(57)【要約】   本発明は、核酸の検出を目的とした、高感受性及び特異的な方法に関するものであり、例えば稀な変異の検出に有用であり、又は核酸配列中の少量の多様体の検出に有用である。本方法は、非対称性漸増ポリメラーゼ反応（ＡＩＰＲ）と、その後の指数関数的ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を含む。【選択図】  図１Ａ−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含有する、サンプル中の、標的核酸配列の存在の検出方法、又は標的核酸配列中の多様体配列の存在の検出方法：
ａ）鋳型核酸を含有するサンプルを提供すること
ｂ）標的核酸配列の増幅を特異的に行うことができる、少なくとも１つのプライマー対を含有するプライマーセットを提供することであって、前記プライマーセットは少なくともプライマーＨとプライマーＬを含有しており、前記プライマーＨの融点は、前記プライマーＬの融点よりも少なくとも１０℃高く、好ましくは少なくとも１５℃高く、例えば少なくとも２０℃高く、例えば１５〜５０℃の範囲で高く、前記プライマーＬは、プライマーＨの伸長産物断片に対し相補的な配列を含有していること
ｃ）伸長温度でポリメラーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを提供すること
ｄ）区分化ＰＣＲ反応物を調製することであって、各区分はサンプルの一部、プライマーセット、核酸ポリメラーゼ、ＰＣＲ試薬、及び任意で検出試薬を含有していること
ｅ）以下の工程を含有する、非対称性漸増ポリメラーゼ反応（ＡＩＰＲ）を行うこと：
ｉ．変性温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによって、ＤＮＡを一本鎖分子に変性させること
ｉｉ．高いアニーリング温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、プライマーＨはアニーリングできるが、プライマーＬはアニーリングできないようにすること
ｉｉｉ．任意で、伸長温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートすること
ｉｖ．任意で、工程ｉ〜ｉｉｉを繰り返すこと
ｖ．それによって、標的核酸配列の１つの鎖のみを増幅させること
ｆ）以下の工程を含む、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと：
１）変性温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによって、ＤＮＡを一本鎖分子に変性させること
２）低いアニーリング温度でＰＣＲをインキュベートし、それによって、プライマーＨとプライマーＬの両方のアニーリングを可能にさせること
３）伸長温度でＰＣＲをインキュベートし、それによって、すべてのアニーリングされたプライマーの伸長を可能にさせること
４）任意で、工程ＩＩ〜ＩＶを繰り返すこと
５）それによって、標的核酸配列の両方の鎖を増幅させ、ＰＣＲ産物を得ること
ｇ）ＰＣＲ産物が、標的核酸配列を含有しているか否か、又は標的核酸配列中に多様体配列を含有しているか否かを検出すること。
【請求項２】
前記多様体配列が、一塩基変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程ｅ）のＡＩＰＲが、以下の工程を含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法：
ｉ．変性温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによって、ＤＮＡを一本鎖分子へと変性させること、
ｉｉ．高いアニーリング温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによってプライマーＨのアニーリングは可能にさせるが、プライマーＬのアニーリングは可能にさせず、この場合において前記高いアニーリング温度は、伸長温度でもあり、それによって、アニーリングされたプライマーＨの伸長が可能になること、
ｉｉｉ．工程ｉ〜ｉｉを繰り返すこと
ｉｖ．それによって、標的核酸配列の１つの鎖のみを増幅させること。
【請求項４】
前記プライマーＨが、プライマーＬの融点よりも少なくとも１０℃高い、例えば少なくとも１５℃高い融点を有するプライマーセット中の唯一のプライマーである、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
前記プライマーセットが、異なる標的核酸配列を増幅することができる２つ以上のプライマー対を含有している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
プライマーＨが、プライマーＨと共に標的核酸配列を増幅させることができるプライマーセット内の他のすべてのプライマーの融点よりも少なくとも１５℃高い融点を有している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記プライマーセットが、以下のプライマーをいずれも含有しない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法：
ｃ）プライマーＨの融点の、±１５℃の範囲、好ましくは±２０℃の範囲、例えば±２５℃の範囲にある融点を有するプライマー、及び
ｄ）プライマーＨと共に、標的核酸配列を特異的に増幅することができるプライマー対を構成することができるプライマー。
【請求項８】
工程ｅ）の高いアニーリング温度が、プライマーＬの融点よりも少なくとも１０℃高い、好ましくは少なくとも１５℃高い、例えば少なくとも２０℃高い、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程ｅ）が、プライマーＨの伸長は生じさせるが、他のいずれのプライマーの検出可能な伸長は生じさせない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
プライマーＬが、ミスマッチ改変プライマーＬであり、前記方法が、工程ｅ）とｆ）の間に低い温度のＰＣＲの工程を含有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、前記低い温度のＰＣＲが以下の工程を含む、前記方法：
１）変性温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによってＤＮＡを一本鎖分子に変性させること、
２）非常に低いアニーリング温度でＰＣＲをインキュベートし、それによって、プライマーＨと、プライマーＬの非ミスマッチ部分の両方のアニーリングを可能にさせること、
３）伸長温度でＰＣＲをインキュベートし、それによってすべてのアニーリングされたプライマーの伸長を可能にさせること、
４）任意で、工程１）〜３）を繰り返し、それによってＰＣＲ産物を得ること。
【請求項１１】
前記非常に低いアニーリング温度が、低いアニーリング温度よりも少なくとも５℃低い、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
プライマーＬが、以下からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１０〜１１のいずれか１項に記載の方法：
ａ）１〜１０個のヌクレオチドの５’配列、及び
ｂ）標的核酸配列の断片と同一、又は相補的な、７〜１５個のヌクレオチドの範囲の連続配列。
【請求項１３】
前記区分化ＰＣＲ反応物が各々、検出試薬を含有し、前記検出試薬が、多様体検出プローブであり、前記多様体検出プローブが、多様体配列を含有しない標的核酸配列よりも有意に高いアフィニティーで、多様体配列を含有する標的核酸配列にハイブリダイズすることができるか、及び／又は前記区分化ＰＣＲ反応物が各々、検出試薬を含有し、前記検出試薬が、野生型検出プローブであり、前記野生型検出プローブが、多様体配列を含有しない標的核酸配列にハイブリダイズすることができる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
個体における臨床状態の存在を予測する方法であって、前記臨床状態が、標的核酸配列中の多様体配列の存在に関連づけられているか、又は前記臨床状態が、標的核酸配列の存在に関連づけられており、前記方法が、以下の工程を含み、
ａ）鋳型核酸を含有する前記個体由来のサンプルを提供すること、
ｂ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を実行することであって、
前記標的核酸中の前記多様体配列の存在、又は前記標的核酸配列の存在が、前記臨床状態の存在の指標である、前記方法。
【請求項１５】
前記臨床状態が、癌である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
以下を含有する部分キット：
ａ）標的核酸配列を特異的に増幅することができる少なくとも１つのプライマー対を含有するプライマーセットであって、前記プライマーセットは、少なくともプライマーＨとプライマーＬとを含有し、前記プライマーＨの融点は、前記プライマーＬの融点よりも少なくとも１０℃高く、プライマーＬは、プライマーＨの伸長産物に対して相補的な配列を含有する、前記プライマーセット、
ｂ）標的核酸配列にハイブリダイズすることができる検出プローブであって、前記プローブは、少なくとも１つのフルオロフォアと少なくとも１つのクエンチャーとに連結されている、前記検出プローブ、
ｃ）核酸ポリメラーゼ
ｄ）ＰＣＲ試薬
ｅ）区分化ＰＣＲ反応物を含有するドロップレットを調製するための試薬。
【請求項１７】
請求項１６に記載の部分キットであって、
ａ）前記プライマーＨが、配列番号６９の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号６９の相補配列の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有するか、又は
ｂ）前記プライマーＨが、配列番号６９の相補配列の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号６９の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、
この場合においてプライマーＨとプライマーＬはともに、配列番号６９のヌクレオチド３１４０、１６２４、又は１６３３の内の少なくとも１つを含有する標的配列を増幅することができる、前記部分キット。
【請求項１８】
請求項１６に記載の部分キットであって、
ａ）前記プライマーＨが、配列番号７０の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号７０の相補配列の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有するか、又は
ｂ）前記プライマーＨが、配列番号７０の相補配列の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号７０の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、
この場合においてプライマーＨとプライマーＬはともに、配列番号７０のヌクレオチド１７９９を含有する標的配列を増幅することができる、前記部分キット。
【請求項１９】
請求項１６に記載の部分キットであって、
ａ）前記プライマーＨが、配列番号７１の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号７１の相補配列の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有するか、又は
ｂ）前記プライマーＨが、配列番号７１の相補配列の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号７１の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、
この場合においてプライマーＨとプライマーＬはともに、配列番号７１のヌクレオチド２５７３又は２３６９の内の少なくとも１つを含有する標的配列を増幅することができる、前記部分キット。
【請求項２０】
請求項１６に記載の部分キットであって、
ａ）前記プライマーＨが、配列番号７２の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号７２の相補配列の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有するか、又は
ｂ）前記プライマーＨが、配列番号７２の相補配列の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号７２の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、
この場合においてプライマーＨとプライマーＬはともに、少なくとも、配列番号７２のヌクレオチド３４、３５、又は３８を含有する標的配列を増幅することができる、前記部分キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の検出方法の分野に関するものである。本発明方法は、高感度及び特異的であり、ゆえに例えば稀な変異の検出に有用であり、又は核酸配列中の少量の多様体の検出に有用である。
【背景技術】
【０００２】
非常に少量及び／又は低頻度で存在する核酸の検出が多くのアプリケーションに望まれている。遺伝子変異の検出は、例えば嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、及び癌などの無数の疾患にとって重要である。並外れて高感度で、特異的な変異の検出方法が、特に例えば循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）などの低インプットサンプルや単一細胞解析に必要であると、次第に認識されてきている。今日の標準的な方法では、インプットサンプルＤＮＡの量に対する高い要求、サンプル当たりの高いコスト、複雑で面倒なワークフロー、不十分な感度及び／又は特異性、ならびに正常な野生型配列の高いバックグラウンドの中、少量の変異ＤＮＡ配列を検出することができないこと（いわゆる、変異対立遺伝子画分（ＭＡＦ：ｍｕｔａｎｔ  ａｌｌｅｌｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ））をはじめとする、様々な問題に悩んでいる。ほぼすべての変異検出法が、ＤＮＡポリメラーゼ酵素を使用して指数関数的に標的対象ＤＮＡ領域を複製するポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ−ｒｅａｃｔｉｏｎ）にを使用したＤＮＡ増幅に頼っている。
【０００３】
目的が、正常な野生型配列と、わずか１つの単一ヌクレオチド塩基しか違わない可能性がある多様体（変異体）配列の識別である場合、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の忠実度は、（変異検出能の評価基準に最も影響を与える）識別力にとって重大な制限となり得る。すべてのポリメラーゼ酵素は、予測される不正確な各塩基変化に対し、ある程度の塩基組み込みエラーを有しており、典型的には、増幅される塩基対１００万個あたり、０．５〜３００個の範囲のエラーを有している（すなわち、５ｘ１０−７〜３ｘ１０−4）。多くのアプリケーションにとって、これら一塩基ポリメラーゼの塩基組み込みエラーは、耐容できる。例えば、もし大量のＤＮＡが入手可能であり、ＭＡＦが例えば＞１０〜２０％と中程度〜高度であれば、通常のＰＣＲで充分であろう。しかしながら、少量の多様体検出を含むアプリケーションでは、真の陽性の変異と、ポリメラーゼエラーにより誘導された偽陽性を区別できるようにするために、超高感度な検出方法が必要とされる。現在の変異検出分析法では、１０〜２０％ＭＡＦの検出限界（サンガー配列解析法）、５〜１０％ＭＡＦの検出限界（ピロシークエンス法）、１〜５％ＭＡＦの検出限界（次世代シークエンス法）、及び０．１％ＭＡＦの検出限界（デジタルＰＣＲ、ＣＯＬＤ−ＰＣＲ、超ディープ次世代シークエンス法）がある。
【０００４】
デジタルＰＣＲは、ＰＣＲ反応物を、多くの小さな個別反応物へと区分化し、それによって各反応区分が、ゼロから、非常に少数の標的配列分子のみを含有するようになる方法である。全ての分子の区分化は無作為化され、ポワソン分布に従っている。区分化は、豊富な野生型配列の中で、稀な多様体の配列は非常に低い相対存在量という状況を、ほとんどの区分は野生型配列のみを有し、一部の区分が、野生型配列と比較し、非常に高い相対存在量の稀少多様体配列を有するという状況へと変化させる。その結果、各区分内の野生型配列を希釈して取り除くことにより、稀な多様体配列の検出感度が増大する。しかしながら、デジタルＰＣＲであってもポリメラーゼエラーは依然として重大な課題であり、偽陽性を導かれる可能性があり、識別能と検出限界に負の影響を与えている。
【０００５】
少数の対立遺伝子及び変異を富化し、検出するための、異なるＰＣＲをベースとした方法が例えば、Milbury et al., Clin Chem. 2009 Apr; 55(4): 632-640に報告されているが、非常に高感度で容易く実行できる方法は無い。
【発明の概要】
【０００６】
ゆえに、少量の核酸を、非常に低頻度の偽陽性で検出するための、極めて高感度な方法に対するアンメットニーズが存在する。
【０００７】
本発明者らは、標準的なＰＣＲを使用する方法において、ＤＮＡポリメラーゼのエラー率は、検出限界に対する障壁となる特性を生じさせることを見出した。その理由は、ＤＮＡは数十億のコピー数にまで指数関数的に増幅されるため、多くのＤＮＡ複製にエラーが無作為に導入されるが、これには対象の配列多様体を誤って生成させたものも含まれ、そしてこれらエラーが複製及び増幅されるためである。
【０００８】
標準的デジタルＰＣＲアッセイにおいて達成可能な最大感度は、反応に使用されるポリメラーゼ酵素の忠実度にも制限される。ポリメラーゼによって野生型配列が不正確に複製された場合、偽変異配列を保持するコピーが生成され、そしてそのような反応物は、変異標的配列に対し、陽性と読まれる可能性がある。ＰＣＲサイクルがどのくらい多く行われたかによって、及びどのサイクルで偽変異配列が導入されたかによって、このシグナルが、真の陽性のシグナルから識別不能となる場合があり、そのため偽陽性として読まれてしまう。このポリメラーゼエラー事象が後半のＰＣＲサイクルの間に発生した場合には、真の陽性シグナルは、潜在的な偽陽性シグナルに対し「ヘッドスタート」をすでに得ており、真の陽性と偽陽性を識別することができる。
【０００９】
本発明方法は、真の陽性反応物に対し、いずれの潜在的な偽陽性反応も超える、一貫したシグナル上の利益を与える。
【００１０】
ゆえに、本発明は、ポリメラーゼエラーによる帰結に対抗し、少なくとも１桁、アッセイ性能を増大させ得る方法を提供する。本発明方法は、極めて高感度及び特異的な方法を達成し、及びシンプルなワークフローを有し、比較的安価である。
【００１１】
本発明は、少量の核酸を、非常に低頻度の偽陽性で検出するための、極めて高感度な方法を提供する。本発明方法は、概して、高いアニーリング温度を使用した非対称性漸増ポリメラーゼ反応（ＡＩＰＲ：ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）の段階、その後の低いアニーリング温度を使用したより標準的な対称性ＰＣＲ段階からなり、両段階は、例えばドロップレットデジタルＰＣＲなどの区分化反応物内で行われる。
【００１２】
異なる融点（Ｔｍ：ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を有するプライマーを使用した、ＰＣＲをベースとしたアッセイを使用した核酸の増幅方法が、当分野に公知である。例えばＷＯ２００６／０９４３６０は、単一閉管ＰＣＲを記載しており、この中で、２つの連続的な対称性ＰＣＲが行われている。最初のラウンドで、対象の遺伝子座にある核酸が、包括的ＰＣＲの実行に適した遺伝子座特異的タグ化プライマーを使用して特異的に増幅される。２回目のラウンドで、遺伝子座特異的タグ化プライマーよりも低いＴｍを有するタグ化プライマーを使用し、最初のラウンドで増幅された産物が増幅される。
【００１３】
高感度及び特異的であるために、本発明方法は、少量の核酸配列の検出に有用である。特に、本方法は、多量の野生型対立遺伝子の中の、稀な一塩基多様体の検出に有用であり、及び患者血漿中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の場合のような、サンプルの総インプット量が少ない場合でさえも使用できる。
【００１４】
本発明方法は概して、非対称性漸増ポリメラーゼ反応（ＡＩＰＲ）段階と、その後のより標準的な対称性ＰＣＲ段階からなる。ＡＩＰＲ段階では概して、標的核酸配列の１つの鎖のみが複製され、それが標準的な対称性ＰＣＲのための複数の鋳型を生じさせる。ゆえに、原理として標準的なＰＣＲが指数関数的増幅である一方で、ＡＩＰＲは原理として線形的増幅である。任意の所与の標的配列の増幅に対し、少なくとも２つのプライマーが、対象配列に隣接して設計され、１つのプライマー（「プライマーＨ」と本明細書において名付けられる）は非常に高い融点（Ｔｍ）を有し、反対側の鎖及び方向のもう１つのプライマーは、かなり低いＴｍを有している（プライマーＬ）。２つの段階（ＡＩＰＲとＰＣＲ）は、サーモサイクル条件と、各段階で機能的に活性なプライマーが異なっている。
【００１５】
ＡＩＰＲ段階において、標的の一本鎖配列はポリメラーゼにより複製され、対象の標的配列の１つの末端に対して相補的なプライマーＨオリゴヌクレオチドを使用してプライミングされる。そしてサーマルサイクル１回当たり、１つコピー（例えば、鋳型に対し相補的な配列）のみが合成される。これは概して、１）ＤＮＡを一本鎖分子に変性させる温度、２）ＤＮＡポリメラーゼによる、標的配列の一方向性複製をプライミングするプライマーＨのアニーリングを許容する温度であるが、プライマーＬのアニーリングは許容しない温度、３）ＤＮＡポリメラーゼにより合成された鎖の伸長を可能とする温度であるが、プライマーＬは未だアニーリングできない温度、４）必要に応じて、反復サイクルで工程１〜３を繰り返す、サーマルサイクルにより行われ、１サイクル当たり、プライマーＨからプライミングされ、伸長される、追加の相補的コピーが１つ合成される。合成されたコピーは、プライマーＨがアニーリングする一本鎖配列に対しワトソン−クリック相補的であるため、合成された各コピーは、ＡＩＰＲ段階のすべてのサーマルサイクルの間のさらなる増幅のための鋳型にはなれない。数回から非常に多くの回数のＡＩＰＲにより、一方向でのみ複製が行われる。これは上述の温度条件のサイクリングにより行われるものであり、その条件では、一方向性のプライマーＨのみがアニーリング及び伸長し、核酸鎖を合成することができる。従って、オリジナルの各一本鎖鋳型から、及び各サーマルサイクルに対し、１つの相補的標的配列が作製され、それによって例えば、Ｘ回の非対称サイクルが行われた後、その段階の最後には、区分中のＹ個の各一本鎖開始鋳型に対して、Ｘ個の新しい相補的ＤＮＡ分子が存在する（ゆえに、この反応区分中の新しい相補的ＤＮＡ分子の総数は、Ｘ＊Ｙである）。例えば、反応区分中、１つの一本鎖標的鋳型のみを用いて６４回のサイクルを行った後には、その１つの一本鎖鋳型に加え、１＊６４＝６４個の相補的コピーが区分中に存在する。非常に高い確率で、これら新たな分子の大部分は、オリジナルの鋳型分子の正確な相補的コピーである。その理由は、ポリメラーゼエラー率が低く（増幅される百万個の塩基対当たり、０．５〜３００エラー）、及び例えば数ダースから数千の各塩基対の長さの、たった６４個のコピーのみが合成されるからである。開始時に、野生型標的配列分子を１個のみ、及び変異標的配列を０個含有する反応区分において、これらＡＩＰＲ段階のうちの１つでポリメラーゼエラーが発生した場合でさえも、その６４個の新たなＤＮＡ分子のうち、たった１個のみが変異型であり、６３個は非変異型である。このエラー誘導型変異標的配列が、もし最も対象とされる、まさにその配列の位置で発生した場合には問題となる可能性があるが、他の位置で発生した場合には問題とはならないであろう。逆に、１個の真の変異標的配列分子と、０個の野生型標的で開始された、真の陽性反応区分においては、６４個の新たな変異含有ＤＮＡ分子が存在する。そして非常にまれではあるが、６３個の新たな変異含有分子と、１個の偽野生型分子が存在する場合もある。従って、デジタルＰＣＲ反応において、真の陽性反応区分は、６２個から６４個の追加の変異標的分子を有しており、稀に、ポリメラーゼエラーによる偽陽性変異配列を含有する区分が発生する。このＡＩＰＲ段階の後、従来的な対称性ＰＣＲ段階が開始され、真の陽性反応区分は、分子コピー数を単位として、偽陽性反応区分を超え、およそｌｏｇ２（Ｘ）サイクルの「ヘッドスタート」相当を有している。言い換えると、Ｘ＝６４の非対称サイクルの上述の例において、真の陽性反応区分は、およそｌｏｇ２（６４）＝６サイクルのヘッドスタートを有している。
【００１６】
