(57)【要約】  Ａ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する第１の結合ドメイン及びＢ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する第２の結合ドメインを有する結合分子を含む、少なくとも２つの抗インフルエンザ結合ドメインを含む二重特異性抗体を含む結合分子が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、且つＡ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのグループ１サブタイプ及び少なくとも１つのグループ２サブタイプを中和する能力がある第１の結合ドメイン；及び
（ｂ）Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、且つ少なくとも２つの系統学的に異なる系統におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する能力がある第２の結合ドメイン
を含む、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する単離された結合分子。
【請求項２】
前記第１の結合ドメインが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８及びそれらの変異体から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプ；並びにＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５及びそれらの変異体から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのグループ２サブタイプを中和する能力がある、請求項１に記載の単離された結合分子。
【請求項３】
前記第２の結合ドメインが、Ｙａｍａｇａｔａ及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統の双方におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する能力がある、請求項１〜２のいずれか一項に記載の単離された結合分子。
【請求項４】
前記第１の結合ドメインが抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合断片を含み、且つ前記第２の結合ドメインが抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された結合分子。
【請求項５】
前記第１の結合ドメインが、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、ここで６つのＣＤＲセットが、
（ａ）配列番号８のＨＣＤＲ１、配列番号９のＨＣＤＲ２、配列番号１０のＨＣＤＲ３、配列番号３のＬＣＤＲ１、配列番号４のＬＣＤＲ２及び配列番号５のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；及び
（ｂ）配列番号１８のＨＣＤＲ１、配列番号１９のＨＣＤＲ２、配列番号２０のＨＣＤＲ３、配列番号１３のＬＣＤＲ１、配列番号１４のＬＣＤＲ２、配列番号１５のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された結合分子。
【請求項６】
前記第１の結合ドメインが、
（ａ）配列番号７のＶＨ及び配列番号２のＶＬ；及び
（ｂ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ
から選択されるＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列の各々に対して少なくとも７５％同一であるＶＨ及びＶＬを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離された結合分子。
【請求項７】
前記第２の結合ドメインが、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、ここで６つのＣＤＲセットが、
（ａ）配列番号２８のＨＣＤＲ１、配列番号２９のＨＣＤＲ２、配列番号３０のＨＣＤＲ３、配列番号２３のＬＣＤＲ１、配列番号２４のＬＣＤＲ２及び配列番号２５のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２、配列番号４６のＨＣＤＲ３、配列番号３９のＬＣＤＲ１、配列番号４０のＬＣＤＲ２及び配列番号４１のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；及び
（ｃ）配列番号６０のＨＣＤＲ１、配列番号６１のＨＣＤＲ２、配列番号６２のＨＣＤＲ３、配列番号５５のＬＣＤＲ１、配列番号５６のＬＣＤＲ２、配列番号５７のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された結合分子。
【請求項８】
前記第２の結合ドメインが、
（ａ）配列番号２７のＶＨ及び配列番号２２のＶＬ；
（ｂ）配列番号３３のＶＨ及び配列番号３２のＶＬ；
（ｃ）配列番号３６のＶＨ及び配列番号３５のＶＬ；
（ｄ）配列番号４３のＶＨ及び配列番号３８のＶＬ；
（ｅ）配列番号４９のＶＨ及び配列番号４８のＶＬ；
（ｆ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ；
