(57)【要約】  ペプチドを含む組成物、その医薬調製物、ならびにそれを用いる光受容体細胞死の予防方法およびFas媒介性またはTRAIL媒介性アポトーシスから、限定するものではないが、光受容体および網膜色素上皮をはじめとする網膜細胞を保護する方法が、本明細書中に提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Iの化合物：
【化１】
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または製薬上許容されるその塩。
【請求項２】
請求項1の化合物のポリアセテート塩。
【請求項３】
請求項1の化合物の三酢酸塩。
【請求項４】
眼の光受容体でのFas媒介性またはTRAIL媒介性アポトーシスを予防するための医薬製剤での使用のための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項５】
眼の網膜色素上皮の細胞でのアポトーシスまたはネクロプトーシスを予防するための医薬製剤での使用のための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項６】
網膜剥離の治療のための医薬製剤での使用のための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項７】
網膜神経節細胞の疾患または症状（conditions）を予防するための医薬製剤での使用のための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項８】
請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物、および眼への送達用につくられた製薬用担体。
【請求項９】
眼内、硝子体内、または眼周囲投与用に製剤化される、請求項8に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物中の前記化合物が、剥離した網膜光受容体細胞を保護する、請求項8または9に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物中の前記化合物が、眼の網膜色素上皮の細胞でのアポトーシスまたはネクロプトーシスを予防する、請求項8または9に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物中の前記化合物が、眼の網膜神経節の細胞でのアポトーシスまたはネクロプトーシスを予防する、請求項8または9に記載の組成物。
【請求項１３】
組成物が眼に対して無毒である、請求項10〜12のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１４】
少なくとも1種の非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項10〜13のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記少なくとも1種の非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート80、ポリソルベート20、ポロキサマー407、およびチロキサポールからなる群より選択される、請求項14に記載の組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも1種の非イオン性界面活性剤が、前記組成物の約0.01％〜20％(w/w)を形成する、請求項14または15に記載の組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも1種の非イオン性界面活性剤が、前記組成物の約0.05％〜10％(w/w)を形成する、請求項14または15に記載の組成物。
【請求項１８】
前記少なくとも1種の非イオン性界面活性剤が、前記組成物の約0.25％〜3％(w/w)を形成する、請求項14または15に記載の組成物。
【請求項１９】
急性か慢性かにかかわらず、治療対象である徴候に合う硝子体または網膜薬物動態などのパラメータを最適化する比率で、2種類以上の非イオン性界面活性剤が用いられ、添加される非イオン性界面活性剤の総量が前記組成物の0.01％〜20％(w/w)である、請求項14〜18のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項２０】
有機共溶媒をさらに含む、請求項9〜19のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項２１】
プロピレングリコールおよびジメチルスルホキシドのうちの少なくとも1種をさらに含む、請求項9〜20のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記有機共溶媒が前記組成物の約1％〜50％(w/w)を形成する、請求項21に記載の組成物。
【請求項２３】
前記有機共溶媒が前記組成物の約1％〜20％(w/w)を形成する、請求項21に記載の組成物。
【請求項２４】
前記有機共溶媒が前記組成物の約1％〜5％(w/w)を形成する、請求項21に記載の組成物。
【請求項２５】
2.5〜6.0の範囲のpHを有する、請求項7〜24のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項２６】
眼の症状、疾患、または眼の健康に影響を及ぼす症状もしくは疾患に罹患している被験体に、請求項9〜25のいずれか1項に記載の組成物を投与するステップを含む、眼の症状、疾患、または眼の健康に影響を及ぼす症状もしくは疾患を治療する方法。
【請求項２７】
前記眼の症状、疾患、または眼の健康に影響を及ぼす症状もしくは疾患が、網膜剥離、黄斑変性、加齢黄斑変性、非滲出型加齢黄斑変性、滲出型加齢黄斑変性、脈絡膜血管新生、網膜症、糖尿病性網膜症、急性および慢性黄斑性視神経網膜症（acute and chronic macular neuroretinopathy）、中心性漿液性脈絡網膜症、黄斑浮腫、類嚢胞黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、ブドウ膜炎/網膜炎/脈絡膜炎、多発性小板状色素上皮症、ベーチェット病、バードショット網脈絡膜症、感染（梅毒、ライム病、結核、トキソプラズマ症)、ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎（扁平部炎）、前部ブドウ膜炎、多巣性脈絡膜炎、多発消失性白点症候群（MEWDS）、眼サルコイドーシス、後部強膜炎、匐行性脈絡膜炎、網膜下線維症、ブドウ膜炎症候群、フォークト-小柳-原田症候群；網膜動脈閉塞性疾患、網膜中心静脈閉塞症、播種性血管内凝固障害、網膜静脈分枝閉塞症、高血圧性眼底変化（hypertensive fundus changes）、眼部虚血症候群、網膜動脈毛細血管瘤、コーツ病、傍中心窩毛細血管拡張症、半網膜静脈閉塞症（hemi-retinal vein occlusion）、乳頭静脈炎（papillophlebitis）、網膜中心動脈閉塞症、網膜動脈分枝閉塞症、頸動脈疾患（CAD）、樹氷状血管炎（frosted branch angitis）、鎌状赤血球網膜症および他の異常ヘモグロビン症、網膜色素線条、家族性滲出性硝子体網膜症、イールズ病（Eales disease）、交感性眼炎、ブドウ膜性網膜疾患（uveitic retinal disease）、網膜剥離、外傷、レーザー、PDT、光凝固、手術中の血流低下、放射線網膜症、骨髄移植網膜症、増殖性硝子体網膜症および網膜上膜、増殖性糖尿病網膜症、眼ヒストプラスマ症、眼トキソカラ症、眼ヒストプラスマ症候群（OHS）、眼内炎、トキソプラズマ症、HIV感染に関連する網膜疾患、HIV感染に関連する脈絡膜疾患、HIV感染に関連するブドウ膜疾患、ウイルス性網膜炎、急性網膜壊死、進行性外側網膜壊死、真菌性網膜疾患、眼梅毒、眼結核、びまん性片側性亜急性神経網膜炎、ハエ幼虫症、網膜色素変性、網膜ジストロフィーに伴う全身性障害、先天性停止性夜盲、錐体ジストロフィー、スタルガルト病、黄色斑眼底、ベスト病、網膜色素上皮のパターンジストロフィー（pattern dystrophy）、X連鎖網膜分離、ソースビー眼底ジストロフィー、良性中心性黄斑変性（benign concentric maculopathy）、ビエッティ結晶性ジストロフィー（Bietti's crystalline dystrophy）、弾力線維性仮性黄色腫、網膜剥離、黄斑円孔、巨大網膜裂孔、腫瘍に関連する網膜疾患、RPEの先天性肥大、後部ブドウ膜黒色腫、脈絡膜血管腫、脈絡膜骨腫、脈絡膜転移、網膜および網膜色素上皮の混合性過誤腫、網膜芽細胞腫、眼底の血管増殖性腫瘍（vasoproliferative tumor）、網膜星状細胞腫、眼内リンパ系腫瘍、点状脈絡膜内層症、急性後部多発性小板状色素上皮症、近視性網膜変性症、網膜色素上皮ホメオスタシス異常、急性網膜色素上皮炎、緑内障、角膜ジストロフィーまたは異形成などからなるリストより選択される、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記被験体が網膜剥離に罹患している、請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
前記被験体が黄斑変性に罹患している、請求項26に記載の方法。
【請求項３０】
前記被験体が網膜RPE（網膜色素上皮）ホメオスタシス異常に罹患している、請求項26に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物が、被験体体内での細胞死を軽減させるために十分な量で投与される、請求項26に記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物が、被験体体内での光受容体生存率を高めるために十分な量で投与される、請求項26に記載の方法。
【請求項３３】
請求項9〜25のいずれか1項に記載の組成物を被験体に投与するステップを含む、光受容体細胞死を予防する方法。
【請求項３４】
光受容体細胞死がFas媒介性またはTRAIL媒介性の光受容体アポトーシスである、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
前記被験体が、光受容体細胞死のリスクを有する、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物が、被験体に、眼内投与、硝子体内投与、または眼周囲投与される、請求項33〜35のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本特許書類は、米国特許法第119条(e)の定めにより、参照により本明細書中に組み入れられる米国特許仮出願第62/155,711号（2015年5月1日出願）の出願日の利益を主張する。
本明細書中に引用されるすべての特許、特許出願および公報、ならびに他の参考文献は、その全体が参照により本明細書中に組み入れられる。これらの刊行物の開示は、その全体が、本明細書中に記載および請求される発明の日に当業者に公知である技術水準をさらに完全に説明するために、本出願中に参照により組み入れられる。
【０００２】
連邦により支援された研究開発
本発明は、米国国立衛生研究所（NIH）により与えられる助成金第R44EY022512号による政府の支援を用いてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
ペプチドを含む組成物、その医薬調製物、ならびにそれを用いる光受容体細胞死の予防方法およびFas媒介性またはTRAIL媒介性アポトーシスから、限定するものではないが、光受容体および網膜色素上皮をはじめとする網膜細胞を保護する方法が、本明細書中に提供される。
【背景技術】
【０００４】
Fas媒介性アポトーシス、TRAIL媒介性アポトーシス、TNF媒介性ネクロプトーシス、およびピロプトーシスなどの外因性経路媒介性細胞死から、細胞、特に限定するものではないが、光受容体、網膜色素上皮（RPE）、および光受容体からの視覚情報を受け取る網膜神経節細胞をはじめとする網膜細胞を保護するペプチド組成物、ならびに該組成物を用いる方法が記載される。
【０００５】
網膜剥離、緑内障および黄斑変性などの失明のいくつかの主要な原因は、その先に網膜での一部の非常に重要なタイプの細胞でのプログラムされた細胞死を引き起こすアポトーシスシグナル伝達の重要な構成要素を有する。これらの細胞タイプのうちの3種類が、網膜色素上皮細胞（その欠損は、網膜退色（retinal bleaching）、網膜色素変性および乾燥型の加齢黄斑変性で見られる）、網膜神経節細胞（その欠損は、緑内障で見られる）、および一次視覚シグナル伝達細胞である光受容体細胞それ自体（その欠損は、網膜疾患による失明の最大の原因である）である。
【０００６】
下部のRPEからの感覚神経網膜の分離として定義される網膜剥離（RD）は、光受容体細胞のアポトーシス型細胞死をもたらす（Cook et al. 1995; 36(6):990-996；Hisatomi et al. Curr Eye Res. 2002; 24(3):161-172；Zacks et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003; 44(3):1262-1267.；Yang et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004; 45(2):648-654；その全体が参照により本明細書中に組み入れられる）。RDのげっ歯類およびネコ科モデルは、網膜がRPEから分離した後ほとんどすぐに、プロアポトーシス経路の活性化を示した（Cook et al. 1995; 36(6):990-996；Hisatomi et al. Curr Eye Res. 2002; 24(3):161-172；Zacks et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003; 44(3):1262-1267；Yang et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004; 45(2):648-654；その全体が参照により本明細書中に組み入れられる）。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼニック末端標識（TUNEL）染色などのアポトーシスの組織学的マーカーは、RDから約3日後にピークに到達し、剥離の持続期間中、アポトーシス活性および進行性細胞死が継続する。このことはまた、ヒトの網膜剥離でも確認されている（Arroyo et al. Am J Ophthalmol. 2005 Apr;139(4):605-10）。しかしながら、網膜剥離の修復での臨床的経験では、一部の視力の保存を伴う修復の機会がある期間はあるが、剥離と修復との間の時間が広がれば、視力が著しく低下することが実証されている（Burton. Trans Am Ophthalmol Soc. 1982; 80:475-497；Ross et al. Ophthalmology. 1998; 105(11):2149-2153；Hassan et al. Ophthalmology. 2002; 109(1):146-152；その全体が参照により本明細書中に組み入れられる）。プロアポトーシス経路の迅速な活性化速度および比較的ゆっくりとした失明の速度は、内因性の神経保護因子が、神経網膜内で活性化している可能性があること、および網膜-RPE分離により活性化されるプロアポトーシス経路の作用を相殺するように機能し得ることを示唆する。
【０００７】
加齢黄斑変性（AMD）は、米国での永久的失明の主因である（Bourne et al. Br J Ophthalmol. 2014; 98:629-638；Klein et al. Arch Ophthalmol. 2011; 129:75-80；Cruciani et al. Clin Ter. 2011; 162:e35-42）。網膜外層（本明細書中では、網膜色素上皮（RPE）と光受容体（PR）細胞との複合物であると定義される）の死滅は、AMDでの失明の根本的な原因であり、現行の治療の有効性を制限している（Murakami et al. Prog Retin Eye Res. 2013; 37:114-140；Huckfeldt and Vavvas. Int Ophthalmol Clin. 2013; 53:105-117）。PR-RPEホメオスタシスの崩壊は、PRの細胞死をもたらす。Fasは、健常対照と比較して、ウェット型または萎縮型と定義される進行したAMDを有する人の眼で顕著に発現されており、血管新生性および萎縮性病変部の周囲に最も集中していた（Dunaief et al. Arch Ophthalmol. 2002; 120:1435-1442）。RPEは炎症性ストレスまたは酸化ストレスなどのAMDの進行中に生じるストレス条件下でのFas媒介性アポトーシスに対して感受性であり、年齢を適合させた健康な対応被験体と比較して、AMD患者でより高濃度の可溶性Fasリガンドが、見出された（Jiang et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008; 37:114-140）。同様に、AMDの進行中に生じる酸化ストレスは、RPEでのFas発現の増大をもたらし（Lin et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011; 52:6308-6314）、かつ酸化ストレス条件で生じるRPEの細胞死はFasシグナル伝達に依存する（Wang et al. Apoptosis. 2012; 17:1144-1155）。加えて、Fasは、Alu RNA蓄積（AMD病理の別の認識されている因子）により引き起こされるRPE細胞死と直接関連付けられている（Kim et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111:16082-16087）。同じ経路を介して部分的に作動するTRAIL-R1受容体（DR4）は、加齢黄斑変性に対する遺伝的リスク因子であることが示されている（Miyake et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 56, 5353 (2015)）。
【０００８】
Fasは、緑内障に関連する網膜神経節細胞死にも関与しているとされている（Gregory et al. PLoS One. 2011; 6(3):e17659）。さらに、眼圧（IOP）は緑内障進行における主要なリスク因子であり、IOPの動物モデルは、FasおよびFasL発現の増大（Ju et al. Brain Res. 2006; 1122(1): 209-221）およびアポトーシスによる網膜神経節細胞死を示す（Ji et al. Vision Res. 2005; 45(2): 169-179）。IOPの制御は緑内障の臨床的治療の主要な原則であるが、IOPの適正な制御後でさえも疾患が進行し続ける無視できない数の患者がおり、追加の研究は、緑内障に対するさらなる寄与因子に取り組む必要があり得るとの見解を強化してきた（Kamat et al. Semin Ophthalmol. 2016; 31(1-2):147-154）。
【０００９】
アポトーシス（プログラムされた細胞死）は、すべての多細胞生物の発生およびホメオスタシスで中心的役割を果たす。アポトーシス経路の変化は、発達障害、癌、自己免疫疾患、ならびに神経変性障害、および網膜劣化（retinal degradation）をはじめとする多数のタイプのヒト病理状態に関与しているとされてきた。アポトーシスは個別の細胞の細胞死プロセスを統制する厳格に調節された経路であり、外因的または内因的に開始されることができる。後者はミトコンドリアにより引き起こされる細胞内メカニズムであり、前者は細胞膜での「細胞死受容体」とその対応するリガンドとの相互作用を含む。つまり、プログラムされた細胞死の経路は、治療剤の開発における魅力的な標的になっている。特に、細胞を維持するよりも細胞を死滅させることの方が概念的には容易であるので、アポトーシス促進剤を用いる抗癌療法に注目が集められてきた。しかしながら、アポトーシス経路の不適切な活性化が組織の変性へとつながる多数の疾患があり、この特定の疾患病理で活性化されているアポトーシス経路を、内因性または外因性のいずれであっても遮断する治療が考案されなければならない。
【００１０】
Fas受容体は、網膜の変性疾患でのアポトーシスに関与する最も一般的な細胞死受容体である（Chinsky et al. Curr Opin Ophthalmol. 2014 25(3); 228-233）。Fasは、典型的なサイトカイン細胞表面受容体であり、その三量体同種リガンドであるFasLに結合する際に三量体化により活性化される。ストレスを受けた網膜細胞、例えば、RD後の光受容体では、Fas受容体がアップレギュレートされる。ストレス応答に引き付けられた侵入免疫細胞は、その表面に膜貫通型タンパク質であるFasリガンド（FasL）を発現する。FasLは、網膜細胞上のFas受容体と結合し、それがカスパーゼカスケードを介したシグナル伝達を含む外因性細胞死経路の迅速な活性化につながる。最初に、「開始因子」であるカスパーゼ-8が切断されて活性型となり、続いてそれがカスパーゼ3を活性化し、これはアポトーシス型細胞死経路の下流「実行因子」（executioner）である。しかしながら、マウスサイトメガロウイルスに感染したマウスの眼では、Fas、ならびに関連する細胞死受容体であるTNFR1およびTRAILが活性化することが示され、この活性は、眼の細胞でのアポトーシス、ネクロプトーシス、およびピロプトーシスにつながり得る（Chien and Dix J Virol 86, 10961 (2012)）。
【００１１】
培養中の光受容体細胞は、FasLにより誘導されるアポトーシスに対して非常に感受性であることが示されており、このことは、FasL誘導型のアポトーシスが網膜疾患での失明に対する主要な寄与因子であることを示唆する（Burton. Trans Am Ophthalmol Soc. 1982; 80:475-497；Ross et al. Ophthalmology. 1998; 105(11):2149-2153；Hassan et al. Ophthalmology. 2002; 109(1):146-152.）。さらに、癌タンパク質MetのFas結合性細胞外ドメイン由来のFas受容体の短いペプチド阻害剤であるMet-12（H60HIYLGAVNYIY71（配列番号2））（Zou et al. Nature Medicine 13, 1078 (2007)）は、細胞培養実験、ならびに網膜と網膜色素上皮との分離および他の眼症状または疾患の設定の両方で、光受容体に対して保護性であることが示されている（Besirli et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 51(4):2177-84 (2010)；米国特許第8,343,931号；その全体が参照により本明細書中に組み入れられる）。さらに、恐らくはMet-12、FasL、TNAαおよびTRAILに対する相同性を有する同じ結合性ドメインを用いるc-Metが、種々の腫瘍でのTRAIL誘導型アポトーシスを遮断することが示されている（Du et al.  PLoS One 9, e95490 (2014)）。
【００１２】
Met-12ペプチドそれ自体は、その極端に低い水溶性によって支配される、生物薬剤特性を有する。最適な活性を示すためには、in vitroおよびin vivoの両方で、Met-12は溶液として投与される必要があることが実験により明らかに示され、主に水性の媒体中でのそのような溶液の作製は、硝子体内注入に対して許容される条件下では特に、非常に困難であることが証明されている。Met-12の懸濁液剤またはゲル剤の投与は、効力の大幅な低下をもたらす。例えば、20mMクエン酸バッファー（pH2.8）中の見た目は透明なMet-12の10mg/mL溶液でさえ、ろ過すれば無視できない量の物質の損失が示され、下記のin vitroおよびin vivoアッセイの両方で用いられる場合、活性の少なくとも5分の1の減少がもたらされた。徹底的な開発活動にもかかわらず、見出されたMet-12の溶液製剤は、一部の非常に低いpHの溶液注入剤（pH2.8以下）または混じりけのない（neat）DMSO注入剤のみを含み、これらのすべてが、硝子体内注入に対して適切ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第8,343,931号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Cook et al. 1995; 36(6):990-996
【非特許文献２】Hisatomi et al. Curr Eye Res. 2002; 24(3):161-172
【非特許文献３】Zacks et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003; 44(3):1262-1267.
