(57)【要約】  一部の実施態様では、本発明は、シルクフィブロイン溶液を提供するステップ、および、シルクフィブロイン溶液からシルク耳チューブを形成するステップを含む、再吸収可能な耳チューブを作製する方法を提供し、ここで、シルク耳チューブは、２ｍｍ未満の長さであり、１．５ｍｍ未満の外径を有し、およびここで、シルク耳チューブは、再吸収可能である。一部の実施態様では、本発明は、シルク耳チューブを対象の外耳道に導入するステップを含む、中耳炎を処置する方法も提供し、ここで、シルク耳チューブは、２ｍｍ未満の長さであり、１．５ｍｍ未満の外径を有し、およびここで、シルク耳チューブは、対象によって再吸収される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
再吸収可能な耳チューブを作製する方法であって、
シルクフィブロイン溶液を提供するステップ；および
前記のシルクフィブロイン溶液からシルク耳チューブを形成するステップ、
を含み、
前記のシルク耳チューブは、２ｍｍ未満の長さであり、１．５ｍｍ未満の外径を有し、
前記のシルク耳チューブは、再吸収可能である、
方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、
前記のシルク耳チューブは、ゲル紡糸またはゲル沈着を介して形成される、
方法。
【請求項３】
請求項１の方法であって、
前記のシルク耳チューブは、浸漬コーティングまたは溶液沈着を介して形成される、
方法。
【請求項４】
請求項１の方法であって、
前記のシルク耳チューブは、マイクロ造型を介して形成される、
方法。
【請求項５】
請求項１の方法であって、
前記方法は、複数のポアを前記のシルク耳チューブに導入するステップをさらに含む、
方法。
【請求項６】
請求項５の方法であって、
前記ポアは、前記のシルク耳チューブを形成する前に、前記シルクフィブロイン溶液とポロゲンを関連させることによって導入される、
方法。
【請求項７】
請求項６の方法であって、
前記ポロゲンは、ポリエチレンオキシド、ＮａＣｌ、アルカリ金属、ハロゲン化アルカリ土類金属、リン酸、硫酸、糖結晶、水溶性マイクロスフェア、多糖類、タンパク質マイクロスフェア、ワックス粒子、および、合成ポリマー粒子から選択される、
方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項の方法であって、
前記のシルク耳チューブは、少なくとも２つの層を含む、
方法。
【請求項９】
請求項１の方法であって、
前記のシルク耳チューブの形成前または形成中に、少なくとも１つの治療剤を、前記シルクフィブロイン溶液と関連させるステップをさらに含む、
方法。
【請求項１０】
請求項９の方法であって、
前記の少なくとも１つの治療剤は、抗生物質、鎮痛剤、およびステロイドからなる群より選択される、
方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項の方法であって、
前記のシルクフィブロイン溶液は、１％〜３０％ｗｔのシルクフィブロインを含む、
方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項の方法であって、
前記のシルク耳チューブは、１日〜１週を含めた再吸収速度を有する、
方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項の方法であって、
前記のシルク耳チューブは、８日〜２年を含めた再吸収速度を有する、
方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項の方法であって、
前記のシルク耳チューブは、１〜６０％のベータシート含有量を含む、
方法。
【請求項１５】
請求項１４の方法であって、
実質的なベータシート含有量は、オートクレービング、水蒸気アニーリング、および、メタノールによる処理の少なくとも１つによって導入される、
方法。
【請求項１６】
中耳炎を処置する方法であって、
シルク耳チューブを対象の外耳道に導入するステップを含み、
ここで、前記のシルク耳チューブは、２ｍｍ未満の長さであり、１．５ｍｍ未満の外径を有し、および、前記のシルク耳チューブは、前記対象によって再吸収される、
方法。
【請求項１７】
請求項１６の方法であって、
前記のシルク耳チューブの導入前に、少なくとも１つの治療剤を前記対象に投与するステップをさらに含む、
方法。
【請求項１８】
請求項１６の方法であって、
前記のシルク耳チューブの導入後に、少なくとも１つの治療剤を前記対象に投与するステップをさらに含む、
方法。
【請求項１９】
請求項１６の方法であって、
前記のシルク耳チューブの導入と実質的に同時に（ｐｒｉｏｒ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ  ｗｉｔｈ）、少なくとも１つの治療剤を前記対象に投与するステップをさらに含む、
方法。
【請求項２０】
請求項１６から１９のいずれか一項の方法であって、
前記の少なくとも１つの治療剤は、抗生物質、鎮痛剤、またはステロイドである、
方法。
【請求項２１】
請求項１６から２０のいずれか一項の方法であって、
前記中耳炎は、急性中耳炎、浸出のある中耳炎、または慢性の化膿性中耳炎である、
方法。
【請求項２２】
請求項１６から２１のいずれか一項の方法であって、
前記のシルク耳チューブは、１日〜１週を含めた期間にわたって再吸収される、
方法。
【請求項２３】
請求項１６から２１のいずれか一項の方法であって、
前記のシルク耳チューブは、８日〜２年を含めた期間にわたって再吸収される、
方法。
【請求項２４】
請求項１６から２２のいずれか一項の方法であって、
前記のシルク耳チューブは、１〜６０％のベータシート含有量を含む、
方法。
【請求項２５】
請求項２４の方法であって、
実質的なベータシート含有量は、オートクレービング、水蒸気アニーリング、および、メタノールによる処理の少なくとも１つによって導入される、
方法。
【請求項２６】
請求項１６から２５のいずれか一項の方法であって、
前記のシルク耳チューブは、少なくとも２つの層を含む、
方法。
【請求項２７】
請求項２６の方法であって、
前記のシルク耳チューブは、少なくとも１つの多孔質層を含む、
方法。
【請求項２８】
請求項１から２７のいずれか一項の方法であって、
前記のシルクフィブロインは、スパイダーシルク、カイコシルク、および組み換えシルクからなる群より選択される、
方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
鼓膜切開術チューブは、中耳の通気を維持するために、および、中耳内の流体の蓄積を防ぐために、鼓膜の中に挿入される小さなチューブである。鼓膜切開術チューブの配置は、子どもでは全身麻酔下で行なわれる、単一の最も一般的な外来通院の外科的手順であり、しばしば中耳炎または気圧性外傷の処置として、米国において毎年６６７，０００の手順が行なわれる。手順あたり、およそ＄２，７００であり、合計財政負担は、周術期訪問および追加試験を除き、１８億ドル近くに見積もられる。３才までに子どもの７％近くが所定の位置にチューブを有する。残念なことに、以前の鼓膜切開術チューブは、慢性炎症および瘢痕を引き起こすこと、および繰り返しの外科的介入を行なう必要があることを含む、様々な理由で満足なものでないことが証明されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
鼓膜切開術チューブ（「耳チューブ」とも称される）を製造する以前の試みとは異なり、本発明は、対象において実質的な炎症性反応を引き起こさず、任意の様々な物理的および機械的特性を有して製造され得る、生体吸収性を提供する。例えば、様々な実施態様によれば、提供されるシルク耳チューブは、患者の体内に再吸収される前に、対象において何週間も、何月も、または何年もの間、存続するように製造され得る。また、一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブは多層を含み、そのそれぞれが、ポア、治療剤、および異なる機械的および／または物理的特性の１つまたは複数を含み得る。一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブは、それらの長さに沿って異なる組成および／または特性を有してもよい。一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブは、フランジ、ベベル、および／または他の機構を含み得る。
【０００３】
一部の実施態様では、本発明は、シルクフィブロイン溶液を提供するステップ、および、シルクフィブロイン溶液からシルク耳チューブを形成するステップを含む、再吸収可能な耳チューブを作製する方法を提供し、ここで、シルク耳チューブは、２ｍｍ未満の長さであり、１．５ｍｍ未満の外径を有し、およびここで、シルク耳チューブは、再吸収可能である。
【０００４】
一部の実施態様では、本発明は、シルク耳チューブを対象の外耳道に導入するステップを含む、中耳炎を処置する方法も提供し、
ここで、シルク耳チューブは、２ｍｍ未満の長さであり、１．５ｍｍ未満の外径を有し、およびここで、シルク耳チューブは、対象によって再吸収される。一部の実施態様では、中耳炎は、急性中耳炎、浸出のある中耳炎、または慢性の化膿性中耳炎である。
