(57)【要約】【課題】本発明は、発熱性物質検出用細胞モデルの構築方法、及び細胞モデル並びに発熱性物質検出キットを提供する。【解決手段】CRISPR/Cas9技術によりゲノムの特定部位で二重結合の断裂を誘導して、相同組換え修復により細胞株の2つの染色体に、TLR4及びCD14-MD2をそれぞれノックインして緑色蛍光タンパク質GFP及び赤色蛍光タンパク質RFPでそれぞれ追跡することで、TLR4/CD14/MD2ノックイン蛍光追跡細胞モデルを構築する。LPS刺激細胞モデルにおいて、エライザ法、ウエスタンブロッティング法、質量分析法及び磁気ビーズ法によりサイトカインIL-6、TNF-αの放出を検出することができる。該細胞モデルは、安定性に優れており、感度が高く、検出下限は0.005EU/mLと、LAL試薬法の0.025EU/mLよりもはるかに低い。
2018532409.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
TLR4遺伝子を、緑色蛍光タンパク質を発現できる発現ベクターに組み込むことで、TLR4遺伝子を含む組み換えプラスミドを構築する、ステップ１と、
CRISPR/Cas9技術により、TLR4遺伝子を細胞株の1本の染色体中の遺伝子のイントロンにノックインすることで、TLR4遺伝子を安定的に発現する細胞株を得る、ステップ２と、
2つの異なる2Aペプチドを用いて、CD14、MD2及び赤色蛍光タンパク質RFP遺伝子を区切ることで、CD14遺伝子及びMD2遺伝子を含み、且つ赤色蛍光タンパク質を発現できる組み換えプラスミドを構築する、ステップ３と、
CRISPR/Cas9技術により、CD14遺伝子及びMD2遺伝子をステップ２で得られた細胞株における上記TLR4遺伝子をノックインした染色体以外の染色体中の遺伝子のイントロンにノックインすることで、TLR4遺伝子、CD14遺伝子及びMD2遺伝子を安定的に発現でき、且つ緑色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質を発現できる細胞株、すなわち上記の細胞モデルを得る、ステップ４と、を含む発熱性物質検出用細胞モデルの構築方法。
【請求項２】
前記細胞株をHEK293T、HEK293又はNIH3T3とすることを特徴とする、請求項１に記載の構築方法。
【請求項３】
前記ステップ２でTLR4遺伝子をノックインする部位を、第19番染色体のPPR1R12C遺伝子の第1イントロンとすることを特徴とする、請求項１に記載の構築方法。
【請求項４】
前記ステップ４でCD14遺伝子及びMD2遺伝子をノックインする部位を第3番染色体のCCR5遺伝子の第1イントロンとすることを特徴とする、請求項１に記載の構築方法。
【請求項５】
細胞株HEK293Tの第19番染色体のPPR1R12C遺伝子の第1イントロンにTLR4遺伝子をノックインし、第3番染色体のCCR5遺伝子の第1イントロンにCD14遺伝子及びMD2遺伝子をノックインすることで得ることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の構築方法で構築される細胞モデル。
【請求項６】
寄託期日2016年05月19日、寄託番号CGMCC  No.12296にて中国微生物菌種保藏管理委員会普通微生物センター(北京市朝陽区北辰西路1号院3号、中国科学院微生物研究所)に寄託されている、分類名称がヒト胎児由来腎臓細胞(HEK)バリアント293T/TLR4/CD14/MD2であることを特徴とする、請求項５に記載の細胞モデル。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の構築方法で構築される細胞モデル、又は請求項５又は６に記載の細胞モデル、発熱性物質標準品、IL6及び/又はTNF-α標準品からなることを特徴とする、発熱性物質検出キット。
【請求項８】
前記の発熱性物質標準品をLPS凍結乾燥粉末、IL6標準品をIL6凍結乾燥粉末、TNF-α標準品をTNF-α凍結乾燥粉末とすることを特徴とする、請求項７に記載の発熱性物質検出キット。
【請求項９】
試料溶液及び発熱性物質標準品溶液を調製する、ステップ１と、
前記試料溶液を、請求項１〜４のうちいずれか１項に記載の構築方法で構築される細胞モデル、又は請求項５〜６に記載の細胞モデルの培養液に加えて、37℃下で5時間培養する、ステップ２と、
培養上澄み液を収集してIL-6及び/又はTNF-αの含有量を測定する、ステップ３と、を含むことを特徴とする、発熱性物質検出方法。
【請求項１０】
前記のステップ３に記載のIL-6及び/又はTNF-α含有量測定は、ウエスタンブロッティング法(Western  Blot)、エライザ法(ELISA)、金コロイド標識法、又は質量分析法で行うことを特徴とする、請求項９に記載の発熱性物質検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー分野に属し、薬物及び遺伝子組み換え製品を含むバイオ製品における発熱性物質検出に関し、具体的には、発熱性物質検出用細胞モデルの構築方法、及び細胞モデル並びに発熱性物質検出方法及び発熱性物質検出キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
１．１  発熱性物質について
【０００３】
周知のように、臨床治療において、注射用薬物や関連医療機器の使用により、患者に悪寒、身震い、吐き気、発熱、嘔吐、頭痛、白血球減少、血管透過性亢進、昏迷、ショックなどの有害事象を引き起こして病状を悪化させることがよくある。それは、患者を一層苦しめ、救急処置効果及び治療効果に悪影響を与え、ひいては患者の命まで危険を及ぼすことになる。1875年、Burdon-Sanderson氏は、研究により腐敗肉から分離させた、生菌を含んでいない物質が前記一連の不良事象を引き起こし得ることを判明し、それを発熱性物質(Pyrogen)と名づけ、前記一連の症状を発熱反応として定義する(李増宏，王瑞東.佛山科学技術学院学報,2007,25(3):43-45)。その後、科学研究の進歩により、発熱性物質の定義は、微生物に生成した定温動物の異常な体温上昇を引き起こし得る発熱関連物質と、より的確になった。1923年、Seibert氏は、発熱性物質は微生物により生成され、耐熱性、非揮発性、水溶性、濾過性及び吸着性を有しており、引き止められにくく、熱安定性に優れており、厳格な滅菌を行っても、発熱反応を根絶できないことを判明した。発熱性物質には、外因性発熱性物質及び内因性発熱性物質の2種類があり、外因性発熱性物質は、主にグラム陰性菌における内毒素及びグラム陽性菌におけるタイコ酸であり、内因性発熱性物質は、主にTNF-α、INF-β、IL-1、成長因子などの体内サイトカイン、及びステロイド、プロスタグランジンなどのホルモンなどを含む。一般的に、発熱性物質とは主に、細菌性発熱性物質を指すものである。それは、一部の細菌の代謝物質、細菌の死骸及び内毒素を含み、そのうち発熱性が最も高いのは、グラム陰性G-桿菌の産物で、その次はグラム陽性G+桿菌であり、それに対してグラム陽性G+球菌の発熱性が低く、なお、カビ、酵母菌さらにウィルスも、発熱性物質を生成し得る(Charles  A,Dinarello.Endotoxin  Research,2004,10:201)。
【０００４】
細菌内毒素(Endotoxin)は、外因性発熱性物質であり、リン脂質、リポ多糖(Lipopolysaceharide、LPS)がタンパク質と結合して形成される、グラム陰性G-菌の細胞壁外層上の特殊な構造の複合体である。LPSは、複合体の主要成分及び活性中心で、その発熱性が最も高い。なお、その化学組成は、菌種によって異なり、分子量が5×104-5×105で、分子量が大きいほど、発熱性が高くなる。細菌内毒素は、細菌そのものでも細菌の代謝物質でもなく、細菌の死亡又は分解後に放出された、慣例的な滅菌方法では除去できないほどの生物活性を有する毒性物質であり、これまでに発見された生物活性が高い物質のうちの一つでもある。(劉宣亜.明膠(ゼラチン)科学与技術,2013,33(1):45-48)。細菌内毒素が、消化系統を介して人体に入った場合は、悪影響を生じさせないが、注射などの方式で血液に入った場合は、発熱性反応に代表される様々な疾患を引き起こし得る。人体に入った細菌内毒素は、細胞内の生体膜に対して直接毒性を示すだけでなく、単核食細胞によって媒介される免疫炎症反応を介して、複数種類のサイトカイン及び炎症性サイトカインの合成と放出を誘導することで過剰発現した炎症性メディエーターは、自己分泌、傍分泌、または内分泌の方式で、単核食細胞の細胞膜上の受容体に作用し、炎症性メディエーターの発現をより一層活性化させる(Guha  M,Mackman  N.Cell  Signal,2001,13(2):85-94.)。これらの炎症性サイトカインの過度放出は、細胞の機能的完全性に影響を及ぼして体内の代謝異常、血液凝固機能亢進、組織への血液灌流低下を引き起こし、ひいては多臓器不全を生じさせて死亡に至らしめることがある(Hotchkiss  RS,Karl  IE.N  Engl  J  Med,2003,348(2):138-150.)。薬物と医療管理機関が、臨床上の発熱反応をますます重要視してきている中、グラム陰性菌が幅広く分布していることから、薬物と医療機器に対する発熱性物質検出は、最近の研究の焦点となっている。
