(57)【要約】  本発明は、触媒的抗体領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むプログラム可能な普遍的細胞受容体(ＰＵＣＲ)を提供する。ここに開示するＰＵＣＲは、任意の目的の分子に対する特異性に対して受容体をプログラムするために、特異性作用物質にコンジュゲートし得る。また提供されるのは、このようなＰＵＣＲをコードする核酸および該ＰＵＣＲを発現する細胞である。このような細胞を、癌および感染症を含む多様な医学的状態および疾患の処置に使用し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プログラム可能な普遍的細胞受容体をコードする単離核酸配列であって、ここで、該プログラム可能な普遍的細胞受容体が
ａ. 反応性アミノ酸残基を含む触媒的抗体またはその触媒的部分；
ｂ. 膜貫通ドメイン；および
ｃ. 細胞内ドメイン
を含む、単離核酸配列。
【請求項２】
触媒的抗体またはその触媒的部分がアルドラーゼ触媒的抗体、ベータラクタマーゼ触媒的抗体、アミダーゼ触媒的抗体、チオエステラーゼ触媒的抗体およびその触媒的部分からなる群から選択される、請求項１に記載の単離核酸配列。
【請求項３】
触媒的抗体またはその触媒的部分がアルドラーゼ触媒的抗体またはその触媒的部分である、請求項１または２に記載の単離核酸配列。
【請求項４】
反応性アミノ酸残基が反応性システイン残基、反応性チロシン残基、反応性リシン残基および反応性チロシン残基からなる群から選択される、請求項１〜３の何れかに記載の単離核酸配列。
【請求項５】
反応性アミノ酸残基が反応性リシン残基である、請求項１〜４の何れかに記載の単離核酸配列。
【請求項６】
触媒的抗体またはその触媒的部分がヒト化モノクローナル抗体３８Ｃ２またはその触媒的部分である、請求項１〜５の何れかに記載の単離核酸配列。
【請求項７】
触媒的抗体またはその触媒的部分が配列番号４のアミノ酸配列またはその触媒的部分を含む、請求項１に記載の単離核酸配列。
【請求項８】
触媒的抗体またはその触媒的部分がヒト化モノクローナル抗体３３Ｆ１２またはその触媒的部分である、請求項１に記載の単離核酸配列。
【請求項９】
触媒的抗体またはその触媒的部分がマウスモノクローナル抗体３８Ｃ２または３３Ｆ１２またはその触媒的部分である、請求項１に記載の単離核酸配列。
【請求項１０】
触媒的部分が一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)である、請求項１〜９の何れかに記載の単離核酸配列。
【請求項１１】
触媒的部分がＦａｂフラグメントである、請求項１〜１０の何れかに記載の単離核酸配列。
【請求項１２】
触媒的部分がｓｃＦａｂ、二重特異性抗体、Ｆ(ａｂ’)２フラグメント、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメントおよびｄＡｂフラグメントからなる群から選択される、請求項１〜１１の何れかに記載の単離核酸配列。
【請求項１３】
細胞内ドメインがシグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜１２の何れかに記載の単離核酸配列。
【請求項１４】
シグナル伝達ドメインがＣＤ３−ζシグナル伝達ドメインである、請求項１３に記載の単離核酸配列。
【請求項１５】
シグナル伝達ドメインがＣＤ２８シグナル伝達ドメインである、請求項１３に記載の単離核酸配列。
【請求項１６】
細胞内ドメインが共刺激性シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜１５の何れかに記載の単離核酸配列。
【請求項１７】
共刺激性シグナル伝達ドメインがＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ８３リガンドおよびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の細胞内ドメインを含む、請求項１６に記載の単離核酸配列。
【請求項１８】
膜貫通ドメインがＴ細胞受容体のアルファ鎖、Ｔ細胞受容体のベータ鎖、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＦＡ−１Ｔ細胞共受容体、ＣＤ２Ｔ細胞共受容体／接着分子、ＣＤ８アルファおよびこれらのフラグメントからなる群から選択される、タンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項１〜１７の何れかに記載の単離核酸配列。
【請求項１９】
プログラム可能な普遍的細胞受容体がさらにヒンジ領域を含む、請求項１〜１８の何れかに記載の単離核酸配列。
【請求項２０】
ヒンジ領域がＣＤ８ヒンジ領域である、請求項１９に記載の単離核酸配列。
【請求項２１】
プログラム可能な普遍的細胞受容体がさらに検出可能部分を含む、請求項１〜２０の何れかに記載の単離核酸配列。
【請求項２２】
検出可能部分がポリペプチドである、請求項２１に記載の単離核酸配列。
【請求項２３】
検出可能部分がＧＳＴタグ、ＨＩＳタグ、ｍｙｃタグおよびＨＡタグからなる群から選択される、請求項２１に記載の単離核酸配列。
【請求項２４】
プログラム可能な普遍的細胞受容体が配列番号１０に示すアミノ酸配列を含む、プログラム可能な普遍的細胞受容体をコードする単離核酸配列。
【請求項２５】
請求項１〜２４の何れかに記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項２６】
ウイルスベクターである、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
請求項１〜２７の何れかに記載の単離核酸を含む、単離宿主細胞。
【請求項２９】
プログラム可能な普遍的細胞受容体が反応性部分により特異性作用物質にコンジュゲートし、ここで、反応性部分が触媒的抗体またはその触媒的部分の反応性アミノ酸残基に結合される、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
プログラム可能な普遍的細胞受容体が反応性部分により特異性作用物質に共有結合により結合される、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
反応性部分がジケトン、Ｎ−スルホニル−ベータ−ラクタムおよびアゼチジノンからなる群から選択される、請求項２９または３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
特異性作用物質がリンカーによりコンジュゲートされる反応性部分を含む、請求項２９〜３１の何れかに記載の宿主細胞。
【請求項３３】
リンカーがペプチド、小分子、アルキルリンカーおよびＰＥＧリンカーからなる群から選択される、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
特異性作用物質が癌と関連するタンパク質と結合する、請求項２９〜３３の何れかに記載の宿主細胞。
【請求項３５】
癌と関連するタンパク質がＣＤ１９、インテグリン、ＶＥＧＦＲ２、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＧＭ２、ＧＤ２、ＧＤ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖIII、ＨＥＲ２、ＩＬ−１３ＲおよびＭＵＣ−１からなる群から選択される、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
特異性作用物質がウイルスタンパク質に結合する、請求項２９〜３４の何れかに記載の宿主細胞。
【請求項３７】
ウイルスタンパク質がＨＩＶタンパク質、肝炎ウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ヘルペスウイルスタンパク質、ロタウイルスタンパク質、呼吸器多核体ウイルスタンパク質、ポリオウイルスタンパク質、ライノウイルスタンパク質、サイトメガロウイルスタンパク質、サル免疫不全ウイルスタンパク質、脳炎ウイルスタンパク質、水痘帯状疱疹ウイルスタンパク質またはエプスタイン・バーウイルスタンパク質である、請求項３６に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
特異性作用物質が疾患原因生物により発現されるタンパク質に結合する、請求項２９〜３４の何れかに記載の宿主細胞。
【請求項３９】
疾患原因生物が単細胞である、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
疾患原因生物が多細胞である、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
疾患原因生物がウイルス、プリオン、細菌、真菌、原生動物および寄生虫からなる群から選択される、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４２】
特異性作用物質が結合タンパク質、小分子、ペプチド、ペプチド模倣体、治療剤、ターゲティング剤、タンパク質アゴニスト、タンパク質アンタゴニスト、代謝制御因子、ホルモン、毒素または増殖因子を含む、請求項２９〜４１の何れかに記載の宿主細胞。
【請求項４３】
小分子が葉酸またはＤＵＰＡである、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
結合タンパク質が抗体、抗体の抗原結合部分、リガンド、サイトカインまたは受容体である、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
第一抗原に特異的な特異性作用物質にコンジュゲートしたプログラム可能な普遍的細胞受容体および
第一抗原と異なる第二抗原に特異的な特異性作用物質にコンジュゲートしたプログラム可能な普遍的細胞受容体
を含む、請求項２９〜４１の何れかに記載の宿主細胞。
【請求項４６】
免疫細胞である、請求項２９〜４５の何れかに記載の宿主細胞。
【請求項４７】
免疫細胞が樹状細胞、単球、肥満細胞、好酸球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、細胞毒性Ｔリンパ球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、単球およびナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ)細胞からなる群から選択される、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項４８】
ＮＫ細胞がＮＫ−９２細胞または修飾ＮＫ−９２細胞である、請求項４７に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
免疫細胞が修飾ＮＫ−９２細胞(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６６７２)である、請求項４８に記載の宿主細胞。
【請求項５０】
癌を有するヒト対象から単離される、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項５１】
ａ. 第一抗原に結合する特異性作用物質に結合したプログラム可能な普遍的細胞受容体を含む宿主細胞の亜集団および
ｂ. 第一抗原と異なる第二抗原に結合する特異性作用物質に結合したプログラム可能な普遍的細胞受容体を含む宿主細胞の亜集団
を含む、請求項２９〜５０の何れかに記載の宿主細胞の集団。
【請求項５２】
対象における癌を処置するまたは腫瘍増殖を阻害する方法であって、対象に請求項２９〜３５または４２〜５０の何れかに記載の宿主細胞または請求項５１に記載の宿主細胞の集団を投与し、それにより対象における癌を処置するまたは腫瘍増殖を阻害することを含む、方法。
【請求項５３】
処置を必要とする対象における疾患原因生物により引き起こされる医学的状態を処置する方法であって、対象に請求項３６〜４１の何れかに記載の宿主細胞または請求項５１に記載の宿主細胞の集団を投与し、それにより対象における疾患原因生物により引き起こされる医学的状態を処置することを含む、方法。
【請求項５４】
処置を必要とする対象における癌処置に使用するためのカスタマイズされた治療的宿主細胞を製造する方法であって、
免疫細胞と、該免疫細胞の細胞膜に発現されるプログラム可能な普遍的細胞受容体に結合する特異性作用物質を接触させることを含み、ここで、特異性作用物質が処置を必要とする対象の癌抗原プロファイルに対応する癌関連抗原と結合する、方法。
【請求項５５】
免疫細胞が樹状細胞、肥満細胞、単球、好酸球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、細胞毒性Ｔリンパ球、マクロファージ、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球およびナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ)細胞からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
免疫細胞がＴ細胞またはＮＫ細胞である、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
ＮＫ細胞がＮＫ−９２細胞または修飾ＮＫ−９２細胞である、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
ＮＫ細胞が修飾ＮＫ−９２細胞(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６６７２)である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
癌関連抗原がＣＤ１９、インテグリン、ＶＥＧＦＲ２、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＧＭ２、ＧＤ２、ＧＤ３、シアリルＴｎ(ＳＴｎ)、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖIII、ＨＥＲ２、ＩＬ−１３ＲおよびＭＵＣ−１からなる群から選択される、請求項５４〜５８の何れかに記載の方法。
【請求項６０】
特異性作用物質が結合タンパク質、小分子、ペプチド、ペプチド模倣体、治療剤、ターゲティング剤、タンパク質アゴニスト、タンパク質アンタゴニスト、代謝制御因子、ホルモン、毒素または増殖因子を含む、請求項５４〜５８の何れかに記載の方法。
【請求項６１】
結合タンパク質が抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
抗原結合フラグメントがｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
抗体またはその抗体結合フラグメントが可変カッパ軽鎖を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
処置を必要とする対象における癌を処置する方法であって、
(ａ)対象における癌抗原プロファイルを決定し、
(ｂ)(ａ)において同定された抗原に結合する特異性作用物質を選択し、そして
(ｃ)(ｂ)において同定された特異性作用物質に結合するプログラム可能な普遍的細胞受容体を含む免疫細胞を投与し、
それにより処置を必要とする対象における癌を処置することを含む、方法。
【請求項６５】
プログラム可能な普遍的細胞受容体を含む宿主細胞の集団を含む容器を含むキットであって、
プログラム可能な普遍的細胞受容体が
基質に結合しない反応性アミノ酸残基を含む触媒的抗体またはその触媒的部分；
膜貫通ドメインおよび
細胞内ドメイン
を含むものである、キット。
【請求項６６】
宿主細胞が免疫細胞である、請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
免疫細胞が修飾ＮＫ−９２細胞(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６６７２)である、請求項６６に記載のキット。
【請求項６８】
さらに特異性作用物質を含む、請求項６５〜６７の何れかに記載のキット。
【請求項６９】
約１×１０２〜約１×１０１６免疫細胞を含む、請求項６５〜６８の何れかに記載のキット。
【請求項７０】
請求項１〜２４の何れかに記載の核酸を含む容器を含む、キット。
【請求項７１】
請求項２５〜２７の何れかに記載のベクターを含む容器を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年１０月２３日出願の米国仮出願特許６２／２４５,９７８号および２０１６年９月１日出願の米国仮出願特許６２／３８２,６９１号に基づく優先権を主張し、これらの内容全体を引用により明示的に本明細書に包含させる。
【０００２】
配列表
本出願は配列表を含み、これはASCII形式で電子的に提供され、その全体を引用により本明細書に包含させる。該ASCIIコピーは、２０１６年１０月２４日に作成し、126591-00120_ST25.txtなる名称であり、１１２キロバイトサイズである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
癌および感染症のような複雑な疾患に対して利用可能な有効な処置が限られていることは、世界規模の健康問題である。複雑な疾患を処置するための従来法で開発された医薬品および生物学的エフェクター分子は、高毒性のために、その使用がしばしば限られる。例えば、化学療法を含む癌処置はしばしば非特異的であり、望ましくない副作用を引き起こす。
【０００４】
最近の開発において、疾患細胞(例えば、癌細胞)または疾患原因生物を攻撃するために、患者自身の細胞(例えば、免疫細胞)を利用する細胞ベースの治療が開発されている。特異的細胞ベースの治療を開発する努力は、対象における標的特異的疾患細胞集団または疾患原因生物に対する個別化細胞ベースの治療を迅速に開発する技能が我々にないことにより妨げられる。問題は、癌のような複雑な疾患の不均質な抗原プロファイルによりさらに悪化する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、複雑な疾患の処置に使用できる、カスタマイズされた細胞ベースの治療を改善する必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要約
本発明は核酸、宿主細胞、その医薬組成物、そのキットおよびここに開示する組成物の使用方法を提供する。
【０００７】
ある態様において、本発明は、プログラム可能な普遍的細胞受容体(ここではＰＵＣＲとも称する)をコードする単離核酸配列を提供し、ここで、該プログラム可能な普遍的細胞受容体は、触媒的抗体またはその触媒的部分を含み、反応性アミノ酸残基、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。
【０００８】
ある実施態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分は、アルドラーゼ触媒的抗体、ベータラクタマーゼ触媒的抗体、アミダーゼ触媒的抗体、チオエステラーゼ触媒的抗体およびその触媒的部分からなる群から選択される。ある実施態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分は、アルドラーゼ触媒的抗体またはその触媒的部分である。
【０００９】
ある実施態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分の反応性アミノ酸残基は、反応性システイン残基、反応性チロシン残基、反応性リシン残基および反応性チロシン残基からなる群から選択される。ある実施態様において、反応性アミノ酸残基は反応性リシン残基である。
【００１０】
ある実施態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分は、ヒト化モノクローナル抗体３８Ｃ２またはその触媒的部分である。ある実施態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分は、配列番号４のアミノ酸配列またはその触媒的部分を含む。ある実施態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分は、配列番号３のアミノ酸配列またはその触媒的部分を含む。ある実施態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分は、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分は、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分は、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分は、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分は、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分は、配列番号１３の核酸配列によりコードされる。ある実施態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分は、配列番号１４の核酸配列によりコードされる。ある実施態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分は、配列番号４７の核酸配列によりコードされる。ある実施態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分は、ヒト化モノクローナル抗体３３Ｆ１２またはその触媒的部分である。ある実施態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分は、マウスモノクローナル抗体３８Ｃ２または３３Ｆ１２またはその触媒的部分である。
【００１１】
ある実施態様において、触媒的部分は、一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)である。ある実施態様において、触媒的部分は、Ｆａｂフラグメントである。ある実施態様において、触媒的部分は、ｓｃＦａｂである。さらなる実施態様において、触媒的部分は、ｓｃＦａｂ、二重特異性抗体、Ｆ(ａｂ’)２フラグメント、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメントおよびｄＡｂフラグメントからなる群から選択される。
【００１２】
ある実施態様において、細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ζシグナル伝達ドメインである。ある実施態様において、ＣＤ３−ζシグナル伝達ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＣＤ３−ζシグナル伝達ドメインは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＣＤ３−ζシグナル伝達ドメインは、配列番号１８の核酸配列によりコードされる。ある実施態様において、ＣＤ３−ζシグナル伝達ドメインは、配列番号６２の核酸配列によりコードされる。他の実施態様において、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインである。ある実施態様において、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインは、配列番号１７の核酸配列によりコードされる。
【００１３】
ある実施態様において、細胞内ドメインは、共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ８３リガンドおよびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の細胞内ドメインを含む。
【００１４】
ある実施態様において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、Ｔ細胞受容体のベータ鎖、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＦＡ−１Ｔ細胞共受容体、ＣＤ２Ｔ細胞共受容体／接着分子、ＣＤ８アルファおよびこれらのフラグメントからなる群から選択される、タンパク質の膜貫通ドメインを含む。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、ＣＤ３−ζ膜貫通ドメインである。ある実施態様において、ＣＤ３−ζ膜貫通ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＣＤ３−ζ膜貫通ドメインは、配列番号１６の核酸配列によりコードされる。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。ある実施態様において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号６１の核酸配列によりコードされる。
【００１５】
なおさらなる実施態様において、プログラム可能な普遍的細胞受容体は、さらにヒンジ領域を含む。ある実施態様において、ヒンジ領域は、ＣＤ８ヒンジ領域である。ある実施態様において、ＣＤ８ヒンジ領域は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ヒンジ領域は、ハイブリッドＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域である。ある実施態様において、ヒンジ領域は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ヒンジ領域は、配列番号５６のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ヒンジ領域は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ヒンジ領域は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ヒンジ領域は、配列番号１５の核酸配列によりコードされる。ある実施態様において、ヒンジ領域は、配列番号６０の核酸配列によりコードされる。
【００１６】
ある実施態様において、プログラム可能な普遍的細胞受容体は、さらに検出可能部分を含む。ある実施態様において、検出可能部分は、ポリペプチドである。ある実施態様において、検出可能部分は、ＧＳＴタグ、ＨＩＳタグ、ｍｙｃタグおよびＨＡタグからなる群から選択される。ある実施態様において、ｍｙｃタグは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ｍｙｃタグは、配列番号１２の核酸配列によりコードされる。ある実施態様において、ｍｙｃタグは、配列番号３９の核酸配列によりコードされる。
【００１７】
ある態様において、本発明は、プログラム可能な普遍的細胞受容体をコードする単離核酸配列を提供し、ここで、プログラム可能な普遍的細胞受容体は、配列番号１０に示すアミノ酸配列を含む。また提供されるのはプログラム可能な普遍的細胞受容体をコードする単離核酸配列であり、ここで、プログラム可能な普遍的細胞受容体は、配列番号９に示すアミノ酸配列を含む。また提供されるのはプログラム可能な普遍的細胞受容体をコードする単離核酸配列であり、ここで、プログラム可能な普遍的細胞受容体は、配列番号１０２に示すアミノ酸配列を含む。また提供されるのはプログラム可能な普遍的細胞受容体をコードする単離核酸配列であり、ここで、プログラム可能な普遍的細胞受容体は、配列番号１０３に示すアミノ酸配列を含む。また提供されるのはプログラム可能な普遍的細胞受容体をコードする単離核酸配列であり、ここで、プログラム可能な普遍的細胞受容体は、配列番号１０５に示すアミノ酸配列を含む。また提供されるのはプログラム可能な普遍的細胞受容体をコードする単離核酸配列であり、ここで、プログラム可能な普遍的細胞受容体は、配列番号４５に示すアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、プログラム可能な普遍的細胞受容体をコードする核酸配列は、配列番号１９の核酸配列を含む。ある実施態様において、プログラム可能な普遍的細胞受容体をコードする核酸配列は、配列番号２０の核酸配列を含む。ある実施態様において、プログラム可能な普遍的細胞受容体をコードする核酸配列は、配列番号４８の核酸配列を含む。ある実施態様において、プログラム可能な普遍的細胞受容体をコードする核酸配列は、配列番号１０６の核酸配列を含む。
【００１８】
他の態様において、本発明は、ここに開示する核酸配列を含むベクターを提供する。ある実施態様において、ベクターは、ウイルスベクターである。ある実施態様において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される。ある実施態様において、ウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス(ＭＬＶ)ベースのレトロウイルスベクターである。ある実施態様において、ウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス(ＭｏＭｕＬＶ)ベースのレトロウイルスベクターである。
【００１９】
ある態様において、本発明は、ここに開示する単離核酸を含む単離宿主細胞を提供する。
【００２０】
ある実施態様において、ここに提供されるプログラム可能な普遍的細胞受容体は、反応性部分により特異性作用物質にコンジュゲートされ、ここで、反応性部分は、触媒的抗体またはその触媒的部分の反応性アミノ酸残基に結合される。ある実施態様において、プログラム可能な普遍的細胞受容体は、反応性部分により特異性作用物質に共有結合により結合される。ある実施態様において、反応性部分は、ジケトン、Ｎ−スルホニル−ベータ−ラクタムおよびアゼチジノンからなる群から選択される。ある実施態様において、特異性作用物質は、リンカーによりコンジュゲートされる反応性部分を含む。なおさらなる実施態様において、リンカーは、ペプチド、小分子、アルキルリンカーおよびＰＥＧリンカーからなる群から選択される。
【００２１】
ある実施態様において、特異性作用物質は、癌と関連するタンパク質と結合する。ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、ＣＤ１９、インテグリン、ＶＥＧＦＲ２、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＧＭ２、ＧＤ２、ＧＤ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖIII、ＨＥＲ２、ＩＬ−１３Ｒ、葉酸受容体およびＭＵＣ−１からなる群から選択される。ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、コレシストキニンＢ受容体、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体、ソマトスタチン受容体２、ガストリン放出ペプチド受容体、ニューロキニン１受容体、メラノコルチン１受容体、ニューロテンシン受容体、神経ペプチドＹ受容体およびＣ型レクチン様分子１からなる群から選択される。ある実施態様において、特異性作用物質は、表４に挙げるターゲティング分子を含む。
【００２２】
他の実施態様において、特異性作用物質は、ウイルスタンパク質に結合する。ある実施態様において、ウイルスタンパク質は、ＨＩＶタンパク質、肝炎ウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ヘルペスウイルスタンパク質、ロタウイルスタンパク質、呼吸器多核体ウイルスタンパク質、ポリオウイルスタンパク質、ライノウイルスタンパク質、サイトメガロウイルスタンパク質、サル免疫不全ウイルスタンパク質、脳炎ウイルスタンパク質、水痘帯状疱疹ウイルスタンパク質およびエプスタイン・バーウイルスタンパク質からなる群から選択される。
【００２３】
ある実施態様において、特異性作用物質は、疾患原因生物により発現されるタンパク質に結合する。ある実施態様において、疾患原因生物は、単細胞である。他の実施態様において、疾患原因生物は、多細胞である。ある実施態様において、疾患原因生物は、ウイルス、プリオン、細菌、真菌、原生動物および寄生虫からなる群から選択される。
【００２４】
ある実施態様において、特異性作用物質は、結合タンパク質、小分子、ペプチド、ペプチド模倣体、治療剤、ターゲティング剤、タンパク質アゴニスト、タンパク質アンタゴニスト、代謝制御因子、ホルモン、毒素または増殖因子を含む。ある実施態様において、小分子は、葉酸またはＤＵＰＡである。ある実施態様において、結合タンパク質は、抗体、抗体の抗原結合部分(例えば、ｓｃＦｖ)、リガンド、サイトカインまたは受容体である。ある実施態様において、結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある実施態様において、抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントである。ある実施態様において、抗原結合フラグメントは、一本鎖Ｆａｂフラグメント(ｓｃＦａｂ)である。ある実施態様において、抗体またはその抗体結合フラグメントは、カッパ軽鎖(例えば、ヒト化カッパ軽鎖またはヒトカッパ軽鎖)を含む。ある実施態様において、抗体またはその抗体結合フラグメントは、可変カッパ軽鎖(例えば、ヒト化可変カッパ軽鎖またはヒト可変カッパ軽鎖)を含む。
【００２５】
ある実施態様において、宿主細胞は、第一抗原に特異的な特異性作用物質にコンジュゲートしたプログラム可能な普遍的細胞受容体および第一抗原と異なる第二抗原に特異的な特異性作用物質にコンジュゲートしたプログラム可能な普遍的細胞受容体を含む。
【００２６】
ある実施態様において、宿主細胞は、リンカーにコンジュゲートしたプログラム可能な普遍的細胞受容体を含む。
【００２７】
ある実施態様において、宿主細胞は、免疫細胞である。ある実施態様において、免疫細胞は、樹状細胞、単球、肥満細胞、好酸球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、細胞毒性Ｔリンパ球、マクロファージ、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球およびナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ)細胞からなる群から選択される。ある実施態様において、ＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞または修飾ＮＫ−９２細胞である。ある実施態様において、免疫細胞は、修飾ＮＫ−９２細胞(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６６７２)である。ある実施態様において、宿主細胞は、癌を有するヒト対象から単離される。
【００２８】
ある態様において、本発明は、宿主細胞の集団を提供し、ここで、該集団は、ａ)第一抗原に結合する特異性作用物質に結合したプログラム可能な普遍的細胞受容体を含む宿主細胞の亜集団およびｂ)第一抗原と異なる第二抗原に結合する特異性作用物質に結合したプログラム可能な普遍的細胞受容体を含む宿主細胞の亜集団を含む。
【００２９】
ある態様において、本発明は、対象にここに開示する宿主細胞または宿主細胞の集団を投与し、それにより対象における癌を処置するまたは腫瘍増殖を阻害することを含む、対象における癌を処置するまたは腫瘍増殖を阻害する方法を提供する。ある実施態様において、本発明は、ＶＥＧＦＲ２に関連する癌を処置する方法を提供する。ある実施態様において、本発明は、ＰＳＭＡに関連する癌、例えば、前立腺癌を処置する方法を提供する。ある実施態様において、本発明は、ＣＤ１９に関連する癌、例えば、急性リンパ芽球性リンパ腫(ＡＬＬ)、非ホジキンリンパ腫、肺癌および慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)を処置する方法を提供する。ある実施態様において、本発明は、ＨＥＲ２に関連する癌、例えば、卵巣癌、胃癌、子宮癌および乳癌を処置する方法を提供する。ある実施態様において、本発明は、ＥＧＦＲに関連する癌、例えば、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、結腸癌、直腸癌、頭頸部扁平上皮細胞癌(ＨＮＳＣＣ)、乳癌および膵臓癌を処置する方法を提供する。ある実施態様において、本発明は、ＩＬ−１３Ｒに関連する癌、例えば、乳癌または悪性神経膠腫を処置する方法を提供する。
【００３０】
他の態様において、本発明は、対象にここに開示する宿主細胞または宿主細胞の集団を投与し、それにより対象における疾患原因生物により引き起こされる医学的状態を処置することを含む、処置を必要とする対象における疾患原因生物により引き起こされる医学的状態を処置する方法を提供する。
【００３１】
ある態様において、本発明は、免疫細胞と、該免疫細胞の細胞膜に発現されるプログラム可能な普遍的細胞受容体に結合する特異性作用物質を接触させることを含み、ここで、該特異性作用物質が処置を必要とする対象の癌抗原プロファイルに対応する癌関連抗原に結合する、処置を必要とする対象における癌処置に使用するためのカスタマイズされた治療的宿主細胞を製造する方法を提供する。ある実施態様において、免疫細胞は、樹状細胞、肥満細胞、単球、好酸球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、細胞毒性Ｔリンパ球、マクロファージ、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球およびナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ)細胞からなる群から選択される。ある実施態様において、免疫細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。ある実施態様において、ＮＫ細胞は、ＮＫ−９２細胞または修飾ＮＫ−９２細胞である。ある実施態様において、ＮＫ細胞は、修飾ＮＫ−９２細胞(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６６７２)である。ある実施態様において、癌関連抗原は、ＣＤ１９、インテグリン、ＶＥＧＦＲ２、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＧＭ２、ＧＤ２、ＧＤ３、シアリルＴｎ(ＳＴｎ)、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖIII、ＨＥＲ２、ＩＬ−１３Ｒ、葉酸受容体およびＭＵＣ−１からなる群から選択される。ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、コレシストキニンＢ受容体、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体、ソマトスタチン受容体２、ガストリン放出ペプチド受容体、ニューロキニン１受容体、メラノコルチン１受容体、ニューロテンシン受容体、神経ペプチドＹ受容体およびＣ型レクチン様分子１からなる群から選択される。なおさらなる実施態様において、特異性作用物質は、結合タンパク質、小分子、ペプチド、ペプチド模倣体、治療剤、ターゲティング剤、タンパク質アゴニスト、タンパク質アンタゴニスト、代謝制御因子、ホルモン、毒素または増殖因子を含む。
