(57)【要約】第１および第２のＦＧＦファミリーメンバー由来の断片を含む融合ポリペプチド、この融合ポリペプチドをコードする核酸、これを含有するベクターおよび宿主細胞、ならびにＦＧＦ関連疾患、障害および状態の処置においてかかる組成物を作製および使用する方法が提供される。この融合ペプチドは、タンパク質ファミリーの第１のメンバー由来の第１の断片と、前記タンパク質ファミリーの第２のメンバー由来の第２の断片とを含み得、前記第１および第２の断片が、融合部位において一緒に融合して、連続ポリペプチドを形成している。
2018524005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質ファミリーの第１のメンバー由来の第１の断片と、前記タンパク質ファミリーの第２のメンバー由来の第２の断片とを含む融合ポリペプチドであって、前記第１および第２の断片が、融合部位において一緒に融合して、連続ポリペプチドを形成し、前記融合部位が、前記タンパク質ファミリーの前記第１および前記第２のメンバーにおける対応する配列と同一である少なくとも約６アミノ酸の配列を含み、前記融合ポリペプチドが、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合と同等の、ＦＧＦ受容体を発現する細胞の成長を促進する能力を有する、融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記細胞が、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ３ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ−１ｃ、ＦＧＦＲ３ｂ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ４−１ｃおよびＦＧＦＲｄｅｌｔａ４−１ｃからなる群から選択される少なくとも１種のＦＧＦ受容体を発現する、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記少なくとも１種のＦＧＦ受容体が、ＦＧＦＲ３ｃおよびＦＧＦＲ３ｃ−１ｃからなる群から選択される、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記少なくとも１種のＦＧＦ受容体が、ＦＧＦＲ３ｃ−１ｃであり、前記融合ポリペプチドが、ＦＧＦ１８（配列番号１）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルで前記細胞の成長を促進する能力を有する、請求項３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記融合ポリペプチドが、前記ＦＧＦ受容体を発現するＢａＦ３細胞の成長をｉｎ  ｖｉｔｒｏで促進する能力を有する、前記請求項のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記融合ポリペプチドが、約１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、２９ｎｇ／ｍｌ、２８ｎｇ／ｍｌ、２７ｎｇ／ｍｌ、２６ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、２４ｎｇ／ｍｌ、２３ｎｇ／ｍｌ、２２ｎｇ／ｍｌ、２１ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、１９ｎｇ／ｍｌ、１８ｎｇ／ｍｌ、１７ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、１．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、０．９ｎｇ／ｍｌ、０．８ｎｇ／ｍｌ、０．７ｎｇ／ｍｌ、０．６ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、０．４ｎｇ／ｍｌ、０．３ｎｇ／ｍｌ、０．２ｎｇ／ｍｌまたは０．１ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で適用された場合、前記ＦＧＦ受容体を発現するＢａＦ３細胞の成長をｉｎ  ｖｉｔｒｏで促進する前記能力を有する、前記請求項のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記融合ポリペプチドが、約１００ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、２９ｎｇ／ｍｌ、２８ｎｇ／ｍｌ、２７ｎｇ／ｍｌ、２６ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、２４ｎｇ／ｍｌ、２３ｎｇ／ｍｌ、２２ｎｇ／ｍｌ、２１ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、１９ｎｇ／ｍｌ、１８ｎｇ／ｍｌ、１７ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌまたは２ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で適用された場合、前記ＦＧＦ受容体を発現するＢａＦ３細胞の成長をｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記促進する能力を有する、請求項６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記融合ポリペプチドが、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルで軟骨細胞増殖を刺激する能力を有する、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記融合ポリペプチドが、ＦＧＦ１８（配列番号１）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルで軟骨細胞増殖を刺激する能力を有する、請求項８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記融合ポリペプチドが、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルで軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成を増加させる能力を有する、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記融合ポリペプチドが、ＦＧＦ１８（配列番号１）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルで軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成を増加させる能力を有する、請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
ＦＧＦファミリーの第１のメンバー由来の第１の断片と、前記ＦＧＦファミリーの第２のメンバー由来の第２の断片とを含む融合ポリペプチドであって、前記第１および第２の断片が、融合部位において一緒に融合して、連続ポリペプチドを形成し、前記融合部位が、前記ＦＧＦファミリーの前記第１および前記第２のメンバーにおける対応する配列と同一である少なくとも約６アミノ酸の配列を含む、融合ポリペプチド。
【請求項１３】
前記融合ポリペプチドが、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルでＦＧＦ受容体を発現する細胞の成長を促進し、軟骨細胞増殖を刺激し、そして／または軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成を増加させる能力を有する、請求項１２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
前記融合ポリペプチドが、ＦＧＦ１８（配列番号１）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルでＦＧＦ受容体を発現する細胞の成長を促進し、軟骨細胞増殖を刺激し、そして／または軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成を増加させる能力を有する、請求項１３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
前記融合ポリペプチドが、ＦＧＦ１８（配列番号１）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルでＦＧＦＲ３ｃ−１ｃを発現するＢａＦ３細胞の成長を促進する能力を有する、請求項１４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
前記融合ポリペプチドが、前記第１または前記第２のメンバーの二次構造を保持する、請求項１または１２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１７】
前記融合ポリペプチドが、前記第１または前記第２のメンバーと比較して、任意の追加的なＴ−エピトープを欠く、請求項１または１２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１８】
前記融合ポリペプチドが、前記第１または前記第２のメンバーと比較して、任意の追加的なＢ−エピトープを欠く、請求項１または１２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１９】
前記タンパク質ファミリーが、ＦＧＦタンパク質ファミリーである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２０】
前記第１のメンバーが、ＦＧＦ１８またはそのアイソフォームである、請求項１２または１９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２１】
前記第２のメンバーが、ＦＧＦ１７−１またはそのアイソフォームである、請求項１２または１９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
前記第１のメンバーが、ＦＧＦ１８またはそのアイソフォームであり、前記第２のメンバーが、ＦＧＦ１７−１またはそのアイソフォームである、請求項１２または１９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
式（Ｉ）：
（Ｓ１）−（β１）−（Ｓ２）−（β２）−（Ｓ３）−（β３）−（Ｓ４）−（β４）−（Ｓ５）−（β５）−（Ｓ６）−（β６）−（Ｓ７）−（β７）−（Ｓ８）−（β８）−（Ｓ９）−（β９）−（Ｓ１０）−（β１０）−（Ｓ１１）−（β１１）−（Ｓ１２）−（β１２）−Ｓ１３  （Ｉ）
の構造を有し、
ａ）β２は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｉ３９〜Ｇ４３またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｖ４４〜Ｇ４８の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、
ｂ）β３は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｒ４５〜Ａ４８またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｒ５０〜Ａ５３の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、
ｃ）β５は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ６９〜Ｋ７５またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｒ７４〜Ａ８０の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、
ｄ）β６は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｆ７９〜Ｌ８１またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ８４〜Ｉ８６の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、
ｅ）β７は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｋ８８〜Ｇ９１またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ９３〜Ｇ９６の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、
ｆ）β８は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｖ１０１〜Ｋ１０５またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｖ１０６〜Ｉ１１０の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、
ｇ）β１０は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｇ１２１〜Ｖ１２４またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｇ１２６〜Ｍ１２９の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、
ｈ）β１１は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｋ１３４〜Ｔ１３８またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ１３９〜Ｓ１４３の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、
Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ１１、Ｓ１２およびＳ１３のそれぞれは独立に、１〜約５０個の間のアミノ酸残基を有するスペーサー配列である
融合ポリペプチドであって、
ｉ）β１が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｉｉ）β１が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｉｉｉ）β１が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｉｖ）β１が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｖ）β１が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｖｉ）β１が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｖｉｉ）β１が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｖｉｉｉ）β１が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｉｘ）β１が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｘ）β１が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｘｉ）β１が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｘｉｉ）β１が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｘｉｉｉ）β１が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｘｉｖ）β１が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
融合ポリペプチド。
【請求項２４】
β１が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片と同一である、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２５】
β１が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片と同一である、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２６】
β４が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片と同一である、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２７】
β４が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｔ６８からの残基を有する断片と同一である、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２８】
β９が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片と同一である、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２９】
β９が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片と同一である、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３０】
β１２が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片と同一である、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３１】
β１２が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片と同一である、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３２】
ＦＧＦ１８（配列番号１）におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基において少なくとも１個の修飾をさらに含み、前記少なくとも１個の修飾が、Ｙ１５１Ｌ、Ｐ１５２Ｙ、Ｋ１５３Ｑ、１５６ａＬ、１５６ｂＰ、１５６ｃＦ、１５６ｄＰ、１５６ｅＮ、１５６ｆＨ、Ｐ１５６Ａ、Ｌ１５８Ｋ、Ｐ１６１Ｑ、Ｋ１６３Ｅ、Ｙ１６４Ｆ、１６５ａＶ、１６５ｂＧ、１６５ｃＳ、１６５ｄＡ、１６５ｅＰ、Ｔ１６６Ｒ、Ｖ１６７Ｒ、Ｓ１７１Ｔ、Ｉ１７４Ｐ、Ｒ１７５Ｑ、Ｔ１７７Ｌ、Ｈ１７８Ｔ、ｄｅｓ  Ｐ１７９およびｄｅｓ  Ａ１８０からなる群から選択される、請求項２２または２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３３】
ＦＧＦ１７−１（配列番号２）におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基において少なくとも１個の修飾をさらに含み、前記少なくとも１個の修飾が、Ｉ３０Ｌ、Ｅ３２Ｌ、Ｌ１５６Ｙ、Ｙ１５７Ｐ、Ｑ１５８Ｋ、ｄｅｓ  Ｌ１６１、ｄｅｓ  Ｐ１６２、ｄｅｓ  Ｆ１６３、ｄｅｓ  Ｐ１６４、ｄｅｓ  Ｎ１６５、ｄｅｓ  Ｈ１６６、Ａ１６７Ｐ、Ｋ１６９Ｌ、Ｑ１７２Ｐ、Ｅ１７４Ｋ、Ｆ１７５Ｙ、ｄｅｓ  Ｖ１７６、ｄｅｓ  Ｇ１７７、ｄｅｓ  Ｓ１７８、ｄｅｓ  Ａ１７９、ｄｅｓ  Ｐ１８０、Ｒ１８２Ｔ、Ｒ１８３Ｖ、Ｔ１８７Ｓ、Ｐ１９０Ｉ、Ｑ１９１Ｒ、Ｌ１９３Ｔ、Ｔ１９４Ｈ、１９５ａＰおよび１９５ｂＡからなる群から選択される、請求項２２または２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３４】
ＦＧＦ１８（配列番号１）およびＦＧＦ１７−１（配列番号２）における対応する配列と同一である少なくとも約６アミノ酸の配列を含む融合部位をさらに含む、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３５】
前記融合部位が、ＦＧＦ１８（配列番号１）およびＦＧＦ１７−１（配列番号２）における対応する配列と同一である少なくとも約８アミノ酸の配列を含む、請求項３４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３６】
前記融合部位が、ＦＧＦ１８（配列番号１）およびＦＧＦ１７−１（配列番号２）における対応する配列と同一である約６〜２５アミノ酸の配列を含む、請求項３４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３７】
前記融合ポリペプチドが、ＦＧＦ１８（配列番号１）またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の二次構造を保持する、請求項２２または２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３８】
前記融合ポリペプチドが、ＦＧＦ１８（配列番号１）またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合に比較して、任意の追加的なＴ−エピトープを欠く、請求項２２または２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３９】
前記融合ポリペプチドが、ＦＧＦ１８（配列番号１）またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合に比較して、任意の追加的なＢ−エピトープを欠く、請求項２２または２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４０】
前記融合ポリペプチドが、ＦＧＦ１８（配列番号１）またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）に対し約９０％未満の配列相同性を示す、請求項２２または２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４１】
前記融合ポリペプチドが、ＦＧＦ１８（配列番号１）またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）に対し約９５％未満の配列相同性を示す、請求項２２または２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４２】
前記融合ポリペプチドのＮ末端が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によってさらに修飾される、請求項１、１２または２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４３】
前記ポリエチレングリコールが、モノメトキシＰＥＧプロピオンアルデヒドである、請求項４２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４４】
前記ポリエチレングリコールが、約１２Ｋｄ〜４０Ｋｄの分子量を有する、請求項４３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４５】
ＦＧＦ１８（配列番号１）またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）に比較して延長したｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を示す、請求項４２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４６】
前記融合ポリペプチドが、ＦＧＦ１８（配列番号１）またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）に比較して増強した化学安定性を示す、請求項２２または２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４７】
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２２または２３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４８】
請求項１〜４７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを発現する宿主細胞。
