(57)【要約】ミセル構築物、抗体単鎖可変断片(scFv)、NF-kb阻害剤、およびトポイソメラーゼII阻害剤を含む組成物およびナノコンジュゲートが、本明細書において開示される。ミセル構築物および抗体単鎖可変断片(scFv)を含む標的指向ミセルに薬物分子を結合させる段階；ならびに標的指向ミセルに結合させた薬物分子を、細胞内送達によって腫瘍部位に送達する段階を含む、対象の腫瘍部位に薬物分子を送達する方法が、本明細書においてさらに開示される。ミセル構築物、抗体単鎖可変断片(scFv)、NF-kb阻害剤、およびトポイソメラーゼII阻害剤を含む組成物の治療的有効投与量を、それを必要とする対象に投与する段階を含む、癌を治療する方法または腫瘍細胞増殖を阻害する方法もまた、本明細書において開示される。2018532776.tif 000003
2018532776.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)ミセル構築物；
(b)抗体単鎖可変断片(scFv)；
(c)NF-kb阻害剤；および
(d)トポイソメラーゼII阻害剤
を含む、組成物。
【請求項２】
scFvが、ミセル構築物にコンジュゲートされている、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
ミセル構築物が、NF-kb阻害剤にコンジュゲートされている、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
ミセル構築物が、NF-kb阻害剤およびトポイソメラーゼII阻害剤にコンジュゲートされている、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
NF-kb阻害剤が、クルクミンまたはその薬学的等価物、類似体、誘導体、および/もしくは塩である、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
トポイソメラーゼII阻害剤が、doxまたはその薬学的等価物、類似体、誘導体、および/もしくは塩である、請求項1記載の組成物。
【請求項７】
scFvが、glut-1_1 scFvまたはglut-1_2 scFvである、請求項1記載の組成物。
【請求項８】
ミセル構築物が、glut-1_1 scFvおよび/またはglut-1_2 scFvに結合するように標的指向されている、請求項1記載の組成物。
【請求項９】
標的指向ミセルを形成する、請求項1記載の組成物。
【請求項１０】
標的指向ミセルの分子サイズが、30nmまたはそれ未満である、請求項9記載の組成物。
【請求項１１】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１２】
以下の段階を含む、対象の腫瘍部位に薬物分子を送達する方法:
(a)ミセル構築物および抗体単鎖可変断片(scFv)を含む標的指向ミセルに、該薬物分子を結合させる段階；ならびに
(b)該標的指向ミセルに結合させた該薬物分子を、細胞内送達によって該腫瘍部位に送達する段階。
【請求項１３】
薬物分子が、doxおよび/もしくはクルクミンまたはその薬学的等価物、類似体、誘導体、および/もしくは塩を含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
標的指向ミセルの分子サイズが、30nmまたはそれ未満である、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
腫瘍が、ドキソルビシン耐性の腫瘍である、請求項12記載の方法。
【請求項１６】
対象がヒトである、請求項12記載の方法。
【請求項１７】
ミセル構築物、抗体単鎖可変断片(scFv)、NF-kb阻害剤、およびトポイソメラーゼII阻害剤を含む組成物の治療的有効投与量を、それを必要とする対象に投与する段階を含む、癌を治療する方法。
【請求項１８】
組成物が対象に静脈内投与される、請求項17記載の癌を治療する方法。
【請求項１９】
対象がヒトである、請求項17記載の癌を治療する方法。
【請求項２０】
癌が脳癌である、請求項17記載の癌を治療する方法。
【請求項２１】
癌が卵巣癌である、請求項17記載の癌を治療する方法。
【請求項２２】
癌が結腸癌である、請求項17記載の癌を治療する方法。
【請求項２３】
癌がドキソルビシン耐性癌である、請求項17記載の癌を治療する方法。
【請求項２４】
ミセルの分子サイズが、30nmまたはそれ未満である、請求項17記載の癌を治療する方法。
【請求項２５】
以下の段階を含む、腫瘍細胞の細胞増殖を阻害する方法:
(a)ミセル構築物、抗体単鎖可変断片(scFv)、NF-kb阻害剤、およびトポイソメラーゼII阻害剤を含む組成物を提供する段階；ならびに
(b)該組成物の治療的有効投与量を該腫瘍細胞に投与することによって細胞増殖を阻害する段階。
【請求項２６】
トポイソメラーゼ阻害剤がDoxを含む、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
NF-kb阻害剤がクルクミンを含む、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
腫瘍細胞が、脳癌細胞、卵巣癌細胞、および/または結腸癌細胞である、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
(a)ミセル構築物；
(b)抗体単鎖可変断片(scFv)；
(c)NF-kb阻害剤；および
(d)トポイソメラーゼII阻害剤
を含むナノコンジュゲートであって、
該ミセル構築物、該抗体単鎖可変断片(scFv)、該NF-kb阻害剤、および該トポイソメラーゼII阻害剤が互いにコンジュゲートされている、ナノコンジュゲート。
【請求項３０】
ナノコンジュゲートが、20nm〜50nmの分子サイズを有する、請求項29記載のナノコンジュゲート。
【請求項３１】
ナノコンジュゲートが、10nm〜20nmの分子サイズを有する、請求項29記載のナノコンジュゲート。
【請求項３２】
ナノコンジュゲートが、20nm未満の分子サイズである、請求項29記載のナノコンジュゲート。
【請求項３３】
ミセルに封入されている、請求項29記載のナノコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる2015年10月23日に出願された米国仮特許出願第62/245,813号の優先権の恩典を主張する。
【０００２】
発明の分野
本開示は、医学の分野、およびより具体的には癌の治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
開示の背景
癌の研究に何十億ドルもが費やされているにも関わらず、癌の完全かつ効果的な治療は開発されていない。腫瘍細胞が、それらの細胞が増殖し様々な変異を受ける際に生じる様々な細胞型から構成され得ることが、その理由の一つである。言い換えると、この多様性が、癌の治療を非常に困難にしている一因であり、癌細胞の集団は、投与される任意の個々の治療薬または化学療法薬に対して偶然に耐性である突然変異変種を容易に含む可能性があるからである。これらの少数の耐性癌細胞には、他の細胞と比較して、強い選択有利性が与えられ、時間とともに、これらの耐性細胞の出現率が上昇する。
【０００４】
したがって、薬物耐性腫瘍をもっと上手く標的とし、癌細胞の多様性を場合によっては無視することができるものを含む、その他の癌治療薬の開発が、当技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
