(57)【要約】本開示は、腫瘍細胞に対するタンパク質毒性ストレスを増大する薬剤又はシャペロームの生化学的再接続を誘導する薬剤と組み合わせて、ＨＳＰ９０阻害剤などのシャペロンタンパク質の阻害剤を使用する方法を提供する。タンパク質毒性薬剤は、相乗活性を達成するためにシャペロンタンパク質の投与前に投与される。具体的に、本発明者らは、癌細胞が、異常細胞中での増大した活性を見込んで、その全ての付随物（コシャペロン及び補助因子）と共に事前形成されたシャペローム複合体の貯留（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を有することを示す。さらに、本発明者らは、生化学的に再接続されて、これらの多重シャペローム集塊（エピシャペローム）を形成する癌細胞が、生存のためにエピシャペロームに依存性であることも明らかにする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質毒性ストレッサーによる前処置後、ＨＳＰ９０の阻害剤を癌患者に投与することによって癌を治療する方法であって、前記タンパク質毒性ストレッサーが、エピシャペロームの形成を増大するために前記ＨＳＰ９０阻害剤の投与前の十分な時点で投与される、方法。
【請求項２】
癌を治療する方法であって、ＨＳＰ９０の阻害剤を癌患者に投与するステップを含み、前記患者が、エピシャペロームの形成を増大するために前記ＨＳＰ９０阻害剤の投与前の十分な時点でタンパク質毒性ストレッサーを受けている、方法。
【請求項３】
癌を治療する方法であって、Ｈｓｐ９０の阻害剤を受けている癌患者に、エピシャペロームの形成を増大するために前記ＨＳＰ９０阻害剤の投与前の十分な時点でタンパク質毒性ストレッサーを投与するステップを含む方法。
【請求項４】
前記ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも１時間後に投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質毒性ストレッサーが化学療法薬である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記化学療法薬が微小管安定剤である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記化学療法薬がプロテアソーム阻害剤である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質毒性ストレッサーが放射線である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質毒性ストレッサーが、温熱療法を誘導する薬剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータによる前処置後にＨＳＰ９０の阻害剤を癌患者に投与することによって癌を治療する方法。
【請求項１１】
前記ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータが、エピシャペローム複合体の形成を増大するために前記ＨＳＰ９０阻害剤の投与前の十分な時点で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＳＰ９０阻害剤が、前記ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータの投与から少なくとも１時間後に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータがホスファターゼである、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータがキナーゼ阻害剤である、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記キナーゼ阻害剤がＰＤ４０７８２４である、請求項１４項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＨＳＰ９０阻害剤が８−（６−ヨード−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルスルファニル）−９−（３−イソプロピルアミノ−プロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン（ＰＵ−Ｈ７１）又はその薬学的に許容される塩である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＵ−Ｈ７１の塩がＨＣｌ塩である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＨＳＰ９０阻害剤がＳＮＸ−５４２２、ＳＮＸ−２１１２、ＡＴ１３３８７、ＫＷ−２４７８、又はＳＴＡ−９０９０である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＨＳＰ９０阻害剤が、図１６又は図１７に示される化合物である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＨＳＰ９０阻害剤がＧＲＰ９４を選択的に阻害する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＨＳＰ７０阻害剤を投与するステップをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＨＳＰ７０阻害剤が前記タンパク質毒性ストレッサーの後に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＨＳＰ７０阻害剤が、前記ＨＳＰ９０阻害剤の前記投与と同時に又はその前に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が、乳癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌を含む肺癌、子宮頸癌、結腸癌、絨毛癌、膀胱癌、子宮頸癌、基底細胞癌、絨毛癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭部及び頚部癌、急性リンパ性癌（ＡＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む骨髄性白血病、多発性骨髄腫、Ｔ細胞白血病リンパ腫、肝臓癌、ホジキン病、リンパ性リンパ腫、神経芽細胞腫、濾胞性リンパ腫及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、黒色腫などの皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、腎臓癌、骨髄増殖性疾患、胃腸間質性腫瘍、食道癌、胃癌、膀胱癌、肛門癌を含む消化管癌、神経膠腫を含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫から選択される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
７〜３１日のサイクルにわたってタンパク質毒性ストレッサーとＨＳＰ９０阻害剤との組合せを投与することによって癌を治療する方法であって、前記タンパク質毒性ストレッサー及び前記ＨＳＰ９０阻害剤が、前記サイクルにわたって少なくとも１回投与され、前記タンパク質毒性ストレッサーの各投与後に前記ＨＳＰ９０阻害剤が投与される、方法。
【請求項２６】
前記治療サイクルが７日である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質毒性ストレッサー及びＨＳＰ９０阻害剤が前記治療サイクルの第１日にのみ投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記治療サイクルが２１日である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記タンパク質毒性ストレッサー及びＨＳＰ９０阻害剤が前記治療サイクルの第１日にのみ投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記タンパク質毒性ストレッサーが化学療法薬である、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記化学療法薬が微小管安定剤である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記化学療法薬がプロテアソーム阻害剤である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記プロテアソーム阻害剤がボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、及びＣＥＰ−１８７７０（デランゾミブ）から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＨＳＰ９０阻害剤の前に投与される前記化学療法薬が、ペメトレキセド、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ドキソルビシン、レナリドミド、アピオシリブ、ＰＤ４０７８２４及びＭＫ１７７５から選択される化学療法薬である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記タンパク質毒性ストレッサーが放射線である、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記タンパク質毒性ストレッサーが、温熱療法を誘導する薬剤である、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＨＳＰ９０阻害剤が８−（６−ヨード−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルスルファニル）−９−（３−イソプロピルアミノ−プロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン（ＰＵ−Ｈ７１）又はその薬学的に許容される塩である、請求項２５〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＰＵ−Ｈ７１の塩がＨＣｌ塩である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＨＳＰ７０阻害剤を投与するステップをさらに含む、請求項２５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＨＳＰ７０阻害剤が前記タンパク質毒性ストレッサーの後に投与される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＨＳＰ７０阻害剤が前記ＨＳＰ９０阻害剤の投与と同時に又はその前に投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記癌が、乳癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌を含む肺癌、子宮頸癌、結腸癌、絨毛癌、膀胱癌、子宮頸癌、基底細胞癌、絨毛癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭部及び頚部癌、急性リンパ性癌（ＡＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む骨髄性白血病、多発性骨髄腫、Ｔ細胞白血病リンパ腫、肝臓癌、ホジキン病、リンパ性リンパ腫、神経芽細胞腫、濾胞性リンパ腫及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、黒色腫などの皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、腎臓癌、骨髄増殖性疾患、胃腸間質性腫瘍、食道癌、胃癌、膀胱癌、肛門癌を含む消化管癌、神経膠腫を含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫から選択される、請求項２６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
癌を治療する方法であって、
癌患者からのサンプル中におけるエピシャペロームの存在を検出するステップ、
前記癌患者にＨＳＰ９０の阻害剤を投与するステップ
を含む方法。
【請求項４４】
前記エピシャペロームがタンパク質毒性ストレッサーによる前記癌患者の前処置後に検出される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記エピシャペロームが、ネイティブ多量体タンパク質複合体の等電点電気泳動と、その後の１つ又は複数の抗体による固定化複合体のプロービングとによって検出される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記１つ又は複数の抗体がＨＳＰ９０抗体を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＨＳＰ９０の阻害剤が、タンパク質毒性ストレッサーによる前処置後に投与され、前記タンパク質毒性ストレッサーが、前記エピシャペロームの形成を増大するために前記ＨＳＰ９０阻害剤の投与前の十分な時点で投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記患者が、前記エピシャペロームの形成を増大するために前記ＨＳＰ９０阻害剤の投与前の十分な時点でタンパク質毒性ストレッサーを受けている、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年１０月５日に提出された米国仮出願第６２／２３７，４７０号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の恒常性は、シャペローム、分子シャペロン及びコシャペロンのネットワーク並びにそれらの機能を補助する折り畳み酵素の協調的作用によって維持される。哺乳動物の細胞では、２００超の遺伝子が、細胞の総ポリペプチド質量の計約１０％を占めるシャペロームのメンバーをコードする。これらの大部分は、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）であり、シャペローム質量の５０〜６０％を構成するＨＳＰ９０及びＨＳＰ７０を含む。癌で複製による不死化を可能にするものなどの異常細胞プロセスは、プロテオーム機能不全により課された負荷を解消するためにシャペロームを抑制すことができる。しかしながら、逸脱したストレスシャペローム種は、依然として十分に特性決定されておらず、そのため、疾患生物学における重要な発展が妨げられている。
【０００３】
恒常性を維持するために、細胞は、明確な機能を実行するようにプログラムされた数千のタンパク質からなる複雑な分子機構を使用する。誤発現又は突然変異によるこれらの経路の異常調節は、悪性の表現型を付与する生物学的利点をもたらし得る。細胞レベルでこうした異常調節は有利であり得る（すなわち、生存率を高める）が、分子レベルでは、これにより、細胞は、これらのタンパク質の安定性及び機能を維持することにエネルギーを使う必要がある。これらのタンパク質を擬似安定状態で維持するために、癌細胞は、ＨＳＰ９０をはじめとする分子シャペロンを利用すると考えられる。
【０００４】
この恒常性の支持に際して、ＨＳＰ９０は、形質転換された表現型を維持する上で重要な役割を果たすことが認識されている。ＨＳＰ９０とその関連コシャペロンとは、集合的に「クライアントタンパク質」と呼ばれる細胞タンパク質の正しい構造的折り畳みを補助するが、クライアントタンパク質の多くは、細胞増殖、分化、ＤＮＡ損傷応答、及び細胞生存を制御するシグナル伝達経路のエフェクターである。従って、脱調節タンパク質（例えば、突然変異、異常発現、不適切な細胞転位などによる）への腫瘍細胞嗜癖（ａｄｄｉｃｔｉｏｎ）は、極めてＨＳＰ９０依存性であり得る。
【０００５】
様々な癌の形態におけるＨＳＰ９０療法の根拠は、現在、標準療法に対して抵抗性の疾患に関するものをはじめとする前臨床及び臨床試験によって十分に支持されている。例えば、研究により、ＨＳＰ９０阻害剤に対する特定のＨＥＲ２＋腫瘍の顕著な感受性が証明されている。これらの腫瘍では、１７−ＡＡＧ（タネスピマイシン（Ｔａｎｅｓｐｉｍｙｃｉｎ）とも呼ばれる）及び１７−ＤＭＡＧ（アルベスピマイシン））は、トラスツズマブ療法後の進行性疾患を有する患者において、並びに特にそうした患者でも応答を誘発した。ＰＵ−Ｈ７１などの他のＨＳＰ９０阻害剤は、いくつかのトリプルネガティブ乳癌マウスモデルにおいて、臨床前に試験された際、この難治性乳癌サブタイプでこれまで報告された最も強力な標的単剤抗腫瘍効果を送達した。
【０００６】
国際公開第２０１３／００９６５５号パンフレットでは、ＨＳＰ９０発現単独によって指令されない特定の「発癌性ＨＳＰ９０」種の存在量は、ＨＳＰ９０阻害療法に対する感受性を予測させるものであり、従ってＨＳＰ９０療法のバイオマーカであることが明らかにされた。「発癌性ＨＳＰ９０」は、シャペロン複合体の細胞ストレス特異的形態を代表するＨＳＰ９０部分として定義され、これは、拡大して、腫瘍細胞環境に構成的に維持され、悪性表現型を維持するのに必要な機能を実行し得る。このような役割は、過剰発現（すなわち、ＨＥＲ２）、突然変異（すなわち、ｍＢ−Ｒａｆ）又はキメラタンパク質（すなわち、Ｂｃｒ−Ａｂｌ）のフォールディングを調節するだけでなく、異常に活性化されたシグナル伝達複合体（すなわち、ＳＴＡＴ５、ＢＣＬ６）に関与する分子のスカフォールディング及び複合体形成を促進することでもある。腫瘍は、ＨＳＰ９０発癌性タンパク質のネットワーク上での生存に対して嗜癖性になると同時に、これらのタンパク質は、機能性及び安定性に関して「発癌性ＨＳＰ９０」に依存性になる。この共生相互依存は、ＨＳＰ９０発癌性タンパク質に対する腫瘍の依存が、「発癌性ＨＳＰ９０」に対する依存と等しいことを示唆する。
【０００７】
さらに、国際公開第２０１３／００９６５５号パンフレットでは、ＨＳＰ９０は、悪性細胞において生化学的に異なる複合体を形成することが明らかされた。癌細胞ＨＳＰ９０の主要部分は、正常な細胞と類似する「ハウスキーピング」シャペロンを保持するが、癌細胞中で濃縮又は拡大された機能的に異なるＨＳＰ９０プール（すなわち、「発癌性ＨＳＰ９０」）は、腫瘍細胞生存、異常増殖特性、並びに浸潤性及び転移性挙動を維持するために必要な発癌性タンパク質と特異的に相互作用する。
癌細胞及び正常細胞におけるＨＳＰ９０含有シャペローム複合体の構成の不一致は、当初、上方制御されたメンバーの発現であると考えられていた。しかしながら、現在では、後成的修飾がストレス修飾シャペロームの組成物を指令することが提唱されている。以下を参照されたい：Ｔａｌｄｏｎｅ，Ｔ．，Ｏｃｈｉａｎａ，Ｓ．Ｏ．，Ｐａｔｅｌ，Ｐ．Ｄ．＆Ｃｈｉｏｓｉｓ，Ｇ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｃｈａｐｅｒｏｍｅ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｙ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  ３５，５９２−６０３（２０１４）及びＭｏｌｌａｐｏｕｒ，Ｍ．＆Ｎｅｃｋｅｒｓ，Ｌ．Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｈｓｐ９０  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ  １８２３，６４８−６５５（２０１２）。そうではなく、特に翻訳後修飾などの化学的修飾、又はコシャペロン及びアダプタータンパク質の前動員による生化学的変更は、ストレスシャペローム種の明らかな特徴であり得る。その組成物及び安定性は、ネイティブ腫瘍に見出される内在性条件に高度に依存性である可能性があり、細胞環境を破壊又は改変して、分析を容易にする方法には制限があるため、こうしたストレスシャペローム種は、既存の実験室的アプローチによる研究を妨げている。
癌細胞におけるＨＳＰ９０機能の生物学の理解が近年進歩したにもかかわらず、ＨＳＰ９０の根本的な性質、構造及び機能並びにシャペローム内でのその役割は依然として十分にわかっていない。シャペロームについてのより根本的な理解は、癌治療のための新規の標的療法を開発する上で有益となるであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１３／００９６５５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔａｌｄｏｎｅ，Ｔ．，Ｏｃｈｉａｎａ，Ｓ．Ｏ．，Ｐａｔｅｌ，Ｐ．Ｄ．＆Ｃｈｉｏｓｉｓ，Ｇ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｃｈａｐｅｒｏｍｅ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｙ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  ３５，５９２−６０３（２０１４）
【非特許文献２】Ｍｏｌｌａｐｏｕｒ，Ｍ．＆Ｎｅｃｋｅｒｓ，Ｌ．Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｈｓｐ９０  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ  １８２３，６４８−６５５（２０１２）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、腫瘍細胞に対するタンパク質毒性ストレスを増大する薬剤又はシャペロームの生化学的再接続を誘導する薬剤と組み合わせて、ＨＳＰ９０阻害剤などのシャペロンタンパク質の阻害剤を使用する方法を提供する。
【００１１】
本開示では、本発明者らは、悪性形質転換などのストレスの条件下でシャペロームが生化学的に「再接続されて」、安定した生存促進性高分子量複合体を形成することを明らかにする。正常な生理的条件は、シャペロームアセンブリの一時的存在を誘導するが、本発明者らは、特定の癌細胞において安定した多シャペローム集塊（エピシャペロームと呼ばれる）の蓄積を明示するデータを提供する。具体的に、本発明者らは、癌細胞が、異常細胞中での増大した活性を見込んで、その全ての付随物（コシャペロン及び補助因子）と共に事前形成されたシャペローム複合体の貯留（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を有することを示す。さらに、本発明者らは、生化学的に再接続されて、これらの多重シャペローム集塊（エピシャペローム）を形成する癌細胞が、生存のためにエピシャペロームに依存性であることも明らかにする。
【００１２】
さらには、本発明者らは、適切なタンパク質毒性ストレスの誘導により、前述の安定した多シャペローム集塊（エピシャペローム）を形成するように癌細胞を誘導し得ることも示す。特定の状況では、タンパク質毒性ストレスは、本明細書で定義するエピシャペローム複合体中に、正常な生理条件下で存在する一過性シャペロームアセンブリを形質転換することができる。他の状況下では、タンパク質毒性ストレスは、既に形成されたエピシャペロームの安定性を増大することができる。いずれの場合にも、タンパク質毒性ストレスは、実際に癌細胞を、生存のためにＨＳＰ９０並びにエピシャペローム中の他のシャペロン及びコシャペロンタンパク質に対してより依存性にする。本発明者らは、本明細書において、ストレスを受けた癌細胞が、エピシャペロームを形成する少なくとも１つのタンパク質の阻害剤、例えばＨＳＰ９０阻害剤などによる治療を有意に受けやすいことを明らかにする。そのため、エピシャペロームを形成するタンパク質（例えば、ＨＳＰ９０）の１つの阻害剤を投与する前の十分な時点で腫瘍をタンパク質毒性ストレッサーで前処理することにより、タンパク質毒性ストレッサーで処理しなかった腫瘍と比較して、腫瘍を阻害療法に対して有意に感受性にすることを証明した。加えて、本発明者らは、エピシャペロームを形成するタンパク質の１つの阻害剤を投与する前の十分な時点で腫瘍をタンパク質毒性ストレッサーで前処理することは、細胞毒性ストレス因子と、エピシャペロームを形成するタンパク質の１つ（例えば、ＨＳＰ９０）の阻害剤とを同時に投与するよりも有意に効果的であることも明らかにする。
【００１３】
Ｔａｘｏｌ（登録商標）又はドキソルビシンと１７−ＡＡＧとを組み合わせて、癌細胞株にアポトーシスを誘導するという報告がある。Ｍｕｅｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．７，２２２８−２２３６，Ａｕｇ．２００１；Ｓｏｌｉｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．６３，２１３９−２１４４，Ｍａｙ  ２００３；及び米国特許第７，２１１，５６２号明細書（集合的に「Ｒｏｓｅｎら」とする）を参照されたい。しかしながら、本開示と異なり、Ｒｏｓｅｎらは、組合せの効果が細胞中の網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）発現の状態に依存的であることを見出した。特に、Ｒｏｓｅｎらは、１７−ＡＡＧによるＴａｘｏｌ（登録商標）誘導のアポトーシス増大が突然変異Ｒｂ又はＲｂ陰性細胞中で投与スケジュールと無関係であったことを示す。同様の結果が異種移植片実験で観測された。しかしながら、本発明の方法は、Ｒｂ状態に依存的でなく、Ｒｂ状態と無関係に優れた結果をもたらす。Ｒｏｓｅｎらはまた、アポトーシスに対して癌細胞を感受性にする上で細胞周期の役割にも注目する。しかし、本開示は、癌細胞の感受性化をもたらす主要因子としてのエピシャペロームの誘導に関する。
【００１４】
さらに、本発明とは対照的に、Ｒｏｓｅｎらは、いくつかの組合せ、例えばドキソルビシンと１７−ＡＡＧとの場合、投与の順序が無関係であることを見出した。しかし、続く実施例は、タンパク質毒性ストレッサー（例えば、ドキソルビシン）をＨｓｐ９０阻害剤の前に投与すると、その逆の順序と比較して投与スケジュール（すなわち、連続的治療）が優れた結果をもたらすことを示す。
【００１５】
Ｒｏｓｅｎらはまた、１７−ＡＡＧをＴａｘｏｌ（登録商標）と同時に投与した場合とその直後に投与した場合とでは、その組合せがＲｂ−陽性（例えば、野生型Ｒｂ）癌細胞に対して同様の結果をもたらすことも述べている。Ｍｕｅｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｐｇ．２２３４を参照されたい。これに対し、本発明は、タンパク質毒性ストレッサーの後に投与されたＨｓｐ９０阻害剤が、他の投与スケジュールと比較して予想外に優れた効果をもたらすという認識も包含する。
【００１６】
従って、本開示は、特定のタンパク質毒性ストレッサーの投与により癌細胞に対するタンパク質毒性ストレスを増加すると、ＨＳＰ９０阻害療法に対する細胞の感受性が増大するというエビデンスを提供する。タンパク質毒性ストレッサーは、癌細胞を、それらがＨＳＰ９０並びに他のシャペロン及びコシャペロンタンパク質に対する依存を高める状態に移行させることができる。従って、本開示は、タンパク質毒性ストレッサーとＨＳＰ９０阻害剤との合理的併用療法を用いて癌を治療する方法を提供し、この併用療法は、タンパク質毒性ストレッサーとＨＳＰ９０阻害剤との適切なタイミングに依存する。
【００１７】
一態様では、本開示は、タンパク質毒性ストレッサーによる前処置後、ＨＳＰ９０の阻害剤を癌患者に投与することによって癌を治療する方法を提供する。エピシャペローム複合体の形成を最大にし、それによって腫瘍をＨＳＰ９０阻害療法に対して最も脆弱性にするために、タンパク質毒性ストレッサーがＨＳＰ９０阻害剤の投与前の十分な時点で投与される。これに対し、エピシャペローム複合体が形成されたかなり後の時点でＨＳＰ９０阻害剤を投与すると、腫瘍は、生存のためにエピシャペロームに対してそれほど依存性ではなくなるため、ＨＳＰ９０阻害剤の効果が軽減され得る。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも１時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも２時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも３時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも４時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも５時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも６時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも７時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも８時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも９時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも１０時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも１２時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも１８時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも２４時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与後２４時間以内の時点で投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも３６時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与後３６時間以内の時点で投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも４８時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与後４８時間以内の時点で投与される。いくつかの実施形態では、タンパク質毒性ストレッサーは、前述の実施形態のいずれかの間、例えば、ＨＳＰ９０阻害剤の投与の約１〜３時間前、ＨＳＰ９０阻害剤の投与の約２〜４時間前、ＨＳＰ９０阻害剤の投与の約３〜５時間前、ＨＳＰ９０阻害剤の投与の約２〜６時間前、ＨＳＰ９０阻害剤の投与の約３〜６時間前、ＨＳＰ９０阻害剤の投与の約４〜６時間前、ＨＳＰ９０阻害剤の投与の約４〜８時間前、ＨＳＰ９０阻害剤の投与の約４〜１０時間前、ＨＳＰ９０阻害剤の投与の約５〜７時間前等の範囲内の時点で投与される。
