(57)【要約】  本発明は、少なくとも、（i）免疫グロブリンのFc部分である第1部分と、（ii）ヒトB7-H1ポリペプチドの細胞外部分またはその変異体を含む第2部分とを含む、敗血症に罹患している対象における臓器不全の治療および／または予防における使用のための融合ポリペプチドに関する。更に、敗血症に罹患している対象における臓器不全の治療および／または予防における使用のための融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明に含まれる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、（i）免疫グロブリンのFc部分である第1部分と、（ii）ヒトB7-H1ポリペプチドの細胞外部分またはその変異体を含む第2部分とを含む、敗血症に罹患している対象における臓器不全の治療および／または予防における使用のための融合ポリペプチド。
【請求項２】
臓器不全がCD8細胞傷害性T細胞依存的多臓器不全である、請求項1記載の使用のための融合ポリペプチド。
【請求項３】
免疫グロブリンがヒトIgGである、請求項1または2記載の使用のための融合ポリペプチド。
【請求項４】
ヒトB7-H1ポリペプチドの細胞外部分またはその変異体が、
（a）配列番号1または5に示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（b）配列番号2または6に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（c）（a）または（b）のポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を有し、PD1ポリペプチドに尚も結合できるポリペプチド；ならびに
（d）アミノ酸置換L27A、S34Y、D49S、Y56S、E58S、K62S、H69F、E72S、K75S、K89S、A98F、Q100S、R113YおよびS117Yのうちの少なくとも1つを含む（a）または（b）に記載のアミノ酸配列を有し、PD1ポリペプチドに尚も結合できるポリペプチド
からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項記載の使用のための融合ポリペプチド。
【請求項５】
融合ポリペプチドが、（iii）細胞傷害性T細胞に特異的に結合できるポリペプチドである第3部分を含む、請求項1〜4のいずれか1項記載の使用のための融合ポリペプチド。
【請求項６】
細胞傷害性T細胞に特異的に結合しうるポリペプチドが、CD8に結合できるMHC-1複合体の部分を含むポリペプチド、CD28に結合できるCD80の部分、CD8に特異的に結合できる抗体またはそのフラグメントであるポリペプチド、CD28に特異的に結合できる抗体またはそのフラグメントであるポリペプチド、およびリンパ球機能関連抗原-3（LFA-3）のCD2結合性部分からなる群から選択される、請求項5記載の使用のための融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記の少なくとも第1部分と少なくとも第2部分とが永久的または可逆的に互いに連結されている、請求項1〜6のいずれか1項記載の使用のための融合ポリペプチド。
。
【請求項８】
対象が哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項1〜7のいずれか1項記載の使用のための融合ポリペプチド。
【請求項９】
融合ポリペプチドがボーラスとして1回適用される、または少なくとも2回適用される、請求項1〜8のいずれか1項記載の使用のための融合ポリペプチド。
【請求項１０】
融合ポリペプチドが少なくとも1つのさらなる薬物と共に適用される、請求項1〜9のいずれか1項記載の使用のための融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記の少なくとも1つのさらなる薬物が、抗生物質、昇圧薬、ステロイド、抗凝固薬、抗血栓薬、炎症性サイトカインおよびDAMPインヒビターからなる群から選択される、請求項10記載の使用のための融合ポリペプチド。
【請求項１２】
融合ポリペプチドが、投与されると、対象における敗血症誘導性細胞傷害性T細胞を抑制する、請求項1〜11のいずれか1項記載の使用のための融合ポリペプチド。
【請求項１３】
融合ポリペプチドが、投与されると、敗血症起因性活性化に対して対象における細胞傷害性T細胞における長期持続的寛容を誘導する、請求項1〜12のいずれか1項記載の使用のための融合ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項1〜13のいずれか1項記載の融合ポリペプチドをコードする、敗血症に罹患している対象における臓器不全の治療および／または予防における使用のためのポリヌクレオチド。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドが、該対象における該ポリヌクレオチドの発現を可能にする発現構築物中に含まれる、請求項14記載の使用のためのポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも、（i）免疫グロブリンのFc部分である第1部分と、（ii）ヒトB7-H1ポリペプチドの細胞外部分またはその変異体を含む第2部分とを含む、敗血症に罹患している対象における臓器不全の治療および／または予防における使用のための融合ポリペプチドに関する。更に、敗血症に罹患している対象における臓器不全の治療および／または予防における使用のためのその融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明に含まれる。
【背景技術】
【０００２】
敗血症は、全身が感染に反応する場合に生じうる、生命を脅かす疾患である。集中的な研究にもかかわらず、依然として敗血症は集中治療室における第3位の死亡原因である（Balk, 2004; Dellingerら, 2008; Kaukonenら, 2014; Vincentら, 2014）。病態生理学的には、敗血症の進行中に、部分的に並行して生じる低炎症期の開始を引き起こす初期の過剰炎症（hyper-inflammatory）期が存在する（Angusおよびvan der Poll, 2013; MunfordおよびPugin, 2001; Vincentら, 2013）。
【０００３】
最近の治療アプローチは、主に、炎症促進性メディエーターの放出を抑制し、それらの機能を遮断し、またはそれらを循環から除去するための、過剰炎症応答の治療に焦点を合わせている。1つの最も有望な候補はTNF-αであり、その抑制は敗血症を有意に改善することが示された（Marquez-Velascoら, 2006）。中和抗体を使用して、このアプローチはヒトの状況に合ったものに改変されたが、敗血症生存率を改善することはできなかった（Clarkら, 1998; Reinbartら, 2001）。しかし、このアプローチでは、過剰炎症は限られたものであり、ほとんどの患者はこの炎症期を生き延びた。炎症促進性免疫応答の遮断は、一次および二次感染と闘い該感染を抑制する宿主の能力を低下させるため、この治療アプローチは最終的に敗血症生存率を有意に改善することはできずに、低炎症期を生じさせ、または増強した。この免疫抑制は、しばしば、多臓器不全症候群（MODS）および患者の死を招く（Ottoら, 2011; Torgersenら, 2009）。
【０００４】
免疫麻痺中の患者を救うための治療アプローチも適用されている。単球が不活性化されていることを考慮して（Dockeら, 1997; Pangaultら, 2006）、GM-CSF治療が敗血症中の単球機能を回復させた（Meiselら, 2009）。マウスモデルにおいて、核内受容体ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPARγ）を拮抗阻害することは、敗血症死亡率と相関する過剰炎症期に伴う免疫麻痺の特徴の1つ（Hotchkissら, 2006; Wesche-Soldatoら, 2007b）であるT細胞枯渇を回避することが示されている（Schmidtら, 2011）。敗血症の多因的原因、様々な既存合併症または患者の遺伝的前提条件ゆえに、適切な患者特異的治療の達成は尚も困難である（HotchkissおよびKarl, 2003; HotchkissおよびOpal, 2010）。
【０００５】
一般に、敗血症が患者において診断され、敗血症の進行中の比較的末期の事象である肝臓損傷が既に生じている場合、疾患の重症度は既に遥かに進行している。敗血症時に、臓器不全およびそれに続いてしばしば生じる多臓器不全症候群（MODS）が頻繁に患者の死を招く。したがって、既存のケアオプションを改善し、または新規治療アプローチを確立するためには、臓器損傷をもたらすメカニズムを理解することが不可欠である。
【０００６】
このように、敗血症時の臓器不全の治療および／または予防が大いに必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の根底にある技術的課題は、前記の必要性を満たすための手段および方法の提供と認めることができれる。この技術的課題は、特許請求の範囲および後記において特徴づけられている実施形態により解決される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明は、少なくとも、（i）免疫グロブリンのFc部分である第1部分と、（ii）ヒトB7-H1ポリペプチドの細胞外部分またはその変異体を含む第2部分とを含む、敗血症に罹患している対象における臓器不全の治療および／または予防における使用のための融合ポリペプチドに関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】敗血症マウスの肝臓におけるCD8+ T細胞数の増加。偽手術またはCLP手術の24時間後、マウスを犠死させた。肝臓を取り出して単細胞懸濁液を調製した。細胞亜集団をFACS分析により決定した。各処理の5匹のマウスの定量が示されている。
【図２】CLP後の肝臓におけるB7-H1、B7-DC、FasおよびPD-1の発現。偽手術またはCLP手術の24時間後、マウスを犠死させた。肝臓を取り出して単細胞懸濁液を調製した。B7-H1、PD-1およびFasの発現を分析するために、（A）および（C）において全ライセートを調製した。（B）B7-Hの肝細胞特異的発現および（D）B7-DC表面発現をFACS分析により行った。全ての実験は少なくとも5回行った。データは平均±SD（*p<0.5）を表し、または代表的なブロットを示す。
