(57)【要約】  一体型サンプル精製システムはハウジング、サンプル容器ラック、フィルターホルダー、および円筒形磁石を含む。サンプル容器ラックおよびフィルターデバイスホルダーはハウジング内に排置される。サンプル容器ラックは１つ以上のサンプル容器を保持するよう設計され、フィルターデバイスホルダーは１つ以上のフィルターデバイスを保持するよう設計される。円筒形磁石は、サンプル容器ラックの近傍且つ外部にあり、ハウジング内に排置された電動モーターによって磁石の中心、長軸を中心に回転して細胞を溶解する。溶解した細胞内の目的の分子は、目的の分子と特異的に結合するフィルターを用いて精製する。システムは自動化、および核酸およびタンパク質などの目的の分子の迅速精製および分析に容易に適合する。【選択図】図１
2018537676.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル精製システムであって：
ハウジング；
前記ハウジング内に排置されたサンプル容器ラックであって、前記サンプル容器ラックが１つ以上のサンプル容器を保持するよう設計された前記サンプル容器ラック；
前記ハウジング内に排置されたフィルターデバイスホルダーであって、前記フィルターホルダーが目的の分子と結合するためのフィルターを含む１つ以上のフィルターデバイスを保持するよう設計された前記フィルターデバイスホルダー；および
前記サンプル容器ラックの近傍且つ外部にある円筒形磁石であって、前記ハウジング内に排置された電動モーターによって前記磁石が前記磁石の中心、長軸を中心に回転する前記円筒形磁石を含む前記サンプル精製システム。
【請求項２】
請求項１に記載の前記サンプル精製システムであって、前記サンプルラック内に排置されたサンプル容器をさらに含み、前記サンプル容器がサンプル懸濁液、マグネティックスターラー、および複数のビーズを含む、前記サンプル精製システム。
【請求項３】
請求項１に記載の前記サンプル精製システムであって、前記ハウジング内に排置された１つ以上の試薬ラックをさらに含み、前記試薬ラックが各ラック内で個別に、密封された容器に保存された複数の試薬を含む、前記サンプル精製システム。
【請求項４】
請求項１に記載の前記サンプル精製システムであって、自動化ピペッティングシステムをさらに含む前記サンプル精製システム。
【請求項５】
請求項４に記載の前記サンプル精製システムであって、所定の様式で前記１つ以上のサンプル容器に試薬を自動的に分注し且つサンプル材料および試薬を廃棄するよう設計された１つ以上のロボティックアームをさらに含む前記サンプル精製システム。
【請求項６】
請求項５に記載の前記サンプル精製システムであって、前記システムが複数のサンプル容器、前記複数のフィルターチップおよび１つ以上の試薬ラックをさらに含む前記サンプル精製システム。
【請求項７】
請求項１に記載の前記サンプル精製システムであって、前記円筒形磁石が前記磁石の長軸に沿って且つこれを中心として対称に排置された磁極を有する前記サンプル精製システム。
【請求項８】
請求項１に記載の前記サンプル精製システムであって、前記円筒形磁石が前記磁石の長軸の対側端に排置された対磁極を有する前記サンプル精製システム。
【請求項９】
請求項２に記載の前記サンプル精製システムであって、前記ビーズが１０〜１０００μｍの範囲内の直径を有するシリカビーズである前記サンプル精製システム。
【請求項１０】
請求項２に記載の前記サンプル精製システムであって、前記マグネティックスターラーがポリマーでコーティングされた合金コアを含む前記サンプル精製システム。
【請求項１１】
請求項１０に記載の前記サンプル精製システムであって、前記合金コアがネオジム鉄ホウ素またはサマリウムコバルトを含み且つ前記ポリマーがＰＴＥＥまたはパリレンである前記サンプル精製システム。
【請求項１２】
請求項１に記載の前記サンプル精製システムを用いてサンプルから目的の分子を精製するための方法であって：
液状サンプル懸濁液、マグネティックスターラーおよび細胞溶解ビーズを収容するサンプルチューブをサンプルラックに載置すること；
前記マグネティックスターラーおよび細胞溶解ビーズの存在下で前記サンプル懸濁液中の細胞を溶解するのに十分なスピードで前記円筒形磁石を回転させることにより前記サンプル懸濁液をホモジナイズすること；
フィルターデバイスが前記フィルターデバイスホルダーに装着される、前記の目的の分子がフィルターマトリクスと結合する条件下で、前記フィルターマトリクスを含む前記フィルターデバイスを経て前記のホモジナイズされたサンプル懸濁液を流すこと；
前記フィルターマトリクスを洗浄すること；および
結合した目的の分子を前記フィルターマトリクスから溶離することを含む前記方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の前記方法であって、前記サンプルチューブがマグネティックスターラー、細胞溶解ビーズ、細胞溶解を促進する試薬および前記目的の分子の完全性を保持する試薬からなる群から選択される１つ以上の品目と共に事前包装される前記方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の前記方法であって、前記の目的の分子が核酸である前記方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の前記方法であって、前記液状サンプル懸濁液が喀痰を含む前記方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の前記方法であって、前記の溶離した核酸をＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに特異的なプライマーで増幅し且つ前記核酸がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＤＮＡを含むか判定するステップをさらに含む前記方法。
【請求項１７】
サンプルから核酸を精製するための方法であって：
サンプルチューブが液状サンプル懸濁液、マグネティックスターラーおよび細胞溶解ビーズを収容し、サンプルラックが円筒形磁石の近傍に位置する、前記サンプルチューブを前記サンプルラックに載置すること；
前記サンプル懸濁液中の細胞を破壊して細胞溶解液を生成するのに十分な程度に各サンプルチューブ内の前記マグネティックスターラーが回転して前記細胞溶解ビーズを攪拌するよう前記円筒形磁石をその長軸を中心に回転させること；
前記細胞溶解液に由来する核酸がフィルターピペットチップのフィルターマトリクスと結合するよう前記細胞溶解液の少なくとも一部を前記ピペットチップの第１の開口部を経て流すこと：
前記フィルターチップの前記第１の開口部から流す前記ステップにおいて前記フィルターマトリクスを通過した前記細胞溶解液の未結合の部分を排出すること；
前記フィルターチップの前記第１の開口部を経て溶離バッファーを取り入れ、前記フィルターマトリクスを経て前記溶離バッファーを流し、且つ前記フィルターマトリクスを経て流れた前記溶離バッファーを前記フィルターチップから前記第１の開口部を経て排出することによって前記フィルターマトリクスに結合した前記核酸を溶離することを含む前記方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の前記方法であって、前記サンプルが喀痰を含む前記方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の前記方法であって、前記の溶離した核酸をＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに特異的なプライマーで増幅し且つ前記核酸がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＤＮＡを含むか判定するステップをさらに含む前記方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の前記方法であって、前記円筒形磁石が前記磁石の長軸に沿って且つこれを中心として対称に排置された磁極を有する前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に、特に困難なサンプルマトリクスおよび／または破壊することの難しい生命体に由来する、核酸またはタンパク質などの目的の分子を分離および／または精製するための一体型サンプル処理システム、さらには固形モノリスフィルターと組み合わせた磁気誘導渦動攪拌を用いる、サンプルから核酸を分離および／または精製するための自動化に適した方法に関係する。
【背景技術】
【０００２】
分子的試験は、そのスピード、感度および特異性によって、一部の診断試験に対する至適基準として登場しつつある。自家調製検査法（ＬＤＴ）は、「体外診断（ＩＶＤ）市場において現在最も速く成長している部門の１つである。サンプル調製は試験の妥当性にとって決定的であるが、臨床分子生物学のワークフローおよび診断試験に対してしばしば支障をもたらす。多くの分子検出様式があるものの、自動化サンプル調製ワークフロー戦略は数えるほどしかない。これらのサンプル調製戦略および化学を中心として構築された既存の器具の費用は１７，０００ドルから１５０，０００ドルの範囲内であるが、それでもなお、生の喀痰のような困難なサンプルマトリクス、および／またはグラム陽性細菌および抗酸菌（すなわちＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などの破壊することが困難な生命体を処理するための一体化法を提供しない。
【０００３】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を含む抗酸菌は、典型的には感染患者の喀痰から分離される。その脂質に富んだ細胞膜は、フェノールと併用しない限り多様な塩基性色素に対して比較的不透過性であるために、「抗酸菌」と呼ばれる。喀痰は濃厚、粘稠で処理が困難である。分析する喀痰検体の大半は、様々な量の有機体デブリおよび多様な汚染性、正常または一過性細菌叢を含む。典型的には、化学的な除染／処理を用いて粘度を低下させ、汚染菌を殺菌する一方で、マイコバクテリアの回収を可能とする。しかし、ミコール酸および高含有量の脂質を含むその特異な細胞外被により、細胞は疎水性で互いに凝集する傾向にある。これにより、グラム染色などの通常の色素に対して不透過性となる。一般に、カルボールフクシン、およびオーラミンまたはオーラミン−ローダミンなどの蛍光色素の２種類の抗酸菌染料を用いる。一旦染色されると、細胞は酸性化有機溶媒を用いた脱色に抵抗し、それゆえ「抗酸菌」と呼ばれる。しかし、酸とアルコールで連続または同時に処理した後も、フクシンまたはオーラミン染色を保持する。
【０００４】