【０００５】
１．２  従来の主な発熱性物質検出方法及びその限界性
【０００６】
中国薬局方には、発熱性物質検出方法として、ウサギ発熱性物質試験法及びLAL試薬内毒素検出法が収録されている。その他に、欧州薬局方第7版(2011版)には、単球活性化試験法という新しい方法が収録されている。
【０００７】
ウサギ発熱性物質試験法
【０００８】
ウサギにおける発熱反応は、ヒトの発熱反応と似ているため、世界各国の薬局方には、正式な発熱性物質検出方法に規定されている。それは、一定の量の試料を、ウサギの体内に静脈注射し、所定の時間内で、ウサギの体温上昇状況を観察することで、試料における発熱性物質の許容限度が関連規定を満たしているか否かを判定するものである。
【０００９】
ウサギ法は、様々な面で限界性がある。その一つに、ウサギ法は定量化と標準化ができず、感度と再現性が低いうえ、ウサギの発熱性物質への感受性に個体差があり、その差が10倍以上に上る場合もある点である。もう一つに、解熱鎮痛薬、細胞毒性薬、または体温調節中枢に影響を与えやすい一部の薬物は、検出結果を偏らせる可能性がある。また、ウサギ発熱性物質試験にて合格とされた製品であっても、その多くは臨床において発熱反応を生じさせている。細胞工学が日増しに発展しており、新しい生物材料や漢方薬製品が、次々と打ち出される今は、ウサギ法では、ヒトの発熱反応を完全には再現できなくなり、その操作が複雑で時間がかかるため、注射剤の生産過程における品質管理には利用できず、一部の薬物では適用できない場合もある。
【００１０】
LAL試薬内毒素検出法
【００１１】
アメリカカブトガニの血液が、グラム陰性菌と接触したらゲルを生じさせることに基づく該検出法は、すでにアメリカ、英国、欧州、日本及び中国の薬局方に収録されている。LAL試薬内毒素検出法は、LAL試薬を用いて、グラム陰性菌が生成した細菌内毒素を検出または量化することで、試薬中の細菌内毒素の許容限度が、関連規定を満たしているか否かを判定するものである。細菌内毒素の量は、エンドトキシン活性単位(EU)で示す。LAL試薬法の内毒素検出感度は0.015EU/mLと、ウサギ法を上回っており、操作が簡単で実行しやすく、コストが低く、結果が確実でかつ迅速に得られるため、注射剤の生産過程における発熱性物質の管理及びウサギ法では検出できない細胞毒性薬物製剤に適用されている。
【００１２】
その一方で、LAL試薬は、環境要因に影響されやすく、多数の偽陽性結果を引き起こしており、また、有色製剤に対する検出はできない。LAL試薬で検出するのは、内毒素の人体に対する発熱活性または化学的含有量ではなく、アメリカカブトガニの血液細胞に対する凝集活性に過ぎず、内毒素以外の他の発熱性物質の検出はできない。また、該方法は、酵素阻害剤、カルシウムイオン・マグネシウムイオン含有キレート剤に対する検出もできないため、LAL試薬法は、ウサギ発熱性物質試験法を完全には代替できていないのが現状である。中国ではLAL試薬の調製において、カブトガニという、恐竜よりも前に出現した古い生物種を使用しているが、近年盛んに行われている埋め立てや漁業活動は、カブトガニを絶滅させている。これに鑑み、実験動物学における、Reduction(削減)、Refinement(改善)及びReplacement(代替)という3Rの原則に基づくLAL試薬法の代替方法の開発は、急務となっている。
【００１３】
単球活性化試験法
【００１４】
ウサギ法及びLAL試薬法の他に、欧州薬局方第7版(2011版)には、単球活性化試験法(monocyte  activation  test、MAT)という新しい発熱性物質検出法が収録されている。その原理は、ヒト全血と試料を共培養し、血液中の単球が放出したIL-6、IL-1β、TNF-αなどのサイトカインの量により、試料中の発熱性物質の活性を評価することである。MAT法は、発熱性物質、グラム陰性菌における内毒素及び非内毒素由来の炎症性サイトカインなどの有害物質を検出でき、有害物質の例としては、グラム陽性菌、グラム陰性菌、ウィルス、真菌の病原体関連分子パターン(PAMPs)、及び製品や加工プロセス関連の生物的又は化学的実体が挙げられる。なお、単球活性化試験法においては、由来が異なるヒト血液から分離された単球の反応性に差がある可能性があり、新鮮なヒト血液の大量取得が困難であるといった限界性があるため、普及しにくく、安定性が低いという欠点が存在する。
【００１５】
全世界では、該分野において、従来の方法の代わりに、新しい遺伝子技術に基づくin-vitro発熱性物質検出方法を導入する動向がみられており、発熱性物質検出に関する研究は、細胞・分子レベルまで進んでいるが、中国では、これに関する研究は、まだ初歩的な段階にあり、中国薬局法には、発熱性物質検出用の細胞モデルが収録されていないのが現状である。とはいえ、細胞モデルによる発熱性物質検出は、その操作しやすさと効率性から、研究の焦点となることが見込まれている。
【００１６】
１．３  発熱性物質関連の受容体及びシグナル伝達経路
【００１７】
近年、グラム陰性G-菌が引き起こした内毒素反応のメカニズムへの認識が深まるに伴い、LPSが体内の免疫応答の活性化及び発熱反応の誘発において支配的な役割を果たすという知見が得られた。LPSは、種々の病原体において保存病原性構造として存在しており、これらの保存病原性構造は、病原体関連分子パターン(Pathogen  associated  molecular  patterns、PAMP)と呼ばれる。Toll様受容体は、自然免疫系の重要な組成成分であり、その主な作用は、病原微生物の表面のPAMPを認識することで、免疫反応を開始させて外来抗原を取り除くことであり、パターン認識受容体(Pattern-recognition  receptors、PRRs)の役割に似ているとされる。
【００１８】
LPSによる炎症シグナルの伝達経路において、リポ多糖結合タンパク質(Lipopolysaccharide  binding  protein、LBP)、Toll様受容体4(Toll  like  receptor-4、TLR4)、骨髄性分化タンパク質2(Myeloid  differentiation  protein-2、MD2)及び白血球分化抗原14(Monocyte  differentiation  antigen  14、CD14)の4種類の決定的な役割を果たす受容体がある。
【００１９】
LBPは、ヒト及び動物の血清に幅広く存在している糖タンパク質であり、厳密にいうと、LPS結合タンパク質はLPS受容体ではないが、LPSによって媒介される細胞活性化には、血漿または細胞の表面でLPSと結合可能なタンパク質の関与が必要であるため、LPSが生物学的役割を果たす上での重要なベクターである。それは、細菌内毒素及びLPS中のリピドAへの親和性が非常に高い。LBPがLPSと結合して複合体を形成することで、LPSを細胞膜上のCD14受容体に輸送して、TLR4-MD2複合物と結合して一連の膜横断、細胞内シグナル伝達プロセスにより、標的細胞を活性化して炎症性サイトカイン及び免疫調節因子を放出させる。
【００２０】