【図３】LPSまたはLTA刺激後のHepa1-6細胞におけるB7-H1発現。Hepa1-6細胞を、示されている時間にわたり、100ng/mlのLPSまたは100ng/mlのLTAで刺激した。ついで細胞を回収し、mRNAを単離し、またはタンパク質溶解物を調製した（「材料および方法」に記載されているとおりに行った）。B7-H1（A）のmRNA発現を定量的PCRにより分析した。18s rRNAをハウスキーピング遺伝子として使用した。（B）LPS刺激後のB7-H1タンパク質発現をウエスタン分析により測定した。全ての実験は少なくとも5回行った。データは平均±SD（*p<0.5）を表し、または代表的なブロットを示す。
【図４】LPS依存的B7-H1ダウンレギュレーションはCTL媒介細胞傷害性を増強する。細胞傷害性T細胞を単離し、エフェクター細胞として「材料および方法」に記載されているとおりにOT-Iマウスの脾臓から富化した。Hepa1-6細胞を標的細胞として使用した。（A）細胞傷害性アッセイを確立するために、Hepa1-6細胞を、オボアルブミンペプチド257-264（OVA）またはB型肝炎ウイルス（HBV）対照ペプチドのXYμg/mlで2時間パルスした。Hepa1-6細胞をLPS [100ng/ml]で24時間処理し、または対照として未処理のままにした。ついでHepa1-6細胞をCellTrackerOrange（商標）で染色し、細胞傷害性T細胞（標的：エフェクター細胞の比は1：5）と共に24時間インキュベートした。生存標的細胞の数をFACS分析により決定した。5つの独立した実験の定量が示されている。データは平均±SD（*p<0.5）を表す。（B）Hepa1-6細胞を、B7-H1 EGFPをコードするベクターまたは対照ベクター（CV）で安定にトランスダクションした。FACS富化後、陽性細胞を、示されている時間にわたりLPS [100ng/ml]で刺激し、または対照として未処理のままとした。ついでHepa1-6細胞をCellTrackerOrange（商標）で染色し、細胞傷害性T細胞（標的：エフェクター細胞の比は1：5）と共に24時間インキュベートした。生存標的細胞の数をFACS分析により決定した。5つの独立した実験の定量が示されている。データは平均±SD（*p<0.5）を表す。
【図５】アデノウイルスB7-H1発現はCLP後の肝臓損傷を改善する。EGFP（adTrack）またはB7-H1 EGFP（adTrack B7-H1）をコードする5×109個のアデノウイルス粒子をマウスに静脈内注射した。アデノウイルス粒子の投与の4日後、CLP手術によりマウスを多微生物性敗血症に付した。24時間後、マウスを犠死させ、肝臓を取り出し、血液を集めた。トランスダクション効率は、非免疫細胞、すなわちCD45-（A）に関してゲート化された肝単細胞懸濁液におけるFACS分析により決定した。1つの代表的な結果が示されている。血清を血液から単離し、ALT/AST放出をReflotron Plus血液分析装置（B）で測定した。それぞれ4匹のマウスの結果を示す。
【図６】組換えB7-H1 Fcキメラは敗血症時の肝臓損傷を予防する。（A）細胞傷害性T細胞依存的肝細胞死を、標的細胞としてのHepa1-6細胞およびエフェクター細胞としてのOT-Iマウス由来CD8+ T細胞を使用して測定した。CellTrackerOrange（商標）染色Hepa1-6細胞をOVA257-264ペプチドで2時間パルスした。ついでHepa1-6細胞をOT-Iマウスの脾臓に由来する富化CD8+ T細胞と5：1（エフェクター：標的細胞）の比で共培養した。並行して、示されている濃度で組換えB7-H1 Fcを加えた。生存標的細胞の数をFACS分析により調べた。5つの独立した実験の定量が示されている。データは平均±SD（*p<0.5）を表す。（B）野生型マウスをCLP手術に付した。その直後、B7-H1 Fcを静脈内投与した。溶媒対照としてPBSのみを投与した。血清中へのALT/AST放出（これはReflotron Plus血液分析装置で調べられる）を測定することにより、CLP手術後の肝臓損傷を評価する（B7-H1 Fc処理対対照; CLP; n = 5/5, *p <0.5）。
【図７】GSH前駆体N-アセチル-システイン（NAC）を加えてB7-H1発現を回復させた。Hepa1-6細胞を、示されている時間にわたり、10mM NACを含有する100ng/ml LPSで刺激した。ついで細胞を回収し、タンパク質ライセートを調製した（「材料および方法」に記載されているとおりに行った）。B7-H1タンパク質の発現をウエスタン分析により測定した。全ての実験は少なくとも5回行った。代表的なブロットが示されている。
【図８】Nox4の抑制はB7-H1発現を増強する。Hepa1-6細胞をNox4特異的インヒビターGKT137831 [10μM]で24時間処理した。ついで細胞を回収し、B7-H1発現をFACS分析により測定した。5つの独立した実験の定量を（A）に示す。全体的NOX4ノックアウトマウスの肝臓ホモジネートにおいて、B7-H1タンパク質発現をウエスタンブロット法により調べた（B）。代表的なブロットが示されている。B7-H1発現の定量（WT対NOX4-KO; n = 5/5; *p <0.5）を（C）に示す。盲腸結紮・穿刺（CLP）による多微生物敗血症の発症の後の肝細胞上のB7-H1発現を、「材料および方法」に記載されているとおり、CD45-、すなわち、非免疫細胞に関してゲート化するFACS分析により、肝単細胞懸濁液において調べた。定量が示されている（D）（偽 対 CLP; 野生型（WT）偽が1に設定されている; n = 5/5/5/5; *p <0.5）。CLP手術後の全体的NOX4ノックアウトマウスにおける肝臓損傷を、血清中へのALT/AST放出（これは、Reflotron Plus血液分析装置を使用して測定される）を調べることにより評価する（E）（NOX4-KO; 偽 対 CLP; n = 5/5; *p <0.5）。
【図９】全体的NOX2ノックアウトは敗血症時の肝B7-H1発現を回復させる。全体的NOX2ノックアウト（NOX2-KO）を有する及び骨髄系統特異的ノックアウト（LysM-Cre NOX2-KO）を有するマウスならびに野生型同腹仔（WT）を使用した。CLPまたは偽手術の24時間後、マウスを犠死させた。血液を集め、肝臓を取り出した。（A）肝細胞におけるB7-H1タンパク質の発現を、「材料および方法」に記載されているとおり、CD45-、すなわち、非免疫細胞に関してゲート化するFACS分析により、肝単細胞懸濁液において測定した（WT 対 NOX2-KO 対 LysM-Cre NOX2-KO; 偽 対 CLP; 偽処理WTが1に設定されている; n = 5/5/5; *p<0.5）。（B）血清を血液から単離し、Reflotron Plus血液分析装置でALT / AST放出を測定した（LysM-Cre NOX2-KO 対 NOX2-KO; 偽 対 CLP; n = 5/5/5/5; *p>0.5）。
【図１０】敗血症時のB7-H1発現の維持 - 新規治療アプローチ。（A）多微生物性敗血症時には、十中八九はLPSまたはLTAのような細菌成分に応答して肝Nox2により活性酸素種（ROS）が形成される。これらのROSは肝細胞の表面上の共抑制性タンパク質B7-H1の発現をダウンレギュレーションし、その結果、自己免疫様態での細胞傷害性T細胞（CTL）の活性化を可能にしている。ROS生成酵素Nox2の遺伝的欠損によるB7-H1発現の維持（B）または組換えB7-H1（C）の外的投与（C）はCTL寛容を維持し、したがって敗血症の結果を改善する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書中で用いる「ポリペプチド」なる語は、ペプチド結合によって互いに共有結合している幾つかの、典型的には少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個または少なくとも60個のアミノ酸からなる分子を意味する。ペプチド結合によって共有結合している20個未満のアミノ酸からなる分子は、通常、ペプチドと考えられる。
【００１１】
本発明における「融合ポリペプチド」は、少なくとも2つのポリペプチドまたはペプチドから構成されるポリペプチドを意味する。したがって、本明細書中で言及されている融合ポリペプチドは、2個、3個、4個、5個または更にはそれ以上のポリペプチドまたはペプチド部分を含みうると理解される。しかし、本発明においては、融合ポリペプチドは、少なくとも、本明細書に特定されている第1および第2部分を含むものとする。融合ポリペプチドに含まれるポリペプチドまたはペプチド部分は、永久的に、典型的にはペプチド結合により、あるいは可逆的に、例えばイオン結合、水素結合および／もしくはファンデルワールス力に基づくアフィニティー結合またはジスルフィド結合により、互いに連結されうる。本発明の融合ポリペプチドの部分間の永久的結合は、典型的には、組換え製造によって達成されうる。この目的には、該部分をコードするポリヌクレオチドを化学的に又は組換えDNA技術により合成し、適当な発現系で発現させる。ついで、発現された融合ポリペプチドを発現系から精製することが可能である。リガンドおよび受容体部分を含む種々のアフィニティー結合系が当技術分野で公知であり、したがって、更に手間をかけることなく、互いに可逆的に結合した種々のペプチドまたはポリペプチド部分を含む融合ポリペプチドを構築するために当業者により使用されうる。そのようなアフィニティー結合系の典型例としては、抗体／抗原、ストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチン、および当技術分野でよく知られた他のものに基づくものが挙げられる。
【００１２】
本発明に従い適用される融合ポリペプチドは、免疫グロブリンのFc部分である第1部分と、ヒトB7-H1ポリペプチドの細胞外部分またはその変異体を含む第2部分とを含むものとする。好ましくは、ヒトB7-H1ポリペプチドの細胞外部分またはその変異体は融合ポリペプチドのN末端に位置し、一方、免疫グロブリンのFc部分はC末端に位置する。
【００１３】
