(57)【要約】本発明は、二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤、その製造、それを含有する医薬組成物及び治療活性物質としてのその使用に関する。本発明の活性化合物は、例えばアルツハイマー病の治療的及び／又は予防的処置に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＡＣＥ酵素の酵素活性部位及び触媒ドメインの両方に結合する二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤であって、エキソサイト阻害部分（Ａ’）が、リンカー（Ｌ’）により前記ＢＡＣＥ１阻害剤の活性部位阻害部分（Ｂ’）に結合している二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤、又はその薬学的に許容し得る塩。
【請求項２】
Ｌ’が、
ｉ．  −（Ｇｌｙ）ｘ−［式中、ｘは３である］、
ｉｉ．  ＰＥＧ（４）、及び
ｉｉｉ．  −Ｇｌｙ−ＤＬｙｓ−Ｇｌｙ−
からなる群より選択される、請求項１〜２のいずれか一項記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤。
【請求項３】
Ａ’が、
【化６】
2018523636.tif 000022
からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤。
【請求項４】
Ａ’が、
【化７】
2018523636.tif 000023
からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤。
【請求項５】
Ｂ’が、
【化８】
2018523636.tif 000024
からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤。
【請求項６】
【化９】
2018523636.tif 000025
2018523636.tif 000026
からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項記載の化合物。
【請求項７】
【化１０】
2018523636.tif 000027
からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項記載の化合物。
【請求項８】
薬学的に許容し得る塩がトリフルオロアセタートである、請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物。
【請求項９】
治療活性物質として使用するための、請求項１〜８のいずれか一項記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤。
【請求項１０】
上昇したβ−アミロイドレベル及び／又はβ−アミロイドオリゴマー及び／又はβ−アミロイド斑及びさらなる沈着物によって特徴付けられる疾患及び障害、特にアルツハイマー病の治療的及び／又は予防的処置のための治療活性物質として使用するための、請求項１〜８のいずれか一項記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤並びに薬学的に許容し得る担体及び／又は薬学的に許容し得る補助物質を含む医薬組成物。
【請求項１２】
上昇したβ−アミロイドレベル及び／又はβ−アミロイドオリゴマー及び／又はβ−アミロイド斑及びさらなる沈着物によって特徴付けられる疾患及び障害、特にアルツハイマー病の治療的及び／又は予防的処置のための医薬を製造するための、請求項１〜８のいずれか一項記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤の使用。
【請求項１３】
ＢＡＣＥ１活性の阻害に使用するための、特に、上昇したβ−アミロイドレベル及び／又はβ−アミロイドオリゴマー及び／又はβ−アミロイド斑及びさらなる沈着物によって特徴付けられる疾患及び障害、アルツハイマー病、糖尿病又は２型糖尿病の治療的及び／又は予防的処置のための方法であって、請求項１〜８のいずれか一項記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤をヒト又は動物に投与することを含む方法。
【請求項１４】
本明細書上記のとおりの発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二重ＢＡＣＥ１阻害特性を有するペプチド、その製造、それを含有する医薬組成物及び治療活性物質としてのその使用に関する。
【０００２】
技術分野
本化合物は、Ａｓｐ２（β−セクレターゼ、ＢＡＣＥ１又はメマプシン−２）阻害活性を有し、したがって、上昇したβ−アミロイドレベル及び／又はβ−アミロイドオリゴマー及び／又はβ−アミロイド斑及びさらなる沈着物によって特徴付けられる疾患及び障害、特にアルツハイマー病の治療的及び／又は予防的処置に使用され得る。
【０００３】
背景技術
アルツハイマー病（ＡＤ）は、中枢神経系の神経変性障害であり、そして高齢者人口における進行性認知症の主な原因である。その臨床症状は、記憶、認知、時間及び場所の見当識、判断力並びに論理的思考の機能障害であるが、また重度の情緒障害でもある。現在のところ、この疾患又はその進行を防ぐか、あるいはその臨床症状を安定に回復させることができる利用可能な処置法は存在しない。ＡＤは、高い平均余命を持つ全ての社会において主要な健康問題になっており、そしてまたそれらの医療制度にとって重大な経済的負担にもなっている。
