(57)【要約】  本発明は、血液癌の治療に使用するための、少なくとも1つの薬剤と減少させたカロリー摂取の組みあわせに関する。特に前記薬剤は、CD20インヒビター、ブルトン型チロシンキナーゼインヒビター、ホスホイノシチド３キナーゼインヒビター、クラスI及び/又はクラスIIヒストンデアセチラーゼインヒビター、非タキサンレプリケーションインヒビター、あるいはプロテアソームインヒビターである。前記組み合わせは、前記薬剤に対して癌細胞を増感させる一方、前記薬剤により誘導される毒性から正常細胞を保護する点で有益である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における血液癌の治療に使用するための、減少させたカロリー摂取、ならびにCD20インヒビター、ブルトン型チロシンキナーゼインヒビター、ホスホイノシチド３キナーゼインヒビター、クラスI及び/又はクラスIIヒストンデアセチラーゼインヒビター、非タキサンレプリケーションインヒビター又はプロテアソームインヒビターから選択される薬剤であって、
前記減少させたカロリー摂取が、24時間から190時間の間継続し、
前記減少させたカロリー摂取が、10%から100%減少させた1日当たりのカロリー摂取である、減少させたカロリー摂取ならびに薬剤。
【請求項２】
前記CD20インヒビターが、リツキシマブ、アフツズマブ、ブロンツヴェトマブ、FBTA05、イブリツモマブチウキセタン、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、サマリズマブ、トシツモマブ及びヴェルツスマブからなる群から選択され、
前記ブルトン型チロシンキナーゼインヒビターが、イブルチニブ、アカラブルチニ、ONO-4059 (GS-4059と再命名)、スペブルチニブ(AVL-292, CC-292)及びBGB-3111から選択され、
前記ホスホイノシチド３キナーゼインヒビターが、イデラリシブBEZ235 (NVP-BEZ235, ダクトリシブ)、ピクチリシブ (GDC-0941)、LY294002、CAL-101 (イデラリシブ, GS-1101)、BKM120 (NVP-BKM120, ブパルリシブ)、PI-103、NU7441 (KU-57788)、IC-87114、ウォルトマニン、XL147アナログ、ZSTK474、アルペリシブ (BYL719)、AS-605240、PIK-75、3-メチルアデニン(3-MA)、A66、ヴォクスタリシブ (SAR245409, XL765)、PIK-93、オミパリシブ(GSK2126458, GSK458)、PIK-90、PF-04691502 (T308)、AZD6482、アピトリシブ(GDC-0980, RG7422)、GSK1059615、デュヴェリシブ (IPI-145, INK1197)、ゲダトリシブ(PF-05212384, PKI-587)、TG100-115、AS-252424、BGT226 (NVP-BGT226)、CUDC-907、PIK-294、AS-604850、BAY 80-6946 (コパンリシブ)、YM201636、CH5132799、PIK-293、PKI-402、TG100713、VS-5584 (SB2343)、GDC-0032、CZC24832、ヴォクスタリシブ (XL765, SAR245409)、AMG319、AZD8186、PF-4989216、ピララリシブ(XL147)、PI-3065TOR、HS-173、クエルセチン、GSK2636771、CAY10505及びラパマイシンからなる群から選択され、
前記クラスI及び/又はクラスIIヒストンデアセチラーゼインヒビターが、ロミデプシン、ヴォリノスタット、チダミド、パノビノスタット、ベリノスタット (PXD101)、ヴァルプロ酸 (ヴァルプロ酸Mgとして)、モセチノスタット(MGCD0103)、アベキシノスタット(PCI-24781)、エンチノスタット(MS-275)、レスミノスタット (4SC-201)、ギヴィノスタット(ITF2357)、クイシノスタット (JNJ-26481585)、HBI-8000、(ベンズアミドHDI)、ケヴェトリン及びギヴィノスタット(ITF2357)からなる群から選択され、
前記非タキサンレプリケーションインヒビターが、ヴィンクリスチン、エリブリン、ヴィンブラスチン、ヴィノレルビン及びテニソピドからなる群から選択され、
前記プロテアソームインヒビターが、ボルテゾミブ、ラクタシスチン、ディスルフィラム、マリゾミブ(サリノスポラミドA)、オプロゾミブ(ONX-0912)、デランゾミブ (CEP-18770)、エポキソミシン、MG132、ベータ−ヒドロキシベータメチルブチレート、カルフィルゾミブ、イクサゾミブ、エポネマイシン、TMC-95、フェルタミドB、MLN9708及びMLN2238からなる群から選択される、
請求項１に記載の使用のための減少させたカロリー摂取ならびに薬剤。
【請求項３】
前記薬剤が、ロミデプシン、ベリノスタット、ボルテゾミブ、リツキシマブ、ヴィンクリスチン及びエリブリンからなる群より選択される、請求項１又は２に記載の使用のための減少させたカロリー摂取ならびに薬剤。
【請求項４】
前記減少させたカロリー摂取が、50から100%、好ましくは85から100%もしくは10から85％減少させた1日当たりのカロリー摂取である、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用のための減少させたカロリー摂取ならびに薬剤。
【請求項５】
前記哺乳動物が、20から60%の含量のモノ不飽和及び/又はポリ不飽和脂肪、5から10%の含量のタンパク質、及び20から50%の含量の炭水化物を有する食物を与えられる、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のための減少させたカロリー摂取ならびに薬剤。
【請求項６】
カロリー摂取を減少する期間が、48から168時間、好ましくは120時間である、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用のための減少させたカロリー摂取ならびに薬剤。
【請求項７】
放射線治療、あるいはブルトン型チロシンキナーゼインヒビター、ホスホイノシチド３キナーゼインヒビター、クラスIヒストンデアセチラーゼインヒビター、クラスIIヒストンデアセチラーゼインヒビター、CD20インヒビター、非タキサンレプリケーションインヒビター、タキサンレプリケーションインヒビター、アルキル化剤、プロテアソームインヒビター、抗炎症剤、及び他の薬剤から選択される少なくとも１つのさらなる薬剤が投与される、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用のための減少させたカロリー摂取ならびに薬剤。
【請求項８】
前記アルキル化剤が、シクロホスファミド、ゲムシタビン、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、モノ官能性アルキレーター、ダカルバジン (DTIC)、ニトロソウレア及びテモゾロミドからなる群から選択され、
前記タキサンレプリケーションインヒビターは、パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン及びタキソテールからなる群から選択され、
前記抗炎症剤は、非ステロイド抗炎症剤、デキサメタゾン、プレドニゾン及びコルチゾン、又はそれらの誘導体から選択され、
前記別の薬剤は、クルクミン、Ｌ−アスコルビン酸、EGCG及びポリフェノンから選択される、
請求項７に記載の使用のための減少させたカロリー摂取ならびに薬剤。
【請求項９】
前記哺乳動物に下記のものを投与することを含む、請求項７又は８に記載の使用のための減少させたカロリー摂取ならびに薬剤：
−少なくとも1つのCD20インヒビター及び少なくとも1つのプロテアソームインヒビター、又は
−少なくとも1つのCD20インヒビター及び少なくとも1つのクラスI及び/又はクラスIIヒストンデアセチラーゼインヒビター、又は
−少なくとも1つのクラスI及び/又はクラスIIヒストンデアセチラーゼインヒビター及び少なくとも1つのプロテアソームインヒビター、又は
−少なくとも1つのクラスI及び/又はクラスIIヒストンデアセチラーゼインヒビター及び少なくとも1つのアルキル化剤。
【請求項１０】
CD20インヒビターがリツキシマブであり、プロテアソームインヒビターがボルテゾミブであり、クラスI及び/又はクラスIIヒストンデアセチラーゼインヒビターがベリノスタット又はロミデプシンであり、かつアルキル化剤がシクロホスファミドである、請求項９に記載の使用のための減少させたカロリー摂取ならびに薬剤。
【請求項１１】
以下のものからなる群より選択される組み合わせを哺乳動物に投与することを含む、請求項７に記載の使用のための減少させたカロリー摂取ならびに薬剤：
−ロミデプシン及びベリノスタット；
−ボルテゾミブ及びロミデプシン；
−ボルテゾミブ及びベリノスタット； 
−ボルテゾミブ及びリツキシマブ；
−シクロホスファミド及びロミデプシン；
−シクロホスファミド及びボルテゾミブ；
−シクロホスファミド及びベリノスタット；
−ボルテゾミブ、ロミデプシン及びベリノスタット；
−シクロホスファミド、ロミデプシン及びベリノスタット；
−シクロホスファミド、ボルテゾミブ及びベリノスタット；ならびに
−シクロホスファミド、ボルテゾミブ、ベリノスタット及びロミデプシン。
【請求項１２】
前記血液癌が、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫からなる群より選択される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の使用のための減少させたカロリー摂取ならびに薬剤。
【請求項１３】
白血病が慢性リンパ球白血病(CLL)である、請求項１２に記載の使用のための減少させたカロリー摂取ならびに薬剤。
【請求項１４】
請求項１から３のいずれか一項に規定される少なくとも1つの薬剤で血液癌細胞を治療するインビトロ方法であって、
−血清又はグルコース濃度を減少させた培地中で癌細胞を培養する工程；及び
−前記少なくとも1つの薬剤で癌細胞を処理する工程
を含み、培地中の血清濃度は10%未満である、あるいは培地中のグルコース濃度は1g/l未満である、方法。
【請求項１５】
薬剤に血液癌細胞を増感させる一方で非癌細胞に対する薬剤毒性を最小化するための方法に使用するための、減少させたカロリー摂取、ならびにCD20インヒビター、ブルトン型チロシンキナーゼインヒビター、ホスホイノシチド３キナーゼインヒビター、クラスIヒストンデアセチラーゼインヒビター、クラスIIヒストンデアセチラーゼインヒビター、非タキサンレプリケーションインヒビター、又はプロテアソームインヒビターからなる群より選択される前記薬剤であって、
前記減少させたカロリー摂取は、24から190時間の間継続し、前記減少させたカロリー摂取は、1日当たりカロリー摂取を10から100%減少させる、
減少させたカロリー摂取ならびに薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液癌の治療において使用するための、少なくとも1つの薬剤と、カロリー摂取減少の組み合わせに関する。特に薬剤は、CD20インヒビター、ブルトン型チロシンキナーゼインヒビター、ホスホイノシチド３キナーゼインヒビター、クラスI及び/又はクラスIIヒストンデアセチラーゼインヒビター、非タキサンレプリケーションインヒビター(non-taxane replication inhibitor)、あるいはプロテアソームインヒビターである。組み合わせは、前記薬剤に対して癌細胞を感作させる一方、前記薬剤により誘導される毒性から正常細胞を保護する点で有益である。
【背景技術】
【０００２】
CLLは、最も一般的なヒト白血病である
西洋世界において、年間10万人当たり約20個の新たなケースのリンパ腫／白血病が診断されている1。約95%のリンパ球白血病がＢ細胞起源であり、残りがＴ細胞悪性腫瘍である。約15個の型のＢ細胞白血病が、現在の世界保健機関の白血病分類表に列記されている2。