【００１９】
特定の実施形態では、タンパク質毒性薬剤は、非経口（例えば、静脈内）投与される。こうした実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、非経口投与の完了後のある時点で投与される。例えば、ＨＳＰ９０阻害剤は、タンパク質毒性薬剤の経口投与から１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、又は１２時間後に投与され得る。いくつかの実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、タンパク質毒性薬剤の非経口投与の完了から１８、２４、３６、又は４８時間後に投与され得る。いくつかの実施形態では、ＨＳＰ９０は、前述の実施形態のいずれかの間、例えば、タンパク質毒性薬剤の非経口投与の完了から約１〜３時間後、タンパク質毒性薬剤の非経口投与の完了から約２〜４時間後、タンパク質毒性薬剤の非経口投与の完了から約３〜５時間後、タンパク質毒性薬剤の非経口投与の完了から約２〜６時間後、タンパク質毒性薬剤の非経口投与の完了から約３〜６時間後、タンパク質毒性薬剤の非経口投与の完了から約４〜６時間後、タンパク質毒性薬剤の非経口投与の完了から約４〜８時間後、タンパク質毒性薬剤の非経口投与の完了から約４〜１０時間後、タンパク質毒性薬剤の非経口投与の完了から約５〜７時間後等の範囲内の時点で投与される。
【００２０】
別の実施形態では、シャペロームの生化学的再接続を誘導する細胞にストレスを与える以外の手段により、ＨＳＰ９０又は別のシャペロンタンパク質を誘導して安定なエピシャペローム複合体を形成することができる。例えば、エピシャペローム複合体の安定性は、ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）のモジュレータで癌細胞を前処理することによって増大することができる。１つのこうした実施形態では、翻訳後修飾は、シャペロームタンパク質のリン酸化の量を制限することによって達成される。例えば、ホスファターゼを添加することにより、リン酸基を除去することができる。或いは、ＨＳＰ９０阻害剤の投与前のある時点でキナーゼ阻害剤を添加して、シャペロンタンパク質のリン酸化を低減することができる。１つのこうした実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤の投与前に薬剤ＰＤ４０７８２４、すなわちチェックポイントキナーゼＣｈｋ１及びＷｅｅ１の阻害剤で癌細胞を前処理する。
【００２１】
本明細書に開示される方法を用いて、限定されないが、乳癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌を含む肺癌、子宮頸癌、結腸癌、絨毛癌、膀胱癌、子宮頸癌、基底細胞癌、絨毛癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭部及び頚部癌、急性リンパ性癌（ＡＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む骨髄性白血病、多発性骨髄腫、Ｔ細胞白血病リンパ腫、肝臓癌、ホジキン病、リンパ性リンパ腫、神経芽細胞腫、濾胞性リンパ腫及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、黒色腫などの皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、腎臓癌、骨髄増殖性疾患、胃腸間質性腫瘍、食道癌、胃癌、膀胱癌、肛門癌を含む消化管癌、神経膠腫を含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫を含む様々な癌を治療することができる。
【００２２】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）欠失又はＲｂ陰性癌を治療することができる。一部の施形態では、本明細書に開示される方法を使用して、乳癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌を含む肺癌、子宮頸癌、結腸癌、絨毛癌、膀胱癌、子宮頸癌、基底細胞癌、絨毛癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭部及び頚部癌、急性リンパ性癌（ＡＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む骨髄性白血病、多発性骨髄腫、Ｔ細胞白血病リンパ腫、肝臓癌、ホジキン病、リンパ性リンパ腫、神経芽細胞腫、濾胞性リンパ腫及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、黒色腫などの皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、腎臓癌、骨髄増殖性疾患、胃腸間質性腫瘍、食道癌、胃癌、膀胱癌、肛門癌を含む消化管癌、神経膠腫を含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫を含む様々な癌を治療することができ、ここで、癌は、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）欠失又はＲｂ陰性癌である。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して、小細胞肺癌、トリプルネガティブ乳癌、ＨＰＶ陽性頭部及び頚部癌、網膜芽細胞腫、膀胱癌、前立腺癌、骨肉腫、又は子宮頸癌を治療することができ、ここで、癌は、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）欠失又はＲｂ陰性癌である。
【００２３】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）発現、Ｒｂ陽性、及び／又はＲｂ野生型癌を治療することができる。一部の施形態では、本明細書に開示される方法を使用して、網膜芽細胞腫、骨肉腫、又は小細胞肺癌以外の癌を治療することができる。一部の施形態では、本明細書に開示される方法を使用して、Ｒｂ陽性である、乳癌以外の癌を治療することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して、ＨＥＲ２を過剰発現する、乳癌以外の癌を治療することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して、Ｒｂ陽性であり、且つＨＥＲ２を過剰発現する、乳癌以外の癌を治療することができる。ＨＥＲ２過剰発現の決定には、適切な基準との比較を使用してもよく、この基準が、一部の実施形態では、中度、低度、又は検出不可能なＨＥＲ２発現を有する乳癌であり、他の実施形態では、中度、低度、又は検出不可能なＨＥＲ２発現を有する別の癌であることは理解されるであろう。
【００２４】
一実施形態では、ＨＳＰ９０の前に投与されるタンパク質毒性ストレッサーは、化学療法薬である。特定の化学療法試薬としては、限定されないが、微小管安定剤、プロテアソーム阻害剤、抗代謝薬、アントラサイクリン、及びアルキル化剤が挙げられる。化学療法薬は、細胞中に形成されるエピシャペロームのレベルを増加することができる用量で提供される。一実施形態では、化学療法薬は、癌患者に一般に投与される用量で投与され得る。一部の実施形態では、化学療法薬（例えば、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）などのタキサン）は、化学療法薬についての添付文書（例えば、薬剤ラベル）に表示されるのと同じ用量で投与される。別の実施形態では、化学療法薬は、癌患者に典型的に投与される量より少ない用量で投与され得る。例えば、癌患者に投与される化学療法薬の用量は、化学療法薬の添付文書に表示される量の８０％、その量の７０％、その量の６０％、その量の５０％、その量の４０％、その量の３０％、又はその量の２０％であってよい。いくつかの実施形態では、化学療法薬は、前述の実施形態のいずれかの間、例えば、化学療法薬の添付文書に表示される量の２０％〜８０％、化学療法薬の添付文書に表示される量の４０％〜８０％、化学療法薬の添付文書に表示される量の５０％〜７０％、化学療法薬の添付文書に表示される量の５０％〜６０％等の量で投与され得る。
【００２５】
こうした一実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤の前に投与される化学療法薬は、微小管安定剤である。具体的な微小管安定剤としては、限定されないが、ドセタキセル、パクリタキセル、カバジタキセル、イキサベピロン、ビンクリスチン、ラウリマリド、ジスコデルモリド、及びエポチロンが挙げられる。一実施形態では、タンパク質毒性ストレッサーは、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）などのタンパク質結合パクリタキセル組成物である。他の実施形態では、タンパク質毒性ストレッサーは、クレマフォールを基剤とするパクリタキセル組成物（例えば、Ｔａｘｏｌ（登録商標））である。
【００２６】
別のこうした実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤の前に投与される化学療法薬は、プロテアソーム阻害剤である。具体的なプロテアソーム阻害剤としては、限定されないが、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、及びＣＥＰ−１８７７０（デランゾミブ）が挙げられる。
【００２７】
別のこうした実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤の前に投与される化学療法薬は、ペメトレキセド、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ドキソルビシン、レナリドミド、アピオシリブ、ＰＤ４０７８２４、及びＭＫ１７７５から選択される化学療法薬である。
【００２８】
一実施形態では、被験者は、本開示に従う投与レジメンの投与前に１つ又は複数の化学療法薬の投与を受けるか又は以前に受けている。患者が特定の化学療法薬の投与レジメンを現在受けている場合、投与レジメンを本開示に従って修正する必要もあり得る。従って、本開示は、癌を治療する方法を提供し、前記方法は、ＨＳＰ９０の阻害剤を癌患者に投与するステップを含み、患者は、エピシャペロームの形成を増大するためにＨＳＰ９０阻害剤の投与前の十分な時点でタンパク質毒性ストレッサーを受けている。
【００２９】
本開示の一実施形態では、タンパク質毒性ストレッサーの投与後に投与されるＨＳＰ９０阻害剤は、患者の癌細胞中に存在するＨＳＰ９０の発癌形態（すなわち、発癌性ＨＳＰ９０）に直接且つ優先的に結合するＨＳＰ９０阻害剤である。本開示の一実施形態では、タンパク質毒性ストレッサーの投与後に投与されるＨＳＰ９０阻害剤は、８−（６−ヨード−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルスルファニル）−９−（３−イソプロピルアミノ−プロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン（ＰＵ−Ｈ７１）又はその薬学的に許容される塩（例えば、ＨＣｌ塩）である。ＰＵ−Ｈ７１は、週１回、週２回、週３回、週４回、又は週５回から選択される投与スケジュールに従って約５ｍｇ／ｍ２〜３５０ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与され得る。本開示によれば、タンパク質毒性ストレッサーは、一般に、ＰＵ−Ｈ７１の各投与前に予め定めた時点で投与される。特定の実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、週１回、週２回、週３回、週４回、又は週５回から選択される投与スケジュールに従って約２０ｍｇ／ｍ２〜６０ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される。別の実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、週１回、週２回、週３回、週４回、又は週５回から選択される投与スケジュールに従って約６０ｍｇ／ｍ２〜１５０ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される。別の実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、週１回、週２回、週３回、週４回、又は週５回から選択される投与スケジュールに従って約２００ｍｇ／ｍ２〜３５０ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される。別の実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、週１回、週２回、週３回、週４回、又は週５回から選択される投与スケジュールに従って約２５０ｍｇ／ｍ２〜３００ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される。別の実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、週２回の投与スケジュールに従って約２５０ｍｇ／ｍ２〜３００ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される。別の実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、週１回の投与スケジュールに従って約３００ｍｇ／ｍ２〜３５０ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される。
【００３０】
ＰＵ−Ｈ７１は、週１回、２週に１回、３週に１回、又は４週に１回から選択される投与スケジュールに従って約５ｍｇ／ｍ２〜３５０ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与され得る。本開示によれば、タンパク質毒性ストレッサーは、一般に、ＰＵ−Ｈ７１の各投与前に予め定めた時点で投与される。特定の実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、週１回、２週に１回、３週に１回、又は４週に１回から選択される投与スケジュールに従って約２０ｍｇ／ｍ２〜６０ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される。別の実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、週１回、２週に１回、３週に１回、又は４週に１回から選択される投与スケジュールに従って約６０ｍｇ／ｍ２〜１５０ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される。別の実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、週１回、２週に１回、３週に１回、又は４週に１回から選択される投与スケジュールに従って約２００ｍｇ／ｍ２〜３５０ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される。別の実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、週１回、２週に１回、３週に１回、又は４週に１回から選択される投与スケジュールに従って約２５０ｍｇ／ｍ２〜３００ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される。別の実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、３週に１回の投与スケジュールに従って約２５０ｍｇ／ｍ２〜３００ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される。別の実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、３週に１回の投与スケジュールに従って約３００ｍｇ／ｍ２〜３５０ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される。
【００３１】
他の実施形態では、タンパク質毒性ストレッサーの投与後に投与されるＨＳＰ９０阻害剤は、ＳＮＸ−５４２２、ＳＮＸ−２１１２、ＫＷ−２４７８、ＡＴ１３３８７、及びＳＴＡ−９０９０から選択される。
【００３２】
一態様では、本開示は、７日〜３１日の治療サイクルにわたってタンパク質毒性ストレッサー（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）とＨＳＰ９０阻害剤との組合せを投与することによって癌を治療する方法を提供し、ここで、タンパク質毒性ストレッサー（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）及びＨＳＰ９０阻害剤は、前記サイクルにわたって少なくとも１回投与され、前記ンパク質毒性ストレス因子（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）の各投与後に前記ＨＳＰ９０阻害剤が投与される。本開示によれば、ＨＳＰ９０阻害剤の投与は、タンパク質毒性ストレッサー（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）によって誘導されるエピシャペローム形成の増加後に始める。一部の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）の投与から少なくとも１時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）の投与から少なくとも２時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）の投与から少なくとも３時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）の投与から少なくとも４時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）の投与から少なくとも５時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）の投与から少なくとも６時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）の投与から少なくとも７時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）の投与から少なくとも８時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）の投与から少なくとも９時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）の投与から少なくとも１０時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）の投与から少なくとも１２時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）の投与から少なくとも１８時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）の投与から少なくとも２４時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）の投与から少なくとも３６時間後に投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）の投与から少なくとも４８時間後に投与される。いくつかの実施形態では、タンパク質毒性ストレッサー又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）は、前述の実施形態のいずれかの間、例えば、ＨＳＰ９０阻害剤の投与の約１〜３時間前、ＨＳＰ９０阻害剤の投与の約２〜４時間前、ＨＳＰ９０阻害剤の投与の約３〜５時間前、ＨＳＰ９０阻害剤の投与の約２〜６時間前、ＨＳＰ９０阻害剤の投与の約３〜６時間前、ＨＳＰ９０阻害剤の投与の約４〜６時間前、ＨＳＰ９０阻害剤の投与の約４〜８時間前、ＨＳＰ９０阻害剤の投与の約４〜１０時間前、ＨＳＰ９０阻害剤の投与の約５〜７時間前等の範囲内の時点で投与される。
【００３３】
一部の実施形態では、治療サイクルは、２１日サイクルであってよく、その際、タンパク質毒性ストレッサー（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）及びＨＳＰ９０阻害剤は、サイクルの第１日にのみ投与される。一部の実施形態では、治療サイクルは、２１日サイクルであってよく、その際、タンパク質毒性ストレッサー（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）及びＨＳＰ９０阻害剤は、サイクル期間中に２回、３回、４回、５回、６回、７回又は８回投与される。一部の実施形態では、治療サイクルは、１４日サイクルであってよく、その際、タンパク質毒性ストレッサー（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）及びＨＳＰ９０阻害剤は、サイクル期間にわたって１回、２回、３回、４回、５回、又は６回投与される。一部の実施形態では、治療サイクルは、２８日サイクルであってよく、その際、タンパク質毒性ストレッサー（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）及びＨＳＰ９０阻害剤は、サイクル期間中に２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、又は１０回投与される。一部のこうした実施形態では、タンパク質毒性ストレッサー（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）及びＨＳＰ９０阻害剤は、２８治療サイクルの第１、第８、及び第１５日に投与され得る。別の実施形態では、治療サイクルは、７日サイクルであってよく、その際、タンパク質毒性ストレッサー（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）及びＨＳＰ９０阻害剤は、サイクルの第１日に投与される。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）は、タンパク質毒性ストレッサー（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）が投与される日にのみ投与される。別の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、タンパク質毒性ストレッサー（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）が投与される日及びタンパク質毒性ストレッサー（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）が投与されない日に投与される。例えば、２週間サイクルの場合、ＨＳＰ９０阻害剤及びタンパク質毒性ストレッサー（又はＨＳＰ９０の翻訳後修飾のモジュレータ）は、サイクルの第１及び第８日に投与され得、ＨＳＰ９０阻害剤は、サイクルの第４及び第１１日に単独で投与され得る。
【００３５】
別の実施形態では、エピシャペロームが腫瘍中に存在するか否かを決定する方法を提供する。出願者は、癌細胞中のエピシャペロームの形成量が大きいほど、癌細胞が生存及び増殖のためにエピシャメロームに対して依存的になることを見出した。本開示は、腫瘍中のエピシャペロームの検出を可能にする生化学アッセイを提供する。このように、エピシャペロームは、バイオマーカとして利用することができる生化学的シグネチャーをもたらす。遺伝的又は組織属性とは無関係に、いくつかの腫瘍タイプにおいてそれが起こることから、このバイオマーカは、既に臨床又は後期前臨床評価において数種のＨＳＰ９０及びＨＳＰ７０阻害剤に応答するであろう腫瘍の同定のための患者階層化の手段を提供する。本開示はまた、エピシャペロームの発生を有する腫瘍が、エピシャペローム複合体のない腫瘍よりも、シャペロン及びコシャペロンメンバー（例えば、ＨＳＰ９０又はＨＳＰ７０）をターゲッティングする薬物に対する治療をはるかに受けやすいことも立証する。さらに、本明細書に開示される生化学的技術によって測定されるエピシャペローム複合体の存在量は、シャペロームメンバーをターゲッティングする薬物に応答する癌細胞の脆弱性を示すものである。
【００３６】
一実施形態では、エピシャペローム複合体の存在又はその欠乏は、等電点電気泳動をイムノブロット能力と組み合わせるキャピラリーベースのプラットホームを用いて決定される。この方法は、固定化したｐＨ勾配を用いて、等電点（ｐＩ）に基づいてネイティブ多量体タンパク質複合体を分離した後、特定の抗体を含む固定化複合体のプロービングを行う。さらに、これは、微量のサンプルのみを使用するため、１次試料の検査が可能になる。別の実施形態では、エピシャペローム複合体の存在又はその欠如は、ネイティブＰＡＧＥを用いて決定される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１−１】いくつかの癌細胞を示すが、その全てが、ＨＳＰ９０が重要な成分であるマルチシャペローム複合体が豊富というわけではない。１ａ、１ｂ）ネイティブキャピラリー等電点電気泳動分離条件下で細胞ホモジネートを分析し、ＨＳＰ９０α及びＨＳＰ９０βに対する抗体でプロービングした。ＰＴ；原発性腫瘍、ＮＰＴ；腫瘍と隣接する正常組織。２つの技術的反復から得た平均±ｓ．ｄ．を示す。１ｃ）培養細胞及び原発性腫瘍のＨＳＰ９０の生化学的プロフィール。ＴＢＮＣ、トリプルネガティブ乳癌。１ｄ）ネイティブ及び変性ゲル条件下でのいくつかのシャペロームメンバーの生化学的プロフィール。ＩＢ、イムノブロッティング。全てのデータは、２又は３回の独立した実験を代表するものである。
【図１−２】同上。
【図１−３】同上。
【図２−１】相互接続し、安定した多量体シャペローム複合体がタイプ１癌細胞中に存在することを示す。２ａ）タイプ１、２及び非形質転換細胞中の重要なシャペロームメンバー同士の機能及び生化学的関係性に関する研究を示す概略図。２ｂ）ＨＳＰ７０、ＨＳＣ７０、及びＨＯＰに対する抗体が欠失したタイプ１癌細胞ホモジネート、並びにＡＨＡ−１が特定のｓｉＲＮＡによりノックダウンされた細胞についての多量体シャペローム複合体の変化。２ｃ）表示される細胞ホモジネートからそれぞれの化学ベイトによって単離されたＨＳＰ９０及びＨＳＰ７０のカーゴ又は相互作用タンパク質。ホモジネート及び単離物中のタンパク質のレベルは、ウエスタンブロットによりプロービングした。全てのデータは、２又は３回の独立した実験を代表するものである。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【図３−１】エピシャペロームが癌細胞生存を促進することを立証する。３ａ）表示の細胞：ＭＤＡＭＢ４６８（タイプ１、高エピシャペローム、ＨＳＰ９０阻害剤に対して感受性）、ＡＳＰＣ１（タイプ２、低からゼロエピシャペローム、ＨＳＰ９０阻害剤に耐性）及びＨＭＥＣ（非形質転換）の溶解物をＰＵ−Ｈ７１ビーズ（固体支持体に結合させたＰＵ−Ｈ７１）と共にその量を増加させながら、又は対照ビーズ（不活性化学物質を結合させたビーズ）と一緒にインキュベートした。３ｂ）〜３ｄ）ＰＵ−Ｈ７１捕捉により測定されるエピシャペローム存在量と、アネキシンＶ染色により測定されるＰＵ−Ｈ７１による４８時間処理時点の細胞生存能との相関分析。各データポイントは、細胞株を示し；データは、２回の技術反復から得られる平均である。３ｅ）ｓｉＲＮＡ又はスクランブルコントロールによってＡＨＡ−１レベル低下したＰＵ−Ｈ７１感受性。ＰＵ−Ｈ７１と一緒にその濃度を増加させながら、細胞を２４時間処理した。２回の技術反復からの平均±ｓ．ｄ．及び代表的なウエスタンブロットを示す。３ｆ）図３ｄに対応する遺伝子損傷。３ｇ）アネキシンＶ染色により測定される、表示のＨＳＰ９０剤で４８時間処理したタイプ１及びタイプ２癌細胞のアポトーシス感受性。
【図３−２】同上。
【図３−３】同上。
【図３−４】同上。
【図３−５】同上。
【図３−６】同上。
【図３−７】同上。
【図４】実施例６の処理の概略的エクスビボ試験を示す。
【図５−１】エピシャペローム陽性腫瘍がＨＳＰ９０阻害に対して感受性であることを明らかにするエクスビボ試験を示す。５ａ）は、ＨＳＰ９０阻害剤ＰＵ−Ｈ７１でエクスビボ処理した原発性乳癌試料の感受性及びエピシャペローム発現を示す。５ｂ）ＰＵ−Ｈ７１でエクスビボ処理した原発性乳癌試料の代表的な例。５ｃ）ＰＵ−Ｈ７１でエクスビボ処理した急性骨髄性白血病試料の代表的な例。５ｄ）ＨＳＰ９０阻害剤ＰＵ−Ｈ７１でエクスビボ処理した急性骨髄性白血病試料の感受性。５ｅ）Ｈｓｐ９０阻害剤ＰＵ−Ｈ７１でエクスビボ処理した原発性乳癌試料の感受性及びエピシャペローム発現をさらに示す。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【図５−４】同上。
【図５−５】同上。
【図５−６】同上。
【図５−７】同上。
