(57)【要約】  表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサシステムの機器依存パラメータを決定する方法は、ａ）既知の分子量、既知の拡散定数、既知の屈折率増分および既知の濃度を有する、較正ステップで使用するための検体を特定するステップ（Ｓ１）；ｂ）ステップａ）で特定された検体および検体が結合することができるチップを使用する既知の方法に従って、好ましくは較正不要濃度分析に従って、ＳＰＲバイオセンサシステムを使用して検体の活性濃度を測定するステップ（Ｓ３）であって、前記既知の方法は、それぞれの特定の機器、チップおよびフローセルの組合せに適合しない機器依存定数の使用を含む、ステップ（Ｓ３）；ｃ）検体の既知の濃度をステップｂ）で取得した活性濃度と比較するステップ（Ｓ５）；およびｄ）ステップｃ）での比較の結果に従って、活性濃度を測定するための既知の方法で使用される機器依存定数を調整するステップ（Ｓ７）を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサシステムの機器依存パラメータを決定する方法であって、
ａ）既知の分子量、既知の拡散定数、既知の屈折率増分および既知の濃度を有する、較正ステップで使用するための適切な検体を特定するステップ（Ｓ１）；
ｂ）前記特定された検体および前記検体が結合することができるチップを使用する既知の方法に従って、前記ＳＰＲバイオセンサシステムを使用して活性濃度を測定するステップ（Ｓ３）であって、前記既知の方法は、それぞれの特定の機器、チップおよびフローセルの組合せに適合しない機器依存定数の使用を含む、ステップ（Ｓ３）；
ｃ）前記検体の前記既知の濃度をステップｂ）で測定した前記活性濃度と比較するステップ（Ｓ５）；および
ｄ）ステップｃ）で取得した差異に従って、活性濃度を測定するための前記既知の方法で使用される前記機器依存定数を調整するステップ（Ｓ７）を含む、方法。
【請求項２】
ステップｄ）で取得した前記調整された機器依存定数から応答を質量単位に変換する定数を計算するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｄ）で取得した前記調整された機器依存定数からフローセル、チップ、および他の機器接続量に接続された他の定数を計算するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
有用な検体を特定するステップがまた、前記検体が前記結合パートナーに対して既知の親和性および既知の速度定数を有する必要があることも含む、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１および２において実行される計算に使用される計算アルゴリズムにおいて物質移動定数が使用される、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップｂ）が、較正不要濃度分析と呼ばれる方法によって活性濃度を測定することを含む、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項２で計算された前記定数が、Ｇと呼ばれる定数およびフォームファクタと呼ばれる定数であり、両者が前記較正不要濃度分析に必要な移動係数を計算する際に使用される、請求項２および６に記載の方法。
【請求項８】
ＳＰＲバイオセンサにおける表面結合相互作用をモニタする方法であって、
−請求項１乃至７のいずれか一項に記載の、現在使用されている特定の機器、チップおよびフローセルの組合せの機器依存パラメータを決定するステップ；
−ＳＰＲ関連の応答を決定するために請求項１のステップｄ）で取得したこの新たな機器依存定数を使用するステップを含む、方法。
【請求項９】
請求項１のステップｄ）で取得した前記新たな機器依存定数が、前記検体の濃度を決定するために使用される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１のステップｄ）で取得した前記新たな機器依存定数が、異なるシステムおよびチップからの信号を均一化するために使用される、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサシステムの機器依存パラメータを決定する方法、およびＳＰＲバイオセンサにおける表面結合相互作用をモニタする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リアルタイムで分子相互作用をモニタすることができる分析センサシステム（すなわち、ラベルフリーシステム）は、ますます関心を集めている。これらのシステムは、光学バイオセンサに基づく場合が多く、通常、相互作用分析センサまたは生体特異的相互作用分析センサと呼ばれる。