(57)【要約】  本発明は、アポミクシスの一部として複相胞子生殖を提供する、Ｄｉｐ遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列、並びにその（機能的な）相同体、断片及び変異体を提供する。また、複相胞子生殖植物及びこれを作製するための方法が提供され、これらを使用する方法、及びアポミクティック種子を作製する方法も提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の核酸配列、又は配列番号１の核酸配列と少なくとも５０％若しくは７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、なおさらにより好ましくは少なくとも９６％若しくは９７％、最も好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号２の核酸配列、又は配列番号２の核酸配列と少なくとも５０％若しくは７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、なおさらにより好ましくは少なくとも９６％若しくは９７％、最も好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１又は配列番号２の核酸配列を含む又は有する、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチド及び／又は前記ポリヌクレオチドの発現産物及び／又は前記ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、植物又は植物細胞に複相胞子生殖機能を提供することができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチド及び／又は前記ポリヌクレオチドの発現産物及び／又は前記ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、植物又は植物細胞に導入された場合、植物又は植物細胞に複相胞子生殖機能を提供する、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記発現産物が、ＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ分子である、請求項４又は５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの断片であって、前記断片及び／又は前記断片の発現産物及び／又は前記断片によってコードされるタンパク質が、植物又は植物細胞に複相胞子生殖機能を提供することができる前記ポリヌクレオチドの断片。
【請求項８】
前記断片、及び／又は前記断片の発現産物及び／又は前記断片によってコードされるタンパク質が、植物又は植物細胞に導入された場合、植物又は植物細胞に複相胞子生殖機能を提供する、請求項７に記載の断片。
【請求項９】
前記発現産物がＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ分子である、請求項７又は８に記載の断片。
【請求項１０】
前記発現産物が、配列番号５の核酸配列を含む又は有する、請求項９に記載の断片。
【請求項１１】
配列番号４又は６の核酸配列を含む又は有する、請求項７又は８に記載の断片。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドの少なくとも２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００又は３０００個の連続したヌクレオチドの長さを有する、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の断片。
【請求項１３】
配列番号３のアミノ酸配列、又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも５０％若しくは７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、なおさらにより好ましくは少なくとも９６％若しくは９７％、最も好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号３のアミノ酸配列を含む又は有する、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
植物又は植物細胞に複相胞子生殖機能を提供することができる、請求項１３又は１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
植物又は植物細胞に導入された場合、植物又は植物細胞に複相胞子生殖機能を提供する、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１３又は１４に記載のポリペプチドの断片であって、植物又は植物細胞に複相胞子生殖機能を提供することができる前記ポリペプチドの断片。
【請求項１８】
配列番号７又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の断片。
【請求項１９】
前記ポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００又は５００個の連続したアミノ酸の長さを有する、請求項１７又は１８に記載の断片。
【請求項２０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項７〜１２のいずれか一項に記載の断片を含むキメラ遺伝子。
【請求項２１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の断片、又は請求項２０に記載のキメラ遺伝子を含む遺伝子構築物。
【請求項２２】
請求項１３〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド又は断片をコードするオープンリーディングフレームポリヌクレオチドを５’−３’方向に含む遺伝子構築物。
【請求項２３】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の断片、請求項２０に記載のキメラ遺伝子、又は請求項２１若しくは２２に記載の遺伝子構築物に作動可能に連結された、植物細胞において活性なプロモーター配列を含む核酸ベクター。
【請求項２４】
前記プロモーター配列が、
ｅ）配列番号２の核酸配列の天然のプロモーター配列；
ｆ）ａ）のプロモーター配列の機能的断片；又は
ｇ）配列番号２の核酸配列の天然のプロモーター配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含む核酸配列；
ｈ）配列番号６の核酸配列の天然のプロモーター配列；
ｉ）ｄ）のプロモーター配列の機能的断片；又は
ｊ）配列番号６の核酸配列の天然のプロモーター配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含む核酸配列
を含む、請求項２３に記載の核酸ベクター。
【請求項２５】
前記プロモーターが雌性子房特異的プロモーター、好ましくは大胞子母細胞特異的プロモーター及び／又は雌性配偶子特異的プロモーターである、請求項２３に記載の核酸ベクター。
【請求項２６】
請求項２０に記載のキメラ遺伝子、請求項２１若しくは２２に記載の遺伝子構築物、及び／又は請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の核酸ベクターを含む植物、植物部分又は植物細胞であって、ここで、前記遺伝子、構築物及び／又はベクターが、少なくとも雌性子房、好ましくは大胞子母細胞及び／又は雌性配偶子に存在する及び／又は発現される前記植物、植物部分又は植物細胞。
【請求項２７】
前記種子が前記植物のアポミクティック種子である、請求項２６に記載の植物の種子。
【請求項２８】
前記種子が、それが発生した植物のクローンである、請求項２７に記載の種子。
【請求項２９】
タンポポ属、アキノノゲシ属、エンゾウ属、トウガラシ属、ナス属、キュウリ属、トウモロコシ属、ワタ属、ダイズ属、コムギ属、オリザ属、ネギ属、アブラナ属、ヒマワリ属、フダンソウ属、キクニガナ属、菊属、ペンニセツム属、ライムギ属、オオオムギ属、ウマゴヤシ属、インゲンマメ属、バラ属、ユリ属、コーヒーノキ属、アマ属、アサ属、キャッサバ属、ニンジン属、カボチャ属、スイカ属、及びモロコシ属からなる群から選択される種由来である、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の植物、植物部分、植物細胞又は種子。
【請求項３０】
アポミクティック種子を生産するための方法であって、
ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の断片、請求項２０に記載のキメラ遺伝子、請求項２１若しくは２２に記載の遺伝子構築物、及び／又は請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の核酸ベクターを用いて植物、植物部分又は植物細胞を形質転換して、一次形質転換体を生産するステップ；
ｂ）前記一次形質転換体由来の顕花植物及び／又は花を生育するステップであって、ここで、前記ポリヌクレオチド、断片、遺伝子、構築物及び／又はベクターが、少なくとも雌性子房、好ましくは大胞子母細胞及び／又は雌性配偶子に存在する及び／又は発現されるステップ；並びに
ｃ）好ましくは四倍体植物の花粉又は前記一次形質転換体の自家花粉を用いて、種子の生産を誘導するために前記一次形質転換体を受粉するステップ
を含む、方法。
【請求項３１】
前記植物、植物部分又は植物細胞が単為生殖能を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
雑種植物のクローンを生産するための方法であって、
ａ）請求項２６、２９、３７又は４２のいずれか一項に記載の植物の花粉を用いて有性的に生殖する植物を他家受精させて、Ｆ１雑種種子を生産するステップ；
ｂ）請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の断片、又は請求項１３〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチドを含み、及び／又はそれを少なくとも雌性子房において、好ましくは大胞子母細胞及び／又は雌性配偶子において発現するＦ１植物を選択するステップ；
ｃ）任意選択で好ましくは四倍体植物の花粉を用いて、種子の生産を誘導するために、前記選択されたＦ１植物を受粉するステップ；及び
ｄ）種子を収穫するステップ；並びに
ｅ）任意選択で前記種子から雑種クローン植物を生育させるステップ
を含む、方法。
【請求項３３】
前記植物、植物部分又は植物細胞が単為生殖能を有し、前記クローンがアポミクティッククローンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項３２又は３３に記載の方法によって得ることができる又は得られた雑種植物。
【請求項３５】
植物、植物部分又は植物細胞に複相胞子生殖を付与するための方法であって、
ａ）前記植物、植物部分又は植物細胞を、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の断片、請求項２０に記載のキメラ遺伝子、請求項２１若しくは２２に記載の遺伝子構築物、及び／又は請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の核酸ベクターを用いて形質転換するステップ；並びに
ｂ）任意選択で前記ポリヌクレオチド、断片、遺伝子、構築物及び／又はベクターが、少なくとも雌性子房、好ましくは大胞子母細胞及び／又は雌性配偶子に存在し及び／又は発現される、植物を再生するステップ
を含む、方法。
【請求項３６】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項７〜１２のいずれか一項に記載の断片を前記植物、植物部分又は植物細胞のゲノムに組み込む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項３５又は３６に記載の方法によって得ることができる又は得られた複相胞子生殖植物、植物部分又は植物細胞。
【請求項３８】
植物、植物部分又は植物細胞に複相胞子生殖を付与するための方法であって、
ａ）植物、植物部分又は植物細胞において、内在性ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの断片、好ましくは液胞タンパク質選別関連タンパク質遺伝子を改変して、改変後に植物、植物部分又は植物細胞が、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項７〜１２のいずれか一項に記載の断片を含むステップ；及び
ｂ）任意選択で植物を再生するステップ
を含む、方法。
【請求項３９】
改変されたポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの断片が発現され及び／又はポリペプチドをコードする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
改変されたポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの断片が、少なくとも雌性子房、好ましくは大胞子母細胞及び／又は雌性配偶子に存在する、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記改変が、
ａ）前記植物、植物部分又は植物細胞に少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼを導入し又は発現させること、好ましくは、前記ヌクレアーゼがＣａｓ／ＲＮＡ  ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びＴＡＬエフェクターヌクレアーゼからなる群から選択される；及び／又は
ｂ）オリゴヌクレオチドを用いるオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドである；及び／又は
ｃ）化学的突然変異誘発、好ましくはエチルメタンスルホネートを用いる
による、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる又は得られた複相胞子生殖植物。
【請求項４３】
植物に複相胞子生殖を誘導するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項７〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの断片の使用。
【請求項４４】
複数の遺伝子、ＱＴＬ又は導入遺伝子の分離を防止するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項７〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの断片の使用。
【請求項４５】
遺伝子をスタッキングするための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項７〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの断片の使用。
【請求項４６】
複相胞子生殖形質用のマーカーの開発及び／又は同定のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又はその断片の使用。
【請求項４７】
植物において倍数体化を誘導するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項７〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの断片の使用。
【請求項４８】
植物においてアポミクシスを誘導するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項７〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの断片の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、特に、無性植物育種を含む植物バイオテクノロジーに関する。特に、本発明は、アポミクシス、特に複相胞子生殖による配偶体のアポミクシスの根底にあるプロセスに関連して、遺伝子、その変異体又は断片、並びにそれらがコードするタンパク質及びペプチドの同定に関する。また、本発明は、植物及び作物における複相胞子生殖による配偶体のアポミクシスを誘導するための本発明の遺伝子、タンパク質、その変異体及び断片を使用する方法、並びに複相胞子生殖植物及びアポミクティック種子を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物学において、アポミクシス（アガモスパーミー（ａｇａｍｏｓｐｅｒｍｙ）としても知られている）は、無性生殖プロセスによる種子の形成を指す。アポミクシスは、一連の発生プロセスを経て起こり、植物の有性発生プログラムを無性発生プログラムに集合的に変換する。再現性アポミクシスは、４００を超える顕花植物種において起こることが報告されている（Ｂｉｃｋｎｅｌｌ及びＫｏｌｔｕｎｏｗ  ２００４）。アポミクシスは、配偶体のアポミクシス及び胞子体のアポミクシス（不定胚形成とも呼ばれる）として知られる少なくとも２つの形態を含む様々な形態で生じ得る。配偶体のアポミクシスが起こる植物の例としては、タンポポ（タンポポ属種（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｓｐ．））、ヤナギタンポポ（ヤナギタンポポ属種（Ｈｉｅｒａｃｉｕｍ  ｓｐ．））、ケンタッキーブルーグラス（ナガハグサ（Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ））、イースタンガマグラス（ガマグラス（Ｔｒｉｐｓａｃｕｍ  ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ））及びその他などが挙げられる。胞子体のアポミクシスが起こる植物の例としては、シトラス（シトラス属種（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐ．））、マンゴスチン（マンゴスチン（Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｍａｎｇｏｓｔａｎａ）及びその他などが挙げられる。
【０００３】
一般的なアポミクシス、但し特に配偶体のアポミクシスへの関心は、特にクローン種子生産の目的で、農業におけるその潜在的な有用性のために過去数十年にわたって増加してきた。配偶体のアポミクシスは、以下の少なくとも２つの発生プロセス：（１）減数分裂による減数の回避（アポマイオシス）、及び（２）受精なしでの卵細胞から胚への発生（単為生殖）によって特徴付けられる。配偶体のアポミクシスのプロセスから生じる種子は、アポミクティック種子と呼ばれる。
【０００４】
アポミクティック種子は母系親植物と遺伝的に同一であるため、母系親植物のクローンと考えられ、したがって、このような種子を生産するプロセスはクローン種子生産と呼ばれている。アポミクシスは植物育種において非常に有用であり得ることが長い間認識されている（Ａｓｋｅｒ  １９７９，Ｈｅｒｍｓｅｎ，Ｊ．Ｇ．Ｔｈ．１９８０．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ａｐｏｍｉｘｉｓ  ｉｎ  ｐｏｔａｔｏ：Ｐｕｒｓｕｉｎｇ  ａ  ｕｔｏｐｉａｎ  ｓｃｈｅｍｅ．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  ２９：５９５−６０７，Ａｓｋｅｒ及びＪｅｒｌｉｎｇ  １９９０，ＤｅＶｉｅｌｌｅ  Ｃａｌｚａｄａら  １９９５）。アポミクシスの利点は、雑種強勢のＦ１雑種の純粋な育種（すなわち、均一な遺伝的品質のＦ１雑種の無限繁殖）を行う能力である。ほとんどの作物において、Ｆ１雑種は、しばしば「雑種強勢」と呼ばれる現象であるより高い収量と関連があるため、最良の品種である。Ｆ１雑種の自家受精は、Ｆ２有性作物における組換えによる雑種強勢の喪失を引き起こすため、Ｆ１雑種は、純系ホモ接合型の両親を交配することによって、それぞれの世代で再び生産されなければならない。有性Ｆ１種子を生産することは、複雑で高価なプロセスであり、永続的に繰り返される必要がある。対照的に、アポミクティックＦ１雑種は純粋な育種生物であり、すなわち形質を維持した純粋育種をすることができる。
【０００５】
アポミクシスは、遺伝的複雑さにかかわらず好都合な遺伝子型を固定する力があり、一段階で純粋育種をし得る生物の生産を可能にするため、農業において大きな関心事である。これは、アポミクシスが、関心のある多遺伝子定量的形質の即時固定に使用できることを意味する。ほとんどの収量形質は多遺伝子であることに留意すべきである。アポミクシスは、複数の形質（例えば、種々の抵抗性、いくつかの導入遺伝子、又は複数の定量的形質遺伝子座）の積み重ね（又はピラミッド化）に使用され得る。アポミクシスがないと、このような形質群を固定するためには、各形質遺伝子座を個別にホモ接合体にし、後で再び雑種に組み込む必要がある。形質に関与する遺伝子座の数が増加するにつれて、交配によってホモ接合形質遺伝子座を生成することは、面倒で時間がかかり、効率上の課題である。同様に、Ｆ１雑種に適した親系統を選択するには、時間と労力に大きな投資が必要である。さらに、対立遺伝子間の特異的なエピスタシス相互作用は、ホモ接合性（親系統）相で失われ、Ｆ１雑種中での組み合わせ時に戻らない場合がある。アポミクシスにより、このタイプの非相加的な遺伝的変異を固定することが可能になる。
【０００６】
任意の遺伝子型の即座の固定に加えて、その複雑さにかかわらず、アポミクシスの重要な追加的農業用途がある。有性種間雑種及び同質倍数体は、減数分裂の問題のために不稔性を被ることが多い。アポミクシスは減数分裂をスキップするため、種間雑種及び同質倍数体で起こるこれらの問題が解決されるであろう。アポミクシスは雌性雑種を防止するため、トランスジェニック作物の野生関連種への遺伝子導入を防ぐために、導入遺伝子の封じ込めのために雄性不稔性と一体になったアポミクシスが提案されている（Ｄａｎｉｅｌｌ，Ｈ．２００２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｃｒｏｐｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：５８１−５８６）。虫媒受粉作物（例えば、アブラナ属）において、アポミクティックの種子結実は、不十分な受粉媒介作業によって制限されない。これは、受粉を媒介するハチの集団の健康問題（ミツバチヘギイタダニ（Ｖａｒｒｏａ  ｍｉｔｅ）感染症、アフリカ系キラービー）の増加の観点からより重要になってきている。ほとんどのウイルスは種子によって伝染しないため、ジャガイモのような塊茎増殖作物において、アポミクシスは、優れた遺伝子型をクローン的に維持するために活用することができるが、塊茎によるウイルス伝染のリスクを排除する。またアポミクティック種子の貯蔵コストは、塊茎の貯蔵コストよりもはるかに低い。観賞植物において、アポミクシスは、労働集約的で高価な組織培養増殖を置き換えることができる。一般的に、アポミクシスが栽培品種の開発及び繁殖のコストを大幅に削減することは十分に理解されている。
【０００７】
アポミクシスは主な作物では起こらず、主な作物の大部分は有性種子作物である。有性作物にアポミクシスを導入する試みが数多くなされてきた。具体的には、アポミクシスは遺伝的制御下にあるため、多くはアポミクシスプロセスに関与する遺伝子を同定することを試みている。天然のアポミクトにおけるアポミクシスは、アポミクシス遺伝子の供給源として調査されている（Ｏｚｉａｓ−Ａｋｉｎｓ，Ｐ．及びＰ．Ｊ．ｖａｎ  Ｄｉｊｋ．２００７  ｉｎ：Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．４１：５０９−５３７）。しかしながら、アポミクシスの遺伝学的及び分子的背景は依然として十分に解明されていないままであり、アポミクシス遺伝子を同定する試みはこれまで農業における使用に適した遺伝子を生産していない。これは主に、アポミクシス遺伝子の同定及び単離が困難な課題であることが証明されているという事実のためである。天然のアポミクトはしばしば倍数体であり、倍数性植物における位置クローニングは実施には困難である。他の複雑な要因は、アポミクシスに特異的な染色体領域における組換えの抑制、反復配列及び交配における分離の歪みである。さらに、アポミクティック植物のゲノムはまだ配列決定されておらず、アポミクシス遺伝子全体の探索を複雑にしている。したがって、アポミクシス遺伝子はクローン化及び／又は単離されていない。有性作物におけるアポミクシスを導入しようとする試みは、以下のように要約することができる：
ａ）野生交配による野生アポミクティック植物由来のアポミクシス（アポミクティック）遺伝子の作物種への遺伝子移入は、これまで成功していない。例えば、ガマグラスからトウモロコシ及びキビにアポミクシスを移入する試みが挙げられる［Ｓａｖｉｄａｎ，Ｙ．（２００１）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ａｐｏｍｉｘｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｗｉｄｅ  ｃｒｏｓｓｅｓ．Ｉｎ  Ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｐｏｍｉｘｉｓ：Ｆｒｏｍ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｙ．；ａｐｏｍｉｘｉｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｓｑｕａｍｕｌａｔｕｍ  ｉｎｔｏ  ｐｅａｒｌ  ｍｉｌｌｅｔ．Ｓａｖｉｄａｎ，Ｊ．Ｇ．Ｃａｒｍａｎ及びＴ．Ｄｒｅｓｓｅｌｈａｕｓ編（Ｍｅｘｉｃｏ：ＣＩＭＭＹＴ，ＩＲＤ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ＤＧ  ＶＩ），ｐｐ．１５３−１６７；Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．，Ｏｚｉａｓ−Ａｋｉｎｓ，Ｐ．及びＨａｎｎａ，Ｗ．Ｗ．（１９９８）．Ｓｅｅｄ  ｓｅｔ  ｉｎ  ａｎ  ａｐｏｍｉｃｔｉｃ  ＢＣ３  ｐｅａｒｌ  ｍｉｌｌｅｔ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１５９，８９−９７．；国際公開第９７／１０７０４号］
【０００８】
ｂ）有性モデル種の突然変異体、特にシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における突然変異体。例えば、国際公開第２００７／０６６２１４号は、シロイヌナズナにおいてＤｙａｄと呼ばれるアポマイオシス突然変異体の使用を記載している。しかしながら、Ｄｙａｄは非常に低浸透率の劣性変異である。この突然変異を有する作物種におけるこの突然変異体の実際の使用は、非常に限定された実用的な使用のものである。
【０００９】
ｃ）２つの有性エコタイプ間のハイブリダイゼーションによってデノボでアポミクシスを行うことは、農学的に興味深いアポミクトをもたらさなかった（米国特許出願公開第２００４／０１６８２１６号及び米国特許出願公開第２００５／０１５５１１１号）。
【００１０】
ｄ）トウモロコシのトランスポゾンタグ化による候補アポミクシス遺伝子のクローニング。米国特許出願公開第２００４／０１４８６６７号は、アポミクシスを誘導すると仮定された、伸長遺伝子のオルソログを開示している。しかしながら、Ｂａｒｒｅｌｌ及びＧｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ（２００５）ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｖｏｌ：３４，ｐｐ  ３０９−３２０によれば、伸長遺伝子は減数分裂ＩＩをスキップし、したがって母親の遺伝子型を維持しない。
【００１１】
さらに、いわゆる「逆育種」がアポミクシスの代替物として役立ち得ることが、米国特許出願公開第２００６／０１７９４９８号に記載されている。しかしながら、逆育種は、外部（ヒト）の介入なしに植物自体によって行われるインビボ手順であるため、いかなる実験室手順をも必要としないアポミクシスと比較して、複雑であり、手間のかかるインビトロ実験室手順を表す。さらに、逆育種を用いて、いったん親系統が再構築されたら（二倍性配偶子ホモ接合体）、交配がなおも行われなければならない。
【００１２】
