(57)【要約】  本発明は、体細胞胚を増加させた植物細胞培養物を得る方法、これらの細胞培養物に由来する抽出物の調製方法、並びに皮膚老化に関連する欠点を処置すること及び皮膚組織若返り効果を誘導することを目的とした化粧品組成物における得られた抽出物の使用に関する。
2018514588.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚老化に関連する欠点を処置するため、及び皮膚組織若返り効果を誘導するための体細胞胚を増加させた植物細胞培養物に由来する少なくとも１つの抽出物の化粧品としての使用。
【請求項２】
前記体細胞胚を増加させた植物細胞培養物が、ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）及びローザ・ガーデニア（Ｒｏｓａ  ｇａｒｄｅｎｉａ）の種に属する植物細胞培養物である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
好ましくはミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）及びローザ・ガーデニア（Ｒｏｓａ  ｇａｒｄｅｎｉａ）の種に属する、体細胞胚を増加させた植物細胞培養物から少なくとも１つの抽出物を調製する方法であって、以下の工程：
ａ）植物細胞懸濁培養物を体細胞胚を形成するよう誘導する工程；
ｂ）得られた前記体細胞胚を生理食塩水溶液中でホモジナイズし、ホモジネートを得る工程；
ｃ）前記ホモジネートの液体部分から固体部分を分離する工程であって、前記液体部分は水溶性抽出物を構成している工程
を含む方法。
【請求項４】
前記植物細胞培養物が、植物から植物組織を採取すること、固体基質上に前記組織からのカルス形成を誘導すること、これらから液体培養物を調製すること、とによって得られる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ホモジネートの液体部分から固体部分を分離する前記工程ｃ）が遠心分離によって行われる、請求項３又は請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記固体部分を親油性溶媒で抽出し、脂溶性抽出物を得る工程をさらに含む、請求項３から請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
体細胞胚の細胞壁の糖タンパク質を加水分解し、ペプチド及び糖が濃縮された抽出物を得るために、前記固体部分を酸溶液中のタンパク質分解酵素で処理する工程をさらに含む、請求項３から請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの抽出物が請求項３から請求項５のいずれか一項に記載の方法によって得られる水溶性抽出物である、請求項１又は請求項２に記載の使用。
【請求項９】
前記少なくとも１つの抽出物が請求項６に記載の方法によって得られる脂溶性抽出物である、請求項１又は請求項２に記載の使用。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの抽出物が請求項７に記載の方法によって得られるペプチド及び糖が濃縮された抽出物である、請求項１又は請求項２に記載の使用。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの抽出物が請求項８から請求項１０に定義される３つの抽出物の少なくとも２つ、好ましくは３つ全てを含む、請求項１又は請求項２に記載の使用。
【請求項１２】
請求項３から請求項５のいずれか一項に記載の方法によって得られる水溶性抽出物、請求項６に記載の方法によって得られる脂溶性抽出物、及び請求項７に記載の方法によって得られるペプチド及び糖が濃縮された抽出物を含む組成物。
【請求項１３】
１重量部の前記水溶性抽出物に対して、０．０１〜１００重量部、好ましくは１重量部の前記脂溶性抽出物、並びに独立に、０．０１〜１００重量部、好ましくは０．１重量部の前記ペプチド及び糖が濃縮された抽出物を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
１重量部の前記水溶性抽出物に対して、１重量部の前記脂溶性抽出物並びに０．１重量部の前記ペプチド及び糖が濃縮された抽出物を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
水、生理食塩水溶液又は有機溶媒、好ましくは油、アルコール、グリセロール、有機酸、アミド、アミン、アルデヒド及びケトンを含む群から選択される少なくとも１種の親水性溶媒をさらに含む、請求項１２から請求項１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
皮膚老化に関連する欠点を処置するため、及び皮膚組織若返り効果を誘導するための請求項１２から請求項１５のいずれか一項に記載の組成物の化粧品としての使用。
【請求項１７】
請求項１、請求項２、請求項８から請求項１０のいずれか一項に定義される抽出物又は請求項１２から請求項１４のいずれか一項に記載の組成物と、化粧品的に許容されるビヒクルとを含む化粧品配合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体細胞胚を形成するよう誘導された植物細胞培養物に由来する抽出物の化粧品としての使用、これらの抽出物の調製方法及び皮膚用化粧品（ｄｅｒｍｏ−ｃｏｓｍｅｔｉｃ）に使用するためのこれらの抽出物を含む関連する化粧品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢又は皮膚老化は避けられない生物学的現象であり、これが起こる時期及び様式は個人の遺伝的背景によって主に影響されるが、環境因子及び生活様式によっても影響される。
