(57)【要約】  本明細書は治療用タンパク質の製造方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用タンパク質の製造方法であって、
コレステロール栄養要求性でかつグルタミン栄養要求性の細胞を培養する工程、
前記細胞に、前記細胞におけるコレステロール生合成を回復させることができるタンパク質をコードする核酸（ｉ）と、前記細胞におけるグルタミン生合成を回復させることができるタンパク質をコードする核酸（ｉｉ）と、治療用タンパク質をコードする核酸（ｉｉｉ）とをトランスフェクトする工程、
前記細胞を前記治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養する工程、
前記治療用タンパク質を単離及び／又は精製する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記治療用タンパク質が、抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記トランスフェクション工程において、前記細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸（ｉｉｉ）をトランスフェクトする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
核酸（ｉ）が、３−ケトステロイドレダクターゼをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
核酸（ｉｉ）が、グルタミンシンセターゼをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第１発現ベクターが、核酸（ｉ）及び（ｉｉｉ）を含み、第２発現ベクターが、核酸（ｉｉ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第１発現ベクターが、核酸（ｉ）を含み、第２発現ベクターが、核酸（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１発現ベクターのトランスフェクションが、前記第２発現ベクターのトランスフェクションに先立って行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１発現ベクターのトランスフェクションが、前記第２発現ベクターのトランスフェクションと同時に行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞を、外来的に導入したコレステロールの不在下で、例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション後に培養する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞を、外来的に導入したグルタミンの不在下で、例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション後に培養する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞を、グルタミンシンセターゼ阻害剤、例えば、メチオニンスルホキシイミンの存在下で、例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後に培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞を、３−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で、例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクションの間及び／又はトランスフェクションの後に、培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、ＮＳ０細胞である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質が、アダリムマブ、インフィリキシマブ、パリビズマブ、セツキシマブ、ナタリズマブ、エクリズマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、オファツマブ、カナキヌマブ、ベリムマブ、アリロクマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、ジヌツキシマブ、セクキヌマブ、エボロクマブ、ブリナツモマブ、ペムブロリズマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、シルツキシマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ラキシバクマブ、ペルツズマブ、ブレンツキシマブ、イピリムマブ、デノスマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブ、カツマキソマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リツキシマブ、アブシキシマブ、アレファセプト、エンタネルセプト、アバタセプト、ベラタセプト、アフリベルセプト、ｚｉｖ−アフリベルセプト、リロナセプト、ロミプロスチム、アポセプト、トレバナニブ、ブリシビモド及びデュラグルチドから成る群から選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
治療用タンパク質の製造方法であって、
コレステロール栄養要求性細胞を培養する工程、
前記細胞に、前記細胞におけるコレステロール生合成を回復させることができるタンパク質をコードする核酸（ｉ）と、１種以上の選択マーカーを発現するタンパク質をコードする核酸（ｉｉ）と、治療用タンパク質をコードする核酸（ｉｉｉ）とをトランスフェクトする工程、
前記細胞を前記治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養する工程、
前記治療用タンパク質を単離及び／又は精製する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
前記治療用タンパク質が、抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記トランスフェクション工程において、前記細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸（ｉｉｉ）をトランスフェクトする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
核酸（ｉ）が、３−ケトステロイドレダクターゼをコードする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
核酸（ｉｉ）が、グルタミンシンセターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）又は１種以上の抗生物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイオシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸をコードする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
第１発現ベクターが、核酸（ｉ）及び（ｉｉｉ）を含み、第２発現ベクターが核酸（ｉｉ）を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
第１発現ベクターが、核酸（ｉ）を含み、第２発現ベクターが核酸（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１発現ベクターのトランスフェクションが、前記第２発現ベクターのトランスフェクションに先立って行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１発現ベクターのトランスフェクションが、前記第２発現ベクターのトランスフェクションと同時に行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞を、外来的に導入したコレステロールの不在下で、例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション後に培養する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞を、外来的に導入したグルタミンの不在下で、例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション後に培養する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞を、３−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で、例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクションの間及び／又はトランスフェクションの後に培養する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が、ＮＳ０細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
前記タンパク質が、アダリムマブ、インフィリキシマブ、パリビズマブ、セツキシマブ、ナタリズマブ、エクリズマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、オファツマブ、カナキヌマブ、ベリムマブ、アリロクマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、ジヌツキシマブ、セクキヌマブ、エボロクマブ、ブリナツモマブ、ペムブロリズマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、シルツキシマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ラキシバクマブ、ペルツズマブ、ブレンツキシマブ、イピリムマブ、デノスマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブ、カツマキソマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リツキシマブ、アブシキシマブ、アレファセプト、エンタネルセプト、アバタセプト、ベラタセプト、アフリベルセプト、ｚｉｖ−アフリベルセプト、リロナセプト、ロミプロスチム、アポセプト、トレバナニブ、ブリシビモド及びデュラグルチドから成る群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項３０】
治療用タンパク質の製造方法であって、