抗酸菌スメア顕微鏡検査は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種に対する感度が乏しい。顕微鏡検査の感度は、疾患の有病率および重症度、検体の種類、検体採取の品質、検体中に存在するＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞数、処理方法（直接法または濃縮法）、遠心分離法、染色技術、および検査の品質などの数多くの因子によって影響される。液浸顕微鏡検査で少なくとも１００視野（低所得国）および好ましくは３００視野（先進国）（または同等の蛍光視野）を検査した後で、始めて陰性の結果を報告するよう推奨される。したがって、顕微鏡検査を正しく実施する場合、時間と手間がかかることがある。
【０００５】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株は成長が遅い桿菌であり、その通常の世代時間は１２から１８時間である。通常、コロニーは１週間から８週間のインキュベーション時間後に始めて目視できるようになる。低濃度のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を含むサンプルは、さらに数回の継代培養を必要とする。専用の培地でＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを培養すると、生体サンプル中に含有される個別のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の同定が可能となる。しかし、特にまだ感染過程の開始時にある患者にとっては、これは時間がかかる。  
【０００６】
核酸ハイブリダイゼーション試験は、生体サンプル中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を検出するために開発されている。最初の試験は、直接プローブハイブリダイゼーションを利用した。しかし、患者から採取したサンプルに含まれるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞の濃度は、通常、陽性ハイブリダイゼーションシグナルを生成するには低すぎる。したがって、ＰＣＲ増幅を利用する試験が開発されている。たとえば、「Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ（登録商標）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ検出キット」として市販されているＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ（登録商標）キット、またはＭＴＤ検査キット（ジェン・プローブ社、米国カリフォルニア州サンディエゴ９２１２１）はＭｔｂＣ特異性ｒＲＮＡの増幅（転写媒介増幅）の後、ジェン・プローブＨＰＡ法（ハイブリダイゼーション保護分析）に準拠したアンプリコン検出を利用する。
【０００７】
上記の限界の観点より、臨床検査室およびユーザーのニーズの双方を同様に満たすために、サンプルホモジナイゼーション、破壊の困難な微生物の溶解、およびポリヌクレオチドの精製を一体化した簡便且つ効率的なシステムに対するニーズが存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１つの態様においては、本願はハウジング、サンプル容器ラック、フィルターチップラック、および円筒形磁石を含む一体型サンプル精製システムを提供する。サンプル容器ラックおよびフィルターチップラックはハウジング内に排置される。サンプル容器ラックは１つ以上のサンプル容器を保持するよう設計され、フィルターチップラックは１つ以上のフィルターチップを保持するよう設計される。円筒形磁石は、サンプル容器ラックの近傍且つ外部にあり、ハウジング内に排置された電動モーターによって駆動されて磁石の中心、長軸を中心に回転する。
【０００９】
一部の実施形態においては、ハウジングは１つ以上の試薬を収容する１つ以上の試薬ラックを含む。
【００１０】
一部の実施形態においては、システムは複数のサンプル容器、複数のフィルターチップおよび１つ以上の試薬ラックを含む。
【００１１】
一定の実施形態においては、円筒形磁石は磁石の長軸に沿って且つその周りに対称に排置された磁極を有する。他の実施形態においては、円筒形磁石は磁石の長軸の対側端に排置された対磁極を有する。さらなる他の実施形態においては、円筒形磁石は電磁石である。
【００１２】
１つの実施形態においては、１つ以上のサンプル容器は、１つ以上の試薬溶液の導入後に密封され且つ閉鎖系を維持するよう設計される。
【００１３】
１つの実施形態においては、システムは、それにより試薬ラックがラック内で分離され密封されたウェルに保存された試薬を含む、ハウジング内に排置された１つの試薬ラックをさらに含む。
【００１４】
サンプル容器は、使用時に、サンプル容器が細胞材料を収容し且つ円筒形磁石がその長軸を中心に回転するとき、マグネティックスターラーが回転してビーズを攪拌し、細胞材料の無秩序な混合を受け、サンプルのホモジナイゼーションおよび細胞破壊をもたらすよう設計されたマグネティックスターラーおよび複数のビーズを含む。
【００１５】
１つの実施形態においては、ビーズはガラス、プラスチック、セラミック材料、鉱質、金属またはその組み合わせを含む。具体的な実施形態においては、ビーズはシリカビーズである。
【００１６】
１つの実施形態においては、ビーズは１０〜１０００μｍの範囲内の直径を有する。
【００１７】
１つの実施形態においては、マグネティックスターラーは金属または合金を含む。具体的な実施形態においては、マグネティックスターラーはステンレススチールを含む。他の実施形態においては、マグネティックスターラーはポリマーでコーティングされた合金コアを含む。具体的な実施形態においては、マグネティックスターラーは、それにより合金コアがネオジム鉄ホウ素またはサマリウムコバルトを含み、且つ／またはポリマーがＰＴＦＥまたはパリレンである、ポリマーでコーティングされた合金コアを含む。
【００１８】
他の態様においては、自動化核酸精製システムは、自動化ピペッティングシステムと、所定の様式で１つ以上のサンプル容器に試薬を自動的に分注し、且つサンプル材料および試薬を廃棄するよう設計された１つ以上のロボティックアームとを組み合わせて、上記の機能を含む。自動化精製システムは、使用時に、それぞれが１つのスターラーおよび複数のビーズを含む複数のサンプル容器、複数のフィルターチップおよび１つ以上の試薬ラックを含む。
【００１９】
他の態様においては、サンプルから標的分子を生成するための方法は（ａ）本開示によるサンプル精製システムを提供するステップ；（ｂ）サンプルをマグネティックスターラーおよび複数のビーズと共にサンプル容器に入れるステップ；（ｃ）サンプル容器をサンプル容器ラックに載置するステップ、（ｄ）円筒形磁石をその長軸を中心として回転させ、その結果サンプルをホモジナイズし且つサンプル中の細胞を破壊し、細胞溶解液を形成するのに十分な程度にマグネティックスターラーを回転させてビーズを攪拌するステップ；（ｅ）フィルターチップの第１の開口部を経て細胞溶解液の少なくとも一部を流し、その結果細胞溶解液中の標的分子をフィルターチップ内のフィルターと結合させるステップ；（ｆ）細胞溶解液の未結合部分をフィルターチップから第１の開口部を経て排出し、このとき未結合部分がフィルターチップから出る前に少なくとも２回フィルターを通過するステップ；および（ｇ）フィルターチップの第１の開口部を経て溶離バッファーを流入させ、且つ溶離バッファーをフィルターチップから第１の開口部を経て排出することによりフィルターに結合した標的分子をフィルターチップの第１の開口部から溶離し、溶離バッファーはフィルターチップから出る前に少なくとも２回フィルターを通過するステップを含む。
【００２０】
一部の実施形態においては、標的分子はポリヌクレオチド分子である。１つの実施形態においては、サンプルは喀痰を含む。具体的な実施形態においては、喀痰サンプルはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＭＴＢ）を含有することが疑われ、且つ方法は、溶離されたポリヌクレオチド分子をＭＴＢ特異的プライマーで増幅するステップ、およびポリヌクレオチド分子がＭＴＢ  ＤＮＡを含むか判定するステップをさらに含む。
【００２１】
他の実施形態においては、標的分子を精製するための方法は、自動化ピペッティングシステムと、所定の様式で１つ以上のサンプル容器に試薬を自動的に分注し且つサンプル材料および試薬を廃棄するよう設計された１つ以上のロボティックアームをさらに含む、自動化精製システムの使用を含む。この場合、１つ以上の試薬ラックと組み合わせて、同等の数のフィルターチップを用いる複数のサンプル容器のそれぞれにおいて、上記のステップが反復される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
発明を実施するための形態は、以下の図面を参照する：
【図１】細胞を溶解してそこから核酸を精製するための一体化法の実施形態を示すフローチャートである。
【図２】１つの実施形態による典型的なシングルチャネル核酸精製システムを示す。
【図３】サンプル溶解チャンバーに対する典型的な磁石の配置位置を示す。
【図４】代表的なピペットフィルターチップを示す。
【図５】他の実施形態による自動化８チャネル核酸精製システムを示す模式図である。
【図６】他の実施形態によるディスポーザブル輸送器具を示す。
【図７】喀痰由来の核酸のＭａｇＶｏｒ／フィルターチップ精製のための典型的な一連のステップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の好ましい実施形態を記述する際は、明確さを目的として専用の用語を使用する。しかし、本発明はそうして選択された特定の用語によって制限されることを意図していない。具体的な要素は、同様の目的を達成するために同様の様式で作動する全ての技術的同等物をそれぞれに含むことが理解すべきである。
【００２４】
図１は、細胞を溶解し、そこから核酸またはタンパク質などの目的の分子を精製するための一体化法における、典型的なステップを示すフローチャートである。方法１０は、液状サンプル懸濁液、マグネティックスターラーおよび細胞溶解ビーズを収容するサンプルチューブを、磁石の近傍にあるサンプルラックに載置すること（ステップ１１）；マグネティックスターラーおよび細胞溶解ビーズの存在下で、サンプル懸濁液中の細胞を溶解するのに十分なスピードで磁石を回転させることにより、サンプル懸濁液をホモジナイズすること（ステップ１３）；目的の分子がフィルターマトリクスと結合する条件下で、ホモジナイズしたサンプル懸濁液をフィルターマトリクスを経て流すこと（ステップ１５）；フィルターマトリクスを洗浄すること（ステップ１７）および結合した目的の分子をフィルターマトリクスより溶離すること（ステップ１９）を含む。一部の実施形態においては、サンプルチューブはマグネティックスターラー、および／または細胞溶解ビーズ、および／または細胞溶解を促進および／または標的分子の完全性を保持する試薬と共に事前包装される。
