(57)【要約】  本発明は、抗GPC3抗体及びそれらの用途に関する。本発明は、腫瘍成長、増殖、遊走に対する抗GPC3抗体の潜在的な阻害効果並びに診断上及び治療上の目的でのそれらの用途について検討する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離抗体又はその抗原結合部分がGPC3に結合するような、配列番号1、2、3若しくは4のアミノ酸残基を含む重鎖相補性決定領域1(H-CDR1)、又は配列番号1〜4のいずれかに対して少なくとも80%同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体;配列番号5、6、7、8若しくは9のアミノ酸残基を含む重鎖CDR2(H-CDR2)、又は配列番号5〜9のいずれかに対して少なくとも80%同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体;及び配列番号10、11、12、13若しくは14のアミノ酸残基を含む重鎖CDR3(H-CDR3)、又は配列番号10〜14のいずれかに対して少なくとも80%同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体のうちの少なくとも1つ、並びに
配列番号15、16若しくは17のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR1(L-CDR1)、又は配列番号15〜17のいずれかに対して少なくとも80%同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体;配列番号18、19、20、21若しくは22のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR2(L-CDR2)、又は配列番号18〜22のいずれかに対して少なくとも80%同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体;及び配列番号23、24、25、26若しくは27のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR3(L-CDR3)、又は配列番号23〜27のいずれかに対して少なくとも80%同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体のうちの少なくとも1つ
を含む単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２】
配列同一性が、少なくとも95%である、請求項1に記載の抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３】
モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項1に記載の単離抗体。
【請求項４】
配列番号1、2、3若しくは4のアミノ酸残基から成る重鎖相補性決定領域1(H-CDR1);配列番号5、6、7、8若しくは9のアミノ酸残基から成る重鎖CDR2(H-CDR2);及び配列番号10、11、12、13若しくは14のアミノ酸残基から成る重鎖CDR3(H-CDR3);並びに配列番号15、16若しくは17のアミノ酸残基から成る軽鎖CDR1(L-CDR1);配列番号18、19、20、21若しくは22のアミノ酸残基から成る軽鎖CDR2(L-CDR2);及び配列番号23、24、25、26若しくは27のアミノ酸残基から成る軽鎖CDR3(L-CDR3)を含む、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項５】
配列番号1のアミノ酸残基を含む重鎖相補性決定領域1(H-CDR1)、配列番号5のアミノ酸残基を含む重鎖CDR2(H-CDR2)及び配列番号10のアミノ酸残基を含む重鎖CDR3(H-CDR3);並びに配列番号15のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR1(L-CDR1)、配列番号18のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR2(L-CDR2)及び配列番号23のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR3(L-CDR3)を含む、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項６】
配列番号2のアミノ酸残基を含む重鎖相補性決定領域1(H-CDR1)、配列番号6のアミノ酸残基を含む重鎖CDR2(H-CDR2)及び配列番号11のアミノ酸残基を含む重鎖CDR3(H-CDR3);並びに配列番号15のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR1(L-CDR1)、配列番号19のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR2(L-CDR2)及び配列番号24のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR3(L-CDR3)を含む、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項７】
配列番号3のアミノ酸残基を含む重鎖相補性決定領域1(H-CDR1)、配列番号7のアミノ酸残基を含む重鎖CDR2(H-CDR2)及び配列番号12のアミノ酸残基を含む重鎖CDR3(H-CDR3);並びに配列番号16のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR1(L-CDR1)、配列番号20のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR2(L-CDR2)及び配列番号25のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR3(L-CDR3)を含む、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項８】
配列番号4のアミノ酸残基を含む重鎖相補性決定領域1(H-CDR1)、配列番号8のアミノ酸残基を含む重鎖CDR2(H-CDR2)及び配列番号13のアミノ酸残基を含む重鎖CDR3(H-CDR3);並びに配列番号15のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR1(L-CDR1)、配列番号21のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR2(L-CDR2)及び配列番号26のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR3(L-CDR3)を含む、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項９】
配列番号3のアミノ酸残基を含む重鎖相補性決定領域1(H-CDR1)、配列番号9のアミノ酸残基を含む重鎖CDR2(H-CDR2)及び配列番号14のアミノ酸残基を含む重鎖CDR3(H-CDR3);並びに配列番号17のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR1(L-CDR1)、配列番号22のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR2(L-CDR2)及び配列番号27のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR3(L-CDR3)を含む、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１０】
モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１１】
配列番号28〜35に記載されるようなものから成る群から選択される配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１２】
配列番号28に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含み、H-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3が、それぞれ、配列番号2〜4のいずれか、配列番号6〜9のいずれか及び配列番号11〜14のいずれかで置き換えられている、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１３】
配列番号29に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含み、H-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3が、それぞれ、配列番号1、3及び4のいずれか、配列番号5及び7〜9のいずれか並びに配列番号10及び12〜14のいずれかで置き換えられている、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１４】
配列番号30に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含み、H-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3が、それぞれ、配列番号1、2及び4のいずれか、配列番号5、6、8及び9のいずれか並びに配列番号10、11、13及び14のいずれかで置き換えられている、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１５】
配列番号31に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含み、H-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3が、それぞれ、配列番号1、2及び4のいずれか、配列番号5、6、8及び9のいずれか並びに配列番号10、11、13及び14のいずれかで置き換えられている、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１６】
配列番号32に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含み、H-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3が、それぞれ、配列番号1〜3のいずれか、配列番号5〜7及び9のいずれか並びに配列番号10〜12及び14のいずれかで置き換えられている、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１７】
配列番号33に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含み、H-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3が、それぞれ、配列番号1、2及び4のいずれか、配列番号5〜8のいずれか及び配列番号10〜13のいずれかで置き換えられている、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１８】
配列番号34に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含み、H-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3が、それぞれ、配列番号2〜4のいずれか、配列番号6〜9のいずれか及び配列番号11〜14のいずれかで置き換えられている、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１９】
配列番号35に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含み、H-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3が、それぞれ、配列番号1、2及び4のいずれか、配列番号5、6、8及び9のいずれか及び配列番号10、11、13及び14のいずれかで置き換えられている、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２０】
配列番号36〜43に記載されるようなものから成る群から選択される配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２１】
配列番号36に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、L-CDR1、L-CDR2及びL-CDR3が、それぞれ、配列番号16及び17のいずれか、配列番号19〜22のいずれか及び配列番号24〜27のいずれかで置き換えられている、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２２】
配列番号37に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、L-CDR1、L-CDR2及びL-CDR3が、それぞれ、配列番号16及び17のいずれか、配列番号18及び20〜22のいずれか並びに配列番号23及び25〜27のいずれかで置き換えられている、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２３】
配列番号38に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、L-CDR1、L-CDR2及びL-CDR3が、それぞれ、配列番号15及び17のいずれか、配列番号18、19、21及び22のいずれか並びに配列番号23、24、26及び27のいずれかで置き換えられている、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２４】
配列番号39に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、L-CDR1、L-CDR2及びL-CDR3が、それぞれ、配列番号15又は17のいずれか、配列番号18、19、21及び22のいずれか並びに配列番号23、24、26及び27のいずれかで置き換えられている、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２５】
配列番号40に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、L-CDR1、L-CDR2及びL-CDR3が、それぞれ、配列番号16及び17のいずれか、配列番号18、19、20及び22のいずれか及び配列番号23〜25及び27のいずれかで置き換えられている、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２６】
配列番号41に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、L-CDR1、L-CDR2及びL-CDR3が、それぞれ、配列番号15及び16のいずれか、配列番号18〜21のいずれか及び配列番号23〜26のいずれかで置き換えられている、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２７】
