(57)【要約】本発明は、対象となる細胞内表現型に影響を及ぼす、内在性の生理学的に関連する遺伝要素を同定するのに一般的に適用可能な方法を含む。本方法において、突然変異誘発処理に供された死んだ細胞が、表現型に基づいてソートされ、遺伝要素を同定するのに分析される。これらの方法を使用することにより、表現型に関与することが既知でなかった要素を、例えば、健康状態、外部ストレス、又は薬剤応答に対する関係において、特にガンにおいて、同定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の表現型に影響を及ぼす遺伝要素を同定するための方法であって、
ここで好ましくは、前記表現型は、細胞内に現れ、
（ａ）細胞プールを、突然変異誘発処理に供する工程と、
（ｂ）細胞プールを、好ましくは、固定試薬、及び場合により、架橋剤により固定し、細胞プールを、好ましくは、透過試薬により透過させる工程と、
（ｃ）細胞プールを、１つ以上の検出可能なプローブ、好ましくは、抗体又はＲＮＡプローブにより処理して、影響を受けた表現型を検出する工程と、
（ｄ）１つ以上の検出可能なプローブの内の少なくとも１つの検出に基づいて、細胞をソートして、１つ以上の細胞集団を得る工程と、
（ｅ）場合により、得られた各細胞集団の細胞を脱架橋させる工程と、
（ｆ）得られた細胞集団の少なくとも一部の細胞の少なくとも一部を配列決定して、細胞の表現型に影響を及ぼす遺伝要素を同定する工程と、
を含む、
方法。
【請求項２】
工程（ｄ）において、少なくとも２つの細胞集団が、１つ以上の検出可能なプローブの内の少なくとも１つの検出に基づいて細胞をソートすることにより得られ、及びここで、工程（ｆ）において、少なくとも２つの細胞集団が配列決定され、比較され、細胞の表現型に影響を及ぼす遺伝要素が同定される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
遺伝要素が、遺伝子、イントロン、エクソン、プロモーター、及び非コードＲＮＡからなる群より選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
細胞が、真核生物細胞、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、又は幹細胞からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
細胞が、一倍体に近い細胞又は完全な一倍体細胞、好ましくは、一倍体に近い細胞又は完全な一倍体の哺乳類細胞、より好ましくは、一倍体に近い細胞又は完全な一倍体のヒト細胞である、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
突然変異誘発が、ランダム突然変異誘発である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
突然変異誘発が、放射線、突然変異誘発化学物質、好ましくは、メタンスルホン酸エチル、亜硝酸、又はエチルニトロソウレア、挿入突然変異誘発、好ましくは、トランスポゾン系挿入突然変異誘発又はレトロウイルス系（ランダム）挿入突然変異誘発、ガイドＲＮＡ配列のＣＲＩＳＰＲライブラリの使用による、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
工程（ｂ）において細胞が固定され、透過される前に、好ましくは、工程（ａ）と工程（ｂ）とを行う間に、細胞が、ストレス条件もしくは増殖条件に曝され、及び／又はここで、細胞が、化合物、好ましくは、薬剤により処理される、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
細胞を固定する固定試薬が、架橋試薬、好ましくは、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、及びグルタルアルデヒド、又は、非架橋試薬、好ましくは、塩化第二水銀系固定剤、エタノール、メタノール、もしくはアセトンからなる群より選択され、ならびに／又はここで、透過試薬が、溶媒、好ましくは、メタノール及びアセトン、又は、界面活性剤、好ましくは、サポニン、ジギトニン、Triton X-100、NP-40、Leucoperm、及びTween-20からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
検出可能なプローブが、タンパク質、翻訳後修飾タンパク質、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡに結合し、又は、代謝産物もしくは細胞要素に結合し、もしくは、これらを検出する、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
ソートが、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ分析、質量サイトメトリー、及び／又は磁性ソートによる、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
プローブが、好ましくは、蛍光部分、放射性部分、磁性部分、又は質量分光法を使用して測定することができるラベルから選択される検出可能な部分を含む、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
表現型が、細胞質ゾル中、小器官内部、小器官の膜中、細胞膜中に現れる、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
表現型が、タンパク質量の増大、タンパク質量の減少、タンパク質活性の上昇、タンパク質活性の低下、タンパク質の翻訳後修飾の増大、タンパク質の翻訳後発現の減少、ｍＲＮＡ量の増大、又はｍＲＮＡ量の減少である、請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
配列決定が、高スループットシーケンシングによる、請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
細胞の表現型に影響を及ぼす候補遺伝子によりコードされる遺伝子産物のモデュレーターを同定するための方法であって、ここで好ましくは、前記表現型は、細胞内に現れ、
（ａ）細胞プールを、突然変異誘発処理に供する工程と、
（ｂ）細胞プールを、好ましくは、固定試薬、及び場合により、架橋剤により固定し、細胞プールを、好ましくは、透過試薬により透過させる工程と、
（ｃ）細胞プールを、１つ以上の検出可能なプローブ、好ましくは、抗体又はＲＮＡプローブにより処理して、影響を受けた表現型を検出する工程と、
（ｄ）１つ以上の検出可能なプローブの内の少なくとも１つの検出に基づいて、細胞をソートして、１つ以上の細胞集団を得る工程と、
（ｅ）場合により、得られた各細胞集団の細胞を脱架橋させる工程と、
（ｆ）得られた細胞集団の少なくとも一部の細胞の少なくとも一部を配列決定して、細胞の表現型に影響を及ぼす遺伝要素を同定する工程であって、遺伝要素は、候補遺伝子である工程と、
（ｇ）細胞の表現型に影響を及ぼす前記同定された候補遺伝子の発現又は発現産物の活性に影響を及ぼすモデュレーターを同定する工程と、
を含む、
方法。
【請求項１７】
工程（ｄ）において、少なくとも２つの細胞集団が、１つ以上の検出可能なプローブの内の少なくとも１つの検出に基づいて細胞をソートすることにより得られ、及びここで、工程（ｆ）において、少なくとも２つの細胞集団が配列決定され、細胞の表現型に影響を及ぼす遺伝要素を同定するのに比較される、請求項１７記載の方法。
【請求項１８】
生体経路を確立するか、又は、分析するため、疾患、好ましくは、ガンに関与する遺伝子を同定するため、薬剤−ターゲット相互作用を研究するため、薬剤−薬剤相互作用を研究するため、又は、表現型のサプレッションもしくはモデュレーションを分析するために使用され、好ましくはここで、表現型が、疾患に関連する表現型である、請求項１６又は１７記載の方法。
【請求項１９】
同定された遺伝要素に関連する細胞要素を同定することを、更に含み、好ましくはここで、細胞要素が、タンパク質である、請求項１６〜１８のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[従来技術]
突然変異誘発系遺伝学は、数多くの種類の表現型を研究するのに使用されてきた。この強力なアプローチにより、細胞分裂（温度感受性変異酵母株についての調査による）、初期胚発達（ハエにおける異常な胚形成についてのスクリーニングによる）、及びプログラムされた細胞死（C. elegansにおける発達中における細胞死の研究による）に必要とされる遺伝子が同定されてきた。典型的には、選択された生物を突然変異誘発し、得られた子孫（場合により、交雑後）を、対象となる表現型について試験する。
【０００２】
これらの場合において、対象となる変異を観察された表現型に結び付けるために、生きている変異生物へのアクセスを有するのが重要である。一部の場合には、表現型は、致死性であるか、又は、適合性を低下させる（例えば、Drosophilaにおける初期発達欠陥又は酵母における細胞分裂表現型）。このような表現型について、原因となる変異は、影響を受けた子孫の両親においてマッピングすることができ、又は、温度感受性アレルを使用することができる。
【０００３】
一般的には、遺伝子スクリーニングにおける１つの主な問題は、研究中の表現型に関連する関連候補／遺伝子の同定を著しく妨害する、高レベルの「ノイズ」の存在である。このようなノイズの例は、関連性が無い、再現性が無い等がわかる、数多くの潜在的なヒットの存在を含む。このため、遺伝子スクリーニングは、発見する（多くの潜在的なヒットの中から関連するものを同定する）ための労働集約的な試行錯誤及び追認研究を必要とするだけでなく、非常に強力なシグナルのみがピックアップされるであろう手段をも必要とする。スクリーニングにおいて弱いが、研究中の表現型に対する関係に関連するシグナル／ヒットは見過ごされる。
【０００４】
これを考慮して、例えば、細胞内に現れる（すなわち、細胞又は生物の細胞に存在する）か、又は、細胞内のみ（細胞内部へのアクセスを必要とする）において検出することができる形質に基づいて、真核生物系において、信頼性のある遺伝子スクリーニングを可能にする高スループットアプローチのための方法が、非常に望まれているが、突然変異誘発系遺伝学又は修飾細胞の大集団（プール、複雑なプール）（変異の存在に関する異種集団）に行われる他の遺伝子スクリーニングについては未だに容易に利用できない。
【０００５】
特に、細胞又は生物の表現型に影響を及ぼす（すなわち、所定の特徴の同定の形質を変化させる、又は、提供するのに関与する）未知の遺伝要素（遺伝子、エクソン、イントロン、ＳＮＰ等）の簡易な同定を可能にする、信頼性があり、効率的で、再現性がある方法についての、当技術分野における明確な必要性が存在している。同遺伝子要素には、従来技術の遺伝子スクリーニングにおいて、高レベルのノイズのために同定するのが困難であろうような遺伝要素が含まれる。このことは、特に、細胞内に現れる（又は、細胞内においてのみ検出することができる）表現型に関連する。このような方法は、これらの遺伝要素に関連する細胞要素（このような遺伝要素により発現されもしくはモデュレーションされるタンパク質、このような細胞要素の活性、及び／又は、これらの細胞要素によりモデュレーションされもしくは生成される関連する生体分子（例えば、脂質、他のタンパク質又は酵素、代謝産物）の活性を含むが、これらに限定されない）の同定を同時に可能にするであろう。
【０００６】
したがって、本発明の根底にある技術的課題は、前述の必要性のいずれかに適合するような方法の提供にあることが分かる。この技術的課題は、特許請求の範囲及び以下の本明細書において特徴付けられる実施態様により解決される。
【０００７】
本発明の目的は、表現型、好ましくは、（少なくとも一部において）細胞内に現れ、及び／又は、細胞内において検出されるかもしくは検出される必要がある表現型に影響を及ぼす遺伝要素、特に、内在性遺伝要素の同定を可能する方法または改善された方法を提供することである。
【０００８】
本発明の更なる目的は、表現型に影響を及ぼす遺伝要素に関連する細胞要素の同定を可能にするような方法を提供することである。
【０００９】
本発明の目的は、１つ又はそれ以上の遺伝要素（及び／又は、それに関連する細胞要素）を、突然変異誘発処理に供された大きな細胞集団から同定するのを可能にする方法を提供することである。ここで、各遺伝要素は、単独又は組み合わせにおいて、細胞内に現れ、及び／又は、細胞内において検出される表現型に影響を及ぼす。
【００１０】
本発明の目的は、遺伝要素（及び／又は、それに関連する細胞要素）、特に、細胞内に現れ、及び／又は、細胞内において検出される表現型に影響を及ぼす内在性遺伝要素の同定を可能するフォワード遺伝子スクリーニングを提供することである。
【００１１】
本発明の目的は、関連するヒット比を上回って相対的に高いノイズにより妨害されないか、又は、ほとんど妨害されない、すなわち、低レベルのノイズを示す、すなわち、関連するヒットを示さないようなフォワード遺伝子スクリーニングを提供することである。このため、これにより、関連する遺伝要素の簡易な同定が可能となり、更なる労働集約的な確認研究をさせないか、又は、減らすことができる。
【００１２】
本発明の目的は、真核生物細胞における上記を提供することである。同細胞は、例えば、ヒト細胞を含むが、これに限定されない。同ヒト細胞は、疾患原因変異を有する細胞、例えば、ヒトガン細胞を含む。
【００１３】
また、本発明の目的は、細胞の表現型に影響を及ぼす候補遺伝子によりコードされる遺伝子産物、及び特に、内在性遺伝子産物のモデュレーター、例えば、薬剤を同定するための方法を提供することでもある。
【００１４】
本発明の目的は、生体経路を確立し、又は、分析し、疾患（例えば、ガンを含むが、これに限定されない）に関与する遺伝子を同定するため、薬剤−ターゲット相互作用を研究するため、薬剤−薬剤相互作用を研究するため、又は、表現型、好ましくは、疾患（ガンを含む）に関連する表現型のサプレッションもしくはモデュレーションを分析するための方法を提供することである。
【００１５】
これら及び他の目的は、本明細書で開示された本発明の方法により解決される。
[本発明の説明]
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−１】パラホルムアルデヒドにより固定されている突然変異誘発細胞集団の遺伝子スクリーニング。
【図１−２】パラホルムアルデヒドにより固定されている突然変異誘発細胞集団の遺伝子スクリーニング。
【図１−３】パラホルムアルデヒドにより固定されている突然変異誘発細胞集団の遺伝子スクリーニング。
【図２】突然変異誘発細胞プールの表現型分離及び配列決定による遺伝子トラップ挿入部位の同定。
【図３−１】ＡＫＴリン酸化のレギュレーターを同定するためのゲノムワイド突然変異誘発スクリーニング。
【図３−２】ＡＫＴリン酸化のレギュレーターを同定するためのゲノムワイド突然変異誘発スクリーニング。
【図４−１】ＫＣＴＤ５により、ＡＫＴリン酸化が影響を受ける。
【図４−２】ＫＣＴＤ５により、ＡＫＴリン酸化が影響を受ける。
【図５】シグナル強度に基づいて細胞集団を可視化することができ、同集団を分離するのに使用することができるスクリーニング法は、任意の細胞内表現型に適している。
【図６】ＩＲＦ１タンパク質レベル（タンパク質発現）についてのスクリーニング。
【図７】ＩκＢα発現（タンパク質分解）についてのスクリーニング。
【図８】ｐ３８リン酸化についてのスクリーニング。
【図９】照射された細胞におけるＤＮＡ損傷についてのスクリーニング。
【図１０】ヒストンテイル修飾についてのスクリーニング。
【図１１−１】ＫＣＴＤ５により、ＧＰＣＲシグナル伝達がモデュレーションされる。
【図１１−２】ＫＣＴＤ５により、ＧＰＣＲシグナル伝達がモデュレーションされる。
【図１２】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系スクリーニングにより、ホスホ−ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）についてのネガティブレギュレーターとしてのＫＣＴＤ５が同定される。
【図１３−１】表現型パネル間での遺伝子関連表現型の比較。
【図１３−２】表現型パネル間での遺伝子関連表現型の比較。
【図１３−３】表現型パネル間での遺伝子関連表現型の比較。
【図１４】ヒストンタンパク質中の同じアミノ酸における２つの類似する翻訳後修飾（ＰＴＭ）に必要とされる遺伝子の比較分析。
【図１５】リソソームタンパク質ＬＡＭＰ１量についてのスクリーニング。
【図１６】一倍体遺伝子スクリーニングにより、変異に基づいて疾患マーカーレベルが変化した遺伝子が同定される。
【００１７】
定義