人体の最大器官である皮膚は、特定の機能を果たす３つの主要層で構成されている。表皮は皮膚の最上層であり、細胞質にケラチンを蓄積することによって角質細胞に分化する特殊細胞ケラチノサイトで主に構成されている。ケラチノサイトに加えて、メラニン形成細胞も表皮中に存在し、この細胞は皮膚色素沈着を担い、また免疫系の一部であるランゲルハンス細胞も存在する。第２の層である真皮は、血管、免疫細胞及び感覚受容器に富む結合組織であり；主に、全て皮膚に強度、水分補給、柔軟性及び弾力性を提供する重要な成分であるコラーゲン繊維、エラスチン及びヒアルロン酸で構成されるマトリックスを含む。マトリックスに分散しているのは、真皮を構成する全ての成分の合成を担う細胞である線維芽細胞である。第３の層は真皮の下に位置する皮下組織であり、これは脂肪組織であり、生物全体にとってエネルギー貯蔵として重要である。
【０００３】
皮膚老化の間に起こる最も劇的な変化は、真皮に関するものである。年齢とともに、真皮の厚さの段階的な薄化が観察され、その結果として、皮膚は色調及び弾力性を失い、弱くなり、しわが現れる。これは、線維芽細胞の数及び活性の低下によるものであり、ヒト皮膚の７５％を構成し、強度及び色調などの真皮の物理特性を主に担う細胞外真皮マトリックスの成分、特にコラーゲンを産生する能力を失う。２８種のコラーゲンが同定されており、その中で最も重要なのは、真皮の細胞外マトリックスの主要な構造成分であるＩ型コラーゲン；軟骨中に多量に存在するＩＩ型コラーゲン、及び皮膚真皮中に存在し、血管壁にも局在するＩＩＩ型コラーゲンである。エラスチン繊維は、全皮膚繊維の５〜１０％を占め、皮膚の弾力性を確保するために不可欠である。フィブリリンのミクロフィブリルは、弾性繊維自体の凝集において重要な役割を果たすためにエラスチン繊維の機能にとって重要である。これらはエラスチンの前に合成され、エラスチン分子が沈着する骨格を形成する。その後、ミクロフィブリルは、成長中に繊維の周囲に移動し、弾性繊維の周りに鞘を形成する。
【０００４】
皮膚老化の主な原因である真皮マトリックス成分の量及び質の低下は、線維芽細胞がこれらの成分を産生する能力、したがってそれらの健康状態及び老化状態と密接に関連している。過去数年間、サーチュインを含む細胞の長寿に関連する分子成分に研究がますます集中している。サーチュインは、全ての多細胞生物に存在するタンパク質であり、多種多様な転写因子及びＤＮＡに結合する他のタンパク質の活性を調節するので、核安定性保護因子として作用する。いくつかの薬理学的アプローチは、細胞内でのこれらのタンパク質の高レベルの存在が長寿を促進することを示している（Ｌａｖｕら、２００８）。実際に、おそらくサーチュインファミリーの中で最も研究され特徴が明らかにされているサーチュイン１タンパク質（ＳＩＲＴ１）は、ヒト細胞の長寿及びその内部代謝を調節することができることを示すいくつかの研究がある（Ｚｓｃｈｏｅｒｎｉｇ及びＭａｈｌｋｎｅｃｈｔ、２００８）。さらに、サーチュイン６（ＳＩＲＴ６）は、ＤＮＡ修復、を活性化し、酸化ストレスの存在下で増幅される役割である。そのため、ＳＩＲＴ６はＤＮＡ修復の中心的な調節因子として作用し、別の酵素因子ＰＡＲＰ１を活性化する：細胞におけるＳＩＲＴ６発現の増加は、可能な限り迅速にＤＮＡ損傷を修復するためにＰＡＲＰ１の活性化増加をもたらす（Ｍａｏら、２０１１）。これらの研究から、サーチュインが細胞生存率の調節及び細胞老化プロセスの減速における重要な因子であることが明らかになり、したがってこれらの因子の潜在的な活性化因子を同定することがますます重要と思われる。
【０００５】
近年、老齢生物の血液中よりも若齢生物の血液中に多量に存在するＧＤＦ１１タンパク質（増殖分化因子１１）が同定されており、実際、その量は年齢が進むにつれて減少する。特定のｇｄｆ−１１遺伝子によってコードされるＧＤＦ１１は、「トランスフォーミング増殖因子β」（ＴＧＦβ）のスーパーファミリーのメンバーであり、最初に、特に神経系の胚発生及び前後部域化における調節の役割について同定された（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、２０１３；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ２００６）。近年、ＧＤＦ１１は、年齢による心臓の肥大を減少させることができ（Ｌｏｆｆｒｅｄｏら、２０１３）、筋肉老化を回復させることができ（Ｓｉｎｈａら、２０１４）、脳の機能的老化によるいくつかの有害な効果を減少させることさえできる（Ｋａｔｓｉｍｐａｒｄｉａｙら、２０１４）ことが示された。この驚異的な発見は、ＧＤＦ１１因子を含む若齢マウスの血液を「並体結合」系を用いて、老齢ラットに属する血液と混合した実験によって検証されている。若齢マウスの血液を老齢マウスの体内に循環させることを可能にするために２匹のマウスを外科的に接合した、又は若齢マウスの血液の老齢マウスへの輸血を行った：老齢マウスにおいて、筋細胞のＤＮＡが修復され、筋繊維がより健康的で若くなることが観察された。さらに、筋肉握力が増加し、マウスが、未処理マウスと比較して、ベルトコンベヤー上でより長く走ることができた（Ｌｏｆｆｒｅｄｏら、２０１３；  Ｓｉｎｈａら、２０１４）。
【０００６】
若齢マウスから老齢マウスにＧＤＦ１１を導入する同様のシステムを使用している別の研究者グループは、嗅覚に関連する脳の領域である脳室下帯中の動物細胞が、より多い若齢血液流を受容し、これがこの領域の循環を改善するだけでなく、新たな神経細胞の産生も刺激することを観察した。老齢マウスの嗅覚が有意に改善され、老化に伴う正常な感覚喪失が逆行した。この研究の最も興味深い発見は、匂いに関連する脳領域だけでなく、脳全体でも血流の増加が観察されたことであった（Ｋａｔｓｉｍｐａｒｄｉａｙら、２０１４）。
【０００７】
近年、化粧品市場の傾向は天然植物起源の製品に向かっており、実際、多数の多様な例が既に存在している。植物は光合成を通して自身の食物を作り出し、同時に大気に酸素を供給することができるユニークな生物である。植物はまた、他の全ての生物のための食物及び治療用化合物の重要な供給源でもある。植物は、その大きな合成汎用性について驚異的である：植物界によって合成される化学構造の範囲は他の生物群のものより広く、植物を医薬、食品及び化粧品における自然療法の主要な源にしている（Ｆｏｗｌｅｒ、１９８４）。ヒトは自然環境との一定の接触を通じて、歴史の中で有用な植物に関する豊富な知識を開発し、伝統的な医学における植物及び植物抽出物の使用が古代から知られている。
【０００８】