配列番号42に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、L-CDR1、L-CDR2及びL-CDR3が、それぞれ、配列番号16及び17のいずれか、配列番号17及び19〜22のいずれか並びに配列番号24〜27のいずれかで置き換えられている、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２８】
配列番号43に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、L-CDR1、L-CDR2及びL-CDR3が、それぞれ、配列番号15及び17のいずれか、配列番号18、19、21及び22のいずれか並びに配列番号23、24、26及び27のいずれかで置き換えられている、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２９】
(i)配列番号28〜35から成る群から選択される配列で記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖又は配列番号28〜35のいずれかに対して少なくとも80%同一性を有する変異体;及び(ii)配列番号36〜43から成る群から選択される配列で記載されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖又は配列番号36〜43のいずれかに対して少なくとも80%同一性を有する変異体を含む、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３０】
配列同一性が、少なくとも95%である、請求項1に記載の単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３１】
配列番号28で記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖(G5S1(555S1))及び配列番号36で記載されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖(G5S1(555S1))、配列番号29で記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖(G5S8(555S8))及び配列番号37で記載されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖(G5S8(555S8))、配列番号30で記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖(GES1(GPC3 S1))及び配列番号38で記載されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖(G5S8(555S8))、配列番号31で記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖(GES2(GPC3 S2))及び配列番号39で記載されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖(G5S8(555S8))、配列番号32で記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖(GES6(GPC3 S6))及び配列番号40で記載されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖(G5S8(555S8))、又は配列番号33で記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖(GES8(GPC3 S8))及び配列番号41で記載されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖(G5S8(555S8))を含む、単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３２】
ヒト化scFv抗体である、請求項1に記載の単離抗体。
【請求項３３】
ヒト化scFv抗体が、配列番号34で記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号42で記載されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項32に記載の単離抗体(G5S1ヒト化scFv抗体)。
【請求項３４】
ヒト化scFv抗体が、配列番号35で記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号43で記載されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項32に記載の単離抗体(GES1ヒト化scFv抗体)。
【請求項３５】
請求項1から34のいずれか一項に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項３６】
更なる抗腫瘍薬を含む、請求項35に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
対象においてがんを治療する方法であって、請求項1から34のいずれか一項に記載の抗GPC3抗体を対象に投与する工程を含む方法。
【請求項３８】
がんが、肝臓、皮膚、頭頸部、肺、胸部、前立腺、卵巣、子宮内膜、子宮頸部、結腸、直腸、膀胱、脳、胃、膵臓又はリンパ系のがんである、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
がんが、肝細胞癌(HCC)、肝芽腫及び肉腫様HCC等の肝臓がんである、請求項37に記載の方法。
【請求項４０】
放射線療法、手術及び化学療法と併用される、請求項37に記載の方法。
【請求項４１】
対象においてがんを診断する方法であって、生物学的試料中のGPC3と請求項1から34のいずれか一項に記載の抗GPC3抗体の結合を検出する工程を含み、結合が、対象の、がんを発症する可能性を示す方法。
【請求項４２】
がんが、卵巣がん、乳がん、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん(小細胞癌(燕麦細胞がん)、混合小細胞/大細胞癌、及び混合型小細胞癌を含む)、結腸がん、前立腺がん、膵臓がん、脳がん、腎臓がん、胃のがん、黒色腫、骨がん、胃がん、神経膠腫、神経膠芽腫(gliobastoma)、肝細胞癌、乳頭状腎細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、白血病、リンパ腫又は骨髄腫である、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
対象において肝硬変又は肝臓がんを診断する方法であって、生物学的試料中のGPC3と請求項1から34のいずれか一項に記載の抗GPC3抗体の結合を検出する工程を含み、結合が、対象の、肝硬変又は肝臓がんを発症する可能性を示す方法。
【請求項４４】
生物学的試料が、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸水、血清、リンパ液、唾液、尿、組織、腹水、又は腹腔内洗浄液である、請求項37、41又は43のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
請求項37、41又は43のいずれか一項に記載の方法で規定されるようながん、肝硬変又は肝臓がんを診断するための、請求項1から34のいずれか一項に記載の抗GPC3抗体を含む診断剤又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん診断及び治療のための抗体に関する。特に、本発明は、グリピカン-3(GPC3)に対する抗体及びがんの治療における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリピカン-3(GPC3)は、HCC及び黒色腫を含む幾つか他のヒトのがんにおいて高度に発現される細胞表面タンパク質である。GPC3遺伝子は、580個のアミノ酸を有する70kDaの前駆体コアタンパク質をコードし、それは、フューリンによって切断されて、40kDaのアミノ(N)末端タンパク質及び30kDaの膜結合型カルボキシル(C)末端タンパク質を生成することができ、それは、2つのヘパラン硫酸(HS)グリカン鎖を有する。6つのグリピカン(GPC1〜6)が、哺乳動物において同定されている。グリピカンは全て、特徴的な構造を共有する。これらの共通の特色により、グリピカンが、類似した三次元(3D)構造を共有し得ることが示唆される。
【０００３】
GPC3とFGF-2との間の相互作用もまた、HCC細胞において見出されている(Midorikawa等、(2003)、International journal of cancer Journal international du cancer 103、455〜465頁)。GPIアンカードメインを欠如する突然変異GPC3は、Wntシグナル伝達を阻止し、Wnt依存性腫瘍の成長を阻害することができると仮定されてきた。しかしながら、HCC成長の阻害が、HS鎖によって調節されるヘパリン結合増殖因子等の他の因子の活性に起因し得ることを除外することはできない。肝細胞癌(HCC)及び胆管細胞癌(CCA)は、原発肝臓がんの2つの主な形態である。GPC3が、HCCに関する新たな腫瘍マーカーであることを支持する証拠が増えている。GPC3は、HCC細胞株、HepG2、Hep3B、HT17、HuH6、HuH7及びPLC/PRFで高度に発現される(Song, H.H.等、(2005)、The Journal of biological chemistry 280、2116〜2125頁)。更に、GPC3は、HCCにおいて高度に発現される(Hsu, H.C.、Cheng, W.及びLai, P.L.、(1997)、Cancer research 57、5179〜5184頁)が、CCA又は正常な肝臓組織では発現されない。GPC3はまた、程度は低くなるが黒色腫(Nakatsura, T.等、(2004a)、Clinical cancer research :an official journal of the American Association for Cancer Research 10、6612〜6621頁)、卵巣腎明細胞癌(Stadlmann, S.、Gueth等、(2007)、Clinical cancer research :an official journal of the International Society of Gynecological Pathologists 26、341〜344頁)、卵黄嚢腫(Zynger, D.L等、(2006)、The American journal of surgical pathology 30、1570〜1575頁)、神経芽細胞腫、肝芽腫、ウィルムス腫瘍細胞及び他の腫瘍(Baumhoer, D.、Tornillo等、(2008)、American journal of clinical pathology 129、899〜906頁; Saikali, Z.及びSinnett, D.、(2000)、International journal of cancer Journal international du cancer 89、418〜422頁)においても発現される。他方で、GPC3は、乳がん、中皮腫、卵巣上皮がん及び肺腺癌では発現停止される。GPC3タンパク質発現は、ヒトGPC3に対して産生したウサギポリクローナル抗体(残基303〜464)を使用する場合、70%を超えるHCC腫瘍において見出されるが、正常な肝臓組織では見出されない(Nakatsura, T.等、(2003)、Biochemical and biophysical research communications 306、16〜25頁)。GPC3陽性HCC患者が、GPC3陰性HCC患者よりも著しく低い5年生存率を有するという見解に起因して、GPC3発現は、HCCにおける乏しい予後と相関する(Shirakawa, H等、(2009)、Cancer science 100、1403〜1407頁)。それは、HCCにおいて高い発現を示すため、GPC3は、腫瘍特異的な療法に関する有望な標的としての可能性を有する。また、少量のGPC3は、GPC陽性がんを伴う数人の患者の血液中で検出され得る(Capurro, M.等、(2003)、Gastroenterology 125、89〜97頁; Hippo, Y.等、(2004)、Cancer research 64、2418〜2423頁)ので、血液中のGPC3の測定は、これらの患者の経過を追跡するための有用な診断であり得る。
【０００４】
HCC、黒色腫及び卵巣の腎明細胞癌におけるGPC3の高い発現を前提として、抗体ベース及び細胞ベースの免疫療法に関する潜在的な候補としてのGPC3の有用性が評価されてきた。2003年に、GPC3及びFGF-2の相互作用を研究するために、17個の酸基(355〜371)から成るGPC3ペプチドに対するmAbが報告された(Midorikawa, Y.等、(2003)、International journal of cancer Journal international du cancer 103、455〜465頁)。次に、GPC3タンパク質のC末端の最後の70個のアミノ酸に特異的なmAb(IgG1、κ)(Capurro, M.等、(2003)、Gastroenterology 125、89〜97頁)及びGPC3の残基25〜358に特異的な2つのmAbを生成して、HCC患者において血清GPC3を検出するのに使用した(Hippo, Y.、Watanabe等、(2004)、Cancer research 64、2418〜2423頁)。両方の研究室が、2つの異なる末端基を有するmAbを使用したが、研究室は、HCC患者において類似した比率のGPC3陽性血清を見出した。更に、Yamauchi等は、免疫原としてGPIアンカーを欠如するGPC3タンパク質を使用して、それぞれ、GPC3のN末端に関する、及びC末端に関する2つのmAbを得た。これらのmAbは、がんの免疫組織化学分析に使用した(Yamauchi, N.等、(2005)、Modern pathology :an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc 18、1591〜1598頁)。
【０００５】
