(57)【要約】  本発明は、免疫腫瘍中胚葉前駆（ｉｏＭＰ）細胞および治療でのそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫腫瘍中胚葉前駆（ｉｏＭＰ）細胞であって、
前記細胞は、検出可能なレベルのＣＤ６６ｅ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１６４、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２６４、ＣＤ２７０、ＣＤ３２８、ＣＤ３５８、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）γδ、ＦＭＣ７およびＩＴＧＢ７を発現し、
ここで、前記細胞は、検出可能なレベルのＨＬＡ−ＡＢＣ、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、Ｎｏｔｃｈ２、ＣＤ３６０、ＣＬＩＰ、およびＣＤ１１ｂを発現しない、
免疫腫瘍中胚葉前駆（ｉｏＭＰ）細胞。
【請求項２】
請求項１に記載のｉｏＭＰ細胞であって、
前記ｉｏＭＰ細胞は、検出可能なレベルの１つまたは複数のβ２−ミクログロブリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４７、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１／ＣＤ６１、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６３、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１０５、ＣＤ１０８、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１３０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５１、ＣＤ１５５、ＣＤ１６６、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ２５７、ＣＤ２７６、ＣＤ２８８、ＣＤ２９５、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３５１、ＣＤ２３０、カドヘリン−１１（ＣＤＨ１１）、およびリンホトキシンβ受容体（ＬＴＢＲ）をさらに発現する、
ｉｏＭＰ細胞。
【請求項３】
請求項１または２に記載のｉｏＭＰ細胞であって、
前記ｉｏＭＰ細胞は、検出可能なレベルの１つまたは複数のＣＤ２６、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５４、ＣＤ１１０、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１４６、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１７８、ＣＤ１８６、ＣＤ１９３、ＣＤ１９６、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２２１、ＣＤ２２７、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２４５、ＣＤ２５２、ＣＤ２５６、ＣＤ２６７、ＣＤ２７２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８６、ＣＤ２９０、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０９、ＣＤ３１２、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３５４、ポドプラニンおよびＳＳＥＡ−４をさらに発現する、
ｉｏＭＰ細胞。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載のｉｏＭＰ細胞であって、
前記ｉｏＭＰ細胞は、請求項２または３に定義されるマーカーの全てを検出可能なレベルで発現する、
ｉｏＭＰ細胞。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載のｉｏＭＰ細胞であって、
前記ｉｏＭＰ細胞は、ＣＤ６６ｅに関して少なくとも３５０の抗体平均蛍光強度（ＭＦＩ）、ＣＤ１２１ｂに関して少なくとも７００のＭＦＩ、ＣＤ１２２に関して少なくとも３００のＭＦＩ、ＣＤ１６４に関して少なくとも４００のＭＦＩ、ＣＤ１７２ａに関して少なくとも３００のＭＦＩ、ＣＤ２０３ｃに関して少なくとも３００のＭＦＩ、ＣＤ２６４に関して少なくとも３５０のＭＦＩ、ＣＤ２７０に関して少なくとも３００のＭＦＩ、ＣＤ３２８に関して少なくとも３００のＭＦＩ、ＣＤ３５８に関して少なくとも３５０のＭＦＩ、ＴＣＲγδに関して少なくとも３５０のＭＦＩ、ＦＭＣ７に関して少なくとも３５００のＭＦＩ、および、ＩＴＧＢ７に関して少なくとも１５００のＭＦＩを示す、
ｉｏＭＰ細胞。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のｉｏＭＰ細胞であって、
前記ｉｏＭＰ細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と比較して、増加した量の１つまたは複数のＣＤ６６ｅ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１６４、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ２６４、ＣＤ２７０、ＣＤ３２８、ＣＤ３５８、ＴＣＲγδおよびＩＴＧＢ７を発現する、
ｉｏＭＰ細胞。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のｉｏＭＰ細胞であって、
前記ｉｏＭＰ細胞は、ＭＳＣと比較して、増加した量の１つまたは複数のβ２−ミクログロブリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４７、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１／ＣＤ６１、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６３、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１０５、ＣＤ１０８、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１３０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５１、ＣＤ１５５、ＣＤ１６６、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ２５７、ＣＤ２７６、ＣＤ２８８、ＣＤ２９５、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３５１、ＣＤ２３０、カドヘリン−１１（ＣＤＨ１１）、およびリンホトキシンβ受容体（ＬＴＢＲ）を発現する、
ｉｏＭＰ細胞。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載のｉｏＭＰ細胞であって、
前記ｉｏＭＰ細胞は、ＭＳＣと比較して、増加した量の１つまたは複数のβ２−ミクログロブリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１／ＣＤ６１、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６３、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１０５、ＣＤ１０８、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１３０、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４６、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５１、ＣＤ１５５、ＣＤ１６６、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７８、ＣＤ１８６、ＣＤ１９３、ＣＤ１９６、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２２１、ＣＤ２２７、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２４５、ＣＤ２５２、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２６７、ＣＤ２７２、ＣＤ２７６、ＣＤ２８３、ＣＤ２８６、ＣＤ２８８、ＣＤ２９０、ＣＤ２９５、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０９、ＣＤ３１２、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３５１、ＣＤ３５４、ＣＤＨ１１、ＬＴＢＲ、ポドプラニンおよびＳＳＥＡ−４を発現する、
ｉｏＭＰ細胞。
【請求項９】
請求項５から８のいずれか一項に記載のｉｏＭＰ細胞であって、
前記のＭＦＩまたは量は、ハイスループット蛍光活性化セルソーティング（ＨＴ−ＦＡＣＳ）を用いて測定される、
ｉｏＭＰ細胞。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載のｉｏＭＰ細胞であって、
前記ｉｏＭＰ細胞は、検出可能なレベルのインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）またはＭＳＣと比較して増加した量のＩＦＮ−γを分泌する、
ｉｏＭＰ細胞。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のｉｏＭＰ細胞であって、
前記ｉｏＭＰ細胞は、表１のマーカーの全てを検出可能なレベルで発現する、
ｉｏＭＰ細胞。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のｉｏＭＰ細胞であって、
前記ｉｏＭＰ細胞は、自家または同種異系である、
ｉｏＭＰ細胞。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の２以上のｉｏＭＰ細胞の集団。
【請求項１４】
ｉｏＭＰ細胞の集団であって、
（ｉ）前記集団内の細胞の少なくとも６０％は、検出可能なレベルのＣＤ６６ｅを発現し、
（ｉｉ）前記集団内の細胞の少なくとも４５％は、検出可能なレベルのＣＤ１２１ｂを発現し、
（ｉｉｉ）前記集団内の細胞の少なくとも３５％は、検出可能なレベルのＣＤ１２２を発現し、
（ｉｖ）前記集団内の細胞の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＣＤ１６４を発現し、
（ｖ）前記集団内の細胞の少なくとも４５％は、検出可能なレベルのＣＤ１７２ａを発現し、
（ｖｉ）前記集団内の細胞の少なくとも３５は、検出可能なレベルのＣＤ２０３ｃを発現し、
（ｖｉｉ）前記集団内の細胞の少なくとも４５％は、検出可能なレベルのＣＤ２６４を発現し、
（ｖｉｉｉ）前記集団内の細胞の少なくとも３５％は、検出可能なレベルのＣＤ２７０を発現し、
（ｉｘ）前記集団内の細胞の少なくとも３５％は、検出可能なレベルのＣＤ３２８を発現し、
（ｘ）前記集団内の細胞の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＣＤ３５８を発現し、および
（ｘｉ）前記集団内の細胞の少なくとも４５％は、検出可能なレベルのＴＣＲγδを発現し；
（ｘｉ）前記集団内の細胞の少なくとも９５％は、検出可能なレベルのＦＭＣを発現し、および
（ｘｉｉ）前記集団内の細胞の少なくとも９５％は、検出可能なレベルのＩＴＧＢ７を発現し；
およびここで
（ａ）前記集団内の細胞の０．５％以下は、検出可能なレベルのＨＬＡ−ＡＢＣを発現し、
（ｂ）前記集団内の細胞の０．５％以下は、検出可能なレベルのＭＩＣ  Ａ／Ｂを発現し、
（ｃ）前記集団内の細胞の０．５％以下は、検出可能なレベルのＮｏｔｃｈ２を発現し、
（ｄ）前記集団内の細胞の０．５％以下は、検出可能なレベルのＣＤ３６０を発現し、
（ｅ）前記集団内の細胞の０．５％以下は、検出可能なレベルのＣＬＩＰを発現し、および
（ｆ）前記集団内の細胞の０．１％以下は、検出可能なレベルのＣＤ１１ｂを発現する、
ｉｏＭＰ細胞の集団。
【請求項１５】
ｉｏＭＰ細胞の集団であって、
（ｉ）前記集団内の細胞の少なくとも６９％は、検出可能なレベルのＣＤ６６ｅを発現し、
（ｉｉ）前記集団内の細胞の少なくとも５４％は、検出可能なレベルのＣＤ１２１ｂを発現し、
（ｉｉｉ）前記集団内の細胞の少なくとも４３％は、検出可能なレベルのＣＤ１２２を発現し、
（ｉｖ）前記集団内の細胞の少なくとも６０％は、検出可能なレベルのＣＤ１６４を発現し、
（ｖ）前記集団内の細胞の少なくとも５６％は、検出可能なレベルのＣＤ１７２ａを発現し、
（ｖｉ）前記集団内の細胞の少なくとも４７％は、検出可能なレベルのＣＤ２０３ｃを発現し、
（ｖｉｉ）前記集団内の細胞の少なくとも５５％は、検出可能なレベルのＣＤ２６４を発現し、
（ｖｉｉｉ）前記集団内の細胞の少なくとも４７％は、検出可能なレベルのＣＤ２７０を発現し、
（ｘｉ）前記集団内の細胞の少なくとも４３％は、検出可能なレベルのＣＤ３２８を発現し、
（ｘ）前記集団内の細胞の少なくとも６２％は、検出可能なレベルのＣＤ３５８を発現し、
（ｘｉ）前記集団内の細胞の少なくとも５６％は、検出可能なレベルのＴＣＲγδを発現し、
（ｘｉ）前記集団内の細胞の少なくとも９９％は、検出可能なレベルのＦＭＣを発現し、および
（ｘｉｉ）前記集団内の細胞の少なくとも９９％は、は、検出可能なレベルのＩＴＧＢ７を発現し；
およびここで
（ａ）前記集団内の細胞の０．１％以下は、検出可能なレベルのＨＬＡ−ＡＢＣを発現し、
（ｂ）前記集団内の細胞の０．１％以下は、検出可能なレベルのＭＩＣ  Ａ／Ｂを発現し、
（ｃ）前記集団内の細胞の０．２％以下は、検出可能なレベルのＮｏｔｃｈ２を発現し、
（ｄ）前記集団内の細胞の０．１％以下は、検出可能なレベルのＣＤ３６０を発現し、
（ｅ）前記集団内の細胞の０．１％以下は、検出可能なレベルのＣＬＩＰを発現し、および
（ｆ）前記集団内の細胞の０．０５％以下は、検出可能なレベルのＣＤ１１ｂを発現する、
ｉｏＭＰ細胞の集団。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の集団であって、
前記集団内の細胞の少なくとも８５％は、検出可能なレベルの１つまたは複数のβ２−ミクログロブリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４７、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１／ＣＤ６１、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６３、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１０５、ＣＤ１０８、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１３０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５１、ＣＤ１５５、ＣＤ１６６、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ２５７、ＣＤ２７６、ＣＤ２８８、ＣＤ２９５、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３５１、ＣＤ２３０、カドヘリン−１１（ＣＤＨ１１）およびリンホトキシンβ受容体（ＬＴＢＲ）をさらに発現する、
集団。
【請求項１７】
請求項１６に記載の集団であって、
前記集団内の細胞の少なくとも８５％は、請求項１８に挙げられるマーカーの全てを検出可能なレベルで発現する、
集団。
【請求項１８】
請求項１４から１７のいずれか一項に記載の集団であって、
前記集団内の細胞の少なくとも７５％は、検出可能なレベルの１つまたは複数のＣＤ４９ａ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１４６、ＣＤ１７８、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２２１、ＣＤ２３１、ＣＤ２５２、ＣＤ２５６、ＣＤ２６７、ＣＤ３３７およびＳＳＥＡ−４をさらに発現する、
集団。
【請求項１９】
請求項１８に記載の集団であって、
前記集団内の細胞の少なくとも７５％は、請求項１８に挙げられるマーカーの全てを検出可能なレベルで発現する、
集団。
【請求項２０】
請求項１４から１９のいずれか一項に記載の集団であって、
前記集団内の細胞の少なくとも６０％は、検出可能なレベルの１つまたは複数のＣＤ４６ｆ、ＣＤ５４、ＣＤ１１０、ＣＤ１８６、ＣＤ１９３、ＣＤ２０１、ＣＤ２４５、ＣＤ２７２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８６、ＣＤ２９０、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０９、ＣＤ３３８、ＣＤ３５４およびポドプラニンをさらに発現する、
集団。
【請求項２１】
請求項２０に記載の集団であって、
前記集団内の細胞の少なくとも６０％は、請求項２０に挙げられるマーカーの全てを検出可能なレベルで発現する、
集団。
【請求項２２】
請求項１４から２１のいずれか一項に記載の集団であって、
前記集団内の細胞の少なくとも５０％は、検出可能なレベルの１つまたは複数のＣＤ２６、ＣＤ１９６、ＣＤ２２７、ＣＤ２３５ａおよびＣＤ３１２をさらに発現する、
集団。
【請求項２３】
請求項２２に記載の集団であって、
前記集団内の細胞の少なくとも５０％は、請求項２２に挙げられるマーカーの全てを検出可能なレベルで発現する、
集団。
【請求項２４】
請求項１４から２３のいずれか一項に記載の集団であって、
前記集団内の細胞の少なくとも３５％は、検出可能なレベルのＣＤ１５６ｂをさらに発現する、
集団。
【請求項２５】
請求項１６から２４のいずれか一項に記載の集団であって、
前記集団内の細胞の１％以下は、検出可能なレベルの１つまたは複数のＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ３ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１８、ＣＤ１８４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３５２、ＣＤ３５７、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８３、ＣＤ８８、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９４、ＣＤ９７、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＤ１２９、ＣＤ１３１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４２、ＣＤ１４４、ＣＤ１５４、ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ１５８ｅ２、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６３、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９７、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０９、ＣＤ２２０、ＣＤ２２６、ＣＤ２２９、ＣＤ２１２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４９、ＣＤ２５３、ＣＤ２５８、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２９４、ＣＤ３０１、ＣＤ３０３、ＣＤ３２２、ＣＤ３３２、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３６２、ＣＤｗ１９９、ＣＤｗ３２９、カドヘリン−６（ＣＤＨ６）、ＤＣ免疫受容体（ＤＣＩＲ）、ＦＭＣ７、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＲ、インテグリンβ−７（ＩＴＧＢ７）、高ロイシン反復配列含有Ｇタンパク質共役受容体５（Ｌｇｒ−５）、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ３、プロカスパーゼ活性化化合物１（ＰＡＣ−１）、Ｓｔｒｏ−１およびトロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）をさらに発現する、
集団。
【請求項２６】
請求項２５に記載の集団であって、
前記集団内の細胞の１％以下は、請求項２５に挙げられるマーカーの全てを検出可能なレベルで発現する、
集団。
【請求項２７】
請求項１６から２６のいずれか一項に記載の集団であって、
前記集団は、少なくとも５０００細胞、少なくとも５０，０００細胞または少なくとも２５０，０００細胞を含む、
集団。
【請求項２８】
医薬組成物であって、
（ａ）請求項１から１２のいずれか一項に記載のｉｏＭＰ細胞または請求項１３から２７のいずれか一項に記載の集団、および、（ｂ）薬学的に許容できる担体または希釈剤、１つまたは複数のリポソームおよび／または１つまたは複数の微小気泡を含む、
医薬組成物。
【請求項２９】
医薬組成物であって、
（ａ）請求項１から１２のいずれか一項に記載のｉｏＭＰ細胞または請求項１５から２７のいずれか一項に記載の集団；（ｂ）免疫細胞；（ｃ）抗原；および（ｄ）薬学的に許容できる担体または希釈剤を含む、
医薬組成物
【請求項３０】
請求項２９に記載の医薬組成物であって、
前記免疫細胞は、Ｔ細胞、γδＴ細胞またはＮＫ細胞である、
医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１３から２７のいずれか一項に記載のｉｏＭＰ細胞の集団を生産する方法であって、
（ａ）単核細胞（ＭＣ）を、前記ＭＣがｉｏＭＰ細胞に分化するのを誘導する条件下で培養するステップ、および
（ｂ）請求項１から９のいずれか一項に定義される発現パターンを有するｉｏＭＰ細胞を採取および培養して、それにより、請求項１３から２７のいずれか一項に記載の集団を生産するステップ、
を含む、
方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、
前記ＭＣは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、
方法。
【請求項３３】
請求項３１または３２に記載の方法であって、
ステップ（ａ）は、前記ｉｏＭＰ細胞が接着するのを可能にする条件下で、前記ＭＣを培養するステップを含む、
方法。
【請求項３４】
請求項３１から３３のいずれか一項に記載の方法であって、
ステップ（ａ）および／または（ｂ）は、前記のＭＣおよび／またはｉｏＭＰ細胞を、血小板溶解物とともに培養するステップを含む、
方法。
【請求項３５】
請求項３１から３４のいずれか一項に記載の方法であって、
前記ＭＣは、患者または同種異系ドナーから得られる、
方法。
【請求項３６】
抗原に応答して、細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞の活性を増大させるインビトロの方法であって、
前記Ｔ細胞の活性を増大させる条件下で、前記Ｔ細胞を、前記抗原および請求項１４から２７のいずれか一項に記載の集団とともにインキュベートするステップを含む、
方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法を用いて生産される、
感作された（ｐｒｉｍｅｄ）細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞。
【請求項３８】
抗原に応答して、制御性Ｔ細胞の活性を増大させるインビトロの方法であって、
前記Ｔ細胞の活性を増大させる条件下で、前記Ｔ細胞を、前記抗原および請求項１３から２７のいずれか一項に記載の集団とともにインキュベートするステップを含む、
方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法を用いて生産される、
感作された制御性Ｔ細胞。
【請求項４０】
抗原に応答して、細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞の活性を低減させるインビトロの方法であって、
前記Ｔ細胞の活性を低減させる条件下で、前記Ｔ細胞を、前記抗原および請求項１３から２７のいずれか一項に記載の集団とともにインキュベートするステップを含む、
方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法を用いて生産される、
抑制された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞。
【請求項４２】
抗原に応答して、制御性Ｔ細胞の活性を低減させるインビトロの方法であって、
前記Ｔ細胞の活性を低減させる条件下で、前記Ｔ細胞を、前記抗原および請求項１３から２７のいずれか一項に記載の集団とともにインキュベートするステップを含む、
方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法を用いて生産される、
抑制された制御性Ｔ細胞。
【請求項４４】
請求項３６、３８、４０または４２のいずれか一項に記載の方法であって、
前記Ｔ細胞を、樹状細胞とともにインキュベートするステップをさらに含む、
方法。
【請求項４５】
抗原に応答して、細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞の活性を増大させるインビボの方法であって、
前記Ｔ細胞の活性を増大させる条件下で、請求項１３から２７のいずれか一項に記載の集団または請求項２８から３０のいずれか一項に記載の医薬組成物を、対象に投与するステップを含む、