【請求項４９】
原核細胞である、請求項４８に記載の宿主細胞。
【請求項５０】
それを必要とする哺乳動物における軟骨欠損を処置する方法であって、前記哺乳動物に、治療有効量の請求項１〜４７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドまたはそのペグ化誘導体を投与するステップを含む方法。
【請求項５１】
前記軟骨欠損が、骨関節炎、変性椎間板疾患および軟骨損傷からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記軟骨欠損を処置することが軟骨修復である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記軟骨修復が、軟骨のマイクロフラクチャー手術である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項１〜４７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドのうち少なくとも１種またはそのペグ化誘導体と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項５５】
請求項１〜４７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドのうち少なくとも１種またはそのペグ化誘導体と、第２の治療剤とを含む医薬組成物。
【請求項５６】
請求項１〜４７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５７】
請求項１〜４７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを産生する方法であって、タンパク質発現に適した条件下で、細胞において請求項５６に記載のベクターを発現させ、これにより、前記融合ポリペプチドを産生するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、２０１５年７月１５日に出願したＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１５／０８４１３３号に対する優先権を主張する。この出願は、その全体がすべての目的のために参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）１８は、ＦＧＦ８およびＦＧＦ１７と共に、ＦＧＦファミリーのサブセットを代表する。これらは、ヘパリン硫酸グリコサミノグリカン（heparin  sulfate  glycosaminoglycan）（ＨＳＧＡＧ）依存性様式でチロシンキナーゼ受容体のＦＧＦＲファミリーに結合し、これを介してシグナルを伝達する（Nature  reviews  drug  discovery、２００９年；８巻：２３５〜２５３頁）。
【０００３】
ＦＧＦ１８は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、およびｉｎ  ｖｉｖｏでは正常でない損傷された関節で軟骨細胞の増殖を増加させ、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の形成を刺激する（Arthritis  Rheum、２００６年；５４巻：３８５０〜３８５８頁、Gene、２００８年；４２０巻：８２〜８９頁）。
骨関節炎（ＯＡ）は、今日の社会に対する膨大な社会経済効果を有する蔓延している疾患である。これは、高齢者の間の障害の主因である（Clin  Orthop  Relat  Res、２００４年：Ｓ６〜Ｓ１５）。この状態の病因は、軟骨組織の進行性の劣化を含む。早期ＯＡを含む軟骨全層の欠損は、治癒の可能性が限られている。ＦＧＦ１８の使用は、軟骨修復およびＯＡのための可能性のある治療法として検討中である（OsteoarthritisおよびCartilage、１９Ｓ１、（２０１１年）、Ｓ７〜Ｓ５２）。ライフスタイルの変更、鎮痛剤および手術を含む現在の治療は、効果が限られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Nature  reviews  drug  discovery、２００９年；８巻：２３５〜２５３頁
【非特許文献２】Arthritis  Rheum、２００６年；５４巻：３８５０〜３８５８頁
【非特許文献３】Gene、２００８年；４２０巻：８２〜８９頁
【非特許文献４】Clin  Orthop  Relat  Res、２００４年：Ｓ６〜Ｓ１５
【非特許文献５】OsteoarthritisおよびCartilage、１９Ｓ１、（２０１１年）、Ｓ７〜Ｓ５２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
そこで、軟骨修復に関する、ＯＡおよび他の疾患のための新たな薬物が大いに必要とされている。本開示は、そのような必要性を取り扱い、関連する利点も同様に提供する。本開示は、修飾された融合ポリペプチドを包含する。本開示は、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核生物系等における、融合ポリペプチドの産生のための方法も提供する。さらに、本開示は、骨関節炎、変性椎間板疾患および軟骨損傷が挙げられるがこれらに限定されない軟骨欠損の処置における融合ポリペプチドの薬学的使用を提供する。一部の実施形態において、本開示は、軟骨修復、例えば、軟骨のマイクロフラクチャー手術における融合ポリペプチドの薬学的使用を提供する。
【０００６】
１つの態様では、本開示は、タンパク質ファミリーの第１のメンバー由来の第１の断片と、前記タンパク質ファミリーの第２のメンバー由来の第２の断片とを含む融合ポリペプチドであって、前記第１および第２の断片が、融合部位において一緒に融合して、連続ポリペプチドを形成する、融合ポリペプチドを提供する。一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、前記融合部位が、前記タンパク質ファミリーの前記第１および前記第２のメンバーにおける対応する配列と同一である少なくとも約６アミノ酸の配列を含む。
【０００７】
前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合と同等の、ＦＧＦ受容体を発現する細胞の成長を促進する能力を有する。一部の実施形態において、前記細胞は、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ３ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ−１ｃ、ＦＧＦＲ３ｂ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ４−１ｃおよびＦＧＦＲｄｅｌｔａ４−１ｃからなる群から選択される少なくとも１種のＦＧＦ受容体を発現する。一部の実施形態において、前記少なくとも１種のＦＧＦ受容体は、ＦＧＦＲ３ｃおよびＦＧＦＲ３ｃ−１ｃからなる群から選択される。一部の実施形態において、前記少なくとも１種のＦＧＦ受容体は、ＦＧＦＲ３ｃ−１ｃである。さらに、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルで前記細胞の成長を促進する能力を有し得る。一部の実施形態において、前記細胞は、前記ＦＧＦ受容体を発現するＢａＦ３細胞である。
【０００８】
一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、前記ＦＧＦ受容体を発現するＢａＦ３細胞の成長をｉｎ  ｖｉｔｒｏで促進する能力を有し得る。一方で、前記融合ポリペプチドは、前記ＦＧＦ受容体を発現するＢａＦ３細胞の成長をｉｎ  ｖｉｖｏで促進する能力を有し得る。一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、約１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、２９ｎｇ／ｍｌ、２８ｎｇ／ｍｌ、２７ｎｇ／ｍｌ、２６ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、２４ｎｇ／ｍｌ、２３ｎｇ／ｍｌ、２２ｎｇ／ｍｌ、２１ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、１９ｎｇ／ｍｌ、１８ｎｇ／ｍｌ、１７ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、１．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、０．９ｎｇ／ｍｌ、０．８ｎｇ／ｍｌ、０．７ｎｇ／ｍｌ、０．６ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、０．４ｎｇ／ｍｌ、０．３ｎｇ／ｍｌ、０．２ｎｇ／ｍｌまたは０．１ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で適用された場合、前記ＦＧＦ受容体を発現するＢａＦ３細胞の成長をｉｎ  ｖｉｔｒｏで促進する前記能力を示す。一部の実施形態において、適用される濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、例えば、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１７ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１８ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１９ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２２ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２３ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２４ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２６ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２７ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２８ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２９ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、または９０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌであり得る。
【０００９】
一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合と同等の、軟骨細胞増殖を刺激する能力を有する。例えば、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルで軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し得る。一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルで軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し得る。さらなる事例において、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）の軟骨細胞増殖刺激能力の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％または２００％であるレベルにおいて軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し得る。
【００１０】
一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合と同等の、軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成を増加させる能力を有する。例えば、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルで軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成を増加させる能力を有し得る。一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルで軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成を増加させる能力を有する。さらなる事例において、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）の場合の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％または２００％のレベルで軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成を増加させる能力を有し得る。
【００１１】
別の態様において、本開示は、ＦＧＦファミリーの第１のメンバー由来の第１の断片と、前記ＦＧＦファミリーの第２のメンバー由来の第２の断片とを含む融合ポリペプチドであって、前記第１および第２の断片が、融合部位において一緒に融合して、連続ポリペプチドを形成する、融合ポリペプチドを提供する。前記融合部位は、前記ＦＧＦファミリーの前記第１および前記第２のメンバーにおける対応する配列と同一である少なくとも約６アミノ酸の配列を含み得る。
【００１２】
一部の実施形態において、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合と同等の、ＦＧＦ受容体を発現する細胞の成長を促進し、軟骨細胞増殖を刺激し、そして／または軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成を増加させる能力を有する。例えば、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルでＦＧＦ受容体を発現する細胞の成長を促進し、軟骨細胞増殖を刺激し、そして／または軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成を増加させる能力を有し得る。
【００１３】
一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルでＦＧＦ受容体を発現する細胞の成長を促進し、軟骨細胞増殖を刺激し、そして／または軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成を増加させる能力を有する。例えば、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）の場合の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％または２００％のレベルでＦＧＦ受容体を発現する細胞の成長を促進し、軟骨細胞増殖を刺激し、そして／または軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成を増加させる能力を有し得る。
【００１４】
一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルでＦＧＦＲ３ｃ−１ｃを発現するＢａＦ３細胞の成長を促進する能力を有する。例えば、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）の場合の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％または２００％のレベルでＦＧＦＲ３ｃ−１ｃを発現するＢａＦ３細胞の成長を促進する能力を有し得る。
【００１５】
一部の実施形態において、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルでＦＧＦ受容体を発現する細胞の成長を促進し、軟骨細胞増殖を刺激し、そして／または軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成を増加させる能力を有する。例えば、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％または２００％のレベルでＦＧＦ受容体を発現する細胞の成長を促進し、軟骨細胞増殖を刺激し、そして／または軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成を増加させる能力を有し得る。
【００１６】
一部の実施形態において、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルでＦＧＦＲ３ｃ−１ｃを発現するＢａＦ３細胞の成長を促進する能力を有する。例えば、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％または２００％のレベルでＦＧＦＲ３ｃ−１ｃを発現するＢａＦ３細胞の成長を促進する能力を有し得る。
【００１７】
一部の実施形態において、融合ポリペプチドは、前記第１または前記第２のメンバーの二次構造を保持する。
【００１８】
一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、前記第１または前記第２のメンバーと比較して、任意の追加的なＴ−エピトープを欠く。
【００１９】
一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、前記第１または前記第２のメンバーと比較して、任意の追加的なＢ−エピトープを欠く。
【００２０】
一部の実施形態において、前記タンパク質ファミリーは、ＦＧＦタンパク質ファミリーである。
【００２１】
一部の実施形態において、本開示の前記融合ポリペプチドにおいて、前記第１のメンバーは、ＦＧＦ１８またはそのアイソフォームである。
【００２２】
一部の実施形態において、本開示の前記融合ポリペプチドにおいて、前記第２のメンバーは、ＦＧＦ１７−１またはそのアイソフォームである。
【００２３】
一部の実施形態において、本開示の前記融合ポリペプチドにおいて、前記第１のメンバーは、ＦＧＦ１８またはそのアイソフォームであり、前記第２のメンバーが、ＦＧＦ１７−１またはそのアイソフォームである。
【００２４】
別の態様において、本開示は、
式（Ｉ）：
（Ｓ１）−（β１）−（Ｓ２）−（β２）−（Ｓ３）−（β３）−（Ｓ４）−（β４）−（Ｓ５）−（β５）−（Ｓ６）−（β６）−（Ｓ７）−（β７）−（Ｓ８）−（β８）−（Ｓ９）−（β９）−（Ｓ１０）−（β１０）−（Ｓ１１）−（β１１）−（Ｓ１２）−（β１２）−Ｓ１３  （Ｉ）
の構造を有し、
ａ）β２は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｉ３９〜Ｇ４３またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｖ４４〜Ｇ４８の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、
ｂ）β３は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｒ４５〜Ａ４８またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｒ５０〜Ａ５３の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、
ｃ）β５は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ６９〜Ｋ７５またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｒ７４〜Ａ８０の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、
ｄ）β６は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｆ７９〜Ｌ８１またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ８４〜Ｉ８６の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、
ｅ）β７は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｋ８８〜Ｇ９１またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ９３〜Ｇ９６の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、
ｆ）β８は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｖ１０１〜Ｋ１０５またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｖ１０６〜Ｉ１１０の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、
ｇ）β１０は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｇ１２１〜Ｖ１２４またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｇ１２６〜Ｍ１２９の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、
ｈ）β１１は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｋ１３４〜Ｔ１３８またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ１３９〜Ｓ１４３の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、
Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ１１、Ｓ１２およびＳ１３のそれぞれは独立に、１〜約５０個の間のアミノ酸残基を有するスペーサー配列である
融合ポリペプチドであって、
ｉ）β１が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｉｉ）β１が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｉｉｉ）β１が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｉｖ）β１が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｖ）β１が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｖｉ）β１が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｖｉｉ）β１が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｖｉｉｉ）β１が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｉｘ）β１が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｘ）β１が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｘｉ）β１が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｘｉｉ）β１が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｘｉｉｉ）β１が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
または
ｘｉｖ）β１が、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β４が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β９が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含み、β１２が、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片に対し少なくとも９０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む、
