(57)【要約】  細胞のゲノム中のヌクレオチドを編集し、かつ／または標的部位を変更する組成物および方法が提供される。当該方法および当該組成物は、単一ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合したＰｏｌ−ＩＩプロモーターを含む組み換えＤＮＡコンストラクトを使用し、前記ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成することができ、前記複合体は、細胞、例えば真核生物細胞のゲノム中の標的部位配列に結合することができ、かつこれを切断することができる。本開示はさらに、前記組み換えＤＮＡコンストラクトを使用して、非従来型酵母のゲノムを改変する方法および組成物を記載する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合したポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）プロモーターを含む組み換えＤＮＡコンストラクトであって、前記ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成することができ、前記複合体は、真核生物のゲノム中の標的部位配列に結合することができ、かつこれを切断することができる、組み換えＤＮＡコンストラクト。
【請求項２】
デュアルガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合したポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）プロモーターを含む組み換えＤＮＡコンストラクトであって、前記デュアルガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成することができ、前記複合体は、真核生物のゲノム中の標的部位配列に結合することができ、かつこれを切断することができる、組み換えＤＮＡコンストラクト。
【請求項３】
請求項１または２に記載の組み換えＤＮＡを含む真核生物。
【請求項４】
前記真核生物は、微生物、酵母、非従来型酵母、真菌、植物、古細菌、ヒト以外の動物、昆虫、および線虫を含む群から選択される、請求項１または２に記載の組み換えＤＮＡコンストラクト。
【請求項５】
請求項１に記載の組み換えＤＮＡによってコードされる、単一ガイドＲＮＡまたはデュアルガイドＲＮＡ。
【請求項６】
請求項１に記載の少なくとも１つの組み換えＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項７】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチドをさらに含む、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記ベクターはさらに、ポリヌクレオチド改変鋳型ＤＮＡまたはドナーＤＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項９】
非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位を改変する方法であって、非従来型酵母に、請求項１に記載の少なくとも第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、およびＣａｓエンドヌクレアーゼをコードする第２の組み換えＤＮＡコンストラクトを提供することを含み、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、前記標的部位に一本鎖切断または二本鎖切断を導入する、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の少なくとも第１の組み換えＤＮＡコンストラクトおよび第２の組み換えＤＮＡコンストラクトは、同じポリヌクレオチドまたは別個のポリヌクレオチドの上に位置決めされている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的部位に改変を有する少なくとも１つの非従来型酵母細胞を同定することをさらに含み、前記改変は、前記標的部位において、１つ以上のヌクレオチドの少なくとも１つの欠失、付加、または置換を含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
ドナーＤＮＡを前記酵母に提供することをさらに含み、前記ドナーＤＮＡは、注目するポリヌクレオチドを含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的部位に統合された注目する前記ポリヌクレオチドを染色体またはエピソーム中に含む少なくとも１つの酵母細胞を同定することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記非従来型酵母における突然変異効率を同定することをさらに含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１５】
非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上のヌクレオチド配列を編集する方法であって、非従来型酵母に、ポリヌクレオチド改変鋳型ＤＮＡ、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および請求項１に記載の第２の組み換えＤＮＡコンストラクトを提供することを含み、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、前記酵母の染色体またはエピソーム中の標的部位に、一本鎖切断または二本鎖切断を導入し、前記ポリヌクレオチド改変鋳型ＤＮＡは、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド改変を含む、方法。
【請求項１６】
非従来型酵母の染色体またはエピソーム上のヌクレオチド配列をサイレンシングする方法であって、非従来型酵母に、不活化ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および請求項１に記載の少なくとも第２の組み換えＤＮＡコンストラクトを提供することを含み、前記ガイドＲＮＡ分子および前記不活化Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、前記酵母の前記染色体または前記エピソーム中の前記ヌクレオチド配列に結合することによって、前記ヌクレオチド配列の転写を阻止する複合体を形成することができる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１２月１８日出願の米国仮特許出願第６２／２６９１２２号明細書の利益を主張する。この出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、分子生物学の分野に、特に、ガイドＲＮＡｓｅを作製する方法、および細胞のゲノムを変更する方法に関する。
【０００３】
配列表の正式な写しは、２０１５年１２月１７日作成の２０１５１２１７＿ＣＬ６５６３ＵＳＰＳＰ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔのファイル名を備え、２３２キロバイトのサイズを有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出されている。このＡＳＣＩＩフォーマットの文書内に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
組み換えＤＮＡ技術により、標的のゲノム位置にＤＮＡ配列を挿入し、かつ／または特定の内因性染色体配列を改変（編集）することが可能になり、それにより、生命体の表現型を変えることが可能になった。部位特異的組み換えシステムを使用する部位特異的組み込み技術は、他の組み換え技術と同様、様々な生命体における目的遺伝子の標的挿入の生成に使用されてきた。デザイナージンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングメガヌクレアーゼ、操作されたヌクレオチドなどのゲノム編集技術は、標的ゲノムパータベーションの生成に利用可能であるが、これらのシステムは、特異性が低く、各標的部位用に再設計することが必要であり、そのために作製に多額の費用と時間を要する設計ヌクレアーゼを使用する傾向がある。ＣＲＩＳＰＲ−関連（Ｃａｓ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼシステムが、部位特異的ＤＮＡ鎖切断を特定の標的部位に導入する手段として開発された。このヌクレアーゼベースのシステムは、標的ヌクレオチド中に一本鎖切断または二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせることができ、これにより、標的遺伝子座での相同組み換えの頻度が増大し得る。
【０００５】
遺伝子発現の阻害は、例えば、遺伝子のＤＮＡ配列を分断または欠失させて、遺伝子の「ノックアウト」を生じさせることによって、達成され得る。遺伝子ノックアウトは、殆どの場合、細菌から哺乳動物まで広範囲にわたる生物全体に適用可能な技術である相同組み換え（ＨＲ）により実行されてきた。遺伝子機能を研究するための別のツールとして、遺伝的「ノックイン」によるものがあり得、これもまた、通常、ＨＲによって実行される。遺伝子ターゲティング（ノックアウトまたはノックイン）のためのＨＲは、標的部位と相同性を有する、外来から供給されるＤＮＡの存在を用いてよい。ＨＲによる遺伝子ターゲティングは強力なツールであるが、複雑な、労力を要する手順となり得る。ＨＲを用いた殆どの研究は一般に、経路中の複数遺伝子ではなく単一遺伝子のノックアウトに限定されてきた。なぜなら、ＨＲは一般に、対費用効果を高くしてスケールアップするのが困難なためである。この困難は、ＨＲが効率的でない生物において深刻化する。そのような低い効率により、実務者は典型的に、所望のＨＲ事象が起こった細胞を同定するのを補助するための選択可能な表現型または外因性マーカーに頼ることを強いられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ゆえに、生物のゲノム内の複数の位置を標的とするのに手頃で、準備が容易で、スケーラブルで、かつ適用可能である、新しくてより効率的なゲノム操作技術が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
細胞のゲノム中のヌクレオチドを編集し、かつ／または標的部位を変更する組成物および方法が提供される。当該方法および当該組成物は、単一ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合したＰｏｌ−ＩＩプロモーターを含む組み換えＤＮＡコンストラクトを使用し、前記ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成することができ、前記複合体は、細胞、例えば微生物細胞のゲノム中の標的部位配列に結合することができ、かつこれを切断することができる。本開示はさらに、前記組み換えＤＮＡコンストラクトを使用して、非従来型酵母のゲノムを改変する方法および組成物を記載する。
【０００８】
本開示の一実施形態において、本開示は、単一ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合したＰｏｌ−ＩＩプロモーターを含む組み換えＤＮＡコンストラクトを含み、前記組み換えＤＮＡコンストラクトは、リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含まず、前記ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成することができ、前記複合体は、非従来型酵母のゲノム中の標的部位配列に結合することができ、かつこれを切断することができる。
【０００９】
また、提供されるのは、本明細書中に記載される組み換えＤＮＡコンストラクトのいずれか１つを含む非従来型酵母である。非従来型酵母は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、およびパキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属からなる群から選択される属のメンバーであってよい。
【００１０】
本明細書に記載の方法によって作製された核酸コンストラクト、微生物細胞もまた提供する。本開示の方法および組成物のさらなる実施形態を本明細書中に示す。
【００１１】
図面の簡単な説明および配列表
下記の詳細な説明、および本出願の一部を形成する添付図面および配列表から、本開示をより完全に理解することができる。配列の記載および本明細書に添付した配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２５に規定されている特許出願におけるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の開示に適用される規則に適合している。配列の記載は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２５（これは参照により本明細書に組み込まれる）で定義されるアミノ酸の３文字コードを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａは、ガイドＲＮＡ発現カセットを示す。図１Ａは、ターミネーター有り、そして無しのガイドＲＮＡ発現カセットをコードするＤＮＡに作動可能に結合したＰｏｌ−ＩＩプロモーターを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ガイドＲＮＡ発現カセットを示す。図１Ｂは、Ｃｓｙ４認識ドメインをコードするＤＮＡに作動可能に結合したＰｏｌ−ＩＩプロモーター、ガイドＲＮＡ発現カセットをコードするＤＮＡ、およびＣｓｙ４認識ドメインをコードするＤＮＡを示す。
【図２】図２は、様々なｇＲＮＡ発現プラスミド形質転換体由来のｃａｎ１突然変異頻度を示す。ｃａｎ１突然変異頻度は、カナバニンプレート（ＣａｎＲ）上のコロニーの数とＣＭ−ｕｒａプレート上の形質転換体の総数とを比較することによって算出した。ＴＤＨ１：：２８ｎｔ−ｇＣＡＮ１−２８ｎｔ（ｐＹＲＨ３７６）、ＴＤＨ１：：ｇＣＡＮ１（ｐＹＲＨ３７８）、ＴＤＨ１：：ｇＣＡＮ１：：ターミネーター（ｐＹＲＨ３７９）、およびＦＢＡ１：：２８ｎｔ−ｇＣＡＮ１−２８ｎｔ（ｐＹＲＨ３８０）。
【図３Ａ】図３Ａは、４つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）ｇＲＮＡ発現カセットを示す図の１つである。白色のボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを示し、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（斜線のストライプ）は、５’非翻訳領域（垂直のストライプ）の末端に融合し得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの３’末端は、プロセシング要素（ドット）（例えば、ＨＤＶリボザイム）に直接融合し得る。
【図３Ｂ】図３Ｂは、４つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）ｇＲＮＡ発現カセットを示す図の１つである。白色のボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを示し、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（斜線のストライプ）は、５’非翻訳領域（垂直のストライプ）の末端に融合し得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの３’末端は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写ターミネーター（黒色）に直接融合し得る。
【図３Ｃ】図３Ｃは、４つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）ｇＲＮＡ発現カセットを示す図の１つである。白色のボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを示し、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（斜線のストライプ）は、プロモーターの５’末端（転写開始部位）に融合し得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの３’末端は、プロセシング要素（ドット）（例えば、ＨＤＶリボザイム）に直接融合し得る。
【図３Ｄ】図３Ｄは、４つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）ｇＲＮＡ発現カセットを示す図の１つである。白色のボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを示し、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（斜線のストライプ）は、プロモーターの５’末端（転写開始部位）に融合し得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの３’末端は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写ターミネーター（黒色）に直接融合し得る。
【図４】異なるＤＮＡコンストラクトによるヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）一次形質転換体のパッチを含有するＬ−カナバニン含有アガープレートの画像を示す。コロニー増殖は、ＣＡＮ１遺伝子の機能の消失を示す。
【００１３】
【表１−１】
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【００１４】
【表１−２】
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【００１５】
【表１−３】
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【発明を実施するための形態】
【００１６】
細胞のゲノム中のヌクレオチドを編集し、かつ／または標的部位を変更する組成物および方法が提供される。当該方法および当該組成物は、単一ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合したＰｏｌ−ＩＩプロモーターを含む組み換えＤＮＡコンストラクトを使用し、前記組み換えＤＮＡコンストラクトは、リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含まず、前記ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成することができ、前記複合体は、細胞、例えば微生物細胞のゲノム中の標的部位配列に結合することができ、かつこれを切断することができる。
【００１７】
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化等間隔短鎖回文リピート）遺伝子座は、例えば、外来ＤＮＡを破壊するのに細菌細胞および古細菌細胞によって用いられる、クラスＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ  ＤＮＡ切断システムの特定の遺伝的遺伝子座コーディング因子を指す（Ｈｏｒｖａｔｈ  ａｎｄ  Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，２０１０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：１６７−１７０）。ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素が、細胞におけるＤＮＡターゲティングに、本明細書中で非相同的に利用される。
【００１８】
細菌由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）を使用して、そのＤＮＡ標的にＣａｓエンドヌクレアーゼをガイドする。ｃｒＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡ標的の一方の鎖に相補的な領域と、ｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）と塩基対形成して、ＤＮＡ標的を切断するようにＣａｓエンドヌクレアーゼを導くＲＮＡ二本鎖を形成する領域とを含有する。ＣＲＩＳＰＲシステムは様々なクラスに属し、リピートパターン、遺伝子のセット、および種の範囲が異なる。所定のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子の数は、種間で変化し得る（Ｈａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  １（６）：ｅ６０．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．００１００６０）。
【００１９】
本明細書中の用語「Ｃａｓ遺伝子」は、一般に、隣接するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に結合し、関連し、またはこの近くにある遺伝子を指す。用語「Ｃａｓ遺伝子」、「ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子」は、本明細書中で互換的に用いられる。本明細書中の用語「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ」は、Ｃａｓ遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。本明細書中のＣａｓエンドヌクレアーゼは、適切なポリヌクレオチド構成要素と複合体を形成すると、特定のＤＮＡ標的配列の全てまたは一部を認識し、それに結合し、かつ場合によりニッキングまたは切断をすることができる。本明細書中に記載のＣａｓエンドヌクレアーゼは、１つ以上のヌクレアーゼドメインを含む。本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼとしては、ＨＮＨもしくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインおよび／またはＲｕｖＣもしくはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを有するものが挙げられる。開示されるＣａｓエンドヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ２タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、Ｃａｓ３、Ｃａｓ５、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、またはこれらの複合体が挙げられる。
【００２０】
本明細書で使用される場合、用語「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体」、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム」、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓ複合体」、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓシステム」、「誘導型Ｃａｓシステム」は、本明細書中で互換的に使用され、複合体を形成することができる、少なくとも１つのガイドポリヌクレオチド、および少なくとも１つのＣａｓエンドヌクレアーゼを指し、前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に誘導することができ、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、それに結合し、かつ任意選択によりそれをニッキングまたは切断（一本鎖または二本鎖切断の導入）するのを可能にする。本明細書におけるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、４つの既知のＣＲＩＳＰＲシステム（Ｈｏｒｖａｔｈ  ａｎｄ  Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，２０１０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：１６７−１７０）、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのいずれかのＣａｓタンパク質および好適なポリヌクレオチド構成要素を含んでよい。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ＣＡＳタンパク質と複合化したポリヌクレオチド（例えば、限定はされないが、ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡ）により標的配列を認識して、標的配列でＤＮＡ二本鎖をほどき、場合により、少なくとも１本のＤＮＡ鎖を切断する。正確なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が、ＤＮＡ標的配列の３’末端に位置するか、またはＤＮＡ標的配列の３’末端に隣接するなら、そのようなＣａｓエンドヌクレアーゼによる標的配列の認識および切断は、通常、起こる。これ以外にも、Ｃａｓタンパク質は、本明細書中で、適切なＲＮＡ構成要素と複合化する場合、ＤＮＡ切断活性またはニッキング活性を欠くかもしれないが、ＤＮＡ標的配列に依然として特異的に結合することができる。（２０１５年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１５／００８２４７８Ａ１号明細書、および２０１５年２月２６日公開の米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０Ａ１号明細書（両文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）もまた参照されたい）。
【００２１】
ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＤＮＡ標的配列の一方または双方の鎖を切断することができる。ＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断することができるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、通常、エンドヌクレアーゼドメインの全てを機能的な状態で有するＣａｓタンパク質（例えば、各エンドヌクレアーゼドメインの一部または全ての活性を保持する野生型エンドヌクレアーゼドメインまたはその変異体）を含む。したがって、Ｃａｓタンパク質の各エンドヌクレアーゼドメインの一部または全ての活性を保持する野生型Ｃａｓタンパク質（例えば、本明細書中に開示されるＣａｓ９タンパク質）またはその変異体が、ＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断することができるＣａｓエンドヌクレアーゼの適切な例である。機能的なＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインを含むＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断することができるＣａｓタンパク質の例である。ＤＮＡ標的配列の一方の鎖を切断することができるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、本明細書において、ニッカーゼ活性（例えば、部分的切断能力）を有すると特徴付けられ得る。Ｃａｓニッカーゼは、通常、ＣａｓがＤＮＡ標的配列の一方の鎖のみを切断する（すなわち、ニックを入れる）ことを可能にする１つの機能的エンドヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼは、（ｉ）変異した、機能不全ＲｕｖＣドメイン、および（ｉｉ）機能的ＨＮＨドメイン（例えば、野生型ＨＮＨドメイン）を含み得る。他の例として、Ｃａｓ９ニッカーゼは、（ｉ）機能的ＲｕｖＣドメイン（例えば野生型ＲｕｖＣドメイン）、および（ｉｉ）突然変異した、機能不全ＨＮＨドメインを含んでよい。本明細書での使用に好適なＣａｓ９ニッカーゼの非限定的例は、および米国特許出願公開第２０１４／０１８９８９６号明細書（これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００２２】
ＤＮＡターゲティングの特異性を高めるのに、一対のＣａｓ９ニッカーゼを用いることができる。一般に、これは、２つのＣａｓ９ニッカーゼを提供することによってなされ得、これらが、異なるガイド配列を有するＲＮＡ構成要素との関連により、所望のターゲティング領域における反対側の鎖の近接するＤＮＡ配列を標的とし、そこにニックを入れる。そのような各ＤＮＡ鎖の近くの切断は、二本鎖切断（すなわち、単鎖オーバーハングを有するＤＳＢ）を引き起こし、これは、その後、非相同性末端結合ＮＨＥＪ（変異につながる不完全な修復になりやすい）、または相同組み換えＨＲの基質として認識される。これらの実施形態における各ニックは、例えば、互いと少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００（または５〜１００の任意の整数）塩基、離れていてよい。本明細書においては、１つまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼタンパク質が、Ｃａｓ９ニッカーゼ対に用いられてよい。例えば、変異したＲｕｖＣドメインを有するが、機能するＨＮＨドメインのないＣａｓ９ニッカーゼ（すなわち、Ｃａｓ９  ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ−）が使用されるであろう（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９  ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ−）。各Ｃａｓ９ニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９  ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ−）は、各ニッカーゼをそれぞれの特定のＤＮＡ部位に標的として向けるガイドＲＮＡ配列を有する本明細書中の適切なＲＮＡ構成要素を用いることによって、互いに近い（最大で１００塩基対離れている）特定のＤＮＡ部位に導かれることになる。
【００２３】
Ｃａｓタンパク質は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、Ｃａｓタンパク質に加えて１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のドメイン）を含む融合タンパク質の一部であってよい。そのような融合タンパク質は、任意のさらなるタンパク質配列を、そして、任意選択により、任意の２つのドメイン間、例えばＣａｓと第１の異種ドメインとの間にリンカー配列を含み得る。本明細書において、Ｃａｓタンパク質に融合し得るタンパク質ドメインの例としては、限定されないが、エピトープタグ（例えば、ヒスチジン［Ｈｉｓ］、Ｖ５、ＦＬＡＧ、インフルエンザヘマグルチニン［ＨＡ］、ｍｙｃ、ＶＳＶ−Ｇ、チオレドキシン［Ｔｒｘ］）、リポータ（例えば、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ［ＧＳＴ］、ホースラディッシュペルオキシダーゼ［ＨＲＰ］、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ［ＣＡＴ］、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ［ＧＵＳ］、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン色蛍光タンパク質［ＣＦＰ］、黄色蛍光タンパク質［ＹＦＰ］、青色蛍光タンパク質［ＢＦＰ］）、および以下の活性の１つ以上を有するドメインが挙げられる：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性（例えば、ＶＰ１６またはＶＰ６４）、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、および核酸結合活性。Ｃａｓタンパク質はまた、ＤＮＡ分子または他の分子、例えばマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ  Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、ＧＡＬ４Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン、および単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）ＶＰ１６と結合するタンパク質と融合し得る。
【００２４】
本明細書中のＣａｓタンパク質は以下の属のいずれか由来であり得る：アエロピルム（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、ピロバクルム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルホロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アーキオグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロアーキュラ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎ）、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルシナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノパイラス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィラス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、テルモプラズマ（Ｔｈｅｒｎｉｏｐｌａｓｎｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクウィフェクス（Ａｑｕｉｆｒｘ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｖｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾアルカス（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ニトロソモナス（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ゲオバクター（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）ミロコッカス（Ｍｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、キャンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）またはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）。Ｃａｓタンパク質のより多くの例について、２０１５年５月１５日出願の米国特許出願第６２／１６２３７７号明細書および２０１５年５月１５日出願の米国特許出願第６２／１６２３５３号明細書（双方の出願とも参照によって本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体はＤＮＡ標的部位配列に結合することができるが、標的部位配列ではいかなる鎖も切断しない。そのような複合体は、全ヌクレアーゼドメインが、変異した、機能不全のＣａｓタンパク質を含んでよい。例えば、ＤＮＡ標的部位配列に結合することができるが、標的部位配列でいかなる鎖も切断しない本明細書におけるＣａｓ９タンパク質は、変異した、機能不全ＲｕｖＣドメイン、および変異した、機能不全ＨＮＨドメインの双方を含んでよい。標的ＤＮＡ配列に結合するがこれを切断しない本明細書中のＣａｓタンパク質は、遺伝子発現を調整するために用いることができ、例えば、その場合、Ｃａｓタンパク質は、転写因子（または、その一部）（例えば、リプレッサーまたは活性化因子、例えば本明細書中に開示されるもののいずれか）と融合し得る。
【００２６】
本明細書中のＣａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、ＩＩ型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、例えば、限定はされないが、２００７年３月１日に公開され、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレットの配列番号４６２、４７４、４８９、４９４、４９９、５０５および５１８に記載のＣａｓ９遺伝子をコードし得る。他の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、微生物または最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ遺伝子である。Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、任意選択により、Ｃａｓコドン領域のＳＶ４０核標的シグナル上流、およびＣａｓコドン領域の二分ＶｉｒＤ２核定位シグナル（Ｔｉｎｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７４４２−６）下流に作動可能に結合することができる。
【００２７】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子として、原則として標的とされ得るＮ（１２−３０）ＮＧＧ形態のあらゆるゲノム配列を認識することができる植物コドンまたは微生物コドン最適化化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９遺伝子、またはブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）Ｍｌｃ３、ラクトバチルス・ロシアエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｏｓｓｉａｅ）ＤＳＭ  １５８１４、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）ＳＬ４、ラクトバチルス・ノデンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎｏｄｅｎｓｉｓ）ＪＣＭ  １４９３２、スルフロスピリラム（Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属種ＳＣＡＤＣ、ビフィドバクテリウム・サーモフィルム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）ＤＳＭ  ２０２１０、ロクタネラ・ベストフォルデンシス（Ｌｏｋｔａｎｅｌｌａ  ｖｅｓｔｆｏｌｄｅｎｓｉｓ）、スフィンゴモナス・サンキサニゲネンス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓａｎｘａｎｉｇｅｎｅｎｓ）ＮＸ０２、エピリソニモナス・テナックス（Ｅｐｉｌｉｔｈｏｎｉｍｏｎａｓ  ｔｅｎａｘ）ＤＳＭ  １６８１１、スポロサイトファガ・ミクソコッコイデス（Ｓｐｏｒｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｍｙｘｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）、およびサイクロフレクサス・トークイス（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ  ｔｏｒｑｕｉｓ）ＡＴＣＣ  ７００７５５からなる群から選択される生物に由来するＣａｓ９エンドヌクレアーゼが挙げられ、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的配列の全てまたは一部を認識し、これに結合し、かつ場合によってはこれにニックを入れ、またはこれを切断することができるガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成することができる。他のＣａｓエンドヌクレアーゼシステムは、２０１５年５月１５日出願の米国特許出願第６２／１６２３７７号明細書および２０１５年５月１５日出願の米国特許出願第６２／１６２３５３号明細書に記載されており、双方の出願とも参照によって本明細書に組み込まれる。