【図６−１】全ての腫瘍が、エピシャペロームに依存するわけではないが、過半数がそうであることを立証する。ａ〜ｃ）９５の癌細胞株（ａ）及び４０の原発性ＡＭＬ（ｂ）の群ではＰＵ−ＦＩＴＣにより、並びに５０の固形腫瘍ではＰＵ−ＰＥＴにより決定されたエピシャペローム存在量。ＰＵ−ＰＥＴの場合、代表的な固形腫瘍の横断面ＣＴ及びＰＵ−ＰＥＴ画像を各々同じ横断面で示す。腫瘍の位置は矢印で示される。
【図６−２】同上。
【図６−３】同上。
【図７−１】タンパク質毒性ストレッサーの導入による癌細胞のストレスの増大が癌細胞の薬理学的脆弱性を増すことを明らかにする。左側の図は、細胞をタンパク質毒性ストレッサーの導入後にＨＳＰ嗜癖の状態にさせると、安定したシャペローム複合体が形成されることを示す。左下に示すように、ストレス状態の細胞（すなわち、エピシャペローム形成がより大きい）は、ＨＳＰ９０療法に対してより脆性である。右側の図は、化学療法薬の添加又はＨＳＰ９０及び／若しくはその相互作用シャペロームの翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータでの前処理をはじめとする、エピシャペローム形成を増大するいくつかの手段を示す。
【図７−２】同上。
【図８−１】ＨＳＰ９０阻害剤（ＰＵ−Ｈ７１について例示）の添加前にタキサンで乳癌及び膵臓癌を処理すると、いずれかの化合物を単独で又は反対の順序で添加した場合と比較してストレスシャペロームレベルが増加することを立証する。８ａ、８ｂ）ビヒクル、正の対照、パクリタキセル若しくはボルテゾミブで処理した細胞における、ネイティブ及び変性ゲル条件下でのＨＳＰ９０及びいくつかのシャペロームメンバーの生化学的プロフィール。８ｃ）表示される通りにビヒクル、ＰＵ−Ｈ７１及びドセタキセルの連続的組合せで処理したＭｉａＰａＣａ２膵臓癌細胞の脆弱性。７２時間時点の細胞生存能は、スルホローダアミン（ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ）Ｂアッセイを用いて測定した。タキサンの前のＰＵが拮抗性であることに留意されたい。８ｄ）ネイティブ条件下でのＨＳＰ９０の生化学的プロフィール。パクリタキセルで胞を１時間細前処理した後、薬剤を洗い落として、インビボ条件を模倣した。エピシャペロームレベル（標識上部＞二量体）は、釣鐘状を描き、５〜７時間時点でピークが認められ、その後２４時間までに内在性レベルに減少することに留意されたい。８ｅ、８ｆ）表示される化学療法薬で処理した表示の癌細胞（乳癌、膵臓癌及び肺癌を示す）における、ネイティブ及び変性ゲル条件下でのＨＳＰ９０の生化学的プロフィール。エピシャペロームの増加をもたらした実験条件を星印で示す。
【図８−２】同上。
【図８−３】同上。
【図８−４】同上。
【図８−５】同上。
【図８−６】同上。
【図９−１】翻訳後修飾改変  −  リン酸化の作用によるエピシャペロームの調節を立証する。９ａ）ビヒクル又はホスファターゼ（ＬＰＰ）で処理した癌細胞溶解物における、ネイティブ及び変性ゲル条件下でのＨＳＰ９０の生化学的プロフィール。右側、固体支持体に結合させたＰＵ−Ｈ７１の結合プロフィール。ＬＰＰで処理した溶解物中のストレスＨＳＰ９０の増加（エピシャペロームの形成の阻害又は制限におけるリン酸化の潜在的役割を示唆する）に留意されたい。９ｂ）表示されるキナーゼ阻害剤及び化学療法薬で処理した表示の乳癌細胞における、ネイティブゲル条件下でのＨＳＰ９０の生化学的プロフィール。全てではないが、いくつかのキナーゼの阻害がエピシャペロームの細胞レベルの増加をもたらすことに留意されたい。ＹＫ１９８は、アロステリックＨＳＰ７０阻害剤である。
【図９−２】同上。
【図１０】エピシャペローム形成を誘導することができる特定のタンパク質毒性ストレッサーを示す。
【図１１−１】異種移植ＭｉａＰａｃａ２膵臓癌腫瘍を担持するマウスに、表示の治療パラダイムで投与される場合のＰＵ−Ｈ７１及びＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の効果及び安全性をモニターするインビボ試験を示す。１１ａ、１１ｂ）連続的（投与）は、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）、その６時間後のＰＵ−Ｈ７１を示す。Ａｂ、ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）、ＰＵ、ＰＵ−Ｈ７１。腫瘍体積は、Ａ．平均±ＳＤ及びＢ．個々のマウスの腫瘍体積として示す。薬剤は、ｉｐ注射により週１回（１×ｗｋ）投与した。１１ｃ、１１ｄ）マウスは、週２回モニターした。１１ｅ）Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）とＰＵ−Ｈ７１との同時投与、又はＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の１時間、３時間若しくは６時間後それぞれのＰＵ−Ｈ７１の連続的投与の腫瘍退縮に対する作用。表示される治療パラダイムの第２８日に測定した異種移植腫瘍の体積測定値（１１ｆ）及びマウス体重（１１ｇ）。
【図１１−２】同上。
【図１１−３】同上。
【図１１−４】同上。
【図１２】異種移植されたＭｉａＰａｃａ２膵臓癌腫瘍を担持するマウスに、表示される治療パラダイムで投与した場合のＰＵ−Ｈ７１及びＡｒａｂａｘａｎｅ（登録商標）の治療レジメンの５週間時点で撮影された代表的なマウスの写真を示す。Ａｒａｂａｘａｎｅ（登録商標）投与から６時間後のＰＵ−Ｈ７１の連続的処理によって治癒が達成されたのに対し、ＰＵ−Ｈ７１とＡｒａｂａｘａｎｅ（登録商標）との同時処理では、停滞又は退縮が達成された。
【図１３−１】異種移植ＮＣＩ−Ｈ１９７５  ＥＧＦＲ突然変異非小細胞肺癌腫瘍を担持するマウスに、表示の治療パラダイムで投与される場合のＰＵ−Ｈ７１及びＡｂｒａｘａｎｅの効果及び安全性をモニターするインビボ試験を示す。１３ａ）ＰＵ−Ｈ７１は、Ａｒａｂａｘａｎｅ（登録商標）の６時間〜２４時間前（ＰＵ→６時間後Ａｂ；ＰＵ→２４時間後Ａｂ）又はその逆（Ａｂ→６時間後ＰＵ、Ａｂ→２４時間後ＰＵ）に投与した。各薬剤は、単独で又は同時併用でも投与した。薬剤は、ｉｐ注射により週１回（１×ｗｋ）投与した。１３ｂ）同時及びＡｂ→６時間後ＰＵアームを処置し、表示のようにモニターした。同時アームでは全てのマウスが第１００日前後で再発したのに対し、連続的Ａｂ→６時間後ＰＵアームでは治癒が認められたことに留意されたい。１３ｃ）Ａｒａｂａｘａｎｅ（登録商標）に関して、腫瘍再発に対するＡｂ→６時間後ＰＵの作用。体重減少は記録されなかった（示していない）。表示される治療パラダイムの第１４日（１３ｄ）及び第２８日（１３ｅ）の異種移植腫瘍の体積測定値。
【図１３−２】同上。
【図１３−３】同上。
【図１４−１】異種移植乳癌腫瘍を担持するマウスに、表示の治療パラダイムで投与される場合のＰＵ−Ｈ７１及びＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の効果及び安全性をモニターするインビボ試験を示す。１４ａ、１４ｃ、及び１４ｄ）ＨＣＣ−１８０６腫瘍モデルの結果を示し；１４ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍モデルの結果を示す。
【図１４−２】同上。
【図１５】Ｉｎｕｃｙｔｅ速度論的増殖アッセイ（実施例１１）の結果を示す。
【図１６−１】本開示の方法に従って投与されるＨＳＰ９０阻害剤の構造を示す。
【図１６−２】同上。
【図１６−３】同上。
【図１６−４】同上。
【図１６−５】同上。
【図１６−６】同上。
【図１７−１】本開示の方法に従って投与されるＨＳＰ９０阻害剤の構造を示す。
【図１７−２】同上。
【図１７−３】同上。
【図１７−４】同上。
【図１７−５】同上。
【図１８−１】ケモプロテオームストレッサーの後に投与されるＨＳＰ９０阻害剤の効果をさらに立証する。１８ａは、ＰＵ−Ｈ７１の添加前にドキシルビシン（ＤＯＸ）の階段希釈物に曝露されたバーキットリンパ腫細胞の生存能を示す。１８ｂは、ＤＬＢＣＬ細胞に対する次の組合せ：ＤＯＸ、続いてＰＵ−Ｈ７１（茶色の丸）、ＰＵ−７１、続いてＤＯＸ（青色の丸）又は同時投与（黒い丸）の投与の併用係数を示す。１８ｃは、表示される薬剤組合せに曝露されたＤＬＢＣＬ細胞においてフローサイトメトリーにより測定されるカスパーゼ−３活性化を示す。
【図１８−２】同上。
【図１９−１】表示される異種移植腫瘍を担持するマウス（ｎ＝３〜５）に、表示の治療パラダイムで投与される場合のＰＵ−Ｈ７１及びＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の効果及び安全性をさらに立証する。腫瘍体積は、平均±ＳＤ又は個々のマウスの腫瘍体積として示す。薬剤は、週１回（１×ｗｋ）投与した。ＰＵ；ＰＵ−Ｈ７１、７５ｍｐｋ、ｉｐ；Ａｂ、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）、３０ｍｐｋ、ｉｐ；Ａｂ→ＰＵ連続的（投与）は、Ａｒａｂａｘａｎｅ（登録商標）、その６時間後のＰＵ−Ｈ７１を示す。前述の治療パラダイムでの腫瘍成長（１９ａ〜１９ｃ）及びマウス体重（１９ｄ、次の順に表示される：「ビヒクル」、左端の欄、続いて「ＰＵ（１×ｗｋ）」、「Ａｂ（１×ｗｋ）」、Ａｂ＋ＰＵ同時（１×ｗｋ）」、及び右端に「Ａｂ→６時間後ＰＵ（１×ｗｋ）」）を、表示される腫瘍：ａ、ＮＣＩ−Ｈ１９７５肺癌、ｂ、ＨＣＣ−１８０６、トリプルネガティブ乳癌、ｃ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、トリプルネガティブ乳癌においてモニターした。長期体重モニタリングについては図２０ｃ及び２０ｄを参照されたい。
【図１９−２】同上。
【図２０−１】表示される異種移植腫瘍を担持するマウス（ｎ＝５）に、表示の治療パラダイムで投与される場合のＰＵ−Ｈ７１及びＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の効果及び安全性をさらに立証する。腫瘍体積は、個々のマウスについて示し（Ａ、Ｂ）、マウス体重は、平均±ＳＥＭとして示す（Ｃ、Ｄ）。薬剤は、週１回（１×ｗｋ）投与した。ＰＵ；ＰＵ−Ｈ７１、７５ｍｐｋ、ｉｐ；Ａｂ、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）、３０ｍｐｋ、ｉｐ；Ａｂ→ＰＵ連続的は、Ａｒａｂａｘａｎｅ（登録商標）の６時間後ＰＵ−Ｈ７１を示す。マウスは、２０サイクル超連続した毎週連続的Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）／ＰＵ−Ｈ７１を受けたが、毒性の臨床徴候及び体重減少は認められなかった。
【図２０−２】同上。
【図２１】異種移植ＭｉａＰａＣａ２  ４膵臓癌腫瘍を担持するマウス（ｎ＝４〜５）に、表示の治療パラダイムで投与される場合のＰＵ−Ｈ７１及びＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（３０ｍｇ／ｋｇ）の効果及び安全性をさらに立証する。処置の第２８日の腫瘍体積（ａ）及びマウス体重（ｂ）の値は、平均±ＳＥＭとして示す。データは、左から右の欄へと次の順に表示される：「第２１日までビヒクル、その後ＡＢ＞６時間後ＰＵに変更（１４Ｆ）」、「Ａｂｒａｘａｎｅ（１×ｗｋ）３０ｍｐｋ  ｉｖ」、「Ａｂｒａｘａｎｅ（１×ｗｋ）３０ｍｐｋ  ｉｖ」、「Ａｂｒａｘａｎｅ（１×ｗｋ）３０ｍｐｋ  ｉｖ＞６時間後ＰＵ−Ｈ７１（１×ｗｋ）７５ｍｐｋ  ｉｐ」、「Ａｂｒａｘａｎｅ（１×ｗｋ）３０ｍｐｋ  ｉｖ＞同時ＰＵ−Ｈ７１（１×ｗｋ）７５ｍｐｋ  ｉｐ」、「Ａｂｒａｘａｎｅ（１×ｗｋ）３０ｍｐｋ  ｉｖ＞６時間後ＰＵ−Ｈ７１（１×ｗｋ）７５ｍｐｋ  ｉｐ」、「Ａｂｒａｘａｎｅ（１×ｗｋ）３０ｍｐｋ  ｉｖ＞６時間後ＰＵ−Ｈ７１（２×ｗｋ）７５ｍｐｋ  ｉｐ」、「ビヒクル」。
【図２２−１】異種移植ＭｉａＰａＣａ２  ４膵臓癌腫瘍を担持するマウス（ｎ＝４〜５）に、表示の治療パラダイムで投与される場合のＰＵ−Ｈ７１及びＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の効果及び安全性をさらに立証する。処置期間中の腫瘍体積（ａ）及びマウス体重（ｂ、ｃ）の値は、平均±ＳＥＭとして示す。Ｓｉｄａｋの多重比較検定を含む二元配置分散分析を適用して１４Ｆと１４Ｇを比較した。１４Ｆ＝Ａｂ＞ＰＵ（６時間）Ａｒａｂａｘａｎｅ（登録商標）３０ｍｇ／ｋｇ  ｉｖ  １×ｗｖＰＵ−Ｈ７１  ７５ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ  １×ｗｋ、Ａｂの６時間後；１４Ｇ＝Ａｂ＞ＰＵ（６時間）Ａｒａｂａｘａｎｅ（登録商標）３０ｍｇ／ｋｇ  ｉｖ  １×ｗｋ  ＰＵ−Ｈ７１  ７５ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ  ２×ｗｋ、Ａｂの６時間後。
【図２２−２】同上。
【図２３】異種移植ＨＣＣ１８０６トリプルネガティブ乳癌腫瘍を担持するマウス（ｎ＝５）に、表示の治療パラダイムで投与される場合のＰＵ−Ｈ７１（７５ｍｇ／ｋｇ）及びＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（３０ｍｇ／ｋｇ）の効果及び安全性をさらに立証する。処置期間中の腫瘍体積（ａ）及びマウス体重（ｂ）の値は、平均±ＳＥＭとして示す。Ｓｉｄａｋの多重比較検定を含む二元配置分散分析を適用して１５Ｆと１５Ｇを比較した。１５Ｆ＝Ａｂ＞ＰＵ（６時間）Ａｒａｂａｘａｎｅ（登録商標）３０ｍｇ／ｋｇ  ｉｖ  １×ｗｖＰＵ−Ｈ７１  ７５ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ  １×ｗｋ、Ａｂの６時間後；１５Ｇ＝Ａｂ＞ＰＵ（６時間）Ａｒａｂａｘａｎｅ（登録商標）３０ｍｇ／ｋｇ  ｉｖ  １×ｗｋ  ＰＵ−Ｈ７１  ７５ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ  ２×ｗｋ、Ａｂの６時間後。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本開示は、タンパク質毒性ストレッサーによる前処理後、治療有効量のＨＳＰ９０の阻害剤を癌患者に投与することによって癌を治療する方法を提供する。
【００３９】
本出願で使用されるとき、「治療」という用語は、症状の発症を遅らせ、重症度を軽減するか、又は癌の症状の進行を遅らせることを指す。疾患の治癒が治療の範囲内にある必要はない。さらに、これらの治療目標の具体的な結果が個体によって変わること、一部の個体が、代表的集団の統計平均よりも高い又は低い利益を被り得ることは理解されるであろう。このように、治療は、治療利益を得ることを期待して、それを必要とする個体への組成物の投与を指す。
【００４０】
「投与する」という用語は、治療組成物を個体に導入する行為を指す。一般に、任意の投与経路を使用することができる。従って、治療しようとする状態の性質に応じて経口投与、髄腔内、静脈内、筋肉内又は非経口注射が適切である。また、ＢＢＢ毛細血管を有することなく、鼻の上方に脳と連絡する区画があるため、吸入による脳への投与を実施することも可能である。この投与法の場合、血液脳関門を通過する化合物が好ましいが、この特徴が必ずしも要求されるわけではない。
【００４１】
「治療有効量」という用語は、個体の疾患を予防する、その重症度を軽減する、又はその進行を遅らせるという結果をもたらす化合物の投与量及び投与スケジュールの両方を包含する。理解されるように、好ましい量は、治療効果及び投与法と毒性／耐容性とを均衡させるために、化合物によって変動し得る。投与回数及び頻度に関する最大耐性量及び治療レジメンの決定は、化合物の早期臨床評価のルーチンの一部である。
【００４２】
実施例１〜５に記載されるように、本発明者らは、エピシャペローム、すなわち、起源となる組織又は原因となる遺伝子突然変異とは無関係に、腫瘍の過半数に存在する修飾シャペロームを同定し、特性決定した。本発明者らは、生化学的修飾により、エピシャペロームが正常細胞に特有のハウスキーピングシャペロームから識別されることを立証する。正常細胞中に見出される一過性シャペローム複合体は、形成されると急速に分解するが、その比較的短い存在時間は、非形質転換細胞の増殖需要を満たす速度でタンパク質を折り畳み、安定化させるそれらの役割と一致する速度論的プロフィールを表す。これに対して、形質転換細胞中の永続的シャペローム複合体（すなわち、エピシャペローム）は、比較的長い半減期を有し、これにより、これらはシグナル伝達及び転写複合体を活性構成に維持して、連続的増殖及び代謝を適応させる癌シャペロームの役割により良好に適するようになる。実施例１〜３に記載されるように、エピシャペロームは、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＣ７０、ＨＯＰ、ＡＨＡ−１、ＣＤＣ３７、ＨＳＰ４０及びＨＳＰ１１０をはじめとするシャペロン及びコシャペロンタンパク質中で富化される。さらに、実施例３に示すように、安定した多量体エピシャペローム複合体は、ＨＳＰ９０上に核を形成し、物理的且つ機能的にＨＳＰ７０及びＨＳＰ９０機構の成分を集合させる。
【００４３】
さらに、本発明者らは、実施例６及び７において、ＨＳＰ９０阻害剤が高エピシャペローム細胞においてアポトーシスを有意に増大することを明らかにするが、これは、この細胞機構に対する細胞の依存性を表す。管弦すれば、本発明者らは、エピシャペロームの存在量と、ＨＳＰ９０阻害剤に対するこれらの癌細胞の感受性との間に有意な相関があることを明らかにする。実施例６及び７で述べるように、エピシャペロームの存在量が減少すると、細胞はＨＳＰ９０阻害剤による殺傷を受けにくくなる。これらの実験から、本発明者らは、エピシャペロームが豊富な細胞が、エピシャペロームのレベルが低い細胞と比較して、ＨＳＰ９０阻害剤に曝露されたときに死滅する可能性が高いことを見出した。乳癌、肺癌、膵臓癌及び胃癌、並びに白血病及びリンパ腫を含む９０超の癌細胞株において、本発明者らは、エピシャペロームの存在量と、ＨＳＰ９０阻害に対するこれらの細胞の感受性との間に有意な相関（Ｐ＜０．０００１）を見出した（図３ｄ及び３ｆ）。
【００４４】
さらに、ＡＨＡ−１タンパク質のレベルを低下させ、従ってエピシャペロームタンパク質の安定性を低下させることによってエピシャペロームの存在量が減少すると、細胞はＨＳＰ９０阻害剤による殺傷を受けにくくなる（図３ｅ）。
【００４５】
これらの知見により、ＨＳＰ９０阻害剤による治療を受けやすい患者を決定するために使用される新規のバイオマーカの開発に到った。エピシャペロームは、こうしたバイオマーカとして用いられる生化学的シグネチャーをもたらす。遺伝的又は組織属性とは無関係に、いくつかの腫瘍タイプにおいてそれが起こることから、このバイオマーカは、ＨＳＰ９０療法、或いは別のシャペロン又はコシャペロンタンパク質を利用する療法に応答するであろう患者についての患者階層化の手段を提供する。
【００４６】
本発明者らのプロテオーム及び遺伝子研究では、特定の癌細胞中に観測されるエピシャペロームの富化と特異的に関連する病変の存在は明らかにされなかった。ＰＵ−Ｈ７１に対して感受性の腫瘍に、ｐ５３、ｒａｓ−、ｍｙｃ−、ＨＥＲ−、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ−及びＪＡＫ−細胞周期に関連する欠陥が見出されたが、これらは、ＰＵ−Ｈ７１耐性細胞でも明らかであった（図３ｆ）。これは、シャペローム再構成、並びにシャペローム依存性腫瘍に特有のエピシャペロームに対する細胞の依存を招くプロテオーム改変が多様な遺伝子起源を有し得るか、又は遺伝的背景に非依存的であり得ることを示唆する。ＨＳＰ９０複合体（ＳＮＸ２１１２）及び（ＮＶＰ−ＡＵＹ−９２２）に対する様々な選択性の化学的に異なるＨＳＰ９０指向性薬剤がＰＵ−Ｈ７１のプロフィールを再現したことから、この作用はＰＵ−Ｈ７１治療に限定されなかった。これらのＨＳＰ９０阻害剤の構造については図１６を参照されたい。タイプ１腫瘍もこれらの薬剤によって有効に殺傷されたが、タイプ２腫瘍は不応性のままであった（図３ｇ）。総合すると、以上の観測結果から、これらの腫瘍における生存を促進する手段としてのエピシャペロームが確認される。
【００４７】
これらの観察された作用は、文献にあるいくつかの報告、例えば、Ｈｓｐ９０阻害剤１７−ＡＡＧと化学療法薬（例えば、Ｔａｘｏｌ（登録商標）又はドキソルビシン）の様々な組合せによる癌細胞株のインビトロ試験（Ｍｕｅｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．７，２２２８−２２３６，Ａｕｇ．２００１を参照されたい）とは対照的である。上で述べたように、この参照文献は、化合物を同時に投与するか、又は１７−ＡＡＧをＴａｘｏｌ（登録商標）の直後に投与したとき、Ｔａｘｏｌ（登録商標）と１７−ＡＡＧとの組合せによるアポトーシスに対する細胞の感受性が最も顕著になったことを報告している。さらに、Ｔａｘｏｌ（登録商標）と１７−ＡＡＧとの組合せに関してＭｕｅｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．が観察した作用は、Ｒｂ依存的であった。その上、以下に記載する結果とは対照的に、Ｍｕｅｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．は、ドキソルビシンと１７−ＡＡＧとの組合せに対する細胞の感受性が化合物の添加の順序又はタイミングに依存的ではなかったことも報告している。
【００４８】
次に、本発明者らは、エクスビボ試験を用いて、原発性腫瘍中のエピシャペロームの機能的重要性を確認した（例えば、原発性乳房腫瘍及び急性骨髄性白血病については実施例６を参照されたい）。エクスビボで原発性乳房腫瘍（ｎ＝４）をＰＵ−Ｈ７１で処理した（処理の概略図を図４に示す）ところ、本発明者らは、安定した多量体エピシャペローム形態を発現するものがＰＵ−Ｈ７１によって最も効果的に殺傷されることを見出した。例えば、乳房腫瘍を有する４人の患者（患者１０６６、患者１０６７、患者１０６８、患者１０６９）について試験を実施した（図５ａ、左）。左上は、等電点電気泳動法により測定した４つの乳房腫瘍の生化学的シグネチャーを示す。左中央は、ＨＳＰ９０阻害によるこれらのサンプルの感受性を示す。左下は、４つの分析済乳癌腫瘍の受容体状態を示す。この試験で、患者１０６６は、電荷ベースのネイティブゲル（等電点電気泳動法）により決定される通り、安定した多量体エピシャペローム形態が豊富な腫瘍を有していた（図５ａを参照されたい）。患者１０６６の癌細胞は、ＰＵ−Ｈ７１の導入後、容易にアポトーシスを被った。図５ａに示すように、対照と比較したアポトーシスの程度は、ＰＵ−Ｈ７１の濃度に依存的であった。対照的に、また培養細胞での本発明者らの知見と同様に、安定した多量体エピシャペローム形態を発現しない腫瘍は、大部分が影響されないままであった。例えば、患者１０６７、１０６８及び１０６９は、安定したエピシャペローム複合体が豊富な腫瘍を有していなかったが、これらの腫瘍は、患者１０６６の腫瘍と比べ、ＰＵ−Ｈ７１阻害に対してはるかに感受性が低かった（図５ａ）。さらに、乳房試料の事例において隣接する良性組織は、エピシャペロームをほとんど乃至全く含有しておらず、従ってＰＵ−Ｈ７１に対して非感受性であった。
【００４９】
別の患者由来の乳房腫瘍サンプルについての試験によって前述の観測をさらに進めた（図５ｅ）。図５ｅの左パネルは、等電点電気泳動法による８人の患者の乳房腫瘍サンプル（ＰＴ５９、ＰＴ６０、ＰＴ６１、ＰＴ６６、ＰＴ１４、ＰＴ３０、ＰＴ１８、及びＰＴ６２）の生化学的シグネチャーの分析を示す。ＰＴ５９、ＰＴ６６、及びＰＴ１８からのサンプルは、電荷ベースのネイティブゲル（等電点電気泳動）により決定される通り、安定した多量体エピシャペローム形態の富化を示した。特に、これらの患者の癌細胞は、ＰＵ−Ｈ７１の導入後にアポトーシスを容易に受けた（図５ｅ、右パネル）。さらに、これまでの結果を確認すると、安定した多量体エピシャペローム形態を発現しない腫瘍は、大部分が影響されないままであった。例えば、患者ＰＴ６０、ＰＴ６１、ＰＴ１４、ＰＴ３０、及びＰＴ６２からのサンプルは、安定したエピシャペローム複合体が豊富な腫瘍を有していなかったが、これらの腫瘍は、ＰＵ−Ｈ７１処理に対してはるかに感受性が低かった（図５ｅ、右パネル）。
【００５０】
別の実験では、３つの原発性トリプルネガティブ乳房腫瘍（ＴＮＢＣ＃１、ＴＮＢＣ＃２及びＴＮＢＣ＃３）の生化学的シグネチャーをサイズベースのネイティブゲルにより分析した後、ＨＳＰ９０、ＨＳＣ７０、ＡＨＡ１及びＣＤ３６を含むエピシャペロームの存在量を測定した（図５ａ、右パネル）。生化学的シグネチャーに基づき、３つの腫瘍のうちの１つのみ（ＴＮＢＣ＃１）に有意な程度まで、もう１つ（ＴＮＢＣ＃３）に中程度まで多量体複合体が観測された。特に、ＴＮＢＣ＃２は、エピシャペローム形成を示す多量体複合体の形成が微少から皆無であった。図５ａの右下パネルに示されるように、ＨＳＰ９０阻害に対して最も感受性であった腫瘍は、最も安定した多量体ＨＳＰ９０中心複合体を含む腫瘍であった。特に、ごくわずかなエピシャペローム形成を示したＴＮＢＣ＃２は、ＨＳＰ９０療法に対して抵抗性であった。
【００５１】
図３ａに示されるように、ＰＵ−Ｈ７１は、エピシャペローム複合体中にあるとき、ＨＳＰ９０に対してより高い親和性及び選択性で結合する。例えば、最もＰＵ−Ｈ７１感受性の高いＨＳＰ９０複合体を捕捉するために、固体支持体固定化ＰＵ−Ｈ７１を細胞ホモジネートと一緒にインキュベートした。次に、上清（すなわち、残滓又はＰＵ−Ｈ７１に対して最も感受性が低い）を等電点電気泳動法により分析した。図３ａは、エピシャペローム複合体中のＨＳＰ９０がＰＵ−Ｈ７１に対して最も感受性が高い（図３ａ、少量のＰＵビーズが高分子量の安定したＨＳＰ９０複合体を著しく減少させるが、ＨＳＰ９０二量体はそうではない、ＭＤＡＭＢ４６８細胞を参照されたい）のに対し、ハウスキーピングＨＳＰ９０は不変のままである（等電点電気泳動によるＨＳＰ９０シグネチャーに変化がないＨＭＥＣ細胞を参照されたい）ことを示す。図３ｂは、ＰＵ−Ｈ７１のこの特性を、エピシャペロームレベルを測定する代替的方法としてどのように使用できるかを説明する。例えば、図３ｂは、これらの細胞の総ＨＳＰ９０は類似している（図３ｂ、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）ものの、高エピシャペロームを含む細胞（タイプ１）において、標識ＰＵ−Ｈ７１（蛍光標識ＰＵ−ＦＩＴＣなど）がタイプ２細胞よりも多くのＨＳＰ９０を捕捉する（図３ｃ、ｙ軸）ことを示す。また図３ｃも、ＨＳＰ９０阻害剤によってこれらの細胞中に誘導されたアポトーシスを測定すると（ｘ軸、アネキシン対染色）、高エピシャペロームを含む細胞（等電点電気泳動図３ｂ、及び／又はＰＵ−Ｈ７１染色、図３ｃによって測定される）が、ＨＳＰ９０阻害剤で処理した場合に死滅する傾向が高いことを示す。図３ｄは、ＰＵ−Ｈ７１染色を用いた原発性急性骨髄性白血病の群におけるエピシャペロームの測定を示す。これは、ＰＵ−Ｈ７１で処理した場合のこれらの細胞の生存能（アネキシンＶ染色によるアポトーシス測定）も示す。最終的に、これは、エピシャペロームレベルとアポトーシスを相関させて、これらの細胞中のエピシャペロームレベルが高いほど、ＨＳＰ９０阻害剤で処理すると死滅しやすいことを明らかにする。
【００５２】
以上の発見に基づき、本発明者らは、癌細胞を誘導して、前述の安定した多重シャペローム集塊（エピシャペローム）を形成することができると仮定した。エピシャペローム導入の一手段は、適切なタンパク質毒性ストレスの付加によるものである。その結果、エピシャペロームがほとんど乃至全くない癌細胞を誘導して、エピシャペロームを含有させ、これによりＨＳＰ９０阻害剤などのエピシャペローム阻害剤に対するそれらの感受性を高めることができる。加えて、エピシャペロームの形成に既に幾分依存性の癌細胞を誘導して、エピシャペロームに極めて依存性にすることもできる。さらに、本発明者らは、癌細胞が生存、シグナル伝達を維持すると共に、連続的増殖及び代謝を支持するためにエピシャペローム（例えば、ＨＳＰ９０及びＨＳＰ７０の阻害）に最大限に依存性であるとき、形成されるエピシャペローム複合体の安定性は、タンパク質毒性ストレッサーの投与又は導入後のある時点で最大になるであろうことも仮定した。このように、再接続されてエピシャペロームを形成するシャペロンに対する細胞の最大依存の時点を過ぎると、エピシャペローム複合体の安定性は次第に低下し、シャペロンタンパク質は、タンパク質を折り畳み、安定化させるその伝統的な役割を担う。
【００５３】
さらにまた、本発明者らは、タンパク質毒性ストレッサーの投与又は導入後、癌細胞が実質的なストレスの状態にある時点で、エピシャペローム複合体を含む特定のタンパク質をターゲッティングする阻害剤を投与し得ることも仮定した。阻害剤は、癌細胞中のエピシャペロームの機能を低減又は排除し、これにより細胞の生存能を破壊し、細胞をアポトーシスに対して脆弱にすることができる。基本的な概念を図７に描く。図７の左上に示すように、正常な「ハウスキーピング」又は他の機能を果たすために、単にシャペロン及びコシャペロンタンパク質に依存性の癌細胞を、生存のためにエピシャペロームに嗜癖性の細胞に形質転換することができる。嗜癖状態は、エピシャペローム複合体の形成で予測される。さらには、図７の右下に示すように、嗜癖状態にある細胞は、依存状態にある細胞より、ＨＳＰ９０阻害に対してはるかに脆弱である。従って、ＨＳＰ９０阻害の前に、タンパク質毒性ストレッサーの投与によって癌細胞中のエピシャペロームの量を増加すれば、ＨＳＰ９０療法の効果に顕著な作用をもたらす。さらに、タンパク質毒性ストレッサーは、癌細胞の生存能を含む固有の活性を有する。従って、タンパク質毒性ストレッサーとＨＳＰ９０阻害剤との組合せは、本開示の方法に従い投与されると相乗効果を示す。
【００５４】
癌細胞に対するタンパク質毒性ストレッサーの影響を試験するために、本発明者らは、セクション５、実施例１で述べる生化学的技術を適用した。実施例８に示されるように、タンパク質毒性ストレッサーとしての化学療法薬の存在下又は非存在下で様々な癌を培養した。化学療法薬で前処理した細胞と、前処理していない細胞（ビヒクル）とをＮａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥに付して、シャペローム複合体の性質を決定した。図７〜９に示され、また実施例８に記載するように、数種の化学療法薬は、より安定したエピシャペロームの形成と一致する安定多量体シャペローム複合体の形成を誘導することができた。化学療法薬の全てが安定多量体シャペローム複合体の形成を誘導したわけではない。図１０は、エピシャペローム複合体の形成に向けて癌細胞を誘導するその能力について試験された特定の化学療法薬の表を示す。