TLR4は、Toll様受容体(Toll  like  receptors)の一種である。現在、10種のToll様受容体が発見されており、それぞれTLR1-10として命名されている(Lemaitre  B,Nicolas  E,Miehaut  L  et  al.Cell,1996,86(6):973-983；HuangB．Zhao  J．Unkeless  J  C  et  a1．Oneogene，2008,27(2)：218-224；劉興，馮文莉，康格非.国外医学臨床生物化学与検験学分册(海外臨床医療における生化学及び検査学部分),2001,22(3):134-136；T  Kawai,S  Akira.Cell  Death  and  Differentiation,2006,13:816-825)。異なるTLRs伝達シグナルは、由来の異なる微生物の刺激により発生するものであるため、TLRの種類によって体内に侵入した病原体の種類をある程度認識して区分することができる。Toll様受容体に関しては、体内の自然免疫におけるTLR4、TLR2の役割関連の研究が最も多くなされており、その中でTLR4のLPSシグナル伝達メカニズムに関する研究が最も多く、その研究レベルが最も高い。(秦玉新，張慶柱.中国薬理学通報(紙),2003,19(12):1336-1339；Li-Yun  Huang,James  L.DuMontelle,et  al.Clinlcal  Microbiology,2009,47:3427-3434)。TLR4は、炎症反応における最も重要なパターン識別受容体であり、LPSなど、微生物の進化過程における一部の保存配列を特異的に認識できる。TLR4はLPSによる細胞内シグナル伝達誘導における最も重要な受容体であり、主に、末梢血中の白血球、Tリンパ球、Bリンパ球、単核食細胞、肥満細胞、ラングハンス巨細胞、樹状細胞など、宿主の防御機能に関与する細胞に発現されており、なお骨髄単球での発現量が最も多い(Medzhitov  R,Preston  Hurlburt  P,Janeway  Jr.CA.Nature,1997,388:394-79)。
【００２１】
MD2は、分泌タンパク質の一種であり、TLR4及びMD2のトランスフェクタントを発現して免疫沈降実験を行ったところ、MD2はTLR4と共に発現されて細胞の表面に分泌され、TLR4への物理的作用により細胞膜にアンカーされる。MD2は、TLR4がLPSを認識して、LPSをTLR4の結合部位に定着させることに役立ち、TLR4の細胞膜への輸送及びその発現において非常に重要な役割を果たしている。関連研究では、MD2分子が欠如していれば、TLR4のLPSに対する反応性が非常に低下すると指摘している(Miyake  K，R.Shimazu,J.Kondo,et  al.Immunol.1998,161:1348-1353；Pugin  J,Stem  Voeffray  S,Daubeuf  B.Blood.2004,104(13):4071-4079；劉亜偉，劉靖華，唐靖ら.南方医科大学学報,2006,26(8):1101-1105；鐘田雨，劉靖華，姜勇.生物化学与生物物理進展,2007,34(5):460-464)。
【００２２】
CD14は、細胞質基質及び白血球の表面において、ブドウ糖とホスファチジルイノシトールのリガンジンとして発現されるタンパク質であり、LPSへの親和性が高いが、CD14分子に細胞質基質セグメントがないため、細胞内へのLPSシグナルの直接伝達はできない。LPSがCD14と結合すると、LPS-LBP-CD14リガンドと補因子の複合体を形成し、続いてTLR4と結合してシグナルを細胞内部に伝達する(Saitoh  S,Akashi  S,Yamada  T,et  al.Endotoxin  Res,2004,10(4):257-260；Nagai  Y,Akashi  S,Nagafuku  M,et  al.Nat  Immunol,  2002,3(7):667-672；Zielger,Heitbrock  HWL  and  Ulevitch  RJ.Immunol  Today,1993,14(3):121-125)。
【００２３】
細菌が体内に侵入したら、LPSは細菌の分解により血液中に放出され、血漿中に遊走するリポ多糖結合タンパク質LBPと結合して複合体を形成し、そしてCD14分子と結合するか、またはTLR4のアクセサリータンパク質である骨髄性分化タンパク質MD2と結合してLPS-MD2/TLR4複合体を形成し、これらの分子の補助により、TLR4を活性化することができる。
【００２４】
１．４  CRISPR/Cas9技術の基本原理
【００２５】
CRISPR/Cas9(The  Clustered  Regularly  Interspaced  Short  Palindromic  Repeats(CRISPR)and  CRISPR  Associated(Cas)system)は、ヒトゲノムのいかなる遺伝子でも標的とすることが可能で、且つ迅速で容易で効率的に実行できる新しい方法である。CRISPRsは、細菌や古細菌の遺伝子に幅広く存在している反復構造であり、クラスター化された、等間隔にスペーサーが入った、短い回文型の反復配列(clustered  regularly  inter-spaced  short  palindromic  repeats)を指す。それは、細菌における適応免疫応答メカニズムであり、進化途中でバクテリオファージ(bacteriophages)に対抗するために形成されたDNA断片である。細菌は、Cas9タンパク質の発現と同時に、CRISPR  RNAを転写し、このRNAは、ウィルスのゲノムと相補的対合することができる。このため、このようなCas9複合体は、ウィルスのゲノムを切断して、ウィルスを不活性化させることができる。関連研究により、CRISPRは一連の関連タンパク質、リーダー配列と共に、原核生物にバクテリオファージなどの外来遺伝子に対抗する獲得免疫性を賦与できることが判明した。CRISPR-Cas9技術は、標的配列と同一のシングルガイドRNA(sgRNA)を利用して、Cas9ヌクレアーゼをガイドして、特異的ターゲティングDNAを認識・切断させることで、DNAの二本鎖または一本鎖を断裂させ、そして細胞は、それ自体における非相同末端結合(NHEJ)及び相同組換え修復(HDR)の2種の修復メカニズムにより、断裂したDNAを修復するものである。
【００２６】
CRISPR/Cas技術は、遺伝子工学における有力なツールとなり、それはゲノムの特定遺伝子座の編集に関連する研究及び応用分野、特に遺伝子の機能解析、ヒト疾患の標的治療などへの応用において、大いなる潜在力と将来性を潜めており、これまでにない技術革新をもたらすことが見込まれている。また、その操作しやすさ、短い実験周期、低コストにより、一般のラボラトリーへの普及も可能である。よって、CRISPR/Cas技術の幅広い応用は、生物学的研究に大きな変革をもたらし、CRISPR/Cas技術によるゲノムの特定遺伝子座の編集は、遺伝子の機能解析において大きく役立つだろう。
【００２７】
内毒素は、グラム陰性菌の発熱反応誘発における主な要因であり、薬物の安全性を大きく左右する要因でもあるため、より合理的で適切な発熱性物質検出方法の構築は、早急に解決すべき課題となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
本発明は、遺伝子組み換え薬を含む薬物、バイオ製品における発熱性物質検出用細胞モデル、発熱性物質検出用の前記細胞モデルの構築方法、及び前記細胞モデルを含む発熱性物質検出キット、並びに前記キットによる発熱性物質検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明は、上記の目的を達成すべく、以下の技術的解決手段を採用する。
【００３０】
本発明は、以下のステップを含む発熱性物質検出用細胞モデルの構築方法を提供する。
【００３１】
ステップ１：TLR4遺伝子を、緑色蛍光タンパク質を発現できる発現ベクターに組み込むことで、TLR4遺伝子を含む組み換えプラスミドを構築する。
【００３２】
ステップ２：CRISPR/Cas9技術により、TLR4遺伝子を細胞株の1本の染色体中の遺伝子のイントロンにノックインすることで、TLR4遺伝子を安定的に発現する細胞株を得る。
【００３３】
ステップ３：2つの異なる2Aペプチドを用いて、CD14、MD2及び赤色蛍光タンパク質RFP遺伝子を区切ることで、CD14遺伝子及びMD2遺伝子を含み、且つ赤色蛍光タンパク質を発現できる組み換えプラスミドを構築する。
【００３４】
ステップ４：CRISPR/Cas9技術により、CD14遺伝子及びMD2遺伝子をステップ２で得られた細胞株中の上記TLR4遺伝子をノックインした染色体以外の染色体中の遺伝子のイントロンにノックインすることで、TLR4遺伝子、CD14遺伝子及びMD2遺伝子を安定的に発現でき、且つ緑色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質を発現できる細胞株、すなわち上記の細胞モデルを得る。
