(57)【要約】【課題】  組織又は細胞試料の処理において試薬の蒸発を低減する。【解決手段】  組織又は細胞試料を、一般式Ｘ１−Ｒ−Ｘ２（式中、Ｒは酸素、窒素、又は硫黄で置換されていてもよい炭素数１以上のアルキル、アルケニル、アルキニル、又は芳香族部分であり、Ｘ１及びＸ２は水素結合を受けやすい部分となるように独立に選択される）を有する蒸発低減剤（１又は複数）を含む試薬と接触させる工程と、前記組織又は細胞試料を処理する工程と、を含む方法。蒸発低減剤を含有する試薬による組織又は細胞試料の処理において使用される、試薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織又は細胞試料を、一般式：
Ｘ１−Ｒ−Ｘ２
を有する少なくとも１種の蒸発低減剤と接触させる工程であって、
式中、Ｒは、酸素、硫黄、又は窒素原子で置換又は中断されていてもよいアルキル部分、アルケニル部分、アルキニル部分、又は芳香族部分であり、Ｘ１及びＸ２は、電気陰性の原子を含むか又は水素結合を受けやすい部分となるように独立に選択され、
前記少なくとも１種の試薬は、その少なくとも１種の試薬が非グリコール含有試薬又は２種以上の試薬の組み合わせである場合は１％以上の量で存在し、又はその少なくとも１種の試薬がグリコール含有試薬である場合は１１体積％以上の量で存在する工程と、
前記組織又は細胞試料を処理する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記蒸発低減剤は６０体積％までの量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記処理が高温を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記処理がハイブリダイゼーションを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記処理がデハイブリダイゼーションを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記処理が洗浄工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記処理が抗原結合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記処理が抗原賦活化、細胞調整、又は細胞老化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ｘ１及びＸ２が、少なくとも一方がヒドロキシル部分、カルボニル部分、アミン部分、アルデヒド部分、ハロゲン部分、エーテル部分、カルボキシル部分、及びアミド部分からなる群からの１つ以上を含有するように独立に選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｘ１及びＸ２が、少なくとも−ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＯＲ１、−ＮＨ２、−ＣＯＯＲ２、及び−ＣＯＮＨ２からなる群から選択される部分を含むように独立に選択され、式中Ｒ１はアルキルでありＲ２は水素原子又はアルキルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｒが、２つ以上の炭素原子を含みそのうち１つ以上がＯ、Ｎ、又はＳで置換されていても置換されていなくてもよいアルキルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記試薬がエチレングリコールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試薬がグリシン、セリン、イソエチオニン酸、エタノールアミン、グリセリン、ポリエチレングリコール、１，３−プロパンジオール、又は剤の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記試薬が洗浄剤又は界面活性剤を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記試薬が蒸発低減剤の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
組織又は細胞試料の処理における使用のために作用可能な試薬であって、前記試薬は、前記少なくとも１種の試薬が非グリコール含有試薬又は２種以上の試薬の組み合わせである場合は１％以上の量で存在し、前記少なくとも１種の試薬が一般式：
Ｘ１−Ｒ−Ｘ２
を有するグリコール含有試薬である場合は１１体積％以上の量で存在する蒸発低減剤を含み、
式中、Ｒは酸素、硫黄、又は窒素原子で置換又は中断されていてもよいアルキル部分、アルケニル部分、又はアルキニル部分であり、Ｘ１及びＸ２は、電気陰性の原子を含むか又は水素結合を受けやすい部分となるように独立に選択される、試薬。
