(57)【要約】  ＴＣＲＬ結合ドメインを有する親和性結合体およびその使用方法を提供する。より詳しくは、これらの組成物は、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１＋、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ４、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ９、ＨＬＡ−Ａ２／ＰＡＰまたはＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ＋細胞と結合するものであり、したがって、診断および治療において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原結合ドメインを含む親和性結合体であって、前記抗原結合ドメインはＮ末からＣ末への順に下記ＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１重鎖（ＨＣ）      配列番号３０９        ＳＹＧＶＨ
ＣＤＲ２  ＨＣ            配列番号３１０        ＶＩＷＡＧＧＴＴＮＹＮＳＡＬＭＳ
ＣＤＲ３  ＨＣ            配列番号３１１        ＤＧＨＦＨＦＤＦ
ＣＤＲ１軽鎖（ＬＣ）      配列番号３０３        ＲＡＳＤＩＩＹＳＮＬＡ
ＣＤＲ２  ＬＣ            配列番号３０４        ＡＡＴＮＬＡＡ
ＣＤＲ３  ＬＣ            配列番号３０５        ＱＨＦＷＧＳＳＩＳ
を含み、ＭＨＣ拘束的にＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７と結合可能である、親和性結合体。
【請求項２】
抗原結合ドメインを含む親和性結合体であって、前記抗原結合ドメインはＮ末からＣ末への順に下記ＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１重鎖（ＨＣ）      配列番号２９３        ＴＳＧＭＧＶＳ
ＣＤＲ２  ＨＣ            配列番号２９４        ＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳ
ＣＤＲ３  ＨＣ            配列番号２９５        ＫＤＹＧＳＳＦＹＡＭＨＹ
ＣＤＲ１軽鎖（ＬＣ）      配列番号２８７        ＫＡＳＱＤＩＨＮＹＩＡ
ＣＤＲ２  ＬＣ            配列番号２８８        ＹＴＳＴＬＱＰ
ＣＤＲ３  ＬＣ            配列番号２８９        ＬＱＹＤＮＬＷＴ
を含み、ＭＨＣ拘束的にＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７と結合可能である、親和性結合体。
【請求項３】
抗原結合ドメインを含む親和性結合体であって、前記抗原結合ドメインはＮ末からＣ末への順に下記ＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１  ＨＣ      配列番号３２５        ＳＹＤＭＳ
ＣＤＲ２  ＨＣ      配列番号３２６        ＹＭＳＳＧＧＧＴＹＹＰＤＴＶＫＧ
ＣＤＲ３  ＨＣ      配列番号３２７        ＨＤＥＩＴＮＦＤＹ
ＣＤＲ１  ＬＣ      配列番号３１９        ＲＡＳＱＳＩＳＮＳＬＨ
ＣＤＲ２  ＬＣ      配列番号３２０        ＹＡＳＱＳＩＳ
ＣＤＲ３  ＬＣ      配列番号３２１        ＱＱＳＹＳＷＰＬＴ
を含み、ＭＨＣ拘束的にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１１２６−１３４と結合可能である、親和性結合体。
【請求項４】
抗原結合ドメインを含む親和性結合体であって、前記抗原結合ドメインはＮ末からＣ末への順に下記ＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１  ＨＣ      配列番号３４１        ＧＹＷＩＥ
ＣＤＲ２  ＨＣ      配列番号３４２        ＥＩＬＰＧＳＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＧ
ＣＤＲ３  ＨＣ      配列番号３４３        ＤＳＮＳＦＴＹ
ＣＤＲ１  ＬＣ      配列番号３３５        ＳＶＳＳＳＶＤＹＩＨ
ＣＤＲ２  ＬＣ      配列番号３３６        ＳＴＳＩＬＡＳ
ＣＤＲ３  ＬＣ      配列番号３３７        ＱＱＲＳＳＹＴ
を含み、ＭＨＣ拘束的にＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ４３２８−３４３と結合可能である、親和性結合体。
【請求項５】
抗原結合ドメインを含む親和性結合体であって、前記抗原結合ドメインはＮ末からＣ末への順に下記ＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１  ＨＣ      配列番号３５７        ＦＳＳＳＷＭＮ
ＣＤＲ２  ＨＣ      配列番号３５８        ＲＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＮＥＫＦＫＧ
ＣＤＲ３  ＨＣ      配列番号３５９        ＥＡＴＴＶＶＡＰＹＹＦＤＹ
ＣＤＲ１  ＬＣ      配列番号３５１        ＲＡＳＥＮＩＹＲＮＬＡ
ＣＤＲ２  ＬＣ      配列番号３５２        ＡＡＴＮＬＡＤ
ＣＤＲ３  ＬＣ      配列番号３５３        ＱＨＦＷＧＴＰＬＴ
を含み、ＭＨＣ拘束的にＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ９３４４−３５９と結合可能である、親和性結合体。
【請求項６】
抗原結合ドメインを含む親和性結合体であって、前記抗原結合ドメインはＮ末からＣ末への順に下記ＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１  ＨＣ      配列番号３７３        ＤＹＮＭＤ
ＣＤＲ２  ＨＣ      配列番号３７４        ＤＩＮＰＮＹＤＴＴＴＹＮＱＫＦＫＧ
ＣＤＲ３  ＨＣ      配列番号３７５        ＲＮＹＧＮＹＶＧＦＤＦ
ＣＤＲ１  ＬＣ      配列番号３６７        ＫＡＳＱＲＶＮＮＤＶＡ
ＣＤＲ２  ＬＣ      配列番号３６８        ＹＡＳＮＲＹＴ
ＣＤＲ３  ＬＣ      配列番号３６９        ＱＱＤＹＳＳＰＦＴ
を含み、ＭＨＣ拘束的にＨＬＡ−Ａ２／ＰＡＰ３６０−３７５と結合可能である、親和性結合体。
【請求項７】
抗体、ＣＡＲおよびＴＣＲからなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の親和性結合体。
【請求項８】
抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の親和性結合体。
【請求項９】
ＴＣＲである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の親和性結合体。
【請求項１０】
ＣＡＲである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の親和性結合体。
【請求項１１】
可溶性物質である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の親和性結合体。
【請求項１２】
ヒト化抗体である、請求項７または８に記載の親和性結合体。
【請求項１３】
治療用部分を含む、請求項１〜８、１１〜１２のいずれか一項に記載の親和性結合体。
【請求項１４】
治療用部分を含む、請求項１〜８、１１〜１２のいずれか一項に記載の親和性結合体。
【請求項１５】
検出可能部分を含む、請求項１〜８、１１〜１２のいずれか一項に記載の親和性結合体。
【請求項１６】
前記抗体が単鎖抗体、二重特異性抗体または全長抗体である、請求項７〜８、１１〜１５のいずれか一項に記載の親和性結合体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の親和性結合体をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
シス作用性調節エレメントと作動可能に連結された、請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１８に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の親和性結合体、請求項１８に記載のベクターまたは請求項１９に記載の細胞を含む、医薬組成物。
【請求項２１】
細胞と、請求項７〜８、１１〜１６のいずれか一項に記載の抗体とを、免疫複合体を形成可能な条件下で接触させることを含み、前記免疫複合体の存在またはそのレベルが、がん細胞の指標となる、がん細胞の検出方法。
【請求項２２】
がんの診断および治療を必要とする対象において、がんを診断および治療する方法であって、
（ａ）請求項２１に記載の方法に従って、前記対象におけるがん細胞の存在を検出し、
（ｂ）がん細胞が検出された場合に、前記対象をがんと診断し、
（ｃ）前記対象を抗がん療法で治療する
ことを含む方法。
【請求項２３】
がん診断を必要とする対象のがんを診断する方法であって、前記対象の細胞と、請求項７〜８、１１〜１６のいずれか一項に記載の抗体とを、免疫複合体を形成可能な条件下で接触させることを含み、前記免疫複合体の存在またはそのレベルが、がんの指標となる、がんの診断方法。
【請求項２４】
前記細胞が、皮膚細胞である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
がんの治療方法であって、がん治療を必要とする対象に、治療上有効な量の、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の親和性結合体、請求項１９に記載のベクター、または請求項１９に記載の細胞を投与することによって前記がんを治療することを含む、方法。
【請求項２６】
がんを治療するための医薬の製造における、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の親和性結合体、請求項１９に記載のベクター、または請求項１９に記載の細胞の使用。
【請求項２７】
前記親和性結合体がＴｙｒＤに対するものである場合、前記がんは、黒色腫および神経膠芽腫からなる群より選択されるものである、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法または請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記親和性結合体がＷＴ１に対するものである場合、前記がんは、慢性骨髄球性白血病、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）／骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、中皮腫、卵巣がん、胃腸がん、例えば、結腸直腸がん腺癌、甲状腺がん、乳がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、黒色腫、骨肉腫、子宮内膜がん、前立腺がんおよび神経膠芽腫からなる群より選択されるものである、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法または請求項２６に記載の使用。［請求項２２］前記親和性結合体がＭＡＧＥ−Ａ４に対するものである場合、前記がんは、黒色腫、卵巣がん、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（例えば、ＡＴＬＬ）、精巣がん、頭頸部がん、膀胱がんおよび食道がんからなる群より選択されるものである、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法または請求項２６に記載の使用。
【請求項２９】
前記親和性結合体がＭＡＧＥ−Ａ９に対するものである場合、前記がんは、腎細胞癌、膀胱がん、乳がんおよび肝細胞癌腫からなる群より選択されるものである、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法または請求項２６に記載の使用。
【請求項３０】
前記親和性結合体がＰＡＰに対するものである場合、前記がんは、前立腺がんからなる群より選択される、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法または請求項２６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態では、高親和性および微細特異性を有するＴＣＲ様抗体結合ドメインを含む親和性結合体ならびにその使用に関する。
【０００２】
腫瘍およびウイルス感染細胞は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞によって認識され、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞は、それに応じて、これらの細胞を排除するように活性化される。クロノタイプＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、活性化されるために、膜表面主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される特異的ペプチド抗原と遭遇する必要がある。悪性形質転換を経たか、またはウイルスに感染した細胞は、そのＭＨＣクラスＩ分子上に、腫瘍関連抗原またはウイルスタンパク質に由来するペプチドを提示する。したがって、疾患特異的ＭＨＣ−ペプチド複合体は、免疫治療アプローチの望ましい標的である。このようなアプローチの１つは、ＴＣＲ独特の、ＭＨＣ−ペプチド複合体に対する微細特異性ではあるが、低い固有の親和性を、腫瘍またはウイルスエピトープに対するＴＣＲ様特異性を付与された高親和性可溶性抗体分子に変換する。ＴＣＲ様抗体と呼ばれるこれらの抗体は、腫瘍およびウイルス感染細胞を標的とし、その特異的死滅を媒介することのできる新規クラスの免疫治療薬として開発されている。ＴＣＲ様抗体は、その治療能力に加え、がんおよび感染性疾患の診断試薬としても開発されており、ＭＨＣクラスＩ抗原提示を研究するための価値ある研究ツールとして機能する。
【発明の概要】
【０００３】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、抗原結合ドメインを含む親和性結合体であって、抗原結合ドメインはＮ末からＣ末への順に下記ＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１重鎖（ＨＣ）      配列番号３０９        ＳＹＧＶＨ
ＣＤＲ２  ＨＣ            配列番号３１０        ＶＩＷＡＧＧＴＴＮＹＮＳＡＬＭＳ
ＣＤＲ３  ＨＣ            配列番号３１１        ＤＧＨＦＨＦＤＦ
ＣＤＲ１軽鎖（ＬＣ）      配列番号３０３        ＲＡＳＤＩＩＹＳＮＬＡ
ＣＤＲ２  ＬＣ            配列番号３０４        ＡＡＴＮＬＡＡ
ＣＤＲ３  ＬＣ            配列番号３０５        ＱＨＦＷＧＳＳＩＳ
を含み、ＭＨＣ拘束的にＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７と結合可能である、親和性結合体が提供される。
【０００４】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、抗原結合ドメインを含む親和性結合体であって、抗原結合ドメインはＮ末からＣ末への順に下記ＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１重鎖（ＨＣ）      配列番号２９３        ＴＳＧＭＧＶＳ
ＣＤＲ２  ＨＣ            配列番号２９４        ＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳ
ＣＤＲ３  ＨＣ            配列番号２９５        ＫＤＹＧＳＳＦＹＡＭＨＹ
ＣＤＲ１軽鎖（ＬＣ）      配列番号２８７        ＫＡＳＱＤＩＨＮＹＩＡ
ＣＤＲ２  ＬＣ            配列番号２８８        ＹＴＳＴＬＱＰ
ＣＤＲ３  ＬＣ            配列番号２８９        ＬＱＹＤＮＬＷＴ
を含み、ＭＨＣ拘束的にＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７と結合可能である、親和性結合体が提供される。
【０００５】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、抗原結合ドメインを含む親和性結合体であって、前記抗原結合ドメインはＮ末からＣ末への順に下記ＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１  ＨＣ      配列番号３２５        ＳＹＤＭＳ
ＣＤＲ２  ＨＣ      配列番号３２６        ＹＭＳＳＧＧＧＴＹＹＰＤＴＶＫＧ
ＣＤＲ３  ＨＣ      配列番号３２７        ＨＤＥＩＴＮＦＤＹ
ＣＤＲ１  ＬＣ      配列番号３１９        ＲＡＳＱＳＩＳＮＳＬＨ
ＣＤＲ２  ＬＣ      配列番号３２０        ＹＡＳＱＳＩＳ
ＣＤＲ３  ＬＣ      配列番号３２１        ＱＱＳＹＳＷＰＬＴ
を含み、ＭＨＣ拘束的にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１１２６−１３４と結合可能である、親和性結合体が提供される。
【０００６】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、抗原結合ドメインを含む親和性結合体であって、抗原結合ドメインはＮ末からＣ末への順に下記ＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１  ＨＣ      配列番号３４１        ＧＹＷＩＥ
ＣＤＲ２  ＨＣ      配列番号３４２        ＥＩＬＰＧＳＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＧ
ＣＤＲ３  ＨＣ      配列番号３４３        ＤＳＮＳＦＴＹ
ＣＤＲ１  ＬＣ      配列番号３３５        ＳＶＳＳＳＶＤＹＩＨ
ＣＤＲ２  ＬＣ      配列番号３３６        ＳＴＳＩＬＡＳ
ＣＤＲ３  ＬＣ      配列番号３３７        ＱＱＲＳＳＹＴ
を含み、ＭＨＣ拘束的にＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ４３２８−３４３と結合可能である、親和性結合体が提供される。
【０００７】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、抗原結合ドメインを含む親和性結合体であって、抗原結合ドメインはＮ末からＣ末への順に下記ＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１  ＨＣ      配列番号３５７        ＦＳＳＳＷＭＮ
ＣＤＲ２  ＨＣ      配列番号３５８        ＲＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＮＥＫＦＫＧ
ＣＤＲ３  ＨＣ      配列番号３５９        ＥＡＴＴＶＶＡＰＹＹＦＤＹ
ＣＤＲ１  ＬＣ      配列番号３５１        ＲＡＳＥＮＩＹＲＮＬＡ
ＣＤＲ２  ＬＣ      配列番号３５２        ＡＡＴＮＬＡＤ
ＣＤＲ３  ＬＣ      配列番号３５３        ＱＨＦＷＧＴＰＬＴ
を含み、ＭＨＣ拘束的にＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ９３４４−３５９と結合可能である、親和性結合体が提供される。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、抗原結合ドメインを含む親和性結合体であって、抗原結合ドメインはＮ末からＣ末への順に下記ＣＤＲ配列：
ＣＤＲ１  ＨＣ      配列番号３７３        ＤＹＮＭＤ
ＣＤＲ２  ＨＣ      配列番号３７４        ＤＩＮＰＮＹＤＴＴＴＹＮＱＫＦＫＧ
ＣＤＲ３  ＨＣ      配列番号３７５        ＲＮＹＧＮＹＶＧＦＤＦ
ＣＤＲ１  ＬＣ      配列番号３６７        ＫＡＳＱＲＶＮＮＤＶＡ
ＣＤＲ２  ＬＣ      配列番号３６８        ＹＡＳＮＲＹＴ
ＣＤＲ３  ＬＣ      配列番号３６９        ＱＱＤＹＳＳＰＦＴ
を含み、ＭＨＣ拘束的にＨＬＡ−Ａ２／ＰＡＰ３６０−３７５と結合可能である、親和性結合体が提供される。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、親和性結合体は、抗体、ＣＡＲおよびＴＣＲからなる群より選択される。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、親和性結合体は、抗体である。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、親和性結合体は、ＴＣＲである。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、親和性結合体は、ＣＡＲである。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、親和性結合体は、可溶性物質である。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、親和性結合体は、ヒト化抗体である。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、親和性結合体は、治療用部分を含む。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、親和性結合体は、検出可能部分を含む。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体は、単鎖抗体、二重特異性抗体または全長抗体である。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、親和性結合体をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、シス作用性調節エレメントと作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む細胞が提供される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、親和性結合体、ベクターまたは細胞を含む医薬組成物が提供される。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、細胞と抗体とを、免疫複合体を形成可能な条件下で接触させることを含み、免疫複合体の存在またはそのレベルが、がん細胞の指標となる、がん細胞の検出方法が提供される。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、がんの診断および治療を必要とする対象において、がんを診断および治療する方法であって、
（ａ）上記方法に従って、対象におけるがん細胞の存在を検出し、
（ｂ）がん細胞が検出された場合に、対象をがんと診断し、
（ｃ）対象を抗がん療法で治療する
ことを含む方法が提供される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、がんの診断を必要とする対象においてがんを診断する方法であって、対象の細胞と抗体とを、免疫複合体を形成可能な条件下で接触させることを含み、免疫複合体の存在またはそのレベルががんの指標となる、方法が提供される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は、皮膚細胞である。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、がんの治療方法であって、がん治療を必要とする対象に、治療上有効な量の親和性結合体、ベクター、または細胞を投与することによって、がんを治療することを含む方法が提供される。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、がんを治療するための医薬の製造における、親和性結合体、ベクターまたは細胞の使用が提供される。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、親和性結合体はＴｙｒＤに対するものであり、がんは、黒色腫および神経膠芽腫からなる群より選択されるものである。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、親和性結合体はＷＴ１に対するものであり、がんは、慢性骨髄球性白血病、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）／骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、中皮腫、卵巣がん、胃腸がん、例えば、結腸直腸がん腺癌、甲状腺がん、乳がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、黒色腫、骨肉腫、子宮内膜がん、前立腺がんおよび神経膠芽腫からなる群より選択されるものである。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、親和性結合体がＭＡＧＥ−Ａ４に対するものである場合、がんは、黒色腫、卵巣がん、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（例えば、ＡＴＬＬ）、精巣がん、頭頸部がん、膀胱がんおよび食道がんからなる群より選択されるものである。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、親和性結合体はＭＡＧＥ−Ａ９に対するものであり、がんは、腎細胞癌、膀胱がん、乳がんおよび肝細胞癌腫からなる群より選択されるものである。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、親和性結合体はＰＡＰに対するものであり、がんは、前立腺がんからなる群より選択されるものである。
【００３３】
別段の指定がない限り、本明細書で使用される全ての技術的および／または科学的な用語は、本発明が関連する当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で説明したものに類似した、または同等な方法および材料も本発明の実施形態の実施または試験で使用することができるが、例示的な方法および／または材料が後述される。矛盾がある場合、定義を含めて本特許明細書が優先される。加えて、材料、方法、および実施例は単なる例示にすぎず、必ずしも限定を意図するものではない。
【００３４】
単なる例示として、添付の図面を参照しながら、本発明のいくつかの実施形態について記載する。ここで、具体的な図面に詳細に参照するが、ここに示す詳細は例示に過ぎず、本発明の実施形態を例証するための考察を目的とすることを強調する。この観点から、図面とともに本記載を検討することで、当業者には、いかに本発明の実施形態を実施するかが明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼ複合体を標的とするＴＣＲ様抗体の見かけの結合親和性の決定。抗マウスまたはヒトＩｇＧを用いて、精製ＩｇＧをＳＰＲセンサーチップに間接的に固定化した。分析物は、大腸菌によって発現されたｓｃＨＬＡ−Ａ２複合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ再フォールディングによって生成した、精製組み換え単鎖ＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼ複合体であった。
【図２】アラニンスキャニングによるＴＣＲ様抗体のエピトープ特異性の決定。チロシナーゼペプチド配列の１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位および８位をアラニンで置換した。Ａｌａで変異されたペプチドを合成し、Ｔ２細胞ＡＰＣ上に、１０−４〜１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。濃度１０μｇ／ｍｌのＴＣＲ様抗体の結合をフローサイトメトリーによって評価し、平均蛍光強度の測定によって求められる結合強度を測定し、ＷＴ天然チロシナーゼペプチドに対する結合強度と比較した。各位置のＡｌａ置換の相対効果を、ＷＴペプチドとの結合に対するパーセンテージとして評価した。