1つの態様において、ミセル構築物、抗体単鎖可変断片(scFv)、NF-kb阻害剤、およびトポイソメラーゼII阻害剤を含む組成物が、本明細書において開示される。1つの態様において、scFvは、ミセル構築物にコンジュゲートされている。1つの態様において、ミセル構築物は、NF-kb阻害剤にコンジュゲートされている。1つの態様において、ミセル構築物は、NF-kb阻害剤およびトポイソメラーゼII阻害剤にコンジュゲートされている。1つの態様において、NF-kb阻害剤は、クルクミンまたはその薬学的等価物、類似体、誘導体、および/もしくは塩である。1つの態様において、トポイソメラーゼII阻害剤は、doxまたはその薬学的等価物、類似体、誘導体、および/もしくは塩である。1つの態様において、scFvは、glut-1_1 scFvまたはglut-1_2 scFvである。1つの態様において、ミセル構築物は、glut-1_1 scFvおよび/またはglut-1_2 scFvに結合するように標的指向されている。1つの態様において、組成物は、標的指向ミセルを形成する。1つの態様において、標的指向ミセルの分子サイズは、30nmまたはそれ未満である。1つの態様において、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【０００６】
別の態様において、次の段階を含む、対象の腫瘍部位に薬物分子を送達する方法が、本明細書において開示される:標的指向ミセルに薬物分子を結合させる段階であって、標的指向ミセルが、ミセル構築物および抗体単鎖可変断片(scFv)を含む、段階；ならびに標的指向ミセルに結合させた薬物分子を、細胞内送達によって腫瘍部位に送達する段階。1つの態様において、薬物分子は、doxおよび/もしくはクルクミンまたはその薬学的等価物、類似体、誘導体、および/もしくは塩を含む。1つの態様において、ミセルの分子サイズは、30nmまたはそれ未満である。1つの態様において、腫瘍は、ドキソルビシン耐性の腫瘍である。1つの態様において、対象はヒトである。
【０００７】
別の態様において、ミセル構築物、抗体単鎖可変断片(scFv)、NF-kb阻害剤、およびトポイソメラーゼII阻害剤を含む組成物の治療的有効投与量を、それを必要とする対象に投与する段階を含む、癌を治療する方法が、本明細書において開示される。1つの態様において、組成物は、対象に静脈内投与される。1つの態様において、対象はヒトである。1つの態様において、癌は、脳癌である。1つの態様において、癌は、卵巣癌である。1つの態様において、癌は、結腸癌である。1つの態様において、癌は、ドキソルビシン耐性の癌である。1つの態様において、標的指向ミセルの分子サイズは、30nmまたはそれ未満である。
【０００８】
別の態様において、ミセル構築物、抗体単鎖可変断片(scFv)、NF-kb阻害剤、およびトポイソメラーゼII阻害剤を含む組成物を提供する段階；ならびに組成物の治療的有効投与量を腫瘍細胞に投与することによって細胞増殖を阻害する段階を含む、腫瘍細胞の細胞増殖を阻害する方法が、本明細書において開示される。1つの態様において、トポイソメラーゼ阻害剤は、Doxを含む。1つの態様において、NF-kb阻害剤は、クルクミンを含む。1つの態様において、腫瘍細胞は、脳癌細胞、卵巣癌細胞、および/または結腸癌細胞である。
【０００９】
別の態様において、ミセル構築物、抗体単鎖可変断片(scFv)、NF-kb阻害剤、およびトポイソメラーゼII阻害剤を含むナノコンジュゲートであって、ミセル構築物、抗体単鎖可変断片(scFv)、NF-kb阻害剤、およびトポイソメラーゼII阻害剤が互いにコンジュゲートされている、ナノコンジュゲートが、本明細書において開示される。1つの態様において、ナノコンジュゲートは、20nm〜50nmの分子サイズを有する。1つの態様において、ナノコンジュゲートは、10nm〜20nmの分子サイズを有する。1つの態様において、ナノコンジュゲートは、20nm未満の分子サイズである。1つの態様において、ナノコンジュゲートは、ミセルに封入されている。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
例示的な態様が、参照図面において示される。本明細書において開示される態様および図面は、制限的ではなく例示的とみなされるべきであることが意図される。
【００１１】
【図１】本明細書の態様に従って、48時間の連続的接触後の、ドキソルビシン耐性卵巣癌細胞株A2780/Adrに対するCUR40/DOX0.8ミセルの有効性を示す。各棒は、CUR/DOX濃度80/1.6、40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、1.25/0.025における細胞生存率を示す。実験データは、空ミセル、G1_1-空ミセル、G1_2-空ミセル、CUR40/DOX0.8ミセル、G1_1-CUR40/DOX0.8ミセル、およびG1_2-CUR40/DOX0.8ミセルについて細胞生存率を比較したものである。
【図２】本明細書の態様に従って、4〜44時間の接触後の、ドキソルビシン感受性卵巣癌細胞株A2780/Sensに対する遊離CUR、遊離DOX、および遊離CUR/DOXの有効性を示す。実験データは、CUR/DOX濃度(uM)40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025で、遊離CUR、遊離DOX、および遊離CUR/DOXについて細胞生存率を比較したものである。
【図３】本明細書の態様に従って、4〜44時間の接触後の、ドキソルビシン感受性卵巣癌細胞株A2780/Sensに対する空ミセルおよびCURのみのミセルの有効性を示す。データは、CUR/DOX濃度(uM)40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025で、空ミセル、G1_1-空ミセル、G1_2-空ミセル、CURミセル、CUR-G1_1ミセル、およびCUR-G1_2ミセルについて細胞生存率(％)を比較したものである。
【図４】本明細書の態様に従って、4〜44時間の接触後の、ドキソルビシン感受性卵巣癌細胞株A2780/Sensに対するCURミセルおよびCUR/DOXミセルの有効性を示す。各棒は、CUR/DOX濃度40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率を示す。実験データは、CURミセル、CUR-G1_1ミセル、CUR-G1ミセル、CUR/DOXミセル、CUR/DOX-G1_1ミセル、およびCUR/DOX-G1_2ミセルについての細胞生存率を比較したものである。
【図５】本明細書の態様に従って、4〜44時間の接触後の、ドキソルビシン耐性卵巣癌細胞株A2780/Adrに対する空ミセルおよびCURのみのミセルの有効性を示す。各棒は、CUR/DOX濃度(uM)40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率を示す。実験データは、空ミセル、G1_1-空ミセル、G1_2-空ミセル、CURミセル、CUR-G1_1ミセル、およびCUR-G1_2ミセルについての細胞生存率を比較したものである。
【図６】本明細書の態様に従って、4〜44時間の接触後の、ドキソルビシン耐性卵巣癌細胞株A2780/Adrに対するCURミセルおよびCUR/DOXミセルの有効性を示す。各棒は、CUR/DOX濃度(uM)40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率を示す。実験データは、CURミセル、CUR-G1_1ミセル、CUR-G1_2ミセル、CUR/DOXミセル、CUR/DOX-G1_1ミセル、およびCUR/DOX-G1_2ミセルについての細胞生存率を比較したものである。