GPC3の残基524〜563を認識する第1の治療用mAbについて、最近記載されている(Ishiguro, T.等、(2008)、Cancer research 68、9832〜9838頁; Nakano, K.等、(2009)、Biochemical and biophysical research communications 378、279〜284頁)。GC33と称されるmAbは、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を誘発し、マウスにおいて皮下移植したHepG2及びHuH-7異所性異種移植片の腫瘍成長阻害を示した。GC33はまた、同所性モデルにおいてHepG2細胞を腹腔内移植したマウスの血中α-フェトプロテインレベルを低減させた。ヒト化GC33(hGC33)は、HepG2異種移植片に対して、GC33と同程度有効である(Nakano, K.、Ishiguro等、(2010)、Anti-cancer drugs 21、907〜916頁)。GC33のADCC抗腫瘍活性は、主にナチュラルキラー細胞に起因する(Ishiguro, T.、Sugimoto等、(2008)、Cancer research 68、9832〜9838頁)。他方で、Takai等は、GPC3の膜発現と腫瘍関連マクロファージ(TAM)の動員との間での関連性について研究した(Takai, H.等、(2009a)、Cancer biology & therapy 8、2329〜2338頁; Takai, H.等、(2009b)、Liver international : official journal of the International Association for the Study of the Liver 29、1056〜1064頁)。彼等は、GC33を使用した抗GPC3免疫療法モデルにおける浸潤したTAMの関与を観察し、マクロファージが、GPC3機能の調節等の非ADCCメカニズムによって、GC33の抗腫瘍活性において重要な役割を果たし得ることを示した(Takai, H等、(2009c). Cancer biology & therapy 8、930〜938頁)。更に、GC33は、GPC3陽性腫瘍細胞の増殖を直接的に阻害しない。GPC3を標的とする抗体療法を完全に評価するために、GPC3の種々の機能性ドメイン(HS鎖を含む)を標的とするmAbが有用である。Wnt及び/又は他のシグナル伝達経路を阻止することによって、がん細胞増殖及び/又は生存を直接的に阻害することが可能である抗GPC3 mAbの抗腫瘍活性を研究することは興味深い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Midorikawa等、(2003)、International journal of cancer Journal international du cancer 103、455〜465頁
【非特許文献２】Song, H.H.等、(2005)、The Journal of biological chemistry 280、2116〜2125頁
【非特許文献３】Hsu, H.C.、Cheng, W.及びLai, P.L.、(1997)、Cancer research 57、5179〜5184頁
【非特許文献４】Nakatsura, T.等、(2004a)、Clinical cancer research :an official journal of the American Association for Cancer Research 10、6612〜6621頁
【非特許文献５】Stadlmann, S.、Gueth等、(2007)、Clinical cancer research :an official journal of the International Society of Gynecological Pathologists 26、341〜344頁
【非特許文献６】Zynger, D.L等、(2006)、The American journal of surgical pathology 30、1570〜1575頁
【非特許文献７】Baumhoer, D.、Tornillo等、(2008)、American journal of clinical pathology 129、899〜906頁、
【非特許文献８】Saikali, Z.及びSinnett, D.、(2000)、International journal of cancer Journal international du cancer 89、418〜422頁
【非特許文献９】Nakatsura, T.等、(2003)、Biochemical and biophysical research communications 306、16〜25頁
【非特許文献１０】Shirakawa, H等、(2009)、Cancer science 100、1403〜1407頁
【非特許文献１１】Capurro, M.等、(2003)、Gastroenterology 125、89〜97頁
【非特許文献１２】Hippo, Y.、Watanabe等、(2004)、Cancer research 64、2418〜2423頁
【非特許文献１３】Yamauchi, N.等、(2005)、Modern pathology :an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc 18、1591〜1598頁
【非特許文献１４】Ishiguro, T.、Sugimoto等、(2008)、Cancer research 68、9832〜9838頁
【非特許文献１５】Nakano, K.等、(2009)、Biochemical and biophysical research communications 378、279〜284頁
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【非特許文献５０】http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、GPC3タンパク質中に存在する機能性ドメイン又は抗原エピトープが、診断用途及び/又は治療用途に関する潜在的な標的として機能を果たすことができるという見解に少なくとも基づいている。したがって、本発明の態様は、抗GPC3抗体を特性決定して、診断目的及び治療目的での腫瘍成長、増殖、遊走及びそれらの用途に対する抗GPC3抗体の潜在的な阻害効果を示す。特に、肝細胞癌(HCC)は依然として、世界的に多い悪性がんである。新規治療的アプローチの開発のための新たな分子標的を同定することが緊急に必要とされている。驚くべきことに、本発明は、GPC3が、それがHCCにおいて高い発現を示すことを前提として、肝臓がん療法に関する有望な候補であることを見出している。本明細書中で、膜結合型PGC3分子が、免疫療法に関する治療的標的であり、可溶性GPC3が、HCCに関する有用な血清バイオマーカーであり得ることが示される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様において、本発明は、単離抗体又はその抗原結合部分がGPC3に結合するような、配列番号1、2、3若しくは4のアミノ酸残基を含む重鎖相補性決定領域1(H-CDR1)、又は配列番号1〜4のいずれかに対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体;配列番号5、6、7、8若しくは9のアミノ酸残基を含む重鎖CDR2(H-CDR2)、又は配列番号5〜9のいずれかに対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体;及び配列番号10、11、12、13若しくは14のアミノ酸残基を含む重鎖CDR3(H-CDR3)、又は配列番号10〜14のいずれかに対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体のうちの少なくとも1つ、並びに配列番号15、16若しくは17のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR1(L-CDR1)、又は配列番号15〜17のいずれかに対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体;配列番号18、19、20、21若しくは22のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR2(L-CDR2)、又は配列番号18〜22のいずれかに対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体;及び配列番号23、24、25、26若しくは27のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR3(L-CDR3)、又は配列番号23〜27のいずれかに対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体のうちの少なくとも1つを含む単離抗GPC3抗体及び/又はその抗原結合部分を提供する。
【０００９】
幾つかの実施形態において、本発明は、配列番号28〜35に記載されるような配列から成る群から選択される配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖を提供する。
【００１０】
幾つかの実施形態において、本発明は、配列番号36〜43に記載されるようなものから成る群から選択される配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を提供する。
【００１１】
別の態様において、本開示はまた、GPC3に結合する抗体及び/又はその断片であって、重鎖CDRの少なくとも1つ及び/又は軽鎖CDRの少なくとも1つが、少なくとも1つのアミノ酸修飾を含む抗体及び/又はその断片を提供する。
【００１２】
一実施形態において、抗体は、ヒト化scFv抗体である。更なる実施形態において、ヒト化scFv抗体は、配列番号34で記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号42で記載されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖を含む(G5S1ヒト化scFv抗体)。別の更なる実施形態において、本発明は、配列番号35で記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号43で記載されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖を含むヒト化scFv抗体を含む(GES1ヒト化scFv抗体)。
【００１３】
別の態様において、本発明は、本発明の抗GPC3抗体及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、必要とする対象においてがんを治療する方法であって、抗GPC3抗体を含む有効量の本発明の薬学的に許容される組成物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。
【００１５】
更なる態様において、本発明は、がんの診断に関する方法であって、試料中で本発明の抗体の、GPC3タンパク質への結合を検出する工程を含む方法を提供する。
【００１６】
一実施形態において、本発明は、対象において肝硬変又は肝臓がんを診断する方法であって、生物学的試料中で本発明の抗体の、GPC3への結合を検出する工程を含み、結合が、対象の、肝硬変又は肝臓がんを発症する可能性が見られることを示す方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】GPC3_ECDタンパク質の分析結果を示す図である。
【図２】ELISAを使用した抗GPC3抗体の結合活性を示す図である。
【図３】SDS-PAGEにおける精製scFv抗体の分析を示す図である。
【図４】ニワトリのGPC3遺伝子の選択scFv配列の重鎖(A)及び軽鎖(B)(555 S1、S8及びGPC3 S1、S2、S6、S8)並びに本発明のヒト化scFv配列の重鎖及び軽鎖(G5S1ヒト化scFv配列及びGES1ヒト化scFv配列)を示す図である。
【図５】4つの肝細胞腫細胞株(レーン1〜4)及び4つの肉腫様肝細胞腫細胞株(レーン5〜8)の細胞溶解物の電気泳動分析を示す図である。A:還元条件下での市販のGPC3細胞外ドメインタンパク質(レーンC)。上部矢印は、C末端断片を示し、下部矢印は、N末端断片を示す; B:抗GPC3ポリIgYによって同定される2つの断片; C:G5S1 scFvによって同定される断片; D:GES1 scFvによって同定される断片。
【図６】ELISAに関する特異的な抗GPC3 scFv抗体の結合分析を示す図である。
【図７Ａ】肝細胞腫細胞に関する特異的な抗GPC3 scFv抗体の増殖阻害を示す図である。異なる日の特異的な抗GPC3 scFv抗体の増殖阻害。
【図７Ｂ】肝細胞腫細胞に関する特異的な抗GPC3 scFv抗体の増殖阻害を示す図である。異なる濃度での特異的な抗GPC3 scFv抗体の増殖阻害。
【図８】フローサイトメトリーを使用した特異的な抗GPC3 scFv抗体の結合分析を示す図である。
【図９Ａ】免疫蛍光染色を使用した特異的な抗GPC3 scFv抗体の結合分析を示す図である;Hep 3B細胞。
【図９Ｂ】免疫蛍光染色を使用した特異的な抗GPC3 scFv抗体の結合分析を示す図である;Hep G2細胞。
【図１０】免疫沈降分析を使用した特異的な抗GPC3 scFv抗体の結合分析を示す図である。
【図１１】コロニー形成アッセイに関する特異的な抗GPC3 scFv抗体の阻害を示す図である。
【図１２】細胞周期分析の結果を示す図である。細胞は、0.5μMのG5S1及びGES1 scFv抗体で処理した場合にG1期で停止した(A及びB)。subG1段階での細胞集団は、それぞれ、GES1及びG5S1処理HepG2細胞において28.8%及び16.6%にまで著しく増加し、それは、細胞アポトーシスの誘発に起因し得る(C)。
【図１３】細胞遊走に関する特異的な抗GPC3 scFv抗体の阻害を示す図である。
【図１４Ａ】ヒトHep3B異種殖片モデルに対するG5S1及びGES1の抗腫瘍効果を示す図である。
【図１４Ｂ】マウスの体重に対するG5S1及びGES1の抗腫瘍効果を示す図である。
【図１５Ａ】異種移植マウスにおける腫瘤性組織に関する免疫組織化学分析を示す図である。
【図１５Ｂ】異種移植マウスにおける腫瘤性組織に関する免疫組織化学分析を示す図である。
【図１６Ａ】1mg/Kg及び5mg/KgのGES1 IgGが、それぞれ、腫瘍成長を32.4%及び51.2%にまで阻害することができる一方で、ソラフェニブのみが、48.8%阻害を有することを示す図である。
【図１６Ｂ】マウスの体重の著しい変化は見られないことを示す図である。
【図１７】10mg/KgのGES1 IgGが、腫瘍成長を著しく阻害することができる(P<0.01)こと(A)、抗体処理後のp-AKT及びp-Erkの発現レベルが減少したこと(B、B2-2、B2-3及びB2-5)、GES1 IgGによって処理した腫瘍組織におけるKi-67タンパク質の発現レベルが、市販の抗体によって処理したものと比較して著しく減少したこと(C及びD)を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
続く説明において、多数の用語が使用され、特許請求される主題の理解を容易にするために下記の定義を提供する。本明細書中で明確に定義されない用語は、それらの明白な且つ通常の意味に従って使用される。
【００１９】
定義
別記されない限り、単数形(a or an)は、「1つ又は複数」を意味する。
【００２０】
本明細書中で使用する場合、「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原上の部位を指す。
【００２１】
本明細書中で使用する場合、「抗体」という用語は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ及びヒト化抗体の種類に属する単鎖、2本鎖及び複数鎖のタンパク質並びにポリペプチドを指す。それはまた、これらの抗体の合成変異体及び遺伝子操作した変異体を含む。「抗体断片」は、Fab、Fab'、F(ab')2及びFv断片、並びに所望の標的エピトープ(単数又は複数)に対して特異性を有する抗体の任意の部分を含む。
【００２２】
本明細書中で使用する場合、「ポリクローナル抗体」という用語は、1つ又は複数の他の非同一抗体の間で、又はそれらの存在下で産生される抗体を指す。概して、ポリクローナル抗体は、非同一抗体を産生する幾つか他のBリンパ球の存在下で産生される。通常、ポリクローナル抗体は、免疫化動物から直接得られる。
【００２３】