【非特許文献４】Yang et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004; 45(2):648-654
【非特許文献５】Arroyo et al. Am J Ophthalmol. 2005 Apr;139(4):605-10
【非特許文献６】Burton. Trans Am Ophthalmol Soc. 1982; 80:475-497
【非特許文献７】Ross et al. Ophthalmology. 1998; 105(11):2149-2153
【非特許文献８】Hassan et al. Ophthalmology. 2002; 109(1):146-152
【非特許文献９】Bourne et al. Br J Ophthalmol. 2014; 98:629-638
【非特許文献１０】Klein et al. Arch Ophthalmol. 2011; 129:75-80
【非特許文献１１】Cruciani et al. Clin Ter. 2011; 162:e35-42
【非特許文献１２】Murakami et al. Prog Retin Eye Res. 2013; 37:114-140
【非特許文献１３】Huckfeldt and Vavvas. Int Ophthalmol Clin. 2013; 53:105-117
【非特許文献１４】Dunaief et al. Arch Ophthalmol. 2002; 120:1435-1442
【非特許文献１５】Jiang et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008; 37:114-140
【非特許文献１６】Lin et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011; 52:6308-6314
【非特許文献１７】Wang et al. Apoptosis. 2012; 17:1144-1155
【非特許文献１８】Kim et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111:16082-16087
【非特許文献１９】Miyake et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 56, 5353 (2015)
【非特許文献２０】Gregory et al. PLoS One. 2011; 6(3):e17659
【非特許文献２１】Ju et al. Brain Res. 2006; 1122(1): 209-221
【非特許文献２２】Ji et al. Vision Res. 2005; 45(2): 169-179
【非特許文献２３】Kamat et al. Semin Ophthalmol. 2016; 31(1-2):147-154
【非特許文献２４】Chinsky et al. Curr Opin Ophthalmol. 2014 25(3); 228-233
【非特許文献２５】Chien and Dix J Virol 86, 10961 (2012)
【非特許文献２６】Burton. Trans Am Ophthalmol Soc. 1982; 80:475-497
【非特許文献２７】Zou et al. Nature Medicine 13, 1078 (2007)
【非特許文献２８】Besirli et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 51(4):2177-84 (2010)
【非特許文献２９】Du et al.  PLoS One 9, e95490 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、眼に対する（またはそれ以外の）毒性を引き起こす可能性がある賦形剤を用いることなく、十分な曝露を生じる様式で眼に送達することができる溶液剤または懸濁液剤へと製剤化することが容易であり、かつ使用し易い、Fas媒介性およびTRAIL媒介性アポトーシスをはじめとする外因性経路細胞死から、限定するものではないが、光受容体、網膜神経節細胞および網膜色素上皮をはじめとする網膜細胞を保護するペプチド組成物が、視力の維持を助けるためにいまだ必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
光受容体保護性ペプチドの生物学的に活性な水性製剤の医薬調製物、その医薬調製物、およびそれを用いて光受容体細胞死を予防する方法ならびに治療方法が、本明細書中に提供される。
【００１７】
【化１】
2018514590.tif 000003
【００１８】
一部の実施形態は、C末端アミドペプチドである化合物1（上記）または製薬上許容されるその塩に関する。特定の他の実施形態は、化合物1のポリアセテート塩に関する。特定のさらなる実施形態は、化合物1の三酢酸塩に関する。化合物は、眼の光受容体でのFas媒介性またはTRAIL媒介性アポトーシスを予防するための医薬製剤での使用のためのものであり得る。化合物は、眼の網膜色素上皮の細胞でのFas媒介性アポトーシスを予防するための医薬製剤での使用のためのものであり得る。化合物は、網膜剥離の治療用の医薬製剤での使用のためのものであり得る。化合物は、緑内障などの網膜神経節細胞の疾患の治療用の医薬製剤での使用のためのものであり得る。特定の他の実施形態では、化合物は、以下のものをはじめとする眼疾患または症状の治療用の医薬製剤での使用のためのものであり得る：黄斑症/網膜変性（加齢黄斑変性（AMD）をはじめとする黄斑変性など（非滲出型加齢黄斑変性および滲出型加齢黄斑変性など））；脈絡膜血管新生；網膜症（糖尿病性網膜症、急性および慢性黄斑性視神経網膜症（acute and chronic macular neuroretinopathy）、中心性漿液性脈絡網膜症など）；ならびに黄斑浮腫（類嚢胞黄斑浮腫、および糖尿病性黄斑浮腫など）；ブドウ膜炎/網膜炎/脈絡膜炎（急性多発性小板状色素上皮症など）、ベーチェット病、バードショット網脈絡膜症、感染（梅毒、ライム病、結核、トキソプラズマ症)、ブドウ膜炎（中間部ブドウ膜炎（扁平部炎）および前部ブドウ膜炎など）、多巣性脈絡膜炎、多発消失性白点症候群（MEWDS）、眼サルコイドーシス、後部強膜炎、匐行性脈絡膜炎、網膜下線維症、ブドウ膜炎症候群、およびフォークト-小柳-原田症候群；血管疾患/滲出性疾患（網膜動脈閉塞性疾患、網膜中心静脈閉塞症、播種性血管内凝固障害、網膜静脈分枝閉塞症、高血圧性眼底変化（hypertensive fundus changes）、眼部虚血症候群、網膜動脈毛細血管瘤、コーツ病、傍中心窩毛細血管拡張症、半網膜静脈閉塞症（hemi-retinal vein occlusion）、乳頭静脈炎（papillophlebitis）、網膜中心動脈閉塞症、網膜動脈分枝閉塞症、頸動脈疾患（CAD）、樹氷状血管炎（frosted branch angitis）、鎌状赤血球網膜症および他の異常ヘモグロビン症、網膜色素線条、家族性滲出性硝子体網膜症、イールズ病（Eales disease）など）、外傷性疾患/外科疾患：交感性眼炎、ブドウ膜性網膜疾患（uveitic retinal disease）、網膜剥離、外傷、レーザー、PDT、光凝固、手術中の血流低下、放射線網膜症、骨髄移植網膜症；増殖性障害（増殖性硝子体網膜症および網膜上膜、増殖性糖尿病網膜症など）。感染性障害：眼ヒストプラスマ症、眼トキソカラ症、眼ヒストプラスマ症候群（OHS）、眼内炎、トキソプラズマ症、HIV感染に関連する網膜疾患、HIV感染に関連する脈絡膜疾患、HIV感染に関連するブドウ膜疾患、ウイルス性網膜炎、急性網膜壊死、進行性外側網膜壊死、真菌性網膜疾患、眼梅毒、眼結核、びまん性片側性亜急性神経網膜炎、およびハエ幼虫症；遺伝性障害（網膜色素変性、網膜ジストロフィーに伴う全身性障害、先天性停止性夜盲、錐体ジストロフィー、スタルガルト病および黄色斑眼底、ベスト病、網膜色素上皮のパターンジストロフィー（pattern dystrophy）、X連鎖網膜分離、ソースビー眼底ジストロフィー、良性中心性黄斑変性（benign concentric maculopathy���、ビエッティ結晶性ジストロフィー（Bietti's crystalline dystrophy）、弾力線維性仮性黄色腫など）。網膜裂孔/円孔：網膜剥離、黄斑円孔、巨大網膜裂孔；腫瘍（腫瘍に関連する網膜疾患、RPEの先天性肥大、後部ブドウ膜黒色腫、脈絡膜血管腫、脈絡膜骨腫、脈絡膜転移、網膜および網膜色素上皮の混合性過誤腫、網膜芽細胞腫、眼底の血管増殖性腫瘍（vasoproliferative tumor）、網膜星状細胞腫、眼内リンパ系腫瘍など）；ならびに他の疾患および症状（点状脈絡膜内層症、急性後部多発性小板状色素上皮症、近視性網膜変性症、急性網膜色素上皮炎、角膜ジストロフィーまたは異形成など）。
【００１９】
さらなる実施形態は、眼への送達のためにつくられた化合物1または製薬上許容されるその塩（例えば、ポリアセテート塩および三酢酸塩）および製薬用担体を含む組成物に関する。組成物は、眼内投与、硝子体内投与、または眼周囲投与用に製剤化することができる。組成物中の化合物1、または製薬上許容されるその塩は、剥離した網膜光受容体細胞を保護する。組成物中の化合物1、または製薬上許容されるその塩は、眼の網膜色素上皮の細胞でのアポトーシスをはじめとする外因性経路細胞死を予防する。組成物中の化合物1、または製薬上許容されるその塩は、緑内障などの網膜神経節細胞の疾患を予防する。組成物は、無菌であり、パイロジェン不含であり、かつ眼に対して無毒である、組成物は、少なくとも1種の非イオン性界面活性剤をさらに含むことができる。少なくとも1種の非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート80、ポリソルベート20、ポロキサマー、またはチロキサポールであり得るが、これらの例に限定されない。少なくとも1種の非イオン性界面活性剤は、組成物の約0.01％〜20％(w/w)；あるいは、組成物の約0.05％〜10％(w/w)；あるいは、組成物の約0.1％〜3％(w/w)を形成することができる。あるいは、非イオン性界面活性剤の混合物を用いることができ、このとき、上記に挙げたもののうちの少なくとも2種、または他の非イオン性界面活性剤が、製剤の所望の薬物動態を最適化する比率で一緒に用いられ、界面活性剤の総量は、上述の限界の範囲内に入る。組成物は、プロピレングリコールまたはジメチルスルホキシドなどの有機共溶媒をさらに含むことができる。有機共溶媒は、組成物の約1％〜50％(w/w)；あるいは、組成物の約1％〜20％(w/w)；あるいは、組成物の約1％〜5％(w/w)を形成することができる。等張化剤（トレハロースまたはマンニトールまたはソルビトールなど）、または可溶性無機塩（NaClなど）もまた、溶液の張性を250〜400mOsm/Lの範囲にするために加えることができる。組成物は、2.5〜6.0の範囲のpHを有し、かつ当業者に公知の手段により緩衝化することができる。
【００２０】
別の実施形態は、眼の症状、疾患、または眼の健康に影響を及ぼす症状もしくは疾患に罹患している被験体へと、光学送達のためにつくられた、化合物1、または製薬上許容されるその塩、および製薬用担体を含む組成物を投与するステップを含む、眼の症状、疾患、または眼の健康に影響を及ぼす症状もしくは疾患を治療する方法に関する。眼の症状、疾患、または眼の健康に影響を及ぼす症状もしくは疾患は、網膜剥離、黄斑変性、加齢黄斑変性、非滲出型加齢黄斑変性、滲出型加齢黄斑変性、脈絡膜血管新生、網膜症、糖尿病性網膜症、急性および慢性黄斑性視神経網膜症（acute and chronic macular neuroretinopathy）、中心性漿液性脈絡網膜症、黄斑浮腫、類嚢胞黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、ブドウ膜炎/網膜炎/脈絡膜炎、多発性小板状色素上皮症、ベーチェット病、バードショット網脈絡膜症、感染（梅毒、ライム病、結核、トキソプラズマ症)、ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎（扁平部炎）、前部ブドウ膜炎、多巣性脈絡膜炎、多発消失性白点症候群（MEWDS）、眼サルコイドーシス、後部強膜炎、匐行性脈絡膜炎、網膜下線維症、ブドウ膜炎症候群、フォークト-小柳-原田症候群；網膜動脈閉塞性疾患、網膜中心静脈閉塞症、播種性血管内凝固障害、網膜静脈分枝閉塞症、高血圧性眼底変化（hypertensive fundus changes）、眼部虚血症候群、網膜動脈毛細血管瘤、コーツ病、傍中心窩毛細血管拡張症、半網膜静脈閉塞症（hemi-retinal vein occlusion）、乳頭静脈炎（papillophlebitis）、網膜中心動脈閉塞症、網膜動脈分枝閉塞症、頸動脈疾患（CAD）、樹氷状血管炎（frosted branch angitis）、鎌状赤血球網膜症および他の異常ヘモグロビン症、網膜色素線条、家族性滲出性硝子体網膜症、イールズ病（Eales disease）、交感性眼炎、ブドウ膜性網膜疾患（uveitic retinal disease）、網膜剥離、外傷、レーザー、PDT、光凝固、手術中の血流低下、放射線網膜症、骨髄移植網膜症、増殖性硝子体網膜症および網膜上膜、増殖性糖尿病網膜症、眼ヒストプラスマ症、眼トキソカラ症、眼ヒストプラスマ症候群（OHS）、眼内炎、トキソプラズマ症、HIV感染に関連する網膜疾患、HIV感染に関連する脈絡膜疾患、HIV感染に関連するブドウ膜疾患、ウイルス性網膜炎、急性網膜壊死、進行性外側網膜壊死、真菌性網膜疾患、眼梅毒、眼結核、びまん性片側性亜急性神経網膜炎、ハエ幼虫症、網膜色素変性、網膜ジストロフィーに伴う全身性障害、先天性停止性夜盲、錐体ジストロフィー、スタルガルト病、黄色斑眼底、ベスト病、網膜色素上皮のパターンジストロフィー（pattern dystrophy）、X連鎖網膜分離、ソースビー眼底ジストロフィー、良性中心性黄斑変性（benign concentric maculopathy）、ビエッティ結晶性ジストロフィー（Bietti's crystalline dystrophy）、弾力線維性仮性黄色腫、網膜剥離、黄斑円孔、巨大網膜裂孔、腫瘍に関連する網膜疾患、RPEの先天性肥大、後部ブドウ膜黒色腫、脈絡膜血管腫、脈絡膜骨腫、脈絡膜転移、網膜および網膜色素上皮の混合性過誤腫、網膜芽細胞腫、眼底の血管増殖性腫瘍（vasoproliferative tumor）、網膜星状細胞腫、眼内リンパ系腫瘍、点状脈絡膜内層症、急性後部多発性小板状色素上皮症、近視性網膜変性症、網膜色素上皮ホメオスタシス異常、急性網膜色素上皮炎、緑内障、角膜ジストロフィーまたは異形成などであり得る。組成物は、被験体での細胞���を軽減するために十分な量で投与することができる。組成物は、被験体での光受容体生存率を高めるために十分な量で投与される。組成物は、被験体での網膜色素上皮細胞を保護するために十分な量で投与される。組成物は、被験体での網膜神経節細胞を保護するために十分な量で投与される。
【００２１】
別の実施形態は、化合物1、または製薬上許容されるその塩、および無菌のパイロジェン不含製薬用担体を含む組成物を被験体に投与するステップを含む、光受容体、RPEまたは網膜神経節細胞死を予防する方法に関する。光受容体、RPEまたは網膜神経節細胞死は、Fas媒介性の光受容体またはRPE細胞アポトーシスである。被験体は、光受容体、RPEまたは網膜神経節細胞死のリスクを有し得る。組成物は、被験体に対して、眼内投与、硝子体内投与、または眼周囲投与することができる。
【００２２】
また別の実施形態は、化合物1、または製薬上許容されるその塩を含む、光受容体、RPEまたは網膜神経節保護組成物を投与するステップを含む、光受容体、RPEまたは網膜神経節細胞生存率を上昇させる方法に関する。光受容体、RPEまたは網膜神経節細胞生存率の上昇は、光受容体、RPEまたは網膜神経節細胞アポトーシスを阻害することを含む。光受容体、RPEまたは網膜神経節細胞死は、Fas媒介性の光受容体、RPEまたは網膜神経節細胞アポトーシスを含む。光受容体、RPEまたは網膜神経節細胞死は、TRAIL媒介性の光受容体、RPEまたは網膜神経節細胞アポトーシスを含む。光受容体、RPEまたは網膜神経節細胞死は、TNFR媒介性の光受容体、RPEまたは網膜神経節細胞ネクロプトーシスを含む。光受容体、RPEまたは網膜神経節細胞死は、外因性経路媒介性の光受容体、RPEまたは網膜神経節細胞ピロプトーシスを含む。組成物は、静脈内注入、皮下注入もしくは筋内注入を介して全身的に、または経口的に、あるいは局部的に、すなわち、眼内投与、硝子体内投与、局所投与、脈絡膜上腔投与、結膜下投与、網膜下投与または眼周囲投与を介して、被験体に投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】661W細胞でのMet-12および化合物1三塩酸塩によるFas誘導型カスパーゼ8活性化の遮断を示すグラフである。661W細胞は、いずれも20mg/mLでDMSO中に溶解された様々な量のMet-12または化合物1を用いて1時間にわたって前処理された。続いて、FasL（500ng/mL）を加え、カスパーゼ8活性を、FasLを用いた処理の48時間後に測定した。
【図２】661W細胞でのMet-12および化合物1三塩酸塩によるFas誘導型カスパーゼ8活性化の遮断を示すグラフである。661W細胞は、様々な量の、DMSO中のMet-12（丸）、DMSO中の化合物1（20mg/mL、菱形）および2％ポリソルベート（PS）20、2％プロピレングリコール（PG）pH4製剤中の化合物1（三角）（すべての製剤が10mg/mL濃度）を用いて1時間にわたって前処理された。続いて、FasL（500ng/mL）を用いて細胞を処理し、カスパーゼ8活性を、FasLを用いた処理の48時間後に測定した。