融合ポリペプチドを提供する。
【００２５】
一部の実施形態において、β１は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片と同一である。
【００２６】
一部の実施形態において、β１は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片と同一である。
【００２７】
一部の実施形態において、β４は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片と同一である。
【００２８】
一部の実施形態において、β４は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｔ６８からの残基を有する断片と同一である。
【００２９】
一部の実施形態において、β９は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片と同一である。
【００３０】
一部の実施形態において、β９は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片と同一である。
【００３１】
一部の実施形態において、β１２は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片と同一である。
【００３２】
一部の実施形態において、β１２は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片と同一である。
【００３３】
一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基において少なくとも１個の修飾をさらに含み、前記少なくとも１個の修飾は、Ｙ１５１Ｌ、Ｐ１５２Ｙ、Ｋ１５３Ｑ、１５６ａＬ、１５６ｂＰ、１５６ｃＦ、１５６ｄＰ、１５６ｅＮ、１５６ｆＨ、Ｐ１５６Ａ、Ｌ１５８Ｋ、Ｐ１６１Ｑ、Ｋ１６３Ｅ、Ｙ１６４Ｆ、１６５ａＶ、１６５ｂＧ、１６５ｃＳ、１６５ｄＡ、１６５ｅＰ、Ｔ１６６Ｒ、Ｖ１６７Ｒ、Ｓ１７１Ｔ、Ｉ１７４Ｐ、Ｒ１７５Ｑ、Ｔ１７７Ｌ、Ｈ１７８Ｔ、ｄｅｓ  Ｐ１７９およびｄｅｓ  Ａ１８０からなる群から選択される。
【００３４】
一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基において少なくとも１個の修飾をさらに含み、前記少なくとも１個の修飾は、Ｉ３０Ｌ、Ｅ３２Ｌ、Ｌ１５６Ｙ、Ｙ１５７Ｐ、Ｑ１５８Ｋ、ｄｅｓ  Ｌ１６１、ｄｅｓ  Ｐ１６２、ｄｅｓ  Ｆ１６３、ｄｅｓ  Ｐ１６４、ｄｅｓ  Ｎ１６５、ｄｅｓ  Ｈ１６６、Ａ１６７Ｐ、Ｋ１６９Ｌ、Ｑ１７２Ｐ、Ｅ１７４Ｋ、Ｆ１７５Ｙ、ｄｅｓ  Ｖ１７６、ｄｅｓ  Ｇ１７７、ｄｅｓ  Ｓ１７８、ｄｅｓ  Ａ１７９、ｄｅｓ  Ｐ１８０、Ｒ１８２Ｔ、Ｒ１８３Ｖ、Ｔ１８７Ｓ、Ｐ１９０Ｉ、Ｑ１９１Ｒ、Ｌ１９３Ｔ、Ｔ１９４Ｈ、１９５ａＰおよび１９５ｂＡからなる群から選択される。
【００３５】
一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）およびＦＧＦ１７−１（配列番号２）における対応する配列と同一である少なくとも約６アミノ酸の配列を含む融合部位をさらに含む。一部の実施形態において、前記融合部位は、ＦＧＦ１８（配列番号１）およびＦＧＦ１７−１（配列番号２）における対応する配列と同一である少なくとも約８アミノ酸の配列を含む。一部の実施形態において、前記融合部位は、ＦＧＦ１８（配列番号１）およびＦＧＦ１７−１（配列番号２）における対応する配列と同一である約６〜２５アミノ酸の配列を含む。
【００３６】
一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の二次構造を保持する。
【００３７】
一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合に比較して、任意の追加的なＴ−エピトープを欠く。
【００３８】
一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合に比較して、任意の追加的なＢ−エピトープを欠く。
【００３９】
一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）に対し約９０％未満の配列相同性を示す。
【００４０】
一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）に対し約９５％未満の配列相同性を示す。
【００４１】
一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドのＮ末端は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によってさらに修飾される。一部の実施形態において、前記ポリエチレングリコールは、モノメトキシＰＥＧプロピオンアルデヒドである。一部の実施形態において、前記ポリエチレングリコールは、約１２Ｋｄ〜４０Ｋｄの分子量を有する。
【００４２】
一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）に比較して延長したｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を示す。
【００４３】
一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）に比較して増強した化学安定性を示す。
【００４４】
一部の実施形態において、前記融合ポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４５】
別の態様において、本開示は、本開示の融合ポリペプチドを発現する宿主細胞を提供する。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、原核細胞である。
【００４６】
さらなる態様において、本開示は、それを必要とする哺乳動物における軟骨欠損を処置する方法であって、前記哺乳動物に、治療有効量の本開示に記載される融合ポリペプチドまたはそのペグ化誘導体を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態において、前記軟骨欠損は、骨関節炎、変性椎間板疾患および軟骨損傷からなる群から選択される。一部の実施形態において、前記軟骨欠損を処置することは、軟骨修復、例えば、軟骨のマイクロフラクチャー手術である。
【００４７】
別の態様において、本開示は、それを必要とする哺乳動物における軟骨欠損を処置するための組成物の調製における、本開示に記載の融合ポリペプチドまたはそのペグ化誘導体の使用を提供する。一部の実施形態において、軟骨欠損は、骨関節炎、変性椎間板疾患および軟骨損傷からなる群から選択される。一部の実施形態において、前記軟骨欠損を処置することは、軟骨修復、例えば、軟骨のマイクロフラクチャー手術である。一部の実施形態において、組成物は医薬組成物である。一部の実施形態において、組成物は医薬に製剤化される。
【００４８】
さらに別の態様において、本開示は、本開示の融合ポリペプチドのうち少なくとも１種またはそのペグ化誘導体と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００４９】
一部の実施形態において、本開示は、本開示の融合ポリペプチドのうち少なくとも１種またはそのペグ化誘導体と、第２の治療剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００５０】
別の態様において、本開示は、本開示の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。さらなる態様において、本開示は、本開示の融合ポリペプチドを産生する方法であって、タンパク質発現に適した条件下で、細胞においてベクターを発現させ、これにより、融合ポリペプチドを産生するステップを含む方法を提供する。
【００５１】
本開示の単なる説明的な実施形態が示され記載されている次の詳細な説明から、本開示の追加的な態様および利点が、当業者に容易に明らかである。了解される通り、本開示は、他の異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、全て本開示から逸脱することのない、様々な明らかな観点における修正が可能である。したがって、図面および記載は、制限的ではなく説明的な性質のものとみなされたい。
【００５２】
参照による援用
本明細書において言及されているあらゆる刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが、参照により援用されることが特にかつ個々に示されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
本開示の新規特色は、添付の特許請求の範囲において詳細に記載されている。本開示の特色および利点のより十分な理解は、本開示の原理が利用されている説明的な実施形態を記載する次の詳細な説明と、次の添付の図面を参照することにより得られるであろう。
【００５４】
【図１】図１は、本開示の方法を使用した融合ポリペプチドおよびこれらの参照ポリペプチド（配列番号１、２、４、１１および１５）のタンパク質発現後の可溶化された封入体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を図解する。
【００５５】
【図２】図２は、本開示の方法を使用した融合ポリペプチドおよびこれらの参照ポリペプチド（配列番号１、２、４、１１および１５）のリフォールディングおよび精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を図解する。
【００５６】
【図３】図３は、陽性対照（ＦＧＦ１）、参照ポリペプチド（配列番号１および２）および融合ポリペプチド（配列番号４、配列番号１１および配列番号１５）による処理の９６時間後のＢａＦ３／ＦＧＦＲ１ｂ細胞の用量依存的増殖を図解する。
【００５７】
【図４】図４は、陽性対照（ＦＧＦ１）、参照ポリペプチド（配列番号１および２）および融合ポリペプチド（配列番号４、配列番号１１および配列番号１５）による処理の９６時間後のＢａＦ３／ＦＧＦＲ１ｃ細胞の用量依存的増殖を図解する。
【００５８】
【図５】図５は、陽性対照（ＦＧＦ１）、参照ポリペプチド（配列番号１および２）および融合ポリペプチド（配列番号４、配列番号１１および配列番号１５）による処理の９６時間後のＢａＦ３／ＦＧＦＲ２ｃ細胞の用量依存的増殖を図解する。
【００５９】
【図６】図６は、陽性対照（ＦＧＦ１）、参照ポリペプチド（配列番号１および２）および融合ポリペプチド（配列番号４、配列番号１１および配列番号１５）による処理の９６時間後のＢａＦ３／ＦＧＦＲ３ｂ細胞の用量依存的増殖を図解する。
【００６０】
【図７】図７は、陽性対照（ＦＧＦ１）、参照ポリペプチド（配列番号１および２）および融合ポリペプチド（配列番号４、配列番号１１および配列番号１５）による処理の９６時間後のＢａＦ３／ＦＧＦＲ３ｃ−１ｃ細胞の用量依存的増殖を図解する。
【００６１】
【図８】図８は、陽性対照（ＦＧＦ１）、参照ポリペプチド（配列番号１および２）および融合ポリペプチド（配列番号４、配列番号１１および配列番号１５）による処理の９６時間後のＢａＦ３／ＦＧＦＲ４−１ｃ細胞の用量依存的増殖を図解する。
【００６２】
【図９】図９は、陽性対照（ＦＧＦ１）、参照ポリペプチド（配列番号１および２）および融合ポリペプチド（配列番号４、配列番号１１および配列番号１５）による処理の９６時間後のＢａＦ３／ＦＧＦＲｄｅｌｔａ４−１ｃ細胞の用量依存的増殖を図解する。
【００６３】
【図１０】図１０は、参照ポリペプチド（配列番号１および２）および融合ポリペプチド（配列番号４、配列番号１１および配列番号１５）による軟骨細胞増殖の刺激を図解する。
【００６４】
【図１１】図１１は、サフラニンＯ染色により示される、参照ポリペプチド（配列番号１および２）および融合ポリペプチド（配列番号４、配列番号１１および配列番号１５）のプロテオグリカン産生に対する効果を図解する。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
開示の詳細な説明
本開示の実施形態について記載する前に、かかる実施形態が、単なる一例として提示されており、本明細書に記載されている本開示の実施形態の様々な代替を本発明の実施において用いてよいことを理解されたい。そこで、当業者であれば、本開示から逸脱することなく、多数の変種、変化および置換を想起し得る。
【００６６】
他に規定がなければ、本明細書に使用されているあらゆる技術および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本開示の実施または検査において、本明細書に記載されているものと同様のまたは均等の方法および材料を使用することができるが、適した方法および材料について後述する。矛盾が生じる場合、定義を含む本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は、単なる説明であり、限定することを目的としない。そこで、当業者であれば、本開示から逸脱することなく、多数の変種、変化および置換を想起し得る。
【００６７】
本明細書および特許請求の範囲において使用されている通り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそれ以外を明らかに指示しない限り、複数の参照を含む。
【００６８】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すように、本明細書において互換的に使用される。ポリマーは、直鎖状または分枝状であり得、修飾アミノ酸を含むことができ、非アミノ酸によって中断されていてよい。これらの用語は、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識構成成分とのコンジュゲーション等の他の任意の操作によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。
【００６９】
用語「アミノ酸」は、ＤまたはＬ光学異性体およびアミノ酸アナログおよびペプチド模倣の両方が挙げられるがこれらに限定されない、天然および／または非天然または合成アミノ酸のいずれかを指す。標準１文字または３文字コードを使用して、アミノ酸を命名する。
【００７０】
用語「天然Ｌ−アミノ酸」は、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）およびスレオニン（Ｔ）のＬ光学異性体型を意味する。用語「非天然起源」は、配列に適用され、本明細書において使用される場合、哺乳動物に存在する野生型または天然起源配列の対応物を持たない、それに相補的でない、またはそれと高度な相同性を持たないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、非天然起源のポリペプチドまたは断片は、適切に整列された場合に天然配列と比較して、９９％、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％未満またはさらに低いアミノ酸配列同一性を共有することができる。あるいは、非天然起源のポリペプチドまたは断片は、適切に整列された場合に天然配列と比較して、９９％、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％超またはさらに高いアミノ酸配列同一性を共有することができる。
【００７１】
用語「親水性」および「疎水性」は、水に対しある物質が有する親和性の程度を指す。親水性物質は、水に対し強い親和性を有し、水に溶解する、これと混合するまたはこれに湿らされる傾向があるが、疎水性物質は、水に対する親和性を実質的に欠如し、水を忌避し吸収しない傾向があり、水に溶解せず、これと混合せず、これに湿らされない傾向がある。アミノ酸は、その疎水性に基づき特徴付けることができる。いくつかの尺度が開発されてきた。その一例は、Hopp,  TPら、Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A（１９８１年）７８巻：３８２４頁に収載されているLevitt,  Mら、J  Mol  Biol（１９７６年）１０４巻：５９頁によって開発された尺度である。「親水性アミノ酸」の例は、アルギニン、リシン、スレオニン、アラニン、アスパラギンおよびグルタミンである。親水性アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸およびセリンおよびグリシンが特に興味深い。「疎水性アミノ酸」の例は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシンおよびバリンである。
【００７２】
「断片」は、タンパク質に適用される場合、治療的および／または生物学的活性の一部分を保持していてもしていなくてもよい、ネイティブの生物学的に活性なタンパク質のトランケート型である。「バリアント」は、タンパク質に適用される場合、生物学的に活性なタンパク質の治療的および／または生物学的活性の少なくとも部分を保持する、ネイティブの生物学的に活性なタンパク質に対し配列相同性を有するタンパク質である。例えば、バリアントタンパク質は、参照の生物学的に活性なタンパク質と比較して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％アミノ酸配列同一性を共有することができる。本明細書において、用語「生物学的に活性なタンパク質部分」は、例えば、部位特異的突然変異誘発、コード遺伝子の合成、挿入による等、計画的に、または突然変異により偶発的に修飾されたタンパク質を含む。
【００７３】
「コンジュゲートされる」、「連結される」、「融合される」および「融合」は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段を含む任意の手段により、２個またはそれを超える化学元素、配列または構成成分を一緒に接続することを指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結される」は、連結されているＤＮＡ配列同士が、近接しており、リーディングフェーズ（reading  phase）またはインフレームにあることを意味する。「インフレーム融合」は、２個またはそれを超えるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を接続して、本来のＯＲＦの正確な読み枠を維持する様式で、連続的なより長いＯＲＦを形成することを指す。よって、その結果得られる「融合ポリペプチド」は、本来のＯＲＦ（そのセグメントが元来、正常であればこのように接続されていない）にコードされるポリペプチドに対応する２個またはそれを超える断片を含有する単一のタンパク質である。「融合部位」は、２個またはそれを超える断片が一緒に接続された配列を指す。一部の事例において、融合部位は、接続されている２個またはそれを超える断片における配列と同一の配列であり得る。例えば、融合部位は、接続されている断片における配列と同一である約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれを超えるアミノ酸の配列を含み得る。一部の実施形態において、融合部位は、接続されている断片における配列と同一である約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれを超えるアミノ酸の配列を含み得る。例えば、融合部位は、接続されている断片における配列と同一である約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８アミノ酸の配列を含み得る。一部の事例において、融合部位は、接続されている２個またはそれを超える断片のいずれの配列とも同一でないギャップセグメントをさらに含み得る。ギャップセグメントは、融合部位のアミノ酸配列内に見出し得る。さらに、ギャップセグメントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸を含むことができる。例えば、融合部位は、それぞれが２個の断片の一方または両方である８個のアミノ酸、および接続されている２個またはそれを超える配列のいずれとも同一でない８アミノ酸の配列内の２アミノ酸のギャップセグメントを含み得る。
【００７４】
ポリペプチドの文脈において、「直鎖状配列」または「配列」は、配列において互いに隣接する残基が、ポリペプチドの一次構造において近接する、アミノからカルボキシル末端方向でのポリペプチドにおけるアミノ酸の順序である。「部分的配列」は、一方向または両方向に追加的な残基を含むことが公知である、ポリペプチドの一部を形成する直鎖状配列である。
【００７５】
本開示においては、用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用される。これらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはこれらのアナログのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー型を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することもでき、既知または未知の任意の機能を行うこともできる。以下は、ポリヌクレオチドの非限定例である：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（単数または複数）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ等、修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分によって中断されていてよい。ポリヌクレオチドは、標識構成成分とのコンジュゲーションによる等、重合後にさらに修飾することができる。
【００７６】
用語「遺伝子」および「遺伝子断片」は、本明細書において互換的に使用される。これらは、転写および翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることができる、少なくとも１個のオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。遺伝子または遺伝子断片は、ポリヌクレオチドが、少なくとも１個のオープンリーディングフレームを含有する限りにおいて、ゲノムまたはｃＤＮＡであり得、これは、コード領域全体またはそのセグメントを網羅することができる。「融合遺伝子」は、一緒に連結された少なくとも２個の異種ポリヌクレオチドで構成された遺伝子である。
【００７７】
「相同性」または「相同」または「配列同一性」は、２種もしくはそれを超えるポリヌクレオチド配列の間または２種もしくはそれを超えるポリペプチド配列の間の配列類似性または互換性を指す。プログラム（例えば、Ｅｍｂｏｓｓ  ＮｅｅｄｌｅまたはＢｅｓｔＦｉｔ）を使用して、２種の異なるアミノ酸配列の間の配列同一性、類似性または相同性を決定する場合、デフォルト設定を使用することができる、あるいはｂｌｏｓｕｍ４５またはｂｌｏｓｕｍ８０等、適切なスコアリングマトリックスを選択して、同一性、類似性または相同性スコアを最適化することができる。好ましくは、相同なポリヌクレオチドとは、本明細書に定義されるストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、これらの配列と比較して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、さらにより好ましくは９９％の配列同一性を有する。同等の長さの配列が最適に整列された場合、相同であるポリペプチドは、好ましくは、少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも９５％または少なくとも９７％または少なくとも９８％の配列同一性を有する、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００７８】
用語「パーセント同一性」および「％同一性」は、ポリヌクレオチド配列に適用される場合、標準化アルゴリズムを使用して整列された少なくとも２種のポリヌクレオチド配列の間でマッチする残基のパーセンテージを指す。かかるアルゴリズムは、２配列間の整列を最適化し、したがって、２配列のより有意義な比較を達成するために、標準化された再現性のある仕方で、比較されている配列にギャップを挿入することができる。パーセント同一性は、定義されたポリヌクレオチド配列全体の長さにわたって測定することができる、またはより短い長さ、例えば、より大型の定義されたポリヌクレオチド配列から得られる断片、例えば、少なくとも４５、少なくとも６０、少なくとも９０、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも２１０もしくは少なくとも４５０の近接残基の断片の長さにわたって測定することができる。かかる長さは、単なる例示であり、本明細書、表、図または配列表に示す配列によって支持される任意の断片の長さを使用して、パーセンテージ同一性を測定することができる長さを記載してもよいことが理解される。
