(57)【要約】  本発明は、血液凝固障害の治療に使用するための改変したＶＷＦ分子に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸位置２２９８にＯ−グリコシル化部位を欠失したＣ１ドメインを含む、第ＶＩＩＩ因子に結合し得るフォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）分子。
【請求項２】
天然ＶＷＦ中に存在する２２９８位置のＯ−グリコシル化部位が欠失することにより、又はＶＷＦアミノ酸配列の２２９２〜２３０３位置の１種又はそれ以上のアミノ酸を、置換することにより、不活性化した、請求項１に記載のＶＷＦ分子。
【請求項３】
２２９８位置のスレオニンを欠失しているか、又はスレオニン及びセリン以外のアミノ酸で置換した、請求項２に記載のＶＷＦ分子。
【請求項４】
前記スレオニン及びセリン以外のアミノ酸が、グリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン及びバリンからなる群から選択された、請求項３に記載のＶＷＦ分子。
【請求項５】
配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４の何れか１項に記載のＶＷＦ分子。
【請求項６】
配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５の何れか１項に記載のＶＷＦ分子。
【請求項７】
２２９５位置、２２９７位置、又は２３０２位置のプロリンが欠失しているか、又は異なるアミノ酸で置換された、請求項２に記載のＶＷＦ分子。
【請求項８】
天然の血漿由来ＶＷＦよりも低減したインビボクリアランスを有する、請求項１〜７の何れか１項に記載のＶＷＦ分子。
【請求項９】
天然の血漿由来ＶＷＦと同時投与された第ＶＩＩＩ因子の半減期と比較して、前記ＶＷＦ分子と同時投与された第ＶＩＩＩ因子の半減期を増加し得る、請求項１〜８の何れか１項に記載のＶＷＦ分子。
【請求項１０】
血液凝固障害の治療に使用するための、請求項１〜９の何れか１項に特定したＶＷＦ分子。
【請求項１１】
前記血液凝固障害が、血友病Ａ又はフォン・ヴィレブランド病である、請求項１０に記載した使用のためのＶＷＦ分子。
【請求項１２】
前記治療が第ＶＩＩＩ因子分子を投与することを更に含む、請求項１０又は１１に記載した使用のためのＶＷＦ分子。
【請求項１３】
前記ＶＷＦ分子及び前記第ＶＩＩＩ因子分子を別々に投与する、請求項１２に記載した使用のためのＶＷＦ分子。
【請求項１４】
請求項１〜９の何れか１項に記載のＶＷＦ分子を含む医薬組成物。
【請求項１５】
（ｉ）請求項１〜９の何れか１項に記載のＶＷＦ分子と、（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子分子とを含む医薬キット。
【請求項１６】
前記ＶＷＦ分子及び前記第ＶＩＩＩ因子分子が別々の組成物に含まれる、請求項１５に記載の医薬キット。
【請求項１７】
血液凝固障害の治療において、同時に、別々に又は逐次使用するための、（ｉ）請求項１〜９の何れか１項のＶＷＦ分子及び（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子分子を含む医薬キット。
【請求項１８】
インビボで第ＶＩＩＩ因子の半減期を増加させるための、請求項１〜９の何れか１項に記載のＶＷＦ分子の使用。
【請求項１９】
治療的処置において第ＶＩＩＩ因子の半減期の延長に使用するための、請求項１〜９の何れか１項に特定したＶＷＦ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液凝固障害の治療を改善するための製品及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固因子の欠失に起因する様々な出血性障害がある。最も一般的な障害は、
血友病Ａ及びＢであり、夫々血液凝固因子、第ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）及びＩＸ、の欠失がもたらす。もう一種の既知の出血性障害はフォンヴィレブランド病（ＶＷＤ）である。
【０００３】
ＦＶＩＩＩは、血漿中に、ほとんどフォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）との非共有
結合複合体として存在し、その凝固機能は、因子ＸからＸａへの転換に依存する因子ＩＸａを促進することである。
【０００４】
古典的血友病又は、血友病Ａは、遺伝性出血性疾患である。これは、血液凝固因子ＦＶＩＩＩの染色体Ｘ−結合欠失がもたらす結果であり、ほぼ独占的に男性に影響を及ぼし、発症率は１０，０００人あたり１〜２人である。Ｘ染色体欠損は、女性キャリアによって伝達されるが、彼女達自身は血友病患者ではない。血友病Ａの臨床症状は出血傾向が大きいことである。
【０００５】
予防的にＦＶＩＩＩ治療により療養している重症の血友病Ａの患者は、ＦＶＩＩＩの血漿半減期が約１２〜１４時間と短いために、週に約３回静脈内（ｉ．ｖ．）投与をしなければならない。毎回のｉ．ｖ．投与は煩わしく、痛みを伴い、かつ、感染の危険性を伴う、というのは、これは特に患者自身で、又は、血友病Ａと診断された子供の両親により、家庭で行われるからである。
【０００６】
従って、ＦＶＩＩＩの半減期を増加し、投与しなければならない頻度を低減したＦＶＩＩＩを含有する医薬組成物が強く望まれている。
【０００７】
活性化していないＦＶＩＩＩの半減期を延長するための、数種の試みとしては、細胞受容体とのその相互作用を低減することにより（特許文献１、特許文献２）、ポリマーをＦＶＩＩＩに共有結合させることにより（特許文献３、特許文献４及び特許文献５）、ＦＶＩＩＩをカプセル化することにより（特許文献６）により、新規な金属結合部位を導入することにより（特許文献７）により、Ａ２領域をＡ３領域に、ペプチド結合（特許文献８及び特許文献９）で、又は、ジスルフィド結合（特許文献１０）の何れかで共有結合させることにより、又は、Ａ１領域をＡ２領域に共有結合させることにより（特許文献
１１）なされている。
【０００８】
ＦＶＩＩＩ又は、ＶＷＦの機能的半減期を増強するための別のアプローチは、ＦＶＩＩＩのＰＥＧ化（特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４）又は、ＶＷＦのＰＥＧ化（特許文献１５）であり、増加した半減期を有することにより、ＰＥＧ化したＶＷＦが血漿中に存在するＦＶＩＩＩの半減期をも間接的に増強する。また、ＦＶＩＩＩの融合タンパク質も記載されている（特許文献１６、特許文献１７、及び特許文献１８）。
【０００９】
フォンヴィレブランド病（ＶＷＤ）の異なる形態中において、欠損しているか、機能的な欠陥を有するか、又は、減少した量でのみ得られる、ＶＷＦは、複数の生理学的機能を有し、哺乳動物の血漿中に存在する多量体接着性糖タンパク質である。一次止血の間、ＶＷＦは、血小板表面上の特異的受容体と、コラーゲンなどの細胞外マトリックスの成分との間の介在物質として作用する。更に、ＶＷＦは、凝血原ＦＶＩＩＩのための担体及び安定化タンパク質としての役割を有する。ＶＷＦは２８１３アミノ酸前駆体分子として内皮細胞及び巨核球内で合成される。野生型ＶＷＦのアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列は、非特許文献１に開示されている。前駆体ポリペプチドである、プレプロＶＷＦは、成熟血漿ＶＷＦ中に見出される２２残基のシグナルペプチド、７４１残基のプロペプチド及び２０５０残基のポリペプチドからなる（非特許文献２）。小胞体におけるシグナルペプチドの切断後、ＶＷＦの２つの単量体の間でＣ末端ジスルフィド架橋が形成される。分泌経路を更に輸送する間に、１３Ｎ結合型及び１０  Ｏ結合型炭水化物側鎖が付加される（非特許文献３、Ｃａｎｉｓ  ら、（２０１２））。重要なことは、ＶＷＦ二量体は、Ｎ末端ジスルフィド架橋を介して多量体化され、７４１アミノ酸長のプロペプチドは、後期ゴルジ体内の酵素ＰＡＣＥ／フューリンによって切断されることである。プロペプチド並びにＶＷＦの高分子量多量体（ＶＷＦ−ＨＭＷＭ）は、内皮細胞のバイベル−パラード（Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ）小体又は、血小板のα−顆粒に貯蔵される。
【００１０】
一旦、血漿中に分泌されたプロテアーゼＡＤＡＭＴＳ１３は、ＶＷＦのＡ１領域内でＶＷＦを切断する。従って、血漿ＶＷＦは、５００ｋＤａの単一の二量体から１０，０００ｋＤａを超える分子量を有する二量体２０以上からなる多量体までの全範囲の多量体からなる。これにより、最強の止血活性を有する  ＶＷＦ−ＨＭＷＭ（ＨＭＷＭ）は、リストセチン補因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）中で測定しても良い。ＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ抗原の比率が高いほど、高分子量多量体の相対量が高くなる。
【００１１】
ＶＷＦの欠損が、フォンヴィレブランド病（ＶＷＤ）の原因であり、多かれ少なかれ明白な出血性表現型を特徴とする。ＶＷＤ３型は、最も重篤な形態であり、ＶＷＦが完全に欠損しており、ＶＷＤ１型は、ＶＷＦの定量的な損失に関連し、その表現型は非常に軽度となり得る。ＶＷＤ２型は、ＶＷＦの定性的欠損に関連し、ＶＷＤ３型と同等に重篤となり得る。ＶＷＤ２型は、多くの副次的形態を有し、その内、いくつかは高分子量多量体の損失又は、減少と関連している。Ｖｏｎ  ＶＷＤ２ａ型は、中間型多量体と大型多量体の両方の損失が特徴的である。ＶＷＤ２Ｂ型は、最高分子量の多量体の損失が特徴的である。
【００１２】
ＶＷＤは、ヒトにおいて最も頻出する遺伝性の出血性疾患であり、血漿又は、組換え由来のＶＷＦを含有する濃縮物を用いる補充療法によって治療しても良い。
【００１３】
血漿中で、ＦＶＩＩＩは高い親和性でＶＷＦに結合し、成熟前の異化作用から保護し、従って一次止血における役割の他に、ＦＶＩＩＩの血漿レベルを調節する重要な役割を果たし、結果として二次止血を制御する中心的因子でもある。ＶＷＦに結合した活性化していないＦＶＩＩＩの半減期は、血漿中で約１２〜１４時間である。ＶＷＦがほとんど又は全く存在しないフォンヴィレブランド病３型では、ＦＶＩＩＩの半減期は僅か約６時間であり、ＦＶＩＩＩの濃度低下のため、そのような患者が、軽度から中等度の血友病Ａの症状に至るのである。ＦＶＩＩＩに及ぼすＶＷＦの安定化効果は、又、ＣＨＯ細胞におけるＦＶＩＩＩの組換え発現を補助するためにも使用されている（非特許文献４）。
【００１４】
ＶＷＦ、ＦＶＩＩＩ又は、両因子の半減期を増加させるための製品及び方法についての必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際特許公開第０３／０９３３１３号
【特許文献２】国際特許公開第０２／０６０９５１号
【特許文献３】国際特許公開第９４／１５６２５号
【特許文献４】国際特許公開第９７／１１９５７号
【特許文献５】米国特許第４９７０３００号
【特許文献６】国際特許公開第９９／５５３０６号
【特許文献７】国際特許公開第９７／０３１９３号
【特許文献８】国際特許公開第９７／４０１４５号
【特許文献９】国際特許公開第０３／０８７３５５号
【特許文献１０】国際特許公開第０２／１０３０２４号
【特許文献１１】ＷＯ２００６／１０８５９０
【特許文献１２】国際特許公開第２００７／１２６８０８号
【特許文献１３】国際特許公開第２００６／０５３２９９号
【特許文献１４】国際特許公開第２００４／０７５９２３号
【特許文献１５】国際特許公開第２００６／０７１８０１号
【特許文献１６】国際特許公開第２００４／１０１７４０号
【特許文献１７】国際特許公開第２００８／０７７６１６号
【特許文献１８】国際特許公開第２００９／１５６１３７号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９８７、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，４３９３−４３９７
【非特許文献２】Ｆｉｓｃｈｅｒら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ。３５１：３４５−３４８，１９９４
【非特許文献３】Ｃａｎｉｓら（２０１０）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，８：  １３７−１４５
【非特許文献４】Ｋａｕｆｍａｎら、１９８９、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
別の発明で、ＶＷＦモノマーが、マクロファージ上に存在する受容体タンパク質であるカルシウム型レクチンドメインファミリー１０メンバーＡ（ＣＬＥＣ１０Ａ）に強く結合することが見出されている。特に、ＣＬＥＣ１０ＡがＶＷＦクリアランスにおいて決定的な役割を果たし得ることが示された。更に、本発明において、ＶＷＦ上に存在するＯ−結合グリカン部位２２９８はＣＬＥＣ１０Ａと相互作用することが見出された。従って、本発明は、インビボでのＶＷＦ分子の半減期を延長するために、２２９８部位にＯ−結合グリコシル化を欠く改変ＶＷＦ分子を提供するものである。  
【００１８】
従って、本発明は、［１］項〜［２１］項に定義される主題に関する。
［１］  アミノ酸位置２２９８にＯ−グリコシル化部位を欠くＣ１ドメインを含む、第ＶＩＩＩ因子に結合し得るフォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）分子。好ましくは、ＶＷＦ分子はマウスではない。より好ましくは、ＶＷＦ分子はヒトである。
［２］  天然ＶＷＦに存在する２２９８位のＯ−グリコシル化部位が、ＶＷＦアミノ酸配列の２２９２位〜２３０３位の１つ又はそれ以上のアミノ酸を欠失又は置換することによって不活性化されている、［１］項に記載のＶＷＦ分子。
［３］  ２２９８位のスレオニンが欠失しているか、又はスレオニン及びセリン以外のアミノ酸で置換されている、［２］項に記載のＶＷＦ分子。
［４］  前記スレオニン及びセリン以外のアミノ酸がグリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択される、［３］項に記載のＶＷＦ分子。
［５］  配列番号１０又は１１に示されるアミノ酸配列を含む、前記１〜４項の何れか１項に記載のＶＷＦ分子。
［６］  ２２９５位、２２９７位及び２３０２位のうちの１箇所にあるプロリンが欠失しているか、又は異なるアミノ酸で置換されている、［２］項に記載のＶＷＦ分子。