【０００４】
ＢＡＣＥ１酵素は、アルツハイマー病関連Ａβ−ペプチドの生成をもたらすＡＰＰタンパク質のタンパク質分解性切断のうち１つを担っている。ＢＡＣＥ１酵素の阻害によりＡβ−ペプチドの産生を遅延又は停止させることは、有望な治療概念である。
【０００５】
活性部位指向型ＢＡＣＥ１阻害剤は、例えば国際公開公報第２００６／００２９０７号に記載されており、エキソサイト指向型（触媒ドメイン）ＢＡＣＥ１阻害剤は、例えばKornacker et al., Biochemistry 2005, 44, 11567-73に記載されている。さらに、Linning, Organic & Biomolecular Chemistry 10(41), 2012, p8216、国際公開公報第２００５０９７１９９号、US2007149763及び国際公開公報第２０１３０５６０５４号は、ペプチド構造を有するＢａｃｅ１阻害剤を記載している。
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明の目的は、ＢＡＣＥ酵素の酵素活性部位及び触媒ドメインの両方に結合する二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤、前述の化合物の調製、それを含有する医薬及びその製造、並びにアルツハイマー病などの、ＢＡＣＥ１活性の阻害に関連する疾患及び障害の治療的及び／又は予防的処置における前述の化合物の使用である。その上、神経組織（例えば、脳）内、その上又はその周囲におけるβ−アミロイド斑の形成、又は形成及び沈着は、本化合物により、ＡＰＰ又はＡＰＰフラグメントからのＡβ産生を阻害することによって阻害される。
【０００７】
本明細書に使用される一般用語の以下の定義は、問題となる用語が単独で又は他の基と組み合わせて出現するかにかからわらず適用される。
【０００８】
【表１】
2018523636.tif 000002
【０００９】
用語「Ｓｔａ」は、スタチン、（３Ｓ，４Ｓ）−４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（CAS49642-07-1）を表す。
【００１０】
用語「ＭｅｔＳｔａ」は、（３Ｓ，４Ｓ）−４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルチオヘキサン酸（CAS n/a）（Ｆｍｏｃ保護型のCAS:268542-18-3）を表す。
【００１１】
用語「ＰＥＧ（４）」は、１５−アミノ−４，７，１０，１３，テトラオキサペンタデカン酸（CAS:n/a）（Ｆｍｏｃ保護型のCAS:557756-85-1）を表す。
【００１２】
用語Ｌｅｕ＊Ａｌａは、「Ｔａｎｇ」ヒドロキシエチレンジペプチドアイソスターを表す（参考文献：A. K. Ghosh, D. Shin, D. Downs, G. Koelsch, X. Lin, J. Ermolieff and J. Tang, J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 3522）。
【００１３】
用語「ＰＥＧ２」は、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（CAS:n/a）（Ｆｍｏｃ保護型のCAS:166108-71-0）を表す。
【００１４】
用語「ＰＥＧ３」は、１２−アミノ−４，７，１０−トリオキサドデカン酸（CAS:n/a）、Ｆｍｏｃ保護型のCAS:867062-95-1）を表す。
【００１５】
用語「薬学的に許容し得る塩」は、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するために適切な塩を表す。無機酸及び有機酸との適切な塩の例は、非限定的に、酢酸、クエン酸、ギ酸、フマル酸、塩酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、硝酸、リン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、コハク酸、硫酸（sulfuric acid、sulphuric acid）、酒石酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などである。特定の塩は、トリフルオロ酢酸塩である。
【００１６】
用語「薬学的に許容し得る担体」及び「薬学的に許容し得る補助物質」は、製剤の他の成分と適合性の希釈剤又は賦形剤などの担体及び補助物質を表す。
【００１７】
用語「医薬組成物」は、特定の成分を予め決定された量又は比率で含む産物、及び特定の成分を特定の量で組み合わせることに直接又は間接的に起因する任意の産物を包含する。好ましくは、医薬組成物は、１つ以上の活性成分及び不活性成分を含む任意の担体を含む産物、並びに成分のうち任意の２つ以上の組合せ、複合体化若しくは凝集に、又は成分のうち１つ以上の解離に、又は成分のうち１つ以上の他の種類の反応若しくは相互作用に、直接又は間接的に起因する任意の産物を包含する。
【００１８】