したがって、現在の技術水準の限界の少なくとも一部を取り去る、有性作物におけるアポミクシスを誘導するための代替手順が必要とされている。特に、複相胞子生殖植物及びアポミクティック種子を生産する方法が必要とされている。また、上記の方法での使用に適していて、有性作物のアポミクティック経路を実質的に模倣することができる、アポミクシス、特に複相胞子生殖のプロセスに関与する代替遺伝子及びタンパク質を明らかにする必要がある。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、アポミクシスの一部として複相胞子生殖を提供する、Ｄｉｐ遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列、並びにその（機能的な）相同体、断片及び変異体を提供する。また、複相胞子生殖植物及びこれを作製する方法が提供され、これらを使用する方法、及びアポミクティック種子を作製する方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】他家受粉がない場合の、完全にアポミクティックな三倍体植物Ａ６８（野生型）の種子頭部。完全に発育した種子の暗色の中心に留意されたい。
【図１Ｂ】他家受粉がない場合の、Ａ６８の複相胞子生殖の欠損（ＬｏＤ）欠失突然変異体の典型的な種子頭部。典型的には、これらの条件下でのＬｏＤ突然変異体は、Ａ６８野生型よりも小さい種子頭部を有する。斑点のついた中心に留意されたく、単為生殖遺伝子がない場合は、多数の白色の発育していない種子であり、単為生殖遺伝子がある場合は、いくつかの発育している種子である。単為生殖は、配偶体的に発現した遺伝子であり、したがって、複相胞子生殖が失われ、減数分裂に置き換えられたときに分離する。
【図２】広範なタンポポ属種の生殖質パネル内の関連配列多型及び複相胞子生殖表現型。有性的（ｄｉｐ）と複相胞子生殖対立遺伝子（Ｄｉｐ）の間の差を灰色で示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
用語「有性植物生殖」とは、本明細書で使用するとき、「大胞子母細胞」と呼ばれる二倍体体細胞が減数分裂を起こして４つの減数した大胞子を生産する発生経路を指す。これらの大胞子の１つは有糸分裂により分裂して、減数した卵細胞（すなわち、母親に比べて染色体数が減数した細胞）及び２つの減数した極性核を含む大配偶体（胚嚢としても知られている）を形成する。花粉粒の１つの精細胞による卵細胞の受精は、二倍体胚を生成し、一方、第２の精細胞による２つの極性核の受精は、三倍体胚乳を生成する（二倍受精と呼ばれるプロセス）。
【００１６】
用語「大胞子母細胞（ｍｅｇａｓｐｏｒｅ  ｍｏｔｈｅｒ  ｃｅｌｌ）」又は「大胞子母細胞（ｍｅｇａｓｐｏｒｏｃｙｔｅ）」は、本明細書で使用するとき、雌性配偶体に発生する４つの一倍体大胞子を生成するために、減数、通常は減数分裂によって、大胞子を生産する二倍体細胞を指す。被子植物（顕花植物としても知られている）において、大胞子母細胞は、大胞子形成（珠心における大胞子、又は大胞子嚢の形成）、及び大配偶子形成（大配偶体への大胞子の発生）を含む２つの異なるプロセスによる大配偶体に発生する大胞子を生産する。
【００１７】
用語「無性植物生殖」は、本明細書で使用するとき、受精及び配偶子の融合なしで植物の生殖が達成されるプロセスである。無性生殖は、突然変異が生じた場合を除いて、親植物と遺伝的に同一であり、互いに遺伝的に同一である新しい個体を生産する。植物は、栄養生殖（すなわち、元の植物の栄養芽の出芽分げつなどを伴う）及びアポミクシスを含む２つの主要なタイプの無性生殖を有する。
【００１８】
用語「アポミクシス」とは、本明細書で使用するとき、無性プロセスによる種子の形成を指す。
【００１９】
用語「複相胞子生殖」とは、本明細書で使用するとき、減数していない胚嚢が、有糸分裂によって直接的に又は中断された減数分裂事象によってのいずれかで大胞子母細胞に由来する状況を指す。複相胞子生殖の３つの主要なタイプが報告されていて、それらが発生する植物の名前が付けられており、それらはタンポポ属種（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、ニガナ属種（Ｉｘｅｒｉｓ）及びアンテンナリア属種（Ａｎｔｅｎｎａｒｉａ）型である。タンポポ属種型において、減数分裂前期が開始されるが、その後プロセスが中断され、２つの減数していないダイアドが生じ、そのうちの１つが有糸分裂によって胚嚢を生じる。ニガナ属種型において、８つの核体の胚嚢を生じる核の２つのさらなる有糸分裂は、減数分裂前期の後の等価分割に従う。タンポポ属種及びニガナ属種型は、減数分裂の改変を伴うため、減数分裂複相胞子生殖として知られている。対照的に、有糸分裂複相胞子生殖と呼ばれるアンテンナリア属種型において、大胞子母細胞は減数分裂を開始せず、直接３回分裂して減数していない胚嚢を生産する。複相胞子生殖による配偶体のアポミクシスにおいて、減数していない配偶体が減数していない大胞子から生産される。この減数していない大胞子は、有糸分裂様の分裂（有糸分裂の変形（ｄｉｓｐｌｏｒｙ））又は改変された減数分裂（減数分裂の変形）のいずれかの結果生じる。無胞子生殖による配偶体のアポミクシスと複相胞子生殖による配偶体のアポミクシスの両方において、減数していない卵細胞は、胚に単為生殖的に発生する。タンポポ属種のアポミクシスは、複相胞子生殖型のものであり、これは、最初の雌性減数分裂（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ）（減数分裂（Ｍｅｉｏｓｉｓ）Ｉ）はスキップされ、その結果、母植物と同じ遺伝子型を有する２つの減数していない大胞子が生じることを意味する。これらの大胞子の１つは変性し、他方の生存している減数していない大胞子は、減数していない大配偶体（又は胚嚢）を生じさせ、これは減数していない卵細胞を含む。この減数していない卵細胞は、母植物と同じ遺伝子型を有する胚に受精することなく発達する。配偶体のアポミクシスのプロセスから生ずる種子は、アポミクティック種子と呼ばれる。
【００２０】
用語「複相胞子生殖機能」とは、植物、好ましくは雌性子房、好ましくは大胞子母細胞及び／又は雌性配偶子の中で複相胞子生殖を誘導する能力を指す。このように、複相胞子生殖機能が導入された植物は、複相胞子生殖プロセスを行うことができ、すなわち、減数分裂Ｉ回復を介して減数していない配偶子を生産することができる。
【００２１】
用語「配偶体のアポミクシスの一部としての複相胞子生殖」とは、アポミクシスのプロセスの複相胞子生殖構成要素を指し、すなわち、複相胞子生殖が無性プロセスによる種子の形成において果たす役割を指す。特に、複相胞子生殖機能の次に、単為生殖機能は、同様にアポミクシスのプロセスを確立するために必要である。したがって、複相胞子生殖機能と単為生殖機能の組み合わせは、アポミクシスをもたらす可能性がある。
【００２２】
アポミクシスは、配偶体のアポミクシス及び胞子体のアポミクシス（不定胚形成とも呼ばれる）として知られる少なくとも２つの形態を含む様々な形態で生じることが知られている。配偶体のアポミクシスが起こる植物の例としては、タンポポ（タンポポ属種）、ヤナギタンポポ（ヤナギタンポポ属種）、ケンタッキーブルーグラス（ナガハグサ）、イースタンガマグラス（ガマグラス）及びその他などが挙げられる。胞子体のアポミクシスが起こる植物の例としては、シトラス（シトラス属種）、マンゴスチン（マンゴスチン）及びその他などが挙げられる。
【００２３】
用語「複相胞子生殖植物」とは、本明細書で使用するとき、複相胞子生殖により配偶体のアポミクシスを受ける植物、又は複相胞子生殖により配偶体のアポミクシスを受けるために（例えば、遺伝子改変によって）誘導されている植物を指す。両方の場合において、複相胞子生殖植物は、単為生殖因子と組み合わせた場合、アポミクティック種子を生産する。
【００２４】
用語「アポミクティック種子」とは、本明細書で使用するとき、アポミクティック植物種から得られる種子、又はアポミクシスを受けるように誘導されている、特に複相胞子生殖により配偶体のアポミクシスを受けるように誘導されている植物若しくは作物を指す。アポミクティック種子は、クローンであり、親植物と遺伝的に同一であり、純粋な育種が可能な植物を発芽させることを特徴とする。
【００２５】
細胞、植物、植物部分又は種子の「クローン」は、それらが、それらの同胞種及びそれらが由来する親植物と遺伝的に同一であることを特徴とする。個々のクローンのゲノムＤＮＡ配列はほとんど同一であるが、しかしながら、突然変異は軽微な違いを引き起こす可能性がある。
【００２６】
本明細書で使用される「純粋な育種」又は「純粋な育種生物」（純粋な育種の生物としても知られている）は、その子孫に変化しないか又はほとんど変化しないある特定の表現型形質を常に伝える生物を指す。生物は、これが適用される各形質について純粋な育種と呼ばれ、用語「純粋な育種」とはまた、個々の遺伝形質を記述するためにも使用される。
【００２７】
用語「Ｆ１雑種」（又は一代雑種）とは、本明細書で使用するとき、親タイプと明確に異なる子孫の第一雑種世代を指す。Ｆ１雑種は、遺伝学及び選択育種において使用され、この場合、Ｆ１交雑として現れ得る。明らかに異なる親タイプの子孫は、親からの特徴の組み合わせで新しい均一な表現型を生成する。「Ｆ１雑種」は、雑種強勢などの明確な利点と関連していて、したがって、農作業において非常に望ましい。本発明の一実施形態において、本明細書において教示される方法、遺伝子、タンパク質、その変異体又は断片は、その遺伝的複雑性にかかわらず、Ｆ１雑種の遺伝子型を固定するために使用され得、一段階で純粋育種することができる生物を生産することを可能にする。
【００２８】
用語「対立遺伝子（複数可）」とは、本明細書で使用するとき、特定の遺伝子座における遺伝子の１つ又は複数の代替形態のいずれかを指す。生物の二倍体細胞において、所与の遺伝子の対立遺伝子は、染色体上の特定の位置又は遺伝子座（複数の遺伝子座）に位置する。１つの対立遺伝子は、相同染色体対の各染色体上に存在する。二倍体又は倍数体植物種は、特定の遺伝子座に非常に多数の異なる対立遺伝子を含むことができる。一実施形態において、本明細書において教示される野生タンポポ属種の受入のＤｉｐ遺伝子は、ヌクレオチド及び／又はコードされたアミノ酸配列においてごくわずかに変化し得る様々なＤｉｐ又はｄｉｐ対立遺伝子を含み得る。
【００２９】
用語「遺伝子座」（複数の遺伝子座）とは、本明細書で使用するとき、例えば、１つ又は複数の遺伝子又は遺伝子マーカーが位置する染色体上の１つ又は複数の特定の位置又は部位を指す。例えば、「Ｄｉｐ遺伝子座」とは、本明細書において教示されるとき、Ｄｉｐ遺伝子（及び２つ（又はそれ以上）のｄｉｐ対立遺伝子）が本明細書において教示されるように見出されるゲノム中の位置を指す。
【００３０】
用語「優性対立遺伝子」とは、本明細書で使用するとき、１つの対立遺伝子の表現型に対する効果（すなわち、優性対立遺伝子）が、同じ遺伝子座における第２の対立遺伝子（劣性対立遺伝子）の寄与を隠す１つの遺伝子の対立遺伝子間の関係を指す。第１の対立遺伝子は優性であり、第２の対立遺伝子は劣性である。常染色体（性染色体以外のいずれかの染色体）上の遺伝子の場合、対立遺伝子及びそれらの関連形質は常染色体優性又は常染色体劣性である。優性は、メンデルの遺伝及び古典的遺伝学における重要な概念である。例えば、優性対立遺伝子は機能性タンパク質をコードし得、一方、劣性対立遺伝子は機能性タンパク質をコードし得ない。一実施形態において、本明細書において教示される遺伝子及びその断片又は変異体は、Ｄｉｐ遺伝子の優性対立遺伝子を指す。
【００３１】
用語「雌性子房」（複数形は「子房（ｏｖａｒｉｅｓ）」である）は、本明細書で使用するとき、胞子が形成される筺体を指す。これは、単一の細胞から構成されてもよく、又は多細胞であってもよい。全ての植物、真菌、及び他の多くの系統は、それらのライフサイクルのある時点で子房を形成する。子房は有糸分裂又は減数分裂によって胞子を生産することができる。一般的に、各子房内で、大胞子母細胞の減数分裂は、４つの一倍体大胞子を生産する。裸子植物及び被子植物において、これらの４つの大胞子のうちの１つだけが成熟時に機能的になり、他の３つは退化する。残っている大胞子は、有糸分裂的に分裂し、最終的に１つの卵細胞を生産する雌性配偶体（大配偶体）に成長する。
【００３２】
用語「雌性配偶子」とは、本明細書で使用するとき、有性的に生殖する生物において受精（受胎）中に別の（「雄性」）細胞と融合する細胞を指す。２つの形態学的に異なるタイプの配偶子を生産する種において、各個体が１つのタイプしか生産しない場合、雌はより大きなタイプの配偶子（胚珠（卵子）又は卵と呼ばれる）を生産するいずれかの個体である。植物において、雌性胚珠は花の子房によって生産される。成熟すると、一倍体の胚珠は、雌性配偶子を生産し、受精の準備が整う。雄性細胞は（ほとんどが一倍体）花粉であり、葯によって生産される。
【００３３】
用語「受粉」又は「受粉すること」とは、本明細書で使用するとき、花粉が植物の葯（雄の部分）から柱頭（雌の部分）に運搬され、それによって受精及び生殖を可能にするプロセスを指す。それは、被子植物、花保有植物に固有である。各花粉粒は、雄性一倍体配偶体であり、雌性配偶体に輸送されるように構成され、そこで二重受精のプロセスにおいて雄性配偶子（又は配偶子）を生産することによって受精をもたらすことができる。雄性配偶子を含む成功した被子植物の花粉粒（配偶体）は、柱頭に運搬され、そこで発芽し、その花粉管は子房への花柱を成長させる。その２つの配偶子は、雌性配偶子を含む配偶体（複数可）が心皮中で保持されているところまで管を移動する。一方の核は極性核と融合して胚乳組織を生産し、他方の核は胚珠と融合して胚を生産する。胚乳の有性発生のために大部分の天然のアポミクトでさえ受粉が必要である。しかしながら、少数のアポミクトにおいて、例えば、タンポポ属種及びヤナギタンポポ属種（ヤナギタンポポ）において、胚乳は、自律的な胚乳発生として知られるプロセスによって、極性核の受精を伴わずに発生する。シロイヌナズナ属種では、自律的な胚乳発生を引き起こす多数の突然変異が知られている。
【００３４】
用語「単為生殖」とは、本明細書で使用するとき、受精を伴わずに胚の成長及び発生が起こる無性生殖の形態を指す。本発明の遺伝子及びタンパク質は、単為生殖因子、例えば遺伝子又は化学因子と組み合わせて、アポミクティック子孫を生産することができる。
【００３５】
用語「液胞タンパク質選別関連タンパク質タイプ１３」（ＶＰＳ１３と省略される）とは、本明細書で使用するとき、トランス−ゴルジネットワークを介して液胞及び細胞膜へのタンパク質の循環における段階の制御に関与する、Ｖｐｓ１３遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。
【００３６】
用語「遺伝子マーカー」又は「多型マーカー」とは、本明細書で使用するとき、ゲノムＤＮＡ上の領域を指し、これは、染色体上の特定の位置を「マークする」ために使用され得る。遺伝子マーカーが遺伝子に密接に連結されているか、遺伝子「中」（遺伝子マーカー中に）ある場合、それは遺伝子が見出されたＤＮＡを「マークし」、したがって、本明細書において教示される（分子）マーカー分析に使用し、遺伝子の存在のために又はそれに対して選択することができ、例えば、マーカー支援した育種／選択（ＭＡＳ）法において使用され得る。遺伝子マーカーの非限定的な例としては、ＡＦＬＰ（増幅断片長多型、欧州特許第５３４８５８号）、マイクロサテライト、ＲＦＬＰ（制限断片長多型）、ＳＴＳ（配列タグ化部位）、ＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）、ＳＦＰ（単一特徴多型；Ｂｏｒｅｖｉｔｚら（２００３）Ｉｎ：Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ：１３，ｐｐ  ５１３−５２３参照）、ＳＣＡＲ（配列が特徴付けられた増幅領域）、ＣＡＰＳマーカー（切断された増幅された多型配列）などが含まれる。マーカーが遺伝子からさらに離れているほど、マーカーと遺伝子の間で組換え（交叉）が起こり、それによって連結（及びマーカーと遺伝子の共分離）が失われる可能性が高くなる。遺伝子座間の距離は、組換え頻度に関して測定され、ｃＭ（センチモルガン；１ｃＭは、２つの１％マーカー間の減数分裂組換え頻度である）で与えられる。ゲノムサイズが種間で大きく異なるため、１ｃＭ（すなわち、２つのマーカー間のキロベース、ｋｂ）によって表される実際の物理的距離も種間で大きく変動する。本明細書の「連結された」マーカーを指す場合、これはまた、遺伝子そのものの「中に」マーカーを包含することが理解される。
【００３７】
用語「マーカー支援選択」（「ＭＡＳ」と省略される）とは、本明細書で使用するとき、（エリート）育種系統にマーカー（任意選択で隣接領域が欠如している）を含むＤＮＡ領域の転写を加速するために、植物が、１つ又は複数の遺伝子マーカー及び／又は表現型マーカーの存在及び／又は非存在についてスクリーニングされるプロセスを指す。
【００３８】
用語「分子マーカーアッセイ」（又は試験）とは、本明細書で使用するとき、植物又は植物部分における特定の対立遺伝子（例えば、Ｄｉｐ対立遺伝子）の存在又は非存在を（直接的又は間接的に）示す（ＤＮＡベースの）アッセイを指す。いずれかの個々の植物におけるＤｉｐ遺伝子座で特定の対立遺伝子がホモ接合性又はヘテロ接合性であるかどうかを決定することができるのが好ましい。例えば、一実施形態において、Ｄｉｐ遺伝子座に連結された核酸はＰＣＲプライマーを用いて増幅され、増幅産物は酵素的に消化され、増幅産物の電気泳動的に分解されたパターンに基づいて、どのＤｉｐ対立遺伝子がいずれかの個々の植物に存在し、Ｄｉｐ遺伝子座での対立遺伝子（すなわち、個々の遺伝子座での遺伝子型）の接合性を決定することができる。分子マーカーアッセイの非限定的な例には、配列特徴付け増幅領域（ＳＣＡＲ）マーカーアッセイ、切断増幅多型配列（ＣＡＰＳ）マーカーアッセイなどが含まれる。
【００３９】
用語「ヘテロ接合性」とは、本明細書で使用するとき、２つの（又は倍数体の場合には２を超える）異なる対立遺伝子が、Ｄｉｐ遺伝子座（例えば、優性Ｄｉｐ対立遺伝子／劣性ｄｉｐ対立遺伝子）などの特定の遺伝子座に存在し、細胞内の対応する相同染色体対上に個々に配置される場合に存在する遺伝的条件を指す。
【００４０】
用語「ホモ接合性」とは、本明細書で使用するとき、２つの（又は倍数体の場合には２を超える）同一の対立遺伝子が、特定の遺伝子座（例えば、優性対立遺伝子Ｄｉｐに対してホモ接合性、又は劣性対立遺伝子ｄｉｐに対してホモ接合性）に存在するが、細胞内の対応する相同染色体対上に個々に配置される場合に存在する遺伝的条件を指す。
【００４１】
用語「多様性」とは、本明細書で使用するとき、ＵＰＯＶ規則に準拠し、最も低い公知のランクの単一の植物分類群内の植物群を指し、その群は所与の遺伝子型又は遺伝子型の組み合わせから生じる特徴の発現によって定義することができ、上記特徴の少なくとも１つの発現によって、他のいずれかの植物群と区別することができ、変化せずに（安定して）繁殖させるための適性に関する単位と考えられる。
【００４２】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」とは、本明細書で使用するとき、互換的に使用され、特定の作用様式、サイズ、３次元構造又は起源に関係なく、アミノ酸鎖からなる分子を指す。
【００４３】
用語「単離されたポリペプチド」又は「単離されたタンパク質」とは、本明細書で使用するとき、互換的に使用され、もはやその天然の環境にはないタンパク質を指し、例えばチューブ（インビトロ）又は組換え細菌若しくは植物の宿主細胞に存在するタンパク質は単離されたタンパク質である。
【００４４】
本明細書で使用するとき、用語「核酸」とは、ピリミジン及びプリン塩基、好ましくはそれぞれシトシン、チミン及びウラシル、並びにアデニン及びグアニンの任意のポリマー又はオリゴマーを指す（全ての目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれるＡｌｂｅｒｔ  Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｔ  ７９３−８００（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂ．１９８２）を参照されたい）。本発明は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又はペプチド核酸成分、及びその任意の化学的変異体、例えば、これらの塩基のメチル化、ヒドロキシメチル化又はグリコシル化形態などを意図する。ポリマー又はオリゴマーは、組成が不均一又は均質であってもよく、天然に存在する供給源から単離されてもよく、又は人工的に若しくは合成的に製造されてもよい。
【００４５】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」、「核酸配列」又は「ヌクレオチド配列」は、一本鎖又は二本鎖形態のポリマーＤＮＡ又はＲＮＡ分子、特に、本発明によるタンパク質をコードするＤＮＡ、その変異体又は断片を指す。
【００４６】
用語「単離されたポリヌクレオチド」、「単離された核酸分子」、「単離された核酸配列」、又は「単離されたヌクレオチド配列」とは、本明細書で使用するとき、もはや自然環境にはないポリヌクレオチド、すなわち天然の配列又はタンパク質を天然に付随しない他の細胞成分、例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、他の多数の配列及びタンパク質を指す。この用語は、天然に存在する環境から除去されたポリヌクレオチドを包含し、組換え又はクローニングされた核酸単離体、及び化学的に合成された類似体又は異種系によって生物学的に合成された類似体、例えば細菌宿主細胞又は植物の核若しくはプラスチドゲノムを含む。
【００４７】
用語「機能的ＤＩＰ遺伝子又はタンパク質」又は「機能的ＤＩＰ遺伝子又はタンパク質変異体若しくは断片」（例えば、オルソログ又は変異体及び遺伝子の一部）とは、本明細書で使用するとき、植物において１つ又は複数の遺伝子の発現レベルを（例えば、過剰発現又はサイレンシングによって）変化させることにより、アポミクシス、特に複相胞子生殖を介した配偶体のアポミクシスの根底にあるプロセスを上記植物に（定量的及び／又は定性的に）改変又は導入することができる、遺伝子及び／又はコードされたタンパク質の能力を指す。例えば、植物種Ｘから得られる推定上のＤＩＰタンパク質の機能性は、様々な方法によって試験することができる。タンパク質が機能的である場合、例えば、遺伝子サイレンシングベクターを用いた、植物種Ｘのタンパク質をコードするＤｉｐ遺伝子のサイレンシングは、複相胞子生殖の減少（すなわち、染色体数が減少する）又は抑制をもたらし、一方、感受性植物における過剰発現は、複相胞子生殖の増強をもたらすのが好ましい。また、機能的ＤＩＰタンパク質を補完することにより、複相胞子生殖を回復又は付与することができる。当業者は、機能性を試験するのは困難でない。
【００４８】
用語「遺伝子」とは、本明細書で使用するとき、適切な調節領域（例えば、プロモーター）に作動可能に連結された、細胞内のＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）を含むＤＮＡ配列を指す。したがって、遺伝子は、いくつかの作動可能に連結された配列、例えばプロモーター、例えば、翻訳開始に関与する配列を含む５’リーダー配列、（タンパク質）コード領域（ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、及び例えば、転写終止部位を含む３’非翻訳配列を含み得る。
【００４９】
用語「キメラ遺伝子」又は「組換え遺伝子」とは、本明細書で使用するとき、通常は種において天然では見出されない任意の遺伝子、特に、核酸配列の１つ又は複数の部分が存在し、天然において互いに結合しない遺伝子を指す。例えば、プロモーターは、天然において、転写された領域の一部若しくは全部又は別の調節領域と結合しない。用語「キメラ遺伝子」とは、プロモーター又は転写調節配列が１つ又は複数のコード配列又はアンチセンス（センス鎖の逆相補体）又は逆方向反復配列（センス及びアンチセンス、それによりＲＮＡ転写物が転写の際に二本鎖ＲＮＡを形成する）に作動可能に連結している発現構築物を含むものと理解される。
【００５０】
用語「３’ＵＴＲ」又は「３’非翻訳配列」（「３’非翻訳領域」又は「３’末端」としても知られる）は、遺伝子のコード配列の下流に見出される核酸配列を指し、これは、転写終結部位、及び（大部分であるが全てではない真核生物ｍＲＮＡにおいて）ポリアデニル化シグナル（例えば、ＡＡＵＡＡＡ又はその変異体）を含む。転写の終結後、ｍＲＮＡ転写産物は、ポリアデニル化シグナルの下流で切断され、ｍＲＮＡの細胞質（翻訳が行われる場所）への輸送に関与するポリＡ尾部が付加され得る。
【００５１】
用語「５’ＵＴＲ」又は「リーダー配列」又は「５’非翻訳領域」とは、本明細書で使用するとき、ｍＲＮＡ転写が始まる＋１位置とコード領域の翻訳開始コドン（通常、ｍＲＮＡ上のＡＵＧ又はＤＮＡ上のＡＴＧ）の間のｍＲＮＡ転写物及び対応するＤＮＡの領域を指す。５’ＵＴＲは、通常、翻訳、ｍＲＮＡ安定性及び／又は代謝回転、並びに他の調節エレメントにとって重要な部位を含有する。
【００５２】
用語「遺伝子又はその変異体若しくは断片の発現」とは、本明細書で使用するとき、適切な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡ領域が、生物学的に活性なＲＮＡに転写され、すなわち生物学的に活性なタンパク質又はペプチド（又は活性ペプチド断片）に翻訳されることができ、又はそれ自体が活性であるＲＮＡ（例えば、転写後の遺伝子サイレンシング又はＲＮＡｉ）に転写されることを意味する。ある特定の実施形態における活性タンパク質は、構成的に活性であるタンパク質を指す。コード配列は、好ましくはセンス配向であり、所望の生物学的に活性なタンパク質若しくはペプチド、又は活性なペプチド断片をコードする。遺伝子サイレンシングアプローチにおいて、ＤＮＡ配列は、好ましくは、標的遺伝子の短い配列をアンチセンス又はセンス及びアンチセンス配向に含むアンチセンスＤＮＡ又は逆方向反復ＤＮＡの形態で存在する。「異所性発現」とは、遺伝子が通常発現されていない組織における発現を指す。
【００５３】
用語「転写調節配列」とは、本明細書で使用するとき、転写調節配列に作動可能に連結された（コード）配列の転写速度を調節することができる核酸配列を指す。したがって、本明細書で定義される転写調節配列は、転写開始のため、並びに転写を維持及び調節するために必要とされる配列エレメント（プロモーターエレメント）の全てを含み、例えば、アテニュエーター又はエンハンサーが挙げられる。ほとんどのコード配列の上流（５’）転写調節配列が参照されるが、コード配列の下流（３’）に見出される調節配列もまたこの定義に包含される。
【００５４】
用語「プロモーター」とは、本明細書で使用するとき、遺伝子の転写開始部位の転写の方向に対して上流に位置する１つ又は複数の遺伝子の転写を制御するように機能し、並びにＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのための結合部位、転写開始部位及び任意の他のＤＮＡ配列、例えば、限定されないが、転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位、及びプロモーターからの転写量を調節するために直接的又は間接的に作用する、当業者に公知であるヌクレオチドの任意の他の配列の存在によって構造的に同定される核酸断片を指す。任意選択で用語「プロモーター」はまた、５’ＵＴＲ領域を含んでもよい（例えば、プロモーターは、本明細書において、この領域が転写及び／又は翻訳において役割を有し得るため、遺伝子の転写開始コドンの上流（５’）に１つ又は複数の部分を含み得る）。
【００５５】
用語「構成的プロモーター」とは、本明細書で使用するとき、大部分の生理学的及び発生条件下でほとんどの組織において活性であるプロモーターを指す。
【００５６】
用語「誘導性プロモーター」とは、本明細書で使用するとき、生理学的（例えば、ある特定の化合物の外部適用によって）又は発生的に調節されるプロモーターを指す。
【００５７】
用語「組織特異的プロモーター」とは、本明細書で使用するとき、特定のタイプの組織又は細胞においてのみ活性であるプロモーターを指す。「植物又は植物細胞において活性なプロモーター」とは、植物又は植物細胞内で転写を駆動するためのプロモーターの一般的な能力を指す。プロモーターの時空間的活性については何ら示唆していない。
【００５８】
用語「作動可能に連結された」とは、本明細書で使用するとき、機能的関係におけるポリヌクレオチドエレメントの連結を指す。核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれた場合、「作動可能に連結される」。例えば、プロモーター、又はむしろ転写調節配列は、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結される。作動可能に連結されるとは、連結されているＤＮＡ配列が典型的には隣接していて、必要に応じて、キメラタンパク質を生成するように連続して、リーディングフレームにある、２つのタンパク質コード領域を接続することを意味する。