【請求項１７】
前記蒸発低減剤が６０体積％までの量で存在する、請求項１６に記載の試薬。
【請求項１８】
Ｘ１及びＸ２が、少なくとも一方はヒドロキシ部分、カルボニル部分、アミン部分、アルデヒド部分、ハロゲン部分、エーテル部分、カルボキシル部分、及びアミド部分の群からの１つ以上を含有するように独立に選択される、請求項１６に記載の前記試薬。
【請求項１９】
洗浄剤又は界面活性剤を含む、請求項１６に記載の試薬。
【請求項２０】
蒸発低減剤の組み合わせを含む、請求項１６に記載の前記試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１５年４月１５日に出願され本明細書に参照として援用される係属中の米国特許出願１４／７０１，０４３号に基づき優先権を主張する非仮出願である。
【０００２】
本発明は分析用試薬に関する。
【背景技術】
【０００３】
インサイチュハイブリダイゼーションに基づく免疫組織化学的分析及び分析技術は、癌性腫瘍に見られるような異常細胞の診断やその他の疾病の診断等の医療診断において広く使用されている。多くの分析は、スライド上の試薬中の試料などの試料に対する熱の付加を伴う。昇温時の分析工程は分析試薬の実質的な蒸発を引き起こすおそれがある。少量が使用される場合、試料の変性、ハイブリダイゼーション、洗浄及び老化工程、並びに得られる分析結果が蒸発によって損なわれるおそれがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
組織又は細胞試料の処理において試薬の蒸発を低減する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
組織又は細胞試料の処理において試薬の蒸発を低減するように作用可能な、水溶液中の蒸発低減剤を含む試薬及び試薬の使用方法が開示される。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
上記したような試薬が用途を見出す代表的な処理としては、昇温工程（例えば、インサイチュハイブリダイゼーション手順における昇温工程）を伴う、脱ろう、細胞調整／抗原賦活化／細胞老化、過酸化物／ホスファターゼ阻害、プローブ変性、プローブハイブリダイゼーション、洗浄、リンカーハイブリダイゼーション、抗体インキュベーション、プローブ検出、色原体沈殿、及び対比染色が挙げられるが、これらに限定されない。溶液は典型的には、核酸（一本鎖若しくは二本鎖プローブ）ハイブリダイゼーション分析の変性、洗浄、若しくはハイブリダイゼーション工程において、又は免疫組織化学若しくは免疫細胞化学染色における抗体を使用するインキュベーション、抗原賦活化、若しくは洗浄工程において、使用され得る。好適な試薬は、ハイブリダイゼーション溶液試薬における溶液拡散に役立つ洗浄剤／界面活性剤等の他の成分を含んでもよい。一実施形態では、組織又は細胞処理のために作用可能な試薬における蒸発低減剤の好適な量は、ハイブリダイゼーション溶液を２５℃〜５０℃の高温に１０分〜２４時間暴露する（例えば、ハイブリダイゼーション又はインキュベーションプロセス）又は６０℃〜１００℃の高温に２〜９０分間暴露する（例えば、変性又は抗原賦活化プロセス）といった工業的に許容可能な試薬処理条件下で、蒸発に起因する試薬の損失を２０％以下に制限する量である。一実施形態では、蒸発低減剤の好適な量は、試薬組成物（例えば溶液）の１１体積％〜６０体積％の範囲である。
【０００７】
一実施形態では、試薬（組成物）は、効果的な蒸発低減量の、一般式Ｉ：
Ｘ１−Ｒ−Ｘ２
の式を含む蒸発低減剤を含み、
式中、Ｒは、酸素原子、硫黄原子、及び／又は窒素原子で置換されていてよい（例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、又は芳香族を画定する１つ以上の炭化水素の水素原子を−ＯＨ、−ＳＨ、又は−ＮＨ２で置換）か、酸素原子、硫黄原子、及び／又は窒素原子で中断（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔ）してよい（例えば、−Ｃ−Ｏ−Ｃ−、−Ｃ−ＳＨ−Ｃ−、−Ｃ−ＮＨ−Ｃ−）、炭素数１以上（例えば、一実施形態では炭素数１〜６、別の実施形態では炭素数１〜４）のアルキル、アルケニル、アルキニル、又は芳香族部分である（Ｒが炭素数１の部分である場合にはＲはアルキルであることが理解される）。アルキル部分はＸ１及びＸ２への接続のための連結部の開点を含有するアルカンである。アルケニル部分はＸ１及びＸ２への接続のための連結部の開点を含有するアルケンである。アルキニル部分はＸ１及びＸ２への接続のための連結部の開点を含有するアルキンである。代表的なアルキルとしては、さらに置換されていてもされていなくてもよい直鎖又は分枝鎖アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル）が挙げられる。代表的なアルケニルとして直鎖又は分枝鎖アルケニル（例えば、エテニル、プロペニル、イソプロペニル）が挙げられる。代表的なアルキニルとしては、さらに置換されていてもされていなくてもよい直鎖又は分枝鎖アルキニル（例えば、エチニル、プロピニル、イソプロピニル）が挙げられる。芳香族部分は環を形成する結合の相互作用によって安定化されている原子の不飽和環である。芳香族部分の例はベンジルである。中断された芳香族部分の例はピリジン（窒素原子により中断；フラン（酸素原子により中断）；及びチオフェン（硫黄原子により中断）である。