【００２５】
液状サンプル懸濁液は、液状溶解媒体に懸濁されたサンプルである。典型的なサンプルは生体サンプル、環境サンプルまたは非天然サンプルを含みうる。典型的な生体サンプルは、組織サンプル、生体液サンプル、細胞サンプル、菌類サンプル、原生動物サンプル、細菌サンプル、およびウイルスサンプルを含みうる。組織サンプルは、任意の動物または植物から分離された組織を含む。生体サンプルは血液、臍帯血、血漿、バフィーコート、尿、唾液、喀痰、ＮＡＬＣ処理喀痰、鼻咽頭スワブ（ＮＰＳ）、鼻咽頭吸引液（ＮＰＡ）、胃吸引液、濃縮喀痰採取物、脳脊髄液、バッカル、洗浄液（気管支など）、胸水、糞便、およびロイコフォレーシスサンプルを含むが、これに限定されない。細胞サンプルは、培養細胞、新鮮または凍結細胞、および固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織を含む任意の細胞採取源に由来する組織をさらに含む。細菌サンプルは培養細菌、分離細菌、および前述の生体サンプルのいずれかに含まれる細菌を含むが、これに限定されない。ウイルスサンプルは、培養ウイルス、分離ウイルス、および前述の生体サンプルのいずれかの中にあるウイルスを含むが、これに限定されない。環境サンプルは、空気サンプル、水サンプル、土壌サンプル、岩石サンプル、および自然環境から入手された他の任意のサンプルを含むが、これに限定されない。人工物サンプルは、自然環境中に存在しない任意のサンプルを含む。「人工物」サンプルの例は、精製または分離された材料、培養材料、合成材料および他の任意の人工材料を含むが、これに限定されない。
【００２６】
液状溶解媒体は等張、低張または高張とすることができる。一部の実施形態においては、液状溶解媒体は水性である。一定の実施形態においては、液状溶解媒体はバッファーおよび／または少なくとも１つの塩または塩の組み合わせを含む。一部の実施形態においては、液状溶解媒体のｐＨは約５から約８、約６から約８、または約６．５から約８．５の範囲である。多様なｐＨバッファーを用いて所望のｐＨを達成しうる。適切なバッファーはトリス、ＭＥＳ、ビス−トリス、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ビス−トリスプロパン、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＥＡ、ＨＥＰＰＳ、トリシン、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、ビシン、およびリン酸バッファー（とりわけリン酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウム−カリウムなど）を含むが、これに限定されない。液状溶解媒体は、約１０ｍＭから約１００ｍＭバッファー、約２５ｍＭから約７５ｍＭバッファー、またはとりわけ約４０ｍＭから約６０ｍＭバッファーを含みうる。液状媒体において使用されるバッファーの種類および量は、用途によって異なるものとすることができる。一部の実施形態においては、液状溶解媒体は、約５０ｍＭトリスバッファーを用いて達成することのできる約７．４のｐＨを有する。一部の実施形態においては、液状溶解媒体は水である。
【００２７】
真核細胞、原核細胞、および／またはウイルスは任意の適切な濃度で懸濁しうる。サンプルは、好ましくはマグネティックスターラーの動きに干渉しない濃度で液状媒体に懸濁された細胞を含む。一部の実施形態においては、真核細胞および／または原核細胞は１から１×１０１０個／ｍＬ、１から１×１０５個／ｍＬ、またはとりわけ１×１０３から１×１０４個／ｍＬの範囲の濃度で懸濁される。一部の実施形態においては、ウイルス粒子は１から１×１０１３個／ｍＬ、１から１×１０１０個／ｍＬ、または１×１０５から１×１０７個／ｍＬの範囲の濃度で懸濁される。
【００２８】
一定の好ましい実施形態においては、サンプルはＭＴＢを含むことが疑われる。１つの実施形態においては、サンプルは鼻咽頭吸引液である。他の実施形態においては、サンプルは鼻咽頭スワブである。
【００２９】
本願で用いる用語「細胞」は真核細胞、原核細胞、ウイルス、内生胞子またはその任意の組み合わせを指す。したがって、細胞は細菌、細菌芽胞、真菌、ウイルス粒子、単細胞真核生物（原生動物、酵母など）、多細胞生物に由来する分離または凝集細胞（１次細胞、培養細胞、組織、生命体全体など）、またはとりわけその任意の組み合わせを含みうる。
【００３０】
用語「サンプル」は標的分子を含むか、または標的分子を含むことを疑われる任意の材料を指す。
【００３１】
用語「核酸」は、天然に生成したにせよ人工的に合成されたにせよ（そのアナログを含めて）、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む個々の核酸または核酸の重合鎖またはその修飾、特に任意の鎖長を有する天然に生成することが知られた修飾を指す。
【００３２】
用語「サンプル容器」は、核酸を精製するためにサンプルを保護および／または処理するため、または試薬を処理したサンプルと共に受けるための細長く、一般的には管状の容器またはバイアルを指す。サンプル容器は円筒形である必要がなく、その全長またはその一部に沿ってわずかに円錐形であってもよい。
【００３３】
細胞に関する用語「溶解する」は、核酸およびタンパク質などの細胞内成分を崩壊した細胞から放出するための、細胞の少なくとも一部の完全性の崩壊を意味する。
【００３４】
用語「ホモジナイズする」は、（糞便、組織、喀痰、唾液などの多様な要素を）混合または渦動混合して均一な混合物とすることを意味する。
【００３５】
用語「閉鎖系」または「閉鎖容器」は、処理中のチューブまたは容器への（またはチューブまたは容器からの）外因性または外部物質の導入を阻害または予防するために、密封され、完全ではなくとも相当閉鎖された様式で作動するチューブまたは容器を指す。閉鎖系または容器の構成要素は、使用前に製造所で事前滅菌、使用場所で滅菌、および／または使用前に各閉鎖系を組み立て閉鎖した後に滅菌することができる。
【００３６】
用語「１回使用ディスポーザブル」は、再使用しない構成要素を指す。すなわち、その意図した使用、すなわち標的サンプルの処理または生成を完了した後に廃棄される。
【００３７】
本願で用いる用語「モノリス吸着剤」または「モノリス吸着材料」は、単一片内に連続して互いに接続した小孔構造を有する多孔質３次元吸着材料であり、硬質で、自立性で、ほぼモノリス型の構造を含みうる。モノリスは、たとえば前駆物質を所望の形状の型で鋳造、焼結、または重合させて調製する。用語「モノリス吸着剤」または「モノリス吸着材料」は、充填してベッド形態とするか、または多孔質マトリクスに包埋し、最終生成物が個別の吸着剤粒子を含む、個別の吸着剤粒子の収集物と識別されることを意図する。多孔質モノリスポリマーは、最近数十年間に開発された新しい材料のカテゴリーである。非常に小さなビーズから構成されるポリマーとは対照的に、モノリスは簡便な成形プロセスを用いて調製された単一の連続したポリマー片である。用語「モノリス吸着剤」または「モノリス吸着材料」は、ろ紙または吸着剤でコーティングされたろ紙などの、吸着剤繊維または吸着剤でコーティングされた繊維の集合体とも識別されることを意図する。
【００３８】
１つの態様においては、本願はハウジング、サンプル容器ラック、フィルターチップラック、および円筒形磁石を含む一体型サンプル精製システムを提供する。サンプル容器ラックおよびフィルターチップラックはハウジング内に排置される。サンプル容器ラックは１つ以上のサンプル容器を保持するよう設計され、フィルターチップラックは１つ以上のフィルターチップを保持するよう設計される。円筒形磁石は、サンプル容器ラックの近傍且つ外部にあり、ハウジング内に排置された電動モーターによって駆動されて磁石の中心、長軸を中心に回転する。
【００３９】
図２は、１つの実施形態による典型的なシングルチャネルサンプル精製システム１００を示す。図２のシステム１００は、ハウジング１０４、サンプル容器ラック１０８、フィルターチップアクチュエータ／ラック１１２、および円筒形磁石１１６を含む。サンプル容器ラック１０８およびフィルターチップラック１１２はハウジング１０４内に排置される。サンプル容器ラックまたはスタンド１０８はサンプル容器１２０を保持する。図２のフィルターチップアクチュエータ／ラック１１２は、シリンジ１７６のシリンジプランジャー１７４が上下に動き、フィルターチップ１２４を経て液状物を吸引および分注するよう設計された、シリンジ１７６に着接されたフィルターチップ１２４を保持するよう設計される。プランジャー１７４は、プランジャーの動きを制御するラック１１２のアクチュエータに接続される。円筒形磁石１１６は、サンプル容器ラック１０８の近傍且つ外部にあり、ハウジング内１０４に排置された電動モーター１３０によって磁石１１６の中心、長軸を中心に回転させられる。
【００４０】
サンプル容器１２０は、それぞれサンプル中の細胞を溶解するための溶解チャンバーを１つ以上含みうる。好ましくは、サンプル容器１２０（および他のシステム構成要素）は、サンプル１４４および／または１つ以上の試薬溶液の導入前後に閉鎖系を維持するよう密封および設計される。容器１２０は蓋、キャップまたはカバーで密封しうる。サンプル容器１２０は任意の適切な材料、寸法および形状で作製することができる。一定の実施形態においては、容器１２０はプラスチック製である。好ましくは、容器１２０の内面は化学的に不活性である。サンプル容器１２０は、たとえば採尿カップ、マイクロ遠心管（エッペンドルフチューブなど）、遠心管、バイアル、マイクロウェルプレートなどの形状でありうる。一部の実施形態においては、図３に示すように、容器１２０は細胞１８０、ビーズ１６０、およびスターラー１５６を保持するための単一のコンパートメント／チャンバーを含む。一部の実施形態においては、所与の容器１２０は、それぞれが細胞１８０、ビーズ１６０およびマグネティックスターラー１５６の混合物を、互いに分離した状態で保持することが可能な、複数の別個のコンパートメント／チャンバー（ウェルアレイなど）を含みうる。一部の実施形態においては、サンプル容器１２０はマグネティクスターラーおよび／または細胞溶解ビーズ、さらには細胞溶解を促進し且つ標的分子の生物活性を維持する化学物質および／または酵素と共に事前包装される。
【００４１】
システム１００は複数のサンプル容器１２０、複数のフィルターチップ１２４、１つ以上の試薬ラック１３２またはその組み合わせを含みうる。サンプル容器ラック１０８は複数のサンプル容器１２０を保持するよう設計され、且つ複数のサンプル１４４の同時処理のためにハウジング１０４の支持面に載置することができる。同様に、フィルターチップラック１１２は複数のフィルターチップ１２４を保持するよう設計され、且つ複数のサンプル１４４の同時処理のためにハウジング１０４の支持面に載置することができる。またサンプル容器ラック１０８も、保存を目的としたサンプル１４４のホルダーとして用いうる。たとえば、複数のサンプル容器１２０をサンプル容器ラック１０８内に配置し、分析の前に冷蔵庫または冷凍庫に保存しうる。