［７］  天然血漿由来のＶＷＦよりも低減したインビボでのクリアランスを有する、前記１〜６項の何れか１項に記載のＶＷＦ分子。
［８］  半減期延長部分に連結した、好ましくはヒトアルブミンに融合した、アミノ酸位置２２９８にＯ−グリコシル化部位を含むＶＷＦ  Ｃ１ドメイン。
［９］  天然血漿由来のＶＷＦを同時投与した第ＶＩＩＩ因子の半減期と比較したとき、前記のＶＷＦ分子を同時投与した方の第ＶＩＩＩ因子の半減期を増加し得る、前記１〜８項の何れか１項に記載のＶＷＦ分子。
［１０］  血液凝固障害の治療に使用するための、前記１〜９項の何れか１項に定義したＶＷＦ分子。
［１１］  前記血液凝固障害が血友病Ａ又はフォンビレブランド病である［１０］項に記載した使用のためのＶＷＦ分子。
［１２］  前記治療が更に第ＶＩＩＩ因子分子を投与することを含む［１０］項又は［１１］項に記載した使用のためのＶＷＦ分子。
［１３］  前記ＶＷＦ分子と前記第ＶＩＩＩ因子分子とを別々に投与する、［１２］項に記載した使用のためのＶＷＦ分子。
［１４］  ［１］〜［９］項の何れか１項に記載のＶＷＦ分子を含む医薬組成物。
［１５］ （ｉ）［１］〜［９］項の何れか１項に記載のＶＷＦ分子と、（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子分子とを含む医薬キット。
［１６］  前記ＶＷＦ分子と前記第ＶＩＩＩ因子分子とを別々の組成物中に含む［１５］項に記載の医薬キット。
［１７］  血液凝固障害の治療において、同時に、別々に、又は逐次使用するための、（ｉ）［１］〜［９］項の何れか１項に記載のＶＷＦ分子と、（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子分子とを含む医薬キット。
［１８］  第ＶＩＩＩ因子の半減期をインビボで増加させるための［１］〜［９］項の何れか１項に記載のＶＷＦ分子の使用。
［１９］  治療処置において第ＶＩＩＩ因子の半減期を延長するのに使用するための［１］〜［９］項の何れか１項に定義したＶＷＦ分子。
［２０］  ［１］〜［９］項の何れか１項に記載のＶＷＦ分子の有効量を被験者に投与することを含む、インビボでの第ＶＩＩＩ因子の半減期を増加する方法。
［２１］  ［１］〜［９］項の何れか１項に記載のＶＷＦ分子の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、血液凝固障害を治療する方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】成熟ＶＷＦ単量体のドメイン構造、機能的結合部位及びグリカン位置  ＶＷＦ単量体のタンパク質構造では、Ａ、Ｃ及びＤドメインと名付けた内部相同性の領域を示す。ＶＷＦは、ある範囲の生物学的機能を有する多数のリガンドと相互作用する。各成熟ＶＷＦ単量体は、図示するように分布した１３箇所のＮ−連結（上向き矢印）及び１０箇所のＯ−連結（下向き矢印）グリコシル化部位を含む。グリコシド結合に関与するアミノ酸の配列番号を示す。ＶＷＦ成熟サブユニット構造の改訂された注釈はＺｈｏｕら、（２０１２）Ｂｌｏｏｄ  １２０（２）：４４９−４５８からの適正化と修正によるものである
【図２】トリプシンＶＷＦ断片を可溶性ＣＬＥＣ１０Ａと共にインキュベートした後の溶出画分で検出した主要なＯ−グリカン（ＮｅｕＧｃ＝Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｇａｌ＝ガラクトース、ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミン）  コア２グリカン（Ａ）、１つのＮｅｕＧｃ残基を有するコア１グリカン（Ｂ）、及びジサッカリドＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌで伸長したコア２グリカン（Ｃ）を、溶出画分中に存在する主要なＯ−グリカン構造として同定した。トリプシンＶＷＦ断片を可溶性ＣＬＥＣ１０Ａと共にインキュベートし、結合したＶＷＦペプチドを洗浄及び溶出した後、遊離グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析から、ＣＬＥＣ１０Ａとのインキュベーション前の出発物質と比較した場合、グリカン構造Ａ（濃度因子＞４０）、Ｂ（因子９）及びＣ（因子７）が顕著に富化していることを示した。  表示された３種のＯ−グリカンは、検出されたすべてのＯ−グリカン構造の約８０％を代表したものである（４０％は構造Ｂに関連し、Ａ及びＣはそれぞれ２０％を占めた）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
第１の態様において、本発明は、アミノ酸位置２２９８にＯ−グリコシル化部位を欠失したＣ１ドメインを含む、第ＶＩＩＩ因子に結合し得る改変したフォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）分子に関する。
【００２１】
ＶＷＦ
本明細書で使用する用語「フォンヴィレブランド因子」（ＶＷＦ）とは、天然に存在する（天然）ＶＷＦを含むが、その変異体をも含み、例えば、断片、融合タンパク質又は、コンジュゲート、又は１種若しくはそれ以上の残基を挿入、欠失又は、置換した配列変異体であり、生物学的活性を保持している天然のＶＷＦである。もし、ＶＷＦ変異体が野生型の少なくとも１種の生物学的活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％を保持しているならば、本発明の意味において生物学的活性が保持されていることになる。野生型ＶＷＦ及びその変異体の生物学的活性は、リストセチン補因子活性に関する方法（Ｆｅｄｅｒｉｃｉ  ＡＢ  ら、２００４．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ８９：７７−８５）、血小板糖タンパク質複合体Ｉｂ−Ｖ−ＩＸのＧＰＩｂαへのＶＷＦの結合（Ｓｕｃｋｅｒら．２００６．Ｃｌｉｎ  Ａｐｐｌ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ．１２：３０５−３１０）、又は、コラーゲン結合アッセイ（Ｋａｌｌａｓ＆Ｔａｌｐｓｅｐ．２００１．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ８０：４６６−４７１）、又は第ＶＩＩＩ因子結合アッセイ（Ｖｅｙｒａｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，ｖｏｌ．１７，ｐｐ９４４−９５１）．を使用して、当業者により、決定することができる。
【００２２】
ヒト天然ＶＷＦをコードする遺伝子は、推定分子量３１０，０００Ｄａを有する２８１３アミノ酸のプレプロポリペプチドに翻訳される９ｋｂのｍＲＮＡに転写される。プレプロポリペプチドは、２２アミノ酸シグナルペプチド、７４１アミノ酸プロポリペプチド（配列番号２のアミノ酸２３〜７６３）及び成熟サブユニット（配列番号２のアミノ酸７６４〜２８１３）を含む。Ｎ末端からの７４１アミノ酸のプロポリペプチドの切断は、２０５０アミノ酸からなる成熟ＶＷＦを生じる。ヒト天然ＶＷＦプレプロポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２に示される。特に指示しない限り、本出願におけるＶＷＦ残基のアミノ酸番号付けは、たとえ、ＶＷＦ分子が配列番号２の全ての残基を含まなくても、配列番号２を意味する。本明細書で使用する用語「ＶＷＦ」は、特に指示しない限り、成熟型ＶＷＦを意味する。
【００２３】
天然のＶＷＦのプロポリペプチドは複数のドメインを含む。異なるドメイン注釈は、文献に見出すことができる（例えば、Ｚｈｏｕら（２０１２）Ｂｌｏｏｄ  １２０（２）：４４９−４５８を参照）。本出願では、ＶＷＦの天然プレプロペプチドには以下のドメイン注釈を適用している（図１も参照）。
Ｄ１−Ｄ２−Ｄ’−Ｄ３−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ｄ４−Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６−ＣＫ
【００２４】
配列番号２を参照すると、Ｄ’ドメインはアミノ酸７６４〜８６５からなり、Ｄ３ドメインはアミノ酸８６６−１２４２からなり、かつ、Ｃ１ドメインはアミノ酸２２５５−２３８８からなる。
【００２５】
「改変した」ＶＷＦ分子は、成熟ヒト天然ＶＷＦのアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸７６４−２８１３）とは異なるアミノ酸配列を有する。
【００２６】
本発明の改変ＶＷＦ分子は、アミノ酸位置２２９８にＯ−グリコシル化部位を欠失したＶＷＦのＣ１ドメインを含む。本発明の改変ＶＷＦ分子に含まれるＣ１ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列番号２の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸２２５５〜２３２８と同一の配列を有する。
【００２７】
好ましい実施形態では、配列番号２のアミノ酸２２５５〜２３２８中に存在する１個、２個又は３個（但しそれを超えない）のアミノ酸は、本発明の改変ＶＷＦ分子内に含まれるＣ１ドメインにおいて欠失しているか及び／又は置換されている。
【００２８】
第１の実施形態では、本発明の改変ＶＷＦ分子は、３種のアミノ酸を除く、配列番号２のアミノ酸２２５５〜２３２８を含み、３種のアミノ酸の各々が欠失しているか、又は配列番号２内の夫々の位置に存在しないアミノ酸で置換されている。即ち、本発明の改変ＶＷＦ分子のＣ１ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２のＣ１ドメインのアミノ酸配列とは、３種（そして、それを超えない）のアミノ酸が異なる。
【００２９】
第２の実施形態では、本発明の改変ＶＷＦ分子は、２種のアミノ酸を除く配列番号２のアミノ酸２２５５〜２３２８を含み、前記２種のアミノ酸の夫々れが欠失しているか、配列番号２の中の夫々の位置に存在しないアミノ酸で置換されている。即ち、本発明の改変ＶＷＦ分子のＣ１ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２のＣ１ドメインのアミノ酸配列と２種（そして、それを超えない）のアミノ酸が異なる。
【００３０】
第３の実施形態では、本発明の改変ＶＷＦ分子は、１種のアミノ酸を除く配列番号２のアミノ酸２２５５〜２３３３を含み、前記１種のアミノ酸は欠失しているか、又は配列番号２の中の夫々の位置に存在しないアミノ酸で置換されている。即ち、本発明の改変ＶＷＦ分子のＣ１ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２のＣ１ドメインのアミノ酸配列とは１種（そして、それを超えない）のアミノ酸が異なる。
【００３１】
好ましくは、ＶＷＦアミノ酸配列の２２９８位のＯ−グリコシル化部位は、２２９８位のスレオニンを欠失させるか、又はそれを異なるアミノ酸、好ましくはスレオニン及びセリン以外のアミノ酸で置換することによって不活性化される。
【００３２】
従って、本発明は、更なる実施形態において、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む改変ＶＷＦ分子を提供するものである。好ましい態様において、本発明のＶＷＦ分子は、
・  Ｘａａが存在しない配列番号１０に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがグリシンである配列番号１０に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがアラニンである配列番号１０に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがアルギニンである配列番号１０に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがアスパラギンである配列番号１０に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがアスパラギン酸である配列番号１０に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがシステインである配列番号１０に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがグルタミン酸である配列番号１０に示されるアミノ酸配列。
・  Ｘａａがグルタミンである配列番号１０に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがヒスチジンである配列番号１０に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがイソロイシンである配列番号１０に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがロイシンである配列番号１０に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがリジンである配列番号１０に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがメチオニンである配列番号１０に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがフェニルアラニンである配列番号１０に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがプロリンである配列番号１０に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがトリプトファンである配列番号１０に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがチロシンである配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は
・  Ｘａａがバリンである配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む。
【００３３】