下記説明及び実施例において、数多くの用語が使用される。このような用語に与えられる範囲を含めて、本明細書及び特許請求の範囲の明確かつ一貫した理解を提供するために、下記定義が提供される。本明細書で他に定義されない限り、使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「一般的な科学的用語」という用語は、他に定義されない限り、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する、本明細書で使用される技術的及び科学的用語を意味する。当業者であれば、本明細書で記載されたものに類似し、又は、それらと均等な多くの方法及び材料を認識するであろうし、これらを、本発明の実施に使用することができる。実際に、本発明は、記載された方法及び材料に何ら限定されるものではなく、分子生物学、生化学、コンピュータ化学、細胞培養、リコンビナントＤＮＡ、バイオインフォマティックス、ゲノム学、シーケンシング、及び関連する分野の実務は、当業者に周知である。
【００１９】
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、他で明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「ａ」ＤＮＡ分子を単離するための方法は、複数の分子（例えば、１０、１００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、又はそれ以上の分子）を単離することを含む。
【００２０】
本明細書で使用する場合、文脈から具体的に示されない又は明らかでない限り、「約」という用語は、当技術分野において通常の許容範囲内、例えば、平均の２つの標準偏差内と理解される。約は、記載された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内と理解することができる。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「及び／又は」という用語は、１つ以上の記載された事例が、単独又は、記載された事例の少なくとも１つ、最大で、全ての記載された事例との組み合わせにおいて生じる可能性あることを示す。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「少なくとも」について、同定の値は、その同定の値以上を意味する。例えば、「少なくとも２」は、「２以上」と同様である、すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５．．．等であると理解される。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「増幅」及び「増幅すること」という用語は、ポリヌクレオチド増幅反応、すなわち、１つ以上の開始配列から複製されたポリヌクレオチド集団を意味する。増幅は、各種の増幅反応を意味することができる。同増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応、直線ポリメラーゼ反応、核酸配列系増幅、ローリングサークル増幅、及び同様の反応を含むが、これらに限定されない。典型的には、増幅プライマーが、増幅に使用され、増幅反応の結果が、アンプリコンである。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「含むこと」及び「含む」という用語ならびにそれらの結合は、前記用語がこの語に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目が排除されないことを意味するその非限定的な意味で使用される、状況を意味する。この用語は、より限定的な動詞である「からなる」も包含する。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「架橋」という用語は、作用物質をＤＮＡと２つの異なる位置で反応させ、これにより、これらの２つの異なる位置を結合させることができる、作用を意味する。架橋は、同じ（二本鎖）ＤＮＡ分子のＤＮＡ鎖間及び／又はＤＮＡとタンパク質間で生じる場合がある。本発明において有利に使用することができる架橋剤は、（パラ）ホルムアルデヒドである。ホルムアルデヒドは、タンパク質−タンパク質及びＤＮＡ−タンパク質架橋を誘引する。このため、ホルムアルデヒドは、異なるＤＮＡ鎖を互いに、その会合したタンパク質を介して架橋させることができる。架橋は、加熱工程、例えば、６０℃でのインキュベーションにより反転させることができる。架橋は、タンパク質及び／又はＤＮＡ間の架橋の形成をもたらし、ＤＮＡの三次元状態を大部分が変化していない状態のままにするのを可能にする。
【００２６】
本明細書で使用する場合、遺伝子の「発現レベル」という用語は、遺伝子により転写されたＲＮＡ転写物の量、及び／又は、ＲＮＡ転写物、例えば、ｍＲＮＡから翻訳することができるタンパク質の量を意味する。例えば、ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子については、発現レベルは、例えば、標準的な方法、例えば、成熟ｍｉＲＮＡの定量ＰＣＲ、マイクロアレイ、又はノーザンブロットを使用して、発現されたＲＮＡ転写物の量を定量することにより決定することができる。あるいは、発現レベルは、ターゲットｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡの影響を測定することによっても決定することができる。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「遺伝子の発現」という用語は、適切なレギュラトリー領域、特に、プロモーターに操作可能に結合しているＤＮＡ領域が、生物学的に活性であり、すなわち、生物学的に活性なタンパク質もしくはペプチド（又は、活性なペプチドフラグメント）に翻訳することができる、又は、（例えば、転写後遺伝子サイレンシング又はＲＮＡｉにおいて）それ自体活性な、ＲＮＡに転写されるプロセスを意味する。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「遺伝子」という用語は、細胞中でＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）に転写される、適切なレギュラトリー領域（例えば、プロモーター）に操作可能に結合している領域（転写領域）を含むＤＮＡ配列を意味する。このため、遺伝子は、複数の操作可能に結合している配列、例えば、プロモーター、５’リーダー配列（例えば、転写開始に関与する配列を含む）、（タンパク質）コード領域（ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、及び３’非翻訳配列（例えば、転写終了部位を含む）を含むことができる。
【００２９】
本明細書で使用する場合、遺伝要素という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子中の要素、すなわち、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子の基礎部分、又は、当業者に基礎部分であると考えられている部分を意味する。遺伝要素は、１つのヌクレオチドからなることができ、又は、２つ以上のヌクレオチドを含むことができる。遺伝要素が２つ以上のヌクレオチドを含む場合、これらのヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドである。このため、遺伝要素は、例えば、任意の数の隣接する核酸（例えば、長さが少なくとも／最大で、１、５、１０、１００、１０００、１００００、１０００００、１００００００個の核酸）からなることができ、又は、種々の群のこのように隣接する核酸（例えば、空間的に分離しているエクソン）からなることができる。本発明の文脈内において、遺伝要素は、本発明の方法により、研究中の表現型に影響を及ぼすと認識されるＤＮＡ又はＲＮＡの一部である。遺伝要素は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子（の一部）である場合があり、例えば、染色体又はエピソーム上に存在する場合がある。真核生物において、遺伝要素は、例えば、核、細胞質ゾル、任意の他の小器官（ミトコンドリアを含む）に存在する場合がある。遺伝要素は、本発明の方法に供される細胞中に本来存在する場合があり、又は、意図的にこれらの細胞中に導入された遺伝要素である場合がある。ただし、好ましくは、遺伝要素は、本発明の方法に使用される細胞に内在性の（すなわち、細胞が得られる生物に由来する、及び／又は、生物の生殖系統／細胞が保有する）遺伝要素である。例えば、遺伝要素は、本発明の方法が、研究中の表現型に関連するＳＮＰの存在を同定した場合、遺伝子についての同定される一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）であることができる。ただし、好ましくは、遺伝要素は、当業者に一般的に認識された機能的な遺伝要素である。同遺伝要素は、プロモーター、遺伝子、イントロン、エクソン、エンハンサー、非コードＲＮＡ分子、リプレッサーエレメント等を含み、好ましいが、これらに限定されない。一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、例えば、関連する遺伝子を有さないＳＮＰも企図される。本明細書で使用する場合、「細胞要素」は、任意の他の要素、特に、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子ではない細胞中の生体分子を意味する。本文脈において細胞要素という用語は、遺伝要素ではない細胞中の任意の他の要素を意味し、細胞中に存在するタンパク質、脂質、糖、及び炭水化物を含むが、これらに限定されず、また、細胞、細胞の小器官又は膜に存在する他の代謝産物及び生体分子も含む。当業者に理解されるであろうように、本発明の方法による遺伝要素の同定により、関連する細胞要素の同定も可能となる場合がある。例えば、遺伝要素がタンパク質をコードする遺伝子（の一部）である場合、遺伝子によりコードされたタンパク質は、対応する細胞要素である。例えば、遺伝要素が同定の脂質に結合することが公知のタンパク質をコードする遺伝子（の一部）である場合、脂質も、対応する細胞要素であることができる。例えば、遺伝要素が非コードＲＮＡであり、例えば、ＲＮＡ干渉に関与する場合、前記非コードＲＮＡに相補性を含むＲＮＡ及びコードされるタンパク質は、対応する細胞要素である。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「遺伝子産物」という用語は、同定の遺伝子の転写及び翻訳産物である、具体的な作用モード、サイズ、三次元構造、又は起源に関わらず、ヌクレオチド又はアミノ酸の鎖からなる分子を意味する。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「高スループットシーケンシング」及び「次世代シーケンシング」、及び「ディープシーケンシング」という用語は、時間当たりに数百程度ではなく、大量の読取り、典型的には、数千（すなわち、１００００又は１０００００）又は１００００００のオーダーでの配列読取りを生成することが可能なシーケンシング技術を意味する。高スループットシーケンシングは、従来のサンガー又はキャピラリーシーケンシングとは区別され、別箇のものである。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「以下」又は「最大」等は、０から提供された値までで、提供された値を含む範囲を意味する。例えば、「１０以下」又は「最大１０」は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０と理解される。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「表現型」という用語は、生物又は生物の細胞における少なくとも１つの観察可能な特徴又は形質、例えば、その形態、発達、生化学的又は生理学的特性、生物季節学、挙動、及び挙動産物を意味する。表現型は、遺伝子の発現及び環境要因の影響ならびにこれら２つの間の相互作用から生じる。表現型は、生物により表わされた観察可能な特徴のアンサンブルであるが、フェノムという語は、形質の集合を意味するのに使用される場合がある。その同時研究は、フェノム学（fenomics）と呼ばれる。このため、本明細書で使用する場合、「表現型に影響を及ぼす遺伝要素」は、前記表現型の出現に影響を及ぼす、すなわち、前記表現型のモデュレーターである／同表現型をモデュレーションし／影響を及ぼす、本明細書で定義された遺伝要素を意味する。遺伝要素は、例えば、表現型の第１形質（又は、特徴の第１形質）を生じさせ又は促進するのに関与する場合があり、または、同じ表現型の別の形質をリプレッションするのに関与する場合がある。このため、例えば、本明細書で記載された突然変異誘発処理の結果として、このような遺伝要素における変化を誘引することは、このような表現型の修飾を生じる場合がある（形質が変化する場合がある）。このため、本発明の方法により、影響を受けた（変化し、修飾され、改変された）表現型（すなわち、形質、生物又は細胞の表現型特徴又は特性の別箇の変異の出現）の検出に基づいて、このような遺伝要素の同定が可能となる。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「プロモーター」という用語は、１つ以上の遺伝子の転写を制御するのに機能し、遺伝子の転写開始部位の転写方向に関して上流に位置し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ用の結合部位、転写開始部位、および任意の他のＤＮＡ配列（転写因子結合、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位、及び、プロモーターからの転写量を直接的又は間接的にレギュレーションするように作用するのが当業者に公知である任意の他のヌクレオチド配列を含むが、これらに限定されない）の存在により構造的に認識される核酸フラグメントを意味する。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「配列決定」という用語は、核酸サンプル、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ中のヌクレオチドの順序（塩基配列）を決定することを意味する。
【００３６】
本明細書で使用する場合、生物学の文脈において、「形質」という用語は、生物の個々のメンバー又は個々の細胞における、同じ生物の（任意の）他の個々のメンバー又は（任意の）他の個々の細胞と比較して、任意の表現型上区別できる特徴に関する形質を意味する。例えば、本発明において、（同じ生物からの）細胞の（好ましくは、同じ特徴の）形質が比較される。本発明の文脈内で、形質は、生物の遺伝情報により、次の世代に伴って、遺伝子する、すなわち、受け継ぐことができる。本明細書で使用する場合、「同じ特徴の形質」及び「前記特徴の形質」という用語は、特徴について存在する（又は、明らかとなる）少なくとも２つの形質の群のいずれか１つを意味する。例えば、「花の色」の特徴の場合、表現型出現（形質）は、青色、赤色、白色等を含むことができる。上記例では、青色、赤色、及び白色は、同じ特徴の異なる全ての形質である。
【００３７】
[発明の詳細な説明]
本発明の目標及び目的は、特許請求の範囲、項目、説明、図面、及び実施例において、本明細書で特徴付けられた本発明の方法により解決される。
【００３８】
本発明の方法は、好ましくは、細胞内に現れるか、又は、細胞内においてのみ検出することができる形質に基づいて、例えば、真核生物系において、信頼性のある遺伝子スクリーニングを提供する、高スループットアプローチである。本方法は、大きな細胞集団、すなわち、細胞プール又は複雑な細胞プールに／について行われる突然変異誘発系遺伝学に関する。好ましくは、細胞プールは、同質遺伝子的な細胞からなるか、又は、同じ種類の（例えば、同じ細胞系統から得られた）細胞である。プール中の細胞は、突然変異誘発処理に供することができる。これらの処理は、異種の細胞集団が細胞に導入される変異に関して得られるようにであることができる。すなわち、処理後に、プール内の種々の細胞は、種々の変異を、種々の位置及び種々の数で含むことができる。例えば、集団中の第１細胞は、このような突然変異誘発処理後に５つの変異、例えば、遺伝子Ａ、遺伝子Ｂ、エクソンＣ、イントロンＤ、及び遺伝子Ｅにおける変異を含む場合がある。一方、別の細胞は、同じか又は異なる数の変異を、ゲノム中の種々の位置に含む場合がある。対応する状況は、本明細書で詳述されたように、遺伝子発現を改変する処理の場合に想定することができる。つぎに、処理されたプール中の細胞は、（好ましくは、細胞の固定及び透過後に）研究中の表現型に基づいて、例えば、所定の特徴の定義された（又は、望ましいかもしくは予め決定された）形質を有さない第１集団と、形質を有する第２集団とにおいて、ソートされる。ソートに基づいて、表現型（特徴、形質）に関与する、基礎をなす遺伝子要素を同定することができる。