「免疫グロブリンの結晶化可能フラグメント（Fc）部分」なる語は、例えばパパインを使用する抗体のタンパク質分解切断により得られうる、抗体のCH2およびCH3ドメインを含む抗体フラグメントを意味する。多種多様な種に由来する種々の免疫グロブリンが当技術分野で公知である。これらの免疫グロブリンには、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgWまたはIgYが含まれる。しかし、本発明においては、免疫グロブリンのうち、哺乳類、特にヒトにおいて見られるもの、すなわち、IgA、IgD、IgE、IgG、IgMが好ましい。抗体のFc部分がクラス効果を決定する。重鎖の定常ドメインのみが抗体のFc部分を形成するため、重鎖のクラスがクラス効果を決定する。抗体における重鎖の可能なクラスには、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミューが含まれる。これらの重鎖クラスがアイソタイプを定める。抗体のアイソタイプが異なれば、それらのそれぞれのFc部分ゆえに、該アイソタイプが有するクラス効果も異なる。そのようなFc媒介性クラス効果には、エフェクター細胞またはエフェクター分子に影響を及ぼすもの、例えばオプソニン作用、凝集、溶血、補体活性化およびマスト細胞脱顆粒が含まれる。Fc部分を形成するCH2およびCH3ドメインのアミノ酸配列は種々の抗体アイソタイプに関して当技術分野でよく知られており、更に手間をかけることなく当業者により提供されうる。本発明において言及されるFc部分は、好ましくは、翻訳後修飾、より好ましくは、グリコシル化されうる。好ましくは、本発明における該免疫グロブリンはIgGであり、より好ましくは、ヒトIgGである。ヒトIgGをコードするアミノ酸配列は当技術分野でよく知られており、同様に、それらをコードする核酸配列もよく知られている。更に、どのアミノ酸が該アミノ酸配列のFc部分に対応するかもよく知られている。
【００１４】
「ヒトB7-H1ポリペプチドの細胞外部分」は、プログラム死-リガンド1（PD-L1）または分化クラスター274（CD274）としても公知であるヒトB7ホモログ1タンパク質の細胞外部分を意味する。B7-H1タンパク質は、活性化T細胞上に見出されるPD-1受容体に結合することが知られている40kDaの膜貫通タンパク質である。B7-H1/PD-1複合体はCD8+ T細胞の増殖の制御に関与することが示唆されている。ヒトB7-H1タンパク質のアミノ酸配列は当技術分野でよく知られている。
【００１５】
好ましくは、本発明に従い使用されるヒトB7-H1のアミノ酸配列はUniprot KB番号Q9NZQ7として公的に入手可能であり、配列番号4に示されており、または配列番号3もしくはGenBankアクセッション番号AF177937に示されている核酸配列によりコードされる。該ヒトB7-H1の細胞外部分は、Uniprot KB番号Q9NZQ7として公的に入手可能な配列のアミノ酸19〜239を含み、配列番号2に示されており、配列番号1に示されている核酸配列によりコードされ、またはGenBankアクセッション番号AF177937の配列のヌクレオチド55〜717によりコードされる。
【００１６】
好ましくは、本発明に従い使用されるマウスB7-H1のアミノ酸配列はUniprot KB番号Q9EP73として公的に入手可能であり、配列番号8に示されているか、または配列番号7に示されるかもしくはまたはGenBankアクセッション番号NM 021893のもとで入手可能な核酸配列によりコードされる。該マウスB7-H1の細胞外部分はUniprot KB番号Q9EP73として公的に入手可能な配列のアミノ酸19〜239を含み、配列番号6に示されており、配列番号5に示されている核酸配列によりコードされ、またはGenBankアクセッション番号NM 021893の配列のヌクレオチド55〜717によりコードされる。
【００１７】
本発明におけるヒトB7-H1ポリペプチドの細胞外部分としては、好ましくは、前記の特定の細胞外ドメインのいずれかの変異体が含まれる。そのような変異体は、典型的には、少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失および／または付加によって、前記の特定のアミノ酸配列とは異なる。それでも、ヒトB7-H1ポリペプチドの細胞外部分の変異体は、ヒトB7-H1ポリペプチドの細胞外部分によりもたらされる生物学的効果を尚も奏することが可能であり、特に、依然としてPD-1に結合可能である。該変異体は、好ましくは、配列番号2もしくは6に示されているアミノ酸配列に対して、または配列番号1もしくは5に示されている核酸配列によりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を有する。本明細書中で用いるアミノ酸配列または核酸配列間の配列同一性は、最高オーダーのマッチが得られるようにそれらの配列を整列（アライメント）させて、2つの核酸配列またはアミノ酸配列の間の同一ヌクレオチドまたはアミノ酸の数を決定することにより評価することができる。それは、例えばBLASTP、BLASTNまたはFASTAのようなコンピュータプログラムにおいてコード化された公開技術または方法を用いて計算されうる（Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403）。同一性の割合（％）の値は、好ましくは、比較ウィンドウにわたって計算される。比較ウィンドウは、好ましくは、整列される短い方の配列の配列全体の長さ、または該配列の少なくとも半分である。異なる配列を比較するためには、種々のアルゴリズムに基づく一連のプログラムが当業者に利用可能である。この場合、NeedlemanおよびWunschまたはSmithおよびWatermanのアルゴリズムは、特に信頼性のある結果をもたらす。配列アラインメントを行うためには、プログラムPileUp（Higgins 1989, CABIOS 5, 151）またはプログラムGapおよびBestFit（Needleman 1970, J Mol Biol 48: 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2: 482）[これらはGCGソフトウェアパケット（Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711）の一部である]が使用されうる。本発明のもう1つの態様においては、パーセント（％）単位の前記の配列同一性値は、以下の設定で全配列領域にわたってプログラムGAPを使用して決定される：ギャップウェイト（Gap Weight）：50、長さウェイト（Length Weight）：3、平均マッチ：10.000および平均ミスマッチ：0.000（これらは、特に示されていない限り、常に配列アライメントのための標準設定として用いられるものとする）。
【００１８】
また、ヒトまたはマウスB7-H1ポリペプチドの前記の特定の細胞外部分をコードする核酸配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズできる核酸配列を有するポリヌクレオチドによりコードされるものも、ヒトB7-H1ポリペプチドの前記の特定の細胞外部分の変異体として本発明に含まれる。本明細書中で用いるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、B7-H1と実質的に同じ生物学的機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特定することを可能にするものである。好ましくは、本発明におけるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は45℃における6×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）中のハイブリダイゼーションおよびそれに続く50℃〜65℃の温度における0.2×SSC、0.1％ SDS中の1回以上の洗浄工程である。これらのハイブリダイゼーション条件は、核酸のタイプ、そして例えば有機溶媒が存在する場合に依存して、温度およびバッファー濃度に関して異なることが、当業者に公知である。核酸ハイブリダイゼーション技術に関する詳細は当業者によく知られており、標準的なテキスト、例えばSambrookらに見出されうる。あるいは、前記変異体をコードするポリヌクレオチドは、PCRに基づく技術、例えば、混合オリゴヌクレオチドプライマーに基づくDNA増幅（すなわち、ヒトまたはマウスB7-H1ポリペプチドの細胞外部分の保存ドメインに対する縮重プライマーを使用するもの）によっても得られうる。保存ドメインはヒトまたはマウスB7-H1の細胞外部分のアミノ酸または核酸配列の配列比較により特定されうる。
【００１９】
好ましくは、ヒトB7-H1ポリペプチドの細胞外部分の前記変異体は、以下のアミノ酸置換（交換）、すなわち、L27A、S34Y、D49S、Y56S、E58S、K62S、H69F、E72S、K75S、K89S、A98F、Q100S、R113YおよびS117Yの少なくとも1つを含む。ヒトB7-H1ポリペプチドの細胞外部分におけるこれらの前記アミノ酸置換はマウスB7-H1ポリペプチドの細胞外部分における以下のアミノ酸置換（交換）に対応する：L27A、S34Y、D49S、Y56S、E58S、E62S、A69F、E72S、K75S、K89S、A98F、Q100S、C113YおよびS117Y。これらのアミノ酸置換はPD-1へのB7-H1タンパク質の結合および／または活性を増強することが既に報告されている。Wang 2003, J. Exp. Med. 197 No. 9: 1083-1091を参照されたい。
【００２０】
また、好ましくは、本発明に従い適用される融合ポリペプチドは、配列番号9に示されているアミノ酸配列を有する。あるいは、該融合ポリペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失および／または付加を有するその変異体である。該変異体融合タンパク質は、ヒトB7-H1ポリペプチドの細胞外部分によりもたらされる生物学的効果を尚も奏することが可能であり、特に、依然としてPD-1に結合可能である。該変異体は、好ましくは、配列番号9に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００２１】
本発明による融合ポリペプチドはまた、個々の部分の間に例えばリンカーまたはスペーサー配列のようなさらなる部分を含みうる。更に、さらなる機能に寄与する部分も含まれる。そのような部分には、例えば、生物における或る細胞の標的化を可能にする部分、融合ポリペプチドの安定性を増強する部分、ならびに例えばタグのような、融合ポリペプチドの製造および／または精製を容易にする部分が含まれる。
【００２２】
好ましくは、該融合ポリペプチドは標的化のための第3部分、特に、細胞傷害性T細胞に特異的に結合できるポリペプチドである第3部分を含む。より好ましくは、細胞傷害性T細胞に特異的に結合できる該ポリペプチドは、CD8に結合できるMHC-1複合体の部分を含むポリペプチド、CD28に結合できるCD80の部分、CD8に特異的に結合できる抗体またはそのフラグメントであるポリペプチド、CD28に特異的に結合できる抗体またはそのフラグメントであるポリペプチド、およびリンパ球機能関連抗原-3（LFA-3）のCD2結合性部分からなる群から選択される。そのような部分がそれぞれのタンパク質からどのようにして誘導されうるかは当業者によく知られている。
