(57)【要約】繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌動物を生成するための方法及び組成物が提供される。方法及び組成物は、Ｆ０世代において繁殖可能な雌ＸＹ動物を生成することができるＸＹ多能性もしくは全能性動物細胞、インビトロ細胞培養物、または胚を作製することを伴う。このような細胞、胚、及び動物は、Ｙ染色体の領域をサイレンシングすることによって作製され得る。場合により、細胞はまた、低オスモル濃度培地などの雌化培地中で培養され得る、ならびに／またはＳｒｙタンパク質のレベル及び／もしくは活性を減少させるように改変され得る。雌化培地中でＸＹ多能性または全能性動物細胞を維持することによって、ＸＹ多能性もしくは全能性動物細胞、またはインビトロ細胞培養物、胚、もしくはそれらに由来する動物におけるＹ染色体の領域をサイレンシングするための方法及び組成物もまた提供される。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞における雌化活性に関する標的化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の第１集団及び第２集団を、前記非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の前記多能性を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む培地中で培養し、前記第１集団が、標的化合物の存在下で培養され、前記第２集団が、前記標的化合物の不存在下で培養されることと、
（ｂ）Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性について、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の前記第１及び第２集団の各々で前記非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞のうち１種以上をアッセイし、それによって雌化活性が、前記第２集団からの前記１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞と比較して、前記第１集団からの前記１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞におけるＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の前記発現及び／または活性の減少によって同定されることと、
（ｃ）Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の前記発現及び／または活性に基づいて、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を生成するために、前記第１集団からドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を選択し、前記Ｆ０世代における前記繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物の比率が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の前記発現及び／または活性に逆相関することと、
（ｄ）前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を宿主胚に導入することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記宿主胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して、前記宿主胚を懐胎させることと、
（ｆ）表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を含むＦ０  ＸＹ非ヒト哺乳動物子孫を得て、性成熟に達すると、前記Ｆ０の表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物が繁殖可能かつ妊孕可能になること
とを含む、前記方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）の前記アッセイによって、ｍＲＮＡレベルでＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の発現が検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）の前記アッセイによって、タンパク質レベルでＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の発現が検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記雌化活性が、前記第２集団からの前記１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞と比較して、前記第１集団からの前記１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞における、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの前記発現及び／または活性の減少によってステップ（ｂ）で同定される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記雌化活性が、前記第１集団からの前記１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞における、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の発現及び／または活性の欠如によってステップ（ｂ）で同定される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記雌化活性が、前記第１集団からの前記１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞における、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの発現及び／または活性の欠如によってステップ（ｂ）で同定される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）の前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞、すなわち、前記対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の前記多能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる前記細胞の能力を変化させない培地中で培養された前記細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）の前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、前記第２集団からの対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｃ）の前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、前記対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの減少した発現及び／または活性を有する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性について、前記第１集団における少なくとも２種の前記非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞をアッセイすることを含み、ステップ（ｃ）が、前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞として、他方のアッセイした細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の最も低い発現及び／または活性を有するステップ（ｂ）の前記アッセイした細胞を選択することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ）の前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の発現及び／または活性を欠いている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｃ）の前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの発現及び／または活性を欠いている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１集団が、アッセイステップ（ｂ）の前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、前記標的化合物の存在下で培養される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記多能性細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記多能性細胞が、ＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的化合物の不存在下で、ステップ（ａ）の前記培地が、前記非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の前記多能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる前記細胞の能力を変化させない、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的化合物の不存在下で、ステップ（ａ）の前記培地が、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を有する低オスモル濃度培地である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記低オスモル濃度培地が、以下の特性：
（Ｉ）前記低オスモル濃度培地が、約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有すること、
（ＩＩ）前記低オスモル濃度培地が、２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有すること、
（ＩＩＩ）前記低オスモル濃度培地が、約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの伝導度を有すること、
（ＩＶ）前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で含むこと、
（Ｖ）前記基本培地が、塩化ナトリウムを約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で含むこと、
（ＶＩ）前記基本培地が、炭酸塩を約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で含むこと、
（ＶＩＩ）前記基本培地が、重炭酸ナトリウムを約１３ｍＭ〜約２５ｍＭの濃度で含むこと、
（ＶＩＩＩ）前記基本培地が、約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総濃度を有すること、
（ＩＸ）前記基本培地が、塩化ナトリウムを８７±５ｍＭの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有すること、
（Ｘ）前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で、及び炭酸塩を約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有すること、ならびに
（ＸＩ）前記低オスモル濃度培地が、２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し、前記基本培地が、塩化ナトリウムを５０ｍＭ〜１１０ｍＭの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを１３ｍＭ〜２５ｍＭの濃度で含むこと
のうち１つ以上を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記基本培地が、炭酸塩を約１８ｍＭ〜約４４ｍＭの濃度で含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記炭酸塩が重炭酸ナトリウムであり、前記アルカリ金属及び前記ハロゲン化物の前記塩が塩化ナトリウムであり、前記低オスモル濃度培地が、約２１６ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記基本培地が、塩化ナトリウムを約３ｍｇ／ｍＬの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを約２．２ｍｇ／ｍＬの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、約２１６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記非ヒト哺乳動物が、げっ歯類である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記げっ歯類がラットまたはマウスである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記げっ歯類がＣ５７ＢＬ／６系統を含むマウスである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｙ染色体が、Ｃ５７ＢＬ／６系統、１２９系統、またはＢＡＬＢ／ｃ系統からのものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記げっ歯類が、Ｃ５７ＢＬ／６系統及び１２９系統を含むマウスである、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記宿主胚が前桑実期胚であり、ステップ（ｄ）が、前記宿主胚を胚盤胞期まで培養することをさらに含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、前記宿主胚への導入前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、前記標的化合物の存在下で培養される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の作製方法であって、
（ａ）非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の集団を、前記非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の前記多能性を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む低オスモル濃度培地中で培養し、前記低オスモル濃度培地が、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を有することと、
（ｂ）Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性について、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の前記集団において前記非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞のうち１種以上をアッセイすることと、
（ｃ）Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の前記発現及び／または活性に基づいて、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を生成するためにドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を選択し、前記Ｆ０世代における前記繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物の前記比率が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の前記発現及び／または活性に逆相関すること
とを含む、前記方法。
【請求項３１】
ステップ（ｂ）の前記アッセイによって、前記ｍＲＮＡレベルでＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の発現が検出される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ｂ）の前記アッセイによって、前記タンパク質レベルでＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の発現が検出される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞、すなわち、前記対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の前記多能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる前記細胞の能力を変化させない培地中で培養された前記細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の減少した発現及び／または活性に基づいて選択される、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、前記対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの減少した発現及び／または活性を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（ｂ）が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性について、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の前記集団における少なくとも２種の前記非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞をアッセイすることを含み、ステップ（ｃ）が、前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞として、他方のアッセイした細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の最も低い発現及び／または活性を有するステップ（ｂ）の前記アッセイした細胞を選択することを含む、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の発現及び／または活性を欠いている、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの発現及び／または活性を欠いている、請求項３０〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、アッセイステップ（ｂ）の前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、前記低オスモル濃度培地中で培養される、請求項３０〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記多能性細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項３０〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記多能性細胞が、ＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記低オスモル濃度培地が、以下の特性：
（Ｉ）前記低オスモル濃度培地が、約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有すること、
（ＩＩ）前記低オスモル濃度培地が、２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有すること、
（ＩＩＩ）前記低オスモル濃度培地が、約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの伝導度を有すること、
（ＩＶ）前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で含むこと、
（Ｖ）前記基本培地が、塩化ナトリウムを約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で含むこと、
（ＶＩ）前記基本培地が、炭酸塩を約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で含むこと、
（ＶＩＩ）前記基本培地が、重炭酸ナトリウムを約１３ｍＭ〜約２５ｍＭの濃度で含むこと、
（ＶＩＩＩ）前記基本培地が、約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総濃度を有すること、
（ＩＸ）前記基本培地が、塩化ナトリウムを８７±５ｍＭの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有すること、
（Ｘ）前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で、及び炭酸塩を約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有すること、ならびに
（ＸＩ）前記低オスモル濃度培地が、２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し、前記基本培地が、塩化ナトリウムを５０ｍＭ〜１１０ｍＭの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを１３ｍＭ〜２５ｍＭの濃度で含むこと
のうち１つ以上を有する、請求項３０〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記基本培地が、炭酸塩を約１８ｍＭ〜約４４ｍＭの濃度で含む、請求項３０〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で含む、請求項３０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記炭酸塩が重炭酸ナトリウムであり、前記アルカリ金属及び前記ハロゲン化物の前記塩が塩化ナトリウムであり、前記低オスモル濃度培地が、約２１６ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項３０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記基本培地が、塩化ナトリウムを約３ｍｇ／ｍＬの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを約２．２ｍｇ／ｍＬの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、約２１６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項３０〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記非ヒト哺乳動物が、げっ歯類である、請求項３０〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記げっ歯類がラットまたはマウスである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記げっ歯類がＣ５７ＢＬ／６系統を含むマウスである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｙ染色体が、Ｃ５７ＢＬ／６系統、１２９系統、またはＢＡＬＢ／ｃ系統からのものである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記げっ歯類が、Ｃ５７ＢＬ／６系統及び１２９系統を含むマウスである、請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
（ｄ）前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を宿主胚に導入することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記宿主胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して、前記宿主胚を懐胎させることと、
（ｆ）表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を含むＦ０  ＸＹ非ヒト哺乳動物子孫を得て、性成熟に達すると、前記Ｆ０の表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物が繁殖可能かつ妊孕可能になること
とをさらに含む、請求項３０〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記宿主胚が前桑実期胚であり、ステップ（ｄ）が、前記宿主胚を前記胚盤胞期まで培養することをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、前記宿主胚への導入前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、前記低オスモル濃度培地中で培養される、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
（ａ）非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞においてＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性レベルを検出するための検出試薬と、
（ｂ）前記検出試薬を使用して、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を生成するための前記非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の予測傾向と検出を相互に関連付けるための説明書
とを含む、キット。
【請求項５５】
前記検出試薬が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の発現を検出するための、１つ以上のプライマーセット及び／または１つ以上のプローブを含む、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
雌化培地における標的培地成分の前記濃度の最適化方法であって、
（ａ）非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の第１集団及び第２集団を、前記非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の前記多能性を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む培地中で培養し、
前記第１集団が、第１濃度の前記標的培地成分の存在下で培養され、前記第２集団が、前記第１濃度とは異なる第２濃度の前記標的培地成分の存在下で培養されることと、
（ｂ）Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性について、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の前記第１及び第２集団の各々で前記非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞のうち１種以上をアッセイすることと、
（ｃ）Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の前記発現及び／または活性が、前記第２集団からの前記１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞と比較して、前記第１集団からの前記１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞で減少する場合に、前記第１濃度を選択することと、
（ｄ）Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の前記発現及び／または活性に基づいて、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を生成するために、前記第１集団からドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を選択し、前記Ｆ０世代における前記繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物の前記比率が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の前記発現及び／または活性に逆相関することと、
（ｅ）前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を宿主胚に導入することと、
（ｆ）ステップ（ｅ）の前記宿主胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して、前記宿主胚を懐胎させることと、
（ｇ）表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を含むＦ０  ＸＹ非ヒト哺乳動物子孫を得て、性成熟に達すると、前記Ｆ０の表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物が繁殖可能かつ妊孕可能になること
とを含む、前記方法。
【請求項５７】
ステップ（ｂ）の前記アッセイによって、前記ｍＲＮＡレベルでＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の発現が検出される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ステップ（ｂ）の前記アッセイによって、前記タンパク質レベルでＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の発現が検出される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記第１集団からの前記１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、前記第２集団からの前記１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの減少した発現及び／または活性を有する場合に、前記第１濃度がステップ（ｃ）で選択される、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記第１集団からの前記１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の発現及び／または活性を欠いている場合に、前記第１濃度がステップ（ｃ）で選択される、請求項５６〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記第１集団からの前記１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの発現及び／または活性を欠いている場合に、前記第１濃度がステップ（ｃ）で選択される、請求項５６〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
ステップ（ｄ）の前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞、すなわち、前記対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の前記多能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる前記細胞の能力を変化させない培地中で培養された前記細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する、請求項５６〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
ステップ（ｄ）の前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、前記第２集団からの対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する、請求項５６〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、前記対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの減少した発現及び／または活性を有する、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
ステップ（ｂ）が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性について、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の前記第１集団における少なくとも２種の前記非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞をアッセイすることを含み、ステップ（ｄ）が、前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞として、他方のアッセイした細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の最も低い発現及び／または活性を有するステップ（ｂ）の前記アッセイした細胞を選択することを含む、請求項５６〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の発現及び／または活性を欠いている、請求項５６〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの発現及び／または活性を欠いている、請求項５６〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記第１及び第２集団が、アッセイステップ（ｂ）の前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、前記標的培地成分の存在下で培養される、請求項５６〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記多能性細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項５６〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記多能性細胞が、ＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
ステップ（ａ）の前記培地が、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を有する低オスモル濃度培地である、請求項５６〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記低オスモル濃度培地が、以下の特性：
（Ｉ）前記低オスモル濃度培地が、約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有すること、
（ＩＩ）前記低オスモル濃度培地が、２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有すること、
（ＩＩＩ）前記低オスモル濃度培地が、約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの伝導度を有すること、
（ＩＶ）前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で含むこと、
（Ｖ）前記基本培地が、塩化ナトリウムを約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で含むこと、
（ＶＩ）前記基本培地が、炭酸塩を約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で含むこと、
（ＶＩＩ）前記基本培地が、重炭酸ナトリウムを約１３ｍＭ〜約２５ｍＭの濃度で含むこと、
（ＶＩＩＩ）前記基本培地が、約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総濃度を有すること、
（ＩＸ）前記基本培地が、塩化ナトリウムを８７±５ｍＭの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有すること、
（Ｘ）前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で、及び炭酸塩を約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有すること、ならびに
（ＸＩ）前記低オスモル濃度培地が、２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し、前記基本培地が、塩化ナトリウムを５０ｍＭ〜１１０ｍＭの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを１３ｍＭ〜２５ｍＭの濃度で含むこと
のうち１つ以上を有する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記基本培地が、炭酸塩を約１８ｍＭ〜約４４ｍＭの濃度で含む、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で含む、請求項７１〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記炭酸塩が重炭酸ナトリウムであり、前記アルカリ金属及び前記ハロゲン化物の前記塩が塩化ナトリウムであり、前記低オスモル濃度培地が、約２１６ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項７１〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記基本培地が、塩化ナトリウムを約３ｍｇ／ｍＬの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを約２．２ｍｇ／ｍＬの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、約２１６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項７１〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記非ヒト哺乳動物が、げっ歯類である、請求項５６〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記げっ歯類がラットまたはマウスである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記げっ歯類がＣ５７ＢＬ／６系統を含むマウスである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記Ｙ染色体が、Ｃ５７ＢＬ／６系統、１２９系統、またはＢＡＬＢ／ｃ系統からのものである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記げっ歯類が、Ｃ５７ＢＬ／６系統及び１２９系統を含むマウスである、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記宿主胚が前桑実期胚であり、ステップ（ｅ）が、前記宿主胚を前記胚盤胞期まで培養することをさらに含む、請求項５６〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、前記宿主胚への導入前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、前記標的培地成分の存在下で培養される、請求項５６〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記多能性細胞が、標的ゲノム遺伝子座に標的遺伝子改変を含む、請求項１〜５３及び５６〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記標的遺伝子改変が、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点変異、またはこれらの組合せを含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
（ｈ）子孫を生成するために前記繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物を交配させること
をさらに含む、請求項１〜２９、５１〜５３、及び５６〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または全ての前記ＸＹ子孫が、表現型的に雄かつ繁殖可能である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記ＸＹ子孫には表現型的に雌がいない、請求項８６または８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記交配が、前記繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物をコホートＦ０  ＸＹ雄非ヒト哺乳動物と交雑させて、ここで前記繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物及び前記Ｆ０  ＸＹ雄非ヒト哺乳動物が各々、遺伝子改変についてヘテロ接合体であること、ならびに前記遺伝子改変についてホモ接合体であるＦ１子孫非ヒト哺乳動物を得ることを含む、請求項８６〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の前記Ｆ０  ＸＹ子孫が、性成熟に達すると繁殖可能になる表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物である、請求項１〜２９、５１〜５３、及び５６〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物である前記Ｆ０  ＸＹ子孫の前記パーセンテージが、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する前記Ｆ０雌の全てが、ＸＹ遺伝子型を有する、請求項１〜２９、５１〜５３、及び５６〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の前記Ｆ０  ＸＹ雌が、繁殖可能である、請求項１〜２９、５１〜５３、及び５６〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
繁殖可能な前記Ｆ０  ＸＹ雌の前記パーセンテージが、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の前記Ｆ０  ＸＹ雌が、少なくとも２匹、３匹、４匹、５匹、６匹、７匹、８匹、９匹、または１０匹の仔を有する同腹仔を産生することができる、請求項１〜２９、５１〜５３、及び５６〜９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌により産生される前記平均産子数が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の前記Ｆ０  ＸＹ雌が、それらの生涯において少なくとも２匹、３匹、４匹、５匹、６匹、７匹、８匹、９匹、または１０匹の同腹仔を産生することができる、請求項１〜２９、５１〜５３、及び５６〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌により産生される一生涯における同腹仔の前記平均数が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌により産生される一生涯における子孫の前記平均数が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち前記１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い、請求項１〜２９、５１〜５３、及び５６〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年９月１７日出願の米国特許出願第６２／２１９，９２７号明細書の利益を主張し、その全体があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＥＦＳ  ＷＥＢによりテキストファイルとして提出された配列表の参照
９．１７ｋｂのファイル４８４３８７ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ内に記載された配列表は、２０１６年９月１６日に作成されたものであり、これは参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
標的変異を持つ遺伝子改変マウスの作製は、通常、雄の胚に由来するＸＹ  ＥＳ細胞株で行われる。ＥＳ細胞を、雄または雌のいずれかであり得る胚盤胞期胚に注入し、続いて代理母の子宮に移すと、宿主胚及びＥＳ細胞の両方から遺伝的な寄与を受けるキメラＦ０世代の仔を出産する。この種類の実験における成功の特徴は、ＸＸ雌の胚において発達している生殖隆起を持つＸＹ  ＥＳ細胞による定着及び雄状態への転換の結果として、雄が優勢なＦ０マウスにおける性比のねじれである。強力なＥＳ細胞由来の毛色の寄与を有する雄キメラは、標的変異を持つ精子を生成する可能性があり、それゆえ、それらの子孫にＥＳ細胞ゲノムを伝達させるための良好な候補と見なされる。雌キメラは、効率が悪いため生殖細胞系伝達を達成し得ることはめったにないが、それらはＥＳ細胞の寄与が不十分であると予想され、通常は、変異体マウス株を確立するために繁殖させることはない。
【０００４】
遺伝子改変マウスの生成を促進するために、発明者らは、８細胞期胚中に注入されたＥＳ細胞が完全にＥＳ細胞由来のＦ０世代マウスに転換される、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を開発した（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１−９９）。ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法がキメラを排除するので、全てのＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）は、それらが由来したＥＳ細胞の遺伝子型を共有する。ＸＹ  ＥＳ細胞は、雄のＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）のみを生成すると予想されることになる。性転換がＸＹマウスで報告されているが、このようなマウスは、多くの場合に不妊である、または繁殖力が非常に低い。
大半の遺伝子改変は、２つの既存の対立遺伝子のうち１つに改変を作製するようにＸＹ  ＥＳ細胞を標的とすることによって実施され、得られたドナーマウスＥＳ細胞は、遺伝子改変についてヘテロ接合体である。しかしながら、遺伝子改変についてホモ接合体であるマウスを得ることが多くの場合に望ましい。改変を含む本質的に完全にＥＳ細胞由来の雌マウスは、Ｆ０世代では産まれないため、Ｆ０雄は、少なくとも１匹の雌（Ｆ１雌）が遺伝子改変についてヘテロ接合体の可能性がある同腹仔を生成するために典型的には雌（例えば、適合する近交系雌）と交配させる。次いで、ヘテロ接合体Ｆ１雌をＦ１ヘテロ接合体雄と互いに交雑させて、ホモ接合体子孫を得る。このような交配に必要なのは、高額な費用と時間のかかるステップである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１−９９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を含むＦ０  ＸＹ非ヒト哺乳動物子孫を生成することができるドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を作製するための方法及び組成物が提供される。一態様では、本発明は、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞における雌化活性について標的化合物をスクリーニングする方法を提供し、本方法は以下を含む：（ａ）非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の多能性を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む培地中で非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の第１集団及び第２集団を培養し、第１集団は、標的化合物の存在下で培養され、第２集団は、標的化合物の不存在下で培養されること、ならびに（ｂ）Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性について、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の第１及び第２集団の各々で非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞のうち１種以上をアッセイし、それによって雌化活性が、第２集団からの１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞と比較して、第１集団からの１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞におけるＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性の減少によって同定されること。場合により、このような方法は、さらに以下を含む：（ｃ）Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性に基づいて、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を生成するために、第１集団からドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を選択し、Ｆ０世代における繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物の比率が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性に逆相関すること。場合により、このような方法は、さらに以下を含む：（ｄ）ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を宿主胚に導入すること、（ｅ）ステップ（ｄ）の宿主胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して、宿主胚を懐胎させること、及び（ｆ）表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を含むＦ０  ＸＹ非ヒト哺乳動物子孫を得て、性成熟に達すると、Ｆ０の表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物が繁殖可能になる、または繁殖可能かつ妊孕可能になること。
【０００７】
いくつかのこのような方法では、ステップ（ｂ）のアッセイによって、ｍＲＮＡレベルでＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現が検出される。いくつかのこのような方法では、ステップ（ｂ）のアッセイによって、タンパク質レベルでＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現が検出される。
【０００８】
いくつかの方法では、雌化活性は、第１集団からの１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞における、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性の欠如によってステップ（ｂ）で同定される。いくつかの方法では、雌化活性は、第２集団からの１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞と比較して、第１集団からの１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞における、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの発現及び／または活性の減少によってステップ（ｂ）で同定される。いくつかの方法では、雌化活性は、第１集団からの１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞における、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの発現及び／または活性の欠如によってステップ（ｂ）で同定される。
【０００９】
いくつかの方法では、ステップ（ｃ）のドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の多能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる細胞の能力を変化させない培地中で培養された対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する。いくつかの方法では、ステップ（ｃ）のドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、第２集団からの対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する。いくつかの方法では、ステップ（ｃ）のドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの減少した発現及び／または活性を有する。いくつかの方法では、ステップ（ｂ）は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性について、第１集団における少なくとも２種の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞をアッセイすることを含み、ステップ（ｃ）は、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞として、他方のアッセイした細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の最も低い発現及び／または活性を有するステップ（ｂ）のアッセイした細胞を選択することを含む。いくつかの方法では、ステップ（ｃ）のドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性を欠いている。いくつかの方法では、ステップ（ｃ）のドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの発現及び／または活性を欠いている。
【００１０】
いくつかの方法では、第１集団は、アッセイステップ（ｂ）の前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、標的化合物の存在下で培養される。
【００１１】
いくつかの方法では、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。場合により、多能性細胞は、ＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である。
【００１２】
いくつかの方法では、標的化合物の不存在下で、ステップ（ａ）の培地は、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の多能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる細胞の能力を変化させない。
【００１３】
いくつかの方法では、標的化合物の不存在下で、ステップ（ａ）の培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を有する低オスモル濃度培地である。場合により、低オスモル濃度培地は、以下の特性のうち１つ以上を有する：（Ｉ）低オスモル濃度培地は、約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、（ＩＩ）低オスモル濃度培地は、２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、（ＩＩＩ）低オスモル濃度培地は、約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する、（ＩＶ）基本培地は、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で含む、（Ｖ）基本培地は、塩化ナトリウムを約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で含む、（ＶＩ）基本培地は、炭酸塩を約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で含む、（ＶＩＩ）基本培地は、重炭酸ナトリウムを約１３ｍＭ〜約２５ｍＭの濃度で含む、（ＶＩＩＩ）基本培地は、約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総濃度を有する、（ＩＸ）基本培地は、塩化ナトリウムを８７±５ｍＭの濃度で含み、低オスモル濃度培地は、２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、（Ｘ）基本培地は、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で、及び炭酸塩を約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で含み、低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、ならびに（ＸＩ）低オスモル濃度培地は、２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し、基本培地は、塩化ナトリウムを５０ｍＭ〜１１０ｍＭの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを１３ｍＭ〜２５ｍＭの濃度で含む。場合により、基本培地は、炭酸塩を約１８ｍＭ〜約４４ｍＭの濃度で含む。場合により、基本培地は、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で含む。場合により、炭酸塩は重炭酸ナトリウムであり、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩は塩化ナトリウムであり、低オスモル濃度培地は、約２１６ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。場合により、基本培地は、塩化ナトリウムを約３ｍｇ／ｍＬの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを約２．２ｍｇ／ｍＬの濃度で含み、低オスモル濃度培地は、約２１６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
【００１４】
いくつかの方法では、非ヒト哺乳動物は、げっ歯類である。場合により、げっ歯類はラットまたはマウスである。いくつかの方法では、げっ歯類はＣ５７ＢＬ／６系統を含むマウスである。場合により、Ｙ染色体はＣ５７ＢＬ／６系統からのものである。いくつかの方法では、げっ歯類は１２９系統を含むマウスである。場合により、Ｙ染色体は１２９系統からのものである。場合により、Ｙ染色体はＢＡＬＢ／ｃ系統からのものである。いくつかの方法では、マウスは１２９系統を含まない。いくつかの方法では、Ｙ染色体は１２９系統からのものではない。いくつかの方法では、げっ歯類はＣ５７ＢＬ／６系統及び１２９系統を含むマウスである。
【００１５】
いくつかの方法では、多能性細胞は、標的ゲノム遺伝子座に標的遺伝子改変を含む。場合により、標的遺伝子改変は、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点変異、またはこれらの組合せを含む。
【００１６】
いくつかの方法は、以下をさらに含む：（ｇ）子孫を生成するために繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物を交配させること。場合により、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または全てのＸＹ子孫が、表現型的に雄かつ繁殖可能である。場合により、ＸＹ子孫には表現型的に雌はいない。場合により、全てのＸＹ子孫が、表現型的に雄かつ繁殖可能である。場合により、交配は、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物をコホートＦ０  ＸＹ雄非ヒト哺乳動物と交雑させて、ここで繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物及びＦ０  ＸＹ雄非ヒト哺乳動物が各々、遺伝子改変についてヘテロ接合体であること、ならびに遺伝子改変についてホモ接合体であるＦ１子孫非ヒト哺乳動物を得ることを含む。
【００１７】
いくつかの方法では、宿主胚は前桑実期胚であり、ステップ（ｄ）は、宿主胚を胚盤胞期まで培養することをさらに含む。
【００１８】
いくつかの方法では、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、宿主胚への導入前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、標的化合物の存在下で培養される。
【００１９】
いくつかの方法では、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ子孫が、性成熟に達すると繁殖可能になる表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物である。場合により、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。
【００２０】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０雌の全てが、ＸＹ遺伝子型を有する。
【００２１】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ雌が、繁殖可能である。場合により、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。
【００２２】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ雌が、少なくとも２匹、３匹、４匹、５匹、６匹、７匹、８匹、９匹、または１０匹の仔を有する同腹仔を産生することができる。場合により、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌により産生される平均産子数は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【００２３】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ雌が、それらの生涯において少なくとも２匹、３匹、４匹、５匹、６匹、７匹、８匹、９匹、または１０匹の同腹仔を産生することができる。場合により、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌により産生される一生涯における同腹仔の平均数は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【００２４】
いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌により産生される一生涯における子孫の平均数は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【００２５】
別の態様では、本発明は、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を作製する方法を提供し、本方法は以下を含む：（ａ）非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の多能性を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む低オスモル濃度培地中で非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の集団を培養し、低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を有すること、（ｂ）Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性について、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の集団において非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞のうち１種以上をアッセイすること、ならびに（ｃ）Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性に基づいて、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を生成するために、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を選択し、Ｆ０世代における繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物の比率が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性に逆相関すること。
