(57)【要約】  飲料中の混濁を減少するためのシステインエンドプロテアーゼの使用  本発明は、発酵又は非発酵穀物ベース飲料の混濁を防止又は減少するための、システインエンドプロテアーゼ又は麦芽抽出物の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３及び／又は配列番号４と５５％以上の同一性を有する配列を含む１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ又はシステインエンドプロテアーゼ活性を有するその断片の、発酵又は非発酵穀物ベース飲料の混濁を減少するための使用。
【請求項２】
前記１つ以上のシステインエンドプロテアーゼが、麦芽抽出物の形態で使用される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
発酵又は非発酵穀物ベース飲料の混濁を減少するための、エンドプロテアーゼ活性を有する麦芽抽出物の使用。
【請求項４】
前記麦芽抽出物が、システインエンドプロテアーゼＡ及び／又はシステインエンドプロテアーゼＢ活性を有する、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
発酵又は非発酵穀物ベース飲料の調製における、（ｉ）請求項１又は２のいずれかに記載の１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ、又は（ｉｉ）請求項３又は４のいずれかに記載の麦芽抽出物の使用。
【請求項６】
前記発酵又は非発酵穀物ベースの飲料がビールである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
発酵又は非発酵穀物ベース飲料の混濁を防止又は減少する方法であって、当該飲料を製造する方法の間に、（ｉ）請求項１又は２のいずれかに記載の１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ、又は（ｉｉ）請求項３又は４のいずれかに記載の麦芽抽出物を添加する工程を含む、方法。
【請求項８】
前記飲料が穀物ベース発酵飲料であり、前記１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ又は麦芽抽出物が、当該飲料を生産する方法の発酵工程の間に添加される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
発酵又は非発酵穀物ベース飲料を製造する方法であって、（ｉ）請求項１又は２のいずれかに記載の１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ、又は（ｉｉ）請求項３又は４のいずれかに記載の麦芽抽出物を、麦汁又はジュースに添加する工程を含む、方法。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法によって取得された穀物ベースの飲料。
【請求項１１】
発酵穀物ベース飲料の製造における収量を増大するための、（ｉ）請求項１又は２のいずれかに記載の１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ、又は（ｉｉ）請求項３又は４のいずれかに記載の麦芽抽出物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、飲料、特にビールを清澄するためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
清澄化は、ビール、ワイン又は果物ジュースの保存の間の混濁の形成に対処する、飲料産業における必須の工程である。主要な問題である故、この課題に対して多くの研究が実施されており、それは現在では周知の現象である。コロイド懸濁はポリフェノール‐タンパク質及びタンパク質‐タンパク質の相互作用による。混濁は、麦汁中に存在するタンパク質‐ポリフェノール比だけでなく、麦汁中に存在するタンパク質のプロリン含量、重合化の度合い、及びポリフェノールの水酸基の数にも依存する（Ｓｉｅｂｅｒｔ  （２００６）  ＬＷＴ  ３９：  ９８７−９９４  ）。
【０００３】
より具体的には、ビールの場合、混濁の形成に関与するタンパク質は麦芽ホルデインであることが知られている（Ｓｔｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１１）  Ｅｕｒ．  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２３２：  １９１−２０４）。ほとんどのホルデインは、醸造プロセスの間に麦芽の内在性プロテアーゼによって加水分解されて消滅する。しかしながら、ビールを構成するタンパク質の解析により、懸濁形成の原因となる残留Ｂ及びγ３ホルデイン（Ｐｅｒｒｏｃｈｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５：  ２８４９−２８５８，  Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１１）  Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３５：１５２２−１５２７）の存在が示された。
【０００４】
ビールを安定化するために、多くの代替が、混濁に関与する化合物を排除するために醸造家によって実行されてきた。ベントナイトによるタンパク質の除去等の物理的手段が使用され得るが、この相互作用は非特異的（ａｓｐｅｃｉｆｉｃ）であり、混濁の形成に関与するタンパク質だけでなく、泡の形成に関与するタンパク質まで除去してしまう。同様の弱点が、超遠心の使用にも関連する。
【０００５】
混濁形成の初期に物質の沈殿及び排除を促進するために、保存前に、飲料にタンニン酸等のポリフェノール、又はゼラチン等のプロリンリッチタンパク質を添加することも提案されている。他の代替は、より具体的にはプロリンリッチタンパク質に結合するシリカゲルを使用することである。これらのシリカゲルは、ポリフェノールに富む飲料の清澄において効果的ではない。ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）は、しばしば、ポリフェノールフラクションの抽出に使用される。しかしながら、ポリフェノールは、有益であり得る抗酸化作用を有する。混濁の形成を含む低温通路後の濾過も使用されるが、後者の技術は、長時間（数ヶ月）かかるという短所を有する。
【０００６】
非常に広い作用特異性の天然のタンパク質のパパインによるタンパク質フラクションの加水分解等の酵素的手段も使用されるが、後者は泡のタンパク質も分解し、これは望まれない副作用である。近年、プロラミンを特異的に分解するプロリン特異的エンドプロテアーゼの使用が記載され、これは、糸状菌類Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  （ＵＳ  ８，１１９，１７１）由来のクラスＥＣ３．４．２１．２６の組換えプロリルエンドプロテアーゼであるＢｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標）である。しかしながら、このエンドプロテアーゼも、泡のタンパク質まで分解し得る。
【０００７】
従って、飲料製造設備の顕著な変更を要さず、既知の従来技術に対し不利益を有さない、特に泡の形成に影響を有さない、飲料の混濁を減少する代替手段、特に低コストの代替手段に、未だ顕著な需要が存在する。
【０００８】
発芽の過程で、穀物の種子は、幼苗の生育を保証するために貯蔵タンパク質を加水分解するプロテアーゼを生産する。緑麦芽中の少なくとも約４０種類のプロテアーゼの存在は、Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ  （１９９５）  Ｊ．  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉ．  ２１：１４５−１５３によって報告されている。これらのプロテアーゼは、既存の４種類：セリン、メタロ、システイン及びアスパルチルプロテアーゼに属する。しかしながら、穀物の発芽の過程でプロラミンの分解に主に寄与するプロテアーゼは、システインプロテアーゼであることが示されている（Ｓｈｉ  ａｎｄ  Ｘｕ  （２００９）  Ｊ．  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．，  ５１：  ５２−５７）。プロラミンに対するこれらのプロテアーゼの活性のため、穀物製品における穀物性免疫応答を誘導するペプチド成分の減少のための、又はこれらの食品の消化の過程での、それらの使用が提案されている（Ｓｔｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ａｌ．，  （２０１０）  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６１：  ２４２−２４９）。組換え大麦ＥＰ−Ｂプロテアーゼの使用は、不溶性大麦タンパク質の消化性を増大するために豚試料の食品添加物として使用することが最近提案されている。発明者の知る限り、これらの用途の可能性のいずれも実行されてはおらず、これらのシステインエンドプロテアーゼの他の用途は、現在のところ示唆されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、麦芽、特に麦芽抽出物が、ビールの混濁を効果的に減少することが可能なプロテアーゼ活性を有するという、発明者らによる予想外の発見に基づく。発明者らは、より具体的には、このプロテアーゼ活性がシステインエンドプロテアーゼ、より具体的には、大麦麦芽中のエンドプロテアーゼＡ及びＢを含むことを実証した。
【００１０】
大麦のエンドプロテアーゼＡ及びＢの有用性は、さらに驚くべきことに、多くのプロテアーゼと異なり、広くホルデイン中に存在するアミノ酸であるプロリンの存在が、それらのタンパク質分解活性を損なわないように見えることである。穀物システインエンドプロテアーゼは、プロリン及びグルタミンに富むホルデイン及びグリアジンのＮ末端リピートを開裂できる（Ｂｅｔｈｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６）  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  １３：  ６３７−６４７）。
【００１１】
さらに、発明者らは、このプロテアーゼ活性が、並行して、そして驚異的に、ビール製造の過程で発酵収率を増大することを示した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び／又は配列番号４と５５％以上の同一性を有する配列を含む１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ又はシステインエンドプロテアーゼ活性を有するその断片の、発酵又は非発酵穀物ベース飲料の混濁を減少するための使用に関する。
【００１３】
本発明は、エンドプロテアーゼ活性を有する麦芽抽出物の、発酵又は非発酵穀物ベース飲料の混濁を減少するための使用も目的とする。
【００１４】
本発明の他の目的は、発酵又は非発酵穀物ベース飲料の調製における、（ｉ）上記の１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ、又は（ｉｉ）上記の麦芽抽出物の使用に関する。
【００１５】
また、本発明は、発酵又は非発酵穀物ベース飲料の混濁を防止又は減少する方法にも関し、当該方法は、その間に、（ｉ）上記の１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ、又は（ｉｉ）上記の麦芽抽出物を添加する工程を含む。
【００１６】
また、本発明は、（ｉ）上記の１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ、又は（ｉｉ）上記の麦芽抽出物の、発酵又は非発酵穀物ベース飲料の製造過程で発酵収量を増大するための使用にも関する。
【００１７】
また、本発明は、麦汁又はジュース中に、（ｉ）上記の１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ、又は（ｉｉ）上記の麦芽抽出物を添加する工程を含む、発酵又は非発酵穀物ベース飲料の製造プロセスにも関する。
【００１８】
本発明の他の目的は、本発明の方法の１つによって取得された穀物ベース飲料に関する。
【００１９】
発明の詳細な説明
穀物ベース飲料
「飲料」は、本発明において、それらを調製する全ての段階での飲料を意味する。従って、飲料は、消費されるばかりの飲料だけでなく、当該飲料を調製するのに用いる任意の組成物も含む。好ましくは、本発明の文脈における飲料は、消費されるばかりの飲料である。
【００２０】
「穀物ベース飲料」は、本発明において、その調製に使用される原材料の少なくとも１つが穀物に由来する任意の飲料を意味する。本発明の文脈において取得された穀物ベース飲料は、従って、大麦、小麦、特に小麦、燕麦、ライ麦、トウモロコシ、米、ソルガム、粟、キヌア又は蕎麦等の偽穀物、又はそれらの混合物に由来するものであり得る。好ましくは、本発明の文脈において取得される穀物ベース飲料は、大麦又は小麦ベース飲料である。
【００２１】
本発明の文脈において取得される穀物ベース飲料は、発酵又は非発酵飲料であり得る。好ましくは、それは発酵飲料である。
【００２２】
発酵又は非発酵穀物ベース飲料の保存の過程で見られる混濁は、一般に、ポリフェノール‐タンパク質及び／又はタンパク質‐タンパク質相互作用による。従って、特定の態様において、本発明の範囲内で取得される穀物ベース又は発酵は、タンパク質及びポリフェノールを含有する。
【００２３】
発明者らは、システインエンドプロテアーゼ及び／又は麦芽抽出物が、ビールの混濁を防止又は減少するのに特に効果的であることを示している。
【００２４】
従って、特定の態様において、発酵又は非発酵穀物ベース飲料は、ビールの製造に用いられる液体である。特に好ましくは、発酵又は非発酵穀物ベース飲料は、ビールである。
【００２５】