植物細胞培養物は、その製造を工業規模で容易に拡大することができる、生物的持続可能（ｂｉｏｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ）で、標準化された汚染物質を含まない製品を得ることを可能にするので、化粧品及び皮膚科学有効成分の製造のための実行可能な代替となる（Ｌｅｅら、２０１０）。屋外で栽培される植物の使用に対して、植物細胞培養物を有効成分の供給源として使用することの多数の利点が存在する：１）季節又は植物の生殖周期にかかわらず、新鮮な材料を連続的に供給する；２）バッチ間で高レベルの一貫性を得るために、増殖条件を容易に標準化することができる；３）抽出された成分が安全で清潔である（病原体汚染又は環境汚染のリスクがないことを意味する）；４）生産システムが非常に持続可能である：農地が必要ではなく、水の消費が少なく、廃棄物も少ない；５）単に増殖条件を変えることによって、又は培養培地中に異なる物質を添加することによって、細胞が分化する又は一定の代謝産物を産生するよう誘導することができるのでこれは極めて汎用的な系である（Ｂａｒｂｕｌｏｖａら、２０１４）。
【０００９】
植物細胞培養物は、証明された化粧品有効性を有する抽出物の貴重な供給源となるにもかかわらず、その全能性及び未分化状態のためにいくつかの制限を有し、より具体的な用途を有するいくつかのクラスの活性物質の製造に最適なシステムとなることができない。その代わりに、分化した植物組織培養物（例えば、根培養物、体細胞胚、苗条等）は高度に特殊化され、分化しているので、他の植物器官で産生されない化合物を合成することができる。
【００１０】
体細胞胚形成は、分化した又は未分化の体細胞が、実験室で、一連の形態学的変化及び生化学的変化を通して、元の組織との導管接続なしに双極性構造を形成する胚形成細胞を産生するよう誘導される過程である（Ｑｕｉｒｏｚ−Ｆｉｇｕｅｒｏａら、２００６）。これらの構造は、形態学的及び生理学的に接合体胚、すなわち植物の種子中に存在するものと同一であるため、体細胞胚と呼ばれる。
【００１１】
体細胞胚の全ての発生過程は、植物ホルモン、酵素及び体細胞胚形成に関連する他の二次代謝産物を含む様々な因子によって調節される。一定の有糸分裂活性を有する若い構造であるため、体細胞胚は、若返りの効果を有する化粧品有効成分の優れた供給源となり、ヒト皮膚の老化プロセスを遅くすることができるだろう。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の著者らは、液体培養での体細胞胚の産生及び抽出の方法を開発しており、その方法で、いずれも分子機構によって個別に及び相乗的に、ＧＤＦ１１及びサーチュインに特異的に作用することによって皮膚細胞の老化現象を減速及び逆行させることができる３種の抽出物を同定した。そのため、これらの抽出物に基づく化粧品組成物は、皮膚老化における若返りの一般的な効果を有するはずである。
【００１３】
その一態様で、本発明は、皮膚老化に関連する欠点を処置するため、及び皮膚に若返り効果を生じさせるための体細胞胚を増加させた植物細胞培養物に由来する少なくとも１つの抽出物の化粧品としての使用に関する。
【００１４】
体細胞胚を増加させた上記植物細胞培養物は、好ましくはミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）及びローザ・ガーデニア（Ｒｏｓａ  ｇａｒｄｅｎｉａ）の種に属する植物細胞培養物である。
【００１５】
別の態様では、本発明は、好ましくはミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）及びローザ・ガーデニア（Ｒｏｓａ  ｇａｒｄｅｎｉａ）の種に属する、体細胞胚を増加させた植物細胞培養物から少なくとも１つの抽出物を調製する方法であって、以下の工程：
ａ）植物細胞懸濁培養物を体細胞胚を形成するよう誘導する工程；
ｂ）得られた体細胞胚を生理食塩水溶液中でホモジナイズし、ホモジネートを得る工程；
ｃ）得られたホモジネートの液体部分から固体部分を分離する工程であって、液体部分は水溶性抽出物を構成している工程
を含む方法に関する。
上記植物細胞培養物は、植物から組織を採取し、固体基質上にカルス形成を誘導し、得られたカルスを液体培養に懸濁させることによって得られる。
上記生理食塩水溶液は、一般的に、ｐＨ７．４のリン酸生理食塩水緩衝液ＰＢＳなどの緩衝溶液である。
好ましくは、液体部分からホモジネートの固体部分を分離する上記工程ｃ）は、遠心分離によって実施され、上清（液体部分）とペレット（固体部分）の分離をもたらす。
【００１６】
本発明による方法はまた、親油性溶媒を使用することによって固体部分を抽出し、脂溶性抽出物を得るさらなる工程を含んでもよい。親油性溶媒は、好ましくはアルコール、アセトン、エーテル、ステロール及び油から選択され、好都合には２〜４個の炭素原子のアルコール、好ましくはエタノールによって構成される有機溶媒である。
【００１７】
あるいは、本発明による方法は、体細胞胚の細胞壁からのタンパク質を加水分解し、ペプチド及び糖が濃縮された抽出物を得るために、固体部分を酸溶液中のタンパク質分解酵素で処理するさらなる工程を含んでもよい。
好ましくは、固体部分を予め蒸留水で処理して細胞質成分の残渣を除去し、次いで、グルコシド結合の加水分解のための酸溶液、及び細胞壁からタンパク質を加水分解する酵素で処理する。
好ましくは、蒸留水で処理した後、酸溶液で処理する前に、固体部分をＥＤＴＡ溶液（例えば２ｍＭ）で処理し、沸騰させる。
【００１８】
上記の抽出物（水溶性抽出物、脂溶性抽出物及びペプチド／糖が濃縮された抽出物）を、公知の方法（例えば、凍結乾燥機、ロータリーエバポレーター又は噴霧乾燥機を用いる）で蒸発乾固して、場合によって、粉末又は半固体ペーストを得ることができる。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、上記少なくとも１つの抽出物が、上記方法によって得られる水溶性抽出物、脂溶性抽出物又はペプチド及び糖が濃縮された抽出物から選択される、上で定義される抽出物の化粧品としての使用に関する。