用語「最大半値阻害濃度」（ＩＣ５０）は、インビトロで生物学的過程の５０％阻害を得るために必要な特定の化合物の濃度を意味する。ＩＣ５０値は、ｐＩＣ５０値（−ｌｏｇ ＩＣ５０）に対数変換することができ、ｐＩＣ５０においてより高い値は、指数関数的により高い効力を示す。ＩＣ５０値は、絶対値ではないが、実験条件、例えば採用された濃度に依存する。ＩＣ５０値は、Cheng-Prusoffの式を用いて絶対阻害定数（Ｋｉ）に変換することができる（Biochem. Pharmacol. (1973) 22:3099）。用語「阻害定数」（Ｋｉ）は、受容体に対する特定の阻害剤の絶対結合親和性を意味する。それは、競合結合アッセイを用いて測定され、競合リガンド（例えば放射性リガンド）が存在しなかったならば特定の阻害剤が受容体の５０％を占有する濃度に等しい。Ｋｉ値は、より高い値が指数的により大きな効力を示す、ｐＫｉ値（−ｌｏｇ Ｋｉ）に対数変換することができる。
【００１９】
「治療有効量」は、病状を処置するために対象に投与された場合に、その病状についてそのような処置をもたらすために十分な化合物の量を意味する。「治療有効量」は、化合物、処置されている病状、処置される重症度又は疾患、対象の年齢及び相対的な健康状態、投与経路及び投与形態、担当の医師又は獣医の判断、並びに他の要因に応じて変動する。
【００２０】
変数を参照する場合の用語「本明細書に定義される」及び「本明細書に記載される」は、もしあれば、その変数の広い定義、並びに好ましい、より好ましい及び最も好ましい定義を参照により組み入れるものである。
【００２１】
化学反応を参照する場合の用語「処置する」、「接触させる」及び「反応させる」は、表示された及び／又は所望の産物を産生するために適切な条件で２つ以上の試薬を添加又は混合することを意味する。表示された及び／又は所望の産物を産生する反応は、最初に添加された２つの試薬の組合せに必ずしも直接的に起因するわけではない場合があること、すなわち最終的に表示された及び／又は所望の産物の形成に至る混合物中に産生される１つ以上の中間体があり得ることが認識されるべきである。
【００２２】
本発明は、また、医薬組成物、前述の化合物を使用する方法、及びそれを調製する方法を提供する。
【００２３】
全ての別々の実施態様を組み合わせることができる。
【００２４】
本発明は、ＢＡＣＥ１酵素の酵素活性部位及び触媒ドメインの両方に結合する二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤に関する。
【００２５】
エキソサイトモチーフ及びスタチン型遷移状態ミメティックを含有する活性部位阻害剤は、単独ではＢＡＣＥ１の阻害を示さない。
【００２６】
本発明のある特定の実施態様は、ＢＡＣＥ酵素の酵素活性部位及び触媒ドメインの両方に結合する、本明細書記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤であって、エキソサイト阻害部分（Ａ’）が、リンカー（Ｌ’）により該ＢＡＣＥ１阻害剤の活性部位阻害部分（Ｂ’）に結合している二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤、又はその薬学的に許容し得る塩に関する。
【００２７】
本発明のある特定の実施態様は、Ｌ’が、
ｉ．  −（Ｇｌｙ）ｘ−［式中、ｘは３である］、
ｉｉ．  ＰＥＧ（４）、及び
ｉｉｉ．  −Ｇｌｙ−ＤＬｙｓ−Ｇｌｙ−
からなる群より選択される、本明細書記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤に関する。
【００２８】
本発明のある特定の実施態様は、Ａ’が、
【００２９】
【化１】
2018523636.tif 000003
からなる群より選択される、本明細書記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤に関する。
【００３０】
本発明のある特定の実施態様は、Ａ’が、
【００３１】
【化２】
2018523636.tif 000004
からなる群より選択される、本明細書記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤に関する。
【００３２】
本発明のある特定の実施態様は、Ｂ’が、
【００３３】
【化３】
2018523636.tif 000005
からなる群より選択される、本明細書記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤に関する。
【００３４】
本発明のある特定の実施態様は、
【００３５】
【化４】
2018523636.tif 000006
2018523636.tif 000007
からなる群より選択される、本明細書記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤に関する。
【００３６】
本発明のある特定の実施態様は、
【００３７】
【化５】
2018523636.tif 000008
からなる群より選択される、本明細書記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤に関する。
【００３８】
