(57)【要約】本発明は、標的化成分及びエフェクター成分を有する様々な分子構築物を提供する。本発明は、このような分子構築物を用いて様々な疾患を治療する方法も提供する。【選択図】図1A
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
中心コア、複数のリンクアーム、複数の第1成分、必要に応じてカップリングアームを含むリンカーユニットであって、
前記中心コアは、(1)第1ポリペプチド又は(2)第2ポリペプチドを含み、前記第1ポリペプチドは、複数のリジン(K)残基を有し、各K残基とその次のK残基との間がグリシン(G)及びセリン(S)残基を有する充填配列により区切られ、K残基の数が2〜15であり、前記第2ポリペプチドは、(Xaa-K)n配列を有し、前記Xaaが 2〜12個のエチレングリコール(EG)の繰り返し単位を有するPEG化アミノ酸であり、前記nが2〜15の整数であり、
前記複数のリンクアームは、それぞれ前記中心コアのK残基に結合され、
前記複数の第1成分は、それぞれアミド結合を形成することにより前記複数のリンクアームに結合され、又は、銅触媒型アジド-アルキン環化付加(CuAAC)反応、歪み促進型アジド-アルキンクリックケミストリー(SPAAC)反応、若しくは逆電子要請型ディールス・アルダー(iEDDA)反応により前記複数のリンクアームに結合され、各前記第1成分は、フィブリンに特異的な一本鎖可変領域断片(scFv)であり、
前記中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、アジド基又はアルキン基を有し、或いは、前記中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、システイン残基であり、該システイン残基のチオール基は、前記カップリングアームに結合され、前記カップリングアームは、前記カップリングアームの遊離末端にアジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基、又はシクロオクチン基を有し、
前記複数の第1成分がそれぞれCuAAC又はSPAAC反応により前記複数のリンクアームに結合される場合に、前記中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基はシステイン残基であり、前記カップリングアームの遊離末端は、テトラジン基又はシクロオクテン基であり、
前記複数の第1成分がそれぞれiEDDA反応により前記複数のリンクアームに結合される場合に、前記中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、アジド基又はアルキン基を有し、或いは、前記中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基がシステイン残基であり、前記カップリングアームの遊離末端は、アジド基、アルキン基又はシクロオクチン基であるリンカーユニット。
【請求項２】
前記充填配列は、GS, GGS, GSG又は配列番号:1-16の配列を含む請求項1に記載のリンカーユニット。
【請求項３】
前記第1ポリペプチドは、2-15単位のG1-5SK配列を含む請求項1に記載のリンカーユニット。
【請求項４】
前記第1ポリペプチドは、(GSK)2-15配列を含む請求項3に記載のリンカーユニット。
【請求項５】
各前記リンクアームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖である請求項1に記載のリンカーユニット。
【請求項６】
前記カップリングアームは、2-12個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖である請求項1に記載のリンカーユニット。
【請求項７】
前記アジド基を有するアミノ酸残基は、L-アジドホモアラニン(AHA)、4-アジド-L-フェニルアラニン、4-アジド-D-フェニルアラニン、3-アジド-L-アラニン、3-アジド-D-アラニン、4-アジド-L-ホモアラニン、4-アジド-D-ホモアラニン、5-アジド-L-オルニチン、5-アジド-d-オルニチン、6-アジド-L-リジン、又は6-アジド-D-リジンである請求項1に記載のリンカーユニット。
【請求項８】
前記アルキン基を有するアミノ酸残基は、L-ホモプロパギルグリシン(L-HPG)、D-ホモプロパギルグリシン(D-HPG)、又はβ-ホモプロパギルグリシン(β-HPG)である請求項1に記載のリンカーユニット。
【請求項９】
前記シクロオクテン基は、トランス-シクロオクテン(TCO)であり、前記シクロオクチン基は、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)、ジフルオロシクロオクチン(DIFO)、ビシクロノニン(BCN)、又はジベンゾシクロオクチン(DICO)である請求項1に記載のリンカーユニット。
【請求項１０】
前記テトラジン基は、1, 2, 3, 4-テトラジン、1, 2, 3, 5-テトラジン若しくは1, 2, 4, 5-テトラジン、又はそれらの誘導体である請求項1に記載のリンカーユニット。
【請求項１１】
第2成分をさらに含み、
前記第2成分は、アジド基又はアルキン基と前記第2成分との間で起きるCuAAC反応、アジド基又はシクロオクチン基と第2成分との間で起きるSPAAC反応、シクロオクテン基又はテトラジン基と第2成分との間で起きるiEDDA反応のいずれかにより前記中心コアに結合される請求項1に記載のリンカーユニット。
【請求項１２】
前記第2成分は、組織プラスミノーゲン活性化因子、又は、トロンビン若しくは第Xa因子の阻害剤である請求項11に記載のリンカーユニット。
【請求項１３】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子は、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、又はラノテプラーゼである請求項12に記載のリンカーユニット。
【請求項１４】
前記第Xa因子の阻害剤は、アピキサバン、エドキサバン、又はリバロキサバンであり、前記トロンビンの阻害剤は、アルガトロバン又はメラガトランである請求項12に記載のリンカーユニット。
【請求項１５】
前記第2成分は、CuAAC反応により前記中心コアのN末端又はC末端アミノ酸残基のアジド基又はアルキン基に結合される請求項11に記載のリンカーユニット。
【請求項１６】
iEDDA反応により前記カップリングアームに結合される第3成分をさらに含む請求項15に記載のリンカーユニット。
【請求項１７】
前記第3成分は、分子量約20,000〜50,000ダルトンの分子量を有する長いPEG鎖である請求項16に記載のリンカーユニット。
【請求項１８】
前記第2成分は、SPAAC反応により前記中心コアのN末端又はC末端アミノ酸残基のアジド基に結合される請求項11に記載のリンカーユニット。
【請求項１９】
iEDDA反応により前記カップリングアームに結合される第3成分をさらに含む請求項18に記載のリンカーユニット。
【請求項２０】
前記第3成分は、約20,000〜50,000ダルトンの分子量を有する長いPEG鎖である請求項19に記載のリンカーユニット。
【請求項２１】
血餅形成の予防を必要とする被験体の血餅形成を予防する方法であって、前記被験体に治療有効量の請求項12に記載のリンカーユニットを投与するステップを含む方法。
【請求項２２】
前記第2成分は、第Xa因子又はトロンビンの阻害剤である請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記第Xa因子の阻害剤は、アピキサバン、エドキサバン又はリバロキサバンであり、前記トロンビンの阻害剤は、アルガトロバン又はメラガトランである請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
治療を必要とする被験体の血栓症を治療する方法であって、前記被験体に治療有効量の請求項12に記載のリンカーユニットを投与するステップを含む方法。
【請求項２５】
前記第2成分は、前記組織プラスミノーゲン活性化因子である請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子は、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、又はラノテプラーゼである請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
第1リンカーユニット及び第2リンカーユニットを含む分子構築物であって、
前記第1リンカーユニットは、
複数のアミン基を含む第1中心コアと、
前記第1中心コアに結合される第1リンクアームと、
前記第1リンクアームに結合される第1成分と、
前記第1中心コアに結合される必要に応じて第1カップリングアームと、を含み、
前記第2リンカーユニットは、
複数のアミン基を含む第2中心コアと、
前記第2中心コアに結合される第2リンクアームと、
前記第2リンクアームに結合される第2成分と、
必要に応じて前記中心コアに結合される第2カップリングアームと、を含み、
前記第1リンカーユニット及び第2リンカーユニットは、前記第1中心コアと第2中心コア、前記第1カップリングアームと第2中心コア、前記第1カップリングアームと第2カップリングアーム、又は前記第1中心コアと第2カップリングアームのいずれかの間で起きる銅触媒型アジド-アルキン環化付加(CuAAC)反応、歪み促進型アジド-アルキンクリックケミストリー(SPAAC)反応、若しくは逆電子要請型ディールス・アルダー(iEDDA)反応により互いに結合され、
前記第1成分は、フィブリンに特異的なscFvであり、前記第2成分は、組織プラスミノーゲン活性化因子、又は、第Xa因子若しくはトロンビンの阻害剤である分子構築物。
【請求項２８】
前記第1リンカーユニット及び第2リンカーユニットはそれぞれ、それに結合される複数の前記第1リンクアーム及び第2リンクアームを含む請求項27に記載の分子構築物。
【請求項２９】
前記第1リンクアーム及び第2リンクアームにそれぞれ結合される複数の第1成分及び第2成分をさらに含む請求項28に記載の分子構築物。
【請求項３０】
各前記第1リンクアーム及び第2リンクアームは、2-20個のエチレングリコール(EG)の繰り返し単位を有するPEG鎖であり、
各前記第1カップリングアーム及び第2カップリングアームは、2-12個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖である請求項27に記載の分子構築物。
【請求項３１】
前記第1カップリングアーム及び第2カップリングアームのうちの一方は、その遊離末端にアジド基を有し、前記第1カップリングアーム及び第2カップリングアームのうちの他方は、その遊離末端にアルキン又はシクロオクチン基を有し、
前記第1リンカーユニット及び第2リンカーユニットは、前記第1カップリングアームと第2カップリングアームとの間で起きる銅触媒型アジド-アルキン環化付加(CuAAC)反応又は歪み促進型アジド-アルキンクリックケミストリー(SPAAC)反応により互いに結合される請求項27に記載の分子構築物。
【請求項３２】
前記シクロオクチン基は、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)基、ジフルオロシクロオクチン(DIFO)基、ビシクロノニン(BCN)基、又はジベンゾシクロオクチン(DICO)基である請求項31に記載の分子構築物。
【請求項３３】
前記第1カップリングアーム及び第2カップリングアームのうちの一方は、その遊離末端にテトラジン基を有し、前記第1カップリングアーム及び第2カップリングアームのうちの他方は、その遊離末端にシクロオクテン基を有し、
前記第1リンカーユニット及び第2リンカーユニットは、前記第1カップリングアームと第2カップリングアームとの間で起きるiEDDA反応により互いに結合される請求項27に記載の分子構築物。
【請求項３４】
前記テトラジン基は、1, 2, 3, 4-テトラジン基、1, 2, 3, 5-テトラジン基若しくは1, 2, 4, 5-テトラジン基、又はそれらの誘導体である請求項33に記載の分子構築物。
【請求項３５】
前記第1中心コア及び第2中心コアの少なくとも1つは、化合物コアであり、前記化合物コアに結合されるカップリングアームは、前記化合物コアの複数のアミン基の1つとアミド結合を形成することにより前記化合物コアに結合され、且つ前記カップリングアームは、その遊離末端にアジド基、アルキン基、シクロオクテン基、シクロオクチン基、又はテトラジン基を有する請求項27に記載の分子構築物。
【請求項３６】
前記化合物コアの化合物は、ベンゼン-1, 3, 5-トリアミン、2-(アミノメチル)-2-メチルプロパン-1,3-ジアミン、トリス(2-アミノエチル)アミン、ベンゼン-1,2,4,5-テトラアミン、3,3',5,5'-テトラアミン-1,1'-ビフェニル、テトラキス(2-アミノエチル)メタン、テトラキス-(エチルアミン)ヒドラジン、N,N,N',N'-テトラキス(アミノエチル)エチレンジアミン、ベンゼン-1,2,3,4,5,6-ヘキサアミン、1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-ヘキサキス(メチルアミン)-ベンゼン-1,3,5-トリアミン、1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N,-オクタキス(メチルアミン)-ベンゼン-1,2,4,5-トリアミン、及びN,N-ビス[(1-アミノ-3,3-ジアミノエチル)ペンチル]メタンジアミンからなる群から選択される請求項35に記載の分子構築物。
【請求項３７】
前記第1中心コア及び第2中心コアのうちの一方は、前記化合物コアであり、前記化合物コアに結合されるカップリングアームは、前記化合物コアの複数のアミン基の1つとアミド結合を形成することにより前記化合物コアに結合され、前記カップリングアームは、その遊離末端にDBCO、DIFO、BCN、又はDICO基を有し、
前記第1中心コア及び第2中心コアのうちの他方は、ポリペプチドであり、前記ポリペプチドのN末端又はC末端アミノ酸残基は、L-アジドホモアラニン(AHA)、4-アジド-L-フェニルアラニン、4-アジド-D-フェニルアラニン、3-アジド-L-アラニン、3-アジド-D-アラニン、4-アジド-L-ホモアラニン、4-アジド-D-ホモアラニン、5-アジド-L-オルニチン、5-アジド-d-オルニチン、6-アジド-L-リジン、又は6-アジド-D-リジンであり、
前記第1リンカーユニット及び第2リンカーユニットは、前記カップリングアームと前記N末端又はC末端アミノ酸残基との間で起きるSPAAC反応により互いに結合される請求項35に記載の分子構築物。
【請求項３８】
前記第1中心コア及び第2中心コアの少なくとも1つは、複数のリジン（K）残基を有するポリペプチドである請求項27に記載の分子構築物。
【請求項３９】
K残基の数が2〜15であり、各K残基とその次のK残基がグリシン(G)及びセリン(S)残基を有する充填配列により区切られる請求項38に記載の分子構築物。
【請求項４０】
前記充填配列は、GS, GGS, GSG又は配列番号:1-16の配列を含む請求項39に記載の分子構築物。
【請求項４１】
前記ポリペプチドは、2-15単位のG1-5SK配列を含む請求項39に記載の分子構築物。
【請求項４２】
前記ポリペプチドは、(GSK)2-15配列を含む請求項41に記載の分子構築物。
【請求項４３】
前記ポリペプチドは、(Xaa-K)n配列を含み、Xaaは、2〜12個のエチレングリコール(EG)の繰り返し単位を有するPEG化アミノ酸であり、nは、2〜15の整数である請求項38に記載の分子構築物。
【請求項４４】
前記第1中心コア及び第2中心コアは、ともに前記ポリペプチドである請求項38に記載の分子構築物。
【請求項４５】
前記第1中心コア及び第2中心コアのそれぞれのN末端は、アセチル基で修飾される請求項44に記載の分子構築物。
【請求項４６】
前記第1中心コア及び第2中心コアのうちの一方のN末端又はC末端アミノ酸残基は、AHA、4-アジド-L-フェニルアラニン、4-アジド-D-フェニルアラニン、3-アジド-L-アラニン、3-アジド-D-アラニン、4-アジド-L-ホモアラニン、4-アジド-D-ホモアラニン、5-アジド-L-オルニチン、5-アジド-d-オルニチン、6-アジド-L-リジン、又は6-アジド-D-リジンであり、
前記第1中心コア及び第2中心コアのうちの他方のN末端又はC末端アミノ酸残基は、L-ホモプロパギルグリシン(L-HPG)、D-ホモプロパギルグリシン(D-HPG)又はβ-ホモプロパギルグリシン(β-HPG)であり、
前記第1中心コア及び第2中心コアは、N末端又はC末端アミノ酸残基の間で起きる銅触媒型アジド-アルキン環化付加(CuAAC)反応により互いに結合される請求項44に記載の分子構築物。
【請求項４７】
前記第1中心コア及び第2中心コアのそれぞれは、そのN末端又はC末端にシステイン残基を有し、前記第1カップリングアーム及び第2カップリングアームは、それぞれチオール-マレイミド反応により、前記第1中心コア及び第2中心コアのシステイン残基に結合される請求項44に記載の分子構築物。
【請求項４８】
前記第1中心コア及び第2中心コアのうちの一方のN末端又はC末端アミノ酸残基は、AHA、4-アジド-L-フェニルアラニン、4-アジド-D-フェニルアラニン、3-アジド-L-アラニン、3-アジド-D-アラニン、4-アジド-L-ホモアラニン、4-アジド-D-ホモアラニン、5-アジド-L-オルニチン、5-アジド-d-オルニチン、6-アジド-L-リジン、又は6-アジド-D-リジンであり、
前記第1中心コア及び第2中心コアのうちの他方のN末端又はC末端アミノ酸残基は、システイン残基であり、前記カップリングアームは、チオール-マレイミド反応により前記システイン残基に結合され、前記カップリングアームは、その遊離末端にDBCO、DIFO、BCN、又はDICO基を有し、
前記第1中心コア及び第2中心コアは、前記N末端又はC末端アミノ酸残基と前記カップリングアームとの間で起きるSPAAC反応により互いに結合される請求項44に記載の分子構築物。
【請求項４９】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子は、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、又はラノテプラーゼである請求項27に記載の分子構築物。
【請求項５０】
前記第Xa因子の阻害剤は、アピキサバン、エドキサバン又はリバロキサバンであり、前記トロンビンの阻害剤は、アルガトロバン又はメラガトランである請求項27に記載の分子構築物。
【請求項５１】
前記第1リンカーユニット又は第2リンカーユニットに結合される第3リンクアームをさらに含む請求項27に記載の分子構築物。
【請求項５２】
前記第3リンクアームは、その遊離末端にマレイミド基を有し、チオール-マレイミド反応により第3成分が前記第3リンクアームに結合される請求項51に記載の分子構築物。
【請求項５３】
前記第3成分は、前記第1成分及び第2成分と異なる請求項51に記載の分子構築物。
【請求項５４】
前記第3成分は、約20,000〜50,000ダルトンの分子量を有する長いPEG鎖である請求項53に記載の分子構築物。
【請求項５５】
血餅形成の阻害を必要とする被験体の血餅形成を阻害する方法であって、前記被験体に治療有効量の請求項27に記載の分子構築物を投与するステップを含む方法。
【請求項５６】
前記第1成分は、フィブリンに特異的なscFvであり、
前記第2成分は、第Xa因子又はトロンビンの阻害剤である請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
前記第Xa因子の阻害剤は、アピキサバン、エドキサバン又はリバロキサバンであり、
前記トロンビンの阻害剤は、アルガトロバン又はメラガトランである請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
治療を必要とする被験体の血栓症を治療する方法であって、前記被験体に治療有効量の請求項27に記載の分子構築物を投与するステップを含む。
【請求項５９】
前記第1成分は、フィブリンに特異的なscFvであり、
前記第2成分は、前記組織プラスミノーゲン活性化因子である請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子は、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、又はラノテプラーゼである請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
IgG.Fcの1対のCH2-CH3セグメントと、1対のエフェクター成分と、1対の標的化成分とを含む分子構築物であって、
前記1対のエフェクター成分のそれぞれは、組織プラスミノーゲン活性化因子、第Xa因子の阻害剤若しくはトロンビンの阻害剤の複数の分子を含む又は薬物バンドルであり、
前記1対の標的化成分のそれぞれは、フィブリンに特異的な抗体断片であり、
前記1対のエフェクター成分が前記組織プラスミノーゲン活性化因子である場合に、前記1対のエフェクター成分は、前記1対のCH2-CH3セグメントのN末端に結合され、前記1対の標的化成分は、前記1対のCH2-CH3セグメントのN末端に結合され、若しくはその逆もまた然りであり、
前記1対のエフェクター成分が前記薬物バンドルである場合に、前記1対のエフェクター成分は、前記1対のCH2-CH3セグメントのC末端に結合され、前記1対の標的化成分は、前記1対のCH2-CH3セグメントのN末端に結合される分子構築物。
【請求項６２】
前記1対のCH2-CH3セグメントは、ヒトγ1又はγ4免疫グロブリンに由来する請求項61に記載の分子構築物。
【請求項６３】
前記1対の標的化成分は、抗原結合断片(Fab)の形態であり、且つ前記1対のCH2-CH3セグメントのN末端に結合されることにより、前記分子構築物はIgG構造を採用する請求項61に記載の分子構築物。
【請求項６４】
(G2-4S)2-8Cの配列を有する延長ペプチド及びカップリングアームを更に含み、
前記延長ペプチドは、前記1対のCH2-CH3セグメントの1つのC末端に結合され、
前記カップリングアームは、前記延長ペプチドのC末端に、それらの間で起きるチオール-マレイミド反応により結合され、
前記薬物バンドルは、前記カップリングアームに、それらの間で起きる、逆電子要請型ディールス-アルダー(iEDDA)反応、歪み促進型アジド-アルキンクリックケミストリー(SPAAC)反応、又は銅(I)触媒型アルキン-アジド環化付加(CuAAC)反応により結合される請求項61に記載の分子構築物。
【請求項６５】
前記薬物バンドルは、中心コアと、複数のリンクアームとを含み、
前記中心コアは、複数のアミン基を有する化合物、又は複数のリジン（K）残基を有するポリペプチドであり、
前記複数のリンクアームのそれぞれは、前記アミン基の1つ又は前記K残基の1つとの反応により前記中心コアに結合される1つの末端を有し、且つ、その遊離末端にマレイミド基を有し、各前記分子は、前記マレイミド基との反応により、前記リンクアームを介して前記中心コアに結合される請求項64に記載の分子構築物。
【請求項６６】
前記第Xa因子の阻害剤は、アピキサバン、エドキサバン、又はリバロキサバンである請求項61に記載の分子構築物。
【請求項６７】
前記トロンビンの阻害剤は、アルガトロバン又はメラガトランである請求項61に記載の分子構築物。
【請求項６８】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子は、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ又はラノテプラーゼである請求項61に記載の分子構築物。
【請求項６９】
形成血餅の阻害を必要とする被験体の形成血餅を阻害する方法であって、前記被験体に有効量の請求項61に記載の分子構築物を投与するステップを含み、前記エフェクター成分は、第Xa因子の阻害剤又はトロンビンの阻害剤の複数の分子を含む薬物バンドルである方法。
【請求項７０】
治療を必要とする被験体の血栓症を治療する方法であって、前記被験体に有効量の請求項61に記載の分子構築物を投与するステップを含み、前記エフェクター成分は、組織プラスミノーゲン活性化因子である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、医薬品分野に関し、特に、エフェクター(例えば、治療薬)を標的部位に送達するための標的化成分及びエフェクター成分を有するような多機能分子構築物に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的化抗原に対するモノクローナル抗体(mAb)の広範な選別及び選択方法の継続的な発展は、数年前に治療できないと考えられた多くの疾患に対する多くの治療用抗体の開発に寄与してきた。治療用抗体のデータベースに基づいて、約2,800種類の抗体が研究されているか、又はヒト臨床試験のために計画されており、約80種類の抗体の臨床応用が政府の薬物規制当局により承認されている。抗体の治療効果に関する大量のデータは、抗体が治療薬として作用する薬理学的メカニズムに関する情報を提供している。
【０００３】
抗体が治療薬として作用する1つの主要な薬理学的メカニズムは、抗体が、血液循環、間質腔、又はリンパ節に存在するサイトカイン又は免疫成分であり得る疾患を引き起こすメディエーターを中和又は捕捉できることである。中和活性は、疾患を引き起こすメディエーターとそれらの受容体との相互作用を阻害する。サイトカインの可溶性受容体又は受容体の細胞外部分及びIgGのFc部分からの融合タンパク質は、抗体による中和と同様に、サイトカイン又は免疫因子を中和することができるため、治療剤として開発されている。
【０００４】
臨床応用が承認されているか、又は臨床開発に供されているいくつかの治療用抗体は、受容体との結合により薬理学的効果を発揮することで、受容体とそのリガンドとの相互作用を遮断する。これらの抗体薬物では、抗体依存性細胞毒性(ADCC)及び補体媒介性細胞溶解(CMC)等のFc媒介性メカニズムは、主要なメカニズムではない。
【０００５】
いくつかの治療用抗体は、標的細胞上の特定の表面抗原に結合することにより、標的細胞でFc媒介性機能及び他のメカニズムを発揮する。最も重要なFc媒介性メカニズムは、抗体依存性細胞毒性(ADCC)、及び補体媒介性細胞溶解(CMC)であり、いずれも抗体結合標的細胞の溶解を引き起こす。特定の細胞表面抗原に結合するいくつかの抗体は、結合した標的細胞のアポトーシスを誘導することができる。
【０００６】
二重特異性を有する抗体を調製する概念及び方法が生まれたのは、30年以上前のことである。近年、組換え抗体工学方法の発展、及び改良医薬品の開発の推進に伴い、種々の構造を有する二重特異性抗体が開発されてきた。
【０００７】
例えば、二価又は多価抗体は、2つ以上の抗原結合部位を含み得る。接続構造を介して3つ又は4つのFab断片を共有結合することにより多価抗体を調製する方法は、多く報告されている。例えば、組換え工学により、タンデムの3つ又は4つのFab繰り返し単位を発現できる抗体が調製されている。
【０００８】
合成架橋剤を用いて異なる抗体又は結合断片を化学的に結合することにより、多価抗体を調製するいくつかの方法は開示されている。上記方法の1つとして、異なるリンカーを用いて、3つ、4つ、又はそれ以上の別々のFab断片を化学的に架橋する方法がある。別の方法として、複数のFabを有する構築物を調製し、それを一次元DNA足場に組み立てる方法が提供されている。標的分子への結合のために設計されたそれらの種々の多価Ab構築物は、サイズ、半減期、構造の可撓性、及び免疫系を調節する能力において互いに異なる。以上のことから、一定数のエフェクター成分を有する分子構築物、又は2つ以上の異なる種類の機能成分(例えば、少なくとも1つの標的化成分及び少なくとも1つのエフェクター成分)を有する分子構築物の調製に関する報告が成されている。しかし、通常、化学合成又は組換え技術により、標的化成分とエフェクター成分との特定の組み合わせを有する分子構築物を構築することは、困難である。従って、従来技術において、幅広い疾患に適用されるより汎用性の高い分子を構築するための新たな分子プラットフォームを提供する必要がある。
【発明の概要】
【０００９】
<I> ペプチドコアに基づくマルチアームリンカー
【００１０】
第1の態様において、本開示は、少なくとも2つの異なる機能成分が結合されたリンカーユニットに関する。例えば、該リンカーユニットには、2つの異なるエフェクター成分、1つの標的化成分及び1つのエフェクター成分、又は1つのエフェクター成分及びリンカーユニットの循環時間を延長可能なポリエチレングリコール(PEG)鎖が結合され得る。本発明のリンカーユニットは、少なくとも2つの異なる官能基を有するように設計されることにより、機能成分が各官能基と反応することでリンカーユニットに結合されることができる。従って、本発明のリンカーユニットは、2つ以上の機能成分を有する分子構築物を調製するためのプラットフォームとして機能することができる。
【００１１】
本開示の様々な実施形態によれば、上記リンカーユニットは、中心コア及び複数のリンクアームを含む。中心コアは、(1)複数のリジン(K)残基、又は(2)(Xaa-K)n配列を含むポリペプチドコアである。複数のリジン(K)残基において、各K残基とその次のK残基との間がグリシン(G)及びセリン(S)残基を含む充填配列により区切られ、K残基の数が2〜15である。(Xaa-K)n配列において、 Xaaが2〜12個のエチレングリコール(EG)の繰り返し単位を有するPEG化アミノ酸であり、nが2〜15の整数である。上記充填配列は、2〜20個のアミノ酸残基から構成され得る。様々な実施形態において、上記充填配列は、GS、GGS、GSG、又は配列番号:1-16の配列を含み得る。本開示のいくつかの実施形態によれば、中心コアは、2-15単位の配列G1-5SKを含み、好ましくは、中心コアは、(GSK)2-15配列を含む。各リンクアームは、K残基とリンクアームとの間にアミド結合を形成することにより、中心コアのK残基に結合される。中心コアに結合されたリンクアームは、その遊離末端にマレイミド基、N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)基、アジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基、又はシクロオクチン基を有する。また、中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、アジド基又はアルキン基を有する。或いは、中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、システイン(C)残基である。アミノ酸残基のチオール基は、遊離末端にアジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基、又はシクロオクチン基を有するカップリングアームに結合される。
【００１２】
本開示の様々な実施形態によれば、上記リンカーユニットは、複数の第1成分をさらに含む。いくつかの実施形態において、各第1成分は、リンクアームと第1成分との間にアミド結合を形成することにより1つのリンクアームに結合される。他の実施形態において、各第1成分は、リンクアームと第1成分との間で起きるチオール - マレイミド反応、銅触媒型アジド-アルキン環化付加(CuAAC)反応、歪み促進型アジド-アルキンクリックケミストリー(SPAAC)反応、又は逆電子要請型ディールス・アルダー(iEDDA)反応により、1つのリンクアームに結合される。
【００１３】