【００３５】
好ましくは、上記細胞株をHEK293T、HEK293又はNIH3T3とする。
【００３６】
より好ましくは、上記ステップ２でTLR4遺伝子ノックイン部位は、第19番染色体のPPR1R12C遺伝子の第1イントロンとする。
【００３７】
より好ましくは、上記ステップ４でCD14遺伝子及びMD2遺伝子をノックインする部位は、第3番染色体のCCR5遺伝子の第1イントロンとする。
【００３８】
本発明は、上記の構築方法で構築される細胞モデルをさらに提供する。前記細胞モデルは、細胞株HEK293Tの第19番染色体のPPR1R12C遺伝子の第1イントロンにTLR4遺伝子をノックインし、第3番染色体のCCR5遺伝子の第1イントロンにCD14遺伝子及びMD2遺伝子をノックインすることで得る。
【００３９】
なお、上記の細胞モデルの分類名称は、ヒト胎児由来腎臓細胞(HEK)バリアント293T/TLR4/CD14/MD2である(中国微生物菌種保藏管理委員会普通微生物センターにて寄託、住所：北京市朝陽区北辰西路1号院3号、中国科学院微生物研究所、寄託期日：2016年05月19日、寄託番号：CGMCC  No.12296)。
【００４０】
本発明は、上記の構築方法で構築される細胞モデル又は上記の細胞モデル、発熱性物質標準品、IL6及び/又はTNF-α標準品からなる発熱性物質検出キットをさらに提供する。
【００４１】
好ましくは、上記の発熱性物質標準品をLPS凍結乾燥粉末、IL6標準品をIL6凍結乾燥粉末、TNF-α標準品をTNF-α凍結乾燥粉末とする。
【００４２】
本発明は、以下のステップを含む発熱性物質検出方法をさらに提供する。
【００４３】
ステップ１：試料溶液及び発熱性物質標準品溶液を調製する。
【００４４】
ステップ２：上記の試料溶液を、上記の構築方法で構築される細胞モデル又は上記の細胞モデルの培養液に加えて、37℃下で5時間培養する。
【００４５】
ステップ３：培養上澄み液を収集してIL-6及び/又はTNF-αの含有量を測定する。
【００４６】
好ましくは、ステップ３に記載のIL-6及び/又はTNF-α含有量測定は、ウエスタンブロッティング法(Western  Blot)、エライザ法(ELISA)、金コロイド標識法、又は質量分析法で行う。
【００４７】
本発明は、CRISPR/Cas9技術により、細胞に3つの遺伝子をノックインし、そのうち2つの遺伝子を1本の染色体にノックインし、もう1つの遺伝子を他の染色体にノックインする。ノックインされたTLR4遺伝子を緑色蛍光タンパク質GFPで、ノックインされたCD14-MD2遺伝子を赤色蛍光タンパク質RFPで追跡する。自己切断2Aペプチドによる複数遺伝子ベクター構築方法を用いて、2つの異なる2AペプチドでCD14遺伝子、MD2遺伝子と赤色蛍光タンパク質RFP遺伝子を区切ることで、タンパク質発現への影響を回避する。
【００４８】
本発明の実施例では、F2A及びT2Aの2種の2Aペプチド構造を使用し、なお、F2Aは口蹄疫ウィルス(foot-and-mouth  disease  viruses、FMDV)由来の2Aペプチドで、T2Aは、タイラーマウス脳脊髄炎ウィルス(Theiler’s  murine  encephalitis  virus、TMEV)由来の2Aペプチドであり、これにより同一の2Aペプチドの遺伝子配列が発現ベクターの構築時に交差反応を引き起こして標的遺伝子座にクローニングしにくくなることを回避する。
【００４９】
発熱性物質が上記の細胞モデルを刺激すると、エライザ法、ウエスタンブロッティング法、質量分析法、磁気ビーズ法などの方法によりIL-6及び/又はTNF-αサイトカインの放出が検出されている。
【００５０】
本発明は以下の特徴を有する。
【００５１】
１、CRISPR/Cas9技術により特定遺伝子をノックインする。
【００５２】
本発明は、ウィルス、レンチウイルスベクターなどのベクターによる一過性トランスフェクションではなく、ノックインにより外来遺伝子を細胞に導入することで、遺伝的安定性を実現する。従来のCRISPR/Cas9技術は、ほとんど遺伝子ノックアウト又は遺伝子突然変異に用いられており、従来の方法で遺伝子ノックインを行う場合、オフターゲット効果、相同組換え効率が低い、ノックインベクターの構築プロセスが複雑であるといった難題を克服しなければならず、複数遺伝子をノックインする場合は、より困難になる。本発明は、特定遺伝子座へのノックインにより、複数遺伝子を細胞株(例えばHEK293T細胞)にノックインすることで、CRISPR/Cas9技術では遺伝子ノックインが困難であるという問題を解決する。
【００５３】
２、遺伝子を異なる染色体にノックインする。
【００５４】
本発明は、TLR4遺伝子、CD14遺伝子及びMD2遺伝子の3つの遺伝子を2本の異なる染色体にノックインし、挿入部位は、遺伝子ノックイン後に細胞自身の生理機能に影響を与えず、細胞の正常な生存と安定した継代を保証できる遺伝子座とする。例えば、本発明の実施例では、TLR4遺伝子をHEK293Tの第19番染色体のPPR1R12C遺伝子の第1イントロンに挿入し、CD14遺伝子及びMD2遺伝子をHEK293Tの第3番染色体のCCR5遺伝子の第1イントロンに挿入するが、この2つの部位は、いずれも遺伝子ノックイン後に細胞自身の生理機能に影響を与えず、細胞の生存と安定した継代を保証できる部位である。また、3つの遺伝子を同一の染色体に挿入しないのは、同一の染色体に挿入すると、立体障害が発現に影響を与え、また、3つの遺伝子による融合タンパク質が大きすぎると、染色体における遺伝子発現に影響を与えるからである。染色体に挿入された遺伝子の後に緑色蛍光タンパク質遺伝子又は赤色蛍光タンパク質遺伝子を加えることで、タンパク質が発現されたか否かを追跡することができ、細胞の継代において、タンパク質の発現を追跡することもできる。
【００５５】
３、検出感度が高い。
【００５６】
本発明で構築する細胞モデルは、ツール型細胞であり、LPS刺激がない場合、IL-6、TNF-αなどのサイトカインを発現しない。ヒト単球など、他の由来の細胞は、LPS刺激がなくても一定の量のIL-6、TNF-αなどのサイトカインのバックグラウンド発現が存在し、バックグラウンド発現は、後続の検出に影響を与えるのに対し、本細胞モデルは、LPS刺激がないとサイトカインを発現しないため、バックグラウンド発現が存在しない。また、一部の遺伝子組み換え製品は、細胞増殖促進物質を含んでおり、この物質による細胞増殖は、検出の不確かさを増すというデメリットがあるが、本発明にはこういう不利な点がない。本発明にかかる細胞のLPS検出下限は、0.005EU/mLに達しており、LAL試薬法の検出下限0.025EU/mLよりもはるかに低く、検出感度が高い。
【００５７】
4、従来の発熱性物質検出における欠点を解消する。
【００５８】
カブトガニは、中国国家二級重点保護野生動物で、その血液供給量が制限されている。LAL試薬の使用により、カブトガニの保護や生物資源の持続可能な利用を不利な状況にする。また、メーカーによってLAL試薬の調製方法が異なるため、同一の製品であっても発熱性物質の検出結果が一致しないことがある。単球活性化試験法では、ヒト血液を使用する必要があり、異なるヒト血液由来のヒト単球に反応性の差があるため、該方法は安定的でない。本発明にかかる細胞モデルは、検出遺伝子を染色体に挿入することで、安定的な継代を実現し、発熱性物質検出の再現性、反応性に優れており、モデルが安定的であり、従来の方法及びヒト単球活性化試験法という新しい方法における欠点が解消される。
【発明の効果】
【００５９】
本発明は、遺伝子組み換え薬品を含む薬物、バイオ製品における発熱性物質検出用細胞モデル、その構築方法、及び発熱性物質検出方法並びにキットを提供する。前記細胞モデルは、CRISPR/Cas9技術によりゲノムの特定部位で二重結合の断裂を誘導し、相同組換え修復を用いて細胞株の2本の染色体に、TLR4及びCD14-MD2をそれぞれノックインして緑色蛍光タンパク質GFP及び赤色蛍光タンパク質RFPでそれぞれ追跡することで、TLR4/CD14/MD2ノックイン蛍光追跡細胞モデルを構築する。LPS刺激細胞モデルにおいて、エライザ法、ウエスタンブロッティング法、質量分析法及び磁気ビーズ法によりサイトカインIL-6、TNF-αの放出を検出することができる。該細胞モデルは、安定性に優れており、感度が高く、検出下限は0.005EU/mLと、LAL試薬法の0.025EU/mLよりもはるかに低い。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１Ａ】本発明の一つの好適な実施例におけるTLR4を連結したpMD19-Tのプラスミドプロファイル。
