(57)【要約】  アルツハイマー病(AD)は、年老いていく大人で最も一般的なタイプの認知症であり、ADを抱えて生きる人の数は増加すると予想され、そのため、治療並びに疾患進行を診断及び測定するツールの探索がますます急を要するようになっている。特に、ADの診断のための理想的なバイオマーカーは、非疾患と比べた疾患に対する高い特異性と疾患型を区別する高い感度を有するべきであるだけでなく、疾患のごく初期の段階で変化を検出することができるべきでもある。ミクログリア活性化をAD発症の初期事象として用いて、本発明者らは、ADを診断し、その病期を判定し、それを発症する可能性を決定する潜在能力を有するCSF中のバイオマーカーのパネルを同定した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マーカー:
i)配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;
及び/或いは
ii)配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片
を含むバイオマーカーパネル。
【請求項２】
前記パネルが、配列番号4のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼL1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片をさらに含む、請求項1記載のバイオマーカーパネル。
【請求項３】
前記パネルが、配列番号5のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するビタミンD結合タンパク質又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片をさらに含む、請求項1又は請求項2のいずれか一項記載のバイオマーカーパネル。
【請求項４】
前記パネルが、補体及び凝固カスケード、解糖/グリコーゲン合成、プリオン病、アミノ及びヌクレオチド糖代謝、抗原プロセシング及び提示、細胞外マトリックス-受容体相互作用、焦点接着、アクチン細胞骨格の調節、又はアラニン/アスパラギン酸/グルタミン酸代謝の群から選択されるKEGG経路に関与するタンパク質から選択される1以上のバイオマーカーをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のバイオマーカーパネル。
【請求項５】
前記パネルが、表1、2、3、4、5、6、7、8、もしくは9のいずれか1つから選択される少なくとも1つ、任意に、2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のバイオマーカーパネル。
【請求項６】
前記パネルが、ダイナクチンサブユニット1、コフィリン-1、ペルオキシレドキシン-1、MARCKS関連タンパク質、モエシン、アクチン、タンパク質TMSB4XP4、ApoE、ゲルゾリン、セクレトグラニン、アルブミン、及び補体タンパク質の群から選択される少なくとも2つ又はそれより多く、任意に、少なくとも3つ又はそれより多くのバイオマーカーをさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のバイオマーカーパネル。
【請求項７】
対象の神経認知障害を診断する方法であって:
a)該対象から得られた試料を請求項1〜6のいずれか一項記載のバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、その対象が神経認知障害を有するかどうかを決定すること
を含む、前記方法。
【請求項８】
対象の神経認知障害の病期を判定する方法であって:
a)該対象から得られた試料を請求項1〜6のいずれか一項記載のバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、該対象の神経認知障害の病期を決定すること
を含む、前記方法。
【請求項９】
神経認知障害を発症する可能性を対象で評価する方法であって:
a)該対象から得られた試料を請求項1〜6のいずれか一項記載のバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、その対象が神経認知障害を発症する可能性があるかどうかを決定すること
を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記神経認知障害がミクログリア活性化を特徴とする、請求項7〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記神経認知障害が、軽度認知障害、アルツハイマー病、血管性認知症、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、又はこれらの組合せの群から選択される、請求項7〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記神経認知障害がアルツハイマー病である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
対象のアルツハイマー病を治療する方法であって:
a)該対象から得られた試料を請求項1〜6のいずれか一項記載のバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、その対象がアルツハイマー病を有するかどうかを決定すること;
d)該対象にメマンチン(例えば、Namenda(登録商標))、ガランタミン(例えば、Razadyne(登録商標))、リバスチグミン(例えば、Exelon(登録商標))、ドネペジル(例えば、Aricept(登録商標))、ソラネズマブ、5HT5アンタゴニスト、又はこれらの組合せの群から選択されるアルツハイマー病治療を施すこと
を含む、前記方法。
【請求項１４】
対象のアルツハイマー病の治療の予後判定を助ける方法であって:
a)該対象から得られた試料を請求項1〜6のいずれか一項記載のバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、該アルツハイマー病の治療が成功しているかどうかを決定すること
を含む、前記方法。
【請求項１５】
前記アルツハイマー病の治療が、メマンチン(例えば、Namenda(登録商標))、ガランタミン(例えば、Razadyne(登録商標))、リバスチグミン(例えば、Exelon(登録商標))、ドネペジル(例えば、Aricept(登録商標))、ソラネズマブ、5HT5アンタゴニスト、又はこれらの組合せの群から選択される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
前記試料が、脳脊髄液(CSF)、血液、血漿、血清、唾液、尿、組織(例えば、脳組織)、又はこれらの組合せの群から選択される、請求項7〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
前記試料がCSFである、請求項7〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
前記対象がヒト対象である、請求項7〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が以前に軽度認知障害と診断されたヒト対象である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が認知症のさらなる臨床評価を受けているヒト対象である、請求項18又は19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
アッセイする工程a)及び/又は測定する工程b)が:
i)前記試料を前記バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々に対する1以上の結合剤と接触させること;又は
ii)該試料中で該バイオマーカーの各々に特異的な自己抗体を検出すること;又は
iii)任意に、該試料を1以上のアイソバリックな反応性質量標識で事前に標識することにより、該試料中で、質量分析により、該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々を検出すること;又は
iv)該試料中で、2Dゲル電気泳動により、該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々を検出すること;又は
v) i)、ii)、iii)、もしくはiv)のいずれかの組合せ
を含む、請求項7〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
工程a)のアッセイすること及び/又は工程b)の測定することが、前記バイオマーカーパネル中のバイオマーカーの1以上の断片を検出することを含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
前記試料が固体支持体上に固定化されている、請求項21又は請求項22記載の方法。
【請求項２４】
対象から得られた試料中のバイオマーカーを同定する方法であって、該バイオマーカーがアルツハイマー病の診断又は病期判定に好適であり、ここで、該方法が、活性化ミクログリア細胞(例えば、BV2細胞)及び/もしくはその培養培地を質量分析で使用することを含み、並びに/又は該バイオマーカーが、活性化ミクログリア細胞を参照として使用することにより、該試料中で同定される、前記方法。
【請求項２５】
前記バイオマーカーパネルが請求項1〜6のいずれか一項記載のバイオマーカーを含む、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
該試料が、CSF、血液、血清、又は血漿の群から選択される、請求項24又は25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
請求項1〜6のいずれか一項記載のバイオマーカーパネルのバイオマーカーを試料中でアッセイ及び/又は測定するための試薬を含むキット。
【請求項２８】
前記試薬が、前記バイオマーカーパネルのバイオマーカーに特異的に結合する1以上の結合剤を含む、請求項27記載のキット。
【請求項２９】
前記1以上の結合剤が一次抗体であり、ここで、各々の一次抗体が前記バイオマーカーパネルの異なるバイオマーカーに特異的に結合する、請求項28記載のキット。
【請求項３０】
前記試薬が、前記一次抗体に特異的に結合する1以上の二次抗体をさらに含む、請求項29記載のキット。
【請求項３１】
前記二次抗体が標識されている、請求項30記載のキット。
【請求項３２】
該試料が、脳脊髄液(CSF)、血液、血漿、血清、唾液、尿、組織(例えば、脳組織)、又はこれらの組合せの群から選択される、請求項27〜31のいずれか一項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、神経認知障害を診断し、その病期を判定し、及びそれを発症する可能性を評価するためのバイオマーカーパネル及び方法に関する。特に、本発明は、アルツハイマー病の診断及び治療のための方法において有用なバイオマーカーパネルに関する。
【背景技術】
【０００２】
(発明の背景)
アルツハイマー病(AD)は、年老いていく大人で最も一般的なタイプの認知症であり、ADを抱えて生きる人の数は、今後数十年にわたって劇的に増加すると予想され、そのため、治療並びに疾患進行を診断及び測定するツールの探索がますます急を要するようになっている。
【０００３】
認可されている治療は少なくかつ有効性が限られており、ほとんどは、進行を減速又は遅延させる役割を果たしている。現在のところ、治療法はない。
【０００４】
ADは、認知機能及び機能自律性の不可逆的な進行性喪失を引き起こす。ADが発症するのにかかる時間は、人によって様々であるが、進行した徴候には、重篤な記憶障害、錯乱、言語障害、判断力の低下、人格変化及び行動変化が含まれる。AD患者は、話し好きでなくなったり(non-communicative)、非友好的になったりすることがある。この疾患は、その進行が深刻な認知症に帰するので、患者は、自身のケアができず、施設収容又は家庭環境における専門家のケアを必要とすることが多い。一部の患者は、ADと診断を受けた後、何年にもわたって生存し得るが、診断後の平均余命は、8年である。
【０００５】
ADは、脳の生検によるか又は患者が死亡した後の剖検時にしか確定診断することができないが、臨床現場では、脳の生検は滅多に行われず、診断は、今でも主に、症状の履歴に基づいて行われ、一連の神経学的検査、心理測定的検査、及びバイオマーカーの測定を含む生化学的検査に依存している。
【０００６】
とはいえ、これらの現在の方法は、潜在的な治療が神経変性を予防するか又は減速させる可能性がより高い疾患の初期でのAD及び他の神経認知障害を診断する上で依然として満足の行くものではない。
【０００７】
脳は脳脊髄液(CSF)と直に接しており、かつ脳の病理学的変化はCSFの生化学的組成の変化をもたらすことが多いので、このために、CSFは神経認知障害のバイオマーカーの理想的な供給源となる。ADでは、現在、3つの「中核的」CSFバイオマーカー(アミロイドβ1-42、全タウ、及びリン酸化タウ)をルーチンに用いて、ADを診断している。これらのCSFバイオマーカーの3つ全てが高レベルの感度を示すが(国立神経障害・脳卒中研究所(National Institute of Neurological and Disorders and Stroke)とアルツハイマー病・関連障害協会(Alzheimer Disease and Related Disorders Work Group)によって規定された80〜90％の基準に収まる)、ADを他の形態の認知症及び神経障害と識別するのに苦労している。例えば、CSFアミロイドβ1-42のレベルはADで減少しているが、レビー小体型認知症(LBD)、前頭側頭型認知症(FTD)、血管性認知症(VaD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、及びクロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)でも低いと報告されている(Blennow Kらの文献、Nat Rev Neurol. 2010,6:131-44)。同様に、全タウのレベルはADで上昇しているが、脳卒中、外傷性脳損傷、FTD、VaD、及びCJD1の後に上昇していることも分かっている。
【０００８】
理想的なバイオマーカーの2つの重要な特徴は、非疾患と比べた疾患に対する高い特異性と疾患型を区別する高い感度である。さらに、ADの病理学的プロセスを反映するバイオマーカーであって、脳のイメージング及び神経病理学的検査によって変性が観察される前の、疾患のごく初期の段階で変化を検出することができるバイオマーカーが非常に求められている。
【０００９】
理想的なバイオマーカー又はバイオマーカーパネルであれば、変性がまだ限られているときに、できるだけ早く治療を開始するための第一の指標となるであろうし、臨床試験の現場、特に、神経病理学的変化の発症を予防することに重点を置いている試験で新しい療法の有効性をスクリーニングする際に非常に有益であることが分かるであろう。そのようなバイオマーカー又はバイオマーカーパネルであれば、本疾患の発症の追跡調査においても有用であろう。
【００１０】
したがって、アルツハイマー病及び他の神経認知障害を有する患者の早期診断、病期判定、及び予後モニタリングにおいて優れた感度及び/又は特異性で機能し得るバイオマーカーが依然として必要である。
【発明の概要】
【００１１】
(発明の概要)
したがって、本発明は、神経認知障害、特に、アルツハイマー病を診断し、その病期を判定し、及びそれを発症する可能性を評価するための方法で使用される新規のバイオマーカーパネルを提供する。
【００１２】
第一の態様において、本発明は:
i)配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは
ii)配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片
を含むバイオマーカーパネルを提供する。
【００１３】
この第一の態様の一実施態様において、該パネルは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼL1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号5のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するビタミンD結合タンパク質又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片をさらに含む。
【００１４】
この第一の態様の別の実施態様において、該パネルは、KEGG経路に関与するタンパク質から選択される1以上のバイオマーカーをさらに含み、ここで、KEGG経路は、補体及び凝固カスケード、又は解糖/グリコーゲン合成、又はプリオン病、又はアミノ及びヌクレオチド糖代謝、又は抗原プロセシング及び提示、又は細胞外マトリックス-受容体相互作用、又は焦点接着、又はアクチン細胞骨格の調節、又はアラニン/アスパラギン酸/グルタミン酸代謝の群から選択される。
【００１５】
この態様の別の実施態様において、該パネルは、表1、2、3、4、5、6、7、もしくは8のいずれか1つから選択される少なくとも1つ、任意に、2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片をさらに含む。
【００１６】
この態様の別の実施態様において、該パネルは、ダイナクチンサブユニット1、コフィリン-1、ペルオキシレドキシン-1、MARCKS関連タンパク質、モエシン、アクチン、タンパク質TMSB4XP4、ApoE、ゲルゾリン、セクレトグラニン、アルブミン、及び補体タンパク質の群から選択される少なくとも2つ又はそれより多く、任意に、少なくとも3つ又はそれより多くのバイオマーカーをさらに含む。
