０１４年からの公知のネオアンチゲンとの比較により、オペレーションが、９０％より高い感度として表２に示されているように、公知のネオアンチゲンの１９個のうちの１８個を同定したことが明らかにされた。
【表２−１】
2018524008.tif 000003
【表２−２】
2018524008.tif 000004
【００７５】
（実施例５）
がんゲノムデータセット（例えば、ＴＣＧＡ）およびがん変異データベース（例えば、ＣＯＳＭＩＣ）を使用して、本発明者らは、任意の腫瘍型において少なくとも１％頻度で起こる１０００個を超える再発性変異を同定した。その後、本発明者らは、変異に隣接するタンパク質領域、およびフレームシフト変異によるネオＯＲＦを予測した。北米集団について最も普及率の高いＨＬＡクラスＩアレルを、ＮＣＢＩからのｄｂＭＨＣを使用して編纂し、９０個の特有の４デジットアレルを生じ、それぞれ、０．１５％以上の集団頻度を有した。
【００７６】
１０００個を超える体細胞変異関連ペプチドおよび９０個のＨＬＡアレルに本発明の方法を適用して、候補ネオアンチゲンを予測し、優先順位付けした。表３は、変異関連ペプチドが、編纂されたＨＬＡアレルの少なくとも１つに対する候補ネオアンチゲンであると予測される、再発性体細胞変異の部分的リストを提供する。北米集団におけるＨＬＡアレルの報告された頻度は、特定のネオアンチゲン関連体細胞変異を有する患者が、そのネオアンチゲンを認識するＨＬＡアレルの少なくとも１つを有すると予想される確率の評価を可能にする。
【００７７】
本明細書で同定された再発性体細胞変異は、効果的なワクチンおよびＴ細胞治療のための潜在的に有望な標的であるネオアンチゲンをもたらし得る。それらの抗原は、もっぱら腫瘍細胞だけに発現しており、いかなる他の細胞にも発現していないため、それらを標的にするワクチンおよびＴ細胞治療は、細胞毒性が低下した、焦点が絞られた免疫応答を開始すると予想される。さらに、それらの変異は複数の患者で生じるため、それらの大部分は、腫瘍について成長優位を与え得、したがって、一旦根絶されれば、腫瘍成長を妨げると予想される。さらに、多くの変異について、生じた候補ネオアンチゲンは、北米集団のかなりの部分集合において、ＨＬＡアレルと結合し得、そのようなネオアンチゲンを標的にするワクチンまたはＴ細胞治療は、多くの患者に恩恵をもたらす可能性があることを示唆している。驚くほどのことではないが、上記で概要を示された分析により同定されたいくつかの変異は、抗腫瘍免疫を誘導することがすでに実証されており、それらには、ＩＤＨ１−Ｒ１３２Ｈ（Schumacherら、Nature  ２０１４年）、ＫＲＡＳ−Ｇ１２変異（Chaftら、Clin  Lung  Cancer  ２０１４年）、およびＥＧＦＲ−ＶＩＩＩ欠失（Taylor  ら、Curr  Cancer  Drug  Targets  ２０１２年）が挙げられる。
【表３−１】
2018524008.tif 000005
【表３−２】
2018524008.tif 000006
【００７８】
参照による組み入れ
特許、特許出願、特許公開、雑誌、本、論文、ウェブコンテンツなどの他の文書への参照および引用は、この開示を通じてなされている。全てのそのような文書は、全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【００７９】
等価物
本明細書で示され、記載されたものに加えて、本発明の様々な改変およびその多くのさらなる実施形態は、本明細書に引用された科学的および特許文献への参照を含むこの文書の全内容から当業者に明らかになると予想される。本明細書における主題は、本発明の、その様々な実施形態およびそれらの等価物における実施に適応することができる、重要な情報、例示、およびガイダンスを含有する。
【図１】
2018524008.tif 000007
【図２】
2018524008.tif 000008
【図３】
2018524008.tif 000009
【図４】
2018524008.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成30年5月23日(2018.5.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018524008000001.app
【国際調査報告】
2018524008.tif 000011
2018524008.tif 000012
2018524008.tif 000013