【図３−１】Ｄ１１およびＤ７  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼペプチドおよび対照ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−４〜１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用してフローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図３−２】Ｄ１１およびＤ７  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼペプチドおよび対照ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−４〜１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用してフローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図４−１】Ｄ１１およびＤ７  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼペプチドおよび対照ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−４〜１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用してフローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図４−２】Ｄ１１およびＤ７  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼペプチドおよび対照ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−４〜１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用してフローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図５−１】Ｄ１１  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼペプチドおよび対照ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−４〜１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用してフローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図５−２】Ｄ１１  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼペプチドおよび対照ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−４〜１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用してフローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図６−１】Ｄ７  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼペプチドおよび対照ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−４〜１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用してフローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図６−２】Ｄ７  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼペプチドおよび対照ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−４〜１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用してフローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図７−１】ＭＣ１  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼペプチドおよび対照ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−４〜１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用してフローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図７−２】ＭＣ１  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼペプチドおよび対照ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−４〜１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用してフローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図８−１】ＭＣ１  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼを発現する黒色腫細胞との結合。ＴＣＲ様抗体ＭＣ１の結合について、二次ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧを使用して、黒色腫細胞をフローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図８−２】ＭＣ１  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼを発現する黒色腫細胞との結合。ＴＣＲ様抗体ＭＣ１の結合について、二次ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧを使用して、黒色腫細胞をフローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図９−１】ＭＣ１  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋およびチロシナーゼ抗原陽性または陰性細胞との結合。ＴＣＲ様抗体ＭＣ１の結合について、二次ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧを使用して、ＨＬＡ−Ａ２を発現し、チロシナーゼについて陽性または陰性である腫瘍細胞をフローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図９−２】ＭＣ１  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋およびチロシナーゼ抗原陽性または陰性細胞との結合。ＴＣＲ様抗体ＭＣ１の結合について、二次ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧを使用して、ＨＬＡ−Ａ２を発現し、チロシナーゼについて陽性または陰性である腫瘍細胞をフローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図１０−１】Ｄ１１およびＤ７  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋およびチロシナーゼ抗原陽性または陰性細胞との結合。ＴＣＲ様抗体ＭＣ１の結合について、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、ＨＬＡ−Ａ２を発現し、チロシナーゼについて陽性または陰性である腫瘍細胞をフローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図１０−２】Ｄ１１およびＤ７  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋およびチロシナーゼ抗原陽性または陰性細胞との結合。ＴＣＲ様抗体ＭＣ１の結合について、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、ＨＬＡ−Ａ２を発現し、チロシナーゼについて陽性または陰性である腫瘍細胞をフローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図１０−３】Ｄ１１およびＤ７  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋およびチロシナーゼ抗原陽性または陰性細胞との結合。ＴＣＲ様抗体ＭＣ１の結合について、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、ＨＬＡ−Ａ２を発現し、チロシナーゼについて陽性または陰性である腫瘍細胞をフローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図１０−４】Ｄ１１およびＤ７  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋およびチロシナーゼ抗原陽性または陰性細胞との結合。ＴＣＲ様抗体ＭＣ１の結合について、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、ＨＬＡ−Ａ２を発現し、チロシナーゼについて陽性または陰性である腫瘍細胞をフローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図１１】Ｄ１１およびＤ７  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋およびチロシナーゼ陰性細胞との結合。ＨＬＡ−Ａ２を発現し、チロシナーゼについては陰性である腫瘍細胞を、ＴＣＲ様抗体ＭＣ１の結合については二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図１２−１】Ｄ１１、Ｄ７およびＭＣ１  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋およびチロシナーゼ陽性または陰性細胞との相対的な結合。ＴＣＲ様抗体Ｄ１１、Ｄ７およびＭＣ１の結合について、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、ＨＬＡ−Ａ２を発現し、チロシナーゼについて陽性または陰性である腫瘍細胞をフローサイトメトリーでモニタリングした。
【図１２−２】Ｄ１１、Ｄ７およびＭＣ１  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋およびチロシナーゼ陽性または陰性細胞との相対的な結合。ＴＣＲ様抗体Ｄ１１、Ｄ７およびＭＣ１の結合について、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、ＨＬＡ−Ａ２を発現し、チロシナーゼについて陽性または陰性である腫瘍細胞をフローサイトメトリーでモニタリングした。
【図１２−３】Ｄ１１、Ｄ７およびＭＣ１  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋およびチロシナーゼ陽性または陰性細胞との相対的な結合。ＴＣＲ様抗体Ｄ１１、Ｄ７およびＭＣ１の結合について、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、ＨＬＡ−Ａ２を発現し、チロシナーゼについて陽性または陰性である腫瘍細胞をフローサイトメトリーでモニタリングした。
【図１２−４】Ｄ１１、Ｄ７およびＭＣ１  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋およびチロシナーゼ陽性または陰性細胞との相対的な結合。ＴＣＲ様抗体Ｄ１１、Ｄ７およびＭＣ１の結合について、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、ＨＬＡ−Ａ２を発現し、チロシナーゼについて陽性または陰性である腫瘍細胞をフローサイトメトリーでモニタリングした。
【図１３−１】Ｄ１１  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋／チロシナーゼ陰性正常一次細胞との結合。ＴＣＲ様抗体  Ｄ１１の結合について、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、ＨＬＡ−Ａ２を発現し、チロシナーゼについて陰性であると示される組織学的起源の一次正常細胞をフローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用して、ＨＬＡ−Ａ２の発現をモニタリングした。
【図１３−２】Ｄ１１  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋／チロシナーゼ陰性正常一次細胞との結合。ＴＣＲ様抗体  Ｄ１１の結合について、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、ＨＬＡ−Ａ２を発現し、チロシナーゼについて陰性であると示される組織学的起源の一次正常細胞をフローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用して、ＨＬＡ−Ａ２の発現をモニタリングした。
【図１４】Ｄ１１  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋／チロシナーゼ陰性正常一次細胞との結合。ＴＣＲ様抗体  Ｄ１１の結合について、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、ここに示した組織学的起源であり、ＨＬＡ−Ａ２を発現し、チロシナーゼについて陰性である一次正常細胞をフローサイトメトリーでモニタリングした。
【図１５】Ｄ７  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋／チロシナーゼ陰性正常一次細胞との結合。ＴＣＲ様抗体  Ｄ７の結合について、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、ここに示した組織学的起源であり、ＨＬＡ−Ａ２を発現し、チロシナーゼについて陰性である一次正常細胞をフローサイトメトリーでモニタリングした。
【図１６】ＢＢ７．２と、正常一次細胞との結合。ＨＬＡ−Ａ２の発現について、ＭＡｂ  ＢＢ７．２および二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、組織学的起源の一次正常細胞をフローサイトメトリーでモニタリングした。
【図１７−１】ＭＣ１、Ｄ１１およびＤ７  ＴＣＲ様抗体と、正常ＰＢＭＣとの結合。ＰＣＲによって、ＰＢＭＣのＨＬＡ−Ａ２ホモまたはヘテロ接合性に関する特徴付けを行った。ＴＣＲ様抗体の結合を、ＰＥ標識二次抗マウスＩｇＧによってモニタリングした。
【図１７−２】ＭＣ１、Ｄ１１およびＤ７  ＴＣＲ様抗体と、正常ＰＢＭＣとの結合。ＰＣＲによって、ＰＢＭＣのＨＬＡ−Ａ２ホモまたはヘテロ接合性に関する特徴付けを行った。ＴＣＲ様抗体の結合を、ＰＥ標識二次抗マウスＩｇＧによってモニタリングした。
【図１８】Ｄ１１  ＴＣＲ様抗体の選択性の概要。Ｄ１１  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋抗原陽性および陰性細胞との結合を、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用してモニタリングした。＋／−は、ＰＣＲによって測定される、チロシナーゼｍＲＮＡ遺伝子発現を示す。ＭＡｂ  ＢＢ７．２を用いてＨＬＡ−Ａ２発現をモニタリングした。
【図１９】Ｄ７  ＴＣＲ様抗体の選択性の概要。Ｄ７  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋抗原陽性および陰性細胞との結合を、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用してモニタリングした。＋／−は、ＰＣＲによって測定される、チロシナーゼｍＲＮＡ遺伝子発現を示す。ＭＡｂ  ＢＢ７．２を用いてＨＬＡ−Ａ２発現をモニタリングした。
【図２０】ＭＣ１、Ｄ１１およびＤ７  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼペプチドおよびチロシナーゼ類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−４Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。
【図２１−１】Ｄ１１  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼペプチド類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図２１−２】Ｄ１１  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼペプチド類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図２２−１】Ｄ１１  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼペプチド類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図２２−２】Ｄ１１  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼペプチド類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図２３−１】Ｄ１１  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼペプチド類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図２３−２】Ｄ１１  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼペプチド類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図２４−１】Ｄ１１  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼ類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図２４−２】Ｄ１１  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼ類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図２５−１】Ｄ７  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼ類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図２５−２】Ｄ７  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼ類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図２６−１】Ｄ７  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼ類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図２６−２】Ｄ７  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼ類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図２７−１】Ｄ７  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼ類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図２７−２】Ｄ７  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼ類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図２８−１】Ｄ７  ＴＣＲ様抗体と、アラニンスキャニング後に同定されたチロシナーゼ類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチド（Ａｌａ変異ペプチドＤ７のエピトープ認識特異性に従って選択したもの）を、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用してフローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図２８−２】Ｄ７  ＴＣＲ様抗体と、アラニンスキャニング後に同定されたチロシナーゼ類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、チロシナーゼペプチドおよびここに記載したペプチド（Ａｌａ変異ペプチドＤ７のエピトープ認識特異性に従って選択したもの）を、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用してフローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図２９】ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１複合体を標的とするＴＣＲ様抗体Ｂ４７Ｂ６の見かけの結合親和性の決定。抗マウスを用いて、精製ＩｇＧをＳＰＲセンサーチップに間接的に固定化した。分析物は、大腸菌によって発現されたｓｃＨＬＡ−Ａ２複合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ再フォールディングによって生成した、精製組み換え単鎖ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１複合体であった。
【図３０】Ｂ４７およびＥＳＫ１  ＴＣＲ様抗体と、ＷＴ１  ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、ＷＴ１を１０−４〜１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ（Ｂ４７について）またはヒトＩｇＧ（ＥＳＫ１について）を使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図３１−１】Ｂ４７およびＥＳＫ１  ＴＣＲ様抗体と、ＷＴ１ペプチドおよび対照ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、ＷＴ１ペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−４Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ（Ｂ４７について）またはヒトＩｇＧ（ＥＳＫ１について）を使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図３１−２】Ｂ４７およびＥＳＫ１  ＴＣＲ様抗体と、ＷＴ１ペプチドおよび対照ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、ＷＴ１ペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−４Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ（Ｂ４７について）またはヒトＩｇＧ（ＥＳＫ１について）を使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を使用してモニタリングした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図３２−１】Ｂ４７およびＥＳＫ１  ＴＣＲ様抗体と、ＷＴ１類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、ＷＴ１ペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−４〜１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ（Ｂ４７について）またはヒトＩｇＧ（ＥＳＫ１について）を使用してフローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図３２−２】Ｂ４７およびＥＳＫ１  ＴＣＲ様抗体と、ＷＴ１類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、ＷＴ１ペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−４〜１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ（Ｂ４７について）またはヒトＩｇＧ（ＥＳＫ１について）を使用してフローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図３３−１】Ｂ４７  ＴＣＲ様抗体と、ＷＴ１ペプチドまたは対照ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、ＷＴ１ペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−４Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図３３−２】Ｂ４７  ＴＣＲ様抗体と、ＷＴ１ペプチドまたは対照ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、ＷＴ１ペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−４Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図３４−１】Ｂ４７  ＴＣＲ様抗体と、ＷＴ１類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、ＷＴ１ペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−４〜１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図３４−２】Ｂ４７  ＴＣＲ様抗体と、ＷＴ１類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、ＷＴ１ペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−４〜１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用して、フローサイトメトリーでモニタリングした。ＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合は、ペプチド負荷効率の測定を確実にした。
【図３５−１】Ｂ４７およびＥＳＫ１  ＴＣＲ様抗体と、ＷＴ１を発現するか、または発現しないＨＬＡ−Ａ２陽性細胞との結合。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ（Ｂ４７について）またはヒトＩｇＧ（ＥＳＫ１について）を使用してフローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現を、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を用いて評価した。
【図３５−２】Ｂ４７およびＥＳＫ１  ＴＣＲ様抗体と、ＷＴ１を発現するか、または発現しないＨＬＡ−Ａ２陽性細胞との結合。結合を、二次ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ（Ｂ４７について）またはヒトＩｇＧ（ＥＳＫ１について）を使用してフローサイトメトリーでモニタリングした。ＨＬＡ−Ａ２の発現を、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を用いて評価した。
【図３６】Ｂ４７  ＴＣＲ様抗体選択性の概要。Ｂ４７  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋抗原陽性および陰性細胞との結合を、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧを使用してモニタリングした。＋／−は、ＰＣＲによって測定されるＷＴ１  ｍＲＮＡ遺伝子発現を示す。ＨＬＡ−Ａ２発現は、ＭＡｂ  ＢＢ７．２を用いてモニタリングした。
【図３７】アラニンスキャニングによる、ＴＣＲ様抗体のエピトープ特異性の決定。ＷＴ１ペプチド配列の１位、３位、４位、５位、７位および８位をアラニンで置換した。Ａｌａ変異されたペプチドを合成し、ＴＣＲ様抗体ＥＳＫ１の負荷されたＡＰＣ結合を、フローサイトメトリーによって評価し、平均蛍光強度の測定によって求められる結合強度を測定し、ＷＴ天然ＷＴ１ペプチドに対する結合強度と比較した。各位置のＡｌａ置換の相対効果を、ＷＴペプチドとの結合に対するパーセンテージとして評価した。Dao et al. Sci Transl Med 5, 176ra33 (2013)からのデータ。
【図３８】Ｄ１１、Ｄ７およびビオチン化ＭＣ１と、チロシナーゼペプチドおよびチロシナーゼ類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｓ１７−Ｓ２３は、アラニンに基づく類似ペプチドである。Ｔ２細胞に、チロシナーゼおよびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。細胞を濃度１０μｇ／ｍｌのＴＣＲＬ抗体、およびそれに続く二次ＰＥ標識ストレプトアビジン／抗マウス抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図３９】Ｄ１１、Ｄ７およびＭＣ１  ＴＣＲ様抗体と、チロシナーゼペプチドおよびチロシナーゼ類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。ＫＩＡＡ０３５５、Ｓ７、Ｓ１７−Ｓ２３は、アラニンに基づく類似ペプチドである。Ｔ２細胞に、チロシナーゼおよびここに示したぺプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。細胞を、濃度１０μｇ／ｍｌのＴＣＲＬ抗体、およびそれに続く二次ＰＥ標識ストレプトアビジン／抗マウス抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図４０Ａ】Ｄ１１  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋、チロシナーゼ抗原陽性または陰性細胞との結合。腫瘍およびＨＬＡ−Ａ２を発現する正常一次細胞を、チロシナーゼｍＲＮＡ発現についてｑＰＣＲによって試験した。腫瘍細胞を、濃度１０μｇ／ｍｌのここに記載のＴＣＲ様抗体、およびそれに続く二次ＰＥ標識ストレプトアビジン／抗マウス抗体とで染色し、フローサイトメトリーによって解析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図４０Ｂ】Ｄ７  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋、チロシナーゼ抗原陽性または陰性細胞との結合。腫瘍およびＨＬＡ−Ａ２を発現する正常一次細胞を、チロシナーゼｍＲＮＡ発現についてｑＰＣＲによって試験した。腫瘍細胞を、濃度１０μｇ／ｍｌのここに記載のＴＣＲ様抗体、およびそれに続く二次ＰＥ標識ストレプトアビジン／抗マウス抗体とで染色し、フローサイトメトリーによって解析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図４０Ｃ】ビオチン化ＭＣ１  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋、チロシナーゼ抗原陽性または陰性細胞との結合。腫瘍およびＨＬＡ−Ａ２を発現する正常一次細胞を、チロシナーゼｍＲＮＡ発現についてｑＰＣＲによって試験した。腫瘍細胞を、濃度１０μｇ／ｍｌのここに記載のＴＣＲ様抗体、およびそれに続く二次ＰＥ標識ストレプトアビジン／抗マウス抗体とで染色し、フローサイトメトリーによって解析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図４１】Ｔｙｒ  Ｄ１１  ＢＳ  ＴＣＲＬと呼ばれる抗ＣＤ−３アームおよびＤ１１アームを有する二重特異性（ＢＳ）ＴＣＲＬによる、ＨＬＡ−Ａ２＋／チロシナーゼ＋（陽性）細胞株およびＨＬＡ−Ａ２＋／チロシナーゼ−（陰性）細胞株の死滅。Ｔｙｒ  Ｄ１１  ＢＳ  ＴＣＲＬを、黒色腫  ＨＬＡ−Ａ２＋／チロシナーゼ＋細胞およびＨＬＡ−Ａ２＋／チロシナーゼ−である対照腫瘍細胞とともにインキュベートした。Ｅ：Ｔ比を１０：１（エフェクター：標的比を１０：１）として、細胞を、Ｔｙｒ  Ｄ１１  ＢＳ  ＴＣＲＬおよび健常個体から単離した未処理ＰＢＭＣとともに２４時間インキュベートした。細胞傷害性は、乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイによって決定した。
【図４２】Ｔｙｒ  Ｄ１１によるＨＬＡ−Ａ２＋／チロシナーゼ−正常一次細胞の死滅。ＢＳ  Ｄ１１を、対照となる黒色腫ＨＬＡ−Ａ２＋／チロシナーゼ＋細胞、およびＨＬＡ−Ａ２＋／チロシナーゼ−である正常一次細胞とともにインキュベートした。Ｅ：Ｔ比を１０：１として、細胞を、Ｄ１１  ＢＳ  ＴＣＲＬおよび健常個体から単離した未処理ＰＢＭＣとともに２４時間インキュベートした。
【図４３】Ｔｙｒ  Ｄ７  ＢＳ  ＴＣＲＬによるＨＬＡ−Ａ２＋／チロシナーゼ＋細胞株およびＨＬＡ−Ａ２＋／チロシナーゼ−細胞株の死滅。Ｄ７  ＢＳを、黒色腫ＨＬＡ−Ａ２＋／チロシナーゼ＋細胞および対照腫瘍細胞となるＨＬＡ−Ａ２＋／チロシナーゼ−の細胞とともにインキュベートした。Ｅ：Ｔ比を１０：１として、細胞を、Ｄ７  ＢＳおよび健常個体から単離した未処理ＰＢＭＣとともに２４時間インキュベートした。
【図４４】Ｄ７  ＢＳによるＨＬＡ−Ａ２＋／チロシナーゼ−正常一次細胞の死滅。Ｄ７  ＢＳを、対照となる黒色腫ＨＬＡ−Ａ２＋／チロシナーゼ＋細胞、およびＨＬＡ−Ａ２＋／チロシナーゼ−である正常一次細胞とともにインキュベートした。Ｅ：Ｔ比を１０：１として、細胞を、Ｄ７  ＢＳおよび健常個体から単離した未処理ＰＢＭＣとともに２４時間インキュベートした。
【図４５】ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける、Ｓ．Ｃ．５０１Ａ黒色腫の腫瘍形成防止に対するＤ７  ＢＳのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性。
【図４６】ビオチン化ＥＳＫ１およびＢ４７Ｂ６  ＴＣＲ様抗体と、ＷＴ１ペプチドおよびその他のＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、ＷＴ１ペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。細胞を、濃度１０μｇ／ｍｌのＥＳＫ１またはＢ４７Ｂ６  ＴＣＲＬ抗体、およびそれに続く二次ＰＥ標識ストレプトアビジン／抗マウス抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図４７】ＥＳＫ１およびＢ４７Ｂ６  ＴＣＲ様抗体と、ＷＴ１ペプチドおよびＷＴ１類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｓ２、Ｓ６およびＳ７は、アラニンに基づく類似ペプチドである。Ｓ１１は、ヘテロクリティックペプチドである。Ｔ２細胞に、ＷＴ１ペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。細胞を、濃度１０μｇ／ｍｌのＥＳＫ１またはＢ４７Ｂ６  ＴＣＲＬ抗体、およびそれに続く二次ＰＥ標識ストレプトアビジン／抗マウス抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図４８】ＳＰＲによる、親和性−ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１複合体を標的とするＥＳＫ１およびＢ４７Ｂ６  ＴＣＲ様抗体の見かけの結合親和性の決定。大腸菌によって発現されたｓｃＨＬＡ−Ａ２複合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ再フォールディングによって生成した精製組み換えビオチン化単鎖ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１複合体を、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎを用いて、ＳＰＲセンサーチップに間接的に固定化した。精製ＥＳＫ１およびＢ４７Ｂ６  ＴＣＲＬ  Ｆａｂを、分析物とした。