方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法を用いて生産される、
感作された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞。
【請求項４７】
抗原に応答して、制御性Ｔ細胞の活性を増大させるインビボの方法であって、
前記Ｔ細胞の活性を増大させる条件下で、請求項１３から２７のいずれか一項に記載の集団または請求項２８から３０のいずれか一項に記載の医薬組成物を、対象に投与するステップを含む、
方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法を用いて生産される、
感作された制御性Ｔ細胞。
【請求項４９】
抗原に応答して、細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞の活性を低減させるインビボの方法であって、
前記Ｔ細胞の活性を低減させる条件下で、請求項１３から２７のいずれか一項に記載の集団または請求項２８から３０のいずれか一項に記載の医薬組成物を、対象に投与するステップを含む、
方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法を用いて生産される、
抑制された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞。
【請求項５１】
抗原に応答して、制御性Ｔ細胞の活性を低減させるインビボの方法であって、
前記Ｔ細胞の活性を低減させる条件下で、請求項１３から２７のいずれか一項に記載の集団または請求項２８から３０のいずれか一項に記載の医薬組成物を、対象に投与するステップを含む、
方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法を用いて生産される、
抑制された制御性Ｔ細胞。
【請求項５３】
請求項４５、４７、４９または５１のいずれか一項に記載の方法であって、
前記抗原を前記対象に投与するステップをさらに含む、
方法。
【請求項５４】
対象において、抗原に対する細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞応答を増大させることにより、疾患を治療する方法であって、
前記方法は、前記対象に、
（ａ）請求項１３から２７のいずれか一項に記載の集団または請求項２８から３０のいずれか一項に記載の医薬組成物；
（ｂ）請求項１３から２７のいずれか一項に記載の集団または請求項２８から３０のいずれか一項に記載の医薬組成物、および、請求項３７または４６に記載の感作された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞；または
（ｃ）請求項３７または４６に記載の感作された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞、
を投与するステップを含む、
方法。
【請求項５５】
対象において、抗原に対する制御性Ｔ細胞応答を低減させることにより、疾患を治療する方法であって、
前記方法は、前記対象に、
（ａ）請求項１３から２７のいずれか一項に記載の集団または請求項２８のいずれか一項に記載の医薬組成物；
（ｂ）請求項１３から２７のいずれか一項に記載の集団または請求項２８から３０のいずれか一項に記載の医薬組成物および請求項４３または５２に記載の抑制された制御性Ｔ細胞；または
（ｃ）請求項４３または５２に記載の抑制された制御性Ｔ細胞、
を投与するステップを含む、
方法。
【請求項５６】
対象において、抗原に対する制御性Ｔ細胞応答を低減させることにより、疾患を治療する方法であって、
前記方法は、前記対象に、
（ａ）請求項１３から２７のいずれか一項に記載の集団または請求項２８から３０のいずれか一項に記載の医薬組成物および請求項３７または４６に記載の感作された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞；または
（ｂ）請求項３７または４６に記載の感作された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞、
を投与するステップを含む、
方法。
【請求項５７】
請求項５４から５６のいずれか一項に記載の方法であって、
前記疾患は、癌である、
方法。
【請求項５８】
対象において、抗原に対する細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞応答を低減させることにより、疾患を治療する方法であって、
前記方法は、前記対象に、
（ａ）請求項１３から２７のいずれか一項に記載の集団または請求項２８から３０のいずれか一項に記載の医薬組成物；
（ｂ）請求項１３から２７のいずれか一項に記載の集団または請求項２８から３０のいずれか一項に記載の医薬組成物および請求項４１または５０に記載の抑制された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞；または
（ｃ）請求項４１または５０に記載の抑制された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞、
を投与するステップを含む、
方法。
【請求項５９】
対象において、抗原に対する制御性Ｔ細胞応答を増大させることにより、疾患を治療する方法であって、
前記方法は、前記対象に、
（ａ）請求項１３から２７のいずれか一項に記載の集団または請求項２８から３０のいずれか一項に記載の医薬組成物；
（ｂ）請求項１３から２７のいずれか一項に記載の集団または請求項２８から３０のいずれか一項に記載の医薬組成物および請求項３９または４８に記載の感作された制御性Ｔ細胞；または
（ｃ）請求項３９または４８に記載の感作された制御性Ｔ細胞、
を投与するステップを含む、
方法。
【請求項６０】
対象において、抗原に対する細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞応答を低減させることにより、疾患を治療する方法であって、
前記方法は、前記対象に、
（ａ）請求項１３から２７のいずれか一項に記載の集団または請求項２８から３０のいずれか一項に記載の医薬組成物および請求項３９または４８に記載の感作された制御性Ｔ細胞；または
（ｂ）請求項３９または４８に記載の感作された制御性Ｔ細胞
を投与するステップを含む、
方法。
【請求項６１】
請求項５８から６０のいずれか一項に記載の方法であって、
前記疾患は、アレルギー性、自己免疫性または免疫介在性疾患である、
方法。
【請求項６２】
請求項６１に記載の方法であって、
前記アレルギー性疾患は、アトピー性皮膚炎、アレルギー性気道炎症または通年制アレルギー性鼻炎である、
方法。
【請求項６３】
請求項６１に記載の方法であって、
前記自己免疫疾患は、自己免疫性脳脊髄炎である、
方法。
【請求項６４】
請求項６１に記載の方法であって、
前記免疫介在性疾患は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である、
方法。
【請求項６５】
請求項５４から６４のいずれか一項に記載の方法であって、
前記Ｔ細胞は、自家または同種異系である、
方法。
【請求項６６】
請求項５４に記載の方法であって、
前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である、
方法。
【請求項６７】
請求項５４から６６のいずれか一項に記載の方法であって、
前記集団内のｉｏＭＰ細胞は、炎症促進性サイトカインおよび／またはアポトーシス促進性分子を分泌する、
方法。
【請求項６８】
請求項５７に記載の方法であって、
前記集団内のｉｏＭＰ細胞は、接触依存性溶解によって、腫瘍性細胞を標的化する、
方法。
【請求項６９】
対象において、癌を治療する方法であって、
前記方法は、前記対象に、請求項１３から２７のいずれか一項に記載の細胞の集団または請求項２８から３０のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、
方法。
【請求項７０】
対象において、アレルギー性、自己免疫性または免疫介在性疾患を治療する方法であって、
前記方法は、前記対象に、請求項１３から２７のいずれか一項に記載の細胞の集団または請求項２８から３０のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、
方法。
【請求項７１】
ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性、生存能力または安定性を改善する方法であって、
請求項１３から２７のいずれか一項に記載の集団の存在下で、ＣＡＲ  Ｔ細胞をインキュベートするステップを含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫腫瘍中胚葉前駆（ｉｏＭＰ）細胞および治療でのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
中胚葉細胞は、多くの組織から得られて、他の細胞タイプのための支持構造としての役割を果たす。例えば、骨髄は、造血性および間葉性由来細胞の両方から作られる。２つの原則の間葉系細胞型は、以前に述べられて特徴付けられていて、すなわち（ｉ）間葉系幹細胞（ＭＳＣ）およびそれらの前駆体、および、（ｉｉ）骨髄内に見られる間葉前駆細胞（ＭＰＣ）である。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、多能性の成体幹細胞である。ＭＳＣは、分化して、骨組織内に見られる異なる分化細胞を形成する。例えば、それらは、軟骨細胞（コンドロサイト）、骨細胞（骨芽細胞）および脂肪細胞（アディポサイト）に分化することができる。
【０００３】
ＭＳＣは、老人性黄斑変性（ＡＭＤ）および心筋梗塞の治療のような様々な治療において既に用いられている。対象に投与された時点で、ＭＳＣは典型的に、損傷組織へ遊走（またはホーミング）して、パラクリンシグナリングを通して、および、損傷組織内の隣接細胞の生存、修復および再生を促進させることによって、それらの治療的効果を発揮する。
【０００４】
ＭＳＣが特定の免疫抑制性および免疫亢進性の特性を保有し得ることを示唆するいくつかの証拠が存在する。したがって、ＭＳＣを用いて免疫応答を操って、それにより疾患を治療することができる。しかしながら、現在の治療は、典型的に、ＭＳＣサブタイプの混合物の注入を伴い、そのほとんどは、要求される免疫調節特性を保有しない。このことは、高い細胞投与量の使用を余儀なくさせて、オフターゲットの副作用および容量依存的副作用をもたらし得る。さらに、ＭＳＣは典型的に骨髄から得られるので、このアプローチに必要な大量の細胞を得ることが困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、以前に同定または単離されたことのない新規の細胞型である、免疫腫瘍中胚葉前駆（ｉｏＭＰ）細胞に関する。このｉｏＭＰ細胞は、その組成、機能および特徴において、ＭＳＣおよびＭＰＣの両方とはかなり区別されかつ異なり、高い免疫調節能を与える。
【０００６】
本発明者らは、驚くべきことに、特異的なマーカー発現パターンを有する新規の免疫腫瘍中胚葉前駆（ｉｏＭＰ）細胞を同定した。具体的には、ｉｏＭＰ細胞は、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１６４、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２６４、ＣＤ２７０、ＣＤ３２８、ＣＤ３５８、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）γδ、ＦＭＣ７およびＩＴＧＢ７を発現する。ｉｏＭＰ細胞は、ＭＳＣよりも有意に多い量のこれらのマーカーを発現する。ｉｏＭＰ細胞は、検出可能なレベルのＨＬＡ−ＡＢＣ、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、Ｎｏｔｃｈ２、ＣＤ３６０、ＣＬＩＰ、およびＣＤ１１ｂを発現しない。本発明のｉｏＭＰ細胞は、単核細胞（ＭＣ）、例えば末梢血ＭＣから単離され得る。ｉｏＭＰ細胞は、インビトロおよびインビボで、Ｔ細胞応答を増大または低減させることが可能である。また、ｉｏＭＰ細胞は、疾患を治療するためにも用いられ得る。例えば、ｉｏＭＰ細胞は、細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞応答を増大させる、および／または、制御性Ｔ細胞応答を低減させることによって、疾患（癌など）を治療するために用いられ得る。あるいは、ｉｏＭＰ細胞は、細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞応答を低減させる、および／または、制御性Ｔ細胞応答を増大させることによって、疾患（アレルギー性、自己免疫性または免疫介在性疾患など）を治療するために用いられ得る。ｉｏＭＰ細胞は、炎症促進性および抗炎症性サイトカインおよびアポトーシス促進性および抗アポトーシス性分子の、ホーミング、付着、遊出、増殖、分泌、および細胞間接触依存性の溶解が可能である。さらに、ｉｏＭＰ細胞は、Ｔ細胞を発現しているキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の安定性、生存能力または機能を改善するために用いられ得る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明は、免疫腫瘍中胚葉前駆（ｉｏＭＰ）細胞を提供し、細胞は、検出可能なレベルのＣＤ６６ｅ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１６４、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２６４、ＣＤ２７０、ＣＤ３２８、ＣＤ３５８、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）γδ、ＦＭＣ７およびＩＴＧＢ７を発現し、および、検出可能なレベルのＨＬＡ−ＡＢＣ、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、Ｎｏｔｃｈ２、ＣＤ３６０、ＣＬＩＰ、およびＣＤ１１ｂを発現しない。
【０００８】
また、本発明は、以下も提供する：
−本発明の２以上のｉｏＭＰ細胞の集団；
−ｉｏＭＰ細胞の集団、ここで
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも６０％は、検出可能なレベルのＣＤ６６ｅを発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも４５％は、検出可能なレベルのＣＤ１２１ｂを発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも３５％は、検出可能なレベルのＣＤ１２２を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＣＤ１６４を発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも４５％は、検出可能なレベルのＣＤ１７２ａを発現し、
（ｖｉ）集団内の細胞の少なくとも３５％は、検出可能なレベルのＣＤ２０３ｃを発現し、
（ｖｉｉ）集団内の細胞の少なくとも４５％は、検出可能なレベルのＣＤ２６４を発現し、
（ｖｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも３５％は、検出可能なレベルのＣＤ２７０を発現し、
（ｉｘ）集団内の細胞の少なくとも３５％は、検出可能なレベルのＣＤ３２８を発現し、
（ｘ）集団内の細胞の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＣＤ３５８を発現し、
（ｉｘ）集団内の細胞の少なくとも４５％は、検出可能なレベルのＴＣＲγδを発現し、
（ｘ）集団内の細胞の少なくとも９５％は、検出可能なレベルのＦＭＣを発現し、および
（ｘｉ）集団内の細胞の少なくとも９５％は、検出可能なレベルのＩＴＧＢ７を発現する；
およびここで
（ａ）集団内の細胞の０．５％以下は、検出可能なレベルのＨＬＡ−ＡＢＣを発現し、
（ｂ）集団内の細胞の０．５％以下は、検出可能なレベルのＭＩＣ  Ａ／Ｂを発現し、
（ｃ）集団内の細胞の０．５％以下は、検出可能なレベルのＮｏｔｃｈ２を発現し、
（ｄ）集団内の細胞の０．５％以下は、検出可能なレベルのＣＤ３６０を発現し、
（ｅ）集団内の細胞の０．５％以下は、検出可能なレベルのＣＬＩＰを発現し、および
（ｆ）集団内の細胞の０．１％以下は、検出可能なレベルのＣＤ１１ｂを発現する；
−（ａ）本発明のｉｏＭＰ細胞または本発明の集団および（ｂ）薬学的に許容できる担体または希釈剤、１つまたは複数のリポソームおよび／または１つまたは複数の微小気泡を含む、医薬組成物；
−（ａ）本発明のｉｏＭＰ細胞または本発明の集団；（ｂ）免疫細胞；（ｃ）抗原；および（ｄ）薬学的に許容できる担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
−（ａ）単核細胞（ＭＣ）を、ＭＣがｉｏＭＰ細胞に分化するのを誘導する条件下で培養するステップ、および、（ｂ）上記に定義される発現パターンを有するｉｏＭＰ細胞を採取および培養して、それにより、本発明の集団を生産するステップ、を含む、本発明のｉｏＭＰ細胞の集団を生産する方法；
−Ｔ細胞の活性を増大させる条件下で、Ｔ細胞を、抗原および本発明の集団とともにインキュベートするステップを含む、抗原に応答して、細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞の活性を増大させるインビトロの方法；
−上記方法を用いて生産される、感作された（ｐｒｉｍｅｄ）細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞；
−Ｔ細胞の活性を増大させる条件下で、Ｔ細胞を、抗原および本発明の集団とともにインキュベートするステップを含む、抗原に応答して、制御性Ｔ細胞の活性を増大させるインビトロの方法；
−上記方法を用いて生産される、感作された制御性Ｔ細胞；
−Ｔ細胞の活性を低減させる条件下で、Ｔ細胞を、抗原および本発明の集団とともにインキュベートするステップを含む、抗原に応答して、細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞の活性を低減させるインビトロの方法；
−上記方法を用いて生産される、抑制された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞；
−Ｔ細胞の活性を低減させる条件下で、Ｔ細胞を、抗原および本発明の集団とともにインキュベートするステップを含む、抗原に応答して、制御性Ｔ細胞の活性を低減させるインビトロの方法；
−上記方法を用いて生産される、抑制された制御性Ｔ細胞；
−Ｔ細胞の活性を増大させる条件下で、対象に、本発明の集団または医薬組成物を投与するステップを含む、抗原に応答して、細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞の活性を増大させるインビボの方法；
−上記方法を用いて生産される、感作された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞；
−Ｔ細胞の活性を増大させる条件下で、対象に、本発明の集団または医薬組成物を投与するステップを含む、抗原に応答して、制御性Ｔ細胞の活性を増大させるインビボの方法；
−上記方法を用いて生産される、感作された制御性Ｔ細胞；
−Ｔ細胞の活性を低減させる条件下で、対象に、本発明の集団または医薬組成物を投与するステップを含む、抗原に応答して、細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞の活性を低減させるインビボの方法；
−上記方法を用いて生産される、抑制された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞；
−Ｔ細胞の活性を低減させる条件下で、対象に、本発明の集団または医薬組成物を投与するステップを含む、抗原に応答して、制御性Ｔ細胞の活性を低減させるインビボの方法；
−上記方法を用いて生産される、抑制された制御性Ｔ細胞；
−対象において、抗原に対する細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞応答を増大させることにより、疾患を治療する方法であって、当該方法は、対象に、以下を投与するステップを含む：
（ａ）本発明の集団または医薬組成物
（ｂ）本発明の集団または医薬組成物、および、本発明の感作された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞；または
（ｃ）本発明の感作された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞；
−対象において、抗原に対する制御性Ｔ細胞応答を低減させることにより、疾患を治療する方法であって、当該方法は、対象に、以下を投与するステップを含む：
（ａ）本発明の集団または医薬組成物；
（ｂ）本発明の集団または医薬組成物、および、本発明の抑制された制御性Ｔ細胞；または
（ｃ）本発明の抑制された制御性Ｔ細胞；
−対象において、抗原に対する制御性Ｔ細胞応答を低減させることにより、疾患を治療する方法であって、当該方法は、対象に、以下を投与するステップを含む：
（ａ）本発明の集団または医薬組成物、および、本発明の感作された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞；または
（ｂ）本発明の感作された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞；
−対象において、抗原に対する細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞応答を低減させることにより、疾患を治療する方法であって、当該方法は、対象に、以下を投与するステップを含む：
（ａ）本発明の集団または医薬組成物；
（ｂ）本発明の集団または医薬組成物、および、本発明の抑制された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞；または
（ｃ）本発明の抑制された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞；
−対象において、抗原に対する制御性Ｔ細胞応答を増大させることにより、疾患を治療する方法であって、当該方法は、対象に、以下を投与するステップを含む：
（ａ）本発明の集団または医薬組成物；
（ｂ）本発明の集団または医薬組成物、および、本発明の感作された制御性Ｔ細胞；または
（ｃ）本発明の感作された制御性Ｔ細胞；
−対象において、抗原に対する細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞応答を低減させることにより、疾患を治療する方法であって、当該方法は、対象に、以下を投与するステップを含む：
（ａ）本発明の集団または医薬組成物；および、本発明の感作された制御性Ｔ細胞；または
（ｂ）本発明の感作された制御性Ｔ細胞；
−対象において、癌を治療する方法であって、当該方法は、対象に、本発明の集団または医薬組成物を投与するステップを含む；
−対象において、アレルギー性、自己免疫性または免疫介在性疾患を治療する方法であって、当該方法は、対象に、本発明の集団または医薬組成物を投与するステップを含む；
および
−本発明の集団の存在下で、ＣＡＲ  Ｔ細胞をインキュベートするステップを含む、ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性、生存能力または安定性を改善する方法。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
開示される産物および方法の異なる適用は、当該分野における特定のニーズに合わせられ得ることが理解されるよう。また、本明細書において用いられる専門用語は、本発明の特定の実施態様を説明する目的のためだけのものであり、限定されることを意図しないことも理解されよう。
【００１０】
さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに別段の指示をしない限り、複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」との言及は、複数の細胞（ｃｅｌｌｓ）を含み、「組織（ａ  ｔｉｓｓｕｅ）」との言及は、２以上のそのような組織（ｔｉｓｓｕｅｓ）を含み、「対象（ａ  ｓｕｂｊｅｃｔ）」との言及は、２以上のそのような対象（ｓｕｂｊｅｃｔｓ）を含む、などである。
【００１１】
上記であろうと下記であろうと、本明細書中に挙げられる全ての刊行物、特許および特許出願は、それらの全体で参照により本明細書に援用される。
【００１２】
本発明のｉｏＭＰ細胞
本発明は、免疫腫瘍中胚葉前駆（ｉｏＭＰ）細胞を提供する。ｉｏＭＰ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ６６ｅ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１６４、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２６４、ＣＤ２７０、ＣＤ３２８、ＣＤ３５８、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）γδ、ＦＭＣ７およびＩＴＧＢ７を発現する。ｉｏＭＰ細胞は、検出可能なレベルのＨＬＡ−ＡＢＣ、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、Ｎｏｔｃｈ２、ＣＤ３６０、ＣＬＩＰ、およびＣＤ１１ｂを発現しない。
【００１３】