【００３９】
特に、本方法は、細胞又は生物の表現型、特に、細胞内に現れ、細胞内においてのみ検出することができるような表現型に関して影響を及ぼす未知の遺伝要素の同定を可能にする、信頼性があり、効率的で、再現性がある方法を提供する。
【００４０】
第１態様では、細胞の表現型に影響を及ぼす遺伝要素を同定するための方法であって、ここで好ましくは、表現型は、細胞内に現れる（すなわち、例えば、表現型を細胞内において検出するプローブを使用して、細胞中において検出することができ、又は、検出される必要がある）、方法が提供される。細胞の表現型に影響を及ぼす遺伝要素を同定するための方法は、以下の本明細書で記載されたように、複数の工程を含む。本発明の工程は、
（ａ）細胞プールを、突然変異誘発処理に供する工程と、
（ｂ）細胞プールを、好ましくは、固定試薬、及び場合により、架橋剤により固定し、細胞プールを、好ましくは、透過試薬により透過させる（すなわち、処理された細胞プール中の細胞の少なくとも一部を、固定及び透過、ならびに場合により、架橋に供する）工程と、
（ｃ）細胞プールを、１つ以上の検出可能なプローブ、好ましくは、抗体又はＲＮＡプローブにより処理して、影響を受けた（又は現れた）表現型を特異的に検出する工程と、
（ｄ）１つ以上の検出可能なプローブの内の少なくとも１つの検出に基づいて、細胞をソートして、１つ以上の細胞集団を得る工程と、
（ｅ）場合により、得られた各細胞集団の細胞を脱架橋させる工程と、
（ｆ）得られた細胞集団の少なくとも一部の細胞の少なくとも一部を配列決定して、細胞の表現型に影響を及ぼす遺伝要素を同定する工程と、
を含む。
【００４１】
本発明の方法の連続的な工程は、連続的に行うことができる（すなわち、本明細書で記載された工程間に行われる任意の他の工程を含まない）が、本発明は、これに限定されない。更なる工程を、本明細書で開示された本発明の方法の工程のいずれかの前もしくは後、又は、本発明の方法の２つの連続的な工程の間に行うことができる。
【００４２】
本発明の方法は、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。ただし、原理的には、本方法の同定の工程を、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、例えば、植物又は非ヒト動物中で行うことができる。特に、本方法が生きた細胞を環境条件（例えば、ストレス、増殖条件、薬剤及び代謝産物、他の細胞により生成された代謝産物等）に曝すことを含む実施態様では、本方法の少なくとも一部を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて行うのが望ましい場合がある。
【００４３】
本発明の方法は、１つの細胞プールのみを必要とするが、２つ以上の細胞プールを、連続的又は平行して使用する、すなわち、第１細胞プールの後、又は、同時に（平行実験において）本方法の種々の工程を受けることができる。
【００４４】
本発明の文脈内において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏという用語は、細胞について行われる方法（工程）を示すのに使用され、これらの細胞の正常な生物学的環境外、例えば、人工的な培養培地を使用する組織又は細胞培養（系）中で行われる。本発明の文脈内において、この用語は、ｅｘ  ｖｉｖｏも包含する（すなわち、実験が、外部環境において（動物の身体の外側において）、生物からの組織中又は同組織上で行われる）。ｉｎ  ｖｉｖｏでの研究は、動物又は植物において行われるものである。当業者であれば、本発明の方法は、単細胞生物及び／又は限られた量の細胞からなる生物（例えば、細菌及び真菌）にも使用することができることを理解するであろう。好ましくは、本発明の方法は、真核生物細胞を使用して行われる。
【００４５】
本発明の方法は、遺伝要素の同定を可能にする。本発明の文脈内において、同定は、同定の遺伝要素を、影響を受けた表現型に対する関係において確立し、認識し、及び／又は、関連付けることを意味する。本方法は、表現型に関与する、又は、表現型を生じさせ、又は、表現型を改変する、例えば、特徴の形質を出現させる、遺伝要素の同定を可能にする。以下の本明細書における実施例で例示されたように、本発明の方法は、遺伝要素を、所定の表現型に対する関係において、確立し、認識し、又は、関連付けることができる。遺伝要素は、公知の遺伝要素、又は更に、所定の表現型に対する関係において公知の遺伝要素であることができるが、本方法は、特に、未知であるか、又は、所定の表現型に関連する／関与することが未知であるかのいずれかである、遺伝要素の同定を可能にする。
【００４６】
同定される遺伝要素は、細胞中に存在する任意の遺伝要素であることができる。遺伝要素は、ＤＮＡ遺伝要素又はＲＮＡ遺伝要素であることができ、例えば、染色体又はエピソームに存在することができる。真核生物において、遺伝要素は、例えば、核、細胞質ゾル、又は、任意の他の小器官（ミトコンドリアを含む）に存在することができる。遺伝要素は、本発明の方法に供される細胞中に本来存在する場合があり、又は、意図的にこれらの細胞中に導入されている遺伝要素である場合がある。ただし、好ましくは、遺伝要素は、本発明の方法に使用される細胞に内在性の（すなわち、細胞が得られる生物に由来する、及び／又は、生物の生殖系統／細胞が保有する）遺伝要素である。例えば、遺伝要素は、細胞中の染色体中／上に存在する場合がある。
【００４７】
遺伝要素は、所定の表現型について同定される限り、任意の数の隣接する核酸（例えば、長さが少なくとも／最大で、１、５、１０、１００、１０００、１００００、１０００００、１００００００個の核酸）からなることができる。
【００４８】
例えば、遺伝要素は、本発明の方法により研究中の表現型に関連するＳＮＰの存在を同定された場合、遺伝子について同定された一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）であることができる。ただし、好ましくは、遺伝要素は、当業者に一般的に認識された機能的な遺伝要素である。同遺伝要素は、プロモーター、遺伝子、イントロン、エクソン、エンハンサー、非コードＲＮＡ分子、リプレッサーエレメント等を含み、好ましいが、これらに限定されない。一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、例えば、関連する遺伝子を有さないＳＮＰも企図される。
【００４９】
当業者に理解されるであろうように、遺伝要素の同定は、その後に、細胞要素を更に同定するのに使用することができる。例えば、本発明の方法により遺伝子が同定されると、このような遺伝子によりコードされるタンパク質も、本発明の方法により同定される。加えて、例えば、同定された遺伝子によりコードされたタンパク質が代謝産物を生成する酵素である場合、この代謝産物を、本発明の方法により同定することができる。別の例は、タンパク質が、例えば、他のタンパク質及び／もしくは資質の翻訳後修飾に関与する場合（例えば、キナーゼ）、又は、後成的な修飾に関与する場合であり、このようなタンパク質のターゲットも、本発明の方法により同定することができる。別の例は、遺伝子が別の遺伝子の発現に影響を及ぼす非翻訳転写産物、例えば、マイクロＲＮＡをコードする場合であり、このような転写産物のターゲットも、本発明の方法により同定することができる。細胞要素、特に、タンパク質及び酵素（例えば、（ＤＮＡ及びＲＮＡの）メチル化酵素を含む）のこのような同定は、本明細書で記載された本発明に属すると特に企図される。
【００５０】
本明細書で開示された方法は、細胞における表現型に影響を及ぼす遺伝要素（及び対応する細胞要素（例えば、タンパク質又は代謝産物）の同定を可能にする。本発明の方法は、例えば、化学物質突然変異誘発、遺伝子トラップを使用し、又は、ガイドＲＮＡ配列のＣＲＩＳＰＲライブラリ（以下の本明細書で詳細に検討）を使用して、細胞を、突然変異誘発に供することを含む。好ましい実施態様では、この処理により、例えば、この処理に供された細胞プールに、数多くの種類及びゲノムワイドな変異の同定の導入が可能となる。すなわち、細胞プール中において（すなわち、同じサンプル中において）、細胞は、この細胞の処理の結果として、多くの種類（例えば、ランダムな）変異を有するであろう。ここで、種々の細胞は、種々の変異を有する。
【００５１】
次に、所定の表現型を生じさせ、又は、同表現型に関連する、すなわち、表現型に影響を及ぼす遺伝要素を同定するために、細胞を、少なくとも１つの所定の表現型に基づいてソートする。すなわち、本発明の方法により同定される遺伝要素は、考慮される特徴の表現型及び／又は形質を生じさせるのに関与し、又は、これらに関連付けられる。例えば、同定された遺伝要素は、例えば、突然変異誘発処理の結果として、例えば、対応するタンパク質を発現させないようにし、次に、所定の特徴、表現型の同定の形質を生じさせるように変異している遺伝子であることができる。このため、遺伝子の場合において、遺伝要素は、特徴の種々の形質を確立するのに関与する（ある形質は、遺伝子場合には、遺伝要素の非発現の結果であり、一方、その結果として、別の形質は、遺伝要素の発現に関連する）ため、本発明の文脈内において、表現型に影響を及ぼす。
【００５２】
本発明の文脈内において、表現型は、生物又は細胞により現される同定の特徴の形質（表現型上の特徴の区別できる変化）である。形質は、直接的又は間接的に観察することができる。後者の場合には、形質は、付加的な手段を使用して（例えば、抗体もしくは任意の他の手段又は機能的なアッセイ法を使用することにより）、検出可能である。例えば、特徴は、「薬剤に対する応答」であることができ、可能性のある形質は、「抵抗性」又は「感受性」である。別の特徴は、タンパク質量であることができ、可能性のある形質は、「低い」、「正常」、又は「高い」である。第３の例は、形質「タンパク質の細胞キナーゼ活性」であり、可能性のある形質は、「活性なし」、「低い活性」、又は「高い活性」である。最後の例は、「タンパク質のリン酸化状態」であり、再度、可能性のある形質は、例えば、「リン酸化されていない」又は「リン酸化されている」である。上記から、当業者であれば、形質（又は表現型）は、定性的方法（例えば、タンパク質の発現に対して発現なし）、又は、定量的方法（発現なし、低い発現、正常な発現、正常を超える発現、高い発現（又は量））において検討することができることを理解する。
【００５３】
他の好ましい特徴（及び対応する表現型／形質）の例は、タンパク質の活性、タンパク質の量、ＲＮＡの量、代謝産物の量、ミトコンドリアの膜電位、タンパク質の翻訳後修飾リソソームの数、小器官の形状（例えば、フローサイトメトリー、例えば、Amnisにより提供されるIMAGESTREAMを使用）、反応性酸素種（ＲＯＳ）、ペルオキシソーム又は他の小器官の数、Ｃａ流動又は他のカチオン、タンパク質のコンホーメーション（コンホーメーション特異的抗体スクリーニングを使用（例えば、ミスホールディングタンパク質を検出））、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性等を含むが、これらに限定されない。他の一般的なタンパク質活性を列記することができる。
【００５４】
本発明の方法について、表現型（特徴／形質）は、細胞中もしくは細胞上（例えば、細胞表面、細胞膜中（内側及び／もしくは外側の層）、細胞質ゾル中、小器官の膜もしくは管腔中等）のいずれかにおいて現され、又は、検出することができる。表現型は、直接的又は間接的に検出することができる。ただし、当技術分野において公知の方法とは対照的に、本発明の方法は、細胞内（すなわち、細胞表面の除くどこか）に現れ、又は検出することができる表現型（特徴／形質）に、特に適している。本発明の方法について、細胞プール中の個々の細胞におけるこのような細胞内表現型を（実際には、細胞プール中の細胞を（透過及び固定することにより）殺傷することにより）検出し、細胞を細胞プールから（遺伝要素が探察される表現型に基づいて）ソートし、配列決定技術を使用して、表現型に関与し、又は、関連する遺伝要素を同定することが可能となる。好ましい実施態様では、表現型は、細胞内に現れ、特に、例えば、細胞プールの固定及び透過（以下の本明細書でより詳細に検討）後に細胞内において検出することができる、表現型である。更に好ましい実施態様では、表現型は、細胞内においてのみ検出することができるため、固定及び透過に供されており、このような処理の結果として、死んでいる細胞の提供を必要とする、表現型である。好ましくは、細胞内において検出される表現型は、間接的にのみ検出することができる（すなわち、眼で見ることができず、表現型を検出するための更なる手段、例えば、プローブを必要とする）、表現型である。特に好ましい実施態様では、本発明の方法は、細胞の表現型に影響を及ぼす遺伝要素（例えば、プロモーター、遺伝子、イントロン、エクソン、非コードＲＮＡ）を検出するための方法であって、表現型が、細胞内において検出される（検出されるべき）表現型である、方法である。すなわち、本発明の方法は、表現型が、例えば、細胞膜を透過させ、細胞内への検出可能なプローブの進入を可能にすることにより、細胞内において検出することができるような方法において、細胞を処理した後に検出することができるような表現型に、特に適しているが、それには限定されない。このような処理により、細胞は死んだ状態になる（すなわち、細胞は、これ以上増えることができない）。更に好ましい実施態様では、本方法は、細胞内においてのみ検出することができる、すなわち、細胞膜の透過を必要とし、その後、形質（表現型、特徴）を検出することができる、形質（表現型；特徴）についてであるが、本発明は、それに限定されない。このような実施態様では、形質（表現型、特徴）は、細胞の外側からは検出することができない（すなわち、形質（表現型、特徴）は、細胞内においてのみ検出することができる）。
【００５５】
本明細書で記載された方法の最初の工程において、細胞プールを、（例えば、本明細書で詳述された）突然変異誘発処理に供する。これに限定されないが、細胞プールは、好ましくは、１つの同じ個体生物から得られた細胞であることができる。ただし、異なる起源の細胞を含む細胞プールを使用することもできる。細胞プールは、初代細胞であることができるが、実務上の理由で、好ましくは、細胞系統が使用される。細胞系統は、確立された細胞系統（例えば、市販されている細胞系統）であることができる。プール中の細胞数は、本明細書で記載された方法には重要ではない。ただし、プールは、例えば、この最初の工程に使用される細胞及び／又は処理方法に応じて、典型的には、１００万〜数億個 細胞を含むことができる。
【００５６】
突然変異誘発処理という用語は、当技術分野において周知であり、細胞中に存在する元の遺伝情報（ＤＮＡ）中に、例えば、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換により、変化を導入する処理に関連する。変異は、（例えば、欠失により、又は、更なるヌクレオチドの挿入により）１つのみのヌクレオチドの変化を含むことができ、又は、多くの隣接するヌクレオチドを含むことができる。本発明の文脈内において、突然変異誘発処理は、好ましくは、ゲノムワイドな欠失、挿入、又は置換を生じる、すなわち、処理に供される細胞中に存在するゲノム全体の種々の位置において、変異を生じさせることができる。変異処理は、好ましくは、ランダム又は半ランダムな方法において変異を導入する、すなわち、例えば、１つの予め決定された遺伝要素を特別に目的とする処理ではない処理である。各手段が同定の位置に同定の変異を導入する手段を含むライブラリの使用も企図される。この場合、ライブラリ中の手段は共に、ゲノムワイド変異を（すなわち、ゲノム全体の種々の位置に）導入する。
【００５７】
この最初の工程に使用される突然変異誘発処理は、好ましくは、ゲノム全体に多くの種類の変異を導入する処理であるが、これに限定されない。すなわち、本発明の方法による突然変異誘発処理は、好ましくは、多くの種類の変異を、処理に供される細胞中に存在する遺伝物質全体の多くの異なる位置に導入する処理である。その結果として、ある細胞が、同じ細胞プール中の別の細胞と比較して異なる変異を有する場合がある細胞プールが得られる。この場合、細胞は、２つ以上の変異を、細胞中に存在する遺伝物質における種々の位置に有することができる。すなわち、突然変異誘発処理は、２つ以上の位置に変異を導入する処理である。すなわち、突然変異誘発処理は、互いに比較した場合、異なる変異を有する細胞を提供する。例えば、突然変異誘発処理は、ランダム又は半ランダムに変異を導入し、その結果として、細胞中に存在する種々の遺伝要素に影響を及ぼすことができる処理であることができる。あるいは、突然変異誘発は、同定のターゲットをそれぞれ目的とする（数多くの）変異原を使用する（例えば、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用する）ことにより提供することができる。このようなライブラリによる処理によっても、種々の（位置及び数の）変異をそれぞれ有する細胞が得られるであろう。このため、突然変異誘発処理により、細胞プールは、個々の細胞における変異の存在に関して、処理されていない細胞プールと比較して、異種性の細胞プール、すなわち、異種的に突然変異誘発された細胞プールになる。
