(57)【要約】本開示の局面は、酵素の基質特異性を修飾する酵素結合ポリペプチド（EBP）の組成物、ならびに、少なくとも1つの基質に結合する酵素の基質特異性を修飾するEBPを同定するための方法であって、該酵素を、該酵素の異なるエピトープに結合する複数のEBPを含むポリペプチドライブラリーと接触させる工程；該酵素と結合してEBP-酵素複合体を形成するEBPを同定する工程；EBP-酵素複合体の活性レベルおよび基質特異性についてアッセイする工程；ならびに、EBP-酵素複合体の状態にあるとき、複合体化していないEBPとは異なる基質特異性を有するEBPを同定することによって、該酵素の基質特異性を修飾するEBPを同定する工程を含み；EBP-酵素複合体の触媒速度定数が、少なくとも1つの基質について、複合体化していない酵素の≧50％であり、かつ／または、EBP-酵素複合体が基質への結合性を保持している、方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの基質に結合する酵素の基質特異性を修飾する酵素結合ポリペプチド（EBP）を同定するための方法であって、
該酵素を、該酵素の異なるエピトープに結合する複数のEBPを含むポリペプチドライブラリーと接触させる工程；
該酵素と結合してEBP-酵素複合体を形成する、EBPを同定する工程；
EBP-酵素複合体の活性レベルおよび基質特異性についてアッセイする工程；ならびに
EBP-酵素複合体の状態にあるとき、複合体化していないEBPとは異なる基質特異性を有するEBPを同定することによって、該酵素の基質特異性を修飾するEBPを同定する工程
を含み；
該EBP-酵素複合体が、複合体化していない活性レベルの少なくとも50％である活性のレベルを有し、かつ／または、該EBP-酵素複合体が基質への結合性を保持している、
方法。
【請求項２】
基質特異性を修飾するEBPを同定する工程が、
a）既定期間の反応後の酵素1ユニット当たりの関心対象の第1の生成物の量を低減するポリペプチドを同定する工程；および
b）既定期間の反応後の酵素1ユニット当たりの関心対象の第2の生成物の量を低減しないポリペプチドを同定する工程
を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
分子が低分子またはポリペプチドである、請求項2記載の方法。
【請求項５】
基質特異性を修飾するEBPが、触媒作用の部位に結合しない、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
基質特異性を修飾するEBPが、酵素の活性部位の接近性を修飾するポリペプチドである、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
酵素の触媒活性を阻害する分子との競合アッセイを実施する工程をさらに含む、請求項22〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記分子が酵素の阻害剤である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
酵素の基質特異性を修飾するEBPが、酵素への結合に関して、酵素の活性部位に結合する阻害剤と競合するEBPである、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質の3次元構造が未知である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
酵素の優性エピトープをマスクする工程をさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
優性エピトープが、エピトープへの分子の結合によってマスクされる、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記分子が、酵素の特異性または酵素活性を修飾しない、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
EBP-酵素複合体が、複合体化していない活性レベルの少なくとも75％である活性のレベルを有する、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
EBP-酵素複合体が、複合体化していない活性レベルの少なくとも90％である活性のレベルを有する、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
EBP-酵素複合体が、複合体化していない活性レベルの少なくとも95％である活性のレベルを有する、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
酵素が、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、アミダーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、ヌクレオチドポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、トランスペプチダーゼ、トランスアミダーゼ、カルボキシラーゼ、γ-グルタミルトランスフェラーゼ、イソメラーゼ、エピメラーゼ、リアーゼ、オキシゲナーゼ、リガーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ、プロテイングルタミナーゼ、アミラーゼ、デアセチラーゼ、またはデメチラーゼである、請求項22〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
酵素がβ-ガラクトシダーゼである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
ポリペプチドライブラリーが、抗体、アフィボディ、アンチカリン、Kunitzバリアント、モノボディ、またはDARPinのライブラリーである、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
ポリペプチドライブラリーが、100kDa未満であるポリペプチドのライブラリーである、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
ポリペプチドライブラリーが、50kDa未満であるポリペプチドのライブラリーである、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
ポリペプチドライブラリーが、25kDa未満であるポリペプチドのライブラリーである、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
ポリペプチドライブラリーが、15kDa未満であるポリペプチドのライブラリーである、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
ポリペプチドライブラリーが、モノボディのライブラリーである、請求項20記載の方法。
【請求項２６】
モノボディライブラリーが、野生型（SEQ ID NO:78）と比較して、ベータ鎖C、ベータ鎖D、ベータ鎖F、および／またはベータ鎖Gの1つまたは複数に1つまたは複数の変更を含むバリアントフィブロネクチンIII型（FN3）ドメインを有する複数のポリペプチドを含む、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
バリアントアミノ酸の1つまたは複数が、SEQ ID NO:91の位置30、31、33、49、47、75、76、84、および／または85に対応する、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
バリアントFN3ドメインが、FN3の少なくとも1つのループ領域内に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25のアミノ酸の挿入または欠失をさらに含む、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
バリアントFN3ドメインが、ループFG内にアミノ酸挿入を含む、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
ポリペプチドライブラリーが、SEQ ID NO:91のアミノ酸位置31、33、47、49、73、および／または75に対応する1つまたは複数のアミノ酸置換を含む複数のFN3ドメインポリペプチドを含む、請求項20〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
FN3ドメインポリペプチドが、SEQ ID NO:91のアミノ酸位置30、41、42、43、44、45、76、77、78、79、80、81、82、83、84、および／または85に対応する1つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
FN3ドメインポリペプチドが、SEQ ID NO:91のアミノ酸位置15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、32、34、35、36、37、38、39、40、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、72、74、75、86、87、88、89、90、91、92、93、および／または94に対応する1つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、請求項30または31記載の方法。
【請求項３３】
FN3ドメインポリペプチドが、SEQ ID NO:91と少なくとも50％、60％、70％、80％、または90％同一である、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
請求項1〜33のいずれか一項記載の方法に従って同定された、酵素の基質特異性を修飾するポリペプチド。
【請求項３５】
EBP-酵素複合体の特異性が酵素とは異なり、該EBP-酵素複合体が複合体化していない活性レベルの少なくとも50％である活性のレベルを有し、かつ／または、基質への結合性を保持している、EBP-酵素複合体。
【請求項３６】
請求項34または35記載のポリペプチドをコードする、ヌクレオチド。
【請求項３７】
酵素を請求項34または35記載のポリペプチドと接触させる工程を含む、該酵素の特異性を修飾するための方法。
【請求項３８】
酵素をEBPと接触させる工程を含む、該酵素の特異性を修飾するための方法。
【請求項３９】
SEQ ID NO:1〜90から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４０】
β-ガラクトシダーゼに結合する、請求項39記載のポリペプチド。
【請求項４１】
β-ガラクトシダーゼの不活性結合剤である、請求項40記載のポリペプチド。
【請求項４２】
SEQ ID NO:1、8、14、23、26、30、38、39、47、52、62、67、69、70、75、または76と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項39または41記載のポリペプチド。
【請求項４３】
β-ガラクトシダーゼの阻害剤である、請求項40記載のポリペプチド。
【請求項４４】
SEQ ID NO:73、74、77、または83と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項39または43記載のポリペプチド。
【請求項４５】
β-ガラクトシダーゼの特異性修飾剤である、請求項40記載のポリペプチド。
【請求項４６】
SEQ ID NO:78、81、86、87、または88と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項39または45記載のポリペプチド。
【請求項４７】
SEQ ID NO:87を含むポリペプチド。
【請求項４８】
修飾をさらに含む、請求項39〜47のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項４９】
修飾がグリコシル化である、請求項48記載のポリペプチド。
【請求項５０】
修飾が検出可能標識へのコンジュゲーションである、請求項48記載のポリペプチド。
【請求項５１】
修飾が診断剤へのコンジュゲーションである、請求項48記載のポリペプチド。
【請求項５２】
修飾が、蛍光物質、発光物質、または生物発光物質へのコンジュゲーションである、請求項48記載のポリペプチド。
【請求項５３】
修飾が放射性物質へのコンジュゲーションである、請求項48記載のポリペプチド。
【請求項５４】
修飾が治療剤へのコンジュゲーションである、請求項48記載のポリペプチド。
【請求項５５】
修飾が第2のポリペプチドへのコンジュゲーションである、請求項48記載のポリペプチド。
【請求項５６】
第2のポリペプチドが、Avi、カルモジュリン、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアルギニン、E、FLAG、HA、His、Myc、ポリヒスチジン、GST、MBP、S、SBP、Softag 1、Softag3、Strep、TC、V5、VSV、レクチン、ビオチン、ストレプトアビジン、SUMO、HaloTag、SiTag、またはExpressポリペプチドである、請求項55記載のポリペプチド。
【請求項５７】
請求項39〜56のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項５８】
請求項39〜56のいずれか一項記載のポリペプチドを製造するための方法であって、請求項57記載のポリヌクレオチドを細胞中で発現させる工程を含む、方法。
【請求項５９】
請求項57記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【請求項６０】
SEQ ID NO:93〜112または114〜117から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項６１】
キャンディダ・ルゴサ（Candida rugosa）リパーゼ1（CRL1）に結合する、請求項60記載のポリペプチド。
【請求項６２】
CRL1の不活性結合剤である、請求項61記載のポリペプチド。
【請求項６３】
SEQ ID NO:93、94、96、または97と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項62記載のポリペプチド。
【請求項６４】
CRL1の阻害剤である、請求項61項記載のポリペプチド。
【請求項６５】
SEQ ID NO:107、116、または117と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項64記載のポリペプチド。
【請求項６６】
CRL1の特異性修飾剤である、請求項61記載のポリペプチド。
【請求項６７】
SEQ ID NO:115または109と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項66記載のポリペプチド。
【請求項６８】
修飾をさらに含む、請求項60〜67のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項６９】
修飾がグリコシル化である、請求項68記載のポリペプチド。
【請求項７０】
修飾が検出可能標識へのコンジュゲーションである、請求項68記載のポリペプチド。
【請求項７１】
修飾が診断剤へのコンジュゲーションである、請求項68記載のポリペプチド。
【請求項７２】
修飾が、蛍光物質、発光物質、または生物発光物質へのコンジュゲーションである、請求項68記載のポリペプチド。
【請求項７３】
修飾が放射性物質へのコンジュゲーションである、請求項68記載のポリペプチド。
【請求項７４】
修飾が治療剤へのコンジュゲーションである、請求項68記載のポリペプチド。
【請求項７５】
修飾が第2のポリペプチドへのコンジュゲーションである、請求項68記載のポリペプチド。
【請求項７６】
第2のポリペプチドが、Avi、カルモジュリン、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアルギニン、E、FLAG、HA、His、Myc、ポリヒスチジン、GST、MBP、S、SBP、Softag 1、Softag3、Strep、TC、V5、VSV、レクチン、ビオチン、ストレプトアビジン、SUMO、HaloTag、SiTag、またはExpressポリペプチドである、請求項75記載のポリペプチド。
【請求項７７】
請求項60〜76のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項７８】
請求項60〜76のいずれか一項記載のポリペプチドを製造するための方法であって、請求項77記載のポリヌクレオチドを細胞中で発現させる工程を含む、方法。
【請求項７９】
請求項19記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、2015年7月17日に出願された米国仮特許出願第62/193,955号の優先権の恩典を主張するものである。
【０００２】
政府支援の声明
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって付与された助成金第R01-GM072688号および第R01-GM090324号の下、政府支援をもって成されたものである。政府は、本発明に特定の権利を所有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
I. 発明の分野
態様は、概して、生物学、医学、およびタンパク質エンジニアリングを対象とする。
【０００４】
II. 背景
酵素は、化学品、医薬品、食品、乳製品、および繊維製品を含む多くの製造業において重要であることから、望ましい触媒特性を有する酵素のエンジニアリングは、引き続きバイオテクノロジーの主要な目標である。基本的に全ての標準的な酵素エンジニアリングアプローチ、例えば、構造誘導設計および指向性進化法は、酵素それ自体を修飾する。これらのアプローチの前提条件は、それらのより広範な用途を制限している。構造誘導設計は、標的酵素の3次元（3D）構造および触媒機構の詳細な知識を必要とし、そして、指向性進化法は、多数の突然変異酵素を生成およびスクリーニングするための効果的な戦略を必要とする。デノボ酵素設計もまた、反応機構の詳細な理解を必要とする。工業用酵素は、大腸菌（Escherichia coli）および酵母のようなタンパク質工学に好適な生物において組換え産生できないため、工業用酵素はその天然宿主から精製されることが多い。それらの3D構造はほとんど知られておらず、そして、それらのアッセイは労働集約的であることが多い。これらの特徴は、標準的なタンパク質エンジニアリングアプローチを工業用酵素に適用することを厄介な難題にしているが、それらの特性を調節することが望ましい場合が多い。したがって、とりわけ3次元構造に関してほとんど情報が入手できない酵素について、酵素の活性および／または特異性を修飾するためのより良好な方法が当技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、酵素の構造に関する知識が全くなくても生成することができる新規の酵素基質特異性修飾剤を開発するための方法を提供することによって、先に記載された問題の解決法を提供する。また、本明細書に記載されるのは、β-ガラクトシダーゼまたはリパーゼ1に結合するポリペプチド、ならびにβ-ガラクトシダーゼまたはリパーゼ1の阻害剤および特異性修飾剤であるポリペプチドである。本開示の局面は、SEQ ID NO:1〜90、93〜112、または114〜117から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
【０００６】
いくつかの態様において、ポリペプチドは、β-ガラクトシダーゼに結合する。β-ガラクトシダーゼは、ラクトース加水分解およびトランスガラクトシル化反応を触媒する。いくつかの態様において、β-ガラクトシダーゼは、バチルス・サーキュランス（B. circulans）（ATCC 31382）に由来する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、Biolacta（登録商標）に結合する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、不活性結合剤である。用語「不活性結合剤」は、タンパク質または酵素の活性を全く修飾しない結合ポリペプチドを指す。いくつかの態様において、不活性結合剤は、タンパク質の活性を10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1％（またはその中の導出可能な任意の範囲）を超えて低減させることはない。活性は、基質特異性、選択性、酵素活性、基質結合性などを含む。いくつかの態様において、不活性結合剤は、SEQ ID NO:1、8、14、23、26、30、38、39、47、52、62、67、69、70、75、または76と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【０００７】
いくつかの態様において、ポリペプチドは、β-ガラクトシダーゼの阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、SEQ ID NO:73、74、77、または83と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【０００８】
いくつかの態様において、ポリペプチドは、β-ガラクトシダーゼの特異性修飾剤である。用語「特異性修飾剤」は、本明細書において使用される場合、酵素の基質プロファイルを変化させるが必ずしも酵素の活性を変化させることのない、ポリペプチドである。例えば、特異性修飾剤は、酵素の結合活性を、酵素がある基質に別の基質よりも優先的に結合するように、または酵素が過去に結合していない基質に酵素が結合するように、変化させ得る。しかしながら、特異性修飾剤は、典型的には、酵素の活性のレベルを変化させないだろう。いくつかの態様において、特異性修飾剤は、SEQ ID NO:78、81、86、87、または88と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、特異性修飾剤は、SEQ ID NO: 87と少なくとも90％同一であるポリペプチドである。
【０００９】
いくつかの態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:1、8、14、23、26、30、38、39、47、52、62、67、69、70、75、または76と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:73、74、77、または83と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:78、81、86、87、または88と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:87と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１０】
さらなる局面は、キャンディダ・ルゴサ（Candida rugosa）リパーゼ1（CRL1）に結合するポリペプチドに関する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:93〜112または114〜117から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:93〜112または114〜117と少なくとも70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100％の同一性を有する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、CRL1の不活性結合剤である。いくつかの態様において、不活性結合剤は、SEQ ID NO:93、94、96、または97と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、CRL1の阻害剤である。いくつかの態様において、阻害剤は、SEQ ID NO:107、116、または117と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、CRL1の特異性修飾剤である。いくつかの態様において、特異性修飾剤は、SEQ ID NO:115または109と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