【００２３】
本明細書中で用いる「治療」なる語は、疾患またはそれに関連する少なくとも1つの症状を改善または治癒することを意味する。したがって、疾患またはそれに関連する症状の改善または治癒が認められる場合、その治療は有効であるとみなされる。治療は全ての対象において有効であるわけではない可能性があると理解される。しかし、本発明においては、治療は、治療される対象の少なくとも統計的に有意な割合において有効であることが想定される。有効に治療されうる対象の統計的に有意な割合をどのようにして決定するかは当業者によく知られている。ある割合が統計的に有意かどうかは、よく知られた種々の統計的評価手段、例えば、信頼区間の決定、p値の決定、スチューデントt検定、マンホイットニー検定などを用いて、更に手間をかけることなく当業者により決定されうる。詳細はDowdyおよびWearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に記載されている。好ましい信頼区間は少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％である。p値は、好ましくは、0.1、0.05、0.01、0.005または0.0001である。好ましくは、本発明により想定される確率は、与えられたコホートまたは集団の対象の少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％または少なくとも90％に関して、有効な治療の所見が正確であることを可能にする。
【００２４】
本明細書中で用いる「予防」なる語は、疾患またはそれに関連する少なくとも1つの症状の発症を回避すること、または該疾患または前記の少なくとも1つの症状の悪化を防ぐことを意味する。本明細書中で言及される予防は、典型的には、薬物が投与される期間のいずれかで達成されうる。しかし、薬物の投与を停止すると、予防は無限には持続しないかもしれないが、薬物の投与後の或る予防時間枠にわたって存在し続けうる。典型的には、本発明による予防時間枠は少なくとも1日、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも6日または少なくとも7日でありうる。しかし、予防時間枠は薬物の投与量および投与様式または製剤の種類にも左右されうる。例えば、高投与量が適用される場合、通常はより長い予防時間枠が得られうる。薬物の徐放製剤が投与される場合、または対象における薬物の即時代謝をもたらさない経路で薬物が投与される場合、同じことが言える。そのような場合、予防時間枠は数週間、数ヶ月または更には数年まで増加しうる。予防は全ての対象において有効であるわけではない可能性があると理解される。しかし、本発明においては、予防は、少なくとも、対象の統計的に有意な割合において有効であることが想定される。有効に予防されうる対象の統計的に有意な割合をどのようにして決定するかは当業者によく知られている。ある割合が統計的に有意であるかどうかは、前記の種々のよく知られた統計評価手段を用いて、更に手間をかけることなく当業者により決定されうる。
【００２５】
本発明の融合ポリペプチドは臓器不全の治療および／または予防に使用されるため、それは、好ましくは、医薬として製剤化される。本発明の場合の医薬は、好ましくは、医薬上活性な化合物としての本発明の生物学的に活性な融合ポリペプチドと、1以上の他の成分、例えば1以上の医薬上許容される担体とを含有する医薬組成物を意味する。
【００２６】
融合ポリペプチドは液体または凍結乾燥形態で存在しうる。例えば、融合ポリペプチドはグリセロールおよび／またはタンパク質安定化剤（例えば、ヒト血清アルブミン）と共に存在しうる。
【００２７】
医薬は典型的には全身投与され、好ましくは静脈内または筋肉内に投与される。しかし、製剤の性質および所望の治療用途に応じて、医薬は他の経路によっても投与されうる。
【００２８】
融合ポリペプチドは医薬の有効成分または薬物であり、好ましくは、通常の方法に従い薬物を標準的な医薬担体と組合せることにより製造された通常の剤形で投与される。これらの方法は、混合、顆粒化および圧縮、または必要に応じて、成分を所望の製剤に溶解することを含みうる。医薬上許容される担体または希釈剤の形態および性質は、それと組合される有効成分の量、投与経路および他のよく知られた変数によって決まると理解される。
【００２９】
担体は、製剤のその他の成分に適合性であり、その被投与者に有害でないという意味で許容されうるものでなければならない。使用される医薬担体には、固体、ゲル、または液体が含まれうる。固体担体の典型例としては、乳糖、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などが挙げられる。液体担体の典型例としては、リン酸緩衝食塩水、シロップ、油、水、エマルジョン、種々のタイプの湿潤剤などが挙げられる。同様に、担体または希釈剤は、当技術分野でよく知られた時間遅延（time delay）物質、例えばグリセリルモノステアラートまたはグリセリルジステアラートを、単独で、またはワックスと共に含みうる。前記の適当な担体は前記のもの、および当技術分野でよく知られた他のものを含む。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaを参照されたい。
【００３０】
希釈剤は、組合せ物の生物活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例としては、蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液およびハンクス液が挙げられる。また、医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または無毒性で非治療用で非免疫原性の安定剤などをも含みうる。
【００３１】
治療的有効量は、本明細書中で言及されている疾患または状態に伴う症状を予防し、改善し、または治癒させる、医薬中で使用される本発明の融合ポリペプチドの量を意味する。薬物の治療有効性および毒性は細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法、例えばED50（集団の50％において治療上有効な量）およびLD50（集団の50％に対して致死的な量）により決定されうる。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療指数であり、それはLD50 / ED50なる比として表されうる。投与レジメンは主治医および臨床的要因により決定される。医学分野においてよく知られているとおり、任意の1人の患者に対する投与量は、患者のサイズ、年齢、投与される医薬の個々の製剤、性別、投与の時間および経路、全身健康状態ならびに併用投与される他の薬物に左右される。進行は定期的な評価によりモニターされうる。推奨投与量は、考慮される被投与者に応じて投与量の調整を予想するために、処方者または使用者の説明書に示される。
【００３２】
本明細書中で言及される医薬は、好ましくは、少なくとも1回、例えばボーラスとして投与される。しかし、該医薬は、2回以上、好ましくは、少なくとも2回、例えば、一定の時間窓の後で永久に又は定期的に投与されうる。
【００３３】
本発明の医薬は、本発明のもう1つの態様においては、その製剤時に加えられる薬物を、融合ポリペプチドに加えて含みうる。好ましくは、本発明の融合ポリペプチドは少なくとも1つの他の薬物と共に適用されるべきであり、したがって、これらの他の薬物と共に医薬として製剤化されうる。より好ましくは、前記の少なくとも1つの他の薬物は、抗生物質、昇圧薬、ステロイド、抗凝固薬、抗血栓薬、炎症性サイトカインおよびDAMPインヒビターからなる群から選択される。
【００３４】
最後に、医薬組成物の製剤化は、医薬の品質、薬学的安全性および有効性を保証するために、GMP標準化条件などの下で行われることが理解されるべきである。
【００３５】
本明細書中で用いる「臓器不全」なる語は、正常な恒常性を維持することも内的に補償することもできない程度に臓器の生理学的に期待される機能に影響を及ぼす臓器の任意の機能不全を意味する。臓器不全は急性または慢性でありうる。臓器不全に関連する症状は罹患臓器に左右され、通常、例えば臨床的または生化学的パラメータにより決定されうる対象における病態生理学的特徴によって明らかになる。臓器不全の症状も当技術分野においてよく知られており、医学テキストに記載されている。好ましくは、本明細書中で言及されている臓器不全は多臓器不全である。多臓器不全は同時または短期間内の連続的な2以上の臓器の不全により特徴づけられる。それは重篤な感染または炎症反応、例えば全身性炎症反応症候群（SIRS）または敗血症の結果としてしばしば観察されうる。SIRSまたは敗血症の際に不全状態となる典型的な臓器は肺、腎臓、心臓および／または全循環系、胃腸系ならびに神経系である。好ましくは、本明細書中で言及される多臓器不全は自己反応性細胞傷害性細胞により引き起こされ、より好ましくは、CD8細胞傷害性T細胞依存的多臓器不全である。
【００３６】
本明細書中で用いる「対象」なる語は、例えば、哺乳動物、鳥類、魚類または爬虫類を含む任意の種類の動物を意味する。しかし、典型的には、該動物は哺乳動物、例えばペットとして用いられる哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマまたはげっ歯類、実験用動物、例えばラット、マウスまたは類人猿、あるいは家畜、例えばブタ、ウシ、ヤギまたはヒツジである。より好ましくは、哺乳動物は霊長類であり、最も好ましくはヒトである。本発明における対象は敗血症に罹患している。すなわち、それは、敗血症に典型的に関連した臨床的に明らかな症状または生理学的もしくは分子的パラメータの変化のような少なくとも1以上の病理学的変化を示す。
【００３７】
本明細書中で用いる「敗血症」なる語は、生物の全身に影響を及ぼす炎症反応を意味する。敗血症に関連した典型的な症状は当技術分野においてよく知られており、内科学の標準的なテキストに記載されている。それらには、大幅に変化した体温（低温または発熱）、急速な呼吸、頻脈、末梢血管抵抗の減少による低血圧、精神錯乱および浮腫形成が含まれる。凝固機能障害または代謝性アシドーシスのような生化学的パラメーターも敗血症の典型的な徴候である。敗血症は細菌、ウイルス、寄生虫または真菌による重度の感染によって引き起こされる。更に、敗血症の発症または結果に悪影響を及ぼす交絡因子（例えば糖尿病または癌）が存在する。好ましくは、本発明において言及される敗血症は、感染に応答する以下の症状のうち2以上の存在により特徴づけられる：異常体温（好ましくは36℃未満または38℃以上）、異常心拍数（好ましくは90心拍/分以上）、異常呼吸数（好ましくは20呼吸/分以上）または血液ガス組成（好ましくは4.3kPa未満のCO2）および異常白血球数（好ましくは4×109/L未満または12×109/L以上またはバンド好中球の組織学的存在）。