通常、本発明の改変ＶＷＦ分子は、Ｄ’Ｄ３ドメインを更に含む。好ましくは、改変ＶＷＦ分子は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４２、又は配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４２からなるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％が同一の配列を有するアミノ酸配列を含む。
【００３４】
更なる実施形態では、本発明の改変ＶＷＦ分子は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。好ましい態様において、本発明のＶＷＦ分子は、
・  Ｘａａが存在しない配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがグリシンである配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがアラニンである配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがアルギニンである配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがアスパラギンである配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがアスパラギン酸である配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがシステインである配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがグルタミン酸である配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがグルタミンである配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがヒスチジンである配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがイソロイシンである配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがロイシンである配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがリジンである配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがメチオニンである配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがフェニルアラニンである配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがプロリンである配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがトリプトファンである配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
・  Ｘａａがチロシンである配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は
・  Ｘａａがバリンである配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む又はからなる。
【００３５】
或いは、２２９８位のＯ−グリコシル化部位は、欠失により、又は、グリコシルトランスフェラーゼによるグリコシル化部位の認識に関与する１種又はそれより多いアミノ酸と置換することによって不活性化される。推定グリコシル化モチーフは、ＶＷＦのアミノ酸２２９２−２３０３を含む。一実施形態では、２２９５位、２２９７位及び／又は２３０２位の少なくとも１個のプロリンを欠失しているか、又は異なるアミノ酸で置換されている。或いは、２２９２位、２２９３位及び／又は２３０３位の少なくとも１個のトレオニンを欠失しているか、又は異なるアミノ酸で置換されている。
【００３６】
本発明の改変ＶＷＦ分子は、第ＶＩＩＩ因子分子に結合が可能であり、及び／又はＤ’ドメイン及びＤ３ドメイン（例えば、配列番号３のＤ’ドメイン及びＤ３ドメイン）を含む。好ましくは、改変ＶＷＦ分子は、ヒト天然型第ＶＩＩＩ因子の成熟形態に結合し得る。別の実施形態では、改変ＶＷＦ分子は、アミノ酸配列番号１２からなる単鎖第ＶＩＩＩ因子分子に結合し得る。
【００３７】
ＶＷＦの第ＶＩＩＩ因子への結合は、以前報告された方法の記述（Ｖｅｙｒａｄｉｅｒら（２０１１）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ、１７巻、９４４−９５１頁）に基づいて、商業的に頒布されている、即用ＥＬＩＳＡキット（Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ  ＶＷＦ：ＦＶＩＩＩＢ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ、Ａｓｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて決定することができる。試料は、試験キットの供給者によって夫々定義された即用式希釈緩衝液で希釈される。試験される試料中に存在するＶＷＦは、マイクロタイタープレート上にプレコートされたウサギ抗ヒトＶＷＦポリクローナル抗体によって捕捉される。その後、潜在的に付随する内因性ＦＶＩＩＩは、ＶＷＦから解離し、排除される。捕捉されたＶＷＦと相互作用した組換えＦＶＩＩＩを添加した後、ペルオキシダーゼと結合したマウスモノクローナル抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体を付着したＦＶＩＩＩに結合させ、引き続く基質反応を５分間の反応時間後、１Ｍ硫酸で停止し、４５０ｎｍで光度測光法で定量した。試験結果は、試験キット関連の基準を用いて計算する。
【００３８】
或いは、フローサイトメトリー／平衡結合アッセイを利用することが出来る、例えば、Ｂｅｎｄｅｔｏｗｉｃｚら、（１９９８）Ｂｌｏｏｄ、ｖｏｌ  ９２、Ｎｏ２：ｐｐ５２９−５３８。
【００３９】
第ＶＩＩＩ因子
用語「第ＶＩＩＩ因子」と「ＦＶＩＩＩ」とは、本明細書において同義語として使用する。  「ＦＶＩＩＩ」は、ある個体から別の個体に存在して発生し得るＦＶＩＩＩの天然の対立遺伝子変異を含む。ＦＶＩＩＩは、周知の産生及び精製方法を用いて、血漿由来で又は、組換え的に産生しても良い。グリコシル化、チロシン硫酸化及び他の翻訳後改変の程度及び位置は、選択された宿主細胞及びその増殖条件に依存して変化し得る。
【００４０】
用語ＦＶＩＩＩには、ＦＶＩＩＩ類似体が含まれる。本明細書で使用する用語「ＦＶＩＩＩ類似体」とは、ＦＶＩＩＩの野生型アミノ酸配列（即ち、ＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｐ００４５１によって定義される配列）と比較して１種又はそれ以上のアミノ酸が置換又は、欠失しているＦＶＩＩＩ分子（完全長又は、Ｂ−領域切断／欠失）を、又は、Ｂ領域切断／欠失ＦＶＩＩＩ分子については、そのアミノ酸配列に対応する部分を意味する。ＦＶＩＩＩ類似体は天然では存在しないが、ヒトの操作によって得られる。本発明に従って使用する第ＶＩＩＩ因子分子は又、Ｂ領域切断／欠失ＦＶＩＩＩ分子であっても良く、ここで残された領域は、ＦＶＩＩＩ野生型アミノ酸配列のアミノ酸番号１−７４０及び１６４９−２３３２に示されるような配列に対応する。Ｂ−領域欠失ＦＶＩＩＩ分子の他の形態は、ａ３領域に部分的欠失を更に有し、単鎖ＦＶＩＩＩ分子をもたらす。
【００４１】
これらのＦＶＩＩＩ分子は、形質転換された、好ましくは哺乳動物由来の宿主細胞内で組換えた分子であることになる。然しながら、Ｂ領域欠失ＦＶＩＩＩ（即ち、３つのＡ領域、２つのＣ領域、及びａ１、ａ２及びａ３領域）内の残りの領域は、僅かに、例えば各々の野生型アミノ酸配列（アミノ酸１−７４０及び１６４９−２３３２）から約１％、２％、３％、４％又は、５％、異なり得る。
【００４２】
本発明に従って使用されるＦＶＩＩＩ分子は、二本鎖ＦＶＩＩＩ分子又は、一本鎖ＦＶＩＩＩ分子であっても良い。本発明の組成物に含まれるＦＶＩＩＩ分子は又、生物学的に活性なＦＶＩＩＩの断片であっても良く、即ち、Ｂ領域以外の領域が欠失若しくは切断されてはいるが、欠失／切断された形態内でＦＶＩＩＩ分子は、血餅の形成を補助するその能力を保持している。ＦＶＩＩＩ活性は、当該分野で周知の技術を用いてインビトロで評価することが出来る。本発明によるＦＶＩＩＩ活性を決定するための好ましい試験は、発色基質アッセイ又は、１段階アッセイ（下記参照）である。アミノ酸の改変（置換、欠失等）を残りの領域等の中に導入して、例えば、（ＶＷＦ）、低密度リポタンパク質受容体の関連タンパク質（ＬＰＲ）、種々の受容体、他の凝固因子、細胞表面など種々の他の成分で、第ＶＩＩＩ因子の結合能力を改変しても良く、又は、グリコシル化部位などを導入及び／又は、廃止しても良い。本発明の組成物における使用のためにＦＶＩＩＩ活性を消失させない他の変異体もまた、ＦＶＩＩＩ分子／類似体中で適応し得る。
【００４３】
ＦＶＩＩＩ類似体は又、親ポリペプチドの１種若しくはそれ以上のアミノ酸残基が欠失し、又は、他のアミノ酸残基で置換したＦＶＩＩＩ分子を含み、及び／又は、追加的にアミノ酸残基が親ＦＶＩＩＩポリペプチドに付加されている。
【００４４】
更に、第ＶＩＩＩ因子分子／類似体は、例えば、切断されたＢ−領域内に、及び／又は、分子（「ＦＶＩＩＩ誘導体」）の１種若しくはそれ以上の他の領域内に、他の改変を含み得る。  これらの他の改変は、第ＶＩＩＩ因子分子にコンジュゲートした種々の分子の形態、例えば、高分子化合物、ペプチド化合物、脂肪酸由来化合物等でも良い。
【００４５】
用語ＦＶＩＩＩは、グリコＰＥＧ化ＦＶＩＩＩを含む。本明細書の文脈上、用語「グリコＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ」とは、第ＶＩＩＩ因子分子（全長ＦＶＩＩＩ及びＢ領域切断／欠失ＦＶＩＩＩを含む）を指定することを意図しており、ここで、１種若しくはそれ以上のＰＥＧ基がポリペプチドの多糖類側鎖（グリカン）を介してＦＶＩＩＩポリペプチドに結合している。
【００４６】
用語ＦＶＩＩＩは、保護基又は、半減期延長部位を有するＦＶＩＩＩ分子を含む。用語「保護基」／「半減期延長部部位」とは、本明細書では、１種若しくはそれ以上のアミノ酸サイト鎖官能基に結合した１種若しくはそれ以上の−ＳＨ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨ２などの化学基、又は、１種若しくはそれ以上のＮ−及び／又は、Ｏ−グリカン構造を意味し、しかも、これらのタンパク質／ペプチドにコンジュゲートした場合、多数の治療タンパク質／ペプチドのインビボ循環半減期を延長し得るものを意味すると理解する。保護基／半減期延長部位の例としては、生体適合性脂肪酸及びその誘導体、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、例えば、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリ（Ｇｌｙｘ−Ｓｅｒｙ）ｎ（ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ））、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパロサンポリマー（ＨＥＰ）、ホスホリルコリン系ポリマー（ＰＣポリマー）、Ｆｌｅｘｉｍｅｒ（登録商標）ポリマー（Ｍｅｒｓａｎａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社製，ＭＡ，ＵＳＡ）、デキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｆｃ領域、トランスフェリン、アルブミン、エラスチン様ペプチド、ＸＴＥＮ（登録商標）ポリマー（Ａｍｕｎｉｘ社製、ＣＡ、ＵＳＡ）、アルブミン結合ペプチド、フォンヴィレブランド因子断片（ｖＷＦ断片）、カルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰペプチド、Ｐｒｏｌｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、ＩＬ）、及びそれらの任意の組合わせ（例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、ＣＬ、ＡＢ  Ｌｏｗｅ及びＮ．Ａｙｒｅｓ、Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、ｉｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００２、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．）。誘導体化の手法には重大な意味はなく、上記から解明することができる。
【００４７】
本発明に従って使用し得るＦＶＩＩＩ分子としては、異種アミノ酸配列に融合したＦＶＩＩＩアミノ酸配列、好ましくは半減期延長アミノ酸配列を含む融合タンパク質が挙げられる。好ましい融合タンパク質としては、Ｆｃ融合タンパク質及びアルブミン融合タンパク質である。本明細書において、用語「Ｆｃ融合タンパク質」とは、任意の抗体アイソタイプに由来し得るＦｃ領域に融合したＦＶＩＩＩを包含した意味を有する。ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ＩｇＧ抗体の循環半減期が比較的長いため、好ましいことが多い。Ｆｃ領域を、更に改変し、例えば結合を補完し及び／又は、特定のＦｃ受容体へ結合する等の、特定のエフェクター機能、を調節しても良い。ＦｃＲｎ受容体に結合する能力を有するＦｃ領域とＦＶＩＩＩとの融合は、一般に、野生型ＦＶＩＩＩ（ｗｔ  ＦＶＩＩＩ）の半減期と比較して、融合タンパク質の循環半減期を延長させるであろう。本発明における使用のためのＦＶＩＩＩ分子は、ＦＶＩＩＩ類似体の誘導体、例えば、ＦＶＩＩＩ類似体の融合タンパク質、ＰＥＧ化又は、グリコＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ類似体又は、又は、ヘパロザンポリマーとコンジュゲートしたＦＶＩＩＩ類似体等でも良い。本明細書において、「アルブミン融合タンパク質」という用語は、アルブミンアミノ酸配列又は、その断片に、若しくはその誘導体に融合したＦＶＩＩＩを包含した意味を有する。異種アミノ酸配列を、ＦＶＩＩＩのＮ末端やＣ末端に融合しても良く、又、ＦＶＩＩＩアミノ酸配列内部に挿入しても良い。異種アミノ酸配列は、国際特許公開第２００８／０７７６１６号に記載されている「半減期延長ポリペプチド」の何れでもよく、その開示は参照により本明細書に組込まれる。