【０００５】
様々な実施態様によれば、提供されるシルク耳チューブは、任意の公知の方法を介して形成され得る。一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブは、ゲル紡糸またはゲル沈着を介して形成される。一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブは、浸漬コーティングまたは溶液沈着を介して形成される。一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブは、注入成形、マイクロ造型、または機械加工を介して形成される。
【０００６】
一部の実施態様では、提供される方法は、シルク耳チューブが多層を含むのを可能にし得る。一部の実施態様では、シルク耳チューブは、少なくとも２つの層（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０またはより多くの層）を含む。一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブは、単一の層を含む。
【０００７】
一部の実施態様では、提供される方法は、例えば、特定のシルク耳チューブ（単数または複数）を、特定の適用および／または対象に適合させるための、１つまたは複数のさらなるステップを含む。一部の実施態様では、提供される方法は、提供されるシルク耳チューブの少なくとも１つの層に、複数のポアを導入するステップをさらに含む。一部の実施態様では、ポアは、シルク耳チューブを形成する前に、ポロゲンをシルクフィブロイン溶液と関連させることによって導入される。一部の実施態様では、ポロゲンは、ポリエチレンオキシド、ＮａＣｌ、アルカリ金属、ハロゲン化アルカリ土類金属、リン酸、硫酸、糖結晶、水溶性マイクロスフェア、多糖類、タンパク質マイクロスフェア、ワックス粒子、および、合成ポリマー粒子から選択される。一部の実施態様では、ポアは、他の公知の方法、例えば、凍結乾燥またはガス放散の方法を用いて導入される。
【０００８】
様々な実施態様によれば、シルクフィブロイン溶液の１つまたは複数の特性は、異なってよく、制限されないが、ほんの数個を挙げれば、シルクフィブロイン溶液中のシルクフィブロイン量、シルクフィブロイン溶液中のさらなる材料の存在または不存在、および、シルクフィブロイン溶液中の溶媒の組成を含む。例えば、一部の実施態様では、シルクフィブロイン溶液は、水中に１％〜３０％ｗｔのシルクフィブロインを含む。一部の実施態様では、シルクフィブロイン溶液は、例えばグリセロールおよび／またはグリコールを含む１つまたは複数の他の添加剤を含んでもよい。一部の実施態様では、１つまたは複数の添加剤の添加は、提供されるシルク耳チューブの形成および／または形態の制御に有用であり得る。
【０００９】
一部の実施態様では、提供される方法において用いられるシルク耳チューブは、少なくとも１つの治療剤を含む。一部の実施態様では、提供される方法は、シルク耳チューブの形成前または（ｏｆ）形成中に、少なくとも１つの治療剤をシルクフィブロイン溶液と関連させるステップをさらに含んでよい。一部の実施態様では、提供される方法は、シルク耳チューブの導入前に、少なくとも１つの治療剤を対象に投与するステップをさらに含む。一部の実施態様では、提供される方法は、シルク耳チューブの導入後に、少なくとも１つの治療剤を対象に投与するステップをさらに含む。一部の実施態様では、提供される方法は、シルク耳チューブの導入と実質的に同時に、少なくとも１つの治療剤を対象に投与するステップをさらに含む。一部の実施態様では、前記の少なくとも１つの治療剤は、抗生物質、鎮痛剤、および、ステロイドからなる群より選択される。
【００１０】
様々な実施態様によれば、提供されるシルク耳チューブは、対象において再吸収可能である（すなわち、分解されて対象の体内に吸収される）。一部の実施態様では、シルク耳チューブは、１日〜１週を含めた再吸収速を有する。一部の実施態様では、シルク耳チューブは、８日〜２年を含めた再吸収速度を有する。
【００１１】
提供されるシルク耳チューブの１つまたは複数の物理的特性は、特定の適用および／または対象のニーズに合うために変更され得ることが検討される。例えば、一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブは、実質的なベータシート含有量を含む。一部の実施態様では、実質的なベータシート含有量は、オートクレービング、水蒸気アニーリング、および、メタノールによる処理の、少なくとも１つによって導入される。一部の実施態様では、ベータシート含有量は、１〜７５％（例えば、１〜１０％、１〜２０％、１〜３０％、１〜４０％、１〜５０％、１〜６０％、１０〜２０％、１０〜３０％、１０〜４０％、１０〜５０％、１０〜６０％、２０〜６０％、２０〜５０％、２０〜４０％、２０〜３０％、または０〜６０％）であってよい。特定の理論に縛られることを望まずに、より高いベータシート含有量は、提供されるシルク耳チューブのインビボでの分解をより遅くさせると考えられる。一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブのベータシート含有量は、任意の適用に適切な様式で異なってよい。例えば、一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブは、ベータシート含有量の勾配を含んでよい。一部の実施態様では、勾配は、少なくとも１つの他の層とは異なる（例えば、より高い、またはより低い）ベータシート含有量を有する少なくとも１つの層を有する、多層のシルク耳チューブを含んでよい。
【００１２】
様々な実施態様によれば、任意のシルクフィブロインは、提供される方法およびシルク耳チューブにおいて用いられ得る。一部の実施態様では、シルクフィブロインは、スパイダーシルク（例えば、Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｉａｖｉｐｅｓ由来）、カイコシルク（例えば、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ由来）、および、スパイダーシルクまたはカイコ由来の組み換えシルクからなる群より選択される。
【００１３】
本明細書において、刊行物、特許、または特許出願に対する任意の引用は、それらの全体で参照により援用される。約（ａｂｏｕｔ）／およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）を伴いまたは伴わずに本出願において用いられる任意の数字は、関連のある分野における通常の知識を有する者によって理解される任意の正常な変動をカバーすることを意味する。
【００１４】
本発明の他の特徴、目的、および利点は、後の詳細な説明において明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施態様を説明しながら、説明としてのみ与えられて、限定ではないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の様々な変更および改変は、詳細な説明から当業者に明らかになる。
【００１５】
［定義］
本出願において、文脈からそれ以外が明らかでない限り、（ｉ）用語「ａ」は、「少なくとも１つ」を意味することが理解され得て；（ｉｉ）用語「または」は、「および／または」を意味することが理解され得て；（ｉｉｉ）用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、それら自体でまたは１つまたは複数のさらなる構成要素またはステップとともに示されたかにどうかかかわらず、箇条書きされた構成要素またはステップを包含することが理解され得て；および、（ｉｖ）用語「約（ａｂｏｕｔ）」および「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、等価として用いられ、当業者によって理解される標準的な変動を許容することが理解され得て；および、（ｖ）範囲が提供される場合は、エンドポイントが含まれる。
【００１６】
薬剤：本明細書において用いられる用語「薬剤」は、例えば、ポリペプチド、核酸、糖類、脂質、小分子、金属、またはそれらの組み合わせを含む、任意の化学的なクラスの物質または化合物を指し得る。文脈から明らかであるように、一部の実施態様では、薬剤は、細胞または生物、または、それらの画分、抽出物または構成要素であってよく、または含んでよい。一部の実施態様では、薬剤は、自然において見られる、および／または、自然から得られるという点で、天然物であり、または含む。一部の実施態様では、薬剤は、人の手の働きを通してデザイン、改変および／または生産され、および／または、天然に見られないという点で、人造である１つまたは複数の物質であり、または含む。一部の実施態様では、薬剤は、単離または純粋な形態で使用され得て；一部の実施態様では、薬剤は、クルード形態で使用され得る。一部の実施態様では、潜在的な薬剤は、例えば、それらの中の活性の薬剤を同定または特性化するためにスクリーニングされ得るコレクションまたはライブラリーとして提供される。本発明に従って使用され得る薬剤の一部の特定の実施態様は、小分子、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム）、ペプチド、ペプチド模倣物などを含む。一部の実施態様では、薬剤は、ポリマーであり、または含む。一部の実施態様では、薬剤はポリマーではなく、および／または、任意のポリマーから実質的にフリーである。一部の実施態様では、薬剤は、少なくとも１つの高分子部分を含む。一部の実施態様では、薬剤は、任意の高分子部分を欠き、または実質的にフリーである。