【００２８】
「Ｃａｓ９」（以前はＣａｓ５、Ｃｓｎ１、またはＣｓｘ１２と呼ばれた）は、本明細書中で、ｃｒヌクレオチドおよびｔｒａｃｒヌクレオチドと、または単一のガイドポリヌクレオチドと複合体を形成して、ＤＮＡ標的配列の全てまたは一部を特異的に認識して切断する、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＣａｓエンドヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン、およびＨＮＨ（Ｈ−Ｎ−Ｈ）ヌクレアーゼドメインを含み、これらはそれぞれ、標的配列で一本鎖ＤＮＡを切断することができる（両ドメインが協調して作用すると、ＤＮＡ二本鎖が切断されるが、一方のドメインの活性ではニックに至る）。一般に、ＲｕｖＣドメインは、サブドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを含み、ドメインＩは、Ｃａｓ９のＮ末端近くに位置し、サブドメインＩＩおよびＩＩＩは、タンパク質の中央に位置し、ＨＮＨドメインにフランキングしている（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  １５７：１２６２−１２７８）。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムとしては、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを少なくとも１つのポリヌクレオチド構成要素と複合させて使用するＤＮＡ切断システムが挙げられる。例えば、Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と複合させることができる。他の例では、Ｃａｓ９は、単一ガイドＲＮＡと複合させることができる。
【００２９】
本明細書中に記載のＣａｓ９タンパク質、および本明細書中の他のいくつかのＣａｓタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓ．ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・コンステラトゥス（Ｓ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ）、ストレプトコッカス・シュードポルシナス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属種（例えば、リステリア・イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ））、スピロプラズマ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ）属種（例えば、スピロプラズマ・アピス（Ｓ．ａｐｉｓ）、スピロプラズマ・シルフィディコーラ（Ｓ．ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ））、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）科種、アトポビウム（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）属種、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属種（例えば、ポルフィロモナス・カトニアエ（Ｐ．ｃａｔｏｎｉａｅ））、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属種（例えば、プレボテラ・インテルメディア（Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属種、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属種（例えば、トレポネーマ・ソクランスキィ（Ｔ．ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ））、カプノシトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）属種、フィネゴルディア（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ）属種（例えば、フィネゴルディア・マグナ（Ｆ．ｍａｇｎａ））、コリオバクテリア（Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科種（例えば、Ｃ．バクテリウム（Ｃ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ））、オルセネラ（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ）属種（例えば、オルセネラ・プロフューザ（Ｏ．ｐｒｏｆｕｓａ））、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属種（例えば、ヘモフィルス・スプトルム（Ｈ．ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘモフィルス・ピットマニエ（Ｈ．ｐｉｔｔｍａｎｉａｅ））、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属種（例えば、パスツレラ・ベッティアエ（Ｐ．ｂｅｔｔｙａｅ））、オリビバクター（Ｏｌｉｖｉｂａｃｔｅｒ）属種（例えば、オリビバクター・シティエンシス（Ｏ．ｓｉｔｉｅｎｓｉｓ））、エピリソニモナス（Ｅｐｉｌｉｔｈｏｎｉｍｏｎａｓ）属種（例えば、エピリソニモナス・テナックス（Ｅ．ｔｅｎａｘ））、メソニア（Ｍｅｓｏｎｉａ）属種（例えば、メソニア・モビリス（Ｍ．ｍｏｂｉｌｉｓ））、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種（例えば、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ））、アクイマリーナ（Ａｑｕｉｍａｒｉｎａ）属種（例えば、アクイマリーナ・ムエレリ（Ａ．ｍｕｅｌｌｅｒｉ））、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種（例えば、クリセオバクテリウム・パルストレ（Ｃ．ｐａｌｕｓｔｒｅ））、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属種（例えば、バクテロイデス・グラミニソルベンス（Ｂ．ｇｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属種（例えば、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属種（例えば、フランシセラ・ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））、またはフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種（例えば、フラボバクテリウム・フリギダリウム（Ｆ．ｆｒｉｇｉｄａｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム・ソリ（Ｆ．ｓｏｌｉ））に由来のものであってよい。他の例として、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：７２６−７３７および２０１５年５月１５日出願の米国特許出願第６２／１６２３７７号明細書（これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる））に開示されるＣａｓ９タンパク質のいずれかであり得る。
【００３０】
したがって、本明細書中のＣａｓ９タンパク質の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｇ３ＥＣＲ１（ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、ＷＰ＿０２６７０９４２２、ＷＰ＿０２７２０２６５５、ＷＰ＿０２７３１８１７９、ＷＰ＿０２７３４７５０４、ＷＰ＿０２７３７６８１５、ＷＰ＿０２７４１４３０２、ＷＰ＿０２７８２１５８８、ＷＰ＿０２７８８６３１４、ＷＰ＿０２７９６３５８３、ＷＰ＿０２８１２３８４８、ＷＰ＿０２８２９８９３５、Ｑ０３ＪＩ６（ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、ＥＧＰ６６７２３、ＥＧＳ３８９６９、ＥＧＶ０５０９２、ＥＨＩ６５５７８（ストレプトコッカス・シュードポルシナス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ））、ＥＩＣ７５６１４（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＩＤ２２０２７（ストレプトコッカス・コンステラトゥス（Ｓ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ））、ＥＩＪ６９７１１、ＥＪＰ２２３３１（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＪＰ２６００４（ストレプトコッカス・アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ））、ＥＪＰ３０３２１、ＥＰＺ４４００１（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＰＺ４６０２８（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＱＬ７８０４３（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＱＬ７８５４８（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＲＬ１０５１１、ＥＲＬ１２３４５、ＥＲＬ１９０８８（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＡ５７８０７（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＡ５９２５４（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＵ８５３０３（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＴＳ９６８０４、ＵＣ７５５２２、ＥＧＲ８７３１６（ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ））、ＥＧＳ３３７３２、ＥＧＶ０１４６８（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＨＪ５２０６３（ストレプトコッカス・マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ））、ＥＩＤ２６２０７（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＩＤ３３３６４、ＥＩＧ２７０１３（ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓ．ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ））、ＥＪＦ３７４７６、ＥＪＯ１９１６６（ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＢＳ３５ｂ）、ＥＪＵ１６０４９、ＥＪＵ３２４８１、ＹＰ＿００６２９８２４９、ＥＲＦ６１３０４、ＥＲＫ０４５４６、ＥＴＪ９５５６８（ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、ＴＳ８９８７５、ＥＴＳ９０９６７（ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＳＲ４）、ＥＴＳ９２４３９、ＥＵＢ２７８４４（ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＢＳ２１）、ＡＦＪ０８６１６、ＥＵＣ８２７３５（ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＣＭ６）、ＥＷＣ９２０８８、ＥＷＣ９４３９０、ＥＪＰ２５６９１、ＹＰ＿００８０２７０３８、ＹＰ＿００８８６８５７３、ＡＧＭ２６５２７、ＡＨＫ２２３９１、ＡＨＢ３６２７３、Ｑ９２７Ｐ４、Ｇ３ＥＣＲ１、またはＱ９９ＺＷ２（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））（これらの文献は参照により組み込まれる）に開示されるＣａｓ９アミノ酸配列のいずれかを含み得る。これらのＣａｓ９タンパク質配列のいずれの変異体が用いられてもよいが、本明細書中のＲＮＡ構成要素と関連する場合に、ＤＮＡに向けた特異的な結合活性を、そして場合によってはエンドヌクレアーゼ活性を有さなければならない。そのような変異体は、基準Ｃａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。
【００３１】
あるいは、Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、前述のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでよい。そのようなＣａｓ９タンパク質変異体は、本明細書中のＲＮＡ構成要素と関連する場合に、ＤＮＡに向けた特異的な結合活性を、そして場合によっては、切断またはニッキング活性を有さなければならない。
【００３２】
本明細書中のＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９は、異種の核局在化配列（ＮＬＳ）を含み得る。本明細書中の異種ＮＬＳアミノ酸配列は、例えば、本明細書中の酵母細胞の核内で検出可能な量のＣａｓタンパク質の蓄積を駆動するのに十分な強度を有し得る。ＮＬＳは、塩基性の、正に帯電する残基（例えば、リシンおよび／またはアルギニン）の１つ（一分節）または複数（例えば、二分節）の短い配列（例えば、２〜２０残基）を含んでよく、また、タンパク質表面に曝されるのであれば、Ｃａｓアミノ酸配列のどこに位置してもよい。ＮＬＳは、例えば、本明細書中のＣａｓタンパク質のＮ末端またはＣ末端に作動可能に結合してもよい。例えば、２つ以上のＮＬＳ配列が、Ｃａｓタンパク質に、例えばＣａｓタンパク質のＮ末端およびＣ末端の両方に結合してもよい。本明細書中の適切なＮＬＳ配列の非限定的な例としては、米国特許第７，３０９，５７６号明細書に開示されるものが挙げられる（これらの文献はいずれも参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００３３】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドの改変された形態を含み得る。Ｃａｓ９ポリペプチドの改変形態としては、Ｃａｓ９タンパク質の自然発生のヌクレアーゼ活性を低下させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入または置換）を挙げることができる。例えば、いくつかの例では、Ｃａｓ９タンパク質の改変形態が有するヌクレアーゼ活性は、対応する野生型Ｃａｓ９ポリペプチドの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満または１％未満である（２０１４年３月６日公開の米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７Ａ１号明細書）。いくつかの例では、Ｃａｓ９ポリペプチドの改変形態はヌクレアーゼ活性を実質的に有さず、触媒的に「不活化されたＣａｓ９」または「失活したｃａｓ９（ｄＣａｓ９）」と呼ばれる。触媒的に不活化されたＣａｓ９変異体としては、ＨＮＨおよびＲｕｖＣヌクレアーゼドメインに変異を有するＣａｓ９変異体が挙げられる。これらの触媒的に不活化されたＣａｓ９変異体は、ｓｇＲＮＡと相互作用し、インビボで標的部位に結合することができるが、標的ＤＮＡの鎖はいずれも切断することができない。
【００３４】
触媒的に不活性なＣａｓ９は、異種配列に融合することができる（２０１４年３月６日公開の米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７Ａ１号明細書）。好適な融合パートナーとしては、限定はされないが、標的ＤＮＡ、または標的ＤＮＡに関連するポリペプチド（例えば、ヒストンまたは他のＤＮＡ結合性タンパク質）に直接作用することによって、転写を間接的に増加させる活性を示すポリペプチドが挙げられる。さらなる好適な融合パートナーとしては、限定はされないが、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホフファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性を提供するポリペプチドが挙げられる。さらに他の好適な融合パートナーとしては、限定はされないが、標的核酸の転写増加を直接引き起こすポリペプチド（例えば、転写活性化因子またはその断片、転写活性化因子、小分子／薬剤反応性転写調節因子などを誘導するタンパク質またはその断片）が挙げられる。触媒的に不活性なＣａｓ９はまた、二本鎖切断を生成するＦｏｋＩヌクレアーゼに融合することができる（Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌｕｍｅ  ３２、ｎｕｍｂｅｒ６、Ｊｕｎｅ  ２０１４）。
【００３５】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼの「機能的断片」、「機能的に等価である断片」および「機能的に等価な断片」という用語は、本明細書中で互換的に使用され、標的部位を認識し、結合し、そして場合によりニッキングまたは切断を行う（一本鎖切断または二本鎖切断を入れる）能力が保持されている本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼ配列の一部分またはサブ配列を指す。
【００３６】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼの「機能的変異体」、「機能的に等価である変異体」および「機能的に等価な変異体」という用語は、本明細書中で互換的に使用され、標的部位を認識し、結合し、そして場合によりニッキングまたは切断を行う（一本鎖切断または二本鎖切断を入れる）能力が保持されている本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼの変異体を指す。断片および変異体は、部位特異的変異誘発法および合成構築法（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）により得ることができる。
【００３７】
ガイドされるあらゆるエンドヌクレアーゼが、本明細書中で開示される方法に用いられ得る。そのようなエンドヌクレアーゼとして、以下に限定されないが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが挙げられる。現在まで、特定のＰＡＭ配列を認識することができ（例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７  ｐ  ８１６−８２１、２０１５年５月１５日出願の米国特許出願第６２／１６２３７７号明細書および２０１５年５月１５日出願の米国特許出願第６２／１６２３５３号明細書、ならびにＺｅｔｓｃｈｅ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．２０１５．Ｃｅｌｌ  １６３，１０１３参照）、そして特定の位置にて標的ＤＮＡを切断することができる多くのエンドヌクレアーゼが記載されてきた。ガイドされるＣａｓシステムを利用する、本明細書中に記載される方法および実施形態に基づいて、現在、これらの方法を、ガイドされるあらゆるエンドヌクレアーゼシステムを利用することができるように調整することができることが理解される。
【００３８】
用語「オフターゲット部位効果」および「オフターゲット効果」は、互換的に用いられ、そして、エンドヌクレアーゼ切断の活性に起因する、オフターゲット部位のあらゆる変更を含み、当該変更として、例えば：（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のあらゆる組み合わせ、および意図されない部位での鋳型ＤＮＡまたはドナーＤＮＡのあらゆる統合が挙げられる。意図されない部位は、標的部位でない、生物のゲノム中のあらゆる部位であってよい。
【００３９】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼの特異性を向上させ、かつオフターゲット部位効果を低下させるいくつかのアプローチが探究されており、細胞中で活性がある酵素の量の引下げ、標的と相補的なガイドＲＮＡの部分の短縮、操作されたニッキングＣａｓ９の対の配置（ｄｅｐｌｏｙｉｎｇ）（Ｎｉｃｏｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１５，２６（７）：４２５−４３１）、および構造ガイドタンパク質工学（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｇｕｉｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）（Ｓｌａｙｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５２２７）を含む。これらのアプローチの多くは限界があるままであり、これが多くの場合、オンターゲット編集効率を低下させている。
【００４０】
米国特許出願ｃｌ６５０１（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるのは、残存しながら細胞中のオフターゲット部位効果を低下させ、かつ／またはＮＨＥＪインヒビターもしくはＨＤＲエンハンサー等の小分子を用いてオンターゲット編集効率を増大させる方法である。
【００４１】
エンドヌクレアーゼは、当該技術において知られているあらゆる方法、例えば、以下に限定されないが、一過性導入法、形質移入、マイクロインジェクション、および／もしくは局所的アプリケーションによって、または組み換えコンストラクトを介して間接的に、細胞に提供されてよい。エンドヌクレアーゼは、タンパク質として、またはガイドされるポリヌクレオチド複合体として、細胞に直接的に、または組み換えコンストラクトを介して間接的に提供されてよい。エンドヌクレアーゼは、当該技術において知られているあらゆる方法を用いて、細胞中に一時的に導入されてもよいし、宿主細胞のゲノム中に組み込まれてもよい。細胞中に吸収されるエンドヌクレアーゼおよび／またはガイドされるポリヌクレオチドは、２０１４年１１月６日出願の米国特許出願第６２／０７５９９９号明細書に記載される細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）により促進され得る。
【００４２】
エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のリン酸ジエステル結合を切断する酵素であり、ＤＮＡを特定の部位にて、塩基を損傷させることなく切断する制限エンドヌクレアーゼが挙げられる。制限エンドヌクレアーゼは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型エンドヌクレアーゼを含み、これらはさらにサブタイプを含む。Ｉ型システムおよびＩＩＩ型システムでは、メチル化酵素活性および制限活性の双方が、単一複合体に含有される。また、エンドヌクレアーゼとして、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥａｓｅ）としても知られているメガヌクレアーゼが挙げられ、これは、制限エンドヌクレアーゼのように、特定の認識部位に結合してこれを切断する。しかしながら、メガヌクレアーゼの認識部位は、典型的に長く、約１８ｂｐ以上である（２０１２年３月２２日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／３００６１号明細書）。メガヌクレアーゼは、保存配列モチーフに基づいて４つのファミリーに分類されており、当該ファミリーは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈ−Ｎ−Ｈ、およびＨｉｓ−Ｃｙｓボックスのファミリーである。これらのモチーフは、金属イオンの配位およびリン酸ジエステル結合の加水分解に関与する。ＨＥａｓｅは、その長い認識部位で、そしてＤＮＡ基質の一部の配列多型を許容することで、注目に値する。メガヌクレアーゼの命名規則は、他の制限エンドヌクレアーゼの規則と類似している。メガヌクレアーゼはまた、フリースタンディングのＯＲＦ、イントロン、およびインテインによってコードされる酵素について、それぞれ接頭語Ｆ−、Ｉ−、またはＰＩ−によって特徴付けられる。組み換えプロセスにおける一工程が、認識部位またはその近くにおけるポリヌクレオチド切断を含む。この切断活性は、二本鎖切断をもたらすのに用いられ得る。部位特異的リコンビナーゼおよびその認識部位の総説について、Ｓａｕｅｒ（１９９４）Ｃｕｒｒ  Ｏｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５：５２１−７；およびＳａｄｏｗｓｋｉ（１９９３）ＦＡＳＥＢ  ７：７６０−７を参照されたい。一部の例では、リコンビナーゼは、インテグラーゼファミリーまたはリゾルバーゼファミリー由来である。
【００４３】
ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、植物または他の生物のゲノム中の特定の標的配列にて二本鎖切断を行うのに用いられ得る配列特異的ヌクレアーゼのクラスである（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９：１４３−１４８）。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよび二本鎖切断誘発剤ドメインで構成される、操作された二本鎖切断誘発剤である。認識部位特異性は、ジンクフィンガードメインによって与えられ、これは典型的に、例えばＣ２Ｈ２構造を有する、２、３、または４つのジンクフィンガーを含む。しかしながら、他のジンクフィンガー構造が知られており、操作されてきた。ジンクフィンガードメインは、選択されたポリヌクレオチド認識配列に特異的に結合するポリペプチドを設計するのに適用可能である。ＺＦＮとして、非特異的エンドヌクレアーゼドメインに結合した、操作されたＤＮＡ結合ジンクフィンガードメイン、例えば、ＦｏｋＩ等のＩＩ型エンドヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメインが挙げられる。追加的な機能性がジンクフィンガー結合ドメインに融合されてよく、転写アクティベータドメイン、転写リプレッサードメイン、およびメチル化酵素が挙げられる。一部の例では、ヌクレアーゼドメインの二量化が、切断活性に必要とされる。各ジンクフィンガーが、標的ＤＮＡ中の３つの連続する塩基対を認識する。例えば、３つのフィンガードメインが、９個の連続するヌクレオチドの配列を認識し、ヌクレアーゼの二量化要求によって、２組のジンクフィンガートリプレットが用いられて、１８ヌクレオチドの認識配列に結合する。
【００４４】
本明細書で使用される用語「ガイドポリヌクレオチド」は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができ、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、結合し、かつ場合により切断することを可能にするポリヌクレオチド配列に関連する。ガイドポリヌクレオチドは単分子または二重分子であり得る。ガイドポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、またはこれらの組み合わせ（ＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列）であり得る。任意選択により、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチド、ホスホジエステル結合または連結修飾、例えば、限定はされないが、Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣ、２，６−ジアミノプリン、２’−フルオロＡ、２’−フルオロＵ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８（ヘキサエチレングリコール鎖）分子への連結、または環化をもたらす５’から３’への共有結合的連結を含み得る。リボ核酸のみを含むガイドポリヌクレオチドはまた、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と呼ばれる（２０１５年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１５／００８２４７８Ａ１号明細書、および２０１５年２月２６日公開の米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０Ａ１号明細書、（両文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）もまた参照されたい）。
【００４５】
ガイドポリヌクレオチドは、ｃｒヌクレオチド配列およびｔｒａｃｒヌクレオチド配列を含む二重分子（二本鎖ガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）であり得る。ｃｒヌクレオチドは、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変標的ドメインまたはＶＴドメインと呼ばれる）、およびＣａｓエンドヌクレアーゼ認識（ＣＥＲ）ドメインの一部である第２のヌクレオチド配列（ｔｒａｃｒメイト配列とも呼ばれる）を含む。ｔｒａｃｒメイト配列は、ｔｒａｃｒヌクレオチドに相補性領域に沿ってハイブリダイズし、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン、すなわちＣＥＲドメインを共に形成することができる。ＣＥＲドメインは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用することができる。二本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドおよびｔｒａｃｒヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、および／またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であり得る。いくつかの実施形態では、二本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチド分子は、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｃｒＤＮＡ」と称され、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｃｒＲＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「ｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」と称される。ｃｒヌクレオチドは、細菌中および古細菌中に天然に存在するｃＲＮＡの断片を含むことができる。本明細書で開示するｃｒヌクレオチド中に存在することができる、細菌中および古細菌中に天然に存在するｃＲＮＡの断片のサイズは、限定はされないが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のヌクレオチド長の範囲をとることができる。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒヌクレオチドは、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｔｒａｃｒＲＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｔｒａｃｒＤＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「ｔｒａｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」と称される。一実施形態では、ＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体を誘導するＲＮＡは、二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである。
ｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）は、５’から３’の方向に（ｉ）ＣＲＩＳＰＲＩＩ型ｃｒＲＮＡの反復領域とアニールする配列と、（ｉｉ）ステムループ含有部とを有する（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７１：６０２−６０７）。二本鎖ガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができ、前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムとも呼ばれる）は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをゲノム標的部位に誘導することができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがその標的部位を認識し、それに結合し、かつ任意選択によりそれをニッキングまたは切断（一本鎖または二本鎖切断の導入）するのを可能にする。（２０１５年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１５／００８２４７８Ａ１号明細書、および２０１５年２月２６日公開の米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０Ａ１号明細書（両文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）もまた参照されたい）。
【００４６】
ガイドポリヌクレオチドはまた、ｔｒａｃｒヌクレオチド配列に結合したｃｒヌクレオチド配列を含む単一分子（単一ガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）であり得る。単一ガイドポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変標的ドメインまたはＶＴドメインと呼ばれる）、およびＣａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用するＣａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲドメイン）を含む。「ドメイン」は、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であり得るヌクレオチドの連続ストレッチを意味する。単一ガイドポリヌクレオチドのＶＴドメインおよび／またはＣＥＲドメインは、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含み得る。Ｃｒヌクレオチド由来の配列およびｔｒａｃｒヌクレオチド由来の配列で構成されている単一ガイドポリヌクレオチドを、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「単一ガイドＲＮＡ」と称することができ、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「単一ガイドＤＮＡ」と称することができ、（ＲＮＡヌクレオチドとＤＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「単一ガイドＲＮＡ−ＤＮＡ」と称することができる。単一ガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができ、前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムとも呼ばれる）は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをゲノム標的部位に誘導することができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがその標的部位を認識し、それに結合し、かつ任意選択によりそれをニッキングまたは切断（一本鎖または二本鎖切断の導入）するのを可能にする。（２０１５年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１５／００８２４７８Ａ１号明細書、および２０１５年２月２６日公開の米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０Ａ１号明細書（両文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）もまた参照されたい）。
【００４７】
用語「可変標的ドメイン」または「ＶＴドメイン」は本明細書中で互換的に使用され、二本鎖ＤＮＡ標的部位の一方の鎖（ヌクレオチド配列）にハイブリダイズすることができる（相補的である）ヌクレオチド配列を含む。第１のヌクレオチド配列ドメイン（ＶＴドメイン）と標的配列との間の相補性％は、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６３％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であり得る。可変標的ドメインの長さは、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、可変標的ドメインは１２〜３０ヌクレオチドの連続するストレッチを含む。可変標的ドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列、またはこれらの任意の組み合わせで構成され得る。
【００４８】
（ガイドポリヌクレオチドの）「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン」または「ＣＥＲドメイン」という用語は、本明細書中で互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用するヌクレオチド配列を含む。ＣＥＲドメインは、ｔｒａｃｒヌクレオチドメイト配列に続いてｔｒａｃｒヌクレオチド配列を含む。ＣＥＲドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列（例えば、２０１５年２月２６日公開の米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０Ａ１号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、またはこれらの任意の組み合わせで構成され得る。
【００４９】
単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含み得る。一実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列の長さは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００ヌクレオチド長であり得る。他の実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、限定はされないが、ＧＡＡＡテトラループ配列などのテトラループ配列を含み得る。