【０００８】
一般式Ｉ中のＸ１及びＸ２は、一方又は両方が水素結合を受けやすい及び／又は電気陰性の原子を含有する部分となるように独立に選択される。Ｘ１及びＸ２のための代表的な部分は、ヒドロキシル部分（−ＯＨ）；カルボニル部分（−ＣＯ）；アミン部分（−ＮＨ２）；アルデヒド部分（−ＣＨＯ）；ハロゲン部分（−Ｙ、ＹはＣｌ−、Ｆ−、Ｂｒ−、又はＩ−）；エーテル部分（−ＯＲ１、Ｒ１は水素結合を受けやすい若しくは水素結合できる及び／又は電気陰性の原子を含有する部分で置換されていてもよいアルキル（例えば、炭素数１〜６のアルキル）である）；カルボキシル部分（−ＣＯＯＲ２、Ｒ２は水素原子、又は水素結合を受けやすい若しくは水素結合できる及び／又は電気陰性の原子を含有する部分で置換されていてもよいアルキル（例えば、炭素数１〜６のアルキル）である）；及びアミド部分（−ＣＯＮＲ３Ｒ４、Ｒ３及びＲ４は水素原子又は水素結合を受けやすい若しくは水素結合できる及び／又は電気陰性の原子を含有する部分で置換されていてもよいアルキル（例えば、炭素数１〜６のアルキル）から独立に選択される）等であるがこれらに限定されない、水素結合できる官能基を含むことになる。Ｘ１及びＸ２のためのエーテル、カルボキシル、及びアミド部分に関連する注記したアルキル（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４）のための水素結合を受けやすい若しくは水素結合できる置換部分の代表例としては、ヒドロキシル、カルボニル、アミン、アルデヒド、ハロゲン、エーテル、カルボキシル、及びアミド部分が挙げられる。
【０００９】
一般式Ｉを有する好適な蒸発低減剤の例としては、エチレングリコール、グリシン、セリン、イソエチオニン酸、エタノールアミン、ポリエチレングリコール、及び１，３−プロパンジオールが挙げられる。一実施形態では、Ｒは置換も中断もされていない。Ｒが置換も中断もされていない蒸発低減剤の代表例は、ＲがエチルでありＸ１及びＸ２の各々がヒドロキシル部分である、エチレングリコール（ＨＯ（ＣＨ２）２ＯＨ）である。Ｘ２が水素結合を受けやすい若しくは水素結合できる部分でさらに置換された一級アミドである蒸発低減剤の例は、Ｒが−（ＣＨ２）３−；Ｘ１が−ＮＨ２、及びＸ２が−ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＯＯＨである、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＯＯＨである。一実施形態では、好適な試薬は、一般式Ｉの式を有する１種以上の蒸発低減剤を含む（例えば、試薬は一般式Ｉの式を有する２つ又は３つの蒸発低減剤の組み合せを含む）。
【００１０】
蒸発低減剤は分子の遊離形態（分子）であってもその許容可能な塩（化合物）若しくはイオン性の液体であってもよい。塩の例は、塩酸塩のような分子のハロゲン化水素酸塩である。
【００１１】
一実施形態では、溶質としての蒸発低減剤は、１種以上の他の試薬と混合されると溶液の蒸気圧を低下させる。かかる溶質は、水との完全な又は部分的な溶解性又は混和性を示す場合があり、その溶質が混合される又は他の態様で導入される水溶液の分圧を低下させることができる、分子、イオン性塩、イオン性液体、非イオン性剤であり得る。加えて、蒸発低減剤は水との共沸性混合物を形成してもしなくてもよい。蒸発低減剤が水との共沸性混合物を形成する場合には、一実施形態では溶質は、水と負の共沸混合物を形成する。
【００１２】
一般的に言うと、この文脈において溶媒及び溶質が混合される場合、結果として生ずる溶媒の化学ポテンシャルは低下し、その結果溶媒分子の分圧が下がって、溶媒単独溶液に対して気体相への移行しやすさが低下する。典型的に、溶質が非揮発性の蒸発低減剤である水溶液中における水の分圧は低下することになり、このことが混合物の沸点の上昇並びに表面における蒸発の低下につながる場合がある。
【００１３】
水素結合は、分子中で、水素原子が酸素、窒素、又はフッ素原子等の電気陰性の原子に結合され分子が電気陽性原子に近接したときに起こり得る。この性質の静電引力は５〜３０ｋＪ／ｍｏｌ程度の強さを有し、ファンデルワールス引力よりも強いが、共有結合やイオン結合よりは弱い。