【０００３】
慢性リンパ球白血病(CLL)は、最も一般的なヒト白血病である。それは、米国で各年約12000の新たなケースの原因となり、全ての白血病のケースの3分の1を占める。ほとんどのCLL患者は、比較的軽症の兆候を数年間示して生存することができる。悪性CLL白血病細胞は、形態学的に成熟した外見を示し、典型的にはインビトロ(in vitro)で増殖しない3,4。しかし、それらは血液、骨髄及びリンパ球組織中に漸進的に蓄積する。疾患が末梢血及び骨髄に関連する場合、それはCLLと呼ばれ、リンパ節又は他の組織が、CLLと同一の形態及び免疫表現型の特徴を有する細胞に浸潤され、疾患の白血病の兆候がまだ表れない場合、それは小リンパ球性リンパ腫(SLL)又は前白血病性モノクローナルB細胞リンパ球増加症(MBL)と呼ばれる5。CLLの診断には、末梢血1マイクロリットル中に少なくとも5000個のＢリンパ球の存在が必要である。Ｂ-CLLクローンの決定的な特徴は、CD19、CD20、CD5及びCD23の共発現である。表面免疫グロブリン、CD20及びCD79のレベルは、正常Ｂ細胞と比較して低いのが特徴である6。
【０００４】
CLLは、成熟Ｂ細胞のクローン性富化に由来し、抗原性刺激の特徴を示し、CD5細胞表面抗原を発現する。時間が経過し、かつ未知の分子事象のために、CLLは、共起表現前リンパ球性形質転換(prolymphocytoid transformation)により特徴づけられる攻撃性の形態に進行する場合がある。CD5陽性微小細胞は、CD5発現がしばしば失われている、クローン性の関連した巨大な要素（共起表現前リンパ球(prolymphocytes)）により徐々に置換される。有効な治療が利用できないため、患者の予後は厳しくなり、生存は短くなる7,8。
【０００５】
ほとんどの組織における自己更新能力は、細胞がその分化の正常なステージを進行するにつれて失われる。しかしリンパ系では、自己更新能力は、一生にわたる免疫記憶を維持するために、記憶リンパ球ステージまで保存される9。体細胞高突然変異(somatic hyper-mutation)は、Ｂ細胞悪性腫瘍が生じる分化ステージに対するマーカーとして機能する。一般的に、体細胞高突然変異の存在は、胚中心(germinal center)もしくは胚中心後(post germinal center)Ｂ細胞に生じた腫瘍を同定する。リンパ性悪性疾患、白血病又はリンパ腫において、細胞は通常、モノクローナル免疫グロブリン又はＴ細胞受容体遺伝子再構成を有し、細胞がリンパ系にゆだねられた後に、リンパ性悪性疾患幹細胞が生じることを示唆する。
【０００６】
CLLは、ナイーブから記憶Ｂ細胞への移行の間に胚中心で通常起こる、イムノグロブリン重鎖(IGHV)遺伝子の可変領域中における体細胞高突然変異の存在に基づいて、2つのサブグループに分けられる。変異BCRを有するCLLのグループは、変異なしBCRを有するものよりも、より好ましい予後を有する10,11。
【０００７】
細胞遺伝学により検出可能な最も一般的な染色体異常は、13q (55%)、11q (18%)、トリソミー12 (12-16%)及び17p (8%)における欠失を含む12,13。しかし、非ホジキンリンパ腫(NHL)のほとんどの他のサブタイプと比べて、CLLは、1ケースあたりより低い頻度の遺伝学的突然変異を示し、染色体欠失(13q14、ATM及びTP53)又は増幅(染色体12のトリソミー)をほとんどの場合含む、異なる範囲の遺伝学的異常を示す14,15。おそらく遺伝学的異常（例えば、mir-15a/16-1の欠失によるBCL2及びMCL1）の直接的な結果として、正常なリンパ球と比較してCLL腫瘍細胞では多数の遺伝子が過剰発現している。最後に、ゲノムワイドな関連研究により、Ｂ細胞発生過程における既知の制御因子であるIRF4遺伝子17における単一ヌクレオチド多形を含む、家族性CLLに対する複数の感受性部位が同定されている16。
【０００８】
CLLにおけるHSCは、疾患病態に関連しており、増大した数のポリクローナルプロＢ細胞を生成する異常な前白血病細胞として働く。結果生じる成熟Ｂ細胞は、自己抗原により選択されるようであり、モノもしくはオリゴクローナルＢ細胞集団を生じる。これは、Ｂ細胞抗原レセプター(BCR)シグナルが、CLLの病態の中心であり、ポリクローナルプロＢ細胞からモノもしくはオリゴクローナルＢ細胞を生成する結果となることを示唆する。Ｂ細胞レセプター(BCR)は、正常Ｂ細胞及びほとんどのＢ細胞悪性腫瘍にとり生存の鍵であり、有糸分裂前要素である。BCR活性化は、大量の異なる相互接続経路を介して、最終的にシグナル伝達を維持する事象のカスケードを引き起こす18。LYNキナーゼ(SRCファミリー)は、PI3K/AKT/mTOR及びNF-κB/MAPK経路の両方に対するBCR活性化シグナルに応答する。最終的には、サイクリンD2及びMYCのような細胞周期のキー制御因子、又はMCL１及びBIMのような重要な生存因子の制御に至る19-21。BCRシグナルの伝達は、多数のキナーゼ、ホスファターゼ及びアダプタータンパク質が関与する複雑なプロセスであり、潜在的な治療標的を示しうる。実際に、複数のチロシンキナーゼインヒビターが開発されており、例えば、LYN作用と下流NF-κB/MAPK経路活性化の間の鍵となる接続因子であるブルトン型チロシンキナーゼ(Burton’s Tyrosin Kinase (BTK))を強力かつ不可逆的に阻害するイブルチニブ(Ibrutinib (PCI-32765))のように、臨床治療においてすでに使用されている22-24。
【０００９】
絶食模倣食（Fasting-Mimicking Diet、FMD）は、CLL細胞死を促進する
過去60年間、化学療法は広範囲の悪性腫瘍に対する主要な医学的治療法であった25。不幸なことに、これらの薬剤は、主に細胞毒性薬剤であり、あまり高い選択性を示さず、本発明者は、正常細胞もまた重篤な化学療法に依存した損傷を経験し、骨髄抑制、疲労感、吐き気、下痢、ある場合は死亡さえも含む、深刻な副作用に至ることを知る。特定の癌細胞を特異的に標的とするよう設計された、先進治療の開発に努力が注がれているにもかかわらず、副作用は、細胞毒性薬剤、ならびに広範囲の抗体に基づく治療に伴い続け、選択的に悪性腫瘍細胞を除去するための根源的に新しい戦略に対する必要性が潜在的に存在する。
【００１０】
近年、本発明者は、多くのタイプの癌細胞の重要な弱点が、絶食もしくはFMDに対応することができないことを示す発見を、より数多く蓄積している26。健康な細胞が、維持及びストレス応答メカニズムを活性化することにより栄養及び成長因子除去に対応する一方、癌細胞はしばしば、異常な癌遺伝子活性化の主な結果としてそのようなことができない26,27。成長促進シグナル経路及びタンパク質合成の活性を低下させる代わりに、飢餓癌細胞は両方のプロセスを加速化し、最終的に代謝の平衡異常に直面し、酸化ストレス、カスパーゼ活性化、DNA損傷及びアポトーシスを行うことになる26。
【００１１】
臨床前モデルにおいて、本発明者の研究室は、絶食模倣食(FMD)がそれ自体腫瘍の成長を遅らせるために十分であり、ある場合には化学療法の効果に一致し、化学療法及び放射線療法と組み合わせて適用した場合、それらと相乗効果を発揮することを以前示した26,28,29。FMDの間に化学治療薬を投与する別の利点は、その全体の耐性が増大しているようであり、潜在的に、重篤な毒性を伴わずに高用量の化学治療薬を投与することが可能となることである27,30,31。
【００１２】
複数の臨床試験において、化学治療を行っている患者における絶食の効果又は絶食模倣食の効果が現在試験されている（NCT01304251、NCT01175837、NCT00936364、NCT01175837、NCT01802346、NCT02126449）。予備的な臨床観察により、このタイプの食事中断は、可能であり、安全に導入できることが示されている31。ごく最近、白血球減少のリスクの低下という点で、化学療法を受ける患者におけるFMDの潜在的に有益な効果の証拠が報告されている30。
【００１３】
概説すると、楽観的な材料となる試験により、FMDが、人間において実行可能かつ安全であり、また化学療法から患者を保護しうることが示される。さらなる臨床試験が必要であるが、FMD及び他の類似戦略は、現在の薬物に基づく治療を増強し、治療の特異性、力及び全体の安全性を実現する際に使用される潜在性を有している。複数の生理学的プロセスにおいて、及び癌治療においても、FMDの有益な効果に関連する分子経路を明らかにする試験の数が増大している32。循環するIGF-1のレベルが、癌において、特にCLLにおいて上昇制御されるRAS/MAPK経路及びAKT/mTOR経路の活性化に影響する。さらに癌細胞は、それに差異的に応答し（差異的ストレス感作、DSS）、外部の刺激に無反応であり、そのため飢餓の間正常細胞がスイッチをオンにするストレス耐性を獲得できないのみならず、一部は高いレベルの栄養物に対する依存により、より感受性となる（図１）27,33。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
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【非特許文献２】Vardiman, J. W. Chem. Biol. Interact. 184, 16-20 (2010)
【非特許文献３】Sgambati, M., Linet, M. & Devesa, S. BASIC AND CLINICAL ONCOLOGY 26, 33-62 (2001)
【非特許文献４】Bullrich, F. & Croce, C. BASIC AND CLINICAL ONCOLOGY 26, 9-32 (2001)
【非特許文献５】Alizadeh, A. A. & Majeti, R. Cancer Cell 20, 135-136 (2011)
【非特許文献６】Garcia-Munoz, R., Galiacho, V. R. & Llorente, L. Ann Hematol 91, 981-996 (2012)
【非特許文献７】Dungarwalla, M., Matutes, E. & Dearden, C. E. Eur J Haematol 80, 469-476 (2008)
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
CLLの事象は、男性と女性の両方で高く、ほとんどの患者が疾患を有して多年生存するにもかかわらず、めったに治癒することができない。CLL治療は、しばしば間欠的であり、皮膚癌や肺癌、又は白血病、リンパ腫及び他のタイプの癌のような二次悪性腫瘍を進行させるリスクも増大させ得る。CLL進行の脅威とともに生活することは、困難でありかつ非常なストレスをもたらしうる。従って、血液癌、特に、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫、特にCLLの治療に対して、よりよい患者の耐性のために有効であり、かつ副作用を減少させる必要がいまだ存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、血液癌、特に白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫を治療するための新たなアプローチを記載する。本発明は、FMDが、種々の悪性腫瘍を治療するために一般に使用される、FDA承認済みの低毒性薬剤から正常細胞を保護し、一方でこれらの薬剤に対して血液癌細胞を増感させるという驚くべき発見に基づく。これらの薬剤は、ロミデプシン(Romidepsin)、ベリノスタット(Belinostat)、ベルテゾミブ(Bortezomib)、リツキシマブ(Rituximab)、シクロホスファミド(Cyclophosphamide)を含み、異なるカクテル組み合わせにおいて、又は異なる日に使用してよい。
【００１７】
現在のインビトロ研究により、特定のFDA承認薬剤とFMDの組み合わせを使用することにより、血液癌細胞の殺傷率が100％まで達成されることが示されている。さらに、絶食が、これらの化学治療薬剤の副作用（毒性）から正常細胞を保護する。