クエンチ化蛍光プローブを使用するデジタルＰＣＲ系において、そのプローブは対象の標的配列に相補的で、標的配列にアニーリングするものであり、そのフルオロフォアはポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により開裂され、それにより非クエンチ化される。放出されたフルオロフォアは区分中に蓄積し、その蛍光シグナルを増大させる。従来的なＰＣＲは、数回のサイクルにより真の陽性シグナルが識別可能となり、偽陽性シグナルはまだ追いつかない状態まで継続される。閾値は、２つのシグナルを分離させるように設定される。他の方法を使用して従来的なＰＣＲの産物を検出してもよい。
【００１７】
図１は、本発明の１つの実施形態に従う方法の概要を提供している。
【００１８】
非対称性段階を行う間に、反対方向（逆鎖）の複製を回避しながら、１個の鋳型鎖のみの一方向性複製を行う１つの方法は、ＡＩＰＲ段階の間は１つのプライマーのみを含ませ、第二のプライマーは対称性ＰＣＲ段階の開始時に添加することである。しかしながらほとんどの区分化をベースとしたデジタルＰＣＲ法では現在のところ、分配が発生したら試薬の添加は許可されず、例えば、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）において反応ドロップレットに試薬を添加することは難しい。
【００１９】
１つの実施形態において、本発明は、大きく異なる融点を有するプライマー対を使用することにより、両プライマーが反応物中に存在するＡＩＰＲを可能とするプライマーを生成するアッセイデザインのための方法を提供するものである。高いＴｍのプライマー（プライマーＨ）は、対象の標的配列の末端の１つの鎖に対して設計されており、低いＴｍ（プライマーＬ）は、対象の標的配列の他方の末端のもう１つの鎖に対して設計されている。当該方法はまた、特定の対立遺伝子を検出するための手段を含んでいる。当該手段は、たとえば、多様性塩基全体にわたって位置づけられた、対立遺伝子特異的なプローブであってもよい。ＡＩＰＲ段階は、非常に高い温度で行われ、高いＴｍのプライマーＨは効率的にアニーリングすることができ、一方で低いＴｍのプライマーＬはアニーリングすることができない。従来的な対称性ＰＣＲ段階は、低い温度で行われ、低いＴｍのプライマーＬと高いＴｍのプライマーＨが、特定の鋳型に効率的に結合することができる。もしこの系で対立遺伝子特異的なプローブを使用している場合、低いアニーリング温度で、又は低いアニーリング温度付近で、これらが結合できるよう、これらは選択的に設計される。プライマーのＴｍ、そしてこの２段階の間の活性は、プライマーの長さ、プライマー中に設計された配列ミスマッチの導入、及び／又はプライマーの改変（例えば、固定核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）塩基などの多様体ヌクレオチドの使用による改変、又は例えば小溝結合剤（ＭＧＢ：ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ）の付加などの他のオリゴヌクレオチド改変）によって操作することができる。非対称性ＡＩＰＲ段階の間、プライマーＬの活性を抑制することが重要である。その理由は、低いＴｍのプライマー結合と伸長が発生するたびに、両鎖の対称性の複製が発生してしまい、それによって潜在的なポリメラーゼエラーの基質が増大し、その後の各サイクルの間、さらにそれらが増幅されてしまうからである。この理由のために、偽陽性回避という観点で好ましいアッセイ設計は、非対称性段階のアニーリング温度と、低Ｔｍプライマーの融点の間の差を大きくするような設計である。
【００２０】
ゆえに本発明の１つの態様は、標的核酸配列の存在の検出方法、又はサンプル中の標的核酸配列中の多様体配列の存在の検出方法を提供するものであり、当該方法は、以下の工程を含有する：
ａ）鋳型核酸を含有するサンプルを提供すること
ｂ）標的核酸配列の増幅を特異的に行うことができる、少なくとも１つのプライマー対を含有するプライマーセットを提供することであって、当該プライマーセットは少なくともプライマーＨとプライマーＬを含有しており、プライマーＨの融点は、プライマーＬの融点よりも少なくとも１５℃高く、プライマーＬは、プライマーＨの伸長産物断片に対し相補的な配列を含有していること
ｃ）伸長温度でポリメラーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを提供すること
ｄ）区分化ＰＣＲ反応物を調製することであって、各区分はサンプルの一部、プライマーセット、核酸ポリメラーゼ、ＰＣＲ試薬、及び任意で検出試薬を含有していること
ｅ）以下の工程を含む、非対称性漸増ポリメラーゼ反応（ＡＩＰＲ）を行うこと：
ｉ．変性温度で区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによって、ＤＮＡを一本鎖分子に変性させること
ｉｉ．高いアニーリング温度で区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、プライマーＨはアニーリングできるが、プライマーＬはアニーリングできないようにすること
ｉｉｉ．任意で、伸長温度で区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートすること
ｉｖ．任意で、工程ｉ〜ｉｉｉを繰り返すこと
ｖ．それによって、標的核酸配列の１つの鎖のみを増幅させること
ｆ）以下の工程を含む、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと：
１）変性温度で区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートすることであって、それによって、ＤＮＡを一本鎖分子に変性させること
２）低いアニーリング温度でＰＣＲをインキュベートし、それによって、プライマーＨとプライマーＬの両方のアニーリングを可能にさせること
３）伸長温度でＰＣＲをインキュベートし、それによって、すべてのアニーリングされたプライマーの伸長を可能にさせること
４）任意で、工程ＩＩ〜ＩＶを繰り返すこと
５）それによって、標的核酸配列の両方の鎖を増幅させ、ＰＣＲ産物を得ること
ｇ）ＰＣＲ産物が、標的核酸配列を含有しているか否か、又は標的核酸配列中に多様体配列を含有しているか否かを検出すること。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ＩＢＳＡＦＥ法の概要を示す。図１Ａは、変異鋳型が存在している状態を示す。ＡＩＰＲ段階の間に、変異配列の相補的コピーが生成される。温度は充分に高く維持され、プライマーＬとプローブがアニーリングしないようにする。対称性段階で、変異ＤＮＡが指数関数的に増幅される。図１Ｂは、野生型の鋳型が存在しているが、ポリメラーゼエラーも発生している状態を示す。ＡＩＰＲ段階の間、野生型配列のコピーがいくつか生成されるが、１つのコピーのみ、エラーが生じた変異配列である。温度は充分に高く維持され、プライマーＬとプローブがアニーリングしないようにする。対称性段階では、野生型ＤＮＡとエラー変異ＤＮＡの両方が指数関数的に増幅される。しかしながら、指数関数的段階の開始時、野生型ＤＮＡのコピーのほうがより多く存在しているため、野生型ＤＮＡが、変異ＤＮＡを、数で大きく凌駕する。
【００２２】
【図２】図２は、対象の２つの標的配列に対するアッセイ設計の２つの具体的な例を示す。両方とも、癌遺伝子のＰＩＫ３ＣＡの中にあり、Ｈ１０４７Ｒ多様体は、コドン３１４０に位置し、ＡからＧのヌクレオチド変化を有している（上）。Ｅ５４２Ｋ多様体はコドン１６２４に位置し、ＧからＡのヌクレオチド変化を有している（下）。
【００２３】
【図３】図３は、ドロップレットデジタルＰＣＲのプロットを示す。図は、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ多様体（上半分）と、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ多様体（下半分）に対する、ＰｒｉｍｅＰＣＲ（商標）変異アッセイ（左側）と、ＩＢＳＡＦＥアッセイ（右側）から得られた変異ＤＮＡシグナルを示す。ドロップレット（Ｘ軸）は、その蛍光強度（Ｙ軸）と共に、ドットとして示されている。ＩＢＳＡＦＥ法を使用した場合には、ＰｒｉｍｅＰＣＲ（商標）変異アッセイと比較して、陰性対照ウェル内に偽陽性ドロップレットが無いことに注意されたい（各ダイアグラムの上の右側の角にあるボックス内に概要される）。
【００２４】
【図４】図４は、実験的アッセイ設計を示す。アッセイ設計は、ＰＩＫ３ＣＡ  ｃ．３１４０Ａ＞Ｇ（Ｈ１０４７Ｒ）を標的としており、プライマーＨの別バージョンを用いている（ベータ１とベータ２）。プライマーＨ  ベータ１は短く、そのため、プライマーＨ  ベータ２よりも融点が低い。このアッセイに使用されたプローブは、カスタムのＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）であり、５’レポーター色素（ＦＡＭ又はＨＥＸ）、３’非蛍光クエンチャー、及びそのクエンチャー分子に付加された３’小溝結合剤（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ）を含有している。
【００２５】
【図５】図５は、偽陽性シグナルに対するＡＩＰＲの効果を示す、変異（特異的）シグナルのプロットを示す。図４に示される実験アッセイ設計を使用し、ベータ１とベータ２のプライマーＨを、プライマーＬと共に含ませ、ならびに変異特異的プローブ及び野生型特異的プローブ（図４を参照）を、変異陽性ＤＮＡ鋳型（示さず：すべてのアッセイが、変異を検出した）、ＡＩＰＲを伴わない野生型鋳型（Ａ）、低い温度（６７℃）のＡＩＰＲを伴う野生型鋳型（Ｂ）、及び高い温度（７４℃）のＡＩＰＲを伴う野生型鋳型（Ｃ）と共に使用した。パネルＤ、Ｅ及びＦは、異なるＡＩＰＲアニーリング温度と、対称性アニーリング温度を使用した、変異（特異的）シグナル、及び無偽陽性シグナルを示す。（Ｄ）ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ変異に対するＩＢＳＡＦＥアッセイ。この実験において、ＡＩＰＲは７５℃のアニーリング温度で行われ、対称性段階は４６℃のアニーリング温度で行われる。（Ｅ）ＰＩＫ３ＣＡの変異Ｅ５４５Ｋに対するＩＢＳＡＦＥアッセイ。この実験において、ＡＩＰＲは７５℃のアニーリング温度で行われ、対称性段階は、４６℃のアニーリング温度で行われる。（Ｆ）ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｒ変異に対するＩＢＳＡＦＥアッセイ。ＡＩＰＲは７３℃のアニーリング温度を使用し、対称性段階は４８℃のアニーリング温度を使用する。
【００２６】
【図６】図６は、検出限界の比較例を示す−ＰｒｉｍｅＰＣＲ（商標）変異アッセイ（左側）とＩＢＳＡＦＥアッセイ（右側）の、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ多様体（上のパネルと下のパネル）、及びＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ多様体（真ん中パネル）に関して測定された変異対立遺伝子頻度を示す。上のパネルと真ん中のパネルは、０、０．０１、０．１及び１％の変異ＤＮＡ（残りは野生型）を含有する鋳型ＤＮＡを含むアッセイから得られた結果を示し、下のパネルは、０、０．００１、０．０１、０．１、１、及び１０％の変異ＤＮＡを含有する鋳型ＤＮＡを含むアッセイから得られた結果を示す。ＰｒｉｍｅＰＣＲ（商標）変異アッセイの偽陽性シグナルは、０．０１％のＭＡＦでの結果は、信用できない（陰性対照との重複）ことを示し、従って、検出の下限は、０．１％である。対照的に、ＩＢＳＡＦＥアッセイでは、０．０１％のＭＡＦが信頼可能であり、さらに０．００１％であっても、結果は信頼可能である。検出の最下限は未だ完全には検証されていないが、おそらくはアッセイに応じて、０．００１％よりもかなり低いであろう。
【００２７】
【図７】図７は、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ変異を標的とする、ミスマッチ改変プライマーＬを使用した、本発明に従う方法のアッセイ設計（Ａ）とその結果（Ｂ）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
定義
増幅：核酸の増幅は、当該核酸のコピーの生成である。「標的核酸の増幅が可能なプライマー対」という用語は、本明細書において使用される場合、当該プライマー対が標的核酸、ヌクレオチド、及び核酸ポリメラーゼと共にＰＣＲに加えられた場合に、当該ＰＣＲに標的核酸の生成をもたらすプライマー対を指す。
【００２９】
およそ：本明細書において使用される場合、およそという用語は、±１０％、好ましくは±５％、例えば±１％を指す。
【００３０】
変性温度：変性温度は、サンプル中のすべてのＤＮＡ分子、及び／又はＰＣＲ反応物中のすべてのＤＮＡ分子、及び／又はＡＩＰＲ中のすべてのＤＮＡ分子を一本鎖分子に変性させる温度である。変性温度は、確実に核酸ポリメラーゼが恒久的に変性されないほど、充分に低いことが好ましい。典型的には、変性温度は、９０〜９９℃の範囲の温度であり、例えば９２〜９７℃の範囲であり、例えば９４〜９５℃の範囲である。
【００３１】
伸長温度：伸長温度は、核酸ポリメラーゼの酵素活性が許容する温度である。典型的には、核酸ポリメラーゼは、ある温度範囲にわたって活性を有しており、従って、伸長温度は、その範囲内の任意の温度であってもよい。大多数の核酸ポリメラーゼは、最適温度を有しているが、最適温度とは異なる温度でも活性は維持している。そのような場合、伸長温度は、たとえその温度が最適な温度ではなくても、核酸ポリメラーゼが活性を有している任意の温度であることができる。本明細書において使用される場合、「伸長温度でポリメラーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ」という用語は、核酸ポリメラーゼが、その伸長温度で、鋳型鎖に対し相補的な新規核酸鎖の合成を触媒することができることを指す。本発明の一部の実施形態において、伸長温度は、プライマーＨの融点に近い。従って、核酸ポリメラーゼは、プライマーＨの融点に近い温度でポリメラーゼ活性を有するものを選択されてもよく、及び／又はプライマーＨが、伸長温度に近い融点を有するよう設計されてもよい。この関連で使用された場合、「近い温度」という用語は、例えば当該温度の±５℃内、例えば±２℃内、例えば±１℃内であってもよい。通常、伸長温度は、６５〜８０℃の範囲であり、例えば６８〜７５℃の範囲である。
【００３２】
融点：プライマーの融点は、そのプライマーの５０％が安定的な二重らせんを形成し、その相補配列と残りの５０％は一本鎖分子に分離されている温度である。融点はまたＴｍとも呼称される。好ましくは、本明細書において使用される場合、Ｔｍは、Breslauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 3746-50 (1986)に記載される方法に基づき、最近傍法により算出され、塩濃度パラメーターは５０ｍＭ、プライマー濃度は９００ｎＭを使用する。例えば、この方法は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．の、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｚｅｒ」ソフトウェアにより実行される。
【００３３】
本明細書において使用される場合、「標的核酸の増幅が可能なプライマー対」という用語は、当該プライマー対が標的核酸、ヌクレオチド、核酸ポリメラーゼ、及び他のＰＣＲ試薬と共にＰＣＲに加えられた場合に、当該ＰＣＲに標的核酸の生成をもたらすプライマー対を指す。プライマー対のうちの１つのプライマーは、フォワードプライマーであり、他方はリバースプライマーである。プライマーＨがフォワードプライマーである場合、プライマーＬは選択的にリバースプライマーであり、逆もまたしかりである。
【００３４】
ＰＣＲ試薬：ＰＣＲ試薬は、核酸ポリメラーゼ、サンプル、及びプライマーセットに加えて、ＰＣＲに加えられる試薬である。ＰＣＲ試薬は少なくともヌクレオチドを含有する。さらにＰＣＲ試薬は、例えば塩（複数含む）及び緩衝剤（複数含む）などの他の化合物を含有してもよい。
【００３５】
プライマーＨ及びプライマーＬ：プライマーＨは、高い融点を有するプライマーであり、一方でプライマーＬは、低い融点を有するプライマーである。
【００３６】
プライマーセット：プライマーセットは、２個以上の異なるプライマーを含有している。プライマーセットは、標的核酸を特異的に増幅することができるプライマーを少なくとも１対含有する。さらに、本発明に従うプライマーセットは、少なくともプライマーＨとプライマーＬを含有する。従って、本発明の実施形態において、プライマーセットが２個の異なるプライマーのみを含有する場合、プライマーセットは、プライマーＨとプライマーＬを含有しており、そのプライマーＨとプライマーＬは、標的核酸を増幅することができる。
【００３７】
標的核酸：その存在を検出することが望まれている、任意の核酸配列である。標的核酸は例えば、臨床状態に関連した核酸配列であってもよい。
【００３８】
多様体配列又は標的核酸の検出方法
本発明は、サンプルにおいて標的核酸中の多様体配列の存在を検出するための方法を提供する。
【００３９】
当該方法は、サンプル中に多様体配列が存在しているか否かを検出するのに有用であり得、そのサンプルは、標的核酸の混合物を含んでいてもよく、この場合において、標的核酸の一部のみが多様体配列を含有していてもよい。特に、当該方法は、標的核酸を含有するサンプル中の多様体配列の存在の検出に有用であり、その標的核酸の少量の画分のみが多様体配列を潜在的に含有してもよい。
【００４０】
当該多様体配列は、検出することが望まれている任意の多様体配列であってもよい。例えば、多様体配列は、以下において本明細書に記載されるような臨床状態と関連していてもよく、詳細には、「臨床状態の存在の予測方法」の項に記載されている。特に、多様体配列は、以下の「多様体配列及び標的核酸配列」の項に記載されている多様体配列の内の任意のものであってもよい。
【００４１】
サンプルは、当該多様体配列が存在しているか否かに関わらず、検出することが望まれている任意のサンプルであってもよい。例えばもし多様体配列が臨床状態の指標である場合、サンプルは、当該臨床状態になるリスクがある個体からのサンプルであってもよい。
【００４２】
本発明はまた、サンプル中の標的核酸配列の存在の検出方法を提供する。
【００４３】
当該方法は、サンプル中に標的核酸配列が存在しているか否かを検出するのに有用な場合がある。当該サンプルは、標的核酸配列を潜在的に含有する鋳型核酸の混合物を含んでいてもよい。特に、当該方法は、サンプル中の標的核酸配列の存在の検出に有用であり、当該サンプルは、非常に低レベルの当該標的核酸配列のみを潜在的に含有していてもよい。
【００４４】
当該標的核酸配列は、検出することが望まれている任意の標的核酸配列であってもよい。例えば、標的核酸配列の存在は、以下において本明細書に記載されるような臨床状態と関連していてもよく、詳細には、「臨床状態の存在の予測方法」の項に記載されている。特に、標的核酸配列は、以下の「多様体配列及び標的核酸配列」の項に記載されている標的核酸配列のうちの任意のものであってもよい。
【００４５】
サンプルは、当該標的核酸配列が存在しているか否かに関わらず、検出することが望まれている任意のサンプルであってもよい。例えばもし標的核酸配列が臨床状態の指標である場合、サンプルは、当該臨床状態となるリスクがある個体からのサンプルであってもよい。
【００４６】
サンプル中の標的核酸配列の存在、又は多様体核酸配列の存在を検出する方法は、概して、以下の工程を含有する：
ａ）鋳型核酸を含有するサンプルを提供すること、
ｂ）例えば本明細書において以下の「プライマーセット」の項に記載されているプライマーセットのいずれかであり得る、プライマーセットを提供すること、
ｃ）伸長温度でポリメラーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを提供することであって、当該ポリメラーゼは、例えば本明細書において以下の「ＰＣＲ試薬」の項に記載されている核酸ポリメラーゼのいずれかであり得ること、
ｄ）例えば本明細書において以下の「区分化ＰＣＲ反応物」の項に記載されている区分化ＰＣＲ反応物を調製すること、
ｅ）例えば本明細書において以下の「非対称性漸増ポリメラーゼ反応」の項に記載されている、非対称性漸増ポリメラーゼ反応（ＡＩＰＲ）を行うこと、
ｆ）ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、好ましくは本明細書において以下の「指数関数的ＰＣＲ」に記載されている指数関数的ＰＣＲ反応を行うこと、
ｇ）ＰＣＲ産物が、標的核酸配列を含有しているか否か、又は標的核酸配列中に多様体配列を含有しているか否かを検出することであって、当該検出は例えば、本明細書において以下の「検出」の項に記載されるように行われてもよい。
【００４７】
各区分化ＰＣＲ反応物は、ＰＣＲ反応を可能とするために、少なくともサンプルの一部、プライマーセット、及び充分なＰＣＲ試薬を含有しなければならない。ＰＣＲ反応の実行に有用な方法及び試薬は当業者に公知である。例えば各区分化ＰＣＲ反応物は、本明細書において以下の「ＰＣＲ試薬」の項に記載されている核酸ポリメラーゼ及びＰＣＲ試薬のいずれかを含有してもよい。
【００４８】
ＰＣＲ産物が多様体配列を含有しているか否かを検出する様式に応じて、各区分化ＰＣＲ反応物は、検出試薬、例えば本明細書において以下の「検出」の項に記載される検出試薬のいずれかを含有してもよい。
【００４９】
本発明方法は、例えば、多くのヌクレオチド塩基が異なっている任意の２つの配列の間の高性能な識別を必要とするアプリケーションに有用である。本発明方法は、例えば、たった１個又は数個のヌクレオチド塩基しか異なっていない任意の２つの配列の間の高性能な識別を必要とするが、固有ポリメラーゼの塩基組み込みエラー率が、対象の偽陽性標的配列をもたらし得るアプリケーションに有用である。当該方法は、例えば本明細書において以下の「検出」の項に記載されている一塩基多様体のプローブを基にした識別、又はプライマーを基にした識別を用いて、使用することができる。当該方法は、任意の生物体において、任意のタイプの非改変もしくは改変デオキシリボ核酸又はリボ核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）の対象配列に適用することができ、及び数ダースのヌクレオチドの長さから、数百から数千のヌクレオチドの長さまでの任意の長さのものに適用することができる。当該方法は、非改変又は改変されたプライマーを用いて、非改変又は改変されたプローブとともに、又は伴わずに、使用することができる。当該方法は、複数の標的配列の、多数の同時調査を用いて、多重的に行うことができる。
【００５０】
概して、本発明方法は、非常に低い検出限界を有している。これによって、潜在的に非常に低いレベルで存在している標的核酸配列の検出が可能になり、及び／又は他の標的核酸配列を含有している混合物中に潜在的に非常に低いレベルで存在している多様体配列の存在の検出が可能となる。概して、プライマーＨとプライマーＬの融点に大きな差があることによって、非常に低い検出限界が可能となり得る。プライマーＨとプライマーＬの有用な融点は本明細書において以下に記載されている。また、適用される高いアニーリング温度と低いアニーリング温度の間に大きな差があることによって、非常に低い検出限界が可能となり得る。有用な高アニーリング温度及び低アニーリング温度は、本明細書において以下に記載されている。
【００５１】
検出限界は、様々な方法で決定することができる。例えば検出限界は、野生型の鋳型のみを含有している陰性対照と信頼可能に識別され得る最小変異対立遺伝子画分（ＭＡＦ）を決定することにより決定することができる。変異対立遺伝子画分は、検出される対立遺伝子の総数（野生型と変異型）に対する、検出される変異対立遺伝子の画分である。理論上は、インプット鋳型が野生型のみである場合にはＭＡＦはゼロでなくてはならないが、偽陽性があるために、当該画分はゼロよりも高くなる場合がある。偽陽性によって、方法は不十分な検出限界を有することとなる。その理由は、真の陽性であるＭＡＦは非常に低く、真の陰性で検出される非常に低いＭＡＦと識別することができないためである。好ましくは、本発明方法は、０．０１％よりも低く、例えば０．００１％よりも低い場合もある、検出限界ＭＡＦを有している。ＭＡＦは例えば、本明細書において以下の実施例１に記載されるように決定されてもよい。
【００５２】
部分キット（ｋｉｔ−ｏｆ−ｐａｒｔｓ）
本発明はまた、以下を含有する部分キットを提供する：
ａ）プライマーセット。例えば本明細書において以下の「プライマーセット」の項に記載されているプライマーセットのいずれかであってもよい。
ｂ）標的核酸配列にハイブリダイズすることができる検出プローブ。当該プローブは、少なくとも１つのフルオロフォアと少なくとも１つのクエンチャーが連結しており、この場合において当該検出プローブは例えば本明細書において以下の「検出」の項に記載されている検出プローブのいずれかであってもよい。