【００１４】
一実施形態では、蒸発低減剤は溶質として水と混合されて、水の分圧が低下される溶液を生成することによって水の蒸気圧を低下させて、分圧が下がらなかった場合よりも効率的に分析（例えば、免疫組織化学的分析）を行うことができる。一実施形態では、溶質は、当業者に既知の分析を妨害し得る残存する残留物が全くないか最小限となるように選択される。
【００１５】
一実施形態では、細胞又は組織試料を処理する際に使用するために作用可能な試薬は、ベース試薬と蒸発低減剤とを組み合わせることにより調製される。好適な組成物中にさらなる成分を組み合わせてもよい。試薬を水性の緩衝溶液に加えて、高温時の蒸発を低減することもできる。一実施形態では、蒸発に起因する組み合わせのあらゆる損失を２０％以下に、別の実施形態では１０％以下に、制限するような量で蒸発低減剤を組み合わせる。典型的には、蒸発低減剤又は低減剤の組み合わせが１１体積％〜６０体積％の量で組成物中に存在するか、又は低減剤の１％〜６０％の量が非グリコール含有化合物又は低減剤の組み合わせである。ベース試薬、蒸発低減剤、及び何れかの他の成分を組み合わせた後、組成物を混合してもよい。
【００１６】
一実施形態では、高温での分析に使用するための、パラフィンを含まない、または脱パラフィン化した組織又は細胞試料の処理において作用可能な方法が開示される。一実施形態では、方法はいずれかの水系の処理試薬の蒸発を低減するために作用可能である。この方法は、組織又は細胞試料を一般式Ｉ：
Ｘ１−Ｒ−Ｘ２
の式を有する蒸発低減剤を（例えば、溶質として）含む試薬と接触させることを含む。
このような接触は、試薬をスライド上の試料に塗布することを含む。試料を試薬と接触させた後、試料を当該技術分野で既知の技術によって処理してよい。
【００１７】
一実施形態では、高温における分析に使用するための、パラフィンを含まない又は脱パラフィン化された組織又は細胞試料の処理において作用可能な方法が開示される。一実施形態では、方法は、溶質を溶媒に加えることによって何れかの水性の処理試薬の蒸発を低減するために作用可能である。結果として得られる溶媒の化学ポテンシャルは低下し、その結果溶媒分子の分圧が低下して、溶媒分子の気相への移行のしやすさが低下する。溶質が非揮発性物質である水溶液における水の分圧が低下した結果、沸点が上昇し得るとともに表面における蒸発が低下し得る。
【実施例】
【００１８】
実施例１：異なるハイブリダイゼーション温度でのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション中の蒸発に起因する体積損失
４００μｌのハイブリダイゼーション溶液（試薬）を６つの試料スライドの各々に塗布し、これらのスライドを個々に異なる温度で３０分間加熱した。ハイブリダイゼーション工程の間、ハイブリダイゼーション溶液を有するスライド上で蒸発が起こったことが観察された。
【００１９】
【表１】
2018518941.tif 000002
【００２０】
実施例２：異なる試薬によるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション中の蒸発の低減
異なる蒸発低減剤を有する４００μｌのハイブリダイゼーション溶液（試薬）を各試料スライドに塗布し、４３℃で３０分間加熱した。１つの試料スライドは蒸発低減剤を有さないハイブリダイゼーション溶液を含んでいた。４３℃のハイブリダイゼーション工程中、蒸発低減剤を有さないハイブリダイゼーション溶液を含有する試料スライドで実質的により大きなハイブリダイゼーション溶液の蒸発が起こったが、蒸発低減剤の添加により低減されたことが観察された。
【００２１】
【表２】
2018518941.tif 000003
【００２２】
実施例３：異なる濃度のエチレングリコールを用いたハイブリダイゼーション中の蒸発の低減
異なる濃度のエチレングリコールの蒸発低減剤を有する４００μｌのハイブリダイゼーション溶液（試薬）を、各試料スライドに塗布し、４３℃で３０分間加熱した。比較のために、エチレングリコールを有さない４００μｌのハイブリダイゼーション溶液もまた試料スライドに塗布し４３℃で３０分間加熱した。ハイブリダイゼーション溶液へのエチレングリコールの添加により蒸発が低減されたことが観察された。エチレングリコールを含有するハイブリダイゼーション溶液についての分析性能は、エチレングリコールを有さないハイブリダイゼーション溶液と類似していることがわかった。
【００２３】
【表３】
2018518941.tif 000004
【００２４】
実施例４：ハイブリダイゼーション中の蒸発体積損失の減少の再現性
特定の濃度のエチレングリコールの蒸発低減剤を有する４００μｌのハイブリダイゼーション溶液を、各試料スライドに塗布し、４３℃で３０分間加熱した。比較のために、４００μｌのハイブリダイゼーション溶液を各試料スライドに塗布し４３℃で３０分間加熱した。ハイブリダイゼーション溶液へのエチレングリコールの添加により、蒸発が低減されたことが観察された。