【００５０】
ガイドポリヌクレオチド、ＶＴドメインおよび／またはＣＥＲドメインのヌクレオチド配列改変は、限定はされないが、５’キャップ、３’ポリアデニル化テイル、リボスイッチ配列、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する配列、ガイドポリヌクレオチドの標的を細胞内部位に設定する改変または配列、トラッキングが生じる改変または配列、タンパク質用の結合部位が生じる改変または配列、Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣヌクレオチド、２，６−ジアミノプリンヌクレオチド、２’−フルオロＡヌクレオチド、２’−フルオロＵヌクレオチド；２’−Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８分子への連結、５’から３’への共有結合的連結、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができる。これらの改変により、少なくとも１種の追加の有利な特徴がもたらされ得、この追加の有利な特徴は、安定性の変更または調節、細胞内ターゲティング、トラッキング、蛍光標識、タンパク質用またはタンパク質複合体用の結合部位、相補的な標的配列に対する結合親和性の変更、細胞分解に対する耐性の変更、および細胞透過性の増加からなる群から選択される。
【００５１】
ガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡの「機能的断片」、「機能的に等価である断片」および「機能的に等価な断片」という用語は、本明細書中で互換的に使用され、それぞれ本開示のガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡとして機能する能力が保持されているガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡの一部分またはサブ配列を指す。
【００５２】
ガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ（それぞれ）の「機能的変異体」、「機能的に等価である変異体」および「機能的に等価な変異体」という用語は、本明細書中で互換的に使用され、それぞれ本開示のガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡとして機能する能力が保持されているガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡそれぞれの変異体を指す。
【００５３】
用語「単一ガイドＲＮＡ」および「ｓｇＲＮＡ」は、本明細書中で互換的に使用され、２つのＲＮＡ分子の合成融合体、ｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）に融合した、（ｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に連結した）可変標的ドメインを含むｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）を指す。単一ガイドＲＮＡは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ断片、およびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ断片を含み得、前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に誘導することができ、ＣａｓエンドヌクレアーゼがそのＤＮＡ標的部位を認識し、それに結合し、かつ任意選択によりそれをニッキングまたは切断（一本鎖または二本鎖切断の導入）するのを可能にする。
【００５４】
細胞におけるガイドＲＮＡの発現システムの向上が必要とされている。本明細書中で記載されるのは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをその標的部位にガイドすることができるガイドＲＮＡを、Ｐｏｌ−ＩＩプロモーターを用いて発現する組成物および方法である。
【００５５】
本開示の一実施形態において、本開示は、単一ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合したＰｏｌ−ＩＩプロモーターを含む組み換えＤＮＡコンストラクトを記載し、前記組み換えＤＮＡコンストラクトは、リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含まず、前記ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成することができ、前記複合体は、非従来型酵母のゲノム中の標的部位配列に結合することができ、かつこれを切断することができる。
【００５６】
用語「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ複合体」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓシステム」、「ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体」、「ｇＲＮＡ／Ｃａｓシステム」、「ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ」、「ＲＧＥＮ」は、本明細書中で互換的に使用され、複合体を形成することができる、少なくとも１つのＲＮＡ構成要素、および少なくとも１つのＣａｓエンドヌクレアーゼを指し、前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に誘導することができ、ＣａｓエンドヌクレアーゼがそのＤＮＡ標的部位を認識し、それに結合し、かつ任意選択によりそれをニッキングまたは切断（一本鎖または二本鎖切断の導入）するのを可能にする。本明細書中のガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムなどの、４つの既知のＣＲＩＳＰＲシステム（Ｈｏｒｖａｔｈ  ａｎｄ  Ｂａｒｒａｎｇｏｕ、２０１０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：１６７−１７０）のいずれかのＣａｓタンパク質および適切なＲＮＡ構成要素を含み得る。ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＩＩ型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと少なくとも１つのＲＮＡ構成要素（例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｇＲＮＡ）を含み得る（２０１５年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１５／００８２４７８Ａ１号明細書、および２０１５年２月２６日公開の米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０Ａ１号明細書（両文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）も参照されたい）。
【００５７】
ガイドポリヌクレオチドは、当該技術において知られているあらゆる方法、例えば、以下に限定されないが、粒子撃込み、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属形質転換、または局所的アプリケーションを用いて、一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドとして細胞中に一時的に導入されてよい。また、ガイドポリヌクレオチドは、細胞中でガイドＲＮＡを転写することができる特定のプロモーターに作動可能に結合されたガイドポリヌクレオチドをコードする非相同核酸断片を含む組み換えＤＮＡ分子を（以下に限定されないが、粒子撃込みまたはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属形質転換等の方法によって）導入することによって、前記細胞中に間接的に導入されてよい。
【００５８】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（Ｐｏｌ−ＩＩＩプロモーター）は、５’末端および３’末端が正確に定義され、未改変であるＲＮＡの転写を可能にする（ＤｉＣａｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４１：４３３６−４３４３；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ３：ｅ１６１；ＳＮＲ５２  ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｍａｒｃｋ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｎｕｃｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３４（６）：１８１６−１８３５）。
【００５９】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰ  ＩＩおよびＰｏｌ−ＩＩ）は、真核生物の細胞中に見出される酵素である。これは、ＤＮＡの転写を触媒して、ｍＲＮＡ、ならびに殆どのｓｎＲＮＡおよびマイクロＲＮＡの前駆体を合成する（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  Ｒ（１９９９）．「Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ」。Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９（１２）：Ｍ４６．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０９６２−８９２４（９９）０１６７９−７．ＰＭＩＤ  １０６１１６８１；Ｓｉｍｓ，Ｒ．Ｊ．３ｒｄ；Ｍａｎｄａｌ，Ｓ．Ｓ．；Ｒｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．（Ｊｕｎｅ  ２００４）．「Ｒｅｃｅｎｔ  ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ  ｏｆ  ＲＮＡ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ＩＩ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」。Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １６（３）：２６３−２７１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｂ．２００４．０４．００４．ＩＳＳＮ  ０９５５−０６７４。
【００６０】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、当該技術において周知である（総説について、Ｂｕｔｌｅｒ  Ｊ．ａｎｄ  Ｋａｄｏｎａｇａ  Ｊ．２００２．Ｔｈｅ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ  ｃｏｒｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ：ａ  ｋｅｙ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＧＥＮＥＳ  ＆  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ  １６：２５８３−２５９２参照）。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターとして、ＦＢＡ１プロモーターが挙げられる（Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｙｅａｓｔ．２９：５９−７２；２０１４年８月１３日出願の米国特許出願第６２／０３６６５２号明細書も参照（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。
【００６１】
用語「Ｐｏｌ−ＩＩガイドＲＮＡ発現カセット」および「ポリメラーゼＩＩ−ｇＲＮＡ発現カセット」は、本明細書中で互換的に用いられて、発現カセット（組み換えＤＮＡコンストラクト）を指し、ポリメラーゼＩＩプロモーターは、ガイドＲＮＡをコードする。
【００６２】
用語「標的部位」、「標的配列」、「標的部位配列」、「標的ＤＮＡ」、「標的遺伝子座」、「ゲノム標的部位」、「ゲノム標的配列」、「ゲノム標的遺伝子座」および「プロトスペーサー」は、本明細書中で互換的に使用され、限定はされないが、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体が認識し、結合し、かつ場合によりニッキングまたは切断をすることができる、細胞の、染色体、エピソーム、またはゲノム中のあらゆる他のＤＮＡ分子（例えば、染色体ＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ）上のヌクレオチド配列などのポリヌクレオチド配列を指す。標的部位は細胞ゲノム中の内因性部位であり得、あるいは、標的部位は真菌細胞に対して異種であり、そのため細胞のゲノム中に天然には存在していないか、または天然で生じる場所と比較して異種のゲノム位置に見出すことができる。本明細書で使用される場合、用語「内因性標的配列」および「天然標的配列」は、本明細書中で互換的に使用され、細胞のゲノムに内在するか、または細胞のゲノムで生じ、細胞のゲノム中のその標的配列の内在位置または発生位置に存在する標的配列を指す。細胞としては、限定はされないが、ヒト、非ヒト、動物、細菌、真菌、昆虫、酵母、非従来型酵母および植物の細胞、ならびに本明細書に記載の方法によって作製された植物体および種子が挙げられる。「人工標的部位」または「人工標的配列」は、本明細書中で互換的に使用され、細胞のゲノムに導入された標的配列を指す。そのような人工標的配列は、細胞のゲノム中の内因性標的配列または天然標的配列と配列は同一であるが、細胞のゲノム中の異なる位置（すなわち、非内在位置または非発生位置）に位置し得る。
【００６３】
「変更標的部位」、「変更標的配列」、「改変標的部位」、「改変標的配列」は、本明細書中で互換的に使用され、非変更標的配列と比較して少なくとも１つの変更を含む、本明細書に開示の標的配列を指す。そのような「変更」としては、例えば、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせが挙げられる。
【００６４】
「標的部位を改変する」方法、および「標的部位を変更する」方法は、本明細書中で互換的に用いられて、変更された標的部位を作製する方法を指す。
【００６５】
標的ＤＮＡ配列（標的部位）の長さは様々であってよく、例えば、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のヌクレオチド長の標的部位が挙げられる。標的部位は回文構造であり得る、すなわち、一方の鎖上の配列が相補鎖上で反対方向に同じものを読み取ることがさらに可能である。ニッキング／切断部位は標的配列内に存在することができる、またはニッキング／切断部位は標的配列の外側に存在する可能性がある。別の変形では、切断は互いに直接向かい合ったヌクレオチド位置で起きて平滑末端切断が起きる可能性があり、その他の場合では、切り込みがジグザグ状となり、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングであり得る一本鎖オーバーハング（「粘着末端」とも呼ばれる）を生じさせる可能性がある。ゲノム標的部位の活性変異体もまた使用することができる。そのような活性変異体は、所与の標的部位に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を含むことができ、活性変異体は生物学的活性を保持しており、したがってＣａｓエンドヌクレアーゼにより認識され切断され得る。エンドヌクレアーゼによる標的部位の一本鎖または二本鎖切断を測定するためのアッセイは、当該技術分野で知られており、一般には、認識部位を含むＤＮＡ基質への薬剤の全体的な活性および特異性を測定する。
【００６６】
本明細書中の「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ））は、本明細書に記載のガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムにより認識される（標的とされる）標的配列（プロトスペーサー）に隣接する短いヌクレオチド配列を指す。標的ＤＮＡ配列の後にＰＡＭがなければ、その標的ＤＮＡ配列を正しく認識することはできない。本明細書におけるＰＡＭの配列および長さは、用いるＣａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質複合体に応じて異なり得る。ＰＡＭ配列は任意の長さであり得るが、一般には、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド長である。
【００６７】
用語「ターゲティング」、「遺伝子ターゲティング」および「ＤＮＡターゲティング」は、本明細書中で互換的に使用される。本明細書中のＤＮＡターゲティングは、例えば細胞の染色体またはプラスミド中の、特定のＤＮＡ配列でのノックアウト、編集、またはノックインの特異的な導入であってよい。本明細書においては、ＤＮＡターゲティングは、一般に、適切なポリヌクレオチド構成要素を伴ったエンドヌクレアーゼが、細胞中の特定のＤＮＡ配列にて一方の鎖または双方の鎖を切断することによって実行され得る。そのようなＤＮＡ切断は、二本鎖切断（ＤＳＢ）の場合、標的部位での改変に繋がり得るＮＨＥＪまたはＨＤＲプロセスを引き起こすことができる。
【００６８】
本明細書中の標的方法は、例えば、２つ以上のＤＮＡ標的部位が、当該方法で標的とされるように実行され得る。そのような方法は、場合によっては、多重化法として特徴付けられ得る。２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の標的部位が、特定の実施形態において、同時に標的とされ得る。多重化法は、典型的に、本明細書中で、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を特有のＤＮＡ標的部位にガイドするようにそれぞれ設計されている複数の様々なＲＮＡ構成要素が提供される標的方法によって実行される（２０１４年８月１３日出願の米国特許出願第６２／０３６６５２号明細書（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。
【００６９】
用語「ノックアウト」、「遺伝子ノックアウト」および「遺伝的ノックアウト」は、本明細書中で互換的に用いられる。ノックアウトは、Ｃａｓタンパク質によるターゲティングによって部分的に、または完全に無効とされた、細胞のＤＮＡ配列を表す；ノックアウト前のそのようなＤＮＡ配列は、例えば、アミノ酸配列をコードすることができたか、または、調節機能（例えば、プロモーター）を有していたはずである。ノックアウトは、インデル（ＮＨＥＪによる標的ＤＮＡ配列中のヌクレオチド塩基の挿入または欠失）、または標的部位もしくはその近傍の配列の機能を低下もしくは喪失させる配列の特異的除去により産生し得る。
【００７０】
ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムは、共送達されるポリヌクレオチド改変鋳型と組み合わせて使用することができ、目的のゲノムヌクレオチド配列の編集（改変）を可能にする。（２０１５年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１５／００８２４７８Ａ１号明細書、および２０１５年２月２６日公開の国際公開第２０１５／０２６８８６Ａ１号パンフレット（両文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００７１】
「改変ヌクレオチド」または「編集ヌクレオチド」は、その非改変ヌクレオチド配列と比較して少なくとも１つの変更を含む目的のヌクレオチド配列を指す。そのような「変更」としては、例えば、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせが挙げられる。
【００７２】
用語「ポリヌクレオチド改変鋳型」には、編集されるべきヌクレオチド配列と比較して、少なくとも１つのヌクレオチド改変を含むポリヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチド改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、付加または欠失であり得る。場合により、ポリヌクレオチド改変鋳型は、さらに、少なくとも１つのヌクレオチド改変にフランキングする相同ヌクレオチド配列を含み得、そのフランキング相同ヌクレオチド配列は、編集されるべき所望のヌクレオチド配列に十分な相同性を提供する。
【００７３】
ゲノム編集は利用可能な任意の遺伝子編集方法によって行うことができる。例えば、遺伝子編集は、宿主細胞に、その宿主細胞のゲノム内の遺伝子に対する標的改変を含むポリヌクレオチド改変鋳型（遺伝子修復オリゴヌクレオチドと呼ばれることもある）を導入することによって行うことができる。そのような方法に使用するポリヌクレオチド改変鋳型は、一本鎖または二本鎖であり得る。そのような方法の例は、広く、例えば、米国特許出願公開第２０１３／００１９３４９号明細書などに記載れている。
【００７４】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、所望の変更部近傍のゲノムの所定の位置に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入することによって促進され得る。ＤＳＢは、利用可能な任意のＤＳＢ導入剤、例えば、限定はされないが、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡシステム（細菌性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの基づく）などを使用して導入することができる。いくつかの実施形態では、ＤＳＢの導入は、ポリヌクレオチド改変鋳型の導入と組み合わせることができる。
【００７５】
ＤＳＢと改変鋳型を組み合わせるゲノム配列の編集プロセスは、一般に、染色体配列中の標的配列を認識し、ゲノム配列にＤＳＢを導入することができる、ＤＳＢ誘発物質、またはＤＳＢ誘発物質をコードする核酸、および、編集されるべきヌクレオチド配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドの変更を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド改変鋳型を、宿主細胞へ提供することを含む。ポリヌクレオチド改変鋳型は、さらに、少なくとも１つのヌクレオチド変更部にフランキングするヌクレオチド配列を含み得る。そのフランキング配列は、ＤＳＢにフランキングする染色体領域に実質的に相同である。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体などのＤＳＢ誘発物質を使用するゲノムの編集は、例えば、２０１５年３月１９日公開の米国特許出願公開第２０１５−００８２４７８Ａ１号明細書、２０１５年２月２６日公開の国際公開第２０１５／０２６８８６Ａ１号パンフレット、２０１４年７月７日出願の米国特許出願第６２／０２３２４６号明細書、および２０１４年８月１３日出願の米国特許出願第６２／０３６，６５２号明細書（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００７６】
用語「ノックイン」、「遺伝子ノックイン」、「遺伝子挿入」および「遺伝的ノックイン」は、本明細書中で互換的に用いられる。ノックインは、（適切なドナーＤＮＡポリヌクレオチド配列もまた使用される場合、ＨＲによる）Ｃａｓタンパク質によるターゲティングによる、細胞中の特定のＤＮＡ配列でのＤＮＡ配列の置換または挿入を表す。ノックインの例としては、遺伝子のコード領域中の異種アミノ酸コード配列の特異的な挿入、または遺伝子座中への転写調節要素の特異的な挿入がある。
【００７７】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼの標的部位に挿入される目的ポリヌクレオチドを有する細胞または生命体を得るために、様々な方法および組成物を使用することができる。そのような方法は、標的部位に目的ポリヌクレオチドを組み込む相同組み換えを用いることができる。提示された１つの方法では、目的ポリヌクレオチドがドナーＤＮＡコンストラクトとして生命体細胞に供給される。本明細書で使用される場合、「ドナーＤＮＡ」には、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの標的部位に挿入される目的ポリヌクレオチドを含むＤＮＡコンストラクトが含まれる。ドナーＤＮＡコンストラクトは、さらに、目的ポリヌクレオチドにフランキングする第１および第２の領域を含む。ドナーＤＮＡの相同の第１および第２の領域はそれぞれ、細胞または生命体ゲノムの標的部位に存在するかまたはフランキングする第１および第２のゲノム領域に対する相同性を共有する。「相同性」は、類似するＤＮＡ配列を意味する。例えば、ドナーＤＮＡ上で見出される「ゲノム領域に対する相同領域」とは、細胞または生命体ゲノムの所与の「ゲノム領域」と類似する配列を有するＤＮＡ領域のことである。相同領域は、切断される標的部位での相同組み換えを促進するのに十分な任意の長さであり得る。例えば、相同領域は、この相同領域が、対応するゲノム領域との相同組み換えを受けるのに十分な相同性を有するように、少なくとも５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５、５〜１００、５〜２００、５〜３００、５〜４００、５〜５００、５〜６００、５〜７００、５〜８００、５〜９００、５〜１０００、５〜１１００、５〜１２００、５〜１３００、５〜１４００、５〜１５００、５〜１６００、５〜１７００、５〜１８００、５〜１９００、５〜２０００、５〜２１００、５〜２２００、５〜２３００、５〜２４００、５〜２５００、５〜２６００、５〜２７００、５〜２８００、５〜２９００、５〜３０００、５〜３１００、またはそれ以上の塩基長を含むことができる。「十分な相同性」は、２つのポリヌクレオチド配列が相同組み換え反応用の基質として作用するのに十分な構造的類似性を有することを示す。この構造的類似性は、各ポリヌクレオチド断片の全長とポリヌクレオチドの配列類似性とを含む。配列類似性は、配列の全長にわたる配列同一性パーセント、ならびに／または１００％配列同一性を有する連続ヌクレオチドなどの局在化した類似性を含む保存領域、および配列の長さの一部にわたる配列同一性パーセントで説明することができる。
【００７８】
標的およびドナーポリヌクレオチドにより共有される相同性または配列同一性の量は多様であり得、約１〜２０ｂｐ、２０〜５０ｂｐ、５０〜１００ｂｐ、７５〜１５０ｂｐ、１００〜２５０ｂｐ、１５０〜３００ｂｐ、２００〜４００ｂｐ、２５０〜５００ｂｐ、３００〜６００ｂｐ、３５０〜７５０ｂｐ、４００〜８００ｂｐ、４５０〜９００ｂｐ、５００〜１０００ｂｐ、６００〜１２５０ｂｐ、７００〜１５００ｂｐ、８００〜１７５０ｂｐ、９００〜２０００ｂｐ、１〜２．５ｋｂ、１．５〜３ｋｂ、２〜４ｋｂ、２．５〜５ｋｂ、３〜６ｋｂ、３．５〜７ｋｂ、４〜８ｋｂ、５〜１０ｋｂの範囲で単位整数値を有する全長および／もしくは全領域を含む、または最大で標的部位の全長を含む。これらの範囲には、この範囲内の全ての整数が含まれ、例えば１〜２０ｂｐの範囲には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０ｂｐが含まれる。相同性の量はまた、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性パーセントを含む２つのポリヌクレオチドの完全にアラインされた長さ全体にわたる配列同一性パーセントで説明することもできる。十分な相同性は、ポリヌクレオチドの長さと、全体的な配列同一性パーセントと、任意選択で連続ヌクレオチドの保存領域または局所的な配列同一性パーセントとの任意の組み合わせを含み、例えば、十分な相同性を、標的遺伝子座の領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する７５〜１５０ｂｐの領域として説明することができる。十分な相同性はまた、高ストレンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズする２つのポリヌクレオチドの予測能力によって説明することができ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）；および、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「ゲノム領域」とは、標的部位のいずれかの側上に存在する、細胞のゲノム中の染色体のセグメントのことであるか、または標的部位の一部も含むセグメントのことである。このゲノム領域は、このゲノム領域は、対応する相同領域との相同組み換えを受けるのに十分な相同性を有するように、少なくとも５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５、５〜１００、５〜２００、５〜３００、５〜４００、５〜５００、５〜６００、５〜７００、５〜８００、５〜９００、５〜１０００、５〜１１００、５〜１２００、５〜１３００、５〜１４００、５〜１５００、５〜１６００、５〜１７００、５〜１８００、５〜１９００、５〜２０００、５〜２１００、５〜２２００、５〜２３００、５〜２４００、５〜２５００、５〜２６００、５〜２７００、５〜２８００、５〜２９００、５〜３０００、５〜３１００個、またはそれ以上の塩基を含むことができる。
【００８０】
目的ポリヌクレオチドおよび／または形質は、２０１３年１０月３日公開の米国特許出願公開第２０１３／０２６３３２４−Ａ１号明細書および２０１３年１０月２４日公開のＰＣＴ／ＵＳ１３／２２８９１号明細書（両出願は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、複合形質遺伝子座に共にスタッキングすることができる。本明細書に記載のガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼシステムは、二重鎖切断を効率よく生成するシステムを提供し、複合形質遺伝子座における形質のスタッキングを可能にする。
【００８１】
所与のゲノム領域とドナーＤＮＡ上に見出される対応する相同領域との間の構造類似性は、相同組み換えが起こることを可能にする任意の程度の配列同一性であることができる。例えば、ドナーＤＮＡの「相同領域」および生命体ゲノムの「ゲノム領域」により共有される相同性または配列同一性の量は、配列が相同組み換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性であることができる。
【００８２】
ドナーＤＮＡ上の相同領域は、標的部位にフランキングする任意の配列に対する相同性を有することができる。いくつかの実施形態では、相同領域は、標的部位に直接フランキングするゲノム配列に対して相当な配列相同性を共有するが、この相同領域を、標的部位に対してさらに５’または３’であり得る領域に対して十分な相同性を有するように設計することができることが認識される。さらに他の実施形態では、相同領域はまた、下流のゲノム領域に沿った標的部位の断片とも相同性を有し得る。一実施形態では、第１の相同領域は標的部位の第１の断片をさらに含み、第２の相同領域は標的部位の第２の断片を含み、これら第１の断片および第２の断片は異なる。
【００８３】
本明細書中で用いられる「相同組み換え」は、相同性の部位での２つのＤＮＡ分子間のＤＮＡ断片の交換を含む。相同組み換えの頻度は、いくつかの因子によって影響される。異なる生物は、相同組み換えの量、および、相同組み換えの、非相同組み換えに対する割合に関して、異なる。通常、相同性の領域の長さは、相同組み換え事象の頻度に影響を及ぼす：相同性の領域が長いほど、頻度は高い。また、相同組み換えを観察するのに必要な相同性領域の長さも、種によって変動する。多くの場合に、相同性の少なくとも５ｋｂが利用されてきたが、相同組み換えは、相同性の僅か２５〜５０ｂｐでも観察された。例えば、Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３１：２５−３３；Ｓｈｅｎ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，（１９８６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１２：４４１−５７；Ｗａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４７６８−７２，Ｓｕｇａｗａｒａ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，（１９９２）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２：５６３−７５，Ｒｕｂｎｉｔｚ  ａｎｄ  Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，（１９８４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４：２２５３−８；Ａｙａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５１９９−２０３；Ｌｉｓｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１５：１６１−７を参照されたい。
【００８４】
相同配向型修復（ＨＤＲ）は、二本鎖ＤＮＡ切断および一本鎖ＤＮＡ切断の細胞における修復機構である。相同配向型修復として、相同組み換え（ＨＲ）および一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）（Ｌｉｅｂｅｒ．２０１０  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９：１８１−２１１）が挙げられる。ＨＤＲの最も一般的な形態は、相同組み換え（ＨＲ）と呼ばれ、これは、ドナーＤＮＡとアクセプターＤＮＡとの最も長い配列相同性を要求する。ＨＤＲの他の形態として、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）および切断誘導複製が挙げられ、これらは、ＨＲと比べて短い配列相同性を必要とする。ニック（一本鎖切断）に対する相同配向型修復は、二本鎖切断に対するＨＤＲと異なる機構で起こり得る（Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｉｚｅｌｓ．（２０１４）ＰＮＡＳ（００２７−８４２４），１１１（１０），ｐ．Ｅ９２４−Ｅ９３２）。
【００８５】
例えば、相同組み換え（ＨＲ）による植物細胞のゲノムの変更は、遺伝子工学にとって強力なツールである。相同組み換えは、植物において（Ｈａｌｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２３１：１８６−９３）、そして昆虫において（Ｄｒａｙ  ａｎｄ  Ｇｌｏｏｒ，１９９７，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４７：６８９−９９）実証されてきた。相同組み換えは、他の生物においても達成されてきた。例えば、相同性の少なくとも１５０〜２００ｂｐが、寄生性の原虫リーシュマニアの相同組み換えに必要とされた（Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｕ  ａｎｄ  Ｄｕｍａｓ，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：４２７８−８６）。糸状菌アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）では、遺伝子置換が、僅か５０ｂｐのフランキング相同性でも達成された（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８：ｅ９７）。標的遺伝子置換は、繊毛虫テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）でも実証されてきた（Ｇａｅｒｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２：５３９１−８）。哺乳動物では、相同組み換えは、培養で増殖されて、形質転換されて、選択されて、かつマウス胚中に導入され得る多能性胚性幹細胞株（ＥＳ）を用いて、マウスにおいて最も良好であった（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，２ｎｄ  Ｅｄ．，（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  ｂｙ  ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．））。
【００８６】
エラーを起こしやすいＤＮＡ修復機構が、二本鎖切断部位にて突然変異をもたらし得る。染色体の構造的完全性は、通常、修復によって保存されるが、欠失、挿入またはその他の再配置は起こり得る。１つの二本鎖切断の２末端は、ＮＨＥＪの最も一般的な基質である（Ｋｉｒｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）ＥＭＢＯ  Ｊ  １９：５５６２−６）が、２つの異なる二本鎖切断が起きる場合、異なる切断のフリー端でライゲーションが起こり、染色体の欠失（Ｓｉｅｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｐｕｃｈｔａ、（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：１１２１−３１）、または異なる染色体間の染色体転座転移（Ｐａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７５：２１−９）が生じる。マイクロホモロジー媒介末端結合ＭＭＥＨは、２０１４年８月２８日公開の米国特許出願公開第２０１４／０２４２７０２号明細書に記載されており、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００８７】
本明細書中に記載される方法に用いられるＣａｓエンドヌクレアーゼは、あらゆる二本鎖切断誘導剤、例えば、以下に限定されないが、ＴＡＬヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、デザイナージンクフィンガーヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、およびホーミングメガヌクレアーゼによって置換されてよいことが、当業者によって理解される。
【００８８】
エピソームＤＮＡ分子もまた、二本鎖切断中にライゲーションされ得、例えば、Ｔ−ＤＮＡの、染色体二本鎖切断中への組み込みがなされ得る（Ｃｈｉｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕｅ，（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １３３：９５６−６５；Ｓａｌｏｍｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｃｈｔａ，（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ  １７：６０８６−９５）。例えば、二本鎖切断の成熟に関与するエクソヌクレアーゼ活性によって、二本鎖切断の周りの配列が一旦変更されると、非分裂体細胞中の相同染色体、またはＤＮＡ複製後の姉妹染色分体等の相同配列が利用できるならば、遺伝子変換経路が、本来の構造を修復し得る（Ｍｏｌｉｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １６：３４２−５２）。異所性ＤＮＡ配列および／または後成的ＤＮＡ配列もまた、相同組み換え用のＤＮＡ修復鋳型として機能し得る（Ｐｕｃｈｔａ，（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５２：１１７３−８１）。