【００３２】
ある態様において、本発明は、処置を必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、該方法は、対象の癌抗原プロファイルを決定し、先に同定した癌抗原プロファイルにおける抗原に結合する特異性作用物質を選択し、そして先に同定した特異性作用物質に結合するプログラム可能な普遍的細胞受容体を含む免疫細胞を投与することを含む。
【００３３】
ある態様において、本発明は、プログラム可能な普遍的細胞受容体を含む宿主細胞の集団を含む容器を含むキットを提供し、ここで、プログラム可能な普遍的細胞受容体は、反応性アミノ酸残基を含む触媒的抗体またはその触媒的部分を含み、ここで、反応性アミノ酸残基は、基質、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに結合しない。ある実施態様において、宿主細胞は、免疫細胞である。ある実施態様において、免疫細胞は、修飾ＮＫ−９２細胞(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６６７２)である。ある実施態様において、キットは、さらに特異性作用物質を含む。ある実施態様において、キットは、約１×１０２〜約１×１０１６免疫細胞を含む。
【００３４】
他の態様において、本発明は、ここに開示する核酸を含む容器を含むキットを提供する。
なおさらなる態様において、本発明は、ここに開示するベクターを含む容器を含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】特異性作用物質にコンジュゲートするプログラム可能な普遍的細胞受容体を含む宿主細胞(例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞)のプログラミングのための模式図を示す。
【００３６】
【図２】触媒的抗体ｈ３８Ｃ２(ヒト化３８Ｃ２)の可変ドメインにおける反応性Ｌｙｓ９３残基への小分子の部位特異的コンジュゲーションのための模式的反応を示す。リシン残基は、抗体の疎水性コアに位置する。Ｌｙｓ９３の側鎖ＮＨ２基は生理学的条件下非保護のままであり、そこで、反応性部分を攻撃し、共有結合を形成できる。
【００３７】
【図３】非還元および還元条件両方でのヒト化およびマウス３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃ精製のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【００３８】
【図４】アゼチジノン−ＰＥＧ５−メチルエステルでのヒト化３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃ反応性のマススペクトロメトリー分析を示す。
【００３９】
【図５】アゼチジノン−ＰＥＧ５−メチルエステルでのマウス３８ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃ反応性のマススペクトロメトリー分析を示す。
【００４０】
【図６】アゼチジノン−ＰＥＧ５−メチルエステルにコンジュゲートしたヒト化３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃのペプチドマッピングデータを示す。ペプチドフラグメントの質量は、コンジュゲーション反応が重鎖のＬｙｓ  ９３で生じたことを示すヒト化３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−ＦｃのＬｙｓ９３を含むことを示した。
【００４１】
【図７】例示的特異性作用物質葉酸−ジケトン(２−[[４−[(２−アミノ−４−オキソ−３Ｈ−プテリジン−６−イル)メチルアミノ]ベンゾイル]アミノ]−５−[２−[２−[２−[[５−[４−(３,５−ジオキソヘキシル)アニリノ]−５−オキソ−ペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]−５−オキソ−ペンタン酸)の化学構造を示す。
【００４２】
【図８】例示的特異性作用物質葉酸−アゼチジノン(２−[[４−[(２−アミノ−４−オキソ−３Ｈ−プテリジン−６−イル)メチルアミノ]ベンゾイル]アミノ]−５−オキソ−５−[２−[２−[３−オキソ−３−[４−[３−オキソ−３−(２−オキソアゼチジン−１−イル)プロピル]アニリノ]プロポキシ]エトキシ]エチルアミノ]ペンタン酸)の化学構造を示す。
【００４３】
【図９】例示的特異性作用物質ジケトン−ＰＥＧ５−ＤＵＰＡ  ((２Ｓ)−２−[[(１Ｓ)−４−[[８−[[(１Ｓ)−１−ベンジル−２−[[(１Ｓ)−１−ベンジル−２−[２−[２−[３−[２−[２−[２−[２−[３−[４−(３,５−ジオキソヘキシル)アニリノ]−３−オキソ−プロポキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロパノイルアミノ]エトキシ]エチルアミノ]−２−オキソ−エチル]アミノ]−２−オキソ−エチル]アミノ]−８−オキソ−オクチル]アミノ]−１−カルボキシ−４−オキソ−ブチル]カルバモイルアミノ]ペンタン二酸)の化学構造を示す。
【００４４】
【図１０】例示的特異性作用物質ＤＵＰＡ−アゼチジノン((２Ｓ)−２−[[(１Ｓ)−４−[[８−[[(１Ｓ)−１−ベンジル−２−[[(１Ｓ)−１−ベンジル−２−オキソ−２−[２−[２−[３−[２−[２−[２−[２−[３−オキソ−３−[４−[３−オキソ−３−(２−オキソアゼチジン−１−イル)プロピル]アニリノ]プロポキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロパノイルアミノ]エトキシ]エチルアミノ]エチル]アミノ]−２−オキソ−エチル]アミノ]−８−オキソ−オクチル]アミノ]−１−カルボキシ−４−オキソ−ブチル]カルバモイルアミノ]ペンタン二酸)の化学構造を示す。
【００４５】
【図１１】例示的特異性作用物質アゼチジノン−ＰＥＧ８−ビオチン(５−[(３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ)−２−オキソ−１,３,３ａ,４,６,６ａ−ヘキサヒドロチエノ[３,４−ｄ]イミダゾール−４−イル]−Ｎ−[２−[２−[２−[２−[２−[２−[２−[３−[２−[３−オキソ−３−[４−[３−オキソ−３−(２−オキソアゼチジン−１−イル)プロピル]アニリノ]プロポキシ]エトキシ]プロパノイルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エチル]ペンタンアミド)の化学構造を示す。
【００４６】
【図１２】１μMまたは１０μMの特異性作用物質ＡＺＤ−ＰＥＧ８−ビオチンと反応させた、野生型ＮＫＬ細胞(“−ＰＵＣＲ”；中央行)または３８Ｃ２  ｓｃＦａｂを含むＰＵＣＲを発現するＮＫＬ細胞(“＋ＰＵＣＲ”；下部行)のフローサイトメトリーデータを示す。ＡＺＤ−ＰＥＧ８−ビオチンのＰＵＣＲへのコンジュゲーションをＤＴＡＦコンジュゲートストレプトアビジンを使用して検出し、ＦＡＣＳにより分析した。背景蛍光対照を、左のグラフ、上部行に示す。ＤＴＡＦコンジュゲートストレプトアビジン暴露細胞(二次対照)を右グラフ、右グラフに示す。
【００４７】
【図１３】１μMまたは１０μMの特異性作用物質ＡＺＤ−ＰＥＧ８−ビオチンと反応させた、野生型ＮＫＬ細胞(“−ＰＵＣＲ”)または３８Ｃ２  ｓｃＦａｂを含むＰＵＣＲを発現するＮＫＬ細胞(“＋ＰＵＣＲ”)のフローサイトメトリーデータを示す。ＡＺＤ−ＰＥＧ８−ビオチンのＰＵＣＲへのコンジュゲーションを１μM  ＤＴＡＦコンジュゲートストレプトアビジン(“ＤＴＡＦ−ストレプトアビジン”)を使用して検出し、ＦＡＣＳで分析した。背景蛍光を減算した。
【００４８】
【図１４】ＡＺＤ−ＰＥＧ１３−ＰＦＰエステルリンカーとコンジュゲートした抗ＶＥＧＦＲ２  ＶＫ−Ｂ８  Ｆａｂフラグメントで組み換え３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃをプログラムするためのコンジュゲーション反応の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の蛍光検出画像を示す。左パネルは、非染色ゲルの蛍光画像を示す。ＡＺＤ−ＰＥＧ１３−ＰＦＰエステルリンカーとコンジュゲートした抗ＶＥＧＦＲ２  ＶＫ−Ｂ８  Ｆａｂフラグメントを、AlexaFluor(登録商標)４８８  ＮＨＳエステルで蛍光標識した(“ＶＫＢ８  Ｆａｂ  ＡＺＤ  ４８８”)。対照として、AlexaFluor(登録商標)４８８  ＮＨＳエステルで蛍光標識した(“ＶＫＢ８  Ｆａｂ  ４８８”)または蛍光標識していない(“ＶＫＢ８  Ｆａｂ”)ＡＺＤ−ＰＥＧ１３−ＰＦＰエステルリンカーとコンジュゲートしなかった抗ＶＥＧＦＲ２  ＶＫＢ８  Ｆａｂフラグメントを使用した。ＡＺＤ−ＰＥＧ１３−ＰＦＰエステルリンカーとコンジュゲートした蛍光標識抗ＶＥＧＦＲ２  ＶＫＢ８  ＦａｂフラグメントまたはＡＺＤ−ＰＥＧ１３−ＰＦＰエステルリンカーとコンジュゲートしなかった蛍光標識抗ＶＥＧＦＲ２  ＶＫＢ８  Ｆａｂフラグメントを、マウス触媒的３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃと反応させた。ゲルで流したマウス触媒的３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃで蛍光は観察されなかった(“ｍ３８Ｃ２”)。ＡＺＤ−ＰＥＧ１３−ＰＦＰエステルリンカーにコンジュゲートした抗ＶＥＧＦＲ２  ＶＫＢ８  Ｆａｂフラグメントとマウス触媒的３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃの反応(“ＶＫＢ８  Ｆａｂ  ＡＺＤ  ４８８＋ｍ３８Ｃ２”)は、ＶＫ−Ｂ８  Ｆａｂフラグメントコンジュゲート３８Ｃ２  ｓｃＦｖの蛍光高分子量複合体の検出をもたらした(“＊”で示す)。対照的に、蛍光高分子量複合体は、ＡＺＤ−ＰＥＧ１３−ＰＦＰエステルリンカーとコンジュゲートしなかった抗ＶＥＧＦＲ２  ＶＫＢ８  Ｆａｂフラグメントを使用して、観察されなかった(“ＶＫＢ８  Ｆａｂ  ４８８＋ｍ３８Ｃ２”)。右パネルは、ゲルローディングを検出するためのSypro(登録商標)Rubyタンパク質染色後の同じゲルを示す。
【００４９】
【図１５】野生型ＫＨＹＧ−１ナチュラルキラー細胞(“ＫＨＹＧ−１”；丸)または０.１nM、１nM、１０nMまたは１００nMのＤＫ−ＰＥＧ５−ＤＵＰＡでプログラムした３８Ｃ２  ｓｃＦａｂを含むＰＵＣＲを発現するＫＨＹＧ−１ナチュラルキラー細胞(“ＫＨＹＧ−１／Ｆａｂ３８Ｃ２”；四角)への組み換えＰＳＭＡ結合についての結合曲線を示す。
【００５０】
【図１６Ａ】野生型ＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞(“ＫＨＹＧ−１”；丸)または３.２nM、１０nM、３２nM、１００nM、３２０nMまたは１０００nMのＤＫ−ＰＥＧ５−ＤＵＰＡでプログラムした３８Ｃ２  ｓｃＦａｂを含むＰＵＣＲを発現するＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞(“ＫＨＹＧ−１／Ｆａｂ３８Ｃ２”；四角)によるＰＳＭＡ陽性ＬＮＣａＰ細胞の細胞毒性(％殺滅)を示す。
【００５１】
【図１６Ｂ】野生型ＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞(“ＫＨＹＧ−１”；丸)または３.２nM、１０nM、３２nM、１００nM、３２０nMまたは１０００nMのＤＫ−ＰＥＧ５−ＤＵＰＡでプログラムした３８Ｃ２  ｓｃＦａｂを含むＰＵＣＲを発現するＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞(“ＫＨＹＧ−１／Ｆａｂ３８Ｃ２”；四角)によるＰＳＭＡ陰性ＰＣ−３細胞の細胞毒性(％殺滅)を示す。
【００５２】
【図１７】例示的リンカージケトン−ＰＥＧ５−ＰＦＰエステル(２,３,４,５,６−ペンタフルオロフェニル)３−[２−[２−[２−[２−[３−[４−(３,５−ジオキソヘキシル)アニリノ]−３−オキソ−プロポキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロパノエート)の化学構造を示す。
【００５３】
【図１８Ａ】抗ＰＳＭＡ  Ｃｌｏｎｅ  Ａ１１  Ｆａｂフラグメントのマススペクトロメトリー分析を示す。
【００５４】
【図１８Ｂ】抗ＰＳＭＡ  Ｃｌｏｎｅ  Ａ１１  Ｆａｂフラグメントとジケトン−ＰＥＧ５−ＰＦＰエステルリンカーの反応により得られる生成物のマススペクトロメトリー分析を示す。
【００５５】
【図１９】例示的リンカーアゼチジノン−ＰＥＧ１３−ＰＦＰ((２,３,４,５,６−ペンタフルオロフェニル)３−[２−[２−[２−[２−[２−[２−[２−[２−[２−[２−[２−[２−[３−オキソ−３−[４−[３−オキソ−３−(２−オキソアゼチジン−１−イル)プロピル]アニリノ]プロポキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロパノエート)の化学構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
発明の詳細な記載
Ｉ. 定義
本開示がより容易に理解され得るように、いくつかの用語をまず定義する。これらの定義は、本開示の残りに照らして、また当業者に理解されているとおりに解釈されるべきである。他に定義しない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。付加的な定義を、以下の詳細な記載において示す。
【００５７】
ここで相互交換可能に使用する用語“高発現レベル”または“高レベルの発現”は、正常レベル、すなわち、癌を有しない健常対象のものと比較して増加している分子マーカー(例えば、タンパク質および／またはＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ))のレベルをいう。ある好ましい実施態様において、高レベルの発現は、対象における癌と関連するレベルをいう。
【００５８】
ここで相互交換可能に使用する用語“プログラム可能な普遍的細胞受容体”または“ＰＵＣＲ”は、触媒的抗体またはその触媒的部分を含む細胞外ドメイン(ここでは触媒的抗体領域とも称する)、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む、組み換え分子をいう。ある実施態様において、プログラム可能な普遍的細胞受容体は、受容体を発現する特異的宿主細胞についてコドン最適化されている核酸分子によりコードされる。
【００５９】
ここで使用する用語“抗体”は、２個の重(Ｈ)鎖および２個の軽(Ｌ)鎖の４個のポリペプチド鎖からなるあらゆる免疫グロブリン鎖(Ｉｇ)分子またはそのあらゆる機能的フラグメント、変異体、バリアントまたは誘導物をいう。このような変異体、バリアントまたは誘導体抗体形式は、当分野で知られる。完全長抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域(ここではＨＣＶＲまたはＶＨと略す)および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３個のドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域(ここではＬＣＶＲまたはＶＬと称する)および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１個のドメイン、ＣＬからなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、さらに、フレームワーク領域(ＦＲ)と称される、より保存された領域が散在する、相補性決定領域(ＣＤＲ)と称する超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは３個のＣＤＲおよび４個のＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端で次のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で配置される。免疫グロブリン分子は、あらゆるタイプ(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ)、クラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２)またはサブクラスであり得る。ある実施態様において、抗体は完全長抗体である。ある実施態様において、抗体はマウス抗体である。ある実施態様において、抗体はヒト抗体である。ある実施態様において、抗体はヒト化抗体である。他の実施態様において、抗体はキメラ抗体である。キメラおよびヒト化抗体は、ＣＤＲグラフティング法(例えば、米国特許５,８４３,７０８号、６,１８０,３７０号、５,６９３,７６２号、５,５８５,０８９号および５,５３０,１０１号参照)、鎖シャッフリング戦略(例えば、米国特許５,５６５,３３２号; Rader et al. (1998) PROC. NAT'L. ACAD. SCI. USA 95: 8910-8915参照)、分子モデリング戦略(米国特許５,６３９,６４１号)などを含む、当業者に周知の方法により製造できる。ある実施態様において、抗体はロバ抗体である。ある実施態様において、抗体はラット抗体である。ある実施態様において、抗体はウマ抗体である。ある実施態様において、抗体はラクダ抗体である。ある実施態様において、抗体はサメ抗体である。
【００６０】
ここで使用する抗体の“抗原結合部分”(または単に“抗体部分”)なる用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上のフラグメントをいう。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントにより発揮され得ることが示されている。このような抗体実施態様はまた二特異的、二重特異的または多特異的形式でもあり得て、２以上の異なる抗原に特異的結合する。抗体の“抗原結合部分”なる用語の範囲内に包含される結合フラグメントの例は、(ｉ)ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント、(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合された２Ｆａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ(ａｂ’)２フラグメント、(iii)ＶＨドメインとＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；(iv)抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、(ｖ)単一可変ドメインを含むｄＡｂフラグメント(Ward et al. (1989) NATURE 341: 544-546；およびWinter et al.、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０５１４４Ａ１号、これらの内容は引用により本明細書に包含させる)および(vi)単離相補性決定領域(ＣＤＲ)を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２ドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされるが、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対となって一価分子(一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として知られる；例えば、Bird et al. (1988) SCIENCE 242:423-426;およびHuston et al. (1988) PROC. NAT'L. ACAD. SCI. USA 85:5879-5883参照)を形成する単一タンパク質鎖として製造されることを可能とする、合成リンカーにより、組み換え法を使用して、連結され得る。このような一本鎖抗体も、抗体の“抗原結合部分”なる用語に包含されることが意図される。二重特異性抗体のような他の形態の一本鎖抗体も包含される。用語抗体の抗原結合部分は、“ｓｃＦａｂ”としても知られる“一本鎖Ｆａｂフラグメント”を含む。
【００６１】
“一本鎖Ｆａｂフラグメント”または“ｓｃＦａｂ”は、抗体重鎖可変ドメイン(ＶＨ)、抗体定常ドメイン１(ＣＨ１)、抗体軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)、抗体軽鎖定常ドメイン(ＣＬ)およびリンカーを含むポリペプチドであり、ここで、該抗体ドメインおよび該リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向で次のａ)ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ)ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ)ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１またはｄ)ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬの順番の一つを有し、そしてここで、該リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２〜５０アミノ酸のポリペプチドである。該一本鎖Ｆａｂフラグメントａ)ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ)ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ)ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１およびｄ)ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬは、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインの間の天然ジスルフィド結合により安定化され得る。さらに、これらの一本鎖Ｆａｂフラグメントは、システイン残基の挿入(例えば、Ｋａｂａｔナンバリングによる可変重鎖における４４位および可変軽鎖における１００位)による鎖間ジスルフィド結合の産生によりさらに安定化され得る。用語“Ｎ末端”は、Ｎ末端の最後のアミノ酸をいう。用語“Ｃ末端”は、Ｃ末端の最後のアミノ酸をいう。
【００６２】
ここで使用する用語“ＣＤＲ”は、抗体可変配列内の相補性決定領域をいう。重鎖および軽鎖の可変領域の各々に３個のＣＤＲがあり、各可変領域についてＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と命名される。ここで使用する用語“ＣＤＲセット”は、抗原と結合できる単一可変領域に生じる３ＣＤＲの群をいう。これらのＣＤＲの正確な境界は、種々のシステムにより種々に定義されている。Ｋａｂａｔにより記載されたシステム(Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991))は、抗体のあらゆる可変領域に適用可能な明確な残基ナンバリングシステムを提供するだけでなく、３ＣＤＲを規定する正確な残基境界も提供する。これらのＣＤＲをＫａｂａｔ  ＣＤＲと称してもよい。Ｃｈｏｔｈｉａおよび共同研究者らは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ内のある小部分が、アミノ酸配列レベルでの大きな多様性にもかかわらず、ほぼ同一のペプチド主鎖構造に適合することを発見した(Chothia et al. (1987) J. MOL. BIOL. 196: 901-917, and Chothia et al. (1989) NATURE 342: 877-883)。これらの小部分はＬ１、Ｌ２およびＬ３またはＨ１、Ｈ２およびＨ３と称し、ここで“Ｌ”および“Ｈ”は、それぞれ軽鎖および重鎖領域をいう。これらの領域はＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲと称することができ、これは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複する境界を有する。Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複するＣＤＲを規定する他の境界は、Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-139, and MacCallum et al. (1996) J. MOL. BIOL. 262(5): 732-45により記載されている。さらに他のＣＤＲ境界定義は上記システムの一つに厳密に従わないかもしれないが、それにもかかわらずＫａｂａｔ  ＣＤＲと重複するが、特定の残基または残基の群またはＣＤＲ全体が抗原結合に顕著に影響しないとの予測または実験的発見に照らして、短くしても長くしてもよい。ここで使用する方法は、これらのシステムの何れかにより定義したＣＤＲを利用し得るが、好ましい実施態様はＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａ規定ＣＤＲを使用する。
【００６３】
ここで使用する用語“触媒的抗体”は、反応性部分との生化学的反応を触媒できる免疫グロブリン分子をいう。触媒的抗体は、反応性免疫化により産生でき、それによって動物は免疫原としての反応性ハプテンで免疫化される。触媒的抗体は、マウス、ラット、ウシ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウマ、ヒト、霊長類、ブタおよびニワトリを含むが、これらに限定されない、あらゆる動物で産生し得る。ある実施態様において、触媒的抗体は完全長抗体である。ある実施態様において、触媒的抗体はマウス抗体である。ある実施態様において、触媒的抗体はヒト抗体である。ある実施態様において、触媒的抗体はヒト化抗体である。ある実施態様において、触媒的抗体はキメラ抗体である。本発明により使用し得る多くの触媒的抗体および触媒的抗体を産生する方法は、当分野で知られる(例えば、Zhu et al., (2004) J. MOL. BIOL. 343: 1269-80; Rader et al. (1998) PROC. NAT'L. ACAD. SCI. USA 95: 8910-8915；米国特許６,２１０,９３８号、６,３６８,８３９号、６,３２６,１７６号、６,５８９,７６６号および５,９８５,６２６号、５,７３３,７５７号、５,５００,３５８号、５,１２６,２５８号、５,０３０,７１７号および４,６５９,５６７参照；これらの内容、特に、触媒的抗体および触媒的抗体を産生する方法は引用により本明細書に包含させる)。ある実施態様において、触媒的抗体はアルドラーゼ抗体である。他の実施態様において、触媒的抗体は、マウス抗体３８Ｃ２または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである(例えば、Karlstrom et al. (2000) PROC. NAT'L. ACAD. SCI. USA 97(8): 3878-3883; and Rader et al. (2003) J. MOL. BIOL. 332: 889-99)。マウス抗体３８Ｃ２は、ＨＣＤＲ３の近辺、しかし外側に反応性リシンを有し、天然アルドラーゼ酵素を機構的に模倣する反応性免疫化により産生される触媒的抗体である(例えば、Barbas et al. (1997) SCIENCE 278: 2085-2092参照)。ある実施態様において、触媒的抗体は、マウス抗体３３Ｆ１２または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである(例えば、Goswami et al. (2009) BIOORG. MED. CHEM. LETT. 19(14): 3821-4参照)。ある実施態様において、触媒的抗体は、ハイブリドーマ４０Ｆ１２により産生される抗体(Zhu et al., (2004) J. MOL. BIOL. 343: 1269-80; Rader et al., (1998))または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。ある実施態様において、触媒的抗体は、抗体はハイブリドーマ４２Ｆ１により産生される(Zhu et al., (2004); Rader et al., (1998))または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。他の実施態様において、触媒的抗体は、ハイブリドーマ８５Ａ２により産生される抗体(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１５)または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。ある実施態様において、触媒的抗体は、ハイブリドーマ８５Ｃ７により産生される抗体(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１４)または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。他の実施態様において、触媒的抗体は、ハイブリドーマ９２Ｆ９により産生される抗体(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１７)または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。ある実施態様において、触媒的抗体は、ハイブリドーマ９３Ｆ３により産生される抗体(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２３)または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。他の実施態様において、触媒的��体は、ハイブリドーマ８４Ｇ３により産生される抗体(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２４)または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。ある実施態様において、触媒的抗体は、ハイブリドーマ８４Ｇ１１により産生される抗体(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１８)または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。他の実施態様において、触媒的抗体は、ハイブリドーマ８４Ｈ９により産生される抗体(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１９)または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。ある実施態様において、触媒的抗体は、ハイブリドーマ８５Ｈ６により産生される抗体(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２５)または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。他の実施態様において、触媒的抗体は、ハイブリドーマ９０Ｇ８により産生される抗体(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１６)または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。ある実施態様において、触媒的抗体はベータラクタマーゼ抗体である。他の実施態様において、触媒的抗体はエステラーゼ抗体である。ある実施態様において、触媒的抗体はアミダーゼ抗体である。他の実施態様において、触媒的抗体はチオエステラーゼ抗体である。ある実施態様において、触媒的抗体はロバ抗体である。ある実施態様において、触媒的抗体はラット抗体である。ある実施態様において、触媒的抗体はウマ抗体である。ある実施態様において、触媒的抗体はラクダ抗体である。ある実施態様において、触媒的抗体はサメ抗体である。
【００６４】
ここで使用する用語“触媒的部分”または“触媒的フラグメント”は、反応性部分との生化学的反応を触媒する能力を保持する、触媒的抗体のフラグメントをいう。ある実施態様において、触媒的抗体の触媒的部分は、反応性アミノ酸残基、例えば、反応性リシン残基を保持し、これが、アミノ酸残基が生化学的反応を触媒することを可能とする。例えば、アルドラーゼ抗体の触媒的部分は、天然アルドラーゼのエナミン機序を使用するアルドールおよび／またはレトロ−アルドール反応の触媒に必要な反応性リシンおよび微小環境を含み得る。ある実施態様において、触媒的抗体の種々の形態の触媒的部分が、触媒的部分が反応性アミノ酸残基を保持する限り、企図される。ある実施態様において、触媒的部分は、(ｉ)ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントである触媒的抗体のＦａｂフラグメント、(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合した２個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである、触媒的抗体のＦ(ａｂ’)２フラグメント、(iii)ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる触媒的抗体のＦｄフラグメント、(iv)触媒的抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなる触媒的抗体のＦｖフラグメント、(ｖ)単一可変ドメインを含む触媒的抗体のｄＡｂフラグメントおよび(vi)触媒的抗体の単離相補性決定領域(ＣＤＲ)を含む。ある実施態様において、触媒的部分は、触媒的抗体のＶＨドメインからのＣＤＲ３である(例えば、ここに開示する触媒的抗体)。ある実施態様において、触媒的部分は、一本鎖Ｆａｂ(ｓｃＦａｂ)である。さらに、触媒的抗体のＦｖフラグメントの２ドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされるが、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対となって一価分子(一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として知られる)を形成する、単一タンパク質鎖として製造されることを可能とする合成リンカーにより、組み換え法を使用して、連結され得る。ある実施態様において、触媒的抗体の触媒的部分はｓｃＦｖである。他の実施態様において、触媒的抗体の触媒的部分はｓｃＦａｂである。このような一本鎖抗体も、触媒的抗体の“触媒的部分”からなる用語に包含されることが意図される。二重特異性抗体のような他の形態の一本鎖抗体も包含される。
【００６５】
ここで使用する用語“反応性アミノ酸残基”は、反応性側鎖により、反応性部分と生化学的に反応性である、触媒的抗体に存在するアミノ酸残基をいう。反応性アミノ酸残基は、触媒的抗体に天然に存在し得る。あるいは、反応性アミノ酸残基は、特定の目的の反応性アミノ酸残基をコードするように触媒的抗体をコードするＤＮＡを意図的に変異させることにより生じさせ得る。ある実施態様において、反応性アミノ酸残基またはその反応性官能基(例えば、求核性アミノ基またはスルフヒドリル基)を抗体のアミノ酸残基に結合させ、それにより触媒的抗体を形成させ得る。ある実施態様において、反応性アミノ酸残基はシステインである(例えば、チオエステラーゼ抗体の反応性システイン残基)。他の実施態様において、反応性アミノ酸残基はセリンである。ある実施態様において、反応性アミノ酸残基はチロシンである。ある実施態様において、反応性アミノ酸残基はリシンである(例えば、アルドラーゼ抗体の反応性リシン残基)。他の実施態様において、反応性アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリングによるマウス抗体３８Ｃ２の重鎖のＬｙｓ９３である。他の実施態様において、反応性アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリングによるヒト化抗体３８Ｃ２のＬｙｓ９３である。ある実施態様において、反応性アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリングによるマウス抗体３３Ｆ１２のＬｙｓ９３である。他の実施態様において、反応性アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリングによるヒト化抗体３３Ｆ１２のＬｙｓ９３である。ある実施態様において、反応性アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリングによるマウス抗体４０Ｆ１２のＬｙｓ９３である。他の実施態様において、反応性アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリングによるヒト化抗体４０Ｆ１２のＬｙｓ９３である。ある実施態様において、反応性アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリングによるマウス抗体４２Ｆ１のＬｙｓ９３である。他の実施態様において、反応性アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリングによるヒト化抗体４２Ｆ１のＬｙｓ９３である。ある実施態様において、反応性アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリングによるマウス抗体８４Ｇ３のＬｙｓ８９である。他の実施態様において、反応性アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリングによるヒト化抗体８４Ｇ３のＬｙｓ８９である。ある実施態様において、反応性アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリングによるマウス抗体９３Ｆ３のＬｙｓ８９である。他の実施態様において、反応性アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリングによるヒト化抗体９３Ｆ３のＬｙｓ８９である。