【図３】661W細胞での化合物1三塩酸塩によるFas誘導型カスパーゼ8活性化の遮断を示すグラフである。661W細胞は、様々な量の、DMSO中の化合物1（20mg/mL）（丸）、3％ポリソルベート20、3％プロピレングリコールpH4製剤中の化合物1（三角）、および1％ポリソルベート20、3％プロピレングリコールpH4製剤中の化合物1（菱形）（すべての製剤が10mg/mL濃度）を用いて1時間にわたって前処理された。続いて、FasL（500ng/mL）を用いて細胞を処理し、カスパーゼ8活性を、FasLを用いた処理の48時間後に測定した。
【図４】661W細胞での化合物1三塩酸塩によるFas誘導型カスパーゼ8活性化の遮断を示すグラフである。661W細胞は、様々な量の、DMSO中の化合物1三塩酸塩（20mg/mL）（丸）、および0.4％ポリソルベート-20、4.5％マンニトール、10mM酢酸、pH4製剤中の化合物1三塩酸塩（三角）（2mg/mL濃度）を用いて前処理された。続いて、FasL（500ng/mL）を用いて細胞を処理し、カスパーゼ8活性を、FasLを用いた処理の48時間後に測定した。
【図５】図5aは、3種類のポロキサマー製剤として硝子体内送達された化合物1のウサギ網膜濃度の対数グラフを示す。図5bは、ポロキサマー407ベースの製剤をポリソルベート-20ベースの製剤と比較するために、硝子体内送達された化合物1のウサギ網膜濃度を時間に対して示す対数グラフである。
【図６】図6aは、種々の濃度の界面活性剤（0.4％または0.1％）および種々の濃度の化合物1（2mg/mLまたは0.5mg/mL）を含む3種類のポロキサマー製剤として硝子体内送達された化合物1のウサギ硝子体液（VH）濃度を時間に対して示す線形グラフである。図6bは、異なる界面活性剤の選択肢（0.4％ポロキサマー407または0.4％ポリソルベート20）および種々の量の化合物1（2mg/mLまたは1mg/mL）を用いた場合の、ウサギVH濃度を時間に対して示す線形グラフである。
【図７】4.5％マンニトール、10mM酢酸、0.4％ポロキサマー（PX）407、pH4.5中の化合物1三酢酸塩（0.06mg/mLを5μL）の300ngの名目量での注入から24時間および72時間後の、ブラウンノルウェー種ラットの硝子体液中での化合物1三酢酸塩の総量（濃色）および網膜中の濃度（淡色）を示す図である。
【図８】Met-12三塩酸塩（淡色縞模様）（5μL DMSO中、5μg）、および化合物1三塩酸塩（濃色）（5μL DMSO中、0.5、1.0、5および10μg）、またはDMSOビヒクル（淡色）を用いたラットでの剥離した網膜のin vivo処理から72時間後のアポトーシス細胞数を示す棒グラフである。LHSバーは、注入なしでの未剥離対照網膜である。
【図９】化合物1三塩酸塩（5μLのF1またはF2中の1.0および5μg）を用いたラットでの剥離した網膜のin vivo処理から72時間後のアポトーシス細胞数を、DMSO中の同じ化合物（5μL中、5μg）またはDMSOビヒクル（灰色）と比較して示す棒グラフである。LHSバーは、注入なしでの未剥離対照網膜である。F1（5/1μg）は、3％PG/3％PS-20、pH4.0中の1.0/0.2mg/mL化合物1三塩酸塩（黒色）であり、F2（5/1μg）は、2％PG/2％PX-407、pH4.0中の1.0/0.2mg/mL化合物1三塩酸塩（縦縞）である。
【図１０】ラットでの剥離した網膜のin vivo処理から72時間後のアポトーシス細胞の割合（％）を示す棒グラフである。バー1は剥離した網膜でのビヒクル対照である。バー2は、0.2mg/mL DMSO溶液としての1μgの化合物1三酢酸塩である。バー3は、0.2mg/mL DMSO溶液としての1μgの化合物1三塩酸塩である。バー4は注入なしでの未剥離対照網膜である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書中に引用されるすべての特許、特許出願および公報、ならびに他の参考文献は、その全体が参照により本明細書中に組み入れられる。これらの刊行物の開示は、その全体が、本明細書中に記載および請求される発明の日に当業者に公知である技術水準をさらに完全に説明するために、本出願中に参照により組み入れられる。
生物学的に活性なペプチド組成物、生物学的に活性なペプチド組成物の医薬調製物、およびペプチド組成物を用いる方法が記載される。
【００２５】
「治療的有効量」との用語は、特定の被験体クラス（例えば、幼児、小児、若年者、成人）での所望の治療的効果を高めるために有効な薬物または薬剤（例えば、化合物1）の量を意味する。本明細書中で用いる場合、用語「治療的未満」（subtherapeutic）とは、平均的かつ/または典型的被験体（例えば、平均的な体格、禁忌薬を摂取していない、用量に対して集団の大部分と類似の反応を有する、等）に対する投与に際して、所望かつ/または予期された治療結果/転帰を達成するために不十分である、医薬または薬剤の量を意味する。米国食品医薬品局（FDA）推奨投与量は、治療的用量を示すものである。
【００２６】
本明細書中で用いる場合、「医薬」（pharmaceutical drug）または「薬剤」（pharmaceutical agent）との用語は、所望の生物学的応答を引き起こすために被験体に投与される（例えば、医薬組成物の文脈内で）、化合物、ペプチド、高分子、その他の物質を意味する。薬剤は、局所的および/または全身的に、ヒトまたは他の哺乳動物で生物学的に活性である「薬物」またはいずれかの他の物質（例えば、ペプチド、ポリペプチド）であり得る。薬物の例は、Merck IndexおよびPhysicians Desk Referenceに開示され、その全体の開示は、すべての目的のために本明細書中に参照により組み入れられる。
【００２７】
本明細書中で用いる場合、「医薬製剤」との用語は、医薬を、被験体に対する投与に際して所望の効果を達成するために好適にすることを補助する1種以上の追加の構成要素と組み合わされた、少なくとも1種の医薬（例えば、化合物1）を意味する。医薬製剤は、1種以上の添加剤、例えば、製薬上許容される賦形剤、担体、浸透促進剤、コーティング剤、安定化剤、緩衝剤、酸、塩基、または投与剤型の投与、放出（例えば、放出のタイミング）、送達性、バイオアベイラビリティ、有効性等を強化するために医薬と物理的に関連付けられる他の物質を含むことができる。製剤は、例えば、液剤、懸濁液剤、固形剤、ナノ粒子剤、エマルジョン剤、ミセル剤、軟膏剤、ゲル剤、エマルジョン剤、コーティング剤等であり得る。医薬製剤は、単一の医薬（例えば、化合物1）または複数の医薬を含有し得る。医薬組成物は、単一の医薬製剤または複数の医薬製剤を含有することができる。一部の実施形態では、医薬（例えば、化合物1）は、特定の投与様式（例えば、眼への投与（例えば、硝子体内投与等）等）のために製剤化される。医薬製剤は、無菌、パイロジェン不含、かつ眼に対して無毒である。
【００２８】
本明細書中で用いる場合、用語「医薬組成物」とは、組成物を、in vitro、in vivoもしくはex vivoでの診断的または治療的用途に対して特に好適にする、不活性または活性な1種以上の担体との1種以上の医薬の組み合わせを意味する。医薬組成物は、被験体に投与される物理的実体を含み、錠剤、カプセル剤、経口崩壊錠剤、丸剤、散剤、坐剤、溶液剤、エリキシル剤、シロップ剤、懸濁液剤、クリーム剤、ロゼンジ剤、パスタ剤、スプレー剤などの固体、半固体または液体投与剤型の形態を採ることができる。医薬組成物は、単一の医薬製剤（例えば、徐放性、即時放出性、遅延放出性、ナノ粒子状等）または複数製剤（例えば、即時放出性および遅延放出性、ナノ粒子状および非ナノ粒子状等）を含むことができる。用語「医薬組成物」および「医薬製剤」は、相互に交換可能に用いることができる。
【００２９】
本明細書中で用いる場合、「製薬上許容される担体」との用語は、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、エマルジョン（例えば、油/水エマルジョンまたは水/油エマルジョンなど）、および種々のタイプの湿潤化剤などの標準的な製薬用担体のうちのいずれかを意味する。組成物はまた、安定化剤および保存剤も含むことができる。担体、安定化剤および助剤の例に関しては、例えば、Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, Pa. [1975]（その全体が参照により本明細書中に組み入れられる）を参照されたい。
【００３０】
本明細書中で用いる場合、「製薬上許容される塩」との用語は、医薬品の酸もしくは塩基またはその活性な代謝生成物もしくは残留物を意味する。当業者には公知である通り、本発明の化合物の「塩」は、無機または有機酸および塩基から誘導することができる。酸の例としては限定するものではないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン-p-スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられる。それ自体は製薬上許容されるものではないシュウ酸などの他の酸を、本発明の化合物およびそれらの製薬上許容される酸付加塩を得る過程で中間体として有用な塩の調製に用いることができる。
【００３１】
本明細書中で用いる場合、「投与」との用語は、被験体（例えば、被験体、またはin vivo、in vitro、もしくはex vivoの細胞、組織、および器官）へと、薬物、プロドラッグ、もしくは他の薬剤、または治療的処置（例えば、本発明の組成物）を与える動作を意味する。ヒト身体への例示的投与経路は、眼（眼科的）、口（経口）、皮膚（経皮）、鼻（経鼻）、肺（吸入）、口腔粘膜（頬内）、耳、直腸を介するもの、注入によるもの（例えば、静脈内、皮下、腫瘍内、腹腔内等）などであり得る。
【００３２】
本明細書中で用いる場合、「共投与」との用語は、少なくとも2種の薬剤（例えば、化合物1および1種以上の追加の治療剤）または療法の被験体への投与を意味する。一部の実施形態では、2種以上の薬剤/療法の共投与は同時である。他の実施形態では、2種以上の薬剤/療法の共投与は順次的である（例えば、第1の薬剤/療法が第2の薬剤/療法に先立って投与される）。一部の実施形態では、2種以上の療法が同時に投与されるが、順次的に放出される（例えば、吸収される、生体利用可能になるなど）。用いられる種々の薬剤/療法の製剤化および/または投与経路は変わり得ることを、当業者は理解する。共投与のための適切な投与量は、当業者が容易に決定することができる。一部の実施形態では、薬剤/療法が共投与される場合、それぞれの薬剤/療法は、それらの単独での投与に対して適切な投与量よりも低い投与量で投与される。
【００３３】
光受容体保護性ペプチドの生物学的に活性な水性製剤の医薬調製物、その医薬調製物、およびそれを用いた光受容体細胞死を予防する方法ならびに治療方法が、本明細書中に提供される。
【００３４】
【化２】
2018514590.tif 000004
【００３５】
一部の実施形態は、C末端アミドペプチド、化合物1（上記）、または製薬上許容されるその塩に関する。特定の実施形態は、化合物1のポリアセテート塩に関する。特定のさらなる実施形態は、化合物1の三酢酸塩に関する。
【００３６】
化合物は、眼の光受容体でのFas媒介性またはTRAIL媒介性アポトーシスを予防するための医薬製剤での使用のためのものであり得る。661W細胞での光受容体毒性のFasL誘導型モデルでは、化合物1は、IC50ではMet-12よりもカスパーゼ8活性化の予防に関して10倍強力であり、最大阻害での用量効力によって測定するとMet-12よりも約3倍強力である。網膜剥離のin vivoラットモデルでは、化合物1はアポトーシスからの光受容体細胞の保護に関してMet-12よりも少なくとも10倍強力であり、Met-12とは異なり、臨床的に許容される製剤中で効率的に送達することができる。
【００３７】
実施例で実証される通り、化合物1によるFas阻害は、in vivoでの光受容体細胞の顕著な維持をもたらした。661W細胞では、化合物1処理は、カスパーゼ8活性化の強い阻害を生じた。従って、眼の症状、疾患、または眼の健康に影響を及ぼす症状もしくは疾患を有する被験体に対する化合物1の投与が、Fas媒介性アポトーシスからの、限定するものではないが光受容体、網膜色素上皮細胞および網膜神経節細胞をはじめとする網膜細胞の保護の改善をもたらし、このことが、眼の症状、疾患、または眼の健康に影響を及ぼす症状もしくは疾患の改善および/または治療をもたらし得ると考えられる。
【００３８】
臨床的実務では、患者は一般的に、既に起こっている剥離を有している。網膜-RPE分離の動物モデルは、Fas経路活性化が早期に起こり、剥離の期間中に上昇したままであることを示す（Zacks et al. Arch Ophthalmol 2007；125:1389-1395、Zacks et al. IOVS 2004；45(12):4563-4569.8.）。網膜とRPEとの分離はまた、広範囲の網膜疾患でも見られる。網膜細胞生存での抗Fas療法の臨床的重要性は、網膜剥離に限られないことが予期される。例えば、Fas媒介性アポトーシスは、加齢黄斑変性（AMD）での光受容体細胞死に関与し得る（Dunaief et al. Arch Ophthalmol. 2002；120(11):1435-1442；Zacks et al. Arch Ophthalmol 2007；Petrukhin K. New therapeutic targets in atrophic age-related macular degeneration. Expert Opin Ther Targets. 2007. 11:625-639；Miller JW. Treatment of age-related macular degeneration：beyond VEGF. Jpn J Ophthalmol. 2010. 54:523-528；Rogala J, Zangerl B, Assaad N, Fletcher EL, Kalloniatis M, Nivison-Smith L. In Vivo Quantification of Retinal Changes Associated with Drusen in Age-Related Macular Degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015. 56:1689-1700、その全体が参照により本明細書中に組み入れられる）。加齢黄斑変性は、RPEの進行性変性を特徴とし、外側網膜変性および網膜剥離後に生じるものと類似した再編成を引き起こす（Jager et al. N Engl J Med. 2008；358:2606-17、Johnson et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003；44:4481-488、その全体が参照により本明細書中に組み入れられる）。血管新生型AMDでは、網膜下の体液の滲出もあり、これがこの組織を下層のRPEから実際に分離させる（Jager et al. N Engl J Med. 2008；358:2606-17、その全体が参照により本明細書中に組み入れられる）。血管新生型AMDは、長期間の網膜-RPE分離およびFas経路活性化を生じさせ得る。抗Fas処置は、根本的な障害が治療されている間に、網膜細胞（光受容体および網膜色素上皮など）を保護する目的での補助的処置として最も用いられ易いであろう（Brown et al. N Engl J Med. 2006 Oct. 5；355(14):1432-44、その全体が参照により本明細書中に組み入れられる）。
【００３９】
緑内障は、網膜神経節細胞（RGC）の細胞死を特徴とする進行性の眼の変性状態であり、以前に公表されている研究では、RGCはアポトーシスにより細胞死することが実証されている（Ji et al. Vision Res. 2005；45(2)：169-179）。眼圧（IOP）は緑内障発症に対する主要なリスク因子であり、実質的な努力は、RGCアポトーシスを防止するために、プロスタグランジンアナログを用いてIOPを低下させることに注がれている（Doucette and Walter. Ophthalmic Genet. 2016；12:1-9）。Fasもまた、RGCの細胞死に関与すると考えられており（Gregory et al. PLoS One. 2011；6(3):e17659）、IOPの動物モデルは、FasおよびFasL発現の上昇を示し（Ju et al. Brain Res. 2006；1122(1)：209-221）、このことは、RGC生存性を保護し、かつ緑内障の変性的性質を軽減するための手段としてのFas阻害の潜在的な有用性を示唆する。
【００４０】
一部の実施形態では、記載されるポリペプチドは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、特許請求される化合物1は、標準的な固相ポリペプチド合成技術（例えば、Fmoc）を用いて合成することができる。あるいは、ポリペプチドは、組み換えDNA技術を用いて合成することができ（例えば、細菌または真核生物発現系を用いて）、組み換えDNA技術では、C末端アミド化を行なうために、ペプチドと適切なアミダーゼ酵素の両方を過剰発現させる。
【００４１】