【００１７】
第二の態様において、対象の神経認知障害を診断する方法であって:
a)該対象から得られた試料を第一の態様及びその実施態様によるバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、その対象が神経認知障害を有するかどうかを決定すること
を含む、方法が提供される。
【００１８】
第三の態様において、対象の神経認知障害の病期を判定する方法であって:
a)該対象から得られた試料を第一の態様及びその実施態様によるバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、該対象の神経認知障害の病期を決定すること
を含む、方法が提供される。
【００１９】
第四の態様において、本発明は、神経認知障害を発症する可能性を対象で評価する方法であって:
a)該対象から得られた試料を第一の態様及びその実施態様によるバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、その対象が神経認知障害を発症する可能性があるかどうかを決定すること
を含む、方法を提供する。
【００２０】
これらの第二、第三、及び第四の態様の実施態様において、神経認知障害は、ミクログリア活性化を特徴とし、及び/又は軽度認知障害、アルツハイマー病、血管性認知症、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、もしくはこれらの組合せの群から選択される。
【００２１】
特に、神経認知障害は、アルツハイマー病である。
【００２２】
本発明の第五の態様において、対象のアルツハイマー病を治療する方法であって:
a)該対象から得られた試料を第一の態様及びその実施態様によるバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、その対象がアルツハイマー病を有するかどうかを決定すること;
d)該対象にメマンチン(例えば、Namenda(登録商標))、ガランタミン(例えば、Razadyne(登録商標))、リバスチグミン(例えば、Exelon(登録商標))、ドネペジル(例えば、Aricept(登録商標))、ソラネズマブ、5HT5アンタゴニスト、又はこれらの組合せの群から選択されるアルツハイマー病治療を施すこと
を含む、方法が提供される。
【００２３】
本発明の第六の態様において、対象のアルツハイマー病の治療の予後判定を助ける方法であって:
a)該対象から得られた試料を第一の態様及びその実施態様によるバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、該アルツハイマー病の治療が成功しているかどうかを決定すること
を含む、方法が提供される。
【００２４】
この第六の態様の実施態様において、アルツハイマー病の治療は、メマンチン(例えば、Namenda(登録商標))、ガランタミン(例えば、Razadyne(登録商標))、リバスチグミン(例えば、Exelon(登録商標))、ドネペジル(例えば、Aricept(登録商標))、ソラネズマブ、5HT5アンタゴニスト、又はこれらの組合せの群から選択し得る。
【００２５】
第二から第六の態様の他の実施態様において、試料は、脳脊髄液(CSF)、血液、血漿、血清、唾液、尿、組織(例えば、脳組織)、又はこれらの組合せの群から選択される。好ましくは、試料はCSFであり、及び/又は対象は、ヒト対象、任意に、軽度認知障害と以前に診断されたヒト対象もしくは認知症のさらなる臨床評価を受けているヒト対象である。
【００２６】
第二から第六の態様の他の実施態様において、工程a)のアッセイすること及び/又は工程b)の測定することは:
i)該試料を該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々に対する1以上の結合剤と接触させること;又は
ii)該試料中で該バイオマーカーの各々に特異的な自己抗体を検出すること;又は
iii)任意に、該試料を1以上のアイソバリックな反応性質量標識で事前に標識することにより、該試料中で、質量分析により、該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々を検出すること;又は
iv)該試料中で、2Dゲル電気泳動により、該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々を検出すること;又は
v) i)、ii)、iii)、及び/もしくはiv)のいずれかの組合せ
を含む。
【００２７】
好ましくは、アッセイする工程a)及び/又は測定する工程b)は、該バイオマーカーパネル中のバイオマーカーの1以上の断片を検出することを含む。
【００２８】
任意に、試料は、固体支持体上に固定化されている。
【００２９】
第七の態様において、本発明は、対象から得られた試料中のバイオマーカーを同定する方法であって、該バイオマーカーがアルツハイマー病の診断又は病期判定に好適であり、ここで、該方法が、活性化ミクログリア細胞(例えば、BV2細胞)及び/もしくはその培養培地を質量分析で使用することを含み、並びに/又は該バイオマーカーが、活性化ミクログリア細胞を参照として使用することにより、該試料中で同定される、方法を提供する。
【００３０】
好ましくは、バイオマーカーパネルは、第一の態様及びその実施態様に定義されているようなバイオマーカーを含む。
【００３１】
この第七の態様の実施態様において、試料は、CSF、血液、血清、又は血漿の群から選択される。
【００３２】
第八の態様において、本発明は、第一の態様及びその実施態様によるバイオマーカーパネルのバイオマーカーを試料中でアッセイ及び/又は測定するための試薬を含むキットを提供する。
【００３３】
この第八の態様の一実施態様において、試薬は、バイオマーカーパネルのバイオマーカーに特異的に結合する1以上の結合剤を含む。好ましくは、該1以上の結合剤は一次抗体であり、ここで、各々の一次抗体は、バイオマーカーパネルの異なるバイオマーカーに特異的に結合する。
【００３４】
別の実施態様において、試薬は、該一次抗体に特異的に結合する1以上の二次抗体をさらに含む。任意に、該二次抗体は標識されている。
【００３５】
他の実施態様において、試料は、脳脊髄液(CSF)、血液、血漿、血清、唾液、尿、組織(例えば、脳組織)、又はこれらの組合せの群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
(図面の簡単な説明)
【図１】ヒトホスホグルコムターゼ1の配列。記号□又は*で印が付けられているアミノ酸は、それぞれ、ヒトホスホグルコムターゼ1のアイソフォーム又は変異体中で異なる又は修飾されたアミノ酸に置換されているアミノ酸を示している。
【図２】ヒトチモシンβ-4の配列。*で輪郭が描かれているアミノ酸は、ヒトチモシンβ-4の変異体中で異なるアミノ酸に置換されているアミノ酸を示している。
【図３】平均シグナル強度の関数として示された、対照CSFと比較したAD CSFにおけるペルオキシデロキシン(peroxideroxin)-1(A)、MARCKS関連タンパク質(B)、メオシン(Meosin)(C)、及びアクチン(D)の上方調節。
【図４】平均シグナル強度の関数として示された、対照CSFと比べたAD CSFにおけるホスホグルコムターゼ-1(A)、タンパク質TMSB4XP4(B)、ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼアイソザイムL1(C)、及びビタミン-D結合タンパク質(D)の上方調節。
【図５】平均シグナル強度の関数として示された、対照CSFと比べたAD CSFにおけるダイナクチンサブユニット1の上方調節(A)及びコフィリン-1の下方調節(B)。
【図６】実験A(左パネル)及び実験B(右パネル)で使用されたTMT10-プレックス設定を示す試料デザイン。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
(定義)
「バイオマーカー」という用語は、翻訳後修飾を含む、同定されたタンパク質の全ての生物学的に関連のある形態を含む。例えば、バイオマーカーは、グリコシル化形態、リン酸化形態、多量体形態、断片化形態、又は前駆体形態で存在することができる。バイオマーカー断片は、天然に存在するものであってもよく、又は例えば、酵素的に生成され、完全なタンパク質の生物学的に活性のある機能を依然として保持しているものであってもよい。断片は、典型的には、少なくとも約10アミノ酸、通常、少なくとも約50アミノ酸の長さであり、300アミノ酸もの長さ、又はそれより長いものであることができる。
【００３８】
「標準配列」という用語は、オーソロガスな種の中で最もよく見られる配列及び/又は最もよく似ている配列を指すために本明細書において使用される。特に、別途規定されない限り、標準配列は、本明細書において、ヒト配列を指す。
【００３９】
「KEGG経路」という用語は、代謝、遺伝情報処理、環境情報処理、細胞プロセス、生物システム、ヒト疾患、及び創薬についての分子相互作用及び反応ネットワークを表す手描きの一群の経路地図を指す。「KEGG経路マッピング」とは、分子データセット、特に、ゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、及びメタボロミクスにおける大規模なデータセットを、高次全身機能の生物学的解釈のためにKEGG経路地図にマッピングするプロセスのことである;(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)。
【００４０】
「濃度又は量」という用語は、例えば、曲線下面積及びスペクトルカウントなどのLC-MS/MS無標識定量法によって測定されるような試料中のバイオマーカーの相対濃度又は量を指す。
【００４１】
「比較すること」もしくは「比較する」という用語又はその文法的等価物は、試料中のバイオマーカーの相対濃度又は量を、他の試料(例えば、私的な又は公的なデータベースに保存されているタンパク質濃度又は量)と比べて測定することを意味する。
【００４２】
「参照濃度もしくは量」又は「参照値」という用語は、私的な又は公的なデータベースに保存されているタンパク質濃度又は量を指すが、この用語は、それに限定されるものではない。「参照濃度又は量」は、患者の大規模スクリーニングから、又はそのような決定と対照患者における臨床情報との間の既知のもしくは以前に決定された相関を参照することにより得られたものであってもよい。例えば、参照値は、対象と同様の年齢及び性別の対照対象、例えば、健常者(すなわち、認知症を有しない者)におけるバイオマーカーの濃度又は量との比較によって決定されてもよい。或いは、参照値は、文献中に見出すことができる値、例えば、位置112及び158における突然変異の有無が比較すべき参照を表すApoE ε4アレルの存在、又はCSF中の＞350ng/Lの全タウ(T-タウ)、＞80ng/Lのホスホ-タウ(P-タウ)、及び＜530ng/LのAβ42のレベルのようなものである(Hansson Oらの文献、Lancet Neurol. 2006, 5:228-34)。さらに、参照値は、時間的に試験時点よりも前の1以上の時点で同じ対象から得られたものであってもよい。そのような早期の試料を、試験時点の日付から1週間以上、1カ月以上、3カ月以上、最も好ましくは、6カ月以上前に採取してもよい。いくつかの実施態様において、複数の早期の試料を長期的に比較してもよく、バイオマーカー発現の変化の傾きを認知低下の関連要因として算出してもよい。参照値又は参照レベルは、絶対的な値;相対的な値;上限もしくは下限を有する値;値の範囲;平均的な値;中央値、平均値、又は特定の対照もしくはベースライン値と比較したときの値であることができる。
【００４３】
本発明によれば、バイオマーカーのレベルは、試料中の該バイオマーカーのレベルが参照値よりも高いとき、増加している。バイオマーカーのレベルは、それが、参照値よりも少なくとも1.5％、少なくとも2％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％:少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも110％、少なくとも120％、少なくとも130％、少なくとも140％、少なくとも150％、又はそれを上回って高いとき、その参照値よりも高いとみなされる。
【００４４】
同様に、本発明との関連において、バイオマーカーのレベルは、試料中の該バイオマーカーのレベルが参照値よりも低いとき、減少している。バイオマーカーのレベルは、それが、参照値よりも少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％:少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも110％、少なくとも120％、少なくとも130％、少なくとも140％、少なくとも150％、又はそれを下回って低いとき、その参照値よりも低いとみなされる。
【００４５】
「対照」又は本明細書で使用される場合、「非AD対照」もしくは「非AD対象」という用語は、認知異常と診断されたか又はその症状を呈しているが、既存の生化学的検査に関して、非AD対象と定義される、ヒト又は非ヒト対象から採取された組織試料又は体液試料を指す。
【００４６】
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗血清、モノクローナル抗体、抗体の断片、例えば、単鎖及びFab断片、並びに遺伝子改変抗体を含む。抗体は、キメラであっても、単一種のものであってもよい。
【００４７】
「選択反応モニタリング」、「SRM」、及び「MRM」という用語は、既知のバイオマーカーを表す既知の質量電荷比のプリカーサーイオンが、優先的にイオントラップ又は三連四重極質量分析計でのタンデム質量分析による分析の標的とされる質量分析アッセイを意味する。分析中、親イオンは断片化され、第二の予め規定された質量電荷比の娘イオンの数がカウントされる。通常、定量的内部標準としての役割を果たすように、予め規定された数の安定同位体置換を有するが、他の点では、標的イオンと化学的に同一である等価なプリカーサーイオンが本方法に含まれる。
【００４８】
「単離された」という用語又はその文法的等価物は、本明細書の全体を通じて、タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、又は化学的分子が、場合によっては、それが天然に生じ得る物理的環境とは異なる物理的環境で存在することを意味する。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、齧歯類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
【００５０】
「治療する」、「治療すること」、「治療」、「予防する」、「予防すること」、もしくは「予防」という用語又はこれらの文法的等価物は、治療的治療、予防的治療、及び対象が障害を発症するリスク又は他のリスク因子を軽減する適用を含む。治療は、障害の完全な治癒を必要とせず、症状又は基礎となるリスク因子の軽減を包含する。
【００５１】
本明細書で使用される「診断」という用語又はその文法的等価物は、患者における障害の存在(existence)もしくは存在(presence)、非存在もしくは不在、又は可能性に関する何らかの情報の提供を含む。これは、障害又はそれに関連して経験されるもしくは経験され得る症状の種類又は分類に関する情報の提供をさらに含む。これには、例えば、障害の重症度の診断が含まれてもよい。これは、障害の医学的経過の予後、例えば、その持続期間、重症度、及び軽度認知障害(MCI)からAD又は他の認知症への進行の経過を包含する。
【００５２】
本明細書で使用される「病期を判定すること」という用語又はその文法的等価物は、対象において、神経認知障害、特に、ADの病期を特定することを意味する。例えば、ADは、使用される診断の枠組みに応じて、3つの病期又は7つの病期により特徴付けられる。全般的認知症スケールは、全体的機能の1つのそのような尺度である。これは、標準化された重症度基準セットに対する認知及び機能を含む重症度の評価によって測定される。
【００５３】
「効力」という用語は、所与の介入(例えば、薬物、医療機器、外科的手技など)の有益な変化に関する能力を示す。効力が立証されれば、その介入は、それが比較されることになる他の利用可能な介入と少なくとも同じ程度に良好である可能性がある。「効力」及び「有効性」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００５４】
「含む」という用語は、対象が、列挙された全ての要素を含むが、任意に、追加の、名前を挙げていない要素も含み得ること(すなわち、非限定(open))を示す。
【００５５】
本明細書で使用される場合の「及び/又は」という用語は、2つの特定された特徴又は成分の各々の、他方を伴う又は伴わない具体的開示として解釈されるべきである。例えば、「A及び/又はB」は、各々が個別に本明細書に記述されているように、(i)A、(ii)B、並びに(iii)A及びBの各々の具体的開示として解釈されるべきである。
【００５６】
文脈上、そうでないと指示されない限り、上に記述された特徴/用語の定義は、本発明の任意の特定の態様又は実施態様に限定されるのではなく、本明細書に記載される全ての態様及び実施態様に等しく適用される。
【００５７】
(略語)
CSF(脳脊髄液); LBD(レビー小体型認知症); FTD(前頭側頭型認知症); VaD(血管性認知症); ALS(筋萎縮性側索硬化症); CJD(クロイツフェルト・ヤコブ病); CNS(中枢神経系); LPS(リポ多糖); INFγ(インターフェロン-γ); TMT(登録商標)(Tandem Mass Tag(登録商標)); TEAB(テトラ-エチルアモニウム(amonium)重炭酸塩)、SDS(ドデシル硫酸ナトリウム); TCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン); ACN(アセトニトリル); PGM1(ホスホグルコムターゼ1); TMS4(チモシンβ-4)。