【００４８】
本発明の組成物で使用するためのＦＶＩＩＩ分子の例としては、例えば、国際特許公開第２０１０／０４５５６８号、国際特許公開第２００９／０６２１００号、国際特許公開第２０１０／０１４７０８号、国際特許公開第２００８／０８２６６９号、国際特許公開第２００７／１２６８０８、米国特許公開第２０１０／０１７３８３１号、米国特許公開第２０１０／０１７３８３０号、米国特許公開第２０１０／０１６８３９１号、米国特許公開第２０１０／０１１３３６５号、米国特許公開第２０１０／０１１３３６４号、国際特許公開第２００３／０３１４６４号、国際特許公開第２００９／１０８８０６号、国際特許公開第２０１０／１０２８８６号、国際特許公開第２０１０／１１５８６６号、国際特許公開第２０１１／１０１２４２号、国際特許公開第２０１１／１０１２８４号、国際特許公開第２０１１／１０１２７７号、国際特許公開第２０１１／１３１５１０号、国際特許公開第２０１２／００７３２４号、国際特許公開第２０１１／１０１２６７号、国際特許公開第２０１３／０８３８５８、及び国際特許公開第２００４／０６７５６６に記載されたＦＶＩＩＩ分子を含む。
【００４９】
本発明の組成物に使用し得るＦＶＩＩＩ分子の例としては、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）、Ｈｅｌｉｘａｔｅ（登録商標）、Ｋｏｇｅｎａｔｅ（登録商標）、Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）の活性成分ならびに国際特許公開第２００８／１３５５０１号、国際特許公開第２００９／００７４５１号に記載されたＦＶＩＩＩ分子、及び国際特許公開第２００４／０６７５６６号の「ｄＢＮ（６４−５３）」と命名した構築物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を含む。
【００５０】
凝固障害の治療
本発明の改変したＶＷＦ分子は、限定する訳ではないが、血友病及びフォンヴィレブランド病を含む凝固障害の治療に有用である。好ましくは、該疾患は、血友病Ａ又は、フォンヴィレブランド病である。
【００５１】
用語「血友病Ａ」とは、機能性凝固ＦＶＩＩＩの欠損を意味し、通常遺伝性である。
【００５２】
用語「フォンヴィレブランド病」（ＶＷＤ）とは、ＶＷＦの定性的又は、定量的欠損に関連する凝固異常を意味する。
【００５３】
疾患の治療は、いずれかの臨床段階又は、症状において既に疾患の任意の形態を有すると診断された患者の治療を包含し、発症又は進展又は悪化、症状の憎悪、又は疾患の徴候の遅延、及び／又は、疾患の重篤度を予防及び／又は、低減することを含む。
【００５４】
本発明の改変したＶＷＦ分子を投与する「被験者」又は、「患者」は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）又は、霊長類（例えば、サル又は、ヒト）等の哺乳類でも良い。特定の態様において、ヒトは小児患者である。他の態様において、ヒトは成人患者である。
【００５５】
本発明の改変したＶＷＦ分子、及び、場合により１種又は、それ以上の追加治療薬、例えば、以下に記載の第２の治療薬、を含む組成物を本明細書に記載する。  組成物は、通常は、薬学的に許容される担体を含む無菌の医薬組成物の一部として供給される。この組成物は、（患者に投与する所望の方法に応じて）適切であれば任意の形態でも良い。
【００５６】
本発明の改変したＶＷＦ分子は、経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、局所的又は、局部的等種々の経路により、患者に投与しても良い。与えられる如何なる場合でも投与のために最も適切な経路は、特定の抗体、被験者、及び疾患の性質及び重症度ならびに被験者の体調に依存する。通常は、本発明の改変したＶＷＦ分子を静脈内投与する。
【００５７】
通常の実施形態では、本発明の改変したＶＷＦ分子は、静脈内投与を可能にするのに十分な濃度０．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇで医薬組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法における使用に適した改変したＶＷＦ分子の濃度としては、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、又は、前記の何れかの値の間の範囲の濃度、例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、又は、１０ｍｇ／ｋｇ〜１８ｍｇ／ｋｇを含むが、これに限定する訳ではない。
【００５８】
改変したＶＷＦ分子の有効用量は、単回（例えば、ボーラス）投与、複数回投与又は、連続投与当たり約０．００１〜約７５０ｍｇ／ｋｇの範囲で良く、又は、（例えば、ボーラス）投与、複数回の投与又は、連続投与で、血清濃度０．０１〜５０００μｇ／ｍｌの血清濃度を達成することができ、又は、投与する対象の症状、投与経路及び対象の年齢、体重、及び状態に依存するがその中の任意の有効な範囲又は、値で良い。特定の実施形態では、各用量は、体重１キログラム当たり約０．５ｍｇ〜約５０ｍｇ又は、体重キログラムあたり約３ｍｇ〜約３０ｍｇの範囲で良い。改変したＶＷＦ分子は、水溶液として製剤化しても良い。
【００５９】
医薬組成物は、用量当たり所定量の本発明の改変したＶＷＦ分子を含有する単位用量形態で簡便に提供することができる。その単位は、０．５ｍｇ〜５ｇであり、例えば、１ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ、１０００ｍｇ、又は、前記値の何れか２つの間の任意の範囲、例えば１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、２０ｍｇ〜５０ｍｇ、又は、３０ｍｇ〜３００ｍｇであるが、これに限定する訳ではない。薬学的に許容される担体は、例えば、治療される状態又は、投与経路に応じて多種多様な形態を採り得る。
【００６０】
本発明の改変したＶＷＦ分子を用いる有効投薬量、総用量数及び治療期間の決定は、当業者の能力の範囲内に十分納まり、標準的な用量増量試験を用いて決定しても良い。
【００６１】
本明細書に記載した方法に適した本発明の改変したＶＷＦ分子の治療用製剤は、凍結乾燥製剤又は、水溶液として保存するために調製しても良く、所望の程度の純度を有する改変したＶＷＦ分子を、当該分野で通常使用される任意の薬学的に許容される担体、賦形剤又は、安定剤（これら全てを本明細書で担体と称す）即ち、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張剤、非イオン性界面活性剤、酸化防止剤、及びその他の種々の添加剤と混合する。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版（Ｏｓｏｌ、編．１９８０）を参照のこと。このような添加剤は、使用される用量及び濃度でレシピエントに対して無毒でなければならない。
【００６２】
緩衝剤は、生理学的条件を近似する範囲のｐＨを維持するのに役立つ。それらは、約２ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で提供し得る。適切な緩衝剤としては有機及び無機酸の両方、及びその塩であり、クエン酸塩緩衝液（例、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸塩緩衝液（例、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸塩緩衝剤（例、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物、フマル酸塩緩衝液（例、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物等）、グルコン酸塩緩衝液（例、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸-水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物等）、シュウ酸塩緩衝液（例、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物、等）、乳酸塩緩衝液（  例、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸-水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物等）及び酢酸塩緩衝液（例、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸-水酸化ナトリウム混合物等）等を含む。更に、リン酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液及びトリスなどのトリメチルアミン塩を使用しても良い。
【００６３】
保存剤を、微生物の増殖を遅らせるために添加しても良く、０．２％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲の量を添加しても良い。適切な保存剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウムハライド（例、塩化物、臭化物及びヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、及び、メチル若しくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び３−ペンタノールを挙げられる。時々は、「安定化剤」として知られる等張化剤を添加し、液体組成物の等張性を確実にしても良く、例えば、多価糖アルコール、好ましくはグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールなどの３価又はそれ以上の糖アルコールを含んでも良い。安定剤は、広範囲のカテゴリーの賦形剤を意味し、機能的に、バルキング剤から治療剤を可溶化するか、又は、変質若しくは、容器壁への付着を防止するのに役立つ添加剤までの範囲を有し得る。通常の安定化剤としては、多価糖アルコール（上記に列挙）、アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのアミノ酸、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロールなどであり、イノシトールなどのシクリトールを含む、有機糖又は糖アルコーを挙げられ、ポリエチレングリコール、アミノ酸ポリマー、硫黄含有還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム、低分子量ポリペプチド（例、１０又はそれ以下の残基を有するペプチド）、タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は、免疫グロブリンなど、親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、単糖類、例えばキシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなど、二糖類、例えばラクトース、マルトース、スクロース及び三糖類、例ラフィノースなど、及び多糖類  例デキストランなどを挙げられる。安定化剤は、活性タンパク質１重量部当たり０．１〜１０，０００重量の範囲で存在することができる。  
【００６４】
非イオン性表面活性剤又は、界面活性剤（「湿潤剤」としても知られている）を添加して、治療剤の可溶化を補助するとともに、撹拌により誘発される凝集から治療用タンパク質を保護し、又、製剤がタンパク質の変質を引き起こすことなく、せん断面応力に曝されるのを可能にする。適切な非イオン性表面活性剤は、ポリソルベート（２０，８０等）、ポリオキサマー（１８４，１８８等）、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０等）を含む。非イオン性表面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌの範囲で、又は、約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在し得る。
【００６５】
更に他の種々の賦形剤としては、バルキング剤（例えばデンプン）、キレート化剤（例えばＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、及び共溶媒が挙げられる。
【００６６】
本明細書の製剤は又、改変したＶＷＦ分子の他に第２の治療剤を含有しても良い。第２の治療薬として適切な例を以下に示す。
【００６７】
投与スケジュールは、月に１度から毎日と、変動し得るが、疾患の型、疾患の重症度、及び本発明の改変したＶＷＦ分子に対する患者の感受性を含む臨床的因子の数に依拠する。特定の実施形態では、本発明の改変したＶＷＦ分子を、毎日、週に２回、週に３回、５日毎に、１０日毎に、２週間毎に、３週間毎に、４週間毎に、又は１ヶ月に１回、又は前述の値のうちの任意の２つの値の間の任意の範囲、例えば、４週間から一月毎、１０日から２週間毎、又は、１週間に２〜３回などに投与する。
【００６８】
投与される本発明の改変したＶＷＦ分子の投与量は、特定の本発明の改変したＶＷＦ分子、被験体、及び疾患の性質及び重症度、被験者の体調、治療計画（例えば、第２の治療剤を使用するかどうか）、及び選択された投与経路に従って変動し、適切な投薬量は、当業者により、直ちに決定され得る。
【００６９】
本発明の改変したＶＷＦ分子の個々の投薬量の最適な量及び間隔は、治療される状態の性質及び程度、投与の形態、経路及び部位、及び治療を受ける特定の被験者の年齢及び状態により決定され、しかも使用する適切な投薬量を最終的に医師が決定するものであることは当業者には認識されるであろう。この投薬量は、適切な回数繰り返しても良い。もし、副作用が発現する場合、投薬の量及び／又は頻度は、標準的臨床基準に従って、変更や低減しても良い。
【００７０】
併用療法