【図７】本明細書の態様に従って、24時間の連続的接触後の、ドキソルビシン感受性卵巣癌細胞株A2780/Senに対するCUR40/DOX0.8ミセルの有効性を示す。各棒は、CUR/DOX濃度(uM)80/1.6、40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、1.25/0.025、および0.625/0.0125における細胞生存率を示す。実験データは、空ミセル、G1_1-空ミセル、G1_2-空ミセル、CUR40/DOX0.8ミセル、G1_1-CUR40/DOX0.8ミセル、およびG1_2-CUR40/DOX0.8ミセルについての細胞生存率を比較したものである。
【図８】本明細書の態様に従って、48時間の連続的接触後の、ドキソルビシン感受性卵巣癌細胞株A2780/Senに対するCUR40/DOX0.8ミセルの有効性を示す。各棒は、CUR/DOX濃度(uM)80/1.6、40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率を示す。実験データは、空ミセル、G1_1-空ミセル、G1_2-空ミセル、CUR40/DOX0.8ミセル、G1_1-CUR40/DOX0.8ミセル、およびG1_2-CUR40/DOX0.8ミセルについての細胞生存率を比較したものである。
【図９】本明細書の態様に従って、24時間の連続的接触後の、ドキソルビシン耐性卵巣癌細胞株A2780/Adrに対するCUR40/DOX0.8ミセルの有効性を示す。各棒は、CUR/DOX濃度(uM)80/1.6、40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率を示す。実験データは、空ミセル、G1_1-空ミセル、G1_2-空ミセル、CUR40/DOX0.8ミセル、G1_1-CUR40/DOX0.8ミセル、およびG1_2-CUR40/DOX0.8ミセルについての細胞生存率を比較したものである。
【図１０】本明細書の態様に従って、48時間の連続的接触後の、ドキソルビシン耐性卵巣癌細胞株A2780/Adrに対するCUR40/DOX0.8ミセルの有効性を示す。各棒は、CUR/DOX濃度(uM)80/1.6、40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率を示す。実験データは、空ミセル、G1_1-空ミセル、G1_2-空ミセル、CUR40/DOX0.8ミセル、G1_1-CUR40/DOX0.8ミセル、およびG1_2-CUR40/DOX0.8ミセルについての細胞生存率を比較したものである。
【図１１】本明細書の態様に従って、4〜44時間の接触後の、HCT-116細胞に対する遊離CUR、遊離DOX、および遊離CUR/DOXの有効性を示す。各棒は、CUR/DOX濃度(uM):40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率(％)を例示する。
【図１２】本明細書の態様に従って、4〜44時間の接触後の、HCT-116細胞に対するCURミセルおよびCUR/DOXミセルの有効性を示す。各棒は、CUR/DOX濃度(uM)40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率を示す。実験データは、CURミセル、CUR-G1_1ミセル、CUR-G1_2ミセル、CUR/DOXミセル、CUR/DOX-G1_1ミセル、およびCUR/DOX-G1_2ミセルについての細胞生存率を比較したものである。
【図１３】本明細書の態様に従って、24時間の連続的接触後の、HCT-116細胞に対するCUR40/DOX0.8ミセルの有効性を示す。各棒は、CUR/DOX濃度(uM)80/1.6、40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率を示す。実験データは、空ミセル、G1_1-空ミセル、G1_2-空ミセル、CUR40/DOX0.8ミセル、G1_1-CUR40/DOX0.8ミセル、およびG1_2-CUR40/DOX0.8ミセルについての細胞生存率(％)を比較したものである。
【図１４】本明細書の態様に従って、48時間の連続的接触後の、HCT-116細胞に対するCUR40/DOX0.8ミセルの有効性を示す。各棒は、CUR/DOX濃度(uM)80/1.6、40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率を示す。実験データは、空ミセル、G1_1-空ミセル、G1_2-空ミセル、CUR40/DOX0.8ミセル、G1_1-CUR40/DOX0.8ミセル、およびG1_2-CUR40/DOX0.8ミセルについての細胞生存率(％)を比較したものである。
【図１５】本明細書の態様に従って、24時間の連続的接触後の、U87MG細胞に対する遊離薬物およびミセルの有効性を示す。各棒は、CUR/DOX濃度(uM)40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率を示す。実験データは、遊離CUR、遊離DOX、遊離CUR/DOX、CURミセル、CUR-G1_1ミセル、CUR-G1_2ミセル、CUR/DOXミセル、CUR/DOX-G1_1ミセル、およびCUR/DOX-G1_2ミセルについての細胞生存率(％)を比較したものである。
【図１６】本明細書の態様に従って、48時間の連続的接触後の、U87MG細胞に対する遊離薬物およびミセルの有効性を示す。各棒は、CUR/DOX濃度(uM):40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率(％)を示す。実験データは、遊離CUR、遊離DOX、遊離CUR/DOX、CURミセル、CUR-G1_1ミセル、CUR-G1_2ミセル、CUR/DOXミセル、CUR/DOX-G1_1ミセル、およびCUR/DOX-G1_2ミセルについての細胞生存率を比較したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
本明細書において引用される参照文献、刊行物、および特許はすべて、あたかもそれらが全面的に説明されるかのように、それらの全体が参照により組み入れられる。他に規定されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有している。Hornyak, et al., Introduction to Nanoscience and Nanotechnology, CRC Press (2008); Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2001); March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7th ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2013);およびSambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)は、本出願において使用される用語の多くについての一般的指針を当業者に提供する。当業者は、本発明の実践において使用され得る、本明細書において説明されるものと同様または等価な多くの方法および材料を認識するであろう。実際、本発明は、説明される方法および材料に決して限定されない。