【００７９】
本明細書に同定されているポリペプチド配列に関する「パーセント（％）配列同一性」は、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮することもなく、配列を整列し、必要に応じてギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を達成した後に、第２の参照ポリペプチド配列またはその部分のアミノ酸残基と同一である、問い合わせ配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定することを目的とする整列は、本技術分野の技能範囲内の様々な仕方で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＮＥＥＤＬＥまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等、公開されているコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較されている配列の全長にわたる最大整列の達成に必要とされる任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメータを決定することができる。パーセント同一性は、定義されたポリペプチド配列全体の長さにわたって測定することができる、またはより短い長さ、例えば、より大型の定義されたポリペプチド配列から得られる断片、例えば、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０もしくは少なくとも１５０の近接残基の断片の長さにわたって測定することができる。かかる長さは、単なる例示であり、本明細書、表、図または配列表に示す配列によって支持される任意の断片の長さを使用して、パーセンテージ同一性を測定することができる長さを記載してもよいことが理解される。
【００８０】
「宿主細胞」は、本ベクターのレシピエントであり得るまたはそうであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の後代を含む。後代は、天然、偶発的または計画的突然変異により、本来の親細胞と必ずしも完全に同一（形態または総ＤＮＡ相補体のゲノムが）でなくてよい。宿主細胞は、本開示のベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクトされた細胞を含む。一部の事例において、宿主細胞は、原核細胞である。一部の例において、原核細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【００８１】
「ベクター」は、好ましくは適切な宿主において自己複製する核酸分子であり、これは挿入された核酸分子を宿主細胞の中におよび／またはその間に移入する。この用語は、細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡの挿入のために主に機能するベクター、ＤＮＡまたはＲＮＡの複製のために主に機能するベクターの複製、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを含む。上述の機能のうち２種以上を提供するベクターも含まれる。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞へと導入されると、ポリペプチド（複数可）へと転写および翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」は通常、所望の発現産物を生じるように機能することができる発現ベクターで構成された適した宿主細胞を暗示する。
【００８２】
用語「有効量」または「治療有効量」は、下に定義する疾患処置が挙げられるがこれらに限定されない、意図される用途を達成するのに十分である、本明細書に記載されている化合物の量を指す。治療有効量は、意図される用途（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）、または処置されている対象および疾患状態、例えば、当業者であれば容易に決定することができる、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与様式その他に応じて変動し得る。この用語は、標的細胞において特定の応答、例えば、標的遺伝子誘導、増殖および／またはアポトーシスを誘導するであろう用量にも適用される。特異的な用量は、選ばれた特定の化合物、従うべき投薬レジメン、他の化合物と組み合わせて投与されるか否か、投与のタイミング、これが投与される組織およびこれが運搬される物理的送達系に応じて変動するであろう。
【００８３】
本明細書において、「処置」または「処置する」または「緩和する」または「寛解する」は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、治療上の利益および／または予防上の利益が挙げられるがこれらに限定されない、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療上の利益とは、処置されている根底にある障害の根絶または寛解を意味する。また、治療上の利益は、対象が依然として根底にある障害を患っている可能性があるにもかかわらず、対象において改善が観察されるような、根底にある障害に関連する生理学的症状のうち１種または複数の根絶または寛解により達成される。予防上の利益のために、組成物は、特定の疾患の発症リスクがある対象に、または疾患の生理学的症状のうち１種もしくは複数を報告する対象に、この疾患の診断が未だ為されていない場合であっても投与することができる。
【００８４】
「治療上の効果」は、この用語が本明細書において使用される場合、上述の治療上の利益および／または予防上の利益を包含する。予防上の効果は、疾患もしくは状態の出現の遅延もしくは排除、疾患もしくは状態の症状の発病の遅延もしくは排除、疾患もしくは状態の進行の緩徐化、停止もしくは逆転、またはこれらの任意の組合せを含む。
【００８５】
用語「同時投与」、「と組み合わせた投与」およびこれらの文法的均等物は、本明細書において、両方の薬剤および／またはこれらの代謝物が、同時に対象に存在するような、動物への２種またはそれを超える薬剤の投与を包含する。同時投与は、別々の組成物における同時的な投与、別々の組成物における異なる時点の投与、または両方の薬剤が存在する組成物における投与を含む。
【００８６】
用語「薬学的に許容される塩」は、本技術分野において周知の種々の有機および無機対イオンに由来する塩を指し、単なる一例として、分子が酸性官能性を含有する場合は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムその他を；分子が塩基性官能性を含有する場合は、塩酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩（メタンスルホン酸塩）、エタンスルホン酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩、リン酸塩その他等の有機または無機酸の塩を含む。２個以上の塩基性部分を有する化合物において、塩基性部分のうち２個以上は、ｂｉｓまたはｔｒｉｓ塩が挙げられるがこれらに限定されない、塩形態へと変換させることができる。あるいは、２個以上の塩基性部分を有する化合物は、塩基性部分の１個のみに塩を形成することができる。
【００８７】
用語「アンタゴニスト」および「阻害剤」は、本明細書において互換的に使用され、標的タンパク質の活性または発現のいずれかを阻害することにより、標的タンパク質の生物学的機能を阻害する能力を有する化合物を指す。したがって、用語「アンタゴニスト」および「阻害剤」は、標的タンパク質の生物学的役割の文脈において定義される。本明細書において好ましいアンタゴニストは、標的と特異的に相互作用（例えば、これに結合）するが、標的タンパク質がそのメンバーであるシグナル伝達経路の他のメンバーと相互作用することにより、標的タンパク質の生物学的活性を阻害する化合物も、この定義内に特に含まれる。アンタゴニストによって阻害される好ましい生物学的活性は、腫瘍の発達、成長または伝播に関連する。
【００８８】
用語「アゴニスト」は、本明細書において、標的タンパク質の活性または発現を阻害または増強することのいずれかにより、標的タンパク質の生物学的機能を惹起または増強する能力を有する化合物を指す。したがって、用語「アゴニスト」は、標的ポリペプチドの生物学的役割の文脈において定義される。本明細書において好ましいアゴニストは、標的と特異的に相互作用（例えば、これに結合）するが、標的ポリペプチドがそのメンバーであるシグナル伝達経路の他のメンバーと相互作用することにより、標的ポリペプチドの生物学的活性を惹起または増強する化合物も、この定義内に特に含まれる。
【００８９】
本明細書において、「薬剤」または「生物学的活性薬剤」は、生物学的、薬学的または化学的な化合物または他の部分を指す。非限定例として、単純なもしくは複雑な有機もしくは無機分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体誘導体、抗体断片、ビタミン誘導体、炭水化物、毒素または化学療法化合物が挙げられる。様々な化合物を合成することができ、例えば、小分子およびオリゴマー（例えば、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチド）、ならびに様々なコア構造に基づく合成有機化合物が挙げられる。加えて、植物または動物抽出物その他等、様々な天然供給源が、スクリーニングのための化合物を提供することができる。
【００９０】
「抗がん剤」、「抗腫瘍剤」または「化学療法剤」は、新生物状態の処置において有用な任意の薬剤を指す。抗がん剤の１クラスは、化学療法剤を含む。「化学療法」は、静脈内、経口、筋肉内、腹腔内、膀胱内、皮下、経皮、頬側もしくは吸入または坐薬の形態を含む様々な方法による、がん患者への１種または複数の化学療法薬および／または他の薬剤の投与を意味する。
【００９１】
用語「細胞増殖」は、分裂の結果、細胞数が変化する現象を指す。例えば、細胞増殖は、細胞数の増加をもたらすことができる。この用語は、増殖シグナルと一貫した、細胞形態が変化（例えば、サイズが増加）する細胞成長も包含する。
【００９２】
用語「選択的阻害」または「選択的に阻害する」は、生物学的活性薬剤が、標的との直接的または間接的相互作用により、オフターゲットシグナリング活性と比較して標的シグナリング活性を優先的に低下させる能力を指す。
【００９３】
用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、対象の身体内で行われる事象を指す。
【００９４】
用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、対象の身体の外側で行われる事象を指す。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、対象の外側で行われる任意のアッセイを包含する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、死んでいるまたは生きている細胞が用いられる、細胞に基づくアッセイを包含する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、インタクトな細胞が用いられない無細胞アッセイも包含する。
【００９５】
ポリペプチドの命名法
ポリペプチドは、本明細書において、互換的に、ポリペプチド命名法、有機化学的命名法、化学式、アミノ酸配列またはこれらの混合を使用して命名される。例えば、ＦＧＦ１８のアナログにおける置換は、「本来のアミノ酸−位置−置換されたアミノ酸」として示すことができる。
【００９６】
したがって、表示法「Ｌ２５Ｉ  ＦＧＦ１８」または「Ｌｅｕ２５ＩＬえ  ＦＧＦ１８」は、ＦＧＦ１８アナログが、アナログおよびＩＬ２８Ｂが後述の通りに整列された場合（「整列」）、ＦＧＦ１８（配列番号１）における位置２５のアミノ酸に対応するアナログアミノ酸位置に、イソロイシンによるロイシンの置換を含むことを意味する。複数の置換は、コンマ（コンマの後にスペースを入れる）によって分離し、これらが同じアナログに属することを明確にするために括弧で囲むことができる。したがって、「（Ｌ２５Ｉ，Ｌ２７Ｅ）  ＦＧＦ１８」は、ＦＧＦ１８アナログが、それぞれ、ＦＧＦ１８（配列番号１）における位置２５および２７のアミノ酸に対応するアナログアミノ酸位置における２個の置換（イソロイシンによるロイシンの置換およびグルタミン酸によるシステインの置換）を含むことを意味する。
【００９７】
ＦＧＦ１８のアナログにおける伸長は、その正確な配列を使用して問題になっている化合物へと、位置番号の付加により（Ｃ末端には正数を続け、Ｎ末端には負数を続ける）、またはより単純に、問題になっている伸長のアミノ酸を付加することにより、配列番号１を参照しつつ記載することができる。したがって、Ｍ−ＦＧＦ１８は、配列番号１を参照した位置−１にＭを有する配列番号２のポリペプチドを命名する。
【００９８】
ＦＧＦ１８のアナログにおける挿入は、「挿入前のアミノ酸位置番号−インデックス−挿入されたアミノ酸」として記載することができる。挿入前のアミノ酸位置番号は、挿入アナログおよびＦＧＦ１８が後述通りに整列される際に生じる（「整列」）ギャップの直前のＦＧＦ１８（配列番号１）におけるアミノ酸位置を指す。インデックスは、アルファベット順の小文字であり、例えば、第１の挿入されたアミノ酸は「ａ」、第２の挿入されたアミノ酸は「ｂ」等である。したがって、「８２ａＧ  ＦＧＦ１８」は、ＦＧＦ１８（配列番号１）におけるアミノ酸位置８２の後にグリシンの挿入を有するＦＧＦ１８のアナログを命名する。
【００９９】
ＦＧＦ１８のアナログにおける欠失は、「ｄｅｓ  欠失されたアミノ酸−欠失されたアミノ酸位置」または「ｄ  欠失されたアミノ酸−欠失されたアミノ酸位置」として記載することができる。欠失されたアミノ酸位置は、アナログおよびＦＧＦ１８が後述通りに整列された際に生じる（「整列」）ギャップにおける、ＦＧＦ１８（配列番号１）におけるアミノ酸位置を指す。したがって、「ｄｅｓ  Ｌ２５  ＦＧＦ１８」は、ＦＧＦ１８（配列番号１）における位置２５のロイシン残基の欠失を有するＦＧＦ１８のアナログを命名する。
【０１００】
必要に応じて、２種のアミノ酸配列の整列は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラムを使用することにより為すことができる（http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/）。Ｎｅｅｄｌｅプログラムは、グローバル整列アルゴリズムを実行する（J.  Mol.  Biol.１９７０年、４８巻：４４３〜４５３頁）。使用される置換マトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２であり、ギャップオープニングペナルティは５０であり、ギャップ伸長ペナルティは０．５である。
【０１０１】
融合ポリペプチド、宿主細胞およびベクター
本開示は、哺乳動物における疾患状態の処置に有用である融合ポリペプチドに関する。融合ポリペプチドは、タンパク質ファミリーの第１のメンバー由来の第１の断片と、第２のメンバー由来の第２の断片とを含むことができる。一部の事例において、第１および第２のメンバーは両者共に、同じタンパク質ファミリーのメンバーであり得る。他の事例において、第１および第２のメンバーは、異なるタンパク質ファミリーに属することができる。ある特定の実施形態において、第１および／または第２のメンバーは、ＦＧＦファミリーに属する。一部の例において、融合ポリペプチドは、第１および第２のＦＧＦファミリーメンバー（またはそのアイソフォーム）に由来する断片を含むことができる。ＦＧＦファミリーメンバーの例としては、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１７およびＦＧＦ８、ならびにこれらの様々なアイソフォームが挙げられるがこれらに限定されない。一部の例において、第１のＦＧＦファミリーメンバーは、配列番号１に記載されているものが挙げられるがこれらに限定されない、ＦＧＦ１８またはそのアイソフォームである。一部の例において、第２のＦＧＦファミリーメンバーは、配列番号２に記載されているものが挙げられるがこれらに限定されない、ＦＧＦ１７−１またはそのアイソフォームである。さらなる例において、第１のＦＧＦファミリーメンバーは、ＦＧＦ１８またはそのアイソフォームであり、第２のＦＧＦファミリーメンバーは、ＦＧＦ１７−１またはそのアイソフォームである。
【０１０２】
一部の事例において、断片は、融合部位において一緒に融合させ、これにより、連続ポリペプチドを形成することができる。一部の例において、融合部位は、第１および第２のファミリーメンバーに存在する対応する配列と同一である少なくとも約６アミノ酸の配列を含むことができる。さらなる例において、融合部位は、第１および第２のファミリーメンバーに存在する対応する配列と同一である約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれを超えるアミノ酸の配列を含むことができる。第１および第２のメンバーのそれぞれがＦＧＦファミリーメンバーである事例において、融合部位は、第１および第２のＦＧＦファミリーメンバー、そのアイソフォームおよび／または突然変異体に存在する対応する配列と同一である約８、９、１０または１１アミノ酸の配列を含むことができる。
【０１０３】
一部の事例において、融合ポリペプチドは、式Ｉ：
（Ｓ１）−（β１）−（Ｓ２）−（β２）−（Ｓ３）−（β３）−（Ｓ４）−（β４）−（Ｓ５）−（β５）−（Ｓ６）−（β６）−（Ｓ７）−（β７）−（Ｓ８）−（β８）−（Ｓ９）−（β９）−（Ｓ１０）−（β１０）−（Ｓ１１）−（β１１）−（Ｓ１２）−（β１２）−Ｓ１３
（式中、β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、β８、β９、β１０、β１１およびβ１２のそれぞれは独立に、β−シートであり、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ１１、Ｓ１２およびＳ１３のそれぞれは独立に、スペーサー配列である）
の構造を有することができる。
【０１０４】
一部の事例において、β１は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片に対し少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができる。一部の例において、β１は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片と同一であり得る。他の例において、β１は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片と同一であり得る。
【０１０５】
一部の事例において、β４は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片に対し少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができる。一部の例において、β４は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片と同一であり得る。他の例において、β４は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約ＱＫ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片と同一であり得る。
【０１０６】
一部の事例において、β９は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片に対し少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができる。一部の例において、β９は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片と同一であり得る。他の例において、β９は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片と同一であり得る。
【０１０７】
一部の事例において、β１２は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片に対し少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができる。一部の例において、β１２は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片と同一であり得る。他の例において、β１２は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片と同一であり得る。
【０１０８】
一部の事例において、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ１１、Ｓ１２およびＳ１３のそれぞれは独立に、１〜約５個の間、１〜約１０個の間、１〜約１５個の間、１〜約２０個の間、１〜約３０個の間、１〜約４０個の間、１〜約５０個の間、１〜約６０個の間、１〜約７０個の間、１〜約８０個の間、１〜約９０個の間、または１〜約１００個の間のアミノ酸残基を有することができる。
【０１０９】
一部の実施形態において、β１は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β４は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β９は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β１２は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができる。例えば、β１は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β４は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β９は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β１２は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができる。
【０１１０】
他の実施形態において、β１は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β４は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β９は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β１２は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができる。例えば、β１は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β４は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β９は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β１２は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができる。
【０１１１】
なお他の実施形態において、β１は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β４は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β９は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β１２は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができる。例えば、β１は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β４は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β９は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β１２は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができる。
【０１１２】