【図１Ｂ】本発明の一つの好適な実施例におけるCD14を連結したpMD19-Tのプラスミドプロファイル。
【図１Ｃ】本発明の一つの好適な実施例におけるMD2を連結したpMD19-Tのプラスミドプロファイル。
【図２Ａ】本発明の一つの好適な実施例におけるTLR4とpCAG-GFPで構築される一過性発現ベクターpCAG-TLR4-GFPのプラスミドプロファイル。
【図２Ｂ】本発明の一つの好適な実施例におけるCD14とpCAG-GFPで構築される一過性発現ベクターpCAG-CD14-GFPのプラスミドプロファイル。
【図２Ｃ】本発明の一つの好適な実施例におけるMD2とpCAG-GFPで構築される一過性発現ベクターpCAG-MD2-GFPのプラスミドプロファイル。
【図３】本発明の一つの好適な実施例におけるTLR4ノックインベクター構築の方法。
【図４】本発明の一つの好適な実施例における細胞へのTLR4ノックインの原理概略図。
【図５Ａ】本発明の一つの好適な実施例におけるTLR4ノックイン細胞への白光照射後の状態の画像。
【図５Ｂ】本発明の一つの好適な実施例におけるTLR4ノックイン細胞への励起後の緑色蛍光放出の画像。
【図６】本発明の一つの好適な実施例におけるMD2-CD14ノックインベクターの構築方法。
【図７】本発明の一つの好適な実施例における細胞へのMD2-CD14ノックインの原理概略図。
【図８】本発明の一つの好適な実施例における細胞へのMD2-CD14ノックイン後の蛍光検出図。
【図９】本発明の一つの好適な実施例における4種の細胞の蛍光発現状況。
【図１０】本発明の一つの好適な実施例における共焦点顕微鏡で観察した4種の細胞における発現状況。
【図１１Ａ】本発明の一つの好適な実施例における4種の細胞へのTLR4ノックインのPCR法解析の概略図。
【図１１Ｂ】図11AのPCR結果の電気泳動図。
【図１１Ｃ】本発明の一つの好適な実施例における4種の細胞へのCD14/MD2ノックインのPCR法解析の概略図。
【図１１Ｄ】図11CのPCR結果の電気泳動図。
【図１２】本発明の一つの好適な実施例における4種の細胞のタンパク質発現状況のウエスタンブロッティング法検出結果。
【図１３Ａ】本発明の一つの好適な実施例における4種の細胞株へのLPS刺激後のIL-6放出状況のエライザ法検出結果。
【図１３Ｂ】本発明の一つの好適な実施例における4種の細胞株へのLPS刺激後のTNF-α放出状況のエライザ法検出結果。
【図１４】本発明の一つの好適な実施例における293T/TLR4/CD14/MD2細胞株へのLPS刺激後のIL-6放出量の経時変化に対するエライザ法検出結果。
【図１５】本発明の一つの好適な実施例における異なる細胞数の293T/TLR4/CD14/MD2へのLPS刺激後のIL-6放出量のエライザ法測定結果。
【図１６】本発明の一つの好適な実施例における293T/TLR4/CD14/MD2細胞株への異なる濃度LPS刺激後のIL-6放出への感度に対するエライザ法検出結果。
【図１７Ａ】本発明一つの好適な実施例における293T/TLR4/CD14/MD2細胞のLPS刺激によるTNF-αへの反応性のウエスタンブロッティング法解析結果。
【図１７Ｂ】本発明一つの好適な実施例における293T/TLR4/CD14/MD2細胞のLPS刺激によるIL-6への反応性のウエスタンブロッティング法解析結果。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
以下、本発明の技術的解決手段を、実施例を用いてさらに説明するが、本発明は下記実施例だけに限定されるものではない。
【００６２】
機器及び材料：
1、制限酵素は、すべてカナダのFermentas社から購入する。
2、pMD19-Tは、宝生物工程(中国大連)有限公司から購入する。
3、pCAG-GFP、pCAG-RFP、pX330、pMCS.DT-A及びpAAV-CAG-RFPはすべて米Addgene社から購入する。
4、ヒト単球分離溶液キットは、中国天津▲こう▼洋生物製品公司から購入する。
5、RPMI1640培地(無血清)及びDMEM培地(無血清)は、GIBCO社から購入し、ウシ胎児血清は米Hyclone社から購入する。
6、HEK293T細胞は、中国科学院(上海)細胞バンクから購入する。
7、DNAシークエンシングは、汎用プライマー又は特異的なプライマーを用いて、北京奥科鼎盛生物科技有限公司により実行する。
【００６３】
なお、本明細書に詳細なステップを記載していない内容に関しては、いずれも慣例的な分子生物学的方法又は試薬説明書の記載に従って実行する。
【実施例１】
【００６４】
細胞モデルの構築
【００６５】
ステップ１：ヒト末梢血単球cDNAの調製
【００６６】
ステップ１.１：ヒト末梢血単球の分離及び培養
【００６７】
ヒト単球分離溶液キットの説明書の記載に従って操作し、健常者からの抗凝固剤入りの新鮮全血5mLから、ヒト末梢血単球を抽出して、RPMI1640培地に加えて1回遠心洗浄し、1500r/分で10分遠心分離し、上澄み液を捨てる。血液試料1mLあたりウシ胎児血清を10%含んでいるRPMI1640培養液3-4mLを加え、細胞を再懸濁させて細胞数を計測し、細胞密度を2×107/mLに調節して10cm2培養皿で培養し、37℃下で静置し、5%CO2インキュベーターで2-3時間培養して上澄み液を捨てると、単層培養ヒト単球が得られる。所定の比率で希釈した細胞懸濁液10μLを吸い取って、0.4%のトリパンブルー染色液10μLと混合して生細胞数を計測し、細胞密度を2×107/mL程度に制御する。
【００６８】
ステップ１.２：ヒト末梢血単球cDNAの調製
【００６９】
ステップ１.１で調製したヒト末梢血単球の細胞培養液を捨て、PBS溶液で3回リンスし、6ウェルプレートのウェル毎にTRIzol試薬(Gibco  BRL社製)200μLを加え、数回ピペッティングを行って細胞を溶解する。溶解した細胞を1.5mL遠心管に収集し、室温下で5分静置する。クロロホルム0.1mLを加え、15秒激しく振動させ、室温下で2-3分静置する。12000g、4℃下で15分遠心分離して、水相を吸い取り、他の1.5mL遠心管に移す。イソプロパノール250μLを加え、均一に混合し、室温下で10分静置する。12000g、4℃下で10分遠心分離してRNAを沈殿させ、75%エタノール1mLを加えて沈殿を洗浄し、空気中で5-10分乾燥させる。適量のRNaseを含まないDEPC水を加えてRNAを溶解し、55-60℃水浴を10分行ってRNAを十分に溶解させる。紫外分光光度計でRNA試料の濃度(OD260)及び純度(OD260/OD280)を測定し、続いてRNAの濃度を1μg/μLに調節しておく。
【００７０】
RNA試料を70℃水浴で5分変性させて、氷の上に5分置く。次表に示す反応系にて逆転写反応を行い、合計反応容積を20μLとする。
【００７１】
RT-PCR反応系
【表１】
2018532409.tif 000003
【００７２】
均一に混合し、37℃下で60分、70℃下で10分不活化させ、水を加えて100μLとし、-20℃下で保管しておく。
【００７３】
ステップ２：TLR4、CD14、MD2遺伝子ベクターの構築及び解析
【００７４】
ステップ２.１：TLR4、CD14、MD2遺伝子原核細胞発現ベクターの構築及び解析
【００７５】
ステップ２.１．１：TLR4、CD14、MD2遺伝子のDNA断片の取得
【００７６】
NCBIにて検索して、ヒトゲノムTLR4、MD2及びCD14遺伝子のmRNA配列を得る。Primer  premier5.0を用いて、関連文献を参照してリRT-PCR用プライマーを設計し、それぞれMD2及びCD14遺伝子の上流プライマーの5'末端側に制限酵素認識配列EcoRIを、下流プライマーの5'末端側に制限酵素認識配列KpnI及び保護塩基を導入し、TLR4遺伝子の上流プライマーの5'末端側に制限酵素認識配列KpnIを、下流プライマーの5'末端側に制限酵素認識配列SmaI及び保護塩基を導入する。プライマーは、北京奥科鼎盛生物科技有限公司によって合成される。PCR反応が指数関数的増幅期にあるように、増幅曲線からサイクル数を決定する。なお、用いる制限酵素切断部位は、いずれも該当遺伝子にない切断部位とする。
【００７７】
PCRプライマー配列及びPCR産物の長さ
