(57)【要約】  本発明は、軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害防止及び／又は処置のための、タンパク質キナーゼ阻害剤の使用、より具体的には、タンパク質キナーゼであるｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼの阻害剤、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、又はそれをコードする核酸並びにそれを含有する医薬組成物の使用に言及するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置において使用するための、１５０未満の長さのアミノ酸を含むＪＮＫ阻害剤配列。
【請求項２】
前記ＪＮＫ阻害剤配列が、５〜１５０個の範囲のアミノ酸残基、より好ましくは１０〜１００個の範囲のアミノ酸残基、更により好ましくは１０〜７５個の範囲のアミノ酸残基、最も好ましくは１０〜５０個の範囲のアミノ酸残基を含む請求項１に従って使用するためのＪＮＫ阻害剤配列。
【請求項３】
前記ＪＮＫ阻害剤配列が、ｃ−ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）に結合する請求項１から２のいずれかに従って使用するためのＪＮＫ阻害剤配列。
【請求項４】
前記ＪＮＫ阻害剤配列がＪＮＫ発現細胞中に存在する場合に、前記ＪＮＫ阻害剤配列が少なくとも１つのＪＮＫ標的転写因子の活性化を阻害する請求項１から３のいずれかに従って使用するためのＪＮＫ阻害剤配列。
【請求項５】
前記ＪＮＫ標的転写因子が、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、及びＥｌｋｌからなる群から選択される請求項４に従って使用するためのＪＮＫ阻害剤配列。
【請求項６】
前記ペプチドがＪＮＫ発現細胞中に存在する場合に、前記ＪＮＫ阻害剤配列がＪＮＫ効果を変化させる請求項１から５のいずれかに従って使用するためのＪＮＫ阻害剤配列。
【請求項７】
前記ＪＮＫ阻害剤配列が、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、又は両方の組合せから構成され、好ましくは、少なくとも１個又は更には２個、好ましくは、少なくとも３、４又は５個、より好ましくは、少なくとも６、７、８又は９個及び更により好ましくは、少なくとも１０個又はそれ以上のＤ−及び／又はＬ−アミノ酸を含み、前記Ｄ−及び／又はＬ−アミノ酸がブロックごとに（ｂｌｏｃｋｗｉｓｅ）、非ブロックごとに（ｎｏｎ−ｂｌｏｃｋｗｉｓｅ）、又は交互の様式で前記ＪＮＫ阻害剤配列中に配置され得る請求項１から６のいずれかに従って使用するためのＪＮＫ阻害剤配列。
【請求項８】
前記ＪＮＫ阻害剤配列が、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４又は配列番号１０５の配列のいずれかにより定義又はコードされるヒト又はラットＩＢ１配列の断片、バリアント、又はそのような断片のバリアントを含む請求項１から７のいずれかに従って使用するためのＪＮＫ阻害剤配列。
【請求項９】
前記ＪＮＫ阻害剤配列が、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の少なくとも１つのアミノ酸配列、又はその断片、誘導体若しくはバリアントを含む又はからなる請求項１から８のいずれかに従って使用するためのＪＮＫ阻害剤配列。
【請求項１０】
軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置において使用するための、共有結合により連結される少なくとも１つの第１のドメイン及び少なくとも１つの第２のドメインを含み、前記第１のドメインが輸送配列を含み、前記第２のドメインが請求項１から９のいずれかに定義されたＪＮＫ阻害剤配列を含むことを特徴とするキメラペプチド。
【請求項１１】
前記キメラペプチドが、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、又は両方の組合せから構成され、好ましくは、少なくとも１個又は更には２個、好ましくは、少なくとも３、４又は５個、より好ましくは、少なくとも６、７、８又は９個及び更により好ましくは、少なくとも１０個又はそれ以上のＤ−及び／又はＬ−アミノ酸を含み、前記Ｄ−及び／又はＬ−アミノ酸がブロックごとに、非ブロックごとに、又は交互の様式で前記キメラペプチド中に配置され得る請求項１０に従って使用するためのキメラペプチド。
【請求項１２】
前記輸送配列が、ヒト免疫不全ウイルスＴＡＴポリペプチドのアミノ酸配列を含む請求項１０から１１のいずれかに従って使用するためのキメラペプチド。
【請求項１３】
前記輸送配列が、配列番号５、６、７、８、２１又は２２のアミノ酸配列からなる又は含む請求項１０から１２のいずれかに従って使用するためのキメラペプチド。
【請求項１４】
前記輸送配列が、前記ペプチドの細胞取込みを増大させる請求項１０から１３のいずれかに従って使用するためのキメラペプチド。
【請求項１５】
前記輸送配列が前記ペプチドの核局在化を導く請求項１０から１４のいずれかに従って使用するためのキメラペプチド。
【請求項１６】
前記キメラペプチドが、配列番号９〜１２及び２３〜３２のいずれかのアミノ酸配列、又はその断片、若しくはバリアントからなる又は含む請求項１０から１５のいずれかに従って使用するためのキメラペプチド。
【請求項１７】
前記キメラペプチドが、配列番号９又は１１と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる又は含む請求項１０から１６のいずれかに従って使用するためのキメラペプチド。
【請求項１８】
前記キメラペプチドが、配列番号９又は１１のアミノ酸配列からなる又は含む請求項１７に従って使用するためのキメラペプチド。
【請求項１９】
前記キメラペプチドが、
（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）配列番号１１と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる又は含む請求項１７から１８のいずれかに従って使用するためのキメラペプチド。
【請求項２０】
（ｉ）前記キメラペプチドのＣ末端が、アミド修飾により修飾されている、及び／又は
（ｉｉ）前記キメラペプチドのＮ末端が、ＮＨ２保護基によって、例えばアシル化によって修飾されている請求項１０から１９のいずれかに従って使用するためのキメラペプチド。
【請求項２１】
軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置に使用するための、
（ａ）請求項１から９のいずれかに定義されるＪＮＫ阻害剤配列又は請求項１０から２０のいずれかに定義されるキメラペプチドと、
（ｂ）ＰＫＲ阻害剤との組合せ。
【請求項２２】
前記組合せが、
（ｃ）アミロイド低下剤、及び／又は
（ｄ）グルココルチコイドを更に含む請求項２１に従って使用するための組合せ。
【請求項２３】
軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置に使用するための、
（ａ）請求項１から９のいずれかに定義されるＪＮＫ阻害剤配列又は請求項１０から２０のいずれかに定義されるキメラペプチドと、
（ｂ）アミロイド低下剤との組合せ。
【請求項２４】
前記組合せが、
（ｃ）ＰＫＲ阻害剤、及び／又は
（ｄ）グルココルチコイドを更に含む請求項２３に従って使用するための組合せ。
【請求項２５】
前記ＪＮＫ阻害剤配列又は前記キメラペプチドが、前記ＰＫＲ阻害剤、前記アミロイド低下剤、及び／又は前記グルココルチコイドの前後に投与される請求項２１から２４のいずれかに従って使用するための組合せ。
【請求項２６】
前記ＪＮＫ阻害剤配列又はキメラペプチドが、前記ＰＫＲ阻害剤、前記アミロイド低下剤、及び／又は前記グルココルチコイドと同一又は異なる投与経路で投与される請求項２１から２５のいずれかに従って使用するための組合せ。
【請求項２７】
軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置において使用するための、請求項１から９のいずれかに定義されるＪＮＫ阻害剤配列又は請求項１０から２０のいずれかに定義されるキメラペプチドと、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２８】
前記医薬組成物が、ＰＫＲ阻害剤を更に含む請求項２７に従って使用するための医薬組成物。
【請求項２９】
前記医薬組成物が、アミロイド低下剤及び／又はグルココルチコイドを更に含む請求項２７から２８のいずれかに従って使用するための医薬組成物。
【請求項３０】
前記軽度認知障害が、健忘性軽度認知障害（ａ−ＭＣＩ）又は非健忘性軽度認知障害（ｎａ−ＭＣＩ）、好ましくは、前記軽度認知障害が、健忘性軽度認知障害（ａ−ＭＣＩ）、より好ましくは、前記軽度認知障害が、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害である請求項１から９のいずれかに従って使用するためのＪＮＫ阻害剤配列、請求項１０から２０のいずれかに従って使用するためのキメラペプチド、請求項２１から２６のいずれかに従って使用するための組合せ、又は請求項２７から２９のいずれかに従って使用するための医薬組成物。
【請求項３１】
軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置において使用するための、請求項１から９のいずれかに定義されるＪＮＫ阻害剤配列又は請求項１０から２０のいずれかに定義されるキメラペプチドをコードすることを特徴とする単離された核酸。
【請求項３２】
軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置において使用するための、請求項３１に定義される核酸を含むことを特徴とするベクター。
【請求項３３】
軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置において使用するための、請求項３１に定義される単離された核酸及び／又は請求項３２に定義されるベクターを含むことを特徴とする細胞。
【請求項３４】
軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置において使用するための、請求項１から９のいずれかに定義されるＪＮＫ阻害剤配列又は請求項１０から２０のいずれかに定義されるキメラペプチドに免疫特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項３５】
前記ＪＮＫ阻害剤配列、前記キメラペプチド、又は前記医薬組成物が、（ｉ）静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経皮などの非経口経路、（ｉｉ）経口、直腸などの経腸経路、（ｉｉｉ）経鼻、鼻腔内などの局所経路、（ｉｖ）ＣＳＦ内、髄腔内などの血液脳関門を避ける投与経路、及び（ｖ）表皮又はパッチ送達などの他の経路からなる群から選択される投与経路によって投与される、請求項１から９及び３０のいずれかに従って使用するためのＪＮＫ阻害剤配列、請求項１０から２０及び３０のいずれかに従って使用するためのキメラペプチド、請求項２１から２６及び３０のいずれかに従って使用するための組合せ、又は請求項２７から３０のいずれかに従って使用するための医薬組成物。
【請求項３６】
前記ＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドの用量（体重１ｋｇあたり）が、１０ｍｍｏｌ／ｋｇまで、好ましくは、１ｍｍｏｌ／ｋｇまで、より好ましくは、１００μｍｏｌ／ｋｇまで、更により好ましくは、１０μｍｏｌ／ｋｇまで、更により好ましくは、１μｍｏｌ／ｋｇまで、更により好ましくは、１００ｎｍｏｌ／ｋｇまで、最も好ましくは、５０ｎｍｏｌ／ｋｇまでの範囲にある、請求項１から９、３０及び３５のいずれかに従って使用するためのＪＮＫ阻害剤配列、請求項１０から２０、３０及び３５のいずれかに従って使用するためのキメラペプチド、請求項２１から２６、３０及び３５のいずれかに従って使用するための組合せ、又は請求項２７から３０及び３５のいずれかに従って使用するための医薬組成物。
【請求項３７】
前記ＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドの用量（体重１ｋｇあたり）が、１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは、５０ｍｇ／ｋｇまで、より好ましくは、１０ｍｇ／ｋｇｍまで、最も好ましくは、１ｍｇ／ｋｇまでの範囲にある、請求項１から９、３０、３５及び３６のいずれかに従って使用するためのＪＮＫ阻害剤配列、請求項１０から２０、３０、３５及び３６のいずれかに従って使用するためのキメラペプチド、請求項２１から２６、３０、３５及び３６のいずれかに従って使用するための組合せ、又は請求項２７から３０、３５及び３６のいずれかに従って使用するための医薬組成物。
【請求項３８】
前記ＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドの用量が、約１ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約０．０１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１μｍｏｌ／ｋｇ、約１００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約３００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約５００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約７５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約３０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、又は前記値のいずれか２つの組合せの範囲にある、請求項１から９、３０、３５から３７のいずれかに従って使用するためのＪＮＫ阻害剤配列、請求項１０から２０、３０、３５から３７のいずれかに従って使用するためのキメラペプチド、請求項２１から２６、３０、３５から３７のいずれかに従って使用するための組合せ、又は請求項２７から３０、３５から３７のいずれかに従って使用するための医薬組成物。
【請求項３９】
前記ＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドの用量（体重１ｋｇあたり）が、１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１０μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、１００μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは、５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの範囲にある、請求項１から９、３０、３５から３８のいずれかに従って使用するためのＪＮＫ阻害剤配列、請求項１０から２０、３０、３５から３８のいずれかに従って使用するためのキメラペプチド、請求項２１から２６、３０、３５から３８のいずれかに従って使用するための組合せ、又は請求項２７から３０、３５から３８のいずれかに従って使用するための医薬組成物。
【請求項４０】
前記ＪＮＫ阻害剤配列及び／又は前記キメラペプチドが、繰り返し投与される、好ましくは、１ヶ月間ごとに少なくとも１回、３週間ごとに少なくとも１回、２週間ごとに少なくとも１回、又は１週間ごとに少なくとも１回投与される；より好ましくは、１ヶ月間ごとに少なくとも１回、３週間ごとに少なくとも１回、又は２週間ごとに少なくとも１回投与される；更により好ましくは、１ヶ月間ごとに少なくとも１回又は３週間ごとに少なくとも１回投与される；最も好ましくは、３週間ごとに少なくとも１回投与される、請求項１から９、３０、３５から３９のいずれかに従って使用するためのＪＮＫ阻害剤配列、請求項１０から２０、３０、３５から３９のいずれかに従って使用するためのキメラペプチド、請求項２１から２６、３０、３５から３９のいずれかに従って使用するための組合せ、又は請求項２７から３０、３５から３９のいずれかに従って使用するための医薬組成物。
【請求項４１】
軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の処置及び／又は防止のための（医薬組成物の調製のための）請求項１から９のいずれかに定義されるＪＮＫ阻害剤配列又は請求項１０から２０のいずれかに定義されるキメラペプチドの使用。
【請求項４２】
それを必要とする対象における軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害を防止及び／又は処置する方法であって、前記対象に、請求項１から９のいずれかに定義されるＪＮＫ阻害剤配列又は請求項１０から２０のいずれかに定義されるキメラペプチドを投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項１から９のいずれかに定義されるＪＮＫ阻害剤配列、請求項１０から２０のいずれかに定義されるキメラペプチド、請求項２１から２６のいずれかに定義される組合せ、又は請求項２７から２９のいずれかに定義される医薬組成物が前記対象に投与される請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象が、軽度認知障害、好ましくは健忘性又は非健忘性軽度認知障害、より好ましくは健忘性軽度認知障害、更により好ましくはアルツハイマー病に起因する軽度認知障害と診断された対象である請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＪＮＫ阻害剤配列又は前記キメラペプチドが請求項３５から４０のいずれかに定義されるように投与される請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軽度認知障害の防止及び／又は処置のための、タンパク質キナーゼ阻害剤の使用、より具体的には、タンパク質キナーゼｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼの阻害剤（ＪＮＫ）、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、又はそれをコードする核酸の使用並びにそれを含有する医薬組成物の使用に言及するものである。
【背景技術】
【０００２】
ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼは、分裂促進因子活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼのストレス活性化群のメンバーである。これらのキナーゼは、細胞増殖及び分化の制御、より一般的には、環境刺激に対する細胞の応答に関与してきた。ＪＮＫシグナル伝達経路は、環境ストレスに応答して、また、いくつかのクラスの細胞表面受容体の関与によって活性化される。これらの受容体は、サイトカイン受容体、セルペンチン受容体及び受容体チロシンキナーゼを含んでもよい。哺乳動物細胞において、ＪＮＫは発がん性形質転換などの生物学的プロセス及び環境ストレスに対する適応反応の媒介に関与してきた。ＪＮＫはまた、免疫細胞の成熟及び分化などを含む免疫応答の調節、並びに免疫系による破壊について同定された細胞におけるプログラム細胞死の実行と関連してきた。このユニークな特性は、ＪＮＫシグナリングを、薬学的介入を開発するための有望な標的にする。いくつかの神経障害のうち、ＪＮＫシグナリングは虚血性脳卒中及びパーキンソン病に特に関与するが、以下に更に記載される他の疾患にも関与する。また、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、脊髄神経結紮（ＳＮＬ）によりもたらされる神経障害性疼痛に関与し、ＳＮＬはＪＮＫ、特に、ＪＮＫ１の遅く持続的な活性化を誘導するが、ｐ３８分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ活性化はＳＮＬ後に脊髄ミクログリア中に見出され、２１日までに基底レベル近くまで低下したことも示された（非特許文献１）。
【０００３】
したがって、ＪＮＫシグナリング経路の阻害又は中断、特に、ＪＮＫシグナリング経路の阻害剤の提供は、前述の神経障害に対抗するための有望な手法であると考えられる。しかしながら、今までのところ知られるＪＮＫシグナリング経路の阻害剤はほんのわずかしか存在しない。
【０００４】
先行技術において既に公知であるＪＮＫシグナリング経路の阻害剤としては、特に、例えば、上流キナーゼ阻害剤（例えば、ＣＥＰ−１３４７）、例えば、タンパク質キナーゼのＡＴＰ結合部位と競合することによってキナーゼ活性に直接影響するＪＮＫの低分子化学的阻害剤（ＳＰ６００１２５及びＡＳ６０１２４５）、並びにＪＮＫとその基質（Ｄ−ＪＮＫＩ及びＩ−ＪＩＰ）との相互作用のペプチド阻害剤（例えば、非特許文献２）が挙げられる。
【０００５】
上流キナーゼ阻害剤ＣＥＰ−１３４７（ＫＴ７５１５）は、混合系統キナーゼファミリーの半合成阻害剤である。ＣＥＰ−１３４７（ＫＴ７５１５）は、栄養除去後の初代胚性培養物及び分化したＰＣ１２細胞において、並びに１−メチル−４−フェニルテトラヒドロピリジンで処置されたマウスにおいてｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化を阻害する用量でニューロン生存を促進する。更に、ＣＥＰ−１３４７（ＫＴ７５１５）は、培養ニワトリ胚の後根神経節、交感神経、毛様体及び運動ニューロンの長期生存を促進することができる（例えば、非特許文献３を参照されたい）。
【０００６】
低分子化学的ＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５は、Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスにおけるＭＰＴＰ誘発性ＰＤにおいて、ｃ−Ｊｕｎリン酸化のレベルを低下させ、ドーパミン作動性ニューロンをアポトーシスから保護し、ドーパミンのレベルを部分的に回復させることが見出された（非特許文献４）。これらの結果は、ＪＮＫ経路がｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＰＴＰの神経毒性効果の主要なメディエータであり、ＪＮＫ活性の阻害がＰＤを処置するための新しく有効なストラテジーであり得ることを更に示している。
【０００７】
低分子化学的阻害剤の更なる例は、上記のＪＮＫ阻害剤ＡＳ６０１２４５である。ＡＳ６０１２４５は、ＪＮＫシグナリング経路を阻害し、脳虚血後の細胞生存を促進する。ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＡＳ６０１２４５は、一過性全脳虚血のスナネズミモデルにおいて海馬ＣＡ１ニューロンの遅延喪失に対する有意な保護を提供した。この効果はＪＮＫ阻害によって、したがって、ｃ−Ｊｕｎの発現及びリン酸化によって媒介される（例えば、非特許文献５を参照されたい）。
【０００８】
第３のクラスのＪＮＫシグナリング経路の阻害剤は、上記のような、ＪＮＫとその基質との相互作用のペプチド阻害剤である。そのようなＪＮＫ阻害剤ペプチドの構築のための出発点として、天然に存在するＪＮＫタンパク質の配列アラインメントを使用することができる。典型的には、これらのタンパク質は、ＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）を含み、ＩＢ１又はＩＢ２などの様々なインスリン結合（ＩＢ）タンパク質中に存在する。そのような例示的な配列アラインメントの結果は、例えば、ＩＢ１（配列番号１３）、ＩＢ２（配列番号１４）、ｃ−Ｊｕｎ（配列番号１５）及びＡＴＦ２（配列番号１６）のＪＮＫ結合ドメインの間の配列アラインメントである（例えば、図１Ａ〜図１Ｃを参照されたい）。そのようなアラインメントは、部分的に保存された８アミノ酸の配列を示す（例えば、図１Ａを参照されたい）。ＩＢ１とＩＢ２のＪＢＤの比較は、２つの配列間で高度に保存された７個及び３個のアミノ酸の２つのブロックを更に示す。
【０００９】
そのようなアラインメントに基づいて構築された配列は、例えば、特許文献１、特許文献２、又は特許文献３に開示されている。特許文献２、特許文献１、及び特許文献３は、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質の基本輸送配列に由来するいわゆるＴＡＴ細胞透過配列と、ＩＢ１の最小２０アミノ酸の阻害的配列とを含む、低分子細胞透過性融合ペプチドを開示する。両成分は、互いに共有結合される。特許文献２、特許文献１、及び特許文献３に開示されたＭＡＰＫ−ＪＮＫシグナリング経路の例示的な（及び現在唯一の）阻害剤は、例えば、Ｌ−ＪＮＫＩ１（Ｌアミノ酸から構成されるＪＮＫ阻害剤ペプチド）又は、特に、プロテアーゼ耐性Ｄ−ＪＮＫＩ１ペプチド（非天然Ｄアミノ酸から構成されるＪＮＫ阻害剤ペプチド）である。これらのＪＮＫ阻害剤（ＪＮＫＩ）ペプチドは、ＪＮＫ（ＪＮＫ１、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３）に対して特異的である。上記で考察されたこれらの低分子化合物阻害剤とは対照的に、特許文献２、特許文献１、及び特許文献３中の阻害剤配列、例えば、ＪＮＫＩ１はむしろ、ＪＮＫとその基質との相互作用を阻害する。ＴＡＴに由来するその輸送配列により、融合ペプチドは細胞中に効率的に輸送される。輸送成分により得られる新規特性のため、融合ペプチドは細胞中に能動的に輸送され、そこでそれらはタンパク質分解的分解まで有効なままである。
【００１０】
特許文献３は、特に、アルツハイマー病の処置におけるそのような新規ＪＮＫ阻害剤ペプチドの使用を開示する。しかしながら、軽度認知障害（ＭＣＩ）は、アルツハイマー病（ＡＤ）と異なり、認知症を伴わない患者において診断される。認知症を伴わないことが、ＡＤとＭＣＩとを区別する幾つかの重要な基準の一つである。
【００１１】
軽度認知障害は、個人の年齢及び教育レベルから予想されるよりも大きく且つ認知症の診断基準を満たさない、認知及び機能の主観的及び客観的低下として定義される症候群である。しかしながら、ＭＣＩと診断された高齢患者は、認知症、特に、アルツハイマー病（ＡＤ）のほか、他の認知症、例えば、血管性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、及びレビー小体型認知症（ＤＬＢ）などを発症する高リスク人口を構成する。ＭＣＩは、認知症を伴わない、本質的に正常な機能活性を有する人における、加齢による客観的な認知に関する訴えであると、しばしば言及される。６５歳以上の人の１９％がこれに罹患する。同年齢の人口では３％であるのに対して、ＭＣＩの人では約４６％が３年以内に認知症を発症する。
【００１２】
特に高齢患者において、軽度認知障害の罹患率が高いにもかかわらず、現在、軽度認知障害の処置のための薬剤は承認されていない。ＭＣＩと診断された患者は、アルツハイマー病などの認知症、及び他の認知症を発症するリスクがより高いので、アルツハイマー病の処置のために承認されている薬剤の多くが、ＭＣＩの潜在的な治療剤として幾つかの臨床試験で評価されている。しかしながら、アルツハイマー病を治療するために承認された薬剤は、ＭＣＩにおいて又はＭＣＩの認知症への進行の遅延又は防止において持続的な利益を示していない。
【００１３】
すなわち、ドネペジル、ガランタミン、及びリバスチグミンなどのコリンエステラーゼ阻害剤が、アルツハイマー病の処置のために承認されている。しかしながら、ＭＣＩの臨床試験において、有望な結果を示したコリンエステラーゼ阻害剤はなかった（非特許文献６）。これに鑑みて、コリンエステラーゼ阻害剤は、ＭＣＩに対して臨床的に処方しないことが推奨されている（非特許文献７；非特許文献６）。
【００１４】
コリンエステラーゼ阻害剤に加えて、ニコチン、イチョウ（ｇｉｎｇｋｏ  ｂｉｌｏｂａ）、ビタミンＢ群、ビタミンＥ、及びオメガ３多価不飽和脂肪酸などの他の化合物も、ＭＣＩの潜在的な治療剤として評価されたが、それらの研究の結果は、有望でも特筆すべきものでもなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】ＷＯ０１／２７２６８
【特許文献２】ＷＯ２００７／０３１２８０
【特許文献３】ＷＯ２００９／１４４０３７
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｚｈｕａｎｇら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｒｃｈ  ２９、２００６、２６（１３）：３５５１〜３５６０頁
【非特許文献２】Ｋｕａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ−ＣＮＳ  ＆  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００５、ｖｏｌ．４、ｎｏ．１、６３〜６７頁（５）
【非特許文献３】Ｂｏｒａｓｉｏら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．９（７）：１４３５〜１４３９頁、１９９８年５月１１日
【非特許文献４】Ｗａｎｇら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．２００４  Ｆｅｂ；４８（２）；１９５〜２０２頁
【非特許文献５】Ｃａｒｂｏｎｉら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．２００４  Ｊｕｌ；３１０（１）：２５〜３２頁、ＥＰＵＢ  ２００４年２月２６日
【非特許文献６】Ｃ．Ｃｏｏｐｅｒら，  ２０１３，  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｍｉｌｄ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ：  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ，  Ｔｈｅ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２０３：  ２５５−２６４頁
【非特許文献７】Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｃａｒｅ  Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ．  Ｄｅｍｅｎｔｉａ：  ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｐｅｏｐｌｅ  ｗｉｔｈ  ｄｅｍｅｎｔｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃａｒｅｒｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｓｏｃｉａｌ  ｃａｒｅ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ４２．  ＮＩＣＥ，  ２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
上記に鑑みて、本発明の目的は、軽度認知障害（ＭＣＩ）、特に、アルツハイマー病（ＡＤ）に起因するＭＣＩを防止及び／又は処置するための化合物を同定することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
この目的は、添付の請求項の主題によって解決され、特に、軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害を処置及び／又は防止するための医薬組成物の調製のためのＪＮＫ阻害剤配列、好ましくは、本明細書に定義されるＪＮＫ阻害剤配列、典型的には、１５０未満の長さのアミノ酸を含むＪＮＫ阻害剤配列の使用によって解決される。すなわち、この目的は、特に、軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の処置及び／又は防止において使用するためのＪＮＫ阻害剤配列、好ましくは、本明細書に定義されるＪＮＫ阻害剤配列、典型的には、１５０未満の長さのアミノ酸を含むＪＮＫ阻害剤配列によって解決される。
【００１９】
そのようなＪＮＫ阻害剤ペプチドは、アルツハイマー病の潜在的処置として既に知られていたが、ＭＣＩの防止及び／又は処置におけるその応用は、驚くべきことである。注目すべきこととして、ＡＤのための薬剤が多く承認されているにもかかわらず、これらの薬剤をＭＣＩの治療剤として評価する臨床試験において、それらはいずれも、有望な結果を示さなかった。これは、それらの根底にある神経生物学的プロセスにおける違いによる可能性がある。すなわち、アルツハイマー病に関連するある経路が、軽度認知障害に関連しない（まだ関連していない）可能性がある。そのような経路を標的とする薬剤は、アルツハイマー病では十分有効であり得るが、ＭＣＩの防止又は処置には役立たない。
【００２０】
例えば、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｆｓｏｎら，  ２０１２，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ７１（１１）：  １０１８−１０２９頁は、認知障害がない（「ＮＣＩ」）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病（ＡＤ）の対象において、ＰｒｏＮＧＦシグナル経路の関与と、細胞生存促進及び細胞死促進作用に関連する、それらの下流のタンパク質キナーゼシグナル経路について研究した。この経路は、Ｅｒｋ及びタンパク質キナーゼＢ／Ａｋを含むが、これらは、神経生存及び神経突起分化並びにｃ−ｊｕｎキナーゼ（ＪＮＫ）仲介アポトーシス促進性経路を司る細胞内イベントを活性化する。
【００２１】
Ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、３つの遺伝子ＪＮＫ１、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３によりコードされ、ｍＲＮＡ選択的スプライシングによって１０の異なるアイソフォームとして発現されるセリン−トレオニンタンパク質キナーゼであり、それぞれのアイソフォームは短い形態（４６ｋＤａ）及び長い形態（５４ｋＤａ）として発現される（Ｄａｖｉｓ、２０００、Ｃｅｌｌ  １０３：２３９〜５２頁）。ＪＮＫ１及びＪＮＫ２は遍在性であるが、ＪＮＫ３は主に脳において発現される（Ｋｙｒｉａｋｉｓ及びＡｖｒｕｃｈ、２００１、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ８１：８０７〜６９頁）。ＪＮＫは、紫外線ストレス、サイトカイン及びＡβペプチドなどの細胞外刺激によるＭＡＰキナーゼ活性化を介するリン酸化により活性化され（ｐＪＮＫ）、それらは遺伝子発現調節、細胞増殖及びアポトーシスなどの複数の機能を有する（Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎ及びＲｅｄｄｙ、２００８、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２７：６２４５〜５１頁）。
【００２２】
興味深いことに、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｆｓｏｎら．，  ２０１２，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ７１（１１）：  １０１８−１０２９頁は、認知障害がない（「ＮＣＩ」）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病（ＡＤ）の対象において、ＪＮＫ発現に違いがないことを報告する。しかしながら、ホスホＪＮＫ及びホスホＪＮＫ対ＪＮＫ比（活性化されたＪＮＫのレベルを示す）が、ＮＣＩ群及びＭＣＩ群に比べてＡＤ群において有意に上昇した。更に、ＡＤ群におけるホスホＪＮＫレベルの高さが、エピソード記憶を含む認知テストスコアの低さと相関した。これに鑑みると、ＪＮＫは、アルツハイマー病の魅力的な治療標的であるように見える。しかしながら、軽度認知障害群においては、「認知障害がない」群に比べて、ＪＮＫ、ホスホＪＮＫ、又はホスホＪＮＫ対ＪＮＫ比の違いが特定されなかった。より驚くべきことは、ＪＮＫ阻害剤が確かにＭＣＩの治療剤として有用であるという本発明者らの知見であった。