【００１８】
本発明の主な利点は、治療アプローチが、FDAの承認が必要でない若しくは早期承認の適格である食事療法プラスFDA承認薬剤に基づくものであるため、血液癌細胞患者、特にCLLに罹患した患者に対して有益な結果を迅速に実現することができることである。
【００１９】
インビトロ実験の現在のセットで、CLLを治療するために使用される18の異なる基質（現在推奨される用量を使用する、一般的に使用される化学療法薬剤、ならびにより毒性の低い薬剤）を、FMDとともに、及びFMDなしで試験した。
【００２０】
特に、4つの一般的なFDA承認化学療法薬剤の異なる組み合わせが、血液癌細胞を100%殺傷することが発見された。FMDなしでは、これらの4つの抗癌剤の組み合わせは、血液癌細胞のおよそ70%の殺傷に成功した。これは良い結果であるが、疾患の完全な寛解には十分でないかもしれない。
【００２１】
比較として、FMDなしで、単独で投与された18の薬剤のいずれも、血液癌細胞の25%より高い殺傷率を達成できなかった。試験された薬剤が、血液癌、特にCLLを治療するために現在使用される薬剤の多くを含むことは注目に値する。
【００２２】
興味深いことに、FMD又は絶食は、おそらく正常細胞がこれらの薬剤の生化学的経路のスイッチをオフにするために、これらの同じ薬剤の毒性効果から正常細胞を保護するようである。現在の研究では、FMDあり及びなしで薬剤の毒性を比較して、正常マウス細胞に対する毒性の劇的な減少が示された。単独で薬剤にさらされた正常細胞は生存したが、これはFMDが加わった場合75%に増大した。この結果は驚くべきものであり、予想外であった。
【００２３】
FMDもしくは絶食は、１）絶食（水の自由な消費とともに、2から4日の絶食）により、及び２）絶食の効果を模倣する前記の範囲の製剤で達成することができる、「絶食模倣食(fasting mimicking diet、FMD)」を使用することにより、達成されてよい34,35。ほとんどの患者は、彼らの化学療法セッションの間2から4日の絶食に耐えられず、本発明者は、正常及び癌細胞に同じ絶食の効果が達成される一方で、患者が「食物」を食べることができるようにFMDを開発した。絶食もしくはFMDは、治療の1日前に開始し、それに続く治療が最も活動的な間の2日から4日継続する。FMDは、低タンパク質及び低糖の、植物に基づく製剤での4日間の低カロリー摂取（1日目に通常カロリー摂取の50%、2から4日目に10%）と、それに続く10日間の標準自由食からなる34,35。
【００２４】
本発明は、血液癌、特に白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫、好ましくはCLLの治療のための迅速な効果の配備、低い毒性及び低い費用を提供し、現在血液癌とともに生きる多数の人々の全体の生存及び生活の質を改善する。
【００２５】
従って、本願発明は、哺乳動物における血液癌の治療において使用するための、カロリー摂取の減少、ならびにCD20インヒビター、ブルトン型チロシンキナーゼインヒビター、ホスホイノシチド３キナーゼインヒビター、クラスI及び/又はクラスIIヒストンデアセチラーゼインヒビター、非タキサンレプリケーションインヒビター又はプロテアソームインヒビターから選択される薬剤を提供し、ここでカロリー摂取の減少は、24時間から190時間の間継続し、前記カロリー摂取の減少は、1日当たりのカロリー摂取を10%から100%減少する。
【００２６】
前記減少は、通常の1日当たりのカロリー摂取と比較される。通常の1日当たりのカロリー摂取は、1200Kcalから3000 Kcalである。好ましくは、通常の1日当たりのカロリー摂取は以下のとおりである（範囲は、年齢、性別及び身体活性に基づく）：
4から8歳：1200-2000 Kcal
9から13歳：1800-2600 Kcal
19から30歳：1800-3000 Kcal
31から50歳：1800-2600 Kcal
51歳以上：1600-2600 Kcal。
【００２７】
好ましくは、カロリー摂取の減少は、薬剤が投与される少なくとも24時間前に開始する。好ましくは、カロリー摂取の減少は、薬剤が投与される少なくとも48時間前に開始する。好ましくは、カロリー摂取の減少は、薬剤が投与された後少なくとも24時間継続し、好ましくはそれは薬剤が投与された後少なくとも48、72、96、120時間継続する。
【００２８】
好ましくは、カロリー摂取の減少は、薬剤が投与される1日前に開始し、薬剤が投与された後、引き続き2から4日間（すなわち、薬剤が最も活性を有する間）継続する。好ましくは、カロリー摂取の減少は、低カロリー摂取（1日目に通常のカロリー摂取の50%、及び2から4日目に10%）の4日間からなる。
【００２９】
好ましい態様において、前記ブルトン型チロシンキナーゼインヒビターは、イブルチニブ(Ibrutinib)、アカラブルチニ(Acalabrutini)、ONO-4059 (GS-4059と再命名)、スペブルチニブ(Spebrutinib) (AVL-292, CC-292)及びBGB-3111から選択され、前記ホスホイノシチド３キナーゼインヒビターは、イデラリシブ(Idelalisib) BEZ235 (NVP-BEZ235, ダクトリシブ(Dactolisib))、ピクチリシブ(Pictilisib) (GDC-0941)、LY294002、CAL-101 (イデラリシブ(Idelalisib), GS-1101)、BKM120 (NVP-BKM120, (ブパルリシブ(Buparlisib))、PI-103、NU7441 (KU-57788)、IC-87114、ウォルトマニン(Wortmannin)、XL147アナログ、ZSTK474、アルペリシブ(Alpelisib) (BYL719)、AS-605240、PIK-75、3-メチルアデニン(3-MA)、A66、ヴォクスタリシブ(Voxtalisib) (SAR245409, XL765)、PIK-93、オミパリシブ(Omipalisib) (GSK2126458, GSK458)、PIK-90、PF-04691502 (T308)、AZD6482、アピトリシブ(Apitolisib) (GDC-0980, RG7422)、GSK1059615、デュヴェリシブ(Duvelisib) (IPI-145, INK1197)、ゲダトリシブ(Gedatolisib) (PF-05212384, PKI-587)、TG100-115、AS-252424、BGT226 (NVP-BGT226)、CUDC-907、PIK-294、AS-604850、BAY 80-6946 (コパンリシブ(Copanlisib))、YM201636、CH5132799、PIK-293、PKI-402、TG100713、VS-5584 (SB2343)、GDC-0032、CZC24832、ヴォクスタリシブ(Voxtalisib) (XL765, SAR245409)、AMG319、AZD8186、PF-4989216、ピララリシブ(Pilaralisib) (XL147)、PI-3065TOR、HS-173、クエルセチン(Quercetin)、GSK2636771、CAY10505及びラパマイシン(Rapamycin)からなる群から選択され、前記クラスI及び/又はクラスIIヒストンデアセチラーゼインヒビターは、ロミデプシン(Romidepsin)、ヴォリノスタット(Vorinostat)、チダミド(Chidamide)、パノビノスタット(Panobinostat)、ベリノスタット(Belinostat) (PXD101)、ヴァルプロ酸(Valproic acid) (ヴァルプロ酸Mgとして)、モセチノスタット(Mocetinostat) (MGCD0103)、アベキシノスタット(Abexinostat) (PCI-24781)、エンチノスタット(Entinostat) (MS-275)、レスミノスタット(Resminostat) (4SC-201)、ギヴィノスタット(Givinostat) (ITF2357)、クイシノスタット(Quisinostat) (JNJ-26481585)、HBI-8000, (ベンズアミドHDI)、ケヴェトリン(Kevetrin)及びギヴィノスタット(Givinostat) (ITF2357)からなる群から選択され、前記CD20インヒビターは、リツキシマブ(Rituximab)、アフツズマブ(Afutuzumab)、ブロンツヴェトマブ(Blontuvetmab)、FBTA05、イブリツモマブチウキセタン(Ibritumomab tiuxetan)、オビヌツズマブ(Obinutuzumab)、オカラツズマブ(Ocaratuzumab)、オクレリズマブ(Ocrelizumab)、オファツムマブ(Ofatumumab)、サマリズマブ(Samalizumab)、トシツモマブ(Tositumomab)及びヴェルツスマブ(Veltusumab)からなる群から選択され、前記非タキサンレプリケーションインヒビターは、ヴィンクリスチン(Vincristine)、エリブリン(Eribulin)、ヴィンブラスチン(Vinblastine)、ヴィノレルビン(Vinorelbine)及びテニソピド(Tenisopide)からなる群から選択され、前記プロテアソームインヒビターは、ボルテゾミブ(Bortezomib)、ラクタシスチン(Lactacystin)、ディスルフィラム(Disulfiram)、マリゾミブ(Marizomib) (サリノスポラミドA(salinosporamide A))、オプロゾミブ(Oprozomib) (ONX-0912)、デランゾミブ(Delanzomib) (CEP-18770)、エポキソミシン(Epoxomicin)、MG132、ベータ−ヒドロキシベータメチルブチレート(Beta-hydroxy beta-methylbutyrate)、カルフィルゾミブ(Carfilzomib)、イクサゾミブ(Ixazomib)、エポネマイシン(Eponemycin)、TMC-95、フェルタミドB(Fellutamide B)、MLN9708及びMLN2238からなる群から選択される。
【００３０】
本発明の全てのインヒビターを、先行技術においてよく知られたルーチンのアッセイによりスクリーニングしてよい。例えば、プロテアソームインヒビターは、タンパク質を破壊する細胞内複合体、プロテアソームの作用をブロックする薬剤である。複数のメカニズムが関係しているようであるが、プロテアソーム阻害は、p53タンパク質のような前アポトーシス因子の分解を防止し、前アポトーシス経路の抑制に依存して、新生物細胞におけるプログラム細胞死の活動を許容するのかもしれない。例えば、ボルテゾミブは、細胞内ペプチドのレベルにおいて迅速かつ急激な変化を引き起こす。ボルテゾミブは、S26プロテアソームのインヒビターである。
【００３１】
好ましい態様において、薬剤は、ロミデプシン、ベリノスタット、ボルテゾミブ、リツキシマブ、ヴィンクリスチン及びエリブリンからなる群から選択される。
【００３２】
好ましい態様において、前記カロリー摂取の減少は、1日当たりのカロリー摂取を、50から100%、好ましくは85から100%もしくは10から85％減少させる。
【００３３】
好ましい態様において、前記哺乳動物は、20から60%の含量のモノ不飽和及び/又はポリ不飽和脂肪、5から10%の含量のタンパク質、及び20から50%の含量の炭水化物を有する食物を与えられる。
【００３４】
好ましい態様において、カロリー摂取を減少する期間は、48から168時間、好ましくは120時間である。
【００３５】
好ましい態様において、放射線治療、あるいはブルトン型チロシンキナーゼインヒビター、ホスホイノシチド３キナーゼインヒビター、クラスIヒストンデアセチラーゼインヒビター、クラスIIヒストンデアセチラーゼインヒビター、CD20インヒビター、非タキサンレプリケーションインヒビター、タキサンレプリケーションインヒビター、アルキル化剤、プロテアソームインヒビター、抗炎症剤、及び他の薬剤から選択される少なくとも１つのさらなる薬剤が、カロリー摂取の減少及び前記の薬剤と投与されてよい。インヒビターは上記のとおりである。