好ましくは、本発明の改変したＶＷＦ分子を用いる治療を受けている患者は、又、従来の凝固障害の療法の治療も受ける。例えば、血友病に罹患している患者は、通常、血液凝固因子、ＶＩＩＩ（第ＶＩＩＩ因子）を用いる治療も受けている。
【００７１】
本発明に従って使用される組成物中の第ＶＩＩＩ因子の濃度は、通常、１０〜１０，０００ＩＵ／ｍＬの範囲である。異なる実施形態において、本発明の組成物中のＦＶＩＩＩ分子の濃度は、１０〜８，０００ＩＵ／ｍＬ、又は、１０〜５，０００ＩＵ／ｍＬ、又は、２０〜３，０００ＩＵ／ｍＬ、又は、５０〜１５００ＩＵ／ｍＬ、又は３，０００ＩＵ／ｍＬ、又は、２，５００ＩＵ／ｍＬ、又は、２，０００ＩＵ／ｍＬ、又は、１，５００ＩＵ／ｍＬ又は、１，２００  ＩＵ／ｍＬ、又は、１，０００ＩＵ／ｍＬ、又は、８００ＩＵ／ｍＬ、又は、６００ＩＵ／ｍＬ、又は、５００ＩＵ／ｍＬ、又は、４００ＩＵ／ｍＬ、又は、３００ＩＵ／ｍＬ、又は、２５０ＩＵ／ｍＬ、又は、２００ＩＵ／ｍＬ、又は、１５０ＩＵ／ｍＬ、又は、１００ＩＵ／ｍＬである。
【００７２】
「国際単位」又は、「ＩＵ」は、ＦＶＩＩＩ活性アッセイ、例えば、一次段階凝固アッセイ又は、発色基質ＦＶＩＩＩ活性アッセイ等により測定されるＦＶＩＩＩの血液凝固活性（効力）の測定単位であり、「ＩＵ」で較正した国際標準製剤に対する標準の較正を用いる。Ｎ  Ｌｅｅ、Ｍａｒｔｉｎ  Ｌら、Ａｎ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｐｒｅｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｐｏｔｅｎｃｙ  Ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  ＦＶＩＩＩ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ社）３０，５１１，５１９（１９８３年）に記載されているような、一段階凝固アッセイ法が当該技術分野に知られている。一段階アッセイの原理。この試験は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイの改良版として実施される。血漿とリン脂質及び表面活性化剤とのインキュベーションにより、内因性凝固系の因子が活性化する。カルシウムイオンの添加が、凝固カスケードのトリガーとなる。測定可能なフィブリン血餅の形成までの時間を測定する。アッセイは、第ＶＩＩＩ因子欠損血漿の存在下で実施される。その欠損血漿の凝固能力は、試験される試料に含まれる凝固因子ＶＩＩＩによって回復される。凝固時間の短縮は、試料中に存在する第ＶＩＩＩ因子の量に比例する。凝固第ＶＩＩＩ因子の活性は、活性既知の標準的な第ＶＩＩＩ因子の製剤の国際単位と直接比較することによって定量化される。
【００７３】
別の標準的なアッセイは、発色基質アッセイである。発色基質アッセイは、ｃｏａｍａｔｉｃ  ＦＶＩＩＩ試験キット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＳｐＡ  Ｖ．ｌｅ  Ｍｏｎｚａ  ３３８−２０１２８  Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙ）などの市販品を購入しても良い。発色アッセイの原理。カルシウム及びリン脂質の存在下で、第ＩＸａ因子により、第Ｘ因子が第Ｘａ因子に活性化される。この反応は補因子としての第ＶＩＩＩａ因子によって刺激される。ＦＶＩＩＩａは、測定すべき試料中のＦＶＩＩＩ由来の反応混合物中の少量のトロンビンにより形成される。最適濃度のＣａ２＋、リン脂質及び第ＩＸａ因子及び過剰量の第Ｘ因子を使用する場合、第Ｘ因子の活性化は第ＶＩＩＩ因子の効力に比例する。活性化した第Ｘ因子は発色基質Ｓ−２７６５から発色団ｐＮＡを放出する。従って、４０５ｎｍで測定するｐＮＡの放出は、形成したＦＸａの量に比例し、従って、サンプルの第ＶＩＩＩ因子活性にも比例する。
【００７４】
一実施形態では、治療は、血友病、好ましくは血友病Ａに罹患している患者に、本発明の改変ＶＷＦ分子及び第ＶＩＩＩ因子を投与することを含む。
【００７５】
別の実施形態では、治療は、本発明の改変ＶＷＦ分子及びＣＬＥＣ１０Ａに結合し得る化合物を、ＶＷＤ又は血友病、好ましくは血友病Ａに罹患している患者に投与することを含む。
【００７６】
さらに別の実施形態では、治療は本発明の改変ＶＷＦ分子、第ＶＩＩＩ因子分子、及びＣＬＥＣ１０Ａに結合し得る化合物を、血友病、好ましくは血友病Ａに罹患している患者に、投与することを含む。
【００７７】
特定の実施形態では、本発明の改変ＶＷＦ分子及び第２の治療剤（例えば、第ＶＩＩＩ因子及び／又はＣＬＥＣ１０Ａに結合し得る化合物）を同時に投与する。別の実施形態では、本発明の改変ＶＷＦ分子及び第２の治療剤（例えば、第ＶＩＩＩ因子及び／又はＣＬＥＣ１０Ａに結合し得る化合物）を別々に投与する。本発明の改変ＶＷＦ分子及び第２の治療剤（例えば、第ＶＩＩＩ因子及び／又はＣＬＥＣ１０Ａに結合し得る化合物）の投与の間の時間は、特に限定されない。本発明の改変ＶＷＦ分子は、ＣＬＥＣ１０Ａに結合し得る化合物の前に投与するが好ましい。
【００７８】
ＣＬＥＣ１０Ａ
ＣＬＥＣ１０Ａは、マクロファージＧａｌ型レクチンとしても知られており、ＣＬＥＣファミリーのヒトＩＩ型膜貫通型受容体タンパク質である。更に、Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバー１４、マクロファージレクチン２及びＣＤ３０１は同義語である。ＣＬＥＣ１０Ａは、肝臓ＡＳＧＰＲタンパク質と密接に関連しているが、中間単球、マクロファージ及び樹状細胞によって発現される。  本明細書で使用される場合、用語「ＣＬＥＣ１０Ａ」は、識別子Ｑ８ＩＵＮ９−１、Ｑ８ＩＵＮ９−２、及びＱ８ＩＵＮ９−３の内の１つのもとでＵｎｉＰｒｏｔデータベース内に示されるようなアミノ酸配列を有するか又はそれからなるヒトタンパク質を意味する。最も好ましくは、ＣＬＥＣ１０Ａは、識別子Ｑ８ＩＵＮ９−１の１つでＵｎｉＰｒｏｔデータベース内に示されるようなアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【００７９】
ＣＬＥＣ１０Ａに結合し得る化合物
ＣＬＥＣ１０Ａに結合し得る化合物（以下、「化合物」という）の種類や分類は特に限定されない。然しながら、好ましくは、化合物はペプチド又は、ポリペプチドであり、最も好ましくは化合物は抗体又は、その断片である。
【００８０】
本明細書で使用する用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子を意味し、特定の抗原と結合、又は、免疫学的に反応性を示し、かつポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子操作抗体及びその他の改変した形態の抗体を含み、抗体としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディ）、単一領域抗体（ナノボディ）及び抗体の抗原結合断片、例えばＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ及びｓｃＦｖなど、を含むが、これに限定する訳ではない。更に、特に示さない限り、用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、無処置の分子、ならびにタンパク質に結合し得る抗体断片（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片）の両方を含むことを意味する。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、無処置の抗体のＦｃ断片を欠損しており、動物又は、植物の循環からより迅速に除去され、無処置の抗体よりも非特異的組織結合が少ない可能性がある（Ｗａｈｌら、１９８３、Ｊ  Ｎｕｃｌ。Ｍｅｄ。２４：３１６）。
【００８１】
本発明で使用する抗体は、ＣＬＥＣ１０Ａの少なくとも１つの変異体に結合し得る。他の実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａの細胞外ドメイン、例えばＣＬＥＣ１０Ａのアミノ酸配列のアミノ酸６１〜３１６内のエピトープに結合し得る。好ましくは、抗体はＣＬＥＣ１０Ａのレクチン結合部位に結合する。
【００８２】
又、抗体がＣＬＥＣ１０Ａに特異的に結合することも好ましい。一実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａに結合し得るが、以下の受容体、ＡＳＧＰＲ１、ＣＬＥＣ１０Ａ、ＣＯＬＥＣ１２、ＣＬＥＣ４Ｆ、ＣＬＥＣ４Ｍ、ＳＣＡＲＡ５及びＭＭＲの全てに結合し得ない。別の実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａに結合し得るが、ＡＳＧＰＲ１（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子：Ｐ０７３０６）には結合し得ない。別の実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａに結合し得るが、ＣＯＬＥＣ１２（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子、Ｑ５ＫＵ２６）には結合し得ない。別の実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａに結合し得るが、ＣＬＥＣ４Ｆ（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子、Ｑ８Ｎ１Ｎ０）には結合し得ない。別の実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａに結合し得るが、ＣＬＥＣ４Ｍ（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子、Ｑ９Ｈ２Ｘ３）には結合し得ない。別の実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａに結合し得るが、ＳＣＡＲＡ５（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子、Ｑ６ＺＭＪ２）には結合し得ない。別の実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａに結合し得るが、ＭＭＲ（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子、Ｐ２２８９７）には結合し得ない。更に別の実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａに結合し得るが、以下の受容体、ＡＳＧＰＲ１、ＣＬＥＣ１０Ａ、ＣＯＬＥＣ１２、ＣＬＥＣ４Ｆ、ＣＬＥＣ４Ｍ、ＳＣＡＲＡ５及びＭＭＲ、の何れの１種にも結合し得ない。
【００８３】
別の実施形態では、抗体は、ＣＬＥＣ１０Ａの少なくとも１種のマウスオルソログに結合し得る。その実施形態において、抗体は、ＭＧＬ１、ＭＧＬ２、又は、ＭＧＬ１及びＭＧＬ２の両方に結合し得る。抗体は、ＵｎｉＰｒｏｔ識別子番号Ｐ４９３００に定義されるアミノ酸配列を有するか又は、それからなるタンパク質に結合し得る。この抗体は、ＵｎｉＰｒｏｔ識別子番号Ｆ８ＷＨＢ７に定義されるアミノ酸配列を有するか又は、それからなるタンパク質に結合し得る。抗体は、ＵｎｉＰｒｏｔ識別子番号Ｑ８ＪＺＮ１に定義されるアミノ酸配列を有するか又は、それからなるタンパク質に結合し得る。
【００８４】
別の実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａのラットオルソログに結合し得る。別の実施形態では、抗体はＣＬＥＣ１０Ａのウサギオルソログに結合し得る。別の実施形態では、抗体は、ＣＬＥＣ１０Ａのカニクイザル（ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）オルソログ、及び／又はアカゲザル（ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）オルソログに結合し得る。
【００８５】
ＣＬＥＣ１０Ａ及び抗体によって形成される複合体の解離定数ＫＤは、好ましくは１００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、最も好ましくは５ｎＭ未満である。通常、ＫＤは、約１０ｐＭ〜約１００ｎＭ、又は、約１００ｐＭ〜約１０ｎＭ、又は、約５００ｐＭ〜約５ｎＭの範囲である。
【００８６】
好ましくは、本発明で使用する抗体はモノクローナル抗体である。本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物、原核生物又は、ファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体を意味し、それが産生される方法ではない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイ技術、又は、それらを組合わせる使用を含む、当該分野で公知の多種多様な技術を用いて調製しても良い。（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ  １９８８、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。
【００８７】
ヒトにおける抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体のインビボでの使用を含む他の実施形態では、キメラ、霊長類化された、ヒト化された、又は、ヒト抗体を使用しても良い。好ましい実施形態では、抗体はヒト抗体又は、ヒト化抗体であり、より好ましくはモノクローナルヒト抗体又は、モノクローナルヒト化抗体である。
【００８８】
本明細書で使用される用語「キメラ」抗体とは、例えば、ラット又は、マウス抗体等等の非ヒト免疫グロブリン、及び、通常、ヒト免疫グロブリン鋳型から選択されるヒト免疫グロブリン定常領域、から誘導される可変配列を有する抗体を意味する。キメラ抗体を産生するための方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９（４７１９）：１２０２−７を参照のこと。Ｏｉら、１９８６、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４−２２１、  Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９８５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ。  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２、米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、及び第４，８１６，３９７号に記載され、これらは、その全体を参照により本明細書に組込まれる。