コレステロール栄養要求性細胞を培養する工程、
前記細胞に、前記細胞におけるコレステロール生合成を回復させることができるタンパク質をコードする核酸（ｉ）と、
第１選択マーカーを発現するタンパク質をコードする核酸（ｉｉ）と、
第２選択マーカーを発現するタンパク質をコードする核酸（ｉｉｉ）と、
治療用タンパク質をコードする核酸（ｉｖ）と、
をトランスフェクトする工程、
前記細胞を前記治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養する工程、
前記治療用タンパク質を単離及び／又は精製する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
前記治療用タンパク質が、抗体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記トランスフェクション工程において、前記細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸（ｉｖ）をトランスフェクトする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
核酸（ｉ）が、３−ケトステロイドレダクターゼをコードする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
核酸（ｉｉ）が、グルタミンシンセターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）又は１種以上の抗生物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイオシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸をコードする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
核酸（ｉｉｉ）が、グルタミンシンセターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）又は１種以上の抗生物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイオシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸をコードする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞を、外来的に導入したコレステロールの不在下で、例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション後で培養する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞を、外来的に導入したグルタミンの不在下で、例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション後で培養する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞を、３−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で、例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後で培養する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が、ＮＳ０細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
前記タンパク質が、アダリムマブ、インフィリキシマブ、パリビズマブ、セツキシマブ、ナタリズマブ、エクリズマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、オファツマブ、カナキヌマブ、ベリムマブ、アリロクマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、ジヌツキシマブ、セクキヌマブ、エボロクマブ、ブリナツモマブ、ペムブロリズマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、シルツキシマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ラキシバクマブ、ペルツズマブ、ブレンツキシマブ、イピリムマブ、デノスマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブ、カツマキソマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リツキシマブ、アブシキシマブ、アレファセプト、エンタネルセプト、アバタセプト、ベラタセプト、アフリベルセプト、ｚｉｖ−アフリベルセプト、リロナセプト、ロミプロスチム、アポセプト、トレバナニブ、ブリシビモド及びデュラグルチドから成る群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
核酸（ｉｉ）が、グルタミンシンセターゼをコードし、核酸（ｉｉｉ）が、１種以上の抗生物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイオシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸をコードする、請求項３０に記載の方法。
【請求項４２】
核酸（ｉｉ）が、グルタミンシンセターゼをコードし、核酸（ｉｉｉ）が、ネオマイシン抗生物質耐性遺伝子をコードする、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
哺乳動物の細胞発現系を用いた治療用タンパク質の生産はバイオテクノロジー業界において重要性を増している。様々な培養系及びトランスフェクション系があるが、どの系にもかなりの制約がある。
【背景技術】
【０００２】
本明細書に記載の発明は、部分的に、コレステロール栄養要求性細胞と１種以上の追加の選択マーカーとの組み合わせを治療用タンパク質の製造方法において利用することで、コレステロール栄養要求性細胞に関わる、製造時に起きる予期せぬ問題（例えば、低生産性）を回避することができるという発見に基づく。１つの態様において、本開示は治療用タンパク質の製造方法を特徴とし、この方法は、コレステロール栄養要求性及びグルタミン栄養要求性細胞を培養し、細胞に、細胞におけるコレステロール生合成機能を回復させることができるタンパク質をコードする核酸（ｉ）と、細胞におけるグルタミン生合成機能を回復させることができるタンパク質をコードする核酸（ｉｉ）と、治療用タンパク質をコードする核酸（ｉｉｉ）とをトランスフェクトし、この細胞を治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養し、治療用タンパク質を単離及び／又は精製することを含む。
【発明の概要】
【０００３】
一実施形態において、細胞はＮＳ０細胞である。
【０００４】
幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は抗体である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は融合タンパク質である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質はＦｃ含有融合タンパク質である。
【０００５】
幾つかの実施形態においては、トランスフェクションステップにおいて、細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸（ｉｉｉ）をトランスフェクトする。幾つかの実施形態において、核酸（ｉ）は３−ケトステロイドレダクターゼをコードする。幾つかの実施形態において、核酸（ｉｉ）はグルタミンシンセターゼをコードする。
【０００６】
幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）及び（ｉｉｉ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは、第２発現ベクターのトランスフェクションに先立って行われる。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは、第２発現ベクターのトランスフェクションと同時に行われる。
【０００７】
幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したグルタミンの不在下で培養する（例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、グルタミンシンセターゼ阻害剤（例えば、メチオニンスルホキシイミン）の存在下で培養する（例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、３−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後）。
【０００８】
幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下及び外来的に導入したグルタミンの不在下で培養する。幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下、外来的に導入したグルタミンの不在下及びグルタミンシンセターゼ阻害剤（例えば、メチオニンスルホキシイミン）の存在下で培養する。幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養し（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション後）、細胞は、外来的に導入したグルタミンの不在下で培養する（例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション後）。
【０００９】
１つの態様において、本開示は治療用タンパク質の製造方法を特徴とし、この方法は、コレステロール栄養要求性細胞を培養し、細胞に、細胞におけるコレステロール生合成機能を回復させることができるタンパク質をコードする核酸（ｉ）と、１種以上の選択マーカーを発現するタンパク質をコードする核酸（ｉｉ）と、治療用タンパク質をコードする核酸（ｉｉｉ）をトランスフェクトし、この細胞を治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養し、治療用タンパク質を単離及び／又は精製することを含む。
【００１０】
一実施形態において、細胞はＮＳ０細胞である。
【００１１】
幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は抗体である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は融合タンパク質である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質はＦｃ含有融合タンパク質である。