本明細書中で使用する場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す。換言すると、モノクローナル抗体は、単一の細胞クローン(例えば、ハイブリドーマ、均質な抗体をコードするDNA分子をトランスフェクトした真核生物宿主細胞又は均質な抗体をコードするDNA分子をトランスフェクトした原核生物宿主細胞)の成長から生じる均質な抗体から成る。これらの抗体は、単一のエピトープに対して誘導され、したがって高度に特異的である。
【００２４】
本明細書中で使用する場合、「可変ドメイン」は、抗原結合を媒介して、特定の抗原に関する特定の抗体の特異性を規定するドメインを指す。抗原結合部位は、特異性を規定する2つの可変ドメインから成る:一方は、重鎖(VH)に位置し、他方は、軽鎖(VL)に位置する。場合によっては、特異性は、ラクダ科の動物で見出される重鎖抗体由来の単一ドメイン抗体で見られるように、2つのドメインの専ら1つのみに存在し得る。自然重及び軽鎖の可変ドメインは主に、3つの高頻度可変領域によって結合されるベータシート立体配置をとる4つのFRを含み、それらはループを形成する。各鎖中の高頻度可変領域は、FRによって極めて接近して一緒に保持され、他の鎖由来の高頻度可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(上述のKabat E A等を参照)。「高頻度可変領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。高頻度可変領域は概して、「相補性決定領域」又は「CDR」由来のアミノ酸残基を含み、後者が、最も高い配列可変性を有し、及び/又は抗原認識に関与する。全ての可変ドメインに関して、番号付けはKabatに従う(上述のKabat E A等)。
【００２５】
使用時の多数のCDR定義が、本明細書中に包含される。Kabat定義は、配列可変性に基づく(上述のKabat E A等)。Chothiaは、代わって構造ループの位置を指す(Chothia C & Lesk A M (1987) J. Mol. Biol. 196: 901〜917頁)。AbM定義は、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェアによって使用される(Martin A C R等、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 9268〜72頁、Oxford University Press、Oxford、141〜172)。contact定義は最近導入され(MacCallum R M等、(1996) J. Mol. Biol. 262: 732〜745頁)、Protein Databankで利用可能な入手可能な複雑な構造の分析に基づく。国際ImMunoGeneTics情報システム.RTM (IMGT(登録商標))(http://www.imgt.org)によるCDRの定義は、全ての免疫グロブリン及び全ての種のT細胞受容体V-R領域に関するIMGT番号付けに基づく(IMGT(登録商標)、国際ImMunoGeneTics情報システム; Lefranc M P等、(2005) Dev. Comp. Immunol. 29(3): 185〜203頁; Kaas Q等、(2007) Briefings in Functional Genomics & Proteomics、6(4): 253〜64頁)。
【００２６】
本明細書中で使用する場合、本発明で論述される相補性決定領域(CDR)は全て、好ましくはIMGT(登録商標)に従って定義される。これらのCDRに関する可変ドメイン残基は、IMGT(登録商標)に従って番号付けられる(Lefranc M P.、(1999) The Immunologist.7: 132〜136頁; Lefranc M P等、(2003) Dev. Comp. Immunol.27(1): 55〜77頁)。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、「ヒト化抗体」は、ある種由来の抗体、例えばネズミ又はニワトリ抗体由来のCDRが、種由来の抗体の重及び軽可変ドメイン鎖から、ヒト重及び軽可変ドメイン(フレームワーク領域)へ移行される組換えタンパク質を指す。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体のものに由来する。場合によっては、ヒト化抗体のフレームワーク領域の特異的な残基、特にCDR配列に及ぶか、又はそれに近いものは、修飾されてもよく、例えば、元のネズミ、げっ歯類、類人霊長類由来の相当する残基、又は他の抗体で置き換えられてもよい。ヒト化抗体は、(i)重要なフレームワーク残基を保持して、又は保持せずに、非ヒトCDRのみを、ヒトフレームワーク及び定常領域へグラフトすること、又は(ii)非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによって、それらをヒト様セクションで「覆いをすること」を含む様々な方法によって達成され得る。本発明を実施する際に有用であるかかる方法は、Padlan、Mol. Immunol.、31(3): 169〜217頁(1994)に開示されるものを含む。
【００２８】
本明細書中で使用する場合、「キメラ抗体」は、ある種に由来する抗体、好ましくは齧歯類抗体又はニワトリ抗体、より好ましくはネズミ抗体の相補性決定領域(CDR)を含む、重及び軽抗体鎖の両方の可変ドメインを含有する組換えタンパク質を指すのに対して、抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体のものに由来する。
【００２９】
本明細書中で使用する場合、「Fv」という用語は、完全な抗原結合部位を含有する最小抗体断片である。一実施形態において、2鎖Fv種は、緊密に非共有結合的に結合している1つの重鎖可変ドメイン及び1つの軽鎖可変ドメインの二量体から成る。単鎖Fv(scFv)種において、1つの重鎖可変ドメイン及び1つの軽鎖可変ドメインは、軽及び重鎖が、2鎖Fv種におけるものに類似した「二量体」構造で結合することができるように、可撓性ペプチドリンカーによって共有結合され得る。この立体配置では、各可変ドメインの3つのHVRが相互作用して、VH-VL二量体の表面上で、抗原結合部位を規定する。6つのHVRは、抗体へ抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的な3つのHVRのみを含むFvの半分)でさえ、抗原を認識及び結合する能力を有するが、結合部位全体よりも親和性が低い。
【００３０】
本明細書中で使用する場合、「診断」又は「診断される」という用語は、病理学的状態の存在又は性質を同定することを意味する。
【００３１】
本明細書中で使用する場合、「治療」、「治療すること」等の用語は、哺乳動物における、特にヒトにおける疾患の任意の治療を網羅し、(a)疾患にかかりやすい可能性があるが、それを有するとはまた診断されていない対象において疾患が起きることを防止すること、(b)疾患を阻害すること、即ちその発達を停止させること、及び(c)疾患を軽減させること、即ち疾患の退行を引き起こすことを含む。
【００３２】
本明細書中で交換可能に使用される場合、「個体」、「対象」、「宿主」及び「患者」という用語は、ネズミ(ラット、マウス)、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物(例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ)等を含むが、これらに限定されない哺乳動物を指す。
【００３３】
本明細書中で使用する場合、「治療上有効量」又は「効果的な量」という用語は、疾患を治療するために哺乳動物又は他の対象に投与すると、疾患のかかる治療をもたらすのに十分である主題の抗GPC-3抗体の量を指す。
【００３４】
本明細書中で使用する場合、「生物学的試料」という用語は、個体、対象又は患者から得られる様々な試料型を包含し、診断又はモニタリングアッセイで使用することができる。その定義は、生物学的起源の血液及び他の液体試料、生検標本又はそれらに由来する組織培養物若しくは細胞及びそれらの子孫等の固体組織試料を包含する。
【００３５】
抗GPC-3抗体
本発明は、グリピカン-3(GPC3)に結合するGPC3に対する抗体及びそれらの断片に関する。「GPC3に結合する抗体又はそれらの断片」という用語は、本明細書中で使用する場合、GPC3に結合する抗体又はそれらの断片を含む。抗GPC3抗体は、化学療法剤に対するHCCの感受性を増大させ得る(Ishiguro T等、(2010). Proceedings of the 101st Annual Meeting of the AACR)。併用レジメンは、抗肝臓がん療法として臨床的に有用であり得る。
【００３６】
一態様において、本発明は、単離抗体又はその抗原結合部分がGPC3に結合するような、配列番号1、2、3若しくは4のアミノ酸残基を含む重鎖相補性決定領域1(H-CDR1)、又は配列番号1〜4のいずれかに対して少なくとも80%同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体;配列番号5、6、7、8若しくは9のアミノ酸残基を含む重鎖CDR2(H-CDR2)、又は配列番号5〜9のいずれかに対して少なくとも80%同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体;及び配列番号10、11、12、13若しくは14のアミノ酸残基を含む重鎖CDR3(H-CDR3)、又は配列番号10〜14のいずれかに対して少なくとも80%同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体のうちの少なくとも1つ、並びに配列番号15、16若しくは17のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR1(L-CDR1)、又は配列番号15〜17のいずれかに対して少なくとも80%同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体;配列番号18、19、20、21若しくは22のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR2(L-CDR2)、又は配列番号18〜22のいずれかに対して少なくとも80%同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体;及び配列番号23、24、25、26若しくは27のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR3(L-CDR3)、又は配列番号23〜27のいずれかに対して少なくとも80%同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体のうちの少なくとも1つを含む単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分を提供する。好ましくは、上述するような配列同一性は、少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%である。
【００３７】
一態様において、本発明は、配列番号1のアミノ酸残基を含む重鎖相補性決定領域1(H-CDR1)、配列番号5のアミノ酸残基を含む重鎖CDR2(H-CDR2)及び配列番号10のアミノ酸残基を含む重鎖CDR3(H-CDR3);並びに配列番号15のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR1(L-CDR1)、配列番号18のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR2(L-CDR2)及び配列番号23のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR3(L-CDR3)を含む単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【００３８】
一態様において、本発明は、配列番号2のアミノ酸残基を含む重鎖相補性決定領域1(H-CDR1)、配列番号6のアミノ酸残基を含む重鎖CDR2(H-CDR2)及び配列番号11のアミノ酸残基を含む重鎖CDR3(H-CDR3);並びに配列番号15のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR1(L-CDR1)、配列番号19のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR2(L-CDR2)及び配列番号24のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR3(L-CDR3)を含む単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【００３９】
一態様において、本発明は、配列番号3のアミノ酸残基を含む重鎖相補性決定領域1(H-CDR1)、配列番号7のアミノ酸残基を含む重鎖CDR2(H-CDR2)及び配列番号12のアミノ酸残基を含む重鎖CDR3(H-CDR3);並びに配列番号16のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR1(L-CDR1)、配列番号20のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR2(L-CDR2)及び配列番号25のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR3(L-CDR3)を含む単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【００４０】
一態様において、本発明は、配列番号4のアミノ酸残基を含む重鎖相補性決定領域1(H-CDR1)、配列番号8のアミノ酸残基を含む重鎖CDR2(H-CDR2)及び配列番号13のアミノ酸残基を含む重鎖CDR3(H-CDR3);並びに配列番号15のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR1(L-CDR1)、配列番号21のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR2(L-CDR2)及び配列番号26のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR3(L-CDR3)を含む単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【００４１】
一態様において、本発明は、配列番号3のアミノ酸残基を含む重鎖相補性決定領域1(H-CDR1)、配列番号9のアミノ酸残基を含む重鎖CDR2(H-CDR2)及び配列番号14のアミノ酸残基を含む重鎖CDR3(H-CDR3);並びに配列番号17のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR1(L-CDR1)、配列番号22のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR2(L-CDR2)及び配列番号27のアミノ酸残基を含む軽鎖CDR3(L-CDR3)を含む単離抗GPC3抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【００４２】
重鎖及び軽鎖における相補性決定領域のアミノ酸配列を、それぞれ以下に列挙する。
【００４３】
【表１】
2018518474.tif 000002
【００４４】
