(57)【要約】メナキノールの固体形態及びメナキノンの化学的又は酵素的還元によってそれらを得る方法を開示する。前記固体形態は、酸化に対して高い安定性を有し、これによりビタミンＫ２が使用される最も一般的な製剤におけるメナキノールの効果的な使用が可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＩＩ）のメナキノールの結晶形態の調製方法であって、
【化３】
2018514507.tif 000008
（式中、ｎは０又は１〜１１の整数である。）、以下：
ａ）式（Ｉ）のメナキノン
【化４】
2018514507.tif 000009
（式中、ｎは上で定義したとおりである。）を水非混和性溶媒、好ましくは酢酸エチル及び亜ジチオン酸ナトリウムの水溶液からなる二相系において還元する工程、
ｂ）好ましくは低圧における蒸発によって前記溶媒を除去する工程、
ｃ）工程ｂ）で得た水相を２５℃未満の温度、好ましくは２℃〜８℃、さらにより好ましくは２℃〜４℃の温度にて冷却及び濾過して、式（ＩＩ）のメナキノールの結晶形態を得る工程
を含む方法。
【請求項２】
工程ａ）が２℃〜７５℃、好ましくは２０℃〜２５℃の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記亜ジチオン酸ナトリウムの溶液が３〜８の範囲のｐＨを有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｃ）で得た前記結晶形態をアスコルビン酸の溶液で洗浄し、続いて４０℃を超えない温度にて前記結晶を乾燥させる工程をさらに含む、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
前記式（ＩＩ）の化合物において、ｎが６である、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
前記式（ＩＩ）の化合物において、ｎが３である、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項７】
図４に示すような、７５℃以上の温度に吸熱ピークを示すＤＳＣプロファイル並びに／又は図６で報告するような、３３４０〜３３５０cm-1におけるブロードなピーク、２９６４、２９１６及び２８５１cm-1における３つの特徴的なピーク並びに１５９９、１５０４、１３２６、１１８２、１１４９、１０９６、１０４６、９８０、９５０及び７５２cm-1におけるシャープなピークを有するＦＴ−ＩＲスペクトルを有する、メナキノール７の結晶形態。
【請求項８】
図３に示すような、７８．４℃以上の温度における吸熱ピーク及び３９〜４５℃の範囲における第２の吸熱事象を示すＤＳＣプロファイルを有する、メナキノール７の結晶形態。
【請求項９】
式（ＩＩ）のメナキノール
【化５】
2018514507.tif 000010
（式中、ｎは、０又は１〜１１の整数である。）の固体形態の調製方法であって、式（Ｉ）のメナキノン
【化６】
2018514507.tif 000011
（式中、ｎは上で定義したとおりである。）の酵素的還元を含む、方法。
【請求項１０】
前記酵素的還元が好ましくはバチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）及びバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）から選択されるバチルス（Bacillus）属の微生物を使用して行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵素的還元がシュードモナス（Pseudomonas）属の微生物、特にシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）又はエシェリヒア（Escherichia）属の微生物、特にエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）又はエンテロバクター（Enterobacter）属の微生物、特にエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）を使用して行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物の懸濁液を、水混和性溶媒中の式（Ｉ）のメナキノンの溶液と接触させる、請求項１０及び１