【００１２】
幾つかの実施形態においては、トランスフェクションステップにおいて、細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸（ｉｉｉ）をトランスフェクトする。
【００１３】
幾つかの実施形態において、核酸（ｉ）は３−ケトステロイドレダクターゼをコードする。
【００１４】
幾つかの実施形態において、核酸（ｉｉ）はグルタミンシンセターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）又は１種以上の抗生物質耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイオシン（ｈｙｇｒｏｍｙｏｃｉｎ）、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸）をコードする。
【００１５】
幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）及び（ｉｉｉ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは第２発現ベクターのトランスフェクションに先立って行われる。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは第２発現ベクターのトランスフェクションと同時に行われる。
【００１６】
幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、３−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養する。
【００１７】
１つの態様において、本開示は治療用タンパク質の製造方法を特徴とし、この方法は、機能性ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を発現しないコレステロール栄養要求性細胞を培養し、細胞に、細胞におけるコレステロール生合成機能を回復させることができるタンパク質をコードする核酸（ｉ）と、ＤＨＦＲをコードする核酸（ｉｉ）と、治療用タンパク質をコードする核酸（ｉｉｉ）とをトランスフェクトし、この細胞を治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養し、治療用タンパク質を単離及び／又は精製することを含む。
【００１８】
一実施形態において、細胞はＮＳ０細胞である。
【００１９】
幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は抗体である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は融合タンパク質である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質はＦｃ含有融合タンパク質である。
【００２０】
幾つかの実施形態においては、トランスフェクションステップにおいて、細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸（ｉｉｉ）をトランスフェクトする。幾つかの実施形態において、核酸（ｉ）は３−ケトステロイドレダクターゼをコードする。
【００２１】
幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）及び（ｉｉｉ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは、第２発現ベクターのトランスフェクションに先立って行われる。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは、第２発現ベクターのトランスフェクションと同時に行われる。
【００２２】
幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、ＤＨＦＲ阻害剤（例えば、メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ））の存在下で培養する（例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、３−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後）。
【００２３】
幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養する。幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下及びＤＨＦＲ阻害剤（例えば、メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ））の存在下で培養する。
【００２４】
１つの態様において、本開示は治療用タンパク質の製造方法を特徴とし、この方法は、ネオマイシンに感受性があるコレステロール栄養要求性細胞を培養し、細胞に、細胞におけるコレステロール生合成機能を回復させることができるタンパク質をコードする核酸（ｉ）と、ネオマイシン耐性遺伝子をコードする核酸（ｉｉ）と、治療用タンパク質をコードする核酸（ｉｉｉ）とをトランスフェクトし、この細胞を治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養し、治療用タンパク質を単離及び／又は精製することを含む。
【００２５】
一実施形態において、細胞はＮＳ０細胞である。
【００２６】
幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は抗体である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は融合タンパク質である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質はＦｃ含有融合タンパク質である。
【００２７】
幾つかの実施形態においては、トランスフェクションステップにおいて、細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸（ｉｉｉ）をトランスフェクトする。幾つかの実施形態において、核酸（ｉ）は３−ケトステロイドレダクターゼをコードする。幾つかの実施形態において、核酸（ｉｉ）はアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ３’ＩＩ）をコードするＴｎ５からのネオマイシン耐性遺伝子をコードする。
【００２８】
幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）及び（ｉｉｉ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは、第２発現ベクターのトランスフェクションに先立って行われる。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは、第２発現ベクターのトランスフェクションと同時に行われる。
【００２９】
幾つかの実施形態において、第１及び第２発現ベクターは共にＨＣ及びＬＣを含有し、一方のベクターはＫＳＲを含有し、他方はＧＳ又は別の抗生物質耐性遺伝子を含有する。幾つかの実施形態においては３つの異なるベクター（例えば、三重選択の場合）があり、３つ全てのベクターがＨＣ及びＬＣを含有し、第１ベクターはＫＳＲを含有し、第２ベクターはＧＳを含有し、第３ベクターは任意の抗生物質耐性遺伝子、例えばＮＥＯを含有する。
【００３０】
幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、アミノグリコシド抗生物質（例えば、Ｇ４１８）の存在下で培養する（例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、３−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後）。
【００３１】
幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養する。幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下及びアミノグリコシド抗生物質（例えば、Ｇ４１８）の存在下で培養する。
【００３２】
１つの態様において、本開示は治療用タンパク質の製造方法を特徴とし、この方法は、ブラストサイジンに感受性があるコレステロール栄養要求性細胞を培養し、細胞に、細胞におけるコレステロール生合成機能を回復させることができるタンパク質をコードする核酸（ｉ）と、ブラストサイジン耐性遺伝子をコードする核酸（ｉｉ）と、治療用タンパク質をコードする核酸（ｉｉｉ）とをトランスフェクトし、この細胞を治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養し、治療用タンパク質を単離及び／又は精製することを含む。
【００３３】
一実施形態において、細胞はＮＳ０細胞である。
【００３４】
幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は抗体である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は融合タンパク質である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質はＦｃ含有融合タンパク質である。
【００３５】
幾つかの実施形態においては、トランスフェクションステップにおいて、細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸（ｉｉｉ）をトランスフェクトする。幾つかの実施形態において、核酸（ｉ）は３−ケトステロイドレダクターゼをコードする。幾つかの実施形態において、核酸（ｉｉ）は、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）からのブラストサイジン耐性遺伝子（ブラストサイジン−Ｓデアミナーゼをコードする）をコードする。
【００３６】
幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）及び（ｉｉｉ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは、第２発現ベクターのトランスフェクションに先立って行われる。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは、第２発現ベクターのトランスフェクションと同時に行われる。
【００３７】
幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、ペプチジルヌクレオシド抗生物質（例えば、ブラストサイジン）の存在下で培養する（例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、３−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後）。