ＣＤ６６ｅ（代替的名称：癌胎児性抗原関連細胞接着分子５、ＣＥＡＣＡＭ−５）は、ＣＥＡＣＡＭ−１とのホモフィリックおよびヘテロフィリックな相互作用を通して、カルシウム非依存性接着分子として機能する。ＣＤ６６ｅは、細胞遊走、浸潤および接着を促進し、そして、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）アンカレージの喪失（アノイキス）の後のアポトーシスをブロックする。
【００１４】
ＣＤ１２１ｂ（代替的名称：インターロイキン１受容体ＩＩ型、ＩＬ１Ｒ２）は、インターロイキンα（ＩＬ１Ａ）、インターロイキンβ（ＩＬ１Ｂ）およびインターロイキン１受容体Ｉ型（ＩＬ１Ｒ１／ＩＬ１ＲＡ）に結合して、そのリガンドの活性を阻害するデコイ受容体として作用する。インターロイキン４（ＩＬ−４）は、このサイトカインの発現および放出を誘導することによって、インターロイキン１の活性に拮抗することが報告されている。
【００１５】
インターロイキン２（ＩＬ−２）は、ＩＬ−２受容体に結合し、３つの形態を有する。これらの３つの形態は、「鎖」としばしば呼ばれる３つの異なるタンパク質：α（アルファ）（ＩＬ−２Ｒα、ＣＤ２５、またはＴａｃ抗原とも呼ばれる）、β（ベータ）（ＩＬ−２Ｒβ、またはＣＤ１２２とも呼ばれる）、およびγ（ガンマ）（ＩＬ−２Ｒγ、γｃ、一般的なガンマ鎖、またはＣＤ１３２とも呼ばれる）の異なる組み合わせによって生じる。ＩＬ−２およびその受容体は、耐性および免疫性のような、免疫系のキーとなる機能において重要な役割を有する。ＩＬ−２およびその受容体の効果は、Ｔ細胞に対するそれらの直接的な効果を介して主に仲介される。
【００１６】
ＣＤ１６４は、シアロムチンコアタンパク質２４としても知られ、細胞接着分子として機能する。シアロムチンは、第一には細胞保護的または抗接着性の作用物質として、第二には接着受容体として、２つの重要だが反対の役割をインビボで果たすと考えられる、分泌型または膜結合型ムチンの異種のグループである。ＣＤ１６４は、前駆細胞における増殖、接着および遊走を調節する、シグナリング受容体としての役割を果たし得る。また、ＣＤ１６４は、場合により、ＣＸＣＲ４リガンドＳＤＦ−１αに関する共役受容体として、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４と関連し得る。
【００１７】
ＣＤ１７２ａ（代替的名称：シグナル調節タンパク質α、ＳＩＲＰα）は、骨髄性細胞によって主に発現されて、幹細胞またはニューロンによっても発現される、ＳＩＲＰファミリー由来の調節膜糖タンパク質である。ＳＩＲＰαは、阻害受容体として作用し、および、幅広く発現される膜貫通タンパク質ＣＤ４７と相互作用する（「ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ」シグナルとしても知られる）。この相互作用は、宿主細胞の貪食のような先天性の免疫細胞のエフェクター機能をネガティブに制御する。
【００１８】
ＣＤ２０３ｃ（他には、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３として知られる）は、細胞外ヌクレオチドの加水分解に関与する、一連のエクトエンザイムの１つである。これらのエクトエンザイムは、ＡＴＰａｓｅおよびＡＴＰピロホスファターゼ活性を保有し、ＩＩ型膜貫通タンパク質である。
【００１９】
ＣＤ２６４は、ＣＤ２５３（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド、ＴＲＡＩＬ）に関する膜受容体であり、他のＴＲＡＩＬ受容体との結合に関して競合することによってデコイ受容体として作用すると考えられ、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを阻害する。ＣＤ２６４は、アポトーシスを誘導せず、ＴＲＡＩＬ誘導性の細胞アポトーシスにおいて、阻害の役割を果たすことが示されている。
【００２０】
ＣＤ２７０は、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、ＴＮＦＲ−ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーである。Ｔ細胞に対するＣＤ２７０相互作用は、ＣＤ２７０シグナリングを介して共刺激シグナルを提供する。ＣＤ２７０は、サイトカインおよびマトリックスメタロプロテイナーゼの誘導に関与することが報告されている。
【００２１】
ＣＤ３２８（代替的名称：シアル酸結合Ｉｇ様レクチン７、ＳＩＧＬＥＣ７）は、細胞に対するシアル酸依存性の結合を仲介する、推定の接着分子である。ＣＤ３２８は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞傷害性機能の阻害を仲介する。また、ＣＤ３２８は、骨髄単球性細胞系統へのＣＤ３４＋細胞前駆体の分化およびインビトロでの白血病性骨髄性細胞のインビトロ増殖を阻害する。
【００２２】
ＣＤ３５８（細胞死受容体６、ＤＲ６、またはＴＮＦＲＳＦ２１としても知られる）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ３５８は、核因子κＢおよび分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ８を活性化して、細胞アポトーシスを誘導する。マウスにおけるノックアウト試験は、この遺伝子が、ヘルパーＴ細胞活性化において役割を果たし、炎症および免疫制御に関与し得ることを示唆する。
【００２３】
ＴＣＲ−γδは、γおよびδＴＣＲ鎖を含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。ＴＣＲは、ＩＩ型主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される外来物を自己ペプチドから区別し、効果的な適応性の免疫応答に必須である。ＴＣＲ−γδを発現しているＴ細胞は、γδＴ細胞として知られる。γδＴ細胞は、抗腫瘍および免疫調節活性が示されている。
【００２４】
ＦＭＣ７は、特にＴ細胞非依存性抗原に対する、Ｂ細胞免疫応答の最適化に関与する。
【００２５】
ＩＴＧＢ７は、白血球の接着相互作用を仲介する。
【００２６】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、非常に多くの利点を有する。重要な利点をここに要約する。しかしながら、さらなる利点が、以下の記述から明らかになる。
【００２７】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、対象における疾患を治療するために有利に用いられ得る。例えば、ｉｏＭＰ細胞は、対象における癌を治療するために用いられ得る。また、ｉｏＭＰ細胞は、対象におけるアレルギー性、自己免疫性または免疫介在性疾患を治療するためにも用いられ得る。
【００２８】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、それらの直接的な効果を介して疾患を治療し得る。例えば、ｉｏＭＰ細胞は、接触依存性の細胞溶解を介して細胞を死滅させ得る。好ましくは、ｉｏＭＰ細胞は、接触依存性の細胞溶解を介して腫瘍細胞を死滅させる。また、ｉｏＭＰ細胞は、他の細胞に作用する分子も分泌し得る。そのような分子は、細胞代謝、増殖、生存、機能またはシグナリングに影響を及ぼし得る。例えば、ｉｏＭＰ細胞は、炎症促進性サイトカインおよび／または抗炎症性サイトカインを分泌し得る。ｉｏＭＰ細胞は、アポトーシス促進性分子および／または抗アポトーシス性分子を分泌し得る。
【００２９】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、免疫応答を調節し得る。換言すれば、ｉｏＭＰ細胞は、免疫調節効果を有し得る。例えば、ｉｏＭＰは、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、γδＴ細胞および制御性Ｔ細胞のような、免疫細胞の活性を増大または低減させ得る。γδＴ細胞が好ましい。本発明のｉｏＭＰ細胞は、したがって、Ｔ細胞応答を増大または低減させることにより、対象における疾患を治療するために用いられ得る。このことは、以下により詳細に述べられる。
【００３０】
加えて、本発明のｉｏＭＰ細胞は、インビトロまたはインビボで、抗原に応答して、Ｔ細胞の活性を調節するために用いられ得る。したがって、ｉｏＭＰ細胞は、抗原に応答して調節された活性を有するＴ細胞の集団を生産するために用いられ得る。例えば、ｉｏＭＰ細胞は、感作された、または、抑制されたＴ細胞の集団を生産するために用いられ得る。感作された、または、抑制されたＴ細胞は、対象における疾患を治療するために用いられ得る。具体的には、感作された、または、抑制されたＴ細胞は、Ｔ細胞の活性を増大または低減させることによって、対象における疾患を治療するために用いられ得る。感作された、または、抑制されたＴ細胞は、単独で、または、ｉｏＭＰ細胞と組み合わせて、対象に投与され得る。
【００３１】
また、本発明のｉｏＭＰ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の有効性、生存能力および／または安定性を改善する方法において使用され得る。このこともまた、以下により詳細に述べられる。
【００３２】
以下により詳細に述べられるように、ｉｏＭＰ細胞は、ヒト個体のような個体から得られる、単核細胞（ＭＣ）、例えば末梢ＭＣから生産される。ｉｏＭＰ細胞は、ＭＣから生産されるので、それらは（例えば末梢血から）簡単に生産され得て、治療される対象に関して自家であり得て、したがって、対象による免疫学的拒絶のリスクを避ける。
【００３３】
様々なＭＣサンプル（すなわち様々な血液サンプル）が得られ得るので、単一の個体から、無制限の数のｉｏＭＰ細胞を生産することが原理的に可能である。単一の個体から、非常に大量のｉｏＭＰ細胞を生産することが確実に可能である。本発明のｉｏＭＰ細胞は、したがって、大量に作られ得る。
【００３４】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、臨床関連の条件下で、例えば、微量のエンドトキシンおよび他の環境汚染物質、ならびに、ウシ胎仔血清などの動物産物の不存在下で生産される。このことは、本発明のｉｏＭＰ細胞を、対象への投与に特に適切にさせる。
【００３５】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、ＭＣから生産されるので、実質的に同質であり、自家であり得る。それらは、ＭＳＣで頻繁に生じるドナー間の変動も避ける。非常に多くの本発明のｉｏＭＰ細胞の集団が、化学療法または放射線療法のような任意の他の治療が始まる前に対象から取得された単一サンプルから生産され得る。したがって、本発明のｉｏＭＰ細胞は、これらの治療の任意の有害効果を避けることができる。
【００３６】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、迅速に作成され得る。ｉｏＭＰ細胞は、ＭＣから、３０日未満で、例えば、約２９日、約２８日、約２７日、約２６日、約２５日、約２４日、約２３日、約２２日、約２１日、約２０日、約１９日、約１８日、約１７日、約１６日、約１５日、約１４日、約１３日、約１２日、約１１日、約１０日、約９日、約８日、約７日、約６日、約５日、約４日、約３日、約２日または約１日で生産され得る。
【００３７】
ＭＣからのｉｏＭＰ細胞の生産は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に由来する間葉系幹細胞ＭＳＣの使用と関連する道徳的および倫理的影響を回避する。
【００３８】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、典型的に、ヒトＭＣから生産される。本発明のｉｏＭＰ細胞は、したがって、典型的にヒトである。あるいは、ｉｏＭＰ細胞は、他の動物または哺乳類由来、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタのような商業的に飼育される動物由来、マウスまたはラットのような実験動物由来、または、ネコ、イヌ、ウサギまたはモルモットのようなペット由来の、ＭＣから生産され得る。
【００３９】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、系列制限マーカーの発現、構造的および機能的特徴を含む、当技術分野で知られている標準的な方法を用いて、免疫腫瘍中胚葉前駆細胞として同定され得る。ｉｏＭＰ細胞は、ｉｏＭＰ細胞の特徴であることが知られる検出可能なレベルの細胞表面マーカーを発現する。これらは以下に述べられる。
【００４０】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、分化アッセイをインビトロでうまく完了させて、それらが中胚葉系列であることを確認することが可能である。そのようなアッセイは、限定されないが、脂肪生成分化アッセイ、骨分化アッセイおよび神経分化アッセイを含む（Ｚａｉｍ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ  Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１２  Ａｕｇ；９１（８）：１１７５−８６）。
【００４１】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、幹細胞ではない。具体的には、それらはＭＳＣではない。それらは最終分化している。それらは、インビトロで適切な条件下で、例えば軟骨または骨細胞へ分化させることができるが、それらは典型的に、インビボでは分化しない。本発明のｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、（ｉ）接触依存性の細胞溶解、サイトカインの分泌および／またはアポトーシス促進性または抗アポトーシス性分子の分泌のような、直接的な効果；または、（ｉｉ）免疫応答または免疫細胞活性の調節（すなわち免疫調節効果）によって、それらの効果を有する。対照的に、幹細胞は、典型的に、置換組織へ分化することによって疾患を治療する。
【００４２】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、典型的に、紡錘形の形態によって特徴付けられる。ｉｏＭＰ細胞は典型的に、線維芽細胞様であり、すなわちそれらは、長細い多少の細胞突起を有する小さな細胞体を有する。細胞は典型的に、約１０〜約２０μｍの直径である。
【００４３】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、ＭＳＣを含む公知の細胞から、それらのマーカー発現パターンを介して区別される。ｉｏＭＰは、検出可能なレベルのＣＤ６６ｅ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１６４、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２６４、ＣＤ２７０、ＣＤ３２８、ＣＤ３５８、ＴＣＲγδ、ＦＭＣ７およびＩＴＧＢ７を発現する。ｉｏＭＰは、好ましくは、ＭＳＣと比較して増加した量のこれらのマーカーを発現する。ｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、ＭＳＣと比較して増加した量の全てのマーカーを発現する。これは、同一の条件下で同一の技術を用いて、本発明のｉｏＭＰにおけるマーカーの発現レベル／量を、ＭＳＣにおける発現レベル／量と比較することによって判定され得る。適切なＭＳＣは、市販されている。比較に用いられるＭＳＣは、好ましくはヒトＭＳＣである。ヒトＭＳＣは、Ｍｅｓｏｂｌａｓｔ（登録商標）Ｌｔｄ、Ｏｓｉｒｉｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（登録商標）Ｉｎｃ．またはＬｏｎｚａ（登録商標）から市販される。ヒトＭＳＣは、好ましくは、Ｌｏｎｚａ（登録商標）から得られる。そのような細胞は、実施例において比較のために用いた。ＭＳＣは、上記に述べた任意の動物または哺乳類に由来し得る。
【００４４】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、検出可能なレベルのＨＬＡ−ＡＢＣ、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、Ｎｏｔｃｈ２、ＣＤ３６０、ＣＬＩＰおよびＣＤ１１ｂを発現しない。
【００４５】
当技術分野で知られている標準的な方法は、上記（および以下）に述べられる様々なマーカーの、検出可能な発現または増大した発現を判定するために用いられ得る。適切な方法は、限定されないが、免疫細胞化学、免疫測定法、フローサイトメトリー、例えば、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む。適切な免疫測定法は、限定されないが、ウェスタンブロッティング、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫吸着スポット分析（ＥＬＩＳＰＯＴ分析）、競合的酵素免疫分析法、放射性アレルゲン吸着（ＲＡＳＴ）試験、ラジオイムノアッセイ、ラジオバインディングアッセイおよび免疫蛍光を含む。ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡおよびＲＴ−ＰＣＲは、全て定量的なので、存在するならば様々なマーカーの発現のレベルを測定するために用いられ得る。ハイスループットＦＡＣＳ（ＨＴ−ＦＡＣＳ）の使用は、実施例に開示される。本明細書に開示される任意のマーカーの発現または増大した発現は、好ましくは、ＨＴ−ＦＡＣＳを用いてなされる。本明細書において述べられる様々なマーカーの全てに関する抗体および蛍光標識抗体は、市販される。
【００４６】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、ＣＤ６６ｅに関して、少なくとも４１０、例えば、少なくとも４５０または少なくとも５００の抗体平均蛍光強度（ＭＦＩ）；ＣＤ１２１ｂに関して、少なくとも７７０、例えば、少なくとも８００または少なくとも８５０のＭＦＩ；ＣＤ１２２に関して、少なくとも３６５、例えば、少なくとも４００または少なくとも４５０のＭＦＩ；ＣＤ１６４に関して、少なくとも４５５、例えば、少なくとも８００または少なくとも８５０のＭＦＩ；ＣＤ１７２ａに関して、少なくとも３６３、例えば、少なくとも４００または少なくとも４５０のＭＦＩ；ＣＤ２０３ｃに関して少なくとも３７１のＭＦＩ；ＣＤ２６４に関して、少なくとも４１１、例えば、少なくとも４５０または少なくとも５００のＭＦＩ；ＣＤ２７０に関して、少なくとも３７０、例えば、少なくとも４００または少なくとも４５０のＭＦＩ；ＣＤ３２８に関して、少なくとも３６９、例えば、少なくとも４００または少なくとも４５０のＭＦＩ；ＣＤ３５８に関して、少なくとも４０６、例えば、少なくとも４５０または少なくとも５００のＭＦＩ；ＴＣＲγδに関して、少なくとも４３０、例えば、少なくとも４５０または少なくとも５００のＭＦＩ、ＦＭＣ７に関して、少なくとも３５００、例えば、少なくとも３７５０または少なくとも４０００のＭＦＩ、および、ＩＴＧＢ７に関して、少なくとも１５００、例えば、少なくとも１７５０または少なくとも２０００のＭＦＩを示す。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、平方メートルあたりのワットで測定される、強度、時間平均エネルギー束の測定単位である。それはＳＩ単位である。各マーカーに関するＭＦＩは、典型的に、ＨＴ−ＦＡＣＳを用いて測定される。各マーカーに関するＭＦＩは、好ましくは、実施例に記載のＨＴ−ＦＡＣＳを用いて測定される。
【００４７】
上記に規定されるマーカーに加えて、本発明のｉｏＭＰ細胞は、典型的に、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、Ｎｏｔｃｈ２、ＣＤ３６０、ＣＬＩＰ、およびＣＤ１１ｂを除き、実施例の表１に示される他のマーカーの１つまたは複数を、検出可能なレベルで発現する。ｉｏＭＰ細胞は、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、Ｎｏｔｃｈ２、ＣＤ３６０、ＣＬＩＰ、およびＣＤ１１ｂを除き、任意の数および組み合わせの表１のマーカーを、検出可能なレベルで発現し得る。ｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、Ｎｏｔｃｈ２、ＣＤ３６０、ＣＬＩＰ、およびＣＤ１１ｂを除き、表１のマーカーの全てを、検出可能なレベルで発現する。
【００４８】
ｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの１つまたは複数のβ２−ミクログロブリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４７、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１／ＣＤ６１、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６３、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１０５、ＣＤ１０８、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１３０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５１、ＣＤ１５５、ＣＤ１６６、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ２５７、ＣＤ２７６、ＣＤ２８８、ＣＤ２９５、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３５１、、ＣＤ２３０、カドヘリン−１１（ＣＤＨ１１）、およびリンホトキシンβ受容体（ＬＴＢＲを、さらに発現する。ｉｏＭＰ細胞は、これらのマーカーの任意の数および組み合わせを、検出可能なレベルで発現し得る。ｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、これらのマーカーの全てを検出可能なレベルで発現する。
【００４９】
ｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、ＭＳＣと比較して、増加した量の１つまたは複数のβ２−ミクログロブリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４７、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１／ＣＤ６１、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６３、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１０５、ＣＤ１０８、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１３０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５１、ＣＤ１５５、ＣＤ１６６、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ２５７、ＣＤ２７６、ＣＤ２８８、ＣＤ２９５、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３５１、ＣＤ２３０、カドヘリン−１１（ＣＤＨ１１）およびリンホトキシンβ受容体（ＬＴＢＲを発現する。ｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、これらのマーカーの全てを、ＭＳＣと比較して増加した量で発現する。
【００５０】
ｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの１つまたは複数のＣＤ２６、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５４、ＣＤ１１０、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１４６、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１７８、ＣＤ１８６、ＣＤ１９３、ＣＤ１９６、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２２１、ＣＤ２２７、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２４５、ＣＤ２５２、ＣＤ２５６、ＣＤ２６７、ＣＤ２７２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８６、ＣＤ２９０、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０９、ＣＤ３１２、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３５４、ポドプラニンおよびＳＳＥＡ−４をさらに発現する。ｉｏＭＰ細胞は、これらのマーカーの任意の数および組み合わせを、検出可能なレベルで発現し得る。ｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、これらのマーカーの全てを検出可能なレベルで発現する。
【００５１】
ｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、ＭＳＣと比較して、増加した量の１つまたは複数のＣＤ２６、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５４、ＣＤ１１０、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１４６、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１７８、ＣＤ１８６、ＣＤ１９３、ＣＤ１９６、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２２１、ＣＤ２２７、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２４５、ＣＤ２５２、ＣＤ２５６、ＣＤ２６７、ＣＤ２７２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８６、ＣＤ２９０、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０９、ＣＤ３１２、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３５４、ポドプラニンおよびＳＳＥＡ−４を発現する。ｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、これらのマーカーの全てを、ＭＳＣと比較して増加した量で発現する。