本開示のいくつかの実施形態によれば、上記複数の第1成分がそれぞれCuAAC又はSPAAC反応により上記複数のリンクアームに結合される場合に、中心コアの N末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、システイン残基であり、上記カップリングアームの遊離末端は、テトラジン基又はシクロオクテン基である。本開示の他の実施形態によれば、上記複数の第1成分がそれぞれiEDDA反応により上記複数のリンクアームに結合される場合に、中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、アジド基又はアルキン基を有し、或いは、中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基はシステイン残基であり、カップリングアームの遊離末端はアジド基、アルキン基、又はシクロオクチン基である
【００１４】
いくかの実施形態において、上記リンクアームは、PEG鎖であり、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖であることが好ましい。別の実施形態において、カップリングアームは、PEG鎖であり、2-12個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖であることが好ましい。
【００１５】
アジド基を有するアミノ酸残基として、L-アジドホモアラニン(AHA)、4-アジド-L-フェニルアラニン、4-アジド-D-フェニルアラニン、3-アジド-L-アラニン、3-アジド-D-アラニン、4-アジド-L-ホモアラニン、4-アジド-D-ホモアラニン、5-アジド-L-オルニチン、5-アジド-d-オルニチン、6-アジド-L-リジン、及び6-アジド-D-リジン等が挙げられる。アルキン基を有するアミノ酸残基として、例えば、L-ホモプロパギルグリシン(L-HPG)、D-ホモプロパギルグリシン(D-HPG)、及びβ-ホモプロパギルグリシン(β-HPG)が挙げられる。
【００１６】
中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基がシステイン残基である場合に、カップリングアームの遊離末端にあるシクロオクテン基は、トランス-シクロオクテン(TCO)基であり、カップリングアームの遊離末端にあるシクロオクチン基は、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)基、ジフルオロシクロオクチン(DIFO)基、ビシクロノニン(BCN)基、又はジベンゾシクロオクチン(DICO)基であり得る。或いは、カップリングアームの遊離末端にあるテトラジン基は、1, 2, 3, 4-テトラジン、1, 2, 3, 5-テトラジン、1, 2, 4, 5-テトラジン、及びそれらの誘導体、例えば、6-メチルテトラジンを含むが、これらに制限されない。
【００１７】
本開示の様々な任意の実施形態によれば、上記第1成分は、被験体において所望の効果(例えば、治療効果)を発揮するのに適したエフェクター成分である。或いは、上記第1成分は、リンカーユニットを目的部位に案内する標的化成分であり得る。本開示の実施形態によれば、上記第1成分は、フィブリンに特異的な一本鎖可変領域断片(scFv)である。
【００１８】
必要に応じて、上記リンカーユニットは、上記第1成分と異なる第2成分をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記第2成分は、アジド基又はアルキン基を有することにより、CuAAC反応で、中心コア又はカップリングアームの対応するアルキン基若しくはアジド基に結合されることで中心コア又はカップリングアームに結合される。或いは、いくつかの実施形態において、アジド基又はシクロオクチン基を有する第2成分は、SPAAC反応により、中心コア又はカップリングアームの対応するシクロオクチン基若しくはアジド基に結合されることで、中心コア又はカップリングアームに結合される。或いは、特定の実施形態において、テトラジン基若しくはシクロオクテン基を有する第2成分は、iEDDA反応により、中心コア又はカップリングアームの対応するシクロオクテン基若しくはテトラジン基に結合されることで、中心コア又はカップリングアームに結合される。本開示の実施形態によれば、上記第2成分は、組織プラスミノーゲン活性化因子、又は、第Xa因子若しくはトロンビンの阻害剤である。組織プラスミノーゲン活性化因子の非限定的な例は、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、ラノテプラーゼを含む。第Xa因子の阻害剤は、アピキサバン、エドキサバン及びリバロキサバンからなる群より選択される。トロンビンの阻害剤は、アルガトロバン又はメラガトランであり得る。
【００１９】
特定の実施形態において、リンカーユニットは、必要に応じて第1成分及び第2成分と異なる第3成分をさらに含む。第2成分が中心コアに直接結合される場合に、中心コアのもう一方の末端(即ち、第2成分に結合されていない遊離末端)は、必要に応じて、第3成分の導入に用いられることができるシステイン残基であってもよい。具体的には、システイン残基のチオール基をPEG鎖のマレイミド基と反応させ、このように結合されたPEG鎖は、カップリングアームと呼ばれ、その遊離末端にテトラジン基又はシクロオクテン基を有する。従って、第3成分は、iEDDA反応によりカップリングアームに結合される。好ましくは、第3成分は、リンカーユニットの薬物動態学的特性を改善させる成分である。薬物動態学的特性を改善させる成分の一例として、分子量約20,000〜50,000ダルトンを有する長いPEG鎖である。
【００２０】
<II> ペプチドコアに基づくマルチアームリンカーの使用
【００２１】
本開示の第1の態様に係るリンカーユニットは、臨床医学において、種々の疾患の治療に適用される。 そのため、本開示の第2の態様は、これらの疾患の治療方法に関する。本開示の種々の実施形態によれば、特定の疾患の治療方法は、治療を必要とする被験体に治療有効量の本開示の上述した態様及び実施形態に係るリンカーユニットを投与するステップを含む。 理解され得るように、上記リンカーユニットは、医薬製剤として投与され得る。該医薬製剤には、本発明のリンカーユニットに加えて、所望の投与経路に適した薬学的に許容される賦形剤を含む。
【００２２】
本開示のいくつかの実施形態によれば、本発明のリンカーユニットは、血餅形成の予防に有用である。これらの実施形態において、第1成分は、フィブリンに特異的なscFvであり、第2成分は、第Xa因子又はトロンビンの阻害剤である。第Xa因子の阻害剤は、アピキサバン、エドキサバン及びリバロキサバンからなる群より選択される。トロンビンの阻害剤は、アルガトロバン又はメラガトランであり得る。
【００２３】
本開示の他の実施形態によれば、血栓症の治療に適したリンカーユニットは、第1成分としてフィブリンに特異的なscFv、及び第2成分として組織プラスミノーゲン活性化因子を含む。組織プラスミノーゲン活性化因子の非限定的な例は、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ及びラノテプラーゼを含む。
【００２４】
<III> 標的化部分及びエフェクター部分を有する分子構築物
【００２５】
第3の態様において、本開示は、直接的又は間接的に互いに結合される2つのリンカーユニットを含む分子構築物に関する。1つのリンカーユニットのコアは、少なくとも1つの標的化成分に結合されるように構成され、もう1つのリンカーユニットのコアは、少なくとも1つのエフェクター成分に結合されるように構成される。本発明の分子構築物は、2つのリンカーユニットが、iEDDA反応、SPAAC反応、又はCuAAC反応により互いに結合されている利点を有する。このような設計により、複雑な構造を有する分子構築物を容易に合成することができる。本開示の原則及び精神によれば、異なる数及び/又はタイプの機能成分をそれぞれ有する2つのリンカーユニットを、独立して調製し、さらに結合することができる。このようにして、当業者であれば、異なる機能成分をそれぞれ有する分子構築物のライブラリーを構築し、そして、必要及び/又は所望の用途に応じて、該ライブラリーから分子構築物(又は、リンカーユニット)を選択して組合せることで、所望の構築物を生成することができる。さらに、リンカーユニットあたりの機能成分の数は、コアの特定の官能基の数を調整することにより制御することができる。
【００２６】
本開示の一実施形態によれば、 上記分子構築物は、第1リンカーユニット及び第2リンカーユニットを含む。具体的には、第1リンカーユニットは、(1)第1中心コア、(2)第1中心コアに結合される1つ以上のリンクアーム(以下、第1リンクアーム)、(3)第1リンクアーム結合される1つ以上の成分(以下、第1成分)、及び(4)必要に応じて第1中心コアに結合されるカップリングアーム(以下、第1カップリングアーム)を含む。第2リンカーユニットは、(1)第2中心コア、(2)第2中心コアに結合される1つ以上のリンクアーム(以下、第2リンクアーム)、(3)第2リンクアームに結合される1つ以上の成分(以下、第2成分)、(4)必要に応じて第2中心コアに結合されるカップリングアーム(以下、第2カップリングアーム)を含む。第1リンカーユニット及び第2リンカーユニットは、第1中心コアと第2中心コア、第1カップリングアームと第2中心コア、第1カップリングアームと第2カップリングアーム、又は、第1中心コアと第2カップリングアームのいずれかの間で起きるiEDDA、SPAAC、又はCuAAC反応により、互いに結合される。
【００２７】
本開示の実施形態によれば、第1中心コア及び第2中心コアは、両方とも複数のアミン基を有する。各リンクアームは、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)基とアミン基との間に、アミド結合を形成することにより中心コアに結合される。中心コアに結合された後、リンクアームは、その遊離末端にNHS、マレイミド、アジド、アルキン、テトラジン、シクロオクテン又はシクロオクチン基を有する。
【００２８】
NHS基の存在下で、第1成分及び第2成分は、該成分(即ち、第1成分又は第2成分)とリンクアーム(即ち、第1リンクアーム又は第2リンクアーム)との間にアミド結合を形成することにより、それぞれ第1リンクアーム及び第2リンクアームに結合される。リンクアームがその遊離末端にマレイミド、アジド、アルキン、テトラジン、シクロオクテン、又はシクロオクチン基を有する場合に、第1成分及び第2成分はそれぞれ、該成分(即ち、第1化成分又は第2成分)とリンクアーム(即ち、第1リンクアーム又は第2リンクアーム)との間で起きるチオール-マレイミド、CuAAC、iEDDA、又はSPAAC反応により、第1リンクアーム及び第2リンクアームに結合される。
【００２９】
本開示のいくつかの実施形態によれば、各リンクアームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖である。本開示の他の実施形態によれば、各カップリングアームは、2-12個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖である。
【００３０】
本開示の種々の実施形態によれば、第1中心コア及び第2中心コアのそれぞれは、化合物コア又はポリペプチドコアであり得る。いくつかの例において、第1中心コア及び第2中心コアは両方とも、同一又は異なる化合物の化合物コアである。特定の好ましい実施形態において、第1中心コア及び第2中心コアは両方とも、同一又は異なる配列を有するポリペプチドコアである。或いは、該2つのコアのうちの一方は化合物コアであり、他方はポリペプチドコアである。
【００３１】
本発明の化合物コアとして適用される化合物の非限定的な例として、ベンゼン-1,3,5-トリアミン、2-(アミノメチル)-2-メチルプロパン-1,3-ジアミン、トリス(2-アミノエチル)-アミン、ベンゼン-1,2,4,5-テトラアミン、3,3',5,5'-テトラアミン-1,1'-ビフェニル、テトラキス-(2-アミノエチル)メタン、テトラキス(エチルアミン)-ヒドラジン、N,N,N',N',-テトラキス-(アミノエチル)-エチレンジアミン、ベンゼン-1,2,3,4,5,6-ヘキサアミン、1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-ヘキサキス-(メチルアミン)-ベンゼン-1,3,5-トリアミン、1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N-オクタキス-(メチルアミン)-ベンゼン-1,2,4,5-トリアミン、及びN,N-ビス[(1-アミノ-3,3-ジアミノエチル)-ペンチル]メタン-ジアミンを含む。
【００３２】
中心コアが化合物コアである場合に、カップリングアームは、カップリングアームと中心コアとの間にアミド結合を形成することにより中心コアの複数のアミン基の1つに結合される。一方、カップリングアームの遊離末端には、アジド基、アルキン基、シクロオクテン基、シクロオクチン基、又はテトラジン基を有する。
【００３３】
本開示のいくつかの実施形態によれば、本発明のポリペプチドコアとして適用されるポリペプチドは、複数のリジン(K)残基、必要に応じて、2〜15個のK残基を含む。また、各K残基とその次のK残基との間が充填配列により区切られ、該充填配列は、グリシン(G)及びセリン(S)残基を含み、必要に応じて、該充填配列は、2〜20個のアミノ酸残基からなる。種々の実施形態において、上記充填配列は、GS、GGS、GSG、配列番号:1-16の配列を含み得る。いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドは、2-15単位のG1-5SK配列、例えば、(GSK)2-15配列を含む。或いは、ポリペプチドコアは、(Xaa-K)nを含み得る。Xaaは、2〜12個のエチレングリコール(EG)の繰り返し単位を有するPEG化アミノ酸であり、nは、2〜15の整数である。
【００３４】
中心コアは、ポリペプチドコアである場合に、そのN末端若しくはC末端にシステイン残基を含み得る。これらの場合において、カップリングアームは、チオール-マレイミド反応により、中心コアのシステイン残基に結合される。システイン残基に結合されるカップリングアームは、その遊離末端にアジド基、アルキン基、シクロオクテン基、シクロオクチン基、又はテトラジン基を有する。
【００３５】
第1リンカーユニット及び第2リンカーユニットは、以下に詳細に説明するように、第1カップリングアームと第2カップリングアームの有無に応じて、種々の構造により結合され得る。化合物コアを有するリンカーユニットの場合に、カップリングアーム(即ち、第1カップリングアーム又は第2カップリングアーム)を介してもう1つのリンカーユニットに結合されることが好ましい一方、ポリペプチドコアを有するリンカーユニット場合に、カップリングアームの必要性は任意となる。
【００３６】
第1リンカーユニット及び第2リンカーユニットがそれぞれカップリングアームを含む場合に、一方のカップリングアーム(例えば、第1カップリングアーム)は、その遊離末端にテトラジン基を有し、他方のカップリングアーム(この場合に、第2カップリングアーム)は、その遊離末端にシクロオクテン基を有することにより、2つのリンカーユニットは、2つのカップリングアーム(即ち、第1カップリングアームと第2カップリングアーム)の間で起きるiEDDA反応により結合される。好ましくは、テトラジン基は、1, 2, 3, 4-テトラジン、1, 2, 3, 5-テトラジン、1, 2, 4, 5-テトラジン又はそれらの誘導体、例えば、6-メチルテトラジンであり、シクロオクテン基は、TCOである。両方のカップリングアーム遊離末端がそれぞれアジド基及びアルキン基を有する場合にも同様である。この場合に、2つのリンカーユニットは、2つのカップリングアーム(即ち、第1カップリングアームと第2カップリングアーム)の間で起きるCuAAC反応により結合される。或いは、一方のカップリングアーム(例えば、第1カップリングアーム)は、アジド基を有し、他方のカップリングアーム(この場合に、第2カップリングアーム)は、シクロオクチン基(好ましくは、DBCO、DIFO、BCN、又はDICO基)を有する。従って、2つのカップリングアームは、SPAAC反応により結合されることができる。これらの構成は、2つのリンカーユニットの間に形成されることができる。ここで、2つのユニットは両方とも、化合物コア若しくはポリペプチドコアを有し、又は、場合によって、一方のリンカーユニットは化合物コアを有し、他方はポリペプチドコアを有する。
【００３７】
1つのリンカーユニットのみがカップリングアーム(例えば、第1カップリングアームを有する第1リンカーユニット)を有する場合に、もう1つのリンカーユニットの中心コア(例えば、第2中心コア)は、ポリペプチドコアである。この場合に、1つの第2中心コアのN末端又はC末端にある第1アミノ酸残基は、アジド基又はアルキン基を有するアミノ酸残基である。いくつかの実施形態において、アジド基又はアルキン基を有するアミノ酸残基は、第1リンカーユニットの第1カップリングアームの対応するアルキン又はアジド基とCuAAC反応を起こすことにより、第1リンカーユニットと第2リンカーユニットとを結合する。或いは、1つの第2中心コアのN末端又はC末端にある第1アミノ酸残基は、アジド基を有するアミノ酸残基であり、且つSPAAC反応により、第1リンカーユニットのカップリングアームに結合され得る。該カップリングアームの遊離末端にシクロオクチン基(好ましくは、DBCO、DIFO、BCN、又はDICO)を有する。この構成は、2つのリンカーユニットの間に形成されることができる。ここで、2つのユニットは両方とも、ポリペプチドコアを有し、又は、場合によって、一方のリンカーユニットは化合物コアを有し、他方はポリペプチドコアを有する。
【００３８】
第1リンカーユニット及び第2リンカーユニットは、カップリングアーム(即ち、第1カップリングアーム及び第2カップリングアーム)が存在しなくても、結合されることも可能である。言い換えると、第1カップリングアームと第2カップリングアームは、互いに直接結合される。この構成は、主に2つのポリペプチドコアの間に形成される。具体的には、2つの中心コアのうちの一方(例えば、第1中心コア)は、そのN末端又はC末端にアジド基を有するアミノ酸残基を含み、他方の中心コア(例えば、第2中心コア)は、そのN末端又はC末端にアルキン基を有するアミノ酸残基を含む。このようにして、第1中心コアのアジド基と第2中心コアのアルキン基との反応により、第1リンカーユニットと第2リンカーユニットとが結合する。
【００３９】
アジド基を有するアミノ酸残基の非限定的な例として、L-アジドホモアラニン(AHA)、4-アジド-L-フェニルアラニン、4-アジド-D-フェニルアラニン、3-アジド-L-アラニン、3-アジド-D-アラニン、4-アジド-L-ホモアラニン、4-アジド-D-ホモアラニン、5-アジド-L-オルニチン、5-アジド-d-オルニチン、6-アジド-L-リジン、及び6-アジド-D-リジンが挙げられる。アルキン基を有するアミノ酸残基の例示的な例として、L-ホモプロパギルグリシン(L-HPG)、D-ホモプロパギルグリシン(D-HPG)、及びβ-ホモプロパギルグリシン(β-HPG)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
本開示のいくつかの実施形態によれば、分子構築物の第1リンカーユニット及び第2リンカーユニットのうちの一方は、第1リンカーユニット又は第2リンカーユニットに結合される追加のリンクアーム(以下、第3リンクアーム)をさらに含む。
【００４１】
第1リンクアーム及び第2リンクアームと同様に、第3リンクアームは、アミド結合を形成することにより、又は、チオール-マレイミド、CuAAC、iEDDA若しくはSPAAC反応により、1つの成分に結合されるように構成される。いくつかの実施形態において、別の成分は、第2標的化成分又は第2エフェクター成分であり、本発明の分子構築物の標的効果又は治療効果を向上させるのに使用される。或いは、分子量20,000〜50,000ダルトンの長いPEG鎖は、上記別の成分として使用することにより、本発明の分子構築物の安定性を向上させる。
【００４２】
他の実施形態において、本発明の分子構築物は、第3リンカーユニットをさらに含む。第3リンカーユニットは、(1)第3中心コア;(2)第3中心コアに結合される1つ以上のリンクアーム(以下、第3リンクアーム);(3)第3リンクアームに結合される1つ以上の成分(以下、第3成分);及び(4)必要に応じて、第3中心コアに結合されるカップリングアーム(以下、第3カップリングアーム)を含む。この場合に、第3リンカーユニットは、第1カップリングアーム又は第2カップリングアームと第3カップリングアーム、第1中心コア又は第2中心コアと第3カップリングアーム、第1中心カップリングアーム又は第2中心カップリングアームと第3中心コア、或いは第1中心又は第2中心コアと第3中心コアのいずれかの間で起きるCuAAC反応、iEDDA反応、又はSPAAC反応により、第1リンカーユニット又は第2リンカーユニットに結合される。
【００４３】
第3リンカーユニットの第3リンクアームは、その遊離末端にNHS、マレイミド、アジド、アルキン、シクロオクテン、シクロオクチン、又はテトラジン基を有し得る。従って、第3リンクアームは、直接にアミド結合を形成することにより、又は、チオール-マレイミド、CuAAC、iEDDA若しくはSPAAC反応により第3成分に結合され得る。
【００４４】
本開示の種々の実施形態によれば、第1中心コア、第2中心コア、及び必要に応じて第3中心コアは、同一でも異なっていてもよい。
【００４５】
<IV> 標的化部分及びエフェクター部分を有する分子構築物の使用
【００４６】
本開示の第3の態様に係る分子構築物は、臨床医学において、疾患の治療に適用される。そのため、本開示の第4の態様は、疾患の治療方法に関する。本開示の種々の実施形態によれば、特定の疾患の治療方法は、治療を必要とする被験体に治療有効量の本開示の上述した態様及び実施形態に係る分子構築物を投与するステップを含む。理解され得るように、上記分子構築物は、医薬製剤として投与され得る。該医薬製剤には、本発明の分子構築物に加えて、所望の投与経路に適した薬学的に許容される賦形剤を含む。
【００４７】
以下、本開示のいくつかの実施形態の理解を容易にするために、いくつかの特定の疾患を治療するための本発明の分子構築物の第1成分及び第2成分の種々の例示的な組み合わせを説明する。
【００４８】
本開示のいくつかの実施形態によれば、本発明のリンカーユニットは、血餅形成の予防に有用である。これらの実施形態において、第1成分は、フィブリンに特異的なscFvであり、第2成分は、第Xa因子又はトロンビンの阻害剤である。第Xa因子の阻害剤は、アピキサバン、エドキサバン及びリバロキサバンからなる群より選択される。トロンビンの阻害剤は、アルガトロバン又はメラガトランであり得る。
【００４９】
本開示の他の実施形態によれば、血栓症の治療に適したリンカーユニットは、第1成分としてフィブリンに特異的なscFv及び第2成分として組織プラスミノーゲン活性化因子を含む。組織プラスミノーゲン活性化因子の非限定的な例は、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ及びラノテプラーゼを含む。
【００５０】
<V>血餅形成の予防及び血栓症の治療のためのFcに基づく分子構築物及びその使用
【００５１】
第5の態様において、本開示は、免疫グロブリンのCH2-CH3ドメインに直接的又は間接的に結合される少なくとも1つの標的化成分及び少なくとも1つのエフェクター成分を有する結晶化可能断片(Fc)に基づく分子構築物に関する。本発明のFcに基づく分子構築物の標的化成分及びエフェクター成分は、これらのFcに基づく分子構築物が血餅形成の予防及び血栓症の治療、又はこのような使用のための医薬の製造に適されるように特異的に選択される。理解され得るように、このFcに基づく分子構築物を使用する血餅形成の予防方法及び血栓症の治療方法も本開示の態様に含まれる。
【００５２】
本開示の特定の実施形態によれば、Fcに基づく分子構築物は、IgG.Fcの1対のCH2-CH3セグメント、1対のエフェクター成分、及び1対の標的化成分を含む。この1対のエフェクター成分は、組織プラスミノーゲン活性化因子、又は、第Xa因子の阻害剤若しくはトロンビンの阻害剤の複数の分子を含む薬物バンドルであり、この1対の標的化成分は、フィブリンに特異的な抗体断片である。
【００５３】
上記エフェクター成分が組織プラスミノーゲン活性化因子(例えば、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、及びラノテプラーゼ)である場合に、1対のエフェクター成分は、1対のCH2-CH3セグメントのN末端に結合され、1対の標的化成分は、1対のCH2-CH3セグメントのC末端に結合され、その逆もまた然りである。或いは、上記エフェクター成分が薬物バンドルである場合に、1対のエフェクター成分は、1対のCH2-CH3セグメントのC末端に結合され、1対の標的化成分は、1対のCH2-CH3セグメントのN末端に結合される。
【００５４】
特定の実施形態において、1対のCH2-CH3セグメントは、ヒトIgG 重鎖γ4又はヒトIgG 重鎖γ1に由来する。
【００５５】
いくつかの例において、1対の標的化成分は、Fab構造(即ち、VH-CH1ドメイン及びVL-Cκドメインを含む)を取る。このFab断片が第1重鎖及び第2重鎖のN末端に結合されることにより、Fcに基づく分子構築物は、IgG構造を採用する。この場合に、Fab構造ではない1対のエフェクター成分は、1対のCH2-CH3セグメントのC末端に結合される。
【００５６】
いくつかの任意の実施形態によれば、上記エフェクター成分は、リンカーユニットに基づく薬物バンドルである。このような薬物バンドルは、少なくとも抗体分子に結合される前に別々に製造され得るという点で有利であり、それにより、抗体分子との直接結合の過酷な化学条件下で薬物分子を施すことを回避できる。本開示の様々な実施形態によれば、上記薬物バンドルは、血液凝固に関連する複数の阻害剤、例えば、第Xa因子阻害剤(例えば、アピキサバン、エドキサバン及びリバロキサバン)及びトロンビン阻害剤(例えば、アルガトロバン及びメラガトラン)を含む。非制限的な一例として、これらのFcに基づく分子構築物は、血液凝固の予防に有用である。
【００５７】
特定の実施形態によれば、本発明のFcに基づく分子構築物は、延長ペプチド及びカップリングアームをさらに含む。 具体的には、延長ペプチドは、(G2-4S)2-8Cの配列を含み、1対のCH2-CH3セグメントの1つのC末端に結合される。この場合に、カップリングアームは、延長ペプチドのC末端にそれらの間で起きるチオール-マレイミド反応により結合される。また、薬物バンドルに結合される前に、カップリングアームの遊離末端(即ち、システイン残基に結合されていない末端)が、アルキン基、アジド基、歪んだアルキン基、又はテトラジン基で修飾されることにより、薬物バンドルが該遊離末端に、それらの間で起きる、逆電子要請型ディールス-アルダー(iEDDA)反応、歪み促進型アジド-アルキンクリックケミストリー(SPAAC)反応、又は銅(I)触媒型アルキン-アジド環化付加(CuAAC)反応により結合される。
【００５８】
いくつかの任意の実施形態によれば、上記薬物バンドルは、中心コア及び複数のリンクアームを含む。本開示の様々な実施形態によれば、上記中心コアは、複数のアミン基又は複数のリジン(K)残基を含むポリペプチドを有する化合物であり得る。各リンクアームは、化合物コアのアミン基、又はポリペプチドコアのK残基との反応により中心コアに結合される末端を有する。リンクアームは、その遊離末端にマレイミド基を有し、各分子(例えば、血液凝固に関連する阻害剤の分子)は、マレイミド基との反応により、リンクアームを介して中心コアに結合される。
【００５９】
中心コアがポリペプチドコアである場合に、中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、システイン残基であり、又はアジド基若しくはアルキン基を有する。
【００６０】
アジド基又はアルキン基を有する末端アミノ酸残基を含むポリペプチドコアの場合、薬物バンドルは、末端残基と延長ペプチドのC末端との間で起きるCuAAC反応により延長ペプチドに結合される。
【００６１】
被験体の血餅形成の予防及び/又は血栓症の治療のための方法は、被験体に有効量の本形態の分子構築物を投与するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
本説明は、以下に簡単に説明する添付図面に照らして読まれた以下の詳細な説明からよりよく理解されるであろう。
【図１Ａ−１Ｋ】図1A−1Kは、本開示の特定の実施形態に係るリンカーユニットを説明する模式図である。
【図２】図2は、化合物コアを有するリンカーユニットを説明する模式図である。
【図３Ａ−３Ｄ】図3A−3Dは、本開示のいくつかの実施形態に係るT-E分子構築物を説明する模式図である。
【図４】図4は、本開示のいくつかの実施形態に係る分子構築物を構築するためのライブラリーを説明する模式図である。
【図５Ａ−５Ｂ】図5A−5Bは、本開示のいくつかの実施形態に係る分子構築物を説明する模式図である。
【図６】図6は、本開示のいくつかの実施形態に係る分子構築物を説明する模式図である。
【図７Ａ−７Ｂ】図7A−7Bは、本開示の種々の実施形態に係る分子構築物を説明する模式図である。
【図８Ａ−８Ｃ】図8A−8Cは、本開示の種々の実施形態に係るFcに基づく分子構築物を説明する模式図である。
【図９Ａ−９Ｂ】図9A−9Bは、本開示の様々な実施形態に係るFcに基づく分子構築物を示す模式図である。
【図１０】図10は、本開示の実施例に係る、TCO基を有する1つのリンクアーム及びマレイミド基を有する5つのPEG6リンクアームを含むペプチドコアに基づくリンカーユニットの質量分析法 MALDI-TOFの結果を示す。
【図１１】図11は、本開示の実施例で合成されたアピキサバン-PEG3-S-S-PEG3-アピキサバンの質量分析法 MALDI-TOFの結果を示す。
【図１２】図12は、本開示の実施例で合成されたアルガトロバン-PEG3-S-S-PEG3-アルガトロバンの質量分析法 MALDI-TOFの結果を示す。
【図１３Ａ−１３Ｃ】図13A−13Cは、それぞれ本開示の実施例に係る、精製したヒトフィブリンに特異的な102-10 scFvのSDS-PAGE、MALDI-TOF及びELISA分析の結果を示す。
【図１４Ａ−１４Ｂ】図14A−14B は、それぞれ本開示の実施例に係る、ヒトフィブリンに特異的なファージディスプレイscFvのファージ力価分析及びシングルコロニー ELISA分析の結果を示す。
【図１５Ａ−１５Ｂ】図15A−15Bは、本開示の実施例に係る、精製したレテプラーゼのSDS-PAGE及びMALDI-TOF分析の結果を示す。
【図１６】図16は、本開示の実施例に係る、TCO結合レテプラーゼの質量分析の結果を示す。
【図１７Ａ−１７Ｂ】図17A−17Bは、それぞれ本開示の実施例に係る、1つの遊離テトラジン官能基及び1つのセットのヒトフィブリンに特異的な3つのscFvを有する標的化リンカーユニットのSDS-PAGE分析及び質量分析の結果を示す。
【図１８】図18は、本開示の実施例に係る、ヒトフィブリンに特異的な3つのscFv(標的化成分として)及び1つのレテプラーゼ分子(エフェクター成分として)を有する単一のリンカーユニット分子構築物のMS結果を示す。
【図１９】図19は、本開示の実施例に係る、アピキサバン-PEG3-SH分子阻害分析の結果を示す。
【図２０】図20は、本開示の実施例に係る、精製した組換え二本鎖(レテプラーゼ)-hIgG4.Fc融合タンパク質のSDS-PAGE分析の結果を示す。
【図２１】図21は、本開示の実施例に係る、精製した組換え二本鎖(レテプラーゼ)-hIgG4.Fc-(scFv α フィブリン)融合タンパク質のSDS-PAGE分析の結果を示す。
【図２２】図22は、本開示の実施例に係る、精製した組換え二本鎖(レテプラーゼ)-(scFv α フィブリン)融合タンパク質のSDS-PAGE分析の結果を示す。