【００５８】
実際には、１つの目的は、所定の表現型に関与する（新たな）遺伝要素の同定を可能にする、本発明の方法を提供することである。それに関して、本方法は、フォワード遺伝子スクリーニング、すなわち、所定（予め決定された）表現型を担い、同表現型に関与し、又は、関連する遺伝的基礎を決定するのに関連すると考えられる。このため、本発明の方法は、表現型、例えば、予め決定された表現型を担い、同表現型に関与し、又は、関連する遺伝要素を決定するための方法であるとも考えることができる。本方法では、まず、表現型を検出し、又は、決定し、次に、表現型に影響を及ぼす遺伝要素を同定する（フォワード遺伝アプローチ）。フォワード遺伝学は、リバース遺伝学とは異なる。同リバース遺伝学は、（例えば、予め決定された遺伝要素に目的をもって又は選択的に変異を導入することにより）変異したＤＮＡ配列の表現型への影響を分析することにより遺伝子の機能を決定する。
【００５９】
当業者であれば、細胞プールが突然変異誘発処理及び／又は遺伝子発現を修飾する処理に供されるのに必要とされる条件及び環境を十分知っている。このような方法は、種々のハンドブックに広く記載されており、当業者であれば、容易に利用することができる。例えば、本明細書における実施例に記載された方法を使用することができる。
【００６０】
本発明の方法における次の工程において、突然変異誘発処理に供された細胞プールを、固定し、透過させる。これは、１つの工程において（細胞を固定し、透過させるのを両方ともする１つの組成物を使用して）行うことができ、又は、別々の組成物を使用して、別々の工程において行うことができる。当業者であれば、細胞を固定するための手段及び方法を十分知っている。固定は、架橋を含むことができるが、非架橋性の作用物質によっても行うことができる。このため、一実施態様において、及び場合により、固定は、架橋を含む。別の実施態様では、細胞を、固定し、架橋し、透過させる。他の実施態様では、細胞を、固定し、透過させる。これは、１つ及び同じ処置において、又は、別々の処理において行うことができる。細胞の固定により、自己溶解及び／又は腐敗が防止されるため、細胞成分が保存される。特に、細胞の固定により、（細胞）ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの後の抽出及びその後の配列決定が可能となる。
【００６１】
当技術分野において、多くの種類の方法又はプロトコールを、本発明の方法に使用されるこのような細胞プールを含めて、細胞の固定に利用することができる。例えば、固定を、架橋性固定剤、例えば、アルデヒドの使用に基づくプロトコールを使用して行うことができる（架橋性固定剤は、細胞中のタンパク質間に、共有化学結合を生じさせることにより作用する）。また、固定は、沈殿性固定剤、例えば、アルコールの使用に基づくプロトコールを使用して行うことができる（例えば、Smith et al. Anal Biochem. 1987;160(1):135-8に記載されたように、沈殿性固定剤は、タンパク質分子の溶解性を低下させることにより、かつ（多くの場合）、多くのタンパク質にその三次構造を与える疎水性相互作用を崩壊させることにより作用する）。ただし、細胞の固定のための他の方法も使用することができ（酸化剤及びＨＯＰＥ（Ｈｅｐｅｓ−グルタミン酸バッファー媒介性有機溶媒保護効果）固定剤（例えば、http://www.dcs-diagnostics.de/）に基づく方法を含む）、タンパク質抗原の良好な保存ならびに良好なＲＮＡ及びＤＮＡ収量、ならびに架橋性タンパク質の不存在を提供することが報告されている。
【００６２】
細胞の固定に加えて、細胞を透過させる。固定及び透過は、同じ工程において提供することができ、及び／又は、同じ試薬を使用することができる。再度、当業者であれば、細胞を透過させるための手段及び方法を十分知っている。細胞内及び小器官内の化合物（すなわち、細胞要素）、例えば、抗原又は脂質等を検出するために、透過を必要とする場合がある。このために、細胞プールを、まず、例えば、固定後（ただし、固定及び透過を、同時に行うこともできる）、透過させる必要がある。
【００６３】
原理的には、任意の種類の試薬を、プール中の細胞を透過させるのに使用することができる。２種類の一般的な試薬：有機溶媒（固定にも使用することができる）、例えば、メタノール、エタノール、及びアセトンと、界面活性剤、例えば、サポニン、Triton X-100、及びTween 20が、一般的に使用される。有機溶媒は、細胞膜から脂質を溶解させ、細胞を透過性にする。有機溶媒は、タンパク質も凝集させるため、有機溶媒は、同時に細胞を固定し、透過させるのに使用することができる。サポニンは、膜のコレステロールと相互作用して、それを選択的に除去し、膜に穴を開ける。界面活性剤、例えば、Triton X-100及びTween 20は、本質的には非選択的である（Jamur Methods Mol Biol. 2010;588:63-6に詳細にレビューされている）。
【００６４】
当業者により理解されるであろうように、プール中の細胞を固定し、透過させることにより、これらの細胞は、分裂し、増殖する能力を失う。細胞は、細胞の固定及び透過処理後に生きていないためである。このため、本発明の方法は、表現型の検出に細胞の固定及び／又は透過を必要とする、表現型に影響を及ぼす遺伝要素を同定するのに特に有用であるが、これに限定されない。
【００６５】
本明細書で記載された方法の次の工程において、固定され、透過された細胞プールを、遺伝要素が同定される影響を受けた（又は、現れた）表現型（すなわち、特徴の形質）を検出することができ、かつ、（特異的に）検出するのに使用することができる、１つ以上のプローブにより処理する。上記の本明細書で既に検討されたように、形質は、定性的形質及び／又は定量的形質であることができる。形質が定性的形質である場合、プローブを、表現型（形質）の存在又は不存在のいずれかを検出するのに使用することができる。定量的形質の場合、使用されるプローブは、所定の表現型を有する細胞と所定の表現型を有さない細胞との両方における検出シグナルを最初に導くことができ、シグナルレベルに基づいて、細胞を、研究中の所定の表現型を現すために、定性し、又は、不適格にするであろう。例えば、抗体がタンパク質の量を検出するプローブとして使用される場合、高レベルのタンパク質を有するであろう細胞と、低レベルのタンパク質を有するであろう細胞との両方が、プローブにより検出されるであろう。量のレベル（例えば、低い対高い）に基づいて、表現型が多い量のタンパク質として定義される場合、少ない量のタンパク質を表わす細胞が、表現型を有さないと考えられる（ソートされる）であろう。多い量は、例えば、総細胞プールの、５、１０、２０、又は２０％最も高いシグナルを提供する細胞と定義することができる。
【００６６】
本発明の方法において、１つ以上の検出可能なプローブを使用することができる。プローブは、同じ表現型に指向性を有することができるが、同じ実験において、種々の表現型を検出するように指向性を有することもできる。このため、同じ実験において、２つ以上の表現型（多重）についての１つ又はそれ以上の遺伝要素を同定する方法も提供される。
【００６７】
本発明の方法は、２つ以上の要素からなる表現型に特に使用することができる。例えば、表現型／形質を、第１タンパク質の高い発現を有し、第２タンパク質の低い発現を有すると定義することができる。このため、このような実施態様では、表現型は、表現型の第１要素を検出する第１プローブと、表現型の第２要素を検出する第２プローブとにより検出することができる。この例では、両プローブに基づくその後のソートにより、望ましい、定義され、及び／又は、所定の表現型を現す細胞を（細胞プールから）得ることができる。このため、本発明の文脈内において、表現型は、１つのみの要素を含む表現型であることができるが、本質的により複雑であることもでき、表現型を定義するのに合わさった種々の要素を含むこともできる。
【００６８】
本方法のこの工程に使用されるプローブは、所定の表現型（の要素）の検出に使用するのに適していることができる、任意のプローブであることができる。好ましい実施態様では、検出可能なプローブは、抗体、ＲＮＡプローブ、又はＤＮＡプローブである。当業者に公知であるように、ＲＮＡプローブは、サンプル中の相補なヌクレオチド配列の存在を検出するのに使用される可変長の配列である。ＲＮＡプローブは、例えば、蛍光又は化学発光により検出することができる修飾ヌクレオチドによりラベルすることができる。例えば、あるものは、ＲＮＡ蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＮＡ  ＦＩＳＨ）を含む技術を使用することができる。例えば、あるものは、テロメアＤＮＡの量（例えば、影響を受けた表現型として）を定量するためのテロメラーゼに対するＲＮＡプローブを使用することができる。あるいは、分子ビーコン又はＲＮＡビーコンを使用することができる（分子ビーコンは、一方端に蛍光クエンチャーを備え、反対側の端部に蛍光染料（レポーター又は蛍光体とも呼ばれる）を備えるステムループヘアピン構造を有するオリゴヌクレオチドを含む。この構造により、そのターゲットとなる相補配列の不存在下において、ビーコンは蛍光しないことが可能となる。ターゲットへの結合に基づいて、ビーコンは、クエンチャーとレポーターとの空間的分離により、蛍光を発する）。分子ビーコンは、本発明の方法における検出可能なプローブとして使用することができ（Journal of Nucleic Acids Volume 2011 (2011), Article ID 741723も参照のこと）、種々の企業、例えば、Eurogentecから得ることができる。一般的には、これらのＲＮＡプローブは、ＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ分子を定量するのに使用される。それらは、ハイブリダイゼーションによりターゲットを見出し、蛍光体又は他のものを備えていることができる（例えば、Klemm et al. Nat Methods. 2014 May;11(5):549-51.doi: 10.1038/nmeth.2910を参照のこと）。
【００６９】
適切な抗体は、同定のタンパク質を検出する抗体、同定の翻訳後修飾の存在もしくは不存在を特異的に検出する抗体（例えば、ホスホ特異的抗体）、又は、タンパク質の三次構造を特異的に検出する抗体を含むが、これらに限定されない。他の好ましいプローブは、抗体類似物（例えば、アビマー、アフィボディ分子等）、ビオチン／ストレプトアビジン系プローブ、抗体様タンパク質捕捉剤、ナノボディ、アプタマー等を含むが、これらに限定されない。
【００７０】
次に、プール中の細胞を、１つ以上の検出可能なプローブの内の少なくとも１つの検出に基づいてソートする。陰性集団と陽性集団との比較（すなわち、一方が形質を有し、一方が形質を有さない）から、レギュレーターの同定がもたらされる。細胞のソーティングは、当業者に周知の技術である。当技術分野において公知の任意の方法を使用することができる。非限定的な例は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を含む、フローサイトメトリーを含む。フローサイトメトリー及びセルソーターは、臨床診断及び生物医学調査において、十分確立された技術である。一般的には、ＦＡＣＳ中に、細胞の異種混合物を、懸濁状で配置し、１つ以上のレーザーインテロゲーション点を通過させる。粒子から発せられたシグナルを収集し、所定の表現型、例えば、細胞形態、表面及び細胞内タンパク質発現、遺伝子発現、及び細胞生理に相関される。ついで、ユーザーにより定義されたパラメーターに基づいて、個々の細胞を、流動流から得ることができ、非常に高速、かつ、１００％に近い純度で、同種画分に収集することができる（Ibrahim SF Adv Biochem Eng Biotechnol. 2007;106:19-39を参照のこと）。当業者により理解されるであろうように、本発明の方法においてソートされた細胞は、固定及び透過工程の結果として、もはや生きていない。
【００７１】
他の適切な技術は、磁性細胞ソート（ＭＡＣＳ）、親和性結合技術、及び微少流体に基づく方法（Autebert J. Methods. 2012 57(3):297-307にレビューされている）を含む。行うことができるソートは、１つの工程であるか、又は、２つ以上の工程からなることができる（すなわち、ここで、次の工程において、ソートされた細胞の第１セットが更にソートされる）。ソートにより、研究中の表現型に基づく１つ以上の細胞集団がもたらされる。例えば、ソートにより、プローブにより検出された形質を有する第１細胞集団と、形質を有さない第２細胞集団とをもたらすことができる。細胞は、複数種類の集団、例えば、プローブによる検出に基づき、同定のタンパク質又はＲＮＡを含まない細胞、（ユーザーにより定義された）低レベルの同定のタンパク質又はＲＮＡを含む細胞、（ユーザーにより定義された）正常なレベルの同定のタンパク質又はＲＮＡを含む細胞、及び、（ユーザーにより定義された）高レベルの同定のタンパク質又はＲＮＡを含む細胞にソートすることもできる。また、ソートにより、１つのみの集団をもたらすこともできる。この場合、例えば、全ての細胞が、（検出に使用されたプローブに基づいて）所定の表現型を現すか、又は、全ての細胞が、所定の表現型を現さない。１つの集団を、例えば、表現型／形質を有さない細胞集団から予め得られた情報と、又は、ソート前の細胞集団全体（の一部）（すなわち、ソートされていない集団）との比較により、比較することができる。
【００７２】
細胞をソートした後、場合によるが好ましくは、架橋系固定後に、細胞を、本発明の方法における配列決定工程に利用可能なＤＮＡ及び／又はＲＮＡを生成するために、脱架橋させてもよい。加えて、例えば、アルコールを細胞の固定及び透過に使用する場合、細胞は、ソートされた細胞からＤＮＡ／ＲＮＡを精製するために、プロテアーゼにより更に処理することができる。架橋を含まない方法において、ＤＮＡ／ＲＮＡは、脱架橋を必要とすることなく、当業者に公知の方法を使用して、容易に単離することができる。他の試薬、例えば、ホルムアルデヒド（及び、例えば、界面活性剤）により固定され、透過された細胞を、ＤＮＡ単離前に、脱架橋させることができる。細胞を脱架橋させるための方法は、当業者であれば容易に利用することができ、一部において、使用された固定及び透過方法により決まる。例えば、ソートされた細胞のペレットの脱架橋を容易にするために、細胞を、バッファー中に再懸濁させ、振とうしながら、プロテイナーゼＫ及び溶解バッファーの添加後に、数時間インキュベーションすることができる（以下の本明細書における実施例を参照のこと）。他の脱架橋プロトコールは、プロテイナーゼＫを使用せずに、摂氏６５度で５時間インキュベーションし、その後、プロテイナーゼＫを加え、摂氏４２度で数時間インキュベーションすることを含む。
【００７３】
このため、本発明の好ましい実施態様では、細胞プールの固定は、可逆的、すなわち、固定剤による可逆的な固定工程を含む方法（例えば、Eltoum I  Advanced concepts in fixation: 1. Effects of fixation on immunohistochemistry, reversibility of fixation and recovery of proteins, nucleic acids, and other molecules from fixed and processed tissues. 2. Developmental methods of fixation. J Histotechnol 2001;24;201-210も参照のこと）、及び／又は、その後の処理について遺伝物質に影響を及ぼさない方法のいずれかの固定である。このような方法は、一般的には、当技術分野において公知である。１つの非限定的な例は、ホルムアルデヒドによる可逆的な固定である。その例は、本明細書における実施例に示されている。あるいは、本明細書において既に検討されたように、固定及び透過は、例えば、アルコールを使用して、架橋することなく行うことができる。このような方法において、脱架橋は必要ではない。ＤＮＡ／ＲＮＡは、容易に得ることができる。
【００７４】