【００５９】
用語「キメラタンパク質」又は「ハイブリッドタンパク質」とは、本明細書で使用するとき、天然においては見出されないが、機能的タンパク質を形成するよう接続され、接続されたドメインの機能性を提示する様々なタンパク質ドメイン又はモチーフで構成されるタンパク質を指す。キメラタンパク質はまた、天然に存在する２つ以上のタンパク質の融合タンパク質であってもよい。
【００６０】
用語「ドメイン」とは、本明細書で使用するとき、少なくともドメインの機能的特徴を有する新規なハイブリッドタンパク質を提供するために、別のタンパク質に転写され得る、特定の構造又は機能を有するタンパク質の任意の部分（複数可）又はドメイン（複数可）を意味する。
【００６１】
用語「標的ペプチド」とは、本明細書で使用するとき、色素体、好ましくは、葉緑体、ミトコンドリアなどの細胞内小器官に、又は細胞外空間若しくはアポプラスト（分泌シグナルペプチド）にタンパク質又はタンパク質断片を標的化させるアミノ酸配列を指す。標的ペプチドをコードする核酸配列は、タンパク質若しくはタンパク質断片のアミノ末端（Ｎ末端）をコードする核酸配列に融合（インフレームで）することができ、又は天然の標的ペプチドを置換するために使用することができる。
【００６２】
用語「核酸構築物」又は「ベクター」とは、本明細書で使用するとき、組換えＤＮＡ技術の使用によって生じる人造の核酸分子を指し、これは、宿主細胞への外来性ＤＮＡ又はＲＮＡの送達に使用される。ベクター骨格は、例えば、当該技術分野において公知であり、本明細書の他の箇所に記載されているように、バイナリー若しくはスーパーバイナリーベクター（例えば、米国特許第５，５９１，６１６号、米国特許出願公開第２００２／１３８８７９号、及び国際公開第９５／０６７２２号参照）、同時組み込みベクター又はＴ−ＤＮＡベクターであり得、その中にキメラ遺伝子が組み込まれ、或いは、適した転写調節配列が既に存在する場合、所望の核酸配列（例えば、コード配列、アンチセンス又は逆方向反復配列）のみが、転写調節配列の下流に組み込まれる。ベクターは通常、例えば、選択可能マーカー、マルチクローニングサイトなど（後述を参照）、分子クローニングにおけるそれらの使用を容易にするための遺伝的エレメントをさらに含む。
【００６３】
用語「宿主細胞」又は「組換え宿主細胞」又は「形質転換細胞」又は「トランスジェニック細胞」とは、本明細書で使用するとき、上記細胞に導入された、特に、所望のタンパク質をコードするキメラ遺伝子又は転写されると標的遺伝子／遺伝子ファミリーをサイレンシングするためのアンチセンスＲＮＡ若しくは逆方向反復ＲＮＡ（又はヘアピンＲＮＡ）又はｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを生じる核酸配列を含む少なくとも１種の核酸分子の結果として生じる、新たな個々の細胞（又は生物）を指す。宿主細胞は、好ましくは、植物細胞又は細菌細胞である。宿主細胞は、染色体外で（エピソームで）複製する分子として核酸構築物を含有することができ、又は、より好ましくは、宿主細胞の核又は色素体ゲノムに組み込まれたキメラ遺伝子を含む。
【００６４】
用語「組換え植物」又は「組換え植物部分」又は「トランスジェニック植物」とは、本明細書で使用するとき、全ての細胞及び植物部分において同一の遺伝子座で本明細書において教示されるキメラ遺伝子を含む植物又は植物部分（例えば、種子又は果実又は葉）を指し、たとえ遺伝子が全ての細胞において発現されなくてもよい。
【００６５】
用語「エリート事象」とは、本明細書で使用するとき、植物の良好な若しくは所望の表現型及び／又は農業的特徴をもたらすゲノム中の位置に組換え遺伝子を含むように選択された組換え植物を指す。組込み部位の隣接ＤＮＡを配列決定して、組込み部位を特徴付けることができ、ゲノム中の他の位置で同じキメラ遺伝子を含む他のトランスジェニック植物と区別することができる。
【００６６】
用語「選択可能マーカー」とは、本明細書で使用するとき、当業者に一般的に公知の用語を指し、本明細書においては、発現した場合、細胞又は該選択可能マーカーを含有する細胞の選択に用いることができるいずれかの遺伝的実体を説明するために使用される。選択可能マーカー遺伝子産物は、例えば、抗生物質抵抗性又はより好ましくは、除草剤抵抗性又は表現型形質（例えば、色素沈着の変化）若しくは栄養要求性などの別の選択可能な形質を付与する。用語「レポーター」は、主に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｅＧＦＰ、ルシフェラーゼ、ＧＵＳなどの可視マーカーを指すために使用される。
【００６７】
用語「遺伝子のオルソログ」又は「タンパク質のオルソログ」とは、本明細書で使用するとき、遺伝子又はタンパク質と同じ機能を有するが、該遺伝子を有する種が分岐した時点から配列において（通常は）分岐した、別の種において見出された相同な遺伝子又は相同なタンパク質を指す（すなわち、種形成によって共通の祖先から進化した遺伝子）。一実施形態において、したがって、タンポポ属種のＤｉｐ遺伝子のオルソログは、配列比較（例えば、配列全体又は特定のドメインにわたる配列同一性パーセントに基づく）と機能解析の両方に基づいて、他の植物種において同定され得る。
【００６８】
表現「シンテニック（ｓｙｎｔｅｎｉｃ）領域」とは、本明細書で使用するとき、比較ゲノム学において使用される用語を指し、２つの関連する種の染色体上の同じ領域を指す。
【００６９】
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、本明細書で使用するとき、所定のヌクレオチド配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を同定するために用いることができる状況を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、様々な状況において異なる。一般的に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度及びｐＨにおいて、特異的配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるよう選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びｐＨ下で）である。典型的には、ｐＨ７において塩濃度が約０．０２モル濃度であり、温度が少なくとも６０℃であるストリンジェントな条件が選ばれる。塩濃度の低下及び／又は温度の上昇は、ストリンジェンシーを増加させる。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（例えば１００ｎｔのプローブを用いたノーザンブロット）のためのストリンジェントな条件は、例えば、０．２×ＳＳＣにおける６３℃、２０分間の少なくとも１回の洗浄を含む条件又は等価条件である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（例えば１００ｎｔのプローブを用いたサザンブロット）のためのストリンジェントな条件は、例えば、０．２×ＳＳＣにおける少なくとも５０℃、通常約５５℃の温度で２０分間の少なくとも１回の洗浄（通常２回）を含む条件又は等価条件である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）並びにＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）も参照されたい。
【００７０】
用語「高ストリンジェンシー条件」とは、本明細書で使用するとき、例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは、３．０Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  Ｎａ−クエン酸、ｐＨ７．０を含有する）、５×デンハルト液（１００×デンハルト液は、２％フィコール、２％ポリビニルピロリドン、２％ウシ血清アルブミンを含有する）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び非特異的競合者として２０μｇ／ｍｌ変性担体ＤＮＡ（一本鎖の魚精子ＤＮＡ、平均長１２０〜３０００ヌクレオチド）を含有する水溶液における６５℃でのハイブリダイゼーションにより達成することができる。ハイブリダイゼーション後に、高ストリンジェンシー洗浄を数回の工程において行うことができ、最終洗浄（約３０分間）は、ハイブリダイゼーション温度で０．２〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて行う。
【００７１】
用語「中等度ストリンジェンシー」とは、本明細書で使用するとき、上述の溶液における、但し、約６０〜６２℃でのハイブリダイゼーションに等しい条件を指す。この場合、最終洗浄は、ハイブリダイゼーション温度で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて行われる。
【００７２】
用語「低ストリンジェンシー」とは、本明細書で使用するとき、上述の溶液における約５０〜５２℃でのハイブリダイゼーションに等しい条件を指す。この場合、最終洗浄は、ハイブリダイゼーション温度で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて行われる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）並びにＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）も参照されたい。
【００７３】
用語「実質的に同一の」又は「実質的な同一性」又は「本質的に類似した」又は「本質的な類似性」又は「変異体」又は「配列同一性」とは、本明細書で使用するとき、アミノ酸配列又は核酸配列の文脈で使用される場合、例えばデフォルトパラメータを用いたプログラムであるＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって最適に整列させた場合、少なくともある特定の配列同一性パーセントを共有する２つのアミノ酸配列又は２つのヌクレオチド配列を指す。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズムを用いて、２種の配列をそれらの完全長にわたり整列し、マッチ数を最大化し、ギャップ数を最小化する。一般的に、ＧＡＰデフォルトパラメータが用いられ、ギャップクリエーションペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップエクステンションペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）である。ヌクレオチドに関して、用いるデフォルトスコア化マトリクスはｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質に関して、デフォルトスコア化マトリクスはＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，ＰＮＡＳ  ８９，９１５−９１９）。ＲＮＡ配列が本質的に類似している、又はＤＮＡ配列とある程度の配列同一性を有すると言われるとき、ＤＮＡ配列中のチミン（Ｔ）はＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）と等しいと考えられることは明らかである。配列同一性パーセントのための配列アライメント及びスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  ９２１２１−３７５２  ＵＳＡから入手できるＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３などのコンピュータプログラムを用いて、又はＥｍｂｏｓｓＷＩＮ（バージョン２．１０．０）においてはプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」を用いて、上述と同じＧＡＰパラメータ又はギャップオープニングペナルティ１０．０、ギャップエクステンションペナルティ０．５を用い、マトリックスとしてＤＮＡＦＵＬＬを用いて決定され得る。異なる長さの配列間の配列同一性を比較するためには、例えば、ＥｍｂｏｓｓＷＩＮプログラム「ｗａｔｅｒ」を用いた、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ＴＦ，Ｗａｔｅｒｍａｎ  ＭＳ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  １４７（１）；１９５−７）などの局所的アラインメントアルゴリズムを使用することが好ましい。デフォルトパラメータは、ギャップオープニングペナルティ１０．０、ギャップエクステンションペナルティ０．５であり、タンパク質についてＢｌｏｓｕｍ６２及び核酸についてＤＮＡＦＵＬＬマトリックスを用いる。
【００７４】
用語「含むこと」及び「含む」並びにそれらの活用は、本明細書で使用するとき、上記用語が非限定的な意味で使用され、その語に続く項目が含まれることを意味するが、特に言及されていない項目は除外されない状況を指す。それはまた、より制限的な動詞「からなる」を包含する。さらに、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」による要素への言及は、文脈が、要素のうち１つ及び１つのみが存在することを明確に要求しない限り、１を超える要素が存在する可能性を排除するものではない。したがって、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。本明細書において「配列」に言及する場合、一般的に、ある特定のサブユニットの配列（例えば、アミノ酸）を有する実際の物理的分子が言及されることがさらに理解される。
【００７５】
用語「植物」とは、本明細書で使用するとき、植物細胞、植物組織又は器官、植物プロトプラスト、植物を再生することができる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物細胞塊、及び植物おいて無傷である植物細胞、又は植物の部分、例えば、胚、花粉、胚珠、胞子嚢、果実、花、葉（例えば、収穫されたレタス作物）、種子、根、根端などを含む。
【００７６】
用語「遺伝子サイレンシング」とは、本明細書で使用するとき、１つ又は複数の標的遺伝子（例えば、内在性Ｄｉｐ遺伝子）の遺伝子発現の下方調節又は完全な阻害を指す。遺伝子発現を低下又は消失させるための阻害性ＲＮＡの使用は、当該技術分野において十分に確立されていて、いくつかの総説の主題である（例えば、Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ  １９９６，Ｓｔａｍら  １９９７，Ｄｅｐｉｃｋｅｒ及びＶａｎ  Ｍｏｎｔａｇｕ，１９９７）。標的遺伝子の全体若しくは部分のアンチセンスＲＮＡを産生する（例えば、欧州特許第０１４０３０８号、欧州特許第０２４０２０８号及び欧州特許第０２２３３９９号を参照）又はセンスＲＮＡを産生する（同時抑制とも称される）（欧州特許第０４６５５７２号を参照）キメラ遺伝子など、植物における遺伝子サイレンシングの達成に利用できる多数の技術が存在する。しかしながら、これまでのところ最も成功したアプローチは、細胞において二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成し、標的遺伝子をサイレンスする、標的遺伝子のセンス及びアンチセンスＲＮＡ両方の産生であった（「逆方向反復」）。ｄｓＲＮＡ産生及び遺伝子サイレンシングのための方法及びベクターは、欧州特許第１０６８３１１号、欧州特許出願公開第９８３３７０号、欧州特許出願公開第１０４２４６２号、欧州特許出願公開第１０７１７６２号及び欧州特許出願公開第１０８０２０８号に記載されている。したがって、本発明によるベクターは、本発明によるＤＩＰ遺伝子のセンス及び／又はアンチセンスＤＮＡ断片に作動可能に連結された、植物細胞において活性である転写調節領域を含み得る。一般的に、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３ヌクレオチドのコード又は非コード配列などの短い（センス及びアンチセンス）ストレッチの標的遺伝子配列が十分である。５０、１００、２００又は２５０ヌクレオチド以上などのより長い配列も用いられる。好ましくは、短いセンス及びアンチセンス断片は、イントロンなどのスペーサー配列により分離され、これは、ｄｓＲＮＡ形成によりループ（又はヘアピン）を形成する。任意の短いストレッチの配列番号４及び／又は配列番号５、又はそれらの断片若しくは変異体を用いて、ＤＩＰ遺伝子由来のサイレンシングベクター、及び１つ又は複数の標的遺伝子が全ての若しくは一部の組織又は器官においてサイレンスされたトランスジェニック植物を作製してもよい（使用されるプロモーターに依存する）。
【００７７】
ヘアピン構築物を作製する簡便な仕方は、ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ及びｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥなどのジェネリック（ｇｅｎｅｒｉｃ）ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術に基づくベクターを使用することであり（Ｗｅｓｌｅｙら  ２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２６５：１１７−３０；Ｗｅｓｌｅｙら  ２００３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２３６：２７３−８６及びＨｅｌｌｉｗｅｌｌ＆Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ２００３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３０（４）：２８９−９５参照）、これら全ては参照により本明細書に組み込まれる。
【００７８】
第１の態様において、本発明は、配列番号１の核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド、又は配列番号１の核酸配列に対して少なくとも５０％若しくは７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、なおさらにより好ましくは少なくとも９６％若しくは９７％、最も好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列に関する。
【００７９】
第２の態様において、本発明は、配列番号２の核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド、又は配列番号２の核酸配列に対して少なくとも５０％若しくは７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、なおさらにより好ましくは少なくとも９６％若しくは９７％、最も好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を有する核酸配列に関する。
【００８０】
配列番号１又は配列番号２の核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドは、広義のセイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）の推定される液胞タンパク質選別関連タンパク質遺伝子であるＶｐｓ１３の一部であると同定された。Ｖｐｓ１３遺伝子は大きな遺伝子である。したがって、配列番号１及び配列番号２の上記核酸配列は、単一の単離された核酸配列に含まれてもよく、すなわち同じ核酸配列の一部であってもよい。したがって、単離された核酸配列は、配列番号１及び配列番号２の両方又はその変異体を含み得る。Ｖｐｓ１３遺伝子は、多くのエキソン及びイントロン、及び配列番号１に包含されるプロモーター及びターミネーター配列などの他の遺伝子関連配列を含み、指示されたタンパク質コード配列（オープンリーディングフレーム；ＯＲＦ）の５’及び３’に及ぶことが理解され、したがって配列番号２よりも大きくてもよい。したがって、配列同一性パーセントは、単離された核酸配列の完全な配列ではなく、相対的であり得る。むしろ、上記単離された核酸配列に含まれる核酸配列のみが、配列番号１又は配列番号２と上記配列同一性パーセントを有することができる。したがって、配列同一性パーセントは次に、単離された核酸配列に含まれる核酸配列に対して計算されることが理解され、その核酸配列の最初と最後のヌクレオチドが配列番号１及び／又は配列番号２の核酸配列とともに整列する。したがって、配列同一性パーセントを計算する場合、好ましくは、それは配列番号１及び／又は配列番号２に対応する配列に対してのみである。配列番号１及び配列番号２又はその変異体は、コード配列、すなわちアミノ酸配列をコードすることも理解される。したがって、このようなコード配列は、ＤＮＡ中にイントロン配列によって点在していてもよい。したがって、配列同一性がＤＮＡ配列から計算される場合、イントロンなどの、配列番号１及び／又は配列番号２とのアライメントを示さない配列の部分を考慮してはならない。
【００８１】
一実施形態において、本明細書において教示される単離されたポリヌクレオチドは、本明細書において教示される配列番号１若しくは配列番号２の核酸配列又はその変異体を有する。
【００８２】
一実施形態において、本明細書において教示される配列番号１若しくは配列番号２の核酸配列又はその変異体若しくは断片を含む、本明細書において教示される単離されたポリヌクレオチドは、「Ｄｉｐ、又はＤＩＰポリヌクレオチド」又は「Ｄｉｐ又はＤＩＰ遺伝子」又は「アポミクシスポリヌクレオチド又はアポミクシス遺伝子」又は「複相胞子生殖ポリヌクレオチド又は複相胞子生殖遺伝子」と称してもよい。
【００８３】
一実施形態において、本明細書において教示される配列番号１若しくは配列番号２の核酸配列又はその変異体を含む、本明細書において教示される単離されたポリヌクレオチド、並びに／或いは上記ポリヌクレオチドの発現産物並びに／或いは上記ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、植物又は植物細胞への複相胞子生殖機能を提供することができ、又は複相胞子生殖若しくは配偶体のアポミクシスの一部としての複相胞子生殖を誘導することができ、好ましくは複相胞子生殖により生じるタイプを誘導することができ、好ましくは有性作物であると現在考えられている作物において誘導することができる。複相胞子生殖による配偶体のアポミクシスは、親植物と遺伝的に同一の子孫を生産する。したがって、一実施形態において、本明細書において教示される単離されたポリヌクレオチド又はその変異体は、受精及び交雑の必要がなく、親植物と遺伝的に同一である子孫を生産するために使用され得る。
【００８４】
好ましい実施形態において、上記で教示されたＤｉｐポリヌクレオチド若しくは遺伝子及びその変異体、及び／又は上記ポリヌクレオチドの発現産物、及び／又は上記ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、植物又は植物細胞に複相胞子生殖機能を提供することができ、好ましくは、植物又は植物細胞に導入された場合、有性作物において複相胞子生殖によって生じるタイプを提供することができる。
【００８５】
用語「単離されたポリヌクレオチド」又はその変異体（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡ）は、天然に存在する、人工的又は合成の核酸分子を含むことが理解される。核酸分子は、本明細書において教示されるポリペプチド又はその変異体のいずれかをコードし得る。上記核酸分子は、本明細書において教示されるポリペプチド若しくはタンパク質又はその変異体を生産するために使用され得る。遺伝暗号の縮重のために、種々の核酸分子は、同じポリペプチド（例えば、配列番号３及び／又は配列番号７若しくは１２のアミノ酸配列を含む、本明細書において教示されるポリペプチド若しくはタンパク質又はその変異体）をコードし得る。
【００８６】
一実施形態において、本明細書において教示される単離されたポリヌクレオチドは、任意の変異核酸分子を含み、これは、配列番号１又は配列番号２の核酸配列と５０％超、好ましくは５５％超、好ましくは６０％超、好ましくは６５％超、好ましくは７０％超、好ましくは７５％超、好ましくは８０％超、好ましくは８５％超、好ましくは９０％超、好ましくは９５％超、好ましくは９６％超、好ましくは９７％超、好ましくは９８％超、及び好ましくは９９％超の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む任意の核酸分子を包含する。変異体はまた、配列番号１又は配列番号２の核酸配列を有する核酸分子から、１つ又は複数の核酸の置換、欠失又は挿入によって誘導された核酸分子も含む。このような核酸分子は配列番号１又は配列番号２と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上から約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５個までの核酸の置換、欠失又は挿入を含むのが好ましい。配列同一性は、当該技術分野において利用可能な任意の適切な手段によって決定され得る。例えば、バイオインフォマティクスは、配列間の機能的、構造的又は進化的関係に起因し得る類似性の領域を同定するために、核酸配列間のペアワイズアライメントを行うために使用され得る。また、核酸ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ技術、インシリコ分析及び核酸合成などの、本明細書において教示されるポリヌクレオチドの変異体を同定、合成又は単離するために多数の方法を使用できることが理解される。
【００８７】
一実施形態において、用語「変異体」はまた、天然において、例えば、他のタンポポ属種において又は他の植物において、見出される天然の変異体を包含する。他のタンポポ属種又は他の植物においてから単離された上記変異体ヌクレオチド配列は、優性Ｄｉｐ対立遺伝子並びに異なる植物種（例えば、異なるタンポポ属種、品種、受入又は育種系を包含する）由来の劣性ｄｉｐ対立遺伝子を包含し得る。例えば、理論に束縛されるものではないが、実施例において同定されたＥＭＳ突然変異は、複相胞子生殖機能が失われたため、劣性ｄｉｐとみなされ得る変異体であるが、一方、野生型配列は、野生型配列が複相胞子生殖機能を提供したため、優性Ｄｉｐとみなされ得る。
【００８８】
一実施形態において、ホモロガス又はオルソログなどの本発明による変異体単離ポリヌクレオチドは、タンポポ属に属するもの以外の植物に見出され、及び／又はそれから単離されてもよい。上記単離されたポリヌクレオチドは、ＰＣＲ、ストリンジェントなハイブリダイゼーション法などの公知の方法を用いて、他の野生型若しくは栽培されたアポミクティック又は非アポミクティック植物から、及び／又は他の植物から単離され得る。したがって、配列番号１及び／又は配列番号２の変異体はまた、例えば、他のタンポポ属種の植物、系統若しくは品種において天然に見出され、及び／又は他の種の他の植物において天然に見出されるヌクレオチド配列を含む。このようなヌクレオチドは、例えば、Ｂｌａｓｔ検索において同定され得、又は植物体においてデノボで対応する配列を同定することによって同定され得る。
【００８９】
一実施形態において、本明細書において教示される単離されたポリヌクレオチド変異体は、例えば、タンポポ属種の起源である配列番号１及び／又は配列番号２のものとは異なる「起源」に由来する本発明による単離されたポリヌクレオチドを含む。したがって、特に、本発明は、野生又は栽培植物などの、及び／又は他の植物由来の、複相胞子生殖（複相胞子生殖による配偶体のアポミクシスの一部として）が存在する植物に由来する遺伝子又は対立遺伝子を包含する。そのようなホモログは、提供されたヌクレオチド配列及び／若しくはその相補的配列、又はその一部をプライマー若しくはプローブとして用いて容易に単離することができる。例えば、中程度にストリンジェントな、ストリンジェントな、又は高度にストリンジェントな核酸ハイブリダイゼーション法を使用することができる。例えば、配列番号１及び／若しくは配列番号２の配列の断片又はその相補配列を用いることができる。このようなハイブリダイゼーション法において使用される上記断片は、配列番号１及び／又は配列番号２の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００個又はそれ以上の連続した核酸を含み得る。
【００９０】