【表２】
2018532409.tif 000004
【００７８】
PCR反応系
【表３】
2018532409.tif 000005
【００７９】
PCR反応条件
【表４】
2018532409.tif 000006
【００８０】
反応完了後、アガロースゲル電気泳動を行って、PCR産物のサイズを解析する。解析結果では、TLR4遺伝子、CD14遺伝子及びMD2遺伝子のサイズはそれぞれ2500bp程度、1100bp程度、500bp程度で、いずれも想定したサイズと一致する。アガロースゲルDNA回収キットを用いてTLR4遺伝子、CD14遺伝子及びMD2遺伝子をそれぞれ回収し-20℃下で保管する。
【００８１】
ステップ２.１.２：TLR4、CD14、MD2遺伝子原核細胞発現ベクターの構築及び解析
【００８２】
回収されたDNA断片をそれぞれpMD19-Tクローニングベクターに連結し、なお、TLR4をKpnIとSmaIの間に、CD14をEcoRIとKpnIの間に、MD2をEcoRIとKpnIの間に挿入することで、3種のクローニングベクターを得て、続いて形質転換により大腸菌DH5αに導入し、増幅し、プラスミドを抽出し、制限酵素切断を行って、電気泳動により陽性クローンを選別する。
【００８３】
得られた陽性クローンをpMD19-T-TLR4、pMD19-T-CD14、pMD19-T-MD2と命名し(それぞれ図1A、図1B、図1Cを参照)、DNAシークエンシングを行って、Pubmed遺伝子データベースにて、それとマッチする遺伝子クローンを検索する。
【００８４】
ステップ２.２：TLR4、CD14、MD2遺伝子真核細胞発現ベクターの構築及び解析
【００８５】
ステップ２.２.１：TLR4、CD14、MD2遺伝子真核細胞発現ベクターの構築及び解析
【００８６】
DNAシークエンシング結果が正しいpMD19-T-TLR4陽性クローニングプラスミド及びpCAG-GFP真核細胞発現ベクタープラスミドに対して、制限酵素SmaI及びKpnIでダブルダイジェスションを行い、得られた断片を電気泳動分離させて、目標断片及びベクターアームを回収する。
【００８７】
TLR4断片とpCAG-GFP断片を連結して、形質転換により大腸菌DH5αに導入して増幅し、プラスミドを抽出し、制限酵素切断を行い、電気泳動により陽性クローンを選別する。
【００８８】
得られた組み換え陽性プラスミドをpCAG-TLR4-GFPと命名し(図2Aを参照)、DNAシークエンシングを行って、Pubmed遺伝子データベースにてそれとマッチする遺伝子クローンを検索する。
【００８９】
MD2、CD14遺伝子真核細胞発現ベクターの構築方法は、TLR4遺伝子発現ベクターと概ね同じであり、DNAシークエンシング結果が正しいpMD19-T-MD2、pMD19-T-CD14陽性クローニングプラスミド及びpCAG-GFP真核細胞発現ベクタープラスミドに対して、制限酵素EcoRI及びKpnIでダブルダイジェスションを行って連結し、形質転換後に単クローン性プラスミドを選別して培養を行い、プラスミドを少量抽出して、再び制限酵素ダブルダイジェスションを行い、アガロースゲル電気泳動を行って観察し、目標断片が挿入されたサイズが正しい陽性クローンを選別して、それぞれpCAG-MD2-GFP(図2Bを参照)、pCAG-CD14-GFP(図2Cを参照)と命名し、DNAシークエンシングを行って、Pubmed遺伝子データベースにてBLAST検索を行い、遺伝子クローンがマッチするか否かを確認する。
【００９０】
ステップ３：CRISPR/Cas9技術によるTLR4ノックイン細胞モデルの構築
【００９１】
ステップ３.１：ノックイン部位の決定
【００９２】
NCBIのNucleotideデータベースにて検索して、ヒトゲノム第19番染色体PPPR1R12CのゲノムDNA塩基配列を得る。ヒトPPP1R12C遺伝子は19q13.42に位置し、遺伝子IDは54776である。ゲノムDNAの全長は26688bpで、第1エクソン配列は1-378bp、第1イントロン配列は378-4806bpである。PPPR1R12Cの第1イントロン配列をhttp://crispr.mit.edu/に入力して、CRISPRノックインに適する標的部位について検討する。前記サイトにて得られた結果に基づき、適切なguideRNA標的部位を得る。sgRNAの標的部位は1849bpに位置し、Primer  premier5.0を用いてプライマーを設計して、1849bpから上流1000bpあたりのロングアーム及び下流1000bpあたりのショートアームを増幅する。
【００９３】
本実施例では、第19番染色体PPPR1R12CのゲノムDNA塩基配列の第1イントロン領域をTLR4遺伝子ノックイン部位とし、関連報告によると、前記部位に挿入された外来遺伝子は、細胞自身の生理機能に影響を与えないという。なお、TLR4遺伝子を、細胞の生理機能に影響を与えない他の遺伝子座に挿入してもよく、挿入対象遺伝子が異なれば、ターゲティングプライマーの設計時に適宜調整してもよい。
【００９４】
ステップ３.２：CRISPR/Cas9プラスミドの設計及び構築
【００９５】
ステップ３.１.１：CRISPR/Cas9プラスミドの構築
【００９６】
pX330プラスミドを骨格とし、相補的なターゲティングsgRNA配列を合成して、両端に制限酵素BbsI切断部位を導入する。sgRNAの合成配列を表5に示す。
【００９７】
PPPR1R12C遺伝子のターゲティングsgRNAの合成配列
【表５】
2018532409.tif 000007
【００９８】
制限酵素BbsIでpX330を消化し、得られた断片を電気泳動分離させ、pX330のシングルダイジェスション断片を回収する。相補的な2つのsgRNA断片をアニーリングしてリン酸化し、sgRNAを制限酵素切断済みの線状化pX330に連結する。連結反応の産物を大腸菌DH5αに導入して、増幅し、プラスミドを抽出してBbsIによるシングルダイジェスションを行い、制限酵素切断を行って電気泳動により、挿入断片が存在するか否かを確認する。組み換え陽性プラスミドを得て、pPsg-Cas9と命名し、DNAシークエンシングを行う。
【００９９】
ステップ３.２.２：ターゲティングベクターの構築
【０１００】
HEK293T(以下293T)のゲノムDNAを抽出し、PPPR1R12C遺伝子のsgRNAターゲティング部位の上流、下流からそれぞれ1000bp程度の配列を選択して、ターゲティングベクターのロングアーム及びショートアームとする。Primer  premier5.0を用いてプライマーを設計する(表6を参照)。ロングアーム、ショートアームをPCRしてゲル回収し、pMD19-Tベクターに連結して、形質転換、解析、DNAシークエンシングを行うことで、pMD19-T-ロングアームプラスミド及びpMD19-T-ショートアームプラスミドを得る。
【０１０１】
PPPR1R12C遺伝子のロングアーム及びショートアームのプライマー及び産物の長さ
【表６】
2018532409.tif 000008
【０１０２】
ロングアーム、ショートアームをそれぞれ制限酵素切断してpMCS.DT-Aターゲティングベクターに連結する。具体的な手順は、pMCS.DT-Aプラスミド及びDNAシークエンシング結果が正しいpMD19-T-ロングアームプラスミドに対して、制限酵素SalI及びHindIIIによるダブルダイジェスションを行い、電気泳動分離させて、回収し、T4連結酵素を用いてロングアーム断片とショートアーム断片を連結し、連結反応の産物を形質転換により大腸菌DH5αに導入する。組み換えプラスミドに対して、制限酵素切断、電気泳動及びDNAシークエンシングを行うことで、DTA-ロングアームを得る。DNAシークエンシング結果が正しいDTA-ロングアームプラスミド及びpMD19-T-ショートアームプラスミドに対して、制限酵素SalI及びHindIIIによるダブルダイジェスションを行って、電気泳動を行って回収し、T4連結酵素を用いてショートアーム断片とDTA-ロングアーム断片を連結し、連結反応の産物を形質転換により大腸菌DH5αに導入する。組み換えプラスミドに対して、制限酵素切断、電気泳動及びDNAシークエンシングを行うことで、DTA-ロングアーム-ショートアームプラスミドを得て、DNAシークエンシングを行う。
【０１０３】