具体的には、実施例1に記載される通り、化合物1は、Met-12ペプチド配列であるH60HIYLGATNYIY71（配列番号2）を、当業者に公知である通りにアミノ樹脂上に構築し、脱保護および樹脂切断後に、そのC末端アミドであるH60HIYLGATNYIY71-NH2（化合物1；配列番号1）を生じさせることにより、取得することができる。具体的には、化合物1は、概念的には、残基59と残基60との間の正常なアミド加水分解、および残基71のカルボニル炭素ではなく残基72のペプチド窒素とα炭素との間でのペプチド鎖の不自然な破壊により、c-Met配列から取得することができる。これは天然に存在する切断ではない。Met-12は、米国特許第8,343,931号（その全体が本明細書中に組み入れられる）に以前に記載されている。
【００４２】
C末端アミド化ペプチド、すなわち化合物1の使用は、この特異的修飾が、pH3より上では顕著に脱プロトン化する遊離カルボン酸の除去により、ペプチドが水溶性であるかまたはミセル中に混和性になるpHを上昇させ得るという考えに基づいた。得られた分子種は、いかなる生理的に重要なpHでもC末端アニオンを有しないか、またはいかなる物理的に重要な環境でも両性イオン性であり、かつ約pH5未満ではトリカチオン性（tricationic）分子種であろう。この変化は、生理的条件下ではいずれもが脱プロトン化可能でないアミドまたはエステルへの変換により最も容易に達成できるであろう。アミドはエステルよりも生物学的および化学的に安定であり、また疎水性も低く、したがって単純な第1級アミドが選択された。
【００４３】
特定の実施形態では、化合物1は、Met-12をそのC末端第1級アミドへと変換して化合物1を形成させることにより生成することができるが、当業者がよく知るアミノ樹脂の使用により、既にアミノ化されている第1アミノ酸残基からペプチドを組み立てることが、一般的にはより実践的である。下記の実施例の節に記載される通り、化合物1は、最初は三塩酸塩として取得および試験されたが、後には三酢酸塩が製剤化においてより有利であると見なされた。
【００４４】
化合物1を用いることには、Met-12を超える一定の利点がある。具体的には、下記の実施例に示される通り、化合物1は、眼用製剤での先例があるpHおよび添加剤量でのミセル状溶液剤を生成するために界面活性剤と共に製剤化することができる。第2に、in vitroでの有効性アッセイに基づけば、化合物1は、驚くべきことにIC50測定ではMet-12よりも10倍強力であり、最大阻害濃度で測定すると約3倍強力である。具体的には、Met-12および化合物1をin vitroで同じ製剤中で試験すると、化合物1はMet-12よりも大きな用量効力を有する。このことは、Met-12よりも少量の化合物1を用いて同じ生理学的効果が達成されることを可能にする。第3に、網膜剥離のラットモデルでのin vivo試験では、化合物1は、驚くべきことに、網膜の剥離部分での光受容体細胞のアポトーシスの予防においてMet-12よりも少なくとも5倍強力である。第4に、化合物1の開示された製剤の一部では、ラット網膜剥離モデルでの有効性は、Met-12で見られたものよりも10倍超低いレベルで達成される。最後に、化合物1は、硝子体内処置されたウサギの硝子体液および網膜の両方で非常に長い半減期を示し、これらの半減期は、様々な製剤を用いることにより種々の程度まで延長させることができ、このことは、選択される製剤によって化合物1に対する全体的な網膜の曝露を制御することを可能にする。
【００４５】
一部の実施形態では、化合物1は、以下のうちの1種以上で有効である：Fas媒介性光受容体アポトーシスの予防/阻害/軽減、眼の網膜色素上皮の細胞でのアポトーシスの予防、光受容体の生存率の増加、加齢黄斑変性（AMD）に関連する細胞死の予防、網膜剥離に関連する細胞死の予防など。一部の追加の実施形態では、化合物1は、双極細胞および網膜アマクリン細胞という2種類の介在ニューロンを介して光受容体からの視覚情報を受け取る網膜神経節細胞の保護において有効である。
【００４６】
一部の実施形態では、化合物1またはその調製物（すなわち、製剤または組成物）の治療的有効量が、治療（例えば、特定の眼の症状に対して）を必要とする哺乳動物被験体に対して、患者体内での（例えば、所望の組織内での）アポトーシスを阻害または減弱するために十分な部位に投与される。好ましい被験体は、眼の症状、疾患、または眼の健康に影響を及ぼす症状もしくは疾患を有するヒトである。
【００４７】
投与される量は、限定するものではないが、光受容体、網膜色素上皮および網膜神経節をはじめとする網膜細胞および/または網膜神経節細胞のFas媒介性アポトーシスからの保護を改善するか、または網膜細胞死を予防して、それにより眼の症状、疾患、または眼の健康に影響を及ぼす症状もしくは疾患の改善および/または治療をもたらすために十分なものである。
【００４８】
治療的有効用量の決定は、当技術分野の実務家の能力の範囲内である。一部の実施形態では、有効なヒト用量は、5〜10,000μg/眼、50〜5,000μg/眼、または100〜2,000μg/眼の範囲内であろう。有効なレベルを維持するために、反復投与が意図される（例えば、毎週、隔週、毎月、年4回、半年毎など）。
【００４９】
一部の実施形態では、医薬製剤は、無菌のパイロジェン不含液体であり、少なくとも0.1mg/mL（例えば、＞0.1、＞0.2、＞0.5、＞0.6、＞0.7、＞0.8、および＞0.9)、少なくとも1mg/mL（例えば、＞1mg/mL、＞2mg/mL、＞5mg/mL、＞10mg/mL、など）のペプチド/ポリペプチド（例えば、化合物1）の本明細書中に記載されるペプチド/ポリペプチド（例えば、1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、またはそれ以上）を含む。
【００５０】
一部の実施形態では、治療的用量は、少なくとも0.01mL（例えば、0.01mL、0.02mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、ならびにそれらの間の体積および範囲）の、光受容体またはRPE保護性ペプチド/ポリペプチド（例えば、化合物1）を含有する液体医薬製剤を含む。一部の実施形態では、10〜500μLの液量がヒトの眼に注入される（例えば、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、75μL、100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、ならびにそれらの間の体積および範囲）。一部の実施形態では、50〜600μLの体積がヒトの眼に注入される（例えば、50μL、75μL、100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、600μL、ならびにそれらの間の体積および範囲）。一部の実施形態では、手術中に（intra-operatively）注入される場合、ミリリットル単位の体積が用いられる場合がある（例えば、最大で硝子体腔の総体積まで、例えば、約4mL）。一部の実施形態では、化合物は、硝子体切除術中に内部眼圧を維持するために用いられる灌流液中に組み込むことができる。
【００５１】
一部の実施形態では、単回用量が提供される（例えば、急性症状（例えば、網膜剥離）を治療するため）。一部の実施形態では、複数回用量（例えば、毎日、毎週、毎月、等）が、慢性症状の治療のために提供される。製剤は、治療対象の症状に対して必要とされる曝露の持続期間に応じて異なり得る。
【００５２】
一部の実施形態では、治療投与量は、安全性および有効性を最適化するために、低レベルから上向きに力価決定される。硝子体内注入に関する一部の実施形態では、用量は、0.01〜5mgのペプチド（例えば、0.1〜2.0mg）を含む。
【００５３】
一部の実施形態では、医薬調製物（すなわち、製剤および/または組成物）は、1種以上の賦形剤を含む。眼への投与に好適な賦形剤としては、限定するものではないが、等張化剤、保存剤、キレート剤、緩衝剤、界面活性剤、共溶媒および抗酸化剤が挙げられる。好適な張性調節剤としては、マンニトール、塩化ナトリウム、グリセリン、ソルビトールなどが挙げられる。好適な保存剤としては、p-ヒドロキシ安息香酸エステル、塩化ベンザルコニウム、臭化ベンゾドデシニウム、ポリクオタニウム-1などが挙げられる。好適なキレート剤としては、エデト酸ナトリウムなどが挙げられる。好適な緩衝剤としては、リン酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、トロメタミンなどが挙げられる。好適な界面活性剤としては、イオン性および非イオン性界面活性剤が挙げられるが、ポリソルベート、ポリエトキシル化ヒマシ油誘導体、ポリエトキシル化脂肪酸、ポリエトキシル化アルコール、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマー（ポロキサマー）、およびオキシエチレン化第3級オクチルフェノールホルムアルデヒドポリマー（チロキサポール）などの非イオン性界面活性剤が好ましい。他の好適な界面活性剤もまた含めることができる。好ましい抗酸化剤としては、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、アスコルビン酸塩、BHA、BHT、トコフェロールなどが挙げられる。
【００５４】
本発明の組成物は、任意により、追加の活性薬剤を含む。そのような追加の活性薬剤としては、アダリムマブ（Ophthalmic Surg Lasers Imaging Retina 45、332 (2014), Curr Eye Res 39, 1106 (2014)）またはエタネルセプト（PLoS One, 7, e40065）などの抗TNF抗体、またはROCK阻害剤Y-27632（Molecular Medicine Reports 12, 3655 (2015)）、アデノシンキナーゼ阻害剤ABT-702（Life Sci 93, 78 (2013)）、もしくはJNK阻害ペプチドD-JNK-1（Diabetes 50, 77 (2001), Adv Exptl Med Biol 854, 677 (2016)）などの網膜構造を維持することが示されているキナーゼ阻害剤、あるいはドコサヘキサエン酸（J Lipid Res, 54,2236 (2013)）またはRXR汎アゴニストPA024（同上）もしくはネクロスタチン、またはダブラフェニブなどのRIPキナーゼ阻害剤（Cell Death Dis 5, 1278 (2014)）が挙げられる。
【００５５】
一部の例示的実施形態では、賦形剤（ポリソルベート20（例えば、最大3％）、ポロキサマー407（例えば、最大2％）、チロキサポール（例えば、最大3％）、クレモホール（例えば、最大1％）など）；および/または共溶媒（例えば、0.5〜50％）（N,N-ジメチルアセトアミド、エタノール、PEG-400、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド（DMSO）など）；油またはシクロデキストリン、のうちの少なくとも1種を、医薬調製物に添加することができる。
【００５６】
さらなる例示的実施形態では、ポリソルベート80、ポリソルベート20、ポロキサマー、またはチロキサポールなどの少なくとも1種の非イオン性界面活性剤（例えば、組成物の0.1％〜20％(w/w)）を、医薬組成物に含めることができる。加えて、約1〜50％の量のプロピレングリコールまたはジメチルスルホキシドなどの有機共溶媒を、医薬組成物に含めることができる。あるいは、約1〜20％の量のN,N-ジメチルアセトアミド、エタノール、PEG-400、プロピレングリコール、DMSOなどの有機共溶媒を、医薬組成物に含めることができる。あるいは、約1〜5％の量のプロピレングリコールまたはジメチルスルホキシドなどの有機共溶媒を、医薬組成物に含めることができる。あるいは、組成物の張性を250〜400mOsm/Lの範囲にするために必要な量の、マンニトール、ソルビトール、グルコースもしくはトレハロース、または塩化ナトリウムなどの無機塩などの等張化剤を、医薬組成物に含めることができる。
【００５７】
組成物のpHは、2.5〜6.0の範囲内であり得る。pHは、適切な緩衝剤により制御することができ、かつ3.0〜5.0の範囲または3.5〜4.5の範囲内であり得る。
【００５８】
別の例示的実施形態では、ポリソルベート80、ポリソルベート20、ポロキサマー、またはチロキサポールなどの少なくとも1種の非イオン性界面活性剤（例えば、組成物の0.5％〜10％(w/w)）を、医薬組成物に含めることができる。加えて、約1〜50％の量のプロピレングリコールまたはジメチルスルホキシドなどの有機共溶媒を、医薬組成物に含めることができる。あるいは、約1〜20％の量のプロピレングリコールまたはジメチルスルホキシドなどの有機共溶媒を、医薬組成物に含めることができる。あるいは、約1〜5％の量のN,N-ジメチルアセトアミド、エタノール、PEG-400、プロピレングリコール、DMSOなどの有機共溶媒を、医薬組成物に含めることができる。あるいは、組成物の張性を250〜400mOsm/Lの範囲にするために必要な量の、マンニトール、ソルビトール、グルコースもしくはトレハロース、または塩化ナトリウムなどの無機塩などの等張化剤を、医薬組成物に含めることができる。組成物のpHは、2.5〜6.0の範囲内であり得る。pHは、適切な緩衝剤により制御することができ、かつ3.0〜5.0の範囲または3.5〜4.5の範囲内であり得る。
【００５９】
またさらなる例示的実施形態では、ポリソルベート80、ポリソルベート20、ポロキサマー、またはチロキサポールなどの少なくとも1種の非イオン性界面活性剤（例えば、組成物の1％〜3％(w/w)）を、医薬組成物に含めることができる。加えて、約1〜50％の量のプロピレングリコールまたはジメチルスルホキシドなどの有機共溶媒を、医薬組成物に含めることができる。あるいは、約1〜20％の量のN,N-ジメチルアセトアミド、エタノール、PEG-400、プロピレングリコール、DMSOなどの有機共溶媒を、医薬組成物に含めることができる。あるいは、約1〜5％の量のプロピレングリコールまたはジメチルスルホキシドなどの有機共溶媒を、医薬組成物に含めることができる。あるいは、組成物の張性を250〜400mOsmの範囲にするために必要な量の、マンニトール、ソルビトール、グルコースもしくはトレハロース、または塩化ナトリウムなどの無機塩などの等張化剤を、医薬組成物に含めることができる。組成物のpHは、2.5〜6.0の範囲内であり得る。pHは、適切な緩衝剤により制御することができ、かつ3.0〜5.0の範囲または3.5〜4.5の範囲内であり得る。
【００６０】
一部の実施形態では、医薬組成物は、化合物1または製薬上許容されるその塩、およびポロキサマー407（例えば、組成物の0.1％〜2％(w/w)）を、3.0〜6.0の範囲のpHを有する水性媒体中に含むことができる。
【００６１】
一部の実施形態では、医薬組成物は、化合物1または製薬上許容されるその塩、およびポロキサマー407（例えば、組成物の0.1％〜2％(w/w)）を、4.0〜5.0の範囲のpHを有するプロパン酸ナトリウム/プロパン酸または酢酸ナトリウム/酢酸により緩衝されている水性媒体中に含むことができる。
【００６２】
一部の実施形態では、医薬組成物は、化合物1または製薬上許容されるその塩、およびポロキサマー407（例えば、組成物の0.1％〜2％(w/w)）を、4.0〜5.0の範囲のpHを有する、プロパン酸ナトリウム/プロパン酸または酢酸ナトリウム/酢酸により緩衝され、かつ3〜5％マンニトールにより等張化されている水性媒体中に含むことができる。
【００６３】
一部のさらなる実施形態では、医薬組成物は、化合物1または製薬上許容されるその塩、ポリソルベート-20（例えば、組成物の0.1％〜3％(w/w)）、およびプロピレングリコール（例えば、組成物の3％(w/w)）を、3.0〜6.0のpH範囲を有する水性媒体中に含むことができる。
【００６４】
特定のさらなる実施形態では、医薬組成物は、化合物1または製薬上許容されるその塩、ポリソルベート-20（例えば、組成物の0.1〜3％(w/w)）、およびプロピレングリコール（例えば、組成物の3％(w/w)）を、4.0〜5.0のpH範囲で酢酸ナトリウム/酢酸により緩衝されている水性媒体中に含むことができる。
【００６５】
一部のさらなる実施形態では、医薬組成物は、化合物1または製薬上許容されるその塩、ポリソルベート-20（例えば、組成物の0.1〜3％(w/w)）、およびマンニトール（例えば、組成物の3〜5％(w/w)）を、3.0〜6.0のpH範囲を有する水性媒体中に含むことができる。
【００６６】
特定のさらなる実施形態では、医薬組成物は、化合物1または製薬上許容されるその塩、ポリソルベート-20（例えば、組成物の0.1〜3％(w/w)）、およびマンニトール（例えば、組成物の3〜5％(w/w)）を、4.0〜5.0のpH範囲で酢酸ナトリウム/酢酸により緩衝されている水性媒体中に含むことができる。
【００６７】
一部の実施形態では、医薬組成物は、化合物1または製薬上許容されるその塩、およびポロキサマー407（例えば、組成物の0.1〜2％(w/w)）およびポリソルベート20（例えば、組成物の0.1〜2％(w/w)）を、3.0〜6.0の範囲のpHを有する水性媒体中に含むことができる。
【００６８】
一部の実施形態では、医薬組成物は、化合物1または製薬上許容されるその塩、およびポロキサマー407（例えば、組成物の0.1〜2％(w/w)）、およびポリソルベート-20（例えば、組成物の0.1〜2％(w/w)）を、4.0〜5.0の範囲のpHでプロパン酸ナトリウム/プロパン酸または酢酸ナトリウム/酢酸により緩衝されている水性媒体中に含むことができる。
【００６９】
