(57)【要約】本発明は、腫瘍特異的Ｔ細胞調製物を提供するための方法に関し、以下の工程：ａ  腫瘍特異的Ｔ細胞クローンを以下により選択する工程：  −  患者から得られた腫瘍試料を提供する工程；  −  核酸単離工程において該腫瘍試料から核酸調製物を単離する工程；  −  該核酸調製物から複数のＴ細胞受容体核酸配列を得る工程又は該複数のＴ細胞受容体核酸配列によってコードされる複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列を得る工程；  −  配列選択工程において、前記複数のＴ細胞受容体核酸配列から腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列を選択する工程、又は前記複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列から腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列を選択する工程；ｂ  腫瘍特異的Ｔ細胞クローンを以下により選別する工程：  −  前記患者から得られたリンパ球調製物を提供する工程；  −  前記選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列又は前記選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列を含む細胞を、単離工程において前記リンパ球調製物から単離する工程を含む方法に関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍特異的Ｔ細胞調製物を提供するための方法であって、以下の工程：
ａ  腫瘍特異的Ｔ細胞クローンを以下により選択する工程：
−  患者から得られた腫瘍試料を提供する工程；
−  核酸単離工程において該腫瘍試料から核酸調製物を単離する工程；
−  該核酸調製物から複数のＴ細胞受容体核酸配列を得る工程又は該複数のＴ細胞受容体核酸配列によってコードされる複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列を得る工程；
−  配列選択工程において、前記複数のＴ細胞受容体核酸配列から腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列を選択する工程、又は前記複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列から腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列を選択する工程；
ｂ  腫瘍特異的Ｔ細胞クローンを以下により選別する工程：
−  前記患者から得られたリンパ球調製物を提供する工程；
−  前記選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列又は前記選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列を含む細胞を、単離工程において前記リンパ球調製物から単離する工程
を含む、腫瘍特異的Ｔ細胞調製物を提供するための方法。
【請求項２】
前記単離工程は、以下の工程：
−  前記リンパ球調製物を、前記選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列又は前記選択されたＴ細胞受容体アミノ酸配列に対応するＴ細胞受容体のＶセグメント内に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合することができる反応性リガンドと、接触させる工程であって、前記リガンドが検出可能な標識に結合し、及び特に前記リガンドは、１０−７、１０−８又は１０−９ｍｏｌ／ｌ以下の解離定数で前記アミノ酸配列に結合する工程、及び
−  前記リンパ球調製物から、前記検出可能な標識を有するＴ細胞を単離する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単離工程は、以下の工程：
−  前記リンパ球調製物を、前記選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列に特異的に結合する核酸プローブと接触させる工程であって、前記核酸プローブが検出可能な標識に結合する工程、
−  前記リンパ球調製物から、前記検出可能な標識を有するＴ細胞を単離する工程
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記単離工程は、以下の工程：
−  前記リンパ球調製物を複数の画分に分離する、分離工程、
−  前記複数の画分に含まれる細胞を細胞培養条件下で増殖させる、増殖工程、及び
−  前記選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列又は選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列を含む前記複数の画分の少なくとも１つの画分が選択される、選択工程
を含み、及び
前記単離工程は、任意で、
−  前記選択された前記複数の画分のうちの少なくとも１つの画分に対して、前記分離工程、前記増殖工程及び前記選択工程を、繰り返す工程
をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記選択工程は、以下の工程：
−  前記複数の画分を、前記選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列に特異的に結合する核酸プローブと接触させ、ここで前記核酸プローブが検出可能な標識に結合しており、かつ前記選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体配列を含む画分を同定する工程、又は
−  前記複数の画分からＴ細胞受容体核酸配列を得て、及び前記選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列を含む画分を同定する工程
を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記配列選択工程は、以下の工程：
−  前記複数のＴ細胞受容体核酸配列又は前記複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列を整列させる工程；
−  前記複数のＴ細胞受容体核酸配列に含まれるＴ細胞受容体核酸配列、前記複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列に含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列を、複数の腫瘍試料クローン型に分類する工程であって、ここで、特定のクローン型内に含まれる核酸配列又はアミノ酸配列は、実質同一又は同一の配列を表す工程；
−  各クローン型に関連するＴ細胞受容体核酸配列の数を決定し、又は各クローン型に関連するＴ細胞受容体アミノ酸配列の数を決定し、それにより前記クローン型の各々についてクローン型頻度を取得する工程；
−  前記複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで前記腫瘍特異的クローン型は、前記複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型１００個のうちの１つである、及び／又は前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、前記複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度１００個のクローン型のうちの前記１つの腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体核酸配列によりコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるＴ細胞受容体アミノ酸配列を含む、前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である工程、及び
−  前記選択された腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体核酸配列を、前記腫瘍特異的受容体核酸配列として選択する工程、又は前記選択された腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体アミノ酸配列を、前記腫瘍特異的アミノ酸配列として選択する工程
を含む、請求項１〜５のいずれか一項を含む方法。
【請求項７】
更に以下の工程：
−  前記患者から得られた非腫瘍試料を提供する工程；
−  核酸単離工程において前記非腫瘍試料から核酸調製物を単離する工程；
−  前記核酸調製物から複数のＴ細胞受容体核酸配列を得て、又は該Ｔ細胞受容体核酸配列によってコードされる複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列を得て、複数の非腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列又は複数の非腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列を取得する工程；
−  前記複数の非腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列又は前記複数の非腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列を整列させる工程；
−  前記複数の非腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列又は前記複数の非腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列に含まれるＴ細胞受容体核酸配列を、複数の非腫瘍特異的クローン型に分類する工程であって、ここで、特定のクローン型に含まれるＴ細胞受容体核酸配列又はＴ細胞受容体アミノ酸配列は、同一又は実質的に同一の配列を表す工程、
−  前記複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・  前記腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型１００個のうちの１つであるか、又は該複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、前記複数の腫瘍試料クローン型の１００個の最大頻度のクローン型のうちの前記１つの腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体核酸配列によりコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるＴ細胞アミノ酸配列を含む、前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び
・  前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの１００個の最大頻度のクローン型のうちの前記１つの腫瘍特異的クローン型は、前記非腫瘍試料中には存在しないか、又は前記腫瘍特異的クローン型の頻度の２０％、１５％、１０％、又は５％以下の頻度を示す非腫瘍特異的クローン型に割り当てることができる、工程
を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
更に以下の工程：
−  前記患者から得られた血液試料を提供する工程；
−  核酸単離工程において該血液試料から核酸調製物を単離する工程；
−  該核酸調製物から複数のＴ細胞受容体核酸配列、又は該複数のＴ細胞受容体核酸配列によってコードされる複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列を得る工程； 
−  該複数のＴ細胞受容体核酸配列又は該複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列を整列させる工程；
−  該複数のＴ細胞受容体核酸配列に含まれるＴ細胞受容体核酸配列又はＴ細胞受容体アミノ酸配列を、複数の血液試料クローン型に分類する工程であって、ここで特定のクローン型内に含まれるＴ細胞受容体核酸配列又はＴ細胞受容体アミノ酸配列は同一又は実質的に同一の配列を表す工程；
−  前記複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・  前記腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料のうち最大頻度のクローン型１００個のうちの１つであるか、又は該複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、該複数の腫瘍試料クローン型の１００個の最大頻度のクローン型のうちの前記１つの腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体核酸配列によりコードされるＴ細胞受容体アミノ酸と同一又は実質的に同一であるＴ細胞受容体アミノ酸配列を含む、前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び
・  前記複数の腫瘍試料のうちの１００個の最大頻度のクローン型のうちの前記１つの腫瘍特異的クローン型は、前記１つの腫瘍特異的クローン型の頻度未満の頻度を示す血液試料クローン型に割り当てることができる、工程
を含む、請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
更に以下の工程：
−  前記患者から得られた無細胞試料を提供する工程；
−  核酸単離工程において該無細胞試料から核酸調製物を単離する工程；
−  該核酸調製物から複数のＴ細胞受容体核酸配列、又は該複数のＴ細胞受容体核酸配列によってコードされる複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列を得る工程； 
−  該複数のＴ細胞受容体核酸配列又は該複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列を整列させる工程；
−  該複数のＴ細胞受容体核酸配列に含まれるＴ細胞受容体核酸配列又は該複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列に含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列を、複数の無細胞試料クローン型に分類する工程であって、ここで特定のクローン型内に含まれるＴ細胞受容体核酸配列又はＴ細胞受容体アミノ酸配列は同一又は実質的に同一の配列を表す工程；
−  前記複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・  前記腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型１００個のうちの１つであるか、又は該複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、該複数の腫瘍試料クローン型の１００個の最大頻度のクローン型のうちの前記１つの腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体核酸配列によりコードされるＴ細胞受容体アミノ酸と同一又は実質的に同一であるＴ細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び
・  前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの１００個の最大頻度のクローン型のうちの前記１つの腫瘍特異的クローン型は、無細胞試料クローン型に割り当てることができる、工程
を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型１００個のうちの前記１つの腫瘍特異的クローン型は、前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、前記１００個の最大頻度の腫瘍特異的クローン型のうちの前記１つの腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体核酸酸配列にコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるＴ細胞アミノ酸配列、又は前記１００個の最大頻度の腫瘍特異的クローン型のうちの前記１つの腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるＴ細胞アミノ酸配列
を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型
に割り当てることができる、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍試料クローン型の最大頻度のクローン型、又は前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、前記最大頻度の腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体配列にコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるＴ細胞アミノ酸配列を含む、前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型が、選択され、ここで特に前記最大頻度のクローン型が、前記非腫瘍試料中には存在しないか、又は前記腫瘍特異的クローン型の頻度の、２０％、１５％、１０％、又は５％以下の頻度を示す非腫瘍クローン型に割り当てることができ、及び／又は前記各腫瘍試料クローン型の頻度未満の頻度を示す血液試料クローン型に割り当てることができ、及び／又は無細胞クローン型に割り当てることができ、及び／又は前記最大頻度の腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体核酸配列によりコードされるＴ細胞受容体アミノ酸と同一又は実質的に同一であるＴ細胞アミノ酸配列を含む、前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型に割り当てることができる、
請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
更に以下の工程：
−  前記腫瘍試料から５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・  前記選択された腫瘍特異的クローン型は、該最大頻度のクローン型１００個のうちの５、１０、１５又は２０個であって、前記複数の腫瘍試料クローン型のうち該５個の最大頻度のクローン型、該１０個の最大頻度のクローン型、該１５個の最大頻度のクローン型、該２０個の最大頻度のクローン型であるか、及び／又は前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの前記選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型のいずれか１つに含まれる前記複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸と同一又は実質的に同一であるＴ細胞アミノ酸配列を含む、前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び任意に
・  前記選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型は、非腫瘍試料中には存在しないか、又は前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの前記選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型の頻度の、２０％、１５％、１０％、又は５％以下の頻度を表す非腫瘍特異的クローン型に割り当てることができる、及び／又は
・  前記選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型は、前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの前記選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型の頻度未満の頻度を示す血液試料クローン型に割り当てることができる、及び／又は
・  前記選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型は、無細胞試料クローン型に割り当てることができる、及び／又は
・  前記選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型は、前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの別のクローン型に割り当てることができ、これは、前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの前記選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のＴ細胞受容体配列のうちの前記Ｔ細胞受容体核酸配列のいずれか一つにコードされるＴ細胞受容体アミノ酸と同一又は実質的に同一であるＴ細胞アミノ酸配列を含む、前記複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型に割り当てることができる、
請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
−  前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの、前記１００個の最大頻度のクローン型のうちの１つ、前記選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型のうちのいずれか１つが、以下の場合に非腫瘍特異的クローン型に割り当てられ、これは、前記腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のＴ細胞受容体核酸配列の中のＴ細胞受容体核酸配列にコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列、又は前記腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列のうちの１つのＴ細胞アミノ酸配列が、前記非腫瘍試料クローン型に含まれるＴ細胞受容体核酸配列によりコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合、又は前記腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列のＴ細胞アミノ酸配列が、前記非腫瘍試料クローン型に含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合である、及び／又は
−  前記複数の腫瘍試料クローン型のうちの、前記１００個の最大頻度のクローン型のうちの１つ、前記選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型のうちのいずれか１つが、以下の場合に血液試料クローン型に割り当てられ、これは、前記腫瘍特異的クローン型に含まれるＴ細胞受容体配列にコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列が、前記血液試料クローン型に含まれるＴ細胞受容体核酸配列によりコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合、又は前記腫瘍特異的クローン型に含まれるＴ細胞アミノ酸配列が、前記血液試料クローン型に含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合である、及び／又は