ｃ）核酸ポリメラーゼ。例えば、本明細書において以下の「ＰＣＲ試薬」の項に記載されている核酸ポリメラーゼのいずれかであってもよい。
ｄ）ＰＣＲ試薬。例えば、本明細書において以下の「ＰＣＲ試薬」の項に記載されている試薬のいずれかであってもよい。
ｅ）区分化ＰＣＲ反応物を含有するドロップレットを調製するための試薬。例えば、本明細書において以下の「区分化ＰＣＲ反応物」の項に記載されている試薬のいずれかであってもよい。
【００５３】
部分キットは特に、本発明方法の実行に有用である。
【００５４】
多様体配列及び標的核酸配列
上述のように、本発明方法は、標的核酸配列中の多様体配列の存在の検出に有用である。
【００５５】
しばしば、多様体配列は変異した配列である場合がある。従って、標的核酸配列は、野生型配列として、又は変異配列としてのいずれかで存在し得る核酸配列であってもよい。
【００５６】
また、多様体配列は多型である場合もあり、従って、標的核酸配列は、様々な異なる多型として存在していてもよい。検討を単純化するために、たとえ厳密には一部の環境下では多様体配列も野生型配列と見なされ得るとしても、最も普遍的に発生する標的核酸配列を、本明細書においては「野生型配列」と呼称する。
【００５７】
従って本発明方法は、標的核酸配列中の多様体配列の存在を検出する方法であり得、この場合において当該標的核酸配列は、潜在的に、野生型配列として存在することもでき、又は多様体配列を含有していてもよい。
【００５８】
多様体配列は、置換（複数含む）、欠失（複数含む）、及び／又は挿入（複数含む）によって野生型配列と異なっていてもよい。野生型配列と多様体配列の両方とも、ＰＣＲ反応物中で、標的核酸配列を特異的に増幅することができるプライマー対により増幅され得ることが望ましい場合がある。従って、野生型配列と多様体配列は、長さでは互いに大きく違わないことが望ましい場合がある。多様体配列は例えば、１〜１０００ヌクレオチドの範囲の挿入、例えば１〜１００ヌクレオチドの範囲の挿入、例えば１〜５０ヌクレオチドの範囲の挿入、例えば１〜１０ヌクレオチドの範囲の挿入、例えば１〜５ヌクレオチドの範囲の挿入、例えば１ヌクレオチドの挿入により、野生型配列と異なっていてもよい。同様に、多様体配列は例えば、１〜１０００ヌクレオチドの範囲の欠失、例えば１〜１００ヌクレオチドの範囲の欠失、例えば１〜５０ヌクレオチドの範囲の欠失、例えば１〜１０ヌクレオチドの範囲の欠失、例えば１〜５ヌクレオチドの範囲の欠失、例えば１ヌクレオチドの欠失により、野生型配列と異なっていてもよい。多様体配列はまた、例えば１〜１０００ヌクレオチドの範囲の置換、例えば１〜１００ヌクレオチドの範囲の置換、例えば１〜５０ヌクレオチドの範囲の置換、例えば１〜１０ヌクレオチドの範囲の置換、例えば１〜５ヌクレオチドの範囲の置換、例えば１ヌクレオチドの置換により、野生型配列と異なっていてもよい。
【００５９】
従って、本発明の１つの実施形態において、多様体配列は、例えば１ヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換など、たった１つのヌクレオチドによって野生型配列と異なっていてもよい。従って、多様体配列は、一塩基多様又は一塩基変異であってもよい。多様体配列はまた、例えば一塩基多型などの多型であってもよい。
【００６０】
上記に例示されるように、野生型配列と多様体配列の両方が、標的核酸配列を特異的に増幅することができるプライマー対を使用したＰＣＲ反応において増幅され得ることが望ましい。当該プライマー対は、フォワードプライマーとリバースプライマーからなる。フォワードプライマーは、野生型標的配列と、多様体配列を含有する標的配列の両方に存在している標的配列の一部に対して同一の配列を含有するか、又はからなることが好ましい。しかしながらまた、フォワードプライマーは、標的配列の一部に対し、数個のミスマッチ、例えば１０個以下のミスマッチ、例えば５個以下のミスマッチ、例えば２個以下のミスマッチを除き、同一である配列を含有し、又はからなることも可能である。同様に、リバースプライマーは、野生型標的配列と、多様体配列を含有する標的配列の両方に存在している標的配列の一部に対して相補的な配列を含有するか、又はからなることが好ましい。しかしながらまた、リバースプライマーは、標的配列の一部に対し、数個のミスマッチ、例えば１０個以下のミスマッチ、例えば５個以下のミスマッチ、例えば２個以下のミスマッチを除き、相補的である配列を含有し、又はからなることも可能である。プライマーは、様々な理由、例えばプライマーを適切なＴｍに調節するために、ミスマッチを含有してもよい。そのようにして本発明方法は、野生型標的配列と、多様体配列を含有する標的配列の両方の増幅を生じさせる。ゆえに、ＰＣＲ産物は、多様体配列を含有する標的核酸配列と、多様体配列を有していない標的核酸配列の両方を含有してもよい。
【００６１】
その後、多様体配列の存在は、当業者に利用可能な任意の方法、例えば本明細書において以下の「検出」の項に記載されている方法により決定されることができる。
【００６２】
本明細書において上に記載されるように、本発明方法を使用して、２つの非状に類似した配列を識別してもよく、それによって、野生型配列に類似した多様体配列の存在を検出してもよい。
【００６３】
なぜ所与の多様体配列を検出することが望ましいか、多くの異なる理由が存在し得る。例えば、多様体配列は臨床状態、又は臨床状態となるリスクに関連している場合がある。多様体配列はまた、フィンガープリントを提供し、又は少なくとも個体のフィンガープリントに寄与し、それによって、個体の識別に役立つ場合がある。これは法医学的応用を有し得る。
【００６４】
しかしながら本発明はまた、単純に、所与の標的核酸配列の存在を検出するために使用されてもよい。当該標的核酸配列は、検出が望まれている任意の核酸配列であってもよい。例えば、外来性病原体由来の核酸の存在の検出が望ましい場合がある。概して、標的核酸配列は、核酸ポリメラーゼの鋳型として適切であることが望ましい。
【００６５】
プライマーセット
本明細書に記載される方法は、プライマーセットの使用を含む。プライマーセットは、標的核酸配列を特異的に増幅することができる少なくとも１つのプライマー対を含有し、当該プライマーセットは、少なくともプライマーＨとプライマーＬを含有する。
【００６６】
本発明には、プライマーＨとプライマーＬが、標的核酸配列の特異的な増幅が可能な１つのプライマー対を構成し得ることが包含される。従って、本発明の一部の実施形態において、プライマーセットは、プライマーＨとプライマーＬからなる場合がある。
【００６７】
本発明の特定の実施形態において、区分化ＰＣＲ反応物は、以下の核酸のみを含有する：サンプル中に存在する核酸、プライマーＨ、プライマーＬ、遊離ヌクレオチド、及び任意で１個以上の検出プローブ。
【００６８】
しかしながら、標的核酸配列の特異的な増幅が可能なプライマー対は、プライマーＨ及びプライマーＬとは異なっていることも可能である。また、本発明には、プライマーＬが、プライマーＨではないプライマーと共に、標的核酸配列の特異的な増幅が可能なプライマー対を構成することも包含される。
【００６９】
標的核酸配列の特異的な増幅が可能なプライマー対は、２つのプライマーからなり、それらはフォワードプライマーとリバースプライマーという名称であってもよい。フォワードプライマーは、標的核酸配列の５’末端で、又は５’末端の近傍で、標的核酸配列の相補鎖にアニーリングできることが好ましい。フォワードプライマーは、標的核酸配列の５’末端と同一である配列を含有することが好ましい。フォワードプライマーは、標的核酸配列の５’末端と同一である配列からなっていてもよい。フォワードプライマーが標的核酸配列と同一ではない配列を含有する場合、そのプライマーの３’末端は、標的核酸配列と同一である配列からなることが好ましい。リバースプライマーは、標的核酸配列の３’末端で、又は標的核酸配列の３’末端の近傍で、標的核酸配列にアニーリングできることが好ましい。リバースプライマーは、標的核酸配列の３’末端に対し相補的である配列を含有することが好ましい。リバースプライマーは、標的核酸配列の３’末端に対し相補的である配列からなっていてもよい。リバースプライマーが標的核酸配列に対し相補的ではない配列を含有する場合、そのプライマーの５’末端は、標的核酸配列に対し相補的である配列からなることが好ましい。
【００７０】
フォワードプライマーはプライマーＨであり得、リバースプライマーはプライマーＬであり得ることが予期される。
【００７１】
また、フォワードプライマーはプライマーＨであり得、リバースプライマーは、プライマーＨでもプライマーＬでもないプライマーであり得ることも予期される。
【００７２】
また、フォワードプライマーはプライマーＬであり得、リバースプライマーはプライマーＨであり得ることも予期される。
【００７３】
また、フォワードプライマーはプライマーＬであり得、リバースプライマーは、プライマーＨでもプライマーＬでもないプライマーであり得ることも予期される。
【００７４】
フォワードプライマーがプライマーＨである場合の本発明の実施形態において、ＰＣＲ反応物は、プライマーＨの融点よりも、少なくとも１０℃低い、好ましくは少なくとも１５℃低い、例えば少なくとも２０℃低い、例えば少なくとも２５℃低い、例えば少なくとも３０℃低い、例えば１５〜５０℃低い範囲にある、例えば１５〜４０℃低い範囲にある、融点を有するリバースプライマーのみを含有することが好ましい場合がある。プライマーセットが、プライマーＨとリバースプライマーからなるプライマー対をいくつか含有する場合の本発明の実施形態において、各リバースプライマーは、そのプライマー対のプライマーＨに関し、前述の融点を有していることが好ましい。
【００７５】
リバースプライマーがプライマーＨである場合の本発明の実施形態において、ＰＣＲ反応物は、プライマーＨの融点よりも、少なくとも１０℃低い、好ましくは少なくとも１５℃低い、例えば少なくとも２０℃低い、例えば少なくとも２５℃低い、例えば少なくとも３０℃低い、例えば１５〜５０℃低い範囲にある、例えば１５〜４０℃低い範囲にある、融点を有するフォワードプライマーのみを含有することが好ましい場合がある。プライマーセットが、プライマーＨとフォワードプライマーからなるプライマー対をいくつか含有する場合の本発明の実施形態において、各フォワードプライマーは、そのプライマー対のプライマーＨに関し、前述の融点を有していることが好ましい。
【００７６】
プライマーは、適切な条件下でＤＮＡ合成の開始点として作用することができる任意のオリゴヌクレオチド又は核酸であってもよい。当該条件としては、本明細書において以下の「非対称性漸増ポリメラーゼ鎖反応」又は「指数関数的ＰＣＲ」の項で記載されるＡＩＰＲ又はＰＣＲの条件が挙げられる。
【００７７】
一部の例において、プライマーは検出可能に標識されていてもよい。一部の例において、プライマーは検出可能に標識されていない。
【００７８】
プライマーの長さは、標的核酸配列の配列に依存し得る。本明細書の別段に説明されているように、プライマーＨは、プライマーＬの融点よりも著しく高い融点を有している。もしプライマーセットが、プライマーＨとプライマーＬ以外の多くのプライマーを含有している場合、他のプライマーは、プライマーＬの融点と類似した融点を有するよう設計されることが好ましく、又はプライマーＬの融点よりも低い融点を有するよう設計されることが好ましい。しかしながら、本発明には、プライマーセットが、２以上のプライマーＨを含有している場合も包含される。そのような場合において、任意のプライマーは、それらプライマーＨのうちのいずれかと共に、標的核酸を増幅することができること、及びプライマーＬの融点と類似した融点又はプライマーＬの融点よりも低い融点を有していることが好ましい。
【００７９】
従って、プライマーセットは、プライマーＨとプライマーＬを含有することが好ましく、この場合においてプライマーＨは、プライマーセットの他の全てのプライマーの融点よりも少なくとも１０℃高い融点を有している。例えば、プライマーＨは、プライマーセット中の他の全てのプライマーの融点よりも少なくとも１２℃、例えば少なくとも１４℃、例えば少なくとも１６℃、例えば少なくとも１８℃、例えば少なくとも２０℃高い融点を有していてもよい。プライマーＨはさらに高い融点を有していてもよく、例えば、プライマーセット中の他の全てのプライマーの融点よりも、少なくとも２５℃高い、例えば少なくとも３０℃高い融点を有していてもよく、１５〜５０℃高い範囲、例えば１５〜４０℃高い範囲の融点を有していてもよい。もし区分化ＰＣＲ反応物もまた１つ以上のプローブを含有する場合、当該プローブもまた、プライマーＨの融点よりも少なくとも１０℃、例えば少なくとも１２℃、例えば少なくとも１４℃、例えば少なくとも１６℃、例えば少なくとも１８℃、例えば少なくとも２０℃低い融点を有していてもよい。しかしながら、プローブはまた、より高い融点を有していてもよい。
【００８０】
１つの実施形態において、プライマーＨは、プライマーＬの融点よりも少なくとも１０℃高い融点を有する、プライマーセット中の唯一のプライマーである。当該実施形態において、すべての他のプライマーは、プライマーＬの融点よりも最大で１０℃高い融点を有している。例えば、プライマーＨを除くすべてのプライマーは、プライマーＬの融点の±１０℃の範囲内の融点、例えばプライマーＬの融点の±８℃の範囲内の融点、例えばプライマーＬの融点の±６℃の範囲内の融点、例えばプライマーＬの融点の±４℃の範囲内の融点を有していてもよい。もし区分化ＰＣＲ反応物も１つ以上のプローブを含有している場合、当該プローブもまた、プライマーＬの融点の±１０℃の範囲内の融点、例えばプライマーＬの融点の±８℃の範囲内の融点、例えばプライマーＬの融点の±６℃の範囲内の融点、例えばプライマーＬの融点の±４℃の範囲内の融点を有していてもよい。しかしながら、本発明には、プローブが、さらに高い融点、例えばプライマーＬの融点よりも最大で２０℃高い融点を有するプローブもまた包含される。
【００８１】
本発明の１つの実施形態において、プライマーセットは以下の任意のプライマーを含有しないことが好ましい：
ａ）プライマーＨの融点の、±１５℃の範囲、好ましくは±２０℃の範囲、例えば±２５℃の範囲、例えば±１０℃の範囲、例えば±８℃の範囲、例えば±６℃の範囲、例えば±４℃の範囲にある融点を有するプライマー、及び
ｂ）プライマーＨと共に、標的核酸配列を特異的に増幅することができるプライマー対を構成することができるプライマー。
【００８２】
本発明の１つの実施形態において、プライマーセット内のすべてのプライマーは、プライマーＨと共に、標的核酸配列を特異的に増幅することができるプライマー対を構成することができ、プライマーＨの融点よりも少なくとも１０℃、好ましくは少なくとも１５℃、例えば少なくとも２０℃、例えば少なくとも２５℃、例えば少なくとも３０℃、例えば１５〜５０℃低い範囲、例えば１５〜４０℃低い範囲の融点を有していることが好ましい。
【００８３】
従って、プライマーセットは、プライマーＨとプライマーＬを含有し、この場合においてプライマーＨは、プライマーセット中の他の全てのプライマーの融点よりも少なくとも１０℃高い融点を有していることが好ましい。例えば、プライマーＨは、プライマーセット中の他の全てのプライマーの融点よりも少なくとも１２℃、例えば少なくとも１４℃、例えば少なくとも１６℃、例えば少なくとも１８℃、例えば少なくとも２０℃高い融点を有していてもよい。もし区分化ＰＣＲ反応物が１つ以上のプローブも含有する場合、当該プローブは、プライマーＨの融点よりも少なくとも１０℃、例えば少なくとも１２℃、例えば少なくとも１４℃、例えば少なくとも１６℃、例えば少なくとも１８℃、例えば少なくとも２０℃低い、例えば２０〜４５℃低い範囲の融点を有していてもよい。しかしながら、本発明には、プローブが、さらに高い融点、プライマーＨの融点と類似した融点を有し得るプローブさえもまた包含される。
【００８４】
当業者であれば、適切な融点を有するプライマーを設計することができる。概して、プライマーの融点は、プライマーの長さ、プライマーの配列に依存し得、及びヌクレオチドアナログの存在にも依存し得る。プライマー配列にはいくつかの制限も存在する。それは、標的核酸配列及び／又は相補的配列にアニーリングできなければならないことである。従って、配列に対する制限の内で、当業者は、プライマーの長さを調節することにより、望ましい融点を有するプライマーを設計してもよい。融点（Ｔｍ）は、本明細書において上記の「定義」の項に記載されるように決定されてもよい。
【００８５】
融点はまた、ヌクレオチドアナログの存在にも依存し得、ゆえに、適切な融点を有するプライマーは、１つ以上のヌクレオチドアナログを含有するプライマーを設計することにより、設計することもできる。融点はまた、標的核酸配列に対するヌクレオチドミスマッチの存在にも依存し得、ゆえに、適切な融点を有するプライマーは、１つ以上のヌクレオチドミスマッチを含有するよう設計されることもできる。
【００８６】
プライマーは、プライマーの検出又は固定を可能とする追加の特性を組み込むこともできるが、プライマーの基本的な性質（例えば、ＤＮＡ合成開始点として作用すること）は変えない。例えば、プライマーは、標的核酸配列にハイブリダイズしない、又は標的核酸配列に相補的な配列にハイブリダイズしないが、増幅産物のクローニング又は検出を容易にする追加の核酸配列を５’末端に含有することができる。例えば、追加の配列は、制限酵素開裂部位及び／又は認識部位を含有することができる。ハイブリダイズするために鋳型に対し充分に相補的なプライマーの領域は、本明細書において、ハイブリダイズ領域と呼称され得る。プライマーはまた、例えば蛍光タグ、機能性タグ、又は結合タグなどのタグに連結されてもよい。当該タグは、その末端、糖、又はヌクレオ塩基に結合されてもよい。プライマーはまた、設計で３’末端ミスマッチを含有してもよく、そこでプライマーは野生型と多様体標的核酸配列を識別し、望ましくない鋳型配列の伸長を減少させ、又は途絶えさせる。
【００８７】
プライマーは、鋳型核酸に結合する前は、一本鎖ＤＮＡであってもよい。一部の例において、プライマーは当初、二本鎖配列を含有している。例えば、プライマーはヘアピンループを形成していてもよい。従って、概して、プライマーは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドであり、しばしば、プライマーはＤＮＡである。しかしながら、本発明に従うプライマーは、１つ以上のヌクレオチドアナログを含有してもよく、ならびにリボ核酸（ＲＮＡ）を含有してもよい。
【００８８】
ヌクレオチドアナログは当分野に公知であり、本発明のプライマー及びプローブは、任意の有用なヌクレオチドアナログを組み込むことができる。ヌクレオチドアナログは、例えば、修飾糖類、固定核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドアナログ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオチドアナログ、グリコール核酸（ＧＮＡ）ヌクレオチドアナログ、トレオース核酸（ＴＮＡ）ヌクレオチドアナログ、二環式及び三環式ヌクレオシドアナログ、主鎖中にリン基を組み込んでいるホスホノモノエステル核酸、又は１つ以上の天然型複素環式塩基部分の代わりに使用され得る多環式複素環式化合物を有するヌクレオチドアナログであってもよい。
【００８９】
他の実施形態において、本明細書に記載される方法及び組成物中で使用されるプライマー及びプローブは、１つ以上のユニバーサルヌクレオシド（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）を含有することができる。ユニバーサルヌクレオシドの非限定的な例は、５−ニトロインドール及びイノシンである。
【００９０】
プライマーは、二次構造及び自己ハイブリダイゼーションの回避を目的とした公知のパラメーターに従い、設計されることができる。
【００９１】
プライマーは多くのプロバイダーから入手可能であり、限定されないが、当分野に公知の方法を使用した適切な配列のクローニングと直接化学合成法を含む、様々な方法により調製することができる（Narang et al., Methods Enzymol. 68:90 (1979); Brown et al., Methods Enzymol. 68:109 (1979)）。
【００９２】
プライマーＨ及びプライマーＬ
本発明の方法及びキットは、プライマーＨ及びプライマーＬを含有するプライマーセットの使用を含むものであり、この場合においてプライマーＨの融点は、プライマーＬの融点よりも少なくとも１０℃、好ましくは少なくとも１５℃高く、プライマーＬは、プライマーＨの伸長産物に対して相補的な配列を含有している。プライマーセットは他のプライマー、例えば本明細書において上記の「プライマーセット」の項に記載されている他のプライマーを含有してもよいが、プライマーセットは、プライマーＨとプライマーＬからなっていてもよく、この場合においてプライマーＨとプライマーＬは、標的核酸配列を特異的に増幅することができる。
【００９３】
プライマーＨは、好ましくは、標的配列、又は標的配列に相補的な配列の増幅用プライマーとして設計される。従って、プライマーＨは、好ましくは、標的核酸配列、又は標的核酸配列に相補的な配列のいずれかにアニーリングすることができる。例えば、プライマーＨは、標的核酸配列の５’末端、又は５’末端の近傍で、標的核酸配列の相補的な鎖にアニーリングすることができてもよく、又はプライマーＨは、標的核酸配列の３’末端、又は３’末端の近傍で、標的核酸配列にアニーリングすることができてもよい。従って、プライマーＨは、標的核酸配列の５’末端と同一の配列を含有してもよい。さらには、プライマーＨは、標的核酸配列の５’末端と同一の配列からなっていてもよい。プライマーＨはまた、標的核酸配列と同一な配列を含有してもよい。従って、プライマーＨは、標的核酸配列の３’末端に対して相補的な配列を含有してもよい。さらには、プライマーＨは、標的核酸配列の３’末端に対して相補的な配列からなっていてもよい。
【００９４】
同様に、プライマーＬは、好ましくは、標的配列、又は標的配列に相補的な配列の増幅用プライマーとして設計される。もしプライマーＨが標的配列の増幅用に設計されている場合、プライマーＬは、好ましくは標的配列に相補的な配列の増幅用に設計され、逆もまたしかりである。従って、プライマーＬは、好ましくは、標的核酸配列、又は標的核酸配列に相補的な配列のいずれかにアニーリングすることができる。もしプライマーＨが標的核酸配列にアニーリングすることができる場合、プライマーＬは、好ましくは、標的核酸配列に対して相補的な配列にアニーリングすることができ、逆もまたしかりである。例えば、プライマーＬは、標的核酸配列の５’末端、又は５’末端の近傍で、標的核酸配列の相補的な鎖にアニーリングすることができてもよく、又はプライマーＬは、標的核酸配列の３’末端、又は３’末端の近傍で、標的核酸配列にアニーリングすることができてもよい。従って、プライマーＬは、標的核酸配列の５’末端と同一の配列を含有してもよい。さらには、プライマーＬは、標的核酸配列の５’末端と同一の配列からなっていてもよい。プライマーＬはまた、標的核酸配列と同一な配列を含有してもよい。従って、プライマーＬは、標的核酸配列の３’末端に対して相補的な配列を含有してもよい。さらには、プライマーＬは、標的核酸配列の３’末端に対して相補的な配列からなっていてもよい。
【００９５】
本発明の１つの実施形態において、プライマーＨは、標的核酸配列の５’末端の配列に同一なヌクレオチド配列を含有し、又はからなり、プライマーＬは、標的核酸配列の３’末端の相補配列と同一な配列を含有し、又はからなる。
【００９６】
本発明の他の実施形態において、プライマーＬは、標的核酸配列の５’末端の配列に同一なヌクレオチド配列を含有し、又はからなり、プライマーＨは、標的核酸配列の３’末端の相補配列と同一な配列を含有し、又はからなる。
【００９７】
本発明のさらに他の実施形態において、プライマーＬは２つの部分からなり、１つの部分は、標的核酸配列の断片に対して相補的又は同一であり、もう一方の部分は、標的核酸配列に対して相補的又は同一ではない。かかるプライマーはまた、本明細書において「ミスマッチ改変プライマーＬ」と呼称される場合がある。標的核酸配列の断片に対して相補的又は同一な当該部分は、非常に低い融点を有し、「プライマーＬの非ミスマッチ部分」と呼称される場合がある。プライマーＬの非ミスマッチ部分は、典型的には７〜１５個の範囲のヌクレオチドからなり、例えば７〜１２個の範囲のヌクレオチドからなる。標的核酸配列の断片に対して相補的又は同一ではない当該部分は、無作為配列を含有し、「プライマーＬのミスマッチ部分」と呼称される場合がある。プライマーＬのミスマッチ部分は、典型的には２〜８個の範囲のヌクレオチドからなり、例えば２〜６個の範囲のヌクレオチドからなる場合があるが、１個のヌクレオチド又は８個より多いヌクレオチドであってもよい。これは特に、本発明が、本明細書において上記の「低い温度のＰＣＲ」において記載されるような、低い温度のＰＣＲの工程を含有する実施形態の場合であり得る。当該プライマーＬの３’末端は例えば、真の標的核酸配列と、非標的核酸配列に非常に相同な配列の間で変化している塩基であってもよい。このミスマッチ部分は、新たに合成された核酸内に組み込まれ、２番目の相補鎖が合成された後に、適切なハイブリダイゼーション領域となることができる。
