(57)【要約】本開示は、齧歯類および霊長類、特に、ヒトを含む脊椎動物において、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド、特に、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣおよびアクチビンＥなどのリガンドの活性を阻害するための組成物および方法を提供する。本開示の組成物は、フォリスタチン関連ポリペプチドが共有結合または非共有結合により会合する、ヘテロマーＦｃ相互作用ペアを含むタンパク質複合体／融合体を含有する。本組成物は、フォリスタチン関連ポリペプチドおよび／またはフォリスタチンリガンドの異常活性に関連する疾患または障害の処置または予防に使用することができる。
2018510637.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第２のポリペプチドと共有結合または非共有結合により会合した第１のポリペプチドを含むタンパク質複合体であって、
ａ．前記第１のポリペプチドが、フォリスタチン関連ポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用ペアの第１のメンバーのアミノ酸配列を含み、
ｂ．前記第２のポリペプチドが、前記相互作用ペアの第２のメンバーのアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチドが、フォリスタチン関連ポリペプチドを含まない、
タンパク質複合体。
【請求項２】
前記フォリスタチン関連ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１〜３３のうちいずれかのアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質複合体。
【請求項３】
前記第１のポリペプチドが、前記フォリスタチン関連ポリペプチドのアミノ酸配列および前記相互作用ペアの前記第１のメンバーのアミノ酸配列の間に配置されたリンカーポリペプチドを含む、請求項１または２に記載のタンパク質複合体。
【請求項４】
前記相互作用ペアの前記第１のメンバーが、免疫グロブリンの定常ドメインを含み、前記相互作用ペアの前記第２のメンバーが、免疫グロブリンの定常ドメインを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項５】
前記相互作用ペアの前記第１のメンバーが、免疫グロブリンのＦｃドメインを含み、前記相互作用ペアの前記第２のメンバーが、免疫グロブリンの定常ドメインを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項６】
前記相互作用ペアの前記第１のメンバーが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃドメインであるアミノ酸配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項７】
前記相互作用ペアの前記第１のメンバーが、配列番号３４〜４６のうちのいずれかに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のタンパク質複合体。
【請求項８】
前記相互作用ペアの前記第２のメンバーが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃドメインであるアミノ酸配列を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項９】
前記相互作用ペアの前記第２のメンバーが、配列番号３４〜４６のうちのいずれかに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項１０】
前記相互作用ペアの前記第１のメンバーが、前記相互作用ペアの前記第２のメンバーと共有結合または非共有結合により会合して、二量体のタンパク質複合体を形成する、請求項１から９のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項１１】
前記相互作用ペアが、非対称相互作用ペアである、請求項１から１０のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項１２】
前記非対称相互作用ペアの前記第１のメンバーが、ＩｇＧの第１の修飾された定常ドメインを含み、前記非対称相互作用ペアの前記第２のメンバーが、ＩｇＧの第２の修飾された定常ドメインを含み、前記非対称相互作用ペアの前記第１のメンバーおよび前記第２のメンバーが、会合して、ヘテロ二量体の複合体を形成する、請求項１１に記載のタンパク質複合体。
【請求項１３】
前記非対称相互作用ペアの前記第１のメンバーが、ＩｇＧの第１の修飾されたＦｃ部分を含み、前記非対称相互作用ペアの前記第２のメンバーが、ＩｇＧの第２の修飾されたＦｃ部分を含み、前記非対称相互作用ペアの前記第１のメンバーおよび前記第２のメンバーが、会合して、ヘテロ二量体の複合体を形成する、請求項１１に記載のタンパク質複合体。
【請求項１４】
ＩｇＧの前記第１のＦｃ部分が、群：配列番号３４〜４６から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＩｇＧの前記第２のＦｃ部分が、ＩｇＧの前記第１のＦｃ部分のアミノ酸配列とは異なり、かつ群：配列番号３４〜４６から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のタンパク質複合体。
【請求項１５】
前記非対称相互作用ペアの前記第１のメンバーが、配列番号３９のアミノ酸配列に、少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３または１４に記載のタンパク質複合体。
【請求項１６】
前記非対称相互作用ペアの前記第２のメンバーが、配列番号４０のアミノ酸配列に、少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項１７】
前記非対称相互作用ペアの前記第１のメンバーが、配列番号４０のアミノ酸配列に、少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３または１４に記載のタンパク質複合体。
【請求項１８】
前記非対称相互作用ペアの前記第２のメンバーが、配列番号３９のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３、１４または１７のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項１９】
前記非対称相互作用ペアの前記第１のメンバーが、配列番号４１のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３または１４に記載のタンパク質複合体。
【請求項２０】
前記非対称相互作用ペアの前記第２のメンバーが、配列番号４２のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３、１４または１９のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項２１】
前記非対称相互作用ペアの前記第１のメンバーが、配列番号４２のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３または１４に記載のタンパク質複合体。
【請求項２２】
前記非対称相互作用ペアの前記第２のメンバーが、配列番号４１のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３、１４または２１のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項２３】
前記非対称相互作用ペアの前記第１のメンバーが、配列番号４３のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３または１４に記載のタンパク質複合体。
【請求項２４】
前記非対称相互作用ペアの前記第２のメンバーが、配列番号４４のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３、１４または２３のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項２５】
前記非対称相互作用ペアの前記第１のメンバーが、配列番号４４のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３または１４に記載のタンパク質複合体。
【請求項２６】
前記非対称相互作用ペアの前記第２のメンバーが、配列番号４３のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３、１４または２５のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項２７】
前記非対称相互作用ペアの前記第１のメンバーが、配列番号４５のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３または１４に記載のタンパク質複合体。
【請求項２８】
前記非対称相互作用ペアの前記第２のメンバーが、配列番号４６のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３、１４または２７のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項２９】
前記非対称相互作用ペアの前記第１のメンバーが、配列番号４６のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３または１４に記載のタンパク質複合体。
【請求項３０】
前記非対称相互作用ペアの前記第２のメンバーが、配列番号４５のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３、１４または２９のいずれか一項に記載のタンパク質複合体。
【請求項３１】
前記相互作用ペアが、ガイドされない相互作用ペアである、請求項１から１１のいずれかに記載のタンパク質複合体。
【請求項３２】
前記ガイドされない相互作用ペアの前記第１のメンバーが、前記相互作用ペアの前記第２のメンバーと共有結合または非共有結合により会合して、二量体の複合体を形成する、請求項３１に記載のタンパク質複合体。
【請求項３３】
前記ガイドされない相互作用ペアの前記第１のメンバーが、前記ガイドされない相互作用ペアの前記第２のメンバーと同じアミノ酸配列を有する、請求項３１または３２に記載のタンパク質複合体。
【請求項３４】
前記第２のポリペプチドが、前記相互作用ペアの第２のメンバーのアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチドが、実質的な生物学的活性を付与するいかなる他のアミノ酸配列も含まない、請求項１から３３のいずれかに記載のタンパク質複合体。
【請求項３５】
前記第２のポリペプチドが、前記相互作用ペアの前記第２のメンバーのアミノ酸配列のＣ末端、Ｎ末端またはＣおよびＮ末端の両方に融合された追加的な１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０または１〜１０アミノ酸を含み得る条件で、前記第２のポリペプチドが、前記相互作用ペアの第２のメンバーのアミノ酸配列からなる、請求項１から３４のいずれかに記載のタンパク質複合体。
【請求項３６】
前記追加的なアミノ酸が、実質的な生物学的活性を付与しない、請求項３５に記載のタンパク質複合体。
【請求項３７】
１０−９、１０−１０、１０−１１もしくは１０−１２を超えるまたはこれに等しいＫＤで、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣまたはアクチビンＥから選択される１つまたは複数のリガンドに結合する、請求項１から３６のいずれかに記載のタンパク質複合体。
【請求項３８】
細胞ベースのアッセイにおいて、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣまたはアクチビンＥから選択される１つまたは複数のリガンドによるシグナル伝達を阻害する、請求項１から３６のいずれかに記載のタンパク質複合体。
【請求項３９】
少なくとも６、１２、２４、３６、４８または７２時間の、マウスにおける血清半減期を呈示する、請求項１から３８のいずれかに記載のタンパク質複合体。
【請求項４０】
少なくとも６、８、１０または１２日間の、ヒトにおける血清半減期を呈示する、請求項１から３８のいずれかに記載のタンパク質複合体。
【請求項４１】
ヘテロ二量体である、請求項１から４０のいずれかに記載のタンパク質複合体。
【請求項４２】
請求項１から４１のいずれかに記載のタンパク質複合体を含む医薬調製物。
【請求項４３】
請求項１から４０のいずれかに記載のタンパク質複合体が、他のポリペプチド構成要素に関して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％純粋である、請求項４２に記載の医薬調製物。
【請求項４４】
第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドの自己会合によって形成された、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％または１％未満のホモ二量体を含む、請求項４２または４３に記載の医薬調製物。
【請求項４５】
フォリスタチン関連ポリペプチドのアミノ酸配列および非対称相互作用ペアのメンバーのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
【請求項４６】
前記フォリスタチン関連ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１から３３のうちのいずれかのアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４７】
前記フォリスタチン関連ポリペプチドのアミノ酸配列および前記非対称相互作用ペアの前記メンバーのアミノ酸配列の間に配置されたリンカーポリペプチドを含む、請求項４５または４６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４８】
前記非対称相互作用ペアの前記メンバーが、免疫グロブリンの定常ドメインを含む、請求項４５、４６または４７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４９】
前記非対称相互作用ペアの前記メンバーが、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む、請求項４５、４６または４７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５０】
前記非対称相互作用ペアの前記メンバーが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃドメインであるアミノ酸配列を含む、請求項４５、４６または４７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５１】
前記非対称相互作用ペアの前記メンバーが、配列番号３４〜４６のうちのいずれかに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４５、４６または４７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５２】
前記非対称相互作用ペアの前記メンバーが、配列番号３９〜４６のうちのいずれかに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４５、４６または４７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５３】
ａ．前記第１のポリペプチドが、配列番号５７のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｂ．前記第２のポリペプチドが、配列番号５８のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載のタンパク質複合体。
【請求項５４】
ａ．前記第１のポリペプチドが、配列番号７１のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｂ．前記第２のポリペプチドが、配列番号７２のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載のタンパク質複合体。
【請求項５５】
請求項４５から５２のいずれか一項に記載の融合タンパク質のコード配列を含む核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１５年３月２６日に出願された米国仮出願第６２／１３８，８８６号（現在係属中）の利益を主張する。上記出願の内容および開示は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーは、共通の配列エレメントおよび構造モチーフを共有する種々の増殖因子を含有する。これらのタンパク質は、脊椎動物および無脊椎動物の両方における多種多様な細胞型において生物学的効果を発揮することが公知である。このスーパーファミリーのメンバーは、胚発生の際にパターン形成および組織特異化において重要な機能を果たし、脂肪生成、筋形成、軟骨形成、心臓発生、造血発生、神経発生および上皮細胞分化を含む種々の分化過程に影響を与えることができる。スーパーファミリーメンバーは、多様な、多くの場合補完的な効果を有する。ＴＧＦβファミリーのメンバーの活性を操作することにより、生物に有意な生理的変化を引き起こすことが可能になることが多い。筋肉、骨、軟骨および他の組織の変化は、適切なＴＧＦβスーパーファミリーメンバーにより媒介されるシグナル伝達を増加するか、またはこれに拮抗することにより達成することができる。
【０００３】
多くの場合リガンドトラップと称される天然に存在するタンパク質は、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドの細胞外調節因子として機能する。このようなリガンドトラップは、可溶性形態でまたは細胞外マトリクスに取り付けられて作用し、典型的には、受容体活性化に必要とされるエピトープに結合することによりリガンドを隔離する。リガンドトラップの１ファミリーは、フォリスタチンおよびフォリスタチン関連タンパク質を含み、これらは、複数系統の証拠に基づく望ましい機能活性を保持するが、治療剤として使用するのは困難であることが判明した。したがって、ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達の強力な調節因子として機能するような薬剤が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
部分的に、本開示は、フォリスタチン関連融合タンパク質を含むヘテロマータンパク質複合体を提供する。このようなヘテロマータンパク質複合体は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１などのリガンドの高アフィニティー結合および阻害を任意選択で呈示し、天然型のフォリスタチン関連タンパク質と比べて、組換え細胞株における改善された産生、精製に関する改善された特性および／または延長された血清半減期を任意選択で呈示する。
【０００５】
ある特定の態様では、本明細書で記載されるタンパク質複合体は、第２のポリペプチドと共有結合または非共有結合により会合した第１のポリペプチドであって、第１のポリペプチドが、フォリスタチン関連ポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用ペアの第１のメンバーのアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが、相互作用ペアの第２のメンバーのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。他の態様では、本明細書で記載されるタンパク質複合体は、第２のポリペプチドと非共有結合により会合した第１のポリペプチドであって、第１のポリペプチドが、フォリスタチン関連ポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用ペアの第１のメンバーのアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが、相互作用ペアの第２のメンバーのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０００６】
本明細書で記載されるフォリスタチン関連ポリペプチドは、配列番号１〜３３のうちのいずれか一配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるが、またはこれからなるポリペプチドを含む。任意選択で、フォリスタチン関連ポリペプチドは、相互作用ペアの第１のメンバーに直接的に接続される、またはリンカーなど、介在配列が、フォリスタチン関連ポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用ペアの第１のメンバーのアミノ酸配列の間に配置されてもよい。リンカーの例として、配列ＴＧＧＧ、ＴＧＧＧＧ、ＳＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＳおよびＧＧＧが挙げられる。任意選択で、第１のポリペプチドは、相互作用ペアの第１のメンバーまたはフォリスタチン関連ポリペプチドに対しＣ末端および／またはＮ末端に配置された追加的なアミノ酸（例えば、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０または１〜１０アミノ酸）を含み得る。相互作用ペアの第１のメンバーまたはフォリスタチン関連ポリペプチドに対しＣ末端またはＮ末端に配置されたこのような追加的なアミノ酸は、生物学的活性を付与することができる。代替的に、このような追加的なアミノ酸は、生物学的活性を付与しなくてよいまたは実質的に付与しなくてよい。任意選択で、このような追加的なアミノ酸は、フォリスタチン関連ポリペプチドに対して異種であり、好ましくは、フォリスタチン関連ポリペプチドではない。
【０００７】
第２のポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバーから本質的になるか、またはこれからなることができる。任意選択で、第２のポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバーに対しＣ末端および／またはＮ末端に配置された追加的なアミノ酸（例えば、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０または１〜１０アミノ酸）を含み得る。相互作用ペアの第２のメンバーに対しＣ末端またはＮ末端に配置されたこのような追加的なアミノ酸は、生物学的活性を付与することができる。代替的に、相互作用ペアの第２のメンバーに対しＣ末端またはＮ末端に配置されたこのような追加的なアミノ酸は、生物学的活性を付与しなくてよいまたは実質的に付与しなくてよい。任意選択で、相互作用ペアの第２のメンバーに対しＣ末端またはＮ末端に配置されたこのような追加的なアミノ酸は、フォリスタチン関連ポリペプチドにとって異種となるべきであり、好ましくは、フォリスタチン関連ポリペプチドではない。
【０００８】
本明細書で記載される相互作用ペアは、二量体化を促進するか、または高次の多量体を形成するように設計されている。一部の実施形態では、相互作用ペアは、相互作用して複合体、特に、ヘテロ二量体の複合体を形成する任意の２つのポリペプチド配列の場合もあるが、実効性のある実施形態は、ホモ二量体の複合体を形成する相互作用ペアを用いることもできる。相互作用ペアの第１および第２のメンバーは、非対称ペアとなることができ、これは、ペアのメンバーが、自己会合するよりもむしろ、互いと優先的に会合することを意味する。したがって、非対称相互作用ペアの第１および第２のメンバーは、会合して、ヘテロ二量体の複合体を形成することができる。代替的に、相互作用ペアは、ガイドされなくてよく、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先度なしで、互いと会合しても自己会合してもよく、よって、同じまたは異なるアミノ酸配列を有することができることを意味する。したがって、ガイドされない相互作用ペアの第１および第２のメンバーは、会合して、ホモ二量体の複合体またはヘテロ二量体の複合体を形成することができる。任意選択で、相互作用的作用ペア（例えば、非対称ペアまたはガイドされない相互作用ペア）の第１のメンバーは、相互作用ペアの第２のメンバーと共有結合により会合する。任意選択で、相互作用的作用ペア（例えば、非対称ペアまたはガイドされない相互作用ペア）の第１のメンバーは、相互作用ペアの第２のメンバーと非共有結合により会合する。
【０００９】
伝統的なＦｃ融合タンパク質および抗体は、ガイドされない相互作用ペアの例である一方で、種々の操作されたＦｃドメインが、非対称相互作用ペアとして設計された。したがって、本明細書で記載される相互作用ペアの第１のメンバーおよび／または第２のメンバーは、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、免疫グロブリンの定常ドメインを含み得る。任意選択で、相互作用ペアの第１のメンバーは、哺乳動物、好ましくはヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４免疫グロブリンのＦｃドメインに由来するアミノ酸配列を含み得る。例えば、相互作用ペアの第１のメンバーは、配列番号３４〜４６のうちのいずれか一配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなることができる。任意選択で、相互作用ペアの第２のメンバーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃドメインに由来するアミノ酸配列を含み得る。例えば、相互作用ペアの第２のメンバーは、配列番号３４〜４６のうちのいずれか一配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなることができる。一部の実施形態では、相互作用ペアの第１のメンバーおよび第２のメンバーは、同じ免疫グロブリンクラスおよびサブタイプに由来するＦｃドメインを含む。他の実施形態では、相互作用ペアの第１のメンバーおよび第２のメンバーは、異なる免疫グロブリンクラスまたはサブタイプに由来するＦｃドメインを含む。任意選択で、相互作用ペア（例えば、非対称ペアまたはガイドされない相互作用ペア）の第１のメンバーおよび／または第２のメンバーは、例えば、免疫グロブリンの修飾されたＦｃ部分を含む、免疫グロブリンの修飾された定常ドメインを含む。例えば、本開示のタンパク質複合体は、群：配列番号３４〜４６から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、ＩｇＧの第１の修飾されたＦｃ部分と、群：配列番号３４〜４６から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、ＩｇＧの第１の修飾されたＦｃ部分のアミノ酸配列と同じであっても異なっていてもよいＩｇＧの第２の修飾されたＦｃ部分とを含み得る。
【００１０】
一部の実施形態では、相互作用ペアの第１のメンバーは、配列番号３９のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、相互作用ペアの第２のメンバーは、配列番号４０のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、相互作用ペアの第１のメンバーは、配列番号４０のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、相互作用ペアの第２のメンバーは、配列番号３９のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