「ビール」は、本発明において、非麦芽穀物から調製されたトウモロコシから、麦芽穀物から調製されたトウモロコシから、又は麦芽又は非麦芽穀物から調製されたトウモロコシ取得されたビールを意味する。本発明において、「ビール」は、低発酵ビール、即ちその発酵が一般に８〜１２℃の温度で実施されるビール、高発酵ビール、即ちその発酵が一般に２０〜２５℃の温度で実施されるビール、単、二重又は三重発酵（その発酵温度が発酵の間に変更される）のビール、自然発酵によるビール、即ちその発酵が麦汁への酵素の添加を要しないビール、混合発酵によるビール、即ち酵母と細菌（乳酸菌型または酢酸菌型）、又は２つの酵母を組み合わせる発酵によるビール、添加物により調製されたビール、及びアルコールレベルが０〜１０％の範囲に及ぶビールを包含する。
【００２６】
混濁の減少
「混濁（ｃｌｏｕｄｉｎｅｓｓ）」及び「濁り、濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）」は、本願で区別されず用いられる。混濁は、当業者に周知の技術、典型的には濁度計、例えばタンノメーター（ｔａｎｎｏｍｅｔｅｒ）を用いて測定され得る。濁度計において、放射された光が、存在する粒子（濁り）によって反射される。散乱した光は、光源に対して直角（９０°）に配置された光検出器によって測定される。濁りは、ＮＴＵ（Ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ  Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ  Ｕｎｉｔｓ）又はＥＢＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｒｅｗｅｒｙ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ  ｕｎｉｔｓ）で表され、１ＮＴＵは０．２５ＥＢＣに等しい。測定は、好ましくは‐８℃で行われる。濁りは、Ｃｈａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｉｎｓｔ．  Ｂｒｅｗ．  ９９：  ４９−５６に記載されるＣｈａｐｏｎ試験、特にＣｈａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｉｎｓｔ．  Ｂｒｅｗ．  ９９：  ４９−５６に記載されるＡｌｃｏｈｏｌ−Ｃｈｉｌｌ−Ｔｅｓｔを使用して測定される。典型的には、９．４ｍｌの試料を０．６ｍｌのエタノールと混合し、３０分以上、例えば３０分間又は４０分間‐８℃でこれをインキュベーションする。濁りは、−８℃で、濁度計、典型的にはＰｆｅｕｆｆｅｒ社製タンノメーターで測定される。結果は典型的にはＥＢＣ単位で表される。
【００２７】
「混濁の減少」、「濁りの減少」及び「清澄化」は、本願では区別されずに用いられる。好ましくは、本発明の文脈で用いられるシステインエンドプロテアーゼ及び麦芽抽出物は、同一の無処理飲料と比較して、飲料の混濁を顕著に減少することが可能である。
【００２８】
好ましくは、本発明の文脈で用いられるシステインエンドプロテアーゼ及び麦芽抽出物は、特に濁度を上記Ｃｈａｐｏｎ試験によって‐８℃で測定したとき、同一の無処理飲料と比較して、７０％以上、より好ましくは７３％以上、７４％以上、７５％以上、７７％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、又はより好ましくは９３％以上、９４％以上、又は９５％以上、飲料の濁度を減少することが出来る。
【００２９】
好ましくは、本発明の文脈で用いられるシステインエンドプロテアーゼ及び麦芽抽出物は、特に濁度を上記Ｃｈａｐｏｎ試験によって‐８℃で測定したとき、同一の無処理飲料と比較して、６５ＥＢＣ単位以上、６７  ＥＢＣ単位以上、６８  ＥＢＣ単位以上、７０  ＥＢＣ単位以上、７４  ＥＢＣ単位以上、７５  ＥＢＣ単位以上、８０  ＥＢＣ単位以上、８１  ＥＢＣ単位以上、８７  ＥＢＣ単位以上、８９  ＥＢＣ  ＥＢＣ単位以上、９０  ＥＢＣ単位以上、９４  ＥＢＣ単位以上、９５  ＥＢＣ単位以上、１００  ＥＢＣ単位以上、１０２  ＥＢＣ単位以上、又は１０３  ＥＢＣ単位以上、飲料の混濁を減少することが出来る。
【００３０】
発酵収量の増大
「発酵収量の増大」は、本発明において、同等の発酵時間で、異なる対照、特に陽性及び／又は陰性対照と比較して、麦汁中に尚もより存在する発酵可能な糖がより少ないことを意味する。陰性対照、好ましくは２つの陰性対照は、何も添加しない麦汁及び熱変性大麦麦芽の抽出物を添加した麦汁からなるものであってもよく、一方、陽性対照は、Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標）を添加した麦汁によって構成されてもよい。
【００３１】
発酵のモニタリングは、酵母集団及び麦汁の乾燥抽出物の質量％をモニタリングすることにより典型的には実施され、Ｐｌａｔｏ度（°Ｐｌａｔｏと表記する）で表される。１°Ｐｌａｔｏは、１００ｇの麦汁あたり１ｇの乾燥可溶性固体（主に発酵可能な糖）に対応する。麦汁中に最初に含まれる糖の量は、製造されるビール中のアルコール及び二酸化炭素の量を決定する。Ｐｌａｔｏ度は、典型的には、自動密度計（Ａｎｔｏｎ−Ｐａａｒ  ＤＭＡ３５  ｄｅｎｓｉｍｅｔｅｒ）によって測定される。
【００３２】
発明者らは、本発明の文脈で用いられるシステインエンドプロテアーゼ及び麦芽抽出物は、それが発酵工程の過程で添加されるとき、Ｄ０＋８で１以下の°Ｐｌａｔｏを達成できる。
【００３３】
従って、好ましくは、本発明のシステインエンドプロテアーゼ及び麦芽抽出物は、特に発酵が約１３℃で実施されるとき、特に１１°Ｐｌａｔｏでの麦汁が「ＥＢＣ会議」型醸造によって生産されるとき、発酵開始後８日で、１以下、より好ましくは０．８以下、０．７以下、０．６以下、０．５以下、又は０．２以下の°Ｐｌａｔｏを達成するために、発酵収量を増大する。
【００３４】
システインエンドプロテアーゼ
本発明において、「システインエンドプロテアーゼ」又は「システインエンドペプチダーゼ」は、クラスＥＣ３．４．２２の酵素を意味し、システインでありペプチド鎖内でタンパク質を開裂する触媒的３残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｔｒｉａｄ）の求核アミノ酸残基である。
【００３５】
本発明で使用されるシステインエンドプロテアーゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び／又は配列番号４と、５５％以上同一、より好ましくは６０％以上同一、６５％以上同一、７０％以上同一、７５％以上同一、８０％以上同一、８５％以上同一、９０％以上同一、９０％以上同一、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％以上同一であるもの、又はシステインエンドプロテアーゼ活性を呈するそれらの断片を含み、又はこれからなる。
【００３６】
本発明において、「参照配列とＸ％以上同一の配列」は、その配列が、参照配列と同一であるか、又は参照配列の１００個のアミノ酸に対して最大で１００−Ｘ個のアミノ酸が異なることを意味する。参照配列に対するアミノ酸の相違は、これらの変化が酵素の酵素的活性に顕著な影響を与えないような位置での、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入であり得る。特に、置換は、保存的置換、又は非天然アミノ酸若しくは偽アミノ酸による天然アミノ酸の置換に対応してもよい。特定の態様において、タンパク質配列は、保存的置換の存在によってのみ参照配列と相違する。保存的置換は、同一のクラス、例えばアミノ酸の非荷電側鎖（例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、システイン及びチロシン）への置換、アミノ酸の塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン及びヒスチジン）への置換、
アミノ酸から酸性側鎖（例えばアスパラギン酸及びグルタミン酸）への置換、アミノ酸から側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン及びトリプトファン）への置換である。
【００３７】
アラインメント及び同一性パーセンテージの決定は、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  （１９７０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：  ４４３−４５３に記載のＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムに基づくＮｅｅｄｌｅプログラムを用いて、手動又は自動で実施されてもよい。例えば、タンパク質配列の比較のために、以下のパラメーターが使用され得る。比較行列：ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープンペナルティ＝１０、ギャップエクステンドペナルティ＝０．５、エンドギャップペナルティ＝偽、エンドギャップオープンペナルティ＝１０；エンドギャップエクステンドペナルティ＝０．５。また、核酸配列の比較のために、以下のパラメーターが使用され得る。比較行列：ＤＮＡＦＵＬＬ；ギャップオープンペナルティ＝１０、ギャップエクステンドペナルティ＝０．５、エンドギャップペナルティ：偽、エンドギャップオープンペナルティ＝１０、エンドギャップエクステンドペナルティ＝０．５。
【００３８】
配列番号１及び配列番号２の配列は、大麦のシステインエンドプロテアーゼＥＰ−Ａのアミノ酸配列に対応する。
【００３９】
ＥＰ−Ａ大麦システインエンドプロテアーゼは、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏ  （１９８８）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ８７：  ９５−１０３に記載されている。ＥＰ−Ａは、見掛けの分子量３７ｋＤａで、ｐＨ５．０及び温度４５℃で最適な活性を呈する。それは、ジベレリン酸によって誘導される。組換えＣ−型ホルデインの開裂部位は、Ｄａｖｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１７：  ２５５−２６１において特定されており、ＥＰ−Ａは、アルギニン及びグルタミン、好ましくはアルギニンの後のホルデインを切断する。アルギニン又はグルタミンの後のフェニルアラニン、ロイシン又はバリン等のアミノ酸の開裂部位での存在は、これらの２つの残基の前又は後のプロリンの存在の一方、その触媒効率を低下するがそれを阻害しない。ＥＰ−Ａのプロラミンに対する触媒特異性はあまり特定されていないが、Ｂｅｔｈｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）によって記載されるＥＰ−Ｂ−ロイペプチン複合体の結晶画像構造によると、ＥＰ−Ａ及びＥＰ−Ｂの配列同一性（プレプロタンパク質で５２％、成熟タンパク質で６０％）、及び触媒及びペプチド断片のアンカーに関与する活性部位のアミノ酸の厳しい保存性に基づいているようである。ここで、ＥＰ−Ａ及びＥＰ−Ｂは、同一の触媒特異性を有する。大麦システインエンドプロテアーゼＥＰ−Ａの２つのバリアントが同定されている。これらの配列を下記に示す。
ＭＷＲＣＩＬＬＳＡＶＶＶＡＬＡＬＡＰＡＰＡＬＧＶＰＦＴＥＫＤＬＡＳＥＥＳＬＲＧＬＹＥＲＷＲＳＨＹＴＶＳＲＲＧＬＧＡＤＡＥＥＲＲＦＮＶＦＫＥＮＡＲＹＶＨＥＧＮＫＲＤＲＰＦＲＬＡＬＮＫＦＡＤＭＴＴＤＥＦＲＲＴＹＡＧＳＲＶＲＨＨＬＳＬＳＧＧＲＲＧＤＧＧＦＲＹＡＤＡＤＮＬＰＰＡＶＤＷＲＱＫＧＡＶＴＡＩＫＤＱＧＱＣＧＳＣＷＡＦＳＴＩＶＡＶＥＧＩＮＫＩＲＴＧＫＬＶＳＬＳＥＱＥＬＭＤＣＤＮＶＮＮＱＧＣＥＧＧＬＭＤＹＡＦＱＦＩＱＫＮＧＩＴＴＥＳＮＹＰＹＱＧＥＱＧＳＣＤＱＡＫＥＮＡＱＡＶＴＩＤＧＹＥＤＶＰＡＮＤＥＳＡＬＱＫＡＶＡＧＱＰＶＳＶＡＩＤＡＳＧＱＤＦＱＦＹＳＥＧＶＦＴＧＥＣＳＴＤＬＤＨＧＶＡＡＶＧＹＧＡＴＲＤＧＴＫＹＷＩＶＫＮＳＷＧＥＤＷＧＥＫＧＹＩＲＭＱＲＧＶＳＱＴＥＧＬＣＧＩＡＭＱＡＳＹＰＴＫＳＡＰＨＡＳＴＶＲＥＧＳＨＴＤＥＬ（配列番号１）
ＭＷＲＣＩＬＬＳＡＶＶＶＡＬＡＬＡＰＡＰＡＬＧＶＰＦＴＥＫＤＬＡＳＥＥＳＬＲＧＬＹＥＲＷＲＳＨＹＴＶＳＲＲＧＬＧＡＤＡＥＥＲＲＦＮＶＦＫＱＮＡＲＹＶＨＥＧＮＫＲＤＭＰＦＲＬＡＬＮＫＦＡＤＭＴＴＤＥＦＲＲＴＹＡＧＳＲＶＲＨＨＬＳＬＳＧＧＲＲＧＤＧＧＦＲＹＧＤＡＤＮＬＰＰＡＶＤＷＲＱＫＧＡＶＴＡＩＫＤＱＧＱＣＧＳＣＷＡＦＳＴＩＶＡＶＥＧＩＮＫＩＲＴＧＫＬＶＳＬＳＥＱＥＬＭＤＣＤＮＶＮＮＱＧＣＤＧＧＬＭＤＹＡＦＱＦＩＱＫＮＧＩＴＴＥＳＮＹＰＹＱＧＥＱＧＳＣＤＱＡＫＥＮＡＱＡＶＴＩＤＧＹＥＤＶＰＡＮＤＥＳＡＬＱＫＡＶＡＧＱＰＶＳＶＡＩＤＡＳＧＱＤＦＱＦＹＳＥＧＶＦＴＧＥＣＳＴＤＬＤＨＧＶＡＡＶＧＹＧＡＴＲＤＧＴＫＹＷＩＶＫＮＳＷＧＥＤＷＧＥＫＧＹＩＲＭＱＲＧＶＳＱＴＥＧＬＣＧＩＡＭＱＡＳＹＰＴＫＳＡＰＨＡＳＴＶＲＥＥＳＨＴＤＥＬ（配列番号２）
【００４０】
ＥＰ−Ａのタンパク質配列中に、複数のドメインが同定されている。従って、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸１〜２３はシグナルペプチドに対応し、配列番号１又は配列番号２の１２８〜３６５は、成熟鎖配列番号５及び６に対応する。ＥＰ−Ａの触媒部位は特定されなかった。しかしながら、触媒部位は、ＥＰ−Ｂとのホモロジーにより、以下のアミノ酸：システイン２９、ヒスチジン１６４、セリン２８、グリシン７１、アスパラギン酸１６３、アスパラギン１８５、グルタミン２３を含むものと推定され得る。番号は、配列番号５又は６の成熟タンパク質配列に基づく。
【００４１】
配列番号３及び４は、大麦のシステインエンドプロテアーゼＥＰ−Ｂのアミノ酸配列に対応する。
【００４２】