−  前記複数の腫瘍試料クローン型のうち前記最大頻度のクローン型１００個のうちの１つ、前記選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型のうちのいずれか１つが、以下の場合に無細胞試料クローン型に割り当てられ、これは、前記腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のＴ細胞受容体核酸配列の中のＴ細胞受容体核酸配列にコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列が、前記無細胞試料クローン型に含まれるＴ細胞受容体核酸配列によりコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合、又は前記腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のＴ細胞アミノ酸配列のうちのＴ細胞アミノ酸配列が、前記無細胞試料クローン型に含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合である、
請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸プローブは、
−  二本鎖オリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドの第１の鎖は前記選択された腫瘍特異的核酸配列に相補的であり、かつ金ナノ粒子に結合されており、及び第２の鎖が前記第１の鎖に相補的であり、かつ発光標識を有し、ここで前記標識の発光は、前記第２の鎖が前記第１の鎖に結合している場合、前記金ナノ粒子によって消光される、
−  ペプチド核酸プローブであり、ここで核酸塩基は、プローブが前記選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列に結合する際に発光する色素で置換される、又は
−  核酸プローブであり、ここで核酸塩基は、プローブが前記選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列に結合する際に、発光する色素で置き換えられる、
請求項３及び５〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸単離工程は、以下の工程：
ａ．  前記腫瘍試料からＴ細胞を単離し、前記単離されたＴ細胞から核酸を単離する工程、及び／又は
ｂ．  Ｔ細胞受容体核酸配列を特異的に増幅する核酸増幅反応を行う工程
を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記単離工程の後に増殖工程が続き、ここで前記単離されたＴ細胞は、細胞培養の条件下で増殖する増殖工程である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列は、ヒトＴ細胞受容体の鎖のＣＤＲ３領域、特に該ヒトＴ細胞受容体のアルファ鎖又はベータ鎖のＣＤＲ３領域をコードし、又は前記腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列は、ヒトＴ細胞受容体の鎖のＣＤＲ３領域、特に該ヒトＴ細胞受容体のアルファ鎖又はベータ鎖のＣＤＲ３領域に含まれるか、又はそのものである、
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍特異的核酸配列は、ＲＮＡ、特に前記ヒトＴ細胞受容体のアルファ鎖又はベータ鎖のＣＤＲ３領域内に含まれるアミノ酸配列をコードするＲＮＡに含まれる、
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
−  トランスフェクション試薬、及び
−  Ｔ細胞に特有のｍＲＮＡ、特にＴ細胞受容体ベータ鎖の定常部分をコードするｍＲＮＡに特異的に結合する核酸プローブ、
−  及び任意に、前記Ｔ細胞受容体をコードするｍＲＮＡの転写レベルを増加させる薬剤、特にインターロイキン２又はシクロヘキシミド、
−  コントロールＴ細胞株、及び該コントロールＴ細胞株内に含まれる特有のアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡに、特異的に結合する核酸プローブ、
−  血液からＴ細胞を単離するための手段、特に、ＣＤ３、ＣＤ４又はＣＤ８に対する抗体を含むビーズ又は粒子、又はＣＤ３、ＣＤ４又はＣＤ８に対する抗体であって、蛍光に基づくサイトメトリーに適する抗体、
−  クローン型特異的核酸プローブ
を含む、腫瘍特異的Ｔ細胞を単離するための部品のキット。
【請求項２０】
−  患者から、前記請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法により腫瘍特異的Ｔ細胞調製物を提供する工程、
−  該腫瘍特異的Ｔ細胞調製物を該患者に投与する工程
を含む、腫瘍をもつ患者の癌を治療するための方法。
【請求項２１】
特定のＴ細胞受容体配列によって特徴付けられる目的のＴ細胞クローン型を濃縮、特に単離する方法であって、該方法は以下の工程：
−  目的のＴ細胞クローン型を含むリンパ球調製物を提供する工程、
−  分離工程において前記リンパ球調製物を複数の画分に分離する工程、
−  前記複数の画分に含まれる細胞を、増殖工程における細胞培養の条件下で増殖させる増殖工程、及び
−  選択工程において前記特異的Ｔ細胞受容体核酸配列を含む前記複数の画分のうちの少なくとも１つの画分を選択する工程、
−  及び任意に、前記分離工程、前記増殖工程及び前記選択工程を繰り返す工程であって、前記複数のうち前記選択された少なくとも１つの画分により、繰り返す工程
を含む、方法。
【請求項２２】
人工腫瘍特異的Ｔ細胞受容体を製造する方法であって、該方法は、以下の工程：
−  請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法による腫瘍特異的Ｔ細胞調製物を提供する工程、
−  個々の腫瘍特異的Ｔ細胞を前記腫瘍特異的Ｔ細胞調製物から単離する工程；
−  前記単離された個々の腫瘍特異的Ｔ細胞の中の前記Ｔ細胞受容体の両方のサブユニットのＣＤＲ３領域を決定する工程；
−  前記両方のサブユニットの前記決定されたＣＤＲ３領域を含む人工Ｔ細胞受容体を調製する工程
を含む、人工腫瘍特異的Ｔ細胞受容体を製造する方法。
【請求項２３】
腫瘍特異的抗原を有する細胞を単離する方法であって、該方法は、以下の工程：
−  請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法による腫瘍特異的Ｔ細胞調製物を提供する工程、
−  個々の腫瘍特異的Ｔ細胞を前記腫瘍特異的Ｔ細胞調製物から単離する工程；
−  前記単離された個々の腫瘍特異的Ｔ細胞のＴ細胞受容体の両サブユニットのＣＤＲ３領域を決定する工程；
−  両サブユニットの前記決定されたＣＤＲ３領域を含む人工Ｔ細胞受容体を調製する工程であって、該人工Ｔ細胞受容体は部分を含み、この部分により前記人工Ｔ細胞受容体が選択的に単離可能となる工程、
−  前記人工Ｔ細胞受容体を、抗原を有する細胞と接触させる工程、
−  前記人工Ｔ細胞受容体に結合する細胞を単離する工程
を含む、腫瘍特異的抗原を有する細胞を単離する方法。
【請求項２４】
配列番号０１、配列番号０２、配列番号０４、配列番号０７、配列番号１１又は配列番号１２によって特徴付けられるオリゴペプチドを含むか又はそれからなるオリゴペプチド又はポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号０１、配列番号０２、配列番号０４、配列番号０７、配列番号１１又は配列番号１２によって特徴付けられるオリゴペプチドをコードする核酸配列を含むか又はそれからなる核酸。
【請求項２６】
ＮＳＣＬＣを診断するための方法における、請求項２４記載のオリゴペプチド又はポリペプチド、又は請求項２５記載の核酸の使用。
【請求項２７】
ＮＳＣＬＣを診断するための方法であって、該方法は、以下の工程：
−  患者から得られた試料を提供する工程であって、前記試料はＴ細胞を含む工程、
−  配列番号０１、配列番号０２、配列番号０４、配列番号０７、配列番号１１又は配列番号１２によって特徴付けられるオリゴペプチドを含むか又はそれからなるオリゴペプチド又はポリペプチドを含むＴ細胞の存在を検出する工程であって、特に配列番号０１、配列番号０２、配列番号０４、配列番号０７、配列番号１１又は配列番号１２によって特徴付けられる前記オリゴペプチドと、特に１０−７、１０−８又は１０−９ｍｏｌ／ｌ以下の解離定数で、特異的に結合することができる反応性リガンドと、前記試料を接触させることによって、検出する工程
を含む、ＮＳＣＬＣを診断するための方法。
【請求項２８】
ＮＳＣＬＣを診断するための方法であって、該方法は、以下の工程：
−  患者から得られた試料を提供する工程であって、前記試料はＴ細胞を含む工程、
−  前記試料から核酸調製物を得る工程、
−  配列番号０１、配列番号０２、配列番号０４、配列番号０７、配列番号１１又は配列番号１２によって特徴付けられるオリゴペプチドをコードする核酸配列の存在を検出する工程
を含む、ＮＳＣＬＣを診断するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
説明
本発明は、腫瘍特異的、特に腫瘍反応性のＴ細胞調製物を提供する方法及びその使用、特に養子移入及び癌治療のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、先進国の国で最も頻繁に死亡する原因の１つである。癌治療の分野での徹底的な研究にもかかわらず、癌治療のための治療法はいまだに非常にニーズがある。最近では、疾患と戦うために、患者の免疫細胞を自己移植することによって癌を治療する努力がなされており、ここでは、患者の腫瘍から得られたＴ細胞が増殖され、養子移入されていた。しかしながら、これらの移入された細胞は、一般に、多くのタイプのＴ細胞の広範なコレクションに似ているにすぎず、したがって、中等度かつ改善可能な免疫応答のみを誘導するため、高い腫瘍特異性及び反応性を欠いている。結果として、自己の、高い腫瘍特異的及び腫瘍反応性Ｔ細胞の提供が非常に望ましいであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明の目的は、特に養子移入及び癌の治療に使用するためのそのような細胞を提供することである。この目的は、独立請求項の保護対象によって達成される。
【０００４】
用語と定義
本明細書の文脈における「核酸」という用語は、ヌクレオチドのオリゴマー又はポリマーを指す。このオリゴマー又はポリマーは、天然ヌクレオシド（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン及びデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば２−アミノプリン、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び２−チオシチジン）、化学的に修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えばメチル化された塩基）、挿入塩基、無塩基部位、リボース糖（ＲＮＡ）、２’−デオキシリボース糖（ＤＮＡ）、末端３’−デオキシリボース又は２’、３’−ジデオキシリボース糖、修飾糖（例えば、２’−フルオロリボース、アラビノース及びヘキソース）、又は修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエート結合及び５’−Ｎ−ホスホロアミダイト結合）を含み得る。さらに、骨格は、修飾されたロックド（ＬＮＡ）アンロックド（ＵＮＡ）糖、鏡形態の糖（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）又はペプチド骨格（ＰＮＡ）又はそれらの混合物を含み得る。
【０００５】
本明細書の文脈における用語「プローブ」は、相補的な核酸にハイブリダイズすることができる核酸を指す。プローブは、蛍光色素又は放射性同位体のような検出又は同定のための標識、ビオチン又はジゴキシゲニンのような捕捉、検出又は固定化のためのハプテン、又はチオール、アルキン、アジド又はＥＤＣのような官能基であって、固定化、ライゲーション又は誘導体化のためのものを含むよう修飾され得る。
【０００６】
本明細書の文脈における「腫瘍試料」という用語は、患者の腫瘍から得られた試料又は試料のプールを指す。腫瘍には、転移又は転移の集合も含まれ得る。
【０００７】
本明細書の文脈における「非腫瘍試料」という用語は、患者の腫瘍に近接した組織から得られた試料又は試料のプールを指す。
【０００８】
本明細書の文脈における「血液試料」又は「血液からの試料」という用語は、患者の血液から得られた試料又は患者の血液から得られた試料のプールを意味する。
【０００９】
本明細書の文脈における「無細胞試料」という用語は、好ましくはＴ細胞を含まないか、又はより好ましくは核酸を含むあらゆる細胞を完全に含まない、患者から得られた試料又は試料プールをいう。無細胞試料は、好ましくは血液から、典型的には血清又は血漿試料として得られる。無細胞試料の他の例は、脳脊髄液、腹腔液、滑液、唾液、尿又は糞便などの他の体液から得られる試料である。
【００１０】
本明細書の文脈における「クローン型」という用語は、ＴＣＲの可変領域に関して実質的に同一の核酸配列を示すＴ細胞受容体核酸配列を含むか、又はＴＣＲの可変領域に関して実質的に同一のアミノ酸配列を示すＴ細胞受容体アミノ酸配列を含む。ＴＣＲの可変領域に関して本質的に同一のアミノ酸配列を示すクローン型は、クラスター型とも称され得る。
【００１１】
本明細書の文脈における「クラスター型」という用語は、ＴＣＲの可変領域に関して実質同一のアミノ酸配列を示すＴ細胞受容体核酸配列を含むＴ細胞の群を指す。本明細書の文脈における「可変領域」という用語は、Ｖ−セグメント及びＪ−セグメント並びにＣＤＲ３領域（図１参照）を含むＴＣＲ再配列によって新たに生成される領域を指す。
【００１２】
本明細書の文脈における用語「ＣＤＲ３」は、超可変相補性決定領域３を指す。ＣＤＲ３のサイズは、特に、Ｖβ、Ｖα又はＶγ又はＶσセグメント内に保存されたシステインからＪβ又はＪα、Ｊγ又はＪσ内に保存されたフェニルアラニンの位置までのアミノ酸（ＡＡ）及びそれぞれのヌクレオチドの総数によって特徴付けられる。
【００１３】
本明細書の文脈における「腫瘍特異的」という用語は、特定の腫瘍中に存在し、特に特定の腫瘍において優先的な分布を示すＴ細胞を特に指す。
【００１４】
本明細書の文脈における「腫瘍反応性」という用語は、特に、特定の腫瘍の腫瘍細胞の成長、生存又は増殖を間接的又は直接的に調節することができるＴ細胞を指す。このような腫瘍反応性Ｔ細胞は、特に、特定の腫瘍の自己腫瘍細胞と共培養した場合に、サイトカイン又は表面活性化マーカーの発現が増加することにより特徴付けられる。
【００１５】
本明細書の文脈における用語「ＴＩＬ」は、腫瘍浸潤リンパ球を指す。
【００１６】
本明細書の文脈における用語「ＣＤ４５ＲＡ」は、ヒトナイーブＴリンパ球マーカー（ＰＴＰＲＣ；Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ０７５８５；アイソフォームＡ）を指す。
【００１７】
本明細書の文脈における用語「ＣＣＲ７」は、ヒトケモカイン受容体７（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ３２２４８）を指す。
【００１８】
本発明の文脈における用語「ＣＤ６２Ｌ」は、リンパ球の表面上の細胞接着分子（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ１４１５１）を指す。ＣＤ６２Ｌは、Ｌ−セレクチンとも呼ばれる。
【００１９】
本明細書の文脈における用語「ＣＤ２５」は、ヒトインターロイキン−２受容体のアルファ鎖（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ０１５８９）を意味する。
【００２０】
本明細書の文脈における「Ｆｏｘｐ３」という用語は、天然のＴ制御性Ｔ細胞及び誘導されたＴ制御性Ｔ細胞（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｂ７ＺＩＧ１）の特異的マーカーを指す。Ｆｏｘｐ３はｓｃｕｒｆｉｎとも呼ばれる。
【００２１】
本明細書の文脈における用語「ＬＡＧ３」（リンパ球活性化遺伝子３）は、活性化Ｔ細胞のマーカー（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１８６２７）を指す。
【００２２】
本明細書の文脈における用語「ＣＤ６９」は、活性化Ｔ細胞のマーカー（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ７１０８）を指す。
【００２３】
本明細書の文脈における用語「ＣＤ１３７」は、活性化Ｔ細胞のマーカー（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ０７０１１）を指す。
【００２４】
本明細書の文脈における用語「ＣＤ１５４」は、活性化Ｔ細胞のマーカー（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ２９９６５）を指す。
【００２５】
本明細書の文脈における「ＰＤ−１」という用語は、Ｔ細胞（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ１５１１６）によって発現される細胞表面受容体を指す。ＰＤ−１はＣＤ２７９とも呼ばれる。
【００２６】
本明細書の文脈における用語「Ｂ７−Ｈ４」は、活性化Ｔ細胞のマーカー（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ７Ｚ７Ｄ３）を指す。Ｂ７−Ｈ４は、ＶＴＣＮ１とも呼ばれる。
【００２７】
本明細書の文脈における用語「ＯＸ４０」は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー４（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ４３４８９）を指す。ＯＸ４０はＴＮＦＦＳＦ４又はＣＤ１３４とも呼ばれる。
【００２８】
本明細書の文脈における用語「ＣＤ１０７ａ」は、リソソーム膜タンパク質１（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ１１２７９）を意味し、ＣＤ１０７ａは、ＬＡＭＰ−１とも称される。
【００２９】
本明細書の文脈における用語「ＶＩＳＴＡ」は、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサーを指す。ＶＩＳＴＡはＰＤ−１ホモログ（ＰＤ−１Ｈ）とも呼ばれる。
【００３０】
本明細書の文脈における「ブチロフィリン」という用語は、活性化されたＴ細胞上で発現される、ＩＧスーパーファミリーのサブグループを構成するタンパク質のファミリーを指す。
【００３１】
本明細書の文脈における「ブチロフィリン様タンパク質」という用語は、活性化Ｔ細胞のマーカーを指す。
【００３２】
本明細書の文脈における「ＴＮＦアルファ」という用語は、活性化Ｔ細胞（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１３７５）によって分泌されるサイトカインを意味する。
【００３３】
本明細書の文脈における「インターフェロンガンマ」又は「ＩＦＮガンマ」という用語は、活性化Ｔ細胞（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１５７９）によって分泌されるサイトカインを意味する。
【００３４】
いずれかの細胞集団が特定のマーカータンパク質に対して「陽性」と指定されている場合、この指定は前記細胞集団がマーカータンパク質に対する共通の蛍光色素標識抗体によって染色され得ることを意味し、また、標識されていない細胞又は同じ抗体で標識されているが前記マーカータンパク質を発現しないことが一般に知られている細胞と比較して、少なくとも１ｌｏｇ高い強度の蛍光シグナルを示し得ることを意味する。あるいは、細胞集団は、前述のマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡ又は関連する制御エンティティに特異的にハイブリダイズすることができる標識された核酸プローブによって染色され得る。マーカータンパク質関連エンティティは、マーカータンパク質制御転写因子ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、又は前記マーカータンパク質を発現する細胞集団において特異的に共発現される任意の他のＲＮＡを表すことができる。
【００３５】
本明細書の文脈における「Ｔ細胞活性化マーカー」という用語は、活性化されたＴ細胞の表面上の分子を指す。
【００３６】
本明細書の文脈における高親和性は、リガンドの標的分子への結合の解離定数を指し、ここで解離定数は、１０−７  ｍｏｌ／Ｌ、１０−８  ｍｏｌ／Ｌ又は１０−９  ｍｏｌ／Ｌ以下であり、かつリガンドは、無関係な構造的特徴を有する制御分子、例えばタンパク質に結合しない。制御分子は、非限定的な例として、アルブミン、グロブリン、リポタンパク質、フィブリノゲン、プロトロンビン、急性期タンパク質などの血漿タンパク質、及びＣＥＡ、ＣＡ１９−９又はＡＦＰなどの腫瘍マーカー及びトランスフェリンである。
【００３７】
本明細書の文脈における高い特異性は、適切に検出された標的又は検体と検出された全ての化合物又は物質の合計との比率を指し、ここではその比率は、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は９９．９％である。
【００３８】
本明細書の文脈における「最適なアニーリング温度」という用語は、本発明のプローブが細胞内の腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列に結合する最も高い確率を示す温度を指す。
【００３９】
本明細書の文脈における「金ナノ」という用語は、サブミクロンサイズの金粒子を指す。
【００４０】
Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ番号は、ＵｎｉＰｒｏｔナレッジベースのエントリーを指す。
【００４１】
ＤＳＭＺ番号は、Ｌｅｉｂｎｉｚ−ｌｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ−ドイツのブラウンシュヴァイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）にある微生物及び細胞培養ＧｍｂＨドイツコレクションにおけるエントリー又は寄託物をいう。
【００４２】
本発明の文脈におけるトランスフェクション試薬は、核酸を細胞、特にヒト免疫細胞に意図的に導入するプロセスを可能にする又は補助する化合物を指す。
【課題を解決するための手段】
【００４３】
発明の概要
本発明の第一の態様によれば、腫瘍特異的Ｔ細胞調製物を提供するための方法が提供される。この方法は、以下の工程を含む：
ａ  腫瘍特異的Ｔ細胞クローンを以下により選択する工程：
−  患者から得られた腫瘍試料を提供する工程であって、腫瘍試料は腫瘍に浸潤したＴ細胞を含む工程；
−  核酸単離工程において腫瘍試料から核酸調製物を単離する工程；
−  核酸調製物から複数のＴ細胞受容体核酸配列を得る工程又は該複数のＴ細胞受容体核酸配列によってコードされる複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列を得る工程；
−  配列選択工程において、複数のＴ細胞受容体核酸配列から腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列を選択する工程、又は複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列から腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列を選択する工程；
ｂ  腫瘍特異的Ｔ細胞クローンを以下により選別する工程：
−  患者から得られたリンパ球調製物を提供する工程；