好ましくは、化粧品としての使用のために、組み合わせは、上記抽出物の少なくとも１つ、又はそれらの２つ、又は好ましくは３つ全てを含む。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、上記抽出物の３つ全て：水溶性抽出物、脂溶性抽出物並びにペプチド及び糖が濃縮された抽出物を含む組成物に関する。
好ましくは、上記組成物は、１重量部の水溶性抽出物に対して、０．０１〜１００重量部、好ましくは１重量部の脂溶性抽出物、並びに独立に、０．０１〜１００重量部、好ましくは０．１重量部のペプチド及び糖が濃縮された抽出物を含む。
好ましくは、本発明による組成物は、水、塩水溶液及び有機溶媒、好ましくは油、アルコール、グリセロール、有機酸、アミド、アミン、アルデヒド及びケトンを含む群から選択される少なくとも１種の親水性溶媒をさらに含む。
【００２１】
さらに、本発明は、皮膚老化に関連する欠点を処置する及び皮膚若返り効果を生じるための上記の化粧品組成物の使用に関する。
【００２２】
最後に、本発明は、上記の抽出物（水溶性抽出物、脂溶性抽出物、ペプチド及び糖が濃縮された抽出物）の１つ又は上で定義される組成物と、美容上許容されるビヒクルとを含む化粧品配合物に関する。このような化粧品配合物は、例えば、皮膚施用のためのクリーム、ゲル、ローション、口紅、ファンデーションクリーム及びメークアップの形態であり得る。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の一実施形態によると、この方法は、以下の手順及び条件により実施される：
カルス調製：全葉を植物、例えばミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）から採取し、７０％エタノール（水中ｖ／ｖ）で１５分間滅菌し、次亜塩素酸ナトリウム１％（水中ｖ／ｖ）でさらに１５分間滅菌する。アルコール及び次亜塩素酸塩を除去するために水で３回洗浄した後、葉を滅菌刃でそれぞれ約０．５ｃｍ２片に切断する。葉の断片の全てを、植物寒天７．５ｍｇ／Ｌ、ミオイノシトール５００ｍｇ／Ｌ、スクロース３０ｇ／Ｌ、２．４Ｄ  １ｍｇ／Ｌ、カイネチン０．０１ｍｇ／Ｌ、アデニン１ｍｇ／Ｌを含有するｐＨ５．７の固体培地Ｇａｍｂｏｒｇ  Ｂ５培地に置く。暗所中２０℃で約５週間インキュベートした後、葉の細胞の増殖によりカルスが得られる。その後、３〜４週間ごとにカルスを新鮮な培養培地に移す。
【００２４】
ａ）細胞培養物調製：カルスが直径約１ｃｍ（重量約５０ｍｇ）に達したら、これらを摘み取り、液体培地ＡＢ１（ミオイノシトール５００ｍｇ／Ｌ、スクロース３０ｇ／Ｌ、２．４Ｄ  １ｍｇ／Ｌ、カイネチン０．０１ｍｇ／Ｌ、アデニン１ｍｇ／Ｌを含有するＧａｍｂｏｒｇ  Ｂ５培地、ｐＨ５．７）５０ｍｌを入れたＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに分散させる。フラスコを１００ｒｐｍの振盪速度を有するオービタルシェーカー上で暗所に置く。約１０日後、カルスが壊れて増殖して、細胞懸濁培養物を形成する。
【００２５】
ｂ）体細胞胚調製：植物細胞培養物を、植物ホルモンであるチジアスロン（ＴＤＺ）１ｍｇ／Ｌ、及びベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）０．０５ｍｇ／Ｌ、グルタチオン１０ｍｇ／Ｌ、カゼイン５００ｍｇ／Ｌ、リン酸アンモニウム７％及び硫酸アンモニウム１０％を添加した新鮮な液体増殖培地ＡＢ２（ミオイノシトール５００ｍｇ／Ｌ、スクロース３０ｇ／Ｌを含有するＧａｍｂｏｒｇ  Ｂ５培地）に再懸濁して、細胞培養物中の体細胞胚の形成を誘導する。
【００２６】
ｃ）体細胞胚細胞培養物増殖：体細胞胚の誘導を、約７０〜９０％の体細胞胚への分化レベルに達するまで、毎週新鮮な培養培地を添加して４週間実施する。
【００２７】
ｄ）体細胞胚処理：本発明に開示される方法の好ましい実施形態によると、体細胞胚を、それらの生育中に物理的処理（加熱、加冷、ＵＶ）に供する、又は化学化合物（タンパク質、脂質、糖、塩、有機小分子、理学的因子）で処理して、多量の抗酸化特性を有する二次代謝産物の発現を誘導することができる。
【００２８】
ｅ）体細胞胚収集：増殖培地からの胚の分離は、２０００ｇでの遠心分離、沈降又は１００ミクロンより小さい細孔直径を有する膜を通した濾過によって行うことができる。その後、胚を−８０℃で凍結してその化学的特性及び物理的特性を保存する。
【００２９】
ｆ）体細胞胚ホモジナイゼーション：凍結体細胞胚を、１：２ｗ／ｖの比の生理食塩水リン酸ＰＢＳ緩衝液（１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４  １．７６ｍＭ、ｐＨ  ７．４）の存在下で機械的に破壊する（ホモジナイズする）。この工程は、事前に冷却したセラミック乳鉢及びセラミック乳棒などの適切な容器内で実施することができる、又はより大容量の場合には、大型容器、金属さえ使用してもよく、この場合、植物材料を実験室若しくは工業用ブレンダー、又はプレスの両方を使用して、金属刃でホモジナイズすることができる。
【００３０】
ｇ）水溶性抽出物の入手：いったん胚のホモジナイぜーションによる均質な溶解物が得られたら、試料を例えば４℃で約１５分間、４０００ｒｐｍで遠心分離して不溶性成分を沈殿させる。遠心分離によって得られた上清を回収する：これは水溶性抽出物を構成する。
【００３１】
ｈ）脂溶性抽出物の入手：遠心分離によって得られたペレットの半分を有機溶媒（アルコール、アセトン、エーテル、油）で処理し、油溶性成分（水に難溶性の成分と共に）を抽出するために、使用される溶媒の種類に応じて、２０〜８０℃の温度で混合する。４℃で１５分間、４０００ｒｐｍでさらに遠心分離した後、液相を取り出す：これは脂溶性抽出物を構成する。
【００３２】
ｉ）細胞壁からのペプチド及び糖が濃縮された抽出物の入手：工程ｈ）で得られたペレット（細胞壁を含む）の残りの半分をさらに蒸留水で洗浄して可溶性分画の残渣を除去し、再度濾過する。ペレットを秤量し、２倍体積（比ｗ／ｖ）の２ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を用いて２０分間懸濁及び沸騰させる。冷却後、抽出物を、濾布を通して濾過し、洗浄し、再度濾過して残留ＥＤＴＡを除去する。その後、得られたペレットを２倍体積の０．１Ｎ  ＨＣｌ溶液を用いてドラフト下で１時間沸騰させて糖結合を加水分解する。沸騰後、試料を再び懸濁し、氷中で冷却し、次いで、懸濁液各１ｍｌ当たり酵素１ｍｇを用いて、３７℃で１６時間ペプシンで酵素消化する。酵素消化の終わりに、懸濁液を遠心分離又は再度濾過して透明な溶液を得る：これは、細胞壁に由来するペプチド及び糖が濃縮された抽出物を構成する。