【００６６】
ここで使用する用語“コドン最適化”は、核酸分子(例えば、ＤＮＡ分子)によりコードされるポリペプチドを変えることなく、宿主生物の典型的コドン使用を反映するための、遺伝子または核酸分子のコーディング領域におけるコドンの改変をいう。
【００６７】
抗体(例えば、触媒的抗体)およびその部分に関連してここで使用する用語“ヒト化”は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはこれらのフラグメント(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２または抗体の他の抗原結合部分配列)である非ヒト(例えば、マウス)抗体をいう。大部分について、ヒト化抗体および抗体これらのフラグメントは、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲからの残基により置き換えられる、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体または抗体フラグメント)をいう。ある例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。さらに、ヒト化抗体／抗体フラグメントは、レシピエント抗体にも移入ＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体または抗体フラグメント性能をさらに微調整および最適化し得る。一般に、ヒト化抗体またはその抗体フラグメントは、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンに対応し、ＦＲ領域の全てまたは相当部分がヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１個および一般に２個の可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体または抗体フラグメントはまた免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、一般にヒト免疫グロブリンのものも含み得る。さらなる詳細について、Jones et al. (1986) NATURE 321: 522-525; Reichmann et al. (1988) NATURE 332: 323-329; Presta (1992) CURR. OP. STRUCT. BIOL. 2: 593-596を参照のこと。
【００６８】
ここで使用する用語“検出可能部分”は、プログラム可能な普遍的キメラ受容体および／または特異性作用物質に共有結合または非共有結合手段により結合する部分をいう。ある実施態様において、検出可能部分は、検出可能部分を含むプログラム可能な普遍的キメラ受容体および／または特異性作用物質の検出または定量化のための手段を提供する。他の実施態様において、検出可能部分は、検出可能部分を含むプログラム可能な普遍的キメラ受容体および／または特異性作用物質の分離および／または精製のための手段を提供する。ある実施態様において、検出可能部分は、ポリペプチド(例えば、ＧＳＴタグ、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグまたはＨＡタグ、蛍光タンパク質(例えば、ＧＦＰまたはＹＦＰ))を含む。ある実施態様において、検出可能部分は、放射性部分、蛍光部分、化学発光部分、質量標識、電荷標識または酵素(例えば、酵素の基質変換活性がプログラム可能な普遍的キメラ受容体および／または特異性作用物質の存在の確認のために観察される酵素)を含む。本発明において使用するための検出可能部分は、プログラム可能な普遍的細胞受容体および／または特異性作用物質の任意の部分に結合し得る。ある実施態様において、検出可能部分は、プログラム可能な普遍的細胞受容体のＮ末端に結合される。ある実施態様において、検出可能部分は、特異性作用物質のＮ末端に結合される。ある実施態様において、検出可能部分は、プログラム可能な普遍的細胞受容体のＣ末端に結合される。ある実施態様において、検出可能部分は、特異性作用物質のＣ末端に結合される。ある実施態様において、プログラム可能な普遍的細胞受容体および／または特異性作用物質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の検出可能部分を含む。ある実施態様において、検出可能部分は開裂可能である。他の実施態様において、検出可能部分は非開裂可能である。ある実施態様において、検出可能部分は、リンカーによりプログラム可能な普遍的細胞受容体および／または特異性作用物質に結合する。ある実施態様において、リンカーは、開裂可能である。他の実施態様において、リンカーは、非開裂可能である。
【００６９】
ここで使用する用語“特異性作用物質”は、ＰＵＣＲの触媒的抗体領域に結合(例えば、共有結合または非共有結合でコンジュゲート)できる分子をいう。該特異性作用物質は、ＰＵＣＲの触媒的抗体領域に存在する反応性アミノ酸残基に結合する反応性部分をいう。ＰＵＣＲの触媒的抗体領域に結合したとき、特異性作用物質は、ＰＵＣＲに標的分子に対する特異性を与える。ある実施態様において、特異性作用物質は、結合タンパク質(例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント)を含む。他の実施態様において、特異性作用物質は、ペプチドを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、ペプチド模倣体(例えば、ＲＧＤペプチド模倣体)を含む。他の実施態様において、特異性作用物質は、小分子(例えば、葉酸または２−[３−(１、３−ジカルボキシプロピル)−ウレイド]ペンタン二酸(ＤＵＰＡ))を含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、治療剤を含む。他の実施態様において、特異性作用物質は、ターゲティング剤(例えば、細胞ターゲティング分子)を含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、タンパク質アゴニストを含む。他の実施態様において、特異性作用物質は、代謝制御因子を含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、ホルモンを含む。他の実施態様において、特異性作用物質は、毒素を含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、増殖因子を含む。他の実施態様において、特異性作用物質は、リガンドを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、タンパク質を含む。他の実施態様において、特異性作用物質は、ペプトイドを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、ＤＮＡアプタマーを含む。他の実施態様において、特異性作用物質は、ペプチド核酸を含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、ビタミンを含む。他の実施態様において、特異性作用物質は、基質または基質アナログを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸ペプチド(ｃＲＧＤ)を含む。
【００７０】
ある実施態様において、特異性作用物質は、リンカーを含む。ある実施態様において、リンカーは、柔軟性リンカーである。ある実施態様において、リンカーは、非柔軟性リンカーである。ある実施態様において、リンカーは、開裂可能である。ある実施態様において、リンカーは、加水分解可能である。ある実施態様において、リンカーは、非開裂可能である。ある実施態様において、リンカーは、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)リンカーである。
【００７１】
他の実施態様において、特異性作用物質は、ＰＵＣＲの触媒的抗体またはその触媒的部分に共有結合により結合する。ある実施態様において、特異性作用物質は、ＰＵＣＲの触媒的抗体またはその触媒的部分に非共有結合により結合する。他の実施態様において、特異性作用物質とＰＵＣＲの触媒的抗体またはその触媒的部分の共有結合は可逆性である。ある実施態様において、特異性作用物質とＰＵＣＲの触媒的抗体またはその触媒的部分の共有結合は不可逆性である。ある実施態様において、特異性作用物質は、葉酸−ジケトン分子(２−[[４−[(２−アミノ−４−オキソ−３Ｈ−プテリジン−６−イル)メチルアミノ]ベンゾイル]アミノ]−５−[２−[２−[２−[[５−[４−(３,５−ジオキソヘキシル)アニリノ]−５−オキソ−ペンタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]−５−オキソ−ペンタン酸)である。他の実施態様において、特異性作用物質は、葉酸−アゼチジノン分子(２−[[４−[(２−アミノ−４−オキソ−３Ｈ−プテリジン−６−イル)メチルアミノ]ベンゾイル]アミノ]−５−オキソ−５−[２−[２−[３−オキソ−３−[４−[３−オキソ−３−(２−オキソアゼチジン−１−イル)プロピル]アニリノ]プロポキシ]エトキシ]エチルアミノ]ペンタン酸)である。ある実施態様において、特異性作用物質は、ＤＵＰＡ−ジケトン分子((２Ｓ)−２−[[(１Ｓ)−４−[[８−[[(１Ｓ)−１−ベンジル−２−[[(１Ｓ)−１−ベンジル−２−[２−[２−[３−[２−[２−[２−[２−[３−[４−(３,５−ジオキソヘキシル)アニリノ]−３−オキソ−プロポキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロパノイルアミノ]エトキシ]エチルアミノ]−２−オキソ−エチル]アミノ]−２−オキソ−エチル]アミノ]−８−オキソ−オクチル]アミノ]−１−カルボキシ−４−オキソ−ブチル]カルバモイルアミノ]ペンタン二酸、ここでは、ＤＫ−ＰＥＧ５−ＤＵＰＡおよびジケトン−ＰＥＧ５−ＤＵＰＡとも称する)である。他の実施態様において、特異性作用物質は、ＤＵＰＡ−アゼチジノン分子((２Ｓ)−２−[[(１Ｓ)−４−[[８−[[(１Ｓ)−１−ベンジル−２−[[(１Ｓ)−１−ベンジル−２−オキソ−２−[２−[２−[３−[２−[２−[２−[２−[３−オキソ−３−[４−[３−オキソ−３−(２−オキソアゼチジン−１−イル)プロピル]アニリノ]プロポキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロパノイルアミノ]エトキシ]エチルアミノ]エチル]アミノ]−２−オキソ−エチル]アミノ]−８−オキソ−オクチル]アミノ]−１−カルボキシ−４−オキソ−ブチル]カルバモイルアミノ]ペンタン二酸)である。ある実施態様において、特異性作用物質は、ＡＺＤ−ＰＥＧ８−ビオチン(５−[(３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ)−２−オキソ−１,３,３ａ,４,６,６ａ−ヘキサヒドロチエノ[３,４−ｄ]イミダゾール−４−イル]−Ｎ−[２−[２−[２−[２−[２−[２−[２−[３−[２−[３−オキソ−３−[４−[３−オキソ−３−(２−オキソアゼチジン−１−イル)プロピル]アニリノ]プロポキシ]エトキシ]プロパノイルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エチル]ペンタンアミド、ここでは、ＡＺＤ−ＰＥＧ８−ビオチン”とも称する)である。ある実施態様において、特異性作用物質は、アゼチジノン−ＰＥＧ５−メチルエステル(ここではＡＺＤ−ＰＥＧ５−メチルエステルとも称す���)である。ある実施態様において、特異性作用物質は、ＳＣＳ−８７３(例えば、Popkov et al. (2009) PROC. NAT'L. ACAD. SCI. USA 106(11): 4378-83参照)である。他の実施態様において、特異性作用物質は、ｃＲＧＤ−ｄｋ(例えば、Popkov et al. (2009)参照)である。
【００７２】
ここで使用する用語“結合タンパク質”は、標的分子に特異的に結合できるタンパク質またはポリペプチドをいう。ある実施態様において、結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合フラグメントであり、標的分子は抗原である。ある実施態様において、該抗原は、１以上の翻訳後修飾を含む。ある実施態様において、結合タンパク質は、標的分子(例えば、タンパク質複合体結合パートナー)に特異的に結合するタンパク質またはポリペプチドである。ある実施態様において、結合タンパク質は、リガンドである。ある実施態様において、結合タンパク質は、サイトカインである。ある実施態様において、結合タンパク質は、受容体である。ある実施態様において、標的分子は抗原である。他の実施態様において、標的分子はタンパク質である。ある実施態様において、標的分子はペプチドである。ある実施態様において、標的分子はタンパク質複合体である。ある実施態様において、標的分子は脂質である。ある実施態様において、標的分子は炭水化物である。ある実施態様において、標的分子は１以上の翻訳後修飾を含むタンパク質である。ある実施態様において、標的分子は細胞外マトリクス成分である。
【００７３】
ここで使用する用語“特異的結合”は、結合タンパク質が、標的分子と、生理的条件下で比較的安定である複合体を形成することを示す。特異的結合は、少なくとも約１×１０６Ｍ以下の平衡解離定数により特徴づけられ得る(例えば、平衡解離定数が小さいほど結合が密であることを示す)。２分子が特異的に結合するか否かを決定する方法は当分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。
【００７４】
ここで使用する用語“反応性部分”は、ＰＵＣＲの触媒的抗体またはその触媒的部分の反応性アミノ酸残基との反応に参加できる部分をいう。ある実施態様において、反応性部分は、反応性アミノ酸残基に共有結合により結合する。ある実施態様において、反応性部分は、反応性アミノ酸残基の側鎖に共有結合により結合する。ある実施態様において、反応性部分は、反応性アミノ酸残基に非共有結合により結合する。ある実施態様において、反応性部分は、ケトン、ジケトン、ベータラクタム、活性エステルハロケトン、ラクトン、無水物、マレイミド、エポキシド、アルデヒドアミジン、グアニジン、イミン、エンアミン、ホスフェート、ホスホネート、エポキシド、アジリジン、チオエポキシド、遮蔽または保護ジケトン(例えば、ケタール)、ラクタム、ハロケトン、アルデヒドなどからなる群から選択される化学基である。例えば、触媒的抗体またはその触媒的部分がアルドラーゼ抗体またはその触媒的部分であるとき(例えば、マウスまたはヒト化３８Ｃ２)、特異性作用物質は、ジケトンまたはアゼチジノン反応性部分により反応性リシン(例えば、Ｌｙｓ９３)に共有結合により結合し得る。さらに、触媒的抗体またはその触媒的部分がチオエステラーゼ抗体またはその触媒的部分であるとき、特異性作用物質は、マレイミド含有成分またはヨードアセトアミド、アリールハライド、ジスルフヒドリルなどのような他のチオール反応性基を含む反応性部分により反応性システインに共有結合により結合し得る。ある実施態様において、反応性部分は、ジケトンである。他の実施態様において、反応性部分は、アゼチジノンである。ある実施態様において、反応性部分は、Ｎ−スルホニル−ベータ−ラクタムである。
【００７５】
ここで使用する用語“コンジュゲーション官能基”は、特異性作用物質に存在する部分との反応に参加できる、ここに記載するリンカーに存在する部分をいう。ある実施態様において、コンジュゲーション官能基は、特異性作用物質に存在する部分とのクリックケミストリー反応に参加できる。ある実施態様において、コンジュゲーション官能基は、直交官能基を含む。ある実施態様において、コンジュゲーション官能基は、特異性作用物質に存在する部分と共有結合を形成できる。ある実施態様において、コンジュゲーション官能基は、特異性作用物質に存在する部分と非共有結合を形成できる。
【００７６】
ここで使用する用語“宿主細胞”は、ここに開示するプログラム可能な普遍的細胞受容体を発現するために、何らかの方法で修飾、トランスフェクト、トランスフォームおよび／または操作されているあらゆる細胞をいう。例えば、ある実施態様において、宿主細胞は、ここに開示するプログラム可能な普遍的細胞受容体をコードする外因性ポリヌクレオチド(例えば、ベクター、直線状ＤＮＡ分子、ｍＲＮＡ)を含むように修飾されている。ある実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、霊長類細胞である。ある実施態様において、細胞は、マウス細胞である。ある実施態様において、細胞は、ラット細胞である。ある実施態様において、細胞は、家畜細胞(例えば、イヌまたはネコ細胞)である。ある実施態様において、細胞は、ウマ細胞である。ある実施態様において、細胞は、ウシ細胞である。ある実施態様において、細胞は、非ヒト霊長類細胞である。ある実施態様において、細胞は、ヒト細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は対象から単離される。ある実施態様において、宿主細胞は対象に由来し、それによって細胞は対象から単離され、ここに記載のとおり修飾され、宿主細胞が由来した同じ対象に投与される。ある実施態様において、宿主細胞は対象に由来し、それによって細胞は対象から単離され、ここに記載のとおり修飾され、宿主細胞が由来したのと異なる対象に投与される。用語“宿主細胞”は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫もいうことを意図することは理解されるべきである。ある修飾が変異または環境の影響により後代に生じ得るため、このような子孫は、実際、親細胞と同じではないかもしれないが、なおここで使用する用語“宿主細胞”の範囲内に含まれる。ある実施態様において、宿主細胞は、免疫細胞である。ある実施態様において、免疫細胞は、樹状細胞、肥満細胞、好酸球、Ｔ細胞(例えば、制御性Ｔ細胞)、Ｂ細胞、細胞毒性Ｔリンパ球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、単球およびナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ)細胞からなる群から選択される。ある実施態様において、宿主細胞は、不死化細胞株からの細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、株化細胞からの細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、Ｔ細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、ＮＫ細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、ＮＫ−９２細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、修飾ＮＫ−９２細胞(例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６６７２として寄託された修飾ＮＫ−９２細胞；例えば、米国特許８,０３４,３３２にも記載)である。ある実施態様において、宿主細胞は、ＫＨＹＧ−１ナチュラルキラー細胞(ＤＳＭＺ受託番号ＡＣＣ  ７２５；例えば、Yagita et al. (2000) LEUKEMIA 14(5): 922-30参照)である。ある実施態様において、宿主細胞は、ＮＫＬナチュラルキラー細胞(例えば、Robertson et al. (1996) EXP. HEMATOL. 24(3): 406-15参照)である。ある実施態様において、宿主細胞は、細胞毒性Ｔリンパ球である。
【００７７】
ここで使用する用語“核酸”または“ポリヌクレオチド”は、ここで相互交換可能に使用し、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)またはリボ核酸(ＲＮＡ)およびこれらのポリマーをいう。特に断らない限り、本用語は、参照核酸と類似する結合性質を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似の方法で代謝される、天然ヌクレオチドの既知類似体を含む核酸を包含する。特に断らない限り、特定の核酸配列は、明示的に示す配列同様、その保存的に修飾されたバリアント(例えば、縮重コドン置換)、アレル、オルソログ、ＳＮＰおよび相補配列もまた暗示的に包含する。特異的、縮重コドン置換は、１以上の選択(または全)コドンの第三位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換される配列の産生により達成され得る(Batzer et al. (1991) NUCLEIC ACID RES. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. BIOL. CHEM. 260:2605-2608; and Rossolini et al. (1994) MOL. CELL. PROBES 8:91-98)。
【００７８】
ここで使用する用語“対象”はヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物(例えば、哺乳動物および非哺乳動物)、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ニワトリ、両生類および爬虫類を含む。明記されているとき以外、用語“患者”または“対象”はここでは相互交換可能に使用する。具体的実施態様において、癌、例えば、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、非小細胞性肺癌(ＮＳＣＬＣ)または卵巣癌を有する対象は、癌、例えば、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、ＮＳＣＬＣ、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などを有するとして先に診断されている対象である。他の実施態様において、疾患原因生物、例えば、ウイルス、プリオン、細菌、真菌、原生動物または寄生虫により引き起こされる医学的状態を有する対象は、疾患原因生物、例えば、ウイルス、プリオン、細菌、真菌、原生動物または寄生虫により引き起こされる医学的状態を有するとして診断されている対象である。ある実施態様において、医学的状態は、感染性疾患である。ある実施態様において、医学的状態は、ＨＩＶ感染である。ある実施態様において、医学的状態は、肝炎(例えば、Ｃ型肝炎)である。ある実施態様において、医学的状態は、マラリアである。ある実施態様において、医学的状態は、ジアルジア症である。
【００７９】
ここで使用する限りおよび特に断らない限り、用語“約”または“およそ”は、一部、どのように値が測定または決定されたかによる、当業者により決定された特定の値の許容される誤差である。ある実施態様において、用語“約”または“およそ”は、１、２、３または４標準偏差内を意味する。ある実施態様において、用語“約”または“およそ”は、ある値または範囲の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０.５％、０.１％または０.０５％内を意味する。
【００８０】
ここで使用する用語“単離”は、天然状態から変えられまたは移動されていることを意味する。例えば、生存動物に天然に存在する核酸またはペプチドは“単離”されていないが、一部または完全にその天然状態で併存する物質から分離されている同じ核酸またはペプチドは、“単離”されている。単離核酸またはタンパク質は、実質的に純粋な形態で存在できまたは、例えば、宿主細胞のような非天然環境で存在できる。
【００８１】
ここで使用する用語“ペプチド”、“ポリペプチド”および“タンパク質”は、相互交換可能に使用し、ペプチド結合により共有結合により結合したアミノ酸残基からなる化合物をいう。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸を含まなければならず、タンパク質またはペプチド配列を構成するアミノ酸の最大数に制限は設定されない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合により接続した、２以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチドまたはタンパク質を含む。ここで使用する用語“ポリペプチド”は、当分野で一般に、例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される短鎖および一般にタンパク質と称され、多くのタイプが存在する長鎖の両方をいう。ポリペプチドはまた、数ある中で、例えば、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同のポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質も含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチドまたはこれらの組み合わせを含む。
【００８２】
ここで使用する限りおよび特に断らない限り、用語“処置”および“処置する”は、疾患または障害(例えば、癌または疾患原因生物により引き起こされる疾患(例えば、感染性疾患))または疾患または障害と関連する１以上の症状の根絶または改善をいう。ある実施態様において、本用語は、疾患または障害(例えば、癌)を有する対象への１以上の予防剤または治療剤の投与の結果としての、このような疾患または障害の拡大または悪化の最小化をいう。
【００８３】
ここで使用する用語“トランスフェクト”または“トランスフォーム”または“形質導入”は、外因性核酸が宿主細胞に伝達または導入される過程をいう。“トランスフェクト”または“トランスフォーム”または“形質導入”細胞は、外因性核酸がトランスフェクト、トランスフォームまたは形質導入されている細胞である。細胞は、一次対象細胞およびその子孫を含む。
【００８４】
ここで使用する限りおよび特に断らない限り、用語“癌”および“癌状”は、一般に未制御の細胞増殖により特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態をいうまたはそれを表す。癌の例は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などを含むが、これらに限定されない。
【００８５】
II. 本発明の組成物
ここに提供されるのは、プログラム可能な普遍的細胞受容体(ＰＵＣＲ)を使用する、癌または感染性疾患のような疾患の処置のために使用する組成物および方法である。
【００８６】
ある態様において、本発明は、任意の目的の分子(例えば、宿主癌と関連するタンパク質または疾患原因生物タンパク質)を標的とするように操作され得る、触媒的抗体またはその触媒的部分を含む多数のプログラム可能な普遍的細胞受容体(ＰＵＣＲ)を提供する。ある態様において、本発明はＰＵＣＲを発現するように操作された細胞(例えば、Ｔ細胞)を提供し、ここで、細胞は、治療的使用のためにカスタマイズされ得る(例えば、細胞は、抗腫瘍性質を示す)。ある実施態様において、細胞(例えば、Ｔ細胞)は、ＰＵＣＲをコードする核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡでトランスフェクトされる。ある実施態様において、細胞はＰＵＣＲをコードする核酸分子でトランスフォームされ、ＰＵＣＲは、該細胞の細胞表面に発現される。ある実施態様において、細胞(例えば、Ｔ細胞)は、ＰＵＣＲをコードするウイルスベクターで形質導入される。ある実施態様において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。ある実施態様において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。ある実施態様において、細胞は、ＰＵＣＲを安定に発現する。他の実施態様において、細胞は、ＰＵＣＲを一過性に発現する。ある実施態様において、細胞は、ＰＵＣＲを誘導性に発現する
【００８７】
ある態様において、ＰＵＣＲの触媒的抗体領域は、完全長触媒的抗体または該触媒的抗体の触媒的部分を含む。ある態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分は、非ヒト(例えば、マウス)抗体またはその触媒的部分である。
【００８８】
ある態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分は、ヒト化触媒的抗体またはその触媒的部分である。非ヒト触媒的抗体またはその触媒的部分のヒト化は、非ヒト特異的残基が、ＰＵＣＲ投与を含む処置を受ける患者において抗非ヒト抗体応答を誘発し得る、臨床現場で望ましい可能性がある。
【００８９】
ある態様において、ＰＵＣＲの触媒的抗体領域は、触媒的ｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む。ある態様において、ＰＵＣＲの触媒的抗体領域は、それが由来するｓｃＦｖのマウス配列と比較して、ヒト化されている触媒的ｓｃＦｖ抗体フラグメントを含む。親マウスｓｃＦｖアミノ酸配列は、配列番号３として提供するマウス３８Ｃ２  ｓｃＦｖアミノ酸配列である。ある実施態様において、親マウスｓｃＦｖ配列は、ここで配列番号１３として提供する核酸配列によりコードされる。ある実施態様において、ＰＵＣＲの触媒的抗体領域は、配列番号４としてここに提供するヒト化３８Ｃ２  ｓｃＦｖ構築物を含む。ある実施態様において、ＰＵＣＲの触媒的抗体領域は、ここで配列番号１４として提供する核酸配列によりコードされる。
【００９０】
他の態様において、ＰＵＣＲの触媒的抗体領域は触媒的ｓｃＦａｂを含む。ある実施態様において、触媒的ｓｃＦａｂは、マウス３８Ｃ２触媒的抗体由来である。ある実施態様において、触媒的ｓｃＦａｂは、ヒト化３８Ｃ２触媒的抗体由来である。ある実施態様において、触媒的ｓｃＦａｂは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、触媒的ｓｃＦａｂは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、触媒的ｓｃＦａｂは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、触媒的ｓｃＦａｂは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、触媒的ｓｃＦａｂは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、触媒的ｓｃＦａｂは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＰＵＣＲの触媒的抗体領域は、ここで配列番号４７として提供する核酸配列によりコードされる。
【００９１】
【表１】
2018537076.tif 000002
【表２】
2018537076.tif 000003
【表３】
2018537076.tif 000004
【００９２】
ある実施態様において、該抗体フラグメントは、生化学的反応を触媒する能力を維持する点で機能的であり、例えば、それが由来する完全長触媒的抗体と同様、天然アルドラーゼ酵素を模倣する。ある実施態様において、該抗体フラグメントは、目的の特異性作用物質に結合し得るプログラム可能部分を提供する点で、機能的である。ある実施態様において、該抗体フラグメントは、目的のリンカーに結合し得るプログラム可能部分を提供する点で、機能的である。
【００９３】
ある態様において、本発明のＰＵＣＲは、配列が哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞)における発現のためにコドン最適化されている導入遺伝子によりコードされる。ある実施態様において、本発明のＰＵＣＲ構築物全体は、配列全体が哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞)における発現のためにコドン最適化されている導入遺伝子によりコードされる。他の実施態様において、本発明のＰＵＣＲ構築物の領域は、非コドン最適化配列領域およびコドン最適化配列領域を含む導入遺伝子によりコードされる。コドン最適化は、コーディングＤＮＡ中の同義コドン(すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン)の発生頻度が、生物毎に偏っているとの発見をいう。このようなコドン縮重は、多様なヌクレオチド配列により同一ポリペプチドがコードされることを可能とする。多様なコドン最適化方法は、当分野で知られる(例えば、米国特許５,７８６,４６４号および６,１１４,１４８号参照)。ある態様において、本発明のＰＵＣＲは、細胞内ドメインを含む。ある実施態様において、細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインを含む。例えば、ある実施態様において、シグナル伝達ドメインは、次のタンパク質ＣＤ３−ゼータ鎖、４−１ＢＢおよびＣＤ２８シグナル伝達モジュールおよびこれらの任意の組み合わせの、しかしこれに限定されないシグナル伝達ドメインまたはこれらのフラグメントを含む。ある実施態様において、細胞内ドメインは、共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。例えば、ある実施態様において、共刺激性シグナル伝達ドメインは、次のタンパク質ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３リガンドおよびこれらの任意の組み合わせの、しかし、これに限定されない細胞内ドメインまたはフラグメントを含む。
【００９４】
ある態様において、本発明のＰＵＣＲは、膜貫通ドメインを含む。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、次のタンパク質Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、Ｔ細胞受容体のベータ鎖、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＦＡ−１Ｔ細胞共受容体、ＣＤ２Ｔ細胞共受容体／接着分子、ＣＤ８アルファおよびこれらの任意の組み合わせの膜貫通ドメインまたはこれらのフラグメントを含む。
【００９５】
本発明のある態様において、ＰＵＣＲは、ヒンジ領域を含む。ある実施態様において、該ヒンジ領域は、ＣＤ８ヒンジ領域である。ある実施態様において、該ヒンジ領域はＣＤ２８ヒンジ領域である。ある実施態様において、該ヒンジ領域は、ハイブリッドＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域である。
【００９６】
本発明のある態様において、ＰＵＣＲは、特異性作用物質にコンジュゲート(すなわち、結合)する。ある実施態様において、特異性作用物質は、結合タンパク質(例えば、抗原またはその抗原結合フラグメント)、ペプチド、ペプチド模倣体、小分子、治療剤、ターゲティング剤、タンパク質アゴニスト、タンパク質アンタゴニスト、代謝制御因子、ホルモン、毒素または増殖因子の１以上である。
【００９７】
さらに、ある態様において、本発明は、ＰＵＣＲ組成物および、数ある疾患の中で、癌および疾患原因生物が原因の疾患の処置のための医薬または方法におけるこれらの使用を提供する。本発明のある態様において、ＰＵＣＲは腫瘍増殖の阻害に使用できる。本発明の他の態様において、ＰＵＣＲは感染因子(例えば、細菌、原生動物、真菌または寄生虫のような疾患原因生物)の殺滅に使用できる。
【００９８】
ある態様において、本発明はＰＵＣＲを発現するように操作された細胞(例えば、Ｔ細胞)を提供し、ここで、ＰＵＣＲは、任意の目的の分子(例えば、抗原)を標的とするようプログラム可能である。ある実施態様において、目的の分子は、癌と関連するタンパク質である。ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、癌細胞の細胞膜に存在する。ある実施態様において、目的の分子は疾患原因生物からの抗原である。ある実施態様において、目的の分子は疾患原因生物の細胞膜に存在する疾患原因生物からの抗原である。ある実施態様において、目的の分子は、疾患原因生物の細胞の細胞膜に存在する抗原である。ある実施態様において、目的の分子は疾患原因生物により感染された宿主細胞の細胞膜に存在する疾患原因生物からの抗原である。ある実施態様において、目的の分子は細胞外マトリクス成分である。ある実施態様において、目的の分子は複合体炭水化物含有分子(例えば、糖タンパク質)である。ある実施態様において、目的の分子はウイルスタンパク質である。ある実施態様において、目的の分子はタンパク質複合体である。
【００９９】
ある態様において、本発明は、疾患(例えば、癌または感染性疾患)の処置に使用するためのカスタマイズされた治療的宿主細胞を製造する方法を提供する。他の態様において、本発明は、処置を必要とする対象における癌の処置または腫瘍増殖阻害の方法を提供する。ある態様において、本発明は、さらに疾患原因生物(例えば、細菌、ウイルス、プリオン、真菌、寄生虫または原生動物)により引き起こされる医学的状態を処置する方法を提供する。
【０１００】
ある態様において、本発明は、ここに記載するＰＵＣＲを発現する宿主細胞を含むキットを提供する。
【０１０１】
Ａ. プログラム可能な普遍的細胞受容体(ＰＵＣＲ)
本発明は、プログラム可能な普遍的細胞受容体(ＰＵＣＲ)をコードする配列を含む単離核酸分子を包含し、ここで、ＰＵＣＲは触媒的抗体またはその触媒的部分を含み、ここで、触媒的抗体またはその部分の配列は、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインをコードする核酸配列と隣接し、同じリーディングフレーム内にある。ＰＵＣＲは、ＰＵＣＲに対する１以上の特異性作用物質の結合によりプログラムでき、これがここでプログラムされたＰＵＣＲを発現する細胞を、特異性作用物質が特異的結合するリガンドを標的とすることを可能とするため、特に有利である。それ故に、ＰＵＣＲを、望み通り、任意の目的のリガンドを標的とするようカスタマイズでき、これにより、免疫療法のために特に有利となる。
【０１０２】