大麦システインエンドプロテアーゼＥＰ−Ｂは、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏ  （１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ９４：  ２５１−２５８に記載されている。ＥＰ−Ｂは、見掛けの分子量３０ｋＤａで（Ｄａｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１７：  ２５５−２６１）、モデルタンパク質基質（アゾカゼイン又はヘモグロビン）においてｐＨ４．５及び温度４０℃で最適の活性を呈する。これらの最適条件下、ホルデインは、典型的には、２０００〜２５，０００ダルトンの分子量の複数の断片に開裂する。ＥＰ−Ｂは、ジベレリン酸によって誘導される。組換えＣ−型ホルデインの開裂部位は、Ｄａｖｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１７：  ２５５−２６１において特定されており、ＥＰ−Ｂは、アルギニン及びグルタミン、好ましくは第一の切断においてアルギニンの後のホルデインを切断する。アルギニン又はグルタミンの後のフェニルアラニン、ロイシン又はバリン等のアミノ酸の開裂部位での存在は、加水分解を促進する。ＥＰ−Ａと対照的に、ＥＰ−Ｂは、これらの２つのアルギニン又はグルタミン残基の後のプロリンの存在に拘らず、良好な触媒活性を維持する。第二に、開裂部位は、ＥＰ−ＢによるＣ−ホルデインの加水分解が延長されるとき、実証され得る。エンドプロテアーゼは、グルタミン、アルギニン、チロシン、グリシン、グルタミン酸、セリン、ヒスチジン、ロイシンの後を開裂し得る。それはＣ−ホルデインの場合（Ｄａｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）プロリンのＮ−又はＣ−末端を見掛け上切断しないため、エンドプロリダーゼと同化され得ない。同様の結果は、組換えＥＰ−Ｂによるα２−グリアジンの加水分解において得られ、これはグルタミンＣ−末端切断における明らかな好適を示す（Ｂｅｔｈｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。穀物由来のシステインエンドプロテアーゼの開裂の特異性は、ビールの混濁の減少に用いられるパパイン等の他のシステインエンドプロテアーゼとも全く異なる。実際に、パパインは、相対的に非特異的である（Ｋｉｍｍｅｌ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  （１９５４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２０７：  ５１５−５３１）。
【００４３】
大麦のシステインエンドプロテアーゼＥＰ−Ｂの変異体が同定されており、それらの配列を下記に示す。
ＭＧＬＬＳＫＫＬＬＶＡＳＭＶＡＡＶＬＡＶＡＡＶＥＬＣＳＡＩＰＭＥＤＫＤＬＥＳＥＥＡＬＷＤＬＹＥＲＷＱＳＡＨＲＶＲＲＨＨＡＥＫＨＲＲＦＧＴＦＫＳＮＡＨＦＩＨＳＨＮＫＲＧＤＨＰＹＲＬＨＬＮＲＦＧＤＭＤＱＡＥＦＲＡＴＦＶＧＤＬＲＲＤＴＰＡＫＰＰＳＶＰＧＦＭＹＡＡＬＮＶＳＤＬＰＰＳＶＤＷＲＱＫＧＡＶＴＧＶＫＤＱＧＫＣＧＳＣＷＡＦＳＴＶＶＳＶＥＧＩＮＡＩＲＴＧＳＬＶＳＬＳＥＱＥＬＩＤＣＤＴＡＤＮＤＧＣＱＧＧＬＭＤＮＡＦＥＹＩＫＮＮＧＧＬＩＴＥＡＡＹＰＹＲＡＡＲＧＴＣＮＶＡＲＡＡＱＮＳＰＶＶＶＨＩＤＧＨＱＤＶＰＡＮＳＥＥＤＬＡＲＡＶＡＮＱＰＶＳＶＡＶＥＡＳＧＫＡＦＭＦＹＳＥＧＶＦＴＧＤＣＧＴＥＬＤＨＧＶＡＶＶＧＹＧＶＡＥＤＧＫＡＹＷＴＶＫＮＳＷＧＰＳＷＧＥＱＧＹＩＲＶＥＫＤＳＧＡＳＧＧＬＣＧＩＡＭＥＡＳＹＰＶＫＴＹＮＫＰＭＰＲＲＡＬＧＡＷＥＳＱ（配列番号３）
ＭＧＬＬＳＫＫＬＬＶＡＳＭＶＡＡＶＬＡＶＡＡＶＥＬＣＳＡＩＰＭＥＤＫＤＬＥＳＥＥＡＬＷＤＬＹＥＲＷＱＳＡＨＲＶＲＲＨＨＡＥＫＨＲＲＦＧＴＦＫＳＮＡＨＦＩＨＳＨＮＫＲＧＤＨＰＹＲＬＨＬＮＲＦＧＤＭＤＱＡＥＦＲＡＴＦＶＧＤＬＲＲＤＴＰＳＫＰＰＳＶＰＧＦＭＹＡＡＬＮＶＳＤＬＰＰＳＶＤＷＲＱＫＧＡＶＴＧＶＫＤＱＧＫＣＧＳＣＷＡＦＳＴＶＶＳＶＥＧＩＮＡＩＲＴＧＳＬＶＳＬＳＥＱＥＬＩＤＣＤＴＡＤＮＤＧＣＱＧＧＬＭＤＮＡＦＥＹＩＫＮＮＧＧＬＩＴＥＡＡＹＰＹＲＡＡＲＧＴＣＮＶＡＲＡＡＱＮＳＰＶＶＶＨＩＤＧＨＱＤＶＰＡＮＳＥＥＤＬＡＲＡＶＡＮＱＰＶＳＶＡＶＥＡＳＧＫＡＦＭＦＹＳＥＧＶＦＴＧＥＣＧＴＥＬＤＨＧＶＡＶＶＧＹＧＶＡＥＤＧＫＡＹＷＴＶＫＮＳＷＧＰＳＷＧＥＱＧＹＩＲＶＥＫＤＳＧＡＳＧＧＬＣＧＩＡＭＥＡＳＹＰＶＫＴＹＳＫＰＫＰＴＰＲＲＡＬＧＡＲＥＳＬ（配列番号４）
【００４４】
ＥＰ−Ｂのタンパク質配列中に、複数のドメインが同定されている。従って、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸１〜２８はシグナルペプチドに対応し、配列番号３又は配列番号４の２９〜１３０は活性化ペプチドに対応し、配列番号３の１３１〜３７１（配列番号７の配列）又は配列番号４の１３１〜３７３（配列番号８の配列）は、成熟鎖に対応する。ＥＰ−Ａの触媒部位は特定されなかった。しかしながら、触媒部位は、ＥＰ−Ｂとのホモロジーにより、以下のアミノ酸：システイン２９、ヒスチジン１６４、セリン２８、グリシン７１、アスパラギン酸１６３、アスパラギン１８５、グルタミン２３を含むものと推定され得る。番号は、配列番号５又は６の成熟タンパク質配列に基づく。ＥＰ−Ｂの触媒部位は、更に特定された。それは、主に、配列番号３又は配列番号４のシステイン１５８（配列番号７又は８の成熟タンパク質のシステイン２８）及びヒスチジン２９７（配列番号７又は８の成熟タンパク質のヒスチジン１６７）を含む。
【００４５】
これらの２つのタンパク質において、アスパラギン酸２９６（成熟タンパク質のアスパラギン酸１６６）は、システイン１５８（成熟タンパク質のシステイン２８）に関する基質の位置に含まれる（Ｂｅｔｈｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。
【００４６】
本発明の文脈で用いられるシステインエンドプロテアーゼは、システインエンドプロテアーゼＡ又はシステインエンドプロテアーゼＢ活性を有し得る。
【００４７】
特に好ましくは、本発明で用いるシステインエンドプロテアーゼは、（ｉ）配列番号１及び／又は配列番号２と、５５％以上同一、又は６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％以上同一である配列を含み、又はこれからなる、システインエンドプロテアーゼＡ、及び／又はシステインエンドプロテアーゼＡ活性を呈するそれらの断片、及び／又は（ｉｉ）配列番号３及び／又は配列番号４と、５５％以上同一、又は６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％以上同一である配列を含み、又はこれからなる、システインエンドプロテアーゼＡ、及び／又はシステインエンドプロテアーゼＢ活性を呈するそれらの断片である。
【００４８】
最も好ましくは、本発明で用いるシステインエンドプロテアーゼは、（ｉ）配列番号１又は配列番号２の配列を含み、又はこれからなる、大麦のシステインエンドプロテアーゼＥＰ−Ａ、及び／又は（ｉｉ）配列番号３又は配列番号４の配列を含み、又はこれからなる、大麦のシステインエンドプロテアーゼＥＰ−Ｂである。
【００４９】
参照配列の「断片」は、本願において、参照配列よりも小さい配列を意味する。本発明の文脈において、断片のサイズは、例えば、２３０〜３７３アミノ酸、２３５〜３７１アミノ酸、２３６〜３６５アミノ酸、２３７〜３５０アミノ酸、２３９〜３００アミノ酸２４０〜２９０亜美音さん、２５０〜２８０アミノ酸、又は２６０〜２７０アミノ酸であり得る。好ましくは、本発明の範囲内で、断片は、それらが由来する酵素の活性部位を有する。本発明の文脈で用いられる断片は、特異性及びエンドプロテアーゼ活性を保持しつつ、それらが由来するプロタンパク質の又は成熟タンパク質の酵素的又は非酵素的開裂によって取得され得る。
【００５０】
本発明の文脈で用いられる断片は、システインエンドプロテアーゼ活性を呈する。システインエンドプロテアーゼ活性を呈する上記タンパク質配列の断片は、通常の技術によって当業者によって同定され得る。実際に、当業者が承知しているように、システインエンドプロテアーゼはペプチドシグナルを有し、システインエンドプロテアーゼ活性は、成熟システインエンドプロテアーゼ鎖のレベルで配置される。
【００５１】
従って、特に好ましい態様において、本発明の範囲内で使用されるシステインエンドプロテアーゼ断片は、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び／又は配列番号８の配列と５５％以上同一、又は６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％以上同一である配列を含み、又はこれからなり、当該断片は、システインエンドプロテアーゼ活性を呈する。
【００５２】
さらに、当業者が承知しているように、システインエンドプロテアーゼの触媒部位は、触媒に寄与するシステイン及びヒスチジン、並びにＥＰ−Ａにおいて上記した開裂部位の結合及び／又は認識に関与する様々なアミノ酸を含む、ポケットの中に位置する。システインエンドプロテアーゼ活性を有する上記タンパク質配列の断片は、従って、好ましくは、上記システインエンドプロテアーゼ触媒部位のアミノ酸残基を含み、又は好ましくはこれからなる。
【００５３】
従って、好ましい態様において、本発明の範囲内で用いられるシステインエンドプロテアーゼ断片は、プレタンパク質若しくは成熟タンパク質の断片、又は任意の機能的タンパク質断片であって、上記触媒部位のアミノ酸残基を含むものを含み、又はこれからなる。
【００５４】
従って、当業者は、例えばＥ６４（ｔｒａｎｓ‐エポキシスクシニル‐Ｌ−ロイコシルアミド‐（‐４‐グアニジノ）ブタン）等のシステインエンドプロテアーゼ特異的阻害剤を使用する等して、当業者に周知の技術を通じて、それらの活性を測定することにより、これらの断片がシステインエンドプロテアーゼ活性を呈することを実証出来る。
【００５５】
システインエンドプロテアーゼ活性を測定する技術は、実際に当業者に周知である。典型的には、それらは、クロモフォア又はフルオロフォアとジ又はトリペプチドとを用いる比色分析又は蛍光分析技術、質量分析計によって生成されるペプチドの解析と組み合わせた穀物タンパク質（プロラミン）又はこれらのタンパク質の断片を用いる技術を含む。典型的には、システインエンドプロテアーゼ活性は、５０ｍＭクエン酸緩衝剤（２ｍＭシステイン及び２ｍＭβ‐メルカプトエタノール含有、ｐＨ４）中のＮ−ＣＢＺ（ベンジルオキシカルボニル）‐Ｐｈｅ（フェニルアラニン）‐Ａｒｇ（アルギニン）‐ＡＭＣ（７−アミド‐４‐メチルクマリン）等の蛍光ペプチドを使用して測定され得る。基質は、１００μＭの濃度でＤＭＳＯに溶解され、一方、１０μｌが、２ｍＬのクエン酸緩衝剤を入れたクオーツキュベット中に添加される。典型的には１０〜３０μｌの酵素溶液が添加され、温度２０℃で蛍光の増大が経時測定される（励起３６０ｎｍ、放出４６０ｎｍ）。反応の初期の速度は、時間の関数としての蛍光強度曲線の傾きを測定して推定される。全蛍光は、０．２μＭパパイン溶液を用いて測定された。
【００５６】
本発明の文脈で用いられる１つ以上のシステインエンドプロテアーゼは、単離又は精製された形態で使用され得る。
【００５７】
「単離」又は「精製」は、天然の環境から取り出されたシステインエンドプロテアーゼを意味する。例えば、宿主細胞中で組換え生産されたシステインエンドプロテアーゼは、実質的に任意の適切な技術によって精製された組換え又は天然のポリペプチドと同様に本発明の文脈で単離されたものと見なされる。
【００５８】
本発明の文脈で用いられる１つ以上のシステインエンドプロテアーゼは、単離された形態であり得る。しかしながら、それは、この酵素の所望の効果に干渉しない担体又は希釈剤と混合され得、故に、常に単離されたものと見なされる。
【００５９】
本発明の範囲内で用いられる１つ以上のシステインエンドプロテアーゼは、調製物中に１つ以上のシステインエンドプロテアーゼを含有するより実質的に精製された形態であってもよく、ここで当該調製物中のタンパク質の７０％超、又は８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％超は、１つ以上のシステインエンドプロテアーゼである。
【００６０】
本発明の文脈で用いられる１つ以上のシステインエンドプロテアーゼは、粗又は精製天然産物、化学合成で得た産物、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫又は哺乳類細胞当の真核又は原核宿主から組換え技術で得た産物の形態であり得る。
【００６１】
推奨される生産方法において、システインエンドプロテアーゼをコードする核酸を含有するベクターを、好ましくは、対応するタンパク質を発現出来る条件下で培養される宿主細胞中に導入する。生産された酵素は、それから回収及び精製される。所望の拡散配列は、発現ベクターに挿入されてもよく、そこで、それは、その発現、又はその発現の制御を可能とする１つ以上のエレメント、例えば特にプロモーター、アクチベーター及び／又は転写ターミネーターに、操作可能に連結されている。ヌクレオチド配列の発現をコントロールするシグナル（プロモーター、アクチベーター、転写ターミネーター・・・）は、使用する細胞宿主との関係で選択される。故に、所望のタンパク質をコードする核酸配列は、選択された宿主内で自己複製するベクター、又は選択された宿主に取り込まれるベクターに挿入され得る。そのようなベクターは、当業者により通常使用される方法に従い調製され得、得られたクローンは、電気穿孔やリン酸カルシウム沈殿等の標準的な方法によって適切な宿主内に導入され得る。宿主細胞の例は、限定されないが、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６等のヒト細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ等の非ヒト哺乳類細胞、ＳＦ９等の昆虫細胞、Ｅ．  ｃｏｌｉ等の細菌、Ｌ４０及びＹ９０等の真菌及び／又は酵母株を含む。
【００６２】
特定の態様において、本発明の文脈で用いられる１つ以上のシステインエンドプロテアーゼは、天然に生産される直物抽出物から得られる。
【００６３】