【００１３】
本明細書において使用される場合、「HCT-116」とは、結腸腫瘍細胞株を意味する。本明細書において使用される場合、「A2780」とは、卵巣癌細胞株を意味する。本明細書において使用される場合、「U87MG」または「U87」とは、脳癌細胞株を意味する。
【００１４】
本明細書において使用される場合、「CUR」という略語はクルクミンを意味する。本明細書において使用される場合、「DOX」という用語は、ドキソルビシンを意味する。
【００１５】
本明細書において使用される場合、同義的に使用される用語「glut-1」、「GLUT-1」、「G1」、または「glut1」は、グルコーストランスポーター抗体を意味する。本明細書において使用される場合、用語scFvは、単鎖可変断片を意味する。したがって、用語GLUT-1_1 scFvおよび/またはGLUT1_2 scFvは、GLUT-1抗体の単鎖可変断片を意味する。
【００１６】
本明細書において説明するように、本発明者は、有効な癌治療法は、早期に癌を攻撃し、かつ積極的に攻撃することによって利益を得るであろうことを認識した。これは、薬物の量が多いほど単一細胞がそれらに耐性である確率が低くなるため、治療用の薬物の組合せを投与する形式で行われ得る。さらに、有効な癌治療法は、癌細胞がまさに増殖のために依拠しているプロセスを標的とすることにより、癌細胞の多様性を場合によっては無視することもでき得る。1つのこのようなプロセスは、細胞増殖のために糖の産生およびプロセシングに腫瘍が依拠していることである。
【００１７】
本明細書において説明するように、本発明者は、癌および関連した病態を治療するための様々な組成物および方法を開発した。本明細書においてさらに説明する態様に従って、本発明者は、癌治療用組成物および効果的な送達のための方法を開発および最適化し、毒性を最小限に抑えた。例えば、1つの態様において、単鎖抗体を使用することにより、本明細書の様々な態様と連携して、より効率的な送達が可能になる。本明細書においてさらに開示される様々な態様に従って、本発明者はまた、標的指向ミセルにクルクミンを結合させた。標的指向ミセルにクルクミンを結合させることにより、顕著に少ない投与量で治療薬を投与し、それにより、毒性を低下させつつ、腫瘍増殖を効果的に阻害した。ドキソルビシンおよびクルクミンの両方のリポソーム形態と比較して、ミセル調製物は、分子サイズが顕著に小さく(80〜150nmのリポソームに対して10〜20nm)、その結果、血管床からの腫瘍領域浸透が良くなり、それにより、より効果的な癌治療物質を作り出す。
【００１８】
1つの態様において、ミセル構築物、抗体単鎖可変断片(scFv)、NF-kb阻害剤、およびトポイソメラーゼII阻害剤を含む組成物が、本明細書において開示される。1つの態様において、scFvは、ミセル構築物にコンジュゲートされている。1つの態様において、ミセル構築物は、NF-kb阻害剤にコンジュゲートされている。1つの態様において、ミセル構築物は、NF-kb阻害剤およびトポイソメラーゼII阻害剤にコンジュゲートされている。1つの態様において、NF-kb阻害剤は、クルクミンまたはその薬学的等価物、類似体、誘導体、および/もしくは塩である。1つの態様において、トポイソメラーゼII阻害剤は、doxまたはその薬学的等価物、類似体、誘導体、および/もしくは塩である。1つの態様において、scFvは、glut-1_1 scFvまたはglut-1_2 scFvである。1つの態様において、ミセル構築物は、glut-1_1 scFvおよび/またはglut-1_2 scFvに結合するように標的指向されている。1つの態様において、組成物は、標的指向ミセルを形成する。1つの態様において、標的指向ミセルの分子サイズは、30nmまたはそれ未満である。1つの態様において、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００１９】
別の態様において、ミセル構築物および抗体単鎖可変断片(scFv)を含む標的指向ミセルに薬物分子を結合させる段階；ならびに標的指向ミセルに結合させた薬物分子を、細胞内送達によって腫瘍部位に送達する段階を含む、対象の腫瘍部位に薬物分子を送達する方法が、本明細書において開示される。1つの態様において、薬物分子は、doxおよび/もしくはクルクミンまたはその薬学的等価物、類似体、誘導体、および/もしくは塩を含む。1つの態様において、ミセルの分子サイズは、30nmまたはそれ未満である。1つの態様において、腫瘍は、ドキソルビシン耐性の腫瘍である。1つの態様において、対象はヒトである。
【００２０】
別の態様において、ミセル構築物、抗体単鎖可変断片(scFv)、NF-kb阻害剤、およびトポイソメラーゼII阻害剤を含む組成物の治療的有効投与量を、それを必要とする対象に投与する段階を含む、癌を治療する方法が、本明細書において開示される。1つの態様において、組成物は、対象に静脈内投与される。1つの態様において、対象はヒトである。1つの態様において、癌は、脳癌である。1つの態様において、癌は、卵巣癌である。1つの態様において、癌は、結腸癌である。1つの態様において、癌は、ドキソルビシン耐性の癌である。1つの態様において、標的指向ミセルの分子サイズは、30nmまたはそれ未満である。
【００２１】
別の態様において、ミセル構築物、抗体単鎖可変断片(scFv)、NF-kb阻害剤、およびトポイソメラーゼII阻害剤を含む組成物を提供する段階；ならびに組成物の治療的有効投与量を腫瘍細胞に投与することによって細胞増殖を阻害する段階を含む、腫瘍細胞の細胞増殖を阻害する方法が、本明細書において開示される。1つの態様において、トポイソメラーゼ阻害剤は、Doxを含む。1つの態様において、NF-kb阻害剤は、クルクミンを含む。1つの態様において、腫瘍細胞は、脳癌細胞、卵巣癌細胞、および/または結腸癌細胞である。
【００２２】
別の態様において、ミセル構築物、抗体単鎖可変断片(scFv)、NF-kb阻害剤、およびトポイソメラーゼII阻害剤を含むナノコンジュゲートであって、ミセル構築物、抗体単鎖可変断片(scFv)、NF-kb阻害剤、およびトポイソメラーゼII阻害剤が互いにコンジュゲートされている、ナノコンジュゲートが、本明細書において開示される。1つの態様において、ナノコンジュゲートは、20nm〜50nmである。1つの態様において、ナノコンジュゲートは、10nm〜20nmである。1つの態様において、ナノコンジュゲートは、20nm未満である。1つの態様において、ナノコンジュゲートは、ミセルに封入されている。
【００２３】
本開示の態様を、以下の実施例においてさらに説明する。これらの実施例は、例示にすぎず、特許請求される本発明の範囲を決して限定しない。
【実施例】
【００２４】
実施例1
材料
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](PEG-PE)は、Avanti Polar Lipids(Alabaster, AL, USA)製であった。pNP-PEG3400-pNPはLaysan Bio(Arab, AL)から購入した。クルクミン(CUR)、ビタミンE、およびトリエチルアミン(TEA)は、Sigma(St. Louis, MO, USA)から購入した。塩酸ドキソルビシン(DOX)は、LC Laboratories(Woburn, MA)製であった。Accumaxは、Innovative Cell Technologies, Inc.(San Diego, CA)製であった。CellTiter-Glo発光式細胞生存性アッセイ法キットは、Promega(Fitchburg, WI)製であった。他の試薬はすべて、分析グレードのものであった。DOX遊離塩基は、DOX HCl(メタノール中、0.5mg/ml)を5倍モル過剰のTEAと共に一晩インキュベートすることによって得た。pNP-PEG3400-PEは施設内で合成した。