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記還元混合物の凍結乾燥をさらに含む、請求項１０〜１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記還元混合物を濾過し、水及び水非混和性溶媒を含有する二相混合物で希釈し、続いて前記溶媒を蒸発により除去し、このように得た水相を２５℃未満の温度、好ましくは２℃〜８℃、さらにより好ましくは２℃〜４℃の温度にて冷却及び濾過する、請求項１０〜１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜６及び９〜１４の方法から得た生成物又は請求項７及び８の生成物並びに少なくとも１種の賦形剤を含有する、医薬組成物又は栄養補助食品組成物。
【請求項１６】
ビタミンＫに関わる心臓血管障害、骨代謝障害及び炎症状態の治療及び／又は予防のための医薬を調製するための、請求項７若しくは８に記載のメナキノール７の結晶形態又は請求項１〜６に記載の方法によって得たメナキノールの結晶形態又は請求項９〜１４に記載の方法によって得たメナキノールの固体形態の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メナキノール（メナキノンの還元形態）の固体形態であって、酸化に対する特に高い安定性を特徴とし、これによりビタミンＫに関わる心臓血管障害、骨代謝及び炎症過程の予防でのその実際の効果的な使用が可能となる、メナキノールの固体形態に関する。
【背景技術】
【０００２】
メナキノンは、全体として、ビタミンＫ２の成分を構成する分子の一群である。
【０００３】
その最も一般的な酸化形態において、メナキノンは一般式（Ｉ）：
【化１】
2018514507.tif 000002
を有し、式中、ｎは０又は１〜１１の整数である。
【０００４】
メナキノンは、イソプレン単位（式Ｉ中の括弧内に示される分子の部分）の数が異なり、その数は０〜１１の範囲であることが可能であるが、最も一般的な形態は４〜７の範囲であり、それぞれメナキノン−４（ＭＫ−４）、ＭＫ−５、ＭＫ−６及びＭＫ−７に関連付けられる。メナキノンＭＫ−４及びＭＫ−７は最も豊富であり、この２つはダイエット製品市場で入手可能である。
【０００５】
ビタミンＫ２の主な食品源は、卵、乳製品、レバー及び発酵大豆である。
【０００６】
ビタミンＫの治療的使用、特にビタミンＫ２の治療的使用は、いくつかの特許及び科学出版物に記載され、その用途は心臓血管分野（M. K. Shea et al., Am. J. Clin. Nutr.(2009) 89:1-9）から骨代謝（M.H.J.Knapen et al., Osteoporos Int (2013) 24:2499-2507）に及ぶ。ビタミンＫのより最近の用途は、炎症の分野に関する（M.K.Shea et al., Am J Epidemiol. (2008); 167(3):313-320）。
【０００７】
しかし、食物又は栄養補助食品として経口摂取後の種々の形態のビタミンＫの腸吸収は、分子の強い親油性性質のためにあまり高くない。
【０００８】
はるかに親水性が高い分子である、還元形態のメナキノールにおいて、ビタミンＫ２を投与すると、ユビキノンの還元形態である、構造的に類似した分子であるユビキノールについて既に示されているように、ビタミンの吸収が上昇すると考えられる（M. Evans et al., J. Funct. Foods (2009) 1(2); 240）。
【０００９】
メナキノールは、下記一般式（ＩＩ）：
【化２】
2018514507.tif 000003
で表され、式中、Ｎは上で定義したとおりである。
【００１０】
しかしながら、メナキノールは非常に不安定であり、大気中の酸素又は穏やかな酸化剤の作用下で、非常に迅速にメナキノンに再酸化される傾向がある。ビタミンＫ２の還元形態の安定性は、窒素雰囲気中で密封して保存した、単離乾燥固形物の場合と同様に、不活性無酸素環境でも保証が困難である。
【００１１】
有効成分として式（ＩＩ）のメナキノールを含有する医薬組成物及び栄養補助食品組成物は、ＥＰ ２０６０２５６ Ａ１に記載され、そこでは、有機溶媒中のメナキノンの溶液を還元剤の水溶液によって還元し、続いて相を分離して、有機相からメナキノールを回収することによって、メナキノールが調製される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】メナキノンからメナキノールへの還元である。