【００５２】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、対象の病変組織において、炎症促進性または抗炎症性効果を有することが可能である。本発明のｉｏＭＰ細胞が炎症促進性または抗炎症性効果を有する能力は、当技術分野で知られている標準的なアッセイを用いて測定され得る。適切な方法は、限定されないが、サイトカインの分泌に関する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、増強された混合白血球反応、および、共刺激分子および成熟マーカーの上方制御（フローサイトメトリーにより測定される）を含む。用いられ得る具体的な方法は、実施例に開示される。測定されるサイトカインは、典型的に、インターロイキン、例えば、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、セレクチン、接着分子、例えば、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、および、化学誘引物質タンパク質、例えば、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）である。これらのサイトカインに関するアッセイは、市販されている。抗炎症性因子は、好ましくは、実施例に記載のＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイを用いて検出および測定される。そのようなアッセイは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）から市販される。
【００５３】
ｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの１つまたは複数のインターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＩＬ−８、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０；インターフェロンγ誘導性タンパク質１０；ＩＰ−１０）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２；単球走化性タンパク質−１；ＭＣＰ−１）およびケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５；ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ；ＲＡＮＴＥＳ）を分泌する。ｉｏＭＰ細胞は、任意の数および組み合わせのこれらの因子を分泌し得る。ｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、これらのマーカーの全てを分泌する。
【００５４】
ｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、ＭＳＣと比較して増加した量の１つまたは複数のＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１およびＲＡＮＴＥＳを分泌する。ｉｏＭＰ細胞は、任意の数および組み合わせのこれらの因子を、増加した量で分泌し得る。ｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、これらのマーカーの全てを増加した量で分泌する。
【００５５】
ｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、間葉系幹細胞ＭＳＣと比較して減少した量のインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）および／またはＩＬ−１２を分泌する。ＩＬ−１０およびＩＬ−１２は、炎症促進性サイトカインである。
【００５６】
本発明の任意のｉｏＭＰ細胞は、検出可能なレベルの１つまたは複数の（ｉ）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、（ｉｉ）形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、（ｉｉｉ）インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、（ｉｖ）線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、（ｖ）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、（ｖｉ）インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）および（ｖｉｉ）インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）を発現し得る。ＶＥＧＦを過剰発現する細胞由来の馴化培地は、ハムスターモデルにおいて心不全を緩和することが示されている。それ故に、ＶＥＧＦを発現または増加した量で発現する本発明のＩＭＰ細胞は、病変した臓組織の同一効果を有する。
【００５７】
ｉｏＭＰ細胞は、検出可能なレベルの１つまたは複数の（ｉ）〜（ｖｉｉ）を発現し得る。本発明のｉｏＭＰ細胞は、ＭＳＣと比較して増加した量の１つまたは複数の（ｉ）〜（ｖｉｉ）を発現し得る。細胞マーカーに関する定量分析は上述される。これらのマーカーの検出可能な発現およびそれらの発現レベルは、上述のように測定され得る。
【００５８】
上記に与えられる（ｉ）〜（ｖｉｉ）の定義において、任意の組み合わせの１つまたは複数の（ｉ）〜（ｖｉｉ）は、発現または増加した量で発現され得る。例えば、（ｉ）〜（ｖｉｉ）のそれぞれの定義に関して、ＩＭＰ細胞は、（ｉ）；（ｉｉ）；（ｉｉｉ）；（ｉｖ）；（ｖ）；（ｖｉ）；（ｖｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）および（ｖ）；（ｉ）および（ｖｉ）；（ｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉ）および（ｖ）；（ｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉｉ）および（ｖ）；（ｉｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｖ）および（ｖｉ）；（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ、）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）およびｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉｉ）、ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）およびｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）；または（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）を、検出可能なレベルで発現し得て、または、増加した量で発現し得る。（ｉ）〜（ｖｉｉ）の組み合わせは、このリストから独立に選択可能である。
【００５９】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルのインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を発現および／または分泌する。本発明のｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、ＭＳＣと比較して増加した量のＩＦＮ−γを発現および／または分泌する。ＩＦＮ−γの発現または分泌は、上記に示される方法を用いて判定され得る。
【００６０】
上記に述べた任意のマーカーに加えて、本発明のｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、検出可能なレベルの、ＬＩＦおよび／または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体も発現する。本発明のｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、間葉系幹細胞と比較して増加した量のＬＩＦおよび／または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体を発現する。ＰＤＧＦ受容体は、好ましくは、ＰＤＧＦ−Ａ受容体および／またはＰＳＤＧＦ−Ｂ受容体である。これらの受容体が高発現であるＭＳＣは、創傷および血栓性血管のような、血小板が活性化されている領域へ効率的に遊走することができる。受容体を発現または増加した量で発現しているｉｏＭＰ細胞についても同じことが言える。
【００６１】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、対象内で特異的な組織へ遊走することが可能である。換言すれば、疾患（例えば、癌、自己免疫性または免疫介在性疾患、またはアレルギー性疾患）を有する対象に細胞が投与されると、その細胞は、必要とされる組織（単数または複数）へ遊走またはホーミングすることが可能である。組織は、健康な対象内に正常に存在する組織であり得る。あるいは、組織は腫瘍であり得る。ｉｏＭＰ細胞のこの遊走能力は、細胞が、標準的な経路、例えば静脈を介して注入され得て、それから、疾患部位を標的化することを意味するので、利点である。細胞は、病変組織へ送達される必要はない。
【００６２】
特異的な組織は、好ましくは、心臓、骨、軟骨、腱、靭帯、肝臓、腎臓、脳、卵巣、精巣、胸部、肺または皮膚組織である。これは、遊走だけでなく、上記および以下により詳細に述べられるように、付着、遊出、増殖、抗腫瘍効果、免疫調節効果、炎症促進性効果および抗炎症性効果にも当てはまる。
【００６３】
本発明のｉｏＭＰ細胞が病変組織へ遊走する能力は、当技術分野で知られている標準的なアッセイを用いて測定され得る。適切な方法は、限定されないが、ゲノム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（レポーター遺伝子を伴うまたは伴わないＲＴ−ＰＣＲ）および標識化技術を含む。
【００６４】
ＲＴ−ＰＣＲは、対象内で本発明のｉｏＭＰ細胞をトレースする最も直接的かつ単純な手段である。形質導入された導入遺伝子または個々のドナーマーカーを、この目的のために用いることができ、移植された細胞特異的なシグナルが、いくつかの対象試験において得られている。結果は一般に半定量的である。
【００６５】
あるいは、本発明のｉｏＭＰ細胞は、蛍光色素のような目的の色素によって染色され得て、色素からのシグナルを介して対象においてモニターされ得る。そのような方法は、当技術分野において日常的である。
【００６６】
遊走（またはホーミング）は、典型的に、損傷組織に到達する細胞の数を測定することによって判定される。またそれは、（損傷組織ではなく）肺に蓄積された細胞の数を観察することによって間接的に測定もされ得る。
【００６７】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、対象内の特異的な病変組織に接着することが可能である。付着および接着アッセイは、当技術分野で知られている（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；５２２：２０３−１０）。
【００６８】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、血管の内皮を通って、対象内の特異的な病変組織へ遊出することが可能である。遊出アッセイは、当技術分野で知られている（Ｍｕｌｌｅｒａｎｄ  Ｌｕｓｃｉｎｓｋａｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００８；４４３：１５５−１７６）。
【００６９】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、抗腫瘍効果を発揮することが可能である。上記に示されるように、これらの効果は、直接的（例えば、接触依存性の細胞溶解、サイトカイン放出、または、アポトーシスの制御による）、または、間接的（例えば、免疫調節を介する）であってよい。サイトカイン分泌に関するアッセイは上述される。接触依存性の細胞溶解およびアポトーシスに関するアッセイは、当技術分野でよく知られている（Ｅｌｍｏｒｅ，Ｔｏｘｃｏｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００７；３５（４）：４９５−５１６；Ｚａｒｉｔｓｋａｙａ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２０１０  Ｊｕｎｅ；９（６）：６０１−６１６）。
【００７０】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、免疫調節が可能である。免疫調節は、免疫応答または免疫細胞の活性の調節である。免疫調節は、様々なメカニズムによって達成され得る。例えば、ｉｏＭＰ細胞は、免疫細胞に対する作用を変更してそれらの活性を変更するサイトカインまたは炎症性メディエーターを分泌し得る。また、ｉｏＭＰ細胞は、他の手段によって免疫細胞にシグナル伝達し得る。例えば、ｉｏＭＰ細胞に対するリガンドは、標的免疫細胞上の受容体に結合し得て、シグナリングカスケードをトリガーする。サイトカイン分泌およびマーカー（リガンド）発現を測定する方法は、上述される。免疫細胞のシグナリングおよび活性を測定する方法は、当技術分野でよく知られている。ｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、Ｔ細胞と同一の経路を用いて免疫応答を調節する。
【００７１】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、好ましくは自家である。換言すれば、細胞は、好ましくは、細胞が投与される対象から得られる。あるいは、ｉｏＭＰ細胞は、好ましくは同種異系である。換言すれば、細胞は、好ましくは、細胞が投与される対象と免疫学的に適合する対象から得られる。
【００７２】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、単離され得る、実質的に単離され得る、精製され得る、または実質的に精製され得る。ｉｏＭＰ細胞は、任意の他の構成要素、例えば培養培地、本発明の他の細胞または他の細胞型から完全にフリーであるならば、単離または精製されている。ｉｏＭＰ細胞は、その使用目的を妨げない、担体または希釈剤、例えば培養培地と混合されているならば、実質的に単離されている。あるいは、本発明のｉｏＭＰ細胞は、増殖マトリックス内に存在、または、以下に述べるように表面上に固定化され得る。
【００７３】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、抗体に基づく技術を含む様々な技術を用いて単離され得る。細胞は、ｉｏＭＰ細胞上に存在する表面マーカー（上記参照）に対するモノクローナル抗体の結合に基づいて、ネガティブおよびポジティブの選択技術を用いて単離され得る。それ故に、ｉｏＭＰ細胞は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）および磁性ビーズ分離を含む、任意の抗体に基づく技術を用いて分離され得る。
【００７４】
以下により詳細に述べるように、ｉｏＭＰ細胞は、エクスビボで処理され得る。したがって、細胞は、治療薬または診断薬によってロードまたはトランスフェクトされ得て、それから、本発明の方法で治療的に用いられる。
【００７５】
本発明の集団
また、本発明は、２以上の本発明のｉｏＭＰ細胞の集団も提供する。任意の数の細胞が、集団内に存在し得る。本発明の集団は、好ましくは、少なくとも約５×１０５の本発明のｉｏＭＰ細胞を含む。集団は、より好ましくは、少なくとも約１×１０６、少なくとも約２×１０６、少なくとも約２．５  ２×１０６、少なくとも約５×１０６、少なくとも約１×１０７、少なくとも約２×１０７、少なくとも約５×１０７、少なくとも約１×１０８、または、少なくとも約２×１０８の本発明のｉｏＭＰ細胞を含む。ある場合には、集団は、少なくとも約１．０×１０７、少なくとも約１．０×１０８、少なくとも約１．０×１０９、少なくとも約１．０×１０１０、少なくとも約１．０×１０１１、または、少なくとも１．０×１０１２の本発明のｉｏＭＰ細胞またはさらにより多くを含み得る。
【００７６】
２以上の本発明のｉｏＭＰ細胞を含む集団は、本発明のｉｏＭＰ細胞に加えて他の細胞を含み得る。しかしながら、集団内の細胞の少なくとも７０％は、好ましくは本発明のｉｏＭＰ細胞である。より好ましくは、集団内の細胞の、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％は、本発明のｉｏＭＰ細胞である。
【００７７】
また、本発明は、ｉｏＭＰ細胞の特定の集団も提供する。本発明は、ｉｏＭＰ細胞の集団を提供し、ここで
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも６０％は、検出可能なレベルのＣＤ６６ｅを発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも４５％は、検出可能なレベルのＣＤ１２１ｂを発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも３５％は、検出可能なレベルのＣＤ１２２を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＣＤ１６４を発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも４５％は、検出可能なレベルのＣＤ１７２ａを発現し、
（ｖｉ）集団内の細胞の少なくとも３５％は、検出可能なレベルのＣＤ２０３ｃを発現し、
（ｖｉｉ）集団内の細胞の少なくとも４５％は、検出可能なレベルのＣＤ２６４を発現し、
（ｖｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも３５％は、検出可能なレベルのＣＤ２７０を発現し、
（ｉｘ）集団内の細胞の少なくとも３５％は、検出可能なレベルのＣＤ３２８を発現し、
（ｘ）集団内の細胞の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＣＤ３５８を発現し、
（ｘｉ）集団内の細胞の少なくとも４５％は、検出可能なレベルのＴＣＲγδを発現し、
（ｘｉ）集団内の細胞の少なくとも９５％は、検出可能なレベルのＦＭＣを発現し、および
（ｘｉｉ）集団内の細胞の少なくとも９５％は、検出可能なレベルのＩＴＧＢ７を発現し；
およびここで
（ａ）集団内の細胞の０．５％以下は、検出可能なレベルのＨＬＡ−ＡＢＣを発現し、
（ｂ）集団内の細胞の０．５％以下は、検出可能なレベルのＭＩＣ  Ａ／Ｂを発現し、
（ｃ）集団内の細胞の０．５％以下は、検出可能なレベルのＮｏｔｃｈ２を発現し、
（ｄ）集団内の細胞の０．５％以下は、検出可能なレベルのＣＤ３６０を発現し、
（ｅ）集団内の細胞の０．５％以下は、検出可能なレベルのＣＬＩＰを発現し、および
（ｆ）集団内の細胞の０．１％以下は、検出可能なレベルのＣＤ１１ｂを発現する。
【００７８】
また、本発明は、ｉｏＭＰ細胞の集団も提供し、ここで
（ｉ）集団内の細胞の少なくとも６９％は、検出可能なレベルのＣＤ６６ｅを発現し、
（ｉｉ）集団内の細胞の少なくとも５４％は、検出可能なレベルのＣＤ１２１ｂを発現し、
（ｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも４３％は、検出可能なレベルのＣＤ１２２を発現し、
（ｉｖ）集団内の細胞の少なくとも６０％は、検出可能なレベルのＣＤ１６４を発現し、
（ｖ）集団内の細胞の少なくとも５６％は、検出可能なレベルのＣＤ１７２ａを発現し、
（ｖｉ）集団内の細胞の少なくとも４７％は、検出可能なレベルのＣＤ２０３ｃを発現し、
（ｖｉｉ）集団内の細胞の少なくとも５５％は、検出可能なレベルのＣＤ２６４を発現し、
（ｖｉｉｉ）集団内の細胞の少なくとも４７％は、検出可能なレベルのＣＤ２７０を発現し、
（ｉｘ）集団内の細胞の少なくとも４３％は、検出可能なレベルのＣＤ３２８を発現し、
（ｘ）集団内の細胞の少なくとも６２％は、検出可能なレベルのＣＤ３５８を発現し、
（ｘｉ）集団内の細胞の少なくとも５６％は、検出可能なレベルのＴＣＲγδを発現し
（ｘｉ）集団内の細胞の少なくとも９９％は、検出可能なレベルのＦＭＣを発現し、および
（ｘｉｉ）集団内の細胞の少なくとも９９％は、検出可能なレベルのＩＴＧＢ７を発現し；
およびここで
（ａ）集団内の細胞の０．１％以下は、検出可能なレベルのＨＬＡ−ＡＢＣを発現し、
（ｂ）集団内の細胞の０．１％以下は、検出可能なレベルのＭＩＣ  Ａ／Ｂを発現し、
（ｃ）集団内の細胞の０．２％以下は、検出可能なレベルのＮｏｔｃｈ２を発現し、
（ｄ）集団内の細胞の０．１％以下は、検出可能なレベルのＣＤ３６０を発現し、
（ｅ）集団内の細胞の０．１％以下は、検出可能なレベルのＣＬＩＰを発現し、および
（ｆ）集団内の細胞の０．０５％は、検出可能なレベルのＣＤ１１ｂを発現し、または、発現する細胞は存在しない。
【００７９】
これらの好ましい集団内の細胞は、本発明のｉｏＭＰに関して上述した任意のマーカーを検出可能なレベルでさらに発現し得る。これらの好ましい集団内の細胞は、上述したＩＭＰ細胞の任意の有利な特性を有し得る。
【００８０】
集団内の細胞の少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％または少なくとも９５％は、好ましくは、検出可能なレベルの１つまたは複数のβ２−ミクログロブリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４７、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１／ＣＤ６１、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６３、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１０５、ＣＤ１０８、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１３０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５１、ＣＤ１５５、ＣＤ１６６、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ２５７、ＣＤ２７６、ＣＤ２８８、ＣＤ２９５、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３５１、ＣＤ３６０、ＣＤ２３０、カドヘリン−１１（ＣＤＨ１１）、およびリンホトキシンβ受容体（ＬＴＢＲ）を発現する。集団内の細胞の少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％または少なくとも９５％は、検出可能なレベルの任意の数および組み合わせのこれらのマーカーを発現し得る。集団内の細胞の少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％または少なくとも９５％は、好ましくは、これらのマーカーの全てを検出可能なレベルで発現する。
【００８１】
集団内の細胞の少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％は、好ましくは、検出可能なレベルの１つまたは複数のＣＤ４９ａ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１４６、ＣＤ１７８、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２２１、ＣＤ２３１、ＣＤ２５２、ＣＤ２５６、ＣＤ２６７、ＣＤ３３７およびＳＳＥＡ−４を発現する。集団内の細胞の少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％は、検出可能なレベルの任意の数および組み合わせのこれらのマーカーを発現し得る。集団内の細胞の少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％は、好ましくは、これらのマーカーの全てを検出可能なレベルで発現する。
【００８２】
集団内の細胞の少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％または少なくとも７０％は、好ましくは、検出可能なレベルの１つまたは複数のＣＤ４６ｆ、ＣＤ５４、ＣＤ１１０、ＣＤ１８６、ＣＤ１９３、ＣＤ２０１、ＣＤ２４５、ＣＤ２７２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８６、ＣＤ２９０、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０９、ＣＤ３３８、ＣＤ３５４およびポドプラニンを発現する。集団内の細胞の少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％または少なくとも７０％は、検出可能なレベルの任意の数および組み合わせのこれらのマーカーを発現し得る。集団内の細胞の少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％または少なくとも７０％は、好ましくは、これらのマーカーの全てを検出可能なレベルで発現する。