いくつかの態様において、本開示のポリペプチドは、SEQ ID NO:1〜90、93〜112、または114〜117のいずれか1つのアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくともまたは正確に50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％（またはその中の導出可能な任意の範囲）同一である。
【００１２】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、互換的に使用され、かつ、2つのペプチド間のまたは2つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較のために整列され得る各配列内の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列内の位置が同じ塩基またはアミノ酸で占有されているとき、その分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有される一致するまたは相同な位置の数の関数である。「無関係」または「非相同」配列は、本開示の配列の1つと40％未満の同一性を共有するが、好ましくは25％未満の同一性を共有する。2つのポリペプチド間の同一性は、類似である領域のみを比較することによって決定される。20種のアミノ酸の配列を有するポリペプチドを、同じ20種のアミノ酸を有するがその20種のアミノ酸のNまたはC末端にあるセグメントも有するポリペプチドと比較する例では、両ポリペプチドは介在アミノ酸を全く含まず同じ一続きの20種のアミノ酸を有するため、その同一性％は依然として100％であろう。
【００１３】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）が、別の配列に対して、特定のパーセンテージ（例えば、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％または99％）の「配列同一性」または「相同性」を有することは、整列されたとき、そのパーセンテージの塩基（またはアミノ酸）が2つの配列を比較した際に同じであることを意味する。この整列および相同性または配列同一性パーセントを、当技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えばAusubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology に記載されているものを使用して決定することができる。
【００１４】
生物学的に等価なポリヌクレオチドは、特定の相同性パーセントを有しかつ同じまたは類似の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドである。
【００１５】
いくつかの態様において、同一性パーセンテージは、同一性の数を以下の1つで割ることによって算出される：最短配列の長さ、整列の長さ、配列の平均長、非ギャップ位置の数、またはオーバーハングを除いた同等位置の数。
【００１６】
いくつかの態様において、ポリペプチドは、修飾をさらに含む。修飾は、ペグ化、グリコシル化、検出可能標識へのコンジュゲーション、診断剤へのコンジュゲーション、蛍光物質、発光物質、もしくは生物発光物質へのコンジュゲーション、放射性物質へのコンジュゲーション、治療剤へのコンジュゲーション、および／または第2のポリペプチドへのコンジュゲーションであってよい。いくつかの態様において、第2のポリペプチドは、Avi、カルモジュリン、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアルギニン、E、FLAG、HA、His、Myc、ポリヒスチジン、GST、MBP、S、SBP、Softag 1、Softag3、Strep、TC、V5、VSV、レクチン、ビオチン、ストレプトアビジン、SUMO、HaloTag、SiTag、またはExpressポリペプチドである。
【００１７】
本開示のさらなる局面は、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。さらなる局面は、本明細書に記載されるポリペプチドを製造するための方法であって、本開示のポリヌクレオチドを細胞中で発現させる工程を含む方法に関する。なおさらなる局面は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
【００１８】
さらなる局面は、少なくとも1つの基質に結合する酵素の基質特異性を修飾する酵素結合ポリペプチド（EBP）を同定するための方法であって：該酵素を、該酵素の異なるエピトープに結合する複数のEBPを含むポリペプチドライブラリーと接触させる工程；該酵素と結合してEBP-酵素複合体を形成する、EBPを同定する工程；EBP-酵素複合体の活性レベルおよび基質特異性についてアッセイする工程；ならびに、EBP-酵素複合体の状態にあるとき、複合体化していないEBPとは異なる基質特異性を有するEBPを同定することによって、該酵素の基質特異性を修飾するEBPを同定する工程を含み；EBP-酵素複合体が、複合体化していない活性レベルの少なくとも50％である活性のレベルを有し、かつ／または、EBP-酵素複合体が基質への結合性を保持している、方法に関する。
【００１９】
いくつかの態様において、本開示は、少なくとも1つの基質に結合する酵素の基質特異性を修飾するEBPを同定するための方法であって：該酵素を、該酵素の異なるエピトープに結合する複数のEBPを含むポリペプチドライブラリーと接触させる工程；該酵素と結合してEBP-酵素複合体を形成する、EBPを同定する工程；EBP-酵素複合体の活性レベルおよび基質特異性についてアッセイする工程；ならびに、EBP-酵素複合体の状態にあるとき、複合体化していないEBPとは異なる基質特異性を有するEBPを同定することによって、該酵素の基質特異性を修飾するEBPを同定する工程を含み；EBP-酵素複合体の触媒速度定数が、少なくとも1つの基質について、複合体化していない酵素の≧50％であり、かつ／または、EBP-酵素複合体が基質への結合性を保持している、方法に関する。
【００２０】
用語「エピトープ」は、本明細書において使用される場合、抗原とも互換的に使用され、かつ、結合タンパク質（すなわち、本明細書に記載されるEBP）によって認識されるポリペプチドセグメントを指す。いくつかの態様において、エピトープは、複数のポリペプチドセグメント（すなわち、タンパク質の不連続セグメント）である。
【００２１】
いくつかの態様において、EBP-酵素複合体は、複合体化していない活性レベルの少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100％（またはその中の導出可能な任意の範囲）である活性のレベルを有する。
【００２２】
いくつかの態様において、EBP-酵素複合体の触媒速度定数は、少なくとも1つの基質について、複合体化していない酵素の≧50％、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100％（またはその中の導出可能な任意の範囲）である。
【００２３】
タンパク質の活性を、当技術分野において公知の方法によっておよび酵素が保有する酵素活性に依存するアッセイによって決定し得る。例えば、β-ガラクトシダーゼまたはリパーゼ1の活性を、実施例に記載のとおりのアッセイを使用することによって決定し得る。いくつかの態様において、活性は、当技術分野において公知の方法および／または本明細書に記載される方法によって決定することができる、比触媒速度定数（kcat）を指す。いくつかの態様において、活性は、既定期間の反応後の酵素1ユニット当たりの関心対象の生成物の量を指す。
【００２４】
いくつかの態様において、反応の期間は、少なくとも、最大で、または正確に1、2、3、4、5、10、15、20、30、60分間、または1、1.5、2、2.5、3、6、12、24、48、72、または96時間（またはその中の導出可能な任意の範囲）である。
【００２５】
いくつかの態様において、基質特異性を修飾するEBPを同定する工程は：a）未結合活性部位を有する酵素に結合する；およびb）分子が酵素の活性部位で結合しているとき酵素に結合しない、ポリペプチドを同定する工程を含む。いくつかの態様において、分子は、阻害剤である。いくつかの態様において、分子は、低分子またはポリペプチドである。いくつかの態様において、低分子は、2kDa、1.5kDa、1kDa、900Da、800Da、700Da、600Daもしくは500Da未満の、2kDa、1.5kDa、1kDa、900Da、800Da、700Da、600Daもしくは500Daを超える、または正確に2kDa、1.5kDa、1kDa、900Da、800Da、700Da、600Daもしくは500Daの、低分子量有機化合物である。
【００２６】
いくつかの態様において、基質特異性を修飾するEBPを同定する工程は：a）既定期間の反応後の酵素1ユニット当たりの関心対象の第1の生成物の量を低減する；およびb）既定期間の反応後の酵素1ユニット当たりの関心対象の第2の生成物の量を低減しない、ポリペプチドを同定する工程を含む。
【００２７】
いくつかの態様において、基質特異性を修飾するEBPを同定する工程は：a）既定期間の反応後の酵素1ユニット当たりの関心対象の第1の生成物の量を増加させる；およびb）既定期間の反応後の酵素1ユニット当たりの関心対象の第2の生成物の量を増加させない、ポリペプチドを同定する工程を含む。
【００２８】
生成物は、少なくとも、最大で、または正確に5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100％（またはその中の導出可能な任意の範囲）低減されてもまたは増加されてもよい。
【００２９】
いくつかの態様において、基質特異性を修飾するEBPは、酵素の活性部位に結合しない。いくつかの態様において、基質特異性を修飾するEBPは、触媒作用の部位（すなわち、触媒反応が起こる活性部位の領域）に結合しない。いくつかの態様において、基質特異性を修飾するEBPは、酵素の活性部位の接近性を修飾するポリペプチドである。
【００３０】
いくつかの態様において、基質特異性を修飾するEBPは、第1の基質に対する酵素の触媒活性を阻害するが、第2の基質に対する酵素の触媒活性を阻害しない。
【００３１】
いくつかの態様において、方法は、酵素の活性部位に結合する分子との競合アッセイを実施する工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、酵素の触媒活性を阻害する分子との競合アッセイを実施する工程をさらに含む。いくつかの態様において、分子は、酵素の阻害剤である。いくつかの態様において、方法は、活性部位（または推定活性部位）に置換を有する突然変異酵素の使用をさらに含む。この突然変異体は、本明細書に記載されるアッセイにおいてデコイとして作用し得、かつ、EBPを濃縮するために有用であり得る。
【００３２】
いくつかの態様において、酵素の基質特異性を修飾するEBPは、酵素への結合に関して、酵素の活性部位に結合する阻害剤と競合するEBPである。いくつかの態様において、タンパク質の3次元構造は、未知である。
【００３３】
いくつかの態様において、方法は、酵素の優性エピトープをマスクする工程をさらに含む。優性エピトープは、1つまたは複数の結合タンパク質に対して高い親和性を有するエピトープであってよい。いくつかの態様において、優性エピトープは、エピトープへの分子の結合によってマスクされる。いくつかの態様において、分子は、酵素の特異性または酵素活性を修飾しない。いくつかの態様において、分子は、不活性な結合ポリペプチドである。
【００３４】
いくつかの態様において、酵素は、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、アミダーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、ヌクレオチドポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、トランスペプチダーゼ、トランスアミダーゼ、カルボキシラーゼ、γ-グルタミルトランスフェラーゼ、イソメラーゼ、エピメラーゼ、リアーゼ、オキシゲナーゼ、リガーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ、プロテイングルタミナーゼ、アミラーゼ、デアセチラーゼ、またはデメチラーゼである。いくつかの態様において、酵素は、ヒドロラーゼである。いくつかの態様において、酵素は、β-ガラクトシダーゼである。いくつかの態様において、酵素は、リパーゼ1である。
【００３５】
いくつかの態様において、ポリペプチドライブラリーは、抗体（ナノボディおよび抗体の断片を含む）、ジスルフィドで連結されたペプチド、アフィボディ、アフィリン、アンチカリン（リポカリン）、フィノマー、Kunitzバリアント、フィブロネクチンIII型（FN3）ドメイン（モノボディ、およびFN3ドメインを使用した関連結合タンパク質系)、アンキリンリピート（DARPin）、APP、ラクダ科VHH、ジスルフィドで連結されたペプチドまたは他の非抗体スキャフォールドのライブラリーである。いくつかの態様において、ポリペプチドライブラリーは、当技術分野において公知の、及び本明細書に記載される、ライブラリーである。いくつかの態様において、ポリペプチドライブラリーは、100kDa未満であるポリペプチドのライブラリーである。いくつかの態様において、ポリペプチドライブラリーは、約90、80、70、60、50、40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、もしくは10kDa（またはその中の導出可能な任意の範囲）未満または正確に約90、80、70、60、50、40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、もしくは10kDa（またはその中の導出可能な任意の範囲）であるポリペプチドのライブラリーである。
【００３６】
いくつかの態様において、ポリペプチドライブラリーは、モノボディのライブラリーである。いくつかの態様において、モノボディライブラリーは、野生型（SEQ ID NO:91）と比較して、ベータ鎖C、ベータ鎖D、ベータ鎖F、および／またはベータ鎖Gの1つまたは複数に1つまたは複数の変更を含むバリアントフィブロネクチンIII型（FN3）ドメインを有する複数のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、バリアントアミノ酸の1つまたは複数は、SEQ ID NO:91の位置30、31、33、49、47、75、76、84、および／または85に対応する。特定の態様において、アミノ酸変異は、モノボディの結合特異性に寄与する。さらなる局面において、ベータ鎖変異を、FN3のループ内の変異と併用することができる。特定の局面において、ベータ鎖変異を、FN3の、ABループ、BCループ、CDループ、DEループ、および／またはFGループ内の変異と併用して、ポリペプチドライブラリーまたはそれをコードする核酸ライブラリーを生成することができる。AB、BC、CD、DE、およびFGは、それぞれ、SEQ ID NO:91のアミノ酸位置15〜16、22〜30、39〜45、51〜55、および76〜87に対応する。1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20もしくはより多い、またはその中の導出可能な任意の範囲のアミノ酸をFN3ループ内において挿入または欠失することによって、FN3ポリペプチドを修飾することができる。特定の局面において、ループAB、CD、およびEF内の変異を個々にまたは種々の組み合わせのいずれかで、特別に除外してよい。いくつかの態様において、FN3バリアントが、ボトムループ（ループAB、CD、EF）内に置換、挿入および／または欠失を含まないことが企図される。さらなる態様において、ボトムループ内の修飾は、1、2、3、4、もしくは5またはより少ない置換、挿入、および／または欠失に限定される。
【００３７】
特定の態様において、ポリペプチドは、FN3のループ領域およびFN3の非ループ領域の両方に1つまたは複数のアミノ酸置換を含むバリアントフィブロネクチンIII型（FN3）ドメインを含む。特定の局面において、非ループセグメント内の1つまたは複数のアミノ酸置換は、ベータ鎖C、ベータ鎖D、ベータ鎖F、および／またはベータ鎖G内の1つまたは複数の置換である。
【００３８】
さらなる局面において、ベータ鎖C内の1つまたは複数のアミノ酸置換は、SEQ ID NO:91の位置31、32、33、34、35、36、37、38、または39に対応する1つまたは複数のアミノ酸置換である。特定の局面において、ベータ鎖C内のアミノ酸置換は、SEQ ID NO:91の位置31または33に対応する。
【００３９】
特定の局面において、ベータ鎖D内の1つまたは複数のアミノ酸置換は、SEQ ID NO:91の位置44、45、46、47、48、49、50または51に対応する1つまたは複数のアミノ酸置換である。さらなる局面において、ベータ鎖D内のアミノ酸置換は、SEQ ID NO:91の位置44、45、47、または49に対応する。
【００４０】
なおさらなる局面において、ベータ鎖F内の1つまたは複数のアミノ酸置換は、SEQ ID NO:91の位置67、68、69、70、71、72、73、74、または75に対応する1つまたは複数のアミノ酸置換である。さらなる局面において、ベータ鎖F内のアミノ酸置換は、SEQ ID NO:91の位置71、73、75、または76に対応する。
【００４１】
特定の局面において、ベータ鎖G内の1つまたは複数のアミノ酸置換は、SEQ ID NO:91の位置85、86、87、88、89、90、91、92、93、または94に対応する1つまたは複数のアミノ酸置換である。さらなる局面において、ベータ鎖G内のアミノ酸置換は、SEQ ID NO:91の位置84または85に対応する。
【００４２】
ポリペプチドは、SEQ ID NO:91の位置31、33、47、49、73、および／または75における1つまたは複数のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換を含むことができる。特定の局面において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:91の位置30のアミノ酸に対応するアミノ酸置換をさらに含む。さらなる局面において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:91のアミノ酸位置41、42、43、44、または45に対応する1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。ポリペプチドは、SEQ ID NO:91のアミノ酸位置76、77、78、79、80、81、82、83、84、または85に対応する1つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含むことができる。
【００４３】
特定の態様において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:91のアミノ酸に対応するアミノ酸の1、2、3、4またはより多い挿入および／または欠失を含むことができる。挿入は、コンビナトリアルポリペプチドライブラリーを生成するためにその後突然変異誘発されるまたは多様化される、一続きのポリ-セリン、ポリ-アラニン、ポリ-バリン、ポリ-トレオニン、または任意の他の20種のアミノ酸のポリマーを含むことができるが、それらに限定されない。これらの挿入された残基の多様化は、その他の天然アミノ酸の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、または19の変更を含むことができる。特定の局面において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25またはより多い連続アミノ酸が、FN3ドメインポリペプチドのAB、BC、CD、DE、EF、FGループの1つまたは複数に挿入される。さらなる局面において、ポリペプチドは、挿入、欠失、または挿入および欠失の両方を含むことができる。挿入および欠失は、同じ位置に位置する必要はなく、かつ、互いに遠位のまたは隣接する部位に位置してよい。挿入および／または欠失は、FN3ドメインポリペプチドのループまたは非ループ部分内にあることができる。特定の局面において、FN3の少なくとも1つのループ領域は、少なくとも2つのアミノ酸の挿入を含む。さらなる局面において、FN3の少なくとも1つの領域は、少なくとも1つのループ領域内に2〜25のアミノ酸の挿入を含む。特定の局面において、少なくとも2、3、またはより多いループ領域は、挿入を含む。特定の局面において、ポリペプチドは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個（その間にある全ての値および範囲を含む）のアミノ酸の欠失を含むFN3の少なくとも1つのループ領域を有する。特定の局面において、少なくとも2、3、または4つのループまたは非ループセグメント、部分、または領域は、少なくとも1つのアミノ酸の欠失を含む。特定の局面において、ポリペプチドは、少なくとも1つのループまたは非ループ領域内に少なくとも1つの挿入および1つの欠失を含む。さらなる局面において、ポリペプチドは、同じループまたは非ループ領域内に挿入および欠失を含む。領域という用語は、SEQ ID NO:91のアミノ酸またはそのバリアントに対応する二次構造および／または結晶構造によって定義されるとおりのポリペプチドの特定の構造セグメントのアミノ酸を示す。
【００４４】
特定の局面において、ポリペプチドは、SEQ ID NO:91と少なくとも50％、60％、70％、80％、または90％（その間にある全ての値および範囲を含む）同一である。
【００４５】
本開示のポリペプチドは、特定のポリペプチドの特徴、例えば、結合親和性についてスクリーニングすることができる、ポリペプチドライブラリー内に含まれ得るか、またはポリヌクレオチドライブラリー内にコードされ得る。次いで、ライブラリーの1つまたは複数のメンバーをライブラリーの他のメンバーから単離して、分析することができる。特定の局面において、ライブラリーは、複数の本明細書に記載されるそのポリペプチドを含むかまたはそれをコードする。特定の局面において、標的に結合するポリペプチドライブラリーを事前選択し、次いで、その事前選択されたメンバーを選択されたアミノ酸位置でさらに多様化して、標的化されたライブラリーを生成し、その後ライブラリーは特定の特徴または特性についてスクリーニングされる。
【００４６】
特定の局面は、本明細書に記載される1つまたは複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象とする。特定の態様において、ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現構築物である。発現構築物は、コードされたポリペプチドを、原核生物または真核生物の細胞株または細胞系のような宿主細胞中で発現させることが可能である。特定の局面において、発現構築物は、当技術分野において公知の1つまたは複数のポリペプチド発現系において機能的である。さらなる局面において、発現構築物は、細菌、酵母、昆虫細胞などにおいて機能的である。
【００４７】