【００３３】
工程ｈ）、ｉ）及びｊ）で得られた抽出物を凍結乾燥機、ロータリーエバポレーター、乾燥室又は噴霧乾燥機で乾燥させて溶媒を除去する。粉末又は得られた半固体ペーストを、水（水溶性分画及びペプチド／糖分画）又は化粧品配合物と適合する有機溶媒（脂溶性分画）に所望の濃度に懸濁する。工程ｉ）で使用される溶媒がトリグリセリドなどの油である場合、これを除去することができないので、得られた溶液が化粧品用途及び皮膚科学的用途のための配合物で使用するための有効成分を既に構成する。
【００３４】
異なる分画（水溶性、脂溶性及びペプチド／糖のもの）を含む得られた溶液を、０．１％〜１０％（ｗ／ｖ）に及ぶ濃度を有するようにするために、分画の化学的特性に応じて、適当な体積のグリセロール又は別の溶媒（油、アルコール、ステロール）にさらに溶解することができる。これらの溶液は、容易に適用できる化粧品製品又は皮膚科学製品の製造配合物に添加される原材料となる。
【００３５】
結論として、本発明の主題は：ａ）〜ｈ）の方法工程によって得られる体細胞胚の水溶性抽出物；ａ）〜ｉ）の方法工程によって得られる脂溶性抽出物；及びａ）〜ｊ）の方法工程によって得られる細胞壁由来のペプチド及び糖の抽出物からなる。さらに、本発明はまた、皮膚細胞に対して有益な作用を有する物質が濃縮された記載される抽出物を得ることを可能にする、本出願人によって開発された特定の増殖条件及び処理による誘導による上記体細胞胚の調製方法にも関する。
【００３６】
本発明の目的はまた、水溶性抽出物、脂溶性抽出物並びに細胞壁由来のペプチド及び糖が濃縮された抽出物を単独で又は組み合わせて含む化粧品組成物である。
有利には、このような化粧品組成物は、各重量部の水溶性抽出物に対して、０．０１〜１００重量部、好ましくは１重量部の脂溶性抽出物並びに０．０１〜１００重量部、好ましくは０．１重量部のペプチド及び糖が濃縮された抽出物を、おそらくはビヒクル、賦形剤及び／又は美容上許容されるアジュバントと一緒に含む。
特に好ましい化粧品組成物は、１重量部の水溶性抽出物に対して、１重量部の脂溶性抽出物並びに０．１重量部のペプチド及び糖が濃縮された抽出物を、おそらくは美容上許容されるビヒクル、賦形剤及び／又はアジュバントと一緒に含む。
【００３７】
このような組成物は、皮膚施用のためのクリーム、ゲル、美容ローション、並びに口紅、ファンデーションクリーム及びメークアップの形態でもよい。使用することができるビヒクルは、リポソーム、好ましくは多重膜リポソーム、シクロデキストリン、ケイ酸塩である。最後に、本発明は、美容上有効量の上記の、すなわち体細胞胚培養物に由来するこれらの抽出物の少なくとも１つを含む組成物の皮膚への適用を含む、若返り及び皮膚老化の減速のための美容処理方法に関する。
【００３８】
本発明をここで、添付の図面を特に参照して、本発明の好ましい実施形態により例示的及び非限定的な目的で説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】どちらも４週間の増殖後の、ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）の未分化植物細胞培物養及び体細胞胚を増加させた細胞培養物を示す図である。
【図２】ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）体細胞胚抽出物が全ての試験濃度において細胞毒性でないことを示すＭＴＴアッセイを示す図である。縦座標では、１００％とした対照に対する百分率として表される生存細胞の数が記載されている。
【図３】未処理対照細胞の発現解析と比較した、ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）体細胞胚抽出物で処理した細胞におけるＧＤＦ１１遺伝子の発現解析を示す図である。グラフに示される値は、未処理対照試料（１００％とした）と比較した百分率として表されている。
【図４】未処理対照細胞試料の発現解析と比較した、ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）体細胞胚抽出物で処理した細胞における遺伝子サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）及びサーチュイン６（ＳＩＲＴ６）の発現解析を示す図である。グラフに示される値は、未処理対照試料（１００％とした立）と比較した百分率として表されている。
【図５】６時間の処理後の、コラーゲンＩＩＩ（Ｃｏｌ−ＩＩＩ）、フィブリリン１（Ｆｂ１）及びエラスチン（Ｅｌｎ）の遺伝子発現に対するミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）体細胞胚抽出物の効果を示す図である；グラフに示される値は、１００％とした未処理対照試料に対する百分率として表されている。
【図６】異なる濃度のミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）体細胞胚ペプチド／糖抽出物で処理した、若齢線維芽細胞（ＨＤＦ若齢）及び老齢線維芽細胞（ＨＤＦ老齢）における遺伝子ＧＤＦ１１の発現解析を示す図である。グラフに示される値は、１００％とした未処理若齢細胞の対照試料と比較した百分率として表されている。
【図７】若齢（ＨＤＦ若齢）及び老齢（ＨＤＦ老齢）線維芽細胞におけるＧＤＦ１１遺伝子の発現に対する、ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）体細胞胚の単一抽出物及び１：１：１比の３つの抽出物の合体からなる混合物の効果を示す図である。グラフに示される値は、１００％とした未処理若齢細胞の対照試料と比較した百分率として表されている。
【００４０】