【図４９】アラニンスキャニング変異誘発によるエピトープ特異性の決定。１位、２位、３位、４位、５位、７位、８位および９位にアラニン置換を有する変異体ＷＴ１ペプチドを合成し、１０−５Ｍの濃度で、Ｔ２細胞ＡＰＣに３７℃で１２時間負荷した。細胞を、濃度１０μｇ／ｍｌのＢ４７Ｂ６  ＴＣＲ様抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。各位置のＡｌａ置換の相対効果を、野生型ペプチドに対する結合のパーセンテージとして表した。
【図５０】ＥＳＫ１およびＢ４７Ｂ６  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋およびＷＴ１  ｍＲＮＡ陽性または陰性の細胞との結合。ＨＬＡ−Ａ２を発現する腫瘍細胞のＷＴ１  ｍＲＮＡ発現について、ｑＰＣＲによって試験した。腫瘍細胞を、１０μｇ／ｍｌのビオチン化ＥＳＫ１およびＢ４７Ｂ６  ＴＣＲＬ抗体、およびそれに続く二次ＰＥ標識ストレプトアビジンで染色した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。また、本明細書において記載したような、抗体の二重特異性形態（抗ＣＤ３を有する）を用いた場合の、ｍＲＮＡ発現データおよび細胞死滅も示した。
【図５１Ａ】Ｂ４７Ｂ６  ＢＳ対ＥＳＫ１  ＢＳによる、ＨＬＡ−Ａ２＋／ＷＴ１＋正常一次細胞およびＨＬＡ−Ａ２＋／ＷＴ１−正常一次細胞の死滅。Ｂ４７Ｂ６  ＢＳおよびＥＳＫ１  ＢＳを、ＨＬＡ−Ａ２＋／ＷＴ１＋またはＨＬＡ−Ａ２＋／ＷＴ１−である正常一次細胞とともにインキュベートした。Ｅ：Ｔ比を１０：１として、細胞を、Ｂ４７Ｂ６  ＢＳまたはＥＳＫ１  ＢＳと、および健常個体から単離した未処理ＰＢＭＣとともに２４時間インキュベートした。細胞傷害性を、ＬＤＨ放出アッセイによって決定した。
【図５１Ｂ】Ｂ４７Ｂ６  ＢＳ対ＥＳＫ１  ＢＳによる、ＨＬＡ−Ａ２＋／ＷＴ１＋細胞株およびＨＬＡ−Ａ２＋／ＷＴ１−細胞株の死滅。Ｂ４７Ｂ６  ＢＳおよびＥＳＫ１  ＢＳを、ＨＬＡ−Ａ２＋／ＷＴ１＋またはＨＬＡ−Ａ２＋／ＷＴ１−である腫瘍細胞とともにインキュベートした。Ｅ：Ｔ比を１０：１として、細胞を、Ｂ４７Ｂ６  ＢＳまたはＥＳＫ１  ＢＳ、および健常個体から単離した未処理ＰＢＭＣとともに２４時間インキュベートした（＃Ｆ３フォーマット：  抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ断片が、ＦａｂのＶＬＣＬと融合されたもの）。
【図５２】Ｃ１０６Ｂ９  ＴＣＲ様抗体と、ＭＡＧＥ−Ａ４２３０−２３９（ＭＡＧＥ−Ａ４ペプチドとも呼ばれる）ペプチドおよびその他のＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、ＭＡＧＥ−Ａ４およびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。細胞を、１０μｇ／ｍｌのＣ１０６Ｂ９  ＴＣＲＬ抗体、およびそれに続く二次ＰＥ標識抗マウス抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図５３】Ｃ１０６Ｂ９  ＴＣＲ様抗体と、ＭＡＧＥ−Ａ４ペプチドおよびＭＡＧＥ−Ａ４類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、ＭＡＧＥ−Ａ４およびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。細胞を１０μｇ／ｍｌのＣ１０６Ｂ９  ＴＣＲＬ抗体、およびそれに続く二次ＰＥ標識抗マウス抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。
【図５４】ＳＰＲによる、親和性−ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ４複合体を標的とするＣ１０６Ｂ９  ＴＣＲ様抗体の見かけの結合親和性の決定。大腸菌によって発現されたｓｃＨＬＡ−Ａ２複合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ再フォールディングによって生成した精製組み換えビオチン化単鎖ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ４複合体を、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎを用いてＳＰＲセンサーチップに間接的に固定化した。精製Ｃ１０６Ｂ９  ＴＣＲＬ  Ｆａｂを分析物として使用した。
【図５５】アラニンスキャニング変異誘発によるエピトープ特異性の決定。１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位および９位にアラニン置換を有する変異体ＭＡＧＥ−Ａ４ペプチドを合成した。アンカーの可能性のある位置を、灰色の星によって示した。天然および変異体ＭＡＧＥ−Ａ４ペプチドを、１０−５Ｍの濃度でＴ２細胞ＡＰＣ上に３７℃で１２時間負荷した。細胞を、濃度１０μｇ／ｍｌのＣ１０６Ｂ９  ＴＣＲ様抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。変異体および野生型ペプチドが負荷された細胞のＭＦＩ値を比較した。各Ａｌａ置換の相対効果を、天然野生型ペプチドとの結合のパーセンテージとして表した。
【図５６】Ｃ１０６Ｂ９  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋およびＭＡＧＥ−Ａ４抗原陽性または陰性の細胞との結合。細胞におけるＭＡＧＥ−Ａ４  ｍＲＮＡの発現を、ｑＰＣＲによって確認した。腫瘍細胞を、１０μｇ／ｍｌのＣ１０６Ｂ９、およびそれに続く二次ＰＥ標識抗マウス抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。また、本明細書に記載したような抗体の二重特異性形態（抗ＣＤ３を有する）を用いた場合のｍＲＮＡ発現データおよび細胞死滅も示した。
【図５７】Ｃ１０６Ｂ９  ＢＳによるＨＬＡ−Ａ２＋／ＭＡＧＥ−Ａ４＋およびＨＬＡ−Ａ２＋／ＭＡＧＥ−Ａ４−細胞株の死滅。Ｃ１０６Ｂ９  ＢＳを、ＨＬＡ−Ａ２＋／ＭＡＧＥ−Ａ４＋細胞である腫瘍細胞およびＨＬＡ−Ａ２＋／ＭＡＧＥ−Ａ４−である対照腫瘍細胞とともにインキュベートした。Ｅ：Ｔ比を１０：１として、細胞を、Ｃ１０６Ｂ９  ＢＳおよび健常個体から単離した未処理ＰＢＭＣとともに２４時間インキュベートした。
【図５８】Ｃ１０６Ｂ９  ＢＳによるＨＬＡ−Ａ２＋／ＭＡＧＥ−Ａ４−正常一次細胞の死滅。Ｃ１０６Ｂ９  ＢＳを、ＨＬＡ−Ａ２＋／ＭＡＧＥ−Ａ４−である正常一次細胞とともにインキュベートした。Ｅ：Ｔ比を１０：１として、細胞を、Ｃ１０６Ｂ９  ＢＳおよび健常個体から単離した未処理ＰＢＭＣとともに２４時間インキュベートした。
【図５９】ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける、Ｓ．Ｃ．黒色腫の腫瘍形成防止に対するＭＡＧＥ−Ａ４  ＢＳ  Ｃ１０６Ｂ９  ＢＳ  のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性。
【図６０】Ｆ１８４Ｃ７  ＴＣＲ様抗体と、ＭＡＧＥ−Ａ９２２３−２３１ペプチド（ＭＡＧＥ−Ａ９ペプチドとも呼ばれる）およびその他のＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、ＭＡＧＥ−Ａ９ペプチドおよびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。細胞を、１０μｇ／ｍｌのＦ１８４Ｃ７  ＴＣＲＬ抗体、およびそれに続く二次ＰＥ標識抗マウス抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図６１】Ｆ１８４Ｃ７  ＴＣＲ様抗体と、ＭＡＧＥ−Ａ９ペプチドおよびＭＡＧＥ−Ａ９類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｓ８は、アラニンに基づく類似ペプチドである。Ｔ２細胞に、ＭＡＧＥ−Ａ９ペプチドおよびここに記載したペプチドを１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。細胞を１０μｇ／ｍｌのＦ１８４Ｃ７  ＴＣＲＬ抗体、およびそれに続く二次ＰＥ標識抗マウス抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。
【図６２】アラニンスキャニング変異誘発によるエピトープ特異性の決定。２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位および９位にアラニン置換を有する変異体ＭＡＧＥ−Ａ９ペプチドを合成した。Ａｌａ変異体および天然ペプチドを、１０−５Ｍの濃度でＴ２細胞ＡＰＣに３７℃で１２時間負荷した。細胞を濃度１０μｇ／ｍｌのＦ１８４Ｃ７  ＴＣＲ様抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。変異体および野生型ペプチドが負荷された細胞のＭＦＩ値を比較した。各Ａｌａ置換の相対効果を、天然ペプチドとの結合のパーセンテージとして表した。
【図６３】Ｆ１８４Ｃ７  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋正常一次細胞との結合。正常一次細胞を、１０μｇ／ｍｌのＦ１８４Ｃ７  ＴＣＲＬ抗体、およびそれに続く二次ＰＥ標識抗マウス抗体で染色した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）が示されている。
【図６４】Ｄ１０Ａ３  ＴＣＲ様抗体と、ＰＡＰ１１２−１２０ペプチド（ＰＡＰペプチドとも呼ばれる）およびその他のＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、ＰＡＰおよびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。細胞を、１０μｇ／ｍｌのＤ１０Ａ３  ＴＣＲＬ抗体、およびそれに続く二次ＰＥ標識抗マウス抗体で染色した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図６５】Ｄ１０Ａ３  ＴＣＲ様抗体と、ＰＡＰペプチドおよびＰＡＰ類似ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣとの結合。Ｔ２細胞に、ＰＡＰおよびここに記載したペプチドを、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。細胞を１０μｇ／ｍｌのＤ１０Ａ３  ＴＣＲＬ抗体、およびそれに続く二次ＰＥ標識抗マウス抗体で染色した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図６６】アラニンスキャニング変異誘発によるエピトープ特異性の決定。１位、３位、４位、６位、７位、８位および９位にアラニン置換を有する変異体ＰＡＰペプチドを合成し、Ｔ２細胞ＡＰＣに、１０−５Ｍの濃度で、３７℃で１２時間負荷した。細胞を濃度１０μｇ／ｍｌのＤ１０Ａ３  ＴＣＲ様抗体で染色した。変異体および野生型ペプチドが負荷された細胞のＭＦＩ値を比較した。各Ａｌａ置換の相対効果を、ＷＴペプチドとの結合のパーセンテージとして表した。
【図６７】Ｄ１０Ａ３  ＴＣＲ様抗体と、ＨＬＡ−Ａ２＋正常一次細胞との結合。正常一次細胞を１０μｇ／ｍｌのＤ１０Ａ３  ＴＣＲＬ抗体、およびそれに続く二次ＰＥ標識抗マウス抗体で染色した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した。
【図６８】Ｄ１１抗体のアミノ酸および核酸（配列番号２８０〜２９５）。
【図６９】Ｄ７抗体のアミノ酸および核酸（配列番号２９６〜３１１）。
【図７０−１】Ｂ４７Ｂ６抗体のアミノ酸および核酸（配列番号３１２〜３２７）。
【図７０−２】Ｂ４７Ｂ６抗体のアミノ酸および核酸（配列番号３１２〜３２７）。
【図７１−１】Ｃ１０６Ｂ９抗体のアミノ酸および核酸（配列番号３２８〜３４３）。
【図７１−２】Ｃ１０６Ｂ９抗体のアミノ酸および核酸（配列番号３２８〜３４３）。
【図７２−１】Ｆ１８４Ｃ７抗体のアミノ酸および核酸（配列番号３４４〜３５９）。
【図７２−２】Ｆ１８４Ｃ７抗体のアミノ酸および核酸（配列番号３４４〜３５９）。
【図７３−１】Ｄ１０Ａ３抗体のアミノ酸および核酸（配列番号３６０〜３７５）。
【図７３−２】Ｄ１０Ａ３抗体のアミノ酸および核酸（配列番号３６０〜３７５）。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、そのいくつかの実施形態では、親和性および微細特異性を有するＴＣＲ様抗体結合ドメインを含む親和性結合体、およびその使用に関する。
【００３７】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明または実施例によって例示される詳細によって、その用途が必ずしも制限されるものではないことを理解されたい。本発明は、その他の実施形態、または種々の方法による実行または実施が可能である。
【００３８】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）様（ＴＣＲＬ）抗体は、腫瘍エピトープに対するＴＣＲ様特異性が付与されたものである。ＭＨＣ−ペプチド抗原複合体に対して低い親和性を示すＴＣＲとは異なり、ＴＣＲＬは、その可溶性形態でさえも発揮する親和性を特徴とする。ＴＣＲＬは、腫瘍細胞を標的化し、その特異的死滅を媒介するための新規治療クラスとして開発されている。さらに、これらの抗体は、ヒトクラスＩペプチド−ＭＨＣリガンドの提示およびＴＣＲ−ペプチド−ＭＨＣ相互作用の研究を可能にする価値ある研究試薬である。
【００３９】
本発明者らは、本発明において、面倒なスクリーニングおよび実験によって、ＴｙｒＤ−ＨＬＡ−Ａ２（Ｄ７およびＤ１１）、ＷＴ１−ＨＬＡ−Ａ２（Ｂ４７）、ＭＡＧＥ−Ａ４−ＨＬＡ−Ａ２（Ｃ１０６Ｂ９）、ＭＡＧＥ−Ａ９−ＨＬＡ−Ａ２（Ｆ１８４Ｃ７）およびＰＡＰ（Ｄ１０Ａ３）に対して前例のない微細特異性を示す新規なＴＣＲＬを同定した。これら抗体のＣＤＲは、エフェクター活性等を有する任意の親和性結合体、例えば、ＣＡＲおよびＴＣＲ中に、移植することができる。
【００４０】
したがって、本発明の一態様によれば、抗原結合ドメインを含む親和性結合体であって、抗原結合ドメインはＮ末からＣ末への順に下記ＣＤＲ配列：：
ＣＤＲ１重鎖（ＨＣ）      配列番号３０９        ＳＹＧＶＨ
ＣＤＲ２  ＨＣ            配列番号３１０        ＶＩＷＡＧＧＴＴＮＹＮＳＡＬＭＳ
ＣＤＲ３  ＨＣ            配列番号３１１        ＤＧＨＦＨＦＤＦ
ＣＤＲ１軽鎖（ＬＣ）      配列番号３０３        ＲＡＳＤＩＩＹＳＮＬＡ
ＣＤＲ２  ＬＣ            配列番号３０４        ＡＡＴＮＬＡＡ
ＣＤＲ３  ＬＣ            配列番号３０５        ＱＨＦＷＧＳＳＩＳ
を含み、ＭＨＣ拘束的にＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７と結合可能である、親和性結合体が提供される。
【００４１】
本発明の一態様によれば、抗原結合ドメインを含む親和性結合体であって、抗原結合ドメインはＮ末からＣ末への順に下記ＣＤＲ配列：：
ＣＤＲ１重鎖（ＨＣ）      配列番号２９３        ＴＳＧＭＧＶＳ
ＣＤＲ２  ＨＣ            配列番号２９４        ＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳ
ＣＤＲ３  ＨＣ            配列番号２９５        ＫＤＹＧＳＳＦＹＡＭＨＹ
ＣＤＲ１軽鎖（ＬＣ）      配列番号２８７        ＫＡＳＱＤＩＨＮＹＩＡ
ＣＤＲ２  ＬＣ            配列番号２８８        ＹＴＳＴＬＱＰ
ＣＤＲ３  ＬＣ            配列番号２８９        ＬＱＹＤＮＬＷＴ
を含み、ＭＨＣ拘束的にＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７と結合可能である、親和性結合体が提供される。
【００４２】
本発明の一態様によれば、抗原結合ドメインを含む親和性結合体であって、抗原結合ドメインはＮ末からＣ末への順に下記ＣＤＲ配列：：
ＣＤＲ１  ＨＣ      配列番号３２５        ＳＹＤＭＳ
ＣＤＲ２  ＨＣ      配列番号３２６        ＹＭＳＳＧＧＧＴＹＹＰＤＴＶＫＧ
ＣＤＲ３  ＨＣ      配列番号３２７        ＨＤＥＩＴＮＦＤＹ
ＣＤＲ１  ＬＣ      配列番号３１９        ＲＡＳＱＳＩＳＮＳＬＨ
ＣＤＲ２  ＬＣ      配列番号３２０        ＹＡＳＱＳＩＳ
ＣＤＲ３  ＬＣ      配列番号３２１        ＱＱＳＹＳＷＰＬＴ
を含み、ＭＨＣ拘束的にＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１１２６−１３４と結合可能である、親和性結合体が提供される。
【００４３】
本発明の一態様によれば、抗原結合ドメインを含む親和性結合体であって、抗原結合ドメインはＮ末からＣ末への順に下記ＣＤＲ配列：：
ＣＤＲ１  ＨＣ      配列番号３４１        ＧＹＷＩＥ
ＣＤＲ２  ＨＣ      配列番号３４２        ＥＩＬＰＧＳＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＧ
ＣＤＲ３  ＨＣ      配列番号３４３        ＤＳＮＳＦＴＹ
ＣＤＲ１  ＬＣ      配列番号３３５        ＳＶＳＳＳＶＤＹＩＨ
ＣＤＲ２  ＬＣ      配列番号３３６        ＳＴＳＩＬＡＳ
ＣＤＲ３  ＬＣ      配列番号３３７        ＱＱＲＳＳＹＴ
を含み、ＭＨＣ拘束的にＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ４３２８−３４３と結合可能である、親和性結合体が提供される。
【００４４】
本発明の一態様によれば、抗原結合ドメインを含む親和性結合体であって、抗原結合ドメインはＮ末からＣ末への順に下記ＣＤＲ配列：：
ＣＤＲ１  ＨＣ      配列番号３５７        ＦＳＳＳＷＭＮ
ＣＤＲ２  ＨＣ      配列番号３５８        ＲＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＮＥＫＦＫＧ
ＣＤＲ３  ＨＣ      配列番号３５９        ＥＡＴＴＶＶＡＰＹＹＦＤＹ
ＣＤＲ１  ＬＣ      配列番号３５１        ＲＡＳＥＮＩＹＲＮＬＡ
ＣＤＲ２  ＬＣ      配列番号３５２        ＡＡＴＮＬＡＤ
ＣＤＲ３  ＬＣ      配列番号３５３        ＱＨＦＷＧＴＰＬＴ
を含み、ＭＨＣ拘束的にＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ９３４４−３５９と結合可能である、親和性結合体が提供される。
【００４５】
本発明の一態様によれば、抗原結合ドメインを含む親和性結合体であって、抗原結合ドメインはＮ末からＣ末への順に下記ＣＤＲ配列：：
ＣＤＲ１  ＨＣ      配列番号３７３        ＤＹＮＭＤ
ＣＤＲ２  ＨＣ      配列番号３７４        ＤＩＮＰＮＹＤＴＴＴＹＮＱＫＦＫＧ
ＣＤＲ３  ＨＣ      配列番号３７５        ＲＮＹＧＮＹＶＧＦＤＦ
ＣＤＲ１  ＬＣ      配列番号３６７        ＫＡＳＱＲＶＮＮＤＶＡ
ＣＤＲ２  ＬＣ      配列番号３６８        ＹＡＳＮＲＹＴ
ＣＤＲ３  ＬＣ      配列番号３６９        ＱＱＤＹＳＳＰＦＴ
を含み、ＭＨＣ拘束的にＨＬＡ−Ａ２／ＰＡＰ３６０−３７５と結合可能である、親和性結合体が提供される。
【００４６】
本明細書において、「Ｔ細胞受容体様抗体」または「ＴＣＲＬ」とは、ＨＬＡ拘束性ペプチド抗原と複合体形成しているＭＨＣに結合する抗体を指す。ＴＣＲＬとその標的との結合は、ＭＨＣ拘束特異的である。ＴＣＲＬ抗体は、複合体形成ペプチドの不在下では上記ＭＨＣとは結合せず、当該抗体は、上記ＭＨＣの不在下では、上記ペプチドと結合しない。
【００４７】
本明細書において、「結合」または「結合する」とは、抗体−抗原様式の結合を指し、これは一般的に、臨床関連ＴＣＲＬの場合には、表面プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）によって決定されるＫＤの範囲が２０ｎＭ未満である。
【００４８】
抗原結合ドメインの、その抗原に対する親和性は、抗体の抗原結合ドメインのＣＤＲを誘導した抗体の可溶性形態を使用して決定する。親和性評価のためには、抗原をその可溶性形態で使用する、例えば、本明細書において後述する単鎖ＭＨＣ−ペプチド複合体を使用する。
【００４９】
本明細書において、用語「ＫＤ」とは、抗原結合ドメインとその対応する抗原との間の平衡解離定数を指す。
【００５０】
親和性結合体の親和性は、ＣＤＲによって決定されることは認められよう。しかし、親和性は、親和性成熟などの当技術分野で公知の方法を使用して改善することができる。
【００５１】
本明細書において、「親和性結合体」とは、非特異的抗原に対してよりも高い親和性で特異的抗原と結合する結合部分を指し、ＳＰＲを含む当技術分野で周知のアッセイによって決定されるような、少なくとも１０−６Ｍの親和性が与えられる。
【００５２】
特定の実施形態によれば、親和性は、５００ｎＭ〜０．５ｎＭ、１００ｎＭ〜１ｎＭ、５０ｎＭ〜１ｎＭ、２０ｎＭ〜１ｎＭ、１０ｎＭ〜１ｎＭである。
【００５３】
親和性部分は、ＴＣＲ、ＣＡＲ−Ｔおよび抗体からなる群より選択することができる。
【００５４】
特定の実施形態によれば、親和性結合体は抗体である。抗体への言及は、その他の親和性結合体に対する言及よりも詳細であるが、この実施形態の記載は限定とはならず、本発明は、本明細書に記載する結合体と等しく関連し、特に後述する細胞療法の観点で等しく関連する。
【００５５】
本発明において使用される用語「抗体」は、無傷の分子のみならず、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ等の機能的断片、またはＭＨＣ拘束的な方式で抗原のエピトープと結合可能な、ＶＨおよびＶＬなどの単一ドメイン分子が含まれる。より一般的な記載として、用語「抗体」は、細胞表面に提示された分子とＭＨＣ拘束特異的に結合する、任意の親和性結合体を包含することを意図する。したがって、本発明のいくつかの実施形態の抗体のＣＤＲは、本明細書において以下にさらに記載されるように、Ｔ細胞受容体またはＣＡＲなどの人工分子中に移植され得る。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態を実施するために適切な抗体断片は、免疫グロブリン軽鎖（本明細書において「軽鎖」と呼ぶ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）、免疫グロブリン重鎖（本明細書において「重鎖」と呼ぶ）の相補性決定領域、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域、軽鎖、重鎖、Ｆｄ断片、ならびに軽鎖および重鎖両方の実施的に全可変領域を含む、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ  Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２などの抗体断片を含む。
【００５７】
本明細書において、用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの可変領域内に見られる抗原結合領域を指し、同義的に使用される。一般に、抗体は、３種のＣＤＲをＶＨ（ＣＤＲ  ＨＩまたはＨＩ；ＣＤＲ  Ｈ２またはＨ２；およびＣＤＲ  Ｈ３またはＨ３）のそれぞれに１つずつ、および３種をＶＬ（ＣＤＲ  ＬＩまたはＬＩ；ＣＤＲ  Ｌ２またはＬ２；およびＣＤＲ  Ｌ３またはＬ３）のそれぞれに１つずつ含む。このようなＣＤＲ配列の例は、Ｄ７およびＤ１１、すなわち、以下の実施例Ｉに従って製造したＴＣＲＬ、について提供する。さらなる例として、ＷＴ１  Ｂ４７Ｂ６、ＭＡＧＥ−Ａ４  Ｃ１０６Ｂ９、ＭＡＧＥ−Ａ９  Ｆ１８４Ｃ７、ＰＡＰ  Ｄ１０Ａ３（図６８〜７３に示す）が挙げられる。
【００５８】
特定の抗体中の可変領域またはＣＤＲを構成するアミノ酸残基の同一性は、当技術分野で周知の方法を使用して決定することができる。このような方法には、Ｋａｂａｔらによって定義された配列多様性（例えば、Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C.を参照）、Ｃｈｏｔｈｉａらによって定義された造的ループ領域の位置（例えば、Chothia et al., Nature 342:877-883, 1989.を参照）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社のＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（現在はＡｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標）、Martin et al., 1989、Proc. Natl Acad Sci USA. 86:9268およびワールドワイドウェブサイトwww.bioinf-org.uk/absを参照）を使用する、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの折衷案、接触定義によって定義される、利用可能な複合体結晶構造（MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745, 1996を参照）、「コンホメーション定義」（例えば、Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008を参照）、ならびにＩＭＧＴ（Lefranc MP, et al. (2003) IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol 27: 55-77）などが含まれる。
【００５９】
本明細書において、「可変領域」および「ＣＤＲ」とは、当技術分野で公知の任意の手法、複数の手法の組み合わせを含む、によって定義される、可変領域およびＣＤＲを指し得る。特定の実施形態によれば、ＣＤＲは、Kabat et al.（前掲）に従って決定される。
【００６０】
軽鎖および重鎖両方の可変領域の全体または実質的に全体を含む、機能的抗体断片は、以下のように定義される。
（ｉ）Ｆｖ：２つの鎖として発現される、軽鎖（ＶＬ）の可変領域および重鎖（ＶＨ）の可変領域からなる、遺伝子操作された断片と定義されるもの、
（ｉｉ）単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）：適切なポリペプチドリンカーによって、遺伝子融合された単鎖分子として連結された、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む、遺伝子操作された単鎖分子、
（ｉｉｉ）ジスルフィド安定化Ｆｖ（「ｄｓＦｖ」）：遺伝子操作されたジスルフィド結合によって連結された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された抗体、
（ｉｖ）Ｆａｂ：抗体分子の一価の抗原結合部分を含有する抗体分子断片であって、無傷の軽鎖、および重鎖の可変ドメインおよびＣＨ１ドメインからなる重鎖Ｆｄ断片を生じるように完全な抗体を酵素パパインで処理することによって得られる抗体分子断片、
（ｖ）Ｆａｂ’：抗体分子の一価の抗原結合部分を含有する抗体分子断片であって、完全な抗体を酵素ペプシンで処理し、次に還元することによって得られる抗体分子の断片（抗体分子あたり２つのＦａｂ’断片が得られる）、
（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２：抗体分子の一価の抗原結合部分を含有する抗体分子断片であって、完全な抗体を酵素ペプシンで処理することによって得られるもの（すなわち、２つのジスルフィド結合によって結合されたＦａｂ’断片の二量体）、および
（ｖｉｉ）単一ドメイン抗体またはナノボディー：抗原に対して十分な親和性を示す、単一ＶＨまたはＶＬドメインから構成されるもの。
【００６１】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびにそれらの断片を製造する方法は、当技術分野で周知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれるHarlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988を参照）。
【００６２】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびにそれらの断片を製造する方法は、当技術分野で周知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれるHarlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988を参照）。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態の抗体断片は、抗体のタンパク質分解性加水分解によって、または断片をコードするＤＮＡの大腸菌もしくは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物またはその他のタンパク質発現系）における発現によって調製することができる。抗体断片は、従来法による全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれる５Ｓ断片を提供するための、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって製造することができる。この断片を、チオール還元剤による切断、および所望により、ジスルフィド結合の切断に起因するスルフヒドリル基に対するブロッキング基を使用して、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価断片を製造することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素切断によって、２つの一価のＦａｂ’断片およびＦｃ断片が直接製造される。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４，０３６，９４５号および同４，３３１，６４７号およびそれらに包含される参考文献に記載されており、これらの特許は、本参照をもってその全文が本明細書に組み込まれる。Ｐｏｒｔｅｒ，  Ｒ．  Ｒ．［Biochem. J. 73: 119-126 (1959)］も参照。一価の軽鎖−重鎖断片を形成するための重鎖の分離、断片のさらなる切断、またはその他の酵素的、化学的もしくは遺伝子技術などの抗体を切断する他の方法は、得られる断片が無傷の抗体によって認識される抗原と結合する限り、使用することができる。
【００６４】
Ｆｖ断片は、ＶＨおよびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．［Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 69:2659-62 (19720］に記載されるように、非共有結合でもよい。あるいは、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合によって連結されてもよく、またはグルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋されてもよい。好ましくは、Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーによって結び付けられたＶＨおよびＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって結び付けられたＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製することができる。構造遺伝子は、発現ベクター中に挿入され、これは、続いて、大腸菌などの宿主細胞中に導入される。組み換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを製造するための方法は、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Whitlow and Filpula, Methods 2: 97-105 (1991).、Bird et al., Science 242:423-426 (1988).、Pack et al., Bio/Technology 11:1271-77 (1993).、および米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。