【００３６】
本願発明において好ましい組み合わせは、2、3、4、5又は少なくとも6つの薬剤を、カロリー摂取の減少（1日当たりのカロリー摂取を10から100%減少させる）とともに含む。
【００３７】
好ましくはアルキル化剤は、シクロホスファミド(cyclophosphamide)、ゲムシタビン(gemcitabine)、メクロレタミン(Mechlorethamine)、クロラムブシル(Chlorambucil)、メルファラン(Melphalan)、モノ官能性アルキレーター、ダカルバジン(Dacarbazine) (DTIC)、ニトロソウレア(Nitrosoureas)及びテモゾロミド(Temozolomide)からなる群から選択され、前記タキサンレプリケーションインヒビターは、パクリタキセル(Paclitaxel)、ドセタキセル(Docetaxel)、アブラキサン(Abraxane)及びタキソテール(Taxotere) からなる群から選択され、前記抗炎症剤は、非ステロイド抗炎症剤、デキサメタゾン(dexamethasone)、プレドニゾン(prednisone)及びコルチゾン(cortisone)、又はそれらの誘導体（フルドロコロチゾン(fludrocortisone)、ヒドロコルチゾン(hydrocortisone)）から選択され、前記別の薬剤は、クルクミン(curcumin)、Ｌ−アスコルビン酸(L-ascorbic acid)、EGCG及びポリフェノン(polyphenone) から選択される。
【００３８】
好ましくは、非ステロイド抗炎症剤は、アスピリン(Aspirin) (アナシン(Anacin), アスクリプチン(Ascriptin), バイエル(Bayer), バファリン(Bufferin), エコトリン(Ecotrin), エキセドリン(Excedrin))、コリン及びマグネシウムサリチレート (CMT, トリコサル(Tricosal), トリリセート(Trilisate))、コリンサリチレート(アルスロパン(Arthropan))、セレコキシブ(Celecoxib) (セレブレックス(Celebrex))、ジクロフェナックカリウム(Diclofenac potassium) (カタフラム(Cataflam))、ジクロフェナックナトリウム(Diclofenac sodium) (ヴォルタレン(Voltaren), ヴォルタレンXR)、ミソプロストール(misoprostol)を有するジクロフェナックナトリウム (アルスロテック(Arthrotec))、ジフルニサル(Diflunisal)(ドロビド(Dolobid))、エトドラック(Etodolac) (ロジン(Lodine), ロジンXL)、フェノプロフェンカルシウム(Fenoprofen calcium) (ナルフォン(Nalfon))、フルルビプロフェン(Flurbiprofen) (アナサイド(Ansaid))、イブプロフェン(Ibuprofen) (アジビル(Advil), モトリン(Motrin), モトリンIB, ヌプリン(Nuprin))、インドメタシン(Indomethacin) (インドシン(Indocin), インドシンSR)、ケトプロフェン(Ketoprofen) (アクトロン(Actron), オルディス(Orudis), オルディスKT, オルヴァイル(Oruvail))、サリチル酸マグネシウム (アルスリタブ(Arthritab), バイエルセレクト(Bayer Select), ドアンのピル(Doan's Pills), マガン(Magan), モビジン(Mobidin), モボジェシック(Mobogesic))、メコフェナメートナトリウム(Meclofenamate sodium) (メクロメン(Meclomen))、メフェナミック酸(Mefenamic acid) (ポンステル(Ponstel))、メロキシカム(Meloxicam) (モビック(Mobic))、ナブメトン(Nabumetone) (レラフェン(Relafen))、ナプロキセン(Naproxen) (ナプロシン(Naprosyn), ナプレラン(Naprelan*))、ナプロキセンナトリウム (アリーブ(Aleve), アナプロックス(Anaprox))、オキサプロジン (Oxaprozin) (デイプロ(Daypro))、ピロキシカム(Piroxicam) (フェルデン(Feldene))、ロフェコキシブ(Rofecoxib) (ヴィオックス(Vioxx))、サルサレート(Salsalate) (アミジェシック(Amigesic), アナフレックス(Anaflex) 750, ジサルシド(Disalcid), マルスリティック(Marthritic),モノジェシック(Mono-Gesic), サルフレックス(Salflex), サルシタブ(Salsitab))、サリチル酸ナトリウム (種々のジェネリック)、サリンダック(Sulindac) (クリノリル(Clinoril))、トルメチン(Tolmetin)ナトリウム(トレクチン(Tolectin))及びヴァルデコキシブ(Valdecoxib) (ベクストラ(Bextr))からなる群より選択される。
【００３９】
好ましい態様において、該方法は、前記哺乳動物に下記のものを投与する工程を含む：
−少なくとも1つのCD20インヒビター及び少なくとも1つのプロテアソームインヒビター、あるいは
−少なくとも1つのCD20インヒビターならびに少なくとも1つのクラスI及び/又はクラスIIヒストンデアセチラーゼインヒビター、あるいは
−少なくとも1つのクラスI及び/又はクラスIIヒストンデアセチラーゼインヒビターならびに少なくとも1つのプロテアソームインヒビター、あるいは
−少なくとも1つのクラスI及び/又はクラスIIヒストンデアセチラーゼインヒビターならびに少なくとも1つのアルキル化剤。
【００４０】
好ましくは、CD20インヒビターはリツキシマブであり、プロテアソームインヒビターはボルテゾミブであり、クラスI及び/又はクラスIIヒストンデアセチラーゼインヒビターはベリノスタット又はロミデプシンであり、かつアルキル化剤はシクロホスファミドである。
【００４１】
好ましくは、カロリー摂取の減少は、以下のものと組み合わされる：
−ロミデプシン及びベリノスタット；又は
−ボルテゾミブ及びロミデプシン；又は
−ボルテゾミブ及びベリノスタット；又は
−ボルテゾミブ及びリツキシマブ；又は
−シクロホスファミド及びロミデプシン；又は
−シクロホスファミド及びボルテゾミブ；又は
−シクロホスファミド及びベリノスタット；又は
−ボルテゾミブ、ロミデプシン及びベリノスタット；又は
−シクロホスファミド、ロミデプシン及びベリノスタット；又は
−シクロホスファミド、ボルテゾミブ及びベリノスタット；又は
−シクロホスファミド、ボルテゾミブ、ベリノスタット及びロミデプシン。
【００４２】
好ましい組み合わせは、図１１及び１２に規定される。
【００４３】
好ましくは、血液癌は、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫からなる群より選択される。好ましくは、血液癌は慢性リンパ球白血病(CLL)である。
【００４４】
好ましい態様において、哺乳動物はヒトであり、より好ましくはそれは成人被験者であり、好ましくは小児科の被験者（14歳まで）である。
【００４５】
本発明はさらに、以下の工程を含む、上記に規定された少なくとも1つの薬剤で血液癌細胞を処理するインビトロ方法を提供する：
−血清又はグルコース濃度を減少させた培地中で癌細胞を培養する工程；及び
−薬剤で癌細胞を処理する工程
（ここで培地中の血清濃度は10%未満であり、グルコース濃度は1g/l未満であり、好ましくは血清濃度は5%未満であり、さらに好ましくは血清濃度は1%もしくは1%未満である。好ましくはグルコース濃度は0.8g/l未満であり、好ましくは0.6g/l未満であり、さらに好ましくは0.5g/l未満であり、好ましくは0.5g/l未満である）。
【００４６】
好ましくは培地中の血清濃度は10-90%減少され、又は培地中のグルコース濃度は20-90%減少され、該減少は正常又は対照濃度に対する（すなわち10%血清及び1g/lグルコース）ものである。
【００４７】
本願発明はさらに、薬剤に対して血液癌細胞を増感させる一方、非癌細胞に対する毒性を最小化するための方法において使用するために、カロリー摂取の減少、ならびにCD20インヒビター、ブルトン型チロシンキナーゼインヒビター、ホスホイノシチド３キナーゼインヒビター、クラスIヒストンデアセチラーゼインヒビター、クラスIIヒストンデアセチラーゼインヒビター、非タキサンレプリケーションインヒビター、又はプロテアソームインヒビターからなる群より選択される前記薬剤を提供し、ここでカロリー摂取の減少は、24から190時間の間継続し、前記カロリー摂取の減少は、1日当たりのカロリー摂取を10から100%減少させる。
【００４８】
好ましくは、前記薬剤に対して血液癌細胞を増感させる一方、非癌細胞に対する毒性を最小化するための方法において、ブルトン型チロシンキナーゼインヒビター、ホスホイノシチド３キナーゼインヒビター、クラスIヒストンデアセチラーゼインヒビター、クラスIIヒストンデアセチラーゼインヒビター、CD20インヒビター、非タキサンレプリケーションインヒビター、タキサンレプリケーションインヒビター、アルキル化剤、プロテアソームインヒビター、抗炎症剤、及び他の薬剤からなる群より選択される少なくとも１つのさらなる薬剤が、カロリー摂取の減少及び前記の薬剤と投与される。
【００４９】
本願発明はまた、以下の工程を含む、血液癌の治療方法を提供する：
−投与するカロリー摂取を減少させる工程、及び
−CD20インヒビター、ブルトン型チロシンキナーゼインヒビター、ホスホイノシチド３キナーゼインヒビター、クラスI及び／又はクラスIIヒストンデアセチラーゼインヒビター、非タキサンレプリケーションインヒビター、あるいはプロテアソームインヒビターからなる群より選択される薬剤を投与する工程
（ここでカロリー摂取の減少は、24時間から190時間の間継続し、前記カロリー摂取の減少は、毎日のカロリー摂取を10から100%減少させる）。
【００５０】
本願発明において、好ましいカロリー摂取の減少は以下のとおりである：
1日目：54%カロリー摂取、約1,090 kcal（10%タンパク質、56%脂肪、34%炭水化物）
2から7日目：20-34%カロリー摂取、約426-725 kcal（5.3-9%タンパク質、26-44%脂肪、27.6-47%炭水化物）。
【００５１】
本願発明において、好ましくは、カロリー摂取の減少は、絶食又はカロリー及び／又はタンパク質含量を減少させるが、栄養不良を防止するために必要なすべてのマイクロ栄養素を含む特別食によって得られる。
【００５２】
本願発明において、カロリー摂取減少の期間は、5から60日の個別の期間後1回又は複数回繰り返され、その間前記哺乳動物は、薬剤を与えられる一方、通常のカロリー摂取を含む食事に供される。
【００５３】
本願発明において、血液癌は、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫を含む。特に白血病は、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ球白血病(CLL)、及び慢性骨髄性白血病(CML)を含む。リンパ腫には多数のサブタイプがある。リンパ腫の2つの主要なカテゴリーは、ホジキンリンパ腫(HL)と非ホジキンリンパ腫(NHL)である。
【００５４】
世界保健機関(WHO)は、リンパ腫の別の2つのカテゴリーを含む：多発性骨髄腫（形質細胞性骨髄腫としても知られる）及び免疫増殖性疾患。本願の組み合わせは、上記すべての形態の血液癌の治療に使用するためのものである。本発明は、本明細書の図面を参照して、非限定的例により示される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】絶食又はFMD保護において関連する分子経路。絶食又はFMDは、循環IGF-1レベルの顕著な減少をもたらす。GH/IGF-1経路は、AKT/mTOR及び/又はRAS/MAPK経路を介し、チロシンキナーゼレセプターを通してシグナルを伝達する。転写因子のFoxOファミリーは、AKTを介する経路のダウンレギュレートされた標的である。DR=食事制限。