【００２３】
前述したように、軽度認知障害は、通常、アルツハイマー病と区別される。したがって、ＭＣＩは、それ自体、Ｆ０６．７におけるＩＣＤ−１０によって分類される疾患であり、アルツハイマー病（ＡＤ）は、Ｇ３０におけるＩＣＤ−１０によって分類される。言い換えれば、ＩＣＤ−１０は、ＡＤ（第６章−Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）と全く異なる章（第５章−Ｍｅｎｔａｌ，Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）にＭＣＩを分類している。
【００２４】
ＩＣＤ−１０（Ｆ０６．７）においては、ＭＣＩは、記憶障害、学習困難、及び短期間を超えて仕事に集中する能力の低下を特徴とする障害と記載される。精神的作業が試みられる場合に精神的疲労の顕著な感覚があることが多く、新しい学習が、客観的に成功している場合であっても、主観的には難しいとわかっている。これらの症状はいずれもそれほど重篤ではなく、認知症（Ｆ００−Ｆ０３）又はせん妄（Ｆ０５．−）のいずれかの診断を行うことができる。この障害は、脳と全身の両方である様々な感染及び身体障害に先行する、付随する、又はその後に続くものであってもよいが、脳の関与の直接的証拠は必ずしも存在しない。それを、その異なる病因、より厳密な範囲の一般的により軽度の症状、及び通常はより短い持続期間により、脳炎後症候群（Ｆ０７．１）及び脳震とう後症候群（Ｆ０７．２）と区別することができる。
【００２５】
軽度認知障害（ＭＣＩ）、特に、アルツハイマー病に起因するＭＣＩは、記憶及び思考技術を含む認知能力のわずかであるが、顕著で測定可能な低下を引き起こす。ＭＣＩは、個体の年齢及び教育に基づいて予測されるが、その日常活動を妨害するには有意に十分ではないものを超えるあらゆる型の認知障害の開始及び進化を含む。ＭＣＩの診断は、例えば、Ａｌｂｅｒｔ  ＭＳ、ＤｅＫｏｓｋｙ  ＳＴ、Ｄｉｃｋｓｏｎ  Ｄ、Ｄｕｂｏｉｓ  Ｂ、Ｆｅｌｄｍａｎ  ＨＨ、Ｆｏｘ  ＮＣ、Ｇａｍｓｔ  Ａ、Ｈｏｌｔｚｍａｎ  ＤＭ、Ｊａｇｕｓｔ  ＷＪ、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ＲＣ、Ｓｎｙｄｅｒ  ＰＪ、Ｃａｒｒｉｌｌｏ  ＭＣ、Ｔｈｉｅｓ  Ｂ、Ｐｈｅｌｐｓ  ＣＨ（２０１１）Ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｉｌｄ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｄｕｅ  ｔｏ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｎ  Ａｇｉｎｇ−Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｏｒｋｇｒｏｕｐｓ  ｏｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｅｍｅｎｔ．；７（３）：２７０〜９頁により記載されている。ＭＣＩは、あらゆる型の認知症の開始時にあってもよく、又は認知症の臨床症状をもたらすことなく時間と共に消失し得る一時的な（ｅｐｈｅｍｅｒｉｃ）形態の認知障害を表す。ＭＣＩを有する人は、アルツハイマー病又は別の認知症を発症するリスクが高く、特に、アルツハイマー病を発症するリスクが高いが、認知症、特に、アルツハイマー病を必ず発症するとは限らない。軽度認知障害を処置するための薬剤は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって現在認可されていない。アルツハイマー病の症状を処置するために認可された薬物は、ＭＣＩの認知症への進行を遅延させるか、又は防止する際にいかなる持続的な利益も示していない。
【００２６】
１つ又は複数の認知ドメインが影響されているかどうか、及び主要な記憶障害があるかどうかによって、ＭＣＩの各種サブタイプを区別することができる。即ち、
（ｉ）患者がエピソード記憶の神経心理学テストでパフォーマンスの動作障害を示す場合、健忘性ＭＣＩ（ａ−ＭＣＩ）、又は
（ｉｉ）患者が認知の非記憶ドメインの神経心理学テストで動作障害を示す場合、非健忘性ＭＣＩ（ｎａ−ＭＣＩ）。
障害は、１つの認知ドメイン（ＭＣＩ単一ドメイン）又は複数ドメイン（ＭＣＩ複数ドメイン）に限定することができる。したがって、患者は、４つの可能な臨床上のサブタイプの１つとして分類することができる。すなわち、１）ａ−ＭＣＩ単一ドメイン、２）ａ−ＭＣＩ複数ドメイン、３）ｎａ−ＭＣＩ単一ドメイン、又は４）ｎａ−ＭＣＩ複数ドメインとして分類することができる。臨床上のサブタイプと推定される病因（退行性、血管性、精神性、外傷性）の組合せを、ＭＣＩ患者が発症する可能性が最も高い認知症のタイプ（ＡＤ、血管性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、など）の予測に使用できる。
【００２７】
好ましくは、本明細書中に記載されるＪＮＫ阻害剤配列は、健忘性軽度認知障害（ａ−ＭＣＩ）又は非健忘性軽度認知障害（ｎａ−ＭＣＩ）、好ましくは健忘性軽度認知障害（ａ−ＭＣＩ）、より好ましくはアルツハイマー病に起因する軽度認知障害（ＡＤに起因するＭＣＩ）の処置及び／又は防止のために（そのための医薬の調製のために）用いられる。
【００２８】
ＡＤに起因するＭＣＩは、健忘性ＭＣＩ（ａ−ＭＣＩ）のサブタイプである。ＡＤのバイオマーカー、例えば、アミロイドベータ（Ａβ）沈着のバイオマーカー及び神経損傷のバイオマーカーなどが、ＡＤに起因するＭＣＩの診断に推奨される。Ａβ沈着の有効な指標としては、Ａβ４２の脳脊髄液（ＣＳＦ）中濃度（低下したＣＳＦ中β４２レベル）及びポジトロン断層法（ＰＥＴ）アミロイドイメージングなどが挙げられる。神経損傷の有効な指標としては、タウ／リン酸化タウ（上昇したＣＳＦタウ／ｐタウレベル）のＣＳＦ中濃度、海馬の体積又は側頭葉内側萎縮又は構造ＭＲＩを用いて測定される脳萎縮の割合、及びフルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）ＰＥＴイメージングにおける側頭頭頂領域の低下したグルコース代謝などが挙げられる。
【００２９】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶障害及び認知症と共に進行性の認知低下をもたらす破壊的な神経変性障害である。神経病理学的病変は、β−アミロイド（Ａβ）ペプチドにより形成される老人斑の細胞外沈着、及び高リン酸化タウタンパク質から構成される細胞内神経原線維変化（ＮＦＴ）を特徴とする（Ｄｕｙｃｋａｅｒｔｓら、２００９、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  １１８：５〜３６頁）。アミロイドカスケード仮説によれば、ＡＤにおける神経変性は、ベータ部位ＡＰＰ切断酵素１（ＢＡＣＥ１）及びプレセニリン１の活性を介してプロセシングする異常なアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と関連し、Ａβ斑を形成する前に線維状Ａβペプチドに蓄積する毒性Ａβオリゴマーの産生をもたらし得る。Ａβの蓄積は、シナプス機能障害、ＮＦＴ形成をもたらすキナーゼ活性の変化、ニューロン脱落及び認知症をもたらし得る（Ｈａｒｄｙ及びＨｉｇｇｉｎｓ、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１８４〜５頁）。したがって、ＡＤの発病は、Ａβの蓄積によって誘発されると考えられ、Ａβは様々なサイズのものであってよいオリゴマーに自己凝集し、実質及び血管中で拡散斑及び老人斑を形成する。Ａβオリゴマー及び斑は強力なシナプス毒性を有し、プロテアソーム機能を遮断し、ミトコンドリア活性を阻害し、細胞内Ｃａ２＋レベルを変化させ、炎症プロセスを刺激する。Ａβの正常な生理機能の喪失はまた、ニューロン機能障害に寄与すると考えられる。Ａβは、微小管関連タンパク質タウのリン酸化を調節するシグナリング経路と相互作用する。タウの高リン酸化は、軸索内輸送の調節におけるその正常な機能を破壊し、神経原線維変化（ＮＦＴ）及び毒性種の可溶性タウの蓄積をもたらす。更に、プロテアソームによる高リン酸化タウの分解は、Ａβの作用によって阻害される。
【００３０】
典型的には、本明細書に定義されたＪＮＫ阻害剤配列を、ヒト又はラットのＩＢ１配列から、好ましくは、配列番号１０２（ラット由来ＩＢ１  ｃＤＮＡ配列及びその予測アミノ酸配列を記載する）、配列番号１０３（ｒＩＢ１遺伝子−スプライスドナーのエクソン−イントロン境界によりコードされるラット由来ＩＢ１タンパク質配列を記載する）、配列番号１０４（ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来ＩＢ１タンパク質配列を記載する）、又は配列番号１０５（ヒト由来ＩＢ１  ｃＤＮＡ配列を記載する）の配列のいずれかにより定義又はコードされるアミノ酸配列から、より好ましくは、配列番号１０４（ヒト由来ＩＢ１タンパク質配列を記載する）、又は配列番号１０５（ヒト由来ＩＢ１  ｃＤＮＡ配列を記載する）の配列のいずれかにより定義又はコードされるアミノ酸配列から、又はその任意の断片若しくはバリアントから誘導することができる。換言すれば、ＪＮＫ阻害剤配列は、ヒト又はラットＩＢ１配列の断片、バリアント、又はそのような断片のバリアントを含む。ヒト又はラットＩＢ配列は、それぞれ、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４又は配列番号１０５の配列によって定義又はコードされる。
【００３１】
好ましくは、本明細書で使用されるそのようなＪＮＫ阻害剤配列は、全長１５０個未満のアミノ酸残基、好ましくは、５〜１５０個の範囲のアミノ酸残基、より好ましくは、１０〜１００個のアミノ酸残基、更により好ましくは、１０〜７５個のアミノ酸残基、最も好ましくは、１０〜５０個の範囲のアミノ酸残基、例えば、１０〜３０、１０〜２０、又は１０〜１５個のアミノ酸残基を含む。
【００３２】
より好ましくは、そのようなＪＮＫ阻害剤配列及び上記範囲を、上記配列のいずれかから、更により好ましくは、配列番号１０４に従って定義された、又は配列番号１０５によりコードされたアミノ酸配列から、更により好ましくは、配列番号１０５のヌクレオチド４２０〜９８０の領域又は配列番号１０４のアミノ酸１０５〜２９１、最も好ましくは、配列番号１０５のヌクレオチド５６１〜６４７の領域又は配列番号１０４のアミノ酸１５２〜１８０から選択することができる。
【００３３】
特定の実施形態によれば、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、典型的には、ＪＮＫに結合する、及び／又は少なくとも１つのＪＮＫ活性化転写因子、例えば、ｃ−Ｊｕｎ若しくはＡＴＦ２（例えば、それぞれ、配列番号１５及び配列番号１６を参照されたい）又はＥｌｋ１の活性化を阻害する。
【００３４】
同様に、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、好ましくは、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００のいずれか１つに記載の少なくとも１つのアミノ酸配列、又はその断片、誘導体若しくはバリアントを含む又はからなる。より好ましくは、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００のアミノ酸配列、又はそのバリアント、断片若しくは誘導体の１、２、３、４又は更に多くのコピーを含有してもよい。１より多いコピーで存在する場合、本明細書で使用される、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００のこれらのアミノ酸配列、又はそのバリアント、断片、若しくは誘導体を、リンカー配列を用いずに互いに直接連結するか、又は１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸を含むリンカー配列を介して連結することができる。リンカー配列を形成するアミノ酸は、好ましくは、アミノ酸残基としてグリシン又はプロリンから選択される。より好ましくは、本明細書で使用される、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００のこれらのアミノ酸配列、又はその断片、バリアント若しくは誘導体を、２個、３個又はそれ以上のプロリン残基のヒンジによって互いに分離することができる。
【００３５】
本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、又は両方の組合せから構成されていてもよい。好ましくは、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、少なくとも１個又は更には２個、好ましくは少なくとも３、４又は５個、より好ましくは少なくとも６、７、８又は９個、更により好ましくは少なくとも１０個以上のＤ−及び／又はＬ−アミノ酸を含み、ここで、Ｄ−及び／又はＬ−アミノ酸を、ブロックごとに（ｂｌｏｃｋｗｉｓｅ）、非ブロックごとに（ｎｏｎ−ｂｌｏｃｋｗｉｓｅ）、又は交互の様式で、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列中に配置してもよい。
【００３６】
１つの好ましい実施形態によれば、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、Ｌ−アミノ酸のみから構成されていてもよい。次いで、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、配列番号１又は配列番号３の少なくとも１つの「天然ＪＮＫ阻害剤配列」を含む又はからなってもよい。これに関連して、用語「天然」又は「天然ＪＮＫ阻害剤配列」は、全てＬ−アミノ酸から構成される、本明細書で使用される配列番号１又は配列番号３のいずれかの変化していないＪＮＫ阻害剤配列を指す。
【００３７】
したがって、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤は、少なくとも１つの（天然）アミノ酸配列ＮＨ２−Ｘｎｂ−Ｘｎａ−ＲＰＴＴＬＸＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤ−Ｘｎｂ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＩＢ一般（ｓ））（配列番号３）及び／又はＩＢ１のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）ＸＲＰＴＴＬＸＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤＳ／ＴＸ（Ｌ−ＩＢ（一般）（配列番号１９）を含む又はからなってもよい。これに関連して、それぞれのＸは、典型的には、好ましくは任意の（天然）アミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基を表す。Ｘｎａは、典型的には、好ましくはセリン又はトレオニン以外の任意のアミノ酸残基から選択される１つのアミノ酸残基を表し、ここで、ｎ（Ｘの反復数）は０又は１である。更に、それぞれのＸｎｂを、任意のアミノ酸残基から選択することができ、ここで、ｎ（Ｘの反復数）は０〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０以上であるが、但し、Ｘｎａのｎ（Ｘの反復数）が０である場合、Ｘｎｂは好ましくはこの位置でのセリン又はトレオニンを回避するために、そのＣ末端にセリン又はトレオニンを含まない。好ましくは、Ｘｎｂは、配列番号１又は配列番号３に由来するペプチド残基の連続ストレッチを表す。Ｘｎａ及びＸｎｂは、Ｄ又はＬアミノ酸を表してもよい。更に、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１のＪＮＫ結合ドメインＤＴＹＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤＴ（Ｌ−ＩＢ１）（配列番号１７）を含む群から選択される少なくとも１つの（天然）アミノ酸配列を含む又はからなってもよい。より好ましくは、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、少なくとも１つの（天然）アミノ酸配列ＮＨ２−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＩＢ１（ｓ））（配列番号１）を更に含む又はからなってもよい。更に、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１  Ｌ−ＩＢ１（ｓ１）（ＮＨ２−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ、配列番号３３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２）（ＮＨ２−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ、配列番号３４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３）（ＮＨ２−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ、配列番号３５）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ４）（ＮＨ２−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号３６）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ５）（ＮＨ２−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ、配列番号３７）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ６）（ＮＨ２−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ、配列番号３８）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ７）（ＮＨ２−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ、配列番号３９）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ８）（ＮＨ２−ＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ、配列番号４０）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ９）（ＮＨ２−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ、配列番号４１）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１０）（ＮＨ２−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ、配列番号４２）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１１）（ＮＨ２−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号４３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１２）（ＮＨ２−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ、配列番号４４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１３）（ＮＨ２−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ、配列番号４５）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１４）（ＮＨ２−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ、配列番号４６）；Ｌ−Ｉ���１（ｓ１５）（ＮＨ２−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰ−ＣＯＯＨ、配列番号４７）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１６）（ＮＨ２−ＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ、配列番号４８）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１７）（ＮＨ２−ＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ、配列番号４９）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１８）（ＮＨ２−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ、配列番号５０）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１９）（ＮＨ２−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号５１）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２０）（ＮＨ２−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ、配列番号５２）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２１）（ＮＨ２−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ、配列番号５３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２２）（ＮＨ２−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ、配列番号５４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２３）（ＮＨ２−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰ−ＣＯＯＨ、配列番号５５）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２４）（ＮＨ２−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦ−ＣＯＯＨ、配列番号５６）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２５）（ＮＨ２−ＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ、配列番号５７）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２６）（ＮＨ２−ＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ、配列番号５８）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２７）（ＮＨ２−ＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ、配列番号５９）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２８）（ＮＨ２−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号６０）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２９）（ＮＨ２−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ、配列番号６１）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３０）（ＮＨ２−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ、配列番号６２）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３１）（ＮＨ２−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ、配列番号６３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３２）（ＮＨ２−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰ−ＣＯＯＨ、配列番号６４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３３）（ＮＨ２−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦ−ＣＯＯＨ、配列番号６５）；及びＬ−ＩＢ１（ｓ３４）（ＮＨ２−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬ−ＣＯＯＨ、配列番号６６）のＪＮＫ結合ドメインを含む群から選択される少なくとも１つの（天然）アミノ酸配列を含む又はからなってもよい。
【００３８】
更に、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１の（長い）ＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）ＰＧＴＧＣＧＤＴＹＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤＴ（ＩＢ１−ｌｏｎｇ）（配列番号１３）、ＩＢ２の（長い）ＪＮＫ結合ドメインＩＰＳＰＳＶＥＥＰＨＫＨＲＰＴＴＬＲＬＴＴＬＧＡＱＤＳ（ＩＢ２−ｌｏｎｇ）（配列番号１４）、ｃ−ＪｕｎのＪＮＫ結合ドメインＧＡＹＧＹＳＮＰＫＩＬＫＱＳＭＴＬＮＬＡＤＰＶＧＮＬＫＰＨ（ｃ−Ｊｕｎ）（配列番号１５）、ＡＴＦ２のＪＮＫ結合ドメインＴＮＥＤＨＬＡＶＨＫＨＫＨＥＭＴＬＫＦＧＰＡＲＮＤＳＶＩＶ（ＡＴＦ２）（配列番号１６）を含む群から選択される少なくとも１つの（天然）アミノ酸配列を含む又はからなってもよい（例えば、図１Ａ〜図１Ｃを参照されたい）。これに関連して、アラインメントは、部分的に保存された８アミノ酸の配列（例えば、図１Ａを参照されたい）を示し、ＩＢ１とＩＢ２のＪＢＤの更なる比較は、２つの配列間で高度に保存された７個及び３個のアミノ酸の２つのブロックを示した。
【００３９】
別の好ましい実施形態によれば、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、部分的に、又は専ら、上記で定義されたＤ−アミノ酸から構成されていてもよい。より好ましくは、Ｄ−アミノ酸から構成されるこれらのＪＮＫ阻害剤配列は、上記の（天然）ＪＮＫ阻害剤配列の非天然Ｄレトロ−インベルソ配列である。用語「レトロ−インベルソ配列」とは、配列の向きが逆転し、各アミノ酸残基のキラリティが反転した線状ペプチド配列の異性体を指す（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、７４４〜７４６頁（１９９４）；Ｂｒａｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、６９２〜６９３頁（１９９４）を参照されたい）。Ｄ−エナンチオマーとリバース合成との組合せの利点は、各アミド結合中のカルボニル基とアミノ基の位置が交換されるが、各アルファ炭素での側鎖基の位置が保持されるということである。別途、特に記述しない限り、本発明に従って使用される任意の所与のＬ−アミノ酸配列又はペプチドを、対応する天然のＬ−アミノ酸配列又はペプチドの配列又はペプチドのリバースを合成することによって、Ｄレトロ−インベルソ配列又はペプチドに変換することができると推定される。
【００４０】
本明細書で使用され、上記で定義されたＤレトロ−インベルソ配列は、様々な有用な特性を有する。例えば、本明細書で使用されるＤレトロ−インベルソ配列は、本明細書で使用されるＬ−アミノ酸配列と同程度に効率的に細胞に進入するが、本明細書で使用されるＤレトロ−インベルソ配列は対応するＬ−アミノ酸配列よりも安定である。
【００４１】
したがって、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、アミノ酸配列ＮＨ２−Ｘｎｂ−ＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲ−Ｘｎａ−Ｘｎｂ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＩＢ１一般（ｓ））（配列番号４）及び／又はＸＳ／ＴＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲＸ（Ｄ−ＩＢ（一般））（配列番号２０）の少なくとも１つのＤレトロ−インベルソ配列を含む又はからなってもよい。この状況で使用される場合、Ｘ、Ｘｎａ及びＸｎｂは上記で定義された通りであり（好ましくは、Ｄアミノ酸を表す）、ここで、Ｘｎｂは好ましくは、配列番号２又は配列番号４に由来する残基の連続ストレッチを表す。更に、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）ＴＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＹＴＤ（Ｄ−ＩＢ１）（配列番号１８）を含むアミノ酸配列の少なくとも１つのＤレトロ−インベルソ配列を含むか又はからなってもよい。より好ましくは、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、アミノ酸配列ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＩＢ１（ｓ））（配列番号２）の少なくとも１つのＤレトロ−インベルソ配列を含む又はからなってもよい。更に、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１  Ｄ−ＩＢ１（ｓ１）（ＮＨ２−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号６７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２）（ＮＨ２−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ、配列番号６８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３）（ＮＨ２−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ、配列番号６９）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ４）（ＮＨ２−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号７０）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ５）（ＮＨ２−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ、配列番号７１）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ６）（ＮＨ２−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ、配列番号７２）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ７）（ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ、配列番号７３）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ８）（ＮＨ２−ＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号７４）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ９）（ＮＨ２−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ、配列番号７５）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１０）（ＮＨ２−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ、配列番号７６）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１１）（ＮＨ２−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号７７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１２）（ＮＨ２−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ、配列番号７８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１３）（ＮＨ２−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ、配列番号７９）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１４）（ＮＨ２−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ、配列番号８０）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１５）（ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬ−ＣＯＯＨ、配列番号８１）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１６）（ＮＨ２−ＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号８２）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１７）（ＮＨ２−ＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ、配列番号８３）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１８）（ＮＨ２−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ、配列番号８４）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１９）（ＮＨ２−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号８５）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２０）（ＮＨ２−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ、配列番号８６）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２１）（ＮＨ２−ＲＰＶＱＰＦ���ＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ、配列番号８７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２２）（ＮＨ２−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ、配列番号８８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２３）（ＮＨ２−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬ−ＣＯＯＨ、配列番号８９）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２４）（ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮ−ＣＯＯＨ、配列番号９０）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２５）（ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬ−ＣＯＯＨ、配列番号９１）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２６）（ＮＨ２−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮ−ＣＯＯＨ、配列番号９２）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２７）（ＮＨ２−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬ−ＣＯＯＨ、配列番号９３）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２８）（ＮＨ２−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ、配列番号９４）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２９）（ＮＨ２−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ、配列番号９５）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３０）（ＮＨ２−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ、配列番号９６）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３１）（ＮＨ２−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号９７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３２）（ＮＨ２−ＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ、配列番号９８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３３）（ＮＨ２−ＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ、配列番号９９）；及びＤ−ＩＢ１（ｓ３４）（ＮＨ２−ＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号１００）のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）を含むアミノ酸配列の少なくとも１つのＤレトロ−インベルソ配列を含む又はからなってもよい。