【００８９】
非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の「ヒト化」形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又は、その断片（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は、他の標的結合サブ配列など）であり、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む。一般に、ヒト化抗体は、実質的に全ての、少なくとも１種の、及び、通常は２種の可変ドメインを含み、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、かつＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常は選択されたヒト免疫グロブリン鋳型のものを含んでも良い。ヒト化は、キメラ抗体を作製するための技術であり、１種又は、それ以上のアミノ酸、又はヒト可変領域の一部分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されている。ヒト化抗体は、非ヒト種で産生した抗体分子であり、非ヒト種由来の１種又は、それ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する所望の抗原と、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク（ＦＲ）領域とを結合する。しばしば、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換され、抗原結合を改変し、好ましくは改善する。これらのフレームワーク置換は、当該分野で周知の方法によって同定され、例えばＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用をモデリングし、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定し、及び配列比較して、特定の位置での異常なフレームワーク残基を同定する。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−７及びＱｕｅｅｎら、米国特許第５，５３０，１０１号、  第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号及び第６，１８０，３７０号（その各々は、その全体が参照により組込まれる）を参照のこと。抗体は、ヒト化しても良く、当該分野で周知の種々の技術としては、例えばＣＤＲ移植（欧州特許第２３９４００号、国際特許公開第９１／０９９６７号、米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号及び第５，５８５，０８９号）、ベニアリング又は、再表面化（欧州特許第５９２１０６号、欧州特許第５１９５９６号、Ｐａｄｌａｎ，１９９１，ＭｏＩ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２８：４８９−４９８、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．７：８０５−８１４、Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９６９−９７３）、及びチェーンシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を使用し、これらはすべて、参照によりその全体を本明細書に組込む。
【００９０】
いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号及び第６，１８０，３７０号に記載されているように調製する（その各々は、その全体を参照により組込む）。
【００９１】
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体はヒト抗体である。完全な「ヒト」抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体は、ヒト患者の治療的処置に望ましいものとなり得る。本明細書中で使用する「ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、かつ、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、又は、１種又はそれ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニック動物から得られた抗体を含み、しかも、内因性免疫グロブリンを発現しない。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いて上記のファージディスプレイ法を含む、当該分野で公知の種々の方法により作製出来る。米国特許第４，４４４，８８７号、及び第４，７１６，１１１号、及び国際特許公開第  ９８／４６６４５号、国際特許公開第９８／５０４３３号、国際特許公開第９８／２４８９３号、国際特許公開第９８／１６６５４号、国際特許公開第９６／３４０９６号、国際特許公開第９６／３３７３５号、及び国際特許公開第９１／１０７４１号、を参照のこと、これらは、各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ヒト抗体はまた、遺伝子導入マウスを用いて作製出来、これらは機能的内因性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができる。例えば、国際特許公開第９８／２４８９３号、国際特許公開第９２／０１０４７号、国際特許公開第９６／３４０９６号、国際特許公開第９６／３３７３５号、米国特許第５，４１３，９２３号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，５６９，８２５号、第５，６６１，０１６号、第５，５４５，８０６号、第５，８１４，３１８号、第５，８８５，７９３号、第５，９１６，７７１号、及び第５，９３９，５９８号を参照のこと、これらは、各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と称する技術を用いて産生することが出来る。この手法では、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を使用して、完全ヒト抗体の選択を誘導し、同じエピトープを認識する（Ｊｅｓｐｅｒｓら、１９８８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９
９−９０３）。
【００９２】
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体は霊長類化抗体である。用語「霊長類化抗体」とは、サルの可変領域とヒト定常領域とを含む抗体を意味する。霊長類化した抗体を産生する方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，６５８，５７０号、第５，６８１，７２２号  及び第５，６９３，７８０号を参照のこと、これらは、各々その全体が参照により本明細書に組込まれる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体は誘導体化された抗体である。例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞リガンド又は、他のタンパク質への結合（抗体コンジュゲートの考察については以下を参照のこと）などにより改変された誘導体化抗体が挙げられるが、これに  限定する訳ではない。多数の化学改変の何れも、既知の技術、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等、により、実施することが出来るがこれに限定する訳ではない。更に、その誘導体は、１種又はそれ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【００９４】
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体又は、その断片は、その配列が対応する野生型配列と関連する少なくとも１種の定常領域媒介生物学的エフェクター機能を低下させるように改変された抗体又は、抗体断片であり得る。抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体を、Ｆｃ受容体への結合の減少を示すように、改変すると、抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントはＦｃ受容体（ＦｃＲ）相互作用に必要な特定の領域で変異させることが出来る（例えばＣａｎｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９９１、Ｊ．Ｅｘｐ。Ｍｅｄ。１７３：１４８３−１４９１、及びＬｕｎｄら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ。１４７：２６５７−２６６２参照のこと）。抗体のＦｃＲ結合能力の低下はまた、オプソニン作用及び貪食性及び抗原依存性細胞傷害作用のようなＦｃＲ相互作用に依存する他のエフェクター機能を低下させ得る。
【００９５】
更に別の態様では、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体又は、その断片は、胎児性Ｆｃ受容体ＦｃＲｎに対するそれらの結合親和性を増加又は、減少させるように改変した抗体又は、抗体断片でも良い。ＦｃＲｎへの結合親和性を変更するために、抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントは、ＦｃＲｎとの相互作用に必要な特定の領域を突然変異させても良い（例えば、国際特許公開第２００５／１２３７８０号参照）。ＦｃＲｎに対する結合親和性が増加すると、抗体の血清半減期が増加する筈であり、ＦｃＲｎに対する結合親和性が低減すると、逆に抗体の血清半減期が減少する筈である。特定の実施形態では、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体は、重鎖定常領域のアミノ酸残基２５０、３１４及び４２８の少なくとも１種が未改変抗体に存在するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基で置換されたＩｇＧクラスである。ＩｇＧクラスの抗体には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の抗体が含まれる。置換は単独の位置２５０、３１４、又は４２８で、又はそれらの組合わせの何れかで、例えば、位置２５０と４２８とで、又は位置２５０と３１４とで、又は位置３１４と４２８とで、又は位置２５０と３１４並びに４２８とを、好ましい組み合わせとして位置２５０及び４２８とで行なう。各位置において、置換アミノ酸は、非改変抗体のその位置に存在するものとは異なるどのようなアミノ酸残基でも良い。位置２５０について、置換アミノ酸残基は、スレオニン以外のどのようなアミノ酸残基でも良く、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン、又は、チロシン等を含むが、これらに限定する訳ではない。位置３１４については、置換アミノ酸残基は、ロイシン以外のどのようなアミノ酸残基でも良く、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、又は、チロシン等を含むが、これらに限定する訳ではない。位置４２８では、置換アミノ酸残基は、メチオニン以外のどのようなアミノ酸残基でも良く、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、又は、チロシン等を含むが、これらに限定する訳ではない。適切なアミノ酸置換の特定の組み合わせは、国際特許公開第２００５／１２３７８０号の表１と同一であり、この表は、参照によりその全体が本明細書に組込まれる。Ｈｉｎｔｏｎら、米国特許第７，２１７，７９７号、第７，３６１，７４０号、第７，３６５，１６８号、及び第７，２１７，７９８号も参照のこと、これらも参照によりその全体が本明細書に組込まれる。
【００９６】
更に他の態様では、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体は、その超可変領域の１種又はそれ以上に挿入された１種又はそれ以上のアミノ酸を有し、これは例えば米国特許公開第２００７／０２８０９３１号に記載されている。
【００９７】
抗体コンジュゲート
いくつかの実施形態において、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体は、抗体コンジュゲートであり、これは例えば、任意のタイプの分子を抗体へ共有結合することにより改変し、ＣＬＥＣ１０Ａへの結合を共有結合が妨害しないようにしたものである。エフェクター部分を抗体に結合させる技術は、当該分野において周知である（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒａｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、第２版、６２３−５３頁（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ｅｄｓ．，１９８７）、Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３）。
【００９８】