一部の実施形態では、医薬組成物は、化合物1または製薬上許容されるその塩、およびポロキサマー407（例えば、組成物の0.1〜2％(w/w)）、およびポリソルベート-20（例えば、組成物の0.1〜2％(w/w)）を、4.0〜5.0の範囲のpHを有する、プロパン酸ナトリウム/プロパン酸または酢酸ナトリウム/酢酸により緩衝され、かつ3〜5％マンニトールにより等張化されている水性媒体中に含むことができる。
【００７０】
一部の実施形態では、上記の通りの医薬組成物は、化合物1を含むが、対イオンとして塩化物を含まないことができ、酢酸塩が好ましい代替物である。そのような組成物は、塩化物イオンを含有するものよりも優れた性質を示し得る。
【００７１】
一部の実施形態では、ペプチド/ポリペプチド（例えば、化合物1）の重量比は、医薬製剤中の非水性賦形剤の重量に対して1％〜25％であり、これは逆に、0.1〜20％のポロキサマー、ポリソルベート20、プロピレングリコールおよびマンニトールなどの賦形剤である。
【００７２】
医薬製剤の重量に対するペプチド/ポリペプチド（例えば、化合物1）の重量比は、少なくとも約0.1％、少なくとも0.5％、少なくとも1％、少なくとも約2％、少なくとも約3％であり得る。
【００７３】
示された範囲の量のそれぞれの成分を有する以下の2種類の例示的組成物は、種々の眼の（例えば、網膜の）疾患もしくは症状を治療または予防するために用いることができるか、または被験体での眼の疾患もしくは症状などにより生じる網膜細胞死を予防するために用いることができる数種類の組成物のうちの2種類を提供するであろう。
2018514590.tif 000005
【００７４】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、例えば、本明細書中に記載される技術、および/または当業者に公知の他の技術（例えば、注入、局所投与など）を用いて、眼から投与される（例えば、Janoria et al., Expert Opin Drug Deliv., 4(4): 371-388 (July 2007)；Ghate & Edelhauser, Expert Opin Drug Deliv., 3(2):275-87 (2006)；Bourges et al., Adv Drug  Deliv Rev., 58(11):1182-202 (2006), Epub 2006 Sep. 22；Gomes Dos Santos et al., Curr Pharm Biotechnol., 6(1):7-15 (2005)を参照されたい；その全体が参照により本明細書中に組み入れられる）。組成物は、当業者に公知のいずれかの方法を用いて投与することができる。非限定的な例としては、局所投与、結膜下投与、テノン嚢下投与、硝子体内投与、網膜下投与、または被験体の眼の前房への注入が挙げられる。他の投与様式としては、静脈内投与ならびに経口投与をはじめとする全身性投与が挙げられる。特定の実施形態では、組成物は、硝子体内投与される。
【００７５】
特定の実施形態は、化合物1ポリペプチドおよび製薬上許容される担体を含む医薬組成物に関する。担体内でベクターを破壊することなくポリペプチドを供給することができるいずれかの担体が好適な担体であり、そのような担体は当技術分野で周知である。
【００７６】
組成物は、非経口投与、経口投与、または局所投与に対して好適に製剤化および包装することができる。例えば、非経口製剤は無菌のパイロジェン不含製品であり、即時放出もしくは持続放出液体調製物、乾燥散剤、エマルジョン剤、懸濁液剤、またはいずれかの他の標準的製剤からなることができるであろう。医薬組成物の経口製剤は、例えば、希釈剤（例えば、水、生理食塩液、果汁など）中に溶解された有効量の組成物などの液体溶液剤、適切な液体中の懸濁液剤、または好適なエマルジョン剤であり得る。経口用製剤はまた、錠剤形態で送達することもでき、賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤化剤、保存剤、香味剤、および製薬上適合し得る賦形剤を含み得るであろう。局所用製剤は、ジメチルスルホキシドおよび関連するアナログなどの、皮膚または他の罹患領域を通した活性成分の吸収または浸透を高めるための化合物を含むことができるであろう。医薬組成物はまた、パッチなどの経皮デバイスを用いて局所送達することもでき、経皮デバイスは、アクリルエマルジョン、およびポリエステルパッチなどの接着系を含む好適な溶媒系の中に組成物を含むことができるであろう。無菌組成物は、点眼または他の局所的な眼への送達方法を介して送達することができるであろう。無菌のパイロジェン不含組成物は、例えば、硝子体腔、前房などをはじめとする眼のいずれかの場所に、眼内送達することができる。無菌のパイロジェン不含組成物は、ルセンティス（ラニビズマブ（ranabizumab））、アバスチン（ベバシズマブ（bevazizumab））、トリアムシノロン・アセトニド、抗生物質などの硝子体内注入に関して通常行われる通りに、硝子体内送達することができる。組成物は、眼周囲に（例えば、眼球（球体）周囲であるが眼窩の骨の内側の組織に）送達することができる。組成物は、眼内インプラント（例えば、ガンシクロビルインプラント、フルオシノロンインプラントなど）を介して送達することができる。眼内インプラント送達では、本発明の組成物を含有するデバイスを外科的に移植し（例えば、硝子体腔内に）、薬物が眼へと放出される（例えば、所定の速度で）。組成物は、遺伝的に改変された細胞が化合物1ポリペプチドを含む組成物を産生および分泌するように遺伝子操作されているカプセル化細胞技術（例えば、Neurotechによる）を用いて投与することができる。組成物は、薬物を緩やかに溶出し、この薬物が眼へと拡散するであろう、眼球（globe）の隣りに縫合または配置したデバイスを用いる経強膜的（transcleral）薬物送達を介して送達することができる。
【００７７】
一部の実施形態は、光受容体、RPE細胞または網膜神経節細胞死を予防、阻害、遮断、および/または低減するための、組成物、キット、システム、および/または方法に関する。一部の実施形態は、光受容体のアポトーシスの阻害に関する。一部の実施形態は、眼の網膜色素上皮の細胞でのアポトーシスの阻害に関する。一部の実施形態は、眼の網膜神経節の細胞でのアポトーシスの阻害に関する。一部の実施形態では、光受容体細胞死および/もしくはアポトーシスおよび/または網膜色素上皮細胞アポトーシスおよび/もしくはアポトーシスおよび/または網膜神経節細胞アポトーシスおよび/もしくは細胞死は、網膜剥離、加齢黄斑変性、緑内障、外傷、癌、腫瘍、炎症、ブドウ膜炎、糖尿病、遺伝性網膜変性、および/または光受容体細胞、異常網膜色素上皮もしくは網膜神経節に影響を及ぼす疾患により引き起こされる。
【００７８】
一部の実施形態では、本発明は、光受容体、RPEもしくは網膜神経節細胞の生存性を高め、かつ/または（例えば、網膜剥離および/または網膜剥離を含まない眼の症状の間）の光受容体細胞死を阻害する。
【００７９】
一部の実施形態では、本発明は、限定するものではないが、黄斑変性（例えば、乾燥型、ウェット型、非滲出型または滲出/血管新生型）、眼の腫瘍、緑内障、遺伝性網膜変性（例えば、網膜色素変性、スタルガルト病、アッシャー症候群など）、眼の炎症性疾患（例えば、ブドウ膜炎）、眼の感染症（例えば、細菌性、真菌性、ウイルス性）、自己免疫性網膜炎（例えば、感染により引き起こされるもの）、外傷、糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生、網膜虚血、網膜血管閉塞性疾患（例えば、網膜静脈分枝閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、網膜動脈分枝閉塞症、網膜中心動脈閉塞症など）、病的近視、網膜色素線条、黄斑浮腫（例えば、いずれかの病因のもの）、中心性漿液性脈絡網膜症をはじめとする、様々な症状および/または疾患での光受容体、RPEもしくは網膜神経節細胞生存性の強化での利用性があり、かつ/または光受容体、RPEもしくは網膜神経節細胞死を阻害する。
【００８０】
一部の実施形態は、光受容体、RPEまたは網膜神経節細胞死（例えば、アポトーシス）を阻害するための組成物の投与に関する。一部の実施形態では、組成物は、医薬、小分子、ペプチド、核酸、分子複合体等を含む。一部の実施形態では、本発明は、光受容体またはRPEまたは網膜神経節細胞のアポトーシスを阻害する光受容体、RPEまたは網膜神経節細胞保護性ポリペプチドの投与を提供する。
【００８１】
一部の実施形態は、光受容体および/または網膜での、TNFRスーパーファミリーの1種以上のメンバー、望ましくはFasまたはTRAILの活性化を減弱させるためにポリペプチドを用いる方法に関する。一部の実施形態では、そのような方法は、例えば、細胞および組織での細胞死（例えば、アポトーシス）を阻害するために用いられ、in vivo、ex vivoまたはin vitroで用いることができる。つまり、化合物1は、そのような方法に従って、細胞死（例えば、網膜細胞死）を軽減させるために用いることができる。in vitro用途のためには、化合物1は、細胞内でのアポトーシスを阻害するかまたは炎症を阻害するために十分な量および時間経過にわたって、細胞に、典型的には細胞の集団に（例えば、緩衝化された溶液などの好適な調製物内で）与えることができる。所望であれば、本発明のポリペプチドを用いて処置されていない制御された集団を観察することにより、同様の細胞の集団内での細胞死または炎症の阻害を減少させる本発明のポリペプチドの効果を確認することができる。
【００８２】
一部の実施形態では、以下のものをはじめとする、種々の眼の（例えば、網膜の）疾患もしくは症状を治療するかまたは眼の疾患もしくは症状により生じる網膜細胞死を予防する方法が本明細書中に提供される：緑内障、黄斑症/網膜変性（加齢黄斑変性（AMD）をはじめとする黄斑変性など（非滲出型加齢黄斑変性および滲出型加齢黄斑変性など））；脈絡膜血管新生；網膜症（糖尿病性網膜症、急性および慢性黄斑性視神経網膜症（acute and chronic macular neuroretinopathy）、中心性漿液性脈絡網膜症など）；ならびに黄斑浮腫（類嚢胞黄斑浮腫、および糖尿病性黄斑浮腫など）；ブドウ膜炎/網膜炎/脈絡膜炎（急性多発性小板状色素上皮症など）、ベーチェット病、バードショット網脈絡膜症、感染（梅毒、ライム病、結核、トキソプラズマ症)、ブドウ膜炎（中間部ブドウ膜炎（扁平部炎）および前部ブドウ膜炎など）、多巣性脈絡膜炎、多発消失性白点症候群（MEWDS）、眼サルコイドーシス、後部強膜炎、匐行性脈絡膜炎、網膜下線維症、ブドウ膜炎症候群、およびフォークト-小柳-原田症候群；血管疾患/滲出性疾患（網膜動脈閉塞性疾患、網膜中心静脈閉塞症、播種性血管内凝固障害、網膜静脈分枝閉塞症、高血圧性眼底変化（hypertensive fundus changes）、眼部虚血症候群、網膜動脈毛細血管瘤、コーツ病、傍中心窩毛細血管拡張症、半網膜静脈閉塞症（hemi-retinal vein occlusion）、乳頭静脈炎（papillophlebitis）、網膜中心動脈閉塞症、網膜動脈分枝閉塞症、頸動脈疾患（CAD）、樹氷状血管炎（frosted branch angitis）、鎌状赤血球網膜症および他の異常ヘモグロビン症、網膜色素線条、家族性滲出性硝子体網膜症、イールズ病（Eales disease）など）、外傷性疾患/外科疾患：交感性眼炎、ブドウ膜性網膜疾患（uveitic retinal disease）、網膜剥離、外傷、レーザー、PDT、光凝固、手術中の血流低下、放射線網膜症、骨髄移植網膜症；増殖性障害（増殖性硝子体網膜症および網膜上膜、増殖性糖尿病網膜症など）。感染性障害：眼ヒストプラスマ症、眼トキソカラ症、眼ヒストプラスマ症候群（OHS）、眼内炎、トキソプラズマ症、HIV感染に関連する網膜疾患、HIV感染に関連する脈絡膜疾患、HIV感染に関連するブドウ膜疾患、ウイルス性網膜炎、急性網膜壊死、進行性外側網膜壊死、真菌性網膜疾患、眼梅毒、眼結核、びまん性片側性亜急性神経網膜炎、およびハエ幼虫症；遺伝性障害（網膜色素変性、網膜ジストロフィーに伴う全身性障害、先天性停止性夜盲、錐体ジストロフィー、スタルガルト病および黄色斑眼底、ベスト病、網膜色素上皮のパターンジストロフィー（pattern dystrophy）、X連鎖網膜分離、ソースビー眼底ジストロフィー、良性中心性黄斑変性（benign concentric maculopathy）、ビエッティ結晶性ジストロフィー（Bietti's crystalline dystrophy）、弾力線維性仮性黄色腫など）。網膜裂孔/円孔：網膜剥離、黄斑円孔、巨大網膜裂孔；腫瘍（腫瘍に関連する網膜疾患、RPEの先天性肥大、後部ブドウ膜黒色腫、脈絡膜血管腫、脈絡膜骨腫、脈絡膜転移、網膜および網膜色素上皮の混合性過誤腫、網膜芽細胞腫、眼底の血管増殖性腫瘍（vasoproliferative tumor）、網膜星状細胞腫、眼内リンパ系腫瘍など）；および他の疾患および症状（点状脈絡膜内層症、急性後部多発性小板状色素上皮症、近視性網膜変性症、急性網膜色素上皮炎、角膜ジストロフィーまたは異形成な���）。
【００８３】
特定の実施形態は、化合物1、または製薬上許容されるその塩を含む医薬組成物を投与するステップを含む、光受容体、RPEまたは網膜神経節の生存率を高めるための方法を提供する。医薬化合物は、製薬上許容される担体および任意的な賦形剤、助剤等と共に、適正な製薬実務に従って製剤化されている組成物の形態で投与することができる。組成物は、散剤、溶液剤、エリキシル剤、シロップ剤、懸濁液剤、クリーム剤、点眼液、パスタ剤およびスプレー剤などの、固体、半固体または液体剤型の形態であり得る。当業者が認識するであろう通り、選択された投与経路（例えば、点眼、注入など）に応じて、組成物の剤型が決定される。一般的には、活性医薬化合物の容易かつ正確な投与を達成するために、本発明の阻害剤の無菌の単位投与剤型を用いることが好ましい。一般的には、治療的に有効な医薬化合物は、組成物全体の重量に基づいて、約0.01％〜約1.0％の範囲の濃度レベルで、すなわち、所望の単位用量を提供するために十分な量で、そのような剤型中に存在する。
【００８４】
一部の実施形態では、医薬組成物は、単回用量または複数回用量で投与することができる。具体的な投与経路、製品仕様および投与レジメンは、治療対象である個体の症状および治療に対する該個体の応答に沿って、当業者により決定されるであろう。一部の実施形態では、被験体への投与のための単位投与剤型中の組成物は、医薬化合物および1種以上の無毒の製薬上許容される担体、助剤またはビヒクルを含む。単回投与剤型を生成するためにそのような物質と組み合わせることができる活性成分の量は、上記の通りの種々の因子に応じて変わるであろう。様々な物質が、製薬分野で利用可能な通りに、本発明の組成物中で担体、助剤およびビヒクルとして用いることができる。油性溶液、懸濁液またはエマルジョンなどの注射用調製物は、必要な場合には好適な分散化剤または湿潤化剤および懸濁化剤を用いて、当技術分野で公知の通りに製剤化することができる。無菌の注射用調製物は、無菌パイロジェン不含水または1,3-ブタンジオールなどの、無毒の非経口的に許容される希釈剤または溶媒を用いることができる。用いることができる他の許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、5％デキストロース注入液、リンゲル注入液および等張塩化ナトリウム注入液がある（USP/NFに記載される通り）。加えて、無菌の固定油を、溶媒または懸濁媒体として慣用的に用いることができる。この目的のために、合成モノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリドを含むいずれかのブレンド固定油を用いることができる。オレイン酸などの脂肪酸もまた、注入可能な組成物の調製に用いることができる。
【００８５】
眼の組織への薬物送達には、数種類の考えられる経路がある。投与経路は、標的組織に依存する。特定の実施形態では、投与経路は、局所投与または全身性投与のいずれかなどの慣用の投与経路であり得る。ほとんどは点眼剤の形態である局所投与は、前眼部を侵す障害を治療するために用いることができる。投与はまた、直接的な注入、例えば、硝子体内注入を介するものでもあり得、これは、例えば、30G針を用いた硝子体液（VH）への薬物溶液の直接的な注入を含む。例えば、薬物担体を用いる他の投与経路もまた、好適であり得る。
【００８６】
一部の実施形態では、組成物は、例えば、本明細書中に記載される技術、および/または当業者に公知の他の技術（例えば、注入、局所投与等）を用いて、眼から（すなわち、眼に対して）投与することができる（例えば、Janoria et al. Expert Opinion on Drug Delivery. July 2007, Vol. 4, No. 4, Pages 371-388；Ghate & Edelhauser. Expert Opin Drug Deliv. 2006 March; 3(2):275-87；Bourges et al. Adv Drug Deliv Rev. 2006 Nov. 15; 58(11):1182-202. Epub 2006 Sep. 22；Gomes Dos Santos et al. Curr Pharm Biotechnol. 2005 February; 6(1):7-15を参照されたい；これらはその全体が参照により本明細書中に組み入れられる）。
一部の実施形態では、組成物は、光受容体の効果的な保護および/またはアポトーシスの阻害のための1種以上の他の薬剤と一緒に共投与することができる。
【００８７】
一部の実施形態では、化合物1、またはその医薬調製物を含むキットが提供される。一部の実施形態では、キットは、デバイス、物質、バッファー、対照、説明書、容器（例えば、バイアル、シリンジ）など（例えば、投与のための）をさらに提供する。例えば、上記の組成物および/または製剤のうちのいずれかが包装されていることができる。上記の組成物および製剤のうちのいずれかは、予め充填されたシリンジ中で流通させることができる。組成物および加工は、無菌のパイロジェン不含製品を生じる。包装は、製品の無菌性を維持するために機能する。