【図２３】図23は、本開示の実施例に係る、精製した組換え二本鎖(TNK-tPA)-IgG4.Fc融合タンパク質のSDS-PAGE分析の結果を示す。
【図２４】図24は、本開示の実施例に係る、組換え二本鎖(レテプラーゼ)-hIgG4.Fc、二本鎖(レテプラーゼ)-hIgG4.Fc-(scFv α フィブリン)及び(レテプラーゼ)-(scFv αフィブリン)のプロテアーゼ活性の分析結果を示す。
【００６３】
一般的な実施に従って、説明された種々の特徴/要素は、縮尺通りに描かれておらず、代わりに、本発明に関連する特定の特徴/要素を最もよく例示するために描かれている。また、種々の図面における同様の参照番号及び名称は、可能な場合には、同様の要素/部品を示すために使用される。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
添付の図面に関連して以下に提供される詳細な説明は、本実施例の説明として意図されており、本実施例が構築又は利用され得る唯一の形態を表すものではない。この説明は、この実施例の機能と、この実施例を構成し動作させるための一連のステップを示す。しかし、同じ又は同等の機能及び順序は、異なる実施例によって達成されてもよい。
【００６５】
便宜上、本明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここに集める。 本明細書中で他に定義されない限り、本開示において使用される科学技術用語は、当業者によって一般に理解され使用される意味を有するものとする。
【００６６】
文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は複数の形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。具体的には、本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、文脈が明らかに他に示されない限り、単数形「a」及び「an」は複数の言及を含む。また、本明細書及び特許請求の範囲で使用する「少なくとも1つの」及び「1つ以上の」という用語は、同じ意味を有し、1,2,3又はそれ以上を含む。さらに、「A、B及び/又はCの少なくとも1つ」、「A、B又はCの少なくとも1つ」、及び「A、B及び/又はCの少なくとも1つ」という表現は、本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、A単独、B単独、C単独、AとB、BとC、AとC、及びAとBとC、をカバーすることを意図している。
【００６７】
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示された数値は可能な限り正確に報告される。しかし、いずれの数値も本質的に、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含む。また、本明細書で使用する「約」という用語は、一般に、所与の値又は範囲の10％、5％、1％又は0.5％以内を意味する。或いは、用語「約」は、当業者によって考慮される場合、平均の許容可能な標準誤差内にあることを意味する。操作例／実施例以外で、又は特に明記しない限り、本明細書中に開示される材料の量、時間、温度、操作条件、量の比などについての、数値範囲、量、値及びパーセンテージの全てが、すべての場合において、用語「約」により修飾されているものと理解されるべきである。したがって、反対に示されない限り、本開示及び添付の請求項に記載される数値パラメーターは、所望に応じて変化することのできる近似値である。少なくとも、各数値パラメーターは、報告された有効数字の数に照らして、及び通常の丸め技法を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。範囲は、本明細書では、1つのエンドポイントから別のエンドポイントまで、又は2つのエンドポイント間で表現することができる。特に明記しない限り、本明細書中に開示される全ての範囲は、エンドポイントを包含する。
【００６８】
本開示は、一般に分子構築物に関する。各分子構築物は、標的化成分(T)及びエフェクター成分(E)を含む。本明細書において、これらの分子構築物は、「T-E分子」、「T-E医薬品」又は「T-E薬物」と呼ばれる場合がある。
【００６９】
本明細書において、用語「標的化成分」とは、対象となる標的(例えば、細胞表面上の受容体、又は組織内のタンパク質)に直接的又は間接的に結合することにより、本発明の分子構築物の対象となる標的への輸送を容易にする分子構築物の部分を指す。いくつかの例において、標的化成分は、分子構築物を標的細胞の近傍に誘導する。他の場合には、標的化成分は、標的細胞表面に存在する分子、又は細胞表面に存在する分子に特異的に結合する第2分子に特異的に結合する。いくつかの場合において、標的化成分は、対象となる標的に結合されると、本発明の分子構築物とともに内部に移行することができることにより、標的細胞の細胞質基質に移転される。標的化成分は、細胞表面の受容体に対する抗体若しくはリガンドであり得るか、又は、そのような抗体若しくはリガンドに結合する分子であることで、本発明の分子構築物を標的部位(例えば、選択した細胞の表面)に標的化してもよい。標的化機能を有しない治療薬に比べて、本発明の分子構築物は、疾患部位でのエフェクター(治療剤)の局在化を強化でき、又は該局在化に有利である。上記局在化は、程度又は相対的な割合をいい、疾患部位へのエフェクターの全体的又は完全な局在化を意味しない。
【００７０】
本発明によれば、用語「エフェクター成分」とは、分子構築物が標的部位に誘導されると、生物学的活性(例えば、免疫応答、細胞毒性効果の発揮等を含む)又は他の機能的活性(例えば、他のハプテンタグ付き治療分子の動員)を誘発する分子構築物の部分を意味する。「エフェクト」は、治療的又は診断的であり得る。エフェクター成分は、細胞、及び/又は、 細胞外免疫調節因子に結合するものを包含する。エフェクター成分は、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、糖ペプチド、薬物部分(小分子薬物及び生物製剤の両方)、化合物、元素、及び同位体、並びにそれらの断片等の薬剤を含む。
【００７１】
使用される第1、第2、第3等の用語は、本明細書において、種々の成分、構成要素、領域、及び/又は、セクションを説明するために使用することができるが、これらの成分(並びに、構成要素、領域、及び/又は、セクション)は、これらの用語によって制限されない。また、そのような順序番号の使用は、文脈によって明白に示されない限り、順番や順序を意味するものではない。むしろ、これらの用語は、単にある要素を別の要素と区別するために使用される。従って、以下に説明する第1成分は、例示的な実施形態の教示から逸脱することなく、第2成分と呼ぶことができる。
【００７２】
ここで、用語「リンク」、「カップル」及び「接合」は、交換可能に使用され、直接結合又は間接結合により2つの要素を結合することを指すものである。
【００７３】
ここで使用される用語「ポリペプチド」とは、少なくとも2つのアミノ酸残基を有するポリマーを意味する。典型的には、ポリペプチドは、2〜約200残基、好ましくは2〜50残基の長さのアミノ酸残基を含む。本明細書でいうアミノ酸配列は、該配列の、L-、D-、又はβ-アミノ酸の構成を含む。ポリペプチドは、アミノ酸ポリマーも含む。該アミノ酸ポリマーにおいて、1つ又は複数のアミノ酸残基は、天然に存在するアミノ酸に対応する人工化学類似体、又は天然に存在するアミノ酸ポリマーである。さらに、該用語は、ペプチド結合、又は他の「修飾された結合」、例えば、ペプチド結合がα-エステル、β-エステル、チオアミド、ホスホラミド、カーボネート、ヒドロキシレート等に置換されたものにより結合されたアミノ酸に適用される。
【００７４】
特定の実施形態において、本明細書に記載された配列を含むアミノ酸の保存的置換も含まれる。種々の実施形態において、1、2、3、4、又は5つの異なる残基が置換される。用語「保存的置換」とは、アミノ酸の置換が分子の活性(例えば、生物学的若しくは機能的活性、及び/又は、特異性)を実質的に変更しないことをいう。典型的には、保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸を、類似の化学的性質(例えば、電荷又は疎水性)を有する他アミノ酸で置換することである。ある保存的置換は、標準アミノ酸が親残基と僅かに異なる非標準アミノ酸(例えば、希アミノ酸、合成アミノ酸等)に置換された「類似体置換」を含む。アミノ酸類似体は、親アミノ酸の構造を大幅に変化させず、標準アミノ酸から合成的に得ることができ、異性体、又は代謝産物前駆体である。
【００７５】
特定の実施形態において、本明細書に記載されている配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％又は90％、より好ましくは少なくとも95％又は98％の配列同一性を有するポリペプチドも含む。
【００７６】
本明細書でいうポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセンテージ(%)」は、特定のポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるポリペプチド残基のパーセンテージとして定義される。上記配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入することにより、最大パーセント配列同一性が得られる。なお、保存的置換は、配列同一性の一部として考慮されていない。配列同一性パーセンテージを決定するためのアライメントは、当分野内の様々な方法、例えば、公然に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN又はガリン(DNASTAR)ソフトウェアにより達成することができる。当業者であれば、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。上記パラメータは、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要である任意のアルゴリズムを含む。本明細書の目的を達成するために、2つのポリペプチド配列間の配列比較は、国立生物工学情報センター(NCBI)によってオンラインで提供されるコンピュータプログラムBlastp(タンパク質-タンパク質BLAST)により実施される。所与のポリペプチド配列Bに対する所与のポリペプチド配列Aのアミノ酸配列同一性パーセンテージ(本明細書において、所与のポリペプチド配列Bと特定の％アミノ酸配列同一性を有する所与のポリペプチド配列Aとも呼ばれる)は、以下の式により計算される。
2018527350.tif 000003
ここで、Xは、配列アライメントプログラムBLASTにより、配列A、Bをアライメントすることで同一のマッチとして得られたアミノ酸残基の数である。Yは、配列A又はBのいずれか短い方のアミノ酸残基の総数である。
【００７７】
本明細書で使用される用語「PEG化アミノ酸」は、1つのアミノ基及び1つのカルボキシル基を有するポリエチレングリコール(PEG)鎖である。一般的には、PEG化アミノ酸の一般式は、NH2-(CH2CH2O)n-COOHである。本開示において、nの値は、1〜20、好ましくは、2〜12である。
【００７８】
本明細書において、ポリペプチドについては、用語「末端」は、ポリペプチドのN端又はC端にあるアミノ酸残基を指す。ポリマーについては、用語「末端」は、ポリマー(例えば、本開示のポリエチレングリコール)におけるポリマー骨格の端に位置する構成単位を指す。本明細書及び特許請求の範囲において、用語「遊離末端」は、他の分子に化学的に結合していない末端アミノ酸残基又は構成単位を指す。
【００７９】
本明細書において、用語「抗原」又は「Ag」は、免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫応答は、分泌性、体液性、及び/又は、細胞性抗原-特異的応答を含む。本開示において、用語「抗原」は、タンパク質、ポリペプチド(その変異型又は生物学的活性断片を含む)、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、核酸、又はそれらの組合せでありえる。
【００８０】
本明細書及び特許請求の範囲において、用語「抗体」は最も広い意味で使用され、完全に集合した抗体、抗原に結合する抗体断片、例えば、抗原結合断片(Fab/Fab')、F(ab')2断片(互いにジスルフィド結合により結合された2つの抗原結合Fab部分を有する)、可変断片(Fv)、一本鎖可変断片(scFv)、二重特異的性一本鎖可変領域断片(bi-scFv)、ナノボディ、ユニボディ及びダイアボディを包含する。「抗体断片」は、完全抗体の一部、好ましくは、完全抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む。典型的には、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的にコードされる1つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。よく知られている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子、並びに、ミリアド免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパ又はラムダに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンに分類される。これにより、免疫グロブリン:IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEをそれぞれ定義する。典型的な免疫グロブリン(抗体)の構造単位は四量体である。各四量体は、2つの同一の1対のポリペプチド鎖から構成される、各1対のポリペプチド鎖は、1本の「軽」鎖(約25kDa)及び1本の「重」鎖(約50-70kDa)を含む。各鎖のN末端は、抗原認識主に関与する約100〜110又はそれ以上のアミノ酸を含む可変領域を定義する。用語可変軽鎖(VL)及び可変重鎖(VH)は、それぞれ上述した軽鎖及び重鎖を指す。本開示の実施形態によれば、抗体断片は、天然抗体を改変することによって、又は組換えDNA技術を使用して新規合成によって調製され得る。本開示の特定の実施形態において、抗体、及び/又は、抗体断片は、二重特異性であり得、且つ様々な構造であり得る。例えば、二重特異性抗体は、2つの異なる抗原結合部位(可変領域)を含み得る。種々の実施形態において、二重特異性抗体は、ハイブリドーマ技術又は組換えDNA技術によって調製されることができる。特定の実施形態において、二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対し結合特異性を有する。
【００８１】
本明細書において、用語「特異的に結合」は、抗体又はその抗原結合断片が、約1×10-6 M、1×10-7 M、1×10-8 M、1×10-9 M、1×10-10 M、1×10-11 M、1×10-12 M以下の解離定数(Kd)で抗原に結合する能力、及び/又は、非特異的抗原に対する親和性よりも少なくとも2倍大きい親和性で抗原に結合する能力を指す。
【００８２】
本明細書において、用語「治療」は、予防的(例えば、予防薬)、治癒的又は緩和的治療を含む。本明細書で使用される「治療」行為も、予防的(例えば、予防薬)、治癒的又は緩和的治療を含む。特に、本明細書において、用語「治療」は、本発明の分子構築物又はそれを含む医薬組成物を、症状、症状に関連した病状、症状に関連した二次的な疾患若しくは障害、又は症状を引き起こす素因を有する被験体に、上記特定の疾患、障害及び/又は症状の1つ以上の病状又は特徴の、部分的若しくは完全な緩和、改善、軽減、発症の遅延、進行の阻害、重症度の軽減、及び/又は、罹患率の低減を達成する目的で、適用又は投与することを指す。治療は、疾患、障害及び/又は症状の徴候を示していない被験体、及び/又は、疾患、障害及び/又は症状の初期徴候のみを示す被験体にも、疾患、障害及び/又は症状に関連した病理学変化の発展リスクを減少させる目的で施すことができる。
【００８３】
本明細書において、用語「有効量」とは、所望の治療応答を生じるのに十分な本発明の組換えタンパク質の量を指す。薬剤の有効量は、疾患又は症状を治癒する必要はないが、疾患若しくは症状の発症を遅延、妨害又は予防し、又は疾患若しくは症状を緩和し、疾患若しくは症状を治療することができる。有効量は、適切な投薬形態で1回、2回又はそれ以上の用量に分割されることで、所定の期間内で1回、2回又はそれ以上で投与されることができる。具体的な有効量又は十分量は、処置される特定の病状、患者の身体的条件(例えば、患者の体重、年齢、又は性別)、治療を受けている被験体のタイプ、治療期間、併用療法の性質（存在する場合）、採用される特定の処方、化合物の構造又はその誘導体などの要因によって変化する。有効量は、例えば、有効成分の総質量(例えば、グラム、ミリグラム又はマイクログラム)、又は体重に対する活性成分の質量比、例えば、ミリグラム/キログラム（mg / kg）として表すことができる。
【００８４】
用語「適用」及び「投与」は、本明細書において互換的に使用され、本発明の分子構築物又は医薬組成物を、治療を必要とする被検体に適用することを意味する。
【００８５】
用語「被験体」及び「患者」は、本明細書では互換的に使用され、本発明の分子構築物、医薬組成物及び/又は方法によって治療可能な人類を含む動物を意味する。用語「被験体」又は「患者」は、1つの性別が特定されていない限り、オスとメスの両方の性別を指すことが意図される。従って、用語「被験体」又は「患者」は、本開示の治療方法から利益を得ることができる任意の哺乳動物を含む。「被験体」又は「患者」の例は、ヒト、ラット、マウス、モルモット、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ及びニワトリを含むがこれらに限定されない。例示的な実施形態において、患者はヒトである。 用語「哺乳動物」は、ヒト、霊長類、家畜、及び、農場動物、例えば、ウサギ、ブタ、ヒツジ又は牛;動物園、スポーツ又はペット動物;及びマウス及びラットのようなげっ歯類を含む哺乳綱のすべてのメンバーを指す。用語「非ヒト哺乳動物」は、ヒト以外の哺乳綱のすべてのメンバーを指す。
【００８６】
本開示は、少なくとも、T−E医薬品の構築に基づいている。このようなT−E医薬品は、標的細胞、標的組織又は器官に、血液循環、リンパ系、及び他の細胞、組織又は器官よりも相対的に高い割合で送達できる。この場合に、医薬品の治療効果は増加する一方、副作用及び毒性の範囲、重症度は低下する。標的成分を含まない形態よりも低い用量でT-E分子の形態で治療エフェクターを投与することもできる。従って、より低い投薬量で治療エフェクターを投与しても、効力を失うことなく、副作用及び毒性を低下させることができる。
【００８７】
より良い薬物標的から恩恵を受けることができる疾患
【００８８】
多くの疾患に使用される薬物は、疾患部位を標的とすることができれば、すなわち正常組織又は器官よりも有利に疾患部位に局在化又は分配できれば、より良い効力及び安全性を有するように改善されることができる。特定の抗体薬物は、感染性微生物又はそれらの毒性生成物を標的とし、免疫細胞を動員して抗体結合粒子を貪食して消失させる能力を持たせると、治療効果を向上できる。以下は疾患の主要な例であり、薬物を疾患部位又は細胞に優先的に分布させることができれば、又は貪食免疫細胞を摂取することができれば、これらの薬物を改善することができる。
【００８９】
血餅に関連する疾患/病状
【００９０】
血液凝固（又は凝血）の病理学的問題に対処するために、主に2つの側面の医薬的ニーズがある。1つの側面は、凝固塊が形成されると病理学的血餅が形成されるか又はサイズが増大するのを防止若しくは阻害することであり、もう1つの側面は、すでに形成された病理的凝固物を適時に溶解することである。両方の側面において、臨床的に利用可能な一連の医薬品がある。より優れた製品の開発を目指す研究は積極的に進められており、多くの製品が臨床試験中である。
【００９１】
種々の合併症(例えば、心血管、内分泌、又は他の身体の調節状態、外科手術、薬の使用、及び他の要因から生じるもの)を患っている患者は血餅を発症する傾向がある。血餅は、出血性脳卒中、頭部外傷、心筋梗塞、肺塞栓症、又は深刻な静脈血栓症を引き起こすことがあり、生命を脅かす重篤な臨床状態をもたらすことが多い。
【００９２】
凝血は、順次に増幅するプロテアーゼ触媒事象のカスケードに関する。後続のステップでは、第Xa因子は、プロトロンビンをトロンビンに切断し、トロンビンは、フィブリノーゲンをフィブリンに切断し、血小板と組み合わせて血餅の網目構造を形成する。血餅の溶解には、組織プラスミノーゲン活性化因子含むいくつかの酵素のうちの1つを介してプラスミノーゲンから生成されるプラスミンが関与する。
【００９３】
A. a 血餅形成を予防するためのT-E分子の使用
【００９４】
第Xa因子の多数の間接阻害剤が開発され使用されている。何十年もの間、阻害剤は、主にヘパリン（分子量が5〜30kDのグリコサミノグリカンの天然に存在する多糖類の混合物）、低分子量ヘパリン、及びヘパリノイド化合物である。これらの物質は、抗トロンビンを含むヘパリン結合タンパク質に結合することによりこれらの物質を強化し、第Xa因子を阻害して血餅の形成を阻害する。組織因子経路阻害剤（TFPI）は、タンパク質分解の程度に応じて34,000〜40,000ダルトンの一本鎖血清タンパク質であり、第Xa因子を阻害することができる。しかし、組織因子経路阻害剤は治療薬として組換えDNA技術によって産生されていない。
【００９５】
トロンビンの多くの直接阻害剤も開発され、臨床的に使用されている。医療用ヒルと組換えヒルジンから自然に回収された、トロンビンに結合するヒルジンは、他の優れた医薬品の導入により使用中止される前に長年使用されていた。
【００９６】
最近、第Xa因子又はトロンビンの直接阻害剤であるいくつかの小分子が開発され、いくつかの臨床適応症における凝血を予防する臨床用途向けに承認されている。1つのセットの臨床応用において、これらの小分子は第Xa因子の直接阻害剤であり、アピキサバン、エドキサバン又はリバロキサバンであり得る。 別のセットの応用において、これらの小分子はトロンビンの直接阻害剤であり、アルガトロバン又はダビガトランであり得る。直接トロンビン阻害剤であるキシメラガトランは、優れた動力学特性を有し、非常に少量で投与することができるが、肝毒性の問題のために市場から回収されている。キシメラガトランは、プロドラッグであり、経口摂取したキシメラガトランは肝臓でトロンビンに結合してそれを阻害する活性型であるメラガトランに変換されることに留意されたい。キシメラガトランに比べて減少したメラガトランの投与量及び肝臓でのキシメラガトランの変換の回避によってキシメラガトランで見られる肝毒性を回避できる可能性が非常にある。
【００９７】
血餅形成に対処する効果的な方法は、血餅の核が病理学的な血餅に成長するのを阻害することであると合理的に考えている。従って、増大した量の第Xa因子阻害剤、トロンビン阻害剤、又はその両方が血餅の核にもたらされると、血餅が増大して病理学的になることを防止される。IgG又は抗フィブリン抗体のIscFvを用いて第Xa因子の阻害剤若しくはトロンビンの阻害剤の薬物バンドル、又は両方の阻害剤のバンドルの組合せを新しく形成された血餅の核に運ぶこともできる。第Xa因子阻害剤分子(例えば、アピキサバン、エドキサバン、及びリバロキサバン)及びトロンビン阻害剤分子(例えば、アルガトロバン及びメラガトラン)は、共に本開示のリンカーユニットと結合するためのNH2基を有する。
【００９８】
第Xa因子阻害剤及び/又はトロンビン阻害剤が抗フィブリン抗体により血餅部位に運ばれるため、抗フィブリン標的化なしで使用される場合よりも、必要な阻害剤量が減少する。さらに、血流が血管内を流れるため、血餅周囲の運ばれる阻害剤の濃縮効果は、血餅の核が一定のサイズに成長した場合にのみ顕著となる。従って、微小な内部創傷を修復するために生理的に必要とされる凝血は影響を受けない。従って、血餅に対する、抗フィブリン抗体による第Xa因子及びトロンビン阻害剤の標的化は、内出血の副作用を低減しつつ、治療的により効果的であるべきである。
【００９９】
本開示の実施形態によれば、ジョイント-リンカー構成におけるT-E分子は、標的化成分としてフィブリンに特異的なscFv、並びに、エフェクター成分として第Xa因子阻害剤(アピキサバン、エドキサバン、又はリバロキサバン)、トロンビン阻害剤(アルガトロバン及びメラガトラン)又はその両方を含有する。
【０１００】
(B)血餅溶解を促進するためのT-E分子の使用
【０１０１】
病理学的血餅を適時に、そして厳密に制御された方式で溶解するのに適切な薬物を投与することは、薬剤上の非常に重要な課題であった。組換えヒト組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)のいくつかの形式（アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、及びラノテプラーゼ等）の開発は、血栓症問題の重要な部分を解決した。しかし、tPAの使用は、血餅を溶解するのに十分ではない及び/又は重度の内出血を引き起こす場合が多い。制御されたtPAの投与量及び投与スケジュールは、依然として積極的な研究領域である。組み換えtPAのいくつかの形態を比較する臨床試験も非常に積極的である。tPA、その変異体及びそれらの医学的使用に関する豊富な出版物の文献から、tPAの様々な特性（フィブリンへの結合親和性、その半減期、肝細胞による分解に対する感受性、及びプラスミノーゲン活性化因子阻害剤に対する耐性を含む）はすべて、特定の臨床症状についてtPAの所望の特性に関与することが明らかである。
【０１０２】
インタクトなtPAの分子構造は複雑であり、個々の機能又は活性を有するいくつかの構造ドメインを含むが、これらのドメインの全てが、血餅溶解に適用される血栓溶解生成物に必要とされるわけではない。527個のアミノ酸残基を有する完全長tPA分子（アルテプラーゼ）は、(i)フィブリンに結合するフィブロネクチンフィンガードメイン、(2)肝細胞に結合し、tPAのクリアランスを促進する上皮成長因子ドメイン、(3)肝内皮細胞に結合し、tPAのクリアランスを促進するクリングル1ドメイン、(4)フィブリンに結合し、セリンプロテアーゼを活性化するクリングル2ドメイン、(5)プラスミノーゲンを切断し、1型プラスミノーゲン活性化因子阻害剤(PAI-1)によって阻害されるプロテアーゼドメインを含む。アルテプラーゼ、テネクテプラーゼ、及びラノテプラーゼは、哺乳動物細胞、CHO細胞で産生され、レテプラーゼは細菌中で産生される。
【０１０３】
レテプラーゼ（長さ:355個の残基）は、フィブロネクチンフィンガー、上皮成長因子ドメイン、及びクリングル1ドメインを含まない。レテプラーゼは細菌で産生されるため、 翻訳後糖修飾を含まない。レテプラーゼは、フィブリンに対する親和性が低く、そのプロテアーゼはアルテプラーゼのように活性化されないが、14-18分間の血漿半減期を有する一方、アルテプラーゼの半減期は血漿中で3〜4分間しか持続しない。レテプラーゼは、ボーラスで患者に投与される一方、アルテプラーゼは、ボーラスで投与された後、注入により投与される。
【０１０４】
テネクテプラーゼは、アルテプラーゼの527個のアミノ酸残基の全長を有するが、3つの部位に変異を有する。103のトレオニンは、グリコシル化修飾を可能にするためにアスパラギンに置換され、117のアスパラギンは、グリコシル化を除去するためにグルタミンに置換される。これらの変異は、肝臓細胞による分子のクリアランスを阻害する。さらに、296-299の4つの残基（すなわち、リジン-ヒスチジン-アルギニン-アルギニン）が4つのアラニン残基によって置換され、これにより、PAI-1に対する耐性が80倍増加する。テネクテプラーゼは18分間の血漿半減期を有する。
【０１０５】
ラノテプラーゼでは、フィブロネクチンフィンガー及び上皮成長因子ドメインは欠失し、117のアスパラギンはグルタミンに置換される。ラノテプラーゼの血漿半減期は45分に延長され、これにより投与手順が改善される。 
【０１０６】
様々な臨床試験において、tPAの4つの形態の全体的な治療効力はほぼ同じであるが、それぞれが特定の臨床条件で他のものよりもうまく適合しているようである。
【０１０７】
本発明では、レテプラーゼにより示されるものよりもフィブリンに対する結合強度の適度な増加及び血漿半減期の適度な増加が、レテプラーゼの治療特性を向上させることは合理的である。これらの分子構築物は、血餅への結合により特異性を与え、したがってより少ない用量及びより少ない副作用を可能にする。これらの分子構築物は、血餅溶解に関連するすべての臨床症状に適合できない場合、いくつかの状態に適用されることができる。従って、血餅を溶解するための改善されたtPAの本発明の好ましい実施形態は、ジョイント-リンカー構造に抗フィブリン抗体の1-3 scFvを標的化成分として使用し、1-2コピーのレテプラーゼをエフェクター成分として使用することである。代替の構築物では、レテプラーゼは、リンカーユニットのC末端を介してリンカーユニットに結合されることで、 N-末端クリングル2ドメインは、血餅中のフィブリン網目構造に接触する際に柔軟である。C-末端は、リンカー、例えば、(GGGGS)2及びシステイン残基で延長される。さらに別の実施形態では、tPA又はその断片を結合したFc融合タンパク質構築物及びフィブリンに特異的なscFv は、病理学的血餅の溶解を促進するためにも適用可能である。
【０１０８】
パートI:特定疾患の治療に使用されるマルチアームリンカー
【０１０９】
I-(i)マルチアームリンカーに使用されるペプチドコア
【０１１０】
本開示の第1態様は、リンカーユニットに関する。該リンカーユニットは、(1)2-15個のリジン(K)残基を含む中心コアと、(2)中心コアのK残基にそれぞれ結合される2-15個のリンクアームとを含む。本発明の中心コアは、そのN末端若しくはC末端に、アジド基、アルキン基、テトラジン基若しくは歪んだアルキン基を有する、又は結合していることを特徴とする。
【０１１１】
本発明のリンカーユニットの調製において、一端にN-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)基を有し、他端に官能基(例えば、NHS、マレイミド、アジド、アルキン、テトラジン、又は歪んだアルキン基)を有するPEG鎖は、PEG鎖のNHS基とK残基のアミン基との間にアミド結合を形成することにより、中心コアのK残基に結合される。本開示において、K残基に結合されるPEG鎖は、リンクアームと呼ばれ、その遊離末端に官能基を有する。
【０１１２】
本開示の実施形態によれば、上記中心コアは、長さが8-120個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、2〜15個のリジン(K)残基を含み、各K残基とその次のK残基との間が充填配列により区切られる。
【０１１３】
本開示の実施形態によれば、上記充填配列は、グリシン(G)及びセリン(S)残基を含み、好ましくは、上記充填配列は、G、S、及びそれらの組合せから選択される2-15残基からなる。例えば、上記充填配列は、
GS,
GGS,
GSG,
GGGS(配列番号:1),
GSGS(配列番号:2),
GGSG(配列番号:3),
GSGGS(配列番号:4),
SGGSG(配列番号:5),
GGGGS(配列番号:6),
GGSGGS(配列番号:7),
GGSGGSG(配列番号:8),
SGSGGSGS(配列番号:9),
GSGGSGSGS(配列番号:10),
SGGSGGSGSG(配列番号:11),
GGSGGSGGSGS(配列番号:12),
SGGSGGSGSGGS(配列番号:13),
GGGGSGGSGGGGS(配列番号:14),