一部の実施形態では、相互作用ペアの第１のメンバーは、配列番号４１のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、相互作用ペアの第２のメンバーは、配列番号４２のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、相互作用ペアの第１のメンバーは、配列番号４２のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、相互作用ペアの第２のメンバーは、配列番号４１のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、相互作用ペアの第１のメンバーは、配列番号４３のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、相互作用ペアの第２のメンバーは、配列番号４４のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、相互作用ペアの第１のメンバーは、配列番号４４のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、相互作用ペアの第２のメンバーは、配列番号４３のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、相互作用ペアの第１のメンバーは、配列番号４５のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、相互作用ペアの第２のメンバーは、配列番号４６のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、相互作用ペアの第１のメンバーは、配列番号４６のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、相互作用ペアの第２のメンバーは、配列番号４５のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、本開示は、フォリスタチン関連ポリペプチドのアミノ酸配列および非対称相互作用ペアのメンバーのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを提供する。このような融合タンパク質は、配列番号１〜３３のうちいずれかのアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むフォリスタチン関連ポリペプチドを含み得る。任意選択で、融合ポリペプチドは、フォリスタチン関連ポリペプチドのアミノ酸配列および非対称相互作用ペアのメンバーのアミノ酸配列の間に配置されたリンカーポリペプチドを含み得る。ある特定の実施形態では、非対称相互作用ペアのメンバーは、免疫グロブリンのＦｃドメイン等、免疫グロブリンの定常ドメインを含む。例えば、本開示のフォリスタチン関連ポリペプチド融合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃドメインに由来するアミノ酸配列を含む非対称相互作用ペアを含み得る。一部の実施形態では、融合タンパク質の非対称相互作用ペアは、配列番号３４〜４６のうちのいずれか一配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。一部の実施形態では、融合タンパク質の非対称相互作用ペアのメンバーは、配列番号３９〜４６のうちのいずれか一配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。
【００１５】
好ましくは、本開示のタンパク質複合体は、ＧＤＦ８、ＧＤＦ−１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣまたはアクチビンＥからなる群から選択される１つまたは複数のリガンドに結合する。任意選択で、本開示のタンパク質複合体は、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１または１０−１２を超えるまたはこれに等しいＫＤで、これらのリガンドのうち１つまたは複数に結合する。一部の実施形態では、本開示のタンパク質複合体は、ＧＤＦ８、ＧＤＦ−１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣまたはアクチビンＥからなる群から選択される１つまたは複数のリガンドによるシグナル伝達（例えば、ＳＭＡＤ１、２、３、５および／または８によるシグナル伝達）を阻害することができる。任意選択で、本開示のタンパク質複合体は、細胞ベースのアッセイにおいて測定される通り、これらのリガンドのうち１つまたは複数によるシグナル伝達（例えば、ＳＭＡＤ１、２、３、５および／または８によるシグナル伝達）を阻害することができる。
【００１６】
任意選択で、本開示のタンパク質複合体は、天然の単量体フォリスタチン関連ペプチドと比較して、改善された精製を呈示する。任意選択で、本開示のタンパク質複合体は、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）における少なくとも４、６、１２、２４、３６、４８または７２時間の血清半減期を呈示する。任意選択で、本開示のタンパク質複合体は、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）における少なくとも６、８、１０、１２、１４、２０、２５または３０日間の血清半減期を呈示することができる。
【００１７】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書で開示される第１および／または第２のポリペプチドのいずれかをコードする核酸を提供する。本明細書で開示される核酸は、発現のためのプロモーターに作動可能に連結することができ、本開示は、このような組換えポリヌクレオチドにより形質転換された細胞をさらに提供する。好ましくは、細胞は、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞等、哺乳動物細胞である。
【００１８】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書で開示される第１および第２のポリペプチド、ならびに本開示のこのような第１および第２のポリペプチドを含むタンパク質複合体のうちいずれかを作製するための方法を提供する。このような方法は、適した細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞）において、本明細書で開示される核酸のいずれかを発現させる工程を含み得る。このような方法は、ａ）本開示の第１および／または第２のポリペプチドの発現に適した条件下で細胞を培養する工程であって、前記細胞が、第１および／または第２のポリペプチド発現構築物により形質転換されている工程と、ｂ）このようにして発現された第１および／または第２のポリペプチドを回収する工程とを含み得る。同様に、方法は、ａ）本開示の第１および第２のポリペプチドの発現に適した条件下で細胞を培養する工程であって、前記細胞が、第１および第２のポリペプチド発現構築物により形質転換されている工程と、ｂ）このようにして発現された本開示のタンパク質複合体を回収する工程とを含み得る。本明細書で記載される第１および／または第２のポリペプチド、ならびに本開示の第１および第２のポリペプチドを含むタンパク質複合体は、細胞培養物からタンパク質を得るための周知の技法のいずれかを使用して、粗製、部分的に精製されたまたは高度に精製された画分として回収することができる。
【００１９】
本明細書で記載されるタンパク質複合体のいずれかを、医薬調製物に取り込むことができる。任意選択で、このような医薬調製物は、他のポリペプチド構成要素に関して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％純粋である。一部の実施形態では、本明細書で記載される医薬調製物は、第１または第２のポリペプチドの自己会合によって形成された、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％または１％未満のホモ二量体を含む。任意選択で、本明細書で開示される医薬調製物は、１つまたは複数の追加的な活性薬剤を含み得る。
【００２０】
ある特定の態様では、例えば、本明細書で開示されるフォリスタチン関連融合ポリペプチドを含む様々なタンパク質複合体を含む、本開示の組成物は、フォリスタチン関連融合ポリペプチドおよび／またはフォリスタチンリガンド（例えば、ミオスタチン、アクチビン、ＧＤＦ１１）の異常活性に関連する疾患または状態の処置または予防に使用することができる。このような疾患、障害または状態は一般に、本明細書において、「フォリスタチン関連状態」と称される。ある特定の実施形態では、本開示は、治療有効量の本明細書で記載されるタンパク質複合体を個体に投与することにより、それを必要とする個体を処置または予防する方法を提供する。このような方法は、特に、動物、より具体的にはヒトの治療的および予防的処置を目的としている。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、Ｃｌｕｓｔａｌ  ２．１を使用した、ヒトＩｇＧアイソタイプに由来するＦｃドメインの多重配列アラインメントを示す。ヒンジ領域は、点線の下線によって指し示されている。二重の下線は、非対称鎖ペア形成を促進するようにＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号３４）において操作され得る位置と、他のアイソタイプ（配列番号３５、３６、３８）に関する対応する位置の例を指し示す。
【００２２】
【図２】図２は、治療的使用のためのフォリスタチン関連ポリペプチドを含むヘテロマータンパク質複合体の模式的な例を示す。「フォリスタチン関連ポリペプチド」（Ａ）は、「相互作用ペアの第１のメンバー」（Ｂ）に対してＣ末端に、またはこれに対してＮ末端に配置することができる。リンカーと共に他のアミノ酸配列は、フォリスタチン関連ポリペプチドおよび相互作用ペアの第１のメンバーの間に配置することができる。相互作用ペアの第１および第２のメンバー（Ｂ、Ｃ）は、非対称ペアとなることができ、これは、ペアのメンバーが、自己会合するよりもむしろ、互いと優先的に会合することを意味する、あるいは相互作用ペアは、ガイドされなくてよく、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先度なしで、互いと会合しても自己会合してもよく、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得ることを意味する。伝統的なＦｃ融合タンパク質および抗体は、ガイドされない相互作用ペアの例である一方で、種々の操作されたＦｃドメインが、非対称相互作用ペアとして設計された。第２のポリペプチドにおいて、追加的なアミノ酸が、相互作用ペアの第２のメンバーに対しＣ末端またはＮ末端に配置されてよく、このようなアミノ酸は、生物学的活性を付与してもしなくてもよいが、フォリスタチン関連ポリペプチドにとって異種となるべきであり、好ましくは、フォリスタチン関連ポリペプチドではない。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
１．概観
Ａ．ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドによる組織恒常性の調節
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路は、筋肉、骨、脂肪組織、膵臓機能、造血細胞その他を含む多様な細胞型および組織の出生前および出生後調節にとって重要である。本明細書で記載されるタンパク質複合体は、例えば、アクチビン群、増殖分化因子（ＧＤＦ）群、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）群のメンバー、またはスーパーファミリーの１つもしくは複数の他のメンバーを含む、ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のリガンドに結合することができる。ＭＳＴＮ遺伝子によってコードされる、増殖分化因子−８（ＧＤＦ８）としても公知の、スーパーファミリーリガンドのミオスタチンは、骨格筋量（ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｍａｓｓ）の内在性阻害剤として広く認識されている。Ｍｓｔｎの欠失がホモ接合型のマウスは、線維数増加および筋線維肥大の組合せによる、骨格筋量の堅固な増加を示す［ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７年）Ｎａｔｕｒｅ  ３８７巻：８３〜９０頁］。ミオスタチンシグナル伝達の選択的出生後損失は、有意な筋線維肥大を引き起こし、これにより、ミオスタチンが、成体における筋肉恒常性の重要な調節因子であることを指し示す［Ｌｅｅら（２０１０年）Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２４巻：１９９８〜２００８頁］。ミオスタチンの天然に存在する変異は、ヒト、ウシ、ヒツジおよびイヌにおける骨格筋量増加に関連する。例えば、ピエモンテ（Ｐｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅ）およびベルジアン・ブルー（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ）ウシ品種は、著しい筋量増加を引き起こす、ＭＳＴＮにおける機能喪失型変異を保有する［Ｇｒｏｂｅｔら（１９９７年）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １７巻：７１〜７４頁］。ヒトにおいて、ＭＳＴＮの不活性対立遺伝子は、筋量増加と、報告によれば、例外的な強度に関連する［Ｓｃｈｕｅｌｋｅら（２００４年）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００４年、３５０巻：２６８２〜８頁］。逆に、ヒト免疫不全ウイルスによる感染に関連するヒトにおける筋消耗（ｍｕｓｃｌｅ  ｗａｓｔｉｎｇ）は、ＭＳＴＮ発現の増加を伴う［Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら（１９９８年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５巻：１４９３８〜１４９４３頁］。
【００２４】
ミオスタチン活性の阻害は、衰弱性筋肉損失（ｄｅｂｉｌｉｔａｔｉｎｇ  ｍｕｓｃｌｅ  ｌｏｓｓ）に関連する遺伝性および後天性臨床状態を有する患者における筋量および強度を増加させるのに有効な戦略となり得る［Ｌｅｅ（２００４年）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２０巻：６１〜８６頁；Ｔｓｕｃｈｉｄａ（２００８年）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖ  １１巻：４８７〜４９４頁；Ｒｏｄｉｎｏ−Ｋｌａｐａｃら（２００９年）Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ  ３９巻：２８３〜２９６頁］。筋肉疾患のマウスモデルによる研究は、ミオスタチンシグナル伝達の損失が、筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、悪液質、ステロイド誘導性ミオパチーおよび加齢性サルコペニアを含む幅広い疾患状況において有益な効果を有することを示唆した。さらに、ミオスタチンシグナル伝達の損失は、代謝性疾患のモデルにおいて脂肪蓄積を減少し、グルコース代謝を改善することが示され、ミオスタチンを標的化することが、肥満および２型糖尿病などの疾患に対する適用も有し得る可能性を高める。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでのミオスタチンシグナル伝達の治療上の阻害のための方法の同定に相当な関心がある。
【００２５】
他のスーパーファミリーリガンドと同様に、ミオスタチンは、シグナルペプチド、Ｎ末端プロドメインおよびＣ末端成熟ドメインからなる前駆体として合成される。合成の際に、ミオスタチンプロドメインは、成熟ミオスタチンと非共有結合により相互作用して、二量体化を容易にするコンフォメーションにこれらの分子を維持する［Ｈａｒｒｉｓｏｎら（２０１１年）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ２９巻：１７４〜１８６頁］。二量体の前駆体の切断後に、双子のプロドメインは初期に、成熟タンパク質に取り付けられたままとなり、潜在的複合体を形成する［（Ｍｉｙａｚｏｎｏら（１９８８年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３巻：６４０７〜６４１５頁；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（１９８８年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３巻：７６４６〜７６５４頁；Ｂｒｏｗｎら（１９９０年）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３巻：３５〜４３頁］。大部分のＴＧＦβリガンドよりも大きい程度まで、分泌されたミオスタチンは初期に、潜在的または半潜在的（ｓｅｍｉｌａｔｅｎｔ）形態で存在し、次いでその活性は、他の因子によって曝露され得る［Ｗｏｌｆｍａｎら（２００３年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００巻：１５８４２〜１５８４６頁；Ｓｚｌａｍａら（２０１３年）ＦＥＢＳ  Ｊ  ２８０巻：３８２２〜３８３９頁］。潜在的ミオスタチンは、細胞外空間に存在し、そこで、プロドメインは、マトリクスタンパク質と相互作用して、ミオスタチンバイオアベイラビリティを調節する［Ａｎｄｅｒｓｏｎら（２００８年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８３巻：７０２７〜７０３５頁；Ｓｅｎｇｌｅら（２０１１年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８６巻：５０８７〜５０９９頁］、または循環に入り、そこで、ミオスタチンの大部分は、この潜在的形態で存在する［Ｈｉｌｌら（２００２年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７巻：４０７３５〜４０７４１頁］。細胞外区画において、プロテオグリカンであるパールカンとミオスタチンプロドメインとの相互作用は、標的細胞付近での潜在的複合体の濃度を増加させる。潜在的ミオスタチンは、細胞外マトリクスに位置するメタロプロテアーゼによる会合したプロドメインの一方または両方の部位特異的切断によって、活性型に変換される［Ｗｏｌｆｍａｎら（２００３年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００巻：１５８４２〜１５８４６頁］。
【００２６】
そのプロドメインから放出されると、ミオスタチンは、アクチビンＩＩ型受容体（ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢ）およびアクチビンＩ型受容体（一般にＡＬＫ４またはＡＬＫ７）を取り込む三元複合体の形成を誘導することにより、その細胞性効果を発揮する。このような活性化された受容体複合体は続いて、Ｓｍａｄタンパク質（Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３、Ｓｍａｄ２／３）をリン酸化し、これにより、Ｓｍａｄタンパク質が、Ｓｍａｄ４と転写複合体を形成することが可能になり、これは、特異的標的遺伝子の発現を調節する［例えば、ＭａｔｈｅｗｓおよびＶａｌｅ（１９９１年）Ｃｅｌｌ  ６５巻：９７３〜９８２頁；Ａｔｔｉｓａｎｏら（１９９２年）Ｃｅｌｌ  ６８巻：９７〜１０８頁；Ｍａｓｓａｇｕｅ（２０００年）Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１巻：１６９〜１７８頁を参照］。Ｉ型およびＩＩ型受容体は、システインに富む領域を備えるリガンド結合性細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび予測されるセリン／スレオニン特異性を備える細胞質ドメインで構成された膜貫通タンパク質である。ＩＩ型受容体は、リガンドの結合に要求される一方、Ｉ型受容体は、シグナル伝達に必須である。
【００２７】
ミオスタチンが、最もよく確立された事例であるが、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢを介してシグナル伝達する１つまたは複数の追加的なリガンドも、筋肉肥大の内在性阻害剤として意味づけられた［Ｌｅｅら（２００５年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２巻：１８１１７〜１８１２２頁］。アクチビンは、ＴＧＦβスーパーファミリー内の二量体リガンドのファミリーであり、インヒビン−βサブユニットで構成されている。特に、アクチビンは、ホモ二量体型アクチビンＡ（βＡβＡ）、アクチビンＢ（βＢβＢ）、アクチビンＣ（βＣβＣ）およびアクチビンＥ（βＥβＥ）、ならびにアクチビンＡＢ（βＡβＢ）を含むヘテロ二量体型、およびβＣまたはβＥを含有するヘテロ二量体を含む。加えて、構造的に関係するヘテロ二量体インヒビンは、様々な組織におけるアクチビンシグナル伝達の重要な阻害性調節因子である。
【００２８】
アクチビンは、多様な生理的および病理的役割を果たす。複数系統の証拠は、ミオスタチンと協調して機能して、筋量を限定するものとしてアクチビンを意味づけ、アクチビンアンタゴニストは、ｉｎ  ｖｉｖｏで筋肉成長を促進する、または筋肉損失を相殺することができる［Ｌｉｎｋら（１９９７年）Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２３３巻：３５０〜３６２頁；Ｈｅら（２００５年）Ａｎａｔ  Ｅｍｂｒｙｏｌ  （Ｂｅｒｌ）２０９巻：４０１〜４０７頁；Ｓｏｕｚａら（２００８年）Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２２巻：２６８９〜２７０２頁；Ｇｉｌｓｏｎら（２００９年）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２９７巻：Ｅ１５７〜Ｅ１６４頁；Ｌｅｅら（２０１０年）Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２４巻：１９９８〜２００８頁；Ｚｈｏｕら（２０１０年）Ｃｅｌｌ  １４２巻：５３１〜４３頁］。アクチビンは、骨の恒常性において主要な役割を果たし、赤血球生成の調節因子として意味づけられる［Ｍａｇｕｅｒ−Ｓａｔｔａら（２００３年）Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２８２巻：１１０〜１２０頁；Ｆｉｅｌｄｓら（２０１３年）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ２２巻：８７〜１０１頁］。近年の研究は、創傷治癒、血管新生、炎症、免疫、線維症およびがんにおけるアクチビンの役割について指摘した［Ａｎｔｓｉｆｅｒｏｖａら（２０１２年）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １２５巻：３９２９〜３９３７頁］。アクチビン／インヒビンシグナル伝達経路は、卵巣、精巣および副腎のがんに関連する。加えて、アクチビンＡは、肝細胞増殖の主要な阻害性調節因子であり、アクチビンシグナル伝達の調節不全は、炎症、線維症、肝不全およびがんを含む肝疾患に関係づけられた［Ｋｒｅｉｄｌら（２００９年）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  １巻：１７〜２７頁］。アクチビンの他の機能は、中胚葉系分化の誘導、細胞周期のモジュレーション、ニューロン細胞生存の支持および内分泌細胞活性の協調を含む［ＤｅＰａｏｌｏら（１９９１年）Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  １９８巻：５００〜５１２頁；Ｄｙｓｏｎら（１９９７年）Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ７巻：８１〜８４頁；Ｗｏｏｄｒｕｆｆ（１９９８年）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５５巻：９５３〜９６３頁］。
【００２９】
本明細書で記載される通り、「アクチビンＡ」に結合する薬剤は、単離されたβＡサブユニットの文脈であるか、二量体の複合体（例えば、βＡβＡホモ二量体またはβＡβＢヘテロ二量体）としてであるかにかかわらず、βＡサブユニットに特異的に結合する薬剤である。ヘテロ二量体複合体（例えば、βＡβＢヘテロ二量体）の場合、「アクチビンＡ」に結合する薬剤は、βＡサブユニット内に存在するエピトープに特異的であるが、複合体の非βＡサブユニット（例えば、複合体のβＢサブユニット）内に存在するエピトープには結合しない。同様に、「アクチビンＡ」に拮抗（阻害）する本明細書で開示される薬剤は、単離されたβＡサブユニットの文脈であるか、二量体の複合体（例えば、βＡβＡホモ二量体またはβＡβＢヘテロ二量体）としてであるかにかかわらず、βＡサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性を阻害する薬剤である。βＡβＢヘテロ二量体の場合、「アクチビンＡ」を阻害する薬剤は、βＡサブユニットの１つまたは複数の活性を特異的に阻害するが、複合体の非βＡサブユニット（例えば、複合体のβＢサブユニット）の活性は阻害しない薬剤である。この原理は、「アクチビンＢ」、「アクチビンＣ」および「アクチビンＥ」に結合するおよび／またはこれらを阻害する薬剤にも適用される。「アクチビンＡＢ」に拮抗する本明細書で開示される薬剤は、βＡサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性およびβＢサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性を阻害する薬剤である。
【００３０】
骨形成タンパク質−１１（ＢＭＰ１１）としても公知の増殖分化因子−１１（ＧＤＦ１１）は、マウス発生の際に尾芽、肢芽、上顎および顎弓、ならびに後根神経節において発現される［例えば、Ｎａｋａｓｈｉｍａら（１９９９年）Ｍｅｃｈ．  Ｄｅｖ．８０巻：１８５〜１８９頁を参照］。ＧＤＦ１１は、中胚葉系および神経組織の両方のパターン形成において特有の役割を果たし［例えば、Ｇａｍｅｒら（１９９９年）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２０８巻：２２２〜３２頁を参照］、発生中のニワトリ肢における軟骨形成および筋形成の負の調節因子である［例えば、Ｇａｍｅｒら（２００１年）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２２９巻：４０７〜２０頁を参照］。脳におけるＧＤＦ１１の発現は、ＧＤＦ１１が、神経活性を調節することもでき、ＧＤＦ１１が、嗅上皮における神経発生を阻害することを示唆する［例えば、Ｗｕら（２００３年）Ｎｅｕｒｏｎ．３７巻：１９７〜２０７頁を参照］。近年の研究は、赤血球生成における、特に、後期赤血球分化の際の重要な調節シグナルとしてＧＤＦ１１を意味づける［Ｓｕｒａｇａｎｉら（２０１４年）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０巻：４０８〜４１４頁］。加えて、ＧＤＦ１１は、ミオスタチンとの構造的類似性、共有されるシグナル伝達構成要素および骨格筋におけるＧＤＦ１１発現に基づき、筋肉肥大の潜在的な阻害剤として調査された［ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９９年）Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．２２巻：２６０〜２６４頁］。ＧＤＦ１１は、ミオスタチンと同様に、そのプロドメインとの潜在的複合体で全身循環において検出可能であり、ｅｘ  ｖｉｖｏで筋肉細胞分化を阻害するが［Ｓｏｕｚａら（２００８年）Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２２巻：２６８９〜２７０２頁］、遺伝学的研究は、ミオスタチン欠乏の条件（ｃｏｎｄｔｉｏｎ）下であっても、筋肉サイズ、線維数または線維の型の調節におけるＧＤＦ１１の役割を明らかにしなかった［ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（２００９年）ＢＭＣ  Ｄｅｖｅｌ  Ｂｉｏｌ  ９巻：２４頁］。したがって、依然として、ＧＤＦ１１が、筋量の調節に寄与するかについては、未だに決定されていない。
【００３１】
Ｂ．ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドの細胞外阻害剤
上に記すリガンド会合したプロドメインに加えて、いくつかの他の天然のタンパク質が、細胞外でＴＧＦβスーパーファミリーリガンドを阻害し、これにより、決定的な仕方でこれらのリガンドの活性を調節する。ヒトにおいて、ミオスタチン、アクチビンおよびＧＤＦ１１の可溶性内在性阻害剤は、複数のフォリスタチンアイソフォーム、ＦＬＲＧとして公知のフォリスタチン様遺伝子（ＦＳＴＬ３）の産物、ならびに乳清（ｗｈｅｙ）酸性タンパク質ドメイン（Ｗ）、フォリスタチン（ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）−カザール（Ｋａｚａｌ）ドメイン（Ｆ）、免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）ドメイン（Ｉ）、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型プロテアーゼ阻害剤モジュールに関係する２つのタンデムドメイン（ＫＫ）およびネトリン（ｎｅｔｒｉｎ）ドメイン（Ｎ）を含む、その共有されるドメイン構造に基づきＷＦＩＫＫＮ１およびＷＦＩＫＫＮ２と命名される一対の近縁のタンパク質を含む。フォリスタチン、ＦＬＲＧ、ＷＦＩＫＫＮ１およびＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチドはそれぞれ、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドへの選択的結合に重要な、「フォリスタチンドメイン」と一般に称される１つまたは複数の構造モチーフを含有する。したがって、本明細書で開示される通り、用語「フォリスタチン関連ポリペプチド」は、例えば、天然のフォリスタチン、ＦＬＲＧ、ＷＦＩＫＫＮ１およびＷＦＩＫＫＮ２配列、ならびにそれらの改変体および切断型を含む。