【００４２】
ここで図３を参照すると、サンプル容器１２０および円筒型磁石１１６は、使用の際に、円筒形磁石１１６がその長軸を中心に回転するとき、サンプル容器内のマグネティックスターラー１５６が回転し、細胞１８０の破壊およびホモジナイゼーションを引き起こすのに十分な力でビーズ１６０を攪拌するよう設計される。
【００４３】
円筒型磁石１１６は数多くの磁石の幾何学的配置または設計を有しうる。１つの実施形態においては、磁石は、磁石の長軸に沿ってこれを中心として対称に排置された磁極（すなわちＮ極とＳ極）を有する。磁石は、長軸を中心としてその周りに交互に並んだ複数、好ましくは２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４個などの偶数個の対極を有しうる。他の実施形態においては、円筒形磁石は磁石の長軸の対側端に排置された対磁極を有する。さらなる他の実施形態においては、円筒形磁石は電磁石である。
【００４４】
磁石１１６は、サンプル容器１２０の上、下または横で、磁石１１６の中心を通る軸を中心として回転しうる。一定の実施形態においては、サンプル容器１２０は、その上にサンプル容器１２０が存在する表面と垂直に配置され、且つ磁石１１６は、やはりその上にサンプル容器１２０が存在する表面と垂直である軸を中心として回転する。他の実施形態においては、サンプル容器１２０は、その上にサンプル容器１２０が存在する表面と垂直に配置され、且つ磁石１１６は、その上にサンプル容器１２０が存在する表面と平行な軸を中心として回転する。さらなる他の実施形態においては、サンプル容器１２０は、その上にサンプル容器１２０が存在する表面と垂直に配置され、且つ磁石１１６は、その上にサンプル容器１２０が存在する表面とある角度を形成する軸を中心として回転する。角度は０°より大きいが１８０°より小さい。
【００４５】
図３は、サンプル容器１２０に対する磁石１１６の相対的位置を示す。磁石１１６は軸Ａを中心として回転し、サンプル容器１２０内のマグネティックスターラー１５６を、軸Ａと平行な軸Ｂに沿って同じ方向で回転させる。図３では１つの軸Ｂのみが示されるが、当業者であれば、マグネティックスターラー１５６が図に示す他のＡ軸と平行な他のＢ軸を中心として回転しうることを理解するであろう。回転するマグネティックスターラー１５６はビーズ１６０と衝突し、処理中の細胞１８０を溶解させる。磁石１１６は、その上にチャンバー（またはサンプル容器１２０のホルダーの表面１９０と垂直に配置されるサンプル容器１２０の横に、その上に、その下にまたはその対角に位置することができる。
【００４６】
サンプル容器１２０および具体的にはサンプル１４４、ビーズ１６０およびマグネティックスターラー１５６は、変動する磁界の操作範囲内に位置する。たとえば、サンプル容器１２０は、たとえば容器１２０を円筒形磁石１１６と隣接して、またはその近傍に配置することにより、回転する磁界の操作範囲内に位置することができる。変動する磁界は、回転運動、往復運動、またはとりわけその組み合わせなどのマグネティックスターラー１５６の動きを駆動し、これがさらにビーズ１６０、細胞および液状媒体の動きを駆動する。一部の実施形態においては、サンプル懸濁液１４４は、容器１２０の内部の細胞を溶解するのに十分な回転スピードおよび持続時間で、マグネティックスターラー１５６により攪拌される。適切な回転スピードおよび持続時間は用途に依存し、当業者が経験的に決定することができる。一般的に言って、細胞を溶解するのに十分な回転スピードは、細胞の種類、サンプル懸濁液１４４の濃度、サンプル懸濁液の体積、マグネティックスターラー１５６のサイズおよび形状、細胞溶解ビーズ１６０の量／個数、サイズ、形状および固さ、およびサンプル容器１２０のサイズおよび形状などの因子によって決定される。
【００４７】
一定の実施形態においては、マグネティックスターラー１５６は１０００〜６０００ｒｐｍの間、好ましくは約５０００ｒｐｍで１〜６００秒間、好ましくは約９０〜１２０秒間回転している。一定の実施形態においては、サンプル容器１２０（尿検査用カップまたはチューブの形状にある）がマグネティックスターラー上でラック内に配置され、最高スピード設定（＞１，０００ｒｐｍ）で攪拌される。他の実施形態においては、サンプル容器１２０はＥＬＩＳＡプレートなどのマイクロプレートのウェルである。他の実施形態においては、サンプル容器１２０はサンプル入口およびサンプル出口を有する円筒形の容器である。
【００４８】
一定の実施形態においては、マグネティックスターラー１５６の回転のスピードを高めて溶解効率を高め、且つ溶解を達成するのに必要とされる時間を低減する。一定の他の実施形態においては、一定の種類の細胞のみが溶解するよう回転のスピードを調節する。たとえば、複数の種類の細胞１８０を含有するサンプル懸濁液１４４において、スターラー１５６は第１のスピードで回転して第１の細胞群を溶解させ、その後第２のスピードで回転して第２の細胞群を溶解させうる。他の実施形態においては、容器１２０を、溶解処理前、処理中および／または処理後にサンプル懸濁液１４４の温度を制御する温度調節モジュールに接続する。一定の実施形態においては、サンプル懸濁液１４４の温度は２℃〜８℃に維持される。一部の実施形態においては、サンプル懸濁液１４４は溶解処理前、処理中および／または処理後に（マグネティックスターラーの回転中などに）４０℃〜８０℃、５０℃〜７０℃、または約６０℃に加熱される。
【００４９】
マグネティックスターラー１５６は金属製であっても、金属合金製であってもよい。１つの実施形態においては、マグネティックスターラー１５６はステンレスチール製である。他の実施形態においては、マグネティックスターラー１５６はポリマー、ガラスまたはセラミック（ポーセレンなど）といった化学的に不活性の材料でコーティングされた合金コアから作製される。典型的な合金コア材料はネオジム鉄ホウ素およびサマリウムコバルトを含む。典型的なコーティングポリマーは、ＰＴＥＥおよびパリレンなどの生体適合性ポリマーを含む。
【００５０】
マグネティックスターラー１５６は任意の形状のものとすることが可能であり、且つサンプル容器１２０に入れて容器１２０内で動いたり、回転しり、または攪拌したりするよう十分小さくなければならない。マグネティックスターラー１５６は棒形、円柱型、十字型、Ｖ字型、三角形、長方形、桿状またはとりわけ円盤状スターラー１５６とすることができる。一部の実施形態においては、マグネティックスターラー１５６は長方形の形状を有する。一部の実施形態においては、マグネティックスターラー１５６は二叉の音叉形状を有する。一部の実施形態においては、マグネティックスターラー１５６はＶ字様の形状を有する。一部の実施形態においては、マグネティックスターラー１５６は台形の形状を有する。一定の実施形態においては、スターラー１５６の最も長い寸法は、容器の直径よりわずかに小さい（たとえば容器の直径の約７５〜９５％）。
【００５１】
細胞溶解ビーズ１６０は、細胞の固さよりも大きな固さを有する、任意の粒子様および／またはビーズ様構造とすることができる。ビーズ１６０はプラスチック、ガラス、セラミック、鉱質、金属および／または任意の他の適切な材料で作製しうる。一定の実施形態においては、ビーズ１６０は非磁性材料で作製しうる。ビーズ１６０は少なくとも１つの軸を中心として回転対称でありうる（球形、丸形、楕円形、長円形、卵型、および水滴型粒子など）。一定の実施形態においては、ビーズ１６０は多面体形状を有する。他の実施形態においては、ビーズ１６０は不規則な形状をした粒子である。一部の実施形態においては、ビーズ１６０は突起を有する粒子である。ビーズ１６０は１０〜１，０００μｍ、２０〜４００μｍ、またはとりわけ５０〜２００μｍの直径を有しうる。各溶解容器に加えるビーズ１６０の量の範囲は約１〜１０，０００ｍｇ、１〜１０００ｍｇ、１〜１００ｍｇ、とりわけ１〜１０ｍｇでありうる。
【００５２】
細胞が溶解した後、細胞溶解液を適切なフィルターチップ１２４に取り入れ、核酸がその中のフィルターマトリクス１２６に結合することを可能とする（図４を参照）。溶解液は、典型的には未結合の部分をフィルターチップ１２４の同じ末端から排出する前に、少なくとも２回フィルターマトリクス１２６を通過させる。この時点で、別の機会にさらに分析するために、フィルターチップ１２４内で結合した核酸を密封容器に保存することができる。またその代わりに、以下にさらに記載するように、適切な溶離バッファーを用いて結合した核酸をフィルターチップから溶離することができる。
【００５３】
図４は代表的なフィルターチップを示す。フィルターチップ１２４は、ピペットチップ１２７に挿入された多孔質モノリス結合フィルターマトリクス１２６を含む。モノリス結合フィルターマトリクス１２６は、モノリス吸着剤またはモノリス吸着材料を含む。多孔質モノリス材料は核酸と特異的に結合し、硬質で、自立性で、ほぼモノリス型の構造から構成される。一部の実施形態においては、多孔質モノリス材料は核酸親和性を提供する追加的な材料を含まない。一部の実施形態においては、多孔質モノリス材料はガラスフリットなどのガラスベースのモノリス材料である。一定の実施形態においては、ガラスフリットは焼結ガラスフリットである。ガラスフリットまたは焼結ガラスフリットなどの多孔質モノリス材料の多孔度は、用途に依存する。多孔質モノリス材料は、一般に、特定の用途のための所望のサンプル流量を可能とし、かつ所望のサイズ範囲の核酸を保持することが可能な多孔度を有するべきである。一部の実施形態においては、モノリス結合フィルターマトリクス１２６は、多孔度が相異なる２つの部分（１２６ａおよび１２６ｂ）からなるガラスフリットである。
【００５４】