【００４２】
本明細書で使用され、上記に開示されたＪＮＫ阻害剤配列を、表１に提示する（配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００）。この表は、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列の名称、並びにその配列識別番号、その長さ、及びアミノ酸配列を提示する。更に、表１は、例えば、それぞれ、配列番号１、２、５、６、９及び１１並びに配列番号３、４、７、８、１０及び１２に関する配列並びにその一般式を示す。表１は、キメラ配列である配列番号９〜１２及び配列番号２３〜３２（以下を参照されたい）、Ｌ−ＩＢ１配列である配列番号３３〜６６及びＤ−ＩＢ１配列である配列番号６７〜１００を更に開示する。
【００４３】
【表１−１】
2018525337.tif 000002
【表１−２】
2018525337.tif 000003
【表１−３】
2018525337.tif 000004
【表１−４】
2018525337.tif 000005
【００４４】
別の好ましい実施形態によれば、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の上記で定義された天然又は非天然アミノ酸配列の少なくとも１つのバリアント、断片及び／又は誘導体を含む又はからなる。好ましくは、これらのバリアント、断片及び／又は誘導体は、本明細書で使用される上記に開示された天然又は非天然ＪＮＫ阻害剤配列、特に、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の天然又は非天然アミノ酸配列の生物活性、すなわち、ＪＮＫへの結合、及び／又は少なくとも１つのＪＮＫ活性化転写因子、例えば、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２若しくはＥｌｋ１の活性化の阻害を保持する。様々な試験、例えば、ペプチドのその標的分子への結合試験により、又は生物物理学的方法、例えば、分光法、コンピュータモデリング、構造分析などにより、機能を試験することができる。特に、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列又はそのバリアント、断片及び／又は誘導体を、ペプチドの疎水性及び親水性領域を同定するために使用することができ、したがって、結合実験などにおける実験操作のため、又は抗体合成のための基質の設計に役立つ親水性分析（例えば、Ｈｏｐｐ及びＷｏｏｄｓ、１９８１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：３８２４〜３８２８頁を参照されたい）によって分析することができる。また、二次構造分析を実施して、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列又はそのバリアント、断片及び／又は誘導体の領域を同定し、特定の構造モチーフを推定することもできる（例えば、Ｃｈｏｕ及びＦａｓｍａｎ、１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３：２２２〜２２３頁を参照されたい）。操作、翻訳、二次構造予測、親水性及び疎水性プロファイル、オープンリーディングフレーム予測及びプロッティング、並びに配列相同性の決定を、当技術分野で利用可能なコンピュータソフトウェアプログラムを使用して達成することができる。構造分析の他の方法としては、例えば、Ｘ線結晶構造解析（例えば、Ｅｎｇｓｔｒｏｍ、１９７４．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  １１：７〜１３頁を参照されたい）、質量分析及びガスクロマトグラフィー（例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ、１９９７、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照されたい）が挙げられ、コンピュータモデリング（例えば、Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ及びＺｏｌｌｅｒ（編）、１９８６、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照されたい）を用いることもできる。
【００４５】
したがって、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の（天然又は非天然）アミノ酸配列の少なくとも１つのバリアントを含む又はからなってもよい。本発明においては、「配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の（天然又は非天然）アミノ酸配列のバリアント」は、好ましくは、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかに由来する配列であり、ここで、バリアントは、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００のアミノ酸配列のアミノ酸変化を含む。そのような変化は、典型的には、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００のアミノ酸の１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個の置換、付加及び／又は欠失を含み、ここで、バリアントは、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は更には９９％の配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかとの配列同一性を示す。
【００４６】
上記で定義され、本明細書で使用される配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の（天然又は非天然）アミノ酸配列のバリアントが特定のアミノ酸の置換によって得られる場合、そのような置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換を含む。保存的アミノ酸置換は、群のメンバー間での置換が分子の生物活性を保持するような、十分に類似する物理化学的特性を有する群内の同義アミノ酸残基を含んでもよい（例えば、Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．（１９７４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８５、８６２〜８６４頁を参照されたい）。特に、挿入及び／又は欠失がわずかなアミノ酸、例えば、２０個未満、好ましくは、１０個未満しか含まず、機能活性にとって重要であるアミノ酸を除去しない、又は置き換えない場合、アミノ酸を、その機能を変化させることなく上記で定義された配列中で挿入及び／又は欠失させることもできることが当業者には明らかである。更に、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列又は本明細書で使用されるキメラペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの不活化を回避するために、ホスホリラーゼ、好ましくは、キナーゼに接近可能であるアミノ酸位置に追加のトレオニンをもたらす置換を、本明細書で使用されるバリアントにおいては回避すべきである。
【００４７】
好ましくは、同じ群に分類され、典型的には、保存的アミノ酸置換によって交換可能である同義アミノ酸残基を、表２に定義する。
【００４８】
【表２】
2018525337.tif 000006
【００４９】
本明細書で使用される配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００のバリアントの特定の形態は、典型的には、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００と比較して少なくとも１個の欠失によって変化した、本明細書で使用される配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の（天然又は非天然）アミノ酸配列の断片である。好ましくは、断片は、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００のいずれかの少なくとも４個の連続するアミノ酸を含み、その長さは、典型的には、これらの配列のいずれかに由来するエピトープの特異的認識を可能にするために十分なものである。更により好ましくは、断片は、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００のいずれかの４〜１８、４〜１５、又は最も好ましくは４〜１０個の連続するアミノ酸を含み、その範囲の下限は、４、又は５、６、７、８、９、又は１０であってもよい。欠失されるアミノ酸は、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の任意の位置にあってもよいが、好ましくは、Ｎ又はＣ末端にある。
【００５０】
更に、上記のような、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の（天然又は非天然）アミノ酸配列の断片は、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は更には９９％の本明細書で使用される配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかとの配列同一性を有する配列と定義することができる。
【００５１】
本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、上記で定義された配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の（天然又は非天然）アミノ酸配列の少なくとも１つの誘導体を更に含む又はからなってもよい。これに関連して、「配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の（天然又は非天然）アミノ酸配列の誘導体」は、好ましくは、配列番号１〜４、１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかに由来するアミノ酸配列であり、ここで、誘導体は、少なくとも１個の改変されたＬ−又はＤ−アミノ酸（非天然アミノ酸を形成する）、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、更により好ましくは、１〜５個の改変されたＬ−又はＤ−アミノ酸を含む。バリアント又は断片の誘導体もまた、本発明の範囲内にある。
【００５２】
これに関する「改変されたアミノ酸」は、例えば、様々な生物における異なるグリコシル化、リン酸化又は特定のアミノ酸の標識によって変化した任意のアミノ酸であってもよい。次いで、そのような標識は、典型的には、
（ｉ）放射性標識、すなわち、放射性リン酸化又は硫黄、水素、炭素、窒素などを用いる放射性標識；
（ｉｉ）有色色素（例えば、ジゴキシゲニンなど）；
（ｉｉｉ）蛍光基（例えば、フルオレセインなど）；
（ｉｖ）化学発光基；
（ｖ）固相上への固定のための基（例えば、Ｈｉｓ−タグ、ビオチン、ストレプタグ、フラッグタグ、抗体、抗原など）；及び
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）の下で記載された２つ以上の標識の組合せ
を含む標識群から選択される。
【００５３】
上記に関連して、本発明のクエリアミノ酸配列に対して少なくとも、例えば、９５％の「配列同一性を有する」配列を有するアミノ酸配列は、対象アミノ酸配列が、クエリアミノ酸配列のそれぞれの１００個のアミノ酸あたり、５個までのアミノ酸変化を含んでもよいことを除いて、対象アミノ酸配列の配列がクエリ配列と同一であることを意味することが意図される。換言すれば、クエリアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸配列を得るために、対象配列中のアミノ酸残基の最大５％（１００個のうちの５個）を、挿入するか、又は別のアミノ酸で置換するか、又は欠失させることができる。
【００５４】
正確に一致しない配列については、第１の配列の「同一性％」を、第２の配列に対して決定することができる。一般に、比較されるこれらの２つの配列を整列させて、配列間の最大相関を得る。これは、アラインメントの程度を増強するために、一方又は両方の配列に「ギャップ」を挿入することを含んでもよい。次いで、同じか、若しくは類似する長さの配列にとって特に好適である、比較される配列のそれぞれの全長にわたって（いわゆるグローバルアラインメント）、又は等しくない長さの配列にとってより好適である、より短い、規定の長さにわたって（いわゆるグローバルアラインメント）、同一性％を決定することができる。
【００５５】
特に、本明細書で使用されるような、２つ以上の配列の同一性及び相同性を比較するための方法は、当技術分野で周知である。したがって、例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２、３８７〜３９５頁）中で利用可能なプログラム、例えば、プログラムＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＡＰを使用して、２つのポリヌクレオチド間の同一性％並びに２つのポリペプチド配列間の同一性％及び相同性％を決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、（Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７、１９５〜１９７頁）の「部分相同性」アルゴリズムを使用し、２つの配列間の類似性の最良の単一領域を見出すものである。配列間の同一性及び／又は類似性を決定するための他のプログラムも、当技術分野で公知であり、例えば、ワールドワイドウェブサイトｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのＮＣＢＩのホームページを介してアクセス可能なＢＬＡＳＴファミリーのプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５、４０３〜４１０頁）及びＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３、６３〜９８頁；Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８５、２４４４〜２４４８頁）がある。
【００５６】
本発明に従って使用され、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列を、当技術分野で周知の方法、例えば、化学的合成又は以下に考察される遺伝子工学的方法によって取得又は産生することができる。例えば、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列の所望の領域を含む前記ＪＮＫ阻害剤配列の一部に対応する、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏで所望の活性を媒介するペプチドを、ペプチド合成装置の使用によって合成することができる。
【００５７】
本明細書で使用され、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列を、輸送配列によって更に改変し、本明細書で使用され、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列を細胞中に効率的に輸送することができる。そのような改変されたＪＮＫ阻害剤配列は、好ましくは、キメラ配列として提供及び使用される。
【００５８】
したがって、本発明の第２の態様によれば、少なくとも１つの第１のドメインと少なくとも１つの第２のドメインとを含むキメラペプチドの、軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置のための医薬組成物の調製のための使用であって、キメラペプチドの第１のドメインが輸送配列を含み、キメラペプチドの第２のドメインが前記ＪＮＫ阻害剤配列、好ましくは配列番号１〜４、１３〜２０、及び３３〜１００の配列のいずれか又はその誘導体若しくは断片を含む。言い換えれば、本発明は、また、共有結合で結合された少なくとも１つの第１のドメインと少なくとも１つの第２のドメインとを含み、第１のドメインが輸送配列を含み、第２のドメインが請求項１から９のいずれかに記載のＪＮＫ阻害剤配列を含む、本明細書中に記載される、軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置において使用するためのキメラペプチドを提供する。
【００５９】
典型的には、本発明に従って使用されるキメラペプチドは、少なくとも２５個のアミノ酸残基、例えば、２５〜２５０アミノ酸残基、より好ましくは２５〜２００個のアミノ酸残基、更により好ましくは２５〜１５０個のアミノ酸残基、２５〜１００個のアミノ酸残基、最も好ましくは２５〜５０個のアミノ酸残基の長さを有する。
【００６０】
第１のドメインとして、本明細書で使用されるキメラペプチドは、好ましくは、（それが存在する）ペプチドを所望の細胞運命に指向させるアミノ酸の任意の配列から典型的に選択される輸送配列を含む。したがって、本明細書で使用される輸送配列は、典型的には、細胞膜を横断して、例えば、細胞の外部から、細胞膜を通って、細胞質にペプチドを指向させる。あるいは、又は更に、輸送配列は、例えば、２つの成分（例えば、細胞透過のための成分と核局在化のための成分）を組み合わせることにより、又は例えば、細胞膜輸送及び標的化された、例えば、核内での輸送の特性を有する１つの単一成分によって、ペプチドを、細胞内の所望の位置、例えば、核、リボソーム、小胞体（ＥＲ）、リソソーム、又はペルオキシソームに指向させることができる。輸送配列は、細胞質成分又は任意の他の成分又は細胞のコンパートメント（例えば、小胞体、ミトコンドリア、グルーム（ｇｌｏｏｍ）装置、リソソーム小胞）に結合することができる別の成分を更に含んでもよい。したがって、例えば、第１のドメインの輸送配列及び第２のドメインのＪＮＫ阻害剤配列を、細胞質又は細胞の任意の他のコンパートメント中に局在化させることができる。これにより、取込み時の細胞におけるキメラペプチドの局在化を決定することができる。
【００６１】
好ましくは、輸送配列（本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中に含まれる）は、５〜１５０個の長さのアミノ酸配列、より好ましくは５〜１００個の長さ、最も好ましくは５〜５０個、５〜３０個又は更には５〜１５個の長さのアミノ酸を有する。
【００６２】
より好ましくは、輸送配列（本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中に含まれる）は、第１のドメイン中に連続するアミノ酸配列ストレッチとして存在してもよい。あるいは、第１のドメイン中の輸送配列を、２つ以上の断片に分割してもよく、ここで、これらの断片の全ては、輸送配列全体と類似し、輸送配列が上記に開示されたようなその運搬特性をそのまま保持するという条件で、１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸によって互いに分離されていてもよい。輸送配列の断片を分離するこれらのアミノ酸を、例えば、輸送配列とは異なるアミノ酸配列から選択することができる。あるいは、第１のドメインは、それぞれの成分が、第２のドメインのカーゴＪＮＫ阻害剤配列の、例えば、特定の細胞コンパートメントへの輸送のためのそれ自身の機能を有する、１つを超える成分から構成される輸送配列を含有してもよい。
【００６３】
上記で定義された輸送配列は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、又は両方の組合せから構成されていてもよい。好ましくは、輸送配列（本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中に含まれる）は、少なくとも１個又は更には２個、好ましくは少なくとも３、４又は５個、より好ましくは少なくとも６、７、８又は９個、更により好ましくは少なくとも１０個以上のＤ−及び／又はＬ−アミノ酸を含んでもよく、ここで、Ｄ−及び／又はＬ−アミノ酸を、ブロックごとに、非ブロックごとに、又は交互の様式で、ＪＮＫ輸送配列中に配置してもよい。
【００６４】
１つの代替的な実施形態によれば、本明細書で使用されるキメラペプチドの輸送配列は、Ｌ−アミノ酸のみから構成されていてもよい。より好ましくは、本明細書で使用されるキメラペプチドの輸送配列は、上記で定義された少なくとも１つの「天然」輸送配列を含む又はからなる。これに関連して、用語「天然」は、全てＬ−アミノ酸から構成される変化していない輸送配列を指す。
【００６５】
別の代替的な実施形態によれば、本明細書で使用されるキメラペプチドの輸送配列は、Ｄ−アミノ酸のみから構成されていてもよい。より好ましくは、本明細書で使用されるキメラペプチドの輸送配列は、上記に提示された配列のＤレトロ−インベルソペプチドを含んでもよい。
【００６６】
本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメインの輸送配列は、天然の供給源から取得するか、又は遺伝子工学技術若しくは化学的合成（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照されたい）を使用することにより産生することができる。
【００６７】
例えば、ＴＡＴタンパク質（例えば、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる参考文献である米国特許第５，８０４，６０４号及び第５，６７４，９８０号に記載されている）、ＶＰ２２（例えば、ＷＯ９７／０５２６５号；Ｅｌｌｉｏｔｔ及びＯ’Ｈａｒｅ、Ｃｅｌｌ  ８８：２２３〜２３３頁（１９９７）に記載されている）、非ウイルスタンパク質（Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０６９１〜１０６９５頁（１９９２））、アンテナペディア（例えば、アンテナペディア担体配列）に由来する、又は塩基性ペプチド、例えば、５〜１５アミノ酸、好ましくは１０〜１２アミノ酸の長さを有し、例えば、アルギニン、リシン及び／又はヒスチジンなどの、少なくとも８０％、より好ましくは８５％若しくは更には９０％の塩基性アミノ酸を含むペプチドに由来する輸送配列などの、例えば、天然タンパク質を含む第１のドメインの輸送配列のための供給源を用いることができる。更に、輸送配列として使用される天然タンパク質の１つのバリアント、断片及び誘導体が、本明細書に開示される。バリアント、断片及び誘導体に関して、それは本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列について上記に与えられた定義を言う。バリアント、断片並びに誘導体は、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列について上記したように一致して定義される。特に、輸送配列に関連して、バリアント又は断片又は誘導体は、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は更には９９％の上記で定義された輸送配列として使用される天然タンパク質の１つとの配列同一性を有する配列と定義することができる。
【００６８】
本明細書で使用されるキメラペプチドの好ましい実施形態においては、第１のドメインの輸送配列は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１  ＴＡＴタンパク質に由来する配列、特に、ＴＡＴタンパク質を構成する８６個のアミノ酸のいくらか、又は全部を含む又はからなる。
【００６９】
輸送配列（本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中に含まれる）については、ＴＡＴタンパク質の機能的に有効な断片、すなわち、細胞への進入及び取込みを媒介する領域を含むＴＡＴペプチドを形成する、完全長ＴＡＴタンパク質の部分配列を使用することができる。そのような配列がＴＡＴタンパク質の機能的に有効な断片であるかどうかに関して、公知の技術を使用して決定することができる（例えば、Ｆｒａｎｋｅｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ  ８６：７３９７〜７４０１頁（１９８９）を参照されたい）。したがって、本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中の輸送配列を、８６個未満のアミノ酸を含み、細胞への取込み、場合により、細胞核への取込みを示すＴＡＴタンパク質配列の機能的に有効な断片又は部分から誘導することができる。より好ましくは、細胞膜を横断するキメラペプチドの透過を媒介する担体として使用されるＴＡＴの部分配列（断片）は、完全長ＴＡＴの塩基性領域（アミノ酸４８〜５７又は４９〜５７）を含むことが意図される。
【００７０】
より好ましい実施形態によれば、輸送配列（本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中に含まれる）は、ＴＡＴ残基４８〜５７又は４９〜５７を含有するアミノ酸配列、最も好ましくは、一般ＴＡＴ配列ＮＨ２−Ｘｎｂ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｘｎｂ−ＣＯＯＨ（Ｌ−一般−ＴＡＴ（ｓ））（配列番号７）及び／又はＸＸＸＸＲＫＫＲＲＱ  ＲＲＲＸＸＸＸ（Ｌ−一般−ＴＡＴ）（配列番号２１）（ここで、Ｘ又はＸｎｂは上記で定義された通りである）を含む又はからなってもよい。更に、配列番号８中の「Ｘｎｂ」残基の数は、記載されたものに限定されず、上記のように変化してもよい。あるいは、本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中に含まれる輸送配列は、例えば、アミノ酸配列ＮＨ２−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＴＡＴ）（配列番号５）を含有するペプチドを含む又はからなっていてもよい。
【００７１】
別のより好ましい実施形態によれば、輸送配列（本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中に含まれる）は、上記に提示された配列のＤレトロ−インベルソペプチド、すなわち、配列ＮＨ２−Ｘｎｂ−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ−Ｘｎｂ−ＣＯＯＨ（Ｄ−一般−ＴＡＴ（ｓ））（配列番号８）及び／又はＸＸＸＸＲＲＲＱＲＲＫＫＲＸＸＸＸ（Ｄ−一般−ＴＡＴ）（配列番号２２）を有する一般ＴＡＴ配列のＤレトロ−インベルソ配列を含んでもよい。また、ここで、Ｘｎｂは上記で定義された通りである（好ましくは、Ｄアミノ酸を表す）。更に、配列番号８中の「Ｘｎｂ」残基の数は、記載されたものに限定されず、上記のように変化してもよい。最も好ましくは、本明細書で使用される輸送配列は、Ｄレトロ−インベルソ配列ＮＨ２−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＴＡＴ）（配列番号６）を含んでもよい。
【００７２】
別の実施形態によれば、本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中に含まれる輸送配列は、上記で定義された輸送配列のバリアントを含む又はからなっていてもよい。「輸送配列のバリアント」は、好ましくは、上記で定義された輸送配列に由来する配列であり、ここで、バリアントは、上記で定義された輸送配列中に存在する少なくとも１つのアミノ酸の改変、例えば、付加、（断片をもたらす）（内部）欠失及び／又は置換を含む。そのような改変は、典型的には、１〜２０個、好ましくは、１〜１０個、より好ましくは、１〜５個のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失を含む。更に、バリアントは、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は更には９９％の、好ましくは、上記で定義された輸送配列、より好ましくは、配列番号５〜８又は配列番号２１〜２２のいずれかとの配列同一性を示す。
【００７３】
好ましくは、本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中に含まれる輸送配列のそのような改変は、安定性が増大又は減少した輸送配列をもたらす。あるいは、輸送配列のバリアントを、本明細書で使用されるキメラペプチドの細胞内局在化をモジュレートするように設計することができる。外因的に付加した場合、上記で定義されたそのようなバリアントは、典型的には、細胞に進入する輸送配列の能力が保持される（すなわち、細胞中への輸送配列のバリアントの取込みが、輸送配列として使用される天然タンパク質のものと実質的に類似する）ように設計される。例えば、核局在化にとって重要であると考えられる塩基性領域の変化（例えば、Ｄａｎｇ及びＬｅｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１８０１９〜１８０２３頁（１９８９）；Ｈａｕｂｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１１８１〜１１８７頁（１９８９）；ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１〜８頁（１９８９）を参照されたい）は、輸送配列、したがって、本明細書で使用されるキメラペプチドの成分としてのＪＮＫ阻害剤配列の細胞質の位置又は部分的に細胞質の位置をもたらすことができる。上記に加えて、例えば、コレステロール又は他の脂質部分を輸送配列に連結して、膜溶解性が増大した輸送配列を産生することにより、更なる改変をバリアント中に導入することができる。本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメイン中に含まれる輸送配列の上記の開示されたバリアントのいずれかを、典型的には、当業者には公知の技術を使用して産生することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。
【００７４】
第２のドメインとして、本明細書で使用されるキメラペプチドは、典型的には、これらのＪＮＫ阻害剤配列のバリアント、断片及び／又は誘導体を含む、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列のいずれかから選択されるＪＮＫ阻害剤配列を含む。
【００７５】
本明細書で使用されるキメラペプチドの両ドメイン、すなわち、第１及び第２のドメインは、機能的ユニットを形成させるように連結されていてもよい。当技術分野で一般的に公知の第１及び第２のドメインを連結するための任意の方法を適用することができる。
【００７６】
一実施形態によれば、本明細書で使用されるキメラペプチドの第１及び第２のドメインは、好ましくは、共有結合によって連結される。本明細書で定義される共有結合は、例えば、ペプチド結合であってもよく、融合タンパク質として上記で定義されたキメラペプチドを発現させることによって取得することができる。本明細書に記載される融合タンパク質を、以下に記載されるような標準的な組換えＤＮＡ技術と類似するか、又はそれから容易に適合可能である方法で形成させ、使用することができる。しかしながら、両ドメインを、側鎖を介して連結するか、又は化学的リンカー部分により連結することもできる。
【００７７】
本明細書で使用されるキメラペプチドの第１及び／又は第２のドメインは、前記キメラペプチド中に１又はそれ以上のコピーで存在してもよい。両ドメインが単一のコピーで存在する場合、第１のドメインを、第２のドメインのＮ末端又はＣ末端に連結することができる。複数のコピーで存在する場合、第１及び第２のドメインを、任意の可能な順序で配置させることができる。例えば、第１のドメインは、好ましくは、連続する順序で配置される、複数のコピー数で、例えば、２、３又はそれ以上のコピーで、本明細書で使用されるキメラペプチド中に存在してもよい。次いで、第２のドメインは、第１のドメインを含む配列のＮ又はＣ末端に存在する単一コピーで存在してもよい。あるいは、第２のドメインは、複数のコピー数で、例えば、２、３又はそれ以上のコピーで存在してもよく、第１のドメインは単一のコピーで存在してもよい。両方の選択肢によれば、第１及び第２のドメインは、連続する配置においていずれの場所を取ってもよい。例示的な配置を以下に示す：例えば、第１のドメイン−第１のドメイン−第１のドメイン−第２のドメイン；第１のドメイン−第１のドメイン−第２のドメイン−第１のドメイン；第１のドメイン−第２のドメイン−第１のドメイン−第１のドメイン；又は例えば、第２のドメイン−第１のドメイン−第１のドメイン−第１のドメイン。当業者は、これらの例が、例示目的に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではないことをよく理解できる。したがって、コピー数及び配置を、最初に定義されたように変化させることができる。