遺伝暗号の縮重のために、様々な核酸配列が同じアミノ酸配列をコードし得ることが理解される。宿主における最適な発現のために、本発明による単離された核酸配列は、利用可能なコドン使用頻度表を用いて、コドン使用頻度を植物遺伝子、特に、対象とする植物属又は種に固有の遺伝子に適応させることによりコドン最適化することができる（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ＆Ｈａｌｌ，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，３０２６−３０３１；Ｉｔａｋｕｒａら，１９７７  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８，１０５６−１０６３）（例えば、対象とする植物における発現に向けてより構成される）。様々な植物種についてのコドン使用頻度表は、例えば、Ｉｋｅｍｕｒａ（１９９３，Ｉｎ  ”Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｘ”，Ｃｒｏｙ，ｅｄ．，Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ．）及びＮａｋａｍｕｒａら（２０００，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８，２９２．）によって公開され、主要なＤＮＡ配列データベース（例えば、ＥＭＢＬ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎ）において公開される。したがって、同じ又は実質的に同じタンパク質が産生されるように合成ＤＮＡ配列を構築することができる。宿主細胞によって好まれるものへのコドン使用頻度を改変するためのいくつかの技術は、特許及び科学文献に見出すことができる。コドン使用頻度改変の正確な方法は、本発明にとって重要ではない。
【００９１】
上述されるものなどのＤＮＡ配列への小さな改変は、日常的に行われ、すなわち、ＰＣＲ媒介突然変異誘発（Ｈｏら，１９８９，Ｇｅｎｅ  ７７，５１−５９．，Ｗｈｉｔｅら，１９８９，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔ．５，１８５−１８９）によって行うことができる。ＤＮＡ配列への改変はまた、利用可能な技術を使用して所望のコード領域のデノボでのＤＮＡ合成によって日常的に導入することができる。
【００９２】
一実施形態において、本発明による単離されたポリヌクレオチド又はその変異体は、ＤＩＰタンパク質のＮ末端が、該タンパク質のＮ末端で１つ又は複数のアミノ酸を付加又は欠失させることによって最適な翻訳開始状況を有するように改変することができる。しばしば、植物細胞中に発現される本発明のタンパク質は、最適な翻訳開始のためにＭｅｔ−Ａｓｐ又はＭｅｔ−Ａｌａジペプチドから開始することが好ましい。このようにして、Ａｓｐ又はＡｌａコドンを既存のＭｅｔの後ろに挿入するか、又は２番目のコドンであるＶａｌをＡｓｐ（ＧＡＴ又はＧＡＣ）又はＡｌａ（ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ又はＧＣＧ）のコドンに置き換えることができる。ＤＮＡ配列はまた、不当なスプライシング部位を除去するように改変されてもよい。
【００９３】
本発明による単離されたポリヌクレオチド又はその変異体は、好ましくは「機能的」であり、すなわち、それらは、好ましくは、植物又は植物細胞又は有性作物において、好ましくは配偶体のアポミクシスの一部として、好ましくは複相胞子生殖により生じるタイプとして植物に複相胞子生殖機能を提供することができる。一実施形態において、単離されたポリヌクレオチド又はその変異体が提供され、これは、タンポポ属種に由来する核酸配列の配列番号１及び／又は配列番号２を含むポリヌクレオチドに相同であり、上記単離されたポリヌクレオチドはアポミクティック植物から単離される。したがって、本発明による単離されたポリヌクレオチド又はその変異体は、この実施形態において、アポミクティック植物から単離される。このような単離されたポリヌクレオチド又はその変異体は、特に、植物又は植物細胞又は（有性）作物において、複相胞子生殖機能を植物に提供することができる。
【００９４】
本明細書において教示されるポリヌクレオチドの変異体は、本明細書において教示される配列番号１又は配列番号２の核酸配列を含むポリヌクレオチドと同じ機能を発揮し、すなわち、特に植物又は植物細胞又は有性作物に誘導させた場合、植物又は植物細胞に複相胞子生殖機能を提供することができ、好ましくは一部として、植物又は植物細胞又は有性作物において複相胞子生殖又は配偶体のアポミクシスを誘導することができることが理解される。本明細書において教示される任意の単離されたポリヌクレオチド及びその変異体は、本明細書において教示されるポリペプチド及びその変異体のいずれかをコードし得ることがさらに理解される。
【００９５】
一実施形態において、本明細書において教示されるポリヌクレオチド及びその変異体の発現産物は、ＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子又はｓｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡ分子である。
【００９６】
一実施形態において、本明細書において教示されるポリヌクレオチド及びその変異体の断片並びに／又は上記断片の発現産物並びに／又は上記断片によってコードされるタンパク質は、植物又は植物細胞に複相胞子生殖機能を提供することができ、好ましくは一部として配偶体のアポミクシスを誘導することができる。
【００９７】
好ましい実施形態において、本明細書において教示される断片及び／又は上記断片によってコードされるタンパク質は、複相胞子生殖機能を提供することができ、好ましくは複相胞子生殖を誘導することができ、又は一部として配偶体のアポミクシスを誘導することができる。
【００９８】
一実施形態において、本明細書において教示される断片の発現産物は、ＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子又はｓｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡ分子である。
【００９９】
一実施形態において、本明細書において教示される断片は、配列番号１又は配列番号２の核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド及び本明細書において教示されるその変異体の少なくとも２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００又は３０００個の連続したヌクレオチドの長さを有してもよい。
【０１００】
好ましい実施形態において、本明細書において教示される断片は、配列番号４、６又は１１の核酸配列を有する。
【０１０１】
さらに好ましい実施形態において、本明細書において教示される断片の発現産物は、配列番号５の核酸配列を有する。
【０１０２】
一実施形態において、本明細書中に教示される断片の発現産物は、配列番号７及び／又は１２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。
【０１０３】
キメラ遺伝子及びベクター
一実施形態において、キメラ遺伝子は、本明細書において教示されるポリヌクレオチド、その断片及び変異体のいずれかを含み得る。
【０１０４】
一実施形態において、本明細書において教示されるベクターに含まれる場合、本明細書において教示されるポリヌクレオチド、その断片及び変異体のいずれかは、プロモーターに作動可能に連結され得る。当該技術分野において公知であり、本明細書において教示されるポリヌクレオチド、その断片及び変異体との連結に適した任意のプロモーターを使用することができる。適切なプロモーターの非限定的な例としては、構成的又は調節された発現、弱い発現及び強い発現などを可能にするプロモーターが挙げられる。当該技術分野において公知の任意の方法が、キメラ遺伝子中に本明細書において教示されるポリヌクレオチド、その変異体又は断片を組み込むために使用され得る。
【０１０５】
ある特定の実施形態において、本明細書において教示されるポリヌクレオチド、その断片及び変異体を、いわゆる「構成的プロモーター」に作動可能に連結することが有利であり得る。或いは、本明細書において教示されるポリヌクレオチド、その断片及び変異体を、いわゆる「誘導性プロモーター」に作動可能に連結することが有利であり得る。誘導性プロモーターは、調節された生理学的（例えば、ある特定の化合物の外部適用による）プロモーターであってもよい。
【０１０６】
一実施形態において、本明細書において教示される単離されたポリヌクレオチド、その変異体又は断片に作動可能に連結されるプロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーターであってもよく、例えば、以下が挙げられる：分離株ＣＭ１８４１（Ｇａｒｄｎｅｒら，１９８１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９，２８７１−２８８７）、ＣａｂｂＢ−２（Ｆｒａｎｃｋら，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２１，２８５−２９４）及びＣａｂｂＢ−ＪＩ（Ｈｕｌｌ及びＨｏｗｅｌｌ，１９８７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８６，４８２−４９３）のカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の強力な構成的３５Ｓプロモーター又は増強された３５Ｓプロモーター（「３５Ｓプロモーター」）；Ｏｄｅｌｌら（１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１３，８１０−８１２）又は米国特許第５，１６４，３１６号に記載されている３５Ｓプロモーター、ユビキチンファミリー由来のプロモーター（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８，６７５−６８９、欧州特許第０３４２９２６号のトウモロコシユビキチンプロモーター、またＣｏｒｎｅｊｏら  １９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３，５６７−５８１参照）、ｇｏｓ２プロモーター（ｄｅ  Ｐａｔｅｒら，１９９２  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２，８３４−８４４）、ｅｍｕプロモーター（Ｌａｓｔら，１９９０，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１，５８１−５８８）、Ａｎら（１９９６，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１０，１０７）によって報告されているプロモーターなどのシロイヌナズナアクチンプロモーター、Ｚｈａｎｇら（１９９１，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３，１１５５−１１６５）によって報告されているプロモーター及び米国特許第５，６４１，８７６号に記載されるプロモーター又は国際公開第０７／００６７号に記載されているイネアクチン２プロモーターなどのイネアクチンプロモーター；キャッサバ静脈モザイクウイルスのプロモーター（国際公開第９７／４８８１９号、Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら  １９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７，１０５５−１０６７）地下クローバー矮化ウイルス由来のｐＰＬＥＸシリーズのプロモーター（国際公開第９６／０６９３２号、特にＳ７プロモーター）、アルコール脱水素酵素プロモーター、例えば、ｐＡｄｈ１Ｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０４０４９、Ｘ００５８１）、並びにＴ−ＤＮＡのそれぞれ１’及び２’遺伝子の発現を駆動するＴＲ１’プロモーター及びＴＲ２’プロモーター（それぞれ「ＴＲ１’プロモーター」及び「ＴＲ２’プロモーター」）（Ｖｅｌｔｅｎら，１９８４，ＥＭＢＯ  Ｊ  ３，２７２３−２７３０）、米国特許第６，０５１，７５３号及び欧州特許第４２６６４１号に記載されているゴマノハグサモザイクプロモーター、ヒストン遺伝子プロモーター、例えばシロイヌナズナ由来のＰｈ４ａ７４８（ＰＭＢ  ８：１７９−１９１）、又はその他。
【０１０７】
植物におけるキメラ遺伝子、遺伝子構築物又はベクターの構成的発現は、植物の適応性に高いコストがかかる場合があるため、一実施形態において、その活性が誘導性であるプロモーターを使用することが好ましい。誘導性プロモーターの例は、創傷誘導性プロモーターであり、例えば、創傷により誘導される（例えば、昆虫又は身体創傷によって生じる）Ｃｏｒｄｅｒａら（１９９４，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６，１４１）によって報告されるＭＰＩプロモーター、又はＣＯＭＰＴＩＩプロモーター（国際公開第００／５６８９７号）又は米国特許第６，０３１，１５１号に記載されるＲＰ１プロモーターである。或いは、プロモーターは、Ａｏｙａｍａ及びＣｈｕａ（１９９７，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １１：６０５−６１２）によって報告され、米国特許第６，０６３，９８５号において記載されるデキサメタゾンなどの化学物質によって、又はテトラサイクリン（ＴＯＰＦＲＥＥ若しくはＴＯＰ１０プロモーター、Ｇａｔｚ，１９９７，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４８：８９−１０８及びＬｏｖｅら  ２０００，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２１：５７９−８８参照）によって誘導性であり得る。
【０１０８】
構成的ではないが、むしろ植物の１つ若しくは複数の組織又は器官に特異的であるプロモーターを利用することができる。プロモーターは組織特異的であるのが好ましい。好ましくは、プロモーターは、例えば、好ましくは葉又は好ましくは表皮に発生的に調節され得、それにより、上記核酸配列は、特異的な組織（複数可）又は器官（複数可）の細胞にのみ又は優先的に発現され、及び／或いはある特定の発生段階中にのみ、好ましくは雌性子房、大胞子母細胞において及び／又は雌性配偶体において発現される。例えば、Ｄｉｐ遺伝子（複数可）は、米国特許第５，２５４，７９９号に開示されるエンドウ、又は米国特許第５，０３４，３２２号に開示されるシロイヌナズナなどの、植物自体の又は別の植物のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子のプロモーターなどの光誘導性プロモーターの制御下にコード配列を置くことによって植物の葉に選択的に発現させることができる。
【０１０９】
用語「誘導性」とは、必ずしも、誘導因子刺激の不在下でプロモーターが完全に不活性であることを必要としない。このことが植物の重大な収量又は品質のペナルティをもたらさない限り、低レベルの非特異的活性が存在し得る。したがって、誘導性とは、好ましくは、プロモーターの活性の増加を指し、誘導因子との接触後の下流のコード領域の転写の増加をもたらす。
【０１１０】
好ましい実施形態において、内在性遺伝子のプロモーターは、本明細書において教示される配列番号３のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体若しくは断片（例えば、配列番号７及び／又は１２）を発現させるために使用される。例えば、タンポポ属種Ｄｉｐ対立遺伝子のプロモーター又は別の植物種由来の対応するプロモーターは、単離され、本発明によるタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結され得る。上記タンパク質は、好ましくは、複相胞子生殖機能を提供することができ、好ましくは複相胞子生殖又は配偶体のアポミクシスの一部として提供することができる。上記プロモーター、すなわち、他のタンポポ属種起源及び／又は他の植物のホモログなどの、本明細書において教示される配列番号３のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド又はその断片若しくは変異体（例えば、配列番号７及び／又は１２）の、転写開始部位及び／又は翻訳開始コドンの上流の通常、約２０００塩基対（ｂｐ）内の上流転写調節領域は、アポミクティック植物及び／又は他の植物から、公知の方法、例えば、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ（Ｌｉｕら  １９９５，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２５（３）：６７４−８１；Ｌｉｕら  ２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８６：３４１−８）、リンカー−ＰＣＲ、又は逆ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）を用いて単離され得る。上記遺伝子配列は、広義のセイヨウタンポポの推定される液胞タンパク質選別関連タンパク質遺伝子であるＶｐｓ１３（配列番号１）の一部であるため、上記プロモーターは、遺伝子コード領域（配列番号２）の５’に位置する配列番号１内に位置して配列、又はｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡとして発現される、発現したサブゲノム領域の５’に位置した配列番号１内に位置して他の領域を含むことが理解される。発現されたｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡは、雌性配偶体段階を包含するものであり、すなわち、その発現活性は、複相胞子生殖表現型又はこの段階に至る発生段階の発現の場所及び時間に遡ることができる。
【０１１１】
本発明の一実施形態において、本明細書において教示される配列番号３のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド又はその断片若しくは変異体、例えば他のタンポポ属種起源及び／又は他の植物のホモログに由来する内在性プロモーターを使用することができる。また、これらの配列よりも長い配列を使用してもよい。上記核酸配列のいずれかについて、コード領域の翻訳開始コドンの約２０００ｂｐ上流までの領域は、転写調節エレメントを含み得る。したがって、一実施形態において、上記ポリヌクレオチドの翻訳又は転写開始部位の上流の２０００ｂｐ、１５００ｂｐ、１０００ｂｐ、８００ｂｐ、５００ｂｐ、３００ｂｐ未満であるヌクレオチド配列を単離し、そのプロモーター活性を試験し、機能的であれば、配列は、本明細書において教示される配列番号３のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド又はその断片若しくは変異体、例えば配列番号７及び／又は配列番号１２に作動可能に連結され得る。その配列及び断片全体のプロモーター活性は、例えば、欠失分析によって試験することができ、それにより、転写開始部位領域の５’及び／又は３’を欠失され、プロモーター活性は公知の方法（例えば、欠失のある又は複数の欠失のあるプロモーターをレポーター遺伝子に作動可能に連結する）を用いて試験される。
【０１１２】
別の実施形態において、上記プロモーターは、本発明のｍｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ分子の発現を駆動する。
【０１１３】
複相胞子生殖機能を有する植物に由来するＤｉｐ対立遺伝子が、本発明による植物又は植物細胞又は有性作物において、複相胞子生殖機能を、好ましくは配偶体のアポミクシスの一部として提供し又は誘導することができるかどうかは、本明細書において教示される単離されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド又はタンパク質の分子機能に依存し得る。一実施形態では、本明細書において教示される単離されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、その断片及び変異体は、優性機能を有することができ、本明細書において教示される配列番号３のアミノ酸配列を含むタンパク質、又はその変異体若しくは断片（例えば、配列番号７及び／又は１２）を発現又は過剰発現させることによって提供される。植物において発現させた場合に、上記タンパク質をコードする上記単離されたポリヌクレオチドは、植物に複相胞子生殖機能を提供し若しくは植物において複相胞子生殖機能を増強させることができ、又は植物若しくは植物細胞若しくは作物において複相胞子生殖を誘導若しくは増強することができる。
【０１１４】
例えば、配列番号１及び／或いは配列番号２の核酸配列又はその断片若しくは変異体（例えば、配列番号４、５、６又は１１）を含むポリヌクレオチドが植物において適切な植物プロモーターから発現され、機能的な量のコードされたタンパク質が作製される場合、複相胞子生殖機能、又は好ましくは配偶体のアポミクシスの一部としての複相胞子生殖の発生は、上記タンパク質を欠損している植物と比較して、誘導され又は有意に増強され得る。機能性（すなわち、植物において複相胞子生殖を誘導又は引き起こす、本明細書において教示されるポリヌクレオチド、その変異体若しくは断片の能力）は、適切な宿主植物において、例えば、非複相胞子生殖のタンポポ属種系統において発現されるように適切な宿主植物においてこのような核酸配列を誘導し、例えば、本明細書において教示される実施例に記載されるものなどのバイオアッセイにおいて形質転換体の複相胞子生殖機能における効果を分析することにより試験することができる。
【０１１５】
一実施形態において、配列番号３のアミノ酸配列を含むタンパク質又はその変異体若しくは断片（例えば、配列番号７及び／又は１２）をコードすることができる、本明細書において教示される発現されたポリヌクレオチド、その変異体又は断片のサイレンシングは、機能喪失、すなわち、複相胞子生殖の減少、又は複相胞子生殖の不存在、又は複相胞子生殖による配偶体のアポミクシスの非発生をもたらす可能性がある。したがって、当業者は、配列番号３のアミノ酸配列又はその断片若しくは変異体（例えば、配列番号７及び／又は１２）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド又はその変異体若しくは断片、並びに／或いは本明細書において記載されるその断片は、植物又は植物細胞又は作物において、複相胞子生殖を提供し、好ましくは配偶体のアポミクシスの一部として複相胞子生殖を提供することができる。
【０１１６】
一実施形態では、単離されたポリヌクレオチド（配列番号１若しくは配列番号２）、その変異体又は断片（例えば、配列番号４、５、６若しくは１１）のうちのいずれか１つを含む、本明細書において教示されるキメラ遺伝子が提供される。上記キメラ遺伝子は、好ましくは、本発明による植物又は植物細胞又は作物において、植物に複相胞子生殖機能を提供することができる。
【０１１７】
一実施形態において、本明細書において教示されるポリヌクレオチド（例えば、配列番号１若しくは配列番号２）、その変異体又は断片（例えば、配列番号４、５、６若しくは１１）或いは本明細書において教示されるキメラ遺伝子は、遺伝子構築物に含まれ得る。
【０１１８】
好ましい実施形態において、本明細書において教示される遺伝子構築物は、本明細書において教示される、本発明の単離されたポリヌクレオチド（例えば、配列番号２）、その変異体又は断片（例えば、配列番号４、５、６若しくは１１）のオープンリーディングフレームを含み得る。
【０１１９】
一実施形態において、本明細書において教示される、単離されたポリヌクレオチド（例えば、配列番号１若しくは配列番号２）、その変異体又は断片（例えば、配列番号４、５、６若しくは１１）は、核酸ベクターに含まれ得る。
【０１２０】
本発明によるキメラ遺伝子、遺伝子構築物及びベクターの構築は、当該技術分野において一般的に公知である。上記キメラ遺伝子、遺伝子構築物及びベクターは、好ましくは、植物に複相胞子生殖機能を提供することができ、或いは植物、植物細胞又は作物において複相胞子生殖、若しくは複相胞子生殖により配偶体のアポミクシスを誘導することができる。キメラ遺伝子は、内在性遺伝子配列を改変することによって生成され得る。例えば、劣性対立遺伝子（すなわち、ｄｉｐ）は、優性対立遺伝子が、植物、植物細胞若しくは作物において複相胞子生殖機能を提供することができ、又は複相胞子生殖により配偶体のアポミクシスを誘導することができる場合に、劣性対立遺伝子が優性対立遺伝子（すなわち、Ｄｉｐ）へと変化されるように改変することができる。又は、或いは、複相胞子生殖機能を提供することができ、又は複相胞子生殖若しくは複相胞子生殖により配偶体のアポミクシスを誘導することができるが、発現しない内在性遺伝子は、内在性遺伝子が発現されるように、例えば内在性プロモーター配列を改変することによって改変されてもよい。このような改変は、内因性遺伝子の少なくとも１、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００又は１０００ヌクレオチドが突然変異される、（標的化された）突然変異誘発を含み得る。このような改変の例は、実施例５に見出すことができ、それによると、複相胞子生殖の喪失を付与するためにＥＭＳ突然変異において４つの突然変異が見出されており、そのため、上記の突然変異を反転することにより、複相胞子生殖表現型の獲得を提供し得る。
【０１２１】
一実施形態において、本明細書において教示されるキメラ遺伝子は、標準的な分子生物学技術を用いて、宿主細胞における発現に適したプロモーター配列に、本発明によるタンパク質（又は変異体若しくは断片）をコードする核酸配列を作動可能に連結することによって生じさせることができる。プロモーター配列は、ベクター中に既に存在していてもよく、そのため、核酸配列は、ベクター内であって、プロモーター配列の下流に単に挿入される。一実施形態において、キメラ遺伝子は、本発明による核酸配列に作動可能に連結された、植物細胞又は微生物細胞（例えば、細菌）における発現に適切したプロモーターを含み、任意選択で３’非翻訳核酸配列が続く。本発明による核酸配列には、任意選択で５’非翻訳配列領域（ＵＴＲ）が先行する。プロモーター、３’ＵＴＲ及び／又は５’ＵＴＲは、例えば、以下に記載されるように、内在性Ｄｉｐ遺伝子由来であってもよく、又は他の供給源由来であってもよい。さらに、本発明による核酸配列は、３’ＵＴＲ又は５’ＵＴＲ配列に含めることができるイントロン配列を含み得るが、本発明による核酸配列のコード配列に導入することもできる。
【０１２２】
一実施形態において、本明細書において教示されるキメラ遺伝子、遺伝子構築物及びベクターは、好ましくは、本発明によるアミノ酸配列をコードする核酸配列を発現することができ、ここで、本発明による上記アミノ酸配列は、植物又は植物細胞又は作物において、好ましくは、配偶体のアポミクシスの一部として、植物に複相胞子生殖機能を提供することができる。したがって、上記キメラ遺伝子、遺伝子構築物及びベクターは、好ましくは、本発明による優性Ｄｉｐ対立遺伝子を含む。
【０１２３】
一実施形態において、本明細書において教示される核酸ベクターは、本明細書において教示される、単離されたポリヌクレオチド（例えば、配列番号１若しくは配列番号２）、その変異体又は断片（例えば、配列番号４、５、６若しくは１１）のいずれか１つに作動可能に連結された植物細胞において活性なプロモーター配列、又は本明細書において教示されるキメラ遺伝子若しくは本明細書において教示される遺伝子構築物を含み得る。
【０１２４】
好ましい実施形態において、本明細書において教示される核酸ベクターのプロモーター配列は、
ａ）配列番号１及び／又は配列番号２の核酸配列の天然のプロモーター配列；
ｂ）ａ）のプロモーター配列の機能的断片；又は
ｃ）配列番号１及び／又は配列番号２の核酸配列の天然のプロモーター配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含む核酸配列；
ｄ）配列番号６の核酸配列の天然のプロモーター配列；
ｅ）ｄ）のプロモーター配列の機能的断片；又は
ｆ）配列番号６の核酸配列の天然のプロモーター配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含む核酸配列
を含んでもよい。
【０１２５】
好ましい実施形態において、本明細書において教示される核酸ベクターのプロモーターは、雌性子房特異的プロモーター、好ましくは大胞子母細胞特異的プロモーター及び／又は雌性配偶子特異的プロモーターである。
【０１２６】