ポリペプチドは、特定の標的への親和性についてスクリーニングされていてもされていなくてもよい第2のFN3ドメインをさらに含むことができる。第2のFN3ドメインは、追加のアミノ酸変異またはアミノ酸多様性を含有してもしなくてもよい。他の局面において、ポリペプチドは、標的分子に対するFN3ポリペプチド結合親和性を増強する、非FN3ポリペプチドをさらに含むことができる。非FN3ポリペプチドは、ホスホ-チロシン結合に関与するドメイン（例えば、SH2、PTB)、ホスホ-セリン結合に関与するドメイン（例えば、UIM、GAT、CUE、BTB/POZ、VHS、UBA、RING、HECT、WW、14-3-3、Polo-box)、ホスホ-トレオニン結合に関与するドメイン（例えば、FHA、WW、Polo-box)、プロリン-リッチ領域結合に関与するドメイン（例えば、EVH1 、SH3、GYF)、アセチル化リジン結合に関与するドメイン（例えば、Bromo)、メチル化リジン結合に関与するドメイン（例えば、Chromo、PHD)、アポトーシスに関与するドメイン（例えば、BIR、TRAF、DED、Death、CARD、BH)、細胞骨格調節に関与するドメイン（例えば、ADF、GEL、DH、CH、FH2)、または他の細胞機能に関与するドメイン（例えば、EH、CC、VHL、TUDOR、PUFリピート、PAS、MH1、LRR1 IQ、HEAT、GRIP、TUBBY、SNARE、TPR、TIR、START、SOCS Box、SAM、RGS、PDZ、PB1 、LIM、F-BOX、ENTH、EF-Hand、SHADOW、ARM、ANK)、シリカ結合に関与するドメイン（例えば、ポリアルギニン、タンパク質L2)、ケラチン結合に関与するドメイン（例えば、ポリリジン、KBD)、ヒドロキシアパタイト結合に関与するドメイン（例えば、N15)、炭水化物結合に関与するドメイン（例えば、CBD）を含むことができるが、それらに限定されない。
【００４８】
特定の局面において、アミノ酸位置15、16、17、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、38、39、40、41、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、60、61、62、63、64、65、66、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、93、95、および／または96（その間にある全ての範囲を含む）と一致するいずれか1つまたはより多い位置のバリアントを、特許請求される態様中に特別に含めることができる。他の態様において、アミノ酸位置15、16、17、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、38、39、40、41、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、60、61、62、63、64、65、66、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、93、95、および／または96（その間にある全ての範囲を含む）と一致するいずれか1つまたはより多い位置のバリアントを特別に除外することができる。これらの列挙された位置がヒトFN3中の10番目のドメインの配列（SEQ ID NO:91）に基づくことが理解される。態様が他の生物におけるFN3の10番目のドメイン内のFN3バリアントにも同様に関係すること、および、当業者がヒト配列内の位置に基づいて他の生物由来のFN3の10番目のドメイン内の対応する位置を容易に同定することができることが企図される。
【００４９】
特定の態様は、野生型（SEQ ID NO:91）と比較して、ベータ鎖C、ベータ鎖D、ベータ鎖F、および／またはベータ鎖Gの1つまたは複数に1つまたは複数の変更またはバリアントを含むバリアントフィブロネクチンIII型（FN3）ドメインを有する複数のポリペプチドを含むモノボディライブラリーを対象とする。特定の局面において、変更されたまたはバリアントアミノ酸の1つまたは複数は、SEQ ID NO:91の位置30、31、33、49、47、75、76、84、および／または85に対応する。モノボディライブラリーは、FN3の少なくとも1つのループ領域内に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25のアミノ酸の挿入または欠失をさらに含むバリアントFN3ドメインを含むことができる。モノボディライブラリーはまた、ループFG内にアミノ酸挿入を含むバリアントFN3ドメインを含むことができる。モノボディライブラリーはまた、上記の複数のそのポリペプチドを含むことができる。
【００５０】
いくつかの態様において、本明細書に記載されるポリペプチドは、天然に存在しないポリペプチドである。いくつかの態様において、本開示は、SEQ ID NO:1〜90から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるポリペプチドであって、SEQ ID NO:91を含まないポリペプチドに関する。いくつかの態様において、本開示は、SEQ ID NO:93〜112または114〜117から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、SEQ ID NO:91を含まないポリペプチドに関する。
【００５１】
いくつかの態様において、ポリペプチドは、その天然環境で産生されるポリペプチドとは異なる翻訳後修飾を含む。例えば、ポリペプチドは、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化もしくはプレニル化、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化、グリピエーション（glypiation）、リポイル化、ホスホパンテテニル化（phosphopantetheinylation）、ジフタミド形成、エタノールアミンホスホグリセロール付着、ヒプシン形成、アシル化、アセチル化、ホルミル化、アルキル化、メチル化、アルギニル化、ポリグルタミル化、ポリグリシル化、ブチリル化、グリコシル化、ポリシアル化、マロニル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化（例えば、サイログロブリンの）、ADP-リボシル化のようなヌクレオチド付加、酸化、リン酸エステル（O-結合型）もしくはホスホルアミデート（N-結合型）形成、リン酸化、アデニリル化、プロピオニル化、ピログルタミン酸形成、S-グルタチオン化、S-ニトロシル化、S-スルフェニル化、スクシニル化、硫酸化、糖化、カルバミル化、カルボニル化、ビオチン化、保存されたリジン残基のビオチン付加物によるアシル化、またはペグ化の状態が異なっていてよい。
【００５２】
いくつかの態様において、ポリペプチドは、当技術分野において公知でありかつ／または本明細書に記載される宿主細胞において産生され、これらの宿主細胞は、細菌（例えば、大腸菌、枯草菌（B. subtilis）、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー(S.viofoceoruber)）、酵母（例えば、出芽酵母（S.cerevisiae）、ピキア・パストリス（P.pastoris））、真菌（例えば、コウジカビ（A.oryzae））、真核生物細胞、昆虫細胞、A549、B細胞、B16、BHK-21、C2C12、C6、CaCo-2、CAP/、CAP-T、CHO、CHO2、CHO-DG44、CHO-K1、COS-1、Cos-7、CV-1、樹状細胞、DLD-1、胚性幹（ES）細胞もしくは誘導体、H1299、HEK、293、293T、293FT、Hep G2、造血幹細胞、HOS、Huh-7、人工多能性幹（iPS）細胞もしくは誘導体、Jurkat、K562、L5278Y、LNCaP、MCF7、MDA-MB-231、MDCK、間葉細胞、Min-6、単核球細胞、Neuro2a、NIH 3T3、NIH3T3L1、K562、NK細胞、NS0、Panc-1、PC12、PC-3、末梢血細胞、形質細胞、初代線維芽細胞、RBL、Renca、RLE、SF21、SF9、SH-SY5Y、SK-MES-1、SK-N-SH、SL3、SW403、刺激惹起性多能性獲得（STAP）細胞もしくは誘導体、SW403、T-細胞、THP-1、腫瘍細胞、U2OS、U937、末梢血リンパ球、増大したT細胞、造血幹細胞、またはベロ細胞を含む。
【００５３】
特定の態様は、複数のFN3バリアントを含むポリペプチドまたはポリヌクレオチドライブラリーを製造する方法を含む。特定の局面において、ライブラリーは、10、100、1000、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015またはより多い異なるポリペプチドバリアントまたはポリヌクレオチドバリアント（その間にある全ての値および範囲を含む）を含有することができるが、重複バリアントであってよいことが理解される。このようなポリペプチドまたはポリヌクレオチドを製造する方法は、本明細書に記載される種々のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入のエンジニアリングを含む。
【００５４】
特定の態様は、複数の異なるFN3バリアントを有するFN3ライブラリーを使用した1つまたは複数の結合アッセイを実施する工程を含む、1つまたは複数のFN3バリアントを選択する方法を含む。特定の局面において、ライブラリーは、FN3ループ、FN3ベータ鎖、またはFN3ループおよびベータ鎖の両方にアミノ酸変異を有するFN3ポリペプチドを含むことができる。結合アッセイを実施した後、標的への結合特異性および／または結合親和性のような特定の特性を有する1つまたは複数のFN3バリアントが選択される。特定の局面において、選択されたライブラリーメンバーの1つまたは複数のアミノ酸または核酸配列を、従来法を使用して決定することができる。次いで、選択されたFN3ポリペプチドの配列を使用して、選択された配列のさらなる変異を導入する第2のライブラリーを生産することができる。次いで、第2のライブラリーを、特定の特性を有するFN3ポリペプチドについてスクリーニングすることができる。プロセスは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10回またはより多い回数繰り返すことができる。追加の繰り返しは、ライブラリーを濃縮するだけでなく、潜在的には他のバリアントを含むだろう。
【００５５】
特定の局面において、標的に特異的なタンパク質結合ドメインを選択するための方法は、（a）SEQ ID NO:91の少なくともアミノ酸位置31、33、47、49、71、73、および／または75に対応するアミノ酸置換を有する複数のFN3ドメインポリペプチドを含むポリペプチドライブラリーの1つまたは複数のメンバーの標的特異的結合を検出する工程；および（b）標的に特異的に結合するタンパク質結合ドメインを選択する工程を含む。方法は、最初に、本明細書に記載される複数のFN3ドメインポリペプチドバリアント、例えば、SEQ ID NO:91の少なくともアミノ酸位置31、33、47、49、71、73、および／または75に対応するアミノ酸置換を有するFN3ドメインを調製する工程をさらに含むことができる。特定の特徴を示すとして同定されたポリペプチドを単離することができる。特定の局面において、方法は、選択されたタンパク質結合ドメインの配列の核酸および／またはアミノ酸を決定する工程をさらに含むことができる。次いで、選択されたタンパク質結合ドメインを合成または発現させることができる。
【００５６】
方法は、FN3ループのみまたはFN3ベータ鎖のみにアミノ酸変異を有するライブラリーの第1のスクリーニングを実施する工程およびFN3ループのみまたはFN3ベータ鎖のみの変異を使用した第2のスクリーニングを実施する工程をさらに含むことができる。特定の局面において、第1のスクリーニングは、FN3ループの変異のみを使用し、第2のスクリーニングは、FN3ベータ鎖の変異のみを使用する。さらなる局面において、第2のスクリーニングは、FN3ループおよびベータ鎖の両方の変異を使用することができる。特定の局面において、第1のスクリーニングにおいて変動したFN3アミノ酸残基は、第2のスクリーニングにおいて変動するかまたは変動しない。
【００５７】
さらなる局面は、ポリペプチドライブラリーの1つまたは複数のポリペプチドの特異的結合を検出する工程を含む、標的に特異的に結合するポリペプチドを同定する方法であって、ライブラリーが本明細書に記載されるとおりの複数のフィブロネクチンIII型（FN3）ポリペプチドを含む、方法を含む。
【００５８】
さらなる局面は、標的を含有する試料を標的に特異的に結合するフィブロネクチンIII型（FN3）結合ドメインと接触させる工程を含む、標的分子を検出する方法を含む。
【００５９】
さらなる局面は、酵素をEBPと接触させる工程を含む、酵素の特異性を修飾するための方法を含む。
【００６０】
特定の局面は、フィブロネクチンIII型（FN3）バリアントを生産する方法であって、（a）あるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現させる工程；および（b）発現されたバリアントFN3ドメインを、バリアントFN3を発現する宿主細胞から単離および／または精製する工程を含む、方法を含む。
【００６１】
特定の態様は、キットを対象とする。特定の局面において、キットは、本明細書に記載されるとおりの複数のポリペプチドを含むことができる。さらなる局面において、キットは、本明細書に記載されるとおりのFN3ドメインバリアントをコードする複数のポリヌクレオチドを含むことができる。
【００６２】
用語「フィブロネクチンIII型ドメイン」または「FN3ドメイン」は、任意の生物に由来する野生型フィブロネクチン由来のドメイン（領域）を指す。具体的な態様において、FN3ドメインは、フィブロネクチンIII型の10番目のドメインである。
【００６３】
用語「フィブロネクチンIII型ドメインバリアント」または「FN3バリアントドメイン」は、野生型FN3ドメインのアミノ酸配列と比較して1つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入が存在する、ポリペプチド領域を指す。特定の態様において、FN3バリアントまたはFN3バリアントドメインは、具体的にはフィブロネクチンIII型ドメイン配列（SEQ ID NO:91）のヒトの10番目のモジュールに関して変更を有する。用語「置換バリアント」は、ペプチド配列内の1つまたは複数のアミノ酸の、保存または非保存アミノ酸による交換を含む。いくつかの態様において、FN3ドメインバリアントは、特定の標的に対して、野生型FN3ドメインと比較して増加した結合特性を有する。
【００６４】
用語「FN3ドメインポリペプチド」は、少なくとも1つのFN3ドメインを含むポリペプチドを指す。「バリアントFN3ドメインポリペプチド」は、少なくとも1つのバリアントFN3ドメインを含むポリペプチドを指す。このようなポリペプチドがポリペプチドまたはタンパク質に特異的に結合することが可能であることが企図される。
【００６５】
「非FN3結合配列」は、FN3ドメインまたはFN3ドメインバリアント内に存在せずかつタンパク質またはポリペプチドに特異的に結合する、15を超える連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を指す。いくつかの態様において、非FN3結合配列は、具体的には、フィブロネクチンIII型ドメイン結合配列の10番目以外のモジュールである。
【００６６】
βシートは、タンパク質の通常の二次構造の形状である。べータシートは、少なくとも2または3個の水素結合骨格によって横方向に接続されたベータ鎖からなり、一般にねじれたプリーツシートを形成する。ベータ鎖（またβ鎖）は、典型的には3〜10のアミノ酸長の、骨格がほぼ完全に伸びきった立体構造を有する一続きのポリペプチド鎖である。
【００６７】
ループは、典型的にはタンパク質の他の構成要素を接続する、（アルファへリックスおよびベータシートと比較して）不規則でフレキシブルな一続きのアミノ酸である。FN3との関連において、ループは、ループが接続するベータ鎖によって命名され、例えば、ベータ鎖Aとベータ鎖Bとを接続するループは、ABループである。BCループという用語は、SEQ ID NO:91のアミノ酸22〜30に対応するアミノ酸を指す。CDループという用語は、SEQ ID NO:91のアミノ酸39〜45に対応するアミノ酸を指す。DEループという用語は、SEQ ID NO:91のアミノ酸51〜55に対応するアミノ酸を指す。FGループという用語は、SEQ ID NO:91のアミノ酸76〜87に対応するアミノ酸を指す。
【００６８】
ベータ鎖Aは、ABループの前のアミノ酸を指す。
【００６９】
ベータ鎖Bは、ABループとBCループとを接続するアミノ酸を指す。
【００７０】
ベータ鎖Cは、BCループとCDループとを接続するアミノ酸を指す。
【００７１】
ベータ鎖Dは、CDループとDEループとを接続するアミノ酸を指す。
【００７２】
ベータ鎖Eは、DEループとEFループとを接続するアミノ酸を指す。
【００７３】
ベータ鎖Fは、EFループとFGループとを接続するアミノ酸を指す。
【００７４】
ベータ鎖Gは、FGループの後のアミノ酸を指す。
【００７５】
用語「結合タンパク質」は、非共有化学相互作用を介するポリペプチドのような、別の化合物に特異的に結合するポリペプチドを指す。
【００７６】
本明細書において使用される場合、「モノボディ」は、フィブロネクチンIII型ドメイン（FN3）の10番目のモジュールに関係する配列および構造を有するポリペプチドを意味することを意図し、ドメインは、ジスルフィド結合を欠きかつ複数のベータ鎖を含有するベータ鎖ドメインと、各々1つのベータ鎖を別のベータ鎖に接続する2つ以上のループ領域と、場合によりN末端尾部、C末端尾部、または両方とを含み、ここで、2つ以上のループ領域、N末端尾部、および／またはC末端尾部の少なくとも1つは、標的タンパク質または分子に結合する活性によって特徴付けられる。より具体的には、いくつかの態様において、このようなモノボディは、3つ以上のループ領域、またはさらにより具体的には、4つ以上のループ領域を含むことができる。このようなポリペプチドモノボディのサイズは、好ましくは約30kDa未満、より好ましくは約20kDa未満である。
【００７７】
用語「ライブラリー」は、異なるアミノ酸配列および異なるタンパク質結合特性を有するポリペプチドの集合（例えば、多数のポリペプチド）を指す。いくつかの態様において、FN3ドメインの異なる変異を有するポリペプチドを含むバリアントFN3ドメインライブラリーがある。特に断りのない限り、ライブラリーは、ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸の実際の物理的なライブラリーである。さらなる態様において、生成されたライブラリーに関する情報または生成することができる理論上のライブラリーに関する情報を含むデータベースがある。この情報は、複数の潜在的なバリアントFN3ドメインの説明または構造を含む化合物データベースであり得る。「FN3ベースの分子」は、FN3ドメインまたはFN3バリアントドメインのアミノ酸配列を有する分子を指す。
【００７８】
用語「特異的に結合する」または「特異的結合」は、FN3ベースの分子が別の分子（例えば、標的）に結合する測定可能でかつ再現可能な能力を指し、それは生物学的分子を含む異種性の分子集団の存在下での標的分子の存在を決定するものである。例えば、標的に特異的にまたは優先的に結合するFN3ベースの分子は、この標的に、より高い親和性、アビディティーでより容易に結合し、かつ／または、ほとんどのもしくは全ての他の分子に結合するよりも長期間にわたって結合する、ポリペプチドである。「特異的結合」は、必ずしも排他的結合を必要としない（しかし排他的結合を含むことができる）。
【００７９】
標的に特異的に結合するポリペプチドは、表面プラズモン共鳴によって測定したところ、室温にて、生理学的塩条件およびpH条件下で少なくとも1×10-6 Mの親和性を有する。そのような測定の例は、実施例の部に提供される。
【００８０】
用語「標的」は、本明細書に記載されるFN3ベースの結合分子またはモノボディに特異的に結合する、ペプチド、抗原またはエピトープを指す。標的は、タンパク質上に存在するエピトープ、ペプチド、炭水化物、脂質、および／または有機／無機鉱物の表面を含むが、それらに限定されない。
【００８１】
用語「非天然アミノ酸残基」は、ヒトのような哺乳動物における天然に存在するFN3ドメイン内に存在しないアミノ酸残基を指す。
【００８２】
用語「タグ」、「エピトープタグ」、または「親和性タグ」は、本明細書において互換的に使用され、かつ、通常、抗体または他の結合パートナーによって特異的に認識される分子または分子のドメインを指す。この用語はまた、結合パートナー複合体も同様に指す。したがって、例えば、ビオチンまたはビオチン／アビジン複合体は、共に親和性タグとみなされる。エピトープ／抗体相互作用において認識されるエピトープに加えて、親和性タグはまた、他の結合分子によって認識される「エピトープ」（例えば、受容体が結合するリガンド）、他のリガンドが結合してヘテロ二量体またはホモ二量体を形成するリガンド、Ni-NTAが結合するHis6、ビオチン（アビジン、ストレプトアビジン、または抗ビオチン抗体が結合する）などを含む。
【００８３】
エピトープタグは、当業者に周知である。さらに、多種多様なエピトープタグに特異的な抗体が市販されている。これらは、mycエピトープ（c-myc抗体はSigma, St. Louisから入手可能である)、HNK-1炭水化物エピトープ、HAエピトープ、HSVエピトープ、Hisエピトープ特異的抗体によって認識されるHis4、His5、およびHis6エピトープ（例えばQiagenを参照のこと）などを含むが、それらに限定されない。加えて、エピトープタグ化タンパク質用のベクターが市販されている。ポリペプチドを、FLAG（登録商標）エピトープ（N末端、C末端または内部タグ化）、c-mycエピトープ（C末端）、またはFLAG（N末端）およびc-myc（C末端）エピトープの両方でタグ化することができる。
【００８４】
用語「コンジュゲート」は、FN3ベースの分子との関連において、FN3ベースの分子と非FN3ベースの分子との間の化学的連結を指す。これが、いくつかの態様において、生理学的条件下のアミノ酸残基間で見られる通常のペプチド結合を除外することが具体的に企図される。
【００８５】
本発明の他の態様は、本出願を通して考察される。本発明の1つの局面に関して考察される任意の態様は、本発明の他の局面にも同様に適用される（逆もまた同様）。実施例の部における態様は、本発明の全ての局面に適用可能な本発明の態様であると理解される。
【００８６】
用語「〜を阻害する」、「〜を低減する」もしくは「〜を予防（防止）する」、またはこれらの用語の任意の変形型は、添付の特許請求の範囲および／または本明細書において使用されるとき、所望の結果を達成する任意の測定可能な減少または完全な阻害を含む。
【００８７】
語「１つの」または「ある」の使用は、添付の特許請求の範囲および／または明細書において用語「〜を含む」と併用されるとき、「1つ」を意味してよいが、「1つまたは複数」、「少なくとも1つ」、および「1または1つより多い」の意味とも一致する。
【００８８】
本明細書において考察される任意の態様が本明細書において考察される任意の他の態様に関して遂行されることができることが企図される（逆もまた同様）。さらに、組成物およびキットを使用して、列挙された方法を達成することができる。
【００８９】
本出願を通して、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために採用される装置または方法の誤差の標準偏差を含むことを示すために使用される。
【００９０】
添付の特許請求の範囲における用語「または（もしくは）」の使用は、二者択一のみを指すことが明確に示されない限りまたは二者択一が相互に排他的である場合を除き、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、二者択一のみと「および／または」を指す定義を支持する。また、用語「または（もしくは）」を使用して列挙された全てのことも具体的に除外されてよいことが企図される。
【００９１】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、語「〜を含む（comprising）」（および「comprising」の任意の形態、例えば「comprise」および「comprises」）、「〜を有する（having）」（および「having」の任意の形態、例えば「have」および「has」）、「〜を含む（including）」（および「including」の任意の形態、例えば「includes」および「include」）または「〜を含有する（containing）」（および「containing」の任意の形態、例えば「contains」および「contain」）は、包括的または開放型であり、かつ、追加の列挙されていない要素または方法の工程を除外しない。