−  選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列又は選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列を含む細胞を、単離工程においてリンパ球調製物から単離する工程。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１において、Ａ：ヒトＴ細胞受容体のアルファ鎖のＣＤＲ３領域のスキームを示し、Ｂ：Ａと同じであるが、ヒトＴ細胞受容体のベータ鎖の場合、Ｃ：ＣＤＲ３を含むゲノム領域の増幅の原理を示す。ＰＣＲプライマーは、Ｖ／Ｊ−セグメントのレパートリーに特異的であり、及びそれらの間のＣＤＲ３領域を有するＶ−及びＪ−セグメントの小領域を増幅する。
【図２】図２は、本発明の方法の原理を示すフロー図を示す。
【図３】図３は、ＴＩＬ及び非腫瘍Ｔ細胞との比率の程度により、ＴＩＬに対して、Ｔ細胞クローン型の腫瘍反応性が高いか低いかを分けることを示す。破線は腫瘍対非腫瘍比（Ｔ／ｎＴ）を示し、点線及び実線は特異的活性化マーカー（ＰＤ−１、ＩＦＮガンマ）を保有／発現するＴ細胞クローンの頻度を示す。閾値比Ｔ／ｎＴ＞５の場合、ほぼすべての腫瘍反応性クローンが正確に予測され、Ｔ／ｎＴ＞２０の場合、２つのクローンが選択され、腫瘍反応性として正確に予測される。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
特定の実施形態において、単離工程は、以下の工程を含む：
−  リンパ球調製物を、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列又は腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列に対応するＴ細胞受容体のＶセグメント内に含まれるアミノ酸配列に結合することができる特異的反応性リガンドと接触させる工程であって、リガンドが検出可能な標識に結合している工程、及び
−  リンパ球調製物から、検出可能な標識を有するＴ細胞を単離する工程。
【００４６】
特に、Ｖセグメントは、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列と特異的に関連する核酸分子によってコードされる。
【００４７】
特定の実施形態では、リガンドは、１０−７、１０−８又は１０−９ｍｏｌ／ｌ以下の解離定数でアミノ酸配列に結合する。
【００４８】
特定の実施形態では、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列は、ヒトＴ細胞受容体のベータ鎖のＶセグメントをコードする核酸配列に特異的に関連する。
【００４９】
特定の実施形態では、特異的反応性リガンドは、抗−Ｖβ抗体であり、これはＴ細胞受容体のベータ鎖のＶセグメントを対象とする。
【００５０】
このような抗−Ｖβ抗体は公知であり、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ／Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ／ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／ｈｕｍａｎ／ＴＲＢ／ＴＲＢＶ／Ｈｕ  ＴＲＢＶＭａｂ．ｈｔｍｌにて参照可能であり、また、例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ、Ｓｅｒｏｔｅｃ又はＣｏｕｌｔｅｒで得られる。
【００５１】
特定の実施形態において、単離工程は、以下の工程を含む：
−  リンパ球調製物を、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列に特異的に結合する核酸プローブと接触させる工程であって、核酸プローブが検出可能な標識に結合している工程と、
−  リンパ球調製物から、検出可能な標識を有するＴ細胞を単離する工程。
【００５２】
特に、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列への核酸プローブの特異的結合は、特に高ストリンジェンシー条件下で、選択された配列へのプローブのハイブリダイゼーションを特に指す。
【００５３】
特定の実施形態において、単離工程は、以下の工程を含む：
−  選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列又は腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列に対応するＴ細胞受容体のＶ領域内に含まれるアミノ酸配列に結合することができる特異的反応性リガンドとリンパ球調製物を接触させる工程であって、リガンドが検出可能な標識に結合している工程、
−  リンパ球調製物から、検出可能な標識を有するＴ細胞を単離する工程、
−  単離された細胞を、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列に特異的に結合する核酸プローブと接触させる工程であって、前記核酸プローブが別の検出可能な標識に結合している工程と、
−  以前に単離された細胞から他の検出可能な標識を有するＴ細胞を単離する工程。
【００５４】
特定の実施形態において、単離工程は、以下の工程を含む：
−  リンパ球調製物を複数の画分に分離する、分離工程、
−  前記複数の画分に含まれる細胞を細胞培養条件下で増殖させる、増殖工程、及び
−  選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列を含む前記複数の画分の少なくとも１つの画分が選択される、選択工程。
【００５５】
特に、リンパ球調製物は、複数の画分に分けられ、この複数の画分は、全ての画分ではなく、好ましくは該複数の画分の半分未満、より好ましくは該複数の分画の１０％未満、さらにより好ましくは５％未満、最も好ましくは１％未満が、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列を含む。そのような分離は、複数の画分当たりの細胞の数を制限することによって達成され得る。
【００５６】
特定の実施形態では、複数の画分のそれぞれは、１０５以下の細胞、好ましくは１０４以下の細胞、より好ましくは１０３以下の細胞、さらにより好ましくは１０２以下の細胞を含む。
【００５７】
特定の実施形態では、リンパ球調製物は、少なくとも９６の画分、好ましくは９６画分に分離され、特に各画分は１０５以下の細胞を含む。
【００５８】
特定の実施形態において、リンパ球調製物は、９６画分〜３８４画分に分離される。
【００５９】
特定の実施形態では、選択する工程は、複数の画分からＴ細胞受容体核酸配列を得る工程、及び選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列を含む画分を同定する工程を含み、特にＴ細胞受容体核酸配列は、増幅、特にＰＣＲにより得られる。
【００６０】
特定の実施形態では、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列を含む画分は、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸の少なくとも一部に特異的にアニールするプライマーによる増幅反応により同定され、ここで特に、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列を含まない画分は増幅産物を示さない。
【００６１】
特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体核酸配列は、それぞれの画分に含まれる細胞のアリコートから、又はそれぞれの画分の上清から得られる。
【００６２】
好都合なことに、このような選択によって、合成及び検証において長い遅延を有する高価なプローブは必要ではない。さらに、上記実施形態は、ＰＣＲ感度対プローブバックグラウンドに起因する非常にまれなクローン型にも適用可能である。さらに、増幅工程は、潜在的な自己細胞治療のためにインビトロでの増幅に直接適用することができる迅速に分裂する細胞を生じる。
【００６３】
特定の実施形態では、選択する工程は、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列に特異的に結合する核酸プローブと複数の画分を接触させる工程であり、この接触工程では核酸プローブは検出可能な標識に結合している工程と、及び検出可能な標識を有するＴ細胞を含む複数の画分の内の少なくとも１つを選択する工程を含む。
【００６４】
特定の実施形態では、分離工程の前に、
−  リンパ球調製物を、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列、又は選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列に対応する、Ｔ細胞受容体のＶセグメント内に含まれるアミノ酸配列に結合することができる特異的反応性リガンドと接触させる工程、この接触工程ではリガンドが検出可能な標識に結合している工程、及び
−  リンパ球調製物から検出可能な標識を担持するＴ細胞を単離する工程を含み、その後、単離されたＴ細胞は、上記の分離工程に付される。
【００６５】
特定の実施形態において、単離工程は、更に以下の工程を含む：
−  選択された画分を第２の複数の画分に分離する、第２の分離工程、
−  前記第２の複数の画分に含まれる細胞を細胞培養条件下で増殖させる、第２の増殖工程、及び
−  選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列を含む前記第２の複数の画分の少なくとも１つの画分が選択される、第２の選択工程。
【００６６】
特に、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列を含む新たに選択された画分ごとに、分離工程、増殖工程及び選択工程を繰り返すことができる。好ましくは、分離工程、増殖工程及び選択工程は、１〜４回繰り返される。
【００６７】
特定の実施形態において、複数のＴ細胞受容体核酸配列は、核酸配列の核酸を配列決定することによって得られる。特定の実施形態では、核酸調製物の核酸は、並行して配列決定される。平行配列決定に適した方法は、ＷＯ２０１４／０９６３９４Ａ１に開示されている。
【００６８】
特定の実施形態では、核酸調製物は、腫瘍試料の細胞、特に腫瘍に浸潤したＴ細胞のゲノムＤＮＡを含む。
【００６９】
特定の実施形態では、核酸調製物は、腫瘍試料の成熟Ｔ細胞又は活性化Ｔ細胞由来の少なくとも１０ｎｇのＤＮＡを含み、これは、約１，５００個の成熟Ｔ細胞のＤＮＡ量に特に対応する。成熟Ｔ細胞ＤＮＡの量の定量化は、当業者に公知の方法、例えば定量ＰＣＲ又はデジタル液滴ＰＣＲによって決定することができる。核酸調製物の配列決定は、既知の量のＤＮＡを有する参照試料の配列決定を含み得る。さらに、腫瘍試料中の成熟Ｔ細胞の量は、免疫組織化学的染色及び顕微鏡検査、又はＦＡＣＳによる細胞選別によって測定することができる。
【００７０】
特定の実施形態では、リンパ球調製物は、患者から得られた腫瘍試料、患者から得られた血液試料、又は患者から得られた全腫瘍試料によって提供される。
【００７１】
有利には、本発明の方法は、腫瘍特異的クローン型を同定し、それらを調製するために腫瘍試料から得られる生存可能な及び／又は増殖する腫瘍特異的Ｔ細胞とは無関係である。１つ又は複数の腫瘍特異的クローン型が、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列又は腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列によって同定されると、そのクローン型は、患者の他の腫瘍試料又は血液などの他の供給源から調製され得る。
【００７２】
特定の実施形態では、配列選択工程は、以下の工程を含む：
−  腫瘍試料から得られた複数のＴ細胞受容体核酸配列を整列させる工程；
−  複数のＴ細胞受容体核酸配列に含まれるＴ細胞受容体核酸配列を、複数の腫瘍試料クローン型に分類する工程であって、ここで、
−    ａ）特定のクローン型内に含まれるＴ細胞受容体核酸配列は、ＴＣＲの可変領域に対して実質的に同一の核酸配列を表し、及び／又は
−    ｂ）特定のクローン型内に含まれるＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列は、ＴＣＲの可変領域に関して同一のアミノ酸配列を示す工程；
−  各クローン型に関連する複数のＴ細胞受容体核酸配列内のＴ細胞受容体核酸配列の数を決定し、それにより前記クローン型の各々についてクローン型頻度を取得する工程、
−  複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型１００個のうちの１つであるか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、複数の腫瘍試料クローン型の１００個の最大頻度のクローン型のうちの１つの腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体核酸配列によりコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるＴ細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である工程、及び
−  選択された腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体核酸配列を、腫瘍特異的受容体核酸配列として選択する工程。
【００７３】
特に、配列決定の後、１つの塩基対のミスマッチまで逸脱する同一及び関連する核酸配列読み取り断片の全てを結合する対が、クラスター化され、クローン型として指定される。
【００７４】
特定の実施形態において、腫瘍特異的クローン型は、複数の腫瘍試料クローン型の中で５０個の最も頻度の高いクローン型のうちのの１つである複数の腫瘍試料クローン型から選択される。特定の実施形態では、腫瘍特異的クローン型は、複数の腫瘍試料クローン型の中で２０個の最も頻度の高いクローン型のうちの１つである複数の腫瘍試料クローン型から選択される。
【００７５】
特に、第１のＴ細胞受容体核酸配列は、第２のＴ細胞受容体核酸配列と実質的に同一であり、これは両方の配列が１つ以下の位置で異なる場合である。
【００７６】
特定の実施形態では、第１のＴ細胞受容体核酸配列は、第２のＴ細胞受容体核酸配列と実質的に同一であり、これは、両方の配列が１つ以下の位置で異なる場合であり、かつ第１のＴ細胞受容体核酸配列は、各試料、特に腫瘍試料において、第２のＴ細胞受容体核酸配列と比較して、少なくとも２０倍の頻度を示す。結果的に、第１及び第２のＴ細胞受容体核酸配列の両方が同じクローン型に割り当てられる。
【００７７】
同様に、第１のＴ細胞受容体アミノ酸配列は、第２のＴ細胞受容体アミノ酸配列と実質的に同一であり、これは両方のアミノ酸配列が互いに対し１つ又は２つ以下の位置で異なる場合である。上記のＴ細胞受容体アミノ酸配列は、ＴＣＲα／βのアルファ鎖、又はベータ鎖内又はＴＣＲγ／δのガンマ鎖又はデルタ鎖内に含まれ得る。
【００７８】
特に、クローン型頻度は、腫瘍試料内のＴＣＲ核酸配列によって同定されたＴ細胞の相対的又は絶対的頻度の尺度である。
【００７９】
特に、所与の試料におけるクローン型頻度は、前記試料内のＴＣＲ核酸配列によって同定されるＴ細胞の相対的又は絶対的頻度の尺度である。
【００８０】
特定の実施形態では、上記の複数の内のＴ細胞受容体核酸配列は、ヒトＴ細胞受容体、特にＴＣＲα／β又はＴＣＲγ／δを形成するポリペプチド鎖の１つをコードする核酸配列内に含まれる。特定の実施形態では、上記の複数のＴ細胞受容体核酸配列は、非コード核酸配列を含まない。非コード配列は、非機能的ＴＣＲタンパク質配列をもたらす停止コドン又はフレームシフトを有するクローン型をいう。
【００８１】
特定の実施形態では、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列は、３０ヌクレオチド〜１１０ヌクレオチドの長さによって特徴付けられる。
【００８２】
特定の実施形態では、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列は、ヒトＴ細胞受容体を形成するポリペプチド鎖（アルファ、ベータ、ガンマ及びデルタ）のいずれか１つに含まれる特有のアミノ酸配列をコードし、ここで特有のアミノ酸配列は、特定のクローン型又はクラスター型でのみ生じ、他のクローン型又はクラスター型では生じない。
【００８３】
したがって、選択工程は、追加的又は代替的に、以下の工程を含む：
−  腫瘍試料から得られた複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列を整列させる工程；
−  複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列に含まれるＴ細胞受容体核酸配列を、複数の腫瘍試料クローン型に分類する工程であって、ここで、特定のクローン型内に含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列は、ＴＣＲの可変領域と、実質的に同一又は同一のアミノ酸配列を示す工程；
−  各クローン型に関連する複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列内の、Ｔ細胞受容体アミノ酸配列の数を決定し、それにより前記クローン型のそれぞれのクローン型頻度を取得する工程；
−  複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで腫瘍特異的クローン型は、複数の腫瘍試料クローン型のうちの１００の最も頻度の高いクローン型の１つであるか、又は複数の腫瘍試料クローン型のうちの別のクローン型であって、この別のクローン型は、複数の腫瘍試料クローン型のうち１００個の最も頻度の高いクローン型の中の１つの腫瘍特異的クローン型内に含まれる、複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列の中のＴ細胞受容体アミノ酸配列と実質同一又は同一のＴ細胞受容体アミノ酸配列を含む工程；
−  選択された腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体アミノ酸配列を、腫瘍特異的受容体アミノ酸配列として選択する工程。
【００８４】
特定の実施形態では、複数の腫瘍試料クローン型のうちの１００個の最も頻度の高いクローン型のうちの１つ、特に最も頻度の高いクローン型と、及び複数の腫瘍試料クローン型のうちの１つ以上の追加のクローン型であって、複数の腫瘍試料クローン型のうちの１００個の最も頻度の高いクローン型のうちの１つの腫瘍特異的クローン型内に含まれる、複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一のＴ細胞受容体アミノ酸配列を含む複数の腫瘍試料クローン型の１つ以上の追加のクローン型とは、腫瘍特異的クローン型として選択され、及び、特にリンパ球を、選択されたクローン型に含まれる腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列に特異的に結合する核酸プローブと接触させることによって、リンパ球調製物から単離され、ここで、該核酸プローブは、検出可能な標識に結合しており、及び標識を有する細胞は、リンパ球調製物から単離される。
【００８５】
特定の実施形態では、複数の腫瘍試料クローン型の中で、５個の最も頻度の高いクローン型、１０個の最も頻度の高いクローン型、１５個の最も頻度の高いクローン型、又は２０個の最も頻度の高いクローン型、及び／又は複数の腫瘍試料クローン型の中で１つ以上の追加のクローン型であって、複数の腫瘍試料クローン型のうちの、５個の最も頻度の高いクローン型、１０個の最も頻度の高いクローン型、１５個の最も頻度の高いクローン型、又は２０個の最も頻度の高いクローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体核酸配列によってコードされる、Ｔ細胞受容体アミノ酸配列と同一であるＴ細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型のうちの１つ以上の追加のクローン型は、腫瘍特異的クローン型として選択され、そしてリンパ球調製物から単離され、特にリンパ球を、選択されたクローン型に含まれる選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列、又は選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列に対応する、Ｔ細胞受容体のＶセグメント内に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合することができる反応性リガンドと接触させることによって、リンパ球調製物から単離され、ここで、該リガンドは、検出可能な標識に結合しており、及び標識を有する細胞は、リンパ球調製物から単離される。
【００８６】
特定の実施形態において、腫瘍特異的受容体核酸配列は、Ｔ細胞受容体のＣＤＲ３領域をコードする。特定の実施形態では、腫瘍特異的受容体アミノ酸配列は、Ｔ細胞受容体のＣＤＲ３領域を含むか、又はそれに含まれる。
【００８７】
特定の実施形態において、本発明の方法は、更に以下の工程を含む：
−  患者から得られた非腫瘍試料を提供する工程；
−  核酸単離工程において非腫瘍試料から核酸調製物を単離する工程；
−  核酸調製物から複数のＴ細胞受容体核酸配列を得て、複数の非腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列を取得する工程；
−  非腫瘍試料から得られた複数の非腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列を整列させる工程；
−  複数の非腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列に含まれるＴ細胞受容体核酸配列を、複数の非腫瘍特異的クローン型に分類する工程であって、ここで、
ａ）特定のクローン型内に含まれるＴ細胞受容体核酸配列は、ＴＣＲの可変領域、特にＣＤＲ３領域に対して実質的に同一の核酸配列を表し、及び／又は
ｂ）特定のクローン型内に含まれるＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列は、ＴＣＲの可変領域、特にＣＤＲ３領域に関して同一のアミノ酸配列を示す工程；
−  複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・  腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型１００個のうちの１つであるか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、複数の腫瘍試料クローン型の１００個の最大頻度のクローン型のうちの１つの腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体核酸配列によりコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるＴ細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び
・  複数の腫瘍試料クローン型のうちの１００個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記１つの腫瘍特異的クローン型は、非腫瘍試料中には存在しないか、又は腫瘍特異的クローン型の頻度の２０％、１５％、１０％、又は５％以下の頻度（非腫瘍試料中）を示す非腫瘍特異的クローン型に割り当てることができる工程。
【００８８】
特に、非腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列は、腫瘍から得られたＴ細胞受容体核酸配列を複数の腫瘍試料クローン型へ分類する方法と同様に、複数の非腫瘍特異的クローン型に分類され、特に、腫瘍試料のクローン型を非腫瘍クローン型に割り当てることを可能にする。
【００８９】