【００５５】
タンパク質毒性ストレッサーの添加の代わりに、ＨＳＰ９０並びに他のシャペロン及びコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータで癌細胞を前処理することにより、エピシャペローム複合体の安定性を増大することができる。シャペロン及びコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾に影響を与える１つの手段は、リン酸化に影響を与えることによるものである。本発明者らは、リン酸化がエピシャペローム複合体の形成を阻害することを証明する。図９Ａに示されるように、適切なホスファターゼの導入により、リン酸基の量を低減すると、エピシャペローム形成の量を増加することができる。図９Ｂに示されるように、全てのキナーゼ阻害剤で効果が認めらたわけではないが、特定のキナーゼ阻害剤で細胞を前処理することによってリン酸化を低減しても、エピシャペローム形成の増加をもたらし、これは、エピシャペローム形成の調節に特定のエピトープが関与することを示唆する。
【００５６】
特定のタンパク質毒性薬剤が、より安定したエピシャペローム複合体の形成を誘導し得ることが証明されたことから、本発明者らは、次に、ＰＵ−Ｈ７１、ドセタキセル、又はＰＵ−Ｈ７１／ドセタキセルの組合せで処理したときの、ＭｉａＰａＣａ２膵臓癌細胞の生存能を測定するためにインビトロアッセイを開発した（実施例９及び１４を参照されたい）。組合せに関して、各々ＰＵ−Ｈ７１及びドセタキセルの濃度を変えて２つのアッセイを実施した。一方のアッセイでは、ＰＵ−Ｈ７１の投与の６時間前にドセタキセルを投与した。図８ｃに示されるように、ＰＵ−Ｈ７１の投与の６時間前のドセタキセルによる膵臓癌細胞の前処理は、ドセタキセルの投与前のＰＵ−Ｈ７１による癌細胞の前処理よりも有意に強力であった。実際に、後者の投与計画は拮抗的であることが証明された。
【００５７】
タンパク質毒性薬剤とＨｓｐ９０阻害剤との組合せの効力をさらに証明するために、ドキソルビシン（ＤＯＸ）で処理したリンパ腫細胞に対してインビトロアッセイを実施した。ＤＯＸは、ＤＮＡ中に挿入されて、ＤＮＡ損傷及び酸化ストレスを誘導するトポイソメラーゼ阻害剤である。相乗効果の標準的基準である、半数効果／併用係数（ＣＩ）法を用いて、ＤＯＸ及びＰＵ−Ｈ７１の相互作用を評価した。曝露の連続的又は同時スケジュールにおける相互作用についてＤＯＸ：ＰＵ−Ｈ７１の複数の比を体系的にテストするための手段として、用量応答マトリックスを使用した。ＤＯＸに事前に曝露しておいたＤＬＢＣＬ及びバーキットリンパ腫細胞へのＰＵ−Ｈ７１の添加（ＤＯＸ→ＰＵ−Ｈ７１）は、複数の薬剤比で相乗的であったのに対し、薬剤（ＤＯＸ＋ＰＵ−Ｈ７１）の同時投与、又はＤＯＸ前のＰＵ−Ｈ７１の曝露（ＰＵ−Ｈ７１→ＤＯＸ）は、相加的から拮抗的相互作用をもたらした（図１８ａ、ｂ及び図示なし）。ＳＵＤＨＬ４ＤＬＢＣＬ細胞などの低から中度エピシャペロームレベルを有するリンパ腫細胞における細胞周期及びアポトーシスに対する各薬剤及びそれらの組合せの作用を評価した（図１８ｃ）。これらの細胞中、１μＭのＰＵ−Ｈ７１への２４時間曝露は、Ｇ１／Ｓ停止を引き起こした。ＩＣ５０を下回るＤＯＸの用量に対する２４時間曝露は、アポトーシスを示す、ｓｕｂ−Ｇ１ＤＮＡ内容物を示す細胞の小さい分画と共にＳ期分画の減少及びＧ２／Ｍの蓄積をもたらした。ＤＯＸに曝露した細胞にＰＵ−Ｈ７１を２４時間遅らせて添加すると、Ｇ２／ＭＤＮＡ内容物を有する細胞の減少と、断片化ｓｕｂ−Ｇ１ＤＮＡ内容物を有する細胞の出現とが観測された。全てにおいて、ＰＵ−Ｈ７１とＤＯＸとの組合せは、ＰＵ−Ｈ７１の前に細胞をＤＯＸ化学療法薬に曝露したとき、カスパーゼ−３活性化及びアポトーシスの誘導で最も有効であった。
【００５８】
実施例１０、１３、及び１４に記載されるように、インビボ動物実験を実施して、開示される併用投与計画の効果を決定した。動物モデルには、肺癌を評価するためのＨ１９７５腫瘍モデル、膵臓癌を評価するためのＭｉａＰａｃａ２腫瘍モデル、並びにトリプルネガティブ乳癌を評価するためのＨＣＣ−１８０６及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍モデルが含まれた。実施例１０に記載されるモデルでは、ＨＳＰ９０阻害剤としてＰＵ−Ｈ７１を使用し、化学療法薬としてＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）を使用した。様々な試験において動物には対照ビヒクル、ＰＵ−Ｈ７１、Ａｂｒａｘｎｅ又はＰＵ−Ｈ７１とＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）との組合せのいずれかを投与した。連続的投与の場合、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）を初めに投与した後にＰＵ−Ｈ７１を投与するか、又はＰＵ−Ｈ７１を初めに投与した後にＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）を投与した。予め選択した時点で、動物の腫瘍体積を評価した。
【００５９】
図１１〜１４及び１９〜２３に示されるように、インビボ動物モデルにおいて、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の投与から６時間後のＰＵ−Ｈ７１の投与は、ＰＵ−Ｈ７１とＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）との同時投与、又はＰＵ−Ｈ７１の６時間後のＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の投与と比較して有意に増大した効果を示した。さらに、図１３ａ（Ｈ１９７５腫瘍モデル）に示されるように、ＰＵ−Ｈ７１の投与の６時間前のＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）のマウスへの投与は、ＰＵ−Ｈ７１の投与の２４時間前のマウスへの投与と比較して有意に増大した効果を示した。この結果から、エピシャペローム複合体の安定性が、ストレッサー（例えば、化学療法薬）の投与から特定の時点で最大となり、その後徐々に消失することがわかる。Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の前投与の場合、細胞に対するタンパク質毒性ストレスは、６時間〜２４時間のある時点で減少し始める。
【００６０】
エピシャペローム安定性の時間依存性は、ＭｉａＰＡｃａ２腫瘍モデルを用いても示されている（図１１ｅを参照されたい）。この場合、ＰＵ−Ｈ７１をＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）と同時に、又はＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の投与から１時間、３時間若しくは６時間前の時点で毎週投与した。開始から３６日後に腫瘍の退縮率（％）を測定した。Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）をＰＵ−Ｈ７１の前に投与した全ての事例で、３６日後の退縮率は、ＰＵ−Ｈ７１とＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）を同時に投与したときよりも高かった。Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）とＰＵ−Ｈ７１の時間間隔が１〜６時間で増加するにつれて、退縮率も増加した（図１１ｅを参照されたい）。
【００６１】
ＨＳＰ９０阻害剤とタキサンを同時投与する以前の実験では、停滞又は退縮などの控え目な結果が達成された（例えば、Ｐｒｏｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；２０（２）；４１３−２４を参照されたい）。本発明は、開示される組合せでＨＳＰ９０阻害剤とタキサンとを使用する治療的処理計画の初めての実証を提供する。実施例８及び１３並びに図１１〜１４及び１９〜２３に示されるように、Ｈ１９７５肺癌、ＭｉａＰａｃａ２膵臓癌、ＨＣＣ−１８０６トリプルネガティブ乳癌、又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１トリプルネガティブ乳癌の異種移植片を担持するマウスを最初にＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）、その６時間後にＰＵ−Ｈ７１の投与により処理すると、優れた結果が得られた。重要なことに、モデルへのＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）とＰＵ−Ｈ７１との同時投与では、一般に、特定の期間後に腫瘍の再発が起こる。例えば、Ｈ１９７５腫瘍モデル、ＨＣＣ−１８０６腫瘍モデル及びＭｉａＰａＣａ２腫瘍モデルにおいて、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）とＰＵ−Ｈ７１との同時投与から約１００日後に再発が観察される（図１１ｂを参照されたい）。しかし、これらの同じモデルに、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）をＰＵ−Ｈ７１の６時間前に投与すると、概して再発は観察されない（図１１ｂを参照されたい）。例えば、Ｈ１９７５腫瘍モデルでは、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の６時間後のＰＵ−Ｈ７１の投与により処置したマウスには腫瘍成長が観察されなかった。この場合、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）とＰＵ−Ｈ７１との処置を薬剤の最初の投与から１６５日目に停止し、最初の投与から４２１日目までマウスをモニターしたが、腫瘍成長は観察されなかった。この結果から、開示される投与レジメンの使用により、単に停滞をもたらすのではなく、治癒を達成し得ることがわかる。この点を立証するために、図１２は、異種移植されたＭｉａＰａｃａ２膵臓癌腫瘍を担持するマウスに、表示される治療パラダイムで投与した場合のＰＵ−Ｈ７１及びＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の治療レジメンにおいて５週間にわたり撮影された代表的なマウスの写真を示す。Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）投与から６時間後のＰＵ−Ｈ７１の連続的処理によって治癒が達成されたのに対し、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）とＰＵ−Ｈ７１との同時処置では、停滞又は退縮が達成された。同様の結果がＨ１９７５肺癌モデル（図１３ｂを参照されたい）及びＨＣＣ−１８０６及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍モデル（図１４ａ及び１４ｂを参照されたい）でも得られた。
【００６２】
従って、本開示は、タンパク質毒性ストレッサーと、エピシャペローム複合体の一部であるシャペロン又はコシャペロンタンパク質の阻害剤との合理的併用療法を用いて癌を治療する方法を提供する。投与は、タンパク質毒性ストレッサーとシャペロン又はコシャペロン阻害剤との適切なタイミングに依存する。エピシャペローム複合体を形成するタンパク質の具体的な阻害剤としては、ＨＳＰ９０阻害剤、ＨＳＰ７０阻害剤、ＡＨＡ−１阻害剤、ＣＤＣ３７阻害剤、ＨＯＰ阻害剤、ＨＳＰ４０阻害剤及びＨＳＰ１１０阻害剤又はそれらの組合せが挙げられる。一実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質の阻害剤は、ＨＳＰ９０阻害剤である。一実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質の阻害剤は、グルコース調節タンパク質９４（Ｇｒｐ９４）と呼ばれるＨＳＰ９０パラログである。別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質の阻害剤は、ＨＳＰ７０阻害剤である。別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質の阻害剤は、国際公開第２０１１／０２２４４０号パンフレット又は国際公開第２０１５／１７５７０７号パンフレットに（各々の全内容が参照により本明細書に組み込まれる）開示されているＨＳＰ７０阻害剤である。別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質の阻害剤は、ＨＳＰ９０阻害剤とＨＳＰ７０阻害剤との組合せである。別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質の阻害剤は、ＡＨＡ−１阻害剤である。別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質の阻害剤は、ＣＤＣ３７阻害剤である。別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質の阻害剤は、ＨＯＰ阻害剤である。
【００６３】
一部の実施形態では、提供される方法は、治療対象の癌の部分的又は完全な寛解をもたらす。一部の実施形態では、寛解は、癌の徴候及び症状が軽減されるか、又は検出不可能になることを特徴とする。一部の実施形態では、提供される方法は、癌のあらゆる徴候及び症状を消失させる。一部の実施形態では、提供される方法は、癌の再発が治療後に観察されないことを特徴とする。一部の実施形態では、提供される方法は、腫瘍の単なる停滞又は退縮を超える実質的に改善された結果をもたらすことを特徴とする。一部の実施形態では、提供される方法は、治療対象の癌の治癒を達成する。一部の実施形態では、提供される方法により、治療後に検出可能な腫瘍がなくなる。
【００６４】
一態様では、本開示は、タンパク質毒性ストレッサーによる前処理後、エピシャペローム複合体の一部であるシャペロン又はコシャペロンタンパク質の阻害剤を癌患者に投与することによって癌を治療する方法を提供する。タンパク質毒性ストレッサーは、エピシャペローム複合体の形成を増加又は最大にし、それによって腫瘍をシャペロン又はコシャペロン阻害療法に対して最も脆弱にするために、シャペロン又はコシャペロン阻害剤の投与前の十分な時点で投与される。様々なタンパク質毒性ストレッサーが異なる薬物動態及び薬力学プロフィールを有し、これらがその投与のタイミングに影響を与え得ることは理解されるであろう。例えば、生物学的半減期、代謝及び組織分布などの因子は、タンパク質毒性ストレッサーの作用の開始及び持続時間に影響を与えるため、安定化エピシャペローム複合体の形成のタイミングに影響を与えることになる。投与方法（例えば、静脈内対経口）などの他の因子もエピシャペローム複合体の形成に影響を与えるであろう。同様に、シャペロン又はコシャペロン阻害剤の薬物動態及び薬力学プロフィールは、こうした阻害剤のタイミング及び投与に影響を与え得る。
【００６５】
いくつかの実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤の投与から少なくとも１時間後に投与される。別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロン阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤の投与から少なくとも２時間後に投与される。別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロン阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤の投与から少なくとも３時間後に投与される。別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロン阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤の投与から少なくとも３、４時間後に投与される。別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロン阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤の投与から少なくとも３、５時間後に投与される。別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロン阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤の投与から少なくとも６時間後に投与される。別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロン阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤の投与から少なくとも７時間後に投与される。別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロン阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤の投与から少なくとも８時間後に投与される。別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロン阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤の投与から少なくとも９時間後に投与される。別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロン阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤の投与から少なくとも１０時間後に投与される。別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロン阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤の投与から少なくとも１２時間後に投与される。別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロン阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤の投与から少なくとも１８時間後に投与される。別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロン阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤の投与から少なくとも２４時間後に投与される。別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロン阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤の投与から少なくとも３６時間後に投与される。別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロン阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤の投与から少なくとも４８時間後に投与される。いくつかの実施形態では、タンパク質毒性ストレッサーは、前述の実施形態のいずれかの間、例えば、シャペロン又はコシャペロン阻害剤の投与の約１〜３時間前、シャペロン又はコシャペロン阻害剤の投与の約２〜４時間前、シャペロン又はコシャペロン阻害剤の投与の約３〜５時間前、シャペロン又はコシャペロン阻害剤の投与の約２〜６時間前、ＨＳＰ９０阻害剤の投与の約３〜６時間前、シャペロン又はコシャペロン阻害剤の投与の約４〜６時間前、シャペロン又はコシャペロン阻害剤の投与の約４〜８時間前、シャペロン又はコシャペロン阻害剤の投与の約４〜１０時間前、シャペロン又はコシャペロン阻害剤の投与の約５〜７時間前等の範囲内の時点で投与される。
【００６６】
特定の実施形態では、タンパク質毒性薬剤は、非経口（例えば、静脈内）投与される。このような実施形態では、シャペロン又はコシャペロン阻害剤は、非経口投与の完了後のある時点で投与される。例えば、シャペロン又はコシャペロン阻害剤は、タンパク質毒性薬剤の非経口投与の完了から、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間又は１２時間後に投与され得る。いくつかの実施形態では、シャペロン又はコシャペロン阻害剤は、前述の実施形態のいずれかの間、例えば、タンパク質毒性薬剤の非経口投与の完了から約１〜３時間後、タンパク質毒性薬剤の非経口投与の完了から約２〜４時間後、タンパク質毒性薬剤の非経口投与の完了から約３〜５時間後、タンパク質毒性薬剤の非経口投与の完了から約２〜６時間後、タンパク質毒性薬剤の非経口投与の完了から約３〜６時間後、タンパク質毒性薬剤の非経口投与の完了から約４〜６時間後、タンパク質毒性薬剤の非経口投与の完了から約４〜８時間後、タンパク質毒性薬剤の非経口投与の完了から約４〜１０時間後、タンパク質毒性薬剤の非経口投与の完了から約５〜７時間後等の範囲内の時点で投与される。
【００６７】
本開示の一実施形態では、タンパク質毒性ストレッサーの投与後に投与されるシャペロン又はコシャペロン阻害剤は、ＨＳＰ９０阻害剤である。こうした実施形態の１つでは、ＨＳＰ９０阻害剤は、８−（６−ヨード−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルスルファニル）−９−（３−イソプロピルアミノ−プロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン（ＰＵ−Ｈ７１）又はその薬学的に許容される塩である。
【化１】
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【００６８】
タンパク質毒性ストレッサーの投与後に投与され得るＰＵ−Ｈ７１は、８−（６−ヨード−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルスルファニル）−９−（３−イソプロピルアミノ−プロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン（ＰＵ−Ｈ７１）又はその薬学的に許容される塩（例えば、ＨＣｌ塩）である。ＰＵ−Ｈ７１は、週１回、週２回、週３回、週４回、又は週５回から選択される投与スケジュールに従って約５ｍｇ／ｍ２〜約３５０ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与され得る。本開示によれば、タンパク質毒性ストレッサーは、一般に、ＰＵ−Ｈ７１の各投与前の予め定めた時点で投与される。特定の実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、週１回、週２回、週３回、週４回、又は週５回から選択される投与スケジュールに従って約２０ｍｇ／ｍ２〜約６０ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される。別の実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、週１回、週２回、週３回、週４回、又は週５回から選択される投与スケジュールに従って約６０ｍｇ／ｍ２〜約１５０ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される。別の実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、週１回、週２回、週３回、週４回、又は週５回から選択される投与スケジュールに従って約２００ｍｇ／ｍ２〜約３５０ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される。別の実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、週１回、週２回、週３回、週４回、又は週５回から選択される投与スケジュールに従って約２５０ｍｇ／ｍ２〜約３００ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される。別の実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、週２回の投与スケジュールに従って約２５０ｍｇ／ｍ２〜約３００ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される。別の実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、週１回の投与スケジュールに従って約３００ｍｇ／ｍ２〜約３５０ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される。
【００６９】
別の実施形態では、タンパク質毒性ストレッサーＨｓｐ９０阻害剤の投与後に投与されるＨＳＰ９０阻害剤は、式Ｉ：
【化２】
2018537519.tif 000003
の化合物又はその薬学的に許容される塩であり、式中：
各Ｙは、独立にＣＨ又はＮであり；
Ｒは、任意選択で１若しくは複数個のヘテロ原子、又はリンカーを介してＮ９に結合されたターゲッティング部分を含む水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、又はアルキニル基であり；
Ｘ４は、水素又はハロゲンであり；
Ｘ３は、ＣＨ２、ＣＦ２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｏ、ＮＨ、又はＮＲ２であり、ここで、Ｒ２は、アルキルであり；
Ｘ２は、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ハロゲン化アルコキシ、ヒドロキシアルキル、ピロリル、任意選択で置換されたアリールオキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルバミル、アミド、アルキルアミド、ジアルキルアミド、アシルアミノ、アルキルスルホニルアミド、トリハロメトキシ、トリハロ炭素（ｔｒｉｈａｌｏｃａｒｂｏｎ）、チオアルキル、ＣＯＯ−アルキル、ＮＨ２、ＯＨ、ＣＮ、ＳＯ２Ｘ５、ＮＯ２、ＮＯ、Ｃ＝ＳＲ２、ＮＳＯ２Ｘ５、Ｃ＝ＯＲ２であり、ここで、Ｘ５は、Ｆ、ＮＨ２、アルキル又はＨであり、Ｒ２は、アルキル、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル又はＯ−アルキルであり；
Ｘ１は、アリール基の４’及び５’位に配置される、同じでも異なっていてもよい２つの置換基を表し、ここで、Ｘ１は、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ハロゲン化アルコキシ、ヒドロキシアルキル、ピロリル、任意選択で置換されたアリールオキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルバミル、アミド、アルキルアミド、ジアルキルアミド、アシルアミノ、アルキルスルホニルアミド、トリハロメトキシ、トリハロ炭素（ｔｒｉｈａｌｏｃａｒｂｏｎ）、チオアルキル、ＳＯ２−アルキル、ＣＯＯ−アルキル、ＮＨ２ＯＨ、ＣＮ、ＳＯ２Ｘ５、ＮＯ２、ＮＯ、Ｃ＝ＳＲ２、ＮＳＯ２Ｘ５、Ｃ＝ＯＲ２であり、ここで、Ｘ５は、Ｆ、ＮＨ２、アルキル又はＨから選択され、Ｒ２は、アルキル、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、又はＯ−アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル若しくはアルコキシであるか、又はＸ１は、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−を有し、ここで、ｎは、０〜２の整数であり、酸素の一方は５’位で結合され、他方はアリール環の４’−位で結合される。
【００７０】
本開示の別の実施形態では、タンパク質毒性ストレッサーＨｓｐ９０阻害剤の投与後に投与されるＨＳＰ９０阻害剤は、式ＩＩ：
【化３】
2018537519.tif 000004
の化合物であり、式中：
Ｙ’は、−ＣＨ２−又はＳであり；Ｘ４は、水素又はハロゲンであり；Ｒは、アミノ窒素上で、任意選択で、アルキル、アルケニル及びアルキニル置換基からなる群から独立に選択される１又は２個の炭素含有置換基により置換されたアミノアルキル部分であり、ここで、アミノアルキル部分中の炭素の総数は、１〜９である。
【００７１】
本開示の別の実施形態では、タンパク質毒性ストレッサーの投与後に投与されるＨＳＰ９０阻害剤は、式ＩＩＩ又はＩＶ：
【化４】
2018537519.tif 000005
の化合物又はその薬学的に許容される塩であり、式中：
（ａ）Ｚ１、Ｚ２及びＺ３、の各々は、独立にＣＨ又はＮであり；
（ｂ）Ｙは、ＣＨ２、Ｏ、又はＳであり；
（ｃ）Ｘａ、Ｘｂ、Ｘｃ及びＸｄは、原子価を満たすように、ＣＨ、ＣＨ２、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、カルボニル、フルオロメチレン、及びジフルオロメチレンから独立に選択され、ここで、Ｘ基との各結合は、単一結合又は二重結合のいずれかであり；
（ｄ）Ｘ２は、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、飽和若しくは不飽和複素環、アリール、アリールオキシ、アルコキシ、ハロゲン化アルコキシ、アルケニルオキシ、ヒドロキシアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノ、カルバミル、アミド、ジアルキルアミド、アルキルアミド、アルキルスルホンアミド、スルホンアミド、トリハロ炭素、−チオアルキル、ＳＯ２−アルキル、−ＣＯＯ−アルキル、ＯＨ又はアルキル−ＣＮであり；