【００１７】
およそ（Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）：本明細書において用いられる用語「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」は、１つまたは複数の目的値に適用されるとき、述べられた参照値と似た値を指す。特定の実施態様では、用語「およそ」または「約」は、別段の記載がない限り、または、文脈からそれ以外が明白でない限り、いずれかの方向で（よりも大きい、または、よりも小さい）、述べられた参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満に入る値の範囲を指す（そのような数が、可能値の１００％を超える場合を除く）。
【００１８】
関連する（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）：２つのイベントまたは物質は、その用語が本明細書において使われるとき、一方の存在、レベル、および／または形状が、他方のものと相関するならば、互いに「関連する」。例えば、特定の物質（例えば、ポリペプチド、遺伝子シグネチャ、代謝物など）は、その存在、レベル、および／または形状が、疾患、障害、または状態の、発生率および／または脆弱性と、（例えば、関連のある集団にわたって）相関するならば、特定の疾患、障害、または状態と関連すると考えられる。一部の実施態様では、２以上の物質は、それらが互いに物理的に近接して存在および／または存続するようにそれらが直接的または間接的に相互作用するならば、互いと物理的に「関連する」。一部の実施態様では、互いに物理的に関連する２以上の物質は、互いに共有結合され；一部の実施態様では、互いに物理的に関連する２以上の物質は、互いに共有結合されないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気作用、およびそれらの組み合わせを用いて、非共有的に結合される。
【００１９】
生体適合性：本明細書において用いられる用語「生体適合性」は、生組織に対して、例えばインビボでそのような組織と接触して置かれた場合に、重大な害を引き起こさない材料を指す。特定の実施態様では、材料は、それらが細胞に対して毒性でないならば、「生体適合性」である。特定の実施態様では、材料は、インビトロでの細胞へのそれらの添加が２０％以下の細胞死をもたらすならば、および／または、インビボでのそれらの投与が重大な炎症または他のそのような副作用を誘導しないならば、「生体適合性」である。
【００２０】
生分解性：本明細書において用いられる用語「生分解性」は、細胞中に導入された場合に、細胞に対する重大な毒性作用を伴わずに、細胞が再利用または処理のいずれかをすることができる構成要素に、（例えば、細胞の機構によって、例えば、酵素分解によって、加水分解によって、および／または、それらの組み合わせによって）分解される材料を指す。特定の実施態様では、生分解性材料の分解によって生産される構成要素は、生体適合性であり、したがって、重大な炎症および／または他の副作用をインビボで誘導しない。一部の実施態様では、生分解性ポリマー材料は、それらの構成要素モノマーに分解する。一部の実施態様では、生分解性材料（例えば、生分解性ポリマー材料を含む）の分解は、エステル結合の加水分解を含む。これに代えてまたはこれに加えて、一部の実施態様では、生分解性材料（例えば、生分解性ポリマー材料を含む）の分解は、ウレタン結合の切断を含む。例示的な生分解性ポリマーは、例えば、ヒドロキシ酸、例えば乳酸およびグリコール酸のポリマーを含み、制限されないが、ポリ（ヒドロキシル酸）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、および、ＰＥＧ、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）との共重合体、それらのブレンドおよび共重合体を含む。多くの天然起源ポリマーも生分解性であり、例えば、アルブミン、コラーゲン、ゼラチンおよびプロラミンのようなタンパク質、例えば、ゼイン、および多糖類、例えば、アルギン酸、セルロース誘導体およびポリヒドロキシアルカノエート、例えば、ポリヒドロキシ酪酸、それらのブレンドおよび共重合体を含む。当業者は、どのような場合にそのようなポリマーが生体適合性および／またはそれらの生分解性誘導体であるかを理解し、または決定することが可能である（例えば、当技術分野で知られているように、特定の化学基の置換または付加のみが異なる実質的に同一の構造によって、親ポリマーに関する）。
【００２１】
併用療法：本明細書において用いられる用語「併用療法」は、対象が、２以上の治療的レジメン（例えば、２以上の治療剤）に同時に曝される状況を指す。一部の実施態様では、２以上の薬剤は、または（ｏｒ）、同時に投与され得て；一部の実施態様では、そのような薬剤は、連続して投与され得て；一部の実施態様では、そのような薬剤は、重なった投与レジメンで投与される。
【００２２】
組成物：本発明に係る「組成物」または「医薬組成物」は、同一レジメンの一部としての投与または同時投与のための、本明細書に記載の２以上の薬剤の組み合わせを指す。全ての実施態様において薬剤の組み合わせが物理的な混合をもたらす必要はなく、すなわち、別個の共薬剤として組成物のそれぞれの構成要素の投与が可能であり；しかしながら、多くの患者または当該分野の熟練者は、２以上の成分の混合である組成物を、薬学的に許容できる担体、希釈剤、または賦形剤において調製して、組み合わせの構成要素成分を同時に投与することを可能にすることが有利であると考え得る。
【００２３】
改善、増大または低減：本明細書において用いられるように、またはそれらの文法上の等価物は、ベースライン測定、例えば、本明細書に記載の処置の開始前の同一個体における測定、または、本明細書に記載の処置の不存在下でのコントロール個体（または、多数のコントロール個体）における測定と比較される値を示す。一部の実施態様では、「コントロール個体」は、処置される個体と同一形態の疾患または損傷に悩んでいる個体である。
【００２４】
対象：「対象」は、哺乳類（例えばヒト）を意味する。一部の実施態様では、対象は、関連のある疾患、障害または状態を患っている。一部の実施態様では、対象は、疾患、障害、または状態を引き起こしやすい。一部の実施態様では、対象は、疾患、障害または状態の１つまたは複数の症候または特徴を示す。一部の実施態様では、対象は、疾患、障害、または状態のいかなる症候または特徴も示さない。一部の実施態様では、対象は、疾患、障害、または状態に対する脆弱性またはリスクに特徴的な１つまたは複数の特徴を有する者である。一部の実施態様では、対象は患者である。一部の実施態様では、対象は、診断および／または治療が施される、および／または、施されたことのある個体である。
【００２５】
実質的：本明細書において用いられる用語「実質的」は、目的の特徴または特性の全体的またはほぼ全体的な程度または度合いを示す定性的状態を指す。生物学的分野における通常の知識を有する者は、生物学的および化学的現象は、完了するおよび／または完全に進行するまたは絶対的な結果を達成または回避することは、仮にあるとしても滅多にないということを理解している。したがって、用語「実質的」は、本明細書において、多くの生物学的および化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如を捕捉するために用いられる。
【００２６】
治療剤：本明細書において用いられる語句「治療剤」は、一般に、生物に投与されたときに所望の薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。一部の実施態様では、薬剤は、適切な集団にわたって統計的に有意な効果を示すならば、治療剤であると考えられる。一部の実施態様では、適切な集団は、モデル生物の集団であり得る。一部の実施態様では、適切な集団は、様々な基準、例えば、特定の年齢群、性別、遺伝的背景、以前から存在する臨床状態などによって定義され得る。一部の実施態様では、治療剤は、疾患、障害、および／または状態の１つまたは複数の症候または特徴を、軽減する、寛解させる、緩和する、阻害する、予防する、発症を遅らせる、重症度を低減させる、および／または、発生率を低減させるために用いられ得る物質である。一部の実施態様では、「治療剤」は、ヒトに対する投与に関して市場に出すことができる前に、政府機関によって承認されている、またはその必要のある、薬剤である。一部の実施態様では、「治療剤」は、ヒトに対する投与に関して処方箋が必要な薬剤である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】浸漬コーティングを用いて製造されたシルクチューブの画像を示す。（パネルａ）３回浸漬コーティング、（パネルｂ〜ｄ）５回浸漬コーティング、（パネルａ、ｂ）割られた横断面、（パネルｃ）拡大された割られた横断面、（パネルｄ）側面図。