【００９２】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の具体的な態様を示すものである一方で、この詳細な説明から本発明の精神および範囲内における種々の変更および改変が当業者に明らかになるであろうから、例示を目的として与えられるにすぎないと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、かつ、本発明の特定の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される具体的な態様の詳細な説明と併せて、これらの図面の1つまたは複数を参照することによってより良く理解され得る。
【００９４】
【図１】合成結合タンパク質による酵素触媒特性の調節。（a）多様化された残基の位置が球および鎖として示され、ループおよび末端が標識されている、モノボディスキャフォールドの概略。（b）異なるクラスの結合タンパク質の概略図。（c〜e）加水分解反応（c）、および特異性修飾剤（黄色）の非存在下（d）または存在下（e）のBgaD-Dのトランスガラクトシル化反応の概略表示。仮定されたサブサイトは、-1、+1、+2および+3と標識される。加水分解およびトランスガラクトシル化反応が起こる触媒部位は、赤色の三角形で示される。（d）および（e）において、ラクトース切断の初期工程は、簡略化のために省略される。トランスガラクトシル化反応によって新たに形成された糖連結は、赤色でマークされる。特異性エンハンサーは、サブサイトへのより大きなオリゴ糖の接近を制限する（d）。
【図２】モノボディは、BgaD-Dの触媒特性を調節する。（a）3つの選択キャンペーンの設計を示す概略。（b）モノボディ間の競合結合。飽和濃度の精製モノボディの非存在下および存在下でのストレプトアビジンコートビーズ上に固定されたMb（BgaD_L23）へのBgaD-Dの結合シグナルが示される。（c）モノボディの親和性および阻害効果。ONPG加水分解反応に対するKd値および効果が示される。酵素なしのバックグラウンド反応を減算した後の、BgaD-Dおよび表示のモノボディの存在下での加水分解反応の吸光度変化がプロットされる。（d）BgaD-DによるGOS産生に対するモノボディの効果（また図4および5を参照のこと）。糖の総量に対する表示の糖の量（重量／重量）が反応時間（左欄）およびラクトースの消費度（右欄）の関数としてプロットされる。これらの実験に使用されたモノボディの濃度は、Mb（BgaD_L02）では100μM、Mb（BgaD_L14）では200μM、およびMb（BgaD_L23）では100μMであり、これらは酵素の>95％の飽和を達成するのに十分である。（e）GOSの総量が最大に達する時点に測定された、dに示された反応の各々におけるオリゴ糖の相対量。ラクトースの消費度もまた示される。カラースキームは、パネルaおよびcと同じである。（f）モノボディ-BgaD-D相互作用に対する活性部位突然変異の効果（また図5Aを参照のこと）。星印付きのバーは、下限を示す。4つのバーの各群は、それぞれ、BgaD-D/WT、BgaD-D/E447Q、BgaD-D/E447K、およびBgaD-D/E447Rに対応する。（g）モノボディ-BgaD-D相互作用に対するオリゴ糖の効果（また図6Bを参照のこと）。fおよびgでは、モノボディの名称が簡略化のために略される。エラーバーは、標準偏差（s.d.）（n=3）を示す。エラーバーが現れない場合は、誤差はマーカーのサイズの範囲内である。4つのバーの各群は、それぞれ、+ラクトース、+DP3、+DP4、および+DP5に対応する。
【図３】Biolacta（登録商標）のBgaD-Dアイソザイムへのモノボディ結合。（a）モノボディのアミノ酸配列、参照としての野生型FN3配列。突然変異した残基は、赤で色付けされる。酵母表面ディスプレイを使用して決定された解離定数（KD）が示される。示される配列は、それぞれ、SEQ ID NO:91、8、52、62、74、81、および87に対応する。（b）精製された試料を使用して測定されたモノボディの結合滴定曲線および解離定数（KD）。ビオチン化モノボディを保有するストレプトアビジンコートビーズの中央蛍光強度がBgaD-D濃度の関数としてプロットされる。示される誤差は、1：1結合モデルの曲線の当てはめからの標準偏差である。（c）精製モノボディを使用した競合結合実験。競合剤モノボディの存在下および非存在下での、上の各パネルに表示されたモノボディのBgaD-Dへの結合が示される。使用されたBgaD-D濃度は、Mb（BgaD_L02）およびMb（BgaD_S10）では10nM、Mb（BgaD_L14）およびMb（BgaD_L23）では30nM、Mb（BgaD_L19）では40nM、またはMb（BgaD_S09）では180nMであった。競合剤として使用されたモノボディ濃度は、各モノボディとBgaD-Dとの相互作用のKD値の200倍であった。（d）モノボディの非存在下または存在下でのBgaD-DのONPG加水分解活性。25℃で10分間の加水分解反応後の405nmにおける吸光度変化が示される。ONPGを含有するがBgaD-Dまたはモノボディを含有しないブランク反応の吸光度変化が減算されている。これらの結果の一部が図2Cに示される。
【図４】モノボディの非存在下または存在下でのBgaD-DによるGOS産生の時間経過。糖の総量に対する個々の糖の量が反応時間に対してプロットされる。反応は、5％（w/v）ラクトースから開始した。これらの実験に使用されたモノボディの濃度は、Mb（BgaD_L02）では100μM、Mb（BgaD_L14）では200μMおよびMb（BgaD_L23）では100μMであった。データは、平均±s.d.（n=3）として表される。
【図５】ラクトースの消費度に関する、モノボディの非存在下または存在下でのBgaD-DによるGOS産生。糖の総量に対する個々の糖の量（重量／重量）（図5に示されるものと同じデータ）が、反応時間の代わりにラクトース変換度の関数として再プロットされる。これらの実験に使用されたモノボディの濃度は、Mb（BgaD_L02）では100μM、Mb（BgaD_L14）では200μMおよびMb（BgaD_L23）では100μMであった。データは、平均±s.d.（n=3）として表される。
【図６】モノボディ結合に対するBgaD-D突然変異および反応生成物の効果。（a）ビーズアッセイを使用して測定された場合の、表示のモノボディ（精製タンパク質）のBgaD-Dおよびその突然変異体への結合滴定。KD値の誤差は、曲線の当てはめからのs.d.である。（b）表示のオリゴ糖の存在下での、表示のモノボディ（精製タンパク質）のBgaD-Dへの結合。使用されたBgaD-Dの濃度は、Mb（BgaD_L02）およびMb（BgaD_S10）では10nM、Mb（BgaD_L14）およびMb（BgaD_L23）では30nM、Mb（BgaD_L19）では40nMまたはMb（BgaD_S09）では180nMであった。競合剤として使用されたオリゴ糖濃度は、20％（w/v）であった。示される誤差は、3連の実験からのs.d.である。Lac、ラクトース。
【図７】この研究で使用された精製タンパク質のSDS-PAGE分析。1ウェル当たり各タンパク質（1.5μg）が4〜20％の勾配のSDS-ポリアクリルアミドゲル上にロードされ、クマシーブリリアントブルーで染色された。また、標準タンパク質の分子量も表示される。
【図８】CRL1へのモノボディ結合。（a）サイド（上）およびループ（下）ライブラリーから生成されたモノボディのアミノ酸配列。「X」は、30％ Tyr、15％ Ser、10％ Gly、5％ Phe、5％ Trp、およびCysを除くその他の全てのアミノ酸の各々2.5％の混合物；「B」は、Gly、Ser、およびTyrの混合物；「J」は、SerおよびTyrの混合物；「O」は、Asn、Asp、His、Ile、Leu、Phe、Tyr、およびValの混合物；「U」は、His、Leu、Phe、およびTyrの混合物；「Z」は、Ala、Glu、Lys、およびThrの混合物を表す。示される配列は、それぞれ、SEQ ID NOS:92、93、94、96、97、107、109、113、115、116、および117に対応する。（b）酵母表面ディスプレイを使用した競合結合実験。競合剤モノボディの存在下および非存在下での、上の各パネルに表示されたモノボディのCRL1への結合が示される。使用されたCRL1濃度は、Mb（S01）、Mb（S02）、Mb（S03）、およびMb（S05）では10nM、Mb（L23）およびMb（L24）では20nM、ならびにMb（S16）、Mb（L18）、およびMb（S19）では100nMであった。競合剤として使用されたモノボディ濃度は、各競合剤モノボディとCRL1との相互作用のKD値よりも100〜200倍高かった。（c）モノボディの非存在下または存在下でのCRL1のpNP-エステル加水分解活性。このアッセイに使用されたタンパク質濃度は、CRL1およびモノボディではそれぞれ10nMおよび1μMであった。各鎖長のpNP-エステルの活性は、モノボディの非存在下でのCRL1の活性に対して別々に正規化された。
【図９】モノボディは、CRL1の鎖長特異性を調節する。（a）モノボディ（50μM）の非存在下または存在下でのCRL1（175nM）によって触媒されるトリアシルグリセリド加水分解の時間経過。表示の脂肪酸の濃度（mM）が反応時間の関数としてプロットされる。（b）各鎖長のトリアシルグリセリドのKcat値。データ（上のパネル）を線形関数に当てはめることによってKcat値が計算された。モノボディの効果をより良く理解するために縦軸がパネル毎に異なることに留意されたい。
【図１０】切断性および非切断性の脂肪酸結合部位を示す、基質類似体との複合体のCRL1の構造。静電位が計算され、PyMOL（ワールドワイドウェブ上のpymol.orgに見いだされる）を使用してCRL1構造の表面モデルにマッピングされた（PDBID：1LPP）。活性部位残基が、酸素および窒素原子がそれぞれ赤および青で色付けおよび標識された、黄色の球棒モデルとして表示される。切断性および非切断性の脂肪酸結合部位にそれぞれ結合する基質類似体HDS（1-ヘキサデカノスルホン酸）の2つの分子が、その炭素原子が緑で色付けおよび標識された球棒モデルとして示される。非切断性の脂肪酸結合部位として提案される疎水性パッチが標識「Ser209」の後に位置する。また、切断性基質結合部位を覆う螺旋状セグメント「Lid」も表示される。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
発明の詳細な説明
酵素修飾剤を生成する能力は、生化学および製造業に用途を有する。典型的には、酵素の基質特異性を修飾することは、酵素の3次元構造に関する少なくともいくつかの情報を必要とする。しかしながら、時として、3次元構造は、入手可能でなく、かつ／または、それに到達するのは困難である。本明細書に記載されるのは、酵素の構造に関する知識が全くなくても生成することができる新規の酵素基質特異性修飾剤を開発するための方法である。また、本明細書に記載されるのは、β-ガラクトシダーゼに結合するポリペプチド、ならびにβ-ガラクトシダーゼの阻害剤および特異性修飾剤であるポリペプチドである。また、本明細書に記載されるのは、リパーゼ1に結合するポリペプチド、ならびにリパーゼ1の阻害剤および特異性修飾剤であるポリペプチドである。
【００９６】
I. 酵素結合タンパク質
いくつかの態様において、酵素結合タンパク質は、異なる結合特異性を有する酵素結合タンパク質のライブラリーから同定されるタンパク質である。いくつかの態様において、酵素結合タンパク質はCDRベースである。用語「CDRベース」は、抗体由来のCDR（相補性決定領域）と同じもしくは類似する配列および／または結合機序を採用するタンパク質を指す。いくつかの態様において、EBPは、抗体模倣体である。抗体模倣体は、抗体のように抗原に特異的に結合することができるが抗体とは構造的に関連しない、有機化合物である。抗体模倣体は、通常、約3〜20kDaのモル質量の人工ペプチドまたはタンパク質である。核酸および低分子は、時として、同じく抗体模倣体と見なされるが、人工抗体、抗体断片およびこれらから構成される融合タンパク質とは見なされない。いくつかのタイプは、抗体様ベータシート構造を有する。抗体に勝る共通の利点は、より良好な溶解性、組織透過性、熱および酵素に対する安定性、ならびに比較的低い生産コストである。いくつかの態様において、抗体よりも抗体模倣体を使用する利点は、模倣体のより小さいサイズに関係する。
【００９７】
A. モノボディ
いくつかの態様において、EBPは、モノボディである。アドネクチン（Adnectin）としても知られているモノボディは、抗原に結合することができる遺伝子操作されたタンパク質である（Koide et al. 1998）。それらの名称にもかかわらず、これらは抗体の区分ではなく、抗体模倣体の一種となる。モノボディは、94アミノ酸からなり、かつ、約10kDaの分子質量を有し得る。すなわち、IgG型抗体よりも15倍小さくかつ抗体の単一可変ドメインのサイズと同等である。これらは、ヒトフィブロネクチンの構造、より具体的にはその10番目の細胞外III型ドメインに基づく。
【００９８】
フィブロネクチンは、インテグリンと呼ばれる膜貫通受容体タンパク質に結合する、高分子量（およそ440kDa）の細胞外マトリクス糖タンパク質である（Pankov et al., 2002）。フィブロネクチンは、一対のC末端ジスルフィド結合によって連結された2つのほぼ同一のポリペプチド鎖からなる二量体として存在する（Mao and Schwarzbauer, 2005）。各フィブロネクチン単量体は、3種類のモジュール：I型、II型、およびIII型を含有する。全ての3つのモジュールは、2つの逆平行のβ-シートから構成される；しかしながら、I型およびII型は、鎖内ジスルフィド結合によって安定化されるが、一方で、III型モジュールは、ジスルフィド架橋を全く含有しない。III型モジュール内にジスルフィド結合が存在しないと、これらは加力下で部分的にほどかれることを許す（Erickson, 2002）。
【００９９】
モジュールは、フィブロネクチン単量体の長さに沿っていくつかの機能的なタンパク質結合ドメインに分類される。モジュールIII9-10は、フィブロネクチンの「細胞結合ドメイン」に対応する。RGD配列（Arg-Gly-Asp）は、III10内に位置し、かつ、細胞表面のα5β1およびαVβ3インテグリンを介する細胞付着部位である。「相乗作用部位」は、III9内にあり、かつ、α5β1インテグリンとのフィブロネクチンの会合の調節において役割を有する（Sechler et al., 1997）。
【０１００】
3つのフィブロネクチン結合ドメインの1つであるFN3ドメインは、約100アミノ酸長であり、かつ、7つのベータ鎖（鎖A、B、C、D、E、F、およびG）を有するベータサンドイッチ構造を保有し、新規結合タンパク質の生成のための有効な非抗体の「代替」スキャフォールドとして確立されている。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるFN3は、その分子の一端に3つの表面露出ループを有する。このスキャフォールドを使用したエンジニアリング戦略は、表面ループの長さおよびアミノ酸配列の両方を多様化することによって作製されるコンビナトリアルライブラリーに基づく。このようなライブラリーから、関心対象の標的に結合することが可能なFN3バリアントを、種々の選択方法を使用して単離することができる。FN3スキャフォールドの利用は、多数の異なるタンパク質標的への高親和性の結合タンパク質の生産において実証されている（例えば、Gilbreth RN, et al., J Mol Biol. 2008; 381:407-18; Gilbreth RN, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108:7751-6; Grebien F, et al., Cell. 2011; 147:306-19; Koide A, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99:1253-8; Koide A, et al., J Mol Biol. 1998;284:1141-51; Koide A, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104:6632-7; Koide A, et al., J Mol Biol. 2012;415:393-405; Sha F, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110:14924-9; および Wojcik J, et al., Nat Struct Mol Biol. 2010;17:519-27を参照のこと、これらの各々は全ての目的のために参照によって組み入れられる）。このスキャフォールドから生成されるこれらの結合タンパク質は、モノボディと称される。そのジスルフィド結合の欠如、細菌系における高レベル発現の簡便性、および小さいサイズにより、FN3スキャフォールドは、従来の抗体またはその断片と比較して多くの利点を提供する。FN3ポリペプチドまたはスキャフォールドの一例は、以下のアミノ酸配列を有する。
2018524012.tif 000002
【０１０１】
特定の局面において、FN3スキャフォールドまたはボディは、ベータ鎖A、ベータ鎖B、ベータ鎖C、ベータ鎖D、ベータ鎖E、ベータ鎖F、およびベータ鎖Gを含む。接続ベータ鎖A、B、C、D、E、F、およびGは、ループ領域AB（15〜16）、BC（22〜30）、CD（39〜45）、DE（51〜55）、EF（60〜66）、およびFG（76〜87）である。ベータ鎖Aは、ABループの前に、ベータ鎖Gは、FGループの後に来る。
【０１０２】
FN3ポリペプチドを、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20もしくはより多いアミノ酸、またはその中の導出可能な任意の範囲をFN3ループ内において挿入または欠失することによって修飾することができる。バリアントは、米国特許第6,673,901号に考察されており、これは、FN3モノボディに関する態様に関して参照によって本明細書に組み入れられる。
【０１０３】
コンビナトリアルライブラリーは、多数の化学「ビルディングブロック」を組み合わせることによる化学的合成または生物学的合成のいずれかによって生成される多様な化合物のコレクションである。例えば、ポリペプチド（例えば、突然変異タンパク質またはバリアント）ライブラリーのような線形コンビナトリアル化学ライブラリーは、一組の化学ビルディングブロック（アミノ酸と呼ばれる）を、所与の化合物の長さについて全ての可能な方法で組み合わせることによって形成される。このような化学ビルディングブロックのコンビナトリアル混合を通して何百万もの化合物を合成することができる。例えば、一人のコメンテーターは、100の交換可能な化学ビルディングブロックの系統的なコンビナトリアル混合が理論上1億の四量体化合物または100億の五量体化合物を生じることを観察している（Gallop et al., 1994）。
【０１０４】
本開示の態様は、FN3ドメインのコンビナトリアルライブラリーの使用を対象とする。特定の局面において、ライブラリーのポリペプチドは、FN3ドメインのベータ鎖またはボディの1つまたは複数にアミノ酸配列の変異を含む。特定の局面において、ライブラリーは、FN3ドメインの1つまたは複数のループにアミノ酸配列の変異を含む。なおさらなる局面において、ライブラリーは、FN3ドメインのループおよびベータ鎖の両方に変異を含む。
【０１０５】
FN3バリアントは、アミノ酸位置の1つまたは複数にアラニン置換を含むことができる。置換は、タンパク質の全体的な正味電荷、極性、または疎水性に効果がほとんどないか全くない保存的置換を含むが、それらに限定されない。
【０１０６】
特定の局面において、FN3ドメインは、以下のFN3残基の置換（SEQ ID NO:91に対応する）を非限定的に含む、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25のアミノ酸置換を有するだろう：
2018524012.tif 000003
2018524012.tif 000004
。
【０１０７】
なおさらなる態様において、他のアミノ酸置換を、上に列挙されたそのアミノ酸置換の導入の前、間、または後に導入することができる。その他の置換（SEQ ID NO:91に対応する）は、
2018524012.tif 000005
2018524012.tif 000006
の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12を含むがこれらに限定されない。
【０１０８】
特定の局面において、ライブラリーは、アミノ酸30、31、33、35、41、42、43、44、45、47、49、50、71、73、75、76、77、78、79、80、81. 82、83、84、および／または85に対応する1つまたは複数の残基と組み合わせて、SEQ ID NO:91のアミノ酸30、31、33、35、41、42、43、44、45、47、49、50、71、73、75、76、77、78、79、80、81. 82、83、84、および／または85に対応するアミノ酸に変異を含む。
【０１０９】
B. 抗体
いくつかの態様において、EBPは、抗体である。抗体は、本明細書に記載される種々の抗体のいずれかであることができ、この非限定的な例は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ベニヤ抗体（veneered antibody）、ダイアボディ(diabody)、ヒト化抗体、抗体誘導体、組換えヒト化抗体、ナノボディ、重鎖のみの抗体（例えば、ラクダ、ラマ、アルパカのようなラクダ科由来の）またはその各々の誘導体もしくは断片を含む。
【０１１０】
抗体は、当技術分野において公知の従来技術を使用して生成することができ、かつ、文献によく記載されている。ポリクローナル抗体の生産のためのいくつかの方法論が存在する。例えば、ポリクローナル抗体は、典型的には、非限定的に、ニワトリ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、マウス、ラット、およびウサギのような好適な哺乳動物の免疫化によって生産される。抗原は、哺乳動物に注射されると、B-リンパ球を誘発して、抗原に特異的な免疫グロブリンを産生する。免疫グロブリンを哺乳動物の血清から精製し得る。この方法論の一般的な変形は、最適な生産および動物の人道的処置のための、アジュバント、投与の経路および部位、部位当たりの注射容量および動物当たりの部位数の改変を含む。例えば、アジュバントは、典型的には、抗原に対する免疫応答を改善または増強するために使用される。ほとんどのアジュバントは、注射部位抗原貯留を提供し、これは流入領域リンパ節への抗原の遅放を可能にする。他のアジュバントは、広い表面積に広がるタンパク質抗原分子の濃縮を促進する界面活性剤、および免疫刺激分子を含む。ポリクローナル抗体生成のためのアジュバントの非限定的な例は、フロイントアジュバント、Ribiアジュバント系、およびTitermaxを含む。ポリクローナル抗体は、当技術分野において公知の方法を使用して生成することができ、その方法のいくつかは、米国特許第7,279,559号；第7,119,179号；第7,060,800号；第6,709,659号；第6,656,746号；第6,322,788号；第5,686,073号；および第5,670,153号に記載されている。
【０１１１】