【００７８】
好ましくは、第１及び第２のドメインを、いかなるリンカーも用いずに互いに直接連結することができる。あるいは、それらを、１〜１０個、好ましくは、１〜５個のアミノ酸を含むリンカー配列を介して互いに連結することができる。リンカー配列を形成するアミノ酸は、好ましくは、アミノ酸残基としてのグリシン又はプロリンから選択される。より好ましくは、第１及び第２のドメインを、第１のドメインと第２のドメインとの間の２、３個以上のプロリン残基のヒンジによって互いに分離することができる。
【００７９】
少なくとも１つの第１のドメインと少なくとも１つの第２のドメインとを含む、上記で定義され、本明細書で使用されるキメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、又は両方の組合せから構成されていてもよい。その中で、それぞれのドメイン（並びに使用されるリンカー）は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、又は両方の組合せ（例えば、Ｄ−ＴＡＴとＬ−ＩＢ１（ｓ）又はＬ−ＴＡＴとＤ−ＩＢ１（ｓ）など）から構成されていてもよい。好ましくは、本明細書で使用されるキメラペプチドは、少なくとも１個又は更には２個、好ましくは少なくとも３、４又は５個、より好ましくは少なくとも６、７、８又は９個、更により好ましくは少なくとも１０個以上のＤ−及び／又はＬ−アミノ酸を含んでもよく、ここで、Ｄ−及び／又はＬ−アミノ酸を、ブロックごとに、非ブロックごとに、又は交互の様式で、本明細書で使用されるキメラペプチド中に配置してもよい。
【００８０】
特定の実施形態によれば、本明細書で使用されるキメラペプチドは、一般Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドＮＨ２−Ｘｎｂ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｘｎｂ−Ｘｎａ−ＲＰＴＴＬＸＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤ−Ｘｎｂ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ（一般）（ｓ））（配列番号１０）（式中、Ｘ、Ｘｎａ及びＸｎｂは好ましくは上記で定義された通りである）に記載のＬ−アミノ酸キメラペプチドを含む又はからなる。より好ましくは、本明細書で使用されるキメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸キメラペプチドＮＨ２−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ））（配列番号９）を含む又はからなる。あるいは、又は更に、本明細書で使用されるキメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸キメラペプチド配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ  ＰＰＤＴＹＲＰＫＲＰ  ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ  ＲＳＱＤＴ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１）（配列番号２３）、若しくはＸＸＸＸＸＸＸＲＫＫ  ＲＲＱＲＲＲＸＸＸＸ  ＸＸＸＸＲＰＴＴＬＸ  ＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤ  Ｓ／ＴＸ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ一般）（配列番号２４）（式中、Ｘは好ましくは上記で定義された通りである）を含む若しくはからなる、又は本明細書で使用されるキメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸キメラペプチド配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ１））（配列番号２７）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＸｎｃＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ２））（配列番号２８）、若しくはＲＫＫＲＲＱＲＲＲＸｎｃＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ３））（配列番号２９）を含む若しくはからなる。これに関連して、それぞれのＸは、典型的には、上記で定義されたアミノ酸残基を表し、より好ましくは、Ｘｎｃは、それぞれのＸがグリシン又はプロリンから互いに独立に選択されるペプチド残基の連続するストレッチ、例えば、単調なグリシンストレッチ又は単調なプロリンストレッチを表し、ここで、ｎ（Ｘｎｃの反復数）は、典型的には、０〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０又は更により好ましくは０〜５又は５〜１０である。Ｘｎｃは、Ｄ又はＬアミノ酸を表してもよい。
【００８１】
代替的な特定の実施形態によれば、本明細書で使用されるキメラペプチドは、上記で開示されたＬ−アミノ酸キメラペプチドのＤ−アミノ酸キメラペプチドを含む又はからなる。本発明による例示的なＤレトロ−インベルソキメラペプチドは、例えば、一般Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドＮＨ２−Ｘｎｂ−ＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲ−Ｘｎａ−Ｘｎｂ−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ−Ｘｎｂ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ（一般）（ｓ））（配列番号１２）である。ここで、Ｘ、Ｘｎａ及びＸｎｂは、好ましくは上記で定義された通りである（好ましくは、Ｄアミノ酸を表す）。より好ましくは、本明細書で使用されるキメラペプチドは、ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ））（配列番号１１）に記載のＤ−アミノ酸キメラペプチドを含む又はからなる。あるいは、又は更に、本明細書で使用されるキメラペプチドは、Ｄ−アミノ酸キメラペプチド配列ＴＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＹＴＤＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１）（配列番号２５）若しくはＸＴ／ＳＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲＸＸＸＸＸＸＸＸＲＲＲＱＲＲＫＫＲＸＸＸＸＸＸＸ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ一般）（配列番号２６）（式中、Ｘは好ましくは、上記で定義された通りである）を含む若しくはからなる、又は本明細書で使用されるキメラペプチドは、Ｄ−アミノ酸キメラペプチド配列ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ１））（配列番号３０）、ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＸｎｃＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ２））（配列番号３１）、若しくはＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＸｎｃＲＲＲＱＲＲＫＫＲ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ３））（配列番号３２）を含む若しくはからなる。Ｘｎｃは、上記で定義された通りであってもよい。
【００８２】
上記で定義されたキメラペプチドの第１及び第２のドメインを、当技術分野で公知の任意の好適な様式で実行される化学的又は生物化学的カップリングによって、例えば、第１のドメインと第２のドメインとの間のペプチド結合を確立することによって、例えば、融合タンパク質として第１のドメインと第２のドメインを発現させることによって、又は例えば、上記で定義されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを架橋することによって、互いに連結することができる。
【００８３】
上記で定義されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとの化学的架橋にとって好適な多くの公知の方法は非特異的である、すなわち、それらはカップリング点を、輸送ポリペプチド又はカーゴ大分子上の任意の特定の部位に指向させない。結果として、非特異的架橋剤の使用は、機能部位を攻撃するか、又は活性部位を立体的に遮断し、コンジュゲートされたタンパク質を生物学的に不活性にすることができる。したがって、好ましくは、第１のドメインと第２のドメインとのより特異的なカップリングを可能にする、そのような架橋方法が使用される。
【００８４】
これに関連して、カップリング特異性を増大させる１つの方法は、架橋しようとする第１のドメインと第２のドメインの一方又は両方に１回のみ、又は数回存在する官能基への直接的な化学的カップリングである。例えば、チオール基を含有する唯一のタンパク質アミノ酸であるシステインは、多くのタンパク質ではほんの数回出現する。また、例えば、ポリペプチドがリシン残基を含有しない場合、第１級アミンに特異的な架橋試薬は、そのポリペプチドのアミノ末端に対して選択的である。カップリング特異性を増大させるためのこの手法の使用の成功には、ポリペプチドが分子の生物活性を失うことなく変化させることができる分子の領域中に好適には稀で反応性の残基を有することが必要である。システイン残基がポリペプチド配列の一部に存在する場合、それらを置き換えてもよく、そうでなければ橋反応へのそれらの関与が生物活性を阻害する可能性がある。システイン残基が置き換えられる場合、典型的には、ポリペプチドの折りたたみの結果生じる変化を最小化することが望ましい。ポリペプチドの折りたたみの変化は、置き換えがシステインと化学的に、また立体的に類似する場合に最小化される。これらの理由から、セリンが、システインへの置き換えとして好ましい。以下の実施例に示されるように、システイン残基を、架橋目的でポリペプチドのアミノ酸配列中に導入することができる。システイン残基が導入される場合、アミノ末端又はカルボキシ末端での、又はその近くでの導入が好ましい。従来の方法は、そのようなアミノ酸配列改変のために利用可能であり、ここで、目的のポリペプチドは、化学的合成により、又は組換えＤＮＡの発現を介して産生される。
【００８５】
上記で定義され、本明細書で使用されるキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとのカップリングを、カップリング剤又はコンジュゲート剤により達成することもできる。使用することができるいくつかの分子間架橋試薬が存在する（例えば、Ｍｅａｎｓ及びＦｅｅｎｅｙ、ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ、１９７４、３９〜４３頁を参照されたい）。これらの試薬の中には、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）又はＮ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド（両方ともスルフヒドリル基に対して高度に特異的であり、不可逆的結合を形成する）；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセタミド）又は６〜１１個の炭素のメチレン架橋を有する他のそのような試薬（スルフヒドリル基に対して比較的特異的である）；並びに１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（アミノ及びチロシン基との不可逆的結合を形成する）がある。この目的にとって有用な他の架橋試薬としては；ｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン（アミノ及びフェノール基との不可逆的架橋を形成する）；ジメチルアジピミデート（アミノ基に特異的である）；フェノール−１，４ジスルホニルクロリド（主にアミノ基と反応する）；ヘキサメチレンジイソシアネート若しくはジイソチオシアネート、又はアゾフェニル−ｐ−ジイソシアネート（主にアミノ基と反応する）；グルタルアルデヒド（いくつかの異なる側鎖と反応する）及びジスジアゾベンジジン（主にチロシン及びヒスチジンと反応する）が挙げられる。
【００８６】
上記で定義されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを架橋するために使用される架橋試薬は、ホモ二官能性であってもよい、すなわち、同じ反応を受ける２つの官能基を有する。好ましいホモ二官能性架橋試薬は、ビスマレイミドヘキサン（「ＢＭＨ」）である。ＢＭＨは、温和な条件（ｐＨ６．５〜７．７）下でスルフヒドリル含有化合物と特異的に反応する２つのマレイミド官能基を含有する。２つのマレイミド基は、炭化水素鎖によって接続される。したがって、ＢＭＨは、システイン残基を含有するポリペプチドの不可逆的架橋にとって有用である。
【００８７】
上記で定義されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを架橋するために使用される架橋試薬はまた、ヘテロ二官能性であってもよい。ヘテロ二官能性架橋剤は、それぞれ、遊離アミン及びチオールを有する２つのタンパク質を架橋する、２つの異なる官能基、例えば、アミン反応基及びチオール反応基を有する。ヘテロ二官能性架橋剤の例は、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（「ＭＢＳ」）、及びスクシンイミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（「ＳＭＰＢ」）、ＭＢＳの拡張鎖類似体である。これらの架橋剤のスクシンイミジル基は第１級アミンと反応し、チオール反応性マレイミドはシステイン残基のチオールと共有結合を形成する。
【００８８】
上記で定義されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを架橋するのに好適な架橋試薬は、水中で低い溶解度を有することが多い。したがって、スルホネート基などの親水性部分を架橋試薬に付加して、その水溶性を改善することができる。これに関して、スルホ−ＭＢＳ及びスルホ−ＳＭＣＣは、本発明に従って使用することができる、水溶性について改変された架橋試薬の例である。
【００８９】
同様に、多くの架橋試薬は、細胞条件下で本質的に非切断性であるコンジュゲートをもたらす。しかしながら、上記で定義されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを架橋するのに特に好適ないくつかの架橋試薬は、細胞条件下で切断性である、ジスルフィドなどの共有結合を含有する。例えば、トラウト試薬、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオン酸）（「ＤＳＰ」）、及びＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（「ＳＰＤＰ」）は、周知の切断性架橋剤である。切断性架橋試薬の使用により、カーゴ部分は標的細胞中への送達後に輸送ポリペプチドから分離することが可能となる。直接ジスルフィド結合も有用であり得る。
【００９０】
上記で考察されたものを含むいくつかの架橋試薬が商業的に入手可能である。その使用のための詳細な説明書は、業者から容易に入手可能である。タンパク質架橋及びコンジュゲート調製に関する一般的な参考文献は、Ｗｏｎｇ，  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＲＯＳＳＬＩＮＫＩＮＧ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９１）である。
【００９１】
上記で定義されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとの化学的架橋は、スペーサーアームを含んでもよい。スペーサーアームは、分子内可撓性を提供するか、又はコンジュゲートされた部分の間の分子間距離を調整し、それによって、生物活性を保持するのに役立ち得る。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸、例えば、プロリンを含むポリペプチド部分の形態にあってもよい。あるいは、スペーサーアームは、「長鎖ＳＰＤＰ」（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．ＣＯ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．、カタログ番号２１６５１Ｈ）などにおける架橋試薬の一部であってもよい。
【００９２】
好ましくは、本明細書に開示される任意のペプチド、特に、本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤、輸送配列及びキメラペプチド、好ましくは、配列番号１１のＪＮＫ阻害剤は、その末端の一方又は両方に、すなわち、Ｃ若しくはＮ末端又は両方に改変を有してもよい。Ｃ末端は、好ましくは、アミド改変により改変することができるが、Ｎ末端は例えば、アシル化などの任意の好適なＮＨ２保護基により改変することができる。より好ましくは、本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤及びキメラペプチド、好ましくは、配列番号１１のＪＮＫ阻害剤は、Ｃ末端でのアミド改変によって改変される。
【００９３】
好ましくは、本明細書中に記載されるキメラペプチドにおいて、キメラペプチドは、（ａ）配列番号１１と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列、又は（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含み、
（ｉ）キメラペプチドのＣ末端が、アミド修飾により修飾されている、及び／又は
（ｉｉ）キメラペプチドのＮ末端が、ＮＨ２保護基によって、例えばアシル化によって修飾されている。
【００９４】
また、本明細書に開示される任意のペプチド、特に、本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤、輸送配列（例えば、キメラペプチドの）及びキメラペプチド、好ましくは、配列番号１１のＪＮＫ阻害剤を、１、２又は３個のアミノ酸によって、そのＮ及び／又はＣ末端で欠失させることも好ましい。例えば、本発明によるキメラペプチドにおいて、それぞれのドメイン、すなわち、ＪＮＫ阻害剤及び輸送配列ドメインを、１、２若しくは３個のアミノ酸によってそのＮ及び／又はＣ末端で欠失させる、及び／又は本発明によるキメラペプチドを、１、２若しくは３個のアミノ酸によってそのＮ及び／又はＣ末端で欠失させることができる。より好ましくは、本発明のキメラペプチドは、ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチド［ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ−ＣＯＯＨ、配列番号１１］に記載のＤ−アミノ酸キメラペプチドを含む又はからなり、第１のドメインと第２のドメインの連結部分（ＰＰの代わり）は、上記で定義された−Ｘｎａ−Ｘｎｂ−から構成されていてもよい。特に、最終的には（ＰＰ）の代わりに−Ｘｎａ−Ｘｎｂ−を含む配列番号１１の第２のドメインを、１、２又は３個のアミノ酸によってそのＮ及び／又はＣ末端で欠失させることができる。別の好ましい実施形態においては、配列番号１１の第１のドメインを、１、２又は３個のアミノ酸によってそのＮ及び／又はＣ末端で欠失させることができる。この／これらの欠失を、第２のドメインの末端のアミノ酸残基について開示される欠失と組み合わせることができる。繰り返しになるが、ペプチドが短くなるほど、その（非特異的）細胞毒性が低くなる。しかしながら、そのペプチドは、その生物学的機能、すなわち、その細胞膜透過性（第１のドメイン）及びそのＪＮＫ阻害機能（第２のドメイン）を保持しなければならない。
【００９５】
更に、上記で開示されたキメラペプチドの１つのバリアント、断片又は誘導体を、本明細書で使用することができる。断片及びバリアントに関して、それは一般的には、ＪＮＫ阻害剤配列について上記に与えられた定義を言う。
【００９６】
特に、本発明ににおいて、「キメラペプチドのバリアント」は、好ましくは、配列番号９〜１２及び２３〜３２の配列のいずれかに由来する配列であり、ここで、キメラバリアントは、本明細書で使用されるような配列番号９〜１２及び２３〜３２のキメラペプチドのアミノ酸変化を含む。そのような変化は、典型的には、配列番号９〜１２及び２３〜３２のアミノ酸の１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個の置換、付加及び／又は欠失（断片をもたらす）を含み、本明細書で使用される変化したキメラペプチドは、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、又は９５％、９８％又は更には９９％の、配列番号９〜１２及び２３〜３２の配列のいずれかとの配列同一性を示す。
【００９７】
好ましくは、キメラペプチドは、配列番号９又は１１と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる又は含む。より好ましくは、キメラペプチドは、配列番号９又は１１のアミノ酸配列からなる又は含む。キメラペプチドは、
（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）配列番号１１と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる又は含むことが特に好ましい。
【００９８】
好ましくは、前記バリアントは、本明細書で使用されるキメラペプチド中に含まれるような第１及び第２のドメインの生物活性、すなわち、上記で開示された第１のドメインの輸送活性と、ＪＮＫに結合する、及び／又は少なくとも１つのＪＮＫ活性化転写因子の活性化を阻害する第２のドメインの活性とを保持する。
【００９９】
したがって、本明細書で使用されるキメラペプチドはまた、上記に開示されたキメラペプチド、特に、配列番号９〜１２及び２３〜３２のいずれかのキメラペプチド配列の断片も含む。したがって、本発明においては、「キメラペプチドの断片」は、好ましくは、配列番号９〜１２及び２３〜３２の配列のいずれかに由来する配列であり、断片は配列番号９〜１２及び２３〜３２のいずれかの少なくとも４つの連続するアミノ酸を含む。この断片は、好ましくは、これらの配列のいずれかに由来するエピトープの特異的認識を可能にし、前記配列を細胞、核又は更に好ましい位置に輸送するのに十分である長さを含む。更により好ましくは、断片は、配列番号９〜１２及び２３〜３２のいずれかの４〜１８、４〜１５、又は最も好ましくは４〜１０個の連続するアミノ酸を含む。本明細書で使用されるキメラペプチドの断片を、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、又は９５％、９８％又は更には９９％の、配列番号９〜１２及び２３〜３２のいずれかの配列のいずれかとの配列同一性を有する配列と更に定義することができる。
【０１００】
最後に、本明細書で使用されるキメラペプチドはまた、上記で開示されたキメラペプチド、特に、配列番号９〜１２及び２３〜３２のいずれかのキメラペプチド配列の誘導体も含む。
【０１０１】
更なる態様においては、本発明は、軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置に使用するための、
（ａ）本明細書中に記載されるＪＮＫ阻害剤配列又は本明細書中に記載されるキメラペプチドと、
（ｂ）ＰＫＲ阻害剤と
の組合せなどの組合せ療法を提供する。
【０１０２】
ＰＫＲ阻害剤は、二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）の阻害剤である。ＰＫＲ阻害剤の好ましい例としては、Ｃ１６（ＰＫＲｉとも称される）、２−アミノプリン（２−ＡＰ）、及びペプチドＰＫＲ阻害剤（例えば、Ｍ．Ｊ．Ｄｕら、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＰＫＲ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｍｏｓｃ．）  ２０１３  Ｎｏｖ；７８（１１）：１２５４−６２に記載のペプチドＰ１及びＰ２など）が挙げられる。Ｄｕら、２０１３は、また、ＰＫＲペプチド阻害剤をどのように同定するかの方法を提供する。ペプチドＰＫＲ阻害剤がより好ましく、特に好ましいペプチドＰＫＲ阻害剤は、ＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ  Ｇｒｏｕｐによって与えられる「ＳＣ１４８１」である。
【０１０３】
好ましくは、前記組合せは、更に、
（ｃ）アミロイド低下剤、及び／又は
（ｄ）グルココルチコイドを含む。
【０１０４】
アミロイド低下剤は、β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）阻害剤、γ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）及びモジュレータ（ＧＳＭ）を含む。現在、臨床試験中にある、そのようなアミロイド低下剤の例を、Ｖａｓｓａｒ  Ｒ．（２０１４）ＢＡＣＥ１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．；６（９）：８９頁から、又はＪｉａ  Ｑ、Ｄｅｎｇ  Ｙ、Ｑｉｎｇ  Ｈ（２０１４）Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｒ  ｂｅｙｏｎｄ  β−ａｍｙｌｏｉｄ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ．２０１４；２０１４：８３７１５７頁から回収することができ、例えば、ピオグリタゾン、ＣＴＳ−２１１６６、ＭＫ８９３１、ＬＹ２８８６７２１、ＡＺＤ３２９３、Ｅ２６０９、ＮＩＣ５−１５、ベガセスタット、ＣＨＦ５０７４、ＥＶＰ−０９６２、アトルバスタチン、シンバスタチン、エタゾレート、エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣｇ）、シロ−イノシトール（ＥＬＮＤ００５／ＡＺＤ１０３）、トラミプロセート（３ＡＰＳ）、ＰＢＴ２、アフィトープＡＤ０２、及びアフィトープＡＤ０３がある。更に好ましいアミロイド低下剤は、Ｍ．Ｓ．Ｗｏｌｆｅ，  Ａｍｙｌｏｉｄ  ｌｏｗｅｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ，  ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２００８；  ９（Ｓｕｐｐｌ  ２）：  Ｓ４によって記載されているものである。
【０１０５】
グルココルチコイドの好ましい例としては、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、フルドロコルチゾン、及びデオキシコルチコステロンが挙げられる。デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、及びメチルプレドニゾロンが特に好ましい。
【０１０６】
本発明は、また、軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置に使用するための更なる組合せ療法、即ち、
（ａ）本明細書中に記載されるＪＮＫ阻害剤配列又は本明細書中に記載されるキメラペプチドと、
（ｂ）アミロイド低下剤との組合せを提供する。
【０１０７】
好ましくは、前記組合せは、更に、
（ｃ）ＰＫＲ阻害剤、及び／又は
（ｄ）グルココルチコイドを含む。
【０１０８】
アミロイド低下剤、ＰＫＲ阻害剤、及びグルココルチコイドは、前述のように選択することができる。
【０１０９】
一般に、本明細書中に記載される組合せ療法においては、異なる成分を別々又は同一の医薬組成物で投与することができる。組合せ療法が２超の成分を含む場合、成分のうちの２つ（又は２以上）を同一の医薬組成物中に含有させ、少なくとも１つの更なる成分を別の医薬組成物で投与することもできる。一般に、組み合わせる活性成分は、別々の医薬組成物であることが、個々の投与量をよりよく調整できる点で好ましいが、利便性の点では、組み合わせる活性成分を含む単一の医薬組成物も考えられる。
【０１１０】
組み合わせる活性成分が別々の医薬組成物にある場合、本発明に係るＪＮＫ阻害剤又はキメラペプチドは、ＰＫＲ阻害剤、アミロイド低下剤、及び／又はグルココルチコイドなどの他の活性成分の投与前、投与中（同時又は重複投与）、又は投与後に投与することができる。好ましくは、ＪＮＫ阻害剤配列又はキメラペプチドは、ＰＫＲ阻害剤、アミロイド低下剤、及び／又はグルココルチコイドの前又は後に投与される。
【０１１１】
ＰＫＲ阻害剤、アミロイド低下剤、及び／又はグルココルチコイドの投与「前」のＪＮＫ阻害剤配列又はキメラペプチドの投与は、好ましくは、ＪＮＫ阻害剤配列又はキメラペプチドの投与が、ＰＫＲ阻害剤、アミロイド低下剤、及び／又はグルココルチコイドの投与開始前の２４ｈ以内、より好ましくは１２ｈ以内、更により好ましくは３ｈ以内、特に好ましくは１ｈ以内、及び最も好ましくは３０ｍｉｎ以内に終了することを意味する。ＰＫＲ阻害剤、アミロイド低下剤、及び／又はグルココルチコイドの投与「後」のＪＮＫ阻害剤配列又はキメラペプチドの投与は、好ましくは、ＰＫＲ阻害剤、アミロイド低下剤、及び／又はグルココルチコイドの投与終了後の２４ｈ以内、より好ましくは１２ｈ以内、更により好ましくは３ｈ以内、特に好ましくは１ｈ以内、及び最も好ましくは３０ｍｉｎ以内であることを意味する。
【０１１２】
更に、ＪＮＫ阻害剤配列又はキメラペプチドは、ＰＫＲ阻害剤、アミロイド低下剤、及び／又はグルココルチコイドと同一又は異なる投与経路で投与することができる。好ましい投与経路を、特に医薬組成物の文脈において以下に記載する。医薬組成物について記載される好ましい実施形態は、組合せ療法の文脈にも当てはまる。
【０１１３】
本発明は更に、対象における上記で定義された軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害を防止及び／又は処置するための医薬組成物の調製のための、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列をコードする核酸配列、キメラペプチド又はその断片、バリアント若しくは誘導体（いずれも上で定義されている）の使用に関する。言い換えれば、本発明は、また、軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置において使用するための、本明細書中に記載されるＪＮＫ阻害剤配列又は本明細書中に記載されるキメラペプチドをコードする単離された核酸を提供する。本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列をコードする好ましい好適な核酸は、典型的には、ヒトＩＢ１核酸（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０７４０９１）、ラットＩＢ１核酸（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１０８９５９）、若しくはヒトＩＢ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２１８７７８）から、又は上記で定義された配列のいずれかをコードする任意の核酸配列、すなわち、配列番号１〜２６の任意の配列から選択される。
【０１１４】
本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列又は本明細書で使用されるキメラペプチドをコードする核酸を、当技術分野で公知の任意の方法によって取得することができる（例えば、配列の３’及び５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅による、及び／又は所与の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチド配列を使用するｃＤＮＡ若しくはゲノムライブラリーからのクローニングによる）。
【０１１５】
更に、ストリンジェントな条件下で、上記で定義された（天然）ＪＮＫ阻害剤配列又はキメラペプチドをコードする適切な鎖とハイブリダイズする核酸配列も同様に本明細書に開示される。好ましくは、そのような核酸配列は、特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さを有する、少なくとも６個の（連続する）核酸を含む。より好ましくは、そのような核酸配列は、６〜３８個、更により好ましくは６〜３０個、最も好ましくは６〜２０個又は６〜１０個の（連続する）核酸を含む。
【０１１６】
「ストリンジェントな条件」は、配列依存的であり、異なる環境下では異なるものである。一般に、ストリンジェントな条件を、規定のイオン強度及びｐＨで特定の配列に関する融点（ＴＭ）より約５℃低くなるように選択することができる。ＴＭは、標的配列の５０％が、完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度（規定のイオン強度及びｐＨの下で）である。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７で少なくとも約０．０２モルであり、温度が少なくとも約６０℃であるものである。他の因子がハイブリダイゼーションのストリンジェンシー（特に、とりわけ塩基組成及び相補鎖のサイズを含む）、有機溶媒の存在及び塩基不一致の程度に影響し得るため、パラメータの組合せが、いずれか１つの絶対的な尺度よりも重要である。
【０１１７】
「高ストリンジェンシー条件」は、例えば、以下のものを含んでもよい。ステップ１：６＊ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡから構成されるバッファー中、６５℃で８時間から一晩、ＤＮＡを含有するフィルターを予備処理する。ステップ２：１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ及び５〜２０＊１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを添加した上記のプレハイブリダイゼーション混合物中、６５℃で４８時間、フィルターをハイブリダイズさせる。ステップ３：２＊ＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％Ｆｉｃｏｌｌ、及び０．０１％ＢＳＡを含有する溶液中、３７℃で１時間、フィルターを洗浄する。この後、０．１＊ＳＳＣ中、５０℃で４５分間洗浄する。ステップ４：フィルターをオートラジオグラフィーにかける。使用することができる高ストリンジェンシーの他の条件は、当技術分野で周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ＮＹ及びＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照されたい）。
【０１１８】