【図２】実施例１に従って得た還元ビタミンＫ２−（ＭＫ７）のアモルファス形態のＤＳＣサーモグラムである。
【図３】実施例３、４及び５に従って得た還元ビタミンＫ２−（ＭＫ７）（多形体形態）の試料について記録したＤＳＣサーモグラムである。
【図４】実施例２に従って得た還元ビタミンＫ２−（ＭＫ７）試料（高融点多形体）のＤＳＣサーモグラムである。
【図５】実施例６による再結晶後の還元ビタミンＫ２−（ＭＫ７）試料（高融点形態）のＤＳＣサーモグラムである。
【図６】実施例２又は６に従って得た還元結晶性ビタミンＫ２−（ＭＫ７）試料のＦＴＩＲスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の説明
第１の態様において、本発明は、ビタミンＫ２が使用される最も一般的な製剤においてメナキノールを有効に使用できるようにする、標準条件下及び結晶ストレス条件下で、酸化に対する驚くべき安定性を有するメナキノールの固体形態に関する。
【００１４】
前記形態は、図１に示すように、メナキノンをメナキノールに還元することによって得られる。
【００１５】
本発明のこの第１の態様の一実施形態において、固体形態は、式（Ｉ）のメナキノンを亜ジチオン酸ナトリウムで還元し、続いて水から結晶化させることによって得られる、式（ＩＩ）のメナキノールの結晶形態である。
【００１６】
還元は、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルテトラヒドロフラン、ジクロロメタン又はジクロロエタン、好ましくは酢酸エチルなどの水非混和性溶媒及び好ましくは３〜８の範囲のｐＨを有する亜ジチオン酸ナトリウム水溶液からなる二相系で行われる。還元は、２℃〜７５℃、好ましくは２０℃〜２５℃の範囲の温度にて行われる。水溶液中の亜ジチオン酸ナトリウムの濃度は、好ましくは０．５〜１０重量／体積％の範囲であるが、二相の水＋溶媒系の濃度は、好ましくは１／１０〜１／１００の範囲であり、前記比はビタミンの重量と総体積（溶媒＋水）との比である。
【００１７】
還元の終了時に、溶媒を蒸発により、好ましくは低圧蒸発によって除去して、固体を含有する水性懸濁液であって、固体と水との比が１／５〜１／１００の範囲であり得る水性懸濁液を得て、２５℃未満の温度、好ましくは２℃〜８℃、最も好ましくは２℃〜４℃の温度まで冷却することによって、メナキノールを水相から結晶化させる。
【００１８】
次いで、結晶化と同じ温度で操作して、濾過によって、本発明によるメナキノールの固体結晶形態を単離する。
【００１９】
濾過後に、固体をアスコルビン酸の１〜１０％溶液で洗浄し、４０℃を超えない温度で最終乾燥を行うことができる。
【００２０】
結晶化は、他の塩の非存在下で、又は水相に溶解したＮａＣｌ １M以下の存在下で行うことができる。
【００２１】
このように得たメナキノール（ＩＩ）の結晶形態は、エタノールに溶解させ、２５℃未満の温度、好ましくは２℃〜８℃の範囲、さらにより好ましくは２℃〜４℃の範囲の温度にてアスコルビン酸の水溶液を添加することにより再結晶させることによって、再結晶させることができる。
【００２２】
本発明の前記第１の態様の特定の実施形態において、メナキノールの結晶形態は、メナキノール７（式（ＩＩ）の化合物、式中、ｎ＝６）及びメナキノール４（式（ＩＩ）の化合物、式中、ｎ＝３）の両方に関する。
【００２３】
特に、本発明は、例えば図４に示すように、吸熱ピークが７５℃以上の温度に存在するＤＳＣプロファイル、及び、図６に示すように、代表的な吸収バンド：３３４０〜３３５０cm-1におけるブロードなピーク、２９６４、２９１６、２８５１における３つの代表的なバンド、１５９９、１５０４、１３２６、１１８２、１１４９、１０９６、１０４６、９８０、９５０及び７５２cm-1におけるシャープなピークが存在する、ＦＴＩＲスペクトルを有する、メナキノール７の還元結晶形態に関する。
【００２４】
本発明は、例えば図３に示すように、７８．４℃以上の温度における吸熱ピーク及び３９〜４５℃の範囲における第２の吸熱事象を有するＤＳＣプロファイルを有するメナキノン７を還元することによって得られる、メナキノール７の多形体形態の混合物にも関する。
【００２５】
本発明の前記第１の態様の別の実施形態において、式（ＩＩ）のメナキノールの固体形態は、式（Ｉ）のメナキノンを酵素的に還元することによって得られる。
【００２６】