【００３８】
好都合なことに、免疫グロブリンのFc部分とヒトB7-H1ポリペプチドの細胞外部分とを含む融合ポリペプチドが、敗血症に罹患している対象における臓器不全を効果的に治療および／または予防するために使用できることが、本発明の根底にある研究において見出された。特に、前記融合ポリペプチドまたはその変異体は細胞傷害性T細胞に結合し、それにより敗血症誘導性T細胞細胞傷害性を抑制し、臓器不全を予防することができることが見出された。更に、B7-H1タンパク質のダウンレギュレーションは敗血症時の自己免疫CTL活性化を可能にすることが見出された。B7-H1発現の維持または本発明の融合ポリペプチドの適用は肝臓損傷を顕著に改善する。メカニズム的には、B7-H1は活性酸素種（ROS）の生成によりダウンレギュレーションされた。したがって、本発明の融合ポリペプチドは、好ましくは、投与の際に、対象において敗血症誘導性細胞傷害性T細胞を抑制する。更に、それは、好ましくは、投与されると、敗血症起因性（sepsis-caused）活性化に対する対象における細胞傷害性T細胞における長期持続的寛容を誘導する。その結果、それは、驚くべきことに、治療的および予防的方法で適用されうる。
【００３９】
用語の前記説明および定義は本明細書の全体にわたって適用される。更に、本発明に従い使用される融合ポリペプチドの典型的な実施形態を以下に記載する。
【００４０】
本発明に従い使用される融合ポリペプチドの好ましい実施形態においては、該臓器不全はCD8細胞傷害性T細胞依存的多臓器不全である。
【００４１】
本発明に従い使用される融合ポリペプチドのもう1つの好ましい実施形態においては、該免疫グロブリンはヒトIgGである。
【００４２】
本発明に従い使用される融合ポリペプチドのもう1つの好ましい実施形態においては、ヒトB7-H1ポリペプチドの細胞外部分またはその変異体は、
（a）配列番号1または5に示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（b）配列番号2または6に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（c）（a）または（b）のポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を有し、PD1ポリペプチドに尚も結合できるポリペプチド；ならびに
（d）アミノ酸置換L27A、S34Y、D49S、Y56S、E58S、K62S、H69F、E72S、K75S、K89S、A98F、Q100S、R113YおよびS117Yのうちの少なくとも1つを含む（a）または（b）に記載のアミノ酸配列を有し、PD1ポリペプチドに尚も結合できるポリペプチド
からなる群から選択される。
【００４３】
本発明に従い使用される融合ポリペプチドのもう1つの好ましい実施形態においては、該融合ポリペプチドは、（iii）細胞傷害性T細胞に特異的に結合できるポリペプチドである第3部分を含む。
【００４４】
より好ましくは、細胞傷害性T細胞に特異的に結合することができる該ポリペプチドは、CD8に結合できるMHC-1複合体の部分を含むポリペプチド、CD28に結合できるCD80の部分、CD8に特異的に結合できる抗体またはそのフラグメントであるポリペプチド、CD28に特異的に結合できる抗体またはそのフラグメントであるポリペプチド、およびリンパ球機能関連抗原-3（LFA-3）のCD2結合性部分からなる群から選択される。
【００４５】
本発明に従い使用される融合ポリペプチドの好ましい実施形態においては、前記の少なくとも第1部分と少なくとも第2部分とは永久的または可逆的に互いに連結されている。
【００４６】
本発明に従い使用される融合ポリペプチドのもう1つの好ましい実施形態においては、該対象は哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００４７】
本発明に従い使用される融合ポリペプチドのもう1つの好ましい実施形態においては、該融合ポリペプチドはボーラスとして1回適用される、または少なくとも2回適用される。
【００４８】
本発明に従い使用される融合ポリペプチドの好ましい実施形態においては、該融合ポリペプチドは少なくとも1つのさらなる薬物と共に適用される。
【００４９】
より好ましくは、前記の少なくとも1つのさらなる薬物は、抗生物質、昇圧薬、ステロイド、抗凝固薬、抗血栓薬、炎症性サイトカインおよびDAMPインヒビターからなる群から選択される。
【００５０】
本発明に従い使用される融合ポリペプチドの好ましい実施形態においては、該融合ポリペプチドは、投与されると、対象における敗血症誘導性細胞傷害性T細胞を抑制する。
【００５１】
本発明に従い使用される融合ポリペプチドのもう1つの好ましい実施形態においては、該融合ポリペプチドは、投与されると、敗血症起因性活性化に対する対象における細胞傷害性T細胞における長期持続的寛容を誘導する。
【００５２】
本発明は更に、本発明に従い定義される融合ポリペプチドをコードする、敗血症に罹患している対象における臓器不全を治療および／または予防における使用のためのポリヌクレオチドに関する。
【００５３】
本明細書中で用いる「ポリヌクレオチド」なる語は一本鎖または二本鎖DNA分子およびRNA分子を意味する。前記用語には、ゲノムDNA、cDNA、hnRNA、mRNA、ならびにそのような分子種の、全ての天然に存在する又は人工的に修飾された誘導体が含まれる。ポリヌクレオチドは、好ましくは、線状または環状分子でありうる。更に、前記融合ポリペプチドをコードする核酸配列に加えて、本発明のポリヌクレオチドは、適切な転写および／または翻訳に必要な追加的配列、例えば5'-または3'-UTR配列、あるいはスプライシングまたはRNA安定性に必要な配列を含みうる。本発明の融合ポリペプチドをコードする好ましいポリヌクレオチドも前記に更に詳細に記載されている。
【００５４】
本発明に従い使用されるポリヌクレオチドの好ましい実施形態においては、該ポリヌクレオチドは、該対象における該ポリヌクレオチドの発現を可能にする発現構築物中に含まれる。
【００５５】
本明細書中で用いる「発現構築物」なる語は、該融合ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドと、該融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要なそれに対して異種性である核酸とを含む異種性ポリヌクレオチドを意味する。典型的には、そのような異種性核酸はプロモーター配列、エンハンサー配列および／または転写終結配列、例えばターミネーターでありうる。更に、発現構築物は、発現構築物を宿主内に導入するのに必要なさらなる核酸を含みうる。例えば、宿主細胞における発現が望まれる場合、発現構築物は、形質転換またはトランスフェクションに必要な、および宿主細胞における導入発現構築物の増殖に必要なさらなる核酸を含みうる。
【００５６】
好ましくは、本明細書中で言及される発現構築物はベクターでありうる。本発明で意図されるベクターは、好ましくは、ファージ、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスベクター、ならびに人工染色体、例えば細菌または酵母人工染色体を包含する。融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、好ましくは、宿主における増殖および／または選択のための選択マーカーを更に含む。該ベクターは、当技術分野でよく知られた種々の技術により宿主細胞内に組込まれうる。例えば、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物もしくは塩化ルビジウム沈殿物のような沈殿物中に、または荷電した脂質との複合体中に、またはフラーレンのような炭素系クラスター中に導入されうる。あるいは、プラスミドベクターは熱ショックまたはエレクトロポレーション技術により導入されうる。ベクターがウイルスである場合、それは、宿主細胞への適用の前に、適切なパッケージング細胞系を用いてin vitroでパッケージングされうる。レトロウイルスベクターは複製可能または複製欠損型でありうる。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に、補足性宿主／細胞においてのみ生じるであろう。更に、ポリヌクレオチドは、通常、前記ベクターにおいて、原核もしくは真核宿主細胞またはその単離された画分における発現を可能にする発現制御配列に機能的に連結される。ポリヌクレオチドの発現は翻訳可能なmRNAへのポリヌクレオチドの転写を含む。宿主細胞における発現を保証する調節要素は当技術分野においてよく知られている。好ましくは、それらは、転写の開始を保証する調節配列、ならびに／または転写の終結および転写産物の安定化を保証するポリAシグナルを含む。追加的な調節要素には、転写エンハンサーおよび翻訳エンハンサーが含まれうる。原核生物宿主細胞における発現を可能にする可能な調節要素には、例えば大腸菌(E.coli)におけるlac、trpまたはtacプロモーターが含まれ、真核生物宿主細胞における発現を可能にする調節要素の例としては、酵母におけるAOX1-もしくはGAL1-プロモーター、または哺乳類および他の動物細胞におけるCMV-、SV40-、RSV-プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、CMV-エンハンサー、SV40-エンハンサーもしくはグロビンイントロンが挙げられる。本発明によって想定される他の発現系は、ポリヘドリンプロモーターに基づく系のように、昆虫細胞における発現を可能にする。更に、本発明に含まれるベクターにおいては、誘導性発現制御配列が使用されうる。そのような誘導性ベクターはtetもしくはlacオペレーター配列、または熱ショックもしくは他の環境因子により誘導可能な配列を含みうる。適当な発現制御配列は当技術分野でよく知られている。転写の開始を担う要素に加えて、そのような調節要素は、ポリヌクレオチドの下流に、SV40ポリA部位またはtkポリA部位のような転写終結シグナルをも含みうる。この場合、適当な発現ベクターは当技術分野で公知であり、例えば、Okayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1（Pharmacia）、pBluescript（Stratagene）、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3（Invitrogen）もしくはpSPORT1（Invitrogen）またはバキュロウイルス由来ベクターが挙げられる。好ましくは、該ベクターは発現ベクターおよび遺伝子導入または標的化（ターゲッティング）ベクターである。���トロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスまたはウシパピローマウイルスのようなウイルスに由来する発現ベクターは標的化細胞集団への本発明の発現構築物の送達に使用可能であり、例えば遺伝子治療アプローチにおいても使用可能である。当業者によく知られた方法を用いて、組換えウイルスベクターを構築することが可能である。例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.およびAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)に記載されている技術を参照されたい。