「中ストリンジェンシー条件」は、以下のものを含んでもよい。ステップ１：６＊ＳＳＣ、５＊Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％ＳＤＳ及び１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、５５℃で６時間、ＤＮＡを含有するフィルターを予備処理する。ステップ２：５〜２０＊１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを添加した同じ溶液中、５５℃で１８〜２０時間、フィルターをハイブリダイズさせる。ステップ３：２＊ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する溶液中、３７℃で１時間、フィルターを洗浄した後、１＊ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含有する溶液中、６０℃で３０分間、２回洗浄する。ステップ４：フィルターをドライブロットし、オートラジオグラフィーに曝露する。使用することができる中ストリンジェンシーの他の条件は、当技術分野で周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ＮＹ及びＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照されたい）。
【０１１９】
最後に、「低ストリンジェンシー条件」は、以下を含んでもよい。ステップ１：３５％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＰＶＰ、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、１％ＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４０℃で６時間、ＤＮＡを含有するフィルターを予備処理する。ステップ２：０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）硫酸デキストラン、及び５〜２０ｘ１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを添加した同じ溶液中、４０℃で１８〜２０時間、フィルターをハイブリダイズさせる。ステップ３：２ＸＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び０．１％ＳＤＳを含有する溶液中、５５℃で１．５時間、フィルターを洗浄する。洗浄溶液を新鮮な溶液と交換し、６０℃で更に１．５時間インキュベートする。ステップ４：フィルターをドライブロットし、オートラジオグラフィーに曝露する。必要に応じて、フィルターを６５〜６８℃で３回目の洗浄を行い、フィルムに再曝露する。使用することができる低ストリンジェンシーの他の条件は、当技術分野で周知である（例えば、交差種ハイブリダイゼーションのために用いられる）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９３、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ＮＹ；及びＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照されたい。
【０１２０】
本発明による上記で定義された核酸配列を使用して、ペプチド、すなわち、分析、特徴付け又は治療的使用のために；対応するペプチド（本明細書で使用される）が優先的に発現される（構成的に、又は組織分化若しくは発達の特定の段階で、又は疾患状態において）組織のマーカーとして、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列又は本明細書で使用されるキメラペプチドを発現させることができる。これらの核酸のための他の使用としては、例えば、核酸のゲル電気泳動に基づく分析における分子量マーカーが挙げられる。
【０１２１】
本発明の更なる実施形態によれば、発現ベクターを、上記で定義された１つ若しくはそれ以上のＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドの組換え発現のために上記目的で使用することができる。言い換えれば、本発明は、また、軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置において（そのための医薬の調製において）用いるための前記核酸を含むベクターも提供する。用語「発現ベクター」は、二本鎖又は一本鎖である、環状又は線状ＤＮＡ又はＲＮＡを指すように本明細書で使用される。それは、宿主細胞又は単細胞若しくは多細胞宿主生物中に導入される上記で定義された少なくとも１つの核酸を更に含む。本明細書で使用される発現ベクターは、好ましくは、本明細書で使用されるＪＮＫ阻害剤配列又はその断片若しくはバリアント、又は本明細書で使用されるキメラペプチド又はその断片若しくはバリアントをコードする上記で定義された核酸を含む。更に、本発明による発現ベクターは、好ましくは、インスレーター、境界エレメント、ＬＣＲ（例えば、Ｂｌａｃｋｗｏｏｄ及びＫａｄｏｎａｇａ（１９９８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１、６１〜６３頁によって記載されている）又はマトリックス／足場結合領域（例えば、Ｌｉ，Ｈａｒｊｕ及びＰｅｔｅｒｓｏｎ（１９９９）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１５、４０３〜４０８頁によって記載されている）などの、宿主細胞中における挿入されたポリヌクレオチドの発現を駆動する、ウイルス、細菌、植物、哺乳動物、及び他の真核供給源に由来するエンハンサー／プロモーターなどの様々な調節エレメントを含む、発現を支援するための適切なエレメントを含む。いくつかの実施形態においては、調節エレメントは異種性である（すなわち、天然の遺伝子プロモーターではない）。あるいは、必要な転写及び翻訳シグナルを、遺伝子のための天然プロモーター及び／又はその隣接領域によって供給することもできる。
【０１２２】
本明細書で使用される用語「プロモーター」とは、上記で定義された１つ又は複数の核酸配列の転写を制御するように機能し、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼの結合部位及びプロモーター機能を調節するように相互作用する他のＤＮＡ配列の存在によって構造的に同定されるＤＮＡの領域を指す。プロモーターの断片を促進する機能的発現は、プロモーターとしての活性を保持する短縮型又はトランケート型プロモーター配列である。プロモーター活性は、当技術分野で公知の任意のアッセイによって測定することができる（例えば、Ｗｏｏｄ、ｄｅ  Ｗｅｔ、Ｄｅｗｊｉ、及びＤｅＬｕｃａ（１９８４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２４、５９２〜５９６頁；Ｓｅｌｉｇｅｒ及びＭｃＥｌｒｏｙ（１９６０）、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８８、１３６〜１４１頁を参照されたい）、又はＰｒｏｍｅｇａ（登録商標）から商業的に入手可能である。
【０１２３】
本明細書で定義される発現ベクターに対して使用される「エンハンサー領域」は、典型的には、１つ又は複数の遺伝子の転写を増加させるように機能するＤＮＡの領域を指す。より具体的には、本明細書で使用される用語「エンハンサー」は、発現させる遺伝子に関してその位置及び向きと関係なく遺伝子の発現を増強する、増大させる、改善する、又は改良するＤＮＡ調節エレメントであり、１を超えるプロモーターの発現を増強する、増大させる、改善する、又は改良してもよい。
【０１２４】
本明細書で定義される発現ベクター中で使用されるプロモーター／エンハンサー配列は、植物、動物、昆虫、又は真菌調節配列を使用してもよい。例えば、酵母及び他の真菌に由来するプロモーター／エンハンサーエレメント（例えば、ＧＡＬ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター）を使用することができる。あるいは、又は更に、それらは、動物の転写制御領域、例えば、（ｉ）膵臓ベータ細胞内で活性なインスリン遺伝子制御領域（例えば、Ｈａｎａｈａｎら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５〜１２２頁を参照されたい）；（ｉｉ）リンパ系細胞内で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（例えば、Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３８：６４７〜６５８頁を参照されたい）；（ｉｉｉ）肝臓内で活性なアルブミン遺伝子制御領域（例えば、Ｐｉｎｃｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ  １：２６８〜２７６頁を参照されたい）；（ｉｖ）脳のオリゴデンドロサイト細胞内で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（例えば、Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７、Ｃｅｌｌ  ４８：７０３〜７１２頁を参照されたい）；及び（ｖ）海馬内で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（例えば、Ｍａｓｏｎら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２〜１３７８頁を参照されたい）などを含んでもよい。
【０１２５】
更に、本明細書で定義される発現ベクターは、増幅マーカーを含んでもよい。この増幅マーカーを、例えば、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）及びＮ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸耐性（ＣＡＤ）からなる群から選択することができる。
【０１２６】
本発明にとって好適な例示的な発現ベクター又はその誘導体としては、特に、例えば、ヒト又は動物のウイルス（例えば、ワクシニアウイルス又はアデノウイルス）；昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルス）；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダファージ）；プラスミドベクター及びコスミドベクターが挙げられる。
【０１２７】
本発明は、更に、上記で定義された核酸のペプチドコード配列を発現することができる、様々な宿主−ベクター系を使用することができる。これらのものとしては、限定されるものではないが、（ｉ）ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどに感染した哺乳動物細胞系；（ｉｉ）バキュロウイルスなどに感染した昆虫細胞系；（ｉｉｉ）酵母ベクターを含有する酵母又は（ｉｖ）バクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、若しくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌が挙げられる。使用される宿主−ベクター系に応じて、いくつかの好適な転写及び翻訳エレメントのいずれか１つを使用することができる。
【０１２８】
好ましくは、目的の挿入配列の発現をモジュレートする、又は所望の特定の様式で前記配列によってコードされる発現されるペプチドを改変する、若しくはプロセシングする、そのような宿主−ベクター系にとって好適な宿主細胞株を選択することができる。更に、ある特定のプロモーターからの発現を、選択された宿主株中、ある特定の誘導因子の存在下で増強させ、したがって、遺伝子操作されたペプチドの発現の制御を容易にすることができる。更に、様々な宿主細胞が、発現されるペプチドの翻訳及び翻訳後プロセシング及び改変（例えば、グリコシル化、リン酸化など）のための特徴的で特異的な機構を有する。したがって、適切な細胞株又は宿主系を選択して、所望の改変を確保することができ、外来ペプチドのプロセシングが達成される。例えば、細菌系内でのペプチド発現を使用して、非グリコシル化されたコアペプチドを産生させることができるが、哺乳動物細胞内での発現は、異種ペプチドの「天然」グリコシル化を確保する。
【０１２９】
したがって、本発明は、また、軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置において（そのための医薬の調製において）用いるための前記ベクターを含む細胞も提供する。
【０１３０】
本発明は、本明細書で定義される軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置のための、上記のＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドに対する抗体の使用を更に提供する。言い換えれば、本発明は、また、軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置において使用するための請求項１から９のいずれかに定義されるＪＮＫ阻害剤配列又は請求項１０から２０のいずれかに定義されるキメラペプチドに免疫特異的に結合する抗体を提供する。更に、本発明によるＪＮＫ阻害剤配列、又はそのような阻害剤配列を含有するキメラペプチドに特異的な抗体の産生のための効率的な手段が記載され、この目的のために使用することができる。
【０１３１】
本発明によれば、本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチド、並びに、その断片、バリアント又は誘導体を、これらのペプチド成分に免疫特異的に結合する抗体を生成するための免疫原として使用することができる。そのような抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片及びＦａｂ発現ライブラリーが挙げられる。特定の実施形態においては、本発明は、上記で定義されたキメラペプチド又はＪＮＫ阻害剤配列に対する抗体を提供する。当技術分野で公知の様々な手順を、これらの抗体の産生のために使用することができる。
【０１３２】
例えば、様々な宿主動物を、上記で定義された任意のキメラペプチド又はＪＮＫ阻害剤配列を用いる注射によってポリクローナル抗体の産生のために免疫することができる。それにより、様々なアジュバントを使用して、免疫応答を増加させることができ、それには、限定されるものではないが、Ｆｒｅｕｎｄの（完全及び不完全）アジュバント、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノールなど）、ＣｐＧ、ポリマー、プルロニック、並びにカルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）などのヒトアジュバントが挙げられる。
【０１３３】
上記で定義されたキメラペプチド又はＪＮＫ阻害剤配列に対するモノクローナル抗体の調製のために、連続細胞株培養によって抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用することができる。そのような技術としては、限定されるものではないが、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７頁を参照されたい）；トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２頁を参照されたい）及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７〜９６頁を参照されたい）が挙げられる。ヒトモノクローナル抗体を、本発明の実施において使用し、ヒトハイブリドーマの使用（Ｃｏｔｅら、１９８３、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：２０２６〜２０３０頁を参照されたい）により、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＢ細胞をエプスタイン・バーウイルスで形質転換すること（Ｃｏｌｅら、１９８５、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７〜９６頁を参照されたい）により産生することができる。
【０１３４】
本発明によれば、技術を、本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドに特異的な一本鎖抗体（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい）の産生のために適合させることができる。更に、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のために方法を適合させて（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５〜１２８１頁を参照されたい）、これらのＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ効率的な同定を可能にすることができる。当技術分野で周知の技術（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい）により、非ヒト抗体を「ヒト化」することができる。例えば、（ｉ）抗体分子のペプシン消化により産生されるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成されるＦａｂ断片；（ｉｉｉ）抗体分子のパパイン及び還元剤による処理により生成されるＦａｂ断片並びに（ｉｖ）Ｆｖ断片などの、本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドに対するイディオタイプを含有する抗体断片を、当技術分野で公知の技術により産生することができる。
【０１３５】
本発明の一実施形態においては、抗体のスクリーニングのために使用することができ、所望の特異性を有する方法としては、限定されるものではないが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び当技術分野で公知の他の免疫学的に媒介される技術が挙げられる。特定の実施形態においては、本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドの特定のエピトープ（例えば、典型的には、５〜２０個、好ましくは８〜１８個、最も好ましくは８〜１１個のアミノ酸の長さを含むその断片）に特異的である抗体の選択は、そのようなエピトープを有する、本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドの断片に結合するハイブリドーマの生成によって容易になる。上記で定義されたエピトープに特異的であるこれらの抗体も、本明細書で提供される。
【０１３６】
本明細書で定義される抗体を、例えば、適切な生理学的試料内のペプチドのレベルを測定する際に使用するため、診断方法において使用するため、又はペプチドを画像化する際に使用するためなどに、ＪＮＫ阻害剤配列（及び／又は対応する上記で定義されたキメラペプチド）の局在化及び／又は定量化に関する当技術分野で公知の方法において使用することができる。
【０１３７】
本発明にしたがって定義されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、核酸、ベクター、ホスト細胞、及び／又は抗体は、医薬組成物中に処方することができ、これを、本明細書中に定義される軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置に適用することができる。したがって、本発明は、また、軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置において使用するための、
（ｉ）本明細書中に記載されるＪＮＫ阻害剤配列、本明細書中に記載されるキメラペプチド、本明細書中に記載される核酸、本明細書中に記載されるベクター、本明細書中に記載される（ホスト）細胞、及び／又は本明細書中に記載される抗体と、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。
【０１３８】
典型的には、本発明に従って使用されるそのような医薬組成物は、活性成分として、例えば、（ｉ）上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチド、及び／又はそのバリアント、断片若しくは誘導体、特に、配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列及び／又は配列番号９〜１２及び２３〜３２の配列のいずれかのキメラペプチド、好ましくは配列番号１１の配列のキメラペプチド、及び／又は配列番号５〜８及び２１〜２２のいずれかの輸送配列を含む、配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列、又は上記定義内にあるそのバリアント若しくは断片のいずれか１つ若しくは複数；及び／又は（ｉｉ）上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチド及び／又はそのバリアント若しくは断片をコードする核酸、及び／又は（ｉｉｉ）上記で定義された、ＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチド、及び／又はそのバリアント、断片若しくは誘導体のいずれか１つ若しくは複数を含む細胞、及び／又は（ｉｖ）上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチド及び／又はそのバリアント若しくは断片をコードするベクター及び／又は核酸をトランスフェクトされた細胞を含む。
【０１３９】
好ましい実施形態によれば、本発明に従って使用されるそのような医薬組成物は、典型的には、安全かつ有効な量の上記で定義された成分、好ましくは、配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかの少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列及び／又は配列番号９〜１２及び２３〜３２の配列のいずれかの少なくとも１つのキメラペプチド、好ましくは配列番号１１の配列のキメラペプチド、及び／又は配列番号５〜８及び２１〜２２のいずれかの輸送配列を含む、配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかの少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列、又は上記定義内にあるそのバリアント若しくは断片、又はそれをコードする少なくとも１つの核酸、又は上記で定義された少なくとも１つのベクター、宿主細胞若しくは抗体を含む。本発明に従って使用される医薬組成物は、活性成分として、配列番号１１の配列又は上記で定義されたその機能的配列バリアントを含む又はからなるキメラペプチドを含むことが特に好ましい。
【０１４０】
更に、本発明に従って使用される医薬組成物は、更に、すなわち、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドのいずれか１つ若しくは複数、及び／又はそのバリアント、断片若しくは誘導体に加えて、場合により、軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害においても有用である更なる「活性成分」をも含んでもよい。これに関連しては、本発明による医薬組成物は、軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の療法において、更なる「活性成分」を含む更なる医薬組成物と組み合わせることもできる。例えば、本発明によるＪＮＫ阻害剤及び／又はキメラペプチドを含む医薬組成物は、独立型療法として、又はＰＫＲ阻害剤と組み合わせて、場合により、本発明によるＪＮＫ阻害剤及びＰＫＲ阻害剤に加えて、アミロイド低下剤と組み合わせて、軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因するＭＣＩの防止及び／又は処置において使用することができる。
【０１４１】
したがって、医薬組成物は、ＰＫＲ阻害剤を更に含むことが好ましい。更に、医薬組成物は、アミロイド低下剤及び／又はグルココルチコイドを更に含むことができる。組合せ療法の文脈で上に記載した好ましいＰＫＲ阻害剤、アミロイド低下剤、及びグルココルチコイドは、本明細書中に記載される医薬組成物においても好ましい。
【０１４２】
前記組合せ療法の場合、組み合わせる活性成分は、別々の医薬組成物であることが、個々の投与量をよりよく調整できる点で好ましいが、利便性の点では、組み合わせる活性成分を含む単一の医薬組成物も考えられる。
【０１４３】
本発明の発明者らは更に、それぞれ、本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列及びキメラペプチドが、軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害に関与する細胞において特に良好な取込み率を示すことを見出した。したがって、対象に投与される医薬組成物中の、それぞれ、ＪＮＫ阻害剤配列及びキメラペプチドの量は、限定されるものではないが、非常に低用量を有してもよい。したがって、用量は、ＤＴＳ−１０８（Ｆｌｏｒｅｎｃｅ  Ｍｅｙｅｒ−Ｌｏｓｉｃら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００８、２１４５〜５３頁）などの、当技術分野で公知のペプチド薬物よりもはるかに低いものであってもよい。これは、いくつかの肯定的な側面、例えば、潜在的な副反応の減少及び費用の減少を有する。
【０１４４】
好ましくは、本明細書中に記載されるＪＮＫ阻害剤配列、本明細書中に記載されるキメラペプチド、本明細書中に記載される組合せ療法、本明細書中に記載される医薬組成物において、本明細書中に記載されるＪＮＫ阻害剤配列又は本明細書中に記載されるキメラペプチドの用量（体重１ｋｇあたり）は、１０ｍｍｏｌ／ｋｇまで、好ましくは、１ｍｍｏｌ／ｋｇまで、より好ましくは、１００μｍｏｌ／ｋｇまで、更により好ましくは、１０μｍｏｌ／ｋｇまで、更により好ましくは、１μｍｏｌ／ｋｇまで、更により好ましくは、１００ｎｍｏｌ／ｋｇまで、最も好ましくは、５０ｎｍｏｌ／ｋｇまでの範囲にある。
【０１４５】
また、本明細書中に記載されるＪＮＫ阻害剤配列、本明細書中に記載されるキメラペプチド、本明細書中に記載される組合せ療法、本明細書中に記載される医薬組成物において、本明細書中に記載されるＪＮＫ阻害剤配列又は本明細書中に記載されるキメラペプチドの用量（体重１ｋｇあたり）は、１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは、５０ｍｇ／ｋｇまで、より好ましくは、１０ｍｇ／ｋｇまで、最も好ましくは、１ｍｇ／ｋｇまでの範囲にある。
【０１４６】
したがって、本明細書中に記載されるＪＮＫ阻害剤配列又は本明細書中に記載されるキメラペプチドの用量範囲は、好ましくは、約０．０１ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約０．１ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約１．０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約０．０１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１μｍｏｌ／ｋｇ、約５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約３００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約５００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約３０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、約７５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、又は前記値のいずれか２つの組合せであってもよい。
【０１４７】
好ましくは、本明細書中に記載されるＪＮＫ阻害剤配列、本明細書中に記載されるキメラペプチド、本明細書中に記載される組合せ療法、本明細書中に記載される医薬組成物において、本明細書中に記載されるＪＮＫ阻害剤配列又は本明細書中に記載されるキメラペプチドの用量（体重１ｋｇあたり）は、１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１０μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、１００μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは、５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの範囲にある。
【０１４８】
これに関連して、上記の医薬組成物を使用する場合の処置の処方、例えば、用量の決定などは、典型的には、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内にあり、典型的には、処置される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法及び医師には公知の他の因子を考慮に入れる。上記の技術及びプロトコールの例を、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．（編）、１９８０に見出すことができる。したがって、本発明に従って使用される医薬組成物の成分のための上記で定義された「安全かつ有効な量」とは、本明細書で定義される軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の正の改変を有意に誘導するのに十分なものである、これらの成分のそれぞれ又は全部の量を意味する。しかしながら、同時に、「安全かつ有効な量」は、重篤な副作用を回避する、すなわち、利益とリスクとの道理にかなった関係を可能にするのに十分に小さいものであると言える。これらの限界の決定は、典型的には、道理にかなった医学的判断の範囲内にある。そのような成分の「安全かつ有効な量」は、付随する医師の知識及び経験の範囲内で、処置される特定の状態及びまた、処置される患者の年齢及び身体状態、状態の重症度、処置の持続期間、付随する療法の性質、使用される特定の薬学的に許容される担体、及び同様の因子と関連して変化する。本発明による医薬組成物は、ヒトのため、及びまた、獣医学的目的で本発明に従って使用することができる。
【０１４９】
本発明に従って使用される医薬組成物は更に、これらの物質の１つに加えて、（適合性の）薬学的に許容される担体、賦形剤、バッファー、安定剤又は当業者には周知の他の材料を含んでもよい。
【０１５０】
これに関連して、「（適合性の）薬学的に許容される担体」という表現は、好ましくは、液体又は非液体ベースの組成物を含む。用語「適合性」とは、本明細書で使用される医薬組成物の構成要素を、通常の使用条件下で組成物の薬学的有効性を実質的に低下させる相互作用が起こらないような様式で、上記で定義された薬学的に活性な成分及び１つの別の成分と混合することができることを意味する。薬学的に許容される担体は、勿論、それらを処置される人への投与にとって好適なものにするのに十分に高い純度及び十分に低い毒性を有する必要がある。
【０１５１】
本明細書で使用される医薬組成物が液体形態で提供される場合、薬学的に許容される担体は、典型的には、１つ又は複数の（適合性の）薬学的に許容される液体担体を含む。組成物は、（適合性の）薬学的に許容される液体担体として、例えば、発熱源を含まない水；等張食塩水、すなわち、０．９％ＮａＣｌの溶液、又は緩衝化（水性）溶液、例えば、リン酸、クエン酸などで緩衝化された溶液、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及びカカオ油などの植物油；例えば、ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；アルギン酸などを含んでもよい。特に、本明細書で使用される医薬組成物の注射及び／又は輸注のために、バッファー、好ましくは水性バッファー、及び／又は０．９％ＮａＣｌを使用することができる。
【０１５２】
本明細書で使用される医薬組成物が固体形態で提供される場合、薬学的に許容される担体は、典型的には、１つ又は複数の（適合性の）薬学的に許容される固体担体を含む。組成物は、（適合性の）薬学的に許容される固体担体、例えば、１つ若しくは複数の適合性固体若しくは液体充填剤若しくは希釈剤を含んでもよく、又は人への投与にとって好適である封入化合物を同様に使用してもよい。そのような（適合性の）薬学的に許容される固体担体のいくつかの例は、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖；例えば、コーンスターチ又はジャガイモデンプンなどのデンプン；例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体；粉末状トラガカント；モルト；ゼラチン；獣脂；例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムなどの固体流動促進剤；硫酸カルシウムなどである。
【０１５３】
（適合性の）薬学的に許容される担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に依存してもよい。したがって、（適合性の）薬学的に許容される担体の選択を、原理的には、本発明に従って使用される医薬組成物が投与される様式によって決定することができる。様々な可能な投与経路が、参照により本明細書に組み込まれるＦＤＡの「Ｒｏｕｔｅ  ｏｆ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ」（ＦＤＡ：Ｄａｔａ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｍａｎｕａｌ  −  Ｄｒｕｇ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  −  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  Ｎｕｍｂｅｒ：Ｃ−ＤＲＧ−００３０１；Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ００４を参照）の一覧に列挙されている。特に、非ヒト動物のための適切な投与経路を選択するための更なる指針を、参照により本明細書に組み込まれるＴｕｒｎｅｒ  ＰＶら（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．５０、Ｎｏ  ５、６００〜６１３頁に見出すことができる。投与経路に関する好ましい例としては、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、若しくは経皮経路などの非経口経路（例えば、注射による）、経口、若しくは直腸経路などの経腸経路、経鼻、若しくは鼻内経路などの局所経路、又は表皮経路若しくはパッチ送達などの他の経路が挙げられる。より具体的には、好ましい投与経路は、（ｉ）静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経皮などの非経口経路、（ｉｉ）経口、直腸などの経腸経路、（ｉｉｉ）経鼻、鼻腔内などの局所経路、（ｉｖ）ＣＳＦ内、髄腔内などの血液脳関門を避ける投与経路、及び（ｖ）表皮又はパッチ送達などの他の経路が挙げられる。
【０１５４】
本発明に従って使用される医薬組成物は、全身的に投与することが好ましい。一般に、全身投与のための経路としては、例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、皮下、皮内、経皮、若しくは経粘膜経路などの非経口経路（例えば、注射及び／又は輸注による）、及び経口、消化管若しくは直腸経路などの経腸経路（例えば、錠剤、カプセル、坐剤、栄養チューブによるもの、胃瘻として）が挙げられる。全身投与により、全身での作用を達成することができ、全身投与は非常に便利であることが多いが、環境によっては、それは望ましくない「副作用」を誘発することもあり、及び／又は局部投与と比較して高い濃度の本発明によるＪＮＫ阻害剤が必要となることもある。全身投与は、一般に、その全身作用のため、軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置に適用可能である。全身投与の好ましい経路は、静脈内、筋肉内、皮下、経口及び直腸投与であり、静脈内及び経口投与が特に好ましい。