【００８９】
ＤＮＡ中で二本鎖切断が誘発されると、細胞のＤＮＡ修復機構が活性化されて、切断を修復する。エラーを起こしやすいＤＮＡ修復機構が、二本鎖切断部位にて突然変異をもたらし得る。切断された末端を接合する最も一般的な修復機構は、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）経路である（Ｂｌｅｕｙａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  ５：１−１２）。染色体の構造的完全性は典型的に、修復によって保存されるが、欠失、挿入、またはその他の再配置が起こり得る（Ｓｉｅｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｐｕｃｈｔａ，（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：１１２１−３１；Ｐａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７５：２１−９）。
【００９０】
あるいは、二本鎖切断は、相同性ＤＮＡ配列間の相同組み換えによって修復することができる。二本鎖切断部分近傍の配列が、例えば、二本鎖切断の成熟に関与するエクソヌクレアーゼ活性によって変わると、非分裂体細胞中の相同染色体、またはＤＮＡ複製後の姉妹染色分体などの相同配列が利用できるなら、遺伝子変換経路が、元の構造に修復することができる（Ｍｏｌｉｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １６：３４２−５２）。異所性および／または後成的ＤＮＡ配列もまた、相同組み換えのＤＮＡ修復鋳型として機能し得る（Ｐｕｃｈｔａ，（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５２：１１７３−８１）。
【００９１】
ＤＮＡ二本鎖切断は、相同組み換え経路を刺激する有効な因子のようである（Ｐｕｃｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２８：２８１−９２；Ｔｚｆｉｒａ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ、（２００５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：５６７−９；Ｐｕｃｈｔａ、（２００５）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ  ５６：１−１４）。ＤＮＡ−切断物質の使用により、植物の人工的に構築された相同ＤＮＡ反復配列間の相同組み換えの２〜９倍の増加が観察された（Ｐｕｃｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２８：２８１−９２）。トウモロコシのプロトプラストにおける線状ＤＮＡ分子による実験で、プラスミド間の相同組み換えの増進が示された（Ｌｙｚｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２３０：２０９−１８）。
【００９２】
ドナーＤＮＡは、当該技術において知られているあらゆる手段によって導入されてよい。ドナーＤＮＡは、当該技術において知られているあらゆる形質転換法によって提供されてよく、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属媒介形質転換、バイオリスティック粒子撃込み、化学形質転換、プロトプラスト融合、またはエレクトロポレーションが挙げられる。ドナーＤＮＡは、一時的に細胞内に存在してもよいし、細菌、酵母、真菌、またはウィルスのレプリコンを介して導入されてもよい。Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび標的部位の存在下で、ドナーＤＮＡは、形質転換された細胞のゲノム中に挿入される（ガイドの文言参照）。
【００９３】
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムのさらなる使用が報告されており（２０１５年３月１５日公開の米国特許出願公開第２０１５−００８２４７８Ａ１号明細書、２０１５年２月２６日公開の国際公開第２０１５／０２６８８６Ａ１号パンフレット、２０１５年２月２６日公開の米国特許出願公開第２０１５−００５９０１０Ａ１、２０１４年７月７日出願の米国特許出願第６２／０２３２４６号明細書、および２０１４年８月１３日公開の米国特許出願第６２／０３６，６５２号明細書（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、限定はされないが、目的ヌクレオチド配列（調節要素など）の改変または置換、目的ポリヌクレオチドの挿入、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、スプライシング部位の改変および／または代替スプライシング部位の導入、目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の改変、アミノ酸および／またはタンパク質の融合、ならびに目的遺伝子への逆方向反復配列の発現による遺伝子サイレンシングが挙げられる。
【００９４】
目的ポリヌクレオチドはさらに本明細書中に記載されており、商業市場、および作物の開発に関係するそれらの関心を反映したポリヌクレオチドが挙げられる。目的ポリヌクレオチド／目的ポリペプチドとしては、限定はされないが、除草剤耐性コード配列、殺虫物質コード配列、殺線虫物質コード配列、抗真菌性物質コード配列、抗ウィルス物質コード配列、ならびに非生物的ストレスおよび生物的ストレス耐性コード配列、あるいは収穫量、穀粒品質、栄養分、デンプンの品質もしくは量、窒素固定および／もしくは窒素利用、脂肪酸および油分、ならびに／または組成などの微生物または植物形質を改変する配列が挙げられる。
【００９５】
さらに、目的ポリヌクレオチドがまた、目的の標的遺伝子配列のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の少なくとも一部に相補的なアンチセンス配列を含み得ることが確認されている。アンチセンスヌクレオチドは、対応するｍＲＮＡとハイブリダイズするように構成されている。アンチセンス配列は、対応するｍＲＮＡにハイブリダイズし、その発現を妨げるなら、改変されていてもよい。このように、対応するアンチセンス配列と７０％、８０％、または８５％の配列同一性を有するアンチセンス構成が使用され得る。さらに、アンチセンスヌクレオチドの部分は、標的遺伝子の発現を妨げるために使用され得る。一般に、少なくとも５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチドまたはそれ以上からなる配列が使用され得る。
【００９６】
さらに、目的ポリヌクレオチドはまた、植物体および微生物の内因性遺伝子の発現を抑制するセンス配向で使用され得る。センス配向のポリヌクレオチドによって植物体および微生物の遺伝子の発現を抑制する方法は、当該技術分野で知られている。この方法には、一般に、内因性の遺伝子の転写に対応するヌクレオチド配列の少なくとも一部に作動可能に結合した、微生物または植物体内での発現を駆動するプロモーターを含むＤＮＡコンストラクトで植物体および微生物を形質転換することが含まれる。通常、そのようなヌクレオチド配列は、内因性遺伝子の転写配列に対し相当の配列同一性を、一般に、約６５％を超える配列同一性を、約８５％を超える配列同一性を、または約９５％を超える配列同一性を有する。米国特許第５，２８３，１８４号明細書および同第５，０３４，３２３号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００９７】
注目するポリヌクレオチドは、表現型マーカーであってもよい。表現型マーカーは、スクリーニング可能なマーカー、または選択可能なマーカーであり、ポジティブ選択可能なマーカーであるかネガティブ選択可能なマーカーであるかに拘らない、視覚によるマーカーおよび選択可能なマーカーが挙げられる。あらゆる表現型マーカーが用いられ得る。具体的に、選択可能なマーカーまたはスクリーニング可能なマーカーは、多くの場合特定の条件下で、これを含有する分子または細胞を同定して、これらを選択し、または排除することを可能にするＤＮＡセグメントを含む。これらのマーカーは、活性、例えば、以下に限定されないが、ＲＮＡ、ペプチド、またはタンパク質の産生をコードしてもよいし、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機化合物および有機化合物、または組成物等に結合部位を提供してもよい。
【００９８】
本明細書で使用する場合、「核酸」はポリヌクレオチドを意味しており、デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリマーを含む。核酸はまた、断片および改変ヌクレオチドを含んでよい。したがって、用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」および「核酸断片」は、互換的に使用され、一本鎖または二本鎖で、場合により合成ヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基または改変ヌクレオチド塩基を含むＲＮＡおよび／またはＤＮＡのポリマーを示す。ヌクレオチド（通常、５’−一リン酸塩形態で見出される）は、単一文字表示により、以下のように称される：アデノシンまたはデオキシアデノシンに対し（それぞれ、ＲＮＡまたはＤＮＡに対し）「Ａ」、シトシンまたはデオキシシトシンに対し「Ｃ」、グアノシンまたはデオキシグアノシンに対し「Ｇ」、ウリジンに対し「Ｕ」、デオキシチミジンに対し「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）に対し「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）に対し「Ｙ」、ＧまたはＴに対し「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴに対し「Ｈ」、イノシンに対し「Ｉ」、および任意のヌクレオチドに対し「Ｎ」。
【００９９】
「オープンリーディングフレーム」は、ＯＲＦと略される。
【０１００】
用語「機能的に等価である小断片」および「機能的に等価な小断片」は、本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、断片または小断片が活性酵素をコードしているか否かに関わらず、遺伝子発現を変更し得る能力、またはある特定の表現型を生成する能力が保持されている、単離核酸断片の一部またはサブ配列を指す。例えば、断片または小断片は、形質転換植物に所望の表現型を生じさせる遺伝子の設計に使用することができる。遺伝子は、その核酸断片または小断片を、それが活性酵素をコードするか否かに関わらず、植物プロモーター配列に対してセンスまたはアンチセンス配向で結合させることにより、抑制的に使用されるように設計することができる。
【０１０１】
用語「保存ドメイン」または「モチーフ」は、進化的に関連したタンパク質のアラインされた配列に沿って特定の位置に保存される一連のアミノ酸を意味する。他の位置のアミノ酸が相同タンパク質間で変動し得るが、一方、特定の位置に高度に保存されるアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性または活性に必須のアミノ酸を意味する。それらは、そのタンパク質相同体ファミリーのアラインされた配列の高い保存度によって同定されるため、新しく決定された配列を有するタンパク質が予め同定されたタンパク質ファミリーに属するか否かを決定する識別子または「シグネチャー」として使用することができる。
【０１０２】
ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列、その変異体、ならびにこれらの配列の構造的関係は、「相同」、「相同の」、「実質的に同一の」、「実質的に類似の」および「実質的に対応する」という用語によって記載され、これらの用語は本明細書で互換的に使用される。これらは、１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド塩基の変化が、分子の機能、例えば、遺伝子の発現を仲介し、ある特定の表現型を生じさせる能力に影響することのないポリペプチド断片または核酸断片を指す。これらの用語はまた、得られる核酸断片の機能特性が、所期の改変されていない断片と比較して実質的に変わらない核酸断片の改変を指す。これらの改変には、核酸断片中の１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換および／または挿入が含まれる。
【０１０３】
実質的に類似の核酸配列に包含されるものは、（中度のストリンジェンシー条件下、例えば、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃で）本明細書に例示した配列と、または本明細書に開示したヌクレオチド配列の任意の部分にハイブリダイズする能力によって規定することができ、それらは本明細書に開示した核酸配列のいずれかと機能的に等価である。ストリンジェンシー条件を調節して、中度の類似性を有する断片、例えば遠縁の生命体由来の相同配列を、高い類似性を有する断片、例えば近縁の生命体由来の機能酵素を複製する遺伝子などに対しスクリーニングすることができる。ポストハイブリダイゼーション洗浄がストリンジェンシー条件を決定する。
【０１０４】
用語「選択的にハイブリダイズする」には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での、核酸配列の特定の核酸標的配列への、非標的核酸配列へのハイブリダイゼーションより高い検出度（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）のハイブリダイゼーション、および非標的核酸の実質的排除が含まれる。選択的にハイブリダイズする配列は、通常、互いに少なくとも８０％または９０％、最大で１００％の（すなわち、完全相補の）の配列同一性を有する。
【０１０５】
用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」には、インビトロのハイブリダイゼーション分析において、プローブがその標的配列に選択的にハイブリダイズする条件が含まれる。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、また、環境が変わると異なるであろう。ハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することによって、プローブに対し１００％相補的な標的配列を特定することができる（相同プロービング）。あるいは、配列の不一致を許容し、より低い類似性が検出されるように配列の不一致を認めるように、ストリンジェンシー条件を調節することができる（非相同プロービング）。一般に、プローブは長さが約１０００ヌクレオチド未満であり、場合により５００ヌクレオチド未満である。
【０１０６】
通常、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）の場合、少なくとも約３０℃において、また、長いプローブ（例えば、５０超のヌクレオチド）の場合、少なくとも約６０℃の温度において、塩濃度が、約１．５Ｍ  Ｎａイオン濃度、典型的には約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａイオン濃度であるものである。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化物質の添加により形成することができる。低ストリンジェンシー条件の例としては、３７℃の、３０〜３５％のホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）からなる緩衝液によるハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃での１〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍ  クエン酸酸ナトリウム）における洗浄が挙げられる。中度ストリンジェンシー条件の例としては、３７℃の、４０〜４５％のホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、および５５〜６０℃での０．５〜１×ＳＳＣにおける洗浄が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、３７℃の、５０％のホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃での０．１×ＳＳＣにおける洗浄が挙げられる。
【０１０７】
核酸配列またはポリペプチド配列と関連する「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較窓全体にわたり最大の一致のためにアラインされた場合に同一である２種の配列における核酸塩基またはアミノ酸残基を指す。
【０１０８】
用語「配列同一性パーセンテージ」は、比較窓全体にわたり２種の適切にアラインされた配列を比較することにより決定される値を指し、比較窓内のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、これら２種の配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含む場合がある。このパーセンテージは、両方の配列内で同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が発生する位置の数を決定してマッチ位置数を得、このマッチ位置数を比較窓内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性パーセンテージを得ることによって算出される。配列同一性パーセントの有用な例としてが、限定はされないが、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％、または５０％〜１００％の任意の整数パーセンテージが挙げられる。これらの同一性は、本明細書に記載のプログラムのいずれかを使用して決定することができる。
【０１０９】
配列アラインメント、および同一性または類似性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（これに限定されない）などの、相同配列を検出するために設計された様々な比較方法を使用して決定することができる。本願の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析に使用する場合、別途指定しない限り、分析結果は、言及したプログラムの「デフォルト値」をベースとすることは理解されるであろう。本明細書で使用する場合、「デフォルト値」は、最初に初期化したとき、ソフトウェアで最初にロードされる値またはパラメータの任意のセットを意味する。
【０１１０】
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ方法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  ８：１８９−１９１に記載されている）とラベルされ、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム中にあるアラインメント方法に対応する。多重アラインメントの場合、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ方法を使用するタンパク質配列のペアワイズアラインメント用の、および同一性パーセント算出用のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸の場合、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを使用した配列のアラインメントの後、同じプログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性パーセント」を得ることができる。
【０１１１】
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ方法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  ８：１８９−１９１に記載されている）とラベルされ、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム中にあるアラインメント方法に対応する。多重アラインメント用のデフォルトパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを使用した配列のアラインメントの後、同じプログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性パーセント」を得ることができる。
【０１１２】
別途指定しない限り、本明細書に示される配列同一性／類似性値は、以下のパラメータを用いるＧＡＰＶｅｒｓｉｏｎ１０（ＧＣＧ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して得られた値を指す：ヌクレオチド配列の同一性％および類似性％は、ギャップ生成ペナルティウエイト５０、ギャップ長伸長ペナルティウエイト３、およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用；アミノ酸配列の同一性％および類似性％は、ギャップ生成ペナルティウエイト８、ギャップ長伸長ペナルティ２、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５）。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３−５３のアルゴリズムを使用して、一致した数を最大化し、ギャップ数を最小限に抑える２種の配列全体のアラインメントを見出す。ＧＡＰは、全ての可能なアラインメントおよびギャップ位置を考慮し、一致した塩基の単位でギャップ生成ペナルティおよびギャップ伸長ペナルティを使用して、一致した塩基の最大数および最小のギャップを有するアラインメントを作成する。
【０１１３】
「ＢＬＡＳＴ」は、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）によって提供されている、生物学的配列の類似領域を見出すために使用される検索アルゴリズムである。このプログラムでは、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列を配列データベースと比較し、一致の統計学的有意性を計算して、問い合わせ配列に十分類似した配列を、類似性がランダムに起こったと予想されないように特定する。ＢＬＡＳＴは特定された配列およびそれらの問い合わせ配列に対するローカルアライメントを報告する。
【０１１４】
多くのレベルの配列同一性が、その他の種からのまたは天然にもしくは合成により改変されているポリペプチド（そのようなポリペプチドは同一のまたは類似した機能または活性を有する）の特定に有用であることは当業者によく理解されるであろう。同一性パーセントの有用な例としては、限定はされないが、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％または５０％〜１００％の任意の整数パーセンテージが挙げられる。実際に、５０％〜１００％の任意の整数のアミノ酸同一性、例えば、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性は、本開示の説明に有用であり得る。
【０１１５】
「遺伝子」は、機能分子、例えば、限定はされないが、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の調節配列などの特定のタンパク質などを発現する核酸断片を含む。「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出される遺伝子を指す。
【０１１６】
「変異遺伝子」は、ヒトが介入して改変された遺伝子である。そのような「変異遺伝子」は、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失または置換によって、対応する非変異遺伝子と異なる配列を有する。本開示のある特定の実施形態では、変異遺伝子は、本明細書で開示するガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムの結果として生じる変更を含む。変異植物体は、変異遺伝子を含む植物体である。
【０１１７】
本明細書で使用する場合、「標的型変異」は、本明細書で開示する、または当該技術分野で知られる標的配列のＤＮＡに二本鎖切断を導入することができる二本鎖切断誘導剤を含む方法を使用して、天然遺伝子内の標的とされる配列を変更することによりなされた天然遺伝子中の変異のことである。
【０１１８】
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ誘導標的型変異は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって認識され切断されるゲノム標的部位の中または外に位置するヌクレオチド配列で起こり得る。
【０１１９】
突然変異効率が、本明細書中に記載されるようにして計算されてよい（実施例参照）。ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合したＰｏｌ−ＩＩプロモーターを含む組み換えＤＮＡ発現カセットに由来し、前記ガイドＲＮＡが、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成することができ、前記複合体が、非従来型酵母のゲノム中の標的部位配列に結合することができ、かつこれを切断することができるガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムによって引き起こされる突然変異効率は、ガイドＲＮＡが、Ｐｏｌプロモーターを含まない組み換えＤＮＡコンストラクトに由来するガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムによって引き起こされる突然変異頻度と比較されてよい。
【０１２０】
用語「ゲノム」は、植物、真菌の酵母に適用する場合、核内で見出される染色体ＤＮＡだけでなく、細胞の細胞内構成要素（例えば、ミトコンドリアまたはプラスチド）内で見出される細胞小器官ＤＮＡも包含する。
【０１２１】
「コドン改変遺伝子」または「コドン優先遺伝子」または「コドン最適化遺伝子」とは、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するように設計されているコドン使用頻度を有する遺伝子のことである。
【０１２２】
［アレル」は、染色体の所与の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態の１つである。染色体の所与の遺伝子座に存在する全てのアレルが同じである場合、その細胞はその遺伝子座でホモ接合性である。染色体の所与の遺伝子座に存在するアレルが異なっているなら、その細胞はその遺伝子座でヘテロ接合性である。
【０１２３】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を指す。「調節配列」は、コード配列の上流（５’−非コード配列）、コード配列内、またはコード配列の下流（３’−非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、それは関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を及ぼす。調節配列としては、限定はされないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、５’非翻訳配列、３’非翻訳配列、イントロン、ポリアデニル化標的配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造を挙げることができる。
【０１２４】
「植物最適化ヌクレオチド配列」は、植物における発現が増大するように、特に、注目する１つ以上の植物における発現が増大するように最適化されたヌクレオチド配列である。例えば、植物最適化ヌクレオチド配列は、例えば、本明細書に開示する二本鎖切断誘導物質（例えば、エンドヌクレアーゼ）などのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、発現を改善するための１つ以上の植物優先コドンを用いて改変することにより、合成することができる。例えば、宿主優先コドンの利用についての考察には、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｏｗｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１を参照されたい。
【０１２５】
植物優先遺伝子を合成する方法は、当該技術分野で利用可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号明細書および同第５，４３６，３９１号明細書、ならびにＭｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。植物宿主において遺伝子発現を高めるためのさらなる配列の改変は知られている。これらの改変としては、例えば、疑似のポリアデ二ル化シグナルをコードする１つ以上の配列の除去、１つ以上のエクソン−イントロンスプライス部位シグナル、１つ以上のトランスポゾン様反復、および遺伝子発現に有害なおそれのあるそうしたよく特徴付けられた他の配列が挙げられる。配列のＧＣ含量は、所与の植物宿主の平均レベル（その宿主植物細胞で発現する既知の遺伝子を参照して計算される）に調整することができる。可能であれば、１つ以上のｍＲＮＡの予測されるヘアピン二次構造を避けるために配列を改変する。したがって、本開示の「植物最適化ヌクレオチド配列」は、そのような配列の改変を１つ以上含む。
【０１２６】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写開始タンパク質の認識および結合に関与するＤＮＡ領域である。プロモーター配列は近位およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントはエンハンサーと称されることが多い。「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーター固有のエレメントであってもよいし、プロモーターのレベルまたは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントであってもよい。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来していてもよいし、天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成され、かつ／または合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。様々なプロモーターが、様々な組織型もしくは細胞型で、または様々な発達段階で、または様々な環境条件に応じて、遺伝子の発現を誘導し得ることは当業者に理解されている。さらに、殆どの場合に調節配列の正確な境界が完全には定義されていないことから、いくつかのバリエーションのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有する場合があることは認識されている。殆どの細胞型で最も多く遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に、「構成型プロモーター」と呼ばれている。ある特定のプロモーターが他のものよりより高率でＲＮＡの合成を誘導することができることが示された。これらは「強力なプロモーター」と呼ばれている。ある特定の他のプロモーターが、特定の細胞型または組織型でのみ高いレベルでＲＮＡの合成を誘導することが示され、プロモーターがある特定の組織で好適にＲＮＡ合成を誘導し、他の組織では低いレベルでＲＮＡ合成を誘導するなら、「組織特異性プロモーター」または「組織優勢プロモーター」としばしば呼ばれている。植物体に導入されたキメラ遺伝子（または、遺伝子群）の発現パターンはプロモーターによって制御され、特定の組織型または特定の植物成長段階においてある特定のレベルでキメラ遺伝子または（遺伝子群）の発現を制御することができる新規なプロモーターを単離することへの関心が依然存在している。
【０１２７】
化学調節プロモーターが用いられて、外因性の化学調節剤の使用により、植物における遺伝子の発現を調節することができる。当該プロモーターは、化学物質の使用が遺伝子発現を誘導する化学誘導性プロモーターであってもよいし、化学物質の使用が遺伝子発現を抑制する化学抑制性プロモーターであってもよい（Ｄｅ  Ｖｅｙｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３８：５６８−７７）。組織優先プロモーターが利用されて、特定の植物組織内での発現の増強を標的とすることができる（Ｋａｗａｍａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３８：７９２−８０３）。種子優先プロモーターとして、種子発育中に活性がある種子特異的プロモーター、および種子発芽中に活性がある種子発芽プロモーターの双方が挙げられる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  １０：１０８）。
【０１２８】
用語「誘導性プロモーター」は、例えば化学物質（化学誘導剤）による内因性または外因性刺激に応じて、あるいは、環境シグナル、ホルモンシグナル、化学物質シグナルおよび／または発生シグナルに応じて、コード配列または機能性ＲＮＡを選択的に発現するプロモーターを指す。誘導性または調節プロモーターとしては、例えば、光、熱、ストレス、フラッディングもしくは乾燥、塩ストレス、浸透圧ストレス、植物ホルモン、創傷、またはエタノール、アブシジン酸（ＡＢＡ）、ジャスモネート、サリチル酸もしくは毒性緩和剤などの化学物質によって誘導または調節されるプロモーターが挙げられる。
【０１２９】
本明細書中の特定の態様（例えば、真菌および／または酵母細胞）に有用な強いプロモーターの例として、本明細書中で、米国特許出願公開第２０１２／０２５２０７９号明細書（ＤＧＡＴ２）、米国特許出願公開第２０１２／０２５２０９３号明細書（ＥＬ１）、米国特許出願公開第２０１３／００８９９１０号明細書（ＡＬＫ２）、米国特許出願公開第２０１３／００８９９１１号明細書（ＳＰＳ１９）、米国特許出願公開第２００６／００１９２９７号明細書（ＧＰＤおよびＧＰＭ）、米国特許出願公開第２０１１／００５９４９６号明細書（ＧＰＤおよびＧＰＭ）、米国特許出願公開第２００５／０１３０２８０号明細書（ＦＢＡ、ＦＢＡＩＮ、ＦＢＡＩＮｍ）、米国特許出願公開第２００６／００５７６９０号明細書（ＧＰＡＴ）、および米国特許出願公開第２０１０／００６８７８９号明細書（ＹＡＴ１）に開示されるものが挙げられ、これらの出願は、参照によって本明細書に組み込まれる。強いプロモーターの他の例として、ＸＰＲ２（米国特許第４９３７１８９号明細書；ＥＰ２２０８６４号明細書）、ＧＰＤ、ＧＰＭ（米国特許第７２５９２５５号明細書および米国特許第７４５９５４６号明細書）、ＴＥＦ（米国特許第６２６５１８５号明細書）、ＧＰＤＩＮ（米国特許第７４５９５４６号明細書）、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ（米国特許第７２０２３５６号明細書）、ＦＢＡ、ＦＢＡＩＮ、ＦＢＡＩＮｍ（米国特許第７２０２３５６号明細書）、ＧＰＡＴ（米国特許第７２６４９４９号明細書）、ＹＡＴ１（米国特許出願公開第２００６／００９４１０２号明細書）、およびＥＸＰ１（米国特許第７９３２０７７号明細書）が挙げられる。特定の実施形態に有用な強いプロモーターの他の例として、本明細書中で、ＰＧＫ１、ＡＤＨ１、ＴＤＨ３、ＴＥＦ１、ＰＨＯ５、ＬＥＵ２、およびＧＡＬ１プロモーター、ならびにＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌ  ８８：２４３−２５１）（参照によって本明細書中に組み込まれる）に開示される強い酵母プロモーターが挙げられる。
【０１３０】
ｔＲＮＡプロモーターとして、当該技術において知られているあらゆるｔＲＮＡ、例えば、以下に限定されないが、ｔＲＮＡ−リジン（ｔＲＮＡ−Ｌｙｓ；Ａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｓ．３６（１８）：５８３２−５８４４参照）、ｔＲＮＡ−グルタミン（ｔＲＮＡ−Ｇｌｕ）、ｔＲＮＡ−バリン（ｔＲＮＡ  Ｖａｌ；Ｍａｒｃｋ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｎｕｃｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３４（６）：１８１６−１８３５）、または細胞中で活性がある他のあらゆるｔＲＮＡ、ｔＲＮＡ−ロイシン（ｔＲＮＡ  Ｌｅｕ、ｔＲＮＡ−ｌｅｕ（２）、ｔＲＮＡ−ｌｅｕ（３））、ｔＲＮＡ−イソロイシン（ｔＲＮＡ−ｉｌｅ）、ｔＲＮＡ−トリプトファン（ｔＲＮＡ−ｔｒｐ）、ｔＲＮＡ−チロシン（ｔＲＮＡ−ｔｙｒ）、ｔＲＮＡ−ヒスチジン（ｔＲＮＡ−ｈｉｓ；ｔＲＮＡ−ｈｉｓ）をコードするＤＮＡが挙げられる。
【０１３１】
「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコード配列との間に位置決めされているポリヌクレオチド配列を指す。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡにおいて、翻訳開始配列の上流に存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡへの一次転写物のプロセシング、ｍＲＮＡの安定性、または翻訳効率に影響し得る。５’非翻訳領域とも呼ばれる。翻訳リーダー配列の例が記載されている（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ，（１９９５）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３：２２５−２３６）。
【０１３２】
「３’非コード配列」、「転写ターミネーター」または「終止配列」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子の発現に影響を及ぼすことができる、調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸系の付加に影響することによって特徴付けられる。異なる３’非コード配列の使用は、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：６７１−６８０に例示されている。
【０１３３】
「ＲＮＡ転写物」は、ＲＮＡポリメラーゼにより触媒されるＤＮＡ配列の転写により得られる産物を指す。ＲＮＡ転写物が、ＤＮＡ配列の完全に相補的なコピーである場合、これは一次転写物またはプレｍＲＡと呼ばれる。ＲＮＡ転写物は、それが一次転写物プレｍＲＮＡｔの転写後のプロセシングで得られたＲＮＡである場合、成熟ＲＮＡまたはｍＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」は、イントロンを有しておらず、細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ鋳型に相補的であり、かつ逆転写酵素を使用してｍＲＮＡ鋳型から合成されるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは単鎖であってよく、あるいはＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片を使用して、二本鎖形態に変換することができる。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含むＲＮＡ転写物を指し、細胞内またはインビトロでタンパク質に翻訳され得る。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に対して相補的であり、かつ標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（例えば米国特許第５，１０７，０６５号明細書を参照）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物の任意の部分、すなわち５’末端非コーディング配列、３’末端非コーディング配列、イントロンまたはコーディング配列との相補性であり得る。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたはポリペプチドに翻訳され得ないがそれにもかかわらず細胞内プロセスに影響を及ぼすその他のＲＮＡを指す。用語「相補体」および「逆相補体」はｍＲＮＡ転写物に関して本明細書において互換的に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを定義することが意図されている。