例示的及び非限定的な目的のために本発明を説明するために、ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｅｍｏｎ）及びローザ・ガーデニア（Ｒｏｓａ  ｇａｒｄｅｎｉａ）（変種Ｍａｉｐａｌｅｏ）の種の体細胞胚細胞培養物の調製に関するいくつかの例を本明細書で提供する。さらに、ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）体細胞胚由来の水溶性抽出物、脂溶性抽出物並びにペプチド及び糖が濃縮された抽出物の調製の例、及び化粧品分野における上記抽出物の生物学的活性を証明する実験も提供する。
【００４１】
実施例１：
ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｅｍｏｎ）及びローザ・ガーデニア（Ｒｏｓａ  ｇａｒｄｅｎｉａ）（変種Ｍａｉｐａｌｅｏ）体細胞胚培養物の調製及び増殖。ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｅｍｏｎ）及びローザ・ガーデニア（Ｒｏｓａ  ｇａｒｄｅｎｉａ）の若葉数枚を固体培地上のカルス形成に使用し、その後、液体細胞培養物を誘導して体細胞胚を形成した。非誘導細胞培養物及び体細胞胚を形成するよう誘導された細胞培養物の試料の観察により、４週間の増殖後に、誘導培養物中の細胞が分化及び凝集して胚様構造を形成し、これにより培養物が非誘導細胞の培養物と比較してより粒状になったことが明らかになった（図１）。いったん３つの異なる種からの体細胞胚の高密度培養物が得られたら、４週間後の分化の割合を、光学顕微鏡上での観察及び０．０１％水溶液のメチレンブルーによる染色によって評価した。ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）細胞培養物については、９０％の分化収率が計算され、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｅｍｏｎ）細胞培養物については８０％、ローザ・ガーデニア（Ｒｏｓａ  ｇａｒｄｅｎｉａ）細胞培養物については７２％であった。いったん所望の密度に達したら、体細胞胚を採取し、抽出物を得るために処理した。使用した方法は以下の通りであった：
【００４２】
体細胞胚の細胞培養物の入手及び収穫。
植物カルス５０ｍｇを、ＡＢ１液体培養培地（ミオイノシトール５００ｍｇ／Ｌ、スクロース３０ｇ／Ｌ、２．４Ｄ  １ｍｇ／Ｌ、カイネチン０．０１ｍｇ／Ｌ、アデニン１ｍｇ／Ｌを含有するＧａｍｂｏｒｇ  Ｂ５培地、ｐＨ５．７）５０ｍｌを含むＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中に懸濁した。フラスコを１００ｒｐｍのオービタル振盪を有するシェーカー上で暗所に置き、高密度植物細胞培養物を得た。約１０日後、カルス細胞の増殖及び分化によって得られた体細胞胚の高密度培養物が観察された。高密度培養物１００ｍｌを半ＡＢ／ＴＤＺ培地１Ｌに接種して増殖させた。１０日後、植物細胞培養物を、植物ホルモンであるチジアスロン（ＴＤＺ）１ｍｇ／Ｌ、及びベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）０．０５ｍｇ／Ｌ、グルタチオン１０ｍｇ／Ｌ、カゼイン５００ｍｇ／Ｌ、リン酸アンモニウム７％及び硫酸アンモニウム１０％を添加した新たなＡＢ２液体増殖培地（ミオイノシトール５００ｍｇ／Ｌ、スクロース３０ｇ／Ｌを含有するＧａｍｂｏｒｇ  Ｂ５培地）に懸濁して、体細胞胚（体細胞胚を増加させた細胞培養物）の形成及び発達を誘導した。４週間の増殖後、その培養培地を濾過によって除去し、−８０℃で凍結させることによって、体細胞胚を収穫した。
【００４３】
実施例２：ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｅｍｏｎ）及びローザ・ガーデニア（Ｒｏｓａ  ｇａｒｄｅｎｉａ）の種の体細胞胚細胞培養物からの異なる抽出物の調製。
収穫した体細胞胚を処理して、異なる化学的特性を有する抽出物を得た。ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｅｍｏｎ）及びローザ・ガーデニア（Ｒｏｓａ  ｇａｒｄｅｎｉａ）の種に属する体細胞胚細胞培養物からの３種類の抽出物を得た。これらの種の各々について、以下の抽出物を調製した：ａ）水性生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）の使用によって得られた水溶性化合物の抽出物（水溶性抽出物）；ｂ）エタノールを使用することによって得られる非極性又は極性の低い溶媒に溶解することができる親油性化合物の抽出物；ｃ）既に記載された手順によって得られた、細胞壁に由来するペプチド及び糖で構成された抽出物。得られた抽出物を、凍結乾燥又は真空蒸発によって溶媒（特定の場合には水又はエタノール）を除去するために処理した。得られた粉末又は半固体ゲルを秤量し、皮膚細胞培養物について分析するために蒸留水に所望の濃度に溶解した。
【００４４】
抽出物調製に使用する方法は以下の通り記載される：
水性抽出物、エタノール抽出物及びペプチド／糖抽出物の調製。
凍結した体細胞胚５００ｇを機械的に溶解し、次いで、１：２体積／重量の比のＰＢＳ（１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）の存在下でホモジナイズした。得られたホモジネートを４℃で１５分間、８５００ｒｐｍで遠心分離して不溶性成分を沈殿させた。遠心分離から得られた上清は水溶性抽出物を構成し、これを−２０℃で凍結させた。その後、水溶性抽出物を３日間凍結乾燥して粉末を得て、これを生物学的アッセイにさらに使用するために１〜１０％に及ぶ濃度で水に懸濁した。
【００４５】
ペレットの半分を、脂溶性成分を抽出するために絶えず撹拌しながら、化粧品配合物に使用される基礎エマルションと適合性の有機溶媒（アルコール、アセトン、エーテル又は他の非極性溶媒）で処理した。４℃で１５分間、６０００ｒｐｍで遠心分離した後、脂溶性抽出物を構成する液相を生物学的アッセイに使用した。