【００３２】
ミオスタチン、アクチビンおよび／またはＧＤＦ１１の細胞外阻害剤のうち最もよく研究されているのは、フォリスタチンであり、単一遺伝子（ＦＳＴ）から、複数のアイソフォームが生成される。フォリスタチンは、高等動物のほとんど全ての組織において発現される自己分泌糖タンパク質である。これは初期に、卵胞液から単離されており、下垂体前葉からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）分泌を阻害したタンパク質画分として同定された［Ｅｓｃｈら（１９８７年）Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １巻：８４９〜８５５頁］。ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達におけるフォリスタチンの重要性は、フォリスタチン欠損マウスにおいて観察される複数の欠損および周産期死亡によって例証される［Ｍａｔｚｕｋら（１９９５年）Ｎａｔｕｒｅ  ３７４巻：３６０〜３６３頁］。出生後に、フォリスタチンは、ミオスタチンおよびアクチビン［Ｌｅｅら（２０１０年）Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２４巻：１９９８〜２００８頁］ならびに潜在的にはＧＤＦ１１を阻害することにより、筋肉成長を促進する。フォリスタチンの生物学的活性は、これらのリガンドに高アフィニティーで結合し、これにより、リガンドとその細胞表面受容体ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢとの相互作用を防止するその能力から生じる［Ｎａｋａｍｕｒａら（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７巻：８３６〜８３８頁；Ｋｏｇａｗａら（１９９１年）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２８巻：１４３４〜１４４０頁；Ｓｃｈｎｅｙｅｒら（１９９４年）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３５巻：６６７〜６７４頁；ｄｅ  Ｗｉｎｔｅｒら（１９９６年）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １１６巻：１０５〜１１４頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（２００５年）Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ９巻：５３５〜５４３頁］。加えて、フォリスタチンは、一部のアイソフォームにおいて細胞表面におけるプロテオグリカンとのフォリスタチン相互作用を容易にするヘパリン結合性ドメインを含有し［Ｉｎｏｕｙｅら（１９９２年）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ９０巻：１〜６頁］、これにより、リガンド作用の部位の付近におけるより高い濃度のフォリスタチンを維持する。さらに、ミオスタチンへのフォリスタチン（ＦＳＴ２８８）の結合は、ヘパリンに対するフォリスタチンのアフィニティーを実質的に増加させ［Ｃａｓｈら（２００９年）ＥＭＢＯ  Ｊ  ２８巻：２６６２〜２６７６頁］、これにより、リガンド結合が、フォリスタチン−ミオスタチン複合体の細胞表面局在化を促進することを示唆する。
【００３３】
フォリスタチンは、１０個のシステインの保存された線形パターンを包含し、分子内ジスルフィド結合の特徴的な配置を形成する「フォリスタチンドメイン」として公知の特徴的な構造モチーフの３反復を含有する［Ｅｓｃｈら（１９８７年）Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １巻：８４９〜８５５頁］。フォリスタチンドメインは、本明細書において、システインに富む反復を特徴とする、アミノ酸ドメインまたはアミノ酸ドメインをコードする核酸配列と規定される。フォリスタチンドメインは、典型的に、６５〜９０アミノ酸の長さを包含し、１０個の保存されたシステイン残基、およびカザールセリンプロテアーゼ阻害剤ドメインと同様の領域を含有する。よって、フォリスタチンドメインは、「フォリスタチン／カザールドメイン」または「フォリスタチン／カザール様ドメイン」と称されることもある。一般に、システイン残基の間のループ領域は、配列可変性を呈示するが、ある程度の保存が存在する。第４および第５のシステインの間のループは、通常短く、１または２アミノ酸のみを含有する。第７および第８のシステインの間のループにおけるアミノ酸は、一般に、最も高度に保存されており、（Ｇ，Ａ）−（Ｓ，Ｎ）−（Ｓ，Ｎ，Ｔ）−（Ｄ，Ｎ）−（Ｇ，Ｎ）のコンセンサス配列と、続く（Ｔ，Ｓ）−Ｙモチーフを含有する。第９および第１０のシステインの間の領域は、一般に、別のアミノ酸によって隔てられた２個の疎水性残基（特にＶ、ＩまたはＬ）を取り込むモチーフを含有する。
【００３４】
用語「フォリスタチンポリペプチド」は、フォリスタチンファミリーの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、例えば、リガンド結合（例えば、ミオスタチン、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ）を含む有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合物およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを指すのに使用される。例えば、フォリスタチンポリペプチドは、フォリスタチンポリペプチドの配列（配列番号１〜１７）に、少なくとも約８０％同一であり、好ましくは、配列番号１〜１７のいずれかに、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはこれを超える同一性を有する配列を有するいずれか公知のフォリスタチンの配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。用語「フォリスタチン融合ポリペプチド」は、上記で言及されたポリペプチドのいずれかを、異種（非フォリスタチン）部分と共に含む、融合タンパク質を指す場合がある。アミノ酸配列は、配列番号３により表される、ヒトフォリスタチンの長い（３１５アミノ酸）形態内で固有に見出されない場合、フォリスタチンに対して異種であると理解される。本明細書では、異種部分の多くの例が提供され、このような異種部分は、アミノ酸配列によって、融合タンパク質のフォリスタチンポリペプチド部分に、直接隣接する場合もあり、あるいはリンカーまたは他の配列などの介在アミノ酸配列により隔てられる場合もある。加えて、ポリペプチドのライブラリーを作製および検査するための方法が、本明細書に記載されており、このような方法は、フォリスタチンの改変体の作製および検査にも関係する。
【００３５】
フォリスタチンは、選択的なｍＲＮＡスプライシングおよびタンパク質の可変的なグリコシル化に基づき、分子量の範囲を３１〜４９ｋＤａとする、単鎖ポリペプチドである。フォリスタチン遺伝子から選択的にスプライシングされたｍＲＮＡは、２８８アミノ酸（すなわち、ＦＳＴ２８８）および３１５アミノ酸（すなわち、ＦＳＴ３１５）のアイソフォームをコードし、後者は、タンパク質分解によりプロセシングして、さらに別のアイソフォームであるフォリスタチン３０３（ＦＳＴ３０３）を生じることができる。天然のヒトフォリスタチンポリペプチドのアミノ酸配列の解析は、これが、以下の５つのドメインを含むことを明らかにした：シグナル配列（配列番号１のアミノ酸１〜２９）、Ｎ末端ドメイン（ＦＳＴＮＤ）（配列番号１のアミノ酸３０〜９４）、フォリスタチンドメイン−１（ＦＳＴＦＤ１）（配列番号１のアミノ酸９５〜１６４）、フォリスタチンドメイン−２（ＦＳＴＦＤ２）（配列番号１のアミノ酸（１６８〜２３９）およびフォリスタチンドメイン−３（ＦＳＴＦＤ３）（配列番号１のアミノ酸２４５〜３１６）。Ｓｈｉｍａｎｓｋｉら（１９８８年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５巻：４２１８〜４２２２頁を参照されたい。
【００３６】
ヒトフォリスタチン−２８８（ＦＳＴ２８８）前駆体は、シグナルペプチドを、点線の下線で指し示し、Ｎ末端ドメイン（ＦＳＴＮＤ）を、破線の下線で指し示し、フォリスタチンドメイン１〜３（ＦＳＴＦＤ１、ＦＳＴＦＤ２、ＦＳＴＦＤ３）を、実線の下線で指し示す、以下のアミノ酸配列（配列番号１）（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００６３４１；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ１９８８３−２）を有する。
【化１】
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【００３７】
成熟（プロセシング後）ヒトフォリスタチン改変体であるＦＳＴ２８８は、Ｎ末端ドメインを、破線の下線で指し示し、フォリスタチンドメイン１〜３を、実線の下線で指し示す、以下のアミノ酸配列（配列番号２）を有する。さらに、最初のシステインの前の、最初のアミノ酸であるＧまたはＮのいずれかは、プロセシングにより除去することもでき、いかなる影響（ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ）も伴わずに、意図的に消失させることもでき、このようなわずかに小型のポリペプチドを含むポリペプチドもさらに含まれることが認識されるであろう。
【化２】
2018510637.tif 000004
【００３８】
ヒトフォリスタチン−３１５（ＦＳＴ３１５）前駆体は、シグナルペプチドを、点線の下線で指し示し、Ｎ末端ドメイン（ＦＳＴＮＤ）を、破線の下線で指し示し、フォリスタチンドメイン１〜３（ＦＳＴＦＤ１、ＦＳＴＦＤ２、ＦＳＴＦＤ３）を、実線の下線で指し示す、以下のアミノ酸配列（配列番号３）（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０３７５４１．１；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ１９８８３）を有する。
【化３】
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【００３９】
成熟（プロセシング後）ヒトＦＳＴ３１５は、Ｎ末端ドメインを、破線の下線で指し示し、フォリスタチンドメイン１〜３を、実線の下線で指し示す、以下のアミノ酸配列（配列番号４）を有する。さらに、最初のシステインの前の、最初のアミノ酸であるＧまたはＮのいずれかは、プロセシングにより除去することもでき、いかなる影響も伴わずに、意図的に消失させることもでき、このようなわずかに短いポリペプチドを含むポリペプチドもさらに含まれることが認識されるであろう。
【化４】
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【００４０】
本開示のフォリスタチン関連ポリペプチドは、フォリスタチンタンパク質の任意の天然に存在するドメインのほか、有用な活性を保持する、その改変体（例えば、変異体、フラグメントおよびペプチド模倣物形態）を含み得る。例えば、ＦＳＴ３１５およびＦＳＴ２８８が、ミオスタチン、アクチビン（アクチビンＡおよびアクチビンＢ）およびＧＤＦ１１に対する高アフィニティーを有し、フォリスタチンドメイン（例えば、ＦＳＴＮＤ、ＦＳＴＦＤ１、ＦＳＴＦＤ２およびＦＳＴＦＤ３）は、このようなＴＧＦβリガンドの結合に関与すると考えられることが周知である。しかし、これら４種のドメインのそれぞれが、これらのＴＧＦ−βリガンドに対し異なるアフィニティーを有するという証拠がある。例えば、近年の研究は、Ｎ末端ドメインおよび２個のＦＳＴＦＤ１ドメインだけをタンデムで含むポリペプチド構築物は、ミオスタチンに対する高アフィニティーを保持し、アクチビンに対するアフィニティーは、ほとんど示さないか、または全く示さず、マウスに導入されると、遺伝子発現により、全身の筋成長を促進することを実証している［Ｎａｋａｔａｎｉら（２００８年）ＦＡＳＥＢ  ２２巻：４７８〜４８７頁］。したがって、本開示は、部分的に、天然に存在するＦＳＴタンパク質と比べて所定のＴＧＦβリガンドの選択的な結合および／または阻害（例えば、アクチビンに対する有意に低減したアフィニティーを有しつつ、ミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｉｎ）に対する高アフィニティーを維持する）を実証する改変体フォリスタチンタンパク質を包含する。
【００４１】
ある特定の態様では、本開示は、下記に示されるＦＳＴＮＤドメイン（配列番号５）と、例えば、１つまたは複数の異種ポリペプチドとを含むポリペプチドを含み、さらに、下記に示される例における通り（配列番号６）、最初のシステインの前の、最初のアミノ酸であるＧまたはＮのいずれかを欠失させ得ることが認識されるであろう。
【化５】
2018510637.tif 000007
【００４２】
ある特定の態様では、本開示は、下記に示される通り、ヘパリンに結合すると共に、ミオスタチン（および／またはＧＤＦ１１）にも結合する、最小限のコア活性を含有するＦＳＴＦＤ１ドメイン（配列番号７）と、例えば、１つまたは複数の異種ポリペプチドとを含むポリペプチドを含む。
【化６】
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【００４３】
ある特定の態様では、本開示は、下記に示されるＦＳＴＦＤ２ドメイン（配列番号８）および／またはＦＳＴＦＤ３ドメイン（配列番号９）と、例えば、１つまたは複数の異種ポリペプチドとを含むポリペプチドを含む。
【化７】
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【００４４】
ＦＳＴＦＤ１配列は、ＦＳＴＮＤドメインをさらに含むポリペプチドとして発現させることにより、構造的文脈で維持されると有利であり得る。したがって、本開示は、下記に示されるＦＳＴＮＤ−ＦＳＴＦＤ１配列（配列番号１０）と、例えば、１つまたは複数の異種ポリペプチドとを含むポリペプチドを含み、さらに、最初のシステインの前の、最初のアミノ酸であるＧまたはＮのいずれかは、プロセシングにより除去することもでき、いかなる影響も伴わずに、意図的に消失させることもでき、このようなわずかに短いポリペプチドを含むポリペプチドもさらに含まれることが認識されるであろう。
【化８】
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【００４５】
Ｎａｋａｔａｎｉらにより実証されている通り、ＦＳＴＮＤ−ＦＳＴＦＤ１−ＦＳＴＦＤ１構築物は、マウスにおいて遺伝子発現させると、全身筋成長を付与するのに十分であり、したがって、本開示は、下記のアミノ酸配列（配列番号１１）と、例えば、１つまたは複数の異種ポリペプチドとを含むポリペプチドを含む。
【化９】
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【００４６】
ＦＳＴＦＤ１配列は、ミオスタチンおよびＧＤＦ１１への結合を付与する一方で、アクチビン、特にアクチビンＡに加え、アクチビンＢもまた、筋肉の負の調節因子であることが実証されており、したがって、ミオスタチン／ＧＤＦ１１リガンド群およびアクチビンＡ／アクチビンＢリガンド群の両方を阻害するフォリスタチンポリペプチドは、より強力な筋効果をもたらし得る。ＦＳＴＦＤ２が、アクチビンＡおよびＢへの結合を付与することを考慮すると、本開示は、ＦＳＴＦＤ１−ＦＳＴＦＤ２（配列番号１２）およびＦＳＴＦＤ１−ＦＳＴＦＤ２−ＦＳＴＦＤ３（配列番号１３）を含むポリペプチド、ならびにＦＳＴＮＤ−ＦＳＴＦＤ１−ＦＳＴＦＤ２（配列番号１４）と、例えば、１つまたは複数の異種ポリペプチドとを含む構築物を提供する。
【化１０】
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【００４７】
２９１アミノ酸のフォリスタチンポリペプチド（天然に存在するＦＳＴ３１５の切断型を表す）は、ある特定の実施形態では、有利な特性を有する場合がある。したがって、本開示には、プロセシングされていないＦＳＴ２９１ポリペプチド（配列番号１５）および成熟ＦＳＴ２９１ポリペプチド（配列番号１６）が含まれ、異種タンパク質と組み合わせることができる。さらに、最初のシステインの前の、最初のアミノ酸であるＧまたはＮのいずれかは、プロセシングにより除去することもでき、いかなる影響も伴わずに、意図的に消失させることもでき、下記に示される例（配列番号１７）など、このようなわずかにより短いポリペプチドを含むポリペプチドもさらに含まれることが認識されるであろう。
【化１１】
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【００４８】
本明細書において、フォリスタチンタンパク質は、ＦＳＴと称する場合がある。ＦＳＴ２８８など、数字が後続する場合、これは、このタンパク質が、フォリスタチンの２８８アミノ酸アイソフォームであることを指し示す。ＦＳＴ２８８−Ｆｃと提示される場合、これは、Ｆｃドメインが、ＦＳＴ２８８のＣ末端に融合されており、介在リンカーを含んでも含まなくてもよいことを指し示す。この場合のＦｃとは、この用語が本明細書で定義される通り、任意の免疫グロブリンＦｃ部分であり得る。ＦＳＴ２８８−Ｇ１Ｆｃと提示される場合、これは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分が、ＦＳＴ２８８のＣ末端において融合されていることを指し示す。それとは反対のことが指し示されていない限り、この命名法により記載されるタンパク質は、ヒトフォリスタチンタンパク質を表すであろう。
【００４９】
ＦＳＴＮによってコードされる天然のフォリスタチンアイソフォームと近縁であるのは、ＦＳＴＬ３遺伝子によってコードされる天然に存在するタンパク質であり、フォリスタチン関連遺伝子（ＦＬＲＧ）、フォリスタチン様３（ＦＳＴＬ３）またはフォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ）として代替的に公知である［Ｓｃｈｎｅｙｅｒら（２００１年）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １８０巻：３３〜３８頁］。フォリスタチンと同様に、ＦＬＲＧは、高アフィニティーでミオスタチン、アクチビンおよびＧＤＦ１１に結合し、これにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるこれらの生物活性を阻害する［Ｓｉｄｉｓら（２００６年）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４７巻：３５８６〜３５９７頁］。フォリスタチンとは異なり、ＦＬＲＧは、ヘパリン結合性配列を保持せず、細胞表面プロテオグリカンに結合することができず、したがって、細胞表面のすぐ近くにおいてＦＳＴ２８８よりも強力ではないアクチビンの阻害剤である。フォリスタチンとは対照的に、ＦＬＲＧは、成熟ミオスタチンに結合して血液中においても循環するため、この点についてミオスタチンプロペプチドに似ている［Ｈｉｌｌら（２００２年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７巻：４０７３５〜４０７４１頁］。フォリスタチンとは異なり、マウスにおけるＦＬＲＧ欠乏は致死的ではないが、種々の代謝性表現型を引き起こす［Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら（２００７年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４巻：１３４８〜１３５３頁］。
【００５０】
ＦＬＲＧの全体的な構造は、フォリスタチンのものに密接に似ている。天然のヒトＦＬＲＧ前駆体は、以下の４つのドメインを含む単鎖ポリペプチドである：シグナル配列（配列番号１８のアミノ酸１〜２６）、Ｎ末端ドメイン（ＦＬＲＧＮＤ）（配列番号１８のアミノ酸３８〜９６）、ならびに本明細書においてＦＬＲＧＦＤ１（配列番号１８のアミノ酸９９〜１６７）およびＦＬＲＧＦＤ２（配列番号１８のアミノ酸１７１〜２４３）と称される２種のフォリスタチンドメイン。
【００５１】
用語「ＦＬＲＧポリペプチド」は、ＦＬＲＧの任意の天然に存在するポリペプチドと共に、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合物およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを指すのに使用される。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＦＬＲＧポリペプチドは、ミオスタチン、ＧＤＦ１１またはアクチビン、特に、アクチビンＡ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ  Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達のリガンド媒介性活性化）に結合するおよび／またはその活性を阻害する。リガンド結合特性を保持するＦＬＲＧポリペプチドの改変体は、ＦＬＲＧおよびリガンドの間の相互作用をアッセイするための慣例的な方法を使用して同定することができる（例えば、ＵＳ６，５３７，９６６を参照）。加えて、ポリペプチドのライブラリーを作製および検査するための方法が、本明細書に記載されており、このような方法は、ＦＬＲＧの改変体の作製および検査にも関係する。
【００５２】
例えば、ＦＬＲＧポリペプチドは、ＦＬＲＧポリペプチドの配列（例えば、配列番号１８〜２５）に、少なくとも約８０％同一であり、任意選択で、配列番号１８〜２５のいずれかに、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはこれを超える同一性を有する配列を有するいずれか公知のＦＬＲＧの配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。用語「ＦＬＲＧ融合ポリペプチド」は、異種（非ＦＬＲＧ）部分と共に上記で言及されたポリペプチドのいずれかを含む融合タンパク質を指す場合がある。アミノ酸配列は、配列番号１８により表されるヒトＦＬＲＧに固有に見出されない場合、ＦＬＲＧに対して異種であると理解される。本明細書では、異種部分の多くの例が提供され、このような異種部分は、アミノ酸配列によって、融合タンパク質のＦＬＲＧポリペプチド部分に、直接隣接する場合もあり、あるいはリンカーまたは他の配列などの介在アミノ酸配列により隔てられる場合もある。
【００５３】
ヒトＦＬＲＧ前駆体は、シグナルペプチドを、点線の下線で指し示し、Ｎ末端ドメイン（ＦＬＲＧＮＤ）を、破線の下線で指し示し、２個のフォリスタチンドメイン（ＦＳＴＦＤ１、ＦＳＴＦＤ２）を、実線の下線で指し示す、以下のアミノ酸配列（配列番号１８）（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００５８５１．１のアミノ酸１〜２６３）を有する。
【化１２】
2018510637.tif 000014
【００５４】
成熟（プロセシング後）ヒトＦＬＲＧは、Ｎ末端ドメインを、破線の下線で指し示し、２個のフォリスタチンドメインを、実線の下線で指し示す、以下のアミノ酸配列（配列番号１９）（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００５８５１．１のアミノ酸３８〜２６３）を含む。さらに、最初のシステイン（配列番号１８における３８位）の前の、アミノ酸（配列番号１８の２７〜３７位）のいずれかを、実質的な影響を伴わずに含めてよく、このようなわずかにより長いポリペプチドを含むポリペプチドが含まれることが認識されるであろう。
【化１３】
2018510637.tif 000015
【００５５】
ある特定の態様では、本開示は、下記に示される通り、アクチビンＡと比較して、ミオスタチンと異なって相互作用するＦＬＲＧＮＤドメイン（配列番号２０）［Ｃａｓｈら（２０１２年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８７巻：１０４３〜１０５３頁］と、例えば、１つまたは複数の異種ポリペプチドとを含むポリペプチドを含む。さらに、下記に示される例における通り（配列番号２１）、最初のシステインの前の、最初のアミノ酸であるＧまたはＮのいずれかを欠失させ得ることが認識されるであろう。
【化１４】
2018510637.tif 000016
【００５６】
ある特定の態様では、本開示は、下記に示されるＦＬＲＧＦＤ１ドメイン（配列番号２２）と、例えば、１つまたは複数の異種ポリペプチドとを含むポリペプチドを含む。
【化１５】
2018510637.tif 000017
【００５７】
ある特定の態様では、本開示は、下記に示されるＦＳＴＦＤ２ドメイン（配列番号２３）と、例えば、１つまたは複数の異種ポリペプチドとを含むポリペプチドを含む。
【化１６】
2018510637.tif 000018
【００５８】
ＦＬＲＧＦＤ配列は、ＦＬＲＧＮＤドメインをさらに含むポリペプチドとして発現させることにより、構造的文脈で維持されると有利であり得る。したがって、本開示は、下記に示されるＦＬＲＧＮＤ−ＦＬＲＧＦＤ１配列（配列番号２４）およびＦＬＲＧＮＤ−ＦＬＲＧＦＤ１−ＦＬＲＧＦＤ２配列（配列番号２５）と、例えば、１つまたは複数の異種ポリペプチドとを含むポリペプチドを含む。さらに、最初のシステインの前の、最初のアミノ酸であるＧまたはＮのいずれかは、プロセシングにより除去することもでき、いかなる影響も伴わずに、意図的に消失させることもでき、このようなわずかに短いポリペプチドを含むポリペプチドもさらに含まれることが認識されるであろう。
【化１７】
2018510637.tif 000019
【００５９】
ＦＬＲＧ−Ｆｃと提示される場合、これは、Ｆｃドメインが、ＦＬＲＧのＣ末端に融合されており、介在リンカーを含んでも含まなくてもよいことを指し示す。この場合のＦｃとは、この用語が本明細書で定義される通り、任意の免疫グロブリンＦｃ部分であり得る。ＦＬＲＧ−Ｇ１Ｆｃと提示される場合、これは、ＩｇＧ１のＦｃ部分が、ＦＬＲＧのＣ末端において融合されていることを指し示す。それとは反対のことが指し示されていない限り、この命名法により記載されるタンパク質は、ヒトＦＬＲＧタンパク質を表すであろう。
【００６０】
ＦＳＴＮおよびＦＳＴＬ３に加えて、他の２種の遺伝子が同定され、それらのタンパク質産物は、フォリスタチンドメインモチーフを含有し、ミオスタチンおよびＧＤＦ１１の細胞外阻害剤として機能する。ヒトにおいて、これら近縁の遺伝子は、乳清酸性タンパク質ドメイン、フォリスタチン−カザールドメイン、免疫グロブリンドメイン、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤モジュールに関係する２つのタンデムドメインおよびネトリンドメインを含むそれらの共有されるドメイン構造に基づき、ＷＦＩＫＫＮ１およびＷＦＩＫＫＮ２と命名されている［Ｔｒｅｘｌｅｒら（２００１年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８巻：３７０５〜３７０９頁；Ｔｒｅｘｌｅｒら（２００２年）Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ３８３巻：２２３〜２２８頁］。ＷＦＩＫＫＮ２は、ＷＦＩＫＫＮ関連タンパク質（ＷＦＩＫＫＮＲＰ）としても公知であり、これらのタンパク質のマウス対応物は、それらのリガンド結合能力に基づき、それぞれＧＤＦ関連血清タンパク質−２（Ｇａｓｐ２）およびＧａｓｐ１と命名されている［Ｈｉｌｌら（２００３年）Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １７巻：１１４４〜１１５４頁］。
【００６１】
天然のＷＦＩＫＫＮ１（ＧＡＳＰ２）およびＷＦＩＫＫＮ２（ＧＡＳＰ１）タンパク質は、互いともフォリスタチンまたはＦＬＲＧとも全く異なるのにもかかわらず、重複する活性プロファイルを保持する。ＷＦＩＫＫＮは、高アフィニティーで、ミオスタチン、ＧＤＦ１１および場合によってはミオスタチンプロペプチドに結合し、成熟リガンドへの結合は、フォリスタチンドメイン（ＷＦＩＫＫＮ１ＦＤ、ＷＦＩＫＫＮ２ＦＤ）によって主に媒介され、プロペプチド結合は、ネトリンドメインによって主に媒介される［Ｈｉｌｌら（２００３年）Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １７巻：１１４４〜１１５４頁；Ｋｏｎｄａｓら（２００８年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８３巻：２３６７７〜２３６８４頁］。フォリスタチンおよびＦＬＲＧとは対照的に、ＷＦＩＫＫＮ１とＷＦＩＫＫＮ２のいずれも、アクチビンに結合しない［Ｓｚｌａｍａら（２０１０年）ＦＥＢＳ  Ｊ  ２７７巻：５０４０〜５０５０頁］。ＷＦＩＫＫＮタンパク質は、アクチビンＩＩ型受容体へのアクセスを遮断することにより、ミオスタチンおよびＧＤＦ１１シグナル伝達を阻害する［Ｌｅｅら（２０１３年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１０巻：Ｅ３７１３〜Ｅ３７２２頁］。両方のＷＦＩＫＫＮにおけるいくつかのプロテアーゼ阻害性モジュールの存在のために、これらは、複数の種類のプロテアーゼの作用も調節する可能性がある。ＷＦＩＫＫＮ１の組織発現パターンは、出生前および出生後においてＷＦＩＫＫＮ２とは異なるため、この２種のタンパク質が、別個の役割を果たすという見解を支持する［Ｔｒｅｘｌｅｒら（２００２年）Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ３８３巻：２２３〜２２８頁］。