単離されたポリペプチド
第３の態様において、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列、又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも５０％若しくは７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、なおさらにより好ましくは少なくとも９６％若しくは９７％、最も好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドに関する。
【０１２７】
好ましい実施形態において、本明細書において教示されるポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列又はその変異体若しくは断片を有する。
【０１２８】
一実施形態において、上記で教示された配列番号３のアミノ酸配列及びその変異体又は断片を含む、本明細書において教示される単離されたポリペプチドは、「ＤＩＰポリペプチド若しくはタンパク質」又は「アポミクシス関連ポリペプチド若しくはタンパク質」と称される場合がある。
【０１２９】
一実施形態において、上記で教示されたＤＩＰポリペプチド又はタンパク質及びその変異体又は断片は、植物又は植物細胞に複相胞子生殖機能を提供することができ、好ましくは、作物に一部として複相胞子生殖又は配偶体のアポミクシスを誘導することができる。したがって、一実施形態において、本明細書において教示される単離されたポリペプチド又はタンパク質は、受精及び交雑の必要性なしに、親植物と遺伝的に同一である子孫を生産するために使用され得る。
【０１３０】
好ましい実施形態において、上記で教示されたＤＩＰポリペプチド又はタンパク質及びその変異体又は断片は、好ましくは配偶体のアポミクシスの一部として、特に植物又は植物細胞に誘導された場合、植物若しくは植物細胞に複相胞子生殖機能を提供することができ、又は作物に複相胞子生殖を誘導することができる。
【０１３１】
本明細書において教示される配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド若しくはタンパク質又はその変異体は、広義のセイヨウタンポポの推定される液胞タンパク質選別関連タンパク質遺伝子であるＶｐｓ１３又はその一部であることが確認された。Ｖｐｓ１３遺伝子は大きな遺伝子である。したがって、配列番号３の上記アミノ酸配列は、単一の単離されたタンパク質に含まれてもよく、すなわち、同じアミノ酸配列の一部、又はその同じアミノ酸配列の複数の部分であってもよい。したがって、単離されたタンパク質は、配列番号３とその変異体の両方を含み得る。Ｖｐｓ１３遺伝子は、配列番号３のアミノ酸配列又はその変異体のサイズと比較した場合、大きなタンパク質を構成してもよく、配列同一性パーセントは、単離されたタンパク質の完全な配列に対して相対的でなくてもよいことが理解される。むしろ、上記単離されたタンパク質に含まれるアミノ酸配列のみが、配列番号３と上記配列同一性パーセントを有することができる。したがって、配列同一性パーセントは次いで、単離されたタンパク質に含まれるアミノ酸配列に対して計算されることが理解され、そのアミノ酸配列の最初のアミノ酸及び最後のアミノ酸を配列番号３のアミノ酸配列とともに並べる。したがって、配列同一性パーセントが計算される必要がある場合、好ましくは、配列番号３に対応する配列とのみ相対的である。
【０１３２】
本明細書において教示されるポリペプチドはまた、配列番号３のアミノ酸配列を有する変異体ポリペプチドを含み、上記変異体のアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列と５０％超、好ましくは５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、好ましくは７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、好ましくは９６％超、好ましくは９７％超、好ましくは９８％超、及び好ましくは９９％以上の配列同一性を有する。配列番号３のアミノ酸配列を有する変異体ポリペプチドはまた、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドからの１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失又は挿入によって誘導されたポリペプチドを含む。このようなポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上から約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５個までのアミノ酸置換、欠失又は挿入を含むのが好ましい。
【０１３３】
一実施形態において、本明細書において教示される変異体ポリペプチドは、１つ又は複数のアミノ酸の欠失、挿入及び／又は置換によって提供されるアミノ酸配列と異なる場合があり、天然及び／又は合成／人工変異体を含む。
【０１３４】
一実施形態において、用語「変異体ポリペプチド」とはまた、例えば、栽培された若しくは野生のレタス植物及び／又は他の植物において、天然に見出される天然の変異体ポリペプチドを包含する。単離されたタンパク質はまた、単離されたタンパク質の断片、すなわち完全長でないペプチドを含む。断片は、配列番号３によってコードされるアミノ酸配列の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個若しくはそれ以上の連続したアミノ酸を含むか又はそれからなるペプチド又はその変異体、特に配列番号３の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個若しくはそれ以上の連続したアミノ酸を含むか又はそれからなるペプチド又はその変異体を含む。
【０１３５】
本明細書において教示される単離されたポリペプチド又はその変異体は、好ましくは植物に複相胞子生殖機能を提供することができ、好ましくは植物若しくは植物細胞若しくは作物において、複相胞子生殖又は配偶体のアポミクシスを誘導することができる。複相胞子生殖である。これは、本発明による単離されたポリペプチド、断片及び変異体が、複相胞子生殖を誘導することができることを意味する。本発明による複相胞子生殖機能は、最初の雌の減数分裂（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ）（減数分裂（Ｍｅｉｏｓｉｓ）Ｉ）をスキップすることを含み、その結果、母植物と同じ遺伝子型を有する、減数しない２つの大胞子を生じる。これらの大胞子うちの１つは変性し、他の生存している減数していない大胞子は、減数していない卵細胞を含む、減数していない大配偶体（又は胚嚢）を生じさせる。この減数していない卵細胞は受精することなく胚に発生し、母植物と同じ遺伝子型を有し、すなわち母植物のクローンである。
【０１３６】
一実施形態において、本明細書において教示される単離されたポリペプチド又はその変異体は、天然源から単離されてもよく、化学合成（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって供給されるものなどのペプチドシンセサイザーを使用すること）によってデノボで合成されてもよく、又は本明細書において教示される単離されたポリペプチド、その断片及び変異体をコードする核酸配列を発現させることによる組換え宿主細胞によって生産されてもよい。
【０１３７】
一実施形態において、本明細書において教示される単離されたポリペプチド又はその変異体は、以下のカテゴリ内に保存的アミノ酸置換を含み得る：
塩基性（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；
酸性（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）；
非極性（例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ）；又は
極性（例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）。
【０１３８】
加えて、非保存的アミノ酸置換もまた、本発明の範囲内に含まれ得る。
【０１３９】
一実施形態において、本明細書において教示される単離されたポリペプチド又はその変異体はまた、少なくとも２つの異なるドメインから構成されるポリペプチドなどのキメラポリペプチドであってもよい。配列番号３は、Ｖｐｓ１３遺伝子に由来し又は部分的に由来するため、配列番号３又はその変異体は、植物又は植物細胞又は作物において、複相胞子生殖機能を提供しないか若しくはほとんど提供しない、又は複相胞子生殖による配偶体のアポミクシスを誘導することができない、Ｖｐｓ１３タンパク質において対応する配列と交換することができる。このようにして、植物又は植物細胞又は作物において、複相胞子生殖機能若しくは改善された複相胞子生殖機能を提供することができ、又は複相胞子生殖若しくは改善された複相胞子生殖をできる、キメラポリペプチド又はタンパク質を得ることができる。本明細書において教示されるキメラポリペプチドはまた、配列番号３のアミノ酸配列の一部又は複数の部分を有してもよい。さらに、本明細書において教示されるキメラポリペプチドは、１つのタンパク質（例えば、タンポポ属種又は別の植物種から得られる）並びに別のタンパク質の中間ドメイン及び／又はＣ末端ドメイン（例えば、タンポポ属種又は別の植物種から得られる）を含み得る。このようなキメラタンパク質は、天然のタンパク質と比較して改良された複相胞子生殖機能を有し、若しくは誘導を改善するのを助けることができ、又は植物若しくは植物細胞又は作物において複相胞子生殖を改善するのを助けることができる。
【０１４０】
アミノ酸配列同一性は、当該技術分野において利用可能な任意の適切な手段によって決定され得る。例えば、アミノ酸配列同一性は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズム並びに上記で定義されたＧＡＰデフォルトパラメータを用いたペアワイズアラインメントによって決定することができる。また、ウエスタンブロット、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、アミノ酸合成などの、本明細書において教示されるポリペプチドの変異体を同定、合成又は単離するために多くの方法を使用できることが理解される。
【０１４１】
また、本明細書において教示されるＤＩＰポリペプチドの任意の変異体又は断片は、本明細書において教示されるＤＩＰポリペプチドと同じ機能を発揮し及び／又は同じ活性を有することが理解される。任意のＤＩＰポリペプチド若しくはその変異体の機能又は活性は、当業者がこれらの目的に適していると考える、当該技術分野において公知の任意の方法によって決定することができる。
【０１４２】
一実施形態において、本明細書において教示されるポリペプチド（配列番号３）又はその変異体の断片は、複相胞子生殖又は配偶体のアポミクシスを誘導することができる植物又は植物細胞に複相胞子生殖機能を提供することができる。
【０１４３】
一実施形態において、本明細書において教示されるポリペプチド及びその変異体の断片は、上記ポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００又は５００個の連続したアミノ酸の長さを有し得る。
【０１４４】
一実施形態において、本明細書において教示されるポリペプチド及びその変異体の断片は、配列番号７及び／又は１２のアミノ酸配列を有する。
【０１４５】
方法
さらなる態様において、本発明は、アポミクティック種子を生産するための方法に関し、
ａ）植物、植物部分又は植物細胞を、本明細書において教示されるポリヌクレオチド（例えば、配列番号１若しくは配列番号２）又はその変異体若しくは断片（例えば、配列番号４、５、６若しくは１１）、或いは本明細書において教示されるキメラ遺伝子、或いは本明細書において教示される遺伝子構築物及び／或いは本明細書において教示される核酸ベクターのいずれかで形質転換し、一次形質転換体を生産する工程；
ｂ）上記一次形質転換体から顕花植物及び／又は花を生育する工程であって、それにより上記で教示されたポリヌクレオチド、変異体若しくは断片、キメラ遺伝子、構築物及び／又はベクターが、少なくとも雌性子房、好ましくは大胞子母細胞及び／又は雌性配偶子に存在及び／又は発現される工程；並びに
ｃ）種子の生産を誘導するために上記一次形質転換体を、好ましくは四倍体植物の花粉又は上記一次形質転換体の自家花粉を用いて受粉する工程
を含む。
【０１４６】
上記一次形質転換体が自律的胚乳を発生させる場合、工程ｃ）を省略してもよいことが理解されるべきである。
【０１４７】
一実施形態において、本明細書において教示される方法によって得られるアポミクティック種子は、本明細書において教示される一次形質転換体のクローンである。
【０１４８】
工程（ａ）の一実施形態において、植物又は植物部分は、本明細書において教示されるポリヌクレオチド（例えば、配列番号１若しくは配列番号２）又はその変異体若しくは断片（例えば、配列番号４若しくは配列番号５）を含むキメラ遺伝子を用いて形質転換され得る。
【０１４９】
好ましい実施形態において、キメラ遺伝子は配列番号２を含む。
【０１５０】
一実施形態において、キメラ遺伝子は、本発明による遺伝子構築物又はベクターに含まれ得る。
【０１５１】
さらなる実施形態において、キメラ遺伝子はまた、改変された内在性遺伝子を含み得る。このような改変には、標的化された突然変異誘発による改変又はＣｒｉｓｐｒ／Ｃａｓなどのヌクレアーゼの使用が含まれ得るが、これらに限定されない。上記キメラ遺伝子は、好ましくは、植物、植物部分若しくは植物細胞に導入された場合に、上記植物、植物部分若しくは植物細胞において複相胞子生殖機能を提供することができ、又は複相胞子生殖による配偶体のアポミクシスを誘導することができる。ベクターを用いて、核ゲノムに又は色素体、ミトコンドリア若しくは葉緑体のＤＮＡにキメラ遺伝子を挿入する宿主細胞を形質転換することができ、そのために適切なプロモーター（例えば、Ｍｃ  Ｂｒｉｄｅら，１９９５  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３，３６２；米国特許第５，６９３，５０７号）を用いて発現し得る。プラスチドゲノム形質転換の１つの利点は、導入遺伝子（複数可）の広がりのリスクを低減できることである。プラスチドゲノム形質転換は、当該技術分野で公知であるように実施することができ、例えば、Ｓｉｄｏｒｏｖ  ＶＡら  １９９９，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９：２０９−２１６又はＬｕｔｚ  ＫＡら  ２００４，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３７（６）：９０６−１３を参照されたい。
【０１５２】
一実施形態において、上記に教示されるキメラ遺伝子に含まれる、本明細書において教示されるポリヌクレオチド又は変異体若しくは断片は、プロモーター配列に作動可能に連結され、ここで、プロモーター配列は、
（ａ）配列番号１及び／又は配列番号２の核酸配列の内在性プロモーター配列；
（ｂ）上記天然のプロモーター配列の機能的断片；
（ｃ）配列番号１若しくは配列番号２の核酸配列の内在性プロモーター配列と少なくとも７０％の配列同一性を含む核酸配列；又は
（ｄ）（ｃ）の核酸配列の機能的断片；
ｅ）配列番号６の核酸配列の天然のプロモーター配列；
ｆ）ｄ）のプロモーター配列の機能的断片；
ｇ）配列番号６の核酸配列の天然のプロモーター配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含む核酸配列；又は
ｈ）ｇ）の核酸配列の機能的断片
を含む。
【０１５３】
上記で述べたように、本発明によるキメラ遺伝子は、優性対立遺伝子を表し得ることが理解される。したがって、このような優性キメラ遺伝子を有する植物、植物部分又は植物細胞を形質転換することは、上記植物、植物部分若しくは植物細胞に複相胞子生殖機能を提供し、或いは上記植物、植物部分若しくは植物細胞において複相胞子生殖を誘導し、又は複相胞子生殖による配偶体のアポミクシスを誘導するのに十分である。
【０１５４】
一実施形態において、上記に記載したように、本明細書において教示されるタンパク質（配列番号３）又はその変異体若しくは断片（例えば、配列番号７及び／又は１２）をコードすることができ、植物、植物部分若しくは植物細胞に複相胞子生殖機能を提供し、又は上記植物、植物部分若しくは植物細胞において複相胞子生殖による配偶体のアポミクシスを誘導することができる、ポリヌクレオチドが提供される。このようなポリヌクレオチドを用いて、キメラ遺伝子、並びにキメラ遺伝子の宿主細胞への移入のため、及び宿主細胞、例えば、形質転換細胞（複数可）由来の細胞、組織、器官又は生物におけるタンパク質（複数可）の生産のためにこれらのキメラ遺伝子を含むベクターを作製することができる。植物細胞における上記タンパク質（又はタンパク質断片若しくは変異体）を生産するためのベクターは、本明細書においては、「発現ベクター」と称される。宿主細胞は、好ましくは植物細胞である。
【０１５５】
任意の植物が適切な宿主であり得るが、最も好ましくは、宿主は、増強された又は減少された複相胞子生殖の恩恵を受けることができる植物種である。特に、他には農業的特徴が良好な品種又は育種系統が好ましい。本明細書において提供される遺伝子及び／又はタンパク質（又はその変異体若しくは断片）が、宿主植物への複相胞子生殖の必要な増加をもたらすかどうかを、トランスジェニック植物を作製し、複相胞子生殖を誘導することによって、適切な対照植物と一緒に試験することは容易である。
【０１５６】
一実施形態において、適切な宿主植物は、トウモロコシ／コーン（トウモロコシ属種）、コムギ（コムギ属種）、オオムギ（例えば、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））、オートムギ（例えば、アヴィーナ・サティヴァ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ））、ソルガム（モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ））、ライムギ（ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ））、ダイズ（ダイズ属種（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｓｐｐ）、例えばダイズ（Ｇ．ｍａｘ））、コットン（ワタ属種（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えば、リクチワタ（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、Ｇ．バルバデンス（Ｇ．ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ））、アブラナ属種（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐｐ．）（例えば、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、芽キャベツ（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）、カブ（Ｂ．ｒａｐａ）など）、ヒマワリ（ヒグルマ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ））、ベニバナ、ヤム、キャッサバ、アルファルファ（紫馬肥し（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ））、イネ（オリザ属種（Ｏｒｙｚａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えば、オリザ・サティバ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）インド型品種群又は日本型品種群）、イソマツ（ｆｏｒａｇｅ  ｇｒａｓｓｅｓ）、トウジンビエ（ｐｅａｒｌ  ｍｉｌｌｅｔ）（ペンニセツム属種（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｓｐｐ．）、例えば、Ｐ．グラウクム（Ｐ．ｇｌａｕｃｕｍ））、樹種（マツ（Ｐｉｎｕｓ）、ポプラ、モミ、オオバコなど）、紅茶、コーヒーノキ、オイルパーム、ココナッツ、野菜種、例えば、ピーナッツ、ズッキーニ、豆類（例えば、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕ）属種）、唐辛子、キュウリ、アーティチョーク、アスパラガス、ナス、ブロッコリー、ニンニク、ニラ、レタス、タマネギ、大根、カブ、トマト、ジャガイモ、芽キャベツ、ニンジン、カリフラワー、チコリー、セロリ、ホウレンソウ、エンダイブ、ウイキョウ、ビート、果肉を有する果物（ブドウ、モモ、プラム、イチゴ、マンゴー、リンゴ、プラム、サクランボ、アプリコット、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、シトラス、キウイ、イチジク、レモン、ライム、ネクタリン、ラズベリー、スイカ、オレンジ、グレープフルーツなど）、観賞用種（例えば、バラ、ペチュニア、キク、ユリ、ガーベラ種）、ハーブ（ミント、パセリ、バジル、タイムなど）、木質の樹木（例えば、ハコヤナギ属、ヤナギ属、コナラ属、ユーカリ属の種）、繊維種、例えば、亜麻（亜麻（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ））及び大麻（大麻（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ））から選択され得る。
【０１５７】
好ましい実施形態において、宿主植物は、タンポポ属、アキノノゲシ（Ｌａｃｔｕｃａ）属、エンゾウ（Ｐｉｓｕｍ）属、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）属、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ）属、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ）属、トウモロコシ（Ｚｅａ）属、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）属、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ）属、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）属、オリザ（Ｏｒｙｚａ）属及びモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）属からなる群から選択される植物種であり得る。
【０１５８】
一実施形態において、ポリヌクレオチド（配列番号１若しくは配列番号２）、その変異体又は断片（例えば、配列番号４、５、６若しくは１１）は、好ましくは本発明によるキメラ遺伝子に含まれ、タンパク質（配列番号３）又はその変異体若しくは断片（例えば、配列番号７及び／又は１２）をコードすることができ、植物、植物部分若しくは植物細胞に複相胞子生殖機能を提供することができ、又は植物、植物部分若しくは植物細胞に複相胞子生殖又は複相胞子生殖により配偶体のアポミクシスを誘導することができ、単一の植物細胞の核ゲノム内に従来の方法で安定に挿入することができ、そのように形質転換された植物細胞は、従来の方法で使用されて、ある特定の時間にある特定の細胞において上記タンパク質の存在のために変化した表現型を有する形質転換植物を生産することができる。この点について、Ｔ−ＤＮＡベクターは、本明細書において教示されるポリヌクレオチド、その変異体又は断片を含み、本明細書において教示されるタンパク質又はその変異体若しくは断片をコードすることができ、アグロバクテリウム・ツメファシエン（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）において、複相胞子生殖機能を提供することができ、又は複相胞子生殖若しくは複相胞子生殖により配偶体のアポミクシスを誘導することができ、植物細胞を形質転換するために使用することができ、その後、形質転換植物は、例えば、欧州特許第０１１６７１８号、欧州特許第０２７０８２２号、ＰＣＴ出願公開第８４／０２９１３号、及び公開された欧州特許第０２４２２４６号並びにＧｏｕｌｄら（１９９１，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９５，４２６−４３４）に記載されている手法を用いて、形質転換植物細胞から再生することができる。アグロバクテリウム媒介性植物形質転換のためのＴ−ＤＮＡベクターの構築は、当該技術分野において周知である。Ｔ−ＤＮＡベクターは、欧州特許第０１２０５６１号及び欧州特許第０１２０５１５号に記載されるバイナリーベクター、又は欧州特許第０１１６７１８号に記載される相同組換えによってアグロバクテリウムＴｉ−プラスミドに組み込むことができる同時組み込みベクターのいずれかであり得る。レタス形質転換プロトコールは、例えば、Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅら（１９８７）及びＣｈｕｐｅａｕら（１９８９）に記載されている。
【０１５９】
好ましいＴ−ＤＮＡベクターは、それぞれ、複相胞子生殖を提供することができるタンパク質をコードする（例えば、配列番号３又はその変異体若しくは断片（例えば、配列番号７及び／又は１２）をコードする）核酸配列機能に作動可能に連結されたプロモーターを含有する。プロモーターは、Ｔ−ＤＮＡ境界配列間の、又は右側境界配列の左側に少なくとも位置する上記ヌクレオチド配列又は複数の配列に作動可能に連結される。境界配列は、Ｇｉｅｌｅｎら（１９８４，ＥＭＢＯ  Ｊ  ３，８３５−８４５）に記載されている。当然、他のタイプのベクターを用いて、直接遺伝子導入（例えば、欧州特許第０２２３２４７号に記載されている）、花粉媒介性形質転換（例えば、欧州特許第０２７０３５６号及び国際公開第８５／０１８５６号に記載されている）、例えば、米国特許第４，６８４，６１１号に記載されているプロトプラスト形質転換、植物ＲＮＡウイルス媒介性形質転換（例えば、欧州特許第００６７５５３号及び米国特許第４，４０７，９５６号に記載されている）、リポソーム媒介性形質転換（例えば、米国特許第４，５３６，４７５号に記載されている）などの手法及び他の方法を用いて、植物細胞を形質転換することができる。アグロバクテリウムへのＴ−ＤＮＡベクターの導入は、エレクトロポレーション法や三親交配法などの公知の方法を用いて行うことができる。
【０１６０】
同様に、形質転換された細胞からの形質転換植物の選択及び再生は、当該技術分野において周知である。明らかに、異なる種、及び単一の種の異なる変種又は品種に関してさえも、プロトコールは、形質転換体を高い頻度で再生するために特に適合される。
【０１６１】
本明細書において教示される方法によって得ることができる植物又は植物部分又は植物細胞は、複相胞子生殖の変更レベル、特に、有意に増大したレベルの複相胞子生殖を含むトランスジェニック植物を有する。このような植物は、以下にさらに本明細書に記載するように、異なる方法を用いて作製することができる。
【０１６２】
本発明の方法によって得られた、又は本発明の方法によって得ることができる植物は、従来の植物育種スキームで使用して、本明細書において教示される導入遺伝子を含む、より多くの形質転換植物を生産することができる。単一コピーの形質転換植物は、例えば、サザンブロット分析又はＰＣＲに基づく方法又はＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）テクノロジーアッセイ（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて選択することができる。形質転換された細胞及び植物は、キメラ遺伝子の存在によって形質転換されていないものと容易に区別することができる。導入遺伝子の挿入部位に隣接する植物ＤＮＡの配列もまた配列決定することができ、それにより、日常的な使用のために「事象特異的な」検出方法を開発することができる。例えば、統合配列及び隣接（ゲノム）配列に基づくエリート事象検出キット（例えば、ＰＣＲ検出キット）を記載している、例えば国際公開第０１／４１５５８号を参照されたい。
【０１６３】