【００３８】
幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養する。幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下及びペプチジルヌクレオシド抗生物質、アミノグリコシド抗生物質（例えば、ブラストサイジン）の存在下で培養する。
【００３９】
１つの態様において、本開示は治療用タンパク質の製造方法を特徴とし、この方法は、ハイグロマイシンＢに感受性があるコレステロール栄養要求性細胞を培養し、細胞に、細胞におけるコレステロール生合成機能を回復させることができるタンパク質をコードする核酸（ｉ）と、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子をコードする核酸（ｉｉ）と、治療用タンパク質をコードする核酸（ｉｉｉ）とをトランスフェクトし、この細胞を治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養し、治療用タンパク質を単離及び／又は精製することを含む。
【００４０】
一実施形態において、細胞はＮＳ０細胞である。
【００４１】
幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は抗体である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は融合タンパク質である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質はＦｃ含有融合タンパク質である。
【００４２】
幾つかの実施形態においては、トランスフェクションステップにおいて、細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸（ｉｉｉ）をトランスフェクトする。幾つかの実施形態において、核酸（ｉ）は３−ケトステロイドレダクターゼをコードする。幾つかの実施形態において、核酸（ｉｉ）はハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼをコードする。
【００４３】
幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）及び（ｉｉｉ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは、第２発現ベクターのトランスフェクションに先立って行われる。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは、第２発現ベクターのトランスフェクションと同時に行われる。
【００４４】
幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、アミノグリコシド抗生物質（例えば、ハイグロマイシンＢ）の存在下で培養する（例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、３−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後）。
【００４５】
幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養する。幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下及びペプチジルヌクレオシド抗生物質、アミノグリコシド抗生物質（例えば、ハイグロマイシンＢ）の存在下で培養する。
【００４６】
１つの態様において、本開示は治療用タンパク質の製造方法を特徴とし、この方法は、ピューロマイシンに感受性があるコレステロール栄養要求性細胞を培養し、細胞に、細胞におけるコレステロール生合成機能を回復させることができるタンパク質をコードする核酸（ｉ）と、ピューロマイシン耐性遺伝子をコードする核酸（ｉｉ）と、治療用タンパク質をコードする核酸（ｉｉｉ）とをトランスフェクトし、この細胞を治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養し、治療用タンパク質を単離及び／又は精製することを含む。
【００４７】
一実施形態において、細胞はＮＳ０細胞である。
【００４８】
幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は抗体である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は融合タンパク質である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質はＦｃ含有融合タンパク質である。
【００４９】
幾つかの実施形態においては、トランスフェクションステップにおいて、細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸（ｉｉｉ）をトランスフェクトする。幾つかの実施形態において、核酸（ｉ）は３−ケトステロイドレダクターゼをコードする。幾つかの実施形態において、核酸（ｉｉ）はピューロマイシンＮ−アセチル−トランスフェラーゼをコードする。
【００５０】
幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）及び（ｉｉｉ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは、第２発現ベクターのトランスフェクションに先立って行われる。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは、第２発現ベクターのトランスフェクションと同時に行われる。
【００５１】
幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、アミノヌクレオシド抗生物質（例えば、ピューロマイシン）の存在下で培養する（例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、３−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後）。
【００５２】
幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養する。幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下及びペプチジルヌクレオシド抗生物質、アミノヌクレオシド抗生物質（例えば、ピューロマイシン）の存在下で培養する。
【００５３】
１つの態様において、本開示は治療用タンパク質の製造方法を特徴とし、この方法は、ゼオシンに感受性があるコレステロール栄養要求性細胞を培養し、細胞に、細胞におけるコレステロール生合成機能を回復させることができるタンパク質をコードする核酸（ｉ）と、ゼオシン耐性遺伝子をコードする核酸（ｉｉ）と、治療用タンパク質をコードする核酸（ｉｉｉ）とをトランスフェクトし、この細胞を治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養し、治療用タンパク質を単離及び／又は精製することを含む。
【００５４】
一実施形態において、細胞はＮＳ０細胞である。
【００５５】
幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は抗体である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は融合タンパク質である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質はＦｃ含有融合タンパク質である。
【００５６】
幾つかの実施形態においては、トランスフェクションステップにおいて、細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸（ｉｉｉ）をトランスフェクトする。幾つかの実施形態において、核酸（ｉ）は３−ケトステロイドレダクターゼをコードする。幾つかの実施形態において、核酸（ｉｉ）はＳｈ  ｂｌｅ遺伝子産物をコードする。
【００５７】
幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）及び（ｉｉｉ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは、第２発現ベクターのトランスフェクションに先立って行われる。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは、第２発現ベクターのトランスフェクションと同時に行われる。
【００５８】
幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、銅キレート化グリコペプチド抗生物質（例えば、ゼオシン）の存在下で培養する（例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、３−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養する。幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下及び銅キレート化グリコペプチド抗生物質（例えば、ゼオシン）の存在下で培養する。
【００５９】
１つの態様において、本開示は治療用タンパク質の製造方法を特徴とし、この方法は、ミコフェノール酸（ＭＰＡ）に感受性があるコレステロール栄養要求性細胞を培養し、細胞に、細胞におけるコレステロール生合成機能を回復させることができるタンパク質をコードする核酸（ｉ）と、ＭＰＡ耐性遺伝子をコードする核酸（ｉｉ）と、治療用タンパク質をコードする核酸（ｉｉｉ）とをトランスフェクトし、この細胞を治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養し、治療用タンパク質を単離及び／又は精製することを含む。
【００６０】
一実施形態において、細胞はＮＳ０細胞である。
【００６１】
幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は抗体である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は融合タンパク質である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質はＦｃ含有融合タンパク質である。
【００６２】
幾つかの実施形態においては、トランスフェクションステップにおいて、細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸（ｉｉｉ）をトランスフェクトする。幾つかの実施形態において、核酸（ｉ）は３−ケトステロイドレダクターゼをコードする。幾つかの実施形態において、核酸（ｉｉ）はキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子をコードする。