【００５８】
(詳細な説明)
AD患者の脳は、アミロイド斑及び神経原線維の「もつれ」を特徴とする。数多くの遺伝学的、疫学的、及び病理学的証拠は、アミロイド前駆体タンパク質及びそのタンパク質分解産物であるアミロイドβ-ペプチド(Aβ)をADの病因における中心的な役割を果たすものと指摘している(Selkoe DJの文献、Physiol. Rev. 2001, 81:741-66)。斑及びもつれは、本疾患と関連することが多いが、第三の病理学的特徴である「神経膠症」又は脳の炎症もまた、かつて理解されていたよりもずっとADの病因に不可欠である。
【００５９】
神経変性病理の初期事象は、ADに特有のものを含め、ミクログリア細胞の活性化を伴う(Mandrekar Sらの文献、CNS Neurol Disord Drug Targets. 2010, 9:156-67)。遺伝子及びバイオマーカー発見プログラムの数が次第に増え、炎症が疾患の発症に役割を果たしていることを示唆する証拠が増えてきたこともあり、最近では、多くの関心が、神経変性疾患におけるミクログリアの役割に集中している(Wisniewski HMらの文献、Acta Neuropathol. 1992, 84:117-27)。
【００６０】
ミクログリアは、グリア細胞の一種であり、中枢神経系(CNS)の常在性マクロファージ様細胞である(Mandrekar Sらの文献、CNS Neurol Disord Drug Targets. 2010, 9:156-67)。CNS内で、ミクログリア細胞は、免疫応答と細胞恒常性の維持とに関する種々の異なる機能を果たす。ミクログリアは、その周囲の環境を感知し、様々な因子によって活性化され、脳における神経炎症応答及び神経保護応答を判定することができ、AD患者の脳におけるアミロイド斑の形成に応答する。この活性化は、様々な形態を取ることができ、いわゆる、M1活性化状態は、TNF-α、IL-1βなどの炎症促進性サイトカイン、及び反応性酸素/窒素種ROS/NOSの放出を引き起こす(Henkel Jの文献、Neuroimmune Pharmacol. 2009, 4:389-98)。これが、最終的に、神経損傷を引き起こし、又はそれを増大させ得る。
【００６１】
インビボでの内因性調節、Aβ食作用、及びミクログリアAβ受容体複合体を含む、様々なミクログリア活性化機構があるように見える(Mandrekar Sらの文献、CNS Neurol Disord Drug Targets. 2010, 9:156-67)。
【００６２】
本発明者らは、AD病理の初期段階において、活性化ミクログリアが独特のタンパク質を脳内に分泌するという仮説を立てている。そのようなタンパク質であれば、その後、脳脊髄液(CSF)及び他の生物学的流体中に移動し、初期AD病理のバイオマーカーとして同定及び立証されることができるであろう。
【００６３】
(1.バイオマーカーパネル及びその使用方法)
本発明は、そのような新規のバイオマーカー、並びに神経認知障害、特に、アルツハイマー病(AD)を診断し、その病期を判定し、及びそれを発症する可能性を評価する方法におけるその使用に関する。
【００６４】
本明細書に開示されるバイオマーカーパネルは、生検又は他の侵襲的検査によって検査することができなかった脳組織における事象及び経路の調節を反映する末梢シグナルを表す。バイオマーカーパネルは、AD対象におけるミクログリア活性化によって生じる神経炎症を反映するので、これらは、初期段階の本疾患の理想的で測定可能な指標を表す。
【００６５】
バイオマーカーパネルは、配列番号1のアミノ酸配列を含むかもしくは該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又は配列番号2のアミノ酸配列を含むかもしくは該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4を含む。
【００６６】
ヒトホスホグルコムターゼ1(PMG1; P36871)は、ホスホグルコムターゼ(PGM)のアイソザイムであり、ホスホヘキソースムターゼファミリーに属する。異なる遺伝子によってコードされ、グルコースの1位と6位の間のホスフェートの転移を触媒する、いくつかのPGMアイソザイムがある。この遺伝子の突然変異は、14型糖原病を引き起こす。異なるアイソフォームをコードする選択的にスプライシングされた転写物変異体が同定されている。
【００６７】
ヒトチモシンβ-4(TMSB4X; P62328)は、細胞骨格の組織化において重要な役割を果たす。これは、アクチン単量体(G-アクチン)に結合して、それを隔離し、そのため、アクチン重合を阻害する。
【００６８】
バイオマーカーパネルは、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1及び配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4も含み得る。
【００６９】
バイオマーカーパネルは、配列番号1のアミノ酸配列を含むかもしくは該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1のアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/又は配列番号2のアミノ酸配列を含むかもしくは該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4の変異体もしくは断片も含み得る。
【００７０】
アイソフォームは、標準配列に関する選択的タンパク質配列として本明細書に記載されている。アイソフォームは、単一の選択的プロモーター使用、単一の選択的スプライシング、単一の選択的開始、及び単一のリボソームフレームシフトによるか、又はこれらの組合せによって、同じ遺伝子から生じることができる。
【００７１】
変異体は、(天然に生じる)多形、系統、分離株、又は品種間のばらつき、疾患に関連する突然変異、及びRNA編集事象などの、天然の変異体を含むように本明細書に記載されている。変異体は、通常、標準配列に関するアミノ酸変化として報告される。ほとんどの天然に生じる多形(単一アミノ酸多形又はSAPとも呼ばれる)は、コドンレベルでの単一ヌクレオチド変化によるものである。RNA編集事象には、ヌクレオチドの変換、挿入、及び欠失が含まれる。
【００７２】
断片は、タンパク質のタンパク質分解的(酵素的又はその他の)切断の結果として本明細書に記載されている。断片は、天然のタンパク質分解的切断の結果、例えば、補体の活性化、凝固カスケードにおいて、又はマトリックスタンパク質の酵素的切断から生じた断片であり得る。或いは、断片は、インビボ及び/又はインビトロで、例えば、プロテアーゼによって生じ得る。
【００７３】
一実施態様において、ホスホグルコムターゼ1の変異体は、配列番号1のアミノ酸配列であって、
a)位置19のトレオニンがアラニンに置換されているか;又は
b)位置38のアスパラギンがチロシンに置換されているか;又は
c)位置41のグルタミンがアルギニンに置換されているか;又は
d)位置62のアスパラギン酸がヒスタミンに置換されているか;又は
e)位置68のリジンがメチオニンに置換されているか;又は
f)位置88のイソロイシンがバリンに置換されているか;又は
g)位置115のトレオニンがアラニンに置換されているか;又は
h)位置121のグリシンがアルギニンに置換されているか;又は
i)位置221のアルギニンがシステインに置換されているか;又は
j)位置263のアスパラギン酸がグリシンもしくはチロシンに置換されているか;又は
k)位置291のグリシンがアルギニンに置換されているか;又は
l)位置330のグリシンがアルギニンに置換されているか;又は
m)位置377のグルタミン酸がリジンに置換されているか;又は
n)位置388のグルタミン酸がリジンに置換されているか;又は
o)位置420のチロシンがヒスチジンに置換されているか;又は
p)位置501のバリンがイソロイシンに置換されているか;又は
q)位置516のロイシンがプロリンに置換されているか;又は
r)位置1のメチオニンがN-アセチルメチオニンであるか;又は
s)位置16のリジンがN6-アセチルリジンであるか;又は
t)位置117のセリンがホスホセリンであるか;又は
u)位置349のリジンがN6-アセチルリジンであるか;又は
v)位置353のチロシンがホスホチロシンであるか;又は
w)位置419のリジンがN6-スクシニルリジンであるか;又は
x)位置467のトレオニンがホスホトレオニンであるか;又は
y)位置507のトレオニンがホスホトレオニンである、
アミノ酸配列を含むか或いは該アミノ酸配列を有する。
【００７４】
図1は、ヒトホスホグルコムターゼ1(配列番号1)のヒト配列を示しており;記号□で印が付けられているものは、上のa)〜q)に示されているような、ヒトホスホグルコムターゼ1のアイソフォーム中で異なるアミノ酸と置換されているアミノ酸である。*で印が付けられているアミノ酸は、上のr)〜y)に示されているような、ヒトホスホグルコムターゼ1のアイソフォーム中で修飾されたアミノ酸に置換されているアミノ酸である。
【００７５】
別の実施態様において、ホスホグルコムターゼ1のアイソフォームは、
a)配列番号3(アイソフォーム2)のアミノ酸配列であって、メチオニン1がN-アセチルメチオニンである、アミノ酸配列;もしくは
b)アミノ酸198〜562由来の配列番号1(アイソフォーム3)のアミノ酸配列
を含むか又は該アミノ酸配列を有する。
【００７６】
別の実施態様において、ホスホグルコムターゼ1の断片は、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、もしくは配列番号10;又は配列番号11;又は配列番号12;又は配列番号13のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含むか或いは該アミノ酸配列を有する。
【００７７】
別の実施態様において、チモシンβ-4の変異体は、配列番号2のアミノ酸配列であって、
a)位置12のリジンがプロリンに置換されているか;又は
b)位置16のセリンがアラニンに置換されているか;又は
c)位置18のロイシンがアラニンもしくはプロリンに置換されているか;又は
d)位置2のセリンがN-アセチルセリンであるか;又は
e)位置26のリジンがN6-アセチルリジンであるか;又は
f)位置9のリジンがN6-アセチルリジンである、
アミノ酸配列を含むか或いは該アミノ酸配列を有する。
【００７８】
図2は、チモシンβ-4(配列番号2)のヒト配列を示しており;記号□で印が付けられているものは、前の段落のa)〜c)に示されているような、ヒトチモシンβ-4のアイソフォーム中で異なるアミノ酸と置換されているアミノ酸である。*で印が付けられているアミノ酸は、上で前の段落のd)〜f)に示されているような、ヒトチモシンβ-4のアイソフォーム中で修飾されたアミノ酸に置換されているアミノ酸である。
【００７９】
別の実施態様において、チモシンβ-4の断片は、配列番号14、配列番号15、もしくは配列番号16のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有する。
【００８０】
後に本明細書中の実験の節で示されるように、本明細書に開示されるバイオマーカーパネルは、軽度認知障害を呈するが、ADと診断されていない個体に関して、AD患者のCSFに見出される上方調節されたタンパク質のセットとして同定されたものである。通常の臨床診察では、バイオマーカーは、少なくとも2つ、好ましくは、少なくとも3つ又は4つのセットとして測定される。
【００８１】
したがって、本発明によるバイオマーカーパネルは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼL1(UCH-L1; D6R956)又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号5のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するビタミンD結合タンパク質(VBPD; D6RBJ7)又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片をさらに含み得る。
【００８２】
ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼL1又はビタミンD結合タンパク質のアイソフォーム、変異体、又は断片の例は、Uniprotなどの、公的に利用可能なデータベース中に見出すことができる。
【００８３】
一実施態様において、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼL1の断片は、配列番号17に示されるような配列を有するか又は該配列を含む。別の実施態様において、ビタミンD結合タンパク質の断片は、配列番号18に示されるような配列を有するか又は該配列を含む。
【００８４】
したがって、一実施態様において、バイオマーカーパネルは、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片;及び配列番号4のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼL1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片、及び/或いは配列番号5のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するビタミンD結合タンパク質又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片を含む。
【００８５】
バイオマーカーパネルは、KEGG経路に関与するタンパク質から選択される1以上のバイオマーカーをさらに含み得、ここで、KEGG経路は、補体及び凝固カスケード、又は解糖/グリコーゲン合成、又はプリオン病、又はアミノ及びヌクレオチド糖代謝、又は抗原プロセシング及び提示、又は細胞外マトリックス-受容体相互作用、又は焦点接着、又はアクチン細胞骨格の調節、又はアラニン/アスパラギン酸/グルタミン酸代謝の群から選択される。
【００８６】
バイオマーカーパネルは、表1、2、3、4、5、6、7、もしくは8のいずれか1つから選択される少なくとも1つ、任意に、2つもしくはそれよりも多くのバイオマーカー又はそれらの断片をさらに含み得る。
【００８７】
一実施態様において、バイオマーカーパネルは、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片;並びに表1から選択される少なくとも1つ、任意に、2つもしくはそれよりも多くのバイオマーカー又はそれらの断片を含む。
表1
【表１】
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【００８８】
表1は、そのペプチドが、休止細胞と比較して活性化ミクログリア細胞株で少なくとも60％、また、非AD対象のCSFと比較してAD患者のCSFで少なくとも60％調節されることが分かったタンパク質を開示している。Uniprot ID＝データ検索時の注釈付きID;タンパク質名＝マッチした配列に与えられたタンパク質名;全てのUniprotマッチ＝本発明の時点で検出されたペプチド配列とマッチする全てのUniprot ID。アステリスク(*)は、そのエントリーが(冗長性のため)Uniprotから取り除かれたために、削除されたと注釈が付けられたタンパク質を示している。
【００８９】
一実施態様において、バイオマーカーパネルは、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片;並びにペルオキシレドキシン-1、MARCKS関連タンパク質、モエシン、及びアクチンの群から選択される少なくとも1つ、又は少なくとも2つもしくはそれより多く、任意に、少なくとも3つ、又は全てのバイオマーカー或いはそれらの断片を含む。
【００９０】
別の実施態様において、バイオマーカーパネルは、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片;並びにペルオキシレドキシン-1、MARCKS関連タンパク質、モエシン、アクチン、タンパク質TMSB4XP4、ApoE、ゲルゾリン、セクレトグラニン、アルブミン、及び補体タンパク質の群から選択される少なくとも1つ、又は少なくとも2つもしくはそれより多く、任意に、少なくとも3つ、又は全てのバイオマーカー或いはそれらの断片を含む。
【００９１】
一実施態様において、バイオマーカーパネルは、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片;並びに表1及び/もしくは表2から選択される少なくとも1つ、任意に、2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片を含む。
表2
【表２】
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2018510343.tif 000052
【００９２】
表2は、そのペプチドが、非AD対象のCSFと比較してAD患者のCSFで少なくとも60％調節されることが分かったタンパク質を開示している。Uniprot ID＝データ検索時の注釈付きID;タンパク質名＝マッチした配列に与えられたタンパク質名;全てのUniprotマッチ＝本発明の時点で検出されたペプチド配列とマッチする全てのUniprot ID。ハッシュ(#)は、「###と統合された」と注釈が付けられ、Uniprotで再検索されているタンパク質を示している。アステリスク(*)は、そのエントリーが(冗長性のため)Uniprotから取り除かれたために、削除されたと注釈が付けられたタンパク質を示している。
【００９３】