【００６５】
抗体断片の別の形態は、単一相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、対象の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。このような遺伝子は、例えば、抗体生成細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって調製することができる。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｆｒｙ［Methods, 2: 106-10 (1991)］を参照。
【００６６】
非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来である最小配列を含有する、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはその他の抗原結合部分配列など）のキメラ分子である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体中にも、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列中にも見られない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常は２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、この場合、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常は、ヒト免疫グロブリンのもの、の少なくとも一部をさらに含む［Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)、およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【００６７】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである原料からそれに導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、移入残基と呼ばれることが多く、これは、通常、移入可変ドメインから取ってきたものである。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者［Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988).、Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列と置換することによって実施することができる。したがって、このようなヒト化抗体は、無傷のヒト可変ドメインよりも実質的に小さい部分が非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかのＣＤＲ残基および、場合により、いくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体中の類似部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。
【００６８】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー［Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991).、Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含む当技術分野で公知の種々の技術を使用して製造することができる。Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である［Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されているトランスジェニック動物、例えば、マウス、への導入によって作製することができる。曝露の際に、遺伝子再構成、構築および抗体レパートリーを含むあらゆる点で、ヒトにおいて見られるものと非常によく似たヒト抗体の作製が観察される。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同５，５４５，８０６号、同５，５６９，８２５号、同５，６２５，１２６号、同５，６３３，４２５号、同５，６６１，０１６号、および以下の科学刊行物：Marks et al., Bio/Technology 10,: 779-783 (1992).、Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994).、Morrison, Nature 368 812-13 (1994).、Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996).、Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996).およびLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995)に記載されている。
【００６９】
抗体が全長抗体である実施形態では、本発明の抗体の重鎖および軽鎖は、全長（例えば、抗体は、少なくとも１つ、好ましくは２つの完全な重鎖と、少なくとも１つまたは２つの完全な軽鎖を含み得るもの）であり得るか、抗原結合部分（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは単鎖Ｆｖ断片（「ｓｃＦｖ」））を含み得る。その他の実施形態では、抗体重鎖定常領域は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥから選択される。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から、より詳しくは、ＩｇＧ１（例えば、ヒトＩｇＧ１）またはＩｇＧ４（例えば、ヒトＩｇＧ４）から選択される。抗体の種類の選択は、抗体が誘発するように設計されている免疫エフェクター機能に応じて変化する。
【００７０】
本明細書において、抗体の二重特異性立体配置も考慮される。二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡｂ、ＢｓＡｂ）は、２種の異なるモノクローナル抗体の断片から構成され、結果的に２種の異なる種類の抗原と結合する人工タンパク質である。特定の実施形態によれば、ＢｓＭＡｂは、（例えば、ＣＤ３のような受容体を使用して）細胞傷害性細胞に結合し、同時に、破壊されるべき腫瘍細胞のような標的に結合するよう遺伝子操作される（さらに詳細に後述する）。
【００７１】
本明細書において、語句「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」とは、所望の抗原に対する抗体に基づく特異性と、Ｔ細胞受容体活性化細胞内ドメインとを組み合わせて、特定の抗原に対して細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成する組み換え体または合成分子を指す。
【００７２】
本明細書において、語句「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」とは、組換えＴ細胞受容体の可溶性および不溶性の形態を指す。
【００７３】
本明細書において、語句「ＭＨＣ（またはＨＬＡ）拘束性ペプチド」とは、ＭＨＣ分子上に強力に提示されるペプチドを指す。このようなペプチドは、質量分析などの「ウェット」な実験室手順によって、またはコンピュータ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）解析によって同定することができる。ＭＨＣ（またはＨＬＡ）によって提示されたペプチドとは、ＭＨＣ分子によって提示されていることが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで確認されるペプチドを指す。
【００７４】
特定の実施形態によれば、ＭＨＣ拘束性ペプチドはＷＴ１に由来し、親和性結合体はＢ４７Ｂ６のＣＤＲを含む。
【００７５】
特定の実施形態によれば、ＭＨＣ拘束性ペプチドはＴｙｒＤに由来し、親和性結合体はＤ７またはＤ１１のＣＤＲを含む。
【００７６】
特定の実施形態によれば、ＭＨＣ拘束性ペプチドはＭＡＧＥ−Ａ４に由来し、親和性結合体はＣ１０６Ｂ９のＣＤＲを含む。
【００７７】
特定の実施形態によれば、ＭＨＣ拘束性ペプチドはＭＡＧＥ−Ａ９に由来し、親和性結合体はＦ１８４Ｃ７のＣＤＲを含む。
【００７８】
特定の実施形態によれば、ＭＨＣ拘束性ペプチドはＰＡＰに由来し、親和性結合体はＤ１０Ａ３のＣＤＲを含む。
【００７９】
上記の親和性結合体のＣＤＲは、図６８〜７３に記載されている。
【００８０】
それぞれの標的に対する結合親和性および任意で特異性が維持されるか、またはさらには改善される限り、例えば、少なくとも９０％の相同性、９５％の相同性またはさらには少なくとも９９％の相同性の相同配列も考慮される。
【００８１】
本発明の一態様によれば、本明細書において記載されるような親和性結合体をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドも提供される。
【００８２】
また、シス作用性調節エレメントと作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供される。
【００８３】
本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物（本明細書において、「発現ベクター」とも呼ぶ）は、当該ベクターを、原核生物、真核生物または好ましくはこれらの両方（例えば、シャトルベクター）における複製および組込みに適切なものとする付加的な配列を含む。さらに、通常のクローニングベクターはまた、転写および翻訳開始配列、転写および翻訳停止配列、ならびにポリアデニル化シグナルも含有し得る。例として、このような構築物は、通常、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、二本鎖ＤＮＡ合成開始点、および３’ＬＴＲまたはその一部を含む。
【００８４】
本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物は、通常、それを導入した宿主細胞からの親和性結合体の分泌または提示のためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は、哺乳動物のシグナル配列である。
【００８５】
真核細胞のプロモーターは、通常、２種類の認識配列、ＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーターエレメントを含有する。転写開始部位の上流２５〜３０塩基対に位置するＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成開始の指示に関与していると考えられている。その他の上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定する。
【００８６】
好ましくは、本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物によって使用されるプロモーターは、形質転換された特定の細胞集団において活性である。細胞型特異的および／または組織特異的プロモーターの例として、肝臓特異的であるアルブミンプロモーターなど［Pinkert et al., (1987) Genes Dev. 1:268-277］、リンパ系特異的プロモーター［Calame et al., (1988) Adv. Immunol. 43:235-275］、特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター［Winoto et al., (1989) EMBO J. 8:729-733］および免疫グロブリン［Banerji et al. (1983) Cell 33729-740]、ニューロフィラメントプロモーターなどのニューロン特異的プロモーター［Byrne et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477］、膵臓特異的プロモーター［Edlunch et al. (1985) Science 230:912-916］または乳清プロモーターなどの乳腺特異的プロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。
【００８７】
エンハンサーエレメントは、そこに連結した相同または異種プロモーターによる転写を、最大１，０００倍に増加し得る。エンハンサーは、転写開始部位の下流または上流に配置された場合に活性である。ウイルス由来である多数のエンハンサーエレメントが広い宿主域を有し、さまざまな組織において活性である。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多数の細胞株に適している。本発明のいくつかの実施形態に適切なその他のエンハンサー／プロモーターの組合せとしては、ポリオーマウイルス由来のもの、ヒトまたはマウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のもの、マウス白血病ウイルス由来のもの、マウスまたはラウス肉腫ウイルスおよびＨＩＶなどの種々のレトロウイルス由来の長い末端反復配列が挙げられる。本参照によって本明細書に組み込まれる、Enhancers and Eukaryotic Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1983を参照されたい。
【００８８】
発現ベクターの構築において、プロモーターは、異種転写開始部位に対して、その天然の状況における転写開始部位からの距離とおよそ同じの距離に配置されることが好ましい。しかし、当技術分野では公知であるように、この距離の幾分かの変動はプロモーター機能の喪失を伴わずに許容され得る。
【００８９】
ＴＣＲＬ  ｍＲＮＡ翻訳の効率を増大するために、ポリアデニル化配列もまた発現ベクターに付加さることができる。正確且つ効率的なポリアデニル化には、以下の２つの個別の配列エレメントが必要である：ポリアデニル化部位から下流に位置するＧＵまたはＵに富んだ配列、および１１−３０ヌクレオチド上流に位置する、６つのヌクレオチドＡＡＵＡＡＡからなる高度に保存された配列。本発明のいくつかの実施形態に適切な停止およびポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０由来であるものが挙げられる。
【００９０】
すでに記載されたエレメントに加えて、本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターは、通常、クローニングされた核酸の発現のレベルを増大すること、または組み換えＤＮＡを保持する細胞の同定を容易にすることを意図した、その他の特定のエレメントを含有してもよい。例えば、いくつかの動物ウイルスは、許容細胞種におけるウイルスのゲノムの染色体外複製を促進するＤＮＡ配列を含有する。これらのウイルスのレプリコンを有するプラスミドは、プラスミド上に保持される遺伝子または宿主細胞のゲノムを用いて適当な因子が提供される限り、エピソームとして複製される。
【００９１】
ベクターは、真核細胞のレプリコンを含んでも、含まなくてもよい。真核細胞のレプリコンが存在する場合には、ベクターは、適当な選択マーカーを使用して真核細胞において増幅可能である。ベクターが真核細胞のレプリコンを含まない場合には、エピソーム増幅は可能ではない。代わりに、組み換えＤＮＡが、遺伝子操作された細胞のゲノム中に組み込まれ、ここで、プロモーターが、所望の核酸の発現を指示する。
【００９２】
本明細書において記載されるようなポリヌクレオチド／発現ベクターを含む細胞も提供される。
【００９３】
このような細胞は、通常、組み換えタンパク質の高発現のために選択される（例えば、細菌、植物または真核細胞（ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞等））が、特定の免疫エフェクター活性を有する宿主細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）でもよい。当該宿主細胞は、細胞中に形質導入されたＴ細胞受容体またはＣＡＲ中に、ＴＣＲＬのＣＤＲが移植されている場合には、例えば、本明細書において後述するような、養子細胞療法において使用される。
【００９４】
親和性結合体の高い特異性は、それらを診断用途および治療用途に特に適切なものとする。
【００９５】
したがって、本発明の一態様によれば、対象のＨＬＡ拘束性ペプチド抗原を提示する細胞を検出する方法が提供される。当該方法は、細胞を、対象のＨＬＡ拘束性ペプチド抗原に対して特異性を有する本発明の親和性結合体（例えば、抗体）と接触させることを含む。接触は、免疫複合体形成を可能にする条件下で実施され、ここでは、免疫複合体の存在またはそのレベルが、対象のＨＬＡ拘束性ペプチド抗原を提示する細胞の指標となる。
【００９６】
用語「検出すること」とは、本明細書において、細胞の検出、認知、顕在化、暴露、可視化または同定のための行為を指す。検出のための正確な方法は、本明細書において後述するように、抗体が結合している検出可能部分（本明細書において、識別可能部分とも呼ばれる）に応じて変化する。
【００９７】
本発明の教示にしたがって、単細胞も、多細胞も使用することができる。例えば、細胞は、細胞株、一次試料（例えば、腫瘍培養物）および細胞試料、例えば、切開性または切除性生検を含む外科的生検、微細ニードル吸引液などといった任意の生体サンプルに由来するものでよい。生検回収方法は、当技術分野で周知である。
【００９８】
上記の検出方法は、ＨＬＡ−ペプチド複合体の上記の正常な提示または異なる組織分布を特徴とする疾患の診断に利用され得る。
【００９９】
本明細書において、用語「診断すること」とは、疾患の分類、疾患の重症度（グレードまたはステージ）の判定、進行のモニタリング、疾患の転帰および／または回復の見込みの予測を指す。
【０１００】
対象は、日常的な健康検査を受けている健常な対象（例えば、ヒト）であり得る。あるいは、対象は、疾患のリスクを有するものである。さらに、また、当該方法は、治療有効性をモニタリングするために使用することができる。
【０１０１】
ＴＣＲＬは、識別可能な部分を含んでいる、例えば、それに結合していてもよい。この代わりに、またはこれに加えて、ＴＣＲＬ（またはそれを含む複合体）は、二次抗体の使用などによって、間接的に同定されてもよい。
【０１０２】
接触は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（すなわち、細胞株、一次細胞において）、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで達成され得る。
【０１０３】
上述したように、本発明の方法は、免疫複合体（例えば、通常、細胞が溶解されない場合には、本発明の抗体と、ＭＨＣと複合体形成しているペプチドと間の複合体）を形成するのに十分な条件下で実施される。このような条件（例えば、適当な濃度、バッファー、温度、反応時間）、ならびにこのような条件を最適化する方法は、当業者に公知であり、そのような例が本明細書に開示されている。特定の実施形態によれば、本明細書において記載するような、ＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼペプチドと結合する抗体は、黒色腫の診断のために使用することができる。特定の実施形態によれば、本明細書において記載するような、ＷＴ１拘束性ペプチドと結合する抗体は、血液悪性腫瘍および上述のようなＷＴ１と関連するその他の悪性腫瘍の診断のために使用することができる。
【０１０４】
本発明の親和性結合体（例えば、抗体）は、がんの治療に特に有用である。
【０１０５】
用語「がん」は、本明細書において、異常細胞の急速な、未制御の増殖を特徴とする疾患と定義される。がん細胞は、局所的に、または血流およびリンパ系によって身体のその他の部分に広がり得る。
【０１０６】
がんは、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、原発性または転移性腫瘍でもよい。種々のがんの例として、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、腎がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、白血病、肺がんなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のいくつかの実施形態の方法によって治療され得るがんのさらなる限定的ではない例示が、上記の表１によって提供される。
【０１０７】
治療され得るがんとして、血管形成しない腫瘍、またはまだ実質的に血管形成していない腫瘍、および血管形成した腫瘍が挙げられる。がんは、非固形腫瘍（血液腫瘍、例えば、白血病およびリンパ腫など）を含むか、または固形腫瘍を含んでもよい。本発明の抗体を用いて処置するがんの種類としては、癌腫、芽細胞腫および肉腫ならびに特定の白血病またはリンパ系悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍および悪性腫瘍、例えば、肉腫、癌腫および黒色腫が挙げられるが、これらに限定されるものではない。成体腫瘍／がんおよび小児腫瘍／がんも含まれる。
【０１０８】
血液がんは、血液または骨髄のがんである。血液（または血行性）がんの例としては、急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病および骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病および慢性リンパ性白血病など）を含む白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度および高悪性度形態）、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリーセル白血病および脊髄形成異常症が挙げられる。
【０１０９】
固形腫瘍は、通常、嚢胞または液体領域を含有しない異常な組織塊である。固形腫瘍は、良性でも、悪性でもよい。種々の種類の固形腫瘍は、それらを形成する細胞種に基づいて命名されている（肉腫、癌腫およびリンパ腫など）。肉腫および癌腫などの固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫およびその他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、リンパ系腫瘍、膵臓がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌腫、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫  脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、黒色腫およびＣＮＳ腫瘍（神経膠腫（脳幹部神経膠腫および混合膠腫など）、神経膠芽腫（多形神経膠芽腫としても知られる）星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、シュワン腫頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫および脳転移など）が挙げられる。
【０１１０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、病状は、固形腫瘍である。
【０１１１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の親和性結合体は、抗腫瘍効果を有する。
【０１１２】
用語「抗腫瘍効果」とは、本明細書において、腫瘍容量の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の増大または癌性状態と関連する種々の生理学的症状の寛解によって顕在化される生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、そもそも腫瘍を発生させない予防における本発明の医薬の能力によっても顕在化される。
【０１１３】
特定の実施形態によれば、親和性結合体がチロシナーゼ（ＴｙｒＤ）に対するものである場合、がんは、黒色腫および神経膠芽腫からなる群より選択されるものである。
【０１１４】
特定の実施形態によれば、親和性結合体がＷＴ１に対するものである場合、がんは、以下から選択されるものである。
【０１１５】
【表１】
2018527884.tif 000002
【０１１６】
特定の実施形態によれば、親和性結合体がＭＡＧＥに対するものである場合、がんは、以下から選択されるものである。
【０１１７】
【表２】
2018527884.tif 000003
【０１１８】
【表３】
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【０１１９】
特定の実施形態によれば、親和性結合体がＰＡＰに対するものである場合、がんは、前立腺がんである。
【０１２０】
上記分類は、診断および治療の両方に関連する。
【０１２１】
本発明の免疫複合体の存在またはレベルを決定する手段は、抗体が結合されている検出可能な部分に応じて変化する。
【０１２２】
本発明において使用可能な検出可能な部分の例としては、放射性同位体、リン光化学物質、化学発光化学物質、蛍光化学物質、酵素、蛍光ポリペプチドおよびエピトープタグが挙げられるが、これらに限定されるものではない。検出可能な部分は、結合対の一メンバーと直接可視化される標識でもよく、これは、結合対の他のメンバーとの相互作用を介して識別可能である。１つの例では、結合対のメンバーは、対応する標識された抗体によって同定される抗原である。１つの例では、標識は、比色反応を生じる蛍光タンパク質または酵素である。
【０１２３】
検出可能な部分のさらなる例として、陽電子放射断層撮影（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｍａｇｒａｐｈｙ）（ＰＥＴ）および磁気共鳴断層撮影（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ）（ＭＲＩ）によって検出可能なものが挙げられるが、そのすべては、当業者に周知である。
【０１２４】
検出可能な部分が、ポリペプチドである場合には、免疫標識（すなわち、検出可能な部分とコンジュゲートしている抗体）は、組み換え手段、または化学合成、例えば、予め定めた順序で１個または複数のアミノ酸残基を段階的に付加する固相ペプチド合成技術の使用、によって製造することができる。組み換えＤＮＡ技術を使用して本発明の抗体と連結され得る（ＴＣＲＬをコードするポリヌクレオチドが翻訳によって検出可能な部分と融合される）ポリペプチド検出可能部分の例として、蛍光ポリペプチド、リン光ポリペプチド、酵素およびエピトープタグが挙げられる。
【０１２５】
上記の代わりとなる、本発明の抗体と検出可能な部分との化学的結合は、直接的または間接的な、任意の適切な化学的連結を使用して達成することができ、（検出可能な部分がポリペプチドである場合の）ペプチド結合を介した結合、またはリンカーペプチドもしくは有機ポリマーなどのその他の化学的部分といった介在するリンカー要素との共有結合が挙げられる。このようなキメラペプチドは、ペプチドのカルボキシ（Ｃ）末端またはアミノ（Ｎ）末端の結合を介して、または直鎖、分岐もしくは環状の側鎖、内部炭素原子や窒素原子などの内部化学基との結合を介して、連結することができる。このような修飾されたペプチドは、容易に同定可能であり、ペプチド合成および／またはペプチドの共有結合に関する周知の方法を使用して、当業者が容易に調製可能である。抗体の蛍光標識に関しては、米国特許第３，９４０，４７５号、同４，２８９，７４７号および同４，３７６，１１０号に詳細に記載されている。
【０１２６】
２つのペプチド部分を連結するための例示的方法を以下に記載する。
【０１２７】
ＳＰＤＰコンジュゲーション：
当業者に公知の任意のＳＰＤＰコンジュゲーション法を使用することができる。例えば、１つの例示的な実施形態において、以下に記載されるような、Cumber et al (1985, Methods of Enzymology 112: 207-224)の方法の変法を使用する。
【０１２８】
識別可能部分または治療用部分などのペプチド（１．７ｍｇ／ｍｌ）を、１０倍過剰のＳＰＤＰ（エタノール中、５０ｍＭ）と混合し、抗体を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム中の２５倍過剰のＳＰＤＰ、０．１０ＭのＮａＣｌ  ｐＨ７．２と混合し、反応物の各々を、例えば室温で３時間インキュベートする。次いで、反応物をＰＢＳに対して透析する。
【０１２９】
ペプチドは、例えば、５０ｍＭ  ＤＴＴを用いて室温で１時間還元する。還元したペプチドを、Ｇ−２５カラム（最大５％サンプル／カラム容量）で、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４  ｐＨ６．５を用いる平衡化によって脱塩する。還元したペプチドを、ＳＰＤＰ抗体と、抗体：ペプチドのモル比が１：１０となるように組み合わせ、４℃で一晩インキュベートして、ペプチド−抗体結合体を形成する。
【０１３０】
グルタルアルデヒドコンジュゲーション：
ペプチド（例えば、識別可能部分または治療用部分）と抗体との連結は、グルタルアルデヒドを使用する当業者に公知の方法によって実施することができる。例えば、１つの例示的実施形態では、以下に記載する、G.T. Hermanson (1996, "Antibody Modification and Conjugation, in Bioconjugate Techniques", Academic Press、San Diego)による連結方法を使用する。
【０１３１】
抗体およびペプチド（１．１ｍｇ／ｍｌ）を、１０倍過剰量の０．１Ｍリン酸、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．８中、０．０５％のグルタルアルデヒドと混合し、室温で２時間反応させる。過剰な部位をブロッキングするために、０．０１Ｍリシンを添加してもよい。反応後、過剰なグルタルアルデヒドを、ＰＢＳ（１０％ｖ／ｖサンプル／カラム容量）で平衡化したＧ−２５カラムを使用して除去する。
【０１３２】
カルボジイミドコンジュゲーション：
ペプチドと抗体との連結は、カルボジイミドなどの脱水剤を使用する当業者に公知の方法によって実施することができる。最も好ましくは、カルボジイミドを、４−ジメチルアミノピリジンの存在下で使用する。当業者に周知であるように、カルボジイミドコンジュゲーションは、ペプチドのカルボキシル基と、抗体のヒドロキシル基（エステル結合の形成をもたらす）または抗体のアミノ基（アミド結合の形成をもたらす）または抗体のスルフヒドリル基（チオエステル結合の形成をもたらす）との間の共有結合を形成するために使用することができる。
【０１３３】
同様に、カルボジイミドカップリングは、抗体の炭素基と、ペプチドのヒドロキシル基、アミノ基またはスルフヒドリル基との間の、類似の共有結合を形成するために使用することができる。全般的に、J. March, Advanced Organic Chemistry: Reaction's, Mechanism, and Structure, pp. 349-50 & 372-74 (3d ed.), 1985を参照されたい。以下の例示によって制限されるものではないが、ペプチドは、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどのカルボジイミドを使用する共有結合を介して、抗体と連結される。全般的に、B. Neises et al. (1978, Angew Chem., Int. Ed. Engl. 17:522、A. Hassner et al. (1978, Tetrahedron Lett. 4475)、E.P. Boden et al. (1986, J. Org. Chem. 50:2394)およびL.J. Mathias (1979, Synthesis 561)による連結方法を参照されたい。免疫複合体のレベルは、罹患していない対象由来の対照サンプルと比較することができ、ここで、免疫複合体形成の上方制御は、黒色腫の指標となる。対象は、好ましくは同一種、例えば、ヒトであり、さらに好ましくは、年齢、体重、性別などが同じ、対応するヒトのものである。対照サンプルもまた、疾患進行の前または疾患緩解後の健常組織由来である同一対象のものでもよいことが認められよう。