特に、以下の場合に、腫瘍特異的クローン型を非腫瘍特異的クローン型に割り当てることができる：
ａ）  上記のこのクローン型内に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちのＴ細胞受容体核酸配列のいずれか１つは、非腫瘍クローン型内に含まれるＴ細胞受容体核酸配列と実質同一である、及び／又は
ｂ）  上記のこのクローン型内に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちのＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列は、非腫瘍試料クローン型内に含まれるＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である。
【００９０】
同様に、腫瘍特異的クローン型が非腫瘍試料のクローン型のどれにも割り当てることができない場合、この腫瘍特異的クローン型は非腫瘍試料には存在しない。
【００９１】
特定の実施形態では、非腫瘍試料は、腫瘍に隣接する非腫瘍組織の試料である。このような非腫瘍組織は、超音波検査、ラジオグラフィー、ＣＴ又は免疫染色などの一般的な技術によって同定することができる。
【００９２】
特定の実施形態において、本発明の方法は、さらに以下の工程を含む：
−  患者から得られた非腫瘍試料を提供する工程；
−  核酸単離工程において非腫瘍試料から核酸調製物を単離する工程；
−  核酸調製物由来の複数のＴ細胞受容体核酸配列及び複数のＴ細胞受容体核酸配列によりコードされる複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列を得て、複数の非腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列を取得する工程；
−  非腫瘍試料から得られた複数の非腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列を整列させる工程；
−  複数の非腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列に含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列を、複数の非腫瘍特異的クローン型に分類する工程であって、ここで、特定のクローン型内に含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列は、ＴＣＲの可変領域、特にＣＤＲ３領域に対して実質的に同一又は同一の配列を表す工程、
−  複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・  腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型１００個のうちの１つであるか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、複数の腫瘍試料クローン型の１００個の最大頻度のクローン型のうちの１つの腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるＴ細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び
・  複数の腫瘍試料クローン型のうちの１００個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記１つの腫瘍特異的クローン型は、非腫瘍試料中には存在しないか、又は腫瘍特異的クローン型の頻度の２０％、１５％、１０％、又は５％以下の頻度（非腫瘍試料中）を示す非腫瘍特異的クローン型に割り当てることができる工程。
【００９３】
特に、非腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列は、腫瘍から得られたＴ細胞受容体アミノ酸配列を複数の腫瘍試料クローン型へ分類する方法と同様に、複数の非腫瘍特異的クローン型に分類され、特に、腫瘍試料のクローン型を非腫瘍クローン型に割り当てることを可能にする。
【００９４】
特に、腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列の中のＴ細胞受容体アミノ酸配列のいずれかが非腫瘍クローン型に含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列と実質同一又は同一である場合、腫瘍特異的クローン型は非腫瘍特異的クローン型に割り当てることができる。
【００９５】
特定の実施形態において、本発明の方法は、さらに以下の工程を含む：
−  患者から得られた血液試料を提供する工程；
−  核酸単離工程において血液試料から核酸調製物を単離する工程；
−  核酸調製物から複数のＴ細胞受容体核酸配列を得る工程； 
−  複数のＴ細胞受容体核酸配列を整列させる工程；
−  複数のＴ細胞受容体配列に含まれるＴ細胞受容体核酸配列を、複数の血液試料クローン型に分類する工程であって、ここで
ａ）特定のクローン型内に含まれるＴ細胞受容体核酸配列は、ＴＣＲの可変領域、特にＣＤＲ３領域に対して実質的に同一の配列を表し、及び／又は
ｂ）特定のクローン型内に含まれるＴ細胞受容体配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列は、ＴＣＲの可変領域、特にＣＤＲ３領域に関して同一の配列を表す工程；
−  複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・  腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型１００個のうちの１つであるか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、複数の腫瘍試料クローン型の１００個の最大頻度のクローン型のうちの１つの腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体核酸配列によりコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるＴ細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び
・  複数の腫瘍試料クローン型のうちの１００個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記１つの腫瘍特異的クローン型は、前記１つの腫瘍特異的クローン型の頻度未満の頻度を示す血液試料クローン型に割り当てることができる工程。
【００９６】
特に、血液試料から得られたＴ細胞受容体アミノ酸配列は、腫瘍から得られたＴ細胞受容体核酸配列を複数の腫瘍試料クローン型へ分類する方法と同様に、複数の血液試料クローン型に分類され、特に、腫瘍試料のクローン型を血液試料クローン型に割り当てることを可能にする。
【００９７】
特に、以下の場合に、腫瘍特異的クローン型を血液試料クローン型に割り当てることができる：
ａ）  上記のこのクローン型内に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちのＴ細胞受容体核酸配列のいずれか１つは、血液試料クローン型内に含まれるＴ細胞受容体核酸配列と実質同一配列を表す、及び／又は
ｂ）  上記のこのクローン型内に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちのＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列は、血液試料クローン型内に含まれるＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である。
【００９８】
特定の実施形態において、本発明の方法は、さらに以下の工程を含む：
−  患者から得られた血液試料を提供する工程；
−  核酸単離工程において血液試料から核酸調製物を単離する工程；
−  核酸調製物由来の複数のＴ細胞受容体核酸配列及び複数のＴ細胞受容体核酸配列によりコードされる複数のＴ細胞アミノ酸配列を得る工程；
−  複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列を整列させる工程；
−  複数のＴ細胞受容体配列に含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列を、複数の血液試料クローン型に分類する工程であって、ここで、特定のクローン型内に含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列は、ＴＣＲの可変領域に対して実質的に同一の配列を表す工程、
−  複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・  腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型１００個のうちの１つであるか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、複数の腫瘍試料クローン型の１００個の最大頻度のクローン型のうちの１つの腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるＴ細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び
・  複数の腫瘍試料クローン型のうちの１００個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記１つの腫瘍特異的クローン型は、前記１つの腫瘍特異的クローン型の頻度未満の頻度を示す血液試料クローン型に割り当てることができる工程。
【００９９】
特に、血液試料から得られたＴ細胞受容体アミノ酸配列は、腫瘍から得られたＴ細胞受容体アミノ酸配列を複数の腫瘍試料クローン型へ分類する方法と同様に、複数の血液試料クローン型に分類され、特に、腫瘍試料のクローン型を血液試料クローン型に割り当てることを可能にする。
【０１００】
特に、腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列の中のＴ細胞受容体アミノ酸配列のいずれか１つが血液試料クローン型に含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列と実質同一又は同一の配列を表す場合、腫瘍特異的クローン型は血液試料クローン型に割り当てることができる。
【０１０１】
特定の実施形態において、本発明の方法は、さらに以下の工程を含む：
−  患者から得られた無細胞試料を提供する工程；
−  核酸単離工程において無細胞試料から核酸調製物を単離する工程；
−  核酸調製物から複数のＴ細胞受容体核酸配列を得る工程； 
−  複数のＴ細胞受容体核酸配列を整列させる工程；
−  複数のＴ細胞受容体配列に含まれるＴ細胞受容体核酸配列を、複数の無細胞試料クローン型に分類する工程であって、ここで
ａ）特定のクローン型内に含まれるＴ細胞受容体核酸配列は、ＴＣＲの可変領域、特にＣＤＲ３領域に対して実質的に同一の配列を表し、及び／又は
ｂ）特定のクローン型内に含まれるＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列は、ＴＣＲの可変領域、特にＣＤＲ３領域に関して同一の配列を表す工程；
−  複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・  腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型１００個のうちの１つであるか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、複数の腫瘍試料クローン型の１００個の最大頻度のクローン型のうちの１つの腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体核酸配列によりコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるＴ細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び
・  複数の腫瘍試料クローン型のうちの１００個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記１つの腫瘍特異的クローン型は、無細胞試料に割り当てることができ、特に複数の無細胞試料クローン型の全頻度中、０．００１％より大の頻度を示す無細胞試料クローン型に割り当てることができる工程。
【０１０２】
特に、無細胞試料から得られたＴ細胞受容体核酸配列は、腫瘍から得られたＴ細胞受容体核酸配列を複数の腫瘍試料クローン型へ分類する方法と同様に、複数の無細胞試料クローン型に分類され、特に、腫瘍試料のクローン型を無細胞クローン型に割り当てることを可能にする。
【０１０３】
特に、以下の場合に、腫瘍特異的クローン型を無細胞試料クローン型に割り当てることができる：
ａ）  上記のこのクローン型内に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちのＴ細胞受容体核酸配列のいずれか１つは、無細胞試料クローン型内に含まれるＴ細胞受容体核酸配列と実質同一配列を表す、及び／又は
ｂ）  上記のこのクローン型内に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちのＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列は、無細胞試料クローン型内に含まれるＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である。
【０１０４】
特定の実施形態において、本発明の方法は、さらに以下の工程を含む：
−  患者から得られた無細胞試料を提供する工程；
−  核酸単離工程において無細胞試料から核酸調製物を単離する工程；
−  核酸調製物から複数のＴ細胞受容体核酸配列及び複数のＴ細胞受容体核酸配列によりコードされる複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列を得る工程；
−  複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列を整列させる工程；
−  複数のＴ細胞受容体配列に含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列を、複数の無細胞試料クローン型に分類する工程であって、ここで、特定のクローン型内に含まれるＴ細胞受容体核酸配列は、ＴＣＲの可変領域、特にＣＤＲ３領域に対して実質的に同一又は同一の配列を表す工程；
−  複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・  腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型１００個のうちの１つであるか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、複数の腫瘍試料クローン型の１００個の最大頻度のクローン型のうちの１つの腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるＴ細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び
・  複数の腫瘍試料クローン型のうちの１００個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記１つの腫瘍特異的クローン型は、無細胞試料クローン型に割り当てることができ、特に複数の無細胞試料クローン型の全頻度中、０．００１％より大の頻度を示す無細胞試料クローン型に割り当てることができる工程。
【０１０５】
特に、無細胞試料から得られたＴ細胞受容体アミノ酸配列は、腫瘍から得られたＴ細胞受容体アミノ酸配列を複数の腫瘍試料クローン型へ分類する方法と同様に、複数の無細胞試料クローン型に分類され、特に、腫瘍試料のクローン型を無細胞試料クローン型に割り当てることを可能にする。
【０１０６】
特に、腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列の中のＴ細胞受容体アミノ酸配列のいずれか１つが、無細胞試料クローン型に含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列と実質同一又は同一である場合、腫瘍特異的クローン型は無細胞試料クローン型に割り当てることができる。
【０１０７】
特定の実施形態では、選択された腫瘍特異的クローン型を、ヒトサイトメガロウイルス又はエプスタイン−バーウイルスに反応性である既知のクローン型に割り当てることはできない。
【０１０８】
そのような割り当ては、特に、選択された腫瘍特異的クローン型内に含まれる腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列が、ヒトサイトメガロウイルス又はエプスタイン−バーウイルスに反応する既知のクローン型の核酸配列と比較されるバイオインフォマティクス法により行われる。
【０１０９】
特に、以下の場合に、選択された腫瘍特異的クローン型を、ヒトサイトメガロウイルス又はエプスタイン−バーウイルスに反応性である既知のクローン型に割り当てることはできない：
ａ）  上記のこのクローン型内に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちのどのＴ細胞受容体核酸配列も、既知のクローン型内に含まれるＴ細胞受容体核酸配列と実質同一ではない、
ｂ）  上記のこのクローン型内に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちのＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるどのＴ細胞受容体アミノ酸配列も、既知のクローン型内に含まれるＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一ではない、又は
ｃ）  上記のこのクローン型内に含まれる複数のＴ細胞アミノ酸配列のうちのどのＴ細胞受容体アミノ酸配列も、既知のクローン型内に含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列と実質同一又は同一ではない。
【０１１０】
特定の実施形態において、本発明の方法は、さらに以下の工程を含む：
−  複数の腫瘍試料クローン型から腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・  腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型１００個のうちの１つであるか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、複数の腫瘍試料クローン型の１００個の最大頻度のクローン型のうちの１つの腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるＴ細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び
・  複数の腫瘍試料クローン型のうちの１００個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記１つの腫瘍特異的クローン型は、複数の腫瘍試料クローン型のうちの別のクローン型に割り当てることができ、これは、前記１００個の最大頻度の腫瘍特異的クローン型のうちの１つに含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうち１つのＴ細胞受容体核酸配列にコードされるＴ細胞受容体アミノ酸と同一又は実質的に同一であるＴ細胞アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である。
【０１１１】
特定の実施形態において、腫瘍試料クローン型の最大頻度のクローン型、又は複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、最大頻度のクローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体核酸配列にコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と実質的に同一であるＴ細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型は、腫瘍特異的クローン型として選択され、ここで特に最も頻度の高いクローン型は、非腫瘍試料中には存在しないか、又は最も高い頻度のクローン型の頻度の、２０％、１５％、１０％、又は５％以下の頻度（非腫瘍試料中）を示す非腫瘍特異的クローン型に割り当てることができ、及び／又は最大頻度のクローン型の頻度未満の頻度を示す血液試料クローン型に割り当てることができ、及び／又は無細胞クローン型、特に複数の血清試料クローン型の全頻度中、０．００１％より大の頻度を示す無細胞クローン型に割り当てることができ、及び／又は
最大頻度の腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体核酸配列によりコードされるＴ細胞受容体アミノ酸と同一又は実質的に同一であるＴ細胞アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型に割り当てることができる。
【０１１２】
特定の実施形態において、本発明の方法は、さらに以下の工程を含む：
−  腫瘍試料から５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・  腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型１００個のうちの５、１０、１５又は２０個であるか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、複数の腫瘍試料クローン型の１００個の最大頻度のクローン型のうちの５、１０又は２０個の腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるＴ細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び任意に
・  複数の腫瘍試料クローン型のうちの１００個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型は、非腫瘍試料中には存在しないか、又は複数の腫瘍試料クローン型の最も高い頻度のクローン型１００個の腫瘍特異的クローン型の頻度の、２０％、１５％、１０％、又は５％以下の頻度（非腫瘍試料中）を表す非腫瘍特異的クローン型に割り当てることができる、及び／又は
・  複数の腫瘍試料クローン型のうちの１００個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型は、前記腫瘍特異的クローン型の頻度未満の頻度を示す血液試料クローン型に割り当てることができる、及び／又は
・  複数の腫瘍試料クローン型のうちの１００個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型は、無細胞試料クローン型に割り当てることができ、特に複数の無細胞試料クローン型の全頻度中、０．００１％より大の頻度を示す無細胞試料クローン型に割り当てることができる、及び／又は
・  複数の腫瘍試料クローン型のうちの１００個の最も頻度の高いクローン型のうちの前記５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型は、複数の腫瘍試料クローン型のうちの別のクローン型に割り当てることができ、これは、複数の腫瘍試料クローン型のうちの１００個の最大頻度の腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうち１つのＴ細胞受容体核酸配列にコードされるＴ細胞受容体アミノ酸と同一又は実質的に同一であるＴ細胞アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型に割り当てることができる工程。