【表２】
2018518474.tif 000003
【００４５】
本発明に従って、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸の実施形態を、以下に列挙する。
【００４６】
【表３】
2018518474.tif 000004
【００４７】
【表４】
2018518474.tif 000005
【００４８】
幾つかの実施形態において、本発明は、配列番号28〜35に記載されるようなものから成る群から選択される配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖を提供する。
【００４９】
幾つかの実施形態において、重鎖は、配列番号28に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含み、ここで、H-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3は、それぞれ、配列番号2〜4のいずれか、配列番号6〜9のいずれか及び配列番号11〜14のいずれかで置き換えられている。
【００５０】
幾つかの実施形態において、重鎖は、配列番号29に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含み、ここで、H-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3が、それぞれ、配列番号1、3及び4のいずれか、配列番号5及び7〜9のいずれか及び配列番号10、12〜14のいずれかで置き換えられている。
【００５１】
幾つかの実施形態において、重鎖は、配列番号30に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含み、ここで、H-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3が、それぞれ、配列番号1、2及び4のいずれか、配列番号5、6、8及び9のいずれか及び配列番号10、11、13及び14のいずれかで置き換えられている。
【００５２】
幾つかの実施形態において、重鎖は、配列番号31に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含み、ここで、H-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3が、それぞれ、配列番号1、2及び4のいずれか、配列番号5、6、8及び9のいずれか及び配列番号10、11、13及び14のいずれかで置き換えられている。
【００５３】
幾つかの実施形態において、重鎖は、配列番号32に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含み、ここで、H-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3が、それぞれ、配列番号1〜3のいずれか、配列番号5〜7及び9のいずれか及び配列番号10〜12及び14のいずれかで置き換えられている。
【００５４】
幾つかの実施形態において、重鎖は、配列番号33に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含み、ここで、H-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3が、それぞれ、配列番号1、2及び4のいずれか、配列番号5〜8のいずれか及び配列番号10〜13のいずれかで置き換えられている。
【００５５】
幾つかの実施形態において、重鎖は、配列番号34に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含み、ここで、H-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3が、それぞれ、配列番号2〜4のいずれか、配列番号6〜9のいずれか及び配列番号11〜14のいずれかで置き換えられている。
【００５６】
幾つかの実施形態において、重鎖は、配列番号35に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含み、ここで、H-CDR1、H-CDR2及びH-CDR3が、それぞれ、配列番号1、2及び4のいずれか、配列番号5、6、8及び9のいずれか及び配列番号10、11、13及び14のいずれかで置き換えられている。
【００５７】
幾つかの実施形態において、本発明は、配列番号36〜43に記載されるようなものから成る群から選択される配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を提供する。
【００５８】
幾つかの実施形態において、軽鎖は、配列番号36に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含み、ここで、L-CDR1、L-CDR2及びL-CDR3が、それぞれ、配列番号16及び17のいずれか、配列番号19〜22のいずれか及び配列番号24〜27のいずれかで置き換えられている。
【００５９】
幾つかの実施形態において、軽鎖は、配列番号37に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含み、ここで、L-CDR1、L-CDR2及びL-CDR3が、それぞれ、配列番号16及び17のいずれか、配列番号18及び20〜22のいずれか及び配列番号23及び25〜27のいずれかで置き換えられている。
【００６０】
幾つかの実施形態において、軽鎖は、配列番号38に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含み、ここで、L-CDR1、L-CDR2及びL-CDR3が、それぞれ、配列番号15及び17のいずれか、配列番号18、19、21及び22のいずれか及び配列番号23、24、26及び27のいずれかで置き換えられている。
【００６１】
幾つかの実施形態において、軽鎖は、配列番号39に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含み、ここで、L-CDR1、L-CDR2及びL-CDR3が、それぞれ、配列番号15又は17のいずれか、配列番号18、19、21及び22のいずれか及び配列番号23、24、26及び27のいずれかで置き換えられている。
【００６２】
幾つかの実施形態において、軽鎖は、配列番号40に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含み、ここで、L-CDR1、L-CDR2及びL-CDR3が、それぞれ、配列番号16及び17のいずれか、配列番号18、19、20及び22のいずれか及び配列番号23〜25及び27のいずれかで置き換えられている。
【００６３】
幾つかの実施形態において、軽鎖は、配列番号41に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含み、ここで、L-CDR1、L-CDR2及びL-CDR3が、それぞれ、配列番号15及び16のいずれか、配列番号18〜21のいずれか及び配列番号23〜26のいずれかで置き換えられている。
【００６４】
幾つかの実施形態において、軽鎖は、配列番号42に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含み、ここで、L-CDR1、L-CDR2及びL-CDR3が、それぞれ、配列番号16及び17のいずれか、配列番号17及び19〜22のいずれか及び配列番号24〜27のいずれかで置き換えられている。
【００６５】
幾つかの実施形態において、軽鎖は、配列番号43に記載されるような配列を有するアミノ酸配列を含み、ここで、L-CDR1、L-CDR2及びL-CDR3が、それぞれ、配列番号15及び17のいずれか、配列番号18、19、21及び22のいずれか及び配列番号23、24、26及び27のいずれかで置き換えられている。
【００６６】
更なる実施形態において、本発明は、(i)配列番号28〜35から成る群から選択される配列で記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖又は配列番号28〜35のいずれかに対して少なくとも80%同一性を有する変異体;及び(ii)配列番号36〜43から成る群から選択される配列で記載されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖又は配列番号36〜43のいずれかに対して少なくとも80%同一性を有する変異体を含む単離抗体を含む。好ましくは、上述するような配列同一性は、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%である。
【００６７】
更なる実施形態において、本発明は、配列番号28で記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖(G5S1(555S1))及び配列番号36で記載されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖(G5S1(555S1))を含む単離抗体を含む。更なる実施形態において、本発明は、配列番号29で記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖(G5S8(555S8))及び配列番号37で記載されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖(G5S8(555S8))を含む単離抗体を含む。更なる実施形態において、本発明は、配列番号30で記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖(GES1(GPC3 S1))及び配列番号38で記載されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖(G5S8(555S8))を含む単離抗体を含む。更なる実施形態において、本発明は、配列番号31で記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖(GES2(GPC3 S2))及び配列番号39で記載されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖(G5S8(555S8))を含む単離抗体を含む。更なる実施形態において、本発明は、配列番号32で記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖(GES6(GPC3 S6))及び配列番号40で記載されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖(G5S8(555S8))を含む単離抗体を含む。更なる実施形態において、本発明は、配列番号33で記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖(GES8(GPC3 S8))及び配列番号41で記載されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖(G5S8(555S8))を含む単離抗体を含む。
【００６８】
別の態様において、本発明は、GPC3に結合するアンタゴニスト抗体の変異体又はその断片を提供する。したがって、本発明は、重又は軽鎖のいずれかの親アンタゴニスト抗体の重及び/又は軽鎖可変領域配列の非CDR領域のアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一である(少なくとも80%アミノ酸配列同一性を有する)重及び/又は軽鎖可変領域配列の非CDR領域のアミノ酸配列を有する抗体又はその断片を提供する。好ましくは、重及び/又は軽鎖可変領域配列の非CDR領域のアミノ酸配列同一性は、少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、詳細には96%、より詳細には97%、更に詳細には98%、最も詳細には99%であり、例えば、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及び100%を含む。アミノ酸配列に関する同一性又は相同性は、最大配列同一性パーセントを達成するのに、必要であれば、配列を整列させて、ギャップを導入した後に、GPC3に結合するアンタゴニスト抗体又はその断片と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとして本明細書中で定義する。したがって、配列同一性は、2つのポリペプチドのアミノ酸の位置における類似性を比較するのに一般的に使用される標準的な方法によって決定することができる。BLAST又はFASTA等のコンピュータープログラムを使用して、2つのポリペプチドを、それらの各々のアミノ酸の最適なマッチングに関して(一方又は両方の配列の完全長に沿って、或いは一方又は両方の配列の既定の部分に沿って)整列させる。プログラムは、デフォルトオープニングペナルティ及びデフォルトギャップペナルティを提供し、PAM250等のスコアリング行列(標準的なスコアリング行列; Dayhoff M O等、(1978)、Atlas of Protein Sequence and Structure、vol 5、supp. 3にて)は、コンピュータープログラムと併用することができる。例えば、同一性パーセントは、同一のマッチの総数に100を乗算した後、適合させたスパン内のより長い配列の長さ及び2つの配列を整列させるためにより長い配列に導入したギャップの数の合計で除算するように算出することができる。
【００６９】
別の態様において、本開示はまた、GPC3に結合する抗体又はその断片を提供し、ここで、重鎖CDRの少なくとも1つ及び/又は軽鎖CDRの少なくとも1つは、少なくとも1つのアミノ酸修飾を含む。部位特異的突然変異誘発又はPCR媒介性突然変異誘発は、修飾を導入するのに実施することができ、抗体結合に対する影響、又は目的の他の機能特性は、in vitro又はin vivoアッセイにおいて評価することができる。好ましくは、保存的修飾が導入される。修飾は、アミノ酸置換、付加又は欠失であり得るが、好ましくは置換である。通常、5つ以下、好ましくは4つ以下、より好ましくは3つ以下、更に好ましくは2つ以下、最も好ましくは1つ以下のアミノ酸修飾が、CDR領域内で実施される。
【００７０】
ある特定の実施形態において、フレームワーク配列を使用して、変異体抗体を産生するように可変領域を操作することができる。本発明の変異体抗体は、例えば抗体の特性を改善するために、VH及び/又はVK内のフレームワーク残基に対して修飾が成されたものを含む。通常、かかるフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減少させるために行われる。例えば、アプローチの1つは、相当するネズミ配列に対して1つ又は複数のフレームワーク残基を「突然変異する」こと、又は相当する生殖系列配列に対して1つ又は複数のフレームワーク残基を「突然変異する」ことである。
【００７１】
幾つかの実施形態において、単離抗GPC3抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である。本開示はまた、GPC3に結合する一価性抗体又はその断片、即ち単一の抗原結合アームから成る抗体を提供する。本開示はまた、Fab、Fab'、Fab'-SH、Fd、Fv、dAb、F(ab')2、scFv、二重特異性単鎖Fv二量体、二重特異性抗体、三重特異性抗体及び同じか、又は異なる抗体に遺伝的に融合されたscFvから成る群から選択されるGCP3に結合する抗体の断片を提供する。好ましい断片は、scFv、二重特異性単鎖Fv二量体及び二重特異性抗体である。本開示はまた、GPC3に結合する完全長抗体を提供する。