【０１３４】
特定の実施形態によれば、検出は、ＦＡＣＳによって実施する。
【０１３５】
記載されるように、本発明の抗体はまた、抗体が治療用部分を含む治療薬において使用することができる。
【０１３６】
治療用部分は、抗体の不可欠な部分、例えば、全抗体の場合には、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を活性化するＦｃドメインでもよい。ＡＤＣＣは、細胞によって媒介される免疫防御機構であり、免疫系のエフェクター細胞が、膜表面抗原が特異的抗体によって結合されている標的細胞を活発に溶解するものである。これは、抗体が、体液性免疫応答の一部として、感染を制限し、含有するように作用し得る機構の１つである。古典的なＡＤＣＣは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって媒介され、マクロファージ、好中球および好酸球もＡＤＣＣを媒介し得る。例えば、好酸球は、ＩｇＥの仲介するＡＤＣＣによって、蠕虫として知られる特定の寄生虫を死滅させることができる。ＡＤＣＣは、事前の抗体反応に対するその依存性故に、適応免疫応答の一部である。
【０１３７】
上記の代わり、または上記に加えて、抗体を二重特異性抗体とすることができ、この場合、治療用部分をＴ細胞誘導剤（ｅｎｇａｇｅｒ）、例えば、抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ１６ａとするか、あるいは、治療用部分を、抗免疫チェックポイント分子（抗ＰＤ−１）とすることができる。
【０１３８】
上記の代わり、または上記に加えて、抗体を、異種の治療用部分と結合してもよい（連結の方法は、本明細書において上述した通りである）。治療用部分は、例えば、細胞傷害性部分、毒性部分、サイトカイン部分、薬物でもよい。
【０１３９】
抗体は、可溶性の形態でも、不溶性の形態でもよい。
【０１４０】
不溶性の形態は、抗体のＣＤＲを含む分子が、細胞または粒子に固定されるか、またはそれによって発現されるものでもよい（後者は、治療用途ならびに診断用途に使用可能である）。
【０１４１】
このような細胞の例として、免疫細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、ＣＩＫ、ＮＫＴ、ＮＫ細胞（自己、同種異系の、異種）が挙げられる。
【０１４２】
特定の実施形態によれば、抗体（または実際には、そのＣＤＲ）は、（上記で説明されるような）ＣＡＲまたは人工Ｔ細胞受容体を形成する。したがって、このような分子をコードするポリヌクレオチドは、対象の細胞中に形質導入される。
【０１４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、標的細胞に対してエフェクター死滅機能を発揮する細胞、エフェクターＴ細胞に対して抑制効果を発揮する細胞、エフェクター死滅機能を有する遺伝子操作された細胞、または抑制機能を有する遺伝子操作された細胞である。
【０１４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は、Ｔ細胞またはαβＴ細胞またはγδＴ細胞である。
【０１４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
【０１４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナチュラルキラー細胞を、がんを標的とするように使用する。
【０１４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞（エフェクターＴ細胞）である。
【０１４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞傷害性Ｔ細胞（エフェクターＴ細胞）を、がん抗原を標的とするように使用する。
【０１４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞傷害性Ｔ細胞を、がんによって引き起こされる、またはそれと関連する病状を治療するために使用する。
【０１５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇ（Ｔ制御性細胞）を含む。
【０１５１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｔ細胞は、ＣＤ３  Ｔ細胞を含む。
【０１５２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｔ細胞は、ＣＤ４  Ｔ細胞を含む。
【０１５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｔ細胞は、ＣＤ８  Ｔ細胞を含む。
【０１５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗原結合ドメインは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子を含む。
【０１５５】
本発明のＣＡＲ分子の細胞質ドメイン（「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）は、ＣＡＲが導入されていた免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化に関与する。
【０１５６】
用語「エフェクター機能」とは、細胞の専門的な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解性活性またはヘルパー活性である。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルを形質導入し、細胞に専門的な機能を発揮するように指示するタンパク質の一部を指す。通常、全細胞内シグナル伝達ドメインを使用することができるが、多くの場合には、全鎖を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮化された部分を使用する場合には、このような短縮化された部分は、エフェクター機能シグナルを形質導入する限り、全長鎖の代わりに使用することができる。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語には、エフェクター機能シグナルを形質導入するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮化部分をも含むものとする。
【０１５７】
本発明のＣＡＲ分子において使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、抗原受容体結合後に協働してシグナル伝達を開始する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質配列や、これら配列の任意の誘導体または変異体、および同じ機能的な能力を有する任意の合成配列が挙げられる。
【０１５８】
ＴＣＲ単独によって生成されたシグナルは、Ｔ細胞の十分な活性化には不十分であるということ、および二次または共刺激シグナルも必要であるということが知られている。したがって、Ｔ細胞の活性化は、２つの別個のクラスの細胞質シグナル伝達配列、即ち、ＴＣＲによる抗原依存性一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）および抗原依存的に作用して、二次または共刺激シグナルを提供するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）によって媒介され得る。
【０１５９】
一次細胞質シグナル伝達配列は、ＴＣＲ複合体の一次活性化を増強的または阻害的のいずれかの方向に調節する。増強的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られている、シグナル伝達モチーフを含んでもよい。
【０１６０】
本発明において特に役に立つ一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来のものが挙げられる。本発明のＣＡＲ中の細胞質シグナル伝達分子が、ＣＤ３ζ由来の細胞質シグナル伝達配列を含むことが特に好ましい。
【０１６１】
好ましい実施形態では、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを単独で、または本発明のＣＡＲとの関連で有用な任意のその他の所望の１つまたは複数の細胞質ドメインと組み合わせて含むように設計することができるされ得る。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含み得る。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な反応に必要な、抗原受容体やそのリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例として、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。したがって、共刺激シグナル伝達要素として主に４−１ＢＢを用いて本発明を例示するが、その他の共刺激要素も本発明の範囲に含まれる。
【０１６２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達領域およびζ鎖部分を含む。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲ分子の一部を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な反応に必要な、抗原受容体やそのリガンド以外の細胞表面分子である。
【０１６３】
本明細書において、「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上の同族共刺激分子と特異的に結合する、抗原提示細胞［例えば、ａＡＰＣ（人工抗原提示細胞）、樹状細胞、Ｂ細胞など］上の分子であり、当該結合によって、例えば、ペプチドが負荷されたＭＨＣ分子とＴＣＲ／ＣＤ３複合体との結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖、活性化、分化などが挙げられるが、これらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供するものである。共刺激リガンドとしては、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌリガンド受容体と結合するアゴニストまたは抗体およびＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。共刺激リガンドは、特に、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体をさらに包含し、当該抗体としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１６４】
「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指し、当該結合によって、Ｔ細胞による共刺激応答（増殖などが挙げられるが、これらに限定されるものではない）を媒介するものである。共刺激分子としては、ＭＨＣクラス１分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１６５】
「共刺激シグナル」とは、本明細書においては、ＴＣＲ／ＣＤ３連結などの一次シグナルとの組み合わせによって、Ｔ細胞増殖および／または重要分子の上方制御または下方制御をもたらすシグナルを指す。
【０１６６】
用語「刺激」とは、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）と、その同族リガンドとの結合によって誘導され一次応答であって、シグナル伝達事象（一例はＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達であるが、これに限定されない）を媒介する一次反応を意味する。刺激は、ＴＧＦ−βの下方制御および／または細胞骨格構造の再構築などといった特定の分子の発現の変更を媒介することもできる。
【０１６７】
「刺激分子」とは、本明細書において、抗原提示細胞上に存在する同族刺激リガンドと特異的に結合する、Ｔ細胞上の分子を意味する。
【０１６８】
「刺激リガンド」とは、本明細書においては、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上に存在するときに、Ｔ細胞上の同族結合パートナー（本明細書において、「刺激分子」と呼ばれる）と特異的に結合するものであり、当該結合によって、Ｔ細胞による一次応答（活性化、免疫応答の開始、増殖などを含むが、これらに限定されない）を媒介し得るものを意味する。刺激リガンドは、当技術分野で周知であり、特に、ペプチドが負荷されたＭＨＣクラスＩ分子、抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体およびスーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体を包含する。
【０１６９】
細胞質ドメインについては、本発明のいくつかの実施形態のＣＡＲ分子を、ＣＤ２８および／または４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを単独で、または本発明のいくつかの実施形態におけるＣＡＲとの関連で有用な任意のその他の所望の１つまたは複数の細胞質ドメインと組み合わせて含むように設計することができる。一実施形態では、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインをさらに含むように設計することができる。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、これらに限定されるものではないが、ＣＤ３ζ、４−１ＢＢおよびＣＤ２８のシグナル伝達モジュールおよびそれらの組合せを含んでもよい。
【０１７０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζ（ＣＤ２４７、ＣＤ３ｚ）、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０およびＣＤ１３７からなる群より選択される少なくとも１つの、例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、例えば、少なくとも６つのポリペプチドを含む。
【０１７１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞内ドメインは、内因性ＴＣＲからのシグナルの一次伝達物質である、ＣＤ３ζ鎖［「ＣＤ３ζ」および「ＣＤ３ｚ」としても知られるＣＤ２４７分子、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００７２５．１およびＮＰ＿９３２１７０．１］を含む。
【０１７２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞内ドメインは、Ｔ細胞にさらなるシグナルを提供するために、ＣＡＲの細胞質テールに種々の共刺激タンパク質受容体を含む（第２世代ＣＡＲ）。例としては、ＣＤ２８［例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２３０００６．１、ＮＰ＿００１２３０００７．１、ＮＰ＿００６１３０．１］、４−１ＢＢ［腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、「ＣＤ１３７」としても知られるメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１５５２．２］およびＩＣＯＳ［誘導性Ｔ細胞共刺激物質、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３６２２４．１］が挙げられるが、これらに限定されるものではない。前臨床研究は、第２世代のＣＡＲの構成が、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を改善することを示した。
【０１７３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞内ドメインは、効力をさらに増強するために、ＣＤ３ｚ−ＣＤ２８−４１ＢＢまたはＣＤ３ｚ−ＣＤ２８−ＯＸ４０などの複数のシグナル伝達ドメインを含む。用語「ＯＸ４０」とは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４）、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３３１８．１（「第３世代」ＣＡＲ）を指す。
【０１７４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞内ドメインは、ＣＤ２８−ＣＤ３ｚ、ＣＤ３ｚ、ＣＤ２８−ＣＤ１３７−ＣＤ３ｚを含む。用語「ＣＤ１３７」とは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１５５２．２を指す。
【０１７５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＡＲ分子をナチュラルキラー細胞のために設計するとき、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８および／またはＣＤ３ζでよい。膜貫通ドメインは、天然または合成の原料のいずれから誘導したものでもよい。原料が天然である場合には、ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質から誘導することができる。本発明において特に有用な膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα、βまたはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４から誘導したものである（すなわち、その少なくとも膜貫通領域を含む）。上記の代わりに、膜貫通ドメインは、合成でもよく、この場合には、主にロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含む。好ましくは、合成膜貫通ドメインの各末端にフェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンからなるトリプレットが存在する。所望により、短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカー、好ましくは、アミノ酸長が２から１０のものが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連関を形成する。グリシン−セリンダブレットは、特に適切なリンカーとなる。
【０１７６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のＣＡＲ分子中に含まれる膜貫通ドメインは、ＣＡＲ中のドメインの１つと天然で関連している膜貫通ドメインである。本発明のいくつかの実施形態によれば、膜貫通ドメインは、当該ドメインと、同一または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインとの結合を避けるように選択したり、アミノ酸置換によって修飾したりしてもよく、こうすることで受容体複合体のその他のメンバーとの相互作用を最小化することができる。
【０１７７】
いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲ分子の細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間、またはＣＡＲ分子の細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に、スペーサードメインを導入してもよい。本明細書において、用語「スペーサードメイン」は、一般に、膜貫通ドメインを、ポリペプチド鎖中の細胞外ドメインまたは細胞質ドメインのいずれかと連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、最大３００個のアミノ酸、好ましくは、１０〜１００個のアミノ酸、最も好ましくは、２５〜５０個のアミノ酸を含む。
【０１７８】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、がんの治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、対象に親和性結合体を投与することによって、対象においてがんを治療することを含む方法が提供される。
【０１７９】
また、病状、例えば、がん、を治療するための医薬の製造における、本明細書において定義する親和性結合体の使用も提供される。
【０１８０】
ＴＣＲＬの選択は、通常、病状におけるその提示に応じて変化する。例示的ＴＣＲＬおよび病状とのその関連は、本明細書において上記した表によって提供されている。
【０１８１】
用語「治療する」とは、病状（疾患、障害または病態）の発生を阻害、予防もしくは停止すること、および／または病状の低減、緩解もしくは退縮を引き起こすことを指す。当業者ならば、病状の発生を評価するために種々の方法論およびアッセイが使用可能であり、同様に、病状の低減、緩解または退縮を評価するための種々の方法論およびアッセイが使用可能であることを理解するであろう。
【０１８２】
本明細書において、用語「対象」は、哺乳動物、好ましくは、病状を患っている任意の年齢のヒトである。
【０１８３】
本発明のいくつかの実施形態の抗体は、生物にそれ単独で、または適切な担体または賦形剤と混合した医薬組成物の形態で投与することができる。
【０１８４】
本明細書において、「医薬組成物」とは、本明細書において記載した有効成分のうちの１種または複数種と、生理学的に適切な担体および賦形剤などの他の化学成分とを含む製剤を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【０１８５】
本明細書において、用語「有効成分」とは、生物学的効果を担う抗体を指す。
【０１８６】
本明細書において以下、同義的に使用され得る語句「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」は、生物に対して顕著な刺激作用を引き起こさず、且つ投与された化合物の生物活性および特性を抑制しない、担体または希釈剤を指す。アジュバントは、これらの語句に含まれる。
【０１８７】
本明細書において、用語「賦形剤」とは、有効成分の投与をさらに容易にするように医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖およびデンプンの種類、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１８８】
薬物の製剤化および投与のための技術は、参照により本明細書に組み込まれる"Remington’s Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版に見出すことができる。
【０１８９】
適切な投与経路としては、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に、経鼻、腸管または筋肉内、皮下および髄内注射を含む非経口送達、ならびにくも膜下腔内、直接脳室内、心臓内（例えば、右または左心室腔へ、総冠動脈へ）、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼球内への注射を挙げることができる。
【０１９０】
中枢神経系（ＣＮＳ）への薬物送達のための従来アプローチとして、神経外科的戦略（例えば、大脳内注射または脳室内注入）、ＢＢＢの内因性輸送経路の１種を利用する薬剤の構築を目的とした分子操作（例えば、内皮細胞表面分子に対して親和性を有する輸送ペプチドと、自身ではＢＢＢを通過できない薬剤との組み合わせを含む、キメラ融合タンパク質の製造）、薬剤の脂溶性を増大するように設計する薬理学的戦略（例えば、脂質担体またはコレステロール担体への水溶性薬剤の結合）、および高浸透圧性の破壊によるＢＢＢの完全性の一過性の破壊（頚動脈へのマンニトール溶液の注入、またはアンジオテンシンペプチドなどの生物学的に活性な薬剤の使用によるもの）が挙げられる。しかし、これらの戦略の各々には、侵襲的外科的手順に関連する固有のリスク、内因性輸送系に固有の制限によって課せられるサイズの限界、ＣＮＳの外では活性であり得る担体モチーフを含むキメラ分子の全身投与と関連する潜在的に望ましくない生物学的副作用、およびＢＢＢが破壊された脳の領域内で生じうる脳損傷のリスクといった限界が存在し、これら限界故に、準最適な送達法となる。
【０１９１】
上記の代わりに、医薬組成物を全身にではなく局所的に、例えば、患者の組織領域への直接的な医薬組成物の注射によって、投与してもよい。
【０１９２】
用語「組織」とは、１種または数種の機能を実行するように設計された細胞からなる、生物の一部を指す。例として、脳組織、網膜、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、骨、軟骨、結合組織、血液組織、筋肉組織、心臓組織脳組織、血管組織、腎組織、肺組織、生殖腺組織、造血組織が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１９３】
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物は、当技術分野で周知のプロセス、例えば、従来の混合プロセス、溶解プロセス、造粒プロセス、糖衣錠作製プロセス、すりつぶしプロセス、乳化プロセス、カプセル封入プロセス、封入プロセスまたは凍結乾燥プロセスの手段によって製造することができる。
【０１９４】
本発明のいくつかの実施形態に従って使用するための医薬組成物は、したがって、１種または複数の生理学的に許容される担体を使用して従来法で製剤化することができる。担体には、賦形剤および補助剤が含まれ、これは、有効成分を薬学的に使用可能な製剤への加工を促進することができる。適切な処方は、選択された投与経路に応じて変化する。
【０１９５】
注射用には、医薬組成物の有効成分は、水溶液として、好ましくは、ハンクス溶液、リンガー溶液または生理学的塩バッファーなどの生理学的に適合するバッファーの溶液として処方することができる。経粘膜投与用には、透過すべき障壁に適切な浸透剤を処方に用いる。このような浸透剤は、一般的に当技術分野で公知である。
【０１９６】
経口投与用には、活性化合物を当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって、医薬組成物を容易に処方することができる。このような担体は、医薬組成物を、患者による経口摂取のための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方することを可能にする。固体賦形剤を使用し、所望により得られた混合物を粉砕し、必要に応じて適切な補助剤を添加した後に顆粒剤の混合物を加工することで、錠剤または糖衣錠コアを得て、経口使用のための薬理学的製剤を作製することができる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなどのセルロース製剤、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容されるポリマーである。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸、もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を添加してもよい。
【０１９７】
糖衣錠コアは、適切なコーティングと共に提供される。この目的のためには、濃縮された糖溶液が使用可能であり、所望によりアラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい。識別のため、または異なる活性化合物用量の組合せを特徴付けするために、錠剤または糖衣錠コーティングには、色素または顔料を添加することができる。
【０１９８】
経口的に使用され得る医薬組成物としては、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル剤、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤から作られたソフト密閉カプセル剤が挙げられる。プッシュフィットカプセル剤は、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および任意選択で安定化剤との混合物として、有効成分を含有してもよい。ソフトカプセル剤では、有効成分は、脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解または懸濁されていてもよい。さらに、安定化剤を添加してもよい。経口投与用のすべての処方が、選択した投与経路に適切な処方量でなくてはならない。
【０１９９】
頬側投与用の組成物は、従来法で製剤化された錠剤またはトローチ剤の形態をとることができる。
【０２００】
鼻腔の吸入による投与用には、本発明のいくつかの実施形態に従って使用するための有効成分は、加圧パックまたは適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）を使用する噴霧器からの、エアロゾルスプレー型の形態で送達されることが好適である。加圧エアロゾルの場合には、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって、投与量単位を決定することができる。ディスペンサーにおいて使用するための、例えば、ゼラチンのカプセル剤およびカートリッジを、当該化合物と適切な粉末基剤（ラクトースやデンプンなど）との粉末混合物を含有するように処方することができる。
【０２０１】
本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与用に処方することもできる。注射用の処方は、例えば、アンプル中、または所望により防腐剤が添加された複数回用量容器中の単位剤形として提供することができる。組成物は、油性または水性のビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンでもよく、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化物質を含有することができる。
【０２０２】
非経口投与用の医薬組成物は、水溶性形態の活性製剤の水溶液を含む。さらに、有効成分の懸濁液は、適当な油性または水性基材を用いた注射用懸濁液として調製することができる。適切な親油性の溶媒またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油またはオレイン酸エチルなどの合成脂肪酸エステル、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性注射懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどの懸濁液の粘度を増大する物質を含有してもよい。所望により懸濁液はまた、適切な安定化剤または高濃縮溶液の調製を可能せしめるために、有効成分の溶解度を増大させる薬剤を含有してもよい。
【０２０３】
上記の代わりに、有効成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば、滅菌済でパイロジェンフリーの水系溶液、を用いて構成するための、粉末の形態でもよい。
【０２０４】
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物はまた、例えば、ココアバターまたはその他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を使用して、坐剤または保留浣腸などの直腸組成物に処方することもできる。
【０２０５】
本発明のいくつかの実施形態に関連して使用するのに適切な医薬組成物としては、有効成分が、意図される目的を達成するために有効な量で含有される組成物が挙げられる。より詳しくは、治療上有効な量とは、障害（例えば、がん）の症状を予防、軽減または寛解するため、または治療されている対象の寿命を延長するのに有効な、有効成分（ＴＣＲＬ抗体）の量を意味する。
【０２０６】
治療上有効な量の決定は、特に、本明細書において提供される詳細な開示を鑑みる場合には、十分に当業者の能力内である。
【０２０７】
本発明の方法において使用されるいかなる製剤についても、治療上有効な量または用量は、初めにｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイおよび細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、動物モデルにおいて所望の濃度または力価を達成するように、用量を処方することができる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０２０８】