次の工程において、得られた集団の少なくとも一部の細胞の少なくとも一部を配列決定して、細胞の表現型に影響を及ぼす、１つ以上の遺伝要素（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を同定する。本発明について、配列決定法は重要ではない。ただし好ましくは、配列決定は、高スループットシーケンシング法及び／又は次世代シーケンシング技術、例えば、４５４ピロシーケンシング、Illumina（Solexa）シーケンシング（以下の本明細書における実施例を参照のこと）、SOLiDシーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシング、ＲＮＡシーケンシング、又は任意の他の技術を含む。好ましくは、配列決定は、ディープシーケンシング（すなわち、リード総数が研究中の配列長より数倍長いシーケンシング、すなわち、少なくとも２、７、１０、又は更に、５０もしくは１００以上の深さ／カバー）による。
【００７５】
遺伝物質の配列決定前に、遺伝物質は、更なる調製又は処理工程、例えば、遺伝物質の（一部の）、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した増幅を受けることができる。例えば、細胞プールを、遺伝子トラップベクターを使用し、哺乳類ゲノムにわたって挿入変異を導入する、突然変異誘発プロトコールにより処理された場合、配列決定前に、挿入部位を、ＰＣＲを使用して、例えば、及び好ましくは、総ゲノムＤＮＡを使用するLinear Amplificactionポリメラーゼ連鎖反応（ＬＡＭ−ＰＣＲ）を使用して増幅させることができる。当業者であれば、このような方法を、その変形例を含めて十分知っている（例えば、Ranzani et al. (2013) Protocol Exchange   (2013)  doi:10.1038/protex.2013.009又はSchmidt et al. (2007) Nature methods 4, 1051-7を参照のこと）。
【００７６】
一実施態様において、総ＤＮＡ又はＲＮＡを配列決定する。別の実施態様では、ＤＮＡ又はＲＮＡの一部のみを配列決定する。
【００７７】
配列決定の結果に基づいて、表現型に影響を及ぼす１つ以上の遺伝要素を、例えば、所定の表現型を現すのにソートされた第１集団と、所定の表現型を現さない（又は、程度が低い）のにソートされた第２（又はそれ以上の）集団との結果の比較により、同定することができる。得られたＤＮＡ配列における差から、所定の表現型に関与し、又は、関与しない遺伝要素が示される。例えば、遺伝子トラップベクターが、表現型を表わす細胞集団において、所定の遺伝子に挿入され、表現型を示さない細胞集団において挿入されていないことが見出された場合、このような遺伝子は、表現型に影響を及ぼす遺伝要素であると考えられる（遺伝子トラップベクターが遺伝子を不活性化させた場合）。
【００７８】
例えば、各種の方法を、遺伝子トラップベクターが挿入された遺伝子／遺伝要素を同定するのに使用することができる。例えば、インバースＰＣＲは、挿入に隣接するゲノム配列を同定するのに使用することができる。あるいは、splinkerette  ＰＣＲが使用される（Horn, C, et al, Nat. Genet., 39: 807-8, 2007）。また、５’−ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ端の急速な増幅）が、遺伝子トラップ融合転写産物に含有される細胞性配列を増幅させるのに使用される（例えば、Nature Methods, 2(8), 2005を参照のこと）。当業者により理解されるであろうように、同定の遺伝要素が所定の表現型を現す細胞集団中に特異的に見出され／同定され（そして、所定の表現型を示さない集団中において、見出されない／同定されないか、又は、ほとんど見出されない／ほとんど同定されない）、又は、同定の遺伝要素の誘導が同定される（例えば、同じ遺伝子に影響を及ぼす種々の変異の収集）頻度が高いほど、候補遺伝要素が、表現型により影響を及ぼすであろう。例えば、挿入突然変異誘発が本方法の工程（ａ）に使用される場合、ソートされた集団間のゲノムにおける挿入比は、ゲノム中の種々の位置について決定することができる。遺伝要素が所定の表現型／形質のポジティブレギュレーターである場合、その遺伝要素は、形質について陽性である細胞集団における無関係の遺伝要素と比較して、遺伝要素中への相対的に少ない挿入を示すであろう。所定の表現型／形質のネガティブレギュレーターは、形質について陽性である細胞集団において、相対的に多くの挿入を示すであろう。集団を比較するための方法は、当業者に周知である（例えば、van Opijnen et al. Nature Methods 6, 767 - 772 (2009)又はSun et al. Cell Reports 7, 86-93, 2014（http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2014.02.045.）を参照のこと）。このような可能性のある方法の他のものは、実施例に記載されている。
【００７９】
明確に、表現型を現す（又は、独立して、表現型を現さない）細胞を配列決定することから得られた結果を、第２取得集団と比較するのに代えて、初期の分析結果と比較することができる。
【００８０】
本発明の一実施態様では、所定の表現型を現さない細胞から得られた結果を、所定の表現型に影響を及ぼすのに関与する候補遺伝要素を排除するのに使用することができる。
【００８１】
工程（ｄ）において、少なくとも２つの細胞集団を、１つ以上の検出可能なプローブの内の少なくとも１つの検出に基づいて、細胞をソートすることにより得て、工程（ｆ）において、少なくとも２つの細胞集団を配列決定し、細胞の表現型に影響を及ぼす遺伝要素を同定するのに比較するのが、好ましい。
【００８２】
本発明は、本発明の方法の工程（ｄ）において、１つ又は２つの細胞集団に限定されない。表現型に応じて、本発明の方法は、３、４、５、又はそれ以上の集団の使用も含むことができる。例えば、より多くの集団を比較することにより、本方法は、例えば、種々の集団において種々の役割を果たす遺伝要素を同定することができる。例えば、異なる量の所定のｍＲＮＡ（なし、低い、正常、高い）を有する４つの集団を比較する場合、第２集団において、同定の遺伝要素Ａが関与しており、第３集団において、遺伝要素Ａの次に、同定の遺伝要素Ｂも関与しており、一方、第４集団において、遺伝要素Ｃのみが関与していることを、証明することができる。このため、本発明の方法の好ましい実施態様では、工程（ｄ）において、少なくとも３、４、５、６つ、又はそれ以上の集団を得て、好ましくは、工程（ｆ）において、少なくとも２、３、４、５、６つ、又はそれ以上の集団を、配列決定に供する。
【００８３】
上記で検討されたように、遺伝要素は、細胞中に存在する任意の種類の要素であることができる。ただし、好ましくは、遺伝要素は、遺伝物質における機能単位であり、好ましくは、遺伝子、イントロン、エクソン、プロモーター、及び非コードＲＮＡからなる群より選択される。他のものは、オペロン、オペレーター、転写開始部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター等を含む。最も好ましくは、同定される遺伝要素は、遺伝子である。
【００８４】
本明細書で開示された方法を、本発明の工程における種々の処理（突然変異誘発、固定等）に供することができる任意の種類の細胞、例えば、原核生物細胞及び真核生物細胞を使用して利用することができる。ただし、好ましい実施態様では、細胞プール中の細胞は、真核生物細胞、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、又は幹細胞からなる群より選択される。細胞は、例えば、多能性幹細胞又は誘導多能性幹細胞であることができる。細胞は、非ヒト胚から得ることができる。好ましい実施態様では、細胞は、特に、胚の破壊をもたらすヒト胚からは得られない。本方法は、ヒトの生殖系統同一性を改変するのに使用されない。細胞は、初代細胞であることができ、又は、細胞系統であることができる。細胞系統は、遺伝的に改変されていてもよいし、又は、改変されていなくてもよい。
【００８５】
細胞は、細胞が由来して得られた生物にとって正常な倍数性（細胞中の染色体のセット数）を有することができる（例えば、ヒト及びほとんどの動物にとって二倍体）。細胞は、二倍体細胞であることができ、又は、例えば、植物材料の場合には、多数体細胞、例えば、三倍体、四倍体、五倍体等であることができる。好ましい実施態様では、細胞は、一倍体に近い細胞又は完全な一倍体細胞、好ましくは、一倍体に近い又は完全な一倍体の哺乳類細胞、より好ましくは、一倍体に近い細胞又は完全な一倍体のヒト細胞である。
【００８６】
ヒトを含めて、ほとんど全ての動物において、大部分の体細胞は、通常、二倍体である。すなわち、同体細胞は、各染色体（２つの性染色体を除く。同性染色体は、性別及び同定の種に応じて、相同又は非相同のいずれかである場合がある）の２つの相同なコピーを含有する。相同なペアのメンバーは、両方とも同じ遺伝子座に同じ遺伝子を含有するが、それらの遺伝子の異なるアレル（すなわち、異なる遺伝的変異）を有する可能性がある、同一でない染色体である。
【００８７】
対照的に、一倍体細胞は、各染色体の１つのコピーのみを含有する。当技術分野において使用する場合、一倍体に近い哺乳類細胞は、５つ以下の染色体が２つ以上のコピーで存在する哺乳類細胞を意味する。一部の実施態様では、一倍体に近い哺乳類細胞は、２つ以上のコピーで存在する１、２、３、又は４つ以下の染色体を有する。２つ以上のコピーで存在する染色体が存在しない場合、細胞は、一倍体細胞であると考えられる。
【００８８】
本発明の一部の実施態様では、一倍体に近い哺乳類細胞は、ヒト細胞である。本発明の一部の実施態様では、一倍体に近い哺乳類細胞は、非ヒト哺乳類細胞、例えば、非ヒト霊長類細胞又はげっ歯類細胞、例えば、マウス、ラット、もしくはウサギ細胞である。本発明の一部の実施態様では、一倍体に近い哺乳類細胞は、造血細胞系統、例えば、リンパ球又は骨髄細胞である。本発明の一部の実施態様では、一倍体に近い哺乳類細胞は、腫瘍細胞、例えば、腫瘍に由来して得られた細胞の子孫である。例えば、一倍体に近い哺乳類細胞は、ＫＢＭ７細胞系統の細胞又はそのサブクローンである。本発明の他の実施態様では、一倍体に近い哺乳類細胞は、平滑筋肉腫細胞である（Dal Sin, P., et al., J Pathol., 185(1): 112-5, 1988）。一倍体に近い細胞は、当技術分野において公知であり、例えば、欧州特許第２４５１９８２号に記載されている。
【００８９】
突然変異誘発の種々の方法を、本発明の方法に使用することができる。本発明の方法の目的が、所定の表現型に影響を及ぼす遺伝要素を同定すること（フォワード遺伝学）であるため、好ましくは、突然変異誘発に使用される方法により、細胞プールに存在するゲノム全体に改変が導入される。好ましい実施態様では、変異は、ランダム又は半ランダムに導入される。本発明の文脈内において、ランダム及び半ランダムな突然変異誘発は、ランダム又は半ランダムな方法において変異を導入する（例えば、ゲノム全体に存在する同定の領域を相同性に基づいてターゲッティングする）突然変異誘発法に関する。化合物質変異原、例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、亜硝酸、マイトマイシンＣ、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＭＮＵ）、ジエポキシブタン（ＤＥＢ）、１，２，７，８−ジエポキシオクタン（ＤＥＯ）、メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、４−ニトロキノリン  １−オキシド（４−ＮＱＯ）、２−メチルオキシ−６−クロロ−９（３−［エチル−２−クロロエチル］−アミノプロピルアミノ）−アクリジンジヒドロクロリド（ＩＣＲ−１７０）、２−アミノプリン（２ＡＰ）、及びヒドロキシルアミン（ＨＡ）は、ゲノム中にランダム変異を生じさせると考えられる。また、放射線、例えば、紫外線及び／又は放射線の使用によっても、ランダム変異が導入される。あるいは、挿入突然変異誘発（例えば、レトロウイルス又はトランスポゾンを使用）、符号タグ化突然変異誘発、遺伝子トラッピング、及び他の非（特異的）遺伝子ターゲッティングを使用することができる。
【００９０】
あるいは、プール中の細胞の遺伝物質における多くの種々の部位をターゲッティングする変異原のライブラリを利用する突然変異誘発法を使用することができる。ただし、ここで、ライブラリ中の各メンバーは、遺伝物質における１つのみ又は少しの部位に特異的である。例えば、このようなライブラリは、ガイドＲＮＡ配列のＣＲＩＳＰＲライブラリからなることができる。この場合、各ガイドＲＮＡは、プール中の細胞のゲノム中の限られた量の配列／位置をターゲッティングする。ただし、この場合、ライブラリは、細胞中の同定の配列をそれぞれターゲッティングする種々のガイドＲＮＡからなる（ただし、同配列は、細胞中に２回以上存在する場合がある）。
【００９１】
突然変異誘発は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）技術又は、メガヌクレアーゼ（転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮＳ）、ジンクフィンフガーヌクレアーゼ等を含む）の使用も含むことができる。変異を誘導するためのこれらの技術は全て、当業者に周知である。
【００９２】
突然変異誘発処理は、例えば、細胞当たりに平均して少しの変異のみ（例えば、平均して、細胞当たりに１、２、３、４、５、・・・１０個の変異）を導入する方法であることができる。
【００９３】
好ましい実施態様では、突然変異誘発処理は、ランダム突然変異誘発処理である。
【００９４】
好ましい実施態様では、突然変異誘発は、放射線、紫外線、及び電離放射線、突然変異誘発化学物質、好ましくは、メタンスルホン酸エチル、亜硝酸、もしくはエチルニトロソウレア、挿入突然変異誘発、好ましくは、トランスポゾン系挿入突然変異誘発もしくはレトロウイルス系ランダム挿入突然変異誘発、ガイドＲＮＡ配列のＣＲＩＳＰＲライブラリ（多くの又は全てのヒト遺伝子、プロモーター、エンハンサー、又は非コードＲＮＡ等に変異を生じさせるのを目的とする）、メガヌクレアーゼ、及び／又は、ＤＮＡ修復をリプレッションする（ことにより、変異を蓄積させる）方法の使用による。
【００９５】
好ましい実施態様では、細胞を工程（ｂ）において固定し、透過させる前に、好ましくは、工程（ａ）と工程（ｂ）とを行う間に、細胞を、対象となる同定のストレス条件もしくは増殖条件に曝し、及び／又は、細胞を、化合物、好ましくは、薬剤により処理する。
【００９６】
この実施態様では、細胞を固定し、透過させる前に、プール中に存在する細胞を、ストレス条件もしくは増殖条件に曝すことができ、又は、化合物、好ましくは、薬剤により処理することができる。曝露又は処理は、工程（ａ）における処理の前、工程（ａ）における処理中、及び／又は、工程（ａ）の処理後であるが工程（ｂ）における固定及び透過前であることができる。増殖条件のストレス条件は、細胞が所定の表現型を適応し、又は、このような表現型を誘引するのを必要とする増殖条件のストレスであることができる。あるいは、このような条件は、表現型を適応した細胞を選択するために、工程（ａ）の処理との組み合わせにおいて使用することができる（工程（ａ）の処理により、細胞がストレスをより良好に生き残ることができ、かつ、本発明の方法を使用して、この表現型に影響を及ぼす遺伝要素を同定することができるためである）。
例えば、このストレス条件は、温度もしくは塩濃度の上昇、又は、増殖倍地中の毒性物質の存在であることができる。他の例は、代謝ストレス、低酸素、及び病原体への曝露を含む。
【００９７】
本発明の方法において、細胞プールは、同定の表現型、例えば、（遺伝性）（ヒト）疾患を生じさせることが既知である変異を予め有するように改変されている細胞プールであることもできることが、留意される。このような細胞を、本発明の方法における細胞プールとして使用し、種々の工程（ａ）〜（ｆ）に供する場合、例えば、所定の遺伝的背景において、このような表現型に影響を及ぼす遺伝要素を同定することができ、介在のための興味深いターゲットであることができる（図１６を参照のこと）。このため、好ましい実施態様では、本発明の方法に使用される細胞プールは、遺伝的症状等の症状を（動物／ヒト／植物、好ましくは、ヒトにおいて）引き起こす少なくとも１つの変異を含む細胞を含む。例えば、症状は、ガンを含む疾患、又は、例えば、同定の薬剤に対する抵抗性を含むことができる。
【００９８】
異なって処理された、例えば、（遺伝子発現改変処理の突然変異誘発が行われる前、同誘発後、又は同誘発と同時に）種々の形態のストレス又は化合物に供された種々の細胞プールも使用することができ、本発明の方法において比較することができる。
【００９９】