【００６２】
追加的な系統の証拠は、ＷＦＩＫＫＮを骨格筋量の調節に関係づける。ＷＦＩＫＫＮ１またはＷＦＩＫＫＮ２のホモ接合型欠失を有するマウスは、筋肉重量の低減、急速解糖ＩＩｂ型線維から急速酸化ＩＩａ型線維への線維型のシフト、および損なわれた筋肉再生を含む、ミオスタチンおよびＧＤＦ１１の過剰活性と一貫した表現型を示す［Ｌｅｅら（２０１３年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１０巻：Ｅ３７１３〜Ｅ３７２２頁］。逆に、マウスにおけるＷＦＩＫＫＮ２の広範な過剰発現は、筋肉過剰な（ｈｙｐｅｒｍｕｓｃｕｌａｒ）表現型を主にもたらす［Ｍｏｎｅｓｔｉｅｒら（２０１２年）ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３巻：５４１〜５５１頁］。どちらのＷＦＩＫＫＮタンパク質も、ミオスタチンに結合するが、ＷＦＩＫＫＩＮ１およびＷＦＩＫＫＮ２は、ミオスタチンプロペプチドと異なって相互作用することができ、よって、ミオスタチン（ｍｙｏｔａｔｉｎ）および単一ミオスタチンプロペプチド鎖の間の天然の複合体である半潜在的ミオスタチンによるＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢの活性化を差次的に遮断することができる［Ｓｚｌａｍａら（２０１３年）ＦＥＢＳ  Ｊ  ２８０巻：３８２２〜３８３９頁］。まとめると、本明細書で開示されるＷＦＩＫＫＮ１またはＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチドを含むフォリスタチン関連融合タンパク質は、内在性アクチビンの阻害に伴う潜在的に望ましくない効果を引き起こすことなく、ｉｎ  ｖｉｖｏで骨格筋量を増加させることが予測されるであろう。
【００６３】
用語「ＷＦＩＫＫＮ１ポリペプチド」は、ＷＦＩＫＫＮ１の任意の天然に存在するポリペプチドと共に、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合物およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを指すのに使用される。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＷＦＩＫＫＮ１ポリペプチドは、ミオスタチン、ミオスタチンプロペプチド、ミオスタチンおよびそのプロペプチドの間の複合体、ＧＤＦ１１ならびに潜在的にはアクチビン（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ  Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達のリガンド媒介性活性化）に結合するおよび／またはその活性を阻害する。リガンド結合特性を保持するＷＦＩＫＫＮ１ポリペプチドの改変体は、ＷＦＩＫＫＮ１およびリガンドの間の相互作用をアッセイするための慣例的な方法を使用して同定することができる［例えば、Ｋｏｎｄａｓら（２００８年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８３巻：２３６７７〜２３６８４頁；Ｓｚｌａｍａら（２０１３年）ＦＥＢＳ  Ｊ  ２８０巻：３８２２〜３８３９頁を参照］。加えて、ポリペプチドのライブラリーを作製および検査するための方法が、本明細書に記載されており、このような方法は、ＷＦＩＫＫＮ１の改変体の作製および検査にも関係する。
【００６４】
例えば、ＷＦＩＫＫＮ１ポリペプチドは、ＷＦＩＫＫＮ１ポリペプチドの配列（例えば、配列番号２６〜２８）に、少なくとも約８０％同一であり、任意選択で、配列番号２６〜２８のいずれかに、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはこれを超える同一性を有する配列を有するいずれか公知のＷＦＩＫＫＮ１ポリペプチドの配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。用語「ＷＦＩＫＫＮ１融合ポリペプチド」は、異種（非ＷＦＩＫＫＮ１）部分と共に上記で言及されたポリペプチドのいずれかを含む融合タンパク質を指す場合がある。アミノ酸配列は、配列番号２６により表されるヒトＷＦＩＫＫＮ１に固有に見出されない場合、ＷＦＩＫＫＮ１に対して異種であると理解される。本明細書では、異種部分の多くの例が提供され、このような異種部分は、アミノ酸配列によって、融合タンパク質のＷＦＩＫＫＮ１ポリペプチド部分に、直接隣接する場合もあり、あるいはリンカーまたは他の配列などの介在アミノ酸配列により隔てられる場合もある。
【００６５】
ヒトＷＦＩＫＫＮ１前駆体は、シグナルペプチドを、点線の下線で指し示し、フォリスタチンドメイン（ＷＦＩＫＫＮ１ＦＤ）を、実線の下線で指し示す、以下のアミノ酸配列（配列番号２６）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＰ＿４４４５１４．１）を有する。
【化１８】
2018510637.tif 000020
【００６６】
成熟（プロセシング後）ヒトＷＦＩＫＫＮ１は、フォリスタチンドメインを、実線の下線で指し示す、以下のアミノ酸配列（配列番号２７）を有する。さらに、最初のシステインの前の、１３アミノ酸のいずれかを、プロセシングにより除去することもでき、実質的な影響も伴わずに、意図的に消失させることもでき、このようなわずかに小型のポリペプチドを含むポリペプチドもさらに含まれることが認識されるであろう。
【化１９】
2018510637.tif 000021
【００６７】
ある特定の態様では、本開示は、下記に示されるＷＦＩＫＫＮ１ＦＤドメイン（配列番号２８）と、例えば、１つまたは複数の異種ポリペプチドとを含むポリペプチドを含む。
【化２０】
2018510637.tif 000022
【００６８】
ＷＦＩＫＫＮ１−Ｆｃと提示される場合、これは、Ｆｃ部分が、ＷＦＩＫＫＮ１のＣ末端に融合されており、介在リンカーを含んでも含まなくてもよいことを指し示す。この場合のＦｃとは、この用語が本明細書で定義される通り、任意の免疫グロブリンＦｃ部分であり得る。ＷＦＩＫＫＮ１−Ｇ１Ｆｃと提示される場合、これは、ＩｇＧ１のＦｃ部分が、ＷＦＩＫＫＮ１のＣ末端において融合されていることを指し示す。それとは反対のことが指し示されていない限り、この命名法により記載されるタンパク質は、ヒトＷＦＩＫＫＮ１タンパク質を表すであろう。
【００６９】
用語「ＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチド」は、ＷＦＩＫＫＮ２の任意の天然に存在するポリペプチドと共に、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合物およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチドは、ミオスタチン、ミオスタチンプロペプチド、ミオスタチンおよびそのプロペプチドの間の複合体、ＧＤＦ１１、ならびに潜在的にはアクチビン（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ  Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達のリガンド媒介性活性化）に結合するおよび／またはその活性を阻害する。リガンド結合特性を保持するＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチドの改変体は、ＷＦＩＫＫＮ２およびリガンドの間の相互作用をアッセイするための慣例的な方法を使用して同定することができる［例えば、Ｋｏｎｄａｓら（２００８年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８３巻：２３６７７〜２３６８４頁；Ｓｚｌａｍａら（２０１３年）ＦＥＢＳ  Ｊ  ２８０巻：３８２２〜３８３９頁を参照］。加えて、ポリペプチドのライブラリーを作製および検査するための方法が、本明細書に記載されており、このような方法は、ＷＦＩＫＫＮ２の改変体の作製および検査にも関係する。
【００７０】
例えば、ＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチドは、ＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチドの配列（例えば、配列番号２９〜３３）に、少なくとも約８０％同一であり、任意選択で、配列番号２９〜３３のいずれかに、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはこれを超える同一性を有する配列を有するいずれか公知のＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチドの配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。用語「ＷＦＩＫＫＮ２融合ポリペプチド」は、異種（非ＷＦＩＫＫＮ２）部分と共に上記で言及されたポリペプチドのいずれかを含む融合タンパク質を指す場合がある。アミノ酸配列は、配列番号２９により表されるヒトＷＦＩＫＫＮ２に固有に見出されない場合、ＷＦＩＫＫＮ２に対して異種であると理解される。本明細書では、異種部分の多くの例が提供され、このような異種部分は、アミノ酸配列によって、融合タンパク質のＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチド部分に、直接隣接する場合もあり、あるいはリンカーまたは他の配列などの介在アミノ酸配列により隔てられる場合もある。
【００７１】
ヒトＷＦＩＫＫＮ２前駆体は、シグナルペプチドを、点線の下線で指し示し、フォリスタチンドメイン（ＷＦＩＫＫＮ２ＦＤ）を、実線の下線で指し示す、以下のアミノ酸配列（配列番号２９）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＰ＿７８３１６５．１）を有する。
【化２１】
2018510637.tif 000023
【００７２】
成熟（プロセシング後）ヒトＷＦＩＫＫＮ２は、フォリスタチンドメインを、単一の下線で指し示す、以下のアミノ酸配列（配列番号３０）を有する。さらに、最初のシステインの前の、１１アミノ酸のいずれかを、プロセシングにより除去することもでき、実質的な影響も伴わずに、意図的に消失させることもでき、このようなわずかに小型のポリペプチドを含むポリペプチドもさらに含まれることが認識されるであろう。
【化２２】
2018510637.tif 000024
【００７３】
ある特定の態様では、本開示は、下記に示されるＷＦＩＫＫＮ２ＦＤドメイン（配列番号３１）と、例えば、１つまたは複数の異種ポリペプチドとを含むポリペプチドを含む。
【化２３】
2018510637.tif 000025
【００７４】
マウスＷＦＩＫＫＮ２（ＧＡＳＰ１）前駆体は、シグナルペプチドを、点線の下線で指し示し、フォリスタチンドメイン（ＷＦＩＫＫＮ２ＦＤ）を、実線の下線で指し示す、以下のアミノ酸配列（配列番号３２）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＰ＿８６１５４０．２）を有する。
【化２４】
2018510637.tif 000026
【００７５】
成熟（プロセシング後）マウスＷＦＩＫＫＮ２は、フォリスタチンドメインを単一の下線で指し示す、以下のアミノ酸配列（配列番号３３）を有する。さらに、最初のシステインの前の、１１アミノ酸のいずれかを、プロセシングにより除去することもでき、実質的な影響も伴わずに、意図的に消失させることもでき、このようなわずかに小型のポリペプチドを含むポリペプチドもさらに含まれることが認識されるであろう。
【化２５】
2018510637.tif 000027
【００７６】
ＷＦＩＫＫＮ２−Ｆｃと提示される場合、これは、Ｆｃ部分が、ＷＦＩＫＫＮ２のＣ末端に融合されており、介在リンカーを含んでも含まなくてもよいことを指し示す。この場合のＦｃとは、この用語が本明細書で定義される通り、任意の免疫グロブリンＦｃ部分であり得る。ＷＦＩＫＫＮ２−Ｇ１Ｆｃと提示される場合、これは、ＩｇＧ１のＦｃ部分が、ＷＦＩＫＫＮ２のＣ末端において融合されていることを指し示す。それとは反対のことが指し示されていない限り、この命名法により記載されるタンパク質は、ヒトＷＦＩＫＫＮ２タンパク質を表すであろう。
【００７７】
ある特定の態様では、本開示は、リガンドであるミオスタチン、アクチビンＡ、アクチビンＢおよび／またはＧＤＦ１１を阻害することができる、フォリスタチン関連ポリペプチドおよびフォリスタチン関連融合タンパク質を提供する。用語「フォリスタチン関連ポリペプチド」は、少なくとも１つのフォリスタチンドメイン（例えば、ＦＳＴＦＤ１、ＦＳＴＦＤ２、ＦＳＴＦＤ３、ＦＬＲＧＦＤ１、ＦＬＲＧＦＤ２、ＷＦＩＫＫＮ１ＦＤまたはＷＦＩＫＫＮ２ＦＤ）のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９５または１００％同一であるアミノ酸配列を含む単一ポリペプチド鎖を指すように本明細書において使用されている。用語「フォリスタチン関連ポリペプチド」は、フォリスタチン遺伝子、ＦＬＲＧ（ＦＳＴＬ３、ＦＳＲＰ）遺伝子、ＷＦＩＫＫＮ１（ＧＡＳＰ２）遺伝子またはＷＦＩＫＫＮ２（ＧＡＳＰ１）遺伝子の任意の天然に存在するポリペプチド産物と共に、例えば、リガンド結合（例えば、ミオスタチン、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ）を含む有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合物およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを指す。例えば、フォリスタチン関連ポリペプチドは、配列番号１〜３３に対し少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはこれを超える同一性であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００７８】
用語「フォリスタチン関連融合ポリペプチド」は、単一のアミノ酸配列において異種部分と共に上記で言及されたフォリスタチン関連ポリペプチドを含む単鎖融合タンパク質を指す。アミノ酸配列は、ヒトＦＳＴ３１５（配列番号３により表される）、ヒトＦＬＲＧ（配列番号１８により表される）、ヒトＷＦＩＫＫＮ１（配列番号２５により表される）またはヒトＷＦＩＫＫＮ２（配列番号２８により表される）に固有に見出されない場合、フォリスタチン、ＦＬＲＧ、ＷＦＩＫＫＮ１またはＷＦＩＫＫＮ２に対して異種であると理解される。本明細書では、異種部分の多くの例が提供され、このような異種部分は、アミノ酸配列によって、融合タンパク質のフォリスタチン関連ポリペプチド部分に、直接隣接する場合もあり、あるいはリンカーまたは他の配列などの介在アミノ酸配列により隔てられる場合もあり、かつフォリスタチン関連ポリペプチドである部分に対してアミノ末端またはカルボキシ末端に配置される場合もある。
【００７９】
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるフォリスタチン関連融合タンパク質は、天然に存在するフォリスタチン関連ポリペプチドに由来するポリペプチド鎖を含む非対称ヘテロ二量体融合タンパク質を指す。したがって、ある特定の実施形態では、本開示の方法は、任意選択で、種々の適用可能な障害、特に、このようなフォリスタチン関連融合タンパク質が結合するリガンドの阻害によって取り組むことができる障害を処置するための１つまたは複数の支持療法と組み合わせた、少なくとも１つのフォリスタチンドメインを含有する単一腕フォリスタチン関連ポリペプチドを含む融合タンパク質を含む１つまたは複数のフォリスタチン関連融合タンパク質の使用を対象にする。例えば、ミオスタチン、ならびに任意選択でＧＤＦ１１、アクチビンＡおよび／またはアクチビンＢなどの他のリガンドに結合し阻害するフォリスタチン関連融合タンパク質を使用して、それを必要とする被験体における骨格筋量を増加させることができる、および／またはそれを必要とする被験体における骨格筋損失もしくは骨格筋障害を処置もしくは予防することができる。
【００８０】
本明細書に示す通り、フォリスタチン関連ポリペプチドは、単量体型で発現されると、活性タンパク質としての発現にさらに適することができるが、このようなタンパク質は、精製の難易度が高い傾向があり、短い血清滞留時間（半減期）を有する傾向もあり、これらのどちらも、治療状況において望ましくない。精製問題は、当該分野で既に公知の方法による取り付けられたタンパク質の精製を可能にする、ＩｇＧの定常ドメイン部分（例えば、Ｆｃ部分）と会合する特性など、精製を容易にする固有の特徴を有する相互作用ペアの取込みによって解決することができる。血清半減期を改善するための一般的な機構は、ＩｇＧの定常ドメイン部分を有するホモ二量体融合タンパク質としてポリペプチドを発現することである。しかし、ホモ二量体タンパク質（例えば、Ｆｃ融合構築物における）として発現されたフォリスタチン関連ポリペプチドは、単量体型ほど活性がないまたは十分に産生されない場合がある。本明細書に実証される通り、問題は、単量体型を半減期延長部分に融合することにより解決することができ、驚くべきことに、これは、このようなタンパク質を非対称ヘテロ二量体融合タンパク質として発現させることにより迅速に達成することができ、この非対称ヘテロ二量体融合タンパク質では、結合ペアの一方のメンバーが、フォリスタチン関連ポリペプチドに融合され、結合ペアの別のメンバーが、他の部分には融合されないまたは異種部分に融合されており、結合ペアによって付与された血清半減期の改善と相まった、高度に活性なフォリスタチン関連ポリペプチドをもたらす。
【００８１】
フォリスタチン関連ポリペプチド内のアミノ酸の番号付けは、天然のリーダー配列を使用するのかどうかにかかわらず、配列番号１、３、１５、１８、２６、２９または３２の配列に基づく。
【００８２】
本明細書中で使用される用語は、一般に、本開示の文脈の範囲内で、かつ、各々の用語が使用される特定の文脈において、当該分野におけるその通常の意味を有する。本開示の組成物および方法、ならびに、これらの作製方法および使用方法の記載において、専門家にさらなる案内を提供するために、特定の用語が以下または本明細書中の他の場所で論じられている。用語の任意の使用の範囲および意味は、その用語が使用される特定の文脈から明らかである。
【００８３】
「相同」は、そのあらゆる文法的な形態および語の綴りのバリエーションにおいて「共通する進化的起源」を有する２つのタンパク質間の関係を指し、同じ生物種のスーパーファミリーからのタンパク質ならびに異なる生物種からの相同タンパク質を含む。このようなタンパク質（およびこれをコードする核酸）は、％同一性の観点であれ、特定の残基もしくはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであれ、その配列類似性によって反映されるように、配列の相同性を有する。
【００８４】
用語「配列類似性」は、そのあらゆる文法的な形態において、共通する進化の起源を共有している場合も共有していない場合もある、核酸もしくはアミノ酸配列間の同一性もしくは対応性の程度をいう。
【００８５】
しかし、一般的な用法およびこの出願において、用語「相同」は、「高度に」のような副詞で修飾されるとき、配列の類似性を指す場合があり、そして、共通する進化の起源に関連していてもしていなくてもよい。
【００８６】
参照ポリペプチド（またはヌクレオチド）配列に関する「パーセント（％）配列同一性」は、配列を整列し、必要であればギャップを導入して、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せずに、最大パーセント配列同一性を達成した後に、参照ポリペプチド（ヌクレオチド）配列におけるアミノ酸残基（または核酸）と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基（または核酸）のパーセンテージとして規定される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のアラインメントは、当業者の技能範囲内の様々な仕方で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなど、公開されたコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較されている配列の全長にわたる最大アラインメントの達成に必要とされるいずれかのアルゴリズムを含む、配列の整列に適切なパラメータを決定することができる。しかし、本明細書における目的のため、％アミノ酸（核酸）配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して作成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって著作され、ソースコードは、米国著作権局（Ｕ．Ｓ．  Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ）、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、２０５５９においてユーザー文書により提出され、そこでは、米国著作権登録番号（Ｕ．Ｓ．  Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｎｏ．）ＴＸＵ５１００８７にて登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．から公開されている、あるいはソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティング・システムにおける使用のためにコンパイルされるべきである。あらゆる配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変動させない。
【００８７】
本明細書で使用される「Ｘに実質的に結合しない」は、薬剤が、「Ｘ」に対して約１０−７、１０−６、１０−５、１０−４またはそれ超よりも大きいＫＤを有する（例えば、ＫＤの決定に使用したアッセイによって検出可能な結合が見られない）ことを意味するように意図される。
【００８８】
２．フォリスタチン関連融合ポリペプチド
ある特定の態様では、本開示は、１つまたは複数のフォリスタチンドメインを含むフォリスタチン関連融合ポリペプチド（例えば、ＦＳＴ−Ｆｃポリペプチド、ＦＬＲＧ−Ｆｃポリペプチド、ＷＦＩＫＫＮ１−ＦｃポリペプチドおよびＷＦＩＫＫＮ２−Ｆｃポリペプチド）に関する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるポリペプチドは、第２のポリペプチドと共有結合または非共有結合により会合した第１のポリペプチドを含むタンパク質複合体であって、第１のポリペプチドが、フォリスタチン関連ポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用ペアの第１のメンバーのアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが、相互作用ペアの第２のメンバーのアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが、フォリスタチン関連ポリペプチドを含まないタンパク質複合体を形成することができる。相互作用ペアは、相互作用して、複合体、特にヘテロ二量体の複合体を形成する任意の２つのポリペプチド配列の場合もあるが、実効性のある実施形態は、ホモ二量体配列を形成する相互作用ペアを用いることもできる。本明細書で記載される通り、相互作用ペアの一方のメンバーは、配列番号１〜３３のいずれかの配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドなど、フォリスタチン関連ポリペプチドに融合されていてよい。好ましくは、相互作用ペアは、単量体型のフォリスタチン関連ポリペプチドと比べて、改善されたタンパク質精製手段もしくは改善された血清半減期を付与するように、またはポリエチレングリコール部分などの別の部分が取り付けられて、改善された血清半減期をもたらすアダプターとして作用するように選択される。
【００８９】
上記で記載した通り、フォリスタチンは、フォリスタチンリガンド結合を媒介すると考えられる４つのシステインに富む領域（すなわち、ＦＳＴＮＤ、ＦＳＴＦＤ１、ＦＳＴＦＤ２およびＦＳＴＦＤ３）を特徴とする。同様に、ＦＬＲＧは、３つのシステインに富む領域（すなわち、ＦＬＲＧＮＤ、ＦＬＲＧＦＤ１およびＦＬＲＧＦＤ２）を特徴とし、ＷＦＩＫＫＮ１またはＷＦＩＫＫＮ２はそれぞれ、ミオスタチン、アクチビンまたはＧＤＦ１１への結合を媒介すると考えられるシステインに富む領域（ＷＦＩＫＫＮ１ＦＤまたはＷＦＩＫＫＮ２ＦＤ）を特徴とする。さらに、研究者らは、ＦＳＴにおける３つのフォリスタチンドメインのうち１つのみ（例えば、ＦＳＴＦＤ１）を含むポリペプチド構築物が、ある特定のフォリスタチンリガンド（例えば、ミオスタチン）に対する強力なアフィニティーを保持し、ｉｎ  ｖｉｖｏで生物学的に活性であることを実証している。Ｎａｋａｔａｎｉら（２００８年）ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２２巻：４７７〜４８７頁を参照されたい。したがって、本開示の改変体フォリスタチン関連ポリペプチドは、フォリスタチンタンパク質の１つまたは複数の活性部分を含み得る。例えば、本開示の構築物は、配列番号１のアミノ酸３０〜９５に対応する残基で始まり、配列番号１のアミノ酸３１６〜３４４に対応する位置で終わることが可能である。他の例として、配列番号１の３０〜９５に由来する位置で始まり、アミノ酸１６４〜１６７または２３８〜２４４に対応する位置で終わる構築物が挙げられる。
【００９０】
本明細書で記載されるフォリスタチン、ＦＬＲＧ、ＷＦＩＫＫＮ１およびＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチド改変体は、種々の方法で、互いと組み合わせることもでき、異種アミノ酸配列と組み合わせることもできる。例えば、本開示の改変体フォリスタチン関連融合タンパク質は、ＦＳＴＦＤ１（配列番号１のアミノ酸９５〜１６４；すなわち、配列番号７）、ＦＳＴＦＤ２（配列番号１のアミノ酸１６８〜２３９；すなわち、配列番号８）またはＦＳＴＦＤ３（配列番号１のアミノ酸２４５〜３１６；配列番号９）から選択される、１つまたは複数のフォリスタチンドメインを含むポリペプチドのほか、ＦＳＴＦＤ１（配列番号７）、ＦＳＴＦＤ２（配列番号８）またはＦＳＴＦＤ３（配列番号９）に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列から選択される、１つまたは複数のフォリスタチンドメインを含むタンパク質を含む。同様に、本開示の改変体フォリスタチン関連融合タンパク質は、ＦＬＲＧＦＤ１（配列番号１８のアミノ酸９９〜１６７；すなわち、配列番号２２）、ＦＬＲＧＦＤ２（配列番号１８のアミノ酸１７１〜２４３；すなわち、配列番号２３）、ＷＦＩＫＫＮ１ＦＤ（配列番号２６のアミノ酸９３〜１５７；すなわち、配列番号２８）またはＷＦＩＫＫＮ２ＦＤ（配列番号２９のアミノ酸１１１〜１７５；すなわち、配列番号３１）から選択される、１つまたは複数のフォリスタチンドメインを含むポリペプチドのほか、ＦＳＴＦＤ１（配列番号７）、ＦＳＴＦＤ２（配列番号８）、ＦＳＴＦＤ３（配列番号９）、ＦＬＲＧＦＤ１（配列番号２２）、ＦＬＲＧＦＤ２（配列番号２３）、ＷＦＩＫＫＮ１ＦＤ（配列番号２８）またはＷＦＩＫＫＮ２ＦＤ（配列番号３１）に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列から選択される、１つまたは複数のフォリスタチンドメインを含むタンパク質を含む。
【００９１】
これらのフォリスタチンドメインは、このような組換えタンパク質が、例えば、フォリスタチンリガンド結合活性（例えば、ミオスタチン）および生物学的活性（例えば、筋量および／または筋強度（ｍｕｓｃｌｅ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）を誘導する）を含む所望の活性を維持するという条件の下で、本開示の改変体フォリスタチン関連ポリペプチド内、任意の順序で組み合わせることができる。このような改変体フォリスタチンポリペプチドの例として、例えば、ＦＳＴＦＤ１−ＦＳＴＦＤ２−ＦＳＴＦＤ３、ＦＳＴＦＤ１−ＦＳＴＦＤ３、ＦＳＴＦＤ１−ＦＳＴＦＤ１−ＦＳＴＦＤ３、ＦＳＴＦＤ１−ＦＳＴＦＤ２、ＦＳＴＦＤ１−ＦＳＴＦＤ１、ＦＳＴＮＤ−ＦＳＴＦＤ１−ＦＳＴＦＤ２−ＦＳＴＦＤ３、ＦＳＴＮＤ−ＦＳＴＦＤ１−ＦＳＴＦＤ２、ＦＳＴＮＤ−ＦＳＴＦＤ１−ＦＳＴＦＤ１、ＦＳＴＮＤ−ＦＳＴＦＤ１−ＦＳＴＦＤ３、ＦＳＴＮＤ−ＦＳＴＦＤ１−ＦＳＴＦＤ１−ＦＳＴＦＤ３などのドメイン構造を有するポリペプチド、およびこれらのポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に他の異種ポリペプチドを融合することにより得られるポリペプチドが挙げられる。改変体フォリスタチン関連ポリペプチドの例として、例えば、ＦＬＲＧＦＤ１−ＦＬＲＧＦＤ１、ＦＬＲＧＦＤ１−ＦＬＲＧＦＤ２、ＦＬＲＧＦＤ１−ＦＬＲＧＦＤ１−ＦＬＲＧＦＤ２、ＦＬＲＧＮＤ−ＦＬＲＧＦＤ１−ＦＬＲＧＦＤ１、ＦＬＲＧＮＤ−ＦＳＴＦＤ１−ＦＳＴＦＤ２などのドメイン構造を有するポリペプチド、およびこれらのポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に他の異種ポリペプチドを融合することにより得られるポリペプチドが挙げられる。これらのドメインは、直接的に融合しても、リンカーポリペプチドを介して連結してもよい。任意選択で、ポリペプチドリンカーは、任意の配列であることが可能であり、１〜１００、１〜５０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５アミノ酸を含み得る。ある特定の態様では、好ましいリンカーは、システインアミノ酸またはプロテアーゼ切断部位を含有しない。