本発明の文脈で用いられる１つ以上のシステインエンドプロテアーゼは、従って、アリューロン層の細胞培養から、又はアリューロン細胞のプロトプラストから取得され得る。アリューロン細胞又はアリューロン膜のプロトプラストを培養する技術は当業者に周知であり、例えばＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ  ＆  Ｖａｒｎｅｒ  （１９６７）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４２：  ３９８−４０６及びＴａｉｚ  ＆  Ｊｏｎｅｓ  （１９７１）  Ｐｌａｎｔａ  １０１：  ９５−１００に記載されている。システインエンドプロテアーゼは、ジベレリン酸によって誘導されるので、アリューロン層の細胞は、特定の態様において、好ましくは濃度約１μＭのジベレリン酸の存在下で培養される。
【００６４】
システインエンドプロテアーゼの発現を誘導する穀物の発芽、本発明の文脈で用いられる１つ以上のシステインエンドプロテアーゼは、発芽した穀物から、特に下記「麦芽抽出物」の項目で記載される、穀物麦芽から、取得され得る。
【００６５】
本発明の文脈で用いられる１つ以上のシステインエンドプロテアーゼは、組換え細胞培養、植物細胞培養、又は植物若しくは植物の部分から、特にライゼート及び細胞抽出物から、植物又は植物の部分、又は培養培地の上澄みから、当業者に周知の技術により取得され得る。当該技術は、個別又は組み合わせて用いられてもよく、例えば硫酸アンモニウム又はエタノールによる沈殿、酸抽出、クロマトグラフィー法、モノ又はポリクローナル抗体を用いる免疫親和性技術等が挙げられる。
【００６６】
それは、組換え細胞の培養から、植物細胞培養から、又は植物若しくは植物の部分から、又は培養培地の上澄みから、単純な抽出によって粗形態で取得され得る。
【００６７】
従って、特定の態様において、１つ以上のシステインエンドプロテアーゼは、下記「麦芽抽出物」の項目で規定する麦芽抽出物の形態で使用される。
【００６８】
麦芽抽出物
「麦芽」は、本発明において、麦芽化プロセスを通じて得られた発芽した穀物を意味する。
【００６９】
麦芽は、当業者に周知の麦芽化技術により取得され得る。麦芽化は、穀物を湿らせる浸漬、穀物が発芽を開始して「緑麦芽」になる発芽、当該緑麦芽を乾燥させて乾燥麦芽を得る乾燥（ｏａｓｔｉｎｇ）、及び麦芽の細根を取り除く脱胚（ｄｅｇｅｒｍａｇｅ）の、４つの工程を有する。
【００７０】
好ましくは、本発明の文脈で用いられる麦芽は、乾燥麦芽である。特に好ましくは、本発明の文脈で用いられる麦芽は、発芽後５〜１１日に得られた乾燥麦芽である。
【００７１】
本発明の文脈で用いられる麦芽は、好ましくは穀物麦芽、特に大麦、ライ麦、麦の麦芽、より好ましくは大麦の麦芽、より好ましくは大麦冬麦芽又は春大麦麦芽である。
【００７２】
本発明の文脈で用いられる麦芽は、糖化性（ｄｉａｓｔａｔｉｃ）又は非糖化性  麦芽であり得る。
【００７３】
本発明において、「麦芽抽出物」は、適切な溶媒、例えば水、水性緩衝剤、エタノール、これらの油の混合物、又は植物抽出の分野で周知の適切な水性緩衝剤によって、麦芽を抽出して得られる調製物である。本発明の文脈で用いられる麦芽抽出物は、特に、麦芽、好ましくは乾燥麦芽、任意で濃縮されたものであり得る。
【００７４】
本発明の文脈で用いられる麦芽抽出物は、凍結乾燥の形態であってもよく、任意で使用前に再懸濁されてもよい。
【００７５】
本発明の文脈で用いられる麦芽抽出物は、エンドプロテアーゼ活性を有する。
【００７６】
本発明において、「エンドプロテアーゼ活性」は、タンパク質又はペプチド鎖中のペプチドを切断できるプロテアーゼ酵素活性を意味する。エンドプロテアーゼ活性を実証する技術は当業者に周知であり、上記システインエンドプロテアーゼの項目で記載されている。
【００７７】
好ましくは、本発明の文脈で用いられるエンドプロテアーゼ活性を有する麦芽抽出物は、無処理の飲料と比較して、特に、−８℃で、より具体的には上記「混濁の減少」の項目で記載したＣｈａｐｏｎ試験により濁度を測定したとき、７０％以上、より好ましくは７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は尚もより好ましくは９５％以上、上記「穀物ベース飲料」の項目で定義した発酵又は非発酵穀物ベース飲料の濁りの減少をもたらす。
【００７８】
好ましくは、本発明の文脈で用いられるエンドプロテアーゼ活性を有する麦芽抽出物は、無処理の飲料と比較して、特に、−８℃で、より具体的には上記「混濁の減少」の項目で記載したＣｈａｐｏｎ試験により濁度を測定したとき、６５  ＥＢＣ単位以上、７０  ＥＢＣ単位以上、７５  ＥＢＣ単位以上、８０  ＥＢＣ単位以上、８５  ＥＢＣ単位以上、９０  ＥＢＣ単位以上、９５  ＥＢＣ単位以上、又は１００ＥＢＣ単位以上、上記「穀物ベース飲料」の項目で定義した発酵又は非発酵穀物ベース飲料の濁りの減少をもたらす。
【００７９】
そのような特性を有する麦芽抽出物は、典型的には、上記のように、麦芽の遠心上清を回収し、ひき潰し、水溶液中に懸濁して得た、粗麦芽抽出物であってもよい。
【００８０】
より好ましくは、そのような特性を有する麦芽抽出物は、上記粗抽出物を回収及び遠心濾過し、硫酸アンモニウムで、特に１５〜２０％、好ましくは２６％、及び任意で５０％以上、好ましくは８９％の硫酸アンモニウム飽和で処理した、硫酸アンモニウムによる飽和、又は当業者に周知であるように任意のパーセンテージの硫酸アンモニウムで飽和されることによって取得される、処理された大麦抽出物である。
【００８１】
実施例に示すように、発明者らは、実際に、これらの技術の一つによって得た麦芽の抽出物が、上記に適合する比率で、発酵又は非発酵穀物ベース飲料の混濁の減少を可能とすることを実証した。しかしながら、本発明の文脈で用いられる麦芽抽出物は、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、又は疎水相互作用クロマトグラフィー等の当業者に周知の追加の抽出及び／又は精製工程を有する任意の技術によって得られ得る。
【００８２】
また、本発明は、これらの技術の１つにより得られる麦芽抽出物がシステインエンドプロテアーゼ活性を有することも示す。
【００８３】
好ましくは、従って、本発明の文脈で用いられる麦芽抽出物は、上記システインエンドプロテアーゼの項目で定義した、システインエンドプロテアーゼ活性を有する。より好ましくは、本発明の範囲内で用いられる麦芽抽出物は、上記システインエンドプロテアーゼの項目で定義したシステインエンドプロテアーゼＡ及び／又はシステインエンドプロテアーゼＢ活性を有する。
【００８４】
また、発明者らは、これらの技術の１つによって得られた麦芽の抽出物は、発酵穀物ベース飲料の製造の過程で発酵収量を増大出来ることも示している。
【００８５】
混濁を防止又は減少する方法及び飲料を製造する方法
本発明は、上記「穀物ベース飲料」の項目で定義したように、発酵又は非発酵穀物ベース飲料の混濁を防止又は減少する方法に関する。ここで、当該方法は、当該飲料を製造するプロセスにおいて、（ｉ）上記「システインエンドプロテアーゼ」の項目で定義した１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ、又は（ｉｉ）上記「麦芽抽出物」の項目で定義した麦芽抽出物を添加する工程を含む。
【００８６】
また、本発明は、上記「穀物ベース飲料」の項目で定義した発酵又は非発酵穀物ベース飲料の製造において、（ｉ）上記「システインエンドプロテアーゼ」の項目で定義した１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ、又は（ｉｉ）上記「麦芽抽出物」の項目で定義した麦芽抽出物を使用することにも関する。
【００８７】
また、本発明は、上記「穀物ベース飲料」の項目で定義した発酵又は非発酵穀物ベース飲料の製造方法にも関し、当該方法は、特にジュース又は麦汁に、（ｉ）上記「システインエンドプロテアーゼ」の項目で定義した１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ、又は（ｉｉ）上記「麦芽抽出物」の項目で定義した麦芽抽出物を添加する工程を含む。
【００８８】
発酵穀物ベース飲料の製造方法の工程は当業者にとって周知であり、製造される飲料によって、特にその飲料が発酵飲料か否かによって異なり得る。
【００８９】
本発明によって得られる飲料の混濁の予防又は減少は、酵素活性によって得られ、（ｉ）上記「システインエンドプロテアーゼ」の項目で定義した１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ、又は（ｉｉ）上記「麦芽抽出物」の項目で定義した麦芽抽出物を添加する工程は、当該飲料を製造する方法の任意の段階で実施されてもよく、ここで、それは、エンドプロテアーゼ活性を破壊し得る工程の前に行われない。
【００９０】
そのようなエンドプロテアーゼ活性を破壊し得る工程は当業者に周知であり、例えば、増大した温度、特に６２℃以上、特に６５℃以上、又は６８℃、で処理する工程、例えば糖化又は煮沸工程を含む。
【００９１】
従って、特定の態様において、本発明の糖化及び／又は煮沸工程の後に、前記飲料を製造するための追加の工程が実施される。
【００９２】
特定の態様において、製造された飲料が発酵穀物飲料であるとき、特に生産される飲料がビールである場合、前記１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ又は麦芽抽出物は、飲料を製造する工程の発酵工程の間に、好ましくは飲料を製造するプロセスの発酵工程の始めに添加される。
【００９３】
当業者に周知のように、発酵穀物ベース飲料、特にビールの製造のために、数種類の発酵が使用され得る。従って、１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ又は麦芽抽出物は、低発酵工程の間に、高発酵工程の間に、又は自然発酵工程の間に、添加され得る。
【００９４】
好ましくは、製造される飲料は、酵素が混濁の原因となるタンパク質を分解するのに適した時間にわたり、１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ又は麦芽抽出物と接触させられる。そのような時間の長さは、システインエンドプロテアーゼ又は麦芽抽出物と処理される飲料とのインキュベーション条件、特に温度やｐＨ条件に依存し得る。
【００９５】
発明者らは、低発酵又は高発酵のいずれの場合も、ビールを製造するプロセスの間の発酵工程の通常の時間の長さは、上記「混濁の減少」の項目で定義されたビールの混濁の防止又は減少を得るのに特に適していることを示した。
【００９６】
従って、特定の態様において、製造される飲料は、８〜１２日間、好ましくは１０日間、１０〜１２℃、好ましくは１２℃で、出発ｐＨ５．３〜５．４で、１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ又は麦芽抽出物と接触させられ、ここで、最終ｐＨは、発酵過程でのｐＨの自然の変化により、４．２〜４．３に達する。
【００９７】
他の特定の態様において、製造される飲料は、４〜８日間、好ましくは６日間、２０〜２５℃で、好ましくは出発ｐＨ５．３〜５．４で、１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ又は麦芽抽出物と接触させられる。
【００９８】
典型的には、本発明のビール製造方法は、以下の工程：
（ａ）麦芽化又は麦芽を供給する工程、
（ｂ）工程ａ）で得た麦芽を破砕又は挽き潰す工程、
（ｃ）工程ｂ）で得た挽き潰した麦芽を好ましくは加熱した水と混合してマッシュを形成する工程、
（ｄ）工程ｃ）で得たマッシュを、好ましくは煮出し（ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ）、増加による注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｃｒｅｍｅｎｔｓ）又は単純な注入により糖化して麦汁を形成する工程、
（ｅ）濾過して一次麦汁を得る工程、
（ｆ）苦味及び香味ホッピング工程を含む煮沸工程、
（ｇ）「渦」接線分離又は遠心分離により、麦汁から混濁を分離する工程、
（ｈ）麦汁を冷却し、播種し、酸素化する工程、
（ｉ）酵母の存在下での、発酵工程、低、高又は自然発酵工程、この工程の間、好ましくは始めに、１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ又は麦芽抽出物が添加される、
（ｊ）工程ｇ）で得た発酵産物を保存する工程、
（ｋ）酵母を濾過及び分離する工程、並びに
（ｌ）コンディショニング工程、
を含む。
【００９９】
工程ａ）〜ｈ）及びｊ）〜ｌ）は、当業者に周知の条件下で実施され得る。
【０１００】
発酵工程ｉ）において、麦汁は、好ましくは、８〜１２日間、好ましくは１０日間、８〜１４℃、好ましくは１２℃で、好ましくは出発ｐＨ５．３〜５．４で、又は４〜８日間、好ましくは６日間、１５〜２０℃で、好ましくは出発ｐＨ５．３〜５．４で、１つ以上のシステインエンドプロテアーゼ又は麦芽抽出物と接触させられる。
【０１０１】
本発明の方法は、更に、混濁の形成を減少又は防止できる補助的酵素を添加する工程を含み得る。そのような混濁の形成を減少又は防止する補助的酵素は、当業者に周知であり、例えばＤＳＭと表記されるＢｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標）又はパパインを含む。
【０１０２】
本発明の方法で得られる飲料は、それらが本発明の方法の過程で導入されたシステインエンドプロテアーゼ又は麦芽抽出物を含有している（酵素は不活性化されているかされていない）点で従来技術の製造プロセスによって得られた飲料と異なり、斯かるシステインエンドプロテアーゼ又は麦芽抽出物は、得られる産物のペプチド及びタンパク質組成を改変し、通常残留タンパク質の存在による混濁の形成の防止又は減少をもたらす。
【０１０３】
本発明の主題は、従って、本発明の方法によって得られる、上記「穀物ベース飲料」で定義した、特に発酵又は非発酵穀物ベース飲料、好ましくはビールを製造することでもある。