一実施態様において、バイオマーカーパネルは、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片;並びにアポリポタンパク質E、セクレトグラニン-1、セリン/トレオニン-タンパク質ホスファターゼ2A 65kDa調節サブユニットA αアイソフォーム、細胞質ダイニン1重鎖1、RuvB様1、cDNA FLJ54806、α-1-酸性糖タンパク質2、Ras関連タンパク質Rab-13、血清アルブミン、及び色素上皮由来因子の群から選択される少なくとも1つ、又は少なくとも2つもしくはそれより多く、任意に、少なくとも3つ、又は全てのバイオマーカーを含む。
【００９４】
バイオマーカーパネルは、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はその変異体もしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片;並びに表1及び/もしくは表2及び/もしくは表3から選択される少なくとも1つ、任意に、2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片を含み得る。
表3
【表３】
2018510343.tif 000053
2018510343.tif 000054
2018510343.tif 000055
2018510343.tif 000056
2018510343.tif 000057
2018510343.tif 000058
2018510343.tif 000059
【００９５】
表3は、そのペプチドが、非AD対象のCSFと比較してAD患者のCSFで少なくとも60％下方調節されることが分かったタンパク質を開示している。Uniprot ID＝データ検索時の注釈付きID;タンパク質名＝マッチした配列に与えられたタンパク質名;全てのUniprotマッチ＝本発明の時点で検出されたペプチド配列とマッチする全てのUniprot ID。ハッシュ(#)は、「###と統合された」と注釈が付けられ、Uniprotで再検索されているタンパク質を示している。アステリスク(*)は、そのエントリーが(冗長性のため)Uniprotから取り除かれたために、削除されたと注釈が付けられたタンパク質を示している。
【００９６】
一実施態様において、バイオマーカーパネルは、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片;並びにユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼL1、ビタミンD結合タンパク質、ペルオキシレドキシン-1、MARCKS関連タンパク質、モエシン、アクチン、タンパク質TMSB4XP4、ApoE、ゲルゾリン、セクレトグラニン、アルブミン、及び補体タンパク質、アポリポタンパク質E、セクレトグラニン-1、セリン/トレオニン-タンパク質ホスファターゼ2A 65kDa調節サブユニットA αアイソフォーム、細胞質ダイニン1重鎖1、RuvB様1、cDNA FLJ54806、α1-酸性糖タンパク質2、Ras関連タンパク質Rab-13、血清アルブミン、及び色素上皮由来因子の群から選択される少なくとも1つ、又は少なくとも2つもしくはそれより多く、任意に、少なくとも3つ、又は全てのバイオマーカー或いはそれらの断片を含む。
【００９７】
バイオマーカーパネルは、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片;並びに表1及び/もしくは表2及び/もしくは表3及び/もしくは表4から選択される少なくとも1つ、任意に、2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片を含み得る。
表4
【表４】
2018510343.tif 000060
2018510343.tif 000061
2018510343.tif 000062
2018510343.tif 000063
2018510343.tif 000064
2018510343.tif 000065
2018510343.tif 000066
2018510343.tif 000067
2018510343.tif 000068
【００９８】
表4は、キャリブレーターなしのプロテオミクス研究において比較したとき、そのペプチドが、非ADのCSFと比較して、AD患者のCSFで少なくとも60％調節されることが分かったタンパク質を開示している。ここでは、有意性は考慮されていない。全てのキャリブレーター研究で見られるものと同じ6つのCSF試料。列1＝データ検索時の注釈付きID。真ん中の列＝マッチした配列に与えられたタンパク質名。最後の列＝本発明の時点で検出されたペプチド配列とマッチする全てのUniprot ID。
【００９９】
バイオマーカーパネルは、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片;並びに表1及び/もしくは表2及び/もしくは表3及び/もしくは表4及び/もしくは表2から選択される少なくとも1つ、任意に、2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片を含み得る。
【０１００】
本明細書に開示されるバイオマーカーは、ダイナクチンサブユニット-1のように対照と比べてAD患者のCSFで上方調節されていてもよく、又はコフィリン-1のように対照と比べて患者のCSFで下方調節されていてもよい。
【０１０１】
したがって、一実施態様において、バイオマーカーパネルは、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片;並びにコフィリン-1もしくはその断片(例えば、配列番号38を有する断片)及び/又はダイナクチンサブユニット1もしくはその断片(例えば、配列番号37を有する断片)を含む。
【０１０２】
任意に、バイオマーカーパネルは、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼL1、ビタミンD結合タンパク質、ペルオキシレドキシン-1、MARCKS関連タンパク質、モエシン、アクチン、タンパク質TMSB4XP4、ApoE、ゲルゾリン、セクレトグラニン、アルブミン、及び補体タンパク質、アポリポタンパク質E、セクレトグラニン-1、セリン/トレオニン-タンパク質ホスファターゼ2A 65kDa調節サブユニットA αアイソフォーム、細胞質ダイニン1重鎖1、RuvB様1、cDNA FLJ54806、α1-酸性糖タンパク質2、Ras関連タンパク質Rab-13、血清アルブミン、及び色素上皮由来因子の群から選択される少なくとも1つ、もしくは少なくとも2つもしくはそれより多く、任意に、少なくとも3つ、又は全てのバイオマーカー或いはそれらの断片も含み得る。
【０１０３】
本発明の別の実施態様において、バイオマーカーパネルは、配列番号1、6〜13を有するかもしくはこれらを含むホスホルコムターゼ(phospholucomutase) 1及び配列番号2、14〜16を有するかもしくはこれらを含むチモシンβ-4、並びに任意に、配列番号5及び18を有するかもしくはこれらを含むビタミンD結合タンパク質、並びに/又は配列番号4もしくは17を有するかもしくはこれらを含むユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼアイソザイムL1、或いはそれらの断片を含み得、好ましくは、該パネルは、以下のバイオマーカー又はその断片、配列番号37もしくは配列番号57を有するか又はこれらを含むダイナクチンサブユニット1、配列番号38もしくは配列番号58を有するか又はこれらを含むコフィリン1、配列番号19;配列番号39もしくは配列番号39のアミノ酸19〜317を有するか又はこれらを含むアポリポタンパク質E、配列番号20;配列番号40;もしくは配列番号40のアミノ酸21〜677、440〜513、又は617〜673を有するか又はこれらを含むセクレトグラニン-1、配列番号21もしくは配列番号41を有するか又はこれらを含むセリン/トレオニン-タンパク質ホスファターゼ2A 65kDa調節サブユニットA αアイソフォーム、配列番号22;配列番号42もしくは配列番号42のアミノ酸2〜4646を有するか又はこれらを含む細胞質ダイニン1重鎖1、配列番号23もしくは配列番号43を有するか又はこれらを含むRuvB様1、配列番号24もしくは配列番号44を有するか又はこれらを含むcDNA FLJ54806、配列番号25;配列番号45もしくは配列番号45のアミノ酸19〜201を有するか又はこれらを含むα1-酸性糖タンパク質2、配列番号26もしくは配列番号46を有するか又はこれらを含むRas関連タンパク質Rab-13、配列番号27;配列番号47もしくは配列番号47のアミノ酸19〜22又は25〜609を有するか又はこれらを含む血清アルブミン、配列番号28;配列番号48もしくは配列番号48のアミノ酸20〜418を有するか又はこれらを含む色素上皮由来因子、配列番号29;配列番号49もしくは配列番号49のアミノ酸19〜130を有するか又はこれらを含む血清アミロイドA-4タンパク質、配列番号30;配列番号50もしくは配列番号50のアミノ酸19〜267、1〜242、25〜267、もしくは25〜266を有するか又はこれらを含むアポリポタンパク質A-I及びその切断バージョン、配列番号31;配列番号51もしくは配列番号51のアミノ酸20〜35又は36〜866を有するか又はこれらを含むフィブリノーゲンα鎖、配列番号32;配列番号52もしくは配列番号52のアミノ酸19〜406、19〜160、又は162〜406を有するか又はこれらを含むハプトグロビン、配列番号33;配列番号53もしくは配列番号53のアミノ酸25〜418もしくは375〜418を有するか又はこれらを含むα1-アンチトリプシン、Ig μ鎖C領域(配列番号34もしくは配列番号54)、配列番号35もしくは配列番号55を有するか又はこれらを含むヘモグロビンサブユニットδ、配列番号36;配列番号56もしくは配列番号56のアミノ酸24〜5405を有するか又はこれらを含むIgGFc結合タンパク質、或いは配列番号59を有するか又はこれを含むMARCKS関連タンパク質のうちの少なくとも1つ又は複数をさらに含む。
【０１０４】
本明細書で使用される配列のリストについて、下の表5は、配列相関リストを示している。
表5
【表５】
2018510343.tif 000069
2018510343.tif 000070
【０１０５】
本明細書に記載されるバイオマーカーパネルは、神経認知障害、特に、アルツハイマー病を診断するのに、その病期を判定するのに、及びそれを発症する可能性を評価するのに有用である。そのような方法のいずれかにおける本発明によるバイオマーカーパネルの使用は、かなりの利点を有する。第一に、これらのバイオマーカーパネルは、脳で生じる事象及び経路変化を末梢シグナルに変換し、それらは、組織検査を末梢流体検査に置き換えることを可能にする。とりわけ、神経認知障害で主に影響を受ける組織は脳組織であるので、これは大きな利点となる。脳生検が実施されることはなく、実施される唯一の組織解析は死体解剖である。第二に、これらのバイオマーカーパネルは、アルツハイマー病などの、ミクログリア活性化を特徴とする神経認知障害の入口であると考えられている、神経炎症事象などの、脳における初期の事象及び経路変化に変換することができるものとして開発されている。第三に、これらのバイオマーカーパネルは、文献で一般に報告されているものでも、臨床現場で現在使用されているものでもなく、したがって、臨床医に、ADを有する対象及び神経認知機能障害の症状を呈しているが、ADの初期の兆候による影響を受けていない対象を初期の段階で特定し、これらの対象を区別するためのさらなるツールを与えるバイオマーカーを包含する。
【０１０６】
したがって、本発明は、対象の神経認知障害を診断する方法であって:
a)該対象から得られた試料をバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、その対象が神経認知障害を有するかどうかを決定すること;
を含み、ここで、該バイオマーカーパネルが:
i.配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは
ii.配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片
を含む、方法を提供する。
【０１０７】
本発明は、対象の神経認知障害の病期を判定する方法であって:
a)該対象から得られた試料をバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、該対象の神経認知障害の病期を決定すること
を含み、ここで、バイオマーカーパネルが:
i.配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは
ii.配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片
を含む、方法も提供する。
【０１０８】
本発明は、対象で神経認知障害を発症する可能性を評価する方法であって:
a)該対象から得られた試料をバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、その対象が神経認知障害を発症する可能性があるかどうかを決定すること
を含み、ここで、バイオマーカーパネルが:
i.配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは
ii.配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片
を含む、方法も提供する。
【０１０９】
いくつかの実施態様において、神経認知障害を診断するか、その病期を判定するか、又はそれを発症する可能性を対象で評価する方法で使用するためのバイオマーカーパネルは、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片を含む。
【０１１０】
いくつかの他の実施態様において、神経認知障害を診断するか、その病期を判定するか、又はそれを発症する可能性を対象で評価する方法で使用するためのバイオマーカーパネルは、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片、並びに任意に、配列番号4のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼL1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片及び/或いは配列番号5のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するビタミンD結合タンパク質又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片を含む。
【０１１１】
本明細書に記載される方法のいくつかの実施態様において、神経認知障害は、軽度認知障害、アルツハイマー病、血管性認知症、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、又はこれらの組合せの群から選択される。好ましくは、神経認知障害は、アルツハイマー病(AD)である。
【０１１２】
本明細書に記載される方法のこれらの実施態様のいくつかにおいて、神経認知障害、好ましくは、ADは、ミクログリア活性化を特徴とする。
【０１１３】
本発明の一実施態様において、対象の神経認知障害を診断する方法は:
a)該対象から得られた試料を配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はそのアイソフォームもしくは断片を含むバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、その対象が神経認知障害を有するかどうかを決定すること;
を含み、ここで、該神経認知障害はアルツハイマー病であり、任意に、該バイオマーカーパネルは、表1、2、3、4、5、6、7、もしくは8のいずれか1つから選択される少なくとも1つ、或いは2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片をさらに含む。
【０１１４】
本発明の別の実施態様において、対象の神経認知障害の病期を判定する方法は:
a)該対象から得られた試料を配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片を含むバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、該対象の神経認知障害の病期を決定すること;
を含み、ここで、該神経認知障害はアルツハイマー病であり、任意に、該バイオマーカーパネルは、表1、2、3、4、5、6、7、もしくは8のいずれか1つから選択される少なくとも1つ、或いは2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片をさらに含む。
【０１１５】
本発明の別の実施態様において、対象の神経認知障害を発症する可能性を対象で評価する方法は:
a)該対象から得られた試料を配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片を含むバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、その対象が、該対象の神経認知障害を発症する可能性があるかどうかを決定すること;
を含み、ここで、該神経認知障害はアルツハイマー病であり、任意に、該バイオマーカーパネルは、表1、2、3、4、5、6、7、もしくは8のいずれか1つから選択される少なくとも1つ、或いは2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片をさらに含む。
【０１１６】
本発明は、対象のアルツハイマー病を治療する方法であって:
a)該対象から得られた試料を配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片を含むバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、その対象がアルツハイマー病を有するかどうかを決定すること;