他の実施形態において、β１は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β４は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β９は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β１２は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができる。例えば、β１は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β４は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β９は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β１２は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができる。
【０１１３】
なお他の実施形態において、β１は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β４は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β９は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β１２は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができる。例えば、β１は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ２４〜Ｙ３１の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β４は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｑ５８〜Ｔ６３の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β９は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｙ１１１〜Ａ１１７の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β１２は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｈ１５１〜Ｒ１５５の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができる。
【０１１４】
なお別の実施形態において、β１は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β４は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β９は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β１２は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片に対し少なくとも約８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができる。例えば、β１は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｑ２９〜Ｙ３６の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β４は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｋ６３〜Ｔ６８の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β９は、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）の約Ｙ１１６〜Ａ１２２の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができ、β１２は、ＦＧＦ１８（配列番号１）の約Ｈ１４６〜Ｒ１５０の残基を有する断片に対し少なくとも９５％の相同性を示すアミノ酸配列を含むことができる。
【０１１５】
一部の事例において、融合ポリペプチドは、第１および／または第２のメンバーの二次構造を保持することができる。メンバーの二次構造は、アルファ−ヘリックスおよびベータ−シートが挙げられるがこれらに限定されない、二次単位の数および／または順序によって定義することができる。一部の例において、融合ポリペプチドは、第１および／または第２のメンバーと同じ数および順序の二次単位を含むことができる。第１および第２のメンバーがそれぞれＦＧＦファミリーメンバーである場合、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の二次構造を保持することができる。
【０１１６】
一部の事例において、融合ポリペプチドは、ヒトＴ細胞によって認識されるエピトープが実質的になくてよい。免疫原性がより低いタンパク質を作製する目的のためのかかるエピトープの排除は、以前に開示されている；例えば、参照により本明細書に援用される、ＷＯ９８／５２９７６、ＷＯ０２／０７９２３２およびＷＯ００／３３１７を参照されたい。ヒトＴ細胞エピトープのためのアッセイが記載されている（Stickler,  M.ら（２００３年）J  Immunol  Methods、２８１巻：９５〜１０８頁）。Ｔ−細胞エピトープまたは非ヒト配列を作製することなくオリゴマー形成することができるペプチド配列が特に興味深い。これは、Ｔ−細胞エピトープの存在および非ヒトの６〜１５−ｍｅｒ、特に、９−ｍｅｒ配列の発生に関してこれらの配列の直列反復配列を検査し、続いてＸＴＥＮ配列の設計を変更して、エピトープ配列を排除または破壊することによって達成される。ＭＨＣ受容体に結合することができるエピトープの数の低下に伴い、Ｔ細胞活性化と共にＴ細胞ヘルパー機能の潜在力の付随する低下、Ｂ細胞活性化または上方調節の低下および抗体産生の低下が生じる。低い程度の予測されるＴ−細胞エピトープは、例えば、ＴＥＰＩＴＯＰＥ（Sturniolo,  T.ら（１９９９年）Nat  Biotechnol、１７巻：５５５〜６１頁）等、エピトープ予測アルゴリズムによって決定することができる。
【０１１７】
一部の事例において、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合と比較して、任意の追加的なＴ−エピトープを欠き得る。さらなる事例において、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合と比較して、より少ないＴ−エピトープを有し得る。
【０１１８】
一部の事例において、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合と比較して任意の追加的なＢ−エピトープを欠き得る。さらなる事例において、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号１）の場合と比較してより少ないＢ−エピトープを有することができる。
【０１１９】
様々な事例において、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）に対応するアミノ酸残基において少なくとも１個の修飾をさらに含むことができ、少なくとも１個の修飾は、Ｙ１５１Ｌ、Ｐ１５２Ｙ、Ｋ１５３Ｑ、１５６ａＬ、１５６ｂＰ、１５６ｃＦ、１５６ｄＰ、１５６ｅＮ、１５６ｆＨ、Ｐ１５６Ａ、Ｌ１５８Ｋ、Ｐ１６１Ｑ、Ｋ１６３Ｅ、Ｙ１６４Ｆ、１６５ａＶ、１６５ｂＧ、１６５ｃＳ、１６５ｄＡ、１６５ｅＰ、Ｔ１６６Ｒ、Ｖ１６７Ｒ、Ｓ１７１Ｔ、Ｉ１７４Ｐ、Ｒ１７５Ｑ、Ｔ１７７Ｌ、Ｈ１７８Ｔ、ｄｅｓ  Ｐ１７９およびｄｅｓ  Ａ１８０からなる群から選択される。
【０１２０】
様々な事例において、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）に対応するアミノ酸残基において少なくとも１個の修飾をさらに含むことができ、前記少なくとも１個の修飾は、Ｌ１５６Ｙ、Ｙ１５７Ｐ、Ｑ１５８Ｋ、ｄｅｓ  Ｌ１６１、ｄｅｓ  Ｐ１６２、ｄｅｓ  Ｆ１６３、ｄｅｓ  Ｐ１６４、ｄｅｓ  Ｎ１６５、ｄｅｓ  Ｈ１６６、Ａ１６７Ｐ、Ｋ１６９Ｌ、Ｑ１７２Ｐ、Ｅ１７４Ｋ、Ｆ１７５Ｙ、ｄｅｓ  Ｖ１７６、ｄｅｓ  Ｇ１７７、ｄｅｓ  Ｓ１７８、ｄｅｓ  Ａ１７９、ｄｅｓ  Ｐ１８０、Ｒ１８２Ｔ、Ｒ１８３Ｖ、Ｔ１８７Ｓ、Ｐ１９０Ｉ、Ｑ１９１Ｒ、Ｌ１９３Ｔ、Ｔ１９４Ｈ、１９５ａＰおよび１９５ｂＡからなる群から選択される。
【０１２１】
一部の事例において、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）およびＦＧＦ１７−１（配列番号２）における対応する配列と同一である約２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸の配列を含む融合部位をさらに含み得る。他の事例において、融合部位は、ＦＧＦ１８（配列番号１）およびＦＧＦ１７−１（配列番号２）における対応する配列と同一である約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれを超えるアミノ酸の配列を含み得る。
【０１２２】
一部の事例において、融合部位は、少なくともＦＧＦ１８（配列番号１）およびＦＧＦ１７−１（配列番号２）アイソフォームの対応する配列と同一である約２〜２３、約３〜２０、約４〜１５、約５〜１０、約６〜９アミノ酸の配列を含み得る。
【０１２３】
一部の事例において、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）に対し少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を示し得る。例えば、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）に対し少なくとも約９０％の配列相同性を示し得る。さらに、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）に対し少なくとも約９５％の配列相同性を示し得る。
【０１２４】
一部の事例において、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）に対し約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％未満の配列相同性を示し得る。例えば、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）に対し約８０％未満の配列相同性を示し得る。さらに、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）に対し約５０％未満の配列相同性を示し得る。
【０１２５】
一部の事例において、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）に対し少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を示し得る。例えば、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）に対し少なくとも約９０％の配列相同性を示し得る。さらに、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）に対し少なくとも約９５％の配列相同性を示し得る。
【０１２６】
一部の事例において、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）に対し約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％未満の配列相同性を示すことができる。例えば、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１７−１（配列番号２）に対し約９０％未満の配列相同性を示すことができる。さらに、融合ポリペプチドは、ＩＬ２９（配列番号２）に対し約５０％未満の配列相同性を示すことができる。
【０１２７】
一部の事例において、融合ポリペプチドは、さらに修飾することができる。修飾は、Ｎ末端、Ｃ末端または任意の反応性アミノ酸側鎖に生じ得る。
【０１２８】
一部の実施形態において、融合ポリペプチドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によってさらに修飾することができる。ポリエチレングリコールの例として、モノメトキシＰＥＧマレイミド、モノメトキシＰＥＧヨードアセトアミドまたはモノメトキシＰＥＧプロピオンアルデヒドが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、ポリエチレングリコールは、約１Ｋｄ〜２００Ｋｄ、約５Ｋｄ〜２００Ｋｄ、約５Ｋｄ〜１５０Ｋｄ、約８Ｋｄ〜１５０Ｋｄ、約８Ｋｄ〜１００Ｋｄ、約１０Ｋｄ〜１００Ｋｄ、約１０Ｋｄ〜５０Ｋｄ、約１２Ｋｄ〜５０Ｋｄまたは約１２Ｋｄ〜４０Ｋｄの分子量を有することができる。
【０１２９】
一部の事例において、ペグ化融合ポリペプチドは、タンパク質ファミリーの第１および／または第２のメンバーと比較してより延長したｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期を示すことができる。例えば、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）と比較して延長したｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期を示すことができる。
【０１３０】
一部の事例において、融合ポリペプチドは、タンパク質ファミリーの第１および／または第２のメンバーと比較して増強した化学安定性を示すことができる。例えば、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）と比較して増強した化学安定性を示すことができる。
【０１３１】
融合ポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態において、融合ポリペプチドは、配列番号４、１１または１５に記載されたアミノ酸配列を含む。
【０１３２】
本開示の融合ポリペプチドは、ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）を発現する細胞の成長を促進する能力を有することができる。例えば、本開示の融合ポリペプチドは、ＦＧＦＲを発現する細胞に対して細胞分裂促進作用を有することができる。一部の事例において、ＦＧＦ受容体を発現する細胞の成長を促進する、融合ポリペプチドの能力は、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合と同等である。一部の実施形態において、ＦＧＦＲを発現する細胞に対する融合ポリペプチドの細胞分裂促進作用は、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合と同等である。一部の実施形態において、ＦＧＦＲを発現する細胞に対する融合ポリペプチドの細胞分裂促進作用は、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルにある。例えば、本開示の融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルでＦＧＦＲ３ｃ−１ｃを発現する細胞（例えば、ＢａＦ３細胞）の成長を促進する能力を有し得る。
【０１３３】
ＦＧＦＲを発現する細胞は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、これらのアイソフォーム、突然変異体または組合せからなる群から選択される、ＦＧＦＲを発現する細胞または細胞株であり得る。例えば、細胞または細胞株により発現されたＦＧＦＲは、ＦＧＦＲ１ｂ、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｂ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｂ、ＦＧＦＲ３ｃ、ＦＧＦＲｄｅｌｔ４および／またはこれらのスプライシングバリアント（例えば、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ等）であり得る。一部の実施形態において、細胞または細胞株により発現されたＦＧＦＲは、第１のＦＧＦＲまたはそのアイソフォームの１個または複数のドメインと第２のＦＧＦＲまたはそのアイソフォームの１個または複数のドメインとを含むキメラ受容体であり得る。例えば、細胞または細胞株により発現されたＦＧＦＲは、ＦＧＦＲ３ｂ−１ｃ（ＦＧＦＲ１ｃの膜貫通および細胞質ドメインに融合されたＦＧＦＲ３ｂの外部ドメインを含む）、ＦＧＦＲ３ｃ−１ｃ（ＦＧＦＲ１ｃの膜貫通および細胞質ドメインに融合されたＦＧＦＲ３ｃの外部ドメインを含む）、ＦＧＦＲ４−１ｃ（ＦＧＦＲ１ｃの膜貫通および細胞質ドメインに融合されたＦＧＦＲ４の外部ドメインを含む）およびＦＧＦＲｄｅｌｔａ４−１ｃ（ＦＧＦＲ１ｃの膜貫通および細胞質ドメインに融合されたＦＧＦＲｄｅｌｔａ４の外部ドメインを含む）から選択されるキメラ受容体であり得る。一部の実施形態において、ＦＧＦＲは、ヒトＦＧＦＲであり得る。
【０１３４】
ＦＧＦＲを発現する細胞に対する、融合ポリペプチドの細胞成長を促進する能力または融合ポリペプチドの細胞分裂促進作用は、細胞により発現される特異的な１種または複数のＦＧＦＲに基づいて選択的であり得る。例えば、融合ポリペプチドは、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ３ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ−１ｃ、ＦＧＦＲ３ｂ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ４−１ｃまたはＦＧＦＲｄｅｌｔａ４−１ｃを発現する細胞のみに対してそのような能力または作用を有し得る。一部の事例において、本開示の融合ポリペプチドは、低濃度で投与された場合（例えば、細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば、ＢａＦ３細胞または他の哺乳動物細胞または細胞株に適用された場合）、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ３ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ−１ｃ、ＦＧＦＲ３ｂ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ４−１ｃまたはＦＧＦＲｄｅｌｔａ４−１ｃから選択されるＦＧＦＲのうちの１種または複数を発現する細胞に対して強力な細胞分裂促進作用を示し得る。本明細書において使用される低濃度は、約１μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、２９ｎｇ／ｍｌ、２８ｎｇ／ｍｌ、２７ｎｇ／ｍｌ、２６ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、２４ｎｇ／ｍｌ、２３ｎｇ／ｍｌ、２２ｎｇ／ｍｌ、２１ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、１９ｎｇ／ｍｌ、１８ｎｇ／ｍｌ、１７ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、１．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、０．９ｎｇ／ｍｌ、０．８ｎｇ／ｍｌ、０．７ｎｇ／ｍｌ、０．６ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、０．４ｎｇ／ｍｌ、０．３ｎｇ／ｍｌ、０．２ｎｇ／ｍｌ、または０．１ｎｇ／ｍｌ未満の融合ポリペプチドの濃度であり得る。一部の実施形態において、本明細書において使用される低濃度は、約１００ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、２９ｎｇ／ｍｌ、２８ｎｇ／ｍｌ、２７ｎｇ／ｍｌ、２６ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、２４ｎｇ／ｍｌ、２３ｎｇ／ｍｌ、２２ｎｇ／ｍｌ、２１ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、１９ｎｇ／ｍｌ、１８ｎｇ／ｍｌ、１７ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、または２ｎｇ／ｍｌ未満の融合ポリペプチドの濃度であり得る。一部の実施形態において、本明細書において使用される低濃度は、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、例えば、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ〜１０��ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１６ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１７ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１８ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、１９ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２２ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２３ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２４ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２６ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２７ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２８ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２９ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、または９０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの融合ポリペプチドの濃度であり得る。
【０１３５】
本開示の融合ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで軟骨細胞増殖を刺激する能力を有することができ、一部の事例において、そのような能力は、ＦＧＦ１８（例えば、ヒトＦＧＦ１８）および／またはＦＧＦ１７（例えば、ヒトＦＧＦ１７）の場合と同等である。軟骨細胞は、ヒトの関節軟骨細胞であり得る。一部の実施形態において、軟骨細胞増殖を刺激する融合ポリペプチドの能力は、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルにある。例えば、本開示の融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルで、軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し得る。
【０１３６】
本開示の融合ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば、サフラニンＯ染色により明らかにされる）軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成を増加させる能力を有することができる。一部の事例において、そのような能力は、ＦＧＦ１８（例えば、ヒトＦＧＦ１８）および／またはＦＧＦ１７（例えば、ヒトＦＧＦ１７）の場合と同等である。軟骨細胞は、ヒトの関節軟骨細胞であり得る。一部の実施形態において、軟骨細胞におけるプログリカン合成を増加させる融合ポリペプチドの能力は、ＦＧＦ１８（配列番号１）および／またはＦＧＦ１７−１（配列番号２）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルにある。例えば、本開示の融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８（配列番号１）の場合の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％または５００％のレベルで、軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成を増加させる能力を有し得る。