モノクローナル抗体は、当技術分野において公知でありかつ文献によく記載されている従来のハイブリドーマ技術を使用して生成することができる。例えば、ハイブリドーマは、好適な不死化細胞株（例えば、非限定的に、Sp2/0、Sp2/0-AG14、NSO、NS1、NS2、AE-1、L.5、P3X63Ag8,653、Sp2 SA3、Sp2 MAI、Sp2 SS1、Sp2 SA5、U397、MIA 144、ACT IV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH 313、HL-60、MLA 144、NAMAIWA、NEURO 2A、CHO、PerC.6、YB2/Oのような骨髄腫細胞株）など、または異種骨髄腫、その融合産物、またはそれに由来する任意の細胞もしくは融合細胞、または当技術分野において公知のとおりの任意の他の好適な細胞株を、抗体産生細胞、例えば、非限定的に、単離もしくはクローン脾臓細胞、末梢血細胞、リンパ細胞、扁桃細胞、または他の免疫細胞もしくはB細胞含有細胞、または（内因性または異種のいずれかの核酸として、組換えまたは内因性のウイルス、細菌、藻類、原核生物、両生類、昆虫、爬虫類、魚類、哺乳動物、齧歯類、ウマ科、ヒツジ科、ヤギ、ヒツジ、霊長類、真核生物のゲノムDNA、cDNA、rDNA、ミトコンドリアDNAもしくはRNA、葉緑体DNAもしくはRNA、hnRNA、mRNA、tRNA、単鎖、二本鎖もしくは三本鎖、ハイブリッドしたものなど、またはその任意の組み合わせとして）重鎖もしくは軽鎖の定常もしくは可変もしくはフレームワークもしくはCDR配列を発現する任意の他の細胞と融合することによって生産される。また、抗体産生細胞を、関心対象の抗原で免疫されているヒトまたは他の好適な動物の末梢血、または好ましくは脾臓もしくはリンパ節から得ることもできる。また、任意の他の好適な宿主細胞を、本開示の抗体、その特定の断片またはバリアントをコードする異種または内因性核酸を発現させるために使用することもできる。融合細胞（ハイブリドーマ）または組換え細胞を、選択的培養条件または他の好適な公知の方法を使用して単離し、かつ限界希釈法もしくは細胞選別、または他の公知の方法によってクローン化することができる。
【０１１２】
必要な特異性を有する抗体を生産または単離する他の好適な方法を使用することができ、これらの方法は、当技術分野において公知の方法を使用して、組換え抗体を、ペプチドまたはタンパク質ライブラリー（例えば、非限定的に、バクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、cDNAなど）、ディスプレイライブラリー（例えば、MorphoSys（Martinsreid/Planegg, Del.）、BioInvent（Lund, Sweden）、Affitech（Oslo, Norway）などの種々の販売会社から入手可能であるもの）から選択する方法を含むが、それらに限定されない。当技術分野において公知の方法は、特許文献に記載されており、そのいくつかは、米国特許第4,704,692号；第5,723,323号；第5,763,192号；第5,814,476号；第5,817,483号；第5,824,514号；第5,976,862号を含む。代替法は、当技術分野において公知のとおりおよび／または本明細書に記載されるとおりの、ヒト抗体のレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物の免疫化に依拠する（例えば、SCIDマウス、Nguyen et al. (1977) Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997); Sandhu et al. (1996) Crit, Rev. Biotechnol. 16:95-118; Eren et al. (1998) Mumma 93:154-161）。このような技術は、リボソームディスプレイ（Wanes et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942; Hanes et al, (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14130-14135）；単細胞抗体生産技術（例えば、選択されたリンパ球抗体法（「SLAM」）（米国特許第5,627,052号、Wen et al, (1987) J. Immunol 17:887-892; Babcook et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848）；ゲルマイクロドロップおよびフローサイトメトリー（Powell et al. (1990) Biotechnol. 8:333-337; One Cell Systems, (Cambridge, Mass).; Gray et al. (1995) J. Imm. Meth. 182:155-163; および Kenny et al, (1995) Bio. Technol. 13:787-790）；B細胞選択（Steenbakkers et al. (1994) Molec. Biol. Reports 19:125-134）を含むが、それらに限定されない。
【０１１３】
C. アフィボディ
いくつかの態様において、EBPは、アフィボディである。アフィボディ分子は、モノクローナル抗体を模倣する、多数の標的タンパク質またはペプチドに高い親和性で結合するようにエンジニアリングされた低分子タンパク質であり、それゆえ、抗体模倣体のファミリーのメンバーである。アフィボディ分子は、それ自体または他のタンパク質パートナーとの融合を介して種々の宿主細胞において可溶性かつタンパク分解に安定な形態で発現することができる、3ヘリックスバンドルドメインに基づく。これらは、修飾を許容し、かつ、融合タンパク質へ組み込まれるときに独立に折り畳まれる。同じ特異性のアフィボディ分子の頭尾融合は、標的結合においてアビディティー効果を与えることが証明されており、そして、異なる特異性のアフィボディ分子の頭尾融合は、二重特異性または多重特異性の親和性タンパクを得ることを可能にする。他のタンパク質との融合物も作製することができる。部位特異的コンジュゲーションのための部位は、所望の位置での単一のシステインの導入によって容易になる。
【０１１４】
多数の異なるアフィボディ分子が化学的合成によって生産されている。これらはシステインまたはジスルフィド架橋を含有していないため、これらは、保護基が合成後に除去されると、正確な3次元構造へ自発的かつ可逆的に折り畳まれる。
【０１１５】
アフィボディ分子は、58のアミノ酸を有する3つのアルファへリックスからなり、かつ、約6kDaのモル質量を有する。アフィボディ分子は、高温（90℃）または酸性およびアルカリ性条件（それぞれpH 2.5またはpH 11）に耐えることが示されている。ナノモル以下までの親和性を有する結合剤がナイーブなライブラリー選択から得られており、そして、ピコモルの親和性を有する結合剤が親和性成熟後に得られている。
【０１１６】
D. アンチカリン
いくつかの態様において、EBPは、アンチカリンである。アンチカリンは、抗原に、タンパク質または低分子のいずれかに結合することができる人工タンパク質である。これらは、抗体と構造的に関連していないために、これらは抗体模倣体の一種となる。その代わりに、これらは、天然結合タンパク質のファミリーであるヒトリポカリンに由来する。アンチカリンは、モノクローナル抗体の代わりに使用することができるが、サイズが約180アミノ酸であり質量が約20kDaで約8倍小さい。
【０１１７】
アンチカリンは、抗体よりも良好な組織透過性を有し、かつ、70℃までの温度で安定である。抗体と異なり、これらは、大腸菌のような細菌細胞において大量に生産することができる。抗体は、タンパク質のような高分子にのみ指向され得、および高分子が結合している場合に限り低分子（ハプテン）にも指向され得るが、アンチカリンは、低分子にも同様に選択的に結合することができる。
【０１１８】
アンチカリンの特徴は、ループによって2つずつ連結された8つの逆平行のβ鎖と付着したα-ヘリックスとによって形成された、それらのバレル構造にある。アンチカリンの主要構造は、野生型リポカリンと同一である。立体構造に関する偏差は、リガンド結合部位に達する4つのループ内に主に位置している。結合部位におけるアミノ酸の突然変異誘発は、親和性および選択性を変化させることを可能にする。
【０１１９】
E. Kunitzバリアント
いくつかの態様において、EBPは、Kunitzバリアントである。Kunitzドメインは、タンパク質分解酵素の機能を阻害するタンパク質の活性ドメインであるか、または、より具体的には、Kunitz型のドメインはプロテアーゼ阻害剤である。これらは、約50〜60アミノ酸長で分子量が6kDaであり比較的小さい。Kunitz型プロテアーゼ阻害剤の例は、アプロチニン（ウシ膵臓トリプシン阻害剤、BPTI）、アルツハイマー病のアミロイド前駆体タンパク質（APP）、および組織因子経路阻害剤（TFPI）である。
【０１２０】
その構造は、ジスルフィドリッチなアルファ＋ベータ折り畳み構造である。ウシ膵臓トリプシン阻害剤は、広く研究されているモデル構造である。特定のファミリーメンバーは、ダニ抗凝固ペプチド（TAP、P17726）と似ている。これは、血液凝固経路におけるXa因子の高度に選択的な阻害剤である。TAP分子は、高度に双極性であり、かつ、ねじれた二本鎖の逆平行のベータシートとそれに続くアルファヘリックスを形成するように配置される。
【０１２１】
このドメインを有する配列の大部分は、MEROPS阻害剤ファミリーI2、clan IB；Kunitz／ウシ膵臓トリプシン阻害剤ファミリーに属し、これらは、S1ファミリーのプロテアーゼを阻害し、かつ、後生動物に制限される（唯一の例外としてポックスウイルスの一種である昆虫ポックスウイルス（Amsacta moorei entomopoxvirus））。これらは、わずかな二次構造を有する短い（約50〜60アミノ酸残基）アルファ／ベータタンパク質である。この折り畳み構造は、3つのジスルフィド結合によって構築される。このファミリーのタイプの例は、BPTI（または塩基性プロテアーゼ阻害剤）であるが、そのファミリーは、ヘビ毒塩基性プロテアーゼ；哺乳動物のインターアルファトリプシン阻害剤；トリプスタチン、ラットマスト細胞のトリプシンの阻害剤；アルツハイマー病のアミロイドベータタンパク質の選択的スプライシング形態に見いだされるドメイン；VI型およびVII型コラーゲンのアルファ-1およびアルファ-3鎖のC末端にあるドメイン；組織因子経路阻害剤前駆体；ならびにマメ科の種子に含有されるKunitz STIプロテアーゼ阻害剤のような多数の他のメンバーを含む。
【０１２２】
Kunitzドメインは、特異的なタンパク質構造を認識することができる独立型のペプチドとして安定であり、かつまた、遊離形態で競合的プロテアーゼ阻害剤としても作用する。これらの特性は、EBPを開発するために有用である。候補EBPは、ファージディスプレイのようなディスプレイ技術の助けを借りて1000万超のバリアントを含有する分子ライブラリーから選択され、かつ、遺伝子操作された生物によって大スケールで生産することができる。
【０１２３】
F. DARPin
いくつかの態様において、EPBは、DARPinである。DARPin（設計されたアンキリンリピートタンパク質（designed ankyrin repeat protein）の頭字語）は、典型的には高度に特異的でかつ高親和性の標的タンパク質結合を示す、遺伝子操作された抗体模倣体タンパク質である。これらは、天然のアンキリンタンパク質に由来し、これらのタンパク質の少なくとも3つ、通常4つまたは5つのリピートモチーフからなる。それらの分子質量は、4つまたは5つのリピートDARPinでそれぞれ約14または18kDa（キロダルトン）である。
【０１２４】
DARPinは、高親和性のタンパク質-タンパク質相互作用を媒介する性質があるタンパク質クラスである、天然に存在するアンキリンタンパク質に由来する。数千の天然アンキリンリピートモチーフ（各々、約33アミノ酸の）の配列整列が、構造に基づいた設計および組換えDNA法と組み合わされて、これらのタンパク質の生成のために使用される。DARPinは、大きな潜在的な標的相互作用表面を有する安定なタンパク質ドメインを形成する繰り返しの構造単位から構成される。典型的には、DARPinは、天然のアンキリンリピートタンパク質ドメインの平均サイズに対応する4つまたは5つのリピートから構成される。3つ未満のリピートを有するタンパク質は、三次構造を形成しない。リピートの数に依存する分子質量は、以下のとおりである。
2018524012.tif 000007
【０１２５】
1012を超えるバリアントの多様化を有する無作為化された潜在的な標的相互作用残基を伴うDARPinのライブラリーがDNAレベルで生成されている。これらのライブラリーから、リボソームディスプレイまたはシグナル識別粒子（SRP）ファージディスプレイを使用して、最適な標的にピコモルの親和性および特異性で結合するDARPinを選択することができる。
【０１２６】
DARPinは、大腸菌の細胞質内にて、高レベル（発酵中10g/l、振盪フラスコ中1g/lを超える）で、可溶性形態で発現される。そのタンパク質は、高い熱安定性および熱力学安定性（変性中点：Tm>66℃、平衡アンフォールディング：ΔG>9.5kcal/mol）を示し、これはリピート数の増加に伴って増加する。DARPinは、ヒト血清中で安定であり、かつ、T細胞エピトープを含有しない。結合DARPinの高い特異性および親和性は、剛体結合様式に起因している。遺伝子融合によって製造された多重特異性または多価構築物は、単一ドメインDARPinと類似の特性を示す。スキャフォールド中にシステインが存在しないと、部位特異的システインのエンジニアリングが可能になり、分子への化学物質の部位指向的カップリングが可能となる。
【０１２７】
G. 他のEBPスキャフォールド
他のいくつかの態様では、EBPは、当技術分野において公知のものである、さらなる例は、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、およびフィノマーを含む。
【０１２８】
H. ライブラリースクリーニング
特定のリガンドもしくは標的に結合しかつ／または特定の活性の修飾（例えば、基質特異性修飾剤、阻害剤など）を標的（すなわち、酵素）に付与するEBPを選択するために、ライブラリースクリーニングを実施することができる。コンビナトリアルスクリーニングは、特異的突然変異誘発（「ランダム設計」）アプローチで実行可能でない、多数のEBPを容易に生産およびスクリーニングすることができる。所望の結合能を有するEBPをインビトロで選択し、回収し、そして増幅させることができる。選択されたEBPをコードする核酸を配列決定することによって、選択されたクローンのアミノ酸配列を容易に同定することができる。
【０１２９】
いくつかの態様において、特定のEBPは、本明細書において考察された置換の前のポリペプチドの親和性より少なくとも2倍大きい、標的に対する親和性を有する。いくつかの態様において、親和性は、別のFN3ベースの分子と比較して、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100倍増加するか、少なくとも、または最大で約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100倍増加する。
【０１３０】
種々の異なるタイプのEBPのライブラリー構築は、当技術分野において公知であり、また商業的に購入可能である。例えば、Koide and Koide, Methods Mol. Biol., 352:95-109, 2007（参照によって本明細書に組み入れられる）は、モノボディライブラリーの構築を記載している。
【０１３１】
II. ポリペプチド組成物
本発明は、モノボディおよび／または他の結合ポリペプチドの同定および使用に関連する方法および組成物に関係する。いくつかの態様において、結合ポリペプチドおよび／またはモノボディは、酵素結合ポリペプチド（EBP）である。本明細書において使用される場合、「モノボディ」は、別のタンパク質の特異的抗原に結合するポリペプチドである。本明細書において使用される場合、「ポリペプチド」は、一般に、約10〜約1,000またはより多いアミノ酸残基のペプチド配列を指すと本明細書において定義される。
【０１３２】
特定の態様において、ポリペプチドは、NまたはC末端で第2のペプチドまたはポリペプチドに連結された融合ポリペプチドである。第2のポリペプチドは、例えば、別の結合ポリペプチドまたは検出可能標識であってよい。他の態様において、ポリペプチドは、結合ポリペプチドと第2のペプチドまたはポリペプチド配列との間に挿入されるリンカーを含む。リンカーは、本明細書以下により詳しく考察される。
【０１３３】
さらに、本明細書に示されるポリペプチドは、任意の数の追加のアミノ酸残基の配列をアミノ酸配列のN末端またはC末端のいずかに含んでよい。例えば、結合ポリペプチドを含むアミノ酸配列のN末端、C末端、またはN末端とC末端との両方のいずれかに約3〜約1,000またはより多いアミノ酸残基のアミノ酸配列があってよい。
【０１３４】
ポリペプチドは、ポリペプチドの同定、標的化、および／または精製を容易にする、抗体エピトープまたは他のタグの付加を含んでよい。タグとしての6×HisおよびGST（グルタチオンSトランスフェラーゼ）の使用もよく知られている。融合接合部またはその近傍に切断部位を含有することは、精製後の外来ポリペプチドの除去を容易にするだろう。ポリペプチドに含まれ得る他のアミノ酸配列は、機能的ドメイン、例えばヒドロラーゼのような酵素由来の活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞標的化シグナルまたは膜貫通領域を含む。ポリペプチドは、1つまたは複数の追加の組織標的化部分をさらに含んでよい。
【０１３５】
ポリペプチドは、天然配列と比べてアミノ酸の欠失および／または置換を保有してよい。アミノ酸置換を有する配列が企図され、欠失を有する配列、ならびに欠失および置換を有する配列も同じく企図される。いくつかの態様において、これらのポリペプチドは、挿入または付加されたアミノ酸をさらに含んでよい。
【０１３６】
置換または交換バリアントは、典型的には、タンパク質内の1つまたは複数の部位での1つのアミノ酸の別のアミノ酸への交換を含有し、かつ、ポリペプチドの1つまたは複数の特性を調節するよう、特定するとその有効性または特異性を増加させるよう設計されてよい。この種類の置換は、保存的置換であってもまたは保存的置換でなくてもよい。保存的置換は、1つのアミノ酸が類似の形状および電荷のアミノ酸に交換された場合の置換である。結合ポリペプチドがモノボディライブラリーである態様において、モノボディライブラリーは、多様なアミノ酸配列を提供するのに役立ち、そして、結合選択性の保存的置換は必要とされない。しかしながら、使用される場合、保存的置換は、当技術分野において周知であり、かつ、例えば、アラニンからセリンへの変化；アルギニンからリジンへの変化；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへの変化；アスパラギン酸からグルタミン酸への変化；システインからセリンへの変化；グルタミンからアスパラギンへの変化；グルタミン酸からアスパラギン酸への変化；グリシンからプロリンへの変化；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへの変化；イソロイシンからロイシンまたはバリンへの変化；ロイシンからバリンまたはイソロイシンへの変化；リジンからアルギニンへの変化；メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへの変化；フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニンへの変化；セリンからトレオニンへの変化；トレオニンからセリンへの変化；トリプトファンからチロシンへの変化；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへの変化；およびバリンからイソロイシンまたはロイシンへの変化を含む。上に考察されたもの以外の変化は、一般に、保存的置換ではないと見なされる。上の保存的置換の1つまたは複数を態様として含んでよいことが特別に企図される。いくつかの態様において、このような置換は、特別に除外される。さらに、追加の態様において、保存的でない置換がバリアントにおいて採用される。
【０１３７】
欠失または置換に加えて、ポリペプチドは、1つまたは複数の残基の挿入を保有してよい。
【０１３８】
結合ポリペプチド配列は、天然の対応物と構造的に等価であってよい。例えば、結合ポリペプチド配列は、結合標的、タンパク質、またはペプチドセグメントに適切な構造および立体構造を形成する。
【０１３９】
以下は、分子または第二世代の分子のライブラリーを作製するためのポリペプチドのアミノ酸の変化に基づく考察である。例えば、あるアミノ酸を、機能、例えば標的ペプチド配列と相互作用する能力をあまり喪失することなしに、ポリペプチド内で他のアミノ酸に置換し得る。ポリペプチドの機能的活性を規定するのはポリペプチドの相互作用能および性質であるため、あるアミノ酸置換をポリペプチド配列内で行うことができるが、それにもかかわらず類似の特性を有するポリペプチドを生成することができる。
【０１４０】
このような変化を起こす上で、アミノ酸のヒドロパシー指標（hydropathic index）を考慮してよい。タンパク質への相互作用機能の付与におけるヒドロパシーアミノ酸指標の重要性は、当技術分野において一般に理解される（Kyte and Doolittle, 1982）。アミノ酸の相対的なヒドロパシーの特徴が、結果として生じるタンパク質の二次構造に寄与し、これが次に、そのタンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原などとの相互作用を規定することが認められる。
【０１４１】
また、類似のアミノ酸の置換を親水性に基づいて効果的に行うことができることも、当技術分野において理解される。米国特許第4,554,101号（参照によって本明細書に組み入れられる）は、タンパク質の最大の局所的平均親水性が、その隣接するアミノ酸の親水性によって左右されるため、タンパク質の生物学的特性と相関すると述べている。米国特許第4,554,101号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（+3.0）；リジン（+3.0）；アスパラギン酸（+3.0±1）；グルタミン酸（+3.0±1）；セリン（+0.3）；アスパラギン（+0.2）；グルタミン（+0.2）；グリシン（0）; トレオニン（-0.4）；プロリン（-0.5±1）；アラニン（-0.5）；ヒスチジン（-0.5）；システイン（-1.0）；メチオニン（-1.3）；バリン（-1.5）；ロイシン（-1.8）；イソロイシン（-1.8）；チロシン（-2.3）；フェニルアラニン（-2.5）；トリプトファン（-3.4）。
【０１４２】
アミノ酸を類似の親水性値を有する別のアミノ酸に置換しても、依然として生物学的に等価でかつ免疫学的に等価なタンパク質を生成することができると理解される。このような変化において、親水性値が±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そして、±0.5以内であるアミノ酸の置換がさらにより特に好ましい。
【０１４３】
上に概説されたように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。しかしながら、いくつかの局面において、非保存的置換が企図される。特定の局面において、ランダムな置換も企図される。種々の前述の特徴を考慮した例示的な置換は当業者に周知であり、かつ、以下を含む：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシン。
【０１４４】
タンパク性組成物を、（i）標準的な分子生物学技術を通じたタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの発現、（ii）天然源からのタンパク性化合物の単離、または（iii）タンパク性材料の化学的合成を含む、当業者に公知の任意の技術によって製造し得る。種々の遺伝子に関するヌクレオチドならびにタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド配列は、過去に開示されており、かつ、広く認められているコンピューターデータベースにおいて見いだしてよい。このようなデータベースの1つは、National Center for Biotechnology Information（国立バイオテクノロジー情報センター）のGenBankおよびGenPeptデータベース（ワールドワイドウェブ上のncbi.nlm.nih.gov/）である。これらの遺伝子のコード領域の全てまたは一部は、本明細書に開示される技術を用いて、または当業者に公知であるように、増幅および／または発現してもよい。