【００２５】
【表４】
2018518941.tif 000005
【００２６】
実施例５：変性中の蒸発の低減
２０％エチレングリコールの蒸発低減剤を有する約４００μｌのハイブリダイゼーション溶液を、各試料スライドに塗布し、９２〜９８℃で２分間加熱した。比較のためにエチレングリコールを有さない約４００μｌのハイブリダイゼーション溶液を各試料スライドに塗布し９２〜９８℃で２分間加熱した。ハイブリダイゼーション溶液に対するエチレングリコールの添加により、蒸発が低減されたことが観察された。
【００２７】
【表５】
2018518941.tif 000006
【００２８】
実施例６：抗体インキュベーション工程中の蒸発の低減
２０％エチレングリコールの蒸発低減剤を有する約４００μｌの一次抗体希釈液（試薬）を各試料スライドに塗布し、特定の温度で３０分間インキュベートした。比較のために、エチレングリコールを有さない約４００μｌの一次抗体希釈液を各試料スライドに塗布し、特定の温度で３０分間インキュベートした。抗体希釈液へのエチレングリコールの添加により、蒸発が低減されたことが観察された。
【００２９】
【表６】
2018518941.tif 000007
【００３０】
実施例７：異なる試薬によるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション中の蒸発の低減
異なる蒸発低減剤を有する４００μｌのハイブリダイゼーション溶液を各試料スライドに塗布し４３℃で３０分間加熱した。蒸発低減剤を含有しないハイブリダイゼーション溶液もまた、試料スライドに塗布した。４３℃ハイブリダイゼーション工程中に、ハイブリダイゼーション溶液を有するスライドにおいて蒸発が起こったが、特定の試薬の添加により低減されたことが観察された。
【００３１】
【表７】
2018518941.tif 000008
【００３２】
実施例８：異なる温度でのハイブリダイゼーション中のエチレングリコールを用いた蒸発の低減
エチレングリコールを有する４００μｌのハイブリダイゼーション溶液（試薬）を各試料スライドに塗布し、３５、３７、又は４０℃で１２０分間加熱した。比較のために、エチレングリコールを有さない４００μｌのハイブリダイゼーション溶液もまた試料スライドに塗布し、４０℃で１２０分間加熱した。ハイブリダイゼーション溶液へのエチレングリコールの添加により、蒸発が低減されたことが観察された。異なるハイブリダイゼーション温度でのエチレングリコールを含有するハイブリダイゼーション溶液についての分析性能は、エチレングリコールを有さないハイブリダイゼーション溶液と類似していることがわかった。
【００３３】
【表８】
2018518941.tif 000009
【００３４】
【表９】
2018518941.tif 000010
【００３５】
上記の記述では、説明の目的で、実施形態の完全な理解を提供するために多くの特定の詳細事項を記載したが、当業者には、これらの特定の詳細事項の幾つかを有することなく１以上の他の実施形態が実行され得ることが理解されよう。記載された特定の実施形態は発明を限定するためではなく例示するために提示されている。本発明の範囲は上記に提供された特定の実施例によって決まるものではなく、下記の特許請求の範囲によってのみ決まるものである。他の例では、記述の理解の妨げとなるのを避けるために、周知の構造、装置、及び操作は、ブロック図の形態で即ち詳細を述べずに示した。適切と考える場合には、同様の特徴を有していてもよい対応する又は類似の要素を示すために、参照番号又は参照番号の末端部分を図面間で反復させた。
【００３６】
本明細書を通した「一実施形態」「実施形態」「１以上の実施形態」又は「異なる実施形態」への参照は、例えば、本発明の実行においてある特定の特徴が含まれてもよいことを意味するということも理解すべきである。同様に、記述において、開示を簡素化し及び種々の発明の態様の理解を助ける目的で、単一の実施形態、図、又はそれらの記述中で種々の特徴がグループ化される場合があるということも理解すべきである。しかしながら、こうした開示の方法が、本発明が各請求項に明確に記載した以上の特徴を必要とするとの意図を反映するものと解釈すべきではない。むしろ、以下の特許請求の範囲に反映されるように、発明の態様が、開示された単一の実施形態のすべての特徴よりも少ない特徴にある場合もある。したがって、この「発明を実施するための形態」に続く特許請求の範囲はここに「発明を実施するための形態」に明確に組み入れられ、各請求項がそれ自身を本発明の個別の実施形態として主張する。
【国際調査報告】
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