ペレットの残りの半分を水でさらに洗浄し、再び濾過した。ペレットを秤量し、２倍体積の２ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液中で２０分間懸濁及び沸騰させた。冷却後、抽出物を、濾布を通して濾過し、洗浄し、再度濾過して残留ＥＤＴＡを除去した。その後、得られたペレットを２倍体積の０．１Ｎ  ＨＣｌ溶液中で１時間沸騰させて糖を加水分解した。沸騰後、試料を氷冷し、次いで、懸濁液１ｍｌ当たり１ｍｇの酵素を用いて、３７℃で１６時間ペプシンで消化した。得られたペプチド及び糖の抽出物を３日間凍結乾燥して粉末を得て、これをさらなる試験のために１〜１９％に及ぶ濃度で水に溶解した。
【００４６】
実施例３：皮膚細胞に対する体細胞胚細胞培養物由来抽出物の生物学的アッセイ
本発明の例示的及び非限定的な例として、ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）体細胞胚抽出物を使用して、皮膚細胞に対する有益な特性及び治療上の特性を解明した。水溶性抽出物、脂溶性抽出物（エタノール性）、並びに細胞壁に由来するペプチド及び糖で構成された抽出物を、化粧品活性を評価するためにＨＤＦ細胞（ヒト皮膚線維芽細胞）で試験した。アッセイに使用した方法及び得られた結果を以下に記載する。
【００４７】
使用する方法：
細胞毒性アッセイ。
このアッセイは、１９８３年にＭｏｓｍａｎｎによって初めて記載されたＭＴＴ  ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］の使用に基づく。これは、生存細胞の酵素ミトコンドリア脱水素酵素がＭＴＴテトラゾリウム環（淡黄色）を加水分解し、ホルマザン（暗青色）の結晶を形成する能力に基づく。これらの結晶は、細胞膜に不透過性であり、代謝的に活性な細胞の細胞質に蓄積する。したがって、生存細胞及び健常細胞の数は、ホルマザン産物のレベルに正比例する。初期数１．５×１０４個／ウェルのＨＤＦ細胞を、１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ培養培地（Ｌｏｎｚａ）中９６ウェルプレートで約２０時間増殖させた。種々の濃度の混合物で４８時間処理した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２／１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５ｍＭグルコース及び０．５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ比色基質を含む「反応緩衝液」１００μｌ／ウェルと共にインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートした後、無水イソプロパノール中１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．１Ｎ  ＨＣｌを含む可溶化溶液１００μｌを各ウェルに添加した。３０分後、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて５９５ｎｍで比色反応を測定した。
【００４８】
遺伝子ＧＤＦ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ６、Ｃｏｌ−ＩＩＩ、ＥＬＮ及びＦＢｎ１の発現解析。
初期数７×１０４個／ウェルのＨＤＦ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ培養培地（Ｇｉｂｃｏ）中６ウェルプレートで２０時間増殖させた。次いで、細胞を無血清培地中で６時間抽出物と共にインキュベートした。細胞ＲＮＡ抽出のために、Ａｍｂｉｏｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入したキットを使用した。処理後、細胞をＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液に溶解し、キットプロトコルにしたがって抽出手順に供した。ＲＮＡ試料をＤＮａｓｅ  Ｉ（Ａｍｂｉｏｎ）による処理に供してゲノムＤＮＡ汚染物質を除去した。各試料２μＬを、変性「ローディング色素」の存在下で１％のアガロースゲルにローディングし、特異的ＲＮＡマーカー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を基準として使用して定量した。定量のために、遺伝子ソフトウェアツール（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用した。全ＲＮＡ３００ｎｇを逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて逆転写した。半定量的ＲＴ−ＰＣＲの反応を、４：６の比のユニバーサルプライマー対１８Ｓプライマー／ｃｏｍｐｅｔｉｍｅｒ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）として内部標準を用いて行った。ＰＣＲ産物を１，５％アガロースゲルで分離し、Ｇｅｌｉａｎｃｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）ツールを用いて可視化し、遺伝子ツールソフトウェアを用いて濃度測定法により分析した。グラフに示される値は、分析中の遺伝子に対するバンド強度と１８Ｓ標準に対するバンドの強度の比を表すので、対象となる遺伝子の実際の発現に関連し、その試料中に存在するＲＮＡ又はＰＣＲ試薬の量に依存するものではない値が得られる。次いで、未処理対照から得られた値を１００％とすることによって、値を百分率（％）に変換した。
【００４９】
得られた結果
細胞ベースのアッセイに使用するのに最適な抽出物濃度の評価。
バイオアッセイにおいて使用される種々のミヤコグサ体細胞胚抽出物の濃度を決定するために、抽出物の濃度を増加させて試験し、増殖している皮膚細胞培養物の最大非細胞毒性用量を決定した。水性抽出物及びエタノール性抽出物については、０．０５％〜０．０００４％に及ぶ濃度を試験した一方で、ペプチド及び糖の混合物については０．０１％〜０．００００８％の濃度を使用した。図２に示されるように、試験した濃度のいずれも、細胞に対して有意な細胞毒性効果を示さなかった。
【００５０】