本発明の方法は、薬剤に対する細胞の応答、及び、遺伝要素が薬剤（例えば、ストレス経路を誘引し、又は、タンパク質のリン酸化を誘引する薬剤）に対する応答に関連する所定の表現型にどのように関与するのかを研究するのにも使用することができる。例えば、所定の薬剤は、同定のタンパク質のリン酸化の阻害を引き起こすのが公知である場合がある。細胞を薬剤に曝し、本発明の方法を行うことにより、例えば、前記タンパク質のリン酸化阻害を克服するのに関与するか、又は、同阻害に関与する遺伝要素を同定することができる。
【０１００】
本発明の方法について、一部の実施態様では、同じ細胞プールを、突然変異誘発処理に供する。突然変異誘発処理は、１つの同じ細胞プールに、多くの種類の変異（ランダム又はターゲットティング）を生じさせる処理である。すなわち、個々の細胞が数においてのみではなく、変異位置に関しても、種々の変異を含む細胞プールが得られる。本発明の方法により、この異種性の細胞プールから、対象となる表現型を現すこれらの細胞を同定し、次に、形質（又は表現型）に影響を及ぼす（又は、同形質を生じさせる）のを担う遺伝要素を同定するのが可能となる。
【０１０１】
本発明の好ましい実施態様では、細胞を固定する固定試薬は、架橋試薬、好ましくは、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、及びグルタルアルデヒド、又は、非架橋試薬、好ましくは、塩化第二水銀系固定剤、エタノール、メタノール、もしくはアセトンからなる群より選択される。
【０１０２】
本発明の方法に使用される固定試薬は、ゲノムＤＮＡ／ＲＮＡをその後に可溶化することができ、配列分析（同分析は、更なるＤＮＡ増幅工程を含んでもよいし、又は、含まなくてもよい）に使用することができる限り、任意の種類の適切な固定試薬であることができる。ただし、好ましい材料は、架橋試薬、好ましくは、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、及びグルタルアルデヒド、又は、非架橋試薬、好ましくは、塩化第二水銀系固定剤、エタノール、メタノール、もしくはアセトンを含む。
【０１０３】
好ましくは、透過試薬は、溶媒、好ましくは、メタノール及びアセトン、又は、界面活性剤、好ましくは、サポニン、ジギトニン、Triton X-100、及びTween-20からなる群より選択される。本発明の文脈内において、当業者であれば、細胞プールを固定し、透過させるのに適した方法に十分知っている。
【０１０４】
検出可能なプローブは、表現型又はその要素を検出するのに使用することができる、任意の種類のプローブであることができる。好ましくは、検出可能なプローブは、タンパク質、翻訳後修飾タンパク質、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡに結合し、又は、代謝産物もしくは細胞要素に結合し、もしくは、これらを検出する。すなわち、ＲＮＡ、タンパク質、タンパク質修飾（例えば、ユビキチン、メチル基、脂質による修飾等）、ＲＮＡ修飾、ＤＮＡ修飾、又は任意の代謝産物を検出することができ、これらを検出するのに使用することができる任意のプローブは、本発明の方法に使用するのに適していることができる。
【０１０５】
例えば、好ましい実施態様では、プローブは、抗体、好ましくは、ラベル抗体（好ましくは、蛍光ラベルによる）、又は、このようなラベルを含む更なる抗体により検出することができる抗体である。抗体は、ホスホ特異的抗体（例えば、リン酸化版のタンパク質にのみ結合する抗体）であることもできる。検出可能なプローブは、リガンドに対するレセプター又はレセプターに対するリガンドであることもできる。検出可能なプローブは、細胞中のターゲット（ＤＮＡ又はＲＮＡ）に対する配列相補性に基づいて特異的にハイブリダイズするであろう核酸であることもできる。上記されたように、抗体模倣物を含む他の有用なプローブも利用することができる。
【０１０６】
本文脈において細胞要素という用語は、遺伝要素ではない細胞中の任意の他の要素を意味し、細胞中に存在するタンパク質、脂質、ならびに糖及び炭水化物を含むが、これらに限定されず、また、細胞、小器官、又は膜に存在する代謝産物及び生体分子も含む。
【０１０７】
細胞をソートする任意の適切な方法は、本発明の方法に使用されるプローブを検出するのに使用することができる限り、本発明の方法に利用することができる。好ましい実施態様では、ソートは、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ分析、質量サイトメトリー、及び／又は磁性ソートによる。
【０１０８】
好ましくは、本発明の方法に使用されるプローブは、好ましくは、蛍光部分、放射性部分、磁性部分、又は質量分光法を使用して測定することができるラベルから選択される検出部分を含む。このようなラベル及びその使用は、当業者に周知である。
【０１０９】
本発明の方法の好ましい実施態様では、本方法は、細胞質ゾル中、小器官内部、小器官の膜中、又は、細胞膜中、好ましくは、細胞膜の内側層上に現れる表現型に使用される。
【０１１０】
好ましくは、表現型は、プローブによる表現型の検出を可能にするために、細胞の透過を必要とする表現型である。
【０１１１】
本発明の方法は、任意の種類の表現型に使用することができる。好ましくは、表現型は、タンパク質量の増大、タンパク質量の減少、タンパク質活性の上昇、タンパク質活性の低下、タンパク質の翻訳後修飾の増大、タンパク質の翻訳後発現の減少、ｍＲＮＡ量の増大、又はｍＲＮＡ量の減少であるか、又は、これらに関与する。
【０１１２】
別の態様では、細胞の表現型に影響を及ぼす候補遺伝子によりコードされる（内在性）遺伝子産物のモデュレーター、例えば、阻害剤又は活性剤を同定するための方法であって、ここで好ましくは、前記表現型は、細胞内に現れ（又は、細胞内において検出され、存在し）、
（ａ）細胞プールを、突然変異誘発処理に供する工程と、
（ｂ）細胞プールを、好ましくは、固定試薬、及び場合により、架橋剤により固定し、細胞プールを、好ましくは、透過試薬により透過させる工程と、
（ｃ）細胞プールを、１つ以上の検出可能なプローブ、好ましくは、抗体又は（蛍光）ＲＮＡプローブにより処理して、影響を受けた（又は現れた）表現型を検出する工程と、
（ｄ）１つ以上の検出可能なプローブの内の少なくとも１つの検出に基づいて、細胞をソートして、１つ以上の細胞集団を得る工程と、
（ｅ）場合により、得られた各細胞集団の細胞を脱架橋させる工程と、
（ｆ）得られた細胞集団の少なくとも一部の細胞の少なくとも一部を配列決定して、細胞の表現型に影響を及ぼす遺伝要素を同定する工程であって、遺伝要素は、候補遺伝子である工程と、
（ｇ）細胞の表現型に影響を及ぼす前記同定された候補遺伝子の発現又は発現産物の活性に影響を及ぼすモデュレーターを同定する工程と、
を含む、方法が提供される。
【０１１３】
本発明の方法について、所定の表現型に影響を及ぼす遺伝要素を同定することができる。遺伝要素に基づいて、対応する細胞要素、例えば、活性、発現、又は量が同定された遺伝要素（例えば、遺伝要素は、タンパク質をコードする遺伝子である）によりモデュレーションされるタンパク質を認識することができる。次に、同定された候補遺伝子の遺伝子産物（例えば、タンパク質）の活性のモデュレーターを、スクリーニングアッセイ法を使用して同定することができる。モデュレーターは、例えば、遺伝子産物の発現に直接影響を及ぼす場合があり、又は、タンパク質の活性をモデュレーションする場合があり、又は、タンパク質の破壊もしくは翻訳後処理をモデュレーションする場合がある。
【０１１４】
本明細書で記載された方法は、種々の目的で使用することができる。好ましくは、本方法は、生体経路を確立し、もしくは、分析するのに、疾患、好ましくは、ガンに関与する遺伝子を同定するのに、薬剤−ターゲット相互作用を研究するのに、薬剤−薬剤相互作用を研究するのに、又は、表現型（ここで好ましくは、表現型は、疾患に関連する表現型である）のサプレッションもしくはモデュレーションを分析するのに使用される。本明細書における開示を考慮して、当業者であれば、本発明の方法を上記所定の目的についてどのようにして使用することができるかを理解する。
【０１１５】
モデュレーターは、任意の種類の化合物であることができる。同化合物は、有機又は無機化合物、候補薬剤等を含む。
【０１１６】
本発明の方法が、遺伝要素の同定のみを可能にするものではなく、その結果として、遺伝要素に関連するか、又は、対応する細胞要素の同定をも可能することは、当業者に明らかである。例えば、同定された遺伝要素に基づいて、対応するタンパク質もしくは酵素、又は、関連する遺伝要素（例えば、プロモーター及び遺伝子）、又は更に、２つ以上のタンパク質を含む経路を同定することができる。
【０１１７】
本発明の方法は、当技術分野における方法を上回る多くの利点を示し、本明細書で例示されたように、従来技術の方法によっては同定することができなかった遺伝要素の同定（例えば、疾患サプレッションについてのターゲットの同定を含む）を可能にする（図１６を参照のこと）。このアプローチの利点の１つは、本方法が、表現型をゲノム中の実際の変異に直接結び付け（又は定量的な生体分子測定）、数百万種類の遺伝型を有する数百万の細胞を使用して行うことができることである。本方法は、固定され、もはや変異ゲノム数を増大させるように増殖することができない細胞において行うことができ、これにより、例えば、細胞内に存在する表現型の分析が可能となる。一実施態様において、これは、例えば、遺伝子トラップ又は同等の挿入突然変異誘発系アプローチを使用することにより達成される。例えば、遺伝子トラップを使用する場合、組換えが、ゲノム全体にわたって生じ、影響を受けた隣接するＤＮＡ配列を回収するための２つの特異的なプライマー配列を設計することができない。ただし、これは、開発された方法により達成することができる。ここでは、非常にわずかな細胞から、及び更に、固定され、透過された個々の細胞からの遺伝子トラップ挿入部位の回収を可能にする最適化ＬＡＭ−ＰＣＲプロトコールが開発された。感受性を十分に回復させる工程は、例えば、二重ビオチン化補足プライマー、Accurprimeポリメラーゼ、一本鎖ＤＮＡもライゲーションすることができるリコンビナントＲＮＡリガーゼの使用、ならびに、配列最適化プレアデニル化リンカーの使用である。このアプローチは、このような遺伝子トラップ及び同等の挿入突然変異誘発法に十分機能する。例えば、このアプローチは、突然変異誘発のためにプールされたＣＲＩＳＰＲライブラリを使用することによっても機能する。ただし、遺伝子トラップの使用が好ましい。ゲノム中の変異を表現型に直接結び付けることは、精度（以下を参照のこと）及びシグナル強度を向上させる。
【０１１８】
本発明の方法の更なる利点は、多くの遺伝子について、数百又は数千の変異を、個々の遺伝子当たりに測定することができることである。これにより、個々の遺伝子において、変異の頻度をカウントすることができる。カウントを使用することができるため、各変異の量（又は、遺伝子攪乱剤、例えば、ｓｈＲＮＡ又はＣＲＩＳＰＲ）を測定する必要がない。複雑なライブラリの各成分の量を測定することは、ＰＣＲ増幅により導入された変異のために、限られた量の生体材料では困難である。開発された方法では、変異が回収される頻度は無視されるが、個々の遺伝子における変異数はカウントされ、比較される。ここで、種々の表現型状態が比較される場合（例えば、多量のＬＡＭＰ１タンパク質を有する細胞対少量のＬＡＭＰ１タンパク質を有する細胞）、再度、これにより、非常に低い偽陽性結果を伴って、表現型に影響を及ぼす遺伝子の同定がもたらされる。
【０１１９】
この変異スペクトルの定量的性質及び大部分のヒットがノイズにより生じないという事実により、変異スペクトルを表現型の強度（多く／少ない生体分子）に対して、種々の表現型（例えば、アセチル化もしくはトリメチル化リシン残基の生体生成に必要とされる遺伝子）間、又は、遺伝子型（表現型の遺伝子型特異的サプレッサー又はエンハンサー）間で比較することができる。最後に、多くの種類の表現型リードアウトを比較することにより、遺伝子を、その表現型出力に基づいてクラスタリングすることができる。このため、変異スペクトルの比較可能な分析により、生物学的表現型を研究し、比較するための新たな方法が容易となる。重要なことは、これは、著しい量のノイズを報告し、ノイズからリアルなヒットを分離するめの相当な追従実験を必要とするアプローチを使用する場合には、現実的ではないであろう。
【０１２０】
最後に、変異スペクトルを直接比較することができるため、野生型及び変異細胞における比較可能なスクリーニングは、遺伝型特異的表現型エンハンサー又はサプレッサーを指摘することができる。重要なことは、対象となる遺伝型がヒト疾患（例えば、遺伝性疾患又は体細胞性ＤＮＡ変異により引き起こされる疾患）に関連する場合、これは、疾患サプレッションのためのターゲットを指摘することができる。これは、阻害される場合、疾患に対して保護する遺伝子産物を同定するのに使用することができる。このようなターゲットに作用するように開発された薬剤は、疾患をサプレッションするのに使用することができる（図１６を参照のこと）。本明細書において、本発明が完全に記載されているが、当業者であれば、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、過度の試行錯誤をすることなく、同じものを、同等のパラメーター、濃度、及び条件の広い範囲内で行うことができることを、理解するであろう。
【０１２１】
本発明は、その同定の実施態様に関して記載されているが、更なる修飾が可能であることが理解されるであろう。本願は、一般的には、本発明の原理に沿って、本発明が属する分野内の公知又は慣例的な実務に入るように、かつ、添付の特許請求の範囲に沿って説明された前述の本質的な特徴に適用することができるように、本開示からのこのような逸脱を含めた、本発明の任意の変形例、使用、又は採用に及ぶことを意図している。
【０１２２】
本明細書で引用された全ての参考文献（科学文献もしくは要約集、公開されもしくは対応する米国もしくは外国の特許出願、発効された米国もしくは外国の特許、又は、任意の他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。これらには、引用された参考文献中に存在するデータ、表、図面、及び文書の全てを含む。加えて、本明細書で引用された参考文献内で引用された参考文献の内容全体も、参照により組み入れられる。
【０１２３】
公知の方法の工程、従来法の工程、公知の方法、又は従来法への言及は、本発明の任意の態様、説明、又は実施態様が、関連する技術分野において、開示され、教示され、又は、示唆されていることを何ら認めるものではない。
【０１２４】
具体的な実施態様の前述の説明は、本発明の全体的な性質を完全に証明するであろう。他のものは、当業者の知識（本明細書で引用された参考文献の内容を含む）を適用することにより、過度の試行錯誤をすることなく、本発明の全体的な概念から逸脱することなく、このような具体的な実施態様を容易に修飾することができ、及び／又は、このような具体的な実施態様を種々の用途に採用することができる。したがって、このような採用及び修飾は、本明細書で表わされた教示及びガイダンスに基づいて、開示された実施態様の均等の意味及び範囲内であることを意図している。
【０１２５】
本明細書における表現法又は専門用語は、説明を目的とするものであり、限定するものではないことを理解されたい。このため、本明細書の専門用語又は表現法は、本明細書で表わされた教示及びガイダンスを考慮して、当業者により、当業者に知識と組み合わせて解釈されるべきである。
【実施例】
【０１２６】
方法
ＨＡＰ１細胞（例えば、Carette et al. (2011). Nature, 477(7364), 340-3. doi:10.1038/nature10348に記載；www.horizon-genomics.com/hap1-wildtype.htmlから入手可能）の突然変異誘発に必要とされる遺伝子トラップレトロウイルスを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中において、以前に記載された（Jae et al., Science 2013 340(6131):479-83）遺伝子トラップベクターを使用して生成した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）に交換されている、類似の遺伝子トラップレトロウイルスを使用した。
【０１２７】
細胞を、１２本のＴ１７５フラスコに、４０％コンフルエントで播種した。翌日、培地を、３０％ ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を加えたＤＭＥＭで置き換えた。その後、Ｔ１７５フラスコ当たりに、６．６ミマイクログラム 遺伝子トラッププラスミドにより、パッケージプラスミドＧａｇ−ｐｏｌ、ＶＳＶｇ、及びｐＡｄｖ（Carette et al., Science 2009 326(5957):1231-1235）との組み合わせにおいてトランスフェクションした。培地を、トランスフェクション後４８時間で収集し、その後、２１，０００rpm、４℃での超遠心分離により２時間濃縮した。上清を廃棄し、ペレットを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、life technologies） ２００マイクロリットル中に、４℃で一晩再懸濁させた。レトロウイルス含有培地を収集し、１日２回、３日間濃縮した。