本発明のある特定の実施態様は、本明細書記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤であって、薬学的に許容し得る塩がトリフルオロアセタートである二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤に関する。
【００３９】
本発明のある特定の実施態様は、治療活性物質として使用するための本明細書記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤に関する。
【００４０】
本発明のある特定の実施態様は、ＢＡＣＥ１活性の阻害剤として使用するための本明細書記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤に関する。
【００４１】
発明のある特定の実施態様は、上昇したβ−アミロイドレベル及び／又はβ−アミロイドオリゴマー及び／又はβ−アミロイド斑及びさらなる沈着物によって特徴付けられる疾患及び障害、特にアルツハイマー病の治療的及び／又は予防的処置のための治療活性物質として使用するための本明細書記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤に関する。
【００４２】
本発明のある特定の実施態様は、アルツハイマー病の治療的及び／又は予防的処置のための治療活性物質として使用するための本明細書記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤に関する。
【００４３】
本発明のある特定の実施態様は、本明細書記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤並びに薬学的に許容し得る担体及び／又は薬学的に許容し得る補助物質を含む医薬組成物に関する。
【００４４】
本発明のある特定実施態様は、ＢＡＣＥ１活性の阻害に使用するための医薬を製造するための、本明細書記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤の使用に関する。
【００４５】
本発明のある特定の実施態様は、上昇したβ−アミロイドレベル及び／又はβ−アミロイドオリゴマー及び／又はβ−アミロイド斑及びさらなる沈着物によって特徴付けられる疾患及び障害、特にアルツハイマー病の治療的及び／又は予防的処置のための医薬を製造するための、本明細書記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤の使用に関する。
【００４６】
本発明のある特定の実施態様は、アルツハイマー病の治療的及び／又は予防的処置のための医薬を製造するための、本明細書記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤の使用に関する。
【００４７】
本発明のある特定の実施態様は、ＢＡＣＥ１活性の阻害に使用するための、本明細書記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤に関する。
【００４８】
本発明のある特定の実施態様は、上昇したβ−アミロイドレベル及び／又はβ−アミロイドオリゴマー及び／又はβ−アミロイド斑及びさらなる沈着物によって特徴付けられる疾患及び障害、特にアルツハイマー病の治療的及び／又は予防的処置に使用するための、本明細書記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤に関する。
【００４９】
本発明のある特定の実施態様は、アルツハイマー病の治療的及び／又は予防的処置に使用するための、本明細書記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤に関する。
【００５０】
本発明のある特定の実施態様は、ＢＡＣＥ１活性の阻害に使用するための、特に、上昇したβ−アミロイドレベル及び／又はβ−アミロイドオリゴマー及び／又はβ−アミロイド斑及びさらなる沈着物によって特徴付けられる疾患及び障害、アルツハイマー病の治療的及び／又は予防的処置のための方法であって、本明細書記載の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤をヒト又は動物に投与することを含む方法に関する。
【００５１】
その上、本発明は、全ての光学異性体、すなわちジアステレオ異性体、ジアステレオマー混合物、ラセミ混合物、それらの対応する鏡像異性体全て及び／又は互変異性体並びにそれらの溶媒和物を含む。
【００５２】
二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤は、本明細書記載のように調製され得る。出発物質は市販されている場合があり、又は公知の方法により調製される場合がある。
【００５３】
酸との対応する薬学的に許容し得る塩は、当業者に公知の標準的な方法によって、例えば、二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤を例えばジオキサン又はＴＨＦなどの適切な溶媒中に溶解させること、及び適切な量の対応する酸を添加することによって得ることができる。産物は、通常、濾過又はクロマトグラフィーによって単離することができる。塩基を用いた二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤の薬学的に許容し得る塩への変換は、そのような塩基を用いたそのような化合物の処理によって実施することができる。そのような塩を形成させる可能な一方法は、例えば、適切な溶媒（例えばエタノール、エタノール−水混液、テトラヒドロフラン−水混液）中の化合物溶液に、例えばＭ（ＯＨ）ｎ［式中、Ｍ＝金属陽イオン又はアンモニウム陽イオン、ｎ＝水酸化物陰イオンの数］などの１／ｎ当量の塩基性塩を添加し、蒸発又は凍結乾燥によって溶媒を除去することによる。