【図２】MEC1、MEC2及びL1210生存率ならびに死亡率増大に対するFMDの効果。細胞を、生理学的グルコース濃度（1.0 g/リットル; 白棒）で48時間培養し、10%ウシ胎児血清(FCS)又は「FMD」条件（0.5g/リットルのグルコース; 1% FCS; 緑棒）で補填した。細胞生存率を、エリスロシン除外により測定した。3つの独立実験からの結果である。データを、生存/死亡細胞±SDのパーセントで表示する。***P<0.001。
【図３】MEC1形態に対するFMDの効果。A-B: Tom20抗体を使用したミトコンドリア形態の免疫蛍光分析（緑）。C-D: LC3抗体を使用したオートファジープロセスの免疫蛍光分析（緑）。E-F:カスパーゼ3切断抗体を使用したアポトーシスの免疫蛍光分析（緑）。核をdapiで染色し（青）、細胞質をファロイジンでマークした（赤）。
【図４】インビトロ実験ワークフローのスキーム。0日目に、生理学的(CTRL)又はFMD培地中に細胞を播種した。24時間後、さらに細胞を24時間薬剤で処理した。播種から48時間後、エリスロシンB除外アッセイ(Erythrosin B exclusion assay)により細胞死を測定した。
【図５Ａ】L1210に対する薬剤パネルの効果。生理学的又はFMD条件下で細胞を培養し、本明細書に記載されているように処理した。黒棒は薬剤のみで処理したサンプルに対する生存率であり、斜線棒は、薬剤とFMD条件の組み合わせを示す。
【図５Ｂ】L1210に対する薬剤パネルの効果。生理学的又はFMD条件下で細胞を培養し、本明細書に記載されているように処理した。黒棒は薬剤のみで処理したサンプルに対する死亡率であり、斜線棒は、薬剤とFMD条件の組み合わせを示す。
【図６Ａ】L1210の薬剤処理に対するFMDの効果。薬剤でのみ処理した細胞に対する生存率は、FMDと連結した薬剤で処理した生存及び死亡によりそれぞれ分割される。HDAC及びプロテアソームインヒビターは最も高い効果を示す。
【図６Ｂ】L1210の薬剤処理に対するFMDの効果。薬剤でのみ処理した細胞に対する死亡率は、FMDと連結した薬剤で処理した生存及び死亡によりそれぞれ分割される。HDAC及びプロテアソームインヒビターは最も高い効果を示す。
【図７】MEC1の薬剤処理に対するFMDの効果。HDAC、プロテアソームインヒビター及びヒト抗CD20抗体（リツキシマブ）の存在下、CTRL及びFMDで培養した細胞に対する生存及び死亡率である。CTRL、生理学的条件；FMD、絶食模倣食；BTZ、ボルテゾミブ10nM；RMD、ロミデプシン10μM；BLN、ベリノスタット50nM；RTX、リツキシマブ1μg/ml。3つの独立実験由来の結果である。データを、平均± SDで示す。
【図８】MEC2の薬剤処理に対するFMDの効果。HDAC、プロテアソームインヒビター及びヒト抗CD20抗体（リツキシマブ）の存在下、CTRL及びFMDで培養した細胞に対する生存及び死亡率である。CTRL、生理学的条件；FMD、絶食模倣食；BTZ、ボルテゾミブ10nM；RMD、ロミデプシン10μM；BLN、ベリノスタット50nM；RTX、リツキシマブ1μg/ml。3つの独立実験由来の結果である。データを、平均± SDで示す。
【図９】L1210における薬剤暴露後の生存率。細胞を、生理学的（ひし形）又はFMD条件（四角）で培養し、本明細書に記載の異なる濃度のロミデプシン(A)、ボルテゾミブ(B)、ベリノスタット(C)、及びシクロホスファミド(D)に暴露した。
【図１０】L1210における薬剤暴露後の死亡率。細胞を、生理学的（ひし形）又はFMD条件（四角）で培養し、本明細書に記載の異なる濃度のロミデプシン(A)、ボルテゾミブ(B)、ベリノスタット(C)、及びシクロホスファミド(D)に暴露した。
【図１１】MEC1 (A)及びMEC2 (B)における薬剤カクテル暴露の効果。細胞を、生理学的（青棒）又はFMD条件（赤棒）で培養し、本明細書に記載の異なる薬剤カクテルに暴露した。CTRL、生理学的条件；FMD、絶食模倣食；BTZ、ボルテゾミブ10nM；RMD、ロミデプシン10μM；BLN、ベリノスタット50nM；RTX、リツキシマブ1μg/ml。3つの独立実験由来の結果である。データを、平均± SDで示す。
【図１２】L1210における薬剤カクテル暴露の効果。細胞を、生理学的（ひし形）又はFMD条件（四角）で培養し、本明細書に記載の異なる薬剤カクテルに暴露した。生存率(A)及び死亡率(B)を示す。HDAC（ロミデプシン及びベリノスタット）ならびにプロテアソームインヒビター（ボルテゾミブ）の混合物に存する薬剤カクテルが、最も高い効果を示し、培養L1210において、生きた細胞が0%で死亡した細胞が100%となった。CTRL＝生理学的条件；FMD＝絶食模倣食。
【図１３】一次(primary)MEFにおける薬剤暴露後の生存率。細胞を、生理学的（CRTL、ひし形）又はFMD条件（四角）で培養し、本明細書に記載の異なる濃度のロミデプシン(A)、ボルテゾミブ(B)、ベリノスタット(C)、及びシクロホスファミド(D)に暴露した。
【図１４】一次MEFにおける薬剤暴露後の死亡。細胞を、生理学的（CRTL、ひし形）又はFMD条件（四角）で培養し、本明細書に記載の異なる濃度のロミデプシン(A)、ボルテゾミブ(B)、ベリノスタット(C)、及びシクロホスファミド(D)に暴露した。
【図１５】FMD/ロミデプシン処理に対する一時MEF細胞における生存率及び死亡率。ロミデプシン(10μM)で処理した後のマウス胚性線維芽細胞（MEF-6664/5及びMEF-6664/8）の2つの異なる生成における差異ストレス応答(DSR)に対する絶滅模倣食(FMD)の効果である。本明細書に記載されるように生理学的(CTRL)及び絶食模倣食(FMD)条件下で細胞を培養し、エリスロシンB除外アッセイを使用して分析した。
【図１６】一次MEFにおける差異ストレス応答に対するFMDの効果。2つの異なるのマウス胚性線維芽細胞生成物（MEFI若しくはMEF-6664/5及びMEFI若しくはMEF-6664/8）を、ロミデプシン(10μM)で処理した。本明細書に記載されるように生理学的(CTRL)及び絶食模倣食(FMD)条件下で細胞を培養した。グループ中の相対的細胞死を、対照で観察された細胞死の関数として測定する。
【図１７−１】正常ヒトBJ及びマウス3T3-NIH線維芽細胞における差異ストレス応答に対するFMDの効果。正常線維芽細胞系統、ヒトBJ(A)及び3T3-NIH(B)を、ボルテゾミブ(10nM)で処理した。細胞の死亡率を、アネキシンV/PI試験により評価した。3つの独立実験由来の結果である。データを、平均± SDで示す。CTRL＝生理学的条件；FMD＝絶食模倣食；BTZ＝ボルテゾミブ。
【図１７−２】図１７−１の続きである。
【図１８】一次MEFにおける薬剤カクテル暴露の細胞毒性。細胞を、出生前発生の11.5日目のマウス胚から得た。生存(A及びB)及び死亡(C及びD)を示す。薬剤カクテルは、本明細書に記載のHDAC（ロミデプシン及びベリノスタット）ならびにプロテアソームインヒビター（ボルテゾミブ）の混合物に存する。
【図１９】CLLインビボ(in vivo)モデルにおける周期的STS及びボルテゾミブのスキーム。- Rag2-/-IL2-/-メスマウス(8-12週)に、100μlのPBS中の10x106個のMEC-1細胞を静脈注射した。注射3日後、マウスを、以下の処理により6つの実験グループ（それぞれ5匹のマウス）に分割した：自由に(Ad lib) =  + ビヒクル; STS = 絶食+ ビヒクル；BTZ = 自由に + ボルテゾミブ（ベルケイド(Velcade) ミレニアム社 - 0.35mg/kg 週に一度を3週間（7日、14日、21日)；STS+BTZ =  絶食+ ボルテゾミブ（0.35 mg/kg）週に一度を3週間（7日、14日、21日）；BTZ+RTX = 自由に + ボルテゾミブ（0.35 mg/kg 週に一度）+リツキシマブ（10mg/kg 週に一度）3週間（7日、14日、21日）；STS+BTZ+RTX = 絶食+ボルテゾミブ（0.35 mg/kg 週に一度）+リツキシマブ（10mg/kg 週に一度）3週間。
【図２０】体重(グラム)。Rag2-/-IL2-/-メスマウス(8-12週)に、100μlのPBS中の10x106個のMEC-1細胞を静脈注射し、本明細書に記載のように処理し、通常の方法で体重測定した。絶食したマウスでは、STSレジメンによる変動を受けた。体重は、再給餌後24時間で急速に回復した。
【図２１】脾臓重量(グラム)。Rag2-/-IL2-/-メスマウス(8-12週)に、100μlのPBS中の10x106個のMEC-1細胞を静脈注射し、本明細書に記載のように処理した。実験手順の最後に、全てのグループのマウスからの脾臓重量を記録した。絶食マウス+/-薬剤では、他のグループと比較して有意に脾臓重量が低い。Ad lib = 自由に；STS = 短期間飢餓；BTZ = ボルテゾミブ；RTX = リツキシマブ。
【図２２】注射Rag2-/-マウスの複数の臓器におけるCD19 MEC1陽性細胞。骨髄(A)、脾臓(B)、血液(C)及び腹腔(D)から回収した細胞を、ヒトCD19に対するmAbで染色後サイトメトリーにかけて白血病性Ｂ細胞集団を同定することにより分析した。CTRL = Ad lib + ビヒクル；STS = 短期間飢餓 + ビヒクル；BTZ = Ad lib + ボルテゾミブ(ベルケイド ミレニアム) - 1mg/kg；STS+BTZ = 短期間飢餓 + ボルテゾミブ(1mg/kg)；BTZ+RTX = Ad lib + ボルテゾミブ+ リツキシマブ; BTZ+RTX + STS = ボルテゾミブ+ リツキシマブ+ 短期間飢餓。
【図２３】注射Rag2-/-マウスの複数の臓器におけるCD20 MEC1陽性細胞。骨から回収した細胞で静脈内投与したMEC1細胞は、Rag2-/-マウスの複数の臓器に局在する。骨髄(A)、脾臓(B)、血液(C)及び腹腔(D)から回収した細胞を、ヒトCD20に対するmAbで染色後サイトメトリーにかけて白血病性Ｂ細胞集団を同定することにより分析した。CTRL = Ad lib + ビヒクル；STS = 短期間飢餓 + ビヒクル; BTZ = Ad lib + ボルテゾミブ(ベルケイド ミレニアム) - 1mg/kg; STS+BTZ = 短期間飢餓 + ボルテゾミブ(1mg/kg)；BTZ+RTX = Ad lib + ボルテゾミブ+ リツキシマブ；BTZ+RTX + STS = ボルテゾミブ+ リツキシマブ+ 短期間飢餓。
【図２４】注射Rag2-/-マウスの複数の臓器におけるCD45 MEC1陽性細胞。骨から回収した細胞で静脈内投与したMEC1細胞は、Rag2-/-マウスの複数の臓器に局在する。骨髄(A)、脾臓(B)、血液(C)及び腹腔(D)から回収した細胞を、ヒトCD45に対するmAbで染色後サイトメトリーにかけて白血病性Ｂ細胞集団を同定することにより分析した。CTRL = Ad lib + ビヒクル；STS = 短期間飢餓 + ビヒクル；BTZ = Ad lib + ボルテゾミブ(ベルケイド ミレニアム) - 1mg/kg；STS+BTZ = 短期間飢餓 + ボルテゾミブ(1mg/kg)；BTZ+RTX = Ad lib + ボルテゾミブ+ リツキシマブ；BTZ+RTX + STS = ボルテゾミブ+ リツキシマブ+ 短期間飢餓。
【図２５】骨髄の解剖病理学解析。MEC1で静脈注射したRag2-/-マウスからの骨髄の解剖病理学解析は、他の実験グループと比較して、BTZ+RTXにおいて、及びSTS+BTZ+RTXにおいて、腫瘍性リンパ球の浸潤を示さなかった（矢頭）。H&E染色である。注射なし = MEC1細胞で注射しなかった健康なマウス。CTRL = Ad lib + ビヒクル；STS = 短期間飢餓 + ビヒクル；BTZ = Ad lib + ボルテゾミブ(ベルケイド ミレニアム) - 1mg/kg；STS+BTZ = 短期間飢餓 + ボルテゾミブ(1mg/kg)；BTZ+RTX = Ad lib + ボルテゾミブ+ リツキシマブ；BTZ+RTX + STS = ボルテゾミブ+ リツキシマブ+ 短期間飢餓。