【０１４５】
これらの組成物の他のポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、置換、挿入、または欠失バリアントであることができる。ポリペプチド内の修飾は、元のポリペプチドと比較した場合に、ペプチドまたはポリペプチドの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500またはより多い非連続または連続アミノ酸に影響を及ぼし得る。
【０１４６】
タンパク質は、組換えであっても、またはインビトロで合成されてもよい。代替的に、組換えタンパク質を細菌または他の宿主細胞から単離してよい。
【０１４７】
用語「機能的に等価なコドン」は、アルギニンまたはセリンの6つのコドンのような同じアミノ酸をコードするコドンを指すために本明細書において使用され、かつまた、生物学的に等価なアミノ酸をコードするコドンも指す。
【０１４８】
また、アミノ酸および核酸配列が、それぞれ、追加のN末端アミノ酸もしくはC末端アミノ酸、または5'もしくは3'核酸配列などの、追加の残基を含んでよく、それでもまだ、その配列が、生物学的なタンパク質活性の維持を含む、上に示された基準を満たす限り、本質的に本明細書に開示される配列の1つに示されたものであると理解されよう。末端配列の付加は、例えばそのコード領域の5'または3'部分のいずれかに隣接する種々の非コード配列を含み得る核酸配列に特に適用される。
【０１４９】
組成物の態様において、1ml当たり約0.001mg〜約10mgの総タンパク質があることが企図される。したがって、組成物中のタンパク質の濃度は、約、少なくとも約または最大で約0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、50、100.mu.g/mlまたはmg/ml、またはより多い（またはその中の導出可能な任意の範囲）であることができる。
【０１５０】
本明細書に記載されるポリペプチドは、標識に、融合、コンジュゲート、または機能的に連結されてよい。本明細書において使用される場合、用語「標識」は、検出されるべき組成物、例えば、ポリヌクレオチドまたはタンパク質に直接または間接的にコンジュゲートされて「標識された」組成物を生成する、直接または間接的に検出可能な化合物または組成物を意図する。この用語はまた、緑色蛍光タンパク質（GFP）などの、挿入された配列の発現によってシグナルを提供するポリヌクレオチドにコンジュゲートされた配列を含む。標識は、それ自体検出可能（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）であってもよく、または酵素的標識の場合には、検出可能である基質化合物または組成物の化学的変更を触媒してもよい。標識は、小スケール検出に好適であり、またはハイスループットスクリーニングにさらに好適であることができる。そうであるから、好適な標識は、放射性同位体、蛍光色素、化学発光化合物、色素、および酵素を含むタンパク質を含むが、それらに限定されない。標識は、単に検出されても、または定量化されてもよい。単に検出される応答は、一般に、その存在が確認されるだけの応答を含むが、一方で、定量化される応答は、一般に、強度、偏光、および／または他の特性のような定量化可能な（例えば、数値で報告可能な）値を有する応答を含む。発光または蛍光アッセイでは、検出可能な応答を、結合に実際に関与するアッセイ成分と会合する発光団もしくは蛍光団を使用して直接生成しても、または、別の（例えば、レポーターまたはインジケーター）成分と会合する発光団もしくは蛍光団を使用して間接的に生成してもよい。
【０１５１】
シグナルを発する発光標識の例は、生物発光および化学発光を含むが、それらに限定されない。検出可能な発光応答は、一般に、発光シグナルの変化または発生を含む。発光標識アッセイ成分ための好適な方法および発光団は、当技術分野において公知であり、かつ、例えばHaugland、Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6.sup.th ed.) に記載されている。発光プローブの例は、エクオリンおよびルシフェラーゼを含むが、それらに限定されない。
【０１５２】
好適な蛍光標識の例は、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル-クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー.TM.、およびテキサスレッドを含むが、それらに限定されない。他の好適な光学色素は、Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6.sup.th ed.) に記載されている。
【０１５３】
別の局面において、蛍光標識は、細胞表面マーカーのような細胞または組織の内部もしくは表面に存在する細胞成分への共有結合を容易にするよう官能化される。好適な官能基は、イソチオシアナート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシンイミジルエステル、およびハロゲン化スルホニルを非限定的に含み、その全てを使用して蛍光標識を第2の分子へ付着させ得る。蛍光標識の官能基の選択は、リンカー、作用物質、マーカー、または第2の標識剤のいずれかへの付着の部位に依存するだろう。
【０１５４】
蛍光標識の付着は、細胞成分もしくは化合物へ直接であっても、代替的にリンカーを介するものであってもよい。蛍光標識を中間体へ間接的に連結する際に使用するための好適な結合対は、抗原／抗体、例えば、ローダミン／抗ローダミン、ビオチン／アビジンおよびビオチン／ストレプトアビジンを含むが、それらに限定されない。
【０１５５】
III. ポリヌクレオチド
本開示の局面は、ポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、かつ、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかまたはそれらの類似体の任意の長さの多量体型形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、任意の3次元構造を有することができ、かつ、公知または未知の任意の機能を遂行し得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ESTまたはSAGEタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA（mRNA）、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体のような修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブルの前後に付与されることができる。ヌクレオチドの配列に非ヌクレオチド成分を挿入することができる。ポリヌクレオチドを、重合後、例えば標識化成分とのコンジュゲーションによってさらに修飾することができる。この用語はまた、二本鎖および一本鎖の両方の分子を指す。他に規定のない限りまたは必要のない限り、ポリヌクレオチドである本開示の任意の態様は、二本鎖形態と二本鎖形態を構成することが公知または予測される2つの相補的な一本鎖形態の各々との両方を包含する。
【０１５６】
用語「相補的な」は、本明細書において使用される場合、ヌクレオチド間のワトソン・クリック型塩基対合を指し、具体的には、2つの水素結合によってアデニン残基に連結されるチミンまたはウラシル残基、ならびに3つの水素結合によって連結されるシトシンとグアニン残基によって、互いに水素結合されるヌクレオチドを指す。一般に、核酸は、特定の第2のヌクレオチド配列に対してある「相補性パーセント」を有するとして記載される、ヌクレオチド配列を含む。例えば、ヌクレオチド配列は、特定の第2のヌクレオチド配列に対して80％、90％、または100％の相補性を有してよく、このことは、配列の10のうち8、10のうち9または10のうち10のヌクレオチドが特定の第2のヌクレオチド配列に対して相補的であることを示している。例えば、ヌクレオチド配列3'-TCGA-5'は、ヌクレオチド配列5'-AGCT-3'に対して100％相補的である。さらに、ヌクレオチド配列3'-TCGA-は、ヌクレオチド配列5'-TTAGCTGG-3'の領域に対して100％相補的である。2つの相補的なヌクレオチド配列がセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むことが当業者によって認識されよう。
【０１５７】
ポリペプチドは、組成物中の核酸分子によってコードされてよい。特定の態様において、核酸分子は、核酸ベクターの形態であることができる。用語「ベクター」は、異種核酸配列を複製および発現することができる細胞への導入のために該異種核酸配列を挿入することができる、キャリア核酸分子を指すために使用される。核酸配列は、「異種」であることができ、これは、ある状況において、ベクターが導入されている細胞にとってまたは組み込まれる核酸にとって核酸配列が外来であることを意味し、これは、細胞または核酸中の配列と相同である配列であるが、それが通常見られない宿主細胞または核酸内の位置にある配列を含む。ベクターは、DNA、RNA、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、および人工染色体（例えば、YAC）を含む。当業者は、標準的な組換え技術を通じてベクターを構築する能力を十分に備えていよう（例えば、Sambrook et al., 2001; Ausubel et al. , 1996、共に参照によって本明細書に組み入れられる）。抗体を生産するために、ベクターを宿主細胞中に使用してよい。
【０１５８】
用語「発現ベクター」は、転写させることが可能であるかまたは宿主細胞のゲノムに安定的に組み込みその後転写させることが可能である遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含有するベクターを指す。いくつかの場合には、次いでRNA分子がタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドへと翻訳される。発現ベクターは、様々な「制御配列」を含有することができ、これは、特定の宿主生物における機能的に連結されたコード配列の転写およびおそらくは翻訳に必要な核酸配列を指す。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能にも役立ちかつ本明細書に記載される核酸配列を含有してよい。マーカーを発現する発現ベクターが本発明において有用であり得ることが企図される。他の態様において、マーカーは、mRNA上にコードされ、発現ベクター内にはコードされない。
【０１５９】
「プロモーター」は、制御配列である。プロモーターは、典型的には、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である。プロモーターは、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子のような調節タンパク質および分子が結合し得る遺伝要素を含有し得る。語句「機能的に位置付けられた」、「機能的に連結された」、「制御下」および「転写制御下」は、プロモーターが、核酸配列に関して、その配列の転写開始および発現を制御するのに正確な機能的位置および／または配向にあることを意味する。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用調節配列を指す「エンハンサー」と併用してもまたは併用しなくてもよい。
【０１６０】
ポリヌクレオチドをコードするペプチドまたはタンパク質の発現を制御するために採用される特定のプロモーターは、ポリヌクレオチドを標的化細胞、好ましくは細菌細胞中で発現させることが可能である限り、重要でないと考えられる。ヒト細胞が標的化される場合、ヒト細胞において発現可能なプロモーターに隣接しかつその制御下にポリヌクレオチドコード領域を位置付けることが好ましい。一般的に言うと、このようなプロモーターは、細菌、ヒトまたはウイルスのいずれかのプロモーターを含み得る。いくつかの態様において、宿主細胞は、真核生物細胞である。いくつかの態様において、真核生物細胞はある原核生物系に存在し得ない二次修飾を提供するため、真核生物細胞を使用することが有益である。
【０１６１】
特定の開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳に必要とされ得る。これらのシグナルは、ATG開始コドンまたは隣接配列を含む。ATG開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルが提供される必要があり得る。当業者は、容易にこれを決定し、必要なシグナルを提供することが可能であろう。
【０１６２】
ベクターは、複数の制限酵素部位を含有する核酸領域である多重クローニング部位（MCS）を含むことができ、そのいずれもベクターを消化するために標準的な組換え技術と併用することができる（参照によって本明細書に組み入れられる、Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, and Cocea, 1997を参照のこと）。
【０１６３】
ほとんどの転写された真核生物RNA分子は、RNAスプライシングを受けて、一次転写物からイントロンを除去するだろう。真核生物のゲノム配列を含有するベクターは、タンパク質発現のための転写物の適切なプロセシングを確実にするためにドナーおよび／またはアクセプタースプライシング部位を必要とし得る（参照によって本明細書に組み入れられる、Chandler et al., 1997を参照のこと）。
【０１６４】
ベクターまたは構築物は、一般に、少なくとも1つの終結シグナルを含むだろう。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、RNAポリメラーゼによるRNA転写物の特異的終結に関与するDNA配列で構成されている。したがって、特定の態様において、RNA転写物の産生を終わらせる終結シグナルが企図される。ターミネーターは、望ましいメッセージレベルを達成するために、インビボで必要であり得る。真核生物系において、ターミネーター領域はまた、ポリアデニル化部位を露出させるための、新たな転写物の部位特異的な切断を可能にする特定のDNA配列を含み得る。これは、転写物の3'末端に一続きの約200のA残基（ポリA）を加えるために、特殊化された内因性ポリメラーゼにシグナル伝達する。このポリAテールで修飾されたRNA分子は、より安定であると考えられ、かつ、より効率的に翻訳される。したがって、真核生物を含む他の態様において、そのターミネーターがRNAの切断のためのシグナルを含むことが好ましく、ターミネーターシグナルがメッセージのポリアデニル化を促進することがより好ましい。
【０１６５】
発現において、特に真核生物発現において、典型的には、転写物の適切なポリアデニル化をもたらすためのポリアデニル化シグナルを含むだろう。
【０１６６】
宿主細胞中でベクターを増殖させるために、ベクターは、複製が開始される特定の核酸配列である、1つまたは複数の複製部位の起点（しばしば「ori」と称される）を含有してよい。代替的に、宿主細胞が酵母である場合、自己複製配列（ARS）を採用することができる。
【０１６７】
いくつかのベクターは、それが原核生物細胞および真核生物細胞の両方において複製されるおよび／または発現されることを可能にする制御配列を採用し得る。当業者は、上記の宿主細胞の全てをインキュベートし、それらを維持し、かつベクターの複製を可能にするための条件をさらに理解するだろう。また、ベクターの大スケール産生、ならびにベクターによりコードされる核酸およびその同族ポリペプチド、タンパク質、またはペプチドの産生を可能にする技術および条件も理解されておりかつ公知である。
【０１６８】
本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、宿主細胞中にトランスフェクトもしくは形質転換しても、または宿主細胞中で発現させてもよい。本明細書において使用される場合、用語「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」は、互換的に使用してよい。これらの用語の全てはまた、新たに単離された細胞と、エクスビボ培養され、活性化されたまたは増殖された細胞との両方を含む。これらの用語の全てはまた、ありとあらゆる後続の世代であるそれらの子孫を含む。意図的なまたは偶然の突然変異に起因して全ての子孫が同一でなくてもよいことが理解される。異種の核酸配列の発現との関連において、「宿主細胞」は、原核生物または真核生物の細胞を指し、そして、それは、ベクターを複製するかまたはベクターによってコードされる異種遺伝子を発現することが可能な任意の形質転換可能な生物を含む。宿主細胞を、ベクターまたはウイルスのレシピエントとして使用することができ、これまでに使用されている。宿主細胞は、「トランスフェクト」または「形質転換」され得、これは組換えタンパク質をコードする配列のような外因性核酸が宿主細胞に移送または導入されるプロセスを指す。形質転換細胞は、対象の初代細胞およびその子孫を含む。一般的な宿主細胞は、細菌（例えば、大腸菌、枯草菌、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー(S.viofoceoruber）)、酵母（例えば、出芽酵母、ピキア・パストリス）、真菌（例えば、コウジカビ（A.oryzae））または真核生物の細胞を含む。
【０１６９】
IV. キット
本開示の特定の局面において製造または使用されるとおりのキットもまた企図される。例えば、本開示のポリペプチドまたは核酸をキットに含めることができる。キットを密閉容器に含めることができる。容器の非限定的な例は、マイクロタイタープレート、ボトル、金属チューブ、ラミネートチューブ、プラスチックチューブ、ディスペンサー、加圧容器、バリア性容器、パッケージ、コンパートメント、または他のタイプの容器、例えば、分散物もしくは組成物または所望のボトル、ディスペンサー、またはパッケージが内部に保持される射出成型またはブロー成形プラスチック容器を含む。容器の他の例は、ガラスまたはプラスチック製のバイアルまたはボトルを含む。キットおよび／または容器は、その表面に指示を含むことができる。その指示は、例えば、語、語句、略称、絵、または記号であることができる。
【０１７０】
容器は、所定量の本開示の組成物を分注または含有することができる。組成物は、液体、流体、または半固体として分注されることができる。キットはまた、キットおよび／または組成物を使用するための説明書を含むことができる。説明書は、組成物の使用および保存方法の説明を含むことができる。
【０１７１】
キットはまた、結合ポリペプチドのライブラリー（例えば、モノボディライブラリー）と酵素基質修飾剤、阻害剤、および／または結合タンパク質を同定するための説明書とを含んでよい。キットは、追加の成分、例えば緩衝剤、希釈剤、ならびに酵素活性および／または酵素基質特異性を決定するための特定のアッセイ成分を含んでよい。
【０１７２】
表1は、本開示のポリペプチドを記載する。
【０１７３】
（表１）
2018524012.tif 000008
2018524012.tif 000009
2018524012.tif 000010
2018524012.tif 000011
ループライブラリーからのクローンは、アミノ酸24〜29位に突然変異（下線）を有する（WT（SEQ ID NO:91）に二重下線）。
【実施例】
【０１７４】
V. 実施例
以下の実施例は、種々の態様を説明するために与えられるものであって、決して本発明を限定することを意味するものではない。当業者であれば、本発明が、目的を達成するために、かつ、述べられた目標および利点、ならびに本明細書固有の目的、目標および利点を得るために十分に適合されることが容易に理解されよう。本実施例は、本明細書に記載される方法と共に、現時点での好ましい態様の代表であり、典型であり、そして、本発明の範囲に対する限定を意図するものではない。当業者であれば、添付の特許請求の範囲によって規定されるとおりの本発明の精神の中に包含されるそれらの変形および他の使用に気付くであろう。
【０１７５】
実施例1：β-ガラクトシダーゼ酵素特異性のモノボディ媒介濃縮
酵素をエンジニアリングするための現行の方法は、酵素それら自体を修飾し、かつ、詳細な機構的理解またはハイスループットアッセイを必要とする。本開示の現行の方法は、未修飾酵素に指向される結合タンパク質を用いて触媒特性が調節される、新しいアプローチを記載する。この実施例は、モノボディと呼ばれる合成結合タンパク質を使用する。3次元構造が未知のβ-ガラクトシダーゼの例を使用して、その基質を制限しかつ低分子オリゴ糖プレバイオティクスの生産を選択的に増強したモノボディが同定された。
【０１７６】
酵素は、化学品、医薬品、食品、乳製品および繊維製品を含む多くの製造業において重要であることから、望ましい触媒特性を有する酵素のエンジニアリングは、引き続きバイオテクノロジーの主要な目標である。基本的に全ての標準的な酵素エンジニアリングアプローチ、例えば、構造誘導設計および指向性進化法（例えば、Wilks, H.M. et al. Science 242, 1541-1544 (1988); Chen, K.Q. & Arnold, F.H. Biotechnology (N Y) 9, 1073-1077 (1991); Bornscheuer, U.T. et al. Nature 485, 185-194 (2012); Davids, T., Schmidt, M., Bottcher, D. & Bornscheuer, U.T. Curr Opin Chem Biol 17, 215-220 (2013); および Goldsmith, M. & Tawfik, D.S. Curr Opin Struct Biol 22, 406-412 (2012) を参照のこと）は、酵素それ自体を修飾する。これらのアプローチの前提条件は、それらのより広範な用途を制限している。構造誘導設計は、標的酵素の3次元（3D）構造および触媒機構の詳細な知識を必要とし、そして、指向性進化法は、多数の突然変異酵素を生成およびスクリーニングするための効果的な戦略を必要とする。デノボ酵素設計もまた、反応機構の詳細な理解を必要とする（Mak, W.S. & Siegel, J.B. Curr Opin Struct Biol 27, 87-94 (2014)）。工業用酵素は、大腸菌および酵母のようなタンパク質エンジニアリングに好適な生物において組換え産生できないため、工業用酵素はその天然宿主から精製されることが多い。それらの3D構造はほとんど知られておらず、そして、それらのアッセイは労働集約的であることが多い。これらの特徴は、標準的なタンパク質エンジニアリングアプローチを工業用酵素に適用することを厄介な難題にしているが、それらの特性を調節することが望ましい場合が多い。
【０１７７】
この実施例は、モノボディと称される合成結合タンパク質を使用することによる、伝統的な酵素エンジニアリング技術では扱いにくい酵素の触媒特性を調節する新しいアプローチを記載する（図1A）。タンパク質設計技術は、標的酵素に結合する合成結合タンパク質の生成に適用される。重要なことに、この方法は、標的酵素それ自体を未変化のままにし、そして、方法を任意の酵素に適用することができる。それらの効果およびそれらのそれぞれの有用性の観点から様々なクラスの結合タンパク質を想定することができるが（図1B）、本研究は、タンパク質エンジニアリングにおける一般的に困難な課題である基質特異性を増強させることに焦点を当てている。
【０１７８】