【００５４】
それらの調製が実施例に記載されていない限り、二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤及び全ての中間産物は、類似の方法又は本明細書記載の方法に従って調製することができる。出発物質は市販されている、当技術分野において公知である、又は当技術分野において公知若しくはそれに類似の方法によって調製することができる。
【００５５】
親化合物にインビボで戻り変換することが可能な誘導体を提供するために、本発明における二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤が官能基で誘導体化される場合があることが認識されている。
【００５６】
薬理学的試験
二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤及びその薬学的に許容し得る塩は、貴重な薬理学的特性を有する。本発明の化合物は、ＢＡＣＥ１活性の阻害に関連することが見出された。化合物は、本明細書下記の試験に従って研究された。
【００５７】
細胞Ａβ低下アッセイ法：
ヒトＡＰＰ ｗｔ遺伝子（ＡＰＰ６９５）のｃＤＮＡを発現しているベクターを安定的にトランスフェクションされたヒトＨＥＫ２９３細胞を使用して、細胞アッセイ法で化合物の効力を評価した。細胞を細胞培養培地（１０％(v/v) ウシ胎仔血清、グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン添加イスコフ）中で９６ウェルマイクロタイタープレート中に約８０％の集密度に蒔き、ＦＣＳ不含の８％ ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯの終濃度を０．８％v/vに保った）含有培地１／１０体積中に１０×濃度の化合物を添加した。加湿インキュベーターに入れて３７℃及び５％ ＣＯ２で１８〜２０時間インキュベーション後に、Ａβ４０濃度の決定のために培養上清を採集した。Ａβ４０のＣ末端を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いて９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（例えば、Nunc MaxiSorb）をコーティングした（Brockhaus et al., NeuroReport 9, 1481-1486; 1998）。例えば１％ ＢＳＡで非特異的結合部位をブロッキングし、洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合型Ａβ検出用抗体（例えば、抗体４Ｇ８、Senetek, Maryland Heights, MO）と一緒に培養上清を適切に希釈して添加し、５〜７時間インキュベートした。続いて、０．０５％ ツイーン２０を含有するトリス緩衝塩類溶液でマイクロタイタープレートのウェルを徹底的に洗浄し、クエン酸緩衝液中でテトラメチルベンジジン／Ｈ２Ｏ２を用いてアッセイ物を呈色させた。１体積の１N Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させた後、ＥＬＩＳＡリーダーにより波長４５０nmで反応を測定した。公知量の純粋なＡβペプチドを用いて得られた標準曲線から培養上清中のＡβ濃度を計算した。
【００５８】
【表２】
2018523636.tif 000009
2018523636.tif 000010
2018523636.tif 000011
【００５９】
エキソサイトモチーフ及びスタチン型遷移状態ミメティックを含有する活性部位阻害剤は、単独ではＢＡＣＥ１阻害を示さない。
【００６０】
【表３】
2018523636.tif 000012
【００６１】
【表４】
2018523636.tif 000013
【００６２】
医薬組成物
二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤及び薬学的に許容し得る塩を、治療活性物質として、例えば薬学的調合物の形態で使用することができる。薬学的調合物を、例えば錠剤、コーティング錠、糖衣錠、ゼラチン硬及び軟カプセル剤、液剤、乳剤又は懸濁剤の形態で経口投与することができる。しかし、投与は、例えば坐剤の形態で直腸的に、又は例えば注射液の形態で非経口的にもたらすこともできる。
【００６３】
薬学的調合物の産生のために、二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤及びその薬学的に許容し得る塩を、薬学的に不活性な無機又は有機担体を用いて加工することができる。例えば、錠剤、コーティング錠、糖衣錠及びゼラチン硬カプセル剤用のそのような担体として、ラクトース、コーンスターチ又はその誘導体、タルク、ステアリン酸又はその塩などを使用することができる。ゼラチン軟カプセル剤に適切な担体は、例えば、植物油、ロウ、脂肪、半固形状及び液状ポリオールなどである。しかし、活性物質の性質に応じて、ゼラチン軟カプセル剤の場合、担体は通常必要とされない。液剤及びシロップ剤の産生に適切な担体は、例えば、水、ポリオール、グリセロール、植物油などである。坐剤に適切な担体は、例えば、天然又は硬化油、ロウ、脂肪、半液状又は液状ポリオールなどである。