【００８３】
集団内の細胞の少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％は、好ましくは、検出可能なレベルの１つまたは複数のＣＤ２６、ＣＤ１９６、ＣＤ２２７、ＣＤ２３５ａおよびＣＤ３１２を発現する。集団内の細胞の少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％は、検出可能なレベルの任意の数および組み合わせのこれらのマーカーを発現し得る。集団内の細胞の少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％は、好ましくは、これらのマーカーの全てを検出可能なレベルで発現する。
【００８４】
集団内の細胞の少なくとも３５％、例えば少なくとも４０％は、好ましくは、検出可能なレベルのＣＤ１５６ｂを発現する。ＣＤ１５６ｂは、ＡＤＡＭ（ジスインテグリンおよびメタロプロテアーゼドメイン）ファミリーに属する、Ｉ型膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ１５６ｂは、１２５ｋＤであり、腫瘍壊死因子−α変換酵素（ＴＡＣＥ）として機能する。また、ＣＤ１５６ｂも、多くの炎症性モジュレーターを引き起こして外部ドメインシェディングを受けて、ＴＮＦＲ７５、ＩＬ−１ＲＩＩ、ＴＮＦＲ５５、Ｌ−セレクチン、とりわけアミロイド前駆体タンパク質を含む。ＣＤ１５６ｂは、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の活性化において顕著な役割を果たす。ＣＤ１５６ｂは、したがって、ヒト癌における見込みのある治療的標的である。
【００８５】
集団内の細胞の１％以下、例えば０．８％以下、０．５％、０．２％以下、または０．１％以下は、好ましくは、検出可能なレベルの１つまたは複数のＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ３ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１８、ＣＤ１８４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３５２、ＣＤ３５７、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４８、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８３、ＣＤ８８、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９４、ＣＤ９７、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＤ１２９、ＣＤ１３１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４２、ＣＤ１４４、ＣＤ１５４、ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ１５８ｅ２、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６３、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９７、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０９、ＣＤ２２０、ＣＤ２２６、ＣＤ２２９、ＣＤ２１２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４９、ＣＤ２５３、ＣＤ２５８、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２９４、ＣＤ３０１、ＣＤ３０３、ＣＤ３２２、ＣＤ３３２、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３６２、ＣＤｗ１９９、ＣＤｗ３２９、カドヘリン−６（ＣＤＨ６）、ＤＣ免疫受容体（ＤＣＩＲ）、ＦＭＣ７、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＲ、インテグリンβ−７（ＩＴＧＢ７）、高ロイシン反復配列含有Ｇタンパク質共役受容体５（Ｌｇｒ−５）、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ３、プロカスパーゼ活性化化合物１（ＰＡＣ−１）、Ｓｔｒｏ−１およびトロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）を発現する。集団内の細胞の１％以下、例えば０．５％以下は、検出可能なレベルの任意の数および組み合わせのこれらのマーカーを発現し得る。集団内の細胞の１％以下、例えば０．５％以下は、好ましくは、これらのマーカーの全てを検出可能なレベルで発現する。
【００８６】
上記の任意の実施態様において、集団が、特定のマーカーを発現している細胞の％に関して定義される場合、集団は、好ましくは、少なくとも５，０００細胞、例えば、少なくとも６，０００、少なくとも７，０００、少なくとも８，０００、少なくとも９，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００細胞、少なくとも５０，０００細胞、少なくとも１００，０００細胞、少なくとも２００，０００細胞、少なくとも２５０，０００細胞、または、少なくとも５００，０００細胞を含む。集団は、より好ましくは、少なくとも５０００細胞、少なくとも５０，０００細胞または少なくとも２５０，０００細胞を含む。これらの集団は、上述される任意の数の細胞を含み得る。
【００８７】
本明細書に開示される細胞の任意の集団は、使用前に他の細胞によって希釈され得る。例えば、集団は、対象の血液、単核細胞（ＭＣ）、ＭＳＣ、中胚葉系列の前駆細胞（ＰＭＬ）、免疫調節前駆（ＩＭＰ）細胞、またはそれらの組み合わせと、組み合わせられ得る。ＰＭＬは、ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５１６００に開示される（ＷＯ２０１３／００５０５３として公開）。ＩＭＰ細胞は、ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５１６７３に開示される。
【００８８】
本発明の集団は、以下に述べられる治療に有利である。本発明のｉｏＭＰ細胞を大量に含む集団を生産する能力は、本発明の重要な利点の１つである。本発明は、目的の組織へ効率的に遊走することができて、そこに到達した時点で、抗腫瘍、抗炎症性および／または免疫調節効果を有する細胞の集団を用いて、対象の治療を可能にする。このことは、低い細胞投与量の使用を可能にして、オフターゲットの副作用および容量依存的副作用を避ける。
【００８９】
本発明の集団は、好ましくは同質である。換言すれば、集団内の全てのＩＭＰ細胞は、好ましくは、遺伝子型および表現型が同一である。集団は、好ましくは、上記に定義されるように、自家または同種異系である。
【００９０】
しかしながら、集団は、半−同種異系でもあり得る。半−同種異系集団は、典型的に、集団が投与される対象と免疫学的に適合する２以上の対象由来の単核細胞から生産される。換言すれば、集団内の全ての細胞は、好ましくは、遺伝学的に同一であり、または、集団が投与される対象と、集団が免疫的に適合するように、十分に遺伝学的に同一である。本発明のｉｏＭＰ細胞は、対象に由来し得るので、治療される対象と自家であり得る（すなわち、対象と遺伝学的に同一であり、または、それらが対象への投与に適合するように十分に遺伝学的に同一である）。
【００９１】
本発明の集団は、単離され得る、実質的に単離され得る、精製され得る、または、実質的に精製され得る。集団は、任意の他の構成要素、例えば培養培地および他の細胞から完全にフリーならば、単離または精製されている。集団は、その使用目的を妨げない、担体または希釈剤、例えば培養培地と混合されるならば、実質的に単離されている。他の担体および希釈剤は、以下により詳細に述べられる。実質的に単離または実質的に精製された集団は、本発明のｉｏＭＰ細胞以外の細胞を含まない。一部の実施態様では、本発明の集団は、増殖マトリックス内に存在し得て、または、以下に述べられるように表面上に固定化され得る。
【００９２】
集団は、典型的に、インビトロで培養される。細胞を培養する技術は、当業者によく知られる。細胞は、血清を含まない培地中で、３７℃、５％ＣＯ２の標準的な条件下で培養され得る。細胞は、好ましくは、以下により詳細に述べられる低酸素条件下で培養される。細胞は、任意の適切なフラスコまたは標準的な６ウェルプレートのような平板のウェルを含む容器内で培養され得る。そのようなプレートは、Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＶＷＲ  ｓｕｐｐｌｉｅｒｓ、Ｎｕｎｃ、ＳｔａｒｓｔｅｄｔまたはＦａｌｃｏｎから市販される。ウェルは、典型的に、約１ｍｌ〜約４ｍｌの容量を有する。
【００９３】
フラスコ、容器またはウェル（その中に集団が含まれ、または培養される）は、ｉｏＭＰ細胞のハンドリングを促進するように改変され得る。例えば、フラスコ、容器またはウェルは、例えば増殖マトリックスを含むことによって、細胞の培養を促進するように改変され得る。フラスコ、容器またはウェルは、ｉｏＭＰ細胞の付着を可能にするように、または、表面上へのｉｏＭＰ細胞の固定化を可能にするように改変され得る。１つまたは複数の表面は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、ラミニンまたはコラーゲン、または、細胞に結合してそれらを表面（単数または複数）上に固定化または捕捉する任意の他の捕捉分子によりコーティングされ得る。
【００９４】
集団は、本明細書に記載の任意の技術を用いて、エクスビボで改変され得る。例えば、集団は、治療薬または診断薬によってトランスフェクトまたはロードされ得る。それから集団は、以下により詳細に述べられる治療の方法において使用され得る。
【００９５】
本発明のｉｏＭＰ細胞を生産する方法
また、本発明は、本発明の集団を生産するための方法も提供する。当該方法は、単核細胞（ＭＣ）を、ＭＣがｉｏＭＰ細胞に分化するのを誘導する条件下で培養するステップ（ステップ（ａ））を含む。当該方法は、それから、検出可能なレベルのＣＤ６６ｅ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１６４、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２６４、ＣＤ２７０、ＣＤ３２８、ＣＤ３５８、ＴＣＲγδ、ＦＭＣ７およびＩＴＧＢ７を発現し、検出可能なレベルのＨＬＡ−ＡＢＣ、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、Ｎｏｔｃｈ２、ＣＤ３６０、ＣＬＩＰ、およびＣＤ１１ｂを発現しない、ｉｏＭＰ細胞を採取および培養するステップを含む。（ステップ（ｂ））。採取された細胞は、検出可能なレベルまたは増加した量の本発明の細胞に関して上述される任意のマーカーおよび因子を発現し得る。
【００９６】
単核細胞（ＭＣ）およびそれらを単離する方法は、当技術分野で知られている。ＭＣは、骨髄から単離される初期の（ｐｒｉｍａｒｙ）ＭＣであってよい。ＭＣは、好ましくは、末梢血ＭＣ（ＰＢＭＣ）、例えば、リンパ球、単球、および／または、マクロファージである。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）のような親水性多糖類を用いて、血液から単離され得る。例えば、ＰＢＭＣは、実施例に開示されるようにＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）（市販の密度培地）を用いて血液から単離され得る。
【００９７】
ＭＣは、培養される前に、間葉系幹細胞エンリッチメントカクテルに曝され得る。カクテルは、好ましくは、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ６６ｂ（不要な細胞上に存在する）を認識する抗体および赤血球の成分を含む。そのようなカクテルは、不要な細胞を赤血球と架橋させてイムノロゼットを形成し、それは必要なＭＣから除去され得る。好ましいカクテルはＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（登録商標）である。
【００９８】
ＭＣが間葉系細胞（主に中胚葉に由来する組織）へ分化するのを誘導する適切な条件は、当該分野で知られている。例えば、適切な条件は、Ｃａｐｅｌｌｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｌｙｓａｔｅ  ａｌｌｏｗｓ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｒａｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｓｍａｌｌ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ａｓｐｉｒａｔｅｓ  ｏｒ  ｍａｒｒｏｗ  ｆｉｌｔｅｒ  ｗａｓｈｏｕｔｓ．Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００７．４０：ｐ．７８５−７９１）に開示される。これらの条件は、ＭＣが本発明に係るｉｏＭＰ細胞に分化するのを誘導するためにも用いられ得る。ＭＣは、血清を含まない培地中で、３７℃、５％ＣＯ２の標準的な条件下で培養され得る。ＭＣは、典型的に、１×１０５細胞ｃｍ２の密度で蒔かれる。
【００９９】
当該方法は、好ましくは、血漿溶解物とともにＭＣを培養して、ＭＣがｉｏＭＰ細胞に分化するのを誘導するステップを含む。血小板溶解物とは、血小板に含まれる天然の増殖因子の組み合わせ（これらの血小板の溶解により放出されたもの）を指す。溶解は、化学的手段（すなわちＣａＣｌ２）、浸透圧的手段（蒸留Ｈ２Ｏの使用）を通して、または、凍結／融解手順を通して、達成され得る。血小板溶解物は、米国特許第５，１９８，３５７号に記載のように、全血に由来し得る。血小板溶解物は、好ましくは、ＰＣＴ／ＧＢ１２／０５２９１１（ＷＯ２０１３／０７６５０７として公開）に記載されるように調製される。血漿溶解物は、好ましくは、ヒト血漿溶解物である。
【０１００】
好ましい実施態様では、本発明の方法のステップ（ａ）は、ＭＣがｉｏＭＰ細胞に分化するのを誘導するのに十分な時間、血小板溶解物を含む培地中でＭＣを培養するステップを含む。十分な時間は、典型的に、約１５〜約２５日、好ましくは約２２日である。培地は、好ましくは、約２０体積％以下、例えば、約１５体積％以下または約１０体積％以下の血小板溶解物を含む。培地は、好ましくは、約５体積％〜約２０体積％、例えば、約１０体積％〜約１５体積％の血小板溶解物を含む。培地は、好ましくは、約１０体積％の血小板溶解物を含む。
【０１０１】
別の好ましい実施態様では、本発明の方法のステップ（ａ）は、間葉エンリッチメントカクテルにＭＣを曝して、それから、ＭＣがｉｏＭＰ細胞に分化するのを誘導するのに十分な時間、血小板溶解物を含む培地中でＭＣを培養するステップを含む。十分な時間は、典型的に、約１５〜約２５日、好ましくは約２２日である。
【０１０２】
ステップ（ａ）では、培地は、好ましくは最小必須培地（ＭＥＭ）である。ＭＥＭは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈを含む様々な供給源から市販される。培地は、好ましくは、ヘパリン、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトアビジン（Ｐ／Ｓ）の１つまたは複数をさらに含む。Ｌ−グルタミンは、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販される）によって置き換えられ得る。
【０１０３】
ステップ（ａ）は、好ましくは、ｉｏＭＰ細胞が接着するのを可能にする条件下で、ＭＣを培養するステップを含む。適切な条件は、上記により詳細に述べられる
【０１０４】
ステップ（ａ）では、ＭＣは、好ましくは、低酸素条件下で培養される。ＭＣは、好ましくは、約２０％未満の酸素（Ｏ２）、例えば、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または、約１％未満の酸素（Ｏ２）で培養される。ＭＣは、好ましくは、約０％〜約１９％のＯ２、例えば約１％〜約１５％のＯ２、約２％〜約１０％のＯ２、または、約５％〜約８％のＯ２で培養される。ＭＣは、最も好ましくは、約０％のＯ２で培養される。上記で見積もられた酸素の％（またはＯ２の％）に関する数字は、例えば細胞インキュベーターにより、培養中に細胞に供給されるガス中の酸素の体積％に関連する。一部の酸素は、インキュベーター内に漏れ得て、または、ドアーが開いているときに入り得ることが可能である
【０１０５】
ステップ（ａ）では、ＭＣは、最も好ましくは、血小板溶解物存在下および低酸素条件下で培養される。この組み合わせは、損傷組織内の自然条件を模倣するので、より健康的かつより治療的に強力な細胞をもたらす。従来の細胞培養は、２０％または２１％酸素（およそ大気の含有量）で行われるが、ヒト体内に、この酸素レベルを有する場所はない。肺内の上皮細胞は、この酸素レベルを「見る」が、酸素が溶解して肺を去る時点で、１７％付近に減少する。そこから、組織の大部分でさらにいっそう約１〜２％まで減少するが、関節内の軟骨のような無血管組織では０．１％という低さになる。
【０１０６】
ステップ（ａ）では、当該方法は、好ましくは、ＭＣが免疫調節前駆（ｉＭＰ）細胞に分化するのを誘導する条件下で、ＭＣを培養するステップを含む。これは、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５１６７３（ＷＯ２０１５／１８９５８７）に記載される。ｉＭＰ細胞は、検出可能なレベルのＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＣＤ３０４（ニューロピリン１）、ＣＤ１７８（ＦＡＳリガンド）、ＣＤ２８９（Ｔｏｌｌ様受容体９）、ＣＤ３６３、（スフィンゴシン−１−リン酸受容体１）、ＣＤ９９、ＣＤ１８１（Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ１；ＣＸＣＲ１）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）、ＣＸＣＲ２およびＣＤ１２６を発現する。また、ｉＭＰ細胞は、典型的に、検出可能なレベルのＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２７１も発現し、検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない。血小板溶解物、付着、および低酸素のいずれか、好ましくは全てを含む上述のステップ（ａ）の任意の培養条件は、ＭＮＣをｉＭＰ細胞に分化させるために用いられ得る。
【０１０７】
ステップ（ａ）では、当該方法は、好ましくは、ｉｏＭＰ細胞を形成するようにｉＭＰ細胞を後成的に改変する、または、ｉｏＭＰ細胞に分化するようにｉＭＰ細胞を誘導する条件下で、ｉＭＰ細胞を培養するステップをさらに含む。条件は、好ましくは、約６０００細胞／ｃｍ２以下の密度で、例えば、約５５００細胞／ｃｍ２以下、約５０００細胞／ｃｍ２以下、または約４５００細胞／ｃｍ２以下の密度で、ｉＭＰ細胞を蒔くステップを含む。条件は、好ましくは、ＣＯ２を、５％よりも上に、例えば、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、または少なくとも約０．３％（すなわち、例えば、少なくとも約５．１％に、少なくとも約５．２％に、または少なくとも約５．３％に）増加させるステップを含む。条件は、好ましくは、ｉＭＰ細胞を、約５．１％〜約５．５％のＣＯ２、例えば、約５．２％、約５．３％または約５．４％のＣＯ２で培養するステップを含む。条件は、好ましくは、ｉＭＰ細胞を、約５．３％のＣＯ２で培養するステップを含む。条件は、好ましくは、Ｏ２を、約０．１％以下、例えば約０．０５％低減させるステップを含む。条件は、好ましくは、Ｌ−アラニン、リン酸ナトリウム一塩基（無水）および２’−デオキシグアノシン、例えば、Ｌ−アラニン；リン酸ナトリウム一塩基（無水）；２’−デオキシグアノシン；Ｌ−アラニンおよびリン酸ナトリウム一塩基（無水）；Ｌ−アラニンおよび２’−デオキシグアノシン；リン酸ナトリウム一塩基（無水）および２’−デオキシグアノシン；またはＬ−アラニン、リン酸ナトリウム一塩基（無水）および２’−デオキシグアノシンの１つまたは複数で、培地を補充するステップを含む。
【０１０８】
ステップ（ａ）では、当該方法は、好ましくは、ｉｏＭＰ細胞を形成するようにｉＭＰ細胞を後成的に改変する、または、ｉｏＭＰ細胞に分化するようにｉＭＰ細胞を誘導する条件下で、ｉＭＰ細胞を培養するステップをさらに含み、その条件は、（ｉ）約６０００ｃｍ２以下の密度、例えば、上述される任意の密度で、ｉＭＰ細胞を蒔くステップ、（ｉｉ）ＣＯ２を、５％よりも高く、例えば、約５．１％〜５．５％、または約５．１％に、約５．２％に、または約５．３％に、増大させるステップ、（ｉｉｉ）Ｏ２を、約０．１％以下、例えば約０．０５％減少させるステップ、および、（ｉｖ）Ｌ−アラニン、リン酸ナトリウム一塩基（無水）および２’−デオキシグアノシンの１つまたは複数、例えば上記に開示される任意の組み合わせで培地を補充するステップ、の１つまたは複数を含む。条件は、（ｉ）；（ｉｉ）；（ｉｉｉ）；（ｉｖ）；（ｉ）および（ｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；または（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含んでよい。
【０１０９】
ステップ（ｂ）では、当該方法は、上述の必須マーカー発現パターンを有するｉｏＭＰ細胞を採取および培養するステップをさらに含む。必須マーカー発現パターンを有するｉｏＭＰ細胞は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）および磁性ビーズ分離を含む任意の抗体に基づく技術を用いて採取され得る。ＦＡＣＳが好ましい。ＨＴ−ＦＡＣＳがより好ましい。
【０１１０】
ステップ（ａ）に関して開示されるｉｏＭＰ細胞を培養するための任意の方法は、ステップ（ｂ）に等しく当てはまる。具体的には、ステップ（ａ）に関して上述のように、血小板溶解物存在下および低酸素条件下で、ステップ（ｂ）において細胞は培養される。
【０１１１】
上記の議論から明らかなように、本発明の方法は、臨床関連の条件、すなわち、微量のエンドトキシンおよび他の環境汚染物質、例えば、リポ多糖、リポペプチドおよびペプチドグリカンなどの不存在下で行なわれる。このことは、本発明のｉｏＭＰ細胞を、対象への投与に特に適切にさせる。
【０１１２】
ＭＣは、好ましくは、対象または同種異系ドナーから得られる。また、本発明は、対象への投与に適切な本発明の集団を生産するための方法も提供し、ここで、当該方法は、ＭＣがｉｏＭＰ細胞に分化するのを誘導する条件下で、対象から得られたＭＣを培養するステップ、および、（ｂ）上記に定義される発現パターンを有する前駆細胞を採取および培養して、それにより、対象への投与に適切な本発明の集団を生産するステップ、を含む。集団は対象と自家であり、したがって、移植の際に拒絶されない。また、本発明は、対象への投与に適切でありこの様式で生産される本発明の集団も提供する。
【０１１３】
あるいは、本発明は、対象への投与に適切な本発明の集団を生産するための方法を提供し、当該方法は、ＭＣがｉｏＭＰ細胞に分化するのを誘導する条件下で、細胞が投与される対象と免疫学的に適合する異なる対象から得られたＭＣを培養するステップ、および、（ｂ）上記に定義される発現パターンを有するｉｏＭＰ細胞を採取および培養して、それにより、対象への投与に適切な本発明の集団を生産するステップ、を含む。集団は、対象と同種異系であり、したがって、移植の際の拒絶の機会を低減させる。また、本発明は、対象への投与に適切でありこの様式で生産される本発明の集団も提供する。
【０１１４】
インビトロ方法
本発明のｉｏＭＰ細胞または集団は、免疫細胞の活性を調節するインビトロの方法において用いられ得る。ｉｏＭＰ細胞は、任意の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、好中球、好塩基球、肥満細胞、好酸球、先天性リンパ系細胞（ＩＬＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、巨核球、胸腺細胞または血小板の活性を調節し得る。好ましくは、ｉｏＭＰ細胞は、Ｔ細胞の活性を調節するために用いられる。より好ましくは、ｉｏＭＰ細胞は、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、γδＴ細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞の活性を調節するために用いられ得る。γδＴ細胞が好ましい。
【０１１５】
本明細書において、細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞に対する任意の言及は、（ｉ）細胞傷害性Ｔ細胞、（ｉｉ）ヘルパーＴ細胞、（ｉｉｉ）γδＴ細胞、（ｉｖ）細胞傷害性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞、（ｖ）ヘルパーＴ細胞およびγδＴ細胞、（ｖｉ）細胞傷害性Ｔ細胞およびγδＴ細胞、または（ｖｉｉ）細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞およびγδＴ細胞を指し得る。
【０１１６】