【００９８】
プライマーＨとプライマーＬは、本明細書において示される融点を有するよう設計される。当業者であれば、プライマーの配列、プライマーの長さを調節することにより、及び任意で本明細書において上記の「プライマーセット」の項に記載されるようにヌクレオチドアナログを組み込むことにより、プライマーＨとプライマーＬが所望される融点を有するよう設計することができる。
【００９９】
プライマーＨは、プライマーＬのアニーリング温度よりも非常に高いアニーリング温度、例えば少なくとも１０℃高いアニーリング温度を有するよう、設計される。従って、プライマーＨの融点は、プライマーＬの融点よりも、少なくとも１２℃高くてもよく、例えば少なくとも１５℃高く、好ましくは少なくとも１４℃高く、さらに好ましくは少なくとも１６℃高く、よりさらに好ましくは１８℃高く、例えば少なくとも２０℃高く、例えば１５〜５０℃の範囲で高く、例えば１５〜４０℃の範囲で高く、例えば１５〜２５℃の範囲で高くてもよい。一部の実施形態において、プライマーＨの融点は、少なくとも３０℃高く、例えば３０〜５０の範囲で高いことが好ましい。
【０１００】
概して、プライマーＨの融点は、可能な限り高いほうが好ましいが、少なくとも１つの核酸ポリメラーゼの最も高い機能的伸長温度よりも高くてはいけない。当該伸長温度は、当該核酸ポリメラーゼにとって最適な温度である必要はないが、少なくとも１つの核酸ポリメラーゼが、そのプライマーＨの融点で活性を有することが好ましい。従って、プライマーＨの融点は、８０℃に近くてもよく、又は８０℃を超えていてもよい。
【０１０１】
プライマーＨは、１つ以上のヌクレオチドアナログ、例えば本明細書において上記の「プライマーセット」の項に記載されているヌクレオチドアナログのいずれかを含有してもよい。いくつかのヌクレオチドアナログを組み込むことにより、融点が上昇する場合がある。従って、プライマーＨは特にヌクレオチドアナログを含有してもよく、この場合において当該ヌクレオチドアナログの組み込みにより、プライマーの融点が上昇する。従って、プライマーＨは、１つ以上のＬＮＡ、ＰＮＡ、ＧＮＡ、及び／又はＴＮＡを含有してもよい。例えば、プライマーＨは、１〜２０個の範囲の、例えば１〜１５個の範囲の、例えば５〜１０個の範囲のヌクレオチドアナログ、例えばＬＮＡを含有してもよい。
【０１０２】
また、プライマーＬの融点が、プライマーＬの標的核酸配列／標的核酸配列の相補配列への特異的アニーリングが確実に行われるほど充分に高いことが好ましいため、プライマーＨの融点はプライマーＨの融点よりも著しく高くなければならず、しばしば、プライマーＨの融点は少なくとも６０℃である。しばしば、プライマーＨの融点はまた少なくとも７０℃である場合がある。プライマーＨの融点は例えば６０〜９０℃の範囲、例えば６０〜８５℃の範囲、例えば７０〜８５℃の範囲、例えば７０〜８０℃の範囲であってもよい。
【０１０３】
プライマーＬの融点は、プライマーＬの標的核酸配列／標的核酸配列の相補配列への特異的アニーリングが確実に行われるほど充分に高いが、プライマーＨの融点よりも著しく低いことが好ましい。しばしば、プライマーＬの融点は３０〜５５℃の範囲、例えば３５〜５５℃の範囲、好ましくは４０〜５０℃の範囲である。
【０１０４】
ＰＣＲ試薬
本発明方法はＰＣＲを行う工程を含む。当業者であれば、どのようにＰＣＲを実行するか、及びどの試薬がＰＣＲの実行に有用であり得るかを良く認識している。かかる試薬は本明細書においてＰＣＲ試薬と呼称される。本発明の部分キットもまたＰＣＲ試薬を含有する。
【０１０５】
ほとんどの目的に対し、ＰＣＲ試薬はヌクレオチドを含有する。従って、ＰＣＲ試薬は、デオキシヌクレオシド三リン酸塩（ｄＮＴＰ）、特に４つの天然型デオキシヌクレオシド三リン酸塩（ｄＮＴＰ）のすべてを含有してもよい。
【０１０６】
ＰＣＲ試薬はしばしば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの全てを含む、デオキシリボヌクレオシド三リン酸塩分子を含有する。一部の場合において、ｄＵＴＰが加えられる。
【０１０７】
ＰＣＲ試薬はまた、核酸ポリメラーゼの活性の補助に有用な化合物を含有してもよい。従って、ＰＣＲ試薬は二価カチオン、例えばマグネシウムイオンを含有してもよい。当該マグネシウムイオンは、例えば塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）又は酢酸マグネシウムの形態で添加されてもよく、又は硫酸マグネシウムが使用される。
【０１０８】
ＰＣＲ試薬はまた、以下のうちの１つ以上を含有してもよい：
−非特異的ブロッキング剤、例えばＢＳＡ又はウシの皮膚由来のゼラチン、ベータラクトグロブリン、カゼイン、粉乳、又は他の普遍的なブロッキング剤、
−非特異的バックグラウンド／ブロッキング核酸（例えばサケの精子ＤＮＡ）、
−バイオプリザバティブ（例えばアジ化ナトリウム）
−ＰＣＲ増強剤（例えば、ベタイン、トレハロースなど）
−阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｅ阻害剤）。
【０１０９】
ＰＣＲ試薬はまた、他の添加剤、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ベタイン（一）水和物（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン＝[カロキシ−メチル]トリメチルアンモニウム）、トレハロース、７−デアザ−２’−デオキシグアノシン三リン酸塩（ｄＣ７ＧＴＰ又は７−デアザ−２’−ｄＧＴＰ）、ホルムアミド（メタンアミド）、塩化テトルメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、他のテトラアルキルアンモニウム誘導体（例えば、塩化テトラエチアンモニウム（ＴＥＡ−Ｃｌ）及び塩化テトラプロピルアンモニウム（ＴＰｒＡ−Ｃｌ））、非イオン性洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０））、又はＰＲＥＸＣＥＬ−Ｑを含有してもよい。
【０１１０】
ＰＣＲ試薬は緩衝剤を含有してもよい。
【０１１１】
一部の例において、非イオン性エチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマーが、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、又は１．０％の濃度で水層に添加される。普遍的な生物界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８、Ｔｅｔｒｏｎｉｃｓ、Ｚｏｎｙｌ  ＦＳＮが挙げられる。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８は、約０．５％  ｗ／ｖの濃度で存在することができる。
【０１１２】
一部の例において、硫酸マグネシウムが、類似した濃度で、塩化マグネシウムの代わりとなり得る。普遍的で、様々なベンダーから市販されている、広範囲なＰＣＲ緩衝剤を緩衝溶液の代わりとしてもよい。
【０１１３】
本発明方法はまた、核酸ポリメラーゼの使用を含み、本発明の部分キットもまた核酸ポリメラーゼを含む。当該核酸ポリメラーゼは、例えばＤＮＡポリメラーゼなどの任意の核酸ポリメラーゼであってもよい。核酸ポリメラーゼは、伸長温度で活性を有していなければならない。
【０１１４】
一部の実施形態において、核酸ポリメラーゼは、５’〜３’のエキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼである。これは特に、当該方法又はキットが、例えばＴａｑｍａｎ検出プローブなどの検出プローブの使用を含む場合の本発明の実施形態の場合であり得る。
【０１１５】
任意のＤＮＡポリメラーゼ、例えばプライマー伸長を触媒する５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。例えば、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。
【０１１６】
１つの実施形態において、核酸ポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼである。
【０１１７】
ＰＣＲ反応物の区分化
本発明方法は概して、区分化ＰＣＲ反応物を調製する工程を含有する。区分化ＰＣＲ反応物はその後、ＡＩＰＲ工程に供され、その後、本明細書に記載されるように１回以上のＰＣＲに供される。区分化ＰＣＲ反応物の調製は、サンプルを複数の小さな画分に分割することを含み、それら各々がプライマーセット、核酸ポリメラーゼ、ＰＣＲ試薬、及び任意で検出試薬を含有している。
【０１１８】
区分化ＰＣＲ反応物は、多くの異なる方法により調製されてもよい。概して、ＰＣＲ反応物を物質的に、及び空間的に分離された区画へと分割することを含む。当該区画は、多くの方法で得ることができ、例えばＰＣＲ反応物を異なる容器へと分割してもよい。区分化ＰＣＲ反応物はまた、ＰＣＲ反応物を、マイクロタイタープレートのウェルへと分割することにより調製されてもよい。区分化ＰＣＲ反応物はまた、ＰＣＲ反応物をマイクロウェル、マイクロ流体チャンバー、キャピラリー、エマルションの分散相、チャンバー（例えば、小型化チャンバーのアレイ中のチャンバー）、ドロップレット、又は核酸結合表面へと分割することにより調製されてもよい。区分化ＰＣＲ反応物はまた、ＰＣＲ反応物を固形支持体上の別個のスポット上に分割することにより調製されてもよい。
【０１１９】
ＰＣＲ反応物は、各区分化ＰＣＲ反応物が、標的核酸配列を含有する鋳型核酸を少数のみ含有するような方法で区分化されることが好ましい。通常、サンプルは無作為に区分化ＰＣＲ反応物へと分配されるため、一部の反応物が、他よりも標的核酸配列を含有する鋳型核酸を多く含有することが可能である。実際に、区分化ＰＣＲ反応物の一部は、標的核酸配列を含有する鋳型核酸を含有せず、一方で他ではいくつかのコピーを含有する場合もある。もし鋳型核酸のコピーが区分間で無作為に分配される場合、一部の区分はコピーを含有せず、他は１個のコピーのみを含有するはずであり、もし区分の数が充分に大きい場合、それでも他は２個のコピー、３個のコピー、さらに多くの数のコピーを含有するはずである。厳密に０個、１個、２個、３個、又はそれ以上のコピーが区分中に見出される確率は、その区分中の鋳型核酸の所与の平均濃度に応じて、ポワソン分布で表される。一部のサンプルは、標的配列を含有する鋳型核酸を含有せず、及びかかる実施形態においては、区分化ＰＣＲ反応物がいずれも標的配列を含有する鋳型核酸を含有しない。
【０１２０】
１つの実施形態において、区分化ＰＣＲ反応物は各々、標的核酸配列を含有する鋳型核酸を最大で１０個、例えば最大で５個、含有する。
【０１２１】
区分化ＰＣＲ反応物を調製するための、ある非常に有用な方法は、封入された反応ドロップレットを調製することによるものであり、この場合において各ドロップレットが区分化ＰＣＲ反応物を含有する。従って、区分化ＰＣＲ反応物は、各々、ドロップレット生成器を使用して調製されたドロップレット中に含有されてもよい。
【０１２２】
かかるドロップレットのサイズは変化し得るが、区分化ＰＣＲ反応物は各々、例えば１〜１０，０００ピコリットルの範囲の量、例えばおよそ１０００ピコリットルの量のドロップレット中に含有されてもよい。
【０１２３】
本明細書において使用されるドロップレットは、例えば、米国特許第７，６２２，２８０号に記載される、又は本明細書において以下の実施例に記載されるようなエマルション組成物（又は２つ以上の不混和流体の混合物）を含有することができる。ドロップレットは、ＷＯ／２０１０／０３６３５２に記載さされるデバイスにより生成することができる。エマルションという用語は、本明細書において使用される場合、不混和液体の混合物（例えば、水と油）を指し得る。油相及び／又は油中水型のエマルションにより、水性ドロップレット内の反応混合物の区画化が可能となる。エマルションは、連続的な油相内に水性ドロップレットを含有することができる。本明細書において提供されるエマルションは、水中油エマルションであってもよく、この場合においてドロップレットは、連続的な水相中の油ドロップレットである。本明細書において使用されるドロップレットは通常、区画間の混合を阻害するよう設計されており、各区画は、その内容物が蒸発しないよう、及び他の区画の内容物と融合しないよう、保護されている。
【０１２４】
約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００、又は５００ミクロンの平均直径、約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００、又は５００ミクロン未満の平均直径、又は約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００、又は５００ミクロン超の平均直径、又は少なくとも約０．００１、０．０１、０．０５、０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、３００、４００、又は５００ミクロンの平均直径を有するドロップレットが生成されてもよい。ドロップレットは、約０．００１〜約５００、約０．０１〜約５００、約０．１〜約５００、約０．１〜約１００、約０．０１〜約１００、又は約１〜約１００ミクロンの平均直径を有していてもよい。マイクロチャネル直交流集束、又は物理的攪拌を使用した、エマルションドロップレットのマイクロ流体的作製方法は、単分散エマルション又は多分散エマルションのいずれかを生成することが知られている。ドロップレットは単分散ドロップレットであってもよい。ドロップレットは、ドロップレットのサイズが、ドロップレットの平均サイズの±５％よりも大きく変化しないよう生成されてもよい。一部の例において、ドロップレットは、ドロップレットのサイズが、ドロップレットの平均サイズの±２％よりも大きく変化しないよう生成されてもよい。ドロップレット生成器は、単一サンプルからドロップレット群を生成することができ、この場合において、ドロップレットは、総ドロップレット群の平均サイズの約±０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、又は１０％よりも大きくサイズが変化しない。
【０１２５】
機械的安定性が高いと、マイクロ流体操作に有用であり、及び（例えば、マイクロ流体キャピラリーにおける、又は例えばバルブなど、流体経路における９０度の回転を通じた）高せん断流体処理に有用である。熱処理前、及び後のドロップレット又はカプセルは、標準的なピペット操作及び遠心に対し、機械的に安定であり得る。
【０１２６】
ドロップレットは、攪拌、ソニケーション、又はＴ−チャンネルジャンクションを通じた微小流体的に生成される、又は当分野の当業者による他の手段により生成される、多分散又は単分散であってもよい。
【０１２７】
ドロップレットは、水性サンプルを通して油相を流すことにより形成することができる。水相は、緩衝溶液、ならびにヌクレオチド、プライマー、蛍光検出用プローブ（複数含む）、鋳型核酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、及び任意で逆転写酵素をはじめとする、ＰＣＲ反応を実行するための試薬を含有してもよい。
【０１２８】
水相は概して、サンプル、ＰＣＲ試薬、核酸ポリメラーゼ、プライマーセット、及び任意で検出試薬を含有する。
【０１２９】
油相は、フッ素化基油を含有してもよく、例えばパーフルオロ化ポリエーテルなどのフッ素化界面活性剤と組み合わせることにより、さらに安定され得る。一部の例において、基油は、ＨＦＥ  ７５００、ＦＣ−４０、ＦＣ−４３、ＦＣ−７０、又は他の普遍的なフッ素化油のうちの１つ以上であってもよい。一部の例において、アニオン性界面活性剤は、アンモニウムＫｒｙｔｏｘ（Ｋｒｙｔｏｘ−ＡＭ）、Ｋｒｙｔｏｘ  ＦＳＨのアンモニウム塩、又はＫｒｙｔｏｘ−ＦＳＨのモルホリノ誘導体である。
【０１３０】
油相は、例えば蒸気圧、粘度、又は表面張力などの油の特性を調整するための添加剤をさらに含有することができる。非限定的な例としては、パーフルオロ−オクタノール、及び１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデカノールが挙げられる。
【０１３１】
エマルションは、高度に単分散化されたドロップレットを生成するよう構成されてもよく、当該ドロップレットは、加熱によって、固体様界面膜を有するマイクロカプセルへと転換され得る液体様界面膜を有しており、当該マイクロカプセルは、例えばＡＩＰＲ又はＰＣＲ増幅などの反応処理の間、その内容物を維持することができるバイオリアクターとして振る舞うことができる。マイクロカプセル型への転換は、加熱で発生し得る。例えば、転換は、約５０、６０、７０、８０、９０、又は９５℃よりも高い温度で発生し得る。一部の例において、この加熱はサーモサイクラーを使用して発生する。加熱プロセスの間、液体又は鉱物油の上覆いを使用して、蒸発を防ぐことができる。生体適合性があるカプセルは、広範な熱処理工程及び機械的工程にわたり、癒着及び／又は軟凝集に対して抵抗性であり得る。
【０１３２】
一部の例において、ドロップレットは、市販のドロップレット生成器、例えばＢｉｏ−Ｒａｄ  ＱＸ１００（商標）ドロップレット生成器などを使用して生成される。ＡＩＰＲ及びＰＣＲは、市販の装置を使用して実行してもよく、及びドロップレットは、市販のドロップレット読み取り機、例えば生成器、例えばＢｉｏ−Ｒａｄ  ＱＸ１００（商標）ドロップレット読み取り機を使用して解析されてもよい。
【０１３３】
非対称性漸増ポリメラーゼ反応
本発明方法は、非対称性漸増ポリメラーゼ反応（ＡＩＰＲ）の工程を含む。指数関数的ＰＣＲのいずれの工程よりも前にＡＩＰＲが行われることが重要である。従って、概して、工程ｅ）は、工程ｆ）の前に行われる。ＡＩＰＲは、以下の工程を含む：
ｉ）変性温度で区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによって、ＤＮＡを一本鎖分子へと変性させること、
ｉｉ）高いアニーリング温度で区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、プライマーＨをアニーリングさせるが、プライマーＬはアニーリングさせないこと、
ｉｉｉ）任意で、伸長温度で区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートすること、
ｉｖ）任意で、工程ｉ〜ｉｉｉを繰り返すこと。
【０１３４】
概して、ＡＩＰＲは、標的核酸配列の１つの鎖のみの増幅を生じさせる非対称性反応である。従って、ＰＣＲ反応物は、プライマーＨと共に標的核酸配列の増幅を行うことができる他のいずれのプライマーも含まないことが好ましく、この場合において、当該他のプライマーは、プライマーＨの融点と類似した融点、又はプライマーＨの融点よりも高い融点を有している。本発明の実施形態において、プライマーセットが複数のプライマーＨを含有している場合、ＰＣＲ反応物は、プライマーＨのいずれかと共に、標的核酸配列のいずれかの増幅を行うことができる他のプライマーをいずれも含まないことが好ましく、当該他のプライマーは、プライマーＨの融点と類似した融点、又はプライマーＨの融点よりも高い融点を有している。プライマーの好ましい融点は、「プライマーセット」及び「プライマーＬとプライマーＨ」の項に記載されている。従って、高いアニーリング温度では、プライマーＨのみがアニーリングし、その結果、プライマーＨからのみ重合が生じる。従って、複数ラウンドのＡＩＰＲを行うことによって、標的核酸配列の１つの鎖のみが増幅され、よって、ＡＩＰＲは原理的には線形増幅である。
【０１３５】
しばしば、核酸ポリメラーゼは、高いアニーリング温度で伸長活性を有している。かかる実施形態において、高いアニーリング温度は、たとえその高いアニーリング温度が核酸ポリメラーゼにとって最適な温度ではなかったとしても、伸長温度でもあるとみなされ得る。従って、ＡＩＰＲは、２つの工程のみを含有してもよく、それらが繰り返される。すなわち、変性温度でのインキュベーションによる変性工程と、高いアニーリング温度でのインキュベーションによる、プライマーＨのアニーリング及び伸長の混合工程である。当該実施形態において、プライマーＨは、核酸ポリメラーゼが、プライマーＨの伸長を触媒する活性を十分に有する温度で、融点を有するよう設計されることが好ましい。
【０１３６】
ゆえに、ＡＩＰＲの工程ｅ）は、以下の工程を含んでもよい：
ｉ．変性温度で区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによって、ＤＮＡを一本鎖分子へと変性させること、
ｉｉ．高いアニーリング温度で区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによってプライマーＨはアニーリングできるが、プライマーＬはアニーリングできず、この場合において当該高いアニーリング温度は、伸長温度でもあり、それによって、当該アニーリングされたプライマーＨの伸長が可能となること、
ｉｉｉ．工程ｉ〜ｉｉを繰り返すこと。
【０１３７】
本発明の他の実施形態において、プライマーＨの融点は、伸長温度とは異なっている。かかる実施形態において、ＡＩＰＲの工程ｅ）は、以下の工程を含んでもよい：
ｉ．変性温度で区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによって、ＤＮＡを一本鎖分子へと変性させること、
ｉｉ．高いアニーリング温度で区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによってプライマーＨはアニーリングできるが、プライマーＬはアニーリングできないこと、
ｉｉｉ．区分化ＰＣＲ反応物を伸長温度でインキュベートし、それによって、アニーリングされたプライマーＨの伸長を可能とすること、
ｉｉｉ．工程ｉ〜ｉｉｉを繰り返すこと。
【０１３８】
工程ｉの、変性温度での区分化ＰＣＲ反応物のインキュベートは、ＤＮＡを一本鎖分子に変性させるために充分な長さで行われる。工程ｉは、最初のＡＩＰＲのサイクルの間、後半のサイクルよりも長時間行われることが可能である。当業者であれば、変性温度でのインキュベーションに適した時間を選択することができる。最初のサイクルにおいて、変性温度でのインキュベーションは、例えば０．５〜１０分間（例えば、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼの場合）の範囲であってもよく、一方で、その後のサイクルでは、変性温度でのインキュベーションは例えば、０．１〜２分間の範囲であってもよい。
【０１３９】
同様に、当業者であれば、高いアニーリング温度／伸長温度でのインキュベーションに適した時間を選択することができる。最後のサイクルにおいて、伸長温度でのインキュベーションは、他のサイクルよりも長くてもよく、例えば０．５〜１０分間の範囲であってもよく、一方で、他のサイクルでは、伸長温度でのインキュベーションは、例えば０．１〜２分間の範囲であってもよい。上記に概略されるように、高いアニーリング温度は、伸長温度と同じであってもよい。高いアニーリング温度と伸長温度が異なっている実施形態においては、アニーリング温度でのインキュベーションは、例えば０．１〜２分間の範囲であってもよい。
【０１４０】
工程ｉ〜ｉｉは、適切な回数で繰り返されてもよい。概して、工程ｉ〜ｉｉは、偽陽性シグナルの発生が、非常に低いか、又は全く無いことを確実にするために充分に多い回数で繰り返される。例えば、工程ｉ〜ｉｉは、８〜２５６回の範囲で、好ましくは１６〜１２８回の範囲で、例えば３２〜１２８回の範囲で、例えばおよそ６４回、例えば６４回、繰り返されてもよい。
【０１４１】
本発明の実施形態において、高いアニーリング温度と伸長温度が異なる場合、工程ｉ〜ｉｉｉは、８〜２５６回の範囲で、好ましくは１６〜１２８の範囲で、例えば３２〜１２８回の範囲で、例えばおよそ６４回で、例えば６４回、繰り返されてもよい。
【０１４２】
ＡＩＰＲの間は、漸増複製のみが行われることが好ましい。言い換えると、ＡＩＰＲの間は、標的核酸の１つの鎖のみが、複製に対する鋳型として供されることが好ましい。もしプライマーＨが標的核酸配列に対し相補的な配列にアニーリングする場合、標的核酸配列を含有する鎖のみが、ＡＩＰＲの間に合成されることが好ましい。ＡＩＰＲは一方向性であるため、当該鎖は異なる長さを有していてもよいが、少なくとも標的核酸配列を含有していることが好ましい。この実施形態において、標的核酸配列に対し相補的な配列は、好ましくは、ＡＩＰＲ段階の間に合成されない。同様に、もしプライマーＨが標的核酸配列にアニーリングする場合、標的核酸配列に相補的な配列を含有する鎖のみがＡＩＰＲ段階の間に合成されることが好ましい。ＡＩＰＲは一方向性であるため、当該鎖は異なる長さを有していてもよいが、少なくとも標的核酸配列に対し相補的な配列を含有していることが好ましい。この実施形態において、標的核酸配列は好ましくはＡＩＰＲ段階の間に増幅されない。
【０１４３】
ゆえに、本発明の１つの実施形態において、工程ｅ）は、プライマーＨの伸長を生じさせるが、プライマーＬの検出可能な伸長は生じさせない。例えば工程ｅ）は、プライマーＨの伸長は生じさせてもよいが、プライマーＬの伸長は生じさせない。