【００６４】
その上、薬学的調合物は、保存料、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、着香料、浸透圧を変動させるための塩、緩衝剤、マスキング剤又は抗酸化剤などの薬学的に許容し得る補助物質を含有することができる。薬学的調合物は、他の薬学的に貴重な物質もなお含有することができる。
【００６５】
二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤又はその薬学的に許容し得る塩及び治療的に不活性な担体を含有する医薬も本発明の目的であり、１つ以上の二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤及び／又はその薬学的に許容し得る塩並びに所望であれば１つ以上の他の治療的に貴重な物質を、１つ以上の治療的に不活性な担体と一緒にガレヌス投与形態にすることを含むそれらの製造方法も同様である。
【００６６】
投薬量は、広い範囲内を変動することができ、もちろん各特定の場合における個別の要件に調整しなければならない。経口投与の場合、成人用投薬量は、二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤約０．０１mg〜約１０００mg/日又はその薬学的に許容し得る塩の対応量まで変動する可能性がある。１日投薬量は、１回量として、又は分割量で投与される場合があり、加えて、適応とされていることが判明した場合は上限を超える可能性もある。
【００６７】
以下の実施例は、本発明を限定せずに例証するが、単にその代表的なものとして役立つ。薬学的調合物は、好都合には、二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤を約１〜５００mg、好ましくは１〜１００mg含有する。本発明による組成物の例は、以下の通りである。
【００６８】
実施例Ａ
以下の組成の錠剤を通常の方法で製造する。
【００６９】
【表５】
2018523636.tif 000014
【００７０】
製造手順
１．  成分１、２、３及び４を混合し、精製水を用いて造粒する。
２．  顆粒を５０℃で乾燥させる。
３．  顆粒に適切な粉砕装置を通過させる。
４．  成分５を添加し、３分間混合し、適切なプレス機で圧縮する
【００７１】
実施例Ｂ−１
以下の組成のカプセル剤を製造する。
【００７２】
【表６】
2018523636.tif 000015
【００７３】
製造手順
１．  成分１、２及び３を適切なミキサーで３０分間混合する。
２．  成分４及び５を添加し、３分間混合する。
３．  適切なカプセルに充填する。
【００７４】
二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤、ラクトース及びコーンスターチを、最初にミキサーで、次に粉砕機で混合する。混合物をミキサーに戻し、それにタルクを添加し、完全に混合する。この混合物を機械により適切なカプセル、例えばゼラチン硬カプセルに充填する。
【００７５】
実施例Ｂ−２
以下の組成のゼラチン軟カプセル剤を製造する。
【００７６】
【表７】
2018523636.tif 000016
【００７７】
【表８】
2018523636.tif 000017
【００７８】
製造手順
二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤を他の成分の温溶融物中に溶解させ、この混合物を適切なサイズのゼラチン軟カプセルに充填する。充填済みゼラチン軟カプセル剤を通常の手順に従って処理する。
【００７９】
実施例Ｃ
以下の組成の坐剤を製造する：
【００８０】
【表９】
2018523636.tif 000018
【００８１】
製造手順
坐剤の塊をガラス又はスチール製容器の中で融解させ、十分に混合し４５℃に冷却する。その後すぐ、微粉末状二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤をそれに添加し、それが完全に分散するまで撹拌する。その混合物を適切なサイズの坐剤鋳型に注ぎ、放冷する。次に、坐剤を鋳型から取り出し、ロウ紙又は金属箔で個包装する。
【００８２】
実施例Ｄ
以下の組成の注射液を製造する：
【００８３】
【表１０】
2018523636.tif 000019
【００８４】
製造手順
二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤をポリエチレングリコール４００と注射用水（一部）との混合物中に溶解させる。酢酸でｐＨを５．０に調整する。残りの量の水の添加により体積を１．０mlに調整する。溶液を濾過し、適切な過量でバイアル中に充填し、滅菌する。
【００８５】
実施例Ｅ
以下の組成の分包を製造する：
【００８６】
【表１１】
2018523636.tif 000020
【００８７】
製造手順