d)該対象にメマンチン(例えば、Namenda(登録商標))、ガランタミン(例えば、Razadyne(登録商標))、リバスチグミン(例えば、Exelon(登録商標))、ドネペジル(例えば、Aricept(登録商標))、ソラネズマブ、5HT5アンタゴニスト、又はこれらの組合せの群から選択されるアルツハイマー病治療を施すこと
を含む、方法も提供する。
【０１１７】
任意に、バイオマーカーパネルは、表1、2、3、4、5、6、7、もしくは8のいずれか1つから選択される少なくとも1つ、或いは2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片をさらに含む。
【０１１８】
本発明は、対象のアルツハイマー病の治療の予後判定を助ける方法であって:
a)該対象から得られた試料をバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、該アルツハイマー病の治療が成功しているかどうかを決定すること
を含む、方法をさらに提供する。好ましくは、アルツハイマー病の治療は、メマンチン(例えば、Namenda(登録商標))、ガランタミン(例えば、Razadyne(登録商標))、リバスチグミン(例えば、Exelon(登録商標))、ドネペジル(例えば、Aricept(登録商標))、ソラネズマブ、5HT5アンタゴニスト、又はこれらの組合せの群から選択される。任意に、バイオマーカーパネルは、表1、2、3、4、5、6、7、もしくは8のいずれか1つから選択される少なくとも1つ、或いは2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片をさらに含む。
【０１１９】
本発明による方法で使用される試料は、脳脊髄液(CSF)、血液、血漿、血清、唾液、尿、組織(例えば、脳組織)、又はこれらの組合せの群から選択することができる。
【０１２０】
一実施態様において、該試料は、脳脊髄液(CSF)である。
【０１２１】
本発明の一実施態様において、対象の神経認知障害を診断する方法は:
a)該対象から得られた試料を配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片を含むバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、その対象が神経認知障害を有するかどうかを決定すること;
を含み、ここで、該神経認知障害はアルツハイマー病であり、ここで、該試料は脳脊髄液(CSF)であり、任意に、該バイオマーカーパネルは、表1、2、3、4、5、6、7、もしくは8のいずれか1つから選択される少なくとも1つ、或いは2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片をさらに含む。
【０１２２】
本発明の別の実施態様において、対象の神経認知障害の病期を判定する方法は:
a)該対象から得られた試料を配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片を含むバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、該対象の神経認知障害の病期を決定すること;
を含み、ここで、該神経認知障害はアルツハイマー病であり、ここで、該試料は脳脊髄液(CSF)であり、任意に、該バイオマーカーパネルは、表1、2、3、4、5、6、7、もしくは8のいずれか1つから選択される少なくとも1つ、或いは2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片をさらに含む。
【０１２３】
本発明の別の実施態様において、対象の神経認知障害を発症する可能性を対象で評価する方法は:
a)該対象から得られた試料を配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片を含むバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、その対象が、該対象の神経認知障害を発症する可能性があるかどうかを決定すること;
を含み、ここで、該神経認知障害はアルツハイマー病であり、ここで、該試料は脳脊髄液(CSF)であり、任意に、該バイオマーカーパネルは、表1、2、3、4、5、6、7、もしくは8のいずれか1つから選択される少なくとも1つ、或いは2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片をさらに含む。
【０１２４】
別の実施態様において、対象のアルツハイマー病を治療する方法は:
a)該対象から得られた試料を配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片を含むバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、その対象がアルツハイマー病を有するかどうかを決定すること;
d)該対象にメマンチン(例えば、Namenda(登録商標))、ガランタミン(例えば、Razadyne(登録商標))、リバスチグミン(例えば、Exelon(登録商標))、ドネペジル(例えば、Aricept(登録商標))、ソラネズマブ、5HT5アンタゴニスト、又はこれらの組合せの群から選択されるアルツハイマー病治療を施すこと;
を含み、ここで、該試料は脳脊髄液(CSF)であり、任意に、該バイオマーカーパネルは、表1、2、3、4、5、6、7、もしくは8のいずれか1つから選択される少なくとも1つ、或いは2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片をさらに含む。
【０１２５】
別の実施態様において、対象のアルツハイマー病の治療の予後判定を助ける方法は:
a)該対象から得られた試料をバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、該アルツハイマー病の治療が成功しているかどうかを決定すること
を含み、ここで、該試料は脳脊髄液(CSF)である。好ましくは、アルツハイマー病の治療は、メマンチン(例えば、Namenda(登録商標))、ガランタミン(例えば、Razadyne(登録商標))、リバスチグミン(例えば、Exelon(登録商標))、ドネペジル(例えば、Aricept(登録商標))、ソラネズマブ、5HT5アンタゴニスト、又はこれらの組合せの群から選択される。任意に、バイオマーカーパネルは、表1、2、3、4、5、6、7、もしくは8のいずれか1つから選択される少なくとも1つ、或いは2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片をさらに含む。本明細書に記載される方法において、対象は、好ましくは、ヒト対象であり、該ヒト対象は、以前に軽度認知障害と診断されたことがあっても、診断されたことがなくてもよい。
【０１２６】
いくつかの実施態様において、ヒト対象は、認知症のさらなる臨床評価を受けていてもよい。
【０１２７】
本明細書に記載される方法のいくつかの実施態様において、工程a)のアッセイすること及び/又は工程b)の測定することは:
i)該試料を該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々に対する1以上の結合剤と接触させること;又は
ii)該試料中で該バイオマーカーの各々に特異的な自己抗体を検出すること;又は
iii)任意に、該試料を1以上のアイソバリックな反応性質量標識で事前に標識することにより、該試料中で、質量分析により、該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々を検出すること;又は
iv)該試料中で、2Dゲル電気泳動により、該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々を検出すること;又は
v) i)、ii)、iii)、及び/もしくはiv)のいずれかの組合せ
をさらに含み得る。
【０１２８】
特に、アッセイする工程a)及び/又は測定する工程b)は、該バイオマーカーパネル中のバイオマーカーの1以上の断片を検出することを含み得る。任意に、試料は、固体支持体上に固定されている。
【０１２９】
したがって、一実施態様において、ヒト対象のアルツハイマー病を診断する方法は:
a)該対象から得られた脳脊髄液(CSF)試料を配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片を含むバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーパネルのバイオマーカー各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、その対象がアルツハイマー病を有するかどうかを決定すること;
を含み、
ここで、工程a)のアッセイすること及び/又は工程b)の測定することは:
i)該試料を該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々に対する1以上の結合剤と接触させること;又は
ii)該試料中で該バイオマーカーの各々に特異的な自己抗体を検出すること;又は
iii)任意に、該試料を1以上のアイソバリックな反応性質量標識で事前に標識することにより、該試料中で、質量分析により、該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々を検出すること;又は
iv)該試料中で、2Dゲル電気泳動により、該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々を検出すること;又は
v) i)、ii)、iii)、及び/もしくはiv)のいずれかの組合せ;
をさらに含み得、かつ
任意に、該バイオマーカーパネルは、表1、2、3、4、5、6、7、もしくは8のいずれか1つから選択される少なくとも1つ、或いは2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片をさらに含む。
【０１３０】
本発明の別の実施態様において、ヒト対象のアルツハイマー病の病期を診断する方法は:
a)該対象から得られた脳脊髄液(CSF)試料を配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片を含むバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、該対象のアルツハイマー病の病期を決定すること;
を含み、
ここで、工程a)のアッセイすること及び/又は工程b)の測定することは:
i)該試料を該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々に対する1以上の結合剤と接触させること;又は
ii)該試料中で該バイオマーカーの各々に特異的な自己抗体を検出すること;又は
iii)任意に、該試料を1以上のアイソバリックな反応性質量標識で事前に標識することにより、該試料中で、質量分析により、該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々を検出すること;又は
iv)該試料中で、2Dゲル電気泳動により、該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々を検出すること;又は
v) i)、ii)、iii)、及び/もしくはiv)のいずれかの組合せ;
をさらに含み得、かつ
任意に、該バイオマーカーパネルは、表1、2、3、4、5、6、7、もしくは8のいずれか1つから選択される少なくとも1つ、或いは2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片をさらに含む。
【０１３１】
本発明の別の実施態様において、ヒト対象のアルツハイマー病を発症する可能性を対象で評価する方法は:
a)該対象から得られた脳脊髄液(CSF)試料を配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片を含むバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、その対象がアルツハイマー病を発症する可能性があるかどうかを決定すること;
を含み、
ここで、工程a)のアッセイすること及び/又は工程b)の測定することは:
i)該試料を該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々に対する1以上の結合剤と接触させること;又は
ii)該試料中で該バイオマーカーの各々に特異的な自己抗体を検出すること;又は
iii)任意に、該試料を1以上のアイソバリックな反応性質量標識で事前に標識することにより、該試料中で、質量分析により、該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々を検出すること;又は
iv)該試料中で、2Dゲル電気泳動により、該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々を検出すること;又は
v) i)、ii)、iii)、及び/もしくはiv)のいずれかの組合せ;
をさらに含み得、かつ
任意に、該バイオマーカーパネルは、表1、2、3、4、5、6、7、もしくは8のいずれか1つから選択される少なくとも1つ、或いは2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片をさらに含む。
【０１３２】
別の実施態様において、ヒト対象のアルツハイマー病を治療する方法は:
a)該対象から得られた脳脊髄液(CSF)試料を配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片を含むバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、その対象がアルツハイマー病を有するかどうかを決定すること;
d)該対象にメマンチン(例えば、Namenda(登録商標))、ガランタミン(例えば、Razadyne(登録商標))、リバスチグミン(例えば、Exelon(登録商標))、ドネペジル(例えば、Aricept(登録商標))、ソラネズマブ、5HT5アンタゴニスト、又はこれらの組合せの群から選択されるアルツハイマー病治療を施すこと;
を含み、
ここで、工程a)のアッセイすること及び/又は工程b)の測定することは:
i)該試料を該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々に対する1以上の結合剤と接触させること;又は
ii)該試料中で該バイオマーカーの各々に特異的な自己抗体を検出すること;又は
iii)任意に、該試料を1以上のアイソバリックな反応性質量標識で事前に標識することにより、該試料中で、質量分析により、該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々を検出すること;又は
iv)該試料中で、2Dゲル電気泳動により、該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々を検出すること;又は
v) i)、ii)、iii)、及び/もしくはiv)のいずれかの組合せ;
をさらに含み得、かつ
任意に、該バイオマーカーパネルは、表1、2、3、4、5、6、7、もしくは8のいずれか1つから選択される少なくとも1つ、或いは2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片をさらに含む。
【０１３３】
別の実施態様において、ヒト対象のアルツハイマー病の治療の予後判定を助ける方法は:
a)該対象から得られた試料を配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片を含むバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイすること;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定すること;
c)該試料中の該バイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、該アルツハイマー病の治療が成功しているかどうかを決定すること
を含み、ここで、アルツハイマー病の治療は、メマンチン(例えば、Namenda(登録商標))、ガランタミン(例えば、Razadyne(登録商標))、リバスチグミン(例えば、Exelon(登録商標))、ドネペジル(例えば、Aricept(登録商標))、ソラネズマブ、5HT5アンタゴニスト、又はこれらの組合せの群から選択され、かつ
ここで、工程a)のアッセイすること及び/又は工程b)の測定することは:
i)該試料を該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々に対する1以上の結合剤と接触させること;又は
ii)該試料中で該バイオマーカーの各々に特異的な自己抗体を検出すること;又は
iii)任意に、該試料を1以上のアイソバリックな反応性質量標識で事前に標識することにより、該試料中で、質量分析により、該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々を検出すること;又は
iv)該試料中で、2Dゲル電気泳動により、該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々を検出すること;又は
v) i)、ii)、iii)、及び/もしくはiv)のいずれかの組合せ
をさらに含み得る。
【０１３４】
任意に、バイオマーカーパネルは、表1、2、3、4、5、6、7、もしくは8のいずれか1つから選択される少なくとも1つ、或いは2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片をさらに含む。