【００２５】
実施例2
ミセルの調製
薄膜水和法によって、DOXおよび/またはCUR薬物を詰めた混合ミセルを調製した。CUR(1mg/ml、0.1％酢酸メタノール溶液)および/またはDOX遊離塩基(0.5mg/ml、メタノール溶液)をPEG2000-PEのクロロホルム溶液に添加した。製剤最適化研究後、CUR:DOX比が32(w/w)となるように、初期の薬物量を調整した。回転式蒸発によって有機溶媒を除去し、薬物/ミセル形成材料混合物の薄膜を形成させた。この薄膜を凍結乾燥器中で一晩、さらに乾燥して、有機溶媒の任意の残留物を除去した(Freezone 4.5 Freeze Dry System, Labconco, Kansas City, MO)。この膜をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH7.2中に再懸濁することによって、薬物を詰めたミセルを形成させ、すべての製剤中のミセル形成材料の最終濃度を5mMにした。これらのミセル製剤をPBS pH7.2に対して1時間透析して、過剰なTEAを除去した。0.2μmのシリンジフィルターを通すろ過によって、組み込まれなかった過剰な薬物を分離した。
【００２６】
標的指向ミセルを得るために、GLUT-1 scFvをpNP-PEG3400-PEと反応させた。簡単に説明すると、必要量のクロロホルム中pNP-PEG3400-PEを丸底フラスコに添加し、回転式蒸発とそれに続く減圧乾燥によって溶媒を除去した後、ポリマー膜を形成させた。この膜を水和し、クエン酸緩衝生理食塩水(CBS)pH5.0と共に最初にボルテックスして、pNPの遠位の基が早期に加水分解されるのを防止した。ミセルを形成させた後、GLUT-1 scFvのPBS(pH7.4)溶液を混合物に添加し、NaOHを用いてpHを8.2に調整した。pNP基とscFvのモル比は40:1で維持した。反応時間は4℃で一晩とし、十分に結合させ、より高いpHで未反応pNP基を完全に加水分解させた。次いで、50,000MWCOセルロースエステル膜を用いて、PBS(pH7.4)に対して4℃で4時間、標的指向ミセルを透析して、結合していないscFvの完全な除去を徹底した。製造業者の取扱い説明書に従ってマイクロBCAキット(Pierce, Rockford, IL)を用いて、GLUT-1 scFvの結合効率を測定した。GLUT-1 scFvコンジュゲートミセルを混合し、薬物を詰めたPEG-PEミセルと共に室温で4時間、同時インキュベートした。ミセル中のGLUT-1 scFvの最終モル比率を0.05％に調整した。
【００２７】
実施例3
卵巣癌細胞株に対するGLUT-1 scFv修飾ミセルの細胞障害性
細胞障害性評価のために、A2780ヒト卵巣癌(ATCC)およびそのドキソルビシン耐性派生物A2780/Adr(ECACC)を使用した。10％FBSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したRPMI培地中でA2780細胞を培養した。薬物耐性卵巣癌細胞を、100nM DOXを添加した同じ培地中で増殖させた。
【００２８】
これらの細胞を、48時間処置群または24時間処置群について、それぞれ3000細胞/ウェルまたは5,000細胞/ウェルの密度で、96ウェルプレート中に播種した。これらの細胞を、血清入りRPMI完全培地中で、遊離薬物または40μM CURおよび0.8μM DOXを含むミセル製剤によって処置した。連続処置群では、24時間および48時間、連続的に細胞をインキュベートした。さらに、別の処置計画では、これらの細胞を薬物/ミセルと共に4時間インキュベートし、次いで洗浄し、さらに44時間インキュベートした。処置時間の最後に、培地でウェルを2回洗浄し、次いで、20％(v/v)CellTiter-Blue試薬を含む培地50μlと共にインキュベートした。蛍光発光の値を測定し、PBS処置細胞を対象群として用いることにより、細胞生存率(％)を算出した。
【００２９】
実施例4
3D神経膠芽腫スフェロイドの調製およびミセルの細胞障害性評価
10％FBSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEM培地中でU87MG細胞を培養した。単層細胞障害性実験のために、48時間および24時間の連続処置時間について、96ウェルプレートの各ウェル中にそれぞれ3000個または5000個の細胞を播種した。プレートを一晩インキュベーションした後、遊離薬物またはミセル製剤としてのCURおよび/またはDOXによって、これらの細胞を処置した。前述のように、CellTiter-Blueを細胞障害性評価方法として使用した。
【００３０】
3D癌細胞スフェロイドを調製するために、リキッドオーバーレイ法を使用した。簡単に説明すると、1.5％(w/v)寒天を含む無血清DMEM培地を調製し、滅菌した。寒天溶液50μLを96ウェルプレートの各ウェルの底に添加して、ウェル表面への細胞接着を防止した。使用前に、プレートを45分間、放冷した。U87MG細胞をトリプシン処理し、計数し、次いで、10,000細胞/ウェルの密度で播種した。1,500rcf、24℃で15分間、プレートを遠心分離した。Nikon Eclipse E400顕微鏡(Nikon Inc., Melville, NY)をSpot InsightカメラおよびSpot Advancedソフトウェア (Spot Imaging, Sterling Heights, MI)と共に用いて、スフェロイド形成を継続的に追跡調査した。5日後にスフェロイドが形成され高密度になると、それらを製剤で処置した。48時間の処置後に、スフェロイドの細胞生存率を測定した。様々な製剤、薬物濃度、および組合せを用いて処置した後、スフェロイドと共に、対応するウェルの培地をすべて採取し、遠心分離チューブ中に入れた。感度を高めるために、1回の実験分として5つのスフェロイドを採取した。これらのスフェロイドをPBSで2回洗浄した。残存PBSを除去した後、AccuMax(登録商標)細胞分離溶液を添加し、水平振盪機に入れて37℃で10分間、時々ピペッティングしながら、チューブをインキュベートした。スフェロイドを分散させて単細胞にした後、これらのチューブにFBSを添加した。得られた細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。体積比1:1の完全DMEMおよびCellTiter-Glo試薬をチューブに添加し、完全に細胞溶解させるために細胞を20分間インキュベートした。100μLの溶液を96ウェル黒壁プレートに移すことにより、マルチプレートリーダーを用いて発光を測定した。
【００３１】
実施例5
組成物および方法
本明細書において説明するように、本発明者は、癌および関連した病態を治療するための様々な組成物および方法を開発した。1つの態様において、本発明は、glut-1受容体抗体によって標的指向され、かつ1つまたは複数のクルクミン分子および/またはdox分子に結合されているミセルを含む組成物を提供し、治療的有効投与量を対象に投与することによって、対象において癌を治療するか、かつ/または腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。別の態様において、組成物は、対象に静脈内投与される。別の態様において、glut-1受容体抗体は、単鎖抗体である。別の態様において、glut-1受容体抗体は、GLUT-1_1 scFvおよび/またはGLUT1_2 scFvである。別の態様において、腫瘍細胞は卵巣腫瘍である。別の態様において、腫瘍細胞は脳腫瘍である。別の態様において、腫瘍細胞はA2780である。別の態様において、腫瘍細胞はU87MGである。