二重部位ＢＡＣＥ１阻害剤をラクトース、微結晶セルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウムと混合し、水へのポリビニルピロリドンの混合物を用いて造粒する。顆粒をステアリン酸マグネシウム及び着香添加剤と混合し、分包に充填する。
【００８８】
実験の部
本発明の例証のために以下の実施例を提供する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものとして見なされてはならず、単にその代表として見なされるべきである。
【００８９】
ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙマイクロ波ペプチド合成装置のための一般的手順：
０．１mMol規模：
Ｆｍｏｃの脱保護：
最初の脱保護のために、洗浄され、予め膨潤された樹脂（４３５mg、０．１mMol、TentaGel S RAM（負荷：０．２３mMol/g）を、５０℃の（Rapp Polymere, Cat: S30023）をマイクロ波条件においてジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％ ピペリジン溶液（７．０mL）で３分間処理した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、脱保護のためにＤＭＦ中２０％ ピペリジン溶液（７．０mL）でマイクロ波条件下において７５℃で５分間処理した。
【００９０】
アミノ酸のカップリング：
洗浄され、予め膨潤された樹脂に、ＤＭＦ中０．２Ｍ アミノ酸溶液（２．５mL、５．０eq.）に続いてＤＭＦ中０．５M （１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ−モルホリノ−カルベニウムヘキサフルオロホスファート（ＣＯＭＵ）溶液（１．０mL、５．０eq.）（CAS: 1075198-30-9, Iris Biotech, Cat: RL-1175.1000）、続いてＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中２M ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）溶液（０．５mL、１０．０eq.）を添加した。カップリングのために、この反応混合物をマイクロ波条件下において７５℃で５分間処理した。
【００９１】
０．２５mMol規模：
Ｆｍｏｃの脱保護：
洗浄され、予め膨潤された樹脂（１．０９ｇ、０．２５mMol、TentaGel S RAM（負荷：０．２３mMol/g）、（Rapp Polymere, Cat: S30023）を最初の脱保護のためにＤＭＦ中２０％ ピペリジン溶液（１０．０mL）でマイクロ波条件下において５０℃で３分間処理した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、脱保護のためにＤＭＦ中２０％ ピペリジン溶液（１０．０mL）でマイクロ波条件下において７５℃で５分間処理した。
【００９２】
アミノ酸のカップリング：
洗浄され、予め膨潤された樹脂に、ＤＭＦ中０．２M アミノ酸溶液（５．０mL、４．０eq.）に続いてＤＭＦ中０．５M ＣＯＭＵ溶液（２．０mL、４．０eq.）、（CAS: 1075198-30-9, Iris Biotech, Cat: RL-1175.1000）、続いてＮＭＰ中２M ＤＩＰＥＡ溶液（１．０mL、８．０eq.）を添加した。カップリングのためにこの反応混合物をマイクロ波条件下において７５℃で５分間処理した。
【００９３】
最終切断のための一般的手順：
０．１mMol規模：
樹脂をＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、次に振盪器上で室温のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）：水 ９５：２．５：２．５の溶液（５mL）で３０分間処理した。樹脂を濾過した。粗ペプチドをＥｔ２Ｏ（３５mL）で沈殿させた。懸濁物を遠心分離し、溶媒をデカントした。固体をアセトニトリル及び水に溶解させ、凍結乾燥し、粗ペプチドを得た。
【００９４】
精製のための一般的手順：
粗生成物をアセトニトリル及び水（ＴＦＡを０．１％含有）に溶解させ、次に調製用ＨＰＬＣにより精製した。カラムYMC-Actus Pro C8、５μm、７５×３０mm、水（ＴＦＡを０．１％含有）：アセトニトリルが７０：３０〜２：９８の勾配、流速３０mL/min。
【００９５】
実施例は、本明細書記載の一般的手順と同様に調製することができる。
【００９６】
包括的５アミノ酸長ペプチドアレイを用いたＢＡＣＥ１結合物質の発見
アレイの設計、合成及びバックグラウンド対照：ＢＡＣＥ１結合物質を発見するために、２．４７M ペプチド（システインを除く全てのあり得る５アミノ酸長ペプチドの包括的リストを表す）を有するアレイを設計した。各５アミノ酸長ペプチドを、Ｎ末端及びＣ末端の３サイクルのリンカー合成で合成した。リンカー合成のために、Ｇ及びＳを３：１の比で含む混合物を使用した。ペプチド配列は、以下の形式である：ＺＺＺ−５アミノ酸−ＺＺＺ［配列中、Ｚはリンカー混合物からのアミノ酸である。ペプチドの合成後、ＱＣのためにアレイをＣｙ５−ストレプトアビジンで予備染色し、３３３ng/ml Ｃｙ５−ストレプトアビジン（Amersham, UK, cat# PA45001）を含有する結合緩衝液（１％ アルカリ可溶性カゼイン、Novagen, Billerica, USA, cat#70955, ０．０５％ ツイーン２０）３０ml中で１時間バックグラウンドシグナルを測定した。アレイを洗浄緩衝液Ｉ（Roche/Nimblegen, Madison, USA）中で３０秒間洗浄し、０．１ ＴＥ緩衝液中で短く洗浄した。マイクロ遠心機で回転させることによってアレイを乾燥させて微量の水を除去し、MS200スキャナー（Roche/Nimblegen）を用いて波長６３５nm及び分解能２μmでスキャンした。このステップの後に、アレイは標的タンパク質と結合する準備ができていた。