【００６３】
幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）及び（ｉｉｉ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは、第２発現ベクターのトランスフェクションに先立って行われる。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは、第２発現ベクターのトランスフェクションと同時に行われる。
【００６４】
幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、ＭＰＡの存在下で培養する（例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、３−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後）。
【００６５】
幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養する。幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下及びＭＰＡの存在下で培養する。
【００６６】
１つの態様において、本開示は治療用タンパク質の製造方法を特徴とし、この方法は、ミコフェノール酸（ＭＰＡ）に感受性があるコレステロール栄養要求性細胞を培養し、細胞に、細胞におけるコレステロール生合成機能を回復させることができるタンパク質をコードする核酸（ｉ）と、ＭＰＡ耐性遺伝子をコードする核酸（ｉｉ）と、治療用タンパク質をコードする核酸（ｉｉｉ）とをトランスフェクトし、この細胞を治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養し、治療用タンパク質を単離及び／又は精製することを含む。
【００６７】
一実施形態において、細胞はＮＳ０細胞である。
【００６８】
幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は抗体である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は融合タンパク質である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質はＦｃ含有融合タンパク質である。
【００６９】
幾つかの実施形態においては、トランスフェクションステップにおいて、細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸（ｉｉｉ）をトランスフェクトする。幾つかの実施形態において、核酸（ｉ）は３−ケトステロイドレダクターゼをコードする。幾つかの実施形態において、核酸（ｉｉ）は、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子をコードする。
【００７０】
幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）及び（ｉｉｉ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは、第２発現ベクターのトランスフェクションに先立って行われる。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは、第２発現ベクターのトランスフェクションと同時に行われる。
【００７１】
幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、ＭＰＡの存在下で培養する（例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、３−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後）。
【００７２】
幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養する。幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下及びＭＰＡの存在下で培養する。
【００７３】
１つの態様において、本開示は治療用タンパク質の製造方法を特徴とし、この方法は、コレステロール栄養要求性及びグルタミン栄養要求性細胞を培養し、細胞に、細胞におけるコレステロール生合成機能を回復させることができるタンパク質をコードする核酸（ｉ）（例えば、ＫＳＲ）と、細胞におけるグルタミン生合成機能を回復させることができるタンパク質をコードする核酸（ｉｉ）（例えば、グルタチオンシンセターゼ）と、Ｇ４１８への耐性を付与できるタンパク質をコードする核酸（ｉｉｉ）（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）と、治療用タンパク質をコードする核酸（ｉｖ）（例えば、抗体、例えば、重鎖及び軽鎖）とをトランスフェクトし、この細胞を治療用タンパク質の発現に適した条件下で培養し、治療用タンパク質を単離及び／又は精製することを含む。
【００７４】
幾つかの実施形態においては、最初に核酸（ｉｉｉ）をトランスフェクトし、トランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後、Ｇ４１８を細胞培地に添加する。幾つかの実施形態においては、最初に核酸（ｉｉｉ）をトランスフェクトし、トランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後、Ｇ４１８を細胞培地に添加し、２番目に核酸（ｉｉ）をトランスフェクトし、トランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後、コレステロールは細胞培地で不在である。幾つかの実施形態においては、最初に核酸（ｉｉｉ）をトランスフェクトし、トランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後、Ｇ４１８を細胞培地に添加し、２番目に核酸（ｉｉ）をトランスフェクトし、トランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後、コレステロール（例えば、外来的に添加したコレステロール）は細胞培地で不在であり、３番目に核酸（ｉ）をトランスフェクトし、トランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後、グルタミン（例えば、外来的に添加したグルタミン）は細胞培地で不在である（任意で、メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）を細胞培地に添加する）。
【００７５】
幾つかの実施形態においては、核酸（ｉｉ）及び（ｉ）を同時にトランスフェクトし、Ｇ４１８を細胞培地に添加し、細胞培地はコレステロール（例えば、外来的に添加したコレステロール）を含有しない。幾つかの実施形態においては、核酸（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を同時にトランスフェクトし、Ｇ４１８を細胞培地に添加し、細胞培地はコレステロール（例えば、外来的に添加したコレステロール）を含有せず、またグルタミン（例えば、外来的に添加したグルタミン）を含有しない（任意で、メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）を細胞培地に添加する）。幾つかの実施形態においては、核酸（ｉｖ）を（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のそれぞれと同じ核酸配列（例えば、ベクター）に組み込む。幾つかの実施形態においては、核酸（ｉｖ）を、（ｉ）及び（ｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｉｉ）又は（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のそれぞれと同じ核酸配列（例えば、ベクター）に組み込む。幾つかの実施形態において、核酸（ｉｖ）は、治療用抗体の重鎖及び軽鎖をコードする。幾つかの実施形態において、軽鎖は、（ｉ）及び（ｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）又は（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のそれぞれと同じ核酸配列（例えば、ベクター）に組み込む。幾つかの実施形態において、重鎖は、（ｉ）及び（ｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）又は（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のそれぞれと同じ核酸配列（例えば、ベクター）に組み込む。幾つかの実施形態において、軽鎖及び重鎖は、（ｉ）及び（ｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）又は（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のそれぞれと同じ核酸配列（例えば、ベクター）に組み込む。
【００７６】
幾つかの実施形態においては、核酸（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）のいずれかを１つの核酸（例えば、１つのベクター）に組み込む。例えば、幾つかの実施形態においては、核酸（ｉ）及び（ｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｖ）、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）又は（ｉｉ）及び（ｉｖ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を１つの核酸に組み込む。幾つかの実施形態においては、核酸（ｉｖ）は２つの別々の核酸を含み、一方は治療用抗体の重鎖をコードし、一方は軽鎖をコードする。幾つかの実施形態において、重鎖は別の核酸、例えば（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）上に組み込む。幾つかの実施形態において、軽鎖は、別の核酸、例えば（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）上に組み込む。
【００７７】
一実施形態において、細胞はＮＳ０細胞である。
【００７８】
幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は抗体である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は融合タンパク質である。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質はＦｃ含有融合タンパク質である。