【図２６】脾臓の解剖病理学解析。MEC1で静脈注射したRag2-/-マウスからの脾臓の解剖病理学解析は、他の実験グループと比較して、BTZ+RTXにおいて、及びSTS+BTZ+RTXにおいて、腫瘍性リンパ球の浸潤を示さなかった（矢頭）。挿入図、高拡大。H&E染色である。注射なし  = MEC1細胞で注射しなかった健康なマウス。CTRL = Ad lib + ビヒクル; STS = 短期間飢餓 + ビヒクル; BTZ = Ad lib + ボルテゾミブ(ベルケイド ミレニアム) - 1mg/kg; STS+BTZ = 短期間飢餓 + ボルテゾミブ(1mg/kg); BTZ+RTX = Ad lib + ボルテゾミブ+ リツキシマブ; BTZ+RTX + STS = ボルテゾミブ+ リツキシマブ+ 短期間飢餓。
【図２７】腎臓の解剖病理学解析。MEC1で静脈注射したRag2-/-マウスからの腎臓の解剖病理学解析は、他の実験グループと比較して、BTZ+RTXにおいて、及びSTS+BTZ+RTXにおいて、腫瘍性リンパ球の浸潤を示さなかった（矢頭、暗紫）。挿入は、高拡大。H&E染色である。注射なし  = MEC1細胞で注射しなかった健康なマウス。CTRL = Ad lib + ビヒクル; STS = 短期間飢餓 + ビヒクル; BTZ = Ad lib + ボルテゾミブ(ベルケイド ミレニアム) - 1mg/kg; STS+BTZ = 短期間飢餓 + ボルテゾミブ(1mg/kg); BTZ+RTX = Ad lib + ボルテゾミブ+ リツキシマブ; BTZ+RTX + STS = ボルテゾミブ+ リツキシマブ+ 短期間飢餓。
【図２８】肝臓の解剖病理学解析。MEC1で静脈注射したRag2-/-マウスからの肝臓の解剖病理学解析は、他の実験グループと比較して、BTZ+RTXにおいて、及びSTS+BTZ+RTXにおいて、腫瘍性リンパ球の浸潤を示さなかった（矢頭、暗紫）。挿入は、高拡大。H&E染色である。注射なし = MEC1細胞で注射しなかった健康なマウス。CTRL = Ad lib + ビヒクル；STS = 短期間飢餓 + ビヒクル；BTZ = Ad lib + ボルテゾミブ(ベルケイド ミレニアム) - 1mg/kg；STS+BTZ = 短期間飢餓 + ボルテゾミブ(1mg/kg)；BTZ+RTX = Ad lib + ボルテゾミブ+ リツキシマブ；BTZ+RTX + STS = ボルテゾミブ+ リツキシマブ+ 短期間飢餓。
【図２９】CLL患者における白血球及び完全リンパ球数。白血球(WBC)数及び完全リンパ球(ABC Lymph)数を、2回の一連の絶食模倣食(FMD)サイクル後に測定した。FMD前 = FMDの2サイクル前；FMD後 = FMDの2サイクル後。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
材料と方法
細胞培養
ヒトMEC1及びMEC2 CLL細胞系統、マウスL1210 CLL細胞系統、ヒトBJ線維芽細胞系統及びマウス3T3-NIH細胞系統を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から購入した。全ての細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)及び10% FBS中、37°C及び5% CO2で維持した。
【００５７】
インビトロ処理
細胞を、12ウェルマイクロリットルプレートに1X106個播種し、本明細書に記載のように処理した。全ての処理を、5% CO2下37°Cで行った。インビトロFMDを、1%血清中、低グルコース(0.5 g/リットル, Sigma)で補填されたグルコースフリーDMEM(Invitrogen)中で細胞をインキュベートすることにより行った。対照グループを、10%血清及び1 g/リットルのグルコースで補填されたDMEM/F12中で細胞をインキュベートすることにより行った。インビトロ処理のスキームを図４に示す。表１に列記されるすべての薬剤を、インビトロ及びインビボ細胞毒性試験のために使用した。
【００５８】
【表１−１】
2018527396.tif 000002
【表１−２】
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【表１−３】
2018527396.tif 000004
【００５９】
インビトロFMD処理の24時間後、細胞を、生理学的又はFMD培地中で24時間異なる薬剤とインキュベートした（図４）。生存率及び死亡率を、エリスロシンB除外アッセイ又はアネキシンV/PI試験により測定した。簡単に言うと、48時間の最後に、各グループについて25μLの細胞懸濁物を、チューブ中でエリスロシンB溶液(1:1)で染色した。細胞を、40倍の拡大率の顕微鏡下で計数した。死亡細胞（細胞膜が損傷したもの）は、明赤色に見え、生存細胞は染色されないまま（染色除去）であった。細胞生存率を、グループあたりの非染色細胞の数を、対照において計数された生存細胞で割って計算し、パーセントで表した。各グループについて、死亡率を、染色細胞の数を、細胞の総数で割って計算し、パーセントで表した。FMD条件は、増大する死亡細胞のパーセントと直接関連する効果（図２Ａ及び２Ｂ）として、それぞれMEC1及びMEC2細胞数の両方の主な減少を引き起こした。アネキシンV/PIに対して、細胞を穏やかに回収し、洗浄し、アネキシン−ＡＰＣ抗体(1:50)を含むアネキシングバッファー中に再懸濁した。細胞を、暗所で室温1時間インキュベートし、アネキシンバッファーで一度洗浄し、プロピジウムヨージド(PI)存在下、0.5 mlのアネキシンバッファー中に再懸濁した。試料を、FC500フローサイトメーター(Beckman-Coulter)で分析した。
【００６０】
免疫蛍光染色及び共焦点顕微鏡
細胞を回収し、ポリリジンコート化カバースリップ上に10分間で播種した。4%パラホルムアルデヒドで10分固定した後、細胞を洗浄し、3% BSAで20分間インキュベートした。一次ポリクローナルウサギ抗体は、Tom20 (AB-CAM) , LC3B 及びカスパーゼ3-切断 (Cell Signaling)（1時間、室温）であった。細胞を洗浄し、FITC及び／又はTRITCコンジュゲート化二次抗体（ヤギ抗ウサギ、Sigma）とインキュベートした。核を、DAPI (Sigma)で染色した。
【００６１】
インビトロFMDレジメン
細胞FMDを、グルコース及び／又は血清制限により行い、絶食及び正常給餌マウスの典型的な血中グルコースレベル：およそ0.5 g/リットルの最低レベル及び2.0 g/リットルの最高レベルを達成した。ヒト細胞系統に対して、正常グルコースは1.0 g/リットルと考えられた。血清(FBS)を、飢餓条件に対して1%で補填した。絶食培地に変更する前に、細胞をPBSで2回洗浄した。
【００６２】
動物倫理ステートメント
全ての動物の仕事及びケアは、ガイドラインの下で行い、実験動物のケア及び使用ガイドの推薦に従っており、動物実験倫理委員会(IACUC)の承認と、イタリア保健省による最終承認を受けて行った。本研究において実行したマウス実験（Rag2-/-γ c-/-におけるヒトMEC1 CLL細胞の注射）のための特定承認は、プロトコル#742/2015 - PR: “Ruolo della restrizione calorica e del sistema immunitario nella sensibilizzazione della leucemia linfatica cronica a terapia antitumorale（抗腫瘍療法に対する慢性リンパ性白血病の感作におけるカロリー制限と免疫系の役割）”において得られた。本発明者フランカ・ラウッチ及びヴァルター・ロンゴは、本実験の責任者として選任されている。全ての合理的な努力が、動物の苦痛を緩和するためになされている。マウスを犠牲とするために、本研究に提案され、倫理委員会(IACUC)及びイタリア保健省により承認されたプロトコルに従って、マウスCO2吸入器を使用した。
【００６３】
インビボCLLモデル
8週齢Rag2-/-γ c-/-メスマウスを、以前Bertilaccio et al., (2010)に記載されたように、27-ゲージ針により0.1 ml生理食塩水中10×106個のMEC1細胞を尾側部静脈に静脈内(iv)チャレンジした。注射前、対数増殖にある細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に100 × 106 細胞/mlで懸濁し、100 μl (マウスあたり10 × 106細胞)を静脈内注射した。全てのマウスを、静脈内注射前に穏やかに温め、静脈を拡張させた。毎日体重を測定し、血液標本により腫瘍の進行を測定した。毎日、体重及び一般的な健康状態について動物をモニターし、プロトコル#742/2015 - PR (動物倫理ステートメント参照)で承認され記載されている基準に従って、病気の臨床兆候を経験したときに、屠殺した。
【００６４】
インビボ絶食レジメン及び薬物処理
完全に食物を除去するが自由に水にアクセスすることにより、総計48時間動物を絶食させた。共食い、食糞及び残余食物を減少させるために、個々のマウスをクリーンで新しいケージに収納した。毎日、ならびに絶食の直前及び直後、体重を測定した。インビボ試験について、BTZ (0.35mg/kg体重)及びRTX (10mg/kg体重)を、合計3サイクルの処理に対する絶食レジメンの24時間後、（単独で及び／又は組み合わせて）腹腔内注射した。処理の3度目のサイクル後、プロトコル#742/2015 - PRに従って、動物を屠殺した（図１９）。
【００６５】
サンプル収集
末梢血、腹水及び組織（脾臓、大腿部骨髄、腎臓、肝臓及び肺）を収集し、フローサイトメトリー(FACS)又は形態分析のいずれかに使用した。FACS分析は、血液、腹水、脾臓及び骨髄に対して実行した。単一細胞懸濁物を、塩化アンモニウム溶液(ACK)溶解バッファー(NH4Cl 0.15 M, KHCO3 10 mM, Na2EDTA 0.1 mM, pH 7.2-7.4)中でインキュベーションすることにより赤血球細胞を枯渇させ、その後結晶化可能フラグメント(Fc)レセプターをブロックした後染色した。Fcブロック(BD Biosciences Pharmingen)で室温10分Fcレセプターをブロックし、抗体の非特異的結合を回避した後、末梢血、骨髄、腹腔滲出液及び脾臓からの細胞を、抗ヒトCD19、抗ヒトCD20及び抗ヒトCD45抗体で別々に染色し、それぞれ異なるコンパートメントにおけるMEC1細胞の存在を調査し、FC500フローサイトメーター(Beckman-Coulter)で分析した。
【００６６】
形態学的分析
マウス組織（骨髄、脾臓、腎臓、肝臓及び肺）セクションを、キシレンで脱パラフィン化し、エタノールで再水和し、PBS中に浸し、マイヤー−ヘマトキシリン及びエオシンで順次染色した。エタノール及びキシレン中で脱水後、スライドをオイキット(Eukitt) (Bio-Optica)中に恒久的にマウントした。
【００６７】
患者試験
全てのCLL男性患者は、自発的に2回のFMDサイクル（植物ベース及びタンパク質フリー食）を実行した。FMDは、4日間の低タンパク質及び低糖、植物ベースの配合物を有する低カロリー摂取（1日目に通常カロリー摂取の50%、及び2から4日目に10%）と、それに続く10日間の標準自由食に存する。FMDサイクル（2サイクル）の前及び最後に、白血球(WBC)及び完全リンパ球(Abs Lymph)数を、標準技術を使用して測定した。
【００６８】
統計学的分析
グループ間の比較を、Excelソフトウェアを使用するスチューデントのt試験で行った。P値<0.05を有意とみなした。
【実施例】
【００６９】
FMDはCLL成長に影響を及ぼす
本発明者は、絶食又はFMD処理が、成長促進シグナル経路を減少させ、化学療法剤とカップリングした場合のみならずそれが存在しない場合にも、腫瘍細胞の感受性を増感させて死に至らしめることを以前示している26,38。