【実施例】
【００８８】
化合物1の生物学的に活性な医薬製剤（例えば、硝子体内投与用）を開発するために、記載される実施形態の開発中に実験が行なわれた。化合物1の光受容体保護特性を、DMSO中のペプチド溶液の投与後にin vitroおよびin vivoで調べた。化合物1は、pH約3超では水溶性が乏しく、水性環境ではゲルまたは沈殿を形成する傾向が高い。動物種内での硝子体体積に従うラットとヒトとの有効用量の比例的調整により、10〜20mg/mLの標的濃度を当初の目標に定め、試験により、記載される実施形態の驚くほど優れた効能および曝露が実証されたので、より低い濃度（0.5〜2.0mg/mL）がより望ましくなった（実施例1〜6）。
【００８９】
［実施例1：化合物1の調製および試験］
化合物1ペプチド（ペプチドHis-His-Ile-Tyr-Leu-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Ile-Tyr-NH2；配列番号1）は、複数の供給業者により、Fmoc化学を介してFmoc-アミド-AMS樹脂上で合成された。Fmoc保護アミノ酸は、GL Biochem社から購入した。カップリングおよび切断用の試薬は、Aldrich社から購入した。溶媒は、Fisher Scientific社から購入した。
【００９０】
ペプチド鎖は、Fmoc保護基の反復除去および保護されたアミノ酸のカップリングにより樹脂上に組み立てられた。DICおよびHOBtをカップリング試薬として用い、NMMを塩基として用い；DMF中の20％ピペリジンを脱Fmoc試薬として用いた。カップリング効率をチェックするために、各カップリング後にニンヒドリン試験を行なった。
【００９１】
最後のカップリング後、樹脂を洗浄および乾燥させ、ペプチドを、切断カクテル（TFA/Tis/H2O/DOTA：95/3/2/2）を用いて処理することにより樹脂から切断した。ペプチドを冷エーテルから沈殿させ、ろ過により回収して、46％の純度を有する13gの粗精製物が得られた（収率：127％）。
【００９２】
2回の調製的精製実験の各回において、約4.4gの粗ペプチドを、TFAバッファー（バッファーA：0.1％TFA（水中）；バッファーB：100％アセトニトリル）を用いて2インチポリマーカラムにより精製し、85％超の純度を有する得られた画分を、TFAバッファーを用いて2インチC18カラムによりさらに精製した。95％超の純度を有する回収された画分を凍結乾燥させ、3.68gの物質を、95％超の純度を有するTFA塩として8.8gの粗精製物から得た。1.5gのペプチド（対イオンとしてTFA）に対して、十分量のHCl水溶液を加え、ペプチドを溶解させた。HCl水溶液中のペプチドを凍結乾燥させた。HCl塩としての1.4gの最終ペプチドを、97.0％の純度で得た。HPLC 15％ACN（水中）0.1％TFA、Venusil XBP-C18 4.6×250mm 1.0mL/分；RT 17.79分。質量分析APCI MH+ 1461.5。
【００９３】
微量分析。実測値：C, 52.21; H, 6.49; N, 15.42; Cl, 6.73、KF, 3.75％。C71H100N18O16・3HCl・3.4H2Oに対する計算値：C, 52.24; H, 6.59; N, 15.45; Cl, 6.52、KF, 3.75％. 活性（％）＝89.55％。
後者のペプチドサンプルはまだトリフルオロ酢酸塩として合成されたが、酢酸を用いてアニオン交換を行ない、化合物1をその三酢酸塩として得た。
【００９４】
［実施例2：化合物1のpH-溶解度プロフィール］
実施例1に記載される通りに三塩酸塩として得た化合物1を、以下のプロトコールに従ってpH滴定を行なうことにより、様々なpHでの水溶性に関してスクリーニングした。一部のケースでは、Met-12を、同じ条件下でのその溶解度pHプロフィールを決定するために、同一の実験手順に供した。複数回の事前の実験では、Met-12が2.7を超えるいずれかのpHで大部分が水性である媒体中に満足に製剤化できる条件を見い出せなかった。
【００９５】
化合物1（10mg）を、2mL透明プラスチック遠心管の中でボルテックスしながら水（270〜900μL）に溶解させて、pH約2.4の溶液を得た。すべてのケースで、ペプチドは透明な溶液を形成し、このことは、低pHでの少なくとも40mg/mLの溶解度を示唆した。続いて、この溶液を、適切な量の共溶媒または他の賦形剤（糖、界面活性剤など）を用いて希釈し、室温（22〜23℃）で900μLの試験溶液中の10mgの化合物1の透明な酸性溶液を得た。塩基性溶液（通常は1.0Mまたは0.1M水酸化ナトリウムであるが、緩衝剤について調べる場合は他の塩基である場合もある）の少量のアリコートを、マイクロリットルシリンジを用いて加えた。添加と添加の間には、溶液をボルテックスにより混合し、溶液を、種々のタイプの沈殿、濁度（微小な沈殿のよくある徴候）、および粘度（ゲル形成を検出するため）について目視検査した。pH測定を、それらすべての観察時点で行なった。一部の実験は内因性の低pHからpH10まで滴定したが、後半の滴定はpH7をはるかに超えるpHでは（またはときにはそれよりも低いpHでさえ）行なわなかった。
【００９６】
水酸化ナトリウムを用いた化合物1水溶液の滴定により、Met-12に関するpH3とは異なり約pH3.3まで透明な流動性溶液を生じて、Met-12よりも若干良好なpH限定的溶解度が示唆された。しかしながら、5種類の緩衝性塩基である、トリス、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムを水酸化ナトリウムの代わりに用いて滴定を行なった場合には、粘度および凝集の徴候が、一般的にpH2.6〜2.9の範囲で見られた。pH3未満での線維形成も、1〜2回は見られた。これらの実験から、化合物1は、Met-12よりも良好な水溶性-pHプロフィールを有するわけではないことが明らかである。
【００９７】
［実施例3：共溶媒混合物中での化合物1のpH依存的溶解度］
化合物1のpH依存的溶解度を、共溶媒および添加剤を用いて検討し、同じ条件下でのMet-12の溶解度と比較した。
70％DMSO実験は、pH5.5付近でのゲル形成を伴ってMet-12滴定と同様であったが、この場合に、おそらくはC末端がイオン化できないせいで、ゲルはより高いpHで再溶解しなかった。
【００９８】
70％プロピレングリコール（PG）はMet-12と比較して化合物1の溶解度を改善し、Met-12ではpH3.2であったのと比較してpH4.7付近までゲル化が生じず、その後、pH10までゲルのままであった。この滴定は、より少量のPG（35％、10％）を用いて繰り返されたが、いずれも、水のみの場合に対して溶解度プロフィールを改善したようには見えなかった。
70％PEG400および70％グリセロール溶液は、有用には見えず、2種類の糖添加剤である10％マンニトールまたは10％トレハロースもまた有用には見えなかった。
【００９９】
これらの実験から、プロピレングリコールは、化合物1に関しては一部の限定的な状況下で共溶媒として有用であり得るが、Met-12に対しては有用でないと結論付けられた。
【０１００】
［実施例4：非イオン性界面活性剤混合物中での化合物1のpH依存的溶解度］
驚くべきことに、検討した界面活性剤の一部は、化合物1のpH-溶解度プロフィールの顕著な改善をもたらしたが、試験した界面活性剤のいずれも、Met-12のpH-溶解度プロフィールを改善しなかった。10％チロキサポールの存在下での化合物1は、pHが5.87を超えるまで、透明なままであり、かつ許容できる粘度を有した。10％ポリソルベート80を用いる場合、透明な溶液は、pH6.36を超えるまで明らかに粘性にはならなかった。10％ポリソルベート20を用いる場合、pH3.2で線維が観察されたが、pH7.14まで、濁りまたはゲル化の徴候は見られなかった。10％ポロキサマー407は、溶液は流動性に見えるが、pH5〜9の範囲で第2の相が明らかに存在したので、不溶性の開始がいつ生じたかに関して幾分か不明瞭であった。これは、溶液中に形成された非常に大きな透明球からなるように思われた。これは、高いポロキサマー濃度のアーチファクトであると考えられ、なぜなら、15％ポロキサマー溶液は27℃で完全にゲル化する一方で、10％ポロキサマーは25℃では明らかにはゲル化しないが、種々の添加剤がゾル-ゲル臨界温度を上昇または低下させることができ、かつゲル化に関する通常の粘度測定は分離したゲル相の最初の出現を効率的に取り上げることがないであろうからである。したがって、混合物中のペプチドの溶解度は損なわれなかったが、多量のポロキサマーがゾル相とゲル相からなる2種類のポロキサマー相を形成したと考えられる。ポビドンK30は、pH3.60で粘性溶液を生じ、pH4.0超ではゲル化した。
【０１０１】
続いて、界面活性剤の一部を、添加する界面活性剤の量に関して下方に向かって滴定した。ポリソルベート20を3％濃度および1％濃度まで下方に滴定した場合、pH2.5未満で線維形成が見られたが、両方のケースで、それぞれpH4.14およびpH3.76まで、沈殿の他の徴候は見られなかった。4％のポロキサマー407は少数かつ明らかに増加はしない線維を滴定の開始時に生じたが、pH6.2超まで沈殿の他の徴候はなく、2％では、pH5.6超まで透明な溶液を生じた。0.5％では、滴定を開始すると溶液中に線維が見られたが、pH4.5超まで沈殿のさらなる徴候は見られなかった。
【０１０２】
化合物1は、検討された界面活性剤の大部分、特にポリソルベート80、ポロキサマー407およびチロキサポールでMet-12よりも明らかに優れており、最初に線維形成が観察されたことから、ポリソルベート20のデータは幾分か不明瞭であったが、同じビヒクル中でのMet-12とは対照的に、化合物の大部分はpH3〜6で溶液中にあったことは明らかである。したがって、化合物1の溶解度は、サンプル数の少ないマトリックス実験設計で、高濃度の添加剤で開始して、その後に、より低い濃度の一方または両方の添加剤を有する共溶媒-界面活性剤混合物中で検討された。
【０１０３】
［実施例5：化合物1の混合型非イオン性界面活性剤/共溶媒溶解度研究］
70％PGと10％ポリソルベート80との組み合わせは、透明な溶液を生じ、この溶液はpH3.4まで粘稠になり、pH5.25でゲル化し、このことにより、この組み合わせは70％PGよりも良好ではなく、10％PS-80よりも劣っていた。
70％PGおよび3％PSを用いる場合、pH4.6で粘性が生じたが、物質はpH5.25まではゲルのままであった。
35％PGおよび3％PS-80を用いる場合、pH2.66の低pHで溶液中に線維が現われ、pH3.48の溶液で凝集物が見られた。
【０１０４】
35％PG、10％PS-80は線維または凝集物の徴候を示さず、はっきりした粘性はpH4.05で見られ、ゲル化はpH5.71で見られた（10％PS-80そのものよりも劣る）。
10％PGおよび10％PS-80はpH4.94までは低い粘度を有する透明溶液を生じ、pH5.13超で物質の沈殿が始まった。
10％PGおよび3％PS-80はpH3.16までは透明な溶液を生じたが、幾分かの沈殿がpH3.4までに起こった。
【０１０５】
上述の通り、10％ポリソルベート20の溶液は、pH7までずっと透明な流動性溶液を与えるように見えたが、低pHでさえも、幾分かの線維が見られ、線維はpHが上昇するにつれて増加する傾向にあった。
【０１０６】
驚くべきことに、10％PGと10％ポリソルベート20との組み合わせは良好な溶解度をもたらし、明らかな粘性の開始は再現性高くpH7超でしか起こらず、いかなる沈殿物の視覚的徴候も見られなかった。しかしながら、一晩静置すると、溶液はゲル化し、pHは約0.2単位低下した。軽く撹拌すると、ゲルから、注入可能な液体へと再変換された。
3％ポリソルベート20および10％PGはpH5.3まで透明な流動性溶液を生じたが、PS-20を1％にまで低下させると、pH3未満で線維が生成された。
【０１０７】
10％PGを、4％、2％および0.5％ポロキサマー製剤に添加した。4％ポロキサマー製剤では、若干の改善があるように見え、低pHでの線維は見られず、少なくともpH5.36まで透明な溶液であった。2％ポロキサマーおよび10％PGは同等に良好であり、pH5.74まで透明な流動性溶液を生じた。0.5％ポロキサマー製剤は滴定の開始時に線維を示し、pH3.45で幾分かの濁度を示したが、pH6まで低粘度のままであった。
【０１０８】
2％、1％および0.5％ポロキサマー製剤に3％PG、1％PGを添加するかまたはPGを添加せずに、pH4.0、pH5.5およびpH7.0で、RTにて3日間静置した後に、目視アッセイおよびろ過アッセイ（次の実施例を参照されたい）を用いて安定性を測定した。目視では、新規に作製されたサンプルでは線維が観察される頻度が低く、より少ない賦形剤が存在する場合、およびより高いpHで観察され易く、一方ですべてのpH7.0サンプルは最初から濁っており、かつ一部のものは明らかな沈殿物を有した。すべてのpH4.0サンプルが最初は濁っておらず、0.5％PX、0％PGのみが静置後に若干の濁りを示した。pH5.5サンプルでは、当初の若干の濁りが、0％PGサンプルのすべて、および1％PG 0.5％PXサンプルで見られたが、静置後には、より少ない賦形剤のサンプル（0.5％PX 0％PG）のみが若干の濁りを示した。これらのサンプルのうちのいくつかは、撹拌すると若干濁ってきた。ろ過アッセイは、また別の結果を示した。2％ポロキサマー製剤では、3種類すべてのpH4製剤が、ろ過後に98％超の回収率を有し、pH5.5では96％超の回収率を有し、pH7.0での回収率はまだ86〜93％であった。pH4の1％PX製剤では、ろ過後の回収率は97〜98％であり、pH5.5では87〜93％であったが、pH7では1〜13％のみであった。0.5％PX製剤では、pH4でのろ過後の回収率は73〜88％であり、pH5.5では12〜43％であり、pH7では、3種類のサンプルのいずれでもろ過後に回収されなかった。
【０１０９】
これらの実験から、共溶媒としての比較的少量のPGは、一部の界面活性剤と一緒の場合に中程度に有用であり得るが、高濃度では有害であり、これらの製剤の効果の予測性は高くはないと結論付けることができる。PX製剤では、存在するPXの量および製剤のpHは、両方とも、PGレベルよりも重要である。さらに、視覚的な結果は、より信頼性の高いろ過アッセイとは必ずしも一致せず、線維の観察は特に、存在する濾出可能な薬物の量とは相関しないようであった。
【０１１０】
［実施例6：化合物1の比較的低濃度の非イオン性界面活性剤溶解度試験］
in vitro有効性実験および後のin vivo有効性実験により、化合物1が、光受容体細胞でのFasL（または網膜剥離）誘導型アポトーシスを遮断する上で3〜10倍超の範囲でより強力であることが実証された。これらの驚くべき結果は、予測されるヒト用量を25〜200μg/眼の範囲まで減少させることを可能にし、製剤化された薬物の最大必要濃度を2.0mg/mLにまで低下させた。その濃度での最適製剤化条件を見い出すために、さらに低い薬物濃度を検討する数種類の実験を用いてさらなる実験セットを行なった。この実験は、すべて、界面活性剤としてポロキサマー407またはポリソルベート20のいずれかを検討した。目視できる濁りおよび粘性の視覚的評価の両方が、有用なスクリーニング観察であるが、上述の通り、それらは凝集したペプチドの存在を常に示すものではないことが見出され、後の実験の大部分では、0.2ミクロンPVDFメンブレンまたはPALL 25mm 0.2μM Ultipor Nylon 6,6フィルターを通す前後でサンプル中に存在する薬物量を測定することにより、溶解度を評価した。濁っているかまたは非常に粘稠な溶液は、一般的に、ろ過が難しいかまたは不可能であり、それらがろ過できた場合には、多くの場合には非常に低い薬物回収率をもたらした。驚くべきことに、一部の流動性の透明溶液もまたろ過時に大きな損失を示したので、満足できる製剤は、ろ過後に90％超の薬物回収率を与えるものとして定義された。線維を形成する、化合物1のような化合物を用いるすべての溶解度測定は、動的溶解度しか測定できないことに留意すべきである。線維形成は、多数の条件セットの下では非常に緩慢であり得、準安定性溶液の溶解度を測定している可能性があり、この場合、最も安定な考えられる線維形態とは異なり、真の熱力学的溶解度に完全に到達するのには数日間から数年間を要し得る。しかしながら、少なくとも製剤化後の迅速な沈殿を回避するために、製剤は、慣用的に、ろ過前に24〜72時間保持される。
【０１１１】
最初の実験は、3％PS-20/3％PGおよび2％PX/2％PG中のpH4での化合物1の1mg/mL溶液を検討した。すべてのサンプルが透明な溶液を生じ、ろ過時にAPIの損失はなかった。次の実験は2％PGおよび0.1％、0.25％および0.5％PX、ならびに0.5％PGおよびPX中でpH約3、pH4、pH5.5およびpH7での2mg/mLを検討した。pH7、0.1％PXサンプル（若干濁っており、見た目では流動性であったが、ろ過時に回収されなかった）を除くすべてのサンプルが、透明かつ流動性に見えた。pH5.5では回収率は78％のみであり、pH4.0では92％であった。より多量のPXが、pH3および4.0での完全な回収率をもたらし、pH5.3では93〜97％であり、pH7.0では88〜92％であった。高いレベルおよび低いレベルのPGおよび0.5％PXは実質的に同一であり、このことは、この範囲の製剤化多様性ではPGはそれほど重要ではないことを示唆する。
【０１１２】