一部の実施形態においては、多孔質モノリス材料は２〜４００ミクロン、２〜３００ミクロン、２〜２２０ミクロン、２〜２００ミクロン、２〜１８０ミクロン、２〜１６０ミクロン、２〜１４０マイクロ、２〜１２０マイクロ、２〜１００ミクロン、２〜８０ミクロン、２〜６０ミクロン、２〜４０ミクロン、２〜２０ミクロン、２〜１６ミクロン、２〜１０ミクロン、２〜５．５ミクロン、４〜４００ミクロン、４〜３００ミクロン、４〜２２０ミクロン、４〜２００ミクロン、４〜１８０ミクロン、４〜１６０ミクロン、４〜１４０マイクロ、４〜１２０マイクロ、４〜１００ミクロン、４〜８０ミクロン、４〜６０ミクロン、４〜４０ミクロン、４〜２０ミクロン、４〜１６ミクロン、４〜１０ミクロン、４〜５．５ミクロン、１０〜４００ミクロン、１０〜３００ミクロン、１０〜２２０ミクロン、１０〜２００ミクロン、１０〜１８０ミクロン、１０〜１６０ミクロン、１０〜１４０マイクロ、１０〜１２０マイクロ、１０〜１００ミクロン、１０〜８０ミクロン、１０〜６０ミクロン、１０〜４０ミクロン、１０〜２０ミクロン、１０〜１６ミクロン、１６〜４００ミクロン、１６〜３００ミクロン、１６〜２２０ミクロン、１６〜２００ミクロン、１６〜１８０ミクロン、１６〜１６０ミクロン、１６〜１４０マイクロ、１６〜１２０マイクロ、１６〜１００ミクロン、１６〜８０ミクロン、１６〜６０ミクロン、１６〜４０ミクロン、４０〜４００ミクロン、４０〜３００ミクロン、４０〜２２０ミクロン、４０〜２００ミクロン、４０〜１８０ミクロン、４０〜１６０ミクロン、４０〜１４０マイクロ、４０〜１２０マイクロ、４０〜１００ミクロン、４０〜８０ミクロン、４０〜６０ミクロン、１００〜４００ミクロン、１００〜３００ミクロン、１００〜２２０ミクロン、１００〜２００ミクロン、１００〜１８０ミクロン、１００〜１６０ミクロン、１００〜１４０マイクロ、１００〜１２０マイクロ、１６０〜４００ミクロン、１６０〜３００ミクロン、１６０〜２２０ミクロン、１６０〜２００ミクロン、１６０〜１８０ミクロン、２００〜４００ミクロン、２００〜３００ミクロン、または２００〜２２０ミクロンの範囲の多孔度（すなわち平均孔径）を有するガラスフリットまたは焼結ガラスフリットである。他の実施形態においては、多孔質一体型材料は、相異なる多孔度の２つの部分（１２６ａおよび１２６ｂ）を有するガラスフリットまたは焼結ガラスフリットである。各部分は上記の範囲の多孔度を有しうる（４〜１０ミクロンの部分と１６〜４０ミクロンの部分、または１６〜４０ミクロンの部分と１００〜１６０ミクロンの部分など）。
【００５５】
一部の実施形態においては、フィルターは１〜３０ｍｍ、１〜２５ｍｍ、１〜２０ｍｍ、１〜１５ｍｍ、１〜１０ｍｍ、１〜８ｍｍ、１〜６ｍｍ、１〜４ｍｍ、２〜３０ｍｍ、２〜２５ｍｍ、２〜２０ｍｍ、２〜１５ｍｍ、２〜１０ｍｍ、２〜８ｍｍ、２〜６ｍｍ、２〜４ｍｍ、４〜３０ｍｍ、４〜２５ｍｍ、４〜２０ｍｍ、４〜１５ｍｍ、４〜１０ｍｍ、４〜８ｍｍ、４〜６ｍｍ、６〜３０ｍｍ、６〜２５ｍｍ、６〜２０ｍｍ、６〜１５ｍｍ、６〜１０ｍｍ、６〜８ｍｍ、８〜３０ｍｍ、８〜２５ｍｍ、８〜２０ｍｍ、８〜１５ｍｍ、８〜１０ｍｍ、１０〜３０ｍｍ、１０〜２５ｍｍ、１０〜２０ｍｍ、１０〜１５ｍｍ、１５〜３０ｍｍ、１５〜２５ｍｍ、１５〜２０ｍｍ、２０〜３０ｍｍ、２０〜２５ｍｍ、または２５〜３０ｍｍの範囲の厚さを有する。
【００５６】
一部の実施形態においては、多孔質モノリス材料は、ポリヌクレオチド、タンパク質、脂質または多糖類などの目的の分子に対する親和性を有する１つ以上の材料で修飾しうる。一部の実施形態においては、多孔質モノリス材料は、核酸に対する親和性を有する１つ以上の材料で修飾しうる。
【００５７】
一部の実施形態においては、フィルターは多孔質ガラスモノリス製、多孔質ガラス−セラミック製または多孔質モノリスポリマー製である。一部の実施形態においては、多孔質ガラスモノリスは、本願に参照文献として援用する米国特許第４，８１０，６７４号明細書および第４，７６５，８１８号明細書に記載のゾル−ゲル法を用いて生成することができる。多孔質ガラス−セラミックは、多孔質ガラスモノリスの制御結晶化によって生成しうる。好ましい実施形態においては、多孔質ガラスモノリス、多孔質ガラス−セラミックまたは多孔質モノリスポリマーは、その核酸との結合親和性を改善することを目的として、ポリヌクレオチドまたは抗体などのいかなる追加的材料でもコーティングされたり、またはこれを包埋されたりしない。
【００５８】
一部の好ましい実施形態においては、フィルターは液状サンプルがそこを通過しうる細孔径多孔質ガラスフリット製である。多孔質ガラスフリットは、その核酸または他の目的分子との親和性を改善することを目的として、ポリヌクレオチドまたは抗体などのいかなる追加的材料でもコーティングされたり、またはこれを包埋されたりしない。核酸を精製するのに適した基材は、単一のモノリス構造を形成するために、ビーズをホットプレスで粉砕することで形成される焼結ガラスによって作製される、多孔質ガラスフリットを含む。フリットの均一な構造は、フリット内部での予測可能な液状物の流動をもたらし、且つ溶離液がサンプル流動と同様の流体力学を有することを可能とする。予測可能な液体物の流動は、溶離プロセスにおける高い回収率を可能とする。
【００５９】
フィルターマトリクス１２６は、典型的にはピペットチップ１２７に配置されるものの、体積および形状の異なるカラム、シリンジまたは他のハウジングにも嵌合されうる。手動または自動ピペット、シリンジ、シリンジポンプ、手持ちシリンジ、またはフィルターマトリクス１２６に液状物を通過させるための他の種類の自動化または手動法を用いて、フィルターマトリクス１２６に液状溶液を通過させうる。
【００６０】
図５Ａおよび５Ｂに示すように、システムはハウジング内に排置された１つ以上の試薬ラック１３２をさらに含みうる。試薬ラック１３２は１つ以上の試薬を保持するよう設計される。試薬ラック１３２は、使用する準備ができたときにその中に試薬を注入することのできるトレイの形態としうる。この場合、サンプル１４４の処理中に複数のサンプルウェルに送達するために、試薬をトレイに注入して試薬を複数のピペットチップで受けやすくする。またその代わりに、試薬ラック１３２は、複数のウェル１５２を含むブロックまたはマルチウェルプレート（２４ウェル、９６ウェルなど）の形態としてもよく、これにより複数のウェルが、それぞれ別個のサンプル１４４を処理するために、試薬のいずれかを保持するよう設計される。一定の実施形態においては、ウェル１５２は事前に試薬を充填され、ラック１３２の中で密封されうる。一部の実施形態においては、ラック１３２はサンプル容器ラック１０８および／またはフィルターチップラック１１２の近傍に位置する（図５Ｂ）。
【００６１】
サンプル精製システム１００は手動で操作してもよく、あるいはプログラマブルロジックにより半自動化または完全自動化状態で実行するよう設計してもよい。一定の実施形態において、システムは自動化ピペッティングシステム１３６（図５Ａ）、および所定のコンピュータ制御様式によって、自動的に１つ以上の試薬ラック１３２から複数のサンプル容器１２０に試薬を分注し、サンプル材料および使用済み試薬を適切な廃棄用受け器１７２に廃棄するよう設計された（図５Ｂ）、１つ以上のロボティックアーム（示さず）をさらに含む。
【００６２】
操作の様式の１つにおいては、試薬ラック１３２はマルチウェルプレート（２４ウェル、９６ウェルなど）の形態にある。好ましくは、自動化液状物操作は、試験しようとする混合物を調製するために行う必要のある作業の量を低減するので、混合物はこれを用いて混合される。また自動サンプリングプロトコルも、技術上既知の装置および方法を用いて、ロボティクスにより実施しうる。
【００６３】
任意の適切な機器または装置を用いて、自動精製システム１００およびその多様な処理ステップによってサンプル１４４を移動させうる。たとえば、本願で用いられるシステム１００は、技術上既知である多様なロボティクスを用いて、サンプル１４４、試薬および他のシステム構成要素の移動を自動化することができる。典型的なロボティクスシステムは、サンプルを１つ、２つまたは３つの軸上で移動し且つ／または１つ、２つまたは３つの軸を中心として回転する能力を有する。典型的なロボティクスは、工作物の上、下または横に位置しうるトラック上で移動する。ロボティクス構成要素は、典型的には工作物を握り且つ／または移動し、ピペッターを挿入し、試薬を分注し、吸引することなどが可能なロボティックアームなどの機能的構成要素を含む。本願で用いる「ロボティックアーム」は、好ましくはマイクロプロセッサによって制御される、サンプル１４４、容器１２０、フィルターチップ１２４、サンプル容器ラック１０８、フィルターチップラック１１２および試薬ラック１３２を１つの場所から他の場所に物理的に移動するデバイスを意味する。それぞれの場所を自動化精製システム１００におけるユニットとすることができる。ロボティックアームの制御のためのソフトウェアは、一般にアームの製造業者から入手可能である。
【００６４】
ロボティクスは、たとえば作業領域の上、下または横にあるトラック上で並進してもよく、且つ／またはアームが作業領域の異なる位置に到達することを可能とする接合部分を含んでもよい。ロボティクスは、たとえば電気、空気圧または水圧で動力を供給しうる、技術上既知のモーターによって駆動しうる。標準的なＰＬＣプログラミングまたは他の技術上既知の方法などの、任意の適切な駆動制御システムを用いて、ロボティクスを制御することができる。任意選択として、ロボティクスは光学的または機械的に位置および／または力を測定し、ロボットが所望の位置に誘導されることを可能とする位置フィードバックシステムを含む。任意選択として、ロボティクスは、繰り返し特定の位置を取ることを可能とする機械的停止、光学的マーカーまたはレーザー誘導などの位置確保メカニズムも含む。
【００６５】
典型的な自動サンプリングプロトコルは、たとえばエッペンドルフｅｐＭｏｔｉｏｎ５０７０、ｅｐＭｏｔｉｏｎ５０７５、ハミルトンＳＴＡＲｌｅｔ、ＳＴＡＲおよびＳＴＡＲｐｌｕｓ液状物操作ロボットなどを利用する。そのようなプロトコルはＲＮＡ分離、全血、組織、唾液、スワブからのゲノムＤＮＡの分離、さらには循環腫瘍ＤＮＡおよび循環胎児ＤＮＡなどの無細胞ＤＮＡの抽出および母体血漿からの濃縮のために適合化しうる。
【００６６】
（核酸を精製するための方法）
他の実施形態においては、サンプルから核酸を精製するための方法は：（ａ）本開示による核酸精製システムを提供するステップ；（ｂ）サンプル、マグネティックスターラーおよび複数のビーズをサンプル容器に導入するステップ；（ｃ）円筒形磁石をその長軸を中心に回転させ、その結果サンプルをホモジナイズし且つサンプル中の細胞を破壊して細胞溶解液を形成するのに十分な程度に、マグネティックスターラーが回転し且つビーズが攪拌されて細胞内容物の無秩序な混合を受けるステップ；（ｄ）細胞溶解液の少なくとも一部をフィルターチップの第１の開口部を経て流し、その結果細胞溶解液中の核酸をフィルターチップ内のフィルターと結合させるステップ；（ｅ）細胞溶解液の未結合部分をフィルターチップから第１の開口部を経て排出し、このとき未結合部分がフィルターチップから出る前に少なくとも２回フィルターを通過するステップ；および（ｆ）フィルターチップの第１の開口部から溶離バッファーを流入させ、溶離バッファーをフィルターチップから第１の開口部を経て排出することによりフィルターに結合した核酸を溶離し、このとき溶離バッファーがフィルターチップから出る前に少なくとも２回フィルターを通過するステップを含む。
【００６７】
完全手動、半自動化、または完全自動化プロトコルを含む、本願に記載の方法を実施する任意の様式を用いることができる。しかし、フィルターチップの特性、適合性、単純さおよびワークフローによって、容易に適合化、自動化、および数多くの臨床サンプルマトリクス、投入サンプル体積、および液状物操作システムに対して有効とすることができる。したがって、好ましい実施形態においては、操作の様式はある種の自動化を含む。１つの実施形態においては、核酸を精製するための方法は、自動化ピペッティングシステムと、所定の様式で１つ以上のサンプル容器に試薬を自動的に分注し、且つサンプル材料および試薬を適切なディスポーザブル受け器に廃棄するよう設計された１つ以上のロボティックアームを含む。この場合、１つ以上の試薬ラックと組み合わせた、同等の数のフィルターチップを用いる複数のサンプル容器のそれぞれにおいて、上記のステップが反復される。