【図２】例示的な製作工程の一部を示す。（パネルＡ）ゲルを紡いだシルクチューブの製作のデジタル写真。左の画像では、ポリプロピレンチューブ（１０９０μｍ外径）を集めて、チューブの一方の末端を、より大きな内側ルーメンが合うように作成した。中央の画像では、非常に濃縮されたシルク溶液を、回転している金属ワイヤ上に紡いだ。右の画像では、ゲルを紡いだシルクチューブが凍結乾燥後に得られた。（パネルＢ）シルクカテーテルの概略。一方の末端を濃縮されたシルク溶液中に浸漬して乾燥させることによって、チューブの他方の末端をシルクでキャップした。（パネルＣ）写真は、ゲルを紡いだチューブが、乾燥した場合でさえ柔軟性があることを示す。
【図３】耳チューブ製作に関する例示的な提供される方法を示す。（パネルＡ）提供される注入成形工程を介して耳チューブを製造するための概略を示す。注入、凍結乾燥、メタノール処理、乾燥（パネルＢ）および機械加工の製作ステップに従ってチューブを製作した（側面図（パネルＣ）、および上面図（パネルＤ）で示される）。（パネルＥ）ＳＥＭ画像は、この例示的な実施態様において、低い度合いの多孔性を示す。
【図４】パネル（Ａ）は、Ｉｎｓｔｒｏｎ機械的試験が行われた結果を示し、圧縮弾性率は、図３に示される（図３、パネルＣ、Ｄ、およびＥに示される）例示的な耳チューブに関して計算された。パネル（Ｂ）例示的な圧縮弾性率が示され、パネル（Ｃ）は、市場で売られている現行のＰＴＦＥチューブの圧縮弾性率であり、同様の方法を用いて製作されるシルク骨スクリューよりもいっそう低い（パネルＣ）。
【図５】（パネルＡ）は、例示的な耳チューブのベンチトップ凍結乾燥の結果を示し、（パネルＢ）および（パネルＣ）は、−２０℃〜−３０℃の温度で６時間、提供される耳チューブの例示的なメタノールに基づく脱水を示し、（パネルＢ）は、２５％シルクフィブロイン溶液で作られた耳チューブに関する結果を示し、（パネルＣ）３３％シルクフィブロイン溶液で作られた耳チューブに関する結果を示す。
【図６】多孔性コーティングを有する耳チューブを得るために、ＰＥＯ／シルク溶液を混合するステップ（パネルＡ）、ペイントブラシを用いてコーティングをペイントするステップ（パネルＢ）、メタノール処理（パネルＣ）、および、乾燥するステップ（パネルＤ）を含む、提供されるコーティング工程の例示的な写真を示す。
【図７】とりわけ鼓膜付着および分解のために多孔質層を提供する、耳チューブ上のＰＥＯコーティングを含む、図６に示される方法に従って作られる特定の提供される組成物の例示的な写真を示す。
【図８】滅菌後にＩｍａｇｅＪソフトウェアで測定した、図７に示される特定の提供される実施態様の例示的な画像および寸法を示す（内径を１．１ｍｍに調整した）。
【図９】５．２１＊１０７ＣＦＵ／ｍＬのグラム陰性ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ細菌株で、３７℃で２４時間インキュベーション後の、浸漬コーティング方法を介した特定の薬剤溶出チューブの有効性に関する例示的な結果を示す（上列）。図９の上列に示されるように、コーティング薬物でコーティングされた例示的な提供されるシルク耳チューブ（チューブ＋Ｄ）は、薬物コーティングを有さない同様のチューブ（チューブ−Ｄ）およびグラム陰性細菌を含むＬＢ培地のポジティブコントロール（ＬＢ、Ｇ−）と比較して、抗菌活性を示す。さらに２４時間の培地の培養後に、薬剤溶出チューブは、薬物を含まないチューブ（下列、中央）およびポジティブコントロール（下列、左）と比較して、増殖防止および細菌死滅の両方とも効果的であったことを示す（下列、右）。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、とりわけ、高度にカスタマイズ可能な物理的および機械的特性を有する再吸収可能なシルク耳チューブ、ならびに、提供されるシルク耳チューブを製造および使用する方法を提供する。
【００２９】
様々な実施態様によれば、本発明は、シルクフィブロイン溶液を提供するステップ、および、シルクフィブロイン溶液からシルク耳チューブを形成するステップを含む、再吸収可能な耳チューブを作製する方法を提供し、ここで、シルク耳チューブは、２ｍｍ未満の長さであり、１．５ｍｍ未満の外径を有し、およびここで、シルク耳チューブは、再吸収可能である。一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブは、実質的に完全に再吸収可能である。一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブは、部分的にのみ再吸収可能である。
【００３０】
シルクフィブロイン溶液
本明細書に記載の方法および組成物において用いられるシルクフィブロイン溶液は、例えばＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ由来の溶解されたカイコシルクを含む溶液から得られ得る。あるいは、シルクフィブロイン溶液は、例えばＮｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ由来の溶解されたスパイダーシルクを含む溶液から得られ得る。また、シルクフィブロイン溶液は、例えば、細菌、酵母、哺乳類の細胞、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物由来の遺伝学的に操作されたシルクを含む溶液から得ることもできる。例えば、ＷＯ９７／０８３１５および米国特許５，２４５，０１２を参照。一部の実施態様では、遺伝学的に操作されたシルクは、例えば、治療剤、例えば、サイトカイン、酵素、または任意の数のホルモンまたはペプチド系薬物、抗菌剤および関連基質との融合タンパク質を含むことができる。
【００３１】
様々な実施態様によれば、シルクフィブロイン溶液は、当業者に公知の任意の慣習の方法によって調製され得る。一部の実施態様では、溶液は水溶液である。例えば、Ｂ．ｍｏｒｉ繭は、水溶液中で約３０分間ボイルされる。一部の実施態様では、水溶液は、約０．０２ＭのＮａ２ＣＯ３である。繭は、例えば水を用いてリンスされてセリシンタンパク質が抽出され得て、抽出されたシルクは、塩類水溶液中に溶解される。この目的に有用な例示的な塩類は、臭化リチウム、チオシアン酸リチウム、硝酸カルシウム、または、シルクの可溶化が可能な他の化学物質を含む。好ましくは、一部の実施態様では、抽出されたシルクは、約９〜１２ＭのＬｉＢｒ溶液中に溶解される。塩は、その結果として、例えば透析を用いて除去される。
【００３２】
必要ならば、溶液を、それから、例えば、吸湿性ポリマー、例えば、ＰＥＧ、ポリエチレンオキシド、アミロースまたはセリシンに対する透析を用いて、濃縮することができる。好ましくは、ＰＥＧは、８，０００〜１０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量であり、２５〜５０％の濃度を有する。ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ，ＭＷ  ＣＯ  ３５００）が好ましくは用いられる。しかしながら、任意の透析システムが用いられ得る。透析は１０〜３０％の終濃度のシルク水溶液をもたらすのに十分な期間である。ほとんどの場合では、２〜１２時間の透析が十分である。
【００３３】
様々な実施態様によれば、シルク溶液は、任意の様々な濃度のシルクフィブロインを含んでよい。一部の実施態様では、シルク溶液は、０．１〜４０重量％シルクフィブロインを含んでよい。一部の実施態様では、シルク溶液は、約０．５重量％〜４０重量％（例えば、０．５重量％〜２５重量％、０．５重量％〜２０重量％、０．５重量％〜１５重量％、０．５重量％〜１０重量％、０．５重量％〜５重量％、０．５重量％〜１．０重量％）を含めたシルクフィブロインを含んでよい。一部の実施態様では、シルク溶液は、１５〜３０重量％（例えば、２０〜２５重量％）を含めたシルクフィブロインを含んでよい。一部の実施態様では、シルク溶液は、少なくとも０．１重量％（例えば、少なくとも０．５重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％）のシルクフィブロインを含んでよい。一部の実施態様では、シルク溶液は、最大で３０重量％（例えば、最大で４０重量％、３５重量％、３０重量％、２５重量％、２０重量％、１５重量％、１４重量％、１３重量％、１２重量％１１重量％、１０重量％、５重量％、４重量％、３重量％、２重量％、１重量％）のシルクフィブロインを含んでよい。
【００３４】
一部の実施態様では、本明細書に記載のシルク耳チューブ組成物、およびそれらを使用する方法は、任意の有機溶媒の不存在下で行なわれ得る。したがって、これらの組成物および方法は、不安定分子、例えば、生物活性剤または治療薬の取り込みに特に適していて、特定の実施態様では、制御放出生体材料を生産するために用いられ得る。好ましくは、当該方法は、水中でのみ行なわれる。
【００３５】