この目的のために、バチルス（Bacillus）属の微生物の細胞懸濁液を使用することができ、特に、前記微生物は、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）及びバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）から選択することができ、又はシュードモナス（Pseudomonas）属の微生物、特にシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）；若しくはエシェリヒア（Escherichia）属の微生物、特にエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）種；若しくはエンテロバクター（Enterobacter）属の微生物、特にエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）を使用することができ、これらは従来の方法によって調製される。通例、微生物の細胞は、２〜６g/lの濃度のグルコースを添加したＬＢ ２ｘなどの好適な培養培地中、２８〜３７℃で増殖させる。増殖終了時に、培養ブロスを遠心分離し、細胞をリン酸緩衝液 ｐＨ７．４で洗浄し、０．５〜２．５g/lのコハク酸ナトリウム及び２〜６g/lのグルコースを添加したリン酸緩衝液 ｐＨ７．４中で再懸濁して、５〜１５g/lの最終濃度で細胞懸濁液を得る。
【００２７】
酵素的還元は、通例、好ましくは１０g/lの濃度のこのように得た細胞懸濁液４体積量を、通例０．６〜１．４g/lの濃度の水混和性溶媒中のメナキノンの溶液１体積量と混合することによって行う。水混和性溶媒は、好ましくは、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトン、ＴＨＦ、メチル−ＴＨＦ、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド及びジメチルスルホキシドの群から選択される。このように調製した反応混合物を撹拌下で光から保護しながら、２８〜３２℃、好ましくは３０℃にて、使用する細胞濃度に応じて、通例２〜１２時間の範囲のインキュベーション時間にわたってインキュベーションする。インキュベーション終了時に、本発明によるメナキノールの固体形態を含む反応塊を凍結し、凍結乾燥する。
【００２８】
このように得た凍結乾燥物は、水及び上記の水非混和性有機溶媒の少なくとも１つを含有する二相混合物に再懸濁させ、濾過して、前記濾液を上に記載し、実施例２でさらに説明する結晶化によって回収することができる。
【００２９】
あるいは、還元ビタミンＫ２を含有する反応塊を濾過して、水及び上記の水非混和性有機溶媒の少なくとも１つを含有する二相混合物で希釈し、上に記載し、実施例２で説明する結晶化によって回収することができる。
【００３０】
本発明は、記載した固体形態を含有する医薬組成物又は栄養補助食品組成物にも関する。
【００３１】
本発明は、ビタミンＫに関わる心臓血管及び骨代謝障害並びに炎症状態の治療及び／又は予防のための医薬を調製するための、上記固体形態の使用にも関する。
【００３２】
本発明による一般式（ＩＩ）の還元固体形態は、Ｃａｃｏ−２細胞の単層に対して実施したインビトロ吸収実験によって示唆されるように、対応する一般式（Ｉ）のメナキノンよりも高いバイオアベイラビリティを有する。
【００３３】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【００３４】
実施例１（比較）：還元アモルファスビタミンＫ２−（ＭＫ７）の取得
アッセイ値＞９７％であるビタミンＫ２−（ＭＫ７）０．２５ｇを窒素下でＴＨＦ ２０mlに溶解させる。前記溶液に亜鉛０．２６ｇを加え、窒素雰囲気下に維持した反応塊を加熱還流する。該溶液をＨＰＬＣで分析して、ビタミンが完全に還元されたことを確認する。２３時間後、反応塊を濾過して亜鉛粉末を除去し、濾液を真空下にてその場で濃縮乾固する。この方法により、淡ピンク色の油０．２６ｇが得られ、この油は、時間が経つと凝固してろう状の固体を形成する傾向がある。ＨＰＬＣ分析は、９６．５％還元された（酸化＝３．５％）ビタミンＫ２−（ＭＫ７）に関連するクロマトグラフィー純度を示す。
【００３５】
対応する安定性試験を表1に示す。
【００３６】
表１：ビタミンＫ２−（ＭＫ７）の低融点多形体（アモルファス試料）の試料の安定性データ。データは、還元形態の初期値のパーセンテージとして表される。
【表１】
2018514507.tif 000004