（ｅ）Ｘ４は、水素又はハロゲンであり；
（ｆ）Ｒは、−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ−Ｒ１０Ｒ１１Ｒ１２又は−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ−Ｒ１０Ｒ１１であり、ここで、ｍは、２又は３であり、Ｒ１０〜Ｒ１２は、水素、メチル、エチル、エテニル、エチニル、プロピル、ヒドロキシアルキル、イソプロピル、ｔ−ブチル、イソブチル、ネオペンチル、シクロペンチル、窒素を含む３員環又はＮと任意選択で原子価を満たすための置換基を有する別のヘテロ原子とを含む６員環から独立に選択され、但し、Ｒ１０〜Ｒ１２の全てが存在する場合、化合物は、薬学的に許容される対イオンをさらに含む。
【００７２】
本開示の別の実施形態では、タンパク質毒性ストレッサーの投与後に投与されるＨＳＰ９０阻害剤は、ゲルダナマイシンである。本開示の別の実施形態では、タンパク質毒性ストレッサーの投与後に投与されるＨＳＰ９０阻害剤は、１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧ）である。
【００７３】
他の実施形態では、タンパク質毒性ストレッサーの投与後に投与されるＨＳＰ９０阻害剤は、１７−ＤＭＡＧ、合成化合物ＣＮＦ−２０２４（ＢＩＩＢ０２１）、及び合成化合物ＰＵ−ＤＺ１３から選択される。
【００７４】
他の実施形態では、タンパク質毒性ストレッサーの投与後に投与されるＨＳＰ９０阻害剤は、ＳＮＸ−５４２２、ＳＮＸ−２１１２、及びＫＷ−２４７８から選択される。これらの化合物の構造は、図１６及び１７に描かれている。
【００７５】
別の実施形態では、タンパク質毒性ストレッサーの投与後に投与されるＨＳＰ９０阻害剤は、ＳＴＡ−９０９０である。ＳＴＡ−９０９０は、以下の構造：
【化５】
2018537519.tif 000006
を有する。
【００７６】
一実施形態では、タンパク質毒性ストレッサーの投与後に投与されるＨＳＰ９０阻害剤は、図１６又は１７に描かれる化合物である。
【００７７】
一実施形態では、タンパク質毒性ストレッサーの投与後に投与されるＨＳＰ９０阻害剤は、国際公開第２００６／０８４０３０号パンフレット、国際公開第２００８／００５９３７号パンフレット、国際公開第２０１１／０４４３９４号パンフレット、国際公開第２０１２／１３８８９４号パンフレット、又は国際公開第２０１２／１３８８９６号パンフレット（各々の全内容が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている化合物である。
【００７８】
本開示の一実施形態では、タンパク質毒性ストレッサーの投与後に投与されるシャペロン又はコシャペロン阻害剤は、ＨＳＰ９０阻害剤である。本開示の方法に従って投与されるＧＲＰ９４阻害剤の具体的な例は、国際公開第２０１５０２３９７６Ａ２号パンフレットに記載されており、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７９】
一実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤の前に投与されるタンパク質毒性ストレッサーは、化学療法薬である。具体的な化学療法試薬としては、限定されないが、微小管安定剤、プロテアソーム阻害剤、抗代謝薬、アントラサイクリン、及びアルキル化剤が挙げられる。化学療法薬は、細胞中に形成されるエピシャペメームのレベルを増加することができる用量で供給される。一実施形態では、化学療法薬は、癌患者に一般に投与される用量で投与され得る。別の実施形態では、化学療法薬は、癌患者に一般に投与される量より低い用量で投与され得る。
【００８０】
こうした一実施形態では、シャペロン又はコシャペロン阻害剤の前に投与される化学療法薬は、微小管安定剤である。具体的な微小管安定剤としては、限定されないが、ドセタキセル、パクリタキセル、カバジタキセル、イキサベピロン、ビンクリスチン、ラウリマリド、ジスコデルモリド及びエポチロンが挙げられる。一実施形態では、タンパク質毒性ストレッサーは、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）などのタンパク質結合パクリタキセル組成物である。
【００８１】
別のこうした実施形態では、シャペロン又はコシャペロン阻害剤の前に投与される化学療法薬は、プロテアソーム阻害剤である。具体的なプロテアソーム阻害剤としては、限定されないが、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ及びＣＥＰ−１８７７０（デランゾミブ）が挙げられる。
【００８２】
別のこうした実施形態では、シャペロン又はコシャペロン阻害剤の前に投与される化学療法薬は、ペメトレキセド、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ドキソルビシン、レナリドミド、アピオシリブ、ＰＤ４０７８２４及びＭＫ１７７５から選択される化学療法薬である。
【００８３】
別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤の前に投与されるタンパク質毒性ストレッサーは、放射線療法によって供給される。放射線は、身体外部の機械によって送達してもよく（体外照射療法）、又は身体内の癌細胞近傍に配置された放射性物質から放出させてもよい（内部放射線療法）。
【００８４】
別の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤の前に投与されるタンパク質毒性ストレッサーは、温熱療法によって供給される。温熱療法は、身体外部の機械から身体表面付近の腫瘍に向けられる高エネルギーによって外部から誘導することができる。或いは、温熱療法は、腫瘍内に配置された針又はプローブによって体内で誘導することもできる。
【００８５】
本開示の一実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、パクリタキセル又はドセタキセルの投与後に投与される。１つの具体的な実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、Ｔａｘｏｌ（登録商標）（クレモホール中のパクリタキセル）の投与後の特定の時点で投与される。別の実施形態では、パクリタキセルは、ＬＥＰ−ＥＴＵ（ＮｅｏＰｈａｒｍ）、ＥｎｄｏＴＡＧ（登録商標）−１（Ｍｅｄｉｇｅｎｅ）又は；Ｌｉｐｕｓｕ（登録商標）（Ｌｕｙｅ  Ｐｈａｒｍａ  Ｇｒｏｕｐ）などのリポソーム製剤中で投与される。一実施形態では、パクリタキセルは、ナノ分散液として投与される。こうしたナノ分散液ベースのパクリタキセル注射の一例は、ＰＩＣＮ（ナノ分散液用パクリタキセル注射）（Ｓｕｎ  Ｐｈａｒｍａ）である。
【００８６】
特定の一実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、パクリタキセルの投与後の指定された時点で投与される。パクリタキセルは、様々な方法によって製剤化することができる。例えば、パクリタキセルは、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）などのタンパク質結合パクリタキセル組成物又はＴａｘｏｌ（登録商標）などのクレモホールベースの製剤として製剤化することができる。こうした実施形態では、パクリタキセルは、一般に、静脈内投与される。パクリタキセルの各静脈内投与は、予め定められた期間にわたって行われるが、これは、患者及び用量に応じて変わり得る。例えば、パクリタキセルは、１時間〜９６時間の範囲の期間にわたって注入され得る。特定の実施形態では、パクリタキセルは、１、３、又は２４時間かけて注入される。次に、パクリタキセルの静脈内投与の完了後、指定された時点でＰＵ−Ｈ７１が投与され得る。例えば、ＰＵ−Ｈ７１は、パクリタキセルの投与完了から少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間又は少なくとも１２時間後に投与され得る。一部の実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、パクリタキセルの投与完了から少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、又は少なくとも４８時間後に投与され得る。一部の実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、パクリタキセルの投与後１２時間以内に投与される。具体的な実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、パクリタキセルの投与後２４時間以内に投与される。具体的な実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、パクリタキセルの投与後４８時間以内に投与される。別の実施形態では、ＰＵ−Ｈ７１は、パクリタキセルの投与後５〜７時間後に投与される。
【００８７】
ＰＵ−Ｈ７１がＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の投与後に投与される実施形態では、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の投与量及びタイミングは、一般に、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の静脈内投与後の指定された時点でＰＵ−Ｈ７１が投与される限り、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）についての添付文書で指示されるスケジュールに従うことができる。例えば、転移性乳癌の場合、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の推奨される用量は、３週間毎に静脈内で３０分間２６０ｍｇ／ｍ２である。非小細胞肺癌の場合、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の推奨される用量は、各２１日サイクルの第１、８及び‘５日に静脈内で３０分間１００ｍｇ／ｍ２である。膵臓の腺癌の場合、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の推奨される用量は、２８日サイクルの第１、８及び１５日に静脈内で１２５ｍｇ／ｍ２である。しかしながら、添付文書に示される投与量及びタイミングがそれから変動し得ることは理解されるであろう。例えば、ＰＵ−Ｈ７１をＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の後に投与する場合に呈示される相乗効果は、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の添付文書に示される用量に比してＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の用量の減少を可能にするであろう。このように、本開示の方法に従って投与されるＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）及びＰＵ−Ｈ７１のレジメンで、癌患者に投与されるＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の用量は、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の添付文書に示される量の８０％、その量の７０％、その量の６０％、その量の５０％、その量の４０％、その量の３０％又はその量の２０％であり得る。いくつかの実施形態では、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）は、前述の実施形態のいずれかの間、例えば、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の添付文書に示される量の２０％〜１００％、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の添付文書に示される量の４０％〜１００％、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の添付文書に示される量の６０％〜１００％、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の添付文書に示される量の２０％〜８０％、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の添付文書に示される量の４０％〜８０％、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の添付文書に示される量の５０％〜７０％、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の添付文書に示される量の５０％〜６０％等の量で投与され得る。
【００８８】
ＰＵ−Ｈ７１がＴａｘｏｌ（登録商標）の投与後に投与される実施形態では、Ｔａｘｏｌ（登録商標）とＰＵ−Ｈ７１は、限定されないが、３週に１用量、２週に１用量又は毎週１用量などの様々な投与スケジュールで投与され得る。３週及び２週実行スケジュールは、一般に、３時間、２４時間又は９６時間の注入で１３５〜２５０ｍｇ／ｍ２のＴａｘｏｌ（登録商標）用量を利用する。１週間投与スケジュールは、一般に、４０〜１００ｍｇ／ｍ２のＴａｘｏｌ（登録商標）の１時間注入を利用する。例えば、Ｔａｘｏｌ（登録商標）は、毎週４０ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、７０ｍｇ／ｍ２、８０ｍｇ／ｍ２、９０ｍｇ／ｍ２又は１００ｍｇ／ｍ２の用量で投与され得る。
【００８９】
タンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ（例えば、ＨＳＰ９０）とシャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤とは、治療サイクルと呼ばれる一定の間隔で投与され得る。治療サイクルは、投与スケジュールが、その反復を開始する日数として定義される。タンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）とシャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤とは、一般に、治療サイクルの第１日に投与され、その治療サイクルの別の日に投与され得る。例えば、タンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）とシャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤とは、７日、１０日、１４日、２１日、２８日又は３０日の投与スケジュールにわたって１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回又は１０回投与され得る。週１回の薬剤投与が処方されている場合、治療サイクルは、タンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）とシャペロン又はコシャペロンタンパク質（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）とがサイクルの第１日に投与され、タンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）、又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質阻害剤が治療サイクルの第２〜６日に投与されない、７日の期間として定義される。３週に１回の薬剤投与が処方されている場合、治療サイクルは、タンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）とシャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤とがサイクルの第１日に投与され、タンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）、又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質阻害剤が治療サイクルの第２〜２１日に投与されない、２１日の期間として定義される。タンパク質毒性ストレッサーとシャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤とが２８日投与スケジュールの第１、８及び１５日に投与されるように処方されている場合、タンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）、又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質阻害剤は、各サイクルの第１６〜２８日に投与すべきではない。
【００９０】
一態様では、本開示は、タンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）とシャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤との組合せを７日〜３１日の治療サイクルにわたって投与することにより癌を治療する方法を提供し、ここで、タンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）とシャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤とは、前記サイクルにわたって少なくとも１回投与され、前記タンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）の各投与後、前記シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤が投与される。本開示によれば、シャペロン又はコシャペロンタンパク質の投与は、タンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）によって誘導されるエピシャペローム形成の増加後に開始する。一部の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）を投与してから少なくとも１時間後に投与される。他の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）を投与してから少なくとも２時間後に投与される。他の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）を投与してから少なくとも３時間後に投与される。他の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）を投与してから少なくとも３、４時間後に投与される。他の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）を投与してから少なくとも５時間後に投与される。他の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）を投与してから少なくとも６時間後に投与される。他の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）を投与してから少なくとも７時間後に投与される。他の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）を投与してから少なくとも８時間後に投与される。他の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）を投与してから少なくとも９時間後に投与される。他の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）を投与してから少なくとも１０時間後に投与される。他の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）を投与してから少なくとも１２時間後に投与される。他の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）を投与してから少なくとも２４時間後に投与される。他の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）を投与してから少なくとも３６時間後に投与される。他の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤は、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）を投与してから少なくとも４８時間後に投与される。いくつかの実施形態では、タンパク質毒性ストレッサー又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）は、前述の実施形態のいずれかの間、例えば、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤の投与の約１〜３時間前、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤の投与の約２〜４時間前、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤の投与の約３〜５時間前、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤の投与の約２〜６時間前、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤の投与の約３〜６時間前、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤の投与の約４〜６時間前、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤の投与の約４〜８時間前、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤の投与の約４〜１０時間前、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤の投与の約５〜７時間前等の範囲内の時点で投与される。
【００９１】
一部の実施形態では、治療サイクルは、２１日サイクルであってよく、タンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）とシャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤とは、サイクルの第１日にのみ投与される。一部の実施形態では、治療サイクルは、２１日サイクルであってよく、タンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）とシャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤とは、サイクル期間中、２回、３回、４回、５回、６回、７回又は８回投与される。一部の実施形態では、治療サイクルは、１４日サイクルであってよく、タンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）とシャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤とは、サイクル期間中、１回、２回、３回、４回、５回、又は６回投与される。一部の実施形態では、治療サイクルは、２８日サイクルであってよく、タンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）とシャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤とは、サイクル期間中、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回又は１０回投与される。いくつかのこうした実施形態では、タンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）とシャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤とは、２８治療サイクルの第１、８及び１５日に投与され得る。他の実施形態では、治療サイクルは、７日サイクルであってよく、タンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）とシャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤とは、サイクルの第１日に投与される。
【００９２】
一部の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）は、タンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）が投与される日にのみ投与される。他の実施形態では、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤は、タンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）が投与される日、並びにタンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）が投与されない日に投与される。例えば、２週間サイクルの場合、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤とタンパク質毒性ストレッサー（又はシャペロン若しくはコシャペロンタンパク質の翻訳後修飾のモジュレータ）とは、サイクルの第１及び８日に投与され得、シャペロン又はコシャペロンタンパク質阻害剤は、サイクルの第４及び１１日に単独で投与され得る。
【００９３】
タンパク質毒性ストレッサーとシャペロンタンパク質阻害剤又はコシャペロンタンパク質阻害剤とを投与する方法としては、限定されないが、内皮、筋肉内、腹腔内、経口、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、経口、舌下、大脳内、膣内、経皮、直腸、吸入による、又は局所、特に耳、鼻、眼、若しくは皮膚が挙げられる。
【００９４】
タンパク質毒性ストレッサーとシャペロンタンパク質阻害剤又はコシャペロンタンパク質阻害剤は、各々薬学的に許容される組成物として投与され得る。組成物は、任意選択で、治療を受ける患者への適切な投与のための形態を提供するように、好適な量の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。こうした医薬賦形剤は、希釈剤、懸濁剤、可溶化剤、結合剤、崩壊剤、防腐剤、着色剤、潤滑剤などであってよい。医薬賦形剤は、液体、例えば、水、又は石油、動物、植物、若しくは合成由来の油をはじめとする油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであってよい。医薬賦形剤は、食塩水、アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などであってよい。加えて、補助、安定化、増粘、潤滑、及び着色剤を使用することができる。一実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、動物に投与される場合、無菌である。
【００９５】
食塩水及び水性デキストロース及びグリセロ―ル溶液も液体賦形剤として、特に注射液の場合に使用することができる。好適な医薬賦形剤として、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、ＥｔＯＨなども挙げられる。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含んでもよい。経口剤形を製剤化するために使用することができる薬学的に許容される担体及び賦形剤の具体的な例は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，（Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓ’ｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，１９８６）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００９６】
組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、ペレット、液体を含むカプセル、粉末、徐放性製剤、坐薬、乳剤、エアゾル、スプレー、懸濁体、又は使用に適した他の任意の形態をとることができる。
【００９７】
化合物を非経口注射する場合、これは、例えば、滅菌等張液の形態であってよい。或いは、本開示の化合物を吸入させる場合、これを乾燥エアゾルに製剤化するか、又は水溶液若しくは部分水溶液に製剤化することができる。
【００９８】
一実施形態では、タンパク質毒性ストレッサーとシャペロンタンパク質阻害剤又はコシャペロンタンパク質阻害剤とは、静脈内投与のために個別に製剤化することができる。いくつかの実施形態では、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性バッファーを含む。必要に応じて、組成物は、可溶化剤をさらに含んでもよい。一般に、成分は、例えば、活性剤の量を示すアンプル又はサシェットなどの密封容器内の乾燥凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、単位剤形中に個別に又は混合して供給される。化合物を注入により投与する場合、例えば、滅菌医薬グレード水又は食塩水の入った注入ボトルを用いて化合物を分散させることができる。注射により化合物を投与する場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用の滅菌水又は食塩水のアンプルを用意することができる。