【０１２８】
突然変異誘発させたＨＡＰ１細胞集団を生じさせるために、４０００万個 ＨＡＰ１細胞を播種し、８マイクログラム/ml プロタミンスルファート（Sigma）の存在下において、２つの組み合わせた収集物からの遺伝子トラップレトロウイルスにより、３日間連続で形質導入した。その後に、変異ライブラリを、最大１０日間増殖させた。その後、細胞内表現型を、ＦＡＣＳ染色により分析した。
【０１２９】
遺伝子スクリーニングのために、突然変異誘発させたＨＡＰ１ライブラリを、３×１０９個に増殖させ、トリプシン−ＥＤＴＡ（Life technologies）を使用して解離させ、その後、ＢＤ固定バッファーＩ（BD biosciences）を使用して、３７℃で１０分間固定した。１％ ＦＣＳを含有するＰＢＳによる洗浄後、細胞を、冷えた（−２０℃）ＢＤ透過バッファー（BD biosciences）中において、ボルテックスしながら懸濁させることより透過させ、氷上で３０分間インキュベーションした。
【０１３０】
ＰＢＳ／１％ ＦＣＳ中で２回洗浄した後、細胞を、４０マイクロメートル ストレナー（BD Falcon TM）を通してろ過した。染色を、１０７個当たりに１００マイクロリットル中で、特異的な一次抗体（１：２００〜１：４００）により、室温で１時間行った。細胞を、洗浄バッファー（ＰＢＳ／１％ ＦＣＳ）中で２回洗浄し、二次抗体（ALEXA488、568、又は647抗体、Life Technologies）により、暗所で１時間染色した。
【０１３１】
加えて、遺伝子トラップ組換えを有するアレルについてヘテロ接合性の二倍体細胞の潜在的な交絡作用を最小化するために、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）含量を、３マイクロM ４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）又は１０マイクログラム/ml ヨウ化プロピジウム（Life Technologies）溶液のいずれかを使用して染色した。後者の場合には、細胞を、１００マイクログラム/ml ＲＮＡｓｅ  Ａ（Qiagen）によっても、室温で１時間処理した。
【０１３２】
核区画（例えば、ヒストン修飾）中を染色する抗体について、細胞を、固定／透過バッファー（eBioscience）により、暗所において、室温で１時間固定した。５％ ＦＣＳを含有する透過バッファー中で２回洗浄した後、細胞を、２M ＨＣｌ中で再懸濁させ、室温で３０分間インキュベーションして、細胞を凝集させ、ＤＮＡを変性させた。それにより、細胞懸濁液を、穏やかに混合した。中和のために、細胞を、０．１M Ｎａ２Ｂ４Ｏ７（ｐＨ＝８．５）により洗浄し、５％ ＦＣＳを含有する透過バッファー（eBioscience）中の一次抗体（１０７個 細胞当たりに１００マイクロリットル；１：２００〜１：４００）により染色した。室温で１時間後、細胞を洗浄し、（５％ ＦＣＳを含有する透過バッファー（eBioscience）中において）二次抗体により、暗所において、室温で１時間染色した。最後の洗浄工程を、ＰＢＳ／１％ ＦＣＳ中で行った。
【０１３３】
染色後、細胞を、Biorad S3セルソーター（ＤＮＡ含量を測定するための組み合わせ：ＢＦＰ遺伝子トラップ、Alexa488二次抗体、ＰＩ）又はAstrios Moflo（ＤＮＡ含量を測定するための組み合わせ：ＧＦＰ遺伝子トラップ、Alexa488、568、又は647抗体、ＤＡＰＩ）のいずれかにおいて、対象となるシグナル（照会抗体について、約１〜５％ 最高及び最低染色集団）及びＤＮＡ含量（１ｎ）に基づいてソートした。
【０１３４】
ソートされた細胞を、遠心分離（２５００rpm、１０分）によりペレットにした。ゲノムＤＮＡを、Qiagen DNA miniキットを使用して単離した。脱架橋を促進するために、ペレットを、ＰＢＳ（２００マイクロリットル/１０００万個 細胞）中で再懸濁させ、Proteinase K（Qiagen）及び溶解バッファー（バッファーＡＬ、Qiagen）を加えた後、振とうしながら、５６℃で一晩インキュベーションした。翌日、ＤＮＡを、製造メーカーの仕様書に従って単離し、Nanodrop2000分光計（Thermo fisher）により測定した。
【０１３５】
挿入部位を、Linear Amplificationポリメラーゼ連鎖反応（ＬＡＭ−ＰＣＲ）を使用し、総ゲノムＤＮＡ（０．５〜２マイクログラム/反応）を使用して増幅させた。ここで、各反応（ｒｘｎ） ５０マイクロリットルには、１mM ＭｇＳＯ４、０．７５pmol 二重ビオチン化プライマー（5’-二重ビオチン/ggtctccaaatctcggtggaac-3'）（配列番号：１）、Accuprime Taq HiFi（０．４マイクロリットル/ｒｘｎ）、及び供給されたバッファーＩＩ（Life technologies）が含有される。反応を、アニーリング温度５８℃で３０秒間、及び、伸張温度６８℃で６０秒間による１２０サイクルで行った。ビオチン化一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）生成物を補足するために、ＰＣＲ反応物を、Ｍ２７０ストレプトアビジンコート磁性ビーズ（Life technologies）と、２×結合バッファー（６M ＬｉＣｌ、１０mM Ｔｒｉｓ、１mM ＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．５）中において、室温で２時間結合させ、その後、磁石を使用して補足した。結合前に、ビーズを、１．５ml ノンスチックチューブ（Life technologies）中の、０．１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ中において、１回洗浄した。磁性沈殿後、ビーズを、０．０５％ Triton X-100（Sigma）を含有するＰＢＳで３回洗浄した。その後、リンカーをライゲーションした。
【０１３６】
ｓｓＤＮＡリンカー（5'/ホスホ/atcgtatgccgtcttctgcttgactcagtagttgtgcgatggattgatg/ジデオキシシチジン/3'）（配列番号：２）を、２．５mM ＭｎＣｈ、１M ベタイン、１２．５pmol リンカー、Circligase II（Illumina）バッファー １マイクロリットル及び０．５マイクロリットル、ならびに酵素それぞれを含有する、反応Ｎ×１０μl中において、ビオチン化生成物の３’端にライゲーションした。ここで、Ｎ＝ＬＡＭ−ＰＣＲ反応数。あるいは、プレアデニル化リンカー（5'/アデニル/atcgtatgccgtcttctgcttgactcagtagttgtgcgatggattgatg/ジデオキシシチジン/3'）（配列番号：３）を、Thermus scotoductusバクテリオファージ由来のE coli精製ＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼ１（Blondal et al, Nucleic Acid Research 2005, 33(1) 135-142、国際公開公報第２０１０／０９４０４０号）を使用して、１２．５pmol アデニル化リンカー、１８．７５％ ＰＥＧ６０００、２．５マイクログラム ＢＳＡ、２．５mM ＭｎＣｈ、バッファー（５００mM ＭＯＰＳ、１００mM ＫＣｌ、５０mM ＭｇＣｌ２、１０mM ジチオスレイトール（ＤＴＴ）） １マイクロリットル、及び２マイクログラム ＲＮＡリガーゼを含有する反応 Ｎ×１０マイクロリットル中において、一本鎖増幅ＤＮＡ産物にライゲーションした。全てのライゲーション反応を、ノンスチック１．５mlチューブ（Life technologies）中において、６０℃で２時間行い、続けて、室温で２０分のインキュベーション後、０．０５％ Triton X-100（Sigma）を含むＰＢＳで３回洗浄した。その後、２５pmol 各プライマー、バッファーＩＩ ５マイクロリットル、及びAccuprime Taq HiFi（Life technologies） ０．６マイクロリットルを含有する反応 Ｎ×５０マイクロリットル中に、Illuminaシーケンシングに必要なアダプター配列（Ｐ５及びＰ７）を導入したＰＣＲ反応を行った（ここで、Ｎ＝０．５×ＬＡＭ−ＰＣＲ反応数）。
【０１３７】
この最終的な増幅を、アニーリング温度５５℃で３０秒のアニーリング、続けて、プイマー：5'-aatgatacggcgaccaccgagatctgatggttctctagcttgcc-3'（配列番号：４）及び5'-caagcagaagacggcatacga-3'（配列番号：５）を使用する１０５秒間の伸張（６８℃）の１８サイクルを使用して行った。
【０１３８】
生成物を精製し（ＰＣＲ精製キット、Qiagen）、５１bp シングルリード（１８ピコモル濃度 ローディング濃度）として、Illumina HiSeq2000（Illumina）又はHiSeq2500（Illumina）において、シーケンシングプライマー5'-ctagcttgccaaacctacaggtggggtctttca-3'（配列番号：６）を使用して配列決定した。
【０１３９】
ディープシーケンシングにより、高及び低ソート細胞内表現型集団の両方について、遺伝子トラップ挿入部位を、ボウタイ（Langmead et al., Genome Biol 2009, 10:R25）を使用するシングルミスマッチの有無で、ヒトゲノム（ｈｇ１９）に対して固有にアニーリングするリードとして同定した。アライメントされたリードを、intersectBED（Quinlan and Hall, Bioinformatics 2010, 26 (6): 841-842）を使用して、ｈｇ１９遺伝子座標とインターセクションさせて、ゲノム内挿入部位及び遺伝子に対するその配向を確立した。この分析の目的で、ゲノム内にセンスで組込まれた挿入部位は、破壊されていると考えられた。対向するコード鎖についてのオーバーラップ遺伝子について、固有の領域のみを考慮した。加えて、同じコード鎖を使用するオーバーラップ遺伝子について、遺伝子名を連結させた。いずれかの照会集団において、破壊的遺伝子トラップ組込みについて濃縮された遺伝子を同定するために、各遺伝子における破壊的挿入部位数及び１つの集団（例えば、高シグナル）の全体数を、他の集団（例えば、低シグナル）におけるそれらの値と、一側フィッシャー直接検定及びその逆を使用して比較した。得られたＰ値を、Benjamini and Hochberg  ＦＤＲ相関を使用して、多重検定について調節した。フィッシュテールプロットを、２つの集団における総組込み数により正規化された両集団における遺伝子当たりの破壊的組込み数（ｙ軸にプロット）と、高及び低集団の両方において同定された破壊的組込みの合計（ｘ軸にプロット）との比を算出することにより生成した。
【０１４０】
遺伝子ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系スクリーニングについて、レンチウイルスGeCKOライブラリ（バージョン１及びバージョン２）を、Zhang lab through Addgene（Shalem et al., 2014 Science, 343(6166), 84-87. doi:10.1126/science.1247005；www.addgene.org/crispr/libraries/geckov2/）から得た。このライブラリを、E. Coli中で増幅させた。ＤＮＡを、製造メーカーの説明（QIAgen）に従って精製した。ライブラリの複雑性を、ディープシーケンシングにより確認した（回収率９８％超）。レンチウイルスを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中において、適切なパッケージプラスミドを使用して生じさせた。ウイルスを、数日で収集し、Beckmann SW28ローター（２１，０００rpm、４℃で２時間）においてペレット化した。ウイルスを、５０mM ＨＥＰＥＳを加えた完全な培地中に再懸濁させ、−８０℃において、アリコートで凍結させた。ウイルス力価測定後、１億個 ＨＡＰ１細胞に、レンチウイルスライブラリを形質導入し、０．７５マイクログラム/ml ピューロマイシンにより、感染後２日間で選択した。抵抗性細胞を、６〜８日間増殖させた。その後、細胞を、バイアル当たりに５０００万個 細胞のアリコートで凍結させた。１回のスクリーニングについて、複数のアリコートを融解し、複数のＴ１７５フラスコ中に播種した。細胞を、７日の培養（目標±１．１０９細胞）後に固定し、透過させ、上記された抗体染色及びソートについて処理した。ソートされた細胞集団のディープシーケンシング及びデータ分析を、Shalem et al. 2014に記載されたように、小さな変更を加えて行った。単離されたゲノムＤＮＡからライブラリを増幅するための最初のＰＣＲに使用されたプライマー：5'-AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG-3'（配列番号：７）及び5'-CTTTAGTTTGTATGTCTGTTGCTATTATGTCTACTATTCTTCC-3'（配列番号：８）。ＰＣＲ１の生成物についての２番目のネステッドＰＣＲ２用：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNtcttgtggaaaggacgaaacaccg-3'（配列番号：９）及び5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTtctactattctttcccctgcactgt-3'（配列番号：１０）。
【０１４１】
ＫＣＴＤ５ノックアウト細胞の発生
ＨａｐＩ：ＫＣＴＤ５（ＫＣＴＤ５＃１  5'-caccGAGGTGCCGCCGACGTTGAGT-3'（配列番号：１１）及びＫＣＴＤ５＃２  5'-caccGGACGTTGAGTCGGACCCACT-3'）（配列番号：１２）をターゲッティングするＣＲＩＳＰＲを設計し、px330（Cong et al. Science. 2013, PMID: 23287718）中でクローニングした。ＨＡＰ１細胞を、Zebrafish ＴＩＡ遺伝子に対するガイドＲＮＡ（5'-ggtatgtcgggaacctctcc-3'）（配列番号：１３）及び、２つのＴＩＡターゲット部位に隣接する、２Ａ配列、続けて、ブラスチシジン抵抗性遺伝子のカセットを含有するベクターに加えて、１つのpx330ベクターによりトランスフェクションした。px330による共トランスフェクションにより、プラスミドからのカセットの切除、及び、（Maresca et al, Genome Res. 2013 Mar;23(3):539-46に記載されたのと同様の）非相同的端部結合によるターゲッティングされたゲノム座の部位における、その後の散発性組込みがもたらされる。ターゲッティングされた遺伝子へのカセットの組込みの成功により、アレルが破壊され、細胞がブラスチシジン抵抗性になり、変異位置にタグが提供される。トランスフェクション後４日で、培養培地に、ブラスチシジン（１０マイクログラム/ml）を加えた。生存しているコロニーを、クローン性に増殖させた。
【０１４２】
ＨＥＫ２９３Ｔ：ＫＣＴＤ５（ＫＣＴＤ５＃３  5'-caccGAGGATTTCGGGTCCCGGCAC-3'）（配列番号：１４）をターゲッティングする、更なるＣＲＩＳＰＲを設計し、px330中でクローニングした。細胞を、ＣＲＩＳＰＲ  ＫＣＴＤ５＃３及びＣＲＩＳＰＲ  ＫＣＴＤ５＃１又はＣＲＩＳＰＲ  ＫＣＴＤ５＃３及びＣＲＩＳＰＲ  ＫＣＴＤ５＃２によりトランスフェクションし、pMX-ires-Blastにより共トランスフェクションした。２つのＣＲＩＳＰＲの共トランスフェクションにより、遺伝子中の２箇所において、二本鎖破壊がもたらされ、ゲノム領域の欠失がもたらされるであろう。トランスフェクション選択を、ブラスチシジン（８０マイクログラム/ml）を使用して、２日間行った。生存しているコロニーを、クローン性に増殖させ、遺伝子型を同定した。
【０１４３】
【表１】
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【０１４４】
結果及び検討
行われた種々の実験結果を、図に示す。
【０１４５】