【００９２】
一部の実施形態では、本開示のフォリスタチン改変体は、１つまたは複数のフォリスタチンリガンドに対する結合アフィニティーを低減しているか、または消失させている。ある特定の態様では、本開示は、アクチビンに対する結合アフィニティーを低減しているか、または消失させているフォリスタチン改変体を提供する。ある特定の態様では、本開示は、アクチビンに対する結合アフィニティーを低減しているか、または消失させているが、ミオスタチンに対する高アフィニティーは保持するフォリスタチン改変体を提供する。ある特定の態様では、本開示は、ＧＤＦ１１に対する結合アフィニティーを低減しているか、または消失させているが、ミオスタチンに対する高アフィニティーは保持するフォリスタチン改変体を提供する。
【００９３】
ある特定の実施形態では、本発明は、対象のフォリスタチン関連融合ポリペプチドにより、アクチビン、ＧＤＦ８またはＧＤＦ１１など、フォリスタチンまたは別のフォリスタチン関連ポリペプチドのリガンドに拮抗することに関する。したがって、本開示の組成物および方法は、１つまたは複数のこのようなリガンドの異常または望ましくなく高い活性に関連する障害の処置に有用である。
【００９４】
本開示のフォリスタチン関連ポリペプチドは、シグナル配列を含み得る。シグナル配列は、フォリスタチン前駆体（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜２９）、ＦＬＲＧ前駆体（例えば、配列番号１８のアミノ酸１〜２６）、ＷＦＩＫＫＮ１前駆体（例えば、配列番号２６のアミノ酸１〜１９）、ＷＦＩＫＫＮ２前駆体（例えば、配列番号２９のアミノ酸１〜３４）の天然のシグナル配列、または組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）シグナル配列もしくはミツバチメリチン（ｍｅｌａｔｉｎ）（ＨＢＭ）シグナル配列などの別のタンパク質に由来するシグナル配列の場合もある。
【００９５】
さらなるＮ−連結グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）を、フォリスタチン関連ポリペプチドに付加することができ、フォリスタチン関連融合タンパク質の血清半減期を延長することができる。Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列は一般に、リガンド結合性ポケットの外側の位置に導入することができる。Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列は、フォリスタチン配列と、Ｆｃまたは他の融合物構成要素との間のリンカーに導入することができる。このような部位は、あらかじめ存在するＳもしくはＴに照らして適正な位置にＮを導入することにより、またはあらかじめ存在するＮに対応する位置にＳもしくはＴを導入することにより、最小限の労力で導入することができる。グリコシル化されることが予測される任意のＳは、グリコシル化によりもたらされる保護のために、免疫原性部位を創出せずにＴに変更させることができる。同様に、グリコシル化されることが予測される任意のＴは、Ｓに変更させることができる。したがって、フォリスタチン関連ポリペプチド改変体は、１つまたは複数の追加の、非内因性Ｎ−連結グリコシル化コンセンサス配列を含み得る。
【００９６】
ある特定の実施形態では、本開示は、治療有効性または安定性（例えば、エクスビボの貯蔵寿命およびインビボでのタンパク質分解に対する抵抗性）を増強することなどの目的のために、フォリスタチン関連ポリペプチドの構造を改変することにより機能的改変体を作製することを企図する。改変フォリスタチン関連ポリペプチドは、例えば、アミノ酸の置換、欠失または付加によって生成することもできる。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンでの単発的な置換、アスパラギン酸のグルタミン酸での単発的な置換、スレオニンのセリンでの単発的な置換、または、あるアミノ酸の、構造的に関連したアミノ酸での同様の置換（例えば、保存的変異）は、結果として生じる分子の生物学的活性に対して大きな影響を及ぼさないと予想するのは理にかなっている。保存的置換は、その側鎖が関連しているアミノ酸のファミリー内で行われる置換である。フォリスタチン関連ポリペプチドのアミノ酸配列の変化の結果として、機能的相同体がもたらされるのかどうかは、野生型フォリスタチン関連ポリペプチドと同様の様式で細胞内の応答を生成するか、または、野生型フォリスタチン関連ポリペプチドと同様の様式で、ミオスタチンまたはアクチビンなど、１つまたは複数のリガンドに結合する、改変体フォリスタチン関連ポリペプチドの能力を評価することにより、たやすく決定することができる。
【００９７】
ある特定の実施形態では、本発明は、ポリペプチドのグリコシル化を変更させるような、フォリスタチン関連ポリペプチドの特異的変異を企図する。このような変異は、１または複数のグリコシル化部位（例えば、Ｏ−連結もしくはＮ−連結のグリコシル化部位）を導入もしくは排除するように選択され得る。アスパラギン連結グリコシル化認識部位は、一般に、トリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここで、「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を含み、この配列は、適切な細胞のグリコシル化酵素によって特異的に認識される。変化はまた、（Ｏ−連結グリコシル化部位については）野生型フォリスタチン関連ポリペプチドの配列への、１または複数のセリンもしくはスレオニン残基の付加、または、１または複数のセリンもしくはスレオニン残基による置換によってなされ得る。グリコシル化認識部位の第１位もしくは第３位のアミノ酸の一方もしくは両方における種々のアミノ酸置換もしくは欠失（および／または、第２位におけるアミノ酸の欠失）は、改変されたトリペプチド配列において非グリコシル化をもたらす。フォリスタチン関連ポリペプチドにおける糖質部分の数を増加させる別の手段は、フォリスタチン関連ポリペプチドへのグリコシドの化学的もしくは酵素的なカップリングによるものである。使用されるカップリング様式に依存して、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）フリーのカルボキシル基；（ｃ）フリーのスルフヒドリル基（例えば、システインのもの）；（ｄ）フリーのヒドロキシル基（例えば、セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのもの）；（ｅ）芳香族残基（例えば、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのもの）；または（ｆ）グルタミンのアミド基に付加され得る。これらの方法については、１９８７年９月１１日に公開された、ＷＯ８７／０５３３０、ならびに、参照により本明細書に組み込まれる、ＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ（１９８１年）、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９〜３０６頁において記載されている。１または複数の糖質部分の除去は、化学的および／または酵素的に達成され得る。化学的な脱グリコシル化は、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物へのフォリスタチン関連ポリペプチドの曝露を含み得る。この処理は、アミノ酸配列をインタクトなままにしつつ、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどもしくは全ての糖の切断を生じる。化学的脱グリコシル化については、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら（１９８７年）、Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５９巻：５２頁；およびＥｄｇｅら（１９８１年）、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１８巻：１３１頁によりさらに記載されている。フォリスタチン関連ポリペプチドにおける、炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、（１９８７年）、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１３８巻：３５０頁により記載されているように、様々なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。哺乳動物、酵母、昆虫および植物の細胞は全て、ペプチドのアミノ酸配列によって影響され得る異なる���リコシル化パターンを導入し得るため、フォリスタチン関連ポリペプチドの配列は、適切なように、使用される発現系のタイプに応じて調節され得る。一般に、ヒトにおいて使用するためのフォリスタチン関連融合タンパク質は、適切なグリコシル化を提供する哺乳動物細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞株、ＣＯＳ細胞株またはＣＨＯ細胞株）において発現されるが、他の哺乳動物発現細胞株も同様に有用であることと期待される。
【００９８】
本開示はさらに、改変体、特に、任意選択で、切断型改変体を含む、フォリスタチン関連ポリペプチドのコンビナトリアル改変体のセットを生成する方法を想定し、コンビナトリアル変異体のプールは、機能的な改変体配列を同定するために、とりわけ有用である。このようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、変更された薬物動態または変更されたリガンド結合など、変更された特性を有するフォリスタチン関連ポリペプチド改変体を生成することとなり得る。種々のスクリーニングアッセイを下に提示するが、このようなアッセイを使用して、改変体を評価することができる。例えば、フォリスタチン関連ポリペプチド改変体は、アクチビンＡ、Ｂ、ＣもしくはＥ、ＧＤＦ８またはＧＤＦ１１などのリガンドに結合する能力、あるいはＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢなどのリガンド受容体へのリガンドの結合を防止する能力に関してスクリーニングすることができる。
【００９９】
フォリスタチン関連ポリペプチドまたはその改変体の活性はまた、細胞ベースのアッセイまたはインビボアッセイで調べることもできる。例えば、フォリスタチン関連ポリペプチド改変体の、筋生成に関与する遺伝子の発現に対する効果を評価することができる。これは、必要に応じて、１つまたは複数の組換えリガンドタンパク質（例えば、ミオスタチンまたはアクチビンＡ）の存在下で実施することができ、細胞に、フォリスタチン関連ポリペプチドおよび／またはその改変体と、任意選択で、リガンドとを生成するように、トランスフェクトすることができる。同様に、フォリスタチン関連ポリペプチドを、マウスまたは他の動物に投与することができ、筋量または筋強度など、１つまたは複数の筋特性を評価することができる。当技術分野では、このようなアッセイが周知であり、日常的である。応答性のレポーター遺伝子を、このような細胞株内で使用して、下流のシグナル伝達に対する効果をモニタリングすることができる。
【０１００】
天然に存在するフォリスタチン関連ポリペプチドと比べて選択的な効力を有するコンビナトリアルに誘導された改変体を生成することができる。このような改変体タンパク質は、組換えＤＮＡ構築物から発現されたとき、遺伝子治療のプロトコルにおいて使用され得る。同様に、変異誘発は、対応する野生型フォリスタチン関連ポリペプチドとは劇的に異なる細胞内半減期を有する改変体を生じ得る。例えば、変更されたタンパク質は、天然のフォリスタチン関連ポリペプチドのタンパク質分解、または、その崩壊もしくは他の方法で不活性化をもたらす他のプロセスに対してより安定性であるかもしくは安定性が低いかのいずれかにされ得る。このような改変体およびこれをコードする遺伝子は、そのフォリスタチン関連ポリペプチドの半減期を調節することによってフォリスタチン関連ポリペプチドレベルを変更するのに利用され得る。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、本開示のフォリスタチン関連ポリペプチドはさらに、フォリスタチン関連ポリペプチド内に天然に存在する任意の翻訳後修飾に加えて翻訳後修飾を含み得る。このような修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が挙げられるがこれらに限定されない。結果として、フォリスタチン関連ポリペプチドは、ポリエチレングリコール、脂質、多糖類もしくは単糖類およびホスフェイトのような非アミノ酸成分を含み得る。このような非アミノ酸成分の、フォリスタチン関連ポリペプチドの機能に対する影響は、他のフォリスタチン関連ポリペプチド改変体について本明細書中に記載されるようにして試験され得る。フォリスタチン関連ポリペプチドの新生形態を切断することによってフォリスタチン関連ポリペプチドが細胞内で生成される場合、翻訳後プロセシングもまた、このタンパク質の正確な折り畳みおよび／または機能にとって重要となり得る。様々な細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３）が、このような翻訳後の活性のための特定の細胞機構および特徴的なメカニズムを有し、そして、フォリスタチン関連ポリペプチドの正確な修飾およびプロセシングを保証するように選択され得る。
【０１０２】
ある特定の態様では、フォリスタチン関連ポリペプチドの機能的改変体または修飾形態は、少なくともフォリスタチン関連ポリペプチドの部分と、１つまたは複数の融合ドメインとを有する融合タンパク質を含む。このような融合ドメインの周知の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（例えば、Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンが挙げられるがこれらに限定されない。融合ドメインは、所望される特性を与えるように選択され得る。例えば、いくつかの融合ドメインが、アフィニティクロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティ精製の目的では、グルタチオン−、アミラーゼ−、およびニッケル−もしくはコバルト−結合化樹脂のような、アフィニティクロマトグラフィーのための適切なマトリクスが使用される。このようなマトリクスの多くは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ精製システムおよび（ＨＩＳ６）融合パートナーと共に有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）のような「キット」の形態で利用可能である。別の例としては、融合ドメインは、フォリスタチン関連ポリペプチドの検出を容易にするように選択され得る。このような検出ドメインの例としては、種々の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、ならびに、「エピトープタグ」（これは、特定の抗体に利用可能な、通常は短いペプチド配列である）が挙げられる。特定のモノクローナル抗体に容易に利用可能な周知のエピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）およびｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。いくつかの場合、融合ドメインは、関連のプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによって、そこから組換えタンパク質を解放することを可能にする、第Ｘａ因子またはトロンビンのようなプロテアーゼ切断部位を有する。解放されたタンパク質は、次いで、その後のクロマトグラフィーによる分離によって、融合ドメインから単離され得る。特定の好ましい実施形態では、フォリスタチン関連ポリペプチドは、インビボでフォリスタチン関連ポリペプチドを安定化させるドメイン（「安定化」ドメイン）と融合される。「安定化」とは、それが、分解の低減によるものであるか、腎臓によるクリアランスの低減によるものであるか、他の薬物動態作用によるものであるかとは無関係に、血清半減期を増加させる任意のものを意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合は、広範囲のタンパク質に対して所望の薬物動態特性を与えることが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合は、所望の特性を与え得る。選択され得る融合ドメインの他のタイプとしては、多量体化（例えば、二量体化、四量体化）ドメインおよび機能的ドメイン（例えば、筋肉成長のさらなる刺激のような付加的な生物学的機能を与えるもの）が挙げられる。
【０１０３】
具体例としては、本開示は、免疫グロブリンのＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、もしくはＣＨ３ドメインなど、免疫グロブリンの定常ドメインまたは、Ｆｃを含むポリペプチドに融合させたフォリスタチン関連ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に由来するＦｃドメインを下記に提示する。ＣＤＣ活性またはＡＤＣＣ活性を減殺する、他の変異も公知であり、本開示には、集合的に、これらの改変体のいずれかが含まれ、フォリスタチン融合タンパク質の有利な構成要素として使用することができる。任意選択で、配列番号３４のＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、Ａｓｐ−２６５、Ｌｙｓ−３２２およびＡｓｎ−４３４（対応する全長ＩｇＧ１に従った番号付け）などの残基に１つまたは複数の変異を有する。ある場合において、これらの変異のうち１つまたは複数（例えば、Ａｓｐ−２６５変異）を有する変異体Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比べてＦｃγ受容体に結合する能力が低減する。他の場合において、これらの変異のうち１つまたは複数（例えば、Ａｓｎ−４３４変異）を有する変異体Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比べてＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）に結合する能力が増加する。
【０１０４】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（Ｇ１Ｆｃ）に使用することができる天然のアミノ酸配列の例を下記に示す（配列番号３４）。点線の下線は、ヒンジ領域を指し示し、実線の下線は、天然に存在する改変体を有する位置を指し示す。部分的に、本開示は、配列番号３４に対し８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。Ｇ１Ｆｃにおける天然に存在する改変体は、配列番号３４において使用される番号付け方式に従ったＤ１３４およびＬ１３６を含むであろう（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５７を参照）。
【化２６】
2018510637.tif 000028
【０１０５】
ヒトＩｇＧ２のＦｃ部分（Ｇ２Ｆｃ）に使用することができる天然のアミノ酸配列の例を下記に示す（配列番号３５）。点線の下線は、ヒンジ領域を指し示し、実線の下線は、天然に存在する改変体を有する位置を指し示し、二重の下線は、配列データの矛盾が存在する位置を指し示す（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８５９に従う）。部分的に、本開示は、配列番号３５に対し８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【化２７】
2018510637.tif 000029
【０１０６】
ヒトＩｇＧ３のＦｃ部分（Ｇ３Ｆｃ）に使用することができるアミノ酸配列の２つの例を下記に示す。Ｇ３Ｆｃにおけるヒンジ領域は、他のＦｃ鎖におけるものの最大４倍の長さとなることができ、同様の１７残基セグメントに先行される３つの同一１５残基セグメントを含有する。下記に示される第１のＧ３Ｆｃ配列（配列番号３６）は、単一１５残基セグメントからなる短いヒンジ領域を含有する一方、第２のＧ３Ｆｃ配列（配列番号３７）は、全長ヒンジ領域を含有する。いずれの場合でも、点線の下線は、ヒンジ領域を指し示し、実線の下線は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８５９に従った天然に存在する改変体を有する位置を指し示す。部分的に、本開示は、配列番号３６、３７に対し８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【化２８】
2018510637.tif 000030
【０１０７】
Ｇ３Ｆｃにおける天然に存在する改変体（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５９を参照）は、配列番号３６において使用される番号付け方式に変換された場合、Ｅ６８Ｑ、Ｖ６９、Ｐ７６Ｌ、Ｅ７９Ｑ、Ｙ８１Ｆ、Ｄ９７Ｎ、Ｎ１００Ｄ、Ｔ１２４Ａ、Ｓ１６９Ｎ、Ｓ１６９ｄｅｌ、Ｆ２２１Ｙを含み、本開示は、これらの変種のうち１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含む融合タンパク質を提供する。加えて、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ３遺伝子（ＩＧＨＧ３）は、異なるヒンジ長を特徴とする構造的多型を示す［Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５９を参照］。特に、改変体ＷＩＳは、Ｖ領域の大部分およびＣＨ１領域の全てを欠いている。これは、ヒンジ領域に通常存在する１１個に加えて、７位に余分な鎖間ジスルフィド結合を有する。改変体ＺＵＣは、Ｖ領域の大部分、ＣＨ１領域の全ておよびヒンジの一部を欠く。改変体ＯＭＭは、対立遺伝子型または別のガンマ鎖サブクラスを表すことができる。本開示は、これらの改変体のうち１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含む追加的な融合タンパク質を提供する。
【０１０８】
ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分（Ｇ４Ｆｃ）に使用することができる天然のアミノ酸配列の例を下記に示す（配列番号３８）。点線の下線は、ヒンジ領域を指し示す。部分的に、本開示は、配列番号３８に対し８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【化２９】
2018510637.tif 000031
【０１０９】
Ｆｃドメインにおける種々の操作された変異が、Ｇ１Ｆｃ配列（配列番号３４）に関して本明細書に提示されており、Ｇ２Ｆｃ、Ｇ３ＦｃおよびＧ４Ｆｃにおける類似の変異は、図１におけるＧ１Ｆｃとそれらのアラインメントに由来することができる。不等なヒンジ長のため、アイソタイプアラインメント（図１）に基づく類似のＦｃ位置は、配列番号３４、３５、３６および３８において異なるアミノ酸番号を保持する。
【０１１０】
単一細胞株からの非対称の免疫グロブリンに基づくタンパク質の大規模産生において生じる問題は、「鎖会合課題」として公知である。二重特異性抗体の産生において顕著に直面するように、鎖会合課題は、単一細胞株において異なる重鎖および／または軽鎖が産生される場合に、固有に生じる複数の組合せの中から所望の多重鎖タンパク質を効率的に産生するという難題に関係する［例えば、Ｋｌｅｉｎら（２０１２年）ｍＡｂｓ  ４巻：６５３〜６６３頁を参照］。この問題は、同じ細胞内で２種の異なる重鎖および２種の異なる軽鎖が産生される場合に最も喫緊となり、この場合、１種のみが典型的に望まれるときに、総計１６通りの可能な鎖組合せ（これらのいくつかは同一であるが）が存在する。にもかかわらず、同じ原理が、２種の異なる（非対称）重鎖のみを取り込む所望の多重鎖融合タンパク質の収量縮小の原因である。
【０１１１】
単一細胞株においてＦｃ含有融合ポリペプチド鎖の所望のペア形成を増加させて、許容される収量で好ましい非対称融合タンパク質を産生する様々な方法が、当該分野で公知である［例えば、Ｋｌｅｉｎら（２０１２年）ｍＡｂｓ  ４巻：６５３〜６６３頁を参照］。Ｆｃ含有鎖の所望のペア形成を得るための方法として、電荷に基づくペア形成（静電ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ））、「ノブ・ホール型（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」立体ペア形成およびＳＥＥＤｂｏｄｙペア形成が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｒｉｄｇｗａｙら（１９９６年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ９巻：６１７〜６２１頁；Ｍｅｒｃｈａｎｔら（１９９８年）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １６巻：６７７〜６８１頁；Ｄａｖｉｓら（２０１０年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２３巻：１９５〜２０２頁を参照されたい。本明細書において実証される通り、電荷に基づくペア形成が非対称ポリペプチド鎖の正確なマッチングを促進する、単一ＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチド腕を含む非対称Ｆｃ融合タンパク質は、二重ＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチド腕を含む対称Ｆｃ融合タンパク質よりも大幅に優れた効力（より低いＩＣ５０）で、細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイにおいてミオスタチン活性を阻害する。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、本開示は、電荷ペア形成（静電ステアリング）に基づいて相補的となるように操作されたＦｃ配列を使用した、非対称Ｆｃ含有ポリペプチド鎖の所望のペア形成を提供する。静電相補性を有するＦｃ配列のペアの一方は、任意選択のリンカーありまたはなしで、構築物のフォリスタチン関連ポリペプチド（例えば、フォリスタチンポリペプチド、ＦＬＲＧポリペプチド、ＷＦＩＫＫＮ１ポリペプチドまたはＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチド）に任意に融合して、フォリスタチン関連融合ポリペプチドを生成することができる。この単鎖は、第１のＦｃと相補的なＦｃ配列と共に最適な細胞において共発現（ｃｏｅｘｐｒｅｓｓ）させて、所望の多重鎖構築物（フォリスタチン関連融合タンパク質）の生成に有利に働くことができる。静電ステアリングに基づくこの例において、配列番号３９［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｅ１３４Ｋ／Ｄ１７７Ｋ）］および配列番号４０［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｋ１７０Ｄ／Ｋ１８７Ｄ）］は、操作されたアミノ酸置換に二重の下線が引かれた相補的Ｆｃ配列の例であり、構築物のフォリスタチン関連ポリペプチドは、配列番号３９または配列番号４０のいずれかに融合することができるが、これらの両方には融合できない。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃおよび天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃにおける対応する位置のアミノ酸置換（図１を参照）が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃペア（配列番号３９、４０）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃペアを生成するであろうと認めることができる。
【化３０】
2018510637.tif 000032
【０１１３】