【００２６】
いくつかのこのような方法では、ステップ（ｂ）のアッセイによって、ｍＲＮＡレベルでＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現が検出される。いくつかのこのような方法では、ステップ（ｂ）のアッセイによって、タンパク質レベルでＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現が検出される。
【００２７】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の多能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる細胞の能力を変化させない培地中で培養された対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性に基づいて選択される。いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの減少した発現及び／または活性を有する。いくつかの方法では、ステップ（ｂ）は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性について、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の集団における少なくとも２種の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞をアッセイすることを含み、ステップ（ｃ）は、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞として、他方のアッセイした細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の最も低い発現及び／または活性を有するステップ（ｂ）のアッセイした細胞を選択することを含む。いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性を欠いている。いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの発現及び／または活性を欠いている。
【００２８】
いくつかの方法では、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、アッセイステップ（ｂ）の前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、低オスモル濃度培地中で培養される。
【００２９】
いくつかの方法では、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。場合により、多能性細胞は、ＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である。
【００３０】
いくつかの方法では、低オスモル濃度培地は、以下の特性のうち１つ以上を有する：（Ｉ）低オスモル濃度培地は、約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、（ＩＩ）低オスモル濃度培地は、２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、（ＩＩＩ）低オスモル濃度培地は、約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する、（ＩＶ）基本培地は、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で含む、（Ｖ）基本培地は、塩化ナトリウムを約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で含む、（ＶＩ）基本培地は、炭酸塩を約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で含む、（ＶＩＩ）基本培地は、重炭酸ナトリウムを約１３ｍＭ〜約２５ｍＭの濃度で含む、（ＶＩＩＩ）基本培地は、約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総濃度を有する、（ＩＸ）基本培地は、塩化ナトリウムを８７±５ｍＭの濃度で含み、低オスモル濃度培地は、２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、（Ｘ）基本培地は、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で、及び炭酸塩を約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で含み、低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、ならびに（ＸＩ）低オスモル濃度培地は、２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し、基本培地は、塩化ナトリウムを５０ｍＭ〜１１０ｍＭの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを１３ｍＭ〜２５ｍＭの濃度で含む。場合により、基本培地は、炭酸塩を約１８ｍＭ〜約４４ｍＭの濃度で含む。場合により、基本培地は、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で含む。場合により、炭酸塩は重炭酸ナトリウムであり、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩は塩化ナトリウムであり、低オスモル濃度培地は、約２１６ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。場合により、基本培地は、塩化ナトリウムを約３ｍｇ／ｍＬの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを約２．２ｍｇ／ｍＬの濃度で含み、低オスモル濃度培地は、約２１６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
【００３１】
いくつかの方法では、非ヒト哺乳動物は、げっ歯類である。場合により、げっ歯類はラットまたはマウスである。いくつかの方法では、げっ歯類はＣ５７ＢＬ／６系統を含むマウスである。場合により、Ｙ染色体はＣ５７ＢＬ／６系統からのものである。いくつかの方法では、げっ歯類は１２９系統を含むマウスである。場合により、Ｙ染色体は１２９系統からのものである。場合により、Ｙ染色体はＢＡＬＢ／ｃ系統からのものである。いくつかの方法では、マウスは１２９系統を含まない。いくつかの方法では、Ｙ染色体は１２９系統からのものではない。いくつかの方法では、げっ歯類はＣ５７ＢＬ／６系統及び１２９系統を含むマウスである。
【００３２】
いくつかの方法では、多能性細胞は、標的ゲノム遺伝子座に標的遺伝子改変を含む。場合により、標的遺伝子改変は、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点変異、またはこれらの組合せを含む。
【００３３】
いくつかの方法は、以下をさらに含む：（ｄ）ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を宿主胚に導入すること、（ｅ）ステップ（ｄ）の宿主胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して、宿主胚を懐胎させること、及び（ｆ）表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を含むＦ０  ＸＹ非ヒト哺乳動物子孫を得て、性成熟に達すると、Ｆ０の表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物が繁殖可能になる、または繁殖可能かつ妊孕可能になること。いくつかの方法は、以下をさらに含む：（ｇ）子孫を生成するために繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物を交配させること。場合により、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または全てのＸＹ子孫が、表現型的に雄かつ繁殖可能である。場合により、ＸＹ子孫には表現型的に雌はいない。場合により、全てのＸＹ子孫が、表現型的に雄かつ繁殖可能である。場合により、交配は、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物をコホートＦ０  ＸＹ雄非ヒト哺乳動物と交雑させて、ここで繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物及びＦ０  ＸＹ雄非ヒト哺乳動物が各々、遺伝子改変についてヘテロ接合体であること、ならびに遺伝子改変についてホモ接合体であるＦ１子孫非ヒト哺乳動物を得ることを含む。
【００３４】
いくつかの方法では、宿主胚は前桑実期胚であり、ステップ（ｄ）は、宿主胚を胚盤胞期まで培養することをさらに含む。
【００３５】
いくつかの方法では、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、宿主胚への導入前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、低オスモル濃度培地中で培養される。
【００３６】
いくつかの方法では、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ子孫が、性成熟に達すると繁殖可能になる表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物である。場合により、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。
【００３７】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０雌の全てが、ＸＹ遺伝子型を有する。
【００３８】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ雌が、繁殖可能である。場合により、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。
【００３９】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ雌が、少なくとも２匹、３匹、４匹、５匹、６匹、７匹、８匹、９匹、または１０匹の仔を有する同腹仔を産生することができる。場合により、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌により産生される平均産子数は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【００４０】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ雌が、それらの生涯において少なくとも２匹、３匹、４匹、５匹、６匹、７匹、８匹、９匹、または１０匹の同腹仔を産生することができる。場合により、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌により産生される一生涯における同腹仔の平均数は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【００４１】
いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌により産生される一生涯における子孫の平均数は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【００４２】
別の態様では、本発明は、以下を含むキットを提供する：（ａ）非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞においてＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性レベルを検出するための検出試薬、ならびに（ｂ）検出試薬を使用して、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞がＦ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を生成する予測傾向と検出を相互に関連付けるための説明書。場合により、検出試薬は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現を検出するための、１つ以上のプライマーセット及び／または１つ以上のプローブを含む。
【００４３】
別の態様では、本発明は、雌化培地において標的培地成分の濃度を最適化する方法を提供し、本方法は以下を含む：（ａ）非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の多能性を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む培地中で非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の第１集団及び第２集団を培養し、第１集団は、第１濃度の標的培地成分の存在下で培養され、第２集団は、第１濃度とは異なる第２濃度の標的培地成分の存在下で培養されること、（ｂ）Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性について、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の第１及び第２集団の各々で非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞のうち１種以上をアッセイすること、ならびに（ｃ）Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性が、第２集団からの１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞と比較して、第１集団からの１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞で減少する場合に、第１濃度を選択すること。いくつかのこのような方法は、さらに以下を含む：（ｄ）Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性に基づいて、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を生成するために、第１集団からドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を選択し、Ｆ０世代における繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物の比率が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性に逆相関すること。いくつかのこのような方法は、さらに以下を含む：（ｅ）ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を宿主胚に導入すること、（ｆ）ステップ（ｅ）の宿主胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して、宿主胚を懐胎させること、及び（ｇ）表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を含むＦ０  ＸＹ非ヒト哺乳動物子孫を得て、性成熟に達すると、Ｆ０の表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物が繁殖可能になる、または繁殖可能かつ妊孕可能になること。
【００４４】
いくつかの方法では、ステップ（ｂ）のアッセイによって、ｍＲＮＡレベルでＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現が検出される。いくつかの方法では、ステップ（ｂ）のアッセイによって、タンパク質レベルでＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現が検出される。
【００４５】
いくつかの方法では、第１濃度は、第１集団からの１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性を欠いている場合に、ステップ（ｃ）で選択される。いくつかの方法では、第１濃度は、第１集団からの１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、第２集団からの１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの減少した発現及び／または活性を有する場合に、ステップ（ｃ）で選択される。いくつかの方法では、第１濃度は、第１集団からの１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの発現及び／または活性を欠いている場合に、ステップ（ｃ）で選択される。
【００４６】
いくつかの方法では、ステップ（ｃ）のドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の多能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる細胞の能力を変化させない培地中で培養された対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する。いくつかの方法では、ステップ（ｃ）のドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、第２集団からの対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する。いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、対照非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの減少した発現及び／または活性を有する。いくつかの方法では、ステップ（ｂ）は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性について、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の第１集団における少なくとも２種の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞をアッセイすることを含み、ステップ（ｄ）は、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞として、他方のアッセイした細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の最も低い発現及び／または活性を有するステップ（ｂ）のアッセイした細胞を選択することを含む。いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性を欠いている。いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの発現及び／または活性を欠いている。
【００４７】
いくつかの方法では、第１及び第２集団は、アッセイステップ（ｂ）の前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、標的培地成分の存在下で培養される。
【００４８】
いくつかの方法では、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。場合により、多能性細胞は、ＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である。
【００４９】
いくつかの方法では、ステップ（ａ）の培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を有する低オスモル濃度培地である。場合により、低オスモル濃度培地は、以下の特性のうち１つ以上を有する：（Ｉ）低オスモル濃度培地は、約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、（ＩＩ）低オスモル濃度培地は、２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、（ＩＩＩ）低オスモル濃度培地は、約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する、（ＩＶ）基本培地は、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で含む、（Ｖ）基本培地は、塩化ナトリウムを約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で含む、（ＶＩ）基本培地は、炭酸塩を約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で含む、（ＶＩＩ）基本培地は、重炭酸ナトリウムを約１３ｍＭ〜約２５ｍＭの濃度で含む、（ＶＩＩＩ）基本培地は、約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総濃度を有する、（ＩＸ）基本培地は、塩化ナトリウムを８７±５ｍＭの濃度で含み、低オスモル濃度培地は、２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、（Ｘ）基本培地は、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で、及び炭酸塩を約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で含み、低オスモル濃度培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、ならびに（ＸＩ）低オスモル濃度培地は、２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し、基本培地は、塩化ナトリウムを５０ｍＭ〜１１０ｍＭの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを１３ｍＭ〜２５ｍＭの濃度で含む。場合により、基本培地は、炭酸塩を約１８ｍＭ〜約４４ｍＭの濃度で含む。場合により、基本培地は、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で含む。場合により、炭酸塩は重炭酸ナトリウムであり、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩は塩化ナトリウムであり、低オスモル濃度培地は、約２１６ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。場合により、基本培地は、塩化ナトリウムを約３ｍｇ／ｍＬの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを約２．２ｍｇ／ｍＬの濃度で含み、低オスモル濃度培地は、約２１６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
【００５０】
いくつかの方法では、非ヒト哺乳動物は、げっ歯類である。場合により、げっ歯類はラットまたはマウスである。いくつかの方法では、げっ歯類はＣ５７ＢＬ／６系統を含むマウスである。場合により、Ｙ染色体はＣ５７ＢＬ／６系統からのものである。いくつかの方法では、げっ歯類は１２９系統を含むマウスである。場合により、Ｙ染色体は１２９系統からのものである。場合により、Ｙ染色体はＢＡＬＢ／ｃ系統からのものである。いくつかの方法では、マウスは１２９系統を含まない。いくつかの方法では、Ｙ染色体は１２９系統からのものではない。いくつかの方法では、げっ歯類はＣ５７ＢＬ／６系統及び１２９系統を含むマウスである。
【００５１】
いくつかの方法では、多能性細胞は、標的ゲノム遺伝子座に標的遺伝子改変を含む。場合により、標的遺伝子改変は、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点変異、またはこれらの組合せを含む。
【００５２】
いくつかの方法は、以下をさらに含む：（ｈ）子孫を生成するために繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物を交配させること。場合により、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または全てのＸＹ子孫が、表現型的に雄かつ繁殖可能である。場合により、ＸＹ子孫には表現型的に雌はいない。場合により、全てのＸＹ子孫が、表現型的に雄かつ繁殖可能である。場合により、交配は、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物をコホートＦ０  ＸＹ雄非ヒト哺乳動物と交雑させて、ここで繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物及びＦ０  ＸＹ雄非ヒト哺乳動物が各々、遺伝子改変についてヘテロ接合体であること、ならびに遺伝子改変についてホモ接合体であるＦ１子孫非ヒト哺乳動物を得ることを含む。
【００５３】
いくつかの方法では、宿主胚は前桑実期胚であり、ステップ（ｅ）は、宿主胚を胚盤胞期まで培養することをさらに含む。
【００５４】
いくつかの方法では、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、宿主胚への導入前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、標的培地成分の存在下で培養される。
【００５５】
いくつかの方法では、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ子孫が、性成熟に達すると繁殖可能になる表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物である。場合により、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。
【００５６】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０雌の全てが、ＸＹ遺伝子型を有する。
【００５７】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ雌が、繁殖可能である。場合により、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。
【００５８】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ雌が、少なくとも２匹、３匹、４匹、５匹、６匹、７匹、８匹、９匹、または１０匹の仔を有する同腹仔を産生することができる。場合により、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌により産生される平均産子数は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【００５９】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ雌が、それらの生涯において少なくとも２匹、３匹、４匹、５匹、６匹、７匹、８匹、９匹、または１０匹の同腹仔を産生することができる。場合により、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌により産生される一生涯における同腹仔の平均数は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【００６０】
いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌により産生される一生涯における子孫の平均数は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【００６１】
一態様では、本発明は、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を作製する方法を提供し、本方法は以下を含む：Ｙ染色体の領域をサイレンシングして、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を生成するために非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を改変し、サイレンシングは、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を含む基本培地を含む低オスモル濃度培地中で非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を維持すること以外の手段によって達成され、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を含むＦ０  ＸＹ非ヒト哺乳動物子孫を生成することができること。場合により、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。
【００６２】
いくつかの方法では、領域は、Ｙ染色体の短腕の全てまたは一部を含む。いくつかの方法では、領域は、Ｒｂｍｙクラスター、Ｚｆｙ２、及びＳｒｙのうち１つ以上を除外する。いくつかの方法では、領域は、マウスＹ染色体のＳｘｒａ領域及び／またはＳｘｒｂ領域に対応するＹ染色体の区画の全てまたは一部を含む。いくつかの方法では、領域は、マウスＹ染色体上の欠失区間１、欠失区間２、及び欠失区間３のうち１つ以上に対応するＹ染色体の区画の全てまたは一部を含む。いくつかの方法では、領域は、マウスＹ染色体上の欠失区間２に対応するＹ染色体の区画の全てまたは一部を含む。いくつかの方法では、領域は、Ｋｄｍ５ｄのテロメア側またはＵｓｐ９ｙのセントロメア側におけるＹ染色体の一部を含む。いくつかの方法では、領域は、Ｚｆｙ２、Ｓｒｙ、またはＲｂｍｙクラスターのテロメア側である。いくつかの方法では、領域は、Ｚｆｙ２遺伝子のテロメア側である。
【００６３】
いくつかの方法では、サイレンシングは、Ｙ染色体の短腕の領域上に位置する遺伝子によってコードされるタンパク質のレベル及び／または活性を減少させる。いくつかの方法では、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のレベル及び／または活性が減少する。場合により、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のレベル及び／または活性が排除される。いくつかの方法では、Ｓｒｙ及びＺｆｙ２のうち１つ以上のレベル及び／または活性が減少する。場合により、Ｓｒｙ及びＺｆｙ２のうち１つ以上のレベル及び／または活性が排除される。
【００６４】
いくつかの方法では、サイレンシングは永久的である。いくつかの方法では、サイレンシングは、以下のうち１つ以上によって達成される：（１）標的遺伝子改変、（２）領域の欠失または破壊、（３）領域内の１つ以上の遺伝子から転写されるｍＲＮＡのＲＮＡ干渉またはアンチセンス阻害、（４）領域内の１つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質の指向性分解、（５）ヘテロクロマチン媒介性サイレンシング、（６）Ｙ染色体上におけるヒストンバリアントγＨ２ＡＸのリン酸化型のレベル増加、及び（７）領域内における１つ以上の遺伝子の転写減少。場合により、領域は、標的ヌクレアーゼで欠失または破壊される。場合により、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはクラスター化して規則的な配置の短い回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。
【００６５】
いくつかの方法では、サイレンシングは、以下のタイミングのうち少なくとも１つの間に生じる：（１）ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が宿主胚に導入された後、（２）ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を含む宿主胚が、レシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入された後、（３）雄の性決定プログラムが実行される場合の胚発生中、（４）少なくともマウスのＥ１１〜Ｅ１２に対応する発達段階までの胚発生中、（５）少なくともマウスのＥ１７〜Ｅ１９に対応する発達段階までの胚発生中、（６）胚発生の全体を通して、（７）卵形成期の全体を通して、（８）卵母細胞発生における減数分裂前期中、（９）卵母細胞が受精した後の最初の２細胞分裂中、及び（１０）受精後の最初の２細胞分裂を経た排卵後の卵母細胞において。いくつかの方法では、性転換は、Ｆ１子孫に伝達されることができる。
【００６６】
いくつかの方法では、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を含む基本培地を含む低オスモル濃度培地中で培養されない。その他の方法は、培養下の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む培地中で非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を培養することをさらに含み、培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を含む基本培地を含む低オスモル濃度培地である。いくつかの方法では、領域としては、Ｒｂｍｙクラスター、Ｚｆｙ２、及びＳｒｙのうち１つ以上が挙げられ、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、培養下の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む培地中で培養され、培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を含む基本培地を含む低オスモル濃度培地である。場合により、低オスモル濃度培地は、以下のうち１つ以上を含む基本培地を含む：（１）約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２２ｍＯｓｍ／Ｋｇのオスモル濃度、（２）２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度、（３）約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの伝導度、（４）約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、（５）約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの塩化ナトリウム濃度、（６）約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの炭酸塩濃度、（７）約１３ｍＭ〜約２５ｍＭの重炭酸ナトリウム濃度、（８）約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総濃度、（９）８７±５ｍＭの塩化ナトリウム濃度及び２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度、（１０）約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度の炭酸塩、ならびに約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度、ならびに（１１）２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度、５０ｍＭ〜１１０ｍＭの塩化ナトリウム濃度、及び１３ｍＭ〜２５ｍＭの重炭酸ナトリウム濃度。場合により、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、宿主胚への導入前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、低オスモル濃度培地中で維持される。
【００６７】
いくつかの方法では、非ヒト哺乳動物は、げっ歯類である。場合により、げっ歯類はラットまたはマウスである。いくつかの方法では、げっ歯類はＣ５７ＢＬ／６系統を含むマウスである。場合により、Ｙ染色体はＣ５７ＢＬ／６系統からのものである。いくつかの方法では、げっ歯類は１２９系統を含むマウスである。場合により、Ｙ染色体は１２９系統からのものである。いくつかの方法では、マウスは１２９系統を含まない。いくつかの方法では、Ｙ染色体は１２９系統からのものではない。いくつかの方法では、げっ歯類はＣ５７ＢＬ／６系統及び１２９系統を含むマウスである。場合により、多能性細胞は、ＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である。
【００６８】
いくつかの方法では、多能性細胞は、標的ゲノム遺伝子座に標的遺伝子改変を含む。場合により、標的遺伝子改変は、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点変異、またはこれらの組合せを含む。
【００６９】
いくつかの方法では、領域はＺｆｙ２を含み、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させる改変をさらに含む。場合により、非ヒト哺乳動物はＣ５７ＢＬ／６系統を含むマウスであり、非ヒト哺乳動物は１２９系統を含まないマウスであり、非ヒト哺乳動物はマウスであって、Ｙ染色体はＣ５７ＢＬ／６系統からのものである、または非ヒト哺乳動物はマウスであって、Ｙ染色体は１２９系統からのものではない。場合により、このような方法は、培養下の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む培地中で非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を培養することをさらに含み、培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を含む基本培地を含む低オスモル濃度培地である。
【００７０】
本発明は、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を作製する上記方法のいずれかによって生成されるドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を含むインビトロ培養物もまた提供する。
【００７１】
本発明は、胚を生成する方法もまた提供し、本方法は、上記方法のいずれかによって生成されるドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を宿主胚に導入することを含み、宿主胚は、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を生成することができる。
【００７２】
本発明は、胚を生成する上記方法によって生成される改変非ヒト哺乳動物胚もまた提供する。本発明は、細胞のゲノム中にＹ染色体の領域をサイレンシングする改変を有する細胞を含む改変非ヒト哺乳動物胚もまた提供する。
【００７３】
本発明は、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を作製する方法もまた提供し、本方法は以下を含む：（ａ）宿主胚に、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を作製する上記方法のいずれかによって生成されるドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を導入すること、（ｂ）ステップ（ａ）の宿主胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して、宿主胚を懐胎させること、及び（ｃ）表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を含むＦ０  ＸＹ非ヒト哺乳動物子孫を得て、性成熟に達すると、Ｆ０の表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物が繁殖可能になること。あるいは、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を作製するための方法が提供され、本方法は以下を含む：（ａ）改変胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して、胚を懐胎させ、胚は上記方法によって生成されること、及び（ｂ）表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を含むＦ０  ＸＹ非ヒト哺乳動物子孫を得て、性成熟に達すると、Ｆ０の表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物が繁殖可能になること。
【００７４】
いくつかの方法では、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ子孫が、性成熟に達すると繁殖可能になる表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物である。いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０雌の全てが、ＸＹ遺伝子型を有する。いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ雌が、繁殖可能である。いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ雌が、少なくとも２匹、３匹、４匹、５匹、６匹、７匹、８匹、９匹、または１０匹の仔を有する同腹仔を産生することができる。いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ雌が、それらの生涯において少なくとも２匹、３匹、４匹、５匹、６匹、７匹、８匹、９匹、または１０匹の同腹仔を産生することができる。
【００７５】
本発明は、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を作製する上記方法のいずれかによって生成される繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物もまた提供する。
【００７６】
本発明は、Ｆ１世代において標的ゲノム遺伝子座の標的遺伝子改変についてホモ接合体のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を生成する方法もまた提供し、本方法は以下を含む：（ａ）上記方法によって生成される繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌をＦ０  ＸＹ雄非ヒト哺乳動物と交雑させて、ここで繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物及びＦ０  ＸＹ雄非ヒト哺乳動物が各々、標的遺伝子改変についてヘテロ接合体であること、ならびに（ｂ）標的遺伝子改変についてホモ接合体であるＦ１子孫非ヒト哺乳動物を得ること。場合により、Ｆ０  ＸＹ雄は、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と同じ多能性細胞クローンに由来するコホートクローン兄弟である。
【００７７】
本発明は、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を作製する方法もまた提供し、本方法は以下を含む：（ａ）Ｓｒｙ遺伝子以外のＹ染色体の一部を含むＹ染色体の領域をサイレンシングするために、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を改変することによってドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を生成し、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させる改変をさらに含むこと、（ｂ）ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を宿主胚に導入すること、（ｃ）ステップ（ｂ）の宿主胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して、宿主胚を懐胎させること、ならびに（ｄ）表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を含むＦ０  ＸＹ非ヒト哺乳動物子孫を得て、性成熟に達すると、Ｆ０の表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物が繁殖可能になること。場合により、多能性細胞は胚性幹細胞である。
【００７８】
いくつかの方法では、領域は、Ｙ染色体の短腕の全てもしくは一部を含み、Ｒｂｍｙクラスター、Ｚｆｙ２、及びＳｒｙのうち１つ以上を除外し、マウスＹ染色体のＳｘｒａ領域及び／もしくはＳｘｒｂ領域に対応するＹ染色体の区画の全てもしくは一部を含み、マウスＹ染色体上の欠失区間１、欠失区間２、及び欠失区間３のうち１つ以上に対応するＹ染色体の区画の全てもしくは一部を含み、Ｋｄｍ５ｄのテロメア側もしくはＵｓｐ９ｙのセントロメア側におけるＹ染色体の一部を含み、またはＺｆｙ２、Ｓｒｙ、もしくはＲｂｍｙクラスターのテロメア側である。
【００７９】
いくつかの方法では、サイレンシングは、領域中に位置する遺伝子によってコードされるタンパク質のレベル及び／または活性を減少させる。場合により、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のレベル及び／もしくは活性が減少し、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のレベル及び／もしくは活性が排除され、Ｓｒｙ及びＺｆｙ２のうち１つ以上のレベル及び／もしくは活性が減少し、またはＳｒｙ及びＺｆｙ２のうち１つ以上のレベル及び／もしくは活性が排除される。いくつかの方法では、サイレンシングは永久的である。
【００８０】
いくつかの方法では、サイレンシングは、以下のうち１つ以上によって達成される：（１）標的遺伝子改変、（２）領域の欠失または破壊、（３）領域内の１つ以上の遺伝子から転写されるｍＲＮＡのＲＮＡ干渉またはアンチセンス阻害、（４）領域内の１つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質の指向性分解、（５）ヘテロクロマチン媒介性サイレンシング、（６）Ｙ染色体上におけるヒストンバリアントγＨ２ＡＸのリン酸化型のレベル増加、及び（７）領域内における１つ以上の遺伝子の転写減少。場合により、領域は、標的ヌクレアーゼで欠失または破壊される。場合により、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはクラスター化して規則的な配置の短い回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。
【００８１】
いくつかの方法では、サイレンシングは、以下のタイミングのうち少なくとも１つの間に生じる：（１）ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が宿主胚に導入された後、（２）ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を含む宿主胚が、レシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入された後、（３）雄の性決定プログラムが実行される場合の胚発生中、（４）少なくともマウスのＥ１１〜Ｅ１２に対応する発達段階までの胚発生中、（５）少なくともマウスのＥ１７〜Ｅ１９に対応する発達段階までの胚発生中、（６）胚発生の全体を通して、（７）卵形成期の全体を通して、（８）卵母細胞発生における減数分裂前期中、（９）卵母細胞が受精した後の最初の２細胞分裂中、及び（１０）受精後の最初の２細胞分裂を経た排卵後の卵母細胞において。いくつかの方法では、性転換は、Ｆ１子孫に伝達されることができる。
【００８２】
いくつかの方法では、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を含む基本培地を含む低オスモル濃度培地中で培養されない。その他の方法は、培養下の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む培地中で非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を培養することをさらに含み、培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を含む基本培地を含む低オスモル濃度培地である。場合により、低オスモル濃度培地は、以下のうち１つ以上を含む基本培地を含む：（１）約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２２ｍＯｓｍ／Ｋｇのオスモル濃度、（２）２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度、（３）約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの伝導度、（４）約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、（５）約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの塩化ナトリウム濃度、（６）約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの炭酸塩濃度、（７）約１３ｍＭ〜約２５ｍＭの重炭酸ナトリウム濃度、（８）約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総濃度、（９）８７±５ｍＭの塩化ナトリウム濃度及び２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度、（１０）約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度の炭酸塩、ならびに約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度、ならびに（１１）２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度、５０ｍＭ〜１１０ｍＭの塩化ナトリウム濃度、及び１３ｍＭ〜２５ｍＭの重炭酸ナトリウム濃度。場合により、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、宿主胚への導入前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、低オスモル濃度培地中で維持される。
【００８３】
いくつかの方法では、非ヒト哺乳動物は、げっ歯類、ラット、またはマウスである。場合により、マウスはＣ５７ＢＬ／６系統を含み、マウスは１２９系統を含み、マウスは１２９系統を含まず、マウスはＣ５７ＢＬ／６系統及び１２９系統を含み、非ヒト哺乳動物はマウスであって、Ｙ染色体はＣ５７ＢＬ／６系統からのものであり、非ヒト哺乳動物はマウスであって、Ｙ染色体は１２９系統からのものであり、非ヒト哺乳動物はマウスであって、Ｙ染色体は１２９系統からのものではなく、または非ヒト哺乳動物はマウスであって、多能性細胞はＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である。
【００８４】
いくつかの方法では、多能性細胞は、標的ゲノム遺伝子座に標的遺伝子改変を含む。場合により、標的遺伝子改変は、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点変異、またはこれらの組合せを含む。
【００８５】
いくつかの方法では、領域はＺｆｙ２を含む。場合により、非ヒト哺乳動物はＣ５７ＢＬ／６系統を含むマウスであり、非ヒト哺乳動物は１２９系統を含まないマウスであり、非ヒト哺乳動物はマウスであって、Ｙ染色体はＣ５７ＢＬ／６系統からのものである、または非ヒト哺乳動物はマウスであって、Ｙ染色体は１２９系統からのものではない。場合により、このような方法は、培養下の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む培地中で非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を培養することをさらに含み、培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を含む基本培地を含む低オスモル濃度培地である。
【００８６】
いくつかの方法では、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のＦ０  ＸＹ子孫が、性成熟に達すると繁殖可能になる表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物である。場合により、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物であるＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、Ｓｒｙ遺伝子以外のＹ染色体の一部を含むＹ染色体の領域をサイレンシングすることを含まない非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物のパーセンテージよりも高い。
【００８７】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０雌の全てが、ＸＹ遺伝子型を有する。
【００８８】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のＦ０  ＸＹ雌が、繁殖可能である。場合により、繁殖可能なドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージは、Ｓｒｙ遺伝子以外のＹ染色体の一部を含むＹ染色体の領域をサイレンシングすることを含まない非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージよりも高い。
【００８９】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ雌が、少なくとも２匹、３匹、４匹、５匹、６匹、７匹、８匹、９匹、または１０匹の仔を有する同腹仔を産生することができる。場合により、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌により産生される平均産子数は、Ｓｒｙ遺伝子以外のＹ染色体の一部を含むＹ染色体の領域をサイレンシングすることを含まない非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌により産生される平均産子数よりも多い。
【００９０】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０雌が、それらの生涯において少なくとも２匹、３匹、４匹、５匹、６匹、７匹、８匹、９匹、または１０匹の同腹仔を産生することができる。場合により、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌により産生される同腹仔の平均数は、Ｓｒｙ遺伝子以外のＹ染色体の一部を含むＹ染色体の領域をサイレンシングすることを含まない非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌により産生される同腹仔の平均数よりも多い。場合により、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌により産生される一生涯における子孫の平均数は、Ｓｒｙ遺伝子以外のＹ染色体の一部を含むＹ染色体の領域をサイレンシングすることを含まない非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌により産生される一生涯における子孫の平均数よりも多い。
【００９１】
本発明は、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を作製する方法もまた提供し、本方法は以下を含む：（ａ）Ｙ染色体の領域をサイレンシングするために非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を改変することによってドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を生成し、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は低オスモル濃度培地中で維持されるが、サイレンシングは、低オスモル濃度培地中で非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を維持すること以外の手段またはそれに加えた手段によって達成され、低オスモル濃度培地は、培養下の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含み、基本培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を含むこと、（ｂ）ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を宿主胚に導入すること、（ｃ）ステップ（ｂ）の宿主胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して、宿主胚を懐胎させること、ならびに（ｄ）表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を含むＦ０  ＸＹ非ヒト哺乳動物子孫を得て、性成熟に達すると、Ｆ０の表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物が繁殖可能になること。場合により、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。
【００９２】
いくつかの方法では、領域は、Ｙ染色体の短腕の全てもしくは一部を含み、Ｒｂｍｙクラスター、Ｚｆｙ２、及びＳｒｙのうち１つ以上を除外し、マウスＹ染色体のＳｘｒａ領域及び／もしくはＳｘｒｂ領域に対応するＹ染色体の区画の全てもしくは一部を含み、マウスＹ染色体上の欠失区間１、欠失区間２、及び欠失区間３のうち１つ以上に対応するＹ染色体の区画の全てもしくは一部を含み、Ｋｄｍ５ｄのテロメア側もしくはＵｓｐ９ｙのセントロメア側におけるＹ染色体の一部を含み、またはＺｆｙ２、Ｓｒｙ、もしくはＲｂｍｙクラスターのテロメア側である。
【００９３】
いくつかの方法では、サイレンシングは、領域中に位置する遺伝子によってコードされるタンパク質のレベル及び／または活性を減少させる。場合により、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のレベル及び／もしくは活性が減少し、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のレベル及び／もしくは活性が排除され、Ｓｒｙ及びＺｆｙ２のうち１つ以上のレベル及び／もしくは活性が減少し、またはＳｒｙ及びＺｆｙ２のうち１つ以上のレベル及び／もしくは活性が排除される。いくつかの方法では、サイレンシングは永久的である。
【００９４】
いくつかの方法では、サイレンシングは、以下のうち１つ以上によって達成される：（１）標的遺伝子改変、（２）領域の欠失または破壊、（３）領域内の１つ以上の遺伝子から転写されるｍＲＮＡのＲＮＡ干渉またはアンチセンス阻害、（４）領域内の１つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質の指向性分解、（５）ヘテロクロマチン媒介性サイレンシング、（６）Ｙ染色体上におけるヒストンバリアントγＨ２ＡＸのリン酸化型のレベル増加、及び（７）領域内における１つ以上の遺伝子の転写減少。場合により、領域は、標的ヌクレアーゼで欠失または破壊される。場合により、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはクラスター化して規則的な配置の短い回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。
【００９５】
いくつかの方法では、サイレンシングは、以下のタイミングのうち少なくとも１つの間に生じる：（１）ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞が宿主胚に導入された後、（２）ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を含む宿主胚が、レシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入された後、（３）雄の性決定プログラムが実行される場合の胚発生中、（４）少なくともマウスのＥ１１〜Ｅ１２に対応する発達段階までの胚発生中、（５）少なくともマウスのＥ１７〜Ｅ１９に対応する発達段階までの胚発生中、（６）胚発生の全体を通して、（７）卵形成期の全体を通して、（８）卵母細胞発生における減数分裂前期中、（９）卵母細胞が受精した後の最初の２細胞分裂中、及び（１０）受精後の最初の２細胞分裂を経た排卵後の卵母細胞において。いくつかの方法では、性転換は、Ｆ１子孫に伝達されることができる。
【００９６】
いくつかの方法では、低オスモル濃度培地は、以下のうち１つ以上を含む基本培地を含む：（１）約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２２ｍＯｓｍ／Ｋｇのオスモル濃度、（２）２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度、（３）約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの伝導度、（４）約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、（５）約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの塩化ナトリウム濃度、（６）約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの炭酸塩濃度、（７）約１３ｍＭ〜約２５ｍＭの重炭酸ナトリウム濃度、（８）約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総濃度、（９）８７±５ｍＭの塩化ナトリウム濃度及び２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度、（１０）約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度の炭酸塩、ならびに約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度、ならびに（１１）２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度、５０ｍＭ〜１１０ｍＭの塩化ナトリウム濃度、及び１３ｍＭ〜２５ｍＭの重炭酸ナトリウム濃度。場合により、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、宿主胚への導入前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、低オスモル濃度培地中で維持される。
【００９７】
いくつかの方法では、非ヒト哺乳動物は、げっ歯類、ラット、またはマウスである。場合により、マウスはＣ５７ＢＬ／６系統を含み、マウスは１２９系統を含み、マウスは１２９系統を含まず、マウスはＣ５７ＢＬ／６系統及び１２９系統を含み、非ヒト哺乳動物はマウスであって、Ｙ染色体はＣ５７ＢＬ／６系統からのものであり、非ヒト哺乳動物はマウスであって、Ｙ染色体は１２９系統からのものであり、非ヒト哺乳動物はマウスであって、Ｙ染色体は１２９系統からのものではなく、または非ヒト哺乳動物はマウスであって、多能性細胞はＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である。
【００９８】
いくつかの方法では、多能性細胞は、標的ゲノム遺伝子座に標的遺伝子改変を含む。場合により、標的遺伝子改変は、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点変異、またはこれらの組合せを含む。
【００９９】
いくつかの方法では、領域はＺｆｙ２を含み、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させる改変をさらに含む。
【０１００】
いくつかの方法では、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のＦ０  ＸＹ子孫が、性成熟に達すると繁殖可能になる表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物である。場合により、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物であるＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、Ｙ染色体の領域をサイレンシングすることを含まない非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物のパーセンテージよりも高い。