（ｇ）配列番号５９のＶＨ及び配列番号５４のＶＬ；並びに
（ｈ）配列番号６５のＶＨ及び配列番号６４のＶＬ
から選択されるＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列の各々に対して少なくとも７５％同一であるＶＨ及びＶＬを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された結合分子。
【請求項９】
前記結合分子が二重特異性抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離された結合分子。
【請求項１０】
前記第１の結合ドメインが抗Ａ型インフルエンザウイルスのＦｖドメインを含み、且つ前記第２の結合ドメインが抗Ｂ型インフルエンザウイルスのｓｃＦｖ分子を含む、請求項９に記載の単離された結合分子。
【請求項１１】
前記第１の結合ドメインの前記Ｆｖドメインが、アミノ末端及びカルボキシ末端を有するポリペプチド鎖を含む重鎖（ＨＣ）並びにアミノ末端及びカルボキシ末端を有するポリペプチド鎖を含む軽鎖（ＬＣ）を含み、
（ａ）前記第２の結合ドメインは前記第１の結合ドメインのＨＣのカルボキシ末端に共有結合されるか；
（ｂ）前記第２の結合ドメインは前記第１の結合ドメインのＨＣのアミノ末端に共有結合されるか；
（ｃ）前記第２の結合ドメインは前記第１の結合ドメインのＬＣのアミノ末端に共有結合されるか；又は
（ｄ）前記第２の結合ドメインは前記第１の結合ドメインのＨＣのポリペプチド鎖内で共有結合的にインターカレートされる
請求項１０に記載の単離された結合分子。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離された結合分子をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離された結合分子及び薬学的に許容できる担体を含む組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離された結合分子を作製するための方法であって、宿主細胞を前記結合分子の発現に適した条件下で培養するステップを含む、方法。
【請求項１７】
被験者におけるＡ型インフルエンザ感染、Ｂ型インフルエンザ感染、又はそれらの組み合わせの予防又は治療のための方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の単離された結合分子を有効量で前記被験者に投与するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年６月１日に出願された米国仮特許出願第６２／１６９，２７２号明細書の利益を主張し、その開示内容はその全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
電子的に提出された配列表の参照
２０１６年５月３１日に作成され、ＦＬＵＡＢ＿１００ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称が与えられ、本願とともに出願された１６２，３１５バイトのサイズを有するＡＳＣＩＩテキストファイルで電子的に提出された配列表の中身は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００３】
本発明は、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスに対して広範な中和活性を有する二重特異性抗体及びかかる抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）は、毎年のインフルエンザ流行病や偶発的な世界的大流行を引き起こし、世界規模で公衆衛生に多大な脅威をもたらしている。季節性インフルエンザ感染は、毎年、特に幼児、易感染性患者及び高齢者における２００，０００〜５００，０００人の死亡に関連している。死亡率は、典型的には、パンデミックインフルエンザの大流行に伴い、季節を通じてさらに増加する。特に十分なサービスを受けていない集団においてインフルエンザ感染を予防し、治療するための強力な抗ウイルス薬という多くの満たされていない医学的需要が残っている。
【０００５】
インフルエンザウイルスには、Ａ型、Ｂ型及びＣ型の３つの型が存在する。インフルエンザ疾患の大部分は、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスによって引き起こされる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  ＪＡＭＡ．２９２：１３３３−１３４０；及びＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５４：１４２７−１４３６）。Ａ型、Ｂ型及びＣ型インフルエンザウイルスの全体構造は類似しており、中心コアを囲むウイルスエンベロープを含む。ウイルスエンベロープは、２つの表面糖タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含み、ＨＡはウイルスの標的細胞への結合及び標的細胞への侵入を媒介する一方、ＮＡは子孫ウイルスの感染細胞からの放出に関与する。
【０００６】