代表的なバイオセンサシステムは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって販売されているＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）計測装置であり、これは、試料中の分子と検知表面に固定化した分子構造との間の相互作用を検出するために表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用する。Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムによって、標識化の使用なしに試料中の特定の分子の存在および濃度だけでなく、さらなる相互作用パラメータ、たとえば、分子相互作用の会合速度定数および解離速度定数などもリアルタイムで測定することが可能である。装置および理論的背景は、文献（たとえば、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７（１９９１）参照）に十分に記載されている。通常、この技術は、センサチップ（フローセル）の特殊な光学センサ表面へのリガンドの固定化、目的の検体を含む試料の流れをセンサチップに接触させること、および次にリガンドと検体との結合から発生する、センサチップの表面光学特性の変化を測定することを含む。ＳＰＲのさらなる詳細については、米国特許第５，３１３，２６４号明細書、米国特許第５，５７３，９５６号明細書、および米国特許第５，６４１，６４０号明細書も参照されたい。
【０００３】
較正不要濃度分析（ＣＦＣＡ）は、試験の実行時に評価変数としてもたらされる測定された物質移動特性ならびに拡散係数および分子量についての値から、検体濃度を計算する。評価は、物質移動成分を含む相互作用のカイネティクスのモデルへのセンサグラムデータのフィッティングに基づく。物質移動パラメータは、与えられた拡散係数、フローセル特性、および分子量から計算される。全体的にフィッティングされた変数として設定された検体濃度で、検体の未知の濃度を決定することができる。
【０００４】
ＳＰＲに基づくバイオセンサシステムによって実行されるＣＦＣＡを含む測定は、使用されるチップ、フローセル特性および他の機器特性に依存するシステム依存定数を使用し、測定された応答単位を質量単位に変換することを可能にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１９７５００号
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサシステムにおいて実行される測定の測定精度を改善することである。
【０００７】
これは、請求項１に記載の方法で達成される。これにより、使用される定数の機器に依存する部分は、それぞれの特定の機器、フローシステムおよびセンサ表面に対して調整され、より正確な測定が達成され得る。
【０００８】
異なる実施形態は、従属請求項に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の一実施形態の方法ステップを示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
較正不要濃度分析（ＣＦＣＡ）は、ＳＰＲに基づくバイオセンサシステムの使用によって、活性濃度、すなわちセンサ表面に付着した標的に結合することができる分子の濃度を測定する方法として説明することができる。
【００１１】
タンパク質の活性濃度は、タンパク質とその結合パートナーとの相互作用によって定義され、一部の分子が結合できない場合、総タンパク質濃度が異なる可能性がある。タンパク質がいくつかの異なる結合部位を有する場合、各結合部位について活性濃度を確立することができる。現在のＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）評価ソフトウェアでは、活性濃度は較正不要濃度分析（ＣＦＣＡ）と呼ばれる。
【００１２】
典型的な実験では、相互作用パートナー（リガンド）をセンサ表面に付着させ、濃度が測定される目的の分子（検体）が明確なフローセル内で一定の層流で送達される。この手法では、固定化されたリガンドに結合することができる検体画分の濃度のみが測定される。リガンドと検体との結合は、（ｉ）検体のバルクから表面への拡散、および（ｉｉ）検体−リガンド結合からなる２ステッププロセスである。拡散速度が分子間の結合速度よりもはるかに遅い場合、次に錯体形成速度は移動速度によって制限され、逆の場合、観察された錯体形成の初期速度は、固有の反応速度に対応する。
【００１３】
物質移動係数ｋｍは、方程式１に記載されるように、センサ表面に対する高さｈのフローセル内の拡散係数Ｄを有する分子のフラックスを説明する：
【００１４】
【数１】
2018532127.tif 000003
実用的なＳＰＲ検出システムでは、有効長さはフローセル長さと異なり、ｋｍは次のように定義される：
【００１５】
【数２】
2018532127.tif 000004