【０１３５】
本明細書に記載される全ての方法のいくつかの好ましい実施態様において、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片の濃度又は量は、その参照濃度又は量と比較して増大している。
【０１３６】
本明細書に記載される全ての方法のいくつかの他の好ましい実施態様において、配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片の濃度又は量は、その参照濃度又は量と比較して増大している。
【０１３７】
本明細書に記載される全ての方法のいくつかの他の好ましい実施態様において、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片の濃度又は量は、その参照濃度又は量と比較して増大しており、かつ配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片の濃度又は量は、その参照濃度又は量と比較して増大している。
【０１３８】
本発明は、対象から得られた試料中のバイオマーカーを同定する方法をさらに提供し、ここで、該バイオマーカーは、アルツハイマー病の診断又は病期判定に好適であり、ここで、該方法は、活性化ミクログリア細胞(例えば、BV2細胞)及び/又はその培養培地を質量分析で使用することを含み、及び/又は該バイオマーカーは、活性化ミクログリア細胞を参照として使用することにより該試料中で同定される。好ましくは、バイオマーカーパネルは、本明細書に定義されているようなバイオマーカーを含む。上記のような試料は、CSF、血液、血清、又は血漿の群から選択することができる。
【０１３９】
(2.キット)
本発明は、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片を含むバイオマーカーパネルのバイオマーカーを試料中でアッセイ及び/又は測定するための試薬を含むキットも提供する。
【０１４０】
任意に、バイオマーカーパネルは、表1、2、3、もしくは4のいずれか1つから選択される少なくとも1つ、或いは2つもしくはそれより多くのバイオマーカー又はそれらの断片をさらに含む。
【０１４１】
好ましくは、キットは、神経認知障害、特に、アルツハイマー病の診断及び病期判定を可能にする。
【０１４２】
本発明によるキットの試薬は、バイオマーカーパネルのバイオマーカーに特異的に結合する1以上の結合剤を含み得る。好ましくは、該1以上の結合剤は一次抗体であり、ここで、各々の一次抗体は、バイオマーカーパネルの異なるバイオマーカーに特異的に結合する。
【０１４３】
より好ましくは、一次抗体は、ヒト配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いはヒト配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片に対する抗体である。
【０１４４】
一次抗体は、アッセイプレート、ビーズ、マイクロスフェア、又は粒子に固定化されていてもよい。任意に、ビーズ、マイクロスフェア、又は粒子は、染色されているか、タグ化されているか、又は標識されていてもよい。
【０１４５】
キットが、バイオマーカーパネルのバイオマーカーに対する一次抗体を含む場合、該キットは、該一次抗体に特異的に結合する1以上の二次抗体をさらに含み得る。
【０１４６】
任意に、二次抗体は、標識、例えば、蛍光標識されているか、又はタグ化されていてもよい。
【０１４７】
本発明によるキットは、タグ化された二次抗体の存在を検出するための1以上の検出試薬をさらに含み得る。
【０１４８】
試料は、脳脊髄液(CSF)、血液、血漿、血清、唾液、尿、組織(例えば、脳組織)、又はこれらの組合せの群から選択される。
【０１４９】
本発明のキットは、使用者が:
a)対象から得られた試料を配列番号1のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するホスホグルコムターゼ1又はそのアイソフォームもしくは変異体もしくは断片;及び/或いは配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は該アミノ酸配列を有するチモシンβ-4又はその変異体もしくは断片を含むバイオマーカーパネルのバイオマーカーについてアッセイし;
b)該試料中で該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々の濃度又は量を測定し;
c)該試料中のバイオマーカーの各々の該濃度又は量を該バイオマーカーの参照濃度又は量と比較することにより、その対象が、神経認知障害、特に、アルツハイマー病を有するかどうかを決定する;
ことを可能にする。
【０１５０】
特に、本発明によるキットは、使用者に:
i)該試料を該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々に対する1以上の結合剤と接触させること;又は
ii)該試料中で該バイオマーカーの各々に特異的な自己抗体を検出すること;又は
iii)任意に、該試料を1以上のアイソバリックな反応性質量標識で事前に標識することにより、該試料中で、質量分析により、該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々を検出すること;又は
iv)該試料中で、2Dゲル電気泳動により、該バイオマーカーパネルのバイオマーカーの各々を検出すること;又は
v) i)、ii)、iii)、及び/もしくはiv)のいずれかの組合せ
によって、試料を(工程aと同様に)アッセイし及び/又は(工程bと同様に)測定することを指示し得る。
【０１５１】
また別の実施態様において、キットは、脳組織を調製するのに、任意に、ホルマリン固定パラフィン包埋脳組織切片を調製するのに好適な試薬を含み得る。
【０１５２】
キットは、1以上のバイオマーカー濃度又は量の決定を比較することができる定量的な尺度を提供する参照をさらに提供し得る。該参照は、神経認知障害、特に、ADの存在、又はその病期、又はそれを発症する可能性を示すバイオマーカーの量又は濃度を示し得る。
【０１５３】
キットは、本発明による方法を実施するための印刷された説明書も含み得る。
【０１５４】
一実施態様において、キットは、質量分析アッセイを実施するためのものであってもよく、かつ参照ペプチド(例えば、SRMペプチド)のセットをアッセイ互換フォーマットで含んでいてもよく、ここで、該セット中の各々のペプチドは、表1、2、3、4、5、6、7、又は8に提供されているバイオマーカーの各々を独特に表すものである。好ましくは、そのような独特のペプチドのうちの2つ以上を、そのためにキットがデザインされ、かつ独特のペプチドの各々のセットが健常対象の試料中のそのようなバイオマーカーの量又は濃度を反映する既知の量で提供される、各々のバイオマーカーに使用する。
【０１５５】
任意に、キットは、試料からの本発明によるバイオマーカーの単離及び抽出のためのプロトコル及び試薬、トリプシンなどのタンパク質分解酵素の精製調製物、並びにモニタリングされるべきプリカーサー質量及び比遷移の詳細を含む方法の詳細なプロトコルも提供し得る。ペプチドは合成ペプチドであってもよく、かつ炭素、窒素、酸素、及び/又は水素の1以上の重同位体を含んでいてもよい。
【０１５６】
任意に、本発明のキットは、適当な細胞、容器、成長培地、及びバッファーも含み得る。
【０１５７】
(3.バイオマーカーの検出及び測定)
本明細書に記載されるバイオマーカーパネルは、発現が調節される、すなわち、定量的に増加又は減少するバイオマーカーと、疾患状態と比べて正常状態でもっぱら存在するか又はもっぱら存在しない、すなわち、定性的に発現されるバイオマーカーの両方を含む。その発現が疾患状態と比べて正常状態で異なる程度は、標準的な特徴解析技術によって可視化されるのに十分な大きさであるだけでよい。
【０１５８】
バイオマーカーの検出及び定量の方法は当技術分野で周知であり、任意の好適な方法を利用し得る。
【０１５９】
一実施態様において、バイオマーカーパネル中のバイオマーカーは、そのバイオマーカーに特異的な結合剤、例えば、抗体を、例えば、ELISAアッセイ又はウェスタンブロッティングで用いて検出することができる。
【０１６０】
本明細書に記載されるバイオマーカーパネル中の個々のバイオマーカーの1以上のエピトープを特異的に認識することができる抗体の産生に関する方法は、当技術分野で公知である。そのような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、ヒト化又はキメラ抗体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab')2断片、Fab発現ライブラリーによって産生される断片、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１６１】
抗体の産生のために、様々な宿主動物をタンパク質又はその部分の注射によって免疫することができる。そのような宿主動物としては、ウサギ、マウス、及びラットを挙げることができるが、これらに限定されない。リゾレシチン、Pluronicポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びに潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、BCGカルメット・ゲラン桿菌及びコリネバクテリウム・パルヴム(Corynebacterium parvum)などの活性物質を含む、様々なアジュバントを用いて、宿主種に応じて、免疫学的応答を増大させることができる。
【０１６２】
ポリクローナル抗体は、抗原、例えば、標的タンパク質、又はその抗原性機能性誘導体で免疫した動物の血清に由来する不均一な抗体分子集団である。ポリクローナル抗体の産生のために、宿主動物、例えば、上記のような宿主動物を、同じく上記のようなアジュバントが補充された示差発現タンパク質又は経路タンパク質の注射によって免疫することができる。
【０１６３】
特定の抗原に対する均一な抗体集団であるモノクローナル抗体は、培養下の継続細胞株による抗体分子の産生をもたらす任意の技術によって得ることができる。これらには、Kohler及びMilsteinのハイブリドーマ技術(1975, Nature 256:495-7;及び米国特許第4,376,110号)、ヒトβ細胞ハイブリドーマ技術(Kosborらの文献、1983, Immunology Today 4:72; Coleらの文献、1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-30)、並びにEBVハイブリドーマ技術(Coleらの文献、1985、モノクローナル抗体及び癌療法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)、Alan R. Liss社、pp. 77-96)が含まれるが、これらに限定されない。そのような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDを含む任意の免疫グロブリンクラス及びその任意のサブクラスのものであり得る。本発明のmAbを産生するハイブリドーマは、インビトロ又はインビボで培養することができる。インビボで高力価のmAbを産生するので、これが現在好ましい産生方法になっている。
【０１６４】
さらに、適当な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を適当な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒にスプライシングすることによる「キメラ抗体」の産生のために開発された技術(Morrisonらの文献、1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-5; Neubergerらの文献、1984, Nature 312:604-8; Takedaらの文献、1985, Nature 314:452-4)を使用することができる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えば、マウスmAbに由来する可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子である。
【０１６５】
或いは、単鎖抗体の産生について記載されている技術(米国特許第4,946,778号; Birdの文献、1988, Science 242: 423-6; Hustonらの文献、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83;及びWardらの文献、1989, Nature 334:544-6)を、示差発現タンパク質又は経路タンパク質-単鎖抗体を産生するように適合させることができる。単鎖抗体は、アミノ酸架橋によってFv領域の重鎖断片と軽鎖断片を連結させ、単鎖ポリペプチドを生じさせることにより形成される。
【０１６６】
特異的エピトープを認識する抗体断片は、公知の技術によって作製することができる。例えば、そのような断片としては、抗体分子のペプシン消化によって産生することができるF(ab')2断片及び該F(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することにより作製することができるFab断片が挙げられるが、これらに限定されない。所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ容易な同定を可能にするために、別のFab発現ライブラリーを構築してもよい(Huseらの文献、1989, Science 246:1275-81)。
【０１６７】
本明細書に記載される方法のいくつかの実施態様において、試料は、分析用の固体支持体上に固定化されていてもよい。バイオマーカーパネル中の個々のバイオマーカーに特異的な結合剤、例えば、抗体が、平坦な表面又は微粒子ビーズなどの固体支持体上に固定化され、該パネルのバイオマーカーが、固定化された結合剤、例えば、固定化された抗体によって捕捉される、抗体サンドイッチ技術を利用してもよい。その後、捕捉されたバイオマーカーは、シグナル発生剤(酵素、蛍光タグ、放射性標識など)で直接標識することができるか、又はさらなる増幅(酵素、フルオロフォア、放射性標識などを含む、標識された二次抗体、ストレプトアビジン/ビオチン系)を用いて検出することができる、第二の結合剤、例えば、二次抗体を用いて検出される。他の方法としては、試料の一次元又は二次元(2D)ゲル電気泳動を挙げることができるが、これらに限定されない。そのような方法の後に、ウェスタンブロッティングなどの技術を用いる固体表面への転写、及びその後のADバイオマーカーに特異的な抗体を用いる検出が続く。
【０１６８】
他の実施態様において、バイオマーカーに対する自己抗体は、健常対象、ADの患者又は代表者由来の試料を用いる上記のウェスタンブロッティング法を使用し、その後、試料中に存在するが、健常対象に存在しないバイオマーカーに特異的な自己抗体の存在を検出することにより、検出することができる。
【０１６９】
非抗体結合剤の例は、アプタマーである。アプタマーの例としては、核酸アプタマー及びペプチドアプタマーが挙げられる。
【０１７０】
或いは、バイオマーカーは、とりわけ、2Dゲル電気泳動の銀染色、又はLS/MS/MS、MALDI-TOF、SELDI-TOF、及びTMT-SRMを含む質量分析技術によって検出することができる。
【０１７１】
発現の差を可視化し得る他のそのような標準的な特徴解析技術は当業者に周知である。これらには、クロマトグラフィーによる画分の連続的な分離及びピークの比較、キャピラリー電気泳動、マイクロチップ上でのものを含むマイクロチャネルネットワークを用いた分離、SELDI解析、並びにqPST解析が含まれる。
【０１７２】
クロマトグラフィーによる分離は、クロマトグラムが分離の時間に対する280nmでの光の吸光度のプロットの形で得られる、文献に記載されているような高速液体クロマトグラフィーによって実施することができる。次に、不完全に分解されたピークを生じる材料を、再度クロマトグラフィーにかけるなどする。
【０１７３】
キャピラリー電気泳動は、多くの刊行物に、例えば、Beckmanによって、そのP/ACE 5000システムに同梱される「Total CE Solutions」という文献に記載されている技術である。この技術は、小さいキャピラリーチューブに含まれる試料にわたって電位を印加することに依存する。このチューブは、電荷を帯びた表面、例えば、負の電荷を帯びたケイ酸塩ガラスを有する。反対の電荷を帯びたイオン(この場合、正のイオン)は表面に引き付けられ、その後、表面と同じ極性の適当な電極(この場合、陰極)に移動する。この試料の電気浸透流(EOF)中では、正のイオンが最も速く移動し、電荷を帯びていない材料及び負の電荷を帯びたイオンがそれに続く。したがって、タンパク質は、本質的には、その表面の電荷に従って分離される。
【０１７４】
マイクロチャネルネットワークは、キャピラリーと同様に機能し、ポリマー材料のフォトアブレーションによって形成されることができる。この技術では、UVレーザーを用いて、好適なUV吸収特性を有するポリマー、例えば、ポリエチレンテレフタレート又はポリカーボネートに一気に照射される高エネルギー光パルスを発生させる。入射光子は、限定された空間を有する化学結合を破壊し、内圧の上昇、小爆発、及びアブレーションされた材料の排出をもたらし、マイクロチャネルを形成する空隙を後に残す。マイクロチャネル材料は、キャピラリー電気泳動の場合と同様に、EOFに基づく分離を達成する。これは、各々のチップが、それ自体の試料インジェクター、分離カラム、及び電気化学的検出器を有する、マイクロチップの形態に適応可能である: J.S.Rossierらの文献、1999, Electrophoresis 20:727-31を参照されたい。
【０１７５】