【００７９】
幾つかの実施形態においては、トランスフェクションステップにおいて、細胞に、抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードする核酸（ｉｖ）をトランスフェクトする。幾つかの実施形態において、核酸（ｉ）は３−ケトステロイドレダクターゼをコードする。幾つかの実施形態において、核酸（ｉｉ）はグルタミンシンセターゼをコードする。幾つかの実施形態において、核酸（ｉｉｉ）はネオマイシン耐性遺伝子をコードする。
【００８０】
幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）及び（ｉｖ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターは核酸（ｉ）を含み、第２発現ベクターは核酸（ｉｉ）及び（ｉｖ）を含む。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは、第２発現ベクターのトランスフェクションに先立って行われる。幾つかの実施形態において、第１発現ベクターのトランスフェクションは、第２発現ベクターのトランスフェクションと同時に行われる。
【００８１】
幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したグルタミンの不在下で培養する（例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、グルタミンシンセターゼ阻害剤（例えば、メチオニンスルホキシイミン）の存在下で培養する（例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後）。幾つかの実施形態において、細胞は、３−ケトステロイドレダクターゼ阻害剤の存在下で培養する（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション中及び／又はトランスフェクション後）。
【００８２】
幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下及び外来的に導入したグルタミンの不在下で培養する。幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下、外来的に導入したグルタミンの不在下及びグルタミンシンセターゼ阻害剤（例えば、メチオニンスルホキシイミン）の存在下で培養する。幾つかの実施形態において、細胞は、外来的に導入したコレステロールの不在下で培養し（例えば、核酸（ｉ）のトランスフェクション後）、細胞は外来的に導入したグルタミンの不在下で培養する（例えば、核酸（ｉｉ）のトランスフェクション後）。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】本明細書に記載の方法のプロトコル例を示す。
【図２】３−ケトステロイドレダクターゼのＮＣＢＩリファレンスアミノ酸配列（ＮＰ＿０５７４５５）（配列番号１）を示す。
【図３】ＨＳＤ１７β７のＮＣＢＩリファレンスｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿０１６３７１．３）（配列番号２）を示す。
【図４】グルタミンシンセターゼのＮＣＢＩリファレンスアミノ酸配列（ＮＰ＿００２０５６．２）（配列番号３）を示す。
【図５Ａ−Ｅ】グルタミンシンセターゼのＮＣＢＩリファレンスｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿００２０６５．６）（配列番号４）を示す。
【図６】ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）のＮＣＢＩリファレンスアミノ酸配列（ＮＰ＿０００７８２．１）（配列番号５）を示す。
【図７Ａ−Ｂ】ＤＨＦＲのＮＣＢＩリファレンスｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿０００７９１．３）（配列番号６）を示す。
【図８】３−ＫＳＲ細胞培養系を使用して生産したタンパク質の安定性を示す。１０個の異なる３−ＫＳＲ細胞クローンについての３−ＫＳＲ細胞の上清における最終的なタンパク質力価の一覧である。４つのクローン（３−２６１、３−３３０、３−３５１、３−４９７）は高いタンパク質力価を示した。しかしながら、図８で更に示すように、３−ＫＳＲクローン３−３５１は、細胞特異的生産性において低下を示した。
【図９】Ｎｅｏ（１００μｇ／ｍｌ又は２００μｇ／ｍｌのＧ４１８）を使用した細胞選択を示す折れ線グラフである。グラフは細胞生存率対回収からの日数を示す。
【図１０】グルタチオンシンセターゼ（ＧＳ）を使用した細胞選択を示す折れ線グラフである（グルタミン濃度は２ｍＭから０ｍＭに又は０．５ｍＭから０ｍＭにそれぞれ低下させる）。グラフは細胞生存率対回収からの日数を示す。
【図１１】三重選択として３−ＫＳＲ、ｎｅｏ及びＧＳを使用した細胞選択を示す折れ線グラフである。グラフは細胞生存率対回収からの日数を示す。Ｇ４１８への耐性はｎｅｏ遺伝子により付与できる。ＮＳ０におけるＧ４１８の濃度は１００μｇ／ｍｌ及び２００μｇ／ｍｌである。グルタミン濃度は２ｍＭから０ｍＭに又は０．５ｍＭから０ｍＭに低下させる。ＭＳＸ阻害剤もＧＳ活性の阻害に使用し得る。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
特定の組み換えタンパク質生産系、例えばＮＳ０宿主細胞系において、コレステロール栄養要求性は、３−ケトステロイドレダクターゼ（３−ＫＳＲ）遺伝子を治療用タンパク質をコードするベクターに組み込むことで利用でき、コレステロールを培地から除去することで組み換え細胞を選択する（米国特許出願第２０１０／００２８９４０号）。しかしながら、本開示の発明者は、この系では、この細胞株では増幅が困難であるため、生産性（例えば、タンパク質産物／細胞／日）及びタンパク質力価が低くなる場合があることを思いがけず発見した（例えば、図８を参照のこと）。他のＮＳ０宿主細胞系においては、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）遺伝子を治療用タンパク質をコードするベクターに組み込むことでグルタミン栄養要求性を利用でき、グルタミンを培地から除去することでトランスフェクト済みの細胞を選択する。加えて、ＧＳ阻害剤を培地に添加することで複数のＧＳ遺伝子コピー、ひいては対象とするタンパク質をコードする遺伝子の組み込みへと選択を促すことができる（Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０００．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：ＧＳ−ＮＳ０  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｆｅｂ；３２（２）：１０９−２３）。各系には異なる制約がある。本明細書では、例えばＮＳ０宿主細胞系における治療用産物の代替的な製造方法について説明する。
【００８５】
本明細書において、「グルタミン栄養要求性」細胞とは、グルタミンを合成しない又はグルタミン非含有細胞培地における生存及び増殖を可能にするに十分なグルタミンを合成しない細胞と定義される。
【００８６】
本明細書において、「コレステロール栄養要求性」細胞とは、コレステロールを合成しない又はコレステロール非含有細胞培地における生存及び増殖を可能にするに十分なコレステロールを合成しない細胞と定義される。
【００８７】
本明細書において、「グルタミン生合成機能を回復させる」とは、細胞におけるグルタミン生合成レベルを（グルタミン栄養要求性細胞におけるレベルから）少なくともグルタミン非含有細胞培地における細胞の生存及び増殖を可能にするレベルまで上昇させることを意味する。
【００８８】
本明細書において、「コレステロール生合成機能を回復させる」とは、細胞におけるコレステロール生合成レベルを（コレステロール栄養要求性細胞におけるレベルから）少なくともコレステロール非含有細胞培地における細胞の生存及び増殖を可能にするレベルまで上昇させることを意味する。
【００８９】
本明細書において、「生存及び増殖」とは、細胞又は細胞培養物が、トリパンブルー色素排除法で測定した場合に、対数期増殖中に６０％より高い細胞生存率を維持する能力のことである。
【００９０】
３−ケトステロイドレダクターゼ（ＫＳＲ）
酵素３−ケトステロイドレダクターゼはＨＳＤ１７β７遺伝子によりコードされ、またコレステロールの生合成において３−ケトステロイドレダクターゼとして機能する（Ｍａｒｉｊａｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００３  Ｓｅｐ；１７（９）：１７１５−２５）。ＮＣＢＩリファレンスアミノ酸（ＮＰ＿０５７４５５）及びｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿０１６３７１．３）については図２（配列番号１）及び図３（配列番号２）をそれぞれ参照のこと。
【００９１】
グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）
グルタミンシンセターゼ遺伝子がコードする酵素グルタミンシンセターゼは、グルタメート及びアンモニアからのグルタミンの合成を触媒する（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，２０００，Ｖｏｌ  １４７７，１２２-１４５）。別の形でスプライスしたトランスクリプトバリアントがこの遺伝子について幾つか発見されている。ＮＣＢＩリファレンスアミノ酸ＮＰ＿００２０５６．２及びｍＲＮＡ配列ＮＭ＿００２０６５．６については図４（配列番号３）及びＦＩＧ．５（配列番号４）をそれぞれ参照のこと。
【００９２】
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）
酵素ＤＨＦＲはＤＨＦＲ遺伝子によりコードされ、ジヒドロ葉酸をテトラヒドロ葉酸、プリンのデノボ合成に必要なメチル基シャトル、チミジル酸及び特定のアミノ酸に変換する。別の形でスプライスしたトランスクリプトバリアントがこの遺伝子について幾つか発見されている。ＮＣＢＩレファレンスアミノ酸（ＮＰ＿０００７８２．１）及びｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿０００７９１．３）については図６（配列番号５）及び図７（配列番号６）をそれぞれ参照のこと。
【００９３】
抗生物質耐性遺伝子選択マーカー