【００３２】
本明細書においてさらに説明する態様に従って、本発明者は、癌治療用組成物および効果的な送達のための方法を開発および最適化し、毒性を最小限に抑えた。例えば、1つの態様において、単鎖抗体を使用することにより、本明細書の様々な態様と連携して、より効率的な送達が可能になった。また、例えば、リポソーム化doxまたは単にdoxではなく、例えば、標的指向ミセルに結合させたdoxを脂質ベースの送達ビヒクルとして使用することにより、本発明者は、顕著に高いレベルで腫瘍領域に浸透する癌治療薬を作り出した。高レベルの腫瘍領域浸透をもたらすことに加えて、標的指向ミセルに結合させたdoxを含む組成物を投与することにより、腫瘍細胞それ自体の内部でのdoxの細胞内送達も最適化された。doxは弱塩基性化合物として作用するため、低pH環境または例えば腫瘍細胞のリソソームに入ると、doxは、腫瘍細胞増殖を阻害するための有効性の多くを失う場合がある。例えばリポソーム化doxを投与するのではなく、標的指向ミセルに結合させたdoxを投与することによって、本発明者は、doxが代わりに細胞質に入ることを可能にし、それによって細胞内送達を最適化した。さらに、doxは高い毒性を有する場合があり、したがって、インビボでのその実用的用途およびヒト対象に対する癌治療薬としての有用性が限定され得る。対照的に、本発明者は、標的指向ミセルに結合させたdoxを投与し、その結果、癌治療物質としてのその有効性をさらに最適化した。
【００３３】
本明細書においてさらに開示される様々な態様に従って、本発明者はまた、標的指向ミセルにクルクミンを結合させた。その不溶性の特性が原因で、クルクミンは、直接的に投与される場合、腫瘍増殖を効果的に阻害するには高濃度で投与されなければならない。しかし、このような高濃度では、クルクミンは高い毒性をもたらし、したがって、インビボでは非実用的で効果のない癌治療薬となり、ヒト患者において使用するのは特に困難となる。本明細書の1つの態様によれば、標的指向ミセルにクルクミンを結合させることにより、顕著に少ない投与量で治療薬を投与し、それにより、毒性を低下させつつ、腫瘍増殖を効果的に阻害することができる。
【００３４】
ドキソルビシンおよびクルクミンの両方のリポソーム形態と比較して、ミセル調製物は、分子サイズが顕著に小さく(80〜150nmのリポソームに対して10〜20nm)、その結果、血管床からの腫瘍領域浸透が良くなり、それにより、より効果的な癌治療物質を作り出す。さらに、本明細書の1つの態様によれば、Glut-1 Abをミセルに添加すると、その内容物の細胞内送達を良くすることにより、標的指向されていないミセル調製物よりも、治療的有効性が大いに高まった。Glut-1は、腫瘍グルコース取込みに関与している主要グルコーストランスポーターの内の1つであるため、魅力的な細胞外標的を提示する。固形腫瘍は、正常細胞が行うよりもずっと速い速度でグルコースを取り込むことができる。解糖は、増殖する腫瘍のためのエネルギーおよび炭素基本成分の主要供給源に相当する。したがって、本明細書の1つの態様によれば、glut-1過剰発現が、腫瘍の表現型進化に直面してさえ持続すると考えられ、腫瘍がglut-1過剰発現を避けるように変異し、かつ高い増殖能力を依然として保持することは困難であると考えられることから、Glut-1 Abを含むミセル構築物は、有効な癌治療物質である。glut-1を腫瘍ターゲティング実体として使用することに関して、腫瘍膜で過剰発現されたglut-1に結合することにより、本明細書において説明する治療的ミセルの様々な態様は、低pHのリソソームではなく細胞質中にエンドサイトーシスされ、それによって、(低pHでは活性がはるかに低い)ドキソルビシンの治療的有効性を高める。
【００３５】
これらの実験で使用される腫瘍株はドキソルビシン耐性であったため、クルクミン送達がドキソルビシン曝露と同時に起こることが、その殺腫瘍効果を発揮するためには不可欠であった。NFκB過剰発現およびそれに伴うアポトーシス耐性および化学療法耐性が進行癌には存在するため、本発明者は、ドキソルビシンの殺作用を解除するためにNFκB阻害剤(例えばクルクミン)を含む本明細書の様々な態様を立案した。1つの態様において、本発明は、顕著なインビボ腫瘍阻害効果がありヒト癌治療への適用性が明らかである、アポトーシス阻害剤と一緒に殺腫瘍物質を含む、腫瘍を標的とするミセルである。
【００３６】
実施例6
化学療法耐性の卵巣癌細胞(A2780/Adr)に対する有効性
1つの態様において、本発明者は、ドキソルビシン耐性卵巣癌細胞に関する研究において、本明細書で開示する化合物およびミセルの有効性を実証した。CUR/DOX濃度20/0.4uMにおいて、Glut1抗体ターゲティングの増強効果がはっきりと視認でき、腫瘍細胞生存率が減少している。
【００３７】
図1に示すように、48時間の連続的接触後の、ドキソルビシン耐性卵巣癌細胞株A2780/Adrに対するCUR40/DOX0.8ミセルの有効性を測定した。各棒は、CUR/DOX濃度80/1.6、40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、1.25/0.025における細胞生存率を示す。空ミセル、G1_1-空ミセル、G1_2-空ミセル、CUR40/DOX0.8ミセル、G1_1-CUR40/DOX0.8ミセル、およびG1_2-CUR40/DOX0.8ミセルについての細胞生存率を比較した実験データを示している。
【００３８】
図2に示すように、4〜44時間の接触後の、ドキソルビシン感受性卵巣癌細胞株A2780/Sensに対する遊離CUR、遊離DOX、および遊離CUR/DOXの有効性を測定した。CUR/DOX濃度(uM)40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025で、遊離CUR、遊離DOX、および遊離CUR/DOXについて細胞生存率を比較した実験データを示している。
【００３９】
図3に示すように、4〜44時間の接触後の、ドキソルビシン感受性卵巣癌細胞株A2780/Sensに対する空ミセルおよびCURのみのミセルの有効性を測定した。CUR/DOX濃度(uM)40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025で、空ミセル、G1_1-空ミセル、G1_2-空ミセル、CURミセル、CUR-G1_1ミセル、およびCUR-G1_2ミセルについて細胞生存率(％)を比較したデータを示している。
【００４０】
図4に示すように、4〜44時間の接触後の、ドキソルビシン感受性卵巣癌細胞株A2780/Sensに対するCURミセルおよびCUR/DOXミセルの有効性を測定した。各棒は、CUR/DOX濃度40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率を示す。CURミセル、CUR-G1_1ミセル、CUR-G1ミセル、CUR/DOXミセル、CUR/DOX-G1_1ミセル、およびCUR/DOX-G1_2ミセルについての細胞生存率を比較した実験データを示している。
【００４１】