【００５７】
更に、発現構築物を宿主のゲノム内に導入することが想定されうる。そのような場合、発現構築物は、該発現構築物の異種性組込みまたは相同組込みを可能にする核酸をも含みうる。したがって、本明細書中で言及されている発現構築物はまた、ゲノムDNA内への標的化構築物のランダムまたは部位特異的組込みを可能にする標的化構築物でありうる。そのような標的構築物は、好ましくは、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現カセットに隣接する、相同組換えまたは異種性組換えのための十分な長さのDNAを含む。更に、発現構築物は、Cre/LoxPまたはCRISPR/CASのような組込み系を使用することによっても導入されうる。そのような場合、発現構築物は、そのような組込み系の使用を可能にするさらなる核酸を含みうる。適当な改変／付加は、想定される組込み系に左右され、当業者によく知られている。
【００５８】
本発明は更に、対象における臓器不全を治療および／または予防するための医薬の製造のための、前記融合ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの使用を提供すると理解される。典型的には、融合ポリペプチドまたはポリヌクレオチドならびに治療される対象または言及されている疾患は前記の好ましい特徴を有する。
【００５９】
本発明はまた、対象における臓器不全の治療および／または予防方法を提供すると理解される。
【００６０】
特に、敗血症に罹患している対象における臓器不全の治療方法を提供し、該方法は、（a）少なくとも、（i）免疫グロブリンのFc部分である第1部分と、（ii）ヒトB7-H1ポリペプチドの細胞外部分またはその変異体を含む第2部分とを含む融合ポリペプチドの治療的有効量を対象に投与すること、あるいは（b）該融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの治療的有効量を投与することを含む。
【００６１】
臓器不全の種類、治療対象、敗血症および融合ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関する本発明の典型的な態様は前記に記載されており、必要な変更を加えて、対象における臓器不全の治療および／または予防のための本方法に適用される。
【００６２】
本発明の前記方法の更にもう1つの典型的な態様においては、該方法は、該融合ポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドを投与する前に敗血症の存在を決定することにより、治療対象を特定することを含みうる。
【００６３】
本発明の前記方法のもう1つの典型的な態様においては、該方法は、該融合ポリペプチドの投与の後で臓器不全の徴候に関して対象をモニターし、必要に応じて、該融合ポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドを異なる投与量で再び投与することを含む。
【００６４】
本明細書中に引用されている全ての参考文献を、それらの開示内容全体および本明細書に具体的に記載されている開示内容に関して、参照により本明細書に組み入れることとする。参考文献の完全な列挙は本明細書中の他の箇所に記載されている。
【実施例】
【００６５】
本発明は単なる例示としての以下の実施例により例示される。該実施例は何ら本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
【００６６】
実施例1：細胞傷害性T細胞（CTL）は敗血症マウスの肝臓に蓄積する
敗血症時には、臓器不全およびそれに続いてしばしば生じる多臓器不全症候群（MODS）が頻繁に患者の死を招く。したがって、既存のケアオプションを改善し、または新規治療アプローチを確立するためには、臓器損傷をもたらすメカニズムを理解することが不可欠である。Von Knethenら, 2015は、マウス敗血症モデルにおいてCTLが自己免疫様態で活性化されることを示しており、一方、CD8+ T細胞の活性化はこの敗血症マウスモデルにおける肝臓損傷に関与することが示されている（Wesche Soldatoら, 2007a）。根底にある原理を特徴づけるために、偽手術マウス由来の肝臓におけるCTL数と、盲腸結紮・穿刺（CLP）手術マウス由来の肝臓におけるCTL数とを比較分析した。図1に示されているとおり、CLP手術の24時間後の敗血症マウスに由来する肝臓におけるCTL数は、偽処理マウスまたは対照マウスのそれぞれの場合と比べて増加することが判明した。この結果は肝臓組織内へのCTLの活性化誘導性遊走を示している。
【００６７】
実施例2：B7-H1の発現は多微生物性敗血症モデルにおいてダウンレギュレーションされる
自己免疫CTL活性化は、典型的には、共抑制性タンパク質、例えばB7-H1（CD274またはPD-L1とも称される）またはB7-DC（CD273またはPD-L2とも称される）により予防される（Butteら, 2007; Sharpeら, 2007）。これらの共抑制性タンパク質は、典型的には、抗原提示細胞（APC）上で発現され、これは多微生物性敗血症モデルの場合には、十中八九、肝細胞である（Uekiら, 2011）。したがって、これらの共抑制性因子の発現をCLP後の肝臓において分析した。B7-H1の発現は全タンパク質レベル（図2A）および細胞表面上（図2B）でダウンレギュレーションした。これとは対照的に、その受容体PD-1のmRNAおよびタンパク質発現は変化しなかった（図2C）。マウスおよびヒトにおける免疫応答の調節において重要な役割を果たすことが知られているFas（Fasリガンドの受容体であるCD95としても公知）の発現（Galleら, 1995; Hanabuchiら, 1994）も不変であった（図2C）。B7-DCの全タンパク質発現は非常に低く（データ非表示）、CLP手術の24時間後にその細胞表面発現は不変であった（図2D）。
【００６８】
実施例3：グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の細胞壁成分はHepa1-6細胞におけるB7-H1発現をダウンレギュレーションする
肝細胞の初代培養は全てのTLRのmRNAを発現し、TLR2およびTLR4リガンドに応答する（SekiおよびBrenner, 2008）。したがって、敗血症時に肝臓で得られる細菌成分が肝細胞におけるB7-H1発現の減少を説明しうる。このダウンレギュレーションを引き起こすメカニズムを解明するために、マウス肝癌細胞系Hepa1-6（Darlington, 1987）に基づく細胞培養モデルを確立した。この細胞系はTLR2および-4を発現することが示されている（Matsumuraら, 2000; Romicsら, 2004）。細菌感染を模擬するために、グラム陰性菌の細胞壁成分であるLPSおよびグラム陽性菌の細胞壁成分であるLTAでHepa1-6細胞を処理した。図3に示されているとおり、B7-H1発現は、それらの2つの細菌成分の両方での刺激に応答して、mRNA（図3A）およびタンパク質（図3B）のレベルで時間依存的に減少した。しかし、LPSまたはLTA刺激が肝細胞を、CTL依存的細胞傷害性に対して、より感受性にするかどうか、およびB7-H1発現の維持が自己免疫CTL活性化を防ぐかどうかは依然として分かりにくい。
【００６９】
実施例4：LPS処理Hepa1-6細胞は、CTL依存的細胞傷害性に対して、より感受性である
LPSまたはLTA刺激が、肝細胞を、CTL依存的細胞傷害性に対して、より感受性にするかどうか、またはB7-H1発現の維持が自己免疫CTL活性化を防ぐかどうかを明らかにするため、OT-1マウス（ハプロタイプH2Kb）に由来するCTLをエフェクター細胞（Clarkeら, 2000）として使用し、そしてC57Lマウス（ハプロタイプH2Kb）に元々由来するHepa1-6細胞を標的細胞として使用して、同系細胞傷害性アッセイを準備した。Hepa1-6細胞をLPSで24時間処理し、または対照として維持した。ついで、オボアルブミンペプチド257-264（OVA257-264）、または対照としてのHBV表面抗原（HBsAg）に由来するB型肝炎ウイルス（HBV）由来ペプチドILSPFLPLLで、細胞を2時間パルスした。細胞をPBSで2回洗浄し、CellTrackerOrange（商標）で染色し、1：5（標的細胞：エフェクター細胞）の比でCTLと共に24時間インキュベートした。生存細胞をFACS分析により決定した。対照の状況、すなわち、CTLと共にインキュベートした未処理Hepa1-6細胞においては、標的細胞の約50％が死滅した（図4A）。Hepa1-6細胞のLPS刺激の後、細胞傷害性は、Hepa1-6細胞をOVA257-264ペプチドでパルスした場合には、約70％の死滅標的細胞まで増強された。これとは対照的に、HBVペプチドでパルスされたHepa 1-6細胞はそれほど有意にはCTLによって死滅しなかった。
【００７０】
実施例5：B7-H1の過剰発現はCTL依存的細胞傷害性に対してHepa1-6細胞を保護する
B7-H1発現の維持がCTL依存的細胞傷害性をインビトロで遮断することを確認するために、EGFPに連結されたB7-H1をコードするレンチウイルスベクターをHepa1-6細胞内に安定に導入した。FACS選別後、これらのB7-H1過剰発現細胞および対照ウイルス導入細胞を細胞傷害性アッセイにおいて使用した（図4B）。予想通り、B7-H1過剰発現細胞はCTL依存的死に対して保護されたが（図4B、白色バー）、対照ウイルス導入細胞に対する細胞傷害性はLPS刺激無しでは約50％であり、LPS（100ng/ml）処理の後で時間依存的に増強した（図4B、黒色バー）。
【００７１】
実施例6：B7-H1発現の維持はCLP後の肝臓損傷を抑制する