ＨＡタンパク質は、宿主細胞受容体への結合並びにウイルスと宿主細胞膜との融合に関与し、保護的体液性免疫応答の一次標的である。ＨＡタンパク質は構造が三量体であり、タンパク質分解成熟時、球状頭部（ＨＡ１）及びストーク領域（ＨＡ２）を有する準安定な中間体に切断される単一のポリペプチド前駆体ＨＡ０の３つの同一コピーを含む（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）  Ｎａｔｕｒｅ．２８９：３６６−３７３）。膜遠位の球状頭部は、ＨＡ１構造の大部分を構成し、ウイルス侵入及び主要な抗原ドメインに対するシアル酸結合ポケットを有する。ＨＡ２及びＨＡ１残基から構築される膜近位「ストーク」構造は、膜融合及び細胞への透過性を誘発するための、後期エンドソームの低ｐＨ環境下での立体構造変化を経る融合機構を含む。Ａ型インフルエンザのサブタイプ間の配列相同性の程度は、ＨＡ１（サブタイプ間で３４％〜５９％の相同性）での方がＨＡ２領域（５１％〜８０％の相同性）でよりも小さい。
【０００７】
Ａ型インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子における遺伝的変異に基づくサブタイプに分類され得る。血清学的に、Ａ型インフルエンザは、１８のＨＡサブタイプに分割することができ、それらは２つの異なる系統学的グループ：グループ１（サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７及びＨ１８）及びグループ２（サブタイプＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、及びＨ１５）にさらに分割される。現在、季節性の流行病では、Ａ型インフルエンザＨ１及びＨ３のＨＡサブタイプが主にヒト疾患に関連する一方、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９及びＨ１０をコードするウイルスは、動物からの直接感染に起因する孤発性のヒトでの大流行を引き起こす。Ａ型インフルエンザウイルスに対して、Ｂ型インフルエンザウイルスはヒト感染に限定され、且つＢ型インフルエンザウイルスは、２つの表面糖タンパク質に基づくサブタイプに分けられない。事実、１９７０年代まで、Ｂ型インフルエンザウイルスは１つの均一なグループとして分類された。しかしながら、１９７０年代を通じて、Ｂ型インフルエンザウイルスは、Ｖｉｃｔｏｒｉａ及びＹａｍａｇａｔａ系統と名付けられた２つの抗原的に識別可能な系統に、それら各々の最初の代表であるＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８の後から分岐し始めた（Ｂｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８（４）：１４２５−７；ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＣＭ．０２１１６−０９．Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｊａｎ  ２７）。Ｙａｍａｇａｔａ及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統の双方は毎年の流行病に寄与する。Ｂ型インフルエンザウイルスに起因する罹患率はＡ型インフルエンザＨ３Ｎ２に伴うものより低いが、Ａ型インフルエンザＨ１Ｎ１に伴うものより高い（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５４：１４２７−１４３６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  ＪＡＭＡ．２９２：１３３３−１３４０
【非特許文献２】Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５４：１４２７−１４３６
【非特許文献３】Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）  Ｎａｔｕｒｅ．２８９：３６６−３７３
【非特許文献４】Ｂｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８（４）：１４２５−７；ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＣＭ．０２１１６−０９．Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｊａｎ  ２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
インフルエンザウイルス感染によって誘導される中和抗体は通常、ウイルス受容体結合を阻止するため、可変ＨＡ１球状頭部に標的化され、通常は株に特異的である。１つ以上のサブタイプ又は系統を中和する広範に交差反応性の抗体は希少である。近年、Ａ型インフルエンザウイルスのグループ１及び２の双方における複数のサブタイプ（Ｃｏｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３（６０４４）：８５０−８５６，Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＮＡＳ  １０９（４６）：１８８９７−１８９０２，Ｄｒｅｙｆｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７（６１００）：１３４３−１３４８、及びＮａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １４：９３−１０３）、又は両系統のＢ型インフルエンザウイルス（Ｄｒｅｙｆｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７（６１００）：１３４３−１３４８及びＹａｓｕｇｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈ  ９（２）：ｅ１００３１５０．