このアプローチは、バチルス・サーキュランス ATCC 31382由来のβ-ガラクトシダーゼの基質特異性の調節について試験した。この酵素は、ラクトース加水分解およびトランスガラクトシル化反応を触媒する（それぞれ図1Cおよび図1D）（Song, J. et al. Biosci Biotechnol Biochem 75, 1194-1197 (2011)）。そのトランスガラクトシル化反応が有益なプレバイオティクスとして認識されるガラクト-オリゴ糖（GOS）を生成するので、この酵素は、Biolacta（登録商標）の商標下でGOSの工業生産に利用されている。しかしながら、任意の長さのGOSがトランスガラクトシル化反応の基質であることができるため（図1D）、酵素は広範なGOSを産生し、特定のサイズのGOSの収率は低い。このような広い基質特異性は、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、およびリパーゼを含む、生体高分子を形成および／または破壊する多くの酵素ファミリーについて観察される。これらのクラスの酵素の基質特異性を調整することがしばしば望まれるが、困難である。
【０１７９】
出願人らは、β-ガラクトシダーゼが基質として大きなGOS種を使用できないように酵素をエンジニアリングすることによって、短いGOSの生産を増強することを想定した。この酵素の大腸菌におけるクローニングおよび機能的発現が最近報告されており、そして、推定活性部位を構成する4つの残基が突然変異を不活化することを介して同定されている8。それは大きなタンパク質であり、そして、この研究に使用されたその最短の活性断片は約100kDaであった（BgaD-Dと称される；方法を参照のこと）9。その3D構造またはその基質認識の分子詳細は解明されていない。さらに、利用可能であるGOSをプロファイリングするためのハイスループットアッセイがない。したがって、従来のアプローチを使用してBgaD-Dの触媒特性を変更させることは困難であった。実際に、相同性モデルに基づいて構築された何百ものBgaD-D突然変異の中で、上に定義された所望の触媒プロファイルを示したものはなかった（未発表）。
【０１８０】
出願人らは、BgaD-Dが、各々グリコシル残基を認識するサブサイト（-1、+1、+2、+3など）を有し、加水分解およびトランスガラクトシル化が-1と+1との間に位置する同じ触媒部位を使用して起こると仮説を立てた（図1C、D）。出願人らはさらに、サブサイト+3のブロッキングがテトラおよびより大きなオリゴ糖の産生を減少させるが、一方で、ラクトース加水分解および三糖産生にはわずかにしか影響を及ぼさないと仮説を立てた（図1E）。触媒残基から離れたサブサイトに指向される構造誘導突然変異誘発によって、他のグリコシルトランスフェラーゼおよび他の酵素タイプの基質特異性を変更させることに成功しており（例えば、van der Veen, B.A. et al. J Mol Biol 296, 1027-1038 (2000); Chen-Goodspeed, M., Sogorb, M.A., Wu, F. & Raushel, F.M. Biochemistry 40, 1332-1339 (2001); および Schmitt, J., Brocca, S., Schmid, R.D. & Pleiss, J. Protein Eng 15, 595-601 (2002) を参照のこと）、この概念を支持している。しかしながら、この方法が、このようなサブサイトのBgaD-D内の存在および正確な位置に関する知識が全くなくても実施されることが強調される。これらの仮説は、次に、所望の特異性増強特性を有する結合タンパク質が触媒中心の近傍に結合するはすであるがラクトース加水分解を阻害するはずはないと仮定する。
【０１８１】
BgaD-Dに指向される一連のモノボディ（第10番目のヒトフィブロネクチンIII型（FN3）ドメインに基づく合成結合タンパク質）（図1A）は、先に確立されたとおりのファージ-および酵母-ディスプレイ技術を使用するコンビナトリアルライブラリー選択を実施することによって生成された（Koide, A., Bailey, C.W., Huang, X. & Koide, S. J Mol Biol 284, 1141-1151 (1998) および Koide, A., Wojcik, J., Gilbreth, R.N., Hoey, R.J. & Koide, S. J Mol Biol 415, 393-405 (2012)）。モノボディ系は、多数の強力で特異的な結合タンパク質を生成している（Wojcik, J. et al. Nat Struct Mol Biol 17, 519-527 (2010)）。モノボディは、標的タンパク質内の機能的部位に結合する傾向が強く（Gilbreth, R.N. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 7751-7756 (2011) および Sha, F. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 110, 14924-14929 (2013)）、その小さいサイズが特定のサブサイトを正確に標的化する上で有益であろうと想定された。Mb（BgaD_L02）、Mb（BgaD_S09）およびMb（BgaD_S10）によって表される初期の不偏選択（unbiased selection）からのモノボディは、精製モノボディ試料を使用した競合結合実験において決定したところ、基質の非存在下でBgaD-Dの3つの別個のエピトープに強力に結合した（図2Aおよび図3）。しかしながら、BgaD-D触媒活性に対する有意な効果は全く示されることなく（図2Cおよび図3）、このことは、これらのモノボディが、活性部位から離れた位置に結合する不活性結合剤であることを示唆している（図1Aおよび2A）。
【０１８２】
活性部位の近傍に結合するモノボディを得るために、第2の選択キャンペーンを実施し、その中で3つのモノボディを使用して優性な非機能的エピトープをマスクした（図2A）。この選択は、BgaD-Dに強固に結合したモノボディMb（BgaD_L14）を生成し（KD=31±2.3nM；図3B）、かつ、o-ニトロ-フェニルβ-D-グルコピラノシド（ONPG）加水分解によるアッセイ（二糖加水分解活性の代理アッセイ）のとおり、BgaD-Dを強く阻害した（図2C）。これらの結果は、Mb（BgaD_L14）が触媒作用に重要な領域、例えばサブサイト-1および／または+1に結合し得ることを示唆している（図1C）。
【０１８３】
次いで、所望の特異性エンハンサーが活性部位ポケットの近傍に結合するはずであり、そして、それらのエピトープが阻害性モノボディMb（BgaD_L14）のエピトープと重複する場合があると仮説を立てた。したがって、出願人らは、第三の選択キャンペーンを実施し、その中で、Mb（BgaD_L14）と競合するが低いONPG加水分解阻害を示したモノボディが回収された。Mb（BgaD_L14）によって競合的に阻害されたがONPG加水分解にはわずかにしか影響を及ぼさなかった、新しいモノボディMb（BgaD_L19）が得られた（図2C）。それはBgaD-Dに弱く結合したので（酵母表面ディスプレイを使用してアッセイしたところKD=600±170nM；図3A）、次いで、エラーが起こりやすいPCRおよび指向性進化法によってMb（BgaD_L19）の親和性を改善した。新しいモノボディMb（BgaD_L23）は、より高い親和性を有しており（酵母表面ディスプレイを使用してアッセイしたところKD=12±3nM）、かつ、Mb（BgaD_L19）の所望の結合プロファイルを維持した（図2Bおよび図3）。Mb（BgaD_L19）およびMb（BgaD_L23）は共に、予想どおり3つの不活性モノボディと競合しなかった（図2B）。
【０１８４】
次に、出願人らは、これらのモノボディを特徴付けて、これらが、仮説を立てたとおり酵素の基質特異性を変更するか否かを決定した（図1E）。それらの効果は、各オリゴ糖の量対反応時間のプロットおよびまた各オリゴ糖の量対消化したラクトースの量のプロットで示され、これは、異なる触媒速度を補完するオリゴ糖生産性を比較するための一般的な表示形式である（図2D、図4、および図5）。Mb（BgaD_L23）は、ラクトース加水分解ならびに単糖、二糖、および三糖の産生にほとんど効果を示さなかった（図2D）。それに反して、Mb（BgaD_L23）は、テトラオリゴ糖およびより大きな種（DP4+）の産生を大きく減少させた（図2D）。図2Eは、オリゴ糖の総量が最大に達した時点の生成物プロファイルを比較しており、これは実際の酵素の使用を反映する比較である（酵素のガラクトシダーゼ活性に起因して、この点を超えて反応時間が長くなるとGOSの加水分解を導く）。注目すべきことに、BgaD-D/Mb（BgaD_L23）複合体は、最大量の三糖（DP3）を産生し、かつ、BgaD-D単独および他のモノボディとの複合体と比較して、DP4およびDP5+種の産生をそれぞれ4.5および30倍低減した（図2E）。この制限されたGOSの産生パターンは、本発明者らのモデルと一致している（図1E）。興味深いことに、Mb（BgaD_L14）は、BgaD-Dのラクトースへの加水分解活性を強く阻害し、かつ、トランスガラクトシル化反応の速度を同様に低減したが（図4）、オリゴ糖産生プロファイルには影響を及ぼさなかった（図2D）。これらの結果は、阻害性モノボディが酵素活性部位（例えば、図1Bにおける-1および／または+1）を占有するモデルと一致しており、そして、遊離酵素だけがラクトース加水分解またはトランスガラクトシル化のいずれかに触媒活性である。予想どおり、不活性モノボディMb（BgaD_L02）も同じく効果を示さなかった（図2D）。
【０１８５】
Mb（BgaD_L23）は、ラクトース加水分解ならびに単糖、二糖および三糖の産生にほとんど効果を示さなかった（図2D）。それに反して、Mb（BgaD_L23）は、テトラオリゴ糖（DP4）およびより大きな種（DP5+）の産生を大きく減少させた（図2D）。注目すべきことに、Mb（BgaD_L23）は、より高いラクトース変換方法で三糖（DP3）産生を増強した。この産生パターンは、出願人のモデルと一致している（図1E）。
【０１８６】
モノボディの作用機序を特徴付けるために、推定活性部位残基E447での突然変異の効果を試験した。この残基をGln、ArgまたはLysに突然変異させても、予想どおり不活性モノボディの結合に影響を及ぼさなかった（図2Fおよび図6）。それに反して、これらの突然変異は全て、Mb（BgaD_L14）の結合を無効にした。E447Qによる微細な混乱に対するMb（BgaD_L14）の感受性は、Mb（BgaD_L14）が活性部位に直接結合することを示唆している。特異性増強モノボディMb（BgaD_L19）およびMb（BgaD_L23）は、その突然変異によって中程度に、それゆえE447QよりもE447KおよびE447Rによってより強く影響を受け（図2Fおよび図6）、このことは、これらのモノボディがE447の近くの領域に結合したことを示唆している。結合競合結果（図2B）と併せて、これらの結果は、Mb（BgaD_L14）が活性部位に直接結合し、そして、Mb（BgaD_L19）およびMb（BgaD_L23）が活性部位の近くに結合する、モデル（図2A）をさらに支持する。
【０１８７】
酵素へのより大きな基質の接近を制限することによって特異性増強モノボディがそれらの機能を発揮するか否かを明確にするために、モノボディ-BgaD-D相互作用に対するオリゴ糖の効果を次に試験した。反応生成物とモノボディとの間の競合を試験した。異なるサイズのオリゴ糖は全て阻害性モノボディMb（BgaD_L14）の結合をブロックした一方で、特異性増強モノボディはより長いオリゴ糖DP4およびDP5によってのみ阻害されたが、DP3によっては阻害されなかった（図2G）。DP4およびDP5は、まさに、その産生が特異性増強モノボディによって低減されたオリゴ糖である（図2D）。その結果は、提唱された特異性増強モノボディの機序を強く支持している（図1E）。
【０１８８】
モノボディを使用した酵素特異性の増強における出願人の成功は、合成結合タンパク質が、酵素それ自体を修飾することなしに、酵素特性を正確に調節することができることを説明する。この目標は、酵素の構造機能相関に関する非常に限られた知識があるだけで、ハイスループットスクリーニング法なしに達成された。その代わりに、出願人らは、このクラスの酵素の一般的な反応機序（図1）および簡単に算出できる（back-of-envelop）モノボディ作用の設計（図1E）からこの研究課題を開始した。モノボディについて所望のプロファイルを標的結合の観点から規定する能力は、モノボディ生成に容易に利用可能なハイスループット技術を使用して候補モノボディを同定する際に、かつ、詳細な特徴付けのためのモノボディの数を最小限に抑える際に効果的であり、これは、完了するのに一週間を要する出願人のGOSプロファイリングアッセイにとって重要な要因である。出願人らは、わずか20のモノボディで詳細な酵素アッセイを実施することによって、所望の特異性エンハンサーを同定することに成功した。これらのモノボディは、基質認識機序の調査のための強力なツールであり、これは、酵素内部の突然変異を用いたモノボディの特異性修飾効果を総括する助けとなろう。この研究は、基質特異性を調節することに焦点を当てているが、その他の2つのクラスのモノボディ（すなわち、阻害剤および不活性結合剤；図1B）は、異なる種類の用途に有用なツールであろう。多くの酵素は、グリコシルトランスフェラーゼと概念的に類似する方法で、サブサイトを使用して基質を認識する。それゆえ、この戦略は、構造誘導設計または指向性進化法によっては到達できない手段を含めた、新規でかつ一般化可能な酵素エンジニアリング手段を提供し、それによって酵素エンジニアリング技術ならびに合成結合タンパク質の利用を実質的に拡大する。
【０１８９】
前述の記載は、この実施例において使用される方法の詳細である。
【０１９０】
タンパク質の発現および精製。市販のBiolacta（登録商標）調製物（Amano Enzyme）は、BgaD-A（残基36-1737）、BgaD-B（残基36-1422）、BgaD-C（36-1249）およびBgaD-D（残基36-847）と称される4つのアイソザイムを含有し、そして、GOSは、BgaD-A以外の3つのアイソザイムによって主に産生される。出願人らは、この研究の全ての実験において最も小さいアイソザイムBgaD-Dを使用した。BgaD-Dおよびその活性部位突然変異体（E447Q、E447KおよびE447R）を、pCold IIベクター（Takara）を使用して、C末端にビオチンアクセプタータグ（Avi-タグ）およびHis6タグの融合タンパク質として調製した。インビボビオチン化のために50μM D-ビオチンの存在下、pBirAcmプラスミド（Avidity）を含有するBL21（DE3）においてタンパク質が生産された以外は、先に記載のとおりのタンパク質が生産された。先に記載のとおり、pHFT2ベクターを使用してHis10タグ化タンパク質として、またはpHBTベクターを使用してHis6タグ化およびビオチン化タンパク質として、モノボディを調製した（Koide, A., Gilbreth, R.N., Esaki, K., Tereshko, V. & Koide, S. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 6632-6637 (2007)）。全てのタンパク質を、Ni-セファロースカラム（GE Healthcare）を使用して精製し、さらにSuperdexサイズ排除カラムで精製した（BgaD-DについてはSuperdex200およびモノボディについてはSuperdex75, GE Healthcare）。精製された試料の代表的なSDS-PAGEは、付録の図面7に示される。酵素アッセイ実験については、出願人らは、Avi-タグ7なしのBgaD-Dおよび親和性タグが除かれたモノボディを使用した。
【０１９１】
ファージディスプレイおよび酵母表面ディスプレイ。使用したモノボディライブラリーおよび一般的な選択法は、以前に記載されている（Koide, A., Wojcik, J., Gilbreth, R.N., Hoey, R.J. & Koide, S. J Mol Biol 415, 393-405 （2012） および Wojcik, J. et al. Nat Struct Mol Biol 17, 519-527 (2010)）。結合反応および洗浄に使用した緩衝液は、両ファージディスプレイおよび酵母表面ディスプレイ選択実験について、それぞれBSS（50mM Tris-HCl、pH 7.4、150mM NaClおよび1mg/mLウシ血清アルブミンを含有）およびBSST（BSSおよび0.1％ Tween 20）であった。初期の選択キャンペーンでは、apo BgaD-Dを標的として使用し、選択を不偏的に実施した。ファージディスプレイ選択のラウンド1、2および3に使用したBgaD-D濃度は、それぞれ300nM、200nMおよび100nMであった。モノボディが提示したファージを、ストレプトアビジンコート磁気ビーズ（Z5481/2, Promega）に固定されたビオチン化標的酵素上に捕捉し、次いで、0.1M Gly-HCl（pH 2.1）中に溶出させた。各々の濃縮された集団内のファージクローンの中での遺伝子シャフリングおよび酵母表面ディスプレイベクターへの得られた遺伝子プールの移送後、出願人らは、先に記載のとおり100nMの標的酵素濃度を使用してライブラリー選別を実施した。
【０１９２】
活性部位を含む新しいエピトープに結合するモノボディを同定することを意図する第2の選択キャンペーンでは、標的とモノボディライブラリーとを混合する前にビオチン化標的酵素に、「非機能的」エピトープのために2μMのMb（BgaD_L02）、40μMのMb（BgaD_S09）および3μMのMb（BgaD_S10）を加えた以外は、上記のとおりライブラリー選別実験を実施した。
【０１９３】
活性部位付近に結合するモノボディを濃縮することを目指す第三のキャンペーンでは、出願人らは、上記のとおりライブラリー選別を不偏的に実施し、次いで、回収された集団を、競合剤として2μMのMb（BgaD_L14）を使用したネガティブ選択に供し、その中で出願人らはMb（BgaD_L14）と競合するモノボディを収集した。
【０１９４】
BgaD-Dに対するモノボディの親和性をまず、先に記載のとおり酵母表面ディスプレイを使用して決定した。モノボディを提示する酵母細胞を変動濃度のBgaD-Dとインキュベートし、緩衝液で洗浄し、そして、適切な蛍光標識された二次検出試薬で染色した後に、フローサイトメトリー（Guava EasyCyte 6/L, Millipore）で分析した。SigmaPlotソフトウェア（Systat Software）を使用して1：1結合モデルを適合することによって、BgaD-D濃度に対する平均蛍光強度のプロットからKD値を決定した。
【０１９５】
エラーが起こりやすい突然変異誘発を使用した親和性成熟。Mb（BgaD_L19）親配列からエラーが起こりやすいPCRライブラリーを生成するために、出願人らは、先に記載のとおり、0.3mM MnCl2、7mM MgCl2、各0.2mMのdATP、dGTP、dCTPおよびdTTP、ならびに2.5ユニットのTaq DNAポリメラーゼの存在下でPCRを実施し、そして、酵母相同組換えを使用してライブラリーを構築した。得られた酵母表面ディスプレイライブラリーを、上記のとおり酵母表面ディスプレイを使用した選択に供した。
【０１９６】
精製タンパク質を使用した親和性測定。精製モノボディの親和性を、ビーズベースアッセイを使用して決定した。20μg/mLのストレプトアビジンコートDynabeads M280（Invitrogen）を、適切な濃度のビオチン化モノボディ（10〜30nM）と4℃で30分間回転させながらインキュベートし、次いで、10μM D-ビオチンで15分間ブロッキングした。モノボディが固定されたビーズを洗浄し、BSSに再懸濁した。次いで、ビーズ溶液10μLを96ウェルフィルタープレート（MultiScreenHTS HV、孔径0.45μm、Millipore）のウェルに移し、真空吸引した。BSS中の種々の濃度（0〜5,000nM）のビオチン化BgaD-Dまたはその活性部位突然変異体20μLを、モノボディが固定されたビーズを含有するフィルタープレートのウェルに加え、そして、プレートを振盪しながら25℃で20分間インキュベートした。ウェルを吸引し、BSSTで2回洗浄した。吸引後、BSS中のストレプトアビジンにコンジュゲートした10μg/mLのDyLight650（Thermo）20μLを、ウェルの各々に加えた。振盪しながら4℃で30分間インキュベーションした後、ウェルを吸引し、BSSTで2回洗浄した。ビーズをBSS 180μLに再懸濁し、そして、遠赤チャネル中の蛍光発光をGuava EasyCyte 6/Lで分析した。SigmaPlotソフトウェア（Systat Software）を使用して1：1結合モデルを適合することによって、BgaD-D濃度に対する中央蛍光強度のプロットからKD値を決定した。酵母表面ディスプレイを使用して決定されたものと概して一致した精製モノボディを使用してKD値を得たが（図3AおよびB）、これは先の観察と一致した。
【０１９７】
競合結合アッセイ。競合結合アッセイを、上記のとおり精製タンパク質を用いたビーズベースアッセイを使用して実施した。適切な濃度のビオチン化BgaD-D 20μLをBSS中モノボディ-BgaD-D相互作用のKD値の200倍で加えられた競合剤モノボディと共にまたはそれなしでプレインキュベートした以外は、上記のとおりモノボディの特異性を試験するためのモノボディ競合結合アッセイを行った。使用したビオチン化BgaD-Dの濃度は、異なる親和性を説明するために、Mb（BgaD_L02）およびMb（BgaD_S10）では10nM、Mb（BgaD_L14）およびMb（BgaD_L23）では30nM、Mb（BgaD_L19）では40nMまたはMb（BgaD_S09）では180nMであった。オリゴ糖競合結合アッセイのために、ビオチン化BgaD-Dを、BSS中20％（w/v）のオリゴ糖（ラクトース、DP3、DP4またはDP5）と共にまたはそれなしで、氷上で5分間プレインキュベートし、次いで、混合物20μLをモノボディ結合が起こるウェルに移した。実験を3連で実施した。
【０１９８】
加水分解活性アッセイ。加水分解活性を、アッセイ緩衝液（50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4、150mM NaClおよび0.01％ Triton X-100を含有）中、4mM o-ニトロ-フェニルβ-D-グルコピラノシド（ONPG）を基質として使用して25℃でアッセイした。全ての試薬を25℃で10分間プレインキュベートし、そして、8mM ONPGを含有する基質溶液50μLと62nM BgaD-Dおよび／または10μMモノボディを含有するタンパク質溶液50μLとを混合することによって反応を開始した。25℃で10分間のインキュベーション後、2％（w/v）Na2CO3 250μLの添加によって反応を停止し、次いで、SpectraMax 340PCプレートリーダー（Molecular Devices）を使用して405nmでの吸光度を測定した。基質を含有するがタンパク質を含有しないアッセイ溶液の吸光度をバックグラウンドとしてその他の反応溶液から減算して、触媒活性を決定した。
【０１９９】
GOS産生の定量化。GOSの生産を、アッセイ緩衝液（20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0、150mM NaClを含有）中、5％（w/v）ラクトースを基質として使用して25℃で測定した。20％（w/v）ラクトースを含有する基質溶液125μLと0.4μM BgaD-Dおよび／または適切な濃度のモノボディ（133〜266μM）を含有するタンパク質溶液375μLとを混合することによって反応を開始した。試料を定期的に採取し、10分間煮沸して反応を停止した。単糖、二糖およびGOSの量を、CK04Sカラム（Mitsubishi Chemical）を使用して、蒸発光散乱検出器（ELSD-LTII, Shimadzu）を備えたHPLC（LC-30AD, Shimadzu）で決定した。80℃でH2Oを流速0.4mL/minで使用して、カラムからアッセイ試料を溶出させた。ラクトースおよび他の二糖（DP2）の分離および決定のために、Asahipak NH2P-40 3Eカラム（Shodex）を、30℃で流速0.3mL/minのH2O（溶媒A）およびアセトニトリル（溶媒B）の勾配と共に使用した。ピーク面積から糖濃度を決定した。Wako Chemicalsから購入したグルコース、ガラクトース、ラクトースおよび4'-ガラクトシルラクトース、ならびに市販のGOS（Vivinal（登録商標）GOS, FrieslandCampina）から調製したテトラおよびより大きなオリゴ糖を、これらのアッセイの標準曲線を作成するための基準化合物として使用した。
【０２００】