【００６８】
ＭＴＢを含有することが疑われるサンプルは、ユーザーに対して潜在的なリスクを呈する。したがってサンプルは、このリスクを軽減するために、加熱および／またはサンプル中に存在する微生物を不活化するのに適した試薬の含有によって前処理しうる。ＭＴＢなどの微生物の不活化は、活性タンパク質を変性させる加熱（９０℃、５分など）、細胞壁構造の酵素的消化、細胞を物理的に崩壊または不活化する機械的破壊、化学的処理またはその組み合わせによって遂行しうる。
【００６９】
化学的不活化は、加熱の必要性を低減または除去する可能性をもたらす。培養を目的としてサンプルを処理する場合、簡便な試薬を用いて喀痰を消化しサンプルを消毒する。培養のためには、より増殖の速い他の細菌に追い越されずにＭＴＢが増殖できるよう、喀痰サンプル中に存在する他の細菌叢を不活化することが重要である。除染または不活化ステップは、水酸化ナトリウム（３〜５％など）または塩化セチルピリジニウムなどの試薬を用いてもよく、好ましくは、他の全ての細菌を不活化するが、ＭＴＢ細胞はより厚く堅牢な細胞壁により無傷で生存した状態に保たれるよう選択される。しかし、使用する方法によっては、この処理の際にＭＴＢ細胞の２０〜９０％が死滅することがある。しかし核酸の精製に関しては、細胞ゲノムＤＮＡがなお増幅可能である限り、ＭＴＢ細胞は生存している必要も無傷である必要もない。
【００７０】
好ましくは、不活化試薬は、シリカとの結合に対する適合性について、限られたサンプル希釈および／または低ｐＨを可能とするよう選択される。これらの試薬は採取時にサンプルに添加されうる。一部の実施形態においては、過酸化水素、エタノールなどのアルコール類およびｏ−フェニルフェノール（０．２〜０．５％）を主要活性成分として用いうる。過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）は６〜２５％濃度から化学滅菌剤として用いることができ、かつ溶液内で非常に安定である。０．８５％リン酸と混合するとき、Ｈ２Ｏ２は低ｐＨにおいて活性である。エタノール単独（９５％など）は喀痰または水中のＭＴＢを１５秒で不活化することができる。農業用殺真菌剤ｏ−フェニルフェノールは、ＰＨＥＮＯ−ＣＥＮ、ＳＲＡＹＰＡＫ、およびＣＬＩＰＰＥＲＣＩＤＥ噴霧消毒剤中で、エタノールまたはイソプロパノール中と共に０．１〜０．４１％で用いる。さらに、ｏ−フェニルフェノールは、低い試薬対サンプル比率として室温で１５分間用いてもよく、且つＬｏｗ  ｐＨ  Ｐｈｅｎｏｌｉｃ２５６（５０％〜１００％）中で、エタノールまたはイソプロパノールまたは６．６５％２−ベンジル−４−クロロフェノールと組み合わせて用いうる。
【００７１】
サンプル体積に対する不活化試薬の体積比は、典型的には約０．１：１から３：１の範囲となる。
【００７２】
１次検体容器中の微生物の不活化は、ＢＳＬ−１適合ワークフローを提供するために重要である（すなわち、ワークフローがバイオセイフティキャビネットを必要としない）。多くのプロトコルは消毒前のサンプル移動を包含するが、これはエアロゾルを生成してユーザーを感染させる可能性のある行為である。したがって、ＢＳＬ−１に適合するには、消毒前のサンプル移動、特にエアロゾルを生成してユーザーを感染させる可能性のある移動に対して慎重な注意を必要とする。
【００７３】
サンプルの性質に応じて、一定したサンプル処理のために、サンプルをまず液状化してその粘度および不均一性を低下させうる。喀痰サンプルは特に困難をもたらす。喀痰中のＭＴＢは、抗酸菌の脂質に富んだ疎水性細胞壁および喀痰の粘稠且つ不均一な性質により、最も処理が困難な細胞およびサンプルの種類の１つである。喀痰の標準的な抽出法は、典型的には、Ｎ−アセチル−Ｌシステイン（ＮＡＬＣ）および水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）による処理後の遠心分離、デカンティングおよび再懸濁をしばしば包含する、沈殿のプロセスに始まる。したがって、喀痰などの粘度の高いサンプルを処理する場合、その後の処理ステップ（ＭａｇＶｏｒ）が阻害されないよう、粘度を低減するためにサンプルを化学処理に付しうる。サンプルに添加するための典型的な粘液溶解試薬は、ＮＡＬＣ、ゼフィラン−三ナトリウムリン酸（Ｚ−ＴＳＰ）、ベンザルコニウム、および細菌を溶解してＲＮＡおよびＤＮＡを安定化する特殊な製剤を含むＰｒｉｍｅｓｔｏｒｅ（登録商標）（Ｌｏｎｇｈｏｒｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ＆Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、テキサス州サンアントニオ）、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ  ＴＸ）を含むが、これに限定されない。１つの実施形態においては、粘液溶解剤を用いた化学処理によるサンプルの液状化は、６０℃で２０分間遂行される。患者の喀痰サンプルは、典型的には１〜１０ｍＬ、５〜１０ｍＬの間またはそれ以上の体積で採取される。
【００７４】
喀痰は、せん断速度９０ｓ−１で約１００〜６，０００ｃＰ（ｍＰａ）の範囲の粘度を有する。ｍＰａ単位で測定される粘度は、せん断強度をせん断速度で割ることによって算出される。好ましくは、サンプルは喀痰の粘度を少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％低減するよう液状化される。
【００７５】
サンプルを処理する際は、サンプル容器内に少なくとも１個のマグネティックスターラーおよび複数の細胞溶解ビーズが存在する。ユーザーは、簡便にサンプル容器にサンプル懸濁液を入れ、サンプル容器を円筒形磁石の近傍に配置し、細胞をホモジナイズおよび溶解するのに十分な様式で、サンプル容器内で磁場を回転させてマグネティックスターラーを回転させ、細胞溶解ビーズを攪拌するのに十分なスピードで磁石を回転させることにより、サンプル懸濁液を攪拌しうる。
【００７６】
サンプル懸濁液、細胞溶解ビーズおよびマグネティックスターラーは、任意の順でサンプル容器に入れることができる。一部の実施形態においては、サンプル懸濁液は、細胞溶解ビーズおよびマグネティックスターラーの前にサンプル容器に加える。他の実施形態においては、細胞溶解ビーズおよび／またはマグネティックスターラーはサンプル採取の前にサンプル容器に入れる。
【００７７】
一定の実施形態においては、攪拌ステップの前および／または攪拌ステップ中にサンプル懸濁液に添加剤を加えることによって、特定の種類の細胞の溶解を促進することができる。添加剤の例は酵素、洗剤、界面活性剤および塩基および酸などの他の化学物質を含む。ある種の細胞については、アルカリ条件（１０ｍＭ  ＮａＯＨ）によって攪拌時の溶解効率が高まりうることが確認されている。やはり、またはその代わりに、攪拌時にサンプル懸濁液を加熱して溶解効率を高めてもよい。しかし添加剤は、核酸増幅および検出を含む下流のステップに有害となることがあるので、プロセスを単純化することが可能な場合は除外すべきである。
【００７８】
スターラー／ビーズの組み合わせは、従来の溶解法と比較して多くの利点をもたらす。スターラー／ビーズ法は、化学的および酵素的手法よりもさらに高速で、他の多くの種類の物理的溶解法と比較した細胞またはウイルス溶解の改善を提供する。スターラー／ビーズ法はロボティクスおよび／または微少流動技術を用いた自動化にも適合しやすい。円筒形磁石は再使用が可能であり、容器に対して精密に配置する必要がなく、さらに複数の容器を駆動することができる。マグネティックスターラーはコストが低いので、一回使用ディスポーザブルでの使用が可能となる。
【００７９】
ＭａｇＶｏｒステップ後、１つ以上のカオトロピック剤を含む適切な結合バッファーをサンプル容器に添加し、核酸とフィルターマトリクス１２６との結合を促進する。ブーム化学反応、または核酸とシリカのカオトロピック結合は、溶液のｐＨが７未満の時最も効率が高い。この場合、塩化リチウムまたは塩化ナトリウムまたはグアニジン塩基イオンを含有する高イオン強度溶液を、典型的にはエタノールまたはイソプロパノールなどの脂肪族アルコールと組み合わせ、それぞれＤＮＡを「塩析」し、核酸の結合を促進する。処理サンプルに添加するとき、生成する体積がフィルターチップの容積の範囲内となるよう、適切な結合バッファーを一定の濃度で用いる。これにより吸引および分注サイクルの回数が減少するので、総処理時間が短縮される。
【００８０】
一定の実施形態においては、ＭａｇＶｏｒ後に結合バッファーをサンプルに添加し、６０℃で１０分間インキュベートする。他の実施形態においては、ＭａｇＦｏｒステップの前に、カオトロピック剤と脂肪族アルコールを液状化ステップに含める。他の実施形態においては、不活化、ホモジナイゼーションおよび溶解ステップは１５分間と短い単一ステップで遂行される。
【００８１】
典型的なカオトロピック剤はチオシアン酸グアニジウム、イソチオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、塩化グアニジウム尿素、チオ尿素、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、塩化セチルピリジニウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸リチウム、ヨウ化ナトリウム、およびヨウ化カリウムなどのカオトロピック塩；ブタノール、エタノール、プロパノールおよびイソプロパノールなどの脂肪族アルコール；フェノールおよび他のフェノール系化合物を含むがこれに限定されない。
【００８２】
一部の実施形態においては、高分子量（ＨＭＷ）核酸のフィルターマトリクスへの選択的結合を促進するために、イソプロパノールなどの脂肪族アルコールを約０％から約１０％の間、好ましくは約４％から約６％の間の範囲で提供し（最適＝４．７％）、且つイソチオシアン酸グアニジンおよび／または塩酸グアニジンなどのカオトロピック塩を１．０Ｍから４．０Ｍ、好ましくは約３．０Ｍから約４．０Ｍの間の範囲で提供する。
【００８３】
一部の実施形態においては、低分子量（ＬＭＷ）核酸のフィルターマトリクスへの結合（および濃縮）を促進するため、イソプロパノールなどの脂肪族アルコールを約１０％から約２５％の間、好ましくは約１５％から約２０％の間（最適＝１７．７％）の範囲で提供する。
【００８４】
他の実施形態においては、喀痰からのＭＴＢ  ＤＮＡの分離を促進するため、エタノールなどの脂肪族アルコールを約２０％から約６０％の間、好ましくは約３０％から約５０％の間（最適＝４４％）の範囲で提供しうる。