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００３１５０）を中和し得る幾つかの抗体が発見されているが、大部分は適用範囲、耐性特性、又は効力において制限を有する。Ａ型及びＢ型インフルエンザのＨＡタンパク質の双方に結合することが記載されているのは１つの抗体にすぎないが、この抗体は、治療的に投与されるとき、Ｂ型インフルエンザウイルスを機能的に中和しないか又は疾患を弱毒化することがない（Ｄｒｅｙｆｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７（６１００）：１３４３−１３４８）。現在まで、広範囲のＡ型及びＢ型インフルエンザウイルス感染を広範に中和若しくは阻害するか又はＡ型及びＢ型インフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患を弱毒化するような利用可能な抗体は存在しない。したがって、複数のインフルエンザウイルスに対して保護する新たな抗体を同定する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一実施形態では、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する単離された結合分子が提供される。一実施形態では、単離された結合分子は、Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、Ａ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのグループ１サブタイプ及び少なくとも１つのグループ２サブタイプを中和する能力がある第１の結合ドメイン；並びにＢ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、少なくとも２つの系統学的に異なる系統におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する能力がある第２の結合ドメインを含む。一実施形態では、第１の結合ドメインは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８とそれらの変異体から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプ：並びにＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５とそれらの変異体から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのグループ２サブタイプを中和する能力がある。一実施形態では、第２の結合ドメインは、Ｙａｍａｇａｔａ及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統の双方におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する能力がある。
【００１１】
一実施形態では、結合分子の第１の結合ドメインは、抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合断片を含む。一実施形態では、結合分子の第２の結合ドメインは、抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合断片を含む。一実施形態では、結合分子は、抗体重鎖の少なくとも１つのＶＨ及び抗体軽鎖の少なくとも１つのＶＬを含む。さらなる特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、抗体重鎖の少なくとも１つのＶＨ及び抗体軽鎖の少なくとも１つのＶＬを含む。一実施形態では、第２の結合ドメインは、抗体重鎖の少なくとも１つのＶＨ及び抗体軽鎖の少なくとも１つのＶＬを含む。
【００１２】
一実施形態では、結合分子の第１の結合ドメインは、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、６つのＣＤＲセットは、
（ａ）配列番号８のＨＣＤＲ１、配列番号９のＨＣＤＲ２、配列番号１０のＨＣＤＲ３、配列番号３のＬＣＤＲ１、配列番号４のＬＣＤＲ２及び配列番号５のＬＣＤＲ３に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号８のＨＣＤＲ１、配列番号９のＨＣＤＲ２、配列番号１０のＨＣＤＲ３、配列番号３のＬＣＤＲ１、配列番号４のＬＣＤＲ２及び配列番号５のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１８のＨＣＤＲ１、配列番号１９のＨＣＤＲ２、配列番号２０のＨＣＤＲ３、配列番号１３のＬＣＤＲ１、配列番号１４のＬＣＤＲ２、配列番号１５のＬＣＤＲ３に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；並びに
（ｄ）配列番号１８のＨＣＤＲ１、配列番号１９のＨＣＤＲ２、配列番号２０のＨＣＤＲ３、配列番号１３のＬＣＤＲ１、配列番号１４のＬＣＤＲ２、配列番号１５のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００１３】