当該方法は、免疫細胞の活性を調節する条件下で、免疫細胞を本発明の集団とともにインキュベートするステップを含んでよい。例えば、条件は、免疫細胞の活性を増大させ得る。例えば、インキュベーションは、リポ多糖の存在下で行なってよい。免疫細胞が本発明の集団とともにインキュベートされる全期間は、リポ多糖の存在下で行なってよい。あるいは、免疫細胞を本発明の集団とともにインキュベートする期間のほんの一部のみ、リポ多糖の存在下で行なう。一態様では、免疫細胞は、１時間の期間、本発明の集団およびリポ多糖とともにインキュベートされる。
【０１１７】
別の態様では、条件は、免疫細胞の活性を低減させ得る。例えば、インキュベーションは、ポリＩ：Ｃの存在下で行なってよい。免疫細胞が本発明の集団とともにインキュベートされる全期間は、ポリＩ：Ｃの存在下行なってよい。あるいは、免疫細胞を本発明の集団とともにインキュベートする期間のほんの一部のみ、ポリＩ：Ｃの存在下で行なう。一態様では、免疫細胞は、２４時間の期間、本発明の集団およびポリＩ：Ｃとともにインキュベートされる。
【０１１８】
いずれかの場合において、免疫細胞の活性は、インキュベーションの間または後に評価され得る。例えば、炎症促進性サイトカインまたは他のメディエーターの存在または分泌、または、抗炎症性サイトカインの存在または分泌の低減は、免疫細胞の活性が増大したことを示し得る。抗炎症性サイトカインまたは他のメディエーターの存在または分泌、または、炎症促進性サイトカインの存在または分泌の低減は、免疫細胞の活性が低減したことを示し得る。
【０１１９】
同様に、本発明の集団の表現型は、インキュベーションの前、間、または後に評価され得る。例えば、炎症促進性サイトカインまたは他のメディエーターの存在または分泌、または、抗炎症性サイトカインの存在または分泌の低減は、ｉＯＭＰ細胞が、炎症促進性の表現型を有しかつ免疫細胞の活性を増大させるように感作されていることを示し得る。抗炎症性サイトカインまたは他のメディエーターの存在または分泌、または、炎症促進性サイトカインの存在または分泌の低減は、ｉＯＭＰ細胞が、抗炎症性表現型を有しかつ免疫細胞の活性を低減させるように感作されていることを示し得る。
【０１２０】
当該方法は、免疫細胞を、抗原とともにインキュベートするステップをさらに含み得る。調節されるべき応答は、抗原に対する応答であり得る。応答は、抗原特異的であり得る。
【０１２１】
特に、本発明は、抗原に応答して、細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞の活性を増大させるインビトロの方法を提供する。γδＴ細胞が好ましい。Ｔ細胞の活性を測定するための技術は当技術分野でよく知られている。例えば、Ｔ細胞増殖および／またはサイトカイン分泌は、（例えば、抗原による、または、ＴＣＲおよび／または共刺激受容体に結合する抗体による）刺激に応答して測定され得る。あるいは、ＴＣＲシグナリングの下流のタンパク質の活性化（例えばリン酸化）、または遺伝子発現プロファイリングは、Ｔ細胞の活性化の示度を与え得る。当該方法は、Ｔ細胞を、抗原および本発明の集団とともにインキュベートするステップを含んでよい。インキュベーションは、Ｔ細胞の活性を増大させる条件下で行なわれ得る。そのような条件は、上記および以下に述べられる。また、本発明は、このインビトロの方法によって生産される、感作された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞も提供する。γδＴ細胞が好ましい。感作されたＴ細胞は、抗原とのさらなる接触の後に、抗原と強力に反応するＴ細胞である。
【０１２２】
また、本発明は、抗原に応答して、制御性Ｔ細胞の活性を増大させるインビトロの方法も提供する。Ｔ細胞の活性を測定する方法は上述される。当該方法は、Ｔ細胞を、抗原および本発明の集団とともにインキュベートするステップを含んでよい。インキュベーションは、Ｔ細胞の活性を増大させる条件下で行なわれ得る。そのような条件は、上記および以下に述べられる。本発明は、このインビトロの方法によって生産される、感作された制御性Ｔ細胞をさらに提供する。
【０１２３】
加えて、本発明は、抗原に応答して、細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞の活性を低減させるインビトロの方法を提供する。γδＴ細胞が好ましい。Ｔ細胞の活性を測定する方法は上述される。当該方法は、Ｔ細胞を、抗原および本発明の集団とともにインキュベートするステップを含んでよい。インキュベーションは、Ｔ細胞の活性を低減させる条件下で行なわれ得る。そのような条件は、上記および以下に述べられる。本発明は、このインビトロの方法により生産される、抑制された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞をさらに提供する。γδＴ細胞が好ましい。抑制されたＴ細胞は、抗原とのさらなる接触の後に、抗原と正常以下に（ｓｕｂ−ｎｏｒｍａｌｌｙ）反応するＴ細胞である。
【０１２４】
また、本発明は、抗原に応答して、制御性Ｔ細胞の活性を低減させるインビトロの方法も提供する。Ｔ細胞の活性を測定する方法は上述される。当該方法は、Ｔ細胞を、抗原および本発明の集団とともにインキュベートするステップを含んでよい。インキュベーションは、Ｔ細胞の活性を低減させる条件下で行なわれ得る。そのような条件は、上記および以下に述べられる。本発明は、この方法により生産される、抑制された制御性Ｔ細胞をさらに提供する。
【０１２５】
Ｔ細胞は、抗原および本発明の集団と、同時にインキュベートされ得る。一方で、Ｔ細胞は、抗原および本発明の集団と、別々にインキュベートされ得る。例えば、Ｔ細胞は、抗原とインキュベートされて、それから、本発明の集団とインキュベートされ得る。Ｔ細胞は、本発明の集団とインキュベートされて、それから、抗原とインキュベートされ得る。あるいは、Ｔ細胞は、抗原とインキュベートされて、Ｔ細胞／抗原培養物を形成し得る。本発明の集団は、それから、一定期間が経過した後に、Ｔ細胞／抗原培養物に添加され得る。同様に、Ｔ細胞は、本発明の集団とインキュベートされて、Ｔ細胞／集団培養物を形成し得る。それから、一定期間が経過した後に、Ｔ細胞／集団培養物に抗原が添加され得る。一定期間は、３０秒〜３日のいずれかであってよい。例えば、一定期間は、３０秒、１分、２分、５分、１０分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１日、２日または３日であってよい。
【０１２６】
Ｔ細胞に提供される抗原は、Ｔ細胞が応答する任意の抗原であってよい。例えば、抗原は、腫瘍細胞上に見られる抗原であってよい。また、抗原は、健康または病気の個体内に存在する細胞上に見られる抗原であってもよい。例えば、抗原は、自己免疫性脳脊髄炎のような自己免疫疾患と関連するものであってよい。あるいは、抗原は、細菌、ウイルスまたは原虫のような、病原作用物質上に見られる抗原であってよい。ある場合には、抗原は、アレルゲンのような環境抗原であってよい。好ましくは、抗原は、アトピー性皮膚炎、アレルギー性気道炎症または通年制アレルギー性鼻炎と関連する抗原である。
【０１２７】
任意の上記のインビトロ方法は、Ｔ細胞を、抗原提示細胞とともにインキュベートするステップをさらに含んでよい。本発明のインビトロの方法での使用に適切な抗原提示細胞は、プロフェッショナルの抗原提示細胞、例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、活性化された上皮細胞、ならびに、プロフェッショナルでない抗原提示細胞を含む。Ｔ細胞は、好ましくは、樹状細胞とともにインキュベートされる。
【０１２８】
様々な培養条件を用いて、成果を、増大されたＴ細胞応答または低減されたＴ細胞応答へ歪め得る。例えば、サイトカイン、抗体および／またはさらに抗原を、細胞培養物に添加してよい。具体的には、ＩＬ−１０を、細胞培養物に添加してよい。ＩＬ−１０は、免疫応答を効率的に高めることができ、より強いＴｈ１応答へ成果を歪めることができる。あるいは、Ｔｈ１サイトカイン／メディエーター、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γまたはＩｇＡを添加して、免疫応答をＴｈ１応答へ歪め得る。Ｔｈ２サイトカイン、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−５、ＩＬ−１０またはαインターフェロンを添加して、免疫応答をＴｈ２応答へ歪め得る。培養の酸素飽和度は変更され得る。培養温度は変更され得る。培養培地の組成は変更され得る。培養は異なる容器内で行なわれ得る。
【０１２９】
インキュベーションの間、ｉｏＭＰは、様々な方法でＴ細胞の活性に影響を及ぼし得る。例えば、ｉｏＭＰ細胞機能とＴ細胞機能との間に、相互作用またはクロストークが存在し得る。例えば、ｉｏＭＰ細胞が仲介するＴ細胞機能阻害、およびｉｏＭＰ細胞のＴ細胞傷害性アタック（ａｔｔａｃｋ）の間に、相互作用またはクロストークが存在し得る。あるいは、Ｔ細胞のｉｏＭＰ細胞傷害性アタッチ（ａｔｔａｃｈ）、およびＴ細胞が仲介するｉｏＭＰ機能阻害の間に、相互作用またはクロストークが存在し得る。相互作用のバランスは、ｉｏＭＰ細胞とのインキュベーション後に、Ｔ細胞の活性化の純増または純減があるかどうか決定し得る。
【０１３０】
ｉｏＭＰ細胞−Ｔ細胞相互作用は、ポジティブのフィードバックメカニズムを伴い得る。このメカニズムは、ｉｏＭＰ細胞上に発現されるリガンドとＴ細胞上に発現される受容体との間の相互作用によって仲介され得て、または、逆も同様である。好ましくは、ポジティブのフィードバックメカニズムは、Ｔ細胞上のナチュラルキラーグループ２ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）の活性化を含む。ＮＫＧ２Ｓは、ＮＫ細胞およびＴ細胞上に見られる活性化受容体である。そのリガンドは、ＭＩＣ−ＡおよびＭＩＣ−Ｂのようなストレス誘導性タンパク質であり、その両方とも、ｉｏＭＰ細胞上に少量で発現される。
【０１３１】
また、ｉｏＭＰ細胞は、Ｔ細胞表現型を変えて、Ｔ細胞サイトカイン分泌および細胞毒性を抑制することも可能であり得る。インドールアミン−ピロール２，３−ジオキシゲナーゼおよびプロスタグランジンＥ２は、ｉｏＭＰが誘導するＴ細胞阻害の重要なメディエーターであると考えられる。
【０１３２】
さらに、ｉｏＭＰ細胞およびＴ細胞機能にとって、および、これらの細胞型の間の相互作用にとって、微小環境は重要である。ＩＦＮ−γが豊富な微小環境は、Ｔ細胞によってｉｏＭＰ細胞が攻撃および破壊されるのを保護し得る。したがって、ｉｏＭＰ細胞は、ＩＦＮ−γを分泌して、それら自体の寿命を促進し、それらの免疫調節機能を補助し得る。
【０１３３】
インビボの方法
本発明のｉｏＭＰ細胞または集団は、免疫細胞の活性を調節するインビボの方法において用いられ得る。ｉｏＭＰ細胞は、任意の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、好中球、好塩基球、肥満細胞、好酸球、先天性リンパ系細胞（ＩＬＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、巨核球、胸腺細胞または血小板の活性を調節し得る。好ましくは、ｉｏＭＰ細胞は、Ｔ細胞の活性を調節するために用いられる。より好ましくは、ｉｏＭＰ細胞は、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、γδＴ細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞の活性を調節するために用いられる。
【０１３４】
当該方法は、免疫細胞の活性を調節する条件下で、本発明の集団または医薬組成物を対象に投与するステップを含んでよい。例えば、条件は、免疫細胞の活性を増大させ得る。あるいは、条件は、免疫細胞の活性を低減させ得る。
【０１３５】
具体的には、本発明は、抗原に応答して、細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞の活性を増大させるインビボの方法を提供する。γδＴ細胞が好ましい。Ｔ細胞の活性を測定する方法は上述される。当該方法は、本発明の集団または医薬組成物を、対象に投与するステップを含んでよい。投与は、Ｔ細胞の活性を増大させる条件下で行なってよい。そのような条件は、以下により詳細に述べられる。本発明は、この方法によって生産される、感作された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞をさらに提供する。γδＴ細胞が好ましい。感作されたＴ細胞は上記に定義される。
【０１３６】
また、本発明は、抗原に応答して、制御性Ｔ細胞の活性を増大させるインビボの方法も提供する。Ｔ細胞の活性を測定する方法は上述される。当該方法は、本発明の集団または医薬組成物を、対象に投与するステップを含んでよい。投与は、Ｔ細胞の活性を増大させる条件下で行なってよい。そのような条件は、以下により詳細に述べられる。本発明は、この方法によって生産される、感作された制御性Ｔ細胞をさらに提供する。
【０１３７】
加えて、本発明は、抗原に応答して、細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞の活性を低減させるインビボの方法を提供する。γδＴ細胞が好ましい。Ｔ細胞の活性を測定する方法は上述される。当該方法は、本発明の集団または医薬組成物を、対象に投与するステップを含んでよい。投与は、Ｔ細胞の活性を低減させる条件下で行なってよい。そのような条件は、以下により詳細に述べられる。本発明は、この方法によって生産される、抑制された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞をさらに提供する。γδＴ細胞が好ましい。抑制されたＴ細胞は上記に定義される。
【０１３８】
また、本発明は、抗原に応答して、制御性Ｔ細胞の活性を低減させるインビボの方法も提供する。Ｔ細胞の活性を測定する方法は上述される。当該方法は、本発明の集団または医薬組成物を、対象に投与するステップを含んでよい。投与は、Ｔ細胞の活性を低減させる条件下で行なってよい。そのような条件は、以下により詳細に述べられる。本発明は、この方法によって生産される、抑制された制御性Ｔ細胞をさらに提供する。
【０１３９】
上記の任意のインビボの方法は、対象に抗原を投与するステップをさらに含んでよい。抗原は、集団または医薬組成物が対象に投与される前、同時、または後に、投与され得る。例えば、抗原は、集団または医薬組成物が投与される、１〜２８日、例えば３〜２５日、６〜２２日、９〜１８日、または１２〜１５日前または後に、対象に投与され得る。抗原は、集団または医薬組成物が投与される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８日前または後に、対象に投与され得る。
【０１４０】
抗原は、１の出来事で対象に投与され得る。あるいは、抗原は、少なくとも２の出来事、例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０の出来事で対象に投与され得る。出来事の間の間隔は、１〜２８日、例えば、３〜２５日、６〜２２日、９〜１８日または１２〜１５日であり得る。好ましくは、出来事の間の間隔は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８日である。
【０１４１】
同様に、ｉｏＭＰ細胞は、１の出来事で対象に投与され得る。あるいは、ｉｏＭＰ細胞は、少なくとも２の出来事、例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０の出来事で対象に投与され得る。出来事の間の間隔は、１〜２８日、例えば、３〜２５日、６〜２２日、９〜１８日または１２〜１５日であり得る。好ましくは、出来事の間の間隔は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８日である。
【０１４２】
アジュバントは、抗原の前、同時、または後に、個体に投与され得る。適切なアジュバントは当技術分野で知られている。これらは、限定されないが、ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン酸カルシウム、パラフィン油、死滅化されたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、細菌性トキソイド、スクアレン、チメロサール、洗浄剤、植物サポニン、例えば、Ｑｕｉｌｌａｊａ、ＳｏｙｂｅａｎおよびＰｏｌｙｇａｌａ  ｓｅｎｅｇａ由来のもの、サイトカイン、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２およびＩＬ−１２、フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバントを含む。
【０１４３】
抗原は、Ｔ細胞が応答する任意の抗原であり得る。例えば、抗原は、腫瘍細胞上に見られる抗原であり得る。あるいは、抗原は、自己免疫性脳脊髄炎のような自己免疫疾患と関連するものであり得る。また、抗原は、対象自身の細胞上に見られる抗原であってもよい。対照的に、抗原は、他の健康または病気の個体の細胞上に見られる抗原であってよい。ある場合には、抗原は、別の個体の細胞上に見られるが対象自身の細胞上には見られないものである。抗原は、あるいは、細菌、ウイルスまたは原虫のような病原作用物質上に見られる抗原であってよい。ある場合には、抗原は、アレルゲンのような環境抗原であってよい。好ましくは、抗原は、アトピー性皮膚炎、アレルギー性気道炎症または通年制アレルギー性鼻炎と関連する抗原である。
【０１４４】
本発明の集団の投与の成果（すなわち、Ｔ細胞応答の増大または低減）は、本発明の集団が投与される条件に依存する。そのような条件は、対象内に既に存在し得る。条件は、健康な状態において天然に存在し得る。あるいは、条件は、対象における疾患と関連し得る。ある場合では、条件は、集団の投与の前、同時、または後に、対象内に誘導され得る。条件は、１つまたは複数の物質を対象に投与することによって誘導され得る。そのような物質は、薬物、ワクチン、抗体、抗原、アジュバント、サイトカイン、核酸、ペプチド、タンパク質および細胞を含んでよい。
【０１４５】
例えば、Ｔｈ１および／またはＴｈ２免疫応答は、対象内に既に存在し得て、または、対象内に誘導され得る。Ｔｈ１応答は、サイトカイン／メディエーター、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、およびＩｇＡ（粘膜免疫をサポートする免疫グロブリン）によって高められ得る。Ｔｈ２免疫応答は、ＩＬ４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０によって高められ得る。したがって、１つまたは複数のこれらのサイトカイン／メディエーターは、集団の投与前に対象内に存在し得る。１つまたは複数のこれらのサイトカイン／メディエーターは、集団の投与の前、同時、または後に、対象に投与され得る。
【０１４６】
一態様では、本発明の集団の投与は、対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２バランスに影響を及ぼす。免疫系のＴｈ１アームの失敗および過剰活性のＴｈ２アームは、多種多様の慢性疾患に関与する。これらは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、カンジダ症、アレルギー、多種化学物質過敏状態（ＭＣＳ）、ウイルス肝炎、湾岸戦争症候群（ＧＷＳ）、癌などを含む。ＡＩＤＳでは、例えば、無症状状態から進行性疾患へＨＩＶ感染が進行するにつれて、免疫応答は、より効果的なＴｈ１応答から、非効果的なＴｈ２応答にシフトすることが報告されている。したがって、Ｔｈ１応答を刺激してＴｈ２応答を低減させることによって、免疫系のＴｈ１およびＴｈ２アームの間のバランスを回復させることは、上記に示した慢性疾患と関連する症候の多くを除去または切除し得る。
【０１４７】
ｉｏＭＰ細胞がＴ細胞の活性を調節し得るメカニズムは、上記に述べられる。
【０１４８】
医薬組成物および投与
本発明は、加えて、本発明のｉｏＭＰ細胞または本発明の集団を、（ｉ）薬学的に許容できる担体または希釈剤、（ｉｉ）１つまたは複数のリポソームおよび／または（ｉｉｉ）１つまたは複数の微小気泡と組み合わせて含む、医薬組成物を提供する。組成物は、（ｉ）；（ｉｉ）；（ｉｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；または（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含んでよい。ｉｏＭＰ細胞または集団は、好ましくは、１つまたは複数のリポソームおよび／または１つまたは複数の微小気泡とともに含まれる（ｃｏｎｔａｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ）。任意の数のリポソームおよび／または微小気泡が存在し得る。本発明の集団に関して上述した任意の数が、リポソームおよび／または微小気泡に等しく当てはまる。リポソームまたは微小気泡は、１つのｉｏＭＰ細胞または１つよりも多いｉｏＭＰ細胞を含んでよい。
【０１４９】
また、本発明は、（ｉ）薬学的に許容できる担体または希釈剤と組み合わせた、本発明のＩＭＰ細胞または本発明の集団、（ｉｉ）１つまたは複数の免疫細胞および／または（ｉｉｉ）１つまたは複数の抗原、を含む、医薬組成物も提供する。組成物は、（ｉ）；（ｉｉ）；（ｉｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；または（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含んでよい。免疫細胞は、上述したもののような任意の免疫細胞であってよい。一部の態様では、免疫細胞は、Ｔ細胞、γδＴ細胞またはＮＫ細胞であってよい。抗原は、任意の抗原、例えば、上述した任意の抗原であってよい。
【０１５０】
本発明の様々な組成物は、任意の適切な方法を用いて処方され得る。標準的な薬学的に許容できる担体および／または賦形剤を用いた細胞の処方は、調剤分野における定法を用いて行なわれ得る。処方の正確な特質は、投与される細胞および所望の投与経路を含むいくつかの因子に依存する。処方の適切なタイプは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡに完全に記載される。
【０１５１】
細胞は、任意の経路によって投与され得る。適切な経路は、限定されないが、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、心内膜心筋、心筋外膜、脳室内、冠動脈内、逆行性冠状静脈洞、動脈内、心膜内、骨内、または肺内経路を含む。また、細胞は、肝臓、腎臓または肺組織のような目的の組織に直接投与されてもよい。細胞は、腫瘍内に直接投与され得る。
【０１５２】
組成物は、生理的に許容できる担体または希釈剤をともに調製され得る。典型的に、そのような組成物は、細胞の液体懸濁液として調製される。細胞は、薬学的に許容できて活性成分と適合する賦形剤と混合され得る。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロールなどおよびそれらの組み合わせである。
【０１５３】
加えて、必要に応じて、本発明の医薬組成物は、少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／または、有効性を高めるアジュバントを含んでよい。組成物は、好ましくは、ヒト血清アルブミンを含む。
【０１５４】
１つの適切な担体または希釈剤は、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ  Ａ（登録商標）である。これは、静脈内投与のための、滅菌された、非発熱性の等張溶液である。各１００ｍＬは、５２６ｍｇの塩化ナトリウム、ＵＳＰ（ＮａＣｌ）；５０２ｍｇのグルコン酸ナトリウム（Ｃ６Ｈ１１ＮａＯ７）；３６８ｍｇの酢酸ナトリウム三水和物、ＵＳＰ（Ｃ２Ｈ３ＮａＯ２・３Ｈ２Ｏ）；３７ｍｇの塩化カリウム、ＵＳＰ（ＫＣｌ）；および３０ｍｇの塩化マグネシウム、ＵＳＰ（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）を含む。それは、抗菌剤を含まない。水酸化ナトリウムを用いてｐＨ調整される。ｐＨは７．４（６．５〜８．０）である。
【０１５５】
ｉｏＭＰ細胞は、１つまたは複数のリポソームおよび／または１つまたは複数の微小気泡内に含まれ得る。適切なリポソームは当技術分野で知られている。適切なリポソームは、例えば、Ａｋｂａｒｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１３，８：１０２およびＭｅｇｈａｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２、１（１）：１−１０に開示される。リポソームの形成で用いるための適切な脂質は、微小気泡に関して以下に述べられる。
【０１５６】
微小気泡、それらの形成および生体医学用途は、当技術分野で知られている（例えば、Ｓｉｒｓｉ  ａｎｄ  Ｂｏｒｄｅｎ，Ｂｕｂｂｌｅ  Ｓｃｉ  Ｅｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｎｏｖ  ２００９；１（１−２）：３−１７）。微小気泡は、直径が１ミリメートルよりも小さくて、直径が１マイクロメートルよりも大きい気泡である。本明細書において用いられる微小気泡は、好ましくは、直径が８μｍ以下、例えば直径が７μｍ以下、直径が６μｍ以下、直径が５μｍ以下、直径が４μｍ以下、直径が３μｍ以下、または、直径が２μｍ以下である。
【０１５７】
微小気泡は、任意の物質から形成され得る。微小気泡の一般的な組成は、シェルによって安定化されるガスコアである。ガスコアは、空気または重質ガス、例えば、ペルフルオロカーボン、窒素またはペルフルオロプロパンを含んでよい。重質ガスは、水にあまり溶けず、したがって、微小気泡から漏れ出して微小気泡溶解をもたらす可能性が低い。重質ガスコアを有する微小気泡は、典型的に、循環においてより長持ちする。
【０１５８】
シェルは、任意の材料から作られ得る。シェル材料は、好ましくは、タンパク質、界面活性剤、脂質、ポリマー、またはそれらの混合物を含む。
【０１５９】