【実施例】
【００９９】
５．１  実施例１：シャペローム複合体の同定
５．１．１  材料及び方法
細胞株。細胞株は、ＷＣＭＣ又はＭＳＫＣＣの研究室から取得し、これらは、本来Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）又はＤＳＭＺから購入された。供給者の推奨する培養条件に従って細胞を培養した。短いタンデム反復プロファイリングを用いて、細胞を確認した後、マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）についてテストした。
【０１００】
原発性乳癌試料。患者の組織の入手は、メモリアルスローンケタリング癌センター（Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）の治験審査委員会承認生体試料プロトコル＃０９−１２１によって認可された。表示濃度のＰＵ−Ｈ７１で試料を２４時間処理した。処理後、切片を４％ホルマリン溶液中に１時間固定してから、７０％エタノール中に保存した。組織分析のために、切片をパラフィン包埋し、切断し、スライドに載せ、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。組織スライドは、腫瘍中に存在するアポトーシス並びに正常細胞に対する作用を正確に測定する乳癌病理学者によって盲検的に評価された。
【０１０１】
ＮａｎｏＰｒｏキャピラリーベースの免疫アッセイプラットホームによるタンパク質分析。プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を含有する２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％ＮＰ４０、２０ｍＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４バッファー中で細胞を溶解させた。電荷ベースの分離のために、自動システムのＮａｎｏＰｒｏ（商標）１０００Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ（登録商標））で全タンパク質アッセイを実施した。手短には、１×Ｐｒｅｍｉｘ  Ｇ２  ｐＨ３〜１０分離勾配（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｉｍｐｌｅ（登録商標））及び１×等電点標準ラダー（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ（登録商標））を含有するマスターミックスを用いて、全細胞溶解物を２５０ｎｇ／μｌの最終濃度まで希釈した。このようにして希釈したサンプルはその自然電荷状態を維持し、これらをキャピラリー（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ（登録商標））中にロードし、２１，０００μＷａｔｔの定電力で、それらの等電点に基づいて４０分間分離した。Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎシステムに埋め込まれた紫外線により固定化を実施した後、抗ＨＳ９０β（ＳＭＣ−１０７Ａ，ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又は抗ＨＳ９０α（ａｂ２９２８，Ａｂｃａｍ）と一緒に、続いてＨＲＰ共役抗マウスＩｇＧ（１０３０−０５，ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）又はＨＲＰ共役抗ウサギＩｇＧ（４０１０−０５，ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）と一緒にインキュベートした。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、並びにＳｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎシステムのデジタルイメージング及び関連ソフトウェア（Ｃｏｍｐａｓｓ）を用いた化学発光によってタンパク質シグナルを定量した。
【０１０２】
発現データを収集し、システムにより提供されるソフトウェアＣｏｍｐａｓｓにより分析した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（Ｈｓｐ９０阻害剤に感受性、高エピシャペロームレベル）、Ａｓｐｃ１（Ｈｓｐ９０阻害剤に対して耐性、低からゼロエピシャペローム）及びＨＭＥＣ（非形質転換）細胞中に異なるＨＳＰ９０複合体が検出された。
【０１０３】
いくつかのｎａｎｏｐｒｏ条件を試験した。３〜１０＋５〜８両性電解質の混合物は、標準条件と類似のプロフィールを有したが、所望のものより広いピーク分離をもたらした。
【０１０４】
製造業者によって推奨される２０ｍＭ  Ｂｉｃｉｎｅ  ｐＨ７．６、０．６％ＣＨＡＰＳバッファー（バッファー１）及びＴｒｉｓ緩衝食塩水（バッファー２）をタンパク質抽出バッファーとして試験した。ｐｌ５（Ｈｓｐ９０の標準ｐｌ）を超えるピック（ｐｉｃｋｓ）は、バッファー１及び２中に溶解させたＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞中で有意に減少したが、これは、上記の条件がこれらのタンパク質種の効率的な抽出のために好適でないことを示す。
【０１０５】
Ａｂｃａｍからのａｂ２９２７をはじめとするいくつかのＨｓｐ９０特異的抗体をテストしたところ、Ｈ９０−１０プロフィールと同等のものが得られた。ＥｎｚｏＳＰＡ−８３０及びＳＰＡ−８４５抗体は、検出可能なシグナルをもたらさなかった。
【０１０６】
ウエスタンブロッティング。プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を添加した２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０バッファーで培養した細胞からタンパク質を抽出した。１０〜１５μｇの全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ニトロセルロース膜上に移し、表示の抗体と一緒にインキュベートした。ＨＳＰ９０β及びＨＳＰ１１０抗体は、Ｓｔｒｅｓｓｍａｒｑから；ＨＳＰ７０、ＨＳＣ７０、ＨＩＰ、ＨＯＰ、及びＨＳＰ４０は、Ｅｎｚｏから；ＨＳＰ９０β、ＨＳＰ９０α、及びＡＨＡ−１はＡｂｃａｍから；切断ＰＡＲＰは、Ｐｒｏｍｅｇａから；ＣＤＣ３７は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから；並びにβ−アクチンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからそれぞれ購入した。ブロットは、ＴＢＳ／０．１％ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄してから、適切なＨＲＰ共役二次抗体と一緒にインキュベートした。製造業者の指示に従ってＥｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で化学発光シグナルを検出した。
【０１０７】
ネイティブゲル電気泳動。ネイティブＨｓｐ９０複合体の抽出のために少量の洗剤を含む溶解バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、２０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％ＮＰ４０及び１０％グリセロール）を選択して、溶解工程中、それらを保存した。凍結融解法によって細胞を溶解させた。５０〜１００ｇのタンパク質を４〜１０％ネイティブ勾配ゲルにロードし、４℃で分離させた。０．１％ＳＤＳ含有の転写バッファー中のニトロセルロース上にタンパク質を１時間転移させ、抗Ｈｓｐ９０抗体と一緒にイムノブロッティングした。いくつかの転移条件を試験して、高分子量ＨＳＰ９０複合体の転移及び検出を可能にするものを決定した。本発明者らは、標準条件下での転移前に２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ中でゲルを１５分間にわたり室温でインキュベートし（条件＃１）；０．０５％ＳＤＳ含有の転写バッファー中で転移を実施し（条件＃２）、０．１％ＳＤＳ含有の転写バッファー中で転移を実施した（条件＃３）。陽性対照及びＡＨＡ１ノックダウンサンプルの使用により、シグナルの特異性を試験した。
【０１０８】
いくつかのＨｓｐ９０特異的抗体を、それらが高分子量Ｈｓｐ９０種を認識する能力について試験した。その中には、ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑからのＨ９０−１０クローン（ＳＭＣ−１０７Ａ）、Ａｂｃａｍからのａｂ２９２８、ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの６１０４１８及びＡｂｃａｍからのａｂ２９２７が含まれた。
【０１０９】
５．１．２  結果
類似組成物及びサイズの複合体を分離する上でのタンパク質分離の限界を克服するために、本発明者らは、等電点電気泳動とイムノブロッティング能力とを併せ持つキャピラリーベースプラットホームの利点を利用した。Ｆａｎ，Ａ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １５，５６６−５７１（２００９）。この方法は、その等電点（ｐＩ）に基づいてネイティブ多量体タンパク質複合体を分離するために固定化ｐＨ勾配を使用し、従って、特定の抗体を含む固定化複合体のプロービングを可能にする。さらに、上記の方法は、これを実施するのに微量のサンプルのみを使用するため、一次試料の検査が可能になる。
【０１１０】
この方法を用いて、本発明者らは、初めに、ヒト細胞中最も豊富なシャペロームメンバーであるＨＳＰ９０を分析した。培養された非形質転換細胞（図１ａ）及び正常乳房組織（図１ｂ）において、ＨＳＰ９０は、４．９の予測ｐＩに主に単一種として集中した。反対に、この方法で分析した癌細胞株は、ｐＩ範囲が４．５〜６にまたがるＨＳＰ９０種の複合体混合物を含有した。ＨＳＰ９０α及びＨＳＰ９０βアイソフォームはいずれも、これらの複合体の一部であった。さらに、癌細胞株は、４．９を下回るｐＩ値を有するいくつかのＨＳＰ９０複合体を含有していたが、細胞株のサブセットは、５以上の稀有なｐＩを有するＨＳＰ９０複合体が豊富であり、これらを本明細書では「タイプ１」細胞と呼ぶ（図１ａ）。２つの乳房腫瘍に見られるように、高い（タイプ１）及び低い（タイプ２）ｐＩのＨＳＰ９０複合体のこの区別も原発性乳癌試料で明らかであった（図１ｂ）。興味深いことに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定される通り、ＨＳＰ９０の総レベルは、それらがタイプ１又はタイプ２細胞のいずれであるかにかかわらず、分析した全ての細胞でほぼ同一であった（図１ａ、上部）。
【０１１１】
２つのタイプのタンパク質修飾、化学及び生化学は、所与のタンパク質の等電点を変えることができる。ＨＳＰ９０は、ＨＳＰ７０及びＨＳＣ７０（それぞれ誘導性及び構成性細胞質ゾルＨＳＰファミリーメンバーである）、ＨＳＰ７０−ＨＳＰ９０組織化タンパク質（ＨＯＰ）（ストレス誘導性リンタンパク質１［ＳＴＩＰ１］としても知られる）、Ｈｓｐ９０ＡＴＰａｓｅ１のアクチベータ（ＡＨＡ−１又はＡＨＳＡ−１）、並びに細胞分裂周期３７（ＣＤＣ３７）をはじめとするいくつかのコシャペロンと相互作用することがわかっている。これらのコシャペロンの各々は、異なる役割を有し、ＣＤＣ３７は、ＨＳＰ９０によりキナーゼの活性化を促進し、ＡＨＡ−１は、そのＡＴＰａｓｅ活性を増大し、ＨＳＰ７０及びＨＯＰは、ＨＳＰ９０と共に様々なタンパク質のシャペロン化に参加する。実際に、ネイティブＰＡＧＥにおいてサイズによりＨＳＰ９０複合体を分離すると、高いｐＩのＨＳＰ９０種が豊富な細胞は、高分子量ＨＳＰ９０含有複合体も豊富であることが観察された（図１ｃ）。類似の条件下で、本発明者らは、非形質転換細胞中に１つの主要な種を検出した。これは、正常組織中に一過性ＨＳＰ９０オリゴマー形態（ネイティブ電気泳動条件下で、より小さい二量体及び単量体に解離された）を見出した以前の研究と一致して、ＨＳＰ９０二量体であると推定される。
【０１１２】
５．２  実施例２：シャペロームメンバーの多量体形態の同定
本発明者らは、続いて、抗シャペローム抗体の群を、そのネイティブ形態で標的タンパク質と相互作用したものについてスクリーニングした。本発明者らは、これらの抗体が、シャペロームメンバーの安定した多量体形態を捕捉する傾向がより高いと判断した。これらのネイティブ−コグネイト抗体を用いて、高分子量ＨＳＰ９０複合体の細胞含有量が高いほど、ＨＳＰ７０、ＨＯＰ、ＡＨＡ−１、ＣＤＣ３７、ＨＳＰ４０及びＨＳＰ１１０などの他の必須シャペロームの多量体形態も豊富である（図１ｄ、下部）ことが観察された。シャペロームの四次状態はまちまちであったが、各シャペロームメンバーの全体レベルは比較的一定のままであった（図１ｄ、上部）。
【０１１３】
５．２  実施例３：ＨＳＰ９０及びＨＳＰ７０は、マルチシャペローム複合体の核を形成する
５．３．１  材料及び方法
ｓｉＲＮＡノックダウン。６ウェルプレート当たり１×１０６で細胞を平板培養し、ヒトＡＨＳ１に対するｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）、又はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む負の対照でトランスフェクトし、７２時間インキュベートした後、さらなる分析に付した。
【０１１４】
タンパク質欠失。タンパク質溶解物をＨＳＰ７０（Ｅｎｚｏ）、ＨＳＣ７０（Ｅｎｚｏ）若しくはＨＯＰのいずれか、又は負の対照として同じ種の正常な抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）で３回連続的に免疫沈降させた。得られた上清を収集し、ネイティブ又は変性ゲル上で泳動させた。
【０１１５】
５．３．２  結果
タイプ１腫瘍中の安定した多量体シャペローム複合体の組成物を明らかにし、それらの成分同士の関係を調べるために、本発明者らは、個々のシャペロームメンバー、すなわちＨＳＰ７０、ＨＳＣ７０、ＨＯＰ、及びＡＨＡ−１の細胞発現を改変するか、又はＨＳＰ９０及びＨＳＰ７０に対して特異的なベイトを用いて複合体参加成分を捕捉した（実施例４を参照されたい）。本発明者らは、免疫欠失によってＨＳＰ７０又はＨＳＣ７０のレベルを低減すると、ＨＳＣ７０の低減が、最も頑健な作用を有し、高分子量シャペローム種の再構成が起こった（図２ｂ）。これらの複合体において、免疫ブロッティングにより、ＨＳＰ４０、熱ショック１０５ｋＤａ／１１０ｋＤａタンパク質１（ＨＳ１０５若しくはＨＳＰ１１０）、及びＨＳＣ７０相互作用タンパク質（ＨＩＰ）（別名ＳＴ１３、腫瘍原性の抑制剤）の量の変化が確認されたが、これらは全て既知のＨＳＣ７０相互作用コシャペロンである。本発明者らはまた、ＨＳＰ９０、ＨＯＰ、及び驚くことに、ＨＳＰ９０活性と関連するコシャペロンであるＡＨＡ−１及びＣＤＣ３７のレベルの変化も観察した（図２ｂ）。シャペロームの実質的な再構成は、総シャペロームレベルに若干影響を与えたに過ぎない。本発明者らは、ＨＯＰが免疫欠失した溶解物（ＨＳＰ４０、ＨＳＰ１１０、及びＣＤＣ３７の変化を測定することができた）、並びにＡＨＡ−１が欠失したもの（ＨＳＰ７０コシャペロン機構に有意な再構築が認められなかった）において同様の結果を見出した。総合すると、これらのデータは、タイプ１細胞中のＨＳＰ９０及びＨＳＰ７０シャペロン機構の機能的相互作用を示す（図２ａ、ｂ）。
【０１１６】
５．４．実施例４：親和性によるプロテオミクスを用いたエピシャペロームのタンパク質の捕捉
５．４．１  材料及び方法
化学ベイトプロテオミクス。ＰＵ−Ｈ７１ビーズ（Ｍｏｕｌｉｃｋ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｂｙ  Ｈｓｐ９０．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ７，８１８−８２６（２０１１）及びＹＫビーズ（Ｒｏｄｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１４  Ａｕｇ  １５；９（８）：１６９８−７０５）を他の箇所に記載されるように作製した。ＰＵ−Ｈ７１ビーズプルダウンの場合の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％ＮＰ４０、及び２０ｍＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４、又はＹＫビーズプルダウンの場合の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１％ＮＰ４０のいずれかでタンパク質抽出物を調製した。サンプルは、ＰＵ−Ｈ７１ビーズと一緒に３〜４時間、又はＹＫビーズと一緒に４℃で一晩インキュベートした後、洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続くイムノブロッティング及びウエスタンブロット分析に付した。公開されているプロトコルを用いて、プロテオーム解析を実施した（Ｍｏｕｌｉｃｋ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｂｙ  Ｈｓｐ９０．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ７，８１８−８２６（２０１１）及びＮａｙａｒ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｈｓｐ９０−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｉｎ  ｇａｍｍａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  １２２，２８３７−２８４７（２０１３）。対照ビーズは、不活性分子を含有した。
【０１１７】
バイオインフォマティクス分析。定量的プロテオミクス測定値の代替物である排他的スペクトルカウント値をタンパク質分析に使用した。ＣＨＩＰ及びＰＰ５を調べ、サンプル同士の内部品質対照として使用した。Ｒ（バージョン３．１．３）を用いて統計分析を実施した。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒのｌｉｍｍａパッケージからの調整線形モデルを用いてタンパク質富化差異分析を実施した。タンパク質存在量の対数値をタンパク質富化差異分析に使用した。コントラストフィットモデルを用いた実証的ベイズ（Ｂａｙｅｓｉａｎ）統計学を使用して、タイプ１及び組合せタイプ２並びに非形質転換細胞同士のタンパク質存在量の差を表すｐ値を計算した。パッケージ「ｇｐｌｏｔｓ」及び「ｌａｔｔｉｃｅ」を用いて、最終候補タンパク質を示すためにヒートマップを作製した。
【０１１８】
タンパク質−タンパク質相互作用（ＰＰＩ）ネットワーク。ヒートマップに示されるタンパク質をＳＴＲＩＮＧデータベースにアップロードして、ＰＰＩネットワークを作成した。エッジの厚さは、機能性結合の信頼性スコアを示す。次の４つの基準：共発現、実験及び生化学的検証、精選されたデータベースでの関連、及びＰｕｂＭｅｄ要約中の同時言及に基づいてスコアを計算した。隣接する相互作用のないタンパク質は示さなかった。ノード中のカラースケールは、それぞれタイプ１、タイプ２、及び非形質転換細胞中のタンパク質の平均富化（排他的スペクトルカウントとして測定される）を示す。Ｃｙｔｏｓｃａｐｅのエッジ加重スプリング−電子レイアウトを用い、視覚化を改善するためにマージナルノードを若干調節して、タイプ１腫瘍のネットワークレイアウトを作成した。タイプ２及び非形質転換細胞のレイアウトは、よりよい比較のためにタイプ１のレイアウトを保持した。平均相対存在量の値が１未満のタンパク質は、分析から削除した。それらが参加する生物学的プロセス及びタイプ１腫瘍中で富化されたタンパク質の機能性は、遺伝子オントロジー用語、並びにＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、ＳＴＲＩＮＧ、及び／又はＩ２Ｄデータベースからのそれらの指定インタラクトーム（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ）に基づいて割り当てた。
【０１１９】
５．４．２  結果
本発明者らは、ＨＳＰ９０及びその関連インタラクトーム（Ｍｏｕｌｉｃｋ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｂｙ  Ｈｓｐ９０．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ７，８１８−８２６（２０１１））、又はＨＳＣ７０／ＨＳＰ７０及びそのインタラクトーム（Ｒｏｄｉｎａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｕｓｅ  ｔｏ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｈｓｐ７０  ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ９，１６９８−１７０５（２０１４））を捕捉する化学ベイトを用いて、タイプ１、タイプ２、及び非形質転換細胞から内在性シャペローム複合体を単離した。次に、単離物を主要シャペロームメンバー、特にＨＳＰ４０及びＨＳＰ１１０などのＨＳＰ７０、並びにＡＨＡ−１及びＣＤＣ３７などのＨＳＰ９０の既知調節因子についてプロービングした。さらに、本発明者らは、ＨＳＰ７０とＨＳＰ９０機構の架橋コシャペロンであるＨＯＰについてもプロービングした（図２ａ、ｃ）。これらの実験から２つの主要な知見が得られた。第１に、タイプ１腫瘍中のＨＳＰ９０及びＨＳＣ７０／ＨＳＰ７０核形成複合体の富化を見出した。対照的に、同じ実験条件下で、タイプ２癌細胞及び非形質転換細胞で単離されたこのような複合体は少なかった。第２に、タイプ１細胞では、予想外なことに、ＨＳＰ９０コシャペロンであるＡＨＡ−１及びＣＤＣ３７は、ＨＳＰ７０指向性ベイト上で富化されたのに対し、ＨＳＰ１１０及びＨＳＰ４０などのＨＳＰ７０コシャペロンが、ＨＳＰ９０指向性ベイト上で富化されることが判明した。これらの観測結果は、ＨＳＰ９０及びＨＳＰ７０機構の物理的相互作用を示す（図２ａ、ｃ）。
【０１２０】
ＨＳＰ９０機構の作用について現在容認されているメカニズムは、早期、中間期及び後期のシャペロン複合体の一過性集合及び解体に関与する連続的なものである。早期では、ＨＳＰ７０は、ＨＳＰ４０コシャペロンの１つと一緒に新生又は変性タンパク質を捕捉する。次に、クライアントタンパク質が、ＨＳＰ７０複合体からＨＳＰ９０複合体に転移した中間複合体が形成される。ヌクレオチド及びコシャペロンにより調節される立体構造的変化はこれを成熟複合体に移行し、そこで活性クライアントタンパク質が放出される。ＨＯＰ及びＣＤＣ３７は、経路へのクライアントの進入を制御する中間期コシャペロンであり、ｐ２３及びＡＨＡ−１は、クライアントタンパク質成熟をもたらす周期の後期に関与する（Ｒｅｈｎ，Ａ．Ｂ．＆Ｂｕｃｈｎｅｒ，Ｊ．ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  ｂｙ  Ｃｏ−ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  １１３−１３１（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１５））。
【０１２１】
しかしながら、連続的に作用して、ホメオスタシス中にタンパク質を折り畳む一過性ＨＳＰ９０及びＨＳＰ７０シャペローム複合体のモデルは、タイプ１腫瘍におけるいくつかのＨＳＰ９０及びＨＳＰ７０−中心複合体の同時存在を説明するものではない。そうではなく、本発明者らのデータは、タイプ１腫瘍に特有の認識が起こって、タイプ２腫瘍及び正常細胞中に見られるものと異なるシャペロームをもたらすことを示す。タイプ１シャペロームは、両機構のコシャペロンを同時に組み込む安定なＨＳＰ９０及びＨＳＰ７０−中心複合体の存在を特徴とし；これは、ネイティブＰＡＧＥ条件下でのそれらの安定性、さらには両ベイトによるそれらの捕捉によって立証される。
【０１２２】
タイプ１腫瘍中のシャペロームの特異的再構成を支持する生化学的メカニズムを理解し、さらにはこれらの多量体複合体の成分を同定するために、本発明者らは、非バイアスプロテオーム解析を実施した。具体的には、ＨＳＰ９０ベイトを用いて、タイプ１（ｎ＝６）及びタイプ２（ｎ＝３）癌細胞、並びに非形質転換（ｎ＝３）細胞からのホモジネートをプロービングした。ＨＳＰ９０複合体を捕捉することを確実にするために、本発明者らは、ＨＳＰ９０−ベイト飽和の条件下でこれらの試験を実施した。次に、タンパク質単離物を質量スペクトル分析に供したところ、クライアントタンパク質及びモジュレータをはじめとする多様なＨＳＰ９０相互作用を見出したた。これらのうち、本発明者らは、バイオインフォマティクス分析のために１１０のタンパク質を選択したが、それらには、シャペロン、コシャペロン、スカフォールディング、フォルダーゼ、及びイソメラーゼタンパク質として機能することがわかっており、従ってタイプ１腫瘍中に観察されるシャペローム再構成に参加する可能性が高いタンパク質が含まれる。
【０１２３】
５．５．実施例５：エピシャペロームは、癌細胞生存を促進する
５．５．１  材料及び方法
試薬。ＰＵ−Ｈ７１、ＮＶＰ−ＡＵＹ−９２２、ＳＮＸ−２１１２、及びＹＫをはじめとする、本試験で使用するＨＳＰ９０及びＨＳＰ７０阻害剤は、以前報告されている通りに合成した（Ｍｏｕｌｉｃｋ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｂｙ  Ｈｓｐ９０．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ７，８１８−８２６（２０１１）及びＴａｌｄｏｎｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．２．２，５’−ｔｈｉｏｄｉｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ，５−（ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏ）ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ，２−（ｐｙｒｉｄｉｎ−３−ｙｌｔｈｉｏ）ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ，ａｎｄ  ３−（ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏ）ｐｙｒｉｄｉｎｅｓ  ａｓ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｂｉｎｄｅｒｓ  ｔｏ  ａｎ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｓｉｔｅ  ｏｎ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５７，１２０８−１２２４（２０１４））。ＳＴＡ−９０９０は、ＭｅｄＫｏｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから、ＣＵＤＣ−３０５は、ＣｈｅｍｉｅＴｅｋから購入した。
【０１２４】
表示の細胞：ＭＤＡＭＢ４６８（タイプ１、高エピシャペローム、ＨＳＰ９０嗜癖性、ＨＳＰ９０阻害剤に感受性）、ＡＳＰＣ１（タイプ２、低〜ゼロのエピシャペローム、ＨＳＰ９０依存性、ＨＳＰ９０阻害剤耐性）及びＨＭＥＣ（非形質転換）の溶解物をＰＵ−Ｈ７１ビーズ（固体支持体に結合させたＰＵ−Ｈ７１）と共にその量を増加させながら、又は対照ビーズ（不活性化学物質を結合させたビーズ）と一緒にインキュベートした（図３ａ）。上清をネイティブゲル分離に適用した後、ＨＳＰ９０及びその他のエピシャペローム複合体成分を用いたイムノブロッティング（左、ＭＤＡＭＢ４６８についての例）、又はｎａｎｏｐｒｏ等電点電気泳動及びイムノブロッティング（左、３つの細胞全てについて示す）を実施した。各実験条件の２回反復を表示する。データをグラフ化し、３つの細胞タイプに発現される、ＨＳＰ９０種に対するＰＵ−Ｈ７１の相対結合親和性を示した。
【０１２５】
表示の癌細胞（乳癌、リンパ腫、膵臓癌が示される）におけるネイティブ及び変性ゲル条件下でのＨＳＰ９０の生化学的プロフィールである。ｎａｎｏｐｒｏによる等電点電気泳動は、タイプ１（嗜癖性、ＨＳＰ９０阻害剤に感受性）及びタイプ２（依存性、ＨＳＰ９０阻害剤に抵抗性）癌細胞中のエピシャペローム複合体の存在量を示す（図３ｂ）。
【０１２６】
ＰＵ−ＦＩＴＣフローサイトメトリーアッセイにより決定されたエピシャペローム存在量。（図３ｃ）。細胞を１μＭ  ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣで処理した。処理から４時間後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。生存細胞中のＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ結合を測定するために、室温において細胞をＦＡＣＳバッファー中の７−ＡＡＤで１０分間染色してから、フローサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。アネキシンｖ染色を用いて細胞生存能を決定した。１μＭ  ＰＵＨ７１処理から４８時間後、細胞をアネキシンＶ−Ｖ４５０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びアネキシンＶバッファー中の７−ＡＡＤで染色した後、フローサイトメトリーに供して、アネキシンＶ／７ＡＡＤ二重ネガティブゲートにより決定される生存能を測定した。