多微生物性敗血症マウスモデルにおける病態生理学的役割をインビボで調べるために、肝臓でB7-H1を過剰発現するアデノウイルスアプローチを確立した。図5Aは、約70％の肝細胞トランスダクション効率が達成できたことを示している。マウスを未処理のまま4日間維持して、アデノウイルス導入から回復させたが、それにより、これは該マウスの抗ウイルス免疫応答を誘導する。その期間の後、CLPを24時間開始した。ついでマウスを犠死させ、マウスの血液から血清を単離して、肝臓損傷マーカーであるALTおよびASTを分析することにより疾患重症度を判定した。図5Bに示されているとおり、B7-H1の過剰発現は肝臓損傷を改善した。すなわち、該過剰発現はALT/ASTレベルを有意に減少させた。治療アプローチとしてのB7-H1発現の維持は、B7-H1を外的に加えることにより達成されうる。OVA257-264でパルスされたHepa1-6を標的細胞として、そしてOT-Iマウス由来CTLをエフェクター細胞として使用するインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて、組換えB7-H1 Fcキメラの同時添加はCTL媒介性細胞傷害性を抑制した（図6A）。1μg/mlの組換えB7-H1 Fcキメラは標的細胞死を変化させなかったが、5μg/mlは標的細胞生存を約50％まで向上させた。20μg/mlまでの組換えB7-H1 Fcキメラ濃度の増加は標的細胞の生存を向上させない。インビトロの結果をインビボの状況に置き換えるために、組換えB7-H1 FcキメラをCLP手術の直後に尾静脈内に静脈内（iv）適用した。24時間後、マウスの血液を集め、血清を調製した。肝臓損傷マーカーであるALT/ASTの放出を測定した。図6Bに示されているとおり、組換えB7-H1 Fcキメラの適用はALT/AST放出を有意に減少させ、これはインビボでの敗血症の結果の改善を示している。
【００７２】
実施例7：B7-H1のROS依存的ダウンレギュレーション
LPSおよびLTAは標的細胞上の異なるToll様受容体（TLR）を介して作用する（すなわち、LTAについてはTLR2、そしてLPSについてはTLR4）。これらの受容体への結合は、種々のシグナル伝達カスケード、すなわち、NADPHオキシダーゼ媒介性レドックスシグナル伝達を引き起こすことが示されている。NADPHオキシダーゼNOX4は、O2-またはH2O2のような活性酸素種（ROS）を構成的に生成することが示されている（Dikalovら, 208）。最近のデータは、O2-が、病原体を殺すために生成されるだけでなく、セカンドメッセンジャーとしても働くという仮説を支持している（Bruneら, 2013）。ROS依存的メカニズムがB7-H1の減少の原因となるのかどうかを調べるために、LPSのみで又はそれとN-アセチルシステイン（NAC）との組合せで処理されたHepa 1-6細胞においてROS形成を測定した。ROSインヒビターであるNACでの処理はB7-H1の発現を回復させた（図7および図3Bを比較参照されたい）。
【００７３】
実施例8：Nox4の抑制はB7-H1発現を増強する
NADPHオキシダーゼ4（Nox4）はHepa1-6細胞において発現され（Boudreauら, 2009）、H2O2の構成的産生を誘発し、それは刺激に際して増強されうることが示されている。Nox4がB7-H1発現の調節において役割を果たすかどうかを評価するために、Hepa1-6細胞を、更なる処理を行うことなく、特異的Nox4インヒビターGKT137S31 [10μM]と共に24時間インキュベートした（Jiangら, 2012）。図8Aに示されているとおり、Nox4抑制はHepa1-6細胞においてB7-H1表面発現を約50％まで増加させた。更に、全体的NOX4ノックアウトマウスからの肝臓を単離し、全ライセートウエスタン分析を行った。図8Bは、Nox4欠損マウス由来の肝臓においては、野生型対照と比較して、B7-H1がアップレギュレーションされることを示している。図8Cに示されているデンシトメトリー定量は、NOX4ノックアウトマウス由来の肝臓においては、約2倍高いB7-H1発現を示した。肝細胞におけるB7-H1表面発現の分析はB7-H1発現における同様の上昇を示した（図8D、左バー）。CLPモデルでこれらのマウスを使用すると、野生型マウスおよびノックアウトマウスの両方でB7-H1発現のダウンレギュレーションが観察できた（図8D、右バー）。しかし、Nox4欠損細胞におけるB7-H1の発現は、CLPによる敗血症開始の24時間後、野生型マウスと比較して依然としてわずかに高いままであった。それにもかかわらず、NOX4ノックアウトマウスにおいては疾患の重症度は改善されなかった（図8E）。したがって、Nox4活性を遮断することは、敗血症の生存を改善する手段としては除外されうる。
【００７４】
実施例9：全体的NOX2欠失は多微生物性敗血症時のB7-H1のダウンレギュレーションを予防する
次に、骨髄系統に特異的なNOX2ノックアウトを有するマウス（LysM-Cre Nox2-KO）および全体的NOX2欠損（NOX2-KO）を用いて、実験的敗血症モデルを評価した。図9Aに示されているとおり、偽手術の24時間後、肝細胞におけるB7-H1の発現は3つの遺伝子型の全てにおいて類似していた。興味深いことに、CLPの24時間後、B7-H1の発現は野生型（黒色バー）および骨髄系統におけるNOX-2欠失を有するマウス（灰色バー）においてはダウンレギュレーションされたが、全体的NOX2ノックアウトを有するマウス（白色バー）においては、B7-H1発現は高いままであった。血清中への肝損傷マーカーの放出は、骨髄系統NOX2-欠失を有するマウスにおいてはALTおよびASTの有意な増加を示したが（図9B、灰色バー）、全体的NOX2ノックアウトマウスにおいては弱いままであった（図9B、白色バー）。
【００７５】
実施例10：一般的な方法および材料
骨髄系統に特異的なNOX2ノックアウトを有するマウスは、Shah教授（King's College London BHF Centre of Excellence, London, UK）によって快く提供されたNOX2の条件的loxP隣接対立遺伝子を含有するC57Bl/6マウスを、C57Bl/6N-(Tg) LysM-Creトランスジェニックマウス（これにおいては、LysMプロモーターの後ろにCreリコンビナーゼがノックインされている）（Akiyamaら, 2002; Cuiら, 2002; Hennetら, 1995; Hume, 2011; Schmidtら, 2011）と交配することにより作製した。また、全体的NOX2およびNOX4ノックアウトマウスならびに野生型マウスを同様にC57Bl/6バックグラウンドで使用した。マウスを、温度制御室で12時間の明期および12時間の暗期の概日周期で維持した。それらを、フィルターで上部が覆われた檻で飼育し、標準的な実験室用飼料および水を自由に与えた。遺伝子型を尾部DNAのPCRにより決定し、NOX2およびNOX4の欠失をmRNA分析により確認した（データ非表示）。全ての動物実験はヘッセン（Hessian）動物ケアおよび使用委員会（許可番号F144/15）のガイドラインに従った。
【００７６】
盲腸結紮・穿刺モデル（CLP）は、既に記載されているとおりに（Rittirschら, 2009）、または偽マウス（sham）に関しては結紮および穿刺無しに実施した。簡単に説明すると、マウスをケタミン（Ketavet（登録商標））/キシラジン（Rompun（登録商標））100mg / 200mg / kg体重で麻酔した。正中線開腹切開を無菌的に行い、腸の連続性を乱さないよう注意しながら、盲腸の3分の1を回腸弁の遠位に結紮した。結紮部分に20ゲージの針を貫通穿刺した。動物に手術直後に1mlの0.9％NaClを腹腔内投与し、手術後およびそれ以降は6時間ごとにブプレノルフィン（Temgesic（登録商標））0.5mg/kgを皮下（s.c.）投与した。CLP手術の24時間後、マウスを犠死させ、脾臓を切開し、単細胞懸濁液を調製した。Dynabeads FlowCompマウスCD8キット（Life Sciences, Heidelberg, Germany）を配給業者の指示に従い使用して、脾臓からの陽性選択によりCD8+ T細胞を>95％まで濃縮（富化）した。抗CD8α-FITC標識抗体（EuroBioScience, Friesoythe, Germany）を使用するFACS分析により精製を確認した。幾つかの実験においては、2つの肝臓損傷マーカーであるアラニン-およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの測定のために血清を単離するために心臓穿刺により血液を採取した。それらの2つの酵素の量を、Reflotron Plus血液分析装置（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）を対応試験ストリップと共に使用して分析した。肝臓も摘出した場合、該臓器を予めPBSで洗い流した。ついで肝臓を切開し、単細胞懸濁液を調製した。CellTracker（商標）Orange（Life Technologies GmbH, Frankfurt, Germany）染色の後、これらの細胞を富化CTLと共に共培養細胞傷害アッセイに直接使用した。
【００７７】
100U/mlペニシリン（PAA Laboratories）、100μg/mlストレプトマイシン（PAA Laboratories）および10％熱不活性化ウシ胎仔血清（PAA Laboratories）を加えたRPMI1640（PAA Laboratories）中でHepa1-6細胞（Darlington, 1987）を培養した。
【００７８】
マウスB7-H1をインビトロで過剰発現させるために、本発明者らは、以下のプライマーペア（NM021893）を使用するPCRによりHepa1-6細胞のマウスmRNAからB7-H1を増幅した：フォワード5'-CGC CCG GGG GGG ATC ATG AGG ATA TTT GCT GGC ATT ATA TTC ACA-3'; リバース5'-TCA AGC TTG CAT GCC TTA CTT GTA CAG CTC GTC CA-3'。該プライマーを使用して、レンチウイルスベクターpSEW（Demaisonら, 2002）内に、pSEWベクター内に既に存在するEGFPコード配列の前にmB7-H1をクローニングした。B7-H1のコード配列はイタリック体で示されている。BamHIでpSEWを線状化した後、増幅したmB7-H1断片を、InFusion系（Takara Bio Europe, Saint-Germain-en-Laye, France）を使用して挿入した。正しい配列が配列決定により確認された。マウスの肝臓内へのB7-H1のインビボトランスダクションのために、pSEWベクター内のB7-H1 EGFPをadEasyアデノウイルスベクター系（Luoら, 2007）のpShuttle-CMVベクター内にサブクローニングした。pShuttle-CMVのBglII/EcoRV部位内へのInFusionクローニングに適した隣接配列を含有する以下のプライマーペアを使用した：フォワード5'-GAT CCG CTA GAG ATC GCC ACC ATG AGG ATA TTT GCT GGC ATT ATA TTC ACA GC-3', リバース5'-TCC GGT GGA TCG GAT TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC-3'。B7-H1（フォワードプライマー）およびEGFP（リバースプライマー）のコード配列がイタリック体で示されている。正しい配列が配列決定により確認された。陰性対照として、EGFPのみをコードするpAdTrackベクターを使用した。