一実施形態において、例えば、植物、植物部分又は植物細胞において複相胞子生殖機能を提供し、又は複相胞子生殖により配偶体のアポミクシスを誘導することができる、本発明によるタンパク質、その変異体又は断片を発現させることによって、植物、植物部分若しくは植物細胞に複相胞子生殖機能を提供し、又は植物、植物部分若しくは植物細胞に複相胞子生殖により配偶体のアポミクシスを誘導することができる、本明細書において教示されるポリヌクレオチド、その変異体又は断片を植物細胞ゲノムに挿入して、それにより、挿入されたコード配列は、植物細胞において発現を指向することができるプロモーターの下流（すなわち、３’）として、その制御下とする。これは、好ましくは、植物細胞ゲノム、特に核又はプラスチド（例えば、葉緑体）ゲノムにキメラ遺伝子を挿入することによって達成され得る。
【０１６４】
本発明による核酸配列は、植物又はそれに対応する配列に複相胞子生殖機能を提供することができ、好ましくは、植物ゲノムに挿入されて、それにより、コード配列が適切な３’末端の非翻訳領域（「３’末端」又は３’ＵＴＲ）の上流（５’）とする。適切な３’末端には、ＣａＭＶ  ３５Ｓ遺伝子（「３’３５Ｓ」）、ノパリンシンターゼ遺伝子（「３’ｎｏｓ」）（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら，１９８２  Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １，５６１−５７３）、オクトピンシンターゼ遺伝子（「３’ｏｃｓ」）（Ｇｉｅｌｅｎら，１９８４，ＥＭＢＯ  Ｊ  ３，８３５−８４５）及びＴ−ＤＮＡ遺伝子７（「３’遺伝子７」）（Ｖｅｌｔｅｎ及びＳｃｈｅｌｌ，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３，６９８１−６９９８）の３’末端を含み、これらは形質転換植物細胞において３’−非翻訳ＤＮＡ配列として及びその他として作用する。一実施形態において、複相胞子生殖機能を提供することができるタンポポ属種の対立遺伝子の３’ＵＴＲ及び／又は５’ＵＴＲが使用され、すなわち、配列番号１及び／又は配列番号２（又はその変異体若しくは断片）を含む該３’ＵＴＲ及び／又は５’ＵＴＲが使用される。３’ＵＴＲ及び／又は５’ＵＴＲはまた、別の実施形態において使用され得、また他のコード領域又は他の核酸構築物と組み合わせて使用され得る。
【０１６５】
ＤＩＰをコードする核酸配列は、任意選択でハイブリッド遺伝子配列として植物ゲノムに挿入することができ、これにより、植物に複相胞子生殖機能を提供することができる配列が、選択可能マーカー又はスコア可能マーカーをコードする遺伝子（米国特許第５，２５４，７９９号；Ｖａｅｃｋら，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８，３３−３７）に、例えば、カナマイシン耐性をコードするｎｅｏ（又はｎｐｔＩＩ）遺伝子（欧州特許第０２４２２３６号）などにインフレームで連結され、そのため、植物は、容易に検出可能である融合タンパク質を発現する。
【０１６６】
選択目的のためであるが、さらに雑草防除オプションのために、本発明のトランスジェニック植物はまた、除草剤、例えば広域スペクトルの除草剤、例えば有効成分としてグルホシネートアンモニウム（例えば、Ｌｉｂｅｒｔｙ（登録商標）又はＢＡＳＴＡ；ＰＡＴ又はｂａｒ遺伝子によって耐性が付与される；欧州特許第０２４２２３６号及び欧州特許第０２４２２４６号参照）又はグリホサート（例えば、ＲｏｕｎｄＵｐ（登録商標）；ＥＰＳＰＳ遺伝子によって耐性が付与される；例えば、欧州特許第０５０８９０９号及び欧州特許第０５０７６９８号参照）に基づく除草剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードするＤＮＡを用いて形質転換されてもよいのが好ましい。さらに、選択可能マーカーとして除草剤耐性遺伝子（又は所望の表現型を付与する他の遺伝子）を使用することは、抗生物質耐性遺伝子の導入を回避できるという利点を有する。
【０１６７】
或いは、抗生物質耐性遺伝子などの他の選択可能マーカー遺伝子を使用してもよい。形質転換された宿主植物に抗生物質耐性遺伝子を保持することは認められない場合があるため、これらの遺伝子は、形質転換体の選択後に再び除去することができる。導入遺伝子の除去のための様々な技術が存在する。除去を達成するための１つの方法は、キメラ遺伝子をｌｏｘ部位に隣接させ、選択に続いて、形質転換植物をＣＲＥリコンビナーゼ発現植物と交配させることである（例えば、欧州特許第５０６７６３号参照）。部位特異的組換えは、マーカー遺伝子の切除をもたらす。別の部位特異的組換え系は、欧州特許第６８６１９１号及び米国特許第５，５２７，６９５号に記載されているＦＬＰ／ＦＲＴ系である。ＣＲＥ／ＬＯＸ及びＦＬＰ／ＦＲＴなどの部位特異的組換え系はまた、遺伝子の積み重ねの目的で使用することができる。さらに、一成分切除系が記載されており、例えば、国際公開第９７／３７０１２号又は国際公開第９５／００５５５号を参照されたい。
【０１６８】
また、本発明による核酸配列の全部又は一部は、例えば本発明によるタンパク質をコードするため、複相胞子生殖機能を植物に付与することができ、それを用いて、微生物、例えば細菌（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属種、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種など）、真菌、又は藻類若しくは昆虫への形質転換に使用することができ、又は組換えウイルスを作製することができる。適切なクローニングビヒクルに組み入れられた、本発明の核酸配列の全部又は一部を用いた細菌の形質転換は、従来の方法で、好ましくは、Ｍａｉｌｌｏｎら（１９８９，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ６０，２０５−２１０）及び国際公開第９０／０６９９９号に記載されている従来のエレクトロポレーション技術を用いて行うことができる。原核生物の宿主細胞における発現に関して、核酸配列のコドン使用頻度はそれに応じて最適化され得る。イントロンでの配列は除かれるべきであり、最適発現のための他の適応を公知のように行うことができる。
【０１６９】
本発明による核酸配列のＤＮＡ配列は、翻訳中立的にさらに変化させ、すなわち、アミノ酸配列に関して、遺伝子部分に存在するＤＮＡ配列を可能的に阻害し、及び／又はコドン使用頻度に変化を導入することによって、例えば、上述したように、植物、好ましくは特定の関連する植物属によって最も好ましいものにコドン使用頻度を適用することによって改変することができる。
【０１７０】
上記のように、本発明の一実施形態によれば、植物に複相胞子生殖機能を提供することができる本発明によるタンパク質又はキメラタンパク質は、色素体、好ましくは葉緑体、ミトコンドリアなどの細胞内オルガネラを標的とし、また、潜在的にタンパク質安定性及び／又は発現を最適化するように細胞から分泌されてもよい。同様に、タンパク質は液胞に標的化されてもよい。この目的のために、本発明の一実施形態において、本発明のキメラ遺伝子は、本発明によるタンパク質コード領域に連結された、シグナル又は標的ペプチドをコードするコード領域を含む。本発明のタンパク質に含まれる特に好ましいペプチドは、葉緑体又は他の色素体標的化のための輸送ペプチドであり、特に、遺伝子産物が色素体に標的化される植物遺伝子からの重複輸送ペプチド領域、Ｃａｐｅｌｌａｄｅｓらの最適化された輸送ペプチド（米国特許第５，６３５，６１８号）、ホウレンソウからのフェレドキシン−ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの輸送ペプチド（Ｏｅｌｍｕｌｌｅｒら，１９９３，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３７，２６１−２７２）、Ｗｏｎｇら（１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２０，８１−９３）に記載の輸送ペプチド及び公開されたＰＣＴ特許出願公開第００／２６３７１号における標的化ペプチドである。また、好ましいものは、ポテトプロテイナーゼインヒビターＩＩの分泌シグナル（Ｋｅｉｌら，１９８６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４，５６４１−５６５０）、イネのα−アミラーゼ３遺伝子の分泌シグナル（Ｓｕｔｌｉｆｆら，１９９１，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１６，５７９−５９１）、及びタバコＰＲ１タンパク質の分泌シグナル（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎら，１９８６，ＥＭＢＯ  Ｊ．５，３７−４０）などの細胞外でこのようなペプチドに連結したタンパク質の分泌をシグナル伝達するペプチドである。本発明による特に有用なシグナルペプチドは、葉緑体輸送ペプチド（例えば、Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１３，３５８）、又は葉緑体へのタンパク質の輸送を引き起こす米国特許第５，５１０，４７１号及び米国特許第５，６３５，６１８号の最適化された葉緑体輸送ペプチドを含む。また、分泌シグナルペプチド、又は他の色素体、ミトコンドリア、ＥＲ、又は他のオルガネラにタンパク質を標的化するペプチドを使用することができる。細胞内オルガネラへの標的化のための又は植物細胞外若しくは細胞壁への分泌のためのシグナル配列は、天然に標的化又は分泌されたタンパク質において見出され、好ましくは、Ｋｌｏｓｇｅｎら（１９８９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１７，１５５−１６１）、Ｋｌｏｓｇｅｎ及びＷｅｉｌ（１９９１，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２５，２９７−３０４）、Ｎｅｕｈａｕｓ＆Ｒｏｇｅｒｓ（１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８，１２７−１４４）、Ｂｉｈら（１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２２８８４−２２８９４）、Ｍｏｒｒｉｓら（１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５５，３２８−３３３）、Ｈｅｓｓｅら（１９８９，ＥＭＢＯ  Ｊ．８，２４５３−２４６１）、Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉら（１���９８，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４２６，６２−６６．）、Ｔｅｒａｓｈｉｍａら（１９９９，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５２，５１６−５２３）、Ｐａｒｋら（１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，６８７６−６８８１）、Ｓｈｃｈｅｒｂａｎら（１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２，９２４５−９２４９）に記載されているものに見出される。
【０１７１】
一実施形態において、植物に複相胞子生殖機能を提供することができる、本発明によるいくつかのタンパク質コード核酸配列は、任意選択で異なるプロモーターの制御下で、単一の宿主中で同時発現される。同時発現宿主植物は、本発明のタンパク質を既に発現している植物を形質転換することによって、又は本発明の異なるタンパク質で形質転換された植物を交配することによって容易に得られる。したがって、本発明はまた、本発明の同一又は異なる単離された核酸配列の複数の核酸配列を有する植物又は植物部分を提供し、その各々は、植物に複相胞子生殖機能を提供することが可能であり得る。この点において多様な用語は細胞あたりを意味することが理解される。或いは、各々が植物に複相胞子生殖機能を提供することができ得る、本発明によるいくつかの核酸配列は、単一の形質転換ベクター上に存在してもよく、又は別々のベクターを用い、複数のキメラ遺伝子を含む形質転換体を選択して同時に同時形質転換されてもよい。同様に、本発明による複相胞子生殖機能を提供することができるタンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子は、他のキメラ遺伝子と一緒に、例えば、複相胞子生殖を増大若しくは抑制し、又はアポミクシスに関与する他のタンパク質をコードする他のキメラ遺伝子と一緒に、単一の植物において発現されてもよい。異なるタンパク質は、同じ植物において発現され得、又はそれぞれが単一の植物において発現され得、次に、単一の植物を互いに交配することによって同じ植物において組み合わされ得ることが理解される。例えば、雑種種子生産において、各親植物は単一のタンパク質を発現することができる。親植物を交配して雑種を生産すると、両方のタンパク質が雑種植物中で組み合わされる。
【０１７２】
本発明によるいくつかのキメラ遺伝子が、好ましくは異なるプロモーターの制御下にある植物を生成することもまた、一実施形態である。このようにして、複相胞子生殖表現型の増強又は抑制は、適切な時間及び場所で、植物に複相胞子生殖機能を提供することができる本発明によるタンパク質の適切な量を発現させることによって微調整することができる。このような微調整は、最も適切なプロモーターを決定することによって、及び／又は所望の発現レベルを示す形質転換「事象」を選択することによって行うことができる。
【０１７３】
複相胞子生殖機能を提供することができる本発明による所望レベルのタンパク質を発現する形質転換体は、例えば、コピー数（サザンブロット分析）、ｍＲＮＡ転写レベル（例えば、プライマー対若しくは隣接プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ）を分析することによって、又は様々な組織中の上記複相胞子生殖タンパク質の存在及びレベルを分析する（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；ＥＬＩＳＡアッセイなど）ことによって選択される。調節の理由から、好ましくは単一コピーの形質転換体を選択し、キメラ遺伝子の挿入部位に隣接する配列を分析し、好ましくは配列決定して、形質転換の結果を特徴付ける。高又は中程度のＤＩＰ発現トランスジェニック事象は、安定なＤｉｐ導入遺伝子を有する高性能エリート事象が得られるまで、さらなる発生のために選択される。
【０１７４】
また、いくつかのキメラ遺伝子を有する植物は、複相胞子生殖機能を提供することができるタンパク質をコードする第１のキメラ遺伝子、及び第１のキメラ遺伝子を抑制又はサイレンシングすることができる第２のキメラ遺伝子を有し得ることが想定される。上記第２のキメラ遺伝子は、好ましくは誘導性プロモーターの制御下にある。このような植物は、複相胞子生殖機能を制御することができるため、特に有利であり得る。上記プロモーターからの発現を誘導することにより、植物における複相胞子生殖機能が失われる可能性がある。さらに、このような制御はまた、複相胞子生殖植物に本発明によるキメラ遺伝子を導入することにより得られてもよく又は得ることができ、該キメラ遺伝子はまた、植物に複相胞子生殖機能を提供する内在性遺伝子、すなわち、本発明によるアミノ酸配列を天然にコードする内在性遺伝子を抑制又はサイレンシングすることができる。
【０１７５】
本発明による核酸配列の保存された核酸配列部分を選択することにより、宿主植物又は植物部分における対立遺伝子をサイレンシングすることができる。上記サイレンシングは、上述のように、植物の複相胞子生殖機能の抑制において生じ得る。したがって、また、本明細書に包含されるのは、本発明による核酸配列のセンス及び／又はアンチセンスＤＮＡ断片に作動可能に連結された転写調節エレメントを含み、抑制又は増強された複相胞子生殖を示すことができる、キメラ遺伝子を含む植物である。上記転写調節エレメントは、誘導性プロモーターであってもよい適切なプロモーターであり得る。
【０１７６】
本発明による植物に複相胞子生殖機能を提供することができる１つ又は複数のタンパク質を発現する形質転換植物はまた、病害耐性を付与する遺伝子又は他の生物的及び／又は非生物的ストレスに対する耐性を付与する遺伝子などの他の導入遺伝子を含み得る。「積み重ねられた」導入遺伝子を有するそのような植物を得るために、他の導入遺伝子を形質転換植物に導入するか、又は形質転換植物をその後１つ又は複数の他の遺伝子で形質転換してもよく、又はいくつかのキメラ遺伝子を用いて、植物系統若しくは変種を形質転換してもよい。例えば、いくつかのキメラ遺伝子は単一のベクター上に存在してもよく、又は同時形質転換される異なるベクター上に存在してもよい。
【０１７７】
一実施形態において、以下の遺伝子は、本発明による１つ又は複数のキメラ遺伝子と組み合わせる：公知の病害抵抗性遺伝子、特に壊死病原体に対して増大した耐性を付与する遺伝子、ウイルス耐性遺伝子、昆虫抵抗性遺伝子、非生物的ストレス耐性遺伝子（例えば耐乾性、耐塩性、耐熱性又は耐寒性など）、除草剤耐性遺伝子など。したがって、積み重ねられた形質転換体は、病原体耐性、昆虫抵抗性、線虫耐性、塩分、冷ストレス、熱ストレス、水ストレスなどに対して、さらにより広い生物学的及び／又は非生物的ストレス耐性を有し得る。また、上述されるように、この実施形態において、複相胞子生殖機能アプローチのサイレンシング又は抑制は、単一植物における遺伝子発現アプローチと組み合わせることができる。
【０１７８】
本発明によるキメラ遺伝子を含む植物又は植物部分は、好ましくは、収率低下、病気（特に壊死虫）又は望ましくない構造変化（矮小化、変形）などに対する感受性の増強などの望ましくない表現型を示さず、このような表現型が一次形質転換植物に見られる場合、これらは従来の方法によって除去することができることが理解される。本明細書に記載される植物のいずれも、本発明によるキメラ遺伝子についてホモ接合性又はヘミ接合性であり得る。
【０１７９】
さらなる態様において、本発明は、雑種植物のクローンを生産するための方法に関し、以下：
ａ）有性的に生殖する植物を本明細書において教示される植物の花粉と他家受精させて、Ｆ１雑種種子を生産する工程；
ｂ）本明細書において教示されるポリヌクレオチド、又はその変異体若しくは断片、或いは少なくとも雌性子房、好ましくは大胞子母細胞及び／又は雌性配偶子における、本明細書において教示されるあるポリヌクレオチド、又はその変異体若しくは断片を含み並びに／或いは発現するＦ１植物を選択する工程；
ｃ）任意選択で種子の生産を誘導するために、好ましくは四倍体植物の花粉を用いて、上記選択されたＦ１植物を受粉させる工程；並びに
ｄ）種子を収穫する工程；並びに
ｅ）任意選択で上記種子からハイブリッドクローン植物を生育させる工程
を含む。
【０１８０】
選択されたＦ１植物が自律的胚乳を発生させる場合、工程ｃ）を省略することができる。
【０１８１】
一実施形態において、本明細書において教示される方法の工程（ｅ）のクローンは、アポミクティッククローンである。
【０１８２】
一実施形態において、本明細書において教示される方法は、上記雑種植物を得ることを含む。
【０１８３】
さらなる態様において、本発明は、植物、植物部分若しくは植物細胞に複相胞子生殖を付与し、又は植物、植物部分若しくは植物細胞に複相胞子生殖により配偶体のアポミクシスを誘導するための方法に関し、以下：
ａ）上記植物、植物部分若しくは植物細胞を、本明細書において教示されるポリヌクレオチド、その変異体若しくは断片のいずれか、本明細書において教示されるキメラ遺伝子、本明細書において教示される遺伝子構築物、及び／又は本明細書において教示される核酸ベクターを用いて形質転換する工程；並びに
ｂ）任意選択で植物を再生する工程、ここで、上記ポリヌクレオチド、変異体若しくは断片、遺伝子、構築物及び／又はベクターが少なくとも雌性子房、好ましくは大胞子母細胞及び／又は雌性配偶子に存在し及び／又は発現される工程
を含む。
【０１８４】
一実施形態において、本明細書において教示されるポリヌクレオチド、その変異体又は断片は、上記植物、植物部分又は植物細胞のゲノムに組み込まれる。
【０１８５】
一実施形態において、本明細書において教示される方法は、複相胞子生殖植物を得ることを含む。
【０１８６】
さらなる態様において、本発明は、植物、植物部分若しくは植物細胞に複相胞子生殖を付与し、又は植物、植物部分若しくは植物細胞において複相胞子生殖を誘導し、又は植物、植物部分若しくは植物細胞において複相胞子生殖により配偶体のアポミクシスを誘導するための方法に関し、以下：
ａ）改変後に植物、植物部分又は植物細胞が本明細書において教示されるポリヌクレオチド、その変異体又は断片のいずれか１つを含むように、植物、植物部分又は植物細胞において、好ましくは液胞タンパク質選別関連タンパク質遺伝子の内在性ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの変異体又は断片を改変する工程；及び
ｂ）任意選択で植物を再生する工程
を含む。
【０１８７】
一実施形態において、本明細書において教示される方法の工程（ａ）のポリヌクレオチドの改変されたポリヌクレオチド、変異体又は断片は、発現され及び／又はポリペプチドをコードする。
【０１８８】
一実施形態において、本明細書において教示される方法の工程（ａ）のポリヌクレオチドの改変されたポリヌクレオチド又は断片は、少なくとも雌性子房、好ましくは大胞子母細胞及び／又は雌性配偶子に存在する。
【０１８９】
一実施形態において、本明細書において教示される方法のステップ（ａ）の改変は、
ａ）上記植物、植物部分又は植物細胞に少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼを導入又は発現させることによって、ここで、好ましくは上記ヌクレアーゼはＣａｓ９／ＲＮＡ  ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びＴＡＬエフェクターヌクレアーゼからなる群から選択されて；及び／又は
ｂ）オリゴヌクレオチドを用いてオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発によって、ここで、好ましくはオリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドであり；及び／又は
ｃ）化学的突然変異誘発によって、好ましくはエチルメタンスルホネートを用いて行われる。
【０１９０】
一実施形態において、本明細書において教示される方法は、複相胞子生殖植物を得ることを含む。
【０１９１】
一実施形態において、特にタンポポ属種における上記改変は、配列番号１０に示される内在性ｄｉｐアミノ酸配列の９６〜１００位に対応するアミノ酸残基ＧＧＧＧＷをコードするヌクレオチドの欠失を含み、及び／又は配列番号１０に示される内在性ｄｉｐアミノ酸配列の１０８〜１１０位に対応する残基ＰＰＴをコードする残基をコードするヌクレオチドの欠失を含む。他の生物において、セイヨウタンポポに見られるアミノ酸残基ＧＧＧＧＷ又はＰＰＴに対応するアミノ酸残基をコードするヌクレオチドを欠失させることができる。当業者は、欠失されるべき正しいアミノ酸残基、並びにこれらのアミノ酸残基をコードする対応するヌクレオチド配列を同定することができる。
【０１９２】
一実施形態において、上記改変は、図２に示されるｄｉｐ（有性対立遺伝子；配列番号１３）とＤｉｐ（複相胞子生殖対立遺伝子）ヌクレオチド配列間の１つ又は複数の、例えば全部の相違を含む。
【０１９３】
一実施形態において、本明細書において教示される方法によって得ることができる形質転換植物のいずれかの植物全体、種子、細胞、組織及び後代は本明細書に包含され、例えば、鋳型として全ゲノムＤＮＡを用いて、並びに特定のＰＣＲプライマー対、例えば、配列番号１及び／又は配列番号２及び／又は配列番号４、６若しくは１１の配列或いは上述されるものなどのその変異体に対して設計された特定のプライマー対を用いて、ＰＣＲ分析によって、ＤＮＡにおいて本明細書において教示されるキメラ遺伝子、遺伝子構築物又はベクターの存在を検出することによって同定することができる。また、ＰＣＲプライマーが、挿入されたキメラ遺伝子に隣接する植物ＤＮＡに基づく場合、「事象特異的な」ＰＣＲ診断法を開発することができる（米国特許第６，５６３，０２６号参照）。同様に、形質転換若しくは改変された植物又はそこから誘導された任意の植物、種子、組織若しくは細胞を同定する事象特異的なＡＦＬＰフィンガープリント又はＲＦＬＰフィンガープリントを開発することができる。
【０１９４】
植物及び種子
さらなる態様において、本発明は、本明細書において教示されるキメラ遺伝子、本明細書において教示される遺伝子構築物、及び／又は本明細書において教示される核酸ベクターを含む植物、植物部分又は植物細胞に関し、それにより遺伝子、構築物及び／又はベクターは、少なくとも雌性子房において、好ましくは大胞子母細胞及び／又は雌性配偶子に存在し及び／又は発現される。
【０１９５】
一実施形態において、本明細書において教示される植物の種子は、アポミクティック種子である。
【０１９６】
一実施形態において、本明細書において教示される種子は、それが発生した本明細書において教示される植物のクローンである。
【０１９７】
好ましい実施形態において、本明細書において教示される植物、植物部分、植物細胞又は種子は、タンポポ属、アキノノゲシ属、エンゾウ属、トウガラシ属、ナス属、キュウリ属、トウモロコシ属、ワタ属、ダイズ属、コムギ属、オリザ属、ネギ（Ａｌｌｉｕｍ）属、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）属、フダンソウ（Ｂｅｔａ）属、キクニガナ（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ）属、菊（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）属、ペンニセツム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）属、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ）属、オオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ）属、ウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）属、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）属、バラ（Ｒｏｓａ）属、ユリ（Ｌｉｌｉｕｍ）属、コーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ）属、アマ（Ｌｉｎｕｍ）属、アサ（Ｃａｎａｂｉｓ）属、キャッサバ（Ｃａｓｓａｖａ）属、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ）属、カボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）属、スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）属、及びモロコシ属からなる群から選択される種由来である。
【０１９８】
使用
さらなる態様において、本発明は、植物における複相胞子生殖を誘導するために本明細書において教示される単離されたポリヌクレオチド、その変異体又は断片のいずれかの使用に関する。
【０１９９】
さらなる態様において、本発明は、複数の遺伝子、ＱＴＬ又は導入遺伝子の分離を妨げるための、本明細書において教示される単離されたポリヌクレオチド又はその断片若しくは変異体のいずれかの使用に関する。
【０２００】
さらなる態様において、本発明は、遺伝子の積み重ねについて本明細書において教示される単離されたポリヌクレオチド又はその断片若しくは変異体のいずれかの使用に関する。
【０２０１】
さらなる態様において、本発明は、複相胞子生殖形質用にマーカーを開発及び／又は同定するための、本明細書に開示される、単離されたポリヌクレオチド又はその断片若しくは変異体のいずれかの使用に関する。
【０２０２】
一実施形態において、本明細書において教示されるポリヌクレオチド（配列番号１又は配列番号２）、その変異体又は断片（例えば、配列番号４、５、６若しくは１１）は、本明細書において教示されるタンパク質（配列番号３）又はその変異体若しくは断片（例えば、配列番号７及び／又は１２）をコードすることができ、並びにさらに植物において複相胞子生殖機能を提供し、又は複相胞子生殖若しくは複相胞子生殖による配偶体のアポミクシスを誘導することができる任意のタンパク質及びその変異体をコードするポリヌクレオチド配列は、タンポポ属種の（及び／又は他の植物種の）複相胞子生殖機能を提供することができる対立遺伝子のマーカー支援選択のための遺伝マーカーとして、並びに対象とする植物に／へ、及び複相胞子生殖対立遺伝子（又は変異体）が見出される植物との種内又は種間雑種を生じさせるために使用され得る植物に／へ異種又は同一の複相胞子生殖対立遺伝子の転移及び／又は組み合わせのための遺伝マーカーとして使用され得る。
【０２０３】