本明細書において記載する有効成分の毒性および治療効力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、培養細胞、または実験動物において、標準的な薬学手順によって決定することができる。このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイおよび細胞培養アッセイ、ならびに動物研究において得られたデータを、ヒトにおいて使用するためのさまざまな投与量の処方の際に使用することができる。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて変化し得る。正確な処方、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる（例えば、"The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch.1 p.1のFingl, et al., 1975を参照）。
【０２０９】
投与の量および間隔は、生物学的効果を誘導するか、または抑制するのに十分な、有効成分のＴＣＲＬ（組織ＴＣＲＬ）レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）を提供するように、個々に調整してもよい。ＭＥＣは、各処方について変化するが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投与量は、個々の特徴および投与経路に応じて変化する。血漿中濃度を決定するために検出アッセイは、使用することができる。
【０２１０】
治療すべき病態の重症度および応答性に応じて、投薬は、単回または複数回投与であり、治療は、数日から数週間、または治癒が達成されるまで、もしくは疾患状態の減少が達成されるまで継続することができる。
【０２１１】
投与されるべき組成物の量は、当然のことながら、治療されている対象、苦痛の重症度、投与の方法、処方医師の判断などに応じて変化する。
【０２１２】
本発明のいくつかの実施形態の組成物は、所望により、有効成分を含有する１種または複数種の単位剤形を含有するパックまたはディスペンサー装置、例えば、（診断用または治療用）ＦＤＡ承認キットなど、で提供することができる。パックは、例えば、ブリスターパックのように、金属またはプラスチックホイルを含んでもよい。パックまたはディスペンサー装置は、投与のための説明書を伴ってもよい。パックまたはディスペンサーはまた、医薬の製造、使用または販売を規制する政府機関によって指示された形態の容器と関連する通知を収容してもよく、当該通知は、組成物またはヒトもしくは獣医学的投与の形態が、上記機関の承認済みであることを反映している。このような通知は、例えば、米国食品医薬品局によって承認された、処方薬物のためにラベル、または承認された添付文書でもよい。上記で詳細に説明したように、適合する医薬担体中に処方された本発明の製剤を含む組成物を製造し、適当な容器中に加え、記述した病態の治療用である旨の標識を付すこともできる。
【０２１３】
特定の実施形態によれば、本発明のＴＣＲＬは、以下の表３に示した抗体のＣＤＲを含まず、これらの各々を、別個の実施形態と考える。
【０２１４】
本明細書において、用語「約」とは、±１０％を指す。
【０２１５】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」およびその同根語は、「それだけには限定されないが含む」を意味する。
【０２１６】
用語「からなる」とは、「含み、それに限定されること」を意味する。
【０２１７】
用語「実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、組成物、方法または構造が、追加の成分、ステップ、および／または部分を含んでいてもよいが、当該追加の成分、ステップ、および／または部分が、特許請求の範囲に記載された組成物、方法、または構造の基本的および新規な特徴を物質的に変化させない場合に限られることを意味する。
【０２１８】
本明細書において、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数の言及を含む。例えば、用語「化合物」または「少なくとも１種の化合物」は、その混合物を含む、複数の化合物を含み得る。
【０２１９】
本出願の全体を通して、本発明の様々な実施形態を範囲の形で提示することができる。範囲の形の記載は、単なる便宜上および簡潔さのためであり、本発明の範囲の変更不可能な限定と解釈すべきではないことを理解されたい。したがって、ある範囲の記述は、その範囲に含まれうる全ての部分範囲のみならず、範囲内の個々の数値をも具体的に開示するものと見なすべきである。例えば、１から６などの範囲の記述は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などの部分範囲のみならず、その範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５、および６を具体的に開示するものと見なすべきである。これは、範囲の幅とは無関係に適用される。
【０２２０】
本明細書に数値範囲が記載されている場合、当該数値範囲内の任意の引用された数字（分数または整数）を全て含むものとする。第１指示数から第２指示数との「間の範囲」という表現、および第１指示数「から」第２指示数「までの範囲／の範囲」は、本明細書において同義的に使用され、第１および第２の指示数と、それらの間のすべての分数および整数を含むものとする。
【０２２１】
本明細書において、用語「方法」とは、所与の所与の仕事を実現するための手法、手段、技法、および手順を意味し、化学、薬理学、生物学、生化学、および医学の分野の当業者に公知の手法、手段、技法、および手順、または当該当業者が公知の手法、手段、技法、および手順から容易に開発可能な手法、手段、技法、および手順を含むが、これらに限定されるものではない。
【０２２２】
本明細書において、用語「治療する」とは、病態の進行を無効化する、実質的に阻害する、減速させる、または逆転させることであって、病態に伴う臨床症状または審美的症状の実質的な改善、または病態に伴う臨床症状または審美的症状の出現の実質的な防止を含む。
【０２２３】
特定の配列表に言及する場合、このような言及は、その相補的配列に実質的に対応する配列、例えば、シーケンシングエラー、クローニングエラー、または塩基置換、塩基欠失もしくは塩基付加をもたらす他の変更に起因するわずかな配列の変化を含むものをも含むものであるが、但し、当該変換の頻度は、５０ヌクレオチド中１未満、あるいは、１００ヌクレオチド中１未満、あるいは、２００ヌクレオチド中１未満、あるいは、５００ヌクレオチド中１未満、あるいは、１０００ヌクレオチド中１未満、あるいは、５，０００ヌクレオチド中１未満、あるいは、１０，０００ヌクレオチド中１未満であることを理解されたい。
【０２２４】
本発明の特徴であって、明確にするために個別の実施形態のとして記載したものは、組み合わせて１つの実施形態としても提供可能であることを理解されたい。逆に、簡潔にするために１つの実施形態として記載した本発明の様々な特徴を、個別に、または任意の適切な部分組合せで、または本発明で記載した他の実施形態との適切な組み合わせとして提供することもできる。様々な実施形態に関連して記載された特徴は、その特徴なしでは実施形態が動作不能でない限り、それらの実施形態の必須要件とは見なさない。
【０２２５】
上記で詳細に説明し、下記の請求の範囲内で請求する発明の様々な実施形態および態様について、以下の実施例で実験的裏付けを示す。
【実施例】
【０２２６】
次に、以下の実施例に参照するが、これらは上記説明と共に本発明の実施形態の一部を詳細に示すものであるが、本発明を限定するものではない。
【０２２７】
本明細書において使用される命名法および本発明に使用する実験手順としては、通常、分子的技術、生化学的技術、微生物学的技術および組み換えＤＮＡ技術が挙げられる。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989).、"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994).、Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989).，Perbal、"A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons、New York (1988).、Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York.，Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York (1998).、米国特許第４，６６６，８２８号、同４，６８３，２０２号、同４，８０１，５３１号、同５，１９２，６５９号および同５，２７２，０５７号に記載の方法論、"Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994).、"Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition.、"Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994).、Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994).、Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)を参照。入手可能な免疫アッセイは、特許および科学文献に広く記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；同３，８３９，１５３号；同３，８５０，７５２号、同３，８５０，５７８号、同３，８５３，９８７号、同３，８６７，５１７号、同３，８７９，２６２号、同３，９０１，６５４号、同３，９３５，０７４号、同３，９８４，５３３号、同３，９９６，３４５号、同４，０３４，０７４号、同４，０９８，８７６号、同４，８７９，２１９号、同５，０１１，７７１号および同５，２８１，５２１号、"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984).、"Nucleic Acid Hybridization" Hames、B. D., and Higgins S. J., eds. (1985).、"Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984).、"Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986).、"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986).、"A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984)及び"Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press.、"PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press、San Diego、CA (1990).、Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)を参照。上記文献の全てが、本参照により本明細書に完全に組み込まれるものとする。その他の一般的な参考文献は、本明細書を通じて提供される。それらに記載の手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供する。それらに含まれるすべての情報が、本参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２８】
一般的な材料および方法
ビオチン化単鎖ＭＨＣ−ペプチド複合体の製造
単鎖ＭＨＣ（ｓｃＭＨＣ）３−ペプチド複合体を、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導の際に大腸菌で生成された封入体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ再フォールディングによって製造した。簡単には、可動性リンカーによって互いにつながれた、ＨＬＡ−Ａ２遺伝子のβ２−ミクログロブリンと細胞外ドメインとを含むｓｃＭＨＣを、そのＣ末端に部位特異的ビオチン化のためのＢｉｒＡ認識配列を含むように遺伝子操作した（ｓｃＭＨＣ−ＢｉｒＡ）。記載したように、ペプチドの存在下において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの再フォールディングを実施した。正確にフォールディングされたＭＨＣ−ペプチド複合体を単離し、陰イオン交換Ｑ−セファロースクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｗａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）によって精製し、続いて、ＢｉｒＡ酵素（Ａｖｉｄｉｔｙ社製）を使用して部位特異的ビオチン化を行った。単鎖−ＭＨＣペプチド複合体の製造についてのより詳細な記載は、Denkberg、et al. (2002) PNAS. 99:9421-9426に提供されている。
【０２２９】
フローサイトメトリー
Ｔ−ＢハイブリッドＴ２細胞を、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて洗浄し、１０−４〜１０−５Ｍのチロシナーゼ３６９−３７７ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号１）／ＷＴ１１２６−１３４（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ、配列番号１４１）ペプチド／ＭＡＧＥ−Ａ４２３０−２３９（配列番号１７６）／ＭＡＧＥ−Ａ９２２３−２３１  ２０３／ＰＡＰ１１２−１２０（配列番号２３０）ペプチドまたは関連の対照ペプチド（以下の表１５に列挙される）を含有する培地中で一晩インキュベートした。ペプチド負荷効率は、ペプチドを負荷したＴ２細胞上のＨＬＡ−Ａ２−結合性抗体ＢＢ７．２のＭＦＩと、負荷していないＴ２細胞のＭＦＩとの比（１超）によって確認した。データは示さない。
【０２３０】
Ｔ２または一次細胞または細胞株（１０６個）を、１０μｇ／ｍｌの特異的Ａｂ（ビオチン化済またはなし）とともに４℃で１時間インキュベートし、続いて、ＰＥ標識抗マウス／ヒト／ストレプトアビジンＡｂとともに４℃で４５分間インキュベートした。抗マウス二次抗体またはストレプトアビジンを用いる研究は、Ｄ１１およびＢ４７Ｂ６について類似の結果をもたらすことが認められよう。最後に、細胞を洗浄し、以下を用いて解析した。
ＦＡＣＳ  １：
機械：ＢＤ  ＦＡＣＳ  ｃａｌｉｂｕｒ
解析ソフトウェア：ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ
ＦＡＣＳ  ２：
機械：Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＮＡＶＩＯＳ
解析ソフトウェア：Ｋａｌｕｚａバージョン１．３
【０２３１】
ハイブリドーマ技術を使用した、ＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼ３６９−３７７／ＷＴ１１２６−１３４／ＭＡＧＥ−Ａ４２３０−２３９／ＭＡＧＥ−Ａ９２２３−２３１／ＰＡＰ１１２−１２０に対するＴＣＲ様抗体の製造
ＨＨＤマウスを、ＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体５０μｇ／マウスの５〜６回の注射によって免疫化した。２〜３回の第１の注射は、ＱｕｉｌＡアジュバントを添加してｓ．ｃ投与した。上記の複合体を用いて、（例えば、Weidanz et al. 2011 Int. Rev. Immunol. 30:328-340に既出の方法で）免疫化したマウスから単離した脾細胞をＮＳＯ骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマクローンを作製し、後述するディファレンシャルＥＬＩＳＡアッセイによってスクリーニングし、単離した。例えば、チロシナーゼＴＣＲＬ選択のためには、関連するＴｙｒＤ３６９−３７７ペプチドＨＬＡ−Ａ２複合体を使用し、関連しないｐ６８−ＤＤＸ５対照ペプチド（配列番号２、ＹＬＬＰＡＩＶＨＩ）ＨＬＡ−Ａ２複合体と比較した。特異的クローンの選択には、精製ＨＬＡ−Ａ２−Ｔｙｒ複合体のみならず、その他のＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチド（表１５）を提示する対照ＨＬＡ−Ａ２複合体を用いるＥＬＩＳＡを使用した。単離したハイブリドーマクローンのサブクローニングを行い、シーケンシングに付した。２つのクローン９０６−１１−Ｄ１１（Ｄ１１と命名、図６８）および９０５−２−Ｄ７（Ｄ７と命名、図６９）の特徴付けを行った。
【０２３２】
ハイブリドーマをＨＡＴ  ＤＭＥＭまたは無血清ＤＣＣＭ２培地中で、コンフルエンシーが８０％超まで培養し、その上清を回収した。プロテインＡカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、培養上清から精製ＩｇＧを単離した。精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって、予想通りに分子量が１５０ｋＤａ以下の均質且つ純粋なＩｇＧの存在が明らかとなった。
【０２３３】
全ＩｇＧ  Ａｂの構築
ＨおよびＬ  Ｆａｂ遺伝子（ＭＣ１についてのみ）を、ヒトＩｇＧ１  κ  Ａｂとしての発現のために、真核生物発現ベクターｐＯｐｔｉＶＥＣおよびｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯのそれぞれにクローニングした。各シャトル発現ベクターは、異なる遺伝子選択（ｐＯｐｔｉＶＥＣのためのＤＨＦＲ／ＨＴ−、およびｐｃＤＮＡ３．３のためのジェネテシン）を有する。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用し、懸濁培養物中のジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠損、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）由来ＤＧ４４細胞への上記２種の構築物のコトランスフェクションによって、発現可能とした。コトランスフェクション後に、細胞を選択培地上で増殖させた。チロシナーゼ３６９−３７７ペプチドでパルスしたＪＹ  Ｔ２細胞と特異的に反応したクローンを、０．５％血清中で増殖するように馴化させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用してさらに精製した。精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって、予想通りに分子量が１５０ｋＤａ以下の均質且つ純粋なＩｇＧの存在が明らかとなった。
【０２３４】
上清または精製Ａｂを用いるＥＬＩＳＡ
個々の上清または精製ＴＣＲＬ抗体の結合特異性を、ビオチン化ｓｃＭＨＣ−ペプチド複合体を使用するＥＬＩＳＡによって決定した。Ｍａｘｉ  ｓｏｒｐ  ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  ４４２４０４番）を、ＢＳＡ−ビオチン（１μｇ／ウェル）を用いて一晩被覆した。洗浄後にプレートを、ストレプトアビジン（１μｇ／ウェル）とインキュベートし（１時間、室温）、十分に洗浄し、０．２５μｇのＭＨＣ／ペプチド複合体とさらにインキュベートした（１時間、室温）。ＰＢＳ／２％スキムミルクを用いてプレートを室温で３０分間ブロッキングし、続いて、１μｇ／ウェルの上清または精製ＴＣＲＬ抗体を室温で１時間インキュベートした。洗浄した後、プレートを、ＨＲＰ結合／抗ヒトＡｂまたはマウスＡｂとインキュベートした。ＴＭＢテトラメチルベンジジン試薬（ＤＡＫＯ社製、Ｓ１５９９）を使用して検出を実施した。精製上清または精製ＴＣＲＬ抗体の特異性研究のためにＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドを使用した。
【０２３５】
Ｐｒｏｔｅｏｎ  ＸＰＲ３６表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による結合解析
ＧＬＭ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｌａｙｅｒ  Ｍｅｄｉｕｍ）チップ（米国、カリフォルニア州、ハーキュリーズ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）上に、２５℃、垂直方向に、ＩｇＧ  ＴＣＲ様抗体の固定化を実施し、連続ランニングバッファーは、ＰＢＳＴ（１０ｍＭ  リン酸Ｎａ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４）とした。流速３０μｌ／分の条件で、５０μｌの０．０４Ｍ  Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および０．０１Ｍ  スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）の混合物を用いて、５チャネルを活性化した。抗マウスまたは抗ヒトＩｇＧ／ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎを１０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．５で最終濃度が２５μｇ／ｍｌとなるように希釈し、それを１５０μｌ注入し、続いて、１５０μｌの１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ８．５を注入した。ＩｇＧ  ＴＣＲＬ抗体／精製ビオチン化単鎖組み換えＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼ／ＷＴ１／ＭＡＧＥ−Ａ４／ＭＡＧＥ−Ａ９／ＰＡＰ複合体リガンドを、ＰＢＳＴで５〜１０μｇ／ｍｌに希釈し、その９０μｌを垂直方向に、３０μｌ／分の流速で注入した。６番目のチャネルは、参照として機能するように空のままとした。披検質として精製された単鎖組み換えＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼ／ＷＴ１／ＭＡＧＥ−Ａ４／ＭＡＧＥ−Ａ９／ＰＡＰ複合体／Ｆａｂ  ＴＣＲＬ抗体を、５種の異なる濃度（１０００、５００、２５０、１２５および６２．５ｎＭ）で、ＰｒｏｔｅＯの水平方向に注入した（５０μｌ／分で７５μｌ）。実験の最中に生じる、チップセンサー表面からの捕獲された抗体の喪失を補正するための二重参照として、ランニングバッファーを６番目のチャネルに同時に注入した。すべての結合センサーグラムを回収し、処理し、統合ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒ（米国、ハーキュリーズ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）ソフトウェアを使用して解析した。１：１結合の化学量論を説明するＬａｎｇｍｕｉｒモデルを使用するか、またはＬａｎｇｍｕｉｒおよび質量移動制限モデルを用いて、結合曲線のフィッティングを行った。
【０２３６】
機能的アッセイ
ＬＤＨ放出アッセイ
二重特異性ＴＣＲＬによる再指標的細胞死滅を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用する非放射性細胞傷害性アッセイによって測定した。このアッセイは、細胞溶解の際に放出される酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を定量的に測定する。培養上清中の放出されたＬＤＨを、テトラゾリウム塩（ＩＮＴ）の赤色ホルマザン生成物への変換をもたらす１０分のカップリング酵素アッセイを用いて測定する。生じた色の量は、溶解した細胞数に比例する。
【０２３７】
具体的には、標的細胞およびエフェクター細胞を洗浄し、計数し、フェノールレッドを含まないｃＲＰＭＩ培地（１％ＦＢＳ）中に再懸濁した。標的細胞の細胞密度を１ｍｌあたり２．５×１０５細胞に調整し、エフェクター細胞の細胞密度を１ｍｌあたり２．５×１０６細胞に調整した。４０μｌ（１×１０４細胞）の標的細胞を９６ウェルのＶ型プレート中で培養した。二重特異性ＴＣＲＬ試験試薬の５倍濃縮ストックを最も高い試験濃度で調製し、これを、個別のプレート内で、フェノールレッドを含まない培地で１対１０に段階希釈して、他の試験濃度を得た。次いで、アッセイプレート中の標的細胞に、二重特異性ＴＣＲＬをウェルあたり２０μｌ添加して、最終表示力価測定量を得た。次いで、二重特異性ＴＣＲＬと混合した標的細胞を含むアッセイプレートを３７℃／５％  ＣＯ２で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルに４０μｌのエフェクター細胞（１×１０５細胞）を添加し、その結果、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比が１０：１となった。対照ウェルには、エフェクターによる自然放出を算出するためのエフェクター細胞単独と、標的自然放出を算出するための標的細胞単独と、最大放出を算出するための、最終濃度８０μｇ／ｍｌジギトニンと標的細胞とを用いた。最終容量１００μｌで、各条件についてアッセイを３回繰り返した。プレートを３７℃／５％  ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーション期間後、プレートを７００×ｇで５分間遠心分離し、各ウェルから５０μｌを取り出し、９６ウェル平底Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（Ｎｕｎｃ社製）中の対応するウェルに移した。ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）基質ミックスを、製造業社の使用説明書のとおりにＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）アッセイバッファーを使用して再構成し、プレートの各ウェルに５０μｌを添加した。プレートをアルミニウムホイルで覆い、室温で１０分間インキュベートした。次いで、プレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を記録した。次いで、以下の式を使用して細胞傷害性パーセンテージを算出した：  特異的溶解＝［（実験−エフェクター自然−標的自然）／（標的最大−標的自然）］×１００。死滅アッセイのためのＰＢＭＣは、規制当局によるＩＲＢ承認および書面での同意を得た健常ボランティアから単離した。エフェクターＰＢＭＣは、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ手順を使用して単離した。
【０２３８】
腫瘍細胞株および正常一次細胞
細胞株Ａ３７５（黒色腫）、Ｕ２ＯＳ（骨肉腫）、ＴＣＣＳＵＰ（膀胱癌）およびＦｉｂ（線維芽細胞）を、１０％  ＦＢＳを添加した完全ＤＭＥＭ（いずれもＧＩＢＣＯ社製）中で培養した。５０１Ａ、ＳＫＭｅｌ５、Ｍｅｗｏおよび１９３８（黒色腫）、Ｓａｏｓ２（骨肉腫）、Ｐａｎｃ１（膵臓癌腫）、Ｊ８２およびＵＭＵＣ３（膀胱）、Ｈ１７０３（非小細胞肺腺癌）、ＪＶＭ２（マントル細胞リンパ腫）、ＩＭ９（多発性骨髄腫）、Ｕ２６６（骨髄腫）およびＳＷ６２０（結腸直腸腺癌）は、１０％  ＦＢＳを添加した完全ＲＰＭＩ（いずれもＧＩＢＣＯ社製）中で培養した。Ｍａｌｍｅ３ｍ（黒色腫）、ＪＥＫＯ１（マントル細胞リンパ腫）、ＳＥＴ２（本態性血小板血症）およびＢＶ１７３（Ｂ細胞前駆体白血病）は、２０％  ＦＢＳを添加した完全ＲＰＭＩ（いずれもＧＩＢＣＯ社製）中で培養した。ＴＨＰ−１（ＡＭＬ）は、完全ＲＰＭＩに１０％  ＦＢＳ（いずれもＧＩＢＣＯ社製）および０．０５ｍＭ  β−メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ−ｆｉｓｈｅｒ社製）を添加したもので培養した。ＯＶＣＡＲ−３（卵巣腺癌）は、完全ＲＰＭＩに２０％ＦＢＳ（いずれもＧＩＢＣＯ社製）および０．０１ｍｇ／ｍｌウシインスリン（Ｓｉｇｍａ社製）を添加したもので培養した。すべての細胞株を、７．５％  ＣＯ２の湿潤雰囲気中３７℃で維持し、これらはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入したものである。
【０２３９】
正常一次肝細胞、心筋細胞、骨芽細胞、星状細胞、気管支上皮細胞、結腸平滑筋細胞、尿路上皮細胞および腎上皮細胞は、Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ社から入手し、業社の使用説明書に従って培養した。すべての細胞株を７．５％  ＣＯ２の湿潤雰囲気中３７℃で維持した。
【０２４０】
Ｅｘｐｉ２９３系における可溶性組み換えＦａｂ  Ａｂの発現および精製
真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４によってＦａｂとして発現させるために、Ｔｙｒ  Ｄ１１およびＤ７のＶＨ−ＣＨ１遺伝子とＶＬ−ＣＬ遺伝子、ＭＡＧＥ−Ａ４  Ｃ１０６Ｂ９、ＷＴ１  Ｂ４７Ｂ６およびＥＳＫ１のＩｇＧをクローニングした。ＨｉｓタグをＣＨ１領域のＣ末端に結合させた。
【０２４１】
Ｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）によって、Ｅｘｐｉ２９３発現培地中のＥｘｐｉ２９３Ｆヒト細胞（両方ともＥｘｐｉ２９３発現系の成分である）への２種の構築物（重鎖および軽鎖）のコトランスフェクションによって発現を実施した。コトランスフェクション後、細胞を６日間増殖させた。６日後に、細胞を７００×ｇで５分間遠心分離した。遠心分離後、Ｄ１１、Ｄ７、Ｃ１０６Ｂ９、Ｂ４７Ｂ６またはＥＳＫ１のＦａｂを含有する上清を、細胞から回収し、０．２２μフィルターで濾過した。次いで、上清をＰＢＳに対して一晩透析した。
【０２４２】
Ｄ１１、Ｄ７、Ｃ１０６Ｂ９、Ｂ４７Ｂ６またはＥＳＫ１のＦａｂ組み換えタンパク質を、金属親和性カラム（Ｔａｌｏｎ社製）によって精製し、ＰＢＳに対して一晩透析した。精製Ｄ１１、Ｄ７、Ｃ１０６Ｂ９、Ｂ４７Ｂ６またはＥＳＫ１  Ｆａｂを、還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。
【０２４３】
Ｅｘｐｉ２９３系における二重特異性ＴＣＲＬの構築、発現および精製
真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４によって二重特異性（ＢＳ）のものとして発現させるために、Ｔｙｒ  Ｄ１１およびＤ７のＶＨ−ＣＨ１遺伝子とＶＬ−ＣＬ遺伝子、ＷＴ１  Ｂ４７Ｂ６、およびＥＳＫ１、およびＭＡＧＥ−Ａ４  Ｃ１０６Ｂ９のＩｇＧをクローニングした（配列は、図６８〜７０に示されており、ＥＳＫ１の配列は、国際公開第２０１５／０７００６１号に示されている）。Ｔｙｒ  Ｄ１１、ＷＴ１  Ｂ４７Ｂ６、およびＥＳＫ１、およびＭＡＧＥ−Ａ４  Ｃ１０６Ｂ９の軽鎖ベクターのために、抗ＣＤ３（クローン  ＵＣＨＴ１）ｓｃＦｖを、ＶＬ領域のＮ末端に結合させた（ＢＳ形式３、Ｆ３番）。重鎖ベクターのためには、ＣＨ１領域のＣ末端にＨｉｓ−タグを結合させた。Ｔｙｒ  Ｄ７ようには、抗ＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１）ｓｃＦｖを、重鎖のＶＨ領域のＮ末端に結合させ（ＢＳ形式１、Ｆ１番）、Ｈｉｓ−タグをＣＨ１領域のＣ末端に結合させた。
【０２４４】
Ｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）によって、Ｅｘｐｉ２９３発現培地中のＥｘｐｉ２９３Ｆヒト細胞（両方ともＥｘｐｉ２９３発現系の成分である）への２種の構築物のコトランスフェクションによって発現を実施した。コトランスフェクション後、細胞を６日間増殖させた。６日後に、細胞を７００×ｇで５分間遠心分離した。遠心分離後、ＴＣＲＬ二重特異性抗体を含有する上清を細胞から回収し、０．２２μフィルターで濾過した。上清をＰＢＳに対して一晩透析した。
【０２４５】
ＢＳ−ＴＣＲＬ組み換えタンパク質を、金属親和性（Ｔａｌｏｎ社製）およびサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ  ＧＥ）の２ステップによって精製した。精製ＢＳ−ＴＣＲＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。
【０２４６】
ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
５０１Ａ黒色腫細胞株（米国、バージニア州、マナッサス、ＡＴＣＣ）について