【００９７】
ＢＡＣＥ１のビオチン化：Pierce EZ-link Micro NHS-PEG4-ビオチン化キット、cat#21955を使用してＢＡＣＥ１酵素（WT1-13-2、０．７mg/ml）をビオチンで標識した。標識化のために、ＢＡＣＥ１酵素 ７０μl又は５０μgを、新鮮調製されたＮＨＳ−ビオチン水溶液 ２μlと混合し、ＲＴで１時間インキュベートした。Micro Bio-Spin 30クロマトグラフィーカラム（BioRad, cat 732-6223）を使用した反応溶液の２回のスピン濾過（１，０００ｇ、４分）によって過剰の遊離ビオチンを除去した。ビオチン化ＢＡＣＥ１を小分けして−２０Ｃで保存した。
【００９８】
結合アッセイ法：データの再現性を保証するためにビオチン化ＢＡＣＥ１ ５μｌを結合緩衝液４０μlと混合し、ＨＸ１ミキサーが付属したアレイに負荷し、４Ｃで一晩インキュベートした。インキュベーション後に、混合物を除去し、アレイを洗浄緩衝液Ｉの中で３０秒間洗浄し、０．１ ＴＥ緩衝液中で短く洗浄した。結合緩衝液 ３０ml中、３３３ng/ml ストレプトアビジン−Ｃｙ５（Amersham, UK, cat# PA45001）を用いてビオチン化ＢＡＣＥ１のところでアレイを１時間染色し、上記のように洗浄した。マイクロ遠心機中で回転させることによってアレイを乾燥させて微量の水を除去し、ＭＳ２００スキャナー（Roche/Nimblegen）を使用して波長６３５nm及び分解能２umでデータを取得した。
【００９９】
データ解析及び結果：NimbleGen DEVAソフトウェアを使用して画像解析及びシグナル抽出を行った。全ての５アミノ酸長配列についてＢＡＣＥ１の結合に起因するビオチン特異的蛍光シグナルを、先に収集したバックグラウンドシグナルに対してプロットした（「アレイの設計、合成及びバックグラウンド対照」を参照されたい）。最大のＢＡＣＥ１特異的シグナル及び低いバックグラウンドを有する５アミノ酸長ペプチド配列がこの解析から特定され、これらの配列が共有する６つの最も共通のモチーフを下表の最初の列に挙げる。
【０１００】
【表１２】
2018523636.tif 000021
【０１０１】
伸長ペプチドアレイを使用したＢＡＣＥ１結合物質の最適化
アレイの設計：５アミノ酸長アレイ実験で特定されたモチーフは、最適なＢＡＣＥ１結合物質の短いバージョンだけを表す可能性がある。表２の列２にＸで示した全部で２０種の天然アミノ酸を用いて、５アミノ酸長のアレイから選択されたコア配列をＮ末端及びＣ末端の両方から２つのアミノ酸だけ伸長することによって新しいアレイを設計することにより、より長いモチーフを見出すことができる。伸長ライブラリーのそれぞれは、５回の反復で合成された１６０，０００種の独特なペプチドを含む。実施例１に記載するようにＢＡＣＥ１結合アッセイ法及び画像処理を行った。
【０１０２】
データ解析及び結果：各コアモチーフについて、ＢＡＣＥ１に最高の結合性を有する伸長された配列を表１３（３列目）に示す。「ＹＦＫ」、「ＰＹＦＫ」及び「ＹＦＫＰ」モチーフ（表１３の上の３行）についての伸長された配列は、同じＹＰＹＦＫＰＡ配列を共有し、それらが同じ共通配列に相当することを示唆している。３つの配列ＤＹＰＫＦＬＰ、ＤＹＰＫＦＩＳ、ＳＹＰＫＦＩＤは、ＢＡＣＥ１並びにＮ末端及びＣ末端での多様なアミノ酸組成に類似の結合性を有したので、それらを「ＰＫＦ」モチーフ伸長配列として選択した。
【０１０３】
二重置換／欠失ペプチドアレイを使用したＢＡＣＥ１結合物質の最適化
アレイの設計：第３ラウンドの結合物質最適化は、伸長アレイ実験で特定された配列をグリシン（Ｇ）アミノ酸で伸長して、表１３（第４列）に示されるような１０アミノ酸長ペプチドにし、続いて参照配列の全てのあり得る単一及び二重置換／欠失変異体を含む二重置換／欠失ライブラリーを設計することを含んでいた。１０塩基長ペプチドについて、二重置換／欠失ライブラリーは、約１．６５万種の独特なペプチドを含んでいた。各ペプチドを７回の反復で合成した。
【０１０４】
置換／欠失アレイのためのＢＡＣＥ１結合アッセイ法及び画像処理を上記のように行った（包括的５アミノ酸長ペプチドアレイを使用したＢＡＣＥ１結合物質の発見）。
【０１０５】
データ解析及び結果：異常値を除去し、反復にわたり各ペプチドについてシグナルを平均することを含んだ各ペプチドライブラリーの解析後、最高の結合シグナルを有するペプチド配列を選択した。選択された配列を表１３に示す（最後の列）。
【配列表】
2018523636000001.app
【国際調査報告】
2018523636.tif 000028
2018523636.tif 000029
2018523636.tif 000030
2018523636.tif 000031