【０１５５】
例えば、経口経路は通常、患者にとって最も好都合であり、かかる費用は最も低い。したがって、経口投与は、適用可能な場合、都合のよい全身投与にとって好ましい。経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末又は液体形態にあってもよい。錠剤は、ゼラチンなどの上記で定義された固体担体と、場合により、アジュバントとを含んでもよい。経口投与のための液体医薬組成物は一般に、水、石油、動物又は植物油、ミネラルオイル又は合成油などの、上記で定義された液体担体を含んでもよい。生理食塩水溶液、デキストロース又は他の糖溶液又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含有させることができる。
【０１５６】
本発明にしたがって使用される医薬組成物は、また、例えば、局所的に、例えば、ＣＳＦ内、髄腔内で投与することもできる。したがって、本明細書中に記載されるＪＮＫ阻害剤又はキメラペプチドは、中枢神経系（ＣＮＳ）に直接投与することができる。そのような投与経路としては、特に、硬膜外（ｅｐｉｄｕｒａｌ  （ｐｅｒｉｄｕｒａｌ））、ＣＳＦ内（脳脊髄液内）、脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  （ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ））、くも膜下腔及び大脳内投与、例えば、特定の脳領域への投与が挙げられ、それにより、血液脳関門の通過に関する問題を回避することができる。
【０１５７】
局所投与とは、典型的には、皮膚又は粘膜などの体表面への適用を指すが、より一般的な用語「局部投与」は、身体の特定の部分での、及び／又はその中への適用を更に含む。局部投与のための経路としては、例えば、経鼻、又は鼻内経路などの吸入経路、身体の粘膜を介する投与など、又は表皮経路、経皮経路（皮膚への適用）若しくはパッチ送達などの他の経路及び他の局部適用、例えば、処置される臓器又は組織への注射及び／又は輸注などが挙げられる。局部投与においては、副作用は典型的には大部分回避される。ある特定の投与経路、例えば、吸入は、局部効果と全身効果の両方を提供することができることは注目すべきことである。
【０１５８】
一般に、投与方法は、上記の様々な因子、例えば、選択される薬学的担体及び医薬調製物の性質（例えば、液体、錠剤などとして）並びに投与経路に依存する。例えば、本発明によるＪＮＫ阻害剤を含む医薬組成物は、液体として、例えば、０．９％ＮａＣｌ中の、本発明によるＪＮＫ阻害剤又はキメラペプチド、好ましくは、配列番号１１の配列のキメラペプチドの溶液として調製することができる。液体医薬組成物は、様々な方法により、例えば、スプレー（例えば、吸入、鼻内などの経路について）として、局所適用のための流体として、ボーラス注射などの注射により、輸注により、例えば、ポンプを使用することにより、滴下により投与することができるが、ｐ．ｏ．、例えば、ドロップ又は飲用溶液として、パッチ送達系などにおいても投与することができる。したがって、投与のために、特に、注射及び／又は輸注のために、様々なデバイス、例えば、注射筒（予め充填された注射筒など）；注射デバイス（例えば、ＩＮＪＥＣＴ−ＥＡＳＥＴ（商標）及びＧＥＮＪＥＣＴＴ（商標）デバイス）；輸注ポンプ（例えば、Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ（商標）など）；インジェクターペン（ＧＥＮＰＥＮＴ（商標）など）；無針デバイス（例えば、ＭＥＤＤＥＣＴＯＲ（商標）及びＢＩＯＪＥＣＴＯＲ（商標））；又は自己注射器を使用することができる。
【０１５９】
使用される医薬組成物の好適な量を、動物モデルを用いる所定の実験によって決定することができる。そのようなモデルとしては、限定を意味するものではないが、例えば、ウサギ、ヒツジ、マウス、ラット、スナネズミ、イヌ、ブタ及び非ヒト霊長類モデルが挙げられる。投与のため、特に、注射及び／又は輸注のための好ましい単位剤形は、水、生理食塩水又はその混合物の滅菌溶液を含む。通常、そのような溶液のｐＨを、約７．４に調整するべきである。投与のため、特に、注射及び／又は輸注のための好適な担体としては、ヒドロゲル、制御放出又は遅延放出のためのデバイス、ポリ乳酸及びコラーゲンマトリックスが挙げられる。局所適用のための好適な薬学的に許容される担体としては、ローション、クリーム、ゲルなどにおける使用にとって好適であるものが挙げられる。化合物を経口投与しようとする場合、錠剤、カプセルなどが好ましい単位剤形である。経口投与のために使用することができる単位剤形の調製のための薬学的に許容される担体は、先行技術において周知である。その選択は、本発明の目的にとって重要ではない、味、費用及び保存性などの二次的考察に依存し、当業者は困難を伴わずに行うことができる。
【０１６０】
静脈内、筋肉内、腹腔内、皮膚又は皮下注射及び／又は輸注、又は罹患部位での注射及び／又は輸注、すなわち、局部注射／輸注のために、活性成分は、発熱源を含まず、好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容される水性溶液の形態にある。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、特に、０．９％ＮａＣｌ、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液などの等張性ビヒクルを使用して、好適な溶液を調製することができる。必要に応じて、保存剤、安定剤、バッファー、酸化防止剤及び／又は他の添加剤を含有させることができる。それがポリペプチド、ペプチド、又は核酸分子、個体に与えられる本発明による他の薬学的に有用な化合物であろうと、投与は、好ましくは、「予防有効量又は治療有効量」（場合によって）にあり、これは個体に対して利益を示すのに十分なものである。投与される実際の量、並びに投与の速度及び時間経過は、処置されるものの性質及び重症度に依存する。例えば、ヒトにおけるｉ．ｖ．投与のためには、１０ｍｇ／ｋｇ体重までのＪＮＫ阻害剤配列又はキメラペプチドの単回用量が好ましく、より好ましくは、１ｍｇ／ｋｇ体重まで、更により好ましくは５００μｇ／ｋｇ体重まで、例えば、１００ｎｇ〜１ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、より具体的には、１μｇから５００μｇ／ｋｇ体重の範囲、更により具体的には、５μｇ〜１００μｇ／ｋｇ体重の範囲が好ましい。そのような用量を、例えば、注射及び／又は輸注として、特に、輸注として投与することができ、輸注の持続時間は、例えば、１〜９０ｍｉｎ、好ましくは１０〜７０ｍｉｎ、より好ましくは３０〜６０ｍｉｎで変化する。
【０１６１】
好ましくは、本明細書中に記載されるＪＮＫ阻害剤配列、本明細書中に記載されるキメラペプチド（特に、本明細書中に記載される配列番号１１を含むキメラペプチド）、本明細書中に記載される組合せ、又は本明細書中に記載される医薬組成物において、ＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドは、例えば、１ヶ月間に少なくとも１回、１週間に少なくとも１回、又は１日間に少なくとも１回繰り返し投与される。最も好ましくは、ＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチド（特に、本明細書中に記載される配列番号１１を含むキメラペプチド）は、１ヶ月間に１回又は３週間ごとに１回繰り返し投与される。繰り返し投与の場合、前記特定の好ましい用量範囲は、単回用量を意味し、これを繰り返し投与することができる。
【０１６２】
特に好ましくは、特に本明細書中に定義される医薬組成物中における本発明に係るＪＮＫ阻害剤配列又はキメラペプチド、例えば、配列番号１１の配列を有するキメラペプチドは、１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、１０μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは、１００μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくは、５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの範囲の用量（体重１ｋｇ当たり）で適用される。ＪＮＫ阻害剤配列又はキメラペプチドは、好ましくは、適用可能であれば、一回又は繰り返して、例えば、数日間、数週間、数ヶ月間、又は数年間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、又はそれ以上の日数、週、月、又は年の間、１日間に１回投与される。好ましくは、ＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドは、数週間、数ヶ月間、又は数年間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、又はそれ以上の週、月、又は年の間、１週間ごとに（１週間当たり１回）、数週間、数ヶ月間、又は数年間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、又はそれ以上の週、月、又は年の間、２週間ごとに（２週間当たり１回）、数週間、数ヶ月間、又は数年間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、又はそれ以上の週、月、又は年の間、３週間ごとに（３週間当たり１回）、数ヶ月間又は数年間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、又はそれ以上の月又は年の間、１ヶ月間ごとに（１ヶ月間当たり１回）、数ヶ月間又は数年間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、又はそれ以上の月又は年の間、６週間ごとに（６週間当たり１回）、数ヶ月間又は数年間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、又はそれ以上の月又は年の間、２ヶ月間ごとに（２ヶ月間当たり１回）、数ヶ月間又は数年間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、又はそれ以上の月又は年の間、３ヶ月間ごとに（３ヶ月間当たり１回）、より好ましくは、数週間、数ヶ月間、又は数年間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、又はそれ以上の週、月、又は年の間、１週間ごとに（１週間当たり１回）、数週間、数ヶ月間、又は数年間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、又はそれ以上の週、月、又は年の間、２週間ごとに（２週間当たり１回）、数週間、数ヶ月間、又は数年間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、又はそれ以上の週、月、又は年の間、３週間ごとに（３週間当たり１回）、数ヶ月間又は数年間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、又はそれ以上の月又は年の間、１ヶ月間ごとに（１ヶ月間当たり１回）、更により好ましくは、数週間、数ヶ月間、又は数年間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、又はそれ以上の週、月、又は年の間、３週間ごとに（３週間当たり１回）、又は数ヶ月間又は数年間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、又はそれ以上の月又は年の間、１ヶ月間ごとに（１ヶ月間当たり１回）投与される。ＪＮＫ阻害剤配列又はキメラペプチドは、好ましくは、全身的に、例えば、ｉ．ｖ．、ｐ．ｏ．���ｉ．ｍ．若しくはｓ．ｃ．、又はＣＳＦ内（脳脊髄液内）で適用される。より好ましくは、ＪＮＫ阻害剤配列又はキメラペプチドは、ｉ．ｖ．又はｐ．ｏ．で投与される。
【０１６３】
軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の防止及び／又は処置は、典型的には、上記で定義された医薬組成物の投与を含む。用語「モジュレート」は、ＪＮＫが上記疾患のいずれかにおいて過剰発現される場合に、ＪＮＫの発現の抑制を含む。それはまた、細胞における天然のｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２及びＮＦＡＴ４結合部位の競合的阻害剤として、例えば、配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかの少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列及び／又は配列番号９〜１２及び２３〜３２の配列のいずれか（配列番号１１が特に好ましい）の少なくとも１つのキメラペプチド及び／又は配列番号５〜８及び２１〜２２のいずれかの輸送配列を含む配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかの少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列、又は上記定義内にあるそのバリアント若しくは断片を使用することによる、上記疾患のいずれかにおけるｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２又はＮＦＡＴ４のリン酸化の抑制を含む。用語「モジュレート」はまた、限定されるものではないが、ｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２、又はＮＦＡＴ４及びその関連するパートナー、例えば、ｃ−ｊｕｎ、ＡＦＴ２及びｃ−ｆｏｓから構成されるＡＰ−１複合体などから構成される転写因子のヘテロ及びホモマー複合体の抑制も含む。上記で定義された軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害がＪＮＫ過剰発現と関連する場合、そのような抑制的ＪＮＫ阻害剤配列を細胞に導入することができる。いくつかの場合、次いで、「モジュレート」は、例えば、ＩＢ−ペプチドのＪＮＫへの結合を遮断し、したがって、ＩＢ−関連ペプチドによるＪＮＫ阻害を防止するＩＢペプチド特異的抗体の使用による、ＪＮＫ発現の増加を含んでもよい。
【０１６４】
本明細書に開示されたＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、又は医薬組成物を用いる対象の防止及び／又は処置を、典型的には、（「治療有効」）量の前記医薬組成物を対象に（ｉｎ  ｖｉｖｏで）投与することによって達成することができる。用語「治療有効」とは、医薬組成物の活性成分が、上記で定義された軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害を改善するのに十分な量のものであることを意味する。
【０１６５】
本明細書に開示されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、又は医薬組成物で処置される対象は、例えば、哺乳類、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ又はブタであってもよく、ヒトが特に好ましい。
【０１６６】
したがって、上記で定義された任意のペプチド、例えば、配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかの少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列及び／又は配列番号９〜１２及び２３〜３２の配列のいずれか、好ましくは配列番号１１の少なくとも１つのキメラペプチド、及び／又は配列番号５〜８及び２１〜２２のいずれかの輸送配列を含む配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかの少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列、又は上記定義内にあるそのバリアント若しくは断片を、本発明の特定の実施形態において使用して、例えば、活性化ＪＮＫシグナリング経路をモジュレートすることにより、上記で定義された軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害を処置することができる。
【０１６７】
しかしながら、上記で定義されたペプチドはまた、例えば、遺伝子療法のために、後に本発明の医薬組成物の一部を形成し得る核酸によってコードされていてもよい。これに関連して、遺伝子療法とは、例えば、核酸がＬ−アミノ酸のみを含む、上記で定義された医薬組成物を用いて、上記で定義された特異的核酸の対象への投与によって実施される療法を指す。本発明のこの実施形態においては、核酸は、そのコードされるペプチドを産生し、次いで、ＭＣＩの機能をモジュレートすることによって治療効果を発揮するのに役立つ。当技術分野で利用可能な遺伝子療法に関する方法のいずれかを、本発明の実施において使用することができる（例えば、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、１９９３、Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍ  １２：４８８〜５０５頁を参照されたい）。
【０１６８】
好ましい実施形態においては、上記で定義され、遺伝子療法のために使用される核酸は、好適な宿主内で、上記で定義されたＩＢ関連ペプチドのいずれか１つ又は複数、すなわち、配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列及び／又は配列番号９〜１２及び２３〜３２の配列のいずれかのキメラペプチド、及び／又は配列番号５〜８及び２１〜２２のいずれかの輸送配列を含む配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列、又は上記定義内にあるそのバリアント若しくは断片をコードし、発現する発現ベクターの一部である。特定の実施形態においては、そのような発現ベクターは、ＪＮＫ阻害剤配列のコード領域に作動可能に連結されたプロモーターを有する。プロモーターは、上記で定義されたものであってよく、例えば、誘導性又は構成的、場合により、組織特異的であってもよい。
【０１６９】
別の特定の実施形態においては、上記で定義された核酸分子は、上記で定義された核酸分子のコード配列（及びその任意の他の所望の配列）が、ゲノム内での所望の部位で相同組換えを促進する領域に隣接し、したがって、これらの核酸の染色体内発現を提供する、遺伝子療法のために使用される（例えば、Ｋｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈｉｅｓ、１９８９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：８９３２〜８９３５頁を参照されたい）。
【０１７０】
特に、上記で定義された軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の状況における、遺伝子療法の目的のための患者への本発明による上記で定義された核酸の送達は、直接的なものであっても（すなわち、患者は核酸若しくは核酸含有ベクターに直接曝露される）又は間接的なものであってもよく（すなわち、細胞を最初はｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸で形質転換した後、患者に移植する）、一般には、医薬組成物について上記の投与経路が適用されるが、同様に、例えば、処置される組織又は臓器への局部注射による局部投与が好ましい。これらの２つの手法は、それぞれ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法として公知である。本発明の特定の実施形態においては、核酸はｉｎ  ｖｉｖｏで直接投与され、そこで発現されて、コードされる産物を産生する。これを、例えば、適切な核酸発現ベクターの一部として核酸を構築すること、及びそれが細胞内となるような様式でそれを投与すること（例えば、欠損性若しくは弱毒化レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス若しくは他のウイルスベクターを使用する感染による；米国特許第４，９８０，２８６号を参照されたい）；裸のＤＮＡを直接注入すること；微粒子ボンバードメントを使用すること（例えば、「ＧｅｎｅＧｕｎ」；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、ＤｕＰｏｎｔ）；核酸を脂質でコーティングすること；関連する細胞表面受容体／トランスフェクト剤を使用すること；リポソーム、微粒子、若しくはマイクロカプセル中に封入すること；それを、核に進入することが知られるペプチドと連結させて投与すること；又はそれを、目的の受容体を特異的に発現する細胞型を「標的化する」ために使用することができる受容体媒介性エンドサイトーシスを受けやすくしたリガンドに連結させて投与すること（例えば、Ｗｕ及びＷｕ、１９８７、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：４４２９〜４４３２頁を参照されたい）などを含む、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって達成することができる。
【０１７１】
本発明の実施における遺伝子療法に対する更なる手法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、ウイルス感染などの方法によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組織培養中の細胞に遺伝子（上記で定義された核酸を含む）を導入することを含む。一般に、導入方法は、選択マーカーの細胞への同時的導入を含む。次いで、細胞を選択圧（例えば、抗生物質耐性）下に置いて、導入される遺伝子を取り込んだ、それを発現している細胞の単離を容易にする。次いで、これらの細胞を患者に送達する。特定の実施形態においては、得られた組換え細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの投与の前に、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、目的の核酸配列を含有するウイルス又はバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、微小細胞媒介性遺伝子導入、スフェロプラスト融合、並びにレシピエントの細胞の必要な発達機能及び生理的機能が導入によって破壊されないことを確保する同様の方法を含む、当技術分野で公知の任意の方法によって、核酸を細胞中に導入する。例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ及びＢｅｈｒ、１９９３、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２１７：５９９〜６１８頁を参照されたい。選択される技術は、核酸が細胞によって発現可能であるような、細胞への核酸の安定な導入を提供するべきである。好ましくは、導入される核酸は、細胞子孫によって遺伝され、発現される。
【０１７２】
本発明の好ましい実施形態においては、得られる組換え細胞を、例えば、上皮細胞の注射（例えば、皮下的）、患者への皮膚移植片としての組換え皮膚細胞の適用、及び組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞又は前駆細胞）の静脈内注射を含む当技術分野で公知の様々な方法によって患者に送達することができる。使用について想定される細胞の総量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者は決定することができる。核酸を遺伝子療法の目的のために導入することができる細胞は、任意の望ましい、利用可能な細胞型を包含し、異種性、異種遺伝子型、同系、又は自己性であってもよい。細胞型としては、限定されるものではないが、上皮細部、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞及び血液細胞などの分化した細胞、又は様々な幹細胞若しくは前駆細胞、特に、胚性心筋細胞、肝臓幹細胞（国際特許出願公開ＷＯ９４／０８５９８）、神経幹細胞（Ｓｔｅｍｐｌｅ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９２、Ｃｅｌｌ  ７１：９７３〜９８５頁）、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られるような造血幹細胞若しくは前駆細胞が挙げられる。好ましい実施形態においては、遺伝子療法のために使用される細胞は、患者にとって自己性である。
【０１７３】
あるいは、及び／又は更に、本明細書に記載のＭＣＩを処置するために、標的化療法を使用して、（標的化）抗体又は細胞特異的リガンドなどの標的化系の使用により、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、及び／又は核酸を、より具体的には、ある特定の細胞型に送達することができる。標的化のために使用される抗体は、典型的には、ＭＣＩのいずれかと関連する細胞の細胞表面タンパク質に特異的である。例えば、これらの抗体は、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲタンパク質、ＣＤ１８（ＬＦＡ−１ベータ鎖）、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４０若しくはＢｇｐ９５などのＢ細胞関連表面タンパク質、又は例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ７１、ＣＤ１３８などから選択される細胞表面タンパク質などの、細胞表面抗体に対するものであってもよい。標的化コンストラクトを、典型的には、本発明に従って本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、及び核酸を、細胞表面タンパク質に特異的な抗体に共有結合させることにより、又は細胞特異的リガンドに結合させることにより調製することができる。タンパク質を、例えば、そのような抗体に結合させるか、又はペプチド結合若しくは化学的カップリング、架橋などによりそれに結合させることができる。次いで、薬学的に有効な量の標的化コンストラクトを、以下に定義される投与経路のいずれか、例えば、腹腔内、鼻内、静脈内、経口及びパッチ送達経路によって患者に投与することにより、標的化療法を実行することができる。好ましくは、上記で定義された標的化抗体又は細胞特異的リガンドに結合される、本発明に従って本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、又は核酸を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、共有結合の加水分解により、ペプチダーゼにより、又は任意の他の好適な方法により放出させることができる。あるいは、本発明に従って本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、又は核酸が低分子細胞特異的リガンドに結合される場合、リガンドの放出を実行しなくてもよい。細胞表面に存在する場合、キメラペプチドは、その輸送配列の活動時に細胞に進入することができる。標的化は、様々な理由から望ましいものであってよい；例えば、本発明に従って本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、及び核酸が許容不可能に毒性的である場合、又はその他それが高すぎる用量を必要とする場合である。
【０１７４】
本発明に従って本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドを直接的に投与する代わりに、それらを、細胞中に導入されたコード遺伝子から、例えば、投与されるウイルスベクターからの発現によって標的細胞において産生させることができる。ウイルスベクターは、典型的には、本発明に従って本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドをコードする。ベクターを、処置される特定の細胞に標的化することができる。更に、ベクターは、規定の調節の際に標的細胞により多かれ少なかれ選択的にスイッチされる調節エレメントを含有してもよい。この技術は、その前駆体形態の代わりに成熟タンパク質を使用する、ＶＤＥＰＴ技術（ウイルス誘導性酵素プロドラッグ療法）のバリアントである。
【０１７５】
あるいは、本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドを、抗体又はウイルスの使用によって前駆体形態で投与することができる。次いで、これらのＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドを、処置される細胞において産生される、又はそれに対して標的化される活性化剤によって活性形態に変換することができる。この型の手法は、ＡＤＥＰＴ（抗体誘導性酵素プロドラッグ療法）又はＶＤＥＰＴ（ウイルス誘導性酵素プロドラッグ療法）として知られることもある；前者は、細胞特異的抗体へのコンジュゲーションによって活性化剤を細胞に標的化することを含むが、後者は、ウイルスベクター中のコードＤＮＡからの発現によってベクター中で活性化剤、例えば、ＪＮＫ阻害剤配列又はキメラペプチドを産生させることを含む（例えば、ＥＰ−Ａ−４１５７３１及びＷＯ９０／０７９３６を参照されたい）。
【０１７６】
更なる実施形態によれば、本明細書で定義されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、核酸配列又はＪＮＫ阻害剤配列若しくはキメラペプチドに対する抗体、例えば、配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列及び／又は配列番号９〜１２及び２３〜３２の配列のいずれかのキメラペプチド、及び／又は配列番号５〜８及び２１〜２２のいずれかの輸送配列を含む配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列、又は上記定義内のそのバリアント若しくは断片を、上記で定義された軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害を検出、予後診断、診断若しくはモニタリングするため、又はその処置をモニタリングするための（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アッセイ（例えば、イムノアッセイ）において使用することができる。免疫特異的結合が起こるような条件下で、患者由来試料と、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、又は核酸配列に対する抗体とを接触させた後、前記抗体により任意の免疫特異的結合の量を検出又は測定することを含む方法によって、イムノアッセイを実施することができる。特定の実施形態においては、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド又は核酸配列に特異的な抗体を使用して、ＪＮＫ又はＪＮＫ阻害剤配列の存在について患者由来組織又は血清試料を分析することができる；ここで、ＪＮＫの異常なレベルは疾患状態を示す。使用することができるイムノアッセイとしては、限定されるものではないが、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、蛍光イムノアッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射測定アッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイなどの技術を使用する競合的及び非競合的アッセイシステムが挙げられる。あるいは、上記で定義された、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、核酸配列又はＪＮＫ阻害剤配列若しくはキメラペプチドに対する抗体を、典型的には、例えば、培養動物細胞、ヒト細胞又は微生物から選択される標的細胞に送達し、典型的には、当業者には公知の生物物理学的方法によって細胞応答をモニタリングすることにより、（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アッセイを実施することができる。典型的には、その中で使用される標的細胞は、（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで）培養された細胞又はｉｎ  ｖｉｖｏの細胞、すなわち、生きている動物若しくはヒトの臓器若しくは組織を構成する細胞、又は生きている動物若しくはヒトに見出される微生物であってもよい。
【０１７７】
本発明は更に、診断又は治療目的のため、特に、上記で定義された軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の処置、防止又はモニタリングのためのキットであって、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、核酸配列及び／又はこれらのＪＮＫ阻害剤配列若しくはキメラペプチドに対する抗体、例えば、配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列に対する、配列番号９〜１２及び２３〜３２の配列のいずれかのキメラペプチドに対する、配列番号５〜８及び２１〜２２のいずれかの輸送配列を含む配列番号１〜４及び１３〜２０及び３３〜１００の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列に対する、又は上記定義内のそのバリアント若しくは断片に対する抗ＪＮＫ阻害剤配列抗体を含有する１つ又は複数の容器、又はそのような抗ＪＮＫ阻害剤配列抗体、及び、場合により、前記抗体に対する標識された結合パートナーを含む前記キットの使用を提供する。抗体中に組み込まれる標識は、限定されるものではないが、化学発光部分、酵素部分、蛍光部分、比色部分又は放射活性部分を含んでもよい。別の特定の実施形態においては、上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列及び／又はキメラペプチドをコードするか、又はあるいは、それと相補的である核酸を含有する１つ又は複数の容器を含む、上記で定義された軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害の処置、防止又はモニタリングにおける診断的使用のためのキットが提供され、場合により、これらの核酸に対する標識された結合パートナーも提供される。代替的な特定の実施形態においては、キットを、１つ又は複数の容器、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば、Ｉｎｎｉｓら、１９９０、ＰＣＲ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡを参照されたい）、リガーゼ連鎖反応、環状プローブ反応など、又は上記で定義された核酸に関連して使用される他の公知の方法のための増幅プライマーとして作用することができる一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、それぞれ６〜３０ヌクレオチド長）を含むキットとして、上記目的のために使用することができる。キットは、場合により、上記目的のためのアッセイにおける診断、標準又は対照としての使用のための、所定量の精製された上記で定義されたＪＮＫ阻害剤配列、上記で定義されたキメラペプチド、又はこれらをコードする核酸を更に含んでもよい。
【０１７８】
更なる態様においては、本発明は、また、それを必要とする対象における軽度認知障害、特に、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害を防止及び／又は処置する方法であって、対象に、本明細書中に記載されるＪＮＫ阻害剤配列又は本明細書中に記載されるキメラペプチドを投与することを含む方法も提供する。