【０１２７】
５．５．２  結果
図３ａに示すように、固体支持体に結合したＰＵ−Ｈ７１は、等電点電気泳動によって測定される通り、エピシャペローム形成の量を有効に低減することができた。ＰＵ−Ｈ７１の濃度が増加するにつれて、溶解物中のエピシャペロームの量に明瞭な用量依存的減少が見られた。図３ｂにおいて、本発明者らは、ＨＳＰ９０阻害剤に対して感受性の細胞におけるエピシャペローム複合体の存在量が、ＨＳＰ９０阻害剤に対して感受性ではない細胞より有意に高いことを示す。図３ｃにおいて、本発明者らは、ＨＳＰ９０阻害剤ＰＵ−Ｈ７１が、ハウスキーピング、正常細胞ＨＳＰ９０よりも、ストレスＨＳＰ９０種に対して高い親和性を有するため、適切に標識されたＰＵ−Ｈ７１を用いて、生存細胞中のストレスＨＳＰ９０の存在量を定量し得ることを明らかにする。
【０１２８】
さらに、本発明者らは、エピシャペロームが豊富な細胞は、エピシャペロームのレベルがより低い細胞と比較して、ＰＵ−Ｈ７１に曝露されると死滅する傾向が高いことも見出した（図３ｄ）。乳癌、肺癌、膵臓癌及び胃癌、並びに白血病及びリンパ腫を含む９０超の癌細胞株において、本発明者らは、エピシャペロームの存在量と、ＨＳＰ９０阻害剤に対するこれらの癌細胞の感受性との間に有意な相関（Ｐ＜０．０００１）を見出した。ＡＨＡ−１タンパク質のレベルを低減することによってエピシャペロームの存在量を低下させると、細胞はＰＵ−Ｈ７１による殺傷を被りにくくなった（図３ｅ）。ＨＳＰ９０複合体に対して様々な選択性を有する、化学的に異なるＨＳＰ９０指向性薬剤がＰＵ−Ｈ７１のプロフィールを再現したことから、この作用は、ＰＵ−Ｈ７１処理に限定されなかった。タイプ１腫瘍もこれらの薬剤により有効に殺傷されるが、タイプ２腫瘍は、不応性のままであった（図３ｇ）。総合すると、これらの観測結果から、エピシャペロームが、これらの腫瘍における生存を促進する手段として確認される。
【０１２９】
５．６．  実施例６：エクスビボ試験
５．６．１  材料及び方法
原発性乳房腫瘍プロトコル。この試験で使用されるエクスビボプロトコルを図４に概略的に示す。サンプル調製及び処理は、治療薬の前臨床及び臨床試験のための原発性腫瘍及び／又は関連転移のエクスビボ治療応答に詳述されている。Ｃｏｒｂｅｎ  ＡＤ，Ｕｄｄｉｎ  ＭＭ，Ｃｒａｗｆｏｒｄ  Ｂ，Ｆａｒｏｏｑ  Ｍ，Ｍｏｄｉ  Ｓ，Ｇｅｒｅｃｉｔａｎｏ  Ｊ，Ｃｈｉｏｓｉｓ  Ｇ，Ａｌｐａｕｇｈ  ＭＬ．Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．２０１４  Ｏｃｔ  ２；（９２）：ｅ５２１５７。
【０１３０】
白血病サンプルのＰＵ−ＦＩＴＣフローアッセイ（図５ｃ）。以前記載されている通りにＰＵ−ＦＩＴＣアッセイを実施した（Ｔａｌｄｏｎｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｕｒｉｎｅ−ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９０  ｗｉｔｈ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ２１，５３４７−５３５２（２０１１）。手短には、細胞を１μＭ  ＰＵ−ＦＩＴＣと一緒に３７℃で４時間インキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ／０．５％ＦＢＳ）で２回洗浄してから、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩを含有するＦＡＣＳバッファー中に再懸濁させた。処理済み生存ＡＭＬ細胞（ＤＡＰＩ−ｖｅ）中のＰＵ−ＦＩＴＣの平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーにより評価した。原発性ＡＭＬ試料の場合、芽細胞及びリンパ球集団を同定するために細胞を抗ＣＤ４５−ＡＰＣ−Ｈ７（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でも染色した。ＳＳＣ対ＣＤ４５に基づき、芽細胞及びリンパ球集団をゲーティングした。負の対照としてＦＩＴＣ誘導体ＦＩＴＣ９を使用した。
【０１３１】
原発性乳癌試料。患者組織の入手は、メモリアルスローンケタリング癌センター（Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）の治験審査委員会承認生体試料プロトコル＃０９−１２１によって認可された。表示濃度のＰＵ−Ｈ７１で試料を２４時間処理した。処理後、切片を４％ホルマリン溶液中に１時間固定してから、７０％エタノール中に保存した。組織分析のために、切片をパラフィン包埋し、切断し、スライドに載せ、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。組織スライドは、腫瘍中に存在するアポトーシス並びに正常細胞に対するあらゆる作用を正確に測定する乳癌病理学者によって盲検的に評価された。
【０１３２】
原発性急性骨髄性白血病。凍結保存一次ＡＭＬサンプルは、インフォームドコンセント及びワイルコーネル医科大学（Ｗｅｉｌｌ  Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ）治験審査委員会の承認を得て、ペンシルバニア大学幹細胞及び異種移植片コア施設（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｓｔｅｍ＆Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）から取得した。サンプルを解凍し、３７℃で１時間培養した後、以前記載されている通りに処理を施した（Ｈａｓｓａｎｅ，Ｄ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄｅ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＩ−３  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｍＴＯＲ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｂｌｏｏｄ  １１６，５９８３−５９９０（２０１０））。
【０１３３】
ＰＵ−ＦＩＴＣフローサイトメトリーアッセイによって決定されるエピシャペローム存在量。細胞を１μＭ  ＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣで処理した。処理から４時間後、細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ−０．５％ＦＢＳ）で２回洗浄した。生存細胞中のＰＵ−Ｈ７１−ＦＩＴＣ結合を測定するために、室温においてＦＡＣＳバッファー中の７−ＡＡＤで細胞を１０分間染色してから、ＢＤ−ＬＳＲ−ＩＩ又はＢＤ−Ｃａｎｔｏサイトメトリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。アネキシンＶ染色により細胞生存能を決定した。１μＭ  ＰＵＨ７１処理から４８時間後、アネキシンＶ  ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ−Ｖ４５０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びアネキシンＶバッファー中の７−ＡＡＤで細胞を染色した後、フローサイトメトリーに供して、アネキシンＶ／７ＡＡＤ二重ネガティブゲートにより決定される生存能を測定した。
【０１３４】
５．６．２  結果
本発明者らは、エクスビボで原発性腫瘍におけるエピシャペロームの機能的重要性を検証した（図５ａ〜５ｄ）。原発性乳房腫瘍（ｎ＝４）（図５ａ、図５ｂ）及び急性骨髄性白血病（ｎ＝４０）（図５ｃ、５ｄ）をＰＵ−Ｈ７１でエクスビボ処理したところ、本発明者らは、安定した多量体エピシャペローム形態を発現するものがＰＵ−Ｈ７１により最も効果的に殺傷されることを見出した。対照的に、また培養細胞での本発明者らの知見と同様に、タイプ２腫瘍は、ほとんど影響を受けないままであった。ＡＭＬサンプル中の乳房試料及び非悪性リンパ腫の場合、隣接する良性組織は、エピシャペロームをほとんど又は全く含有せず、従ってＰＵ−Ｈ７１に非感受性である（図５ａ及び５ｂ）。
【０１３５】
５．７．  実施例７：エピシャペロームに対する腫瘍の依存性
５．７．１  材料及び方法
フローサイトメトリーアッセイ：以前記載されている通りにＰＵ−ＦＩＴＣアッセイを実施した（Ｔａｌｄｏｎｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｕｒｉｎｅ−ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９０  ｗｉｔｈ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ２１，５３４７−５３５２（２０１１））。手短には、細胞を１μＭ  ＰＵ−ＦＩＴＣと一緒に３７℃で４時間インキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ／０．５％ＦＢＳ）で２回洗浄してから、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩを含有するＦＡＣＳバッファー中に再懸濁させた。処理済み生存ＡＭＬ細胞（ＤＡＰＩ−ｖｅ）中のＰＵ−ＦＩＴＣの平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーにより評価した。
【０１３６】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のフローサイトメトリー分析。ＮＣＴ０１３９３５０９臨床試験の通り、ＰＵ−Ｈ７１処理前及び処理後に末梢血をＥＤＴＡチューブ（１０ｍｌ）中に収集した。フィコール勾配分離によってバフィーコートを取得した。前述のように、ＰＵ−ＦＩＴＣ結合アッセイを実施した。手短には、２百万個の細胞を１μＭ  ＰＵ−ＦＩＴＣ又は対照と一緒に３７℃で６時間処理した。次に、細胞を洗浄（１×ＰＢＳ／５％ＦＢＳ）してから、氷上においてＥｐＣＡＭ−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１４−ＡＰＣ−Ｃｙ７及びＣＤ４５−ＡＰＣ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）で４５分間染色した。細胞を洗浄してから、４℃においてＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）で３０分間染色した。ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて少なくとも百万の事象を取得した。
【０１３７】
５．７．２  結果
本発明者らは、エピシャペローム複合体が豊富な腫瘍の出現率を評価した。本発明者らは、膵臓癌、胃癌、肺癌、乳癌、リンパ腫、及び白血病を含む９５の癌細胞株についてＰＵ−ＦＩＴＣを用いたフローサイトメトリーを実施し、約６０〜７０％が中〜高レベルのエピシャペローム複合体を呈示することを見出した、図６ａ。この試験を患者の腫瘍サンプルで反復すると、原発性液性腫瘍（ｎ＝４０）、及びリンパ腫などの固形腫瘍について類似の結果が得られた（図６ｂ及び６ｃ）。これは、腫瘍の過半数が、そのサブタイプ、起源、及び遺伝的背景とは無関係に、エピシャペロームを使用することを証明するものである。これは、腫瘍が異なるレベルのエピシャペローム、従ってエピシャペローム成分の阻害、すなわちＨＳＰ９０阻害剤などの薬剤の単剤投与に対して異なる感受性を発現することもさらに証明した。
【０１３８】
５．８  実施例８：エピシャペローム形成の誘導
５．８．１  材料及び方法
実施例１に記載した手順を用いて細胞を培養した。タンパク質毒性ストレッサー（例えば、パクリタキセル又はボルテゾミブ）を６時間かけて添加した後、細胞を溶解させた。ネイティブ条件下、ホモジネートを分離のためにゲル上に塗布した。
【０１３９】
洗い落し試験（図８ｄ）のために細胞を培養し、その後、パクリタキセル（図中、ＰＡＣと称される）で１〜２時間処理してインビボ条件を模倣した。次に、パクリタキセルを洗い落として、どの程度長くエピシャペロームがインビトロで維持されるかを決定した。
【０１４０】
５．８．２  結果
タンパク質毒性ストレッサーとして化学療法薬を用いる試験の結果を図８ａ、８ｂ、８ｅ、８ｆ及び１０に示す。結果については上のセクション４で論述した。図８ｄを参照すると、ＨＳＰ９０の生化学的プロフィールをネイティブ条件下で評価した。細胞をパクリタキセルで１時間前処置した後、薬剤を洗い落としてインビボ条件を模倣した。エピシャペロームレベル（標識上部＞二量体）は釣鐘状を描き、５〜７時間時点でピークが認められ、その後２４時間時点までに内在性レベルまで減少する。
【０１４１】
ホスファターゼ又はリン酸化阻害剤の作用を調べた結果をそれぞれ図９ａ及び９ｂに示す。これらの結果は、上のセクション４で論述した。
【０１４２】
５．９  実施例９：ドセタキセル／ＰＵ−Ｈ７１の組合せ（ＭｉａＣａ２膵臓癌細胞）
５．９．１  材料及び方法
表示される通りにビヒクル、ＰＵ−Ｈ７１及びドセタキセルの連続的組合せで処理したＭｉａＰａＣａ２膵臓癌細胞の生存能。Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂアッセイを用いて、７２時間時点での細胞生存能を測定した。
【０１４３】
５．９．２  結果
ＭｉａＰａＣａ２膵臓癌細胞を用いた試験の結果を図８ｃに示す。これらの結果は、上のセクション４で論述した。
【０１４４】
５．１０  実施例１０：インビボ動物試験
５．１０．１  材料及び方法
４〜６週齢のｎｕ／ｎｕ無胸腺雌マウスをＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから取得した。実験は、全てＭＳＫＣＣの動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認されたプロトコルに従って実施し、実験動物の適正且つ人道的使用のための委員会指針を遵守した。２２ゲージ針を用いて、Ｈ１９７５（３×１０６細胞）又はＭｉａ−Ｐａｃａ２（５×１０６細胞）をマウスの右脇腹に皮下移植し、増殖させた。全てのマウスは、処置中、その飼料中にドキシサイクリンを投与された。処置前に腫瘍を５０〜１５０ｍｍ３の体積に到達させた。マウスは、ランダムにビヒクル、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）、ＰＵ−Ｈ７１又は様々なＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）＋ＰＵ−Ｈ７１組合せにグループ分けした。投与前にＰＵ−Ｈ７１の溶液を１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ約６．４）中で調製した。予め調製したＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（５ｍｇ／ｍｌ）を使用した。Ｈ１９７５又はＭｉａＰａｃａ２腫瘍を担持するマウスに、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（３０ｍｇ／ｋｇ）及び／若しくはＰＵ−Ｈ７１（７５ｍｇ／ｋｇ）を単独で又は組み合わせて、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により投与した。ノギスを用いて週２回腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積をその（長さ×幅２）／２の積として計算した。処置に関連して見た目に明らかな毒性がないことを確実にするために週２回体重も測定した。
【０１４５】
５．１０．２  結果
異種移植ＭｉａＰａＣａ２（膵臓癌、ゲムシタビン耐性）又はＨ１９７５非小細胞肺癌（ｍｕｔ  ＥＧＦＲ、エルロチニブ耐性）腫瘍を担持するマウスを表示の薬剤単独で週１回スケジュールで処置するか、又はＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）とＰＵ−Ｈ７１を同時に混合して投与するか、若しくはＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）、その６時間後にＰＵ−Ｈ７１を順次投与した（腹腔内（ｉ．ｐ．）注射による単独での又は組み合わせたＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（３０ｍｇ／ｋｇ）及び／若しくはＰＵ−Ｈ７１（７５ｍｇ／ｋｇ）；ｎ＝５匹グループ）。腫瘍体積をモニターし、処置時間に対してグラフ化した。図１１では、上方のパネルは、各グループ中の５匹のマウスの平均値を示し、一方、下方のパネルは、モニターした個々のマウスについてのデータを示す。Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）の投与から６時間後にＰＵ−Ｈ７１で処置したマウスの腫瘍体積は、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）及びＰＵ−Ｈ７１の単剤療法及び同時投与と比較して実質的に減少した。図１２の写真は、処置レジメンの５週間時点で撮影され、各処置アームからの代表的マウスを示す。同時投与は、腫瘍の停滞退縮をもたらしたが、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）、次いでＰＵ−Ｈ７１の連続的投与は治癒を達成し、マウスには検出可能な腫瘍がないことが明らかである。図１３は、Ｈ１９７５肺癌モデルについての結果を示す。図１４は、ＨＣＣ−１８０６及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１トリプルネガティブ乳癌モデルの結果を示す。これらのモデルから得られた結果は、ＭｉａＰａＣａ２膵臓癌モデルで得られた結果と一致している。
【０１４６】
５．１１  実施例１１：Ｉｎｃｕｃｙｔｅ速度論的アッセイ
５．１１．１  材料及び方法
ＭＤＡ−ＭＤ−２３１及びＢＴ２０トリプルネガティブ乳癌細胞を組織培養処理皿に接種した。容器の表面積の約５０％まで密集したら、２μＭパクリタキセル、５μＭＰＵ−Ｈ７１、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、又は２μＭパクリタキセルと５μＭＰＵ−Ｈ７１との組合せ（同時若しくは順次）を含有する培地で細胞を処理した。標準的な細胞培養インキュベータ内に収容されたＥｓｓｅｎ  ＩｎｃｕＣｙｔｅ内で上記条件下において細胞を増殖させた。計３１６時間にわたって２時間毎に各条件につき９枚ずつ画像を収集した。前述の処理条件下で２４時間後、パクリタキセル処理細胞を５μＭＰＵ−Ｈ７１若しくは対照ビヒクル含有培地で処理し、ＰＵ−Ｈ７１処理細胞を２μＭパクリタキセル若しくは対照ビヒクル含有培地で処理し、ビヒクル、並びにＰＵ−Ｈ７１とパクリタキセルとの組合せで処理した細胞は、対照ビヒクル含有培地で処理した。初期処理を含む既存の培地に、全ての二次薬剤添加物を加えた。既存の培地をさらに対照ビヒクル含有培地で２倍超希釈し；各希釈は、その前の希釈の２４時間後に行った。培養して９６時間後、培地を各ウェルから吸引し、薬剤を含まない細胞に適した培地に取り換えた。前述したように、細胞を計３１６時間（すなわち、薬剤の完全な除去から２００時間）にわたってモニターした。
【０１４７】
５．１１．２  結果
インビトロ実験はインビボ治療パラダイムを再現することはできないが、この実験は、上のインビボでの実施例と同様に、パクリタキセル−ＨＳＰ９０阻害剤の連続的添加が、いずれかの薬剤を単独で又は両薬剤の組合せを同時に添加するよりも細胞傷害性が高いことを示す。ＢＴ２０トリプルネガティブ乳癌細胞は、中間レベルのエピシャペローム（前述の通り測定して）を有し、タキサンに対して感受性である。図１５からわかるように、細胞密集を記録する顕微鏡検査（ＩｎｃｕＣｙｔｅシステム）によってモニターすると、各薬剤は単独でこれらの細胞において細胞傷害作用を有する。約１３０時間の時点で、培地を取り換え、死滅細胞及び細胞残屑（浮遊細胞、細胞残屑は、洗浄により除去し、急激なシグナル降下によって示される）を除去した。１３０時間から約２３０時間までの間、計器は、各処理群に生存細胞が残っているかどうか、及びそれらが増殖する能力を有するかどうかを記録する。ＰＵ−Ｈ７１及びＰａｃ単独について見られるように少数の生存細胞が存在し、これらの細胞は、再増殖を開始する（曲線は上方に向かう）。ＰａｃとＰＵとの同時添加よりも、連続的Ｐａｃ→ＰＵを受けた群の方が生存細胞は少ない。２３０時間後［培地の交換後の第２の急激なシグナル降下］に収集したデータは、計器の感受性限界のために信頼性がない。
【０１４８】
５．１２  実施例１２：ドキシルビシン／ＰＵ−Ｈ７１の組合せ（リンパ腫）
５．１２．１  材料及び方法
ＢＪＡＢバーキットリンパ腫細胞を５００ｎＭ  ＰＵ−Ｈ７１の添加の２４時間前にＤＯＸの階段希釈物に曝露した。標準的ＭＴＳアッセイを用いて２４時間後に生存能を測定した。６回反復データ点を平均し、非処理（ＤＯＸ単独）又はＰＵ−Ｈ７１処理（ＤＯＸの後、ＰＵ−Ｈ７１）対照に対して正規化した。データは、平均±ＳＤとして示す。５００ｎＭ  ＰＵ−Ｈ７１をＤＯＸの後に連続して添加すると、ＤＯＸのＩＣ５０が４００ｎＭ（塗りつぶした丸）から７５ｎＭ（白い丸）にシフトすることに留意されたい（図１８ａ）。
【０１４９】
ペア毎の薬剤相互作用を、ＣｏｍｐｕＳｙｎを用いて６ずつの用量応答マトリックス分析で体系的に評価し、複数の薬物比率で２５の個別の組合せが得られた。Ｆａｒａｇｅ  ＤＬＢＣＬ細胞を次の組合せに曝露した：ＤＯＸ、その２４時間後にＰＵ−Ｈ７１を添加（茶色の丸、ＤＯＸ→ＰＵ−Ｈ７１）、ＰＵ−Ｈ７１、その２４時間後にＤＯＸを添加（青色の丸、ＰＵ−Ｈ７１→ＤＯＸ）、又は同時投与（黒い丸、ＤＯＸ＋ＰＵ−Ｈ７１）。薬物相互作用をＦａ−ＣＩプロットで評価したが、ここで、相加性、相乗性、及び拮抗性は、それぞれＣＩ＝１、ＣＩ＜１、及びＣＩ＞１として定義される。ＣｏｍｐｕＳｙｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて実験生存データから併用係数（ＣＩ）値を計算し、影響を受けた割合（Ｆａ、組合せによって殺傷された細胞の割合）の関数として示す。ＣｏｍｐｕＳｙｎを用いて、５％〜９５％（線）のＦａ値の範囲全体にわたってＣＩ値をシミュレートすることによってＦａ−ＣＩプロットを構築した（図１８ｂ）。
【０１５０】
ＳＵＤＨＬ４ＤＬＢＣＬ細胞を、表示される様々なスケジュールでＰＵ−Ｈ７１及びＤＯＸ又は組合せに曝露した。ＰＥ結合抗活性カスパーゼ−３抗体を用いたフローサイトメトリーにより、カスパーゼ−３活性化を測定した（図１８Ｃ）。細胞周期分析を並行して実施し、各散布図左上の差し込み図に示す。低二倍体集団の頻度を示す。
【０１５１】
５．１２．２  結果
リンパ腫細胞を用いた試験の結果を図１８に示す。これらの結果については上のセクション４で論述される。
【０１５２】
５．１３  実施例１３：Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）／ＰＵ−Ｈ７１の組合せ（肺、ＴＮＢＣ）
これらの実験は、長期投与での連続的（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）→６時間後ＰＵ−Ｈ７１）処置の効果及び安全性をさらに証明するものであり、処置停止後の腫瘍再発又は欠如を評価することを目的とする。Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）及びＰＵ−Ｈ７１の単独投与、同時投与、又はＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）後のＰＵ−Ｈ７１の連続的投与による６時間の時点での腫瘍成長（図１９ａ〜ｃ及び図２０ａ、ｂ）並びにマウス体重に対する影響（図１９ｄ及び図２０ｃ、ｄ）を分析した。異種移植ＮＣＩ−Ｈ１９７５肺癌、ＨＣＣ１８０６、トリプルネガティブ乳癌又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１、トリプルネガティブ乳癌腫瘍を担持するマウス（ｎ＝３〜５）に、ＰＵ−Ｈ７１（７５ｍｇ／ｋｇ）及びＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（３０ｍｇ／ｋｇ）を単独で又は組み合わせて週１回腹腔内投与した。試験中、有害な作用は観察されなかった。動物は、全て予定された終点まで生存し、投与時点から試験終了まで健康に見え、正常体重を維持し、挙動も正常であった。同時及び連続的併用療法のいずれも腫瘍成長を有意に抑制したが、同時Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）＋ＰＵ−Ｈ７１で処置した腫瘍は、全て治療中及び／又は治療停止後再発した。連続的（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）→６時間後ＰＵ−Ｈ７１）で処置した数匹のマウスは、処置停止から数ヵ月後腫瘍がないままであった（図２０ａ、ｂ）。例えば、５匹のＨＣＣ１８０６担持マウスのうちの３匹は、処置停止から１００日後も腫瘍がなく、５匹のＭＤＡ−ＭＢ−２３１マウスのうちの２匹は、処置停止から１２０日後も腫瘍がなかった。
【０１５３】
５．１４  実施例１４：Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）／ＰＵ−Ｈ７１の組合せ（膵臓）
これらの実験は、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）を静脈内投与する場合の連続的（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）→６時間後ＰＵ−Ｈ７１）処置の効果及び安全性をさらに証明する。これはまた、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）との連続的投与で週１回又は２回投与されるＰＵ−Ｈ７１の効果を比較するためにも設計される。異種移植ＭｉａＰａｃａ２膵臓癌腫瘍を担持するマウス（ｎ＝５）を以下に記載のようにＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）及びＰＵ−Ｈ７１で処置した。処置中、腫瘍体積及びマウスの体重をモニターし、４０日の処置期間にわたってそれぞれ図２１ａ及び図２１ｂにグラフ化した（また、図２２ｂ、ｃも参照されたい）。ＰＵ−Ｈ７１（７５ｍｐｋ）は、単独で又は組み合わせて週１回（１×ｗｋ）又は週２回（２×ｗｋ、月〜木）腹腔内注射により投与した。Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）は、表示の通り、単独で又は組み合わせて３０ｍｐｋで１×ｗｋ、静脈内若しくは腹腔内投与した。組み合わせる場合、ＰＵ−Ｈ７１及びＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）は、同時に又はＡｂ→６時間後ＰＵの連続的計画を用いて投与した。９匹のマウスにビヒクル対照を処置の第２１日に投与し、８匹のうちの５匹は、連続的（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（ｉｖ）→６時間後ＰＵ−Ｈ７１）に変更し、残る４匹は、ビヒクルで続行した。
【０１５４】
試験中、有害な作用は観察されなかった。動物は、全て予定された終点まで生存し、投与時点から試験終了まで健康に見え、正常体重を維持すると共に、挙動も正常であった。
【０１５５】
Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）と併用してＰＵ−Ｈ７１を週１回又は２回投与した場合、効果に差は認められなかった。
【０１５６】
連続的（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（ｉｖ）→６時間後ＰＵ−Ｈ７１）の１回用量を受けた大きい腫瘍（１３１９±５８３ｍｍ３）は、２日で８１７．９±５１５ｍｍ３に退縮し（３８％退縮）、２回目の用量の後は４５２．１±２３６ｍｍ３（６５％退縮）まで退縮し、処置の継続と共に縮小し続けた（図２２ａ）。
【０１５７】
実施例１５：Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）／ＰＵ−Ｈ７１の組合せ（ＴＮＢＣ）
これらの実験は、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）を静脈内投与する場合の連続的（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）→６時間後ＰＵ−Ｈ７１）処置の効果及び安全性をさらに証明する。これはまた、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）との連続的投与で週１回又は２回投与されるＰＵ−Ｈ７１の効果を比較するために設計される。異種移植ＨＣＣ１８０６トリプルネガティブ乳癌腫瘍を担持するマウス（ｎ＝５）を以下に記載のようにＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）及びＰＵ−Ｈ７１で処置した。処置中、腫瘍体積及びマウスの体重をモニターし、４０日の処置期間にわたってそれぞれ図２３ａ及び図２３ｂにグラフ化した。ＰＵＨ７１（７５ｍｐｋ）は、単独で又は組み合わせて週１回（１×ｗｋ）又は週２回（２×ｗｋ、月〜木）腹腔内注射により投与した。Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）は、表示の通り、単独で又は組み合わせて３０ｍｐｋで１×ｗｋ、静脈内投与した。組み合わせる場合、ＰＵ−Ｈ７１及びＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）は、同時に又はＡｂ→６時間後ＰＵの連続的計画を用いて投与した。５匹のマウスにはビヒクル対照を投与した。