式中、αは、フローセル入口から検出領域の中心までの距離であり、βは、検出領域長さである。
【００１６】
濃度の計算に必要な検体の拡散係数は、実験的に、または利用可能であれば、Ｈｙｄｒｏｐｒｏプログラムを使用した三次元構造から得ることができる。ストークスの式およびアインシュタイン−サザーランドの式に基づく実験式（方程式３）を使用してＤを評価することもできるが、相対摩擦比、検体のｆ／ｆ０、および溶媒の粘度ηを知る必要がある。  典型的な水性緩衝剤については、水の粘度を仮定することができる。
【００１７】
【数３】
2018532127.tif 000005
η０は、２０°Ｃでの溶媒の粘度である。
【００１８】
移動係数をＳＰＲバイオセンサシステム（この例では、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））応答に関連させ、実際の流速の特定の入力を可能にするために、移動係数としてｔｃを導入する。
【００１９】
ｔｃ＝フォームファクタ×ｆ（１／３）×Ｇ×ＭＷ×ｋｍ  （４）
Ｇを表すことにより、表面濃度がＲＵ単位でｇ／ｍ２、１ＲＵが１０−６ｇ／ｍ２であり、フォームファクタを０．８１に設定することにより、ｋｍとの関係が確立され、
ｔｃ＝０．８１×１０９×ｆ（１／３）×ＭＷ×ｋｍ  （５）
である。
【００２０】
Ｇは、最初に１００ｎｍのデキストラン層を仮定して計算した。しかし、デキストラン層の伸長は、固定化レベルによって変化し、チップの種類によって異なる。したがって、Ｇファクタの計算においてある程度の不確実性が存在し、ユーザはそれを変更するためにある程度の柔軟性が必要となる可能性がある。フォームファクタは、柔軟性を可能にし、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）評価ソフトウェアで使用される現在の値の０．８１は、実験的に決定されている。
【００２１】
物質移動限界（ＭＴＬ）の程度は、フローセル寸法、流速、表面上の遊離結合部位の密度、相互作用の速度定数、および拡散係数を含むいくつかのパラメータの組合せに依存する。所与の検体−リガンド対およびフローセルの場合、ＭＴＬは、高濃度の遊離の非占有リガンドによって促進され、これは高い固定化レベルおよび低い応答レベルで起こると予想される。さらに、これらの条件下では、１：１の相互作用スキーム（結合）から逸脱する錯体の効果は、無視することができる。
【００２２】
ＭＴＬの程度は、移動限界（方程式６）および速度（方程式７）条件下で観察された初期結合速度から推定することができる：
ｄＲ／ｄｔ＝ｔｃ×Ｃ  （６）、および
ｄＲ／ｄｔ＝ｋａ×Ｃ×Ｒｍａｘ  （７）
移動限界の程度は、以下から推定することができる：
【００２３】
【数４】
2018532127.tif 000006
移動限界ケースの場合、ｋａ×Ｒｍａｘ＞＞ｔｃであり、ＭＴＬは、１に近づく
速度ケースの場合、ｋａ×Ｒｍａｘ＜＜ｋｔであり、ＭＴＬは、０に近づく
これらの関係は、特定の相互作用についてのＣＦＣＡの可能性を推定するために使用することができるが、相互作用の会合速度定数を知る必要があり、常にそうであるとは限らないため実用的でもない。
【００２４】
本発明によれば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサシステムの機器依存パラメータを決定する方法が提供される。図１は、本発明の一実施形態の方法ステップを示すフローチャートである。方法は、以下のステップを含む：
Ｓ１：較正ステップで使用するための適切な検体を特定するステップ。前記検体は、既知の分子量、既知の拡散定数、既知の屈折率増分および既知の濃度を有する必要がある。前記検体はまた、バイオセンサシステムで使用されるチップに結合する必要がある。検体は、チップ自体に、またはチップに付着するリガンドである結合パートナーに結合することができる。
【００２５】
Ｓ３：特定された検体およびチップを使用する既知の方法に従って、ＳＰＲバイオセンサシステムを使用して活性濃度を測定するステップ。前記既知の方法は、それぞれの特定の機器、チップおよびフローセルの組合せに適合しない機器依存定数の使用を含む。
【００２６】
Ｓ５：検体の既知の濃度をステップＳ３で測定した活性濃度と比較するステップ。
【００２７】
Ｓ７：ステップＳ５で取得した差異に従って、活性濃度を測定するための既知の方法で使用される機器依存定数を調整するステップ。
【００２８】
本発明の一実施形態では、方法は、ステップＳ７で取得した調整された機器依存定数から応答を質量単位に変換する定数を計算するステップをさらに含む。
【００２９】
本発明の一実施形態では、方法は、ステップＳ７で取得した調整された機器依存定数からフローセル、チップ、および他の機器接続量に接続された他の定数を計算するステップをさらに含む。
【００３０】