GGGSGSGSGSGGGS(配列番号:15), 又は
SGSGGGGGSGGSGSG(配列番号:16)であり得る。
【０１１４】
2つのリジン残基間にある充填配列は、グリシン及びセリン残基のランダムな配列及び/又は長さが様々でありえる。長い充填配列は、より少ないリジン残基を有するポリペプチドに使用され得る一方、短い充填配列は、多くのリジン残基を有するポリペプチドに使用され得る。親水性アミノ酸残基、例えばアスパラギン酸及びヒスチジンは、グリシン及びセリンと共に充填配列に挿入され得る。充填配列は、グリシン及びセリン残基で構成されたものに加えて、アルブミン及び免疫グロブリンのような一般的なヒト血清タンパク質における可撓性、可溶性のループを採用することもできる。
【０１１５】
基本的に、リジン残基間の充填配列はグリシン及びセリン残基でペプチドを覆う。しかし、側鎖にアミン基を有するもの以外のアミノ酸からなるペプチドであってもよい。これらのアミノ酸は、必ずではないが、主として完全に親水性のアミノ酸である。アミノ酸は必ずしも天然アミノ酸である必要はない。
【０１１６】
本開示の好ましい実施形態によれば、中心コアは、2-15単位のG1-5SK配列を含む。或いは、ポリペプチドは、(GSK)2-15配列を含む。即ち、ポリペプチドは、少なくとも2つの連続した、GSK配列の単位を含む。例えば、本発明の中心コアは、
Ac-CGGSGGSGGSKGSGSK(配列番号:17),
Ac-CGGSGGSGGSKGSGSKGSK(配列番号:18)、又は
Ac-CGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSK(配列番号:19)を含み得る。
ここで、Acは、アセチル基を示す。
【０１１７】
本開示の特定の実施形態によれば、上記中心コアは、(Xaa-K)n配列を含むポリペプチドである。ここで、Xaaは、2〜12個のエチレングリコール(EG)の繰り返し単位を有するPEG化アミノ酸であり、nは、2〜15の整数である。
【０１１８】
理解されるように、本発明の中心コアのリジン残基は、側鎖にアミン基を有するアミノ酸で置換されていてもよい。 例えば、(CH2-)nNH2側鎖を有するα-アミノ酸（n=1-3又は5）、(CH(OH)-)nCH2-NH2側鎖を有するα-アミノ酸（n=1-5）、(CH2-CH(OH)-)nCH2-NH2側鎖を有するα-アミノ酸（n=1-3）、(CH2-CH2-O-)nCH2-NH2側鎖を有するα-アミノ酸（n=1-2）。これらのアミノ酸は必ずしも天然アミノ酸である必要はない。
【０１１９】
上述したように、本発明の中心コアは、そのN末端若しくはC末端に、アジド基、アルキン基、テトラジン基若しくは歪んだアルキン基を有する、又は結合していることを特徴とする。本開示のいくつかの実施形態によれば、本発明の中心コアは、そのN末端又はC末端にアジド基又はアルキン基を有するアミノ酸残基を含む。アジド基を有するアミノ酸残基は、L-アジドホモアラニン(AHA)、4-アジド-L-フェニルアラニン、4-アジド-D-フェニルアラニン、3-アジド-L-アラニン、3-アジド-D-アラニン、4-アジド-L-ホモアラニン、4-アジド-D-ホモアラニン、5-アジド-L-オルニチン、5-アジド-d-オルニチン、6-アジド-L-リジン、又は6-アジド-D-リジンであり得る。例えば、本発明の中心コアは、以下の配列を含み得る。即ち、
Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-AAH,
Ac-AAH-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7,
Ac-AAH-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C,
Ac-C-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-AAH,
Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-AAH,
Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4,
Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C, 又は
Ac-C-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-AAHである。
ここで、Xaaは、特定のEGの繰り返し単位を有するPEG化アミノ酸であり、Acは、アセチル基を示し、AAHは、AHA残基を示す。
【０１２０】
アルキン基を有するアミノ酸の例は、L-ホモプロパギルグリシン(L-HPG)、D-ホモプロパギルグリシン(D-HPG)、又はβ-ホモプロパギルグリシン(β-HPG)を含むが、これらに限定されない。この場合に、本発明の中心コアは、以下の配列を含み得る。即ち、
Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-GHP,
Ac-GHP-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7,
Ac-GHP-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C,
Ac-C-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-GHP,
Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-GHP,
Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4,
Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C, 又は
Ac-C-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-GHPである。
ここで、Xaaは、特定のEGの繰り返し単位を有するPEG化アミノ酸であり、Acは、アセチル基を示し、GHPは、HPG残基を示す。
【０１２１】
なお、側鎖にアジド基又はアルキン基を含む多くのアミノ酸、及びPEG化アミノ酸は、市販されている。これらのアミノ酸は、t-boc（tert-ブチルカルボニル）-又はFmoc（9-フルオレニルメチルオキシカルボニル）の保護基を有し、固相ペプチド合成に容易に適用可能である。
【０１２２】
本開示のいくつかの実施例によれば、中心コアは、下記の配列を含み得る。即ち、
Ac-GHPGGSGGSGGSKGSGSK(配列番号:21),
Ac-GHPGGSGGSGGSKGSGSKGSK(配列番号:22),
Ac-AAHGGSGGSGGSKGSGSKGSK(配列番号:23),
Ac-GHPGGSGGSGGSKGSGSKGSGSC(配列番号:24),
Ac-C-Xaa2-K-Xaa2-K-Xaa2-K(配列番号:25), 又は
Ac-C-Xaa6-K-Xaa6-K-Xaa6-K-Xaa6-K-Xaa6-K(配列番号:26)である。
ここで、Xaaは、特定のEGの繰り返し単位を有するPEG化アミノ酸であり、Acは、アセチル基を示し、AAHは、AHA残基を示し、GHPは、HPG残基を示す。
【０１２３】
或いは、本発明の中心コアは、カップリングアームに結合される。該カップリングアームは、その遊離末端(即ち、中心コアに結合されていない末端)に、官能基(例えば、アジド基、アルキン基、テトラジン基、又は歪んだアルキン基)を有する。この場合に、本発明の中心コアは、そのN末端又はC末端にシステイン残基を有する。カップリングアームに結合されるリンカーユニットを調製するためには1つの末端にマレイミド基を有し、もう1つの末端に官能基を有するPEG鎖を、PEG鎖のマレイミド基とシステイン残基のチオール基との間で起きるチオール-マレイミド反応により、中心コアのシステイン残基に結合する。本開示において、中心コアのシステイン残基に結合されるPEG鎖は、カップリングアームと呼ばれる。該カップリングアームは、その遊離末端に官能基を有する。
【０１２４】
理解されるように、本発明の中心コアのシステイン残基は、側鎖がスルフヒドリル基を有するアミノ酸で置換されていてもよい。例えば、(CH(OH)-)nCH2-SH側鎖を有するα-アミノ酸（n=1-5）、(CH2-CH(OH)-)nCH2-SH側鎖を有するα-アミノ酸（n=1-3）、(CH2-CH2-O-)nCH2-SH側鎖を有するα-アミノ酸（n=1-2）。これらのアミノ酸は必ずしも天然アミノ酸である必要はない。システイン残基は、ペプチドコアのN末端又はC末端に配置する必要はない。例えば、システイン残基をペプチドの中央に配置することでリジン残基をシステイン残基の2つの側に分布させることができる。
【０１２５】
好ましくは、その遊離末端にカップリングアームは、テトラジン基又は歪んだアルキン基(例えば、シクロオクテン基又はシクロオクチン基)を有する。これらのカップリングアームは、2-12個のEG単位を有する。本開示の実施形態によれば、テトラジン基は、1, 2, 3, 4-テトラジン、1, 2, 3, 5-テトラジン、1, 2, 4, 5-テトラジン、又はそれらの誘導体である。歪んだアルキン基は、シクロオクテン基又はシクロオクチン基であり得る。本開示の実施例によれば、シクロオクテン基は、トランス-シクロオクテン(TCO)基であり、シクロオクチン基の例は、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)、ジフルオロシクロオクチン(DIFO)、ビシクロノニン(BCN)、及びジベンゾシクロオクチン(DICO)を含むが、これらに限定されない。本開示のいくつかの実施形態によれば、テトラジン基は、6-メチル-テトラジンである。
【０１２６】
カップリングアームに結合するように構成される本発明の中心コアの例は、
Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-テトラジン,
Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-歪んだアルキン,
Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-C-Xaa2-12-テトラジン,
Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-C-Xaa2-12-歪んだアルキン,
テトラジン-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7,
歪んだアルキン-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7,
テトラジン-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4、及び
歪んだアルキン-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4を含むが、これらに限定されない。
【０１２７】
或いは、上記中心コアは、その1つの末端にアジド基又はアルキン基を有し、1つの末端にテトラジン基又は歪んだアルキン基を有するカップリングアームに結合される。その例は、
Ac-AAH-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-テトラジン,
Ac-AAH-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-歪んだアルキン,
テトラジン-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-AAH,
歪んだアルキン-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-AAH,
Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-テトラジン,
Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-歪んだアルキン,
テトラジン-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-AAH,
歪んだアルキン-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-AAH,
Ac-GHP-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-テトラジン,
Ac-GHP-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-歪んだアルキン,
テトラジン-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-GHP,
歪んだアルキン-Xaa2-12-C(AC)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-GHP,
Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-テトラジン,
Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-歪んだアルキン,
テトラジン-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-GHP,及び
歪んだアルキン-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-GHPである。
【０１２８】
ポリペプチドは、組換え技術を用いて、細菌又は哺乳動物の宿主細胞において、設計された遺伝子セグメントを発現させることにより合成することもできる。コアが数多くのリジン残基を有し、且つかなり長い場合に、組換えタンパク質としてポリペプチドを調製することが好ましい。固相合成が採用される場合に、ポリペプチドの長さが増加するにつれて、エラーの発生確率が増加する一方、純度及び/又は収率が低下する。細菌又は哺乳動物宿主細胞においてポリペプチドを調製する際に、数個のアミノ酸残基から10-20残基の範囲の充填配列を2つのK残基間に配置することができる。さらに、AHA及びHPGは遺伝暗号によりコードされる天然アミノ酸ではないため、それらの組換えポリペプチドのN末端又はC末端残基はシステインである。組換えタンパク質を発現させ、精製した後、末端システイン残基を短い二官能性架橋剤と反応させる。該二官能性架橋剤は、その1つの末端にシステイン残基のSH基と反応可能なマレイミド基を有し、もう1つの末端にアルキン基、アジド基、テトラジン基、又は歪んだアルキン基を有する。
【０１２９】
PEG化アミノ酸を用いてポリペプチドを合成することは、グリシン及びセリンのような通常のアミノ酸を用いることよりも、少ない工程を必要とする。さらに、異なる長さ(即ち、異なる数のエチレングリコールの繰り返し単位)を有するPEG化アミノ酸を使用することにより、可撓性及び可溶性を提供するとともに、リジン残基の隣接するアミノ基の間に空間を提供することができる。PEG化アミノ酸以外、中心コアは、D型アミノ酸、ホモアミノ酸、N-メチルアミノ酸等の人工アミノ酸を含むように構築されてもよい。アミノ酸分子に含まれるPEG部分が構造的可撓性及び結合基間の適切な間隔を提供し、水溶性を増強し、且つ、その免疫原性が弱いため、ポリエチレングリコール(PEG)の様々な長さを有するPEG化アミノ酸を用いて中心コアを構築することが好ましい。PEG化アミノ酸含有中心コアの合成は、通常のポリペプチドの合成方法と類似する。
【０１３０】
場合により、安定性を達成するため、本発明の中心コアは、そのN末端にあるアミノ基を保護するアセチル基を有する。
【０１３１】
理解され得るように、中心コアに結合されるリンクアームの数は、主に、中心コアに含まれるリジン残基の数によって決定される。本発明の中心コアに少なくとも2つのリジン残基が含まれるため、本発明のリンカーユニットは、複数のリンクアームを含み得る。
【０１３２】
図1Aに示すように、リンカーユニット10Aは、1つのHPG(GHP)残基及びそれぞれ充填配列(図面において、点線で示される)によって区切られる4つのリジン(K)残基を有する中心コア11aを含む。HPG残基とK残基との間、又はいずれの2つのK残基の間にある充填配列は、同一又は異なるアミノ酸配列を含み得る。この例において、4つのリンクアーム20a-20dは、それぞれNHS基とリジン残基のアミン基との間にアミド結合を形成することによりリジン残基に結合される。理解され得るように、上述したリンカーユニット10A又は後述のリンカーユニットのある特徴は、ここで開示される他のリンカーユニットと共通であるため、具体的な実施形態の文脈に矛盾しない限り、これらの特徴のいくつか又はすべては、以下の実施例においても適用される。しかし、簡潔のために、以下、これらの共通特徴を繰り返して説明しないこともある。
【０１３３】
図1Bは、本開示の別の実施形態に係るリンカーユニット10Bを提供する。中心コア11bは、1つのシステイン(C)残基及びそれぞれ充填配列により区切られる6つのリジン(K)残基を含む。この例において、リンカーユニット10 Bは、それぞれリジン残基に結合される6つのリンクアーム20a-20fを含む。本開示の実施形態によれば、リンクアームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖である。
【０１３４】
図1Aのリンカーユニット10Aと異なり、リンカーユニット10Bは、カップリングアーム60をさらに含む。上述したように、1つの末端にマレイミド基を有し、もう1つの末端に官能基を有するPEG鎖は、カップリングアーム60の形成に用いられる。このようにして、カップリングアーム60は、チオール-マレイミド反応により中心コア11bのシステイン残基に結合される。この例において、カップリングアーム60の遊離末端にある官能基は、テトラジン基72である。本開示の実施形態によれば、カップリングアームは、2-12個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖である。
【０１３５】
標的部位にあるエフェクター成分の放出を必要となる場合に、リンクアームに切断可能な結合を導入することができる。このような結合は、酸/アルカリ加水分解、還元/酸化、又は酵素によって切断される。カップリングアームの形成に適用される切断可能なPEG鎖の一実施形態は、NHS-PEG2-20-S-S-マレイミドであり、ここで、S-Sはゆっくりと還元され得るジスルフィド結合であり、NHS基は中心コアのアミン基と結合することにより、PEG鎖が中心コアに結合される。リンクアームの遊離末端にあるマレイミド基は、アジド基、アルキン基、テトラジン基、又は歪んだアルキン基で置換されてもよい。
【０１３６】
本開示の実施形態によれば、中心コアのK残基に結合されるリンクアームは、その遊離末端に官能基(即ち、マレイミド、NHS、アジド、アルキン、テトラジン、又は歪んだアルキン基)を有する。好ましくは、リンクアームの遊離末端がアジド,アルキン基又はシクロオクチン基である場合に、中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、システイン残基であり、カップリングアームの遊離末端は、テトラジン又はシクロオクテン基である。或いは、リンクアームの遊離末端は、テトラジン基又はシクロオクテン基である場合に、中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、アジド基若しくはアルキン基を有し、又は中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、システイン残基であり、カップリングアームの遊離末端は、アジド基、アルキン基、又はシクロオクチン基である。
【０１３７】
リンクアームの遊離末端にある官能基(即ち、マレイミド、NHS、アジド、アルキン、テトラジン又は歪んだアルキン基)によって、対応する官能基を有する機能成分(例えば、標的化成分、エフェクター成分、又は薬物動態学的特性を改善させる成分)を設計することにより、機能成分は、以下のいずれかの化学反応によりリンクアームの遊離末端に結合され得る。
【０１３８】
(1)アミド結合の形成:この場合に、リンクアームは、その遊離末端にNHS基を有し、機能成分は、アミン基を有する。
【０１３９】
(2)チオール-マレイミド反応:この場合に、リンクアームは、その遊離末端にマレイミド基を有し、機能成分は、チオール基を有する。
【０１４０】
(3)銅(I)触媒型アルキン-アジド環化付加反応(CuAAC反応、又は「クリック」反応と略称する):リンクアームの遊離末端と機能成分のうちの1つは、アジド基を有し、もう1つは、アルキン基を有する。CuAAC反応をスキーム1に示す。
【０１４１】
(4)逆電子要請型ディールス・アルダー(iEDDA)反応:リンクアームの遊離末端と機能成分のうちの1つは、テトラジン基を有し、もう1つは、シクロオクテン基を有する。iEDDA反応をスキーム2に示す。
【０１４２】
(5)歪み促進型アジド-アルキンクリックケミストリー(SPAAC)反応:リンクアームの遊離末端と機能成分のうちの1つは、アジド基を有し、もう1つは、シクロオクチン基を有する。SPAAC反応をスキーム3に示す。
【０１４３】
<<スキーム 1 CuAAC反応>>
2018527350.tif 000004
【０１４４】
CuAAC反応により、1,5-二置換-1,2,3-トリアゾールが得られる。アルキンとアジドとの間の反応は、非常に選択的であり、天然の生体分子の中にアルキン基及びアジド基は存在しない。さらに、この反応は迅速かつpH非感受性である。クリック反応を触媒するために、臭化第一銅又はヨウ化第一銅のような銅(I)を使用する代わりに、銅(II)と、還元剤、例えば、アスコルビン酸ナトリウムとの混合物を使用して、反応混合物中のその場で銅（I）を生成することがより好ましい。或いは、第2成分は、銅フリー反応により、本発明の中心コアのN末端又はC末端に結合され得る。この銅フリー反応において、ペンタメチルシクロペンタジエニルルテニウムクロライド錯体を触媒として使用して、アジド-アルキンクリックケミストリーを触媒する。
【０１４５】
<<スキーム 2 iEDDA反応>>
【０１４６】
2018527350.tif 000005
【０１４７】
<<スキーム 3 SPAAC反応>>
2018527350.tif 000006
【０１４８】
説明の便宜上、リンクアームに結合される機能成分を第1成分と呼ぶ。理解され得るように、本発明のリンカーユニットが有する第1成分の数は、中心コアのK残基の数(そのため、リンクアームの数)により決定される。従って。当業者であれば、必要に応じて、例えば、所望の標的化又は治療効果を達成するために、リンカーユニットの第1成分の数を調整することができる。
【０１４９】
第1成分を有するリンカーユニット10Cの例を図1Cに示す。後述の特徴以外、図1 Cは図1Bと同様である。第一に、中心コア11dに5つのK残基があり、5つのリンクアーム20a-20eがそれぞれそれらのK残基に結合される。第二に、リンカーユニット10 Cは各リンクアーム20a-20eに結合される5つの第1成分30a-30eを有する。以下に述べるように、必要に応じて使用されるテトラジン基72は、追加の機能成分、別の分子構築物(以下のパートII又はパートIIIを参照)との結合を可能にする。
【０１５０】
所望の効果(例えば、治療効果)を向上させるために、本発明のリンカーユニットは、上記第1成分に加えて、第2成分をさらに含み得る。例えば、第2成分は、標的化成分又はエフェクター成分であり得る。本開示の任意の実施形態において、第1成分は、エフェクター成分であり、第2成分は、第1成分と相加的若しくは相乗的、又は第1成分と独立して作用する別のエフェクター成分であり得る。必要に応じて、第1成分及び第2成分は、異なる特性を示す。例えば、第1成分は、標的化成分であり、第2成分は、エフェクター成分であり、その逆もまた然りである。或いは、第1成分は、エフェクター成分であり、第2成分は、リンカーユニットの溶解性、クリアランス、半減期、及び生物学的利用能等の薬物動態学的特性を改善させる成分である。特定の第1成分及び/又は第2成分の選択は、本発明のリンカーユニット(又はマルチアームリンカー)が使用される予定の用途に依存する。これらの機能成分の例は、本明細書のパートI（iii）で後述する。
【０１５１】
構造上、第2成分は、中心コアのN末端又はC末端にあるアジド基、アルキン基、テトラジン基若しくは歪んだアルキン基に結合される。具体的には、必要に応じて、第2成分を短いPEG鎖(好ましくは、2-12個のEGの繰り返し単位を有する)に結合した後、アジド基若しくはアルキン基を有するN末端又はC末端アミノ酸残基(例えば、AHA残基又はHPG残基)に結合してもよい。或いは、必要に応じて、第2成分を短いPEG鎖に結合した後、中心コアのカップリングアームに結合してもよい。
【０１５２】
本開示のいくつかの実施形態によれば、中心コアは、そのN末端又はC末端に、アジド基(例えば、AHA残基)を有するアミノ酸残基を含む。従って、アルキン基を有する第2成分は、CuAAC反応により中心コアのN末端又はC末端に結合される。本開示の他の実施形態によれば、中心コアは、そのN末端又はC末端に、アルキン基(例えば、HPG残基)を有するアミノ酸残基を含む。それにより、アジド基を有する第2成分は、CuAAC反応により中心コアのN末端又はC末端に結合可能となる。
【０１５３】
図1Dは、複数の第1成分及び1つの第2成分を有する本発明のリンカーユニット10Dの例を示す。この例において、中心コア11cは、1つのHPG(GHP)残基及び5つのリジン(K)残基を含む。5つのリンクアーム20a-20eは、それぞれ中心コア11cの5つのK残基に結合される。5つの第1成分30a-30eは、それぞれチオール-マレイミド反応により上記5つのリンクアーム20a-20eに結合される。上記第1成分に加えて、リンカーユニット10Dは、短いPEG鎖62の1つの末端に結合される1つの第2成分50をさらに含む。中心コア11cとの結合前に、短いPEG鎖62のもう1つの末端にアジド基を有する。このように、アジド基は、CuAAC反応により、アルキン基を有するHPG残基と反応できることにより、第2成分50は、中心コア11cに結合される。図1Dにおけるソリッドドット40は、HPG残基とアジド基との間で起きるCuAAC反応から生じる化学結合を表す。
【０１５４】
或いは、第2成分は、カップリングアームを介して中心コアに結合される。本開示の特定の実施形態によれば、カップリングアームは、iEDDA反応によりTCO基を有する第2成分に効率的に結合可能なテトラジン基を有する。本開示の他の実施形態によれば、カップリングアームは、iEDDA反応によりテトラジン基を有する第2成分に結合可能なTCO基を有する。iEDDA反応において、末端アルキン基よりも、活性化エネルギーが顕著に低い歪んだシクロオクテン基を採用するため、外因性触媒を使用する必要がない。
【０１５５】
図1Eに示すように、リンカーユニット10 Eの中心コア11dは、末端システイン(C)残基及び5つのリジン(K)残基を含む。また、図1Eに示すように、5つのリンクアーム20a-20eは、それぞれ中心コア11dの5つのK残基に結合され、且つ、5つの第1成分30a-30eは、それぞれチオール-マレイミド反応により5つのリンクアーム20a-20eに結合される。システイン残基は、カップリングアーム60に結合される。該システイン残基は、第2成分と結合する前に、その遊離末端にテトラジン基又はTCO基を有する。この例において、対応するTCO基又はテトラジン基を有する短いPEG鎖62に結合される第2成分50は、iEDDA反応によりカップリングアーム60に結合され得る。図1Eにおける楕円70は、カップリングアーム60と短いPEG鎖62との間で起きるiEDDA反応から生じる化学結合を表す。
【０１５６】
本開示の他の実施形態によれば、第2成分と結合する前に、カップリングアームは、アジド基を有する。そのように、カップリングアームは、SPAAC反応(スキーム3を参照)により、短いPEG鎖の遊離末端に歪んだアルキン基(例えば、DBCO、DIFO、BCN、又はDICO基)を有する第2成分に結合されることができ、その逆もまた然りである。
【０１５７】
図1Fにおいて、リンカーユニット10Fは、カップリングアーム60が、テトラジン基又はTCO基の代わりに、アジド基又は歪んだアルキン基(例えば、DBCO基、DIFO基、BCN基、又はDICO基)を有する以外、図1Eのリンカーユニット10Eと類似する構造を有する。従って、短いPEG鎖62に結合される第2成分50は、対応する歪んだアルキン基(例えば、DBCO基、DIFO基、BCN基、又はDICO基)又はアジド基を有することで、SPAAC反応によりカップリングアーム60に結合することができる。図1Fにおけるダイヤモンド90は、カップリングアーム60と短いPEG鎖62との間で起きるSPAAC反応から生じる化学結合を表す。
【０１５８】
スキーム4は、本発明のリンカーユニットの調製プロセスの例示である。ステップ1において、中心コアを調製する。該中心コアは、(GSK)3のアミノ酸配列を含み、且つ中心コアのC末端にL-アジドホモアラニン(AHA)残基を有する。ステップ2において、NHS基とアミン基との間にアミド結合を形成することにより、3つのリンクアームをそれぞれ中心コアのリジン(K)残基に結合する。中心コアに結合されるリンクアームは、その遊離末端にマレイミド(Mal)基を有する。ステップ3において、チオール-マレイミド反応により、3つの抗フィブリンscFv(scFv α フィブリン)を第1成分として、それぞれリンクアームに結合する。ステップ4において、1つのtPA類似体を第2成分として短いPEG鎖に結合する。該短いPEG鎖は、4つのEGの繰り返し単位を含み、且つその遊離末端にDBCO基を有する。最後に、ステップ5において、SPAAC反応により第2成分を中心コアのAHA残基に結合する。
【０１５９】
<<スキーム4 リンクアーム及びC末端アミノ酸残基を介して2つの異なるscFvを結合するリンカーユニットの調製>>
2018527350.tif 000007
【０１６０】
スキーム5は、本発明のリンカーユニットの調製プロセスの別の例を例示する。ステップ1において、中心コアを調製する。該中心コアは、(K-Xaa)3のアミノ酸配列を含み、且つ中心コアのC末端にシステイン残基を有する。ステップ2において、チオール-マレイミド反応によりPEG鎖を（カップリングアームとして)システイン残基に結合する。該PEG鎖は、その1つの末端にマレイミド(Mal)基を有し、もう1つの末端にテトラジン基を有する。ステップ3において、3つのリンクアームをそれぞれ中心コアのリジン(K)残基に結合する。さらに、ステップ4で説明したように、チオール-マレイミド反応により、3つの抗フィブリンscFv(scFv α フィブリン)を第1成分としてそれぞれリンクアームに結合する。ステップ5において、1つのtPA類似体を第2成分として短いPEG鎖に結合する。該短いPEG鎖は、3つのEGの繰り返し単位を含み、且つPEG鎖の遊離末端にTCO基を有する。最後に、ステップ6において、iEDDA反応により第2成分をカップリングアームに結合する。
【０１６１】
<<スキーム 5 リンクアーム及びカップリングアームを介して2つの異なるscFvを結合するリンカーユニットの調製>>
2018527350.tif 000008
【０１６２】
PEG化は、PEG鎖を分子（例えば、薬物又はタンパク質）に結合又は連結するプロセスである。PEG化は、未修飾形態よりもいくつかの有意な薬理学的利点、例えば、溶解性の改善、安定性の向上、循環寿命の延長、及びタンパク質分解の減少を与えることが知られている。本開示の一実施形態によれば、第2成分は、分子量が約20,000〜50,000ダルトンのPEG鎖である。
【０１６３】