一実施形態では、結合分子の第１の結合ドメインは、配列番号７；及び配列番号１７から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨを含む。一実施形態では、結合分子の第１の結合ドメインは、配列番号２から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬ；及び配列番号１２のＶＬを含む。さらなる特定の実施形態では、結合分子の第１の結合ドメインは、配列番号７のＶＨ及び配列番号２のＶＬ；並びに配列番号１７のＶＨ及び配列番号１２のＶＬから選択されるＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列の各々に対して少なくとも７５％同一であるＶＨ及びＶＬを含む。一実施形態では、第１の結合ドメインは、配列番号７のＶＨ及び配列番号２のＶＬ；並びに配列番号１７のＶＨ及び配列番号１２のＶＬから選択されるＶＨ及びＶＬを含む。
【００１４】
一実施形態では、第２の結合ドメインは、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、６つのＣＤＲセットは、
（ａ）配列番号２８のＨＣＤＲ１、配列番号２９のＨＣＤＲ２、配列番号３０のＨＣＤＲ３、配列番号２３のＬＣＤＲ１、配列番号２４のＬＣＤＲ２及び配列番号２５のＬＣＤＲ３に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２８のＨＣＤＲ１、配列番号２９のＨＣＤＲ２、配列番号３０のＨＣＤＲ３、配列番号２３のＬＣＤＲ１、配列番号２４のＬＣＤＲ２及び配列番号２５のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２、配列番号４６のＨＣＤＲ３、配列番号３９のＬＣＤＲ１、配列番号４０のＬＣＤＲ２及び配列番号４１のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２、配列番号４６のＨＣＤＲ３、配列番号３９のＬＣＤＲ１、配列番号４０のＬＣＤＲ２及び配列番号４１のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号６０のＨＣＤＲ１、配列番号６１のＨＣＤＲ２、配列番号６２のＨＣＤＲ３、配列番号５５のＬＣＤＲ１、配列番号５６のＬＣＤＲ２、配列番号５７のＬＣＤＲ３に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；並びに
（ｆ）配列番号６０のＨＣＤＲ１、配列番号６１のＨＣＤＲ２、配列番号６２のＨＣＤＲ３、配列番号５５のＬＣＤＲ１、配列番号５６のＬＣＤＲ２、配列番号５７のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００１５】
一実施形態では、結合分子の第２の結合ドメインは、
（ａ）配列番号２７のＶＨ；
（ｂ）配列番号３３のＶＨ；
（ｃ）配列番号３６のＶＨ；
（ｄ）配列番号４３のＶＨ；
（ｅ）配列番号４９のＶＨ；
（ｆ）配列番号５２のＶＨ；
（ｇ）配列番号５９のＶＨ；及び
（ｈ）配列番号６５のＶＨ
から選択されるＶＨのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨを含む。
【００１６】
一実施形態では、結合分子の第２の結合ドメインは、
（ａ）配列番号２２のＶＬ；
（ｂ）配列番号３２のＶＬ；
（ｃ）配列番号３５のＶＬ；
（ｄ）配列番号３８のＶＬ；
（ｅ）配列番号４８のＶＬ；
（ｆ）配列番号５１のＶＬ；
（ｇ）配列番号５４のＶＬ；及び
（ｈ）配列番号６４のＶＬ
から選択されるＶＬのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬを含む。
【００１７】
一実施形態では、結合分子の第２の結合ドメインは、
（ａ）配列番号２７のＶＨ及び配列番号２２のＶＬ；
（ｂ）配列番号３３のＶＨ及び配列番号３２のＶＬ；
（ｃ）配列番号３６のＶＨ及び配列番号３５のＶＬ；
（ｄ）配列番号４３のＶＨ及び配列番号３８のＶＬ；
（ｅ）配列番号４９のＶＨ及び配列番号４８のＶＬ；
（ｆ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ；
（ｇ）配列番号５９のＶＨ及び配列番号５４のＶＬ；並びに
（ｈ）配列番号６５のＶＨ及び配列番号６４のＶＬ
から選択されるＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列の各々に対して少なくとも７５％同一であるＶＨ及びＶＬを含む。
【００１８】
一実施形態では、結合分子の第２の結合ドメインは、
（ａ）配列番号２７のＶＨ及び配列番号２２のＶＬ；
（ｂ）配列番号３３のＶＨ及び配列番号３２のＶＬ；
（ｃ）配列番号３６のＶＨ及び配列番号３５のＶＬ；
（ｄ）配列番号４３のＶＨ及び配列番号３８のＶＬ；
（ｅ）配列番号４９のＶＨ及び配列番号４８のＶＬ；
（ｆ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ；
（ｇ）配列番号５９のＶＨ及び配列番号５４のＶＬ；並びに
（ｈ）配列番号６５のＶＨ及び配列番号６４のＶＬ
から選択されるＶＨ及びＶＬを含む。
【００１９】