抗生物質耐性遺伝子は、哺乳動物の細胞培養において一般的に使用されるポジティブ選択マーカーである（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｄｉｔｏｒ  Ｍｏｈａｍｅｄ  Ａｌ−Ｒｕｂｅａｉ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ  Ｂ．Ｖ．，ＩＳＢＮ  ９７８−９４−００７−１２５６−０；Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｍｏｈａｍｅｄ  Ａｌ−Ｒｕｂｅａｉ  Ａｕｇｕｓｔ  １１，２００９  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａを参照のこと）。抗生物質耐性遺伝子の例には、以下に限定するものではないが、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸に耐性を付与する遺伝子が含まれる。細胞選択における使用に適した抗生物質耐性遺伝子及び対応する阻害剤は当業者ならばわかる。
【００９４】
【表１】
2018518985.tif 000002
2018518985.tif 000003
【００９５】
ベクター、宿主細胞及び治療用タンパク質の生産
本発明の治療用タンパク質は宿主細胞から生産できる。宿主細胞とは、本明細書に記載のポリペプチド及びコンストラクトをその対応する核酸から発現させるのに必要な細胞成分、例えばオルガネラを含む媒体のことである。核酸は、当該分野で公知の慣用の技法（例えば、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈澱法、直接マイクロインジェクション、感染等）により宿主細胞に導入可能な核酸ベクターに含め得る。核酸ベクターの選択は、使用する宿主細胞に依存する部分がある。概して、好ましい宿主細胞は原核生物（例えば、細菌）又は真核生物（例えば、哺乳動物）由来である。
【００９６】
核酸ベクターの構築及び宿主細胞
本発明の治療用タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、当該分野で公知の多様な方法で用意し得る。これらの方法には、以下に限定するものではないが、オリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）変異誘発及びＰＣＲ変異誘発が含まれる。本発明の治療用タンパク質をコードする核酸分子は標準的な技法、例えば遺伝子合成を用いて得られる。あるいは、野生型の治療用タンパク質をコードする核酸分子を、当該分野における標準的な技法、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）変異誘発を用いて特定のアミノ酸置換基を含むように変異させ得る。核酸分子は、ヌクオチドシンセサイザ又はＰＣＲ技法を用いて合成できる。
【００９７】
本発明の治療用タンパク質をコードする核酸配列は、原核生物又は真核生物の宿主細胞において複製し、核酸分子を発現可能なベクターに挿入し得る。当該分野においては多くのベクターが利用可能であり、また本発明の目的のために使用できる。各ベクターは、特定の宿主細胞と適合するように調節及び最適化し得る様々な成分を含有し得る。例えば、ベクター成分は、以下に限定するものではないが、複製開始点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位、シグナル配列、対象タンパク質をコードする核酸配列及び転写終結配列を含み得る。
【００９８】
一例において、本発明のベクターには、選択遺伝子（例えば、３−ケトステロイドレダクターゼ及びグルタミンシンセターゼ）用の弱いプロモーター及び対象タンパク質（例えば、抗体、例えば、抗体の重鎖及び軽鎖）をコードする遺伝子用の強いプロモーターを含むベクターが含まれる。ベクターは直線化又はスーパーコイル化でき、改善されたトランスフェクション効率を示す。幾つかの実施形態においては、ベクターのコドン最適化を用いることでコード配列中の稀なコドンの使用を最小限にし、タンパク質生産収率を改善する。本発明のベクター例は、Ｗｕｒｍ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  ２２；Ｉｓｓｕｅ  １１：１３９３−１３９８）に記載されている。
【００９９】
幾つかの実施形態においては、哺乳動物の細胞を本発明のための宿主細胞として使用する。グルタミン栄養要求性及びコレステロール栄養要求性表現型は、非グルタミン栄養要求性及び非コレステロール栄養要求性細胞を遺伝子操作することで誘導でき、例えば内因性グルタミン生合成に必要な遺伝子、例えばグルタミンシンセターゼの変異又は欠失が含まれる。遺伝子操作の一般的な方法は当業者には周知であり、例えば部位特異的変異誘発、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ、ｓｈＲＮＡ、トランスポゾンであり、例えばＣｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００７  Ａｐｒ；５３（１−３）：６５-７３を参照のこと。ＮＳ０と称されるマウス骨髄腫細胞は公知のグルタミン栄養要求性及びコレステロール栄養要求性細胞である（例えば、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０００．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：ＧＳ−ＮＳ０  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｆｅｂ；３２（２）：１０９−２３及び米国特許出願第２０１０／００２８９４０号）を参照のこと。
【０１００】
遺伝子操作して宿主細胞として使用し得る哺乳動物の細胞型の追加例には、以下に限定するものではないが、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｆ）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＰＣ３、Ｖｅｒｏ、ＭＣ３Ｔ３、ＮＳ０、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、Ｔ４７Ｄ）、ＣＲＬ７０３０及びＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が含まれる。他の実施形態においては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を本発明のための宿主細胞として使用する。大腸菌株の例には、以下に限定するものではないが、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ（登録商標）３１４４６）、大腸菌λ１７７６（ＡＴＣＣ（登録商標）３１５３７、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＢＡＡ−１０２５）及び大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ（登録商標）３１６０８）が含まれる。様々な宿主細胞が、タンパク質産物の翻訳後プロセシング及び修飾に関して特徴的且つ特異的なメカニズムを有する。適切な細胞株又は宿主系を選択することで、発現する治療用タンパク質を正確に修飾及びプロセシングし得る。上記の発現ベクターを当該分野で慣用の技法、例えば形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈澱法及び直接マイクロインジェクションを用いて適切な宿主細胞に導入し得る。タンパク質生産のために一旦ベクターを宿主細胞に導入したら、プロモーターの誘導、形質転換体の選択又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅にむけて適切に改変した慣用の栄養培地で宿主細胞を培養する。治療用タンパク質の発現方法は当該分野で公知であり、例えばＰａｕｌｉｎａ  Ｂａｌｂａｓ，Ａｒｇｅｌｉａ  Ｌｏｒｅｎｃｅ（ｅｄｓ．）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｒｅｖｉｅｗｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；２ｎｄ  ｅｄ．２００４（Ｊｕｌｙ  ２０，２００４）及びＶｌａｄｉｍｉｒ  Ｖｏｙｎｏｖ  ａｎｄ  Ｊｕｓｔｉｎ  Ａ．Ｃａｒａｖｅｌｌａ（ｅｄｓ．）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；２ｎｄ  ｅｄ．２０１２（Ｊｕｎｅ  ２８，２０１２）を参照のこと。
【０１０１】
タンパク質の生産、回収及び精製
本発明の治療用タンパク質の生産に使用する宿主細胞は、当該分野で公知であり且つ選択した宿主細胞の培養に適した培地で増殖させ得る。哺乳動物宿主細胞に適した培地の例には、基礎培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｅｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）補充ＤＭＥＭ及びＲＰＭＩ−１６４０が含まれる。細菌宿主細胞に適した培地の例には、選択剤、例えばアンピシリン等の必要なものを補充したルリアブロス（ＬＢ）が含まれる。宿主細胞を適切な温度、例えば約２０〜約３９℃、例えば２５〜約３７℃、好ましくは３７℃、ＣＯ2レベル、例えば５〜１０％（好ましくは８％）で培養する。培地のｐＨは通常、約６．８〜７．４、例えば７．０であり、主に宿主生物に依存する。誘導性プロモーターを本発明の発現ベクターで使用するならば、タンパク質の発現は、このプロモーターの活性化に適した条件下で誘導される。治療用タンパク質を生産するための慣用の細胞培養条件は当該分野で公知であり、例えばＢｕｔｌｅｒ，Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｕｐｓｔｒｅａｍ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ；１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｙ  ２５，２００７）を参照のこと。
【０１０２】
タンパク質の回収では、典型的には、宿主細胞を、一般的には浸透圧ショック、超音波処理又は溶解等の手段により破壊する。一旦細胞を破壊したら、細胞片を遠心分離又は濾過により除去し得る。タンパク質は更に精製し得る。本発明の抗体は、当該分野で公知の任意のタンパク質精製方法で精製し得て、例えばタンパク質Ａアフィニティ法、他のクロマトグラフィ（例えば、イオン交換、アフィニティ及びサイズ排除カラムクロマトグラフィ）、遠心分離、較差溶解度法、あるいはタンパク質を精製するための他の標準的な技法により行う。（Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｕｗｅ  Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ（ｅｄ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００９を参照のこと）。幾つかの例においては、治療用タンパク質をマーカー配列、例えばペプチドにコンジュゲートさせて精製を促進できる。マーカーアミノ酸配列の例はヘキサ−ヒスチジンペプチド（Ｈｉｓタグ）であり、ニッケル官能化アガロースアフィニティカラムにマイクロモル親和性でもって結合する。精製に有用な他のペプチドタグには、以下に限定するものではないが、ヘマグルチニン「ＨＡ」タグが含まれ、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する。