図1Gは、本発明のリンカーユニット(リンカーユニット10G)の別の例を示す。ここで、5つの第1成分30は、それぞれリンクアーム20を介してリジン残基に結合される。中心コア11eのAHA(AAH)残基は、CuAAC反応によりPEG鎖80に結合される。図1Gにおけるソリッドドット40は、AHA残基とPEG鎖80との間で起きるCuAAC反応から生じる化学結合を表す。
【０１６４】
図1は、本開示の別の例を提供する。ここで、中心コア11dのN末端は、カップリングアーム60に結合されるシステイン残基である。iEDDA反応により、PEG鎖80をカップリングアーム60に効率的に結合することができる。リンカーユニット10Hの楕円70は、カップリングアーム60とPEG鎖80との間で起きるiEDDA反応から生じる化学結合を表す。
【０１６５】
図1Iは、本発明のリンカーユニットの別の例を提供する。ここで、リンカーユニット10Iは、PEG鎖80がSPAAC反応によりカップリングアーム60に結合される以外、図1Gのリンカーユニット10Gと類似する構造を有する。図1Iにおけるダイヤモンド90は、カップリングアーム60とPEG鎖80との間で起きるSPAAC反応から生じる化学結合を表す。
【０１６６】
本開示のいくつかの実施形態によれば、第1成分及び第2成分に加えて、本発明のリンカーユニットは、第3成分をさらに含む。この場合に、中心コアのN末端及びC末端のうちの一方は、アジド基又はアルキン基を有するアミノ酸であり、中心コアのN末端及びC末端のうちの他方は、システイン残基である。中心コアのリジン残基は、それぞれリンクアームに結合される。各リンクアームは、その遊離末端にマレイミド基を有する。中心コアのシステイン残基は、カップリングアームに結合される。該カップリングアームは、その遊離末端にテトラジン基又は歪んだアルキン基を有する。それにより、上述したように、第1成分は、チオール-マレイミド反応によりリンクアームに結合され、第2成分は、iEDDA反応によりカップリングアームに結合される。さらに、第3成分は、CuAAC反応又はSPAAC反応によりアジド基又はアルキン基を有する末端アミノ酸に結合される。
【０１６７】
図1Jのリンカーユニット10Jにおいて、中心コア11fは、そのN末端にHPG(GHP)残基を有し、そのC末端にシステイン残基を有する。リンクアーム20及びカップリングアーム60は、それぞれ中心コア11fのリジン(K)残基及びシステイン(C)残基に結合される。さらに、5つの第1成分30は、それぞれ5つのリンクアーム20に結合され、第2成分(即ち、PEG鎖)80は、短いPEG鎖62を介してカップリングアーム60に結合され、第3成分50は、HPG残基に結合される。ソリッドドット40は、HPG残基と短いPEG鎖62との間で起きるCuAAC反応から生じる化学結合を表す。楕円70は、カップリングアーム60とPEG鎖80との間で起きるiEDDA反応から生じる化学結合を表す。
【０１６８】
図1Kは、本開示の別の実施形態を提供する。ここで、リンカーユニット10Kは、iEDDA反応の代わりに、SPAAC反応により短いPEG鎖62がHPG残基に結合される以外、図1Jのリンカーユニット10Jと類似する構造を有する。図1Kにおけるダイヤモンド90は、短いPEG鎖62とHPG残基との間で起きるSPAAC反応から生じる化学結合を表す。
【０１６９】
本開示の好ましい実施形態において、リンクアームは、チオール-マレイミド反応によりスルフヒドリル基を有する第1成分に結合するために、遊離末端にマレイミド基を有する。また、第2成分に結合するために、ペプチドコアの1つの末端にシステイン残基、又はアジド基若しくはアルキン基を有するアミノ酸残基があることで、カップリングアームに結合される。
【０１７０】
当業者であれば、上述した構造について様々な変更を施すことができる。リンクアームの遊離末端に、マレイミド基以外の連結基、例えば、アジド基、アルキン基、テトラジン基、又は歪んだアルキン基を使用することにより、CuAAC、iEDDA、又はSPAAC反応により第1成分と結合することができる。また、ペプチドコアのシステイン残基(又は、アジド基若しくはアルキン基を有するアミノ酸残基)をN末端又はC末端に位置させる必要がない。さらに、2つ以上の上記残基をペプチドコアに導入することにより、複数のカップリングアームを結合することができ、それにより、複数の第2成分と結合する。
【０１７１】
I-(ii)マルチアームリンカーに使用される化合物コア
【０１７２】
本明細書において、本開示のパートI-(i)で説明したリンカーユニットに加えて、ポリペプチドの代わりに、化合物を中心コアとして用いた別のリンカーユニットも開示する。具体的には、該化合物は、ベンゼン-1,3,5-トリアミン、2-(アミノメチル)-2-メチルプロパン-1,3-ジアミン、トリス(2-アミノエチル)アミン、ベンゼン-1,2,4,5-テトラアミン、3,3',5,5'-テトラアミン-1,1'-ビフェニル、テトラキス(2-アミノエチル)メタン、テトラキス-(エチルアミン)ヒドラジン、N,N,N',N',-テトラキス(アミノエチル)エチレンジアミン、ベンゼン-1,2,3,4,5,6-ヘキサアミン、1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-ヘキサキス(メチルアミン)-ベンゼン-1,3,5-トリアミン、1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N,-オクタキス(メチルアミン)-ベンゼン-1,2,4,5-トリアミン、ベンゼン-1,2,3,4,5,6-ヘキサアミン、又はN,N-ビス[(1-アミノ-3,3-ジアミノエチル)ペンチル]-メタンジアミンである。各化合物は、同一又は対称的な立体配置で3つ以上のアミン基を有する。従って、化合物の1つのアミン基がカップリングアームに結合された場合に、化合物の分子のすべては、同一の立体配置を有する。
【０１７３】
本開示のパートI-(i)に記載の連結のメカニズムと同様に、上記の化合物が複数のアミン基を含むため、NHS基を有する複数のPEG鎖は、アミン基とNHS基との間にアミン結合を形成することにより該化合物に結合することができる。このように結合されるPEG鎖は、その遊離末端に官能基(例えば、NHS、マレイミド、アジド、アルキン、テトラジン、シクロオクテン、又はシクロオクチン基)を有し、リンクアームとされる。一方、化合物コアの少なくとも1つのアミン基は、1つの末端にNHS基を有し、もう1つの末端に官能基(例えば、アジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基又はシクロオクチン基)を有する他のPEG鎖に結合される。このように結合されるPEG鎖は、その遊離末端に官能基を有し、カップリングアームとされる。
【０１７４】
従って、第1成分は、(1)アミド結合を形成すること;(2)チオール-マレイミド反応;(3)CuAAC反応;(4)iEDDA反応:又は(5)SPAAC反応によりリンクアームに結合され得る。一方、第2成分は、CuAAC、iEDDA又はSPAAC反応によりカップリングアームに結合され得る。
【０１７５】
本開示のいくつかの実施形態によれば、リンクアームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖であり、カップリングアームは、2-12個のEGの繰り返し単位のを有するPEG鎖である。
【０１７６】
スキーム6、7は、それぞれ中心化合物コアとリンクアーム、及び中心化合物コアとカップリングアームとの間の結合を示す。スキーム6、7において、NHSエステルを示し、Malは、マレイミド基を示し、azideは、アジド基を示し、alkyneは、アルキン基を示す。
【０１７７】
<<スキーム 6 それぞれマレイミド基及びアジド基を有するリンクアーム及びカップリングアームの中心コアへの結合>>
2018527350.tif 000009
【０１７８】
<<スキーム 7 それぞれマレイミド基及びアルキン基を有するリンクアーム及びカップリングアームの中心コアへの結合>>
2018527350.tif 000010
【０１７９】
中心コアとなる化合物において、複数のNH2基が対称で同一の方向で存在することを必要とするのは、 以下の理由による。即ち、1つのNH2基を用いてN-ヒドロキシスクシンイミジル基(NHS)、エステル基及びアルキン基、アジド基、テトラジン基、又は歪んだアルキン基を介して二官能性リンクアームと結合する場合に、生成物であるアルキン基、アジド基、テトラジン基又は歪んだアルキン基を有するカップリングアームを含む中心コアは、均質であり、且つ精製され得る。このような生成物を用いて、さらにマルチアームリンカーユニットを調製することができる。該マルチアームリンカーユニットの他のすべてのNH2基は、他の末端にマレイミド基又は他のカップリング基を有するリンクアームに結合される。非対称方向で複数のNH2基を有する化合物の場合に、1つの二官能性リンクアーム/カップリングアームを有する生成物は、均質ではない。
【０１８０】
これらの対称化合物のいくつは、より多くのリンクアーム/カップリングアームを有する中心コアを提供するようにさらに修飾されることができる。例えば、通常の化合物から合成、又は商業的に入手可能なテトラキス(2-アミノエチル)メタンをコアとして用いて、4つのリンクアーム/カップリングアームを有するリンカーユニットを構築することができる。テトラキス(2-アミノエチル)メタンをビス(スルホスクシンイミジル)スベレートと反応させることにより、2つのテトラキス(2-アミノエチル)メタン分子の縮合生成物を生成することができる。該縮合生成物をコアとして用いて、6つのリンクアーム/カップリングアームを有するリンカーユニットを構築することができる。それぞれ3つのリンクアーム/カップリングアーム、4つのリンクアーム/カップリングアーム及び6つのリンクアーム/カップリングアームを有するリンカーユニットは、ジョイント-リンカー構成を有する標的化/エフェクター分子の構築に対する要求の大部を満たすことができる。
【０１８１】
理解され得るように、リンクアーム及び/又はカップリングアーム、並びにそれに結合される成分は、中心コアに含まれるアミン基の数によって変化できる。いくつかの好ましい実施形態において、リンクアーム/カップリングアーム、及びそれに結合される結合成分の数は、約1-7である。
【０１８２】
図2に、4つのアミン基を有するベンゼン-1,2,4,5-テトラアミンが示される。これらのアミン基の3つは、それぞれリンクアーム20に結合され、これらのアミン基の1つは、遊離末端にアジド基を有するカップリングアーム60に結合される。3つの第1成分30は、それぞれチオール-マレイミド反応により3つのリンクアーム20に結合される。1つの第2成分50は、CuAAC反応によりカップリングアーム60に結合される。図2におけるソリッドドット40は、カップリングアーム60と第2成分50との間で起きるCuAAC反応から生じる化学結合を表す。
【０１８３】
I-(iii)マルチアームリンカーに適用される機能成分
【０１８４】
リンカーユニット(又はマルチアームリンカー)が第2及び/又は第3成分を含まず、第1成分のみを含む場合に、第1成分は、被験体において治療効果を発揮できるエフェクター成分である。一方、本発明のリンカーユニットは、第1成分に加えて別の成分を含む場合に、少なくとも1つの該成分は、エフェクター成分であり、他の成分は、別のエフェクター成分、標的化成分、又はリンカーユニットの1つ以上の薬物動態特性(例えば、溶解性、クリアランス、半減期、及び生物学的利用能)を向上できる成分であり得る。例えば、リンカーユニットは、2つの異なる種類のエフェクター成分;1つのエフェクター成分及び1つの標的化成分又は1つの薬物動態特性向上成分;2つの異なる種類の標的化成分及び1種類のエフェクター成分;2つの異なる種類のエフェクター成分及び1種類の標的化成分;又は1種類の標的化成分、1種類のエフェクター成分、及び1種類のリンカーユニットの薬物動態特性を改善できる成分を含み得る。
【０１８５】
本開示のいくつかの実施形態によれば、本発明のリンカーユニットは、血餅形成の予防に有用である。これらの実施形態において、本発明のリンカーユニットは、標的化成分としてフィブリンに特異的なscFvの第1成分、及び、エフェクター成分として第Xa因子阻害剤又はトロンビン阻害剤の第2成分を含む。好ましくは、第Xa因子の阻害剤は、アピキサバン、エドキサバン及びリバロキサバンからなる群より選択され、トロンビンの阻害剤は、アルガトロバン又はメラガトランである。
【０１８６】
血栓症の治療に適用されるリンカーユニットは、標的化成分としてフィブリンに特異的なscFvの第1成分、及び、エフェクター成分として組織プラスミノーゲン活性化因子(例えば、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ及びラノテプラーゼ)の第2成分を含む。
【０１８７】
I-(iv)マルチアームリンカーの使用
【０１８８】
本開示は、また、適切な リンカーユニットを用いて様々な疾患を治療するための方法に関する。一般的に、該方法は、治療を必要とする被験体に有効量の本開示の実施形態に係るリンカーユニットを投与するステップを含む。
【０１８９】
従来の治療用構築物と比較して、パートIで説明した本発明のリンカーユニットは、2点で有利である。
【０１９０】
(1)機能成分の数は、必要又は用途に応じて調整することができる。本発明のリンカーユニットは、適用要件(例えば、治療される疾患、本発明のリンカーユニットの投与経路、本発明のリンカーユニットが有する抗体の結合活性及び/又は親和性)に応じて、2つの成分(即ち、第1成分及び第2成分)又は3つの成分(即ち、第1成分、第2成分、及び第3成分)を含むことができる。例えば、本発明のリンカーユニットを組織/器官(例えば、目の治療)に直接送達する場合に、化標的成分としての第2成分を必要とせず、エフェクター成分だけで十分である。しかし、本発明のリンカーユニットを周辺的に（例えば、経口、経腸、鼻、局所、経粘膜、筋肉内、静脈内、又は腹腔内注射）送達する場合に、本発明のリンカーユニットは、本発明のリンカーユニットを病変部位に標的化する標的化成分、及び病変部位で治療効果を発揮するエフェクター成分を同時に含む必要がある。本発明のリンカーユニットの標的化効果若しくは治療効果、又は安定性を向上させるために、本発明のリンカーユニットに、第3成分(例えば、第2標的化成分、第2エフェクター成分、又はPEG鎖)をさらに含むことができる。
【０１９１】
(2)第1成分は、バンドルの形で提供される。上述したように、第1成分の数は、中心コアに含まれるリジン残基の数によって変化する。中心コアにおけるリジン残基の数が2〜15である場合に、各リンカーユニットに少なくとも2つの第1成分を含み得る。このように、従来の治療用構築物又は方法のように単一分子(例えば、細胞毒性薬物及び抗体)を提供する代わりに、本発明のリンカーユニットは、一度により多くの機能成分(標的化成分又はエフェクター成分)を提供することができ、それによって、治療効果が大きく改善される。
【０１９２】
特定の治療用途において、シングルコピーの標的化成分又はエフェクター成分を有することが望ましい。例えば、シングルコピーの標的化成分は、過度に緊密な結合による望ましくない影響を避けるために使用することができる。この考察は、scFvが標的抗原に対して比較的高い親和性を有する場合、及び標的抗原が標的細胞ではない正常細胞上の細胞表面抗原である場合に関連する。一例において、CD3又はCD16に特異的なscFvを用いて、T細胞又はNK細胞を標的細胞（例えば、グレーブス病患者の甲状腺細胞）を殺すように動員する場合に、CD3又はCD16aに特異的なシングルコピーのscFvが望ましい。 それにより、CD3又はCD16aの架橋による望ましくない影響を回避することができる。同様に、CD32又はCD16bに特異的なscFvを用いて、抗体結合ウイルス若しくは細菌粒子、又はそれらの生成物を除去するように貪食好中球及びマクロファージを動員する場合に、シングルコピーのscFvが望ましい。また、トランスフェリン受容体に特異的なscFvを用いてエフェクター薬物分子をBBBに運んでCNS疾患を治療する場合に、シングルコピーのトランスフェリン受容体に特異的なscFvが望ましい。別の例では、薬物動態特性を高めるために長鎖PEGをシングルコピーだけ有することが望ましい。2つ以上の長いPEG鎖は、もつれを引き起こし、標的化成分又はエフェクター成分の結合特性に影響を与える恐れがある。
【０１９３】
パートII:特定疾患を治療するためのジョイント-リンカー分子構築物
【０１９４】
本開示の別の態様は、少なくとも2つのリンカーユニットを含む分子構築物に関する。ここで、1つのリンカーユニットは、1つ以上の標的化成分を担持し、別のリンカーユニットは、1つ以上のエフェクター成分又は薬物動態特性向上成分を担持する。本開示において、標的化部分及びエフェクター部分(治療的又は薬物動態学的なもの)の両方を有する分子構築物は、ジョイント-リンカー分子構築物と呼ばれる。本開示の様々な実施形態によれば、このようなジョイント-リンカー分子構築物に含まれる各リンカーユニットは、本開示のパートIに記載されているペプチドコアに基づくマルチアームリンカー又は化合物コアに基づくマルチアームリンカーであり得る。本開示の特定の実施形態によれば、本発明の分子構築物の少なくとも1つのリンカーユニットは、ポリペプチドコアを含む。好ましくは、本発明の分子構築物の少なくとも2つのリンカーユニットは、ポリペプチドコアを含む。さらに好ましくは、本発明の分子構築物のすべてのリンカーユニットは、それぞれポリペプチドコアを含む。
【０１９５】
II-(i)ジョイント-リンカー分子構築物の構造
【０１９６】
本開示のいくつかの実施形態によれば、分子構築物は、2つのリンカーユニットを含む。該リンカーユニットは、CuAAC反応(銅又はクロロペンタメチルシクロペンタジエニルルテニウム複合体を触媒として使用する)、SPAAC反応、又はiEDDA反応により互いに結合される。この実施形態において、1つのリンカーユニットは、標的化成分となる複数の第1成分に結合される。他のリンカーユニットは、エフェクター成分となる複数の第2成分に結合される。
【０１９７】
本開示の他の実施形態によれば、分子構築物は、3つのリンカーユニットを含む。ここで、第1リンカーユニット及び第2リンカーユニットは、iEDDA反応により互いに結合され、第3リンカーユニットは、CuAAC反応により第1リンカーユニット又は第2リンカーユニットに結合される。或いは、第1リンカーユニット及び第2リンカーユニットは、iEDDA反応により互いに結合され、第3リンカーユニットは、SPAAC反応により第1リンカーユニット又は第2リンカーユニットに結合される。この実施形態において、第1、第2及び第3リンカーユニットは、それぞれ複数の第1、第2及び第3成分を有する。ここで、第1、第2及び第3成分は異なる。一実施形態によれば、3つの成分(即ち、第1、第2及び第3成)のうちの2つは、標的化成分であり、1つは、エフェクター成分である。別の実施形態によれば、3つの成分のうちの2つは、エフェクター成分であり、1つは、標的化成分である。別の実施形態によれば、3つの成分のうちの1つは、標的化成分であり、1つはエフェクター成分であり、もう1つは分子構築物の溶解性、クリアランス、半減期、及び生物学的利用能等の薬物動態学的特性を改善することができる成分である。
【０１９８】
図3A-3Dは、2つのリンカーユニット間の結合を示す。 図3Aは、iEDDA反応により互いに結合される2つのリンカーユニット(100A、200A)を含む分子構築物を示す。第1リンカーユニット100Aは、第1中心コア110a、リンクアーム120(第1リンクアームとして)、及びカップリングアーム 130a(第1カップリングアームとして)を有し、リンクアーム及びカップリングアームは、それぞれ1つの末端が第1中心コア110aに結合される。同様に、第2リンカーユニット200Aは、第2中心コア 210a、リンクアーム 220(第2リンクアームとして)、及びカップリングアーム230a(第2カップリングアームとして)を有し、リンクアーム及びカップリングアームは、それぞれ1つの末端が第2中心コア210aに結合される。カップリングアーム130a、230aの1つは、その遊離末端にテトラジン基を有し、カップリングアーム130a、230aのもう1つは、TCO基を有する。具体的には、カップリングアーム130aがその遊離末端(即ち、第1中心コア110aに結合されていない末端)にテトラジン基152を有する場合に、カップリングアーム230aは、その遊離末端(即ち、第2中心コア210aに結合されていない末端)にTCO基154を有する。その逆もまた然りである。従って、2つのリンカーユニット(100A、200A)は、カップリングアーム130a、230aのそれぞれの遊離末端の間で起きるiEDDA反応により互いに結合される。図3Aにおける楕円156は、カップリングアーム130a、230aの間で起きるiEDDA反応から生じる化学結合を表す。
【０１９９】
図示の実施形態において、リンクアーム120、220のそれぞれは、その遊離末端にマレイミド基を有する。従って、第1標的化成分140及び第1エフェクター成分240は、それぞれチオール基を有し、チオール-マレイミド反応によりリンクアーム120、220に結合される。
【０２００】
一実施形態によれば、図3Aにおける第1中心コア110a及び第2中心コア210は、両方ともポリペプチドコアである。別の実施形態によれば、図3Aにおける第1中心コア110a及び第2中心コア210aは、化合物コアである。別の実施形態によれば、図3Aにおける第1中心コア110a及び第2中心コア210の1つは、ポリペプチドコアであり、図3Aにおける第1中心コア110a及び第2中心コア210aのもう1つは、化合物コアである。
【０２０１】
図3Bは、本開示の代替の実施形態を提供する。図3Bにおいて、第1中心コア110b及び第2中心コア210bは、両方ともポリペプチドコアであり、それぞれリンクアーム120、220により第1標的化成分140及び第1エフェクター成分240に結合される。この実施形態のユニークな特徴は、中心コア110b、210bの1つがN末端又はC末端にアジド基(例えば、AHA残基)を有するアミノ酸残基を含み、中心コア110b、210bのもう1つは、N末端又はC末端にアルキン基(例えば、HPG残基)を有するアミノ酸残基を含むことである。このような構成により、中心コア110a、210が互いに直接結合されることを可能にする。即ち、図3Aに示すようにカップリングアームを介せず結合される。具体的には、中心コア110bがN末端又はC末端にアジド基162を有するアミノ酸残基を含む場合に、中心コア210bは、N末端又はC末端にアルキン基164を有するアミノ酸残基を含み、その逆もまた然りである。したがって、リンカーユニット100B、200Bは、中心コア110b、210bのN末端又はC末端アミノ酸残基の間で起きるCuAAC反応により互いに直接結合されることができる。図3Bにおけるソリッドドット166は、N末端又はC末端アミノ酸残基の間で生じる化学結合を表す。
【０２０２】
図3Cは、本開示の別の実施形態である。リンカーユニット100C、200Cは、カップリングアーム130b、230bが、図3Aのリンカーユニット100A、200Aに示すようなアジド基152及びアルキン基154の代わりに、それぞれアジド基162及びDBCO基172を有する以外、リンカーユニット100A、200Aと類似する構造を有する。具体的には、中心コア110aは、遊離末端にアジド基162を有するカップリングアーム130b(第1カップリングアームとして)に結合され、中心コア210aは、遊離末端にDBCO基172を有するカップリングアーム 230b(第2カップリングアームとして)に結合される。リンカーユニット100C、200Cは、さらに、カップリングアーム130b、230bの間で起きるSPAAC反応により連結され、ダイアモンドに示される化学結合182を形成する。
【０２０３】
一実施形態において、図3Cにおける第1中心コア110a及び第2中心コア210aは、共にポリペプチドコアである。別の実施形態において、図3Cにおける第1中心コア110a及び第2中心コア210aは、共に化合物コアである。別の実施形態において、図3Cにおける第1中心コア110a及び第2中心コア210aの1つは、ポリペプチドコアであり、図3Cにおける第1中心コア110a及び第2中心コア210aのもう1つは、化合物コアである。
【０２０４】
理解され得るように、2つのリンカーユニットは、中心コアとカップリングアームとの間で起きるCuAAC反応により、互いに結合されることができる。図3Dにおいて、中心コア110bは、アジド基 162(例えば、AHA残基)を有するN末端又はC末端アミノ酸残基を含み、中心コア210aは、遊離末端にTCO基172を有するカップリングアーム230bに結合される。従って、リンカーユニット100B、200Cは、中心コア110bとカップリングアーム230bとの間で起きるSPAAC反応により連結され、化学結合182を形成する。
【０２０５】
一実施形態によれば、図3Dにおけるリンカーユニット100B、200Cは、それぞれポリペプチドコアを含む。別の実施形態によれば、図3D における中心コア100Bは、ポリペプチドコアであり、図3Dにおける中心コア200Cは、化合物コアである。
【０２０６】
或いは、アルキン基160b(例えば、HPG残基)を有するN末端又はC末端アミノ酸残基を含むリンカーユニット200B、及び遊離末端にアジド基160aを有するカップリングアーム130bを含むリンカーユニット100Cは、中心コア210bとカップリングアーム130bとの間で起きるアジド-アルキン環化付加により、一緒に連結されることができる。
【０２０７】
他の治療用構築物に比べて、本発明の分子構築物は、少なくとも以下の3点で有利である。
【０２０８】
(1)特定の数及び/又は種類の標的化/エフェクター成分を有するリンカーユニットは、独立して調製し、次いでCuAAC反応、iEDDA反応、又はSPAAC反応により一緒に結合されることができる。
【０２０９】
(2)標的化成分及び/又はエフェクター成分の数及び種類は、適用要求(例えば、治療される疾患、結合活性、標的成分及び/又はエフェクター成分の親和性)に応じて変化し得る。標的化成分とエフェクター成分の組合せは、具体的な需要及び/又は用途に応じて調整することができる。本発明の各標的化成分及びエフェクター成分は、治療される特定の症状、患者の身体状態、及び/又は治療される疾患の種類などの要因によって変化し得る。臨床開業医は、最良の治療効果を達成するために、最も適切な標的化成分と最も適切なエフェクター成分とを組み合わせることができる。本開示の実施形態によれば、標的化成分は、成長因子、ペプチドホルモン、サイトカイン、又は抗体断片であり得る。エフェクター成分は、免疫調節物質、放射性核種と複合体を形成したキレート剤、細胞毒性薬物、サイトカイン、可溶性受容体、又は断片であり得る。
【０２１０】
(3)他のカップリング反応と比較して、CuAAC反応、iEDDA反応、又はSPAAC反応は、任意の2つのリンカーユニットを結合する点でより効率的である。
【０２１１】
図4において、6つのライブラリーが図示され、独立して調製される。この実施形態において、ライブラリー1〜6は、それぞれ機能成分に結合される複数のリンカーユニット300A、300B、300C、400A、400B、400Cを含む。リンカーユニット300A、300B、300Cのそれぞれは、構造が類似し、リンカーユニット300A、300B、300Cは、それぞれ1つの中心コア 310、1つのカップリングアーム330、及び特定の数のリンクアーム 320を含む。該カップリングアーム330は、中心コア 310に結合され、且つその遊離末端にテトラジン基350を有する。例えば、リンカーユニット300Aは、4つのリンクアーム320を含み、そのため、4つの標的化成分340aは、それぞれ4つのリンクアーム320に結合され得る。同様に、2つの標的化成分340b及び5つの標的化成分340cは、それぞれリンカーユニット300B、300Cに結合され得る。標的化成分340a、340b、及び340cは、同一であってもよいが、異なってもよい。リンカーユニット400A、400b及び400Cにおいて、これらのリンカーユニットのそれぞれは、1つの中心コア410、1つのカップリングアーム430、及び特定の数のリンクアーム420を含む。該カップリングアーム430は、中心コア410に結合され、且つその遊離末端に歪んだアルキン基450を有する。図示のように、3つのエフェクター成分440a、5つのエフェクター成分440b、及び8つのエフェクター成分440cは、それぞれリンカーユニット400A、400B、400Cに結合され得る。エフェクター成分440a、440b、440cは、同一であってもよいが、異なってもよい。ライブラリー1〜6は、独立して調製されることができる。当業者であれば、ライブラリー 1、2、3から第1リンカーユニット、ライブラリー 4、5、6から第2リンカーユニットを選んで、テトラジン基350と歪んだアルキン基450との間で起きるiEDDA反応により第1リンカーユニットと第2リンカーユニットとを結合することで、特定の数の標的化成分及びエフェクター成分を有する分子構築物を調製することができる。
【０２１２】
ライブラリーの概念に基づいて、本発明の分子構築物は、選択されたライブラリーに応じて異なる構成で調製され得る。図5Aは、本発明の分子構築物の実施例を提供する。ここで、第1中心コアと第2中心コア(310、410)のそれぞれは、3つのリンクアーム(320、420)及び1つのリングアーム(330、430)に結合される。3つの標的化成分340は、それぞれリンクアーム320に結合され、3つの第1エフェクター成分440は、それぞれリンクアーム420に結合される。2つのリンカーユニットは、2つのカップリングアーム330、430の間で起きるiEDDA反応により互いに結合され、化学結合356を形成する。この構成により、等しい数の複数の標的化成分及び/又はエフェクター成分が1つの分子構築物に含まれ得る。
【０２１３】
図5Bは、本発明の分子構築物の実施例を提供する。この実施例において、第1中心コアと第2中心コアは、それぞれ異なる数のアミン基(例えば、リジン残基)を含み、それにより、分子構築物は、等しくない標的化成分及びエフェクター成分を含む。図示の例では、第1中心コア310は、1つのカップリングアーム 330、及び2つのリンクアーム320に結合される。第2中心コア410は、1つのカップリングアーム430、及び5つのリンクアーム420に結合される。従って、2つの標的化成分340は、それぞれリンクアーム320に結合され、5つのエフェクター成分440は、それぞれリンクアーム420に結合される。図5Bにおける楕円356は、2つのカップリングアーム330、430の間の結合を表す。
【０２１４】
任意の実施形態では、本発明の分子構築物は、第1中心コア又は第2中心コアに結合される比較的長いPEG鎖をさらに含むことができる。それにより、本発明の分子構築物が細網内皮系からさらに分離されることができ、被験体に投与された後により長い半減期を得る。PEG鎖によりタンパク質を修飾することで、その薬物動態学的特性を改善させ、及び/又は、免疫原性を低下させる場合に、長さが20,000-50,000 ダルトンのPEGが好ましい。従って、本発明の好ましい実施形態において、比較的短いリンクアームを用いて標的化成分とエフェクター成分を結合し、本発明の分子構築物のインビボ半減期を増加させる目的で、20,000〜50,000ダルトンのPEG鎖をリンカーユニットのいずれかに結合する。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、複数のscFv断片を標的化成分及び/又はエフェクター成分として用いて本発明の分子構築物を構築する。scFv断片を含む分子構築物に基づく標的化成分/エフェクター成分医薬品は、個々の抗体断片よりも長いインビボ半減期を有すべきである。いくつかの臨床用途において、医薬品のはるかに長い半減期が望まれている。それによって、薬物を頻繁に投与する必要がない。それらの用途で用いられる分子構築物において、重量が20,000〜50,000ダルトンのPEG鎖をリンクアームとして用いて、標的化成分又はエフェクター成分としてのscFv断片と結合することができる。これらの長さのPEGは、多数の治療用タンパク質を改変してそれらの半減期を増加させることに使用されている。