【００３７】
図２は、本実施例に従って得た、アモルファスビタミンＫ２−（ＭＫ７）の試料について記録されたＤＳＣサーモグラムを示す。
【００３８】
実施例２：還元結晶性ビタミンＫ２−（ＭＫ７）の取得
アッセイ値＞９７％であるビタミンＫ２−（ＭＫ７）５ｇを酢酸エチル２５０mlに溶解させる。
【００３９】
硫酸でｐＨ＝４に調整した亜ジチオン酸ナトリウム水溶液（２５０ml、亜ジチオン酸ナトリウム４．７６ｇ）を前記溶液に添加し、窒素下で激しく撹拌しながら維持する。該溶液をＨＰＬＣで分析して、ビタミンが完全に還元されたことを確認する。反応は３時間後に完了する。反応塊を、水性懸濁液が得られるまで真空下で４０℃にて濃縮する。前記懸濁液を４℃に冷却し、次いでブフナー漏斗で濾過する。ケーキをアスコルビン酸１％水溶液で洗浄して、湿潤固体を得て、これを真空下（８５−１０mbar）４０℃にて一晩乾燥させる。乾燥後に還元ビタミンＫ２−（ＭＫ７）４ｇを回収する。ＨＰＬＣ分析は、９８．５％還元された（酸化＝２．５％）ビタミンＫ２−（ＭＫ７）に関連するクロマトグラフィー純度、ＫＦ＝５．０％を示す。
【００４０】
安定性試験を表２に示す。
【００４１】
表２：還元形態の初期値のパーセンテージとして表した、ビタミンＫ２−（ＭＫ７）の高融点結晶多形体の試料の安定性データ
【表２】
2018514507.tif 000005
【００４２】
実施例３：還元ビタミンＫ２−（ＭＫ７）（多形体の混合物）の取得
アッセイ値＞９７％であるビタミンＫ２−（ＭＫ７）１ｇを酢酸エチル６０mlに溶解させる。
【００４３】
硫酸でｐＨ＝４に調整した亜ジチオン酸ナトリウム溶液（水６０ml、亜ジチオン酸ナトリウム２．４ｇ）をこの溶液に添加し、窒素下で激しく撹拌しながら維持する。該溶液をＨＰＬＣで分析して、ビタミンが完全に還元されたことを確認する。反応は３時間後に完了する。反応塊を分液漏斗に入れ、二相を分離し、上相を窒素下で維持する。前記相をロータリーエバポレーターに移し、直ちに真空下に置き、乾燥するまで溶媒を除去する（４０℃、１０mbar、油状残渣が得られるまで）。アスコルビン酸の水溶液１００mlを油状残渣に添加して、混合物を窒素下で激しく撹拌しながら、２０〜２５℃の温度にて５〜３０分間維持する。次いで混合物をブフナー漏斗で室温（２０〜２５℃）にて濾過する。ケーキをアスコルビン酸１％水溶液で洗浄して、還元ビタミンＫ２−（ＭＫ７）０．５ｇを得る。ＨＰＬＣ分析は、８１．６％還元された（酸化＝１８．４％）ビタミンＫ２−（ＭＫ７）に関連するクロマトグラフィー純度を示す。
【００４４】
ＤＳＣ分析により、４３．７℃及び７６．３℃における２つの吸熱ピークの存在が明らかとなる。
【００４５】
実施例４：還元ビタミンＫ２−（ＭＫ７）（多形体の混合物）の取得
ビタミンＫ２−（ＭＫ７）１ｇを実施例１に記載の手順により還元する。水１００mlを油状残渣に添加し、反応塊を撹拌下及び窒素下で２０〜２５℃にて維持する。次いで、形成された懸濁液（濃ピンク色）を窒素雰囲気下で濾過し、還元ビタミンＫ２−（ＭＫ７）（ビタミンＫ２−（ＭＫ７）としてのＨＰＬＣ純度８１．６％、酸化１８．４％）に相当する固体を得る。
【００４６】
安定性試験を表３に示す。
【００４７】
表３：ビタミンＫ２−（ＭＫ７）の多形体形態の混合物の試料の安定性データ
【表３】
2018514507.tif 000006
【００４８】
ＤＳＣ分析により、４３．６℃及び７８．４℃における２つの吸熱ピークの存在が検出される（図３）。
【００４９】
実施例５：還元ビタミンＫ２−（ＭＫ７）（多形体の混合物）の取得
ビタミンＫ２−（ＭＫ７）１ｇを実施例２に記載の手順により還元する。還元が完了したら、反応塊を真空下（１０mbar残留、内部２５℃）で濃縮し、形成された乳白色の懸濁液を次にブフナー漏斗で濾過して、アスコルビン酸１％溶液で洗浄する。得られた固体を真空下、４０℃にて一晩（４０℃、５mbar）乾燥させて、淡ピンク色の固体０．７６ｇを得る。ＨＰＬＣ分析は、９３．７％還元された（酸化＝６．３％）ビタミンＫ２−（ＭＫ７）に関連するクロマトグラフィー純度、ＫＦ＝３．０％を示す。
【００５０】
ＤＳＣ分析により、４３．７℃及び７９．８℃における２つの吸熱ピークの存在が検出される。
【００５１】
実施例６
実施例２に記載の手順によって得たビタミンＫ２−（ＭＫ７）２ｇ（Ｒｅｄ  Ｖｉｔ純度＝９６．５％）を無水エタノール２mlに溶解させる。この溶液に１０％アスコルビン酸水溶液（１００ml）を滴加し、窒素下２〜８℃にて撹拌しながら維持する。
【００５２】