【０１０１】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０雌の全てが、ＸＹ遺伝子型を有する。
【０１０２】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のＦ０  ＸＹ雌が、繁殖可能である。場合により、繁殖可能なドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージは、Ｙ染色体の領域をサイレンシングすることを含まない非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージよりも高い。
【０１０３】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ雌が、少なくとも２匹、３匹、４匹、５匹、６匹、７匹、８匹、９匹、または１０匹の仔を有する同腹仔を産生することができる。場合により、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌により産生される平均産子数は、Ｙ染色体の領域をサイレンシングすることを含まない非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌により産生される平均産子数よりも多い。
【０１０４】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ雌が、それらの生涯において少なくとも２匹、３匹、４匹、５匹、６匹、７匹、８匹、９匹、または１０匹の同腹仔を産生することができる。場合により、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌により産生される同腹仔の平均数は、Ｙ染色体の領域をサイレンシングすることを含まない非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌により産生される同腹仔の平均数よりも多い。場合により、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌により産生される一生涯における子孫の平均数は、Ｙ染色体の領域をサイレンシングすることを含まない非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌により産生される一生涯における子孫の平均数よりも多い。
【０１０５】
本発明は、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞においてＹ染色体の領域をサイレンシングする方法もまた提供し、本方法は以下を含む：（ａ）多能性を維持しながら培養下の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を成長させるのに好適な基本培地及び添加物を含む培地中で非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を維持し、基本培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を含むこと、ならびに（ｂ）Ｙ染色体の領域におけるサイレンシングを同定するために非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞をアッセイすること。場合により、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。
【０１０６】
いくつかの方法では、低オスモル濃度培地は、以下のうち１つ以上を含む基本培地を含む：（１）約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２２ｍＯｓｍ／Ｋｇのオスモル濃度、（２）２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度、（３）約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの伝導度、（４）約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、（５）約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの塩化ナトリウム濃度、（６）約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの炭酸塩濃度、（７）約１３ｍＭ〜約２５ｍＭの重炭酸ナトリウム濃度、（８）約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総濃度、（９）８７±５ｍＭの塩化ナトリウム濃度及び２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度、（１０）約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度の炭酸塩、ならびに約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度、ならびに（１１）２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度、５０ｍＭ〜１１０ｍＭの塩化ナトリウム濃度、及び１３ｍＭ〜２５ｍＭの重炭酸ナトリウム濃度。場合により、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、アッセイする前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、低オスモル濃度培地中で維持される。
【０１０７】
いくつかの方法では、領域は、Ｙ染色体の短腕の全てもしくは一部を含み、Ｒｂｍｙクラスター、Ｚｆｙ２、及びＳｒｙのうち１つ以上を除外し、マウスＹ染色体のＳｘｒａ領域及び／もしくはＳｘｒｂ領域に対応するＹ染色体の区画の全てもしくは一部を含み、マウスＹ染色体上の欠失区間１、欠失区間２、及び欠失区間３のうち１つ以上に対応するＹ染色体の区画の全てもしくは一部を含み、Ｋｄｍ５ｄのテロメア側もしくはＵｓｐ９ｙのセントロメア側におけるＹ染色体の一部を含み、またはＺｆｙ２、Ｓｒｙ、もしくはＲｂｍｙクラスターのテロメア側である。
【０１０８】
いくつかの方法では、サイレンシングは、領域中に位置する遺伝子によってコードされるタンパク質のレベル及び／または活性を減少させる。場合により、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のレベル及び／もしくは活性が減少し、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のレベル及び／もしくは活性が排除され、Ｓｒｙ及びＺｆｙ２のうち１つ以上のレベル及び／もしくは活性が減少し、またはＳｒｙ及びＺｆｙ２のうち１つ以上のレベル及び／もしくは活性が排除される。
【０１０９】
いくつかのこのような方法は、さらに以下を含む：（ｂ）非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を宿主胚に導入すること、及び（ｃ）ステップ（ｂ）の宿主胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して、宿主胚を懐胎させること。場合により、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、宿主胚への導入前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、培地中で維持される。
【０１１０】
本発明は、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を作製する方法もまた提供し、本方法は以下を含む：（ａ）培養下の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む低オスモル濃度培地中で１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞の集団を維持し、基本培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を含むこと、（ｂ）Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性について、１種以上の非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞をアッセイすること、ならびに（ｃ）Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を選択し、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を生成することができること。場合により、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、アッセイステップ（ｂ）の前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、低オスモル濃度培地中で維持される。場合により、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。
【０１１１】
いくつかの方法では、低オスモル濃度培地は、以下のうち１つ以上を含む基本培地を含む：（１）約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２２ｍＯｓｍ／Ｋｇのオスモル濃度、（２）２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度、（３）約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの伝導度、（４）約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、（５）約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの塩化ナトリウム濃度、（６）約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの炭酸塩濃度、（７）約１３ｍＭ〜約２５ｍＭの重炭酸ナトリウム濃度、（８）約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総濃度、（９）８７±５ｍＭの塩化ナトリウム濃度及び２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度、（１０）約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度の炭酸塩、ならびに約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度、ならびに（１１）２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度、５０ｍＭ〜１１０ｍＭの塩化ナトリウム濃度、及び１３ｍＭ〜２５ｍＭの重炭酸ナトリウム濃度。場合により、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、アッセイする前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、低オスモル濃度培地中で維持される。
【０１１２】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの減少した発現及び／または活性を有する。いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性を欠いている。いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの発現及び／または活性を欠いている。
【０１１３】
いくつかの方法では、非ヒト哺乳動物は、げっ歯類である。場合により、げっ歯類はラットまたはマウスである。いくつかの方法では、げっ歯類はＣ５７ＢＬ／６系統を含むマウスである。場合により、Ｙ染色体はＣ５７ＢＬ／６系統からのものである。いくつかの方法では、げっ歯類は１２９系統を含むマウスである。場合により、Ｙ染色体は１２９系統からのものである。いくつかの方法では、マウスは１２９系統を含まない。いくつかの方法では、Ｙ染色体は１２９系統からのものではない。いくつかの方法では、げっ歯類はＣ５７ＢＬ／６系統及び１２９系統を含むマウスである。場合により、多能性細胞は、ＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である。
【０１１４】
いくつかの方法では、多能性細胞は、標的ゲノム遺伝子座に標的遺伝子改変を含む。場合により、標的遺伝子改変は、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点変異、またはこれらの組合せを含む。
【０１１５】
本発明は、胚を生成する方法もまた提供し、本方法は宿主胚に、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を作製する上記方法によって生成される、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を導入することを含み、宿主胚は、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を生成することができる。
【０１１６】
本発明は、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を作製する方法もまた提供し、本方法は以下を含む：（ａ）宿主胚に、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を作製する上記方法によって生成される、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞を導入すること、（ｂ）ステップ（ａ）の宿主胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して、宿主胚を懐胎させること、ならびに（ｃ）表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を含むＦ０  ＸＹ非ヒト哺乳動物子孫を得て、性成熟に達すると、Ｆ０の表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物が繁殖可能になること。あるいは、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を作製するための方法が提供され、本方法は以下を含む：（ａ）胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して胚を懐胎させ、胚は上記方法によって生成され、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する細胞を含むこと、ならびに（ｂ）表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を含むＦ０  ＸＹ非ヒト哺乳動物子孫を得て、性成熟に達すると、Ｆ０の表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物が繁殖可能になること。場合により、宿主胚は前桑実期胚である。場合により、方法は、宿主胚を胚盤胞期まで培養することをさらに含む。
【０１１７】
いくつかの方法では、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞は、宿主胚への導入前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、低オスモル濃度培地中で維持される。
【０１１８】
いくつかの方法では、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ子孫が、性成熟に達すると繁殖可能になる表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物である。いくつかの方法では、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。
【０１１９】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０雌の全てが、ＸＹ遺伝子型を有する。
【０１２０】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ雌が、繁殖可能である。いくつかの方法では、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。
【０１２１】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ雌が、少なくとも２匹、３匹、４匹、５匹、６匹、７匹、８匹、９匹、または１０匹の仔を有する同腹仔を産生することができる。いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌により産生される平均産子数は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【０１２２】
いくつかの方法では、ドナー非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来する少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＦ０  ＸＹ雌が、それらの生涯において少なくとも２匹、３匹、４匹、５匹、６匹、７匹、８匹、９匹、または１０匹の同腹仔を産生することができる。いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌により産生される一生涯における同腹仔の平均数は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌により産生される一生涯における子孫の平均数は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有する非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【０１２３】
本発明は、以下を含むキットもまた提供する：（ａ）非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞においてＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性レベルを検出するための検出試薬、ならびに（ｂ）検出試薬を使用して、非ヒト哺乳動物ＸＹ多能性細胞がＦ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト哺乳動物を生成する予測傾向と検出を相互に関連付けるための説明書。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１Ａは欠失区間１〜７、Ｓｘｒａ及びＳｘｒｂ領域、ならびにＳｘｒｂ欠失にマッピングされた遺伝子を含む、マウスＹ染色体の概略図を提供する。図１ＢはマウスＹ染色体の短腕（Ｙｐ）の概略図を提供する。
【図２】１８２３ＣＥ６及び１８２３ＣＦ１１クローンに由来する胚から切離した生殖隆起のＳｒｙレベルを示す。分析した胚の発達段階は、１３〜２５尾体節（ｔｓ）の範囲であった。２０ｔｓでのＣＤ１  ＸＹ胚を陽性対照として使用し、２０ｔｓでのＣＤ１  ＸＸを陰性対照として使用した。ｘ軸はｔｓ期を示し、ｙ軸は、ｍＲＮＡのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）逆転写結合定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって測定し、Ｓｆ１参照遺伝子の発現を基準として正規化したＳｒｙ発現を示す。Ｈｐｒｔを正規化参照遺伝子として使用した場合も、同じ結果が得られた。正規化発現値を、１８２３ＣＦ１１  ｔｓ１４試料のうち１つと比較してプロットし、その値を１として適宜設定した。
【図３】同様に正規化してプロットした、図２のＳｒｙ発現について示したのと同じ生殖隆起試料における相対的Ｄｄｘ３ｙ発現レベルを示す。
【図４】同様に正規化してプロットした、図２のＳｒｙ発現について示したのと同じ生殖隆起試料における相対的Ｅｉｆ２ｓ３ｙ発現レベルを示す。
【図５−１】図５Ａ〜図５Ｄは、同様に正規化してプロットした、図２のＳｒｙ発現について示したのと同じ生殖隆起試料における雄の性決定遺伝子Ｓｏｘ９（図５Ａ）、Ｆｇｆ９（図５Ｂ）、ｍＤｈｈ（図５Ｃ）、及びＡｍｈ（図５Ｄ）の相対的発現レベルを示す。
【図５−２】図５Ａ〜図５Ｄは、同様に正規化してプロットした、図２のＳｒｙ発現について示したのと同じ生殖隆起試料における雄の性決定遺伝子Ｓｏｘ９（図５Ａ）、Ｆｇｆ９（図５Ｂ）、ｍＤｈｈ（図５Ｃ）、及びＡｍｈ（図５Ｄ）の相対的発現レベルを示す。
【図６】図６Ａ及び図６Ｂは、同様に正規化してプロットした、図２のＳｒｙ発現について示したのと同じ生殖隆起試料における雌の性決定遺伝子Ｆｏｘｌ２（図６Ａ）及びＲｓｐｏ１（図６Ｂ）の相対的発現レベルを示す。
【図７】ＫＯ−ＤＭＥＭ中で培養した２種の性転換ＸＹ  ＥＳ細胞クローンに由来する胚から切離した生殖隆起におけるＳｒｙの相対的発現レベルを示す。分析した胚の発達段階は、１１〜３４尾体節（ｔｓ）の範囲であった。３つの対照物を使用した：交配によって生成したＸＹマウス胚、非標的ＥＳ細胞からのＸＹマウス胚、及びＫＯ−ＤＭＥＭ中で性転換しない株からのＸＹマウス胚。ｘ軸はｔｓ期を示し、ｙ軸は、ｍＲＮＡのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）逆転写結合定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって測定し、Ｓｆ１参照遺伝子の発現を基準として正規化したＳｒｙ発現を示す。
【図８Ａ】ＫＯ−ＤＭＥＭ中で培養した２種の性転換ＸＹ  ＥＳ細胞クローンに由来する胚から切離した生殖隆起におけるＥｉｆ２ｓ３７（図８Ａ）の相対的発現レベルを示す。分析した胚の発達段階は、１６〜２２尾体節（ｔｓ）の範囲であった。３つの対照物を使用した：交配によって生成したＸＹマウス胚、非標的ＥＳ細胞からのＸＹマウス胚、及びＫＯ−ＤＭＥＭ中で性転換しない株からのＸＹマウス胚。ｘ軸はｔｓ期を示し、ｙ軸は、ｍＲＮＡのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）逆転写結合定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって測定し、Ｓｆ１参照遺伝子の発現を基準として正規化した発現を示す。
【図８Ｂ】ＫＯ−ＤＭＥＭ中で培養した２種の性転換ＸＹ  ＥＳ細胞クローンに由来する胚から切離した生殖隆起におけるＵｔｙ（図８Ｂ）の相対的発現レベルを示す。分析した胚の発達段階は、１６〜２２尾体節（ｔｓ）の範囲であった。３つの対照物を使用した：交配によって生成したＸＹマウス胚、非標的ＥＳ細胞からのＸＹマウス胚、及びＫＯ−ＤＭＥＭ中で性転換しない株からのＸＹマウス胚。ｘ軸はｔｓ期を示し、ｙ軸は、ｍＲＮＡのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）逆転写結合定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって測定し、Ｓｆ１参照遺伝子の発現を基準として正規化した発現を示す。
【図８Ｃ】ＫＯ−ＤＭＥＭ中で培養した２種の性転換ＸＹ  ＥＳ細胞クローンに由来する胚から切離した生殖隆起におけるＤｄｘ３ｙ（図８Ｃ）の相対的発現レベルを示す。分析した胚の発達段階は、１６〜２２尾体節（ｔｓ）の範囲であった。３つの対照物を使用した：交配によって生成したＸＹマウス胚、非標的ＥＳ細胞からのＸＹマウス胚、及びＫＯ−ＤＭＥＭ中で性転換しない株からのＸＹマウス胚。ｘ軸はｔｓ期を示し、ｙ軸は、ｍＲＮＡのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）逆転写結合定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって測定し、Ｓｆ１参照遺伝子の発現を基準として正規化した発現を示す。
【図９】ＫＯ−ＤＭＥＭ中で培養した２種の性転換ＸＹ  ＥＳ細胞クローンに由来する胚から切離した生殖隆起におけるＳｒｙ、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＤｄｘ３ｙの相対的発現を示す。正規化発現レベルを、１７〜２０尾体節（ｔｓ）の範囲の胚発生期にわたって平均化している。３つの対照物を使用した：交配によって生成したＸＹマウス胚、非標的ＥＳ細胞からのＸＹマウス胚、及び性転換しない株からのＸＹマウス胚。ｘ軸はｔｓ期を示し、ｙ軸は、ｍＲＮＡのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）逆転写結合定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって測定し、Ｓｆ１参照遺伝子の発現を基準として正規化した発現を示す。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｄは、ＫＯ−ＤＭＥＭ中で培養した性転換ＸＹ  ＥＳ細胞クローンに由来する、マウスの出産から１週間後の様々な組織におけるＤｄｘ３ｙ（図１０Ａ）、Ｕｔｙ（図１０Ｂ）、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ（図１０Ｃ）、及びＫｄｍ５ｄ（図１０Ｄ）の相対的発現レベルを示す。２つの対照物を使用した：非標的ＥＳ細胞からのＸＹマウス胚、及びＫＯ−ＤＭＥＭ中で性転換しない株からのＸＹマウス胚。ｘ軸は組織の種類を示し、ｙ軸は、ｍＲＮＡのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）逆転写結合定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって測定し、Ｇａｐｄｈ参照遺伝子の発現を基準として正規化した発現を示す。
【図１１】図１１Ａから図１１Ｂは雄の生殖腺発達の最初期中に活性化した遺伝子の性決定期中における相対的発現レベルを示す。図１１Ａは、ＫＯ−ＤＭＥＭ中で培養した２種の性転換ＸＹ  ＥＳ細胞クローンに由来する胚から切離した生殖隆起におけるＳｏｘ９の相対的発現レベルを示し、図１１ＢはＦｇｆ９の相対的発現レベルを示す。分析した胚の発達段階は、１２〜２５尾体節（ｔｓ）の範囲であった。４つの対照物を使用した：交配によって生成したＸＹマウス胚、交配によって生成したＸＸマウス胚、非標的ＥＳ細胞からのＸＹマウス胚、及びＫＯ−ＤＭＥＭ中で性転換しない株からのＸＹマウス胚。ｘ軸はｔｓ期を示し、ｙ軸は、ｍＲＮＡのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）逆転写結合定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって測定し、Ｓｆ１参照遺伝子の発現を基準として正規化したＳｏｘ９発現を示す。
【図１２】図１２Ａから図１２Ｂは雄の生殖腺発達マーカーに関する性決定期中の相対的発現レベルを示す。図１２Ａは、ＫＯ−ＤＭＥＭ中で培養した２種の性転換ＸＹ  ＥＳ細胞クローンに由来する胚から切離した生殖隆起におけるＤｈｈの相対的発現レベルを示し、図１２ＢはＡｍｈの相対的発現レベルを示す。分析した胚の発達段階は、１２〜２５尾体節（ｔｓ）の範囲であった。４つの対照物を使用した：交配によって生成したＸＹマウス胚、交配によって生成したＸＸマウス胚、非標的ＥＳ細胞からのＸＹマウス胚、及びＫＯ−ＤＭＥＭ中で性転換しない株からのＸＹマウス胚。ｘ軸はｔｓ期を示し、ｙ軸は、ｍＲＮＡのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）逆転写結合定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって測定し、Ｓｆ１参照遺伝子の発現を基準として正規化したＳｏｘ９発現を示す。
【図１３】雌の生殖腺発達マーカーに関する性決定期中の相対的発現レベルを示す。図１３は、ＫＯ−ＤＭＥＭ中で培養した２種の性転換ＸＹ  ＥＳ細胞クローンに由来する胚から切離した生殖隆起におけるＦｏｘｌ２の相対的発現レベルを示す。分析した胚の発達段階は、１２〜２５尾体節（ｔｓ）の範囲であった。２つの対照物を使用した：交配によって生成したＸＹマウス胚、及び交配によって生成したＸＸマウス胚。ｘ軸はｔｓ期を示し、ｙ軸は、ｍＲＮＡのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）逆転写結合定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって測定し、Ｓｆ１参照遺伝子の発現を基準として正規化したＳｏｘ９発現を示す。
【図１４Ａ】ＸＹ雄及びＸＹ雌マウスの両方を生成する３種のうちの親Ｆ１Ｈ４  ＸＹ胚性幹細胞クローン（親クローン９７９  ＡＣ７（図１４Ａ））からの胚性幹細胞サブクローンにおけるＲＴ−ＰＣＲによるＥｉｆ２ｓ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＤｄｘ３ｙの相対的発現レベルを示す。発現をＢ２ｍと比較する。Ｄｒｏｓｈａを対照として使用した。
【図１４Ｂ】ＸＹ雄及びＸＹ雌マウスの両方を生成する３種のうちの親Ｆ１Ｈ４  ＸＹ胚性幹細胞クローン（親クローン４０４８  ＢＣ４（図１４Ｂ））からのの胚性幹細胞サブクローンにおけるＲＴ−ＰＣＲによるＥｉｆ２ｓ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＤｄｘ３ｙの相対的発現レベルを示す。発現をＢ２ｍと比較する。Ｄｒｏｓｈａを対照として使用した。
【図１４Ｃ】ＸＹ雄及びＸＹ雌マウスの両方を生成する３種のうちの親Ｆ１Ｈ４  ＸＹ胚性幹細胞クローン（親クローン１５０６９  ＣＤ１（図１４Ｃ））からの胚性幹細胞サブクローンにおけるＲＴ−ＰＣＲによるＥｉｆ２ｓ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＤｄｘ３ｙの相対的発現レベルを示す。発現をＢ２ｍと比較する。Ｄｒｏｓｈａを対照として使用した。
【図１４Ｄ】雄マウスのみを生成する２種のうちの親Ｆ１Ｈ４  ＸＹ胚性幹細胞クローン（９８５  ＡＡ８（図１４Ｄ））からの胚性幹細胞サブクローンにおけるＲＴ−ＰＣＲによるＥｉｆ２ｓ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＤｄｘ３ｙの相対的発現レベルを示す。発現をＢ２ｍと比較する。Ｄｒｏｓｈａを対照として使用した。
【図１４Ｅ】雄マウスのみを生成する２種のうちの親Ｆ１Ｈ４  ＸＹ胚性幹細胞クローン（１８２３  Ｃ１１（図１４Ｅ））からの胚性幹細胞サブクローンにおけるＲＴ−ＰＣＲによるＥｉｆ２ｓ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＤｄｘ３ｙの相対的発現レベルを示す。発現をＢ２ｍと比較する。Ｄｒｏｓｈａを対照として使用した。
【図１５】マウスにおける性決定シグナル伝達経路の概要を示す。マウス胚形成中、両能性生殖腺は、性交後日数（ｄｐｃ）１０．５日で生殖隆起から生じる。ＸＹ生殖隆起の体細胞では、Ｓｒｙ（染色体Ｙ上の性決定領域）発現は１０．５ｄｐｃで開始し、１１．５ｄｐｃでピークに到達して１２．５ｄｐｃには弱くなる。Ｓｏｘ９（ＳＲＹボックス含有遺伝子９）発現は、数時間後に上方制御されて、セルトリ細胞の分化を誘導する。Ｓｏｘ９発現は１１．５〜１２．５ｄｐｃでピークに達し、出生後も発現し続けて、いくつかの正のフィードバックループ（ＦＧＦ９（線維芽細胞増殖因子９）を含む）によって支持され、ＳＯＸ９はその後、Ａｍｈ（抗ミュラー管ホルモン）を含む、多くの雄特異的遺伝子を活性化させる。１２．５ｄｐｃで精巣索が形成されて、精巣と卵巣との間の形態学的差異が明らかとなる。ＳＲＹがない場合では、遺伝子、例えば、Ｗｎｔ４（無翅型ＭＭＴＶ組込み部位ファミリー、メンバー４）、Ｒｓｐｏ１（Ｒ−スポンジン１）、及びＦｏｘｌ２（フォークヘッドボックスＬ２）などが、雌特異的手法で発現され、フォリスタチン及び多くのその他の卵巣特異的遺伝子の発現を特徴とするように、卵巣発達を誘導する。
【発明を実施するための形態】
【０１２５】
定義
「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、本明細書では同じ意味として使用され、コード及び非コードアミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸ポリマー形態を含む。本用語は、修飾されているポリマー、例えば、修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドなども含む。
【０１２６】
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では同じ意味として使用され、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはこれらの類似体もしくは修飾型を含む、任意の長さのヌクレオチドポリマー形態を含む。それらは、プリン塩基、ピリミジン塩基、またはその他の天然の、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、一本鎖、二本鎖、及び多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびにポリマーを含む。
【０１２７】
「遺伝子」という用語は、産物（例えば、ＲＮＡ産物及び／またはポリペプチド産物）をコードし、非コードイントロンが割り込むコード領域、ならびに遺伝子が全長ｍＲＮＡに対応するように５’末端及び３’末端上の両方のコード領域に隣接して位置する配列（５’及び３’非翻訳配列を含む）を含む染色体中のＤＮＡ配列を指す。「遺伝子」という用語はまた、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、及び転写因子結合部位）、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位、サイレンサー、遮断配列、ならびにマトリックス結合領域を含むその他の非コード配列も含む。これらの配列は、遺伝子のコード領域に近接している（例えば、１０ｋｂ以内）、または遠隔部位に存在する場合もあり、それらは遺伝子の転写及び翻訳のレベルまたは率に影響を与える。
【０１２８】
「野生型」という用語は、正常な（変異体、罹患したもの、変化したものなどと対比した場合の）状態または文脈に見られるような構造及び／または活性を有する実体を含む。野生型遺伝子及びポリペプチドは、多くの場合に複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）中に存在する。
【０１２９】
「繁殖力」及び「繁殖可能な」は、交配する、妊娠する、かつ生産子孫を産む雌動物の能力を指す。動物が繁殖可能であると見なされるには、生産子孫を１匹産生することが唯一必要である。
【０１３０】
「妊孕力」及び「妊孕可能な」は、繁殖力の質を指す。妊孕力は定量的尺度であり得て、例えば、動物の一生涯における、または規定の実験時間枠内で産まれる生存子孫の総数などである。同腹仔の数及び頻度ならびに一腹当たりの子孫の数も、妊孕力の尺度である。動物は繁殖可能であり得るが、大いに妊孕可能であるというわけではない（例えば、１匹のみ、またはわずか数匹の同腹仔）。
【０１３１】
１つ以上の列挙された要素を「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」または「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」組成物または方法は、具体的に列挙されていないその他の要素を含んでよい。例えば、タンパク質を「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」または「ｉｎｃｌｕｄｅ（含む）」組成物は、そのタンパク質を単独でまたはその他の構成成分と組み合わせて含有してよい。
【０１３２】
値の範囲の指定は、その範囲内の、またはその範囲を規定する全ての整数、及びその範囲内の整数によって規定される全ての部分範囲を含む。
【０１３３】
文脈から別の意味が明らかでない限り、「約」という用語は、記載値の測定の標準誤差（例えば、ＳＥＭ）内の値を包含する。
【０１３４】
冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の単数形は、その内容に別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「ａ  Ｃａｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｓタンパク質）」または「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  Ｃａｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ（少なくとも１種のＣａｓタンパク質）」という用語は、それらの混合物を含む、複数のＣａｓタンパク質を含み得る。
【０１３５】
統計的に有意とは、ｐ≦０．０５を意味する。
【０１３６】
Ｉ．概要
繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌動物を生成するための方法及び組成物が提供される。方法及び組成物は、Ｆ０世代において繁殖可能な雌ＸＹ動物を生成することができるＸＹ多能性もしくは全能性動物細胞、インビトロ細胞培養物、または胚を作製することを伴う。このような細胞（ならびに胚及びそれらに由来する動物）は、雌化培地中でＸＹ多能性または全能性細胞を培養すること、ならびにＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性を評価することによって作製され得る。動物ＸＹ多能性または全能性細胞クローンがＦ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成する傾向は、これらのクローンにおけるＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの発現または活性と逆相関する。あるいは、このような細胞（ならびに胚及びそれらに由来する動物）は、Ｙ染色体の領域をサイレンシングすることによって作製され得る。場合により、細胞はまた、雌化培地中で培養され得る、ならびに／またはＳｒｙタンパク質のレベル及び／もしくは活性を減少させるように改変され得る。低オスモル濃度培地などの雌化培地中でＸＹ多能性または全能性動物細胞を維持することによって、ＸＹ多能性もしくは全能性動物細胞（またはインビトロ細胞培養物、胚、もしくはそれらに由来する動物）におけるＹ染色体の領域をサイレンシングするための方法及び組成物もまた提供される。雌化培地中でＸＹ多能性または全能性動物細胞の集団を維持するため、及びＦ０世代において繁殖可能な雌ＸＹ動物を生成する高い能力を有する細胞またはクローンを選択するための方法及び組成物もまた提供される。雌化活性を有する化合物についてスクリーニングするため、またはＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／もしくは活性の評価によって雌化培地中で成分の濃度を最適化するための方法及び組成物もまた提供され、ＸＹ多能性または全能性細胞におけるその発現及び／または活性は、動物ＸＹ多能性または全能性細胞クローンがＦ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成する傾向と逆相関する。
【０１３７】
非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）を作製するための大多数のＥＳ細胞株は、雄のＸＹ遺伝子型を有する。哺乳動物の性決定におけるＹ染色体の優性のため、ＸＹ  ＥＳ細胞を宿主胚に導入して懐胎させる場合、ほぼ常に、第１世代（Ｆ０）は、雄ドナーＥＳ細胞（ＸＹ）に由来する細胞及び雄（ＸＹ）または雌（ＸＸ）のいずれかであり得る、宿主胚に由来する細胞を含有するキメラである表現型的に雄の動物であるということになる。表現型的に雌がＦ０世代で観察される場合には、これらは、キメラをもたらす雌ＸＸ胚へのＸＹ  ＥＳ細胞の導入から典型的には生じるが、そのＥＳ細胞寄与は、胚の生殖隆起を雄化するには不十分である。ほとんどの場合、このような雌キメラは、ＸＹ  ＥＳ細胞に由来する卵母細胞を生成せず、それゆえ、ＥＳ細胞ゲノムを次世代に伝達することができない。
【０１３８】
ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（例えば、米国特許第７，６５９，４４２号明細書、同第７，５７６，２５９号明細書、及び同第７，２９４，７５４号明細書、ならびにＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１−９９を参照し、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる）を使用すると、ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０世代マウスを得ることができる。通常の状況及び標準的な実験条件下では、ＸＹドナーＥＳ細胞が、表現型的に雄の完全にＥＳ細胞由来のマウスのみを生成する一方で、ＸＸまたはＸＯであるＥＳ細胞（Ｙ染色体を消失したＸＹ  ＥＳ細胞）は、表現型的に雌の完全にＥＳ細胞由来のマウスのみを生成する。ホモ接合標的変異を有するマウスを、雄及び雌の完全にＥＳ細胞由来のマウスから産生させるには、交配させて最初にＦ１世代ヘテロ接合体の雄及び雌を産生させて、互いに交雑させた場合に、それらがＦ２世代でホモ接合体子孫を産生する能力を有する２つの後続世代を必要とする。
【０１３９】
ＸＹ遺伝子型を有する表現型的に雌のマウスは、特異的変異の結果として生じ得る。例えば、Ｌｏｖｅｌｌ−Ｂａｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０９：６３５−６４６を参照し、Ｃｏｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｅｌｌ  １０４（６）：８７５−８８９も参照のこと。しかしながら、このようなＸＹ雌マウスは、多くの場合に生殖不能である、または非常に限られた繁殖力を有する。
【０１４０】
ＷＯ２０１１／１５６７２３（その全体があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる）は、宿主胚へのＸＹドナー細胞の導入及び好適な宿主での懐胎後、繁殖可能なＸＹ雌動物がＦ０集団において産生され得るように培養下でＸＹドナー細胞を維持するために、雌化培養培地（例えば、本明細書内の他の箇所に開示されるような低オスモル濃度培地または低塩培地）を用いる方法及び組成物を提供する。このような組成物は、標的ゲノム遺伝子座における所与の標的遺伝子改変についてホモ接合体であるＦ１子孫の作製に用途を見出す。
【０１４１】
本出願は、ＸＹドナー細胞（例えば、表現型的に雄のマウスに由来するＸＹドナー細胞）及び好適な宿主胚から表現型的に雌の繁殖可能なＸＹ非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）を作製する方法を提供する。本方法は、Ｆ０世代においてこのような非ヒト哺乳動物を作製することを含み、これにより、Ｆ０世代において交配対（雄Ｆ０及び雌Ｆ０）の形成が可能になる。このことは、ドナー細胞がヘテロ接合遺伝子改変を含む場合、及び遺伝子改変についてホモ接合体の非ヒト哺乳動物が望ましい場合に特に有用である。本開示は、ドナーマウスＸＹ  ＥＳ細胞から表現型的に雌の繁殖可能なＸＹマウスを作製することと関連して本発明を例証するが、本明細書に記載される方法及び組成物は、任意の好適な非ヒト哺乳動物細胞（例えば、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、ＥＳ細胞、または多能性細胞）及び任意の好適な非ヒト哺乳動物胚から表現型的に雌の繁殖可能なＸＹ非ヒト哺乳動物を作製することに適用されてよい。
【０１４２】
本出願は、Ｙ染色体の領域をサイレンシングし、解剖学的に正常で繁殖可能、かつ妊孕可能なＸＹ  Ｆ０雌の生成を促進する改変を有するＸＹドナー細胞を用いる方法及び組成物を提供する。このような方法及び組成物は、Ｆ０世代において繁殖可能な雌のＸＹ非ヒト動物の作製を可能にする。方法及び組成物は、Ｆ０世代において繁殖可能な雌ＸＹ子孫のパーセンテージを著しく増加させるために、組み合わせてＳｒｙタンパク質のレベル及び／もしくは活性を減少させる改変ならびに／または本明細書内の他の箇所に開示される雌化培養培地（例えば、低オスモル濃度培地）中で培養することと組み合わせてさらに用いられ得る。これらの表現型的に雌の繁殖可能なＸＹ非ヒト哺乳動物は、排卵して、動物の排卵によって生成された卵子の受精時に胚を懐胎し、予定日まで胚を懐胎して生産動物を出産するのに十分な表現型的に雌の特性を示す非ヒト哺乳動物を含む。
【０１４３】
効率的な雄から雌への性転換方法は、家畜産業にとって有益である。例えば、雌の仔牛は、雄よりも乳牛産業にとってはるかに有益である。同じことが家禽にも当てはまる。交配目的で、それがウシまたはブタまたはヒツジであろうと、多くの雌をほんのわずかな雄ウシ、雄ブタ、または雄ヒツジと交配させることが好ましい。したがって、本明細書で提供される様々な方法は、様々な商業的に重要な交配産業において用途を見出す。
【０１４４】
ＩＩ．Ｆ０世代において繁殖可能なＸＹ動物を作製するための方法及び組成物
Ａ．Ｆ０世代において繁殖可能なＸＹ雌を生成することができるＸＹ多能性または全能性細胞を作製する方法
ＸＹ遺伝子型を有する表現型的に雌の動物（例えば、マウス）は、特異的変異の結果として生成され得る。例えば、Ｌｏｖｅｌｌ−Ｂａｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０９：６３５−６４６を参照し、Ｃｏｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｅｌｌ  １０４（６）：８７５−８８９も参照のこと。しかしながら、このようなＸＹ雌動物は、多くの場合に生殖不能である、または繁殖可能である場合、非常に不十分な妊孕力を有する。標的ゲノム遺伝子座の標的遺伝子改変についてホモ接合体の動物を生成することと関連して最も有用であるには、性転換及び繁殖力の両方が、ＸＹ雌で達成される必要がある。本明細書で提供される方法及び組成物によって、Ｆ０世代において繁殖可能な雌ＸＹを生成することができるＸＹ多能性もしくは全能性動物細胞または胚が作製され得る。このような細胞（ならびにインビトロ細胞培養物、胚、及びそれらに由来する動物）は、Ｙ染色体の領域をサイレンシングすることによって作製され得る。場合により、細胞はまた、雌化培地中で培養され得る、ならびに／またはＳｒｙタンパク質のレベル及び／もしくは活性を減少させるように改変され得る。
【０１４５】
ｉ．Ｙ染色体の領域のサイレンシング
Ｙ染色体の領域をサイレンシングするためにＸＹ動物細胞（例えば、ＸＹ多能性または全能性細胞、例えば、ＸＹ  ＥＳ細胞など）を改変し、それによって一部の細胞を、繁殖可能な雌動物に発達する可能性のあるドナーＸＹ多能性または全能性細胞に変換し、その結果、細胞をレシピエント胚に移植して繁殖可能な雌子孫を生じ得るための方法及び組成物が提供される。したがって、ドナーＸＹ多能性または全能性細胞は、繁殖可能な表現型的に雌の動物を含むＦ０  ＸＹ子孫を生成することができる。
【０１４６】
サイレンシングされる領域は、Ｙ染色体の任意の一部、例えば、Ｙ染色体の短腕の全てもしくは一部を含む領域または本明細書内の他の箇所に開示されるような雌化培地で処理することによってサイレンシングされる領域などであり得る。サイレンシングは、Ｙ染色体のその他の部分（例えば、長腕（Ｙｑ））、特に雄の繁殖力及び精子形成に必要な遺伝子を持つ部分にも影響を及ぼし得る。例えば、領域は、Ｓｘｒａ領域の全てもしくは一部（例えば、Ｓｒｙ遺伝子を含有する部分）を含み得る、ならびに／または領域は、マウスＹ染色体のＳｘｒｂ領域（例えば、Ｚｆｙ２遺伝子を含有する部分）（図１Ａを参照のこと）もしくはその他の種からのＹ染色体の対応する領域（例えば、ヒトＹ染色体のＡＺＦａ、ＡＺＦｂ、もしくはＡＺＦｃ領域）の全てもしくは一部を含み得る。例えば、領域は、Ｓｘｒａ領域及びＳｘｒｂ領域の両方の一部または全てを含み得る。例えば、Ｓｘｒｂ領域の境界は、Ｚｆｙ１及びＺｆｙ２である（図１Ａ及びＭａｚｅｙｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７（１１）：１７１３−１７２４を参照し、その全体があらゆる目的のために参照によって組み込まれる）。その他の動物種からの対応する領域としては、マウスＹ染色体上の領域における遺伝子とオルソロガスまたは相同である１つ以上の遺伝子を有する領域が挙げられる。例えば、ヒト領域のＡＺＦａ領域は、各領域がＵｔｙ、Ｄｂｙ（Ｄｄｘ３ｙ）、及びＤｆｆｒｙ（Ｕｓｐ９ｙ）を含有するという点で、マウスＹ染色体のＳｘｒｂ領域と対応する。例えば、Ａｆｆａｒａ（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｊａｎ．３、２００１：１−１６、Ｍａｚｅｙｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７（１１）、１７１３−１７２４、及びＳａｒｇｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３６：３７０−３７７を参照し、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって組み込まれる。領域は、Ｓｍｙ領域またはＳｐｙ領域の全てまたは一部も含み得る（図１Ａ及びＡｆｆａｒａ（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｊａｎ．３、２００１：１−１６を参照のこと）。同様に、領域は、マウスＹ染色体の欠失区間１、欠失区間２、欠失区間３、欠失区間４、欠失区間５、欠失区間６、及び欠失区間７のうち１つ以上またはその他の動物種からのＹ染色体の対応する領域の全てもしくは一部を含み得る（例えば、図１Ａ及びＡｆｆａｒａ（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｊａｎ．３、２００１：１−１６を参照のこと）。例えば、領域は、マウスＹ染色体の欠失区間１、欠失区間２、及び欠失区間３のうち１つ以上またはその他の動物種からのＹ染色体の対応する領域の全てもしくは一部を含み得る（例えば、図１Ａを参照のこと）。一例では、領域は、欠失区間２及び欠失区間３、または欠失区間２の一部及び欠失区間３の一部を含み得る。
【０１４７】
領域は、以下のうち１つ以上を含み得る：Ｒｂｍｙクラスター、Ｈ２ａｌ２ｙ、Ｓｒｙ、Ｚｆｙ２、Ｕｓｐ９ｙ、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、Ｔｓｐｙ−ｐｓ、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｋｄｍ５ｄ、Ｕｂａ１ｙ、またはＺｆｙ１（表Ａを参照のこと）。領域は、Ｒｂｍｙクラスターまでのテロメア側であり得る、またはＨ２ａｌ２ｙ、Ｓｒｙ、Ｚｆｙ２、Ｕｓｐ９ｙ、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、Ｔｓｐｙ−ｐｓ、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｋｄｍ５ｄ、Ｕｂａ１ｙ、もしくはＺｆｙ１までのセントロメア側もしくはテロメア側であり得る。例えば、領域は、Ｋｄｍ５ｄのテロメア側もしくはＵｓｐｙ９ｙのセントロメア側におけるＹ染色体の一部を含み得る、または領域は、Ｚｆｙ２、Ｓｒｙ、もしくはＲｂｍｙクラスターのテロメア側であり得る。領域は、Ｒｂｍｙクラスター、Ｈ２ａｌ２ｙ、Ｓｒｙ、Ｚｆｙ２、Ｕｓｐ９ｙ、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、Ｔｓｐｙ−ｐｓ、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｋｄｍ５ｄ、Ｕｂａ１ｙ、またはＺｆｙ１のうち１つ以上を除外し得る。例えば、領域は、Ｒｂｍｙクラスター、Ｚｆｙ２、及びＳｒｙのうち１つ以上を除外し得る。同様に、領域は、Ｒｂｍｙクラスター、Ｈ２ａｌ２ｙ、Ｓｒｙ、Ｚｆｙ２、Ｕｓｐ９ｙ、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、Ｔｓｐｙ−ｐｓ、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｋｄｍ５ｄ、Ｕｂａ１ｙ、またはＺｆｙ１のうち１つ以上以外のＹ染色体の一部を含み得る。例えば、領域は、Ｒｂｍｙクラスター、Ｚｆｙ２、及びＳｒｙのうち１つ以上以外のＹ染色体の一部を含み得る。
【０１４８】
【表Ａ−１】
2018527005.tif 000003
【表Ａ−２】
2018527005.tif 000004
【０１４９】
サイレンシングは、Ｙ染色体上に位置する遺伝子によってコードされるタンパク質のレベル及び／または活性を減少させ得る。例えば、Ｒｂｍｙクラスター、Ｈ２ａｌ２ｙ、Ｓｒｙ、Ｚｆｙ２、Ｕｓｐ９ｙ、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、Ｔｓｐｙ−ｐｓ、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｋｄｍ５ｄ、Ｕｂａ１ｙ、またはＺｆｙ１によってコードされるタンパク質のうち１つ以上のレベル及び／または活性が減少し得る。あるいは、サイレンシングは、Ｙ染色体上に位置する遺伝子の発現の排除をもたらし得る（すなわち、遺伝子が発現されない、または細胞が遺伝子の検出可能な発現を欠いている）。いくつかの方法では、例えば、Ｒｂｍｙクラスター、Ｈ２ａｌ２ｙ、Ｓｒｙ、Ｚｆｙ２、Ｕｓｐ９ｙ、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、Ｔｓｐｙ−ｐｓ、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｋｄｍ５ｄ、Ｕｂａ１ｙ、またはＺｆｙ１のうち１つ以上のうち１つ以上は、サイレンシング時に発現されない。いくつかの方法では、Ｄｄｘ３ｙ、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｕｔｙ、Ｚｆｙ２、及びＳｒｙによってコードされるタンパク質のうち１つ以上のレベル及び／もしくは活性が減少する、またはＤｄｘ３ｙ、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｕｔｙ、Ｚｆｙ２、及びＳｒｙのうち１つ以上が発現されない。
【０１５０】
領域のサイレンシングとしては、例えば、ゲノムからの領域の除去、低減した領域内における１つ以上の遺伝子の発現を減少させること、または領域内の遺伝子によってコードされる１種以上のタンパク質もしくはＲＮＡの活性を減少させることを挙げることができる。対象細胞における発現または活性の減少としては、適切な対照細胞と比較した場合の、発現または活性レベルの任意の統計的に有意な低減を挙げることができる。一般に、発現または活性は、発現または活性が、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変されていない適切な対照細胞における発現または活性よりも統計的に低い場合に、減少する。このような減少は、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変されていない対照細胞と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれを超える低減を含む。統計的有意性は、ｐ≦０．０５を意味する。発現または活性の減少は、任意の段階で任意の機構によって生じ得る。例えば、発現の減少は、領域に対して直接的もしくは間接的に作製された改変によって、または転写中、転写後、翻訳中、もしくは翻訳後に生じる事象もしくは制御によって生じ得る。
【０１５１】
いくつかの場合には、サイレンシングされた領域内の遺伝子は、発現されない（例えば、発現が排除される、または細胞が遺伝子の検出可能な発現を欠いている）。遺伝子は、遺伝子の転写が実施されない場合、または当該技術分野において既知の一般的な技術による遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡもしくはタンパク質）の検出可能なレベルが一切存在しない場合、発現されない。ポリペプチドの発現レベルは、直接的に、例えば、細胞もしくは生物中のポリペプチドレベルについてアッセイすることにより（例えば、ウェスタンブロット分析、ＦＡＣＳ分析、ＥＬＩＳＡ）、または間接的に、例えば、ポリペプチドの活性を測定することにより測定されてよい。その他の場合では、遺伝子の発現及び／または活性の低減は、例えば、サザンブロット分析、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ分析、ノーザンブロット分析、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、マイクロアレイ分析、または表現型分析を含む方法を使用して測定され得る。
【０１５２】
「対象細胞」は、本明細書に開示される遺伝子改変などの遺伝子変化が行われている細胞である、またはそのように変化された細胞の子孫であり、その変化を含む細胞である。「対照」または「対照細胞」は、対象細胞の表現型における変化を測定するための基準点を提供する。対照細胞は、それが、レベルまたは活性の低減をもたらす遺伝子改変または変異を欠いていることを除いて、タンパク質の低減したレベル及び／または活性を有する細胞と可能な限り厳密に合致し得る（例えば、個々の細胞は、同じ細胞株に由来し得る）。その他の場合では、対照細胞は、例えば、以下を含んでよい：（ａ）野生型細胞（すなわち、対象細胞をもたらす遺伝子変化のための出発物質と同じ遺伝子型の細胞）、（ｂ）出発物質と同じ遺伝子型であるが、ヌル構築物で（すなわち、対象となる形質に対して既知の効果を有しない構築物、例えば、マーカー遺伝子を含む構築物などで）遺伝子改変されている細胞、（ｃ）対象細胞の非遺伝子改変子孫である細胞（すなわち、対照細胞及び対象細胞が同じ細胞株に由来する）、（ｄ）対象細胞と遺伝的に同一であるが、タンパク質レベル及び／もしくは活性レベルを変化させることになる条件もしくは刺激に曝露されていない細胞、または（ｅ）遺伝子改変が、タンパク質レベル及び／もしくは活性レベルの発現に変化をもたらさない条件下における対象細胞それ自体。
【０１５３】
サイレンシングは、永久的な遺伝子変化または一過性であり得る。永久的な遺伝子変化は、例えば、追加のステップが変化を覆すために行われる（例えば、追加の改変による）ことなく存続する変化であり得るのに対して、一過性の変化は、たとえ、追加のステップが変化を覆すために行われないとしても、一定の期間だけ持続する変化（例えば、雌化培地中での培養によって達成されるサイレンシング）であり得る。いくつかの方法では、サイレンシングは、本明細書内の他の箇所に開示される雌化培地（例えば、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を含む基本培地を含む低オスモル濃度培地）中でＸＹ多能性または全能性細胞を維持すること以外の手段によって達成される。その他の方法では、サイレンシングは、本明細書内の他の箇所に開示される雌化培地（例えば、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を有する低オスモル濃度培地または約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を有する基本培地を含む低オスモル濃度培地）中でＸＹ多能性または全能性細胞を培養することによって達成される。例えば、サイレンシングは、以下のうち１つ以上によって達成され得る：（１）領域の欠失もしくは破壊などの標的遺伝子改変、（２）領域内の１つ以上の遺伝子から転写されるｍＲＮＡのＲＮＡ干渉もしくはアンチセンス阻害、（３）領域内の１つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質の指向性分解もしくは阻害、（４）ヘテロクロマチン媒介性サイレンシングもしくはＹ染色体上の１つ以上の位置でヘテロクロマチン形成を変化させること、（５）Ｙ染色体上におけるヒストンバリアントγＨ２ＡＸのリン酸化型のレベル増加、または（６）領域内における１つ以上の遺伝子の転写減少。標的遺伝子改変及びそれらを生成する方法は、本明細書内の他の箇所に開示されている。サイレンシングはまた、阻害核酸、例えば、低分子干渉核酸（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））または遺伝子転写物に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドなどを使用して達成され得る。サイレンシングはまた、領域内の１つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質の阻害剤の使用または例えば、リン酸化、ユビキチン化、及びｓｕｍｏ化による翻訳後修飾によるタンパク質の上流制御によって達成され得る。Ｙ染色体上でヘテロクロマチン形成を変化させることもまた、サイレンシングをもたらし得る。例えば、Ｙ染色体の第１領域の欠失は、第２領域をセントロメアのヘテロクロマチンドメインに近付けて、第２領域のサイレンシングをもたらし得る。Ｙ染色体上におけるヒストンバリアントγＨ２ＡＸのリン酸化型のレベル増加もまた、Ｙ染色体の領域のサイレンシングをもたらし得る。リン酸化ヒストンγＨ２ＡＸは、転写抑制と関連することが知られていて、減数分裂前期中のＸＹ性体におけるＸ及びＹ染色体の転写抑制と関連する。例えば、Ａｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  １３５：２４１−２５２を参照のこと。領域内における１つ以上の遺伝子の転写減少もまた、Ｙ染色体の領域のサイレンシングをもたらし得る。１つ以上の遺伝子の転写抑制は、例えば、転写リプレッサードメインまたはエピジェネティック改変ドメインに融合されるＤＮＡ結合タンパク質を使用して行われ得る（例えば、ＷＯ２０１４／０８９２９０を参照し、その全体があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１５４】
タンパク質のレベル及び／または活性の減少は、タンパク質をコードする遺伝子に対する、またはタンパク質のレベルもしくは活性に影響を及ぼす、もしくはそれらを制御するゲノム遺伝子座に対する標的遺伝子改変によって達成され得る。このような標的改変としては、例えば、１つ以上のヌクレオチドの付加、１つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換、対象となるポリヌクレオチドもしくはその一部のノックアウト、対象となるポリヌクレオチドもしくはその一部のノックイン、内因性核酸配列と異種核酸配列との置換え、またはこれらの組合せを挙げることができる。例えば、少なくとも１、２、３、４、５、７、８、９、１０またはそれを超えるヌクレオチドが、標的ゲノム改変を形成するために変化され得る。様々な方法が、標的遺伝子改変を生成するために使用され得る。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  １５３：９１０−９１８、Ｍａｎｄａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ４５７６８：１−９、及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０−５３２を参照し、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。加えて、本明細書に記載される様々な方法が、標的遺伝子改変を、タンパク質をコードする遺伝子またはその他のゲノム遺伝子座に導入するために使用され得る。
【０１５５】
タンパク質のレベル及び／または活性を減少させる標的遺伝子改変を作製する様々な方法が使用され得、本明細書内の他の箇所に開示される。
【０１５６】
タンパク質をコードする遺伝子の、または任意のその他の標的ゲノム遺伝子座における標的遺伝子改変は、細胞（例えば、ＥＳ細胞）が、本明細書内の他の箇所に開示される雌化培地（例えば、低オスモル濃度培地）（例えば、繁殖可能なＸＹ  Ｆ０雌の発達を促進する培地）中で維持されている間に生じ得る。逆に、細胞は、本明細書に開示される雌化培地ではない（例えば、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を含む基本培地を含む低オスモル濃度培地ではない）培地中で培養され得る。あるいは、遺伝子またはその他の標的ゲノム遺伝子座の標的遺伝子改変は、細胞が異なる培養培地中で維持されていて、続いて本明細書に開示される雌化培養培地（例えば、低オスモル濃度）に移している間に生じ得る。
【０１５７】
タンパク質の活性及び／またはレベルはまた、タンパク質のレベルまたは活性を阻害するポリヌクレオチドを細胞中に導入することによって低減または排除され得る。ポリヌクレオチドは、ＳｒｙメッセンジャーＲＮＡの翻訳を防止することによって直接的に、またはタンパク質をコードする遺伝子の転写を阻害するポリペプチドをコードすることによって間接的にタンパク質の発現を阻害してよい。あるいは、タンパク質の活性は、タンパク質の活性を阻害するポリペプチドをコードする配列を細胞中に導入することによって低減または排除される。
【０１５８】
タンパク質のレベル及び／または活性はまた、タンパク質の活性及び／またはレベルを低減させる条件付き対立遺伝子の使用によって制御され得る。条件付き対立遺伝子としては、所望の発達時点で、かつ／または所望の対象となる組織内においてタンパク質の減少したレベル及び／または活性を有するように設計された、タンパク質をコードする改変遺伝子が挙げられる。レベル及び／または活性の低減は、条件付き対立遺伝子を生じる改変を欠いている対照細胞と、または所望の発達時点における活性低減の場合、先行する、かつ／もしくは後続する時点と、または所望の組織の場合、全ての組織の平均活性と比較され得る。例えば、条件付き対立遺伝子は、所望の発達時点で、かつ／または特定の組織中で停止され得る、タンパク質をコードする遺伝子の条件付きヌル対立遺伝子を含み得る。このような条件付き対立遺伝子は、任意の遺伝子標的クローンに由来する繁殖可能なＸＹ雌を作製するために使用され得る。本明細書内の他の箇所に記載されるように、このような方法は、Ｆ１世代において所望のホモ接合遺伝子改変の作製を可能にする。このような方法は、Ｆ２世代まで交配させる必要なく、表現型の迅速な調査を提供する。
【０１５９】