部分的に、本開示は、立体相補性のために操作されたＦｃ配列を使用した、非対称Ｆｃ含有ポリペプチド鎖の所望のペア形成を提供する。部分的に、本開示は、立体相補性の例としてノブ・ホール型ペア形成を提供する。立体相補性を有するＦｃ配列のペアの一方は、任意選択のリンカーありまたはなしで、構築物のフォリスタチン関連ポリペプチド（例えば、フォリスタチンポリペプチド、ＦＬＲＧポリペプチド、ＷＦＩＫＫＮ１ポリペプチドまたはＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチド）に任意に融合して、フォリスタチン関連融合ポリペプチドを生成することができる。この単鎖は、第１のＦｃと相補的なＦｃ配列と共に最適な細胞において共発現されて、所望の多重鎖構築物の生成に有利に働くことができる。ノブ・ホール型ペア形成に基づくこの例において、配列番号４１［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｔ１４４Ｙ）］および配列番号４２［ヒトＧ１Ｆｃ（Ｙ１８５Ｔ）］は、操作されたアミノ酸置換に二重の下線が引かれた相補的Ｆｃ配列の例であり、構築物のフォリスタチン関連ポリペプチドは、配列番号４１または配列番号４２のいずれかに融合することができるが、これらの両方には融合できない。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃおよび天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃにおける対応する位置のアミノ酸置換（図１を参照）が、下の相補的ｈＧ１Ｆｃペア（配列番号４１、４２）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃペアを生成するであろうと認めることができる。
【化３１】
2018510637.tif 000033
【０１１４】
操作されたジスルフィド結合と組み合わせたノブ・ホール型ペア形成に基づくＦｃ相補性の例は、配列番号４３［ｈＧ１Ｆｃ（Ｓ１３２Ｃ／Ｔ１４４Ｗ）］および配列番号４４［ｈＧ１Ｆｃ（Ｙ１２７Ｃ／Ｔ１４４Ｓ／Ｌ１４６Ａ／Ｙ１８５Ｖ）］に開示されている。これらの配列における操作されたアミノ酸置換には二重の下線が引かれ、構築物のフォリスタチン関連ポリペプチドは、配列番号４３または配列番号４４のいずれかに融合することができるが、これらの両方には融合できない。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃおよび天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃにおける対応する位置のアミノ酸置換（図１を参照）が、下記の相補的ｈＧ１Ｆｃペア（配列番号４３、４４）の代わりに使用することができる相補的Ｆｃペアを生成するであろうと認めることができる。
【化３２】
2018510637.tif 000034
【０１１５】
部分的に、本開示は、ヒトＩｇＧおよびＩｇＡ  ＣＨ３ドメインの指状嵌合型（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｉｎｇ）β−ストランドセグメントを生成するように操作されたＦｃ配列を使用した、非対称Ｆｃ含有ポリペプチド鎖の所望のペア形成を提供する。このような方法は、ＳＥＥＤｂｏｄｙ融合タンパク質の形成を可能にするストランド交換操作ドメイン（ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）（ＳＥＥＤ）ＣＨ３ヘテロ二量体の使用を含む［例えば、Ｄａｖｉｓら（２０１０年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｅｌ  ２３巻：１９５〜２０２頁を参照］。ＳＥＥＤｂｏｄｙ相補性を有するＦｃ配列のペアの一方は、任意選択のリンカーありまたはなしで、構築物のフォリスタチン関連ポリペプチド（例えば、フォリスタチンポリペプチド、ＦＬＲＧポリペプチド、ＷＦＩＫＫＮ１ポリペプチドまたはＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチド）に任意に融合して、フォリスタチン関連融合ポリペプチドを生成することができる。この単鎖は、第１のＦｃと相補的なＦｃ配列と共に最適な細胞において共発現されて、所望の多重鎖構築物の生成に有利に働くことができる。ＳＥＥＤｂｏｄｙ（Ｓｂ）ペア形成に基づくこの例において、配列番号４５［ｈＧ１Ｆｃ（ＳｂＡＧ）］および配列番号４６［ｈＧ１Ｆｃ（ＳｂＧＡ）］は、ＩｇＡ  Ｆｃに由来する操作されたアミノ酸置換に二重の下線が引かれた相補的ＩｇＧ  Ｆｃ配列の例であり、構築物のフォリスタチン関連ポリペプチドは、配列番号４５または配列番号４６のいずれかに融合することができるが、これらの両方には融合できない。天然のｈＧ１Ｆｃ、天然のｈＧ２Ｆｃ、天然のｈＧ３Ｆｃおよび天然のｈＧ４Ｆｃの間の高度なアミノ酸配列同一性を考慮すると、ｈＧ１Ｆｃ、ｈＧ２Ｆｃ、ｈＧ３ＦｃまたはｈＧ４Ｆｃの対応する位置におけるアミノ酸置換（図１を参照）が、下記の相補的ＩｇＧ−ＩｇＡペア（配列番号４５、４６）において使用することができるＦｃ単量体を生成するであろうと認めることができる。
【化３３】
2018510637.tif 000035
【０１１６】
融合タンパク質の異なるエレメントは、所望の機能性と符合する任意の様式で配列し得ることが理解される。例えば、フォリスタチン関連ポリペプチドを、異種ドメインに対してＣ末端に配置することもでき、代替的に、異種ドメインを、フォリスタチン関連ポリペプチドに対してＣ末端に配置することもできる。フォリスタチン関連ポリペプチドドメインと、異種ドメインとは、融合タンパク質内で隣接する必要はなく、追加のドメインまたはアミノ酸配列を、いずれかのドメインに対してＣ末端またはＮ末端に含めることもでき、ドメインの間に含めることもできる。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、用語「免疫グロブリンＦｃドメイン」または単に「Ｆｃ」は、免疫グロブリン鎖定常領域、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域、またはその部分のカルボキシル末端部分を意味すると理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または５）２つもしくはこれを超えるドメインと、免疫グロブリンヒンジ領域との組合せを含み得る。好ましい実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも、免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含み、好ましくはＣＨ１ドメインを欠く。また、フォリスタチンポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、またはＣＨ３ドメインなど、免疫グロブリンの１つだけのドメインを含み得ることも理解される。これらのドメインの多くは、望ましい薬物動態特性のほか、二量体化またはより高次の多量体化を付与する。
【０１１８】
一実施形態では、重鎖定常領域が由来する免疫グロブリンのクラスは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、γサブクラス２、γサブクラス３、またはγサブクラス４）である。免疫グロブリンの他のクラスである、ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）、およびＩｇＭ（Ｉｇμ）も使用することができる。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択については、米国特許第５，５４１，０８７号および同第５，７２６，０４４号において詳細に論じられている。特定の結果を達成するための、ある特定の免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスに由来する、特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当技術分野における技術水準の範囲内にあると考えられる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築物の部分は、ヒンジドメインの少なくとも一部と、好ましくはＦｃガンマのＣＨ３ドメイン、またはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭのいずれかにおける相同なドメインの少なくとも一部とを含むことが好ましい。
【０１１９】
さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失は、本明細書で開示される方法および組成物の実施において有用であり得ることが企図される。１つの例は、上方のＣＨ２領域内にアミノ酸置換を導入して、Ｆｃ受容体に対するアフィニティーが低減されたＦｃ改変体を創出することである（Ｃｏｌｅら（１９９７年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５９巻：３６１３頁）。加えて、多くの場合、Ｃ末端のリシンまたはＫは除去され、このため、配列番号３４〜４６において示されるＦｃドメインなど、本明細書で記載される任意のポリペプチドから、Ｆｃドメイン内で見出されるＣ末端のＫが除外され得る。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、本開示のフォリスタチン関連ポリペプチドは、フォリスタチン関連ポリペプチドを安定化させ得る１または複数の改変を含む。例えば、このような改変は、フォリスタチン関連ポリペプチドのインビトロ半減期を増強させるか、フォリスタチン関連ポリペプチドの循環半減期を増強させる、または、フォリスタチン関連ポリペプチドのタンパク質分解を減少させる。このような安定化改変としては、融合タンパク質（例えば、フォリスタチン関連ポリペプチドと安定化ドメインとを含む融合タンパク質が挙げられる）、グリコシル化部位の改変（例えば、フォリスタチン関連ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加が挙げられる）、および糖質部分の修飾（例えば、フォリスタチン関連ポリペプチドからの炭水化物部分の除去が挙げられる）が挙げられるがこれらに限定されない。融合タンパク質の場合、フォリスタチン関連ポリペプチドを、ＩｇＧ分子（例えば、Ｆｃドメイン）など、安定化ドメインに融合させる。本明細書中で使用される場合、用語「安定化ドメイン」は、融合タンパク質の場合のように融合ドメイン（例えば、Ｆｃ）を指すだけでなく、炭水化物部分のような非タンパク質性修飾、または、ポリエチレングリコールのような非タンパク質性ポリマーも含む。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、本発明は、フォリスタチンポリペプチドの単離形態および／または精製形態であって、他のタンパク質から単離されているか、または他の形で、他のタンパク質を実質的に含まない形態を利用可能とする。ある特定の実施形態では、本発明は、精製に有利な特性を保持する相互作用ペア（例えば、Ｆｃドメイン）の取付けにより、治療上活性なフォリスタチン関連ポリペプチドの精製を容易にする。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、本開示のフォリスタチン関連ポリペプチド（改変または非改変）は、当該分野で公知の様々な技法により生成することができる。例えば、そのようなフォリスタチン関連ポリペプチドは、Ｂｏｄａｎｓｋｙ，  Ｍ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３年）；およびＧｒａｎｔ  Ｇ．  Ａ．（編）、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２年）において記載されているものなどの標準的なタンパク質化学技術を使用して合成することができる。加えて、自動式ペプチド合成器も、市販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  ３９６型；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ９６００）。代替的に、フォリスタチン関連ポリペプチド、それらのフラグメントまたは改変体は、当該分野で周知の、種々の発現系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス）を使用して、組換えにより生成することもできる（下記も参照）。さらなる実施形態では、改変フォリスタチン関連ポリペプチドまたは非改変フォリスタチン関連ポリペプチドは、例えば、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシン、またはＰＡＣＥ（ｐａｉｒｅｄ  ｂａｓｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）の使用を介する、天然に存在するまたは組換えにより生成された全長フォリスタチン関連ポリペプチドの消化により生成することができる。（市販のソフトウェア、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．を使用する）コンピュータ解析を使用して、タンパク質分解性切断部位を同定することができる。代替的に、このようなフォリスタチン関連ポリペプチドは、化学的切断（例えば、臭化シアン、ヒドロキシルアミン）によるものなどの当技術分野の公知の標準的な技術などで、天然に存在するまたは組換えにより生成された全長フォリスタチン関連ポリペプチドから生成することができる。
【０１２３】
本明細書で開示されるフォリスタチン関連ポリペプチドのいずれかは、本開示の１つまたは複数の追加的なフォリスタチン関連ポリペプチドと組み合わせて、フォリスタチン関連障害の処置など、所望の効果を達成することができる（例えば、それを必要とする被験体における筋量および／または強度を増加させる、それを必要とする被験体における筋肉損失を処置または予防する、それを必要とする被験体における筋肉損失の１つまたは複数の合併症を処置または予防する；それを必要とする被験体におけるヘモグロビン濃度または赤血球細胞数を増加させる、それを必要とする被験体における不適切なヘモグロビン濃度または赤血球細胞数を処置または予防する、それを必要とする被験体における不適切なヘモグロビン濃度または赤血球細胞数の１つまたは複数の合併症を処置または予防する；それを必要とする被験体における骨量および／または強度を増加させる、それを必要とする被験体における骨損失（ｂｏｎｅ  ｌｏｓｓ）または脆弱性を処置または予防する、それを必要とする被験体における骨損失または脆弱性の１つまたは複数の合併症を処置または予防する；あるいはそれを必要とする被験体におけるがんを処置する）。例えば、本明細書で開示されるフォリスタチンポリペプチドは、ｉ）本明細書で開示される１つもしくは複数の追加的なＦＬＲＧポリペプチド、ｉｉ）本明細書で開示される１つもしくは複数のＷＦＩＫＫＮ１ポリペプチド、および／またはｉｉｉ）本明細書で開示される１つもしくは複数のＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチドと組み合わせて使用することができる。
【０１２４】
３．フォリスタチン関連ポリペプチドをコードする核酸
ある特定の態様では、本発明は、本明細書で開示されるフォリスタチン関連ポリペプチドのいずれかをコードする単離核酸および／または組換え核酸を提供する。対象核酸は、一本鎖でもよく、二本鎖でもよい。このような核酸は、ＤＮＡ分子でもよく、ＲＮＡ分子でもよい。これらの核酸は、例えば、フォリスタチン関連ポリペプチドを作製するための方法において使用することができる。
【０１２５】
例えば、以下の配列は、天然に存在するヒトフォリスタチン前駆体ポリペプチド（配列番号４７）（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１３４０９．２のヌクレオチド３５９〜１３９０）をコードする。
【化３４】
2018510637.tif 000036
【０１２６】
以下の配列は、成熟ＦＳＴ３１５ポリペプチド（配列番号４８）をコードする。
【化３５】
2018510637.tif 000037
【０１２７】
以下の配列は、ＦＳＴ２８８ポリペプチド（配列番号４９）をコードする。
【化３６】
2018510637.tif 000038
【０１２８】
以下の配列は、成熟ＦＳＴ２９１ポリペプチド（配列番号５０）をコードする。
【化３７】
2018510637.tif 000039
【０１２９】
例えば、以下の配列（配列番号５１）は、天然に存在するヒトＦＬＲＧ前駆体ポリペプチド（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００５８６０．２のヌクレオチド３６〜８２４）をコードする。シグナル配列をコードするヌクレオチドには下線が引かれている。
【化３８】
2018510637.tif 000040
【０１３０】
以下の配列（配列番号５２）は、成熟ヒトＦＬＲＧポリペプチド（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００５８６０．２のヌクレオチド１１４〜８２４）をコードする。
【化３９】
2018510637.tif 000041
【０１３１】
例えば、以下の配列（配列番号５３）は、天然に存在するヒトＷＦＩＫＫＮ１前駆体ポリペプチド（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０５３２８４．２のヌクレオチド２４３〜１８８６）をコードする。シグナル配列をコードするヌクレオチドには下線が引かれている。
【化４０】
2018510637.tif 000042
【０１３２】
以下の配列（配列番号５４）は、成熟ヒトＷＦＩＫＫＮ１ポリペプチド（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＭ＿０５３２８４．２のヌクレオチド３００〜１８８６）をコードする。
【化４１】
2018510637.tif 000043
【０１３３】
例えば、以下の配列（配列番号５５）は、天然に存在するヒトＷＦＩＫＫＮ２前駆体ポリペプチド（ＮＣＢＩ参照（Ｒｅｆｅｎｃｅ）配列ＮＭ＿１７５５７５．５のヌクレオチド６９５〜２４２２）をコードする。シグナル配列をコードするヌクレオチドには下線が引かれている。
【化４２】
2018510637.tif 000044
【０１３４】
以下の配列（配列番号５６）は、成熟ヒトＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチド（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＭ＿１７５５７５．５のヌクレオチド７９７〜２４２２）をコードする。
【化４３】
2018510637.tif 000045
【０１３５】
ある特定の態様では、フォリスタチン関連ポリペプチドをコードする対象の核酸は、配列番号４７〜５６の改変体である核酸を含むことがさらに理解される。改変体ヌクレオチド配列は、１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加、または欠失により異なる配列、例えば、対立遺伝子改変体を含み、したがって、配列番号４７〜５６に表示されるコード配列のヌクレオチド配列と異なるコード配列を含む。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号４７〜５６に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である単離核酸配列または組換え核酸配列を提供する。当業者は、配列番号４７〜５６と相補的な核酸配列および配列番号４７〜５６の改変体も、本開示の範囲内にあることを認識するであろう。さらなる実施形態では、本開示の核酸配列は、単離され得る、組換えとなり得る、および／または異種ヌクレオチド配列と融合され得る、またはＤＮＡライブラリー中に存在し得る。
【０１３７】
他の実施形態では、本発明の核酸はまた、配列番号４７〜５６に指定されるヌクレオチド配列、配列番号４７〜５６の相補配列、またはこれらのフラグメントに対して高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。
【０１３８】
当業者は、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変更され得ることを容易に理解する。例えば、約４５℃における６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーションの後に、５０℃における２．０×ＳＳＣの洗浄を行い得る。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃における約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから、５０℃における約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択され得る。さらに、洗浄工程における温度は、室温（約２２℃）の低ストリンジェンシー条件から、約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで上昇され得る。温度と塩の両方が変更されても、温度または塩濃度が一定に保たれ、他の変数が変更されてもよい。一実施形態では、本発明は、室温における６×ＳＳＣとその後の室温で２×ＳＳＣでの洗浄の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
【０１３９】
遺伝子コードにおける縮重に起因して配列番号４７〜５６に示される核酸と異なる単離された核酸もまた、本開示の範囲内である。例えば、多数のアミノ酸が１より多いトリプレットによって示される。同じアミノ酸を特定するコドンまたは同義語（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンに対する同義語である）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異を生じ得る。しかしながら、哺乳動物細胞の中には、本主題のタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列の多型が存在することが予想される。当業者は、天然の対立遺伝子改変に起因して、所与の種の個体間に、特定のタンパク質をコードする核酸の１または複数のヌクレオチド（約３〜５％までのヌクレオチド）におけるこれらのバリエーションが存在し得ることを理解する。任意およびあらゆるこのようなヌクレオチドのバリエーションと、結果として生じるアミノ酸の多型とは、本開示の範囲内である。
【０１４０】
特定の実施形態では、本開示の組換え核酸は、発現構築物において１または複数の調節性ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節性のヌクレオチド配列は、一般に、発現のために使用される宿主細胞に対して適切なものである。種々の宿主細胞について、多数のタイプの適切な発現ベクターおよび適切な調節性配列が当該分野で公知である。代表的には、上記１または複数の調節性ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダー配列もしくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびに、エンハンサー配列もしくはアクチベーター配列が挙げられ得るがこれらに限定されない。当該分野で公知の構成的もしくは誘導性のプロモーターが、本開示によって企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または、１つより多くのプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドのようにエピソーム上で細胞中に存在し得るか、または、発現構築物は、染色体中に挿入され得る。好ましい実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は、当該分野で周知であり、そして、使用される宿主細胞により変化する。
【０１４１】
ある特定の態様では、本主題の核酸は、フォリスタチン関連ポリペプチドをコードし、そして、少なくとも１つの調節性配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターにおいて提供される。調節性配列は当該分野で認識され、そして、フォリスタチン関連ポリペプチドの発現を誘導するように選択される。したがって、用語、調節性配列は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。例示的な調節性配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０年）に記載される。例えば、作動可能に連結されたときにＤＮＡ配列の発現を制御する広範な種々の発現制御配列のいずれかが、フォリスタチン関連ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクターにおいて使用され得る。このような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスもしくはサイトメガロウイルスの前初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣもしくはＴＲＣシステム、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによってその発現が誘導されるＴ７プロモーター、ファージλの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼもしくは他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α−接合因子（ｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、ならびに、原核生物もしくは真核生物の細胞、または、そのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知である他の配列、ならびにこれらの種々の組み合わせが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現されることが所望されるタンパク質のタイプのような要因に依存し得ることが理解されるべきである。さらに、ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質（例えば、抗生物質マーカー）の発現もまた考慮されるべきである。
【０１４２】
本開示の組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部を、原核生物細胞、真核生物細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物）のいずれか、または両方において発現させるために適切なベクター中に連結することによって生成され得る。組換えフォリスタチン関連ポリペプチドの生成のための発現ビヒクルとしては、プラスミドおよび他のベクターが挙げられる。例えば、適切なベクターとしては、以下のタイプのプラスミドが挙げられる：原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のための、ｐＢＲ３２２由来のプラスミド、ｐＥＭＢＬ由来のプラスミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ由来のプラスミドおよびｐＵＣ由来のプラスミド。
【０１４３】
いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を促進するための原核生物の配列と、真核生物細胞において発現される１または複数の真核生物の転写単位との両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核生物細胞のトランスフェクションに適切な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、原核生物細胞および真核生物細胞の両方における複製および薬物耐性選択を容易にするために、細菌プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２）からの配列を用いて改変される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン−バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）のようなウイルスの誘導体が、真核生物細胞におけるタンパク質の一過的な発現のために使用され得る。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、遺伝子治療送達系の説明において以下に見出され得る。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において用いられる種々の方法は、当該分野で周知である。原核生物細胞および真核生物細胞の両方についての他の適切な発現系、ならびに、一般的な組換え手順、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  Ｅｄ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）１６章および１７章を参照のこと。いくつかの場合において、バキュロウイルス発現系を用いて組換えポリペプチドを発現させることが望ましくあり得る。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来のベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来のベクター（例えば、ｐＡｃＵＷｌ）およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（例えば、β−ｇａｌを含むｐＢｌｕｅＢａｃ  ＩＩＩ）が挙げられる。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、ベクターは、ＣＨＯ細胞における本主題のフォリスタチン関連ポリペプチドの生成のために設計される（例えば、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ））。明らかであるように、本主題の遺伝子構築物は、例えば、タンパク質（融合タンパク質または改変体タンパク質を含む）を生成するため、精製のために、培養物において増殖させた細胞において本主題のフォリスタチン関連ポリペプチドの発現を引き起こすために使用され得る。