DNAシークエンシング結果が正しいDTA-ロングアーム-ショートアームプラスミド(ドナー)及びpCAG-TLR4-GFPプラスミドに対して、制限酵素SpeI及びNotIによるダブルダイジェスションを行い、電気泳動を行って回収し、T4連結酵素を用いてCAG-GFP-TLR4断片とDTA-ロングアーム-ショートアームの制限酵素切断断片を連結し、連結反応の産物を形質転換により大腸菌DH5αに導入する。組み換えプラスミドに対して、制限酵素切断、電気泳動及びDNAシークエンシングを行うことで、DTA-ショートアーム-CAG-TLR4-GFP-ロングアームターゲティングベクター(TLR4-ドナー)を得る。構築方法を図3、細胞へのTLR4ノックインの原理を図4に示す。
【０１０４】
ステップ３.２.３：ターゲティングベクター及びCRISPR/Cas9プラスミドの電気的形質転換
【０１０５】
電気的形質転換前24時間に、6ウェルプレートに293T細胞を0.5-1.0×105接種し、トランスフェクタント時は細胞系が90-95%のコンフルエント状態に達する。ターゲティングベクターDTA-ショートアーム-CAG-TLR4-GFP-ロングアームの相同組換えアームのショートアームの5’末端側にてBstBIを用いてシングルダイジェスションすることで線状化する。PBSで細胞を洗浄し、パンクレアチンで消化し、800rpmで3分遠心分離して細胞を収集する。電気的形質転換緩衝液(無血清DMEM)を用いて293T細胞を再懸濁させ、細胞濃度を1×107/mLに調整する。4mmキュベットを選択し、1回に細胞300μL、ターゲティングベクター25ng、pPsg-Casプラスミドをエレクトロポレイションする。室温下で操作し、260V、30ミリ秒にてエレクトロポレイションする。続いて細胞を6ウェルプレートに接種し、培養液2mLを補足し、37℃下で培養する。細胞への電気的形質転換後48時間に、蛍光を観察する。
【０１０６】
ステップ３.２.４：限界希釈法による緑色蛍光単クローン性細胞の選別
【０１０７】
成長状態が良好な細胞を収集して、懸濁液を調製する。細胞増殖測定法により細胞懸濁液の細胞数を正確に測定する。段階希釈法により細胞を10/mLの細胞懸濁液(1細胞/0.1mL)に調製する。細胞懸濁液を96ウェルプレートに接種し、1ウェル0.1mLとする。96ウェルプレートを37℃、5%CO2インキュベーターに配置し、4日後に取り出して観察し、記録して結果を統計する。単クローン性細胞が成長したウェルから、成長状態が良好で緑色蛍光の強度が高い方を選択して、24ウェルプレートに移して再びクローニングし、培養又は拡大培養、複数回の継代を経て緑色蛍光を安定的に発現できる細胞クローンを得て、293T/TLR4細胞クローンと命名し、図5A及び図5Bに示すように、293T/TLR4を白光で照射すると蛍光を発せず、励起光で照射すると緑色蛍光を発する。
【０１０８】
ステップ４：CRISPR/Cas9技術によるCD14-MD2ノックイン細胞モデルの構築
【０１０９】
ステップ４.１：pCAG-MD2-2A-CD14-2A-RFPプラスミドの構築
【０１１０】
pAAV-CAG-RFPを鋳型とし、PCR法によりRFP断片を増幅して、5’末端側のプライマー設計時にF2A配列(表7を参照)、制限酵素AgeI切断部位を導入し、3’末端側に制限酵素NotI切断部位を導入する。制限酵素AgeI及びNotIでpCAG-CD14-GFPプラスミドを消化して、緑色蛍光タンパク質GFP断片を切って、F2A-RFP断片を連結する(プライマー配列は表8を参照)。制限酵素切断及びDNAシークエンシングを経てpCAG-CD14-F2A-RFPプラスミドを得て、293T細胞に一過性トランスフェクションして、蛍光の発現状況を観察する。PCR法によりMD2断片を増幅し、3’末端側のT2A配列(表7を参照)に制限酵素AgeI切断部位を導入し、制限酵素KpnIでpCAG-CD14-F2A-RFPプラスミドを消化して、abm社製のライゲーションフリークローニングキットを用いて相同組換え法により、MD2-T2A断片を連結する(プライマーの配列は表8を参照)。制限酵素切断及びDNAシークエンシングを経て、pCAG-MD2-T2A-CD14-F2A-RFPプラスミドを得る。
【０１１１】
F2A及びT2Aの配列
【表７】
2018532409.tif 000009
【０１１２】
F2A-RFP及びMD2-T2Aプライマー並びに産物の長さ
【表８】
2018532409.tif 000010
【０１１３】
ステップ４.２：ノックイン部位の決定
【０１１４】
NCBIのNucleotideデータベースにて検索して、ヒトゲノム第3番染色体CCR5のゲノムのDNA塩基配列を得る。CCR5遺伝子の第1イントロン配列をhttp://crispr.mit.edu/に入力して、CRISPRノックインに適する標的部位について検討する。前記サイトで得られた結果に基づき、適切なguideRNA標的部位を得る。
【０１１５】
本実施例では、第3番染色体CCR5のゲノムDNA塩基配列の第1イントロン領域をCD14遺伝子及びMD2遺伝子のノックイン部位とし、関連報告によると、前記部位に挿入された外来遺伝子は、細胞自身の生理機能に影響を与えないという。なお、CD14遺伝子及びMD2遺伝子を、細胞の生理機能に影響を与えない他の遺伝子座に挿入してもよく、挿入対象遺伝子が異なれば、ターゲティングプライマーの設計時に適宜調整してもよい。
【０１１６】
ステップ４.３：CRISPR/Cas9プラスミドの設計及び構築
【０１１７】
ステップ４.3.1：CRISPR/Cas9プラスミドの構築
【０１１８】
pX330プラスミドを骨格とし、相補的なターゲティングsgRNA配列を合成して、両端に制限酵素BbsI切断部位を導入する。sgRNAの合成配列を表9に示す。
【０１１９】
CCR5ターゲティングsgRNAの合成配列
【表９】
2018532409.tif 000011
【０１２０】
制限酵素BbsIでpX330消化し、得られた断片に対する電気泳動分離により、pX330のシングルダイジェスション断片を回収する。相補的な2つのsgRNA断片をアニーリングしてリン酸化し、sgRNAを制限酵素切断済みの線状化pX330に連結する。連結反応の産物を形質転換により大腸菌DH5αに導入して、増幅し、プラスミドを抽出してBbsIによるシングルダイジェスションを行い、制限酵素切断後に電気泳動により、挿入断片が存在するか否かを確認することで、組み換え陽性プラスミドを得て、pCsg-Casと命名し、DNAシークエンシングを行う。
【０１２１】
ステップ４.３.２：CCR5遺伝子のターゲティングベクターの構築
【０１２２】
CCR5遺伝子のsgRNAターゲティング部位の上流、下流からそれぞれ1000bp程度の配列を選択して、ターゲティングベクターのロングアーム及びショートアームとする。Primer  premier5.0でプライマーを設計する(表10を参照)。ロングアーム、ショートアームをPCRしてゲル回収し、pM19-Tベクターに連結して、形質転換、解析、DNAシークエンシングを行う。
【０１２３】
ロングアーム及びショートアームのPCR用プライマー配列
【表１０】
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【０１２４】
ロングアーム、ショートアームをそれぞれ制限酵素切断してpMCS.DT-Aターゲティングベクターに連結する。具体的な手順は、ステップ３.2.2を参照する。なお、pMCS.DT-AベクターのSalIとHindIIIの間にショートアームを、SacIIとSacIの間にロングアームを連結し、最終的にDTA-ロングアーム-ショートアームを得る。
【０１２５】
pCAG-MD2-T2A-CD14-F2A-RFPプラスミドを制限酵素切断してDTA-ロングアーム-ショートアームベクターに連結し、具体的な手順はステップ３.2.2を参照する。最終的にターゲティングベクターのDTA-ショートアーム-CAG-MD2-T2A-CD14-F2A-RFP-ロングアームを得る。構築方法を図6、細胞へのMD2及びCD14ノックインの原理を図7に示す。
【０１２６】
ステップ４.３.３：ターゲティングベクター及びCRISPR/Cas9プラスミドの電気的形質転換
【０１２７】
ステップ３.２.３の操作を参照して、ターゲティングベクター及びpCsg-Casを電気的形質転換により293T及び293T/TLR4に導入し、ステップ３.2.4の操作に従い単一クローン性細胞を選別して、293T/CD14/MD2細胞及び293T/TLR4/CD14/MD2細胞の2種の赤色蛍光クローニング細胞を得る。図8に示すように、2種の細胞クローンは、いずれも赤色蛍光を発することができる。なお、293T/CD14/MD2細胞を対照とし、293T/TLR4/CD14/MD2細胞を目標細胞株とする。