１つの実施例において、抗体又はその断片は、共有結合（例えば、ペプチド結合）を介して、場合によりＮ末端又はＣ末端で、別のタンパク質（又は、その一部、好ましくはそのタンパク質の少なくとも１０、２０又は５０個のアミノ酸部分）のアミノ酸配列と融合している。好ましくは、抗体又は、その断片は、抗体の定常領域のＮ末端で他のタンパク質に連結される。組換えＤＮＡ手順を使用して、例えば、国際特許公開第８６／０１５３３号、及び欧州特許第０３９２７４５号に記載されているように、そのような融合物を作製しても良い。別の実施例において、エフェクター分子はインビボで半減期を増加させ得る。この型の適切なエフェクター分子としては、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、又は、国際特許公開第２００５／１１７９８４号、に記載されているようなアルブミン結合化合物が挙げられる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体をポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に結合させても良い。例えば、抗体が抗体断片である場合、ＰＥＧ部分は、抗体断片内に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は、末端アミノ酸官能基、例えば任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル又は、カルボキシル基を介して結合させても良い。このようなアミノ酸は、抗体断片中に天然に存在するものでもよく、又は、組換えＤＮＡ法を用いて断片中に操作したものでも良い。例えば、米国特許第５，２１９，９９６号を参照のこと。複数の部位を用いて、２種又はそれ以上のＰＥＧ分子を結合させても良い。好ましくは、ＰＥＧ部分は、抗体断片内に位置する少なくとも１種のシステイン残基のチオール基を介して共有結合的に連結される。チオール基を結合箇所として使用する場合、適切に活性化されたエフェクター部分、例えば、マレイミド及びシステイン誘導体のようなチオール選択性誘導体を使用しても良い。
【０１００】
別の例において、抗ＣＬＥＣ１０Ａ抗体コンジュゲートは、例えば欧州特許第０９４８５４４号に開示された方法に従ってＰＥＧ化された、即ちそれにＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を共有結合させた改変Ｆａｂ’断片である。Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（ｅｄ．）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２）Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．１９９７）及びＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍ．Ａｓｌａｍ  ａｎｄ  Ａ．Ｄｅｎｔ、編、Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９８）。及びＣｈａｐｍａｎ、２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４：５３１−５４５。も参照のこと。
【０１０１】
ＣＬＥＣ１０Ａ受容体を遮断するために用いることができる別の実施形態は、アルブミンに、好ましくはリンカーを介して融合されるような半減期延長部分に連結された、２２９８位にＯ−グリコシル化部位を含むＶＷＦ−Ｃ１ドメインである。好ましい実施形態は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質である。
【０１０２】
キット
本発明の別の態様は、（ｉ）上記で定義した改変ＶＷＦ分子及び（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子、ＣＬＥＣ１０Ａに結合し得る化合物（好ましくは抗体）及び  それらの組合わせからなる群より選択されるポリペプチドを含む医薬キットである。好ましくは、改変したＶＷＦ分子及びポリペプチドは、別々の組成物中に含まれる。
【０１０３】
本発明の別の態様は、血液凝固障害の治療において、同時に、別々に又は逐次使用するための、（ｉ）上記で定義した改変したＶＷＦ分子及び（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子、ＣＬＥＣ１０Ａに結合し得る化合物（好ましくは抗体）及びそれらの組合わせからなる群より選択されるポリペプチド、を含む医薬キットである。
【０１０４】
本発明の別の態様は、第ＶＩＩＩ因子の半減期を増加するか、又はクリアランスを低減するための、上記定義の改変ＶＷＦ分子の使用である。
【０１０５】
用語「半減期」は、インビボでの血流からタンパク質の半分を除去するのに要する時間を意味する。クリアランス効果を評価するために、曲線下面積（ＡＵＣ）を決定しても良い。クリアランスを低減すると、ＡＵＣ値はより高くなり、しかも、半減期の増加をもたらす。
【０１０６】
本発明の更に別の態様は、第ＶＩＩＩ因子の半減期を増加させるための、上記定義の化合物（好ましくは抗体）の、好ましくは治療的処置における、使用である。
【０１０７】
本発明はさらに、上記で定義した有効量の改変ＶＷＦ分子を被験者に投与することを含む、インビボでの第ＶＩＩＩ因子の半減期を増加するか又はクリアランスを低減する方法に関する。
【０１０８】
本発明の更なる態様は、上記で定義した有効量の改変ＶＷＦ分子を必要とする患者に、投与することを含む血液凝固障害を治療する方法である。
【０１０９】
更なる態様は、血友病Ａの治療におけるＦＶＩＩＩの投与頻度を低減するための、上記に定義した改変したＶＷＦ分子の使用である。ＦＶＩＩＩの静脈内又は皮下投与の頻度は、週に２回に低減し得る。或いは、ＦＶＩＩＩの静脈内又は皮下投与の頻度は、１週間に１回に低減し得る。
【０１１０】
更なる態様は、ＶＷＤの治療におけるＶＷＦの投与頻度を低減するための、上記に定義した改変したＶＷＦ分子の使用である。ＶＷＦの静脈内又は皮下投与の頻度は、週２回に低減し得る。或いは、ＶＷＦの静脈内又は皮下投与の頻度は、週に１回に低減し得る。即ち、本発明の改変したＶＷＦ分子は、１週間に１回又は２回投与される。
【０１１１】
別の態様は、血友病Ａの治療において投与するＦＶＩＩＩの用量を低減するための、上記で定義した改変したＶＷＦ分子の使用である。
【０１１２】
別の態様は、ＶＷＤの治療において投与するＶＷＦの用量を低減するための、上記で定義した改変したＶＷＦ分子の使用である。
【０１１３】
以下の表は、配列表に示されるヌクレオチド及びアミノ酸配列をまとめたものである：
【表１】
2018510212.tif 000002
【実施例】
【０１１４】
実施例１  ＶＷＦ上に存在する特定のグリコシル化構造が、ＣＬＥＣ１０Ａと、並びにＶＷＦ上に存在するＯ−結合グリカンサイト２２９８と、相互作用することを確認した。
ＣＬＥＣ１０Ａに対するヒトＶＷＦ上の結合部位を確認するために、ＶＷＦのトリプシン断片を可溶性ＣＬＥＣ１０Ａと共にインキュベートした。洗浄後、結合したタンパク質断片をｐＨ１１で、かつ、ＧａｌＮＡｃ１００ｍＭを含む溶液を用いて、夫々、溶出した。溶出条件は、規定された条件下で、ＣＬＥＣ１０Ａに結合した全ての成分が完全に溶出することを示す予備のＳＰＲ実験に基づいて選択した。  続いて、夫々の溶出画分をＭＳ分析に付した。
【０１１５】
遊離のＮ−及びＯ−グリカンを、過メチル化し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析によって特徴付けた。得られたデータより、ＣＬＥＣ１０ＡがＮ−及びＯ−グリカンの認識において顕著に異なっていることを実証した。出発物質として使用したＶＷＦ断片（グリカン分析からは１８％の非シアリル化Ｏ−グリカンの存在が観察された）と比較して、溶出画分の両方共に非シアリル化Ｏ−グリカンの強い富化を示したが、一方、１個又はそれ以上のＮｅｕＡｃ残基を含むシアリル化Ｏ−グリカンは、それらのシアリル化状態にかかわらず、Ｎ−グリカンと同様に著しく減少した。
【０１１６】
溶出条件（ＧａｌＮＡｃに対してアルカリ性）の差により、グリカンパターンにほんの僅かの違いをもたらした。溶出画分中にＯ−グリコシル化構造の主要な３種を同定出来、これは検出されたすべてのＯ−グリカン構造の内の約８０％を表す。夫々の構造を図２に示す。コア２グリカン（濃縮因子４０を超える）、１個のＮｅｕＧｃ残基を有するコア１グリカン（濃縮因子約９）、及び二糖ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌで伸長されたコア２グリカン（濃縮因子約７）の富化をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析によって確認した。括弧内に記載した濃縮因子は、ＣＬＥＣ１０Ａとのインキュベーション前の出発物質と比較した場合の、夫々のグリカンの富化を定量的に記述する。
【０１１７】
前述の調査に加え、ＶＷＦ断片の脱グリコシル化後のナノ液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化ＭＳ／ＭＳによる分析を行った。２つの異なる溶出画分中の夫々で検出し、得られたペプチドパターンは類似しており、従って、適用した溶出条件には依存していなかった。その結果、スレオニン２２９８を含むＶＷＦペプチドを、溶出後に明確に確認した。得られた分析データに基づき、ＣＬＥＣ１０Ａ結合における他のグリコシル化ＶＷＦ断片の関与を除外することができた。従って、Ｏ−結合型グリカン部位Ｔ２２９８はシアリル化されていないグリカン構造を含み、従ってそれは、ＣＬＥＣ１０Ａと相互作用する可能性が最も高い。さらに、ＶＷＦ上に存在するこのグリコシル化部位は、ＣＬＥＣ１０Ａの主要な相互作用パートナーであると排他的に確認され、したがって、受容体相互作用の役割を担う唯一のものであることが判明した。他の全てのＶＷＦグリカン部位は、ＣＬＥＣ１０Ａ結合に関与していないようであった。
【０１１８】
要約すると、可溶性ＣＬＥＣ１０Ａからトリプシン消化されたＶＷＦ断片の溶出後、ＭＳ分析から、非シアリル化Ｏ−グリカンがＣＬＥＣ１０Ａに結合することが判明し、一方で、シアリル化されたＯ−グリカン並びにＮ−グリカンは、それらのシアリル化した状態にもかかわらずＣＬＥＣ１０Ａと有意な相互作用はしないことが実証された。ＶＷＦ上に存在する３種の主要なＯ−グリコシル化構造（コア２グリカン、１種のＮｅｕＧｃ残基を有するコア１グリカン、及び二糖ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌで伸長したコア２グリカン）が、相互作用の原因であることを確認した。コア２グリカンについては、他の両方の構造と比較して非常に高い濃度因子を検出したという事実により、ＶＷＦ上に存在するこのグリカンは、ＣＬＥＣ１０Ａに対して強い親和性を有するようであった。更に、Ｏ−結合型グリカン部位２２９８を含むＶＷＦペプチドのみがＣＬＥＣ１０Ａに結合することを確認し、従って、シアリル化していないグリカン構造を含んでいた。最終的に、驚くべきことに、これらの結果はグリカン部位Ｔ２２９８が唯一ＶＷＦ−ＣＬＥＣ１０Ａ相互作用に関与していることを示していた。更に、観察されたグリコシル化パターンは、Ｔ２２９８にのみ存在するようであった。これらの結果及びＣＬＥＣ１０ＡがＶＷＦのクリアランスに介在するという観察に基づけば、ＣＬＥＣ１０Ａによる天然にグリコシル化されたＶＷＦのクリアランスは、Ｏ−結合グリコシル化部位２２９８によってのみ影響を受けることが示唆され得る。その結果として、ＣＬＥＣ１０Ａ結合を防ぐ目的に関しては、ＶＷＦ突然変異体のクリアランスの減少は、夫々のＯ−グリコシル化部位及び／又は夫々の炭水化物構造がこのグリカン部位に存在することを確認する操作の後に想定することができる。
【０１１９】
方法
１）ＶＷＦの還元及びカルボキシメチル化
前章に記載した方法に従って精製したＶＷＦ溶液の３０ｍＬを、還元緩衝液（トリス５０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、ｐＨ８．５）１Ｌに対して＋４℃で一晩透析した。この手順を再度繰り返したが、但し、２回目の透析は室温で４時間行った。引続き、前記溶液に、穏やかな撹拌下（ＩＫＡ、Ｓｔａｕｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、貯蔵溶液ＤＴＴ １Ｍを添加してＤＴＴ １５ｍＭに調整した。ＶＷＦの還元を＋３７℃で６０分間のインキュベーションにより実施した。 次いで、ＶＷＦをヨードアセトアミド４０ｍＭと共に、貯蔵溶液１Ｍを添加することにより、アルキル化し、溶液を室温で６０分間インキュベートした。
【０１２０】
２）ヒト血漿から精製したＶＷＦ単量体の酵素消化
前述の方法に基づく還元及びアルキル化の後、ＶＷＦ単量体（タンパク質濃度１ｍｇ／ｍＬ）６０ｍＬを＋４℃で一晩、Ｍｅｍｂｒａ−Ｃｅｌ  ＭＤ２５−１４透析チューブ（Ｓｅｒｖａ社、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を介してＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ７．８）５０ｍＭ  ２０Ｌで透析した。透析工程を２回繰返した。固定化したトリプシン樹脂（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ７．８）５０ｍＭで洗浄し、タンパク質溶液に加え、タンパク質８ｍｇ当たりトリプシン樹脂１ｍＬを得た。続いて、懸濁液を＋３７℃で２４時間、回転混合機（Ｇｌａｓｗａｒｅｎｆａｂｒｉｋ  Ｋａｒｌ  Ｈｅｃｈｔ社、Ｓｏｎｄｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上でインキュベートした。反応後、固定化したトリプシンを遠心分離（Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  ３ＳＲ、Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｏｓｔｅｒｏｄｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）＋２０℃、２，０００×ｇで、１５分間分離した。更に濾過工程（孔径０．４５μｍ、Ｓｔｅｒｉｖｅｘ−ＨＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃｏｒｋ、Ｉｒｅｌａｎｄ）の後、反応混合物をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−７０装置（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に移し替え、次に及び遠心分離（Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  ３ＳＲ、Ｈｅｒａｅｕｓ、Ｏｓｔｅｒｏｄｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、室温中、３，０００×ｇで１５分間実施した。成功した切断反応は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、実証した（データは示さず）。トリプシンの欠乏は、発色基質を適用することにより確認した（データは示さず）。トリプシン断片（タンパク質濃度約０．５ｍｇ／ｍＬ）をＳｐｅｅｄＶａｃ真空濃縮器システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で最終濃度約４０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。最終的に、濃縮したＶＷＦ断片のペプチド特性をＭＳ分析によって調べ、最初の遠心分離工程の前の中間画分として得られた特性と比較し、これにより両試料がＶＷＦ断片の同組成を有するという証拠を提供した。