【０１５８】
試験中、有害な作用は観察されなかった。動物は、全て予定された終点まで生存し、投与時点から試験終了まで健康に見え、正常体重を維持すると共に、挙動も正常であった。
【０１５９】
Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）と併用してＰＵ−Ｈ７１を週１回又は２回投与した場合、効果に差は認められなかった。
【０１６０】
実施形態
本発明のいくつかの実施形態を、以下の番号付けパラグラフに列挙される下記実施例により例示する：
１．タンパク質毒性ストレッサーによる前処置後、ＨＳＰ９０の阻害剤を癌患者に投与することによって癌を治療する方法であって、タンパク質毒性ストレッサーが、エピシャペロームの形成を増大するためにＨＳＰ９０阻害剤の投与前の十分な時点で投与される、方法。
２．癌を治療する方法であって、ＨＳＰ９０の阻害剤を癌患者に投与するステップを含み、患者が、エピシャペロームの形成を増大するためにＨＳＰ９０阻害剤の投与前の十分な時点でタンパク質毒性ストレッサーを受けている、方法。
３．癌を治療する方法であって、Ｈｓｐ９０の阻害剤を受けている癌患者に、エピシャペロームの形成を増大するためにＨＳＰ９０阻害剤の投与前の十分な時点でタンパク質毒性ストレッサーを投与するステップを含む方法。
４．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも１時間後に投与される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
５．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも２時間後に投与される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
６．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも３時間後に投与される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
７．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも４時間後に投与される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
８．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも６時間後に投与される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
９．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも７時間後に投与される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
１０．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも８時間後に投与される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
１１．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも１０時間後に投与される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
１２．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも１２時間後に投与される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
１３．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから約２時間〜約４時間後に投与される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
１４．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから約３時間〜約５時間後に投与される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
１５．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから約５時間〜約７時間後に投与される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
１６．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから約４時間〜約８時間後に投与される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
１７．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから約４時間〜約１２時間後に投与される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
１８．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから約６時間〜約１２時間後に投与される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
１９．タンパク質毒性ストレッサーが化学療法薬である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
２０．化学療法薬が微小管安定剤である、実施形態１９に記載の方法。
２１．微小管安定剤がドセタキセル、パクリタキセル、カバジタキセル、イキサベピロン、ビンクリスチン、ラウリマリド、ジスコデルモリド及びエポチロンから選択される、実施形態２０に記載の方法。
２２．化学療法薬がパクリタキセルである、実施形態２１に記載の方法。
２３．パクリタキセルがＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）として製剤化される、実施形態２１に記載の方法。
２４．パクリタキセルがＴａｘｏｌ（登録商標）として製剤化される、実施形態２２に記載の方法。
２５．化学療法薬がプロテアソーム阻害剤である、実施形態２０に記載の方法。
２６．プロテアソーム阻害剤がボルテゾミブ、カルフィルゾミブ及びＣＥＰ−１８７７０（デランゾミブ）から選択される、実施形態２５に記載の方法。
２７．ＨＳＰ９０阻害剤の前に投与される化学療法薬が、ペメトレキセド、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ドキソルビシン、レナリドミド、アピオシリブ、ＰＤ４０７８２４及びＭＫ１７７５から選択される化学療法薬である、実施形態２０に記載の方法。
２８．タンパク質毒性ストレッサーが放射線である、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
２９．タンパク質毒性ストレッサーが、温熱療法を誘導する薬剤である、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
３０．ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータによる前処置後にＨＳＰ９０の阻害剤を癌患者に投与することによって癌を治療する方法。
３１．ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータが、エピシャペローム複合体の形成を増大するためにＨＳＰ９０阻害剤の投与前の十分な時点で投与される、実施形態３０に記載の方法。
３２．ＨＳＰ９０阻害剤が、ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータの投与から少なくとも１時間後に投与される、実施形態３１に記載の方法。
３３．ＨＳＰ９０阻害剤が、ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータの投与から少なくとも２時間後に投与される、実施形態３１に記載の方法。
３４．ＨＳＰ９０阻害剤が、ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータの投与から少なくとも３時間後に投与される、実施形態３１に記載の方法。
３５．ＨＳＰ９０阻害剤が、ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータの投与から少なくとも４時間後に投与される、実施形態３１に記載の方法。
３６．ＨＳＰ９０阻害剤が、ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータの投与から少なくとも６時間後に投与される、実施形態３１に記載の方法。
３７．ＨＳＰ９０阻害剤が、ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータの投与から少なくとも７時間後に投与される、実施形態３１に記載の方法。
３８．ＨＳＰ９０阻害剤が、ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータの投与から少なくとも８時間後に投与される、実施形態３１に記載の方法。
３９．ＨＳＰ９０阻害剤が、ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータの投与から少なくとも１０時間後に投与される、実施形態３１に記載の方法。
４０．ＨＳＰ９０阻害剤が、ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータの投与から少なくとも１２時間後に投与される、実施形態３１に記載の方法。
４１．ＨＳＰ９０阻害剤が、ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータの投与から約２〜４時間後に投与される、実施形態３１に記載の方法。
４２．ＨＳＰ９０阻害剤が、ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータの投与から約３〜５時間後に投与される、実施形態３１に記載の方法。
４３．ＨＳＰ９０阻害剤が、ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータの投与から約５〜７時間後に投与される、実施形態３１に記載の方法。
４４．ＨＳＰ９０阻害剤が、ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータの投与から約４〜８時間後に投与される、実施形態３１に記載の方法。
４５．ＨＳＰ９０阻害剤が、ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータの投与から約４〜１２時間後に投与される、実施形態３１に記載の方法。
４６．ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータがホスファターゼである、実施形態３１〜４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータがキナーゼ阻害剤である、実施形態３１〜４５のいずれか１つに記載の方法。
４８．キナーゼ阻害剤がＰＤ４０７８２４である、実施形態４７に記載の方法。
４９．ＨＳＰ９０阻害剤が８−（６−ヨード−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルスルファニル）−９−（３−イソプロピルアミノ−プロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン（ＰＵ−Ｈ７１）又はその薬学的に許容される塩である、実施形態１〜４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．ＰＵ−Ｈ７１の塩がＨＣｌ塩である、実施形態４９に記載の方法。
５１．ＰＵ−Ｈ７１が、週１回、週２回、週３回、週４回又は週５回から選択される投与スケジュールに従って約５ｍｇ／ｍ２〜３５０ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される、実施形態４９又は５０に記載の方法。
５２．ＰＵ−Ｈ７１が、週１回、週２回、週３回、週４回又は週５回から選択される投与スケジュールに従って約２００ｍｇ／ｍ２〜３００ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される、実施形態４９又は実施形態５０に記載の方法。
５３．ＰＵ−Ｈ７１が２５０ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される、実施形態４９又は実施形態５０に記載の方法。
５４．ＰＵ−Ｈ７１が週１回、２週に１回、３週に１回、又は４週に１回投与される、実施形態４９又は実施形態５０に記載の方法。
５５．ＨＳＰ９０阻害剤がＳＮＸ−５４２２、ＳＮＸ−２１１２、ＡＴ１３３８７、ＫＷ−２４７８又はＳＴＡ−９０９０である、実施形態１〜４８のいずれか１つに記載の方法。
５６．ＨＳＰ９０阻害剤が、図１６又は図１７に示される化合物である、実施形態１〜４８のいずれか１つに記載の方法。
５７．ＨＳＰ９０阻害剤がＧＲＰ９４を選択的に阻害する、実施形態１〜５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．ＨＳＰ７０阻害剤を投与するステップをさらに含む、実施形態１〜５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．ＨＳＰ７０阻害剤がタンパク質毒性ストレッサーの後に投与される、実施形態５８に記載の方法。
６０．ＨＳＰ７０阻害剤がＨＳＰ９０阻害剤の投与と同時に又はその前に投与される、実施形態５９に記載の方法。
６１．癌が、乳癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌を含む肺癌、子宮頸癌、結腸癌、絨毛癌、膀胱癌、子宮頸癌、基底細胞癌、絨毛癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭部及び頚部癌、急性リンパ性癌（ＡＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む骨髄性白血病、多発性骨髄腫、Ｔ細胞白血病リンパ腫、肝臓癌、ホジキン病、リンパ性リンパ腫、神経芽細胞腫、濾胞性リンパ腫及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、黒色腫などの皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、腎臓癌、骨髄増殖性疾患、胃腸間質性腫瘍、食道癌、胃癌、膀胱癌、肛門癌を含む消化管癌、神経膠腫を含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫から選択される、実施形態１〜６０のいずれか１つに記載の方法。
６２．７〜３１日のサイクルにわたってタンパク質毒性ストレッサーとＨＳＰ９０阻害剤との組合せを投与することによって癌を治療する方法であって、タンパク質毒性ストレッサー及びＨＳＰ９０阻害剤が、前記サイクルにわたって少なくとも１回投与され、前記タンパク質毒性ストレッサーの各投与後に前記ＨＳＰ９０阻害剤が投与される、方法。
６３．治療サイクルが７日である、実施形態６２に記載の方法。
６４．タンパク質毒性ストレッサー及びＨＳＰ９０阻害剤が治療サイクルの第１日にのみ投与される、実施形態６３に記載の方法。
６５．治療サイクルが２１日である、実施形態６２に記載の方法。
６６．タンパク質毒性ストレッサー及びＨＳＰ９０阻害剤が治療サイクルの第１日にのみ投与される、実施形態６５に記載の方法。
６７．タンパク質毒性ストレッサー及びＨＳＰ９０阻害剤が治療サイクルの第１、８、及び１５日にのみ投与される、実施形態６５に記載の方法。
６８．治療サイクルが２８日である、実施形態６２に記載の方法。
６９．タンパク質毒性ストレッサー及びＨＳＰ９０阻害剤が治療サイクルの第１、８、及び１５日にのみ投与される、実施形態６８に記載の方法。
７０．タンパク質毒性ストレッサー及びＨＳＰ９０阻害剤が治療サイクルの第１、８、１５、及び２１日にのみ投与される、実施形態６８に記載の方法。
７１．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも１時間後に投与される、実施形態６２〜７０のいずれか１つに記載の方法。
７２．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも２時間後に投与される、実施形態６２〜７０に記載の方法。
７３．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも３時間後に投与される、実施形態６２〜７０のいずれか１つに記載の方法。
７４．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも４時間後に投与される、実施形態６２〜７０のいずれか１つに記載の方法。
７５．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも６時間後に投与される、実施形態６２〜７０のいずれか１つに記載の方法。
７６．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも７時間後に投与される、実施形態６２〜７０のいずれか１つに記載の方法。
７７．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも８時間後に投与される、実施形態６２〜７０のいずれか１つに記載の方法。
７８．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも１０時間後に投与される、実施形態６２〜７０のいずれか１つに記載の方法。
７９．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも１２時間後に投与される、実施形態６２〜７０のいずれか１つに記載の方法。
８０．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから約２時間〜約４時間後に投与される、実施形態６２〜７０のいずれか１つに記載の方法。
８１．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから約３時間〜約５時間後に投与される、実施形態６２〜７０のいずれか１つに記載の方法。
８２．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから約５時間〜約７時間後に投与される、実施形態６２〜７０のいずれか１つに記載の方法。
８３．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから約４時間〜約８時間後に投与される、実施形態６２〜７０のいずれか１つに記載の方法。
８４．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから約４時間〜約１２時間後に投与される、実施形態６２〜７０のいずれか１つに記載の方法。
８５．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから約６時間〜約１２時間後に投与される、実施形態６２〜７０のいずれか１つに記載の方法。
８６．タンパク質毒性ストレッサーが化学療法薬である、実施形態６２〜８５のいずれか１つに記載の方法。
８７．化学療法薬が微小管安定剤である、実施形態８６に記載の方法。
８８．微小管安定剤がドセタキセル、パクリタキセル、カバジタキセル、イキサベピロン、ビンクリスチン、ラウリマリド、ジスコデルモリド、及びエポチロンから選択される、実施形態８７に記載の方法。
８９．化学療法薬がパクリタキセルである、実施形態８８に記載の方法。
９０．パクリタキセルがＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）として製剤化される、実施形態８９に記載の方法。
９１．パクリタキセルがＴａｘｏｌ（登録商標）として製剤化される、実施形態８９に記載の方法。
９２．化学療法薬がプロテアソーム阻害剤である、実施形態８６に記載の方法。
９３．プロテアソーム阻害剤がボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、及びＣＥＰ−１８７７０（デランゾミブ）から選択される、実施形態９２に記載の方法。
９４．ＨＳＰ９０阻害剤の前に投与される化学療法薬が、ペメトレキセド、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ドキソルビシン、レナリドミド、アピオシリブ、ＰＤ４０７８２４及びＭＫ１７７５から選択される化学療法薬である、実施形態８６に記載の方法。
９５．タンパク質毒性ストレッサーが放射線である、実施形態６２〜８５のいずれか１つに記載の方法。
９６．タンパク質毒性ストレッサーが、温熱療法を誘導する薬剤である、実施形態６２〜８５のいずれか１つに記載の方法。
９７．ＨＳＰ９０阻害剤が８−（６−ヨード−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルスルファニル）−９−（３−イソプロピルアミノ−プロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン（ＰＵ−Ｈ７１）又はその薬学的に許容される塩である、実施形態６２〜９６のいずれか１つに記載の方法。
９８．ＰＵ−Ｈ７１の塩がＨＣｌ塩である、実施形態９７に記載の方法。
９９．ＰＵ−Ｈ７１が、週１回、週２回、週３回、週４回又は週５回から選択される投与スケジュールに従って約５ｍｇ／ｍ２〜３５０ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される、実施形態９７又は実施形態９８に記載の方法。
１００．ＰＵ−Ｈ７１が、週１回、週２回、週３回、週４回又は週５回から選択される投与スケジュールに従って約２００ｍｇ／ｍ２〜３００ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に静脈内投与される、実施形態９７又は実施形態９８に記載の方法。
１０１．ＰＵ−Ｈ７１が２５０ｍｇ／ｍ２の用量でヒト患者に週２回静脈内投与される、実施形態９７又は実施形態９８に記載の方法。
１０２．ＰＵ−Ｈ７１が週１回、２週に１回、３週に１回、又は４週に１回投与される、実施形態９７又は実施形態９８に記載の方法。
１０３．ＨＳＰ７０阻害剤を投与するステップをさらに含む、実施形態６２〜１０１のいずれか１つに記載の方法。
１０４．ＨＳＰ７０阻害剤がタンパク質毒性ストレッサーの後に投与される、実施形態１０３に記載の方法。
１０５．ＨＳＰ７０阻害剤がＨＳＰ９０阻害剤の投与と同時に又はその前に投与される、実施形態１０４に記載の方法。
１０６．癌が、乳癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌を含む肺癌、子宮頸癌、結腸癌、絨毛癌、膀胱癌、子宮頸癌、基底細胞癌、絨毛癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭部及び頚部癌、急性リンパ性癌（ＡＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む骨髄性白血病、多発性骨髄腫、Ｔ細胞白血病リンパ腫、肝臓癌、ホジキン病、リンパ性リンパ腫、神経芽細胞腫、濾胞性リンパ腫及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、黒色腫などの皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、腎臓癌、骨髄増殖性疾患、胃腸間質性腫瘍、食道癌、胃癌、膀胱癌、肛門癌を含む消化管癌、神経膠腫を含む脳腫瘍、濾胞性リンパ腫及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むリンパ腫から選択される、実施形態６２〜１０５のいずれか１つに記載の方法。
１０７．癌を治療する方法であって、
癌患者からのサンプル中におけるエピシャペロームの存在を検出するステップ、
癌患者にＨＳＰ９０の阻害剤を投与するステップ
を含む方法。
１０８．エピシャペロームがタンパク質毒性ストレッサーによる癌患者の前処置後に検出される、実施形態１０７に記載の方法。
１０９．エピシャペロームが、ネイティブ多量体タンパク質複合体の等電点電気泳動と、その後の１つ又は複数の抗体による固定化複合体のプロービングとによって検出される、実施形態１０７の方法。
１１０．１つ又は複数の抗体がＨＳＰ９０抗体を含む、実施形態１０９に記載の方法。
１１１．癌がＲｂ陰性である、実施形態１〜１０５のいずれか１つに記載の方法。
１１２．癌がＲｂ陽性である、実施形態１〜１０５のいずれか１つに記載の方法。
１１３．癌がトリプルネガティブ乳癌である、実施形態６１又は１０６に記載の方法。
１１４．癌が肺癌である、実施形態６１又は１０６に記載の方法。
１１５．癌が膵臓癌である、実施形態６１又は１０６に記載の方法。
１１６．癌が網膜芽細胞腫、骨肉腫、又は小細胞肺癌ではない、実施形態１〜６０又は６２〜１０５のいずれか１つに記載の方法。
１１７．癌がＲｂ陽性であり、且つ／又はＨＥＲ２を過剰発現する乳癌ではない、実施形態１〜６０又は６２〜１０５のいずれか１つに記載の方法。
１１８．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも１８時間後に投与される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
１１９．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも２４時間後に投与される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
１２０．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも３６時間後に投与される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
１２１．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも４８時間後に投与される、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
１２２．ＨＳＰ９０阻害剤が、ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータの投与から少なくとも１８時間後に投与される、実施形態３１に記載の方法。
１２３．ＨＳＰ９０阻害剤が、ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータの投与から少なくとも２４時間後に投与される、実施形態３１に記載の方法。
１２４．ＨＳＰ９０阻害剤が、ＨＳＰ９０の翻訳後修飾（ＰＴＭ）状態のモジュレータの投与から少なくとも４８時間後に投与される、実施形態３１に記載の方法。
１２５．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから１８時間後に投与される、実施形態６２〜７０のいずれか１つに記載の方法。
１２６．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも２４時間後に投与される、実施形態６２〜７０のいずれか１つに記載の方法。
１２７．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも３６時間後に投与される、実施形態６２〜７０のいずれか１つに記載の方法。
１２８．ＨＳＰ９０阻害剤が、腫瘍細胞にタンパク質毒性ストレスを誘導する薬剤を投与してから少なくとも４８時間後に投与される、実施形態６２〜７０のいずれか１つに記載の方法。
１２９．治療が癌の部分的又は完全な寛解をもたらす、実施形態１〜１２８のいずれか１つに記載の方法。
１３０．治療が癌の完全な寛解をもたらす、実施形態１２９に記載の方法。
１３１．治療が癌のあらゆる徴候及び症状を消失させる、実施形態１〜１２８のいずれか１つに記載の方法。
１３２．癌の再発が治療後に観察されない、実施形態１〜１２８のいずれか１つに記載の方法。
１３３．治療が、単なる腫瘍の停滞又は退縮を超える実質的に改善された結果をもたらすことを特徴とする、実施形態１〜１２８のいずれか１つに記載の方法。
１３４．治療が癌の治癒をもたらす、実施形態１〜１２８のいずれか１つに記載の方法。
１３５．治療後に検出可能な腫瘍が存在しない、実施形態１〜１２８のいずれか１つに記載の方法。
１３６．ＨＳＰ９０の阻害剤がＨＳＰ９０の発癌形態と直接且つ優先的に結合する、実施形態１〜１３５のいずれか１つに記載の方法。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１６−６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１７−５】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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2018537519.tif 000075
2018537519.tif 000076
2018537519.tif 000077
2018537519.tif 000078
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