本発明の一実施形態では、適切な検体を特定するステップはまた、検体が結合パートナーに対して既知の親和性および既知の速度定数を有する必要があることも含む。さらに、本発明の一実施形態では、上述の計算に使用される計算アルゴリズムにおいて物質移動定数が使用される。
【００３１】
本発明の一実施形態では、ステップＳ３は、較正不要濃度分析（ＣＦＣＡ）と呼ばれる方法によって活性濃度を測定することを含む。さらに、本発明の一実施形態では、応答を質量単位に変換するために計算される定数は、Ｇと呼ばれる定数およびフォームファクタと呼ばれる定数であり、両者は較正不要濃度分析に必要な移動係数を計算する際に使用される。
【００３２】
さらに、本発明によれば、ＳＰＲバイオセンサにおける表面結合相互作用をモニタする方法が提供される。前記方法は、以下のステップを含む：
−上述のステップＳ１〜Ｓ７に従って、現在使用されている特定の機器、チップおよびフローセルの組合せの機器依存パラメータを決定するステップ；
−ＳＰＲ関連の応答を決定するためにステップＳ７で取得したこの新たな機器依存定数を使用するステップ。
【００３３】
本発明の一実施形態では、ステップＳ７で取得した新たな機器依存定数は、検体の濃度を決定するために使用される。
【００３４】
ステップＳ７で取得した新たな機器／システム／チップ／−依存定数は、異なるシステムから取得した信号を均一化すること等、他の目的にも使用することができる。
【００３５】
較正不要濃度分析を使用して、標準品を用いずに濃度を決定する。方法は、フローセル内およびセンサ表面上に存在する物質移動限界の条件で機能する。
【００３６】
フローセル内およびセンサ表面上の事象は、以下のように記述することができる：
高分子粒子、たとえば、バルク中のタンパク質（Ａｂｕｌｋ）とチップ表面上の分子（Ｂ）との結合は、２ステッププロセスである。第１のステップでは、バルクからのタンパク質が物質移動係数ｋｍで表面（Ａｓｕｒｆ）に移動され、第２のステップでは、ＡｓｕｒｆとＢとの結合が会合定数ｋａおよび解離定数ｋｄで起こり、錯体ＡＢが形成される。
【００３７】
センサ表面へのＡｂｕｌｋの移動がＡｓｕｒｆのＢへの結合よりも遅い場合、次に物質移動限界が生じ、活性濃度を測定することができる。
【００３８】
【数５】
2018532127.tif 000007
実験手順は、少なくとも２つの広く分けられた流速での応答のモニタおよび適切なモデルによる評価を含む。
【００３９】
そのような実験から得られた曲線（すなわち、センサグラム）の結合フェーズは、活性濃度（Ｃｏｎｃ）がフィッティングされたパラメータである物質移動項（ｋｔ）を有する二分子相互作用モデルにフィッティングされる：
Ａ（溶液）＝Ｃｏｎｃ
Ａ［０］＝０
ｄＡ／ｄｔ＝ｋｔ＊（Ｃｏｎｃ−Ａ）−（ｋａ＊Ａ＊Ｂ−ｋｄ＊ＡＢ）
Ｂ［０］＝ＲＭａｘ
ｄＢ／ｄｔ＝−（ｋａ＊Ａ＊Ｂ−ｋｄ＊ＡＢ）
ＡＢ［０］＝０
ｄＡＢ／ｄｔ＝（ｋａ＊Ａ＊Ｂ−ｋｄ＊ＡＢ）
総応答：
ＡＢ＋ＲＩ
このモデルでは、物質移動定数ｋｔの値は、次の式に従って計算される定数として導入される：
【００４０】
【数６】
2018532127.tif 000008
この式のパラメータをタンパク質依存性と機器依存性に分類すると、次のようになる：
【００４１】
【数７】
2018532127.tif 000009
または：
【００４２】
【数８】
2018532127.tif 000010
ＳＰＲバイオセンサシステムの提案された較正のためには、以下が必要であろう：
検体が明確な濃度およびＣｏｎｓｔａｎａｌｙｔｅ、すなわち、分子量および拡散係数を有する物質移動制限条件を満たすモデルシステム。
【００４３】
較正手順では、実験はＣＦＣＡと同じ方法で実行されるが、実験データは、物質移動項（ｋｔ）を有する二分子相互作用モデルにフィッティングされ、濃度（Ｃｏｎｃ）は、定数であり、ｋｔは、フィッティングされる。Ｃｏｎｓｔｉｎｓｔｒは、以下から計算される
【００４４】
【数９】
2018532127.tif 000011
あるいは、濃度をＣＦＣＡと同じ方法でフィッティングさせ、計算した濃度を検体の真の明確な濃度と比較する。差異は、「機器誤差」であり、Ｃｏｎｓｔｉｎｓｔｒは、調整することができる。
【００４５】
較正物質（すなわち、物質移動制限条件および明確な濃度ならびにＣｏｎｓｔａｎａｌｙｔｅ）の要件を満たすモデルシステムの候補は、たとえば、認定ビタミン標準品（明確な濃度を有する検体）とその相互作用パートナーである。
【符号の説明】
【００４６】
Ｄ  拡散係数
ｈ  高さ
ｋａ  会合定数
ｋｄ  解離定数
ｋｍ  物質移動係数
ｋｔ  物質移動定数
η  粘度
【図１】
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【国際調査報告】
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2018532127.tif 000014
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