【００７２】
実質的に任意の標的抗原に対してモノクローナル抗体に対する技法は、当該技術分野で公知である。例えば、Kohler及びMilstein、Nature 256: 495頁(1975)、及びColigan等(eds.)、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY、VOL. 1、2.5.1〜2.6.7(John Wiley & Sons 1991)を参照されたい。簡潔に述べると、モノクローナル抗体は、抗原を含む組成物をマウス又はニワトリに注射すること、Bリンパ球を得るために脾臓を取り出すこと、Bリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを産生すること、ハイブリドーマをクローニングすること、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択すること、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養すること、及び抗体をハイブリドーマ培養物から単離することによって得ることができる。
【００７３】
キメラ又はヒト化抗体の産生等の様々な技法は、抗体クローニング及び構築の手順を含み得る。目的の抗体に関する抗原結合可変軽鎖及び可変重鎖配列は、RT-PCR、5'-RACE及びcDNAライブラリースクリーニング等の様々な分子クローニング手順によって得られ得る。ネズミ抗体を発現する細胞由来の抗体の可変重又は軽鎖配列遺伝子は、PCR増幅によってクローニングされて、配列決定され得る。それらの信憑性を確認するために、クローニングしたVL及びVH遺伝子は、Orlandi等によって記載されるようにキメラ抗体として細胞培養物において発現させることができる(Proc. Natl. Acad. Sci., USA、86: 3833頁(1989))。続いて、可変性重又は軽鎖遺伝子配列に基づいて、ヒト化抗体は、Leung等(Mol. Immunol., 32: 1413頁(1995))によって記載されるように、設計及び構築することができる。
【００７４】
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域が、例えば、マウス抗体の相補性決定領域(CDR)を含むマウス抗体の可変領域で置き換えられた組換えタンパク質である。キメラ抗体は、対象に投与されると、免疫原性の減少及び安定性の増加を示す。キメラ抗体を構築する方法は、当該技術分野で公知である(例えば、Leung等、1994年、Hybridoma 13:469頁)。
【００７５】
キメラモノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重及び軽可変鎖由来のマウスCDRを、ヒト抗体の相当する可変ドメインへ移行することによってヒト化され得る。キメラ化モノクローナル抗体におけるマウスフレームワーク領域(FR)もまた、ヒトFR配列で置き換えられている。ヒト化モノクローナルの安定性及び抗原特異性を保存するために、1つ又は複数のヒトFR残基は、マウス対応物残基によって置き換えられてもよい。ヒト化モノクローナル抗体は、対象の治療上の処置に使用され得る。ヒト化モノクローナル抗体の産生に関する技法は、当該技術分野で周知である(例えば、Jones等、1986年、Nature、321:522頁; Riechmann等、Nature、1988年、332:323頁; Verhoeyen等、1988年、Science、239:1534頁; Carter等、1992年、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA、89:4285頁; Sandhu、Crit. Rev. Biotech.、1992年、12:437頁; Tempest等、1991年、Biotechnology 9:266頁; Singer等、J. Immun.、1993年、150:2844頁を参照)。
【００７６】
一実施形態において、抗体は、ヒト化scFv抗体である。更なる実施形態において、ヒト化scFv抗体は、配列番号34に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号42に記載されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖を含む(G5S1ヒト化scFv抗体)。別の更なる実施形態において、本発明は、配列番号35に記載されるようなアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号43に記載されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖を含むヒト化scFv抗体を含む(GES1ヒト化scFv抗体)。
【００７７】
本明細書中に記載するポリペプチドをコードする核酸に対する修飾は、その生物学的活性を減少させずに行うことができる。融合タンパク質へのターゲティング分子のクローニング、発現又は組込みを容易にするために、幾つかの修飾を行うことができる。かかる修飾は、当業者に周知であり、例えば、終止コドン、開始部位を提供するためのアミノ末端で付加されるメチオニン、利便性のよい位置に制限部位を創出するためのいずれかの末端に配置される更なるアミノ酸、又は精製工程を助長するための更なるアミノ酸(ポリHis等の)を含む。組換え方法のほかに、本開示の抗体はまた、当該技術分野で周知の標準的なペプチド合成を使用して、全体的に又は部分的に構築することができる。
【００７８】
2鎖抗体精製プロトコールに対する修飾として、重及び軽鎖領域は、別々の可溶化させて、還元した後、リフォールディング溶液中で組み合わせる。これらの2つのタンパク質が、一方のタンパク質が他方のタンパク質に対して5倍モル過剰を超えないようなモル比で混合する場合に、例示的な収率が得られる。過剰な酸化グルタチオン又は他の酸化低分子量化合物を、酸化還元シャフリングが完了した後に、リフォールディング溶液に添加することができる。
【００７９】
組換え方法の他に、本明細書中で開示する抗体及びそれらの変異体はまた、標準的なペプチド合成を使用して、全体的に又は部分的に構築することができる。ポリペプチドの固相合成は、配列のC末端アミノ酸を、不溶性支持体に結合させること、続いて配列中の残りのアミノ酸の順次添加によって遂行され得る。固相合成に関する技術は、Barany & Merrifield、The Peptides: Analysis, Synthesis、Biology. Vol.2: Special Methods in Peptide Synthesis、Part A. 3〜284頁; Merrifield等、J. Am. Chem. Soc. 85: 2149〜2156頁、1963年、及びStewart等、Solid Phase Peptide Synthesis、2nd ed.、Pierce Chem. Co.、Rockford、Ill.、1984年によって記載される。より長い長さのタンパク質は、より短い断片のアミノ及びカルボニル末端の縮合によって合成され得る。
【００８０】
抗GPC3抗体組成物及び投与方法
ある特定の実施形態は、本発明の抗GPC3抗体及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。「薬学的に許容される担体」とは、当業者に公知の任意のタイプの無毒性の固体、半固体若しくは液体の充填剤、希釈剤、封入材料又は製剤助剤を意図するが、これらに限定されない。ポリオール、ポリエチレングリコール及びデキストラン等の希釈剤を使用して、コンジュゲートの生物学的な半減期を増やし得る。
【００８１】
本発明の医薬組成物は、従来の方法(例えば、Remington's Pharmaceutical Science、latest edition、Mark Publishing Company、Easton、U.S.A.)に従って製剤化することができ、同様に薬学的に許容される担体及び添加剤を含有し得る。例として、界面活性剤、賦形剤、着色剤、風味剤、防腐剤、安定剤、緩衝液、懸濁防止剤、等張剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、流動性促進剤、及び矯味薬、並びに適切に使用され得る他の一般的に使用される担体が挙げられるが、これらに限定されない。担体の具体例として、軽質無水ケイ酸、ラクトース、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ジエチルアミノ酸酢酸ポリビニルアセタール、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖トリグリセリド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、ショ糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が挙げられる。
【００８２】
ある特定の実施形態は、対象におけるがんを治療する方法であって、本発明の抗GPC3抗体を対象に投与する工程を含む方法に関する。本発明はまた、がんを治療するための医薬の製造における本発明の抗GPC3の使用を提供する。本方法はまた、他の標準的な療法と同時に、又はそれに続いて、本発明の抗GPC3抗体を投与することを含み、ここで、前記標準的な療法は、放射線療法、手術及び化学療法から成る群から選択される。
【００８３】
好ましい実施形態において、対象は、哺乳動物である。例示的な哺乳動物として、ヒト、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、マウス、イヌ、ネコ、ウシ等が挙げられる。抗GPC3抗体又はそれらの医薬組成物で治療され得る疾患として、肝臓、皮膚、頭頸部、肺、胸部、前立腺、卵巣、子宮内膜、子宮頸部、結腸、直腸、膀胱、脳、胃、膵臓又はリンパ系のがん等のがんが挙げられる。好ましくは、がんは、肝細胞癌(HCC)、肝芽腫及び肉腫様HCC等の肝臓がんである。
【００８４】
抗GPC3抗体又はその医薬組成物は、静脈内、腹腔内、動脈内、髄腔内、膀胱内又は腫瘍内に投与され得る。抗GPC3抗体の有効量は、経験的に決定され得ることは、当業者に理解されよう。ヒト患者に投与されると、抗GPC3又は組成物の毎日の使用の総計は、妥当な医学的判断内で主治医によって決定されることが理解される。任意の特定の患者に関する特定の治療有効容量レベルは、様々な要因:達成されるべき細胞応答のタイプ及び度合い;用いられる特定の抗GPC3抗体又は組成物の活性;患者の年齢、体重、全体的な健康、性別及び食事;抗GPC3抗体の投与の時間、投与の経路、及び排出の速度;  治療の持続期間;  抗GPC3抗体と組み合わせて、又はそれと同時に使用される薬物;  並びに医療技術分野で周知の同様の要因に依存する。
【００８５】
上記の同定した組成物及び治療方法はそれぞれ、更なる抗腫瘍薬及び更なる1つ又は複数の抗腫瘍薬の投与を含む。本発明とともに使用するのに適した抗腫瘍薬として、アポトーシスを誘導する作用物質、アデノシンデアミナーゼ機能を阻害する作用物質、ピリミジン生合成を阻害する作用物質、プリン環生合成を阻害する作用物質、ヌクレオチド相互変換を阻害する作用物質、リボヌクレオチド還元酵素を阻害する作用物質、チミジン一リン酸(TMP)合成を阻害する作用物質、ジヒドロ葉酸還元を阻害する作用物質、DNA合成を阻害する作用物質、DNAと付加体を形成する作用物質、DNAを損傷させる作用物質、DNA修復を阻害する作用物質、DNAとインターカレートする作用物質、アスパラギンを脱アミノ化する作用物質、RNA合成を阻害する作用物質、タンパク質合成又は安定性を阻害する、微小管合成又は機能を阻害する作用物質等が挙げられるが、これらに限定されない。更なる抗腫瘍薬の例として、1)微小管阻害剤(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン及びビンデシン等)、微小管安定剤(例えば、パクリタキセル(TAXOL)及びドセタキセル等)、並びにエピポドフィロトキシン(例えば、エトポシド(VP-16)及びテニポシド(VM-26)等)及びトポイソメラーゼIを標的とする作用物質(例えば、カンプトテシン及びイシリノテカン(isirinotecan)(CPT-11)等)等のトポイソメラーゼ阻害剤を含むクロマチン機能阻害剤を含むアルカロイド、2)ナイトロジェンマスタード(例えば、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、及びブスルファン(MYLERAN)等)、ニトロソウレア(例えば、カルムスチン、ロムスチン及びセムスチン等)及び他のアルキル化剤(例えば、ダカルバジン、ヒドロキシメチルメラミン、チオテパ、及びマイトマイシン等)を含む共有結合性DNA結合剤(アルキル化剤)、3)核酸阻害剤(例えば、ダクチノマイシン(アクチノマイシンD)等)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(ダウノマイシン及びセルビジン(cerubidine))、ドキソルビン(アドリアマイシン)及びイダルビシン(イダマイシン)等)、及びアントラセンジオン(例えば、ミトキサントロン等のアントラサイクリン類似体等)、ブレオマイシン(BLENOXANE)等、及びピリカマイシン(ミトラマイシン)等を含む非共有結合性DNA結合剤(抗腫瘍抗生物質)、4)葉酸代謝拮抗薬(例えば、メトトレキサート、FOLEX、及びMEXATE等)、プリン代謝拮抗薬(例えば、6-メルカプトプリン(6-MP、PURINETHOL)、6-チオグアニン(6-TG)、アザチオプリン、アシクロビル、ガンシクロビル、クロロデオキシアデノシン、2-クロロデオキシアデノシン(CdA)及び2'-デオキシコホルマイシン(ペントスタチン)等)、ピリミジン拮抗薬(例えば、フルオロピリミジン(例えば、5-フルオロウラシル(ADRUCIL)、5-フルオロデオキシウリジン(FdUrd)(フロクスウリジン)等)、及びシトシンアラビノシド(例えば、CYTOSAR(ara-C)及びフルダラビン等)を含む代謝拮抗薬、5)L-アスパラギナーゼ及びヒドロキシウレア等を含む酵素、6)グルココルチコイド、抗エストロゲン剤(例えば、タモキシフェン等)、非ステロイド性抗エストロゲン剤(例えば、フルタミド等)及びアロマターゼ阻害剤(例えば、アナストロゾール(ARIMIDEX)等)を含むホルモン、7)白金化合物(例えば、シスプラチン及びカルボプラチン等)、8)抗がん剤、毒素及び/又は放射性核種とコンジュゲー���されたモノクローナル抗体等、9)生物学的応答修飾因子(例えば、インターフェロン(例えば、IFN-アルファ等)及びインターロイキン(例えば、IL-2等)等)、10)養子免疫療法、11)造血成長因子、12)腫瘍細胞分化を誘導する作用物質(例えば、オールトランスレチノイン酸等)、13)遺伝子療法技法、14)アンチセンス療法技法、15)腫瘍ワクチン、16)腫瘍転移に対して誘導される療法(例えば、バチマスタット等)、17)血管新生阻害剤、18)プロテオソーム(proteosome)阻害剤(例えば、VELCADE)、19)アセチル化及び/又はメチル化の阻害剤(例えば、HDAC阻害剤)、20)NFカッパBの修飾因子、21)細胞周期調節の阻害剤(例えば、CDK阻害剤)、及び22)p53タンパク質機能の修飾因子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
GPC3の発現によるがんの診断