【０１４５】
本開示はまた、１または複数の本主題のフォリスタチン関連ポリペプチドのコード配列（例えば、配列番号１９〜２２）を含む組換え遺伝子をトランスフェクトされた宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、本開示のフォリスタチン関連ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０１４６】
したがって、本開示はさらに、本主題のフォリスタチン関連ポリペプチドを生成する方法に関する。例えば、フォリスタチン関連ポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、フォリスタチン関連ポリペプチドの発現を起こすことが可能な適切な条件下で培養され得る。フォリスタチン関連ポリペプチドは、フォリスタチン関連ポリペプチドを含む細胞および培地の混合物から分泌および単離され得る。あるいは、フォリスタチン関連ポリペプチドは、細胞質または膜画分に保持され得、そして、細胞が回収、溶解され、そして、タンパク質が単離される。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適切な培地は、当該分野で周知である。本主題のフォリスタチン関連ポリペプチドは、タンパク質を精製するための当該分野で公知の技法であって、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびフォリスタチンポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体による免疫アフィニティー精製を含む技法を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、またはこれらの両方から単離することができる。好ましい実施形態では、フォリスタチン関連ポリペプチドは、その精製を容易とするドメインを含有する融合タンパク質である。
【０１４７】
別の実施形態では、精製用リーダー配列（例えば、組換えフォリスタチン関連ポリペプチドの所望の部分のＮ末端に位置するポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位の配列）をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーによる、発現された融合タンパク質の精製を可能にし得る。その後、精製用リーダー配列は、引き続いて、エンテロキナーゼでの処理によって除去され、精製フォリスタチン関連ポリペプチドを提供し得る（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら、（１９８７年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１巻：１７７頁；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８巻：８９７２頁を参照のこと）。
【０１４８】
融合遺伝子を作製するための技術は周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡフラグメントの接合は、ライゲーションのための平滑末端もしくは突出（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じた粘着末端のフィルイン（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、所望されない接合を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および酵素によるライゲーション、を用いる従来の技術に従って行われる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子フラグメント間の相補的なオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を生じるアンカープライマーを用いて行われ得、これらのフラグメントは、その後、キメラ遺伝子配列を生じるようにアニーリングされ得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２年を参照のこと）。
【０１４９】
４．例示的な治療的使用
ある特定の実施形態では、例えば、本明細書で開示されるフォリスタチン関連融合ポリペプチドを含む様々なタンパク質複合体を含む、本開示の組成物を、本節で記載される疾患または状態であって、フォリスタチン関連ポリペプチドおよび／またはフォリスタチンリガンド（例えば、ミオスタチン、アクチビン、ＧＤＦ１１）の異常な活性と関連する疾患または障害を含む、疾患または状態を処置または予防するために使用することができる。本明細書では一般に、これらの疾患、障害、または状態を、「フォリスタチン関連状態」と称する。ある特定の実施形態では、本開示は、個体に、上記で記載したフォリスタチン関連融合ポリペプチドの治療有効量を投与することにより、それを必要とする個体を処置または予防する方法を提供する。これらの方法は、特に、動物、より特定すれば、ヒトの治療的処置および予防的処置を目的とする。
【０１５０】
本明細書で使用される通り、障害または状態を「予防する」治療薬は、統計学的試料において、無処置対照試料と比べて処置された試料における障害もしくは状態の発生を低減する、または無処置対照試料と比べて障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状の発病を遅延させるもしくはその重症度を低減する化合物を指す。本明細書で使用される用語「処置する」は、確立された後の状態の好転（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）または排除を含む。いずれの場合でも、予防または処置は、医師または他の医療提供者によって提供される診断および治療剤の投与の意図した結果において識別することができる。
【０１５１】
一般に、本開示に記載されている疾患または状態の処置または予防は、本開示のフォリスタチン関連ポリペプチド、またはこのようなポリペプチドを含む組成物、複合体もしくは組合せを「有効量」で投与することにより達成される。薬剤の有効量は、所望の治療または予防結果の達成に必要な投薬量および期間において、有効な量を指す。本開示の薬剤の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する薬剤の能力などの因子に応じて変動し得る。「予防有効量」は、所望の予防結果の達成に必要な投薬量および期間において、有効な量を指す。
【０１５２】
フォリスタチン−リガンド複合体は、組織成長のほか、種々の構造の適正な形成などの早期発生プロセスにおいて、または、性的発育、下垂体ホルモンの生成、および筋肉の創出を含む、１つもしくは複数の発生後能において不可欠の役割を果たす。したがって、フォリスタチン関連状態は、組織成長の異常および発生の欠損を含む。
【０１５３】
処置のための例示的な状態は、神経筋障害（例えば、筋ジストロフィーおよび筋萎縮）、うっ血性閉塞性肺疾患（およびＣＯＰＤに関連する筋消耗）、筋消耗症候群、サルコペニアおよび悪液質、脂肪組織障害（例えば、肥満）、２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ、成人発症型糖尿病）ならびに骨変性疾患（例えば、骨粗鬆症）を含む。他の例示的な状態は、筋肉変性障害（ｍｕｓｃｕｌｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）および神経筋障害、組織修復（例えば、創傷治癒）ならびに神経変性疾患（例えば、筋委縮性側索硬化症）を含む。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物（例えば、フォリスタチン関連融合タンパク質）を、筋ジストロフィーのための処置の一部として使用する。用語「筋ジストロフィー」とは、骨格筋、ならびに、ある場合には、心臓および呼吸筋の段階的な筋力低下および劣化を特徴とする、変性性筋疾患の群を指す。筋ジストロフィーは、筋肉の微視的変化と共に始まる、進行性の筋消耗および筋力低下を特徴とする遺伝性障害である。筋肉が経時的に変性するにつれて、個人の筋強度は減衰する。本主題のフォリスタチン関連ポリペプチドを含むレジメンで処置され得る、例示的な筋ジストロフィーとして、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、エメリー−ドレイフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨまたはＦＳＨＤ）（ランドゥジー−デジェリン型としてもまた公知である）、筋強直性ジストロフィー（ｍｙｓｔｒｏｐｈｙ）（ＭＭＤ）（スタイナート病としてもまた公知である）、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー（ＤＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）が挙げられる。
【０１５５】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、フランスの神経学者である、Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ａｍａｎｄ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅにより、１８６０年代において、最初に記載された。ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、ＤＭＤのこの変化形について１９５０年代に最初に記載したドイツの医師であるＰｅｔｅｒ  Ｅｍｉｌ  Ｂｅｃｋｅｒに因んで名付けられた。ＤＭＤは、男性において最も高頻度の遺伝性疾患の１つであり、３，５００人中１人の少年に影響を及ぼす。ＤＭＤは、Ｘ染色体の短腕部に位置するジストロフィン遺伝子が破壊されると生じる。男性が保有するＸ染色体のコピーは、１つだけであるので、男性が有するジストロフィン遺伝子のコピーも１つだけである。ジストロフィンタンパク質を伴わないと、筋肉は、収縮および弛緩の周期において容易に損傷する。疾患の早期では、筋肉は、再生により代償されるが、後に、筋前駆細胞は、進行する損傷に追いつけなくなり、健常筋肉は、非機能的な線維脂肪性組織で置きかえられる。
【０１５６】
ＢＭＤは、ジストロフィン遺伝子における異なる変異から生じる。ＢＭＤ患者は、いくらかのジストロフィンを有するが、量が不十分であるか、または質が不良である。いくらかのジストロフィンを有することで、ＢＭＤを有する人の筋肉は、ＤＭＤを有する人の筋肉と同等の重度または迅速な変性からは保護される。
【０１５７】
例えば、近年の研究は、インビボにおいて、ミオスタチン（フォリスタチンリガンド）の機能を遮断するかまたは消失させることにより、ＤＭＤ患者およびＢＭＤ患者における少なくともある特定の症状を有効に処置し得ることを実証している。したがって、本主題のフォリスタチン関連融合ポリペプチドは、ミオスタチン阻害剤（アンタゴニスト）として作用することが可能であり、ＤＭＤ患者およびＢＭＤ患者におけるミオスタチンの機能を、インビボで遮断する代替的な手段を構成する。
【０１５８】
同様に、本主題のフォリスタチン関連融合ポリペプチドは、筋成長を必要とする他の疾患状態において、筋量を増大させる有効な手段をもたらす。例えば、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルーゲーリック病または運動ニューロン疾患ともまた呼ばれる）は、慢性で、治癒不能、かつ、制止不能なＣＮＳ障害であって、脳を骨格筋に接続するＣＮＳの構成要素である運動ニューロンを攻撃するＣＮＳ障害である。ＡＬＳでは、運動ニューロンは、劣化し、最終的に死滅し、個人の脳は、完全な機能および呼びかけ（ａｌｅｒｔ）を正常に保つが、運動の命令が筋肉に到達することはない。ＡＬＳに罹患する大半の人は、４０〜７０歳の間である。衰弱する最初の運動ニューロンは、腕部または脚部に至る運動ニューロンである。ＡＬＳを有する人は、歩行が困難な場合があり、物を落とし、倒れ、呂律が回らなくなり、制御不能に笑ったり泣いたりする場合がある。最終的に、四肢における筋肉は、不使用のために萎縮し始める。この筋力低下は、消耗性となり、個人は、車椅子を必要とするか、または床から起き上がることができなくなる。大半のＡＬＳ患者は、疾患発病から３〜５年で、呼吸不全、または肺炎のような換気装置支援による合併症で死ぬ。
【０１５９】
フォリスタチン関連融合ポリペプチドによって誘導される筋量増加は、筋消耗疾患を患う患者の利益になることもできる。ミオスタチン発現は、ヒトにおける除脂肪体重と逆相関し、このようなＭＳＴＮ遺伝子の発現増加は、ＡＩＤＳ消耗性症候群の男性における体重減少と関連する。ＡＩＤＳ患者におけるミオスタチンの機能を阻害することにより、ＡＩＤＳの少なくともある特定の症状を、完全に消失させないにせよ、緩和することができ、こうして、ＡＩＤＳ患者における生活の質を著明に改善することができる。
【０１６０】
がん食欲不振−悪液質症候群は、がんの最も衰弱性かつ生命にかかわる側面にある。この症候群は、死亡時にがん患者のおよそ８０％に存在する、多くの種類のがんに共通の特色であり、不十分な生活の質および化学療法に対する不十分な応答のみならず、匹敵する腫瘍を有するが体重減少していない患者よりも短い生存時間の原因にもなる。発病前体重の５パーセントを超える不随意性の体重減少が、６ヶ月間の期間内に起こる場合、悪液質が典型的にがん患者において疑われる。食欲不振、脂肪および筋肉組織の消耗ならびに心理的窮迫に伴い、悪液質が、がんおよび宿主の間の複雑な相互作用から生じる。がん悪液質は、サイトカイン産生、脂質動員およびタンパク質分解誘導因子の放出、ならびに中間代謝の変更に影響を与える。食欲不振が一般的であるが、食物摂取減少単独では、がん患者に観察される体組成の変化を説明することができず、栄養摂取の増加は、消耗性症候群を反転することができない。現在、悪液質過程（ｃａｃｈｅｘｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓ）を制御または反転するための処置は存在しない。成体マウスにおけるＧＤＦ８の全身性過剰発現は、ヒト悪液質症候群に観察されるものと類似の著明な筋肉および脂肪損失を誘導することが判明したため（Ｚｉｍｍｅｒｓら、上記参照）、対象のフォリスタチン関連ポリペプチドは、筋肉成長が望まれる悪液質症候群の症状の予防、処置または軽減に有益に使用することができる。
【０１６１】
他の実施形態では、フォリスタチン関連融合ポリペプチドまたはこのようなポリペプチドの組合せは、動物における体脂肪含量の調節に、およびそれに関係する状態、特に、それに関係する健康を損なう状態の処置または予防に使用することができる。本発明にしたがって、体重を調節（制御）するということは、体重の低減もしくは増加、体重増加の速度の低減もしくは増加、または体重減少の速度の増加もしくは低減を指すことができ、体重を能動的に維持すること、または有意に変化させないこと（例えば、何もしなければ体重を増加または減少させ得る、外部または内部の影響に対して）も含む。本開示の一実施形態は、本開示のフォリスタチン関連融合ポリペプチドまたはこのようなポリペプチドの組合せを、それを必要とする動物（例えば、ヒト）に投与することによる、体重の調節に関する。
【０１６２】
一部の実施形態では、本開示のフォリスタチン関連融合ポリペプチドまたはこのようなポリペプチドの組合せは、動物における体重の低減および／または体重増加の低減に、より具体的には、肥満のリスクがあるまたはこれを患う患者における肥満の処置または好転に使用することができる。別の特異的な実施形態では、本発明は、体重を増加または保持することができない動物（例えば、消耗性症候群の動物）を処置するための方法および化合物を対象にする。このような方法は、体重および／または質量の増加に、または体重および／または質量減少の低減に、または望ましくなく低い（例えば、不健康な）体重および／または質量に関連するもしくはこれに起因する状態の改善に有効である。加えて、高コレステロールの障害（例えば、高コレステロール血症または脂質異常症（ｄｉｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ））は、本開示のフォリスタチン関連融合ポリペプチドまたはこのようなポリペプチドの組合せにより処置することができる。
【０１６３】
一部の実施形態では、本開示のフォリスタチン関連融合ポリペプチドまたはこのようなポリペプチドの組合せは、ＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、低アディポネクチン血症（ｈｙｐｅｒａｄｉｎｅｃｔｏｎｅｍｉａ）、高血糖または高インスリン血症など、代謝性障害の処置に使用することができる。
【０１６４】
線維症は一般に、器官または組織における細胞数の相対的減少と組み合わせた、コラーゲン線維および細胞外マトリクスの両方の過剰な沈着を指す。この過程は、傷害後の自然な創傷治癒の重要な特色であるが、線維症は、例えば、肺、腎臓、肝臓、骨、筋肉および皮膚を含む様々な組織および器官に病理的損傷をもたらし得る。線維症におけるＴＧＦ−ベータスーパーファミリーの役割は、広範に研究されてきた。例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡおよびアクチビンＢ）およびＧＤＦ８を含む、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドは、線維症に関係づけられてきた［Ｈｅｄｇｅｒら（２０１３年）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２４巻：２８５〜２９５頁；Ｈａｒｄｙら（２０１５年）９３巻：５６７〜５７４頁；およびＣａｎｔｉｎｉら（２００８年）Ｊ  Ｓｅｘ  Ｍｅｄ  ５巻：１６０７〜１６２２頁］。したがって、一部の実施形態では、本開示のフォリスタチン関連融合ポリペプチドまたはこのようなポリペプチドの組合せは、線維症、特に、線維症関連障害および状態の処置に使用することができる。例えば、フォリスタチン関連融合ポリペプチドまたはこのようなポリペプチドの組合せは、肺線維症、過敏性肺炎、特発性線維症、結核、肺炎、嚢胞性線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、腎（腎臓）線維症、腎（腎臓）不全、慢性腎（腎臓）疾患、骨線維症、骨髄線維症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、サルコイドーシス、多発血管炎性肉芽腫症、ペロニー病、肝臓線維症、ウィルソン病、糖原病（特に、ＩＩＩ、ＩＶ、ＩＸおよびＸ型）、鉄過剰、ゴーシェ病、ツェルウェーガー症候群、非アルコール性およびアルコール性脂肪性肝炎、胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、バッド・キアリ症候群、外科手術関連線維症、クローン病、デュピュイトラン拘縮（Ｄｕｐｕｔｒｅｎ’ｓ  ｃｏｎｔｒａｃｔｕｒｅ）、縦隔線維症、腎性線維症（ｎｅｐｈｒｏｇｅｎｅｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、後腹膜線維症、心房性線維症、心内膜心筋線維症、膵臓線維症のうち１つまたは複数の処置または予防に使用することができる。
【０１６５】
一部の実施形態では、本開示のフォリスタチン関連融合ポリペプチドまたはこのようなポリペプチドの組合せは、慢性腎臓疾患を処置するための１つまたは複数の支持療法と任意選択で組み合わせて、慢性腎臓疾患の処置または予防に使用することができる。一部の実施形態では、本開示のフォリスタチン関連融合ポリペプチドまたはこのようなポリペプチドの組合せは、慢性腎臓疾患を処置するための１つまたは複数の支持療法と任意選択で組み合わせて、慢性腎臓疾患の１つまたは複数の合併症（症状または症状発現）の処置または予防に使用することができる。一部の実施形態では、本開示のフォリスタチン関連融合ポリペプチドまたはこのようなポリペプチドの組合せは、末期腎臓疾患を処置するための１つまたは複数の支持療法と任意選択で組み合わせて、末期腎臓不全の処置または予防に使用することができる。慢性腎疾患としても公知の慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）は、数ヶ月間または数年間の期間にわたる腎機能の進行性損失である。腎臓機能の悪化の症状は、全体的な体調不良を感じることおよび食欲低減を経験することを含み得る。多くの場合、慢性腎臓疾患は、高血圧または糖尿病を有する者およびＣＫＤの血縁者がいる者など、腎臓問題のリスクがあることが公知の人のスクリーニングの結果として診断される。この疾患は、心血管疾患、貧血または心膜炎など、その認識される合併症の１つをもたらす場合に同定することもできる。近年の専門ガイドラインは、５つのステージにＣＫＤの重症度を分類し、ステージ１が最も軽度であり、通常、ほとんど症状を引き起こさず、ステージ５が重度疾病であり、処置しなければ不十分な平均余命となる。ステージ５のＣＫＤは多くの場合、末期腎臓疾患、末期腎疾患または末期腎臓不全と呼ばれ、これは、現在は旧式の用語である慢性腎不全または慢性腎臓不全とほぼ同義であり；通常、患者が、ある形態の透析が関与し得るが、理想的には腎臓移植を構成する腎代替療法を必要とすることを意味する。ＣＫＤは、初期に特異的な症状がなく、一般に、血清クレアチニンまたは尿中タンパク質の増加としてのみ検出される。腎臓機能が減少するにつれて、後述する通り様々な症状が顕在化し得る。水分過負荷およびレニン・アンジオテンシン系により腎臓によって生成される血管作動性ホルモンの産生により、血圧が増加することがあり、高血圧症を発症するおよび／またはうっ血性心不全を患うリスクを増加させる。尿素が蓄積することがあり、高窒素血症および最終的に尿毒症（嗜眠から心膜炎および脳症に及ぶ症状）をもたらす。その高い全身性循環のため、尿素は、エクリン汗において高濃度で排泄され、汗が蒸発する際に皮膚上で結晶化する（「尿素霜」）。血液中にカリウムが蓄積することがある（倦怠感および潜在的に致死的な心不整脈を含むある範囲の症状を有する高カリウム血症）。高カリウム血症は通常、糸球体濾過率が、２０〜２５ｍｌ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２未満に降下するまで発症せず、このポイントで、腎臓は、カリウムを排泄する能力が減少している。ＣＫＤにおける高カリウム血症は、酸血症（カリウムの細胞外シフトをもたらす）によって、また、インスリンの欠如から増悪され得る。エリスロポエチン合成が減少されることがあり、貧血の原因となる。軽度浮腫から生命にかかわる肺浮腫に及ぶ、液量過負荷症状（ｆｌｕｉｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ｏｖｅｒｌｏａｄ  ｓｙｍｐｔｏｍ）が起こることがある。一般に、糸球体濾過の減少後に、リン酸塩排泄の低減による高リン酸血症が起こることがある。高リン酸血症は、心血管リスクの増加に関連し、血管石灰化に対する直接的な刺激である。一般に、線維芽細胞増殖因子−２３の刺激に起因する、低カルシウム血症が症状発現することがある。骨細胞は、酵素１−アルファ−ヒドロキシラーゼ（２５−ヒドロキシコレカルシフェロールから１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３への変換の原因となる）の強力な阻害剤であるＦＧＦ２３の産生増加の原因となる。後に、これは、二次性副甲状腺機能亢進症、腎性骨形成異常症および血管石灰化へと進行し、これは、心機能をさらに損なう。代謝性アシドーシス（硫酸塩、リン酸塩、尿酸などの蓄積による）が起こり、酵素に作用する過剰な酸による酵素活性の変更を引き起こすことがある；過剰な酸（酸血症）による高カリウム血症の促進により心臓およびニューロン膜の興奮性の増加を引き起こすこともある。アシドーシスは、近位尿細管の細胞から十分なアンモニアを生成する能力の減少によっても起こる。腎臓機能が減少するにつれて有病率が増加する鉄欠乏貧血は、血液透析を必要としている者において特に蔓延している。これは、原因が多因子性（ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒａｌ）であるが、骨髄抑制をもたらす炎症増加、エリスロポエチンの低減および高尿酸血症を含む。ＣＫＤを有する者は、急速進行型アテローム性動脈硬化を患い、母集団よりも心血管疾患を発症する可能性が高い。ＣＫＤおよび心血管疾患を患う患者は、後者のみを患う患者よりも有意に悪い予後を有する傾向がある。
【０１６６】
本明細書で使用される「と組み合わせた」、「の組合せ」または「共同投与」は、追加的な治療法（例えば、第２、第３、第４のなど）が、身体において依然として有効であるような、いずれかの形態の投与を指す（例えば、複数の化合物が、患者において同時に有効となることであり、これらの化合物の相乗効果を含み得る）。有効性は、血液、血清または血漿中の薬剤の測定可能な濃度に相関しないこともある。例えば、異なる治療化合物は、同じ製剤または別々の製剤のいずれかにおいて、随伴的にまたは逐次のいずれかで、異なるスケジュールで投与することができる。よって、このような処置を受ける個体は、異なる治療法の効果の組合せから利益を得ることができる。１つまたは複数の本開示のフォリスタチン関連融合ポリペプチドまたはこのようなポリペプチドの組合せは、１つまたは複数の他の追加的な薬剤または支持療法と同時発生的に、それに先立ち、またはその後に投与することができる。一般に、各治療剤は、この特定の薬剤のために決定された用量および／または時間スケジュールで投与されるであろう。レジメンにおいて用いるための特定の組合せは、治療法と本開示のアンタゴニストとの適合性を考慮に入れるであろう、および／または所望の通りに行われるであろう。
【０１６７】
５．医薬組成物
ある特定の実施形態では、本発明の化合物（例えば、フォリスタチン関連ポリペプチド）を、薬学的に許容されるキャリアと共に製剤化する。例えば、フォリスタチン関連ポリペプチドは、単独で投与することができ、医薬製剤（治療用組成物）の構成要素として投与することもできる。対象の化合物は、ヒト医療または獣医科医療における使用のための、任意の好都合な方式による投与のために製剤化することができる。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、本発明の治療方法は、組成物を外用投与する工程、全身投与する工程、局所投与する工程、またはインプラントもしくはデバイスとして局所投与する工程を含む。投与されるとき、本発明における使用のための治療用組成物は、当然ながら、発熱物質非含有であり、生理学的に許容される形態にある。さらに、組成物は、標的組織部位（例えば、骨、軟骨、筋肉、脂肪、またはニューロン）、例えば、組織損傷を有する部位への送達のための粘性形態で封入されているか、または注射されることが望ましい場合がある。外用投与は、創傷治癒および組織修復に適し得る。フォリスタチン関連ポリペプチド以外の治療的に有用な作用因子であって、任意選択で、上記で記載した組成物中に含まれ得る作用因子も、代替的にまたは付加的に、本発明の方法において本主題の化合物（例えば、フォリスタチン関連ポリペプチド）と共に同時または逐次的に投与することができる。
【０１６９】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、標的組織部位に１つまたは複数の治療化合物（例えば、フォリスタチン関連ポリペプチド）を送達し得、成長中の組織のための構造を提供し得、そして、最適には身体内へと再吸収され得るマトリクスを含み得る。例えば、マトリクスは、フォリスタチン関連ポリペプチドの遅速放出を提供し得る。このようなマトリクスは、他の移植医療用途に現在使用される材料から形成され得る。
【０１７０】