ＧＤＦ１１、ＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ６の遺伝子発現に対するミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）体細胞胚由来の水性抽出物、エタノール抽出物及び糖／ペプチド抽出物の効果。
それにもかかわらず、皮膚細胞上のＧＤＦ１１の研究は報告されてこなかったので、本発明者らはいくつかの予備調査を行い、ＧＤＦ１１が皮膚細胞で産生及び調節されており、よって抗老化活性に関連する同様の機能を有する可能性が高いことを見出した。ミヤコグサ体細胞胚抽出物がＧＤＦ１１遺伝子の発現に影響を及ぼすかどうかを決定するために、ＨＤＦを水溶性抽出物（０．００２％）、エタノール性抽出物（０．００２％）又はペプチド及び糖の混合物（０．０００２％）で６時間処理した。処理後、細胞を採取し、ＲＮＡ抽出のために処理した。遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲによって評価した。図３に示されるように、分析した３つの抽出物は全て、ＧＤＦ１１遺伝子の発現を約３０％有意に刺激した。
【００５１】
ＧＤＦ１１の発現に対する抽出物の効果を検証した後、長寿及び細胞健康を促進することにおいて役割を果たす２つのサーチュインをコードするＳＩＲＴ１遺伝子及びＳＩＲＴ６遺伝子の発現に対する効果を、抽出物で処理したＨＤＦのＲＴ−ＰＣＲ実験によって評価した。図４に示されるように、ペプチド／糖混合物は、両方の遺伝子の発現において、ｓｉｒｔ１については＋１１７％及びｓｉｒｔ６については７３％の有意な増加をもたらした。代わりに、エタノール抽出物の効果は非常に控えめであった。これらの結果は、ミヤコグサ体細胞胚の細胞壁に由来するペプチド及び糖の抽出物が、ＧＤＦ１１及びサーチュイン発現を増加させることによって細胞の若返りを促進するのに最も有効であることを示した。
【００５２】
Ｃｏｌ−ＩＩＩ、ＥＬＮ及びＦＢｎ１の遺伝子発現に対するミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）体細胞胚由来の水性抽出物、エタノール抽出物及び糖／ペプチド抽出物の効果。
ミヤコグサ体細胞胚抽出物が細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の産生を担う遺伝子に効果を及ぼすかどうかを決定するために、ＩＩＩ型コラーゲン、エラスチン及びフィブリリンの遺伝子の発現を、ＨＤＦに対するＲＴ−ＰＣＲによって評価した。
図５に示されるように、３つの抽出物全てが約７０％のコラーゲンＩＩＩの合成に対する有意な効果を生じた。エラスチン遺伝子の発現が水溶性抽出物又はペプチド／糖の混合物で処理した細胞では約３０％増加し、フィブリリン１ではペプチド及び糖の混合物のみが５０％の増加を決定した。これらのデータは、ミヤコグサ体細胞胚由来の抽出物が細胞外マトリックスのタンパク質に対する刺激効果を有し、特に、細胞壁に由来するペプチド及び糖の抽出物が、分析された３つの遺伝子全てに有効であることを証明した。
【００５３】
老齢線維芽細胞におけるＧＤＦ１１発現に対するミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）体細胞胚糖／ペプチド抽出物の効果。
老化した線維芽細胞においてさえ、ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）体細胞胚由来のペプチド／糖抽出物（以前の試験で最も優れた性能を有するもの）がＧＤＦ１１遺伝子を誘導することができるかどうかを評価するために、３６歳の患者由来の初代線維芽細胞（ＨＤＦ老齢）を種々の抽出物濃度で処理し、ＧＤＦ１１の発現レベルを評価し、次いで、若齢線維芽細胞（ＨＤＦ若齢）におけるＧＤＦ１１の発現レベルと比較する新たな実験を行った。図６に示されるように、ペプチド／糖抽出物は、老齢線維芽細胞においてさえも用量依存的にＧＤＦ１１遺伝子の発現を誘導し、若齢線維芽細胞に典型的な発現レベルにほぼ回復させた。この結果は、ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）の体細胞胚の抽出物が、ＧＤＦ１１の活性化を介して細胞の老化の表現型を逆行させることができることを示した。
【００５４】
ＧＤＦ１１遺伝子の発現に対するミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）体細胞胚由来の３つの抽出物の組み合わせの効果。
ＧＤＦ１１の効果が一緒に合わせた全ての抽出物による処理によってさらに増加するかどうかを評価するために、老齢線維芽細胞（ＨＤＦ老齢）を、前に計算した有効濃度（水及びエタノール抽出物については０．００２％、及びペプチド／糖抽出物については０．０００２％）の３つの抽出物を含む混合物及びペプチド／糖抽出物単独で６時間処理した。図７に示されるように、ＧＤＦ１１の発現に対する３つの抽出物を含む混合物の効果は、ペプチド／糖抽出物単独の効果よりも有意に高く、この特定の遺伝子活性化における組み合わせの相乗効果を示唆している。
【００５５】
結論として、ミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）体細胞胚の３つの抽出物の混合物は、ペプチド／糖抽出物単独よりもＧＤＦ１１の活性化において有効であり、よって皮膚細胞における老化防止及び若返り過程において強い応答を誘導した。そのため、この混合物を、スキンケア専用の化粧品配合物中の単一の有効成分として使用することができるだろう。
【００５６】
引用文献（アルファベット順）
【表１】
2018514588.tif 000003
【図１】
2018514588.tif 000004
【図２】
2018514588.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
2018514588.tif 000008
【図６】
2018514588.tif 000009
【図７】
2018514588.tif 000010
【国際調査報告】
2018514588.tif 000011
2018514588.tif 000012
2018514588.tif 000013