【０１２８】
ステップ５：細胞モデルの解析
【０１２９】
ステップ５.１：蛍光検出及び共焦点顕微鏡解析
【０１３０】
ステップ５.１.１：蛍光検出
【０１３１】
293T、293T/TLR4、293T/CD14/MD2、293T/TLR4/CD14/MD2の4種の細胞株をいずれも3回継代させ、蛍光で照射する(図9を参照)。結果によると、293Tにおいて緑色蛍光の発現も赤色蛍光の発現も認められず、293T/TLR4において緑色蛍光の安定的な発現が認められ、293T/CD14/MD2において赤色蛍光の安定的な発現が認められ、293T/TLR4/CD14/MD2において緑色蛍光及び赤色蛍光両方の安定的な発現が認められた。
【０１３２】
ステップ５.１.２：共焦点顕微鏡解析
【０１３３】
続いて、上記4種の細胞株に対して共焦点顕微鏡解析を行う。図10に示すように、293Tにおいて緑色蛍光の発現も赤色蛍光の発現も認められず、293T/TLR4において緑色蛍光の安定的な発現が認められ、293T/CD14/MD2において赤色蛍光の安定的な発現が認められ、293T/TLR4/CD14/MD2において、緑色蛍光及び赤色蛍光両方の安定的な発現が認められた。上記2つの画像が重畳するMergeモデルでは、293T/TLR4/CD14/MD2において、緑色蛍光と赤色蛍光が重畳されているが、293T/TLR4の画像と293T/CD14/MD2の画像を重畳させると、緑色蛍光及び赤色蛍光がそれぞれ表示されており、これは蛍光解析の結果と一致する。また、TLR4における緑色蛍光は、細胞膜及び細胞質基質に集中しているのに対し、CD14-MD2における赤色蛍光は、細胞質基質に集中している。
【０１３４】
ステップ５.２：PCR法解析
【０１３５】
293T、293T/TLR4、293T/CD14/MD2、293T/TLR4/CD14/MD2の4種の細胞株から、ゲノムDNAを抽出し、ゲノムの異なる遺伝子座にてプライマーを設計し、正しくノックインされたか否かを確認する。プライマー配列を表11に示す。その結果、野生型は、プライマー1+プライマー2及びプライマー4+プライマー5で断片を増幅できるのに対し、プライマー1+プライマー3及びプライマー4+プライマー6では断片を増幅できない。TLR4ノックイン細胞は、プライマー1+プライマー3で断片を増幅でき、CD14-MD2ノックイン細胞は、プライマー4+プライマー6で断片を増幅できる。図11A-図11Dに示すように、PCR法解析により、293T/TLR4、293T/CD14/MD2、293T/TLR4/CD14/MD2が所定の部位にノックインされたことが判明した。
【０１３６】
PCR法解析用プライマーの配列
【表１１】
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【０１３７】
ステップ５.３：ウエスタンブロッティング法によるタンパク質の発現状況解析
【０１３８】
293T、293T/TLR4、293T/CD14/MD2、293T/TLR4/CD14/MD2の4種の細胞株の細胞を溶解して総タンパク質を抽出する。アクチンを内標準物質として、ウエスタンブロッティング法によりTLR4、CD14、MD2の3種のタンパク質の発現状況を解析する。図12に示すように、293T細胞においてTLR4、CD14、MD2の発現が認められず、293T/TLR4においてTLR4の発現が認められたがCD14、MD2の発現が認められず、293T/CD14/MD2においてTLR4、CD14、MD2の発現が認められ、293T/TLR4/CD14/MD2においてTLR4、CD14、MD2の発現が認められた。
【０１３９】
なお、293T/CD14/MD2において、CD14/MD2の存在により、細胞内のTLR4が活性化されて少量のTLR4を発現している可能性があると分析している。
【実施例２】
【０１４０】
細胞モデルによる発熱性物質マーカーLPSの検出
【０１４１】
１、エライザ法によるIL-6及びTNF-α発現検出に基づく、LPS刺激への細胞の反応性解析
【０１４２】
293T、293T/TLR4、293T/CD14/MD2、293T/TLR4/CD14/MD2の4種の細胞株にLPS刺激をかけ、エライザ法により上澄み液におけるサイトカインIL-6及びTNF-αの放出量を測定する。図13A及び図13Bに示すように、293T、293T/TLR4がLPS刺激に対して反応が起きなかった。293T/CD14/MD2、293T/TLR4/CD14/MD2はLPS刺激をかけると、IL-6又はTNF-αを放出したが、293T/CD14/MD2における放出量は、293T/TLR4/CD14/MD2における放出量より少ない。
【０１４３】
293T/TLR4/CD14/MD2細胞株を使用して後続の試験を行う。LPS刺激後の異なる時刻のIL-6の放出状況を測定する。図14に示すように、5〜6時間前後に、IL-6の放出ピークとなる。異なる細胞数の293T/TLR4/CD14/MD2への5EU/mLのLPS刺激後6時間のIL-6放出量を測定する。図15に示すように、104の細胞数でも5EU/mLのLPS刺激に対して反応が起こりIL-6を放出した。293T/TLR4/CD14/MD2細胞のLPS刺激への検出下限を測定する。図16に示すように、0.005EU/mLのLPS刺激でも293T/TLR4/CD14/MD2細胞にIL-6を放出させており、LAL試薬の検出下限よりも低い。
【０１４４】
２、ウエスタンブロッティング法によるIL-6及びTNF-αの発現検出に基づく、293T/TLR4/CD14/MD2細胞のLPS刺激への反応性解析
【０１４５】
高濃度(4EU/mL)、中等濃度(1EU/mL)、低濃度(0.5EU/mL)のLPS刺激を用いて1×106個の293T/TLR4/CD14/MD2細胞を刺激し、6時間後に培養上澄み液1mLをとって、200μLに濃縮させ、ウエスタンブロッティング法検出により、培養上澄み液におけるIL-6、TNF-αの放出が認められた(図17A及び図17B参照)。
【０１４６】
３、質量分析法によるIL-6及びTNF-αの発現検出に基づく、293T/TLR4/CD14/MD2細胞のLPS刺激への反応性解析
【０１４７】
293T/TLR4/CD14/MD2細胞株にLPS刺激を5時間かけ、培養上澄み液1000μLをとり精製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置(MALDI-TOF/MS)を用いて解析及び修正を行うことで、タンパク質スポット毎のペプチドマスフィンガープリントを取得し、Mascot  Distillerを用いてスペクトルから単一同位体シグナルピークを認識し、得られたペプチド断片の質量電荷比(m/z)データをMascot検索システムに導入し、IPI  Human  v3．53タンパク質データベースにて検索し、結果として、Mascotスコア＞61(P＜0.05)、陽性と判定する。
【０１４８】
４、金コロイド標識法によるIL-6及びTNF-αの発現検出に基づく、293T/TLR4/CD14/MD2細胞のLPS刺激への反応性解析
【０１４９】
金コロイド標識法は、ナノスケールの金コロイドをトレーサー及び検出剤とする抗原抗体反応に基づく検出方法である。検出時に、293T/TLR4/CD14/MD2細胞株にLPS刺激を5時間かけ、試料とモデル細胞を5時間共培養し(ウエスタンブロッティング法、エライザ法と同一の試料と培養操作)、培養上澄み液50μLにそれぞれIL-6及びTNF-α用金コロイド試験紙(市販品又は特注品)を入れ、検出バンドでの反応に基づき、IL-6及びTNF-αを発現したか否かを判定する。
【０１５０】
上記実施例からわかるように、本発明にかかる細胞モデルは、発熱性物質の刺激に対して反応を起こすことができる。グラム陰性菌における内毒素及び非内毒素由来の、グラム陽性菌、グラム陰性菌、ウィルス、真菌の病原体関連分子パターン(PAMPs)、及び製品や加工プロセス関連の生物的又は化学的実体を含む有害物質を検出できるだけでなく、その検出下限は、LAL試薬よりも低く、感度がより高く、ヒト全血検出よりも高い安定性を有する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【国際調査報告】
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