条件付き対立遺伝子はまた、ＵＳ２０１１／０１０４７９９に記載されているように多機能性対立遺伝子であり得、その全体があらゆる目的のために参照によって組み込まれる。例えば、このような条件付き対立遺伝子は、以下を含み得る：（ａ）標的遺伝子の転写に関するセンス配向における作動配列、及びセンスまたはアンチセンス配向における薬物選択カセット（ＤＳＣ）、（ｂ）アンチセンス配向における、対象となるヌクレオチド配列（ＮＳＩ）及び反転モジュールによる条件付き（ＣＯＩＮ）、これはエクソン分割イントロン及び反転可能な遺伝子トラップ様モジュールを利用する（例えば、ＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照し、その全体があらゆる目的のために参照によって組み込まれる）、ならびに（ｃ）（ｉ）作動配列及びＤＳＣを欠き、（ｉｉ）センス配向にＮＳＩ及びアンチセンス配向にＣＯＩＮを含有する条件付き対立遺伝子を形成するために、第１リコンビナーゼへの曝露時に組み換えられる組換え可能な単位。
【０１６０】
タンパク質をコードする遺伝子の条件付き対立遺伝子は、任意の細胞型で生成され得、ＸＹ多能性または全能性細胞に限定されない。このような細胞型は、Ｙ染色体上のゲノム遺伝子座を標的とする非限定的な方法と共に、本明細書内の他の箇所でさらに詳しく述べられる。
【０１６１】
サイレンシングは、ＸＹ多能性または全能性細胞が培養されている場合、ドナーＸＹ多能性もしくは全能性細胞が宿主胚に導入された後、またはドナーＸＹ多能性もしくは全能性細胞を含む宿主胚が、レシピエント雌動物に導入された後に生じ得る。サイレンシングはまた、異なる胚発生期中に、または胚発生の全体にわたって生じ得る。いくつかの場合には、サイレンシングは出生後も継続する。例えば、卵母細胞が受精した後、一部のサイレンシングは最初の２細胞分裂を経ても維持され得る。サイレンシングにより引き起こされる性転換はまた、Ｆ１子孫に伝達されることが可能であり得る。サイレンシングが生じる期間のいくつかの例としては、以下のうち１つ以上が挙げられる：（１）雄の性決定プログラムが実行される場合の胚発生中、（２）少なくともマウスのＥ１１〜Ｅ１２に対応する発達段階（例えば、性決定もしくは性転換に重要な発達段階）までの胚発生中、（３）少なくともマウスのＥ１７〜Ｅ１９に対応する発達段階（例えば、胚の卵母細胞における繁殖力に重要な発達段階）までの胚発生中、（４）卵形成期の全体を通して、（５）卵母細胞発生における減数分裂前期中、これは出生直前の胚で開始する、（６）卵母細胞が受精した後（例えば、その最初の２細胞分裂中）、または（７）受精後の最初の２細胞分裂を経た排卵後の卵母細胞において。
【０１６２】
ｉｉ．雌化培地中における培養及び維持
Ｆ０世代において繁殖可能なＸＹ雌を促進する様々な方法及び組成物で用いられる培養培地は、それが多能性または全能性細胞（例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＸＹ  ＥＳ細胞、ＸＹ  ｉＰＳ細胞など）を維持するというようなものである。「維持する」、「維持すること」、及び「維持」という用語は、本明細書に記載される多能性または全能性細胞（ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を含む）の特性または表現型のうち少なくとも１つ以上の安定した保存を指す。このような表現型は、細胞の多能性または全能性、細胞形態、遺伝子発現プロファイル、及びその他の機能的特性を維持することを含み得る。「維持する」、「維持すること」及び「維持」という用語はまた、細胞の増殖または培養されている細胞数の増加を包含し得る。本用語は、細胞が分裂して数が増加し続ける場合もあり、またはそうでない場合もある一方で、細胞が多能性のままであることを可能にする培養条件をさらに考慮する。細胞は、様々な濃度の二酸化炭素中で培養され得る。一例では、細胞は５％二酸化炭素中で培養される。
【０１６３】
Ｙ染色体の領域をサイレンシングする改変を有するＸＹ多能性または全能性細胞は、培養下で多能性または全能性細胞（例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＸＹ  ＥＳ細胞、ＸＹ  ｉＰＳ細胞など）を成長させる、または維持する際の使用（添加物を添加して）に好適である、当該技術分野において既知の任意の基本培地（例えば、ＤＭＥＭ）中で培養することによって維持され得る。このような培養されたＸＹ多能性または全能性細胞（例えば、ＥＳ細胞）は、Ｙ染色体の領域のサイレンシングによって、繁殖可能な雌動物へと発達し、かつ多能性または全能性を保持する可能性を有するため、結果として細胞は、レシピエント胚に移植されて繁殖可能な雌子孫を生じ得る。
【０１６４】
１．雌化培地
Ｙ染色体の領域のサイレンシングは、以下でさらに定義されるような雌化培地中でＸＹ多能性または全能性細胞を培養または維持することによって達成され得る。同様に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするさらなる改変を有するＸＹ多能性または全能性細胞もまた、以下でさらに定義されるような雌化培地中で培養することによって維持され得る。培地中において十分な時間、細胞を培養することによって、細胞は、繁殖可能な雌動物へと発達する可能性を有するＸＹ多能性または全能性細胞へと変換され得るため、結果として細胞は、レシピエント胚に移植されて繁殖可能な雌子孫を生じ得る。ＷＯ２０１１／１５６７２３及びＫｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．２４（１）：１９−２９（その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる）は、宿主胚へのＸＹドナー細胞の導入及び好適な宿主での懐胎後、繁殖可能なＸＹ雌動物が、Ｆ０集団において産生され得るように培養下でＸＹドナー細胞を維持するために、このような雌化培養培地（例えば、本明細書内の他の箇所に開示されるような低オスモル濃度培地または低塩培地）を用いる方法及び組成物を提供する。いくつかのこのような方法では、特定のＸＹ多能性または全能性細胞クローンが繁殖可能なＸＹ雌動物を生成する傾向は、０％〜６０％であり得、これらの雌化効果は、対照非雌化培地中でクローンを再成長させることによって反転され得ない。このようなＦ０  ＸＹ雌は、正常な雌の外的及び内的構造を有し得、宿主胚の寄与及びキメラ現象が一切ない、完全にドナー細胞由来であり得、生殖器を含む全ての組織中に１本のＸ染色体及び１本のＹ染色体を有し得、かつ可視の染色体異常もなく、正常なＸＹ雄の核型を有し得る。雌化培地中で培養されたＸＹ多能性または全能性細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌は、ＸＸ雌と同等の繁殖力及び妊孕力を有し得る。例えば、いくつかのこのような方法では、Ｆ０  ＸＹ雌は、Ｆ１  ＸＸ雌対照物のおよそ９０％の繁殖力と比較して６０〜７０％の繁殖力を有する。いくつかのこのような方法では、９か月の交配試験においてＦ０  ＸＹ雌とＦ１  ＸＸ雌との間で妊孕力には全く差がない。
【０１６５】
雌化培地中での培養は、Ｙ染色体遺伝子の抑制またはサイレンシングをもたらし得る（実施例１を参照のこと）。例えば、Ｙ染色体の領域は、Ｙ染色体の短腕の全てまたは一部などでサイレンシングされ得る。機構の理解は実践に必要ではないが、Ｙ染色体の短腕におけるサイレンシングは、雄の性決定経路において重要な調節因子であるＳｒｙ遺伝子まで拡大され得、これにより、マウスの胚発生中、Ｅ１１〜Ｅ１２の正確な時点で十分に発現されないため、両能性生殖隆起において雌の性決定プログラムの発現をもたらす（実施例１及び図２Ａ〜図２Ｄを参照のこと）。Ｄｄｘ３ｙ及びＥｉｆ２ｓ３ｙなどのその他の遺伝子も、発現できない（実施例１ならびに図３及び図４を参照のこと）。それ以降、性転換胚は雌として出生し（Ｆ０世代）、次いで、そのＸＹ遺伝子型にもかかわらず、正常で繁殖可能な雌マウスに成長し得る。いくつかの方法では、雌化培地誘導Ｙ染色体サイレンシングは、永久的な遺伝子変化ではなく、Ｆ１世代まで持続しない（すなわち、ＸＹ雌は、Ｆ０  ＸＹ雌のＦ１子孫の中には一切見られない）。
【０１６６】
機構の理解は実践に必要ではないが、クロマチンの変化及び／またはＹ染色体上におけるヒストンバリアントγＨ２ＡＸのリン酸化型のレベル増加は、サイレンシングに寄与し得る。リン酸化ヒストンγＨ２ＡＸは、転写抑制と関連することが知られていて、減数分裂前期中のＸＹ性体におけるＸ及びＹ染色体の転写抑制と関連する。例えば、Ａｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  １３５：２４１−２５２を参照のこと。
【０１６７】
いくつかの場合には、ＸＹ多能性または全能性細胞におけるＹ染色体の最初の雌化培地誘導サイレンシングは、クローンの全ての細胞全体で完了していないため、クローンの細胞を注入された一部の胚は、正常な雄へと発達することになる。これらのＦ０雄を、それらの遺伝的に同一な性転換した雌のクローン兄弟と交配して、第１（Ｆ１）世代においてホモ接合体遺伝子改変マウスを生成し、それによって、通常はホモ接合体マウスを生成するのに必要となる交配の追加世代（Ｆ２）にかかる時間と費用を排除することができる。
【０１６８】
雌化培地は、繁殖可能なＸＹ  Ｆ０雌の発達を促進し得る。したがって、このような培地中での培養は、適切な対照培地（例えば、ＤＭＥＭに基づく培地など）中で培養されたＸＹ多能性もしくは全能性細胞と比較した場合、またはクローンが雌化培地中で培養されたにもかかわらず、ＸＹ雌マウスを生成する能力を欠いている、もしくは低減したその能力を有するＸＹ多能性もしくは全能性細胞クローンと比較した場合、性成熟に達すると繁殖可能になる表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージ、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージ、または正常な同腹仔数、産子数、及び一生涯における子孫（例えば、野生型雌動物と比較して）を産生することができるＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージを増加させ得る。
【０１６９】
ＸＹ多能性または全能性細胞は、標的ゲノム遺伝子座に対して少なくとも１つの追加の標的遺伝子改変をさらに含み得る。少なくとも１つの追加の標的ゲノム遺伝子座を改変することを含む方法では、ＸＹ多能性または全能性細胞は、標的化プロセス全体、例えば、エレクトロポレーション、薬物耐性コロニーの選択、標的変異についてのスクリーニング、増殖、及び凍結保存、または標的化プロセス全体のうち１つ以上の部分のみにおいて雌化培地中で培養され得る。同様に、細胞は、標的化プロセスの前に、かつ／またはその間に、かつ／またはその後に雌化培地中で培養され得る。
【０１７０】
「基本培地（ｂａｓｅ  ｍｅｄｉｕｍ）」または「基本培地（ｂａｓｅ  ｍｅｄｉａ）」としては、例えば、培養下で多能性または全能性細胞（例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＸＹ  ＥＳ細胞、ＸＹ  ｉＰＳ細胞など）を成長させる、または維持する際の使用（添加物を添加して）に好適である、当該技術分野において既知の基本培地（例えば、ＤＭＥＭ）が挙げられる。繁殖可能なＸＹ雌の作製を促進する基本培地（すなわち、「雌化培地」（例えば、「低塩培地」または「低オスモル濃度培地」））は、培養下でＥＳ細胞を維持するために典型的に使用される基本培地とは異なる。基本培地について一般に述べるために、繁殖可能なＸＹ雌の作製を促進しない基本培地は、「ＤＭＥＭ」（例えば、典型的なＤＭＥＭ培地）として本節及び表１に記載されている。繁殖可能なＸＹ雌の作製を促進する基本培地について述べるために、「雌化培地」という語句（例えば、「低塩培地」、「低塩ＤＭＥＭ」、「低オスモル濃度培地」、または「低オスモル濃度ＤＭＥＭ」）が使用される。培養下で多能性または全能性細胞を維持するために典型的に使用される基本培地（例えば、ＤＭＥＭ）と、繁殖可能なＸＹ雌の作製を促進する基本培地（例えば、「低塩ＤＭＥＭ」などの「雌化培地」）との差異は、本明細書で明確に表される。「低塩培地」という語句は便宜上使用され、繁殖可能なＸＹ雌を作製するのに好適なＤＭＥＭは、「低塩」に限定されない特性を示し、本明細書に記載される特性を含む。例えば、表１に示されるＤＭＥＭは、本明細書で提供されるような塩化ナトリウム及び／または重炭酸ナトリウム濃度を変化させることによって、繁殖可能なＸＹ雌を作製するのに好適にされ得、それはまた、表１に示されるＤＭＥＭと比較した場合、異なるオスモル濃度及び異なる伝導度をもたらすことになる。基本培地の一例は、様々な形態のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）である（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＤＭＥＭ、カタログ番号１  １９７１−０２５、表１）。好適な低塩ＤＭＥＭは、ＫＯ−ＤＭＥＭ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０８２９−０１８）として市販されている。基本培地は、ドナー細胞として使用するための細胞を培養下で維持するために使用される場合、当該技術分野において既知の多数の添加物が典型的には補充される。このような添加物は、本開示において「添加物」または「＋添加物」として示される。
【０１７１】
【表１−１】
2018527005.tif 000005
【表１−２】
2018527005.tif 000006
【０１７２】
「添加物」または「＋添加物」という語句は、培養下で多能性または全能性細胞（例えば、ＸＹ  ＥＳ細胞またはＸＹ  ｉＰＳ細胞）を成長させる、または維持するために（例えば、培養下でドナー細胞の多能性または全能性を維持するために）基本培地に添加される要素を含む。例えば、培養下で多能性または全能性細胞を成長させる、または維持するのに好適な培地添加物としては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、グルタミン、抗生物質（複数可）、ペニシリン及びストレプトマイシン（例えば、ｐｅｎｓｔｒｅｐ）、ピルビン酸塩（例えば、ピルビン酸ナトリウム）、非必須アミノ酸（例えば、ＭＥＭ  ＮＥＡＡ）、２−メルカプトエタノール、ならびに白血病抑制因子（ＬＩＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７３】
いくつかの方法では、基本培地は、多能性または全能性細胞、例えば、胚への注入及び代理母マウスへの子宮内移入後に、雄の性決定発達プログラムに寄与する能力が低減したＸＹ  ＥＳ細胞またはＸＹ  ｉＰＳ細胞を含む細胞を、培養下で維持するのに好適な１種以上の添加物を含む。一部の細胞株については、培地は、Ｗｎｔ馴化培地、例えば、Ｗｎｔ−３ａ馴化培地である。
【０１７４】
例えば、基本培地は、以下の添加物のうち１種以上を含み得る：ＦＢＳ（９０ｍＬのＦＢＳ／０．５Ｌの基本培地）、グルタミン（２．４ｍｍｏｌ／０．５Ｌの基本培地）、ピルビン酸ナトリウム（０．６ｍｍｏｌ／０．５Ｌの基本培地）、非必須アミノ酸（＜０．１ｍｍｏｌ／０．５Ｌの基本培地）、２−メルカプトエタノール、ＬＩＦ、及び１種以上の抗生物質。多能性または全能性細胞、例えば、胚への注入及び代理母マウスへの子宮内移入後に、雄の性決定発達プログラムに寄与する能力が低減したＸＹ  ＥＳ細胞またはＸＹ  ｉＰＳ細胞を含む細胞を、培養下で維持するための培地の一例は、以下の添加物が添加される約５００ｍｌの基本培地を含む：約９０ｍＬのＦＢＳ（例えば、Ｈｙｌｃｏｎｅ  ＦＢＳカタログ番号ＳＨ３００７０．０３）、約２．４ミリモルのグルタミン（例えば、約１２ｍｌの２００ｍＭグルタミン溶液、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号２５０３０−０８１、ペニシリン：ストレプトマイシン（例えば、約５１ｍｇのＮａＣｌを含む６０，０００単位のペニシリンＧナトリウム及び６０ｍｇの硫酸ストレプトマイシン、例えば、約６ｍｌのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｐｅｎｎｓｔｒｅｐ、カタログ番号１５１４０−１２２）、約０．６ミリモルのピルビン酸ナトリウム（例えば、６ｍｌの１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１  １３６０−０７０）、約０．０６ミリモルの非必須アミノ酸（例えば、約６ｍｌのＭＥＭ  ＮＥＡＡ、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１  １  １４０−０５０からのＭＥＭ  ＮＥＡＡ）、約１．２ｍｌの２−メルカプトエタノール、ならびに約１．２マイクログラムのＬＩＦ（例えば、約１２０マイクロリットルの１０６単位／ｍＬのＬＩＦ調製物、例えば、約１２０マイクロリットルのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＥＳＧＲＯ（商標）−ＬＩＦ、カタログ番号ＥＳＧ１  １０７）。繁殖可能なＸＹ雌を作製するためのＸＹ多能性または全能性細胞（例えば、ＸＹ  ＥＳまたはＸＹ  ｉＰＳ細胞）を維持するための基本培地を構成する場合、ほぼ同じ量の典型的には同じ添加物が用いられるが、基本培地の組成は（ＤＭＥＭとは、例えば、表１に記載されている培地とは）異なることになり、差異（複数可）は、本明細書で教示される差異（複数可）に対応する。
【０１７５】
変化され得る雌化培地のその他の特性としては、オスモル濃度、伝導度、塩濃度、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩の濃度、炭酸塩の濃度、アルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総濃度、ならびにアルカリ金属及びハロゲン化物の塩と炭酸の塩とのモル比が挙げられる。例えば、基本培地は、低塩培地（例えば、８５〜１３０ｍＭ（約５．０〜７．６ｍｇ／ｍＬ）のＮａＣｌ濃度を有する低塩ＤＭＥＭ）、低オスモル濃度培地（例えば、２５０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇもしくは２１８〜３２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する低オスモル濃度ＤＭＥＭ）、または低伝導度培地（例えば、１１〜１３ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する低伝導度ＤＭＥＭ）であり得る。
【０１７６】
基本培地または基本培地及び添加物を含む培地のオスモル濃度は、例えば、約３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７５、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、または２００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下であり得る。あるいは、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地のオスモル濃度は、例えば、約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇまたは３３０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下であり得る。場合により、基本培地は、約３４０、３３０、３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７５、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、または２００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下のオスモル濃度を有し、オスモル濃度は、非ヒト動物ＸＹ多能性または全能性細胞の多能性または全能性を維持するのに好適な添加物を基本培地に添加する時、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、または２５％を超えて変化しない。例えば、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２００〜３２９、２１８〜３２２、２４０〜３２０、２５０〜３１０、２７５〜２９５、または２６０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を含み得る。場合により、基本培地は、約２００〜３２９、２１８〜３２２、２４０〜３２０、２５０〜３１０、２７５〜２９５、または２６０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し、オスモル濃度は、非ヒト動物ＸＹ多能性または全能性細胞の多能性または全能性を維持するのに好適な添加物を基本培地に添加する時、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、または２５％を超えて変化しない。あるいは、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２１４、約２１６、約２００〜３２２、約２００〜３４０、約２００〜２９２、約２１４〜３２２、約２１６〜３２２、約２１８〜３２２、約２１４〜３３２、約２１６〜３３２、または約２１８〜３３２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を含み得る。場合により、基本培地は、約２１４、約２１６、約２００〜３２２、約２００〜３４０、約２００〜２９２、約２１４〜３２２、約２１６〜３２２、約２１８〜３２２、約２１４〜３３２、約２１６〜３３２、または約２１８〜３３２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し、オスモル濃度は、非ヒト動物ＸＹ多能性または全能性細胞の多能性または全能性を維持するのに好適な添加物を基本培地に添加する時、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、または２５％を超えて変化しない。例えば、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇまたは２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を含み得る。あるいは、オスモル濃度は、２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇ、２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇ、２９４±２９ｍＯｓｍ／ｋｇ、または３２２±３２ｍＯｓｍ／ｋｇであり得る。あるいは、オスモル濃度は、約２１６もしくは２１４ｍＯｓｍ／ｋｇまたは２１６±２２ｍＯｓｍ／ｋｇもしくは２１４±２２ｍＯｓｍ／ｋｇであり得る。場合により、基本培地は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇ、２１６ｍＯｓｍ／ｋｇ、２１４ｍＯｓｍ／ｋｇ、２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇ、２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇ、２９４±２９ｍＯｓｍ／ｋｇ、３２２±３２ｍＯｓｍ／ｋｇ、２１６±２２ｍＯｓｍ��ｋｇ、または２１４±２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し、オスモル濃度は、非ヒト動物ＸＹ多能性または全能性細胞の多能性または全能性を維持するのに好適な添加物を基本培地に添加する時、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、または２５％を超えて変化しない。
【０１７７】
基本培地または基本培地及び添加物を含む培地の伝導度は、例えば、約１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、または１４．０ｍＳ／ｃｍ以下であり得る。例えば、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約１０〜１４ｍＳ／ｃｍ、約１１〜１３ｍＳ／ｃｍ、または約１２〜１３ｍＳ／ｃｍ以下の伝導度を示し得る。
【０１７８】
基本培地または基本培地及び添加物を含む培地のｐＨは、例えば、約６．９〜約７．５、約６．９８〜約７．４１、約７．０〜約７．４、約７．０５〜約７．３５、約７．１〜約７．３、約７．１５〜約７．２５、約７．１８〜約７．２２、約７．１９〜約７．２３、もしくは約７．２〜約７．２２であり得る、またはｐＨは、約７．２１、約７．１７、約７．３８、約６．９９、約６．９８、約７．４０、約７．４１、約７．３４、もしくは約７．３７であり得る。
【０１７９】
一部の培地は、ＮａＣｌなどのアルカリ金属及びハロゲン化物の塩の濃度を示す。基本培地または基本培地及び添加物を含む培地中のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩の濃度は、例えば、約１００、９０、８０、７０、６０、または５０ｍＭ以下であり得る。例えば、ＮａＣｌについては、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地の濃度は、例えば、約５．８、５．３、４．７、４．１、３．５、または２．９ｍｇ／ｍＬ以下であり得る。例えば、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約５０〜１１０、６０〜１０５、７０〜９５、８０〜９０、９０、または８５ｍＭのアルカリ金属及びハロゲン化物の塩の濃度を含み得る。例えば、ＮａＣｌについては、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地の濃度は、例えば、約２．９〜６．４、３．５〜６．１、４．１〜５．６、４．７〜５．３、５．３、または５．０ｍｇ／ｍＬであり得る。あるいは、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩の濃度は、５０±５ｍＭ、８７±５ｍＭ、１１０±５ｍＭ、約３ｍｇ／ｍＬ、約５．１ｍｇ／ｍＬ、または約６．４ｍｇ／ｍＬであり得る。
【０１８０】
一部の培地は、ナトリウム塩（例えば、重炭酸ナトリウム）などの炭酸の塩（炭酸塩）の濃度を示す。基本培地または基本培地及び添加物を含む培地中における炭酸の塩の濃度は、例えば、４５、４０、３５、３０、２５、または２０ｍＭ以下であり得る。例えば、重炭酸ナトリウムについては、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地の濃度は、例えば、３．８、３．４、２．９、２．５、２．１、または１．７ｍｇ／ｍＬ以下であり得る。例えば、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約１０〜４０、１８〜４４、１７〜３０、１８〜２６、１３〜２５、２０〜３０、２５〜２６、１８、または２６ｍＭの基本培地における炭酸塩の濃度を含み得る。例えば、重炭酸ナトリウムについては、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地の濃度は、例えば、約０．８〜３．４、１．５〜３．７、１．４〜２．５、１．５〜２．２、１．１〜２．１、１．７〜２．５、２．１〜２．２、１．５、または２．２ｍｇ／ｍＬであり得る。あるいは、炭酸塩の濃度は、１８±５ｍＭ、２６±５ｍＭ、約１．５ｍｇ／ｍＬ、または約２．２ｍｇ／ｍＬであり得る。
【０１８１】
基本培地または基本培地及び添加物を含む培地中のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩ならびに炭酸の塩における濃度の和は、例えば、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、または８０ｍＭ以下であり得る。例えば、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約８０〜１４０、８５〜１３０、９０〜１２０、９５〜１２０、１００〜１２０、または１１５ｍＭのアルカリ金属及びハロゲン化物の塩ならびに炭酸の塩における濃度の和を含み得る。
【０１８２】
基本培地または基本培地及び添加物を含む培地中のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩と炭酸の塩とのモル比は、例えば、２．５超であり得る。例えば、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２．６〜４．０、２．８〜３．８、３．０〜３．６、３．２〜３．４、３．３〜３．５、または３．４のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩と炭酸の塩とのモル比を含み得る。
【０１８３】
雌化培地の一例（例えば、低オスモル濃度培地）は、以下の特性のうち１つ以上を含む基本培地を含む培地である：（ａ）約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度、（ｂ）約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの伝導度、（ｃ）約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、（ｄ）約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの炭酸塩濃度、ならびに（ｅ）約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総濃度。あるいは、基本培地及び添加物を含む培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度または約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの伝導度を有し得る。
【０１８４】
雌化培地の別の例（例えば、低オスモル濃度培地）は、以下の特性のうち１つ以上を含む基本培地を含む培地である：（ａ）約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、（ｂ）約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度の炭酸塩、ならびに（ｃ）約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度。例えば、基本培地は、ＮａＣｌを約２．９〜６．４ｍｇ／ｍＬの濃度で含み得る、かつ／または重炭酸ナトリウムを約１．４〜２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で含み得る。あるいは、基本培地及び添加物を含む培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。
【０１８５】
雌化培地の別の例（例えば、低オスモル濃度培地）は、以下の特性のうち１つ以上を含む基本培地を含む培地である：（ａ）約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩（例えば、ＮａＣｌ）、（ｂ）約１８ｍＭ〜約４４ｍＭまたは約１８ｍＭ〜約２６ｍＭの濃度の炭酸塩（例えば、ＮａＨＣＯ３）、ならびに（ｃ）約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度。例えば、基本培地は、ＮａＣｌを約２．９〜６．４ｍｇ／ｍＬの濃度で含み得る、かつ／または重炭酸ナトリウムを約１．５〜３．７ｍｇ／ｍＬもしくは１．５〜２．２ｍｇ／ｍＬの濃度で含み得る。あるいは、基本培地及び添加物を含む培地は、約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。
【０１８６】
雌化培地の別の例（例えば、低オスモル濃度培地）は、以下の特性のうち１つ以上を含む基本培地を含む培地である：（ａ）約２５０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度、（ｂ）約１１〜１３ｍＳ／ｃｍの伝導度、（ｃ）約６０〜１０５ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物塩、（ｄ）約２０〜３０ｍＭの炭酸塩濃度、ならびに（ｅ）約８５〜１３０ｍＭ以下のアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総濃度。あるいは、基本培地及び添加物を含む培地は、約２５０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。
【０１８７】
雌化培地の別の例（例えば、低オスモル濃度培地）は、約１２〜１３ｍＳ／ｃｍの伝導度及び約２６０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を含む基本培地を含む培地である。あるいは、基本培地及び添加物を含む培地は、約１２〜１３ｍＳ／ｃｍの伝導度及び約２６０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。場合により、基本培地は、塩化ナトリウムを約７０〜９５ｍＭ（すなわち、約４．１〜５．６ｍｇ／ｍＬ）の濃度で、または約９０ｍＭのＮａＣｌ（すなわち、約５．３ｍｇ／ｍＬ）をさらに含む。場合により、基本培地は、重炭酸ナトリウムを約３５ｍＭ未満（すなわち、約２．９ｍｇ／ｍＬ）または約２０〜３０ｍＭ（すなわち、約１．７〜２．５ｍｇ／ｍＬ）の濃度でさらに含む。
【０１８８】
雌化培地の別の例（例えば、低オスモル濃度培地）は、約２５０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度ならびに約６０〜１０５ｍＭのアルカリ金属及びハロゲン化物の塩の濃度を含む基本培地を含む培地である。あるいは、基本培地及び添加物を含む培地は、約２５０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。例えば、基本培地は、約３．５〜６．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌを含み、約２５０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る、または基本培地は、約３．５〜６．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌを含み得、基本培地及び添加物を含む培地は、約２５０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。場合により、基本培地は、約２０〜３０ｍＭの炭酸塩の濃度を含む。例えば、基本培地は、約１．７〜２．５ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含み得る。場合により、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩ならびに炭酸の塩における濃度の和は、約８０〜１４０ｍＭである。場合により、基本培地の伝導度は、約１２〜１３ｍＳ／ｃｍである。あるいは、基本培地及び添加物を含む培地の伝導度は、約１２〜１３ｍＳ／ｃｍである。
【０１８９】
雌化培地の別の例（例えば、低オスモル濃度培地）は、約５０±５ｍＭのＮａＣｌ及び約２６±５ｍＭの炭酸塩（例えば、重炭酸ナトリウム）を含む基本培地を含む培地であり、約２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。あるいは、基本培地及び添加物を含む培地は、約２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。例えば、培地は、約２．６〜３．２ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約１．８〜２．６ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含む基本培地を含み得、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。例えば、基本培地は、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含み、約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。あるいは、基本培地及び添加物を含む培地は、約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。
【０１９０】
雌化培地の別の例（例えば、低オスモル濃度培地）は、約８７±５ｍＭのＮａＣｌ及び約１８±５ｍＭの炭酸塩（例えば、重炭酸ナトリウム）を含む基本培地を含む培地であり、約２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。あるいは、基本培地及び添加物を含む培地は、約２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。例えば、基本培地は、約４．８〜５．４ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約１．１〜１．９ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含み得、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。例えば、基本培地は、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約１．５ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含み、約２６１ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。あるいは、基本培地及び添加物を含む培地は、約２６１ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。場合により、基本培地は、４．５ｍｇ／ｍＬのグルコースをさらに含み得る。
【０１９１】
雌化培地の別の例（例えば、低オスモル濃度培地）は、約１１０±５ｍＭのＮａＣｌ及び約１８±５ｍＭの炭酸塩（例えば、重炭酸ナトリウム）を含む基本培地を含む培地であり、約２９４±２９ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。あるいは、基本培地及び添加物を含む培地は、約２９４±２９ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。例えば、基本培地は、約６．１〜６．７ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約１．１〜１．９ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含み得、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２９４±２９ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。例えば、基本培地は、約６．４ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約１．５ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含み、約２９４ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。あるいは、基本培地及び添加物を含む培地は、約２９４ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。場合により、基本培地は、４．５ｍｇ／ｍＬのグルコースをさらに含み得る。
【０１９２】
雌化培地の別の例（例えば、低オスモル濃度培地）は、約８７±５ｍＭのＮａＣｌ及び約２６±５ｍＭの炭酸塩（例えば、重炭酸ナトリウム）を含む基本培地を含む培地であり、約２７０±２７ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。あるいは、基本培地及び添加物を含む培地は、約２７０±２７ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。例えば、培地は、約４．８〜５．４ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約１．８〜２．６ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含む基本培地を含み得、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２７０±２７ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。例えば、基本培地は、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含み、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。あるいは、基本培地及び添加物を含む培地は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。別の例として、基本培地は、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含み得、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。別の例として、基本培地は、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含み得、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２６８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。別の例として、基本培地は、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含み得、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。場合により、基本培地は、４．５ｍｇ／ｍＬのグルコースをさらに含み得る。
【０１９３】
雌化培地の別の例（例えば、低オスモル濃度培地）は、約８７±５ｍＭのＮａＣｌ、約２６±５ｍＭの炭酸塩（例えば、重炭酸ナトリウム）、及び約８６±５ｍＭのグルコースを含む基本培地を含む培地であり、約３２２±３２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。あるいは、基本培地及び添加物を含む培地は、約３２２±３２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。例えば、培地は、約４．８〜５．４ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約１．８〜２．６ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含む基本培地を含み得、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約３２２±３２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。例えば、基本培地は、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、約２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び約１５．５ｍｇ／ｍＬのグルコースを含み、約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。あるいは、基本培地及び添加物を含む培地は、約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。
【０１９４】
雌化培地の別の例（例えば、低オスモル濃度培地）は、５０±５ｍＭのＮａＣｌ及び２６±５ｍＭの炭酸塩を含む基本培地を含む培地であり、２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。あるいは、基本培地及び添加物を含む培地は、約２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。例えば、培地は、約２．６〜３．２ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約１．８〜２．６ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含む基本培地を含み得、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。例えば、基本培地は、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含み、約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。あるいは、基本培地及び添加物を含む培地は、約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。あるいは、基本培地は、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含み得、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２１６ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。あるいは、基本培地は、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含み得、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２１４ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。場合により、基本培地は、４．５ｍｇ／ｍＬのグルコースをさらに含み得る。
【０１９５】
雌化培地の別の例（例えば、低オスモル濃度培地）は、約５０±５ｍＭのＮａＣｌ及び約４４±５ｍＭの炭酸塩（例えば、重炭酸ナトリウム）を含む基本培地を含む培地であり、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２３８±２４ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。例えば、培地は、約２．６〜３．２ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約３．３〜４．１ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含む基本培地を含み得、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２３８±２４ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。例えば、基本培地は、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約３．７ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含み得、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２３８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。場合により、基本培地は、４．５ｍｇ／ｍＬのグルコースをさらに含み得る。
【０１９６】
雌化培地の別の例（例えば、低オスモル濃度培地）は、約８７±５ｍＭのＮａＣｌ及び約４４±５ｍＭの炭酸塩（例えば、重炭酸ナトリウム）を含む基本培地を含む培地であり、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２８８±２９ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。例えば、培地は、約４．８〜５．４ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約３．３〜４．１ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含む基本培地を含み得、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２８８±２９ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。例えば、基本培地は、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約３．７ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含み得、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２８８ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。場合により、基本培地は、４．５ｍｇ／ｍＬのグルコースをさらに含み得る。
【０１９７】
雌化培地の別の例（例えば、低オスモル濃度培地）は、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約１．５ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含む基本培地を含む培地であり、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２０３ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。
【０１９８】
雌化培地の別の例（例えば、低オスモル濃度培地）は、約４４ｍＭの重炭酸ナトリウム（すなわち、約３．７ｍｇ／ｍＬ）を含む基本培地を含む培地であり、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。雌化培地の別の例（例えば、低オスモル濃度培地）は、約２６ｍＭ（すなわち、約２．２ｍｇ／ｍＬ）の重炭酸ナトリウムを含む基本培地を含む培地であり、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２６４ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。雌化培地の別の例（例えば、低オスモル濃度培地）は、約１８ｍＭ（すなわち、約１．５ｍｇ／ｍＬ）の重炭酸ナトリウムを含む基本培地を含む培地であり、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２９２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。雌化培地の別の例（例えば、低オスモル濃度培地）は、約１８ｍＭ（すなわち、約１．５ｍｇ／ｍＬ）の重炭酸ナトリウムを含む基本培地を含む培地であり、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２５１ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有し得る。
【０１９９】
使用され得るその他の培地は、高グルコースＤＭＥＭ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）を、本明細書に開示されるようなＮａＨＣＯ３濃度（例えば、４４ｍＭ、２６ｍＭまたは１８ｍＭ）で、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ｕｇ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）を各々、１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ならびに２０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を補充して含む。
【０２００】
雌化培地（例えば、低オスモル濃度培地）のその他の例は、ＷＯ２０１１／１５６７２３、ＵＳ２０１１／０３０７９６８、及びＵＳ２０１５／００６７９０１に記載されていて、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。さらに、雌化培地のその他の例は、Ｋｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．２４（１）：１９−２９に記載されていて、その全体があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２０１】
２．繁殖可能なＸＹ雌動物を生成するための向上した能力を有するＸＹ多能性または全能性細胞またはクローンの選択
動物ＸＹ多能性または全能性細胞またはクローンが、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成する傾向を決定するための方法及び組成物が提供される。動物ＸＹ多能性または全能性細胞クローンがＦ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成する傾向は、これらのクローンにおけるＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの発現または活性と逆相関する。動物ＸＹ多能性または全能性細胞（例えば、ＸＹ  ＥＳ細胞）におけるこれらの遺伝子のうち１つ以上の発現喪失は、どの細胞クローンがＦ０世代においてＸＹ雌動物を生成することになるかを予測し得る：観察されるＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのサイレンシングが強くなるほど、ＸＹ  ＥＳ細胞クローンがＦ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成する傾向がますます高くなる（例えば、実施例３を参照のこと）。同様に、動物ＸＹ多能性または全能性細胞（例えば、ＸＹ  ＥＳ細胞）におけるこれらの遺伝子のうち１つ以上の活性喪失または発現及び／もしくは活性の減少は、どの細胞クローンがＦ０世代においてＸＹ雌動物を生成することになるかを予測し得る：観察されるＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの発現が低下するほど、ＸＹ  ＥＳ細胞クローンがＦ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成する傾向がますます高くなる（例えば、実施例３を参照のこと）。言い換えれば、これらの遺伝子のうち１つ以上の発現及び／または活性は、ＸＹ雌生成を予測するための代理マーカーであり得る。
【０２０２】
この情報は、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成する傾向が高い動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択するために使用され得る。例えば、１種以上の動物ＸＹ多能性または全能性細胞（例えば、ＥＳ細胞）の集団が、雌化培地（例えば、低オスモル濃度培地）中で維持される場合、このような方法は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性について、１種以上の動物ＸＹ多能性または全能性細胞をアッセイすること、ならびにＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することを含み得、ドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞は、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成することができる。例えば、このようなドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞は、Ｄｄｘ３ｙの、Ｕｔｙの、Ｅｉｆ２ｓ３ｙの、Ｄｄｘ３ｙ及びＵｔｙの、Ｄｄｘ３ｙ及びＥｉｆ２ｓ３ｙの、Ｕｔｙ及びＥｉｆ２ｓ３ｙの、またはＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの減少した発現及び／または活性を有し得る。
【０２０３】
次いで、ドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞が宿主胚に導入され得、宿主胚は、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成することができる。例えば、宿主胚は前桑実期胚であり得、宿主胚は、ドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞の導入時に胚盤胞期まで培養され得る。動物、胚、ドナーＸＹ多能性または全能性細胞を胚に導入する方法、及びＦ０動物を生成する方法は、本明細書内の他の箇所に開示される。
【０２０４】
雌化培地（例えば、培養下で動物ＸＹ多能性または全能性細胞を維持するのに好適な基本培地及び添加物、ここで基本培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を含む）ならびにこのような培地中で細胞を維持する方法は、本明細書内の他の箇所に開示される。
【０２０５】
動物ＸＹ多能性または全能性細胞は、アッセイステップ前に、及び／または宿主胚への導入前に、様々な時間で培地中において維持され得る。例えば、動物ＸＹ多能性または全能性細胞は、アッセイステップ及び／または宿主胚への導入前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、雌化培地中で維持され得る。あるいは、動物ＸＹ多能性または全能性細胞は、アッセイステップ及び／または宿主胚への導入前に１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間以下の間、雌化培地中で維持され得る。いくつかの方法では、ＸＹ多能性または全能性細胞は、細胞を胚に注入するまで雌化培地中で培養または維持される。その他の方法では、ＸＹ多能性または全能性細胞が注入された胚は、代理母に移入されるまで雌化培地中で培養または維持される。
【０２０６】
アッセイステップは、クローンそれ自体をアッセイすること、ならびにＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現または活性のレベルを決定することを含み得る。あるいは、アッセイステップは、クローンに由来するいくつかのサブクローンをアッセイすること、ならびに例えば、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の低減した発現及び／もしくは活性を有する、またはその発現及び／もしくは活性を欠いているサブクローンのパーセンテージを決定することを含み得る。あるいは、アッセイステップは、クローンに由来するいくつかのサブクローンをアッセイすること、ならびにサブクローンの中でもＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の比較発現及び／または活性を決定することを含み得る。Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／もしくは活性が減少し得る、またはＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち全ての発現及び／もしくは活性が減少し得る。あるいは、ドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／もしくは活性を欠いている、またはＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち全ての発現及び／もしくは活性を欠いている。例えば、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち全ての検出可能な発現の欠如であり得る。
【０２０７】
発現は、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルで評価され得る。ポリペプチドの発現レベルは、直接的に、例えば、細胞もしくは生物中のポリペプチドレベルについてアッセイすることにより（例えば、ウェスタンブロット分析、ＦＡＣＳ分析、ＥＬＩＳＡ）、または間接的に、例えば、ポリペプチドの活性を測定することにより測定されてよい。その他の場合では、遺伝子の発現及び／または活性の低減は、例えば、サザンブロット分析、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ分析、ノーザンブロット分析、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、マイクロアレイ分析、または表現型分析を含む方法を使用して測定され得る。例えば、遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、デジタルＰＣＲ、またはｍＲＮＡレベルを測定する任意のその他の好適な方法によって、ｍＲＮＡレベルを測定することにより評価され得る。一例として、ＲＮＡレベルは、Ｂ２ｍなどの対照遺伝子と比較してＲＴ−ＰＣＲにより測定され得る。いくつかの場合には、例えば、対照遺伝子（例えば、Ｂ２ｍ）と標的遺伝子との間のΔＣｔは、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６、または少なくとも８であり得る。同様に、いくつかの場合には、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０サイクル後、標的遺伝子の検出可能なＲＮＡは、一切存在しないことになる。
【０２０８】
場合により、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルを測定する場合、対照実験は、Ｙ染色体の存在を確認するために行われ得る。例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）コピー数アッセイは、Ｙ染色体上の異なるゲノム配列に対するプローブを使用することによって、Ｙ染色体の１コピーの存在を確認するために行われ得る。このようなアッセイは、ゲノム内におけるコピー数変化を測定するように設計される。
【０２０９】
対象細胞、胚、または動物における遺伝子またはそれがコードするタンパク質の発現または活性の減少としては、適切な対照細胞、胚、もしくは動物または対照細胞、胚、もしくは動物の集団と比較した場合の、発現または活性レベルの任意の統計的に有意な低減を挙げることができる。一般に、発現または活性は、発現または活性が、雌化培地ではない適切な対照培地中で培養された適切な対照細胞、胚、またはそれらに由来する動物（例えば、動物ＸＹ多能性細胞）、すなわち、細胞が雌化培地中で培養されたにもかかわらず、歴史的に完全に雄マウスを生成する動物ＸＹ多能性細胞）における発現または活性よりも、統計的に低い場合に減少する。このような減少は、対照細胞と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれを超える低減を含む。統計的有意性は、ｐ≦０．０５を意味する。発現または活性の減少は、任意の段階で任意の機構によって生じ得る。例えば、発現の減少は、転写中、転写後、翻訳中、または翻訳後に生じる事象または制御によって生じ得る。
【０２１０】
「対象細胞」は、雌化培地（例えば、低オスモル濃度培地）中で培養された細胞または雌化培地中で培養された細胞の子孫である細胞である。「対照」または「対照細胞」は、対象細胞の表現型における変化を測定するための基準点を提供する。対照細胞は、それが雌化培地中で培養されなかったこと、または細胞が雌化培地中で培養されたにもかかわらず、ＸＹ雌マウスを生成する能力を欠いている、もしくは低減したその能力を有することのいずれかを除いて、好ましくは対象細胞と可能な限り厳密に合致する（例えば、個々の細胞は、同じ細胞株もしくは同じクローンに由来し得る、または同じ遺伝子型を有し得る）。例えば、対照細胞は、以下を含んでよい：（ａ）同じ遺伝子型である、または対象細胞と同じ細胞株もしくはクローンに由来するが、雌化培地ではない適切な対照培地（例えば、ＤＭＥＭもしくは動物ＸＹ多能性もしくは全能性細胞の多能性もしくは全能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる能力を細胞に付与することにより細胞を変化させない別の種類の培地）中で培養された細胞、（ｂ）対象細胞と遺伝的に同一である、または同じ細胞株もしくはクローンに由来するが、遺伝子改変されていない、もしくは繁殖可能な雌ＸＹ動物を生成する能力を細胞に付与することになる条件もしくは刺激に曝露されていない動物ＸＹ多能性または全能性細胞、ならびに（ｃ）雌化培地（例えば、低オスモル濃度培地）中で培養されるが、細胞が雌化培地中で培養されるにもかかわらず、歴史的に完全に雄動物を生成する動物ＸＹ多能性及び全能性細胞。
【０２１１】
いくつかの実験では、動物ＸＹ多能性または全能性細胞（例えば、ＥＳ細胞）またはクローンの集団は、雌化培地（例えば、低オスモル濃度培地）中で維持され、細胞またはクローンのうち２種以上が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性についてアッセイされる。次いで、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の最も低い発現及び／または活性を有する細胞またはクローンが、ドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞またはクローンであると選択され得、ドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞は、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成することができる。
【０２１２】
Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することは、表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫のより高いパーセンテージ、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫のより高いパーセンテージ、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０  ＸＹ子孫のより高いパーセンテージ、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のより高いパーセンテージ、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌の一生涯における同腹仔のより高い平均数、及びＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のより高い平均産子数をもたらし得る。このようなＦ０子孫は、本明細書内の他の箇所に開示される方法を使用した、宿主胚への細胞の導入及び宿主胚の懐胎後、ドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞から生成され得る。
【０２１３】
増加は、適切な対照物と比較した場合の、任意の統計的に有意な増加であり得る。例えば、増加は、適切な対照物と比較した場合、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または５倍であり得る。
【０２１４】
例えば、表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することによって増加し得る。いくつかの方法では、表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有するＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫ではより高い。
【０２１５】
繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージはまた、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することによって増加し得る。いくつかの方法では、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有するＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫ではより高い。
【０２１６】
繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージはまた、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することによって増加し得る。いくつかの方法では、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有するＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。
【０２１７】
正常な同腹仔数及び／または正常な産子数（例えば、野生型雌動物と比較して）を産生することができるＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージはまた、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することによって増加し得る。いくつかの方法では、正常な同腹仔数及び／または正常な産子数を産生することができるＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有するＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。
【０２１８】
Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される平均産子数はまた、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することによって増加し得る。いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される平均産子数は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有するＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【０２１９】
Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における同腹仔の平均数はまた、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することによって増加し得る。いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における同腹仔の平均数は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有するＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【０２２０】
Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における子孫の平均数はまた、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することによって増加し得る。いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における子孫の平均数は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有するＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【０２２１】
動物ＸＹ多能性または全能性細胞またはクローンが、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成する傾向を決定するためのキットもまた提供される。このようなキットは、例えば、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の検出試薬を含み得る。検出試薬は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性レベルを測定し得る。例えば、検出試薬は、動物多能性または全能性細胞においてＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上から、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のレベルを検出するために使用され得る。このような検出試薬は、動物多能性または全能性細胞においてＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現を検出するための、１つ以上のプライマーセット及び／または１つ以上のプローブを含み得る。
【０２２２】
このようなキットはラベルも含み得る。キットは、典型的には、キットの使用に指示を提供するラベリングを含有する。ラベリングは、キットの製造中、輸送中、販売中、または使用中のいつでも、キットに付属される、またはさもなければキットに付随する任意の記載された、または記録された材料を一般に指す。例えば、ラベリングという用語は、広告リーフレット及びパンフレット、包装材料、説明書、オーディオまたはビデオカセット、コンピュータディスク、加えてキット上に直接転写される文書を含む。
【０２２３】
このようなキットは、検出試薬を使用して、動物ＸＹ多能性または全能性細胞またはクローンが、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成する予測傾向と検出を相互に関連付けるための説明書をさらに含み得る。
【０２２４】
ｉｉｉ．Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させる改変
Ｙ染色体の領域をサイレンシングする改変を有するＸＹ多能性または全能性細胞は、レシピエント胚に移植されて繁殖可能な雌子孫を生じ得るように、一部の細胞を、繁殖可能な雌動物へと発達する可能性を有するＸＹ多能性または全能性細胞に変換させるために、Ｓｒｙタンパク質の減少したレベル及び／または活性をもたらす遺伝子改変をさらに含み得る。同様に、本明細書内の他の箇所に開示されるような雌化培地中で培養されるＸＹ多能性または全能性細胞は、Ｓｒｙタンパク質の減少したレベル及び／もしくは活性をもたらす遺伝子改変を含み得る、またはそれらが、Ｓｒｙタンパク質の減少したレベル及び／もしくは活性をもたらす遺伝子改変を含まないようにし得る。「性決定領域Ｙ」タンパク質または「Ｓｒｙ」タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質の高移動度群（ＨＭＧ）ボックスファミリーのメンバーである転写因子である。Ｓｒｙは、雄性決定を開始する精巣決定因子である。様々な生物からのＳｒｙタンパク質の配列が既知であり、この配列は、マウス（アクセッション番号Ｑ０５７３８）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ６１８８２．１）、ヒト（アクセッション番号Ｑ０５０６６）、ネコ（アクセッション番号Ｑ６７Ｃ５０）、及びウマ（アクセッション番号Ｐ３６３８９）からのものを含み、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２２５】
Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるようにＸＹ多能性または全能性細胞を改変することによって、Ｆ０世代において表現型的に雌のＸＹ動物を作製する方法は、ＷＯ２０１５／２００８０５及びＵＳ２０１５／０３７６６５１に開示されていて、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって組み込まれる。いくつかの遺伝的背景（例えば、ＶＧＢ６マウスＥＳ細胞株を使用し、この細胞株はＣ５７ＢＬ／６系統からのＹ染色体を有する）では、Ｓｒｙのレベル及び／または活性を減少させるようにＥＳ細胞を改変して、このような細胞を、Ｆ０マウスを生成するために使用することによって表現型的に雌のＦ０  ＸＹマウスがもたらされるが、全てのマウスが不妊または生殖不能である。この不妊または非常に限られた繁殖力は、その他の文献で同様に報告されている。例えば、Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ３：３１３６及びＶｅｒｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４１：８５５−８６６を参照のこと。しかしながら、その他の遺伝的背景（例えば、ＶＧＦ１マウスＥＳ細胞株を使用し、この細胞株は１２９系統からのＹ染色体を有する）では、Ｓｒｙのレベル及び／または活性を減少させるようにＥＳ細胞を改変して、このような細胞を、Ｆ０マウスを生成するために使用することによって表現型的に雌のＦ０  ＸＹマウスがもたらされ、その大半が繁殖可能である。これらのＶＧＦ１細胞を、本明細書で開示されるような雌化培地中でさらに培養することによって、さらに高いパーセンテージの表現型的に雌のＦ０  ＸＹマウスが繁殖可能となり得る。ＷＯ２０１５／２００８０５及びＵＳ２０１５／０３７６６５１を参照し、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって組み込まれる。
【０２２６】
ＸＹ多能性または全能性細胞を、Ｓｒｙタンパク質の減少したレベル及び／または活性をもたらす遺伝子改変だけでなく、Ｙ染色体における追加の領域のサイレンシングも含むように改変することによって、繁殖可能なＸＹ  Ｆ０雌の発達が促進され得る（例えば、ＸＹ  Ｆ０雌の産生を増加させることによって、ならびに／またはＸＹ  Ｆ０雌の繁殖力及び／もしくは妊孕力をさらに増加させることによって）。改変のこのような組合せは、Ｓｒｙタンパク質の減少したレベル及び／または活性をもたらす遺伝子改変を含まないＸＹ多能性または全能性細胞と比較した場合、性成熟に達すると繁殖可能になる表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージ、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージ、または正常な同腹仔数及び産子数（例えば、野生型雌動物と比較して）を産生することができるＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージを増加させ得る。
【０２２７】
一般に、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／または活性は、Ｓｒｙタンパク質のタンパク質レベル及び／または活性レベルが、Ｓｒｙタンパク質の発現及び／または活性を阻害するために遺伝子改変されていない、または変異誘発されていない適切な対照細胞において、Ｓｒｙのタンパク質レベルよりも統計的に低い場合に減少する。例えば、Ｓｒｙタンパク質の濃度及び／または活性は、Ｓｒｙタンパク質の減少したレベル及び／または活性を有するように改変されていない対照細胞と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれを超えて減少する。
【０２２８】
「対象細胞」は、本明細書に開示される遺伝子改変などの遺伝子変化が行われている細胞である、またはそのように変化された細胞の子孫であり、その変化を含む細胞である。「対照」または「対照細胞」は、対象細胞の表現型における変化を測定するための基準点を提供する。対照細胞は、それが、活性の低減をもたらす遺伝子改変または変異を欠いていることを除いて、低減したＳｒｙ活性を有する細胞と可能な限り厳密に合致し得る（例えば、個々の細胞は、同じ細胞株に由来し得る）。その他の場合では、対照細胞は、例えば、以下を含んでよい：（ａ）野生型細胞（すなわち、対象細胞をもたらす遺伝子変化のための出発物質と同じ遺伝子型の細胞）、（ｂ）出発物質と同じ遺伝子型であるが、ヌル構築物で（すなわち、対象となる形質に対して既知の効果を有しない構築物、例えば、マーカー遺伝子を含む構築物などで）遺伝子改変されている細胞、（ｃ）対象細胞の非遺伝子改変子孫である細胞（すなわち、対照細胞及び対象細胞が同じ細胞株に由来する）、（ｄ）対象細胞と遺伝的に同一であるが、Ｓｒｙタンパク質レベル及び／もしくは活性レベルを変化させることになる条件もしくは刺激に曝露されていない細胞、または（ｅ）遺伝子改変が、Ｓｒｙタンパク質レベル及び／もしくは活性レベルの発現に変化をもたらさない条件下における対象細胞それ自体。
【０２２９】
Ｓｒｙポリペプチドの発現レベルは、直接的に、例えば、細胞もしくは生物中のＳｒｙポリペプチドレベルについてアッセイすることにより、または間接的に、例えば、Ｓｒｙポリペプチドの活性を測定することにより測定されてよい。Ｓｒｙタンパク質の活性を決定する様々な方法が知られている。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  １５３：９１０−９１８、Ｍａｎｄａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ４５７６８：１−９、及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０−５３２を参照し、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２３０】
その他の場合では、Ｓｒｙポリペプチドの活性及び／またはレベルを低減させる標的遺伝子改変を有する細胞は、例えば、サザンブロット分析、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ分析、ノーザンブロット分析、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、マイクロアレイ分析、または表現型分析を含む方法を使用して選択される。
【０２３１】
Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／または活性の減少は、Ｓｒｙ遺伝子に対する、またはＳｒｙタンパク質のレベルもしくは活性に影響を及ぼす、もしくはそれらを制御するゲノム遺伝子座に対する標的遺伝子改変によって達成され得る。このような標的改変としては、例えば、１つ以上のヌクレオチドの付加、１つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換、対象となるポリヌクレオチドもしくはその一部のノックアウト、対象となるポリヌクレオチドもしくはその一部のノックイン、内因性核酸配列と異種核酸配列との置換え、またはこれらの組合せを挙げることができる。例えば、少なくとも１、２、３、４、５、７、８、９、１０またはそれを超えるヌクレオチドが、標的ゲノム改変を形成するために変化され得る。様々な方法が、標的遺伝子改変を生成するために使用され得る。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  １５３：９１０−９１８、Ｍａｎｄａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ４５７６８：１−９、及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０−５３２を参照し、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。加えて、本明細書に記載される様々な方法が、標的遺伝子改変を、Ｓｒｙ遺伝子またはその他のゲノム遺伝子座に導入するために使用され得る。
【０２３２】
Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させる標的遺伝子改変を作製する様々な方法が使用され得、本明細書内の他の箇所に開示される。
【０２３３】
Ｓｒｙ遺伝子の、または任意のその他の標的ゲノム遺伝子座における標的遺伝子改変は、細胞（例えば、ＥＳ細胞）が、本明細書内の他の箇所に開示される雌化培養培地（例えば、低オスモル濃度培地）（例えば、繁殖可能なＸＹ  Ｆ０雌の発達を促進する培地）中で維持されている間に生じ得る。あるいは、Ｓｒｙ遺伝子またはその他の標的ゲノム遺伝子座の標的遺伝子改変は、細胞が異なる培養培地中で維持されていて、場合により、続いて本明細書内の他の箇所に開示される雌化培養培地（例えば、低オスモル濃度培地）（例えば、繁殖可能なＸＹ  Ｆ０雌の発達を促進する培地）に移されている間に生じ得る。
【０２３４】
Ｓｒｙポリペプチドの活性及び／またはレベルはまた、Ｓｒｙポリペプチドのレベルまたは活性を阻害するポリヌクレオチドを細胞中に導入することによって低減または排除され得る。ポリヌクレオチドは、ＳｒｙメッセンジャーＲＮＡの翻訳を防止することによって直接的に、またはＳｒｙタンパク質をコードする遺伝子の転写を阻害するポリペプチドをコードすることによって間接的にＳｒｙポリペプチドの発現を阻害してよい。あるいは、Ｓｒｙポリペプチドの活性は、Ｓｒｙポリペプチドの活性を阻害するポリペプチドをコードする配列を細胞中に導入することによって低減または排除される。
【０２３５】
Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／または活性はまた、Ｓｒｙタンパク質の活性及び／またはレベルを低減させる条件付きＳｒｙ対立遺伝子の使用によって制御され得る。「条件付きＳｒｙ対立遺伝子」は、所望の発達時点で、かつ／または所望の対象となる組織内においてＳｒｙタンパク質の減少したレベル及び／または活性を有するように設計された改変Ｓｒｙ遺伝子を含む。レベル及び／または活性の低減は、条件付き対立遺伝子を生じる改変を欠いている対照細胞と、または所望の発達時点における活性低減の場合、先行する、かつ／もしくは後続する時点と、または所望の組織の場合、全ての組織の平均活性と比較され得る。例えば、条件付きＳｒｙ対立遺伝子は、所望の発達時点で、かつ／または特定の組織中で停止され得るＳｒｙの条件付きヌル対立遺伝子を含み得る。このような条件付き対立遺伝子は、任意の遺伝子標的クローンに由来する繁殖可能なＸＹ雌を作製するために使用され得る。本明細書内の他の箇所に記載されるように、このような方法は、Ｆ１世代において所望のホモ接合遺伝子改変の作製を可能にする。このような方法は、Ｆ２世代まで交配させる必要なく、表現型の迅速な調査を提供する。
【０２３６】
条件付きＳｒｙ対立遺伝子はまた、ＵＳ２０１１／０１０４７９９に記載されているように多機能性対立遺伝子であり得、その全体があらゆる目的のために参照によって組み込まれる。例えば、このような条件付き対立遺伝子は、以下を含み得る：（ａ）標的遺伝子の転写に関するセンス配向における作動配列、及びセンスまたはアンチセンス配向における薬物選択カセット（ＤＳＣ）、（ｂ）アンチセンス配向における、対象となるヌクレオチド配列（ＮＳＩ）及び反転モジュールによる条件付き（ＣＯＩＮ）、これはエクソン分割イントロン及び反転可能な遺伝子トラップ様モジュールを利用する（例えば、ＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照し、その全体があらゆる目的のために参照によって組み込まれる）、ならびに（ｃ）（ｉ）作動配列及びＤＳＣを欠き、（ｉｉ）センス配向にＮＳＩ及びアンチセンス配向にＣＯＩＮを含有する条件付き対立遺伝子を形成するために、第１リコンビナーゼへの曝露時に組み換えられる組換え可能な単位。
【０２３７】
Ｓｒｙ遺伝子の条件付き対立遺伝子は、任意の細胞型で生成され得、ＸＹ多能性または全能性細胞に限定されない。このような細胞型は、Ｙ染色体上のゲノム遺伝子座を標的とする非限定的な方法と共に、本明細書内の他の箇所でさらに詳しく述べられる。
【０２３８】
ｉｖ．組合せ
Ｙ染色体の領域をサイレンシングするようにＸＹ多能性または全能性動物細胞を改変するために提供される方法及び組成物は、雌化培地（例えば、低オスモル濃度培地）中でＸＹ多能性もしくは全能性動物細胞を培養することを伴う方法ならびに／またはＳｒｙタンパク質のレベル及び／もしくは活性を減少させるようにＸＹ多能性もしくは全能性動物細胞を改変することを伴う方法と組み合わされ得る。同様に、雌化培地（例えば、低オスモル濃度培地）中でＸＹ多能性または全能性動物細胞を培養することを伴う方法は、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするようにＸＹ多能性もしくは全能性動物細胞を改変するために提供される方法及び組成物ならびに／またはＳｒｙタンパク質のレベル及び／もしくは活性を減少させるようにＸＹ多能性もしくは全能性動物細胞を改変することを伴う方法と組み合わされ得る。ＸＹ多能性または全能性細胞は、標的ゲノム遺伝子座に対して少なくとも１つの追加の標的遺伝子改変をさらに含み得る。
【０２３９】
ＸＹ多能性または全能性細胞が雌化培地中で培養される方法では、細胞は、サイレンシングプロセス全体にわたって、またはサイレンシングプロセス全体のうち１つ以上の部分のみにおいて雌化培地中で培養され得る。すなわち、ＸＹ多能性または全能性細胞が雌化培地中で培養されて、Ｙ染色体の領域が別のサイレンシングプロセスによってサイレンシングされる方法では、細胞は、サイレンシングプロセス全体にわたって、またはサイレンシングプロセス全体のうち１つ以上の部分のみにおいて雌化培地中で培養され得る。同様に、細胞は、サイレンシングプロセスの前に、かつ／またはその間に、かつ／またはその後に雌化培地中で培養され得る。雌化培地中で細胞を維持すること、ならびにＳｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させることの両方をさらに含む方法では、細胞は、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／もしくは活性を減少させるプロセス全体にわたって、またはそのプロセスのうち１つ以上の部分のみにおいて雌化培地中で培養され得る。同様に、細胞は、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるプロセスの前に、かつ／またはその間に、かつ／またはその後に雌化培地中で培養され得る。
【０２４０】
雌化培地中でＸＹ多能性または全能性細胞を培養することを伴う方法との、いくつかのこのような組合せでは、ＸＹ多能性または全能性細胞は、雌化培地（例えば、低オスモル濃度培地）中で維持され得るが、Ｙ染色体の領域のサイレンシングは、雌化培地中で細胞を維持すること以外の手段またはそれに加えた手段によって達成される。Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるようにＸＹ多能性または全能性細胞を改変することを伴う方法との、いくつかのこのような組合せでは、Ｙ染色体の領域のサイレンシングは、Ｓｒｙ遺伝子以外のＹ染色体の一部を含む領域のサイレンシングであり得る。
【０２４１】
一例では、Ｓｒｙ遺伝子は、Ｙ染色体上における１つ以上の追加の遺伝子に加えてサイレンシングされる。機構の理解は実践に必要ではないが、Ｓｒｙのサイレンシングは、このようなＸＹ胚の性転換を増強し得（例えば、約１１．０ｄｐｃでの生殖腺体細胞におけるサイレンシングによって）、Ｙ染色体上における１つ以上のその他の遺伝子のサイレンシングは、性転換ＸＹ胚から生成されるＸＹ雌の繁殖力及び／または妊孕力を増強し得る（例えば、約１８．５ｄｐｃ以上での卵母細胞におけるサイレンシングによって）。例えば、Ｚｆｙ２及びＳｒｙ遺伝子の両方が、サイレンシングされ得（例えば、Ｃ５７ＢＬ系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、もしくは１２９以外の系統からのマウスＸＹ  ＥＳ細胞、またはＣ５７ＢＬ系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、もしくは１２９以外の系統からのＹ染色体を有するマウスＸＹ  ＥＳ細胞において）、ＸＹ多能性または全能性動物細胞は、本明細書で開示される雌化培地（例えば、低オスモル濃度培地）中で場合により培養される。いくつかの方法では、Ｓｒｙのサイレンシングは、ＸＹ胚の性転換を増強し得（例えば、約１１．０ｄｐｃでの生殖腺体細胞におけるサイレンシングによって）、Ｚｆｙ２のサイレンシングは、ＸＹ雌の繁殖力及び／または妊孕力を増強し得る（例えば、約１８．５ｄｐｃ以上での卵母細胞におけるサイレンシングによって）。
【０２４２】
このような組合せは、表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫のより高いパーセンテージ、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫のより高いパーセンテージ、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０  ＸＹ子孫のより高いパーセンテージ、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のより高いパーセンテージ、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌の一生涯における同腹仔のより高い平均数、及びＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のより高い平均産子数をもたらし得る。このようなＦ０子孫は、本明細書内の他の箇所に開示される方法を使用した、宿主胚への細胞の導入及び宿主胚の懐胎後、ドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞から生成され得る。
【０２４３】
増加は、適切な対照物と比較した場合の、任意の統計的に有意な増加であり得る。例えば、増加は、適切な対照物と比較した場合、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または５倍であり得る。
【０２４４】
例えば、表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、本明細書に開示される組合せを使用することによって増加し得る。いくつかの方法では、表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるように改変されていないＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつＳｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるようにさらに改変されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫ではより高い。同様に、いくつかの方法では、表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変されていないＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつＳｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるようにさらに改変されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫ではより高い。
【０２４５】
いくつかの方法では、表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、適切な対照培地（例えば、ＤＭＥＭに基づく培地）中で培養されるＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつ雌化培地中で培養されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫ではより高い。同様に、いくつかの方法では、表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変されていないＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつ雌化培地中で培養されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫ではより高い。
【０２４６】
繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージはまた、本明細書に開示される組合せを使用することによって増加し得る。いくつかの方法では、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるように改変されていないＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつＳｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるようにさらに改変されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫ではより高い。同様に、いくつかの方法では、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変されていないＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつＳｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるようにさらに改変されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫ではより高い。
【０２４７】
いくつかの方法では、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、適切な対照培地（例えば、ＤＭＥＭに基づく培地）中で培養されるＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつ雌化培地中で培養されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫ではより高い。同様に、いくつかの方法では、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変されていないＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつ雌化培地中で培養されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫ではより高い。
【０２４８】
繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージはまた、本明細書に開示される組合せを使用することによって増加し得る。いくつかの方法では、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージは、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるように改変されていないＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつＳｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるようにさらに改変されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。同様に、いくつかの方法では、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージは、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変されていないＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつＳｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるようにさらに改変されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。
【０２４９】
いくつかの方法では、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージは、適切な対照培地（例えば、ＤＭＥＭに基づく培地）中で培養されるＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつ雌化培地中で培養されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。同様に、いくつかの方法では、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージは、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変されていないＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつ雌化培地中で培養されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。
【０２５０】
正常な同腹仔数及び／または正常な産子数（例えば、野生型雌動物と比較して）を産生することができるＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージはまた、本明細書に開示される組合せを使用することによって増加し得る。いくつかの方法では、正常な同腹仔数及び／または正常な産子数を産生することができるＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージは、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるように改変されていないＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつＳｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるようにさらに改変されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。同様に、いくつかの方法では、正常な同腹仔数及び／または正常な産子数を産生することができるＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージは、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変されていないＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつＳｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるようにさらに改変されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。
【０２５１】
いくつかの方法では、正常な同腹仔数及び／または正常な産子数を産生することができるＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージは、適切な対照培地（例えば、ＤＭＥＭに基づく培地）中で培養されるＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつ雌化培地中で培養されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。同様に、いくつかの方法では、正常な同腹仔数及び／または正常な産子数を産生することができるＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージは、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変されていないＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつ雌化培地中で培養されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。
【０２５２】
Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される平均産子数はまた、本明細書に開示される組合せを使用することによって増加し得る。いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される平均産子数は、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるように改変されていないＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつＳｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるようにさらに改変されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。同様に、いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される平均産子数は、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変されていないＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつＳｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるようにさらに改変されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【０２５３】
いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される平均産子数は、適切な対照培地（例えば、ＤＭＥＭに基づく培地）中で培養されるＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつ雌化培地中で培養されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。同様に、いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される平均産子数は、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変されていないＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつ雌化培地中で培養されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【０２５４】
Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における同腹仔の平均数はまた、本明細書に開示される組合せを使用することによって増加し得る。いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における同腹仔の平均数は、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるように改変されていないＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつＳｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるようにさらに改変されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。同様に、いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における同腹仔の平均数は、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変されていないＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつＳｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるようにさらに改変されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【０２５５】
いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における同腹仔の平均数は、適切な対照培地（例えば、ＤＭＥＭに基づく培地）中で培養されるＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつ雌化培地中で培養されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。同様に、いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における同腹仔の平均数は、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変されていないＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつ雌化培地中で培養されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【０２５６】
Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における子孫の平均数はまた、本明細書に開示される組合せを使用することによって増加し得る。いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における子孫の平均数は、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるように改変されていないＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつＳｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるようにさらに改変されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。同様に、いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における子孫の平均数は、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変されていないＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつＳｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させるようにさらに改変されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【０２５７】
いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における子孫の平均数は、適切な対照培地（例えば、ＤＭＥＭに基づく培地）中で培養されるＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつ雌化培地中で培養されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。同様に、いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における子孫の平均数は、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変されていないＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変され、かつ雌化培地中で培養されたドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【０２５８】
Ｂ．インビトロ細胞培養物及び培養下で多能性または全能性細胞を培養して維持する方法
Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変されたドナーＸＹ多能性または全能性細胞を含むインビトロ細胞培養物がさらに提供される。本明細書内の他の箇所に開示されるような雌化培地中で培養されるドナーＸＹ多能性または全能性を含むインビトロ細胞培養物もまた提供される。このような細胞を維持または培養するための方法及び組成物もまた提供される。細胞は、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させる改変をさらに含み得る。同様に、ＸＹ多能性または全能性細胞は、標的ゲノム遺伝子座に対して少なくとも１つの追加の標的遺伝子改変をさらに含み得る。
【０２５９】
インビトロ培養物中でＸＹ多能性または全能性細胞を維持または培養する方法が提供され、細胞は、本明細書に記載されるような雌化培地の存在下においてインビトロ培養物中で維持される。同様に、インビトロ培養物中でＸＹ多能性または全能性細胞を維持または培養する方法が提供され、細胞は、Ｙ染色体の領域をサイレンシングする改変を含み、細胞は、本明細書に記載される条件下においてインビトロ培養物中で維持される。インビトロ培養物中でＸＹ多能性または全能性細胞を維持または培養するこのような方法は、宿主胚への非ヒト動物ＸＹ  ＥＳ細胞の導入時、及び宿主胚の懐胎後、繁殖可能なＸＹ  Ｆ０雌動物数の増加を促進することなどである。
【０２６０】
本明細書に開示される任意の培地が、このような維持または培養方法のために用いられ得るが、１つの非限定的な例としては、培養下でＸＹ多能性または全能性細胞を維持または培養するのに好適な基本培地及び添加物を含む培地中で培養することが挙げられる。例えば、培地は、本明細書内の他の箇所に開示されるような雌化培地（例えば、基本培地または基本培地及び添加物を含む培地が、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を示す低オスモル濃度培地）を含み得る。
【０２６１】
ＸＹ多能性または全能性細胞が雌化培地中で維持される時間は、変動し得る。例えば、ＸＹ多能性または全能性細胞は、宿主胚への導入前に約または少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、もしくは１３日間、または２週間、３週間、もしくは４週間の間、培地中で維持され得る（例えば、宿主胚への導入前に約もしくは少なくとも３日間、約もしくは少なくとも１週間、または約もしくは少なくとも２〜４週間、培地中で維持される）。同様に、ＸＹ多能性または全能性細胞は、宿主胚への導入前に１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、もしくは１３日間、または２週間、３週間、もしくは４週間以下の間、培地中で維持され得る。あるいは、ＸＹ多能性または全能性細胞は、雌化培地（例えば、繁殖可能なＸＹ  Ｆ０雌を促進する）中で維持（例えば、凍結）され得、次いで、雌化培地（例えば、繁殖可能なＸＹ  Ｆ０雌を促進する）中で解凍されて、ＸＹ多能性または全能性細胞が宿主胚に導入される前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、またはそれを超える日数の間、その培地中で維持され得る。同様に、ＸＹ多能性または全能性細胞は、雌化培地（例えば、繁殖可能なＸＹ  Ｆ０雌を促進する）中で維持（例えば、凍結）され得、次いで、雌化培地（例えば、繁殖可能なＸＹ  Ｆ０雌を促進する）中で解凍されて、ＸＹ多能性または全能性細胞が宿主胚に導入される前に１日間、２日間、３日間、４日間、またはそれを超える日数以下の間、その培地中で維持され得る。例えば、ＸＹ多能性または全能性細胞は、雌化培地中で少なくとも１回継代され得、その後、細胞が雌化培地中で凍結されて、その後、細胞が雌化培地中で解凍されて、宿主胚への導入前に約または少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、もしくは１３日間、または２週間、３週間、もしくは４週間の間、成長させる。あるいは、ＸＹ多能性または全能性細胞は、雌化培地中で少なくとも１回継代され得、その後、細胞が雌化培地中で凍結されて、その後、細胞が雌化培地中で解凍されて、宿主胚への導入前に１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、もしくは１３日間、または２週間、３週間、もしくは４週間以下の間、成長させる。
【０２６２】
いくつかの方法では、ＸＹ多能性または全能性細胞は、細胞を胚に注入するまで雌化培地中で培養または維持される。その他の方法では、ＸＹ多能性または全能性細胞が注入された胚は、代理母に移入されるまで雌化培地中で培養または維持される。
【０２６３】
Ｃ．Ｆ０世代において繁殖可能なＸＹ雌を生成することができる胚
Ｙ染色体の領域をサイレンシングするように改変された少なくとも１種の異種ドナー多能性または全能性ＸＹ細胞を有する内部細胞塊を含むＦ０胚がさらに提供される。同様に、本明細書内の他の箇所に開示されるような雌化培地中で培養または維持された少なくとも１種の異種ドナー多能性または全能性ＸＹ細胞を有する内部細胞塊を含むＦ０胚がさらに提供される。異種ドナー多能性または全能性ＸＹ細胞は、本明細書に開示される方法によって生成され得る。異種ドナー多能性または全能性ＸＹ細胞は、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させる改変をさらに含み得る。同様に、異種ドナー多能性または全能性ＸＹ細胞は、標的ゲノム遺伝子座に対して少なくとも１つの追加の標的遺伝子改変をさらに含み得る。
【０２６４】
このような胚は、ドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞を宿主胚に導入することによって生成され得る。例えば、胚は前桑実期胚であり得、胚は、ドナーＸＹ多能性または全能性細胞の導入後に胚盤胞期まで培養され得る。ドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞が雌化培地（例えば、低オスモル濃度培地）中で培養される方法では、動物ＸＹ多能性または全能性細胞は、宿主胚に導入される前に、任意の時間で雌化培地中において維持され得る。例えば、動物ＸＹ多能性または全能性細胞は、宿主胚への導入前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、雌化培地中で維持され得る。あるいは、動物ＸＹ多能性または全能性細胞は、宿主胚への導入前に１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間以下の間、雌化培地中で維持され得る。
【０２６５】
一部のＦ０胚では、異種ドナー多能性もしくは全能性ＸＹ細胞及び／または宿主胚は、以下のうち１種以上に由来していない：Ａｋｏｄｏｎ属種、Ｍｙｏｐｕｓ属種、Ｍｉｃｒｏｔｕｓ属種、Ｔａｌｐａ属種。同様に、いくつかの方法では、異種ドナー多能性もしくは全能性ＸＹ細胞及び／または宿主胚は、正常な野生型の特性がＸＹ雌の繁殖力である任意の種に由来していない。異種ドナー多能性もしくは全能性細胞及び／または宿主胚が追加の遺伝子改変を含む、いくつかの方法では、遺伝子改変は、ＸＹＹもしくはＸＸＹ、Ｔｄｙ陰性（すなわち、Ｓｒｙ陰性）性転換、Ｔｄｙ陽性性転換、Ｘ０改変、異数性、Ｆｇｆ９−／−遺伝子型、またはＳｏｘ９改変ではない。
【０２６６】
Ｄ．繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌及びＦ１子孫を生成する方法
Ｙ染色体の領域のサイレンシングを含む改変を有するＸＹ多能性または全能性細胞を用いる様々な方法及び組成物が、標的ゲノム遺伝子座に対して追加の標的遺伝子改変を場合により含む繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌動物を生成するために使用され得る。同様に、本明細書内の他の箇所に開示されるような雌化培地中で培養または維持されるＸＹ多能性または全能性細胞を用いる様々な方法及び組成物が、標的ゲノム遺伝子座に対して追加の標的遺伝子改変を場合により含む繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌動物を生成するために使用され得る。例えば、本明細書に開示される方法によって生成されるＦ０  ＸＹ雌動物は、Ｆ１世代を生成するために野生型動物と交雑させた場合に繁殖可能であり得る。
【０２６７】
ｉ．Ｆ０世代において繁殖可能な雌ＸＹ動物を作製する方法
Ｆ０世代において繁殖可能な雌ＸＹ動物を作製するための方法及び組成物が提供される。このような方法によって生成され、得られた繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物もまた提供される。Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を作製する方法は、（ａ）本明細書内の他の箇所に開示される改変ドナーＸＹ多能性または全能性細胞（すなわち、Ｆ０世代において繁殖可能なＸＹ雌を生成することができるドナーＸＹ多能性または全能性細胞）のいずれかを宿主胚に導入すること、（ｂ）ステップ（ａ）の宿主胚をレシピエント雌動物に導入して、宿主胚を懐胎させること、及び（ｃ）表現型的に雌のＸＹ動物を含むＦ０  ＸＹ動物子孫を得て、性成熟に達すると、Ｆ０の表現型的に雌のＸＹ動物が繁殖可能になることを含み得る。Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を作製するその他の方法は、（ａ）本明細書内の他の箇所に開示される改変胚のいずれかをレシピエント雌動物に導入して、胚を懐胎させること、及び（ｂ）表現型的に雌のＸＹ動物を含むＦ０  ＸＹ動物子孫を得て、性成熟に達すると、Ｆ０の表現型的に雌のＸＹ動物が繁殖可能になることを含み得る。
【０２６８】
胚に移植された細胞は「ドナー細胞」と称され得、細胞を受容した胚は「宿主胚」と称され得る。いくつかの方法では、ドナーＸＹ多能性もしくは全能性細胞または宿主胚は、標的ゲノム遺伝子座に対して少なくとも１つの追加の標的遺伝子改変を含み得る。例えば、用いられるＸＹ多能性または全能性細胞は、（１）Ｙ染色体の領域をサイレンシングするための改変及び（２）１つ以上の標的ゲノム遺伝子座に対する１つ以上の追加の標的遺伝子改変を含み得る。このような改変は、本明細書内の他の箇所で詳細に開示される。本明細書内の他の箇所で概略が述べられるように、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれを超える追加の標的遺伝子改変が、ＸＹ多能性または全能性細胞で行われ得る。このような場合では、Ｆ０の繁殖可能な雌ＸＹ動物は、これらの追加の標的遺伝子改変のうち１つ以上を含み得る。遺伝子改変ゲノム遺伝子座を持つ動物は、本明細書に記載されるような対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイによって同定され得る。
【０２６９】
ドナーＸＹ多能性または全能性細胞は、宿主胚と同じ系統に由来し得る、または宿主胚とは異なる系統に由来し得る。同様に、代理母は、ドナーＸＹ多能性もしくは全能性細胞及び／もしくは宿主胚と同じ系統に由来し得る、または代理母は、ドナーＸＹ多能性もしくは全能性細胞及び／もしくは宿主胚の系統とは異なる系統に由来し得る。
【０２７０】
ＸＹ多能性または全能性細胞の遺伝子型は、宿主胚の遺伝子型と同じ、または異なるものであり得る。例えば、ＸＹドナー細胞は、ＸＸ宿主胚に移植され得る。
【０２７１】
様々な宿主胚が用いられ得る。ＸＹドナー細胞は、例えば、２細胞期、４細胞期、８細胞期、１６細胞期、３２細胞期、または６４細胞期の宿主胚に移植され得る。例えば、ＸＹ多能性または全能性細胞は、対応する生物からの前桑実期胚（例えば、８細胞期胚）中に導入され得る。例えば、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、及びＵＳ２００８−００７８０００Ａ１を参照し、その各々全体が参照によって本明細書に組み込まれる。同様に、宿主胚は、例えば、胚盤胞、前胚盤胞胚、前桑実期、桑実期、非小型化桑実期、または小型化桑実期であり得る。あるいは、宿主胚は、凝集した桑実期宿主胚であり得る。マウスの場合には、宿主胚期は、Ｔｈｅｉｌｅｒ（１９８９）“Ｔｈｅ  Ｈｏｕｓｅ  Ｍｏｕｓｅ：Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されているタイラーステージを参照して、例えば、タイラーステージ１（ＴＳ１）、ＴＳ２、ＴＳ３、ＴＳ４、ＴＳ５、またはＴＳ６胚であり得る（例えば、ＴＳ１、ＴＳ２、ＴＳ３、及びＴＳ４から選択される）。宿主胚が透明帯を含む方法では、ドナー細胞（例えば、及びＸＹ  ＥＳ細胞）は、透明帯の穴を通して宿主胚に導入され得る。透明帯のない胚も使用され得る。
【０２７２】
いくつかの方法では、ドナー多能性もしくは全能性細胞及び／または宿主胚は、以下のうち１種以上に由来していない：Ａｋｏｄｏｎ属種、Ｍｙｏｐｕｓ属種、Ｍｉｃｒｏｔｕｓ属種、Ｔａｌｐａ属種。同様に、いくつかの方法では、ドナー細胞及び／または宿主胚は、正常な野生型の特性がＸＹ雌の繁殖力である任意の種に由来していない。ドナー細胞及び／または宿主胚が追加の遺伝子改変を含む、いくつかの方法では、遺伝子改変は、ＸＹＹもしくはＸＸＹ、Ｔｄｙ陰性（すなわち、Ｓｒｙ陰性）性転換、Ｔｄｙ陽性性転換、Ｘ０改変、異数性、Ｆｇｆ９−／−遺伝子型、またはＳｏｘ９改変ではない。
【０２７３】
核移植技術もまた、動物を生成するために使用され得る。簡潔に述べると、核移植の方法は、以下のステップを含み得る：（１）卵母細胞を除核すること、（２）除核卵母細胞と組み合わせるためにドナー細胞または核を単離すること、（３）細胞または核を除核卵母細胞に挿入して、再構成細胞を形成すること、（４）再構成細胞を動物の子宮に移植して、胚を形成すること、及び（５）胚を発達させること。このような方法では、卵母細胞は一般に死亡動物から回収されるが、それらはまた、生存動物の卵管及び／または卵巣のいずれかから単離されてもよい。卵母細胞は、除核前に当業者に既知の様々な培地中で成熟させられ得る。卵母細胞の除核は、当業者に周知の多数の手法で実施され得る。再構成細胞を形成するための除核卵母細胞へのドナー細胞または核の挿入は、通常、融合前の透明帯下におけるドナー細胞のマイクロインジェクションによるものである。融合は、接触／融合面（電気融合）に対するＤＣ電気パルスの印加によって、ポリエチレングリコールなどの融合促進化学物質への細胞の曝露によって、またはセンダイウイルスなどの不活化ウイルスによって誘導されてよい。再構成細胞は、典型的には、核ドナー及びレシピエント卵母細胞の融合前、融合中、及び／または融合後に電気的及び／または非電気的手段によって活性化される。活性化方法としては、電気パルス、化学的誘導ショック、精子による侵入、卵母細胞中の二価カチオンのレベル増加、及び卵母細胞中の（キナーゼ阻害剤によるような）細胞タンパク質のリン酸化低減が挙げられる。活性化再構成細胞、または胚は、典型的には当業者に周知の培地中で培養され、次いで、動物の子宮に移入される。例えば、ＵＳ２００８／００９２２４９、ＷＯ１９９９／００５２６６Ａ２、ＵＳ２００４／０１７７３９０、ＷＯ２００８／０１７２３４Ａ１、及び米国特許第７，６１２，２５０号明細書を参照し、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２７４】
ドナーＸＹ多能性または全能性細胞を含む宿主胚は、胚盤胞期までインキュベートされ、次いで、代理母に移植されてＦ０動物を生成し得る。次いで、宿主胚は代理母内で懐胎され得る。
【０２７５】
いくつかの方法では、ドナーＸＹ多能性または全能性細胞を含む宿主胚は、好適な宿主への移植前に１日間、２日間、３日間、もしくは４日間またはそれを超える日数にわたって、繁殖可能なＸＹ雌ＥＳ細胞の発達を促進する雌化培地（例えば、低オスモル濃度培地または低塩基本培地）中で維持され得る。あるいは、ドナーＸＹ多能性または全能性細胞を含む宿主胚は、好適な宿主への移植前に少なくとも１日間、２日間、３日間、もしくは４日間もしくはそれを超える日数または１日間、２日間、３日間、もしくは４日間もしくはそれを超える日数以下にわたって、繁殖可能なＸＹ雌ＥＳ細胞の発達を促進する雌化培地（例えば、低オスモル濃度培地または低塩基本培地）中で維持され得る。提供されるこのような方法は、繁殖可能なＦ０の雌動物の生成を促進し得る。
【０２７６】
いくつかの方法では、宿主胚へのドナー非ヒト動物ＸＹ多能性または全能性細胞（例えば、ＸＹ  ＥＳ細胞またはＸＹ  ｉＰＳ細胞）の導入及び宿主胚の懐胎時に、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または全てのＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫が、表現型的に雌のＸＹ動物である。
【０２７７】
これらの方法によって生成されるＦ０  ＸＹ雌動物の繁殖力及び妊孕力は、野生型ＸＸ雌動物と同等であり得る。いくつかの方法では、宿主胚へのドナー非ヒト動物ＸＹ多能性または全能性細胞（例えば、ＸＹ  ＥＳ細胞またはＸＹ  ｉＰＳ細胞）の導入及び宿主胚の懐胎時に、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または全てのＦ０子孫が、性成熟に達すると繁殖可能になる表現型的に雌のＸＹ動物である。
【０２７８】
いくつかの方法では、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または全てのＦ０  ＸＹ子孫が、性成熟に達すると繁殖可能になる表現型的に雌のＸＹ動物である。
【０２７９】
いくつかの方法では、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または全ての、ドナーＸＹ多能性または全能性細胞に由来するＦ０雌が、ＸＹ遺伝子型を有する。
【０２８０】
いくつかの方法では、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または全ての、ドナーＸＹ多能性または全能性細胞に由来するＦ０雌が、繁殖可能である。
【０２８１】
いくつかの方法では、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または全ての、ドナーＸＹ多能性または全能性細胞に由来するＦ０雌が、野生型ＸＸ雌マウスと同等の同腹仔数及び／または一腹当たりの仔数及び／または一生涯における子孫数を産生することができる。いくつかの方法では、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌非ヒト動物は、その生涯の間に１匹、２匹、３匹、４匹、５匹、６匹、７匹、８匹、９匹、または１０匹の同腹仔を産生し得る（例えば、２〜６匹の同腹仔）。いくつかの方法では、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または全ての、ドナーＸＹ多能性または全能性細胞に由来するＦ０雌が、それらの生涯において１匹、２匹、３匹、４匹、５匹、６匹、７匹、８匹、９匹、または１０匹の同腹仔を産生することができる（例えば、２〜６匹の同腹仔）。いくつかの方法では、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌非ヒト動物は、一腹当たり少なくとも１匹、２匹、３匹、４匹、５匹、６匹、７匹、８匹、９匹、または１０匹の子孫（すなわち、仔）を産生し得る（例えば、一腹当たり４〜６匹の子孫）。いくつかの方法では、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または全ての、ドナーＸＹ多能性または全能性細胞に由来するＦ０雌が、一腹当たり少なくとも１匹、２匹、３匹、４匹、５匹、６匹、７匹、８匹、９匹、または１０匹の子孫（すなわち、仔）を有する同腹仔を産生することができる（例えば、一腹当たり４〜６匹の子孫）。例えば、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌非ヒト動物は、２〜６匹の同腹仔を産生し得、各同腹仔は、少なくとも２匹、３匹、４匹、５匹、または６匹の子孫を有する。いくつかの方法では、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の子孫が、繁殖可能なＸＹ雌子孫である（例えば、１５％〜２５％の子孫が繁殖可能なＸＹ雌子孫である）。
【０２８２】
その他の実施形態では、このような方法から生成されるＦ０子孫は、約３％、約１０％以上、または約６３％以上ドナーＸＹ多能性または全能性細胞に由来する。
【０２８３】
本明細書で提供される方法及び組成物は、少なくとも１％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％またはそれを超えるＦ０動物が、Ｆ１子孫に遺伝子改変を伝達するために、標的遺伝子改変（例えば、Ｙ染色体の領域のサイレンシングをもたらす標的遺伝子改変及び／または別の標的ゲノム遺伝子座に対する標的遺伝子改変）を有することを可能にする。
【０２８４】