【０１０４】
本発明は、下記図面及び実施例によってより詳細に例示され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】実施例３で用いる大麦麦芽抽出物を得るプロトコルの概要を示す。
【０１０６】
【図２】実施例３で得た抽出物及びフラクションのビールのコロイド混濁に対する効果（Ｃｈａｐｏｎ試験）を示す。Ａ：陰性対照（１  ｍＬ  Ｔｐクエン酸０．１  Ｍ  ｐＨ  ４．３  ＋  １  ｍＬ  Ｔｐ  Ｔｒｉｓ  ５０  ｍＭ  ｐＨ  ７．５）；Ｂ：陰性対照（１  ｍＬ  Ｔｐクエン酸５０  ｍＭ  ｐＨ  ５）；Ｃ：陽性（１９０  μＬ  Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標）希釈１／２５  ＋  １  ｍＬ  Ｔｐクエン酸０．１  Ｍ  ｐＨ  ４．３）；Ｄ：粗抽出物（ＥＢ）；Ｅ：上澄み１５％  ＳＡ  ｐＨ  ４．３；Ｆ：  Ｃ  ６５％  ＳＡ  ｄｉａ  （Ｔｐクエン酸５０  ｍＭ  ｐＨ  ５）；Ｇ：不保持（ＮＲ）カチオン交換カラム上（ＳＰ）；Ｈ：前ＤＥＡＥカラム（ＮＲ  ＳＰ  ｄｉａ  ｐＨ  ７．５）；Ｉ：  ＮＲ  ＤＥＡＥ  ４２−８２；Ｊ：  ＮＲ  ＤＥＡＥ  ８３−９５；Ｋ：  ＮＲ  ＤＥＡＥ  ９６−１５０：Ｌ：  ＮＲ  ＤＥＡＥ  １５１−終了；Ｍ：フラクション１６；Ｎ：フラクション２１：Ｏ：フラクション２５；Ｐ：フラクション３１；Ｑ；フラクション３８；Ｒ：フラクション４６；Ｓ：フラクション５５。
【０１０７】
【図３】実施例３で記載するＬｕｎａ  Ｃ１８上のＨＰＬＣ中の大麦麦芽及びＢｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標）の酵素によるＤＴＴを用いたグリアジンの加水分解のクロマトグラムを示す。
【０１０８】
【図４】実施例３で記載するＬｕｎａ  Ｃ１８上のＨＰＬＣにおける大麦麦芽及びＢｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標）の酵素によるＤＴＴを用いたβ‐ラクトグロブリンの加水分解のクロマトグラムを示す。
【０１０９】
【図５】実施例３に記載したｐＨ４での大麦麦芽及びＢｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標）の酵素によるペプチドＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡの加水分解の６時間にわたるキネティクスを示す。
【０１１０】
【図６】実施例３に記載したｐＨ５での大麦麦芽及びＢｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標）の酵素によるＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡペプチドの加水分解の６時間にわたるキネティクスを示す。
【０１１１】
【図７】実施例３に記載したｐＨ４での大麦麦芽及びＢｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標）の酵素によるＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡペプチドの加水分解の６時間にわたるキネティクスを示す。
【０１１２】
【図８】実施例３に記載したｐＨ５での大麦麦芽及びＢｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標）の酵素によるＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡペプチドの加水分解の６時間にわたるキネティクスを示す。
【０１１３】
【図９】実施例１で試験した様々な抽出物のビールのコロイド混濁に対する効果（Ｃｈａｐｏｎ試験）を示す。
【０１１４】
【図１０】実施例２で試験した様々な抽出物のビールのコロイド混濁に対する効果（Ｃｈａｐｏｎ試験）を示す。
【０１１５】
【図１１】実施例４に記載のＬｕｎａ  Ｃ１８上でのＨＰＬＣにおける大麦麦芽及び麦芽の粗抽出物の酵素によるグリアジンの加水分解のクロマトグラムを示す。吸光度は２１４ｎｍで測定した。
【０１１６】
【図１２】実施例５に記載の麦芽抽出物の発酵に対する効果を示す。
【実施例】
【０１１７】
【表１】
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【０１１８】
実施例１：異なる種類の大麦麦芽によるビール混濁の減少
この実施例は、異なる種類の大麦から得た麦芽の抽出物がビールの清澄に用いられ得ることを示す。
【０１１９】
材料及び方法
抽出
様々な種類の大麦の完了した麦芽５０ｇを、ｐＨ４．３の０．２Ｍクエン酸緩衝剤２００ｍＬ中で抽出し、４℃の冷蔵庫中で保存した。それらを最大速度で４０秒間ブレンダー中で混和し、そして１４℃で１０分間３６６０ｒｐｍで遠心分離した。上澄みを回収し、濾紙で濾過して、懸濁粒子を除去した。
【０１２０】
非安定化ビール
この実施例で用いたビールは、缶入りＦｉｎｋ’ｂｒａｕ  Ｂｅｅｒ  ３３  ｃＬを室温（２１℃）に置き、濾紙で濾過し、超音波バス中で２０分間ガス抜きしたものである。
【０１２１】
試料
陽性対照（Ｔ＋）は、０．７５  ｍＬ  Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標）希釈１／２５  ＋  非安定化ビールｑｓｐ  ５０  ｍＬに対応する。
【０１２２】
陰性対照（Ｔ−）は、４  ｍＬ  ０．１  Ｍクエン酸緩衝剤ｐＨ  ４．３  ＋  非安定化ビールｑｓｐ  ５０  ｍＬに対応する。
【０１２３】
試験された試料は、以下の大麦麦芽の抽出物を含む：Ｍｅｔａｘａ  ３０８６  Ｎｇｔ  １，  Ｍｅｔａｘａ  ３３５２  Ｎｇｔ  １，  Ｅｓｔｅｒｅｌ  ２３０３６  Ｂ２ＰＩ，  Ｅｓｔｅｒｅｌ  ２３１４５  Ｂ１ＰＯ，  Ａｒｔｕｒｉｏ  ２３００５  Ｂ２ＰＲ，  Ａｒｔｕｒｉｏ  ２３１８２  Ｂ１ＰＯ，  Ａｚｕｒｅｌ  ２３０５４  Ｂ２ＰＲ，  Ａｚｕｒｅｌ  ２３１０８  Ｂ２ＰＲ，  Ｃｅｒｖｏｉｓｅ  ２３０９４  Ｎｇｔ  １，  Ｃｅｒｖｏｉｓｅ  ３４５３  Ｎｇｔ  １，  Ｃａｒｔｅｌ  ２９６５  Ｎｇｔ  １，  Ｃａｒｔｅｌ  ３２５９  Ｎｇｔ  １，  Ｂｅａｔｒｉｘ  ２３０５０  Ｂ２ＳＡ，  Ｂｅａｔｒｉｘ  ２３１８９  Ｂ２ＳＡ，  Ｓｅｂａｓｔｉａｎ  ９９３  Ｎｇｔ  ２，  Ｓｅｂａｓｔｉａｎ  ２３１１９  Ｂ２ＰＩ，  Ｇｒａｃｅ  ２３０７６  Ｂ３ＳＴ，  Ｇｒａｃｅ  ２３２１９  Ｂ３ＳＴ，  Ｐｒｅｓｔｉｇｅ  ２３０７７  Ｂ３ＳＴ，  Ｃｈｉｌｌ  ２３１５１  Ｂ３ＳＴ，  Ｔｉｐｐｌｅ  ２３１９２  Ｂ２ＰＲ，  Ｔｉｐｐｌｅ  ２３２４９  Ｂ２ＳＡ，  Ｃｈａｍｏｎｉｘ  ４０４  Ｎｇｔ  ２，  Ｃｈａｍｏｎｉｘ  ３２２７  Ｎｇｔ  １，  Ｃｈａｒｍｅｙ  ４３６  Ｎｇｔ  ２，  Ｃｈａｒｍｅｙ  ８９７  Ｎｇｔ  ２，  Ｈｅｎｌｅｙ  ３３１９  Ｎｇｔ  １，  Ｈｅｎｌｅｙ  ３３２８  Ｎｇｔ  １。
【０１２４】
試験された試料は、４ｍＬ抽出物＋非安定化ビールｑｓｐ５０ｍＬからなる。
【０１２５】
前記混合物を３７℃のウォーターバス中で１７時間インキュベーションした。
【０１２６】
Ｃｈａｐｏｎ試験
対照及び試料を３７℃で最小５時間インキュベーションした。透明なプラスチック試験管（ポリスチレン）中、０．６ｍＬの９６％エタノール（＝６％）を、ｑｓｐ１０ｍＬの試料と混合した（ｘ２）。
【０１２７】
当該混合物を、クライオスタットバス中で−８℃で３０分間インキュベーションした。
【０１２８】
濁度は−８℃で測定された。
【０１２９】
結果
図９に結果を示す。これらの結果は、濁度の減少が、麦芽を得るのに元にした大麦の種類に拘らず観察されることを示す。
【０１３０】
実施例２：小麦麦芽を用いたビール混濁の減少
この実施例は、小麦麦芽抽出物がビール清澄に用いられ得ることを示す。
【０１３１】
材料及び方法
抽出
様々な種類の大麦の完了した麦芽５０ｇを、ｐＨ４．３の０．１Ｍクエン酸緩衝剤２００ｍＬ中で抽出し、４℃の冷蔵庫中で保存した。それらを最大速度で４０秒間ブレンダー中で混和し、そして１４℃で１０分間３６６０ｒｐｍで遠心分離した。上澄みを回収し、濾紙で濾過して、懸濁粒子を除去した。
【０１３２】
非安定化ビール
この実施例で用いたビールは、缶入りＦｉｎｋ’ｂｒａｕ  Ｂｅｅｒ  ３３  ｃＬを室温（２１℃）に置き、濾紙で濾過し、超音波バス中で２０分間ガス抜きしたものである。
【０１３３】
試料
陽性対照（Ｔ＋）は、０．７５  ｍＬ  Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標）希釈１／２５  ＋  非安定化ビールｑｓｐ  ５０  ｍＬに対応する。
【０１３４】
陰性対照（Ｔ−）は、４  ｍＬ  ０．１  Ｍクエン酸緩衝剤ｐＨ  ４．３  ＋  非安定化ビールｑｓｐ  ５０  ｍＬに対応する。
【０１３５】
試験された試料は、以下の大麦麦芽抽出物を含む：大麦麦芽Ｃｈｉｌｌ  ２２３０４  Ｂ２ＢＲ，  大麦麦芽Ａｒｔｕｒｉｏ  ２３１７５  Ｂ１ＣＡ，  大麦麦芽ｄｉａｓｔａｓｉｃ  Ａｒｔｕｒｉｏ  ２３１１２  Ｂ２ＢＲ，  小麦麦芽Ａｐａｃｈｅ  ２３０８６  （Ａｒｃｉｓ  ｓｕｒ  Ａｕｂｅ）及び小麦麦芽Ｂａｇｏｕ  （Ａｒｃｉｓ  ｓｕｒ  Ａｕｂｅ）。
【０１３６】
試験された試料は、０．５，  １，  ２，  ３又は４ｍＬ抽出物＋非安定化ビールｑｓｐ５０ｍＬからなる。
【０１３７】
前記混合物を、３７℃ウォーターバス中で１７時間インキュベーションした。
【０１３８】
Ｃｈａｐｏｎ試験
対照及び試料を３７℃で最小５時間インキュベーションした。透明なプラスチック試験管（ポリスチレン）中、０．６ｍＬの９６％エタノール（＝６％）を、ｑｓｐ１０ｍＬの試料と混合した（ｘ２）。
【０１３９】
当該混合物を、クライオスタットバス中で−８℃で３０分間インキュベーションした。
【０１４０】
濁度は−８℃で測定された。
【０１４１】
結果
図１０に結果を示す。これらの結果は、濁度の減少が、糖化性大麦麦芽と同様に糖化性小麦麦芽でも観察されることを示す。
【０１４２】
実施例３：濁度に対する効果に関与する酵素の麦芽抽出物中の同定
この実施例は、麦芽抽出物のビール混濁に対する効果及びこの効果におけるシステイン大麦エンドプロテアーゼの関与を示す。
【０１４３】
材料及び方法
材料
様々な実験に用いる麦芽は、Ｓｏｕｆｆｌｅｔ麦芽（Ｎｏｇｅｎｔ  ｓｕｒ  Ｓｅｉｎｅ／Ａｕｂｅ）により麦芽化された変異Ｂｅａｔｒｉｘ  （ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）の大麦穀物から得られたが、酵素は、それらが冬（２又は６行）又は春に拘らず、全ての種類の大麦に存在する。
【０１４４】
麦芽は、Ｆｒｉｔｓｃｈ  （Ｇｅｒｍａｎｙ）社製バイブレーティングフィーダーＬ２４中ですり潰された。
【０１４５】
電気泳動緩衝剤及びゲルに用いる様々な製品は、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ，  Ｃａｒｂｏ  Ｅｒｂａ及びＳｉｇｍａから供給された。４０％アクリルアミドはＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製である。
【０１４６】
タンパク質の比色的決定は、Ｕｐｔｉｍａ  Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ製ＢＣ  Ａｓｓａｙキットを用いて実施された。
【０１４７】
イオン交換クロマトグラフィーは、ＸＫ  ２６／１０カラム及びＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＳＰ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  （ＦＦ）  ５０  ｍｌゲル及びＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＤＥＡＥ  ＦＦ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  ＵＳＡ）を用いてＦＰＬＣ  Ａｋｔａ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００及びＡｋｔａ  Ｐｒｉｍｅ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  ＵＳＡ）上で実施された。他の種類のカチオン及びアニオン交換カラム上でも分離は可能である。
【０１４８】
濾過ゲルは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＨＲ  （Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）  Ｓ２００  （１６／６０）及びＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２  （１０／３０）カラムを用いてＦＰＬＣ  Ａｋｔａ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＡｋｔａ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  ＵＳＡ）上で実施された。
【０１４９】
タンパク質検出は、２１５、２６０及び２８０ｎｍの３波長分光光度計によって実施された。
【０１５０】
ＨＰＬＣ解析は、Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｗａｔｅｒｓ  ２７９５分離モジュール／Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ｄｕａｌ  λ吸光度検出器上で実施され、使用されたカラムはＬｕｎａ  ５μ  （Ｃ１８）  １００Å  （２５０  ×  ４．６０  ｍｍ）  （Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）であった。タンパク質の検出は、２１４及び２８０ｎｍの２波長分光光度計によって実施された。