一実施形態では、結合分子は、少なくとも２つの抗体重鎖及び少なくとも２つの抗体軽鎖を含む。一実施形態では、結合分子は、二重特異性抗体を含む。一実施形態では、結合分子の１つ以上の結合ドメインは、可変断片（Ｆｖ）ドメインを含む。一実施形態では、結合分子の１つ以上の結合ドメインは、ｓｃＦｖ分子を含む。一実施形態では、結合分子の１つ以上の結合ドメインはＦｖドメインを含み、１つ以上の結合ドメインはｓｃＦｖ分子を含む。さらなる特定の実施形態では、結合分子の第１の結合ドメインは、抗Ａ型インフルエンザウイルスのＦｖドメインを含む。一実施形態では、結合分子は、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを含むＦｖドメインを含み、抗Ａ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する。一実施形態では、結合分子の第２の結合ドメインは、抗Ｂ型インフルエンザウイルスのｓｃＦｖ分子を含む。
【００２０】
一実施形態では、第１の結合ドメインは、抗Ａ型インフルエンザウイルスのＦｖドメインを含み、第２の結合ドメインは、抗Ｂ型インフルエンザウイルスのｓｃＦｖ分子を含む。一実施形態では、第１の結合ドメインのＦｖドメインは、アミノ末端及びカルボキシ末端を有するポリペプチド鎖を有する重鎖（ＨＣ）並びにアミノ末端及びカルボキシ末端を有するポリペプチド鎖を有する軽鎖（ＬＣ）を有し、
（ａ）第２の結合ドメインは第１の結合ドメインのＨＣのカルボキシ末端に共有結合されるか；
（ｂ）第２の結合ドメインは第１の結合ドメインのＨＣのアミノ末端に共有結合されるか；
（ｃ）第２の結合ドメインは第１の結合ドメインのＬＣのアミノ末端に共有結合されるか；又は
（ｄ）第２の結合ドメインは第１の結合ドメインのＨＣのポリペプチド鎖内で共有結合的にインターカレートされる。
【００２１】
一実施形態では、結合分子は、１つ以上のＮ末端ドメインを有する抗体又はその断片を含み、ここで１つ以上のｓｃＦｖ分子は、抗体又はその断片の１つ以上のＮ末端ドメインに共有結合される。一実施形態では、抗体又はその断片のＮ末端ドメインは、１つ以上のＦｖドメインを含み、１つ以上のｓｃＦｖ分子は、抗体又はその断片の１つ以上のＦｖドメインに共有結合される。一実施形態では、Ｎ末端ドメインは、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含むＦｖドメインを含む。一実施形態では、１つ以上のｓｃＦｖ分子は、抗体又はその断片の１つ以上の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に共有結合される。一実施形態では、結合分子は、式ｓｃＦｖ−Ｌ１−ＶＬ−ＣＬ（式中、ｓｃＦｖはｓｃＦｖ分子であり、Ｌ１はリンカーであり、ＶＬは軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、ＶＬは軽鎖可変ドメインである）を有する抗体軽鎖を含む抗体又はその断片を含む。一実施形態では、１つ以上のｓｃＦｖ分子は、抗体又はその断片の１つ以上の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）に共有結合される。一実施形態では、重鎖は、式ｓｃＦｖ−Ｌ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（式中、ｓｃＦｖはｓｃＦｖ分子であり、Ｌ１はリンカーであり、ＶＨは重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は重鎖定常ドメインドメイン１であり、ＣＨ２は重鎖定常ドメインドメイン２であり、ＣＨ３は重鎖定常ドメインドメイン３である）を含む。
【００２２】
一実施形態では、結合分子は、配列番号７及び配列番号１７から選択されるアミノ酸ＶＨドメイン配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含む。一実施形態では、結合分子は、配列番号２及び配列番号１２から選択されるアミノ酸ＶＬドメイン配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む。
【００２３】
一実施形態では、結合分子は、Ｃ末端ドメインを有する抗体又はその断片を含み、ここで１つ以上のｓｃＦｖ分子は、抗体又はその断片のＣ末端ドメインに共有結合される。一実施形態では、結合分子は、第１及び第２のＣ末端ドメインを各々有する第１及び第２の重鎖を含み、ここで１つ以上のｓｃＦｖ分子は、第１の重鎖、第２の重鎖、又はそれらの組み合わせのＣ末端ドメインに共有結合される。一実施形態では、結合分子は、１つ以上の重鎖定常ドメインを含む抗体又はその断片を含み、ここで１つ以上のｓｃＦｖ分子は、１つ以上の重鎖の１つ以上の重鎖定常ドメイン間の重鎖に挿入される。一実施形態では、１つ以上の重鎖は、式ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（式中、ＶＨは重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は重鎖定常ドメインドメイン１であり、ＣＨ２は重鎖定常ドメインドメイン２であり、且つＣＨ３は重鎖定常ドメインドメイン３である）を含む。一実施形態では、１つ以上の重鎖は、式ＶＨ−ＣＨ１−Ｌ１−ｓｃＦｖ−Ｌ２−ＣＨ２−ＣＨ３（式中、Ｌ１及びＬ２は独立してリンカーであり、且つｓｃＦｖはｓｃＦｖ分子である）を含む。一実施形態では、１つ以上の重鎖は、式ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−Ｌ１−ｓｃＦｖ−Ｌ２−ＣＨ３（式中、Ｌ１及びＬ２は独立してリンカーであり、且つｓｃＦｖはｓｃＦｖ分子である）を含む。一実施形態では、Ｌ１及びＬ２は、独立して、（ａ）［ＧＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは０、１、２、３、４、若しくは５である）（配列番号９３）、（ｂ）［ＧＧＧＧ］ｎ（式中、ｎは０、１、２、３、４、若しくは５である）（配列番号１０６）、又は（ａ）及び（ｂ）の組み合わせを含む。