【００７９】
アデノウイルス調製のために、Ad-293細胞を75cm2フラスコ内のDMEM（高グルコース、Glutamax）+ 10％FCS +ペニ/ストレプト1：100 + HEPES 1：100 +非必須アミノ酸1：100内に播種した。4日後、細胞を1mlのトリプシンで剥離させた。9mlの培地を加え、細胞を500gで5分間遠心分離した。10mlの培地内でのペレット再懸濁後、3.5mlを2×175cm2のフラスコ内に播種した。3日後、細胞を両方の175cm2フラスコから1×2mlのトリプシンで剥離させた。培地9mlを加え、細胞をスピンし、ペレットを再懸濁させ、16×175cm2フラスコ内に分注した。4日後、100％コンフルエントな細胞から培地を除去した。8×50mlチューブ内には29mlの、そして15mlチューブ内には7.5mlの加温培地を加えた。0.5mlのウイルスストック[1×1011粒子/ml]を室温で解凍した。ウイルスストックを15mlチューブに加え、上下にピペッティングすることにより混合した。1mlの希釈アデノウイルスをそれぞれ50mlのチューブに移した。密閉し混合した後、15mlの希釈アデノウイルスを各フラスコに加えた。フラスコをインキュベーター内で4時間インキュベートした。ついで、15mlの予熱培地を各フラスコに加えた。3日後、ほとんどの感染細胞はクラスターとして剥離した。非感染細胞は依然として広がっており、プラスチックに付着していた。培地は黄色がかっていた。フラスコを手のひらにタッピングすることにより細胞を剥離させた。培地を10×50mlチューブに移し、4℃で5分間500gでスピンした。上清を捨てた。チューブを軽く振った。3×1mlの培地を3本のチューブに移した。1mlのフィルターチップを使用して、最初の3つのペレットを1mlの培地に再懸濁させた。再懸濁細胞をクライオバイアルに移し、これを液体窒素中で急速凍結し、-80℃の冷凍庫に移した。アデノウイルス粒子を精製するために、10個のバイアルの細胞を4回の急速解凍／凍結サイクルにかけることにより、細胞ライセートを調製した。ライセートを15mlチューブに移し、4℃、1500gで10分間スピンした。その間、6つのCsCl勾配を調製した。各超遠心分離管に、PBS中の40％CsCl 4mlを加えた。次にその上にPBS中の15％CsCl4.5mlを注意深く重層した。清澄化した細胞ライセートを50mlチューブに移し、培地を18mlまでフィルアップし、ピペッティングで混合した。3mlの清澄化ライセートを各CsCl勾配上に移した。超遠心分離管をロータのバケット内に移した。対応バケットペアの重量を調整した。CsCl勾配を4℃、25,400rpmで約17時間遠心分離した。加速および減速を共に1に設定した。遠心分離後、チューブを注意深く取り出した。2mlシリンジに接続された23G針を下方のウイルスバンドの下に挿入することにより、ウイルスを収集した。3つの超遠心分離管からのウイルスを回収し、3mlのスライド・ライザー（slide-a-lyzer）カセット（10kDa）（Thermo Scientifc, Darmstadt, Germany）内にローディングした。ウイルス粒子を2リットルの冷PBSに対して4時間透析した。ついでPBSを交換し、透析を12時間延長した。ついでウイルスを集め、氷上の15mlチューブに移した。アリコートをクライオバイアルに移し、急速凍結し、-80℃で保存した。コロニー形成単位容量を決定するために、プラークアッセイを適用した。導入遺伝子のEGFPタグによる蛍光顕微鏡検査により評価を行った。マウストランスダクションの場合、100μlのPBS中の5×1010個の感染性粒子を投与した。
【００８０】
細胞毒性アッセイのために、エフェクター細胞としてのC57Bl/6N OT-Iマウス（ハプロタイプH-2b）の脾臓に由来するCD8+ T細胞を、標的細胞としてのC57L系統（ハプロタイプH-2b）に由来するHepa1-6細胞と共に24時間インキュベートした。これに先立ち、Hepa1-6細胞を対照としてのオボアルブミン（OVA）ペプチド257-264（AnaSpec, Fremont, USA）もしくはHBsAg由来B型肝炎ウイルス（HBV）ペプチドILSPFLPLL（IBA, Goettingen, Germany）で2時間パルスし、または対照として未処理のままにした。抗原をローディングした後、CD8+ T細胞添加の前に、CellTracker（商標）Orange（Life Technologies GmbH, Frankfurt, Germany）でHepa1-6細胞を染色した。24時間後、生存標的細胞をFACS分析（FACS Fortessa, BD, Heidelberg, Germany）により決定した。
【００８１】
peqGOLD RNAPure Kit（Peqlab, Erlangen, Germany）を製造業者の指示に従い使用して、5×105個のCD8+ T細胞、Hepa1-6細胞または初代肝細胞から全RNAを単離した。iScript（商標）cDNA合成キット（Bio-Rad, Munich, Germany）を使用して、2μgのRNAを相補的DNA（cDNA）へと逆転写した。iQ（商標）SYBR（登録商標）Green Supermix（Bio-Rad）を配給業者の指示に従い使用して、定量的PCR（qPCR）を行った。Bio-RadのCFXリアルタイムPCR系を使用して、qPCR測定およびデータ分析を行った。マウス標的に対する以下のプライマーペア（Biomer, Ulm, Germany）を選択した：B7-H1（NM 21893）フォワード: 5'-TGC AGC AGT AAA CGC CTG CG-3', リバース: 5'CGC TGC CAA AGG ACC AGC TT-3'; IL-2 (NM 008366) フォワード: 5'TGA GCA TCC TGG GGA GTT TC-3', リバース: 5'-GTG ACC TCA AGT CCT GCA GG-3'; Fas-L (NM 010177) フォワード: 5'-ACC AAC CAA AGC CTT AAA-3', リバース: 5'-ATA CTT CAC TCC AGA GAT-3'; グランザイムB (NM 013542) フォワード: 5'-CTC CAC GTG CTT TCA CCA AA-3', リバース: 5'-GGA AAA TAG TAC AGA GAG GCA-3'; パーフォリン (NM 011073) フォワード: 5'-TGC TAC ACT GCC ACT CGG TCA-3', リバース: 5'-TTG GCT ACC TTG GAG TGG GAG-3'. IFNγ (NM 008337) フォワード: 5'-TTT GCA GCT CTT CCT CAT GG-3', リバース: 5'-TCG CCT TGC TGT TGC TGA AG-3'。値を18s rRNAに対して正規化した。
【００８２】
全ての抗体および二次試薬を最適濃度に滴定した。抗マウスVα2 TCR FITC（eBioscience, San Diego, CA, USA）および抗マウスVβ5.1, 5.2 TCR-PE（BD Bioscience Heidelberg, Germany）抗体を使用するFACS分析によりOT1 CD8+ T細胞を特定した。OT1 CD8+ T細胞へのFc受容体の結合をCD16/CD32抗マウス抗体により氷上で15分間遮断し、ついでT細胞に対する抗CD8α-APCを氷上で20分間インキュベートした。初代肝細胞の表面上のB7-H1およびB7-DCの表面発現を、抗B7-H-PEまたは抗B7-DC-PEを使用するFACS分析により決定した。免疫細胞はCD45-FITC染色により排除され、その結果、CD45-細胞のみを分析した。
【００８３】
B7-H1、B7-DC、PD-1、FasおよびEGFP 発現をウエスタン分析により分析した。簡潔に説明すると、同等の数の初代肝細胞またはHepa1-6細胞をPBSで2回洗浄し、1×完全プロテアーゼインヒビターカクテル錠（Roche, Basel, Switzerland）を含有するRIPAバッファー中で細胞溶解し、10回のインパルスで超音波処理し、ついで16.000g（4℃）で10分間遠心分離した。SDS-PAGEサンプルバッファー（250mM Tris pH 6.8, 40％グリセロール、10％ 2-ME, 8％ SDS, 0.02％ ブロムフェノールブルー）で上清を95℃で10分間変性させた。同等のタンパク質濃度がLowry（Bio-Rad）によって維持された。タンパク質を10％ SDS-ポリアクリルアミドゲル上で分離し、半乾燥ブロッティングによりニトロセルロース膜上に移した。膜を5％ BSA/TTBSでブロッキングし、ついで抗B7-H1（R＆D system）、抗B7-DC（Santa Cruz）、抗PD-1（Santa Cruz）、a-Fas抗体（Santa Cruz）と共に5％ BSA/TBS中、4℃で一晩インキュベートした。ローディングをβ-アクチン（抗アクチン、Sigma-Aldrich）に対して正規化した。タンパク質の検出のために、膜をIRDye二次抗体（LI-COR, Bad Homburg, Germany）と共に5％ BSA/TTBS中でインキュベートした。タンパク質を可視化し、オデッセイ（Odyssey）赤外線イメージングシステムで濃度測定分析した。
【００８４】
各実験は少なくとも3回行った。対応のあるt検定を用いて統計解析を行った。0.05以下のP値を有意とした。その他においては、代表的なデータが示されている。
【００８５】
本明細書の全体において引用されている参考文献の完全な列挙
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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