【０１３７】
本開示は、本明細書に開示されている融合タンパク質を発現する宿主細胞も提供する。宿主細胞は、個々の細胞、細胞培養物または細胞株を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の後代を含む。宿主細胞は、本開示のベクターを含む異種配列をトランスフェクトすることができる。宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞その他等、原核生物または真核生物であり得る。細菌宿主細胞の例として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓその他の属に属する微生物が挙げられる。例えば、細菌宿主細胞として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、ＤＨ１、ＭＣ１０００、ＫＹ３２７６、Ｗ１４８５、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１、Ｎｏ．４９、ｉ  Ｗ３１１０、ＮＹ４９、Ｇ１６９８、ＢＬ２１またはＴＢ１を挙げることができるがこれらに限定されない。他の細菌宿主細胞として、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ  １４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ  １４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ  １３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ  １３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ  １５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０その他を挙げることができるがこれらに限定されない。
【０１３８】
酵母宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓその他等、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａその他の属に属する微生物を含むことができる。
【０１３９】
真核細胞の例として、哺乳動物細胞等、動物細胞を含み得る。例えば、宿主細胞は、ＣＯＳ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ａ５４９細胞、ＢａＦ３細胞、およびＡＴＣＣまたは他の寄託機関を通して利用できる任意の他の細胞等、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはサル細胞を含み得るがこれらに限定されない。
【０１４０】
本開示の宿主細胞は、培養において、および発酵槽を含む、培養物の成長に使用することができる任意の器具内で育成することができる。これらは、単層としてまたは表面に付着させて育成することができる。あるいは、宿主細胞は、懸濁して育成することができる。細胞は、無血清の培養培地において成長することができる。培地は、これに限定されないが、８ｍＭ  Ｌ−グルタミン等、グルタミンを補充したＯｐｔｉ−ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号＃１２６８１）；１０％仔ウシ血清、１０．５ｎｇ／ｍｌ  ｍＩＬ−３およびＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地；または５％ＦＣＳ培地等、市販の培地であり得る。
【０１４１】
本開示の宿主細胞は、本融合ポリペプチドの発現をもたらすための異種配列を含むことができる。異種配列は、好ましくは自己複製する核酸分子であり、移入し、宿主細胞の中におよび／またはその間に核酸分子を挿入するベクターを含むことができる。ベクターは、細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡの挿入のために主に機能するベクター、ＤＮＡまたはＲＮＡの複製のために主に機能するベクターの複製、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを含むことができる。上述の機能のうち２種以上を提供するベクターも含まれる。発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入されると、ポリペプチド（複数可）へと転写および翻訳され得るポリヌクレオチドである。
【０１４２】
本開示の融合タンパク質をコードする異種配列は、単一のまたは複数のベクターによって発現させることができる。核酸配列は、単一のオペロンにおいて、または１種類もしくは複数のベクターに置かれた別々のオペロンにおいて任意の順序で配置することができる。必要に応じて、単一のオペロンにおいて作動可能に連結された１種または複数の異種配列をそれぞれ含有する、２種またはそれを超える発現ベクターを用いることができる。連結とは、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段を含む任意の手段により、２個またはそれを超える化学元素または構成成分を一緒に接続することを指す。作動可能に連結とは、そのように記載された構成成分が、その意図された様式で機能することを可能にする関係性にある並置を指す。例えば、プロモーター配列が、コード配列の転写を駆動する場合、プロモーター配列は、コード配列に連結または作動可能に連結している。本ベクターは、エピソーム的に、または宿主細胞ゲノムの不可分の一部として複製能を維持することができる。
【０１４３】
本開示の異種配列は、単一の調節エレメントの制御下に置くことができる。一部の事例において、異種核酸配列は、単一のプロモーターによって調節される。他の事例において、異種核酸配列は、単一のオペロン内に置かれる。さらに他の事例において、異種核酸配列は、単一の読み枠内に置かれる。
【０１４４】
本核酸の調製は、種々のルーチン組換え技法および合成手順によって行うことができる。標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技法は、本技術分野において周知であり、Sambrook,  J.、Fritsch,  E.  F.およびManiatis,  T.、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual；Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press：Cold  Spring  Harbor（１９８９年）（Maniatis）ならびにT.  J.  Silhavy、M.  L.  BennanおよびL.  W.  Enquist、Experiments  with  Gene  Fusions、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、Cold  Spring  Harbor、N.Y.（１９８４年）ならびにAusubel,  F.  M.ら、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Greene  Publishing  Assoc.  and  Wiley-Interscienceより出版（１９８７年）によって記載されている。簡潔に説明すると、本核酸は、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡおよびＲＮＡから調製することができ、これらの全ては、細胞から直接的に抽出することができる、またはＰＣＲおよびｒｔ−ＰＣＲが挙げられるがこれらに限定されない、様々な増幅プロセスによって組換えにより産生することができる。
【０１４５】
核酸の直接化学合成は典型的に、成長中のヌクレオチドポリマー鎖の末端５’−ヒドロキシル基への３’−ブロックおよび５’−ブロックしたヌクレオチド単量体の逐次付加を含み、各付加は、典型的にはホスホトリエステル、ホスホラミダイトその他等のリン誘導体である、付加された単量体の３’−位における成長中の鎖の末端５’−ヒドロキシル基の求核攻撃によってもたらされる。かかる方法論は、当業者に公知であり、関連テキストおよび文献に記載されている（例えば、Matteuciら、Tet.  Lett.５２１巻：７１９頁（１９８０年）；米国特許第４，５００，７０７号、Caruthersら；ならびに米国特許第５，４３６，３２７号および同第５，７００，６３７号、Southernら）。
【０１４６】
調節エレメントは、例えば、プロモーターおよびオペレーターを含み、これらを工学的に操作して、糖タンパク質をコードする１種または複数の異種配列の発現を増加させることもできる。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ酵素による核酸配列の転写を開始および制御するヌクレオチドの配列である。オペレーターは、所望の核酸配列の転写を制御するように機能する、プロモーターに隣接するヌクレオチドの配列である。オペレーターは、特異的リプレッサータンパク質が結合することができるタンパク質結合ドメインを含有する。適したリプレッサータンパク質の非存在下で、転写はプロモーターにより開始する。適したリプレッサータンパク質の存在下で、リプレッサータンパク質は、オペレーターに結合し、これにより、プロモーターからの転写を阻害する。
【０１４７】
本開示の一部の実施形態において、発現ベクターにおいて使用されるプロモーターは、誘導性である。他の実施形態において、発現ベクターにおいて使用されるプロモーターは、構成的である。一部の実施形態において、１種または複数の核酸配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結され、１種または複数の他の核酸配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結される。真核生物宿主細胞における使用に適したプロモーターの非限定例として、ＣＭＶ最初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期または後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルス由来のＬＴＲおよびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４８】
発現ベクターにおける遺伝子は典型的に、任意のコードされたｍＲＮＡ遺伝子産物の翻訳（すなわち、合成）を方向付けるためのリボソーム結合部位もコードするであろう。発現ベクターにおいて使用することができる他の調節エレメントは、転写エンハンサーエレメントおよび転写ターミネーターを含む。例えば、Bitterら、Methods  in  Enzymology、１５３巻：５１６〜５４４頁（１９８７年）を参照されたい。
【０１４９】
発現ベクターは、特定の種類の宿主細胞における使用に適し、その他には適さないことがある。しかし、当業者であれば、ルーチン実験法により、特定の発現ベクターが、所与の宿主細胞に適するか容易に決定することができる。例えば、発現ベクターを宿主生物に導入することができ、続いてこの生物を生存率およびベクターに含有される任意の遺伝子の発現に関してモニターする。
【０１５０】
発現ベクターは、発現により、発現ベクターを保有する宿主細胞の選択または他の仕方での同定に有用な１種または複数の表現型形質を付与する、１種または複数の選択可能マーカー遺伝子を含有することもできる。真核細胞に適した選択可能マーカーの非限定例として、ジヒドロ葉酸還元酵素およびネオマイシン抵抗性が挙げられる。
【０１５１】
本ベクターは、種々の確立された技法により、安定的にまたは一過的に宿主細胞へと導入することができる。例えば、一方法は、発現ベクターがカルシウム沈殿物により導入される、塩化カルシウム処理を含む。他の塩、例えば、リン酸カルシウムを同様の手順に従って使用することもできる。加えて、エレクトロポレーション（すなわち、核酸に対する細胞の透過性を増加させるための電流の印加）を使用することができる。他の形質転換方法は、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介性形質転換および酢酸リチウムの存在下での熱ショックを含むこともできる。脂質複合体、リポソームおよびデンドリマーを用いて、宿主細胞をトランスフェクトすることもできる。
【０１５２】
宿主細胞への異種配列の導入後に、種々の方法を実施して、本ベクターが導入された宿主細胞を同定することができる。１つの例示的選択方法は、個々の細胞を継代培養して、個々のコロニーを形成し、続いて所望のタンパク質産物の発現に関して検査することを含む。別の方法は、発現ベクター内に含有される選択可能マーカー遺伝子の発現により付与される表現型形質に基づく、異種配列を含有する宿主細胞の選択を必要とする。当業者であれば、本技術分野で利用できるこれらのまたは他の方法を使用して、遺伝子改変された宿主細胞を同定することができる。
【０１５３】
例えば、宿主細胞への本開示の様々な異種配列の導入は、ＰＣＲ、サザンブロットまたはノーザンブロットハイブリダイゼーション等の方法によって確認することができる。例えば、核酸は、結果として得られる宿主細胞から調製することができ、目的の特異的配列は、目的の配列に特異的なプライマーを使用したＰＣＲにより増幅することができる。増幅された産物を、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動に付し、続いてエチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ溶液その他で染色する、またはＵＶ検出によりＤＮＡを検出する。あるいは、ハイブリダイゼーション反応において目的の配列に特異的な核酸プローブを用いることができる。特異的遺伝子配列の発現は、逆転写と連関したＰＣＲや、ノーザンブロットハイブリダイゼーションにより対応するｍＲＮＡを検出することにより、またはコードされる遺伝子産物と反応性の抗体を使用したイムノアッセイにより確認することができる。例示的イムノアッセイとして、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイおよびサンドイッチイムノアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５４】
さらに、宿主細胞への本開示の様々な異種配列の導入は、異種配列がコードする酵素の酵素活性によって確認することができる。酵素は、本技術分野において公知の種々の方法によってアッセイすることができる。一般に、酵素活性は、試験中である酵素反応の産物の形成または基質の変換によって確認することができる。反応は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。
【０１５５】
別の態様において、本開示は、融合ポリペプチドを産生して、所望の薬物動態学的、薬理学的または薬学的特性を達成する方法を提供する。一部の事例において、融合ポリペプチドは、タンパク質発現に適した条件下で、細胞においてベクターを発現させることにより産生することができる。
【０１５６】
インキュベーション時間、温度および培地等の要因が挙げられるがこれらに限定されない、タンパク質発現に適した条件は、細胞型に依存することができ、当業者によって容易に決定されるであろう。
【０１５７】
処置の方法
一態様において、本開示は、ＦＧＦ受容体（例えば、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３（例えば、ＦＧＦＲ３ｂおよび／またはＦＧＦＲ３ｃ）および／またはＦＧＦＲ４）の機能不全によって関係付けられる状態が挙げられるがこれらに限定されない、哺乳動物における疾患状態を処置するために本開示の融合ポリペプチドを使用する方法を提供する。
【０１５８】
本開示は、ＦＧＦ受容体（例えば、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３（例えば、ＦＧＦＲ３ｂおよび／またはＦＧＦＲ３ｃ）および／またはＦＧＦＲ４）の機能不全によって関係付けられる状態が挙げられるがこれらに限定されない、哺乳動物における疾患状態を処置するための医薬組成物の製造／調製のための本開示の融合ポリペプチドの使用も提供する。例えば、疾患状態は、軟骨欠損であってよい。一部の事例において、軟骨欠損は、骨関節炎または変性椎間板疾患であり得る。他の例において、軟骨欠損は、軟骨損傷であり得る。一部の実施態様において、前記疾患状態を処置することは、軟骨修復、例えば、軟骨のマイクロフラクチャー手術である。
【０１５９】
一部の事例において、本開示は、それを必要とする哺乳動物における軟骨欠損を処置する方法であって、哺乳動物に、治療有効量の本開示の融合ポリペプチドを投与するステップを含む方法を提供する。一部の例において、軟骨欠損は、骨関節炎または変性椎間板疾患であり得る。他の例において、軟骨欠損は、軟骨損傷であり得る。一部の実施形態において、前記軟骨欠損を処置することは、軟骨修復、例えば、軟骨のマイクロフラクチャー手術である。
【０１６０】
一部の事例において、哺乳動物は、ヒトである。他の事例において、哺乳動物は、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、スナネズミ、ハムスター、モルモット、サルまたは他の任意の哺乳動物であり得る。多くのかかる哺乳動物は、固形腫瘍および／または他のがんを含むある特定の疾患または障害のための前臨床モデルとして本技術分野に公知の対象であり得る（例えば、Talmadgeら、２００７年、Am.  J.  Pathol.１７０巻：７９３頁；Kerbel、２００３年、Canc.  Biol.  Therap.２巻（４号追補１）：Ｓ１３４；Manら、２００７年、Canc.  Met.  Rev.２６巻：７３７頁；Cespedesら、２００６年、Clin.  TransL  Oncol.８巻：３１８頁）。
【０１６１】
別の態様において、本開示は、哺乳動物における疾患状態を処置するために本開示の融合ポリペプチドを使用する方法であって、融合ポリペプチドは、第２の薬剤と併せて製剤化されまたは投与されることができる、方法を提供する。一部の事例において、第２の薬剤は、ヒアルロン酸であり得る。他の事例において、第２の薬剤は、骨関節炎、変性椎間板疾患および本明細書に記載の他の疾患等の状態の症状を緩和するために作用する薬剤であり得る。これらの薬剤としては、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えば、アセチルサリチル酸；イブプロフェン；ナプロキセン；インドメタシン；ナブメトン；トルメチン等が挙げられる。コルチコステロイドは、炎症を低減し、免疫系の活動を抑制するために使用される。最も一般的に処方されるこのタイプの薬物はプレドニソンである。パラセタモールも、骨関節炎を有する一部の患者において有効であり得る。抗凝固剤は、血液の急速な凝固を防止するために用いられ得る。これらは、血小板の固着を防止する非常に低用量のアスピリンから、ヘパリン／クマジンに及ぶ。
【０１６２】
医薬組成物
本開示の医薬組成物は、典型的に、本開示明の活性成分（例えば、融合ポリペプチド、ＰＥＧ修飾された融合ポリペプチド）またはその薬学的に許容される塩および／または配位錯体と、不活性固体希釈剤およびフィラー、希釈剤、無菌水溶液および様々な有機溶媒、浸透賦活薬、可溶化剤およびアジュバントが挙げられるがこれらに限定されない、１種または複数の薬学的に許容される賦形剤、担体とを含有する。後述は、非限定的な例示的医薬組成物およびこれを調製するための方法である。
【０１６３】
本医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル、丸薬、粉末、徐放製剤、溶液、懸濁液としての経口投与、無菌溶液、懸濁液もしくはエマルションとしての非経口的注射、軟膏もしくはクリームとしての局所的投与、または坐薬としての直腸投与に適した形態であり得る。医薬組成物は、正確な投薬量の単一の投与に適した単位剤形であり得る。医薬組成物は、活性成分として本開示に係る融合ポリペプチドおよび／またはＰＥＧ修飾された融合ペプチドをさらに含むことができ、従来の医薬品担体または賦形剤を含むことができる。さらに、これは、他の薬用または医薬品薬剤、担体、アジュバント等を含むことができる。
【０１６４】
例示的な非経口的投与形態は、無菌水溶液、例えば、水性プロピレングリコールまたはデキストロース溶液における活性ポリペプチドおよび／またはＰＥＧ修飾されたポリペプチドの溶液または懸濁液を含むがこれらに限定されない。かかる剤形は、必要に応じてヒスチジンおよび／またはリン酸塩等、塩で適切に緩衝することができる。
【０１６５】
一部の事例において、本開示は、本開示のポリペプチドまたはＰＥＧ修飾されたポリペプチドと、注射に適した医薬品賦形剤とを含有する、注射のための医薬組成物を提供する。組成物における薬剤の構成成分および量は、本明細書に記載されている通りである。
【０１６６】
注射による投与のために本開示の新規組成物を取り込むことができる形態は、水性もしくは油性懸濁液、またはゴマ油、トウモロコシ油、綿実油もしくはピーナッツ油とのエマルションと共に、エリキシル剤、マンニトール、デキストロースまたは無菌水溶液および同様の医薬品媒体を含む。
【０１６７】
生理食塩水における水溶液も、注射のために従来より使用される。エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールその他（およびこれらの適した混合物）、シクロデキストリン誘導体および植物油を用いることもできる。適切な流動性は、例えば、分散系の場合は要求される粒子径の維持のための、レシチン等のコーティングの使用により、また、サーファクタントの使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールその他によってもたらすことができる。
【０１６８】
無菌注射用溶液は、要求される量の本開示のポリペプチドまたはＰＥＧ修飾されたポリペプチドを、上に列挙する様々な他の成分を有する適切な溶媒に取り込むことにより調製され、要求に応じて、続いて滅菌濾過される。一般に、分散系は、基本分散培地および上に列挙するものに由来する要求される他の成分を含有する無菌媒体に、様々な滅菌された活性成分を取り込むことにより調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、ある特定の望ましい調製方法は、以前に滅菌濾過したその溶液から活性成分プラスいずれか追加的な所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥および凍結乾燥技法である。
【０１６９】
一部の事例において、本開示は、本開示の融合ポリペプチドまたはＰＥＧ修飾された融合ポリペプチドと、経口投与に適した医薬品賦形剤とを含有する、経口投与のための医薬組成物を提供する。
【０１７０】
一部の事例において、本開示は、（ｉ）有効量の本開示のポリペプチドまたはＰＥＧ修飾されたポリペプチド；任意選択で（ｉｉ）有効量の第２の薬剤；および（ｉｉｉ）経口投与に適した医薬品賦形剤を含有する、経口投与のための固体医薬組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、（ｉｖ）有効量の第３の薬剤をさらに含有する。
【０１７１】
一部の事例において、医薬組成物は、経口消費に適した液体医薬組成物であり得る。経口投与に適した本開示の医薬組成物は、粉末または顆粒、水性もしくは非水性液体における溶液もしくは懸濁液、水中油型エマルションまたは油中水型液体エマルションとして既定量の活性成分をそれぞれ含有する、カプセル、カシェーまたは錠剤または液体またはエアロゾルスプレー等、別々の剤形として提示することができる。かかる剤形は、薬学の方法のいずれかにより調製することができるが、あらゆる方法は、活性成分を、１種または複数の必要な成分を構成する担体と関連させるステップを含む。一般に、組成物は、活性成分を液体担体もしくは微粉化固体担体またはその両方と均一かつ密接に混合し、続いて必要に応じて産物を所望の体裁に成形することにより調製される。
【０１７２】