あるいは、一部の実施態様では、シルクフィブロイン溶液は、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）などの有機溶媒を用いて生産され得る。そのような方法は、例えば、Ｌｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｉ．Ｐｏｌｙ  Ｓｃｉ．２００１，７９，２１９２−２１９９；Ｍｍ，ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｎ  Ｉ  Ｇａｋｋａｉｓｈｉ  １９９７，５４，８５−９２；Ｎａｚａｒｏｖ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００４  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；５（３）：７１８−２６に記載されている。
【００３６】
一部の実施態様では、非シルクの生体適合性ポリマーをシルク溶液に加えて、本明細書に記載のシルク耳チューブにおける混成マトリックスを生産することもできる。本明細書に記載の組成物において有用な生体適合性ポリマーは、例えば、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）（ＵＳ６，３０２，８４８）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（ＵＳ６，３９５，７３４）、コラーゲン（ＵＳ６，１２７，１４３）、フィブロネクチン（ＵＳ５，２６３，９９２）、ケラチン（ＵＳ６，３７９，６９０）、ポリアスパラギン酸（ＵＳ５，０１５，４７６）、ポリリジン（ＵＳ４，８０６，３５５）、アルギン酸（ＵＳ６，３７２，２４４）、キトサン（ＵＳ６，３１０，１８８）、キチン（ＵＳ５，０９３，４８９）、ヒアルロン酸（ＵＳ３８７，４１３）、ペクチン（ＵＳ６，３２５，８１０）、ポリカプロラクトン（ＵＳ６，３３７，１９８）、ポリ乳酸（ＵＳ６，２６７，７７６）、ポリグリコール酸（ＵＳ５，５７６，８８１）、ポリヒドロキシアルカノエート（ＵＳ６，２４５，５３７）、デキストラン（ＵＳ５，９０２，８００）、およびポリ酸無水物（ＵＳ５，２７０，４１９）を含む。一部の実施態様では、２以上の生体適合性ポリマーが用いられ得る。
【００３７】
寸法
提供されるシルク耳チューブの外径は、特定の適用および／または対象のニーズに従って変更することができ、例えば、約０．１ｍｍ〜約４ｍｍまたはそれよりも大きい。本明細書に記載されるように、一部の実施態様では、シルク耳チューブまたは特定の内側ルーメン直径の構築物は、シルク耳チューブを作製する工程において、所望の直径のロッドを用いることによって準備され得る。特定のサイズは、例えば、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１．０ｍｍ、１．２ｍｍ、１．４ｍｍ、１．６ｍｍ、１．８ｍｍ、２．０ｍｍ、２．２ｍｍ、２．４ｍｍ、２．６ｍｍ、２．８ｍｍ、３．０ｍｍ、３．２ｍｍ、３．４ｍｍ、３．６ｍｍ、および３．８ｍｍを含む。好ましいサイズは、範囲として表現することもでき、例えば、０．１〜２．９ｍｍ、０．１〜２．５ｍｍ、０．１〜２ｍｍ、０．１〜１．５ｍｍ、０．１〜１ｍｍ、１．０〜３ｍｍ、１．０〜２ｍｍ、１．０〜１．５ｍｍなどである。一部の実施態様では、提供される実施態様は、これらの値の１つまたは複数から、最大で２０％（例えば、最大で１５％、１０％、５％）変化し得る。
【００３８】
また、提供されるシルク耳チューブの長さは、適用および／または対象−特有の様式でも変化し得る。一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブは、０．５〜３ｍｍ（例えば、０．５〜２．５ｍｍ、０．５〜２ｍｍ、０．５〜１ｍｍ、１〜２．５ｍｍ、１〜２ｍｍ、１〜１．５ｍｍ）の長さを有してよい。特定の長さは、例えば、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１．０ｍｍ、１．２ｍｍ、１．４ｍｍ、１．６ｍｍ、１．８ｍｍ、２．０ｍｍ、２．２ｍｍ、２．４ｍｍ、２．６ｍｍ、２．８ｍｍ、および３．０ｍｍを含む。一部の実施態様では、提供される実施態様は、これらの値の１つまたは複数から、最大で２０％（例えば、最大で１５％、１０％、５％）変化し得る。
【００３９】
本明細書において用いられる、濃度、量、サイズ、多孔性、および他の数値データは、本明細書において範囲形式で示され得る。そのような範囲形式は、単に便利性および簡潔性のために用いられ、柔軟に解釈すべきであり、範囲の限定として明示的に挙げられた数値を含むだけでなく、その範囲内に包含される個々の数値またはサブ範囲の全ても、それぞれの数値およびサブ範囲が明示的に挙げられたかのように含むことが理解されるべきである。
【００４０】
例えば、約１．０〜約３．０ｍｍの範囲は、明示的に挙げられた１．０〜約３．０ｍｍのサイズ限定を含むだけでなく、１．４ｍｍ、１．８ｍｍ、２．０ｍｍ、および２．７ｍｍのような個々の寸法、ならびに、１．０〜１．４ｍｍ、１．０〜１．８ｍｍ、１．８〜２．４ｍｍ、１．４〜３．０ｍｍなどのようなサブ範囲も含むと解釈されるべきである。さらに、そのような解釈は、範囲の幅または説明される特徴、例えば、タンパク質濃度、管状多孔性、ルーメン直径、ポロゲン濃度、および、他の成分または薬剤の量および濃度にかかわらず当てはまるべきである。
【００４１】
様々な実施態様によれば、提供されるシルク耳チューブは、任意の様々な方法で形状が異なってよい。例えば、一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブは、一方または両方の末端に斜めの角を含んでよく、他方の末端よりも大きな外径を有する一方の末端を含んでよく、１つまたは複数のフランジを含んでよく、および／または、滑らかな内側表面および多孔性の外側表面を含んでよい。
【００４２】
層
様々な実施態様によれば、提供されるシルク耳チューブは、２以上の層を含んでよい。一部の実施態様では、それぞれの沈着された層の厚さは、とりわけ、層を形成するために用いられるシルクフィブロイン溶液中のフィブロインの濃度を調節することによって制御することもできる。例えば、提供されるシルク耳チューブが、浸漬コーティングによって形成される実施態様では、シルクフィブロイン水溶液中のフィブロインが濃縮されればされるほど、より多くのフィブロインが、ロッド上またはシルクフィブロインの以前の層上に沈着されて、よりぎっしり詰まった構造が形成される。
【００４３】
一部の実施態様では、シルク耳チューブの各層は、実質的に同様の厚さおよび／または機能付与を有する。一部の実施態様では、シルク耳チューブの少なくとも１つの層は、少なくとも１つの他方の層とは異なる厚さおよび／または機能付与を有する。様々な実施態様によれば、機能付与は、１つまたは複数の治療剤の追加を含んでよい。
【００４４】
一部の実施態様では、シルク耳チューブは、１〜１０層（例えば、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２層）を有してよい。一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブは、単一の層を含む。一部の実施態様では、シルク耳チューブの各層は、１ナノメートル（ｎｍ）〜１ミリメートル（ｍｍ）であってよい。例えば、一部の実施態様では、シルク耳チューブの各層は、１０ｎｍ〜１ｍｍ（例えば、２５ｎｍ〜１ｍｍ、５０ｎｍ〜１ｍｍ、１００ｎｍ〜１ｍｍ、２００ｎｍ〜１ｍｍ、３０ｎｍ〜１ｍｍ、４００ｎｍ〜１ｍｍ、５００ｎｍ〜１ｍｍ、または６００ｎｍ〜１ｍｍ）であってよい。一部の実施態様では、シルク耳チューブの各層は、１０ｎｍ〜１ｍｍ（例えば、１０ｎｍ〜９００ｎｍ、１０ｎｍ〜８００ｎｍ、１０ｎｍ〜７００ｎｍ、１０ｎｍ〜５００ｎｍ、１０ｎｍ〜４００ｎｍ、１０ｎｍ〜３００ｎｍ、または１０ｎｍ〜２００ｎｍ）であってよい。
【００４５】
ポア
一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブは、１つまたは複数のポロゲンの使用を通して、多孔性で作られ得る。任意の公知のポロゲンが、様々な実施態様による使用に適切であり得ると考えられる。一部の実施態様では、ポロゲンは、結晶（例えば、塩化ナトリウム結晶、糖結晶）、マイクロ−および／またはナノ−スフェア、ポリマー（例えば、ポリエチレンオキシド、またはＰＥＯ）、氷晶、硫酸、リン酸、アルカリ金属、ハロゲン化アルカリ土類金属、多糖類、ワックス粒子、合成ポリマー粒子、および／またはレーザーであってよく、または含んでよい。一部の実施態様では、ポロゲンは、ポアの機械的導入を含んでよい（例えば、シルク耳チューブに１回または複数回の穴をあけるための針または他の物品またはデバイスを用いる、または、シルク耳チューブ内に１つまたは複数の裂け目を導入するストレスを用いる）。
【００４６】