これらの配列に基づいて、様々な異なるマーカーアッセイを開発することができる。マーカーアッセイの開発は、一般的に、対立遺伝子間の多型の同定を伴い、そのため多型は特定の対立遺伝子を「マーク」する遺伝マーカーである。次に、多型（複数可）は、マーカーアッセイにおいて使用される。例えば、本発明による配列番号１及び／又は配列番号２及び／又は配列番号４、５、６若しくは１１の核酸配列、或いはその変異体の核酸配列は、複相胞子生殖の存在、非存在、減少、抑制又は増強と相関し得る。これは、例えば、特異的な対立遺伝子を、複相胞子生殖機能の非存在又は存在と相関させるために、このような配列の１つ又は複数について、複相胞子生殖の植物材料及び／又は非複相胞子生殖の植物材料をスクリーニングすることによって行われる。したがって、植物材料から得られた試料（例えば、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ試料）中の配列番号１及び／又は配列番号２及び／又は配列番号４、５、６若しくは１１、或いはその変異体又は断片の存在又は非存在を検出するＰＣＲプライマー又はプローブが生成され得る。配列又はその部分を比較し、複相胞子生殖と相関し得る多型マーカーを同定することができる。次に、Ｄｉｐ又はｄｉｐ対立遺伝子に連結されたＳＮＰマーカーなどの多型マーカーは、複相胞子生殖対立遺伝子の存在又は非存在について植物材料をスクリーニングするための迅速な分子アッセイに発展させることができる。したがって、これらの「遺伝子マーカー」の存在又は非存在は、それに関連するＤｉｐ対立遺伝子の存在を示し、Ｄｉｐ対立遺伝子の検出を遺伝マーカーの検出に置き換えることができる。このようなマーカーの例は、実施例の節に開示されている。
【０２０４】
試料中（例えば、ＤＮＡ試料）中の特異的なＤｉｐ若しくはｄｉｐ対立遺伝子（例えば、例えばｄｉｐなど複相胞子生殖を付与しない対立遺伝子に対して、Ｄｉｐなどの複相胞子生殖を付与する対立遺伝子対対立遺伝子の）又は対立遺伝子の組み合わせの迅速な検出を可能にする、容易であり、速いマーカーアッセイが使用されるのが好ましい。したがって、一実施形態において、試料中のＤｉｐ対立遺伝子及び／又はｄｉｐ対立遺伝子の存在又は非存在、並びに／又は試料が上記対立遺伝子に対してホモ接合性又はヘテロ接合性であるのかどうかを決定するための分子アッセイにおいて、配列番号１及び／又は配列番号２の核酸配列、又はその変異体若しくは断片（配列番号４又は配列番号５、６又は１１）（それと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上の核酸同一性を含む）、又は１つ又は複数のその断片の使用が提供される。
【０２０５】
このようなアッセイは、例えば、以下の工程：
（ａ）複相胞子生殖及び非複相胞子生殖植物材料及び／又はその核酸試料を提供する工程；
（ｂ）ヌクレオチド配列間の多型を同定するために、（ａ）からの材料中にＶｐｓ１３遺伝子に由来するヌクレオチド配列、例えば、配列番号１及び／又は配列番号２に対応する配列又はその変異体及び／若しくは断片（配列番号４、５、６又は１１）を決定する工程；
（ｃ）多型を植物の複相胞子生殖の特徴と相関させ、それにより、多型をＤｉｐ遺伝子座の複相胞子生殖及び非複相胞子生殖対立遺伝子と相関させる工程
相関させた、同定された多型は、工程（ｄ）において任意選択でさらに使用されてもよい。
【０２０６】
（ｄ）上記多型マーカーを用いて、生殖質のスクリーニング又は特徴付け及びＭＡＳにおける使用のためのマーカーアッセイを開発する工程
を伴ってもよい。
【０２０７】
したがって、本発明の一実施形態において、複相胞子生殖遺伝子の対立遺伝子に由来するＤＮＡ又はＲＮＡ配列を検出するためのＰＣＲプライマー及び／又はプローブ、分子マーカー並びにキットが提供される（すなわち、Ｄｉｐ及び／又はｄｉｐ対立遺伝子）。試料からＤｉｐ  ＤＮＡ及び／又はｄｉｐ  ＤＮＡ（例えば、配列番号１及び／又は配列番号２からの核酸配列又はその変異体若しくは断片（例えば、配列番号４、５、６若しくは１１））を増幅し得る縮重又は特異的ＰＣＲプライマーは、当該技術分野において周囲である上記配列（又はその変異体）に基づいて合成され得る（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ及びＤｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５）ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ並びにＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ａｔ  ａｌ．（２０００）ＰＣＲ−Ｂａｓｉｃｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｂｅｎｃｈ，Ｆｉｒｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｇｅｒｍａｎｙを参照されたい）。例えば、これらの配列（又は相補鎖）の９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８又はそれ以上の連続したヌクレオチドの任意のストレッチをプライマー又はプローブとして使用することができる。本発明のポリヌクレオチド配列は、同様にハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。Ｄｉｐ遺伝子／対立遺伝子検出キットは、Ｄｉｐ及び／又はｄｉｐ対立遺伝子特異的プライマー及び／又はＤｉｐ及び／又はｄｉｐ対立遺伝子特異的プローブを含み得る。試料中のＤｉｐ及び／又はｄｉｐ  ＤＮＡを検出するために、プライマー及び／又はプローブに関して、関連プロトコールを使用することができる。このような検出キットは、例えば、植物が本発明のＤｉｐ遺伝子（又はその一部若しくは変異体）で形質転換されたかどうかを決定するために、又はＤｉｐ対立遺伝子（又はＤｉｐホモログ若しくはオルソログ）の存在及び任意選択で接合性決定についてタンポポ属種の生殖質及び／又は他の植物種の生殖質をスクリーニングするために使用されてもよい。
【０２０８】
したがって、一実施形態において、植物組織、例えば、タンポポ属種の組織、又はその核酸試料中のＤＩＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列の存在又は非存在を検出する方法が提供される。該方法は、
ａ）植物組織試料、例えば、タンポポ属種の試料、又はその核酸試料を得る工程、
ｂ）Ｄｉｐ対立遺伝子に連結された１つ又は複数のマーカーの存在又は非存在について分子マーカーアッセイを用いて核酸試料を分析する工程であって、ここで、マーカーアッセイは、上記試料中の配列番号１及び／又は配列番号２のいずれか１つ、及び／又は配列番号４、５、６若しくは１１、又はそれと少なくとも７０％のヌクレオチド同一性を含む配列を検出する工程、及び任意選択で
ｃ）上記マーカーの１つ又は複数を含む植物（例えば、タンポポ属種の植物）を選択する工程
を含む。
【０２０９】
複相胞子生殖のさらなる応用
複相胞子生殖はアポミクシスのエレメントであり、複相胞子生殖用の遺伝子は、アポミクシスを生じさせ、それを上記で列挙した応用のために使用するために、単為生殖用の遺伝子と組み合わせて使用され得る。これらの遺伝子は、形質転換によって有性作物に導入することができる。また、アポミクシス遺伝子の構造及び機能の知識は、内在性の有性生殖遺伝子を、アポミクシス遺伝子になるような方法で改変するために使用することができる。好ましい使用は、誘導性プロモーターの下でアポミクシスをもたらすことであり、それによりアポミクシスは、有性生殖が新しい遺伝子型を生じさせる場合にスイッチオフにされ得、アポミクシスがエリート遺伝子型を広めるために必要とされる場合にスイッチオンにされ得る。
【０２１０】
しかしながら、本発明の複相胞子生殖ポリヌクレオチド又は遺伝子は、まったく新しい方法で使用することもでき、アポミクシスのエレメントとして直接使用することができない。複相胞子生殖遺伝子は、二倍体植物から倍数体の子孫を生成するための有性倍数体化のために使用することができた。倍数体植物は、しばしば二倍体植物よりも異種性であり、高い収量を生産する（Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｅ．Ｔ．，Ｒ．Ｗ．Ｇｒｏｏｓｅ，Ｄ．Ｒ．Ｗｏｏｄｆｉｅｌｄ＆Ｋ．Ｋ．Ｋｉｄｗｅｌｌ，１９９４．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｇｅｎｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｌｆａｌｆａ  ａｒｅ  ｇｒｅａｔｅｒ  ｉｎ  ａｕｔｏｐｏｌｙｐｌｏｉｄｓ  ｔｈａｎ  ｄｉｐｌｏｉｄｓ．Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ  ３４：８２３−８２９．；Ｍｅｎｄｉｂｕｒｕ，Ａ．Ｏ．＆Ｓ．Ｊ．Ｐｅｌｏｑｕｉｎ，１９７１．Ｈｉｇｈ  ｙｉｅｌｄｉｎｇ  ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ４ｘ−２ｘ  ａｎｄ  ２ｘ−２ｘ  ｍａｔｉｎｇｓ．Ａｍｅｒ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｊ  ４８：３００−３０１）。Ｄｉｐ遺伝子、すなわち、本発明によって植物に複相胞子生殖機能を提供することができる遺伝子（或いはキメラ遺伝子、又はベクター又は遺伝子構築物）は、雌性減数分裂Ｉを回避し、したがって、第１分裂回復（ＦＤＲ）卵細胞を生成し、これは、全てのヘテロ接合性及びエピスタシス遺伝子相互作用を含む完全母系ゲノムを移入する（Ｍｏｋ，Ｄ．Ｗ．Ｓ．及びＳ．Ｊ．Ｐｅｌｏｑｕｉｎ．１９７２．Ｔｈｒｅｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ２ｎ  ｐｏｌｌｅｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ．ｄｉｐｌｏｉｄ  ｐｏｔａｔｏｅｓ．Ａｍ．Ｐｏｔａｔｏ  Ｊ．４９：３６２−３６３．；Ｒａｍａｎｎａ，Ｍ．Ｓ．，１９７９．Ａ  ｒｅ−ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ２ｎ  ｇａｍｅｔｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｏｔａｔｏ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  ２８：５３７−５６１）。ＦＤＲ配偶子によって生産される子孫は、親のヘテロ接合性及びエピスタシスの一部のみを子孫に移す第２分裂回復（ＳＤＲ）配偶子によって生産される子孫よりも優れている。減数していない配偶子のＦＤＲタイプとＳＤＲタイプの両方は、交配後に雑種子孫をもたらし、化学的処理（例えばコルヒチン）による体細胞倍数体化と比較して、はるかに増大したヘテロ接合性を有する。したがって、Ｄｉｐ遺伝子によって誘導されるようなＦＤＲ配偶子は、有性倍数体化のための最も好ましいタイプの配偶子である。ＦＤＲ配偶子は、ジャガイモ、アルファルファ、スノキ属種（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｓｐｐ．）、及び飼料牧草の一部などの同質倍数体作物の改良にそれらの使用が証明されている（Ｒａｍａｎｎａ，Ｍ．Ｓ．及びＪａｃｏｂｓｅｎ  Ｅ．２００３．Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  ｓｅｘｕａｌ  ｐｏｌｙｐｌｏｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｒｏｐ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ−ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  １３３：３−８；Ｍａｒｉａｎｉ，Ａ．＆Ｓ．Ｔａｖｏｌｅｔｔｉ，１９９２．Ｇａｍｅｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｏ���ｙｐｌｏｉｄ  Ｐｏｌｙｓｏｍｉｃ  Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｐｅｒｕｇｉａ，Ｔｉｐｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉａ  Ｐｏｒｚｉｕｎｃｏｌａ−Ａｓｓｉｓｉ（ＰＧ）Ｉｔａｌｙ，ｐｐ．１−１０３；Ｖｅｉｌｌｅｕｘ，Ｒ．，１９８５．Ｄｉｐｌｏｉｄ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｐｌｏｉｄ  ｇａｍｅｔｅｓ  ｉｎ  ｃｒｏｐ  ｐｌａｎｔｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄ  Ｒｅｖ  ３：２５２−２８８）。これらの応用において、Ｄｉｐ遺伝子は雌性大胞子形成中にのみ発現され、雄性減数分裂は縮小的であることが非常に有益である。これは、減少した花粉粒を介して二倍体遺伝子プールへのＤｉｐ遺伝子の遺伝子移入を可能にし、交配によって新しい有益な遺伝子の組み合わせを作り出す。植物育種のためのＤｉｐ遺伝子のもう一つの非常に有用な性質は、異型接合体が複相胞子生殖表現型を発現するような優性である。これは、育種スキームにおけるＤｉｐ遺伝子の使用を有意に単純化する。
【０２１１】
有性倍数体化の１つの具体的な応用は、種なしの果実を生産するために使用され得る三倍体の生産である。三倍体はトリソミクスの供給源としても機能することができ、マッピング研究に非常に有用である。
【０２１２】
アポミクシスにおいて、複相胞子生殖と単為生殖の両方が１つの植物で組み合わされ、一方、一世代における複相胞子生殖の使用、及び次世代における単為生殖の使用は、アポマイオシスによる倍数性レベルでの上昇、及び単為生殖による倍数性レベルでの下降によって、二倍体及び倍数体レベルでの作物の有性遺伝子プールを連結させる。倍数体集団がより多くの突然変異に耐えることができ、突然変異誘導にとってより良好であり得るためこれは非常に実用的である。倍数体植物はまた、より活発であり得る。しかしながら、二倍体集団は選択にとってより良好であり、二倍体の交配は遺伝的マッピング、ＢＡＣライブラリーの構築などにとってより良好である。倍数体の単為生殖は二倍体と交配することができるジ単数体を生成する。二倍体の複相胞子生殖は、倍数体から花粉によって受精されて、倍数体の子孫を産生することができる減数していないＦＤＲ卵細胞を生成する。このように、異なる育種世代における複相胞子生殖と単為生殖の交互作用は、二倍体と倍数体遺伝子プールとを連結させる。
【０２１３】
以下の非限定的な実施例は、本発明の様々な実施形態を例証する。実施例において他に記載されていない限り、全ての組換えＤＮＡ技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ並びにＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；並びにｉｎ  Ｖｏｌｕｍｅｓ  １及び２  ｏｆ  Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＵＳＡ．Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｏｒｋ  ａｒｅ  ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｘ（１９９３）ｂｙ  Ｒ．Ｄ．Ｄ．Ｃｒｏｙ，ｊｏｉｎｔｌｙ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ（ＵＫ）及びＢｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＵＫに記載される標準的なプロトコールに従って実施される。
【実施例】
【０２１４】
実施例１．ＤＩＰ遺伝子座の遺伝子マッピング
１．１  アポミクシス組換え集団
複相胞子生殖（Ｄｉｐｌｏｓｐｏｒｏｕｓ）（Ｄｉｐ）遺伝子座の遺伝子マッピングのために、二倍体有性セイヨウタンポポ植物ＴＪＸ３−２０と三倍体アポミクトＡ６８の間で交配を行った。ＴＪＸ３−２０は、メントール花粉の影響の結果として、二倍体×三倍体セイヨウタンポポ交配の場合に通常である、高い割合の自家受粉子孫の生産を防ぐために、雄性不稔（花粉生産なし）の種子親として選択された（Ｔａｓ  ｅｎ  Ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  １９９９）。ＴＪＸ３−２０×Ａ６８交配における平均種子結実は１〜３％の間で低かった。非常に多数の交配は、計１９０個の子孫をもたらした。生存性の正倍数体子孫のみが生産された：９７個の二倍体、９２個の三倍体及び１個の四倍体（倍数性レベルは、ＰＡＲＴＥＣフローサイトメーター、Ｖａｎ  Ｄｉｊｋら  ２００３で決定された）。アポミクシス／アポミクシスなしについて分離された三倍体とは対照的に、二倍体のいずれもアポミクシスではなかった。
【０２１５】
１．２  複相胞子生殖表現型決定
ＤＩＰ遺伝子座を遺伝的にマッピングするために、三倍体後代植物を複相胞子生殖対非複相胞子生殖（減数分裂）の表現型にした。交配受粉を伴わない三倍体種子を生産する三倍体後代植物は、アポミクティックであり、したがって複相胞子生殖でもあった。非アポミクティック植物の複相胞子生殖表現型決定について、いわゆる擬似試験交配を行った（Ｏｚｉａｓ  Ａｋｉｎｓ及びＶａｎ  Ｄｉｊｋ  ２００７）。ＴＪＸ３−２０×Ａ６８交配からの三倍体子孫は、二倍体有性花粉ドナーと交配された。種子を収穫し、発芽させ、後代の倍数性レベルをフローサイトメトリー（Ｐａｒｔｅｃ  Ｐｌｏｉｄｙ  Ａｎａｌｙｓｅｒ，ｖａｎ  Ｄｉｊｋら  ２００３）によって決定した。後代が四倍体植物のみで構成されていた場合、二倍体花粉ドナーは単数体花粉粒を生産したため、三倍体母植物は複相胞子生殖であったことを差し引いて結論付けられた。後代が三倍体又はそれ以下の倍数レベルを有する植物からなる場合、母植物の卵細胞の染色体数が減少し、母植物自体は非複相胞子生殖であると結論付けられた。
【０２１６】
１．３  ＤＩＰ染色体領域の遺伝子マップ
単一用量の優性マーカー（単体、例えば００１）は、Ｗｕら（１９９２）に記載されている方法に従って、同質倍数体植物においてマッピングすることができる。Ｄｉｐ遺伝子座（Ｖｉｊｖｅｒｂｅｒｇら  ２００４）と密接に関連した７つのＡＦＬＰ（Ｖｏｓら  １９９５）マーカーは、ＴＪＸ３−２０×Ａ６８交配から７６個の三倍体後代植物にマッピングされた：（ＡＦＬＰプライマーコードについては、表１参照）Ｅ４０Ｍ６０−５０５（５０５は塩基対の断片サイズを示す；ショートコード：Ｓ４）、Ｅ３８Ｍ４８−２１５（Ｓ８）、Ｅ４２Ｍ５０−４４０（Ｓ７）、Ｅ３５Ｍ５２−２３５（Ｓ１０）、Ｅ３８Ｍ４８−２１５（Ｓ９）、Ｅ４５Ｍ５３−０９０（Ａ４）及びＥ３７Ｍ５９−１３５（Ａ５）。Ｄｉｐ遺伝子座を配置するために、三倍体後代植物を、上記の擬似試験交配法を用いて複相胞子生殖について表現型を決定した。表２は、ＤＩＰ染色体領域における組換え事象を伴う４つの三倍体後代植物（ＡＳ９９、ＡＳ１１２、ＡＳ１９３及びＡＳ１９６）の遺伝子型を示す。
【０２１７】
ＥｃｏＲＩ
【表１】
2018525995.tif 000002
【表２】
2018525995.tif 000003
実施例２：ＤＩＰ遺伝子座の欠失マッピング
２．１  アポミクシス欠失集団
ＴＪＸ３−２０×Ａ６８交配における種子結実は遺伝的に精細マッピングに必要な数千の種子を生成するには低すぎたため、代替方法が必要であった。したがって、この染色体領域の精細マッピングのために、欠失マッピング手法を使用した。ガンマ線照射は、組換えホットスポット又はコールドスポットにかかわらず、ゲノム全体にわたって可変サイズのランダムな欠失を引き起こす。ガンマ線照射の欠失は、ヤナギタンポポ属種のアポミクシス遺伝子のマッピングに首尾よく用いられている（Ｃａｔａｎａｃｈ  ＡＳ，Ｅｒａｓｍｕｓｏｎ  ＳＫ，Ｐｏｄｉｖｉｎｓｋｙ  Ｅ，Ｊｏｒｄａｎ  ＢＲ，Ｂｉｃｋｎｅｌｌ  ＲＡ（２００６）Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｐｏｍｉｘｉｓ  ｉｎ  Ｈｉｅｒａｃｉｕｍ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３（４９）：１８６５０−１８６５５）。最初に、クローンＡ６８に対するガンマ線照射の最適用量（５０％実生生存率）は、乾燥タンポポ属種子の曝露では６０Ｃｏ源（Ｉｓｏｔｒｏｎ  Ｂ．Ｖ．，Ｅｄｅ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって生じる１００〜８００グレイの範囲の一連の試験用量で決定された。最後の実験では、３×２０００個の種子に２５０Ｇｙの１／３、３００Ｇｙの１／３、４００Ｇｙの１／３の３種類の異なる線量を照射した。種子をペトリ皿中の湿ったろ紙上に置き、室温で発芽させた。計３０７５個の植物を温室内の鉢で栽培した（３５０個について２００Ｇｙ処置、１６００個について３００Ｇｙ処理、及び１１２５個について４００Ｇｙ処理）。植物を温めた温室内で２カ月間生育させた（日中２１℃、１６時間明、夜間１８℃）。次に、開花を誘導するために植物を２〜１０℃で２カ月間維持した。この春化期間の後、上記に示した条件で植物を温めた温室内で再び生育させた。植物の９０％以上が花開し、種子を生産した。植物は、アポミクシスの欠損表現型（ＬｏＡ）を示すか否かにかかわらず分類された。アポミクティックのＡ６８植物は種子を自発的に生産し、種子（植物学的用語では１つの種子をもつ果実）が花托に付着している濃い茶色の中心を有する大きな白い種子の頭部を形成する（図１Ａ参照）。
【０２１８】
アポミクシスの欠損表現型の場合、種子頭部の中心はより軽く、しばしば種子頭部は直径が小さくなる。これは種子が適切に発達しないためである。１３０００個を超える種子頭部は、アポミクシスの欠損表現型についてスクリーニングされた。最後に、１０２個の植物が、アポミクシスの欠損表現型として同定された。これらの植物のほとんどは、アポミクシスの欠損生殖とアポミクシスの種子頭部の両方を生産し、それらがキメラであることを示した。これは、照射された種子の茎分裂組織が多細胞系（Ｍ１世代）であったという事実に起因する。
【０２１９】
２．２  複相胞子生殖の欠損表現型決定
照射された植物におけるアポミクシスの欠損は、複相胞子生殖の欠損、単為生殖の欠損、又は他の原因に起因し得る。アポミクシスの欠損植物中の複相胞子生殖の欠損は、擬似試験交配によって検出された（上記参照）。複相胞子生殖の欠損植物はまた、低倍数の三倍体及び低三倍体の子孫を自発的に（したがって、いずれの他家受粉もなし；図１Ｂ参照）生産した。これは、これらの非Ｄｉｐ植物が単為生殖表現型を保持したためである。単為生殖は配偶体的に発現されるため、非複相胞子生殖植物の卵細胞に分離する。
【０２２０】
２．３  低解像度欠失マッピング
３つの相同染色体のうちの１つの一部が欠失した場合、欠失領域に位置する単回投与ＡＦＬＰ／ＳＣＡＲマーカーは失われる。１０２個のアポミクシスの欠損植物のうちのいずれがＤｉｐ遺伝子座の一部を失ったのかを決定するために、以下のＤｉｐ連結した単回投与マーカー：Ｓ８、Ｓ７、Ｓ９、Ｓ１０、Ａ４及びＡ５の存在／非存在を調査した。
【０２２１】
計２３個のアポミクシスの欠損植物は、これらのマーカーの２つ以上を失っていた。これらの植物の大部分は、複相胞子生殖の欠損として表現型としても示され得て、これは、Ｄｉｐ−遺伝子が欠失によって失われたことを確認した。失われたマーカーの数は、欠失のサイズの指標である（Ｃａｔａｎａｃｈら  ２００６）。植物ｉ１２４は、Ｓ９及びＡ４を除いて、これらのマーカーを全て保持し、この植物がＤｉｐ−遺伝子座において最小の欠失を有することを示唆した。最小の欠失を有する５つの植物（ｉ１２４を含む）を組織培養により非キメラにした。葉を滅菌し、外植片をインビトロで成長させて植物全体を再生させた。ＡＦＬＰ分析は、これらの植物が均質であり、依然としてＤＩＰ欠失を有することを確認した。
【０２２２】
実施例３：ＤＩＰ遺伝子座のＤＮＡ配列決定
３．１  欠失集団におけるＡＦＬＰマーカーを用いたＤＩＰ遺伝子座の精細マッピング
検出された最小のＤｉｐ欠失（ｉ１２４）内の新規なＡＦＬＰマーカーを見出すために、バルク分離分析（Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅら  １９９１）と同様に、新規なマーカースクリーニング戦略であるバルク欠失分析（ＢＤＡ）を開発した。３つのＤＮＡ試料である試料Ａ：最小のＤｉｐ欠失を有する植物由来のＤＮＡ（ｉ１２４）、試料Ｂ：Ｄｉｐ領域においてより大きい欠失を有する３つの植物のＤＮＡプール、及び試料Ｃ：照射されていないＡ６８クローン由来のＤＮＡをＡＦＬＰ断片の存在又は非存在について比較した。試料Ａと試料Ｂの両方に欠けているＡＦＬＰのみが最小の欠失に位置する。プールされた試料Ｂを考慮に入れて、Ｄｉｐ遺伝子座以外の欠失の選択を防止した。ＢＤＡからの候補ＡＦＬＰは、個々の複相胞子生殖の欠失植物において確認された。９６６個の異なるＡＦＬＰプライマーの組み合わせのスクリーニングにより、植物ｉ１２４のＤｉｐ欠失内に位置する３つの新規なＤｉｐ欠失マーカー（ＤＤ１：Ｅ４３Ｍ４０−６８、ＤＤ２：Ｅ４９Ｍ４２−２１５及びＤＤ３：Ｅ６０Ｍ４２−７６）がもたらされた。９６６個のＡＦＬＰプライマーの組み合わせを用いてスクリーニングされたＡＦＬＰマーカーの数及び３つの欠損したマーカーに基づいて、植物ｉ１２４におけるＤｉｐ欠失のサイズは４５０ｋｂ未満であると推定された。ＤＤ２マーカーは首尾よくクローニングされ、配列決定された（配列番号１２）。
【０２２３】
３．２  ＢＡＣランディング及びウォーキングによる遺伝子単離
アポミクティッククローンＡ６８のＤｉｐ−遺伝子座完全物理的ＢＡＣコンティグを構築するために、ＢＡＣライブラリーをスクリーニングした。Ａ６８のＢＡＣライブラリーは、Ａｒｉｚｏｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって構築され、ＡＧＩのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｒｉｚｏｎａ．ｅｄｕ／ｏｒｄｅｒｓ／）からＴＯ＿Ｂａとして入手することができる。このＢＡＣライブラリーは、１０ゲノム当量（タンポポ属種ゲノムサイズ：８３５Ｍｂ／１Ｃ）をカバーする１１３ｋｂの平均挿入サイズを有する。それは、ｐＡＧＩＢＡＣ１ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位に構築され、７３７２８のクローンを含有する。ＢＡＣインサートライブラリーを４つのナイロンフィルター上にダブルスポットした。ＢＡＣライブラリー中のクローン由来のＤＮＡもまたプールした（１９２個のスーパープール：３８４個のＢＡＣプレートプール；各プレートはまた９６個のＢＡＣ  ＤＮＡの４つのプールにプールされた）。プールされたＢＡＣ  ＤＮＡのＡＦＬＰ分析により、Ｓ１０、Ａ４、ＤＤ１、ＤＤ２及びＤＤ３マーカーを含むＢＡＣについてＢＡＣインサートライブラリーをスクリーニングした。ＢＡＣライブラリーはまた、ＤＤ２配列（配列番号１２）（Ｒｏｓｓら  １９９９）を用いて、ナイロンフィルターの過剰なハイブリダイゼーションによってもクリーニングされた。各マーカーについて、ＧＳ−ＦＬＸ配列技術を用いて完全に配列決定された１つのＢＡＣインサートを選択した。種菌ＢＡＣの末端を用いて新たな過剰プローブを開発することにより、ＢＡＣコンティグ（ＢＡＣウォーキング）を広げることが可能である。
【０２２４】
ＢＡＣウォーキングに加えて、Ａ６８  ＢＡＣライブラリーの物理的マップは、配列ベースのタグを用いて作成された（全ゲノムプロファイリング−Ｖａｎ  Ｏｅｖｅｒｅｎら  ２０１１）。ＢＡＣウォーキング及びＷＧＰマッピングは、ＤＩＰ領域について一貫したＢＡＣコンティグを与えた。フィンガープリントコンティグ（ＦＰＣ）ソフトウェアを使用して、共有されたＷＧＰタグに基づいて、最小限のＢＡＣタイリングパスを構築した。最小タイリングパスのＢＡＣは、ＧＳ  ＦＬＸ技術を用いて配列決定された。Ｎｅｗｂｌｅｒソフトウェアを使用して個々の４５４個の読み取りをアセンブルした。ほとんどの場合、２つのＢＡＣ変異体が見出され、その間に配列同一性は９５〜９９％の間で変動した。これらの変異体は、異なる対立遺伝子又はハプロタイプとして解釈された。ＤＤ２マーカー（配列番号１２）の存在は、Ｄｉｐとｄｉｐ  ＢＡＣ最小タイリングパスの間を区別した。
【０２２５】
３．３  ＢＡＣ最小タイリングパス上の欠失ブレークポイントのマッピング