水は、一部のポリペプチドの分解を促す場合があるため、本開示は、活性成分を含む無水医薬組成物および剤形をさらに包含する。例えば、製剤の有効期間または経時的な安定性等の特徴を決定するために長期貯蔵をシミュレートする手段として、医薬品技術分野において水を加えることができる（例えば、５％）。本開示の無水医薬組成物および剤形は、無水または低水分含有成分および低水分または低湿度条件を使用して調製することができる。製造、包装および／または貯蔵中の水分および／または湿度との実質的な接触が予想される場合、ラクトースを含有する本開示の医薬組成物および剤形は、無水にすることができる。無水医薬組成物は、その無水性が維持されるように、調製および貯蔵することができる。したがって、無水組成物は、適したフォーミュラリーキットに含まれ得るように、水への曝露を防止することが公知の材料を使用して包装することができる。適した包装の例として、密封ホイル、プラスチックその他、単位用量容器、ブリスターパックおよびストリップパックが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７３】
融合ポリペプチドは、緊密な混合物において、従来の医薬品配合技法に従って、医薬品担体と組み合わせることができる。担体は、投与に望まれる調製物の形態に応じて多種多様な形態を採ることができる。経口剤形のための組成物の調製において、経口液体調製物（懸濁液、溶液およびエリキシル剤等）もしくはエアロゾルの場合は、例えば、水、グリコール、油、アルコール、調味料、保存料、着色料その他等、通常の医薬品培地のいずれかを担体として用いることができる；または経口固体調製物の場合は、デンプン、糖、微結晶性セルロース、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤および崩壊剤等の担体を使用することができ、一部の実施形態において、ラクトースの使用は用いない。例えば、適した担体は、固体経口調製物により、粉末、カプセルおよび錠剤を含む。必要に応じて、錠剤は、標準水性または非水性技法によりコーティングすることができる。
【０１７４】
医薬組成物および剤形における使用に適した結合剤として、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプンまたは他のデンプン、ゼラチン、アカシア等の天然および合成ガム、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸、他のアルギン酸塩、粉末化トラガント、グアーガム、セルロースおよびその誘導体（例えば、エチルセルロース、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシルメチルセルロースナトリウム）、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、アルファ化デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロースならびにこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７５】
本明細書に開示されている医薬組成物および剤形における使用に適したフィラーの例として、タルク、炭酸カルシウム（例えば、顆粒または粉末）、微結晶性セルロース、粉末化セルロース、デキストレート、カオリン、マンニトール、ケイ酸、ソルビトール、デンプン、アルファ化デンプンおよびこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７６】
本開示の組成物において崩壊剤を使用して、水性環境に曝露されると崩壊する錠剤を提供することができる。多すぎる崩壊剤は、ビンの中で崩壊し得る錠剤を産生する場合がある。少なすぎると、崩壊が起こるには不十分となる場合があり、よって、剤形からの活性成分（複数可）の放出の速度および程度を変更し得る。よって、活性成分（複数可）の放出を有害に変更するほど少なすぎでも多すぎでもない十分な量の崩壊剤を使用して、本明細書に開示されている化合物の剤形を形成することができる。使用される崩壊剤の量は、製剤の種類および投与の様式に基づき変動することができ、当業者には容易に識別可能であり得る。約０．５〜約１５重量パーセントの崩壊剤または約１〜約５重量パーセントの崩壊剤を医薬組成物において使用することができる。本開示の医薬組成物および剤形の形成に使用することができる崩壊剤として、アガーアガー（agar-agar）、アルギン酸、炭酸カルシウム、微結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポラクリリンカリウム（polacrilin  potassium）、デンプングリコール酸ナトリウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、他のデンプン、アルファ化デンプン、他のデンプン、粘土、他のアルギン、他のセルロース、ガムまたはこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７７】
本開示の医薬組成物および剤形の形成に使用することができる潤滑剤として、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油、軽油、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール、他のグリコール、ステアリン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、水素化植物油（例えば、ピーナッツ油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油）、ステアリン酸亜鉛、オレイン酸エチル、ラウリン酸エチル、寒天またはこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。追加的な潤滑剤は、例えば、シロイドシリカゲル、合成シリカの凝固エアロゾルまたはこれらの混合物を含む。潤滑剤は、任意選択で、医薬組成物の約１重量パーセント未満の量で添加することができる。
【０１７８】
水性懸濁液および／またはエリキシル剤が、経口投与に望まれる場合、その中の活性成分は、様々な甘味料または調味料、着色物または色素、ならびに、必要に応じて、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンおよびこれらの様々な組合せ等の希釈剤と共に乳化剤および／または懸濁化剤と組み合わせることができる。
【０１７９】
錠剤は、コーティングされていなくても、公知の技法によってコーティングされて、崩壊および胃腸管における吸収を遅延させ、これにより、より長期間にわたる持続的な作用をもたらしてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル等、時間遅延材料を用いることができる。経口使用のための製剤は、活性成分が、不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンと混合される、硬ゼラチンカプセルとして、または活性成分が、水もしくは油培地、例えば、ピーナッツ油、液体パラフィンもしくはオリーブ油と混合される、軟ゼラチンカプセルとして提示することもできる。
【０１８０】
本開示の医薬組成物および剤形の形成に使用することができるサーファクタントとして、親水性サーファクタント、親油性サーファクタントおよびこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、親水性サーファクタントの混合物を用いることができる、親油性サーファクタントの混合物を用いることができる、または少なくとも１種の親水性サーファクタントおよび少なくとも１種の親油性サーファクタントの混合物を用いることができる。
【０１８１】
より低いＨＬＢ値を有するサーファクタントは、より親油性または疎水性であり、油においてより大きい溶解性を有する一方、より高いＨＬＢ値を有するサーファクタントは、より親水性であり、水溶液におけるより大きい溶解性を有する。親水性サーファクタントは一般に、約１０を超えるＨＬＢ値を有する化合物、およびＨＬＢ尺度が一般に適用不能なアニオン性、カチオン性または双性イオン性化合物であると考えられる。同様に、親油性（すなわち、疎水性）サーファクタントは、約１０に等しいまたはそれ未満のＨＬＢ値を有する化合物である。しかし、サーファクタントのＨＬＢ値は、産業的医薬品および化粧品エマルションの製剤を可能にするために一般に使用される単なる大まかなガイドである。
【０１８２】
親水性サーファクタントは、イオン性または非イオン性のいずれかであり得る。適したイオン性サーファクタントとして、アルキルアンモニウム塩；フシジン酸塩；アミノ酸、オリゴペプチドおよびポリペプチドの脂肪酸誘導体；アミノ酸、オリゴペプチドおよびポリペプチドのグリセリド誘導体；レシチンおよび水素化レシチン；リゾレシチンおよび水素化リゾレシチン；リン脂質およびその誘導体；リゾリン脂質およびその誘導体；カルニチン脂肪酸エステル塩；アルキル硫酸の塩；脂肪酸塩；ドクセートナトリウム（sodium  docusate）；アシルラクチレート（acyl  lactylate）；モノおよびジグリセリドのモノおよびジアセチル化酒石酸エステル；サクシニル化モノおよびジグリセリド；モノおよびジグリセリドのクエン酸エステル；ならびにこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１８３】
上述の群の中で、イオン性サーファクタントは、例として：レシチン、リゾレシチン、リン脂質、リゾリン脂質およびこれらの誘導体；カルニチン脂肪酸エステル塩；アルキル硫酸の塩；脂肪酸塩；ドクセートナトリウム；アシルラクチレート（acylactylate）；モノおよびジグリセリドのモノおよびジアセチル化酒石酸エステル；サクシニル化モノおよびジグリセリド；モノおよびジグリセリドのクエン酸エステル；ならびにこれらの混合物を含む。
【０１８４】
イオン性サーファクタントは、レシチン、リゾレシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルセリン、ＰＥＧ−ホスファチジルエタノールアミン、ＰＶＰ−ホスファチジルエタノールアミン、脂肪酸のラクチル酸エステル、ステアロイル−２−ラクチレート、ステアロイルラクチレート、サクシニル化モノグリセリド、モノ／ジグリセリドのモノ／ジアセチル化酒石酸エステル、モノ／ジグリセリドのクエン酸エステル、コリルサルコシン、カプロン酸塩、カプリル酸塩、カプリン酸塩、ラウリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、オレイン酸塩、リシノール酸塩、リノール酸塩、リノレン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリル硫酸塩、テラセシル硫酸塩、ドクセート、ラウロイルカルニチン、パルミトイルカルニチン、ミリストイルカルニチンならびにこれらの塩および混合物の電離型であり得る。
【０１８５】
親水性非イオン性サーファクタントとして、アルキルグルコシド；アルキルマルトシド；アルキルチオグルコシド；ラウリルマクロゴールグリセリド；ポリエチレングリコールアルキルエーテル等、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル；ポリエチレングリコールアルキルフェノール等、ポリオキシアルキレンアルキルフェノール；ポリエチレングリコール脂肪酸モノエステルおよびポリエチレングリコール脂肪酸ジエステル等、ポリオキシアルキレンアルキルフェノール脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールグリセロール脂肪酸エステル；ポリグリセロール脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル等、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル；グリセリド、植物油、水素化植物油、脂肪酸およびステロールからなる群の少なくとも１メンバーによるポリオールの親水性エステル転移反応産物；ポリオキシエチレンステロール、その誘導体およびアナログ；ポリオキシエチル化ビタミンおよびその誘導体；ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー；およびその混合物；ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステルならびにトリグリセリド、植物油および水素化植物油からなる群の少なくとも１メンバーによるポリオールの親水性エステル転移反応産物を挙げることができるがこれらに限定されない。ポリオールは、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、プロピレングリコール、ペンタエリスリトールまたはサッカライドであり得る。
【０１８６】
他の親水性非イオン性サーファクタントは、ＰＥＧ−１０ラウリン酸塩、ＰＥＧ−１２ラウリン酸塩、ＰＥＧ−２０ラウリン酸塩、ＰＥＧ−３２ラウリン酸塩、ＰＥＧ−３２ジラウリン酸塩、ＰＥＧ−１２オレイン酸塩、ＰＥＧ−１５オレイン酸塩、ＰＥＧ−２０オレイン酸塩、ＰＥＧ−２０ジオレイン酸塩、ＰＥＧ−３２オレイン酸塩、ＰＥＧ−２００オレイン酸塩、ＰＥＧ−４００オレイン酸塩、ＰＥＧ−１５ステアリン酸塩、ＰＥＧ−３２ジステアリン酸塩、ＰＥＧ−４０ステアリン酸塩、ＰＥＧ−１００ステアリン酸塩、ＰＥＧ−２０ジラウリン酸塩、ＰＥＧ−２５グリセリルトリオレイン酸塩、ＰＥＧ−３２ジオレイン酸塩、ＰＥＧ−２０グリセリルラウリン酸塩、ＰＥＧ−３０グリセリルラウリン酸塩、ＰＥＧ−２０グリセリルステアリン酸塩、ＰＥＧ−２０グリセリルオレイン酸塩、ＰＥＧ−３０グリセリルオレイン酸塩、ＰＥＧ−３０グリセリルラウリン酸塩、ＰＥＧ−４０グリセリルラウリン酸塩、ＰＥＧ−４０パーム核油、ＰＥＧ−５０水素化ヒマシ油、ＰＥＧ−４０ヒマシ油、ＰＥＧ−３５ヒマシ油、ＰＥＧ−６０ヒマシ油、ＰＥＧ−４０水素化ヒマシ油、ＰＥＧ−６０水素化ヒマシ油、ＰＥＧ−６０トウモロコシ油、ＰＥＧ−６カプリン酸塩／カプリル酸塩グリセリド、ＰＥＧ−８カプリン酸塩／カプリル酸塩グリセリド、ポリグリセリル−１０ラウリン酸塩、ＰＥＧ−３０コレステロール、ＰＥＧ−２５植物ステロール、ＰＥＧ−３０大豆ステロール、ＰＥＧ−２０トリオレイン酸塩、ＰＥＧ−４０ソルビタンオレイン酸塩、ＰＥＧ−８０ソルビタンラウリン酸塩、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ＰＯＥ−９ラウリルエーテル、ＰＯＥ−２３ラウリルエーテル、ＰＯＥ−１０オレイルエーテル、ＰＯＥ−２０オレイルエーテル、ＰＯＥ−２０ステアリルエーテル、トコフェリルＰＥＧ−１００コハク酸塩、ＰＥＧ−２４コレステロール、ポリグリセリル−１０オレイン酸塩、Ｔｗｅｅｎ  ４０、Ｔｗｅｅｎ  ６０、スクロースモノステアリン酸塩、スクロースモノラウリン酸塩、スクロースモノパルミチン酸塩、ＰＥＧ  １０−１００ノニルフェノールシリーズ、ＰＥＧ  １５−１００オクチルフェノールシリーズおよびポロクサマーを限定することなく含む。
【０１８７】
適した親油性サーファクタントは、脂肪アルコール；グリセロール脂肪酸エステル；アセチル化グリセロール脂肪酸エステル；低級アルコール脂肪酸エステル；プロピレングリコール脂肪酸エステル；ソルビタン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル；ステロールおよびステロール誘導体；ポリオキシエチル化ステロールおよびステロール誘導体；ポリエチレングリコールアルキルエーテル；糖エステル；糖エーテル；モノおよびジグリセリドの乳酸誘導体；グリセリド、植物油、水素化植物油、脂肪酸およびステロールからなる群の少なくとも１メンバーによるポリオールの疎水性エステル転移反応産物；油溶性ビタミン／ビタミン誘導体；ならびにこれらの混合物を単なる一例として含む。この群の中で、好ましい親油性サーファクタントは、グリセロール脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルおよびこれらの混合物を含む、または植物油、水素化植物油およびトリグリセリドからなる群の少なくとも１メンバーによるポリオールの疎水性エステル転移反応産物である。
【０１８８】
一実施形態において、組成物は、本開示の化合物の優れた可溶化および／または溶解を確実にするために、また、本開示の化合物の沈殿を最小化するために可溶化剤を含むことができる。これは、非経口使用のための組成物、例えば、注射のための組成物に特に重要となり得る。可溶化剤を加えて、サーファクタント等、親水性薬物および／もしくは他の構成成分の溶解性を増加させる、または安定的なもしくは均質な溶液もしくは分散系として組成物を維持することもできる。
【０１８９】
適した可溶化剤の例として、次のものが挙げられるがこれらに限定されない：エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ベンジルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオールおよびその異性体、グリセロール、ペンタエリスリトール、ソルビトール、マンニトール、トランスクトール（transcutol）、ジメチルイソソルビド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよび他のセルロース誘導体、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体等、アルコールおよびポリオール；テトラヒドロフルフリルアルコールＰＥＧエーテル（グリコフロール（glycofurol））またはメトキシＰＥＧ等、約２００〜約６０００の平均分子量を有するポリエチレングリコールのエーテル；２−ピロリドン、２−ピペリドン、ε−カプロラクタム、Ｎ−アルキルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシアルキルピロリドン、Ｎ−アルキルピペリドン、Ｎ−アルキルカプロラクタム、ジメチルアセトアミドおよびポリビニルピロリドン等、アミドおよび他の窒素含有化合物；プロピオン酸エチル、クエン酸トリブチル、アセチルクエン酸トリエチル、アセチルクエン酸トリブチル、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、酪酸エチル、トリアセチン、モノ酢酸プロピレングリコール、ジ酢酸プロピレングリコール、ε−カプロラクトンおよびその異性体、δ−バレロラクトンおよびその異性体、β−ブチロラクトンおよびその異性体等、エステル；ならびにジメチルアセトアミド、ジメチルイソソルビド、Ｎ−メチルピロリドン、モノオクタノイン、ジエチレングリコールモノエチルエーテルおよび水等、本技術分野において公知の他の可溶化剤。
【０１９０】
可溶化剤の混合物を使用することもできる。例として、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ポリエチレングリコール２００−１００、グリコフロール、トランスクトール、プロピレングリコールおよびジメチルイソソルビドが挙げられるがこれらに限定されない。特に好ましい可溶化剤は、ソルビトール、グリセロール、トリアセチン、エチルアルコール、ＰＥＧ−４００、グリコフロールおよびプロピレングリコールを含む。
【０１９１】
含まれ得る可溶化剤の量は、特に限定されない。所与の可溶化剤の量は、生物が許容できる量に限定することができ、これは、当業者であれば容易に決定することができる。ある状況下では、例えば、薬物の濃度を最大化するように、生物が許容できる量をはるかに超える可溶化剤の量を含み、蒸留または蒸発等、従来の技法を使用して、対象に組成物を与える前に過剰な可溶化剤を除去することが有利であり得る。よって、存在する場合、可溶化剤は、薬物および他の賦形剤の組み合わせた重量に対して、重量で１０％、２５％、５０％、１００％または最大約２００％の重量比となり得る。必要に応じて、５％、２％、１％またはさらに少量等、ごく少量の可溶化剤を使用することもできる。典型的には、可溶化剤は、重量で約１％〜約１００％、より典型的には約５％〜約２５％の量で存在することができる。
【０１９２】
組成物は、１種または複数の薬学的に許容される添加物および賦形剤をさらに含むことができる。かかる添加物および賦形剤は、粘着力低下剤（detackifier）、消泡剤、緩衝剤、ポリマー、抗酸化剤、保存料、キレート化剤、粘性修飾物質、浸透圧調節剤（tonicifier）、香味料、着色剤、匂い物質、乳白剤、懸濁化剤、結合剤、フィラー、可塑剤、潤滑剤およびこれらの混合物を限定することなく含む。
【０１９３】
加えて、加工を容易にするため、安定性を増強するため、または他の理由で、酸または塩基を組成物に取り込むことができる。薬学的に許容される塩基の例として、アミノ酸、アミノ酸エステル、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化アルミニウム、炭酸カルシウム、水酸化マグネシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、合成ヒドロカルサイト（hydrocalcite）、水酸化アルミニウムマグネシウム、ジイソプロピルエチルアミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、トリエタノールアミン、トリエチルアミン、トリイソプロパノールアミン、トリメチルアミン、ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）その他が挙げられる。酢酸、アクリル酸、アジピン酸、アルギン酸、アルカンスルホン酸、アミノ酸、アスコルビン酸、安息香酸、ホウ酸、酪酸、炭酸、クエン酸、脂肪酸、ギ酸、フマル酸、グルコン酸、ハイドロキノスルホン酸、イソアスコルビン酸、乳酸、マレイン酸、シュウ酸、パラ−ブロモフェニルスルホン酸、プロピオン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、タンニン酸、酒石酸、チオグリコール酸、トルエンスルホン酸、尿酸その他等、薬学的に許容される酸の塩である塩基も適している。リン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムおよびリン酸二水素ナトリウム等、多塩基酸の塩を使用することもできる。塩基が塩である場合、カチオンは、アンモニウム、アルカリ金属、アルカリ土類金属その他等、いずれか簡便かつ薬学的に許容されるカチオンであり得る。例として、ナトリウム、カリウム、リチウム、マグネシウム、カルシウムおよびアンモニウムを挙げることができるがこれらに限定されない。
【０１９４】
適した酸は、薬学的に許容される有機または無機酸である。適した無機酸の例として、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、ホウ酸、リン酸その他が挙げられる。適した有機酸の例として、酢酸、アクリル酸、アジピン酸、アルギン酸、アルカンスルホン酸、アミノ酸、アスコルビン酸、安息香酸、ホウ酸、酪酸、炭酸、クエン酸、脂肪酸、ギ酸、フマル酸、グルコン酸、ハイドロキノスルホン酸、イソアスコルビン酸、乳酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、パラ−ブロモフェニルスルホン酸、プロピオン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、タンニン酸、酒石酸、チオグリコール酸、トルエンスルホン酸、尿酸その他が挙げられる。
【０１９５】
本開示の好ましい実施形態について本明細書に示し記載してきたが、当業者には、かかる実施形態が、単なる一例として提示されていることが明らかである。そこで、当業者であれば、本開示から逸脱することなく、多数の変種、変化および置換を想起し得る。本明細書に記載されている本開示の実施形態の様々な代替を、本開示の実施において用いてよいことを理解すべきである。次の特許請求の範囲が、本開示の範囲を定義すること、また、このような特許請求の範囲内の方法および構造ならびにこれらの均等物が、これにより網羅されることが意図される。
【実施例】
【０１９６】
以下に示す実施例および調製は、本開示の融合ポリペプチドならびにこれを使用および調製する方法をさらに図解し例証する。本開示の範囲が、以下の実施例および調製の範囲によって決して限定されないことが理解されるべきである。
【０１９７】
（実施例１）
ＦＧＦ１８／ＦＧＦ１７−１融合ポリペプチドのクローニングおよび発現
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のポリペプチドおよび融合ポリペプチドを設計し、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。簡潔に説明すると、融合ポリペプチドをコードする遺伝子を、発現ベクターｐＥＴ１１ａのＮｄｅ１およびＢａｍＨ１制限部位の間に挿入し、ファージＴ７プロモーターの制御下で発現を行った。このベクターをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充したＬＢ培地において、０．４〜０．６のＯＤ４５０となるまで細胞を成長させた。１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加により１２時間３７℃で発現を誘導した。遠心分離により細胞を収集し、ＰＢＳに懸濁し、超音波処理した。細胞ホモジネートを遠心分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行って、融合ポリペプチド、例えば、配列番号１、２、４、１１および１５の不溶性封入体画分における発現に成功したことを実証した（図１）。