本明細書において用いられる用語「多孔性」は、本明細書に記載のシルク耳チューブの少なくとも１つの層が、チューブの壁を通した材料の通過を可能にする特質を指す（チューブのルーメンを通るまたはそれに沿ったそれらの通過とは対照的）。本明細書に記載のシルク耳チューブは、細胞またはタンパク質の通過を実質的に可能にしないものから、タンパク質の通過を実質的に可能にするが細胞の通過を可能にしないものまで、両方の通過を可能にするものまで、様々な多孔性を包含し得る。本明細書において用いられる用語「非多孔性」は、本明細書に記載のチューブが、２０分のアッセイの過程にわたって、チューブの壁を通したＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−４８８−ラベル化ＢＳＡの通過を実質的に可能にしないことを意味する。「実質的に可能にしない」は、本明細書に記載の検出条件下で、２０分のアッセイ後に、チューブの内側からのラベル化ＢＳＡがチューブの外側で検出されないことを意味する。あるいは、本明細書に記載の管状構成物の多孔性は、本明細書に記載または他の方法で当技術分野において知られているように測定／計算される、透過性係数の観点から表され得る。本明細書に記載の管状構成物は、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−４８８−ラベル化ＢＳＡに関する透過係数が７．３×１０−４±１．５×１０−４ｃｍ／ｓ以下であるならば、タンパク質または細胞の通過に対して「非多孔性」と考えられる。本明細書において用いられる用語「タンパク質に対して通過性」は、本明細書に記載の管状構成物が、チューブ壁を通したＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−４８８−ラベル化ＢＳＡの通過を、本明細書において説明されるように測定された透過係数が少なくとも８．９×１０−４ｃｍ／ｓで可能にすることを意味する。多孔性の評価の他のモードは、提供されるシルク耳チューブの横断面の走査電子顕微鏡評価の後の画像処理；または、水銀ポロシメトリー（ｐｏｒｉｓｉｍｅｔｒｙ）測定を含んでよい。
【００４７】
様々な実施態様は、様々なサイズのポアを含むシルク耳チューブを含んでよい。一部の実施態様では、シルク耳チューブ内のポアは、約１〜１００μｍを含めた直径を有してよい。一部の実施態様では、シルク耳チューブ内のポアは、約１〜５０μｍ（例えば、１〜４０、１〜３５、１〜３０、１〜２５、１〜２０、１〜１５μｍ）を含めた直径を有してよい。一部の実施態様では、シルク耳チューブ内のポアは、約５〜２５μｍを含めた直径を有してよい。一部の実施態様では、シルク耳チューブ内のポアは、約１〜１０μｍを含めた直径を有してよい。
【００４８】
シルク耳チューブを形成する方法
様々な実施態様によれば、提供されるシルク耳チューブは、任意の適用に適切な方法を介して形成され得る。一部の実施態様では、例えば、提供されるシルク耳チューブを作製する方法は、限定されないが、注入成形、浸漬コーティング、ゲル紡糸、３Ｄプリント、および機械加工、多層（ｌａｙｅｒ  ｂｙ  ｌａｙｅｒ）技術、および充填成形を含む。加えて、シルク耳チューブを形成するための特定の例示的な方法は、以下の実施例に示される。
【００４９】
一部の実施態様では、本明細書に記載の提供されるシルク耳チューブは、放射線に基づく滅菌（すなわちガンマ線）、化学に基づく滅菌またはオートクレービングのような、従来の滅菌工程を用いて滅菌され得る。一部の実施態様では、滅菌工程は、５２〜５５℃の温度で８時間以下の時間、エチレンオキシドを用いるものであってよい。一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブは、高い温度および圧力を用いたオートクレービングを介して滅菌され得る。滅菌後、生体材料は、輸送のために適切な滅菌された耐湿性パッケージ内にパッケージされ得る。
【００５０】
治療剤
一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブは、１つまたは複数の治療剤を含む。一部の実施態様では、シルクフィブロイン溶液は、シルク耳チューブを形成する前に治療剤と接触され得て、または、シルク耳チューブ上にそれが（例えばコーティングとして）形成された後にローディングされ得る。一部の実施態様では、少なくとも１つの治療剤は、シルク耳チューブの形成中にシルク内にトラップされて、例えば、一部の実施態様では、ガス流による水性フィブロイン層の乾燥、例えば、Ｎ２ガスによるシルクフィブロイン層の脱水は、フィブロインの、ベータシート構造への構造変化を誘導し、それは薬剤をトラップする。一部の実施態様では、さらなる層は、それから、同一の薬剤、異なる薬剤が加えられ得て、または、薬剤が加えられ得ない。一部の実施態様では、この段階的な沈着アプローチは、様々な濃度の治療薬を各層内にトラップすることも可能にする。様々な実施態様によれば、シルク材料を溶かさない任意の製剤担体が場合により用いられ得る。一部の実施態様では、治療剤は、液体、細かく分割された固体、または任意の他の適切な物理的形状として存在し得る。
【００５１】
本発明のシルク耳チューブとともに用いられ得る様々な異なる治療剤は広大であり、小分子、タンパク質、ペプチドおよび核酸を含む。一般に、本明細書に記載の管状構成物と関連し得る治療剤は、制限されずに：抗感染症、例えば、抗生物質（例えば、シプロフロキサシン）および抗ウイルス剤；抗拒絶剤；鎮痛剤および鎮痛剤の組み合わせ；抗炎症剤（例えば、デキサメタゾン）；ホルモン、例えば、ステロイド；増殖因子（骨形態形成タンパク質（すなわちＢＭＰ’ｓ  １７）、骨形態形成様タンパク質（すなわち、ＧＦＤ−５、ＧＦＤ−７およびＧＦＤ−８）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（すなわちＦＧＦ１−９）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、形質転換増殖因子（すなわちＴＧＦ−β−ＩＩＩ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ））；神経増殖因子、抗血管新生タンパク質、例えば、エンドスタチン、および、他の天然由来または遺伝学的に操作されたタンパク質、多糖類、糖タンパク質、またはリポタンパク質を含む。
【００５２】
一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブは、１つまたは複数のプロテアーゼを含んでよい。一部の実施態様では、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＸＩＶ、またはα−キモトリプシン）、コラゲナーゼ、または、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）（例えば、ＭＭＰ＿１、ＭＭＰ−２など）の１つまたは複数であってよい。一部の実施態様では、１つまたは複数のプロテアーゼは、シルク耳チューブ内に埋め込まれ、または、対象において移植後にシルク耳チューブと関連される。一部の実施態様では、プロテアーゼ活性化を引き起こすために１つまたは複数の活性化イベントを必要とする１つまたは複数のプロテアーゼが用いられ得る。一部の実施態様では、活性化イベントは、例えば、水和、ｐＨ変化（すなわち、上昇または低下）、補因子の添加、および／または、任意の他の適用に適切な活性化イベントであってよい。さらなる情報は、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｓｉｌｋ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，１１：２１２−２２４，（２０１４）に見ることができ、その開示はその全体で本明細書中に援用される。
【００５３】
使用方法
当業者は、提供されるシルク耳チューブに関するいくつかの使用を思い描くことが可能である。一部の実施態様では、本発明は、シルク耳チューブを対象の外耳道に導入するステップを含む、中耳炎を処置する方法を提供し、ここで、シルク耳チューブは、２ｍｍ未満の長さであり、１．５ｍｍ未満の外径を有し、およびここで、シルク耳チューブは、対象によって再吸収される。一部の実施態様では、中耳炎は、急性中耳炎、浸出および伝音難聴のある中耳炎、または慢性の化膿性中耳炎である。
【００５４】
提供されるシルク耳チューブは、以前の鼓膜切開術チューブに勝るいくつかの利点を提供し、以前の鼓膜切開術チューブおよび挿入方法の多くの一般的な合併症の予防を含む。鼓膜切開術チューブの一般的な合併症の中でも、チューブを除去するためのその後の二次的な外科的処置に関する必要性があるチューブの遅延した押し出し、ならびに、押し出されていないチューブの周りに発症し得る鼓室硬化症および肉芽組織である。より不吉な合併症は、鼓膜切開術チューブに隣接する鼓膜の萎縮性領域の進行であり、次にはコレステリン腫の形成をもたらし得る。本発明の様々な実施態様は、少なくとも部分的に、以前に公知の鼓膜切開術チューブの使用に起因する、１つまたは複数のこれらの例示的な合併症を低減または除去することが可能である。一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブの移植または挿入は、対象において炎症性反応をもたらさない。
【００５５】