【０１４４】
１つの実施形態において、工程ｅ）は、プライマーＨの伸長は生じさせるが、他のいずれのプライマーの検出可能な伸長は生じさせない。例えば、工程ｅ）は、プライマーＨの伸長は生じさせてもよいが、他のいずれのプライマーの伸長は生じさせない。
【０１４５】
プライマーＨのアニーリングは可能とするが、プライマーＬのアニーリングは可能とさせない高いアニーリング温度が選択される。従って、高いアニーリング温度は、プライマーＬの融点よりも著しく高くなるよう設定されることが好ましい。ゆえに、工程ｅ）の高いアニーリング温度は、プライマーＬの融点よりも少なくとも１０℃、好ましくは少なくとも１５℃、例えば少なくとも２０℃、例えば少なくとも２５℃高くてもよい。
【０１４６】
高いアニーリング温度は、例えば、大体プライマーＨの融点くらいで設定されることができる。しかしながら、多少低くてもよい。
【０１４７】
低い温度のＰＣＲ
本発明の一部の実施形態において、当該方法は、低い温度のＰＣＲの工程を含み、当該工程は、ＡＩＰＲの完了後、及び指数関数的ＰＣＲの前に行われる。
【０１４８】
かかる実施形態において、プライマーＬは典型的には、本明細書において上述されるミスマッチ改変プライマーＬである。
【０１４９】
これは特に、扱いにくい標的（例えば、ゲノム中の他の場所に、例えば偽遺伝子などの非常に相同な配列がある標的など）の場合であり得、このミスマッチ改変プライマーＬによって、真の標的に対し、より特異的な短いプライマーＬの使用が可能となり得る。
【０１５０】
低い温度のＰＣＲは、典型的には以下の工程を含む：
１）変性温度で区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによってＤＮＡを一本鎖分子に変性させること、
２）非常に低いアニーリング温度でＰＣＲをインキュベートし、それによって、プライマーＨと、プライマーＬの非ミスマッチ部分の両方のアニーリングを可能とさせること、
３）伸長温度でＰＣＲをインキュベートし、それによってすべてのアニーリングされたプライマーの伸長を可能とすること、
４）任意で、工程１）〜３）を繰り返し、それによってＰＣＲ産物を得ること。
【０１５１】
この工程によって、プライマーＬのミスマッチ部分を組み込んでいる産物の増幅が可能となる。充分な当該産物が利用可能になった時点で、通常の指数関数的異ＰＣＲを、例えば大体プライマーＬの融点くらいの低いアニーリング温度を使用して行ってもよい。
【０１５２】
概して、非常に低いアニーリング温度は、低いアニーリング温度よりも低い。典型的には、非常に低いアニーリング温度は、低いアニーリング温度よりも、少なくとも５℃、好ましくは少なくとも１０℃、より好ましくは少なくとも１５℃、例えば少なくとも２０℃低い。例えば、非常に低いアニーリング温度は、低いアニーリング温度よりも、５〜３０℃の範囲で低く、例えば非常に低いアニーリング温度は、低いアニーリング温度よりも２０〜２５℃の範囲で低くてもよい。ゆえに、非常に低いアニーリング温度は、プライマーＨの融点よりも、少なくとも２０℃低くてもよく、例えば少なくとも２５℃低くてもよく、例えば少なくとも３０℃低くてもよく、例えば少なくとも３５℃低くてもよい。
【０１５３】
典型的には、工程１）〜３）を、２回以上、例えば１〜４０回の範囲で繰り返してもよい。例えば、工程１）〜３）は、２〜１０回の範囲で、例えば４〜６回の範囲で繰り返される。しばしば、低い温度のＰＣＲの間、及び指数関数的ＰＣＲの間に行われるＰＣＲサイクルの総数は、２０〜４０回の範囲、例えば２０〜３０回の範囲であることが好ましい。ゆえに、工程Ｉ〜ＩＩＩの指数関数的ＰＣＲがどのくらい多くの回数で繰り返されるかに応じて、低い温度のＰＣＲの工程１）〜３）は、２０〜４０回の範囲、例えば２０〜３０回の範囲の総サイクル数に達するまで繰り返され得る。
【０１５４】
指数関数的ＰＣＲ
本発明方法は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を行う工程を含む。この工程とＡＩＰＲを区別するため、この工程は「指数関数的ＰＣＲ」とも呼称され得る。本発明方法において、ポリメラーゼ鎖反応は、ＡＩＰＲの後に行われる。指数関数的ＰＣＲは、概して、以下の工程を含む：
Ｉ．変性温度で区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、ＤＮＡを一本鎖分子に変性させること、
ＩＩ．低いアニーリング温度でＰＣＲをインキュベートし、それによって、プライマーＨとプライマーＬの両方のアニーリングを可能とすること、
ＩＩＩ．伸長温度でＰＣＲをインキュベートし、それによって、すべてのアニーリングされたプライマーの伸長を可能とすること、
ＩＶ．任意で工程Ｉ〜ＩＩＩを繰り返し、ＰＣＲ産物を得ること。
【０１５５】
低いアニーリング温度でのインキュベーションは、好ましくは、標的核酸配列の特異的増幅が可能なプライマー対の両方のアニーリングを可能とする。さらに、指数関数的ＰＣＲは、標的核酸配列の両鎖の増幅をもたらす。理論上、当該増幅は指数関数的であり、ゆえに、たとえ実際のところ完全には指数関数的ではない可能性があったとしても、「指数関数的ＰＣＲ」と呼称され得る。
【０１５６】
指数関数的ＰＣＲは、任意の方法、例えば当業者に公知のＰＣＲ実行のための従来的な任意の方法で行うことができる。
【０１５７】
工程Ｉの、変性温度での区分化ＰＣＲ反応物のインキュベートは、ＤＮＡを一本鎖分子に変性させるために充分な長さで行われる。最初のＰＣＲサイクルの間、工程Ｉは後半のサイクルよりも長時間行われることが可能である。当業者であれば、変性温度でのインキュベーションに適した時間を選択することができる。最初のサイクルにおいて、変性温度でのインキュベーションは、例えば０．５〜１０分の範囲であってもよく、一方でその後のサイクルでは、変性温度でのインキュベーションは例えば、０．１〜２分の範囲であってもよい。
【０１５８】
同様に、当業者であれば、低いアニーリング温度でのインキュベーションに適した時間を選択することができる。例えば低いアニーリング温度でのインキュベーションは、０．１〜２分の範囲であってもよい。
【０１５９】
同様に、当業者であれば、伸長温度でのインキュベーションに適した時間を選択することができる。最後のサイクルにおいて、伸長温度でのインキュベーションは、他のサイクルよりも長くてもよく、例えば０．５〜１０分の範囲であってもよく、一方で他のサイクルでは、伸長温度でのインキュベーションは例えば、０．１〜２分の範囲であってもよい。
【０１６０】
工程Ｉ〜ＩＩＩは、適切な回数を繰り返されてもよい。概して、工程Ｉ〜ＩＩＩは、偽陽性シグナルのリスクを低減させるために、多すぎる回数で繰り返されないことが好ましい。例えば、工程ｆ）は、工程Ｉ〜ＩＩＩを１５〜６０回の範囲で、好ましくは２０〜４０回の範囲で、例えば２０〜３０回の範囲で、例えば２５〜３０回の範囲で繰り返すことを含んでもよい。
【０１６１】
プライマーセットが、プライマーＨとプライマーＬに加え、追加のプライマーを含有する本発明の実施形態において、一部の実施形態においては当該追加のプライマーもまた、低いアニーリング温度で、その鋳型にアニーリングすることができる。
【０１６２】
ゆえに、本発明の１つの実施形態において、工程ｆ）は、プライマーＨとプライマーＬの伸長を生じさせる。本発明の他の実施形態において、工程ｆ）は、プライマーセットのすべてのプライマーの伸長を生じさせる。
【０１６３】
低いアニーリング温度は、プライマーＬが標的核酸配列にアニーリングすることができるように選択される。ゆえに、低いアニーリング温度は、例えば、大体プライマーＬの融点くらいで設定されてもよい。しかしながら、多少それより低くてもよい。
【０１６４】
指数関数的ＰＣＲに使用することができるＰＣＲ技術の例としては、限定されないが、定量的ＰＣＲ、定量的蛍光ＰＣＲ（ＱＦ−ＰＣＲ）、マルチプレックス蛍光ＰＣＲ（ＭＦ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、単一細胞ＰＣＲ、制限酵素断片長多型ＰＣＲ（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ／ＲＴ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ホットスタートＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕポロニー（ｐｏｌｏｎｙ）ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕローリングサークル増幅（ＲＣＡ：ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、ブリッジＰＣＲ、ピコタイターＰＣＲ、及びエマルションＰＣＲが挙げられる。
【０１６５】
検出
本発明方法は概して、ＰＣＲ産物が多様体配列、及び／又は標的核酸配列を含有しているか否かを、検出する工程を含有する。当該検出は、当業者に公知の任意の適切な方法で達成され得る。例えば、多くの有用な検出方法が先行技術として公知であり、それらを本発明に使用することができる。
【０１６６】
本発明の１つの実施形態において、当該検出は、区分化ＰＣＲ反応物が検出試薬を含有することを含む。当該検出試薬は、任意の検出可能な試薬であってもよく、例えば、検出用標識を含有する化合物であってもよく、この場合において当該検出用標識は例えば、色素、放射活性、フルオロフォア、重金属、又は任意の他の検出用標識であってもよい。
【０１６７】
しばしば、検出試薬は蛍光化合物を含有する。
【０１６８】
本発明の１つの実施形態において、検出試薬は、検出プローブを含有し、又はからなる。検出プローブは、好ましくは、ヌクレオチドのオリゴマー又はポリマーを含有し、又はからなり、それらは任意で例えば本明細書において上記の「プライマーセット」の項に記載されるヌクレオチドアナログのいずれかなどのヌクレオチドアナログを含有してもよい。しばしば、検出プローブは、ＤＮＡオリゴマーであってもよい。典型的には、検出プローブは、例えば共有結合により検出用標識に連結されている。検出用標識は、上述の検出用標識のいずれかであってもよいが、多くの場合、フルオロフォアである。プローブは、プライマーＨと標的核酸を特異的に増幅することができないことが好ましい。例えば、もしプライマーＨが標的配列の断片と同一な配列を有している場合、プローブ（複数含む）は、標的配列の他の断片に対して同一な配列を有していてもよい。もしプライマーＨが、標的配列の断片に対して相補的な配列を有している場合、プローブ（複数含む）は、標的配列の他の断片に対して相補的な配列を有していてもよい。
【０１６９】
検出プローブは、概して、標的核酸配列に特異的に結合することができる。例えば、検出プローブは、多様体配列を含有する標的核酸に特異的に結合することができてもよい。ゆえに、検出プローブは、標的核酸配列にアニーリングすることができてもよく、又は標的核酸配列に対し相補的な配列にアニーリングすることができてもよい。ゆえに、検出プローブは、標的核酸配列、又は標的核酸配列に相補的な配列の断片と同一な配列を含有してもよい。概して、検出プローブは、プライマーセットのうちのプライマーのいずれかの配列とは異なる配列を含有していることが好ましい。
【０１７０】
検出プローブ（複数含む）は、適切な融点を有するよう設計されている。１つの実施形態において、少なくとも１つの検出プローブの融点が、プライマーＨの融点よりも著しく低い。例えば、すべての検出プローブの融点が、プライマーＨの融点よりも著しく低い。ゆえに、少なくとも１つの検出プローブの融点は、プライマーＨの融点よりも、少なくとも１２℃低く、好ましくは少なくとも１４℃低く、さらにより好ましくは少なくとも１６℃低く、より好ましくは１８℃低く、例えば少なくとも２０℃低く、例えば１５〜２５℃の範囲で低く、例えば３０〜４０℃の範囲で低く、又はさらには最大で４５℃低くてもよい。例えば、すべての検出プローブの融点は、プライマーＨの融点よりも少なくとも１２℃低く、好ましくは少なくとも１４℃低く、さらにより好ましくは少なくとも１６℃低く、より好ましくは１８℃低く、例えば少なくとも２０℃低く、例えば１５〜４５℃の範囲で低くてもよい。しかしながら、高い融点のプローブを適用することもできる。
【０１７１】
検出プローブ（複数含む）の融点は、好ましくは、確実に検出プローブが特異的にアニーリングするよう充分に高いが、プライマーＨの融点よりも著しく低い。しばしば、検出プローブの融点は、プライマーＬの融点と類似していてもよい。たとえば、少なくとも１つの検出プローブの融点は、プライマーＬの融点±１０℃と同じであってもよく、例えばプライマーＬの融点±５℃と同じであってもよく、例えばプライマーＬの融点と大体同じであってもよい。他の実施形態において、プローブの融点は、プライマーＬの融点よりも高くてもよく、例えばプライマーＬの融点よりも１５〜２０℃高くてもよい。ゆえに検出プローブは、例えば３５〜６０℃の範囲の融点、例えば３５〜５５℃の範囲の融点、好ましくは４０〜５０℃の範囲の融点を有していてもよい。
【０１７２】
しばしば、検出プローブは、標的核酸配列の存在に応じて、異なる検出シグナルを生じさせることが好ましい。これは多くの異なる方法で達成し得る。
【０１７３】
１つの実施形態において、検出プローブは、少なくとも１つのフルオロフォア及び少なくとも１つのクエンチャーに連結されており、クエンチャーは、当該検出プローブがその標的に結合されていないときに、フルオロフォアのシグナルをクエンチすることができる。従って、当該フルオロフォアの蛍光は検出することができない。しかし、検出プローブが標的核酸配列／標的核酸配列に相補的な配列に結合した場合、それによってクエンチャーはフルオロフォアから充分に遠く離れ、クエンチが消え、フルオロフォアの蛍光が検出されるようになる。フルオロフォアからのクエンチャーの除去は様々な方法で行うことができる。例えば、ＰＣＲで、５’〜３’のエキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼの使用を採用してもよい。伸長が行われると、当該５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性により結合プローブがすべて分解され、それによって、クエンチャーからフルオロフォアが分離される。また、結合によって検出プローブの３Ｄ構造を変化させ、それによって、フルオロフォアからクエンチャーを分離させることも可能である。
【０１７４】
本発明の１つの実施形態において、各区分化ＰＣＲ反応物は、検出試薬を含有し、検出試薬は多様体検出プローブである。多様体検出プローブは、上述の検出プローブであり、多様体配列を含有する標的核酸配列に、多様体配列を含有しない標的核酸配列よりも著しく高いアフィニティーでハイブリダイズすることができる。
【０１７５】
本発明の１つの実施形態において、各区分化ＰＣＲ反応物は、検出試薬を含有し、検出試薬は野生型検出プローブである。野生型検出プローブは、上述の検出プローブであり、多様体配列を含有しない標的核酸配列にハイブリダイズすることができる。野生型検出プローブは、多様体配列を含有しない標的核酸配列に、多様体配列を含有する標的核酸配列よりも著しく高いアフィニティーでハイブリダイズすることができることが好ましい場合がある。標的核酸配列の存在の検出に関する実施形態において、各区分化ＰＣＲ反応物は、野生型検出プローブである検出試薬を含有してもよい。かかる実施形態において、区分化ＰＣＲ反応物は、１つのタイプの検出プローブのみを含有することで充分な場合がある。例えば、ＰＣＲ反応物は、唯一の検出プローブとして野生型検出プローブを含有してもよく、又はＰＣＲ反応物は、唯一の検出プローブとして多様体検出プローブを含有してもよい。
【０１７６】
本発明の１つの実施形態において、各区分化ＰＣＲ反応物は、多様体検出プローブと野生型検出プローブの両方を含有する。これは特に、標的核酸配列中の多様体配列の検出に関連する実施形態の場合であり得る。
【０１７７】
多様体検出プローブは、少なくとも１つのフルオロフォアと少なくとも１つのクエンチャーに連結されていてもよく、クエンチャーは、フルオロフォアの蛍光をクエンチすることができる。好ましくは、プローブが遊離状態で存在しているときに、クエンチャーがフルオロフォアの蛍光をクエンチすることができるような様式で、クエンチャーとフルオロフォアは多様体検出プローブに連結されている。ゆえに、しばしば、フルオロフォアとクエンチャーは、互いに充分に近くに位置付けられており、それによってクエンチャーがフルオロフォアの蛍光をクエンチすることができる。しばしば、フルオロフォアとクエンチャーは、多様体検出プローブの異なるヌクレオチドに連結されている。
【０１７８】
野生型検出プローブは、少なくとも１つのフルオロフォア、及び少なくとも１つのクエンチャーに連結されていてもよく、この場合においてクエンチャーは、フルオロフォアの蛍光をクエンチすることができる。好ましくは、プローブが遊離状態で存在しているときに、クエンチャーがフルオロフォアの蛍光をクエンチすることができるような様式で、クエンチャーとフルオロフォアは野生型検出プローブに連結されている。ゆえに、しばしば、フルオロフォアとクエンチャーは、互いに充分に近くに位置付けられており、それによってクエンチャーがフルオロフォアの蛍光をクエンチすることができる。しばしば、フルオロフォアとクエンチャーは、野生型検出プローブの異なるヌクレオチドに連結されている。
【０１７９】
多様体検出プローブと野生型検出プローブの両方を使用する本発明の実施形態において、多様体検出プローブは、野生型検出プローブとは異なるフルオロフォアに連結されていてもよい。特に、多様体検出プローブは、少なくとも１つのフルオロフォアに連結されていてもよく、当該フルオロフォアは蛍光を有しており、その蛍光は、野生型検出プローブに連結されている全てのフルオロフォアの蛍光から識別可能である。同様に、多様体野生型検出プローブは、少なくとも１つのフルオロフォアに連結されていてもよく、当該フルオロフォアは蛍光を有しており、その蛍光は、多様体検出プローブに連結されている全てのフルオロフォアの蛍光から識別可能である。
【０１８０】
本発明方法の工程ｇ）は、多様体検出プローブからの蛍光の検出を含んでもよい。ゆえに、工程ｇ）は、多様体検出プローブに連結されたフルオロフォアの蛍光を検出することを含んでもよい。これは例えば、本発明の以下の実施形態の場合にあり得る：
・多様体プローブが、少なくとも１つのフルオロフォア、及び当該フルオロフォアの蛍光をクエンチすることができる少なくとも１つのクエンチャーに連結されている；
・核酸ポリメラーゼが、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼである；及び／又は
・当該方法が、標的核酸配列中の多様体配列の存在を検出する方法である。
【０１８１】
同様に、本発明方法の工程ｇ）は、野生型検出プローブからの蛍光の検出を含んでもよい。ゆえに、工程ｇ）は、野生型検出プローブに連結されたフルオロフォアの蛍光を検出することを含んでもよい。これは例えば、本発明の以下の実施形態の場合にあり得る：
・野生型検出プローブが、少なくとも１つのフルオロフォア、及び当該フルオロフォアの蛍光をクエンチすることができる少なくとも１つのクエンチャーに連結されている；
・核酸ポリメラーゼが、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼである；及び／又は
・当該方法が、標的核酸配列の存在を検出する方法である。
【０１８２】
本発明の実施形態において、ＰＣＲが、ドロップレット中に含有されるＰＣＲ反応物へと区分化される場合、当該蛍光は例えば、ドロップレットサンプルに対する対応能力を有する検出器を使用して検出されてもよい。個々のドロップレットは、その検出器に入り、検出を受け、その後検出器を出る。例えば、フローサイトメトリー装置を、ドロップレットサンプルからの蛍光の検出における使用に適合させることができる。一部の例において、ドロップレットの動きを制御するポンプを備えたマイクロ流体装置を使用して、単一ファイルにおけるドロップレットからの蛍光を検出する。一部の例において、ドロップレットは二次元表面上に配置され、検出器がその表面に対して動き、単一のドロップレットを含有する各位置で蛍光を検出する。
【０１８３】
蛍光検出データの取得後、コンピューターを使用して、データを保存し、処理することができる。コンピューターで実行可能なロジックを使用して、バックグラウンド蛍光の差し引き、標的及び／又は基準配列の割り当て、及びデータの定量などの機能を実行することができる。コンピューターは、分子プロファイリングから得られた診断結果の提示、保存、検索、又は算出に有用であり得、ゲノム解析もしくは核酸発現解析からの生データの提示、保存、検索、又は算出に有用であり得、又は本明細書に記載される方法に有用な任意のサンプルもしくは患者情報の提示、保存、検索、又は算出に有用であり得る。
【０１８４】
検出シグナル（複数含む）は、野生型検出プローブにより発光された検出光に基づき作成されてもよく、任意で区分中の多様体検出プローブからの検出光に基づいて作成されてもよい。多様体検出プローブは、シグナルにより示される２個以上の特定の増幅反応のうち少なくとも１つが区分中に発生しているか否か、及び多様体配列の少なくとも１つのコピーが区分中に存在しているか否かを報告してもよい。プローブに対応するシグナルのレベル又は強度を解析し、特定の反応のうちの少なくとも１つが発生しているか否か、及び特定の標的のうちの１つの少なくとも１つのコピーが存在しているか否かを決定してもよい。シグナルのレベル又は強度は、標的核酸配列の存在が各区分中に有るか、又は無いかによって、区分間で異なっている場合がある。例えば、特定の標的に対し陽性の区分は、所与の閾値を超える及び／又は所与の範囲内のシグナルのレベル又は強度を生じさせ得る。区分を解析し、シグナルを任意の適切な時点（複数含む）を生成してもよい。例示的な時点としては、アッセイの最後（エンドポイントアッセイ）が挙げられ、これは反応が完了へと向かい、データがもはや変化しないときである。又はデータが充分であり、信頼可能に分離されている限りは、いくらか早い時点も挙げられる。概して、真の陽性シグナルが充分に高い強度を有するために必要とされる指数関数的ＰＣＲのサイクル数を行った後に、検出が行われることが好ましい場合がある。
【０１８５】
１つの態様において、単一の検出プローブを使用し標的配列の存在を検出する方法が本明細書に提供される。
【０１８６】
一部の例において、ＡＩＰＲ及び指数関数的ＰＣＲは、例えばｄｄＰＣＲなどのｄＰＣＲ設定で行われる。２つの別個のドロップレット群が検出可能であり、及びこれを計数して、多様体配列を含有しない標的核酸配列（図１Ｂを参照のこと）に対する、当該多様体配列を含有する標的核酸配列の濃度を決定することができる（図１Ａの概要を参照のこと）。
【０１８７】
本明細書において使用される場合、フルオロフォアとは、蛍光の発光を伴う化合物、例えば約３５０〜約９００ｎｍの最大蛍光発光を伴う化合物を意味し得る。広範なフルオロフォアを使用することができ、例えば５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセインとも呼称され、またスピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−（９Ｈ）キサンテン）−５−カルボン酸，３’,６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−６−カルボキシフルオロセインとも呼称される）；５−ヘキサクロロ−フルオロセイン；（［４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−（３’，６’−ジピバロイル−フルオレセイニル）−６−カルボン酸］）；６−ヘキサクロロ−フルオロセイン；（［４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−５−カルボン酸］）；５−テトラクロロ−フルオレセイン；（［４，７，２’，７’−テトラ−クロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−５−カルボン酸］）；６−テトラクロロ−フルオレセイン；（［４，７，２’，７’−テトラクロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−６−カルボン酸］）；５−ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン）；キサンチリウム，９−（２，４−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチル−アミノ）；６−ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）；９−（２，５−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）；ＥＤＡＮＳ（５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸）；１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ（５−（（（（２−ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸）；Ｃｙ５（インドジカルボシアニン−５）；Ｃｙ３（インド−ジカルボシアニン−３）；及びＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（２，６−ジブロモ−４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ｐｒ−オプリオン酸（ｏｐｒｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））；Ｑｕａｓａｒ（商標）−６７０色素（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）；Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ（商標）オレンジ色素（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）；Ｒｏｘ色素；Ｍａｘ色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ならびにそれらの適切な誘導体が挙げられる。