マトリクス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、見かけ上の様相および界面の特性に基づく。本主題の組成物の特定の用途が、適切な製剤を画定する。組成物のための可能性のあるマトリクスは、生分解性でかつ化学的に画定された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であり得る。他の可能性のある材料は、生分解性でかつ生物学的に十分に規定されたもの（例えば、骨または皮膚のコラーゲン）である。さらなるマトリクスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリクスの成分から構成される。他の可能性のあるマトリクスは、非生分解性でかつ化学的に規定されたもの（例えば、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオグラス、アルミン酸塩、または他のセラミクス）である。マトリクスは、上述のタイプの材料の任意の組み合わせ（例えば、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、または、コラーゲンおよびリン酸三カルシウム）から構成され得る。バイオセラミクスは、組成物（例えば、カルシウム−アルミン酸−リン酸）中で変化され得、孔径、粒子径、粒子の形状および生分解性を変更するように加工され得る。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、例えば、カプセル、カシェ、丸剤、錠剤、ロゼンジ（矯味矯臭基材、通常は、スクロースおよびアカシアまたはトラガントを使用する）、散剤、顆粒剤の形態で、あるいは水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、あるいは水中油もしくは油中水の液体エマルジョンとして、あるいはエリキシルもしくはシロップとして、あるいは香錠（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基材を使用する）として、および／あるいはマウスウォッシュなどとして経口投与することもでき、各々が、所定量の作用因子を活性成分として含有する。作用因子はまた、ボーラス、舐剤、またはペーストとしても投与することができる。
【０１７２】
経口投与のための固体投薬形態（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤など）において、本発明の１または複数の治療化合物は、１または複数の薬学的に受容可能なキャリア（例えば、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム）、および／または以下のうち任意のものと混合され得る；（１）充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸）：（２）結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシア）：（３）湿潤剤（例えば、グリセロール）：（４）崩壊剤（例えば、アガー−アガー、炭酸カルシウム、ポテトもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）：（５）溶液抑制剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｔａｒｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、パラフィン）：（６）吸収加速剤（例えば、四級アンモニウム化合物）：（７）加湿剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）：（８）吸着剤（例えば、カオリンおよびベントナイトクレイ）：（９）潤滑剤（例えば、滑石、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、およびこれらの混合物：ならびに（１０）着色剤。カプセル、錠剤、および丸剤の場合、組成物はまた、緩衝剤も含み得る。また、同様の種類の固形組成物も、ラクトースまたは乳糖のほか、高分子量ポリエチレングリコールのような賦形剤を使用して、軟充填ゼラチンカプセル中および硬充填ゼラチンカプセル中の充填剤として利用することができる。
【０１７３】
経口投与のための液体投薬形態としては、薬学的に受容可能なエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁物、シロップおよびエリキシルが挙げられる。活性成分に加え、液体投薬形態は、当該分野で一般に用いられる不活性希釈剤（例えば、水または他の溶媒）、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物］を含み得る。不活性な希釈剤に加え、経口用組成物はまた、加湿剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤、芳香剤、および保存剤を含む佐剤を含み得る。
【０１７４】
懸濁液は、活性化合物に加えて、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー−アガー、およびトラガント、ならびにこれらの混合物などの懸濁剤を含有し得る。
【０１７５】
本明細書で開示されるある特定の組成物は、皮膚または粘膜に外用投与することができる。外用製剤はさらに、皮膚透過強化剤または角質層透過強化剤として有効であることが公知の、多種多様な作用因子の１つまたは複数も含み得る。これらの例は、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチルアルコールまたはイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、およびアゾンである。化粧品的に許容可能な製剤を作製するための追加の作用因子も、さらに含めることができる。これらの例は、脂肪、蝋、油、色素、香料、保存剤、安定化剤、および表面活性剤である。当技術分野で公知のものなどの角質溶解剤もまた、含めることができる。例は、サリチル酸および硫黄である。
【０１７６】
外用投与または経皮投与のための剤形は、散剤、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、および吸入剤を含む。活性化合物は、滅菌条件下で、薬学的に許容されるキャリア、および必要とされ得る任意の保存剤、緩衝剤、または促進剤と共に混合することができる。軟膏、ペースト、クリーム、およびゲルは、本発明の対象の化合物（例えば、フォリスタチン関連ポリペプチド）に加えて、動物脂肪および植物脂肪、油、蝋、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、滑石、および酸化亜鉛、またはこれらの混合物などの賦形剤も含有し得る。
【０１７７】
散剤およびスプレーは、対象の化合物に加えて、ラクトース、滑石、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの賦形剤も含有し得る。スプレーは加えて、クロロフルオロハイドロカーボンなど、常用の推進剤、ならびに、ブタンおよびプロパンなどの揮発性非置換炭化水素も含有し得る。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、非経口投与に適する医薬組成物は、１つまたは複数のフォリスタチン関連ポリペプチドを、１つまたは複数の薬学的に許容される、無菌かつ等張の水性もしくは非水性の溶液、分散液、懸濁液、もしくはエマルジョン、または、使用直前に無菌の注射用溶液もしくは注射用分散液に再構成され得る無菌粉末（抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質、懸濁剤、もしくは増粘剤を含有し得る）と組み合わせて含み得る。本発明の医薬組成物中で利用され得る、適切な水性および非水性のキャリアの例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルを含む。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散剤の場合には必要とされる粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。
【０１７９】
本発明の組成物はまた、保存剤、保湿剤、乳化剤、および分散化剤などの佐剤も含有し得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノールなどを組み入れることにより確保することができる。を含む等張化剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを組成物中に組み入れることも望ましいと考えられる。加えて、注射可能な医薬形態の吸収の遅延も、例えば、吸収を遅延させる作用因子、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組み入れることにより、もたらすことができる。
【０１８０】
投与レジメンは、主治医が、本発明の主題の化合物（例えば、フォリスタチン関連ポリペプチド）の作用を修飾する種々の因子について検討して決定することが理解される。種々の因子は、処置される疾患に依存する。
【０１８１】
特定の実施形態では、本発明はまた、本明細書に開示のフォリスタチン関連ポリペプチドまたは他の化合物のインビボ産生のための遺伝子治療を提供する。このような治療は、上に列挙したような障害を有する細胞または組織中にフォリスタチン関連ポリヌクレオチド配列を導入することによってその治療作用を達成する。フォリスタチン関連ポリヌクレオチドの送達は、例えば、キメラウイルスのような組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を用いることによって達成され得る。フォリスタチン関連ポリヌクレオチド配列の治療的送達に好ましいことは、標的化されたリポソームの使用である。
【０１８２】
本明細書中で教示されるような遺伝子治療に利用され得る種々のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または、好ましくは、ＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルス）が挙げられる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスもしくはトリのレトロウイルスの誘導体である。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベーマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。多数のさらなるレトロウイルスベクターが多数の遺伝子を組み込み得る。これらのベクターは全て、形質導入された細胞が同定および生成され得るように、選択マーカーについての遺伝子を移送または組み込み得る。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を付着させることによって、標的特異的とされ得る。好ましい標的化は、抗体を用いて達成される。当業者は、フォリスタチン関連ポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの標的特異的な送達を可能にするために、特定のポリヌクレオチド配列がレトロウイルスゲノム中に挿入され得るか、または、ウイルスエンベロープに付着され得ることを認識する。好ましい一実施形態では、ベクターを、骨、軟骨、筋肉、またはニューロンの細胞／組織に標的化する。
【０１８３】
あるいは、組織培養細胞は、従来のリン酸カルシウムトランスフェクション法によって、レトロウイルスの構造遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをコードするプラスミドを用いて直接トランスフェクトされ得る。これらの細胞は、次いで、関心のある遺伝子を含むベクタープラスミドでトランスフェクトされる。得られた細胞は、培養培地中にレトロウイルスベクターを放出する。
【０１８４】
フォリスタチン関連ポリヌクレオチドのための別の標的化送達システムは、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズおよび脂質ベースの系（水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミセルおよびリポソームを含む）が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして有用な人工の膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクトなビリオンが、水性の内部に封入され得、そして、生物学的に活性な形態で細胞へと送達され得る（例えば、Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．、６巻：７７頁（１９８１年）を参照のこと］。リポソームビヒクルを用いた効率的な遺伝子移入のための方法は当該分野で公知である、例えば、Ｍａｎｎｉｎｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６８２頁、１９８８を参照のこと。リポソームの組成は通常、通常、ステロイド（特に、コレステロール）との組み合わせのリン脂質の組み合わせである。他のリン脂質または他の脂質も使用し得る。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。
【０１８５】
リポソーム産生に有用な脂質として、ホスファチジル化合物、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドが挙げられる。例示的なリン脂質として、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。例えば、器官特異性、細胞特異性および細胞小器官特異性に基づいたリポソームの標的化もまた可能であり、当該分野で公知である。
【０１８６】
例証
本発明について全般的に記載してきたが、次の実施例を参照することにより、より容易に理解できるであろう。この実施例は、単に本発明のある特定の実施形態を例証する目的で含まれており、本発明の限定を意図するものではない。
【実施例】
【０１８７】
（実施例１  単一腕ＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチド融合タンパク質の生成）
本出願人らは、天然の全長ヒトＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチドが、リンカーを介して、２本のヒトＧ１Ｆｃ鎖の一方に取り付けられている、可溶性非対称Ｆｃ融合タンパク質を生成した。
【０１８８】
ＷＦＩＫＫＮ２−Ｆｃホモ二量体の複合体とは対照的に、ＷＦＩＫＫＮ２−Ｆｃヘテロマーの複合体の形成を促進するための方法論は、非対称ヘテロマーの複合体の形成をガイドするために、Ｆｃドメインのアミノ酸配列に変更を導入することである。Ｆｃドメインを使用して非対称相互作用ペアを作製するための多くの異なるアプローチが、本開示に記載されている。
【０１８９】
１つのアプローチにおいて、配列番号５７および５８のポリペプチド配列において例証されている通り、一方のＦｃドメインが、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するように変更されているが、他方のＦｃドメインは、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するように変更されている。本実施例において、２本のポリペプチド鎖の正確なペア形成は、ＷＦＩＫＫＮ２−Ｇ１Ｆｃ（Ｅ１３４Ｋ／Ｄ１７７Ｋ）（配列番号５７）における２つの位置でリシン残基（下線）と、Ｇ１Ｆｃ（Ｋ１７０Ｄ／Ｋ１８７Ｄ）（配列番号５８）における２つの位置でアスパラギン酸残基（下線）を代わりに用いることにより、電荷に基づく機構により促進される。１３アミノ酸の任意選択のＮ末端伸長（下線）は、短鎖（配列番号５８）に含まれて、４位のシステインによるジスルフィド結合形成を容易にする。
【化４４】
2018510637.tif 000046
【０１９０】
これらの改変体の成熟（プロセシング後）型の対応する核酸配列は、配列番号５９、６０である。
【化４５】
2018510637.tif 000047
【化４６】
2018510637.tif 000048
【化４７】
2018510637.tif 000049
【０１９１】
配列番号５７および配列番号５８のタンパク質は、ＣＨＯ細胞株において共発現されて、これから精製して、ＷＦＩＫＫＮ２−Ｆｃを含むヘテロマーの複合体を生じることができる。
【０１９２】
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用してヘテロ多量体の複合体の形成を促進する別のアプローチにおいて、Ｆｃドメインは、配列番号７１および７２のポリペプチド配列において例証される通り、相補的疎水性相互作用および追加的な分子間ジスルフィド結合を導入するように変更される。
【化４８】
2018510637.tif 000050
【０１９３】
可能なホモ二量体の複合体のいずれかではなくヘテロ二量体の形成を促進するために、上の二重の下線で指し示す通り、２個のアミノ酸置換（セリンをシステインにより、また、スレオニンをトリプトファン（ｔｒｙｔｏｐｈａｎ）により置き換える）を融合タンパク質のＦｃドメインに導入することができる。配列番号７１のアミノ酸配列は任意選択で、Ｃ末端からリシン（Ｋ）を除去して提供することができる。
【０１９４】
相補的形態のＦｃ融合ポリペプチド（配列番号７２）を次に示すが、任意選択で、Ｃ末端からリシン（Ｋ）を除去して提供することができる。
【化４９】
2018510637.tif 000051
【０１９５】
上の配列番号７１のポリペプチドによるヘテロ二量体形成をガイドするために、上の二重の下線で指し示す通り、４個のアミノ酸置換をＦｃポリペプチドに導入することができる。配列番号７２のアミノ酸配列は任意選択で、Ｃ末端からリシン（Ｋ）を除去して提供することができる。
【０１９６】
配列番号７１および配列番号７２のタンパク質は、ＣＨＯ細胞株において共発現されて、これから精製して、ＷＦＩＫＫＮ２−Ｆｃを含むヘテロマーの複合体を生じることができる。
【０１９７】
本開示は、例えば、以下のリーダー配列のうちの１つによる、細胞におけるフォリスタチン関連ポリペプチドの発現を提供する：
天然のヒトフォリスタチンリーダー：ＭＶＲＡＲＨＱＰＧＧＬＣＬＬＬＬＬＬＣＱＦＭＥＤＲＳＡＱＡ
（配列番号６１）
天然のヒトＦＬＲＧリーダー：ＭＲＰＧＡＰＧＰＬＷＰＬＰＷＧＡＬＡＷＡＶＧＦＶＳＳ
（配列番号６２）
天然のヒトＷＦＩＫＫＮ１リーダー：ＭＰＡＬＲＰＬＬＰＬＬＬＬＬＲＬＴＳＧ
（配列番号６３）
天然のヒトＷＦＩＫＫＮ２リーダー：ＭＷＡＰＲＣＲＲＦＷＳＲＷＥＱＶＡＡＬＬＬＬＬＬＬＬＧＶＰＰＲＳＬＡ
（配列番号６４）
組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ
（配列番号６５）
ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ
（配列番号６６）
【０１９８】
選択されたフォリスタチン関連ポリペプチド改変体は、ＴＰＡリーダーを取り込み、任意選択のリンカーありまたはなしで、Ｇ１Ｆｃドメイン（配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５または４６）に融合されて、長鎖を形成する。長鎖とのペア形成を促進する相補的Ｇ１Ｆｃドメイン（配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５または４６）を含む短鎖も、ＴＰＡリーダーを取り込む。ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞において構築物を共発現させ、濾過およびプロテインＡクロマトグラフィーにより、馴化培地から精製した。レポーター遺伝子アッセイのための試料の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析によって評価した。
【０１９９】
共発現によって産生された単一腕ＷＦＩＫＫＮ２−ｈＧ１Ｆｃ融合タンパク質との直接比較のために、天然の全長ヒトＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチドを取り込む２つの改変体を生成した。第１の改変体は、二重腕ＷＦＩＫＫＮ２−ｈＧ１Ｆｃ融合タンパク質であり、第２の改変体は、そのＣ末端において、Ｈｉｓ６タグに取り付けられた単鎖ＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチドであった。
【０２００】
本出願人らは、単一腕ＷＦＩＫＫＮ２−ｈＧ１Ｆｃおよび二重腕ＷＦＩＫＫＮ２−ｈＧ１Ｆｃをコードする構築物をＣＯＳ細胞に一過的にトランスフェクトした。ＣＨＯ細胞を使用して、ＷＦＩＫＫＮ２−Ｈｉｓ６を安定的に発現させた。ＷＦＩＫＫＮ２−Ｈｉｓ６をコードするＵＣＯＥ（商標）に基づく構築物をＣＨＯ細胞株に安定的にトランスフェクトし、メトトレキセートによりクローンを選択し、次いでコロニーを形成したあらゆるクローンをプールした。発現の安定性を維持しつつＵＣＯＥ（商標）プールを増幅することが困難であるため、遺伝子増幅は行わなかった。希釈クローニングの代わりに、高発現プールを同定し、ＷＦＩＫＫＮ２−Ｈｉｓ６の生成に使用した。
【０２０１】
例えば、馴化培地の濾過と、続くプロテインＡクロマトグラフィー、グリシン緩衝液（ｐＨ３．０）による溶出、試料中和およびサイズ排除クロマトグラフィーを含む種々の技法により、Ｆｃ含有構築物の精製を達成した。分析用分子ふるいクロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、Ｆｃ含有構築物の純度を評価した。
【０２０２】
例えば、馴化培地のダイアフィルトレーションと、続くニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｑｉａｇｅｎ）アガロースアフィニティークロマトグラフィー、イミダゾール緩衝液による溶出およびＰＢＳに対する透析を含む種々の技法を使用して、ＷＦＩＫＫＮ２−Ｈｉｓ６の精製を達成した。分析用サイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、全構築物に関して試料の純度を評価した。成熟タンパク質の解析は、ＷＦＩＫＫＮ２−Ｈｉｓ６の予想されるＮ末端配列を確認した。
【０２０３】
（実施例２  単一腕ＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチド融合タンパク質の効力）
Ａ２０４横紋筋肉腫細胞におけるレポーター遺伝子アッセイを使用して、ミオスタチンシグナル伝達を阻害する全長ヒトＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチド改変体の能力を評価した。このアッセイは、トランスフェクション効率に関して正規化するための対照Ｒｅｎｉｌｌａレポータープラスミド（ｐＲＬ−ＣＭＶ）と共に、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポータープラスミド［Ｄｅｎｎｌｅｒら（１９９８年）ＥＭＢＯ  １７巻：３０９１〜３１００頁］をトランスフェクトしたヒト横紋筋肉腫細胞株に基づく。ＣＡＧＡ１２モチーフは、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤１型などのＴＧＦβ応答性遺伝子に存在するため、このベクターは、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３を経てシグナル伝達する因子に関する一般的使用のためのものである。
【０２０４】
アッセイ１日目に、Ａ２０４細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−８２）を、４８ウェルプレート内にウェル当たり１０５個の細胞で分布させ、１０％ＦＢＳを補充したＭｃＣｏｙの５Ａ成長培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において終夜インキュベートした。全てのインキュベーションは、他に断りがなければ３７℃、５％ＣＯ２にて行った。２日目に、１０μｇ  ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２、０．１μｇ  ｐＲＬ−ＣＭＶ、３０μｌ  Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）および９７０μｌ  ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する溶液を３０分間室温にてインキュベートし、その後、アッセイ緩衝液（ＭｃＣｏｙの５Ａ培地＋０．１％ウシ血清アルブミン）を添加し、終夜インキュベーションのために、平板培養した細胞（５００μｌ／ウェル）に加えた。３日目に、培地を除去し、後述する通りに調製したリガンドおよび阻害剤の混合物と共に細胞を６時間インキュベートした。
【０２０５】
ミオスタチンシグナル伝達を阻害するＷＦＩＫＫＮ２構築物の能力を評価するために、４８ウェルプレート内に、２００μｌの最終容量となるようアッセイ緩衝液において各被験物質（それぞれ２回複製）の系列希釈を作製した。続いて、アッセイ緩衝液における等容量のミオスタチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、最終濃度３２ｎｇ／ｍｌ）を添加した。被験溶液を３０分間インキュベートし、その後、２５０μｌのこの混合物を、トランスフェクトしたＡ２０４細胞の４８ウェルプレートの各ウェルに添加した。被験溶液との６時間インキュベーション後に、細胞をリン酸緩衝食塩水ですすぎ、次いで受動的溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９４１）により溶解し、終夜−７０℃で貯蔵した。４日目の最終日に、プレートを穏やかに振盪しつつ室温まで温めた。細胞ライセートを９６ウェルケミルミネッセンスプレートに移し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ１９８０）の試薬によりルミノメーターで解析した。実験レポーターのルシフェラーゼ活性を、Ｒｅｎｉｌｌａ対照レポーターにより得られるルシフェラーゼ活性に対して正規化した。
【０２０６】
ＷＦＩＫＫＮ２ポリペプチド構築物は、ミオスタチンによるシグナル伝達を阻害する能力が著しく異なった。下の表に示す通り、単鎖ＷＦＩＫＫＮ２−Ｈｉｓ６および単一腕ＷＦＩＫＫＮ２−Ｇ１Ｆｃは、低ナノモル濃度範囲内のＩＣ５０値により、ミオスタチンシグナル伝達を強力に阻害した。対照的に、二重腕ＷＦＩＫＫＮ２−Ｇ１Ｆｃは、検査した濃度範囲にわたってミオスタチンシグナル伝達のいかなる低減も示さず、この構築物のＩＣ５０値が、少なくとも１００ｎＭであることを示唆する。よって、単一腕ＷＦＩＫＫＮ２−Ｇ１Ｆｃによるミオスタチン阻害の効力は、二重ＷＦＩＫＫＮ２腕を含むＧ１Ｆｃ融合タンパク質よりも大幅に高い。
【表１】
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【０２０７】
単鎖ＷＦＩＫＫＮ２−Ｈｉｓ６および単一腕ＷＦＩＫＫＮ２−Ｇ１Ｆｃの排除薬物動態を、マウスで行った別々の実験において研究した。単一用量の皮下投与後のマウス血清試料における単鎖ＷＦＩＫＫＮ２−Ｈｉｓ６の濃度を、市販の抗Ｈｉｓ６抗体（ａｂｃａｍ（登録商標）ａｂ１８１８４）を用いたＥＬＩＳＡにより測定した。単一用量の皮下投与後の単一腕ＷＦＩＫＫＮ２−Ｇ１Ｆｃの濃度を、市販の抗ヒトＩｇＧ１抗体（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＡＰ００６）を用いたＥＬＩＳＡにより測定した。上の表において指し示す通り、マウスにおける単鎖ＷＦＩＫＫＮ２−Ｈｉｓ６タンパク質の半減期は、およそ２．５時間（データ図示せず）であったのに対し、マウス（ｎ＝３）における単一腕ＷＦＩＫＫＮ２−Ｇ１Ｆｃ融合タンパク質の半減期は、１００時間を超え（データ図示せず）、この結果は、この分子が、ヒトにおいて１０〜２０日間の薬理学的に有用な血清半減期を有することを予測するであろう。したがって、ヘテロ二量体または非対称アプローチを利用して、単一腕ＷＦＩＫＫＮ２構築物を生成することにより、本出願人らは、単鎖（天然の）タンパク質の望ましいリガンド結合活性を、伝統的なホモ二量体Ｆｃ融合タンパク質の望ましい血清半減期と組み合わせることができた。
【０２０８】
まとめると、これらの結果は、単一腕ＷＦＩＫＫＮ２−Ｇ１Ｆｃが、有用な治療剤となり得ることを指し示す。本実施例を越えて、本出願人らは、単一腕フォリスタチン関連ポリペプチドを含む他の非対称融合タンパク質も、ホモ二量体Ｆｃ融合タンパク質構築物に典型的な精製の容易さおよび血清半減期を付与しつつ、その二重腕対応物よりも強力なリガンドシグナル伝達阻害を示すであろうと予測する。
【０２０９】
参照による組込み
本明細書中で言及される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が、具体的かつ個別に参考として援用されると示されるかのように、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０２１０】
本主題の特定の実施形態が考察されてきたが、上記明細書は、例示的であり、限定的なものではない。本明細書および以下の特許請求の範囲を精査すれば、多くの変更が当業者に明らかとなる。本発明の完全な範囲は、その等価物の完全な範囲と共に特許請求の範囲を、そして、このような変更と共に明細書を参照することによって決定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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