【０１３４】
本明細書で使用する場合、「作動可能に結合される」という用語は、一方の機能が他方により調節されるような、単一の核酸断片上の核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現を調節することができる場合には、このコード配列に作動可能に連結されている（すなわち、このコード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向に、作動可能に調節配列と結合することができる。別の例では、相補的ＲＮＡ領域は、直接または間接的に、標的ｍＲＮＡの５’末端、もしくは標的ｍＲＮＡの３’末端と、または標的ｍＲＮＡ内で作動可能に結合することができるか、あるいは最初の相補的領域は５’末端であり、その相補体は標的ｍＲＮＡの３’末端である。
【０１３５】
本明細書で使用される、標準の遺伝子組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野ではよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）に、より詳しく説明されている。形質転換法は当業者にはよく知られており、以下で説明する。
【０１３６】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は特定のＤＮＡセグメントの合成技術であり、一連の反復的な変性サイクル、アニーリングサイクルおよび伸長サイクルからなる。通常、二本鎖ＤＮＡは熱変性を起こし、標的セグメントの３’末端バウンダリーに相補的な２つのプライマーが低い温度でＤＮＡにアニーリングされ、その後、中間温度で伸長する。これら３つの連続した工程の１セットを「サイクル」と呼ぶ。
【０１３７】
用語「組み換え」は、例えば化学合成による、または、遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの操作による、配列の２つの、通常であれば分離しているセグメントの人工的な結合を指す。
【０１３８】
用語「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」は、細胞の中央代謝の一部でない遺伝子をしばしば運ぶ、追加の染色体要素を指し、通常、二本鎖ＤＮＡの形態をとる。そのような要素は、多くのヌクレオチド配列が、目的のポリヌクレオチドを細胞に導入することができる固有の構築物に連結されている、または組み換えられている任意の起源に由来する、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの、線状のまたは環状の、自律的に複製する配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であることができる。「形質転換カセット」は、遺伝子を含み、かつ、遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、遺伝子を含み、かつ、遺伝子に加えて、宿主にその遺伝子を発現させることのできる要素を有する特定のベクターを指す。
【０１３９】
用語「組み換えＤＮＡ分子」、「組み換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「コンストラクト」、「コンストラクト」および「組み換えＤＮＡコンストラクト」は、本明細書では互換的に使用される。組み換えコンストラクトは、自然界では一緒に見出されるとは限らない、核酸断片、例えば、調節配列およびコード配列の人工的な組み合わせを含む。例えば、コンストラクトは、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列を含み得るか、または同一起源に由来するが、自然界に見出されるのとは異なる方法で配列された調節配列およびコーディング配列を含み得る。そのようなコンストラクトは、それだけで使用し得るか、またはベクターと共に使用し得る。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者にはよく知られているように、宿主細胞を形質転換するために使用する方法に依存する。例えばプラスミドベクターを使用することができる。熟練した職人は、宿主細胞を成功裡に形質転換し、選択し、そして増殖させるために、ベクター上に存在しなければならない遺伝要素をよく知っている。熟練した職人は、また、異なる、独立した形質転換イベントは、異なる発現レベルとパターンをもたらすこと（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ  ４：２４１１−２４１８；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８−８６）、したがって、所望の発現レベルとパターンを示す系統を得るためには、多重イベントは通常スクリーニングされることも認識するであろう。そのようなスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、ＰＣＲ、実時間定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、タンパク質発現の免疫ブロッティング、酵素もしくは活性分析、および／または表現型分析を含む、標準の分子生物学的、生化学的および他の分析法により行い得る。
【０１４０】
用語「発現」は、本明細書で使用する場合、前駆体または成熟型のいずれかの形態の機能的最終産物（例えばｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡまたはタンパク質）の産生を指す。
【０１４１】
用語「提供」は、核酸（例えば発現コンストラクト）、またはペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質を細胞に提供することを含む。提供は、核酸またはポリペプチドの、真核生物または原核生物の細胞中への組み込みであって、核酸が細胞のゲノム中に組み込まれ得る組み込みへの言及を含み、そして核酸またはタンパク質の、細胞への一過性の提供への言及を含む。提供は、安定した、または一過性の形質転換法、形質移入、形質導入、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ウィルス法、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属媒介形質転換、弾道粒子加速、および有性交雑への言及を含む。ゆえに、核酸断片（例えば、組み換えＤＮＡコンストラクト／発現コンストラクト、ガイドＲＮＡ、ガイドＤＮＡ、鋳型ＤＮＡ、ドナーＤＮＡ）を細胞中に挿入するという文脈での「提供」は、「形質移入」、「形質転換」、または「形質導入」を含み、そして真核または原核細胞の細胞中への核酸断片の組み込みへの言及を含み、ここで核酸断片は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアＤＮＡ）中に組み込まれてもよいし、自律性レプリコンに変換されてもよいし、一時的に発現されてもよい（例えば、形質移入されるｍＲＮＡ）。
【０１４２】
組成物（例えばヌクレオチド配列、ペプチド、またはポリペプチド）を生物に接触させ、提供し、かつ／または導入する種々の方法が知られており、安定形質転換法、一過性形質転換法、ウィルス媒介法、有性交雑、および有性育種が挙げられる。安定形質転換は、導入されたポリヌクレオチドが、生物のゲノム中に組み込まれて、その後代によって遺伝され得ることを示す。一過性形質転換は、導入された組成物が、生物中で一時的にしか発現されない、または存在しないことを示す。
【０１４３】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの細胞または生命体への接触、提供、導入のためのプロトコルは知られており、マイクロインジェクション法（Ｃｒｏｓｓｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：３２０−３４および米国特許第６，３００，５４３号明細書）、分裂組織形質転換法（米国特許第５，７３６，３６９号明細書）、エレクトロポレーション法（Ｒｉｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５６０２−６、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属媒介形質転換法（米国特許第５，５６３，０５５号明細書および同第５，９８１，８４０号明細書）、遺伝子直接導入法（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯＪ３：２７１７−２２）および弾道粒子加速法（米国特許第４，９４５，０５０号明細書；同第５，８７９，９１８号明細書；同第５，８８６，２４４号明細書；同第５，９３２，７８２号明細書；Ｔｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）”Ｄｉｒｅｃｔ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｉｎｔａｃｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ”  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．Ｇａｍｂｏｒｇ  ＆  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；ＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−６；Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ２２：４２１−７７；Ｓａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：２７−３７（ｏｎｉｏｎ）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８７：６７１−４（ｓｏｙｂｅａｎ）；Ｆｉｎｅｒ  ａｎｄ  ＭｃＭｕｌｌｅｎ，（１９９１）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２７Ｐ：１７５−８２（ｓｏｙｂｅａｎ）；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ，（１９９８）Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  ９６：３１９−２４（ｓｏｙｂｅａｎ）；Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：７３６−４０（ｒｉｃｅ）；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３０５−９（トウモロコシ）；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：５５９−６３（トウモロコシ）；米国特許第５，２４０，８５５号明細書；同第５，３２２，７８３号明細書および同第５，３２４，６４６号明細書；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ９１：４４０−４（トウモロコシ）；Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３−９（トウモロコシ）；Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ  Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１１：７６３−４；米国特許第５，７３６，３６９号明細書（穀草類）；Ｂｙｔｅｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ���．ＵＳＡ  ８４：５３４５−９（ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ））；Ｄｅ  Ｗｅｔ  ｅｔ  ａｌ，（１９８５）ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｖｕｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，ｅｄ．Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｌｏｎｇｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．１９７−２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ９：４１５−８）およびＫａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  ８４：５６０−６（ウィスカー媒介形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ４：１４９５−５０５（エレクトロポレーション）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  １２：２５０−５；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ａｎｄ  Ｆｏｒｄ（１９９５）Ａｎｎａｌｓ  Ｂｏｔａｎｙ  ７５：４０７−１３（コメ）ならびにＯｓｊｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：７４５−５０（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）経由トウモロコシ）が含まれる。
【０１４４】
あるいは、ポリヌクレオチドは、細胞または生命体とウィルスまたはウィルス性核酸とを接触させることにより、細胞または生命体に導入され得る。一般に、そうした方法は、ポリヌクレオチドをウィルス性ＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に組み込むことを含む。いくつかの実施例では、目的のポリペプチドは、最初、ウィルス性ポリタンパク質の一部として合成され、これは、後でインビボまたはインビトロのタンパク質分解処理を受けて、所望の組み換えタンパク質を生成し得る。ウィルス性ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含む、ポリヌクレオチドを植物体に導入し、そこにコードされているタンパク質を発現させる方法は知られており、例えば、米国特許第５，８８９，１９１号明細書、同第５，８８９，１９０号明細書、同第５，８６６，７８５号明細書、同第５，５８９，３６７号明細書および同第５，３１６，９３１号明細書を参照されたい。一過性形質転換法は、限定はされないが、二本鎖切断誘発剤などのポリペプチドの生命体への直接導入、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドの導入、および二本鎖切断誘発剤をコードするｍＲＮＡなどのＲＮＡ転写物の生命体への導入を含む。そのような方法は、例えば、マイクロインジェクション法または粒子撃ち込み法を含む。例えば、Ｃｒｏｓｓｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２０２：１７９−８５；Ｎｏｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ４４：５３−８；Ｈｅｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２１７６−８０；およびＨｕｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １０７：７７５−８４を参照されたい。
【０１４５】
ガイドされたＣａｓシステムの、いずれかのまたは全ての構成要素（タンパク質および／または核酸）の摂取を容易にする分子を使用する方法、例えば細胞貫通ペプチドおよびナノキャリアを含む任意の方法で、核酸およびタンパク質を、細胞に提供することができる。米国特許出願公開第２０１１／００３５８３６号明細書  Ｎａｎｏｃａｒｉｅｒ  ｂａｓｅｄ  ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ、および欧州特許出願公開第２８２１４８６Ａ１号明細書Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ（参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
【０１４６】
細胞へのガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の提供は、細胞への前記複合体の個々の構成要素の直接的な、または組み換えコンストラクトを介した提供を含み、そして細胞への複合体全体の同様の提供を含む。
【０１４７】
「安定な形質転換」は、核酸断片が、核ゲノムおよび細胞小器官ゲノムの両者を含む、宿主生命体のゲノムへ移動し、遺伝子的に安定な継承をもたらすことを指す。対照的に「一過性形質転換」は、核酸断片が、宿主生命体の核または他のＤＮＡ含有細胞小器官へ移動し、組み込まれることなく、あるいは安定に継承されずに発現することを指す。形質転換された核酸断片を含む宿主生命体を「トランスジェニック」生命体と称する。
【０１４８】
用語「細胞」は、本明細書中で、あらゆるタイプの細胞、例えば原核生物または真核生物の細胞を指す。真核生物の細胞は、核および他の膜包囲構造（細胞小器官）を有するが、原核生物の細胞は、核を欠く。特定の実施形態における細胞は、哺乳動物細胞であっても非哺乳動物細胞であってもよい。非哺乳動物細胞は、真核生物の細胞であっても原核生物の細胞であってもよい。例えば、非哺乳動物細胞は、本明細書中で、微生物の細胞、または非哺乳動物多細胞生物、例えば植物、昆虫、線虫、鳥類種、両生類、爬虫類もしくは魚類の細胞を指し得る。
【０１４９】
用語「対照細胞」および「適切な対照細胞」は、本明細書中で互換的に用いられて、特定の改変（例えば、ポリヌクレオチドの過剰発現、ポリヌクレオチドのダウンレギュレーション）がなされる細胞（すなわち「実験細胞」）に対して言及され得る。対照細胞は、実験細胞の特定の改変を有してもいないし発現もしないあらゆる細胞であってよい。ゆえに、対照細胞は、非形質転換野生型細胞であってもよいし、遺伝的に形質転換されていてもよいが、遺伝的形質転換を発現しない。例えば、対照細胞は、実験細胞の直接の親であってよく、この直接の親細胞は、実験細胞中に存在する特定の改変を有していない。これ以外にも、対照細胞は、一世代以上によって除去される実験細胞の親であってもよい。これ以外にも、対照細胞は、実験細胞のきょうだいであってもよく、このきょうだいは、実験細胞中に存在する特定の改変を含まない。
【０１５０】
微生物細胞は、本明細書中で、例えば、真菌細胞（例えば酵母細胞）、原核生物細胞、原生生物細胞（例えば藻類細胞）、ユーグレナ細胞、ストラメノパイル細胞、または卵菌綱細胞を指し得る。原核生物細胞は、本明細書中で、例えば、細菌細胞または古細菌細胞を指し得る。真菌細胞（例えば酵母細胞）、原生生物細胞（例えば藻類細胞）、ユーグレナ細胞、ストラメノパイル細胞、および卵菌綱細胞は、真核生物の微生物細胞の例を示す。真核生物の微生物細胞は、核および他の膜包囲構造（細胞小器官）を有するが、原核生物の細胞は、核を欠く。
【０１５１】
用語「酵母」は、本明細書中で、単細胞の形態で主に存在する真菌種を指す。酵母は代わりに「酵母細胞」と呼ばれ得る。特定の態様の酵母は、本明細書中で、無性生殖（アナモルフィック）または有性生殖（テレオモルフィック）で繁殖する酵母であってよい。酵母は、本明細書中で典型的に、単細胞の形態で存在する一方、当該酵母の特定のタイプは、場合によっては、偽菌糸（連結された出芽性細胞のストリング）を形成することができる。さらなる態様において、酵母は、半数体であっても二倍体であってもよく、かつ／またはこれらの倍数性形態のいずれでも存在する能力を有してもよい。酵母は、本明細書中で、例えば、従来型酵母または非従来型酵母のいずれかとして特徴付けられ得る。
【０１５２】
用語「従来型酵母」（「モデル酵母」）は、本明細書中で、一般にサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属またはシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母種を指す。従来型酵母として、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって媒介される修復プロセスよりも、相同組み換え（ＨＲ）ＤＮＡ修復プロセスを優先する酵母が挙げられる。従来型酵母の例として、本明細書中で、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の種（例えば、出芽酵母、パン酵母、および／または醸造酵母としても知られているサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；サッカロミセス・バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）；サッカロミセス・ボウラルディイ（Ｓ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）；サッカロミセス・ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）；サッカロミセス・カリオカヌス（Ｓ．ｃａｒｉｏｃａｎｕｓ）；サッカロミセス・カリオカス（Ｓ．ｃａｒｉｏｃｕｓ）；サッカロミセス・チェバリエリ（Ｓ．ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）；サッカロミセス・ダイレネンシス（Ｓ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）；サッカロミセス・エリプソイデウス（Ｓ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）；サッカロミセス・ユーバヤヌス（Ｓ．ｅｕｂａｙａｎｕｓ）；サッカロミセス・エクシグウス（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）；サッカロミセス・フロレンティヌス（Ｓ．ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ）；サッカロミセス・クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）；サッカロミセス・マティニアエ（Ｓ．ｍａｒｔｉｎｉａｅ）；サッカロミセス・モナケンシス（Ｓ．ｍｏｎａｃｅｎｓｉｓ）；サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓ．ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）；サッカロミセス・パラドクスス（Ｓ．ｐａｒａｄｏｘｕｓ）；サッカロミセス・パストリアヌス（Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）；サッカロミセス・スペンケロルム（Ｓ．ｓｐｅｎｃｅｒｏｒｕｍ）；サッカロミセス・トゥリセンシス（Ｓ．ｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ）；サッカロミセス・ウニスポルス（Ｓ．ｕｎｉｓｐｏｒｕｓ）；サッカロミセス・ウバルム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）；サッカロミセス・ゾナツス（Ｓ．ｚｏｎａｔｕｓ））、およびシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の種（例えば、分裂酵母としても知られているシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）；シゾサッカロミセス・クリオフィルス（Ｓ．ｃｒｙｏｐｈｉｌｕｓ）；シゾサッカロミセス・ジャポニクス（Ｓ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）；シゾサッカロミセス・オクトスポルス（Ｓ．ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ））が挙げられる。
【０１５３】
用語「非従来型酵母」は、本明細書中で、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母種（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））またはシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母種ではないあらゆる酵母を指す。非従来型酵母は、Ｎｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ．Ｗｏｌｆ，Ｋ．Ｄ．Ｂｒｅｕｎｉｇ，Ｇ．Ｂａｒｔｈ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００３）に記載されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。特定の実施形態における非従来型酵母は、追加的に（または代わりに）、相同組み換え（ＨＲ）によって媒介される修復プロセスよりも、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復プロセスを優先する酵母であってよい。
【０１５４】
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）等の従来型酵母は、典型的に、ドナーＤＮＡの、短いフランキング相同アーム（３０〜５０ｂｐ）との特異的な統合を示し、効率はルーチン的に７０％を超える。一方、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、およびクルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）等の非従来型酵母は、通常、類似した構造のドナーＤＮＡとの特異的な統合を示し、効率は１％未満である（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８：ｅ５７９５２）。ゆえに、ＨＲプロセスの優先度が、例えば、酵母を適切なドナーＤＮＡで形質転換して、ドナーＤＮＡによって標的とされると予測されるゲノム部位と特異的に組み換えられる程度を判定することによって、評価され得る。そのようなアッセイにより、酵母ゲノムにおけるドナーＤＮＡのランダムな統合の程度が高いならば、例えば、ＮＨＥＪの優先度が明らかであろう（すなわちＨＲの優先度が低い）。酵母におけるＤＮＡの特異的な（ＨＲ媒介）、かつ／またはランダムな（ＮＨＥＪ媒介）統合の割合を判定するアッセイが、当該技術において知られている（例えば、Ｆｅｒｒｅｉｒａ  ａｎｄ  Ｃｏｏｐｅｒ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１８：２２４９−２２５４；Ｃｏｒｒｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８：ｅ６９６２８；Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：６３５４−６３５８；Ｋｅｅｎｅｙ  ａｎｄ  Ｂｏｅｋｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３６：８４９−８５６）。
【０１５５】
ＨＲ活性の低いレベルを考えると、本明細書中の非従来型酵母は、（ｉ）３０〜５０ｂｐのフランキング相同アームを有する適切なドナーＤＮＡによる特異的なターゲティング率が、例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、もしくは８％未満であることを示し得、かつ／または（ｉｉ）前述のドナーＤＮＡのランダムな統合率が、例えば、約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、もしくは７５％超であることを示し得る。適切なドナーＤＮＡのこれらの（ｉ）特異的なターゲティング率、および／または（ｉｉ）ランダムな統合率は、非従来型酵母を特徴付けることができる。というのも、本明細書中に開示されるＲＧＥＮが提供されるよりも前から存在するためである。特定の実施形態においてＲＧＥＮを非従来型酵母に提供する目的は、特定の部位にて酵母をＨＲに偏らせるための部位特異的ＤＮＡ一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせることである。ゆえに、非従来型酵母において適切なＲＧＥＮを提供することで、典型的に、酵母は、特定のドナーＤＮＡとのＨＲ率の増大を示すことができるはずである。そのような率の増大は、適切な対照（例えば、適切なＲＧＥＮを欠く以外は同じドナーＤＮＡで形質転換された同じ非従来型酵母）のＨＲ率よりも少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍高くなり得る。
【０１５６】
非従来型酵母は、本明細書中で、当該技術において知られるあらゆる手段に従って培養されてよく、例えば、Ｎｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ．Ｗｏｌｆ，Ｋ．Ｄ．Ｂｒｅｕｎｉｇ，Ｇ．Ｂａｒｔｈ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００３）、Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｈａｂｉｔａｔｓ（Ｊ．Ｆ．Ｔ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９７）、および／またはＹｅａｓｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｔ．Ｓａｔｙａｎａｒａｙａｎａ，Ｇ．Ｋｕｎｚｅ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００９）に記載されており、これらの文献は全て、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１５７】
本明細書中の非従来型酵母の非限定的な例として、以下の属の酵母が挙げられる：ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、パキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属、およびモニリエラ（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ）属。ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属種の適切な例として、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）がある。ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属種の適切な例として、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・スティピティス（Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ピキア・アノマーラ（Ｐ．ａｎｏｍａｌａ）、およびピキア・アングスタ（Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ）が挙げられる。シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属種の適切な例として、シュワニオミセス・カステリィ（Ｓ．ｃａｓｔｅｌｌｉｉ）、シュワニオミセス・アルビウス（Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ）、シュワニオミセス・ホミニス（Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、シュワニオミセス・オキシデンタリス（Ｓ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、シュワニオミセス・カプリオッティ（Ｓ．ｃａｐｒｉｏｔｔｉｉ）、シュワニオミセス・エチェルシィ（Ｓ．ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ）、シュワニオミセス・ポリモルファス（Ｓ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ）、シュワニオミセス・シュードポリモルファス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ）、シュワニオミセス・バンリジエ（Ｓ．ｖａｎｒｉｊｉａｅ）、およびシュワニオミセス・ヤマダエ（Ｓ．ｙａｍａｄａｅ）が挙げられる。クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属種の適切な例として、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイベロミセス・フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロミセス・ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）、クルイベロミセス・サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、クルイベロミセス・ファゼオロスポラス（Ｋ．ｐｈａｓｅｏｌｏｓｐｏｒｕｓ）、クルイベロミセス・バヌデニィ（Ｋ．ｖａｎｕｄｅｎｉｉ）、クルイベロミセス・ワルティ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）、クルイベロミセス・アフリカヌス（Ｋ．ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、およびクルイベロミセス・ポリスポラス（Ｋ．ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｓ）が挙げられる。アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属種の適切な例として、アルクスラ・アデニニボランス（Ａ．ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）およびアルクスラ・テレストレ（Ａ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｅ）が挙げられる。トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属種の適切な例として、トリコスポロン・クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、トリコスポロン・キャピタトゥム（Ｔ．ｃａｐｉｔａｔｕｍ）、トリコスポロン・インキン（Ｔ．ｉｎｋｉｎ）、およびトリコスポロン・ビーメリ（Ｔ．ｂｅｅｍｅｒｉ）が挙げられる。カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属種の適切な例として、カンディダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンディダ・アスカラフィダルム（Ｃ．ａｓｃａｌａｐｈｉｄａｒｕｍ）、カンディダ・アムフィキシエ（Ｃ．ａｍｐｈｉｘｉａｅ）、カンディダ・アンタークティカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、カンディダ・アピコーラ（Ｃ．ａｐｉｃｏｌａ）、カンディダ・アルゲンティア（Ｃ．ａｒｇｅｎｔｅａ）、カンディダ・アトランティカ（Ｃ．ａｔｌａｎｔｉｃａ）、カンディダ・アトモスファェリカ（Ｃ．ａｔｍｏｓｐｈａｅｒｉｃａ）、カンディダ・ブラッテ（Ｃ．ｂｌａｔｔａｅ）、カンディダ・ブロメリアセアルム（Ｃ．ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｒｕｍ）、カンディダ・カルポフィラ（Ｃ．ｃａｒｐｏｐｈｉｌａ）、カンディダ・カルバジャリス（Ｃ．ｃａｒｖａｊａｌｉｓ）、カンディダ・セラムビシダルム（Ｃ．ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｒｕｍ）、カンディダ・チャウリオデス（Ｃ．ｃｈａｕｌｉｏｄｅｓ）、カンディダ・コリダリ（Ｃ．ｃｏｒｙｄａｌｉ）、カンディダ・ドッセイ（Ｃ．ｄｏｓｓｅｙｉ）、カンディダ・デュブリニエンシス（Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、カンディダ・エルガテンシス（Ｃ．ｅｒｇａｔｅｎｓｉｓ）、カンディダ・フルクトゥス（Ｃ．ｆｒｕｃｔｕｓ）、カンディダ・グラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）、カンディダ・フェルメンタティ（Ｃ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、カンディダ・ギリエルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンディダ・ハエムロニィ（Ｃ．ｈａｅｍｕｌｏｎｉｉ）、カンディダ・インセクタメンス（Ｃ．ｉｎｓｅｃｔａｍｅｎｓ）、カンディダ・インセクトルム（Ｃ．ｉｎｓｅｃｔｏｒｕｍ）、カンディダ・インテルメディア（Ｃ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、カンディダ・イェフレシィ（Ｃ．ｊｅｆｆｒｅｓｉｉ）、カンディダ・ケフィア（Ｃ．ｋｅｆｙｒ）、カンディダ・ケロセニエ（Ｃ．ｋｅｒｏｓｅｎｅａｅ）、カンディダ・クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、カンディダ・ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンディダ・リキソソフィラ（Ｃ．ｌｙｘｏｓｏｐｈｉｌａ）、カンディダ・マルトーサ（Ｃ．ｍａｌｔｏｓａ）、カンディダ・マリーナ（Ｃ．ｍａｒｉｎａ）、カンディダ・メンブラニファシエンス（Ｃ．ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、カンディダ・ミレリ（Ｃ．ｍｉｌｌｅｒｉ）、カンディダ・モギィ（Ｃ．ｍｏｇｉｉ）、カンディダ・オレオフィラ（Ｃ．ｏｌｅｏｐｈｉｌａ）、カンディダ・オレゴネンシス（Ｃ．ｏｒｅｇｏｎｅｎｓｉｓ）、カンディダ・パラシローシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンディダ・クエルシトルーサ（Ｃ．ｑｕｅｒｃｉｔｒｕｓａ）、カンディダ・ルゴサ（Ｃ．ｒｕｇｏｓａ）、カンディダ・サケ（Ｃ．ｓａｋｅ）、カンディダ・シェハテア（Ｃ．ｓｈｅｈａｔｅａ）、カンディダ・テムノキラエ（Ｃ．ｔｅｍｎｏｃｈｉｌａｅ）、カンディダ・テヌイス（Ｃ．ｔｅｎｕｉｓ）、カンディダ・テアエ（Ｃ．ｔｈｅａｅ）、カンディダ・トレランス（Ｃ．ｔｏｌｅｒａｎｓ）、カンディダ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンディダ・ツチヤエ（Ｃ．ｔｓｕｃｈｉｙａｅ）、カンディダ・シノラボランティウム（Ｃ．ｓｉｎｏｌａｂｏｒａｎｔｉｕｍ）、カンディダ・ソーヤ（Ｃ．