適切なタンパク質は、限定されないが、アルブミン、リゾチームおよびアビジンを含む。シェル内のタンパク質は、例えばシステイン−システイン結合によって、化学的に架橋され得る。他の架橋剤は当技術分野で知られている。
【０１６０】
適切な界面活性剤は、限定されないが、ソルビタンモノパルミテート（例えばＳＰＡＮ−４０）、ポリソルベート洗浄剤（例えばＴＷＥＥＮ−４０）、ＳＰＡＮ−４０およびＴＷＥＥＮ−４０の混合物、およびステアリン酸スクロース（モノ−およびジ−エステル）を含む。
【０１６１】
適切なポリマーは、限定されないが、アルギネートポリマー、エチリデンの二重エステルポリマー、共重合体ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、共重合体ポリペルフルオロオクチルオキシカロニル−ポリ（乳酸）（ＰＬＡ−ＰＦＯ）および他のブロック共重合体を含む。ブロック共重合体は高分子材料であり、２以上のモノマーサブユニットが共に重合して単一のポリマー鎖を作る。ブロック共重合体は、典型的に、各モノマーサブユニットによって寄与される特性を有する。しかしながら、ブロック共重合体は、個々のサブユニットから形成されるポリマーが保有しない独特の特性を有してよい。ブロック共重合体は、モノマーサブユニットの一方が疎水性（すなわち親油性）であり、一方で、他方のサブユニット（単数または複数）が水性培地中で親水性であるように改変され得る。この場合では、ブロック共重合体は、両親媒性の特性を有し得て、生物学的な膜を模倣する構造を形成し得る。ブロック共重合体は、ジブロック（２つのモノマーサブユニットからなる）であってよいが、２つよりも多いモノマーサブユニットから構成されて、両親媒性物質として挙動するより複雑な配置も形成し得る。共重合体は、トリブロック、テトラブロックまたはペンタブロック共重合体であってよい。また、ブロック共重合体は、脂質サブ材料として分類されないサブユニットから構成されてもよく；例えば、疎水性ポリマーは、シロキサンまたは他の非炭化水素系モノマーから作られ得る。また、ブロック共重合体の親水性のサブ部分は、低いタンパク質結合特性を保有してもよく、生の生物学的サンプルに曝された場合に耐性が高い膜の作成を可能にする。また、この頭部ユニットは、非古典的な脂質頭部に由来され得る。
【０１６２】
微小気泡を形成する任意の脂質材料が用いられ得る。脂質組成は、要求される特性、例えば、表面電荷、充填密度または機械的特性を微小気泡が有するように選択される。脂質組成は、１つまたは複数の異なる脂質を含むことができる。例えば、脂質組成は、１００までの脂質を含むことができる。脂質組成は、好ましくは、１〜１０の脂質を含む。脂質組成は、天然起源の脂質および／または人工の脂質を含んでよい。
【０１６３】
脂質は、典型的に、頭部、界面部分および２つの疎水性尾部を含み、同一または異なってよい。適切な頭部は、限定されないが、中性頭部、例えば、ジアシルグリセリド（ＤＧ）およびセラミド（ＣＭ）；双性イオン性頭部、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）；負に帯電した頭部、例えば、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）；ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、リン酸（ＰＡ）およびカルジオリピン（ＣＡ）；および正に帯電した頭部、例えば、トリメチルアンモニウム−プロパン（ＴＡＰ）を含む。適切な界面部分は、限定されないが、天然起源の界面部分、例えば、グリセロール系またはセラミド系部分を含む。適切な疎水性尾部は、限定されないが、飽和炭化水素鎖、例えば、ラウリン酸（ｎ−ドデカン酸（Ｄｏｄｅｃａｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ））、ミリスチン酸（ｎ−テトラデカン酸（Ｔｅｔｒａｄｅｃｏｎｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））、パルミチン酸（ｎ−ヘキサデカン酸（Ｈｅｘａｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ））、ステアリン酸（ｎ−オクタデカン）およびアラキジン（ｎ−エイコサン）；不飽和炭化水素鎖、例えば、オレイン酸（シス−９−オクタデカン）；および分岐炭化水素鎖、例えば、フィタノイルを含む。鎖の長さ、および、不飽和炭化水素鎖内の二重結合の位置および数は、変えることができる。鎖の長さ、および、分岐の位置および数、例えば、分岐炭化水素鎖内のメチル基は、変えることができる。疎水性尾部は、エーテルまたはエステルとして界面部分に結合され得る。
【０１６４】
また、脂質は、化学的にも改変され得る。脂質の頭部または尾部は、化学的に改変され得る。頭部が化学的に改変されている適切な脂質は、限定されないが、ＰＥＧ−改変脂質、例えば、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］；官能化ＰＥＧ脂質、例えば、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ビオチニル（ポリエチレングリコール）２０００］；および、コンジュゲートのために改変された脂質、例えば、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（スクシニル）および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（ビオチニル）を含む。尾部が化学的に改変されている適切な脂質は、限定されないが、重合可能な脂質、例えば、１，２−ビス（１０、１２−トリコサジイノイル（ｔｒｉｃｏｓａｄｉｙｎｏｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；フッ素化脂質、例えば、１−パルミトイル−２−（１６−フルオロパルミトイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；重水素化脂質、例えば、１，２−ジパルミトイル−Ｄ６２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；およびエーテル結合脂質、例えば、１，２−Ｄｉ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを含む。脂質は、上述の抗体への（ｒｏ）リガンド、受容体の結合を促進するように、化学的に改変され、または官能化され得る。
【０１６５】
脂質組成は、微小気泡の特性に影響を与える１つまたは複数の添加剤を含んでよい。適切な添加剤は、限定されないが、脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ミリスチン酸およびオレイン酸；脂肪族アルコール類、例えば、パルミチンアルコール、ミリスチンアルコールおよびオレインアルコール；ステロール類、例えば、コレステロール、エルゴステロール、ラノステロール、シトステロールおよびスチグマステロール；リゾリン脂質類、例えば、１−アシル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；およびセラミド類を含む。
【０１６６】
微小気泡シェルは、好ましくはリン脂質から作られる。適切なリン脂質は当技術分野で知られている。
【０１６７】
いくつかの市販される脂質シェル微小気泡製剤、例えば、Ｄｅｆｉｎｉｔｙ（Ｌａｎｔｈｅｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ）およびＳｏｎｏｖｕｅ（登録商標）（Ｂｒａｃｃｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）がある。
【０１６８】
また、微小気泡は、事前に形成された微小気泡上の高分子電解質多層（ＰＥＭ）シェルの形成を含む、ポリマー界面活性剤ハイブリッドからも形成され得る。事前に形成された微小気泡は、帯電された界面活性剤またはタンパク質層でコーティングされて、それは、ＰＥＭ沈着のための基質としての役割を果たす。層ごとのアセンブリ技術を用いて、反対に帯電したポリイオンを微小気泡シェルに連続して吸着させる。例えば、ＰＥＭは、ポリイオン対のために、ポリ（アリルアミンハイドロクロライド）（ＰＡＨ）およびポリ（スチレンスルホナート）（ＰＳＳ）を用いて微小気泡上に沈着され得る。カチオン性頭部トリメチルアンモニウムプロパン（ＴＡＰ）を基盤シェルとして、および、ＤＮＡおよびポリ（Ｌ−リジン）（ＰＬＬ）をポリイオン対として含む、リン脂質を有するＰＥＭ微小気泡もまた開発されている。
【０１６９】
微小気泡は、典型的に、ガスと微小気泡シェル材料との間に界面を提供することによって形成される。上述した任意の材料が用いられ得る。リン脂質のような一部の材料は、微小気泡を自然に形成する。リン脂質は、微小気泡へ自己集合する。他の材料は、界面の超音波処理、すなわち、界面への音響エネルギーまたは音波の適用を必要とする。超音波が典型的に用いられる。適切な方法は、超音波処理に関して当技術分野で知られている。
【０１７０】
微小気泡は、微小気泡の形成後、または、微小気泡の形成中に、ｉｏＭＰ細胞によってロードされ得る。
【０１７１】
ｉｏＭＰ細胞は、投与製剤と適合する様式で、治療的に効果的な量で投与される。投与される量は、治療される対象、対象の免疫系の能力、および、所望の修復度合に依存する。投与されることが要求されるｉｏＭＰ細胞の正確な量は、熟練者の判断に依存し得て、各対象に特有であり得る。
【０１７２】
任意の適切な数の細胞が対象に投与され得る。例えば、少なくとも、または約、０．２×１０６、０．２５×１０６、０．５×１０６、１．５×１０６、４．０×１０６または５．０×１０６の細胞／対象のｋｇが投与され得る。例えば、少なくとも、または約、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９の細胞が投与され得る。目安として、与されるべき本発明の細胞の数は、１０５〜１０９、好ましくは、１０６〜１０８であり得る。典型的に、２×１０８までのｉｏＭＰ細胞が、各対象に投与される。本発明の集団に関して上述される任意の特定の数が投与され得る。細胞が投与または存在するそのようなケースでは、細胞の生存を促進するために培養培地が存在してよい。ある場合には、本発明の細胞は、凍結アリコートで与えられ得て、ＤＭＳＯのような物質が、凍結中の生存を促進するために存在してよい。そのような凍結細胞は、典型的に解凍されて、それから、維持または投与のいずれかのためにバッファーまたは培地中に置かれる。
【０１７３】
薬物、方法および治療的使用
本発明のｉｏＭＰ細胞は、ヒトまたは動物の体の治療方法で使用され得る。したがって、本発明は、治療によるヒトまたは動物の体の治療の方法での使用のための、本発明のｉｏＭＰ細胞、本発明の集団、または本発明の医薬組成物を提供する。具体的には、本発明は、免疫細胞応答を調節することによって疾患を治療するための、本発明のｉｏＭＰ細胞、本発明の集団、または本発明の医薬組成物の使用に関する。免疫細胞は、好ましくはＴ細胞である。また、本発明は、対象における癌を治療するための、本発明のｉｏＭＰ細胞、本発明の集団または本発明の医薬組成物の使用にも関する。本発明はさらに、対象におけるアレルギー性または自己免疫疾患を治療するための、本発明のｉｏＭＰ細胞、本発明の集団または本発明の医薬組成物の使用に関する。
【０１７４】
より具体的には、本発明は、対象において、抗原に対する細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞応答を増大させることにより、疾患を治療する方法を提供し、当該方法は、対象に、（ａ）本発明の集団または本発明の医薬組成物；（ｂ）本発明の集団または本発明の医薬組成物、および、本発明の感作された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞；または（ｃ）本発明の感作された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞、を投与するステップを含む。γδＴ細胞が好ましい。
【０１７５】
また、本発明は、対象において、抗原に対する制御性Ｔ細胞応答を低減させることにより、疾患を治療する方法も提供し、当該方法は、対象に、（ａ）本発明の集団または本発明の医薬組成物；（ｂ）本発明の集団または本発明の医薬組成物および本発明の抑制された制御性Ｔ細胞；または（ｃ）本発明の抑制された制御性Ｔ細胞、を投与するステップを含む。
【０１７６】
本発明はさらに、対象において、抗原に対する制御性Ｔ細胞応答を低減させることにより、疾患を治療する方法を提供し、当該方法は、対象に、（ａ）本発明の集団または本発明の医薬組成物、および、本発明の感作された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞；または（ｂ）本発明の感作された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞、を投与するステップを含む。γδＴ細胞が好ましい。
【０１７７】
疾患は、抗原に対する増大した細胞傷害性、ヘルパーＴまたはγδＴ細胞応答または低減した制御性Ｔ細胞応答によって対象が恩恵を受け得る任意の疾患であってよい。疾患は、好ましくは癌である。好ましくは、癌は、肛門癌、胆管癌（胆管細胞癌）、膀胱癌、血液癌、骨癌、腸癌、脳腫瘍、乳癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、内分泌癌、眼の癌（例えば眼のメラノーマ）、卵管癌、胆嚢癌、頭部および／または頸部の癌、カポシ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ節癌、リンパ腫、メラノーマ、中皮腫、骨髄腫、神経内分泌腫瘍、卵巣癌、食道癌、膵癌、陰茎癌、原発性腹膜癌、前立腺癌、腹膜偽性粘液腫、皮膚癌、小腸癌、軟組織肉腫、脊髄腫瘍、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、気管癌、未知の原発性癌、膣癌、外陰部癌または子宮内膜癌である。白血病は、好ましくは、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病または慢性骨髄性白血病である。リンパ腫は、好ましくは、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫である。癌は、好ましくは、原発性癌または二次癌である。
【０１７８】
また、本発明は、対象において、癌を治療する方法も提供し、当該方法は、対象に、本発明の集団または本発明の医薬組成物を投与するステップを含む。癌は、好ましくは、Ｔ細胞応答を調節することによる疾患の治療に関して上述した癌である。
【０１７９】
別の態様では、本発明は、対象において、抗原に対する細胞傷害性および／またはヘルパーＴ細胞応答を低減させることにより、疾患を治療する方法を提供し、当該方法は、対象に、（ａ）本発明の集団または本発明の医薬組成物；（ｂ）本発明の集団または本発明の医薬組成物および本発明の抑制された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞；または（ｃ）本発明の抑制された細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞、を投与するステップを含む。γδＴ細胞が好ましい。
【０１８０】
また、本発明は、対象において、抗原に対する制御性Ｔ細胞応答を増大させることにより、疾患を治療する方法も提供し、当該方法は、対象に、（ａ）本発明の集団または本発明の医薬組成物；（ｂ）本発明の集団または本発明の医薬組成物、および本発明の感作された制御性Ｔ細胞；または（ｃ）本発明の感作された制御性Ｔ細胞、を投与するステップを含む。
【０１８１】
本発明は、対象において、抗原に対する細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞応答を低減させることにより、疾患を治療する方法をさらに提供し、当該方法は、対象に、（ａ）本発明の集団または本発明の医薬組成物および本発明の感作された制御性Ｔ細胞；または（ｂ）本発明に係る感作された制御性Ｔ細胞、を投与するステップを含む。γδＴ細胞が好ましい。
【０１８２】
疾患は、抗原に対する低減した細胞傷害性、ヘルパーまたはγδＴ細胞応答または増大した制御性Ｔ細胞応答によって対象が恩恵を受け得る任意の疾患であってよい。γδＴ細胞が好ましい。ある場合には、疾患は、好ましくはアレルギー性疾患である。より好ましくは、疾患は、アトピー性皮膚炎、アレルギー性気道炎症または通年制アレルギー性鼻炎である。他の例では、疾患は、好ましくは自己免疫疾患である。例えば、疾患は、円形脱毛症、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病（１型）、自己免疫性若年性特発性関節炎、糸球体腎炎、グレーヴス病、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、自己免疫性心筋炎、多発性硬化症、天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症／全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、ブドウ膜炎または白斑であってよい。疾患は、好ましくは自己免疫性脳脊髄炎である。他の場合では、疾患は、好ましくは免疫介在性疾患である。疾患は、より好ましくは移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である。
【０１８３】
さらなる態様では、本発明は、対象において、アレルギー性、自己免疫性または免疫介在性疾患を治療する方法を提供し、当該方法は、対象に、本発明の集団または本発明の医薬組成物を投与するステップを含む。アレルギー性、自己免疫性または免疫介在性疾患は、好ましくは、Ｔ細胞応答を調節することによる疾患の治療に関して上述される疾患である。
【０１８４】
任意の上記の方法に関して、抗原は、Ｔ細胞が応答する任意の抗原であってよい。例えば、抗原は、腫瘍細胞上に見られる抗原であってよい。あるいは、抗原は、自己免疫性脳脊髄炎のような自己免疫疾患と関連するものであってよい。また、抗原は、対象自身の細胞上に見られる抗原であってもよい。対照的に、抗原は、別の健康または病気の個体の細胞上に見られる抗原であってよい。ある場合には、抗原は、別の個体の細胞上に見られるが対象自身の細胞上には見られないものである。抗原は、あるいは、細菌、ウイルスまたは原虫のような病原作用物質上に見られる抗原であってよい。ある場合には、抗原は、アレルゲンのような環境抗原であってよい。好ましくは、抗原は、アトピー性皮膚炎、アレルギー性気道炎症または通年制アレルギー性鼻炎と関連する抗原であってよい。
【０１８５】
上記に示されるように、当該方法は、対象への本発明のＴ細胞の投与を伴ってよい。Ｔ細胞は、好ましくは自家または同種異系である。Ｔ細胞は、好ましくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、以下により詳細に述べられる。対象へ投与されるＴ細胞の数は、好ましくは、治療的に効果的な数である。例えば、０．２×１０６、０．２５×１０６、０．５×１０６、１．５×１０６、４．０×１０６または５．０×１０６のＴ細胞／対象のｋｇが投与され得る。例えば、少なくとも、または約、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９のＴ細胞が投与され得る。目安として、投与されるＴ細胞の数は、１０５〜１０９、好ましくは、１０６〜１０８であってよい。典型的に、２×１０８までのＴ細胞が各対象に投与される。
【０１８６】
当該方法は、（ｉ）本発明の集団または本発明の医薬組成物、および（ｉｉ）本発明のＴ細胞の両方を、対象に投与するステップも伴ってよい。そのような場合では、本発明の集団または医薬組成物は、本発明のＴ細胞と同時に、連続して、または別個に投与され得る。本発明の集団または医薬組成物は、本発明のＴ細胞の前または後に投与され得る。例えば、本発明の集団または医薬組成物は、本発明のＴ細胞が投与される１〜２８日、例えば、３〜２５日、６〜２２日、９〜１８日または１２〜１５日前または後に、対象に投与され得る。本発明の集団または医薬組成物は、本発明のＴ細胞が投与される１日まで、２日まで、３日まで、４日まで、５日まで、６日まで、７日まで、８日まで、９日まで、１０日まで、１１日まで、１２日まで、１３日まで、１４日まで、１５日まで、１６日まで、１７日まで、１８日まで、１９日まで、２０日まで、２１日まで、２２日まで、２３日まで、２４日まで、２５日まで、２６日まで、２７または２８日まで、前または後に、対象に投与され得る。
【０１８７】
本発明の集団および／または本発明の医薬組成物および／または本発明のＴ細胞は、１の出来事で対象に投与され得る。あるいは、本発明の集団および／または本発明の医薬組成物および／または本発明のＴ細胞は、少なくとも２の出来事、例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０の出来事で対象に投与され得る。出来事の間の間隔は、１〜２８日、例えば、３〜２５日、６〜２２日、９〜１８日または１２〜１５日であり得る。好ましくは、出来事の間の間隔は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８日である。
【０１８８】
上記に示される任意の治療的方法では、ｉｏＭＰ細胞は、サイトカインを分泌し得る。ｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、炎症促進性サイトカインまたは抗炎症性サイトカインを分泌する。ｉｏＭＰ細胞によるサイトカインの分泌は、上記により詳細に述べられる。また、ｉｏＭＰ細胞は、アポトーシスを調節する分子も分泌し得る。好ましくは、ｉｏＭＰ細胞は、アポトーシス促進性または抗アポトーシス性分子を分泌する。
【０１８９】
例えば、ｉｏＭＰ細胞は、Ｎｏｔｃｈ２、カドヘリン１１（ＣＤＨ１１）、ＣＤ８１、ＣＤ９５、ＣＤ２３０、ＣＤ２９５、ＣＤ５５、ＣＤ８２、ＬＢＴＲ、ベータ２−ミクログロブリン（ｍｉｃｒｏｇｌｕｂｕｌｉｎ）および／またはＤＲ６のようなアポトーシス促進性分子を分泌または発現し得る。Ｎｏｔｃｈ２シグナリングは、アポトーシスを誘導することが知られる。ＣＤ８２、ＣＤ９５、ＣＤ２３０、ＣＤ８１およびベータ２−ミクログロブリンもまた、アポトーシスを誘導することが知られる。高いＣＤ２９５発現は、アポトーシスの細胞をマークする。ＬＴＢＲは、多数のシグナル経路を活性化し、接着分子およびケモカインの発現、および細胞死をもたらす。また、ＤＲ６は、ＣＤ３５８またはＴＮＦＲＳＦ２１としても知られ、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである。ＤＲ６は、核因子κＢおよび分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ８を活性化して、細胞アポトーシスを誘導する。
【０１９０】
ｉｏＭＰ細胞は、ＣＤ６６ｅ（ＣＥＡＣＡＭ−５）、ＣＤ２６４、ＣＤ６３、ＣＤ１２０ａおよび／またはＣＤ１０５のような抗アポトーシス性分子を分泌し得る。ＣＤ６６ｅは、腫瘍細胞遊走、浸潤、接着、および転移を促進して、そして、分化刺激の存在下で細胞増殖を維持することにより、および、ＥＣＭアンカレージの喪失後のアポトーシスをブロックすることにより、腫瘍形成に寄与する。ＣＤ２６４は、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）によって誘導される細胞アポトーシスにおいて、阻害的な役割を果たすことが示されている。ＣＤ６３は、ＴＩＭＰ−１によって結合されて、細胞内シグナル伝達経路の活性化をもたらし、アポトーシスを阻害する。ＣＤ１２０ａがリン酸化されてＢｃｌ−２を動員して、アポトーシスに対して保護する。
【０１９１】
ｉＯＭＰ細胞は、アポトーシスを調節する他の分子、例えばＣＤ４４および／またはＣＤ５９を分泌または発現し得る。ＣＤ５９は、ヒト肺癌細胞のアポトーシスを調節することが示されている。
【０１９２】
ｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、接触依存性の細胞溶解によって細胞を標的化する。具体的には、ｉｏＭＰ細胞は、接触依存性の細胞溶解によって腫瘍細胞を攻撃し得る。ｉｏＭＰ作用のメカニズムは、上記により詳細に述べられる。
【０１９３】
全ての場合において、ｉｏＭＰ細胞は、好ましくは、対象または同種異系ドナーから得られる。本発明のｉｏＩＭＰ細胞を対象から得ることは、ｉｏＭＰ細胞がそれら自体、対象の免疫系によって拒絶されないことを確実にするはずである。ドナーとレシピエントとの間の任意の違いは、最終的に、ｉｏＭＰ細胞のクリアランスを引き起こすが、それらが関連のあるＴ細胞応答を調節および／または少なくとも部分的に疾患を治療する前ではない。
【０１９４】
本発明は、対象に、治療的に効果的な数の本発明のｉｏＭＰ細胞を対象に投与することに関する。治療的に効果的な数は、疾患の１つまたは複数の症候を改善する数である。治療的に効果的な数は、好ましくは、疾患を治療する数である。ｉｏＭＰ細胞の適切な数は、上記により詳細に述べられる。
【０１９５】
本発明のｉｏＭＰ細胞は、任意の適切な対象に投与され得る。対象は一般的にヒト対象である。対象は、ｉｏＭＰ細胞の供給源に関して上述した任意の動物または哺乳類であってよい。
【０１９６】
対象は、幼児、子どもまたは成人であってよい。対象は、疾患を有することが知られていてよく、または、疾患を有する疑いがある。対象は、関連のある疾患を起こしやすく、またはそのリスクがあってよい。例えば、対象は、遺伝学的に癌または自己免疫疾患に罹りやすくてよい。
【０１９７】
本発明は、疾患を治療するための他の手段および物質と組み合わせて用いられ得る。ある場合には、本発明のｉｏＭＰ細胞は、疾患を治療または疾患の症候を寛解させる、または疼痛緩和を提供することを目的とする他の物質と同時に、連続して、または別個に投与され得る。ｉｏＭＰ細胞は、疾患のための既存の治療と組み合わせて用いられ得て、および、例えば、そのような治療と単純に混合され得る。したがって、本発明は、疾患のための既存の治療の有効性を増大させるために用いられ得る。