【０１１３】
特に、５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型のそれぞれは、上記の非腫瘍試料、血液試料及び／又は無細胞試料のクローン型と個々に比較され、及び特に割り当てられる。
【０１１４】
特定の実施形態において、
−  複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型１００個のうちの１、５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型のうちのいずれか１つが、以下の場合に非腫瘍特異的クローン型に割り当てられ、これは、腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列の中のＴ細胞受容体配列にコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列が、非腫瘍試料クローン型に含まれるＴ細胞受容体配列によりコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合、又は前記腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列のＴ細胞アミノ酸配列が、前記非腫瘍試料クローン型に含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合である、及び／又は
−  複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型１００個のうちの１、５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型のうちのいずれか１つが、以下の場合に血液試料クローン型に割り当てられ、これは、腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列の中のＴ細胞受容体配列にコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列が、血液試料クローン型に含まれるＴ細胞受容体配列によりコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合、又は前記腫瘍特異的クローン型に含まれるＴ細胞アミノ酸配列が、前記血液試料クローン型に含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合である、及び／又は
−  複数の腫瘍試料クローン型のうち最大頻度のクローン型１００個のうちの１、５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型のうちのいずれか１つが、以下の場合に無細胞試料クローン型に割り当てられ、これは、１つ又は複数の腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列の中のＴ細胞受容体核酸配列にコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列が、無細胞試料クローン型に含まれるＴ細胞受容体核酸配列によりコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合、又は前記腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のＴ細胞アミノ酸配列のうちのＴ細胞アミノ酸配列が、前記無細胞試料クローン型に含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合である。
【０１１５】
特定の実施形態において、本発明の方法は、さらに以下の工程を含む：
−  腫瘍試料から５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型を選択する工程であって、ここで、
・  腫瘍特異的クローン型は、該複数の腫瘍試料クローン型のうちの、５個の最大頻度のクローン型、１０個の最大頻度のクローン型、１５個の最大頻度のクローン型又は２０個の最大頻度のクローン型であるか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型であって、これは、複数の腫瘍試料クローン型のうち前記選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちの１つのＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一又は実質的に同一であるＴ細胞受容体アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型である、及び任意に
・  前記選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型は、非腫瘍試料中には存在しないか、又は複数の腫瘍試料クローン型の中で前記選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型の頻度の、２０％、１５％、１０％、又は５％以下の頻度（非腫瘍試料中）を表す非腫瘍特異的クローン型に割り当てることができる、及び／又は
・  複数の腫瘍試料クローン型のうちの前記選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型は、複数の腫瘍試料クローン型のうちの選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型の頻度未満の頻度を示す血液試料クローン型に割り当てることができる、及び／又は
・  複数の腫瘍試料クローン型のうちの前記選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型は、無細胞試料クローン型に割り当てることができ、特に複数の無細胞試料クローン型の全頻度中、０．００１％より大の頻度を示す無細胞試料クローン型に割り当てることができる、及び／又は
・  複数の腫瘍試料クローン型のうちの前記選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型は、複数の腫瘍試料クローン型のうちの別のクローン型に割り当てることができ、これは、複数の腫瘍試料クローン型のうちの１００個の最大頻度の腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列のうち１つのＴ細胞受容体アミノ酸配列と実質的に同一であるＴ細胞アミノ酸配列を含む、複数の腫瘍試料クローン型の中の別のクローン型に割り当てることができる工程。
【０１１６】
特に、選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型のそれぞれは、上記の非腫瘍試料、血液試料及び／又は無細胞試料のクローン型と個々に比較され、及び特に割り当てられる。
【０１１７】
特定の実施形態において、
−  複数の腫瘍試料クローン型のうちの選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型のうちのいずれか１つが、以下の場合に非腫瘍特異的クローン型に割り当てられ、これは、腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列の中のＴ細胞受容体配列にコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列が、非腫瘍試料クローン型に含まれるＴ細胞受容体核酸配列によりコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合、又は前記腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列のＴ細胞アミノ酸配列が、前記非腫瘍試料クローン型に含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合である、及び／又は
−  複数の腫瘍試料クローン型のうちの選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型のうちのいずれか１つが、以下の場合に血液試料クローン型に割り当てられ、これは、腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列の中のＴ細胞受容体核酸配列にコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列が、血液試料クローン型に含まれるＴ細胞受容体核酸によりコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合、又は前記腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列のＴ細胞アミノ酸配列が、前記血液試料クローン型に含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合である、及び／又は
−  複数の腫瘍試料クローン型のうちの選択された５、１０、１５又は２０個の腫瘍特異的クローン型のうちのいずれか１つが、以下の場合に無細胞試料クローン型に割り当てられ、これは、腫瘍特異的クローン型に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列の中のＴ細胞受容体核酸配列にコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列が、無細胞試料クローン型に含まれるＴ細胞受容体核酸配列によりコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合、又は前記腫瘍特異的クローン型に含まれる前記複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列のうちのＴ細胞アミノ酸配列が、前記無細胞試料クローン型に含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合である。
【０１１８】
特定の実施形態では、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列に特異的に結合する核酸プローブは二本鎖オリゴヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドの第１の鎖は選択された腫瘍特異的核酸配列に相補的であり、かつ金ナノ粒子に結合されており、及び第２の鎖が第１の鎖に相補的であり、発光標識を有し、この標識の発光は、第２の鎖が第１の鎖に結合している場合、金ナノ粒子によって消光される。そのようなプローブの非限定的な例は、メルクミリポア（メルクＫＧａＡ、ダルムシュタット、ドイツ）から入手可能なＳｍａｒｔＦｌａｒｅ（登録商標）プローブである。特定の実施形態では、上記二本鎖オリゴヌクレオチドは、３５塩基未満の長さ、特に１８〜３０塩基の長さで特徴付けられる。
【０１１９】
特定の実施形態では、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列に特異的に結合する核酸プローブはペプチド核酸プローブであり、ここで核酸塩基は、プローブが選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体配列に結合又はハイブリダイゼーションする際に発光（蛍光又は燐光）する色素で置換される。そのような色素はインターカレーティング色素として知られており、非限定的な例はチアゾールオレンジ色素又はオキサゾールイエロー色素のような色素を包含する。そのようなプローブはまた強制インターカレーションプローブとしても知られている。 そのようなプローブの例は、国際公開第２００６／０７２３６８号Ａ２に開示されている。特定の実施形態では、上記ペプチド核酸プローブは、２０塩基未満の長さ、特に１８ヌクレオチド長で特徴付けられる。
【０１２０】
特定の実施形態では、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列に特異的に結合する核酸プローブはペプチド酸プローブであり、ここで核酸塩基、又はペプチド酸モノマーは、プローブが選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列に結合又はハイブリダイゼーションされた際に発光する色素で置き換えられる。特定の実施形態では、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列に特異的に結合する核酸プローブは、核酸塩基がチアゾールオレンジ色素又はオキサゾールイエロー色素で置き換えられる核酸プローブである。
【０１２１】
特定の実施形態では、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列に特異的に結合する核酸プローブは、核酸モノマー及びペプチド酸モノマーを含むオリゴマーであり、モノマーのうち少なくとも１つは、プローブが結合又はハイブリダイゼーションする際発光する色素、特にチアゾールオレンジ色素又はオキサゾールイエロー色素により置き換えられる。
【０１２２】
特定の実施形態では、核酸単離工程は、以下の工程を含む：
ａ．  腫瘍試料からＴ細胞を単離し、Ｔ細胞から核酸を単離する工程、及び／又は
ｂ．  Ｔ細胞受容体核酸配列を特異的に増幅する核酸増幅反応を行う工程。
【０１２３】
特定の実施形態において、細胞懸濁液は、腫瘍試料から調製され、ここで、細胞懸濁液は、腫瘍試料の腫瘍細胞及び特に腫瘍に浸潤したＴ細胞を含む。このような細胞懸濁液は、例えば、ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュ  グラートバッハ、ドイツ製のｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（登録商標）システムによる、腫瘍試料から調製可能である。
【０１２４】
特定の実施形態では、ＣＤ３＋Ｔ細胞は、腫瘍試料又は細胞懸濁液、及び任意に非腫瘍試料、及び／又は血液試料から単離され、ここで特にクローン型の頻度が、腫瘍試料又は細胞懸濁液と非腫瘍試料及び／又は血液試料との間における単離された細胞間で評価又は比較される。
【０１２５】
特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、腫瘍試料又は細胞懸濁液、及び任意に非腫瘍試料、及び／又は血液試料から単離され、ここで特にクローン型の頻度が、腫瘍試料又は細胞懸濁液と非腫瘍試料及び／又は血液試料との間における単離された細胞間で評価又は比較される。
【０１２６】
特定の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、腫瘍試料又は細胞懸濁液、及び任意に非腫瘍試料、及び／又は血液試料から単離され、ここで特にクローン型の頻度が、腫瘍試料又は細胞懸濁液と非腫瘍試料及び／又は血液試料との間における単離された細胞間で評価又は比較される。
【０１２７】
特定の実施形態では、Ｔ細胞活性化マーカー又は分泌インターフェロンガンマ又はＴＮＦアルファを含むＴ細胞は、腫瘍試料又は細胞懸濁液、及び任意に非腫瘍試料、及び／又は血液試料から単離され、ここで特にクローン型の頻度が、腫瘍試料又は細胞懸濁液と非腫瘍試料及び／又は血液試料との間における単離された細胞間で評価又は比較され、及び特にＴ細胞は、１０−７、１０−８又は１０−９モル／ｌ以下の解離定数を有するＴ細胞活性化マーカー、インターフェロンガンマ又はＴＮＦアルファに特異的に結合することができる反応性リガンドで染色されるか、又は活性化マーカー、インターフェロンガンマ又はＴＮＦアルファをコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブで染色され、そして染色されたＴ細胞が単離される。
【０１２８】
特定の実施形態において、腫瘍試料から単離されたＴ細胞は、Ｔ細胞活性化マーカーに特異的に結合するリガンドで染色される。
【０１２９】
特定の実施形態では、腫瘍試料から単離されたＴ細胞は、Ｔ細胞が細胞培養の条件下で増殖する増殖工程に供される。
【０１３０】
特定の実施形態において、Ｔ細胞は、１０−７、１０−８又は１０−９モル／ｌ以下の解離定数でＴ細胞活性化マーカーに特異的に結合することができる反応性リガンドで単離する前に染色され、そして染色されたＴ細胞が単離される。
【０１３１】
本発明によるリガンドは、高い親和性及び特異性で標的分子又は分析物に結合する任意の分子であり得る。そのようなリガンドは、長さが１０〜７５ヌクレオチドの抗体、抗体フラグメント、抗体様分子又は核酸アプタマー分子であり、そのいずれも標的分子に結合する。
【０１３２】
抗体フラグメントは、抗体の抗原結合フラグメントであるＦａｂフラグメント、又はペプチドリンカーにより結合される抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の融合タンパク質である一本鎖可変フラグメントであり得る。抗体様分子は、設計されたアンキリンリピートタンパク質（モレキュラー  パートナーズ、スイス）のようなリピートタンパク質であり得る。
【０１３３】
本発明の上記態様による適切なリガンドは、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ又はＳＥＬＥＸのような方法によっても開発することができ、ここでポリペプチド又はオリゴヌクレオチドは、目的の標的に対するそれらの結合親和性に基づき選択される。さらに、同定されたリガンドの結合親和性は、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の進化のサイクルによって改善され得、進化した阻害剤の選択は、必要とされる親和性に基づいて行われ得る。
【０１３４】
ある実施形態において、Ｔ細胞活性化マーカーは、ＬＡＧ３、ＯＸ４０、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１５４、ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ、ＶＩＳＴＡ、Ｂｕｔｙｒｏｐｈｉｌｉｎのメンバー、Ｂｕｔｙｒｏｐｈｉｌｉｎ様タンパク質、ＣＤ６９及びＣＤ１３７から選択される。特定の実施形態では、Ｔ細胞活性化マーカーは、インターフェロンガンマ又はＴＮＦアルファの分泌である。特に、インターフェロンガンマ及び／又はＴＮＦアルファを分泌するＴ細胞は、例えば、ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュ  グラートバッハ、ドイツによるＩＦＮ−γ分泌アッセイ又はＩＦＮガンマ及びＴＮＦアルファ細胞内サイトカイン染色アッセイ、を用いて単離することができる。
【０１３５】
特定の実施形態では、核酸調製物が単離細胞から単離される単離工程の前、又は上記の核酸増幅工程を実施する前に、上記単離されたＴ細胞は、ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞及び／又は制御性Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞から枯渇される。特に、ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞及び／又は制御性Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞は、上記細胞を抗−ＣＤ２５抗体又は少なくとも部分的にＣＤ２５又はＦｏｘｐ３をコードする核酸にハイブリダイズすることができる核酸プローブで染色し、染色された細胞を選別することで、例えば、フローサイトメトリー法によって涸渇することができる。
【０１３６】
特定の実施形態では、細胞懸濁液が、腫瘍試料の腫瘍細胞及び腫瘍に浸潤したＴ細胞を含む腫瘍試料から調製され、ＣＤ１５４＋Ｔ細胞が細胞懸濁液から単離され、核酸は単離されたＣＤ１５４＋Ｔ細胞から単離され、及び複数のＴ細胞受容体核酸配列は単離された核酸から得られる。好ましくは、ＣＤ１５４＋Ｔ細胞は、例えば蛍光色素分子のような光学的標識、又は磁性粒子又はビーズに結合した抗−ＣＤ１５４抗体で標識され、標識細胞はフローサイトメトリー又は磁気分離によって単離される。有利なことに、細胞懸濁液中に腫瘍抗原が存在するため、例えば抗原、抗原フラグメント又は抗原提示細胞の形態でさらなる刺激は必要ではない。さらに、ＣＤ１５４＋Ｔ細胞のダウンレギュレーションを防止するための抗−ＣＤ４０抗体の使用も必要ではない。細胞懸濁液の残りの部分は、上記のようにさらに処理することができる。
【０１３７】
特定の実施形態では、腫瘍特異的Ｔ細胞がリンパ球調製物から単離される単離工程に続いて、単離されたＴ細胞が細胞培養の条件下で増殖する増殖工程が続く。
【０１３８】
特に、単離された腫瘍特異的Ｔ細胞は、１〜２０個の異なるクローン型を含み得るか、又はそれらから構成され得る。特定の実施形態では、単離された腫瘍特異的Ｔ細胞は、５、１０、１５又は２０個の異なるクローン型を含むか又はそれらから構成される。好都合には、単離された腫瘍特異的Ｔ細胞は、患者の腫瘍又は腫瘍細胞に対する高い親和性及び反応性によって特徴付けられる。
【０１３９】
Ｔ細胞活性化マーカーを含むか又は暴露するＴ細胞、及び／又はインターフェロンガンマ又はＴＮＦアルファを分泌するＴ細胞は、リンパ球調製物又は増殖したＴ細胞調製物から単離された腫瘍特異的Ｔ細胞調製物から単離することができ、特にＴ細胞はＴ細胞活性化マーカーのため、及び／又はインターフェロンガンマ又はＴＮＦアルファの分泌のために染色され、そして染色された細胞は単離され、活性化された腫瘍特異的Ｔ細胞調製物を生じる。
【０１４０】
本発明の腫瘍特異的Ｔ細胞調製物又は増殖したＴ細胞調製物は、また、患者の自己腫瘍の細胞懸濁液と共培養することができ、及びＴ細胞活性化マーカーを含むか又は暴露するＴ細胞、及び／又はインターフェロンガンマ又はＴＮＦアルファを分泌するＴ細胞は、また、上記のＴ細胞調製物から単離され、活性化された腫瘍特異的Ｔ細胞調製物を産生する。
【０１４１】
そのような活性化Ｔ細胞調製物は、特に、高い腫瘍反応性を有するＴ細胞で特徴づけられる。
【０１４２】
特定の実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、本発明の腫瘍特異的Ｔ細胞調製物、増殖Ｔ細胞調製物、又は活性化腫瘍特異的Ｔ細胞調製物から単離される。
【０１４３】
特定の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、本発明の腫瘍特異的Ｔ細胞調製物、増殖Ｔ細胞調製物、又は活性化腫瘍特異的Ｔ細胞調製物から単離される。
【０１４４】
特定の実施形態において、ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリーＴ細胞、特にＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、より具体的にはＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞は、本発明の腫瘍特異的Ｔ細胞調製物、増殖Ｔ細胞調製物、又は活性化腫瘍特異的Ｔ細胞調製物から単離され、腫瘍特異的セントラルメモリーＴ細胞調製物を産生する。
【０１４５】
特定の実施形態では、ＣＤ４＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリーＴ細胞、特に
ＣＤ４＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、より具体的にはＣＤ４＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞を、本発明の腫瘍特異的Ｔ細胞調製物、増殖Ｔ細胞調製物、又は活性化腫瘍特異的Ｔ細胞調製物から単離され、腫瘍特異的セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞調製物を産生する。
【０１４６】