本発明のある実施態様において、ＰＵＣＲは、触媒的抗体(例えば、触媒的３８Ｃ２抗体)またはその触媒的部分(例えば、ｓｃＦｖまたはｓｃＦａｂ)、ヒンジ領域(例えば、ＣＤ８ヒンジ領域またはハイブリッドＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域)、膜貫通ドメイン(例えば、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメイン)、細胞内ドメイン(例えば、ＣＤ２８細胞内ドメインおよび／またはＣＤ３ζ細胞内ドメイン)を含む。ある実施態様において、ＰＵＣＲは、さらにシグナルペプチドを含む。ある実施態様において、ＰＵＣＲは、さらに検出可能部分(例えば、ｍｙｃタグ)を含む。
【０１０３】
本発明のある実施態様において、ＰＵＣＲは、マウス３８Ｃ２  ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントまたはｓｃＦａｂ、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む。場合により、ＰＵＣＲはＮ末端シグナルペプチドを含み得る。ＰＵＣＲに包含され得る別の細胞内ドメインは、４−１ＢＢ細胞内ドメイン、ＯＸ４０細胞内ドメイン、ＣＤ３０細胞内ドメイン、ＣＤ４０細胞内ドメイン、ＩＣＯＳ細胞内ドメイン、ＬＦＡ−１細胞内ドメイン、ＣＤ２細胞内ドメイン、ＣＤ７細胞内ドメイン、ＬＩＧＨＴ細胞内ドメイン、ＮＫＧ２Ｃ細胞内ドメイン、ＣＤ８３リガンド細胞内ドメインを含む。それ故に、ある実施態様において、ＰＵＣＲは、マウス３８Ｃ２  ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメント、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインおよびＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ８３リガンド細胞内ドメインからなる群から選択される１以上の細胞内ドメインを含む。ＰＵＣＲに包含され得る別の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＦＡ−１  Ｔ細胞共受容体、ＣＤ２  Ｔ細胞共受容体／接着分子、ＣＤ４０、ＣＤ４ＯＬ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳまたはＦＧＦＲ２Ｂ由来の膜貫通ドメインを含むが、これらに限定されない。ＰＵＣＲに包含され得る別のヒンジ領域は、抗体(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ)、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎリンカーまたはＸＴＥＮペプチドのヒンジ領域を含むが、これらに限定されない。
【０１０４】
本発明のある実施態様において、ＰＵＣＲは、ヒト化３８Ｃ２  ｓｃＦｖ、ＦａｂフラグメントまたはｓｃＦａｂ、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む。場合により、ＰＵＣＲはＮ末端シグナルペプチドを含み得る。ＰＵＣＲに包含され得る別の細胞内ドメインは、４−１ＢＢ細胞内ドメイン、ＯＸ４０細胞内ドメイン、ＣＤ３０細胞内ドメイン、ＣＤ４０細胞内ドメイン、ＩＣＯＳ細胞内ドメイン、ＬＦＡ−１細胞内ドメイン、ＣＤ２細胞内ドメイン、ＣＤ７細胞内ドメイン、ＬＩＧＨＴ細胞内ドメイン、ＮＫＧ２Ｃ細胞内ドメイン、ＣＤ８３リガンド細胞内ドメインを含むが、これらに限定されない。それ故に、ある実施態様において、ＰＵＣＲは、ヒト化３８Ｃ２  ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメント、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインおよびＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ８３リガンド細胞内ドメインからなる群から選択される１以上の細胞内ドメインを含む。ＰＵＣＲに包含され得る別の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＦＡ−１  Ｔ細胞共受容体、ＣＤ２  Ｔ細胞共受容体／接着分子、ＣＤ４０、ＣＤ４ＯＬ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳまたはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメインを含むが、これらに限定されない。ＰＵＣＲに包含され得る別のヒンジ領域は、抗体(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ)、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎリンカーまたはＸＴＥＮペプチドのヒンジ領域を含むが、これらに限定されない。
【０１０５】
本発明のある実施態様において、ＰＵＣＲは、マウス３３Ｆ１２  ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントまたはｓｃＦａｂ、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む。場合により、ＰＵＣＲはＮ末端シグナルペプチドを含み得る。ＰＵＣＲに包含され得る別の細胞内ドメインは、４−１ＢＢ細胞内ドメイン、ＯＸ４０細胞内ドメイン、ＣＤ３０細胞内ドメイン、ＣＤ４０細胞内ドメイン、ＩＣＯＳ細胞内ドメイン、ＬＦＡ−１細胞内ドメイン、ＣＤ２細胞内ドメイン、ＣＤ７細胞内ドメイン、ＬＩＧＨＴ細胞内ドメイン、ＮＫＧ２Ｃ細胞内ドメイン、ＣＤ８３リガンド細胞内ドメインを含むが、これらに限定されない。それ故に、ある実施態様において、ＰＵＣＲは、マウス３３Ｆ１２  ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメント、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインおよびＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ８３リガンド細胞内ドメインからなる群から選択される１以上の細胞内ドメインを含む。ＰＵＣＲに包含され得る別の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＦＡ−１  Ｔ細胞共受容体、ＣＤ２  Ｔ細胞共受容体／接着分子、ＣＤ４０、ＣＤ４ＯＬ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳまたはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメインを含むが、これらに限定されない。ＰＵＣＲに包含され得る別のヒンジ領域は、抗体(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ)、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎリンカーまたはＸＴＥＮペプチドのヒンジ領域を含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
本発明のある実施態様において、ＰＵＣＲは、ヒト化３３Ｆ１２  ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントまたはｓｃＦａｂ、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む。場合により、ＰＵＣＲはＮ末端シグナルペプチドを含み得る。ＰＵＣＲに包含され得る別の細胞内ドメインは、４−１ＢＢ細胞内ドメイン、ＯＸ４０細胞内ドメイン、ＣＤ３０細胞内ドメイン、ＣＤ４０細胞内ドメイン、ＩＣＯＳ細胞内ドメイン、ＬＦＡ−１細胞内ドメイン、ＣＤ２細胞内ドメイン、ＣＤ７細胞内ドメイン、ＬＩＧＨＴ細胞内ドメイン、ＮＫＧ２Ｃ細胞内ドメイン、ＣＤ８３リガンド細胞内ドメインを含むが、これらに限定されない。それ故に、ある実施態様において、ＰＵＣＲは、ヒト化３３Ｆ１２  ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメント、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインおよびＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ８３リガンド細胞内ドメインからなる群から選択される１以上の細胞内ドメインを含む。ＰＵＣＲに包含され得る別の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＦＡ−１  Ｔ細胞共受容体、ＣＤ２  Ｔ細胞共受容体／接着分子、ＣＤ４０、ＣＤ４ＯＬ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳまたはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメインを含むが、これらに限定されない。ＰＵＣＲに包含され得る別のヒンジ領域は、抗体(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ)、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎリンカーまたはＸＴＥＮペプチドのヒンジ領域を含むが、これらに限定されない。
【０１０７】
本発明のある実施態様において、ＰＵＣＲは、マウス３８Ｃ２  ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントまたはｓｃＦａｂ、ハイブリッドＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む。場合により、ＰＵＣＲはＮ末端シグナルペプチドを含み得る。ＰＵＣＲに包含され得る別の細胞内ドメインは、４−１ＢＢ細胞内ドメイン、ＯＸ４０細胞内ドメイン、ＣＤ３０細胞内ドメイン、ＣＤ４０細胞内ドメイン、ＩＣＯＳ細胞内ドメイン、ＬＦＡ−１細胞内ドメイン、ＣＤ２細胞内ドメイン、ＣＤ７細胞内ドメイン、ＬＩＧＨＴ細胞内ドメイン、ＮＫＧ２Ｃ細胞内ドメイン、ＣＤ８３リガンド細胞内ドメインを含むが、これらに限定されない。それ故に、ある実施態様において、ＰＵＣＲは、マウス３８Ｃ２  ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントまたはｓｃＦａｂ、ハイブリッドＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメインおよびＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ８３リガンド細胞内ドメインからなる群から選択される１以上の細胞内ドメインを含む。ＰＵＣＲに包含され得る別の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＦＡ−１  Ｔ細胞共受容体、ＣＤ２  Ｔ細胞共受容体／接着分子、ＣＤ４０、ＣＤ４ＯＬ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳまたはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメインを含むが、これらに限定されない。ＰＵＣＲに包含され得る別のヒンジ領域は、抗体(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ)、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎリンカーまたはＸＴＥＮペプチドのヒンジ領域を含むが、これらに限定されない。
【０１０８】
本発明のある実施態様において、ＰＵＣＲは、ヒト化３８Ｃ２  ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントまたはｓｃＦａｂ、ハイブリッドＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む。場合により、ＰＵＣＲはＮ末端シグナルペプチドを含み得る。ＰＵＣＲに包含され得る別の細胞内ドメインは、４−１ＢＢ細胞内ドメイン、ＯＸ４０細胞内ドメイン、ＣＤ３０細胞内ドメイン、ＣＤ４０細胞内ドメイン、ＩＣＯＳ細胞内ドメイン、ＬＦＡ−１細胞内ドメイン、ＣＤ２細胞内ドメイン、ＣＤ７細胞内ドメイン、ＬＩＧＨＴ細胞内ドメイン、ＮＫＧ２Ｃ細胞内ドメイン、ＣＤ８３リガンド細胞内ドメインを含むが、これらに限定されない。それ故に、ある実施態様において、ＰＵＣＲは、ヒト化３８Ｃ２  ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントまたはｓｃＦａｂ、ハイブリッドＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメインおよびＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ８３リガンド細胞内ドメインからなる群から選択される１以上の細胞内ドメインを含む。ＰＵＣＲに包含され得る別の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＦＡ−１  Ｔ細胞共受容体、ＣＤ２  Ｔ細胞共受容体／接着分子、ＣＤ４０、ＣＤ４ＯＬ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳまたはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメインを含むが、これらに限定されない。ＰＵＣＲに包含され得る別のヒンジ領域は、抗体(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ)、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎリンカーまたはＸＴＥＮペプチドのヒンジ領域を含むが、これらに限定されない。
【０１０９】
本発明のある実施態様において、ＰＵＣＲは、マウス３３Ｆ１２  ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントまたはｓｃＦａｂ、ハイブリッドＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む。場合により、ＰＵＣＲはＮ末端シグナルペプチドを含み得る。ＰＵＣＲに包含され得る別の細胞内ドメインは、４−１ＢＢ細胞内ドメイン、ＯＸ４０細胞内ドメイン、ＣＤ３０細胞内ドメイン、ＣＤ４０細胞内ドメイン、ＩＣＯＳ細胞内ドメイン、ＬＦＡ−１細胞内ドメイン、ＣＤ２細胞内ドメイン、ＣＤ７細胞内ドメイン、ＬＩＧＨＴ細胞内ドメイン、ＮＫＧ２Ｃ細胞内ドメイン、ＣＤ８３リガンド細胞内ドメインを含むが、これらに限定されない。それ故に、ある実施態様において、ＰＵＣＲは、マウス３３Ｆ１２  ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントまたはｓｃＦａｂ、ハイブリッドＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメインおよびＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ８３リガンド細胞内ドメインからなる群から選択される１以上の細胞内ドメインを含む。ＰＵＣＲに包含され得る別の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＦＡ−１  Ｔ細胞共受容体、ＣＤ２  Ｔ細胞共受容体／接着分子、ＣＤ４０、ＣＤ４ＯＬ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳまたはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメインを含むが、これらに限定されない。ＰＵＣＲに包含され得る別のヒンジ領域は、抗体(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ)、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎリンカーまたはＸＴＥＮペプチドのヒンジ領域を含むが、これらに限定されない。
【０１１０】
本発明のある実施態様において、ＰＵＣＲは、ヒト化３３Ｆ１２  ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントまたはｓｃＦａｂ、ハイブリッドＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む。場合により、ＰＵＣＲはＮ末端シグナルペプチドを含み得る。ＰＵＣＲに包含され得る別の細胞内ドメインは、４−１ＢＢ細胞内ドメイン、ＯＸ４０細胞内ドメイン、ＣＤ３０細胞内ドメイン、ＣＤ４０細胞内ドメイン、ＩＣＯＳ細胞内ドメイン、ＬＦＡ−１細胞内ドメイン、ＣＤ２細胞内ドメイン、ＣＤ７細胞内ドメイン、ＬＩＧＨＴ細胞内ドメイン、ＮＫＧ２Ｃ細胞内ドメイン、ＣＤ８３リガンド細胞内ドメインを含むが、これらに限定されない。それ故に、ある実施態様において、ＰＵＣＲは、ヒト化３３Ｆ１２  ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントまたはｓｃＦａｂ、ハイブリッドＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメインおよびＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ８３リガンド細胞内ドメインからなる群から選択される１以上の細胞内ドメインを含む。ＰＵＣＲに包含され得る別の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＦＡ−１  Ｔ細胞共受容体、ＣＤ２  Ｔ細胞共受容体／接着分子、ＣＤ４０、ＣＤ４ＯＬ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳまたはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメインを含むが、これらに限定されない。
【０１１１】
ＰＵＣＲに包含され得る別のヒンジ領域は、抗体(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ)、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎリンカーまたはＸＴＥＮペプチドのヒンジ領域を含むが、これらに限定されない。
【０１１２】
１. 触媒的抗体
本発明のある態様において、ＰＵＣＲは、ここで“触媒的抗体領域”と称する触媒的抗体またはその触媒的部分を含む。触媒的抗体は、多様な分子と自己集合過程において反応させ、該分子と連結するようになる反応性アミノ酸残基を含む免疫グロブリンである(例えば、Guo et al. (2006) Proc. NAT'L. Acad. Sci. USA 103(29): 11009-14；米国特許５,７３３,７５７号参照)。多くの触媒的抗体およびそれを産生する方法は、当分野で知られる(例えば、米国特許６,２１０,９３８号、６,３６８,８３９号、６,３２６,１７６号、６,５８９,７６６号、および５,９８５,６２６、５,７３３,７５７号、５,５００,３５８号、５,１２６,２５８号、５,０３０,７１７号および４,６５９,５６７号参照；これらの全内容は引用によりその全体を本明細書に包含させる)。本発明のＰＵＣＲにおいて使用するのに適する触媒的抗体は、インビボでの慣用の免疫化、反応性免疫化またはインビトロでのファージディスプレイを用いるような反応性選択により得ることができる。
【０１１３】
ある実施態様において、触媒的抗体はアルドラーゼ触媒的抗体である。アルドラーゼ触媒的抗体は、ε−アミノ基を有する反応性リシン残基(例えば、マウスまたはヒト化３８Ｃ２のＬｙｓ９３)を含む。この反応性リシン残基を介し、これらの抗体は、天然アルドラーゼのエナミン機序を使用してアルドール反応およびレトロ−アルドール反応を触媒する(Wagner et al. (1995) SCIENCE 270, 1797-1800; Barbas et al. (1997) SCIENCE 278, 2085-2092; Zhong et al. (1999) ANGEW. CHEM. INT. ED. 38, 3738-3741; Karlstrom et al. (2000) PROC. NAT'L. ACAD. SCI. USA, 97: 3878-3883)。それ故に、アルドラーゼ触媒的抗体は、目的の特異性作用物質と結合するケトン、ジケトン、ベータラクタム、活性エステルハロケトン、ラクトン、無水物、マレイミド、エポキシド、アルデヒドアミジン、グアニジン、イミン、エンアミン、ホスフェート、ホスホネート、エポキシド、アジリジン、チオエポキシド、遮蔽または保護ジケトン(例えばケタール)、ラクタム、ハロケトン、アルデヒドなどを含む反応性部分と共有結合により結合し得る。ある実施態様において、触媒的抗体は、マウス抗体３８Ｃ２または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。ある実施態様において、触媒的抗体は、マウス抗体３３Ｆ１２または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである(例えば、Goswami et al. (2009) BIOORG. MED. CHEM. LETT. 19(14): 3821-4参照)。ある実施態様において、触媒的抗体は、ハイブリドーマ４０Ｆ１２により産生される抗体(Zhu et al., (2004) J. MOL. BIOL. 343: 1269-80; Rader et al., (1998))または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。ある実施態様において、触媒的抗体は、ハイブリドーマ４２Ｆ１により産生される抗体(Ｚhu et al., (2004); Rader et al., (1998))または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。他の実施態様において、触媒的抗体は、ハイブリドーマ８５Ａ２により産生される抗体(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１５)または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。ある実施態様において、触媒的抗体は、ハイブリドーマ８５Ｃ７により産生される抗体(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１４)または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。他の実施態様において、触媒的抗体は、ハイブリドーマ９２Ｆ９により産生される抗体(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１７)または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。ある実施態様において、触媒的抗体は、ハイブリドーマ９３Ｆ３により産生される抗体(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２３)または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。他の実施態様において、触媒的抗体は、ハイブリドーマ８４Ｇ３により産生される抗体(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２４)または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。ある実施態様において、触媒的抗体は、ハイブリドーマ８４Ｇ１１により産生される抗体(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１８)または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。他の実施態様において、触媒的抗体は、ハイブリドーマ８４Ｈ９により産生される抗体(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１９)または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。ある実施態様において、触媒的抗体は、ハイブリドーマ８５Ｈ６により産生される抗体(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２５)または���抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。他の実施態様において、触媒的抗体は、ハイブリドーマ９０Ｇ８により産生される抗体(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１６)または該抗体のキメラもしくはヒト化バージョンである。さらなるアルドラーゼ触媒的抗体は当分野で知られる(例えば、Kumar et al. (2009) BIOORG. MED. CHEM. LETT. 19(14): 3821-4参照)。
【０１１４】
他の触媒的抗体も本発明のＰＵＣＲにおいて使用し得る。例えば、ある実施態様において、触媒的抗体はベータラクタマーゼ触媒的抗体である。他の実施態様において、触媒的抗体はエステラーゼ触媒的抗体である(例えば、Wirsching et al. (1995) SCIENCE 270: 1775-82参照)。ある実施態様において、触媒的抗体はアミダーゼ触媒的抗体である。他の実施態様において、触媒的抗体はチオエステラーゼ触媒的抗体である(例えば、Janda et al. (1994) PROC. NAT'L. ACAD. SCI. USA 91: 2532-2536参照)。
【０１１５】
ある実施態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分は、反応性システイン残基、反応性チロシン残基、反応性リシン残基および反応性セリン残基からなる群から選択される反応性アミノ酸残基を含む。例えば、チオエステラーゼ触媒的抗体は、反応性システイン残基を含む。チオエステラーゼ触媒的抗体は、マレイミド含有部分またはヨードアセトアミド、アリールハライド、ジスルフヒドリルなどのような他のチオール反応性基と共有結合により結合し得る。
【０１１６】
ある実施態様において、本発明のＰＵＣＲにおいて使用する触媒的抗体またはその触媒的部分は、可逆性共有結合を形成する触媒的抗体である。他の実施態様において、本発明のＰＵＣＲにおいて使用する触媒的抗体またはその触媒的部分は、非可逆性共有結合を形成する触媒的抗体である。例えば、１,３−ジケトンでの反応性免疫化に由来する触媒的抗体は、可逆性共有結合を形成する。この可逆性のため、アルドラーゼ抗体(例えば、３８Ｃ２)に結合するジケトン誘導体化合物を含む反応性部分は、共有結合ハプテンＪＷ(Wagner et al. (1995) SCIENCE 270, 1797-800)または関連化合物との競合により抗体から遊離され得る。これは、必要に応じて、特異性作用物質のＰＵＣＲへのコンジュゲーションの即時の中和を可能とする。あるいは、触媒的抗体は、非可逆性共有結合を形成する。非可逆性共有結合を形成する触媒的抗体の使用は、ＰＵＣＲがジケトンである反応性部分を含む特異性作用物質でプログラムされたとき、特に有利であり得る。何らかの特定の理論に拘束されることを望まないが、該非可逆性共有結合は、周囲環境のｐＨに係わらず安定であると考えられる(例えば、ｐＨ３.０〜ｐＨ１１.０)。この安定性は、ある腫瘍環境が、正常組織環境と比較して低いｐＨを示すため、腫瘍をターゲティングするとき特に有利である。この安定性はまた本発明のＰＵＣＲの製剤、輸送および保存にも有利である。
【０１１７】
ある実施態様において、本発明のＰＵＣＲにおいて使用する触媒的抗体の触媒的部分はｓｃＦｖである。ある実施態様において、ｓｃＦｖは、マウスアルドラーゼ触媒的抗体３８Ｃ２由来ｓｃＦｖである。他の実施態様において、ｓｃＦｖは、ヒト化アルドラーゼ触媒的抗体３８Ｃ２由来ｓｃＦｖである。ある実施態様において、ｓｃＦｖは、マウスアルドラーゼ触媒的抗体３３Ｆ１２由来ｓｃＦｖである。他の実施態様において、ｓｃＦｖは、ヒト化アルドラーゼ触媒的抗体３３Ｆ１２由来ｓｃＦｖである。
【０１１８】
ｓｃＦｖｓは、当分野で知られる方法により製造できる(例えば、Hust et al. (2007) BMC BIOTECHNOL. 7:14; and Koerber et al. (2015) J. MOL. BIOL. 427(2): 576-86参照)。ｓｃＦｖ分子は、可動性ポリペプチドリンカーを使用してＶＨ領域とＶＬ領域を一緒に連結することにより製造できる。ある実施態様において、本発明において使用するｓｃＦｖは、最適化された長さおよび／またはアミノ酸組成のリンカー(例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー)を含む。リンカー長は、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折りたたまれ、相互作用するかに大きく影響し得る。リンカー配向およびサイズの例について、例えば、Hollinger et al. (1993) PROC. NAT'L. ACAD. SCI. USA 90: 6444-6448、米国特許公開２００５／０１００５４３号、２００５／０１７５６０６号、２００７／００１４７９４号およびＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０２０２５８号およびＷＯ２００７／０２４７１５号を参照のこと(これらの内容は、特にリンカーに関する開示は、引用により本明細書に包含させる)。
【０１１９】
ある実施態様において、本発明のＰＵＣＲにおいて使用するｓｃＦｖは、ＶＬ領域とＶＨ領域の間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上のアミノ酸残基のリンカーを含む。リンカー配列は、あらゆる天然に存在するアミノ酸を含み得る。ある実施態様において、リンカー配列は、アミノ酸グリシンおよびセリンを含む。他の実施態様において、リンカー配列は、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎ(式中、ｎは１以上の正の整数である)(配列番号２１)のようなグリシンおよびセリン反復を含む。他の実施態様において、リンカーは、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号２２)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号２３)である。リンカー長の変動は、活性を維持または増強させ、活性試験で優れた効果を生じさせ得る。
【０１２０】
ある実施態様において、本発明のＰＵＣＲにおいて使用する触媒的抗体の触媒的部分は、ｓｃＦａｂである。ある実施態様において、ｓｃＦａｂは、マウスアルドラーゼ触媒的抗体３８Ｃ２由来ｓｃＦａｂである。他の実施態様において、ｓｃＦａｂは、ヒト化アルドラーゼ触媒的抗体３８Ｃ２由来ｓｃＦａｂである。ある実施態様において、ｓｃＦａｂは、マウスアルドラーゼ触媒的抗体３３Ｆ１２由来ｓｃＦａｂである。他の実施態様において、ｓｃＦａｂは、ヒト化アルドラーゼ触媒的抗体３３Ｆ１２由来ｓｃＦａｂである。
【０１２１】
ｓｃＦａｂｓは、当分野で知られる方法により製造できる(例えば、Hust et al. (2007) BMC BIOTECHNOL. 7:14;およびKoerber et al. (2015) J. MOL. BIOL. 427(2): 576-86)。ある実施態様において、ｓｃＦａｂは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２〜５０アミノ酸のポリペプチドリンカーを含む。ある実施態様において、ポリペプチドリンカーは、ポリＧｌｙＳｅｒリンカー(例えば、配列番号５４のリンカー)である。当業者には、本発明のＰＵＣＲにおいて使用する触媒的抗体またはその触媒的部分が、触媒的活性を除去するのではなく、触媒的活性を増加または減少するために、アミノ酸配列を(野生型触媒的抗体またはその触媒的部分と比較して)変えるために修飾し得ることは理解される。ある実施態様において、触媒的抗体またはその触媒的部分(例えば、ｓｃＦｖ)は、ここに開示する触媒的抗体またはその触媒的部分と実質的に同一である。
【０１２２】
２以上の核酸またはポリペプチド配列の状況での同一性パーセントは同じである２以上の配列をいう。２個の配列は、次の配列比較アルゴリズムの一つまたは手動アラインメントおよび目視検査を使用して測定して、比較窓または指定領域にわたり最大対応となるために比較およびアラインしたとき、２個の配列が特定のパーセンテージ(例えば、特定領域にわたり、または、特定していないとき、配列全体にわたり６０％同一性、場合により７０％、７１％。７２％。７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％,８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性)の同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドを有するならば、“実質的に同一”である。ある実施態様において、同一性は、少なくとも約３０ヌクレオチド(または１０アミノ酸)長である領域またはより好ましくは６０〜１５０または６００以上のヌクレオチド(または２０、５０、２００以上のアミノ酸)長である領域にわたり存在する。
【０１２３】
配列比較のため、一般にある配列が参照配列として役立ち、それに対し試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験および参照配列をコンピューターに入力し、必要であれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを使用でき、または別のパラメーターを指定できる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づき参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列のアラインメントの方法は当分野で周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith and Waterman (1970) ADV. APPL. MATH. 2: 482cの局所相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. MOL. BIOL. 48: 443-53の相同性ラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) PROC. NAT'L. ACAD. SCI. USA 85: 2444の類似性の検索方法、これらのアルゴリズムのコンピューター履行(Wisconsin Genetics Software PackageにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ)または手動アラインメントおよび目視検査により実施できる。パーセント配列同一性および配列類似性決定に適するアルゴリズムの二つの例はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２.０アルゴリズムであり、これは、それぞれAltschul et al., (1977) NUC. ACIDS RES. 25: 3389-3402およびAltschul et al. (1990) J. MOL. BIOL. 215: 403-410に記載される。ＢＬＡＳＴ分析実施のためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationから一般に入手可能である。２アミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)に組み込まれている、E. Meyers and W. Miller (1988) COMPUT. APPL. BIOSCI. 4:11-17を使用して、ＰＡＭ  １２０加重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して決定できる。さらに、２アミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ(www.gcg.comで入手可能)におけるＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch (1970) J. MOL. BIOL. 48:444-453に記載のアルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスおよびギャップ加重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ加重１、２、３、４、５または６を使用しても決定できる。
【０１２４】
２. 膜貫通ドメイン
本発明のＰＵＣＲの膜貫通ドメインは、当分野で知られるすべての形態であり得る。ここで使用する用語“膜貫通ドメイン”は、細胞膜、好ましくは真核生物細胞膜(例えば、哺乳動物細胞膜)で熱力学的に安定なすべてのポリペプチド構造をいう。ここに開示するＰＵＣＲにおける使用に適合性である膜貫通ドメインは、あらゆる天然に存在する膜貫通タンパク質またはそのフラグメントから得ることができる。あるいは、膜貫通ドメインは、細胞膜(例えば、哺乳動物細胞膜)で熱力学的に安定である合成の、天然に存在しない膜貫通タンパク質またはそのフラグメント、例えば、疎水性タンパク質セグメントであり得る。典型的膜貫通ドメインは、細胞膜二重層の約３０オングストロームに及ぶらせんを形成する約１５〜約３５疎水性アミノ酸残基を含む。
【０１２５】
ある実施態様において、膜貫通ドメインは、Ｉ型膜タンパク質、すなわち、タンパク質のＮ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のＣ末端が細胞質側に存在するように配向された単一膜貫通領域を有する膜タンパク質に由来する。ある実施態様において、膜貫通タンパク質は、II型膜タンパク質、すなわち、タンパク質のＣ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のＮ末端が細胞質側に存在するように配向された単一膜貫通領域を有するII膜タンパク質に由来し得る。さらに他の実施態様において、膜貫通ドメインは、III型膜タンパク質、すなわち、複数膜貫通セグメントを有する膜タンパク質に由来する。
【０１２６】