細胞を、１０％ウシ胎児血清（米国、マサチューセッツ州、ウォルサム、ＧＩＢＣＯ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０増殖培地（米国、マサチューセッツ州、ウォルサム、ＧＩＢＣＯ社製）中で培養した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＳｅｐＭａｔｅＴＭ−５０チューブ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ社製）を使用することによって、健常ドナーから調製した。
【０２４７】
０日目に、８〜１０週齢の雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（イスラエル国、Ｅｎｖｉｇｏ社製、ｎ＝６〜８）に、単回の皮下（ｓ．ｃ．）注射によって、最終容量０．２５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の、５×１０６個の５０１Ａ黒色腫細胞±２５×１０６個のＰＢＭＣ（エフェクター：腫瘍細胞比は５：１）を接種した。また、上記ｓ．ｃ．接種の１時間後に、最終容量０．２ｍｌのビヒクル（ＰＢＳ）をｉ．ｖ．投与し、さらなる用量を、４回にわたり、２４時間毎に投与した。
【０２４８】
Ａ３７５黒色腫細胞株（米国、バージニア州、マナッサス、ＡＴＣＣ）について
細胞を、１０％ウシ胎児血清（米国、マサチューセッツ州、ウォルサム、ＧＩＢＣＯ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０増殖培地（米国、マサチューセッツ州、ウォルサム、ＧＩＢＣＯ社製）中で培養した。活性化したＣＤ８Ｔ細胞を、高速増殖プロトコール（ＲＥＰ）を使用してヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製した。未処理ＰＢＭＣを、ＳｅｐＭａｔｅＴＭ−５０チューブ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ社製）を使用して健常ドナーの末梢血から調製し、次に、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ（商標）ヒトＣＤ８Ｔ細胞キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ社製）を使用して、ＣＤ８Ｔ細胞を濃縮した。精製ＣＤ８Ｔ細胞の活性化を、ＣＤ３（ＯＫＴ３）およびＣＤ２８に対するモノクローナル抗体で予め被覆したフラスコ中で、１０％ＦＢＳおよび１００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ−２を添加した培地中で７２時間実施した。１０％ＦＢＳ、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３および２×１０８個の照射済ＰＢＭＣを添加した培地中で、活性化された細胞を１４日間にわたって増殖させた。
【０２４９】
０日目に、８〜１０週齢の雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（イスラエル国、Ｅｎｖｉｇｏ社製、ｎ＝６〜８）に、単回の皮下（ｓ．ｃ．）注射によって、最終容量０．２５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の、５×１０６個のＡ３７５黒色腫細胞±１０×１０６個のＲＥＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞（エフェクター：腫瘍細胞比は２：１）を接種した。また、上記ｓ．ｃ．接種の１時間後に、最終容量０．２ｍｌのＭＡＧＥ−Ａ４  Ｃ１０６Ｂ９二重特異性ＴＣＲＬ（０．１ｍｇ／ｋｇ）、ＷＴ１  Ｂ４７Ｂ６二重特異性ＴＣＲＬ（０．１ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクル（ＰＢＳ）をｉ．ｖ．投与し、さらなる用量を、４回にわたり、２４時間毎に投与した。
【０２５０】
いずれ（５０１ＡおよびＡ３７５）の場合も、週２回、ノギスを用いて腫瘍の垂直な２方向の長さを測定し、以下の式に基づき、腫瘍体積を算出した。
【０２５１】
【数１】
2018527884.tif 000005
【０２５２】
本研究に使用する、その他のＴＣＲＬ抗体
ＭＣ１の作製は、国際公開第２００８／１２０２０２号に記載されている。
【０２５３】
ＥＳＫ１の作製（Dao T、Yan S, Veomett N, Pankov D, Zhou L, Korontsvit T, Scott A, Whitten J, Maslak P, Casey E, Tan T, Liu H, Zakhaleva V, Curcio M, Doubrovina E, O'Reilly RJ, Liu C, Scheinberg DA. Targeting the intracellular WT1 oncogene product with a therapeutic human antibody. Sci Transl Med. 2013 Mar 13.，5(176):176ra33）。ＥＳＫ１を、国際公開第２０１５／０７００６１号の配列表に記載の公知配列である、ＷＯ  ２０１５／０７００６１  ＥＳＫ１全長ＶＨ−配列番号１２８およびＥＳＫ１全長ＶＬ−配列番号１３０に基づき、合成遺伝子合成によって作製した。上記のようにＥｘｐｉ２９３系を使用して、ＨＥＫ２９３細胞によってＩｇＧとして抗体を製造し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して培養上清から精製した。
【０２５４】
核酸の抽出
ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を製造業社の使用説明書に従って使用し、１×１０６〜５×１０６細胞の培養細胞から全ＲＮＡを抽出した。
【０２５５】
ｃＤＮＡ合成
オリゴｄＴとランダムヘキサマーとの組合せ（１：１）を、スーパースクリプト（登録商標）ＩＩＩ第一鎖合成系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と共に製造業社の使用説明書に従って使用し、ｃＤＮＡを１〜５μｇのＲＮＡから合成した。定量的ＰＣＲのために、ｃＤＮＡをＨ２Ｏを用いて１：５に希釈した。
【０２５６】
従来ＰＣＲ（ＰＣＲ）
ＰＣＲのサイクル条件は、９５℃で２分、それに続く、９５℃で２０秒、６０℃で１分および７２℃で１分の４０サイクルとした。７２℃で１０分の最終伸長によってＰＣＲを終了させた。反応は、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＰＣＲキット（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を製造業社の使用説明書に従って実施した。
【０２５７】
以下のプライマーを使用した：
チロシナーゼ発現のためのＴＹＲ＿Ｓ：ＴＴＡＧＣＡＡＡＧＣＡＴＡＣＣＡＴＣＡ（配列番号３）およびＴＹＲ＿ＡＳ：ＣＣＡＧＡＣＡＡＡＧＡＧＧＴＣＡＴＡＡ（配列番号４）（予測される産物の大きさ：１１７ｂｐ）、ならびにＷＴ１発現のためのＷＴ１＿Ｓ：ＡＧＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＧＡＧＡＴＡ（配列番号５）およびＷＴ１＿ＡＳ：ＴＴＣＧＣＴＧＡＣＡＡＧＴＴＴＴＡＣ（配列番号６）（予測される産物の大きさ：１８８ｂｐ）。
【０２５８】
増幅産物を可視化するために、１０μＬのサンプルを、２μＬの６×ローディングバッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と混合し、ＤＮＡマーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）とともに、臭化エチジウムを用いて染色した１．５％アガロースゲル上での電気泳動に付した。ＰＣＲ産物のバンドの存在および強度を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ  ４０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で決定した。
【０２５９】
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
ＡＢＩ  ７３００機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を製造業社の使用説明書に従って使用し、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックスを用いて、定量的ＰＣＲを実施した。リアルタイムＰＣＲのためのサイクル条件は、９５℃で１０分と、それに続く９５℃で１５秒および６０℃で１分の４０サイクルとした。リアルタイムＰＣＲのためのプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入し、それらは、５’末端で蛍光色素ＦＡＭと結合されていた。以下のアッセイ（プライマーおよびプローブ）を使用した：ＴＹＲ用（カタログ番号Ｈｓ００１６５９７６）、ＭＡＧＥ  Ａ４用（カタログ番号Ｈｓ００７５１１５０）およびＷＴ１用（カタログ番号Ｈｓ０１１０３７５１）。正規化のためにハウスキーピング遺伝子としてβ−アクチンを使用した（カタログ番号Ｈｓ９９９９９９０３）。
【０２６０】
【表４】
2018527884.tif 000006
【０２６１】
【表５】
2018527884.tif 000007
【０２６２】
【表６】
2018527884.tif 000008
【０２６３】
【表７】
2018527884.tif 000009
【０２６４】
【表８】
2018527884.tif 000010
【０２６５】
【表９】
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【０２６６】
【表１０】
2018527884.tif 000012
【０２６７】
【表１１】
2018527884.tif 000013
【０２６８】
【表１２】
2018527884.tif 000014
【０２６９】
【表１３】
2018527884.tif 000015
【０２７０】
【表１４】
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【０２７１】
【表１５】
2018527884.tif 000017
【０２７２】
実施例Ｉ
ＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼに対するＴＣＲ様抗体
ＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼ３６９−３７７に対するＴＣＲ様特異性を有するＡｂの単離
ＭＨＣ−ＴｙｒＤ３６９−３７７複合体の作製：  本発明者らによって実施されたこれまでの研究は、大きな抗体ファージライブラリーを使用した、腫瘍およびウイルスＴ細胞エピトープに対する、ペプチド特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束特異性を有する組み換え抗体の作製を示すものである。これらの分子は、ＴＣＲ様抗体と呼ばれる。ＨＬＡ−Ａ２／ＴｙｒＤ３６９−３７７複合体に対する特異性を有する抗体を作製するために、単鎖ＭＨＣ構築物を用いて、チロシナーゼペプチド（チロシナーゼ３６９−３７７ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ、配列番号１）を提示する組み換えペプチド−ＨＬＡ−Ａ２複合体を作製した。ＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体５０μｇ／マウスの５〜６回の注射によって、ＨＨＤマウスを免疫した。初めの２〜３回の注射は、ＱｕｉｌＡアジュバントを添加したｓ．ｃ投与とした。免疫したマウスから単離した脾細胞（公知のもの、例えば、Weidanz et al. 2011 Int. Rev. Immunol. 30:328-340に記載）と、ＮＳＯ骨髄腫細胞との融合によってハイブリドーマクローンを作製し、ｐ６８−ＤＤＸ５対照ペプチドとともにフォールディングされたＴｙｒＤ３６９−３７７ペプチドおよびＨＬＡ−Ａ２複合体を使用し、上述のディファレンシャルＥＬＩＳＡアッセイによってスクリーニングし、単離した。精製ＨＬＡ−Ａ２−Ｔｙｒ複合体のみならず、その他のＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドを提示する対照ＨＬＡ−Ａ２複合体を用いるＥＬＩＳＡを使用して、特異的クローンを選択した。単離されたハイブリドーマクローンをサブクローニングし、シーケンシングした。２つのクローン、９０６−１１−Ｄ１１（Ｄ１１と呼ばれる、図６９）および９０５−２−Ｄ７（Ｄ７と呼ばれる、図６８）、の特徴付けを行った。
【０２７３】
ＨＬＡ  Ａ２／チロシナーゼ３６９−３７７に対する特異性を有するＴＣＲ様抗体の特徴付け
単離されたＴＣＲ様抗体の見かけの親和性を決定するために、単離された精製ＩｇＧ  ＴＣＲ様抗体をＳＰＲセンサーチップに固定化し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合解析を使用した。固定化には、ＴＣＲ様抗体をチップ表面に間接的に固定化するための抗マウスＩｇＧを使用した。分析物は、種々の濃度とした、精製単鎖組み換えＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼ複合体である。図１に示したように、ＳＰＲ解析のセンサーグラムは、ＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼ特異的ＴＣＲ様抗体クローンＭＣ１、Ｄ１１およびＤ７に対して類似の親和性を示し、ＭＣ１およびＤ１１に対して４．１ｎＭの対応する親和性およびＤ７に対して３．８ｎＭの対応する親和性を有していた。これらの結果は、３種のＴＣＲ様抗体クローンのすべてが、特定のＨＬＡ−Ａ２／ペプチド複合体に対して４ｎＭという類似した高い親和性を示すということを表している。
【０２７４】
チロシナーゼ３６９−３７７ペプチドに対する、単離されたＴＣＲ様抗体の微細なペプチドエピトープ特異性を調べるために、アラニンスキャニングを実施した。スキャニングには、ペプチド中の特定の残基をアラニンに変異させ、Ａｌａ変異ペプチドに対するＴＣＲ様抗体の結合を、それらのＴ２抗原提示細胞への負荷によって試験した。結合をフローサイトメトリーによってモニタリングし、平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定される、変異提示ペプチドに対するＴＣＲ様抗体の結合の程度を、天然の変異していないチロシナーゼペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣと比較して相対的に見た。種々のＡｌａ変異されたペプチド（図２に記載）の適切な負荷を、ＨＬＡ−Ａ２に対するＢＢ７．２モノクローナル抗体を使用するフローサイトメトリーでモニタリングした。
【０２７５】
天然の変異されていないチロシナーゼペプチドとの比較において、すべてのＡｌａ変異ペプチドがＴ２細胞上に効率的に負荷された（データは示さない）。ペプチド負荷効率は、ペプチドが負荷されたＴ２細胞上のＨＬＡ−Ａ２−結合性Ａｂ  ＢＢ７．２のＭＦＩと、負荷されていないＴ２細胞のＭＦＩとの比（１超）を用いて確認する。図２に示したように、３種のＴＣＲ様抗体すべてがペプチド依存性結合を示し、これは、特定の変異が結合に影響を及ぼし、特定のペプチド位置でのＡｌａの導入の際に、ＴＣＲ様抗体の結合強度の減少を誘導したためである。これらの結果は、３種のＴＣＲ様抗体のすべてが、種々のＡｌａ変異チロシナーゼペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ａ２との関連で、ペプチド特異的に拘束された結合を示したことを表しており、これらの抗体は、その結合特性においてＴＣＲ様であり、したがって、これらは、ＭＨＣ拘束性であり、且つペプチド特異的な様式でＭＨＣ−ペプチド複合体と結合することを示している。
【０２７６】
しかし、３種のＴＣＲ様抗体は、その微細特異性およびペプチド依存性反応性において異なり、Ａｌａ変異に対して感受性であり、結合感受性に影響を及ぼすペプチド中の位置が異なる。ＭＣ１が、６位に１つのみの単一Ａｌａ変異ペプチドとの結合について９０％という著しい減少を示したのに対し、Ｄ１１およびＤ７については、Ｄ１１は３位と６位の２箇所で９０％超の減少を示し、Ｄ７は３位、４位、６位、７位の４箇所で９０％超の結合の減少を示した。Ａｌａ変異ペプチドに対するＭＣ１の結合については、７０％超という、上記より弱いが、非常に顕著な減少が、１位、３位、６位の３箇所について見られ、Ｄ１１およびＤ７は、５個のペプチド残基がＡｌａに変異された場合（Ｄ１１については１位、２位、３位、４位およびと６位、Ｄ７については２位、３位、４位、６位および７位）に、７０％超の顕著な減少を示した。
【０２７７】
種々のＡｌａ変異Ｔｙｒペプチドの、Ｔｙｒ特異的ＴＣＲ様抗体と適切に結合する能力によって観察されるように、全体に、アラニンスキャニング解析は、Ｄ１１およびＤ７が、ＭＣ１と比較して、Ａｌａ変異に対してより影響を受けやすく、より感受性であることを示す。図２に示したデータによれば、Ｄ１１およびＤ７は、ＭＣ１と比較して、その結合特性はよりペプチド拘束性で感受性である。これらは、９個のペプチド残基のうち４箇所のＡｌａ変異に対して感受性（アンカー位置を含まない）であるが、ＭＣ１は、３箇所のみである。Ｄ１１およびＤ７の結合特性は、それぞれ、５箇所目の位置である７位および５位に対してさえ感受性を示す。具体的には、Ｄ１１は、７位で６８％、５位で６７％、８位で５９％の結合の減少が見られ、Ｄ７は、５位で６６％、１位で６３％、８位で６３％の結合の減少が見られる。
【０２７８】
ＴＣＲ様抗体の選択性および微細特異性を決定するための手段としてＡｌａスキャニングを使用できると結論付けられる。Ａｌａ変異に対するより多い感受性が示されるにつれ、より特異的で、ペプチド依存性の結合が観察される。この戦略を使用して、ＭＨＣ拘束性ペプチド特異的結合物質として、より高く最適化された選択性および特異性に関する特性を示す、最適なＴＣＲ様抗体をフィルタリングし、選択することができる。
【０２７９】
ＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼに対する、ＴＣＲ様抗体の結合選択性および特異性
単離されたＴＣＲ様抗体の結合特異性の特徴付けを行うために、精製ＩｇＧの反応性および特異性をフローサイトメトリーによって評価した。Ｔ２  ＡＰＣに特異的なペプチドまたは対照ペプチドを負荷し、Ａｂとともにインキュベートし、続いて、ＰＥ標識された抗ヒトまたはマウスＡｂとともにインキュベートした。図３〜７に示したように、ＭＣ１  ＩｇＧ（図７）、Ｄ１１  ＩｇＧおよびＤ７  ＩｇＧ（図３〜６）は、チロシナーゼペプチドが負荷されたＴ２細胞と結合したが、対照ペプチドが負荷された細胞とは有意に結合しなかった（表１５）。ＭＣ１については、ＭＦＩ比が３〜７という極めて低いバックグラウンドの結合が対照ペプチドについて観察されたが（図７）、Ｄ１１およびＤ７については、バックグラウンド結合は全く見られなかった（図３〜６）。負荷されたペプチドの提示の程度を、すべてのＨＬＡ−Ａ２ペプチド複合体と結合するＭＡｂ  ＢＢ７．２の結合によってモニタリングした。これらの結果は、３種のＴＣＲ様抗体のすべてが、チロシナーゼを提示する細胞とのみ結合し、その他のＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドとは結合しないことから、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドに特異的な結合を示すことを表した。
【０２８０】
ＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼＴＣＲ様Ａｂが、腫瘍細胞の表面に存在する、内因性のＭＨＣ−チロシナーゼ複合体と結合可能であるか否かを調査するために、黒色腫患者由来の細胞株のフローサイトメトリー解析を行った。細胞を抗チロシナーゼ３６９−３７７／ＨＬＡ−Ａ２  ＴＣＲ様抗体Ａｂとともにインキュベートし、続いて、ＰＥ標識抗ヒトまたは抗マウスＡｂとともにインキュベートした。図８〜１２に示したように、ＴＣＲ様抗体は、チロシナーゼ陽性およびＨＬＡ−Ａ２陽性細胞を極めて高い強度で認識した。ここに示したように、多数のＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼ複合体が、黒色腫細胞表面に提示されることを示す。ＴＣＲ様抗体による染色は極めて均質であり、チロシナーゼタンパク質に対するＡｂを用いるこれらの黒色腫細胞（例えば、６２４．３８および５０１Ａ）の細胞内染色は、試験した各細胞株の約９５％が、チロシナーゼタンパク質を発現することを示した（データは示さない）。チロシナーゼ陰性またはＨＬＡ−Ａ２陰性細胞を用いた場合には、反応性は検出されなかった。ＨＬＡ−Ａ２陽性およびＡｇ（チロシナーゼ）陰性である、種々の組織学的起源の複数の細胞株の広範なフローサイトメトリー解析によって、抗チロシナーゼ／ＨＬＡ−Ａ２  ＴＣＲ様Ａｂの特異性が確認された。この解析を、図１０〜１２に示した。Ｄ１１およびＤ７の反応性は、内皮細胞、線維芽細胞、星状細胞、肝細胞、腎細胞、心筋細胞、結腸筋肉およびＰＢＭＣを含む正常一次細胞のパネル上でも試験した（図１３〜１７）。これらＨＬＡ−Ａ２＋およびＴｙｒ−の正常一次細胞との結合は観察されなかったが、ＭＣ１をＰＢＭＣに対して試験した際には、バックグラウンド結合が観察された（図１７）。ＨＬＡ−Ａ２＋／チロシナーゼ＋黒色腫細胞および正常一次細胞を含む種々の組織学的起源のＨＬＡ−Ａ２＋／チロシナーゼ細胞の広範なパネルに対するＤ１１およびＤ７反応性の解析の概要を、図１８〜１９に示した。Ｄ１１およびＤ７  ＴＣＲ様抗体の反応性は、ＨＬＡ−Ａ２および抗原チロシナーゼを発現する黒色腫細胞に対して極めて特異的に見える。
【０２８１】
これらの研究からの全体的な結論は、ＴＣＲ様Ａｂは、特異的であり、それらは、ＨＬＡ対立遺伝子と、Ａｇとの妥当な組合せが存在する場合に、細胞表面に提示された特異的ペプチド−ＭＨＣ複合体のみを認識するということである。しかし、フローサイトメトリーデータの注意深い評価は、Ｄ１１およびＤ７と比べて差次的であるＭＣ１の選択性を実証する結果を示した。例えば、ＨＬＡ−Ａ２＋およびＴｙｒ−細胞株ＨｅｐＧ２、ＳＷ６２０およびＬｏｕｃｙと、ＭＣ１との結合の解析は、図９に示したように、ＭＦＩによって測定されるようなバックグラウンド結合を示すが、これらの細胞でのＤ１１およびＤ７の類似の解析は、結合を示さなかった（図１０および１２）。これらおよびさらなる細胞に対する３種のＴＣＲ様抗体の直接的な比較（図１２）は、ＭＣ１は、ＨＬＡ−Ａ２＋／Ｔｙｒ＋黒色腫細胞との有意な結合を示すが、さまざまなＨＬＡ−Ａ２＋／Ｔｙｒ−細胞（ＳＷ６２０、Ｃｏｌｏ２０５、ＨｅｐＧ２、Ｐａｎｃ１、ＲＰＭＩ、ＤＧ７５、Ｊｅｋｏ１およびＬｏｕｃｙ）に対するバックグラウンド結合を有し、一方、Ｄ１１およびＤ７は、これらの細胞とのバックグラウンド結合を全く示さないことを明らかにした。
【０２８２】
したがって、Ｄ１１およびＤ７は、ＭＣ１と比較してより特異的且つ選択的であり、包括的なフローサイトメトリー研究のみならず、他の研究、例えば、適当なＨＬＡ対立遺伝子を発現し、抗原について陽性または陰性である異なる組織学的起源の細胞の大きなパネルを利用する機能的アッセイは、ＴＣＲ様抗体の選択性を評価するための有用なツールであると結論付けることができる。
【０２８３】
チロシナーゼ特異的ＴＣＲ様抗体の微細特異性をさらに評価するために、天然チロシナーゼに対して配列類似性を示すペプチドとの反応性を評価した（表５）。
【０２８４】
したがって、特定のＴＣＲ様抗体に関する上記のようなアラニン／グリシンスキャニングデータが入手可能である場合には、さらなる類似ペプチド選択を実施する。アラニンスキャニングに基づいて、ペプチド抗原中の各アミノ酸残基の、ＴＣＲＬ結合への貢献を測定し、評価する。重要な位置を保存する類似ペプチドを、上記のツールによって同定し、より高い優先度を割り当てる。これらのペプチドを合成し、上述したような微細特異性評価のために使用する。
【０２８５】
本明細書に記載される戦略は、コンピュータによるペプチド配列類似性の解析を、溶出されたＨＬＡペプチドの質量分析解析と組み合わせるが、ペプチドデータベースおよびアラニンスキャニングは、ＢＬＡＳＴやＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅといったその他のツールを超える、ペプチド検索パラメータを十分に制御するためのツールボックスを提供する。許容ペプチド長の範囲、配列中の最大許容数または相違、ならびにＨＬＡ結合スコアの要件を含む、さらなるパラメータが使用される。ツールはまた、その能力を、特定のアミノ酸を等価物として定義するためにも適用する。最も重要なのは、質量分析またはペプチドデータベースによって見出されたペプチドを強調する能力である。
【０２８６】
上記のツールを適用し、本明細書に記載の選択基準に従って、評価のために選択された類似ペプチドの大きなパネルを合成することによって、３種のＴＣＲ様抗体の微細特異性を評価した（表５）。これらの類似ペプチドを、Ｔ２  ＡＰＣに負荷し、ＴＣＲ様抗体の反応性を試験した。図２０に示したように、ＭＣ１を類似ペプチドのパネルで試験した場合、天然チロシナーゼペプチドとの結合と比較して、ＫＩＡＡ０３３５およびＫＰＮＡ１などの、チロシナーゼと配列類似性を有するペプチドに対してバックグラウンド結合を示すことが観察された。しかし、図２１〜２８に示したように、Ｄ１１およびＤ７  ＴＣＲ様抗体は、ペプチド負荷によって解析された大きなパネル由来の類似ペプチドと全く結合せず、これにはＭＣ１とのバックグラウンド結合を示したＫＩＡＡ０３３５およびＫＰＮＡ１ペプチドを認識しないことも含まれる。これらのデータは、Ｄ１１およびＤ７の、ＭＣ１と比べて優れた選択性および微細特異性を実証し、さらなる評価のための最良および最適な候補を得るためのＴＣＲ様抗体のパネルを評価する際に、上述したように開発した類似ペプチドアプローチおよびツールが、選択性および微細特異性の階層を評価するための重要なツールとなることを実証する。
【０２８７】
さらに、ＴＣＲ様抗体のアラニンスキャニング後に、さらなる類似ペプチドを選択し、試験した。ＴｙｒＤペプチド配列内の各アミノ酸が、Ｔｙｒ  ＴＣＲＬ結合に等しく貢献する可能性は低いので、Ｔｙｒ  ＴＣＲＬによる認識において重要なペプチド残基を同定した。ＴｙｒＤ  ９量体の各アミノ酸が、アラニンによって連続して置換された合成ペプチドのセットを製造した。Ｔｙｒ  ＴＣＲＬが、これらアラニン置換ペプチドの各々がパルスされた細胞に結合するの能力を、ＦＡＣＳ解析によって決定し、結合結果を、非変異ペプチドを用いて得られたものと比較した。アラニン置換が、非変異ペプチドと比較して、結合の大きな減少をもたらす位置の残基を重要と考えた。次いで、直接的なコンピュータによる検索を実施して、重要な位置のモチーフのみを含有するタンパク質配列を同定した。これらのペプチドはまた、Ｔｙｒ  ＴＣＲＬの特異性評価のために利用した（表５  Ｓ１７〜Ｓ２３）。アラニンスキャニング解析由来の類似ペプチドを合成し、Ｔ２  ＡＰＣ細胞に負荷し、Ｄ１１およびＤ７のその反応性を試験した。図２８に示したように、これらペプチドとの結合は観察されず、それによって、これらのＴＣＲ様抗体の微細特異性および選択性がさらに確認され、強化された。
【０２８８】
実施例ＩＡ
ＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼに対するＴＣＲ様抗体の特徴付け
ＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼ３６９−３７７に対するＴＣＲ様特異性を有するＡｂの、微細特異性の比較
単離されたＴＣＲ様抗体の結合特異性の特徴付けを行うために、精製ＩｇＧ（ビオチン化ありまたはなし）の反応性および特異性を、フローサイトメトリーによって評価した。Ｔ２  ＡＰＣにチロシナーゼペプチドまたは対照ペプチドを負荷し（表１５）、Ａｂ（Ｄ７、Ｄ１１またはＭＣ１）とともにインキュベートし、続いて、ＰＥ標識ストレプトアビジンまたはＰＥ標識抗マウスＡｂとともにインキュベートした。図３８に示したように、Ｄ１１およびＤ７  ＴＣＲＬは、チロシナーゼペプチドを負荷したＴ２細胞と結合したが、対照ペプチドを負荷した細胞とは結合を示さなかった。対照的に、ＭＣ１  ＴＣＲＬは、チロシナーゼペプチドおよび対照として使用した関連しないペプチドの両方を負荷したＴ２細胞に対する結合を示した。
【０２８９】
Ｄ７およびＤ１１  ＴＣＲ様抗体の特異性をさらに評価するために、チロシナーゼペプチドに対する配列類似性を有するペプチドとの反応性を評価した。ペプチドは、表５に示した。
【０２９０】
図３９に示したように、ＭＣ１  ＴＣＲＬは、ＫＩＡＡ０３３５およびＫＰＮＡ１（表１４）などの、チロシナーゼペプチドに対して配列類似性を有する種々のペプチド、およびＳ２、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ９、Ｓ１１、Ｓ１３、Ｓ１８、（Ｓ１９、Ｓ２２およびＳ２３）として記号を付したペプチドと、検出容易な結合を示した。Ｄ１１およびＤ７  ＴＣＲ様抗体は、上記と同じ類似ペプチドのパネル由来のペプチドのいずれとも結合しなかった。これらのデータは、ＭＣ１  ＴＣＲＬと比較して、Ｄ１１およびＤ７  ＴＣＲＬの優れた選択性および微細特異性を実証し、上記のように開発された類似ペプチドアプローチおよびツールの、ＴＣＲＬの選択性および微細特異性階層を評価するための有用性を実証する。
【０２９１】
本発明者らは、黒色腫細胞株の表面に内因的に提示されたＭＨＣ−チロシナーゼペプチド複合体と、ＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼＴＣＲ様Ａｂとの結合特異性を調査した。細胞を、抗チロシナーゼ３６９−３７７／ＨＬＡ−Ａ２  ＴＣＲ様抗体Ａｂ（ビオチン化ありまたはなし）とともにインキュベートし、続いて、ＰＥ標識ストレプトアビジンまたは抗マウスＡｂとともにインキュベートした。ＨＬＡ−Ａ２（陽性）およびチロシナーゼ（陽性または陰性）の発現について特徴付けられた腫瘍細胞のパネルおよび正常一次細胞を、ＴＣＲ様抗体の結合を比較するために使用した。図４０Ａ〜Ｃに示したように、ＴＣＲ様抗体は、チロシナーゼ陽性およびＨＬＡ−Ａ２陽性の細胞を認識した。ＴＣＲ様抗体を、Ｔｙｒ  ＲＮＡ発現を示さない（Ｔｙｒ陰性の）種々の起源の複数のＨＬＡ−Ａ２陽性細胞株について試験した。図４０Ａ〜Ｂに示したように、Ｄ１１およびＤ７  ＴＣＲＬは、これらの細胞と全く結合しないが、ＭＣ１は、種々のＨＬＡ−Ａ２＋／Ｔｙｒ−細胞を容易に染色した。Ｄ７およびＤ１１  ＴＣＲＬは、正常一次細胞との結合を全く示さないが、ＭＣ１は、それらの一部とは検出可能な結合を示した（図４０Ｃ）。
【０２９２】
全体的に、Ｄ７およびＤ１１  ＴＣＲＬは、ＭＣ１  ＴＣＲＬと比較して、ＨＬＡ−Ａ２によって提示されたチロシナーゼペプチドを認識する優れた特異性および選択性を発揮した。
【０２９３】
機能的アッセイを使用して、Ｄ７およびＤ１１  ＴＣＲ様抗体の特徴付けをさらに行った。ＴＣＲＬ可変領域を抗ＣＤ３  ｓｃＦｖと融合し、これは、エフェクターＴ細胞を再標的化して、二重特異的な形式で腫瘍標的細胞を死滅させることができる。図４１〜４４に示したように、Ｄ７およびＤ１１  ＣＤ３二重特異性ＴＣＲ様抗体構築物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのヒトＰＢＭＣの存在下で、黒色腫５０１Ａ細胞に対してロバストな細胞傷害性を示した。チロシナーゼ陰性細胞株であるＰａｎｃ−１は陰性対照として機能し、細胞傷害性を実証しなかった。ＨＬＡ−Ａ２＋／Ｔｙｒ−正常ヒト一次細胞のパネルに対する細胞傷害性は検出されず、Ｄ７およびＤ１１  ＴＣＲＬの選択性が確認された。
【０２９４】
実施例ＩＢ
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるｓ．ｃ．５０１Ａ黒色腫腫瘍形成モデルにおける、Ｄ７  ＢＳ  ＴＣＲＬのｉｎ  ｖｉｖｏの有効性
図４５は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス内のＳ．Ｃ．５０１Ａ黒色腫腫瘍形成モデルにおける、Ｄ７  ＢＳ  ＴＣＲＬのｉｎ  ｖｉｖｏの有効性を示す。腫瘍体積によって証明されるように、二重特異性抗体の投与が、実験の６５日間にわたって腫瘍形成を完全に阻害したことが明確に示された。結果は、本明細書に記載のＴＣＲＬ可変配列の、臨床設定における使用を支持する。
【０２９５】
実施例ＩＩ
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に対するＴＣＲ様抗体
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に対するＴＣＲ様特異性を有するＡｂの単離および特徴付け
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１複合体に対する特異性を有するこのような抗体を作製するために、単鎖ＭＨＣ構築物を用いて、ＷＴ１ペプチド（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ、配列番号１５１）を提示する組み換えペプチド−ＨＬＡ−Ａ２複合体を作製した。抗体の作製は、一般的な材料および方法ならびに上記の実施例Ｉに記載されるとおりに実施し、Ｂ４７と呼ばれる（Ｂ４７Ｂ６とも呼ばれる）ＴＣＲ様特異的クローンを単離し、特徴付けを行った（図７０）。