【０１８８】
本明細書において使用される場合、クエンチャーは、検出プローブに付着したとき、又は検出プローブに近接したときに、フルオロフォアの蛍光を低減させることができる化合物の分子、又は部分を意味し得る。クエンチは、蛍光共鳴エネルギー移動、光誘起性電子移動、項間交差の常磁性体増強、デクスター交換カップリング、及び例えば暗色複合体の形成などの励起子カップリングをはじめとする数種のメカニズムの内のいずれかにより発生することができる。クエンチャーの選択は、使用されるフルオロフォアに依存し得る。多くの市販のクエンチャーが当分野に公知であり、限定されないが、ＤＡＢＣＹＬ、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ（商標）Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、及びＢＨＱ−３）、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（商標）ＦＱ、及びＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（商標）ＲＱが挙げられる。これらはいわゆる、ダーククエンチャーである。これらは天然の蛍光を有しておらず、例えばＴＡＭＲＡなど、もともと蛍光性である他のクエンチャーで見られるバックグラウンドを除外することができる。
【０１８９】
特定のプローブに対する適切なレポーター−クエンチャーのペア選択に関する文献中で、非常に多くの実用的な指針が入手可能であり、例えば以下の文献に例示される：Clegg, Meth. Enzymol., 211: 353-388 (1992); Wo et al., Anal. Biochem., 218: 1-13 (1994); Pesce et al., editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970)など。この文献にはまた、レポーター−クエンチャーのペア選択に関する、蛍光性分子及び発色性分子、ならびにそれらの関連する光学特性の包括的なリストを提示する文献が含まれており、例えば、Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Colour and Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992) Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949)などが挙げられる。さらに、オリゴヌクレオチドに付着させることができる普遍的な反応基を介した共有結合に関する、レポーター分子及びクエンチャー分子の誘導体化に関する文献中に広範な指針があり、例えば以下の文献に例示される：Haugland (上記に引用); Ullmanら、米国特許第３，９９６，３４５号；Ｋｈａｎｎａら、米国特許第４，３５１，７６０号。
【０１９０】
検出可能な標識（例えばフルオロフォア）とクエンチャーの両方ともが、当分野に公知の方法を使用してプローブに付着させることができる。一部の例において、レポーター／クエンチャーのペアのうちの１つは、プローブの５’部分に付着され、もしプローブ配列が標的遺伝子座に対して相補的である場合には、標的遺伝子座に対し５’側に付着させ、ならびにその他のレポーター／クエンチャーのペアは、プローブの３’部分に付着させる。
【０１９１】
検出可能な標識とクエンチャーは、標準的なホスホラミダイト化学を介したオリゴヌクレオチド合成の間に付加することができる。それらはまた、オリゴ合成の間に適切な官能基を有するリンカーを導入することにより、合成後に付加することもできる。合成後に、検出可能な（例えばフルオロフォア）を、オリゴヌクレオチドの官能基にカップリングさせることができる。長い配列に対しては、効率的なクエンチングを可能とするために、フルオロフォアのすぐ３’側の配列と、クエンチャーのすぐ５’側 の配列を、互いに相補的に作成し、ヘアピンステム（例えば、分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ））の形成を可能とさせることができる。ゆえに、ＡＩＰＲ及び／又は指数関数的ＰＣＲのアニーリング段階の間に、増幅された標的配列に当該プローブをハイブリダイズさせ、それによって、クエンチャーから検出可能な標識（例えば、フルオロフォア）を物理的に遠ざけ、より強い蛍光が検出されるようにする。しかしながら、増幅された標的配列が無い場合、プローブはヘアピンを生成し、検出可能な（例えば、フルオロフォア）とクエンチャーは互いに近接したままとなり、反応物の蛍光は制限されたものとなる。これらの反応物において、プローブを開裂させるための、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは必要ではない。シグナルレポーター（例えば、フルオロフォア）とクエンチャーの適切な付加部位と、シグナルレポーター（例えば、フルオロフォア）とクエンチャーの間の距離は、当分野に公知である。
【０１９２】
一部の例において、検出プローブは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブである。
【０１９３】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ(Heid et. al, 1996)は、Ｔａｑポリメラーゼの蛍光性５’エキソヌクレアーゼ活性を使用し、ｃＤＮＡサンプル中の標的配列の量を測定することができる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、通常、５’塩基に、又は５’塩基の近くにフルオロフォアを含有することができ、クエンチャーは、３’塩基に、又は３’塩基の近くにあることができる。クエンチャーは、例えばＴＡＭＲＡなどの色素であってもよく、又は例えば４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）などの非蛍光分子であってもよい。Tyagi et al., Nature Biotechnology 16:49-53 (1998)を参照のこと。照射されたとき、励起された蛍光色素は、蛍光を発するのではなく、エネルギーをすぐ近くのクエンチ色素分子へと移す（これは、ＦＲＥＴ＝Ｆｏｒｓｔｅｒ又は蛍光共鳴エネルギー移動と呼ばれている）。ゆえに、プローブが反応していない間、フルオロフォアとクエンチャーを近接させることにより、すべての蛍光の発光を阻害することができる。ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）は、ＰＣＲ産物の内部領域にアニーリングするよう設計されることができる。ポリメラーゼが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが結合した鋳型を複製する場合、その５’エキソヌクレアーゼ活性は、プローブを開裂することができる。この開裂は、クエンチャーの活性を止めることができ（ＦＲＥＴではない）、及びレポーター色素は蛍光を発光しはじめ、その蛍光は、プローブ開裂率に比例し、各サイクルで増強され得る。ＰＣＲ産物の蓄積は、フルオロフォアの蛍光の増加をモニターすることにより検出することができる。検出プローブが標的核酸配列にハイブリダイズした場合に、開裂は発生することができるため、検出された蛍光は、特異的増幅に由来し得る。一部の例において、ハイブリダイゼーションと開裂のプロセスは、指数関数的ＰＣＲを阻害しない。一部の例において、蛍光性プローブは、５’末端にＧを有していない。レポーター色素に隣接するＡ及びＧは、開裂後でも、レポーターの蛍光をクエンチする場合がある。
一部の例において、検出プローブは、分子ビーコンである。分子ビーコン（ＭＢ）は、標的核酸（例えば、標的ＤＮＡ）の検出と定量を目的として設計されたオリゴヌクレオチドであり得る。ＭＢの５’末端と３’末端は、集合的に部分の対を含有しており、それらが、ＭＢに検出特性を寄与し得る。その末端のうちの１つはフルオロフォアに付加され、他方が当該フルオロフォアの蛍光発光をクエンチすることができるクエンチャー分子に付加され得る。例えば、フルオロフォア／クエンチャーの対は、例えばＥＤＡＮＳ又はフルオレセインなどのフルオロフォアを例えば５’末端に使用することができ、及び例えばＤａｂｃｙｌなどのクエンチャーを例えば３’末端に使用することができる。
【０１９４】
ＭＢが溶液中に遊離して存在している場合、すなわち、第二の核酸にハイブリダイズしていない場合、ＭＢのステムは、相補的な塩基対形成により安定化され得る。この自己相補的対形成は、ＭＢに「ヘアピンループ」構造を生じさせ、その中でフルオロフォアとクエンチ部分が互いに近接している。この構造中、蛍光部分は、フルオロフォアによりクエンチされ得る。
【０１９５】
分子ビーコンのループは、標的核酸配列の一部に対して相補的、又は同一であってもよく、それによって、ループが、標的中のその相補配列へハイブリダイゼーションし、ステムを強制的に解離させ、フルオロフォアとクエンチャーを互いに遠ざけさせる。距離を取ることによって、フルオロフォアのクエンチが消え、ＭＢの蛍光の増強が生じ得る。
【０１９６】
ＭＢの標準的な作製方法及び使用方法に関するさらなる詳細は、例えばLeone et al. (1995) “Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogenous real-time detection of RNA.” Nucleic Acids Res. 26:2150-2155; Tyagi and Kramer (1996) “Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization” Nature Biotechnology 14:303-308; Blok and Kramer (1997)、及び米国特許第６，５４８，２５４号などの文献中に確立されている。
【０１９７】
検出プローブはまた、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）プローブであってもよい。Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）プローブは、分子ビーコンに似た、ＦＲＥＴをベースとしたステムループ検出メカニズムを提供することができるが、ただしこのプローブは増幅プライマーとして役立つ付加セグメントもまた有している（例えば、Whitcombe et al. Nat. Biotechnol. 1999, August 17(8): 804-7;米国特許第６，３２６，１４５号などを参照のこと）。一部の例において、プローブは、Ｓｕｎｒｉｓｅ（商標）プローブであってもよい。Ｓｕｎｒｉｓｅ（商標）プローブは、ヘアピンプロープに付加されたプライマーを含有し得、当該プライマーは増幅の間に伸長される。この配置によって、５’末端のフルオロフォアから内部クエンチャー標識が分離され得る（Nazarenko et al., Nucl. Acids Res. 1997, 25: 2516-2521）。
【０１９８】
オリゴヌクレオチドプローブの３’末端ヌクレオチドは、ブロックされ、又は核酸ポリメラーゼによる伸長できないようにすることができる。かかるブロックは、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端炭素にレポーター分子又はクエンチャー分子をリンカー部分により付加することにより簡便に行うことができる。
【０１９９】
一部の例において、基準プローブが、区分化ＰＣＲ反応物中に含有されてもよい。基準プローブは、非特異的基準プローブ又は特異的基準プローブであってもよい。基準プローブは、基準遺伝子座にハイブリダイズしてもよい。
【０２００】
１つの実施形態において、本発明方法は、例えば多様体検出プローブ又は野生型検出プローブなどの１つの検出プローブと組み合わせて、プライマーＨ及びプライマーＬからなる単一プライマー対を使用することを含む。本発明の他の実施形態において、当該方法は、２つの検出プローブと組み合わせて、プライマーＨ及びプライマーＬからなる単一プライマー対を使用することを含み、この場合においてプローブは、多様体検出プローブと野生型検出プローブである。
【０２０１】
１つの実施形態において、検出は、検出試薬の補助により行われ、この場合において検出試薬は、色素である。色素は例えば特に、大溝結合剤（ｍａｊｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ）、小溝結合剤、挿入剤、又は外部結合剤などであってもよい。適切であり得る例示的な色素としては、発光性シアニン、フェナントリジン、アクリジン、インドール、イミダゾールなどが挙げられ、例えばＤＡＰＩ、ヘキスト（登録商標）３３２５８色素、アクリジンオレンジなどがある。適切であり得る例示的な挿入色素としては特に、エチジウムブロマイド、ヨウ化プロピジウム、ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）色素、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン色素、ＳＹＢＲ（登録商標）ゴールド色素、及び７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）が挙げられる。
【０２０２】
本明細書において使用される場合、「特定の変異を検出することができるプローブ」は、典型的には、当該変異を含有する標的配列、又はその相補配列の連続配列を含有するプローブである。
【０２０３】
臨床状態の存在を予測する方法
本発明方法は、多くの様々な応用を有し得る。事実、当該方法は、標的核酸配列の存在を検出することが望まれる、及び／又は多様体配列を含有する、もしくは含有しない標的核酸を識別することが望まれる、すべての応用に有用である。
【０２０４】
たとえば、当該方法は、非常に限られた材料で核酸の解析が行われることが多い法医学的応用に有用であり得る。当該方法は例えば、特定の多型の存在を決定するための、遺伝子材料のフィンガープリントの調製に有用であり得る。
【０２０５】
本発明方法の１つの非常に有用な応用は、個体における臨床状態の存在を予測する方法である。
【０２０６】
多くの臨床状態が、特定の標的核酸配列の存在に関連している。一部の臨床状態は、標的核酸中の多様体配列の存在により特徴づけられる。他の臨床状態は、マーカーと関連しており、例えば、多様体配列の存在が、臨床状態の指標である場合がある。
【０２０７】
ゆえに、１つの実施形態において、本発明は、個体における臨床状態の存在の予測方法に関連しており、当該臨床状態は、標的核酸配列中の多様体配列の存在に関連づけられており、当該方法は、以下の工程を含む：
ａ）鋳型核酸を含有する当該個体由来のサンプルを提供すること、
ｂ）本明細書に記載される標的核酸配列中の多様体配列の検出方法を実行すること、
ここで、当該標的核酸中の多様体配列の存在は、当該臨床状態の存在の指標である。
【０２０８】
多くの臨床状態が、１つ以上の多様体配列の存在と関連づけられている。ゆえに、臨床状態は、標的核酸配列中の多様体配列の存在に関連づけられた任意の臨床状態であってもよい。
【０２０９】
多様体配列は、バイオマーカーであってもよく、当該バイオマーカーは、例えば臨床状態の存在、臨床状態の進行のリスク、所与の治療に対する臨床状態の感受性、又は死亡リスクと関連している。ゆえに、多様体配列は、臨床状態に関連した予測と相関していてもよい。
【０２１０】
本発明の１つの実施形態において、臨床状態は癌である。当該癌は、任意の癌であってもよく、例えば乳癌、大腸癌、膵臓癌、胃癌、ＧＩＳＴ、肝細胞癌、肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、悪性黒色腫、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉腫、グリア芽腫、又は他の脳腫瘍、頭／頸部の癌、他の消化管の癌、及び胚細胞腫瘍、及び血液悪性腫瘍からなる群から選択される癌であってもよい。
【０２１１】
多様体配列は、当該癌に関連づけられていてもよい。例えば、多様体配列の存在は、当該癌の存在の指標であってもよい。しかしながら、当該個体が当該癌に罹患しているかどうかを決定するために、さらなる調査が必要となることが頻繁にある。
【０２１２】
以下の表は、癌に関連した変異の非限定的な例を提供するものであり、その存在は、本発明方法を用いて検出されることができる。しかしながら、当業者であれば、本発明方法を使用して検出されることができる、癌に関連した他の多くの変異を認知しているであろう。
【０２１３】
【表１】
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【０２１４】
上述の変異は、タンパク質レベルで示されている。最初の文字は、野生型アミノ酸を示し、数値は、アミノ酸の位置であり、最後の文字は、変異体に存在する置換アミノ酸である。ゆえに、例示の目的で、Ｈ１０４７Ｒは、アミノ酸番号１０４７のヒスチジンが、アルギニンに置換されていることを示す。アミノ酸に対するＩＵＰＡＣの一文字コード又は三文字コードが本明細書において使用されている。
【０２１５】
ゆえに本発明は、1つのプライマー対を含有する（使用する）方法及び部分キットに関する場合があり、ここで、
・プライマーＨは、配列番号６９、７０、７１又は７２の５０〜１００個のヌクレオチドの範囲の連続配列を含有し、プライマーＬは、配列番号６９、７０、７１又は７２に相補的な配列の１０〜２０個のヌクレオチドの範囲の連続配列を含有するか、又は
・プライマーＨは、配列番号６９、７０、７１又は７２に相補的な配列の５０〜１００個のヌクレオチドの範囲の連続配列を含有し、プライマーＬは、配列番号６９、７０、７１又は７２の１０〜２０個のヌクレオチドの範囲の連続配列を含有し、
ここで、プライマーＨとプライマーＬは共に、本明細書に言及される変異のいずれかをコードするヌクレオチドの少なくとも１つを含有する標的配列を増幅することができる。
【０２１６】
１つの実施形態において、本発明は、個体における臨床状態の存在の予測方法を提供するものであり、当該臨床状態は、標的核酸配列の存在に関連づけられており、当該方法は、以下の工程を含む：
ａ）鋳型核酸を含有する当該個体由来のサンプルを提供すること、
ｂ）本明細書に記載される標的核酸配列中の多様体配列の検出方法を実行すること、
ここで、当該標的核酸の存在は、当該臨床状態の存在の指標である。
【０２１７】
臨床状態は、感染性病原体による感染症であってもよく、この場合において、標的核酸は例えば、当該病原体のゲノム由来の核酸配列であってもよい。
【０２１８】
サンプルは、当該個体由来の任意のサンプルであってもよい。特に、サンプルは、鋳型核酸を含有するサンプルでなくてはならない。本発明の実施形態において、臨床状態が癌である場合、サンプルは、癌細胞由来のＤＮＡを含有することが好ましい。ゆえに、サンプルは、ＤＮＡを含有する癌細胞を含有してもよく、及び／又はサンプルは、癌細胞由来の遊離ＤＮＡを含有してもよい。
【０２１９】
サンプルは例えば、血液サンプル、生検、糞便サンプル、唾液サンプル、尿サンプル、膣液サンプル、腹水サンプル、脳脊髄液サンプル、及び組織滲出液サンプルからなる群から選択されてもよい。サンプルはまた、上述のいずれかの分画であってもよい。例えばサンプルは、血液サンプル、又は血漿サンプルもしくは血清サンプルなどその分画であってもよい。
【０２２０】
鋳型核酸は、サンプル中に含有される任意の核酸であってもよく、例えばゲノムＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。鋳型核酸はまた、サンプル中に存在するＲＮＡに基づいて調製されたｃＤＮＡであってもよい。
【０２２１】
１つの実施形態において、鋳型核酸は、セルフリーＤＮＡ、ヌクレオソームＤＮＡ、及び循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）からなる群から選択され、それらは、血液循環中、又は他の体液中に存在し得る。
【０２２２】
本発明に従うサンプルは、個体から抽出されることができ、及び本発明方法に使用されることができる。
【０２２３】
個体は、任意の動物であってもよく、例えばヒトをはじめとする哺乳類であってもよい。好ましい実施形態において、個体は、ヒトである。
【０２２４】
実施例
本発明は以下の実施例によりさらに解説されるが、それらは本発明に対する限定であるとみなされないものとする。
【０２２５】
項目
本発明は、以下の項目によりさらに規定され得る：
１．以下の工程を含有する、サンプル中の標的核酸配列中の多様体配列の存在の検出方法：
ａ）鋳型核酸を含有するサンプルを提供すること
ｂ）標的核酸配列の増幅を特異的に行うことができる、少なくとも１つのプライマー対を含有するプライマーセットを提供することであって、前記プライマーセットは少なくともプライマーＨとプライマーＬを含有しており、前記プライマーＨの融点は、前記プライマーＬの融点よりも少なくとも１０℃高く、前記プライマーＬは、プライマーＨの伸長産物断片に対し相補的な配列を含有していること
ｃ）伸長温度でポリメラーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを提供すること
ｄ）区分化ＰＣＲ反応物を調製することであって、各区分はサンプルの一部、プライマーセット、核酸ポリメラーゼ、ＰＣＲ試薬、及び任意で検出試薬を含有していること
ｅ）以下の工程を含有する、非対称性漸増ポリメラーゼ反応（ＡＩＰＲ）を行うこと：
ｉ．変性温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによって、ＤＮＡを一本鎖分子に変性させること
ｉｉ．高いアニーリング温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、プライマーＨはアニーリングできるが、プライマーＬはアニーリングできないようにすること
ｉｉｉ．任意で、伸長温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートすること
ｉｖ．任意で、工程ｉ〜工程ｉｉｉを繰り返すこと
ｆ）以下の工程を含む、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと：
Ｉ．変性温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートすることであって、それによって、ＤＮＡを一本鎖分子に変性させること
ＩＩ．低いアニーリング温度でＰＣＲをインキュベートし、それによって、プライマーＨとプライマーＬの両方のアニーリングを可能にさせること
ＩＩＩ．伸長温度でＰＣＲをインキュベートし、それによって、すべてのアニーリングされたプライマーの伸長を可能にさせること
ＩＶ．任意で、工程ＩＩ〜ＩＶを繰り返し、それによってＰＣＲ産物を得ること
ｇ）ＰＣＲ産物が、標的核酸配列中に多様体配列を含有しているか否かを検出すること。
２．工程ｅ）は、標的核酸配列のうちの１つの鎖のみを増幅させる、項目１に記載の方法。
３．工程ｆ）は、標的核酸配列の両方の鎖を増幅させ、ＰＣＲ産物を得る、項目１〜２のいずれかに記載の方法。
４．前記多様体配列が、一塩基変異である、項目１〜３のいずれか１つに記載の方法。
５．前記多様体配列が、一塩基多型（ＳＮＰ）である、項目１〜３のいずれか１つに記載の方法。
６．前記ＰＣＲ産物が、多様体配列を含有する標的核酸配列と、多様体配列を有しない標的核酸配列の両方を含有し得る、項目１〜５のいずれか１つに記載の方法。
７．以下の工程を含む、サンプル中の標的核酸配列の存在を検出する方法：
ａ）鋳型核酸を含有するサンプルを提供すること
ｂ）標的核酸配列の増幅を特異的に行うことができる、少なくとも１つのプライマー対を含有するプライマーセットを提供することであって、前記プライマーセットは少なくともプライマーＨとプライマーＬを含有しており、前記プライマーＨの融点は、前記プライマーＬの融点よりも少なくとも１０℃高く、前記プライマーＬは、プライマーＨの伸長産物に対し相補的な配列を含有していること