驚くべきことに、本発明は、GPC3の高度な発現ががんと関連付けられることを見出した。したがって、本発明は、対象におけるがんを診断する方法であって、生物学的試料中でGPC3への本発明の抗体の結合を検出する工程を含み、結合が、対象の、がんを発症する可能性を示す方法を提供する。がんとして、卵巣がん、乳がん、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん(小細胞癌(燕麦細胞がん)、混合小細胞/大細胞癌、及び混合型小細胞癌を含む)、結腸がん、前立腺がん、膵臓がん、脳がん、腎臓がん、胃のがん、黒色腫、骨がん、胃がん、神経膠腫、神経膠芽腫(gliobastoma)、肝細胞癌、乳頭状腎細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫、又は他の腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。特にGPC3の高度な発現は、HCC関連遺伝子のmRNA発現を強化して、肝硬変における異形成と正の相関を示すことができ、したがって、GPC3は、肝硬変及び肝臓がんにおける前がん性バイオマーカーとして機能を果たし得る。更に、GPC3によるHCC関連遺伝子のmRNA発現の増加は、肝硬変において顕著であることが確認された。したがって、GPC3は、肝硬変又は肝臓がんを検出するための特異的なバイオマーカーとして有用である。したがって、別の態様において、本発明は、対象における肝硬変又は肝臓がんを診断する方法であって、生物学的試料中でGPC3への本発明の抗体の結合を検出する工程を含み、結合が、対象は肝硬変又は肝臓がんを発症する可能性があること示す方法を提供する。
【００８７】
本発明の診断方法で使用される生物学的試料は、それらがGPC3タンパク質を含有し得る試料である限りは特に限定されない。具体的には、哺乳動物等の生物の身体から収集した試料が好ましい。ヒトから収集した試料が最も好ましい。試験試料の具体例として、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸水、血清、リンパ液、唾液、尿、組織、腹水、及び腹腔内洗浄液が挙げられる。
【００８８】
試験試料中に含有されるGPC3タンパク質への本発明の抗GPC3抗体の結合を検出する方法は、特に限定されない。放射免疫測定法(RIA)、酵素免疫測定法(EIA)、蛍光免疫測定法(FIA)、発光免疫測定法(LIA)、免疫沈降(IP)、比濁免疫測定法(TIA)、ウェスタンブロッティング(WB)、免疫組織化学的(IHC)法、及び一元放射免疫拡散法(SRID)等の、検出のために抗GPC3抗体を使用する免疫学的方法。
【００８９】
本発明はまた、がんを診断するための診断剤又はキットであって、試験試料中のGPC3タンパク質を検出するための診断剤を含む診断剤又はキットを提供する。一実施形態では、本発明はまた、肝硬変又は肝臓がんを診断するための診断剤又はキットであって、試験試料中のGPC3タンパク質を検出するための診断剤を含む診断剤又はキットを提供する。本発明の診断剤は少なくとも、本発明の抗GPC3抗体を含む。
【００９０】
がんを診断するためのキットは、肝硬変又は肝臓がんを診断するための作用物質を、GPC3を検出するのに使用される別の要素と組み合わせることによって生産することができる。より具体的には、本発明は、肝硬変又は肝臓がんを診断するためのキットであって、GPC3へ結合する抗GPC3抗体及び抗体とGPC3との間の結合を検出するための試薬を含むキットに関する。更に、測定操作について記載する説明書を、本発明のキットに添付することができる。
【００９１】
本発明は、GPC3タンパク質中に存在する機能性ドメイン又は抗原性エピトープが、臨床上診断又は治療用途のための潜在的な標的として機能を果たし得ることを示唆する。したがって、本発明は、抗腫瘍活性を有する抗GPC3抗体、並びに腫瘍成長、増殖及び遊走の阻害を含む診断上及び治療上の目的のためのそれらの用途を提供する。
【実施例】
【００９２】
(実施例1)
scFv抗体ライブラリー及びバイオパニングのGPC3タンパク質発現及び精製及び構築
ヒトGPC3タンパク質をコードする遺伝子の様々な断片は、PCRによって増幅され、pET21aベクターへクローニングして、His融合GPC3としての発現のために大腸菌(E. coli)BL-21(DE3)株へ形質転換した。個々のクローンを、アンピシリン(100μg/ml)を含有するLB培地5ml中で、37℃で一晩成長させた。細菌培養液を、同じLB培地中で10倍希釈して、OD600が0.6〜1.0に到達するまで更に成長させた。イソプロピル-ベータ-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を、培養液中で最終濃度0.5mMになるように添加した。細胞ペレットを、1% Triton x-100を含有する1×PBS 2ml中に再懸濁させて、プロテアーゼ阻害剤の存在下で超音波処理によって溶解させた。遠心分離後、製造業者の説明書に従って、得られた細胞溶解物をNi2+負荷樹脂カラムとともにインキュベートして、GPC3タンパク質を精製した(General Electronics社、ピスカタウェイ、NJ、USA)。図1は、市販のGPC3細胞外ドメイン(ECD)及び切断型(C185)タンパク質の分析の結果を示す。
【００９３】
雌白色レグホン(ガルス・ドメスティクス(Gallus domesticus))ニワトリを、筋内注射によって、フロイント完全アジュバントと等体積の精製GPC3 100μgで免疫化した。不完全アジュバントを用いた更に3回の免疫化を7日間隔で実施した。各免疫化後、卵黄中のニワトリIgY抗体を収集して、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって滴定して、体液性抗GPC3抗体免疫応答の存在を決定した。卵黄は、公開済のプロトコールに従って、10%硫酸デキストランを使用してIgY精製のために卵白から分離される(Akita, E.M.、及びNakai, S. (1993). Production and purification of Fab' fragments from chicken egg yolk immunoglobulin Y (IgY). J Immunol Methods 162、155〜164頁)。
【００９４】
抗体ライブラリーは、過去の報告に基づいて確立される(Andris-Widhopf、J., Rader, C.、Steinberger, P.、Fuller, R.、及びBarbas, C.F.、3rd (2000). Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display. J Immunol Methods 242、159〜181頁。Barbas, C.F.、3rd、Kang, A.S.、Lerner, R.A.、及びBenkovic, S.J. (1991). Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: the gene III site. Proc Natl Acad Sci U S A 88、7978〜7982頁)。簡潔に述べると、ニワトリの脾臓を収集して、即座にトリゾールに入れた。総RNA 10μgを、第1鎖  cDNA1へ逆転写する。ニワトリ特異的なプライマーを使用した増幅後、短又は長リンカーを有する重及び軽鎖可変(VH及びVL)領域のPCR産物を、第2ラウンドのPCRに付して、SfiIで消化して、pComb3Xベクターへクローニングした。組換えDNAをエレクトロポレーションによって大腸菌(E. coli) ER2738株へ形質転換した。組換えファージは、VCS-M13ヘルパーファージの添加によって産生され、4%ポリエチレングリコール8000及び3% NaCl(w/v)で沈降させて、1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に再懸濁させた。次に、1011のプラーク形成単位(pfu)の組換えファージを、GPC3タンパク質で予めコーティングしたウェル(0.5μg/ウェル)に添加して、37℃で2時間インキュベートした。結合したファージを0.1M HCl/グリシン(pH2.2)/0.1% BSAで溶出させて、2Mトリス塩基緩衝液で中和して、ER2738株に感染させるのに使用した。増幅ファージは、次の回の選択のために上述するように回収した。パニング手順を3回又は4回繰り返した。総DNAを精製して、TOP 10Fの大腸菌(E. Coli)株へ形質転換した。20個のクローンを無作為に選択して、最終的なパニングプロセスから成長させた。細菌細胞を溶解させて、scFv抗体発現及びGPC3への結合反応性に関して分析した。scFv抗体は、製造業者によって記載されるようにNi2+負荷セファロースを使用して精製した(Amersham Biosciences社、UK)。図2は、ELISAを使用した抗GPC3抗体の結合活性を示す。4回目のバイオパニング後に各ELISA陽性ファージライブラリーから無作為に選択される16個のクローンの総細胞溶解物を使用して、それらの抗GPC3活性を検査した。これらのscFv抗体によって使用される重及び軽可変断片の配列分析は、同一の遺伝子使用が、GES2、GES3及びGES4クローンにおいても該当することを示唆した(データは示していない)。GPC3S1-S8及び5S1-S8の命名法は、それぞれGES1-S8及びG5S1-S8として置き換えられた。
【００９５】
(実施例2)
ELISAによるGPC3に対するscFvの精製
scFv抗体発現を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で分析した。特異的な抗GPC3scFvを有する6個のクローンは、細胞質において良好な発現レベルを有することがわかった。図3は、SDS-PAGEでの精製scFv抗体の分析を示す。6個のクローン、即ちG5S1、G5S8、GES1、GES2、GES6及びGES8(レーン1〜6)で発現されるscFv抗体を精製して、クマシーブルー染色によって可視化させた。ヘビ毒タンパク質と反応するscFv抗体(ctrl)は、対照として含まれ、分子量25KDを示した。レーン1及びレーン2における25kDよりも大きな分子量を有する余分なバンドは、抗his及び抗ニワトリ抗体の両方が、これらのバンドと反応することが可能であったため、scFv抗体の凝集形態(四量体又は二量体)であると考えられた(データは示していない)。
【００９６】
(実施例3)
抗GPC3 scFvの配列アラインメント及び分析
scFvの、ニワトリ-ヒトキメラ抗体への変換
抗GPC3 scFv抗体のVL及びVH遺伝子を、組換えPCR法によってエクソンに変換する(Tsurushita等、2004)。第1工程のPCRで、VL(又はVH)のシグナルペプチドコード領域は、5'末端がKpn I部位を含有し、3'末端が、抗GPC3 scFv VL(又はVH)コード領域の5'末端に対して相同的な配列に結合されるようにPCRによって増幅される(左側断片)。scFv抗体のVL(又はVH)は、3'末端が、スプライシングドナーシグナル及びNhe I部位を保有したのに対して、5'末端が、VL(又はVH)のシグナルペプチドコード領域の3'末端に対して相同的な配列に結合されるようにPCRによって増幅される(右側断片)。抗GPC3 scFv VL及びVHそれぞれの左及び右側断片は、組み合わせて、PCRによって増幅させて、Kpn I及びNhe I部位によって隣接されるミニエクソンを作製する。実験的確証後、選択したscFvは、in vivo試験のためにIgG型に変換される。マウス/ニワトリscFvのVH及びVL遺伝子は、ヒトIgGスカフォールドにグラフトされて、キメラIgG構築物を生成する。IgG発現ベクターは、IgG1免疫グロブリンの重及び軽鎖に関する最適化された定常ドメインを含有する。
【００９７】
ヒト化
ニワトリscFv抗体の可変領域のヒト化は、これまでの研究で適用されるアルゴリズムによって作成された分子モデルを活用して実施される(Tsurushita等、2004; Zilber等、1990)。簡潔に述べると、抗GPC3 scFv抗体のCDRに関して受容体として使用されるヒトV領域フレームワークは、配列相同性に基づいて選択される。CDR構造の適正な形成に重要であるべき三次元モデルから予測されるヒト化V領域におけるアミノ酸残基は、ニワトリ抗GPC3 scFv抗体の相当する残基で置換される。ヒト化抗GPC3抗体の構造を更に微調整するのに、他の方法を組み合わせて、使用する(Ewert等、2003; Sidhu等、2004)。
【００９８】
選択されるscFv発現クローン由来の重及び軽可変領域のヌクレオチド配列決定は、ompseq(5'-AAGACAGCTATCGCGATTGCAGTG-3')及びHRML-F(5'-GGTGGTTCCTCTAGATCTTCC-3')プライマーを使用して、オートシーケンサーによって実行される。結果は、アラインメントプログラムBLAST及びVector NTI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)を使用して分析される。図4は、ニワトリのGPC3遺伝子の選択したscFv配列の重鎖(A)及び軽鎖(B)(555 S1、S8及びGPC3 S1、S2、S6、S8)並びに本発明のヒト化scFv配列の重鎖及び軽鎖(G5S1ヒト化scFv配列及びGES1ヒト化scFv配列)を示す。
【００９９】
ニトロセルロース膜を、TBST中で1時間、5%脱脂乳でブロックした。ポリクローナルヤギ抗ニワトリIgY軽鎖抗体を1:5000希釈で添加して、更に1時間インキュベートした。膜をTBSTで3回洗浄して、結合した抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HPR)コンジュゲートロバ抗ヤギIg抗体を1:3000希釈で添加することによって検出された。3回の洗浄後、所望の強度に達するまで、膜をジアミノベンジジン(DAB)基質で発色させた。大腸菌発現scFv抗体のIgY抗体を精製して、ニトロセルロース膜又はELISAプレートウェル上に固定化した精製GPC3タンパク質又はGPC3陽性HepG2及びHep3B細胞の細胞溶解物とともにインキュベートした。続いて、それらの結合を、上述するようにヤギ抗マウスIgG又は抗ニワトリIgY軽鎖、続いてHPRコンジュゲートロバ抗ヤギIg抗体を添加することによって検出した。図5は、4つの肝細胞腫細胞株(レーン1〜4)及び4つの肉腫様肝細胞腫細胞株(レーン5〜8)の細胞溶解物の電気泳動分析を示す。図5Aは、還元条件下での8つの細胞溶解物タンパク質及び市販のGPC3細胞外ドメインタンパク質を示し(レーンC)、上部矢印は、C末端断片を示し、下部矢印は、N末端断片を示す。図5Bは、抗GPC3ポリIgYによって同定される2つの断片を示す。図5Cは、G5S1 scFvによって同定される断片を示す。図5Dは、GES1 scFvによって同定される断片を示す。図5C及び図5Dの2つのscFvは、細胞溶解物においてGPC3のC末端断片及びGPC3を同定することができる(矢印を参照)。
【０１００】
(実施例4)
ELISAでの抗GPC3 scFv抗体の結合分析