【０１９８】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞
Ｔ細胞は、多くの免疫応答において重要な役割を果たす。具体的には、Ｔ細胞は、癌細胞に対する細胞が仲介する免疫にとって重要である。癌細胞は、宿主免疫応答を避ける多くのストラテジーを用いる。例えば、癌細胞は、Ｔ細胞によって標的化される抗原を下方制御し得て、または、弱い免疫原性である抗原のみ発現し得る。加えて、多くの腫瘍は、効果的なＴ細胞応答の助けとならない免疫抑制性の微小環境を作る。
【０１９９】
Ｔ細胞は、それらの抗腫瘍応答を増大させるために遺伝子改変され得て、それにより、腫瘍免疫を高める。例えば、Ｔ細胞は、癌細胞上に存在する抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように誘導され得る。このようにして、Ｔ細胞は、重要な腫瘍抗原に関して特異的になる。このことは、Ｔ細胞の応答が癌の方へ効率的に標的化されることを確実にする。
【０２００】
より詳細には、ＣＡＲは、典型的に、抗原結合領域、膜貫通ドメイン、および、少なくとも１つの細胞内ドメインを含む。抗原結合領域は、ＣＡＲの特異性を与えて、しばしば抗体に由来する。多くの標的に対する抗体が知られているので、ほとんどの任意の抗原に特異的なＣＡＲが改変され得る。膜貫通ドメインは、ＣＡＲをＴ細胞に固定する。細胞内ドメインは、Ｔ細胞シグナリングを誘導し、活性化、持続性およびエフェクター機能をもたらす。
【０２０１】
通常、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞が、抗原提示細胞と相互作用することを必要とする。具体的には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、抗原提示細胞上に存在するＭＨＣ分子と関連するペプチド抗原を認識する。このことは、伝統的なＴ細胞の活性化が、抗原取り込み、プロセッシングおよび抗原提示細胞による提示に依拠することを意味する。
【０２０２】
対照的に、ＣＡＲ発現Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）は、ＭＨＣ分子との相互作用の不存在下で活性化され得る。抗原結合領域が標的抗原に結合すると、ＣＡＲ細胞内ドメイン（単数または複数）を介してシグナリングイベントがトリガーされて、ＣＡＲ  Ｔ細胞が活性化されるようになる。ＭＨＣ制限のこの回避は、ＣＡＲ  Ｔ細胞アプローチを用いて、採用されるＴ細胞療法の適用性を広げることができることを意味する。さらに、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、タンパク質またはペプチド以外の抗原を認識し得る。特に、ＣＡＲは、典型的に癌細胞の表面上に発現される炭水化物および糖脂質構造を認識し得る。したがって、ＣＡＲは、抗体または同様の標的化ドメインが利用可能である限り、Ｔ細胞のエフェクター機能を、細胞表面上に発現された任意のタンパク質または非タンパク質標的へ向け直すことができる。
【０２０３】
ＣＡＲ  Ｔ細胞は、対象から単離されたＴ細胞において、ＣＡＲ発現を誘導することによって生産される。具体的には、Ｔ細胞は、血液または他の組織から単離され得て、ＣＡＲを発現するように改変され得る。このようにして生産されるＣＡＲ  Ｔ細胞は、概して、自家に投与される。換言すれば、生じるＣＡＲ  Ｔ細胞は、それらが得られた同一対象に投与される。しかしながら、同種異系ＣＡＲ  Ｔ細胞（すなわち、細胞が投与される対象と免疫学的に適合する対象に由来するＣＡＲ  Ｔ細胞）を投与する能力は、有利である。例えば、特定の抗原に向けられたＣＡＲ  Ｔ細胞のバンクは、ＭＨＣが合わない対象のアレイの治療での使用のために生産および維持され得る。実際には、同種異系ＣＡＲ  Ｔ細胞は安定性でなく、したがって、自家ＣＡＲ  Ｔ細胞よりも生存できない。したがって、同種異系ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与は挑戦である。
【０２０４】
この問題を対処するために、本発明は、本発明の集団の存在下でＣＡＲ  Ｔ細胞をインキュベートするステップを含む、ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性、生存能力または安定性を改善する方法を提供する。本発明の方法は、改善された持続性および機能をＣＡＲ  Ｔ細胞に引き起こし、したがって、自家または同種異系に投与され得る。さらに、より安定的な表現型は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性を増大させて、オフターゲット効果を低減させる。換言すれば、本発明の方法に従って生産されるＣＡＲ  Ｔ細胞は、関連のある抗原に対してより特異的に標的化されたままであり、したがって、インビボでの使用により安全である。
【０２０５】
本発明の方法は、ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビトロおよび／またはインビボでの有効性、生存能力または安定性を改善し得る。Ｔ細胞の有効性、生存能力および安定性を評価する方法は、当技術分野でよく知られている．
【０２０６】
本発明の集団とＣＡＲ  Ｔ細胞のインキュベーションは、ＣＡＲ  Ｔ細胞を集団と接触させるステップを含んでよい。例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、集団と、少なくとも１分、少なくとも２分、少なくとも５分、少なくとも１０分、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、または少なくとも８時間、接触されてよい。また、本発明の集団とＣＡＲ  Ｔ細胞のインキュベーションは、集団とＣＡＲ  Ｔ細胞の共培養を含んでもよい。例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞および集団は、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間または少なくとも９６時間、共培養され得る。細胞を培養するための技術は、当技術分野でよく知られている。細胞は、血清を含まない培地中、３７℃、５％ＣＯ２の標準的な条件下で培養され得る。細胞は、任意の適切なフラスコまたは標準的な６ウェルプレートのような平板のウェルを含む容器内で培養され得る。そのようなプレートは、Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＶＷＲ  ｓｕｐｐｌｉｅｒｓ、Ｎｕｎｃ、ＳｔａｒｓｔｅｄｔまたはＦａｌｃｏｎから市販される。ウェルは、典型的に、約１ｍｌ〜約４ｍｌの容量を有する。
【０２０７】
フラスコ、容器またはウェル（その中に集団が含まれ、または培養される）は、細胞のハンドリングを促進するように改変され得る。例えば、フラスコ、容器またはウェルは、例えば増殖マトリックスを含むことによって、細胞の培養を促進するように改変され得る。フラスコ、容器またはウェルは、細胞の付着を可能にするように、または、表面上への細胞の固定化を可能にするように改変され得る。１つまたは複数の表面は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、ラミニンまたはコラーゲン、または、細胞に結合してそれらを表面（単数または複数）上に固定化または捕捉する任意の他の捕捉分子によりコーティングされ得る。
【０２０８】
他の物質が、インキュベーション期間中に、ＣＡＲ  Ｔ細胞および本発明の集団に提供され得る。具体的には、インキュベーションは、抗原提示細胞、Ｔ細胞活性化ビーズ、または１つまたは複数の抗体の存在下で行なわれ得る。抗原提示細胞は、好ましくは樹状細胞である。抗体は、好ましくは抗−ＣＤ３および／または抗−ＣＤ２８である。また、インキュベーションは、抗原の存在下でも行なわれ得る。抗原は、好ましくは、ＣＡＲ  Ｔ細胞が特異的である抗原である。インキュベーションステップ中に提供され得る他の物質は、サイトカイン、核酸、ペプチド、タンパク質および他のタイプの細胞である。
【０２０９】
ハイブリッド組成物
１つまたは複数の本発明のｉｏＭＰ細胞は、ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５１６７２に開示されるハイブリッド組成物の一部を形成し得て、好ましくは、そのような組成物の一部として対象に投与される。具体的には、本発明は、
（ａ）１つまたは複数の生体適合性繊維；
（ｂ）１つまたは複数の本発明のｉｏＭＰ細胞；および
（ｃ）（ｉ）１つまたは複数のｉｏＭＰ細胞を１つまたは複数の繊維に付着させる、および／または、１つまたは複数のｉｏＭＰ細胞および１つまたは複数の繊維を埋め込む、および／または、（ｉｉ）組成物を組織に付着させることが可能な、１つまたは複数の生体適合性成分を含む、ハイブリッド組成物を提供する。
【０２１０】
本発明のハイブリッド組成物は、１つまたは複数の生体適合性繊維を含む。繊維は、損傷組織と接触した場合にいかなる有害反応または副作用も起こさないならば、生体適合性である。
【０２１１】
任意の数の生体適合性繊維が組成物中に存在してよい。組成物は、１のみの繊維を含んでよい。組成物は典型的に、１を超える繊維、例えば、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００の繊維、少なくとも１０００の繊維またはさらにより多い繊維を含む。
【０２１２】
適切な生体適合性繊維は当技術分野で知られている。１つまたは複数の生体適合性繊維は、天然または合成であってよい。好ましい生体適合性繊維は、限定されないが、セルロース繊維、コラーゲン繊維、コラーゲン−グリコサミノグリカン繊維、ゼラチン繊維、絹フィブロイン繊維、１つまたは複数のフィブリン繊維、キトサン繊維、スターチ繊維、アルギン酸繊維、ヒアルロン酸繊維、ポロクサマー（ｐｏｌｏａｘｍｅｒ）繊維またはそれらの組み合わせを含む。グリコサミノグリカンは、好ましくはコンドロイチンである。セルロースは、好ましくは、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはメチルセルロースである。ポロクサマーは、好ましくは、プルロニック酸、場合によりプルロニックＦ−１２７である。
【０２１３】
１よりも多い繊維が組成物中に存在する場合は、繊維の集団は同種であってよい。換言すれば、集団内の全ての繊維は、同じタイプの繊維、例えばセルロース繊維であってよい。あるいは、繊維の集団は異種であってよい。換言すれば、繊維の集団は、異なるタイプの繊維、例えばセルロース繊維およびコラーゲン繊維を含んでよい。
【０２１４】
１つまたは複数の繊維は、任意の長さであってよい。１つまたは複数の繊維は、好ましくは、組成物を用いて治療される組織内の損傷の深さとほぼ同じ長さである。１つまたは複数の繊維の長さは、好ましくは、定められた深さまで組成物が損傷組織を貫通することができるように設計される。１つまたは複数の繊維は、任意の長さであってよい。１つまたは複数の繊維の長さの下限は、典型的に、１つまたは複数の治療的細胞の直径によって決定される。適切な長さは、限定されないが、少なくとも１μｍの長さ、少なくとも１０μｍの長さ、少なくとも１００μｍの長さ、少なくとも５００μｍの長さ、少なくとも１ｍｍの長さ、少なくとも１０ｍｍ（１ｃｍ）の長さ、少なくとも１００ｍｍ（１０ｃｍ）の長さ、少なくとも５００ｍｍ（５０ｃｍ）の長さ、または、少なくとも１０００ｍｍ（１００ｃｍまたは１ｍ）の長さを含む。１つまたは複数の繊維は、さらにより長くてよい。例えば、１つまたは複数の繊維は、例えばヒト腸管に沿って損傷を修復するために用いられる場合は、５ｍまたは１０ｍまでの長さであってよく、または、ウマのような、より大きな動物で用いられる場合は、より長くてよい。１つまたは複数の繊維の長さは、典型的に、それらの使用目的、および／または、例えば外科医による、ロボットによる、または磁性のような一部の他の手段を介した、それらが扱われる能力によって決定される。
【０２１５】
１つまたは複数の繊維は、帯電していてよい。１つまたは複数の繊維は、好ましくは正に帯電している。１つまたは複数の繊維は、好ましくは負に帯電している。
【０２１６】
１つまたは複数の繊維は、磁性であってよい。１つまたは複数の繊維は、１つまたは複数の磁性原子または磁性基を含むように改変され得る。このことは、組成物の磁性標的化を可能にする。磁性原子または磁性基は、常磁性または超常磁性であってよい。適切な原子または基は、限定されないが、金原子、鉄原子、コバルト原子、ニッケル原子および金属キレート基、例えば、これらの原子のいずれかを含むニトリロ三酢酸を含む。金属キレート基は、例えば、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ−Ｏ−Ｃ−、−Ｃ（＝Ｏ）、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−Ｉ、−Ｓ（＝Ｏ）２−および−Ｓ−から選択される基を含んでよい。
【０２１７】
また、組成物は、１つまたは複数の生体適合性成分も含む。１つまたは複数の生体適合性成分は、（ｉ）１つまたは複数のｉｏＭＰ細胞を１つまたは複数の繊維に付着させる、および／または、１つまたは複数のｉｏＭＰ細胞および１つまたは複数の繊維を埋め込む、および／または、（ｉｉ）組成物を組織に付着させることが可能である。１つまたは複数の生体適合性成分は、（ａ）１つまたは複数のｉｏＭＰ細胞を１つまたは複数の繊維に付着させ得る、（ｂ）１つまたは複数のｉｏＭＰ細胞および１つまたは複数の繊維を埋め込み得る、（ｃ）組成物を組織に付着させることが可能であり得る、（ｄ）１つまたは複数のｉｏＭＰ細胞を１つまたは複数の繊維を付着させて、１つまたは複数のｉｏＭＰ細胞および１つまたは複数の繊維を埋め込み得る、（ｅ）１つまたは複数のｉｏＭＰ細胞を１つまたは複数の繊維に付着させて、組成物を組織に付着させることが可能であり得る、（ｆ）１つまたは複数のｉｏＭＰ細胞および１つまたは複数の繊維を埋め込み、組成物を組織に付着させることが可能であり得る、または、（ｇ）１つまたは複数のｉｏＭＰ細胞を１つまたは複数の繊維に付着させて、１つまたは複数のｉｏＭＰ細胞および１つまたは複数の繊維を埋め込み、そして、組成物を組織に付着させることが可能であり得る。
【０２１８】
成分は、損傷組織と接触した場合に、いかなる有害反応または副作用も引き起こさないならば、生体適合性である。
【０２１９】
任意の数の生体適合性成分が組成物中に存在してよい。組成物は、典型的に、１つのみの成分または２つの成分を含む。組成物は、２よりも多い成分、例えば、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０の成分、またはさらにより多くの成分を含んでよい。
【０２２０】
１つまたは複数の生体適合性成分は、好ましくは、１つまたは複数の治療的細胞を１つまたは複数の繊維に付着させる生体適合性接着剤を含む。生体適合性接着剤は、１つまたは複数のｉｏＭＰ細胞を、（ａ）１つまたは複数の繊維の表面上、（ｂ）１つまたは複数の繊維の中、または、（ｃ）１つまたは複数の繊維の表面上および中の両方に、付着させ得る。
【０２２１】
生体適合性接着剤は、天然または合成であってよい。適切な生体適合性接着剤は当技術分野で知られている。適切な接着剤は、限定されないが、フィブリン、フィブリンゲル、インテグリン、インテグリンゲル、カドヘリンおよびカドヘリンゲルを含む。
【０２２２】
１つまたは複数の生体適合性成分は、好ましくは、１つまたは複数の治療的細胞および１つまたは複数の繊維を埋め込む生体適合性ゲルを含む。適切な生体適合性ゲルは当技術分野で知られている。生体適合性ゲルは、天然または合成であってよい。好ましい生体適合性ゲルは、限定されないが、セルロースゲル、コラーゲンゲル、ゼラチンゲル、フィブリンゲル、キトサンゲル、スターチゲル、アルギン酸ゲル、ヒアルロン酸ゲル、アガロースゲル、ポロクサマーゲル、または、それらの組み合わせを含む。
【０２２３】
セルロースゲルは、上述の任意のセルロースから形成され得る。セルロースポリマー濃度は、好ましくは、約１．５％（ｗ／ｗ）〜約４．０％（ｗ／ｗ）、例えば、約２．０％（ｗ／ｗ）〜約３．０％（ｗ／ｗ）である。セルロースポリマーは、好ましくは、約４５０，０００〜約４，０００，０００、例えば、約５００，０００〜約３，５００，０００、約５００，０００〜約３，０００，０００、または、約７５０，０００〜約２，５００，０００、または、約１０００，０００〜約２，０００，０００の分子量を有する。
【０２２４】
ポロクサマーゲルは、好ましくはプルロニック酸ゲル、場合によりプルロニックＦ−１２７ゲルである。
【０２２５】
接着剤および／またはゲルは、好ましくは、室温で１０００〜５００，０００ｍＰａ・ｓ（ｃｐｓ）、例えば、室温で約１５００〜約４５０，０００ｍＰａ・ｓ、室温で約２０００〜約４００，０００ｍＰａ・ｓ、室温で約２５００〜約３５０，０００ｍＰａ・ｓ、室温で約５０００〜約３００，０００ｍＰａ・ｓ、室温で約１０，０００〜約２５０，０００ｍＰａ・ｓ、室温で約５０，０００〜約２００，０００ｍＰａ・ｓ、または、室温で約５０，０００〜約１５０，０００ｍＰａ・ｓの範囲の粘度を有する。
【０２２６】
粘度は、接着剤および／またはゲルが、剪断応力または引張応力のいずれかによって変形される耐性の尺度である。粘度は、当該分野で知られている任意の方法を用いて測定することができる。適切な方法は、限定されないが、粘度計またはレオメータの使用を含む
【０２２７】
室温は、典型的に、約１８℃〜約２５℃、例えば、約１９℃〜約２４℃または約２０℃〜約２３℃または約２１℃〜約２２℃である。室温は、好ましくは、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃および２５℃のいずれかである。粘度は、最も好ましくは、２５℃で測定される。
【０２２８】
１つまたは複数の生体適合性成分は、好ましくは、１つまたは複数の治療的細胞を１つまたは複数の繊維に付着させる生体適合性接着剤、および、１つまたは複数の治療的細胞および１つまたは複数の繊維を埋め込む生体適合性ゲルを含む。例えば、組成物は、１つまたは複数のｉｏＭＰ細胞を１つまたは複数の繊維に付着させるフィブリンゲル、および、１つまたは複数のｉｏＭＰ細胞および１つまたは複数の繊維を埋め込むセルロースゲルを含んでよい。
【０２２９】
上述の任意の実施態様において、生体適合性接着剤および／または生体適合性ゲルは、好ましくは、血小板溶解物を含む。例えば、接着剤および／またはゲルは、血小板溶解物（ｌｙｓｔａｅ）ゲルであってよい。血小板溶解物とは、血小板に含まれる天然の増殖因子の組み合わせ（これらの血小板の溶解により放出されたもの）を指す。溶解は、化学的手段（すなわちＣａＣｌ２）、浸透圧的手段（蒸留Ｈ２Ｏの使用）を通して、または、凍結／融解手順を通して、達成され得る。血小板溶解物は、米国特許第５，１９８，３５７号に記載のように、全血に由来し得る。血小板溶解物は、好ましくは、ＰＣＴ／ＧＢ１２／０５２９１１（ＷＯ２０１３／０７６５０７として公開）に記載のように調製される。例えばそれは、血小板の集団を少なくとも１回の凍結融解サイクルに供することにより調製され得て、ここで、各サイクルの凍結部分は、−７８℃以下の温度で行なわれる。
【０２３０】
接着剤および／またはゲルは、好ましくは、（ａ）血小板溶解物、（ｂ）少なくとも１つのｉｏＭＰが（ｉｏＭＰｌｙ）許容できるポリマー、および、（ｃ）リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、メチオニン、プロリン、セリン、アスパラギン、システイン、ポリアミノ酸、プロタミン、アミノグアニジン、亜鉛イオンおよびマグネシウムイオンからなる群より選択される、少なくとも１つのｉｏＭＰが許容できる正に帯電した化学種を含み、ここで、組成物は、室温で１０００〜５００，０００ｍＰａ・ｓ（ｃｐｓ）の範囲の粘度を有する水性ゲルである。ｉｏＭＰが許容できるポリマーは、好ましくはセルロースまたはポロクサマーである。上述のセルロースおよびポロクサマーのいずれかであってよい。
【０２３１】
血小板溶解物は、好ましくはヒト血小板溶解物である。血小板溶解物は、上記により詳細に述べられる。
【０２３２】
ハイブリッド組成物は、１つまたは複数のリポソームまたは１つまたは複数の微小気泡内に含まれ得る。そのような構造は当技術分野で知られている。
【０２３３】
以下の実施例は、本発明を説明する。
【実施例】
【０２３４】
実施例１−骨髄および末梢血分離＆ｉｏＭＰ細胞の拡張
骨髄サンプルを、ハンク緩衝生理食塩水で希釈して、遠心分離による単核細胞（ＭＣ）の単離のために、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの上に層化させた。それから、ＭＣをハンク緩衝生理食塩水中に再懸濁して、０．４％トリパンブルー色素排除法アッセイを用いてカウントして細胞の生存能力を評価した。細胞を、Ｔ２５フラスコ（５ｍｌの細胞培地中、αＭＥＭ、ＧｌｕｔａＭＡＸ、ペニシリン−ストレプトマイシン、血小板溶解物、ヘパリン）中に蒔いて、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。８日目に、培地を交換した。ｉＭＰ様細胞（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５１６７３；ＷＯ２０１５／１８９５８７の対象）の観察のために細胞を毎日モニターして、存在する場合は、ｉｏＭＰ細胞を形成するようにｉＭＰ細胞を後成的に改変した。これは、ｉＭＰ細胞を、Ｔ２５フラスコ（５ｍｌの細胞培地中、αＭＥＭ、ＧｌｕｔａＭＡＸ、ペニシリン−ストレプトマイシン、血小板溶解物、ヘパリン、Ｌ−アラニン、リン酸ナトリウム一塩基（無水）、２’−デオキシグアノシン）中に、５０００個／ｃｍ２で蒔いて、それらを３７℃、５．３％ＣＯ２でインキュベートすることによって行なった。Ｏ２は、０．０５％低減した。ｉｏＭＰ様細胞の観察のために細胞を毎日モニターして、存在する場合は、製造元の説明書に従って細胞分離溶液を用いて採取して、上記と同一の培地中でサブ培養した。細胞を、継代培養２において、１０％ジメチルスルホキシドで補充された培養培地中で−８０℃に凍結乾燥して、後の使用のために液体窒素中で保管した。
【０２３５】
実施例２−ＨＴ−ＦＡＣＳ分析
ハイスループット蛍光活性化セルソーティング（ＨＴ−ＦＡＣＳ）分析は、懸濁液中の細胞の細胞表面表現型を迅速に特性化することのできるハイスループットスクリーニングプラットフォームであり、現在のところ３７０個を超える細胞表面マーカーがパネルにある。このプラットフォームは、広範囲の検証がなされていて、多くのタイプのヒト組織および細胞で実施されている。パネルは、９６ウェルプレート内に並べられた３７０個のヒト細胞表面−特異的抗体からなる。
【０２３６】
目的は、Ｌｏｎｚａ（登録商標）から得られるヒトＭＳＣおよび出願人が所有する免疫調節性前駆（ＩＭＰ）細胞と比較して、本発明のヒトｉｏＭＰ細胞の表面抗原発現プロファイルを決定することであった。ＩＭＰ細胞は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５１６７３（ＷＯ２０１５／１８９５８７）の対象である。ハイスループット−ＦＡＣＳ（ＨＴ−ＦＡＣＳ）プラットフォームは、３７０個までの表面抗原のスクリーニングを可能にする。
【０２３７】
凍結保存されたＰＢ−ＭＳＣ（１×１０６細胞／ｍｌ）の１バイアルを、１５ｍＬのＣＴＬ培地（３７℃、５％ＣＯ２）を含むＴ７５  ｃｍ２フラスコ中に蒔いた。２〜３日毎に培地を変えて８０〜９０％のコンフルエンスまで細胞を増殖させた。細胞を継代培養するために、培地を除去して、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。細胞を、引き離されるまで３ｍｌのトリプシン０．２５％で処理した。８ｍｌの培地を添加してトリプシンを不活化して、４００ｇで５分の遠心分離によって細胞を集めた。５ｍｌの培地中に細胞を再懸濁して、３０ｍＬのＣＴＬ培地（３７℃、５％ＣＯ２）を含むＴ１７５  ｃｍ２フラスコ中に蒔いた。ＨＴ−ＦＡＣＳスクリーニングのために２０００〜３０００万個の細胞（継代培養４）を採取するためには、８０〜９０％コンフルエンスで８〜１０のＴ１７５  ｃｍ２フラスコが必要とされる。抗体あたり十分な数のフローサイトメトリー「イベント」を得るためには、およそ２０００万の生存細胞が最適である。細胞を集めるために、培地を除去して、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、引き離されるまで５ｍｌのトリプシン０．２５％で処理した。培地を添加して（８ｍｌ）トリプシンを不活化して、細胞を集めた。細胞を、４００ｇで５分間、遠心分離した。合計５ｍｌのＨＢＳＳ（２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１％ＢＳＡで補充された、ハンク緩衝食塩水、マイナス、カルシウム／マグネシウム）中に、細胞ペレットを再懸濁した（単一細胞懸濁液）。サンプルの１アリコート（１０μｌ）を用いて、排除色素（０．２％トリパンブルー）の使用により生存細胞の全数を決定した。
【０２３８】
１００μｌのサンプルを各ウェルにロードした（約４０，０００細胞／ウェルであり、ＦＡＣＳにおける１０，０００〜２０，０００イベントの回収を確実にする）。サンプルは、ＢＤ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ＳａｍｐｌｅｒがアップグレードされたＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａで操作された（自動サンプラー）。フローサイトメトリーデータの分析は、ＦｌｏｗＪｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて行なった。結果は、プロット、および、各抗体に関するメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）および陽性細胞のパーセンテージを含むＥｘｃｅｌスプレッドシートで得られた。
【０２３９】
【表１】
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【国際調査報告】
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