図5に示すように、4〜44時間の接触後の、ドキソルビシン耐性卵巣癌細胞株A2780/Adrに対する空ミセルおよびCURのみのミセルの有効性を測定した。各棒は、CUR/DOX濃度(uM)40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率を示す。空ミセル、G1_1-空ミセル、G1_2-空ミセル、CURミセル、CUR-G1_1ミセル、およびCUR-G1_2ミセルについての細胞生存率を比較した実験データを示している。
【００４２】
図6に示すように、4〜44時間の接触後の、ドキソルビシン耐性卵巣癌細胞株A2780/Adrに対するCURミセルおよびCUR/DOXミセルの有効性を測定した。各棒は、CUR/DOX濃度(uM)40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率を示す。CURミセル、CUR-G1_1ミセル、CUR-G1_2ミセル、CUR/DOXミセル、CUR/DOX-G1_1ミセル、およびCUR/DOX-G1_2ミセルについての細胞生存率を比較した実験データを示している。
【００４３】
図7に示すように、24時間の連続的接触後の、ドキソルビシン感受性卵巣癌細胞株A2780/Senに対するCUR40/DOX0.8ミセルの有効性を測定した。各棒は、CUR/DOX濃度(uM)80/1.6、40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、1.25/0.025、および0.625/0.0125における細胞生存率を示す。空ミセル、G1_1-空ミセル、G1_2-空ミセル、CUR40/DOX0.8ミセル、G1_1-CUR40/DOX0.8ミセル、およびG1_2-CUR40/DOX0.8ミセルについての細胞生存率を比較した実験データを示している。
【００４４】
図8に示すように、48時間の連続的接触後の、ドキソルビシ感受性卵巣癌細胞株A2780/Senに対するCUR40/DOX0.8ミセルの有効性を測定した。各棒は、CUR/DOX濃度(uM)80/1.6、40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率を示す。空ミセル、G1_1-空ミセル、G1_2-空ミセル、CUR40/DOX0.8ミセル、G1_1-CUR40/DOX0.8ミセル、およびG1_2-CUR40/DOX0.8ミセルについての細胞生存率を比較した実験データを示している。
【００４５】
図9に示すように、24時間の連続的接触後の、ドキソルビシン耐性卵巣癌細胞株A2780/Adrに対するCUR40/DOX0.8ミセルの有効性を測定した。各棒は、CUR/DOX濃度(uM)80/1.6、40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率を示す。空ミセル、G1_1-空ミセル、G1_2-空ミセル、CUR40/DOX0.8ミセル、G1_1-CUR40/DOX0.8ミセル、およびG1_2-CUR40/DOX0.8ミセルについての細胞生存率を比較した実験データを示している。
【００４６】
図10に示すように、48時間の連続的接触後の、ドキソルビシン耐性卵巣癌細胞株A2780/Adrに対するCUR40/DOX0.8ミセルの有効性を測定した。各棒は、CUR/DOX濃度(uM)80/1.6、40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率を示す。空ミセル、G1_1-空ミセル、G1_2-空ミセル、CUR40/DOX0.8ミセル、G1_1-CUR40/DOX0.8ミセル、およびG1_2-CUR40/DOX0.8ミセルについての細胞生存率を比較した実験データを示している。
【００４７】
実施例7
結腸癌細胞株に対する有効性
1つの態様において、本発明者は、ヒト結腸癌細胞株HCT-116に対する、本明細書で開示する化合物およびミセルの有効性を実証した。
【００４８】
図11に示すように、4〜44時間の接触後の、HCT-116細胞に対する遊離CUR、遊離DOX、および遊離CUR/DOXの有効性を測定した。各棒は、CUR/DOX濃度(uM):40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率(％)を例示する。
【００４９】
図12に示すように、4〜44時間の接触後の、HCT-116細胞に対するCURミセルおよびCUR/DOXミセルの有効性を測定した。各棒は、CUR/DOX濃度(uM)40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率を示す。CURミセル、CUR-G1_1ミセル、CUR-G1_2ミセル、CUR/DOXミセル、CUR/DOX-G1_1ミセル、およびCUR/DOX-G1_2ミセルについての細胞生存率を比較した実験データを示している。
【００５０】
図13に示すように、24時間の連続的接触後の、HCT-116細胞に対するCUR40/DOX0.8ミセルの有効性を測定した。各棒は、CUR/DOX濃度(uM)80/1.6、40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率を示す。空ミセル、G1_1-空ミセル、G1_2-空ミセル、CUR40/DOX0.8ミセル、G1_1-CUR40/DOX0.8ミセル、およびG1_2-CUR40/DOX0.8ミセルについての細胞生存率(％)を比較した実験データを示している。
【００５１】
図14に示すように、48時間の連続的接触後の、HCT-116細胞に対するCUR40/DOX0.8ミセルの有効性を測定した。各棒は、CUR/DOX濃度(uM)80/1.6、40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率を示す。空ミセル、G1_1-空ミセル、G1_2-空ミセル、CUR40/DOX0.8ミセル、G1_1-CUR40/DOX0.8ミセル、およびG1_2-CUR40/DOX0.8ミセルについての細胞生存率(％)を比較した実験データを示している。
【００５２】
実施例8
脳癌細胞株に対する有効性
1つの態様において、ヒト原発性神経膠芽腫細胞株U87MGに対する、本明細書で開示する化合物およびミセルの有効性を実証した。GLUT1_1 scFvおよびGLUT1_2 scFvは、作製された2種の抗Glut1 scFv'である。ミセルで処置したU87MG単層を用いて、実験を実施した。これまでのところ、この細胞株は、GLUT1_1 scFvおよびGLUT1_2 scFvに対する応答性が高い株であった。薬物による細胞障害性作用が頭打ちになるため、48時間の接触は、この細胞株にとって長すぎた。しかし、24時間の間、行効果および列効果が有意であったことは、用量反応およびまた抗体ターゲティング効果があったことを意味する。有意差は、標的指向されていないミセルとGLUT1_1またはGLUT1_2に標的指向されたミセルとの差に対応していた。二元配置ANOVA、P<0.05。様々な態様によれば、U87MGへの投与は、GLUT 1_2に良く反応した。
【００５３】
図15に示すように、24時間の連続的接触後の、U87MG細胞に対する遊離薬物およびミセルの有効性を測定した。各棒は、CUR/DOX濃度(uM)40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率を示す。遊離CUR、遊離DOX、遊離CUR/DOX、CURミセル、CUR-G1_1ミセル、CUR-G1_2ミセル、CUR/DOXミセル、CUR/DOX-G1_1ミセル、およびCUR/DOX-G1_2ミセルについての細胞生存率(％)を比較した実験データを示している。