ある実施態様において、本発明のＰＵＣＲの膜貫通ドメインは、Ｉ型１回膜貫通タンパク質に由来する。１回膜貫通タンパク質は、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＦＡ−１  Ｔ細胞共受容体、ＣＤ２  Ｔ細胞共受容体／接着分子、ＣＤ４０、ＣＤ４ＯＬ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳおよびＦＧＦＲ２Ｂを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、次のＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＦＡ−１  Ｔ細胞共受容体、ＣＤ２  Ｔ細胞共受容体／接着分子、ＣＤ４０、ＣＤ４ＯＬ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳおよびＦＧＦＲ２Ｂから選択される膜タンパク質に由来する。ある実施態様において、膜貫通ドメインはＣＤ８αに由来する。ある実施態様において、膜貫通ドメインは４−１ＢＢ／ＣＤ１３７に由来する。他の実施態様において、膜貫通ドメインはＣＤ２８またはＣＤ３４に由来する。ある実施態様において、膜貫通ドメインは合成である。ある実施態様において、合成膜貫通ドメインは主にロイシンおよびバリンのような疎水性残基を含む。ある実施態様において、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見られる。場合により、例えば、２〜１０アミノ酸長のポリペプチドリンカーは、ＰＵＣＲの膜貫通ドメインと細胞内ドメインの間の結合を形成し得る。ある実施態様において、ポリペプチドリンカーは、グリシン−セリンダブレットである。
【０１２７】
ここに記載するＰＵＣＲにおいて使用する膜貫通ドメインは、少なくとも合成の、天然に存在しないタンパク質セグメントの部分も含み得る。ある実施態様において、膜貫通ドメインは、合成の、天然に存在しないアルファらせんまたはベータシートである。ある実施態様において、タンパク質セグメントは、少なくともおよそ２０アミノ酸、例えば、少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０またはそれ以上のアミノ酸長である。合成膜貫通ドメインの例は当分野で、例えば米国特許７,０５２,９０６Ｂ１号およびＰＣＴ公開ＷＯ２０００／０３２７７６Ａ２号において知られる(これらの内容、特に合成膜貫通ドメインに関する開示は引用により本明細書に包含させる)。
【０１２８】
ある実施態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列はシステイン残基を含まない。ある実施態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は１個のシステイン残基を含む。ある実施態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は２システイン残基を含む。ある実施態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は２個のを超える(例えば、３、４、５またはそれ以上の)システイン残基を含む。
【０１２９】
ある実施態様において、ＰＵＣＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζの膜貫通ドメインまたはその機能的部分、例えば、アミノ酸配列LDPKLCYLLDGILFIYGVILT ALFLRVK(配列番号６)または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上配列同一性であるアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインを含む。ある実施態様において、ＰＵＣＲの膜貫通ドメインは、配列番号１６の核酸配列または配列番号１６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上配列同一性を有する核酸配列によりコードされるＣＤ３ζの膜貫通ドメインを含む。アミノ酸配列LCYLLDGILFIYGVILTALFL(配列番号３８)は、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン配列の規定疎水性ストレッチである。
【０１３０】
ある実施態様において、ＰＵＣＲの膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメイン(例えば、受託番号Ｐ０１７４７.１)またはその機能的部分、例えばアミノ酸配列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(配列番号２４)または配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上配列同一性であるアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインを含む。ある実施態様において、ＣＤ２８の膜貫通ドメインはアミノ酸配列IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVL VVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(配列番号２５)または配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上配列同一性であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＰＵＣＲの膜貫通ドメインは、配列番号６１の核酸配列または配列番号６１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上配列同一性を有する核酸配列によりコードされるＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む。
【０１３１】
３. 細胞内ドメイン
ここに開示するＰＵＣＲは、細胞内ドメインまたは領域を含む。ある実施態様において、ＰＵＣＲの細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインを含む。シグナル伝達ドメインは、一般にＰＵＣＲが発現される細胞(例えば、免疫細胞(例えば、Ｔ細胞)の正常エフェクター機能の少なくとも一つの活性化を担う。用語“エフェクター機能”は、細胞の特殊化機能をいう。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性を含み得る。それ故に、用語“シグナル伝達ドメイン”は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化機能を実施するよう指示するタンパク質の部分をいう。通常細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合鎖またはドメイン全体の使用は必要ではない。それ故に、細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分を使用する限り、このような切断部分を、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトドメインの代わりに使用し得る。用語“シグナル伝達ドメイン”は、それ故に、エフェクター機能シグナル伝達に十分なシグナル伝達ドメインのあらゆる切断部分を含み得る。しかしながら、ある実施態様において、ＰＵＣＲは、ＰＵＣＲが発現される細胞において機能シグナルを有効に伝達しないシグナル伝達ドメインを含む。ここに開示するＰＵＣＲにおいて使用するのに適する細胞内シグナル伝達ドメインの例は、抗原受容体結合後シグナル伝達の開始に協調して作用するＴ細胞受容体(ＴＣＲ)および共受容体の細胞質配列ならびにこれらの配列のあらゆる誘導体またはバリアントならびに同じ機能的能力を有するあらゆる組み換え配列を含む。
【０１３２】
一次シグナル伝達ドメインは、刺激性方向または阻害性方向でＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する。刺激性方法で作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)として知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明のＰＵＣＲにおいて使用するためのＩＴＡＭを含む一次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄのシグナル伝達ドメインを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、本発明のＰＵＣＲは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン。他の実施態様において、本発明のＰＵＣＲは、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含む。本発明のある実施態様において、ＰＵＣＲは、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメイン(ＣＤ１３７としても既知)を含む。本発明のある実施態様において、ＰＵＣＲは、ここに記載するシグナル伝達ドメインの２以上の組み合わせを含む。本発明のある実施態様において、ＰＵＣＲは、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインの両方を含む。本発明のある実施態様において、ＰＵＣＲは、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインの両方を含む。本発明のある実施態様において、ＰＵＣＲは、ａ４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインの両方を含む。
【０１３３】
本発明のある実施態様において、ＰＵＣＲは、ＣＤ２８の細胞内ドメインを含む。ある実施態様において、ＣＤ２８細胞内ドメインは、配列番号７もしくはその機能的部分のアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上配列同一性であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＣＤ２８細胞内ドメインは、配列番号１７の核酸配列または配列番号１７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。
【０１３４】
本発明のある実施態様において、ＰＵＣＲは、ＣＤ３ζの細胞内ドメインを含む。ある実施態様において、ＣＤ３ζの細胞内ドメインは、配列番号８もしくはその機能的部分のアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上配列同一性であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＣＤ３ζ細胞内ドメインは、配列番号１８の核酸配列または配列番号１８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。
【０１３５】
本発明のある実施態様において、ＰＵＣＲは、ＣＤ３ζの細胞内ドメインを含む。ある実施態様において、ＣＤ３ζの細胞内ドメインは、配列番号５９もしくはその機能的部分のアミノ酸配列または配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上配列同一性であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＣＤ３ζ細胞内ドメインは、配列番号６２の核酸配列または配列番号６２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。
【０１３６】
本発明のある実施態様において、ＰＵＣＲは、４−１ＢＢの細胞内ドメインを含む。４−１ＢＢは、ＣＤ２８活性化後に発現される腫瘍壊死因子受容体ファミリーメンバーである。ある実施態様において、４−１ＢＢ細胞内ドメインは、アミノ酸配列KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQ TTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(配列番号２６)、その機能的部分または配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上配列同一性であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、４−１ＢＢ細胞内ドメインは、配列番号２７の核酸配列または配列番号２７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。
【０１３７】
【表４】
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【０１３８】
ある実施態様において、本発明のＰＵＣＲにおいて使用するシグナル伝達ドメインは、天然ＩＴＡＭと比較して改変(例えば、変異または切断)されている修飾ＩＴＡＭを含む。ある実施態様において、該修飾ＩＴＡＭは、天然ＩＴＡＭと比較して活性が増加している。ある実施態様において、該修飾ＩＴＡＭは、天然ＩＴＡＭと比較して活性が減少している。ある実施態様において、シグナル伝達ドメインは１ＩＴＡＭを含む。ある実施態様において、シグナル伝達ドメインは、複数(例えば、１、２、３、４またはそれ以上)のＩＴＡＭを含む。
【０１３９】
ある実施態様において、本発明のＰＵＣＲの細胞内ドメインは、共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、本発明のＰＵＣＲの細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインおよび共刺激性ドメインを含む。ここで使用する用語“共刺激性シグナル伝達ドメイン”は、応答、例えば、エフェクター機能を誘発するために細胞内でシグナル伝達に介在するタンパク質の部分をいう。本発明のＰＵＣＲの共刺激性シグナル伝達ドメインは、シグナルを伝達し、免疫細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)が介在する応答を調節する、共刺激性タンパク質からの細胞質シグナル伝達ドメインであり得る。
【０１４０】
キメラ受容体において使用するための刺激性シグナル伝達ドメインは、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー(例えば、Ｂ７−１／ＣＤ８０、Ｂ７−２／ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ７−Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７−Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣおよびＰＤＣＤ６)；ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー(例えば、４−１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン−アルファ／ＴＮＦ−ベータ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ  ＲII／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ)；インターロイキン−１受容体／トール様受容体(ＴＬＲ)スーパーファミリーのメンバー(例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９およびＴＬＲ１０)；ＳＬＡＭファミリーのメンバー(例えば、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ−３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６およびＳＬＡＭ／ＣＤ１５０)；および任意の他の共刺激性分子、例えばＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ−１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ−ＤＲ、ｉｋａｒｏｓ、インテグリンアルファ４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンアルファ４ベータ１、インテグリンアルファ４ベータ７／ＬＰＡＭ−１、ＬＡＧ−３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＭＹＤ８８、ＴＲＩＦ、ＴＩＲＡＰ、ＴＲＡＦ、デクチン−１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ−１／ＫＩＭ−１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ−４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ  Ｒ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)およびＮＫＧ２Ｃを含むが、これらに限定されない共刺激性タンパク質の細胞質シグナル伝達ドメインであり得る。ある実施態様において、共刺激性ドメインは、α４β１インテグリン、β２インテグリン(ＣＤ１１ａ−ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１８)、ＣＤ２２６、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２７、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ８０、ＮＫＧ２Ｄ、ＫＩＲ−Ｓ、ＣＤ１００、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＥＮ５、ＣＥＡＣＡＭ１、ＢＹ５５、ＣＲＡＣＣ、Ｌｙ９、ＣＤ８４、ＮＴＢＡ、２Ｂ４、ＳＡＰ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＥＡＴ２、ＦｃＲγ、ＣＤ３ζおよびＥＲＴからなる群から選択される活性化受容体タンパク質の細胞内ドメインを含む。ある実施態様において、共刺激性ドメインは、ＫＩＲ−Ｌ、ＬＩＬＲＢ１、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＫＬＲＧ−１、ＮＫＲ−Ｐ１Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＣＥＡＣＡＭ、ＳＩＧＬＥＣ  ３、ＳＩＧＬＥＣ  ７、ＳＩＧＬＥＣ９およびＬＡＩＲ−１からなる群から選択される阻害性受容体タンパク質の細胞内ドメインを含む。ある実施態様において、共刺激性ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３と特異的結合するリガンドなどからなる群から選択されるタンパク質の細胞内ドメインを含む。
【０１４１】
ある実施態様において、共刺激性本発明のＰＵＣＲにおいて使用するシグナル伝達ドメインは、天然共刺激性シグナル伝達ドメインと比較して改変(例えば、変異または切断)されている修飾共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、共刺激性シグナル伝達ドメインは、野生型共刺激性シグナル伝達ドメインと比較して最大１０アミノ酸残基差異(例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０)を含む。１以上のアミノ酸差異を含む共刺激性シグナル伝達ドメインは、バリアント共刺激性シグナル伝達ドメインと称し得る。共刺激性シグナル伝達ドメインの１以上のアミノ酸残基の変異は、変異を含まない共刺激性シグナル伝達ドメインと比較して、シグナル伝達を増強し、細胞応答の刺激の増強をもたらし得る。共刺激性シグナル伝達ドメインの１以上のアミノ酸残基の変異は、変異を含まない共刺激性シグナル伝達ドメインと比較して、あるいはシグナル伝達を減少させ、細胞応答の刺激の低減をもたらし得る。例えば、天然ＣＤ２８アミノ酸配列の残基１８６および１８７の変異は、ＰＵＣＲの共刺激性シグナル伝達ドメインによる共刺激性活性の増加および免疫応答誘導をもたらし得る。ある実施態様において、変異は、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインにおける１８６位および１８７位の各々のリシンのグリシン残基への置換であり、ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアントと称する。ドメインの共刺激性活性を増強または低減し得る共刺激性シグナル伝達ドメインにおいて行い得る付加的な変異は、当業者には明らかである。
【０１４２】
ある実施態様において、本発明のＰＵＣＲは、１を超える共刺激性シグナル伝達ドメイン(例えば、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上の共刺激性シグナル伝達ドメイン)を含み得る。ある実施態様において、ＰＵＣＲは、ここに記載する任意の２以上の共刺激性タンパク質のような、異なる共刺激性タンパク質からの２以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。ある実施態様において、ＰＵＣＲは、同じ共刺激性タンパク質からの２以上の共刺激性シグナル伝達ドメイン(すなわち、反復)を含む。
【０１４３】
共刺激性シグナル伝達ドメインのタイプの選択は、ＰＵＣＲを発現する宿主細胞のタイプ(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球または好酸球)および所望の細胞性エフェクター機能(例えば、免疫エフェクター機能)のような因子に基づき得る。
【０１４４】
細胞内ドメインにおけるシグナル伝達配列(すなわち、シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激性シグナル伝達ドメイン)は互いに無作為にまたは特定の順番で連結させ得る。ＰＵＣＲの細胞内ドメインは、シグナル伝達配列間に配置される１以上のリンカーを含む。ある実施態様において、リンカーは、短オリゴまたはポリペプチドリンカー、例えば、２〜１０アミノ酸(例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸)長であり得る。ある実施態様において、リンカーは、１０を超えるアミノ酸長であり得る。ここに開示するまたは当業者に明らかな任意のリンカーを本発明のＰＵＣＲの細胞内ドメインにおいて使用し得る。
【０１４５】
４. ヒンジ領域
ある実施態様において、ＰＵＣＲは、さらにヒンジ領域を含む。ある実施態様において、ヒンジ領域は、触媒的抗体領域と膜貫通ドメインの間に位置する。ヒンジ領域は、タンパク質の２個のドメインの間に一般に見られ、ＰＵＣＲの可動性およびドメインの一方または両方の互いに対する移動を可能にし得る、アミノ酸セグメントである。ＰＵＣＲの膜貫通ドメインの触媒的抗体領域に対するこのような可動性および移動を提供するあらゆるアミノ酸配列が使用され得る。
【０１４６】
ある実施態様において、ヒンジ領域は、約１０〜約１００アミノ酸、例えば、約１５〜約７５アミノ酸、約２０〜約５０アミノ酸または約３０〜約６０アミノ酸含む。ある実施態様において、ヒンジ領域は１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００アミノ酸長である。ある実施態様において、ヒンジ領域は１００アミノ酸長を超える。
【０１４７】
ある実施態様において、ヒンジ領域は、天然に存在するタンパク質のヒンジ領域である。ヒンジ領域を含むことが当分野で知られるあらゆるタンパク質のヒンジ領域を、ここに記載するＰＵＣＲにおいて使用し得る。ある実施態様において、ヒンジ領域は、天然に存在するタンパク質のヒンジ領域の少なくとも一部であり、ＰＵＣＲの細胞外領域に可動性を提供する。
【０１４８】
ある実施態様において、ヒンジ領域は、ＣＤ８ヒンジ領域である。ある実施態様において、ヒンジ領域はＣＤ８αヒンジ領域である。ある実施態様において、ヒンジ領域は、ＣＤ８ヒンジ領域の一部、例えば、ＣＤ８ヒンジ領域の少なくとも１５(例えば、２０、２５、３０、３５または４０)連続アミノ酸を含むフラグメントである。ある実施態様において、ヒンジ領域は、ＣＤ８αヒンジ領域の一部、例えば、ＣＤ８αヒンジ領域の少なくとも１５(例えば、２０、２５、３０、３５または４０)連続アミノ酸を含むフラグメントである。ＣＤ８ヒンジ領域は、配列番号５もしくはその機能的部分のアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上配列同一性であるアミノ酸配列を含み得る。あるいは、ＣＤ８ヒンジ領域は、配列番号２８、配列番号２９もしくはその機能的部分のアミノ酸配列または配列番号２８もしくは配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上配列同一性であるアミノ酸配列を含み得る。ある実施態様において、ＣＤ８ヒンジ領域は、配列番号３０の核酸配列または配列番号３０と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。
【０１４９】
ある実施態様において、ヒンジ領域は、ハイブリッドＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域である。ある実施態様において、ハイブリッドＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域は、配列番号５５もしくはその機能的部分のアミノ酸配列または配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上配列同一性であるアミノ酸配列を含み得る。ある実施態様において、ハイブリッドＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域は、配列番号５６もしくはその機能的部分のアミノ酸配列または配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上配列同一性であるアミノ酸配列を含み得る。ある実施態様において、ハイブリッドＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域は、配列番号５８もしくはその機能的部分のアミノ酸配列または配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上配列同一性であるアミノ酸配列うぃ含み得る。ある実施態様において、ハイブリッドＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域は、リンカー配列(例えば、配列番号５７のリンカー配列)を含み得る。ある実施態様において、ＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域は配列番号６０の核酸配列または配列番号６０と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上配列同一性を有する核酸配列によりコードされる。
【０１５０】
【表５】
2018537076.tif 000006
【０１５１】
ある実施態様において、ヒンジ領域は、抗体(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤ抗体)のヒンジ領域である。ある実施態様において、ヒンジ領域は、抗体の定常ドメインＣＨ１とＣＨ２を連結するヒンジ領域である。ある実施態様において、ヒンジ領域は抗体のものであり、該抗体のヒンジ領域と該抗体の１以上の定常領域を含む。ある実施態様において、ヒンジ領域は抗体のヒンジ領域および該抗体のＣＨ３定常領域を含む。ある実施態様において、ヒンジ領域は抗体のヒンジ領域および該抗体のＣＨ２およびＣＨ３定常領域を含む。
【０１５２】
ある実施態様において、ヒンジ領域は天然に存在しないペプチドである。ある実施態様において、ヒンジ領域は触媒的ドメインのＣ末端およびＰＵＣＲの膜貫通ドメインのＮ末端に配置される。ある実施態様において、ヒンジ領域は(ＧｌｙｘＳｅｒ)ｎリンカーであり、ここで、ｘおよびｎは独立して３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２を含む、３〜１２の整数またはそれ以上であり得る。ある実施態様において、ヒンジ領域は(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎであり、ここで、ｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０を含む３〜６０またはそれ以上の整数であり得る。ある実施態様において、ヒンジ領域は、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号２３)である。ある実施態様において、ヒンジ領域は、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)６(配列番号３１)である。ある実施態様において、ヒンジ領域は、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)９(配列番号３２)である。ある実施態様において、ヒンジ領域は、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)１２(配列番号３３)である。ある実施態様において、ヒンジ領域は、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)１５(配列番号３４)である。ある実施態様において、ヒンジ領域は、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３０(配列番号３５)である。ある実施態様において、ヒンジ領域は、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４５(配列番号３６)である。ある実施態様において、ヒンジ領域は、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)６０(配列番号３７)である。ある実施態様において、ヒンジ領域は、ポリＧｌｙＳｅｒリンカー(配列番号５４)である。
【０１５３】
ある実施態様において、ヒンジ領域は、伸長組み換えポリペプチド(ＸＴＥＮ)であり、これは、種々の長さ(例えば、１０〜８０アミノ酸残基)の親水性残基からなる非構造化ポリペプチドである。ＸＴＥＮペプチドのアミノ酸配列は、当分野で知られる(例えば、内容を引用により本明細書に包含させる米国特許８,６７３,８６０号参照)。ある実施態様において、ヒンジ領域はＸＴＥＮペプチドであり、６０アミノ酸含む。ある実施態様において、ヒンジ領域はＸＴＥＮペプチドであり、３０アミノ酸含む。ある実施態様において、ヒンジ領域はＸＴＥＮペプチドであり、４５アミノ酸含む。ある実施態様において、ヒンジ領域はＸＴＥＮペプチドであり、１５アミノ酸含む。
【０１５４】
５. シグナルペプチド
ある実施態様において、ここに開示するＰＵＣＲは、さらにポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチド(シグナル配列としても知られる)を含む。一般に、シグナル配列は、ポリペプチドに細胞における所望の部位を標的とさせ、ペプチド配列である。ある実施態様において、シグナル配列は、ＰＵＣＲに細胞の分泌経路を標的とさせ、ＰＵＣＲの細胞膜の脂質二重層への組込みおよび繋留を可能とさせる。ここに記載するＰＵＣＲにおける使用に適合性である、天然に存在するタンパク質のシグナル配列または合成の、天然に存在しないシグナル配列を含むシグナル配列は、当業者には明らかである。ある実施態様において、本発明のＰＵＣＲにおいて使用するためのシグナル配列は、ＣＤ８αのシグナル配列である。他の実施態様において、シグナル配列は、ＣＤ２８のシグナル配列である。ある実施態様において、シグナル配列は、マウスカッパ鎖のシグナル配列である。さらに他の実施態様において、シグナル配列は、ＣＤ１６のシグナル配列である。ある実施態様において、シグナル配列は、マウス免疫グロブリン重鎖のシグナル配列である。ある実施態様において、シグナルペプチドは、アミノ酸配列MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(配列番号１)を含む。ある実施態様において、シグナルペプチドは、配列番号１１の核酸配列によりコードされる。ある実施態様において、シグナルペプチドは、配列番号４６の核酸配列によりコードされる。
【０１５５】
Ｂ. 特異性作用物質
ここに記載するＰＵＣＲの一つの利点は、それらが、ＰＵＣＲにあらゆる標的分子(例えば、抗原)に対する特異性を与えるためにプログラムされ得ることである。それ故に、特異性作用物質をＰＵＣＲにコンジュゲートおよび／または結合し、ＰＵＣＲが任意の目的の分子(例えば、抗原)を標的とするようプログラムできる。ある実施態様において、特異性作用物質は、結合タンパク質(例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント)を含む。それ故に、本発明のある実施態様において、ＰＵＣＲを、目的の抗原に対する特異性を有するプログラムされたＰＵＣＲを作製するために、抗体またはその抗原結合部分を含む特異性作用物質とコンジュゲートさせ得る。ある実施態様において、該結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある実施態様において、該結合タンパク質は、リガンドである。ある実施態様において、該結合タンパク質は、サイトカインである。ある実施態様において、該結合タンパク質は、受容体である。
【０１５６】
ある実施態様において、特異性作用物質は、ペプチド(例えば、１以上のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ(ＲＧＤ)モチーフを含むペプチド)を含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、ペプチド模倣体(例えば、ＲＧＤペプチド模倣体)を含む。他の実施態様において、特異性作用物質は、小分子(例えば、葉酸または２−[３−(１、３−ジカルボキシプロピル)−ウレイド]ペンタン二酸(ＤＵＰＡ))を含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、治療剤を含む。他の実施態様において、特異性作用物質は、ターゲティング剤を含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、タンパク質アゴニストを含む。他の実施態様において、特異性作用物質は、代謝制御因子を含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、ホルモンを含む。他の実施態様において、特異性作用物質は、毒素を含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、増殖因子を含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、ビオチンのような、しかしこれに限定されない検出可能部分を含む。他の実施態様において、特異性作用物質は、リガンドを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、タンパク質を含む。他の実施態様において、特異性作用物質は、ペプトイドを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、ＤＮＡアプタマーを含む。他の実施態様において、特異性作用物質は、ペプチド核酸を含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、ビタミンを含む。他の実施態様において、特異性作用物質は、基質または基質アナログを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸ペプチド(ｃＲＧＤ)を含む。
【０１５７】
ある実施態様において、特異性作用物質は、癌と関連するタンパク質と結合する。ある実施態様において、特異性作用物質は、癌と関連するタンパク質と特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。抗原結合フラグメントの例は、ＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖを含むが、これらに限定されない。
【０１５８】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、癌細胞(例えば、腫瘍細胞)に高度に発現されるタンパク質である。ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、癌細胞(例えば、腫瘍細胞)の表面に高度に発現されるタンパク質である。ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、癌バイオマーカーである。ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、ＣＤ１９、ＶＥＧＦＲ２、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＧＭ２、ＧＤ２、ＧＤ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖIII、ＨＥＲ２、ＩＬ−１３Ｒ、葉酸受容体およびＭＵＣ−１からなる群から選択されるタンパク質である。ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、インテグリン(例えば、ａｖβ３)である。ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、コレシストキニンＢ受容体、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体、ソマトスタチン受容体２、ガストリン放出ペプチド受容体、ニューロキニン１受容体、メラノコルチン１受容体、ニューロテンシン受容体、神経ペプチドＹ受容体およびＣ型レクチン様分子１からなる群から選択される。ある実施態様において、特異性作用物質は、表４に挙げるターゲティング分子を含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、癌と関連する炭水化物抗原と結合する。ある実施態様において、癌と関連する炭水化物抗原は、Ｔｎ抗原である(ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ju et al. (2008) CANCER RES. 68(6): 1636-46参照)。ある実施態様において、癌と関連する炭水化物抗原は、ＳＴｎ抗原である(ＮｅｕＡｃα６ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ju et al. (2008))。