【０２１６】
本開示のいくつかの実施形態によれば、リンカーユニットは、それぞれ異なる機能成分に結合される複数のリンクアームを含み得る。図6において、分子構築物は、2つのリンカーユニット100A、200Dを含む。第1機能成分 140及び第2機能成分240(1つは標的化成分、もう1つはエフェクター成分である)は、それぞれリンクアーム120、220を介して第1中心コア110a及び第2中心コア210cに結合される。2つの中心コア110a、210cは、カップリングアーム130a、230aの間で起きるiEDDA反応により互いに結合される。楕円156は、カップリングアーム130a、230aの間に形成する化学結合を表す。機能成分240に加えて、第2中心コア210cは、さらにPEG鎖260に結合される。具体的には、第2中心コア210cは、AHA残基を含む。該AHA残基は、SPAAC反応により歪んだアルキン基を有するPEG鎖260と反応してそれに結合することができる。ダイヤモンド182は、SPAAC反応から生じる化学結合を表す。所望の用途に応じて、第3成分は、第2標的化成分、第2エフェクター成分、又は分子構築物の医薬品特性を改善できる成分であり得る。本開示の実施形態によれば、PEG鎖260の分子量は、約20,000〜50,000ダルトンである。
【０２１７】
上記の概念に基づいて、リンカーユニットは、複数の機能成分に結合可能な複数のリンクアームを含み得る。例えば、リンカーユニットは、5-12個の機能成分に結合可能な5-12個のリンクアームを含み得る。これは、機能成分が細胞毒性薬又はトール様受容体アゴニストのような小分子である場合に特に有用である。本明細書において、細胞毒性薬の複数の分子を担持するリンカーユニットが薬物バンドルと呼ばれる。
【０２１８】
さらに、ポリペプチドコアを用いて3つのリンカーユニットを含む分子構築物を調製することができる。従って、本開示の別の態様は、3つのリンカーユニットを含む分子構築物に関する。この3つのリンカーユニットのうちの2つは、iEDDA反応により互いに結合され得る一方、第3リンカーユニットは、SPAAC反応又はCuAAC反応により上記の2つのリンカーユニットのいずれかに結合され得る。マルチリンカーユニット(例えば、3つのリンカーユニット)を構築する根拠は、2つの異なるセットの標的化成分又は2つの異なるセットのエフェクター成分をその中に組み込むことができることである。
【０２１９】
図7において、分子構築物は、3つのリンカーユニット(500、600、700A)を含む。リンカーユニット 500、600、700Aは、それぞれ中心コア(510、610、710)、及び中心コア(510、610、710)に結合される機能成分(540、640、740)を有するリンクアーム(520、620、720)を含む。リンカーユニット600は、カップリングアーム630に結合される1つのN末端又はC末端にあるシステイン残基、及びもう1つのN末端又はC末端にアジド基又はアルキン基を有するアミノ酸残基を含むことを特徴とする。カップリングアーム530、630の一方は、その遊離末端にテトラジン基を有し、カップリングアーム530、630のうちの他方は、 その遊離末端に歪んだアルキン基を有する。従って、リンカーユニット500、600は、図3Aに示めす結合方式のように、カップリングアーム530、630の間で起きるiEDDA反応により互いに結合され得る。リンカーユニット700Aの結合において、中心コア610のN末端又はC末端アミノ酸残基は、アジド基(例えば、AHA残基)を有する場合に、中心コア710は、そのN末端又はC末端に、アルキン基(例えば、HPG残基)を有するアミノ酸を含む。或いは、中心コア610のN末端又はC末端アミノ酸残基にアルキン基(例えば、HPG残基)を有する場合に、中心コア710は、そのN末端又はC末端に、アジド基(例えば、AHA残基)を有するアミノ酸を含む。このように、図3Bに示す結合方式のように、リンカーユニット600、700Aは、カップリングアームが存在しなくても、中心コア610、710のN末端又はC末端アミノ酸残基の間で起きるCuAAC反応により互いに直接結合され得る。図7における楕円560及びソリッドドット670は、それぞれiEDDA反応及びCuAAC反応から生じる化学結合を表す。
【０２２０】
或いは、上記の3つのリンカーユニットのうちの2つは、iEDDA反応により互いに結合され得る一方、第3リンカーユニットは、SPAAC反応により上記の2つのリンカーユニットのいずれかに結合され得る。図7Bにおいて、リンカーユニット500、600は、図7Aに示すように、iEDDA反応により互いに結合される一方、リンカーユニット700Bは、中心コア610とカップリングアーム730の間で起きるSPAAC反応によりリンカーユニット600に結合される。図7Bにおけるダイヤモンド672は、SPAAC反応から生じる化学結合を表す。
【０２２１】
理解され得るように、リンカーユニット100、200、300にそれぞれ結合される機能成分540、640、740の数は、所望の用途に応じて異なる。図4に示すライブラリーの概念では、異なる数及び/又は種類の機能成分をそれぞれ有するリンカーユニットは、異なるライブラリーとして別々に調製することができ、当業者であれば、種々の用途に応じてライブラリーから所望のリンカーユニットを選択して組み合わせることができる。
【０２２２】
基本的に、上述した態様及び/又は本開示の実施形態で説明した本発明の分子構築物のカップリングアームは、2-12個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖として設計される。上記カップリングアームは、末端にアジド基、アルキン基、テトラジン基、又は歪んだアルキン基を有する。リンクアームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖として設計される。
【０２２３】
ポリペプチドを中心コアとして採用することにより、本発明の分子構築物に多様性を提供することができる。該分子構築物では、1つの構築物に複数のコピー又は種類の標的化/エフェクター成分が存在し得る。それにより、薬物送達の特異性の増強、及び標的部位に対する効力が達成される。複数のリンカーユニットを含む分子構築物を用いることにより、多数の構成が採用されることができる。例えば、3つのscFv標的化成分を有する第1リンカーユニット、及び5つの細胞毒性薬を有する第2リンカーユニット;3つのscFv標的化成分を有する第1リンカーユニット、及び3つのscFvエフェクター成分を有する第2リンカーユニット;第1セットの標的化成分の2つのscFvを有する第1リンカーユニット 、第2セットの標的化成分の2つのscFvを有する第2リンカーユニット、及び5つの細胞毒性薬を有する第3リンカーユニット;2つのbi-scFv標的化成分を有する第1リンカーユニット、及び2つのscFvエフェクター成分を有する第2リンカーユニット;又は3つのscFv標的化成分を有する第1リンカーユニット、2つのscFvエフェクター成分を有する第2リンカーユニット、薬物動態学的特性の向上の目的で20,000-50,000ダルトンの長いPEGを導入したリンクアームである。
【０２２４】
本発明のいくつかの実施形態において、リンクアームとしての二機能性 PEGを用いて、標的化成分又はエフェクター成分としての抗体の抗原結合断片をポリペプチドコアにあるアミン基に結合する。各PEGは、1つの末端にNHS基、もう1つの末端にマレイミド基を有することができる。NHS基は、ポリペプチドコアにあるアミン基と結合可能であり、マレイミド基は、抗体のscFv、bi-scFv、又はFab断片のシステイン残基のスルフヒドリル基に結合可能である。scFv及びbi-scFvは、C末端に末端システイン残基を有するポリペプチドリンカーを含むように設計される。Fabは、IgG全体にペプシン切断を行うことにより得ることができ、遊離のスルフヒドリル基は、穏やかな還元反応により鎖間ジスルフィド結合に由来する。
【０２２５】
スキーム8-12は、特定のリンカーユニットの結合及び調製を示すいくつかの実施例を提供する。
【０２２６】
スキーム8は、本開示の一実施形態に係る本発明の分子構築物の調製を示す模式図である。ここで、NHSは、NHSエステルを示し、Malは、マレイミド基を示し、AAHは、L-アジドホモアラニン(AHA)残基を示し、GHPは、ホモプロパギルグリシン(HPG)残基を示し、Acは、アセチル基を示し、scFvは、一本鎖可変領域断片を示す。
【０２２７】
スキーム8は、本開示の一実施形態に係る本発明の分子構築物の調製を示す模式図である。ここで、NHSは、NHSエステルを示し、Malは、マレイミド基を示し、AAHは、L-アジドホモアラニン(AHA)残基を示し、GHPは、ホモプロパギルグリシン(HPG)残基を示し、Acは、アセチル基を示し、scFvは、一本鎖可変領域断片を示す。ステップ1において、第1中心コア及び第2中心コアをそれぞれ調製する。該第1中心コアは、(GSK)3のアミノ酸配列を含み、且つそのC末端にL-アジドホモアラニン(AHA)残基を有する。該第2中心コアは、(GSK)5のアミノ酸配列を含み、且つそのC末端にホモプロパギルグリシン(HPG)残基を有する。ポリペプチドを安定化するために、第1中心コアと第2中心コアのN末端をそれぞれアセチル基で修飾する。ステップ2において、リンクアームをそれぞれ第1中心コアと第2中心コアにおけるリジン残基に、それらの間にアミド結合を形成することで結合する。中心コアに結合されるリンクアームは、遊離末端にマレイミド基を有する。ステップ3において、チオール-マレイミド反応により、チオール基(例えば、システイン残基)を有する第1標的化成分(例えば、フィブリンに特異的なscFv)を第1中心コアに結合されるリンクアームに結合する。同様に、チオール-マレイミド反応により、チオール基を有するエフェクター成分(即ち、薬物、例えば、Xa因子阻害剤又はトロンビン阻害剤)を第2中心コアに結合されるリンクアームに結合する。ステップ4において、AHA残基とHPG残基との間で起きるCuAAC反応により2つのリンカーユニットを結合する。
【０２２８】
<<スキーム8:末端アミノ酸残基によるリンカーユニットの結合>>
2018527350.tif 000011
【０２２９】
必要に応じて、別の方法において、標的化/エフェクター成分は、中心コアに結合され得る。スキーム9は、エフェクター成分とポリペプチドコアとの結合を示す。スキーム9において、まず、リンクアームが中心コアに結合され、次いで、エフェクター成分(即ち、薬物)がチオール-マレイミド反応によりリンクアームに結合される。
【０２３０】
<<スキーム9:リンクアームへの結合によりエフェクター成分をポリペプチドコアに結合する方法>>
【０２３１】
2018527350.tif 000012
【０２３２】
スキーム10の上記別の方法において、エフェクター成分(即ち、薬物)をリンクアームに結合することにより、リンクアーム-エフェクター複合体(即ち、PEG-drug)を調製する。次に、リジン残基とNHSエステルとの間にアミド結合を形成することでリンクアーム-エフェクター複合体を中心コアに結合する。
【０２３３】
<<スキーム10:まず、PEG鎖に結合し、そしてリジン残基のアミノ基に結合することで、エフェクター成分をポリペプチドコアに結合する別の方法>>>
【０２３４】
2018527350.tif 000013
【０２３５】
或いは、ジョイント-リンカー構成のためのリンクアームは、二重特異性scFvを結合することに使用され得る。該二重特異性scFvは、標的化成分又はエフェクター成分である。これらの構成は、標的化の特異性及び/又はエフェクターメカニズムの効力を向上させることができる。
【０２３６】
スキーム11は、本発明の分子構築物の調製の例を提供する。該分子構築物は、2つのリンカーユニットを含み、リンカーユニットは、両方とも(K-Xaa4)3のアミノ酸配列を含み、そのC末端にシステイン(C)残基を有する。
【０２３７】
<<スキーム11:カップリングアームの間で起きるiEDDA反応による分子構築物の調製>>
2018527350.tif 000014
【０２３８】
ステップ1において、2つのカップリングアームをそれぞれリンカーユニットのC残基に結合する。そのうち1つのカップリングアームは、1つの末端にマレイミド(Mal)基を有し、もう1つの末端にテトラジン基を有する。もう1つのカップリングアームは、1つの末端にMal基を有し、もう1つの末端にTCO基を有する。ステップ2において、リンクアームとK残基との間にアミド結合を形成することでリンクアームをそれぞれリジン(K)残基に結合する。さらに、ステップ3において、チオール-マレイミド反応により3つの抗AフィブリンscFv(scFv α フィブリン)及び3つのtPA類似体をそれぞれリンカーユニットのリンクアームに結合する。最後に、ステップ4において、テトラジン基とTCO基との間で起きるiEDDA反応により2つのリンカーユニットを互いに結合する。
【０２３９】
標的化成分及びエフェクター成分は、すべてscFvであり、且つ600ダルトン(12単位のEG)のリンクアームを使用する場合に、合計6つのscFvを有する分子構築物は、分子量が約170,000ダルトンである。7つのscFvを有する分子構築物は、分子量が約200,000ダルトンである。8つのscFvを有する分子構築物は、分子量が約230,000ダルトンである。本発明の分子構築物のほとんどは、分子量が200,000ダルトン未満である一方、いくつかの分子構築物は、分子量が200,000-250,000ダルトンである。
【０２４０】
4つの異なるセットのscFvが1つの分子構築物に含まれる場合に、結合された一本鎖、scFv1-scFv2等の二重特異性scFv(bi-scFv)を含む1つのリンカーユニット、及びそれぞれscFv(即ち、それぞれscFv3及びscFv4)を含む他の2つのリンカーユニットを有することが好ましい。二重特異性scFv1-scFv2の構築に2つの方法がある。「タンデム」構成において、VL1-VH1-VL2-VH2又はVH1-VL1-VH2-VL2が配置され、「ダイアボディー」構成において、VL2-VL1-VH1-VH2又はVH2-VH1-VL1-VL2が配置される。GGGGS(配列番号:6)繰り返し単位又は他の配列を有する適切なポリペプチドリンカーは、免疫グロブリンドメインの間に配置される。
【０２４１】
発明者の経験では、マレイミド及びアジド基を含むペプチド又はPEGリンカーは、マレイミド基とアジド基との間の自動結合反応により、長期間保存すると重合することがある。そのため、新しくかつ独立して各リンカーユニットを調製し、さらに、遅延なく標的化成分又はエフェクター成分をリンカーユニットに結合し、クリック反応によりリンカーユニットを結合するように処理することが好ましい。別の好ましい実施形態は、標的化成分及びエフェクター成分を両方ともアルキン基を介してリンカーユニットに結合し、1つのリンカーユニットにおけるアルキン基を、両端にアジド基を有する短いホモ二機能性リンカーを用いてアジド基に変更することである。そして、リンカーユニット（1つはアルキン基を有し、もう1つはアジド基を有する）をクリック反応により結合する。
【０２４２】
本発明の好ましいリンクアームは PEGである。リンクアームの長さはいくつかの考慮事項にとって重要である。リンクアームの長さは、可撓性がある結合scFv又は他の種類の機能成分が、立体的制約なしに標的細胞表面上の標的抗原部位に到達することを可能にするのに十分な長さであって、リンクアーム及びそれらのscFv断片若しくは機能成分の分子内及び分子間の絡み合いを引き起こすに至らない長さ、又は組織浸透を防げるために分子構築物全体のサイズを不必要に増加させるに至らない長さである。リンクアームが長すぎると、圧縮されたクラスタがアポトーシス又は他の細胞効果のための信号伝達プロセスを開始するために必要とされる場合に、抗原分子を引っ張って圧縮されたクラスタを形成することができない。標的抗原とその結合剤との異なる種類の組み合わせに対するリンクアームの最適長さは、過度の実験をすることなく当業者によって決定され得る。本発明のいくつかの分子構築物においては、NHS-(PEG)12-マレイミド(約500ダルトン)のリンクアームが好ましい。完全に伸張した(PEG)12の長さは40-50オングストロームである。
【０２４３】
適用可能なリンクアーム及びカップリングアームは、PEG鎖に制限されない。グリシン、セリン及び他のアミノ酸親水性残基を含むペプチド、及び多糖類、並びに、NHS及びマレイミド基を含むように修飾された他の生体適合性線状ポリマーを使用することができる。
【０２４４】
特定の治療用途では、本開示の分子構築物におけるエフェクター成分がリンクアームから放出され、標的部位の細胞（標的化成分又は周囲細胞によって結合された細胞を含む）に到達して薬理学的効果を引き起こすことができることが望ましい。この場合に、切断可能な結合がリンクアームに導入されている。加水分解、酸暴露、還元、及び酵素により切断されやすい切断可能な結合が、開発されている。例えば、炎症組織に存在するマトリックスメタロプロテイナーゼに敏感なペプチドセグメントは、治療用構築物の構築に使用されている。 本発明の一実施形態において、マレイミド基に隣接するS-S結合を有するPEGリンカー、即ちNHS-PEG2-12-S-S-マレイミドを使用する。ここで、S-Sジスルフィド結合であり、緩徐に還元することができる。
【０２４５】
本開示のいくつかの実施形態によれば、上記の実施形態で説明した標的化成分は、成長因子、ペプチドホルモン、サイトカイン、及び抗体からなる群から選択され、エフェクター成分は、免疫調節物質、放射性核種と複合体を形成したキレート剤、細胞毒性薬、サイトカイン、可溶性受容体、又は抗体である。
【０２４６】
これらの実施形態において、抗体は、抗原結合断片(Fab)、可変断片(Fv)、一本鎖可変領域断片(scFv)、単一ドメイン抗体(sdAb)、又は二重特異性一本鎖可変領域断片(bi-scFv)の形態である。一実施形態によれば、bi-scFvは、二重特異性タンデムscFv又は二重特異性ダイアボディscFvである。
【０２４７】
分子構築物の拡散能力を保持するために、250,000ダルトン未満の分子サイズが好ましい。したがって、scFv断片は、ほとんどの実施形態にとって好ましい。DNAレベルでは、グリシン及びセリンを主要残基として有する10-25個のアミノ酸残基のペプチドリンカーを介して、いずれかの順序(VL-VH又はVH-VL)でVL及びVHが単一のポリペプチドとして結合されるように、遺伝子が構築される。C末端には、グリシン、セリン、及び末端残基システインを有する短い延伸部が設計されている。 組換えscFv及びbi-scFvは、大腸菌及びシュードモナス・プチダなどの細菌、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母、又はCHO及びHEK293細胞株などの哺乳類細胞で調製することができる。
【０２４８】
本発明者らの研究室では、HEK293及びCHO細胞の細胞株において、インビトロシステム及び動物モデルにおける実験のために、数多くのIgG 抗体、Fab、scFv及び種々の抗体断片、Fcに基づくタンパク質、並びに他の組換え抗体が調製された。本発明者らの研究室では、ヒト臨床試験用の抗体を調製するための細胞株も開発されている。HEK293一過性発現系は、研究室で複数の1〜2Lのフラスコを用いて1gまでのIgG又は抗体断片を調製することに便利に使用することができる。本発明の分子構築物に使用されるscFv断片は、一般に、炭水化物修飾を有さず、且つ、炭水化物修飾は、scFvの、その抗原性標的に対する結合活性には必要とされない。さらに、scFvフラグメントには、1つのジスルフィド結合及び1つの末端システインしか存在しない。従って、小規模細菌発現系がscFv調製の代替手段として開発されている。大腸菌を用いて細胞内封入体、ペリプラズム及び分泌型でscFvを回収するための発現系が用いられている。scFvは、ほとんどの場合に、ほとんどのκ軽鎖のVHと相互作用するプロテインLを有するアフィニティーカラムで精製することができ、又は他の場合に、イオン交換カラムで精製することができる。
【０２４９】
ジョイント-リンカープラットフォームに基づく本発明の例は、主にscFv及びFabを標的化成分及び/又はエフェクター成分を使用する。しかし、特異的結合分子は、sdAb又は他の抗体断片に基づく結合分子の大きなライブラリーから選別されることもできる。免疫グロブリンドメインに基づいていないが、選択された標的分子に特異的結合親和性を有する抗体に似ている結合分子のライブラリーは、(1)標的分子と結合するために選択されたオリゴヌクレオチド又は短いペプチドであるアプタマー;(2)ヒトFyn SH3ドメインに由来する小さな結合タンパク質であるフィノマー;(3)シスタチンのシステインタンパク質阻害剤ファミリーに由来の結合タンパク質であるアフィマー;及び(4)天然のアンキリンタンパク質に由来する構造を有する遺伝子組み換えタンパク質であって、これらのタンパク質の3、4又は5個の繰り返しモチーフからなるダルピン（設計されたアンキリンリピートタンパク質）。これらの抗体模倣物の分子量が約10K〜20Kダルトンである。
【０２５０】
II-(ii)ジョイント-リンカー分子構築物に適用される機能成分
【０２５１】
上記のように、本発明のジョイント-リンカー少なくとも2つのリンカーユニットを含む。ここで、第1リンカーユニットは、1つ以上の標的化成分を担持し、第2リンカーユニットは、1つ以上のエフェクター成分又は薬物動態特性向上成分を担持し、その逆もまた然りである。特定疾患を治療するための本発明のジョイント-リンカー分子構築物に導入される機能成分の特定の例は、後述する。
【０２５２】
血餅に関連する疾患/病状を治療するためのジョイント-リンカー分子構築物を構築する際に、フィブリンに特異的なscFvを標的化成分として使用することができる。血餅形成の予防が主目的である場合に、本発明のジョイント-リンカー 分子構築物は、第Xa因子阻害剤又はトロンビン阻害剤をエフェクター成分として使用することができる。第Xa因子阻害剤の例示的な例は、アピキサバン、エドキサバン及びリバロキサバンを含む。トロンビン阻害剤の非限定的な例は、アルガトロバン及びメラガトランを含む。血栓症を治療することを目的とするジョイント-リンカー分子構築物の場合に、組織プラスミノーゲン活性化因子、例えば、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、及びラノテプラーゼをエフェクター成分として使用することができる。
【０２５３】
II-(iii)ジョイント-リンカー分子構築物の使用
【０２５４】
本開示は、適切なジョイント-リンカー分子構築物を用いて血餅の形成を予防する及び血栓症を治療する方法にも関する。一般的に、該方法は、このような治療を必要とする被験体に有効量の本開示の実施形態に係るジョイント-リンカー分子構築物を投与するステップを含む。 
【０２５５】
パートIII血餅形成の予防及び血栓症の治療のためのFcに基づく分子構築物及びその使用
【０２５６】
Fcに基づく構成の広い意味では、免疫グロブリン抗体を、標的化成分又はエフェクター成分の基礎として使用し、その2つのγ重鎖のC末端にその対応するエフェクター又は標的化成分をscFvドメインの形態で導入することができる。典型的な「Fcに基づく」構成の場合、二本鎖IgG.Fcを分子プラットフォームの基礎を使用することができる。ポリペプチド鎖の各々は、各鎖に合計2〜3個の成分を有するように、1つ又は2つの標的成分及び1つ又は2つのエフェクター成分と融合することができる。Fcに基づく構成を有するT-E分子は、合計4〜6個の成分(例えば、scFv、成長因子、又はサイトカイン)を有する。必要に応じて、分子構築物のFc部分も、Fc媒介エフェクター機能、ADCC及び/又は補体媒介活性化機能を有する。特定の他の用途では、そのFc媒介エフェクター機能が望ましくない。
【０２５７】
本発明のFcに基づく分子構築物のT-E成分を選択することにより、分子構築物は、凝血に関連する病状（血餅形成及び血栓症を含む）の予防及び/又は治療に適用され得る。本開示は、以下の点にも有利である。即ち、いくつかの実施形態において、本開示のリンカーユニットを利用し、本発明のFcに基づく分子構築物の細胞毒性薬物ペイロードの量を制御するための容易な手段を提供する。選択される標的化及び/又はエフェクター成分に応じて、本発明のFcに基づく分子構築物は、以下にそれぞれ説明する異なる構成であり得る。
【０２５８】
第1のシリーズのFcに基づく分子構築物において、標的化成分は、抗体又はその断片であり、エフェクター成分は、ペプチドである。
【０２５９】
図8Aは、1対のCH2-CH3セグメント1210の N末端に結合される1対の標的化成分T1(scFv)、及び1対のCH2-CH3セグメント1210のC末端に結合される1対のエフェクター成分E1(治療用ペプチドの形態)を含むFcに基づく分子構築物1200Aを示す模式図である。或いは、図8B のFcに基づく分子構築物1200Bにおいて、1対の標的化成分T1(scFv)は、1対のCH2-CH3セグメント1210のC末端に結合され、1対のエフェクター成分E1(治療用ペプチドの形態)は、1対のCH2-CH3セグメント1210のC末端に結合される。
【０２６０】
いくつかの実施形態において、CH2-CH3鎖は、ヒト免疫グロブリンγ1又はγ4からである。一般には、Fc媒介性機能、例えば、抗体依存性細胞毒性(ADCC)及び補体媒介活性(炎症活性化又は標的細胞溶解)が必要である場合に、γ1を選択する。Fc媒介性機能が望ましくない場合に、γ4を用いて本発明のFcに基づく分子構築物を構築する。
【０２６１】
いくつかの例において、1対の標的化成分は、Fab構造(即ち、VH-CH1ドメイン及びVL-Cκドメインを含む)を取る。このFab断片は、CH2-CH3鎖のN末端に結合されることにより、Fcに基づく分子構築物は、IgG構造を採用する。この場合に、1対のエフェクター成分は、1対のCH2-CH3セグメントのC末端に結合され得る。
【０２６２】
例えば、図8C のFcに基づく分子構築物1200Cにおいて、2つの標的化成分T1のそれぞれは、VH-CH1ドメイン820及びVL-Cκドメイン825を含んで、CH2-CH3鎖810のN末端に結合されるFab構造830を形成することにより、Fcに基づく分子構築物1200Cは、IgG構造を採用する。この場合に、1対のエフェクター成分E1(治療用ペプチド)は、1対のCH2-CH3鎖810のC末端に結合される。
【０２６３】
第2のシリーズのFcに基づく分子構築物において、標的化成分は、抗体又はその断片、エフェクター成分は、薬物バンドルであり得る。
【０２６４】
これらの場合に、疾患細胞を治療するためのFcに基づく分子構築物は、図9Aの分子構築物1000A又は図9Bの分子構築物1000Bの構造を有し得る。図9Aに示すように、エフェクター成分E1(例えば、薬物バンドル)は、1対のCH2-CH3セグメント 1010のC末端に結合され、標的化成分T1(この場合、scFv)は、1対のCH2-CH3セグメント1010のN末端に結合される。代替的な実施形態によれば、分子構築物1000B(図9B)は、Fab1030の形態を有する1対の標的化成分T1を含む。具体的には、Fab 1030構造は、VH-CH1ドメイン1020及びVL-Cκドメイン1025を含み、1対のCH2-CH3セグメント1010のN末端に結合されることにより、Fcに基づく分子構築物1000Aは、IgG構造を採用する。この場合に、1対のエフェクター成分E1は、1対のCH2-CH3鎖1010のC末端に結合される。
【０２６５】
いくつかの実施形態において、CH2-CH3鎖は、ヒト免疫グロブリンγ1又はγ4からである。一般には、Fc媒介性機能、例えば、抗体依存性細胞毒性(ADCC)及び補体媒介活性(炎症活性化又は標的細胞溶解)が必要である場合に、γ1を選択する。Fc媒介性機能が望ましくない場合に、γ4を用いて本発明のFcに基づく分子構築物を構築する。
【０２６６】
理解されるように、薬物バンドル(即ち、エフェクター成分E1)は、本開示で論じられるリンカーユニットとして提供され得る(例えば、図1A〜図1C)。本開示の原理及び精神によれば、標的構築物(1対のCH2-CH3セグメント1010及び標的化成分T1を含む)及び薬物バンドル(エフェクター成分E1として用いられる)は、別々に調製され、さらに互いに結合されることができる。
【０２６７】
本開示の実施形態によれば、薬物バンドルは、中心コア、複数のリンクアーム、及び必要に応じてカップリングアームを含む。本開示の様々な実施形態によれば、中心コアは、複数のアミン基を有する化合物、又は複数のリジン(K)残基を有するポリペプチドであり得る。各リンクアームは、化合物コアのアミン基、又はポリペプチドコアのK残基のアミン側鎖との反応により中心コアに結合される1つの末端を有する。リンクアームは、その遊離末端にマレイミド基を有する。各薬物分子は、マレイミド基との反応によりリンクアームを介して中心コアに結合される。本開示の任意の実施形態によれば、各エフェクター成分E1は、3-5個の細胞毒性分子を有する薬物バンドルである。
【０２６８】
中心コアがポリペプチドコアである場合に、中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、システイン残基であり、又はアジド基若しくはアルキン基を有する。特定の実施形態によれば、末端アミノ酸残基を有するポリペプチドコアがアジド基を有するため、薬物バンドルは、末端残基と延長ペプチドのC末端との間で起きるSPAAC反応又はCuAAC反応により延長ペプチドに結合される。或いは、ポリペプチドコアがアルキン基を有する末端アミノ酸残基を有する場合に、薬物バンドルは、末端残基と延長ペプチドのC末端との間で起きるCuAAC反応により延長ペプチドに結合される。或いは、システイン基である末端残基を有するポリペプチドコア、又は化合物コアの場合に、薬物バンドルは、上記カップリングアームをさらに含む。具体的には、カップリングアームは、ポリペプチドコアのシステイン残基又は化合物コアの1つのアミン基との反応により中心コアに結合される1つの末端を有する。カップリングアームは、その遊離末端にアルキン基、アジド基、テトラジン基、又は歪んだアルキン基を含むことにより、薬物バンドルは、延長ペプチドのC末端に、それらの間で起きるiEDDA反応(テトラジン基又はシクロオクテン基を有するカップリングアーム)、SPAAC(アジド基又はシクロオクチン基を有するカップリングアーム)反応、又はCuAAC反応(アルキン基又はアジド基を有するカップリングアーム)により結合される。
【０２６９】
特定の実施形態によれば、疾患細胞を治療するための本発明のFcに基づく分子構築物は、それぞれ(G2-4S)2-8C配列を有する1対の延長ペプチド1050(図9A及び9Bを参照)をさらに含む。図示のように、1対の延長ペプチド1050は、1対のCH2-CH3セグメント1010のC末端に結合される。延長ペプチドのC末端にあるシステイン残基は、カップリングアーム1055に、それらの間で起きるチオール-マレイミド反応により結合される。エフェクター成分E1(この場合に、薬物バンドル)に結合される前に、結合アームの遊離末端(即ち、システイン残基に結合されていない末端)がアルキン基、アジド基、歪んだアルキン基、又はテトラジン基で修飾されることにより、薬物バンドルは、該遊離末端に、それらの間で起きるiEDDA反応(図9A)、SPAAC(図9B)又はCUAAC反応（図示せず）により結合される。
【０２７０】
例えば、図9Aにおいて、エフェクター成分 E1(この場合に、薬物バンドル)のカップリングアーム1040は、iEDDA反応によりCH2-CH3セグメント1010に結合される。図9Aに示す楕円1045は、延長ペプチド1050とエフェクター成分E1との間で起きるiEDDA反応により生じる化学結合を示す。理解され得るように、iEDDA反応は、テトラジン基と、シクロオクテン基、例えば、トランスシクロオクテン(TCO)基との間で起きる。