図１に、パラホルムアルデヒドにより固定されているＨＡＰ１細胞の突然変異誘発集団における遺伝子スクリーニングの結果を示す。以前に（Jae et al, Science, 2013）、グリコシル化ジストログリカンを細胞表面において認識する抗体が、細胞表面において各抗原を失った変異体を濃縮するのに使用された。生きている細胞をソートし、培養中で増殖させ、遺伝子トラップ挿入部位のディープシーケンシングに供した（図１Ａ）。（Jae et al, 2013で公表された）図１Ｂにおいて、可変的に選択された細胞集団中の変異について濃縮された遺伝子を示すプロットが示される。アルファ−ジストログリカンのグリコシル化に必要な遺伝子を同定した。図１Ｃ及び図１Ｄに、本発明の方法による結果を示す。同じ抗体染色を、上記されたように行ったが、ここでは、パラホルムアルデヒドにより固定された細胞について行った。この場合、死んだ細胞を、（加熱により）直接脱架橋に供し、ゲノムＤＮＡを、生きている細胞内のゲノムを何ら予め増幅することなく単離した。固定された非増殖細胞からの遺伝子トラップ組込み部位の回収により、ＬＡＭ  ＰＣＲ増幅されたＤＮＡの典型的なスメアが生成される。遺伝子トラップ変異を、ディープシーケンシングを使用して同定し、遺伝子を、破壊的変異の濃縮について分析した。これらの結果から、固定された非増殖性の細胞も、アルファ−ジストログリカンのグリコシル化に必要な遺伝子の同定に適したソースであることが示される。この実験から、生きている細胞に以前に行われたスクリーニングを、表現型実験時に固定され、生きていない細胞集団に再現することができることが証明される。この実験から、個々の固定された変異細胞を、ゲノム変異（遺伝子トラップ挿入）を回収し、配列決定するためのソースとして使用することができることが、更に証明される。
【０１４６】
図２に、突然変異誘発細胞プールの表現型分離及び遺伝子トラップ挿入部位の配列決定を示す。図２Ａに、レトロウイルス遺伝子トラップを使用して突然変異誘発された一倍体又は一倍体に近い細胞集団をどのようにして固定し、透過させ、その後に、ホスホ−ＡＫＴ（セリン４７３）に指向性を有する抗体を使用して蛍光ラベルするかを示す。図２Ｂに、固定され、透過され、ホスホ−ＡＫＴについて染色された細胞を、どのようにして、フローサイトメトリーを使用して分離し、高い又は低い（最高／最低１〜５％ 総集団）ＡＫＴリン酸化を示すプールを濃縮するのかを示す。その後、ゲノムＤＮＡを、両細胞集団から単離し、遺伝子トラップ挿入部位をマッピングするのに使用した。図２Ｃに、ＡＫＴの公知のネガティブレギュレーター（ＩＮＰＰ４Ａ）において検出された破壊的遺伝子トラップ挿入の頻度を示すプロットを示す（左（低ホスホＡＫＴ）細胞集団及び右（高ホスホＡＫＴ）細胞集団）。プロットから、ＩＮＰＰ４Ａについての変異を「高」ホスホＡＫＴシグナルを有する細胞集団において濃縮したことが示される。この実験から、本発明の方法を使用して、差動的なＡＫＴリン酸化について選択された突然変異誘発細胞集団を、照会された細胞内表現型の公知のレギュレーターにおける変異について濃縮し、又は、枯渇させることが証明される。
【０１４７】
図３に、ＡＫＴリン酸化のレギュレーターを同定するためのゲノムワイド突然変異誘発スクリーニングを示す。図３Ａに、ＰＩＰ３シグナル伝達によるＡＫＴリン酸化をもたらす経路及びｍＴＯＲ複合体ＩＩ（ｍＴＯＲＣＩＩ）の模式的概略を示す。図３Ｂに、「低」集団と比較した、ホスホＡＫＴ「高」集団における遺伝子当たりの遺伝子トラップ変異の相対数を示すプロットを示す。ＡＫＴリン酸化に影響を及ぼさない遺伝子が、「高」及び「艇」集団（集団の最高／最低１〜５％）において、比較可能な頻度で変異していることが見出される。変異した場合、ＡＫＴリン酸化に影響を及ぼす遺伝子は、高集団対低集団におけるその変異頻度に顕著な変化を示す。その経路の公知のレギュレーター（例えば、ＰＴＥＮ、ＬＳＴ８、ＳＩＮ１）が同定される（ネガティブ及びポジティブレギュレーターの両方）。この実験から、別々の細胞集団における変異頻度を、ゲノムワイドに実験することができ、ＡＫＴ経路の公知のポジティブ及びネガティブレギュレーターの同定をもたらすことができることが示される。重要なことに、数多くの新たな因子が、その変異頻度において顕著なバイアスを示す（暗灰色ドット）ため、ＡＫＴリン酸化に結び付けられる。
【０１４８】
図４に、ＫＣＴＤ５が、ＡＫＴリン酸化に影響を及ぼすことを示す。図４Ａに、本発明の方法によるＡＫＴレギュレーターについてのゲノムワイドスクリーニングより、有意なはずれ値としてＫＣＴＤ５が同定されたことを示す。図４Ｂに、ＣＲＩＳＰＲを使用するＨＡＰ１細胞におけるＫＣＴＤ５の機能喪失変異により、ＡＫＴリン酸化の増大がもたらされることを示す。図４Ｃに、ＫＣＴＤ５についてのＣＲＩＳＰＲ発生ノックアウト細胞が、フローサイトメトリーにより実験された場合、ホスホＡＫＴについての増大した染色を示すことを示す。図４Ｃに、ＣＲＩＳＰＲ発生ノックアウト細胞におけるＫＣＴＤ５発現の回復により、ＡＫＴリン酸化が正常化されることを示す。これらの実験から、ＡＫＴリン酸化の新たなレギュレーターを同定することができ、ＣＲＩＳＰＲ発生遺伝子不活性化及びウェスタンブロット分析を使用して検証することができることが証明される。これにより、ＷＤ４０リピートＥ３リガーゼＫＣＴＤ５は、ＡＫＴリン酸化の新たなレギュレーターであることが証明される。
【０１４９】
図５に、本発明のスクリーニング法が、シグナル強度に基づいて、細胞集団を可視化することができ、同細胞集団を分離するのに使用することができる、任意の細胞内表現型に適していることを示す。例えば、一倍体突然変異誘発細胞を使用するこのスクリーニング法は、原理上、ＦＡＣＳ等の分離法（例えば、総タンパク質抗体、翻訳後修飾抗体、又は、内在性ＲＮＡ分子の発現もしくは量を定量するラベルプローブを使用）により定量することができる、任意の細胞内形質に使用することができる。図に、スクリーニングアプローチに適用することができる細胞内表現型についての種々のリードアウトを列記する。
【０１５０】
図６に、ＩＲＦ１タンパク質レベル（タンパク質発現）についてのスクリーニング結果を示す。一倍体突然変異誘発細胞を、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）により処理して、ＩＲＦ−１発現を誘発した。２４時間後、細胞を、固定し、透過させ、ＩＲＦ−１について染色した。細胞をソートして、「高」又は「低」レベルのＩＲＦ１を示す集団について濃縮し、いずれかの細胞集団において濃縮された変異を同定するために、遺伝子トラップ挿入部位のディープシーケンシングに供した。また、ＩＲＦ−１転写をもたらすＩＦＮ−γシグナル伝達経路を示すスキームも示される。示されたようにラベルされた種々の遺伝子（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＩＲＦ１、及びＳＴＡＴ１）を、本発明の方法を利用して、スクリーニングにおいて同定した。この方法を使用することにより、ＩＦＮ−γシグナル伝達経路の成分を同定するのが可能となる。
【０１５１】
図７に、ＩカッパＢアルファ発現（タンパク質分解）についてのスクリーニングを示す。一倍体ＨＡＰ１細胞を突然変異誘発し、ＴＮＦ−ａにより３０分間処理した。特異的なＩカッパＢアルファ抗体による染色後、細胞をソートして、高及び低ＩカッパＢアルファ強度を有する集団を濃縮した。いずれかの細胞集団において濃縮された変異を同定するために、遺伝子トラップ挿入部位を配列決定した。また、スクリーニングにおいて同定されたＮＦＫＢシグナル伝達成分を示すスキームも示す。この実験から、ＮＦＫＢシグナル伝達経路において固定された細胞表現型スクリーニングの適用が証明される。ＮＦＫＢシグナル伝達の公知及び未知の修飾因子を同定することができた。
【０１５２】
図８に、ｐ３８リン酸化についてのスクリーニングを示す。一倍体突然変異誘発細胞を、アニソマイシンにより処理して、ｐ３８ａのリン酸化を誘引した。４時間後、細胞を固定し、透過させ、特異的なホスホｐ３８ａ抗体により染色した。細胞をソートして、「高」又は「低」レベルのホスホｐ３８を示す集団を濃縮した。ゲノムＤＮＡを、両細胞集団から単離し、ゲノムトラップ挿入部位をマッピングするのに使用した。また、スクリーニングにおいて同定された遺伝子によるＭＡＰＫシグナル伝達経路を示すスキームも示す。この実験から、ＭＡＰＫシグナル伝達経路における、本発明の固定細胞表現型スクリーニングの適用が証明される。公知の成分が同定されるが、ＲＮＡ代謝／スプライシングに関与する遺伝子、例えば、ＰＲＰＦ３９も同定される。
【０１５３】
図９に、照射された細胞におけるＤＮＡ損傷についてのスクリーニングを示す。一倍体突然変異誘発細胞を、電離放射線に曝し、固定し、透過させ、Ｈ２ＡＸリン酸化について染色した。スキームに例示されたように、ヒストンタンパク質であるＨ２ＡＸは、ＤＮＡ損傷に基づいてリン酸化される。細胞をソートして、「高」又は「低」レベルのＨ２ＡＸリン酸化を示す集団を濃縮し、遺伝子トラップ挿入部位のディープシーケンシングに供して、いずれかの細胞集団において濃縮された変異体を同定した。この実験から、ＤＮＡ損傷シグナル伝達を研究するための、生きていない透過された細胞における突然変異誘発スクリーニングの適用が証明される。より多くのＨ２ＡＸリン酸化を有する（ＤＮＡ損傷を示す）変異体は、核マトリックス、核孔、及びポリコーム経路に影響を及ぼす。このことは、ＤＮＡ損傷における核組織化についての重要な役割を示唆している。
【０１５４】
図１０に、ヒストンテイル修飾についてのスクリーニングを示す。一倍体突然変異誘発細胞を、固定し、透過させ、Ｈ３Ｋ２７トリメチル化について染色した。同トリメチル化は、転写リプレッションに関連している。細胞をソートして、「高」又は「低」レベルのＨ３Ｋ２７トリメチル化を示す集団を濃縮した。ゲノムＤＮＡを、両細胞集団から単離し、ゲノムトラップ挿入をマッピングするのに使用した。この実験から、本発明の方法により、Ｈ３Ｋ２７トリメチル化をレギュレーションする複合体の見識が与えられることが示される。ポリコームリプレッション複合体２は、この修飾の発生に必要であることが公知であり、ＥＺＨ２、ＳＵＺ１２、及びＥＥＤから構成される。これら成分は全て、スクリーニングにおいて同定された。
【０１５５】
図１１に、ＫＣＴＤ５が、どのようにしてＧＰＣＲシグナル伝達をモデュレーションするかを示す。図Ａ及びＢに、ＡＫＴレギュレーターについての２つのゲノムワイドスクリーニング（ＨＡＰ１ｗｔ細胞及びＫＣＴＤ５  ＫＯ細胞におけるスクリーニング）の比較を示し、ＫＣＴＤ５欠損細胞におけるＡＫＴリン酸化を活性化する経路を明らかにする。図１１Ｃに、ＣＰＣＲシグナル伝達についてのスキームを示す。同定された成分を強調する（ＧＮＢ１、ＧＮＢ２、ＧＮＧ５、ＧＮＧ７、ＰＤＬＣ）。図１１Ｄに、Ｅ３リガーゼＫＣＴＤ５により、ＧＮＢ１（グアニンヌクレオチド結合タンパク質ベータ−１）のタンパク質レベルの低下がもたらされることを示す。ヘテロ三量体Ｇタンパク質のサブユニットは、ＧＰＣＲシグナル伝達に関与する。ＫＣＴＤ５  ＫＯ細胞は、２９３野生型細胞と比較して、増大したＧＮＢ１タンパク質発現を示す。本発明の方法により、細胞内形質のゲノム型特異的修飾因子を同定することができ、変異関連表現型を担うメカニズム及びこのような表現型のエンハンサー又はリプレッサーを解明することができる。
【０１５６】
図１２に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系スクリーニングにより、ホスホＡＫＴ（ｐＡＫＴ）についてのネガティブレギュレーターとしてＫＣＴＤ５が同定されることを示す。レンチウイルスGeCKOv2ライブラリ（Sanjana et al. Nat. Methods 2014；±１２３，０００個 ガイドＲＮＡ配列を含有）を、ＨＡＰ１細胞に導入し、高及び低ｐＡＫＴレベルを有する集団を単離した。両細胞集団における（その各遺伝子をターゲッティングする）各ガイドＲＮＡ量を、ＰＣＲ増幅及びディープシーケンシングにより同定した。ＫＣＴＤ５について、５／６ｇＲＮＡ配列（ＫＣＴＤ５により示される）が、高ｐＡＫＴレベルを有する細胞集団において、明確に濃縮された。このことは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系ライブラリを使用する突然変異誘発は、例えば、ＨＡＰ１細胞において、遺伝子トラップ突然変異誘発及び他の種類の突然変異誘発に加えて、細胞内表現型を研究するのにも使用することができる。
【０１５７】
図１３に、表現型パネル間の遺伝子関連表現型の比較を示す。表現型リードアウトを、ｘ軸に列記する。変異指数を、Ｙ軸に示す。有意なポジティブレギュレーターは、負の値を有し、ネガティブレギュレーターは、正の値を有する。ＰＲＣ２（ポリコームリプレッション複合体２）サブユニットが有意なレギュレーターとして同定されないスクリーニングにおいて、データ点を、円でラベルする。複合体は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有し、主に、リシン２７において、ヒストンＨ３をトリメチル化する（すなわち、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３にマークを付けることにより、ＰＲＣ２複合体は、遺伝子発現の主なレギュレーターであるため、広い各種のスクリーニング間で、多くの表現型に影響を及ぼすと予想される。この概観から、ＰＲＣ２複合体の３つの成分（ＥＺＨ２、ＥＥＤ、及びＳＵＺ１２）が、種々のスクリーニング間で、同一に近い表現型の結果を示すことが証明される。この比較可能なアプローチを、機能を遺伝子に割り当てるのに使用することができる。
【０１５８】
スクリーニング：Ｈ３Ｋ２７−ａｃ  ヒストン３リシン２７アセチル；Ｈ３Ｋ２７−ｂｕｔ  ヒストン３リシン２７ブチリル；Ｈ２ＡＫ１１９−ｃｒｏｔ  ヒストン２Ａリシン１１９クロトニル；Ｈ３Ｋ２７−ｃｒｏｔ  ヒストン３リシン２７クロトニル；ｃｒｏｔ−ｐａｎ  ＰＡＮクロトニルリシン；グアニンヌクレオチド結合タンパク質のＧＮＢ１量、ベータポリペプチド１；保存されたヘリックス−ループ−ヘリックスユビキチン性キナーゼのＩｋＫａ量；カリウムチャネル四量体化ドメイン含有５のＫＣＴＤ５量；リソソーム関連膜タンパク質１のＬＡＭＰ１量；微小管関連タンパク質１軽鎖３アルファのＬＣ３量、飢餓及びクロロキン処理中；Ｈ３Ｋ２７−ｍｅ３  ヒストン３リシン２７トリメチル；ｎｏｎ−ｐ−ｂＣａｔ  非リン酸化ベータ−カテニン；ｐ−ＣＨＥＫ１  リン酸化チェックポイントキナーゼ１；ｐ−ＣＨＥＫ２  リン酸化チェックポイントキナーゼ２；ｐ−ＥＲＫ  リン酸化マイトゲン活性化タンパク質キナーゼ１；ｐ−ｐ３８  リン酸化マイトゲン活性化タンパク質キナーゼ１４；Ｈ３Ｋ１４−ｓｕｃｃ  ヒストン３リシン１４スクシニル；ＸＢＰ１  Ｘ−ボックス結合タンパク質量、タプシガルジンによる誘引；Ｍ６Ａ  Ｎ６−メチルアデノシン；ｐ−ＴＳＣ２  リン酸化結節性硬化症２。
【０１５９】
図１４に、ヒストンタンパク質中の同じアミノ酸における、２つの類似する翻訳後修飾（ＰＴＭ）に必要な遺伝子の比較可能な分析を示す。ヒストン３リシン２７（Ｈ３Ｋ２７）は、（活性なクロマチンに関連するマークであるＣＲＥＢ結合タンパク質により）アセチル化され、（サイレントなクロマチンに関連するポリコームリプレッション複合体２（ＰＲＣ２）により）トリメチル化されることが公知である。これらの修飾が同じ残基に影響を及ぼすため、それらは、互いに排他的であり、Ｈ３Ｋ２７Ａｃの増大により、Ｈ３Ｋ２７Ｍｅ３量の減少がもたらされる。このことは、ＣＢＰが、ＰＲＣ２についての、Ｈ３Ｋ２７Ａｃの強力なポジティブレギュレーター、Ｈ３Ｋ２７Ｍｅ３のネガティブレギュレーター、及びその逆として同定されるスクリーニングにおいても観察される。さらに、修飾特異的遺伝子を同定することができる。
【０１６０】
図１５に、リソソームタンパク質であるＬＡＭＰ１量についてのスクリーニングを示す。擬陽性ヒットは、本発明の方法では、非常に稀である。ＨＡＰ１細胞のＲＮＡシーケンシングデータを考慮し、スクリーニングデータセット（左）に、これを重ねた場合、リソソームタンパク質であるＬＡＭＰ１量についてのスクリーニングについてここで示されたように（左）、３０００個の非発現又は最低発現遺伝子（右）は、照会表現型（右）に寄与しない。これにより、アプローチの正確性が示される。
【０１６１】
図１６に、一倍体遺伝子スクリーニングにより、変異に基づいて疾患マーカーのレベルを変化させる遺伝子を同定することができることを示す。「疾患マーカー」の量は、「疾患ゲノム型」における異常な細胞生理を示す。（Ａ）突然変異誘発されたＨＡＰ１細胞を、固定し、透過させ、疾患マーカーを認識する抗体により染色した。低及び高レベルのマーカーを有する細胞をソートした。その後、両集団における変異スペクトルを、記載されたようにマッピングした。複数の公知の疾患誘引遺伝子の変異により、マーカーレベルの上昇がもたらされる（はずれ上限値内はラベルしない）。（Ｂ）疾患遺伝子を欠損させた突然変異誘発されたＨＡＰ１細胞を、上記されたように、染色し、処理した。この「サプレッサー」スクリーニングにより、不活性化に基づいて、疾患遺伝子欠損について疾患マーカーレベルを低下させる、遺伝子１、２、及び３が同定される。同欠損は、遺伝性ヒト症候群を模倣する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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