【００７０】
FMDによる増感がCLLでも起きるか否かを試験するために、本発明者は、ヒトCLL細胞系統、MEC1及びMEC2、あるいはマウスCLL細胞系統、L1210のいずれかを、10%ウシ胎児血清 (FCS)で補填した生理学的グルコース濃度(1.0 g/リットル)中で48時間培養し、「FMD」条件(0.5g/リットルのグルコース; 1% FCS)で培養した場合と、それらの生育能力を比較した。
【００７１】
生存及び死亡細胞を、細胞生存を測定するために一般的に使用されている生体染色色素であるエリスロシンB除外アッセイにより測定した。簡単に言うと、48時間の最後に、各グループに対して25μLの細胞懸濁液を、チューブ中でエリスロシンB溶液(1:1)で染色し、穏やかに混合した。細胞を、40倍の拡大率の顕微鏡下で計数した。死亡細胞（細胞膜が損傷したもの）は、明赤色に見え、生存細胞は染色されないまま（染色除去）であった。細胞生存率を、グループあたりの非染色細胞の数を、対照において計数された生存細胞で割って計算し、パーセントで表した。各グループについて、死亡率を、染色細胞の数を、細胞の総数で割って計算し、パーセントで表した。FMD条件は、増大する死亡細胞のパーセントと直接関連する効果（図２Ａ及び２Ｂ）として、それぞれMEC1及びMEC2細胞数の両方の主な減少を引き起こした。
【００７２】
ヒトCLL細胞と類似して、マウスL1210細胞系統に対するFMD培地の適用は、図２Ｃに示すように、その生存を減少させ、死亡率を増大させた。
【００７３】
低グルコース/FCS培養条件に対するCLL細胞系統の生理学的条件を特徴づけるために、本発明者はミトファジー(Tom20)、オートファジー(LC3B)及びアポトーシス(Casp3)の存在を、それぞれIFLにより観察した（図３）。簡単に言うと、48時間生理学的条件及びFMDにおいて培養した細胞を、4%ホルムアルデヒドで固定し、0.1% Triton-Xで透過処理し、特異的一時抗体（抗ウサギ）とインキュベートし、核蛍光染料4',6-ジアミジン-2-フェニリンドロ(DAPI)及び518nm波長（緑）で発光する蛍光とコンジュゲートしたAlexa488抗ウサギ二次抗体で共染色した。細胞質をファロイジン（赤）で染色した。画像を、共焦点顕微鏡ライカLSM700で取得した。FMD培地で培養したMEC1細胞において、ミトコンドリア形態は劇的に変化し、特異的ミトコンドリアマーカーTom20の局在により示される全体の断片化が示された（図３Ｂと３Ａを比較）。同様の結果が、マウスL1210 CLL細胞系統でも検出された（データ示さず）。ミトコンドリアの断片化は、栄養欠如のような種々の細胞ストレスに対する応答であるため、本発明者は、発明者の培養条件下でLC3B抗体を使用してCLL細胞系統におけるオートファジーの証拠も観察した。FMDにおいて、MEC1は、オートファゴソーム局在LC3Bに結び付く明確な細胞質局在の顕著な存在を示し、MEC1がオートファジー誘導の間オートファゴソームに蓄積しうることを示す（図３Ｄと３Ｃを比較）。発明者の形態学的結果と整合して、活性カスパーゼ3を認識する抗体で陽性染色されるMEC1細胞の存在から示されるように、FMD条件は癌細胞死を誘導する。（図３Ｆと３Ｅを比較）
【００７４】
FMDは、CLL細胞増殖／生存に対する薬剤阻害効果を増強する
本発明者は、癌治療、特にCLLにおいて一般的に使用される18種類の異なる広範な薬剤を、FMDと組み合わせた効果についてスクリーニングした。異なる薬剤を、その作用メカニズム及びその標的特異性に従ってクラスター化した（表１）。
【００７５】
図４は、インビトロのFMD効果を分析する実験手順の図表を示す。簡単に言うと、FMD培地を、薬剤処理の前24時間及び薬剤処理の間の24時間、細胞に適用した。対照グループを、10% FCSで補填したグルコース(1.0 g/リットル)中で培養した。FMDグループを、1% FCSで補填したグルコース(0.5 g/リットル)中で培養した。サンプルを、前述したように細胞生存及び細胞死についてアッセイした。24時間のインビトロインキュベーション後、試験した全ての薬剤（表１）は、対照（非−飢餓）グループの生存率を有意に減少させた。特に、ヴィンクリスチン、エリブリン及びシクロホスファミドは、化合物に暴露しない非処理サンプルと比較して50%未満の生存細胞を示した（図５Ａ、黒棒）。「別の化合物（alternative compound）」（表１で定義される、すなわちポリフェノン-E、EGCG、クルクミン、ビタミンC）のクラスター群と、抗炎症ホルモン、プレドニソンは、単独もしくは低グルコース/FCS培養条件と組み合わせた場合の両方で、強力な効果を示さず、生存率を減少させたが、FMD条件の適用は、試験したすべての薬剤の生育阻害/細胞死効果を劇的に改善した（図５Ａ、縞棒）。
【００７６】
死亡率は、生存率に対する以前の観察をより明確に示した（図５Ｂ）。他のすべての薬剤と区別される「別の化合物」は、FMD処理又は単独で、細胞死をわずかにのみ誘導する。他のすべての場合において、20%未満の中程度の死亡率は、FMD培養条件の感作効果により倍になる（図５Ｂ、縞棒）。特に、HDACインヒビター（ロミデプシン10μM及びベリノスタット50nM）は、プロテアソームインヒビター（ボルテゾミブ10nM）ならびにシクロホスファミドは、腫瘍細胞を殺傷するのに非常に効果的であり、その効果はFMDによりさらに増加した。FMDの生存率及び死亡率に対する特異的な貢献は、図６（Ａ及びＢ）によりよく示されており、ここでHDACインヒビター（特にロミデプシン）及びボルテゾミブは、その生育阻害/死亡促進効果の大きな増大を示した。この分析において、「他の化合物」は、抗炎症剤、プレドニソンとともに、FMDの適用と独立して、L1210生育に全く効果を有さない、又は制限された効果を有した。マウスCLLと同様に、FMD培地のMEC1及びMEC2への適用は、マウスL1210で起きたように、ボルテゾミブ、ロミデプシン及びベリノスタットの生育阻害効果を顕著に改善した（図７及び８）。さらに、両方のCLL細胞系統について、別の薬剤、抗CD20ヒト抗体（リツキシマブ10 μg/ml）は、出願人の培養条件下で、MEC1（図７）及びMEC2（図８）細胞生存及び細胞死に非常に効果的であった。
【００７７】
ロミデプシン、ベリノスタット、ボルテゾミブ及びシクロホスファミドは、FMDでL1210に対して濃度依存的毒性を呈する
現在の試験において、CLLにおいて一般的に使用される18種類の異なる広範な薬剤をスクリーニングすることにより、本出願人は、CLL細胞に対して非常に高い致死率を示すのみでなく、FMDと高い相乗効果を示す、最も効果的な薬剤が、HDACインヒビター（ロミデプシン及びベリノスタット）プロテアソームインヒビター（ボルテゾミブ）及びシクロホスファミドであることを発見した。
【００７８】
FMDによる感受性かが薬剤濃度により依存するか否かを試験するために、本発明者は、図４に記載の実験ワークフロースキームを使用して、異なる濃度の選択された薬剤とL1210をインキュベートした。
【００７９】
簡単に言うと、FMD培地を、薬剤処理前の24時間と薬剤処理の間の24時間、細胞に適用した。対照グループを、10% FCSで補填したグルコース(2.0 g/リットル)中で培養した。FMDグループを、1% FCSで補填したグルコース(0.5 g/リットル)中で培養した。ロミデプシンを10μMから400μM；ベリノスタットを50 nM to 500 nM；ボルテゾミブを10 nMから400 nM；シクロホスファミドを100μMから750μMの濃度で添加した。生存及び死亡細胞を、前述のようにエリスロシンB除外アッセイで計測した。細胞生存率を、グループあたりの非染色細胞の数を、対照で計数された生存細胞の数で割って計算し、パーセントで表した。各グループについて、死亡率を、染色細胞の数を、細胞の総数で割って計算し、パーセントで表した。各実験を、3通り行い、2回繰り返した。
【００８０】
すべての処理グループにおいて、L1210生存パーセントは、対照及びFMD培地の両方で、薬剤濃度の関数として徐々に増大した。しかし、FMD条件の適用は、対照培地で培養したL1210及び薬剤で処理したL1210と比較して、生存率を減少することによる生育阻害効果を劇的に改善した（図９）。再び、本出願人は、ある範囲の濃度を通じた薬剤処理と組み合わせたFMDの相乗的細胞毒性効果を観察した（図１０）。
【００８１】
ロミデプシン、ベリノスタット、ボルテゾミブ及びリツキシマブは、CLL細胞系統の最も高い死亡率を引き起こすことによりFMDと相乗的に相互作用する
FMDがともにCLL細胞系統において最も高い死亡率を引き起こす最善の薬剤混合物を同定するために、本発明者は、ロミデプシン、ベリノスタット、ボルテゾミブ及びリツキシマブの異なる組み合わせから得られる、ある範囲の複数の薬剤カクテルを試験した。カクテルで使用される場合、単一薬剤の濃度は、標準用量で与えられる（ロミデプシン、10μM；ベリノスタット、50 nM；ボルテゾミブ、10 nM；リツキシマブ、10μg/ml）。図１１に示すように、試験したすべての薬剤カクテルは、FMDと相乗的に作用し、対照培地と組み合わせた同一の薬剤の効果と比較して、細胞生存率の劇的な減少と細胞死亡率の劇的な増大を引き起こした。興味深いことに、FMDの存在下で、試験したすべての薬剤カクテルは、非常に強力にCLL細胞を殺傷した。しかし、最も強力なものは、それぞれ、(1) ロミデプシン+ベリノスタット+ボルテゾミブ及び(2) ボルテゾミブ+リツキシマブの組み合わせから得られるものであった（図１１）。薬剤カクテル毒性も、L1210細胞系統で試験し、ヒトCLLインビトロモデルで観察されたものと類似の結果が得られた。実際に、FMDの存在下で、ロミデプシン+ベリノスタット+ボルテゾミブの組み合わせは、L1210細胞の0%生存率（100%細胞死、図１２）をもたらした。
【００８２】
FMD依存ストレス差異耐性は、高濃度化学治療薬に対して正常細胞を保護する
本研究で選択された薬剤の高濃度治療に対して、正常細胞における保護的効果をFMDが誘導するか否かを試験するために、出生前11.5日のマウス胚から得られた一次胚性マウス線維芽細胞（MEF I）を使用した。対照培地中で培養した一次MEFに薬剤を添加すると、生存パーセント率は劇的に減少し、生存の傾向は、濃度依存的なふるまいを示した（図１３）。興味深いことに、FMD条件の適用は、薬剤補填により引き起こされる細胞毒性効果を大きく改善し、薬剤用量暴露の増大とは独立に、一次MEFの生存率プロフィールを維持した（図１３）。
【００８３】
一次MEFで観察された死亡率は、一次MEFで薬剤の細胞毒性作用に対してFMDが保護効果を示したという観察と整合する（図１４）。
【００８４】
別の実験セットにおいて、出生前11.5日のマウス胚から得られた2つの異なる一次胚性マウス線維芽細胞系統(MEF-6664/5及びMEF-666/8)を使用した。インビトロ実験ワークフローに従ってFMD培地を適用し、ロミデプシン(10μM)の細胞毒性効果に対する差異ストレス応答を、エリスロシンB除外により評価した。24時間後、対照グループのものと比較して、FMDは約18%生存率を減少させた（図１５）。生理学的培地の存在下ロミデプシン(10μM)で処理したグループでは、MEFI 6664/5及びMEFI 6664/8の両方で生存細胞パーセントが約50%劇的に減少した一方、死亡率は約12%の値に達した。ロミデプシンの存在下のFMDの適用は、薬剤細胞毒性に対する一次MEF細胞の耐性を顕著に改善した。実際に、両方のMEF細胞系統で、生存率は約77%であり、FMDのみのグループに似ている一方、死亡パーセント率は、標準栄養の存在下ロミデプシンで処理したMEFと比較して、4%減少した。
【００８５】
FMDの死亡率への特異的な寄与は、図１５及び１６によりよく示され、細胞増殖にたいするロミデプシンの阻害効果が明確に示されている。
【００８６】