特定の実施形態では、ＣＤ８＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリーＴ細胞、特にＣＤ８＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、より具体的にはＣＤ８＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞は、本発明の腫瘍特異的Ｔ細胞調製物、増殖Ｔ細胞調製物又は活性化腫瘍特異的Ｔ細胞から単離され、腫瘍特異的セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞調製物を産生する。
【０１４７】
特定の実施形態では、ＣＣＲ７−ＣＤ６２−エフェクターメモリーＴ細胞、特にＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、より具体的にはＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＰ＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞を、本発明の腫瘍特異的Ｔ細胞調製物、増殖Ｔ細胞調製物又は、活性化された腫瘍特異的Ｔ細胞調製物から単離し、腫瘍特異的エフェクターメモリーＴ細胞調製物を産生する。
【０１４８】
特定の実施形態では、ＣＤ４＋ＣＣＲ７−ＣＤ６２−エフェクターメモリーＴ細胞、特に
ＣＤ４＋ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、より具体的には、ＣＤ４＋ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＰ＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞は、本発明の腫瘍特異的Ｔ細胞調製物、増殖Ｔ細胞調製物又は活性化腫瘍特異的Ｔ細胞調製物から単離され、腫瘍特異的エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞調製物を産生する。
【０１４９】
特定の実施形態では、ＣＤ８＋ＣＣＲ７−ＣＤ６２−エフェクターメモリーＴ細胞、特にＣＤ８＋ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、より特定的には、ＣＤ８＋ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＰ＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞は、本発明の腫瘍特異的Ｔ細胞調製物、増殖Ｔ細胞調製物、又は活性化された腫瘍特異的Ｔ細胞から単離され、腫瘍特異的エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞調製物を産生する。
【０１５０】
特定の実施形態において、ＣＤ２５＋及び／又はＦｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞は、本発明の腫瘍特異的Ｔ細胞調製物、増殖Ｔ細胞調製物又は活性化腫瘍特異的Ｔ細胞調製物から単離され、腫瘍特異的制御性Ｔ細胞調製物を産生する。
【０１５１】
特定の実施形態では、本発明の腫瘍特異的Ｔ細胞調製物、増殖Ｔ細胞調製物又は活性化腫瘍特異的Ｔ細胞調製物は、特に増殖工程の前に、ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞及び／又は制御性Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞から枯渇する。
【０１５２】
有利には、得られた腫瘍特異的Ｔ細胞調製物は、腫瘍特異的抑制性制御Ｔ細胞の不在のために、腫瘍反応性の増大及びより高い増殖能を特徴とする。
【０１５３】
特に、本発明の腫瘍特異的Ｔ細胞調製物の腫瘍反応性は、以下により確認され得る：
−  少なくとも本発明の腫瘍特異的Ｔ細胞調製物のいずれか１つのアリコート、特に、単離工程でリンパ球調製物から単離された腫瘍特異的Ｔ細胞の１つのアリコートを、患者の自己腫瘍の細胞懸濁液と、又は患者の自己抗原提示細胞を併せた自己腫瘍の溶解物と共培養すること、及び
−  細胞懸濁液の存在下で、Ｔ細胞調製物によって産生されたインターフェロンガンマ又はＴＮＦアルファの量を決定すること、及び／又は細胞懸濁液の存在下で、Ｔ細胞調製物中のＴ細胞活性化マーカーのレベルを決定すること、特にＯＸ４０、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ４、ＰＤ−１、ブチロフィリンのメンバー、ブチロフィリン様タンパク質及び／又はＣＤ６９の量を決定すること。
【０１５４】
特に、インターフェロンガンマ又はＴＮＦアルファの分泌及び／又はＴ細胞活性化マーカーの発現又は増加した発現を特徴とする腫瘍特異的Ｔ細胞調製物は、活性化腫瘍特異的Ｔ細胞調製物とみなされる。
【０１５５】
特定の実施形態では、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列は、ヒトＴ細胞受容体の鎖のＣＤＲ３領域、特にヒトＴ細胞受容体のアルファ鎖又はベータ鎖をコードする核酸配列内に含まれる。
【０１５６】
特定の実施形態では、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列は、ヒトＴ細胞受容体の鎖のＣＤＲ３領域、特にヒトＴ細胞受容体のアルファ鎖又はベータ鎖に含まれるか、又はそのものである。
【０１５７】
特定の実施形態では、腫瘍特異的核酸配列は、ＲＮＡに含まれる。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、ヒトＴ細胞受容体のアルファ鎖又はベータ鎖のＣＤＲ３領域内に含まれるアミノ酸配列をコードする。
【０１５８】
特定の実施形態において、リンパ球調製物は、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列に特異的に結合する核酸プローブと接触する前に、ＴＣＲｍＲＮＡの転写レベルを増加させる薬剤で処理される。
【０１５９】
有利には、ＴＣＲｍＲＮＡのレベルを増加させることにより、所望の腫瘍特異的クローン型の特異的検出のためのシグナル対ノイズ比が改善される。
【０１６０】
特定の実施形態では、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列に特異的に結合する核酸プローブは、Ｔ細胞細胞質などのアニーリング媒体の生理学的条件下で、４５℃以下の最適な標的アニーリング温度によって特徴付けられる。有利には、最適なアニーリング温度は、リンパ球調製物のための最適な培養温度内にある。特定の実施形態では、最適なアニーリング温度は、２０℃〜３７℃である。
【０１６１】
本発明の別の態様によれば、抗がん剤の免疫抑制効果を決定する方法が提供される。この方法は、以下の工程を含む：
−  本発明の方法による腫瘍特異的Ｔ細胞調製物を提供する工程；
−  腫瘍特異的Ｔ細胞調製物を抗癌剤と接触させる工程；及び
−  接触後の腫瘍特異的Ｔ細胞調製物の機能性及び／又は生存能力を決定する工程。
【０１６２】
特定の実施形態では、腫瘍特異的Ｔ細胞調製物の機能性を決定する工程は、以下の工程を含む：
−  腫瘍特異的Ｔ細胞調製物を、患者の自己腫瘍の細胞懸濁液と、又は患者の自己抗原提示細胞を併せた自己腫瘍の溶解物と共培養する工程、及び
−  細胞懸濁液の存在下で、Ｔ細胞調製物によって産生されたインターフェロンガンマ又はＴＮＦアルファの量を決定すること、及び／又は細胞懸濁液の存在下で、Ｔ細胞調製物中のＴ細胞活性化マーカーのレベルを決定すること、特にＯＸ４０、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ４、ＰＤ−１、ブチロフィリンのメンバー、ブチロフィリン様タンパク質及び／又はＣＤ６９の量を決定する工程。
【０１６３】
本発明の別の態様によれば、腫瘍特異的Ｔ細胞を単離するための部品のキットが提供される。このキットは、トランスフェクション試薬と、成熟Ｔ細胞に特異的なｍＲＮＡに特異的に結合する核酸プローブとを含む。有利には、本発明のキットを用いて本発明の方法を実施することができる。
【０１６４】
核酸プローブは、混合された細胞集団中の成熟Ｔ細胞を同定し、形質移入効率を確認するための陽性対照としての役割を果たすことができる。
【０１６５】
特に、キットに含まれるトランスフェクション試薬は、成熟Ｔ細胞に特異的なｍＲＮＡに特異的に結合する上記の核酸プローブ、特注設計されたＴ細胞クローン特異的プローブなどの細胞内プローブの送達のために設計されており、別々の波長で個々に監視される。
【０１６６】
特定の実施形態では、トランスフェクション試薬は、ストレプトリジン−Ｏ、金ナノ、リポフェクタミン及びポリエチレンイミンからなる群から選択される。
【０１６７】
特定の実施形態では、成熟Ｔ細胞に特異的なｍＲＮＡは、成熟Ｔ細胞受容体の１つのサブユニットをコードするｍＲＮＡである。特定の実施形態では、核酸プローブは、成熟Ｔ細胞受容体の定常部分をコードするｍＲＮＡの領域に特異的に結合する。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、成熟Ｔ細胞受容体のベータサブユニットをコードする。
【０１６８】
特定の実施形態では、トランスフェクション試薬は核酸プローブに接続され、発光と消光の両機能を提供し、且つプローブの細胞取り込みをもたらす。
【０１６９】
Ｔ細胞特異的ｍＲＮＡプローブは、Ｔ細胞に特異的であるＴ細胞受容体ｍＲＮＡ、例えばＴＣＲアルファ又はＴＣＲベータｍＲＮＡ、ＴＣＲガンマ又はＴＣＲデルタｍＲＮＡ又は他のｍＲＮＡ又はＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる。好ましくは、プローブは、Ｃベータ１又はＣベータ２ドメイン及び膜貫通ドメイン（Ｊｕｒｋａｔ  ＴＣＲベータｍＲＮＡのヌクレオチド１８１〜７０９、配列番号１０１）をコードする保存領域を含むＴＣＲベータｍＲＮＡの定常領域に結合し、より好ましくは、異なる個体間で高度に保存され、細胞内に存在する他のＲＮＡ転写物と少なくとも相同性を共有する領域に結合する。さらに、Ｊｕｒｋａｔ  ＴＣＲベータｍＲＮＡのヌクレオチド３５６〜４３７及び６１８〜６６０を含む領域（配列番号１０１）のような、検出のための非常に効率的で特異的なプローブハイブリダイゼーションをもたらすために構造がほとんど複雑でなく高度に保存された領域に、プローブが結合することがより好ましい。最も好ましくは、Ｔ細胞特異的ＲＮＡプローブは、ＪｕｒｋａｔＴＣＲベータｍＲＮＡのヌクレオチド３７０〜４１９を含む領域に特異的にハイブリダイズする。このプローブは、細胞の混合集団におけるＴ細胞を同定し、トランスフェクション又は取り込み効率を確認するための陽性対照として役立ち得る。任意に、キットはまた、標的ＲＮＡに結合せず、細胞内に移されたときに発光性である、一般的な取り込み又はトランスフェクション陽性対照プローブを含んでもよい。キットは、プローブのシグナルバックグラウンドレベルを決定するためにスクランブル陰性対照プローブをさらに含んでもよい。好ましくは、スクランブル陰性対照プローブは、細胞ＲＮＡのどの相補的配列にも存在しない配列を含む。
【０１７０】
好ましくは、細胞選別による配列特異的Ｔ細胞クローンの濃縮を行う前提として、両方のプローブ（成熟Ｔ細胞に特異的なｍＲＮＡに特異的に結合する核酸プローブ及び上記の特別に設計されたＴ細胞クローン特異的プローブ）に由来するシグナルが存在しなければならない。いずれかのプローブシグナルの１つのみを有する細胞、又は全く存在しない細胞は、廃棄される。
【０１７１】
特定の実施形態では、キットは、ＴＣＲｍＲＮＡの転写レベルを増加させる薬剤をさらに含む。特定の実施形態において、薬剤は、インターロイキン２又はシクロヘキシミドである。
【０１７２】
特定の実施形態では、キットは、コントロールＴ細胞株、及びコントロールＴ細胞株内に含まれかつ別のＴ細胞又はＴ細胞株に含まれない特有のアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡに、特異的に結合するコントロール核酸プローブをさらに含む。特定の実施形態では、この特有のアミノ酸配列は、コントロールＴ細胞株のＴ細胞受容体のベータサブユニットのＣＤＲ３領域内に含まれる。特定の実施形態では、コントロールＴ細胞株はＪｕｒｋａｔ細胞株ＤＳＭＺの第ＡＣＣ２８２である。特定の実施形態では、コントロールＴ細胞株内に含まれ、別のＴ細胞又はＴ細胞株に含まれない特有のアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡに特異的に結合するコントロール核酸プローブは、配列番号１０１（Ｊｕｒｋａｔ細胞株由来のヒトＴ細胞受容体活性ベータ鎖ｍＲＮＡ（クローンＪＵＲ−ベータ−１））を特徴とする核酸配列から構成され、又は含む。
【０１７３】
特定の実施形態では、キットは、血液からＴ細胞を単離するための手段をさらに含む。特定の実施形態では、手段は、ＣＤ３、ＣＤ８又はＣＤ４に対する抗体を含む磁気ビーズである。特定の実施形態では、この手段は、例えばＣＤ３、ＣＤ４又はＣＤ８のようなＴ細胞特異的マーカーに対する抗体であり、ここで、抗体は、蛍光に基づくフローサイトメトリーに適する。
【０１７４】
特定の実施形態では、キットは、血液からＴ細胞を単離するための手段をさらに含む。特定の実施形態では、手段は、ＣＤ３、ＣＤ８又はＣＤ４のｍＲＮＡ検出に特異的なプローブであり、特に、ＣＤ３、ＣＤ８又はＣＤ４をコードするｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる標識された核酸プローブである。特定の実施形態では、この手段は、Ｔ細胞特異的マーカーのｍＲＮＡに特異的なプローブ、特に、例えばＣＤ３、ＣＤ４又はＣＤ８のような、Ｔ細胞特異的マーカーをコードするｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブであり、このプローブは、特に、プローブに結合された発光又は蛍光標識を用いる、発光又は蛍光に基づくフローサイトメトリーに適している。特定の実施形態では、手段は、例えばＣＤ３、ＣＤ４又はＣＤ８などのＴ細胞特異的マーカーのｍＲＮＡに特異的なプローブであり、プローブはＰＣＲによる検出に適しており、特にプローブは、Ｔ細胞特異的マーカーをコードする核酸に特異的にアニーリングすることができるプライマー又はプライマー対であり、特にＴ細胞特異的マーカーをコードする核酸を含む細胞のみにおいて、ＰＣＲの増幅産物が得られるようなものである。
【０１７５】
本発明の別の態様によれば、患者の癌を治療するための方法が提供される。該方法は、本発明の方法により腫瘍特異的Ｔ細胞調製物を提供し、該腫瘍特異的Ｔ細胞調製物を該患者に投与する工程を含む。特定の実施形態では、この方法は、投与前に特異的Ｔ細胞調製物の有効性を確認することをさらに含む。
【０１７６】
特定の実施形態では、本発明の上記態様又は実施形態の、活性化腫瘍特異的Ｔ細胞調製物、腫瘍特異的セントラルメモリーＴ細胞調製物、腫瘍特異的セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞調製物、ＣＤ８＋腫瘍特異的セントラルメモリーＴ細胞調製物、腫瘍特異的エフェクターメモリーＴ細胞調製物、ＣＤ４＋腫瘍特異的エフェクターメモリーＴ細胞調製物、ＣＤ８＋腫瘍特異的エフェクターメモリーＴ細胞調製物又は制御性腫瘍特異的Ｔ細胞調製物を患者に投与する。
【０１７７】
本発明の別の態様によれば、人工腫瘍特異的Ｔ細胞受容体を製造する方法が提供される。本方法は、以下の工程を含む：
−  本発明の方法による本発明の腫瘍特異的Ｔ細胞調製物のいずれか１つを提供する工程、特に活性化腫瘍特異的Ｔ細胞調製物を提供する工程、
−  個々の腫瘍特異的Ｔ細胞を腫瘍特異的Ｔ細胞調製物から単離する工程；
−  単離された個々の腫瘍特異的Ｔ細胞の中のＴ細胞受容体の両方のサブユニットのＣＤＲ３領域を決定する工程；
−  両方のサブユニットの決定されたＣＤＲ３領域を含む人工Ｔ細胞受容体を調製する工程。
【０１７８】
特定の実施形態では、人工Ｔ細胞受容体は、受容体が単離され得る部分を含む。特定の実施形態では、人工受容体は、アルファ鎖及びベータ鎖のＣＤＲ３領域を含む。特定の実施形態では、人工受容体は、ガンマ鎖及びデルタ鎖のＣＤＲ３領域を含む。特定の実施形態では、人工Ｔ細胞受容体は、Ｔ細胞受容体の四量体に含まれ、少なくとも１つ又は全ての単量体が、決定されたＣＤＲ３領域を含む。
【０１７９】
特定の実施形態では、人工Ｔ細胞受容体が組換えにより調製され、ここで人工Ｔ細胞受容体をコードする核酸が宿主細胞に導入され、そして発現されて人工Ｔ細胞受容体を産生する。特定の実施形態では、核酸は、宿主細胞において作動可能なプロモーターの制御下にある。特定の実施形態では、宿主細胞はヒトＣＤ３＋細胞である。人工Ｔ細胞受容体を含むこのようなＣＤ３＋細胞は、養子移入のため、特に癌を治療するために使用することができる。特定の実施形態において、人工Ｔ細胞受容体は、宿主細胞の表面上に機能的に曝露される。
【０１８０】
本発明の別の態様によれば、腫瘍特異的抗原を有する細胞を単離する方法が提供される。この方法は、以下の工程を含む：
−  本発明の方法による腫瘍特異的Ｔ細胞調製物を提供する工程、
−  個々の腫瘍特異的Ｔ細胞を腫瘍特異的Ｔ細胞調製物から単離する工程；
−  単離された個々の腫瘍特異的Ｔ細胞のＴ細胞受容体の両サブユニットのＣＤＲ３領域を決定する工程；
−  両サブユニットの決定されたＣＤＲ３領域を含む人工Ｔ細胞受容体を調製する工程であって、人工Ｔ細胞受容体は部分を含み、この部分により人工Ｔ細胞受容体が選択的に単離可能となる、
−  人工Ｔ細胞受容体を、抗原を有する細胞と接触させる工程、
−  人工受容体に結合する細胞を単離する工程。
【０１８１】
特定の実施形態において、単離された個々の腫瘍特異的Ｔ細胞のＴ細胞受容体は、アルファ鎖及びベータ鎖を含み、この両鎖のＣＤＲ３領域が決定される。特定の実施形態では、単離された個々の腫瘍特異的Ｔ細胞のＴ細胞受容体は、ガンマ鎖及びデルタ鎖を含み、この両方の鎖のＣＤＲ３領域が決定される。
【０１８２】
特定の実施形態では、この部分は、ビオチン又は磁気ビーズである。特定の実施形態では、単離されるべき細胞は、対象の血液から得られる。特定の実施形態では、単離された細胞の少なくとも１つから、人工Ｔ細胞受容体により認識される抗原が、特に質量分析によって同定される。
【０１８３】
本発明の別の態様によれば、特定のＴ細胞受容体核酸又はアミノ酸配列によって特徴付けられる目的のＴ細胞クローン型を濃縮、特に単離する方法が提供される。この方法は、以下の工程を含む：
−  目的のＴ細胞クローン型を含むリンパ球調製物を提供する工程、
−  分離工程において前記リンパ球調製物を複数の画分に分離する工程、
−  前記複数の画分に含まれる細胞を、増殖工程における細胞培養の条件下で増殖させる増殖工程、及び
−  選択工程において前記特異的Ｔ細胞受容体核酸配列又はアミノ酸配列を含む前記複数の画分のうちの少なくとも１つの画分を選択する工程。
【０１８４】
特に、リンパ球調製物は複数の画分に分離され、この複数の画分の全てではなく、好ましくは複数の画分の半分未満、より好ましくは複数の画分の１０％未満、さらにより好ましくは５％未満、最も好ましくは１％未満が、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列を含む。そのような分離は、複数のうちの画分当たりの細胞の数を制限することによって達成され得る。
【０１８５】
特定の実施形態では、リンパ球調製物は、目的のＴ細胞クローン型を含む最初のリンパ球調製物を、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列又はアミノ酸配列に対応するＴ細胞受容体のＶセグメント内に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合することができる反応性リガンドと接触させることにより提供され、ここでリガンドは検出可能な標識に結合しており、検出可能な標識を有するＴ細胞は最初のリンパ球調製物から単離され、上記のリンパ球調製物が得られ、これは、本発明の上記態様により分離されるべきものである。
【０１８６】
特定の実施形態では、リンパ球調製物又は最初のリンパ球調製物は、患者から得られた試料によって提供される。特定の実施形態では、患者から得られた試料は、腫瘍試料、組織試料又は体液試料、特に血液試料、より具体的には末梢血の試料である。
【０１８７】
特定の実施形態では、複数の画分のそれぞれは、１０５以下の細胞、好ましくは１０４以下の細胞、より好ましくは１０３以下の細胞、さらにより好ましくは１０２以下の細胞が含まれる。
【０１８８】
特定の実施形態では、リンパ球調製物は、少なくとも９６の画分、好ましくは９６画分に分離され、特に各画分は１０５以下の細胞を含む。
【０１８９】
特定の実施形態において、リンパ球調製物は、９６画分〜３８４画分に分離される。
【０１９０】
特定の実施形態では、選択する工程は、前記複数の画分からＴ細胞受容体核酸配列を取得し、前記選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列を含む画分を同定する工程を含み、特にＴ細胞受容体核酸配列は、増幅、特にＰＣＲにより得られる。
【０１９１】
特定の実施形態では、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体配列を含む画分は、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸の少なくとも一部に特異的にアニールするプライマーを用いる増幅反応により同定され、ここでは、特に、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列を含まない画分は増幅産物を示さない。
【０１９２】
特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体核酸配列は、それぞれの画分に含まれる細胞の１つのアリコート又はそれぞれの画分の上清から得られる。
【０１９３】
特定の実施形態では、選択する工程は、複数の画分を、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列に特異的に結合する核酸プローブと接触させる工程であって、該核酸プローブは検出可能な標識に結合している工程、及び検出可能な標識を有するＴ細胞を含む複数の画分のうちの１つの画分を選択する工程を含む。
【０１９４】
特定の実施形態では、濃縮する方法は、さらに以下の工程を含む：
−  選択された画分が第２の複数の画分に分離される、第２の分離工程、
−  第２の複数の画分に含まれる細胞が、細胞培養条件下で増殖される、第２の増殖工程、及び
−  選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列を含む、第２の複数の画分の少なくとも１つの画分が選択される、第２の選択工程。
【０１９５】
特に、選択された腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列を含む画分が新たに選択されるごとに、分離工程、増殖工程及び選択工程を繰り返してもよい。好ましくは、分離工程、増殖工程及び選択工程は、１〜４回繰り返される。
【０１９６】
特定の実施形態では、特定のＴ細胞受容体配列によって特徴付けられる目的のＴ細胞クローン型を濃縮、特に単離する方法は、マイクロアレイで実施され、ここで、リンパ球調製物が、上記の複数の画分を含むマイクロアレイの異なるコンパートメントにおいて分離される。そのようなマイクロアレイは、複数のウェルを含むマイクロタイタープレート、又は複数の空洞及び／又はチャネル、又はマトリックスを含むマイクロ流体チップであってもよく、ここで、異なる画分は、画分中の細胞が自由に拡散するのを妨げるマトリックスに埋め込まれている。
【０１９７】
本発明のさらなる態様によれば、オリゴペプチド又はポリペプチドが提供され、ここで、該オリゴペプチドは、配列番号０１（ＣＡＳＳＶＤＲＧＡＥＡＦＦ）、配列番号０２（ＣＡＷＮＫＱＶＤＧＹＴＦ）、配列番号０４（ＣＡＳＳＰＤＧＥＴＱＹＦ）、配列番号０７（ＣＡＩＳＤＷＴＧＳＮＹＧＹＴＦ）、配列番号１１（ＣＡＳＳＳＧＬＶＹＥＱＹＦ）、配列番号１２（ＣＡＳＳＴＧＴＧＧＬＧＥＬＦＦ）によって特徴付けられるオリゴペプチドを含むか又はそれからなる、又は該ポリペプチドは、配列番号０１、配列番号０２、配列番号０４、配列番号０７、配列番号１１又は配列番号１２によって特徴付けられているオリゴペプチドを含む。
【０１９８】