欠失ブレークポイントをマッピングし、ｉ１２４における最小タイリングパスが最小のＤｉｐ欠失をカバーすることを確認にするために、ＰＣＲプライマーがＢＡＣ配列あたり１遺伝子に対して設計された。遺伝子はＰＣＲ増幅され、ＤＮＡはＡＢＩ  ３７３０ＸＬで直接サンガー配列決定された。これにより、多数の二重ピークを有する、Ａ６８のＡＢＩトレースファイルに複雑な生シーケンシングデータが生成された。しかしながら、ｉ１２４において、パターンがしばしば簡略化され、Ａ６８パターンのサブセットであり、これは、対立遺伝子（最も相違するもの）のうちの１つが欠失される場合に予想される。遺伝子の配列パターンがＡ６８とｉ１２４の両方に二重のピークを有する場合、この遺伝子はｉ１２４において欠失していないと結論付けた。最小タイリングパスの中央にあるＢＡＣが欠失遺伝子を示すことが多いが、一方、末端のＢＡＣは欠失の兆候を示さなかった。したがって、最小タイリングパスがｉ１２４における欠失に広がっていると結論付けられた。
【０２２６】
実施例４．Ｄｉｐ−遺伝子座内の複相胞子生殖遺伝子の偏りのない同定
４．１  ＥＭＳアポミクシスノックアウトの生成
本発明者らは、タンポポ属種のアポミクシスが遺伝的に制御されている場合、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）などの変異原によってノックアウト突然変異を生成することが可能であると推論した。本発明者らはＤｉｐ遺伝子座内の遺伝子を予測することができたため、複相胞子生殖の欠失の突然変異体のＤｉｐ遺伝子座における遺伝子を再度配列決定することによってＤｉｐ−遺伝子を同定することが可能であるはずである。本発明者らがいくつかの複相胞子生殖の突然変異体を発見した場合、同じ遺伝子（Ｄｉｐ遺伝子）に突然変異を有することが必要であるが、一方、Ｄｉｐ遺伝子座における遺伝子の突然変異であるが、複相胞子生殖表現型に関係しない突然変異は富化されない。したがって、これは機能的Ｄｉｐ遺伝子を同定する。
【０２２７】
ＥＭＳアポミクシスノックアウトを生成するために、１８００個の植物が、０．３５パーセントＥＭＳで１６時間、室温で処理したＡ６８種子から生育された。結実後に、複相胞子生殖の欠失表現型について植物をスクリーニングした（説明については上記を参照されたい）。合計６つの推定されるＤＩＰの欠失突然変異体（ＬｏＤ１からＬｏＤ６）を検出したが、それらのうちの２つであるＬｏＤ３及びＬｏＤ５において、擬似試験交配において種子を生産しなかった。ＬｏＤ植物は単為生殖のために分離されているため、いくつかの生存可能なＭ２種子が生産され、これらのＭ２植物が生育された。本発明者らが知る限り、アポミクシスの欠失の突然変異体がＥＭＳ処置によって首尾よく作製されたのは初めてのことである。他の種のＥＭＳ処置によるアポミクシスの欠失を生成する試みは上手くいかなかった（Ａｓｋｅｒ及びＪｅｒｌｉｎｇ  １９９０，Ｐｒａｅｋｅｌｔ及びＳｃｏｔｔ  ２００１）。
【０２２８】
４．２  アポミクシスの欠失のＥＭＳ突然変異体における複相胞子生殖の欠失の物理的間隔マップにおいて予測される遺伝子のハイスループットの再度の配列決定
オーガスタス属種（Ａｕｇｕｓｔｕｓ）遺伝子予測ソフトウェア（Ｓｔａｎｋｅ  Ｍ．，Ｒ  Ｓｔｅｉｎｋａｍｐ，Ｓ  Ｗａａｃｋ及びＢ  Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ（２００４）”ＡＵＧＵＳＴＵＳ：ａ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｆｉｎｄｉｎｇ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３２，Ｗ３０９−Ｗ３１２）を用いて、Ｄｉｐ及びｄｉｐＢＡＣ最小タイリングパス（上記参照）における遺伝子は、シロイヌナズナ属種遺伝子モデルを用いて予測された。遺伝子注釈は、閾値として４０％のタンパク質同一性を有する、ＮＣＢＩからの非重複データベースに対して予測されたタンパク質配列をＢＬＡＳＴ処理することによって実施された。合計１２９個のタンポポ属種遺伝子がＤｉｐにおいて予測され、ｄｉｐＢＡＣ最小タイリングパスリーフ材料は、タンポポ属種Ａ６８、Ａ６８  ＬｏＤ１から６つのＥＭＳ突然変異体及びＬｏＤ欠失系統（Ａ６８  ｉ１２４）から回収された。ＣＴＡＢ手順（Ｒｏｇｓｔａｄ  １９９２）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。標準的な手順を使用して、ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａ（ＢＧＭ  ＬＡＢＴＨＥＣ）上でＱｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＴＭＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＤＮＡ試料を定量した。ＤＮＡ試料を２０ｎｇ／μｌの濃度に希釈し、続いてＬｏＤ試料をプールして２つのプール（プールＡ＝ＬｏＤ１＋ＬｏＤ２＋ＬｏＤ３；プールＢ＝ＬｏＤ４＋ＬｏＤ５＋Ｌｏｄ６）を生成した。
【０２２９】
１２９個の予測された遺伝子のＰＣＲ増幅用に特異的プライマーを設計して、主にそれらのコード配列を標的化した。合計２９５個のプライマー対を設計した。タンポポ属種のアポミクティックＡ６８クローンであるＡ６８＿ｉ１２４欠失系統（ＬｏＤ表現型）並びにＡ６８  ＬｏＤ  ＥＭＳ突然変異体プールＡ及びＢは、ＥＭＳ突然変異体表現型をＥＭＳ突然変異と関連させて、したがってＤＩＰ遺伝子（複数可）を同定する目的で、アンプリコンスクリーニングの標的として選択された。
【０２３０】
選択された各標的から２９５個のアンプリコンをＰＣＲ反応によって生成させた。各々の試料について８０ｎｇのＤＮＡ、５０ｎｇのフォワードプライマー、５０ｎｇのリバースプライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１ＵのヘラクレスＨＩＩ融合ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及び１×ヘラクレスＨＩＩ反応バッファーを含む５０μｌのＰＣＲ反応を行った。以下の温度プロファイル：９５℃で２分間、続いて９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で３０秒間の３５サイクル、続いて４℃まで冷却するＰＣＲを行った。試料からの等量のＰＣＲ産物をＧＳ  ＦＬＸ断片ライブラリー試料に使用した。
【０２３１】
アンプリコンスクリーニングは、個々のＤＮＡ分子の大規模並列ピコリットルスケール増幅及びパイロシーケンシングを可能にするゲノムシーケンサー（ＧＳ）ＦＬＸ＋ＰＬＡＴＦＯＲＭ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行われた。標準的なＲｏｃｈｅプロトコールを用いて、アンプリコン試料ライブラリーを構築した。ライブラリーの作成中にバーコード（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ，ＭＩＤｓ）が追加された。同時増幅及び配列決定（多重化）のために、ＭＩＤタグ化された試料をプールした。２つの領域を有する１つの完全なピコタイタープレート（ＰＴＰ）（７０×７５ｍｍ）を、アンプリコンライブラリー（Ａ６８、Ａ６８＿ｉ１２４、Ａ６８＿ＥＭＳプールＡ及びＢ）の配列決定に使用した。配列決定は、製造業者の指示（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に従って実施された。
【０２３２】
突然変異スクリーニングのバイオインフォマティクス分析は、５つの部分から構成された：
（１）Ｒｏｃｈｅ  ＧＳ  ＦＬＸ＋ソフトウェアを用いたＧＳ  ＦＬＸ＋データ処理。ベースと呼ばれる読み取りは、品質のためにトリミング及びフィルタリングされ、ＦＡＳＴＡ形式に変換された。
（２）試料処理。配列読み取りの起点は、特定のバーコードに基づいて同定された。バーコード配列をトリミングし、各試料の配列読み取りを別々にデータベースに保存した。
（３）アンプリコン処理。アンプリコンの起点は、標的特異的プライマー配列に基づいて同定された。１アンプリコンあたりの配列読み取りはＣＡＰ３（９５％相同性、４０ヌクレオチドオーバーラップ）を用いてクラスター化された。
（４）多型検出。各々クラスター化されたアンプリコン中の全ての潜在的なＳＮＰ及びＩＮＤＥＬＳの同定。
（５）ＥＭＳ  ＳＮＰの検出。ＥＭＳ処理によって誘導されたＳＮＰの同定。このようなＳＮＰは、ＥＭＳ突然変異体植物（ＥＭＳプールＡ又はＢ）においてのみ期待される。６つの独立したＥＭＳ突然変異体がプールされ（プールＡでは３つ、プールＢでは３つ）、ＥＭＳ誘導性ＳＮＰはプールＡ又はＢのいずれかで検出されるが、両方では検出されないことを考慮する。以下のパラメータと一致する場合、ＳＮＰは真のＥＭＳ−ＳＮＰとみなされた：（ａ）Ａ６８及びＡ６８＿ｉ１２４に存在しない；（ｂ）プールＡ又はプールＢのいずれかで検出された。
【０２３３】
合計６つの推定されるＥＭＳ突然変異（Ｃ→Ｔ又はＧ→Ａ）が同定され、そのうちの４つは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の液胞タンパク質選別（ＶＰＳ）１３様タンパク質（ｇｉ｜１０１２９６５３｜ｅｍｂ｜ＣＡＣ０８２４８．１｜）と非常に高いタンパク質ＢＬＡＳＴ相同性を有する単一遺伝子において見出された（表３）。
【０２３４】
【表３】
2018525995.tif 000004
これは、再度配列決定された全ヌクレオチドの１１％に対応する、配列決定された２９５個のエキソンのうちの３４個を表す大きな遺伝子である。原因Ｄｉｐ遺伝子の突然変異の富化は、複相胞子生殖の欠失表現型の選択により期待される。４つ全てのＴｏＶｐｓ１３  ＥＭＳ突然変異はＤｉｐハプロタイプにあり、いずれもｄｉｐハプロタイプにはなかった。本発明者らは、配列決定された遺伝子に対するこの突然変異の分布が、以下のように偶然に起因する確率を計算する。予測されるＴｏＶｐｓ１３のサイズは、再度配列決定された全領域の１１％である。３つのハプロタイプが存在するため、単一のＴｏＶｐｓ１３ハプロタイプのサイズは、再度配列決定された全領域の３．７％である。最初のＥＭＳ突然変異体がＤｉｐハプロタイプに位置する確率は０．３３である。第２、第３及び第４のＥＭＳ突然変異が同じハプロタイプにおいて同じ遺伝子に位置する確率は、０．０３７×０．０３７×０．０３７＝５．１×１０−５である。最初のＥＭＳ突然変異が右ハプロタイプであり、同じＤＮＡ領域における同じハプロタイプの第２、第３及び第４である組み合わせ確率は、０．３３×５．１＊１０−５＝１．６７×１０−５である。また、これは他のＤＮＡ領域でも起こり得るため、再度配列決定された領域全体にわたる確率は１００／１１×１．６７×１０−５＝１．５４＊１０−４＝である。したがって、この分布が偶然に起因する確率は１０，０００中１．５４である。結果として、Ｖｐｓ１３配列は、複相胞子生殖に関与している可能性が非常に高い。
【０２３５】
２つのＬｏＤ植物において、第２のＥＭＳ突然変異は、再度配列決定された領域において見出され、１つはオリゴペプチドトランスポーターにあり、もう１つは推定されるトランスポーター遺伝子にある。両方の場合において、突然変異はＤｉｐハプロタイに存在せず、ｄｉｐハプロタイプに存在した。したがって、本発明者らは、これらの２つのＥＭＳ突然変異が複相胞子生殖表現型に関連していないと結論付ける。推定されるＬｏＤ３及びＬｏＤ５植物において、再度配列決定された領域にＥＭＳ突然変異は検出されなかった。これらの植物は擬似試験交配で子孫を生産せず（上記参照）、アポミクシスの欠失の突然変異というよりはむしろ、雌性不稔性突然変異であった可能性がある。
【０２３６】
実施例５．無関係な有性及びアポミクティックタンポポの広いパネルにおけるＤＩＰ遺伝子座の関連性マッピング
複相胞子生殖表現型における配列番号１の関与のさらなる証拠を提供するために、配列番号４の配列と複相胞子生殖の間の関連性を、アポミクティック（＝複相胞子生殖）植物のパネル、及び有性（＝減数分裂）植物のパネルにおいて調査した。両方のパネルは、地理的起源及び分類学的グループ（タンポポ属の様々な節及び様々な種）に関して、できるだけ多様な１３個の無関係な植物で構成された。倍数性レベルは、Ｔａｓ及びＶａｎ  Ｄｉｊｋ（１９９９，Ｈｅｒｅｄｉｔｙ  ８３：７０７−７１４）に記載されている方法に従って、フローサイトメトリーによって決定された。育種システムは、受粉媒介者から隔離した際の種子結実によって決定された：アポミクトは、隔離下で完全な種子結実を生産し、有性体は、隔離下で種子を生産しない。配列番号４の部分は、１〜３００ｎｔ又は７〜５８６ｎｔのいずれかに再度配列決定され、第１は、Ｉｌｌｕｍｉａ対末端配列決定によるものであり、第２は、ゲノムシーケンサー（ＧＳ）ＦＬＸ＋ＰＬＡＴＦＯＲＭ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）によるものである。配列は、標準設定でＤｅｃｙｐｈｅｒ（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ）を用いて配列番号４に対するヌクレオチドＢＬＡＳＴを用いて分析された。表４において、植物あたり最高のヌクレオチド配列同一性及び最小のＥ値が示されている。この表から、全てのアポミクトは配列番号４の配列決定された領域を有し、一方、有性体はいずれもこのＤＮＡ断片を有しないことは明らかである。したがって、この配列と複相胞子生殖の間には、最大の連鎖不均衡が存在する。組換え及び突然変異誘発は、ヌクレオチド領域が複相胞子生殖に機能的に関与していない場合、経時的にヌクレオチド領域と複相胞子生殖の間の連鎖不均衡を侵食する。したがって、大きな地理的及び分類学的規模でのアポミクシスと配列番号４の間の完全な関連性は、この配列が複相胞子生殖に必須であることを確実にする。
【０２３７】
【表４】
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実施例６．アポミクトの大胞子母細胞及び準同質遺伝子の複相胞子生殖の欠失の突然変異体におけるＤＩＰ遺伝子の発現
ＤＩＰ候補遺伝子の発現を研究する目的で、ＲＮＡｓｅｑは、アポミクティック（Ａ６８）及び同質遺伝子の欠損系（ｉ１２４）の単離された大胞子母細胞（ＭＭＣ）及び雌性配偶体（ＦＧ）から実施された。パイロット研究により、芽が植物のロゼットにまだ残っている場合、茎伸長の前に、非常に若い花序（約０．５ｃｍ径）の芽に、タンポポ属種に大胞子形成が起こることが明らかになった。後期段階（雌性配偶体；ＦＧ）について、芽を茎長１ｃｍで収穫した。
【０２３８】
新鮮な子房を切り開き、ペクチナーゼ、ペクトリアーゼ、ヘミセルラーゼ及びセルラーゼのマンニトール混合物中に浸軟させた。針を用いた手動による微小切開により、胚珠を周囲組織から分離した。ＣｅｌｌＴｒａｍ（登録商標）Ｏｉｌデバイス（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、単離された胚珠を２０個の胚珠のバッチで収穫し、さらなる処理まで−８０℃の冷凍庫で直ちに凍結した。Ａｒｃｔｕｒｕｓ（登録商標）Ｐｉｃｏｐｕｒｅ（登録商標）ＲＮＡ単離キットを用いて、２０個の胚珠のプールからＲＮＡを抽出した。Ａｍｂｉｏｎ  ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）ＩＩ  ａＲＮＡ増幅キットを用いて、インビトロ逆転写によりＲＮＡを直線的に増幅させた。同じ遺伝子型及び組織由来の２０個の胚珠の様々なプールを生物学的複製物とみなした。
【０２３９】
合計１０個の試料を６個のＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑレーン（Ａ６８  ＭＭＣの３つの生物学的複製物、ＦＧの３つの生物学的複製物及びＭＭＣ  ｉ１２４の４つの生物学的複製物）において配列決定した。試料ごとに、重複する読み取り対をＦＬＡＳＨソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｃｃｂ．ｊｈｕ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＦＬＡＳＨ／）を使用して重ね合わせた。重ね合わせた（フィルタリングされていない）読み取りをＴｒｉｎｉｔｙソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｔｒｉｎｉｔｙｒｎａｓｅｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）を使用してアセンブルした。各試料について、転写物の存在量をＴｒｉｎｉｔｙの「ＲＳＥＭを用いた存在量推定」プロトコール（ｈｔｔｐ：／／ｔｒｉｎｉｔｙｒｎａｓｅｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ａｎａｌｙｓｉｓ／ａｂｕｎｄａｎｃｅ＿ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）に従って推定した。次に、差別的に発現されたアイソフォームは、「差別的に表現されたトリニティ転写物の同定」プロトコール（ｈｔｔｐ：／／ｔｒｉｎｉｔｙｒｎａｓｅｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ａｎａｌｙｓｉｓ／ｄｉｆｆ＿ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＿ａｎａｌｙｓｉｓ．ｈｔｍｌ）に従って同定された。
【０２４０】
デノボでアセンブルされた発現遺伝子の中で、４０個を超える減数分裂遺伝子が検出され（例えば、Ｄｍｃ１，Ｓｐｏ１１，Ｒａｄ５０）、正しい胚珠段階のＭＭＣ及びＦＧが研究されたことが示された。配列番号４はデノボでアセンブルされ、ＭＭＣとＦＧ段階の両方において中程度の発現レベルで単為生殖Ａ６８において発現されることが示された。表５において、この発現は、ＦＰＫＭ値（マッピングされた百万個の読み取りあたりの特徴キロベースあたりの断片（Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  Ｐｅｒ  ｆｅａｔｕｒｅ  Ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｐｅｒ  Ｍｉｌｌｉｏｎ  ｒｅａｄｓ  ｍａｐｐｅｄ））として定量される。欠失突然変異体ｉ１２４において、配列番号４は発現されないが、その複相胞子生殖相同体Ａ６８は発現される。したがって、発現データは、Ｖｐｓ１３遺伝子が欠失にあり、ＭＭＣ及びＦＧ発生段階で発現することを確認する。
【０２４１】
これまでに行われた発現及び関連性マッピング分析は、Ｖｐｓ１３遺伝子の３’末端として現在注釈されている配列番号４に示される核酸分子が、サッカロミセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）の胞子形成遺伝子Ｓｐｏ２に類似した、Ｖｐｓ１３遺伝子の新規遺伝子として又はディファレンシャルスプライシング変異体として独立して転写されることを示す。Ｓｐｏ２遺伝子は、Ｓ．ポンベのＶｐｓ１３遺伝子の最後のエキソンであると誤って注釈された１３３アミノ酸残基で構成される１５ｋＤａのタンパク質をコードする。実際、Ｓｐｏ２遺伝子は、Ｖｐｓ１３遺伝子のすぐ下流にあり、独立して転写される（Ｎａｋａｓｅら  ２００８，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ．Ｖｏｌ．１９，２４７６−２４８７）。
【０２４２】
配列番号５のｍＲＮＡ配列がＡＴＧ開始コドンを含まず、可能な翻訳されたオープンリーディングフレームが短いことは注目すべきことである。しかし、出芽酵母（サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））におけるリボソームプロファイリングを使用して、Ｂｒａｒ研究室（カリフォルニア大学バークレー校、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎａｌ−ａｎｄ−ｂｒａｒ−ｌａｂｓ．ｏｒｇ／ｂｒａｒ−ｓｏｒｆｓ）は、減数分裂中の数千個の新規な短鎖ペプチド非正規の翻訳を同定している。これらの減数分裂特異的に発現される短鎖オープンリーディングフレーム（ｓＯＲＦ）は、ＡＴＧ開始コドンを有さず、それらの翻訳されたペプチドは８０アミノ酸より短く、したがって、標準遺伝子ソフトウェアによって予測されない。ｓＯＲＦは、以前には、発現配列を含むことが知られていない領域に位置する。ｓＯＲＦはまた、公知の機能を有するタンパク質の短い代替アイソフォームであり得る。減数分裂中のこれらの短鎖ペプチドの存在は、古典的方法によって確認されている。しかしながら、これらの何千個のこれらの短い減数分裂特異的ペプチドの機能は謎のままである。
【０２４３】
【表５】
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実施例７．シロイヌナズナにおけるＴｏＤＩＰ及びＴｏｄｉｐの過剰発現
人工ＡＴＧ開始コドンが先行するＴｏＤＩＰ配列断片（配列番号１１）及び人工ＡＴＧ開始コドンが先行するＴｏｄｉｐ配列断片（配列番号９）を、３５Ｓプロモーターを有するベクターにクローニングした。これらの構成的過剰発現ベクターを用いて、３つの独立したシロイヌナズナ属種フローラルｄｉｐ形質転換実験を行った。各実験において、各対立遺伝子について１５〜３０個のＴ０植物が得られた。
【０２４４】
３５Ｓ：：Ｔｏｄｉｐ過剰発現形質転換体は野生型植物と区別がつかず、完全に受粉可能であった。対照的に、３つの実験の全てにおける３５Ｓ：：ＴｏＤＩＰ過剰発現形質転換体のうち、一部の植物は部分的に無菌であった（第１の実験では形質転換体の２０％、第２及び第３の実験では１０％）。
【０２４５】
大胞子母細胞（ＭＭＣ）及び雌性配偶体（ＦＧ）の発生は、Ｙａｄｅｇａｒｉ，Ｒら（１９９４）の方法（Ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｒｅ  ｕｎｃｏｕｐｌｅｄ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｒａｓｐｂｅｒｒｙ  ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，６，１７１３−１７２９）を用いた透明な胚珠のノマルスキー顕微鏡検査によって調べられた。調査された全ての３５Ｓ：：ｄｉｐ形質転換体におけるＭＭＣ及びＦＧ発生は、野生型シロイヌナズナ属種植物のように正常に見えた。しかしながら、３５Ｓ：：ＴｏＤＩＰ植物は、多くの場合、異常な大胞子母細胞、大胞子に隣接する余分な小核、並びにＦＧ１段階での停止のような破壊されたＦＧ発生、液胞の欠如及び崩壊した胚嚢を示した。雌性及び雄性の減数分裂に影響を与えるシロイヌナズナ属種のダイアド突然変異（Ｒａｖｉ  Ｍら（２００８）Ｇａｍｅｔｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｍｅｉｏｓｉｓ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５１：１１２１−１１２４）において、ＦＧ発生の同様の障害が観察された。したがって、観察された３５Ｓ：：ＴｏＤＩＰ異常ＭＭＣ及びＦＧ表現型は、破壊された雌性減数分裂の存在を示している可能性がある。
【０２４６】
これらのＴｏＤＩＰ表現型は、それらがヘミ接合性Ｔ０において観察されたため優性であった。これは、タンポポ属種におけるＤＩＰ対立遺伝子の優性と一致する。第１の実験では、一部の植物において花粉の発生はまた影響を受けていた（余分な核）が、第２及び第３の実験では花粉の発生は正常に見えた。少なくとも第２及び第３の実験では、ＤＩＰ構築物の表現型効果は、雌性減数分裂特異的であり、これはタンポポ属種のＤＩＰ機能と一致する。
【０２４７】
結論として、タンポポ属種ＤＩＰ対立遺伝子は、異種植物種において減数分裂に雌性特異的優性を生じることが見出された。タンポポ属種のｄｉｐ対立遺伝子についてはこの効果は見られなかった。シロイヌナズナ属種の過剰発現表現型は、ＤＩＰ配列がタンポポ属種における複相胞子生殖表現型を引き起こしているという強力な支持的証拠を提供する。
【０２４８】
実施例８．タンポポ属種におけるＤＩＰ遺伝子の機能性
配列番号４の複相胞子生殖機能をさらに確認するために、ＤＩＰ対立遺伝子が欠失しているタンポポ属ｉ１２４植物を配列番号４を含むプラスミドで形質転換し、適切なベクター中の様々なプロモーター及び調節エレメントと融合する。以下のプロモーター配列を使用する：
１．配列番号４の天然のタンポポ属種プロモーター（配列番号１の約１５００ｂｐ、配列番号４の上流）
２．シロイヌナズナ属種Ｄｍｃ１（Ａｔ３ｇ２２８８０）のタンポポ属種オルソログのプロモーター（Ｋｌｉｍｙｕｋ  Ｖ．Ｉ．及びＪｏｎｅｓ  Ｊ．Ｄ．１９９７．ＡｔＤＭＣ１，ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ＤＭＣ１  ｇｅｎｅ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｉｏｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．：１１：１−１４）。この遺伝子は、減数分裂特異的プロモーターを有する。
３．３５Ｓプロモーター。このプロモーターは、配列番号４の過剰発現をもたらす。タンポポ属種植物の形質転換のためのプロトコールは、Ｗａｈｌｅｒら  ２００９（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．１５１，ｐｐ．３３４−３４６）によって公開されている。ｉ１２４はアポミクシスの他の全てのエレメントを持っているため、複相胞子生殖の相補性は、この三倍体植物の高い種子結実によって及びＴ１後代の遺伝マーカーによって容易に決定することができるアポミクシスを修復する。後代植物は、母系マーカーの分離を伴わない、完全な母系ゲノムを含む。
【０２４９】
実施例９  形質転換による有性作物における複相胞子生殖の導入
イネ及びレタスの有性二倍体植物は、それぞれ、Ｄｒｅｎｉ，Ｌら  ２０１１（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２３：２８５０−２８６３）及びＤｉａｓ，Ｂ．Ｂ．Ａ．ら  ２００６（Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ５５：１８７−１９３）のプロトコールに従って形質転換のために使用される。実施例８に開示されているプロモーター及び配列番号４と同じ構築物を使用する。二倍体花粉ドナーを有するＴ０複相胞子生殖植物を交配した後、三倍体子孫が生産される。三倍体は、根端染色体数又はフローサイトメトリーによって決定することができる。両者は、標準的な方法である（Ｔａｓ及びＶａｎ  Ｄｉｊｋ  １９９９，Ｈｅｒｅｄｉｔｙ  ８３：７０７−７１４）。複相胞子生殖のさらなる証拠は、遺伝子マーカーの後代植物の解析において見出すことができる。父系マーカーに加えて、後代は完全な母系遺伝子型を有する。
【０２５０】
実施例１０．ゲノム編集による有性作物における複相胞子生殖の導入
ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９、ＴＡＬＥＮＳ及びＺＦＮ（亜鉛フィンガーヌクレアーゼ）などの標的化されたゲノム編集技術は、既存の遺伝子に突然変異を生成するために当該技術分野において一般的に用いられている。ノックアウト対立遺伝子を作製することによるだけでなく、いわゆる「修復ＤＮＡ」によってコードされる突然変異を導入することにもよる（例えば、Ｄｏｕｄｎａ  Ｊ．Ａ．及びＧｅｒｓｂａｃｈ  Ｃ．Ａ．２０１５  Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ：ｔｈｅ  ｅｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）２０１５１６：２９２、及びそこに引用されている参考文献）。
【０２５１】
このようなＤＮＡのストレッチは、典型的には、変更された遺伝子機能をもたらす変更が導入された（標的）遺伝子配列の断片をコードする。典型的には、このような配列は、相同組換えによってゲノム編集事象において標的化された遺伝子配列を置換し、それにより宿主細胞、例えば植物細胞のゲノムにおいて標的化された方法で最適な突然変異を導入する。
【０２５２】
この実施例は、ＤＩＰへの機能的変化をもたらす所与の植物種におけるｄｉｐ相同体への変更の導入、すなわち、優性な複相胞子生殖（ＤＩＰ）対立遺伝子による、天然に存在する劣性の非複相胞子生殖対立遺伝子の機能の変更の導入を包含する。
【０２５３】
Ｄｉｐ相同体は、多数の植物種において容易に同定される。タンポポ属種系の「修復」プラスミド設計を用いたＣＲｉＳＰＲ  ＣＡＳ媒介ゲノム編集は、タンポポ属種ＤＩＰとｄｉｐ対立遺伝子の間の相違に合わせてＳＮＰ及びインデルを単純に改変することによって、天然のｄｉｐ相同体をそのＤＩＰ同胞に変換することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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