HepG2、Hep3B細胞(2×105個の細胞/ml)をカバーガラス上に播種して、等量の8%の調製したての氷冷パラホルムアルデヒドとともに、氷上で15分間インキュベートした。固定後、細胞を70%、95%及び99%メタノールの連続処理で脱水して、95%及び70%メタノールで再水和させた。続いて、スライドをブロッキング緩衝液(1×PBS中の1% BSA)で、室温(RT)にて1時間覆った。1×PBSで洗浄した後、特異的なモノクローナルマウス又はscFv抗体を、細胞とともにRTで更に1時間インキュベートした。最終的に、GPC3タンパク質へのそれらの結合は、マウス抗HA抗体、続くFITCコンジュゲートヤギ抗マウス抗体によって検出された。核は、並行してPI溶液で対比染色した。Confocal Spectral Microscope Imaging System(TCS SP5、Leica社)を使用して、スライドを検査した。図6は、ELISAでの特異的な抗GPC3 scFv抗体の結合分析の結果を示す。図5に示される部分的に精製したscFv抗体は、プレートウェル上に固定化された市販のGPC3に対するそれらの結合活性に関して検査した。結果は、G5S1、GES1、GES2及びGES6 scFv抗体が、GPC3と相当反応することを示した。抗ヘビ毒scFv(NC)及びポリクローナル抗GPC3抗体は、それぞれ、陰性及び陽性対照として含まれた。
【０１０１】
(実施例5)
抗GPC scFv抗体の増殖(MTT)アッセイ
5×103個のHepG2、Hep3B細胞を含有するDMEM培地100μlの容量を96ウェルプレート上に播種した。24時間後、培地を、最終濃度0.5〜5μMで抗GPC3 scFv抗体を含有する新鮮なDMEMで交換した。細胞を6日間培養した。その後、臭化3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウム(MTT; 10mg/ml)10μlを添加して、生存細胞の数を決定した。インキュベーションの3時間後に上清を除去して、発達したホルマザン結晶は、酸性化した2-プロパノール/ウェル(0.04N HCl)100μlの添加によって溶解させた。消衰は、540nmで自動マイクロタイタープレートリーダーリーダーによって測定した。無関係の抗ヘビ毒抗体(neg)は、対照実験中に含まれた。図7は、肝細胞腫細胞に関する特異的な抗GPC3 scFv抗体の増殖阻害を示す。HepG2細胞は、最終濃度0.1μMで1〜6日間、G5S1、GES1、GES6又は対照scFv抗体を含有する培地中で培養した。上部パネルに見られるように、0.1μMのG5S1、GES1及びGES6が、6日間の細胞増殖でおよそ60%の抑制を示すことを、データは示した。低パネルでのデータは、最終濃度0、0.5、1、2、4、及び8μMで3日間のG5S1及びGES1 scFv抗体が、投与量依存性様式で細胞増殖を阻害することを示した。
【０１０２】
(実施例6)
抗GPC scFv抗体のフローサイトメトリー分析
総計2×106個のHepG2、Hep3B細胞を、これまでに記載されるように、わずかな修飾を伴って、収集して、2%パラホルムアルデヒドで固定した(Leu等、2010)。これらのcanceqazer細胞で発現されるGPC3分子は、精製ニワトリscFv抗体、続くマウス抗HA(1:200)及びFITCコンジュゲートヤギ抗マウス抗体(1:200)を添加することによって検出した。結果は、FACScanフローサイトメーターを使用して、結果を分析した。陰性対照は、一次scFv抗体を省略することによって実施されるのに対して、陽性対照は、自家製ニワトリ抗GPC3 scFv抗体の代わりに、市販のポリクローナル抗ヒトGPC3抗体(1:200)を使用して実施した。図8は、フローサイトメトリーを使用した特異的な抗GPC3 scFv抗体の結合分析を示す。部分的に精製したscFv抗体は、GPC3陽性のHep3B、HepG2及びHepJ5細胞に対するそれらの結合活性に関して検査した。100μg/mlの濃度でのGES1、GES6及びG5S1 scFvは、3個全ての肝細胞腫細胞に対して、様々ではあるが、相当の結合シグナルを示した(左から中心までのパネル)。無関係のscFv抗体(NC)を使用して実施した実験は、ほとんど結合活性を示さなかったか、又は結合活性を示さなかった。
【０１０３】
(実施例7)
抗GPC抗体の免疫蛍光染色アッセイ
HepG2、Hep3B細胞(2×105個の細胞/ml)をカバーガラス上に播種して、等量の8%の調製したての氷冷パラホルムアルデヒドとともに、氷上で15分間インキュベートした。固定後、細胞を70%、95%及び99%メタノールの連続処理で脱水して、95%及び70%メタノールで再水和させた。続いて、スライドをブロッキング緩衝液(1×PBS中の1% BSA)で、室温(RT)にて1時間覆った。1×PBSで洗浄した後、特異的なモノクローナルマウス又はscFv抗体を、細胞とともにRTで更に1時間インキュベートした。最終的に、GPC3タンパク質へのそれらの結合は、マウス抗HA抗体、続くFITCコンジュゲートヤギ抗マウス抗体によって検出された。核は、並行してPI溶液で対比染色した。Confocal Spectral Microscope Imaging System(TCS SP5、Leica社)を使用して、スライドを検査した。図9A及び図9Bは、免疫蛍光染色を使用した特異的な抗GPC3 scFv抗体の結合分析を示す。部分的に精製したscFv抗体は、GPC3陽性HepG2細胞及びHep3B細胞へのそれらの結合活性に関して検査した。GES1、GES6及びG5S1 scFv抗体は、Hep3B細胞(図9A)及びHepG2細胞(図9B)の表面に対して、様々であるが、相当の結合シグナルを示し、それは、4番目の免疫化ニワトリ由来のポリクローナルIgY抗体の結合シグナルに匹敵した。無関係のscFv抗体(図9AにおけるSp scFv及び図9Bにおけるα-RTS3)を用いて、又は特定の抗GPC3抗体を添加せずに(二番目及び三番目のAbのみ)実施した類似の実験は、結合活性を示さなかった。
【０１０４】
(実施例8)
抗GPC抗体の免疫沈降アッセイ
抗体ビーズは、Ni-NTA Sepharose(Amersham Biosciences社)100μl及び抗GPC3 scFv抗体1mgを20mMジメチルピメルイミデートと共有結合させることによって調製した。次に、HepG2及びHep3B細胞溶解物500μlを抗体ビーズ25μlと混合して、4℃で2時間インキュベートした。PBSTで広範囲にわたって洗浄した後、抗体ビーズをSDS-PAGEローディング緩衝液50μl中に再懸濁させて、5分間沸騰させて、続いてウェスタンブロッティング分析に付した。図10は、免疫沈降分析を使用した市販の抗GPC3 scFv抗体の結合分析を示す。Hep3B及びHepG2の総細胞溶解物を、his-ビーズ及びG5S1、GES1、GES6又は70SC対照scFv抗体の混合物ともに個々にインキュベートした。洗浄後、his-ビーズ複合体をSDS-PAGE及びウェスタンブロット分析に付した。結果は、GPC3の予測分子量を有するHep3B細胞中のタンパク質がGES1によって沈降することを示した。他の2つのscFv抗体G5S1及びGES6を使用した結果は、これほど明確ではなかった。対比して、HepG2細胞中のたんぱく質は、GES1、G5S1及びGES6 scFv抗体によって沈降した。しかしながら、データは非常に予備的であり、更なる確証を必要とする。
【０１０５】
(実施例9)
抗GPC scFv抗体の軟寒天アッセイ
HepG2、Hep3B細胞のクローン原性を決定するために、5×105個の細胞を、0.5〜5μMの濃度で抗GPC3抗体を含有するDMEM培地2ml中で48時間予めインキュベートした。その後、細胞を播種して、計数して、0.8%DMEM-メチルセルロース及び30%FBSを補充した半固体培地に移した。最終的に、5×103個の個々のタイプの細胞を含有する半固体培地1mlを、3.5cmのペトリ皿上へ蒔いた。処理プロトコール1つにつき三重反復のペトリ皿を標準的な条件下で5〜7日間培養した。コロニー形成(30個以上の細胞のクラスター)は、クリスタルバイオレットによる染色によって可視化され、倒立顕微鏡によってスコア付けした。図11は、コロニー形成に関する特異的な抗GPC3 scFv抗体の阻害を示す。HepG2及びHep3B細胞の足場依存性成長に対するGPC3 scFvの効果を探究した。肝細胞腫細胞を0.5μMのG5S1、GES1又はα-RTS6(neg)scFv抗体で1時間処理して、0.4%低融点アガロースを含有する培地中に懸濁させて、皿1つ当たり1×105個の細胞密度で、培地中の凝固した0.9%アガロース上へ蒔いた。4週間インキュベートした後、コロニーの数を計数及び記録した。G5S1及びGES1 scFv抗体はともに、HepG2細胞のコロニー形成に対して相当な阻害効果(inhibitory effort)を示した。Hep3B細胞に対するそれらの阻害効果は、これほど明確ではなかった。2つの細胞株に関する明確な阻害の正確な理由は、目下知られていない。
【０１０６】
(実施例10)
細胞周期分析
細胞を1μMの抗GPC3 scFv抗体で2〜5日間処理して、収集して、70%(vol/vol)エタノールで一晩固定した。固定した細胞を、ヨウ化プロピジウムで染色して、FACSで分析した。種々の期の細胞周期分布を、FlowJo v 9.0で分析した。図12A、図12B及び図12Cは、細胞周期分析の結果を示す。G5S1、GES1又はα-RTS6(neg)scFv抗体で48時間処理した後、接着HepG2細胞を剥離させて、洗浄して、70%エタノールに4℃で一晩曝露した。洗浄後、細胞を5mg/mLのヨウ化プロピジウム及び50mg/mLのRNaseAとともにインキュベートした。FACSを実行して、データをFlowJoソフトウェアによって統計学的に分析した。細胞は、0.5μMのG5S1及びGES1 scFv抗体で処理した場合に、G1期で停止された(図12A及び図12B)。更に、サブG1期における細胞集団は、それぞれ、GES1及びG5S1処理HepG2細胞において28.8%及び16.6%まで著しく増大した。これは、細胞アポトーシスの誘導に起因し得る(図12C)。
【０１０７】
(実施例11)
遊走アッセイ
細胞遊走アッセイに関して、1×103個の細胞を、1〜200μg/mlの濃度で48時間、抗GPC3抗体とともにインキュベートした後、トランズウェル遊走系へ移した。孔径8μmを有するポリカーボネートフィルター膜(上部層)へ細胞を蒔き、種々の時間間隔で、5%CO2のインキュベーター中で37℃にてインキュベートした。細胞を膜の下部から下部ウェルへ洗い流すのに0.5mM EDTAを含有する無血清培地を使用した。下部ウェル中の細胞を、3000gで5分間の遠心分離で収集して、顕微鏡下で直接的な細胞計数を実施した。ポリカーボネートフィルターを通る遊走後の平均成長速度(MGR)は、方程式:MGR=log2Nt-log2N0/tによって決定され、N0は、初期細胞数であり、Ntは、最終細胞数であり、tは、日単位での細胞インキュベーションの期間であった。図13は、細胞遊走に関する特異的な抗GPC3 scFv抗体の阻害を示す。GPC3タンパク質が細胞遊走に必須であるかどうかを探究するために、集密するまでHep3B細胞を培養した。単層を傷つけて(wounded)、0.5μMのG5S1又はGES1及び2つの対照(NC-70sc又はNC-spE)scFv抗体を含有する培地を用いて培養し、24時間後に分析した。GES1を使用した際に、細胞遊走に対する部分的な阻害効果が観察された。G5S1 scFvの効果は最小であり、いかなるscFv抗体も伴わない培地中で得られる基底レベルに達した。興味深いことに、細胞遊走に対する効果の増強が、陰性対照NC-70sc又はNC-spE抗体を含有する培地で見られた。これらの結果は、更なる研究を必要とする。
【０１０８】
(実施例12)
腫瘍異種移植片モデル及び異種移植マウスにおける腫瘍状組織に関する免疫組織化学的分析
NOD-SCIDマウスを使用した。簡潔に述べると、4週齢の雌ヌードマウスに、4×106個のHepG2及びHep3Bがん細胞を単一の背側部位で皮下注射した。14日目に、腫瘍を保有するマウスを、実験群(1群当たり5匹)に無作為化して、抗GPC3抗体及び陽性対照で、したがってソラフェニブで処理した。抗体400μg又は800μgを静脈内(i.v.)注射によって、3日毎に3週間投与した。動物を屠殺するまで、腫瘍サイズを2日毎にノギスで測定した。屠殺時に、腫瘍を切断して、秤量した。ヒトHep3B異種移植片モデルに対するG5S1及びGES1の抗腫瘍効果及び体重の変化を図14に示す。
【０１０９】
(実施例12)
異種移植マウスにおける腫瘍状組織に関する免疫組織化学的分析
マウスにおける異種移植片腫瘍組織由来の組織切片を、キシレン中で脱脂して、段階的なアルコールによって再水和した。10mMクエン酸ナトリウム(pH6.0)中で20分間、再水和した組織を加熱することによって、抗原回復を実行した。10mM Tris-HCl(pH7.4)及び150mM塩化ナトリウムを含有する緩衝液で洗浄した後、切片を3%過酸化水素で5分間処理した。抗Ki-67抗体(市販のポリクローナル抗体)を室温で加え1時間放置した。最適なホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体及びジアミノベンジジンを順次添加して、検査した組織においてKi-67増殖マーカー発現を検出した。スライドは、GMヘマトキシリン溶液で対比染色した。図15は、異種移植マウスにおける腫瘍状組織に関する免疫組織化学的分析を示す。屠殺後、一部の腫瘍試料を収集して、細胞増殖を評価するのに一般的に使用されるマーカーであるKi-67タンパク質の発現に関して検査した。結果は、Ki-67発現のレベルの低減が、未処理の群由来のレベルと比較して、GES1(800μg/マウス/時間当たり)処理マウスの腫瘍切片において検出されることを示した。
【０１１０】
(実施例13)
異種移植片動物モデル
GES1 scFv抗体をヒト化して、ヒト化IgG抗体(GES1ヒト化scFv抗体)を得て、異種殖片動物モデルを実施した。Hep3B肝細胞腫細胞をNOD-SCIDマウスにクローニングした。腫瘍を生成した後、1mg/Kg及び5mg/KgのGES1 IgGを、1週に1度、マウスに静脈内注射した。別の群のマウスには、200mg/Kgのソラフェニブ(sorafenic)を経口投与した。図16に示すように、1mg/Kg及び5mg/KgのGES1 IgGは、それぞれ、腫瘍成長を32.4%及び51.2%に阻害することができる一方で、ソラフェニブのみは、48.8%の阻害をもたらす。結果は、1mg/KgのGES1 IgGが腫瘍の阻害において好適な効果を示し、5mg/KgのGES1 IgGが、ソラフェニブよりも高い腫瘍阻害を示すことを示す。マウスの体重において、著しい変化は見られない。
【０１１１】
(実施例14)
直交異方性(Orthotropic)動物モデル
PanC1腫瘍細胞を有する直交異方性動物モデルを実施した。PanC1がん細胞をヌードマウスに接種した。腫瘍を生成した後、10mg/KgのGES1 IgGを、1週に1度、マウスの2群に静脈内注射した。図17Aに示すように、10mg/KgのGES1 IgGは、腫瘍成長を著しく阻害することができる(P<0.01)。腫瘍組織タンパク質の単離後、タンパク質を単離して、ウェスタンブロッティングによって精製した。図17Bに示すように、抗体処理後のp-AKT及びp-Erkの発現レベルは減少した(B2-2、B2-3及びB2-5)。抗体の標的GPC3の発現レベルもまた減少した。更に、図17C及び図17Dに示すように、GES1 IgGによって処理された腫瘍組織におけるKi-67タンパク質の発現レベルは、市販の抗Ki-67抗体によって処理されたレベルと比較して著しく減少した。
【０１１２】
Akt、Erk、p-Akt、p-Erkを検出するための実施例中に記載する抗体は、Cell Signaling Technology社から購入した。GPC3を検出するための実施例中に記載する抗体は、Aviva Systems Biology社から購入した。Ki-67を検出するための実施例中に記載する抗体は、(Dako社)から購入した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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