驚くべきことに、特定のＣＤＲ３ペプチド配列が、ＮＳＣＬＣのような同じ疾患に罹患している患者の大部分に見出され得ることがわかっている。したがって、本発明のオリゴペプチド又はポリペプチドは、特に１０−７、１０−８又は１０−９  ｍｏｌ／ｌ以下の解離定数で、それらのオリゴペプチド又はポリペプチドに特異的に結合することができる反応性リガンドを生成するために使用され得る。
【０１９９】
本発明のさらなる態様によれば、核酸が提供され、この核酸は、配列番号０１、配列番号０２、配列番号０４、配列番号０７、配列番号１１又は配列番号１２によって特徴付けられているオリゴペプチドをコードする核酸配列からなるか、又はそれを含む。
【０２００】
したがって、本発明のさらなる態様において、本発明のオリゴペプチド又はポリペプチドは、本発明のオリゴペプチド又はポリペプチドに特異的に結合することができるリガンドを製造するために、使用することが提供される。そのようなリガンドの製造方法は当該技術分野において公知である。
【０２０１】
本発明のさらなる態様によれば、本発明のオリゴペプチド又はポリペプチドに特異的に結合することができる反応性リガンドが提供され、ここで、特に反応性リガンドは、配列番号０１、配列番号０２、配列番号０４、配列番号０７、配列番号１１又は配列番号１２によって特徴づけられているオリゴペプチドと、１０−７、１０−８又は１０−９  ｍｏｌ／ｌ以下の解離定数で、特異的に結合することができる。
【０２０２】
本発明のさらなる態様によれば、ＮＳＣＬＣを診断するための方法における本発明の特異的反応性リガンドの使用が提供される。
【０２０３】
本発明のさらなる態様によれば、ＮＳＣＬＣを診断するための方法が提供される。この方法は、以下の工程を含む。
−  患者から得られた試料を提供する工程であって、前記試料はＴ細胞を含み、
−  特に本発明のリガンドと試料を接触させることによって、本発明のオリゴペプチド又はポリペプチドを含むＴ細胞の存在を検出する工程。
【０２０４】
特定の実施形態において、本発明のリガンドは、検出可能な標識に結合される。特定の実施形態において、本発明のオリゴペプチド又はポリペプチドを含むＴ細胞は、本発明のリガンドによって標識され、それによって検出される。
【０２０５】
特定の実施形態では、本発明のオリゴペプチド又はポリペプチドを含むＴ細胞の存在は、ＮＳＣＬＣの発生を示す。
【０２０６】
上記局面の代替法によれば、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）を診断するための方法が提供される。この方法は、
−  患者から得られた試料を提供する工程であって、試料はＴ細胞を含む工程、
−  試料から核酸調製物を得る工程、
−  本発明のオリゴペプチド又はポリペプチドをコードする核酸配列の存在を検出する工程。
【０２０７】
本発明の別の態様によれば、特定の人工腫瘍特異的Ｔ細胞受容体を製造する方法が提供される。この方法は、以下の工程を含む：
−  本発明のオリゴペプチド又はポリペプチドを含む人工Ｔ細胞受容体を特に両方のサブユニットにおいて調製する工程。
【０２０８】
本発明は、以下の実施例及び図面によりさらに説明され、それからさらなる実施形態及び利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を説明することを意図しているが、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０２０９】
実施例１：比較配列分析による腫瘍特異的Ｔ細胞及び腫瘍特異的配列の同定
【０２１０】
利用可能な次世代シーケンシング（ＮＧＳ）テクノロジーを用いて、ハイスループットで、１試料あたり数千のＴＣＲベータＣＤＲ３領域（１つのＴＣＲが１つのＴ細胞に相当する）を配列決定し、これにより、ヒトＴＣＲベータのＣＤＲ３−領域のシークエンシングライブラリーが生成された。得られた配列をバイオインフォマティクスツールで分析し、試料当たりの最終結果は、それぞれのクローン型（同じＴＣＲベータを有するＴ細胞のタイプ）を列挙して表にする。
【０２１１】
Ｔ細胞レセプターのＣＤＲ３領域は、定常のＶ及びＪセグメント（図１参照）及びそれらの間の非常に可変な領域によって決定される。この構造に起因して、１つの同一のＣＤＲ３アミノ酸配列は、複数のヌクレオチド配列によってコードされ得、これは異なるＶ／Ｊセグメントで構成されていてもよい。１組の腫瘍特異的Ｔ細胞及び潜在的な腫瘍反応的Ｔ細胞（ＴＲＴＣ）のうち、１つのアミノ酸配列あたり、複数の（＞１）ヌクレオチドＣＤＲ３配列の出現は、それぞれのＣＤＲ３アミノ酸配列を有するＴ細胞は、腫瘍細胞に対して反応性であることの強い教示である。
【０２１２】
ＣＤＲ３配列は、そのスコア（下記の表１を参照）が１０００以上であれば、ＣＤＲ３配列の最終選択にその特性と共に常に加えられる。
【０２１３】
配列プロファイリング及びバイオインフォマティクス分析による腫瘍特異的Ｔ細胞（ＴＳＴＣｓ）の同定のためのスコアリングスキーマ
【０２１４】
本方法は、以下に示すスコアリングシステム（表１）に基づいており、ここでは１つ又はいくつかの試料を採取して並行して分析し、各試料の種類ごとの頻度に対する各比率のクローン型について最良のスコアを得る。一般的に、腫瘍浸潤リンパ球は、以下の一連の分析ステップによって同定された：
【０２１５】
ａ）次世代シークエンシング（ＮＧＳ）は、腫瘍試料から開始して実施される。腫瘍試料は、腫瘍組織から採取された１つの試料又は複製試料のセットとして定義される。実際には、ＴＣＲを分析する材料は、以下のいずれかから選択される：
ｉ．）異なる生検又は１つの生検の中の異なる領域の選択。これは免疫組織化学的染色によって補助され、ここでは、特に、腫瘍反応性Ｔ細胞（ＴＲＴＣ）を、好ましくはＴ細胞活性化マーカー、例えばＬＡＧ３、ＯＸ４０、ＣＤ１０７ａ又はＣＤ１３７で免疫組織学的により染色し、染色された領域をＤＮＡ抽出のために選択する；
ｉｉ．）腫瘍組織の溶解。ＴＣＲ分析の出発点としての単一細胞懸濁液の調製のためであり、ビーズベースの技術による。単一細胞懸濁液は、異なるＴ細胞サブセット、例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットに分けることができる。
さらに、腫瘍試料は、細胞材料のための資源として細胞保存条件下で保存することができる。
【０２１６】
ｂ）同じ患者から得た非腫瘍試料を、腫瘍試料に隣接する組織／領域、もし可能であれば複製で、可能な場合には別個の組織スポットから選択し、かつα及び／又はβＴＣＲ／ＣＤＲ３  ＮＧＳ配列分析を行った。
【０２１７】
ｃ）血液試料（細胞成分）を同じ患者から採取する：標準的な血液学的分画法により、細胞成分を全血から単離し、α及び／又はβＴＣＲ／ＣＤＲ３  ＮＧＳ配列分析を行い、ＴＣＲプロファイルを計算した。
【０２１８】
ｄ）血清、血漿又は他の無細胞生物学的液体／組織は、場合により標準的な血液学的分画法による細胞成分のさらなる除去によって、同じ患者から採取される。無細胞試料中のＴＣＲ特異的ＤＮＡの存在は、Ｔ細胞に対するアポトーシス過程の強力な教示となり得る。有意な量のクローン型（以下の表１を参照）が無細胞試料及び腫瘍において見出される場合、そのスコアはスコアリング表に寄与する（表１）。
【０２１９】
ｅ）任意に、患者の治療／診断の過程における２つ以上の時点が、スクリーニングに使用される。すなわち、試料は血液などから異なる時点で採取される（２．ａ−ｄ参照）。これにより、例えば再発の診断、又は転移などに対する新しいＴＳＴＣの検出をし得る。
【０２２０】
ＮＧＳデータからのクローン型（シーケンスクラスター）計算の原理
【０２２１】
ａ．  ＴＣＲα−及びＴＣＲβ−鎖のＣＤＲ３領域は、ＮＧＳ技術によって配列決定される。ＣＤＲ３領域に隣接するＶ−セグメント及びＪ−セグメントに特異的に結合するＴＣＲα又はＴＣＲβプライマーを用いて、２段階ＰＣＲ法（ＷＯ２０１４／０９６３９４Ａ１に開示されている）を行った。ＤＮＡをＮＧＳプロセスの出発物質として使用した。
【０２２２】
ｂ．  試料当たりの莫大な数（＞１０５）の読み取り断片（ヌクレオチド配列）は、ＮＧＳによって一般的に作成され、この読み取り断片は実質同一のヌクレオチド配列のクラスターに合併され、クラスターあたりの読み取り断片の数によってそのクラスターの頻度が決定され、ここでクラスターの頻度はクラスターに含まれる試料中の読み取り断片のパーセントで測定される。
【０２２３】
ｃ．  クラスター化は非常に慎重であり、２つのラウンドで機能する：第１ステップにおいて、１００％のヌクレオチド配列同一性を有する全ての読み取り断片は、クラスター配列が読み取り配列と同一である１つのクラスターとしてカウントされる。第２のステップでは、クラスターを互いに比較し、そして、
ｉ  １ｂｐ以下のミスマッチ及び
ｉｉ  一方のクラスター（クラスターＡ）が、他方のクラスター（クラスターＢ）より少なくとも２０倍多くの読み取り断片を有する場合、
そのクラスターはマージされてクラスターＡと同一であるとみなされる。ヌクレオチド配列クラスターは、クローン型と等価であるとみなされる。
【０２２４】
ｄ．  ヌクレオチド配列クラスターはアミノ酸配列（ペプチド）に翻訳され、表にされる。各クラスターは、（１．ｂ）で定義された頻度を持つ１つのクローン型とみなされる。頻度は、試料中のそれぞれのＴ細胞の頻度の直接測定値である。
【０２２５】
ｅ．  実質的に同一のアミノ酸配列を共有するクラスター（クローン型）は、クラスター型にマージされ、クラスター型の頻度は前記クラスター型の要素であるヌクレオチド配列クラスターの頻度の合計と同一である。
【０２２６】
ＴＳＴＣ（腫瘍特異的Ｔ細胞）スコアのランク付けは、４桁の数字１０１１、１０１０、１００１、１０００（最高から最低まで）で与えられ、他のすべてのケースは除外される。
【０２２７】
列内では、得点は以下のように定義される。
【０２２８】
【表１】
2018525034.tif 000003
表１  最良のＴＳＴＣ−クローン型の選択のための得点表
【０２２９】
各列（１つの組織型につき１つの列）内で、ＣＤＲ３のヌクレオチド配列（Ｓｅｑ１、２、３、．．）ごとに、単純な２進法スコアが与えられる：「１」は、対応するＣＤＲ３のＤＮＡ配列が生じることを意味し、「０」は、対応するＣＤＲ３のＤＮＡ配列が存在しないか、低レベルで生じることを意味する。正確な定義を以下に示す。表２に示すように、２進法スコアは４桁のＴＳＴＣスコアに結合される。受け入れられたＴＳＴＣスコアのランク付けは、自然順序：１０１１、１０１０、１００１、１０００（最良から最悪）で与えられ、他のすべてのスコアは除外される。ＴＳＴＣ得点スキーマはまた、以下の場合をも含み、例えば、血液試料が存在しない場合、すなわち列Ｃ及びＤは「０」で埋められ、又は腫瘍試料のみが存在する場合、すなわち列Ｂ、Ｃ及びＤは「０」で埋められ得る。１列（＝組織の１種類）あたりの２進法スコアは、次のように定義される：
【０２３０】
Ａ：スコア＝１：配列（ｓｅｑ１、２、・・）は、（最高から最低までの頻度によって選別された）上位１００個のクローン型のうちの１つであり、完全なオープンリーディングフレームを示し、すなわち終止コドン又はフレームシフトは見つからないことをいう。それ以外は、スコア＝０。
【０２３１】
Ｂ：スコア＝０：配列（Ｓｅｑ１、２、３、・・）は、非腫瘍試料には存在しないか、又は非腫瘍試料では同一であるが、ｐｅｐＢが非腫瘍試料中の頻度であり、ｐｅｐＡが腫瘍試料中の頻度である場合、その比Ｒ＝ｐｅｐＢ／ｐｅｐＡが０．２、０．１５、０．１又は０．０５以下である場合である。それ以外の場合はスコア＝１。
【０２３２】
Ｃ：スコア＝１：配列Ｓｅｑ１、２、３、・・の頻度が、腫瘍組織（Ａ）における対応する配列の頻度よりも低い場合である。そうでなければスコア＝０。
【０２３３】
Ｄ：スコア＝  １：配列Ｓｅｑ１、２、３、・・の頻度が、無細胞ＤＮＡ由来の全配列の０．００１％より高い場合。そうでなければスコア＝０。
【０２３４】
Ｅ：既にＴＳＴＣスコア（上記Ａ〜Ｄを参照）によって選択されたＣＤＲ３配列Ｓｅｑ１、２、３・・については、場合により、以下の追加のフィルターを適用することができる：Ａ（腫瘍試料）由来の同一ＣＤＲ３アミノ酸配列が、異なるＣＤＲ３ヌクレオチド配列Ｓｅｑ１、２、３、・・によりコードされる場合、これは、収束組換え及び高度に免疫原性の腫瘍抗原の指標である。この特性を有するクローン型には、最も高いＴＳＴＣスコア＝１０１１が与えられる。
【０２３５】
Ｆ：ＴＳＴＣスコアによって（上記のＡ〜Ｄを参照して）選択されたＣＤＲ３配列Ｓｅｑ１、２、３・・については、場合により、以下の追加のフィルターを適用する：Ａ（腫瘍試料）由来のアミノ酸配列に翻訳されたＣＤＲ３配列を、ＢＬＯＳＵＭ８０又はＢＬＯＳＵＭ６２のようなアミノ酸置換マトリックスを用いたタンパク質アラインメント（ｂｌａｓｔ）により互いに比較し得る。最大１ミスマッチと非常に類似しているアミノ酸配列は、類似性クラスターに分類され、類似性クラスターの各メンバー（Ｓｅｑ１、２、３・・）には、その類似クラスター内の最良得点のＣＤＲ３配列と同じＴＳＴＣスコアが与えられる。
【０２３６】
各スコアグループ１０１１、１０１０、１００１、１０００（最も良いものから最悪のもの）内で、ＣＤＲ３ヌクレオチド配列は頻度が最大のものから最低のものまで選別され、最後の選別されたリストから、上位１〜１００のＣＤＲ３ヌクレオチド配列が次のステップのための候補群として選択される。
【０２３７】
他の実施形態では、上位５、１０、１５、２０、３０、４０又は５０のＣＤＲ３配列が選択される。しかし、好ましいのは２０である。
【０２３８】
最良の得点クローン型（２０まで）は、以下のものとして保存される：
ａ．蛍光タグの合成のためのテンプレート
ｂ．遺伝子導入による新規の腫瘍特異的Ｔ細胞の合成のためのテンプレート。
【０２３９】
上記の腫瘍試料は、患者から得た単一の試料又は試料のセットであり得る。したがって、１人の患者由来の複数の腫瘍試料を、上記のように分析することができる。異なる腫瘍試料で生じたクローン型は、腫瘍試料の少数に存在するクローン型よりも好ましい。
【０２４０】
実施例２：標的配列の同定
【０２４１】
目的のＴ細胞クローンのＴＣＲ核酸配列が同定されると、前記Ｔ細胞クローンの検出及び濃縮に使用することができる理想的な標的配列を定義するためのさらなるステップが必要である。最初に、特定のゲノム配列を使用して、少なくとも部分的に成熟したｍＲＮＡ配列を生成し、生存細胞中のプローブによる特異的認識の標的となり得ないあらゆるイントロン部分を捨てる。次に、クローン成熟ｍＲＮＡ配列を、標的特異的配列のみを同定するために、目的のクローンに属さない他の全てのＴ細胞の成熟ＴＣＲ  ｍＲＮＡを含む完全なトランスクリプトームと比較する。特に、主にＴＣＲ  ｍＲＮＡのＣＤＲ３領域は、クローン型ベースで異なり、細胞内の他の転写物との差異も表示する。標的−クローン特異的配列は、プローブハイブリダイゼーションを妨害する構造についてさらに分析することができる。これは、ハイブリダイゼーション効率を検査することによって実験的に行うことができ、又はＭＦｏｌｄ又はＵＮＡＦｏｌｄ（ｈｔｔｐ：／／ｍｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／）などのツールを用いたコンピューター解析によって行うことができる。最高デルタＧ（ゼロに近い）を有する領域をプローブ設計のために選択することが好ましい。
【０２４２】
実施例３：インビボ検出のためのプローブ
【０２４３】
目的のクローンの標的特異的ＤＮＡ配列を同定した後、生きたＴ細胞における検出のためのプローブを設計することができる。異なるプローブ形式を使用することができる。しかしながら、標的−特異的領域の長さに従って、多部位プローブ又は単一オリゴヌクレオチドプローブを選択することができる。分子ビーコンは、細胞培養に適合する温度で標的ＲＮＡにハイブリダイズするように設計することができる。ＰＲＥＭＩＥＲ  Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ｗｗｗ．ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ）によって開発されたＢｅａｃｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（商標）などのソフトウェアパッケージは市販されている。分子プローブは、標的にハイブリダイズしない間ステムの構造によりクエンチされる、大部分が末端に結合した色素の対を有することができる。標的ハイブリダイゼーションの際に、末端ステムが開かれて、色素が消光されなくなる。しかし、生細胞の細胞質のような複雑な環境では、タンパク質との非特異的相互作用がステムを開き、偽陽性シグナルを生じることがある。分子ビーコンの特異性を高めるために、第２の分子ビーコンは、２成分プローブとして第１の分子ビーコンに直接隣接してハイブリダイズするように設計することができる。両方のビーコンの末端が４ヌクレオチドまでの距離内で特異的にハイブリダイズする場合、隣接する色素間の非常に特異的なＦＲＥＴシグナルを用いてハイブリダイゼーション事象を検出することができる。分子ビーコン形式以外の非構造化プローブでも多部位認識を行うことができる。いわゆるＳｍａｒｔＦｌａｒｅは、金ナノ表面に近接して固定化された蛍光色素の細胞トランスフェクション及び消光を促進する金ナノ粒子の特性を組み合わせた新しいプローブ形式である。したがって、単一の蛍光色素を有する所与の標的配列に相補的な単純なプローブで十分である。プローブの色素は、金ナノ粒子に固定された別の核酸にハイブリダイズすると、効果的に消光される。生存細胞へのトランスフェクションの際に、プローブはその相補的標的配列との特異的ハイブリダイゼーションにより置換され、ナノ粒子から分離することによって蛍光を発することができる。強制インターカレーションプローブ（ＦＩＴプローブ、国際公開第２００６／０７２３６８号Ａ２）はさらに望ましい形式である。形成されたプローブ−標的二本鎖の核酸塩基間の特定の色素のインターカレーションは、前記色素の２つの複素環系のねじり柔軟性を制限する。その結果、ＦＩＴプローブは、ハイブリダイゼーション時の蛍光を強く増加させる。チアゾールオレンジ（ＴＯ）を有するＦＩＴ−プローブは、蛍光強度の少なくとも２５倍の増強を伴って、相補的ＤＮＡ又はＲＮＡの存在下で、シグナルを生じることが報告されている。より最近では、二重蛍光色素標識ＰＮＡ  ＦＩＴプローブが蛍光強度の最大４５０倍の増強によって相補的ＤＮＡ又はＲＮＡの高感度検出のために、極めて応答性が高く、明るいハイブリダイゼーションプローブであることが発見された。既存のＤＮＡベースの分子ビーコンとは対照的に、このＰＮＡベースのプローブ形態は、色素−色素コミュニケーションを強制するためのステム配列を必要としない。ＦＩＴプローブを含むオ���サゾールイエロー（ＹＯ）は、蛍光の減衰によって一塩基ミスマッチを識別することが示されており、一塩基多型（ＳＮＰ）を特異的に検出しなければならない場合に使用することができる。さらに、Ｃ末端リジン残基の付加は、さらなるトランスフェクション試薬を必要とせずに生細胞への取り込みを可能にすることが実証されている。ＦＩＴ−プローブはもともとＰＮＡ−ベースのプローブとして公開されていたが、ＤＮＡとＬＮＡに基づくＦＩＴプローブも同様に開発されている。ＴＯ及びＹＯなどの二重色素の組み合わせを有するＤＮＡ  ＦＩＴプローブは、分子ビーコンの輝度を超えることでインビボにおいて、非常に特異的であることが判明した。さらに、ＰＮＡ及びＤＮＡのいわゆるミックスマーが市販されている。したがって、生存Ｔ細胞クローンの効率的な蛍光検出のためのＦＩＴプローブを生成するために、特異性、溶解性及び融解温度を最適化することが可能である。
【０２４４】
それらの塩基組成及びヌクレオチドの種類に応じて、異なる長さが標的ＴＣＲ  ｍＲＮＡの細胞質認識に最適であろう。標準ＰＮＡプローブの標的特異的ハイブリッド形成部分は２０塩基より短く、標準ＤＮＡプローブでは３５塩基より少ないことが好ましい。しかし、核酸の特異性及び／又は融解温度を上昇又は低下させるために用いることができる多くの非標準的改変が存在する。例えば、無塩基部位及びロック解除された核酸は、融解温度を低下させ、特異性を増加させる可能性がある。ＬＮＡはＤＮＡよりも高い融解温度を有し、ヌクレアーゼ分解から保護される。４つの天然塩基のうちの３つに対合するイノシンなどの修飾塩基でさえ、細胞内認識を微調整するために使用することができる。
【０２４５】
インビボで生じる可能性のある核酸構造が非常に複雑なため、その機能性に対して構造に依存しない単一成分（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）プローブを選択することが好ましい。他の細胞転写産物及び構造的接近可能性と比較して、予め同定された、好ましい特異的標的領域があれば、当業者は、それぞれのバイオインフォマティクス設計ツールを用いて適切なプローブを設計する方法を知るであろう。
【０２４６】
実施例４：プローブ取り込み機構
【０２４７】
核酸は、多数のメカニズムによって生きた細胞に取り込まれる可能性がある。このプロセスは、真核生物細胞が非ウイルス性機構の標的とされる場合、トランスフェクションと呼ばれる。化学ベースのトランスフェクション、非化学的トランスフェクション、及び粒子ベーストランスフェクションと呼ばれる、３つの一般的なトランスフェクション方法が利用可能である。化学ベースのトランスフェクション法は、細胞摂取を促進する追加の化学物質を利用する。そのような添加剤は、塩、ポリマー、リポソーム及びナノ粒子又はそれらの混合物であり得る。
【０２４８】
トランスフェクション法の効率は、細胞型だけでなくヌクレオチドのサイズ及び形態に強く依存する。小さな核酸は、細孔形成化合物によって効率的にトランスフェクションされ得る。ストレプトリジン−Ｏ（ＳＬＯ）可逆的透過化は、ｓｉＲＮＡ又は分子ビーコンなどの小さな核酸を送達する効率的な方法であり、Ｔ細胞と適合性がある。さらに、Ｔ細胞は、ＳｍａｒｔＦｌａｒｅｓのような標識されたプローブと結合する金ナノ粒子によって効果的にトランスフェクションされている。また、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）は、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡなどの小さなオリゴヌクレオチドのＴ細胞へのトランスフェクションに効果的に使用された。
【０２４９】
特に、ＰＮＡは、いくつかのリジン残基によって単純に伸長することにより、追加のトランスフェクション試薬なしで細胞の取り込みを達成することができる。好ましい非化学的トランスフェクション法は、マグネトフェクション及びエレクトロポレーションである。より好ましくは、胚性幹細胞及びナイーブ免疫細胞を含む２０種以上の細胞型に、カーボンナノチューブ、タンパク質及びｓｉＲＮＡなどの広範な物質を送達することが実証された細胞スクイージングである。Ｓｑｚバイオテクノロジー社のマイクロ流体プラットフォームは、トランスフェクション試薬を必要とせずに、Ｔ細胞のハイスループットと効率的なトランスフェクションを可能にする。
【０２５０】
実施例５：特定のシグナルの増加：
【０２５１】
細胞中のＴＣＲｍＲＮＡ転写物のレベルは、好ましくは単一成分プローブによる特異的検出に関し、ノイズに対する高いシグナル比を提供するために増加させることができる。本発明者らは、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２でＴ細胞を一晩前処理すると、ＴＣＲ  ｍＲＮＡの転写レベルを増加させることができることを発見した。あるいは、シクロヘキシミドでＴＣＲｍＲＮＡレベルを上昇させることができる。タンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）は、ＴＣＲ−アルファ遺伝子転写の同時増加なしで成熟ＴＣＲ−アルファ転写物蓄積の２０倍の増加を誘発することから、ＣＨＸが成熟ＴＣＲ−アルファｍＲＮＡの蓄積を妨げる核転写後事象を逆転させることを示唆する。ＴＣＲ−ベータ遺伝子転写は、２〜４倍にしか増加しないが（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ＆ＭｃＬｅｏｄ  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １９８８  Ｊａｎ；  ７（１）：１０１−１０９）、ＣＨＸはまた、９０倍を超える全長ＴＣＲ−ベータ転写物を誘導する。ＣＨＸによる阻害が可逆的であることが判明したので、プローブによる検出のためにｍＲＮＡレベルを１０倍に上昇させるのに十分な短時間だけのインキュベーションを行うことが好ましい。