【０１５１】
試料は、質量分析器によって、トリプトン消化の後、ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ  ＥＳＩ  ＯＲＢＩＴＲＡＰ  Ｖｅｌｏｓ上で解析された。ペプチド解析物は、Ｍａｓｃｏｔ  ２．２ソフトウエアを使用して実施された。
【０１５２】
酵素のモデリングは、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ  ９．１４ソフトウエアを使用して実施された。
【０１５３】
遠心分離は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ａｖａｎｔｉ  （ＵＳＡ）  Ｊ２６  ＸＰ  （ｒｏｔｏｒ：  ＦｉｂｅｒＬｉｔｅ（登録商標）Ｆ１０ＢＣＩ  −  ６ｘ５００ｙ）を用いて実施された。
【０１５４】
混濁は、Ｐｆｅｕｆｆｅｒ  ｔａｎｎｏｍｅｔｅｒ  （Ｇｅｒｍａｎｙ）上で、Ｈｕｂｅｒｔ  Ｖａｒｉｏｓｔａｔ  ＣＣ浸漬クライオサーモスタットに通した後測定された。非安定化対照ビールはＦｉｎｋ’ｂｒａｕ  （Ｌｉｄｌ）であり、陽性対照はＢｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標）（ＤＳＭ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）である。
【０１５５】
加水分解試験に用いるβ−ラクトグロブリン及びグリアジン（全）が供給され、Ｎａｎｔｅｓ  （ＢＩＡ  ｃｅｎｔｅｒ  Ａｎｇｅｒｓ−Ｎａｎｔｅｓ／Ｌｏｉｒｅ  Ａｔｌａｎｔｉｑｕｅ）のＩＮＲＡによって精製された。
【０１５６】
ペプチドＺ−ＧＰ−ｐＮＡ及びＺ−ＦＲ−ｐＮＡは、Ｂａｃｈｅｍ  （Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）社由来のものである。
【０１５７】
ＯＤは、Ｅｐｏｃｈプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ，  ＵＳＡ）によって読まれた。
【０１５８】
透析膜は、カットオフ閾値１２〜１４０００Ｄａのヴィスキング膜であった。
【０１５９】
緩衝剤の調製
ｐＨ４．３の０．１Ｍクエン酸緩衝剤は、０．１Ｍクエン酸（ＭＷ  ＝  ２１０．１４  ｇ／ｍｏｌ  Ｌ−１）で調製され、クエン酸ナトリウムを０．１Ｍ（ＭＷ  ＝  ２９４．１  ｇ／ｍｏｌ  Ｌ−１）まで添加してｐＨ４．３に調整した。使用した他のクエン酸緩衝剤において、それらも、指定のモル濃度での溶液を用いて調製され、クエン酸ナトリウムの添加によって所望のｐＨに調整された。
【０１６０】
凍結乾燥試験の緩衝剤は、１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ  ８．５  （ＰＭ  Ｔ５ｒｉｓ  ＝  １２１．１４  ｇ／ｍｏｌ  Ｌ−１）に、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）  ５  ｍＭ  （ＭＷ  ＝  ２９２．２４  ｇ／ｍｏｌ  Ｌ−１），  ２  ｍＭシステイン（ＭＷ  ＝  １２１．２  ｇ／ｍｏｌ  Ｌ−１），  ４％マンニトール（ｗ／ｖ）及び１％スクロース（ｗ／ｖ）を添加して調製した。
【０１６１】
抽出物の調製
麦芽穀物を液体窒素下で０．５ｍｍにすり潰した。４８ｇのＭＳｉ  （Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｄｒｙ  Ｍａｔｅｒｉａｌ）粉を、ｐＨ４．３の０．１Ｍクエン酸緩衝剤２００ｍＬ中に懸濁し、７℃で３０分間磁石で撹拌した。１００００ｒｐｍ、２０分、７℃で遠心分離した後、上澄みを回収し、濾紙で濾過した。これを「粗抽出物」（ＥＢ）と表記する。このＥＢを、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２  ＳＯ４）（ＳＡ）２６％飽和又は１５％ｗ／ｖで処理し、７℃で３０分間磁石で撹拌した。続いて２０分間７℃１００００ｒｐｍで２回目の遠心分離を行った。上澄みを回収し、濾紙で濾過した。従って、「１５％硫酸アンモニウムで処理した上澄み」（ＳＮ−１５％−ＳＡ）が取得された。ＳＡがＳＮ−１５％−ＳＡに添加されて、最終的に８９％飽和又は６５％ｗ／ｖに至った。１時間３０分間７℃で置いた後７℃で磁石で撹拌して、抽出物を、もう一度２０分間７℃で１００００ｒｐｍで遠心分離した。上澄みを回収し、取得されたベースを、ｐＨ４．３の０．１Ｍクエン酸緩衝剤５０ｍｌ中に再懸濁し、それを最初に２Ｌの蒸留水中で３０分間、続いてｐＨ５の５０ｍＭクエン酸緩衝剤２Ｌ中で２回、そしてもう一度ｐＨ５の５０ｍＭクエン酸緩衝剤５Ｌに対して一昼夜透析して、Ｃ６５％ＳＡ  ｄｉａ  ｐＨ  ５  （ｐＨ５の硫酸アンモニウムで透析したベース６５％）と呼ばれる最終抽出物を得た。これは、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ上に通すための「順カラム」（ＡＣ）でもある（図１）。
【０１６２】
Ｃｈａｐｏｎ試験
ビールの濁りを減少する効率の試験は、全てＣｈａｐｏｎ試験によって実施された（Ｃｈａｐｏｎ  （１９９３）  Ｊ．  Ｉｎｓｔ，  Ｂｒｅｗ  ９９：  ４９−５６）。２ｍｌの試料を２５ｍｌ  ｑｓの非安定化ビールと混合して、それをウォーターバス中で５時間以上３７℃でインキュベーションした。ポリスチレン試験管中に９．４ｍｌのインキュベーションした試料を取り、０．６ｍｌの９６％エタノールを添加した。試験は２回繰り返された。クライオスタットバス中で−８℃で３０分間インキュベーションした後、Ｐｆｅｕｆｆｅｒ濁度計上で−８℃で濁度を測定した。結果はＥＢＣ  （Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｒｅｗｅｒｙ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）  （０．２５  ＥＢＣ  ＝  １  ＮＴＵ  （Ｎｅｐｈｅｌｏｓ  Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ  Ｕｎｉｔ））で表現される。
【０１６３】
イオン交換クロマトグラフィー
カチオン交換クロマトグラフィー  第一の工程において、抽出物（ｐＨ５で透析した）を、５０ｍＭクエン酸緩衝剤ｐＨ  ５  （＝  ｔｐ  Ａ  ）、フロー＝  １３  ｍｌ／ｍｉｎ  （１４７  ｃｍ／ｈ）で平衡化したカラム（ＸＫ  ２６／１０）  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＳＰ  ＦＦ上に置いた。溶出は、２５ＣＶ（カラム体積）中のＢｕｆｆｅｒ  Ｂ  （ｔｐ  Ａ  ＋  １  Ｍ  ＮａＣｌ）の０〜５０％線形勾配によってイオン強度を増大して実施した。２ＣＶ中の５０％のＢでのプラトーの後、カラムを７ＣＶ中の１００％Ｂで洗浄し、そして緩衝剤Ａで再バランスした。１５ｍｌのフラクションを回収した。Ｃｈａｐｏｎ試験において活性な「非保持」フラクションのみ回収された（ＮＲ  ＳＰ）。
【０１６４】
アニオン交換クロマトグラフィー
５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝剤、ｐＨ  ７．５  （＝  ｔｐ  Ａ２）の５ｌバス中で２回２時間そして一晩の透析の後、ＮＲ  ＳＰは、緩衝剤Ａ２で平衡化したＤＥＡＥ  ＦＦ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上に留置され、流速＝５ｍｌ／ｍｉｎ及び流出は８０分間線形勾配０〜３０％のＢ２緩衝剤（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．５  ＋  １  Ｍ  ＮａＣｌ）、続いて３０％で１０分間の段階、及び１００％の緩衝剤Ｂ２で２０分間により実施された。回収されたフラクションは２ｍＬであった。
【０１６５】
ゲル濾過
Ｃｏｌｕｍｎ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｓ２００  −  ＥＰ−Ｂ  を含有するＳＰ／ＤＥＡＥフラクション５ｍＬ（４．４ｍｇのタンパク質）を  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｓ２００カラム上に置いた。流速は  ０．５  ｍＬ／ｍｉｎ  で、使用した緩衝剤は５０ｍＭクエン酸緩衝剤ｐＨ４．５であった。５ｍＬのフラクションを回収した。
【０１６６】
Ｃｏｌｕｍｎ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  −  ＥＰ−Ａを含有するＳＰ／ＤＥＡＥフラクション１．５ｍＬ（１．７５ｍｇのタンパク質）を  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｓ２００カラム上に置いた。フラクションはあらかじめ０．５ｍＬのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １０ＫＤａ  セル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｉｒｅｌａｎｄ）で濃縮された。流速は０．８ｍＬ／ｍｉｎ  で、使用した緩衝剤は５０ｍＭクエン酸緩衝剤ｐＨ４．５であった。２ｍＬのフラクションを回収した。
【０１６７】
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＰＡＧＥ、ザイモグラム、トリシン）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  様々な資料が、１２％アクリルアミド分離ゲル及び５％分離ゲルを有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で、Ｌａｅｍｍｌｉの技術（Ｌａｅｍｍｌｉ  （１９７０）  Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：  ６８０−６８５）に従って解析された。移動は、濃縮ゲルにおいて１０ｍＡ下、及び分離ゲルにおいて２０ｍＡ下、Ａｔｔｏ倒立電気泳動セル中で室温で実施された。ゲルに依存して、色は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｒ２５０ブルー又はＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｇ２５０  ブルーのいずれかを用いて付けられた。ウェルにおいて、５μｌの公知の分子量スタンダード及び２０μｌ試料が置かれた。試料は以下のように調製された。４０μＬの試料＋２０μＬの変性溶液（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ６．８，  ２０％  グリセロール，  ４％  ＳＤＳ，  ０．０１％ブロモフェノールブルー）＋３μＬのβ‐メルカプトエタノール。
【０１６８】
Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ  −  プロトコールは、ＳＤＳの存在以外はＰＡＧＥゲルと同じであった。
【０１６９】
ＳＤＳ−Ｔｒｉｃｉｎｅ  ＰＡＧＥ  −  ＳＤＳ−トリシンＰＡＧＥは、Ｓｃｈａｇｇｅｒ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｊａｇｏｗ  （１９８７）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １６６：  ３６８−３７９  のプロトコールに従い、質量分析器によるバンドの解析前の分離のための１０％アクリルアミドゲル上で、又はホルデインの加水分解の試験においては１６％で実施された。ゲルはＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｇ２５０ブルーで染色された。
【０１７０】
ザイモグラム  −  ザイモグラムは、Ｐｒａｂｕｃｋａ  ａｎｄ  Ｂｉｅｌａｗｓｋｉ  （２００４）  Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ．  ２６：  ３８３−３９１  のプロトコールに従い０．１％グリアジンが含まれた１２％ＰＡＧＥゲル上で実施された。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｒ２５０ブルーによる染色の前に、ゲルを２回１時間ｐＨ４．３の０．１Ｍクエン酸緩衝剤で濯ぎ、そして０．１Ｍクエン酸緩衝剤ｐＨ４．３／４ｍＭシステイン中、４０℃で一昼夜インキュベーションした。
【０１７１】
質量分析器による解析
ＳＤＳ−Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＰＡＧＥ及びＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｇ２５０  ブルーでの染色の後、所望のバンドを滅菌条件下でカッターで切り出し、それをＮａｎｔｅｓ  のＩＮＲＡのＢＩＢＳプラットフォーム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｂｓ．ｉｎｒａ．ｃｏｍ）によって解析した。
【０１７２】
ホルデイン、グリアジン及びβ‐ラクトグロブリンの加水分解
ホルデインの加水分解：０．５ｍｍに挽いた大麦穀物粉２５ｇを２００ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＣｌと１時間室温で磁石による撹拌で混合した。この混合物を、１００００ｒｐｍで３０分間１２℃で遠心分離した。上澄みを除去し、ベースを２００ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＣｌ中に懸濁し、１時間室温で撹拌した。  １００００ｒｐｍで３０分間１２℃で遠心分離した後、上澄みを除去し、ベースを−２０℃で凍結し、そして凍結乾燥した。