Kdおよび機能的活性をBiolactaモノボディの各々について決定し、これを以下の表に示す。
【０２０１】
2018524012.tif 000012
2018524012.tif 000013
2018524012.tif 000014
【０２０２】
実施例2：リパーゼ基質特異性のモノボディ媒介変更
本発明者らは、代理合成結合タンパク質（モノボディと称される）が他の未修飾酵素の特異性を調節する、酵素特異性を変更するための新しい戦略を確立した。ここで、本発明者らは、この戦略をキャンディダ・ルゴサ・リパーゼ1（CRL1）に対して試験した。本発明者らは、短鎖脂質に対するCRL1の基質特異性を制限した代理モノボディを同定することに成功した。ここでのCRL1を用いた成功および先のβ-ガラクトシダーゼを用いた成功は、別個の基質結合部位のアーキテクチャを有する酵素にこの戦略が広く適用可能であることを示唆している。
【０２０３】
酵素は、食品、医薬品、乳製品および繊維製品を含む製造業における広範な用途において重要な成分であるが、天然に存在する酵素は、関心対象の用途に望まれる特性を欠いていることが多く、かつ、エンジニアリングされる必要がある。しかしながら、所望の触媒特性を有する酵素のエンジニアリングは、依然としてバイオテクノロジーにおける困難な課題である。DNA操作および分子生物学の技術の進歩は、任意のアミノ酸配列を有するポリペプチドを作製することを可能にするが、酵素の配列-構造-機能相関に関する現在の知識は依然としてデノボ設計および合理的な酵素設計の初期段階にあり、所望の機能性を有する酵素を設計および生産することは依然として大変な課題となっている。指向性進化法は、このような知識がない場合に酵素をエンジニアリングするための強力なツールとなり、多くの成功例をもたらした。しかしながら、指向性進化法実験は、好適な異種宿主（例えば、大腸菌）での効率的な生産系およびハイスループット酵素アッセイが利用できなければ、容易に妨げられる可能性がある。したがって、従来のアプローチが効果的でないかまたは実用的でない酵素エンジニアリングにおいて多くの課題が残っている。
【０２０４】
実施例1に記載されるのは、酵素基質結合部位内の正確な位置（potion）に指向される代理結合タンパク質を用いた、酵素特異性を変更するための新しい戦略である。バチルス・サーキュランス由来のβ-ガラクトシダーゼ（BgaD-D）およびモノボディ（10番目のヒトフィブロネクチンIII型（FN3）ドメインベースの合成結合タンパク質）の例を使用して、本発明者らは、そのトランスガラクトシル化反応についての酵素の基質特異性を変更し、かつ、短いオリゴ糖の生産を選択的に増強することに成功した。この戦略は、別個のサブサイトが基質内の異なる糖部分を認識するβ-ガラクトシダーゼによる基質認識の一般的機序に基づいて設計された。適切なサブサイトに結合するモノボディを生成し、それによって、基質の結合をブロックすること（ブロックされたサブサイトを必要とする）によって、本発明者らは、酵素が作用する基質の範囲を制限することができる。この戦略は標的酵素それ自体を修飾しないため、それを、異種の発現系も酵素の構造情報の詳細な知識のいずれも必要としない酵素系に適用することができる。さらに、所望の標的結合プロファイルを有するモノボディを、ハイスループットタンパク質設計プラットフォームを通じて容易に同定することができ、ハイスループット酵素アッセイの必要性を排除できる。それゆえ、この戦略は、基質特異性をエンジニアリングするための、特定すると酵素の天然基質の中でもより小さくより短い種に基質を制限するための従来法に代わる魅力的な代替法であるはずである。
【０２０５】
この実施例では、本発明者らは、この戦略を、実施例1において使用したβ-ガラクトシダーゼとは明らかに異なる酵素である、リパーゼ、すなわちキャンディダ・ルゴサ由来のリパーゼ1（CRL1）の基質特異性を制限に対する戦略を試験した。CRL1および他のイソ型の結晶構造は決定されている。リパーゼ（トリアシルグリセロールリパーゼEC 3.1.1.3）は、トリアシルグリセリドおよびいくつかの他のエルテルの加水分解および合成の両方を触媒する。これらは、基質サイズ（短い〜長い脂肪酸）の点でならびに基質の形状および化学（飽和および多不飽和脂肪酸）の点で広い特異性を有する。これらの広い特異性は、食品加工、医薬品合成、石油精製、風味開発、または含油廃水処理のような特定の用途において有用であるが、ある規定の生成物の製造には必ずしも望ましいわけではない。例えば、チーズ風味を熟成および増強する際に、リパーゼは、理想的には、短鎖脂肪酸のみを加水分解して、チーズ風味を生産すべきである。しかしながら、実際には、リパーゼは、望ましくない石鹸臭の原因となる長鎖脂肪酸も加水分解する。それゆえ、特定の脂肪酸鎖長に対するリパーゼの基質特異性を調整することがしばしば望まれる。
【０２０６】
リパーゼは、実施例1において使用したβ-ガラクトシダーゼ（BgaD-D）と同じくそれらの基質に対する加水分解および合成反応を触媒するが、これらの2種類の酵素は、基質結合部位のアーキテクチャの点で実質的に異なる。BgaD-Dの基質結合部位は、代理モノボディによって容易に接近可能な浅い表面が露出したポケットからなるが、一方で、CRL1の基質結合部位は深く埋設したトンネルであり、その内面はモノボディが直接接近できる可能性は低い。さらに、CRL1に必要な識別のレベル（1または2つの炭化水素単位）は、BgaD-D（糖単位）の場合よりもはるかに微小であり、そして、リパーゼの基質結合部位は、異なる長さの炭化水素鎖を識別する別個のサブサイトを有さない。まとめると、CRL1およびその相同体の鎖長特異性は、基質結合トンネル内部にある残基の構造誘導突然変異によって変更されているが、代理モノボディが類似の効果を達成できるかは不明である。したがって、本発明者らは、CRL1の基質特異性の変更を、それらの酵素エンジニアリング戦略の興味深くかつ有益な課題であると考えた。
【０２０７】
本発明者らは、先に確立された手順に従ってファージ-および酵母-ディスプレイ技術を使用するコンビナトリアルライブラリー選択を実施することによって、CRL1に指向される一連のモノボディを生成した。ほとんどのリパーゼでは、リッドと呼ばれる可動性セグメントが、活性部位を覆って、酵素を閉鎖型の不活性な形態に保っている。洗剤のような疎水性溶質の存在下で、リッドは開き、それによってリパーゼ活性部位が基質に接近可能になり、ひいてはリパーゼが活性になる。触媒活性な状態のCRL1に対するモノボディを生成するために、本発明者らは、モノボディ生成中に使用した全ての緩衝液にTriton X-100を含めた。本発明者らは、このようにして基質結合部位の中またはその近くに結合したモノボディを本発明者らが濃縮することを論理的に判断した。
【０２０８】
初期の不偏選択は、合計11のユニークなモノボディを生成した。これらのモノボディの系統発生解析に基づいて、本発明者らは、精製タンパク質として、これらのモノボディの各「ファミリー」を代表する4つのクローンMb（CRL_S01）、Mb（CRL_S02）、Mb（CRL_S04）およびMb（CRL_S05）を生産した（図8A）。これらのモノボディの配列が多様であるにもかかわらず、これらの全てが、精製モノボディ試料を使用した競合結合実験で決定されたとおり、CRL1の重複した表面（「エピトープ」）に結合した（データ示さず）。簡略化のために、以降、本文で「CRL_」を省略したモノボディの略称を使用する。初期のモノボディプール由来のこれらのどれも、CRL1触媒活性に対して有意な効果を示さなかったが（Mb（S05）についてのみデータを図8Cに示す）、このことは、これらが、活性部位から離れた位置に結合する不活性結合剤であることを示唆している。
【０２０９】
活性部位の近傍に結合するモノボディを得るために、本発明者らは、第2の選択キャンペーンを実施し、その中で、本発明者らは、不活性結合剤の１つMb（S05）を使用して、優性な非機能的エピトープをマスクした。この選択は、11の異なるモノボディを生成し、そして、それらの内、本発明者らは、およそ50nMの類似のKD値を有する3つの異なるタイプのモノボディを同定した（図8A）。Mb（S16）は、単一の脂肪族鎖を有する合成p-ニトロフェニル（pNP）-エステルの試験した全ての鎖長に対するCRL1活性を強く阻害した。本発明者らは、これらのpNPエステルを、切断性の脂肪酸結合部位における鎖長特異性を特徴付けるための代理基質として使用した（図8C）。この結果は、Mb（S16）が活性部位のような触媒作用に重要な領域に結合し得ることを示唆している。Mb（L18）は特異性修飾剤としての所望のプロファイルを示したが、そのプロファイルではモノボディがC8より長い鎖長に対するCRL1の活性を有意に低減したが、C4およびC8に対する活性にはほとんど効果を示さなかった（図8C）。Mb（L18）の結合は、Mb（S16）と競合したが、このことは、Mb（L18）が活性部位の近傍の位置に結合し得ることを示唆している（図8B）。Mb（S19）は、CRL1触媒活性に対していかなる有意な効果も示さず、その結合は、Mb（S16）またはMb（L18）のいずれとも競合しなかった（図8Bおよび8C）。Mb（L18）と競合するが異なるプロファイルを有するモノボディを得るためのさらなる選択キャンペーンは、単一のアミノ酸差を有する2つの追加の阻害性モノボディMb（L23）およびMb（L24）を生産した（図8A〜C）。
【０２１０】
CRLモノボディの配列を以下の表に提供する。
【０２１１】
2018524012.tif 000015
2018524012.tif 000016
【０２１２】
次に、本発明者らは、これらモノボディを決定付けて、これらがトリアシルグリセリドにおけるCRL1の鎖長特異性を変更するか否かを決定した。モノボディの効果を、産生された各脂肪酸の量対反応時間のプロットで（図9A）ならびにトリアシルグリセリド基質の長さ毎のKcat値（sec-1）の比較（図9B）で示す。pNP基質を用いて試験した場合の特異性修飾剤であるMb（L18）は、C4およびC6に対する活性にはほとんど効果を示さなかったが、C8、C10およびC12に対する活性を、これらの活性がCRL1単独に比べてそれぞれ11倍、102倍および4.5倍低減されたとおり強く阻害した（図9B）。Mb（S16）およびMb（L24）は共に、試験した全ての鎖長に対するCRL1の活性を阻害した（図9）。それらの内、Mb（L24）は、より強力な阻害を示したが、これはおそらく、モノボディがCRL1により高い親和性を有していたこと（図8B）ならびにその結果としてCRL1との結合が同じモノボディおよび酵素濃度でMb（S16）よりも完全であったことからである。不活性モノボディMb（S05）は予想どおりまったく効果を示さなかった（図9）。したがって、トリアシルグリセリドについて観察されたそれらのプロファイルは、一般に、若干の例外はあるもののpNP-エステルについて観察されたプロファイルと類似していた。Mb（L18）は、C8 pNPエステルにおけるCRL1活性を阻害しなかったが（図8C）、それは、C8トリアシルグリセリドにおける活性の強力な阻害剤であった（図9）。同様に、pNP-エステルに対するMb（S19）の不活性なプロファイルにもかかわらず（図8C）、このモノボディは、C6より長い鎖長のトリアシルグリセリドにおけるCRL1活性を有意に低減した（図9）。これらの結果は、pNP-エステルおよびトリアシルグリセリドにおけるCRL1活性に対するモノボディの効果が異なることができ、これらの差異がこれらの基質中の脂肪族鎖の数が異なることによる可能性が高く、これらがどのようにCRL1によって認識されるかを、以下に考察するとおり示す。
【０２１３】
基質類似体との複合体のCRL1の入手可能な結晶構造（図10）は、2つの修飾剤Mb（L18）およびMb（S19）の作用機序のヒントを与える。その結晶構造は、トリアシルグリセリドのsn-1、sn-2、およびsn-3脂肪酸を収容する3つの疎水性部位を明らかにしている。切断性脂肪酸（sn-1またはsn-3）結合部位は深いトンネル様アーキテクチャを有し、その他の脂肪酸結合部位は溶媒に曝される疎水性パッチである（図10）。pNP-エステル基質は、切断されるためにトンネル様結合部位に結合しなければならず、それゆえ、これらの基質は非切断性部位の変化を報告しない。Mb（L18）がpNP-エステルに対するCRL1の鎖長特異性を変更しかつ阻害剤と競合したという結果によれば、Mb（L18）は、活性部位の近傍の位置に結合し、かつ、トンネル様結合部位への切断性脂肪酸の結合に影響を及ぼし得る。CRL1および他のイソ型について、トンネル内部の残基の突然変異だけでなくトンネルの入り口にある残基の突然変異も鎖長特異性を変更することが報告されている。モノボディは、トンネルを大きく破壊することなくトンネル内部の空間に直接接近するほど小さくないため、Mb（L18）は、トンネルの入り口周辺の特定の位置に結合し、かつ、トンネルへのより長鎖の基質の侵入と干渉し得る。しかしながら、トンネルのサイズまたは形状に間接的に影響を及ぼす他の領域への結合を除外することはできない。Mb（S19）は、Mb（S16）と競合せず、かつpNP-エステルに対して不活性であったが、トリアシルグリセリドに対するCRL1の鎖長特異性を変更した。これらの結果は、Mb（S19）が切断性脂肪酸の結合に影響を及ぼし得ないが、むしろトリアシルグリセリド中の脂肪酸の別の位置のその結合部位への結合に影響を及ぼし得ることを示唆している。非切断性の脂肪酸の結合部位は、比較的大きく、かつ溶媒に曝されており、各結合部位は、切断性の脂肪酸結合部位とはっきり分かれている（図10）。したがって、切断性脂肪酸の結合と干渉することなく非切断性の脂肪酸結合部位内の特定の位置をモノボディによって正確に指し示しかつブロックすることが可能であり得る。非切断性の脂肪酸結合部位の突然変異によって、pNP-エステルへの特異性を維持しながらトリアシルグリセリドに対する鎖長特異性を変更することが、他のイソ型について報告されている。
【０２１４】
この実施例では、CRL1の基質特異性をモノボディによって変更できるという実験的根拠が提供される。CRL1の切断性の基質結合部位へ直接結合することが困難であり、そして、リパーゼ基質間のわずかな差に対してモノボディのサイズが比較的大きいにもかかわらず、本発明者らは、合計で24のモノボディだけをスクリーニングすることによって、基質特異性を変更した修飾剤を同定することに成功した。トンネル様基質結合部位は、普遍的なアーキテクチャとして現在認識されており、かつ、6つの主要クラスの酵素全てに及ぶ。それゆえ、この戦略が広範な酵素の触媒特性をエンジニアリングするために有用であることが予想される。
【０２１５】
以下の材料および方法をこの実施例において使用し、これらは本明細書に記載される方法に適用可能である。
【０２１６】
ビオチン化CRL1の調製：精製CRL1をc-LEcta（Germany）から得た。そのタンパク質を、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit（ThermoScientific）を使用してビオチン化した。簡単に述べると、CRL1をPBS（50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4、150mM NaClを含有）に溶解してそれに対してさらに透析し、そして、5倍のモル濃度の過剰なNHS-LC-ビオチンと4℃で16時間インキュベートした。脱塩カラムを使用して未反応のビオチンを除去し、そして、得られたタンパク質試料をSuperdexサイズ排除カラム（Superdex200, GE Healthcare）で精製した。CRL1へのビオチンの取り込みは、HABA色素比色アッセイによってCRL1分子当たり約2であると推定された。
【０２１７】
モノボディの発現および精製：モノボディを、先に記載のとおりpHFT2ベクターを使用してHis10-タグ化タンパク質として調製した。全てのタンパク質を、Ni-セファロースカラム（GE Healthcare）を使用して精製し、さらにSuperdexサイズ排除カラム（Superdex75, GE Healthcare）で精製した。酵素アッセイ実験のために、本発明者らは、TEVプロテアーゼ切断によって親和性タグが除かれたモノボディを使用した。
【０２１８】
ファージディスプレイおよび酵母表面ディスプレイ：使用したモノボディライブラリーおよび一般的な選択法は、先に記載されている。結合反応および洗浄に使用した緩衝液は、両ファージディスプレイおよび酵母表面ディスプレイ実験についてBSST（50mM Tris-HCl、pH 7.4、150mM NaCl、1mg/mLウシ血清アルブミンおよび0.5％（v/v）Triton X-100を含有）であった。初期の選択キャンペーンでは、選択を不偏的に実施した。ファージディスプレイ選択のラウンド1、2および3に使用したビオチン化標的酵素の濃度は、100nMであった。モノボディが提示したファージを、ストレプトアビジンコート磁気ビーズ（Z5481/2, Promega）に固定されたビオチン化標的酵素上に捕捉し、次いで、0.1M Gly-HCl（pH 2.1）中に溶出させた。
【０２１９】
各々の濃縮された集団内のファージクローンの中での遺伝子シャフリングおよび得られた遺伝子プールの酵母表面ディスプレイベクターへの移送後、本発明者らは、先に記載のとおり、第1ラウンド選別および第2ラウンド選別にそれぞれ100nMおよび20nMの標的酵素濃度を使用してライブラリー選別を実施した。同定されたモノボディのアミノ酸配列を、酵母ディスプレイベクターのDNA配列決定によって推定した。プログラムPhylogeny（EMBL-EBI）を使用して系統樹解析を実施した。
【０２２０】
第2の選択キャンペーンでは、標的とモノボディライブラリーとを混合する前にビオチン化標的酵素に2μMのMb（S05）を加えた以外は、ライブラリー選別実験を上記のとおり実施した。本発明者らは、酵素-モノボディ複合体を用いたライブラリー選別と酵素のみを用いた選別を交互に行って、選択されたモノボディが酵素に結合し、競合剤モノボディには結合しないことを確実にした。第三のキャンペーンでは、本発明者らは、ライブラリー選別を上記のとおり不偏的に実施し、次いで、回収された集団を、競合剤として4μMのMb（L18）を使用したネガティブ選択に供した。
【０２２１】
CRL1へのモノボディの親和性を、先に記載のとおり酵母表面ディスプレイを使用して決定した。モノボディを提示する酵母細胞を変動濃度のCRL1とインキュベートし、緩衝液で洗浄し、切な蛍光標識された二次検出試薬で染色した後、フローサイトメトリー（Guava EasyCyte 6/L, Millipore）で分析した。SigmaPlotソフトウェア（Systat Software）を使用して1：1結合モデルを適合することによって、CRL1濃度に対する平均蛍光強度のプロットからKD値を決定した。
【０２２２】
競合結合アッセイ：競合結合アッセイを、上記のとおり酵母表面ディスプレイを使用して実施した。適切な濃度のビオチン化CRL1 20μLをBSST中モノボディ-CRL1相互作用のKD値の100〜200倍で加えられた競合剤モノボディと共にまたはそれなしでプレインキュベートした以外は上記のとおり、モノボディの特異性を試験するためのモノボディ競合結合アッセイを行った。使用したビオチン化CRL1の濃度は、異なる親和性を説明するために、Mb（S01）、Mb（S02）、Mb（S03）およびMb（S05）では10nM、Mb（L23）およびMb（L24）では20nM、またはMb（S16）、Mb（L18）およびMb（S19）では100nMであった。
【０２２３】
pNP-エステルを用いた加水分解活性アッセイ：脂肪鎖長プロファイルを、酢酸（C2）、酪酸（C4）、カプリル酸（C8）、カプリン酸（C10）、ラウリン酸（C12）およびミリスチン酸（C14）の1mM p-ニトロフェニル（pNP）-エステル（全てSigma-Aldrichから）を基質として使用して、アッセイ緩衝液（50mM HEPES-NaOH、pH 6.8、0.5％ Triton X-100を含有）中、25℃で決定した。全ての試薬を25℃で10分間プレインキュベートし、1.12mM pNPエステルを含有する基質溶液225μLと100nM CRL1および／または10μMモノボディを含有するタンパク質溶液25μLとを混合することによって反応を開始した。酵素活性を、pNP-エステルの初期加水分解速度からSpectraMax 340PCプレートリーダー（Molecular Devices）を使用して405nmでの吸光度に従って決定した。基質を含有するがタンパク質を含有しないアッセイ溶液の吸光度をバックグラウンドとしてその他の反応溶液から減算して、触媒活性を決定した。
【０２２４】
トリアシルグリセリドを用いた加水分解活性アッセイ：トリアシルグリセリド（triacylglyceries）に対する加水分解活性を、トリブチリン（C4；Sigma-Aldrich）、トリカプロイン（C6；Tokyo Kasei）、トリカプリリン（C8；Wako Pure Chemicals）、トリカプリン（C10；Tokyo Kasei）およびトリラウリン（C12；Tokyo Kasei）を基質として使用して測定した。基質溶液は、0.5％（w/v）ポリビニルアルコールおよび80mMのトリブチリンまたは40mMのその他のトリアシルグリセリドの１つからなり、これを超音波処理によって乳化した。乳化の直後、乳化した基質溶液0.3mLを緩衝溶液（0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0）0.6mLと混合し、得られた溶液を25℃で10分間インキュベートした。基質溶液（0.9mL）と0.7μM CRL1および／または200μMモノボディを含有するタンパク質溶液0.3mLとを混合することによってアッセイを開始し、常時振盪しながら25℃でインキュベートした。試料を定期的に採取し、試料150μLを0.5M HCLおよび25mMノナン酸（内部標準として使用したC9；Wako Pure Chemicals）50μLと混合して反応を停止した。クロロホルム0.8mLを添加して脂肪酸を抽出した後、試料5μLをキャピラリーカラム（CP-FFAP CB；25m×0.15mm×0.25μm, Agilent Technologies）を備えたガスクロマトグラフィーシステム（model 7890 A, Agilent Technologies）に流した。ヘリウムをキャリアガスとして使用し；分割比は50：1であり、分流は50mL/minであった。カラム温度を1分間100℃に維持し、10℃/minで240℃まで昇温し、次いで17分間維持した。注入器および検出器の温度をそれぞれ250℃および280℃に設定した。産生した脂肪酸の濃度を、内部標準（ノナン酸（nonanic acid））のピーク面積で較正したピーク面積によって計算した。Wako Pure Chemicalsからの酪酸（C4）、Tokyo Kaseiからのカプロン酸（C6）、カプリル酸（C8）、カプリン酸（C10）、ラウリン酸（C12）を、これらのアッセイの標準曲線を作成するための基準化合物として使用した。酵素なしのブランク実験を使用して、基質の自己加水分解を決定した。
【０２２５】
前述の説明は、本発明の原理を単に例示するものとして考慮される。さらに、当業者であれば多数の改変および変形に容易に気付くであろうから、上記のとおりの正確な構成およびプロセスに本発明が限定されるべきではない。したがって、全ての好適な改変および等価物が、以下の特許請求の範囲によって定義されるとおりの本発明の範囲内にあると考えられ得る。語「〜を含む（comprise）」、「〜を含んでいる（comprising）」、「〜を含む（include）」、「〜を含んでいる（including）」および「〜を含む（includes）」は、本明細書および以下の特許請求の範囲において使用されるとき、記載の特徴、整数、成分、または工程の存在を特定することを意図するが、これらは、1つまたは複数の他の特徴、整数、成分、工程、またはそれらの群の存在または追加を除外するわけではない。
【０２２６】
参考文献
以下の参考文献は、これらが本明細書に記載されるものを補完する典型的な手順または他の詳細を提供する程度に、参照によって本明細書に具体的に組み入れられる。
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図２ｇ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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