【０２９６】
ＴＣＲ様抗体結合選択性についての比較として、ＥＳＫ１と呼ばれるＴＣＲ様抗体を使用した  Dao T、Yan S, Veomett N, Pankov D, Zhou L、Korontsvit T, Scott A, Whitten J, Maslak P, Casey E, Tan T, Liu H, Zakhaleva V, Curcio M, Doubrovina E, O’Reilly RJ, Liu C, Scheinberg DA。
【０２９７】
Ｂ４７の結合親和性を、単離された精製ＩｇＧ  ＴＣＲ様抗体をＳＰＲセンサーチップに固定化し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合解析で評価した。固定化には、ＴＣＲ様抗体をチップ表面に間接的に固定化するための抗マウスＩｇＧを使用した。分析物は、種々の濃度とした、精製単鎖組み換えＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１複合体である。図２９に示したように、ＳＰＲ解析のセンサーグラムは、４．４ｎＭのＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１特異的ＴＣＲ様抗体クローンＢ４７に対する親和性を示した。
【０２９８】
単離されたＴＣＲ様抗体の結合特異性の特徴付けを行うために、精製ＩｇＧの反応性および特異性をフローサイトメトリーによって評価した。Ｔ２  ＡＰＣに特異的なペプチドまたは対照ペプチドを負荷し（表１５）、Ａｂとともにインキュベートし、続いて、ＰＥ標識された抗ヒトまたはマウスＡｂとともにインキュベートした。図３０および３１に示したように、Ｂ４７およびＥＳＫ１は、ＷＴ１ペプチドを負荷したＴ２細胞と結合した（図３０）が、対照ペプチドを負荷した細胞とは結合しなかった（図３１）。Ｂ４７およびＥＳＫ１について観察された結合強度には有意差があった。Ｂ４７は、１０−４〜１０−５Ｍのペプチドが負荷されたＴ２細胞と強く結合したが、ＥＳＫ１は、１０−４ＭのＷＴ１ペプチドが負荷されたＴ２細胞とかなり弱く結合した（Ｂ４７のＭＦＩ  ４７４と比較した、ＥＳＫ１のＭＦＩ  １８）。１０−５Ｍのペプチド濃度で、Ｂ４７は、依然として有意に結合した（ＭＦＩ  ８８）が、ＥＳＫ１の結合は、ほとんど検出不能であるか、または極めて低かった（図３０）。これらの結果は、Ｂ４７の親和性および結合感受性は、ＥＳＫ１と比べて、著しい相違が存在し、Ｂ４７と比較してＥＳＫ１には結合強度の鋭い減少があり、ペプチド濃度で１０倍の減少があった。Ｂ４７およびＥＳＫ１は、対照のＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣと結合しなかった（図３１）。これらの結果は、両ＴＣＲ様抗体は、ＷＴ１を提示する細胞とのみ結合し、その他のＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドを退治する細胞とは結合しないことから、それらがＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチド特異的に結合することを示している。
【０２９９】
ＷＴ１  ＴＣＲ様抗体をさらに調べるために、上記の戦略を用いて、コンピュータによって同定された類似ペプチドに対する結合の微細特異性評価を実施した。図３２および３３に示したように、Ｂ４７は、設計したパネル中の類似ペプチドとは全く結合しなかった（表６）。しかし、図３２に示したように、ＥＳＫ１は、２種の類似ペプチドと低いバックグラウンド結合を示した。さらなる対照ペプチドおよび類似ペプチドに対して、Ｂ４７を評価した（図３４）。これらのＴＣＲ様抗体のさらなる解析を、ＨＬＡ−Ａ２であり、ＷＴ１抗原を発現するか、または発現しない腫瘍細胞を使用するフローサイトメトリーによって実施した。図３５に示したように、ＥＳＫ１  ＷＴ１  ＴＣＲ様抗体は、ＨＬＡ−Ａ２＋／ＷＴ＋  ＢＶ１７３およびＳＥＴ２細胞と強く結合したが、Ｂ４７は、これらの細胞と、フローサイトメトリー感受性レベルの結合は全く示さなかった。特異性をさらに調べるために、ＨＬＡ−Ａ２であるが、ＰＣＲ評価においてＷＴ１遺伝子を発現しない細胞で、ＥＳＫ１およびＢ４７の反応性を評価した。示したように、Ｂ４７はこれらの細胞と全く結合しなかったが、ＥＳＫ１は、ＷＴ１陰性であるとわかった５０１、Ａ４９８およびＳＫＭＥＬ細胞と結合した。その他のＷＴ１陰性細胞は、ＥＳＫ１によって結合されなかった。細胞表面上のすべてのＨＬＡ−Ａ２／ペプチド分子を認識するＭＡｂ  ＢＢ７．２を用いて、ＨＬＡ−Ａ２発現のレベルをモニタリングを行った。Ｂ４７  ＷＴ特異的ＴＣＲ様抗体の結合データの概要を、図３６に示した。
【０３００】
ＨＬＡ−Ａ２＋／ＷＴ１＋  ＢＶ１７３およびＳＥＴ２細胞に対するＥＳＫ１およびＢ４７の結合に関する矛盾するデータ、すなわち、結合は、ＥＳＫ１によって顕著に検出され得るが、Ｂ４７によっては検出されないこと、をさらに調べるために、本発明者らは、直接的な生化学的手段を使用して、これらの細胞による実際のＷＴ１提示を評価した。本発明者らは、ＢＶ１７３およびＳＥＴ２細胞、および種々の組織に対してＨＬＡペプチド溶出戦略を使用し、それに続いて、溶出されたペプチドのＭＳ解析を実施した。これらの実験のデータは、ＷＴ１ペプチドは、臨床組織または細胞株のいずれに対するＭＳにおいても検出されなかったことを示す。ＢＶ１７３またはＳＥＴ−２細胞株（ｍＲＮＡ  ＷＴ１陽性）の徹底な解析では、ペプチドを検出できなかった（ＯｒｂｉｔｒａｐまたはＱ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＭＳ機器）。ＷＴ１ペプチドは、Ｔ２ペプチドが負荷された細胞からの直接溶出後にＯｒｂｉＴｒａｐ  ＭＳによって検出された。これらのＴ２細胞は、１０−５、１０−７、１０−９Ｍの種々のＷＴ１ペプチド濃度で負荷され、ペプチドは、１０−５および１０−７Ｍのペプチド濃度を負荷されたＴ２  ＡＰＣからの溶出によってＭＳで検出された。１０−７Ｍのペプチドが負荷されたＴ２細胞からＭＳによってペプチドを検出することは、約２５０部位／細胞（Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳを使用して）の実際の提示に対応する。 
【０３０１】
これらのデータは、ＴＣＲ様抗体の特異性および選択性を評価するための、類似ペプチドを提示するペプチド負荷細胞および種々の組織学的起源の細胞に向けた、上述した結合ツールの有用性を例示する。
【０３０２】
エピトープの特異性をさらに調べるために、ＷＴ１ペプチド配列に対してアラニンスキャニング変異誘発を実施した。ＷＴ１ペプチドの１位の変異のみがＥＳＫ１の結合強度に影響を及ぼすことを示す図３７は、Ｂ４７と比べて、ＥＳＫ１の結合選択性および微細特異性が限定されていることを示し、Ｂ４７の場合は、類似ペプチドや、ＨＬＡ−Ａ２＋／ＷＴ１−／である細胞に対しても特異性パターンが観察された。これらのデータは、Ｂ４７の選択性および微細特異性は、ＥＳＫ１と比較して優れていること、および本明細書において示したツールボックスは、ＴＣＲ様抗体の選択、特徴付けおよび前臨床開発のプロセスにおいて、その選択性および微細特異性を評価するために価値あるツールであることを示唆する。
【０３０３】
実施例ＩＩＡ
ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に対するＴＣＲ様抗体
Ａｂの微細特異性と、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１に対するＴＣＲ様特異性との比較
ともにＷＴ１ペプチドを認識するＴＣＲ様抗体Ｂ４７およびＥＳＫ１の選択性を比較した（Dao et al. Sci Transl Med. 2013 Mar 13.，5(176):176ra33）。
【０３０４】
Ｔ２  ＡＰＣに、特異的ペプチド（ＷＴ１、配列番号１４１）または対照ペプチド（表１５）を負荷し、Ｂ４７およびＥＳＫ１抗体とともにインキュベートし、続いて、ＰＥ標識ストレプトアビジンまたは抗マウスＡｂとともにインキュベートした。Ｂ４７  ＴＣＲＬおよびＥＳＫ１  ＴＣＲＬの両方とも、ＷＴ１ペプチドが負荷されたＴ２細胞と結合したが、対照ペプチドが負荷された細胞とは結合しなかった（図４６）。類似ペプチドのパネル（表６）を合成して、ＷＴ１  ＴＣＲＬの特異性の特徴付けをさらに行った。Ｂ４７  ＴＣＲＬは、Ｔ２細胞上に負荷された類似ペプチドのいずれとも結合しなかったが、ＥＳＫ１は、いくつかの類似ペプチドとの検出可能な結合を示した（図４７）。ＥＳＫ１  ＴＣＲＬは、多数の正常細胞によって遍在的に提示されるＨＤＡＣ２（ヒストンデアセチラーゼ２、表１４）由来の類似ペプチドとの結合を示した。ＷＴ１−Ｓ１０（配列番号１５１）は、脳、大脳皮質、心臓、腎臓、肝臓、肺およびその他の正常組織の質量分析によって証明されるように、正常組織によって提示される（表１４）。
【０３０５】
ＳＰＲによるＢ４７  ＴＣＲＬおよびＥＳＫ１  ＴＣＲＬの結合のさらなる特徴付けは、Ｂ４７の親和性（５ｎＭ）や、ＥＳＫ１のもの（２００ｎＭ）よりもかなり強く、その主な理由は、ＥＳＫ１とＭＨＣ−ＷＴ１ペプチド複合体とのより速い解離速度であることを示した（図４８）。ＷＴ１ペプチドのさらなるアラニンスキャニング変異誘発を実施して、Ｂ４７  ＴＣＲ様抗体のペプチドエピトープ特異性を精緻化した（図４９）。Ｔ２細胞に変異体ペプチドを負荷し、上記のように結合アッセイを実施した。種々のＡｌａ変異体の負荷を、ＨＬＡ−Ａ２に対するＢＢ７．２モノクローナル抗体を使用するフローサイトメトリーでモニタリングした。
【０３０６】
図４９に示したように、いくつかの位置におけるＡｌａ置換は、変異ペプチドとＢ４７との結合に顕著な影響を及ぼした。Ｂ４７  ＴＣＲＬは、位置的置換に対してより大きな感受性を示した（ＥＳＫ１と比べて、図３７）。Ｂ４７  ＴＣＲ様抗体は、ペプチド中の４残基（１位、３位、４位および７位）がアラニンに変異された場合に、提示されたペプチドとの結合の７３％超を失った。５番目の位置感受性は、５位に起因し得る。Ｂ４７  ＴＣＲＬおよびＥＳＫ１  ＴＣＲＬの両方について、２位は、ＨＬＡ−Ａ２ペプチド結合溝におけるペプチドのアンカー位置として機能すると予想されるため、重要である。
【０３０７】
Ｂ４７  ＴＣＲＬおよびＥＳＫ１  ＴＣＲＬ間のさらなる特徴付けおよび比較を、種々の起源の腫瘍細胞株および一次細胞で行った。図５０に示したように、Ｂ４７はすべてＨＬＡ−Ａ２陽性であり、ＷＴ１  ｍＲＮＡ陽性または陰性細胞である細胞のパネルと結合しなかった。対照的に、ＥＳＫ１  ＴＣＲＬは、いくつかの腫瘍および正常両方の一次細胞（すべてＨＬＡ−Ａ２＋）と結合した。例えば、ＪＶＭ２およびＩＭ９（両方ともＨＬＡ−Ａ２陽性およびＷＴ１陰性）ならびに正常一次星状細胞は結合した。ＴＣＲＬ−ａＣＤ３二重特異性構築物およびヒトＰＢＭＣを使用する細胞傷害性アッセイは、Ｂ４７  ＴＣＲＬが、ＨＬＡ−Ａ２＋／ＷＴ１＋細胞またはＨＬＡ−Ａ２＋／ＷＴ１−細胞の死滅を誘導しないが、ＥＳＫ１  ＴＣＲＬ−ａＣＤ３は、ＷＴ−１陰性を含むいくつかの細胞に対して細胞傷害性であることを示した。したがって、Ｂ４７  ＴＣＲＬは、ＷＴ−１発現にかかわらず、正常一次細胞を含むいくつかの細胞に向けたＣＤ３  Ｔ細胞と結合し、再標的化するＥＳＫ１と比較して、二重特異的な形式の結合および機能活性の両方において優れた特異性を示す。
【０３０８】
実施例ＩＩＩ
ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ４に対する特異性を有するＴＣＲ様抗体
実施例ＩＩＩＡ
ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ４に対する特異性を有するＴＣＲＬの単離および特徴付け
単離されたＴＣＲ様抗体の結合特異性の特徴付けを行うために、精製ＩｇＧの反応性および特異性をフローサイトメトリーによって評価した。Ｔ２  ＡＰＣに、ＭＡＧＥ−Ａ４ペプチドまたは対照ペプチド（表１５）を負荷し、ＴＣＲＬ  Ａｂ  Ｃ１０６Ｂとともにインキュベートし、続いて、ＰＥ標識ストレプトアビジンまたはＰＥ標識抗マウスＡｂとともにインキュベートした。図５２に示したように、Ｃ１０６Ｂ９は、ＭＡＧＥ−Ａ４ペプチドが負荷されたＴ２細胞と結合したが、対照ペプチドが負荷された細胞との結合を示さなかった。
【０３０９】
Ｃ１０６Ｂ９  ＴＣＲ様抗体の特異性をさらに評価するために、ＭＡＧＥ−Ａ４ペプチドに対して配列類似性を示すペプチドとの反応性を評価した。ペプチドは表８に示した。
【０３１０】
図５３に示したように、Ｃ１０６Ｂ９  ＴＣＲＬは、類似ペプチドのパネルである本パネルのペプチドのいずれとも結合しなかった。これらのデータは、Ｃ１０６Ｂ９の高い選択性および微細特異性を実証し、ＴＣＲＬの選択性および微細特異性を評価するための、類似ペプチドアプローチおよび上述のように開発されたツールの有用性を実証する。
【０３１１】
単離されたＴＣＲ様抗体の見かけの親和性を決定するために、単離された精製ＩｇＧ  ＴＣＲ様抗体をＳＰＲセンサーチップに固定化し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合解析を使用した。固定化には、ＴＣＲ様抗体をチップ表面に間接的に固定化するための抗マウスＩｇＧを使用した。分析物は、種々の濃度とした、精製単鎖組み換えＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ４複合体である。図５４に示したように、ＳＰＲ解析のセンサーグラムは、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ４特異的ＴＣＲ様抗体クローンＣ１０６Ｂ９に対して親和性を示し、その対応する親和性は８．８ｎＭであった。
【０３１２】
ＭＡＧＥ−Ａ４ペプチドに対する単離されたＴＣＲ様抗体の微細なペプチドエピトープ特異性を調べるために、アラニンスキャニングを実施した。スキャニングには、ペプチド中の特定の残基をアラニンに変異させ、Ａｌａ変異ペプチドに対するＴＣＲ様抗体の結合を、それらのＴ２抗原提示細胞への負荷によって試験した（表９）。結合をフローサイトメトリーによってモニタリングし、平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定される、変異提示ペプチドに対するＴＣＲ様抗体の結合の程度を、天然の変異していないＭＡＧＥ−Ａ４ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣと比較して相対的に見た。種々のＡｌａ変異されたペプチド（図２に記載）の適切な負荷を、ＨＬＡ−Ａ２に対するＢＢ７．２モノクローナル抗体を使用するフローサイトメトリーでモニタリングした。
【０３１３】
天然の変異されていないＭＡＧＥ−Ａ４ペプチドとの比較において、すべてのＡｌａ変異ペプチドがＴ２細胞上に効率的に負荷された（データは示さない）。図５５に示したように、ＴＣＲ様抗体はペプチド依存性結合を示し、これは、特定の変異が結合に影響を及ぼし、特定のペプチド位置でのＡｌａの導入の際に、ＴＣＲ様抗体の結合強度の減少を誘導したためである。これらの結果は、ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲ様抗体が、種々のＡｌａ変異ＭＡＧＥ−Ａ４ペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ａ２との関連で、ペプチド特異的な拘束された結合を示したことを表しており、この抗体は、その結合特性においてＴＣＲ様である。したがって、これらは、ＭＨＣ拘束性であり、且つペプチド特異的な様式でＭＨＣ−ペプチド複合体と結合することを示している。
【０３１４】
Ｃ１０６Ｂ９  ＴＣＲ様抗体は、４位、５位、６位および７位の４箇所がＡｌａ変異されたペプチドに対して、結合の９０％という著しい減少を示した。５箇所目の位置の感受性は、２位に起因し得る（３３％の減少）。
【０３１５】
全体に、アラニンスキャニング解析は、ＴＣＲ様抗体の選択性および微細特異性を決定するための手段として、Ａｌａスキャニングが有用であることを示す。Ａｌａ変異に対する感受性が多いほど、より特異的なペプチド依存性結合が観察される。この戦略を使用して、ＭＨＣ拘束性ペプチド特異的結合物質として、より高い、最適化された選択性および特異性に関する特性を示す、最適なＴＣＲ様抗体をフィルタリングし、選択することができる。
【０３１６】
本発明者らは、腫瘍細胞株の表面に内因的に提示されたＭＨＣ−ＭＡＧＥ−Ａ４  ペプチド複合体と、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲ様Ａｂの結合特異性を調査した。細胞を、抗ＭＡＧＥ−Ａ４−ＨＬＡ−Ａ２  ＴＣＲ様抗体Ａｂとともにインキュベートし、続いて、ＰＥ標識ストレプトアビジンまたは抗マウスＡｂとともにインキュベートした。ＨＬＡ−Ａ２（陽性）およびＭＡＧＥ−Ａ４（陽性または陰性）の発現について特徴付けられた腫瘍細胞および正常一次細胞のパネルを、ＴＣＲ様抗体の結合を比較するために使用した。図５６に示したように、ＴＣＲ様抗体は、低い強度でＭＡＧＥ４陽性およびＨＬＡ−Ａ２陽性細胞を認識した。ＴＣＲ様抗体を、ＭＡＧＥ−Ａ４  ＲＮＡ発現を示さない（ＭＡＧＥ−Ａ４陰性の）種々の起源の複数のＨＬＡ−Ａ２陽性細胞株について試験し、ＭＡＧＥ−Ａ４／ＨＬＡ−Ａ２  ＴＣＲＬ−二重特異性構築物を用いて、これらの細胞の死滅活性も試験した。図５６に示したように、Ｃ１０６Ｂ９  ＴＣＲＬは、これらの細胞のいずれとも結合しなかった。
【０３１７】
機能的アッセイを使用して、Ｃ１０６Ｂ９  ＴＣＲ様抗体の特徴付けをさらに行った。ＴＣＲＬ可変領域を抗ＣＤ３  ｓｃＦｖと融合すると、これは、エフェクターＴ細胞を再標的化して、二重特異的な形式で腫瘍標的細胞を死滅させることができる。図５７に示したように、Ｃ１０６Ｂ９二重特異性ＴＣＲ様抗体構築物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのヒトＰＢＭＣの存在下で、ＭＡＧＥ−Ａ４陽性細胞に対してロバストな細胞傷害性を示した。ＴＣＣＳＵＰおよびＯＶＣＡＲ、ＭＡＧＥ−Ａ４陰性細胞株は、陰性対照として機能し、細胞傷害性を実証しなかった。図５８にさらに示したように、ＨＬＡ−Ａ２＋／ＭＡＧＥ−Ａ４−正常ヒト一次細胞のパネルに対する細胞傷害性は検出されず、Ｃ１０６Ｂ９  ＴＣＲＬはその選択性が確認された。
【０３１８】
実施例ＩＩＩＢ
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるｓ．ｃ．Ａ３７５黒色腫腫瘍形成モデルにおける、ＭＡＧＥ−Ａ４  Ｃ１０６Ｂ９  ＢＳ  ＴＣＲＬのｉｎ  ｖｉｖｏの有効性
図５９は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス内のＳ．Ｃ．Ａ３７５黒色腫腫瘍形成モデルにおける、Ｃ１０６Ｂ９  ＢＳ  ＴＣＲＬのｉｎ  ｖｉｖｏの有効性を示す。腫瘍体積によって証明されるように、二重特異性抗体の投与が、実験の３５日間にわたって腫瘍形成を完全に阻害したことが明確に示された。結果は、本明細書に記載のＴＣＲＬ可変配列の、臨床設定における使用を支持する。
【０３１９】
実施例ＩＶ
ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ９に対する特異性を有するＴＣＲ様抗体
ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ９に対する特異性を有するＴＣＲＬの単離および特徴付け
単離されたＴＣＲ様抗体の結合特異性の特徴付けを行うために、精製ＩｇＧの反応性および特異性をフローサイトメトリーによって評価した。Ｔ２  ＡＰＣにＭＡＧＥ−Ａ９  ペプチドまたは対照ペプチドを負荷し、ＴＣＲＬ  Ａｂ  Ｆ１８４Ｃ７とともにインキュベートし、続いて、ＰＥ標識されたストレプトアビジンまたはＰＥ標識抗マウスＡｂとともにインキュベートした。図６０に示したように、Ｆ１８４Ｃ７は、ＭＡＧＥ−Ａ９ペプチドが負荷されたＴ２細胞と結合したが、対照ペプチドが負荷された細胞との結合を示さなかった。
【０３２０】
Ｆ１８４Ｃ７  ＴＣＲ様抗体の特異性をさらに評価するために、ＭＡＧＥ−Ａ９ペプチドに対して配列類似性を示すペプチドとの反応性を評価した。ペプチドは、表１０に示した。
【０３２１】
図６１に示したように、Ｆ１８４Ｃ７  ＴＣＲＬは、類似ペプチドのパネル由来のいかなるペプチドとも結合しなかった。これらのデータは、Ｆ１８４Ｃ７の高い選択性および微細特異性を実証し、ＴＣＲＬの選択性および微細特異性を評価するための、類似ペプチドアプローチおよび上述したようにに開発されたツールの有用性を実証する。
【０３２２】
ＭＡＧＥ−Ａ４ペプチドに対する単離されたＴＣＲ様抗体の微細なペプチドエピトープ特異性を調べるために、アラニンスキャニングを実施した。スキャニングには、ペプチド中の特定の残基をアラニンに変異させ、Ａｌａ変異ペプチドに対するＴＣＲ様抗体の結合を、それらのＴ２抗原提示細胞への負荷によって試験した（表１１）。結合をフローサイトメトリーによってモニタリングし、平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定される、変異提示ペプチドに対するＴＣＲ様抗体の結合の程度を、天然の変異していないＭＡＧＥ−Ａ４ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣと比較して相対的に見た。種々のＡｌａ変異されたペプチド（図２に記載）の適切な負荷を、ＨＬＡ−Ａ２に対するＢＢ７．２モノクローナル抗体を使用するフローサイトメトリーでモニタリングした。
【０３２３】
天然の変異されていないＭＡＧＥ−Ａ４ペプチドとの比較において、すべてのＡｌａ変異ペプチドがＴ２細胞上に効率的に負荷された（データは示さない）。図６２に示したように、ＴＣＲ様抗体はペプチド依存性結合を示し、これは、特定の変異が結合に影響を及ぼし、特定のペプチド位置でのＡｌａの導入の際に、ＴＣＲ様抗体の結合強度の減少を誘導したためである。これらの結果は、ＭＡＧＥ−Ａ４  ＴＣＲ様抗体が、種々のＡｌａ変異ＭＡＧＥ−Ａ４ペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ａ２との関連で、ペプチド特異的な拘束された結合を示したことを表しており、この抗体は、その結合特性においてＴＣＲ様であり、したがって、これらは、ＭＨＣ拘束性であり、且つペプチド特異的な様式でＭＨＣ−ペプチド複合体と結合することを示している。
【０３２４】
Ｆ１８４Ｃ７  ＴＣＲ様抗体は、３位、５位、６位、７位および８位の５箇所がＡｌａ変異されたペプチドに対して、結合の９０％という著しい減少を示した。
【０３２５】
全体に、アラニンスキャニング解析は、ＴＣＲ様抗体の選択性および微細特異性を決定するための手段として、Ａｌａスキャニングが有用であることを示す。Ａｌａ変異に対する感受性が多いほど、より特異的なペプチド依存性結合が観察される。この戦略を使用して、ＭＨＣ拘束性ペプチド特異的結合物質として、より高い、最適化された選択性および特異性に関する特性を示す、最適なＴＣＲ様抗体をフィルタリングし、選択することができる。
【０３２６】
本発明者らは、ＴＣＲ様Ａｂを、ＭＡＧＥ−Ａ９  ＲＮＡ発現を示さない種々の起源の正常一次細胞のパネルについて試験し、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧＥ−Ａ９  ＴＣＲ様Ａｂの結合特異性を調査した。図６３に示したように、Ｆ１８４Ｃ７  ＴＣＲＬは、これらの細胞のいずれとも結合しなかった。陽性対照は、Ｆ１８４Ｃ７が強く結合した、ＭＡＧＥ−Ａ９ペプチドが負荷されたＴ２細胞とした。
【０３２７】
実施例Ｖ
ＨＬＡ−Ａ２／ＰＡＰに対する特異性を有するＴＣＲ様抗体
ＨＬＡ−Ａ２／ＰＡＰに対する特異性を有するＴＣＲＬの単離および特徴付け
単離されたＴＣＲ様抗体の結合特異性の特徴付けを行うために、精製ＩｇＧの反応性および特異性をフローサイトメトリーによって評価した。Ｔ２  ＡＰＣにＰＡＰペプチドまたは対照ペプチドを負荷し、ＴＣＲＬ  Ａｂ  Ｄ１０Ａ３とともにインキュベートし、続いて、ＰＥ標識されたストレプトアビジンまたはＰＥ標識抗マウスＡｂとともにインキュベートした。図６４に示したように、Ｄ１０Ａ３は、ＰＡＰペプチドが負荷されたＴ２細胞と結合したが、対照ペプチドが負荷された細胞との結合を示さなかった。
【０３２８】
Ｄ１０Ａ３  ＴＣＲ様抗体の特異性をさらに評価するために、ＰＡＰペプチドに対して配列類似性を示すペプチドとのその反応性を評価した。ペプチドは、表１２に示した。
【０３２９】
図６５に示したように、Ｄ１０Ａ３  ＴＣＲＬは、類似ペプチドのパネル由来のいかなるペプチドとも結合しなかった。これらのデータは、Ｄ１０Ａ３の高い選択性および微細特異性を実証し、ＴＣＲＬの選択性および微細特異性を評価するための、類似ペプチドアプローチおよび上述したようにに開発されたツールの有用性を実証する。
【０３３０】
ＰＡＰペプチドに対する単離されたＴＣＲ様抗体の微細なペプチドエピトープ特異性を調べるために、アラニンスキャニングを実施した。スキャニングには、ペプチド中の特定の残基をアラニンに変異させ、Ａｌａ変異ペプチドに対するＴＣＲ様抗体の結合を、それらのＴ２抗原提示細胞への負荷によって試験した（表１３）。結合をフローサイトメトリーによってモニタリングし、平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定される、変異提示ペプチドに対するＴＣＲ様抗体の結合の程度を、天然の変異していないＭＡＧＥ−Ａ４ペプチドが負荷されたＴ２  ＡＰＣと比較して相対的に見た。種々のＡｌａ変異されたペプチド（図２に記載）の適切な負荷を、ＨＬＡ−Ａ２に対するＢＢ７．２モノクローナル抗体を使用するフローサイトメトリーでモニタリングした。
【０３３１】
天然の変異されていないＰＡＰペプチドとの比較において、すべてのＡｌａ変異ペプチドがＴ２細胞上に効率的に負荷された（データは示さない）。図６６に示したように、ＴＣＲ様抗体はペプチド依存性結合を示し、これは、特定の変異が結合に影響を及ぼし、特定のペプチド位置でのＡｌａの導入の際に、ＴＣＲ様抗体の結合強度の減少を誘導したためである。これらの結果は、ＰＡＰ  ＴＣＲ様抗体が、種々のＡｌａ変異ＰＡＰペプチドが負荷されたＨＬＡ−Ａ２との関連で、ペプチド特異的な拘束された結合を示したことを表しており、この抗体は、その結合特性においてＴＣＲ様であり、したがって、これらは、ＭＨＣ拘束性であり、且つペプチド特異的な様式でＭＨＣ−ペプチド複合体と結合することを示している。
【０３３２】
Ｄ１０Ａ３  ＴＣＲ様抗体は、３位、６位および８位の３箇所がＡｌａ変異されたペプチドに対して、結合の９０％という著しい減少を示した。４位の１箇所がＡｌａ変異されたペプチドに対して、結合の７０％の減少も観察された。５箇所目の位置である７位に対しても感受性を示す（４５％の減少）。
【０３３３】
本発明者らは、ＰＡＰ  ＲＮＡ発現を示さない種々の起源の正常一次細胞のパネルに対する、ＨＬＡ−Ａ２／ＰＡＰ  ＴＣＲ様Ａｂの結合特異性を調査した。図６７に示したように、Ｄ１０Ａ３  ＴＣＲＬは、これらの細胞のいずれとも結合しなかった。陽性対照は、Ｄ１０Ａ３  ＴＣＲＬが強く結合した、ＰＡＰペプチドを負荷したＴ２細胞とした。
【０３３４】
本発明をその特定の実施形態とともに記載したが、多数の代替法、改変および変法も当業者に明らかとなる。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲内に入るすべてのこのような代替法、改変および変法も包含するものとする。
【０３３５】
本明細書で述べた全ての刊行物、特許、および特許出願は、当該刊行物、特許、または特許出願について具体的かつ個別に記載した場合と同様に、参照によりそれらが完全に本明細書に組み込まれるものとする。さらに、本願におけるいかなる参考文献の引用または記載も、そのような参考文献が本願に対する従来技術として存在することの自認と解釈すべきではない。セクションの見出しの使用についても、それらを必ずしも限定として解釈すべきではない。
【配列表フリーテキスト】
【０３３６】
配列番号１：  短鎖ペプチド
配列番号２：  短鎖ペプチド
配列番号３：  短鎖ペプチド
配列番号４：  短鎖ペプチド
配列番号５：  短鎖ペプチド
配列番号６：  短鎖ペプチド
配列番号７：  短鎖ペプチド
配列番号７２：  短鎖ペプチド
配列番号７３：  短鎖ペプチド
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配列番号２８０：  Ｄ１１軽鎖の核酸配列
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配列番号２９６：  Ｄ７軽鎖の核酸配列
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配列番号３１２：  Ｂ４７Ｂ６軽鎖の核酸配列
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配列番号３２８：  Ｃ１０６Ｂ９軽鎖の核酸配列
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配列番号３３０：  Ｃ１０６Ｂ９重鎖の核酸配列
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配列番号３３９：  Ｃ１０６Ｂ９重鎖ＣＤＲの核酸配列
配列番号３４０：  Ｃ１０６Ｂ９重鎖ＣＤＲの核酸配列
配列番号３４１：  Ｃ１０６Ｂ９重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号３４２：  Ｃ１０６Ｂ９重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号３４３：  Ｃ１０６Ｂ９重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列
配列番号３４４：  Ｆ１８４Ｃ７軽鎖の核酸配列
配列番号３４５：  Ｆ１８４Ｃ７軽鎖のアミノ酸配列
配列番号３４６：  Ｆ１８４Ｃ７重鎖
配列番号３４７：  Ｆ１８４Ｃ７重鎖のアミノ酸配列
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配列番号３５０：  Ｆ１８４Ｃ７軽鎖ＣＤＲの核酸配列
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配列番号３５３：  Ｆ１８４Ｃ７軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列
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配列番号３６０：  Ｄ１０Ａ３軽鎖の核酸配列
配列番号３６１：  Ｄ１０Ａ３軽鎖のアミノ酸配列
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配列番号３７０：  Ｄ１０Ａ３重鎖ＣＤＲの核酸配列
配列番号３７１：  Ｄ１０Ａ３重鎖ＣＤＲの核酸配列
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配列番号３８４：  短鎖ペプチド
【図１】
2018527884.tif 000018
【図２】
2018527884.tif 000019
【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
2018527884.tif 000024
【図５−２】
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【図６−１】
2018527884.tif 000026
【図６−２】
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【図７−１】
2018527884.tif 000028
【図７−２】
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【図８−１】
2018527884.tif 000030
【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０−１】
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【図７０−２】
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【図７１−１】
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【図７１−２】
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【図７２−１】
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【図７２−２】
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【図７３−１】
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【図７３−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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