【０２５２】
もう１つの選択肢は、Ｔ細胞を活性化し、活性化された細胞を２４時間インキュベートすることであり、それにより特異的検出のためにｍＲＮＡの量が倍増する。
【０２５３】
実施例６：Ｔ細胞クローン型の配列特異的単離のためのアレイベースの方法
【０２５４】
Ｔ細胞クローン型、特に本発明の腫瘍特異的クローン型は、クローン型陽性ウェルにＴ細胞を希釈し、所望のクローン型を含む均質なＴ細胞集団が生成されるまで、この方法を繰り返すことを含む反復アプローチによって単離することができる。
【０２５５】
核酸に基づくアッセイは、細胞内での直接的なプローブハイブリダイゼーション又は検出のための標的配列の特異的増幅のいずれかによって行うことができる。直接プローブハイブリダイゼーションは、死細胞（Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅによる分析、マイクロタイターウェルスキャン、又はＦＡＣＳ）又は生細胞（ＦＩＴ−プローブ、Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅによる分析、マイクロタイターウェルスキャン、又はＦＡＣＳ）を用いて行うことができる。増幅反応は、好ましくは、アレイ試料についての（ＲＴ−）ＰＣＲである。
【０２５６】
適切な試料は、これに限定されないが、細胞外核酸（無細胞）を含み、上清又はアレイ表面は、有益な細胞を死滅させることなく特異的かつ高感度な同定に使用できる無細胞核酸を含み得る。これにより、細胞分裂や、アレイの一部（ウェル又は位置）、精製された核ＤＮＡ、精製されたｍＲＮＡに由来する粗溶解物を必要とせずに、標的細胞のより迅速な単離が可能になる。
【０２５７】
この方法に適合する異なるアレイ形式は、これに限定されるものではないが、以下を含む：
−  マイクロタイターウェル（少なくとも２ウェル、好ましくは６ウェルより多く、より好ましくは１２８ウェルから３８４ウェルの間である）。
−  埋め込みアレイ。細胞は、好ましくは、細胞の自由な拡散を妨げるマトリックスによって埋め込まれ、したがって、最初に沈着されたクローンの座標を保存する。 マトリックスは、好ましくは、アガロース、ゼラチン又はポリアクリルアミドなどのポリマーを含む。
−  ランダムアレイ。ランダムアレイは、試料を含むのに、事前に形成されたグリッドに依存しない。
−  マイクロフルイディック。 マイクロ流体アレイは、細胞及び／又は核酸の初期細胞分布、洗浄、希釈、増殖及び回収を含む取り扱い段階を可能にするチャネル及び他の構造によって特異的に形成することができる。 そのようなマイクロ流体アレイの非限定的な例は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｍｅｍｓｒｃ．ｏｒｇ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｃｅｌｌ−ｔｉｓｓｕｅ−ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／ｌｉｖｉｎｇ−ｃｅｌｌ−ａｒｒｙに示されている。
【０２５８】
所定の希釈アリコート又はウェル内に１つ以上のクローン型が存在しないことを確実にするために、試料中の標的クローン型の頻度に依存して、適切な限界希釈を行うことができる。単一の細胞さえも、誘電泳動（不均一電場中生きた細胞のような誘電体粒子がマイクロウェルを離れるのを防ぐプロセス）によって、マイクロウェルを連通したアレイに直接閉じ込めることができる。
【０２５９】
培養条件は、細胞の増殖を最適化するように選択することができる。これは、試料から希釈された単一細胞の細胞死又は増殖の欠如を防止するフィーダー細胞との共培養を含み得る。さらに、細胞分裂をさらに増強するために、培地にサイトカイン及び栄養素を含めることができる。所望のＴ細胞の種類に応じて、異なる最適条件を適用することができる。場合によっては、試験のための無細胞核酸の供給源としての標的Ｔ細胞によるエキソソームの生成を誘発又は増強することが有利であり得、ここで前記エキソソームの産生は抗原提示細胞による、又はＩＬ−２と接触させることによって前記Ｔ細胞の活性化により引き起こすことができる。
【０２６０】
血液試料から単離された１０６個のＴ細胞の集団が、予め同定されたＣＤＲ３を有する１つのＴ細胞を含むと仮定すると、アレイベースのスクリーニング手順を用いることができる。典型的なＲＴ−ＰＣＲ装置は、３８４ウェルのマイクロタイタープレートを取り扱うことができる。１０６個のＴ細胞は、ウェルあたり約３×１０３個の細胞に相当する３８４個のウェルに等しく希釈することができ、そのうち１個は目的のクローン型を保持する。４分割の後、各細胞は８個の複製で存在し、これにより、目的のクローンは理想的には以前と同じ１：３×１０３の比で存在する。上清の半分を回収し、１アリコート３８４マイクロタイタープレートの座標を維持しながらＤＮＡ（又はｍＲＮＡ）を精製する。（ＤＮＡ又はＲＮＡの自動精製方法については、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｄｅ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｔｏｏｌｓ／ａｕｔｏｍａｔｅｄ−ｍｅｔｈｏｄｓ／を参照）。試料をＲＴ−ＰＣＲに供して、標的クローン体の座標を検出する。座標が分かれば、座標からの生きた細胞のアリコート（１０４細胞中４個）を別の３８４ウェルプレートに希釈する。ここで、最大４つのウェルには、約１：３０の比で標的クローン型が含まれ得る。４回の細胞分裂の後、ウェルをＰＣＲによって再びスクリーニングし、陽性ウェルのアリコート（１２０例中４例）を適切な寸法を有するマイクロタイタープレートに再度希釈してクローン培養物を得ることができる。いくつかの標的細胞の潜在的な損失でさえも、全ての陽性ウェルを１つの３８４プレートに希釈することができる。さらに４回の細胞分裂の後、ＲＴ−ＰＣＲ又は他のプローブベースの方法によって、陽性クローンをアリコート中で迅速に同定することができる。増殖条件を最適化するために、サイトカイン及びフィーダー細胞（表面抗原によって容易に区別することができる）を有する適切な培地を使用することができる。
【０２６１】
より多くの陽性のクローンが１００万個の細胞の元の試料に存在する場合、この手順は、増殖のために増殖性クローン型を得る機会をより高くするために、より多くの陽性クローンを処理することができる。
【０２６２】
この手順では、細胞分裂速度及び標的クローン型の増殖能力が制限されている。インビトロで初めてＣＤ４＋Ｔ細胞が分裂するのに２４〜４８時間かかることがあり、一方でその後の分裂は典型的にはより速く起こる。１つのＴ細胞分裂が１日かかる場合、３つのアレイを有する手順は少なくとも２週間かかり得る。しかしながら、効果的な治療のためには、前もってクローン型の増殖が不可欠である。上記の方法では、増殖性Ｔ細胞の単離が本質的に好ましい。無細胞上清がＴＣＲ−ベータｍＲＮＡを含有する場合、上清の非破壊分析により、その後の単離がより早く進行し得る。
【０２６３】
実施例７：腫瘍反応性Ｔ細胞クローン型の配列に基づく予測の効率
【０２６４】
表２において、１００個の最も頻度の高いクローン型が例示されている（ＮＮ：非腫瘍組織ではクローン型を測定できなかった）。示された１００個の最も多くのクローン型は、配列番号０１〜１００に等しい。表３、表４及び表５において、ＮＳＣＬＣ−腫瘍試料由来の新たに単離されたＴＩＬの最も多い頻度が５、１０及び１５個のクローン型が、それぞれ示されており（列Ｅ）、これらは、特有のＣＤＲ３−ベータペプチド（列Ａ）、及びそれらに隣接するＶ−及びＪ−セグメント（列Ｂ及び列Ｃ）により特徴付けられる。増殖されたＣＤ４−ＴＩＬｓを自己腫瘍細胞とともに共インキュベートした後のＩＦＮガンマ分泌アッセイにより、上位５、１０及び１５個の中で、有意な数の、明らかに腫瘍反応性のＣＤ８＋クローンの存在を明らかにする（表３〜５の列Ｈ、ＩＦＮガンマ＞０．２５）。
【０２６５】
表３において、ベータＴ細胞受容体のＣＤＲ３領域（ペプチド）は、上位５個のＴＩＬｓ  ＣＤ８＋クローン型について同じ腫瘍患者（ＮＳＣＬＣ）の異なる試料において同一であることが示されている。Ｖセグメント及びＪセグメントは、ＩＭＧＴ命名法によって示される。配列読み取りのパーセントとしてのＣＤＲ３頻度は、以下の試料について与えられる：血液：Ｔ細胞を血液（ＰＢＭＣ）から抽出した。ＴＩＬｓ  ＣＤ８＋：腫瘍（ＴＩＬ）由来のＴ細胞を抽出し、ＣＤ８＋に関して選別した。非腫瘍Ｔ細胞ＣＤ８＋：肺組織試料を腫瘍から遠位に採取し、Ｔ細胞を抽出し、選別した（ＣＤ８＋）。ＴＩＬｓ  ＣＤ４−ＰＤ１＋：Ｔ細胞を腫瘍から抽出し、ＣＤ４に関して枯渇させ、ＰＤ１特異的抗体によって選別し、傷害活性化Ｔ細胞の画分を得た。ＩＦＮガンマＣＤ４−：腫瘍から最初に抽出されたＴ細胞を２０日間培地で維持し、腫瘍細胞と共培養し、ＩＦＮガンマの分泌を市販のアッセイにより測定した結果は、腫瘍反応性の測る直接的な尺度としてのＴ細胞の活性化を示す。ＴＩＬｓ  ＣＤ８＋／非腫瘍  ＣＤ８＋：ＴＩＬ及び非腫瘍試料（ＣＤ８＋）において見出される頻度の比率。比率＞５（＞２０）では、ＩＦＮガンマ及びＰＤ１＋の頻度によって同時に示されているように、高度に腫瘍反応性のクローン型の明らかな有病率がある。
【０２６６】
表４は、表３と同じであるが、上位１０個のＴＩＬｓＣＤ８＋クローン型について示す。再び、ＴＩＬｓ  ＣＤ８＋／非腫瘍  ＣＤ８＋比が＞５（＞２０）の場合、ＩＦＮガンマ及びＰＤ１＋の頻度によって同時に示されるように、高度に腫瘍反応性のクローン型の明らかな有病率がある。
【０２６７】
表５は、表３と同じであるが、上位１５個のＴＩＬｓ  ＣＤ８＋クローン型について示す。再び、ＴＩＬｓ  ＣＤ８＋／非腫瘍  ＣＤ８＋比が＞５（＞２０）の場合、ＩＦＮガンマ及びＰＤ１＋の頻度によって同時に示されるように、高度に腫瘍反応性のクローン型の明らかな有病率がある。
【０２６８】
これらの高頻度の腫瘍反応性クローンは、腫瘍細胞と非腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｔ／ｎＴ比、列Ｉ）との間の頻度の比を適用して予測かつ同定することができる。
【０２６９】
表３において、上位５個の中で、Ｔ／ｎＴ比が＞２０のものは、クローン２を同定し、その比が＞５のものは、クローン１、２及び４を同定する。従って、上位５個内の全ての腫瘍反応性クローンは、Ｔ／ｎＴ比を用いて同定される。
【０２７０】
表４において、上位１０個の内の、Ｔ／ｎＴ比が＞２０のものは、クローン２及び７、その比が＞５のものについては、クローン１、２、４及び７が腫瘍反応性があるものとして同定する。
【０２７１】
表５において、上位１５個の内の、Ｔ／ｎＴ比が＞２０のものは、クローン２及び７を同定し、その比が＞５のものについては、クローン１、２、４、１１及び１２であり、これは最も頻度の高い１５個のＣＤ８＋  ＴＩＬｓ内の全ての腫瘍反応性クローンを含む。
【０２７２】
表６において、ＩＦＮガンマ頻度＞０．２５について、腫瘍特異的Ｔ細胞を同定する３つの方法の比較が示されている：ａ）腫瘍組織のみが使用される、すなわち全ての統計はＴＩＬのみを指す、ｂ）ＴＩＬ（ＣＤ８＋）頻度を、非腫瘍組織由来のＴ細胞（ＣＤ８＋）と比較し、かつＴＩＬは腫瘍／非腫瘍比が＞２０のもののみ使用される、ｃ）ＴＩＬ（ＣＤ８＋）頻度を、非腫瘍組織由来のＴ細胞（ＣＤ８＋）と比較し、かつＴＩＬｓは腫瘍／非腫瘍比が＞５のもののみ使用される。腫瘍反応性Ｔ細胞の数及び測定されたＩＦＮγシグナルの強度に関して最良の結果は、組織比較によって、好ましくはその＞５の比で達成されることは明らかである。
【０２７３】
上位１５個のクローン型の選択について、腫瘍反応性の予測は、図１において非常に正確であることが示されている：ルール比Ｔ／ｎＴ＞５は、Ｔ細胞クローン型を、高腫瘍反応性及び軽微な腫瘍反応性のものに効率的に分離する。比がＴ／ｎＴ＞２０の場合、腫瘍反応性の予測は１００％正確であり、数多くの真に腫瘍反応性のクローン型が欠けている。
【０２７４】
実施例８：腫瘍反応性クローン型のＴＣＲ配列特異的単離
【０２７５】
特定の配列（ＣＤＲ３ベータ、Ｖベータセグメント）によって特徴付けられる腫瘍反応性クローン型の同定は、腫瘍反応性クローンの濃縮のための配列特異的戦略の道を開く。
【０２７６】
腫瘍（ＮＳＣＬＣ）の切除後６週間、血液を患者から採取し、ＰＢＭＣを調製した。ＰＢＭＣの一部をＴＣＲベータについて配列決定した。ＰＢＭＣ調製物のアリコートを患者のクローン２に特異的なＶベータ−３０抗体と共にインキュベートした。
【０２７７】
結果を表７に示し、それぞれのＶベータセグメント特異的抗体を用いた配列特異的選別による、所望のＴ細胞クローンの濃縮を示す。ＣＤＲ３ペプチド：ベータＴ細胞受容体のＣＤＲ３領域（ペプチド）。Ｖセグメント及びＪセグメントは、ＩＭＧＴ命名法によって示される。ＴＩＬｓ  ＣＤ８＋：腫瘍（ＴＩＬ）由来のＴ細胞を抽出し、ＣＤ８＋に関して選別した。ＩＦＮガンマＣＤ４−：腫瘍から最初に抽出されたＴ細胞を２０日間培地で維持し、腫瘍細胞と共培養し、市販のアッセイによってＩＦＮガンマの分泌を測定した結果は、対応する抗原によって刺激されたＴ細胞の活性化を示す。ＴＩＬｓＣＤ４−ＰＤ１＋：Ｔ細胞を腫瘍から抽出し、ＣＤ４に関して枯渇させ、ＰＤ１特異的抗体によって選別し、傷害活性化Ｔ細胞の画分を得る。ＴＩＬｓ  ＣＤ８＋／非腫瘍  ＣＤ８＋：ＴＩＬ及び非腫瘍試料（ＣＤ８＋）で見出される頻度の比率。Ｖベータ−ＡＢ：専用のクローン型の捕捉に使用されるそれぞれのＶベータ−セグメント特異的抗体。ＶベータＡＢ選択後頻度：Ｖベータ特異的抗体を用いてビーズ分離を行った後の各クローン型の頻度。ＰＢＭＣ頻度：末梢血における各クローン型の頻度。濃縮率：Ｖベータ−抗体による分離後のクローン型頻度と末梢血中のクローン型頻度との比。第２のクローン型については、末梢血中に検出可能な頻度はなかったので、濃縮率は、可能な限り高い値として０．００１％の低い閾値を用いることによってのみ推測することができた。
【０２７８】
クローン２は、頻度が０．０９７％の患者のＰＢＭＣにおいて測定した（列Ｊ）。Ｖベータ−３０抗体及びビーズ分離を使用して、頻度を５．５２％に増加させた（列Ｉ）。これは５７．０の濃縮率であり、患者の末梢血からの標準的な手順を用いてクローンを完全に単離する段階を設定する。
【０２７９】
方法及び材料
【０２８０】
以下の実験は、ベルリン医師倫理委員会（Ｎｒ．Ｅｔｈ−６２−１５）によって承認された。
【０２８１】
腫瘍及び肺組織断片由来のＴリンパ球マイクロカルチャーの開始及び増殖
【０２８２】
各腫瘍検体を周囲の正常組織及び壊死領域から解離させた。腫瘍及び正常な肺組織から得た約１ｇの立方体を、各次元において約２〜３ｍｍの小さな塊に切断した。Ｔｕｍｏｕｒ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ミルテニーバイオテク）を使用し、製造者の指示に従って、スライスした腫瘍（及び非腫瘍）の生検材料を市販の機械的／酵素的組織解離システム（ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュ  グラートバッハ、ドイツ製のＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（登録商標））に供した。
【０２８３】
ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ解離後、細胞懸濁液を７０−μｍのストレーナーに通した。腫瘍細胞のアリコートを採取し、後の使用のために１０％ＤＭＳＯ（シグマアルドリッチ）及び９０％ＦＣＳ（ライフテクノロジーズ）中で凍結保存した。残りの細胞懸濁液をＰＢＳ／ＲＰＭＩ  １６４０中のパーコール（登録商標）（ＧＥ  ヘルスケア  ヨーロッパ社）の４０％／８０％段階勾配を用いて密度勾配遠心分離に供した。間期からＴリンパ球を採取し、完全培地（ＲＰＭＩ  １６４０、ロンザ）で洗浄した。続いて、Ｔ−リンパ球を、０．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で２ｍＬの回収培地（ＲＭ）を含む２４ウェル組織培養プレートに入れた。ＲＭは、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２を補充したＲＰＭＩ  １６４０、及びＬ−グルタミン（ロンザ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び５０μＭ  β−メルカプトエタノール（サーモフィッシャー  サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、ＵＳＡ）からなり、これに１０％の自家ヒト血清を含む。プレートを、加湿した３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターに入れ、一晩培養した。
【０２８４】
翌日、細胞を採取し、ウェルからプールし、ＣＤ４及びＣＤ８  マイクロビーズ及びＬＳカラム（ミルテニーバイオテク）を、製造業者のプロトコールに従って用いて、磁気ビーズに基づくＭｉｄｉＭＡＣＳシステムによって分離した。ＣＤ４マイクロビーズ実験、すなわちＣＤ４枯渇細胞画分のフロースルーを、さらにＰＤ１及びＩＮＦガンマ実験におけるＣＤ８ＴＩＬクローン型の追跡に用いた。ＰＤ１＋クローン型の分離のために、ＰＤ−１マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク、陽性選択）を使用した。全ての細胞画分を完全培地（ＣＭ）中で０．５〜１×１０６細胞／ｍｌの密度で培養した。ＣＭは、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２を補充したＲＰＭＩ  １６４０、及びＬ−グルタミン（ロンザ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２．５ｍｇ／ＬアンホテリシンＢ（シグマアルドリッチ、セントルイス、ＵＳＡ）、及び５０μＭのβ−メルカプトエタノール（サーモフィッシャーサイエンティフィック）からなり、これに１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、プラス３０００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−２（ミルテニーバイオテク）及びＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（ライフテクノロジーズ）を、ビーズ：Ｔ細胞の比が１：１で補充した。このプレートを、５％ＣＯ２を含む加湿３７℃インキュベーターに入れ、２２日目まで培養した。２日目又は３日目ごとに培地の半分を取り出し、新鮮なＩＬ−２を補充した新鮮な培地と交換した。必要に応じて、細胞密度がおよそ１０６細胞／ｍｌを維持するために、ＩＬ−２を補充した新鮮な培地を添加することにより、細胞を倍加したウェルに分割した。最初の１週間以内に、細胞培養物をＤＮＡ抽出及びＮＧＳライブラリー調製のために採取し、残留ＴＩＬをさらに増殖した。１４日目と１８日目の間に、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを除去し、培地中のＩＬ−２濃度を１５００ＩＵ／ｍｌに減少させ、１０％ＦＣＳを６％自家ヒト血清と交換した。
【０２８５】
インターフェロン−ガンマ  分泌アッセイ  −  細胞濃縮及び検出
【０２８６】
２２日目の腫瘍共培養アッセイのために、ＩＬ−２を培地から除いた。共培養は、増殖ＴＩＬ及び自己腫瘍細胞（１ウェルあたり１０５個のＴＩＬ及び１０５個の自己腫瘍細胞）が１：１の比で確立した。腫瘍細胞は、１０％ＤＭＳＯ（シグマアルドリッチ）及び９０％ＦＣＳ（ライフ  テクノロジーズ）で凍結保存した初期腫瘍分解物に由来し、添加前にＲＰＭＩ１６４０で洗浄した。共培養物を加湿インキュベーター内で、３７℃で２０時間インキュベートした後、ＩＦＮガンマ分泌アッセイ及び検出キット（ミルテニーバイオテク）において製造者の指示に従ってインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の産生について細胞を採取し分析した。ビーズ結合細胞を溶出し、ゲノムＤＮＡ単離及びＮＧＳライブラリー調製のためにペレット化した。
【０２８７】
Ｖ−ベータ抗体ベースの細胞濃縮
【０２８８】
血液からのＴ細胞の単離のために、新たに採取した血液３ｍｌを５倍量の赤血球溶解緩衝液（ＥＬ緩衝液、キアゲン）とともに４℃で１５分間インキュベートした。単核細胞を、冷凍遠心器にて、４００ｇでペレット化した。細胞をＥＬ緩衝液及びＰＢＳで数回洗浄し、最後に抗−Ｖベータ３０抗体ＰＥ−結合体（ベックマンコールター、ブレア、カリフォルニア州、ＵＳＡ）で標識した。細胞を抗−ＰＥマイクロビーズ（ミルテニーバイオテック）で間接的に磁気標識し、製造元の説明書（ミルテニーバイオテック）に従ってＭｉｎｉＭＡＣＳ磁気分離システムを使用してＭＳカラムで分離した。ビーズ結合細胞を溶出し、ゲノムＤＮＡ単離及びＮＧＳライブラリー調製のためにペレット化した。
【０２８９】
ゲノムＤＮＡの単離
【０２９０】
マッハライ・ナーゲル（デューレン、ドイツ）のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）組織キットを用いて、組織材料からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。血液ｇＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ血液ミニキット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）又はＡＩＩＰｒｅｐ（登録商標）ＤＮＡ／ＲＮＡ／ｍｉＲＮＡユニバーサルキット（キアゲン）のいずれかを用いて製造業者のプロトコールに従って、２〜３ｍｌの新鮮な血液から単離した。
【０２９１】
ＮＧＳデータから得たクローン型（配列クラスター）頻度の計算
【０２９２】
ＣＤＲ３領域に隣接するＶセグメント及びＪセグメントに特異的に結合するＴＣＲベータプライマーを使用する、独自の２段階ＰＣＲ増幅法（ＷＯ２０１４／０９６３９４Ａ１に開示）に従ったＮＧＳ（イルミナＭｉＳＥＱ）技術を用いて配列決定した。ゲノムＤＮＡをＮＧＳプロセスの出発物質として使用した。
【０２９３】
試料ごとに、多数（＞１０５）の対の読み取り（ヌクレオチド配列）は一般にＮＧＳによって生成される。読み取り対は、典型的には４０〜８０塩基で重複しており、読み取り対と読み取り対を合併して、連続配列にする。次いで、これらの配列を実質的に同一のヌクレオチド配列のクラスターに組み立て、クラスターあたりの読み取り断片の数がそのクラスターの頻度を決定し、ここではクラスターに入る試料中の読み取り断片のパーセンテージでクラスターの頻度が測定される。
【０２９４】
クラスター化は非常に慎重であり、２つのラウンドで機能する：第１工程において、１００％ヌクレオチド配列同一性を有する全ての読み取り断片は、クラスター配列が読み取り配列と同一であるクラスター１としてカウントされる。第２の工程では、クラスターを互いに比較し、
−  １ｂｐ以下のミスマッチ及び
−  １つのクラスタ（クラスタＡ）が他のクラスター（クラスターＢ）よりも少なくとも２０倍の読み取り断片を有する
場合には、合併されてクラスターＡと同一であるとみなされる。ヌクレオチド配列クラスターは、クローン型と等価であるとみなされる。
【０２９５】
ヌクレオチド配列クラスターは、アミノ酸配列（ペプチド）に翻訳され、表にされる。各クラスターは、上記で定義した頻度を有する１つのクローン型であるとみなされる。頻度は、試料中のそれぞれのＴ細胞の頻度の直接測定値である。
【０２９６】
試料間のＴＣＲ配列プロファイルの比較
【０２９７】
クローン型のＣＤＲ３アミノ酸配列を、ミスマッチのない配列のみが１つの且つ同一のＣＤＲ３アミノ酸配列として受け入れられる、同一性試験手順によって、試料間で比較した。複数試料比較の結果は、１つのＴＣＲベータＣＤＲ３アミノ酸配列が１行あたり１つ以上の試料によって共有される表であり、各試料は、その試料中のそれぞれのＣＤＲ３頻度を含む１つの列によって表される。別個の試料間の比（同じＣＤＲ３アミノ酸配列を共有する）は、それぞれの頻度の比によって計算される。
【０２９８】
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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