これらの実験中、非常に大きなpH変化が長期の静置時に時々見られたので、2.0mg/mLの化合物1、および0.25％PX、2％PGを用いる同様の実験をpH3、4、5.5および7で行ない、ろ過アッセイによる分析を用いて、自己緩衝化物質（NaOHを用いて滴定されるHCl塩）と、10mMヒスチジンバッファー、酢酸バッファーおよびクエン酸バッファーとを比較した。酢酸バッファーは、すべてのpHで少なくとも自己緩衝性物質と同様に良好であり、ヒスチジンバッファーはわずかに劣り、クエン酸バッファーは高い方の3種類すべてのpHで明らかに劣っており、pH4では75％の回収率しかなく、これに対してヒスチジンバッファーでは91％、未緩衝では92％、酢酸バッファーに関しては97％であった。その後、酢酸バッファーを標準とした。
【０１１３】
等張化剤の効果を調べるために、pH4およびpH5.5の10mM酢酸緩衝溶液を、2mg/mL化合物1、0.25％PXの濃度で、0.5％および2％PG、4.5％マンニトール、2％グリセリンおよび0.8％水性塩化ナトリウムを用いて検討した。塩化ナトリウムサンプルを除くすべてのサンプルが、pH4.0で98〜99％の回収率およびpH5.5で90〜94％の回収率を与え、塩化ナトリウムサンプルはそれらの2種類のpHで89％および79％の回収率を有した。むしろ低張性であった0.5％PGを除いて、すべてのサンプルが230〜310mOsm/Lの範囲であった。10mM酢酸バッファーおよび等張化剤として4.5％マンニトール、2mg/mLの化合物1、ならびにpH4.0および5.5を用いて、5種類の界面活性剤条件を検討した。それらは、界面活性剤なし、0.1％PS-20、0.1％PS-20＋0.25％PX、0.25％PX、および0.4％PXであった。界面活性剤なしでは、高pHでは0％が濾出され、pH4.0では23％が濾出され、0.4％PXおよび0.25％PX/0.1％PS-20混合物は、pH4.0では完全な回収を与え、pH5.5ではそれぞれ95％および91％の回収率を与えた。0.25％PXは幾分劣ってそれぞれ96％および91％であり、0.1％PSはかなり劣等であり、pH4および5.5でそれぞれ90％および65％の回収率を有した。
【０１１４】
等張性実験により、塩酸塩が溶解度に関して性能が良くない可能性があることが示唆されたので、実験は、2mg/mLの化合物1の三酢酸塩を用いて行なった。酢酸の弱い酸性に起因して、水中での2mg/mLでのこの塩の固有のpHは3.4〜3.6であるが、サンプルを10mM酢酸、4.5％マンニトール、および0.4％、0.5％、0.6％、0.8％および1.0％PXまたは0.4％、0.5％、0.75％、1.0％および1.5％PS-20中に溶解し、pHを4.0または5.5に調整した。pHを調製していないすべてのサンプル（pH3.4〜3.6）はろ過後に97％超の回収率を示し、pH4では98％超の回収率を示した。pH5.5では、0.4％および0.5％PXは96％の回収率を有し、より高いPX濃度では98〜99％の回収率がもたらされた一方で、PS-20製剤はそのpHではすべて92〜94％の回収率であった。これらの実験から、最適化された製剤は、同様のPS-20ベースの製剤よりも少ないPXを含有し得るが、PS-20は依然として許容可能であり、かつ比較的高い濃度でさえもPXの一部の潜在的な問題を回避し得る。
【０１１５】
［実施例7：化合物1のin vitro有効性］
細胞培養：661W光受容体細胞株は、Muayyad Al-Ubaidi氏（Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, Oklahoma City, OK）により寛大に提供された。661W細胞株は光受容体細胞株であり、SV40-T抗原をヒト光受容体間レチノール結合性タンパク質（IRBP）プロモーターの制御下に発現させることにより不死化されている（AI-Ubaidi et al., J Cell Biol., 119(6):1681-1687 (1992)、その全体が参照により本明細書中に組み入れられる）。661W細胞は、青色および緑色錐体色素、トランスデューシン、および錐体アレスチンをはじめとする錐体光受容体マーカーを発現し（Tan et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., (3):764-768 (2004)、その全体が参照により本明細書中に組み入れられる）、カスパーゼ媒介性細胞死を生じ得る（Kanan et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 48(1):40-51 (2007)、その全体が参照により本明細書中に組み入れられる）。
【０１１６】
661W細胞株は、10％ウシ胎児血清、300mg/Lグルタミン、32mg/Lプトレシン、40μL/L β-メルカプトエタノール、40μg/Lヒドロコルチゾン21-ヘミコハク酸塩、および40μg/Lプロゲステロンを含有するダルベッコ改変イーグル培地中で維持した。培地は、ペニシリン（90U/mL）およびストレプトマイシン（0.09 mg/mL）も含有した。細胞は、5％CO2および95％空気の加湿雰囲気中、37℃で増殖させた。
【０１１７】
活性アッセイ：カスパーゼ3、カスパーゼ8およびカスパーゼ9活性を、比色テトラペプチド切断アッセイキットを、製造業者の使用説明書に従って用いて測定した（BioVision, Mountain View, Calif）。総（661W/網膜）タンパク質を、以前に公開されているプロトコール通りに抽出した（Zacks et al., IOVS, 44(3):1262-1267 (2003)、その全体が参照により本明細書中に組み入れられる）。100マイクログラムの総（661W/網膜）タンパク質を、200μMの最終濃度のカスパーゼ3基質（DEVD-pNA）、カスパーゼ8基質（IETD-pNA）またはカスパーゼ9基質（LEHD-pNA）と共に、60分間インキュベートした。 405nmでの吸光度を、マイクロプレートリーダー（Spectra-MAX 190, Molecular Devices, Sunnyvale, Calif）で測定した。陰性対照として、（661W/網膜）タンパク質を、テトラペプチドを含まないアッセイバッファーと共にインキュベートした。アッセイバッファーのみがテトラペプチドとインキュベートされた第2の陰性対照が用いられた。陽性対照として、精製されたカスパーゼ3、カスパーゼ8、またはカスパーゼ9を、テトラペプチドのみとインキュベートした。
【０１１８】
本発明の開発中に行なわれた以前の実験により、Fasシグナル伝達が、in vivoでのカスパーゼ8活性化および光受容体アポトーシスで重要な役割を果たしていることが実証された。
【０１１９】
661W細胞を、FasLを用いて処理した。FasLの添加は細胞死をもたらした。661W細胞溶解物中で測定されたカスパーゼ8の活性は、FasLの濃度が増大するにつれて上昇し、500ng/mL用量でピークに達した。661W細胞を、500ng/mL FasLを用いて処理し、種々の時点での活性レベルを測定した。カスパーゼ8活性は、FasLに曝露された661W細胞中で48時間にて顕著に増大した。カスパーゼ8活性は、異なる実験で、安定して20〜30％まで用量依存的に上昇した。
【０１２０】
上記のアッセイ系をin vitroスクリーニングシステムとして用いて、Fas誘導型カスパーゼ8活性化経路の潜在的阻害剤を見い出した。Met-12（三塩酸塩）をこの661W細胞アッセイで試験した場合、10μMで最大化するFasL誘導型カスパーゼ8活性化での用量依存的減少を示し、アッセイによっては、カスパーゼ8活性化はベースラインの0〜25％の範囲まで減少する。この活性はMet-12ペプチドが送達される製剤に非常に依存する。Met-12に関する最終製剤を、このアッセイのために1000倍に希釈し、通常は100μMである用量曲線の頂点に達するために、より低い希釈率を用いた。これらの状況下では、最大用量効力は、混じり気のないDMSO溶液を用いて見られ、これは、見かけのpHが3.0よりも十分に低い透明な流動性の液体として、Met-12ペプチドを送達した。水系製剤を試した場合は、物質が試験ウェルに加えられる前に沈殿または凝集の視覚的な形跡はなかった場合でさえ、製剤は無視できないほど低い用量効力を示し、50〜100μMの用量まで最大阻害は達成されなかった。
【０１２１】
このことは、試験ウェル中での最終的な物理形状に関わりなく、投与溶液中の凝集が、これらの細胞アッセイでさえ、おそらく同じ固有の潜在的溶解度を有するであろう全く同じ条件へと希釈された本物の溶液よりも、かなり低い利用性の薬物を含む分子種をもたらすことを強く示唆する。これに対する最もあり得る説明は、非溶液中に予め形成された凝集物は試験の持続中に最適な速度で溶液中に分解しないために十分に動力学的および熱力学的に安定であるが、試験ウェルへと希釈された場合には、溶液は凝集物を形成しないか、またはよりあり得ることとしては異なる凝集物を形成し、これがより容易に溶解するものであるというものである。凝集物が異なることの主な理由は、ペプチドが、そのpHから、または共溶媒に刺激される可溶性形態からpH7.4での99％水性の環境へと変化する際に、最小でも幾分か濃縮されていない形態であることであろう。しかしながら、効率的な混合は試験ウェル中ではあり得そうになく、かつ眼の中では不可能であり、以下で議論する通り、溶媒和性プロトン（低pH）および小分子溶媒は、疎水性かつ嵩高いペプチドよりもはるかに速く水中で拡散して行くので、これらのペプチドが試験ウェル中または硝子体液中では投与後すぐに迅速に凝集することが非常に考え易い。つまり、溶液投与は懸濁液/ゲル投与よりも明らかに優れているにせよ、ペプチドのうちの多くが不溶性凝集物として隔離されず、かつ投与時に確率論的様式で薬物の有効濃度を低下させないであろうという保証はない。
【０１２２】
予期せぬことには、図1に示される通り、化合物1の三塩酸塩をDMSO中の未緩衝溶液としてこのアッセイで試験した場合、Met-12（これもまたDMSO中の三塩酸塩）と比較して、IC50測定ではMet-12よりも10倍強力であり、FasL誘導型カスパーゼ8活性化の最大阻害をもたらした濃度によって測定すると約3倍強力であることが証明された。EC50は0.4μMであるが、Met-12自体に対するEC50は4μMであり、かつ最大阻害は3μMで見られた。しかしながら、3μMを超えると、化合物1はU字型曲線を示し、30μM超では、ほとんど不活性に見えた。対照的に、同じ様式で投与されたMet-12は10μMでその（若干大きい）最大有効性に到達し、その後は100μMに向かって効力がわずかに損失するのみである（図1を参照されたい；Met-12および化合物1を用いた前処理後のヒト組み換えFasLを用いた処理から48時間後のカスパーゼ8活性）。0％は未処理対照のカスパーゼ8活性のレベルである。100％は、FasLを用いて処理しただけの対照のカスパーゼ8活性に設定されている。
【０１２３】
FasLの作用機序はFas受容体の三価リガンド三量体化を含むので、一価のMet-12誘導体がどのようにして混合型アゴニスト-アンタゴニスト用量曲線を有し得るのかを解明することは非常に困難であり、効力の損失はアッセイの溶解度アーチファクトであると考えられる。しかしながら、化合物1に関する用量効力の予期しない増大は、Met-12そのものに対して必要とされるよりも少量の薬物を投与することを可能にするはずであり、このことは、次に、硝子体内注入用のペプチド製剤に対する溶解度要件を軽減する。
【０１２４】
図2に示されるデータは、上記の説明と一致する。DMSO中の化合物1三塩酸塩（20mg/mL）が、Met-12よりも幾分か用量効力が高いが、より高い濃度では再び不活性になることが、再度示されている。対照的に、2％ポリソルベート20および2％PG（pH4）の透明なろ過できるおそらくはミセル状の溶液中で10mg/mLの濃度で作製された場合、化合物1三塩酸塩は、DMSO中のMet-12または化合物1よりも顕著に用量効力が高く、かつより効率的である。さらに、このアッセイで試験した最大用量である30μMでの最大有効性の低下は非常に小さい。この驚くべき結果は、界面活性剤中に化合物1を製剤化できることが、薬物有効性の大きな促進をもたらし得ることを示す。
【０１２５】
図3は、20mg/mL DMSO溶液と、1％および3％PS-20ならびに3％PG（pH4）を含有する化合物1三塩酸塩の2種類のポリソルベート製剤（すべて10mg/mL濃度）とを比較する。3種類すべてのサンプルが、比較的低い濃度ではこの場合に同様の有効性を示したが、1％PS-20のみがその最大効力である3μM濃度から30μMまでの全体で弱い活性低下を示し、3％PSは試験した最高用量である30μMまでの全体で活性の継続的増加を示す。
【０１２６】
図4では、pH4、10mM酢酸バッファー、4.5％マンニトールおよび0.4％PS-20中での2mg/mLの化合物1三塩酸塩の最適化製剤（濃色三角）を、DMSO中の20mg/mL化合物1三塩酸塩（淡色丸）と、661W細胞で比較する。DMSO中の三塩酸塩は、3μMでの最大効果を有する通常のU字型曲線を示し、より高濃度では顕著な回復をしている。製剤は、その低い濃度が原因で10μMまでしか試験できなかったが、DMSO溶液と同様の有効性を示す。
【０１２７】
ミセル製剤について見られた比較的高い有効性に対するあり得る説明は、pH勾配または小分子共溶媒とは明らかに対照的な、希釈および分散によって緩やかにしか影響を受けない、界面活性剤の自己会合特性により、比較的長時間にわたってペプチド溶解度が維持されるというものである。つまり、共溶媒、または強酸性溶液中では、ペプチドが注入により直接的に配置された領域を越えて分散する実際の機会を有する前に可溶性因子（水素イオン、小分子）が水性媒体中に非常に迅速に拡散する一方で、ミセルはゆっくりとしか離れ離れにならないので、ペプチドが水性媒体中に放出される前に、ミセルおよびペプチドは、水性媒体中へとより広く分散していく。このことにより、ペプチドは、ミセル状製剤からよりも、溶液製剤からはそれほど効率よく分散せず、より多くの不活性凝集物を形成するであろう。
【０１２８】
［実施例8：化合物1を用いたウサギ硝子体内での眼内薬物動態試験］
本試験は、雄性ダッチベルテッド種ウサギの硝子体内注入後の、硝子体液（VH）および網膜組織中の化合物1の濃度を測定するために行なった。濃度は、50μL両側硝子体内（IVT）用量の投与から24時間、72時間、168時間および240時間の組織中で測定した。
試験設計を、表１にまとめる。
【０１２９】
【表１】
2018514590.tif 000006
【０１３０】
試験系は、以下の要素を含む：
動物種/系統/性別：雄性ダッチベルテッド種ウサギ
供給業者：Covance Research Products社
月齢範囲：4〜5ヵ月齢
受け取り時の体重（体重範囲）：1.51〜1.85kg
投与経路：硝子体内（IVT）注入
処置期間：単回投与/眼
製剤濃度：2.0、1.0、および0.5mg/mL 化合物1三酢酸塩
投与体積：50μL/眼
【０１３１】
50μLの硝子体内（IVT）注入眼内用量を、ダッチベルテッド種ウサギのそれぞれの眼の眼球に投与した。
【０１３２】
各時点で、静脈内バルビツール酸過剰投与によりウサギを安楽死させ、眼を摘出して急速凍結した。硝子体液および網膜をすべての動物から回収し、LC-MS/MSにより化合物1について分析した。
【０１３３】
計算：
変動係数（％）：精度の推定値として用いた：
変動係数（％CV）＝（標準偏差/平均値）×100
二次最小二乗分析：標準曲線フィッティングを、1/x2重み付けを用いた二次方程式を用いて決定した：
y＝ax2＋bx＋c
[式中、y＝内部標準に対する較正標準のピーク面積比率
x＝較正標準の濃度
a＝x2の二次係数（quadratic coefficient）
b＝xの二次係数
c＝較正曲線のy切片としての定数]
二次アナライト濃度：アナライトの濃度は、上記で算出される較正曲線パラメータを用い、次にxの値について方程式を解くことにより算出される。
【０１３４】
結果
網膜濃度およびVH濃度は、以下の表2および表3に見出され、図1および図2に図示される。薬物動態パラメータを必要に応じて算出し、以下の表4および表5にまとめる。
【０１３５】
【表２】
2018514590.tif 000007
2018514590.tif 000008
【０１３６】
【表３】
2018514590.tif 000009
2018514590.tif 000010
【０１３７】
網膜および硝子体液の両方での本試験の結果を、それぞれ図5（A＋B）および図6（A＋B）に示す。化合物1の網膜濃度は、すべての群に関して、試験期間にわたって52〜156％の範囲の変動係数（％CV）を有して変動した。網膜Tmaxは、3種類のポロキサマー製剤に関して投与後72時間（3日間）または168時間（7日間）で記録されたが、用量依存的ではなく、ポリソルベート製剤に関する網膜Tmaxは投与後24時間であった。網膜AUC0-lastは、Cmaxと同様の変動パターンに従った。化合物1についての網膜T1/2は、2mg/mLポロキサマー（168時間）および1mg/mLポリソルベート（199時間）網膜データに関してのみ算出可能であった。
【０１３８】