【０１７９】
そのような方法の好ましい実施形態においては、本明細書中に記載されるＪＮＫ阻害剤配列、本明細書中に記載されるキメラペプチド、本明細書中に記載される組合せ、又は本明細書中に記載される医薬組成物が、対象に投与される。
【０１８０】
前記方法の別の好ましい実施形態においては、対象は、軽度認知障害、好ましくは健忘性又は非健忘性軽度認知障害、より好ましくは、健忘性軽度認知障害、更により好ましくは、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害と診断された対象である。
【０１８１】
本発明に係る方法の更に好ましい実施形態は、本明細書中に記載されるＪＮＫ阻害剤配列、本明細書中に記載されるキメラペプチド、本明細書中に記載される組合せ、又は本明細書中に記載される医薬組成物、及び本明細書中に記載される好ましい投与経路、用量、及び処置スケジュールから導くことができる。
【０１８２】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によってその範囲を制限されない。実際、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の様々な改変が、前記説明及び添付の図面から当業者には明らかとなる。そのような改変は、添付の特許請求の範囲内にある。
【０１８３】
様々な刊行物が本明細書で引用され、それらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８４】
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似するか、又は等価である方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が制御するものとする。更に、材料、方法、及び実施例は例示に過ぎず、限定を意図するものではない。本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】示される転写因子中の保存されたＪＢＤドメイン領域のアラインメントを示す略図である。ここで使用されるＪＮＫ阻害剤は、配列アラインメントを実行することによって同定されたものである。このアラインメントの結果を、図１Ａ〜図１Ｃ中に例示的に示す。図１Ａは、ＩＢ１、ＩＢ２、ｃ−Ｊｕｎ及びＡＴＦ２のＪＢＤ間の最も高い相同領域を記載する。パネルＢは、比較のためにＬ−ＩＢ１（ｓ）とＬ−ＩＢ１のＪＢＤのアミノ酸配列を記載する。完全に保存された残基は星印で示されるが、ＧＦＰ−ＪＢＤ２３Ｍｕｔベクター中でＡｌａに変化させた残基は白丸で示される。図１Ｃは、ＪＮＫ阻害剤配列と輸送配列とを含むキメラタンパク質のアミノ酸配列を示す。示される例においては、輸送配列はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＴＡＴポリペプチドに由来し、ＪＮＫ阻害剤配列はＩＢ１（ｓ）ポリペプチドに由来する。ヒト、マウス、及びラットの配列は、パネルＢ及びＣ中で同一である。
【図２】ヒト、マウス及びラットに由来する一般的なＴＡＴ−ＩＢ融合ペプチドの配列を示す略図である。
【図３】１ウェル手法における配列番号９及び配列番号１１の融合ペプチドを使用するＨｅｐＧ２細胞における内因性ＪＮＫ活性の阻害の結果を記載する図である。図３、特に、図３中のパネルｄから見られるように、配列番号１１のＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）（ここではＤ−ＪＮＫＩと省略される）は、配列番号９のＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）（ここではＬ−ＪＮＫＩと省略される）よりも更に良好に、ＪＮＫ活性を効率的に阻害する。
【図４】実施例１２における、（ｉ）１０ｍｇ／ｋｇのＪＮＫペプチド阻害剤ＸＧ−１０２（配列番号１１）又は（ｉｉ）生理食塩水のいずれかで３〜６ヶ月間処置された野生型（ＷＴ）及び５ＸＦＡＤマウスの皮質（Ａ）及び海馬（Ｂ）におけるＪＮＫ活性を示す。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ≧６）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図５】実施例１３における、（ｉ）１０ｍｇ／ｋｇのＪＮＫペプチド阻害剤ＸＧ−１０２（配列番号１１）又は（ｉｉ）生理食塩水のいずれかで３〜６ヶ月間処置された野生型（ＷＴ）及び５ＸＦＡＤマウスの皮質（Ａ）及び海馬（Ｂ）におけるｃＪｕｎ活性を示す。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ≧６）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６】実施例１４における、Ｌａｙｅｒ５皮質におけるＸＧ−１０２（配列番号１１）のＡβ４２クローンモノクローナル抗体（「ＭＯＡＢ」）に対する効果を示す。（Ａ）生理食塩水又はＸＧ−１０２で３ヶ月間処置された５ＸＦＡＤマウスの矢状脳断片を、Ａβ４２に対する抗体と共にインキュベートし、ＤＡＢ染色によって可視化し、Ｌａｙｅｒ５皮質においてマイクロ撮像した。（Ｂ）Ｌａｙｅｒ５皮質におけるＡβ４２標識の定量。ｎ≧６、＊Ｐ＜０．０５。
【図７】実施例１５における、海馬における５ＸＦＡＤマウスにおけるヒトｐＡＰＰレベルに対するＸＧ−１０２（配列番号１１）の効果。ヒストグラムは、生理食塩水又はＸＧ−１０２で３ヶ月間又は６ヶ月間処置された５ＸＦＡＤ及び野生型（ＷＴ）マウスのマウスとヒトｐＡＰＰの各レベルを示す。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ≧４）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図８】実施例１６における、３ヶ月間〜６ヶ月間処置された野生型（ＷＴ）及び５ＸＦＡＤにおける皮質（Ａ）及び海馬（Ｂ）における分解されたカスパーゼ３のレベルに対するＸＧ−１０２（配列番号１１）の効果を示す。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ≧３）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図９】実施例１７における、３ヶ月間〜６ヶ月間処置された野生型（ＷＴ）及び５ＸＦＡＤの皮質（Ａ）及び海馬（Ｂ）におけるセリン８７のリン酸化されたＢｃｌ２の脳レベルに対するＸＧ−１０２（配列番号１１）による処置の効果を示す。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ≧３）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１０】実施例１８における、３ヶ月間〜６ヶ月間処置された野生型（ＷＴ）及び５ＸＦＡＤの皮質（Ａ）及び海馬（Ｂ）におけるカスパーゼ３活性に対するＸＧ−１０２（配列番号１１）による処置の効果を示す。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ≧６）。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１１】実施例１９における、３ヶ月間〜６ヶ月間処置されたＷＴ及び５ＸＦＡＤの皮質におけるサイトカインＩＬ−１βレベルに対するＸＧ−１０２（配列番号１１）による処置の効果を示す。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ≧６）。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１２】実施例２０における、野生型（ＷＴ）及び５ＸＦＡＤマウスにおける記憶に対するＸＧ−１０２（配列番号１１）の効果を示す。マウスは、Ｙ迷路タスクにおける空間及び手続き作業記憶について試験した。８分間の試験中、迷路の３つのアーム間の自発的交替行動を測定した。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ≧６）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【０１８６】
実施例
実施例１
ＪＮＫ阻害配列の特定
ＪＮＫとの効率的な相互作用に関して重要なアミノ酸配列を、公知のＪＮＫ結合ドメインＪＢＤの間の配列のアラインメントによって特定した。ＩＢ１［配列番号１３］、ＩＢ２［配列番号１４］、ｃ−Ｊｕｎ［配列番号１５］及びＡＴＦ２［配列番号１６］のＪＢＤの間の配列比較によって、弱く保存された８つのアミノ酸配列が定義された（図１Ａを参照のこと）。ＩＢ１及びＩＢ２のＪＢＤは、ＪＮＫ結合においてｃ−Ｊｕｎ又はＡＴＦ２の約１００倍効率的であるので（Ｄｉｃｋｅｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７：６９３（１９９７）、これが、ＩＢ１とＩＢ２との間で保存された残基は、最大結合を付与するのに重要でなければならない理由であった。ＩＢ１とＩＢ２のＪＢＤの間の比較によって、２つの配列の間で高度に保存されている７つのアミノ酸及び３つのアミノ酸の２つのブロックを決定した。
【０１８７】
これらの２つのブロックは、Ｌ−ＩＢ１（ｓ）中の１９アミノ酸のペプチド配列［配列番号１］内に含まれ、またＩＢ１由来の２３ａａのペプチド配列［配列番号１７］中の比較の根拠も示される。これらの配列は、図１Ｂに示してあり、Ｌ−ＩＢ１配列中のダッシュは、保存された残基とＬ−ＩＢ１（ｓ）とを整列するための配列中のギャップを示す。
【０１８８】
実施例２
ＪＮＫ阻害融合タンパク質の調製
配列番号９のＪＮＫ阻害融合タンパク質は、２つのプロリン残基からなるリンカーを介して、配列番号１のＣ末端を、配列番号５のＨＩＶ−ＴＡＴ４ｇ５７（Ｖｉｖｅｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１６０１０頁（１９９７年））由来のＮ末端の１０アミノ酸長担体ペプチドに対して共有結合することによって合成した。このリンカーを使用することで、最大可塑性が可能になり、望ましくない二次的な構造の変化が防がれる。基本的なコンストラクトもまた調製し、それぞれ、Ｌ−ＩＢ１（ｓ）（配列番号１）及びＬ−ＴＡＴ［配列番号５］と命名した。
【０１８９】
配列番号１１の全Ｄレトロ−インベルソペプチドを、適宜合成した。基礎的コンストラクトもまた調製し、それぞれ、Ｄ−ＩＢ１（ｓ）［配列番号２］及びＤ−ＴＡＴ［配列番号６］と命名した。
【０１９０】
配列番号９、１０、１１及び１２の全てのＤ及びＬの融合ペプチドは、古典的なＦｍｏｃｋ合成によって生成し、更に質量分析法によって分析した。それらは最終的には、ＨＰＬＣによって精製した。プロリンリンカーの効果を決定するために、一方は２つのプロリンがあり、もう一方には２つのプロリンがない２種類のＴＡＴペプチドを生成した。２つのプロリンの追加は、細胞内側のＴＡＴペプチドの進入も局在化も変更するようには見えなかった。保存されたアミノ酸残基を示す一般的なペプチドを図２に示す。
【０１９１】
実施例３
ＪＢＤ１９による細胞死の阻害
ＪＮＫの生物学的活性に対するＩＢ１（ｓ）の１９ａａ長のＪＢＤ配列の効果を研究した。この１９ａａの配列のＮ末端を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ  ＪＢＤ１９コンストラクト）に連結し、ＩＬ１によって誘発される膵臓β細胞アポトーシスに対するこのコンストラクトの効果を評価した。この方式のアポトーシスは、ＪＢＤ１−２８０によるトランスフェクションによってブロックされることが以前に示されているが、当該分野で公知のＥＲＫ１／２又はｐ３８の特異的な阻害剤は保護しなかった。
【０１９２】
ＪＢＤ１９に対応し、１９アミノ酸の保存された配列を含むオリゴヌクレオチド、及び完全に保存された領域で変異された配列を合成し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈより）をコードするｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターのＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ部位に一方向に挿入した。インスリン産生βＴＣ−３細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００単位／ｍＬのペニシリン及び２ｍＭのグルタミンを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。インスリン産生βＴＣ−３細胞を、示したベクターでトランスフェクトして、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）を細胞培養培地に添加した。アポトーシス細胞の数は、倒立蛍光顕微鏡を使用して、ＩＬ−１βの添加の４８時間後にカウントした。アポトーシス細胞を、細胞質の特徴的な「ブレブ形成（ｂｌｅｂｂｉｎｇ  ｏｕｔ）」によって正常な細胞から区別し、２日後にカウントした。
【０１９３】
ＧＦＰは、対照として使用される緑色蛍光タンパク質発現ベクターであり；ＪＢＤ１９は、ＩＢ１のＪＢＤ由来の１９のａａ配列に連結されたキメラＧＦＰを発現するベクターであり；ＪＢＤ  １９Ｍｕｔは、ＧＦＰ−ＪＢＤ１９と同じベクターであるが、ただし図１Ｂに示されるように４つの保存された残基でＪＢＤが変異されており；ＪＢＤ１−２８０は、ＪＢＤ全体（ａａ１〜２８０）に連結されたＧＦＰベクターである。ＧＦＰ−ＪＢＤ１９発現コンストラクトは、全体のＪＢＤ１−２８０と同じ程度に効率的にＩＬ−１β誘発性の膵臓β細胞のアポトーシスを抑えた。
【０１９４】
追加の対照として、完全に保存されたＩＢ１（ｓ）残基で変異された配列は、アポトーシスを抑える能力が大きく低下していた。
【０１９５】
実施例４
ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドの細胞内導入
ＴＡＴ及びＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（「ＴＡＴ−ＩＢペプチド」）のＬ−及びＤ−鏡像異性形態が細胞に入る能力を評価した。Ｌ−ＴＡＴ、Ｄ−ＴＡＴ、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）及びＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド［それぞれ、配列番号５、６、９及び１２］を、フルオレセインにコンジュゲートされたグリシン残基のＮ末端付加によって標識した。標識されたペプチド（１μＭ）をβＴＣ−３細胞培養物に添加し、これを実施例３に記載のとおり維持した。所定の時点で、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、氷冷メタノール−アセトン（１：１）中で５分間固定した後に、蛍光顕微鏡下で検査した。フルオレセイン標識したＢＳＡ（１μＭ、１２モル／１モルのＢＳＡ）を、対照として用いた。結果から、上記のフルオレセイン標識ペプチドの全てが、培養培地に一旦添加されれば、効率的かつ急速に（５分未満）で細胞に入ったことが示された。逆に、フルオレセイン標識されたウシ血清アルブミン（１μＭのＢＳＡ、１２モルのフルオレセイン／１モルのＢＳＡ）は、細胞に入らなかった。
【０１９６】
経時的な研究によって、Ｌ−鏡像異性体ペプチドの蛍光シグナルの強度は、続く２４時間の期間に７０％低下したことが示された。４８時間ではシグナルは、ほとんど又は全く示されなかった。対照的に、Ｄ−ＴＡＴ及びＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）は細胞内で極めて安定であった。
【０１９７】
これらの全Ｄレトロ−インベルソペプチドからの蛍光シグナルは、１週後もまだ極めて強力であり、シグナルは処置後２週でごくわずかに低下しただけであった。
【０１９８】
実施例５
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｃ−ＪＵＮ、ＡＴＦ２及びＥｌｋ１リン酸化の阻害
それらの標的転写因子のＪＮＫ媒介性リン酸化に対するペプチドの効果を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで検討した。組み換え及び不活性化のＪＮＫ１、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３を、ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮウサギ網状赤血球溶解液キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して生成し、単独か、又は基質としてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合したかのいずれかで、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２及びＥｌｋ１を用いる固相キナーゼアッセイで、使用した。用量反応試験を行い、ここでは、Ｌ−ＴＡＴ又はＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（０〜２５μＭ）を、組み換えＪＮＫ１、ＪＮＫ２、又はＪＮＫ３キナーゼと、反応バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−アセテート、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのｐ−ニトロフェニル−ホスフェート（ｐＮＰＰ）、５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭのｐ−グリセロリン酸エステル、１ｍＭのジチオスレイトール）中で、２０分間混合した。次いで、キナーゼ反応を、１０ｍＭのＭｇＣｌ２及び５ｐＣｉの３３Ｐ−ガンマ−ｄＡＴＰ及び１μｇのＧＳＴ−Ｊｕｎ（ａａ１〜８９）、ＧＳＴ−ＡＦＴ２（ａａ１〜９６）又はＧＳＴ−ＥＬＫ１（ａａ３０７〜４２８）のいずれかの添加によって開始した。ＧＳＴ−融合タンパク質は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から購入した。
【０１９９】
１０μｌのグルタチオン−アガロースビーズも、この混合物に添加した。次いで、反応生成物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、変性１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルを乾燥して、その後、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）に曝露した。ＪＮＫによるｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２及びＥｌｋ１リン酸化のほぼ完全な阻害が、２．５μＭ程度の低いＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチド用量で観察された。しかし、Ｅｌｋ１のＪＮＫ３リン酸化のＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）阻害の顕著な除外はなかった。全体的に、ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドは、それらの標的転写因子のＪＮＫファミリーのリン酸化を阻害するのに優れた効果を示した。Ｄ−ＴＡＴ、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）及びＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（０−２５０μＭ投与量の試験）が、組み換えＪＮＫ１、ＪＮＫ２、及びＪＮＫ３によるＧＳＴ−Ｊｕｎ（ａａ１〜７３）リン酸化を阻害する能力を、上記のように分析した。全体的に、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドは、ｃ−ＪｕｎのＪＮＫ媒介性リン酸化を低下したが、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）よりは約１０〜２０分の１の低い効率のレベルであった。
【０２００】
実施例６
活性化ＪＮＫによるｃ−ＪＵＮリン酸化の阻害
ストレス刺激によって活性化されたＪＮＫに対する、本明細書で定義されたようなＬ−ＴＡＴ又はＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドの効果を、ＧＳＴ−Ｊｕｎを使用してＵＶ光照射ＨｅＬａ細胞又はＩＬ−１β処理ＰＴＣ細胞からＪＮＫを引き出すことにより評価した。ＰＴＣ細胞を、上記のとおり培養した。ＨｅＬａ細胞は、１０％のウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００単位／ｍｌのペニシリン及び２ｍＭのグルタミンを補充したＤＭＥＭ培地中で培養した。細胞抽出物調製に使用する１時間前、ＰＴＣ細胞を、上記のようにＩＬ−１βで活性化し、一方、ＨｅＬａ細胞は、ＵＶ光（２０Ｊ／ｍ２）で活性化した。細胞抽出物を、溶解バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−アセテート、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＭのｐ−ニトロフェニル−リン酸塩、５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＰ−グリセロリン酸エステル、１ｍＭのジチオスレイトール）中で細胞培養物を剥離することによって、対照ＵＶ光照射のＨｅＬａ細胞及びＩＬ−１β処理のβＴＣ−３細胞から調製した。デブリスを、ＳＳ−３４  Ｂｅｃｋｍａｎローター中で１５，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離によって除去した。１００μｇの抽出物を、１μｇのＧＳＴ−ｊｕｎ（アミノ酸１〜８９）及び１０μＬのグルタチオン−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）とともに室温で１時間インキュベートした。前記剥離バッファーを用いて４回洗浄した後、ビーズを、Ｌ−ＴＡＴ又はＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（２５μＭ）を補充した同じバッファー中に２０分間再懸濁した。次いで、キナーゼ反応を、１０ｍＭのＭｇＣｌ２及び５ｐＣｉの３３Ｐ−ガンマ−ｄＡＴＰの添加によって開始し、３０℃で３０分間インキュベートした。
【０２０１】
次いで、反応生成物を、変性１０％のポリアクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ゲルを乾燥し、その後、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）に曝露した。ＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドは、これらの実験において、活性化されたＪＮＫによるｃ−Ｊｕｎのリン酸化を効率的に防いだ。
【０２０２】
実施例７
ｉｎ  ｖｉｖｏでの本明細書において定義されたＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドによるｃ−ＪＵＮリン酸化の阻害
本明細書において定義された細胞透過性ペプチドがｉｎ  ｖｉｖｏでＪＮＫシグナリングをブロックし得るか否かを決定するため、本発明者らは、異種のＧＡＬ４系を用いた。上記のとおりに培養したＨｅＬａ細胞を、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに連結されたｃ−Ｊｕｎの活性化ドメイン（アミノ酸１〜８９）を含むＧＡＬ−Ｊｕｎ発現コンストラクト（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と共に５×ＧＡＬ−ＬＵＣレポーターベクターで同時トランスフェクトした。ＪＮＫの活性化は、直接上流のキナーゼＭＫＫ４及びＭＫＫ７を発現するベクターの同時トランスフェクションによって達成した（Ｗｈｉｔｍａｒｓｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５７３頁（１９９９年）を参照のこと）。要するに、３×１０５個の細胞を、製造業者の指示に従って、ＤＯＴＡＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して３．５ｃｍの培養皿の中でプラスミドを用いてトランスフェクトした。ＧＡＬ−Ｊｕｎを含む実験のために、２０ｎｇのプラスミドを、１μｇのレポータープラスミドｐＦＲ−Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、及び０．５μｇのＭＫＫ４又はＭＫＫ７のいずれかの発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後、細胞培地を交換し、ＴＡＴ及びＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（１μＭ）を添加した。ルシフェラーゼ活性を、タンパク質含量に対する正規化後に、Ｐｒｏｍｅｇａの「二重レポーターシステム（Ｄｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）」を使用して１６時間後に測定した。ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドの追加は、ＪＮＫのＭＫＫ４及びＭＫＫ７媒介性活性後のｃ−Ｊｕｎの活性化をブロックした。ＨｅＬａ細胞は、ＪＮＫ１及びＪＮＫ２のアイソフォームを発現するが、ＪＮＫ３は発現しないので、本発明者らは、細胞をＪＮＫ３でトランスフェクトした。ここでも、ＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドは、ｃ−ＪｕｎのＪＮＫ２媒介性活性化を阻害した。
【０２０３】
実施例８
全Ｄレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチド及びそのバリアントの合成
本発明のペプチドは、自然なタンパク分解を妨げるために逆方向に合成された全Ｄアミノ酸ペプチドであってもよい（すなわち、全Ｄレトロ−インベルソペプチド）。本発明の全Ｄレトロ−インベルソペプチドは、天然のペプチドと同様の機能的な特性をペプチドに与え、成分のアミノ酸の側基は、天然のペプチドのアラインメントに相当するが、プロテアーゼ耐性骨格を保持する。
【０２０４】
本発明のレトロ−インベルソペプチドは、ペプチド鎖中でアミノ酸を結合することによってＤ−アミノ酸を使用して合成されるアナログであり、その結果、レトロ−インベルソペプチドアナログ中のアミノ酸の配列は、モデルとして役立つ選択されたペプチド中の配列と正確に対向する。例示するために、天然に存在するＴＡＴタンパク質（Ｌ−アミノ酸から形成される）が、配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ［配列番号５］を有する場合、このペプチドのレトロ−インベルソペプチドアナログ（Ｄ−アミノ酸から形成される）は、配列ＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ［配列番号６］を有する。レトロ−インベルソペプチドを形成するためにＤ−アミノ酸の鎖を合成する手順は、当該分野で公知である（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、７４４〜７４６頁（１９９４年）；Ｂｒａｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、６９２〜６９３頁（１９９４年）；Ｇｕｉｃｈａｒｄら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９、２０３０〜２０３９頁（１９９６年）を参照のこと）。具体的には、配列番号２、４、６、８、１１〜１２、１８、２０、２２及び２５〜２６によるレトロ−ペプチドは、古典的なＦ−ｍｏｃｋ合成によって生成し、更に、質量分析法によって分析した。それらをＨＰＬＣによって最終的に精製した。
【０２０５】
天然のペプチドによる固有の問題は、自然なプロテアーゼによる分解及び固有の免疫原性であるので、本発明の異種の二価又は異種の多価化合物は、所望のペプチドの「レトロ−インベルソアイソマー」を含むように調製する。したがって、自然なタンパク質分解からペプチドを保護することは、半減期を延長すること、及びペプチドを能動的に破壊する目的の免疫応答の程度を低下することの両方によって、特定の異種の二価又は異種の多価化合物の有効性を増大する。
【０２０６】
実施例９
全Ｄレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチド及びそのバリアントの長期の生物学的活性
実施例５に示されるように、天然のプロテアーゼによる分解からのＤ−ＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドの保護のため天然のＬ−アミノ酸アナログと比較した場合、ペプチドの異種コンジュゲート（上記のキメラ配列を参照のこと）を含むＤ−ＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）レトロ−インベルソに関しては、長期生物学的活性が予想される。
【０２０７】
Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドによるＩＬ−１β誘発性の膵臓のβ細胞死の阻害を分析した。βＴＣ−３細胞を、示したペプチド（１μＭ）の単回の添加を用いて上記のように３０分間インキュベートし、次いでＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。
【０２０８】
次いで、アポトーシス細胞を、ヨウ化プロピジウム及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２核染色の使用によって、ＩＬ−１βとのインキュベーションの２日後にカウントした。最小で１，０００個の細胞を、各々の実験についてカウントした。平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す（ｎ＝５）。Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドは、ＩＬ−１誘発性アポトーシスを、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドと同様の程度まで低下した。
【０２０９】
Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドによるＩＬ−１Ｐ誘発性細胞死の長期阻害もまた分析した。βＴＣ−３細胞を、示したペプチド（１μＭ）の単回の添加によって３０分間上記のようにインキュベートし、次いで、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、続いて、２日ごとにサイトカインを添加した。次いで、アポトーシス細胞を、ヨウ化プロピジウム及びＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２核染色の使用によってＩＬ−１とのインキュベーションの１５日後にカウントした。ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドの単回の添加は、長期間の保護をもたらさないことに注意のこと。最小で１，０００個の細胞を各々の実験についてカウントした。結果として、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）は、長期間（１５日）保護をもたらすことができたが、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）は、できなかった。
【０２１０】
実施例１０
本発明にしたがって使用されるＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドによるＪＮＫ転写因子の抑制
ゲル遅延アッセイは、ＡＰ−１二重標識プローブ（５’−ＣＧＣ  ＴＴＧ  ＡＴＧ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＡ−３’（配列番号１０１）で行った。示したとおり、５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを用いて１時間処置するか又はしなかったＨｅＬａ細胞核抽出物。本発明にしたがって使用されるＴＡＴ及びＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドを、ＴＮＦ−アルファの３０分前に添加した。特定のＡＰ−１のＤＮＡ複合体（非標識の特異的及び非特異的な競合因子との競合実験によって示される）を有するゲルの一部のみを示す。
【０２１１】
本発明にしたがって使用されるＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドは、ＴＮＦ−アルファの存在下でＡＰ−１  ＤＮＡ結合複合体の形成を低下する。
【０２１２】
実施例１１
オールインワンのウェルのアプローチを使用するＨｅｐＧ２細胞における内因性ＪＮＫ活性の阻害（図３を参照のこと）
ＨｅｐＧ２細胞を、実験前日に３’０００細胞／ウェルで播種した。次いで、インターロイキン−１β［ＩＬ−１ベータν）］又は腫瘍壊死因子［ＴＮＦアルファ］（ａ）のいずれかの漸増濃度を添加して、ＪＮＫを３０分間活性化した。細胞を、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．５％のＴｗｅｅｎ（ｐＨ７．４）中で溶解し、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ  ＪＮＫについて処理した。（ｂ）１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βによって誘発され、３８４ウェル／プレート（ｎ＝９６）で測定されたＪＮＫ活性のＺ’。（ｃ）化学ＪＮＫ阻害剤［スタウロスポリン及びＳＰ６００１２５］での内因性ＩＬ−１ベータ誘発性ＪＮＫ活性の阻害。（ｄ）配列番号９によるペプチド阻害剤Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）［ここでは、Ｌ−ＪＮＫｉ（ν）と略称）及び配列番号１１のＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）（ここではＤ−ＪＮＫｉと略称）及びＪＢＤ（ＴＡＴ配列なしのＬ−ＪＮＫＩに相当する）］のＩＬ−１β依存性ＪＮＫ活性に対する効果。全てのパネルは、３つの独立した実験の代表である（ｎ＝３）。
【０２１３】
方法：アルファスクリーンキナーゼアッセイ
原理：アルファスクリーンは、マイクロプレート形式で生体分子の相互作用を研究するために使用される非放射性ビーズに基づく技術である。アクロニムＡＬＰＨＡは、Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ａｓｓａｙの略である。これは、「ドナー」及び「アクセプター」のビーズを近位にさせ、次いで、化学的反応のカスケードが、シグナルの増幅を生じるように作用する生物学的相互作用に関与する。６８０ｎｍでのレーザー励起の際、「ドナー」ビーズ中の光増感剤（フタロシアニン）は、周囲の酸素を励起した一重項の状態に変換する。その４μ秒の半減期のうちに、一重項の酸素分子は、溶液中でほぼ２００ｎｍまで拡散し得、アクセプタービーズがその近位内にあれば、一重項酸素は、「アクセプター」ビーズ中のチオキセン誘導体と反応して、３７０ｎｍで化学発光を生じ、これが更に同じ「アクセプター」ビーズに含まれるフルオロフォアを活性化する。励起したフルオロフォアは引き続き、５２０〜６２０ｎｍで光を放射する。アクセプタービーズの非存在下で、一重項酸素は、基底状態に入り、シグナルは生成されない。
【０２１４】