【０１０３】
医薬組成物及び製剤
本発明は、本明細書に記載の１種以上の治療用タンパク質を含む医薬組成物を特徴とする。治療有効量の治療用タンパク質に加えて、本発明の医薬組成物は１種以上の医薬的に許容可能な担体又は賦形剤を含有し得て、これらは当業者に公知の方法で調合できる。
【０１０４】
医薬組成物中の許容可能な担体及び賦形剤は、採用する用量及び濃度ではレシピエントにとって無毒である。許容可能な担体及び賦形剤は、緩衝剤、酸化防止剤、保存料、ポリマー、アミノ酸及び炭水化物を含み得る。本発明の医薬組成物は非経口的に注射可能な調合物の形態で投与できる。注射用の医薬組成物（すなわち、静脈内注射）は、ビヒクルとして滅菌溶液又は任意の医薬的に許容可能な液体を使用して調合できる。医薬的に許容可能なビヒクルには、以下に限定するものではないが、滅菌水、生理食塩水及び細胞培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α−改変イーグル培地（α−ＭＥＭ）、Ｆ−１２培地）が含まれる。調合方法は当該分野で公知であり、例えばＢａｎｇａ（ｅｄ．）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（２ｎｄ  ｅｄ．）Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２００６）を参照のこと。
【０１０５】
医薬組成物は、必要に応じて単位剤形で形成し得る。有効成分、例えば医薬製剤に含める本発明の１種以上の治療用タンパク質の量は、指定の範囲内の適切な用量となるようなものである（例えば、０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲内の用量）。
【０１０６】
治療用タンパク質
本明細書に記載の方法で作製し得る治療用タンパク質には、対象とする全ての組み換え治療用タンパク質又はそのバイオシミラーが含まれ、以下に限定するものではないが、抗体（例えば、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体）、融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合）、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、組み換えタンパク質スキャフォールド、酵素、増殖因子、ホルモン、ホルモン放出因子、インターフェロン、インターロイキン及び血栓溶解剤が含まれる。治療用タンパク質には、グリコシル化（例えば、少なくとも１つのオリゴ糖鎖を有するタンパク質）及び非グリコシル化タンパク質の両方が含まれる。
【０１０７】
モノクローナル抗体の例には、以下に限定するものではないが、アダリムマブ、インフィリキシマブ（ｉｎｆｉｌｉｘｉｍａｂ）、パリビズマブ、セツキシマブ、ナタリズマブ、エクリズマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、オファツマブ（ｏｆａｔｕｍａｂ）、カナキヌマブ、ベリムマブ、アリロクマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、ジヌツキシマブ、セクキヌマブ、エボロクマブ、ブリナツモマブ、ペムブロリズマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、シルツキシマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ラキシバクマブ、ペルツズマブ、ブレンツキシマブ、イピリムマブ、デノスマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブ、カツマキソマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リツキシマブ及びアブシキシマブが含まれる。
【０１０８】
融合タンパク質の例には、以下に限定するものではないが、アレファセプト、エンタネルセプト（ｅｎｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、アバタセプト、ベラタセプト、アフリベルセプト、ｚｉｖ−アフリベルセプト、リロナセプト、ロミプロスチム、アポセプト（ａｐｏｃｅｐｔ）、トレバナニブ（ｔｒｅｂａｎａｎｉｂ）、ブリシビモド及びデュラグルチドが含まれる。
【０１０９】
他の実施形態
以下の実施例により本発明について更に説明するが、実施例は限定であると解釈されるべきではない。本願を通して引用される全ての参考文献、特許及び公開済みの特許出願の内容は参照により本願に援用される。
【実施例】
【０１１０】
実施例１：二重栄養要求性細胞を利用した治療用抗体の製造
以下の実施例では、治療用タンパク質、例えば抗体を製造する方法について説明し、この方法は対象である治療用タンパク質のコレステロール栄養要求性及びグルタミン栄養要求性細胞における発現を含む。望ましくも、この方法では、対象である遺伝子の増幅及びコピー数の増加、コレステロール（水溶液中では著しく不溶であり取扱いが極めて困難である）の不在下での生産が可能である。例示的な方法を更に図１で略説する。
【０１１１】
グルタミン栄養要求性及びコレステロール栄養要求性細胞、例えばＮＳ０細胞に、３−ケトステロイドレダクターゼ（３−ＫＳＲ）をコードする核酸を含む第１発現ベクターをトランスフェクトする。この第１トランスフェクション中及び第１トランスフェクション後、細胞をコレステロール非含有培地中で維持することで第１発現ベクターを発現する細胞を選択し、３−ＫＳＲ発現グルタミン栄養要求性細胞培養物を得る。これらの細胞に同時に又は続いてグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）及び対象のタンパク質、例えば治療用抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸を含む第２ベクターをトランスフェクトする。この第２トランスフェクション中及び第２トランスフェクション後、細胞をグルタミン非含有培地中で維持することで第２ベクターを発現する細胞を選択する。複数の第２ベクターコピーを取り込んだ細胞を更に選択するために、第２トランスフェクション中及び／又は第２トランスフェクション後の細胞培地にグルタミンシンセターゼ阻害剤、例えばメチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）を補充する。最終的な３−ＫＳＲ−ＧＳ抗体産生細胞をコレステロール非含有培地中で維持することでコレステロールに関わる製造上の問題を回避することができ、またＭＳＸ選択に負うところの高い生産性を示す。
【０１１２】
実施例２：細胞生存率アッセイ
以下の実施例では、十分な生存及び増殖を示す細胞の尺度としての細胞生存率を求めるためのトリパンブルーアッセイについて説明する。
【０１１３】
ｐＨ７．２〜７．３の緩衝等張塩水（すなわち、リン酸緩衝食塩水）中のトリパンブルー０．４％溶液を用意する。０．１ｍＬのトリパンブルー原液を１ｍＬの細胞に添加する。血球計数器に装填し、低倍率の顕微鏡下で速やかに観察する。青色に染まった細胞の数及び全細胞の数を数える。細胞生存率を、生細胞の数を血球計数器上のグリッド内の細胞の総数で割ったものとして計算する。細胞がトリパンブルーを取り込むならば、非生細胞と見なす。細胞生存率は、健康な対数期培養物の場合、少なくとも９０％である。
【０１１４】
〔数１〕
生細胞の割合（％）＝［１．００−（青色細胞数÷総細胞数）］×１００
【０１１５】
細胞株懸濁液の細胞密度は、血球計数器を使用して求めることができる。培養物１ｍＬあたりの生細胞の数を計算するためには以下の式を使用し、希釈係数について補正する：生細胞数×１０Ｅ４×１．１＝細胞／ｍＬ（培養物）
【０１１６】
実施例３：三重選択法を利用した治療用抗体の製造
以下の実施例では、治療用タンパク質、例えば抗体を製造する方法について説明し、この方法は、対象である治療用タンパク質のコレステロール及びグルタミン栄養要求性細胞における発現を、追加の第３の選択メカニズム、例えばネオマイシン耐性遺伝子（例えば、選択にＧ４１８を使用）と共に含む。望ましくも、この方法では、対象である遺伝子の増幅及びコピー数の増加、コレステロール（水溶液中では著しく不溶であり取扱いが極めて困難である）の不在下での生産が可能であり、それでいて例えば低生産性を含めた、３−ＫＳＲ細胞培養選択系に関わる予期せぬ製造上の難題を克服できる。
【０１１７】
ＮＳ０細胞選択をまず、単一ネオマイシン選択（図９）及び単一ＧＳ選択（図１０）の両方を用いて最適化した。ネオマイシン最適化に関しては、細胞に、標準的なやり方で、ネオマイシン耐性遺伝子をコードする核酸ベクターをトランスフェクトした。次に、選択のために、ネオマイシンを細胞培地に（１００μｇ／ｍｌ又は２００μｇ／ｍｌ）で添加した。細胞生存率を回収からの記載の日数で測定した。ＧＳベースの選択の場合は、細胞にＧＳをコードする核酸ベクターをトランスフェクトし、グルタミン非含有細胞培地中で維持した。細胞生存率を、回収からの記載の日数で測定した。３−ＫＳＲベースの三重選択法をネオマイシン、３−ＫＳＲ及びＧＳ選択を用いて最適化することで、３−ＫＳＲ選択に関わる予期せぬ低生産性を克服した（図８）。細胞に、標準的なやり方で、３−ＫＳＲ、ＧＳ及びネオマイシン耐性遺伝子をコードする１種以上の核酸ベクターをトランスフェクトした。選択のために、細胞を、グルタミン及びコレステロールの不在下及びネオマイシンの存在下で維持した。図１１に示すように、三重選択は回収後、十分な細胞生存率を維持した。
【図１】
2018518985.tif 000004
【図２】
2018518985.tif 000005
【図３】
2018518985.tif 000006
【図４】
2018518985.tif 000007
【図５Ａ】
2018518985.tif 000008
【図５Ｂ】
2018518985.tif 000009
【図５Ｃ】
2018518985.tif 000010
【図５Ｄ】
2018518985.tif 000011
【図５Ｅ】
2018518985.tif 000012
【図６】
2018518985.tif 000013
【図７Ａ】
2018518985.tif 000014
【図７Ｂ】
2018518985.tif 000015
【図８】
2018518985.tif 000016
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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