このようにビタミンＥが沈殿し、次に形成された懸濁液を窒素雰囲気下で濾過して、ビタミンＫ２−（ＭＫ７）（ビタミンＫ２−（ＭＫ７）としてのＨＰＬＣ純度９６．３％、酸化４．７％）に相当する固体を得る。
【００５３】
実施例７
ビタミンＫ２−（ＭＫ７）０．３ｇを実施例２に記載の手順により還元する。反応の終了時に、得られた固体をエタノール（１．５ml）に再溶解させて、５℃まで冷却する。沈殿した固体を、窒素下５℃にて１２時間維持する。次に沈殿物を濾過して、真空下４０℃にて乾燥させて、黄色がかった白色の固体０．２ｇ（還元ビタミンにおける純度＝１０．７％、酸化８８．７％）を得る。
【００５４】
実施例８
バチルス・サブティリス細胞を、グルコース（３g/l）を添加したＬＢ ２ｘ培地（カゼイントリプトン２０g/l、酵母抽出物１０g/l、塩化ナトリウム１０g/l）中で３０℃にて一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させた。増殖終了時に、培養ブロスを遠心分離し、細胞を５０mM ｐＨ７．４のリン酸緩衝液で洗浄し、コハク酸ナトリウム（１g/l）及びグルコース（５g/l）を添加した５０mM ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中に再懸濁させて、１０g/lの最終濃度の細胞懸濁液を得た。
【００５５】
懸濁液８mlをＤＭＳＯ中で１g/lの濃度で調製したビタミンＫ２−ＭＫ７の溶液２mlと混合した。このように調製した反応混合物に不活性窒素を流し、撹拌しながら３０℃にて２４時間インキュベーションした。メナキノンからメナキノールへの還元をＨＰＬＣ分析によって確認した。還元形態のビタミンＫ２−（ＭＫ７）の最大濃度は、４時間のインキュベーション後に検出されたが、存在するメナキノンの９３％に相当する。
【００５６】
インキュベーションの終了時に、反応塊を凍結し、凍結乾燥した。
【００５７】
実施例９
実施例８に従って得たビタミンＫ２−（ＭＫ７）２０mg-actを含有する反応塊（１００ml）をブフナー漏斗で濾過してバイオマスを除去した。ＤＭＳＯ（８／２）を含有する水性混合物２０mlでケーキを洗浄し、先の濾液と合わせる。合わせた濾液に酢酸エチル１０mlを窒素下で添加する。得られた溶液を真空下５〜１０mbarにて濃縮して水性懸濁液を得て、これを２〜８℃まで冷却する。３０分後、懸濁液を撹拌しながら濾過し、得られた固体を真空下（１０mbar残留）４０℃にて乾燥させる。回収した固体（１２mg）に対して行ったＨＰＬＣ分析によって、還元ビタミンにおける８２％の純度及び８３．１℃における吸熱ピーク（ＤＳＣ）の存在が示される。
【００５８】
実施例１０：インビトロでのＣａｃｏ−２細胞の細胞単層への還元又は酸化ビタミンＫ２−（ＭＫ７）の吸収
Ｃａｃｏ−２ヒト腺癌細胞を、マイクロプレートのウェルに挿入された透過性インサート上で培養して、頂部区画と基底外側区画との間にバリア機能を有するコンフルエント単層を形成した。単層の完璧な完全性は、低透過性の化合物であるルシファーイエローが通過しないことの試験によって判定した。還元形態（メナキノール）又は酸化形態（メナキノン）のどちらかのビタミンＫ２−（ＭＫ７）の試料をエタノールに溶解させて、頂部区画に適用し、１％エタノール溶液をインキュベーション緩衝液に添加した。インキュベーションウェル中の最終溶液を１００μMのビタミンで固定した。
【００５９】
インキュベーション期間の終了時に、細胞層をインサートから除去し、ホモジナイズして、ホモジネートを遠心分離した。上清中に存在するビタミンの量をＨＰＬＣで測定した。次いで、遠心分離ペレットを水１ｍlに再懸濁させて、イソプロパノール１．５ml及びヘキサン２．５mlを懸濁液に添加した。撹拌後、形成された有機相をビタミンＫ２（ＭＫ７）の濃度について再びＨＰＬＣにより分析した。２つの値の合計を用いて、細胞層によって内部移行したビタミンの量を算出した。
【００６０】
表４に示すように、ホモジネート１ｇ当たりのビタミンのμg数として表される実測値は、還元形態のビタミンＫ２（ＭＫ７）を適用した場合、わずかにではあるが顕著に高い取込みを示す。
【００６１】
表４：インビトロでのＣａｃｏ−２細胞の細胞単層への還元又は酸化ビタミンＫ２−（ＭＫ７）の吸収
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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