これらのデータを確認するために、薬剤細胞毒性を、薬剤毒性スクリーニングで古典的に使用されている、他の2つの正常細胞系統、ヒトBJ線維芽細胞及びマウス3T3-NIH線維芽細胞でも試験した。出願人のインビトロプロトコルに従って細胞を播種し、ボルテゾミブ(10nM)に暴露した。細胞の生存率を、アネキシンV/PI法を使用して評価した。図１７に示すように、ボルテゾミブの存在下FMD条件の適用は、BJ（図１７Ａ）及び3T3-NIH（図１７Ｂ）の両方で保護的な結果を示し、対照で観察されたものと類似のBTZ+FMDで処理した細胞の死亡率であった。
【００８７】
正常細胞に対する有効な薬剤カクテルの細胞毒性を試験するために、一次MEFを、発明者のインビトロ実験デザインに従って、ロミデプシン、ベリノスタット及びボルテゾミブの混合物に暴露した。図１８に示すように、24時間後、対照と比較して、FMDは細胞数を約20%減少させた一方、死亡細胞率は、2つのグループ（対照対FMD）の間に匹敵するものであった。対照培地の存在下で薬剤カクテルで処理した場合、細胞生存率は劇的に減少する（図１８Ａ及びＢ）一方、死亡率は増大し（図１８Ｃ）、50%の値に達した（図１８Ｄ）。興味深いことに、薬剤カクテルとのFMDの適用は、一次MEF細胞の細胞毒性に対する抵抗性を改善することによる保護効果を示した。実際に、このグループにおいて、生存率と死亡率は飢餓グループのものと類似し、それぞれ約77及び9%であった。
【００８８】
インビボ試験
インビボ実験において本発明者は、絶食レジメン（STS、飢餓）と組み合わせた、複数の選択された薬剤（単独）及び/又はカクテルの効果を試験した。
【００８９】
8週齢Rag2-/-γc-/-メスマウスを、前に記載されたように、27-ゲージ針により0.1 ml生理食塩水中10×106個のMEC1細胞を尾側部静脈に静脈内チャレンジした40。3日後、マウスを、絶食した（STS、水の存在下）か、又はBTZのみ、及び/又はBTZ+RTXで薬剤処理前に自由に給餌したかのいずれかで処理した（図１９）。
【００９０】
一般的な健康状態についてマウスを通常にモニターし、体重を毎日記録した。図２０に示すように、絶食したグループの動物は、48時間のSTSにより、体重減少（総体重の約16%未満）を示した。これらの変化は、再給餌24時間で反転した。
【００９１】
実験手順の最後に、末梢血(PB)、腹腔滲出液及び臓器［脾臓、腎臓、肝臓、肺及び大腿部骨髄(BM)］を収集し、FACS又は形態学的分析のいずれかで分析した。全ての実験グループについて、脾臓重量を測定した（図２１）。興味深いことに、脾臓の巨視的な分析は、薬剤治療を自由な条件で与えるすべての群でこの臓器の増大を示す一方、絶食グループ（STSのみ、STS+BTZ及びST+RTX+BTZ）において、脾臓重量が有意に低かった（図２１）。
【００９２】
単一薬剤及び/又は薬剤カクテルと組み合わせたSTSレジメンのインビボ抗CLL効果を評価するために、BM、脾臓、PB及び腹腔滲出液を、ヒトCD19、ヒトCD20及びヒトCD45のような特異的慢性白血病マーカーの存在について分析した。
【００９３】
FACS分析のために、抗体の非特異的結合を回避するために室温で10分間結晶化可能フラグメントレセプターをブロックした後、PB、BM、腹腔滲出液及び脾臓の細胞を、PE-Vio770抗ヒトCD19抗体、FITC抗ヒトCD20及びTRITC抗ヒトCD45抗体でそれぞれ染色し(MACS Miltenyi Biotec)、BD FACSCANTO IIフローサイトメーターで分析した。フローサイトメトリー試験により、ad lib、STS、BTZグループにおいて、及びSTS+BTZグループにおいて、BM、脾臓、PB及び腹腔滲出液中のMEC1細胞の存在が確認された（図２２、２３及び２４）。絶食レジメンのみでは、BM、脾臓及び腹膜におけるCLL腫瘍細胞の存在が減少したが、ビヒクルのみをうけるマウス(ad lib)と比較して血液中では減少しなかった。特に、STSと組み合わせたBTZの処理は、プロテアソームインヒビター薬剤の細胞毒性効果を強化し、分析した組織の大部分で、ヒトCD19（図２２）、ヒトCD20（図２３）、及びヒトCD45（図２４）の発現を有意に減少させた。BTZとRTXを組み合わせて得られた薬剤カクテルでの処理は、全ての組織でCLL特異的マーカーの発現を減少させるが（図２２、２３及び２４）、BTZとRTXに組み合わせた絶食はより高い程度であり、他の実験グループと比較して、BM、脾臓、PB及び腹腔滲出液における白血病Ｂ細胞集団の存在を減少させた。特に、STSと組み合わせたBTZ + RTXとの処理では、ヒトCDマーカーに依存して、BM及び脾臓において白血病細胞の存在はほとんど検出不可能であり、末梢血及び腹腔滲出液ではおよそ1-4 %であった（図２２、２３及び２４；BTZ + RTXとBTZ + RTX + STSを比較）。
【００９４】
形態学的分析のために、臓器（BM、脾臓、腎臓、肝臓及び肺）をホルマリン固定し、パラフィン組み込みし、3-μm厚セクションにカットし、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。組織学的セクションを、二重盲検法で評価した。BM、脾臓、腎臓及び肝臓の組織病理学的評価により、ad lib、STS、BTZ及びBTZ+STSグループのそれぞれにおいて、全ての組織に腫瘍細胞が実質的に局在することが確認された（図２５、２６、２７及び２８）。ad libマウスから評価された各臓器における腫瘍の観察は、分散パターン（図２５、BM）及び/又は限局性で離散的な凝集（図２６、脾臓；図２７、腎臓及び図２８、肝臓）のいずれかで、中程度から大程度のリンパ球からなり、クロマチンが凝集しており、丸く明確な核小体を有することを示した。転移及びクラスターの浸潤は、STS、BTZ及びBTZ+STS動物の臓器の大部分で拡大がより小さかった。FACSスクリーニングによると、+/- STSレジメンにおける薬剤カクテルBTZ+RTXの処理が、転移、浸潤及び腫瘍病巣がBM、脾臓、腎臓及び肺で明確に検出可能ではなかったことから、腫瘍細胞を殺傷するのに有意に効果的であった（図２５、２６、２７及び２８）。これらのマウスグループについて、分析された臓器の形態は、対照と類似していた（注射なし = MEC1で静脈内注射したマウス）。
【００９５】
患者の試験
1人のCLL男性患者が、自発的にFMD2サイクル（植物ベース及びタンパク質フリー食）を実行した。FMDは、低タンパク質及び低糖の、植物に基づく製剤での4日間の低カロリー摂取（1日目に通常カロリー摂取の50%、2から4日に10%）と、それに続く10日間の標準自由食に存する34,35。FMDサイクルの最後に、白血病細胞(WBC)及び完全リンパ球数(Abs Lymph)を、CLL進行の測定として測定した。図２９に示すように、FMDの2サイクルは、マウス及びヒトCLL細胞の上記の結果と整合して、CLL進行のマーカーレベルを減少させた。
【００９６】
議論
本発明は、腫瘍に対する強力な治療としてFMDの効果を確立した多くの証拠に基づいて、CLLに対して新規でより有効な治療法を同定した。本発明者は、CLL治療としてFMD単独及び/又は種々の薬剤と組み合わせた効果を試験するために、既知のCLL腫瘍細胞系統(MEC-1、MEC-2及びL1210)を特徴づけた。本発明者の最初の分析は、MEC-1及びMEC-2（2つのヒトCLL細胞系統）のいずれか、あるいはL1210（マウスCLL細胞系統）に焦点を当てた。FMDのみでは、CLLの成長を減少させる顕著な効果を有したが、FMDは、よく試験されて臨床試験された複数の薬物と組み合わせで特に有効であった。FMDとの最も高い相乗効果は、HDACインヒビター（ロミデプシン及びベリノスタット）；プロテアソームインヒビター（ボルテゾミブ）；シクロホスファミド及び汎Ｂ細胞マーカーCD20を標的とするキメラモノクローナル抗体（リツキシマブ、ヒトCLL細胞系統に対してのみ）で観察された。高用量の薬物に対するL1210細胞の暴露は細胞生育阻害効果を改善し、CLL細胞の生存を減少させたことから、FMDによる感作はまた、薬物濃度にも依存する。これらのデータから、発明者は、インビトロでそのようなカクテルを試験した。非常に興味深く期待できることに、FMDの存在下、最も効果的な薬物混合物は、HDAC（ロミデプシン及びベリノスタット）プラスプロテアソームインヒビター（ボルテゾミブ）＋抗ヒトCD20リツキシマブ、ヒトMEC1及びMEC2に対してのみ）＋FMDを別に組み合わせることにより得られた。そしてそのような薬剤の正常細胞におけるインビトロ細胞毒性効果を評価した。本発明者の実験は、FMDに対する暴露は、マウス胚性線維芽細胞ならびに正常BJ及び3T3-NIH線維芽細胞を、薬物の毒性作用から保護することを示した。
【００９７】
ヒトMEC1及びMEC2細胞ならびにFMD2サイクルを実行したCLL患者由来のものの結果は、上記の効果と一致する。
【００９８】
本発明者のインビボ試験において、本発明者は、薬物単独及び/又は薬物カクテルの効果を試験し始め、低タンパク質及び低グルコースと組み合わせた場合にインビトロでCLL細胞を殺傷するために非常に効果的であるという結果が得られた。そして本発明者は、新規のプロテアソームインヒビターボルテゾミブ(BTZ)単独ならびに絶食レジメン（STS、飢餓）と組み合わせた別の確立された単一の薬剤リツキシマブ(RTX)と一緒の効果を探索した。ボルテゾミブは、以前に少なくとも1回治療を受けた患者に対するヒト悪性腫瘍（多発性骨髄腫、B細胞非ホジキンリンパ腫）を治療するために、米国及び欧州連合で承認されたプロテアソームインヒビターの画期的医薬品である。BTZの抗新生物効果は、細胞サイクル、細胞成長、及び生存経路の阻害、アポトーシスの誘導、細胞接着、移動及び血管形成をコントロールする遺伝子の発現の阻害を含む、複数の潜在的なメカニズムに関わるようである。顕著なことに、BTZはBCL2を過剰発現する細胞においてアポトーシスを誘導した41。リツキシマブ（リツキサン）は、ヒトB細胞に存在するCD20抗原に対するキメラ抗体である。該抗体は、抗体依存性細胞毒性、アポトーシス誘導及び補体活性化により腫瘍リンパ球を殺傷することができる。重要な試験において、RTXは、単独薬剤として使用された場合、再発性及び難治性緩慢性リンパ腫の50%において、全体的な反応率を生成する42。興味深いことに、BTZは、インビトロでリツキシマブ抵抗性細胞系統におけるCD20発現を増大させ43、そしてBTZとRTX（単独もしくは化学療法と組み合わせて）は、濾胞性リンパ腫及びMCLの治療において中毒性の活性を有する44。しかし、これらの治療法はしばしば、十分な細胞減少力及び再発性の環境における応答の十分な効率を提供しない。さらにBTZ + RTXレジメンは、この組みあわせの潜在的な制限因子を示す、予想外に高い細胞毒性率を有する45。BTZ + RTXレジメンの毒性は、血液学的毒性及び非血液学的毒性を含む。主要な血液学的毒性は、好中球減少、貧血及び血小板減少を含む骨髄抑制である。主要な非血液学的毒性は、吐き気、疲労、下痢及び末梢感覚神経障害である45。
【００９９】
本発明者のインビボ実験は、慢性リンパ腫Ｂの治療において、BTZ+RTXの組み合わせは、単独薬剤（BTZ、単独もしくはSTSとの組み合わせにおいて）よりも有意に強力であることを示す。興味深く有望なことに、この薬物カクテルの効果は、STSとの組み合わせにおいて特に強化されるようであり、標的臓器（骨髄及び脾臓）のみならず血液及び腹水においてもCLL細胞の有意な減少を引き起こす。一次MEF及び正常線維芽細胞（ヒトBJ及びマウス3T3-NIH）インビトロ毒性試験は、FMDが、正常健康細胞の死亡率を減少させることにより、薬物の細胞毒性に対する保護効果を発揮することを示す。
【０１００】
ここで示される結果は、BTZ+RTX+STSレジメンは、血液癌、特にCLL、及び非ホジキンリンパ腫及び多発性骨髄腫のような他の悪性腫瘍のために、単独で採用する、又は慣用的な治療法に統合することができる、新しい治療機会を提供することを示す。他の好ましい組み合わせは、図１１及び１２に記載のものを含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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