ｓｏｊａｅ）、カンディダ・サブハシィ（Ｃ．ｓｕｂｈａｓｈｉｉ）、カンディダ・ビスワナシィ（Ｃ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）、カンディダ・ユティリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、カンディダ・ウバトゥベンシス（Ｃ．ｕｂａｔｕｂｅｎｓｉｓ）、およびカンディダ・ゼプリニナ（Ｃ．ｚｅｍｐｌｉｎｉｎａ）が挙げられる。ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属種の適切な例として、ウスティラゴ・アヴェナエ（Ｕ．ａｖｅｎａｅ）、ウスティラゴ・エスクレンタ（Ｕ．ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、ウスティラゴ・ホルデイ（Ｕ．ｈｏｒｄｅｉ）、ウスティラゴ・マイジス（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）、ウスティラゴ・ヌーダ（Ｕ．ｎｕｄａ）、およびウスティラゴ・トリティク（Ｕ．ｔｒｉｔｉｃ）が挙げられる。トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属種の適切な例として、トルロプシス・ゲオチャレス（Ｔ．ｇｅｏｃｈａｒｅｓ）、トルロプシス・アジマ（Ｔ．ａｚｙｍａ）、トルロプシス・グラブラータ（Ｔ．ｇｌａｂｒａｔａ）、およびトルロプシス・カンディダ（Ｔ．ｃａｎｄｉｄａ）が挙げられる。チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種の適切な例として、チゴサッカロミセス・バイリィ（Ｚ．ｂａｉｌｉｉ）、チゴサッカロミセス・ビスポラス（Ｚ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、チゴサッカロミセス・シドリ（Ｚ．ｃｉｄｒｉ）、チゴサッカロミセス・フェルメンタティ（Ｚ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、チゴサッカロミセス・フロレンティヌス（Ｚ．ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ）、チゴサッカロミセス・コンブチャエンシス（Ｚ．ｋｏｍｂｕｃｈａｅｎｓｉｓ）、チゴサッカロミセス・レントゥス（Ｚ．ｌｅｎｔｕｓ）、チゴサッカロミセス・メリス（Ｚ．ｍｅｌｌｉｓ）、チゴサッカロミセス・ミクロエリプソイデス（Ｚ．ｍｉｃｒｏｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｓ）、チゴサッカロミセス・ムラキィ（Ｚ．ｍｒａｋｉｉ）、チゴサッカロミセス・シュードルーキシィ（Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ）、およびチゴサッカロミセス・ルーキシィ（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）が挙げられる。トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属種の適切な例として、トリゴノプシス・バリアビリス（Ｔ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）が挙げられる。クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種の適切な例として、クリプトコッカス・ローレンティ（Ｃ．ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、クリプトコッカス・アルビダス（Ｃ．ａｌｂｉｄｕｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クリプトコッカス・ガッティ（Ｃ．ｇａｔｔｉｉ）、クリプトコッカス・ユニグトゥラトゥス（Ｃ．ｕｎｉｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ）、クリプトコッカス・アデリエンシス（Ｃ．ａｄｅｌｉｅｎｓｉｓ）、クリプトコッカス・アエリウス（Ｃ．ａｅｒｉｕｓ）、クリプトコッカス・アルビドシミリス（Ｃ．ａｌｂｉｄｏｓｉｍｉｌｉｓ）、クリプトコッカス・アンタルクティカス（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ）、クリプトコッカス・アクアティカス（Ｃ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、クリプトコッカス・アーテル（Ｃ．ａｔｅｒ）、クリプトコッカス・ブータネンシス（Ｃ．ｂｈｕｔａｎｅｎｓｉｓ）、クリプトコッカス・コンソルティオニス（Ｃ．ｃｏｎｓｏｒｔｉｏｎｉｓ）、クリプトコッカス・カルバトゥス（Ｃ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、クリプトコッカス・フェノリカス（Ｃ．ｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ）、クリプトコッカス・スキンネリ（Ｃ．ｓｋｉｎｎｅｒｉ）、クリプトコッカス・テレウス（Ｃ．ｔｅｒｒｅｕｓ）、およびクリプトコッカス・ビシュニアッシ（Ｃ．ｖｉｓｈｎｉａｃｃｉ）が挙げられる。ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属種の適切な例として、ロドトルラ・アケニオルム（Ｒ．ａｃｈｅｎｉｏｒｕｍ）、ロドトルラ・トゥラ（Ｒ．ｔｕｌａ）、ロドトルラ・アクタ（Ｒ．ａｃｕｔａ）、ロドトルラ・アメリカーナ（Ｒ．ａｍｅｒｉｃａｎａ）、ロドトルラ・アラウカリエ（Ｒ．ａｒａｕｃａｒｉａｅ）、ロドトルラ・アークティカ（Ｒ．ａｒｃｔｉｃａ）、ロドトルラ・アルメニアカ（Ｒ．ａｒｍｅｎｉａｃａ）、ロドトルラ・アウランティアカ（Ｒ．ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、ロドトルラ・アウリクラリエ（Ｒ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａｅ）、ロドトルラ・バカルム（Ｒ．ｂａｃａｒｕｍ）、ロドトルラ・ベンチカ（Ｒ．ｂｅｎｔｈｉｃａ）、ロドトルラ・ビオウルゲイ（Ｒ．ｂｉｏｕｒｇｅｉ）、ロドトルラ・ボゴリエンシス（Ｒ．ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ブロンキアリス（Ｒ．ｂｒｏｎｃｈｉａｌｉｓ）、ロドトルラ・ブフォニィ（Ｒ．ｂｕｆｆｏｎｉｉ）、ロドトルラ・カリプトゲナエ（Ｒ．ｃａｌｙｐｔｏｇｅｎａｅ）、ロドトルラ・チュングナメンシス（Ｒ．ｃｈｕｎｇｎａｍｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・クラディエンシス（Ｒ．ｃｌａｄｉｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・コラリナ（Ｒ．ｃｏｒａｌｌｉｎａ）、ロドトルラ・クレゾリカ（Ｒ．ｃｒｅｓｏｌｉｃａ）、ロドトルラ・クロセア（Ｒ．ｃｒｏｃｅａ）、ロドトルラ・シクロクラスティカ（Ｒ．ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃａ）、ロドトルラ・ダイレネンシス（Ｒ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ディフルエンス（Ｒ．ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ）、ロドトルラ・エベルグラディエンシス（Ｒ．ｅｖｅｒｇｌａｄｉｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・フェルリカ（Ｒ．ｆｅｒｕｌｉｃａ）、ロドトルラ・
フォリオルム（Ｒ．ｆｏｌｉｏｒｕｍ）、ロドトルラ・フラガリア（Ｒ．ｆｒａｇａｒｉａ）、ロドトルラ・フジサネンシス（Ｒ．ｆｕｊｉｓａｎｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・フトロネンシス（Ｒ．ｆｕｔｒｏｎｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ゲラティノーサ（Ｒ．ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ）、ロドトルラ・グラシアリス（Ｒ．ｇｌａｃｉａｌｉｓ）、ロドトルラ・グルティニス（Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グラシリス（Ｒ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グリンベルグシィ（Ｒ．ｇｒｉｎｂｅｒｇｓｉｉ）、ロドトルラ・ヒマライエンシス（Ｒ．ｈｉｍａｌａｙｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ヒヌレア（Ｒ．ｈｉｎｎｕｌｅａ）、ロドトルラ・ヒストリティカ（Ｒ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ロドトルラ・ヒロフィラ（Ｒ．ｈｙｌｏｐｈｉｌａ）、ロドトルラ・インカルナタ（Ｒ．ｉｎｃａｒｎａｔａ）、ロドトルラ・インゲニオサ（Ｒ．ｉｎｇｅｎｉｏｓａ）、ロドトルラ・ジャバニカ（Ｒ．ｊａｖａｎｉｃａ）、ロドトルラ・コイシカウェンシス（Ｒ．ｋｏｉｓｈｉｋａｗｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ラクトーサ（Ｒ．ｌａｃｔｏｓａ）、ロドトルラ・ラメリブラキエ（Ｒ．ｌａｍｅｌｌｉｂｒａｃｈｉａｅ）、ロドトルラ・ラリンギス（Ｒ．ｌａｒｙｎｇｉｓ）、ロドトルラ・リグノフィラ（Ｒ．ｌｉｇｎｏｐｈｉｌａ）、ロドトルラ・リニ（Ｒ．ｌｉｎｉ）、ロドトルラ・ロンギッシマ（Ｒ．ｌｏｎｇｉｓｓｉｍａ）、ロドトルラ・ルドウィギィ（Ｒ．ｌｕｄｗｉｇｉｉ）、ロドトルラ・リシノフィラ（Ｒ．ｌｙｓｉｎｏｐｈｉｌａ）、ロドトルラ・マリーナ（Ｒ．ｍａｒｉｎａ）、ロドトルラ・マルチニエ−フラガンティス（Ｒ．ｍａｒｔｙｎｉａｅ−ｆｒａｇａｎｔｉｓ）、ロドトルラ・マトリテンシス（Ｒ．ｍａｔｒｉｔｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・メリ（Ｒ．ｍｅｌｉ）、ロドトルラ・ミヌタ（Ｒ．ｍｉｎｕｔａ）、ロドトルラ・ムシラギノーサ（Ｒ．ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、ロドトルラ・ニテンス（Ｒ．ｎｉｔｅｎｓ）、ロドトルラ・ノトファギ（Ｒ．ｎｏｔｈｏｆａｇｉ）、ロドトルラ・オリザエ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）、ロドトルラ・パシフィカ（Ｒ．ｐａｃｉｆｉｃａ）、ロドトルラ・パリダ（Ｒ．ｐａｌｌｉｄａ）、ロドトルラ・ペネウス（Ｒ．ｐｅｎｅａｕｓ）、ロドトルラ・フィリラ（Ｒ．ｐｈｉｌｙｌａ）、ロドトルラ・フィロプラナ（Ｒ．ｐｈｙｌｌｏｐｌａｎａ）、ロドトルラ・ピラティ（Ｒ．ｐｉｌａｔｉｉ）、ロドトルラ・ピリマネ（Ｒ．ｐｉｌｉｍａｎａｅ）、ロドトルラ・ピニコラ（Ｒ．ｐｉｎｉｃｏｌａ）、ロドトルラ・ピリカタ（Ｒ．ｐｌｉｃａｔａ）、ロドトルラ・ポリモルファ（Ｒ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ロドトルラ・シクロフェノリカ（Ｒ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃａ）、ロドトルラ・シクロフィラ（Ｒ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ）、ロドトルラ・パストゥラ（Ｒ．ｐｕｓｔｕｌａ）、ロドトルラ・レティノフィラ（Ｒ．ｒｅｔｉｎｏｐｈｉｌａ）、ロドトルラ・ロザケア（Ｒ．ｒｏｓａｃｅａ）、ロドトルラ・ロスラータ（Ｒ．ｒｏｓｕｌａｔａ）、ロドトルラ・ルベファシエンス（Ｒ．ｒｕｂｅｆａｃｉｅｎｓ）、ロドトルラ・ルベラ（Ｒ．ｒｕｂｅｌｌａ）、ロドトルラ・ルベスセンス（Ｒ．ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）、ロドトルラ・ルブラ（Ｒ．ｒｕｂｒａ）、ロドトルラ・ルブロルゴサ（Ｒ．ｒｕｂｒｏｒｕｇｏｓａ）、ロドトルラ・ルフラ（Ｒ．ｒｕｆｕｌａ）、ロドトルラ・ルティラ（Ｒ．ｒｕｔｉｌａ）、ロドトルラ・サングイネア（Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅａ）、ロドトルラ・サニエイ（Ｒ．ｓａｎｎｉｅｉ）、ロドトルラ・サルトリィ（Ｒ．ｓａｒｔｏｒｙｉ）、ロドトルラ・シルベストリス（Ｒ．ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ）、ロドトルラ・シンプレックス（Ｒ．ｓｉｍｐｌｅｘ）、ロドトルラ・シネンシス（Ｒ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・スルーフィエ（Ｒ．ｓｌｏｏｆｆｉａｅ）、ロドトルラ・ソンクキィ（Ｒ．ｓｏｎｃｋｉｉ）、ロドトルラ・ストラミネア（Ｒ．ｓｔｒａｍｉｎｅａ）、ロドトルラ・スベリコラ（Ｒ．ｓｕｂｅｒｉｃｏｌａ）、ロドトルラ・スガニィ（Ｒ．ｓｕｇａｎｉｉ）、ロドトルラ・タイワネンシス（Ｒ．ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・タイワニアナ（Ｒ．ｔａｉｗａｎｉａｎａ）、ロドトルラ・テルペノイダリス（Ｒ．ｔｅｒｐｅｎｏｉｄａｌｉｓ）、ロドトルラ・テッレア（Ｒ．ｔｅｒｒｅａ）、ロドトルラ・テキセンシス（Ｒ．ｔｅｘｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・トキョエンシス（Ｒ．ｔｏｋｙｏｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ウルザメ（Ｒ．ｕｌｚａｍａｅ）、ロドトルラ・バニリカ（Ｒ．ｖａｎｉｌｌｉｃａ）、ロドトルラ・ブイレミニィ（Ｒ．ｖｕｉｌｌｅｍｉｎｉｉ）、ロドトルラ・ヤロウィ（Ｒ．ｙａｒｒｏｗｉｉ）、ロドトルラ・ユナネンシス（Ｒ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）、およびロドトルラ・ゾルティ（Ｒ．ｚｓｏｌｔｉｉ）が挙げられる。ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属種の適切な例として、ファフィア・ロドジマ（Ｐ．ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）が挙げられる。スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属種の適切な例として、スポロボロミセス・アルボルベスセンス（Ｓ．ａｌｂｏｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）、スポロボロミセス・バナエンシス（Ｓ．ｂａｎｎａｅｎｓｉｓ）、スポロボロミセス・ベイジンゲンシス（Ｓ．ｂｅｉｊｉｎｇｅｎｓｉｓ）、スポロボロミセス・ビスフォフィエ（Ｓ．ｂｉｓｃｈｏｆｉａｅ）、スポロボロミセス・クラバトゥス（Ｓ．ｃｌａｖａｔｕｓ）、スポロボロミセス・コプロスメ（Ｓ．ｃｏｐｒｏｓｍａｅ）、スポロボロミセス・コプロスミコーラ（Ｓ．ｃｏｐｒｏｓｍｉｃｏｌａ）、スポロボロミセス・コラリヌス（Ｓ．ｃｏｒａｌｌｉｎｕｓ）、スポロボロミセス・ディメネ（Ｓ．ｄｉｍｍｅｎａｅ）、スポロボロミセス・ドラコフィリィ（Ｓ．ｄｒａｃｏｐｈｙｌｌｉ）、スポロボロミセス・エロンガトゥス（Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、スポロボロミセス・グラシリス（Ｓ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、スポロボロミセス・イノシトフィルス（Ｓ．ｉｎｏｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ）、スポロボロミセス・ジョンソニィ（Ｓ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、スポロボロミセス・コアラエ（Ｓ．ｋｏａｌａｅ）、スポロボロミセス・マグニスポラス（Ｓ．ｍａｇｎｉｓｐｏｒｕｓ）、スポロボロミセス・ノボゼアランディカス（Ｓ．ｎｏｖｏｚｅａｌａｎｄｉｃｕｓ）、スポロボロミセス・オドラス（Ｓ．ｏｄｏｒｕｓ）、スポロボロミセス・パタゴニカス（Ｓ．ｐａｔａｇｏｎｉｃｕｓ）、スポロボロミセス・プロダクトゥス（Ｓ．ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ）、スポロボロミセス・ロセウス（Ｓ．ｒｏｓｅｕｓ）、スポロボロミセス・サシコーラ（Ｓ．ｓａｓｉｃｏｌａ）、スポロボロミセス・シバタヌス（Ｓ．ｓｈｉｂａｔａｎｕｓ）、スポロボロミセス・シンギュラリス（Ｓ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）、スポロボロミセス・スブルンネウス（Ｓ．ｓｕｂｂｒｕｎｎｅｕｓ）、スポロボロミセス・シンメトリカス（Ｓ．ｓｙｍｍｅｔｒｉｃｕｓ）、スポロボロミセス・シジギィ（Ｓ．ｓｙｚｙｇｉｉ）、スポロボロミセス・タウポエンシス（Ｓ．ｔａｕｐｏｅｎｓｉｓ）、スポロボロミセス・ツガエ（Ｓ．ｔｓｕｇａｅ）、スポロボロミセス・キサンツス（Ｓ．ｘａｎｔｈｕｓ）、およびスポロボロミセス・ユナネンシス（Ｓ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）が挙げられる。パキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属種およびモニリエラ（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ）属種の適切な例としてそれぞれ、パキソレン・タノフィルス（Ｐ．ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）およびモニリエラ・ポリニス（Ｍ．ｐｏｌｌｉｎｉｓ）が挙げられる。本明細書中の非従来型酵母のさらに他の例として、シュードジーマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属種（例えばシュードジーマ・アンタルクティカ（Ｓ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ））、トドトルラ（Ｔｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属種（例えばトドトルラ・ボゴリエンシス（Ｔ．ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ））、ウィケルハミエラ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ）属種（例えばウィケルハミエラ・ドメルクキアエ（Ｗ．ｄｏｍｅｒｃｑｉａｅ））、およびスタルメレラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ）属種（例えばスタルメレラ・ボムビコラ（Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ））が挙げられる。
【０１５８】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が、本明細書中に開示される特定の実施形態において好ましい。適切なヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の例として、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能な以下の単離物が挙げられる：株名称ＡＴＣＣ＃２０３６２、＃８８６２、＃８６６１、＃８６６２、＃９７７３、＃１５５８６、＃１６６１７、＃１６６１８、＃１８９４２、＃１８９４３、＃１８９４４、＃１８９４５、＃２０１１４、＃２０１７７、＃２０１８２、＃２０２２５、＃２０２２６、＃２０２２８、＃２０３２７、＃２０２５５、＃２０２８７、＃２０２９７、＃２０３１５、＃２０３２０、＃２０３２４、＃２０３３６、＃２０３４１、＃２０３４６、＃２０３４８、＃２０３６３、＃２０３６４、＃２０３７２、＃２０３７３、＃２０３８３、＃２０３９０、＃２０４００、＃２０４６０、＃２０４６１、＃２０４６２、＃２０４９６、＃２０５１０、＃２０６２８、＃２０６８８、＃２０７７４、＃２０７７５、＃２０７７６、＃２０７７７、＃２０７７８、＃２０７７９、＃２０７８０、＃２０７８１、＃２０７９４、＃２０７９５、＃２０８７５、＃２０２４１、＃２０４２２、＃２０４２３、＃３２３３８、＃３２３３９、＃３２３４０、＃３２３４１、＃３４３４２、＃３２３４３、＃３２９３５、＃３４０１７、＃３４０１８、＃３４０８８、＃３４９２２、＃３４９２２、＃３８２９５、＃４２２８１、＃４４６０１、＃４６０２５、＃４６０２６、＃４６０２７、＃４６０２８、＃４６０６７、＃４６０６８、＃４６０６９、＃４６０７０、＃４６３３０、＃４６４８２、＃４６４８３、＃４６４８４、＃４６４３６、＃６０５９４、＃６２３８５、＃６４０４２、＃７４２３４、＃７６５９８、＃７６８６１、＃７６８６２、＃７６９８２、＃９０７１６、＃９０８１１、＃９０８１２、＃９０８１３、＃９０８１４、＃９０９０３、＃９０９０４、＃９０９０５、＃９６０２８、＃２０１２４１、＃２０１２４２、＃２０１２４３、＃２０１２４４、＃２０１２４５、＃２０１２４６、＃２０１２４７、＃２０１２４９、および／または＃２０１８４７。
【０１５９】
本明細書中の真菌細胞は、酵母（例えば、先に記載される）、または糸状菌等の他のあらゆる真菌型の細胞であってよい。例えば、本明細書中の真菌として、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、接合菌（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ツボカビ菌（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、または子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）があり得る。本明細書中の糸状菌の例として、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、ネウロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属（例えば、ネウロスポラ・クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）、ネウロスポラ・シトフィラ（Ｎ．ｓｉｔｏｐｈｉｌａ））、クリオネクトリア（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）属（例えばクリオネクトリア・パラシチカ（Ｃ．ｐａｒａｓｉｔｉｃａ））、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属（例えばアウレオバシジウム・プルランス（Ａ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ））、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）属、スキタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）属、スキゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属（例えば、ペニシリウム・ビライアエ（Ｐ．ｂｉｌａｉａｅ）、ペニシリウム・カメムベルチ（Ｐ．ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）、ペニシリウム・カンディドゥム（Ｐ．ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・エクスパンスム（Ｐ．ｅｘｐａｎｓｕｍ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐ．ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・グラウクム（Ｐ．ｇｌａｕｃｕｍ）、ペニシリウム・マルネフェイ（Ｐ．ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）、ペニシリウム・ロケフォルチ（Ｐ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、ペニシリウム・ベルコスム（Ｐ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）、ペニシリウム・ヴリジカツム（Ｐ．ｖｉｒｉｄｉｃａｔｕｍ））、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属（例えば、ギベレラ・アクミナタ（Ｇ．ａｃｕｍｉｎａｔａ）、ギベレラ・アベナケア（Ｇ．ａｖｅｎａｃｅａ）、ギベレラ・バカタ（Ｇ．ｂａｃｃａｔａ）、ギベレラ・キルキナタ（Ｇ．ｃｉｒｃｉｎａｔａ）、ギベレラ・シアノゲナ（Ｇ．ｃｙａｎｏｇｅｎａ）、ギベレラ・フジクロイ（Ｇ．ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、ギベレラ・イントリカンス（Ｇ．ｉｎｔｒｉｃａｎｓ）、ギベレラ・プリカリス（Ｇ．ｐｕｌｉｃａｒｉｓ）、ギベレラ・スティボイデス（Ｇ．ｓｔｉｌｂｏｉｄｅｓ）、ギベレラ・トリキンクタ（Ｇ．ｔｒｉｃｉｎｃｔａ）、ギベレラ・ゼアエ（Ｇ．ｚｅａｅ））、ミケリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属（例えば、ムコール・ロウキシィ（Ｍ．ｒｏｕｘｉｉ）、ムコール・キルキネロイデス（Ｍ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ））、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属（例えば、アスペルギルス・ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・フラヴス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・レンツルス（Ａ．ｌｅｎｔｕｌｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・クラバツス（Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・フミガツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ））、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属（例えば、フサリウム・グラミネアルム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウム・オキシスポルム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ブビゲヌム（Ｆ．ｂｕｂｉｇｅｎｕｍ）、フサリウム・ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）、フサリウム・オキシスポルム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ベルチシリオイデス（Ｆ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・プロリフェラツム（Ｆ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）、フサリウム・ベネナツム（Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ））、およびフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ならびにそれらのアナモルフおよびテレモルフのものが挙げられる。本明細書中の真菌の属および種は、所望される場合、Ｂａｒｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ（Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｅｒａ  ｏｆ  Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ  Ｆｕｎｇｉ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｕｒｇｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９７２）に開示される形態論によって定義され得る。真菌は、場合によっては、特定の実施形態において、植物または動物（例えばヒト）の有害生物／病原体と特徴付けられ得る。
【０１６０】
本明細書中の特定の態様におけるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属種として、トリコデルマ・アグレッシバム（Ｔ．ａｇｇｒｅｓｓｉｖｕｍ）、トリコデルマ・アマゾニクム（Ｔ．ａｍａｚｏｎｉｃｕｍ）、トリコデルマ・アスペレルム（Ｔ．ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ）、トリコデルマ・アトロビリデ（Ｔ．ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・アウレオビリデ（Ｔ．ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・アウストロコニンギィ（Ｔ．ａｕｓｔｒｏｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ブレビコンパクトゥム（Ｔ．ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）、トリコデルマ・カンディドゥム（Ｔ．ｃａｎｄｉｄｕｍ）、トリコデルマ・カリッベウム（Ｔ．ｃａｒｉｂｂａｅｕｍ）、トリコデルマ・カトプトロン（Ｔ．ｃａｔｏｐｔｒｏｎ）、トリコデルマ・クレメウム（Ｔ．ｃｒｅｍｅｕｍ）、トリコデルマ・セラミクム（Ｔ．ｃｅｒａｍｉｃｕｍ）、トリコデルマ・セリヌム（Ｔ．ｃｅｒｉｎｕｍ）、トリコデルマ・クロロスポルム（Ｔ．ｃｈｌｏｒｏｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・クロモスペルマム（Ｔ．ｃｈｒｏｍｏｓｐｅｒｍｕｍ）、トリコデルマ・シナモメウム（Ｔ．ｃｉｎｎａｍｏｍｅｕｍ）、トリコデルマ・シトリノビリデ（Ｔ．ｃｉｔｒｉｎｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・クラッスム（Ｔ．ｃｒａｓｓｕｍ）、トリコデルマ・クレメウム（Ｔ．ｃｒｅｍｅｕｍ）、トリコデルマ・ジングレエアエ（Ｔ．ｄｉｎｇｌｅｙｅａｅ）、トリコデルマ・ドロテアエ（Ｔ．ｄｏｒｏｔｈｅａｅ）、トリコデルマ・エフスム（Ｔ．ｅｆｆｕｓｕｍ）、トリコデルマ・エリナセウム（Ｔ．ｅｒｉｎａｃｅｕｍ）、トリコデルマ・エストニクム（Ｔ．ｅｓｔｏｎｉｃｕｍ）、トリコデルマ・フェルティル（Ｔ．ｆｅｒｔｉｌｅ）、トリコデルマ・ゲラティノサス（Ｔ．ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓ）、トリコデルマ・グハネンセ（Ｔ．ｇｈａｎｅｎｓｅ）、トリコデルマ・ハマトゥム（Ｔ．ｈａｍａｔｕｍ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・ヘリクム（Ｔ．ｈｅｌｉｃｕｍ）、トリコデルマ・イントリカトゥム（Ｔ．ｉｎｔｒｉｃａｔｕｍ）、トリコデルマ・コニラングブラ（Ｔ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）、トリコデルマ・コニンギィ（Ｔ．ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・コニンギオプシス（Ｔ．ｋｏｎｉｎｇｉｏｐｓｉｓ）、トリコデルマ・ロンギブラチアトゥム（Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・ロンギピレ（Ｔ．ｌｏｎｇｉｐｉｌｅ）、トリコデルマ・ミヌティスポルム（Ｔ．ｍｉｎｕｔｉｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・オブロンギスポルム（Ｔ．ｏｂｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・オバリスポルム（Ｔ．ｏｖａｌｉｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・ペテルセニィ（Ｔ．ｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ）、トリコデルマ・フィロスタヒディス（Ｔ．ｐｈｙｌｌｏｓｔａｈｙｄｉｓ）、トリコデルマ・ピルリフェルム（Ｔ．ｐｉｌｕｌｉｆｅｒｕｍ）、トリコデルマ・プレウロティコラ（Ｔ．ｐｌｅｕｒｏｔｉｃｏｌａ）、トリコデルマ・プレウロトゥム（Ｔ．ｐｌｅｕｒｏｔｕｍ）、トリコデルマ・ポリスポルム（Ｔ．ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・シュードコニンギィ（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・プベスセンス（Ｔ．ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）、トリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ロゲルソニィ（Ｔ．ｒｏｇｅｒｓｏｎｉｉ）、トリコデルマ・ロシクム（Ｔ．ｒｏｓｓｉｃｕｍ）、トリコデルマ・サトゥルニスポルム（Ｔ．ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・シネンシス（Ｔ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、トリコデルマ・シヌオスム（Ｔ．ｓｉｎｕｏｓｕｍ）、トリコデルマ・スピラレ（Ｔ．ｓｐｉｒａｌｅ）、トリコデルマ・ストラミネウム（Ｔ．ｓｔｒａｍｉｎｅｕｍ）、トリコデルマ・ストリゴスム（Ｔ．ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ）、トリコデルマ・ストロマティクム（Ｔ．ｓｔｒｏｍａｔｉｃｕｍ）、トリコデルマ・スロトゥンドゥム（Ｔ．ｓｕｒｒｏｔｕｎｄｕｍ）、トリコデルマ・タイワネンセ（Ｔ．ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ）、トリコデルマ・タイランディクム（Ｔ．ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｍ）、トリコデルマ・テレフォリコルム（Ｔ．ｔｈｅｌｅｐｈｏｒｉｃｏｌｕｍ）、トリコデルマ・セオブロミコラ（Ｔ．ｔｈｅｏｂｒｏｍｉｃｏｌａ）、トリコデルマ・トメントスム（Ｔ．ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｍ）、トリコデルマ・ベルティヌム（Ｔ．ｖｅｌｕｔｉｎｕｍ）、トリコデルマ・ビレンス（Ｔ．ｖｉｒｅｎｓ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）、およびトリコデルマ・ビリデスセンス（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓ）が挙げられる。本明細書中のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属種は、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ：Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐ．Ｋ．Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，ＣＡＢＩ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ，２０１３）に記載されるように培養され、かつ／または操作され得、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１６１】
特定の実施形態における微生物細胞は、藻類細胞である。例えば、藻類細胞は、以下のいずれに由来してもよい：緑藻植物（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）門（緑藻類）、紅藻植物（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）門（紅藻類）、褐藻植物（Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ）綱（褐藻類）、珪藻植物（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃａｅａｅ）綱（珪藻類）、および渦鞭毛虫（Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）門（渦鞭毛虫類）。藻類細胞は、他の態様において、微細藻類（例えば、植物プランクトン、微細植物、またはプランクトン藻類）の細胞であっても大型藻類（ケルプ、海草）の細胞であってもよい。さらなる例として、本明細書中で藻類細胞は、アマノリ（Ｐｏｒｐｈｙｒａ）属（アサクサノリ）、ダルス（Ｐａｌｍａｒｉａ）属種、例えばダルス（Ｐ．ｐａｌｍａｔａ）、アルトロスピラ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ）属種、例えばスピルリナ（Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属（例えばクロレラ（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ））、ツノマタ（Ｃｈｏｎｄｒｕｓ）属種、例えばトチャカ（Ｃ．ｃｒｉｓｐｕｓ）、アファニゾメノン（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ）属、ホンダワラ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ）属、コチャユヨ（Ｃｏｃｈａｙｕｙｏ）属、ボツリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えばボツリオコッカス・ブラウニィ（Ｂ．ｂｒａｕｎｉｉ））、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属（例えばドナリエラ・テルティオレクタ（Ｄ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ））、グラシラリア（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）属、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）属（例えばプレウロクリシス・カルテレ（Ｐ．ｃａｒｔｅｒａｅ））、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）属、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属、ハンチア（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）属、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、フェオダクチルム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属（例えばフェオダクチルム・トリコルヌトゥム（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ））、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、スティココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）属（例えばテトラセルミス・スエシカ（Ｔ．ｓｕｅｃｉｃａ））、タラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属（例えばタラシオシラ・シュードナナ（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ））、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属（例えばクリプテコディニウム・コーニィ（Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ））、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属（例えばネオクロリス・オレオアブンダンス（Ｎ．ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ））、またはシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属のものであってよい。本明細書中で藻類種は、例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（Ａｌｇａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＯＬＳＳ），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  １、ｅｏｌｓｓ．ｎｅｔ／ｓａｍｐｌｅ−ｃｈａｐｔｅｒｓインターネットサイトにて入手可能）に記載されるよう��培養され、かつ／または操作され得、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１６２】