【０１５９】
【表６】
2018537076.tif 000007
【表７】
2018537076.tif 000008
【表８】
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【０１６０】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、癌胎児性抗原(ＣＥＡ)である。ある実施態様において、特異性作用物質は、抗ＣＥヒト化ＭＮ１４(ｈＭＮ１４)抗体に対応する重鎖および軽鎖可変領域を含む、抗ＣＥＡ抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントである(各々の内容を引用により本明細書に包含させるSharkey et al. (1995) CANCER RES. 55 (23 Suppl.): 5935および米国特許公開２００２／０１６５３６０号に記載の可変配列参照)。ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、ＣＥＡであり、癌は、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌および肺癌からなる群から選択される。
【０１６１】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)である。ある実施態様において、特異性作用物質は、内容を引用により本明細書に包含させるＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／１４５１３９号に記載の軽鎖および重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントである。ある実施態様において、特異性作用物質は、配列番号５０に示す軽鎖可変アミノ酸配列および配列番号４９に示す重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントである。ある実施態様において、特異性作用物質はＤＵＰＡを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、引用により本明細書に包含させる米国特許公開ＵＳ２０１０／０３２４００８号に開示の、ＰＳＭＡ結合リガンドを含む。
【表９】
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【０１６２】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、ＰＳＭＡであり、癌は、前立腺癌、子宮内膜癌、乳癌、腎臓癌および結腸癌からなる群から選択される。
【０１６３】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、インターロイキン１３受容体(ＩＬ−１３Ｒ)である。ある実施態様において、特異性作用物質は、抗ＩＬ−１３Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、ＩＬ−１３Ｒに結合するＩＬ−１３リガンドドメイン(配列番号５１)のような、ＩＬ−１３Ｒに結合する因子を含む。ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、ＩＬ−１３Ｒであり、癌は、乳癌または悪性神経膠腫である。
【表１０】
2018537076.tif 000011
【０１６４】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、表面抗原分類１９(ＣＤ１９)である。ある実施態様において、特異性作用物質は、抗ＣＤ１９抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを含む。ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、ＣＤ１９であり、癌は、急性リンパ芽球性リンパ腫(ＡＬＬ)、非ホジキンリンパ腫、肺癌および慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)からなる群から選択される。
【０１６５】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２(ＨＥＲ２；ＥｒｂＢ−２としても知られる)である。ある実施態様において、特異性作用物質は、抗ＨＥＲ２抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを含む。ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、ＨＥＲ２であり、癌は、卵巣癌、胃癌、子宮癌および乳癌からなる群から選択される。
【０１６６】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)である。ある実施態様において、特異性作用物質は、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを含む。ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、ＥＧＦＲであり、癌は、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、結腸癌、直腸癌、頭頸部扁平上皮細胞癌(ＨＮＳＣＣ)、乳癌および膵臓癌からなる群から選択される。
【０１６７】
ある実施態様において、癌、例えば、乳癌または悪性神経膠腫と関連するタンパク質は、ＩＬ−１３Ｒである。
【０１６８】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、血管内皮細胞増殖因子受容体２(ＶＥＧＦＲ２)である。ある実施態様において、特異性作用物質は、抗ＶＥＧＦＲ２ヒトＶＫ−Ｂ８抗体に対応する重鎖および軽鎖可変領域を含む、抗ＶＥＧＦＲ２抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを含む(内容を引用により本明細書に包含させる、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／１４９２１９号参照)。ある実施態様において、特異性作用物質は、配列番号５２に示す軽鎖可変アミノ酸配列および配列番号５３に示す重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗ＶＥＧＦＲ２抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを含む。
【表１１】
2018537076.tif 000012
【０１６９】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、ＶＥＧＦＲ２であり、癌は、腎臓細胞癌、卵巣癌、黒色腫、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、結腸癌、直腸癌、頭頸部扁平上皮細胞癌(ＨＮＳＣＣ)、乳癌、骨髄腫、白血病、リンパ腫および膵臓癌からなる群から選択される。
【０１７０】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、、ガングリオシドＧＤ３(ＧＤ３)である。ある実施態様において、特異性作用物質は、抗ＧＤ３抗体ＭＢ３.６に対応する重鎖および軽鎖可変領域を含む、抗ガングリオシドＧＤ３抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを含む(可変アミノ酸配列については、引用により本明細書に包含させる、米国特許公開２００７／００３１４３８号を参照)。
【０１７１】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、ｃ型レクチン様分子１(ＣＬＬ１)である。ある実施態様において、特異性作用物質は、抗ＣＬＬ１抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、ＣＬＬ１に結合する因子を含む。
【０１７２】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、コレシストキニンＢ受容体(ＣＣＫＢＲ)である。ある実施態様において、特異性作用物質は、抗ＣＣＫＢＲ抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、ＣＣＫＢＲに結合する因子を含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、ＣＣＫＢＲアンタゴニストを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、ペンタガストリンを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、ミニガストリンを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、ミニガストリンアナログを含む。ある実施態様において、ミニガストリンアナログは、ＭＧ(配列番号８０)、ＭＧＯ(配列番号８１)、ＭＧ１１(配列番号８２)、Ｈ２−Ｍｅｔ(配列番号８３)、Ｈ２  Ｎｌｅ(配列番号８４)、デモガストリン(配列番号８５)、シクロ−ＭＧ−１(配列番号８６)およびＭＧＤ５(配列番号８７)からなる群から選択される。
【０１７３】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体(ＧｎＲＨＲ)である。ある実施態様において、特異性作用物質は、抗ＧｎＲＨＲ抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(ＧｎＲＨ)を含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、ＧｎＲＨアナログを含む。ある実施態様において、ＧｎＲＨアナログは、ブセレリン(配列番号８８)、ゴセレリン(配列番号８９)、リュープロリド(配列番号９０)、ナファレリン(配列番号９１)、トリプトレリン(配列番号９２)、アバレリクス(配列番号９３)、アシリン(配列番号９４)、アンタレリックス(配列番号９５)、アンチド(配列番号９６)、アザリンＢ(配列番号９７)、セトロレリクス(配列番号９８)、デガレリクス(配列番号９９)、ガニレリクス(配列番号１００)およびオザレリクス(配列番号１０１)からなる群から選択される。ある実施態様において、特異性作用物質は、トリプトレリンを含む。ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、ＧｎＲＨＲであり、癌は、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、子宮内膜癌、黒色腫、神経膠芽腫、肺癌および膵臓癌からなる群から選択される。
【０１７４】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、ソマトスタチン受容体２(ＳＳＲＴ２)である。ある実施態様において、特異性作用物質は、抗ＳＳＲＴ２抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、オクトレオテートを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、オクトレオチドを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、ソマトスタチンアナログを含む。ある実施態様において、ソマトスタチンアナログは、ＳＳ−１４(配列番号６４)、ＯＣ(配列番号６５)、ＴＯＣ(配列番号６６)、ＴＡＴＥ(配列番号６７)、ＮＯＣ(配列番号６８)、ＮＯＣ−ＡＴＥ(配列番号６９)、ＢＯＣ(配列番号７０)、ＢＯＣ−ＡＴＥ(配列番号７１)、ＫＥ１０８(配列番号７２)およびＬＭ３(配列番号７３)からなる群から選択される。ある実施態様において、特異性作用物質は、[Ｔｙｒ３]−オクトレオテートを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、引用により本明細書に包含させる米国特許公開２００４／００４４１７７号に開示のＳＳＲＴ２結合ペプチドを含む。ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、ＳＳＲＴ２であり、癌は、神経内分泌、膵消化管癌、膵臓癌、肺癌、カルチノイド癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、肝臓癌、黒色腫、胃癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、子宮内膜癌および乳癌からなる群から選択される。
【０１７５】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、ａｖβ３インテグリンである。ある実施態様において、特異性作用物質は、抗ａｖβ３抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸ペプチド(ｃＲＧＤ)を含む。
【０１７６】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、ガストリン放出ペプチド受容体(ＧＲＰＲ)である。ある実施態様において、特異性作用物質は、抗ＧＲＰＲ抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、ボンベシンを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、ボンベシンアナログを含む。ある実施態様において、ボンベシンアナログは、ＢＮ(配列番号７４)、ＲＰ５２７(配列番号７５)、デモベシン１(配列番号７６)、デモベシン４(配列番号７７)、ＢＢＳ−３８(配列番号７８)およびＢＡＹ  ８６−４３６７(配列番号７９)からなる群から選択される。
【０１７７】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、ニューロキニン１受容体(ＮＫ１Ｒ)である。ある実施態様において、特異性作用物質は、抗ＮＫ１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを含む。
【０１７８】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、メラノコルチン１受容体(ＭＣ１Ｒ)である。ある実施態様において、特異性作用物質は、抗ＭＣ１Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを含む。
【０１７９】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、ニューロテンシン受容体１(ＮＴＳＲ１)である。ある実施態様において、特異性作用物質は、抗ＮＴＳＲ１抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを含む。
【０１８０】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、神経ペプチドＹ受容体(例えば、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４およびＹ５)を含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、抗神経ペプチドＹ受容体抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメント(例えば、抗Ｙ１、抗Ｙ２、抗Ｙ４または抗Ｙ５抗体またはその抗原結合フラグメント)を含む。
【０１８１】
ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、葉酸受容体である。ある実施態様において、特異性作用物質は、抗葉酸受容体抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、葉酸を含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、引用により本明細書に包含させる国際公開ＷＯ２０１０／０３３７３３号に記載の葉酸受容体結合抗葉酸剤を含む。ある実施態様において、癌と関連するタンパク質は、葉酸受容体であり、癌は、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、結腸直腸癌、結腸癌、直腸癌、卵巣癌、腎臓癌、胃癌および乳癌からなる群から選択される。
【０１８２】
ある実施態様において、特異性作用物質は、疾患原因生物(例えば、プリオン、ウイルス、原生動物、寄生虫、真菌および細菌)からのタンパク質と結合する。ある実施態様において、特異性作用物質は、疾患原因生物からのタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。ある実施態様において、特異性作用物質は、ウイルスタンパク質に結合する。ある実施態様において、特異性作用物質は、ＨＩＶタンパク質に結合する。ある実施態様において、特異性作用物質は、細菌タンパク質に結合する。ある実施態様において、特異性作用物質は、真菌タンパク質に結合する。ある実施態様において、特異性作用物質は、寄生虫タンパク質に結合する。ある実施態様において、特異性作用物質は、原生動物タンパク質に結合する。
【０１８３】
本発明において使用するための特異性作用物質を、ここに開示するＰＵＣＲの触媒的抗体に、反応性部分でコンジュゲートさせる。ある実施態様において、特異性作用物質は、本発明のＰＵＣＲの触媒的抗体領域の反応性アミノ酸残基と反応する反応性部分を含む。本発明において使用するための反応性部分は、当業者に容易に明らかである。ある実施態様において、反応性部分は、ケトン、ジケトン、ベータラクタム、活性エステルハロケトン、ラクトン、無水物、マレイミド、エポキシド、アルデヒドアミジン、グアニジン、イミン、エンアミン、ホスフェート、ホスホネート、エポキシド、アジリジン、チオエポキシド、遮蔽または保護ジケトン(例えば、ケタール)、ラクタム、ハロケトン、アルデヒドなどからなる群から選択される化学基である。ある実施態様において、反応性部分は、マレイミド含有成分またはヨードアセトアミド、アリールハライド、ジスルフヒドリルなどのような他のチオール反応性基を含む。ある実施態様において、反応性部分は、ジケトンである。他の実施態様において、反応性部分は、アゼチジノンである。ある実施態様において、反応性部分は、Ｎ−スルホニル−ベータ−ラクタムである。
【０１８４】
ある実施態様において、特異性作用物質は、リンカーを含む。何らかの特定の理論に拘束させることを望まないが、ある実施態様において、特異性作用物質は、特異性作用物質が結合するＰＵＣＲを含む宿主細胞の活性化を妨害しないリンカーを含む。ある実施態様において、リンカーは、可動性リンカーである。ある実施態様において、リンカーは、非可動性リンカーである。ある実施態様において、リンカーは、開裂可能リンカーである。ある実施態様において、リンカーは、加水分解可能リンカーである。ある実施態様において、リンカーは、非開裂可能リンカーである。ある実施態様において、リンカーは、小分子を含む。ある実施態様において、リンカーは、ペプチドを含む。ある実施態様において、リンカーは、非ペプチドリンカーを含む。ある実施態様において、非ペプチドリンカーは、アルキルリンカーである。例示的非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)リンカーである。ある実施態様において、リンカーは、炭化水素、ペプチド性、グリカン、ポリエチレングリコールまたは他の結合および／またはポリマースペーサーを含む。ある実施態様において、リンカーは、(ＰＥＧ)ｎを含み、ここで、ｎ１、２、３、４、５、６、７,８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０を含む１〜５０の整数またはそれ以上であり得る。ある実施態様において、リンカーは、(ＰＥＧ)ｎを含み、ここで、ｎは５または１３である。ある実施態様において、リンカーは、(ＰＥＧ)ｎを含み、ここで、ｎは２４または４８である。ある実施態様において、リンカーは、１００〜５０００kDa、好ましくは１００〜５００kDaの分子量を有する。ペプチドリンカーは、誘導体を形成するために改変させ得る。ここに開示する任意のリンカーを、反応性部分の特異性作用物質へのコンジュゲートに使用し得る。本発明において使用するための他のリンカーは、当分野で知られ、当業者には容易に明らかである(例えば、米国特許５,１２２,３６８号、５,８２４,８０５号および８,３０９,０９３号、および米国特許公開２００６／００２４３１７号、２００３／００８３２６３号、２００５／０２３８６４９号および２００５／０００９７５１号参照；これらの内容、特にリンカーに関する開示は引用により本明細書に包含させる)。
【０１８５】
Ｄ. リンカー
本発明のさらなる態様において、ここに記載するＰＵＣＲを少なくとも１個の反応性部分を含むリンカーとコンジュゲートさせ得る。ある実施態様において、リンカーは、さらに特異性作用物質をＰＵＣＲに結合させるために、特異性作用物質と反応し得るコンジュゲーション官能基を含み、こうしてＰＵＣＲをプログラミングする。ある実施態様において、特異性作用物質を、コンジュゲーション官能基によりここに開示するリンカーにコンジュゲートさせる。ある実施態様において、ＰＵＣＲを、反応性アミノ酸残基による、反応性部分を含むリンカーとコンジュゲートさせる。
【０１８６】
リンカーは、ここに記載するあらゆる反応性部分を含み得る。ある実施態様において、反応性部分は、ＰＵＣＲの反応性アミノ酸残基に共有結合により結合する。ある実施態様において、反応性部分は、ＰＵＣＲの反応性アミノ酸残基の側鎖に共有結合により結合する。ある実施態様において、反応性部分は、ＰＵＣＲの反応性アミノ酸残基に非共有結合により結合する。ある実施態様において、反応性部分は、ケトン、ジケトン、ベータラクタム、活性エステルハロケトン、ラクトン、無水物、マレイミド、エポキシド、アルデヒドアミジン、グアニジン、イミン、エンアミン、ホスフェート、ホスホネート、エポキシド、アジリジン、チオエポキシド、遮蔽または保護ジケトン(例えば、ケタール)、ラクタム、ハロケトン、アルデヒドなどからなる群から選択される化学基である。例えば、ＰＵＣＲがアルドラーゼ抗体またはその触媒的部分を含むとき(例えば、マウスまたはヒト化３８Ｃ２)、リンカーは、ジケトンまたはアゼチジノン反応性部分により反応性リシン(例えば、Ｌｙｓ９３)にコンジュゲートし得る。さらに、ＰＵＣＲがチオエステラーゼ抗体またはその触媒的部分を含むとき、リンカーを、マレイミド含有成分またはヨードアセトアミド、アリールハライド、ジスルフヒドリルなどのような他のチオール反応性基を含む反応性部分により反応性システインにコンジュゲートさせ得る。ある実施態様において、リンカーの反応性部分は、ジケトンである。他の実施態様において、リンカーの反応性部分は、アゼチジノンである。ある実施態様において、リンカーの反応性部分は、Ｎ−スルホニル−ベータ−ラクタムである。
【０１８７】
ある実施態様において、リンカーは、コンジュゲーション官能基を含む。ある実施態様において、リンカーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のコンジュゲーション官能基を含む。ある実施態様において、コンジュゲーション官能基は、クリックケミストリー反応により特異性作用物質に存在する第二化学部分と反応できる第一化学部分を含む。クリックケミストリー反応は、ターゲティングまたはエフェクター部分コンジュゲート結合ポリペプチドを形成するために互いに迅速かつ選択的に反応する(“クリック”)末端反応性部分の対の間で生じる化学反応である。ある実施態様において、クリックケミストリー反応は、銅(Ｃｕ(Ｉ))により触媒される。ある実施態様において、クリックケミストリー反応は、銅触媒を必要としない。ある実施態様において、コンジュゲーション官能基は、直交反応性官能基を含む。これらの実施態様において、リンカーのコンジュゲーション官能基は、特異性作用物質に存在する適合性直交官能基と反応できる。複数の直交反応性官能基および反応が可能である直交官能基は当分野で知られ、ここに記載する方法において使用できる(例えば、Lang and Chin (2014) CHEM. REV. 114: 4764-4806; and Lang and Chin (2014) ACS CHEM. BIOL. 9: 16-20参照)。直交官能基は、アルデヒド、ケトン、アミノオキシ、ヒドラジン、セレン置換、ジベンゾシクロオクチル、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン、アルキン、アジド、テトラジン、オレフィンなどを含むが、これらに限定されない。適当な直交官能基のこのような反応は、ケトン／アルコキシアミン縮合、アルデヒド／アルコキシアミン縮合、ディールス・アルダー環付加、シュタウディンガー・ライゲーション、交差メタセシス、Ｐｄ触媒クロスカップリング、歪促進アルキン−アジド環付加、歪促進アルキン−ニトロン環化付加、銅触媒アルキン−アジド環付加、光−クリック環付加および１,２−アミノチオール−ＣＢＴ縮合を含むが、これらに限定されない。直交基はまた酵素基質も含む。
【０１８８】
ある実施態様において、リンカーは、可動性リンカーである。ある実施態様において、リンカーは、非可動性リンカーである。ある実施態様において、リンカーは、開裂可能リンカーである。ある実施態様において、リンカーは、加水分解可能リンカーである。ある実施態様において、リンカーは、非開裂可能リンカーである。ある実施態様において、リンカーは、小分子を含む。ある実施態様において、リンカーは、ペプチドを含む。ある実施態様において、リンカーは、非ペプチドリンカーを含む。ある実施態様において、リンカーは、炭化水素、ペプチド性、グリカン、ポリエチレングリコールまたは他の結合および／またはポリマースペーサーを含む。例示的非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)リンカーである。ある実施態様において、リンカーは、(ＰＥＧ)ｎを含み、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７,８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０を含む１〜５０の整数またはそれ以上であり得る。ある実施態様において、リンカーは、(ＰＥＧ)ｎを含み、ここで、ｎは５または１３である。ある実施態様において、リンカーは、(ＰＥＧ)ｎを含み、ここで、ｎは２４または４８である。ある実施態様において、リンカーは、１００〜５０００kDa、好ましくは１００〜５００kDaの分子量を有する。
【０１８９】
ある実施態様において、リンカーは、“Ｃ−Ｌｏｃｋ”コンジュゲーション方法およびリンカー化学を用いる。この化学は、ジスルフィド結合還元後、先にジスルフィド結合により結合していたポリペプチド(例えば、抗体重鎖および軽鎖)を再結合する。架橋が、破壊されたジスルフィド結合あたり１リンカーを導入する。ある実施態様において、コンジュゲーションは、マイケル付加反応により抗体上の個々のスルフヒドリル基と反応できるマレイミドまたはビニル部分を使用して達成できる。遊離スルフヒドリル基を、抗体のジスルフィド結合の還元により形成できる。構造安定性を低下させずにシステインを経るコンジュゲーションを提供する適当な組成物および方法は、全体を引用により本明細書に包含させる、ＷＯ２０１３／１７３３９１号に開示される。
【０１９０】
ある実施態様において、リンカーは、ポリペプチドに存在するリシン残基をターゲティングする“Ｋ−Ｌｏｃｋ”部位選択的コンジュゲーションテクノロジーを用いる。例えば、特異性作用物質が抗体であるとき、“Ｋ−Ｌｏｃｋ”部位選択的コンジュゲーションテクノロジーは、細胞工学または酵素修飾工程を使用する抗体修飾を必要とせず、抗体に存在する８０〜９０のＬｙｓのうち、２個の天然Ｌｙｓ部位を標的とする。ある実施態様において、コンジュゲーションは、例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させるＷＯ２０１３／１７３３９２号およびＷＯ２０１３／１７３３９３号に記載のとおり、リシン側鎖とのアミド結合の形成により達成される。ある実施態様において、リンカーは、可変カッパ軽鎖を含む特異性作用物質(例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント)に結合される。ある実施態様において、リンカーは、可変カッパ軽鎖のリシンに結合される(例えば、ＫａｂａｔナンバリングによるＬｙｓ１８８に対応するリシン)。
【０１９１】
ある実施態様において、リンカーは、ジケトン−ＰＥＧ５−ＰＦＰエステル((２,３,４,５,６−ペンタフルオロフェニル)３−[２−[２−[２−[２−[３−[４−(３,５−ジオキソヘキシル)アニリノ]−３−オキソ−プロポキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロパノエート、ここではＤＫ−ＰＥＧ５−ＰＦＰエステルとも称する)である。ある実施態様において、リンカーは、アゼチジノン−ＰＥＧ１３−ＰＦＰエステル((２,３,４,５,６−ペンタフルオロフェニル)３−[２−[２−[２−[２−[２−[２−[２−[２−[２−[２−[２−[２−[３−オキソ−３−[４−[３−オキソ−３−(２−オキソアゼチジン−１−イル)プロピル]アニリノ]プロポキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]プロパノエート、ここでは、ＡＺＤ−ＰＥＧ５−ＰＦＰエステルとも称する)である。
【０１９２】
Ｃ. 検出可能部分
ある実施態様において、本発明のＰＵＣＲおよび／または特異性作用物質および／またはリンカーは、検出可能部分を含む。ある実施態様において、検出可能部分は、ＰＵＣＲに共有結合により結合する。ある実施態様において、検出可能部分は、特異性作用物質に共有結合により結合する。ある実施態様において、検出可能部分は、ＰＵＣＲに非共有結合により結合する。ある実施態様において、検出可能部分は、検出可能部分を含むＰＵＣＲおよび／または特異性作用物質の検出または定量化のための手段を提供する。ある実施態様において、検出可能部分は、本発明のＰＵＣＲへの特異性作用物質のコンジュゲーションの効率を決定する手段を提供する。
【０１９３】
ある実施態様において、検出可能部分は、ポリペプチド(例えば、ＧＳＴタグ、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグまたはＨＡタグ、蛍光タンパク質(例えば、ＧＦＰまたはＹＦＰ))である。ある実施態様において、検出可能部分は、放射性部分、蛍光部分、化学発光部分、質量標識、電荷標識または酵素(例えば、酵素の基質変換活性がプログラム可能な普遍的キメラ受容体および／または特異性作用物質の存在の確認のために観察される)である。ある実施態様において、検出可能部分は、ビオチンである。
【０１９４】
ある実施態様において、検出可能部分は、プログラム可能な普遍的細胞受容体のＮ末端に結合される。ある実施態様において、検出可能部分は、特異性作用物質のＮ末端に結合される。ある実施態様において、検出可能部分は、プログラム可能な普遍的細胞受容体のＣ末端に結合される。ある実施態様において、検出可能部分は、特異性作用物質のＣ末端に結合される。
【０１９５】
ある実施態様において、プログラム可能な普遍的細胞受容体および／または特異性作用物質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の検出可能部分を含む。
【０１９６】
ある実施態様において、検出可能部分は開裂可能である。他の実施態様において、検出可能部分は非開裂可能である。ある実施態様において、検出可能部分は、リンカーによりプログラム可能な普遍的細胞受容体および／または特異性作用物質に結合する。ある実施態様において、リンカーは、開裂可能である。他の実施態様において、リンカーは、非開裂可能である。検出可能部分と使用するリンカーは、ここに開示するすべてのリンカーまたは当業者に容易に明らかであるすべてのリンカーであり得る。
【０１９７】
ここに記載するＰＵＣＲをコードする核酸の何れも、組み換えテクノロジーのような慣用法により製造できる。ここに記載するＰＵＣＲを製造する方法は、触媒的抗体領域、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む、ＰＵＣＲのドメインの各々を含むポリペプチドをコードする核酸の産生を含む。ある実施態様において、核酸は、シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインをコードする。ある実施態様において、核酸は、共刺激性シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインをコードする。ある実施態様において、核酸は、ＰＵＣＲの触媒的抗体領域と膜貫通ドメインの間のヒンジ領域をコードする。キメラ受容体をコードする核酸もシグナル配列をコードし得る。
【０１９８】
ここに開示するＰＵＣＲの成分の各々の配列は、慣用のテクノロジー、例えば、当分野で知られる多様な起源の何れかからのＰＣＲ増幅により得ることができる。ある実施態様において、ＰＵＣＲの成分の１以上の配列は、哺乳動物細胞(例えば、マウス細胞またはヒト細胞)から得る。あるいは、ＰＵＣＲの成分の１以上の配列は、合成され得る。成分(例えば、ドメイン)の各々の配列を、ＰＣＲ増幅またはライゲーションのような方法を使用して、直接的または間接的に(例えば、ペプチドリンカーをコードする核酸配列を使用して)連結して、ＰＵＣＲをコードする核酸配列を形成させ得る。あるいは、ＰＵＣＲをコードする核酸は、合成され得る。ある実施態様において、核酸は、ＤＮＡである。他の実施態様において、核酸は、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)である。
【０１９９】
さらなる実施態様において、ここに開示する核酸分子の何れかによりコードされる単離ポリペプチド分子も企図される。該ポリペプチドの精製および単離の方法は当分野で周知である(例えば、Sambrook et al. (2012) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY参照)。
【０２００】
Ｄ. 宿主細胞
ここに記載するＰＵＣＲを発現する単離宿主細胞も、本発明において企図される。ある実施態様において、宿主細胞は、免疫細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、好中球、好酸球、細胞毒性Ｔリンパ球、制御性Ｔ細胞またはこれらの任意の組み合わせ)である。ある実施態様において、単離宿主細胞は、Ｔ細胞である。ある実施態様において、単離宿主細胞は、ＮＫ細胞である。他の実施態様において、単離宿主細胞は、株化細胞、例えば、ＮＫ−９２細胞である。ある実施態様において、単離宿主細胞は、修飾ＮＫ−９２細胞(ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６６７２)である。ある実施態様において、宿主細胞は、ＫＨＹＧ−１ナチュラルキラー細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、ＮＫＬナチュラルキラー細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は、胎盤性ＮＫ細胞である。
【０２０１】
ある実施態様において、単離宿主細胞は、免疫細胞である。免疫細胞の集団を、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)、骨髄、脾臓、リンパ節、胸腺または腫瘍組織のような組織のようなあらゆる組織から得ることができる。所望のタイプの宿主細胞を得るのに適当な起源は、当業者には明らかである。ある実施態様において、免疫細胞の集団は、ＰＢＭＣ由来である。
【０２０２】
本発明のＰＵＣＲを発現する宿主細胞を製造する方法は、エクスビボでの単離宿主細胞増大を含み得る。宿主細胞増大は、例えば、宿主細胞を増殖させまたは宿主細胞を増殖
するよう刺激することにより、ＰＵＣＲを発現する細胞数の増加をもたらす、あらゆる方法を含み得る。宿主細胞の増大を刺激する方法は、キメラ受容体発現に使用する宿主細胞のタイプにより、当業者には明らかである。ある実施態様において、本発明のＰＵＣＲを発現する宿主細胞は、対象への投与前にエクスビボで増大される。
【０２０３】
ここに記載するＰＵＣＲの何れかを発現する宿主細胞を製造する方法はまた、エクスビボでの単離宿主細胞(例えば、Ｔ細胞)活性化を含み得る。宿主細胞の活性化は、宿主細胞を、該細胞がエフェクター機能(例えば、細胞毒性機能)を発揮し得る活性状態にまで刺激することを意味する。宿主細胞を活性化する方法は、ＰＵＣＲ発現に使用する宿主細胞のタイプによる。例えば、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２またはフィトヘマグルチニンのような分子の１以上の存在下、エクスビボで活性化され得る。他の例において、ＮＫ細胞は、４−１ＢＢリガンド、抗４−１ＢＢ抗体、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２、ＩＬ１２、ＩＬ−２１およびＫ５６２細胞のような分子の１以上の存在下、エクスビボで活性化され得る。ある実施態様において、ここに記載するＰＵＣＲの何れかを発現する宿主細胞は、対象に投与する前にエクスビボで活性化される。宿主細胞が活性化されているか否かの決定は当業者に明らかであり、細胞活性化と関連する１以上の細胞表面マーカーの発現、サイトカインの発現または分泌および細胞形態学の評価を含み得る。
【０２０４】