【００５４】
図16に示すように、48時間の連続的接触後の、U87MG細胞に対する遊離薬物およびミセルの有効性を測定した。各棒は、CUR/DOX濃度(uM)40/0.8、20/0.4、10/0.2、5/0.1、2.5/0.05、および1.25/0.025における細胞生存率(％)を示す。遊離CUR、遊離DOX、遊離CUR/DOX、CURミセル、CUR-G1_1ミセル、CUR-G1_2ミセル、CUR/DOXミセル、CUR/DOX-G1_1ミセル、およびCUR/DOX-G1_2ミセルについての細胞生存率を比較した実験データを示している。
【００５５】
前述した様々な方法および技術は、本発明を実施するためのいくつかの方法を提供する。当然、説明した目的または利点のすべてが、本明細書において説明する任意の特定の態様に従って実現され得るとは限らないことを理解すべきである。したがって、例えば、当業者は、本明細書において教示または示唆され得る他の目的または利点を必ずしも実現せずに、本明細書中に教示される1つの利点または利点の群を実現または最適化する様式で、方法を実施できることを認識するであろう。様々な有利および不利な代替案を本明細書において挙げている。いくつかの好ましい態様は、1つ、もう1つ、またはいくつかの有利な特徴を特に含み、一方で、他の態様は、1つ、もう1つ、またはいくつかの不利な特徴を特に除外し、一方で、さらに他の態様は、1つ、もう1つ、またはいくつかの有利な特徴を含めることにより、存在する不利な特徴を特に弱めていることが、理解されるべきである。
【００５６】
さらに、当業者は、異なる態様に由来する様々な特徴の応用性を認識するであろう。同様に、上記の様々な要素、特徴、および段階、ならびにこのような各要素、各特徴、または各段階ついての他の公知の等価物を、当業者が組み合わせ、適合させて、本明細書において説明した原則に従って方法を実施することもできる。多様な態様において、様々な要素、特徴、および段階のうちのいくつかは特に含まれ、その他は特に除外されるであろう。
【００５７】
本発明を特定の態様および実施例に関連して開示したが、本発明の態様が、具体的に開示されたそれらの態様を超えて、他の代替の態様および/または使用ならびにそれらの改変物および等価物に及ぶことが、当業者によって理解されるであろう。
【００５８】
多くの変形例および代替要素が、本発明の態様において開示された。さらに別の変形例および代替要素が、当業者には明らかであると考えられる。これらの変形例としては、非限定的に、本発明の組成物のための構成モジュール、ならびに本発明の組成物を用いて診断、予測、または治療され得る疾患および他の臨床状態の選択が挙げられる。本発明の様々な態様は、これらの変形例または要素のいずれかを特に含むか、または除外することができる。
【００５９】
いくつかの態様において、本発明の特定の態様を説明し請求するのに使用される成分の量、濃度のような特性、および反応条件などを表現する数値は、いくつかの場合において用語「約」によって修飾されると理解されるべきである。したがって、いくつかの態様において、記載した明細書および添付の特許請求の範囲において説明される数値パラメーターは、特定の態様によって獲得しようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。いくつかの態様において、数値パラメーターは、報告される有効桁数に照らして、かつ通常の端数を丸める技術を適用することによって、解釈されるべきである。本発明のいくつかの態様の広い範囲を説明する数値範囲および数値パラメーターは近似値であるものの、特定の実施例において説明する数値は、実行できる限り正確に報告されている。本発明のいくつかの態様において提示される数値は、それらの各試験測定値に存在する標準偏差から必然的に生じる一定の誤差を含んでよい。
【００６０】
いくつかの態様において、本発明の特定の態様を説明する状況で(特に、以下の特許請求の範囲の内のいくつかの状況で)使用される用語「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」、ならびに同様の言及は、単数および複数の両方を包含すると解釈することができる。本明細書における値の範囲の詳述は、その範囲に含まれる別々の各値に個別に言及することの簡略方法の役割を果たすためのものにすぎない。本明細書において別段の定めが無い限り、個々の各値は、本明細書に個別に引用されるかのように、明細書中に組み入れられる。本明細書において説明される方法はすべて、本明細書において別段の定めが無い限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書の特定の態様に関して提供される任意およびすべての例、または例示的な言い回し(例えば、「などの」)の使用は、本発明をよりうまく明らかにするためのものにすぎず、別の方法で請求される本発明の範囲に制限を与えない。本明細書中のいかなる言い回しも、本発明の実践に必須である特許請求されていない任意の要素を示すと解釈されるべきではない。
【００６１】
本明細書において開示される本発明の代替の要素または態様のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループメンバーは、個々に、またはグループの他のメンバーもしくは本明細書において見出される他の要素との任意の組合せにおいて、言及され、特許請求され得る。グループの1つまたは複数のメンバーは、簡便性および/または特許性を理由として、グループ中に含めるか、またはグループから削除されてよい。任意のこのような包含または削除が行われる場合、本明細書は、添付の特許請求の範囲において使用されるすべてのマーカッシュ群の記載された説明を満たす、そのように改変されたグループを含むと本明細書においてみなされる。
【００６２】
本発明を実施するための本発明者に公知の最良の形態を含む、本発明の好ましい態様を、本明細書において説明する。これらの好ましい態様についての変形例は、前述の説明を読むと、当業者には明らかになるであろう。当業者は必要に応じてこのような変形例を使用することができ、本明細書において具体的に説明されるのとは別の方法で本発明を実施できることが、予想される。したがって、本発明の多くの態様は、適用法によって許容されるように、本明細書に添付される特許請求の範囲において挙げられる主題のあらゆる改変物および等価物を含む。さらに、そのすべての可能な変形例における前述の要素の任意の組合せは、本明細書において別段の定めが無い限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【００６３】
さらに、本明細書の全体にわたって、特許および出版刊行物が数多く参照される。上記に引用した参照文献および出版刊行物の各々は、その全体が参照により本明細書に個々に組み入れられる。
【００６４】
最後に、本明細書において開示される本発明の態様は、本発明の原則を例証していることが理解されるべきである。使用され得る他の改変は、本発明の範囲に含まれ得る。したがって、例として、限定的ではないが、本発明の代替の構成が、本明細書における教示に従って使用され得る。したがって、本発明の態様は、示され説明されるものに必ずしも限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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