本明細書中の原生生物細胞は、例えば、繊毛虫（Ｃｉｌｉａｔａ）綱（例えば、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）属、ゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ）属、コルピディウム（Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍ）属、コルポダ（Ｃｏｌｐｏｄａ）属、グラウコマ（Ｇｌａｕｃｏｍａ）属、プラティオフリア（Ｐｌａｔｙｏｐｈｒｙａ）属、ボルチセラ（Ｖｏｒｔｉｃｅｌｌａ）属、ポトマカス（Ｐｏｔｏｍａｃｕｓ）属、シュードコニレンブス（Ｐｓｅｕｄｏｃｏｈｎｉｌｅｍｂｕｓ）属、エウプロテス（Ｅｕｐｌｏｔｅｓ）属、エンゲルマニエラ（Ｅｎｇｅｌｍａｎｉｅｌｌａ）属、およびスチロニキア（Ｓｔｙｌｏｎｉｃｈｉａ）属）、マスチゴフォラ（Ｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒａ）亜門（フラゲラーテ（ｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ））、フィトマスチゴフォレア（Ｐｈｙｔｏｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒｅａ）綱（例えば、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属、アスタシア（Ａｓｔａｓｉａ）属、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびクリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属）、鞭毛虫（Ｚｏｏｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒｅａ）綱、リゾポーダ（Ｒｈｉｚｏｐｏｄａ）上綱、ロボセア（Ｌｏｂｏｓｅａ）綱（例えばアメーバ（Ａｍｏｅｂａ）属）、およびエウミケトゾエア（Ｅｕｍｙｃｅｔｏｚｏｅａ）綱（例えば、ディクチオステリウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）属およびフィサルム（Ｐｈｙｓａｒｕｍ）属）から選択され得る。本明細書中の特定の原生生物種は、例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）Ｐｒｏｔｉｓｔｏｌｏｇｙ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｇｕｉｄｅ：ｔｉｐｓ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｏｚｏａ  ａｎｄ  ａｌｇａｅ（２０１３，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎインターネットサイトにて入手可能）に記載されるように培養され、かつ／または操作され得、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。原生生物は、場合によっては、特定の実施形態において、植物または動物（例えばヒト）の有害生物／病原体と特徴付けられ得る。
【０１６３】
特定の実施形態における細菌細胞は、球菌、桿菌、スピロヘータ、スフェロプラスト、プロトプラスト等の形態のものであってよい。細菌の他の非限定的な例として、グラム陰性菌およびグラム陽性菌であるものが挙げられる。細菌のさらに他の非限定的な例として、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属（例えば、サルモネラ・ティフィ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・エンテリティデス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ））、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属（例えばシゲラ・ディセンテリアエ（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ））、エケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エドワードシエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、エウィンゲラ（Ｅｗｉｎｇｅｌｌａ）属、クライベラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、プラノコッカス（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストマトコッカス（Ｓｔｏｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ））、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属（例えばコレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ））、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、プレシオモナス（Ｐｌｅｓｓｉｏｍｏｎａｓ）属、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属（例えばインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属（例えばマイコプラズマ・ニューモニア（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ））、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）属、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）属、ロシャリメア（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）属、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）属、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えばエンテロコッカス・ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ））、アエロコッカス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ゲメラ（Ｇｅｍｅｌｌａ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えばラクトコッカス・ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属（例えばロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ））、ペディコッカス（Ｐｅｄｉｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えば、セレウス菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ））、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えばコリネバクテリウム・ジフテリアエ（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ））、アルカノバクテリウム（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、ロードコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属（例えばリステリア菌（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））、エリシペロスリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）属、ガードネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属（例えば、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ））、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、アクロバクター（Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ）属、ウォリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）属、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属（例えばピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ））、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アキネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えばアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、クリセオモナス（Ｃｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属、エイケネラ（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）属、フラビモナス（Ｆｌａｖｉｍｏｎａｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）属、オリゲラ（Ｏｌｉｇｅｌｌａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（例えば緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、シュワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属、ウィークセラ（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属、フランシエセラ（Ｆｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ）属、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、アフピア（Ａｆｉｐｉａ）属、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）属、カリマトバクテリウム（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カルディオバクテリウム（Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトバチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、サルキニア（Ｓａｒｃｉｎｉａ）属、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、モビルンカス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えば、ラクトバチルス・ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ））、ロチア（Ｒｏｔｈｉａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属（例えば、ボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ））、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ビロフィラ（Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ）属、レプトトリキア（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）属、ウォリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）属、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、メガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）属、ヴェイロネラ（Ｖｅｉｌｏｎｅｌｌａ）属、ノルカルディア（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）属、アクチノマドゥラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）属、ノルカルディオプシス（Ｎｏｒｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ミクロポリスポラス（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｓ）属、サーモアクチノミセテス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）属、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えば、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ミコバクテリウム・ボヴィス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、ミコバクテリウム・レプラエ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ））、トレポネマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属（例えばボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、およびクラミジアエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）属のものが挙げられる。細菌は、場合によっては、特定の実施形態において、植物または動物（例えばヒト）の有害生物／病原体と特徴付けられ得る。細菌は、特定の実施形態において、混合微生物集団（例えば、他の細菌を含有し、または酵母および／もしくは他の細菌を含有する）に含まれてよい。
【０１６４】
特定の実施形態における古細菌細胞は、ユリ古細菌（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）門、クレン古細菌（Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ）門、ナノ古細菌（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）門、コル古細菌（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）門、アイガー古細菌（Ａｉｇａｒｃｈａｅｏｔａ）門、またはタウム古細菌（Ｔｈａｕｍａｒｃｈａｅｏｔａ）門等のあらゆる古細菌門に由来してよい。本明細書中の古細菌細胞は、例えば、好極限性（例えば、殆どの生命にとって有害となる、物理的または地球化学的に極限の条件において増殖かつ／または繁殖することができる）であってよい。好極限性古細菌の一部の例として、好熱性（例えば、４５〜１２２℃の温度で増殖することができる）、超好熱性（例えば、８０〜１２２℃の温度にて増殖することができる）、好酸性（例えば、３以下のｐＨレベルにて増殖することができる）、好アルカリ性（例えば、９以上のｐＨレベルにて増殖することができる）、かつ／または好塩性（例えば、高塩濃度［例えば２０〜３０％ＮａＣｌ］において増殖することができる）であるものが挙げられる。古細菌種の例として、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えば、ハロバクテリウム・ウォルカニイ（Ｈ．ｖｏｌｃａｎｉｉ））、スルフォロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属（例えば、スルフォロブス・ソルファタリクス（Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、スルフォロブス・アシドカルダリウス（Ｓ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ））、テルモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、テルモコッカス・アルカリフィルス（Ｔ．ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｓ）、テルモコッカス・セレール（Ｔ．ｃｅｌｅｒ）、テルモコッカス・キトノファグス（Ｔ．ｃｈｉｔｏｎｏｐｈａｇｕｓ）、テルモコッカス・ガンマトレランス（Ｔ．ｇａｍｍａｔｏｌｅｒａｎｓ）、テルモコッカス・ヒドロテルマリス（Ｔ．ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）、テルモコッカス・コダカレンシス（Ｔ．ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）、テルモコッカス・リトラリス（Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、テルモコッカス・ペプトノフィルス（Ｔ．ｐｅｐｔｏｎｏｐｈｉｌｕｓ）、テルモコッカス・プロフンドゥス（Ｔ．ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ）、テルモコッカス・ステッテリ（Ｔ．ｓｔｅｔｔｅｒｉ））、メタノカルドコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、メタノカルドコッカス・サーモリソトロフィカス（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ヤナシィ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ））、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えばメタノコッカス・マリパルディス（Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ））、メタノサーモバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ）属（例えば、メタノサーモバクター・マルブルゲンシス（Ｍ．ｍａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ）、メタノサーモバクター・サーマオートトロフィクス（Ｍ．ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ））、アーケオグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）属（例えばアーケオグロブス・フルギドゥス（Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ））、ニトロソプミルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ）属（例えば、ニトロソプミルス・マリティムス（Ｎ．ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）、メタロスファエラ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ）属（例えばメタロスファエラ・セドゥラ（Ｍ．ｓｅｄｕｌａ））、フェロプラズマ（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ）属、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）属、メタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）属（例えばメタノブレビバクター・スミチィ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ））、およびメタノスフェラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ）属（例えばメタノスフェラ・スタットマナエ（Ｍ．ｓｔａｄｔｍａｎａｅ））のものが挙げられる。
【０１６５】
本明細書中の昆虫細胞の例として、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）細胞、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）細胞等が挙げられる。ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞として、例えば、Ｓｆ９およびＳｆ２１が挙げられる。イラクサギンウワバ（Ｔ．ｎｉ）卵巣細胞として、例えば、ＨＩＧＨ  ＦＩＶＥ細胞（別名ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）が挙げられる。カイコ（Ｂ．ｍｏｒｉ）細胞として、例えば、Ｎ４が挙げられる。本明細書中の特定の昆虫細胞は、例えば、Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  Ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ（２０１０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍａｎｕａｌ  ｐａｒｔ  ｎｏ．２５−０１２７，ＭＡＮ０００００３０に記載されるように培養され、かつ／または操作され得、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。他の態様において、昆虫細胞は、植物の病害虫／病原体、例えば、ヨトウムシ、タマナヤガ、アメリカタバコガ、コーンノミハムシ、コーンリーフアリマキ、コーンルートアリマキ、ヨーロッパアワノメイガ、ツマジロクサヨトウ、グラニュレートカットワーム、マメコガネ、マダラメイガ、トウモロコシゾウムシ、メラノータス・コムニス（ｍｅｌａｎｏｔｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、シードコーンマゴット、ソッドウェブワーム、ソルガムミッジ、ソルガムウェブワーム、サザンコーンゾウムシ、サザンコーンルートワーム、サザンコーンストークボーラー、サザンポテトワイヤーワーム、ハダニ、ストークボーラー、シュガーケーンビートル、タバコワイヤーワーム、ホワイトグラブ、アリマキ、ワタミゾウムシ、ボールワームコンプレックス、イラクサキンウワバ、ミドリメクラガメ、アザミウマ、ナミハダニ、イエローストライプトアーミーワーム、アルファルファゾウムシ、クローバーゾウムシ、クローバールートカーキュリオ、ツマジロクサヨトウ、バッタ、ホソアワフキ、エンドウヒゲナガアブラムシ、ヒメヨコバイ、ツトガ、ニセタマナヤガ、マダラメイガ、タバコアザミウマ、ハリガネムシ、シリアルハムシ、ナガカメムシ、イングリッシュグレインアフィド、アブラムシ、ヘシアンバエ、マメハムシ、シロイチモジヨトウ、ツチハンミョウ、グレープコラスピス、グリーンクローバーワーム、マダラテントウムシ、ソイビーンルーパー、ソイビーンステムボーラー、クサギカメムシ、スリーコーナードアルファルファホッパー、ベルベットビーンキャタピラー、ハマキガ、イラクサキンウワバ、ヨトウムシ、グリーンジューンビートル、モモアカアブラムシ、スズメガ（ｈｏｒｎｗｏｒｍ）、ジャガイモキバガ、サザーンモールクリケット、サックフライ（ｓｕｃｋｆｌｙ）、タバコノミハムシ、ヤサイゾウムシ、またはホワイトフリンジドビートルの細胞であってよい。これ以外にも、昆虫細胞は、動物（例えばヒト）の病害虫／病原体の細胞であってよい。
【０１６６】
線虫細胞は、例えば、以下の属のいずれかに由来する線虫のものであってよい：メロイドギネ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）属（ネコブセンチュウ）、プラティレンチュス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）属（ネグサレセンチュウ（ｌｅｓｉｏｎ  ｎｅｍａｔｏｄｅ））、ヘテロデラ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）属（シストセンチュウ）、グローボデラ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）属（シストセンチュウ）、ジチレンチュス（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）属（ナミクキセンチュウ）、ティレンチュルス（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ）属（カンキツセンチュウ）、シピネーマ（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ）属（オオハリセンチュウ）、ラドフォルス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ）属（ネモグリセンチュウ）、ロチレンチュルス（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ）属（レニフォーム（ｒｅｎｉｆｏｒｍ）センチュウ）、ヘリコティレンチュス（Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）属（ラセンセンチュウ）、またはベロノライムス（Ｂｅｌｏｎｏｌａｉｍｕｓ）属（スティング（ｓｔｉｎｇ）センチュウ）。線虫は、場合によっては、特定の実施形態において、植物または動物（例えばヒト）の有害生物／病原体と特徴付けられ得る。線虫は、他の態様において、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）であってよい。
【０１６７】
本明細書中の魚類細胞は、例えば、米国特許第７４０８０９５号明細書および米国特許第７２１７５６４号明細書、ならびにＴｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｆｉｓｈ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ（Ｔ．Ｏｔｔ，ＮＷＦＨＳ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  Ｍａｎｕａｌ−Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １０，２００４）に開示される細胞のいずれかであってよく、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。これらの参考文献はまた、魚類細胞の培養および／または操作に関する情報を開示している。魚類細胞の非限定的な例として、ゼブラフィッシュ、メダカ、ジャイアントレリオ（Ｇｉａｎｔ  ｒｅｒｉｏ）、またはフグ等の硬骨類魚に由来するものがあり得る。
【０１６８】
特定の実施形態における哺乳類細胞として、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル、類人猿）、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、またはヒツジの細胞があり得る。本明細書中の哺乳動物細胞の他の例として、一次上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、子宮頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞、網膜上皮細胞）；樹立細胞株（例えば、２９３胚性腎細胞、ＨｅＬａ子宮頸部上皮細胞、ＰＥＲ−Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ、ＣＲＦＫ、ＭＤＣＫ、ＣＨＯ、ＢｅＷｏ、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２、Ｈｅｐ−２、ＫＢ、ＬＳ  １８０、ＬＳ  １７４Ｔ、ＮＣＩ−Ｈ−５４８、ＲＰＭＩ  ２６５０、ＳＷ−１３、Ｔ２４、ＷＩ−２８  ＶＡ１３、２ＲＡ、ＷＩＳＨ、ＢＳ−Ｃ−Ｉ、ＬＬＣ−ＭＫ２、Ｃｌｏｎｅ  Ｍ−３、ＲＡＧ、ＴＣＭＫ−１、ＬＬＣ−ＰＫ１、ＰＫ−１５、ＧＨ１、ＧＨ３、Ｌ２、ＬＬＣ−ＲＣ  ２５６、ＭＨ１Ｃ１、ＸＣ、ＭＤＯＫ、ＶＳＷ、ＴＨ−Ｉ、Ｂ１細胞）；あらゆる組織または臓器由来のあらゆる上皮、間葉（例えば線維芽細胞）、神経、または筋肉細胞（例えば、皮膚、心臓；肝臓；腎臓；結腸；腸；食道；胃；神経組織、例えば、脳または脊髄；肺；血管組織；リンパ組織、例えばリンパ腺、アデノイド、扁桃腺、骨髄、または血液；脾臓）；および線維芽細胞または線維芽細胞様細胞株（例えば、ＴＲＧ−２、ＩＭＲ−３３、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ−２１、ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅｍｉａ細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５５１、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５１０、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５２５、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５２９、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５３２、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５３９、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５４８、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５７３、ＨＥＬ  ２９９、ＩＭＲ−９０、ＭＲＣ−５、ＷＩ−３８、ＷＩ−２６、ＭｉＣｌ１、ＣＶ−１、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−３、ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、ＤＢＳ−ＦｒｈＬ−２、ＢＡＬＢ／３Ｔ３、Ｆ９、ＳＶ−Ｔ２、Ｍ−ＭＳＶ−ＢＡＬＢ／３Ｔ３、Ｋ−ＢＡＬＢ、ＢＬＯ−１１、ＮＯＲ−１０、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２、ＨＳＤＭ１Ｃ３、ＫＬＮ２０５、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、ＳＣＣ−ＰＳＡ１、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、インドホエジカ細胞、ＳＩＲＣ、Ｊｅｎｓｅｎ細胞が挙げられる。哺乳動物細胞株の培養および操作方法は、当該技術において知られている。
【０１６９】
用語「植物体」は、植物体全体、植物器官、植物組織、種子、植物細胞、種子およびその子孫を指す。植物細胞としては、限定はされないが、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉および小胞子の細胞が挙げられる。植物体の部分には、分化組織および未分化組織が含まれ、それらの組織としては、限定はされないが、根、茎、シュート、葉、花粉、種子、腫瘍組織、および様々な形態の細胞および培養物（例えば、単細胞、プロトプラスト、胚およびカルス組織）が挙げられる。植物組織は、植物体中に、または植物器官、組織、もしくは細胞培養物中に存在し得る。用語「植物器官」は、形態的にも機能的にも区別された植物体の部分を構成する、植物組織または組織群を指す。用語「ゲノム」は、生命体の各細胞、またはウィルスもしくは細胞小器官に存在する遺伝物質（遺伝子および非コード配列）の相補体の全体；ならびに／あるいは１つの親から１つの（ハプロイド）単位として受け継いだ一式の染色体を指す。「子孫」は、植物体のその後の世代を含む。
【０１７０】
トランスジェニック植物体としては、例えば、形質転換工程によって導入された異種ポリヌクレオチドをゲノム内に含む植物体が挙げられる。異種ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが後代に継承されるよう、ゲノムに安定に組み込むことができる。異種ポリヌクレオチドは、ゲノムに単独で、または組み換えＤＮＡコンストラクトの一部として組み込んでもよい。トランスジェニック植物体はまた、ゲノム内に複数の異種ポリヌクレオチドを含むことができる。各異種ポリヌクレオチドは、トランスジェニック植物体に異なる形質を付与してもよい。異種ポリヌクレオチドとして、外来種を起源とする配列を挙げることができ、あるいは、同種からの配列であれば、その天然形態から大幅に改変することができる。トランスジェニック体としては、異種の核酸の存在によってその遺伝子型を変化させた、任意の細胞、細胞系統、カルス、組織、植物体の部分または植物体（初めからそのように変更されたトランスジェニック体、および初めのトランスジェニック体から有性交雑または無性増殖によって作られたものを含む）を挙げることができる。従来の植物育種方法による、外来ポリヌクレオチドが挿入されない本明細書に記載のゲノム編集手順による、または自然に発生するイベント（ランダム交雑受精、非組み換えウィルス感染、非組み換え細菌形質転換、非組み換え転位もしくは自然変異など）による、ゲノム（染色体または染色体外の）の変化を、トランスジェニックと見なすことは意図されていない。
【０１７１】
稔性植物は、生存可能な雄性配偶子および雌性配偶子を生み出し、かつ自家稔性の植物である。そのような自家稔性植物は、他のあらゆる植物の配偶子、およびそこに含有される遺伝物質の貢献によらずに、後代植物を生み出すことができる。雄性不稔植物は、生存可能な、またはそうでなければ稔性可能な雄性配偶子を生み出さない植物である。雌性不稔植物は、生存可能な、またはそうでなければ稔性可能な雌性配偶子を生み出さない植物である。雄性不稔植物および雌性不稔植物はそれぞれ、雌性稔性および雄性捻性であり得ることが認められている。さらに、雄性稔性（しかし雌性不稔である）植物は、雌性稔性植物と交雑すると、生存可能な後代を生み出すことができること、そして雌性稔性（しかし雄性不稔である）植物は、雄性稔性植物と交雑すると、生存可能な後代を生み出すことができることが認められている。
【０１７２】
単子葉植物および双子葉植物が挙げられるあらゆる植物が用いられてよい。用いられ得る単子葉植物の例として、以下に限定されないが、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ヒエ（例えばトウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ））、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ）、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、サトウキビ（サトウキビ属種（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐ．））、エンバク（カラスムギ（Ａｖｅｎａ）属）、オオムギ（オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ）属）、スイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、バナナ（ムサ属種（Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．））、ヤシ、観賞植物、芝草、および他のイネ科植物が挙げられる。用いられ得る双子葉植物の例として、以下に限定されないが、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、キャノーラ（セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）およびブラシカ・カンペストリス（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ））、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ａｒｂｏｒｅｕｍ）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、およびジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）等が挙げられる。
【０１７３】
用語「双子葉植物」は、「双子葉類（ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｅａｅ）」としても知られている、被子植物の亜綱を指し、植物体全体、植物器官（例えば、葉、茎、根等）、種子、植物細胞、およびその後代への言及が挙げられる。本明細書中で用いられる植物細胞として、以下に限定されないが、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織部位、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子が挙げられる。
【０１７４】
用語「５’キャップ」および「７−メチルグアニレート（ｍ７Ｇ）キャップ」は、本明細書中で互換的に用いられる。７−メチルグアニレート残基は、真核生物において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）によって転写されたＲＮＡの５’末端上に位置決めされる。本明細書中のキャップＲＮＡは、５’キャップを有するが、キャップ離脱ＲＮＡは、そのようなキャップを有していない。
【０１７５】
用語「キャップ離脱」、「５’キャップを有していない」等は、本明細書中では互換的に用いられ、５’キャップを欠いており、場合によっては、例えば、５’キャップの代わりに５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡを指す。５’キャッピングされたＲＮＡは、核外輸出を受けるため、キャップ離脱ＲＮＡは、転写後、核内により十分に蓄積することができる。