ここに開示するＰＵＣＲを発現する単離宿主細胞を作製するために、ＰＵＣＲの安定なまたは一過性の発現のための発現ベクターを、慣用の方法により構築し、単離宿主細胞へ導入し得る。例えば、ＰＵＣＲをコードする核酸(例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ)を、適当なプロモーターに操作可能に結合したウイルスベクターのような適当な発現ベクターにクローン化し得る。ある実施態様において、プロモーターは、誘導可能プロモーターである。ある実施態様において、プロモーターは、構成的プロモーターである。ある実施態様において、プロモーターは、組織特異的である。ある実施態様において、プロモーターは、細胞特異的である。発現ベクターを、ウイルスベクターの形で細胞に提供し得る。ウイルスベクターテクノロジーは当分野で周知であり、例えば、Sambrook et al. (2012) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NYおよび他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。一般に、適当なベクターは、少なくとも１生物で機能的な複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位および１以上の選択可能マーカーを含む(例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ０１／９６５８４号、ＷＯ０１／２９０５８号および米国特許６,３２６,１９３号に開示のとおり)。適当なベクターおよび導入遺伝子を含むベクターを産生する方法は周知であり、当分野で利用可能である。ある実施態様において、ベクターは、ウイルスベクターである。ある実施態様において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ベクターからなる群から選択される。ある実施態様において、ベクターは、マウス白血病ウイルス(ＭＬＶ)ベースのレトロウイルスベクターである(例えば、引用により本明細書に包含させるKim et al. (1998) J VIROL. 72(2): 994-1004参照)。ある実施態様において、ベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス(ＭｏＭｕＬＶ)ベースのレトロウイルスベクターである。
【０２０５】
サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)中間初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ＨＴＬＶ−１  ＬＴＲ、サルウイルス４０(ＳＶ４０)初期プロモーター、単純ヘルペスｔｋウイルスプロモーターのようなウイルスＬＴＲを含むが、これらに限定されない多様なプロモーターを、ここに記載するＰＵＣＲの発現に使用できる。ＰＵＣＲの発現のための付加的なプロモーターは、哺乳動物細胞(例えば、免疫細胞)におけるあらゆる構成的に活性なプロモーターを含む。あるいは、発現が宿主細胞内で調節可能であるようにあらゆる制御可能プロモーターを使用し得る。
【０２０６】
本発明において使用するためのベクターは、例えば、次の１以上を含み得る、選択可能マーカー遺伝子(例えば、安定なまたは一過性のトランスフェクタント選択のためのネオマイシン遺伝子)；高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの最初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０からの転写終結およびＲＮＡプロセシングシグナル；適切なエピソーム複製のためのＳＶ４０ポリオーマ複製起点およびＣｏｌＥ１；万能複数クローニング部位である配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳｅｓ)；センスおよびアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のためのＴ７およびＳＰ６  ＲＮＡプロモーター；誘発されたとき、ベクターを担持する細胞を殺す“自殺スイッチ”または“自殺遺伝子”(例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ｉＣａｓｐ９のような誘導可能カスパーゼ)およびＰＵＣＲの発現を評価するためのレポーター遺伝子。
【０２０７】
ＰＵＣＲをコードする核酸(例えば、ベクター)を宿主細胞に送達する方法は、当分野で周知である。ＰＵＣＲをコードする核酸(例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ)を、多数の種々の方法、例えば、エレクトロポレーション(Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems)、ECM 830 (BTX)(Harvard Instruments))またはGene Pulser II(BioRad)、Multiporator(Eppendorf)、リポフェクションを使用するカチオン性リポソーム介在トランスフェクション、ポリマーカプセル封入、ペプチド介在トランスフェクションまたは“遺伝子銃”のような微粒子銃粒子送達系を含むが、これらに限定されない、商業的に利用可能な方法の何れかを使用して、宿主細胞に導入させ得る(例えば、Nishikawa et al. (2001) HUM GENE THER. 12(8): 861-70参照)。
【０２０８】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学手段は、コロイド分散系、例えば高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズおよび水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースのシステムを含む。インビトロおよびインビボで送達媒体として使用するコロイド系の例は、リポソーム(例えば、人口膜小胞)である。標的化ナノ粒子でのポリヌクレオチドの送達または他の適当なサブミクロンサイズ送達系のような核酸の標的送達のための他の最先端の方法が利用可能である。
【０２０９】
非ウイルス送達系を利用する場合、例示的送達媒体は、リポソームである。脂質製剤の使用は、核酸の宿主細胞への導入(インビトロ、エクスビボまたはインビボ)のために企図される。他の態様において、核酸は、脂質と結合してよい。脂質と結合する核酸を、リポソームの水性内部に封入するか、リポソームの脂質二重層内に散在させるか、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方と結合する連結分子によりリポソームに結合させるか、リポソームに捕捉されても、リポソームと複合体化するか、脂質含有溶液に分散させるか、脂質と混合するか、脂質と組み合わせても、脂質中の懸濁液として包含させるか、ミセルと合わせるか複合体化させるかまたは脂質と他に結合させ得る。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液での何らかの特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造で、ミセルとしてまたは“崩壊”構造で存在し得る。それらはまた溶液中に単に散在され、おそらく、サイズまたは形が均一ではない凝集体を形成する。脂質は、天然に存在するまたは合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質で自然に生じる脂肪滴ならびに長鎖脂肪族炭化水素および脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドのようなそれらの誘導体を含む化合物群を含む。また企図されるのは、リポフェクタミン−核酸複合体である。ある実施態様において、本発明のＰＵＣＲをコードするベクターは、ウイルス形質導入により宿主細胞に送達される。送達のためのウイルス方法の例は、組み換えレトロウイルス(例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０７９３６号、ＷＯ９４／０３６２２号、ＷＯ９３／２５６９８号、ＷＯ９３／２５２３４号、ＷＯ９３／１１２３０号、ＷＯ９３／１０２１８号、ＷＯ９１／０２８０５号、米国特許５,２１９,７４０および４,７７７,１２７号、ＧＢ特許２,２００,６５１号およびＥＰ特許０３４５２４２号参照)、アルファウイルスベースのベクターおよびアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)ベクター(例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１２６４９号、ＷＯ９３／０３７６９号、ＷＯ９３／１９１９１号、ＷＯ９４／２８９３８号、ＷＯ９５／１１９８４号およびＷＯ９５／００６５５号参照)を含むが、これらに限定されない。
【０２１０】
ある態様において、非ウイルス方法を、ここに記載するＰＵＣＲをコードする核酸の細胞または組織または対象への送達に使用できる。ある実施態様において、非ウイルス方法は、トランスポゾン(転位因子とも称される)の使用を含む。ある実施態様において、トランスポゾンは、自体をゲノムにおけるある位置に挿入できる一片のＤＮＡ、例えば、自己複製し、そのコピーをゲノムに挿入できる一片のＤＮＡまたは長い核酸から切り出され、ゲノムにおける他の位置に挿入され得る一片のＤＮＡである。例えば、トランスポゾンは、転位のための逆反復フランキング遺伝子で構成されるＤＮＡ配列を含む。
【０２１１】
トランスポゾンを使用する核酸送達の例示的方法は、Sleeping Beautyトランスポゾンシステム(ＳＢＴＳ)およびpiggyBac(ＰＢ)トランスポゾンシステムを含む。例えば、各々の内容を引用により本明細書に包含させる、Aronovich et al. (2011) HUM. MOL. GENET. 20:R14-R20; Singh et al. (2008) CANCER RES. 15: 2961-2971; Huang et al. (2008) MOL. THER. 16: 580-589; Grabundzija et al. (2010) MOL. THER. 18: 1200-1209; Kebriaei et al. (2013) BLOOD. 122: 166; Williams (2008) Molecular Therapy 16: 1515-16; Bell et al. (2007) NAT. PROTOC. 2: 3153-65; and Ding et al. (2005) CELL 122: 473-83参照。ＳＢＴＳは、１)導入遺伝子を含むトランスポゾンおよび２)トランスポザーゼ酵素の供給の２成分を含む。トランスポザーゼは、トランスポゾンを担体プラスミド(または他のドナーＤＮＡ)から宿主細胞染色体／ゲノムのような標的ＤＮＡに転位させる。例えば、トランスポザーゼは、担体プラスミド／ドナーＤＮＡと結合し、トランスポゾン(導入遺伝子を含む)をプラスミドから切り出し、宿主細胞のゲノムに挿入する。例えば、Aronovich et al. (2011)参照。ＳＢＴＳの使用は、導入遺伝子、例えば、ここに記載するＰＵＣＲをコードする核酸の効率的組込みおよび発現を可能にする。ここに提供されるのは、例えば、ＳＢＴＳのようなトランスポゾンシステムを使用する、ここに記載するＰＵＣＲを安定に発現する、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を製造する方法である。
【０２１２】
例示的トランスポゾンは、ｐＴ２ベースのトランスポゾンを含む。例えば、内容を引用により本明細書に包含させるGrabundzija et al. (2013) NUCLEIC ACIDS RES. 41: 1829-47; and Singh et al. (2008) CANCER RES. 68: 2961-71参照。例示的トランスポザーゼは、Ｔｃｌ／ｍａｒｉｎｅｒタイプトランスポザーゼ、例えば、ＳＢ１０トランスポザーゼまたはＳＢｌｌトランスポザーゼ(例えば、サイトメガロウイルスプロモーターから発現され得る過活性トランスポザーゼ)を含む。
【０２１３】
ある実施態様において、ＳＢＴＳを使用する遺伝子挿入とヌクレアーゼ(例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮｓ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮｓ)、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたは操作メガヌクレアーゼ再設計ホーミングエンドヌクレアーゼ)を使用する遺伝子編集の組み合わせの使用により、ここに記載するＰＵＣＲを発現する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を産生する。
【０２１４】
本発明に含まれる単離宿主細胞は、１を超えるタイプのＰＵＣＲ(例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のタイプのＰＵＣＲ)を発現し得る。それ故に、本発明のある実施態様において、単離宿主細胞は、１タイプのＰＵＣＲを発現し得る。ある実施態様において、本発明の単離宿主細胞は、２タイプのＰＵＣＲを発現し得る。本発明のある実施態様において、単離宿主細胞は、３タイプのＰＵＣＲを発現し得る。本発明のある実施態様において、単離宿主細胞は、４タイプのＰＵＣＲを発現し得る。本発明のある実施態様において、単離宿主細胞は、５タイプのＰＵＣＲを発現し得る。本発明のある実施態様において、単離宿主細胞は、６タイプのＰＵＣＲを発現し得る。１を超えるタイプのＰＵＣＲの発現は、治療目的で特に有利であり得る。例えば、ある実施態様において、本発明の宿主細胞は、活性化受容体タンパク質からの共刺激性ドメインを含むＰＵＣＲおよび阻害性受容体タンパク質からの共刺激性ドメインを含むＰＵＣＲを発現し得る。該ＰＵＣＲの各々を、異なるリガンドにさらにプログラム(例えば、コンジュゲート)し得る。例えば、ある実施態様において、宿主細胞は、癌と関連するタンパク質と結合する特異性作用物質でプログラム(すなわち、コンジュゲート)されている活性化受容体(例えば、ＤＡＰ１０)からの共刺激性シグナル伝達ドメインを含むＰＵＣＲおよび正常細胞(例えば、非癌細胞)の表面に存在しないまたは存在が最小限であるリガンドに結合する特異性作用物質でプログラム(すなわち、コンジュゲート)されている阻害性受容体(例えば、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ)からの共刺激性シグナル伝達ドメインを含む第二ＰＵＣＲを含み得る。宿主細胞で該ＰＵＣＲの両方が発現されたとき、宿主細胞(例えば、Ｔ細胞)の活性化は、正常宿主細胞に結合しているとき、Ｔ細胞が活性化されないまたは低活性化を示すように制御できる。
【０２１５】
本発明のある実施態様において、ＰＵＣＲを含む宿主細胞を非治療目的で使用できる。例えば、ＰＵＣＲを含む宿主細胞を診断目的で使用てきおよび／または特定の細胞(例えば、癌細胞)がその表面にバイオマーカーを発現するか否かの決定に使用できる。
【０２１６】
ここに開示するＰＵＣＲを発現する本発明の単離宿主細胞は、特異性作用物質の１以上を使用してプログラムされ得る。本発明の一つの利点は、ここに開示するＰＵＣＲを発現する宿主細胞を、１以上の目的のリガンドを標的とするようプログラムできることである。それ故に、本発明の単一宿主細胞は、複数の特異性を有し得る。例えば、ある実施態様において、本発明のＰＵＣＲを含む宿主細胞は、第一リガンドに特異的な特異性作用物質とコンジュゲートするＰＵＣＲを含み、さらに第一リガンドと異なる第二リガンドに特異的な特異性作用物質とコンジュゲートするＰＵＣＲを含む。ある実施態様において、該第一リガンドおよび該第二リガンドは、同一タンパク質の異なるエピトープであり得る。ある実施態様において、該第一および第二リガンドは異なるタンパク質であり得る。
【０２１７】
ある実施態様において、本発明のＰＵＣＲを含む宿主細胞は、第一抗原に特異的な特異性作用物質とコンジュゲートするＰＵＣＲおよび第一抗原と異なる第二抗原に特異的な特異性作用物質とコンジュゲートするＰＵＣＲを含む。ある実施態様において、ここに開示するＰＵＣＲを発現する宿主細胞を、複数特異性作用物質(例えば、２、３、４、５、６、７または８特異性作用物質)でプログラムし得る。それ故に、単一宿主細胞は２、３、４、５、６、７またはそれ以上のＰＵＣＲを含んでよく、ここで、各ＰＵＣＲは、異なる特異性作用物質にコンジュゲートされている。該特異性作用物質は、全て同じタイプの特異性作用物質でも、異なるタイプの特異性作用物質でもよい。例えば、ここに開示するＰＵＣＲを発現する宿主細胞を、結合タンパク質(例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント)を含む第一特異性作用物質および小分子(例えば、葉酸または２−[３−(１、３−ジカルボキシプロピル)−ウレイド]ペンタン二酸(ＤＵＰＡ)を含む第二特異性作用物質を含む。ここに開示するＰＵＣＲを発現する宿主細胞を２以上の特異性作用物質でプログラムする能力は、ここに開示するＰＵＣＲを発現する同じ宿主細胞(例えば、免疫細胞)を使用して複数リガンドを標的とすることが望まれ得る、癌のような複雑な疾患および／または医学的状態の処置に特に有利であり得る。
【０２１８】
ここに開示するＰＵＣＲを発現する本発明の単離宿主細胞を、ＰＵＣＲの反応性アミノ酸残基により反応性部分を含むリンカーにコンジュゲートさせ得る。ある実施態様において、ＰＵＣＲを、インビトロでリンカーにコンジュゲートする。ある実施態様において、ＰＵＣＲを、インビボでリンカーにコンジュゲートする。次いで、ＰＵＣＲをリンカーに存在するコンジュゲーション官能基(例えば、第一直交官能基)と、特異性作用物質に存在する化学部分(例えば、第二直交官能基)の反応によりプログラムできる。ある実施態様において、特異性作用物質を、でインビトロＰＵＣＲにコンジュゲートしたリンカーと反応させる。ある実施態様において、特異性作用物質を、インビボでＰＵＣＲにコンジュゲートしたリンカーと反応させる。
【０２１９】
本発明においてまた提供されるのは、宿主細胞の集団(例えば、免疫細胞)であり、ここで、宿主細胞の集団は、ａ)第一リガンドに結合する特異性作用物質に結合したＰＵＣＲを含む宿主細胞の亜集団およびｂ)第一リガンドと異なる第二リガンドに結合したＰＵＣＲを含む宿主細胞の亜集団を含む。ある実施態様において、本発明は、宿主細胞の集団(例えば、免疫細胞)を提供し、ここで、宿主細胞の集団は、ａ)第一抗原に結合する特異性作用物質に結合したＰＵＣＲを含む宿主細胞の亜集団およびｂ)第一抗原と異なる第二抗原に結合したＰＵＣＲを含む宿主細胞の亜集団を含む。ある実施態様において、本発明は、宿主細胞の集団を提供し、ここで、宿主細胞の集団は、ＰＵＣＲを含む２、３、４、５、６、７またはそれ以上の宿主細胞の亜集団を含み、ここで、各宿主細胞の亜集団は、他の宿主細胞の亜集団の各々の特異性作用物質と異なる特異性作用物質に結合したＰＵＣＲを含む。
【０２２０】
Ｅ. キット
本発明はまた、１以上のここに開示する組成物を含むキットを提供する。本発明のキットは、ここに開示するＰＵＣＲを含む宿主細胞の集団を含み、ある実施態様において、さらにここに記載する方法の何れかにおける使用のための指示を含む、１以上の容器を含む。キットは、さらに処置に適する個体(例えば、特異性作用物質)の選択についての記載を含む。本発明のキットにおいて提供される指示は、一般にラベルまたは添付文書(例えば、キットに含まれる紙)の書面であるが、機械可読指示(例えば、磁気または光学保存ディスク)も許容される。
【０２２１】
ある実施態様において、キットは、ａ)特異性作用物質に結合していない反応性アミノ酸残基、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む触媒的抗体またはその触媒的部分を含むＰＵＣＲを含む宿主細胞の集団を含む、組成物およびｂ)疾患の有効な処置のための対象に宿主細胞の集団を投与するための指示を含む。ある実施態様において、該疾患は、癌である。他の実施態様において、該疾患は、疾患原因生物(例えば、プリオン、ウイルス、細菌、真菌、原生動物および寄生虫)により引き起こされる医学的状態である。ある実施態様において、キットは、さらに１以上の特異性作用物質を含む。ＰＵＣＲおよび特異性作用物質を含む宿主細胞の集団は、別々の容器または一つの容器に存在し得る。ある実施態様において、ＰＵＣＲを含む宿主細胞の集団は、約１×１０１宿主細胞〜約１×１０１２宿主細胞含む。ある実施態様において、ＰＵＣＲを含む宿主細胞の集団は、約１×１０１宿主細胞含む。ある実施態様において、ＰＵＣＲを含む宿主細胞の集団は、約１×１０２宿主細胞含む。ある実施態様において、ＰＵＣＲを含む宿主細胞の集団は、約１×１０３宿主細胞含む。ある実施態様において、ＰＵＣＲを含む宿主細胞の集団は、約１×１０４宿主細胞含む。ある実施態様において、ＰＵＣＲを含む宿主細胞の集団は、約１×１０５宿主細胞含む。ある実施態様において、ＰＵＣＲを含む宿主細胞の集団は、約１×１０６宿主細胞含む。ある実施態様において、ＰＵＣＲを含む宿主細胞の集団は、約１×１０７宿主細胞含む。ある実施態様において、ＰＵＣＲを含む宿主細胞の集団は、約１×１０８宿主細胞含む。ある実施態様において、ＰＵＣＲを含む宿主細胞の集団は、約１×１０９宿主細胞含む。ある実施態様において、ＰＵＣＲを含む宿主細胞の集団は、約１×１０１０宿主細胞含む。ある実施態様において、ＰＵＣＲを含む宿主細胞の集団は、約１×１０１１宿主細胞含む。ある実施態様において、ＰＵＣＲを含む宿主細胞の集団は、約１×１０１２宿主細胞含む。他の実施態様において、キットは、ａ)反応性アミノ酸残基、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む、触媒的抗体またはその触媒的部分を含むＰＵＣＲをコードする核酸分子を含む、組成物；およびｂ)ＰＵＣＲをコードする核酸分子を単離宿主細胞に導入するための指示を含む。
【０２２２】
本発明のキットは、適当に包装される。適当な包装は、バイアル、ビン、ジャー、フレキシブル包装(例えば、密閉マイラーまたはビニール袋)などを含むが、これらに限定されない。キットは、場合により緩衝液および解釈上の情報のような付加的な成分を含み得る。
【０２２３】
ここに開示する組成物の使用に関する指示は、意図する処置についての用量、投与スケジュールおよび投与経路の情報を含む。容器は、単位用量、大量包装(例えば、多用量包装)またはサブユニット用量であり得る。
【０２２４】
II. 本発明の組成物を使用する方法
本発明の組成物は、ここに開示するＰＵＣＲの万能性により、多様な医学的状態および疾患の処置に適する。上記のとおり、本発明のＰＵＣＲをコードする核酸を使用して、任意の目的のリガンドを標的とするようにプログラムされ得る単離宿主細胞を得ることができる。例えば、ある実施態様において、宿主細胞は、免疫細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)である。該実施態様において、本発明は、疾患を処置するために、必要に応じて、カスタマイズされ得る、プログラム可能免疫療法を有利に提供する。該プログラム可能免疫療法は、癌および感染症のような複雑な疾患の処置に特に有利である。
【０２２５】
本発明の方法のある特定の利点は、ＰＵＣＲを含む宿主細胞の集団をここに記載する方法を使用して、まずプログラムされることなく(すなわち、まず特異性作用物質とコンジュゲートされることなく)、容易に製造し、保存(例えば、凍結保存)または対象への投与ができることである。その後、必要に応じて、宿主細胞の集団を回収(例えば、対象から単離)し、随意にプログラム(例えば、目的の特異性作用物質とコンジュゲート)し、対象に投与し得る。それ故に、例えば、宿主細胞が、例えば、Ｔ細胞であるならば、本発明のＰＵＣＲを含むＴ細胞の集団を製造し、ヒト対象に投与できる。何らかの特定の理論に拘束させることを望まないが、ＰＵＣＲを含む該Ｔ細胞の集団は、対象において繁殖、増大および／または確立でき、そうして、ＰＵＣＲを含むＴ細胞を無制限に供給できる可能性があり、これを必要に応じて回収(例えば、対象から単離)し、随意にプログラムし得る。
【０２２６】
キメラ抗原受容体を発現する宿主細胞(すなわち、ＣＡＲ  Ｔ細胞)で処置される患者で生じ得る可能性のある問題は、アナフィラキシーが、細胞で、特に非ヒト由来タンパク質配列または領域(例えば、マウスｓｃＦｖ)を含むキメラ抗原受容体での複数処置後発症し得ることである。このようなアナフィラキシー応答は液性抗ＣＡＲ応答、すなわち、抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＣＡＲ抗体が原因であると考えられる。何らかの特定の理論に拘束させることを望まないが、本発明の方法の特定の利点は、本発明のＰＵＣＲを含む宿主細胞が、投与される対象において液性応答を誘発しない可能性があることである。例えば、ある実施態様において、ＰＵＣＲを、ヒト化および／またはヒト配列のみを含むよう設計できる。それ故に、対象に投与したとき、ＰＵＣＲを含む宿主細胞を、抗原休止状態であるように設計し得る。ある実施態様において、該宿主細胞が、非ヒト由来タンパク質配列または領域を含む特異性作用物質に対してプログラム(すなわち、コンジュゲート)されているＰＵＣＲを含むとしても、該プログラムされたＰＵＣＲは、対象において有害な免疫反応が発症しないように、対象への宿主細胞投与後、限定的な時間しか対象の免疫系に暴露されない。これは、ＰＵＣＲが正常原形質膜再循環プロセス(例えば、エンドサイトーシス)中に内部移行するためまたはプログラムされたＰＵＣＲを含む宿主細胞が死滅するための何れかによるものであり得る。
【０２２７】
本発明の他の態様において、対象に、ここに記載するとおり、コンジュゲーション官能基を含むリンカーとコンジュゲートされているＰＵＣＲを含む宿主細胞の集団を投与し得る。次いで、対象に、随意にＰＵＣＲをプログラムするために、該コンジュゲーション官能基と反応可能な化学部分を含む特異性作用物質を投与し得る。それ故に、ある実施態様において、ＰＵＣＲは、インビボまたはインサイチュでプログラムされる。他の実施態様において、リンカーとコンジュゲートしているＰＵＣＲを含む宿主細胞の集団を対象から摘出し、エクスビボで該コンジュゲーション官能基と反応可能な化学部分を含む特異性作用物質でプログラムし得る。
【０２２８】
ある態様において、本発明は、免疫細胞と、該免疫細胞の細胞膜に発現されるＰＵＣＲに結合する特異性作用物質を接触させることを含み、ここで、特異性作用物質は、処置を必要とする対象の疾患抗原プロファイルに対応する疾患関連抗原に結合するものである、処置を必要とする対象における疾患の処置に使用するためのカスタマイズされた治療的宿主細胞を製造する方法を提供する。ある実施態様において、カスタマイズされた治療的宿主細胞を、インビボでＰＵＣＲと結合する特異性作用物質と接触させる。ある実施態様において、カスタマイズされた治療的宿主細胞を、インビトロでＰＵＣＲと結合する特異性作用物質と接触させる。ある実施態様において、カスタマイズされた治療的宿主細胞を、インサイチュでＰＵＣＲと結合する特異性作用物質と接触させる。また提供されるのは、免疫細胞と、該免疫細胞の細胞膜に発現されるＰＵＣＲに結合する特異性作用物質を接触させることを含み、ここで、特異性作用物質は、処置を必要とする対象の癌抗原プロファイルに対応する癌関連抗原と結合するものである、処置を必要とする対象における癌の処置において使用するためのカスタマイズされた治療的宿主細胞を製造する方法を提供する。本発明はまた、免疫細胞と、該免疫細胞の細胞膜に発現されるＰＵＣＲに結合する特異性作用物質を接触させることを含み、ここで、特異性作用物質は、処置を必要とする対象の疾患原因生物抗原プロファイルに対応する疾患原因生物抗原と結合するものである、処置を必要とする対象における感染性疾患の処置において使用するためのカスタマイズされた治療的宿主細胞を製造する方法を提供する。
【０２２９】
ある態様において、本発明は、対象に、本発明のＰＵＣＲを含む単離宿主細胞または該宿主細胞の集団を投与することを含む、処置を必要とする対象における癌を処置するまたは腫瘍増殖を阻害する方法を提供する。ある実施態様において、単離宿主細胞は、免疫細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)である。ある実施態様において、本発明のＰＵＣＲを含む単離宿主細胞は、対象に由来する。ある実施態様において、本発明のＰＵＣＲを含む単離宿主細胞は、対象に由来しない。ある実施態様において、単離宿主細胞は、株化細胞(例えば、ＮＫ−９２細胞)からの細胞である。
【０２３０】
当分野で知られるあらゆる癌が本発明の方法により処置され得て、前立腺癌、胆管癌、脳癌(神経膠芽腫および髄芽腫を含む)、乳癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、血液腫瘍(例えば、急性リンパ性および骨髄性白血病、多発性骨髄腫、ＡＩＤＳ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病リンパ腫を含む)、上皮内腫瘍(例えば、ボーエン病およびページェット病を含む)、肝臓癌、肺癌、リンパ腫(例えば、ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含む)、神経芽腫、口腔癌(扁平上皮細胞癌を含む)、卵巣癌(上皮性細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉性細胞に起因するものを含む)、膵臓癌、直腸癌、肉腫(例えば、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫および骨肉腫を含む)、皮膚癌(例えば、黒色腫、カポジ肉腫、基底細胞癌および扁平上皮細胞癌を含む)、精巣癌(例えば、胚腫瘍(精上皮腫、非精上皮腫(奇形腫、絨毛癌)、間質腫瘍および生殖細胞腫瘍を含む)、甲状腺癌(例えば、甲状腺腺癌および髄様癌を含む)および腎臓癌(例えば、腺癌およびウィルムス腫瘍を含む)を含む。
【０２３１】
ある実施態様において、癌は、タンパク質の高発現レベルと関連する。該実施態様において、本発明のＰＵＣＲを含む単離宿主細胞を、高発現レベルが癌と関連するタンパク質を標的とする(例えば、特異的結合する)特異性作用物質でプログラム(例えば、コンジュゲート)できる。ある実施態様において、高発現レベルが癌と関連するタンパク質は、癌細胞の表面に発現される。ある実施態様において、高発現レベルが癌と関連するタンパク質は、癌細胞の表面に発現されない。
【０２３２】
ある態様において、本発明は、(ａ)対象における癌抗原プロファイルを決定し、(ｂ)(ａ)において同定された抗原に結合する特異性作用物質を選択し、そして(ｃ)(ｂ)で同定された特異性作用物質に結合(例えば、コンジュゲート)したＰＵＣＲを含む免疫細胞を投与し、それにより処置を必要とする対象における癌を処置することを含む、処置を必要とする対象における癌を処置する方法を提供する。
【０２３３】
ある態様において、本発明は、腫瘍の癌細胞と、癌関連抗原に結合する特異性作用物質にコンジュゲートしたＰＵＣＲを含む免疫細胞を、免疫細胞が該抗原に応答して活性化され、該腫瘍の癌細胞を標的とするように接触させることを含み、ここで、腫瘍の増殖が阻害される、癌関連抗原を発現する腫瘍の増殖を阻害する方法を提供する。ある実施態様において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。他の実施態様において、免疫細胞は、ＮＫ細胞である。ある実施態様において、免疫細胞は、ＮＫ−９２細胞である。ある実施態様において、免疫細胞は、腫瘍細胞を殺す。
【０２３４】
ある態様において、本発明は、癌関連抗原発現細胞集団と、癌関連抗原に結合する特異性作用物質にコンジュゲートした本発明のＰＵＣＲを含む宿主細胞を接触させ、それにより癌関連抗原を発現する癌細胞の集団の増殖を阻害するまたは低減することを含む、癌関連抗原を発現する癌細胞の集団の増殖を阻害するまたは低減する方法を提供する。ある態様において、方法は、宿主細胞を投与される前の対象における悪性および／または癌細胞の数量、数、量またはパーセンテージと比較して、対象における悪性および／または癌細胞の数量、数、量またはパーセンテージの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％または少なくとも９９％減少をもたらす。ある実施態様において、対象は、ヒトである。
【０２３５】
他の態様において、本発明は、対象に、本発明のＰＵＣＲを含む単離宿主細胞または該宿主細胞の集団を投与することを含む、対象における疾患原因生物により引き起こされる医学的状態を処置する方法を提供する。ある実施態様において、単離宿主細胞は、免疫細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)である。ある実施態様において、本発明のＰＵＣＲを含む単離宿主細胞は、対象に由来する。ある実施態様において、本発明のＰＵＣＲを含む単離宿主細胞は、対象に由来しない。ある実施態様において、単離宿主細胞は、株化細胞(例えば、ＮＫ−９２細胞)からの細胞である。
【０２３６】
ある態様において、本発明は、(ａ)対象の疾患原因生物抗原プロファイルを決定し、(ｂ)(ａ)において同定された抗原に結合する特異性作用物質を選択し、そして(ｃ)(ｂ)で同定された特異性作用物質に結合(例えば、コンジュゲート)したＰＵＣＲを含む免疫細胞を投与し、それにより処置を必要とする対象における疾患原因生物により引き起こされる医学的状態を処置することを含む、処置を必要とする対象における疾患原因生物により引き起こされる医学的状態を処置する方法を提供する。
【０２３７】
ある態様において、本発明は、(ａ)対象の疾患原因生物抗原プロファイルを決定し、(ｂ)(ａ)において同定された抗原に結合する特異性作用物質を選択し、そして(ｃ)(ｂ)で同定された特異性作用物質に結合(例えば、コンジュゲート)したＰＵＣＲを含む免疫細胞を投与し、それにより処置を必要とする対象における疾患原因生物が原因の感染を解消することを含む、処置を必要とする対象における疾患原因生物が原因の感染を解消する方法を提供する。
【０２３８】
ある態様において、本発明は、疾患原因生物と、疾患原因生物の抗原に結合する特異性作用物質にコンジュゲートしたＰＵＣＲを含む免疫細胞を、免疫細胞が該抗原に応答して活性化され、疾患原因生物または対象の疾患原因生物に感染した細胞を標的とするように接触させることを含み、ここで、疾患原因生物を殺滅するものである、処置を必要とする対象における疾患原因生物を殺滅させる方法を提供する。ある実施態様において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。他の実施態様において、免疫細胞は、ＮＫ細胞である。ある実施態様において、免疫細胞は、ＮＫ−９２細胞である。ある実施態様において、免疫細胞は、疾患原因生物または対象の疾患原因生物に感染した細胞を殺す。
【０２３９】
ある態様において、本発明は、対象における疾患原因生物の集団と、疾患原因生物の抗原に結合する特異性作用物質とコンジュゲートした本発明のＰＵＣＲを含む宿主細胞を接触させ、それにより疾患原因生物の集団の増殖を阻害するまたは低減することを含む、疾患原因生物の集団の増殖を阻害するまたは低減する方法を提供する。ある態様において、方法は、宿主細胞投与前の対象における疾患原因生物の数量、数、量またはパーセンテージと比較して、対象における疾患原因生物の数量、数、量またはパーセンテージの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％または少なくとも９９％減少をもたらす。ある実施態様において、対象は、ヒトである。
【０２４０】
ある実施態様において、疾患原因生物は、プリオン、ウイルス、原生動物、細菌、真菌または寄生虫からなる群から選択される。何らかの特定の理論に拘束させることを望まないが、本発明の方法は、免疫回避機序として抗原変異を受けることができる疾患原因生物により引き起こされる医学的状態の処置に特に有利である(例えば、トリパノソーマ・ブルセイ；例えば、Horn (2014) MOL. BIOCHEM. PARASITOL. 195(2): 123-129参照)。それ故に、例えば、ここに開示するＰＵＣＲを含む宿主細胞の使用により、治療を、疾患原因生物により発現される抗原変異体を標的とするようカスタマイズし得る。ある実施態様において、疾患原因生物は、病原性ウイルスまたは病原性細菌である。ある実施態様において、ウイルスは、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、肝炎ウイルス(例えば、肝炎ウイルスＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型および／またはＧ型)、サイトメガロウイルス、サル免疫不全ウイルス、脳炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルスおよびコロナウイルス科、ビルナウイルス科またはフィロウイルス科ウイルスファミリーに属するウイルスからなる群から選択される。ある実施態様において、細菌は、マイコバクテリウム(例えば、マイコバクテリウム・ツベルクローシス)、クラミジア、ナイセリア(例えば、ナイセリア・ゴノレア)、シゲラ、サルモネラ、モラクセラ(例えば、モラクセラ・カタラーリス)、ビブリオ(例えば、ビブリオ・コレラエ)、トレポネーマ(例えば、トレポネーマ・パリジウム)、シュードモナス、ボルデテラ(例えば、ボルデテラ・パータシス)、ブルセラ、フランシセラ(例えば、フランシセラ・ツラレンシス)、ヘリコバクター(例えば、ヘリコバクター・ピロリ)、レプトスピラ(例えば、レプトスピラ・インテロガンス)、レジオネラ(例えば、レジオネラ・ニューモフィラ)、エルシニア(例えば、エルシニア・ペスティス)、ストレプトコッカス(例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ)およびヘモフィルス(例えば、ヘモフィルス・インフルエンザ)からなる群から選択される。ある実施態様において、寄生虫は、住血吸虫(例えば、マンソン住血吸虫)、トリパノソーマ(例えば、トリパノソーマ・ブルセイ)、肝蛭属(例えば、肝蛭)、鞭虫属(例えば、鞭虫)、マラリア原虫(例えば、三日熱マラリア原虫および熱帯熱マラリア原虫)からなる群から選択される。ある実施態様において、原生動物は、エントアメーバ属(例えば、赤痢アメーバ)、クリプトスポリジウム属(例えば、クリプトスポリジウム・パルバム)、トキソプラズマ属(例えば、トキソプラズマ・ゴンディ)およびジアルジア属(例えば、ランブル鞭毛虫)からなる群から選択される。
【０２４１】
本発明のある態様において、ＰＵＣＲを含む宿主細胞を、対象に、宿主細胞(またはその子孫)、対象に宿主細胞投与後、対象において、少なくとも０.５日、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日またはそれ以上を含むが、これらに限定されない一定日数存続するように投与する。本発明のある態様において、ＰＵＣＲを含む宿主細胞を対象に投与し、宿主細胞(またはその子孫)は、対象に宿主細胞投与後、対象において少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２年、３年、４年、５年またはそれ以上存続する。
【０２４２】