【０２７１】
或いは、図10Bにおいて、エフェクター成分E1は、SPAAC反応によりCH2-CH3セグメント1010に結合される。図10Bに示すダイヤモンド1045は、延長ペプチド1050とエフェクター成分E1との間で起きるSPAAC反応により生じる化学結合を示す。具体的には、SPAAC反応は、アジド基と歪んだアルキン基(例えば、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)基、ジフルオロシクロオクチン(DIFO)基、ビシクロノニン(BCN)基、及びジベンゾシクロオクチン(DICO)基を含むシクロオクチン基)との間で起きる。
【０２７２】
第3のシリーズのFcに基づく分子構築物において、標的化成分及びエフェクター成分のうちの1つはペプチドであり得る。
【０２７３】
理解されるように、Fcに基づく分子構築物のFc領域及び薬物バンドルについての記載は本実施形態にも適用可能であるため、説明を簡潔にするために、その詳細な説明を省略する。
【０２７４】
III-(ii):Fcに基づく分子構築物との使用に適した機能成分
【０２７５】
以上、抗炎症Fcに基づく分子構築物の基本的な構造的配置を説明した。以下、エフェクター成分及び標的化成分の特定の組合せを説明する。
【０２７６】
血餅に関連する疾患/病状の予防及び/又は治療のためのFcに基づく分子構築物の構築において、フィブリンに特異的な抗体(又はその断片)を標的化成分として使用することができる。
【０２７７】
血餅形成の予防が主目的である場合に、本発明のFcに基づく分子構築物は、第Xa因子阻害剤又はトロンビン阻害剤の複数の分子をエフェクター成分として含む薬物バンドルを使用することができる。第Xa因子阻害剤の例示的な例は、アピキサバン、エドキサバン及びリバロキサバンを含む。トロンビン阻害剤の非限定的な例は、アルガトロバン及びメラガトランを含む。血餅形成を予防するためのFcに基づく分子構築物は、図9A又は9Bに関連して記載された構成をとることができる。
【０２７８】
一方、血栓症を治療することを目的とするFcに基づく分子構築物では、エフェクター成分は、一本鎖ポリペプチドである組織プラスミノーゲン活性化因子(例えば、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ及びラノテプラーゼ)であり得る。血栓症を治療するためのFcに基づく分子構築物は、図8A〜8Cに関連して記載された構成をとることができる。
【０２７９】
本発明の本質は、標的化成分とエフェクター成分との特定の組合せ又はペアリングの合理化及び概念である。好ましい実施形態において、分子構築物についてFc融合構成を採用する。当業者であれば、他の分子プラットフォームを用いて本発明の1対の標的化成分及びエフェクター成分を結合することを想到できる。上記の分子プラットフォームは、例えば、ペプチド、タンパク質(例えば、アルブミン)、多糖類、ポリエチレングリコール、及び他の種類のポリマーであり、複数の分子成分を結合する構造基礎として機能する。
【０２８０】
III-(iii):Fcに基づく分子構築物の使用
本開示は、また、適切なFcに基づく分子構築物を用いて様々な疾患を治療するための方法に関する。一般的に、該方法は、治療を必要とする被験体に有効量の本開示の実施形態に係るFcに基づく分子構築物を投与するステップを含む。
【０２８１】
実施例
実施例1:ペプチドコアとしてのペプチド1(配列番号:18)の合成、及びシステイン残基のSH基と結合アームとしてのマレイミド-PEG4-テトラジンとの結合
【０２８２】
合成したペプチド1(Chinapeptide Inc., Shanghai, China)を最終濃度2mMとなるように50mMのNaCl及び5mMのEDTAを含む100mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)に溶解した。溶解したペプチドを1mMのTCEPを用いて25℃で2時間還元した。ペプチドとマレイミド-PEG4-テトラジンを1/5の割合で混合し、pH7.0、4℃で24時間反応させることにより、システイン残基のSH基とマレイミド-PEG4-テトラジン(Conju-probe Inc. )を結合して機能的連結基であるテトラジンを形成した。逆相HPLCにより（カラム:Supelco C18(250 mm X 10 mm;5 μm);移動相: アセトニトリル及び0.1％トリフルオロ酢酸;アセトニトリルの線形勾配:0％〜100％、30分間以上;流速:1.0 mL/min;カラム温度:25℃）テトラジン結合ペプチドを精製した。
以下に示す本発明のテトラジン-ペプチド1は、m.w.が2, 185.2 ダルトンである。
2018527350.tif 000015
【０２８３】
実施例2:ペプチドコアとしてのペプチド2(配列番号:26)の合成、及び、システイン残基のSH基とカップリングアームとしてのマレイミド-PEG3-トランスシクロオクテン(TCO)との結合
合成したペプチド2(Chinapeptide Inc., Shanghai, China)を同様に処理した。簡単に言えば、ペプチドを最終濃度2mMとなるように50mMのNaCl及び5mMのEDTAを含む100mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に溶解した。溶解したペプチドを1mMのトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン(TCEP)を用いて25℃で2時間還元した。ペプチドとマレイミド-PEG3-TCOとを1/7.5の割合で混合し、pH7.0、25℃で18時間反応させることにより、システイン残基のSH基とマレイミド-PEG3-TCO(Conju-probe Inc. )を結合して機能的連結基TCOを形成して、TCO結合ペプチドを逆相HPLC（カラム:Supelco C18(250 mm X 10 mm;5μm);移動相:アセトニトリル及び0.1％トリフルオロ酢酸;アセトニトリルの線形勾配:0％〜100％、30分間以上;流速:1.0mL/min;カラム温度:25℃）により精製した。
合成したTCO-ペプチド(以下に示す)の同定は、MALDI-TOF質量分析法により行われた。質量分析は、中央研究院分子生物学研究所のマスコア施設(IMB)（台湾、台北）で行った。測定は、ブルカー・オートフレックスIII MALDI-TOF/TOF質量分析計(ブルカー・ダルトニクス、ブレーメン、ドイツ)で行った。
以下に示すこのようにして合成したTCO-ペプチド2は、m.w.が2, 020.09ダルトンである。
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【０２８４】
実施例3: NHS-PEG12-マレイミドとテトラジン-ペプチド1のNH2基との結合によるリンカーユニットの合成  
PEG12-マレイミドの3つのリンクアームをペプチドコア テトラジン-ペプチド1に連結した。Conju-probe Incから架橋剤であるNHS-PEG12-マレイミド(スクシンイミジル-[(N-マレイミド-プロピオンアミド)-ドデカエチレングリコール]エステルを購入した。製造業者の指示に従って、結合手順を行った。リジン残基を有するペプチドを100mMで結合緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.5)）に溶解した。NHS-PEG12-マレイミド架橋剤を1mMの最終濃度(0.1mMのペプチド溶液に対してモルで10倍過剰)となるようにペプチドに添加した。反応混合物を室温で18時間インキュベートした。PEG12-マレイミド結合TCO-ペプチド1を逆相HPLC（カラム:Supelco C18カラム(250mmX4.6mm;5μm);移動相:アセトニトリル及び0.1%トリフルオロ酢酸;アセトニトリルの線形勾配:0%〜100%;30分間以上、流速:1.0mL/min;カラム温度:25°C）により精製した。
以下に示すように、本発明のPEG12-マレイミド結合テトラジン-ペプチド1は、テトラジン基を有する1つのカップリングアーム 及びマレイミド基を有する3つのPEGリンクアームを含み、m.w.が4, 461ダルトンである。
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【０２８５】
実施例4: NHS-PEG6-MalをTCO-ペプチド2のNH2基との結合によるリンカーユニットの合成
NHS-PEG6-MalとTCO-ペプチド2のNH2基との結合は、上記の実施例と同様に行われた。 簡単に言えば、NHS-PEG6-マレイミド架橋剤を40mMの最終濃度(2mMのペプチド溶液に対してモルで20倍過剰)となるように溶解したペプチドに添加した。反応混合物を室温で3時間インキュベートした。
本発明のPEG6-マレイミド結合ペプチド2は、以下に示すように、m.w.が4, 478ダルトンであり、1つのTCO基、及びマレイミド基を有する5つのPEGリンクアームを含むペプチドコアに基づくリンカーユニットである(図10)である。
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【０２８６】
実施例5:アピキサバンカルボン酸分子とNH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2架橋剤との結合
アピキサバンカルボン酸をKM3 Scientific Inc.(New Taipei City, Taiwan)から購入した。スキーム12に示すように、アピキサバンカルボン酸分子の活性化カルボキシル基とホモ二官能性切断可能な架橋剤であるNH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2とを反応させた。
アピキサバンカルボン酸を最終濃度20mMとなるように100％DMSOに溶解し、NH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2（ホモ二官能性切断可能な架橋剤）を最終濃度10mMとなるようにPBSに溶解した。アピキサバンカルボン酸のカルボキシル基を活性化した。1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)(KM3 Scientific Inc. )を1:2([アピキサバン]: [EDC])のモル比でアピキサバンカルボン酸溶液に添加し、15分間インキュベートした。
活性化されたアピキサバンカルボン酸溶液を2mMの最終濃度(0.4mMのNH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2（架橋剤溶液）に対してモルで5倍過剰)となるようにNH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2架橋剤に添加した。反応混合物を室温で3時間インキュベートした。
【０２８７】
<<スキーム12  2つのアピキサバンカルボン酸分子とNH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2架橋剤との結合>>
2018527350.tif 000019
アピキサバン-PEG3-S-S-PEG3-アピキサバンを逆相HPLC（カラム:Supelco C18カラム(250mmX4.6mm;5μm);移動相:アセトニトリル及び0.1%トリフルオロ酢酸;アセトニトリルの線形勾配:0%〜100%;30分間以上、流速:1.0mL/min;カラム温度:25°C）により精製した。
このようにして合成したアピキサバン-PEG3-S-S-PEG3-アピキサバンの質量分析(図11を参照)は、分子構築物のm.w.が1,301.64及び1,323.68ダルトン（それぞれ[M+H]+及び[M+Na]+に対応する）であることを示した。
【０２８８】
実施例6: 2つのアルガトロバン分子とNH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2 架橋剤との結合
アルガトロバンをKM3 Scientific Inc.(New Taipei City, Taiwan)から購入した。上記の実施例と同様にNH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2をアルガトロバン分子のCOOH基と結合した。簡単に言えば、アルガトロバンを最終濃度20 mMとなるように100％DMSOに溶解した。EDC溶液をアルガトロバン溶液に添加してアルガトロバンのCOOH基を活性化し、次いで15分間インキュベートした。活性化されたアルガトロバン溶液を2mMの最終濃度(0.4mMのNH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2架橋剤溶液に対してモルで5倍過剰)となるようにNH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2架橋剤溶液に添加した(スキーム13を参照)。
【０２８９】
<<スキーム13 アルガトロバン分子とNH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2架橋剤との結合>>
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図12に示すMALDI-TOFの結果は、このようにして合成したアルガトロバン-PEG3-S-S-PEG3-アルガトロバンは、m.w.が1, 378.61ダルトンである。
【０２９０】
実施例7:アピキサバン-PEG3-SH及びアルガトロバン-PEG3-SHとマレイミド-PEG6結合TCO-ペプチド2との結合
5つのマレイミド-PEG6リンクアームを有するTCO-ペプチドと結合する前に、アピキサバン-PEG3-S-S-PEG3-アピキサバン及びアルガトロバン-PEG3-S-S-PEG3-アルガトロバン(上記の実施例で調製した)を4mMのTCEPと共にモル比3:1([TCEP]:[薬物-リンカー])で室温で静かに振とうしながら90分間インキュベートすることにより、アピキサバン-PEG3-SH及び遊離のスルフヒドリル基を有するアルガトロバン-PEG3-SH分子を生成した。
このようにして合成した薬物バンドルは、以下に示すように、遊離のTCO官能基及び1つのセットの5つのアピキサバン分子（エフェクター成分）を有するリンカーユニットから構成される。本発明の分子構築物は、m.w.が7,713 ダルトン（[M+H]+に対応）である。
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このようにして合成した別の薬物バンドル, 以下に示すように、遊離のTCO官能基及び1つのセットの5つのアルガトロバン分子（エフェクター成分）を有するリンカーユニットから構成される。本発明の分子構築物は、m.w.が8,112.8 ダルトン（[M+H]+に対応）である。
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【０２９１】
実施例8: Expi293F過剰発現システムによるヒトフィブリンに特異的なマウスmAbのscFvの調製
ヒトフィブリンに特異的なscFvのVL及びVHは、マウスのモノクローナル抗体102-10に由来した(日本特開2012-72)。この抗体に由来のscFvは、C末端に可撓性リンカー（GGGGSGGGGS）及び末端システイン残基を有するように設計された。システイン残基は、種々のリンカーユニットのリンクアームの遊離末端に存在するマレイミド基との結合のために、スルフヒドリル基を提供する。ヒトフィブリンに特異的なmAbのscFvを調整するために、mAb102-10のVH及びVLのDNA配列をさらにコドン最適化した。VL-GSTSGSGKPGSGEGSTKG-VH-(GGGGS)2-CをコードするDNA配列を合成した。本発明の実験で調製したmAb 102-10のscFvのアミノ酸配列は、配列番号:27に記載されている。
哺乳動物発現システムを用いてscFvタンパク質を調製する際に、実験においてExpi293FTM細胞株に基づく過剰発現システムを用いた。該システムは、Expi293FTM細胞株、カチオン性脂質系ExpiFectamineTM293試薬、ExpiFectamineTM293トランスフェクションエンハンサー1、2、及び培地(Gibco、New York、USA)を含むExpiFectamineTM293トランスフェクションキット(Life Technologies、Carlsbad、USA)を使用した。
scFvをコードする配列をpG1K発現カセットに入れた。Expi293F細胞を2.0×106生存細胞/mlの密度でExpi293F発現培地に接種した後、トランスフェクションの際に細胞が活発な分裂の状態にあることを確保するために、18〜24時間維持した後トランスフェクションした。トランスフェクション際に、7.5×108個の細胞を入れた255mlの培地を2Lのエルレンマイヤーシェーカーフラスコに入れた後、ExpiFectamineTM293トランスフェクション試薬でトランスフェクションした。トランスフェクション後、オービタルシェーカー(125 rpm)においてトランスフェクションされた細胞を37℃で16〜18時間インキュベートし、次いで、そこにExpiFectamineTM293トランスフェクションエンハンサー1及びエンハンサー2を加えた後、引き続き、5-6日間インキュベートした。培養上清液を回収し、プロテインLアフィニティークロマトグラフィーにより培地におけるscFvタンパク質を精製した。図13A及び13Bは、それぞれ、精製したヒトフィブリンに特異的なmAbのscFv のSDS-PAGE及び質量分析の結果を示す。SDS-PAGEにおけるヒトフィブリンに特異的なmAbのscFvは、26及び30kDaの2つの主要なバンドにおいて遊走した。同じタンパク質溶液をさらにMALDI-TOFにより分析し、ヒトフィブリンに特異的な102-10scFvが26,838ダルトンの分子量（計算された分子量と一致する）しか有しないことを示した。
【０２９２】
実施例9: 精製したヒトフィブリンに特異的なマウスscFvのELISA分析
米国特許出願公開2016/0011217A1の記載に従ってフィブリノーゲンコーティングプレートを作った。簡単に言えば、ヒトフィブリノーゲン(Sigma)を含む100μlのPBSを1μg/ウェルで96ウェルの平底プレート(Nunc)に添加し、このプレートを密封して4℃で一晩放置した。
以下のようにフィブリンプレートを作った。フィブリノーゲン溶液を除去し、次いで、0.05U/mlのトロンビン(Sigma)、2mMのCaCl2、及び7mMのL-システイン(Sigma)を含む100μLのTBSをウェルに添加した。トロンビン処理プレートを37℃で1時間インキュベートすることにより、フィブリンを形成させた。その後、トロンビン溶液を除去し、室温で10％スキムミルクで1時間ブロックした。
次いで、100μlの102-10 scFv溶液をフィブリノーゲンプレート及びフィブリンプレートに加えた後、室温で1時間振とうした。その後、各プレートをTBS-Tで洗浄し、50μlのTMB(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA)を加え、測色を行った。50μlの1N HClを添加することで反応を停止させた。次いで、プレートリーダーで450nmの吸光度を測定することにより吸光度(O.D.)を得た。
図13Cは、精製された102-10 scFvがフィブリノーゲンではなく、ヒトフィブリンに特異的に結合したことを示すELISA結果を示す。
【０２９３】
実施例10:ヒトフィブリンに特異的なファージディスプレイされたヒトscFvの構築及び選択
ヒトフィブリンに特異的なヒトscFvを有するファージクローンは、中央研究院ゲノミクス研究センター（台湾、台北）のDr. An-Suei Yangの研究室と結約を結んで得た。ヒトIgG抗体断片、G6抗VEGF Fab(タンパク質バンクコード:2FJG)に由来のGH2 scFvライブラリーのフレームワーク配列を、ファージミドベクターpCANTAB5E(GE Healthcare)の制限部位SfiIとNotIにクローン化した。該ファージミドベクターは、アンピシリン耐性、lacZプロモーター、scFv断片を培養上清液に分泌させるためのpelBリーダー配列、及び検出用のE-タグを有する。オリゴヌクレオチド指向性変異誘発法により、scFvテンプレートのVH及びVLドメインを別々に多様化し、各可変ドメインにおける3つのCDRを同時に多様化した。 109を超えたクローンを有するscFvライブラリーを用いてヒトフィブリンの選択を行った。
上記の実施例と同様に、トロンビン処理フィブリンプレート(1 μg/100μl/ウェル)を作った。フィブリンプレートを用いて抗フィブリン抗体をパニングした。簡単に言えば、室温でウェルにおけるコーティング溶液を2時間振とうすることにより、ウェルをヒトTfR1でコーティングした。その後、室温で、フィブリンコーティングウェルをブロッキングバッファー(5％スキムミルク含有PBST(0.1％トゥイーン20を含むリン酸緩衝生理食塩水))で1時間処理した。ブロッキングバッファーにおける組換えファージを8x1011CFU（コロニー形成単位）/mlに希釈した後、フィブリンコーティングウェルに添加し、1時間静かに振とうした。次いで、ウェルをPBSTで10回激烈に洗浄し、続いてPBSで6回洗浄して非特異的結合ファージを除去した。0.1M HCl/グリシン緩衝液（pH 2.2）で結合したファージを溶出した直後、溶出部分を2M トリス塩基緩衝液（pH 9.0）で中和した。大腸菌株ER2738(OD600=〜0.6)を用いて、37℃で30分間ファージ感染した。アンピシリンで30分間処理して感染していない大腸菌を除去した。アンピシリン処理後、カナマイシン耐性を有するヘルパーファージM13KO7を添加し、さらに1時間インキュベートした。大腸菌培地からヘルパーファージにより救出されたファージを選択し、37℃でカナマイシンの存在下で、一晩激烈に振とうして増幅させた。増幅されたファージをPEG/NaClで沈殿させ、次の選択-増幅サイクルのためにPBSに再懸濁させた。この選択増幅-手順を繰り返すことにより、ヒトフィブリンに対して計3回の連続的パンニングラウンドを行った。
ファージ感染ER2738コロニーを段階的に希釈した後、計数し、ファージ力価を計算し、各パンニングラウンド後の出力力価/ml(CFU/ml)を得た。3ラウンドのパンニング後に、ファージ出力力価が2.5E+06 CFU/ウェルから4.3E+09 CFU/ウェルに1000倍増加した。各ラウンドのファージ出力/入力力価比を図14Aに示す。各パンニングラウンドにおいて、ファージ出力/入力力価比をy軸に示す。3ラウンドのパンニング後に、陽性クローンが明確に富化した。3回目のパニングラウンドのファージ出力/入力力価は1回目の500倍であり、結合クローンがライブラリーにおいて支配的になった。
典型的な選択手順では、ヒトフィブリンコーティングELISAプレートウェルに対して3ラウンドの抗原パニングを行った後、コーティングされたフィブリンを有するELISAにおいて、約80％の結合したファージ粒子が特異的にフィブリンに結合した。
【０２９４】
実施例11:ヒトフィブリンに特異的なヒトファージディスプレイscFvのシングルコロニーELISA分析
シングルクローンファージで感染した大腸菌株ER2738のそれぞれは、そのファージミドに選択scFv遺伝子を持っている。深いウェルに2YTブロス(16g/Lトリプトン、10g/L酵母エキス、5g/L NaCl、pH7.0)及び100μg/mlアンピシリンを添加し、37℃で振とうし、これらの大腸菌を中間対数期まで成長させた。ブロスのOD600が1.0に達した後、IPTGを最終濃度1μg/mlとなるように添加した。該プレートを37℃で一晩激烈に振とうしながらインキュベートした。その後、該プレートを4000g、4℃で15分間遠心分離した。
ELISAにより、可溶性scFv結合試験を行った。簡単に言えば、マキシソープ96-ウェルプレート(Nunc)をフィブリン(1μg/100μl PBS/ウェル)又はヒトフィブリノーゲン（陰性対照抗原）でコーティングし、4℃で18時間振とうした。300μlのブロッキングバッファーで1時間処理した後、分泌scFvを含む上清100μlを100μlのブロッキングバッファーに混合し、コーティングされたプレートに添加しさらに1時間処理した。ヤギ抗Eタグ抗体(HRP結合、1:4000, Cat. No. AB19400, Abcam)をプレートに添加し、さらに1時間処理した。ウェルにTMB基質(50μl/ウェル)を添加し、1N HCl(50 μl/ウェル)の添加により反応を停止した後、450nmにおける吸光度を測定した。
3回目のパニング後に、計960個のファージクローンを本分析に供した。そのうち、フィブリノーゲンに対して10を超えるOD450の差異を有するフィブリンに結合した6個のscFvクローンを、これらのscFv遺伝子をコードする遺伝子のDNA配列決定によってさらに特徴付けた。4つの異なるDNA配列が同定された。図14Bは、scFvクローンD10のELISA結果を示す。1.09のOD450でヒトフィブリンに結合したscFVクローンD10のアミノ酸配列を配列番号:29に示す。
【０２９５】
実施例12:Expi293F 過剰発現システムによる組換えレテプラーゼの調製
レテプラーゼのアミノ酸配列は、ドラッグバンクに由来した。組換えタンパク質は、C末端にGGGGSGGGGSの可撓性リンカー及び末端システイン残基を有するように設計された。システイン残基は、種々のリンカーユニットのリンクアームの遊離末端に存在するマレイミド基との結合のために、スルフヒドリル基を提供する。本発明の実験で調製したレテプラーゼのアミノ酸配列は、配列番号:28に記載されている。
本実施例において、遺伝子をコードする配列をpcDNA3発現カセットに入れた。哺乳動物発現システムを用いてレテプラーゼタンパク質を調製するために、上記の実施例に記載した実験においてExpi293FTM細胞株に基づく過剰発現システムを使用した。
図15A及び15Bは、それぞれ精製したレテプラーゼのSDS-PAGE及び質量分析の結果を示す。SDS-PAGEにおける組換えレテプラーゼは、43及び48kDaの2つの主要なバンドにおいて遊走した。同じタンパク質溶液をさらにMALDI-TOFにより分析し、組換えレテプラーゼが43,415ダルトンの分子量（計算された分子量と一致する）しか有しないことを示した。
【０２９６】
実施例13:TCO結合レテプラーゼの調製
レテプラーゼのSH基をMal-PEG3-TCO(Conju-probe, Inc.)に結合するために、室温で5mMのジチオスレイトール(DTT)と共に振とうしながら4時間インキュベートすることにより、精製されたレテプラーゼのC-末端にあるシステイン残基を還元した。NAP-10 Sephadex G-25カラムを用いて、還元型タンパク質を含む緩衝液を、リン酸ナトリウム緩衝液(100 mM リン酸ナトリウム、pH7.0、50mM NaCl及び5mM EDTA)に置換した。還元反応及び緩衝液交換の後、室温で10:1([Mal-PEG3-TCO]:[タンパク質]]のモル比で結合を一晩行った。余分な架橋剤を脱塩カラムで除去し、TCO結合タンパク質生成物を分析した。
質量分析MALDI-TOFの結果は、TCO結合レテプラーゼタンパク質のサンプルのm.w.が45,055ダルトンであることを示した。TCO結合レテプラーゼタンパク質の純度を、10％SDS-PAGEのクーマシーブルー染色によって分析した。図16は、TCO結合レテプラーゼの質量分析を示す。
【０２９７】
実施例14:ヒトフィブリンに特異的な3つのscFvの、テトラジン-ペプチド1に基づく3つのマレイミド-PEG12リンクアームへの結合
上記の実施例と同様に、配列番号:27をコードするDNA配列を合成し、発現した。3つのPEG12-マレイミドリンクアームを有するテトラジン-ペプチド1に結合する前に、5mMのDTTと共に2:1( [DTT]:[scFv] )のモル比 で、室温で静かに振とうしながら4時間インキュベートすることにより、ヒトフィブリンに特異的な精製されたmAbの102-10 scFvのC-末端にあるシステイン残基を還元した。その後、NAP-10 Sephadex G-25カラム(GE Healthcare)を用いて、還元型102-10 scFvを含む緩衝液を、マレイミド-SH結合反応緩衝液(100 mM リン酸ナトリウム、pH7.0、50mM NaCl及び5mM EDTA)に置換した。還元反応及び緩衝液交換の後、4°Cで、1:4([リンカー]:[タンパク質])のモル比で、3つのPEG12-マレイミドリンクアームを有するテトラジン-ペプチド1との結合を一晩行った。
反応混合物をサイズ排除クロマトグラフィーカラムS75に使用した。ヒトフィブリンに特異的な3つの102-10 scFvに結合されたPEG12-マレイミド結合テトラジン-ペプチド1をサイズ排除クロマトグラフィーカラムS75により、遊離scFv、遊離PEG12-マレイミド結合テトラジン-ペプチド1、及びヒトフィブリンに特異的な1つ及び2つの102-10 scFvに結合されたPEG12-マレイミド結合テトラジン-ペプチド1から分離した。生成物(即ち、遊離のテトラジン官能基を有し、且つ 1つのヒトフィブリンに特異的な3つの102-10 scFvに結合されたPEG12-マレイミド結合テトラジン-ペプチド1)を精製し、図17に示す10％SDS-PAGE分析に示した。
【０２９８】
実施例15: テトラジン-ペプチド1に基づく3つのマレイミド-PEG12リンクアームに結合されたヒトフィブリンに特異的な3つのscFvを含む標的化リンカーユニットのMALDI-TOFによる分析
テトラジン-ペプチド1に基づく3つのマレイミド-PEG12リンクアームに結合されたヒトフィブリンに特異的な3つの102-10 scFvを有する標的化リンカーユニットのサンプルをMALDI-TOFにより分析した。実験的分子量の中央値は、3つのマレイミド-PEG12リンクアームを有するテトラジン-ペプチド1に結合されたヒトフィブリンに特異的な3つの102-10 scFvの理論分子量の中央値と一致した。図18Cの質量分析プロファイルから分かるように、合成された標的化リンカーユニットの平均分子量は、84,974ダルトンである。
以下に示す合成した標的化リンカーユニットは、遊離テトラジン官能基及び1つのセットのヒトフィブリンに特異的な3つの102-10 scFvを標的化成分として有するリンカーユニットから構成される。
2018527350.tif 000023
【０２９９】
実施例16:標的化成分としてヒトフィブリンに特異的な3つのscFv、及びエフェクター成分として1つのレテプラーゼ分子を有する分子構築物の調製 
この実施例において、上記の実施例の標的化リンカーユニットと、TCO結合レテプラーゼタンパク質とを、テトラジン-TCO iEDDA反応により結合した。具体的には、標的化リンカーユニットは、ヒトフィブリンに特異的な3つの102-10 scFv及び1つの遊離テトラジン基を有する。
製造者(Jena Bioscience GmbH、Jena、Germany)の指示に従って、テトラジン-TCOライゲーションを行った。簡単に言えば、100μlの標的化リンカーユニット(0.3mg/ml)をエフェクターユニットを含む溶液に1:2([テトラジン]:[TCO])のモル比で加えた。室温で反応混合物を1時間インキュベートした。
以下に示す本発明のジョイント-リンカー分子構築物は、標的化成分としてヒトフィブリンに特異的な3つの102-10 scFv及びエフェクター成分としてレテプラーゼ分子を有する。反応混合物の8％SDS-PAGE分析において、サイズが約180kDaのバンドが観察された。
2018527350.tif 000024
【０３００】