ProteinChip技術と組み合わせた表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(SELDI-TOF-MS)も、迅速でかつ感度の高いバイオマーカープロファイリング手段を提供することができ、2Dゲル電気泳動に代わるものとして補足的に使用される。ProteinChipシステムは、タンパク質試料をチップの表面化学(例えば、アニオン性、カチオン性、疎水性、親水性など)に基づいて選択的に結合させることができるアルミニウムチップからなる。結合したバイオマーカーは、その後、モル濃度過剰の小さいエネルギー吸収性分子とともに共結晶化される。チップは、その後、N2 320nm UVレーザーの高強度短パルスによって分析され、タンパク質の分離及び検出が飛行時間型質量分析によって行われる。実験における各々の群のスペクトルプロファイルを比較し、対象となる任意のピークを下記のような技術を用いてさらに分析して、バイオマーカーの同一性を確認することができる。
【０１７６】
アイソトピック又はアイソバリックTandem Mass Tags(登録商標)(TMT(登録商標))(Thermo Scientific, Rockford, USA)技術を用いて、バイオマーカー、例えば、本明細書に記載されるバイオマーカーパネルのタンパク質を検出することもできる。簡潔に説明すると、比較用の試料中のタンパク質を任意に消化し、安定同位体タグで標識し、質量分析によって定量する。このように、異なる試料中の等価なタンパク質の発現を、そのそれぞれの同位体ピークの強度又はタンデム質量分析実験における断片化の間にTMT(登録商標)試薬から遊離したレポーターイオンの強度を比較することにより直接比較することができる。
【０１７７】
本明細書に記載されるバイオマーカーパネルのバイオマーカーの検出の前に、最も多く存在するタンパク質を試料から取り除く除去工程があってもよい。血清/血漿のタンパク質組成の大部分は、ごくわずかのタンパク質からなる。例えば、35〜50mg/mlの濃度で存在するアルブミンは、全タンパク質含有量の約54％に相当し、IgGは、他の16％を上乗せする。対照的に、疾患に応答して、例えば、組織漏出の結果として変化するタンパク質は、10ng/mlで循環し得る。タンパク質濃度のこの非常に広いダイナミックレンジは、分析上の大きな課題を表しており、この問題を克服するために、複数の親和性除去カラムを用いて、最も大量に存在するタンパク質(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10種、又はそれより多くの大量に存在するタンパク質)を除去することができる。より多くの出発材料を使用することができ、かつ大量に存在する分子からの干渉がより少ないので、これは、より少ない存在量範囲の変化の検出を可能にする。そのような除去戦略を任意の検出法の前に適用することができる。
【０１７８】
(4.神経認知障害の治療のための試験薬剤をスクリーニング及び選択する方法)
本明細書に記載されるバイオマーカーパネルを用いて、ADなどの神経認知障害、又はその1以上の症状を予防又は改善する能力について薬剤を試験することができる。
【０１７９】
そのような薬剤は、臨床試験においてヒト対象で試験することができる。本明細書に記載されるバイオマーカーパネル中のタンパク質の発現を、健常個体で見られるレベルに、又はそれが存在しない方向もしくは場合によっては、存在する方向に回復させる薬剤はいずれも、ADなどの神経認知障害を治療する、すなわち、AD症状を軽減するか又はADの進行を減速させるのに有用である可能性がある。
【０１８０】
臨床試験において、例えば、本明細書に記載されるバイオマーカーパネルの1以上のバイオマーカーの量又は濃度を、試験されている薬剤の存在下又は非存在下で決定することができる。この薬剤の効力に続いて、得られた発現データを正常状態での対応する既知の発現パターンと比較することができる。効力を示す薬剤は、バイオマーカーパネル中のバイオマーカーの存在、量、又は濃度を、正常状態の存在、量、又は濃度により密接に類似するように変化させるものである。
【０１８１】
正常状態でのその発現又は存在と比べた、神経認知障害におけるバイオマーカーパネル中のバイオマーカーの検出を、臨床試験において、ADなどの神経認知障害の治療のための潜在的薬剤の効力をモニタリングするために使用することもできる。臨床試験において、バイオマーカーパネル中のバイオマーカーのレベル及び/又は存在を、試験されている薬剤の存在下又は非存在下、脳脊髄液(CSF)中で決定することができる。この薬剤の効力に続いて、得られたデータ中のバイオマーカーのバイオマーカーレベル及び/又は存在を、正常状態の細胞及び/又は組織及び/又は体液の対応する既知のレベル/存在と比較することができる。効力を示す薬剤は、対象由来の細胞及び/もしくは組織試料及び/もしくは体液のバイオマーカーパネルの存在、量、もしくは濃度を、正常状態の存在、量、もしくは濃度により密接に類似するように変化させるもの、又はパターンを安定させる、すなわち、疾患の進行を妨げるものである。本バイオマーカーパネルは、脳で生じる事象及び経路変化を末梢シグナルに変換するので、それらは、組織検査を末梢流体検査に置き換えることを可能にする。とりわけ、神経認知障害で主に影響を受ける組織は脳組織であるので、これは大きな利点となる。脳生検が実施されることはなく、実施される唯一の組織解析は死体解剖である。
【０１８２】
介入に関して、本明細書に記載されるバイオマーカーパネル中のバイオマーカーの発現を健常レベルに回復又は一部回復させる治療はいずれも、ADなどの神経認知障害の治療的介入の候補とみなされるべきである。試験薬剤の投与量は、用量応答曲線を導出することにより決定することができる。
【０１８３】
同様に、ADなどの神経認知障害の発症を予防するか又はより進んだADのレベルへの進行を予防することができる治療はいずれも、ADの治療的介入の候補とみなされるべきである。
【０１８４】
薬剤は、それが、対照と比べてバイオマーカーパネルのバイオマーカーの存在、濃度、又は量の経時的変化を妨げるか又は減速させる場合に選択することができる。
【０１８５】
好ましくは、薬剤は、それが、バイオマーカーパネルのバイオマーカーの量又は濃度を正常対象の量又は濃度へと転換する場合に選択される。
【０１８６】
薬剤は、それが、濃度又は量の経時的変化を減速させるか又は停止させる場合に選択することができる。例えば、阻害活性を示す薬剤を本発明に従って用いて、軽度認知障害又はADの症状を予防することができる。そのような分子としては、ペプチド(例えば、標的タンパク質膜貫通受容体の可溶性細胞外部分に相当するペプチドなど)、ホスホペプチド、有機もしくは無機小分子、又は抗体(例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、もしくは単鎖抗体、並びにFab、F(ab')2、及びFab発現ライブラリー断片、並びにこれらのエピトープ結合断片を含む)を挙げることができるが、これらに限定されない。
【実施例】
【０１８７】
(5.実施例)
これから、本発明の特定の態様及び実施態様を、例として、図面及び上記の表を参照して、説明することにする。本明細書中に言及される文書は全て、あらゆる目的のために引用により完全に本明細書中に組み込まれている。
【０１８８】
細胞培養及び試料調製用の試薬は全て、明記しない限り、Sigma Aldrich(登録商標)(Dorset, UK)から購入した。Tandem Mass Tags(登録商標)(Thermo Scientific(登録商標));アセトニトリル(Fisher Scientific(登録商標), Loughborough, UK);トリプシン(Roche Diagnostics(登録商標), West Sussex, UK)。
【０１８９】
(BV2細胞試料)−BV2細胞を1ウェル当たり80,000細胞で6ウェルプレートに播種し、37℃、5％CO2で維持した。細胞を、2mM L-グルタミン、100U/mLペニシリン、及び100mg/mLストレプトマイシン、ゲンタマイシン、及びマイコプラズマ除去剤(AbD Serotec(登録商標))が補充された10％胎仔ウシ血清(Gibco(登録商標))を含むダルベッコの改変イーグル培地(Gibco(登録商標), Life Technologies)中で24時間培養した。細胞を活性化するために、2μg/mlリポ多糖(LPS)及び10ng/mlインターフェロン-γ(IFNγ)(R&D Systems(登録商標))で作られた溶液(Gordon Sらの文献、Nat Rev Immunol. 2005, 5, 12, 953-64. Dale DCらの文献、Blood. 2008, 15, 112, 4, 935-45)を24時間適用し、その後、回収した。細胞を8M尿素、75mM NaCl、50mM Tris(pH 8.2)中で溶解させた後、氷上で超音波処理し(20×1秒、20％振幅)、4℃で10分間、12,500gで遠心分離した。細胞溶解物のタンパク質濃度をBradfordアッセイによって推定した。凍結融解を防ぐために、試料を分注し、-80℃で保存した。BV2細胞試料は、次の実験で校正曲線を作成するために使用されるので、これを、本明細書において以後、「キャリブレーター」と呼ぶことにする。
【０１９０】
(脳脊髄液試料)−CSF試料は、認知障害が理由で医師の意見を求めている対象に由来するものであった。対象を、90％の感度でありかつADに対して特異的であるというカットオフ:＞350ng/Lの全タウ(T-タウ)、＞80ng/Lのホスホ-タウ(P-タウ)、及び＜530ng/LのAβ42を用いたCSFバイオマーカー濃度に従って、正常又はADと指定した(Hansson Oらの文献、Lancet Neurol. 2006, 5:228-34)。生化学的に正常な対象のうち、これらの基準を満たすものはいなかった。CSF T-タウ、P-タウ、及びAβ42の濃度は、INNOTEST酵素結合免疫吸着アッセイ(Fujirebio, Ghent, Belgium)を用いて、スウェーデン技術コントロール認定局(SWEDAC)(Swedish Board for Accreditation and Conformity Assessment)によって承認されたプロトコルに従って有資格検査技師により決定された。本研究は、ヨーテボリ大学(University of Gothenburg)の地域倫理委員会による承認を受けた。
【０１９１】
(溶液中トリプシン消化及びTandem Mass Tag(登録商標)(TMT(登録商標))標識)−100mM TEABバッファー及び0.1％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)中での可溶化及び変性の後、CSF試料及びBV2細胞株(キャリブレーター)を、1mM TCEPにより、55℃で60分間還元し、7.5mMヨードアセトアミドにより、室温で60分間アルキル化した。トリプシンを、約1:25のトリプシンと全タンパク質の重量比で消化に使用し、37℃で一晩(〜18時間)インキュベートした。消化後、得られたペプチドをTMT(登録商標)10-プレックス試薬の1つで15mMで標識し、室温で60分間インキュベートした。TMT(登録商標)反応をクエンチするために、0.25％ヒドロキシルアミンを各々の試料に添加し、15分間インキュベートした。その後、試料を合わせて、1:10の校正曲線の非活性化BV2細胞、1:10の校正曲線の活性化BV2細胞、及び等量の6つのCSF試料を含む分析試料を作製し、さらに15分間インキュベートした(図6)。各々の試料を、RP18カラム(Waters, Manchester, UK)を用いて脱塩し、余分な試薬及びSDSを強陽イオン交換(SCX)精製により除去した。ペプチドを75％アセトニトリル(ACN)＋400mM NH4Oac(酢酸アンモニウム)中で溶出させ、最後まで乾燥させた。質量分析(MS)による分析のために、試料を2％ACN＋0.1％ギ酸に再懸濁させた。
【０１９２】
(LC-MS/MS)−定量分析は、Orbitrap Fusion Tribrid(登録商標)質量分析計(Thermo Scientific(登録商標))をポジティブモードでEASYnLC1000システム及び50cm EASY-スプレーカラム(Thermo Scientific(登録商標))とともに用いて3連で実施した。カラム温度は40℃で維持し、ペプチドは200nL/分の流速で分離した。
【０１９３】
ペプチドを、280分で3％から30％の溶媒B(0.1％ギ酸を含むアセトニトリル)、その後、10分で80％溶媒Bに上昇、これをさらに10分間保持という300分の勾配でカラムから溶出させた。溶媒Aは、0.1％ギ酸を含む水であった。洗浄及びブランクLC-MS/MSの実行を分析の前に行った。
【０１９４】
2秒のサイクル時間を用いるTop10 CID-HCD MS3 SPS法を利用し、パラメータは、次の通りであった: MS;スプレー電圧−2000V;イオン移動チューブ温度−275℃;検出器−Orbitrap;スキャン範囲(m/z)−400〜1400;分解能−120000; AGC目標−5×105。MS/MS(CID);分離モード−四重極;衝突エネルギー−35％;検出器−イオントラップ; AGC目標−4×103。MS3(HCD);検出器−Orbitrap;衝突エネルギー−55％;スキャン範囲−100〜1000m/z;分解能−30000; AGC目標−6×104。
【０１９５】
(バイオインフォマティクス)−まず、LC-MS/MSデータを、Proteome Discoverer 1.4内のSequestHT及びMascotを用いて、Uniprotヒトタンパク質データベース(ftp://ftp.uniprot.org/pub/databases/uniprot/current_release/knowledgebase/proteomes/)に対して処理した。5％偽発見率(FDR)を適用して、Proteome Discoverer内のデータにフィルターをかけた後、ペプチド及びタンパク質同定の数を決定した。
【０１９６】
(実験A)
対照(すなわち、非活性化)BV2細胞及び活性化(IFN-γ＋LPS)BV2細胞を3つの(3)AD CSF試料及び3つの非AD CSF試料から構成された6つの(6)CSF試料と同時に用いて2つの2点校正曲線を組み込むように、本実験をデザインし; 3つのAD CSF試料を、対照及び活性化BV2細胞の2×2点校正曲線を用いて、3つの(3)非AD対照CSF試料と比較して、3対3対2対2 TMT(登録商標)10-プレックスMS3法で活性化のバイオマーカーを検出した。BV2細胞のタンパク質含有量が試料中の全タンパク質含有量で優位を占めるように実験をデザインした。この2×2点校正曲線試料を1:10の比で添加し、6つのCSF試料をこの範囲に収まるように計算した。MSカラムに注入することができる全タンパク質含有量は2μgであり、したがって、注入1回当たりのCSF試料のタンパク質含有量は、CSF試料毎にチャネル1つ当たり121ngに限られる。
【０１９７】
全てのCSF試料及びBV2細胞試料を、(上で概説したように)可溶化し、還元し、アルキル化した後、一晩、トリプシン消化した。その後、全てのペプチド試料を、TMT10プレックス試薬を用いて、下記のようにTMT(登録商標)標識した:
・126−対照CSF 1
・127e−対照CSF 2
・127−対照CSF 3
・128e−AD CSF 1
・128−AD CSF 2
・129e−AD CSF 3
・129−非活性化BV2細胞株
・130e−非活性化培養BV2細胞株
・130−IFNγ＋LPS活性化BV2細胞株
・131−IFNγ＋LPS活性化BV2細胞株
【０１９８】
休止細胞(チャネル129及び130e)の1:10校正曲線、活性化細胞(チャネル130及び131)の1:10校正曲線、及び同等レベルの6つのCSF試料を生じるように、TMT10プレックス標識試料を混合した(図6)。この場合、細胞消化物の全タンパク質含有量は、CSF試料の全タンパク質含有量の約2倍となる。混合した分析試料を脱塩し、清澄化し(余分なTMT(登録商標)標識を除去し)、2つに分けた。試料の半分を凍結させ、残りを高pH逆相分画により8つの別々の画分に分画した。これらを、3時間の勾配を用いて、新世代型Orbitrap Fusionで分析した。
【０１９９】
全てのMS注入からの生データファイルを、Proteome Discoverer 1.4のSequestHT及びMascotを用いて、Uniprot ヒトタンパク質データベースに対して検索した。
【０２００】
6つのCSFチャネルからのレポーターイオンシグナル強度を合計スケール標準化という数学的手法によって標準化して、実験バイアスを取り除いた。このプロセスは、所与の試料で測定された全ての分析物の強度値を合計し、その後、全ての合計値にわたる中央値を計算することを含む。中央値を各々の合計値で割って、相関係数を出し、これをもとの強度値に掛けて、標準化された合計スケール測定値を生じさせ(Robinson MDらの文献、Bioinformatics 2010, 26:139-40; De Livera AMらの文献、Anal. Chem. 2012, 84, 24, 10768-76)、CSFデータセットにわたるばらつきを主成分分析(PCA)プロットを用いて調べた。CSF試料がペプチド及びタンパク質レベルで疾患状態別に分かれ、第一の主成分が全変動の79.9％を占めて、群分離をもたらすことが分かった(データは示さない)。
【０２０１】
MSデータの第一の分析において、キャリブレーターチャネル(129、130e、130、及び131)におけるシグナル強度の比は、非活性化細胞(129及び130e)について1:10及び活性化細胞(130及び131)で1:10と予想された。2つの非活性化細胞チャネルにわたる観測強度と2つの活性化細胞チャネル(キャリブレーター)にわたる観測強度を全ての単一ペプチドについて計算した。1:10±15％の比を有するペプチドを許容し得るキャリブレーターとみなした。これらのパラメータを用いて、22個のペプチドしか許容し得るキャリブレーターを含まないことが分かった。
【０２０２】