【０１２１】
３）ＣＬＥＣ１０Ａと相互作用するトリプシンＶＷＦ断片の確認
ＶＷＦ上に存在するグリカン鎖の何れがＣＬＥＣ１０Ａとの相互作用に関与しているかを確認するために、トリプシンＶＷＦ断片を可溶性ＣＬＥＣ１０Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共にインキュベートした。凍結乾燥した受容体タンパク質１ｍｇを、ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ及びＣａＣｌ２２５ｍＭを含む反応緩衝液２ｍＬ中に溶解した。タンパク質含量０．５ｍｇ／ｍＬを有するトリプシン消化後の濃縮ＶＷＦ断片２０ｍＬを、２０倍濃縮した貯蔵緩衝溶液を添加することにより、同じ緩衝液条件に調整し、次いで受容体タンパク質を含む溶液と混合した。インキュベーションは、穏やかな混合（Ｇｌａｓｗａｒｅｎｆａｂｒｉｋ  Ｋａｒｌ  Ｈｅｃｈｔ社、Ｓｏｎｄｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）下、＋３７℃で一晩行った。その後、未結合ＶＷＦ断片を３，０００×ｇ（Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  ３ＳＲ、Ｈｅｒａｅｕｓ社、Ｏｓｔｅｒｏｄｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）での遠心分離（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニット、ＮＭＷＬ  １０ｋＤａ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により、分離し、廃棄した。遠心分離は、残留容量が０．５ｍＬに達するまで室温で行った。次に、ＶＷＦ断片と相互作用する受容体タンパク質を含む濃縮反応混合物を反応緩衝液で洗浄し、再び濃縮した。この濃縮液の洗浄工程を２回繰り返した後、反応液を２等分し、次いで、異なる２種類の溶出緩衝液で処理した。一方では、結合したタンパク質断片をｐＨ１１（１００ｍＭグリシン／ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ１１．０）で溶出させ、他方では、ＧａｌＮＡｃ（１００ｍＭ  ＧａｌＮＡｃ、ｐＨ４．３）を含有する溶液を用いた。溶出緩衝液夫々を、洗浄し濃縮した溶液に添加し、穏やかに混合しながら室温で一晩インキュベートした。遠心分離により分離した後、溶出したＶＷＦ断片を含む得られた濾液を回収し、ＭＳにより分析した。
【０１２２】
４）クリアランス受容体と相互作用するトリプシンＶＷＦ断片の分析
単離したトリプシン断片をＰＮＧａｓｅＦ処理及びβ−脱離により脱グリコシル化し、次いでナノ液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化ＭＳ／ＭＳを適用することによって分析した。更に、遊離のＮ−及びＯ−グリカンを、過メチル化し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析によって特徴付けた。分析は公開された方法に基づいて行った（Ｃａｎｉｓら（２０１０）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、８：１３７−１４５、  Ｃａｎｉｓら（２０１２）Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、４４７：２１７−２２８）。
【０１２３】
実施例２  ＶＷＦ変異体Ｔ２２９８の発現ベクターの産生
多重クローニング部位に全長ＶＷＦ  ｃＤＮＡ配列を含む発現プラスミドが従前より産生されている。このベクターに含まれるＶＷＦ  ｃＤＮＡ配列は、配列番号１として、表示し、それに対応するタンパク質配列は配列番号２として表示する。
【０１２４】
このような発現ベクターを産生するために、ＶＷＦ  ｃＤＮＡを、当業者に公知の標準的な条件下（及び例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら．（編）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｏｍ／ＷｉｌｅｙＣＤＡ／））でプライマーセットＶＷＦ＋及びＶＷＦ−（配列番号３及び４）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＶＷＦ  ｃＤＮＡを含有するプラスミド（市販品より入手可能なもの、例えばＡＴＣＣ、Ｎｏ．６７１２２からのｐＭＴ２−ＶＷＦ）から、増殖した。得られたＰＣＲ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩで線状化した発現ベクターｐＩＲＥＳｎｅｏ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）に連結した。得られた発現プラスミドは、正しく配向したインサートを有し、ＣＭＶプロモーターの下流にＶＷＦの野生型ｃＤＮＡを含んでいた。
【０１２５】
ＶＷＦ配列に突然変異を導入するために、部位特異的突然変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、キット製造者により、提案された以下の手順書に従って上記プラスミドに適用した。突然変異誘発反応当たり１０倍の反応緩衝液を５μｌ、プラスミドＤＮＡ（５０ｎｇ）１μｌ、２種の突然変異誘発オリゴヌクレオチドＷｅ４７８１及びＷｅ４７８２（配列番号５及び６）の各々（１０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、ｄＮＴＰ混合物１μｌ、Ｑｕｉｃｋ−溶液３μｌ、ターボポリメラーゼ（２，５Ｕ／μｌ）１μｌ、及びＨ２Ｏ  ３７μｌを混合し、９５℃で２分間の初期変性を伴うポリメラーゼ連鎖反応、ａ）９５℃で５０秒間の変性、ｂ）６０℃で５０秒間のアニーリング、及びｃ）６８℃で１７分間伸長し、続いて６８℃での７分間の単一末端伸長段階に付すサイクルを１８回行なった。引続き、キットからのＤｐｎＩ酵素１μｌを添加し、反応物を３７℃で更に６０分間インキュベートし反応させた。その後、突然変異誘発反応物３μｌを大腸菌に形質転換した。クローンを単離し、プラスミドＤＮＡを抽出し、ＶＷＦ配列内の突然変異をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１２６】
上述の手順書及びプラスミドを使用し、かつ当業者に公知の分子生物学技術（及び例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、前出、に記載されている）を適用することにより、当業者は、他のアミノ酸残基の突然変異についても、他の構築物を作製することができる。
【０１２７】
実施例３  Ｔ２２９８残基を含むアルブミン融合ＶＷＦ断片の発現ベクターの産生
ヒトアルブミンに融合したアミノ酸残基２２７６〜２３２６を含むＶＷＦ断片の発現ベクターを産生するために、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端２８アミノ酸グリシン／セリンリンカーを含むＶＷＦ断片のコード配列を、５’末端にＮｈｅＩ制限部位を、３’末端にＢａｍＨ１部位を有する遺伝子合成（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により作製した。この断片を、ＮｈｅＩ及びＢａｍＨ１消化によって提供されるクローニングベクターから切り出し、精製し、次にＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ消化発現ベクターｐＩＲＥＳｎｅｏ３（同書）にクローニングした。
【０１２８】
アルブミンコード配列をＰＣＲにより増幅させた。そのために、プラスミドＤＮＡ（５０ｎｇ）を含む野生型アルブミンｃＤＮＡ１μｌ、１０倍の反応緩衝液５μｌ、２種類のＰＣＲプライマーＨＡ＋及びＨＡ−（配列番号７及び８）（１０ｐｍｏｌ／μｌ）の各々１μｌ、ｄＮＴＰ混合物１μｌ、ターボポリメラーゼ（２，５Ｕ／μｌ）１μｌ、及びＨ２Ｏ  ４０μｌを混合し、９５℃で２分間の初期変性を伴うポリメラーゼ連鎖反応、ａ）９５℃で２０秒間の変性、ｂ）６１℃で２０秒間のアニーリング、及びｃ）６８℃で７分間伸長し、続いて６８℃での７分間の単一末端伸長段階に付すサイクルを２５回行なった。断片を精製し、ＢａｍＨ１及びＮｏｔＩで消化し、ＶＷＦ断片を含む上記ベクターのＢａｍＨ１及びＮｏｔＩ部位に連結した。連結混合物をＥ．ｃｏｌｉに形質転換する。クローンを単離し、プラスミドＤＮＡを抽出し、配列をＤＮＡ配列決定により確認した。発現した構築物のアミノ酸配列を配列番号９に示す。
【０１２９】
実施例４  ＣＨＯ細胞におけるプラスミドのトランスフェクション及びＶＷＦ変異体の発現
発現プラスミドを大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で増殖させ、標準手順書（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。ＣＨＯ  Ｋ１細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて発現プラスミドでトランスフェクトした。単一クローンを単離し、ジェネテシン７５０μｇ／ｍｌの存在下で無血清培地（ＣＤ−ＣＨＯ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で増殖させた。クローンをＴ−フラスコを通して振盪フラスコ及びバイオリアクターに広げ、そこから上清を回収し、夫々の組換えＶＷＦタンパク質を精製した。
【０１３０】
実施例５  ＶＷＦ抗原の定量
培養上清中のＶＷＦ抗原を、当業者にはその性能が良く知られているＥＬＩＳＡにより決定した。簡単に述べると、マイクロプレートを、ウェル当たりの捕捉抗体（ウサギ抗ヒトｖＷＦ−ＩｇＧ、Ｄａｋｏ  Ａ００８２［Ｄａｋｏ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ］１００μＬ、緩衝液Ａ  ［Ｓｉｇｍａ  Ｃ３０４１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミュンヘン、ドイツ］で１：２０００に希釈した）と共に、周囲温度で一晩インキュベートした。プレートを緩衝液Ｂ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ３５６３）で３回洗浄した後、各ウェルを緩衝液Ｃ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ３６８８）２００μＬと共に周囲温度（ブロッキング）で１．５時間インキュベートした。緩衝液Ｂで更に３回洗浄した後、緩衝液Ｂ中の試験試料の段階希釈液並びに緩衝液Ｂ（ウェルあたり：１００μＬ）中の標準ヒト血漿（ＯＲＫＬ２１、２０-０．２ｍＵ／ｍＬ、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の段階希釈液を周囲温度で１．５時間インキュベートした。緩衝液Ｂによる３回洗浄工程の後、緩衝液Ｂ中での検出抗体（ウサギ抗ヒトｖＷＦ−ＩｇＧ、Ｄａｋｏ  Ｐ０２２６、ペルオキシダーゼ標識）の１：１６０００希釈液１００μＬを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。緩衝液Ｂによる３回洗浄工程の後、基質溶液（ＯＵＶＦ、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）１００μＬをウェルごとに添加し、暗所、周囲温度で３０分間インキュベートした。希釈してない希釈停止液（ＯＳＦＡ、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）１００μＬを添加し、マイクロプレートリーダーにより、４５０ｎｍの波長で適切に読める試料を調製した。そこで、試験試料の濃度を、標準的なヒト血漿を参考として用いる標準曲線を使用して計算した。
【０１３１】
実施例６  ＶＷＦ  Ｔ２２９８Ｑ変異体の薬物動態解析
実施例４のＶＷＦ−Ｔ２２９８Ｑ及び組換えＶＷＦ（野生型）をそれぞれ合計４匹のＣＤラットに静脈内投与した。用量は、１００Ｕ（ＶＷＦ：Ａｇ）／ｋｇ体重、であり、一回の注射容量は４ｍＬ／ｋｇである。
【０１３２】
血液試料は、交互に採取する計画を使用し、試験物質の適用後５分から適切な間隔で逆行的に抜き取りを開始し、２匹の動物／時点（サブセットＮｏ．１についてはｔ＝０、５、３０、９０分、４時間、１日、及び、サブセットＮｏ．２については０、１５分、１、２、８時間及び２日である。）の試料を得た。この計画は、定量すべき血漿濃度に及ぼす採血方法の潜在的影響を最小限に抑えるように設計した。血液は処理を加え、血漿とし、分析するまで冷凍保存した。続いて、血漿中のＶＷＦ：Ａｇレベルを実施例５に記述したようにＥＬＩＳＡによって定量した。平均血漿濃度を用いて薬物動態パラメーターを計算した。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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