キナーゼ試薬（Ｂ−ＧＳＴ−ｃＪｕｎ、抗Ｐ−ｃＪｕｎ抗体及び活性なＪＮＫ３）を最初に、キナーゼバッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１００μＭのＮａ３ＶＯ４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中に希釈し、ウェル（１５μｌ）に添加した。次いで、反応を、２３℃で１時間、１０μＭのＡＴＰの存在下でインキュベートした。検出は、１０μｌのビーズミックス（プロテインＡアクセプター２０μｇ／ｍｌ及びストレプトアビジンドナー２０μｇ／ｍｌ）の添加によって行い、検出バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭのＮａＣｌ、８０ｍＭのＥＤＴＡ、０．３％ＢＳＡ）中で希釈し、続いて暗所で、２３℃で更に１時間インキュベーションした。ＪＮＫの内因性活性の測定のために、キナーゼアッセイを、活性なＪＮＫ３を細胞溶解液で置き換え、かつ反応キナーゼ成分を、細胞溶解の後に添加した以外は、上記のとおり行った。Ｂ−ＧＳＴ−ｃｊｕｎ及びＰ−ｃＪｕｎ抗体を同じ濃度で使用したが、ＡＴＰは１０μＭの代わりに５０μＭで使用した。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎシグナルを、Ｆｕｓｉｏｎ又はＥｎ  Ｖｉｓｉｏｎ装置で直接分析した。
【０２１５】
実施例１２
野生型及び５ＸＦＡＤマウスにおける内在性ＪＮＫ活性に対する配列番号１１（ＸＧ−１０２）のＪＮＫ阻害剤の効果
アミロイド沈着の５ＸＦＡＤマウスモデル
軽度認知障害における、本明細書中に記載されるＪＮＫ阻害剤ペプチド、特に、配列番号１１（ＸＧ−１０２）のＪＮＫ阻害剤ペプチドの効果を決定するために、５ＸＦＡＤマウスモデルを用いた。
【０２１６】
５ＸＦＡＤマウスは、アミロイド沈着のトランスジェニックマウスモデルである。５ＸＦＡＤトランスジェニックマウスは、Ａβ４２過剰生産を行わせるに当っての付加物（ａｄｄｉｔｉｖｅ）である５つの家族性ＡＤ（ＦＡＤ）突然変異、即ち、２つのＦＡＤ突然変異、Ｍ１４６Ｌ及びＬ２８６Ｖを有するヒトＰＳ１と、スウェーデン（Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ）、フロリダ（Ｉ７１６Ｖ）、及びロンドン（Ｖ７１７Ｉ）家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）突然変異とを有する変異ヒトＡＰＰ（６９５）を過剰発現している。
【０２１７】
５ＸＦＡＤマウスは、１．５ヶ月間で神経内Ａβ４２蓄積、２ヶ月でアミロイド沈着、４月齢までに記憶障害を示すことが知られており、９月齢までに統計的に有意なニューロン損失を生じる。更に、若年の５ＸＦＡＤの脳では、神経内Ａβ４２標識ニューロンの神経細胞体及び近位樹状突起において活性化カスパーゼ３が観察された。老年の５ＸＦＡＤの脳では、ニューロンマーカークラスＩＩＩβ−チューブリンと共局在化する活性化カスパーゼ３陽性点状蓄積（アポトーシスによるニューロン損失を示唆する）が観察された。
【０２１８】
まとめると、５ＸＦＡＤマウスは、生来、認知症などのアルツハイマー病の症状を示さないが、老化の過程でこれらの症状を発現する点が重要である。したがって、このマウスは、アルツハイマー病（老齢）の研究に用いることができるのみならず、アルツハイマー病に起因する軽度認知障害（若齢）の研究にも用いることができる。しかしながら、軽度認知障害を研究するためには、５ＸＦＡＤマウスが完全なＡＤ症状を発現していない月齢又は年齢を選択する必要がある。
【０２１９】
実験設計及び方法
全６０マウス（２９匹が野生型（ＷＴ）、３１匹が５ＸＦＡＤ）を、次のように８つの異なる群に割り当てた：生理食塩水を３ヶ月間のＷＴ（ｎ＝８）、生理食塩水を３ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝７）、ＸＧ−１０２を３ヶ月間のＷＴ（ｎ＝８）、ＸＧ−１０２を３ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝８）、生理食塩水を６ヶ月間のＷＴ（ｎ＝７）、生理食塩水を６ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝７）、ＸＧ−１０２を６ヶ月間のＷＴ（ｎ＝６）、及びＸＧ−１０２を６ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝９）。
【０２２０】
２種類の処置を行った：すなわち、ＸＧ−１０２（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．投与、３週間ごとの１回用量１０ｍｇ／ｋｇ）及び生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、投与経路及びスケジュールはＸＧ−１０２群に対応）。処置期間は、３ヶ月間又は６ヶ月間とし、３月齢のマウスで始めた。処置及び試験後、マウスを６月齢（３ヶ月間の処置期間）又は９月齢（６ヶ月間の処置期間）で犠死させた。犠死後、分析のため脳を除去した。
【０２２１】
ＪＮＫ／ｐ−ＪＮＫレベルは、抗ＪＮＫ抗体及び抗ホスホＪＮＫ抗体を用いるイムノブロット（皮質と海馬）で測定した。タンパク質サンプル（３０〜４０μｇ）を、４〜１５％Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ＴＧＸゲル（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ハーキュリーズ、ＣＡ、ＵＳＡ）上で分離させ、次いで、ニトロセルロース膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にエレクトロブロットした。膜をＴＢＳ中５％乳でブロッキングし、次いで、一次抗体と一晩インキュベートし、最後に、ＩＲ  Ｄｙｅ８００又は７００（Ａｚｕｒｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、ダブリン、ＣＡ、ＵＳＡ）とインキュベートした。結合したタンパク質を、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、リンカーン、ＮＥ、ＵＳＡ）で可視化した。得られたデータを、二元配置ＡＮＯＶＡで統計解析した後、事後多重比較試験、Ｔｕｋｅｙの検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を行った。
【０２２２】
結果
結果を図４に示す。
一般に、５ＸＦＡＤと野生型マウスとの間で、ＪＮＫ活性化（ｐＪＮＫ／ＪＮＫ比）に有意差は検出できなかった。このことは、５ＸＦＡＤマウスがアルツハイマー病症状を発現しなかったことを示す。これは、ＡＤでは、ｐＪＮＫ／ＪＮＫ比の上昇が予想される一方で、認知障害なし及び軽度認知障害（ＭＣＩ）では、そのようなｐＪＮＫ／ＪＮＫ比の上昇が観察されないからである（ｃｆ．Ｅ．Ｊ．Ｍｕｆｓｏｎら、２０１２、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ７１（１１）：１０１８−１０２９頁、特に、Ｍｕｆｓｏｎらの図５）。
【０２２３】
ＷＴ及び５ＸＦＡＤのマウスはいずれも、同じ遺伝子型の６月齢マウスに比べて９月齢で、上昇したＪＮＫ活性レベル（リン酸化ＪＮＫ／ＪＮＫ全体の比で測定）を示した。これは、老化の過程で一般に上昇したＪＮＫ活性を示し、野生型動物においても観察されたので、アルツハイマー病症状とは独立している。
【０２２４】
６ヶ月間のＸＧ−１０２処置により、ＪＮＫ活性化レベルが、ＷＴ及び５ＸＦＡＤマウスの両方で皮質（それぞれ、−５９．６％及び−３９．９％、図４Ａ）と海馬（それぞれ、−４３．７％及び−２２．８％、図４Ｂ）で低下した。更に、ＸＧ−１０２で３ヶ月間処置した５ＸＦＡＤマウスの海馬で、ＪＮＫ活性化レベルの３０．４％の低下が観察された（図４Ｂ）。
【０２２５】
まとめると、これらのデータは、ＪＮＫペプチド阻害剤ＸＧ−１０２（配列番号１１）による処置が、ＷＴ及び５ＸＦＡＤマウスにおいてＪＮＫ活性化レベルに対する強い阻害作用を有することを示す。
【０２２６】
実施例１３
野生型及び５ＸＦＡＤマウスにおけるｃ−Ｊｕｎ活性に対する配列番号１１（ＸＧ−１０２）のＪＮＫ阻害剤の効果
【０２２７】
実験設計及び方法
実施例１２に記載の５ＸＦＡＤマウスを用いた。
全６０マウス（２９匹が野生型（ＷＴ）、３１匹が５ＸＦＡＤ）を、次のように８つの異なる群に割り当てた：生理食塩水を３ヶ月間のＷＴ（ｎ＝８）、生理食塩水を３ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝７）、ＸＧ−１０２を３ヶ月間のＷＴ（ｎ＝８）、ＸＧ−１０２を３ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝８）、生理食塩水を６ヶ月間のＷＴ（ｎ＝７）、生理食塩水を６ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝７）、ＸＧ−１０２を６ヶ月間のＷＴ（ｎ＝６）、及びＸＧ−１０２を６ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝９）。
【０２２８】
２種類の処置を行った：すなわち、ＸＧ−１０２（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．投与、３週間ごとの１回用量１０ｍｇ／ｋｇ）及び生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、投与経路及びスケジュールはＸＧ−１０２群に対応）。処置期間は、３ヶ月間又は６ヶ月間とし、３月齢のマウスで始めた。処置及び試験後、マウスを６月齢（３ヶ月間の処置期間）又は９月齢（６ヶ月間の処置期間）で犠死させた。犠死後、分析のため脳を除去した。
【０２２９】
Ｐｃ−ＪｕｎＳｅｒ６３／ｃ−Ｊｕｎレベルを、抗ｃＪｕｎ（ＪＮＫの主要標的、アポトーシストリガ）抗体と抗ホスホｃＪｕｎ［Ｓｅｒ６３］（ＪＮＫによってリン酸化された位置）抗体とを用いるイムノブロット（皮質と海馬）で測定した。タンパク質サンプル（３０〜４０μｇ）を、４〜１５％Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ＴＧＸゲル（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ハーキュリーズ、ＣＡ、ＵＳＡ）上で分離させ、次いで、ニトロセルロース膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にエレクトロブロットした。膜をＴＢＳ中５％乳でブロッキングし、次いで、一次抗体と一晩インキュベートし、最後に、ＩＲ  Ｄｙｅ８００又は７００（Ａｚｕｒｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、ダブリン、ＣＡ、ＵＳＡ）とインキュベートした。結合タンパク質を、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、リンカーン、ＮＥ、ＵＳＡ）で可視化した。得られたデータを、二元配置ＡＮＯＶＡで統計解析した後、事後多重比較試験、Ｔｕｋｅｙの検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を行った。
【０２３０】
結果
結果を図５に示す。
５ＸＦＡＤマウスは、対応する月齢のＷＴマウスに比べて、６月齢と９月齢のそれぞれで、皮質（それぞれ、＋１２９％及び＋２６０％、図５Ａ）と海馬（それぞれ、＋１７２％及び＋３２１％、図５Ｂ）において、ｃＪｕｎ活性化レベルの上昇を示した。５ＸＦＡＤマウスにおける３ヶ月間のＸＧ−１０２処置は、皮質におけるｃＪｕｎ活性化レベルの３４．９％の低下を示した。５ＸＦＡＤマウスにおける６ヶ月間の処置は、皮質と海馬におけるｃＪｕｎ活性化レベルの大きな低下を示した（それぞれ、−６４％及び−４２．１％）。
【０２３１】
実施例１４
野生型及び５ＸＦＡＤマウスにおけるアミロイドβ量に対する配列番号１１（ＸＧ−１０２）のＪＮＫ阻害剤の効果
【０２３２】
実験設計及び方法
実施例１２に記載の５ＸＦＡＤマウスを用いた。
３月齢の１５匹の５ＸＦＡＤマウスを、２つの異なる群：生理食塩水の５ＸＦＡＤ（ｎ＝７）とＸＧ−１０２の５ＸＦＡＤ（ｎ＝８）に割り当てた。したがって、５ＸＦＡＤマウスをＸＧ−１０２（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．投与、３週間ごとの１回用量１０ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、投与経路及びスケジュールはＸＧ−１０２群に対応）のいずれかで３ヶ月間処置した。処置及び試験後、マウスを犠死させた（６月齢）。犠死後、分析のため脳を除去した。
【０２３３】
皮質の層５におけるアミロイドβ４２（Ａβ４２）のレベルを測定するために、マウス由来の矢状脳断片を、２つの抗ヒトＡβ４２クローンモノクローナル抗体（モノクローナルマウス抗ヒトＡβ４２クローン６Ｆ／３Ｄ、Ｄａｋｏ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ、ＣＡ、ＵＳＡ、ＡＰＰも結合）及びモノクローナルマウス抗ヒトＡβ４２クローン６Ｃ３（ＭＯＡＢ−２）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ、ＵＳＡ、Ａβ４２特異的）をインキュベートした。パラフィン処理した脳を、５μｍでミクロトーム装置上で矢状断片とした。断片を、キシレン中で脱パラフィン処理し、徐々に濃度が低下するエタノール中でリハイドレートした。断片をクエン酸バッファー中で加熱し、次いで、過酸化水素で処理した。断片を、一次抗体と一晩インキュベートする前に、ブロッキング溶液中で処理した。ビオチン化抗ウサギ及び抗マウス（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、メイン、ＵＳＡ）を二次抗体として用いた。染色（試験された合計面積のうちの染色された％面積）の定量を、Ｌａｙｅｒ５皮質及び海馬台において、ＩｍａｇｅＪ  １．４８ｖソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ＵＳＡにより開発）によって行った。得られたデータを、二元配置ＡＮＯＶＡで統計解析した後、事後多重比較試験、Ｔｕｋｅｙの検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を行った。
【０２３４】
結果
結果を図６に示す。生理食塩水で処置した５ＸＦＡＤマウスに比べて、ＸＧ−１０２で処置した５ＸＦＡＤマウスにおいて、アミロイド量の２９．９％の低下が観察された。
【０２３５】
実施例１５
野生型及び５ＸＦＡＤマウスにおけるｐＡＰＰレベルに対する配列番号１１（ＸＧ−１０２）のＪＮＫ阻害剤の効果
【０２３６】
実験設計及び方法
実施例１２に記載の５ＸＦＡＤマウスを用いた。
全６０マウス（２９匹が野生型（ＷＴ）、３１匹が５ＸＦＡＤ）を、次のように８つの異なる群に割り当てた：生理食塩水を３ヶ月間のＷＴ（ｎ＝８）、生理食塩水を３ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝７）、ＸＧ−１０２を３ヶ月間のＷＴ（ｎ＝８）、ＸＧ−１０２を３ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝８）、生理食塩水を６ヶ月間のＷＴ（ｎ＝７）、生理食塩水を６ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝７）、ＸＧ−１０２を６ヶ月間のＷＴ（ｎ＝６）、及びＸＧ−１０２を６ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝９）。
【０２３７】
２種類の処置を行った：すなわち、ＸＧ−１０２（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．投与、３週間ごとの１回用量１０ｍｇ／ｋｇ）及び生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、投与経路及びスケジュールはＸＧ−１０２群に対応）。処置期間は、３ヶ月間又は６ヶ月間とし、３月齢のマウスで始めた。処置及び試験後、マウスを６月齢（３ヶ月間の処置期間）又は９月齢（６ヶ月間の処置期間）で犠死させた。犠死後、分析のため脳を除去した。
【０２３８】
海馬におけるｐＡＰＰ（リン酸化アミロイド前駆体タンパク質）のレベルを、ウサギモノクローナル抗ｐＡＰＰ［Ｔｈｒ６６８］、クローンＤ９０Ｂ８（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ダンバース、ＵＳＡ）を用いるイムノブロットで測定した。タンパク質サンプル（３０〜４０μｇ）を、４〜１５％Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ＴＧＸゲル（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ハーキュリーズ、ＣＡ、ＵＳＡ）上で分離させ、次いで、ニトロセルロース膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にエレクトロブロットした。膜をＴＢＳ中５％乳でブロッキングし、次いで、一次抗体と一晩インキュベートし、最後に、ＩＲ  Ｄｙｅ８００又は７００（Ａｚｕｒｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、ダブリン、ＣＡ、ＵＳＡ）とインキュベートした。結合タンパク質を、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、リンカーン、ＮＥ、ＵＳＡ）で可視化した。得られたデータを、二元配置ＡＮＯＶＡで統計解析した後、事後多重比較試験、Ｔｕｋｅｙの検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を行った。
【０２３９】
結果
結果を図７に示す。ＸＧ−１０２で処置した５ＸＦＡＤマウスの海馬におけるｐＡＰＰのレベルは、生理食塩水で処置した５ＸＦＡＤマウスに比べて、３ヶ月間の処置後に僅かな低下を示し、６ヶ月間処置後に３６．２％の大きな低下を示した。
【０２４０】
実施例１６
野生型及び５ＸＦＡＤマウスにおける活性化カスパーゼ３レベルに対する配列番号１１（ＸＧ−１０２）のＪＮＫ阻害剤の効果
【０２４１】
実験設計及び方法
実施例１２に記載の５ＸＦＡＤマウスを用いた。
全６０マウス（２９匹が野生型（ＷＴ）、３１匹が５ＸＦＡＤ）を、次のように８つの異なる群に割り当てた：生理食塩水を３ヶ月間のＷＴ（ｎ＝８）、生理食塩水を３ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝７）、ＸＧ−１０２を３ヶ月間のＷＴ（ｎ＝８）、ＸＧ−１０２を３ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝８）、生理食塩水を６ヶ月間のＷＴ（ｎ＝７）、生理食塩水を６ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝７）、ＸＧ−１０２を６ヶ月間のＷＴ（ｎ＝６）、及びＸＧ−１０２を６ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝９）。
【０２４２】
２種類の処置を行った：すなわち、ＸＧ−１０２（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．投与、３週間ごとの１回用量１０ｍｇ／ｋｇ）及び生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、投与経路及びスケジュールはＸＧ−１０２群に対応）。処置期間は、３ヶ月間又は６ヶ月間とし、３月齢のマウスで始めた。処置及び試験後、マウスを６月齢（３ヶ月間の処置期間）又は９月齢（６ヶ月間の処置期間）で犠死させた。犠死後、分析のため脳を除去した。
【０２４３】
皮質及び海馬における活性化カスパーゼ３（分解されたカスパーゼ３）のレベルを、抗分解カスパーゼ３抗体（ウサギポリクローナル抗分解カスパーゼ３、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ダンバース、ＵＳＡ）と共にインキュベートしたマウス由来の矢状脳断片に対するイムノブロットによって測定した。タンパク質サンプル（３０〜４０μｇ）を、４〜１５％Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ＴＧＸゲル（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ハーキュリーズ、ＣＡ、ＵＳＡ）上で分離させ、次いで、ニトロセルロース膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にエレクトロブロットした。膜をＴＢＳ中５％乳でブロッキングし、次いで、一次抗体と一晩インキュベートし、最後に、ＩＲ  Ｄｙｅ８００又は７００（Ａｚｕｒｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、ダブリン、ＣＡ、ＵＳＡ）とインキュベートした。結合タンパク質を、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、リンカーン、ＮＥ、ＵＳＡ）で可視化した。得られたデータを、二元配置ＡＮＯＶＡで統計解析した後、事後多重比較試験、Ｔｕｋｅｙの検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を行った。
【０２４４】
結果
結果を図８に示す。カスパーゼ３の活性型（分解されたカスパーゼ３）のレベルは、対応する月齢のＷＴマウスに比べて、６月齢及び９月齢のそれぞれで（皮質でそれぞれ、＋７５％及び＋４０％、海馬でそれぞれ、＋９８％及び＋３６％）生理食塩水処置５ＸＦＡＤマウスの皮質（図８Ａ）と海馬（図８Ｂ）で有意に上昇した。しかしながら、ＸＧ−１０２による処置は、５ＸＦＡＤマウスにおける活性化カスパーゼ３レベルを低下させ、最も大きな減少（分解されたカスパーゼ３レベルの５０．８％）が、ＸＧ−１０２で６ヶ月間処置した５ＸＦＡＤマウスの皮質で観察された。
【０２４５】
実施例１７
野生型及び５ＸＦＡＤマウスにおけるｐＢｃｌ２［Ｓｅｒ８７］レベルに対する配列番号１１（ＸＧ−１０２）のＪＮＫ阻害剤の効果
【０２４６】
実験設計及び方法
実施例１２に記載の５ＸＦＡＤマウスを用いた。
全６０マウス（２９匹が野生型（ＷＴ）、３１匹が５ＸＦＡＤ）を、次のように８つの異なる群に割り当てた：生理食塩水を３ヶ月間のＷＴ（ｎ＝８）、生理食塩水を３ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝７）、ＸＧ−１０２を３ヶ月間のＷＴ（ｎ＝８）、ＸＧ−１０２を３ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝８）、生理食塩水を６ヶ月間のＷＴ（ｎ＝７）、生理食塩水を６ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝７）、ＸＧ−１０２を６ヶ月間のＷＴ（ｎ＝６）、及びＸＧ−１０２を６ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝９）。
【０２４７】
２種類の処置を行った：すなわち、ＸＧ−１０２（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．投与、３週間ごとの１回用量１０ｍｇ／ｋｇ）及び生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、投与経路及びスケジュールはＸＧ−１０２群に対応）。処置期間は、３ヶ月間又は６ヶ月間とし、３月齢のマウスで始めた。処置及び試験後、マウスを６月齢（３ヶ月間の処置期間）又は９月齢（６ヶ月間の処置期間）で犠死させた。犠死後、分析のため脳を除去した。
【０２４８】
皮質及び海馬におけるｐＢｃｌ２［Ｓｅｒ８７］のレベルを、抗ｐＢｃｌ２  ［Ｓｅｒ８７］抗体（マウスモノクローナル抗ｐＢｃｌ−２［Ｓｅｒ８７］、クローンＣ−２、サンタクルーズ、ダンバース、ＵＳＡ）と共にインキュベートしたマウス由来の矢状脳断片に対するイムノブロットによって測定した。タンパク質サンプル（３０〜４０μｇ）を、４〜１５％Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ＴＧＸゲル（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ハーキュリーズ、ＣＡ、ＵＳＡ）上で分離させ、次いで、ニトロセルロース膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にエレクトロブロットした。膜をＴＢＳ中５％乳でブロッキングし、次いで、一次抗体と一晩インキュベートし、最後に、ＩＲ  Ｄｙｅ８００又は７００（Ａｚｕｒｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、ダブリン、ＣＡ、ＵＳＡ）とインキュベートした。結合タンパク質を、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、リンカーン、ＮＥ、ＵＳＡ）で可視化した。得られたデータを、二元配置ＡＮＯＶＡで統計解析した後、事後多重比較試験、Ｔｕｋｅｙの検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を行った。
【０２４９】
結果
結果を図９に示す。セリン８７上のＢｃｌ２のリン酸化により、Ｂｃｌ２の抗アポトーシスの役割が低下する。セリン８７上でリン酸化したＢｃｌ２（ｐＢＣＬ［Ｓｅｒ８７］）のレベルは、対応する月齢のＷＴマウスに比べて、６月齢及び９月齢のそれぞれで（皮質でそれぞれ、＋２６３％及び＋４１５％、海馬でそれぞれ、＋３０２％及び＋８０７％）生理食塩水処置５ＸＦＡＤマウスの皮質（図９Ａ）と海馬（図９Ｂ）で有意に上昇した。しかしながら、ＸＧ−１０２による処置は、５ＸＦＡＤマウスにおけるｐＢＣＬ［Ｓｅｒ８７］レベルを著しく低下させた。
【０２５０】
実施例１８
野生型及び５ＸＦＡＤマウスにおけるカスパーゼ３活性に対する配列番号１１（ＸＧ−１０２）のＪＮＫ阻害剤の効果
【０２５１】
実験設計及び方法
実施例１２に記載の５ＸＦＡＤマウスを用いた。
全６０マウス（２９匹が野生型（ＷＴ）、３１匹が５ＸＦＡＤ）を、次のように８つの異なる群に割り当てた：生理食塩水を３ヶ月間のＷＴ（ｎ＝８）、生理食塩水を３ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝７）、ＸＧ−１０２を３ヶ月間のＷＴ（ｎ＝８）、ＸＧ−１０２を３ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝８）、生理食塩水を６ヶ月間のＷＴ（ｎ＝７）、生理食塩水を６ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝７）、ＸＧ−１０２を６ヶ月間のＷＴ（ｎ＝６）、及びＸＧ−１０２を６ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝９）。
【０２５２】
２種類の処置を行った：すなわち、ＸＧ−１０２（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．投与、３週間ごとの１回用量１０ｍｇ／ｋｇ）及び生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、投与経路及びスケジュールはＸＧ−１０２群に対応）。処置期間は、３ヶ月間又は６ヶ月間とし、３月齢のマウスで始めた。処置及び試験後、マウスを６月齢（３ヶ月間の処置期間）又は９月齢（６ヶ月間の処置期間）で犠死させた。犠死後、分析のため脳を除去した。
【０２５３】
皮質及び海馬におけるカスパーゼ３の活性を測定するために、酵素アッセイを行った。カスパーゼ３活性を、カスパーゼ３アッセイキット試薬及びプロトコル（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、ＵＫ）を用いて測定した。カスパーゼ３アッセイキットは、標識された基質ＤＥＶＤ−ｐＮＡからの、カスパーゼ３による分解後のクロモフォアｐ−ニトロアニリン（ｐ−ＮＡ）の分光光度検出に基づいている。ｐ−ＮＡ発光は、４００−又は４０５ｎｍで分光光度計又はマイクロタイタープレートリーダを用いて定量できた。得られたデータを、二元配置ＡＮＯＶＡで統計解析した後、事後多重比較試験、Ｔｕｋｅｙの検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を行った。
【０２５４】
結果
結果を図１０に示す。３ヶ月間の処置後（６月齢マウス）、群間の違いは観察されなかった。即ち、５ＸＦＡＤと野生型マウスとの間にも、生理食塩水処置又はＸＧ−１０２処置の間にも違いは観察されなかった。しかしながら、９月齢の５ＸＦＡＤマウスでは、対応する月齢の野生型動物と比べて、カスパーゼ３活性が、皮質（＋５９％、図１０Ａ）と海馬（＋２０７％、図１０Ｂ）の両方で有意に上昇した。ＸＧ−１０２による処置は、５ＸＦＡＤマウスでこの効果を逆転させ、生理食塩水処置５ＸＦＡＤマウスに比べて、カスパーゼ３活性を有意に低下させた（皮質及び海馬でそれぞれ、−３７．７％及び−６０．６％）。
【０２５５】
まとめると、カスパーゼ３の活性型及び活性のレベル（これは、神経細胞アポトーシスに関与している）及びｐＢｃｌ２［Ｓｅｒ８７］のレベルが５ＸＦＡＤマウスで上昇すると結論付けることができる。ＸＧ−１０２による処置は、カスパーゼ３の発現及び活性レベルの両方と、ｐＢｃｌ２［Ｓｅｒ８７］の発現レベルとを低下させるのに有効である。したがって、ＸＧ−１０２による処置は、重要な神経細胞死経路を低下させるのに有効である。結論として、ＸＧ−１０２は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける効率的な神経保護作用を有する。
【０２５６】
実施例１９
野生型及び５ＸＦＡＤマウスにおけるＩＬ１−βレベルに対する配列番号１１（ＸＧ−１０２）のＪＮＫ阻害剤の効果
【０２５７】
神経炎症のレベルを評価するために、サイトカインＩＬ１−βに対するＸＧ−１０２の効果を５ＸＦＡＤ及び野生型マウスにおいて測定した。
【０２５８】
実験設計及び方法
実施例１２に記載の５ＸＦＡＤマウスを用いた。
全６０マウス（２９匹が野生型（ＷＴ）、３１匹が５ＸＦＡＤ）を、次のように８つの異なる群に割り当てた：生理食塩水を３ヶ月間のＷＴ（ｎ＝８）、生理食塩水を３ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝７）、ＸＧ−１０２を３ヶ月間のＷＴ（ｎ＝８）、ＸＧ−１０２を３ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝８）、生理食塩水を６ヶ月間のＷＴ（ｎ＝７）、生理食塩水を６ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝７）、ＸＧ−１０２を６ヶ月間のＷＴ（ｎ＝６）、及びＸＧ−１０２を６ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝９）。
【０２５９】
２種類の処置を行った：すなわち、ＸＧ−１０２（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．投与、３週間ごとの１回用量１０ｍｇ／ｋｇ）及び生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、投与経路及びスケジュールはＸＧ−１０２群に対応）。処置期間は、３ヶ月間又は６ヶ月間とし、３月齢のマウスで始めた。処置及び試験後、マウスを６月齢（３ヶ月間の処置期間）又は９月齢（６ヶ月間の処置期間）で犠死させた。犠死後、分析のため脳を除去した。
【０２６０】
皮質におけるサイトカインＩＬ１−βのレベルを測定するために、ＬＵＭＩＮＥＸアッセイを行った。特異的な捕捉抗体がプレコートされた６．５μｍマグネットビーズにサンプルを添加した。抗体は、目的のアナライトに結合する。このアナライトに特異的なビオチン化検出抗体を添加し、次いで、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートストレプトアビジンを添加した。２つのスペクトル的に区別される発光ダイオード（ＬＥＤ）がビーズに光照射するＭａｇＰｉｘ機器で、ビーズを読み取った。１つのＬＥＤでアナライトを同定し、２つ目のＬＥＤでＰＥ由来シグナルの強度を測定した。得られたデータを、二元配置ＡＮＯＶＡで統計解析した後、事後多重比較試験、Ｔｕｋｅｙの検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を行った。
【０２６１】
結果
結果を図１１に示す。３ヶ月間の処置後（６月齢マウス）、群間の違いは観察されなかった。即ち、５ＸＦＡＤと野生型マウスとの間にも、生理食塩水処置又はＸＧ−１０２処置の間にも違いは観察されなかった。しかしながら、６ヶ月間の処置後、ＸＧ−１０２で処置された５ＸＦＡＤマウスでＩＬ−１β発現レベルの３１．４％の低下が観察された（生理食塩水処置５ＸＦＡＤマウスに比べて）。
【０２６２】
実施例２０
野生型及び５ＸＦＡＤマウスにおける空間及び作業記憶に対する配列番号１１（ＸＧ−１０２）のＪＮＫ阻害剤の効果
空間及び手続き作業記憶（海馬）を検証するために、マウスをＹ迷路タスクで試験した。
【０２６３】
実験設計及び方法
実施例１２に記載の５ＸＦＡＤマウスを用いた。
全６０マウス（２９匹が野生型（ＷＴ）、３１匹が５ＸＦＡＤ）を、次のように８つの異なる群に割り当てた：生理食塩水を３ヶ月間のＷＴ（ｎ＝８）、生理食塩水を３ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝７）、ＸＧ−１０２を３ヶ月間のＷＴ（ｎ＝８）、ＸＧ−１０２を３ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝８）、生理食塩水を６ヶ月間のＷＴ（ｎ＝７）、生理食塩水を６ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝７）、ＸＧ−１０２を６ヶ月間のＷＴ（ｎ＝６）、及びＸＧ−１０２を６ヶ月間の５ＸＦＡＤ（ｎ＝９）。
【０２６４】
２種類の処置を行った：すなわち、ＸＧ−１０２（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．投与、３週間ごとの１回用量１０ｍｇ／ｋｇ）及び生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ、投与経路及びスケジュールはＸＧ−１０２群に対応）。処置期間は、３ヶ月間又は６ヶ月間とし、３月齢のマウスで始めた。処置及び試験後、マウスを６月齢（３ヶ月間の処置期間）又は９月齢（６ヶ月間の処置期間）で犠死させた。犠死後、分析のため脳を除去した。
【０２６５】
空間及び作業記憶を測定するために、Ｙ迷路自発的交替行動を用いた。Ｙ迷路自発的交替行動は、げっ歯類の新しい環境を探索する意思を測定するための行動試験である。マウスなどのげっ歯類は、通常、過去に訪れたアームに戻るよりも、迷路の新しいアームを調べることを好む。多数回アームに進入する間に、マウスは、訪問がより最近ではないアームに進入する傾向を示す。アームに進入した回数と、トリアド（ｔｒｉａｄｓ）の数を記録し、交替のパーセンテージを算出する。海馬、中隔野、前脳基底核、及び前頭前皮質脳などの多くの部分がこのタスクに関連する。
【０２６６】
Ｙ迷路自発的交替行動を試験するために、各マウスをＹ迷路の中心に置いた。Ｙ迷路は、長さ２７ｃｍ、幅７ｃｍ、高さ２０ｃｍの３本の等しいアームを有する。８分間の試験中、迷路の３本のアーム間の自発的交替行動を測定した。交替行動のパーセンテージは、アームへの進入回数の総数から２を引いた値で除したトリアドへの進入回数に１００を乗じた値に対応した。得られたデータを、二元配置ＡＮＯＶＡで統計解析した後、事後多重比較試験、Ｔｕｋｅｙの検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を行った。
【０２６７】
結果
結果を図１２に示す。対応する月齢の野生型マウスに比べ、６月齢及び９月齢の５ＸＦＡＤマウスの空間及び手続き作業記憶の有意な低下が観察された（それぞれ、−３０．３％及び−２３．８％）。ＸＧ−１０２で６ヶ月間処置した５ＸＦＡＤマウスは、その空間及び手続き作業記憶の３２％の改善を示した。
【図１】
2018525337.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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