ある実施態様において、対象に、特異性作用物質でプログラム(すなわち、コンジュゲート)されているＰＵＣＲを含む宿主細胞を投与する。プログラムされたＰＵＣＲの一部または全てが正常原形質膜再循環プロセス中、該宿主細胞により内部移行され得るため、宿主細胞は、標的分子に結合する能力が下がるかまたはそれに対する特異性が下がり得る。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、宿主細胞によるプログラムされたＰＵＣＲの内部移行は、プログラムされたＰＵＣＲを含む宿主細胞の活性(例えば、細胞毒性活性)を制御する手段を提供するため、特に有利であり得る。ある実施態様において、対象に、特異性作用物質でプログラムされているＰＵＣＲを含む宿主細胞を再投与しなければならない。ある実施態様において、特異性作用物質でプログラムされていない(すなわちコンジュゲートしていない)ＰＵＣＲを含む宿主細胞の供給源は、対象である。ある実施態様において、特異性作用物質でプログラムされていない(すなわちコンジュゲートしていない)ＰＵＣＲを含む宿主細胞の供給源は、対象ではない。
【０２４３】
ある態様において、本発明は、ここに記載するＰＵＣＲを含む宿主細胞を、１以上の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または添加物と共に含む、医薬組成物を提供する。このような組成物は、緩衝液(例えば、緩衝化食塩水(例えば、リン酸緩衝化食塩水)など)、グルコース、マンノース、スクロース、デキストラン、糖アルコール(例えば、マンニトール)のような炭水化物、タンパク質(例えば、増殖因子およびサイトカイン)、アミノ酸、抗酸化剤、キレート剤(例えば、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ)、アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)および防腐剤を含み得る。ある実施態様において、本発明において使用するための医薬組成物は、静脈内投与用に製剤される。
【０２４４】
本発明の組成物を、例えば、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、注入、留置または移植を含む、当分野で知られる任意の手段により投与し得る。ここに記載する組成物(例えば、ここに記載するＰＵＣＲを含む宿主細胞)を、対象に、経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、静脈内(ｉ.ｖ.)または腹腔内注射により投与し得る。ある実施態様において、本発明の組成物を、対象に皮内または皮下注射により投与する。他の実施態様において、本発明の組成物を、ｉ.ｖ.注射により投与する。ある実施態様において、本発明の組成物を、注射により腫瘍、リンパ節または感染の部位に直接投与する。対象に投与すべき本発明の組成物の正確な量または用量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、転移、感染の程度、対象の既存の医学的状態および対象の現在の生理学的状態の個々の差異を考慮して、医師により決定され得る。
【０２４５】
ある実施態様において、ここに記載する宿主細胞を含む医薬組成物を、約１０１〜約１０９細胞／kg体重の用量で投与し得る。上記用量の間の範囲、例えば、約１０２〜約１０８細胞／kg体重、約１０４〜約１０７細胞／kg体重、約１０５〜約１０６細胞／kg体重も本発明の一部であることが意図される。ある実施態様において、ここに記載する宿主細胞を、約１０２〜約１０１１細胞／ｍ２の用量で投与し得る。上記用量の間の範囲、例えば、約１０３〜約１０９細胞／ｍ２、約１０４〜約１０７細胞／ｍ２、約１０５〜約１０６細胞／ｍ２も本発明の一部であることが意図される。さらに、上限および／または下限としての上記値の何かの組み合わせを使用する値の範囲も包含されることが意図される。ある実施態様において、約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２またはそれ以上の、ここに記載する宿主細胞を対象に投与する。宿主細胞組成物を、これらの用量で複数回投与もし得る。
【０２４６】
III. 例示
本発明を、さらに次の実施例により説明するが、これは、決して限定的に解釈してはならない。本明細書をとおして引用する文献、特許および公開特許出願を含む、全ての引用文献は、引用により本明細書に明示的に包含させる。ここに添付する図および表の全ての内容も、引用により本明細書に明示的に包含させることも理解されるべきである。
【０２４７】
実施例１. ヒト化およびマウス３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃの構築および特徴付け
マウスモノクローナル抗体３８Ｃ２は、１９９０年代にScripps Research InstituteのLerner/Barbasのグループにより発見された触媒的抗体である(Wagner et al. SCIENCE (1995) 270: 1797-1800)。可変ドメインは、疎水性コアに位置するリシン残基を含む。微量化学環境のため、リシン側鎖ＮＨ２基は、生理学的条件下、非プロトン化のままであり、共有結合を形成するために反応性部分で攻撃可能である(図２)。図２に記載するとおり、３８Ｃ２抗体(例えば、ヒト化３８Ｃ２抗体)の可変ドメインにおけるＬｙｓ９３残基は、特異性作用物質の反応性部分と相互作用するために求核試薬として働くことができ、Ｌｙｓ９３残基と特異性作用物質の間の共有結合の形成をもたらす。
【０２４８】
ヒト化またはマウス３８Ｃ２のヒト化およびマウス３８Ｃ２一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)を作製するために、マウスおよびヒト化３８Ｃ２  ＩｇＧの重鎖および軽鎖可変ドメイン配列(Rader et al. J. MOL. BIOL. (2003) 332: 889-899)を、コドン最適化し、合成し、ｓｃＦｖをコードする遺伝子として再フォーマットし、発現および精製のためにｓｃＦｖフラグメントがヒトＩｇＧ１のＦｃ(フラグメント定常)部分に対してフレーム内で融合されるように、哺乳動物細胞発現ベクターにクローン化した。チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞を、トランスフェクション試薬リポフェクタミン(ThermoFisher)を使用して何れかの発現ベクターでトランスフェクトした。マウスおよびヒト化３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃの両方を、触媒的活性試験のために均一になるまで精製した。図３は、非還元および還元条件下のヒト化およびマウス３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃの両方についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図３に示すとおり、ヒト化およびマウス３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃの両方をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用して精製し、単一ｓｃＦｖ−Ｆｃの分子量は還元条件下約６０kDaであり、一方非還元条件で、ｓｃＦｖ−Ｆｃの分子量は約１２０kDaであり、二量体が形成されたことを示した。
【０２４９】
精製マウスおよびヒト化３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃが触媒的活性を保持し、故に機能的であるか否かを決定するために、反応性部分、すなわち、アゼチジノン−ＰＥＧ５−メチルエステルを含む代表的特異性作用物質を、該分子とコンジュゲートした。簡潔にいうと、ＰＣＲチューブで、１.６μLのアゼチジノン−ＰＥＧ５−メチルエステルのＤＭＳＯ溶液(１.０mg／mL)を、９６μLの３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃ(０.５２mg／mL)とＰＢＳ、ｐＨ７.４中混合した。ＰＣＲチューブを、チューブローテイターを使用して一夜、室温で定期的に回転させた。過剰のアゼチジノン−ＰＥＧ５−メチルエステルを、Ultracel-10膜を備えたAmicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit(EMD Millipore Cat. No. UFC801008)を使用する遠心濾過により、反応物から除去した。
【０２５０】
次いで、各サンプルをマススペクトロメトリー分析に供した。マススペクトロメトリーデータは、３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃの大部分が、１または２コピーのアゼチジノン−ＰＥＧ５−メチルエステルとコンジュゲートしたことを示し、精製マウスまたはヒト化３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃがアゼチジノン−ＰＥＧ５−メチルエステルとのコンジュゲーション反応の触媒に機能的であることを確認した(図４および５参照)。ペプチドマッピングを実施して、例えば、Xie et al. (2009) Waters APPLICATION NOTE 720002897ENに記載のとおり、ヒト化３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃ上のアゼチジノン−ＰＥＧ５−メチルエステルのコンジュゲーション部位を確認した(図６参照)。アゼチジノン−ＰＥＧ５−メチルエステルを含むペプチドフラグメントの質量はリシン残基を含むことを示し、コンジュゲーションが重鎖のＬｙｓ９３で起こることをさらに示唆した(図６、表５)。
【表１２】
2018537076.tif 000013
【０２５１】
実施例２. プログラム可能な普遍的細胞受容体の産生
プログラム可能な普遍的細胞受容体(ＰＵＣＲ)を産生するために、ＰＵＣＲのドメインをコードする遺伝子をコドン最適化し、カスタム合成した(GenScript)。ＰＵＣＲの完全長遺伝子は、１)分子の分泌または細胞表面発現のためのシグナルペプチド、２)ＰＵＣＲ発現検出のためのｍｙｃタグ、３)実施例１に記載する触媒的抗体またはその触媒的部分(例えば、ｓｃＦｖ−Ｆｃ)、４)ヒンジ領域(例えば、ＣＤ８ヒンジ領域)、５)膜貫通ドメイン(例えば、ＣＤ３ゼータ膜貫通ドメイン)、６)細胞質ドメイン(例えば、Ｔ細胞存続のためのＣＤ２８細胞内ドメインおよび／またはＮＫまたはＴ細胞活性化のためのＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン)のためのインフレーム配列を含む。成分の各々のアミノ酸および核酸配列を下記表５に挙げる。
【０２５２】
【表１３】
2018537076.tif 000014
【表１４】
2018537076.tif 000015
【表１５】
2018537076.tif 000016
【表１６】
2018537076.tif 000017
【表１７】
2018537076.tif 000018
【表１８】
2018537076.tif 000019
上記例示的配列の何れも、ここに記載するＰＵＣＲに包含させ得る。
【０２５３】
実施例３. プログラム可能な普遍的細胞受容体を発現するＴ細胞またはＮＫ細胞(ＰＵＣＲ−ＴまたはＰＵＣＲ−ＮＫ細胞)の特異性作用物質での標識
ＰＵＣＲ−Ｔ細胞およびＰＵＣＲ−ＮＫ細胞を産生する。ＰＵＣＲを発現するＰＵＣＲ−Ｔ細胞またはＰＵＣＲ−ＮＫ細胞を標識するために、細胞を、ターゲティング部分(例えば、腫瘍特異的タンパク質結合部分)および反応性部分を含む特異性作用物質(例えば、抗原結合分子)と接触させる。反応性部分およびターゲティング部分は、リンカー(例えば、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)フラグメント)により結合させ得る。例えば、葉酸−ジケトン、葉酸−アゼチジノン、ＤＵＰＡ−ジケトンおよびＤＵＰＡ−アゼチジノンを特異性作用物質として使用する。これら４個の例示的特異性作用物質の化学構造を、図７〜１１に記載する。葉酸は、多くの腫瘍タイプの表面に高度に過発現する葉酸受容体を標的とするターゲティング部分として働き、２−[３−(１、３−ジカルボキシプロピル)−ウレイド]ペンタン二酸(ＤＵＰＡ)は、前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)を標的とするターゲティング部分として働く。ジケトン基またはアゼチジノン基は、ＰＵＣＲ内の触媒的抗体、例えば、３８Ｃ２抗体またはその触媒的部分における反応性Ｌｙｓ残基と相互作用する反応性部分である。
【０２５４】
例えば、ＰＵＣＲ−Ｔ細胞(１×１０５)およびＰＵＣＲ−ＮＫ細胞(１×１０５)を、５０nMの葉酸−ジケトンと、ＰＢＳ中、２時間、４℃でインキュベートする。細胞を３回洗浄後、細胞を、下の実施例に記載する結合および細胞毒性アッセイに付す。
【０２５５】
実施例４. 特異性作用物質でプログラムされたＰＵＣＲを含むＴ細胞の標的化抗原との結合特異性
ＰＵＣＲプログラムされた(すなわち、コンジュゲート)と特異性作用物質(例えば、葉酸−ジケトン)の結合特異性を決定するために、競合的結合アッセイを実施する。特異的、ＰＵＣＲ−Ｔ細胞または葉酸受容体発現ＫＢ細胞(１×１０５細胞)を、５０nMの葉酸−ジケトンおよび各々種々の濃度の遊離ジケトンまたは遊離葉酸とインキュベートする。４℃で２時間のインキュベーション時間後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄する。ＫＢ細胞について、細胞をフィコエリスリン(ＰＥ)標識抗ジケトン抗体と３０分、４℃でインキュベートし、さらにＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄する。細胞をIntellicyt HTFCを使用して即時に分析し、葉酸−ジケトンの結合をＰＥ放出により決定する。ＰＵＣＲ−Ｔ細胞について、細胞をィコエリスリン(ＰＥ)標識抗葉酸抗体と３０分、４℃でインキュベートし、さらにＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄する。細胞をIntellicyt HTFCを使用して即時に分析し、葉酸−ジケトンの結合をＰＥ放出により決定する。
【０２５６】
実施例５. ＰＵＣＲ−Ｔ細胞の細胞毒性
葉酸−ジケトン特異性作用物質でプログラムされているＰＵＣＲ−Ｔ細胞が効率的に葉酸受容体発現細胞を標的とできるか否かを決定するために、細胞毒性アッセイを実施する。特異的、葉酸−ジケトンでプログラム(すなわち、コンジュゲート)されたＰＵＣＲ−Ｔ細胞を、１０：１エフェクター細胞(ＰＵＣＲ  Ｔ細胞)：標的細胞(ＫＢ細胞)Ｅ：Ｔ比で、葉酸受容体発現ＫＢ細胞と、１００μlの１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)含有葉酸欠損ＲＰＭＩ培地中混合し、種々の濃度の葉酸−ジケトンと、２４時間、３７℃インキュベートする。細胞毒性活性を、CytoTox 96(登録商標)非放射性細胞毒性アッセイ(Promega Cat. No. G1780)を使用して培養培地に放出された乳酸デヒドロゲナーゼの量を定量することにより計算する。
【０２５７】
実施例６. 検出可能部分を含む特異性作用物質でプログラムされたＰＵＣＲを発現するＮＫＬナチュラルキラー細胞の産生および特徴付け
ヒト化３８Ｃ２  ｓｃＦａｂを含むＰＵＣＲをコードする構築物を産生するために、ヒト化３８Ｃ２  ｓｃＦａｂをコードする核酸を、ヒト化３８Ｃ２  ＶＨドメインをコードする核酸、ヒトカッパＬＣドメインをコードする核酸、ポリＧｌｙＳｅｒリンカーをコードする核酸、ヒト化３８Ｃ２  ＶＨドメインをコードする核酸およびヒトガンマ１  ＨＣ定常ドメイン１をコードする核酸の融合により設計した。得られた核酸フラグメントをレトロウイルスベクターにクローン化し、Ｎ末端リーダーペプチド、続いて３８Ｃ２  ｓｃＦａｂ、続いてハイブリッドＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインを含むＰＵＣＲをコードさせた。ＰＵＣＲの核酸およびアミノ酸配列を下に示す。ＮＫＬ細胞を、ＰＵＣＲをコードするウイルスベクターで形質導入した。
【０２５８】
【表１９】
2018537076.tif 000020
【表２０】
2018537076.tif 000021
【表２１】
2018537076.tif 000022
【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
2018537076.tif 000026
【０２５９】
ＮＫＬ細胞の膜に発現される３８Ｃ２  ｓｃＦａｂを含むＰＵＣＲを、特異性作用物質ＡＺＤ−ＰＥＧ８−ビオチンとコンジュゲート(すなわち、プログラム化)した(図１１参照)。ＰＵＣＲを発現しなかった野生型ＮＫＬを対照として使用した。ＡＺＤ−ＰＥＧ８−ビオチンは、ＰＵＣＲ内の３８Ｃ２  ｓｃＦａｂの反応性リシンと反応し、安定な共有結合を形成する反応性部分アゼチジノンを含む。簡潔にいうと、１×１０５細胞をFluoroBriteTM DMEMで２回洗浄し、１μMまたは１０μM  ＤＫ−ＰＥＧ８−ビオチンと４℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をFluoroBriteTM DMEMで３回洗浄した。１％ＢＳＡ含有FluoroBriteTM DMEM中の二次ＤＴＡＦコンジュゲートストレプトアビジンを、細胞に３０分インキュベーション時間にわたり、室温で暗所で添加した。次いで、細胞を３回洗浄し、その後ＦＡＣＳ分析した。蛍光を、ACEA Biosciences NovoCyteフローサイトメーターを使用して測定した。データをFlowJoソフトウェアで分析し、ＤＴＡＦコンジュゲートストレプトアビジン結合を、平均蛍光強度増加により定量した。データを、GraphPad Prismソフトウェアを使用してプロットした。
【０２６０】
図１２および１３に示すとおり、ＮＫＬ細胞において発現されたＰＵＣＲは、１μMまたは１０μM  ｏｆ  ＡＺＤ−ＰＥＧ８−ビオチンを使用してプログラムが成功した。ＡＺＤ−ＰＥＧ８−ビオチン濃度を上げたとき、非特異的背景染色の濃度が増加したが、発現ＰＵＣＲの特異的コンジュゲーション(すなわち、プログラミング)が観察され、非ＰＵＣＲ発現ＮＫＬ細胞とＰＵＣＲ発現ＮＫＬ細胞は、標識の程度の比較により容易に確認された(図１２参照)。
【０２６１】
実施例７. ジケトン反応性部分およびコンジュゲーション官能基を含むリンカーの抗ＰＳＭＡ  Ｆａｂフラグメントへのコンジュゲーション
リンカーコンジュゲートＦａｂを使用するＰＵＣＲのプログラミングを可能にする、Ｆａｂフラグメントがコンジュゲーション官能基により反応性部分を含むリンカーとコンジュゲートされ得ることを示すために、配列番号５０に示す軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号４９に示す重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む組み換え抗ＰＳＭＡ  Ｃｌｏｎｅ  Ａ１１  Ｆａｂフラグメントを、ジケトン−ＰＥＧ５−ＰＦＰエステルリンカーにコンジュゲートした(図１７参照)。ジケトン−ＰＥＧ５−ＰＦＰ(ＤＫ−ＰＥＧ５−ＰＦＰ)エステルリンカーは、反応性部分ジケトンを含む。簡潔にいうと、組み換え抗ＰＳＭＡ  Ｃｌｏｎｅ  Ａ１１  Ｆａｂフラグメント(５mg／mL)を、１.２当量、２.５当量、５当量または１０当量のＤＫ−ＰＥＧ５−ＰＦＰエステルリンカーと反応させた。コンジュゲーション反応を、およそ１６〜１８時間、４℃で混合しながら、ＤＰＢＳ緩衝液中で実施した。遊離リンカーを遠心濾過により除去した。
【０２６２】
ＤＫ−ＰＥＧ５−ＰＦＰエステルリンカーの抗ＰＳＭＡ  Ｃｌｏｎｅ  Ａ１１  Ｆａｂフラグメントへのコンジュゲーションを検出するために、疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ)ＨＰＬＣを実施した。簡潔にいうと、ＨＩＣ  ＨＰＬＣによる分析は、Agilent 1260 Infinityシステムで４０℃でのTOSOH TSKgel Butyl-NPR(４.６mm  ＩＤ×１０cm、２.５μm)カラムを使用した。分析ランを、０〜６０％Ｂの３０分にわたる直線勾配を使用して、２５μgサンプルで実施した：Ａ＝５０mM  リン酸ナトリウムと１Ｍ硫酸アンモニウム(ｐＨ７)、Ｂ＝５０mM  リン酸ナトリウムと１０％イソプロパノール(ｐＨ７)。全てのデータをOpenLABソフトウェアを使用して分析した。
【０２６３】
図１８Ａは、非コンジュゲート組み換え抗ＰＳＭＡ  Ｃｌｏｎｅ  Ａ１１  Ｆａｂフラグメントのマススペクトルを示す。対照的に、図１８Ｂは、ＤＫ−ＰＥＧ５−ＰＦＰリンカーと反応した組み換え抗ＰＳＭＡ  Ｃｌｏｎｅ  Ａ１１  Ｆａｂフラグメントのコンジュゲーション反応のマススペクトルを示す。単一リンカーコンジュゲーション事象に対応する相当均質なピークが約４８５８０の質量で観察された。マイナーピークもＦａｂフラグメントあたり２リンカー部分のコンジュゲーションに対応する約４９０５０の質量で観察された。これらの結果は、Ｆａｂフラグメントがコンジュゲーション官能基により反応性部分を含むリンカーに首尾よくコンジュゲートし、これは、ＰＵＣＲのプログラミングを可能にすることを示す。
【０２６４】
実施例８. 反応性部分アゼチジノンを含むリンカーにコンジュゲートしたＶＥＧＦＲ２特異的Ｆａｂフラグメントでの組み換え３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃのインビトロプログラミング
触媒的抗体由来のｓｃＦｖ−Ｆｃを含む分子が触媒的活性を保持し、反応性部分を含むリンカーにコンジュゲートした特異性作用物質に首尾よくコンジュゲートするか否かを決定するために、次の実験を実施した。
【０２６５】
反応性部分およびコンジュゲーション官能基を含むリンカーの抗ＶＥＧＦＲ２  ＶＫ−Ｂ８  Ｆａｂフラグメントへのコンジュゲーション。配列番号５２に示す軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号５３に示す重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む組み換え抗ＶＥＧＦＲ２  ＶＫ−Ｂ８  Ｆａｂフラグメントを、ＡＺＤ−ＰＥＧ１３−ＰＦＰエステルリンカーにコンジュゲートした(図１９参照)。ＡＺＤ−ＰＥＧ１３−ＰＦＰエステルは、反応性部分アゼチジノン(ＡＺＤ)を含む。ＡＺＤ−ＰＥＧ１３−ＰＦＰエステルを、２.５当量のリンカーを使用して抗ＶＥＧＦＲ２  ＶＫ−Ｂ８  Ｆａｂフラグメント(５mg／mL)と反応さえた。コンジュゲーション反応を、ＤＰＢＳ緩衝液中、混合しながら、およそ１６〜１８時間、４℃で実施した。遊離リンカーを遠心濾過により除去した。
【０２６６】
ＡＺＤ−ＰＥＧ１３−ＰＦＰエステルリンカーにコンジュゲートした抗ＶＥＧＦＲ２  ＶＫＢ８  Ｆａｂフラグメントでの組み換え３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃのプログラミングの分析。検出のために、ＡＺＤ−ＰＥＧ１３−ＰＦＰエステルリンカーにコンジュゲートした抗ＶＥＧＦＲ２  ＶＫＢ８  Ｆａｂフラグメントを蛍光標識した(“ＶＫＢ８  Ｆａｂ  ＡＺＤ  ４８８”)。対照として、蛍光標識した(“ＶＫＢ８  Ｆａｂ  ４８８”)または蛍光標識していない(“ＶＫＢ８  Ｆａｂ”)ＡＺＤ−ＰＥＧ１３−ＰＦＰエステルリンカーにコンジュゲートしていない抗ＶＥＧＦＲ２  ＶＫＢ８  Ｆａｂフラグメントの両方を使用した。Ｆａｂフラグメントを、１００mM重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８に緩衝液交換し、１０当量AlexaFluor(登録商標)４８８  ＮＨＳエステルと、２時間、暗所で室温で反応させた。次いで、蛍光標識Ｆａｂフラグメントを、ＤＰＢＳに緩衝液交換した。標識Ｆａｂフラグメントで組み換え３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃをプログラムするために、マウス３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃ(“ｍ３８Ｃ２”)を、さらなる分析の間のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの過充填を阻止するため、１mg／mLで、亜飽和１.５当量Ｆａｂフラグメント(すなわち、反応性３８Ｃ２リシンあたり０.７５当量Ｆａｂ)と、１６〜１８時間、室温でインキュベートした。
【０２６７】
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)分析。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、NuPAGE Novex  ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓタンパク質ゲルおよびNuPAGE MOPS SDS Running Bufferを、XCell SureLock Mini電気泳動システムを使用して実施した。全てのサンプル(２.５μg)は、NuPAGE LDS Sample Bufferを含んだ。サンプルを、充填前、９５℃で５分加熱した。PageRuler Prestained NIRタンパク質ラダー(１０μL)を、SYPRO RUBY染色前の蛍光ゲル分析に使用した。ゲルを５分固定し、製造業者の指示に従い、Sypro(登録商標)Ruby Protein Gel Stainで染色した。造影をBio-Rad ChemiDoc MP Systemで実施し、Image Labソフトウェアで分析した。
【０２６８】
図１４に示すとおり、組み換えマウス３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃは、３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−ＦｃにコンジュゲートしたＶＫ−Ｂ８  Ｆａｂフラグメントの蛍光高分子量複合体の検出により示されるとおり、ＡＺＤ標識ＶＫ−Ｂ８  Ｆａｂフラグメントに首尾よくコンジュゲート(すなわち、プログラム化)した。何らかの特定の理論に拘束されることを望まないが、マウス触媒的３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃの触媒的活性の保持は、完全長抗体およびＦａｂフラグメントに存在する定常領域により提供される構造強剛性および安定性をｓｃＦｖは欠くことから、特に驚きである。これらの結果は、実施例１および図６に示すとおり、アゼチジノン−ＰＥＧ５−メチルエステルのヒト化組み換え３８Ｃ２  ｓｃＦｖ−Ｆｃへのコンジュゲーションの成功によりさらに支持される。これらの結果は、触媒的抗体由来ｓｃＦｖが触媒的活性を保持し、特異性作用物質でプログラミングするためにＰＵＣＲに首尾よく取り込まれ得ることを示す。
【０２６９】
実施例９. ＰＳＭＡターゲティング特異性作用物質でプログラムされたＫＨＹＧ−１ナチュラルキラー細胞発現ＰＵＣＲの産生および特徴付け
ＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞の表面に発現されたＰＵＣＲが、目的の抗原に特異的に結合するようにプログラムされ得るか否かを決定するために、次の実験を実施した。ＫＨＹＧ−１細胞を、３８Ｃ２  ｓｃＦａｂを含むＰＵＣＲをコードする構築物で形質導入した(実施例６に記載)。およそ３０％の形質導入効率が、この実験で達成された。
【０２７０】
ＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞の表面膜に発現されたＰＵＣＲを、特異性作用物質ＤＫ−ＰＥＧ５−ＤＵＰＡとコンジュゲート(すなわち、プログラム化)した(図９参照)。ＤＵＰＡは、前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)特異的ターゲティング部分である。反応性部分ジケトンは、３８Ｃ２  ｓｃＦａｂの反応性リシンと反応して、可逆性共有結合を形成する。野生型ＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞および３８Ｃ２  ｓｃＦａｂを含むＰＵＣＲを発現するように構築物で形質導入したＮＫ細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清(ＦＢＳ)および１００IU／mL  ＩＬ−２添加ＲＰＭＩ−１６４０培地中、０.３×１０６細胞／mL(計２０×１０６細胞)に調節した。一夜インキュベーション後、細胞をペレット化し、１０％熱不活性化ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地に３×１０６細胞／mLで再懸濁した。形質導入ＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞により発現されるＰＵＣＲをプログラムするために、０.１nM、１nM、１０nMおよび１００nMの何れかの特異性作用物質ＤＫ−ＰＥＧ５−ＤＵＰＡを、９６ウェル深ウェルプレートで、１０％熱不活性化ＦＢＳ添加ＲＰＭＩでの1/2対数連続希釈の実施により調製した。各濃度のＤＫ−ＰＥＧ５−ＤＵＰＡを、９６ウェルｖ底プレートで、ウェルあたり５０μLの特異性作用物質を使用して、トリプリケートで試験した。３７℃で、加湿５％ＣＯ２雰囲気下の１.５〜２時間インキュベーション後、ＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞をペレット化し、１０％熱不活性化ＦＢＳ添加ＲＰＭＩで洗浄して、遊離特異性作用物質を除去した。
【０２７１】
ＰＵＣＲのプログラミングを、組み換えＰＳＭＡのプログラムされたＰＵＣＲを含むＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞への結合の検出により評価した。簡潔にいうと、処理ＮＫ細胞をＦＡＣＳ緩衝液(ＰＢＳ、０.５％ＢＳＡ、１０％ＦＢＳ、０.０５％ナトリウムアジド)を使用して洗浄した。組み換えヒトＰＳＭＡ(R&D Systems #4234-ZN)をDyLight(登録商標)488(Abcam Cat. No. ab201799)で蛍光標識した。蛍光標識ＰＳＭＡタンパク質を、野生型ＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞またはＤＫ−ＰＥＧ５−ＤＵＰ特異性作用物質でプログラムされたＰＵＣＲを発現するＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞に添加し、３０〜６０分、４℃でインキュベートした。次いで細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。蛍光を、ACEA Biosciences NovoCyteフローサイトメーターを使用して測定した。データをFlowJoソフトウェアで分析し、エフェクター細胞へのＰＳＭＡ結合を、平均蛍光強度増加により定量した。データを、GraphPad Prismソフトウェアを使用してプロットした。
【０２７２】
図１５に示すとおり、ＤＫ−ＰＥＧ５−ＤＵＰ特異性作用物質でプログラムされた３８Ｃ２  Ｆａｂフラグメントを含むＰＵＣＲを発現する細胞は、組み換えＰＳＭＡに特異的に結合し、ＰＵＣＲが、目的の抗原(すなわち、ＰＳＭＡ)を標的とするよう首尾よくプログラムされたことを示す。
【０２７３】
実施例１０. ＰＳＭＡターゲティング特異性作用物質でプログラムされたＰＵＣＲを発現するＫＨＹＧ−１ナチュラルキラー細胞の細胞毒性活性
ＤＫ−ＰＥＧ５−ＤＵＰ特異性作用物質でプログラムされたＰＵＣＲを発現するＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞が、ＰＳＭＡ発現細胞を特異的に殺すことができるか否かを決定するために、細胞毒性アッセイを下記のとおり実施した。ＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞を、３８Ｃ２  ｓｃＦａｂを含むＰＵＣＲをコードする構築物で形質導入した(実施例６に記載)。およそ７０％〜８０％の形質導入効率がこの実験で達成された。
【０２７４】
簡潔にいうと、野生型ＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞(対照)または漸増濃度のＤＫ−ＰＥＧ５−ＤＵＰＡを使用してプログラムされた３８Ｃ２  ｓｃＦａｂを含むＰＵＣＲを発現するＫＨＹＧ−１細胞が、ＰＳＭＡ陽性ＬＮＣａＰ細胞(ＡＴＣＣ(登録商標)ＣＲＬ−１７４０TM)またはＰＳＭＡ陰性ＰＣ−３細胞(ＡＴＣＣ(登録商標)ＣＲＬ−１４３５TM)を殺す能力を、下記細胞毒性アッセイにより決定した。
【０２７５】
ＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞の表面膜に発現されたＰＵＣＲを、特異性作用物質ＤＫ−ＰＥＧ５−ＤＵＰＡにコンジュゲート(すなわち、プログラム化)した。野生型ＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞および３８Ｃ２  ｓｃＦａｂを含むＰＵＣＲを発現するように構築物で形質導入されたＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清(ＦＢＳ)および１００IU／mL  ＩＬ−２添加ＲＰＭＩ−１６４０培地で０.３×１０６細胞／mL(計２０×１０６細胞)に調節した。一夜インキュベーション後、細胞をペレット化し、１０％熱不活性化ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地に３×１０６細胞／mLで再懸濁した。形質導入ＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞により発現されるＰＵＣＲをプログラムするために、３.２nM、１０nM、３２nM、１００nM、３２０nMまたは１０００nMでの特異性作用物質ＤＫ−ＰＥＧ５−ＤＵＰＡを、９６ウェル深ウェルプレートで１０％熱不活性化ＦＢＳ添加ＲＰＭＩでの1/2対数連続希釈の実施により調製した。各濃度のＤＫ−ＰＥＧ５−ＤＵＰＡを、９６ウェルｖ底プレートで、ウェルあたり５０μLの特異性作用物質を使用して、トリプリケートで試験した。３７℃で、加湿５％ＣＯ２雰囲気下の１.５〜２時間インキュベーション後、ＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞をペレット化し、１０％熱不活性化ＦＢＳ添加ＲＰＭＩで洗浄して、遊離特異性作用物質を除去し、次いで、５０μLのＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞をアッセイプレートに添加した。
【０２７６】
９６ウェルプレート中、１０,０００標的細胞／ウェルで、１０：１のＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞：標的細胞比をアッセイに利用した。簡潔にいうと、ＰＳＭＡ陽性(および１０％非熱不活性化ＦＢＳおよび０.５μg／mL  ピューロマイシン含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養)ホタルルシフェラーゼ形質導入前立腺癌標的細胞株ＬＮＣａＰ(ATCC(登録商標)CRL-1740TM)またはＰＳＭＡ陰性(および１０％熱不活性化ＦＢＳおよび１.０μg／mL  ピューロマイシン含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養)ＰＣ−３(ＡＴＣＣ(登録商標)ＣＲＬ−１４３５TM)を使用した。細胞を新鮮１０％熱不活性化ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地に、０.２×１０６細胞／mL濃度で再懸濁し、５０μLの細胞懸濁液を、穏やかに混合しながらアッセイプレートに添加した。標的細胞単独または標的細胞と野生型ＫＨＹＧ−１細胞(対照)またはＤＫ−ＰＥＧ５−ＤＵＰＡでプログラムされた３８Ｃ２  ｓｃＦａｂを含むＰＵＣＲを発現するＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞を、次に３７℃で２時間、加湿５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートし、その後１００μL  ONE Glo Luciferase Assay Reagent(Promega Cat. No. E6120)を添加した。サンプルを、PerkinElmer EnSpireマルチモードプレートリーダーを使用する蛍光測定のために白色９６ウェル平底プレートに移した。データをGraphPad Prismソフトウェアを使用して分析した。
【０２７７】
図１６Ａに示すとおり、野生型ＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞はＰＳＭＡ陽性ＬＮＣａＰ細胞を殺せなかった。対照的に、ＤＫ−ＰＥＧ５−ＤＵＰＡでプログラムされたＰＵＣＲを発現するＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞は、ＰＳＭＡ陽性ＬＮＣａＰ細胞を特異的に殺した。図１６Ｂに示すとおり、ＤＫ−ＰＥＧ５−ＤＵＰＡでプログラムされたＰＵＣＲを発現するＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞の細胞毒性の特異性を、ＰＳＭＡ陰性ＰＣ−３細胞を使用してさらに確認した。野生型ＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞およびＤＫ−ＰＥＧ５−ＤＵＰＡでプログラムされたＰＵＣＲを発現するＫＨＹＧ−１  ＮＫ細胞でＰＳＭＡ陰性ＰＣ−３細胞殺滅に有意差は見られなかった。それ故に、この実験は、ＰＳＭＡターゲティング特異性作用物質でプログラムされたＰＵＣＲを発現するＮＫ細胞が、ＰＳＭＡ陽性細胞を特異的に標的とし、を殺すために首尾よく使用できることを示す。
【０２７８】
【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【０２７９】
【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【０２８０】
【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
2018537076.tif 000035
【０２８１】
【表３５】
2018537076.tif 000036
【表３６】
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【表３７】
2018537076.tif 000038
【０２８２】
【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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