様々な実施態様によれば、提供されるシルク耳チューブは、インビボまたは棚上で長期間持続するように設計され得る。例えば、一部の実施態様では、インビボで実質的な完全性を６か月から５年の期間維持する、提供されるシルク耳チューブが製造され得て、換言すれば、これらの例示的なシルク耳チューブは、６月〜５年の再吸収速度を有する。一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブは、１日〜１週、８日〜２年、１年〜４年、１年および３年、または、１年〜２年の再吸収速度を有してよい。一部の実施態様では、１年、２年、３年、４年、５年、またはそれよりも長いあいだ貯蔵安定性の、提供されるシルク耳チューブが製造され得る。
【００５６】
別段の定義がされない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、当業者の一人によって一般に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料が本発明の実施または試験において用いられ得るが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照により援用される。加えて、材料、方法および実施例は、単なる例示であり、限定されることを意図しない。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。
【実施例】
【００５７】
実施例１−例示的な浸漬コーティングおよびゲル紡糸方法
シルク溶液の調製−シルク溶液は、以前の研究において説明される手順に従って、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉカイコ繭から生産され得る。Ｂ．ｍｏｒｉカイコシルクの繭は、Ｔａｊｉｍａ  Ｓｈｏｊｉ  Ｃｏ（日本、横浜）によって供給され得る。手短には、繭は、沸騰した０．０２ＭのＮａ２ＣＯ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）溶液中で２０分間練られる。それから、フィブロイン抽出物をＭｉｌｌｉ−Ｑ水中で３回リンスして、９．３−Ｍ  ＬｉＢｒ溶液中に溶解させて、２０％（ｗ／ｖ）溶液を産出して、続いて、蒸留水に対して２日間透析して（ＭＷＣＯ  ３，５００）、シルクフィブロイン水溶液を得る（ｃａ．８ｗｔ／ｖｏｌ％）。
【００５８】
シルクチューブの調製−この実施例では、シルクチューブは、例示的な多数の浸漬コーティングまたはゲル紡糸方法を用いて形成される。多数の浸漬コーティング工程のために、シルクフィブロイン（１０ｍｌの８ｗｔ／ｖｏｌ％）およびＰＥＯ（ＭＷ＝９００，０００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（４ｍｌの５ｗｔ／ｖｏｌ％）溶液（シルク：ＰＥＯ  ４：１  ｗ／ｗ）の混合物を調製する（シルク管状マトリックス内のポア形成が所望であれば、ポアが必要でなければ、その結果、ＰＥＯは工程中に含まれる必要はない）。シルクチューブは、ニチノール、テフロンまたは他のワイヤまたはドエル（０．７６ｍｍ直径）を、溶液中に浸漬コーティングするステップ、ワイヤまたはドエル上にコーティングされた混合溶液を、ＭｅＯＨ中で３０秒間処理して、シルクをワイヤ表面上に安定化するステップ、およびそれから、コーティングされた層を空中で１時間乾燥させるステップによって製造される。この浸漬工程を繰り返して、約１．３６ｍｍの外径の管状マトリックスがワイヤ上に生じさせる。浸漬コーティング後、チューブを、ＭｅＯＨ中で２時間処理して、それから、水浴中に２日間置いてＰＥＯを抽出する（使用するならば）。チューブをワイヤから除去して空中で乾燥させる。図１は、この浸漬コーティング方法に従って製造されたシルク耳チューブの例示的な画像を示す。ゲル紡糸工程のために、シルク溶液は、ＣｅｎｔｒｉＶａｐ減圧濃縮器（Ｌａｂｃｏｎｃｏ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）を用いてさらに濃縮される（２５〜３０ｗ／ｖ％）。管状足場は、濃縮されたシルク溶液［２５−３０％（ｗ／ｖ）、０．１ｍｌ／５ｃｍの足場］を、以前に説明される［１０］慣習のゲル紡糸プラットフォームおよびプログラムを用いて、２ｍｍ／ｓｅｃの軸上スルーレート（ＡＳＲ）で軸方向に往復運動および回転（２００ｒｐｍ）するワイヤ上に紡ぐことによって製造される。チューブは、凍結乾燥されて、メタノールで２時間処理されて、そして、ワイヤから除去される。図２は、このゲル紡糸方法に従って製造されるシルク耳チューブの例示的な画像および概略、ならびに、そのようなシルク耳チューブの機械的特徴のいくつかを示す（図２のパネルＣを参照）。
【００５９】
この実施例に示されるのは、シルクフィブロイン溶液を生産して、本発明に係るシルク耳チューブを形成するための、例示的な、非限定の方法である。
【００６０】
実施例２−注入成形を介したシルク耳チューブの例示的な製造
この実施例では、注入成形工程を用いてシルク耳チューブを製造した。
以前に説明された方法に従ってＭａｃｈｉｎａｂｌｅＷａｘ．ｃｏｍ（ＵＳＡ）から調製されたワックスで鋳型を作成した。鋳型は、高さが３．３０ｃｍであり、０．７６ｃｍの直径であった。鋳型は、２つのピースを有し、１ｍｍ底部ウェハの上部に置かれた２ｍｍの厚さの上側ピースは、上側部分におけるＰＴＦＥの望ましい配置に対応する直径が０．７６ｍｍの支持となるホールを与えた。また、鋳型は、０．２５ｃｍの高さを有する、６ウェル上側ピースに取り付けられた薄いウェハを有した。シルク注入の前に、２つのピースを互いの上部に置いて、パラフィンを用いて一緒に密封して、ＰＴＦＥを、ボトム−ウェルソケット中に配置することによってウェルの中央に固定した。次に、ＣｅｎｔｒｉＶａｐベンチトップバキュームを用いて２５〜３３ｗ／ｖ％に濃縮された３０分煮沸シルクを、鋳型の各ウェルにローディングした。ウェルにシルクを添加した後に、鋳型を−２０℃中に４時間置いて、それから、完全に乾燥するまで、−３０℃で、真空で凍結乾燥器内に置いた。
【００６１】
それから、鋳型をメタノール浴に１２時間置いて（図３、パネルＡ）、脱イオン（ＤＩ）水中で洗浄して、機械加工前に空気乾燥させた。一部の実施態様では、注入されたサンプルは、間の凍結乾燥ステップを伴わずにメタノール中に直接移行してよいことに注意することが重要である。機械加工されたチューブは、０．８ｍｍの内径、２ｍｍの外径、および１．７ｍｍの長さを有し、それは、走査電子顕微鏡画像（ＳＥＭ）のＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて測定された（図３、パネルＥ）。一部の実施態様では、寸法は、例えば０．７９ｍｍの内径および１．３６ｍｍの外径に調整され得る。しかしながら、一部の実施態様では、オートクレービングのような滅菌技術は、チューブを縮ませ得て、したがって、サイズのこの縮小は、異なる寸法への機械加工前に考慮されるべきである。一部の実施態様では、縮みを減らすために６０℃オーブン内での乾燥が使用され得て、および／または、シルク耳チューブは、縮みを考慮するように設計され得る。この実施例では、カラー−ボタンフランジを用いたが、他の実施態様では、ポップ−ベベル付きグロメットのような他のデザインが有用であり得る。シルク耳チューブの２つを、Ｉｎｓｔｒｏｎ機械的試験に供して、この方法によって製造されたチューブの機械学を正確に測定した。図４、パネルＡおよびＢに示されるように、チューブの圧縮係数は６２４〜７１７ＭＰａであった。市販のＰＴＦＥチューブの機械学と並び、同様のアプローチを用いて製造されるスクリューよりもさらに低い（図４、パネルＣ）。
【００６２】
加えて、上述のとおりに製造されたサンプルシルク耳チューブを、ａ）真空の間にサンプルを同時に凍結させないベンチトップ凍結乾燥器、ｂ）時間を測定しながらメタノール処理、およびｃ）大きなバッチのシルク濃度方法、を用いて乾燥させた。
【００６３】
特定の理論に縛られることを望まずに、この実施例で用いた鋳型は、乾燥工程中にサンプルが凍ったままであることを確実にするために−２０℃〜−３０℃の温度で維持しながら真空中でサンプルを乾燥させることができる凍結乾燥器を必要とすると考えられる。サンプルをベンチトップ凍結乾燥器内に置くことは、乾燥工程中にチューブを部分的に解凍させた（図５、パネルＡ）。さらに、メタノール処理を６時間行なって、このメタノール処理時間は、図３に示されるチューブを達成するステップによって明らかにされた機械的に優れた材料ではなく、よりスタイロフォーム材料に似ているチューブをもたらした（図５、パネルＢおよびＣを参照）。機械学は、より短いメタノール時間によるチューブについては、それらは機械加工される能力がないので試験しなかった。したがって、一部の実施態様では、さらなるβ−シート形成を促進するために、少なくとも１２時間メタノール処理を施すことが有利であり得る。加えて、大きなバッチのシルク濃度方法は、ＣｅｎｔｒｉＶａｐ機内の２ｍＬチューブ内に配置して濃縮する前に、５〜７ｗ／ｖ％を含むシルクが透析チューブに加えられてシルクを事前濃縮するために１日間フード内に置かれる場合に、行なわれた。一部の実施態様によれば、より大きなバッチの濃度方法への移行は、ＣｅｎｔｒｉＶａｐ紡糸後に、より大量のシルクが回収されるのを可能にし得て、十分なシルクが２ｍＬチューブから押し出されて、その後の注入ステップにおける気泡蓄積を低減させるのを確実にするのを助ける。