ｃ）伸長温度でポリメラーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを提供することであって、前記伸長温度は、プライマーＨの融点よりも高いこと
ｄ）区分化ＰＣＲ反応物を調製することであって、各区分はサンプルの一部、プライマーセット、核酸ポリメラーゼ、ＰＣＲ試薬、及び任意で検出試薬を含有していること
ｅ）以下の工程を含有する、非対称性漸増ポリメラーゼ反応（ＡＩＰＲ）を行うこと：
ｉ．変性温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによって、ＤＮＡを一本鎖分子に変性させること
ｉｉ．高いアニーリング温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、プライマーＨはアニーリングできるが、プライマーＬはアニーリングできないようにすること
ｉｉｉ．任意で、伸長温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートすること
ｉｖ．任意で、工程ｉ〜工程ｉｉｉを繰り返すこと
ｆ）以下の工程を含む、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと：
Ｉ．変性温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートすることであって、それによって、ＤＮＡを一本鎖分子に変性させること
ＩＩ．低いアニーリング温度でＰＣＲをインキュベートし、それによって、プライマーＨとプライマーＬの両方のアニーリングを可能にさせること
ＩＩＩ．伸長温度でＰＣＲをインキュベートし、それによって、すべてのアニーリングされたプライマーの伸長を可能にさせること
ＩＶ．任意で、工程ＩＩ〜ＩＶを繰り返し、それによってＰＣＲ産物を得ること
ｇ）ＰＣＲ産物が、標的核酸配列を含有しているか否かを検出すること。
８．前記工程ｅ）のＡＩＰＲが、以下の工程を含む、項目１〜７のいずれか１つに記載の方法：
ｉ．変性温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによって、ＤＮＡを一本鎖分子へと変性させること、
ｉｉ．高いアニーリング温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによってプライマーＨのアニーリングは可能にさせるが、プライマーＬのアニーリングは可能にさせず、この場合において前記高いアニーリング温度は、伸長温度でもあり、それによって、アニーリングされたプライマーＨの伸長が可能になること、
ｉｉｉ．工程ｉ〜ｉｉを繰り返すこと。
９．前記工程ｅ）のＡＩＰＲが、以下の工程を含む、項目１〜７のいずれか１つに記載の方法：
ｉ）変性温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによって、ＤＮＡを一本鎖分子へと変性させること、
ｉｉ）高いアニーリング温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、プライマーＨのアニーリングを可能にさせるが、プライマーＬのアニーリングは可能にさせないこと、
ｉｉｉ）伸長温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによって、アニーリングされたプライマーＨの伸長が可能になること、
ｉｖ）任意で、工程ｉ〜ｉｉｉを繰り返すこと。
１０．前記プライマーＨが、プライマーＬの融点よりも少なくとも１０℃高い融点を有する、プライマーセット中の唯一のプライマーである、項目１〜９のいずれか１つに記載の方法。
１１．前記プライマーセットが、プライマーＨとプライマーＬからなり、この場合において前記プライマーＨと前記プライマーＬは、標的核酸配列を特異的に増幅することができる、項目１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．前記プライマーＨが、標的核酸配列の５’末端の配列と同一であり、前記プライマーＬが、標的核酸配列の３’末端の相補配列と同一である、項目１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．前記工程ｅ）が、前記プライマーＨの伸長は生じさせるが、前記プライマーＬの検出可能な伸長は生じさせない、項目１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．前記工程ｅ）が、前記プライマーＨの伸長は生じさせるが、他のすべてのプライマーの検出可能な伸長は生じさせない、項目１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．前記プライマーＨの融点が、前記プライマーＬの融点よりも少なくとも１５℃高い、項目１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．前記プライマーＨの融点が、前記プライマーＬの融点よりも少なくとも１６℃高い、好ましくは少なくとも１８℃高い、例えば少なくとも２０℃高い、例えば１５〜５０℃の範囲で高い、例えば１５〜２５℃の範囲で高い、項目１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．前記プライマーＨの融点が、６０〜９０℃の範囲である、例えば６０〜８０℃の範囲である、好ましくは７０〜８５℃の範囲である、例えば７０〜８０℃の範囲である、項目１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．前記プライマーＬの融点が、３０〜５５℃の範囲である、例えば３５〜５５℃の範囲である、好ましくは４０〜５０℃の範囲である、項目１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．プライマーＨが、プライマーＨと共に標的核酸配列を増幅させることができるプライマーセット内の他のすべてのプライマーの融点よりも少なくとも１５℃高い融点を有している、項目１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．前記プライマーセットが、以下のプライマーをいずれも含有しない、項目１〜１９のいずれか１つに記載の方法：
ａ）プライマーＨの融点の、±１５℃の範囲、好ましくは±２０℃の範囲、例えば±２５℃の範囲にある融点を有するプライマー、及び
ｂ）プライマーＨと共に、標的核酸配列を特異的に増幅することができるプライマー対を構成することができるプライマー。
２１．前記プライマーセットが、２つ以上のプライマーＨと、プライマーＨのいずれかと共にプライマー対を形成する任意のプライマーを含有し、前記プライマーは、前記プライマー対のうちの前記プライマーＨの融点よりも少なくとも１５℃低い融点を有する、項目１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．プライマーＨが、例えば１つ以上のＬＮＡなど、１つ以上のヌクレオチドアナログを含有する、項目１〜２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．前記区分化ＰＣＲ反応物の各々が、標的核酸配列を含有する鋳型核酸を平均で最大で１０個、例えば最大で５個、含有する、項目１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．前記区分化ＰＣＲ反応物の各々が、ドロップレット生成機を使用して調製されたドロップレット中に含有される、項目１〜２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．前記区分化ＰＣＲ反応物の各々が、例えば１〜１０，０００ピコリットルの範囲の量、例えばおよそ１０００ピコリットルの量のドロップレット中に含有される、項目１〜２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．前記区分化ＰＣＲ反応物が、マイクロタイタープレート中に含有される、項目１〜２３のいずれか１つに記載の方法。
２７．工程ｅ）は、８〜２５６回の範囲で、好ましくは１６〜１２８回の範囲で、例えば３２〜１２８回の範囲で、例えばおよそ６４回、例えば６４回、工程ｉ〜ｉｉｉを繰り返すことを含む、項目１〜２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．工程ｅ）は、８〜２５６回の範囲で、好ましくは１６〜１２８回の範囲で、例えば３２〜１２８回の範囲で、例えばおよそ６４回、例えば６４回、工程ｉ〜ｉｉｉを繰り返すことを含む、項目９及び１０〜２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．工程ｅ）の高いアニーリング温度が、プライマーＬの融点よりも少なくとも１０℃高い、好ましくは少なくとも１５℃高い、例えば少なくとも２０℃高い、項目１〜２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．工程ｆ）が、１５〜６０回の範囲で、好ましくは２０〜４０回の範囲で、例えば２０〜３０回の範囲で、例えば２５〜３０回の範囲で工程Ｉ〜ＩＩＩを繰り返すことを含む、項目１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．プライマーＬが、ミスマッチ改変プライマーＬであり、前記方法が、工程ｅ）とｆ）の間に低い温度のＰＣＲの工程を含有する、項目１〜３０のいずれか１つに記載の方法であって、前記低い温度のＰＣＲが以下の工程を含む、前記方法：
Ｉ）変性温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによってＤＮＡを一本鎖分子に変性させること、
ＩＩ）非常に低いアニーリング温度でＰＣＲをインキュベートし、それによって、プライマーＨと、プライマーＬの非ミスマッチ部分の両方のアニーリングを可能にさせること、
ＩＩＩ）伸長温度でＰＣＲをインキュベートし、それによってすべてのアニーリングされたプライマーの伸長を可能にさせること、
ＩＶ）任意で、工程Ｉ〜ＩＩＩを繰り返し、それによってＰＣＲ産物を得ること。
３２．前記非常に低いアニーリング温度はが、低いアニーリング温度よりも少なくとも５℃低い、項目３１に記載の方法。
３３．前記非常に低いアニーリング温度は、低いアニーリング温度よりも少なくとも２０℃低い、項目３１〜３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．プライマーＬが、以下からなるオリゴヌクレオチドである、項目３１〜３３のいずれか１つに記載の方法：
・１〜１０個のヌクレオチドの５’配列、及び
・標的核酸配列の断片と同一、又は相補的な、７〜１５個のヌクレオチドの範囲の連続配列。
３５．前記区分化ＰＣＲ反応物が各々、検出試薬を含有し、前記検出試薬が、多様体検出プローブであり、前記多様体検出プローブが、多様体配列を含有しない標的核酸配列よりも有意に高いアフィニティーで、多様体配列を含有する標的核酸配列にハイブリダイズすることができる、項目１〜３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．前記区分化ＰＣＲ反応物が各々、検出試薬を含有し、前記検出試薬が、野生型検出プローブであり、前記野生型検出プローブが、多様体配列を含有しない標的核酸配列にハイブリダイズすることができる、項目１〜３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．各区分化ＰＣＲ反応物が、多様体検出プローブと野生型検出プローブを含有する、項目３５〜３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．前記多様体検出プローブが、フルオロフォアとクエンチャーに連結されており、この場合において前記クエンチャーが、前記フルオロフォアの蛍光をクエンチすることができ、及び前記フルオロフォアとクエンチャーが、前記プローブの異なるヌクレオチドに連結されている、項目３５〜３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．前記野生型検出プローブが、フルオロフォアとクエンチャーに連結されており、この場合において前記クエンチャーが、前記フルオロフォアの蛍光をクエンチすることができ、及び前記フルオロフォアとクエンチャーが、前記プローブの異なるヌクレオチドに連結されている、項目３６〜３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．前記多様体検出プローブが、野生型検出プローブとは異なるフルオロフォアに連結されている、項目３７〜３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．工程ｇ）が、多様体検出プローブに連結されたフルオロフォアの蛍光を検出することを含む、項目３５〜４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．前記プライマーＨが、表３に列挙されるプライマーＨからなる群から選択される、項目１〜４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．前記プライマーＬが、表３に列挙されるプライマーＬからなる群から選択される、項目１〜４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．前記多様体検出プローブが、表３に列挙されるＰｒｏｂｅ−ＭＵＴからなる群から選択される、項目３５〜４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．前記野生型検出プローブが、表３に列挙されるＰｒｏｂｅ−ＷＴからなる群から選択される、項目３６〜４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．個体における臨床状態の存在を予測する方法であって、前記臨床状態が、標的核酸配列中の多様体配列の存在に関連づけられており、前記方法が、以下の工程を含む、前記方法：
・鋳型核酸を含有する前記個体由来のサンプルを提供すること、
・項目１〜４５のいずれか１つに記載の方法を実行することであって、
前記標的核酸中の前記多様体配列の存在が、前記臨床状態の存在の指標であること。
４７．前記臨床状態が、癌である、項目４６に記載の方法。
４８．前記変異が、癌に関連した変異である、項目４６に記載の方法。
４９．前記サンプルが、血液サンプル又はその分画であり、前記鋳型核酸が、セルフリーＤＮＡ、ヌクレオソームＤＮＡ、及び循環腫瘍ＤＮＡからなる群から選択される、項目４５〜４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．前記サンプルが、唾液サンプル、尿サンプル、膣液サンプル、腹水サンプル、脳脊髄液サンプル、及び組織滲出液サンプルからなる群から選択される、項目４５〜４９のいずれか１つに記載の方法。
５１．前記変異が、以下からなる群から選択される、項目４５〜５０のいずれか１つに記載の方法：
Ａ．例えば変異Ｈ１０４７Ｒ又は変異Ｅ５４２Ｋ又は変異Ｅ５４５Ｋのうちのいずれか１つなどの、ＰＩＫ３ＣＡにおける変異、
Ｂ．例えばＶ６００ＥなどのＢＲＡＦ変異、
Ｃ．例えば変異Ｇ１２Ｄ、変異Ｇ１２Ｖ、変異Ｇ１２Ｃ、又は変異Ｇ１３Ｄのうちのいずれか１つなどのＫＲＡＳ変異、及び
Ｄ．変異Ｌ８５８Ｒ、又は変異Ｔ７９０Ｍのうちのいずれか１つなどのＥＧＦＲ変異。
５２．前記変異が、表３に列挙される変異からなる群から選択される、項目４５〜５０のいずれか１つに記載の方法。
５３．個体における臨床状態の存在を予測する方法であって、前記臨床状態が、標的核酸配列の存在に関連づけられており、前記方法が、以下の工程を含む、前記方法：
・鋳型核酸を含有する前記個体由来のサンプルを提供すること、
・項目７〜４５のいずれか１つに記載の方法を実行することであって、
前記標的核酸の存在が、前記臨床状態の存在の指標であること。
５４．前記臨床状態が、感染性病原体による感染症である、項目５３に記載の方法。
５５．前記標的核酸が、前記病原体のゲノム由来の核酸配列である、項目５４に記載の方法。
５６．以下を含有する部分キット：
・標的核酸配列を特異的に増幅することができる少なくとも１つのプライマー対を含有するプライマーセットであって、前記プライマーセットは、少なくともプライマーＨとプライマーＬを含有し、前記プライマーＨの融点は、前記プライマーＬの融点よりも少なくとも１０℃高く、プライマーＬは、プライマーＨの伸長産物に対して相補的な配列を含有する、前記プライマーセット、
・標的核酸配列にハイブリダイズすることができる検出プローブであって、前記プローブは、少なくとも１つのフルオロフォアと少なくとも１つのクエンチャーに連結されている、前記検出プローブ、
・核酸ポリメラーゼ
・ＰＣＲ試薬
・区分化ＰＣＲ反応物を含有するドロップレットを調製するための試薬。
５７．前記プライマーセットが、項目１０〜２２のいずれか１つに規定されるプライマーセットである、項目５６に記載の部分キット。
５８．前記プライマーＨが、項目１０〜２２のいずれか１つに規定されるプライマーＨである、項目５６〜５７のいずれか１項に記載の部分キット。
５９．前記プライマーＬが、項目１０〜２２のいずれか１つに規定されるプライマーＬである、項目５６〜５８のいずれか１項に記載の部分キット。
６０．前記検出プローブが、項目３５〜４５のいずれか１つに規定されるプローブである、項目５６〜５９のいずれか１項に記載の部分キット。
６１．前記プライマーＨが、表３に列挙されるプライマーＨからなる群から選択される、項目５６〜６０のいずれか１項に記載の部分キット。
６２．前記プライマーＬが、表３に列挙されるプライマーＬからなる群から選択される、項目５６〜６１のいずれか１項に記載の部分キット。
６３．前記多様体検出プローブが、表３に列挙されるＰｒｏｂｅ−ＭＵＴからなる群から選択される、項目５６〜６２のいずれか１つに記載の部分キット。
６４．前記野生型検出プローブが、表３に列挙されるＰｒｏｂｅ−ＷＴからなる群から選択される、項目５６〜６３のいずれか１つに記載の部分キット。
６５．項目５６〜６０のいずれか１項に記載の部分キットであって、
・前記プライマーＨが、配列番号６９の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号６９の相補配列の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有するか、又は
・前記プライマーＨが、配列番号６９の相補配列の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号６９の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、
この場合においてプライマーＨとプライマーＬはともに、配列番号６９のヌクレオチド３１４０、１６２４、又は１６３３の内の少なくとも１つを含有する標的配列を増幅することができる、前記部分キット。
６６．前記部分キットが、以下を検出することができるプローブを含有する、項目６５に記載の部分キット：
・配列番号６９のヌクレオチド３１４０のＡからＧへの変異、
・配列番号６９のヌクレオチド１６２４のＧからＡへの変異、及び／又は
・配列番号６９のヌクレオチド１６３３のＧからＡへの変異。
６７．
・前記プライマーＨが、配列番号７０の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号７０の相補配列の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有するか、又は
・前記プライマーＨが、配列番号７０の相補配列の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号７０の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、
この場合においてプライマーＨとプライマーＬはともに、配列番号７０のヌクレオチド１７９９を含有する標的配列を増幅することができる、項目５６〜６０のいずれか１項に記載の部分キット。
６８．前記部分キットが、配列番号７０のヌクレオチド１７９９のＴからＡへの変異を検出することができるプローブを含有する、項目６７に記載の部分キット。
６９．
・前記プライマーＨが、配列番号７１の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号７１の相補配列の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有するか、又は
・前記プライマーＨが、配列番号７１の相補配列の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号７１の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、
この場合においてプライマーＨとプライマーＬはともに、配列番号７１のヌクレオチド２５７３又は２３６９の内の少なくとも１つを含有する標的配列を増幅することができる、項目５６〜６０のいずれか１項に記載の部分キット。
７０．前記部分キットが、以下を検出することができるプローブを含有する、項目６９に記載の部分キット：
・配列番号７１のヌクレオチド２５７３のＴからＧへの変異、及び／又は
・配列番号７１のヌクレオチド２３６９のＣからＴへの変異。
７１．
・前記プライマーＨが、配列番号７２の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号７２の相補配列の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有するか、又は
・前記プライマーＨが、配列番号７２の相補配列の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号７２の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、
この場合においてプライマーＨとプライマーＬはともに、配列番号７２のヌクレオチド３４、３５、又は３８の内の少なくとも１つを含有する標的配列を増幅することができる、項目５６〜６０のいずれか１項に記載の部分キット。
７２．前記部分キットが、以下を検出することができるプローブを含有する、項目７１に記載の部分キット：
・配列番号７２のヌクレオチド３８のＧからＡへの変異、
・配列番号７２のヌクレオチド３４のＧからＴへの変異、
・配列番号７２のヌクレオチド３４のＧからＣへの変異、
・配列番号７２のヌクレオチド３４のＧからＡへの変異、
・配列番号７２のヌクレオチド３５のＧからＴへの変異、
・配列番号７２のヌクレオチド３５のＧからＣへの変異、及び／又は
・配列番号７２のヌクレオチド３５のＧからＡへの変異。
７３．プライマーＨが、５０〜１００個のヌクレオチドの範囲の前記連続配列からなり、この場合において２０個以下、例えば１５個以下、例えば１０個以下のヌクレオチドが、例えばＬＮＡなどのヌクレオチドアナログで置換され得る、項目６５〜７３のいずれか１項に記載の部分キット。
７４．プライマーＨが、前記配列番号の５０〜１００個のヌクレオチドの範囲、例えば５０〜７５個のヌクレオチドの範囲の連続配列からなる、項目６５〜７３のいずれか１項に記載の部分キット。
７５．プライマーＬが、１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの前記連続配列と、１０個以下の追加ヌクレオチドからなる、項目６５〜７４のいずれか１項に記載の部分キット。
７６．前記方法が、項目５５〜７５のいずれか１項に記載の部分キットを使用して行われる、項目１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【実施例】
【０２２６】
本発明は以下の実施例によりさらに解説されるが、それらは本発明に対する限定であるとみなされないものとする。
【０２２７】
実施例１
ＩＢＳＡＦＥ（前に漸増性、後対称性、忠実性増強（Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｂｅｆｏｒｅ，  Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ａｆｔｅｒ，  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ））方法
ＩＢＳＡＦＥ法は、任意の潜在的なＤＮＡポリメラーゼエラーの結果を信頼可能に減少させる革新的な方法であり、真の陽性反応が、偽陽性反応と比べて優位な一貫したシグナルを有している。
【０２２８】
本実施例は、標的特異的なプライマー対と、多様体（例えば変異体）と野生型の配列（対立遺伝子）を識別する蛍光プローブを使用した、ドロップレットデジタルＰＣＲ設定内のＩＢＳＡＦＥ法を記載する。しかし当該方法の原理は、多くの異なるポリメラーゼベースの系にも適用され得る。
【０２２９】
本実施例は、野生型ＤＮＡと変異型ＤＮＡの両方を含有している可能性のあるサンプル中の一塩基変異の検出方法を記載する。