化合物1についての硝子体液の分析は、ポロキサマー製剤に関して各時点での濃度が比較的一定であることを示した。収集されたVHの重量によって標準化して、化合物1の理論的総量が算出された。各ウサギの眼に注入された化合物1の総量は、ポロキサマーについては100μg（2mg/mL×50μL）または25μg（0.5mg/mL×50μL）であり、ポリソルベート群については50μg（1mg/mL×50μL）であった。すべての群において最も低い平均濃度は、10日間でのものであった。群1（100μg）についてVH中に残存している平均化合物1量は84.2μgから106μgの範囲（IVT投与後24時間から10日間）であった。群2（25μg）についてVH中に残存している平均化合物1量は19.5μgから23.0μgの範囲（IVT投与後24時間から10日間）であった。群3（25μg）についてVH中に残存している平均化合物1量は26.0μgから20.4μgの範囲（IVT投与後24時間から10日間）であった。ポリソルベート群4（50μg）についてVH中に残存している平均化合物1量は、IVT投与後24時間で46.8μgという高値から10日間で19.4μgの範囲であった。ポリソルベート群は、時間と共に化合物1濃度が明らかに低下した唯一の製剤であった。それであっても、すべての群で、相当な量の無傷の薬物が、投与から10日間後に検出された。
【０１３９】
VH中の化合物1についての薬物動態パラメータの算出は、各群について投与された薬物の総量と厳密に一致するCmaxを有するIVT投与後24時間または72時間のTmaxを示した（表4）。AUC0-lastは、群2および群3（両方とも0.5mg/mL）のものよりも約4倍高いAUCを有する群1（2mg/mL）のポロキサマー群間ではほとんど用量に比例していた。ポリソルベート群（1mg/mL）は、ポロキサマー群よりも用量に比例しなかったが、このことは、試験期間にわたって化合物1のVH濃度が明らかに低下した唯一の群であったことにより容易に説明できる。ポリソルベート群についてのT1/2は183時間であり、良好に線形フィッティングされたが、ポロキサマー群についてのt1/2は900時間超であり、最適な線形フィッティングには至らなかった。
【０１４０】
【表４】
2018514590.tif 000011
【０１４１】
【表５】
2018514590.tif 000012
【０１４２】
まとめると、ポロキサマー製剤またはポリソルベート製剤のいずれかとしてIVT投与された化合物1は、10日間の試験期間にわたって刺激または忍容性の問題の徴候は示さなかった。ポロキサマー製剤としてIVT投与された場合の化合物1は、網膜またはVHのいずれでも、最大で10日間の期間（より長い可能性もある）では濃度がすぐには低下しない。ポリソルベート製剤として投与された場合の化合物1は、10日間の試験期間にわたって、明らかではあるがゆっくりとした濃度の低下を示し、このことは、硝子体内薬物動態が、用いる非イオン性界面活性剤を慎重に選択することにより、特定のパラメータの範囲内で制御可能であり得ることを示唆した。
【０１４３】
［実施例9：化合物1を用いたラット眼での薬物動態研究］
本試験は、ブラウンノルウェー種ラットの硝子体内注入後の硝子体液および網膜組織での化合物1三塩酸塩の濃度を測定するために行なった。5μL両側硝子体内（IVT）用量の投与から24時間後（群1）、および72時間後（群1および2）の組織で濃度を測定した。
試験を、表6にまとめる。
【０１４４】
【表６】
2018514590.tif 000013
【０１４５】
試験系は、以下の要素を含む：
動物種/系統/性別：ノルウェーブラウン種ラット
供給業者：Charles River社
月齢範囲：1〜2ヵ月齢
受け取り時の体重（体重範囲）：165.9〜181.2g
投与経路：硝子体内（IVT）注入
処置期間：単回投与/眼
製剤濃度：0.06mg/mL ONL-1204三酢酸塩
投与体積：5μL/眼
【０１４６】
眼組織の回収
静脈内バルビツール酸過剰投与によりラットを安楽死させ、眼を摘出して急速凍結した。硝子体液（VH）および網膜をすべての動物から回収し、LC-MS/MSにより化合物1について分析した。
【０１４７】
結果
眼組織濃度
未知ブラウンノルウェー種ラット網膜および硝子体液での化合物1三塩酸塩濃度
【０１４８】
【表７】
2018514590.tif 000014
【０１４９】
【表８】
2018514590.tif 000015
【０１５０】
組織ホモジナイゼーション
未知硝子体液（VH）のホモジナイゼーションについての指示
各未知VHまたは対照ブランクに関して：VHをホモジナイゼーションチューブに量り入れる。VH重量（mg）の4倍のACN：水：1M塩酸（70：20：10、v/v/v）（μL）をホモジナイゼーションチューブに加える。2.8mmおよび1.4mmのサイズの酸化ジルコニウムビーズを加える。Precellys(登録商標)を用いて、すべてのサンプルをホモジナイズする：5500rpm、3×30秒サイクル、サイクル間は20秒間、−10〜0℃の温度。
【０１５１】
網膜眼組織標準のホモジナイゼーションについての指示
各網膜標準に関して：
ブランク網膜組織をホモジナイゼーションチューブに量り入れる。
組織重量（mg）の0.5倍の網膜作業用較正標準（μL）をホモジナイゼーションチューブに加える。
組織重量（mg）の3.5倍のACN：水：1M塩酸（70：20：10、v/v/v）（μL）をホモジナイゼーションチューブに加える。
1.4mmのサイズの酸化ジルコニウムビーズを加える。
Precellys(登録商標)を用いて、すべてのサンプルをホモジナイズする：5500rpm、3×30秒サイクル、サイクル間は20秒間、−10〜0℃の温度。
【０１５２】
網膜組織ブランク対照、および未知網膜組織のホモジナイゼーションについての指示
各未知網膜または対照ブランクに関して：
網膜組織をホモジナイゼーションチューブに量り入れる。
組織重量（mg）の4倍のACN：水：1M塩酸（70：20：10、v/v/v）（μL）をホモジナイゼーションチューブに加える。
1.4mmのサイズの酸化ジルコニウムビーズを加える。
Precellys(登録商標)を用いて、すべてのサンプルをホモジナイズする：5500rpm、3×30秒サイクル、サイクル間は20秒間、−10〜0℃の温度。
【０１５３】
標準、サンプル、およびブランクの調製
較正ストック用標準および作業用標準の調製
ストック用較正標準は、ONL-1204について500μg/mLの濃度でジメチルスルホキシド（DMSO）中に調製した。
【０１５４】
硝子体液についての作業用較正標準は、500ng/mL〜200,000ng/mL ONL-1204の範囲にわたる、ACN：水：1M塩酸（70：20：10、v/v/v）を用いた作業用ストック溶液の連続希釈により、調製した。
【０１５５】
網膜についての作業用較正標準は、100ng/mL〜200,000ng/mL ONL-1204の範囲にわたる、アセトニトリル：水：1M塩酸（70：20：10）を用いた作業用ストック溶液の連続希釈により、調製した。
【０１５６】
硝子体液分析のための、標準、未知サンプル、ブランク、および内部標準を含むブランクの調製
ポリプロピレンチューブ中で、10μL（20μL STD11）の作業用較正標準またはストックを、90μL（80μL STD11）対照ブランク硝子体液に加えた。ブランクおよび内部標準を含むブランクに関しては、100μLの対照ブランクウシ硝子体液を加えた。400μLのACN：水：1M塩酸（70：20：10、v/v/v）を、各標準またはブランクに加えた。
【０１５７】
次に、ACN：ギ酸（1000：1、v/v）を含む100μLの各硝子体液サンプルをアリコートに分けた。100μLのDMSO：水：ギ酸（50：40：10）を各硝子体液サンプルに加えた。サンプルをボルテックス混合し、続いて14,000rpmで10分間（4℃）遠心分離した。50.0μLの上清に対して、100μLの作業用内部標準（50,000ng/mL APi1887、水中）（内部標準を含まないブランクについては水）、および150μLの水を加えた。次に、サンプルをボルテックス混合し、分析のためにオートサンプラープレートに移した。
【０１５８】
網膜分析のための、標準、未知サンプル、ブランク、および内部標準を含むブランクの調製
ポリプロピレンチューブ中で、50μLのブラウンノルウェー種ラット未知ホモジネート、ウシ対照ブランクまたは較正標準ウシホモジネートを加えた。50μLのDMSO：水：ギ酸（50：40：10）を各サンプルに加えた。次に、サンプルをボルテックス混合し、14,000rpmで10分間（4℃）遠心分離した。続いて、80μLの各サンプル上清を96ウェルオートサンプラープレートへとアリコートに分けた。40μLの作業用内部標準（5,000ng/mL APi1887、水中）（内部標準を含まないブランクについては水）、および120μLの水を加えた。次に、サンプルを、マルチチャンネルピペットを用いて混合し、分析した。
【０１５９】
計算
変動係数（％）：精度の推定値として用いた：
変動係数（％CV）＝（標準偏差/平均値）×100
二次最小二乗分析：標準曲線フィッティングを、1/x2重み付けを用いた二次方程式を用いて決定した：
y＝ax2＋bx＋c
[式中、y＝内部標準に対する較正標準のピーク面積比率
x＝較正標準の濃度
a＝x2の二次係数（quadratic coefficient）
b＝xの二次係数
c＝較正曲線のy切片としての定数]
二次アナライト濃度：アナライトの濃度は、上記で算出される較正曲線パラメータを用い、次にxの値について方程式を解くことにより算出される。
【０１６０】
分析
包括的に平均された結果を図7に示す。群1に関して、各動物由来の両方の眼を1回の分析のために組み合わせた。群2では、4頭の動物由来の両眼を組み合わせてサンプルを作製した。群2でのプールされた網膜についての濃度は、A〜DサンプルおよびE〜Hサンプルについてそれぞれ462ng/gおよび1310ng/gであった。化合物1についての硝子体液の分析は、群1および群2の各動物由来のそれぞれの眼からの組み合わされたサンプルを用いて行なった。回収されたVHの重量によって標準化して、化合物1の理論的総量を算出した。各ラットの眼に注入された化合物1の総量は0.3μg（0.06mg/mL×5μL）であった。72時間データを収集した方法が異なっていたので、標準誤差は算出しなかった。濃色バーは各眼の硝子体液中の化合物1三酢酸塩の量を表わし、t＝0のバーは300ngの意図された用量を示し、淡色バーはng/gで表わされる網膜での化合物1の濃度を示す。終末相半減期は明らかに数日間の桁であるが、最初の24時間で、薬物のうちの約半分がVHからなくなった。一方で、網膜濃度は24時間で1μg/g超であり、72時間までは約40％しか有しない。このことは、ラット網膜が、少なくとも1週間は、容易に検出可能な量の薬物に曝露されるであろうことを示唆する。
【０１６１】
化合物1の網膜濃度は、群1の24時間サンプルでは146〜3670ng/gの範囲であり、群1の72時間サンプルでは409〜804ng/gの範囲であった。群1に関してVH中に残存した平均の化合物1量は、24時間および72時間の時点でそれぞれ0.157μg/サンプルおよび0.0994μg/サンプルであった。72時間での群2サンプルに関してVH中に残存した平均の化合物1量は、0.127μg/サンプルであった。このデータは、投与72時間後に、相当な量の無傷の薬物が残存することを示す。
【０１６２】
［実施例10：化合物1のin vivo有効性］
簡潔には、げっ歯類を、ケタミン（100mg/mL）とキシラジン（20mg/mL）の50：50ミックスを用いて麻酔し、フェニレフリン（2.5％）およびトロピカミド（1％）の局所投与により散瞳させた。20ゲージの硝子体網膜微細手術用の刃（Walcott Scientific, Marmora, NJ）を用いて、レンズを損傷しないように注意深く、縁から2mm後方に強膜切開部を作製した。
【０１６３】
手術用顕微鏡を介して直接可視化しながら、網膜下注入器（Glaser、32ゲージチップ；BD Ophthalmic Systems, Sarasota, FL）を強膜切開部から硝子体腔へと、続いて網膜周辺切開部から網膜下腔へと導入した。ヒアルロン酸ナトリウム（10mg/mL）をゆっくりと注入し、それにより感覚神経網膜をその下の網膜色素上皮から剥離させた。
【０１６４】
すべての実験で、上鼻側（superonasal）感覚神経網膜の約3分の1から半分を剥離させた。すべての動物で、網膜細胞数の直接比較を可能にするために、剥離を同じ位置で行なった。剥離は左眼に行ない、右眼は対照として残した。
【０１６５】
一部の眼には、野生型Met-12（HHIYLGAVNYIY、DMSO中5μg）をその三塩酸塩の形態で陽性対照として投与し、それ以外の眼には、化合物1（DMSO中0.5、1.0、5.0または10μg）をその三塩酸塩として、またはビヒクル（ジメチルスルホキシド[DMSO]）を、剥離の作製直後に、ハミルトンシリンジ（Hamilton Company, Reno, NV）を用いて5μLの体積で剥離領域の網膜下腔へと注入した。
【０１６６】
3日後にラットを安楽死させ、網膜を摘出し、固定して薄切し、TUNELアッセイのために染色した。剥離した網膜の領域について、アポトーシス細胞数をカウントした。各実験は、それぞれの投与群について5枚または6枚の網膜から取得した各4枚の切片からの4視野を含んだ。結果を図8に示す。
【０１６７】
図8に示される通り、対照の付着網膜はアポトーシス細胞を示さず、DMSO対照網膜は約4％の細胞がTUNELに関して染色されており、陽性対照Met-12（5μg）はわずか1％超がTUNELに関して陽性である。化合物1三塩酸塩処置は、0.5μgで0.58％、1μgで1.14％、5μgで0.82％、10μgで0.9％をもたらした。このモデルを用いた重要な経験に基づくと、化合物1についての結果は、互いに概ね同等であり、かつMet-12 5μgの陽性対照と概ね同等であると考えられる。つまり、予期せぬことに、化合物1三塩酸塩は、このin vivoモデルではMet-12三塩酸塩よりも大幅に有効である。
【０１６８】
［実施例11：有効性試験］
実施例10と同じげっ歯類網膜剥離モデルを用いて、DMSO中の化合物1の非常に効果的な5μg用量を、2種類の製剤中の化合物1の同じ用量、および1μg用量と比較した。
【０１６９】
第1の製剤は、3％プロピレングリコールおよび3％PS-20（pH4.0）中の化合物1三塩酸塩の1.0mg/mLまたは0.2mg/mL溶液であり、第2の製剤は2％プロピレングリコールおよび2％ポロキサマー407溶液（これもまたpH4）中の同じ濃度の化合物1であった。結果を図9に示す。
付着対照網膜はアポトーシス細胞を示さず、未処置剥離サンプルは、この時点で測定して約6.5％のアポトーシス細胞を示した。
【０１７０】
DMSO中の化合物1はアポトーシス細胞を2.5％まで減少させ、5μg PG/PS-20はアポトーシス細胞を2.9％まで減少させる同様の効力であった。しかしながら、PG/PX製剤は、その濃度では顕著により良好であり、5μgでアポトーシス細胞を0.3％まで減少させた。1μgでは、PG/PX製剤はアポトーシス細胞を0.4％まで減少させたが、PG/PS-20の1μg用量は0.01％までのさらに大きな減少を生じさせた。データにより、ミセル状製剤が機能できるだけでなく、化合物1三塩酸塩は、DMSO中に製剤化された場合よりも、ミセル状製剤中での方がさらにより強力であり得ることが実証された。
【０１７１】
［実施例12：有効性試験］
実施例10と同じげっ歯類網膜剥離モデルを用いて、DMSO中の化合物1三塩酸塩（1μg）を陽性対照として用いた。陰性対照は、評価対象の試験ビヒクル（0.4％ポロキサマー、4.5％マンニトール、10mM酢酸、pH4.5）とした。DMSO中の化合物1三酢酸塩（1μg）を、同じ用量の三塩酸塩と比較した。
【０１７２】
付着網膜（バー4）はアポトーシス細胞を有さず、ビヒクル処置剥離網膜（バー1）は4.2％のアポトーシス細胞を示し、これは未処置網膜剥離サンプルにおける経験的範囲内であるので（実施例10を参照されたい）、活性がないことを示唆する。化合物1三塩酸塩（DMSO）は2.4％のアポトーシス細胞を生じたが、三酢酸塩（DMSO）は1.2％のみしか生じさせず、このことは、塩酸塩から酢酸塩への変更は負の効果を有さず、有効性において非常に可能性の高い正の効果を有することを実証する。
【０１７３】
本出願中で言及されかつ/または以下に列挙されるすべての刊行物および特許は、参照により本明細書中に組み入れられる。記載された本発明の方法および組成物の様々な改変および変更が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明を具体的な好ましい実施形態に関して説明してきたが、特許請求される本発明がそのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるはずである。実際に、関連する技術分野の当業者には明らかである、本発明を実施するための記載された様式の様々な改変が、以下の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
【０１７４】
本発明は、その特定の実施形態を参照して非常に詳細に説明されてきたが、本発明から逸脱することなく、他の実施形態が可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および範囲は、本明細書中に含められる好ましい実施形態の説明に限定されるべきではない。文字通り、または等価物として、特許請求の範囲の意味の範囲内に入るすべての実施形態が、その中に包含されることが意図される。
【０１７５】
さらに、上記の利点は、必ずしも本発明の唯一の利点ではなく、かつ記載された利点のすべてが本発明のあらゆる実施形態により達成されることは必ずしも期待されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月18日(2018.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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