【００６４】
この実施例において製造された例示的な耳チューブの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）イメージングは、非常に低度の多孔性を明らかにした。特定の理論に縛られることを望まずに、より高度の多孔性は、生分解性薬物溶出シルク耳チューブのような一部の実施態様に望ましくあり得る。多孔性は最小限であったが、この実施例の例示的な技術は、以前に見られるものよりも、再生可能で、測定可能で、機械加工可能で、より信頼できる薬物ローディング方法を提供する。
【００６５】
この実施例は、とりわけ、現在市場で売られているＰＴＦＥ耳チューブと似た機械的特徴を有するシルク耳チューブが、迅速かつ経済的な様式で製造され得ることを示す。また、これらのチューブは、特定の適用または特定の対象にさえも合うようにさらにカスタマイズされ得ることも示す。
【００６６】
実施例３−水性工程を介した多孔性シルク耳チューブの例示的な製造
シルク溶液の調製−シルク溶液は、以前の研究において説明された手順に従って、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉカイコ繭から生産され得る。Ｂ．ｍｏｒｉカイコシルクの繭は、Ｔａｊｉｍａ  Ｓｈｏｊｉ  Ｃｏ（日本、横浜）によって供給され得る。手短には、繭は、沸騰した０．０２ＭのＮａ２ＣＯ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）溶液中で３０分間練られて、５〜７％ｗ／ｖのシルク溶液が提供される。それから、溶液を、１日間、およそ８〜９％ｗ／ｖのシルクの溶液に濃縮させた。続いて、ＣｅｎｔｒｉＶＡＰ減圧濃縮器を用いてシルク溶液をさらに濃縮して、２０〜２５％ｗ／ｖの濃度のシルクを含むシルク溶液を得た。
【００６７】
シルクチューブの調製−上述の濃縮されたシルク溶液を、それから、１ｍＬワックス鋳型に注入して、それから、メタノール浴中に鋳型を４８時間置いた。４８時間後、シルクシリンダーを鋳型から取り出して、脱イオン水（ＤＩ）のビーカー内において、２４時間撹拌した。それから、洗浄されたシルクシリンダーを鋳型から取り出して、１ｍＬワックス鋳型に置いて、フード内で乾燥させた。特定の理論に縛られることを望まずに、シルクシリンダーを鋳型内で乾燥させることは、乾燥工程中に材料が歪むのを避けるのを助け得ると考えられる。乾燥後、シルクシリンダーを所望の耳チューブ寸法に機械加工した。
【００６８】
シルクおよびポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）によるチューブのコーティング
ＰＥＯ溶液の調製−６０ｍｇ／ｍＬのポリ（エチレン）オキシド（ＰＥＯ）を５０ｍＬの脱イオン（ＤＩ）水に加えることによって、ＰＥＯの６％ｗｔ溶液を調製した（合計３００ｍｇのＰＥＯ）。ＰＥＯを加える前に、撹拌バーを用いてホットプレート上で、約８０℃で１０分間、ＤＩ水を加熱した。ＰＥＯがＤＩ水に加えられた時点で、混合物を１時間撹拌して、粘性の均質な溶液になった。同時に、２０％ｗ／ｖシルク溶液を調製した。
【００６９】
コーティング溶液の調製およびシルクチューブ上のコーティングのポア形成の誘導／コーティング−次に、シルク／ＰＥＯの８０／２０ｗ／ｗ混合物を、混合するシルクおよびＰＥＯの容量を以下のように計算することによって作成した：
１ｍＬの２０％シルクを使用：
ａ．（ｘ合計ｍｇ）＊０．８＝２００ｍｇのシルク
ｂ．ｘ合計＝２５０ｍｇ、したがって、ＰＥＯのｍｇ＝２５０ｍｇ合計−２００ｍｇシルク＝５０ｍｇ  ＰＥＯ
ｃ．５０ｍｇ  ＰＥＯ／（６０ｍｇ／ｍＬ  ＰＥＯ）＝０．８３ｍＬのＰＥＯ
【００７０】
シルクおよびＰＥＯ容量を２ｍＬエッペンドルフチューブに加えた後に、混合物を針で撹拌して、それから、溶液が完全に混合するまでボルテックスした。次に、シルクチューブをコーティングする前に：０．７９ｍｍの直径を有するポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）がコーティングされたロッド上にチューブを置いて、シルクチューブを、均等に間隔をあけた。ＰＥＯ／シルク溶液がペイントされる間、チューブの最小限の動きを確実にするために、テープを各チューブのいずれか側に置き、それは、コーティングされたチューブが互いに滑り込むのも防いだ（図６を参照）。次に、ロッドを計量ボート上に置いて、タッチアップペイントブラシを用いて、各チューブ上にシルク／ＰＥＯ溶液の平らな層を適用した（図１、パネルＢを参照）。それから、コーティングの直後に、１００％メタノールを皿中に注いで、チューブをその中で１時間、水平に置いたままにし、そこではβ−シート形成がシルク内で生じ、ＰＥＯは非常に可溶性であり、耳チューブの外側に多孔性コーティングを作成した。メタノール浴への配置のおよそ１時間後に、チューブをＦａｌｃｏｎチューブ内のＤＩ水中に置いて、４８時間振とうした。振とう後、チューブを水から取り出して、蒸発気フード内で２４時間乾燥させた。
【００７１】
乾燥後、シルクチューブをオートクレーブして、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて試験した。図７〜８に示されるように、提供される方法は、多孔性シルク耳チューブを提供することが可能である。具体的には、図７は、この実施例において製造されたチューブ内に存在する複数のポアを示す。特定の理論に縛られることを望まずに、これらのポアの存在および特質は、一定期間後、インビボでのチューブの分解および／または鼓膜付着を促進し得ると考えられる。図８は、この実施例において提供されるチューブの例示的なＳＥＭ写真を示し、提供される方法を介して達成可能な重大な度合の多孔性の見た目を含む。
【００７２】
実施例４−シルクおよびシプロフロキサシンによるチューブのコーティング
Ｃｉｐｒｏｄｅｘ（例示的な活性剤）による多孔性チューブのコーティング−９ｍｇ／ｍＬのシプロフロキサシンＨＣＬおよび３ｍｇ／ｍＬのデキサメタゾンを、２０〜２５％シルクｗ／ｖに濃縮されたシルク溶液に加えた。次に、実施例３に上述のとおりに調製された、ＰＥＯコーティングを有さないシルクチューブを、テフロンロッド上に置いた。それから、シルクチューブおよびテフロンロッドを、シルク−シプロフロキサシン−デキサメタゾン溶液中に浸漬して、それから、１００％メタノールで満たされた計量ボート内に水平に１時間置いた。重要なことに、シルク−薬物浸漬コーティングからメタノール溶液中に薬物が放出されるのを防ぐために、メタノール浴を、シプロフロキサシンおよびデキサメタゾンの両方で飽和した。メタノール処理後、シルクチューブを蒸発気フード内で乾燥させた。乾燥後、エチレンオキシド滅菌を用いてシルクチューブを滅菌した。
【００７３】
少なくとも１つの活性剤（ここではシプロフロキサシンおよびデキサメタゾン）でコーティングされた、提供されるシルク耳チューブの有効性を試験するために、これらの薬物がコーティングされたシルクチューブを、細菌の増殖を防止および／または遅らせる能力について、そのようなコーティングがされていないシルク耳チューブに対して比較し、およびまた、ＬＢ培地を含むポジティブコントロールに対しても比較した。これを試験するために、薬物がコーティングされたシルク耳チューブ、薬物がコーティングされていないシルク耳チューブ、およびポジティブコントロール耳チューブのそれぞれを、およそ５．２１＊１０７  ＣＦＵ／ｍＬのグラム陰性細菌Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓとともにマルチウェルプレート中で２４時間インキュベートした（図９上列を参照）。およそ２４時間後、培地をマルチウェルプレートから除去して、培養プレート上でさらに２４時間３７℃でインキュベートした。図９は、薬物コーティングは、細菌の増殖を少なくとも２４時間、防止および／または低減するのに効果的であったことを示す。
【００７４】
これらの実施例に示されるように、提供される方法は、任意の様々なシルク耳チューブを作製するために用いられ得て（ｍａｙ  ｂｅ  ｓｕｅｄ  ｔｏ）、一部の実施態様では、提供されるシルク耳チューブは、生分解性でありかつ、提供される実施態様のポア中またはコーティング中などに１つまたは複数の活性剤を含むことに適していながら、以前に公知の非シルク耳チューブのものと似た物理的および／または機械的特徴を含み得る。
【００７５】
［等価物および範囲］
当業者は、日常的にすぎない実験を用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施態様に対する多くの等価物を認識し、または確認することが可能である。本発明の範囲は、上記の説明に制限されることは意図されないが、むしろ、以下の特許請求の範囲に記載される。
【図１】
2018527060.tif 000002
【図２】
2018527060.tif 000003
【図３】
2018527060.tif 000004
【図４】
2018527060.tif 000005
【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
2018527060.tif 000012
2018527060.tif 000013