【００８５】
上記の不活化およびホモジナイゼーションステップの後、溶液のｐＨを必要に応じて調節し、ｐＨ７未満を達成しなければならない。ｐＨが７超の場合、溶液は酢酸カリウムまたはリン酸ナトリウムなどの弱酸で中和することができる。これは、ｐＨ≧１１を有するＮａＯＨまたはｏ−フェニルフェノールを用いる場合に必要となる。低ｐＨフェノールおよび過酸化水素試薬は本質的に酸性であり、ほとんどの場合追加的なバッファーを必要としない可能性が高くなる。
【００８６】
１つの実施形態においては、核酸のフィルターマトリクスへの結合は、フィルターチップ１２４を、シリンジ１７６との間のルアーロック接続を介してこれに着接することによって遂行しうる。他の実施形態においては、フィルターマトリクスはシリンジ１７６内にある。典型的なフィルターチップ１２４を図４に示す。フィルターチップ１２４は、チップ本体１２７の内部に包埋された多孔質シリカマトリクス１２６、汚染およびユーザーへの曝露を防止するエアロゾルフィルタ１２８、および閉鎖系の維持に有用なチップキャップ１２９を含む。１つの実施形態においては、キャップ１２９はインサートでフィルターチップ１２４に接続される。一部の実施形態においては、キャップは通常のファルコンチューブキャップ２０８である。フィルターチップ１２４は、フィルターチップ１２４の吸引および分注サイクル毎に液状サンプルがマトリクスを通過して流動することができるよう設計されている。シリンジ１７６または他の適切な機器を用いて、容器１２０内の細胞溶解液をフィルターチップ１２４の遠位端を経て上に通過させ、その結果細胞溶解液中の核酸がピペットチップ１２７内のフィルターマトリクス１２６と結合する。典型的には、細胞溶解液がフィルターマトリクス１２６を経て揚上および降下され、その結果、未結合部分がピペットチップ１２７の遠位端を経て適切な廃棄用受け器１７２に排出される前に、溶解液および未結合部分がフィルターマトリクス１２６を少なくとも２回通過する。
【００８７】
サンプルとカオトロピック試薬の組み合わせにより、ＤＮＡとシリカが脱水され、多孔質シリカマトリクス１２６への吸着が促進される。その後、洗浄バッファーの吸引および分注サイクル（２〜３回）によってマトリクス１２６から不純物を除去する。この時点で、フィルターマトリクス１２６と結合した核酸を含むフィルターチップ１２４を、別の機会にさらに分析するために密封容器１２０に保存することができる。またその代わりに、以下にさらに記載するように、結合した核酸を、適切な溶離バッファーを用いてフィルターチップから溶離することができる。
【００８８】
核酸は、特に他の安定化剤を用いることなく脱水条件下で保存されるとき、シリカを含む固形支持体上で非常に安定であることが示されている。したがって本願は、他の態様において、フィルターチップ１２４が適切なホールディングチューブ２１２（５０ｍＬコニカルチューブなど）のキャップ２０８の下面と着接するよう、チューブキャップ２０８の上面に着接したルアーロックアダプター２０４を含む、一回使用ディスポーザブル輸送用デバイス２００の形態での輸送を目的とした、精製された核酸を安定化させるための手段を提供する（図６）。
【００８９】
図２に示すように、使用（すなわち分析用核酸の溶離）の前に、キャップ２０８と着接したフィルターチップ１２４はホールディングチューブ２１２から抜去され、シリンジ１７６に着接される。この場合ユーザーは、チューブキャップ２０８上で支持しながら、ルアーロックアダプター２０４を介してフィルターチップ１２４を容易に挿入および抜去することが可能であり、その結果ホールディングチューブ２１２がユーザーとフィルターチップ１２４を汚染から遮蔽する。この連続操作が完了したならば、核酸が結合した多孔質シリカフィルターマトリクス１２６を乾燥させ、キャップ付きフィルターチップ１２４を空のホールディングチューブ２１２に螺嵌して輸送する。輸送中、ホールディングチューブ２１２はフィルターチップを汚染から保護する。安定化した核酸は、後で溶離バッファーを用いて再水和し、診療所で用いたものと同様の自動化システムを用いるか単純にディスポーザブルシリンジ１７６を用いて、保存チューブ内に溶離して長期間凍結保存するか、または検出測定デバイスまたはサンプルチューブに直接溶離することができる。後者の場合、シリンジ１７６はシリカマトリクス１２６を横断する溶離バッファーの吸引および分注サイクルのメカニズムの役割を果たす。
【００９０】
分子分析に備え、溶離バッファーの吸引および分注サイクル（２〜３回）により結合した不純物をマトリクス１２６から除去する。プロセスが完了すると、ＰＣＲに適したバッファー内に精製された核酸が得られる。この手法はフォーマットについての柔軟性を可能とし、その結果高スループット用途の液状物操作システムと共に、または低スループット用途の単純なピペットチップと共に用いることができる。
【００９１】
図７は、喀痰からの核酸のＭａｇＶｏｒ／フィルターチップ精製を目的とした典型的な連続ステップを示す。サンプル容器でＭＴＢを含有すると疑われる喀痰サンプルを採取する。不活化剤と粘液溶解剤を含む化学試薬混合物を添加する（ステップ１）。次にサンプル容器を抽出スタンド（またはラック）に載置し、サンプル内容物を磁気誘導による渦動攪拌（ＭａｇＶｏｒ）に２〜１５分間、好ましくは１０分間付す（ステップ２）。細胞の溶解後、ビーズを１〜２分間沈殿させ、容器に結合バッファーを加える（ステップ３）。ユーザーは、フィルターチップを図６のチューブキャップ／ルアーロックアダプターの下側に着接し、ルアーロック接続を用いて、シリンジをチューブキャップ／ルアーロックアダプターの上面に接続する（ステップ４）。ユーザーは、フィルターチップをキャップオーバーから容器内に貫通させ、細胞溶解液をチップ内に引き入れ、シリンジレバーを上下動させてフィルターマトリクスを２〜３回通過させ、フィルターマトリクスとの結合を促進し、これにより未結合の部分はチューブ内に戻される（ステップ４）。この結合ステップの後、サンプル容器は洗浄試薬を収容する新しいチューブと交換し、さらにフィルターマトリクスを洗浄バッファーで洗浄し、これをチューブに捕集する（ステップ５）。洗浄ステップの後、チューブを液状物から引き上げる。一部の実施形態においては、フィルターマトリクスを通過させて空気を分注することによりフィルターチップをさらに乾燥させる（ステップ６）。一部の実施形態においては、残留洗浄試薬を減少させるため空気乾燥を数ラウンド実施する。ユーザーは、その後フィルターチップ／キャップアダプターをシリンジから脱着し、乾燥剤の入った新しいホールディングチューブにフィルターチップを戻し、フィルターチップ／キャップアダプターとホールディングチューブを接続して保存する（ステップ７）。フィルターチップ内の核酸は輸送に対して安定であり、あるいはＰＣＲ分析などを目的としてフィルターチップから精製した核酸を溶離することができる。核酸の溶離は、採取前に溶離バッファーをフィルターマトリクスに２〜３回通過させて遂行してもよい。
【００９２】
トレハロース、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００またはＤＮＡｓｔａｂｌｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ試薬（バイオマトリカ）を溶離バッファーと共に含めるか、または溶離した核酸に添加して安定性を高めてもよい。
【００９３】
一部の実施形態においては、方法は、核酸を溶離し、所定の標的に特異的なプライマーで溶離した核酸を増幅し、サンプルが標的に対応する核酸を含有するか判定するステップをさらに含む。検出のための好ましい標的はＭＴＢ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｕｌｕｅｚａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ種、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉ、インフルエンザＡウイルス、サイトメガロウイルスおよびリノウイルスを含むがこれに限定されない、喀痰中に確認される細菌およびウイルス病原体を含む。
【００９４】
本願に記載のシステム１００は、ＭＴＢを１，０００個／ｍＬ未満、好ましくは１００個／ｍＬ未満、より好ましくは５０個／ｍＬ未満、最も好ましくは１０個／ｍＬ未満のレベルで検出することができる。１コロニー形成単位（ｃｆｕ）が細胞１０個とおおよそ等しいと仮定すると、上記のシステムは少なくとも１００ｃｆｕ／ｍＬ、１０ｃｆｕ／ｍＬ、５ｃｆｕ／ｍＬ、さらには１ｃｆｕ／ｍＬの検出を提供するのに用いることができる。
【００９５】
しかし、全ての臨床サンプルは特異であり、粘度、粒子、粘液、表面汚染物質、微生物および／またはヒト遺伝背景が１つ１つ異なることを認識すべきである。それゆえに、臨床サンプル組成の予測される多様性、および自動化フィルターチップサンプル調製プロトコルを使用する意図を前提とすると、所望の結果を達成するためにフィルターチップ手順のいくつかのステップを変更する必要がありうる。
【００９６】
たとえば、本願に記載のフィルターチップが比較的大きな孔径を有する一方で、サンプルホモジナイゼーションおよび液状化は、効率の高い細胞溶解およびその後のフィルターマトリクスとの結合ステップに対して非常に重要である。溶解液が均一で十分に液状化されれば、サンプルをより高い流量でフィルターチップに通過させることが可能であり、これによって全体的なサンプル処理時間が短縮される。以下の大容量血漿プロトコルに示すように、サンプル投入体積が大きいとフィルターチップによって効果的に処理することができ、これにより、投入サンプル体積についてのわずかな懸念のみで、困難なサンプルを（オンラインまたはオフラインで）完全にホモジナイズおよび液状化する機会がユーザーに提供される。
【００９７】
さらに、核酸結合時または溶離時の流量がより低いと、典型的には、総処理時間が犠牲となるものの、核酸の収量が高くなることを認識すべきである。ＤＮＡのせん断度は流量を遅くしても低下する。
【００９８】
残留有機溶媒が精製された核酸サンプルと共溶離して、下流の処理または試験を阻害するのを防ぐため、フィルターマトリクスの完全な乾燥が推奨される。フィルターチップは遠心分離または減圧濾過では乾燥しないので、乾燥ステップにおいて流量もサイクル数も最大とすることが重要である。
【００９９】