【０１７６】
用語「リボザイム」、「リボ核酸酵素」、および「自己切断リボザイム」は、本明細書中で互換的に用いられる。リボザイムは、特定の部位にて、特にリボザイム配列に対するシス部位にて、ＲＮＡを切断することができる（すなわち、自己触媒的である、または自己切断する）二次構造、三次構造、および／または四次構造を形成する１つ以上のＲＮＡ配列を指す。リボザイム核酸分解活性の一般的な性質が記載されてきた（例えば、Ｌｉｌｌｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３９：６４１−６４６）。「ハンマーヘッドリボザイム」（ＨＨＲ）は、塩基対形成された３つのステム、および触媒反応に関与する高度に保存された非相補的ヌクレオチドのコアで構成される、小さな触媒的ＲＮＡモチーフを含んでよい。Ｐｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：６８−７４）、およびＨａｍｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＲＮＡ  １８：８７１−８８５）（これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる）が、ハンマーヘッドリボザイムの構造および活性を開示している。ハンマーヘッドリボザイムは、例えば、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌ  ８１：９９１−１００２（参照によって本明細書に組み込まれる））によって開示される「最小ハンマーヘッド」配列を含んでよい。
【０１７７】
本明細書中で用いられる用語「増大」は、量または活性の増大が比較されることになる量または活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、５０％、１００％、または２００％超える量または活性に言及し得る。用語「増大」、「上昇」、「強化」、「超」、および「向上」は、本明細書中で互換的に用いられる。用語「増大」は、例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を特徴付けるために用いられ得、「発現の増大」は、「過剰発現」を意味することもある。
【０１７８】
標的部位またはその近傍に変更されたゲノムを有する、それらの細胞を、スクリーンマーカー表現型を使用せずに同定するには、様々な方法が利用できる。そうした方法は、標的配列中の変化を検出するための、標的配列の直接分析と見なすことができ、限定はされないが、ＰＣＲ法、配列決定法、ヌクレアーゼ消化法、サザンブロット法およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１７９】
標準のＤＮＡ分離、精製、分子クローニング、ベクターコンストラクションおよび検証／キャラクタリゼーションの方法は十分に確立されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）を参照されたい。ベクターおよびコンストラクトには、環状プラスミドおよび線形ポリヌクレオチドが含まれ、これらには目的のポリヌクレオチド、および場合によりリンカー、アダプター、調節要素または分析要素を含む、他の構成要素が含まれる。いくつかの実施例では、認識部位および／または標的部位は、イントロン、コード配列、５’末端ＵＴＲ、３’末端ＵＴＲおよび／または調節領域内に含有させることができる。
【０１８０】
略語の意味は以下の通りである：「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」マイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」ミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、そして「ｋｂ」キロベースを意味する。
【０１８１】
本明細書中で開示される組成物および方法の非限定的な例として、以下がある：
１．単一ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合したポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）プロモーターを含む組み換えＤＮＡコンストラクトであって、前記組み換えＤＮＡコンストラクトは、リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含まず、前記ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成することができ、前記複合体は、真核生物のゲノム中の標的部位配列に結合することができ、かつこれを切断することができる、組み換えＤＮＡコンストラクト。
２．実施形態１の組み換えＤＮＡを含む非従来型酵母。
３．前記酵母は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、およびパキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属からなる群から選択される属のメンバーである、実施形態２の非従来型酵母。
４．実施形態１の組み換えＤＮＡによってコードされる単一ガイドＲＮＡ。
５．実施形態１の少なくとも１つの組み換えＤＮＡを含む発現ベクター。
６．Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチドをさらに含む、実施形態５の発現ベクター。
７．ベクターはさらに、ポリヌクレオチド改変鋳型ＤＮＡまたはドナーＤＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチドを含む、実施形態５の発現ベクター。
８．非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上の標的部位を改変する方法であって、非従来型酵母に、実施形態１の少なくとも第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、およびＣａｓエンドヌクレアーゼをコードする第２の組み換えＤＮＡコンストラクトを提供することを含み、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、前記標的部位に一本鎖切断または二本鎖切断を導入する、方法。
９．実施形態１の少なくとも第１の組み換えＤＮＡコンストラクトおよび第２の組み換えＤＮＡコンストラクトは、同じポリヌクレオチドまたは別個のポリヌクレオチドの上に位置決めされている、実施形態８の方法。
１０．前記標的部位に改変を有する少なくとも１つの非従来型酵母細胞を同定することをさらに含み、改変は、前記標的部位において、１つ以上のヌクレオチドの少なくとも１つの欠失、付加、または置換を含む、実施形態８または９の方法。
１１．ドナーＤＮＡを前記酵母に提供することをさらに含み、前記ドナーＤＮＡは、注目するポリヌクレオチドを含む、実施形態８または９の方法。
１２．前記標的部位に統合された注目するポリヌクレオチドを染色体またはエピソーム中に含む少なくとも１つの酵母細胞を同定することをさらに含む、実施形態１１の方法。
１３．前記非従来型酵母における突然変異効率を同定することをさらに含む、実施形態８または９の方法。
１４．非従来型酵母中の染色体またはエピソーム上のヌクレオチド配列を編集する方法であって、非従来型酵母に、ポリヌクレオチド改変鋳型ＤＮＡ、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および実施形態１の第２の組み換えＤＮＡコンストラクトを提供することを含み、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、前記酵母の染色体またはエピソーム中の標的部位に、一本鎖切断または二本鎖切断を導入し、前記ポリヌクレオチド改変鋳型ＤＮＡは、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド改変を含む、方法。
１５．非従来型酵母の染色体またはエピソーム上のヌクレオチド配列をサイレンシングする方法であって、非従来型酵母に、不活化ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および実施形態１の少なくとも第２の組み換えＤＮＡコンストラクトを提供することを含み、前記ガイドＲＮＡ分子および不活化Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、前記酵母の染色体またはエピソーム中の前記ヌクレオチド配列に結合することによって、前記ヌクレオチド配列の転写を阻止する複合体を形成することができる、方法。
１６．デュアルガイドＲＮＡ（別々の分子上のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合したポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）プロモーターを含む組み換えＤＮＡコンストラクトであって、デュアルガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成することができ、前記複合体は、真核生物のゲノム中の標的部位配列に結合することができ、かつこれを切断することができる、組み換えＤＮＡコンストラクト。
１７．真核生物は、微生物、酵母、非従来型酵母、真菌、植物、古細菌細胞、ヒト以外の動物、昆虫、および線虫の群から選択される、実施形態１および１６の組み換えＤＮＡコンストラクト。
１８．実施形態１または１６の組み換えＤＮＡによってコードされるデュアルガイドＲＮＡ。
【実施例】
【０１８２】
下記の実施例では、別途明記しない限り、部および割合は重量によるものであり、度は摂氏である。これらの実施例は、本開示の実施形態を示すものであるが、例示のみを目的として提示されることを理解すべきである。上記の議論およびこれらの実施例から、当業者は本開示の様々な変更および改変を行って本開示を様々な用法および条件に適合させることができる。そのような改変も、添付した特許請求の範囲に含まれるものとする。
【０１８３】
実施例１
Ｃｓｙ４またはＮＬＳ−Ｃｓｙ４は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属において機能的である
本実施例は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属におけるＣＡＮ１遺伝子の不活化のために、２８ヌクレオチドＣｓｙ４認識部位が隣接するＣＡＮ１ターゲティングｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡ組み換えＤＮＡを含むＣａｓ９発現プラスミド中に、Ｃｓｙ４（Ｃａｓ６としても知られている）コーディング遺伝子をクローニングすることを記載する。Ｎ末端核局在化配列（ＮＬＳ）の存在下または不在下でＣｓｙ４発現を可能にする、２つの異なる組み換えコンストラクトを作製した。
【０１８４】
ｐＹＲＨ２８６は、ＦＢＡ１プロモーター（配列番号２）の下でＮＬＳ−Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ（配列番号１）を、そしてＦＢＡ１プロモーター（配列番号２）の下でＣｓｙ４（配列番号３）発現についてコドン最適化されたヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子を発現した。
【０１８５】
ｐＹＲＨ２９０は、ｐＹＲＨ２８６に基づいており、そして追加的に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）プロモーターであるＴＤＨ１（配列番号８）の下で、ＣＡＮ１標的配列（配列番号７）を標的とする、２８ヌクレオチド（ｎｔ）Ｃｓｙ４エンドヌクレアーゼ認識配列（配列番号５）が隣接するｐｒｅ−ｓｇＲＮＡ（配列番号６）を発現するＤＮＡ断片（配列番号４）を含有した（図１Ｂ）。
【０１８６】
ｐＹＲＨ３１９は、ｐＹＲＨ２９０に基づいており、Ｃｓｙ４をコードする遺伝子が、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｃｓｙ４（配列番号９）へのＮＬＳ融合体をコードする遺伝子によって置き換えられており、ＮＬＳは、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）一分節アミノ末端基ＮＬＳ（配列番号１０）である。
【０１８７】
ｐＹＲＨ３２７は、ｐＹＲＨ２９０に基づいており、Ｃｓｙ４をコードする遺伝子が欠失していた。したがって、ｐＹＲＨ３２７は、Ｃａｓ９、および２８ヌクレオチド（ｎｔ）Ｃｓｙ４エンドヌクレアーゼ認識配列（配列番号５）が隣接するｐｒｅ−ｓｇＲＮＡ（配列番号６）を発現した。
【０１８８】
全てのベクターは、完全長ＡＲＳ１８（配列番号１２）の３’末端２７ｂｐを欠く不完全な自己複製配列ＡＲＳ１８（配列番号１１）を含有した。
【０１８９】
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属株ＡＴＣＣ２０３６２のＵｒａマイナス誘導体（Ｙ２２２４）をプラスミドで形質転換して、形質転換体を、ウラシルを欠くＣＭプレート上で選択した。選択プレート上で増殖させた形質転換体を、ｃａｎ１突然変異体を選択するためにカナバニンを含有するＣＭプレートにレプリカプレーティングした。カナバニンを含有するＣＭプレート上で増殖したコロニーを計数して、標的部位の突然変異を、配列決定法によって確認した。
【０１９０】
表２は、ＮＬＳ−Ｃａｓ９、Ｃｓｙ４部位が隣接したｇＲＮＡ、およびＮＬＳ−Ｃｓｙ４（ｐＹＲＨ３１９を参照）で形質転換したコロニーが、ＣＡＮ１中に標的突然変異を発生させるのに、ＮＬＳ−Ｃａｓ９、Ｃｓｙ４部位が隣接したｇＲＮＡ、およびＣｓｙ４（ｐＹＲＨ２９０）で形質転換したコロニーよりも約２３％有効であったことを示す。興味深いことに、ＮＬＳ−Ｃａｓ９、およびＣｓｙ４部位が隣接したｇＲＮＡを発現したが、ＣＳＹ４（ｐＹＲＨ３２７）を発現しなかった形質転換体もまた、標的突然変異体をもたらした。
【０１９１】
【表２】
2018537106.tif 000006
【０１９２】
次に、機能的ガイドＲＮＡが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターによって直接発現され得るかを判定する実験を実行した。
【０１９３】
実施例２
ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）の下で発現されたｇＲＮＡは、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属において機能的である
本実施例は、ターミネーター配列の存在下または不在下で、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターに作動可能に結合した単一ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡに隣接する２８ｎｔ  Ｃｓｙ４認識部位を欠く組み換えＤＮＡコンストラクト（図１Ａ）による、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属におけるＣＡＮ１ターゲティングｓｇＲＮＡの発現を記載する。これらの組み換えＤＮＡコンストラクトの有効性を、単一ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡに隣接する２８ｎｔ  Ｃｓｙ４認識部位を有する組み換えＤＮＡコンストラクト（図１Ｂ）と比較した。Ｃａｓ９が、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属におけるＣＡＮ１遺伝子不活化用のプラスミド上で共発現された。
【０１９４】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが機能的ｇＲＮＡをもたらし得るかを試験するために、プラスミドｐＹＲＨ３７６、ｐＹＲＨ３７８、ｐＹＲＨ３７９、およびｐＹＲＨ３８０を構築した。全てのプラスミドは、ＦＢＡ１プロモーター（配列番号２）の下でＮＬＳ−Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ（配列番号１）を発現する同じ骨格プラスミド（ｐＲＦ２９１）を用いた。全てのプラスミドは、完全長ＡＲＳ１８（配列番号１２）を含有した。
【０１９５】
ｐＹＲＨ３７６は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターであるＴＤＨ１プロモーター（配列番号８）の下で、ＣＡＮ１標的配列（配列番号７）を標的とする、２８ｎｔ  Ｃｓｙ４エンドヌクレアーゼ認識配列（配列番号５）が隣接したｐｒｅ−ｓｇＲＮＡ（配列番号６）を発現する。
【０１９６】
ｐＹＲＨ３７８は、ＴＤＨ１プロモーター（配列番号８）の下で、ＣＡＮ１標的配列（配列番号７）を標的とするｐｒｅ−ｓｇＲＮＡ（配列番号６）を発現する。
【０１９７】
ｐＹＲＨ３７９は、ＴＤＨ１プロモーター（配列番号８）の下で、そしてまた、ｐｒｅ−ｓｇＲＮＡの３’のＴＤＨ１ターミネーター配列（配列番号１３）により、ＣＡＮ１標的配列（配列番号７）を標的とするｐｒｅ−ｓｇＲＮＡ（配列番号６）を発現する。
【０１９８】
ｐＹＲＨ３８０は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターであるＦＢＡ１（配列番号２）の下で、ＣＡＮ１標的配列（配列番号７）を標的とする、２８ｎｔ  Ｃｓｙ４エンドヌクレアーゼ認識配列（配列番号５）が隣接したｐｒｅ−ｓｇＲＮＡ（配列番号６）を発現する。
【０１９９】
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属株ＡＴＣＣ２０３６２のＵｒａマイナス誘導体（Ｙ２２２４）をプラスミドで形質転換して、形質転換体を、ウラシルを欠くＣＭプレート上で選択した。選択プレート上で増殖させた形質転換体を、ｃａｎ１突然変異体を選択するためにカナバニンを含有するＣＭプレートにレプリカプレーティングした。カナバニンを含有するＣＭプレート上で増殖したコロニーを計数して、形質転換体の総数と比較することによって、突然変異頻度を算出した。
【０２００】
図２に示すように、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの下で発現されるｇＲＮＡは、機能的であった。そして、ｇＲＮＡの５’および３’の２８ｎｔ  Ｃｓｙ４エンドヌクレアーゼ認識配列の有無に関係なく、全形質転換体の約７０％でカナバニン耐性突然変異体が生じた。
【０２０１】
実施例３
Ｃａｓ９発現プラスミド、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ−ＩＩ）ｇＲＮＡ発現カセットの構築
この実施例は、Ｃａｓ９、およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）染色体配列を標的とするｇＲＮＡの双方を構成的に発現する単一ヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）プラスミドを生じさせるための、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質の構成的発現用のヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）プラスミドの構築、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ  ｇＲＮＡ発現カセットの構築、およびＣａｓ９発現プラスミド中への当該発現カセットの挿入について考察する。
【０２０２】
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属においてｓｇＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを試験するために、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｍ１  ＧＡＳ由来のＣａｓ９遺伝子（ＳＦ３７０（配列番号１））を、当該技術において知られている標準的な技術でヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化した（配列番号１４）。Ｃａｓ９タンパク質を細胞の核に局在化させるために、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）一分節（ＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号１５）核局在化シグナルを、Ｃａｓ９タンパク質のカルボキシ末端に組み込んだ。ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９遺伝子を、標準的な分子生物学の技術によって、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属構成的プロモーター、ＦＢＡ１（配列番号１６）に融合させた。ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９発現カセット（配列番号１７）の例が、ＦＢＡ１プロモーター、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化Ｃａｓ９−ＮＬＳ融合体を含有した。そして、Ｃａｓ９発現カセットを、プラスミドｐＺｕｆ、およびｐＺｕｆＣａｓ９と呼ばれる新しいコンストラクト（配列番号１８）中にクローニングした。
【０２０３】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写ｇＲＮＡ発現カセット（図３Ａ〜図３Ｃ）を生じさせるために、異なるプロモーター（ＦＢＡ１またはＴＥＦ１）を、転写開始部位（ＴＳＳ）に、または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の末端に組み合わせた。ＤＮＡ断片は、Ｃａｎ１−１部位を標的とするｇＲＮＡをコードする。ｇＲＮＡの３’側を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩターミネーター（ＡＣＴ１）と、またはＨＤＶリボザイムおよびその次にＡＣＴ１ターミネーターをコードするＤＮＡと融合させた。これらのコンストラクトは、ｇＲＮＡとのプロモーターの最適な融合を、そして、ＨＤＶリボザイム（それ自体、および転写されるあらゆるターミネーター配列を、ｇＲＮＡの３’末端から自己触媒的に除去することとなる）の存在により、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質による遺伝子ターゲティングが可能となるかを試験する。
【０２０４】
ＴＥＦ１ＴＳＳプロモーター断片（配列番号１９）を、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムＤＮＡから、標準的なＰＣＲ（ｇｇｇｔｔａａｔｔａａＡＧＡＧＡＣＣＧＧＧＴＴＧＧＣＧＧＣＧＣ（配列番号２０）、フォワード、およびｇａｇｇｇｔｇｇｇｔａａｔｃｇｔｔｔｇａｔｔｇａＣＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡ（配列番号２１）、リバース）を用いて増幅させた。フォワードプライマーは、ＰａｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を付加する。リバースプライマーは、Ｃａｎ１−１  ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの最初の２０ヌクレオチドを付加する。ＴＥＦ１ＵＴＲプロモーター（配列番号２２）を、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムＤＮＡから、標準的なＰＣＲ（ｇｇｇｔｔａａｔｔａａＡＧＡＧＡＣＣＧＧＧＴＴＧＧＣＧＧＣＧＣ（配列番号２０）、フォワード、およびｇａｇｇｇｔｇｇｇｔａａｔｃｇｔｔｔｇａＴＴＴＧＡＡＴＧＡＴＴＣＴＴＡＴＡＣＴＣ（配列番号２３）、リバース）を用いて増幅させた。フォワードプライマーは、ＰａｃＩ制限部位を付加し、リバースプライマーは、Ｃａｎ１−１  ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの最初の２０ヌクレオチドを付加する。ＦＢＡ１ＴＳＳプロモーター断片（配列番号２４）を、ｐＺｕｆＣａｓ９（配列番号１８）から、標準的なＰＣＲ（ｇｇｇｔｔａａｔｔａａｇｔｔｔａａａｃｃａｔｃａｔｃｔａａｇｇｇｃｃ（配列番号２５）、フォワード、およびｇａｇｇｇｔｇｇｇｔａａｔｃｇｔｔｔｇａｔｇｇｃａａｃｃｇａｔｔｇｇｇａｇａｇｃ（配列番号２６）、リバース）を用いて増幅させた。フォワードプライマーは、ＰａｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を付加し、リバースプライマーは、Ｃａｎ１−１  ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの２０ヌクレオチドを付加する。ＦＢＡ１ＵＴＲプロモーター（配列番号２７）を、ｐＺｕｆＣａｓ９（配列番号１８）から、標準的なＰＣＲ（ｇｇｇｔｔａａｔｔａａｇｔｔｔａａａｃｃａｔｃａｔｃｔａａｇｇｇｃｃ（配列番号２５）、フォワード、およびｇａｇｇｇｔｇｇｇｔａａｔｃｇｔｔｔｇａｇｇｔｇｔｇａｔｇｔｇｔａｇｔｔｔａｇａ（配列番号２８）、リバース）を用いて増幅させた。フォワードプライマーは、ＰａｃＩエンドヌクレアーゼ認識部位を付加し、リバースプライマーは、Ｃａｎ１−１  ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの２０ヌクレオチドを付加する。
【０２０５】
Ｃａｎ１−１  ｇＲＮＡをコードするＤＮＡへの融合用のＡＣＴ１ターミネーター断片（配列番号２９）を、ｐＦＢ２３（配列番号３０）から、標準的なＰＣＲ（ａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｇｔｇｃｔｔｔｔＧＧＣＣＧＣｇｔｇｔｇｇｔｇａｔｔｇｃｔ（配列番号３１）、フォワード、およびｇｇｇｇａｔｃｇａｔｔｇｇａａｇａｇａｔｔｔｃｇａａｇｃａｃｇ（配列番号３２）、リバース）を用いて増幅させた。フォワードプライマーは、Ｃａｎ１−１  ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの最も３’の２０ヌクレオチドを付加し、リバースプライマーは、ＣｌａＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を付加する。３’ＨＤＶが隣接したＣａｎ１−１  ｇＲＮＡをコードするＤＮＡへの融合用のＡＣＴ１ターミネーター（配列番号３３）を、ｐＦＢ２３（配列番号３０）から、標準的なＰＣＲ（ｃｔｔｃｇｇｃａｔｇｇｃｇａａｔｇｇｇａＧＧＣＣＧＣｇｔｇｔｇｇｔｇａｔｔｇｃｔ（配列番号３４）、フォワード、およびｇｇｇｇａｔｃｇａｔｔｇｇａａｇａｇａｔｔｔｃｇａａｇｃａｃｇ（配列番号３２）、リバース）を用いて増幅させた。フォワードプライマーは、３’ＨＤＶが隣接したＣａｎ１−１  ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの最も３’の２０ヌクレオチドを付加し、リバースプライマーは、ＣｌａＩ部位を付加する。
【０２０６】
Ｃａｎ１−１  ｇＲＮＡ（配列番号３５）をコードするＤＮＡを、ＦＢＡ１ＴＳＳ断片（配列番号２４）およびＡＣＴ１ターミネーター断片（配列番号２９）への融合用に、ｐＲＦ８４（配列番号３６）（ｇｃｔｃｔｃｃｃａａｔｃｇｇｔｔｇｃｃａｔｃａａａｃｇａｔｔａｃｃｃａｃｃｃｔｃ（配列番号３７）、フォワード、およびａｇｃａａｔｃａｃｃａｃａｃＧＣＧＧＣＣａａａａｇｃａｃｃａｃｃｇａｃｔｃｇｇｔ（配列番号３８）、リバース）を用いる標準的なＰＣＲを用いて増幅させた。フォワードプライマーは、ＦＢＡ１ＴＳＳ断片の最も３’の２０ヌクレオチドに対応する２０ヌクレオチドを付加し、リバースプライマーは、ＡＣＴ１ターミネーター断片の最も５’の２０ヌクレオチドに対応する２０ヌクレオチドを付加する。３’ＨＤＶが隣接したＣａｎ１−１  ｇＲＮＡ（配列番号３９）をコードするＤＮＡを、ＦＢＡ１ＴＳＳプロモーター（配列番号２４）断片およびＡＣＴ１ターミネーター断片（配列番号３３）への融合用のｐＲＦ８４（配列番号３６）から、標準的なＰＣＲ（ｇｃｔｃｔｃｃｃａａｔｃｇｇｔｔｇｃｃａｔｃａａａｃｇａｔｔａｃｃｃａｃｃｃｔｃ（配列番号３７）、フォワード、およびａｇｃａａｔｃａｃｃａｃａｃＧＣＧＧＣＣｔｃｃｃａｔｔｃｇｃｃａｔｇｃｃｇａａｇ（配列番号４０）、リバース）を用いて増幅させた。フォワードプライマーは、ＦＢＡ１ＴＳＳ断片の最も３’の２０ヌクレオチドを付加し、リバースプライマーは、ＡＣＴ１ターミネーターの最も５’の２０ヌクレオチドを付加する。Ｃａｎ１−１  ｇＲＮＡ（配列番号４１）をコードするＤＮＡを、ＦＢＡ１ＵＴＲプロモーター断片（配列番号２７）およびＡＣＴ１ターミネーター断片（配列番号２９）への融合用のｐＲＦ８４（配列番号３６）から、標準的なＰＣＲ（ｔｃｔａａａｃｔａｃａｃａｔｃａｃａｃｃｔｃａａａｃｇａｔｔａｃｃｃａｃｃｃｔｃ（配列番号４２）、フォワード、およびａｇｃａａｔｃａｃｃａｃａｃＧＣＧＧＣＣａａａａｇｃａｃｃａｃｃｇａｃｔｃｇｇｔ（配列番号３８）、リバース）を用いて増幅させた。フォワードプライマーは、ＦＢＡ１ＵＴＲ断片の最も３’の２０ヌクレオチドを付加し、リバースプライマーは、ＡＣＴ１ターミネーター断片の最も５’の２０ヌクレオチドを付加する。３’ＨＤＶが隣接したＣａｎ１−１  ｇＲＮＡ（配列番号４３）をコードするＤＮＡを、ＦＢＡ１ＵＴＲ断片（配列番号２７）およびＡＣＴ１ターミネーター（配列番号３３）断片への融合用のｐＲＦ８４（配列番号３６）から、標準的なＰＣＲ（ｔｃｔａａａｃｔａｃａｃａｔｃａｃａｃｃｔｃａａａｃｇａｔｔａｃｃｃａｃｃｃｔｃ（配列番号４２）、フォワード、およびａｇｃａａｔｃａｃｃａｃａｃＧＣＧＧＣＣｔｃｃｃａｔｔｃｇｃｃａｔｇｃｃｇａａｇ（配列番号４０）、リバース）を用いて増幅させた。フォワードプライマーは、ＦＢＡ１ＵＴＲ断片の最も３’の２０ヌクレオチドを付加し、リバースプライマーは、ＡＣＴ１ターミネーター断片の最も５’の２０ヌクレオチドを付加する。Ｃａｎ１−１  ｇＲＮＡ（配列番号４４）をコードするＤＮＡを、ＴＥＦ１ＴＳＳ断片（配列番号１９）およびＡＣＴ１ターミネーター（配列番号２９）断片への融合用のｐＲＦ��４（配列番号３６）から、標準的なＰＣＲ（ＴＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＴＧｔｃａａｔｃａａａｃｇａｔｔａｃｃｃａｃｃｃｔｃ（配列番号４５）、フォワード、およびａｇｃａａｔｃａｃｃａｃａｃＧＣＧＧＣＣａａａａｇｃａｃｃａｃｃｇａｃｔｃｇｇｔ（配列番号３８）、リバース）を用いて増幅させた。フォワードプライマーは、ＴＥＦ１ＴＳＳ断片の最も３’の２０ヌクレオチドを付加し、リバースプライマーは、ＡＣＴ１ターミネーター断片の最も５’の２０ヌクレオチドを付加する。３’ＨＤＶリボザイムが隣接したＣａｎ１−１  ｇＲＮＡ（配列番号４６）を、ＴＥＦ１ＴＳＳ断片（配列番号１９）およびＡＣＴ１ターミネーター断片（配列番号３３）への融合用のｐＲＦ８４（配列番号３６）から、標準的なＰＣＲ（ＴＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＴＧｔｃａａｔｃａａａｃｇａｔｔａｃｃｃａｃｃｃｔｃ配列番号４４、フォワード、およびａｇｃａａｔｃａｃｃａｃａｃＧＣＧＧＣＣｔｃｃｃａｔｔｃｇｃｃａｔｇｃｃｇａａｇ（配列番号４０）、リバース）を用いて増幅させた。フォワードプライマーは、ＴＥＦ１ＴＳＳ断片の最も３’の２０ヌクレオチドを付加し、リバースプライマーは、ＡＣＴ１ターミネーターの最も５’の２０ヌクレオチドを付加する。Ｃａｎ１−１  ｇＲＮＡ（配列番号４７）をコードするＤＮＡを、ＴＥＦ１ＵＴＲ断片（配列番号２２）およびＡＣＴ１ターミネーター断片（配列番号２９）への融合用のｐＲＦ８４（配列番号３６）から、標準的なＰＣＲ（ｇａｇｇｇｔｇｇｇｔａａｔｃｇｔｔｔｇａＴＴＴＧＡＡＴＧＡＴＴＣＴＴＡＴＡＣＴＣ（配列番号４８）、フォワード、およびａｇｃａａｔｃａｃｃａｃａｃＧＣＧＧＣＣａａａａｇｃａｃｃａｃｃｇａｃｔｃｇｇｔ（配列番号３８）、リバース）を用いて増幅させた。フォワードプライマーは、ＴＥＦ１ＵＴＲ断片の最も３’の２０ヌクレオチドを付加し、リバースプライマーは、ＡＣＴ１ターミネーター断片の最も５’の２０ヌクレオチドを付加する。３’ＨＤＶが隣接したｇＲＮＡターゲティング（配列番号４９）Ｃａｎ１−１をコードするＤＮＡを、ＴＥＦ１ＵＴＲ断片（配列番号２２）およびＡＣＴ１ターミネーター（配列番号３３）断片との融合用のｐＲＦ８４（配列番号３６）から、標準的なＰＣＲ（ｇａｇｇｇｔｇｇｇｔａａｔｃｇｔｔｔｇａＴＴＴＧＡＡＴＧＡＴＴＣＴＴＡＴＡＣＴＣ（配列番号４８）、フォワード、およびａｇｃａａｔｃａｃｃａｃａｃＧＣＧＧＣＣｔｃｃｃａｔｔｃｇｃｃａｔｇｃｃｇａａｇ（配列番号４０）、リバース）を用いて増幅させた。フォワードプライマーは、ＴＥＦ１ＵＴＲ断片の最も３’の２０ヌクレオチドを付加し、リバースプライマーは、ＡＣＴ１断片の最も５’の２０ヌクレオチドを付加する。
【０２０７】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩ発現カセット中へのプロモーター／ｇＲＮＡ／ターミネーター断片のアセンブリを、３つ全ての部分を含有する単一ＤＮＡ分子をもたらす重複末端からの合成を用いて実行した（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５４（３）：１２９−１３３）。特定のコンストラクトを構築するように組み合わせた部分のリストを、表３に見出すことができる。最終のコンストラクト（表３）を、ＰａｃＩ／ＣｌａＩで消化して、ｐＺｕｆＣａｓ９（配列番号１８）の同じ部位中にクローニングした。
【０２０８】
【表３】
2018537106.tif 000007
【０２０９】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩ  ｇＲＮＡ発現カセットの存在および配列を、プライマーＨＹ００９（配列番号５８）、ＨＹ０１０（配列番号５９）、およびＯＮ４７６（配列番号６０）によるサンガー配列決定法を介して確認した。各ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ発現コンストラクト（表２）を含有するプラスミドを用いて、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＣａｎ１−１標的部位（配列番号６１）を標的とした。
【０２１０】
実施例４
Ｃａｓ９によるＣａｎ１−１標的部位のターゲティング、およびＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ発現ｇＲＮＡ  
追加的なプロセシング要素（例えば、ｔＲＮＡプロセシング、リボザイム、またはＣｙｓ４切断部位）を用いずにＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを用いてｇＲＮＡが発現され得るかを試験するために、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を、実施例３に記載したコンストラクトで形質転換して、Ｃａｎ１−１標的部位（配列番号６９）での標的効率をモニタリングした。
【０２１１】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ２０３６２のウラシル要求株を、１００ｎｇのｐＺｕｆＣａｓ９（配列番号１８）、ｐＲＦ３０３（配列番号７０）、ｐＲＦ６１７（配列番号６１）、ｐＲＦ６１６（配列番号６２）、ｐＲＦ６１９（配列番号６３）、ｐＲＦ６１８（配列番号６４）、ｐＲＦ６２３（配列番号６７）、ｐＲＦ６２１（配列番号６８）、またはＤＮＡなしで、標準的な酢酸リチウム形質転換技術を用いて形質転換した。ポスト形質転換細胞を、１．８ｗ／ｖ％Ｂａｃｔｏアガー（Ｔｅｋｎｏｖａ）で固めたＣＭ−ｕｒａ培地上にプレーティングした。プレートを、２５℃にて４８時間インキュベートした。各形質転換由来の３２コロニーを、アルギニンを欠き、かつ６０μｇ／ｍｌ  Ｌ−カナバニンを含有する完全最小培地上にパッチ状にした。Ｌ−カナバニンは、細胞へのアルギニンおよびＬ−カナバニンのインポーターである機能的ＣＡＮ１遺伝子を有する細胞にとって、有毒である。ＣＡＮ１遺伝子中に機能対立遺伝子の消失を含有する細胞は、培地中のＬ−カナバニンの存在に対して、表現型的に耐性を示すこととなり、Ｌ−カナバニンを含有するプレート上でコロニーを形成することとなる。ＣＡＮ１遺伝子の野生型コピーを含有する細胞は、Ｌ−カナバニンを含有する培地上で増殖することができない。Ｌ−カナバニンの作用モードは周知である（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ  Ｇ．Ａ．，Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｍｏｄｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−Ｃａｎａｖａｎｉｎｅ，ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｏｇ  ｏｆ  Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ｔｈｅ  ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ  ５２，１９７７，１５５−１７８）。
【０２１２】
Ｃａｓ９を発現するが、ｇＲＮＡ発現カセットを含有しないｐＺｕｆＣａｓ９（配列番号１８）で形質転換した細胞由来のコロニーは、カナバニン耐性コロニーを生じさせない（図４、表４）。
【０２１３】
【表４】
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【０２１４】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターによって駆動されるｇＲＮＡ発現カセット、およびプロセシング用の５’ＨＤＶリボザイムを含有するｐＲＦ３０３（配列番号７０）で形質転換した細胞由来のコロニーは、比較的純粋な突然変異コロニー（図４）を、８８％の頻度にて生じさせる（表３）。また、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターｇＲＮＡ発現カセットを含有する全てのコンストラクトは、類似した頻度（おおよそ６９％から１００％、表３）でカナバニン耐性細胞を含有するコロニーを生じさせた。しかしながら、ｐＲＦ６１８（配列番号６４）、ｐＲＦ６２１（配列番号６８）、およびｐＲＦ６２３（配列番号６７）を除いて、コロニーは、殆どの場合、Ｌ−カナバニン含有培地上の弱いパッチによって実証されるように、非突然変異細胞であった（図４）。ＴＥＦ１コンストラクトおよびＦＢＡ１コンストラクトは双方とも、発現カセットにおけるｇＲＮＡのＨＤＶドメイン３’の付加によって、向上する。このことは、Ｐｏｌ  ＩＩターミネーターが、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡターゲティングを阻害する配列を残しているかもしれないことを示唆している。加えて、プロモーターの５’ＵＴＲを含有するコンストラクトは、ｇＲＮＡが転写開始部位に直接融合して（図４）、頻度全体に影響を及ぼさない（表４）が、単一の形質転換細胞から生じたコロニー内の突然変異細胞：ＷＴ細胞の比率を増大させるコンストラクトよりも効率的に機能する。
【０２１５】
本実施例に提示したデータは、ｇＲＮＡが、転写開始部位または５’非翻訳領域の末端のいずれかとの融合としての追加的なプロセシング要素なしで、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターから発現され得ることを実証している。ｇＲＮＡとターミネーター配列間へのリボザイムの付加により、ターゲティングは向上する。これらのｇＲＮＡの効率は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターおよび／またはプロセシング要素を用いる現存の発現システムと少なくとも同じくらい良好であるが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターでは考えられない組織および条件特異的ｇＲＮＡ発現の可能性を含む、ｇＲＮＡ発現用のプロモーターの非常に大きなプールをオープンする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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