【０２３０】
試験的なアッセイのために、高いＴｍのプライマー（プライマーＨ）を、約６０ｂｐの長さで設計し、約７２℃以上のアニーリング温度で比較的効率的に操作されることを検証した。プローブは、約１３〜１６ｂｐの長さで多様体塩基を覆うよう設計され、Ｔｍを最大化するよう試みながら、中間にバランスを保って多様体塩基を中心に位置づけた。低いＴｍのプライマー（プライマーＬ）は、可能な限り短くなるよう設計され、適切な配列特異性と、フルオロフォアに関わらず充分な質の蛍光シグナルを達成させながら、実行可能な最も低いＴｍ（典型的には＜４８℃）を有するよう設計される。蛍光標識され、クエンチされたプローブは、典型的にはＦＡＭであり、これを変異対立遺伝子に使用し、ＨＥＸを野生型に使用した。しかし、任意のフルオロフォアを使用することもできる。プローブの長さとＴｍは、プライマーＬと同じか、ある程度高くすることができる。使用されるＡＩＰＲサイクルの数も変えることができるが、典型的には６４回であり得、対称性ＰＣＲのサイクル数も変えることができるが、典型的には２７回であり得る。多数回のサーマルサイクルを行うと、ポリメラーゼは高温の総時間数に応じて活性を失うため、本実施例では、各変性工程は１０秒間行うことを選択した（典型的なサーマルサイクルプログラムに関する表１を参照のこと）。
【０２３１】
有用なアッセイ設計例を図２に示す。図２は、癌遺伝子ＰＩＫ３ＣＡ中のＨ１０４７Ｒ及びＥ５４２Ｋと名付けられた２つの変異を検出するための、プライマーＨ及びプライマーＬ、ならびに変異検出プローブ（ＭＵＴプローブ）及び野生型検出プローブ（ＷＴプローブ）を示す。
【０２３２】
先行技術のアッセイと比較した、ＩＢＳＡＦＥの典型的な結果を図３に示す。より具体的には、図３は、表１に概要されるサーマルサイクル条件、図２に示されるプライマー及びプローブを使用したドロップレットデジタルＰＣＲとして行われたＩＢＳＡＦＥアッセイの、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社の市販アッセイ（ＰｒｉｍｅＰＣＲ（商標）  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ＰＩＫ３ＣＡ  ｐ．Ｈ１０４７Ｒ、ヒト、カタログ番号１００−３１２４６、及びＰｒｉｍｅＰＣＲ（商標）  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ＰＩＫ３ＣＡ  ＷＴ、ｐ．Ｈ１０４７Ｒ用、ヒト、カタログ番号  １００−３１２４９）（以下、市販アッセイと呼称される）の、メーカーの標準的なプロトコールに従った実行）と比較した結果を示す。
【０２３３】
市販のアッセイ及びＩＢＳＡＦＥアッセイの両方に対し、デジタルドロップレットＰＣＲは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社のＱＸ１００  ドロップレット生成機（カタログ番号  １８６−３００２）及びＱＸ１００ドロップレット読み取り機（カタログ番号  １８６−３００１）及びＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（カタログ番号  １８６−３００３）を含む機器を使用して行われた。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社の市販アッセイに対しては、メーカーのプロトコールに従った。ＩＢＳＡＦＥアッセイは、本明細書の方法に従い行われた。
【０２３４】
図６は、予測される変異対立遺伝子頻度に対し、測定された変異対立遺伝子頻度を示す。実験は原則として、図３に関し上記に記載されるように行われたが、図中に示されるように、異なる比率の野生型ＤＮＡと変異型ＤＮＡの混合物を含有する鋳型を使用して行われた点は除く。ＩＢＳＡＦＥ法を使用した場合、陰性対照において偽陽性の変異配列は検出されなかった一方で、市販のアッセイの陰性対照は、０．０１％の予測変異対立遺伝子頻度を有するサンプルと同量の変異（偽陽性）を示した。ゆえに、ＩＢＳＡＦＥ法を使用した場合、すべての検証濃度の変異鋳型で予測変異対立遺伝子頻度が得られた一方で、市販のアッセイでは、変異ＤＮＡを含有しないサンプル、０．００１％の変異ＤＮＡを含有するサンプル、及び０．０１％の変異ＤＮＡサンプルを含有するサンプルに対して、同じ頻度の変異対立遺伝子が計測された。従って、ＩＢＳＡＦＥ法は、たった０．００１％の変異ＤＮＡしか含有していないサンプルであっても、予測％の変異対立遺伝子が検出される（図６の下のパネルを参照）。
【０２３５】
【表２】
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【０２３６】
図４は、癌遺伝子ＰＩＫ３ＣＡ中のＨ１０４７Ｒと名付けられた変異の検出を目的とした、２つの異なるプライマーＨ、プライマーＬ、ならびに変異検出プローブ（ＭＵＴプローブ）及び野生型検出プローブ（ＷＴプローブ）を示す。
【０２３７】
異なる反応方法で図４に示されるプライマーとプローブを使用した結果を図５に示す。より具体的には、図４に示される、ベータ１又はベータ２のプライマーＨを、プライマーＬならびに変異特異的プローブ及び野生型特異的プローブと共に含む区分化反応物において、変異陽性ＤＮＡ鋳型（示されず。全てのアッセイが変異を検出した）、及びＡＩＰＲを伴わない（Ａ）、低い温度（６７℃）のＡＩＰＲを伴う（Ｂ）、及び高い温度（７４℃）のＡＩＰＲを伴う（Ｃ）、野生型鋳型を用いて、行われた。偽陽性シグナルの有意な低下がＣにおいて得られている。
【０２３８】
デジタルドロップレットＰＣＲ及びＩＢＳＡＦＥは、図５に概要があるサーマルサイクル条件を使用し、上述のように行われた。
【０２３９】
広範な異なるプライマーを使用した、類似したＩＢＳＡＦＥ反応も行われた。図５Ｄに、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４２Ｋ変異の検出アッセイにおいて、変異特異的シグナルがあり、偽陽性シグナルが無かったことを示す。以下のプライマー及びプローブを使用した。
【０２４０】
【表３】
2018523970.tif 000005
【０２４１】
図５Ｅは、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｅ５４５Ｋ変異の検出アッセイにおいて、変異特異的シグナルがあり、偽陽性シグナルが無かったことを示す。以下のプライマー及びプローブを使用した。
【０２４２】
【表４】
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【０２４３】
図５Ｄ及び図５Ｅに使用されたプライマーＨは、いくつかのＬＮＡ塩基を含有し、それらによって、高い融点が生じ、プライマーＨとプライマーＬの間に大きなＴｍの差が得られ、その結果、ＡＩＰＲ段階は、一本鎖鋳型を複製する純粋な非対称（一方向）となった。示されるように、偽陽性は検出されなかった。
【０２４４】
図５Ｆは、ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｒ変異の検出アッセイにおいて、変異特異的シグナルがあり、偽陽性シグナルが無かったことを示す。以下のプライマー及びプローブを使用した。
【０２４５】
【表５】
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【０２４６】
表２において、標準的なＰＣＲに対する、ＩＢＳＡＦＥ  ＡＩＰＲ及び対称性ＰＣＲの、１サイクル当たりの変異対立遺伝子のコピー数が、１００％の効率と仮定した理論計算を示す。示されるように、１サイクルで偽陽性多様体が導入される最悪の状況で、ＩＢＳＡＦＥ法を使用したシグナル検出は、２７サイクル後の典型的な時点で、真の陽性反応と比較し、およそ２％の存在度で偽核酸の生成をもたらした。逆に、標準的なＰＣＲアッセイにおいては、偽陽性核酸は、原則的にいずれのサイクルでも（典型的には検出は４０サイクルで行われている）真の陽性のおよそ２５％もの存在度であり得、著しい偽陽性シグナルが発生している。
【０２４７】
表２．変異対立遺伝子複製に関する理論計算
【表６】
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【０２４８】
当業者であれば、本明細書に記載されるＩＢＳＡＦＥ法に従う、他の変異の検出に有用なプライマー及びプローブを設計することができる。表３に、多くの異なる変異の検出に有用なプライマーＨ、プライマーＬ、及び検出プローブの非限定的な例を要約する。
【０２４９】
表３に概要される各変異は、本明細書に記載されるようにＩＢＳＡＦＥを行うことにより検出されることができ、この場合において、ＩＢＳＡＦＥ反応は、表３において特定の変異用にと示されているプライマーＨ、プライマーＬ、プローブＷＴ、及びプローブＭＵＴを含有する。ＩＢＳＡＦＥ法は、原則として本実施例に記載されるように行われることができ、例えば、表１に概要されるサーマルサイクル条件を使用して行われることができる。高いアニーリング温度及び低いアニーリング温度は、表３に示されるＴｍに従い設定されることができる。
【０２５０】
表３
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【０２５１】
実施例２
低い温度のＰＣＲの追加工程も使用した点を除き、原則として実施例１に記載されるようにＩＢＳＡＦＥ法が行われた。ＩＢＳＡＦＥ法の本実施例において、プライマーＬに対しミスマッチ配列が使用される。これによって、ＡＩＰＲ段階の間、プライマーＨとプライマーＬの間の融点の効果的な差異にさらなる乖離が生じる。
【０２５２】
本実施例に使用されたアッセイ設計を図７Ａに示し、当該設計はプライマーＨ、野生型検出プローブ（ＷＴプローブ）、及び多様体検出プローブ（ＭＵＴプローブ）を含んでいる。さらにこのアッセイは、４個のミスマッチヌクレオチドを含有するプライマーＬの使用を含んでいる。本実施例で使用される方法は、ＡＩＰＲ工程、低温ＰＣＲ工程、次いで指数関数的ＰＣＲを含有する。使用された正確なサーモサイクルプログラムを図７Ｂに示す。
【０２５３】
本実施例は、ＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ変異に対するＩＢＳＡＦＥアッセイである。４塩基のミスマッチ配列が、プライマーＬの５’末端に含まれ、標的に相補的なプライマー配列は短い。ゆえに、プライマーＬは非常に低い融点を有し、ＡＩＰＲ段階の間の高いアニーリング温度ではアニーリングしない（本実施例では７３℃）。対称性段階では、使用されるアニーリング温度は非常に低い（本実施例では３０℃）。数サイクル後（本実施例では５サイクル）、プライマーＬの全長に対し相補的な配列が、合成産物内に組み込まれる。対称性ＰＣＲは、高いアニーリング温度（本実施例では５３℃）で継続することができ、ここで、プライマーＬの全長が完全にマッチする。
この結果は、図７Ｂに示されており、変異特異的シグナルはあるが、偽陽性シグナルは無いことを示している。
【図１Ａ−１】
2018523970.tif 000012
【図１Ａ−２】
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【図１Ｂ−１】
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【図１Ｂ−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2018523970.tif 000019
【図３Ｃ】
2018523970.tif 000020
【図３Ｄ】
2018523970.tif 000021
【図４】
2018523970.tif 000022
【図５Ａ】
2018523970.tif 000023
【図５Ｂ】
2018523970.tif 000024
【図５Ｃ】
2018523970.tif 000025
【図５Ｄ】
2018523970.tif 000026
【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
2018523970.tif 000028
【図６Ａ】
2018523970.tif 000029
【図６Ｂ】
2018523970.tif 000030
【図６Ｃ】
2018523970.tif 000031
【図６Ｄ】
2018523970.tif 000032
【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月2日(2018.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含有する、サンプル中の、標的核酸配列の存在の検出方法、又は標的核酸配列中の多様体配列の存在の検出方法：
ａ）鋳型核酸を含有するサンプルを提供すること
ｂ）標的核酸配列の増幅を特異的に行うことができる、少なくとも１つのプライマー対を含有するプライマーセットを提供することであって、前記プライマーセットは少なくともプライマーＨとプライマーＬを含有しており、前記プライマーＨの融点は、前記プライマーＬの融点よりも少なくとも１６℃高く、例えば少なくとも２０℃高く、前記プライマーＬは、プライマーＨの伸長産物断片に対し相補的な配列を含有していること
ｃ）伸長温度でポリメラーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを提供すること
ｄ）区分化ＰＣＲ反応物を調製することであって、各区分はサンプルの一部、プライマーセット、核酸ポリメラーゼ、ＰＣＲ試薬、及び任意で検出試薬を含有していること
ｅ）以下の工程を含有する、非対称性漸増ポリメラーゼ反応（ＡＩＰＲ）を行うこと：
ｉ．変性温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによって、ＤＮＡを一本鎖分子に変性させること
ｉｉ．高いアニーリング温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、プライマーＨはアニーリングできるが、プライマーＬはアニーリングできないようにすること
ｉｉｉ．任意で、伸長温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートすること
ｉｖ．任意で、工程ｉ〜ｉｉｉを繰り返すこと
ｖ．それによって、標的核酸配列の１つの鎖のみを増幅させること
ｆ）以下の工程を含む、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと：
１）変性温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによって、ＤＮＡを一本鎖分子に変性させること
２）低いアニーリング温度でＰＣＲをインキュベートし、それによって、プライマーＨとプライマーＬの両方のアニーリングを可能にさせること
３）伸長温度でＰＣＲをインキュベートし、それによって、すべてのアニーリングされたプライマーの伸長を可能にさせること
４）任意で、工程ＩＩ〜ＩＶを繰り返すこと
５）それによって、標的核酸配列の両方の鎖を増幅させ、ＰＣＲ産物を得ること
ｇ）ＰＣＲ産物が、標的核酸配列を含有しているか否か、又は標的核酸配列中に多様体配列を含有しているか否かを検出すること。
【請求項２】
前記多様体配列が、一塩基変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程ｅ）のＡＩＰＲが、以下の工程を含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法：
ｉ．変性温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによって、ＤＮＡを一本鎖分子へと変性させること、
ｉｉ．高いアニーリング温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによってプライマーＨのアニーリングは可能にさせるが、プライマーＬのアニーリングは可能にさせず、この場合において前記高いアニーリング温度は、伸長温度でもあり、それによって、アニーリングされたプライマーＨの伸長が可能になること、
ｉｉｉ．工程ｉ〜ｉｉを繰り返すこと
ｉｖ．それによって、標的核酸配列の１つの鎖のみを増幅させること。
【請求項４】
前記プライマーＨが、プライマーＬの融点よりも少なくとも１５℃高い融点を有するプライマーセット中の唯一のプライマーである、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
前記プライマーセットが、異なる標的核酸配列を増幅することができる２つ以上のプライマー対を含有している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
プライマーＨが、プライマーＨと共に標的核酸配列を増幅させることができるプライマーセット内の他のすべてのプライマーの融点よりも少なくとも１５℃高い融点を有している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記プライマーセットが、以下のプライマーをいずれも含有しない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法：
ｃ）プライマーＨの融点の、±１５℃の範囲、好ましくは±２０℃の範囲、例えば±２５℃の範囲にある融点を有するプライマー、及び
ｄ）プライマーＨと共に、標的核酸配列を特異的に増幅することができるプライマー対を構成することができるプライマー。
【請求項８】
工程ｅ）の高いアニーリング温度が、プライマーＬの融点よりも少なくとも１０℃高い、好ましくは少なくとも１５℃高い、例えば少なくとも２０℃高い、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程ｅ）が、プライマーＨの伸長は生じさせるが、他のいずれのプライマーの検出可能な伸長は生じさせない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
プライマーＬが、ミスマッチ改変プライマーＬであり、前記方法が、工程ｅ）とｆ）の間に低い温度のＰＣＲの工程を含有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、前記低い温度のＰＣＲが以下の工程を含む、前記方法：
１）変性温度で前記区分化ＰＣＲ反応物をインキュベートし、それによってＤＮＡを一本鎖分子に変性させること、
２）非常に低いアニーリング温度でＰＣＲをインキュベートし、それによって、プライマーＨと、プライマーＬの非ミスマッチ部分の両方のアニーリングを可能にさせること、
３）伸長温度でＰＣＲをインキュベートし、それによってすべてのアニーリングされたプライマーの伸長を可能にさせること、
４）任意で、工程１）〜３）を繰り返し、それによってＰＣＲ産物を得ること。
【請求項１１】
前記非常に低いアニーリング温度が、低いアニーリング温度よりも少なくとも５℃低い、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
プライマーＬが、以下からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１０〜１１のいずれか１項に記載の方法：
ａ）１〜１０個のヌクレオチドの５’配列、及び
ｂ）標的核酸配列の断片と同一、又は相補的な、７〜１５個のヌクレオチドの範囲の連続配列。
【請求項１３】
前記区分化ＰＣＲ反応物が各々、検出試薬を含有し、前記検出試薬が、多様体検出プローブであり、前記多様体検出プローブが、多様体配列を含有しない標的核酸配列よりも有意に高いアフィニティーで、多様体配列を含有する標的核酸配列にハイブリダイズすることができるか、及び／又は前記区分化ＰＣＲ反応物が各々、検出試薬を含有し、前記検出試薬が、野生型検出プローブであり、前記野生型検出プローブが、多様体配列を含有しない標的核酸配列にハイブリダイズすることができる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
個体における臨床状態の存在を予測する方法であって、前記臨床状態が、標的核酸配列中の多様体配列の存在に関連づけられているか、又は前記臨床状態が、標的核酸配列の存在に関連づけられており、前記方法が、以下の工程を含み、
ａ）鋳型核酸を含有する前記個体由来のサンプルを提供すること、
ｂ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を実行することであって、
前記標的核酸中の前記多様体配列の存在、又は前記標的核酸配列の存在が、前記臨床状態の存在の指標である、前記方法。
【請求項１５】
前記臨床状態が、癌である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
以下を含有する部分キット：
ａ）標的核酸配列を特異的に増幅することができる少なくとも１つのプライマー対を含有するプライマーセットであって、前記プライマーセットは、少なくともプライマーＨとプライマーＬとを含有し、前記プライマーＨの融点は、前記プライマーＬの融点よりも少なくとも１０℃高く、プライマーＬは、プライマーＨの伸長産物に対して相補的な配列を含有する、前記プライマーセット、
ｂ）標的核酸配列にハイブリダイズすることができる検出プローブであって、前記プローブは、少なくとも１つのフルオロフォアと少なくとも１つのクエンチャーとに連結されている、前記検出プローブ、
ｃ）核酸ポリメラーゼ
ｄ）ＰＣＲ試薬
ｅ）区分化ＰＣＲ反応物を含有するドロップレットを調製するための試薬。
【請求項１７】
請求項１６に記載の部分キットであって、
ａ）前記プライマーＨが、配列番号６９の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号６９の相補配列の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有するか、又は
ｂ）前記プライマーＨが、配列番号６９の相補配列の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号６９の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、
この場合においてプライマーＨとプライマーＬはともに、配列番号６９のヌクレオチド３１４０、１６２４、又は１６３３の内の少なくとも１つを含有する標的配列を増幅することができる、前記部分キット。
【請求項１８】
請求項１６に記載の部分キットであって、
ａ）前記プライマーＨが、配列番号７０の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号７０の相補配列の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有するか、又は
ｂ）前記プライマーＨが、配列番号７０の相補配列の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号７０の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、
この場合においてプライマーＨとプライマーＬはともに、配列番号７０のヌクレオチド１７９９を含有する標的配列を増幅することができる、前記部分キット。
【請求項１９】
請求項１６に記載の部分キットであって、
ａ）前記プライマーＨが、配列番号７１の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号７１の相補配列の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有するか、又は
ｂ）前記プライマーＨが、配列番号７１の相補配列の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号７１の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、
この場合においてプライマーＨとプライマーＬはともに、配列番号７１のヌクレオチド２５７３又は２３６９の内の少なくとも１つを含有する標的配列を増幅することができる、前記部分キット。
【請求項２０】
請求項１６に記載の部分キットであって、
ａ）前記プライマーＨが、配列番号７２の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号７２の相補配列の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有するか、又は
ｂ）前記プライマーＨが、配列番号７２の相補配列の５０〜１００個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、プライマーＬが、配列番号７２の１０〜２０個の範囲のヌクレオチドの連続配列を含有し、
この場合においてプライマーＨとプライマーＬはともに、少なくとも、配列番号７２のヌクレオチド３４、３５、又は３８を含有する標的配列を増幅することができる、前記部分キット。
【国際調査報告】
2018523970.tif 000037
2018523970.tif 000038
2018523970.tif 000039
2018523970.tif 000040