幾何学的配置、フィルターチップ材料およびロボティックチャネルアームとの着接法は各機器の製造者に固有であるので、液状物操作システム毎に異なるフィルターチップ構築が必要とされる。フィルターマトリクスの寸法（直径、厚さおよび孔径）は、あらゆる固相抽出技術について予測されるように、核酸結合能力（および溶離効率）と相関する。１ｍＬフィルターチップに厚い（＞４ｍｍ）マトリクスを包埋して、大容量サンプルの核酸結合能力を高め、且つ／または個別のフィルターチップフォーマット間でマトリクス結合能力を均等化できる一方で、フィルターチップの厚さと（粗溶解液の存在下での）初回結合ステップにおける流量の間にはトレードオフが存在する。したがって、大容量フィルターチップに直径の大きなマトリクスを包埋することが、自動化プロトコルの最初のステップにとって時に有利である（大容量抽出用５ｍＬハミルトン／アコーニＴｒｕＴｉｐｓ（登録商標）など）。しかし、液状物操作ロボットの製造者によって具体的なフィルターチップ構造が指示されると仮定すると、異なる製造者による液状物操作プラットフォーム間、または異なるフィルターチップサイズ間で、フィルターチップ核酸収率が同一となると期待するのは合理的でない。自動化フィルターチッププロトコルの臨床的評価、および市販の自動化システムとの直接比較は、他稿で詳細に報告する予定である。
【０１００】
Ｍａｇ／Ｆｏｒフィルタチッププロセスは、従来法と比較して数多くの利点を有する。第１に、プロセスは自動化に適合する。第２に、フィルターマトリクスをピペットチップ内に封じ込めることによって、交叉汚染を受けにくくする。一方、スピンディスク上の繊維性シリカマトリクスは容易に破裂し、微細な粒子を放出して汚染源となる可能性がある。同様に、精製用磁気ビーズの運動性に依拠する技術も同様のリスクをもたらす。フィルターマトリクスの孔径は比較的大きいため、粘度の高いサンプルを目詰まりさせることなくマトリクスに通過させることができる。複数回の吸引および分注サイクルによって、サンプルに１回のみマトリクスを通過させる遠心分離法と比較して、標的核酸の結合の増加が可能となる。さらに、カオトロピック化学反応によって阻害物質とヌクレアーゼを除去する確立された方法が提供され、長期的に安定となりやすい。
【０１０１】
本発明は、制限的であると解釈すべきでない以下の実施例によってさらに例示される。本願を全体で引用された全ての引用文献、特許明細書および公開特許明細書の内容、さらに図面と表は、参照文献として本願に援用する。
【０１０２】
[実施例１]
（ＭａｇＶｏｒホモジナイゼーションと溶解）
生喀痰中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ芽胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、およびＭＴＢに対するＭａｇＶｏｒシステムの有効性を、ガラスビーズ対サンプル体積ｖ：ｖ比１：１、総サンプル体積１ｍＬ、および３０〜１２０秒間のＭａｇＶｏｒ溶解を用いて試験した。生喀痰からのＭＴＢ  ＤＮＡ抽出は、そのマイコバクテリア細胞壁および低い感染用量（菌体１０個）の観点から特に困難である。溶解の有効性は、ＭａｇＶｏｒ処理前後における同等の生喀痰サンプルの定量的リアルタイムＰＣＲによって推定した。ＭａｇＶｏｒ処理は、未処理サンプル（すなわち同一であるがＭａｇＶｏｒシステムで処理されていない喀痰サンプルの一部）と比較して、核酸検出を平均で２．５サイクル（ほぼｌｏｇ１）改善することが確認された。
【０１０３】
物理的溶解キット構成要素（粒子、攪拌ディスク、コーティング）が核酸抽出および精製に干渉する度合いを検討するため、また４種類のビーズおよび３種類の磁気ディスクの分析を試み、ＭａｇＶｏｒ溶解後に超微細粒子を溶液中に生成しなかった溶解ビーズおよび磁気ディスクを特定した。ＮＰＡサンプルをプールし、リアルタイムＰＣＲで目的の標的ＤＮＡについて陰性であることを確認した後、未処理のメチシリンＭＲＳＡまたはＭＴＢ標的細胞を添加した。検体（０．５ｍＬ）を２セット処理し、５０００ｒｐｍのＭａｇＶｏｒ処理で１０分間溶解した。グアニジンベースの結合バッファーを用いて手動ＭａｇＶｏｒ／フィルターチップ手順で核酸を精製した後、定量的リアルタイムＰＣＲ（またはＲＴ−ＰＣＲ）で分析した。ガラスビーズは容易に溶解チューブの底に沈殿し、これらの試験中ＤＮＡまたはＲＮＡの明らかな阻害または分解は示されなかった。
【０１０４】
表１に示すように、ＭａｇＶｏｒ処理を用いるとき、処理なしの場合と比較して、特に高力価で一定したＤＮＡ回収の改善が得られた。
【０１０５】
（ＭａｇＶｏｒ／フィルターチップの組み合わせによるＭＲＳＡおよびＭＴＢ  ＤＮＡ添加ＮＰＡからのその回収）
【表１】
2018537676.tif 000003
【０１０６】
[実施例３]
（一体型ＭａｇＶｏｒ／フィルターチッププロトタイプのキアゲン核酸精製キットに対する比較）
一体型システムの核酸溶解および精製効率を、同等のキアゲン核酸精製キットと比較して評価した。モデルサンプルの種類はＮＰＡ中のＭＲＳＡ、ＮＰＳ中のインフルエンザＡ、全血由来のヒトゲノムＤＮＡ、およびＮＰＡ中のＭＴＢを含んだ。キアゲンキットはＤＮＡミニキット（機械的溶解はせずプロテイナーゼＫで１０分間処理）、ウイルスＲＮＡミニキット（機械的溶解はせずＲＮＡキャリアーを使用）およびミニ血液キット（プロテイナーゼＫで１０分間インキュベート）を含んだ。キアゲンにはＭＴＢ抽出に特化したキットがないため、ＢＤ  ＧｅｎｅＯｈｍ溶解キットをキアゲンミニＤＮＡ抽出キットと併用した。ＢＤ溶解およびキアゲンキットには投入サンプル容量の制限もあったので、ＮＰＡおよびＮＰＳサンプルは体積２００μＬで処理し、全血は体積１００、１０および１μＬで処理した。反復試薬プレートを調製、密封し、サンプルの種類および力価毎に処理し（１サンプルにつきｎ＝２４抽出）、精製した核酸を定量的リアルタイムＰＣＲで分析し、平均サイクル閾値（Ｃｔ）を同等のキアゲン抽出（１サンプルにつきｎ＝８抽出）から得られたものと比較した。各プレートを用いてポジティブおよびネガティブコントロールを実行し、交叉汚染の可能性を試験した。
【０１０７】
この分析の結果を表２にまとめ、キアゲンキットに匹敵する性能および有効性を立証した。ＮＰＡ中のＭＲＳＡおよびＮＰＳ中のインフルエンザＡの検出の限界は、両システムとも菌体またはビリオン約１０３個／ｍＬであった。ヒトＤＮＡは全血１μＬから容易に回収され、テンプレートコントロールは核酸交叉汚染のエビデンスを示さなかった。これらのデータより、市販の高品質サンプル調製キットと比較して、一体型サンプル調製プロトタイプの拡張性および有効性が立証される。
【０１０８】
（他のＤＮＡ抽出キットと比較したＭａｇＶｏｒフィルターチップシステム（ｎ＝２４）からの核酸回収）
【表２】
2018537676.tif 000004
【０１０９】
[実施例４]
（喀痰液状化）
マイコバクテリア培養に付される検体の大半は、マイコバクテリアよりも迅速に増殖することのできる多様な微生物に汚染されているので、典型的には、呼吸器検体は分析前に消化除染前処理に付される。したがってマイコバクテリアは、最適には、ムチンおよび細胞に捕捉されたマイコバクテリアを放出させながら、汚染細菌を低減または除去する手順の使用により臨床検体から回収される。
【０１１０】
ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ沈殿は、非結核性抗酸菌（ＮＴＭ）の喀痰検体を除染および消化するための標準となっている。しかし、生喀痰からのＭＴＢ  ＤＮＡの抽出は、一方では喀痰の高い粘度と不均一性によって、もう一方ではＭＴＢの破壊しにくい細胞壁のため特に困難である。ＤＮＡ抽出物の輸送は、生喀痰と比較して（冷蔵輸送の点から）輸送の複雑さを低減する。ＮＡＬＣ−ＮａＯＨは実際には消化手順であるが、その一方でＮＡＬＣはその活性を速やかに消失し、毎日新鮮な試薬を再溶解する必要がある。さらに、当該手順は遠心分離を必要とし、これはさらなる複雑さと装置を付け加える。さらに、ＮａＯＨ曝露によってＭＴＢ細胞死が惹起され且つＤＮＡが分解される。
【０１１１】
したがって、生喀痰を処理することに関心を持つユーザーにとって、代替法の役割を果たす可能性のある液状化法を開発することは興味深かった。生喀痰はサンプル容器に移し替えるのが難しい種類の検体であるので、酵素溶液を用いた単一ステップの喀痰液状化手順が開発された。生喀痰１０に対して液状酵素１を添加し、５６℃で１５〜２０分間インキュベートすることにより、不均一性が高く粘稠な喀痰検体であっても液状化されて、５〜１０％グリセロールと同等の粘度となった。これらの液状化された喀痰検体は容易にピペッティングされ、溶解チューブ内の磁気ディスクの回転が止まったり、フィルターチップが詰まったりすることなく、手動ＭａｇＶｏｒおよびフィルターチッププロトコルで処理された。
【０１１２】
[実施例５]
（生喀痰からのＭＴＢ  ＤＮＡの抽出）
図５Ａおよび５Ｂに示す自動化８チャネルプロトタイプシステムを用いて、生ＴＢ陽性喀痰からのＤＮＡ抽出の実現可能性を立証した。Ｔｒｕａｎｔ  ＴＢ蛍光染色を用いて、スメア顕微鏡検査で、個人識別不可能とした患者検体をスメア２＋または４＋のいずれかに判定した。スメア２＋の生喀痰検体４つとスメア４＋喀痰検体４つを、実施例４の液状化プロトコルにしたがって処理した後、ＭａｇＶｏｒチューブに加えた。次に、一体型ＭａｇＶｏｒ／フィルターチッププロトコルを自動化抽出／精製によって実施した。ＩＳ６１１０ｑＰＣＲ分析で溶離液を分析したところ、抽出液の濃度はスメア２＋で３．６±０．７ｐｇ／μｇ、スメア４＋で４９±８ｐｇ／μＬと確認された。このデータより、ＴＢ陽性検体からＤＮＡを抽出するための自動化核酸分離機器の実現可能性が裏付けられる。
【０１１３】
表３は、自動化ＭａｇＶｏｒ／フィルターチップシステムと、手動ＭａｇＶｏｒ／フィルターチップシステムを用いたＭＴＢのリアルタイム検出を比較した連続希釈試験の結果を示す。ＭＴＢ細胞をＴＢ陰性喀痰５００μＬに添加して沈殿させ（ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理喀痰）、このとき菌体１０個は１ｃｆｕ／ｍＬとほぼ等しい。比較を目的として抗酸菌（ＡＦＢ）スメア陽性およびＡＦＢスメア陰性に対応する対応菌体レベルを含めた。
【０１１４】
（手動および自動化ＭａｇＶｏｒ／フィルターチップシステムによるＭＴＢ  ＤＮＡのリアルタイム検出を示す連続希釈試験）
【表３】
2018537676.tif 000005
【０１１５】
上記は、当業者に本発明を実践する方法を教示することを目的としており、本記載を読むとき当業者に明らかとなるその明白な変更および変法の全てを詳述することを意図していない。しかし、そのような明白な変更および変法の全てが、以下の請求項に定義される本発明の範囲内に含まれることが意図されている。請求項は、文脈が反対のことを示されない限り、請求された構成要素およびステップを、そこで意図された目的を満たすのに有効な任意の順で包含することを意図している。
【図１】
2018537676.tif 000006
【図２】
2018537676.tif 000007
【図３】
2018537676.tif 000008
【図４】
2018537676.tif 000009
【図５】
2018537676.tif 000010
【図６】
2018537676.tif 000011
【図７】
2018537676.tif 000012
【国際調査報告】
2018537676.tif 000013