いくつかの方法では、１匹以上のＦ０世代雌ＸＹ非ヒト動物（例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または全てのＦ０世代雌ＸＹ非ヒト動物）は、少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、または９９．８％ドナーＸＹ多能性または全能性細胞に由来する。例えば、１匹以上のＦ０雌ＸＹ非ヒト動物は、ドナーＸＹ多能性または全能性細胞に１００％由来する毛色を有し得る。Ｆ０世代における非ヒト雌ＸＹ動物に対する宿主胚細胞の寄与は、例えば、２，０００分の１細胞（０．０５％）を検出することができる定量アッセイによって決定され得、雌ＸＹ動物の組織には、宿主胚細胞の寄与について陽性であるものは一切ない。
【０２８５】
ｉｉ．繁殖可能な雌ＸＹ  Ｆ０世代を交配させる方法
いくつかの方法では、Ｙ染色体の領域をサイレンシングする遺伝子改変を有するＸＹ多能性または全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞またはＸＹ  ｉＰＳ細胞）に由来する、得られた繁殖可能なＸＹ雌Ｆ０世代を動物と交雑させて、Ｆ１世代子孫を得る。Ｆ０世代雌ＸＹ非ヒト動物は、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または完全にドナーＸＹ多能性または全能性細胞（例えば、ＸＹ  ＥＳ細胞）に由来し得る。
【０２８６】
同様に、本明細書に開示される任意のその他の方法による（例えば、本明細書内の他の箇所に開示されるような低オスモル濃度培地またはその他の雌化培地の使用によって）ＸＹ多能性または全能性細胞に由来する、得られた繁殖可能なＸＹ雌Ｆ０世代を動物と交雑させて、Ｆ１世代子孫を得ることができる。Ｆ０世代雌ＸＹ非ヒト動物は、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または完全にドナーＸＹ多能性または全能性細胞（例えば、ＸＹ  ＥＳ細胞）に由来し得る。子孫（例えば、Ｆ１子孫及び／または子孫のうち任意の、もしくは全てのその他の世代）は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または全てのＸＹ子孫が、正常な雄の表現型を有する、または正常な雄の表現型を有し、かつ繁殖可能であるようにし得る。いくつかの場合には、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、または０％のＸＹ子孫（例えば、Ｆ１子孫及び／または子孫のうち任意の、もしくは全てのその他の世代）が、表現型的に雌である。いくつかの場合には、全てのＸＹ子孫（例えば、Ｆ１子孫及び／または子孫のうち任意の、もしくは全てのその他の世代）が、正常な雄の表現型を有する、または正常な雄の表現型を有し、かつ繁殖可能である。いくつかの場合には、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または全ての子孫が、遺伝子型（すなわち、ＸＹまたはＸＸ）に基づいて予想された性表現型（すなわち、雄または雌）を有する。
【０２８７】
Ｆ０世代雌ＸＹ非ヒト動物が交配され得る非ヒト動物は、これもまた、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または完全にドナーＸＹ多能性または全能性細胞（例えば、ＸＹ  ＥＳ細胞）に由来する雄ＸＹ非ヒト動物であり得る。例えば、Ｆ０雌ＸＹ非ヒト動物及び／または雄ＸＹ非ヒト動物は、ドナーＸＹ多能性または全能性細胞に１００％由来する毛色を有し得る。Ｆ１世代子孫を得るために使用される交配対は各々、同じＦ０世代においてドナーＸＹ多能性または全能性細胞（例えば、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞）に完全に由来し得る。例えば、Ｆ０  ＸＹ雄は、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と同じＸＹ多能性または全能性細胞（例えば、ＸＹ  ＥＳ細胞）クローンに由来するコホートクローン兄弟であり得る。次いで、Ｆ１世代子孫は、ドナーＥＳ細胞に完全に由来するゲノムを含み得る。いくつかの場合には、完全にＥＳ細胞由来のマウスを生じるＦ０世代雄及びＦ０世代雌マウスの交雑頻度は、１００％である。
【０２８８】
Ｆ１子孫は、Ｙ染色体の領域のサイレンシングを含む標的遺伝子改変が存在するかどうかを決定するために特異的プライマー及び／またはプローブを使用して、その遺伝子型が同定され得る。追加の標的遺伝子改変がＦ０世代中に存在した場合（例えば、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／もしくは活性を減少させる改変、または標的ゲノム遺伝子座に対する１つ以上の追加の標的遺伝子改変）、Ｆ１子孫は、このような改変が存在するかどうかを決定する特異的プライマー及び／またはプローブを使用して、その遺伝子型が同定され得る。次いで、所望の使用のために適切なＦ１子孫が同定され得る。例えば、Ｙ染色体の領域のサイレンシングを含む遺伝子改変を欠いているＦ１子孫が選択され得る、またはＹの領域のサイレンシングを含む遺伝子改変を欠いているが、標的ゲノム遺伝子座に対して少なくとも１つの追加の標的遺伝子改変を含むＦ１子孫が選択され得る。特異的プライマー及び／またはプローブで遺伝子型を同定した後、標的ゲノム遺伝子座に対する追加の標的遺伝子改変についてヘテロ接合体であり、Ｙ染色体の領域のサイレンシングを含む遺伝子改変を欠いているＦ１動物を互いに交雑させ得る。このような交雑によって、対象となる遺伝子改変ゲノム遺伝子座についてホモ接合体であり、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするための遺伝子改変を含まないＦ２子孫が生成される。
【０２８９】
Ｆ１世代において標的ゲノム遺伝子座に対する標的遺伝子改変についてホモ接合体のトランスジェニック非ヒト動物を生成する方法がさらに提供される。本方法は、（ａ）Ｙ染色体の領域のサイレンシングを含む改変を有する繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌非ヒト動物を、Ｆ０  ＸＹ雄非ヒト動物と交雑させて、ここで繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌非ヒト動物及びＦ０  ＸＹ雄非ヒト動物が各々、標的ゲノム遺伝子座に対する標的遺伝子改変についてヘテロ接合体であること、ならびに（ｂ）標的ゲノム遺伝子座に対する標的遺伝子改変についてホモ接合体であるＦ１子孫を得ることを含む。いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雄は、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と同じ多能性または全能性細胞クローンに由来するコホートクローン兄弟である。例えば、標的ゲノム遺伝子座に対する標的遺伝子改変についてホモ接合体であるが、Ｙ染色体の領域をサイレンシングする改変を欠いているＦ１子孫が選択され得る。繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌が、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させる改変をさらに含む場合、標的ゲノム遺伝子座に対する標的遺伝子改変についてホモ接合体であるが、Ｙ染色体の領域をサイレンシングする改変ならびにＳｒｙタンパク質のレベル及び／または活性を減少させる改変の一方または両方を欠いているＦ１子孫が選択され得る。
【０２９０】
Ｅ．標的遺伝子改変を作製する方法
標的遺伝子改変（例えば、Ｙ染色体の領域をサイレンシングする、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／もしくは活性を減少させる、または本明細書内の他の箇所に開示されるような任意の追加の標的ゲノム遺伝子座を改変する）を作製するための様々な方法及び組成物が使用され得る。標的遺伝子改変を作製する１つの手段は組換えによるものであり、これは２つのポリヌクレオチド間における遺伝情報の交換という任意のプロセスを含む。二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答する組換えは、主として２つの保存されたＤＮＡ修復経路：すなわち、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換え（ＨＲ）によって生じる。Ｋａｓｐａｒｅｋ＆Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ＆Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２：８８６−８９７を参照し、その全体があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。ＮＨＥＪは、相同鋳型の必要なく、切断末端を互いに直接連結することによる核酸の二本鎖切断の修復を含む。ＮＨＥＪによる不連続配列の連結によって、多くの場合に二本鎖切断部位の近傍に欠失、挿入、または転座がもたらされ得る。このようなシステムは、例えば、標的機能喪失遺伝子改変の生成に用途を見出す。
【０２９１】
組換えはまた、相同組換え修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）によって生じ得る。ＨＤＲまたはＨＲは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし得る核酸修復の形態を含み、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経た分子）の鋳型修復に「ドナー」分子を使用して、ドナーから標的に遺伝情報の移動をもたらす。任意の特定の理論に束縛されることを望むものではないが、このような移動は、切断された標的とドナーとの間で形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、及び／または標的の一部となることになる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される合成依存性鎖アニーリング、及び／または関連プロセスを伴い得る。いくつかの場合には、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部は、標的ＤＮＡ中に組み込まれる。このような標的遺伝子改変を生成する非限定的な方法は、本明細書内の他の箇所で詳細に述べられ、例えば、標的化プラスミド、小さな標的化ベクター（ｓｍａｌｌＴＶＥＣ）、または大きな標的化ベクターの使用を含む。また、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  １５３：９１０−９１８、Ｍａｎｄａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ４５７６８：１−９、及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０−５３２も参照し、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２９２】
標的遺伝子改変を作製する方法は、例えば、標的化ベクター（例えば、ｓｍａｌｌＴＶＥＣまたはＬＴＶＥＣ）を、単独でまたは本明細書内の他の箇所に記載されるような１種以上のヌクレアーゼと組み合わせたいずれかで使用することを含み得る。例えば、ＵＳ２０１５／０１５９１７５、ＵＳ２０１５／０１５９１７４、ＵＳ２０１４／０３１０８２８、ＵＳ２０１４／０３０９４８７、及びＵＳ２０１３−０３０９６７０を参照し、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。同様に、標的遺伝子改変を作製する方法は、１種以上のヌクレアーゼを、単独でまたは標的化ベクターと組み合わせたいずれかで使用することを含み得る。
【０２９３】
例えば、細胞において標的ゲノム遺伝子座（例えば、Ｙ染色体上の）を改変するための方法が提供され、本方法は以下を含む：（ａ）細胞に、標的ゲノム遺伝子座の、またはその近傍の認識部位に１つ以上のニックまたは二本鎖切断を誘導する１種以上のヌクレアーゼ剤を導入すること、及び（ｂ）細胞のゲノム中、標的ゲノム遺伝子座に改変を含む少なくとも１種の細胞を同定すること。
【０２９４】
細胞中の標的ゲノム遺伝子座を改変するその他の方法は、以下を含む：（ａ）細胞に、５’及び３’標的部位に対応する５’及び３’相同腕に隣接する挿入ポリヌクレオチドを含む標的化ベクターを導入すること、ならびに（ｂ）細胞のゲノム中、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１種の細胞を同定すること。
【０２９５】
細胞中の標的ゲノム遺伝子座を改変するその他の方法は、以下を含む：（ａ）細胞に、以下を導入すること、（ｉ）ヌクレアーゼ剤、ここでヌクレアーゼ剤は、標的ゲノム遺伝子座内の認識部位にニックまたは二本鎖切断を誘導する、ならびに（ｉｉ）認識部位に十分に近接して位置する５’及び３’標的部位に対応する５’及び３’相同腕に隣接する挿入核酸を含む標的化ベクター、ならびに（ｃ）標的ゲノム遺伝子座に改変（例えば、挿入核酸の組込み）を含む少なくとも１種の細胞を同定すること。
【０２９６】
Ｙ染色体の領域をサイレンシングする標的遺伝子改変ならびに任意のその他の標的遺伝子改変（例えば、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／もしくは活性を減少させる改変、または任意の標的ゲノム遺伝子座に対する標的遺伝子改変）は、多能性または全能性ＸＹ細胞が、本明細書内の他の箇所に開示される雌化培地（例えば、低オスモル濃度培地）（例えば、繁殖可能なＸＹ  Ｆ０雌の発達を促進する培地）中で維持されている間に生じ得る。あるいは、Ｙ染色体の領域をサイレンシングする標的遺伝子改変及び／または任意のその他の標的ゲノム遺伝子座における標的遺伝子改変は、多能性または全能性ＸＹ細胞が、異なる培養培地中で維持されている間に生じ得る。場合により、細胞は、続いて本明細書内の他の箇所に開示される雌化培養培地（例えば、低オスモル濃度培地）（例えば、繁殖可能なＸＹ  Ｆ０雌の発達を促進する培地）に移され得る。
【０２９７】
Ｙ染色体の領域をサイレンシングする標的遺伝子改変ならびに任意のその他の標的遺伝子改変（例えば、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／もしくは活性を減少させる改変、または任意のその他の標的ゲノム遺伝子座に対する標的遺伝子改変）は、同時にまたは連続して導入され得る。
【０２９８】
ｉ．ヌクレアーゼ剤
所望の認識部位にニックまたは二本鎖切断を誘導する任意のヌクレアーゼ剤が、本明細書に開示される方法及び組成物で使用され得る。天然に存在する、もしくは天然ヌクレアーゼ剤が用いられ得る、または改変もしくは操作ヌクレアーゼ剤（例えば、所望の認識部位におけるニックもしくは二本鎖切断を特異的に認識して誘導するために、その天然型から操作される（改変もしくは誘導される）ヌクレアーゼ）が用いられ得る。
【０２９９】
１種のヌクレアーゼ剤は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、天然もしくは操作転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター、またはその機能部分を、例えば、ＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合させることによって作製される。ＷＯ２０１０／０７９４３０、Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＰＮＡＳ  １０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１３１３３１０７、Ｓｃｈｏｌｚｅ＆Ｂｏｃｈ（２０１０）Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  １：４２８−４３２、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）１８６：７５７−７６１、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１０）ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ７０４、及びＭｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９：１４３−１４８を参照し、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。好適なＴＡＬヌクレアーゼの例、及び好適なＴＡＬヌクレアーゼを調製する方法は、例えば、ＵＳ２０１１／０２３９３１５Ａ１、ＵＳ２０１１／０２６９２３４Ａ１、ＵＳ２０１１／０１４５９４０Ａ１、ＵＳ２００３／０２３２４１０Ａ１、ＵＳ２００５／０２０８４８９Ａ１、ＵＳ２００５／００２６１５７Ａ１、ＵＳ２００５／００６４４７４Ａ１、ＵＳ２００６／０１８８９８７Ａ１、及びＵＳ２００６／００６３２３１Ａ１に開示され、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３００】
別の種類のヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。一部のＺＦＮでは、ＺＦＮの各モノマーは、３つ以上のジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインは、３ｂｐのサブサイトに結合する。その他のＺＦＮでは、ＺＦＮは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立ヌクレアーゼに機能的に連結されるジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ剤は、第１ＺＦＮ及び第２ＺＦＮを含み得、第１ＺＦＮ及び第２ＺＦＮの各々は、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットに機能的に連結され、第１及び第２ＺＦＮは、約５〜７ｂｐスペーサーによって分離される標的ＤＮＡ配列の各鎖において２つの隣接標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは二量体化して、二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを作製する。例えば、ＵＳ２００６０２４６５６７、ＵＳ２００８０１８２３３２、ＵＳ２００２００８１６１４、ＵＳ２００３００２１７７６、ＷＯ／２００２／０５７３０８Ａ２、ＵＳ２０１３０１２３４８４、ＵＳ２０１００２９１０４８、ＷＯ／２０１１／０１７２９３Ａ２、及びＧａｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１（７）：３９７−４０５を参照し、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３０１】
別の種類のヌクレアーゼ剤は、メガヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼは、保存配列モチーフに基づく４つのファミリーに分類されていて、このファミリーは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈ−Ｎ−Ｈ、及びＨｉｓ−Ｃｙｓボックスファミリーである。これらのモチーフは、金属イオンの配位及びホスホジエステル結合の加水分解に関与する。メガヌクレアーゼは、それらの長い認識部位、及びそれらのＤＮＡ基質におけるいくつかの配列多型に対する耐性が注目すべき点である。メガヌクレアーゼドメイン、構造及び機能が知られている。例えば、Ｇｕｈａｎ  ａｎｄ  Ｍｕｎｉｙａｐｐａ（２００３）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３８：１９９−２４８、Ｌｕｃａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９：９６０−９、Ｊｕｒｉｃａ  ａｎｄ  Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（１９９９）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ５５：１３０４−２６、Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（２００６）Ｑ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３８：４９−９５、及びＭｏｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：７６４を参照のこと。
【０３０２】
ヌクレアーゼ剤は制限エンドヌクレアーゼをさらに含み得、これはＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型エンドヌクレアーゼを含む。Ｉ型及びＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、特異的認識部位を認識するが、典型的には、ヌクレアーゼ結合部位からの可変位置で切断し、これは切断部位（認識部位）から離れた数百もの塩基対であり得る。ＩＩ型系では、制限活性はいずれのメチラーゼ活性にも依存せず、切断は、典型的には結合部位内またはその近傍の特定部位で生じる。大半のＩＩ型酵素が回文配列を切り離すが、ＩＩａ型酵素は非回文認識部位を認識して、認識部位の外側で切断し、ＩＩｂ型酵素は認識部位の外側両方の部位で配列を２回切り離し、ＩＩｓ型酵素は非対称認識部位を認識し、片側で、かつ認識部位から約１〜２０ヌクレオチドの規定の距離で切断する。ＩＶ型制限酵素は、メチル化ＤＮＡを標的とする。制限酵素は、例えば、ＲＥＢＡＳＥデータベース（ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍのウェブページ、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：４１８−２０）、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：１８０５−１２、及びＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）ｉｎ  Ｍｏｂｉｌｅ  ＤＮＡ  ＩＩ，ｐｐ．７６１−７８３，Ｅｄｓ．Ｃｒａｉｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）でさらに記載かつ分類されていて、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３０３】
ヌクレアーゼ剤は、クラスター化して規則的な配置の短い回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系またはこのような系の成分をさらに含み得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓ遺伝子の発現に関与する、またはその活性を誘導する転写物及びその他の要素を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、核酸の部位特異的切断のためにＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合化されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）を利用する。例えば、ＷＯ／２０１３／１７６７７２Ａ１、ＷＯ／２０１４／０６５５９６Ａ１、ＷＯ／２０１４／０８９２９０Ａ１、ＷＯ／２０１４／０９３６２２Ａ２、ＷＯ／２０１４／０９９７５０Ａ２、ＷＯ／２０１３１４２５７８Ａ１、ＷＯ２０１４／１３１８３３Ａ１、ＵＳ２０１５／０１５９１７５、ＵＳ２０１５／０１５９１７４、ＵＳ２０１４／０３１０８２８、及びＵＳ２０１４／０３０９４８７を参照し、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３０４】
Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質は一般に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と相互作用する少なくとも１つのＲＮＡ認識または結合ドメイン、及び１つ以上のヌクレアーゼドメインを含む。Ｃａｓタンパク質は融合タンパク質でもあり得、例えば、遺伝子の転写または発現を制御する。例えば、Ｃａｓタンパク質は、切断ドメイン、エピジェネティック改変ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写リプレッサードメインに融合され得る。ＷＯ２０１４／０８９２９０を参照し、その全体があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。Ｃａｓ９ファミリーメンバーの例は、ＷＯ２０１４／１３１８３３に記載されていて、その全体があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３０５】
「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質に結合し、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化するＲＮＡ分子を含む。ガイドＲＮＡは、２つのセグメント、すなわち「ＤＮＡ標的化セグメント」及び「タンパク質結合セグメント」を含み得る。一部のｇＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡ分子を含む：（１）「アクチベーターＲＮＡ」（「トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」または「足場」）、及び（２）「ターゲッターＲＮＡ」（「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」または「ターゲッターＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ反復」）。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）及びｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントにおけるｄｓＲＮＡ二本鎖のうち半分を形成するヌクレオチドのストレッチの両方を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（アクチベーターＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントにおけるｄｓＲＮＡ二本鎖のうち他方の半分を形成するヌクレオチドのストレッチを含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチに相補的であり、それとハイブリダイズしてｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインにおけるｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言われ得る。
【０３０６】
その他のｇＲＮＡは、単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）であり、これは「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」、または「ｓｇＲＮＡ」とも呼ばれ得る。例えば、ＷＯ／２０１３／１７６７７２Ａ１、ＷＯ／２０１４／０６５５９６Ａ１、ＷＯ／２０１４／０８９２９０Ａ１、ＷＯ／２０１４／０９３６２２Ａ２、ＷＯ／２０１４／０９９７５０Ａ２、ＷＯ／２０１３１４２５７８Ａ１、及びＷＯ２０１４／１３１８３３Ａ１を参照し、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」という用語は、二重分子ｇＲＮＡ及び単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。
【０３０７】
ｃｒＲＮＡ及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡは、ハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントをさらに提供する。例えば、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８２３−８２６、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２２７−２２９、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３−２３９、及びＣｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８１９−８２３を参照し、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。Ｃａｓ９による標的ＤＮＡの部位特異的切断は、標的ＤＮＡ中における（ｉ）ｇＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対合相補性及び（ｉｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの両方によって決定される位置で生じ得る。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列に隣接し得る。
【０３０８】
ｉｉ．標的化ベクター
標的化ベクターは、核酸インサートをゲノム標的遺伝子座中に導入して、核酸インサート及び核酸インサートに隣接する相同腕を含むために用いられ得る。標的化ベクターは、線状形態または環状形態であり得、一本鎖または二本鎖であり得る。参照を容易にするために、相同腕は、本明細書において５’及び３’（すなわち、上流及び下流）相同腕と称される。本用語は、標的化ベクター内の核酸インサートに対する相同腕の相対位置に関する。５’及び３’相同腕は、標的遺伝子座内の領域に対応し、これらは本明細書においてそれぞれ「５’標的配列」及び「３’標的配列」と称される。
【０３０９】
核酸インサートは、ゲノム標的遺伝子座に組み込まれることになるＤＮＡのセグメントを含む。標的遺伝子座における核酸インサートの組込みは、標的遺伝子座への対象となる核酸配列の付加、標的遺伝子座における対象となる核酸配列の欠失、及び／または標的遺伝子座における対象となる核酸配列の置換えをもたらし得る。さらに、核酸インサートまたは置き換えられる標的遺伝子座の対応する核酸は、任意の所望の長さ、例えば、約１０ヌクレオチド長〜約５００ｋｂ長またはそれを超える長さを含むものであり得る。
【０３１０】
核酸インサートは、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、レポーター遺伝子、または１つ以上の発現カセットもしくは欠失カセットを含み得る。所与のカセットは、発現に影響を与える様々な調節成分と共に、対象となるヌクレオチド配列、選択マーカーをコードする核酸、及び／またはレポーター遺伝子を含み得る。
【０３１１】
挿入核酸は、部位特異的組換え標的配列（例えば、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘ）と隣接する核酸を含み得る。挿入核酸の全体が、このような部位特異的組換え標的配列に隣接し得る、または挿入核酸内の対象となる任意の領域もしくは個々のポリヌクレオチドが、このような部位に隣接し得る。例えば、部位特異的組換え部位は、挿入核酸内に含有される選択マーカーをコードするポリヌクレオチド及び／またはレポーター遺伝子に隣接し得る。標的遺伝子座における挿入核酸の組込み後、部位特異的組換え部位間の配列は除去され得る。
【０３１２】
相同腕及び標的配列は、２つの領域が相同組換え反応の基質として機能するために、互いに十分なレベルの配列同一性を共有する場合、互いに「対応する」または「対応している」。「相同性」という用語は、対応する配列と同一である、またはそれと配列同一性を共有するかのいずれかであるＤＮＡ配列を含む。所与の標的配列と標的化ベクター上で見られる対応する相同腕との間の配列同一性は、相同組換えが生じることを可能にする任意の程度の配列同一性であり得る。さらに、相同腕と、対応する標的配列との間における相同性の対応する領域は、切断された認識部位における相同組換えを促進するのに十分な任意の長さであり得る。例えば、所与の相同腕及び／または対応する標的配列は、相同腕が、細胞のゲノム内における対応する標的配列と相同組換えを行うのに十分な相同性を有するように例えば、約５ｋｂ〜約３００ｋｂ長またはそれを超える、相同性の対応する領域を含み得る。
【０３１３】
ヌクレアーゼ剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）は、標的遺伝子座の改変に役立つように標的化ベクターと組み合わせて用いられ得る。このようなヌクレアーゼ剤は、標的化ベクターと標的遺伝子座との間の相同組換えを促進する場合がある。ヌクレアーゼ剤が標的化ベクターと組み合わせて用いられる場合、標的化ベクターは、ヌクレアーゼ切断部位におけるニックまたは二本鎖切断上で標的配列と相同腕との間の相同組換え事象の発生を促進するように、ヌクレアーゼ切断部位に十分に近接して位置する５’及び３’標的配列に対応する５’及び３’相同腕を含み得る。標的化ベクターの５’及び３’相同腕に対応する標的遺伝子座内の標的配列は、距離が、認識部位におけるニックまたは二本鎖切断上で５’及び３’標的配列と相同腕との間の相同組換え事象の発生を促進するような場合、ヌクレアーゼ切断部位に「十分に近接して位置」する。
【０３１４】
標的化ベクター（例えば、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）または小さな標的化ベクター（ｓｍａｌｌＴＶＥＣ）を含む）とヌクレアーゼ剤との併用は、標的化ベクター単独での使用と比較して、標的化効率の向上をもたらし得る。
【０３１５】
１．小さな標的化ベクター（ＳｍａｌｌＴＶＥＣ）
いくつかの方法は、小さな標的化ベクターまたはｓｍａｌｌＴＶＥＣを利用する。Ｙ染色体に対して標的遺伝子改変を作製するためにｓｍａｌｌＴＶＥＣを使用する例は、例えば、ＷＯ２０１５／２００８０５及びＵＳ２０１５／０３７６６５１に開示されていて、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって組み込まれる。「ｓｍａｌｌＴＶＥＣ」は、短い相同腕を含む標的化ベクターを含む。ｓｍａｌｌＴＶＥＣ上の相同腕の長さは、例えば、約４００ｂｐ〜約１０００ｂｐであり得る。ｓｍａｌｌＴＶＥＣの相同腕は、対応する標的部位との相同組換え事象を促進するのに十分な任意の長さ、例えば、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、または約９００ｂｐ〜約１０００ｂｐを含む長さであり得る。ｓｍａｌｌＴＶＥＣ上の相同腕の好ましい長さは、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐである。ｓｍａｌｌＴＶＥＣの５’及び３’相同腕の合計は、例えば、約０．５ｋｂ〜約１０ｋｂであり得る。このような方法では、短い長さの相同腕は、より長い相同腕を有する標的化ベクターと比較した場合、標的化効率を向上させ得る。高頻度反復配列を有するＹ染色体の性質によって、ｓｍａｌｌＴＶＥＣの短腕は、Ｙ染色体上における高度に特異的な標的化を可能にし得る。
【０３１６】
２．大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）
一部の標的化ベクターは、「大きな標的化ベクター」または「ＬＴＶＥＣ」であり、これは、細胞中で相同組換えを実施することを目的とするその他の手法で典型的には使用される配列よりも大きな核酸配列に対応し、かつそれらに由来する相同腕を含む標的化ベクターを含む。ＬＴＶＥＣを使用して標的遺伝子改変を生成する例は、例えば、ＷＯ２０１５／０８８６４３、ＵＳ２０１５／０１５９１７５、ＵＳ２０１５／０１５９１７４、ＵＳ２０１４／０３１０８２８、ＵＳ２０１４／０３０９４８７、及びＵＳ２０１３−０３０９６７０に開示されていて、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。ＬＴＶＥＣは、細胞中で相同組換えを実施することを目的とするその他の手法で典型的には使用される配列よりも大きな核酸配列を有する核酸インサートを含む標的化ベクターも含む。例えば、ＬＴＶＥＣは、従来のプラスミドに基づく標的化ベクターではそれらのサイズ制限のために収容できない大きな遺伝子座の改変を可能にする。例えば、標的遺伝子座は、ヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）によって誘導されるニックまたは二本鎖切断の不存在下では、従来の方法を使用しても標的化できない、または不正確にしか、もしくは大幅に低い効率でしか標的とされ得ない細胞の遺伝子座であり得る（すなわち、５’及び３’相同腕がこの遺伝子座に対応し得る）。
【０３１７】
ＬＴＶＥＣの例としては、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）に由来するベクターが挙げられる。ＬＴＶＥＣ及びそれらを作製する方法の非限定的な例は、例えば、米国特許第６，５８６，２５１号明細書、米国特許第６，５９６，５４１号明細書、米国特許第７，１０５，３４８号明細書、及びＷＯ２００２／０３６７８９に記載されていて、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。ＬＴＶＥＣは、線状形態または環状形態であり得る。
【０３１８】
ＬＴＶＥＣは任意の長さ、例えば、少なくとも１０ｋｂまたは約５０ｋｂ〜約４００ｋｂまたはそれを超える長さを含むものであり得る。ＬＴＶＥＣのサイズは、従来のアッセイ、例えば、サザンブロッティング及び長距離（例えば、１ｋｂ〜５ｋｂ）ＰＣＲによる標的化事象のスクリーニングを可能にするには大きすぎる可能性がある。５’相同腕及び３’相同腕の合計は、例えば、少なくとも１０ｋｂであり得る（各相同腕は、例えば、約５ｋｂ〜約２００ｋｂの範囲であり得る）。ＬＴＶＥＣ及び核酸インサートは、ある長さ、例えば、約５ｋｂ〜約３Ｍｂ（例えば、約５００ｋｂ以上）の標的遺伝子座における欠失を可能にするように設計され得る。同様に、ＬＴＶＥＣ及び核酸インサートは、ある長さ、例えば、約５ｋｂ〜約４００ｋｂまたはそれを超える範囲の、外来核酸配列における標的遺伝子座への挿入を可能にするように設計され得る。
【０３１９】
ｉｉｉ．細胞中への成分の導入
細胞中への核酸の導入を可能にする様々な方法及び組成物が、本明細書で提供される。いくつかの場合には、核酸を導入するために用いられるシステムは、特定のゲノム遺伝子座における標的組込みを可能にする。このようなシステムは様々な成分を用いて、参照を容易にするために、「標的ゲノム組込みシステム」という用語は一般に、組込み事象に必要な全ての成分（例えば、ヌクレアーゼ剤、ヌクレアーゼ切断部位、挿入ＤＮＡポリヌクレオチド、標的化ベクター、標的ゲノム遺伝子座、及び対象となるポリヌクレオチドのうち１つ以上）を含む。
【０３２０】
本明細書で提供される方法は、標的ゲノム組込みシステムの１つ以上の成分を含む１種以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド構築物を細胞に導入することを含み得る。「導入すること」は、配列（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）が細胞の内部に到達するような手法で細胞に配列を付与することを含む。本明細書で提供される方法は、核酸またはタンパク質が少なくとも１種の細胞内部に到達するのであれば、細胞に核酸またはタンパク質を導入する特定の方法に依存しない。様々な細胞型に核酸及びタンパク質を導入する方法は、当該技術分野において既知であり、これらとしては、例えば、安定したトランスフェクション法、一過性トランスフェクション法、及びウイルス媒介法が挙げられる。
【０３２１】
トランスフェクションプロトコールに加えて、細胞にポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を導入するためのプロトコールは、変動する場合がある。非限定的なトランスフェクション法としては、リポソーム、ナノ粒子、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２（２）：４５６−６７、Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７４（４）：１５９０−４、及びＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６−９７）、デンドリマー、またはＤＥＡＥ−デキストランもしくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用する化学物質に基づくトランスフェクション法が挙げられる。非化学的方法としては、エレクトロポレーション法、ソノポレーション法、及び光学的トランスフェクションが挙げられる。粒子に基づくトランスフェクションとしては、遺伝子銃の使用、または磁気補助トランスフェクション（Ｂｅｒｔｒａｍ（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７，２７７−２８）が挙げられる。ウイルス法もまた、トランスフェクションに使用され得る。
【０３２２】
いくつかの場合には、細胞への核酸またはタンパク質の導入は、エレクトロポレーション法により、細胞質内注入により、ウイルス感染により、アデノウイルスにより、レンチウイルスにより、レトロウイルスにより、トランスフェクションにより、脂質媒介トランスフェクションにより、またはＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）により媒介される。
【０３２３】
細胞への核酸またはタンパク質の導入は、一度に、またはある期間にわたって複数回実施され得る。例えば、導入は、ある期間にわたって少なくとも２回、ある期間にわたって少なくとも３回、ある期間にわたって少なくとも４回、ある期間にわたって少なくとも５回、ある期間にわたって少なくとも６回、ある期間にわたって少なくとも７回、ある期間にわたって少なくとも８回、ある期間にわたって少なくとも９回、ある期間にわたって少なくとも１０回、少なくとも１１回、ある期間にわたって少なくとも１２回、ある期間にわたって少なくとも１３回、ある期間にわたって少なくとも１４回、ある期間にわたって少なくとも１５回、ある期間にわたって少なくとも１６回、ある期間にわたって少なくとも１７回、ある期間にわたって少なくとも１８回、ある期間にわたって少なくとも１９回、またはある期間にわたって少なくとも２０回実施され得る。
【０３２４】
ヌクレアーゼ剤及び標的化ベクター（例えば、ＬＴＶＥＣ）が両方とも細胞に導入される場合、これらは同時に導入され得る。あるいは、ヌクレアーゼ剤は、標的化ベクターとは別々に導入され得る。例えば、ヌクレアーゼ剤は、標的化ベクターの導入前に導入され得る、またはそれは標的化ベクターの導入後に導入され得る。
【０３２５】
ｉｖ．改変の種類
様々な種類の標的遺伝子改変が、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするために（例えば、Ｙ染色体の領域の欠失または破壊によって）使用され得る。例えば、タンパク質のレベル及び／または活性の減少は、タンパク質をコードする遺伝子に対する、またはタンパク質のレベルもしくは活性に影響を及ぼす、もしくはそれらを制御するゲノム遺伝子座に対する標的遺伝子改変によって達成され得る。このような標的改変としては、例えば、１つ以上のヌクレオチドの付加、１つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換、点変異、対象となるポリヌクレオチドもしくはその一部のノックアウト、対象となるポリヌクレオチドもしくはその一部のノックイン、内因性核酸配列と異種、外因性、もしくはオルソロガス核酸配列との置換え、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、またはこれらの組合せを挙げることができる。例えば、少なくとも１、２、３、４、５、７、８、９、１０またはそれを超えるヌクレオチドが、標的ゲノム改変を形成するために変化され得る。欠失、挿入、または置換えは、本明細書内の他の箇所に開示されるような任意のサイズのものであり得る。様々な方法が、標的遺伝子改変を生成するために使用され得る。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  １５３：９１０−９１８、Ｍａｎｄａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ４５７６８：１−９、及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０−５３２を参照し、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３２６】
Ｙ染色体上の欠失は、任意の核酸配列、例えば、繁殖力／不妊と、または性発達と関連する遺伝子などの欠失であり得る。Ｙ染色体上の欠失は、複数の遺伝子の欠失を含み得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える遺伝子が欠失され得る。２種のヌクレアーゼ剤が使用される場合、それらの対応する認識部位間における配列が欠失され得る。欠失は、例えば、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約７００ｋｂ、約７００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約８００ｋｂ〜約９００ｋｂ、約９００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、または約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂの範囲であり得る。例えば、欠失は、５００ｋｂ超、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、または約５００ｋｂであり得る。
【０３２７】
同様に、Ｙ染色体の破壊は、任意の核酸配列、例えば、繁殖力／不妊と、または性発達と関連する遺伝子などの破壊であり得る。Ｙ染色体の破壊は、複数の遺伝子の破壊を含み得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える遺伝子が破壊され得る。内因性核酸配列の破壊は、例えば、ヌクレアーゼにより作製された二本鎖切断が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介ＤＮＡ修復によって修復される場合に生じ得、これにより核酸配列の挿入または欠失を含む変異体対立遺伝子が生じ、それによってそのゲノム遺伝子座の破壊を引き起こす。破壊の例としては、調節エレメント（例えば、プロモーターもしくはエンハンサー）の変化、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異、切断変異、ヌル変異、または少数のヌクレオチドの挿入もしくは欠失（例えば、フレームシフト変異を引き起こす）が挙げられる。破壊は、対立遺伝子の不活性化（すなわち、機能喪失）または喪失をもたらし得る。
【０３２８】
ｖ．標的改変を有する細胞の同定
様々な方法が、欠失または挿入などの標的改変を有する細胞を同定するために使用され得る。このような方法は、標的遺伝子座に（例えば、第１及び第２ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列間に）標的改変を有する１つの細胞を同定することを含み得る。スクリーニングは、改変ゲノム遺伝子座を有するこのような細胞を同定するために行われ得る。
【０３２９】
スクリーニングステップは、親染色体の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を評価するための定量アッセイを含み得る。例えば、定量アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量ＰＣＲによって実施され得る。リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１プライマーセット及び非標的参照遺伝子座を認識する第２プライマーセットを利用し得る。プライマーセットは、増幅配列を認識する蛍光プローブを含み得る。
【０３３０】
好適な定量アッセイのその他の例としては、蛍光媒介ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化プローブ（複数可）に対する定量的ハイブリダイゼーション、Ｉｎｖａｄｅｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、ＭＭＰアッセイ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ、またはＥｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ技術（例えば、ＵＳ２００５／０１４４６５５を参照し、その全体があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる）が挙げられる。
【０３３１】
Ｆ．細胞及び動物
上記方法及び組成物（例えば、細胞、胚）の動物としては、哺乳動物、魚類、及び鳥類を含む、任意の動物を挙げることができる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類（例えば、サル、マーモセット、アカゲザル、及び類人猿）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、及びモルモット）、家畜または農業哺乳動物（例えば、ヤギ、雄ウシ、シカ、バイソン、ウマなどのウマ種、ウシ及び去勢ウシなどのウシ種、ヒツジなどのヒツジ種、ならびにブタ及び雄ブタなどのブタ種）、ならびに馴化哺乳動物（例えば、ネコ、イヌ、ウサギ、及びフェレット）が挙げられる。鳥類としては、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、及びアヒルが挙げられる。非ヒト動物は、ヒト以外の任意の動物であり得る。例えば、非ヒト動物は、非ヒト哺乳動物、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、サル、農業哺乳動物、馴化哺乳動物、魚類、または鳥類であり得る。
【０３３２】
上記方法及び組成物中の多能性細胞は、２種以上の分化細胞型に発達する能力を有する任意の未分化細胞を含む。例えば、上記方法及び組成物中の多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞であり得る。ＥＳ細胞は、胚への導入時に発達する胚の任意の組織に寄与することができる胚由来の全能性または多能性細胞を含む。あるいは、それらは成体幹細胞、または発達制限前駆細胞であり得る。多能性細胞は、任意の動物からの細胞であり得る。例えば、多能性細胞は、ヒトＥＳ細胞、非ヒトＥＳ細胞、哺乳動物ＥＳ細胞、非ヒト哺乳動物ＥＳ細胞、げっ歯類ＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞、またはハムスターＥＳ細胞であり得る。
【０３３３】
好適な遺伝子改変可能な多能性細胞が容易に入手できないこれらの哺乳動物については、その他の方法が、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８、及びＧｌｉｓ１を含むが、これらに限定されない多能性誘導因子の組合せを体細胞（例えば、線維芽細胞）に導入することなどによって、体細胞を多能性細胞にリプログラミングするために用いられる。
【０３３４】
マウス多能性細胞、全能性細胞、または宿主胚は、例えば、近交系統、ハイブリッド系統、及び非近交系統を含む、マウスの任意の系統からのものであり得る。マウス系統の例としては、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ系統（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６系統）、１２９及びＣ５７ＢＬ／６の混合（例えば、５０％の１２９及び５０％のＣ５７ＢＬ／６）、ＢＡＬＢ／ｃ系統、ならびにＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ系統が挙げられる。１２９系統の例としては、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９５１／ＳＶ、１２９５１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９５９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、及び１２９Ｔ２が挙げられる（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｒｅｖｉｓｅｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｔｒａｉｎ  １２９  ｍｉｃｅ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １０：８３６を参照のこと）。Ｃ５７ＢＬ系統の例としては、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／０１ａが挙げられる。マウスは、上述した１２９系統（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）及び上述したＣ５７ＢＬ／６系統の混合、１種以上の上述した１２９系統の混合、または１種以上の上述したＣ５７ＢＬ系統の混合であり得る。マウスはまた、１２９系統を除く系統からのマウスであり得る。例えば、本明細書で提供される方法に用いられるマウスまたはマウス細胞は、１２９及びＣ５７ＢＬ／６系統の混合、ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６系統の混合、１２９及びＢＡＬＢ／ｃ系統の混合、またはＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、及び１２９系統の混合であり得る。例えば、本明細書で提供される方法に用いられるマウスまたはマウス細胞は、少なくとも部分的にＢＡＬＢ／ｃ系統からのものであり得る（例えば、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％ＢＡＬＢ／ｃ系統に由来する、または約２５％、約５０％、約７５％、もしくは約１００％ＢＡＬＢ／ｃ系統に由来する）。一例では、マウスまたはマウス細胞は、５０％のＢＡＬＢ／ｃ、２５％のＣ５７ＢＬ／６、及び２５％の１２９を含む系統を有し得る。あるいは、マウスまたはマウス細胞は、ＢＡＬＢ／ｃを除外する系統または系統の組合せを含み得る。
【０３３５】
マウスＸＹ多能性細胞中のＹ染色体は、任意の系統からのものであり得る。例えば、マウスＸＹ多能性細胞（例えば、マウスＸＹ  ＥＳ細胞）中のＹ染色体は、１２９系統またはＣ５７ＢＬ系統（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６系統）からのものであり得る。あるいは、Ｙ染色体は、ＢＡＬＢ／ｃ系統からのものであり得る。１２９系統からのＹ染色体を有するマウスＸＹ  ＥＳ細胞の一例は、ＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である。ＶＧＦ１（Ｆ１Ｈ４としても知られる）マウスＥＳ細胞は、雌Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを雄１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウスと交雑させることによって産生されたハイブリッド胚に由来した。したがって、ＶＧＦ１  ＥＳ細胞は、１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウスからのＹ染色体を含有する。例えば、Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９，１０２４−１０２８，１０３０，１０３２を参照し、その全体があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。あるいは、マウスＸＹ多能性細胞中のＹ染色体は、１２９系統からのものではない（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６系統からのものである）。ＶＧＢ６  ＥＳ細胞株は、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ系統の雄及び雌マウスの交配から産生された単一の雄（ＸＹ）胚盤胞胚に由来した。
【０３３６】
ラット多能性細胞、全能性細胞、または宿主胚は、例えば、近交系統、ハイブリッド系統、及び非近交系統を含む、任意のラット系統からのものであり得る。ラット系統の例としては、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、またはＦｉｓｈｅｒ  Ｆ３４４もしくはＦｉｓｈｅｒ  Ｆ６などのＦｉｓｃｈｅｒラット系統が挙げられる。ラット多能性細胞、全能性細胞、または宿主胚はまた、上で列挙された２種以上の系統の混合に由来する系統から得られ得る。例えば、ラット多能性細胞、全能性細胞、または宿主胚は、ＤＡ系統及びＡＣＩ系統から選択される系統に由来し得る。ＡＣＩラット系統は、白色の腹部及び足ならびにＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有する、黒色アグーチであると特徴付けられる。このような系統は、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給元から入手可能である。ＡＣＩラットからのラットＥＳ細胞株の一例は、ＡＣＩ．Ｇ１ラットＥＳ細胞である。Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチ毛及びＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有すると特徴付けられる。このようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ及びＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給元から入手可能である。ＤＡラットからのラットＥＳ細胞株の例は、ＤＡ．２ＢラットＥＳ細胞株またはＤＡ．２ＣラットＥＳ細胞株である。ラット系統のその他の例は、例えば、ＵＳ２０１４／０２３５９３３、ＵＳ２０１４／０３１０８２８、及びＵＳ２０１４／０３０９４８７で提供され、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３３７】
いくつかの方法及び組成物では、動物は、以下のうち１つ以上からの動物ではない：Ａｋｏｄｏｎ属種、Ｍｙｏｐｕｓ属種、Ｍｉｃｒｏｔｕｓ属種、及びＴａｌｐａ属種。同様に、いくつかの方法及び組成物では、動物は、正常な野生型の特性がＸＹ雌の繁殖力である任意の種ではない。
【０３３８】
ＩＩＩ．化合物をスクリーニングする方法
細胞またはクローンが化合物の存在下で培養される場合、動物ＸＹ多能性または全能性細胞またはクローンに対して雌化活性を有する（すなわち、細胞またはクローンがＦ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成する傾向を高める）化合物についてスクリーニングするための方法及び組成物が提供される。動物ＸＹ多能性または全能性細胞クローンがＦ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成する傾向は、これらのクローンにおけるＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの発現または活性と逆相関する。動物ＸＹ多能性または全能性細胞（例えば、ＸＹ  ＥＳ細胞）におけるこれらの遺伝子のうち１つ以上の発現喪失は、どの細胞クローンがＦ０世代においてＸＹ雌動物を生成することになるかを予測し得る：観察されるＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのサイレンシングが強くなるほど、ＸＹ  ＥＳ細胞クローンがＦ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成する傾向がますます高くなる（例えば、実施例３を参照のこと）。同様に、動物ＸＹ多能性または全能性細胞（例えば、ＸＹ  ＥＳ細胞）におけるこれらの遺伝子のうち１つ以上の活性喪失または発現及び／もしくは活性の減少は、どの細胞クローンがＦ０世代においてＸＹ雌動物を生成することになるかを予測し得る：観察されるＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの発現が低下するほど、ＸＹ  ＥＳ細胞クローンがＦ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成する傾向がますます高くなる（例えば、実施例３を参照のこと）。言い換えれば、これらの遺伝子のうち１つ以上の発現及び／または活性は、ＸＹ雌生成を予測するための代理マーカーであり得る。
【０３３９】
この情報は、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成する傾向が高い動物ＸＹ多能性または全能性細胞を生成する化合物についてスクリーニングするために使用され得る。例えば、このような方法は、細胞の多能性または全能性を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む培地中で非ヒト動物ＸＹ多能性または全能性細胞の第１集団及び第２集団を培養し、第１集団は、標的化合物の存在下で培養され、第２集団は、標的化合物の不存在下で培養されることを含み得る。次いで、本方法は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性について、第１及び第２集団の各々で非ヒト動物ＸＹ多能性または全能性細胞のうち１種以上をアッセイし、それによって雌化活性が、第２集団からの１種以上の細胞と比較して、第１集団からの１種以上の細胞におけるＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性の減少によって同定されることをさらに含み得る。すなわち、本方法は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性について、第１及び第２集団の各々で非ヒト動物ＸＹ多能性または全能性細胞のうち１種以上をアッセイし、次いで、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性が、第２集団からの１種以上の細胞と比較して、第１集団からの１種以上の細胞で減少する場合に標的化合物を選択することをさらに含み得る。発現及び／または活性の減少は、Ｄｄｘ３ｙの、Ｕｔｙの、Ｅｉｆ２ｓ３ｙの、Ｄｄｘ３ｙ及びＵｔｙの、Ｄｄｘ３ｙ及びＥｉｆ２ｓ３ｙの、Ｕｔｙ及びＥｉｆ２ｓ３ｙの、またはＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの減少であり得る。
【０３４０】
スクリーニングされ得る化合物の例としては、抗体、抗原結合タンパク質、部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体、ＣＲＩＳＰＲｉライブラリー、ＣＲＩＳＰＲａライブラリー）、ポリペプチド、ベータターン模倣体、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ−置換グリシン、及びオリゴカルバメートが挙げられる。化合物の大きなコンビナトリアルライブラリーは、ＷＯ１９９５／０１２６０８、ＷＯ１９９３／００６１２１、ＷＯ１９９４／００８０５１、ＷＯ１９９５／０３５５０３、及びＷＯ１９９５／０３０６４２に記載されているコード化合成ライブラリー（ＥＳＬ）法によって構築され得、その文献各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。ペプチドライブラリーも、ファージディスプレイ法によって生成され得る。例えば、ＵＳ５，４３２，０１８を参照し、その全体があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を異なる遺伝子に標的化するためのガイドＲＮＡライブラリーの使用は、例えば、ＷＯ２０１４／２０４７２７、ＷＯ２０１４／０９３７０１、ＷＯ２０１５／０６５９６４、ＷＯ２０１６／０１１０８０、Ｓｈａｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）３４３（６１６６）：８４−８７（ゲノムスケールＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ライブラリー）、及びＫｏｎｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）５１７（７５３６）：５８３−５８８（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）プールライブラリー）に開示されていて、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３４１】
細胞の第１集団は、標的化合物の存在下において任意の長さの時間で培養され得る。一例として、細胞の第１集団は、アッセイ前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、標的化合物の存在下で培養され得る。
【０３４２】
培地は、細胞の多能性または全能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる細胞の能力を変化させない培地であり得る。あるいは、培地は雌化培地であり得る。雌化培地（例えば、培養下で動物ＸＹ多能性または全能性細胞を維持するのに好適な基本培地及び添加物、ここで基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を有する）ならびにこのような培地中で細胞を維持する方法は、本明細書内の他の箇所に開示される。
【０３４３】