実施例17:標的化成分としてヒトフィブリンに特異的な3つのscFv、及びエフェクター成分として5つのアピキサバン及びアルガトロバン分子を有する分子構築物の調製
この実施例において、ヒトフィブリンに特異的な3つの102-10 scFv及び5つのアピキサバン分子の薬物バンドルを有するジョイント-リンカー分子構築物を構築した。上記の実施例と同様に、TCO-テトラジンiEDDA反応により分子構築物を調製した。簡単に言えば、100μlの標的化リンカーユニット(0.3 mg/ml)を、エフェクター成分を含有する溶液に1:1.2( [テトラジン]:[TCO])のモル比で加えた。反応混合物を室温で1時間インキュベートした。
得られたジョイント-リンカー分子構築物は、 以下に示すように、標的化成分としてヒトフィブリンに特異的な3つの102-10及びエフェクター成分として5つのアピキサバン分子の薬物バンドルを有する。反応混合物の10％SDS-PAGE分析において、サイズが約160kDaのバンドが観察された。
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以下に示す本発明のジョイント-リンカー分子構築物は、標的化成分としてヒトフィブリンに特異的な3つの102-10 scFv及びエフェクター成分として5つのアルガトロバン分子の薬物バンドルを有する。反応混合物の10％SDS-PAGE分析において、サイズが約165kDaのバンドが観察された。
2018527350.tif 000026
【０３０１】
実施例18:アピキサバン-PEG3-SH分子の阻害分析 
第Xa因子は、不活性プロトロンビンの活性トロンビンへの変換を触媒する。アピキサバンは、トロンビンによる血餅形成を間接的に減少させる第Xa因子阻害剤として使用されている。上記の実施例と同様に、修飾されたアピキサバン分子(アピキサバン-PEG3-SH)を合成した。第Xa因子阻害分析(BioVision, Milpitas, USA)を行うことにより、修飾されたアピキサバン分子(アピキサバン-PEG3-SH)の阻害活性を調べた。第Xa因子阻害分析では、第Xa因子の能力を利用して合成基質を切断することにより、蛍光リーダーを検出できるフルオロフォアを放出する。第Xa因子阻害剤の存在下で、第Xa因子により触媒される開裂反応の程度は減少したか、又は完全になくなった。
この実施例において、50μlの第Xa因子酵素溶液(造業者提供)を96ウェルの平底プレート(Nunc)に加えた。10μlの1μM アピキサバン-PEG3-SH及びアピキサバンカルボン酸を、第Xa因子酵素溶液を含有するプレートに加え、室温で15分間インキュベートした。次いで、40μlの第Xa因子基質溶液(造業者提供)をプレートに加え、37℃で30分間インキュベートした。フルオロフォアの蛍光強度(相対蛍光単位;RFU)は、蛍光プレートリーダーを用いて350nmでの励起下で450nmでの発光を測定することによって得た。 
図19は、アピキサバン-PEG3-SHの阻害活性の分析結果を示す。合成基質の存在下で、第Xa因子阻害剤(基質のみ)の非存在下で、第Xa因子活性を測定した。その結果は、連結アームが結合されたアピキサバン分子は、未修飾のアピキサバンカルボン酸と類似する、第Xa因子の作用を阻害する生物学的活性を有することを示した。第Xa因子阻害剤(GGACK 二塩酸塩;製造業者提供)を対照阻害剤として使用した。
【０３０２】
実施例19:組換えレテプラーゼの生物学的活性の分析
レテプラーゼは、プラスミノーゲンのプラスミンへの変換を触媒する組換えヒト組織プラスミノーゲン活性化因子である。このプロセスは血餅の崩壊に関与する。96ウェルの平底プレートで発色分析を行うことにより、組換えレテプラーゼの生物学的活性を調べた。
簡単に言えば、1μlの1μM 組換えレテプラーゼ、25μlの10μM ヒトプラスミノーゲン(Cat. No. 7549-1, Biovision)及び62.5μlの100mM トリス緩衝液（pH8.5）を上記プレートのウェルに加え、37℃で30分間インキュベートした。次いで、1μlの50 mM 発色基質D-Val-Leu-Lys-p-ニトロアニリド二塩酸塩(Cat. No. V7127, Sigma)（合成プラスミン基質）をこのウェルに加え、25℃で30分間インキュベートした。その後、31.5μlの10 ％クエン酸を各ウェルに加えて反応を停止させた。組換えレテプラーゼは、プラスミノーゲンを触媒してプラスミンを形成し、プラスミンが発色基質を切断して黄色のp-ニトロアニリドを放出した。プレートリーダーでp-ニトロアニリドを405 nmで測定した。
その結果、組換えレテプラーゼは1.8のOD405を有するプロテアーゼ活性を示す一方、陽性対照タンパク質である市販のtPAタンパク質(Cat. No. T0831, Sigma)は1.5のOD405を有する。
【０３０３】
実施例20:レテプラーゼを含む二本鎖IgG4.Fc融合タンパク質をコードする遺伝子セグメントの構築
レテプラーゼを可撓性のヒンジ領域を介してIgG4.FcのCH2ドメインのN-末端に融合することにより、レテプラーゼ-CH2-CH3(ヒトγ4)組換え鎖を構築した。IgG4.Fc融合タンパク質分子構築物における組換え鎖の配列を配列番号:30に示す。
以下、調製した二本鎖(レテプラーゼ)-hIgG4.Fc分子構築物の構成である。
2018527350.tif 000027
【０３０４】
実施例21:レテプラーゼを含有する組換え二本鎖IgG4.Fc融合タンパク質の発現及び精製 
本実施例において、遺伝子をコードする配列をpcDNA3発現カセットに入れた。Expi293F細胞を2.0×106生存細胞/mlの密度でExpi293F発現培地に接種した後、トランスフェクションの際に細胞が活発な分裂の状態にあることを確保するために、18〜24時間維持した後トランスフェクションした。トランスフェクションの際に、7.5×108個の細胞を入れた255mlの培地を2Lのエルレンマイヤーシェーカーフラスコに入れた後、ExpiFectamineTM293トランスフェクション試薬でトランスフェクションした。トランスフェクション後、オービタルシェーカー(125 rpm)においてトランスフェクションされた細胞を37℃で16〜18時間インキュベートし、次いで、そこにExpiFectamineTM293トランスフェクションエンハンサー1及びエンハンサー2を加えた後、7日間インキュベートした。培養上清液を回収し、プロテインAクロマトグラフィーにより培地における組換え二本鎖(レテプラーゼ)-hIgG4.Fc融合タンパク質を精製した。緩衝液をPBSに交換した後、8％SDS-PAGEにより(レテプラーゼ)-hIgG4.Fcタンパク質の濃度を測定し分析した。その結果を図20に示した。Fc融合分子構築物の主要なバンドが約74kDa（予想サイズと同じ）に観察された。  
【０３０５】
実施例22:レテプラーゼ及びヒトフィブリンに特異的なscFvを含む二本鎖IgG4.Fc融合タンパク質をコードする遺伝子セグメントの構築
可撓性のヒンジ領域を介してレテプラーゼをIgG4.FcのCH2ドメインのN-末端に融合することにより、レテプラーゼ-CH2-CH3-scFv(ヒトγ4)組換え鎖を構築し、可撓性リンカー（(GGGGS)3）を介してヒトフィブリンに特異的な102-10 scFvをCH3ドメインのC-末端に融合した。
scFvは、VL-リンカー-VH配向を有した。scFvにおけるVL及びVHは、親水性リンカーであるGSTSGSGKPGSGEGSTKGを介して結合された。IgG4.Fc融合タンパク質分子構築物における組換え鎖の配列を配列番号:31に示す。上記の実施例と同様に、Expi293F細胞において構築された遺伝子の発現及び発現された融合タンパク質の精製を行った。新しい構築物についてSDS-PAGEにより定性分析を行った。図21の8％SDA-PAGE結果は、新しい構築物の組換え鎖が約100kDaのサイズ（予想サイズと同じ）を有することを示した。
以下は、調製した二本鎖(レテプラーゼ)-hIgG4.Fc-(scFv α フィブリン)分子構築物の構成である。
2018527350.tif 000028
【０３０６】
実施例23:レテプラーゼ及びヒトフィブリンに特異的なscFvを含む融合タンパク質をコードする遺伝子セグメントの構築 
可撓性リンカー（(GGGGS)3）を介してレテプラーゼをヒトフィブリンに特異的な102-10 scFvのN-末端に融合することにより、(レテプラーゼ)-scFv組換え鎖を構築した。
scFvは、VL-リンカー-VH配向を有する。scFvにおけるVL及びVHは、親水性リンカーであるGSTSGSGKPGSGEGSTKGを介して結合された。組換え融合タンパク質分子構築物の配列を配列番号:32に示す。新しい構築物についてSDS-PAGEにより定性分析を行った。図22の8％SDA-PAGE結果は、新しい構築物の組換え鎖が約72 kDaのサイズ（予想サイズと同じ）を有することを示した。
以下は、調製した(レテプラーゼ)-(scFv α フィブリン)分子構築物の構成である。
2018527350.tif 000029
【０３０７】
実施例24:テネクテプラーゼ(TNK-tPA)を含む二本鎖IgG4.Fc融合タンパク質をコードする遺伝子セグメントの構築
可撓性のヒンジ領域を介してTNK-tPAをIgG4.FcのCH2ドメインのN-末端に融合することにより、(TNK-tPA)-CH2-CH3(ヒトγ4)組換え鎖を構築した。IgG4.Fc融合タンパク質分子構築物における組換え鎖の配列を配列番号:33に示す。図23の8％SDA-PAGE分析結果は、新しい構築物の組換え鎖が約98 kDaのサイズ（予想サイズと同じ）を有することを示した。
以下は、調製した二本鎖(TNK-tPA)-hIgG4.Fc分子構築物の構成である。
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【０３０８】
実施例25: TNK-tPA 及びヒトフィブリンに特異的なヒトscFvを含む二本鎖IgG4.Fc融合タンパク質をコードする遺伝子セグメントの構築 
可撓性のヒンジ領域を介してTNK-tPAをIgG4.FcのCH2ドメインのN-末端に融合することにより、(TNK-tPA)-CH2-CH3-scFv(ヒトγ4)組換え鎖を構築し、可撓性リンカー（(GGGGS)3）を介してヒトフィブリンに特異的なヒトscFv D10をCH3ドメインのC-末端に融合した。
scFvは、VL-リンカー-VH配合を有する。scFvにおけるVL及びVHは、親水性リンカーであるGSTSGSGKPGSGEGSTKGを介して結合された。IgG4.Fc融合タンパク質分子構築物における組換え鎖の配列を配列番号:34に示す。
低レベルで発現された組換え二本鎖(TNK-tPA)-hIgG4.Fc-(scFv α フィブリン)を検出するために、ゲル電気泳動により単離されたタンパク質のゲル内消化及びトリプシン消化二本鎖(TNK-tPA)-hIgG4.Fc-(scFv α フィブリン)のタンデム質量分析を行うことにより、分子構築物を確認した。全ての質量分析実験は、200Hz SmartBean Laserが装備されたブルカー・オートフレックスIII MALDI TOF/TOF質量分析計(Bremen、Germany)を用いて、陽イオンリフレクトロンモードの遅延抽出により行われた。FlexControl3.4(Bruker Dalton)でデータを手動で収集し、Flex-Analysis3.4(Bruker Dalton)でデータ処理を行った。
Mascot検索エンジンを用いて分子量検索により、タンパク質データベースにおいてタンパク質断片を検索し、ペプチドを確認した。MS/MSスペクトルにおいて1,617.8223及び1,053.5074ダルトンに対応する2つのタンパク質断片のm/z値が、2つのTNK-tPA断片のアミノ酸配列(VYTAQNPSAQALGLGK及びQYSQPQFR)に一致した。MS/MSスペクトルにおいて830.4496ダルトンに対応するタンパク質断片のm/z値が、ヒトIgG Fc領域におけるペプチド断片のアミノ酸配列（GLPSSIEK）に一致した。MS/MSスペクトルにおいて737.3866及び620.3044ダルトンに対応する2つのタンパク質断片のm/z値が、D10 scFv領域における2つのペプチド断片のアミノ酸配列（NTAYLR及びMNSLR）に一致した。
以下は、調製した二本鎖(TNK-tPA)-hIgG4.Fc-(scFv α フィブリン)分子構築物の構成
2018527350.tif 000031
【０３０９】
実施例26:TNK-tPA及びヒトフィブリンに特異的なscFvを含む融合タンパク質をコードする遺伝子セグメントの構築
可撓性リンカー（(GGGGS)3）を介してTNK-tPAをヒトフィブリンに特異的なヒトscFv D10のN-末端に融合することにより、(TNK-tPA)-(scFv α フィブリン)組換え鎖を構築した。 
scFvは、VL-リンカー-VHの配向を有する。scFvにおけるVL及びVHは、親水性リンカーである GSTSGSGKPGSGEGSTKGを介して結合された。組換え融合タンパク質分子構築物の配列を配列番号:35に示す。低レベルで発現された組換え(TNK-tPA)-(scFv α フィブリン)を検出するために、ゲル電気泳動により単離されたタンパク質のゲル内消化及びトリプシン消化(TNK-tPA)-(scFv α フィブリン)のタンデム質量分析を行い、確認することにより、本発明の分子構築物の同定した(上記の実施例を参照)。
以下は、調製した(TNK-tPA)-(scFv α フィブリン)分子構築物の構成
2018527350.tif 000032
【０３１０】
実施例27:レテプラーゼ及びヒトフィブリンに特異的なscFvを含む融合タンパク質の生物学的活性の分析
レテプラーゼは、血餅の崩壊に関与する組換えヒト組織プラスミノーゲン活性化因子である。フィブリン-コーティングプレートで発色分析を行うことにより、ヒトフィブリンに特異的なscFv 102-10と融合した組換えレテプラーゼ含有タンパク質の生物学的活性を調べた(スキーム14)。
【０３１１】
<<スキーム14:ヒトフィブリンに特異的なscFvと融合した組換えレテプラーゼ含有タンパク質の発色分析 >>
2018527350.tif 000033
簡単に言えば、ヒトフィブリノーゲン(Sigma)を含む100μlのPBSを10μg/ウェルで96ウェルの平底プレート(Nunc)に添加してフィブリノーゲンプレートを作った。次いで、このプレートを密封して4℃で一晩放置した。以下のようにフィブリンプレートを作った。フィブリノーゲン溶液を除去し、次いで、0.05U/mlのトロンビン(Sigma)、2mMのCaCl2、及び7mMのL-システイン(Sigma)を含む100μLのTBSをウェルに添加した。トロンビン処理プレートを37℃で1時間インキュベートすることにより、フィブリンを形成させた。その後、トロンビン溶液を除去し、室温で10％スキムミルクで1時間ブロックした。
次いで、サンプル溶液をフィブリノーゲンプレート及びフィブリンプレートに加えた後、室温で1時間振とうした。その後、各プレートをPBSTで2回洗浄し、次に、PBSで洗浄して非特異的結合タンパク質を除去した。25μlの10μM ヒトプラスミノーゲン(Cat. No. 7549-1, Biovision)を添加し、37℃でフィブリノーゲン及びフィブリンプレートのそれぞれのウェルで30分間インキュベートした。次いで、62.5μlの100mM トリス緩衝液（pH8.5）、1μlの50mM発色基質であるD-Val-Leu-Lys-p-ニトロアニリド二塩酸塩(Cat. No. V7127, Sigma)（合成プラスミン基質）をこのウェルに加え、25℃で30分間インキュベートした。31.5μlの10％クエン酸を各ウェルに添加して反応を停止させた。レテプラーゼ含有タンパク質は、プラスミノーゲンを触媒してプラスミンを形成し、プラスミンが発色基質を切断して黄色のp-ニトロアニリドを放出した。プレートリーダーでp-ニトロアニリドを405 nmで測定した。
図24から分かるように、、組換え二本鎖(レテプラーゼ)-hIgG4.Fc、二本鎖(レテプラーゼ)-hIgG4.Fc-(scFv α フィブリン)、及び(レテプラーゼ)-(scFv α フィブリン)は、陽性対照タンパク質である組換えレテプラーゼ及び市販のtPAタンパク質(Cat. No. T0831, Sigma)と同様に、プロテアーゼ活性を示した。hIgG4.Fc及び抗フィブリン102-10 scFvを陰性対照として使用した。結合分析は、TPA及びレテプラーゼが共にフィブリンに結合することを示す。さらに、レテプラーゼ及びフィブリンに特異的なscFvの融合タンパク質、特に、G4Sを有するものは、より良好な結合活性を示した。
【０３１２】
実施形態の上記の説明が単なる例として与えられており、当業者によって様々な変更がなされ得ることが理解されるだろう。上記の明細書、実施例及びデータは、本発明の例示的な実施形態の構造及び使用の完全な説明を提供する。本発明の様々な実施形態が、ある程度具体的に、又は1又は複数の個々の実施形態を参照して、上述されているが、当業者は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、開示された実施形態に多数の変更を行うことができる。
【図１Ａ】
2018527350.tif 000034
【図１Ｂ】
2018527350.tif 000035
【図１Ｃ】
2018527350.tif 000036
【図１Ｄ】
2018527350.tif 000037
【図１Ｅ】
2018527350.tif 000038
【図１Ｆ】
2018527350.tif 000039
【図１Ｇ】
2018527350.tif 000040
【図１Ｈ】
2018527350.tif 000041
【図１Ｉ】
2018527350.tif 000042
【図１Ｊ】
2018527350.tif 000043
【図１Ｋ】
2018527350.tif 000044
【図２】
2018527350.tif 000045
【図３Ａ】
2018527350.tif 000046
【図３Ｂ】
2018527350.tif 000047
【図３Ｃ】
2018527350.tif 000048
【図３Ｄ】
2018527350.tif 000049
【図４】
2018527350.tif 000050
【図５Ａ】
2018527350.tif 000051
【図５Ｂ】
2018527350.tif 000052
【図６】
2018527350.tif 000053
【図７Ａ】
2018527350.tif 000054
【図７Ｂ】
2018527350.tif 000055
【図８Ａ】
2018527350.tif 000056
【図８Ｂ】
2018527350.tif 000057
【図８Ｃ】
2018527350.tif 000058
【図９Ａ】
2018527350.tif 000059
【図９Ｂ】
2018527350.tif 000060
【図１０】
2018527350.tif 000061
【図１１】
2018527350.tif 000062
【図１２】
2018527350.tif 000063
【図１３Ａ】
2018527350.tif 000064
【図１３Ｂ】
2018527350.tif 000065
【図１３Ｃ】
2018527350.tif 000066
【図１４Ａ】
2018527350.tif 000067
【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
2018527350.tif 000069
【図１５Ｂ】
2018527350.tif 000070
【図１６】
2018527350.tif 000071
【図１７】
2018527350.tif 000072
【図１８】
2018527350.tif 000073
【図１９】
2018527350.tif 000074
【図２０】
2018527350.tif 000075
【図２１】
2018527350.tif 000076
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
2018527350000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年4月27日(2018.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１中心コア、複数の第１リンクアーム、複数の第１成分、必要に応じて第１カップリングアームを含むリンカーユニットであって、
前記第１中心コアは、(1)第１ポリペプチド又は(2)第２ポリペプチドを含み、前記第１ポリペプチドは、複数のリジン(K)残基を有し、各K残基とその次のK残基との間がグリシン(G)及びセリン(S)残基を有する充填配列により区切られ、K残基の数が2〜15であり、前記第２ポリペプチドは、(Xaa-K)n配列を有し、前記Xaaが 2〜12個のエチレングリコール(EG)の繰り返し単位を有するPEG化アミノ酸であり、前記nが2〜15の整数であり、
前記複数の第１リンクアームは、それぞれ前記第１中心コアのK残基に結合され、
前記複数の第１成分は、それぞれアミド結合を形成することにより前記複数の第１リンクアームに結合され、又は、銅触媒型アジド-アルキン環化付加(CuAAC)反応、歪み促進型アジド-アルキンクリックケミストリー(SPAAC)反応、若しくは逆電子要請型ディールス・アルダー(iEDDA)反応により前記複数の第１リンクアームに結合され、各前記第１成分は、組織プラスミノーゲン活性化因子、第Xa因子若しくはトロンビンの阻害剤、又はフィブリンに特異的な一本鎖可変領域断片(scFv)であり、
前記第１中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、アジド基又はアルキン基を有し、或いは、前記第１中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、システイン残基であり、該システイン残基のチオール基は、前記第１カップリングアームに結合され、前記第１カップリングアームは、前記第１カップリングアームの遊離末端にアジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基、又はシクロオクチン基を有し、
前記複数の第１成分がそれぞれCuAAC又はSPAAC反応により前記複数の第１リンクアームに結合される場合に、前記第１中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基はシステイン残基であり、前記第１カップリングアームの遊離末端は、テトラジン基又はシクロオクテン基であり、
前記複数の第１成分がそれぞれiEDDA反応により前記複数の第１リンクアームに結合される場合に、前記第１中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、アジド基又はアルキン基を有し、或いは、前記第１中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基がシステイン残基でり、前記第１カップリングアームの遊離末端は、アジド基、アルキン基又はシクロオクチン基であるリンカーユニット。
【請求項２】
各前記第１リンクアームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖であり、
前記第１カップリングアームは、2-12個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖である請求項１に記載のリンカーユニット。
【請求項３】
前記アジド基を有するアミノ酸残基は、L-アジドホモアラニン(AHA)、4-アジド-L-フェニルアラニン、4-アジド-D-フェニルアラニン、3-アジド-L-アラニン、3-アジド-D-アラニン、4-アジド-L-ホモアラニン、4-アジド-D-ホモアラニン、5-アジド-L-オルニチン、5-アジド-d-オルニチン、6-アジド-L-リジン、又は6-アジド-D-リジンであり、
前記アルキン基を有するアミノ酸残基は、L-ホモプロパギルグリシン(L-HPG)、D-ホモプロパギルグリシン(D-HPG)、又はβ-ホモプロパギルグリシン(β-HPG)であり、
前記シクロオクテン基は、トランス-シクロオクテン(TCO)であり、前記シクロオクチン基は、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)、ジフルオロシクロオクチン(DIFO)、ビシクロノニン(BCN)であり、
前記テトラジン基は、1, 2, 3, 4-テトラジン、1, 2, 3, 5-テトラジン若しくは1, 2, 4, 5-テトラジン、又はそれらの誘導体である請求項１に記載のリンカーユニット。
【請求項４】
第2成分をさらに含み、
前記第2成分は、アジド基又はアルキン基と前記第2成分との間で起きるCuAAC反応、アジド基又はシクロオクチン基と第2成分との間で起きるSPAAC反応、シクロオクテン基又はテトラジン基と第2成分との間で起きるiEDDA反応のいずれかにより前記第１中心コアに結合される請求項１に記載のリンカーユニット。
【請求項５】
前記第１成分及び第2成分のうちの一方は、フィブリンに特異的なscFvであり、
前記第１成分及び第2成分のうちの他方は、組織プラスミノーゲン活性化因子、又は、トロンビン若しくは第Xa因子の阻害剤である請求項4に記載のリンカーユニット。
【請求項６】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子は、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、又はラノテプラーゼであり、
前記第Xa因子の阻害剤は、アピキサバン、エドキサバン、又はリバロキサバンであり、
前記トロンビンの阻害剤は、アルガトロバン又はメラガトランである請求項5に記載のリンカーユニット。
【請求項７】
第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットを含む分子構築物であって、
第１リンカーユニットは、請求項１に記載の第１リンカーユニットであり、
前記第２リンカーユニットは、
複数のアミン基を含む第２中心コアと、
前記第２中心コアの複数のアミン基にそれぞれ結合される複数の第２リンクアームと、
前記複数の第２リンクアームにそれぞれ結合される複数の第2成分と、
必要に応じて前記中心コアに結合される第２カップリングアームと、を含み、
前記第１成分及び第2成分のうちの一方は、フィブリンに特異的なscFvであり、前記第１成分及び第2成分のうちの他方は、組織プラスミノーゲン活性化因子、又は、第Xa因子若しくはトロンビンの阻害剤であり、
前記第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットは、前記第１中心コアと第２中心コア、前記第１カップリングアームと第２中心コア、前記第１カップリングアームと第２カップリングアーム、又は前記第1中心コアと第２カップリングアームのいずれかの間で起きるCuAAC反応、SPAAC反応、若しくはiEDDA反応により互いに結合される分子構築物。
【請求項８】
各前記複数の第2リンクアームは、2-20個のエチレングリコール(EG) の繰り返し単位を有するPEG鎖であり、
前記第２カップリングアームは、2-12個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖である請求項7に記載の分子構築物。
【請求項９】
前記第２中心コアは、化合物コアであり、前記化合物コアに結合される第２カップリングアームは、前記化合物コアの複数のアミン基の１つとアミド結合を形成することにより前記化合物コアに結合され、且つ前記カップリングアームは、その遊離末端にアジド基、アルキン基、シクロオクテン基、シクロオクチン基、又はテトラジン基を有する請求項7に記載の分子構築物。
【請求項１０】
前記組織プラスミノーゲン活性化因子は、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、又はラノテプラーゼであり、
前記第Xa因子の阻害剤は、アピキサバン、エドキサバン又はリバロキサバンであり、
前記トロンビンの阻害剤は、アルガトロバン又はメラガトランである請求項7に記載の分子構築物。
【請求項１１】
IgG.Fcの1対のCH2-CH3セグメントと、1対のエフェクター成分と、1対の標的化成分と、必要に応じて延長ペプチドと、必要に応じてカップリングアームとを含む分子構築物であって、
前記1対のエフェクター成分のそれぞれは、組織プラスミノーゲン活性化因子、第Xa因子の阻害剤若しくはトロンビンの阻害剤の複数の分子を含む又は薬物バンドルであり、
前記1対の標的化成分のそれぞれは、フィブリンに特異的な抗体断片であり、
前記延長ペプチドは、(G2-4S)2-8Cの配列を有し、前記1対のCH2-CH3セグメントの1つのC末端に結合され、
前記カップリングアームは、前記延長ペプチドのC末端に、それらの間で起きるチオール-マレイミド反応により結合され、
前記１対のエフェクター成分が前記組織プラスミノーゲン活性化因子である場合に、前記１対のエフェクター成分は、前記１対のCH2-CH3セグメントのN末端に結合され、前記１対の標的化成分は、前記１対のCH2-CH3セグメントのN末端に結合され、若しくはその逆もまた然りであり、
前記１対のエフェクター成分が前記薬物バンドルである場合に、前記１対のエフェクター成分は、前記１対のCH2-CH3セグメントのC末端に結合され、前記１対の標的化成分は、前記１対のCH2-CH3セグメントのN末端に結合され、
前記薬物バンドルは、中心コアと、複数のリンクアームと、第Xa因子の阻害剤又はトロンビンの阻害剤の複数の分子を含み、
前記中心コアは、複数のアミン基を有する化合物、又は複数のリジン（K）残基を有するポリペプチドであり、
前記複数のリンクアームのそれぞれは、前記アミン基の1つ又は前記K残基の1つとの反応により前記中心コアに結合される1つの末端を有し、且つ、その遊離末端にマレイミド基を有し、
前記第Xa因子の阻害剤又はトロンビンの阻害剤の複数の分子のそれぞれの分子は、マレイミド基、NHS、アジド基、アルキン基、テトラジン基、又は歪んだアルキン基との反応により、前記リンクアームを介して前記中心コアに結合され、
前記薬物バンドルは、前記カップリングアームに、それらの間で起きるiEDDA反応、SPAAC反応、又はCuAAC反応により結合される分子構築物。
【請求項１２】
前記第Xa因子の阻害剤は、アピキサバン、エドキサバン、又はリバロキサバンであり、
前記トロンビンの阻害剤は、アルガトロバン又はメラガトランであり、
前記組織プラスミノーゲン活性化因子は、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ又はラノテプラーゼである請求項11に記載の分子構築物。
【請求項１３】
前記第２中心コアは、（1）複数のリジン（K）残基及び（2）(Xaa-K)n配列を含み、
前記K残基の数が2〜15であり、各K残基とその次のK残基がグリシン(G)及びセリン(S)残基を有する充填配列により区切られ、
前記Xaaは、2〜12個のEGの繰り返し単位を有するPEG化アミノ酸であり、前記nは、2〜15の整数である請求項7に記載の分子構築物。
【請求項１４】
前記第２中心コアはポリペプチドであり、前記第２中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基はアジド基又はアルキン基を有し、或いは、前記第２中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基はシステイン残基であり、前記システイン残基のチオール基は、前記第２カップリングアームに結合され、前記第２カップリングアームはその遊離末端にアジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基、又はシクロオクチン基を有する請求項7に記載の分子構築物。
【国際調査報告】
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