【０１７３】
当該凍結乾燥物を、６０℃で４５分間５０％プロパノール（１５ｍＬ／ｇ）中で磁石撹拌で再懸濁し、そして１００００ｒｐｍで３０分間１２℃で遠心分離した。この上澄みを「プロパノール上澄み」と呼び、４℃で保存され、ベースはもう一度５０％プロパノールで抽出された。
【０１７４】
ベースを５０％プロパノール（１５  ｍＬ／ｇ）  ＋  ２％のβ−メルカプトエタノール（βＭＥ）中に６０℃で４５分間磁石撹拌で懸濁した。そしてそれを１００００ｒｐｍで３０分間１２℃で遠心分離した。「  プロパノール／β−メルカプトエタノール上澄み」と名付けられた上澄みを４℃で保存した。ベースは、もう２回この工程を繰り返した。
【０１７５】
プロパノール及びプロパノール／βＭＥ上澄みを、別個に滅菌水２０Ｌに対して透析し（３バス２時間一昼夜）、そして１００００ｒｐｍで３０分間１２℃で遠心分離した。
【０１７６】
ベース及び上澄みを−２０℃で凍結し、そして凍結乾燥した。凍結乾燥物を挽いて微粉末とし、−２０℃で保存した。
【０１７７】
抽出の最後に、プロパノール（Ｈ）及びプロパノール／β‐メルカプトエタノールホルデイン（ＨＰβＭＥ）を得た（Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏ  （１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｉｎｓｔ  Ｂｒｅｗ  ９８：  ４７１−４７８，  Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ  （１９９６）  Ｐｌａｎｔａ  １９９：  ５６５−５７２）。
【０１７８】
これらの抽出物は溶解が困難なため、それらは、解析前に脱脂質化（ｄｅｌｉｐｉｄａｔｅｄ  ）された。ＨＰは、以下のプロトコールに従い脱脂質化された。１５ｍＬガラス管の中で、０．３０２ｇのＨＰが計量され、１０ｍＬのジクロロメタン＋５ｍＬのアセトン中に懸濁された。２０分間ボルテックスし、４℃で１０分間３０００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄みを除去し、ベースを２回処理し、そして真空下で乾燥し、−２０℃で保存した。得られた抽出物は、ＨＰｄｌと呼ばれる。
【０１７９】
ホルデインの加水分解：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ解析  ‐  ホルデイン（ＨＰｄｌ）  （１  ｍｇ／ｍＬ）を、１０ｍＭのβ‐メルカプトエタノールを含有するｐＨ４．５の２０ｍＭコハク酸ナトリウム緩衝剤中に懸濁した後、ＥＰ−Ｂを含有するフラクション及び陽性対照（Ｂｒｅｗｅｒ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標））として、２μｇのタンパク質を添加した。インキュベーションは４０℃で実施された。２０μＬの反応混合物が異なる時間に取られ（Ｔ  ＝  ０／５／１５／３０／６０／９０ｍｉｎ／２ｈ／４ｈ  ａｎｄ  ２４ｈ）、変性緩衝剤で希釈され、煮沸により反応を停止し、そしてＳＤＳ−Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＰＡＧＥ  １６％ゲルで解析するまで‐２０℃で凍結された。逆相ＨＰＬＣによる解析の場合、１００μＬの２４ｈ抽出物が取られた。
【０１８０】
グリアジン及びβ‐ラクトグロブリンの加水分解：逆相ＨＰＬＣ
解析：β‐ラクトグロブリン及びグリアジンの場合、１ｍｇ／ｍＬ溶液をｐＨ４の５０ｍＭ酢酸緩衝剤中で調製した。試験は、インキュベーションする前に２ｍＭの最終濃度となるまで、ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加することによっても実施された。加水分解反応を開始するために、２００μＬの基質＋／−  ４  μＬの０．１  Ｍ  ＤＴＴ中に、２及び５μｇのタンパク質（ＥＰ−Ｂ／ＥＰ−Ａ及びＢＣ）が添加された。反応混合物を、４０℃で２０時間インキュベーションした。
【０１８１】
逆相ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）
を溶出剤Ａ（Ｈ２Ｏ  ｍｉｌｌｉＱ  ＋  トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）  ０．１１％）で平衡化し、溶出は、グリアジンの加水分解の場合、流速１ｍＬ／ｍｉｎで５４分間における０〜５０％溶出剤Ｂ（アセトニトリル＋０．０９％ＴＦＡ）の線形勾配によって、そしてホルデインの加水分解の場合、流速０．８ｍＬ／ｍｉｎで３２分間における０〜６０％Ｂの線形勾配によって、実施された。
【０１８２】
５０μＬの試料を注入した。読み取りは２１４ｎｍ及び２８０ｎｍで行われ、カラム温度は５０℃で維持された（Ｍａｒｃｈｙｌｏ  ａｎｄ  Ｋｒｕｇｅｒ  （１９８４）  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ．，  ６１：  ２９５−３０１，  Ｍａｒｃｈｙｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ．  ６３：  ２１９−２３１）。
【０１８３】
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ及びＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡ  ペプチドの加水分解
試験された各ペプチドにおいて、加水分解はｐＨ４及びｐＨ５で実施された（Ｄａｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １１７：  ２５５−２６１，  Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  １６１：  ８２５−８３８）。
【０１８４】
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡペプチド（Ｚ−ＧＰ−ｐＮＡ）の加水分解  −  １７．６μｇのタンパク質を、ｑｓｐ５００μＬの酸緩衝剤０．１Ｍクエン酸／０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ４又は５）及び１２５μＬの１０ｍＭ基質（同一の緩衝剤＋４０％ジオキサン中で可溶化）と共に、各酵素ＥＰ−Ａ，  ＥＰ−Ｂ及びＢＣ  と反応させた。基質中の反応体積（ＶＲ）における最終濃度は、従って、２ｍＭ及び８％ジオキサンであった。
【０１８５】
各試料において、加水分解は２回実施された（９６ウェルのマイクロプレート中に２５０μＬのＶＲを置く）。
【０１８６】
ｐＮＡの放出は、異なる時間での４１０ｎｍのＯＤを読み取って追跡された（Ｔ  ＝  ０／１０／２０／３０／４０／５０／６０ｍｉｎ及び１ｈ３０／２ｈ／２ｈ３０／３ｈ／３ｈ３０／４ｈ／４ｈ３０／５ｈ／５ｈ３０／６ｈ及び２４ｈ）。
【０１８７】
Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡペプチド（Ｚ−ＦＲ−ｐＮＡ）の加水分解  −  １７．６μｇのタンパク質を、ｑｓｐ５００μＬの５０ｍＭ酢酸緩衝剤（ｐＨ４又は５）＋５％ＤＭＳＯ及び１２５μＬの１０ｍＭ基質（同一の緩衝剤中で可溶化）と共に、各酵素ＥＰ−Ａ，  ＥＰ−Ｂ及びＢＣと反応させた。基質中の反応体積（ＶＲ）における最終濃度は、従って、２ｍＭであった。
【０１８８】
各試料において、加水分解は２回実施された（９６ウェルのマイクロプレート中に２５０μＬのＶＲを置く）。
【０１８９】
ｐＮＡの放出は、異なる時間での４１０ｎｍのＯＤを読み取って追跡された（Ｔ  ＝  ０／１０／２０／３０／４０／５０／６０ｍｉｎ及び１ｈ３０／２ｈ／２ｈ３０／３ｈ／３ｈ３０／４ｈ／４ｈ３０／５ｈ／５ｈ３０／６ｈ及び２４ｈ）。
【０１９０】
凍結乾燥試験
麦芽抽出物がＳＰ及びＤＥＡＥカラムを通過した後、酵素ＥＰ−Ｂの分離ピークに対応するフラクションを組み合わせた。得られた最終体積は２つに分けられ、そして別個に３０分間滅菌水中で、続いて２ｈバスにより、そして４℃で一昼夜、１つは５０ｍＭクエン酸緩衝剤ｐＨ４．２中で、そしてもう一つはＴｒｉｓ／ＨＣｌ／ＥＤＴＡ／Ｃｙｓｔｅｉｎｅ／Ｍａｎｎｉｔｏｌ／Ｓｕｃｒｏｓｅ  中で、透析された。
【０１９１】
透析後の体積をもう一度２つに分けた。第一の部分は、Ｃｈａｐｏｎ試験における解析まで−２０℃で保存され、第二の部分は凍結乾燥された。凍結乾燥物は凍結乾燥機上に置かれた最初の体積と等しい体積の蒸留水中に懸濁し、それがＣｈａｐｏｎ試験において解析された。
【０１９２】
結果
大麦麦芽の酵素抽出物の各段階で得られた抽出物の効率のＣｈａｐｏｎ試験における比較
混濁の低下を測定することにより、Ｃｈａｐｏｎ試験は、精製の過程での活性フラクションの選択を可能とする。従って、硫酸アンモニウムを用いたフラクション化の後、発明者らは、透析されたＳＮ１５％ＳＡ及び透析されたＣ６５％ＳＡにおいて活性が保存されることを示した（図２）。透析されたＣ１５％ＳＡ及び透析されたＳＮ６５％ＳＡは、活性を有しない。同等の量のタンパク質（１ｍｇ）を添加することによって実施されたＣｈａｐｏｎ試験は、Ｃ６５％ＳＡ  ｄｉａにおける強い活性の増大を示した  （ＥＢにおいて１０８  ＥＢＣ、Ｃ６５％ＳＡ  ｄｉａ  において５０．２  ＥＢＣ）。従って、硫酸アンモニウム処理は、所望の酵素の第一の濃縮及び精製を可能とする。
【０１９３】
イオン交換クロマトグラフィーによる大麦麦芽からの酵素の分離
カチオン交換カラム（ＳＰ）上での麦芽抽出物（ｐＨ５で透析したＣ６５％ＳＡ）のクロマトグラフィー後に溶出したフラクションのＣｈａｐｏｎ試験による解析は、カラムに保持されないフラクション中に酵素活性があることを示した。このフラクションは、そして、アニオン交換カラム（ＤＥＡＥ）上で分離された。この第二のクロマトグラフィーは、５．２及び６．１ＥＢＣでビールの濁度を減少出来る２つの酵素フラクションを単離することを可能とする（図２、フラクション３１及び４６）。
【０１９４】
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＰＡＧＥ、ザイモグラム）による解析
電気泳動による解析は、フラクション３１が、約３５ｋＤａで主要なグループを含む幾つかのタンパク質バンド、約６０ｋＤａのバンド、及びより薄い約３０ｋＤａのバンドからなる。ザイモグラムは、プロリンに富むタンパク質（グリアジン）を加水分解できる酵素のフラクション３１及び４６／４７における存在を確認した。これらの２つのフラクション中の酵素は、それらが異なることを示唆する異なる動きを有した。
【０１９５】
ゲルろ過による大麦麦芽からの酵素の分離
イオン交換クロマトグラフィーによる大麦麦芽からの所望の酵素の分離の後、発明者らは、酵素活性を呈するフラクションの純度を高めるため、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いた。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｓ２００カラム上でのフラクション３１の分離は、２つの肩によって先行される主要ピークを示した。Ｃｈａｐｏｎ及びザイモグラム解析は、主要ピークに対応する１Ｃ４フラクション中に酵素が存在することを明らかにした。ＳＤＳ電気泳動によって、発明者らは、このフラクションが、３５ｋＤａの領域中の幾つかのタンパク質バンドで構成されることを見出した。
【０１９６】
フラクション４７のクロマトグラムは、幾つかのはっきり分離していないピークを示した。Ｃｈａｐｏｎ及びザイモグラム解析は、第一のピークに対応する５Ａ５フラクション中に酵素が存在することを示した。
【０１９７】
質量分析器による酵素の特定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、フラクション３１及び４６のタンパク質バンドを切り出し、トリプトン加水分解の後、質量分析器によって解析した。フラクション３１の場合、ＰＭ３０ｋＤａ及び２８ｋＤａの２つのバンドは、システインプロテアーゼ：ＥＰ−Ｂ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｕｎｉｐｒｏｔ：  Ｐ２５２４９  （配列番号３）又はＰ２５２５０  ：  ４））の成熟型に対応する。このプロテアーゼの２つのバリアントが記載されているが、これらの２つのバリアントの間の相違はとても小さく、いずれのバリアントが存在するかを表示するのは困難である。ＥＰ−Ｂ  Ｐ２５２４９及びＰ２５２５０  は、  ＰＭ  ２５１８０及び２５３１８及びｐＩ  ４．７７及び４．９６のプロテアーゼである。フラクション３１は、βーアミラーゼ（ＰＭバンド６００００）及びセルピン（３５０００付近のバンドの群）も含む。
【０１９８】
フラクション４８の場合、システインプロテアーゼは、システインプロテアーゼＥＰ−Ａ  （Ｕｎｉｐｒｏｔ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：  Ｏ０４６７５  （配列番号１）又はＯ０４６７７  （配列番号２））の成熟型に対応するＰＭ３０及び２８ｋＤａの２つのバンド中にも見られた。ＥＰ−Ｂと同様に、バリアントが２つ存在するが、解析は、いずれのバリアントが存在するかを特定できない。成熟タンパク質配列に基づき、これらのプロテアーゼは、それぞれＰＭが２５５９０及び２５６４８、ｐＩが４．４及び４．３７  である。電気泳動で観察された他のバンドも、β‐アミラーゼ及びセルピンに対応する。
【０１９９】