標的化合物の雌化活性は、多数の方法で同定され得る。例えば、雌化活性は、第１集団からの細胞におけるＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性の欠如によって同定され得る。あるいは、雌化活性は、第２集団からの細胞と比較して、第１集団からの細胞におけるＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの全ての発現及び／または活性の減少によって同定され得る。あるいは、雌化活性は、第１集団からの細胞におけるＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの全ての発現及び／または活性の欠如によって同定され得る。発現及び／または活性を評価する方法は、以下でさらに詳しく述べられる。
【０３４４】
いくつかのスクリーニング方法は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性に基づいて、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト動物を生成するために、第１集団からドナー非ヒト動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択し、Ｆ０世代における繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト動物の比率が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性に逆相関することをさらに含み得る。
【０３４５】
次いで、ドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞が宿主胚に導入され得、宿主胚は、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成することができる。例えば、宿主胚は前桑実期胚であり得、宿主胚は、ドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞の導入時に胚盤胞期まで培養され得る。動物、胚、ドナーＸＹ多能性または全能性細胞を胚に導入する方法、及びＦ０動物を生成する方法は、本明細書内の他の箇所に開示される。
【０３４６】
動物ＸＹ多能性または全能性細胞は、アッセイステップ前に、及び／または宿主胚への導入前に、様々な時間で培地中において維持され得る。例えば、動物ＸＹ多能性または全能性細胞は、アッセイステップ及び／または宿主胚への導入前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、雌化培地中で維持され得る。あるいは、動物ＸＹ多能性または全能性細胞は、アッセイステップ及び／または宿主胚への導入前に１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間以下の間、雌化培地中で維持され得る。いくつかの方法では、ＸＹ多能性または全能性細胞は、細胞を胚に注入するまで雌化培地中で培養または維持される。その他の方法では、ＸＹ多能性または全能性細胞が注入された胚は、代理母に移入されるまで雌化培地中で培養または維持される。
【０３４７】
ドナー細胞は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性について、第１集団からの１種以上の細胞をアッセイした後に選択され得る。アッセイステップは、細胞またはクローンそれ自体をアッセイすること、ならびにＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性のレベルを決定することを含み得る。あるいは、アッセイステップは、クローンに由来するいくつかのサブクローンをアッセイすること、ならびに例えば、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の低減した発現及び／もしくは活性を有する、またはその発現及び／もしくは活性を欠いているサブクローンのパーセンテージを決定することを含み得る。あるいは、アッセイステップは、クローンに由来するいくつかのサブクローンをアッセイすること、ならびにサブクローンの中でもＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の比較発現及び／または活性を決定することを含み得る。Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／もしくは活性が減少し得る、またはＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち全ての発現及び／もしくは活性が減少し得る。あるいは、ドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／もしくは活性を欠いている、またはＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち全ての発現及び／もしくは活性を欠いている。例えば、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち全ての検出可能な発現の欠如であり得る。
【０３４８】
発現は、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルで評価され得る。ポリペプチドの発現レベルは、直接的に、例えば、細胞もしくは生物中のポリペプチドレベルについてアッセイすることにより（例えば、ウェスタンブロット分析、ＦＡＣＳ分析、ＥＬＩＳＡ）、または間接的に、例えば、ポリペプチドの活性を測定することにより測定されてよい。その他の場合では、遺伝子の発現及び／または活性の低減は、例えば、サザンブロット分析、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ分析、ノーザンブロット分析、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、マイクロアレイ分析、または表現型分析を含む方法を使用して測定され得る。例えば、遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、デジタルＰＣＲ、またはｍＲＮＡレベルを測定する任意のその他の好適な方法によって、ｍＲＮＡレベルを測定することにより評価され得る。一例として、ＲＮＡレベルは、Ｂ２ｍなどの対照遺伝子と比較してＲＴ−ＰＣＲにより測定され得る。いくつかの場合には、例えば、対照遺伝子（例えば、Ｂ２ｍ）と標的遺伝子との間のΔＣｔは、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６、または少なくとも８であり得る。同様に、いくつかの場合には、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０サイクル後、標的遺伝子の検出可能なＲＮＡは、一切存在しないことになる。
【０３４９】
場合により、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルを測定する場合、対照実験は、Ｙ染色体の存在を確認するために行われ得る。例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）コピー数アッセイは、Ｙ染色体上の異なるゲノム配列に対するプローブを使用することによって、Ｙ染色体の１コピーの存在を確認するために行われ得る。このようなアッセイは、ゲノム内におけるコピー数変化を測定するように設計される。
【０３５０】
対象細胞、胚、または動物における遺伝子またはそれがコードするタンパク質の発現または活性の減少としては、適切な対照細胞、胚、もしくは動物または対照細胞、胚、もしくは動物の集団と比較した場合の、発現または活性レベルの任意の統計的に有意な低減を挙げることができる。一般に、発現または活性は、発現または活性が、雌化培地ではない適切な対照培地中で培養された適切な対照細胞、胚、またはそれらに由来する動物（例えば、動物ＸＹ多能性細胞）、すなわち、細胞が雌化培地中で培養されたにもかかわらず、歴史的に完全に雄マウスを生成する動物ＸＹ多能性細胞における発現または活性よりも、統計的に低い場合に減少する。このような減少は、対照細胞と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれを超える低減を含む。統計的有意性は、ｐ≦０．０５を意味する。発現または活性の減少は、任意の段階で任意の機構によって生じ得る。例えば、発現の減少は、転写中、転写後、翻訳中、または翻訳後に生じる事象または制御によって生じ得る。
【０３５１】
「対象細胞」は、雌化培地（例えば、低オスモル濃度培地）中で培養された細胞または雌化培地中で培養された細胞の子孫である細胞である。「対照」または「対照細胞」は、対象細胞の表現型における変化を測定するための基準点を提供する。対照細胞は、それが雌化培地中で培養されなかったこと、または細胞が雌化培地中で培養されたにもかかわらず、ＸＹ雌マウスを生成する能力を欠いている、もしくは低減したその能力を有することのいずれかを除いて、好ましくは対象細胞と可能な限り厳密に合致する（例えば、個々の細胞は、同じ細胞株もしくは同じクローンに由来し得る、または同じ遺伝子型を有し得る）。例えば、対照細胞は、以下を含んでよい：（ａ）同じ遺伝子型である、または対象細胞と同じ細胞株もしくはクローンに由来するが、雌化培地ではない適切な対照培地（例えば、ＤＭＥＭもしくは動物ＸＹ多能性もしくは全能性細胞の多能性もしくは全能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる能力を細胞に付与することにより細胞を変化させない別の種類の培地）中で培養された細胞、（ｂ）対象細胞と遺伝的に同一である、または同じ細胞株もしくはクローンに由来するが、遺伝子改変されていない、もしくは繁殖可能な雌ＸＹ動物を生成する能力を細胞に付与することになる条件もしくは刺激に曝露されていない動物ＸＹ多能性または全能性細胞、ならびに（ｃ）雌化培地（例えば、低オスモル濃度培地）中で培養されるが、細胞が雌化培地中で培養されるにもかかわらず、歴史的に完全に雄動物を生成する動物ＸＹ多能性及び全能性細胞。例えば、対照細胞は、細胞の多能性または全能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる細胞の能力を変化させない培地中で培養された動物ＸＹ多能性または全能性細胞であり得る。場合により、発現及び／または活性の減少は、第２集団からの対照非ヒト動物ＸＹ多能性または全能性細胞と比較され得る。
【０３５２】
いくつかの実験では、第１集団における細胞またはクローンのうち２種以上が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性についてアッセイされる。次いで、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の最も低い発現及び／または活性を有する細胞またはクローンが、ドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞またはクローンであると選択され得、ドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞は、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成することができる。
【０３５３】
Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することは、表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫のより高いパーセンテージ、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫のより高いパーセンテージ、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０  ＸＹ子孫のより高いパーセンテージ、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のより高いパーセンテージ、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌の一生涯における同腹仔のより高い平均数、及びＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のより高い平均産子数をもたらし得る。このようなＦ０子孫は、本明細書内の他の箇所に開示される方法を使用した、宿主胚への細胞の導入及び宿主胚の懐胎後、ドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞から生成され得る。
【０３５４】
増加は、適切な対照物と比較した場合の、任意の統計的に有意な増加であり得る。例えば、増加は、適切な対照物と比較した場合、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または５倍であり得る。
【０３５５】
例えば、表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することによって増加し得る。いくつかの方法では、表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有するＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫ではより高い。
【０３５６】
繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージはまた、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することによって増加し得る。いくつかの方法では、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有するＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫ではより高い。
【０３５７】
繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージはまた、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することによって増加し得る。いくつかの方法では、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有するＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。
【０３５８】
正常な同腹仔数及び／または正常な産子数（例えば、野生型雌動物と比較して）を産生することができるＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージはまた、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することによって増加し得る。いくつかの方法では、正常な同腹仔数及び／または正常な産子数を産生することができるＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有するＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。
【０３５９】
Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される平均産子数はまた、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することによって増加し得る。いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される平均産子数は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有するＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【０３６０】
Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における同腹仔の平均数はまた、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することによって増加し得る。いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における同腹仔の平均数は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有するＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【０３６１】
Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における子孫の平均数はまた、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することによって増加し得る。いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における子孫の平均数は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有するＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【０３６２】
Ｖ．雌化培地中で成分の濃度を最適化する方法
動物ＸＹ多能性または全能性細胞またはクローンに対する雌化活性増加（すなわち、細胞またはクローンがＦ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成する傾向の増加）のために、雌化培地中で成分の濃度を最適化するための方法及び組成物が提供される。動物ＸＹ多能性または全能性細胞クローンがＦ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成する傾向は、これらのクローンにおけるＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの発現または活性と逆相関する。動物ＸＹ多能性または全能性細胞（例えば、ＸＹ  ＥＳ細胞）におけるこれらの遺伝子のうち１つ以上の発現喪失は、どの細胞クローンがＦ０世代においてＸＹ雌動物を生成することになるかを予測し得る：観察されるＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのサイレンシングが強くなるほど、ＸＹ  ＥＳ細胞クローンがＦ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成する傾向がますます高くなる（例えば、実施例３を参照のこと）。同様に、動物ＸＹ多能性または全能性細胞（例えば、ＸＹ  ＥＳ細胞）におけるこれらの遺伝子のうち１つ以上の活性喪失または発現及び／もしくは活性の減少は、どの細胞クローンがＦ０世代においてＸＹ雌動物を生成することになるかを予測し得る：観察されるＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの発現が低下するほど、ＸＹ  ＥＳ細胞クローンがＦ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成する傾向がますます高くなる（例えば、実施例３を参照のこと）。言い換えれば、これらの遺伝子のうち１つ以上の発現及び／または活性は、ＸＹ雌生成を予測するための代理マーカーであり得る。
【０３６３】
この情報は、増加した雌化効果を有し、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成する傾向が高い動物ＸＹ多能性または全能性細胞を生成するための培地成分の最適濃度についてスクリーニングするために使用され得る。例えば、このような方法は、細胞の多能性または全能性を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む培地中で非ヒト動物ＸＹ多能性または全能性細胞の第１集団及び第２集団を培養し、第１集団は、第１濃度の標的培地成分の存在下で培養され、第２集団は、第１濃度とは異なる第２濃度の標的培地成分の存在下で培養されることを含み得る。第１濃度は、第２濃度よりも高く、または低くなり得る。次いで、本方法は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性について、第１及び第２集団の各々で非ヒト動物ＸＹ多能性または全能性細胞のうち１種以上をアッセイすることをさらに含み得る。次いで、第１濃度は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性が、第２集団からの１種以上の細胞と比較して、第１集団からの１種以上の細胞で減少する場合に選択され得る。発現及び／または活性の減少は、Ｄｄｘ３ｙの、Ｕｔｙの、Ｅｉｆ２ｓ３ｙの、Ｄｄｘ３ｙ及びＵｔｙの、Ｄｄｘ３ｙ及びＥｉｆ２ｓ３ｙの、Ｕｔｙ及びＥｉｆ２ｓ３ｙの、またはＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの減少であり得る。
【０３６４】
その濃度が変化され得る培地成分の例としては、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩（例えば、塩化ナトリウム）、炭酸塩（例えば、重炭酸ナトリウム）、グルコース、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、グルタミン、抗生物質（複数可）、ペニシリン及びストレプトマイシン（例えば、ｐｅｎｓｔｒｅｐ）、ピルビン酸塩（例えば、ピルビン酸ナトリウム）、非必須アミノ酸（例えば、ＭＥＭ  ＮＥＡＡ）、２−メルカプトエタノール、ならびに白血病抑制因子（ＬＩＦ）が挙げられる。その濃度が変化され得るその他の培地成分は、表１に列挙されている。典型的な培地成分は、本明細書内の他の箇所でさらに詳しく述べられる。
【０３６５】
細胞の第１集団は、標的化合物の存在下において任意の長さの時間で培養され得る。一例として、細胞の第１集団は、アッセイ前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、標的化合物の存在下で培養され得る。
【０３６６】
培地は、細胞の多能性または全能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる細胞の能力を変化させない培地であり得る。あるいは、培地は雌化培地であり得る。雌化培地（例えば、培養下で動物ＸＹ多能性または全能性細胞を維持するのに好適な基本培地及び添加物、ここで基本培地または基本培地及び添加物を含む培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満のオスモル濃度を有する）ならびにこのような培地中で細胞を維持する方法は、本明細書内の他の箇所に開示される。
【０３６７】
第１濃度の培地成分における雌化活性は、多数の方法で同定され得る。例えば、第１濃度は、第１集団からの細胞が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性を欠いている場合に選択され得る。あるいは、第１濃度は、第１集団からの細胞が、第２集団からの細胞と比較して、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの全てについて減少した発現及び／または活性を有する場合に選択され得る。あるいは、第１濃度は、第１集団からの細胞が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの全ての発現及び／または活性を欠いている場合に選択され得る。発現及び／または活性を評価する方法は、以下でさらに詳しく述べられる。
【０３６８】
いくつかのスクリーニング方法は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性に基づいて、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト動物を生成するために、第１集団からドナー非ヒト動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択し、Ｆ０世代における繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ非ヒト動物の比率が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性に逆相関することをさらに含み得る。
【０３６９】
次いで、ドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞が宿主胚に導入され得、宿主胚は、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成することができる。例えば、宿主胚は前桑実期胚であり得、宿主胚は、ドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞の導入時に胚盤胞期まで培養され得る。動物、胚、ドナーＸＹ多能性または全能性細胞を胚に導入する方法、及びＦ０動物を生成する方法は、本明細書内の他の箇所に開示される。
【０３７０】
動物ＸＹ多能性または全能性細胞は、アッセイステップ前に、及び／または宿主胚への導入前に、様々な時間で培地中において維持され得る。例えば、動物ＸＹ多能性または全能性細胞は、アッセイステップ及び／または宿主胚への導入前に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間の間、雌化培地中で維持され得る。あるいは、動物ＸＹ多能性または全能性細胞は、アッセイステップ及び／または宿主胚への導入前に１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、または４週間以下の間、雌化培地中で維持され得る。いくつかの方法では、ＸＹ多能性または全能性細胞は、細胞を胚に注入するまで雌化培地中で培養または維持される。その他の方法では、ＸＹ多能性または全能性細胞が注入された胚は、代理母に移入されるまで雌化培地中で培養または維持される。
【０３７１】
ドナー細胞は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現または活性について、第１集団からの１種以上の細胞をアッセイした後に選択され得る。アッセイステップは、細胞またはクローンそれ自体をアッセイすること、ならびにＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現または活性のレベルを決定することを含み得る。あるいは、アッセイステップは、クローンに由来するいくつかのサブクローンをアッセイすること、ならびに例えば、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の低減した発現及び／もしくは活性を有する、またはその発現及び／もしくは活性を欠いているサブクローンのパーセンテージを決定することを含み得る。あるいは、アッセイステップは、クローンに由来するいくつかのサブクローンをアッセイすること、ならびにサブクローンの中でもＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の比較発現及び／または活性を決定することを含み得る。Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／もしくは活性が減少し得る、またはＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち全ての発現及び／もしくは活性が減少し得る。あるいは、ドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／もしくは活性を欠いている、またはＤｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち全ての発現及び／もしくは活性を欠いている。例えば、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち全ての検出可能な発現の欠如であり得る。
【０３７２】
発現は、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルで評価され得る。ポリペプチドの発現レベルは、直接的に、例えば、細胞もしくは生物中のポリペプチドレベルについてアッセイすることにより（例えば、ウェスタンブロット分析、ＦＡＣＳ分析、ＥＬＩＳＡ）、または間接的に、例えば、ポリペプチドの活性を測定することにより測定されてよい。その他の場合では、遺伝子の発現及び／または活性の低減は、例えば、サザンブロット分析、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ分析、ノーザンブロット分析、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、マイクロアレイ分析、または表現型分析を含む方法を使用して測定され得る。例えば、遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、デジタルＰＣＲ、またはｍＲＮＡレベルを測定する任意のその他の好適な方法によって、ｍＲＮＡレベルを測定することにより評価され得る。一例として、ＲＮＡレベルは、Ｂ２ｍなどの対照遺伝子と比較してＲＴ−ＰＣＲにより測定され得る。いくつかの場合には、例えば、対照遺伝子（例えば、Ｂ２ｍ）と標的遺伝子との間のΔＣｔは、少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６、または少なくとも８であり得る。同様に、いくつかの場合には、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０サイクル後、標的遺伝子の検出可能なＲＮＡは、一切存在しないことになる。
【０３７３】
場合により、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルを測定する場合、対照実験は、Ｙ染色体の存在を確認するために行われ得る。例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）コピー数アッセイは、Ｙ染色体上の異なるゲノム配列に対するプローブを使用することによって、Ｙ染色体の１コピーの存在を確認するために行われ得る。このようなアッセイは周知であり、ゲノム内におけるコピー数変化を測定するように設計される。
【０３７４】
対象細胞、胚、または動物における遺伝子またはそれがコードするタンパク質の発現または活性の減少としては、適切な対照細胞、胚、もしくは動物または対照細胞、胚、もしくは動物の集団と比較した場合の、発現または活性レベルの任意の統計的に有意な低減を挙げることができる。一般に、発現または活性は、発現または活性が、雌化培地ではない適切な対照培地中で培養された適切な対照細胞、胚、またはそれらに由来する動物（例えば、動物ＸＹ多能性細胞）、すなわち、細胞が雌化培地中で培養されたにもかかわらず、歴史的に完全に雄マウスを生成する動物ＸＹ多能性細胞における発現または活性よりも、統計的に低い場合に減少する。このような減少は、対照細胞と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれを超える低減を含む。統計的有意性は、ｐ≦０．０５を意味する。発現または活性の減少は、任意の段階で任意の機構によって生じ得る。例えば、発現の減少は、転写中、転写後、翻訳中、または翻訳後に生じる事象または制御によって生じ得る。
【０３７５】
「対象細胞」は、雌化培地（例えば、低オスモル濃度培地）中で培養された細胞または雌化培地中で培養された細胞の子孫である細胞である。「対照」または「対照細胞」は、対象細胞の表現型における変化を測定するための基準点を提供する。対照細胞は、それが雌化培地中で培養されなかったこと、または細胞が雌化培地中で培養されたにもかかわらず、ＸＹ雌マウスを生成する能力を欠いている、もしくは低減したその能力を有することのいずれかを除いて、好ましくは対象細胞と可能な限り厳密に合致する（例えば、個々の細胞は、同じ細胞株もしくは同じクローンに由来し得る、または同じ遺伝子型を有し得る）。例えば、対照細胞は、以下を含んでよい：（ａ）同じ遺伝子型である、または対象細胞と同じ細胞株もしくはクローンに由来するが、雌化培地ではない適切な対照培地（例えば、ＤＭＥＭもしくは動物ＸＹ多能性もしくは全能性細胞の多能性もしくは全能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる能力を細胞に付与することにより細胞を変化させない別の種類の培地）中で培養された細胞、（ｂ）対象細胞と遺伝的に同一である、または同じ細胞株もしくはクローンに由来するが、遺伝子改変されていない、もしくは繁殖可能な雌ＸＹ動物を生成する能力を細胞に付与することになる条件もしくは刺激に曝露されていない動物ＸＹ多能性または全能性細胞、ならびに（ｃ）雌化培地（例えば、低オスモル濃度培地）中で培養されるが、細胞が雌化培地中で培養されるにもかかわらず、歴史的に完全に雄動物を生成する動物ＸＹ多能性及び全能性細胞。例えば、対照細胞は、細胞の多能性または全能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる細胞の能力を変化させない培地中で培養された動物ＸＹ多能性または全能性細胞であり得る。場合により、発現及び／または活性の減少は、第２集団からの対照非ヒト動物ＸＹ多能性または全能性細胞と比較され得る。
【０３７６】
いくつかの実験では、第１集団における細胞またはクローンのうち２種以上が、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の発現及び／または活性についてアッセイされる。次いで、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の最も低い発現及び／または活性を有する細胞またはクローンが、ドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞またはクローンであると選択され得、ドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞は、Ｆ０世代において繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物を生成することができる。
【０３７７】
Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することは、表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫のより高いパーセンテージ、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫のより高いパーセンテージ、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０  ＸＹ子孫のより高いパーセンテージ、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のより高いパーセンテージ、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌の一生涯における同腹仔のより高い平均数、及びＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のより高い平均産子数をもたらし得る。このようなＦ０子孫は、本明細書内の他の箇所に開示される方法を使用した、宿主胚への細胞の導入及び宿主胚の懐胎後、ドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞から生成され得る。
【０３７８】
増加は、適切な対照物と比較した場合の、任意の統計的に有意な増加であり得る。例えば、増加は、適切な対照物と比較した場合、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または５倍であり得る。
【０３７９】
例えば、表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することによって増加し得る。いくつかの方法では、表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有するＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫ではより高い。
【０３８０】
繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージはまた、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することによって増加し得る。いくつかの方法では、繁殖可能な表現型的に雌のＸＹ動物であるＦ０子孫またはＦ０  ＸＹ子孫のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有するＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０子孫ではより高い。
【０３８１】
繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージはまた、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することによって増加し得る。いくつかの方法では、繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有するＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。
【０３８２】
正常な同腹仔数及び／または正常な産子数（例えば、野生型雌動物と比較して）を産生することができるＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージはまた、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することによって増加し得る。いくつかの方法では、正常な同腹仔数及び／または正常な産子数を産生することができるＦ０  ＸＹ雌のパーセンテージは、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有するＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ子孫ではより高い。
【０３８３】
Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される平均産子数はまた、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することによって増加し得る。いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される平均産子数は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有するＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【０３８４】
Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における同腹仔の平均数はまた、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することによって増加し得る。いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における同腹仔の平均数は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有するＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【０３８５】
Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における子孫の平均数はまた、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナー動物ＸＹ多能性または全能性細胞を選択することによって増加し得る。いくつかの方法では、Ｆ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌によって産生される一生涯における子孫の平均数は、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上のより高い発現及び／または活性を有するＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌と比較した場合に、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙのうち１つ以上の減少した発現及び／または活性を有するドナーＸＹ多能性または全能性動物細胞に由来するＦ０  ＸＹ雌または繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌ではより高い。
【０３８６】
Ｖ．その他の用途
本明細書内の他の箇所に開示されるような雌化培地（例えば、低オスモル濃度培地）中でＸＹ多能性または全能性動物細胞を維持することによって、ＸＹ多能性もしくは全能性動物細胞（またはインビトロ細胞培養物、胚、もしくはそれらに由来する動物）におけるＹ染色体の領域をサイレンシングするための方法及び組成物ならびにＹ染色体の領域におけるサイレンシングを同定するためにＸＹ多能性または全能性細胞をアッセイするための方法及び組成物もまた提供される。このような方法は、例えば、標的改変が遺伝子の発現を低減または排除するために使用されることになる状況（例えば、遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を阻害するためのノックアウト）に用途を見出し得る。雌化培地での培養によるサイレンシングに要する時間は、特異的標的改変の生成よりもはるかに短いため、サイレンシングを達成することがより効率的な手段である。
【０３８７】
雌化培地ならびにそれらの成分及び特性の例は、本明細書内の他の箇所に開示されている。同様に、ＸＹ多能性または全能性細胞を雌化培地中で培養するための時間のタイミング及び長さの例が、本明細書内の他の箇所に開示されている。
【０３８８】
雌化培地中での培養は、Ｙ染色体遺伝子の抑制またはサイレンシングをもたらす。例えば、Ｙ染色体の領域は、Ｙ染色体の短腕の全てまたは一部などでサイレンシングされ得る。Ｙ染色体の短腕におけるサイレンシングは、雄の性決定経路において重要な調節因子であるＳｒｙ遺伝子まで拡大され得、これにより、マウスの胚発生中、Ｅ１１〜Ｅ１２の正確な時点で十分に発現されないため、両能性生殖隆起において雌の性決定プログラムの発現をもたらす（実施例１及び図２Ａ〜図２Ｄを参照のこと）。Ｄｄｘ３ｙ及びＥｉｆ２ｓ３ｙなどのその他の遺伝子も、発現できない（実施例１ならびに図３及び図４を参照のこと）。それ以降、性転換胚は雌として出生し（Ｆ０世代）、次いで、そのＸＹ遺伝子型にもかかわらず、正常で繁殖可能な雌マウスに成長し得る。いくつかの方法では、雌化培地誘導Ｙ染色体サイレンシングは、永久的な遺伝子変化ではなく、Ｆ１世代まで持続しない（すなわち、ＸＹ雌は、Ｆ０  ＸＹ雌のＦ１子孫の中には見られない）。
【０３８９】
Ｙ染色体の短腕の全てまたは一部に加えて、その中で、またはそれを含む、雌化培地によってサイレンシングされ得るＹ染色体のその他の領域は、本明細書内の他の箇所に開示されている。サイレンシングされる領域は、長腕（Ｙｑ）、特に精子形成に必要なＹ染色体上のその他の遺伝子も含み得る。例えば、領域は、Ｓｘｒａ領域の全てもしくは一部（例えば、Ｓｒｙ遺伝子を含有する部分）を含み得る、ならびに／または領域は、マウスＹ染色体のＳｘｒｂ領域（例えば、Ｚｆｙ２遺伝子を含有する部分）（図１Ａを参照のこと）もしくはその他の種からのＹ染色体の対応する領域（例えば、ヒトＹ染色体のＡＺＦａ、ＡＺＦｂ、もしくはＡＺＦｃ領域）の全てもしくは一部を含み得る。例えば、領域は、Ｓｘｒａ領域及びＳｘｒｂ領域の両方の一部または全てを含み得る。例えば、Ｓｘｒｂ領域の境界は、Ｚｆｙ１及びＺｆｙ２である（図１Ａ及びＭａｚｅｙｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７（１１）：１７１３−１７２４を参照し、その全体があらゆる目的のために参照によって組み込まれる）。その他の動物種からの対応する領域としては、マウスＹ染色体上の領域における遺伝子とオルソロガスまたは相同である１つ以上の遺伝子を有する領域が挙げられる。例えば、ヒト領域のＡＺＦａ領域は、各領域がＵｔｙ、Ｄｂｙ（Ｄｄｘ３ｙ）、及びＤｆｆｒｙ（Ｕｓｐ９ｙ）を含有するという点で、マウスＹ染色体のＳｘｒｂ領域と対応する。例えば、Ａｆｆａｒａ（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｊａｎ．３、２００１：１−１６、Ｍａｚｅｙｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７（１１）、１７１３−１７２４、及びＳａｒｇｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３６：３７０−３７７を参照し、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって組み込まれる。領域は、Ｓｍｙ領域またはＳｐｙ領域の全てまたは一部も含み得る（図１Ａ及びＡｆｆａｒａ（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｊａｎ．３、２００１：１−１６を参照のこと）。同様に、領域は、マウスＹ染色体の欠失区間１、欠失区間２、欠失区間３、欠失区間４、欠失区間５、欠失区間６、及び欠失区間７のうち１つ以上またはその他の動物種からのＹ染色体の対応する領域の全てもしくは一部を含み得る（例えば、図１Ａ及びＡｆｆａｒａ（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｊａｎ．３、２００１：１−１６を参照のこと）。例えば、領域は、マウスＹ染色体の欠失区間１、欠失区間２、及び欠失区間３のうち１つ以上またはその他の動物種からのＹ染色体の対応する領域の全てもしくは一部を含み得る（例えば、図１Ａを参照のこと）。一例では、領域は、欠失区間２及び欠失区間３、または欠失区間２の一部及び欠失区間３の一部を含み得る。
【０３９０】
領域は、Ｒｂｍｙクラスター、Ｈ２ａｌ２ｙ、Ｓｒｙ、Ｚｆｙ２、Ｕｓｐ９ｙ、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、Ｔｓｐｙ−ｐｓ、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｋｄｍ５ｄ、Ｕｂａ１ｙ、またはＺｆｙ１のうち１つ以上を含み得る。領域は、Ｒｂｍｙクラスターまでのテロメア側であり得る、またはＨ２ａｌ２ｙ、Ｓｒｙ、Ｚｆｙ２、Ｕｓｐ９ｙ、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、Ｔｓｐｙ−ｐｓ、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｋｄｍ５ｄ、Ｕｂａ１ｙ、もしくはＺｆｙ１までのセントロメア側もしくはテロメア側であり得る。例えば、領域は、Ｋｄｍ５ｄのテロメア側もしくはＵｓｐｙ９ｙのセントロメア側におけるＹ染色体の一部を含み得る、または領域は、Ｚｆｙ２、Ｓｒｙ、もしくはＲｂｍｙクラスターのテロメア側であり得る。領域は、Ｒｂｍｙクラスター、Ｈ２ａｌ２ｙ、Ｓｒｙ、Ｚｆｙ２、Ｕｓｐ９ｙ、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、Ｔｓｐｙ−ｐｓ、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｋｄｍ５ｄ、Ｕｂａ１ｙ、またはＺｆｙ１のうち１つ以上を除外し得る。例えば、領域は、Ｒｂｍｙクラスター、Ｚｆｙ２、及びＳｒｙのうち１つ以上を除外し得る。同様に、領域は、Ｒｂｍｙクラスター、Ｈ２ａｌ２ｙ、Ｓｒｙ、Ｚｆｙ２、Ｕｓｐ９ｙ、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、Ｔｓｐｙ−ｐｓ、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｋｄｍ５ｄ、Ｕｂａ１ｙ、またはＺｆｙ１のうち１つ以上以外のＹ染色体の一部を含み得る。例えば、領域は、Ｒｂｍｙクラスター、Ｚｆｙ２、及びＳｒｙのうち１つ以上以外のＹ染色体の一部を含み得る。
【０３９１】
サイレンシングは、Ｙ染色体上に位置する遺伝子によってコードされるタンパク質のレベル及び／または活性を減少させ得る。例えば、Ｒｂｍｙクラスター、Ｈ２ａｌ２ｙ、Ｓｒｙ、Ｚｆｙ２、Ｕｓｐ９ｙ、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、Ｔｓｐｙ−ｐｓ、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｋｄｍ５ｄ、Ｕｂａ１ｙ、またはＺｆｙ１によってコードされるタンパク質のうち１つ以上のレベル及び／または活性が減少し得る。あるいは、サイレンシングは、Ｙ染色体上に位置する遺伝子の発現の排除をもたらし得る（すなわち、遺伝子は発現されない）。いくつかの方法では、例えば、Ｒｂｍｙクラスター、Ｈ２ａｌ２ｙ、Ｓｒｙ、Ｚｆｙ２、Ｕｓｐ９ｙ、Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、Ｔｓｐｙ−ｐｓ、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｋｄｍ５ｄ、Ｕｂａ１ｙ、またはＺｆｙ１のうち１つ以上のうち１つ以上は、サイレンシング時に発現されない。いくつかの方法では、Ｄｄｘ３ｙ、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｚｆｙ２、及びＳｒｙによってコードされるタンパク質のうち１つ以上のレベル及び／もしくは活性が減少する、またはＤｄｘ３ｙ、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｚｆｙ２、及びＳｒｙのうち１つ以上が発現されない。
【０３９２】
対象細胞、胚、または動物における発現または活性の減少としては、適切な対照細胞、胚、または動物と比較した場合の、発現または活性レベルの任意の統計的に有意な低減を挙げることができる。一般に、発現または活性は、発現または活性が、雌化培地ではない適切な対照培地中で培養された適切な対照細胞、胚、またはそれらに由来する動物（例えば、動物ＸＹ多能性細胞）、すなわち、細胞が雌化培地中で培養されたにもかかわらず、歴史的に完全に雄マウスを生成する動物ＸＹ多能性細胞における発現または活性よりも、統計的に低い場合に減少する。このような減少は、対照細胞と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える低減を含む。統計的有意性は、ｐ≦０．０５を意味する。
【０３９３】
「対象細胞」は、雌化培地（例えば、低オスモル濃度培地）中で培養された細胞または雌化培地中で培養された細胞の子孫である細胞である。「対照」または「対照細胞」は、対象細胞の表現型における変化を測定するための基準点を提供する。対照細胞は、それが雌化培地中で培養されなかったこと、または細胞が雌化培地中で培養されたにもかかわらず、ＸＹ雌マウスを生成する能力を欠いている、もしくは低減したその能力を有することのいずれかを除いて、好ましくは対象細胞と可能な限り厳密に合致する（例えば、個々の細胞は、同じ細胞株もしくは同じクローンに由来し得る、または同じ遺伝子型を有し得る）。例えば、対照細胞は、以下を含んでよい：（ａ）同じ遺伝子型である、または対象細胞と同じ細胞株もしくはクローンに由来するが、雌化培地ではない適切な対照培地（例えば、ＤＭＥＭもしくは動物ＸＹ多能性もしくは全能性細胞の多能性もしくは全能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる能力を細胞に付与することにより細胞を変化させない別の種類の培地）中で培養された細胞、（ｂ）対象細胞と遺伝的に同一である、または同じ細胞株もしくはクローンに由来するが、遺伝子改変されていない、もしくは繁殖可能な雌ＸＹ動物を生成する能力を細胞に付与することになる条件もしくは刺激に曝露されていない動物ＸＹ多能性または全能性細胞、ならびに（ｃ）雌化培地（例えば、低オスモル濃度培地）中で培養されるが、細胞が雌化培地中で培養されるにもかかわらず、歴史的に完全に雄動物を生成する動物ＸＹ多能性及び全能性細胞。
【０３９４】
発現または活性の減少は、任意の段階で任意の機構によって生じ得る。例えば、発現の減少は、領域に対して直接的もしくは間接的に作製された改変によって、または転写中、転写後、翻訳中、もしくは翻訳後に生じる事象もしくは制御によって生じ得る。
【０３９５】
機構の理解は実践に必要ではないが、クロマチンの変化及び／またはＹ染色体上におけるヒストンバリアントγＨ２ＡＸのリン酸化型のレベル増加は、サイレンシングに寄与し得る。リン酸化ヒストンγＨ２ＡＸは、転写抑制と関連することが知られていて、減数分裂前期中のＸＹ性体におけるＸ及びＹ染色体の転写抑制と関連する。例えば、Ａｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  １３５：２４１−２５２を参照のこと。
【０３９６】
サイレンシングは、ＸＹ多能性または全能性細胞が培養されている場合、ドナーＸＹ多能性もしくは全能性細胞が宿主胚に導入された後、またはドナーＸＹ多能性もしくは全能性細胞を含む宿主胚が、レシピエント雌動物に導入された後に生じ得る。サイレンシングはまた、異なる胚発生期中に、または胚発生の全体にわたって生じ得る。いくつかの場合には、サイレンシングは出生後も継続する。例えば、卵母細胞が受精した後、一部のサイレンシングは最初の２細胞分裂を経ても維持され得る。サイレンシングにより引き起こされる性転換はまた、Ｆ１子孫に伝達されることが可能であり得る。サイレンシングが生じる期間のいくつかの例としては、以下のうち１つ以上が挙げられる：（１）雄の性決定プログラムが実行される場合の胚発生中、（２）少なくともマウスのＥ１１〜Ｅ１２に対応する発達段階（例えば、性決定もしくは性転換に重要な発達段階）までの胚発生中、（３）少なくともマウスのＥ１７〜Ｅ１９に対応する発達段階（例えば、胚の卵母細胞における繁殖力に重要な発達段階）までの胚発生中、（４）卵形成期の全体を通して、（５）卵母細胞発生における減数分裂前期中、これは出生直前の胚で開始する、（６）卵母細胞が受精した後（例えば、その最初の２細胞分裂中）、または（７）受精後の最初の２細胞分裂を経た排卵後の卵母細胞において。
【０３９７】
当該技術分野において既知の任意の手段が、Ｙ染色体の領域をサイレンシングするための細胞をアッセイするために使用され得る。例えば、サイレンシングされた領域内の遺伝子は、発現されない場合がある（例えば、発現が排除される、または細胞が遺伝子の検出可能な発現を欠いている）。遺伝子は、遺伝子の転写が実施されない場合、または当該技術分野において既知の一般的な技術による遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡもしくはタンパク質）の検出可能なレベルが一切存在しない場合、発現されない。ポリペプチドの発現レベルは、直接的に、例えば、細胞もしくは生物中のポリペプチドレベルについてアッセイすることにより（例えば、ウェスタンブロット分析、ＦＡＣＳ分析、ＥＬＩＳＡ）、または間接的に、例えば、ポリペプチドの活性を測定することにより測定されてよい。その他の場合では、遺伝子の発現及び／または活性の低減は、例えば、サザンブロット分析、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ分析、ノーザンブロット分析、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、マイクロアレイ分析、または表現型分析を含む方法を使用して測定され得る。アッセイすることは、Ｙ染色体上のどの領域、小領域、または遺伝子がサイレンシングされているかを同定することも含み得る。
【０３９８】
上または下で引用される全ての特許申請、ウェブサイト、その他の刊行物、アクセッション番号などは、個々の項目全体が、あらゆる目的のために参照によってそのように組み込まれていると具体的かつ個別に示された場合と同程度に、それらの内容全体があらゆる目的のために参照によって組み込まれる。ある配列の異なるバージョンが、異なる時点でアクセッション番号と関連付けられている場合、本出願の有効出願日においてアクセッション番号と関連付けられたバージョンを意味する。有効出願日は、実際の出願日、または適用可能な場合、アクセッション番号を参照する優先権出願の出願日のうち早い方を意味する。同様に、刊行物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが異なる時点で公開されている場合、別段の指示がない限り、本出願の有効出願日に公開されている最新バージョンを意味する。本発明のあらゆる特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様は、別段の具体的な指示がない限り、その他のいずれとも組み合わせて使用され得る。本発明は、明確化及び理解を促すことを目的として例証及び例示によってある程度詳細に記載されてきたが、何らかの変更及び修正が、添付の特許請求の範囲内で実施されてよいことは明らかだろう。
【０３９９】
配列の簡単な説明
添付の配列表に列挙されるヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基の標準文字略号、及びアミノ酸の３文字コードを使用して示される。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端で始まり、３’末端へと進む（すなわち、各ラインの左から右へ）という標準規則に従う。各ヌクレオチド配列の１本鎖のみが示されているが、表示された鎖の任意の参照によって、相補鎖が含まれると理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端で始まり、カルボキシ末端へと進む（すなわち、各ラインの左から右へ）という標準規則に従う。
【０４００】
【表２−１】
2018527005.tif 000007
【表２−２】
2018527005.tif 000008
【実施例】
【０４０１】
実施例１．ＸＹ  ＥＳ細胞からの繁殖可能かつ妊孕可能なＦ０  ＸＹ雌マウスの生成。
材料及び方法
ＥＳ細胞培養。本明細書に記載される全ての結果は、ＶＧＦ１、すなわち、発明者らのＣ５７ＢＬ６ＮＴａｃ／１２９Ｓ６ＳｖＥｖ  Ｆ１ハイブリッドＸＹ  ＥＳ細胞株を用いて実施された実験からの結果であった（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：９１−９９、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：６５２−６５９）。ＥＳ細胞を、以前に記載された通りに培養した（Ｍａｔｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅｓ．Ｉｎ：Ｊｏｙｎｅｒ  ＡＬ（ｅｄ）Ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ１０１−１３２）。表３に示したＮａＨＣＯ３濃度を有する特注の高グルコースＤＭＥＭ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）に、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、４ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ならびに２，０００Ｕ／ｍｌの白血病抑制因子（ＬＩＦ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を補充した。培地のオスモル濃度を、単一試料用浸透圧計（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．モデル３２５０）で測定した。エレクトロポレーション法では、発明者らは、１２０μｌのエレクトロポレーション緩衝液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中に溶解させた１．５μｇの標的化ベクターＤＮＡを、７．５×１０６ＥＳ細胞と混合して、ＢＴＸ多層エレクトロポレーションプレート（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に移した。エレクトロポレーション後、細胞を氷上で１０分間インキュベートして、その後２つの１５ｃｍゼラチン化ディッシュ上に播種した。選択培地を、エレクトロポレーションから４８時間後に添加し、それ以降毎日取り替えた。コロニーを、エレクトロポレーションから１０日後に選定して、トリプシンを含有する９６ウェルプレートの個々のウェルに移し、その後、細胞をゼラチン化９６ウェルプレート中に播種した。３日後、細胞を再度トリプシン処理して、３分の２の各ウェルの内容物を凍結し、残存する３分の１をＤＮＡ抽出のために新しいプレートに移した。
【０４０２】
ＥＳ細胞スクリーニング、マウス遺伝子型同定、ならびにＸ及びＹ染色体の計数。発明者らは、Ｌｏｓｓ−ｏｆ−Ａｌｌｅｌｅ法（Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５−３０７）を使用して、標的ＥＳ細胞クローンを正確に同定し、マウス対立遺伝子の遺伝子型を決定した。発明者らは、以下のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってＸ及びＹ染色体数を決定した：Ｘについては、プライマー（５’−３’）ＧＧＡＧＧＧＴＡＧＣＡＣＧＧＧＡＡＧＡＡＧ（配列番号：４５）及びＧＣＴＧＧＣＴＡＣＣＣＡＣＴＴＧＡＴＴＧＧ（配列番号：４６）ならびにプローブＴＣＡＡＧＣＡＧＴＣＴＣＴＣＣＣＡＧＣＴＡＡＣＣＴＣＣＣＴ（配列番号：４７）、ならびにＹについては、プライマーＧＡＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＧＧＡＴ（配列番号：４８）及びＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＣＣＴＴＴ（配列番号：４９）ならびにプローブＣＡＧＧＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣＴＴＡＣＡＧＡＡＧＣＣＧＡ（配列番号：５０）。Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ系統が持つ、ＶＧＦ１  ＥＳ細胞ゲノム中には存在しないチロシナーゼ遺伝子におけるアルビノ変異についてのｑＰＣＲアッセイによって、宿主胚の寄与が定量化された。このアッセイの検出限界は、２，０００の半数体ゲノム当量においておよそ１つのアルビノ対立遺伝子である（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：９１−９９）。切離した脾臓を、スペクトル核型分析（ＳＫＹ）のためにＶａｎ  Ａｎｄｅｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（グランドラピッズ、ミシガン州）に送付した。
【０４０３】
マイクロインジェクション法。注入の日に、ＥＳ細胞をトリプシン処理し、ＬＩＦを含まないＥＳ細胞培地中に再懸濁した。凍結した８細胞Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ胚（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を解凍し、マイクロインジェクション前にＫＳＯＭ培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中において３７℃で７．５％ＣＯ２中で９０分間インキュベートした。８細胞胚へのＥＳ細胞の注入を、以前に記載された通りに実施した（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：９１−９９）。注入後、胚を一晩培養し、性交後日数２．５日で偽妊娠レシピエント雌マウスに移入した。
【０４０４】
結果
交配試験及び表現型決定試験の両方についてＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）の収率を最適化するために、発明者らは、遺伝子標的化実験中に、及び８細胞胚注入前に様々なＥＳ細胞培養培地を試験した。発明者らが評価した１つの成分は、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）ＤＭＥＭ（ＫＯ−ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として既知の基本培地であった。当初、ＫＯ−ＤＭＥＭを用いて調製した培地中で成長させたＥＳ細胞では、標準的なＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）を用いて作製した培地中で維持した細胞と比較して、発明者らが、より少ない雄ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を得たという点で良い結果にならなかったと思われた。しかし、発明者らは、雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）の大幅な増加も観察した：３４の異なる遺伝子についての標的化実験から得られた７８のクローン注入から生成したＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）の３１％が、雌であった（表３、ＫＯ−ＤＭＥＭ）。従来のＤＭＥＭ培地中で成長させた５００を超える標的ＥＳ細胞クローンの注入に関する、発明者らのマウス生成データベースで記録した結果の後ろ向き比較によって、全てのＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）において１％のみが、雌であると同定されたことが明らかとなった（表３、ＤＭＥＭ）。稀な雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）は、交配させなかったため、さらに調査しなかった。ＫＯ−ＤＭＥＭ培地中で成長させたＸＹ  ＥＳ細胞クローンからの雌の高発生率にもかかわらず、この実験からの雄と雌のＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）における１８％全収率は、ＤＭＥＭ培地中で誘導したクローンを用いた発明者らの過去の経験と同一であった（表３、ＫＯ−ＤＭＥＭ及びＤＭＥＭ）。