【０１９８】
（実施例２）
ＦＧＦ１８／ＦＧＦ１７−１融合ポリペプチドのリフォールディングおよび精製
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のポリペプチドおよび融合ポリペプチドを、次の通りにリフォールディングし、精製した。発現後、遠心分離により細胞を収集し、ＰＢＳに再懸濁し、ホモジナイズした。次いで、ホモジネートを４０００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心分離した。上清を捨てた後、ポリペプチドおよび融合ポリペプチドを含有するペレットを得た。次いで、２Ｍ尿素を含有するＰＢＳで封入体を洗浄し、４０００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心分離した。洗浄した封入体を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、６Ｍ塩酸グアニジン、１０ｍＭ  ＤＴＴ  ｐＨ８．０に１／１０のｖ／ｖ比で可溶化した。室温において３〜４時間、可溶化を行った。次いで、可溶化された試料を遠心分離により清澄化した。次いで、ＧｕａＨＣｌ／ポリペプチド（または融合ポリペプチド）溶液を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４ｍＭシステイン、２ｍＭ  ＤＴＴ、２Ｍ尿素、１２０ｍＭ  ＮａＣｌを含有するｐＨ８．０のリフォールディングバッファーに１／２０のｖ／ｖ比で滴加して希釈し、４℃で一晩攪拌した。リフォールディングされた試料を濾過により清澄化し、次いで、カチオン交換カラム、例えば、ＳＰ．ＢＢ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でｐＨ８．０において捕捉し、２０ｍＭ  ＰＢ、ｐＨ８．０中、０〜１Ｍ塩化ナトリウムの上昇直線勾配により、結合した（融合）ポリペプチドを溶離した。次いで、溶離されたプールを小体積まで限外濾過した。次いで、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを使用して所望のポリペプチドを精製した。カラムはＰＢＳまたは２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化した。ゲル濾過カラムにロードした試料体積は、カラム体積の３％未満である。（図２に示す通り）所望のポリペプチドを含有する溶離ピークをプールし、１０％の最終濃度までグリセロールを添加した。次いで、−２０℃で試料を保存した。
【０１９９】
（実施例３）
ＦＧＦＲ発現ベクターの構築
ＦＧＦＲ１ｂ、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｂおよびＦＧＦＲ２ｃ発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３−ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂ、ｐｃＤＮＡ３−ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ、ｐｃＤＮＡ３−ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂおよびｐｃＤＮＡ３−ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃを、次の通りに作製した。完全長ヒトＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂ（ＦＪ８０９９１７．１）、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ（ＮＭ＿０２３１１０．２）、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ（ＮＭ＿０２２９７０．３）およびＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ（ＮＭ＿０００１４１．４）遺伝子を合成し、次いでＴａｉｈｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，ＬＴＤ（北京、中国）からのｐｃＤＮＡ３ベクターのＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ制限部位にクローニングした。ベクターｐｃＤＮＡ３−ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ／Ｒ１ｃは、ヒトＦＧＦＲ１ｃの膜貫通および細胞質ドメインに融合されたヒトＦＧＦＲ３ｂの外部ドメインを保有するキメラ受容体を発現する。ベクターｐｃＤＮＡ３−ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ／Ｒ１ｃは、ヒトＦＧＦＲ１ｃの膜貫通および細胞質ドメインに融合されたヒトＦＧＦＲ３ｃの外部ドメインを保有するキメラ受容体を発現する。ベクターｐｃＤＮＡ３−ＦＧＦＲ４／Ｒ１ｃは、ヒトＦＧＦＲ１ｃの膜貫通および細胞質ドメインに融合されたヒトＦＧＦＲ４の外部ドメインを保有するキメラ受容体を発現する。ベクターｐｃＤＮＡ３−ＦＧＦＲΔ４／ＲＩＣは、ヒトＦＧＦＲ１ｃの膜貫通および細胞質ドメインに融合されたヒトＦＧＦＲΔ４（ヒトＦＧＦＲ４のトランケート型）の外部ドメインを保有するキメラ受容体を発現する。
【０２００】
（実施例４）
ＤＮＡトランスフェクションおよび細胞選択
ＢａＦ３細胞を、１０％仔ウシ血清、１０．５ｎｇ／ｍｌ  ｍＩＬ−３およびＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。エレクトロポレーション（１０００ＵＦ、２２０Ｖ）により実施例３において構築した様々なＦＧＦＲ発現ベクターをこれらの細胞にトランスフェクトし、Ｇ４１８（６００μｇ／ｍｌ）＋ｍＩＬ−３馴化培地で選択し、これによりＦＧＦＲを発現する細胞を得た。
【０２０１】
（実施例５）
増殖アッセイ
ＦＧＦＲ発現ベクター（実施例４において得られたもの）でトランスフェクトされたＢａＦ３細胞を、Ｇ４１８により１０日間選択し、次いで、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。細胞（ウェル当たり５×１０４細胞）を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＭＡ）に蒔いた。上昇濃度の本開示の融合ポリペプチド、参照ポリペプチドおよび／または対照ポリペプチドを２μｇ／ｍｌ  ヘパリンと共に、全体積２００μｌで添加した。９６時間後、１００μｌのルシフェラーゼ検出試薬Ｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ  ＵＳＡ）を全てのウェルに添加し、室温で５分間インキュベートした。次いで、マルチプレートリーダーにおいて読み取った。ＥＣ５０をｐｒｉｓｍ５により計算した。
【０２０２】
（実施例６）
細胞分裂促進アッセイ
ヒト関節軟骨細胞をＬｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、製造業者の指示に従って培養した。ヒト関節軟骨細胞を、５％  ＦＣＳ培地中、９６ウェル当たり１０，０００細胞の密度で９６ウェルプレートに蒔き、３７℃、５％ＣＯにおいて一晩インキュベートした。次いで、培養培地を無血清培地に置き換えた。４日後、培地を０．１％  ＢＳＡを含有する無血清培地に交換した。追加的な４８時間の培養後、本開示の融合ポリペプチド、参照ポリペプチドおよび／または対照ポリペプチドをウェルに添加した。追加的な４日間の培養後まで、細胞数はｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ｇｌｏ試薬により評価しなかった。
【０２０３】
（実施例７）
軟骨細胞による微量培養
ヒト関節軟骨細胞から微量培養を樹立した。これらの培養を１μｇ／ｍｌの本開示の融合ポリペプチド、参照ポリペプチドおよび／または対照ポリペプチドの存在下または非存在下のいずれかにおいて、５％ＦＣＳを含むＣＢＭ中で成長させた。４日後、培養物を固定し、サフラニンで染色した。
【０２０４】
（実施例８）
ＦＧＦ１８／ＦＧＦ１７−１融合ポリペプチドによる、ＦＧＦＲ１ｂでトランスフェクトされたＢａＦ３細胞の増殖
ＦＧＦ１８／ＦＧＦ１７−１融合ポリペプチドの活性を、ＢａＦ３／ＦＧＦＲ１ｂ増殖アッセイにおいて評価した。具体的には、ＢａＦ３細胞を、１０％仔ウシ血清、２ｎｇ／ｍｌ  ｍＩＬ−３およびＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。これらの細胞に、ｐｃＤＮＡ３−ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂをエレクトロポレーション（１０００ＵＦ、１４０Ｖ）によりトランスフェクトし、ＩＬ−３の非存在下でＧ４１８（６００μｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ１＋ヘパリン（５０μｇ／ｍｌ）により選択した。この手順は、ＦＧＦＲ１ｂを発現するＢａＦ３細胞コロニーを生じさせた。
【０２０５】
ＢａＦ３／ＦＧＦＲ１ｂ細胞を、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞（ウェル当たり５×１０４細胞）を９６ウェルプレートに蒔いた。適切なＦＧＦおよび本開示の融合ポリペプチドを、ヘパリンと共に２００μｌの全体積で添加した。９６時間後に１００μｌのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を９６ウェルプレートに添加し、室温で１０分間インキュベートした。マルチプレートリーダーｓｙｎｅｒｇｙＩＩ（Ｂｉｏｔｅｃｋ）によりルミネッセンスをモニターした。任意の成長因子を含まないウェルからのバックグラウンドシグナルを、その存在下で得られた値から差し引いた。全ての処理を３連で実施した（図３）。ＦＧＦ１は陽性対照としての役割を果たした。図３に見られるように、ＦＧＦ１は、ＦＧＦＲ１ｂでトランスフェクトされたＢａＦ３細胞において強力な細胞分裂促進作用を示すが、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１７ｂおよび融合ポリペプチドはこの活性を、あったとしても非常にわずかしか示さない。
【０２０６】
（実施例９）
ＦＧＦ１８／ＦＧＦ１７−１融合ポリペプチドによる、ＦＧＦＲ１ｃでトランスフェクトされたＢａＦ３細胞の増殖
ＦＧＦ１８／ＦＧＦ１７−１融合ポリペプチドの活性を、ＢａＦ３／ＦＧＦＲ１ｃ増殖アッセイにおいて評価した。具体的には、ＢａＦ３細胞を、１０％仔ウシ血清、２ｎｇ／ｍｌ  ｍＩＬ−３およびＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。これらの細胞に、ｐｃＤＮＡ３−ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃをエレクトロポレーション（１０００ＵＦ、１４０Ｖ）によりトランスフェクトし、ＩＬ−３の非存在下でＧ４１８（６００μｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ１＋ヘパリン（５０μｇ／ｍｌ）により選択した。この手順は、ＦＧＦＲ１ｃを発現するＢａＦ３細胞コロニーを生じさせた。
【０２０７】
ＢａＦ３／ＦＧＦＲ１ｃ細胞を、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞（ウェル当たり５×１０４細胞）を９６ウェルプレートに蒔いた。適切なＦＧＦおよび本開示の融合ポリペプチドを、ヘパリンと共に２００μｌの全体積で添加した。９６時間後に１００μｌのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を９６ウェルプレートに添加し、室温で１０分間インキュベートした。マルチプレートリーダーｓｙｎｅｒｇｙＩＩ（Ｂｉｏｔｅｃｋ）によりルミネッセンスをモニターした。任意の成長因子を含まないウェルからのバックグラウンドシグナルを、その存在下で得られた値から差し引いた。全ての処理を３連で実施した（図４）。ＦＧＦ１は陽性対照としての役割を果たした。図４に見られるように、ＦＧＦ１は、ＦＧＦＲ１ｃでトランスフェクトされたＢａＦ３細胞において強力な細胞分裂促進作用を示すが、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１７ｂおよび融合ポリペプチドは、高濃度においていくらかの細胞分裂促進活性を示すのみであった。
【０２０８】
（実施例１０）
ＦＧＦ１８／ＦＧＦ１７−１融合ポリペプチドによる、ＦＧＦＲ２ｃでトランスフェクトされたＢａＦ３細胞の増殖
ＦＧＦ１８／ＦＧＦ１７−１融合ポリペプチドの活性を、ＢａＦ３／ＦＧＦＲ２ｃ増殖アッセイにおいて評価した。具体的には、ＢａＦ３細胞を、１０％仔ウシ血清、２ｎｇ／ｍｌ  ｍＩＬ−３およびＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。これらの細胞に、ｐｃＤＮＡ３−ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃをエレクトロポレーション（１０００ＵＦ、１４０Ｖ）によりトランスフェクトし、ＩＬ−３の非存在下でＧ４１８（６００μｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ１＋ヘパリン（５０μｇ／ｍｌ）により選択した。この手順は、ＦＧＦＲ２ｃを発現するＢａＦ３細胞コロニーを生じさせた。
【０２０９】
ＢａＦ３／ＦＧＦＲ２ｃ細胞を、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞（ウェル当たり５×１０４細胞）を９６ウェルプレートに蒔いた。適切なＦＧＦおよび本開示の融合ポリペプチドを、ヘパリンと共に２００μｌの全体積で添加した。９６時間後に１００μｌのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を９６ウェルプレートに添加し、室温で１０分間インキュベートした。マルチプレートリーダーｓｙｎｅｒｇｙＩＩ（Ｂｉｏｔｅｃｋ）によりルミネッセンスをモニターした。任意の成長因子を含まないウェルからのバックグラウンドシグナルを、その存在下で得られた値から差し引いた。全ての処理を３連で実施した（図５）。ＦＧＦ１は陽性対照としての役割を果たした。図５に見られるように、ＦＧＦ１は、ＦＧＦＲ２ｃでトランスフェクトされたＢａＦ３細胞において強力な細胞分裂促進作用を示すが、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１７ｂおよび融合ポリペプチドは、高濃度においていくらかの細胞分裂促進活性を示すのみであった。
【０２１０】
（実施例１１）
ＦＧＦ１８／ＦＧＦ１７−１融合ポリペプチドによる、ＦＧＦＲ３ｂでトランスフェクトされたＢａＦ３細胞の増殖
ＦＧＦ１８／ＦＧＦ１７−１融合ポリペプチドの活性を、ＢａＦ３／ＦＧＦＲ３ｂ増殖アッセイにおいて評価した。具体的には、ＢａＦ３細胞を、１０％仔ウシ血清、２ｎｇ／ｍｌ  ｍＩＬ−３およびＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。これらの細胞に、ｐｃＤＮＡ３−ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂをエレクトロポレーション（１０００ＵＦ、１４０Ｖ）によりトランスフェクトし、ＩＬ−３の非存在下でＧ４１８（６００μｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ１＋ヘパリン（５０μｇ／ｍｌ）により選択した。この手順は、ＦＧＦＲ３ｂを発現するＢａＦ３細胞コロニーを生じさせた。
【０２１１】
ＢａＦ３／ＦＧＦＲ３ｂ細胞を、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞（ウェル当たり５×１０４細胞）を９６ウェルプレートに蒔いた。適切なＦＧＦおよび本開示の融合ポリペプチドを、ヘパリンと共に２００μｌの全体積で添加した。９６時間後に１００μｌのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を９６ウェルプレートに添加し、室温で１０分間インキュベートした。マルチプレートリーダーｓｙｎｅｒｇｙＩＩ（Ｂｉｏｔｅｃｋ）によりルミネッセンスをモニターした。任意の成長因子を含まないウェルからのバックグラウンドシグナルを、その存在下で得られた値から差し引いた。全ての処理を３連で実施した（図６）。ＦＧＦ１は陽性対照としての役割を果たした。図６に見られるように、ＦＧＦ１は、ＦＧＦＲ３ｂでトランスフェクトされたＢａＦ３細胞において強力な細胞分裂促進作用を示すが、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１７ｂおよび融合ポリペプチドは、高濃度においていくらかの細胞分裂促進活性を示すのみであった。
【０２１２】
（実施例１２）
ＦＧＦ１８／ＦＧＦ１７−１融合ポリペプチドによる、ＦＧＦＲ３ｃ−１ｃでトランスフェクトされたＢａＦ３細胞の増殖
ＦＧＦ１８／ＦＧＦ１７−１融合ポリペプチドの活性を、ＢａＦ３／ＦＧＦＲ３ｃ−１ｃ増殖アッセイにおいて評価した。具体的には、ＢａＦ３細胞を、１０％仔ウシ血清、２ｎｇ／ｍｌ  ｍＩＬ−３およびＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。これらの細胞に、ｐｃＤＮＡ３−ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ／Ｒ１ｃをエレクトロポレーション（１０００ＵＦ、１４０Ｖ）によりトランスフェクトし、ＩＬ−３の非存在下でＧ４１８（６００μｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ１＋ヘパリン（５０μｇ／ｍｌ）により選択した。この手順は、ＦＧＦＲ３ｃ−１ｃを発現するＢａＦ３細胞コロニーを生じさせた。
【０２１３】
ＢａＦ３／ＦＧＦＲ３ｃ−１ｃ細胞を、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞（ウェル当たり５×１０４細胞）を９６ウェルプレートに蒔いた。適切なＦＧＦおよび本開示の融合ポリペプチドを、ヘパリンと共に２００μｌの全体積で添加した。９６時間後に１００μｌのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を９６ウェルプレートに添加し、室温で１０分間インキュベートした。マルチプレートリーダーｓｙｎｅｒｇｙＩＩ（Ｂｉｏｔｅｃｋ）によりルミネッセンスをモニターした。任意の成長因子を含まないウェルからのバックグラウンドシグナルを、その存在下で得られた値から差し引いた。全ての処理を３連で実施した（図７）。ＦＧＦ１は陽性対照としての役割を果たした。図７に見られるように、ＦＧＦ１、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１７ｂおよび融合ポリペプチドは全て、ＦＧＦＲ３ｃ−１ｃでトランスフェクトされたＢａＦ３細胞において強力な細胞分裂促進作用を示した。
【０２１４】
（実施例１３）
ＦＧＦ１８／ＦＧＦ１７−１融合ポリペプチドによる、ＦＧＦＲ４−１ｃでトランスフェクトされたＢａＦ３細胞の増殖
ＦＧＦ１８／ＦＧＦ１７−１融合ポリペプチドの活性を、ＢａＦ３／ＦＧＦＲ４−１ｃ増殖アッセイにおいて評価した。具体的には、ＢａＦ３細胞を、１０％仔ウシ血清、２ｎｇ／ｍｌ  ｍＩＬ−３およびＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。これらの細胞に、ｐｃＤＮＡ３−ＦＧＦＲ４／Ｒ１ｃをエレクトロポレーション（１０００ＵＦ、１４０Ｖ）によりトランスフェクトし、ＩＬ−３の非存在下でＧ４１８（６００μｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ１＋ヘパリン（５０μｇ／ｍｌ）により選択した。この手順は、ＦＧＦＲ４−１ｃを発現するＢａＦ３細胞コロニーを生じさせた。
【０２１５】
ＢａＦ３／ＦＧＦＲ４−１ｃ細胞を、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞（ウェル当たり５×１０４細胞）を９６ウェルプレートに蒔いた。適切なＦＧＦおよび本開示の融合ポリペプチドを、ヘパリンと共に２００μｌの全体積で添加した。９６時間後に１００μｌのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を９６ウェルプレートに添加し、室温で１０分間インキュベートした。マルチプレートリーダーｓｙｎｅｒｇｙＩＩ（Ｂｉｏｔｅｃｋ）によりルミネッセンスをモニターした。任意の成長因子を含まないウェルからのバックグラウンドシグナルを、その存在下で得られた値から差し引いた。全ての処理を３連で実施した（図８）。ＦＧＦ１は陽性対照としての役割を果たした。図８に見られるように、ＦＧＦ１は、ＦＧＦＲ４−１ｃでトランスフェクトされたＢａＦ３細胞において強力な細胞分裂促進作用を示すが、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１７ｂおよび融合ポリペプチドは、高濃度においていくらかの細胞分裂促進活性を示すのみであった。
【０２１６】
（実施例１４）
ＦＧＦ１８／ＦＧＦ１７−１融合ポリペプチドによる、ＦＧＦＲｄｅｌｔａ４−１ｃでトランスフェクトされたＢａＦ３細胞の増殖
ＦＧＦ１８／ＦＧＦ１７−１融合ポリペプチドの活性を、ＢａＦ３／ＦＧＦＲｄｅｌｔａ４−１ｃ増殖アッセイにおいて評価した。具体的には、ＢａＦ３細胞を、１０％仔ウシ血清、２ｎｇ／ｍｌ  ｍＩＬ−３およびＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。これらの細胞に、ｐｃＤＮＡ３−ＦＧＦＲΔ４／Ｒ１ｃをエレクトロポレーション（１０００ＵＦ、１４０Ｖ）によりトランスフェクトし、ＩＬ−３の非存在下でＧ４１８（６００μｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ１＋ヘパリン（５０μｇ／ｍｌ）により選択した。この手順は、ＦＧＦＲｄｅｌｔａ４−１ｃを発現するＢａＦ３細胞コロニーを生じさせた。
【０２１７】
ＢａＦ３／ＦＧＦＲｄｅｌｔａ４−１ｃ細胞を、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞（ウェル当たり５×１０４細胞）を９６ウェルプレートに蒔いた。適切なＦＧＦおよび本開示の融合ポリペプチドを、ヘパリンと共に２００μｌの全体積で添加した。９６時間後に１００μｌのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を９６ウェルプレートに添加し、室温で１０分間インキュベートした。マルチプレートリーダーｓｙｎｅｒｇｙＩＩ（Ｂｉｏｔｅｃｋ）によりルミネッセンスをモニターした。任意の成長因子を含まないウェルからのバックグラウンドシグナルを、その存在下で得られた値から差し引いた。全ての処理を３連で実施した（図９）。ＦＧＦ１は陽性対照としての役割を果たした。図９に見られるように、ＦＧＦ１は、ＦＧＦＲｄｅｌｔａ４−１ｃでトランスフェクトされたＢａＦ３細胞において強力な細胞分裂促進作用を示すが、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１７ｂおよび融合ポリペプチドは、高濃度においていくらかの細胞分裂促進活性を示すのみであった。
【０２１８】
（実施例１５）
ヒト関節軟骨細胞の成長に対するＦＧＦ１８アナログの効果
本開示の融合ポリペプチドを、軟骨細胞において細胞分裂促進反応を誘発するこれらの能力に関して試験した。融合ポリペプチドに対する細胞分裂促進反応の代表例を図１０に示す。見られる通り、試験した全ての融合ポリペプチドが、ＦＧＦ１８の場合と同等の、軟骨細胞増殖を刺激する能力を示した。
【０２１９】
（実施例１６）
プロテオグリカン産生に対する効果
プロテオグリカン産生に対する融合ポリペプチドの効果を、実施例７に記載のヒト関節軟骨細胞の微量培養において評価した。図１１に示す通り、試験した融合ポリペプチドは、ＦＧＦ１８の場合と同等の、サフラニンＯ染色により明らかとされたプロテオグリカン合成を増加させる能力を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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