配列アラインメントは、２つのＥＰ−Ｂの配列及び２つのＥＰ−Ａの配列が、それぞれ９８％及び９９％のアミノ酸の同一性を有することを示した。対照的に、ＥＰ−ＡとＥＰ−Ｂの配列同一性は５２％であった。これらの２つのシステインプロテイナーゼは類似の構造を有し、システイン（２８）、アスパラギン酸（１６２）及びヒスチジン（１６３）の３つのアミノ酸で構成される同一の触媒部位を有する。それらは陽性対照酵素（Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標））と比較してビール混濁の減少に対する類似の効果を有するが、それらは確かに異なる。実際に、それらは、Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標）と比較して、それぞれ僅か９及び１１％しかアミノ酸配列が共通しない。更に、このアラインメントに要する多くのギャップは、これらの酵素が構造的関連性を有しないことを示す。この構造的同一性の欠如は、酵素の３Ｄモデリングを用いても実証され得る。
【０２００】
ホルデイン、グリアジン及びβ‐ラクトグロブリンの加水分解
ホルデインの加水分解の電気泳動解析
ゲル解析によるホルデインの加水分解のモニタリングは、ＥＰ−Ｂがより効果的であるように見られるものの、ＥＰ−Ｂ及び陽性対照の間に作用のメカニズムの実際の相違が存在するか否かを結論付けることを可能としなかった。実際に、反応２４時間後に目視できるバンドはもはや無く、一方、Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標）の存在下２４時間後に、バンドはまだ観察され得る。
【０２０１】
ホルデイン加水分解のＨＰＬＣ解析
ＥＰ−Ｂに富むフラクション（フラクション３１）は、ホルデインを加水分解でき、それらを陽性対照（Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標））とは異なる形で分解する。実際に、クロマトグラムは、生成される幾つかのペプチドが異なることを示した。
【０２０２】
グリアジン加水分解のＨＰＬＣ解析
グリアジンの場合、クロマトグラムは、大麦麦芽酵素（ＥＰ−Ｂ及びＥＰ−Ａ）と陽性対照（Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標））との間の異なる作用を示した。システインプロテイナーゼによる加水分解（ＤＴＴの存在下）が、Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（ＢＣ）と異なり完全であると示された。非常に多くの親水性ペプチドが、クロマトグラムを比較するのを困難にする様々な酵素による加水分解によって生成されている。発明者らは、Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘと前記２つの大麦麦芽のプロテアーゼとの間、及びそれらの２つのプロテアーゼの間に、幾つかの相違を尚も見ている（図３）。
【０２０３】
β‐ラクトグロブリン加水分解のＨＰＬＣ解析
β‐ラクトグロブリンの加水分解の場合、クロマトグラムも、大麦麦芽酵素（ＥＰ−Ｂ及びＥＰ−Ａ）と陽性対照（Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標））との間の異なる作用を示した。この違いは、ＤＴＴの存在に拘わらず見られる（図４）。
【０２０４】
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ及びＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡペプチドの加水分解並びにＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ  ペプチドの加水分解
Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標）のみ、実施された試験においてＺ−ＧＰ−ｐＮＡペプチドの加水分解が可能であった（図５及び６）。加えて、Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘは、ｐＨ４及びｐＨ５で等しく効果的であった。大麦麦芽酵素において：ＥＰ−Ａ及びＥＰ−ＢはゼロＯＤで、インキュベーションの２４時間後であっても、反応はｐＨ４又は５で実施される。
【０２０５】
この実験は、Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘの作用部位が、システインプロテイナーゼＥＰ−Ａ及びＥＰ−Ｂのものと異なることを実証する。
【０２０６】
Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡ  ペプチドの加水分解
Ｚ−ＦＲ−ｐＮＡの場合、加水分解は、ＥＰ−Ｂ酵素の場合にのみ見られる。ＥＰ−Ａ又はＢｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘでは消化は見られない。加えて、ＥＰ−ＢはｐＨ４でより効果的である。実際に、ｐＨ５でのＯＤは、ｐＨ４の半分である。
【０２０７】
この試験は、大麦麦芽が異なるブリード部位を有するだけでなく、Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘとも異なるという結論を導く（図７及び８）。
【０２０８】
凍結乾燥試験
発明者らは、酵素活性は凍結乾燥後に維持されたことを観察した。
【０２０９】
２つの試験された緩衝剤は、活性を維持できるが、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ／Ｃｙｓｔｅｉｎｅ／ｍａｎｎｉｔｏｌ／ｓｕｃｒｏｓｅ  緩衝剤はより効果的である。
【０２１０】
結論
発明者らは、大麦麦芽から単離した２つの酵素フラクションが、ビールのコロイド混濁を減少し、穀物のプロラミン（ホルデイン及びグリアジン）を加水分解することを示した。これらの２つの酵素フラクションは、大麦のシステインプロテイナーゼである２つのプロテアーゼＥＰ−Ｂ及びＥＰ−Ａにそれぞれ富む。これらの２つの酵素はアミノ酸配列が非常に類似しており、配列はＢｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標）酵素の配列と全く共通していない。最後に、プロラミン（ホルデイン及びグリアジン）及びβ‐ラクトグロブリンの加水分解、並びにＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ及びＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡ  の加水分解は、これらのシステインプロテイナーゼが異なる特異性（開裂部位）を有し、その点も、Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標）酵素と異なっている。
【０２１１】
実施例４：ＥＰ−Ａ、ＥＰ−Ｂ及び麦芽の粗抽出物によるグリアジンの加水分解
この実施例は、酵素ＥＰ−Ａ及びＥＰ−Ｂが異なる方式でグリアジンを開裂することを示し、これは、これらの２つの酵素の作用における相乗効果を示唆する。
【０２１２】
材料及び方法
グリアインは、５０ｍＭ酢酸中で４ｍｇ／ｍｌで可溶化し、そしてｐＨ５の５０ｍＬ酢酸ナトリウム緩衝剤で１ｍｇ／ｍＬに希釈し、そして様々な抽出物と混合した。グリアジンと酢酸緩衝剤の混合物は対照Ｔ、グリアジンと実施例３で記載したように得られた粗抽出物との混合物はＥＢ、グリアジンと実施例３で記載したように得られたＥＰ−Ａとの混合物はＥＰ−Ａ、グリアジンと実施例３で記載したように得られＥＰ−Ｂとの混合物はＥＰ−Ｂと表記する。これらの混合物を撹拌しながら３７℃で一昼夜インキュベーションした。
【０２１３】
添加した酵素の量は、基質酵素比が４％となるように計算された。試料は３７℃で１８時間インキュベーションした後、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で解析された。
【０２１４】
逆相ＨＰＬＣ解析：
逆相カラム：Ｌｕｎａ，  Ｃ１８，  １００Ａ，  ５μｍ，  ２５０Ｘ４，６  ｍｍ  （Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）
溶出剤Ａ：Ｈ２Ｏ，  ＴＦＡ  ０．１１％
溶出物Ｂ：アセトニトリル，  ＴＦＡ  ０．０９％
流速１ｍｌ／ｍｉｎ；分光光度計検出２１４及び２８０ｎｍ。２８０ｎｍ測定は、トリプトファン等の芳香族アミノ酸を含有するタンパク質を特異的に検出できる。２１４ｎｍのシグナルは、特異性は低いが、２８０ｎｍの約１０倍である。
【０２１５】
溶出は、１０〜６０％の線形勾配の溶出剤Ｂにより２０分以内に実施された。注入体積：４０μｌ。吸光度は、Ｗａｔｅｒｓ２４８７検出器を用いて２１４及び２８０ｎｍで記録された。
【０２１６】
結果
加水分解試験は、全グリアジンに対して実施された。グリアジンに対応する２つの主要ピーク（溶出時間１６．１及び１７．５分）は、グリアジンが、粗抽出物（ＥＢ）及び２つの酵素によって部分的に加水分解されることを示す。ＥＰ−Ｂ及びＥＰ−Ａによる加水分解後のクロマトグラム上に現れるピークは異なり、これは、開裂部位が異なることを示唆する（図１１）。ＥＰ−Ｂ加水分解は、ＥＰ−Ａよりもより顕著で、これは、より小さいペプチド鎖が放出されることを示唆し、一方、ＥＰ−Ａは、より強いピークによってマークされるより特異的な加水分解を可能とする。
【０２１７】
実施例５：ＥＰＢチューブ中での発酵試験（ＫＩＲＩＮ型）
この実施例は、本発明の麦芽抽出物の発酵収率を増大する効果を示す。
【０２１８】
大麦麦芽抽出物の分離プロトコール
麦芽の挽き潰し
麦芽２ＲＰ  Ｐｉｌｓｅｎを４℃で保存し、０．５ｍｍの格子を有するＺＭ２００ミルで破砕した。
【０２１９】
抽出
各抽出において、９００ｇの麦芽が３．６Ｌのクエン酸緩衝剤と共に使用された。抽出は２５０ｒｐｍで撹拌しながら７℃で３０分間行った。得られた抽出物を、３回加速及び減速を行い４℃及び８４００ｒｐｍで２５分間遠心分離した。上澄みを回収し、  Ｍａｒｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ  ６１４  １／４直径３２０ｍｍのフィルターで粗く濾過した。
【０２２０】
変性粗抽出物（ＥＢＤ）の検出
前記上澄みを、第一のブロスが出現するまで撹拌せずに加熱し、そして当該上澄みを、４℃８４００ｒｐｍで２５分間遠心分離し、粗く濾過した。
【０２２１】
硫酸アンモニウム（ＳＡ）に対する沈殿１５％（ｗ／ｖ）
硫酸アンモニウムの添加による沈殿は、抽出物と同じ条件下で実施され、７℃２５０ｒｐｍで撹拌した。混合物を４℃８４００ｒｐｍで２５分間遠心分離した。上澄みを回収し、その体積を測定した。
【０２２２】
ＳＡでの沈殿６５％（ｗ／ｖ）
ベースがクエン酸緩衝剤６００ｍｌ中に回収し、そして粗く濾過した後、０．４５μｍフィルターで濾過した。得られた産物は、脱塩するまで４℃で保存した。
【０２２３】
脱塩
脱塩は、ＡｘｉＣｈｒｏｍ  ７０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中にパックされたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５ゲル上で実施された。脱塩は室温で実施され、試料は流速４０ｍＬ／ｍｉｎで注入された。溶出は、ｐＨ４．３の０．１Ｍクエン酸緩衝剤を用いて実施された。
【０２２４】
イオン交換クロマトグラフィー
使用されるゲルはＳｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ゲルで、ｐＨ５の５０ｍＭクエン酸緩衝剤で平衡化され、クロマトグラフィーは、室温で実施された。システインエンドプロテアーゼは、溶出されたフラクション中にある。
【０２２５】
発酵試験
１１°Ｐｌａｔｏ麦汁は、「ＥＢＣ会議」型を醸造することにより生産され：４５℃で３０分間加熱し、７０℃で６０分間濯ぎ、そして２１０ｇの麦芽が１２６０ｍＬの水に添加された。
【０２２６】
異なる添加（麦芽抽出物、対照、・・・）は、７７０ｍＬの麦汁中に播種する前に行われ、但しＰＶＰＰ（４０ｇ／ＨＬ）は、遠心分離前に添加される。
【０２２７】
試験された様式は、それぞれ以下のように対応する：
‐  Ｔ−は、加熱により変性した大麦麦芽の粗抽出物である。
‐  Ｔｐｖｐｐ：添加無し
‐  ＴＢＣは、Ｂｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標）を添加した陽性対照である。
‐  ＥＢは、大麦麦芽の粗抽出物である。
‐  Ｓ１５は、１５％硫酸アンモニウムの溶液で処理した麦芽の抽出物である。
‐  Ｓ６５は、１５％硫酸アンモニウム溶液で処理したものであり、そして上澄みは、５０％硫酸アンモニウムの溶液で処理される。
‐  ６５ＣＨは、様式Ｓ６５であり、カラムＳＰで精製された。
【０２２８】
番号１、２及び３は試験された異なる３つの体積に対応し：体積１は１５〜３０ｍＬ、体積２は２２．５〜３０ｍＬ、体積３は３０〜３７．５ｍＬに対応する。
【０２２９】
播種：
‐  発酵用：乾燥酵母入り７２０ｍＬ
‐  Ａｐｐａｒｅｎｔ  Ｌｉｍｉｔ  Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎの測定：乾燥酵母入り５０ｍＬ
【０２３０】
発酵／熟成は、温度１３℃で約９日間実施される。
【０２３１】
酵母が除去され、そして麦汁が冷却して保持される（２℃で５日以上）。
【０２３２】
保存の終了時、発酵した麦汁は遠心分離され（４０００ｒｐｍで１０分間）、上澄みが解析される。
【０２３３】
発酵を追跡するために、麦汁を除去し、珪藻土で濾過し、そして麦汁の乾燥抽出物の体積のパーセンテージ測定が実施された。この測定はＰｌａｔｏ度（°Ｐｌａｔｏ）で表され、  Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＤＭＡ  ３５自動密度計によって実施される。酵母集団のモニタリングも実施された。
【０２３４】
結果
発酵は、大麦麦芽抽出物を用いて加速される。同時に、Ｄ０＋３で、発酵糖類の残留は、熱変性した大麦麦芽単独からなる対照、陰性対照及びＢｒｅｗｅｒｓ  Ｃｌａｒｅｘ（登録商標）の陽性対照の発酵の間よりも、大麦麦芽の存在下でより少ない（図１２）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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