【０４０５】
ＫＯ−ＤＭＥＭ中で成長させたＥＳ細胞クローンは、０〜６０％の範囲の割合で雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を生成した。雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を生成する傾向は、各クローンにとって特異的であった。雌を生成しなかったクローンが、反復マイクロインジェクションにおいてこの形質を維持した一方で、雌を生じたクローンは、反復マイクロインジェクション実験においておよそ同じ比率の雌を生じる傾向があった。発明者らが、雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を生成するクローンの能力を変化させ得るかを確認するために、発明者らは培地交換実験を実施した。ＥＳ細胞を、標的化プロセス全体、すなわち、エレクトロポレーション、薬物耐性コロニーの選択、標的変異についてのスクリーニング、増殖及び凍結保存において、ＤＭＥＭに基づく培地またはＫＯ−ＤＭＥＭに基づく培地のいずれかで成長させて維持した遺伝子標的化実験からのＥＳ細胞クローンを解凍し、８細胞胚へのマイクロインジェクションに備えて３日間、反対の培地中で成長させた。胚を、胚盤胞へと分化させるためにＫＳＯＭ中で一晩インキュベートした後、それらを代理母に移入した。発明者らは、生産ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）の間で産生されたＸＹ雌の比率を記録した。
【０４０６】
【表３−１】
2018527005.tif 000009
【表３−２】
2018527005.tif 000010
【０４０７】
ＤＭＥＭからＫＯ−ＤＭＥＭへの切替えでは、発明者らは、ＤＭＥＭ培地中で実施した５つの異なる遺伝子標的化実験から１１のクローンを選択し、それらをＫＯ−ＤＭＥＭまたは対照としてＤＭＥＭのいずれかで解凍し、成長させた。ＤＭＥＭからＫＯ−ＤＭＥＭに切り替えたＥＳ細胞から移入したおよそ４００の胚は、１０５匹の生産ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を生成し、そのうち２匹（１．９％）のみが雌であって（表４、ＤＭＥＭ中で標的化し、ＫＯ−ＤＭＥＭ中で解凍した）、ＤＭＥＭ中で維持したＥＳ細胞を用いて注入した対照胚によって生成された雌の比率（２．４％）と類似していた（表４、ＤＭＥＭ中で標的化し、ＤＭＥＭ中で解凍した）。逆の実験では、発明者らは、ＫＯ−ＤＭＥＭ中で実施した標的化実験から３つのクローンを選択し、それらをＤＭＥＭまたは対照としてＫＯ−ＤＭＥＭのいずれかで解凍し、成長させた。ＫＯ−ＤＭＥＭからＤＭＥＭに切り替えたＥＳ細胞から移入した３００の胚は、４１匹のＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を生成し、そのうち８匹（２０％）が雌であって（表４、ＫＯ−ＤＭＥＭ中で標的化し、ＤＭＥＭ中で解凍した）、ＫＯ−ＤＭＥＭ中で維持したＥＳ細胞を用いて注入した対照胚から生成された雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）の比率（１８％）と類似していた（表４、ＫＯ−ＤＭＥＭ中で標的化し、ＫＯ−ＤＭＥＭ中で解凍した）。
【０４０８】
【表４】
2018527005.tif 000011
【０４０９】
これらの結果は、ＤＭＥＭに基づく培地中で誘導したクローンが、発明者らの過去の経験と同様に（表３、ＤＭＥＭ）、低頻度の雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）生成を維持し、発明者らは、ＫＯ−ＤＭＥＭへの短時間曝露によってこの頻度を高めることができなかったことを示した。同様に、ＫＯ−ＤＭＥＭに基づく培地中で誘導したクローンは、より高頻度の雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を生成し、ＤＭＥＭへの短時間曝露によって、雌を生成するＸＹクローンの傾向が低減することはなかった。実験の両方の群で、ＤＭＥＭまたはＫＯ−ＤＭＥＭのいずれかでの誘導にかかわらず、解凍後にＫＯ−ＤＭＥＭに曝露したクローンは、ＤＭＥＭ培地中で解凍したクローンと比較して（１０％及び１４％）、全体的なＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）生成についてより高く、かつ類似した効率を有した（２７％及び２８％）。
【０４１０】
ＸＹ  ＥＳ細胞に完全に由来した解剖学的に正常な雌。雌ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）現象の説明としてキメラ現象を排除するために、発明者らは、毛色の寄与により見かけ上完全にＥＳ細胞由来であった全ての雌が、尾部生検に対するｑＰＣＲアッセイにより真のＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）であって、ＥＳ細胞を注入したＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ  ８細胞宿主胚からの遺伝的寄与を一切示さなかったことを確認した（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：９１−９９）。発明者らは、雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）がＸＯ  ＥＳ細胞に由来し得、これは雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）のみを生成するが、この可能性は、雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（以後、ＸＹ雌と称される）が、Ｘ及びＹの各々の１コピーを有していたことを立証したｑＰＣＲ染色体計数アッセイによって排除されたことが分かった。ＸＹ  ｑＰＣＲ結果を、５匹のＸＹ雌から採取した脾臓細胞のＳＫＹによって確認し、これによって、検出可能な転座または欠失が一切ない正常な常染色体数も明らかとなった。
【０４１１】
１５匹のＸＹ雌の腹腔における検査によって、それらの外性器において全てのＸＹ雌が示した正常な雌構造が、内部器官まで伸長していたことを確認した。全てが正常な女性生殖器を表し、半陰陽、卵精巣、または不完全な雌の性発達に関するその他の徴候を一切示さなかった。それらは、正常な卵管及び血管に富んだ子宮角を有し、活性な排卵プロセスを示唆する出血黄体を有する機能的な卵巣を有するように見えた。加えて、発明者らは、ＸＹ雌が、交配によって得られた野生型雌マウスに見られる値の範囲内にある体重及び血清生化学プロファイルを有したことを見出した。
【０４１２】
雌の生殖器における組織特異的宿主胚キメラ現象の可能性を排除するために、発明者らは、Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ宿主胚マーカーについて、ならびに正常な構造に関して検査した１５匹のＸＹ雌から切離した組織上のＸ及びＹ染色体についてｑＰＣＲアッセイを実施した。全てのマウスについて、発明者らは、宿主胚の寄与は一切なく、卵巣、卵管、及び子宮を含む全ての組織においてＸ及びＹ染色体の各々の１コピーを見出した。発明者らは、ＸＹ雌が正常な雄の核型を有し、注入したＸＹ  ＥＳ細胞に完全に由来し、かつ宿主胚からの検出可能な遺伝的寄与を一切示さないと結論付ける。それらは、正常な雌マウスと区別ができない外的及び内的構造を提示する。
【０４１３】
性転換ＸＹ雌は、繁殖可能かつ妊孕可能である。ＸＹ雌の繁殖力を試験するために、発明者らは、複数の独立したＸＹ遺伝子標的ＥＳ細胞クローンに由来した１１９匹の雌Ｆ０  ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（５０％のＣ５７ＢＬ／６Ｎ：５０％の１２９ＳｖＥｖＳ６）を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ雄と交配させた。６３％（７５匹）のＸＹ雌が、少なくとも１匹の同腹仔を産生した。このレベルの繁殖力は、発明者らが、同じ親ＥＳ細胞株に由来するＦ１世代（７５％のＣ５７ＢＬ／６Ｎ：２５％の１２９ＳｖＥｖＳ６）ＸＸ雌との交配による産生で観察する、およそ９０％の繁殖力よりも低いが、前述した雄から雌への性転換の場合と比較して非常に高い。ＸＹ雌と正常な交配よって生成したＸＸ雌との妊孕力を比較するために、発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ雄を１８匹のＸＹ雌と、または１４匹の野生型ＸＸ  Ｆ１雌と交配させた。９か月間にわたって、発明者らは、妊孕力の３つの測定値、すなわち、雌当たりの産生した仔及び同腹仔、ならびに産子数（表５）について、ＸＹ雌母とＸＸ対照との間に有意な差異を観察することはなかった。
【０４１４】
【表５】
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【０４１５】
雄から雌への性転換形質は、Ｆ１世代に伝達されない。ＸＹ雌形質の遺伝について試験するために、発明者らは、ＸＹ雌とＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ雄との交配による３９４匹のＦ１子孫でＸ及びＹ染色体数を定量化した。発明者らは、表現型的に雌の子孫にはＸＹ遺伝子型を有したものはなく、少なくとも１本のＹ染色体を有するマウスの全ては表現型的に雄であったことを見出した。しかしながら、発明者らは、雌（１３４匹）よりも２倍多い雄（２６０匹）及び雄と雌のマウスの両方で異常な性染色体数を観察した。異常な雄の核型（ＸＸＹ及びＸＹＹ）は、ＸＹ  ＥＳ細胞の胚盤胞注入によって生成した雌キメラの交配によるＦ１子孫で報告されていて（Ｂｒｏｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：３１２０−３１２３）、不妊症と関連した。発明者らは、ＸＹ雌のＸＸＹ及びＸＹＹ雄Ｆ１子孫は不妊であり、無精液状態または極めて少ない精子数を有したかのいずれかであった非常に小さな精巣を有したことも見出した。
【０４１６】
ＸＹ  ＥＳ細胞からのＸＹ雌の生成を促進する培地条件。ＫＯ−ＤＭＥＭに基づく培地中で成長させたＥＳ細胞は、従来のＤＭＥＭ培地中で成長させたクローンよりも、８細胞胚への注入後にＸＹ雌を生成する傾向がはるかに高かった（表３）。供給業者の仕様書には、これらの基本培地間におけるオスモル濃度の差が示されている：ＤＭＥＭのおよそ３４０ｍＯｓｍ／ｋｇと比較して、ＫＯ−ＤＭＥＭではおよそ２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ。したがって、発明者らは、塩及び糖成分の濃度を変化させることにより、低減した測定オスモル濃度を有するＤＭＥＭの改変版（ｍＤＭＥＭ）を調製し、次いで、改変培地中で生成した標的ＥＳ細胞についてＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）生成を評価した（表３）。その他の実験では、異なるオスモル濃度、塩濃度、及び炭酸塩濃度を、それらのＥＳ細胞から生成したＸＹ  ＥＳ細胞及びＦ０マウスに対するそれらの効果について試験した。繁殖可能なＦ０  ＸＹ雌は、２１８〜３２２ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度で、３．０〜６．４ｍｇ／ｍＬ（約５１．３ｍＭ〜約１０９．５ｍＭ）のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩（例えば、ＮａＣｌ）の濃度で、ならびに１．５〜３．７ｍｇ／ｍＬ（約１７．９ｍＭ〜約４４．０ｍＭ）の炭酸塩（例えば、ＮａＨＣＯ３）の濃度で生成に成功した（表６及び表７）。表７の２行目について（ＤＭＥＭ）、基本培地の典型的なオスモル濃度は、３３７〜３４１または３４０〜３４１ｍＯｓｍ／ｋｇであり、完全培地（１５％ＦＢＳ、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ベータ−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、及びＬＩＦを加えたＤＭＥＭ）の典型的なオスモル濃度は、３２９〜３３８ｍＯｓｍ／ｋｇの間である。表７の１行目について（ＫＯ−ＤＭＥＭ）、基本培地の典型的なオスモル濃度は、２７１〜２７８ｍＯｓｍ／ｋｇの間であり、完全培地（１５％ＦＢＳ、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ベータ−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、及びＬＩＦを加えたＫＯ−ＤＭＥＭ基本培地）の典型的なオスモル濃度は、２７８〜２８０ｍＯｓｍ／ｋｇの間である。表７の４行目について（低ＮａＣｌ基本培地）、基本培地の典型的なオスモル濃度は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、完全培地の典型的なオスモル濃度は、約２１６ｍＯｓｍ／ｋｇである。
【０４１７】
その変動がＸＹ雌の生成における変化と一貫して相関する唯一の成分は、その他の塩濃度、測定オスモル濃度またはｐＨにかかわらず、重炭酸ナトリウムであった。重炭酸ナトリウム濃度の効果は、発明者らが試験した改変培地のうち４種を比較する場合に見られる。遺伝子標的化実験における、ＤＭＥＭ培地の濃度に等しい重炭酸ナトリウム濃度（４４ｍＭ）を有したｍＤＭＥＭ−１（表３）に基づく培地の使用によって、ＤＭＥＭ培地と比較して低減した測定オスモル濃度にもかかわらず、低比率（５．７％）のＸＹ雌を生成したＥＳ細胞が生成された。ＤＭＥＭの濃度未満の重炭酸ナトリウム濃度に低下させると（ｍＤＭＥＭ−２については２６ｍＭならびにｍＤＭＥＭ−３及び−４については１８ｍＭ）、発明者らがＫＯ−ＤＭＥＭで観察した比率と同様に、平均で３０％のＸＹ雌を生成した（表３）。ｍＤＭＥＭ−４培地は、最も低いオスモル濃度を有し、最高比率のＸＹ雌（３４％）及び最高効率の総ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）生成（２５％）の両方を生成した。しかし、低オスモル濃度は、必ずしも高頻度のＸＹ雌と相関するとは限らなかった。ｍＤＭＥＭ−１及び−３培地は、ほぼ同一のオスモル濃度を有したが、非常に異なる比率のＸＹ雌を促進した。概して、発明者らは、ＸＹ雌を生成する培地の傾向と完全にＥＳ細胞由来のＦ０マウスの収率との間に直接相関を観察した。
【０４１８】
【表６−１】
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【表６−２】
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【０４１９】
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【０４２０】
同質遺伝子ＸＹ雄及び雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）の交配から得られたマウスの表現型決定。繁殖可能かつ妊孕可能なＸＹ雌の値を例証する例として、発明者らは、ヘテロ接合体同質遺伝子ＸＹ雄及び雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）の交配から得られたＦ１世代ノックアウトマウスの表現型を、以下の２つの遺伝子について従来の交配から得られたＦ２世代ノックアウトマウスの表現型と比較した：カテプシンＫ、すなわち、骨の恒常性にとって非常に重要なシステインプロテアーゼをコードするＣｔｓｋ、及びクローディン−７、すなわち、密着結合の主な成分をコードするＣｌｄｎ７。両方について、発明者らは、コード領域全体を、開始コドンとインフレームで融合したベータ−ガラクトシダーゼレポーター、続いてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ薬物選択カセットをコードする配列と置き換えた。発明者らは、Ｆ０  ＸＹ雌を、それらのクローン兄弟ＸＹ雄ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）と交配させることによって野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／−）、及びホモ接合体ノックアウト（−／−）マウスのＦ１世代試験コホートを生成した。Ｃｌｄｎ７ノックアウトについて、発明者らは、雄Ｆ０  ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）をＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ雌と交雑させて、Ｆ１ヘテロ接合体マウスを生成し、次いで、これらのマウスを互いに交雑させてＦ２試験コホートを生成することによって、追加の従来の交配対照群を生成した。
【０４２１】
Ｃｔｓｋノックアウトマウスに関する過去の報告と一致して、発明者らは、ＸＹ雌の交配によって産生されたＣｔｓｋ−／−マウスは、生存可能かつ繁殖可能であったが、それらのＣｔｓｋ＋／＋同腹仔と比較して、それらは、ＢＭＤの著しい増加及び雌の大腿骨骨梁の保持増加を含む、多数の骨欠損を発現したことを見出した。過去に報告されたＣｌｄｎ７ノックアウトから予想した通り、従来の交配スキーム及びＸＹ雌の交配スキームの両方によるＣｌｄｎ７−／−マウスは、正常に発育せず、出生から数日後に死亡した。生産マウスの中でも、発明者らは、従来の交配（Ｃｌｄｎ７＋／＋、３２、Ｃｌｄｎ７＋／−、７４、Ｃｌｄｎ７−／−、１３、Ｐ＝４．２×１０−７、χ２検定）によって、及びＸＹ雌の交配（Ｃｌｄｎ７＋／＋、５４、Ｃｌｄｎ７＋／−、１０８、Ｃｌｄｎ７−／−、２４、Ｐ＝９．２×１０−４、χ２検定）の両方によって産生されたホモ接合変異体マウス数の減少を観察し、これは不完全浸透の胚致死を示した。腎臓欠陥と一致し、公開された変異体マウスと同様に、従来の交配スキーム及びＸＹ雌の交配スキームの両方によるＣｌｄｎ７−／−新生児は、血漿カリウムイオンを適切に制御できなかった。適合した成長及び腎機能表現型に加えて、発明者らは、ＸＹ雌及び従来の交配群の両方によるヘテロ接合体の主な成体器官において、同一のベータ−ガラクトシダーゼ全載発現パターンを観察した。
【０４２２】
考察
不和合性の遺伝的背景（Ｅｉｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１７：５３５−５３７、Ｔａｋｅｔｏ−Ｈｏｓｏｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０７：９５−１０５）または性決定に必要な遺伝子の変異（Ｂａｇｈｅｒｉ−Ｆａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３１４：７１−８３、Ｂａｒｒｉｏｎｕｅｖｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．７４：１９５−２０１、Ｂｏｇａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ７：ｅ１０００１９６、Ｃｈａｂｏｉｓｓｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１：１８９１−１９０１、Ｃｏｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｅｌｌ  １０４：８７５−８８９、Ｇｉｅｒｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ２３：１０３２−１０４２、Ｈａｍｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｅｌｌ  １０６：３１９−３２９、Ｋａｔｏｈ−Ｆｕｋｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：６８８−６９２、Ｍｅｅｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３４：３２−３３、Ｔｅｖｏｓｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９：４６２７−４６３４、Ｗａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ２３：１０２０−１０３１）によって引き起こされるものであろうと、マウスの雄から雌への性転換は、ほぼ常に不妊症を伴う。主要な雄の性決定遺伝子であるＳｒｙに変異を持つ一部のＸＹ雌は、繁殖可能であるが、小さく稀な同腹仔及び短い生殖寿命を有する（Ｌｏｖｅｌｌ−Ｂａｄｇｅ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（１９９０）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０９：６３５−６４６）。最近では、類似した低繁殖力及び妊孕力が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）での指向性標的化によって生成されたＳｒｙの４１塩基対（ｂｐ）欠失を持つＸＹ雌マウスについて報告された（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０−５３２）。ＴＡＬＥＮ誘導Ｓｒｙ変異の別の例では、２ｂｐ欠失を持つ１匹のＸＹ雌マウスが生殖不能であることが見出された（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：３１３６）。
【０４２３】
繁殖力に障害のあるこれらの場合とは極めて対照的に、遺伝子標的ＥＳ細胞から生成されたＸＹ雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）は、予想とは逆であると思われる可能性のある前例のないほど高レベルの繁殖力及び正常な妊孕力を示す。正常な２０Ｘ配偶子に加えて、ＸＹ雌は、異常な２０Ｙ、１９Ｏ、及び２１ＸＹ卵型を産生し得、後者の２種は、ＸＹ雌のＦ１子孫におけるＸＸＹ、ＸＹＹ、及びＸＯ性染色体核型について説明する第一減数分裂の不分離事象に起因する。したがって、ＸＹ雌は、低減した数の生存可能かつ機能的な卵を有し得る可能性がある。事実、様々なＦ１性染色体核型の比率は、３種の異常な配偶子型に由来する生存可能な受精子孫の４種類において２５〜３０％の損失を仮定するモデルとベストフィットする（χ２分析による）。このような損失は、全ての卵型から２０％の損失のみをもたらすことになり、これによって、発明者らが、発明者らの９か月の交配試験において識別し得る妊孕力の差を引き起こす可能性はないことになる。
【０４２４】
本明細書に記載されるＸＹ雌の高繁殖力及び妊孕力は、雄から雌への性転換において特有の機構を示唆する。ＸＹ雌形質の伝達性の欠如によって、性転換は、遺伝子標的ＥＳ細胞クローンの一部の細胞が、エピジェネティックマークまたはＸＹ雌の生成を有利にするように細胞を運命づけるあるその他の生理学的交代を獲得する一過性の事象であることが示される。ＥＳ細胞が獲得したマークまたは変化が何であろうと、それは固定されて安定していると思われる。ＸＹ雌を生成する傾向は、各遺伝子標的ＸＹ  ＥＳ細胞クローンに特有である。各々は、通常、反復注入実験においてＸＹ雌の再現可能な比率を生成し、個々のクローンは、それらを遺伝子標的化プロセス後に異なる培養条件に切り替えることによって「雌化」または「雄化」され得ない。ＸＹ雌現象の特徴は、それが遺伝子標的化のプロセス全体、すなわち、解凍、成長、継代、エレクトロポレーション、抗生物質の選択、増殖、及び凍結を通して雌化培地中で維持されていたＥＳ細胞のみに影響を及ぼすことであり、このことは、遺伝子標的化プロセスのストレスが、時としてＸＹ  ＥＳ細胞に対して「雌化」特性を付与するエピジェネティックマークを誘導する可能性があることを示唆している。
【０４２５】
発明者らは、発明者らが、ＤＭＥＭから発明者らの基本培地に、すなわち、高張（＞３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ）から等張（２７５〜２９５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ）ＫＯ−ＤＭＥＭに切り替えた後に著しい数のＸＹ雌を最初に観察した。細胞は、ＭＡＰキナーゼ経路を活性化することによって浸透圧ストレスに応答し、ＭＡＰキナーゼ経路のメンバーであるＭａｐ３ｋ４及びＧａｄｄ４５ｃの変異、またはＭＡＰキナーゼを介してシグナル伝達するインスリン経路の変異は、Ｓｒｙの発現低減をもたらし、未分化生殖隆起において精巣発達を誘導することができない。高張培地中におけるＥＳ細胞の培養は、ＭＡＰキナーゼ経路を刺激し、細胞が発達中の胚で増殖した後、雄分化を増強する生理学的またはエピジェネティック環境を促進する可能性がある。逆に、等張またはわずかに低張の培地中におけるＥＳ細胞の培養は、ＭＡＰキナーゼ経路を介するシグナル伝達を抑え、それゆえ、性転換変異の効果を模倣する可能性がある。
【０４２６】
性決定を理解するためのその含意の他に、発明者らが本明細書で記載する雄から雌への性転換現象は、遺伝子改変マウスの生成について重要で実用的な結果を有する。ＸＹ雌は、繁殖可能かつ妊孕可能の両方であるため、発明者らはＦ０兄弟の相互交配を使用して、Ｆ１ホモ接合体ノックアウトマウスを生成することができ、そのマウスの表現型は、発明者らの実験室で、または公開された報告書に記載されているかのいずれかで、天然交配スキームによって生成された表現型を再現した。異常な性染色体核型を持つマウスが除外される場合であっても、試験コホートの集合について十分に正常なＦ１  ＸＸ雌及びＸＹ雄が存在し続ける。発明者らの培養方法は、ＸＯ  ＥＳ細胞クローンから繁殖可能な雌を生成するよりも、より迅速かつ容易であり、その理由とは、サブクローニング、及びＹ染色体の稀な喪失についてスクリーニングする必要がないからである。性転換を促進する条件及び関与する分子機構のさらなる調査は、任意の標的ＥＳ細胞クローンから雄及び雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）の両方について信頼できる、予測可能かつ効率的な生成における改善された方法の発展を可能にすることもある。
【０４２７】
実施例２．Ｄｄｘ３ｙ（Ｄｂｙ）、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、及びＳｒｙの発現を、低オスモル濃度培地中で培養したＸＹ  ＥＳ細胞に由来する胚中でサイレンシングする、または減少させる。
胚を発達段階の性交後日数（ｄｐｃ）１１．５日で切離し、タイラーステージ診断を使用してそれらのおよその段階を決定した。妊娠期間が同腹仔内で大幅に変動するため、個々の胚についてのより正確なステージ診断を、後肢芽の後方から尾部の末端まで尾体節（ｔｓ）数を計数することにより達成した。この技術を使用して、８尾体節を有する胚は、１０．５ｄｐｃであり、１８尾体節は１１．５ｄｐｃであり、３０尾体節は１２．５ｄｐｃである（Ｈａｃｋｅｒ，Ｃａｐｅｌ，Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌｏｖｅｌｌ−Ｂａｄｇｅ，Ｄｅｖｅｌ  １９９５から）。
【０４２８】
Ｂ６マウスでは、Ｓｒｙは、およそ１３ｔｓで検出可能になると報告されていて、およそ１７〜１８ｔｓでピークに到達し、およそ２７ｔｓで低下する。１２〜２７の間のｔｓを有する胚をマウスから採取し、Ｓｒｙの全時間経過を捕捉した。生殖隆起（生殖腺及び隣接する中腎を含有する）を、これらの段階で胚から切離し、体壁及び後腎（ｍｅｔａｎｅｐｈｒｏｕｓ）（発達中の腎臓）から分離して、ＲＮＡ精製のためにＴｒｉｚｏｌ中で保持した。
【０４２９】
Ｙ染色体上の性決定遺伝子（Ｓｒｙ）は、哺乳動物において雄の性決定開始に関与する。この遺伝子は、発達の限られた期間の間（マウスのおよそ１１．５ｄｐｃ）に生殖腺における細胞の限られた集団中で発現される。この期間中、Ｓｒｙは、精巣になる生殖腺及び雄の運命を獲得する生物に必要な全ての変化を開始する。しかしながら、Ｓｒｙ発現がこの期間中に減少する、または数時間後に発現される場合であっても、ＸＹ個体は卵巣を発達させて雌になり、これが性転換であると考えられている。
【０４３０】
なぜ一部のＸＹクローンが性転換マウスを生成するのかを決定するために、発明者らはＲＴ−ＰＣＲを使用して、雄と雌の両方で早期性決定におけるマーカーの発現レベルを決定した。雄経路では、発明者らは、雄性決定の開始に関与する遺伝子：すなわち、Ｓｒｙ、Ｓｏｘ９（Ｓｒｙの直接標的であると提案されていて、精巣発達の開始及び維持に必要）、雌経路の抑制時に関与する遺伝子（Ｆｇｆ９）、ならびに早期精巣分化の良好なマーカーである遺伝子（Ｄｈｈ及びＡｍｈ）に注目した。雌経路では、発明者らは、非常に早期な雌発達において活性な遺伝子（Ｆｏｘｌ２）及び雄経路の抑制時に関与する遺伝子（Ｒｓｐｏ１）に注目した。図１５を参照のこと。
【０４３１】
ＲＴ−ＰＣＲの試料を調製するために、組織をＴＲＩｚｏｌ中で均質化し、クロロホルムを相分離のために使用した。全ＲＮＡを含有する水相を、製造業者の仕様書に従って、ＭａｇＭＡＸ（商標）−９６  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＡｍｂｉｏｎ、カタログ番号ＡＭ１８３９）を使用して精製した。ゲノムＤＮＡを、上に列挙したＭａｇＭＡＸキット（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＡｍｂｉｏｎ、カタログ番号ＡＭ１８３９）からのＭａｇＭＡＸ（商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）ＤＮａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ及びＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅを使用して除去した。ｍＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ（商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１７５５５００）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３７００７４）を用いて、ＡＢＩ  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して増幅した。サイクリング条件は９５℃で１０分間からなり、続いて９５℃で３秒間及び６０℃で３０秒間を４０サイクルとした。Ｈｐｒｔを、内部標準遺伝子として使用し、任意のｃＤＮＡ入力差を正規化した。参照試料は、デルタデルタＣＴ比較分析法において全ての他方の試料と比較する＃１であった。全てのプローブに、レポーターとして６ＦＡＭ及びクエンチャーとしてＢＨＱ１を標識した。配列を表８に示す。
【０４３２】
【表８−１】
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【表８−２】
2018527005.tif 000019
【０４３３】
ＲＴ−ＰＣＲ試料を正規化するために、発明者らは、一般的なハウスキーピング遺伝子（Ｈｐｒｔ）に加えて、生殖隆起に特異的であり、これらの段階で両性において等レベルで発現される遺伝子（Ｓｆ１及びＧａｔａ４）を使用した。
【０４３４】
過去の実験は、ＥＳ細胞中で通常発現されるＹ染色体上の２つの遺伝子が、性転換株からのＥＳ細胞中では下方制御されたことを示した（Ｄｄｘ３ｙ及びＥｉｆ２ｓ３ｙ、図１を参照のこと）。これらの遺伝子は、Ｓｘｒｂ領域におけるＹ染色体の短腕上にある。欠失試験によって、この領域は、精子形成に重要であるが、性決定には関与しないことが知られている。これらの遺伝子の両方とも、この発達期中に雄の生殖腺で発現されるが、卵巣では発現されない（ＧＵＤＭＡＰ．ｏｒｇからのａｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータ）ため、発明者らは、これらの遺伝子に対してプローブを使用して、性転換を生じるプロセスが、性決定に関与する遺伝子の他に、Ｙ染色体上におけるその他の遺伝子の発現をもたらすかどうかを示した。
【０４３５】
２つのクローンを、この実験に使用した：１８２３ＣＦ１１は、歴史的にＦ０世代において雄のＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）のみを産生するのに対して、１８２３ＣＥ６は、Ｆ０世代において８８％、雌ＸＹのＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（性転換した）を産生した。両方のクローンを、ＫＯ−ＤＭＥＭに基づく培地中におけるそれらの単離及び増殖全体を通して同一条件下で成長させた。ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）の１１匹の同腹仔が、各クローンから産生された：各々からの２匹の同腹仔が予定日になるまで待って、性転換の程度を検証し、生殖隆起収集のために各クローンから９匹の同腹仔を残した（表９を参照のこと）。子孫の性別が決定し得るように予定日まで待った各クローンの同腹仔から、クローンＣＦ１１は、１１匹のＸＹ雄ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を産生したが、ＸＹ雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）は一切産生せず、加えて２匹の雄キメラ及び１匹の雌キメラを産生した。クローンＣＥ６は、２匹のＸＹ雄ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）及び６匹のＸＹ雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を産生し、加えて３匹の雄キメラ及び６匹の雌キメラを産生した。
【０４３６】
各クローンについて、同時刻での胚盤胞注入タイミング及び切離開始時間にもかかわらず、性転換ＣＥ６クローンの同腹仔は、ＣＦ１１と比較して発達的に進行していた（表１０を参照のこと）。例えば、８：３０ＡＭ及び９：３０ＡＭに採取したＣＦ１１同腹仔は、１２〜１３ｔｓで始まる体節範囲を有したが、ＣＥ６同腹仔は、この時点で１６〜２０ｔｓの体節範囲を有した。概して、このことは、ＣＦ１１よりもＣＥ６の方がおよそ８時間先行したことを表し、Ｓｒｙ発現の最初期が、ＣＥ６株におけるこの実験では測定不能であることを意味した。しかしながら、１７〜１８ｔｓにおけるＳｒｙ発現のピーク時間は、なお表されている。
【０４３７】
【表９】
2018527005.tif 000020
【０４３８】
【表１０−１】
2018527005.tif 000021
【表１０−２】
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【０４３９】
対照物については、発明者らは、性決定期間中（２０ｔｓ）に非近交系統ＣＤ１からの生殖隆起も採取した。この非近交系株からのＸＹ試料は、この時点で高レベルのＳｒｙを発現し、強力な陽性対照として機能するはずである。ＸＸ試料はＹ染色体を有しないため、Ｓｒｙ、Ｙ染色体上の遺伝子、及び雄経路のその他のマーカーについて陰性対照である。
【０４４０】
胚盤胞を生成するＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法は、注入したＥＳ細胞に完全に由来するマウスを主に生成するが、少数の宿主由来の胚ならびに宿主及びＥＳ細胞の両方によるキメラが、依然として生成される。考察からこれらの試料を排除するために、発明者らはＰＣＲを使用して、トリオシナーゼ（ｔｒｙｏｓｉｎａｓｅ）の異なる対立遺伝子、すなわち、宿主胚盤胞系統Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ中で変異した毛色遺伝子（ＴｙｒＭｕｔ）及びＦ１Ｈ４  ＥＳ細胞中で機能的な毛色遺伝子（ＴｙｒＷｔ）の存在を探した。試料が０．５以上のＴｙｒＭｕｔを有した場合、または１．５以下のＴｙｒＷｔレベル及びＴｙｒＷｔの２０％超のＴｙｒＭｕｔレベルを有した場合に、試料を排除した。
【０４４１】
各試料の生殖腺組織の量を基準としてＲＴ−ＰＣＲデータを正規化するために、発明者らは、両性の生殖腺で特異的に発現される２つの遺伝子：すなわち、Ｓｆ１及びＧａｔａ４のレベルを検査した。Ｓｆ１は、発明者らが検査した発達段階にわたって、ハウスキーピング遺伝子Ｈｐｒｔと比較して生殖腺中で相対的に定常な発現を有するため、これを後続の試料において正規化遺伝子として使用した。Ｇａｔａ４は、初期段階において増加したレベルを有すると思われるため、正規化遺伝子として使用しなかった。
【０４４２】
図２に示す通り、Ｓｒｙ発現は、性決定の正常な期間中においてＣＦ１１株からの生殖腺で検出可能である。図２のＳｒｙ発現を、この段階での両性の生殖隆起における体細胞のマーカーであるＳｆ１と比較して示す。同様の結果を、Ｈｐｒｔ発現を基準としてＳｒｙ発現を正規化した場合に観察した（データは示さず）。２０ｔｓでのＣＤ１  ＸＹ及びＸＸ試料を対照物として使用した（Ｓｒｙ発現の陽性対照としてＣＤ１  ＸＹ、及び陰性対照としてＣＤ１  ＸＸ）。図２に示す通り、Ｓｒｙ発現は、およそ１３ｔｓから始まって検出可能となり、およそ１６〜１７ｔｓでピークに到達し、およそ２５ｔｓで低下する。しかしながら、性転換ＣＥ６クローンに由来する生殖腺において、Ｓｒｙ発現は、検査した性決定の全ての段階（１６〜２５ｔｓ）中でほとんど検出不能である。ＣＥ６クローンからの大半の生殖腺は、４０サイクル後であっても検出可能なＣＴ値を有しなかった。
【０４４３】
Ｙ染色体遺伝子のＤｄｘ３ｙ及びＥｉｆ２ｓ３ｙは、この段階でＣＦ１１生殖腺において予想される通りに発現されるが、図３及び図４に示す通り、性転換ＣＥ６クローンからの生殖腺ではほとんど検出不能である。図３は、ＣＥ６及びＣＦ１１中においてＳｆ１と比較したＤｄｘ３ｙ発現を示す。図４は、ＣＥ６及びＣＦ１１中においてＳｆ１と比較したＥｉｆ２ｓ３ｙ発現を示す。ＸＹ  ＣＤ１及びＸＸ  ＣＤ１を、それぞれ陽性及び陰性対照物として使用した（２０ｔｓ）。Ｓｒｙ発現に関するデータと共に、これらのデータは、Ｙ染色体上の３つの非関連遺伝子が、性転換クローン（ＣＥ６）中で強力に抑制されることを示していて、このことは、Ｙ染色体の大部分が、性転換クローン中でサイレンシングされる可能性があることを示唆している。
【０４４４】
図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、及び図５Ｄは、Ｓｒｙの下流にある雄性決定及び精巣発達のマーカーが、非性転換ＣＦ１１クローンと比較した場合に性転換ＣＥ６クローンからの生殖腺で減少することを示す。図５Ａは、Ｓｆ１と比較してＳｏｘ９発現を示し、図５Ｂは、Ｓｆ１と比較してＦｇｆ９発現を示し、図５Ｃは、Ｓｆ１と比較してｍＤｈｈ発現を示し、図５Ｄは、Ｓｆ１と比較してＡｍｈ発現を示す。ＸＹ  ＣＤ１及びＸＸ  ＣＤ１を、それぞれ陽性及び陰性対照物として使用した（２０ｔｓ）。
【０４４５】
図６Ａ及び図６Ｂは、非性転換ＣＦ１１クローンと比較して、性転換ＳＥ６クローンからの生殖腺における雌性決定及び卵巣発達のマーカーを示す。図６Ａは、Ｓｆ１と比較してＦｏｘｌ２発現を示し、図６Ｂは、Ｓｆ１と比較してＲｓｐｏ１発現を示す。ＸＹ  ＣＤ１及びＸＸ  ＣＤ１を、それぞれ陽性及び陰性対照物として使用した（２０ｔｓ）。雌性決定及び卵巣発達のマーカーは、一般にこれらよりも幾分遅い段階で開始されるが、卵巣発達の最初期マーカーのうち１つ（Ｆｏｘｌ２）が、性転換ＣＥ６クローンからの生殖腺で強力に増加する。卵巣マーカーのＲｓｐｏ１も、性転換試料においてわずかに上昇している。小さな差とは、単純に、この段階で卵巣特異的発達の大部分を検出するには早すぎるという理由である可能性がある。
【０４４６】
クローン１８２３ＣＥ６は、ある時点でそのＹ染色体を喪失したと後になって実証されたため、発現実験を、１種の中程度の性転換株及び１種の強力に性転換する株を含む、追加のＸＹ  ＥＳ細胞クローンを使用して、両方が実験中の全ての時点でＹ染色体を依然として有していたかを確かめるために、上記のように反復した。クローンを、ＫＯ−ＤＭＥＭに基づく培地中におけるそれらの単離及び増殖全体を通して同一条件下で成長させた。以下でさらに詳しく説明されるように、これらの実験は、Ｓｒｙ、Ｙ染色体遺伝子、及び雄性決定遺伝子の発現がＸＹ  ＥＳ細胞性転換株では減少し、低頻度の性転換をもたらす株と比較した場合、最も高い頻度の性転換をもたらす株では、より強力に抑制される傾向があることを確認した。加えて、これらの実験は、Ｙ染色体遺伝子がマウス発達中、及び出生後に試験した全ての器官において性転換株では一貫して抑制されるため、それらは性転換現象に関して報告する上で適切な方法であることを実証した。加えて、決して性転換しない１種のＸＹ  ＥＳ細胞株では、非常に高レベルのＹ染色体遺伝子の大半及び雄性決定遺伝子を観察した。
【０４４７】
図７では、Ｓｒｙ発現を、性決定中の生殖腺で測定した。３種の対照株を使用した：交配によって生成したＸＹマウス胚、非標的ＸＹ  ＥＳ細胞からのＸＹマウス胚、及び性転換しないＸＹ  ＥＳ細胞株（１８２３−ＣＦ１１）からのＸＹマウス胚。これらの対照物は、Ｓｒｙ発現の通常の時間経過を示し、開始はおよそ１４ｔｓ、ピークは１７〜１８ｔｓで、２６ｔｓで消失する。２種の性転換株は、この臨界期中に著しいＳｒｙ発現の低下を示した。株＃１は、強力に性転換する株（平均で８６％のＸＹ雌）であり、この時間経過にわたって、株＃２（１５０６９−ＣＤ１、４５％のＸＹ雌）よりもＳｒｙ発現が低い。ＸＸマウス胚は一切発現を有しないため（Ｙ染色体の欠如ゆえに）、陰性対照として機能する。
【０４４８】
図８Ａ〜図８Ｃは、性決定中の生殖隆起で、Ｙ染色体上における以下の３つの遺伝子に関する発現レベルを示す：Ｅｉｆ２ｓ３ｙ（図８Ａ）、Ｕｔｙ（図８Ｂ）、及びＤｄｘ３ｙ（図８Ｃ）。３つ全てが、非性転換ＸＹ  ＥＳ細胞株から生成したマウス胚において最も強力な発現、対照物（交配によって生成したＸＹマウス胚及び非標的ＸＹ  ＥＳ細胞からのＸＹマウス胚）において中程度のレベルならびに２種の性転換ＸＹ  ＥＳ細胞株から生成したＸＹマウス胚において最も低いレベルを示し、このことは、Ｓｒｙだけでなく、Ｙ染色体上の複数の遺伝子が、このプロセスの影響を受けることを示していた。図９は、図７及び図８Ａ〜図８Ｃ中のデータを単に要約しただけの同じデータを示し、これは、胚の生殖隆起でアッセイした４種全てのＹ染色体遺伝子の平均を示している。
【０４４９】
Ｙ染色体遺伝子の発現が、性転換株から生成したマウス中で出生後も依然として抑制されるかどうかを決定するために、Ｄｄｘ３ｙ（図１０Ａ）、Ｕｔｙ（図１０Ｂ）、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ（図１０Ｃ）、及びＫｄｍ５ｄ（図１０Ｄ）の発現レベルを、非標的ＸＹ  ＥＳ細胞株、非性転換ＸＹ  ＥＳ細胞株、及び性転換株から生成したマウス中において出生から１週間後に複数の器官で決定した。発現レベルを、生殖腺、腎臓、心臓、肝臓、及び手足で試験した。図１０Ａ〜図１０Ｄは、Ｙ染色体遺伝子が、複数の器官において性転換株から生成したマウス中で出生後も依然として抑制され、これらの遺伝子の発現レベルは、非標的ＸＹ  ＥＳ細胞からのマウス中におけるレベル、及び性転換しないＸＹ  ＥＳ細胞株からのマウス中におけるレベルよりも低いことを示す。
【０４５０】
図１１Ａ（Ｓｏｘ９）及び図１１Ｂ（Ｆｇｆ９）は、Ｓｒｙの下流にある雄性決定及び精巣発達のマーカーが、非性転換ＸＹ  ＥＳ細胞株、非標的対照ＸＹ  ＥＳ細胞株、及び交配によって生成したＸＸマウス胚と比較した場合、性転換ＸＹ  ＥＳ細胞株から生成したマウス胚からの生殖腺で減少することを示す。交配によって生成したＸＹマウス胚を、追加の対照物として使用した。Ｓｏｘ９及びＦｇｆ９の両方とも、雄経路における重要な初期遺伝子であり、両方とも、生殖腺においてＳｒｙ発現のピークあたり（１６〜１８ｔｓ）で上方制御され、雄の精巣発達に必要である。Ｓｏｘ９及びＦｇｆ９のレベルは、性転換しない株からの生殖腺では最も高く、対照物（交配によって生成したＸＹマウス胚及び非標的ＸＹ  ＥＳ細胞からのマウス胚）では中程度であり、交配によって生成したＸＸマウス胚では最も低い。ＸＸマウス胚を使用して、この期間中のＳｏｘ９及びＦｇｆ９の発現における雌レベルを示した。２種の性転換株から生成したマウス胚中の発現レベルは、ＸＸ対照物とＸＹ対照物との間に収まり、より強力に転換する株＃１は、Ｓｏｘ９誘導の期間中に＃２よりも低いレベルを示している。
【０４５１】
Ｄｈｈ及びＡｍｈは、精巣発達中には強力かつ特異的に上方制御され、卵巣発達中には存在しない精巣発達のマーカーである。図１５を参照のこと。これらの遺伝子の両方とも、雄の対照物（性転換しない株からのＸＹマウス胚、交配によって生成したＸＹマウス胚、及び非標的ＥＳ細胞からのＸＹマウス胚）からの生殖腺で最も高く発現された。２種の性転換株から生成したマウスは、ＸＸ交配対照物とＸＹ交配対照物との間に収まる発現レベルを有し、より強力に転換する株＃１は、＃２よりも低く、雌により近いレベルを示した（図１２Ａ（Ｄｈｈ）及び図１２Ｂ（Ａｍｈ））。
【０４５２】
Ｆｏｘｌ２は、雌発達の最初期マーカーであり、２１〜２３ｔｓの間で雌の生殖腺において強力に上方制御される。図１５を参照のこと。図１３に示す通り、２種の性転換ＸＹ  ＥＳ細胞株から生成したマウスにおけるこの遺伝子の発現レベルは、ＸＸ交配対照物とＸＹ交配対照物との間に収まる。
【０４５３】
実施例３．ＸＹ  ＥＳ細胞クローンにおけるＤｄｘ３ｙ（Ｄｂｙ）、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、及びＵｔｙ発現の欠如または減少は、これらのＸＹ  ＥＳ細胞クローンからの繁殖可能なＸＹ  Ｆ０雌マウスの生成と相関する。
表１１は、ＶＧＦ１  ＥＳ細胞株における遺伝子標的化によるＸＹ  ＥＳ細胞クローンが、８細胞胚へのＸＹ  ＥＳ細胞クローンのマイクロインジェクション後に雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を生成する傾向を示す。全てのクローンを、標的化及びマイクロインジェクションプロセス全体を通して、ＫＯ−ＤＭＥＭに基づく培地中で維持し、培養した。クローンのこの試料から、ＸＹ雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を生成する能力がクローン特異的であり、０〜６０％の範囲であることは明らかである。これらの結果は、複数回のマイクロインジェクション実験で再現可能であった：雌を生成しなかったクローンが、反復マイクロインジェクションにおいてこの形質を維持したのに対して、雌を生じたクローンは、反復マイクロインジェクション実験においておよそ同じ比率の雌を生じる傾向があった。効果を、ＤＭＥＭに基づく培地中でクローンを再成長させることによって反転できなかった。ＥＳ細胞を、標的化プロセス全体、すなわち、エレクトロポレーション、薬物耐性コロニーの選択、標的変異についてのスクリーニング、増殖、及び凍結保存において、ＤＭＥＭに基づく培地またはＫＯ−ＤＭＥＭに基づく培地のいずれかで成長させて維持した遺伝子標的化実験からのＥＳ細胞クローンを解凍し、８細胞胚へのマイクロインジェクションに備えて３日間、反対の培地中で成長させた。ＤＭＥＭに基づく培地中で誘導したクローンは、低頻度の雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）生成を維持し、これは、ＫＯ−ＤＭＥＭへの短時間曝露で増加し得なかった。同様に、ＫＯ−ＤＭＥＭに基づく培地中で誘導したクローンは、より高頻度の雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を生成し、ＤＭＥＭへの短時間曝露によって、雌を生成するＸＹクローンの傾向が低減することはなかった。
【０４５４】
【表１１】
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【０４５５】
次いで、雌化対非雌化遺伝子標的ＸＹ  ＥＳ細胞クローンにおける遺伝子発現プロファイルを比較した（表１２を参照のこと）。４種のＥＳ細胞クローンを使用して、各々を全く同じように処理した。４種全てのクローンは、最初の解凍、標的化ベクターを用いたエレクトロポレーション、薬物耐性クローンの選択、及び凍結を含む、プロセス全体を通して、同じＫＯ−ＤＭＥＭに基づく培地中で成長させたＶＧＦ１細胞に由来した。クローンのうち２種は、複数回のマイクロインジェクションでＸＹ雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を一切生成せず、２種のクローンは、反復マイクロインジェクションにおいて＞５０％のＸＹ雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を生成した。Ｙ染色体遺伝子Ｄｄｘ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＥｉｆ２ｓ３ｙの発現レベルは、非雌化ＥＳ細胞と比較した場合、雌化ＥＳ細胞では１０〜２０分の１であった。Ｙ染色体以外の染色体上における２つの遺伝子（Ｃｏｌ１０ａ１及びＴｍ４ｓｆ１）を対照として使用した。
【０４５６】
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【０４５７】
別の実験では、ＫＯ−ＤＭＥＭ培地中で全く同じように誘導した５種の遺伝子標的ＥＳ細胞クローンを、サブクローニング実験のために選択した。クローン９８５−ＡＡ８及び１８２３−ＣＦ１１が、３回の別々のマイクロインジェクション実験で雄のＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）のみを生成したのに対して、クローン１５０６９−ＣＤ１、４０４８−ＢＣ４、及び９７９−ＡＣ７は、反復マイクロインジェクションにおいて、平均で３０％〜５０％のＸＹ雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を生成した（表１３を参照のこと）。ＥＳ細胞クローンを液体窒素保存から解凍し、２つのレプリカ９６ウェルプレートにサブクローニングし、プレートのうち１つを−１５０℃で保存した一方で、他方を成長させてＤＮＡ及びＲＮＡ調製物用に２つのその他のプレート上に継代した。ＤＮＡプレートを使用してＹ染色体の喪失についてスクリーニングした一方で、ＲＮＡプレートを使用して、ＲＴ−ｑＰＣＲによりＥｉｆ２ｓ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＤｄｘ３ｙの発現を検査した。表１３に示す通り、クローンがＸＹ雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を生成する傾向は、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＤｄｘ３ｙを発現しない、または減少した発現を有するサブクローンのパーセンテージに正比例し、このことは、サブクローンにおけるＹ染色体遺伝子発現の喪失によって、クローンがＸＹ雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を生成することになる可能性が予測され得ることを示した：Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＤｄｘ３ｙの発現についてサイレンシングされたサブクローンの比率が高まるほど、親ＥＳ細胞クローンがＸＹ雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を生成する傾向がますます高くなった。
【０４５８】
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【０４５９】
表１３の上部のデータを生成するために、雌及び雄ＸＹマウスの両方を生成する３種の親ＸＹ  ＥＳ細胞株からのサブクローンを、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＤｄｘ３ｙ遺伝子発現のＲＮＡ分析に供した。試験した３種の部分的に性転換しているクローンは、９７９−ＡＣ７、４０４８−ＢＣ４、及び１５０６９−ＣＤ１を含んだ。３２のサブクローンを、クローン９７９−ＡＣ７のサブクローンＡ１〜Ａ４、Ｂ１〜Ｂ４、Ｃ１〜Ｃ４、Ｄ１〜Ｄ４、Ｅ１〜Ｅ４、Ｆ１〜Ｆ４、Ｇ１〜Ｇ４、及びＨ１〜Ｈ４、クローン４０４８−ＢＣ４のサブクローンＡ５〜Ａ８、Ｂ５〜Ｂ８、Ｃ５〜Ｃ８、Ｄ５〜Ｄ８、Ｅ５〜Ｅ８、Ｆ５〜Ｆ８、Ｇ５〜Ｇ８、及びＨ５〜Ｈ８、ならびにクローン１５０６９−ＣＤ１のサブクローンＡ９〜Ａ１２、Ｂ９〜Ｂ１２、Ｃ９〜Ｃ１２、Ｄ９〜Ｄ１２、Ｅ９〜Ｅ１２、Ｆ９〜Ｆ１２、Ｇ９〜Ｇ１２、及びＨ９〜Ｈ１２を含む、各々について試験した。Ｄｒｏｓｈａの発現を対照として使用し、各遺伝子の発現を、Ｂ２ｍ発現と比較して決定した。ＲＴ−ＰＣＲ結果を、図１４Ａ〜図１４ＣにおいてΔＣｔ（対象となる遺伝子−Ｂ２ｍ）という形態で示す。負のΔＣｔは、より高い相対的発現を示し、正のΔＣｔは、より低い相対的発現を示す。図１４Ａに示す通り、クローン９７９−ＡＣ７の３２サブクローンのうち６つ（１８．８％）では、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｕｔｙ、またはＤｄｘ３ｙについて一切発現を検出しなかった。図１４Ｂに示す通り、クローン４０４８−ＢＣ４の３２サブクローンのうち１８（５６．２％）では、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｕｔｙ、またはＤｄｘ３ｙについて一切発現を検出しなかった。図１４Ｃに示す通り、クローン１５０６９−ＣＤ１の３２サブクローンのうち２２では、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｕｔｙ、またはＤｄｘ３ｙについて一切発現を検出しなかった。しかしながら、３２サブクローンの後続の分析によって、３２サブクローンのうち１つ、すなわち、クローンＤ９がＹ染色体を喪失していたことが示され、このことは、１５０６９  ＣＤ１の３２サブクローンのうち２１（６５．６％）がＹ染色体を有したが、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｕｔｙ、またはＤｄｘ３ｙに関して検出可能な発現を一切有しなかったことを意味した。Ｙ染色体の存在評価を、Ｙ染色体上の２つの遺伝子：すなわち、Ｓｒｙ及びＥｉｆ２ｓ３ｙのプローブを用いたコピー数アッセイを行って実施した。クローン９７９−ＡＣ７の３２サブクローン全て、クローン４０４８−ＢＣ４の３２サブクローン全て、及びクローン１５０６９−ＣＤ１の３１／３２サブクローンを、Ｙ染色体の１コピーを有するかについてコピー数アッセイによって確認した。
【０４６０】
表１３の下部のデータを生成するために、雄ＸＹマウスのみを生成する２種の親ＸＹ  ＥＳ細胞株からのサブクローンを、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＤｄｘ３ｙ遺伝子発現のＲＮＡ分析に供した。試験した２種のクローンは、９８５−ＡＡ８及び１８２３−ＣＦ１１を含んだ。４８のサブクローンを、クローン９８５−ＡＡ８のサブクローンＡ１〜Ａ６、Ｂ１〜Ｂ６、Ｃ１〜Ｃ６、Ｄ１〜Ｄ６、Ｅ１〜Ｅ６、Ｆ１〜Ｆ６、Ｇ１〜Ｇ６、及びＨ１〜Ｈ６、ならびにクローン１８２３−ＣＦ１１のサブクローンＡ７〜Ａ１２、Ｂ７〜Ｂ１２、Ｃ７〜Ｃ１２、Ｄ７〜Ｄ１２、Ｅ７〜Ｅ１２、Ｆ７〜Ｆ１２、Ｇ７〜Ｇ１２、及びＨ７〜Ｈ１２を含む、各々について試験した。Ｄｒｏｓｈａの発現を対照として使用し、各遺伝子の発現を、Ｂ２ｍ発現と比較して決定した。ＲＴ−ＰＣＲ結果を、図１４Ｄ〜図１４ＥにおいてΔＣｔ（対象となる遺伝子−Ｂ２ｍ）という形態で示す。負のΔＣｔは、より高い相対的発現を示し、正のΔＣｔは、より低い相対的発現を示す。図１４Ｄに示す通り、クローン９８５−ＡＡ８の４８サブクローンのうち３つ（６．２５％、クローンＡ４、Ｆ６、及びＨ３）では、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｕｔｙ、またはＤｄｘ３ｙについて一切発現を検出しなかった。２種のその他の９８５−ＡＡ８サブクローン、すなわち、Ｄ１及びＦ２は、Ｙ染色体を喪失していたことが分かった。図１４Ｅに示す通り、クローン１８２３−ＣＦ１１の４８サブクローンのうち２つ（４．１６％、クローンＡ９及びＥ８）では、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｕｔｙ、またはＤｄｘ３ｙについて一切発現を検出しなかった。１種のその他の１８２３−ＣＦ１１サブクローン、すなわち、Ｃ１２は、Ｙ染色体を喪失していたことが分かった。Ｙ染色体の存在評価を、Ｙ染色体上の１つの遺伝子：すなわち、Ｓｒｙのプローブを用いたコピー数アッセイを行って実施した。Ｙ染色体の１コピーの存在を、９８５  ＡＡ８の４６／４８サブクローン及び１８２３  ＣＦ１１の４７／４８サブクローンにおけるコピー数アッセイによって確認した。
【０４６１】
実施例４．Ｙ染色体遺伝子ＳｒｙにＴＡＬＥＮ誘導変異を有するＦ０  ＸＹ雌の繁殖力の増加。
ＳｒｙのｌａｃＺ置換対立遺伝子を含む標的欠失を、Ｓｒｙ開始コドンとインフレームで融合したｌａｃＺならびに３８及び３７ｋｂの相同腕に隣接し、ｂＭＱライブラリー（１２９Ｓ７／ＳｖＥｖ  Ｂｒｄ−Ｈｐｒｔ  ｂ−ｍ２）からのＢＡＣに基づくネオマイシン耐性遺伝子を含む挿入カセットを含む大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を用いて作製した。ＬＴＶＥＣ（ＮＩＨ  ＫＯＭＰプロジェクトＶＧ１２７７８  ＬＴＶＥＣ（ＵＲＬ“ｖｅｌｏｃｉｇｅｎｅ．ｃｏｍ／ｋｏｍｐ／ｄｅｔａｉｌ／１２７７８”のＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ（ｗｗｗ）上でインターネットによって入手可能）を参照のこと）は、その相同腕において、Ｓｒｙ発現に関する全ての既知の制御エレメントを含む。そのｌａｃＺコードベータ−ガラクトシダーゼは、Ｓｒｙ遺伝子の組織特異的かつ発達段階特異的発現のレポーターとして機能する。標的化ベクターを用いたＳｒｙ遺伝子の正確な標的化によって作製した対立遺伝子は、Ｓｒｙコード配列の欠失及び挿入カセットによる置換を含む。標的化ベクターを使用して、ＶＧＢ６（Ｂ６Ａ６としても知られる）Ｃ５７ＢＬ／６及びＶＧＦ１（Ｆ１Ｈ４としても知られる）Ｃ５７ＢＬ６／１２９  Ｆ１ハイブリッドＥＳ細胞株の両方でＳｒｙ遺伝子を標的とした。ＶＧＦ１（Ｆ１Ｈ４）マウスＥＳ細胞は、雌Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを雄１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウスと交雑させることによって生成したハイブリッド胚に由来した。したがって、ＶＧＦ１  ＥＳ細胞は、１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウスからのＹ染色体を含有する。ＶＧＦ１細胞株から生成した雌ＸＹマウスは、１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウスに由来するＹ染色体を含有する。
【０４６２】
発明者らは、Ｓｒｙ遺伝子におけるＨＭＧボックスＤＮＡ結合モチーフコード配列（上流認識配列：５’−ＴＣＣＣＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＧＣＡＣ−３’（配列番号：４３）、下流認識配列：５’−ＴＡＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＡＴ−３’（配列番号：４４））の部分を標的とするように設計されたＴＡＬＥＮを得た。ＴＡＬＥＮ−１は、複数の実験においてＳｒｙ遺伝子座にＮＨＥＪ変異を作製する際に活性であった。
【０４６３】
二本鎖ＤＮＡ切断の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復の結果であると推定される欠失変異を、ＴＡＬＥＮの作用によってＳｒｙ遺伝子中に作製した。ＶＧＢ６及びＶＧＦ１マウスＥＳ細胞の両方とも、ＴＡＬＥＮ誘導変異を用いて作製した。表１４は、全てのクローン及びそれらが持つ欠失変異のサイズ及びそれらがＳｒｙ遺伝子座にｌａｃＺ−ｎｅｏ  ＬＴＶＥＣ挿入カセットを有するかどうかに関する一覧を含有する。表１４は、８細胞胚へのＳｒｙ変異体ＥＳ細胞クローンのマイクロインジェクションによって生成したＦ０世代ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）の結果、及びＳｒｙ遺伝子中に変異を有するＸＹ雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（性転換した雌）の交配結果も含む。
【０４６４】
ＶＧＢ６  ＥＳ細胞に由来する、Ｓｒｙ変異を有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）の全てが、Ｓｒｙの不活性化から予想通り、雌であった。表１４に示す通り、Ｓｒｙ変異体雌Ｂ６  ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）は、試験交配した場合に生殖不能であって、これはＳｒｙ変異に関する文献と一致している。生殖不能ゆえに、ＬＴＶＥＣ標的化（すなわち、正確な標的Ｓｒｙ欠失及びｌａｃＺ−ｎｅｏ挿入を有するクローン）を、Ｆ１子孫への変異体対立遺伝子の伝達によっては正式に確認しなかった。しかしながら、発明者らのデータは、ＶＧＦ１クローンを用いて非常に異なる結果を実証した。
【０４６５】
ＫＯ−ＤＭＥＭ様低浸透強度培地中で維持できず、マウスを生成する能力を保持できないＶＧＢ６  ＥＳ細胞とは異なり、ＶＧＦ１細胞は、ＫＯ−ＤＭＥＭ様低浸透強度培地中で維持され得る。したがって、実験を行って、Ｓｒｙに変異を有するＶＧＦ１  ＸＹ  ＥＳ細胞が培地によって雌化され得るかどうかを決定した（すなわち、それらが、ＶＧＢ６  Ｓｒｙ変異体ＸＹ  ＥＳ細胞とは異なり、いくつかの繁殖可能なＸＹ  Ｓｒｙ変異体雌を生成し得るかどうかを決定した）。最初に、ＶＧＦ１  ＥＳ細胞を、通常通りに、雌化する発明者らのＫＯ−ＤＭＥＭ様低浸透強度増殖培地中で維持した：この培地中で成長させた、マイクロインジェクションしたＸＹクローンの一部は、それらが変異を持たなくとも、繁殖可能なＸＹ雌を生成することになる。例えば、クローンＴＨ４（データは示さず）は、Ｓｒｙ変異を一切有しないが、２匹の雌と６匹の雄のＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を産生した。
【０４６６】
５ｂｐ〜１ｋｂを超える範囲のＴＡＬＥＮ誘導小欠失を有する６種のＶＧＦ１  ＥＳ細胞クローンをマイクロインジェクションした。ＬＴＶＥＣ標的化（すなわち、正確な標的Ｓｒｙ欠失及びｌａｃＺ−ｎｅｏ挿入を有するクローン）は、ＫＯ−ＤＭＥＭ様低浸透強度増殖培地中で成長させたＶＧＦ１  ＥＳ細胞中では観察されなかった。全てが雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を産生し、そのうち３２匹を交配させた。驚いたことに、Ｓｒｙ変異体ＸＹ雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）の全てが繁殖可能であった：各々が少なくとも１匹の同腹仔を産生した（表１４）。Ｓｒｙ変異体ＸＹ雌の多くが、正常な産子数で複数の同腹仔を産生したが、ＸＹ雌の一部は、１匹または２匹の小さな同腹仔のみを産生した。遺伝子型を同定したこれらの交配からのＦ１マウス２９９匹のうち、およそ半分（１４６匹、４９％）が正常なＸＹ雄または正常なＸＸ雌である。１７４匹（５８％）のＦ１マウスが表現型的に雌であったが、１２５匹（４２％）は表現型的に雄であった。２６匹の雌（雌の１５％、総Ｆ１世代の８．６％）は、変異体Ｓｒｙ対立遺伝子が遺伝したＸＹ雌であった。ＸＹ卵母細胞と関連する減数分裂の不分離事象ゆえに、多数の異常な遺伝子型、すなわち、ＸＸＹ、ＸＹＹ、ＸＯ、ＸＸＹＹの一部が変異体Ｓｒｙ対立遺伝子を含み、その遺伝子型をＳｒｙ変異体ＸＹ雌ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）のＦ１子孫中で観察した。
【０４６７】
表１４は、Ｓｒｙの変異を有した従来のＤＭＥＭに基づく培地中で成長させたＥＳ細胞に由来するＸＹ雌の繁殖力結果も報告する。予想外にも、ＫＯ−ＤＭＥＭに基づく培地中で成長させたＥＳ細胞を用いた同様の実験に関する結果と比較して、ＤＭＥＭに基づく培地中でのＬＴＶＥＣ標的化によって、正確な標的Ｓｒｙ欠失及びｌａｃＺ−ｎｅｏ挿入（すなわち、ＴＡＬＥＮ補助ＬＴＶＥＣ標的欠失−置換）を有するクローンが生成された。４種の標的クローンに由来する１０匹のＸＹ  Ｓｒｙ（ｌａｃＺ）雌のうち９匹は、交配時に生産仔を産生し、９０％の出生率であった。
【０４６８】
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【０４６９】
ＶＧＢ６  ＸＹ  ＥＳ細胞に由来するＳｒｙ変異を有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）の繁殖力を回復させるために、または従来のＤＭＥＭに基づく培地中で成長させたＶＧＦ１  ＥＳ細胞に由来するＳｒｙ変異を有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）の繁殖力もしくは妊孕力を増加させるために、Ｙ染色体における追加の領域をＸＹ  ＥＳ細胞中でサイレンシングする。このような追加のサイレンシングは、ＸＹ雌の生成も増加させ得る。一例では、Ｚｆｙ２遺伝子を、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、もしくはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼ）及び／またはＳｒｙ遺伝子の標的化について上に記載したようなＬＴＶＥＣなどの標的化ベクターを用いて生成した標的遺伝子改変によってサイレンシングする。
【０４７０】
実施例５．ＥＳ細胞におけるＹ染色体遺伝子の発現。
どのＹ染色体遺伝子がマウス胚性幹（ＥＳ）細胞中で発現されて、性転換マーカーの候補であり得るのかを決定するために、ＲＮＡ−ｓｅｑ分析をＦ１Ｈ４  ＥＳ細胞で行った。表１５に示す通り、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｄｄｘ３ｙ、Ｅｒｄｒ１、Ｋｄｍ５ｄ、Ｕｔｙ、Ｕｂｅ１ｙ１、Ｚｆｙ１、Ｚｆｙ２、Ｒｂｍｙ１ａ１、Ｓｌｙ、Ｕｓｐ９ｙ、ＬＯＣ１０００４１３４６は、Ｆ１Ｈ４  ＥＳ細胞において検出可能な発現レベルを有する。Ｓｒｙは、Ｆ１Ｈ４  ＥＳ細胞中で検出可能な発現レベルを有しなかった。
【０４７１】
【表１５−１】
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【表１５−２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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