どのペプチドが疾患による調節を示すかということを特定するための第二のアプローチにおいて、3つの対照CSF試料の平均シグナルと比較した3つのAD CSF試料の平均シグナル強度のlog2比を決定した。この比のp値を、2つのCSF群にわたる2試料t検定の後、全ての単一ペプチド及びタンパク質について確定した(シグナルが6つ全てのCSF TMT(登録商標)チャネルに存在することを条件とした)。どのペプチドがBV2細胞活性化により調節されるかということを示すために、非活性化細胞及び活性化細胞における2つのキャリブレーターチャネルのlog2比も計算した。活性化細胞及び対照細胞における低スパイクキャリブレーターについて、また、高スパイクキャリブレーターについても、この比を計算した。
【０２０３】
合計564個のペプチドが対照BV2細胞と比べて活性化細胞で少なくとも60％上方調節されることが分かった(高キャリブレーター比と低キャリブレーター比の両方の60％増加に対してフィルターをかけた)。これらは、9つのKEGG経路に位置することが示され、最も顕著なものは、補体及び凝固カスケード経路であり、次いで、解糖/グリコーゲン合成、プリオン病、アミノ及びヌクレオチド糖代謝、抗原プロセシング及び提示、細胞外マトリックス-受容体相互作用、焦点接着、アクチン細胞骨格の調節、及びアラニン/アスパラギン酸/グルタミン酸代謝経路であった。
【０２０４】
この第一のデータセット処理は、欠けているTMR(登録商標)レポーターイオンチャネルの有無にかかわらず、検出された全てのペプチドを含んでいた。これにより、AD患者のCSF中に存在し、対照中に存在しないペプチド、又は同様に、活性化BV2細胞中に存在し、非活性化BV2細胞中に存在しないペプチドの同定が可能になる。
【０２０５】
活性化BV2細胞で上方調節された564個のペプチドのうち、75個は対照CSFと比較してAD CSFで少なくとも60％上昇していることも分かった。これら75個のペプチドは、表1に掲載されている58種のタンパク質に認められる。ペルオキシレドキシンのようなAD患者の脳で上昇することがよく知られているタンパク質(Kim SHらの文献、J Neural Transm Suppl. 2001;(61):223-35)(図3A)及び酸化的ストレスのバイオマーカーと考えられているタンパク質(Poynton RAらの文献、Biochim Biophys Acta. 2014, 1840:906-12)は、LPSによる活性化によってBV2細胞で上昇することがよく知られているタンパク質、例えば、MARCKS関連タンパク質(図3B)(Sunohara JRらの文献、J Neurochem. 2001 78:664-72)及びアミロイド-β(Murphy Aらの文献、Neurosci Lett. 2003, 347:9-12); APPの非アミロイド原性プロセシングに役立つ、細胞外マトリックス複合体の一部である、モエシン(図3C); AD患者のCSFで、特に、ApoE4アレルを保有する個体のCSFで増加していることが知られているアクチン(図3D)(Merched Aらの文献、FEBS Lett. 1998, 425:225-8)とともに存在する。
【０２０６】
調節されるペプチドのリストから、29種のタンパク質由来の35個のペプチドは、10個全てのチャネルでシグナルを有し、4個のペプチドは、表6に示すように、有意な調節(p≦0.05)を有していた。
表6
【表６】
2018510343.tif 000071
【０２０７】
これらのペプチドは、BV2細胞活性化により、少なくとも60％調節されることが分かり、AD患者のCSFで少なくとも60％有意に上方調節されている(図4A〜D)。ペプチド
【化１】
2018510343.tif 000072
は、TMSB4XP4タンパク質と相同タンパク質のチモシンβ-4の両方に見られる。これら2つのタンパク質のタンパク質配列は、チモシンβ-4に存在しないTMSB4XP4の最初の19残基を除いて同一である。
【０２０８】
ホスホグルコムターゼ1は、CSF試料をBV2細胞試料キャリブレーターの非存在下で測定したときに検出されなかったが、チモシンβ-4はどちらの状況でも検出された。ホスホグルコムターゼ1について検出された全8つの(8)ペプチド(表7)のうち、5つは調節されたが(≧60％;表7の太字)、有意ではなく、1つしか≦0.05のP値で有意に調節されないことが分かった
【化２】
2018510343.tif 000073
。
【０２０９】
3つの(3)ペプチドがチモシンβ-4について検出されたが、ペプチド
【化３】
2018510343.tif 000074
しか有意に調節されず(表7)、もう1つも60％以上調節されたが、有意ではなかった(同じく表7の太字)。
表7
【表７】
2018510343.tif 000075
【０２１０】
非AD試料と比較してAD試料由来のCSFで調節されるペプチドを同定するためにデータにフィルターをかけたとき、1924個のペプチドが、非AD CSFと比較してAD CSFで少なくとも60％上方調節されることが分かった。53種のタンパク質に認められる合計63個のペプチドは、表2に示すように、有意に上方調節される(p≦0.05)ことが分かった。表2のリストは、ApoE、ゲルゾリン、セクレトグラニン、アルブミン、及び補体タンパク質のような、AD CSFで調節されることが知られているいくつかのタンパク質を示している。これらの例は、本明細書で使用されるアプローチによって、ミクログリア活性化後のADの初期変化の新規CSFバイオマーカーを表すペプチドの他に、CSF中に共通に見られる周知のADバイオマーカーからのペプチドの同定及び定量が可能になることを示している。
【０２１１】
非ADと比較してAD CSFで最も上方調節される上位10個のペプチド及びその対応するタンパク質を表8に示す。
表8
【表８】
2018510343.tif 000076
【０２１２】
下方調節も観察したが、ペプチド数ははるかに少なかった。8つの(8)ペプチドが活性化BV2細胞及びAD CSFで少なくとも60％下方調節され、3対3のCSFチャネルに基づくと、これらのうちの1つの血清アミロイドA4タンパク質しか有意なp値(p＝0.014)を有しなかった。
表9
【表９】
2018510343.tif 000077
【０２１３】
(実験B)
BV2細胞株キャリブレーターからのMSデータ獲得を強化するために、キャリブレータータンパク質がTMT(登録商標)10-プレックス試料の全タンパク質含有量で優位を占めることを保証するために、組み合わされた全てのCSF試料に1:4:6:10の比で添加される4点校正曲線として、実験Bをデザインした。これらは、分析用のCSF試料からの好適なタンパク質投入量を決定することを可能にする任意値である。6つの個別のCSF試料を、4点校正曲線の範囲に収まる、2:2:2:2:2:2の比で組み合わせた。
【０２１４】
カラムへの最大投入量は2μgであるので、チャネル1つ当たりの真のタンパク質投入量は、最大2μgを必要とされる任意値の総数(x)で割ることにより決定することができ、この総数は、この場合、33(4つのキャリブレーターチャネル＋6つのCSFチャネル)である。33xが2μgと等しいならば、1xは0.06μgとなり、その後、これを用いて、キャリブレーター分析試料に寄与する10個のチャネルの各々由来のタンパク質の総量を決定することができる。0.06μg(1x)、0.24μg(4x)、0.36μg(6x)、及び0.6μg(10x)から構成される4点キャリブレーターとともに、ちょうど0.12μgの各々のCSF試料が必要とされる(2x)。これにより、全てのCSF試料由来の合計0.72μgのタンパク質及びBV2細胞株キャリブレーター由来の1.26μgのタンパク質が得られる−したがって、キャリブレータータンパク質は、全CSFタンパク質投入量よりも1.75倍多い。
【０２１５】
キャリブレーター試料を、300分の勾配でMS3 SPS法を用いて、Oribtrap Fusion Tribridで3連で分析した。3つ全てのMS注入からの生データファイルを、Proteome Discoverer 1.4のSequestHT及びMascotを用いて、Uniprotヒトタンパク質データベースに対して検索した。3連注入の結果を合わせ、分析用の1つの大きいデータセットが得られた。5％偽発見率(FDR)を適用して、Proteome Discovererのデータにフィルターをかけた後、キャリブレーターのみに由来するもの、CSF試料のみに由来するもの、及びミクログリア細胞株キャリブレーターとCSF試料の両方に共通のペプチドのペプチド及びタンパク質IDの数を決定した。この実験のデザインは、MS獲得がより多いミクログリア細胞株ペプチドによって推進され、このことが記録されるペプチドIDに顕著に表れることを保証した。CSF試料に特異的なペプチドは検出されず、キャリブレーター法が非常に多く見られるCSFタンパク質にまつわる問題を回避するという前提が確認された。代わりに、同定されたペプチドは、BV2ミクログリア細胞に特異的であるか(2,317)、又はCSFとBV2ミクログリア細胞に共通であるか(11,150)のいずれかであった。これらの共通のペプチドは、CSF中に存在するミクログリア細胞活性化の任意のバイオマーカーを単離するさらなる分析の焦点となった。10個全てのTMT(登録商標)レポーターイオンのシグナルを有するペプチドは全て、Rで開発された1組の自作のバイオインフォマティクススクリプトによる処理に進められた。
【０２１６】
6つのCSFチャネルからのレポーターイオンシグナル強度を合計スケール標準化によって標準化した。標準化の後、CSFデータセットにわたるばらつきを主成分分析(PCA)を用いて調べた。AD CSFと対照CSFの群分離がペプチド及びタンパク質レベルで見られ、第一主成分を形成し、このデータセットに見られる全変動の44.6％を占めた。第二主成分は、データセット中のばらつきの19.6％を説明し、これは、群内の生物学的変動に対応した。
【０２１７】
データにさらにフィルターをかけるために、本発明者らは、細胞株キャリブレーターデータをキャリブレーターチャネルのうちの1つ(先の実験に見られるチャネル129)に対して標準化した。これをキャリブレーター専用の4つのチャネルについて実施し、これにより、本発明者らは、予想されるTMT(登録商標)キャリブレーターシグナルのシグナチャー又はパターンについてフィルターをかけることが可能になった。標準化の後、チャネル129、130e、130、及び131(キャリブレーターチャネル)におけるシグナル強度の比は、1:4:6:10と予想された。予想されたキャリブレーターシグナル強度と観測されたキャリブレーター強度の対応を測定するために、4つ全てのチャネルにわたるR2値を1つ1つのペプチドについて計算した。4つのTMT(登録商標)キャリブレーターチャネルのPSMレベル強度は、1:4:6:10という予想された線形キャリブレーターシグナル強度比からのわずかな逸脱を示している。39.3％のペプチドが≧0.95のキャリブレーターR2を有しており、さらなるデータ分析に採用された。
【０２１８】
予想された線形キャリブレーターシグナル強度の存在についてフィルターがかけられた標準化されたデータセットに、2つのCSF群にわたる2試料t-検定後の有意性に基づいて、1つ1つのペプチド及びタンパク質についてさらにフィルターをかけた。p値≦0.05のペプチドを有意とみなした。平均AD CSFシグナル強度(チャネル128e、128、及び129e)と対照CSFシグナル強度(チャネル126、127e、及び127)のlog2比も129 TMT(登録商標)キャリブレーターチャネルに対して標準化した。これにより、活性化ミクログリア細胞株とCSF試料に共通のペプチド配列のうちのどれが対照とAD CSFの間で示差調節されるかということを特定する手段が提供された。本発明者らは、対照と比較してAD CSFで少なくとも60％有意に上方調節される77種のタンパク質由来の84個の独特のペプチド配列(log2比≦-0.7)、及び少なくとも60％有意に下方調節される26種のタンパク質由来の34個の独特のペプチド(log2比≧0.7)を同定した。
【０２１９】
AD患者のCSF中の調節されるペプチドのリストを分析すると、従来のプロテオミクス法に優るTMT(登録商標)キャリブレーターの利益を理解することができる。述べられているように、75μm直径の分析LCカラムへの注入1回当たりの最大タンパク質投入量は2ugである。TMT(登録商標)キャリブレーターデザインでは、この2μgを4点キャリブレーターと6つのCSF試料に不均等に分ける(キャリブレーターについては1:4:6:10の比、AD CSFについては2:2:2の比、及び非AD CSFについては2:2:2の比)。キャリブレーターを添加しなくても、6つのCSF試料を、多重化実験で、注入1回当たり0.33μgを各々の試料から合わせてTMTで標識することができる。これでは、MS獲得に影響を及ぼす大量に存在するCSFタンパク質と関連する問題が克服されず、より少量しか存在しないバイオマーカーの検出を妨げるであろう。細胞株キャリブレーターを含めた後に見られる異なる結果を強調するために、TMT(登録商標)キャリブレーター研究で使用された同じ6つのCSF試料を均等に合わせ、2μgの全投入量を同じ方法を用いて3連で分析した。同じバイオインフォマティクス処理の後、結果にフィルターをかけ、分析して、対照CSF試料と比較してAD CSFで有意に調節されるペプチドを同定した。73種のタンパク質がCSFで少なくとも60％有意に調節されたが(上方又は下方調節)、これらのうち16種しか、TMT(登録商標)キャリブレーター研究での有意に調節されるペプチドと重複しなかった。CSF試料で同定されたタンパク質の大多数は、そのUniprotアクセッションエントリーの下でそのように注釈が付けられている分泌タンパク質であることが知られている(例えば、プラスミノーゲン、ミメカン、及びヘモペキシン)。核内で共通に見られるタンパク質などの細胞内バイオマーカーは、特に興味深い。キャリブレーターを援用して、核内に局在する合計29個のバイオマーカーを有意に調節されるリストから同定することが可能となった。キャリブレーターの非存在下では、5種のタンパク質しか発見されなかった。TMT(登録商標)キャリブレーターなしで発見された有意に調節されるタンパク質の大部分は、血清アルブミン、補体タンパク質(C3、C5、及びC7)、フィブリノーゲンγ鎖、並びにIgγ鎖を含む、CSF研究で一般に観察されるタンパク質であった(Boche Dらの文献、Neuropathol Appl Neurobiol. 2013, 39, 1, 3-18)。これらのタンパク質は、ADに特異的な細胞性変化ではなく、特異性の低い疾患関連変化を表すものである可能性が高い。これらは、CSF中に見られる最も多く存在するタンパク質の一部であり、大多数のCSFプロテオーム分析研究で報告されている(Huhmer AFらの文献、Disease Markers. 2006, 22, 1-2, 3-26)。それと比較して、BV2細胞株を用いて実験を進めるときに得られる大多数のペプチドは細胞性のものであり、疾患に特異的な細胞性応答を表す可能性がある。これらには、ダイナクチン(図5A)、コフィリン(図5A)、アルコールデヒドロゲナーゼ、フィラミン-A、モエシンタンパク質、及びRas関連タンパク質由来のペプチドが含まれる。これらは、ADで調節される細胞性タンパク質であり、これらのタンパク質は、CSF試料がBV2細胞試料(キャリブレーター試料)の非存在下で分析されていたとすれば検出されなかったであろう。ダイナクチンサブユニット1(図5A)に対応するペプチド
【化４】
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は、非AD対照と比較したとき、AD患者のCSFで最も上方調節されるペプチドであり、一方、コフィリン-1(図5B)に対応するペプチド
【化５】
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は、最も下方調節されるペプチドであった。
【０２２０】
結論として、バイオマーカーは、病理学的過程及び生物学的事象の指標である。そのレベルは、疾患の結果として変化し、また薬理学的介入に応答しても変化する。課題は、高いタンパク質ダイナミックレンジ及びアルブミンなどの超大量のタンパク質を含む血液又はCSFなどの生物流体中でこれらの分子をどのようにして発見するかということである。
【０２２１】
本発明者らは、AD患者のCSFにおけるミクログリア活性化のバイオマーカーを探索するために、新規のTandem Mass Tag(登録商標)(TMT(登録商標))質量分析(MS)法であるTMT(登録商標)キャリブレーター分析を適用した。BV2細胞は、raf/myc不死化マウス新生仔ミクログリアに由来するミクログリア細胞株であり(Blasi Eらの文献、J neuroimmunology. 1990, 27, 2-3, 229-37)、ミクログリア活性化を研究するために広く使用されている。研究により、使用される動物に関して費用がかかり、かつ準備に時間がかかる初代ミクログリア培養物の代用物としてのその有用性が示されている(Henn Aらの文献、Alternatives to animal experimentation. 2009, 26, 2, 83-94; Stansley Bらの文献、J Neuroinflammation. 2012, 31, 9, 115)。
【０２２２】
本研究におけるTMT(登録商標)キャリブレーター分析の適用の成功により、活性化ミクログリアに由来し、CSF中に循環している可能性が高く、かつ非AD対象と比較してAD患者で示差発現されている新規の潜在的バイオマーカー候補のリストが提供された。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年12月14日(2017.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2018510343.tif 000089
2018510343.tif 000090
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