【００２４】
一実施形態では、ｓｃＦｖは式ＶＨ−ＬＳ−ＶＬ（式中、ＶＨは重鎖可変ドメインであり、ＬＳはリンカーであり、且つＶＬは軽鎖可変ドメインである）を含む。一実施形態では、ＬＳは、（ａ）［ＧＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは０、１、２、３、４、若しくは５である）（配列番号９３）、（ｂ）［ＧＧＧＧ］ｎ（式中、ｎは０、１、２、３、４、若しくは５である）（配列番号１０６）、又は（ａ）及び（ｂ）の組み合わせを含む。
【００２５】
一実施形態では、第１の結合ドメインの重鎖及び軽鎖は、１つ以上のジスルフィド結合によって連結される。さらなる特定の実施形態では、第２の結合ドメインのｓｃＦｖは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ｓｃＦｖのＶＨは、４３位、４４位、１００位、１０１位、１０５位、及びこれらの組み合わせから選択される位置にシステイン残基を含み、且つｓｃＦｖのＶＬは、４３位、４４位、４６位、４９位、５０位、１００位、及びこれらの組み合わせから選択される位置にシステイン残基を含む。一実施形態では、ｓｃＦｖのＶＬ及びＶＨは、ＶＬ１００−ＶＨ４４、ＶＬ４３−ＶＨ１０５、ＶＬ４６−ＶＨ１０１、ＶＬ４９−ＶＨ１００、ＶＬ５０−ＶＨ１００、及びこれらの組み合わせから選択されるジスルフィド結合によって連結される。一実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬは、ＶＨ４４−ＶＬ１００、ＶＨ１００−ＶＬ４９、ＶＨ１００−ＶＬ５０、ＶＨ１０１−ＶＬ４６、ＶＨ１０５−ＶＬ４３、及びこれらの組み合わせから選択されるジスルフィド結合によって連結される。
【００２６】
一実施形態では、ＶＨは、３つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、ここで３つのＣＤＲセットは、
（ａ）配列番号２８のＨＣＤＲ１、配列番号２９のＨＣＤＲ２、配列番号３０のＨＣＤＲ３に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２８のＨＣＤＲ１、配列番号２９のＨＣＤＲ２、配列番号３０のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２、配列番号４６のＨＣＤＲ３に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２、配列番号４６のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号６０のＨＣＤＲ１、配列番号６１のＨＣＤＲ２、配列番号６２のＨＣＤＲ３に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；並びに
（ｆ）配列番号６０のＨＣＤＲ１、配列番号６１のＨＣＤＲ２、配列番号６２のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
から選択される。
【００２７】
一実施形態では、ＶＬは、３つのＣＤＲセット：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、ここで３つのＣＤＲセットは、
（ａ）配列番号２３のＬＣＤＲ１、配列番号２４のＬＣＤＲ２及び配列番号２５のＬＣＤＲ３に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２３のＬＣＤＲ１、配列番号２４のＬＣＤＲ２及び配列番号２５のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３９のＬＣＤＲ１、配列番号４０のＬＣＤＲ２及び配列番号４１のＬＣＤＲ３に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号３９のＬＣＤＲ１、配列番号４０のＬＣＤＲ２及び配列番号４１のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号５５のＬＣＤＲ１、配列番号５６のＬＣＤＲ２、配列番号５７のＬＣＤＲ３に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；並びに
（ｆ）配列番号５５のＬＣＤＲ１、配列番号５６のＬＣＤＲ２、配列番号５７のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
から選択される。
【００２８】
一実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３１、配列番号３４、配列番号４７、配列番号５０、配列番号６３から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００２９】
一実施形態では、結合分子は、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する二重特異性抗体であり、配列番号６６又は配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号６６又は配列番号６８のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。一実施形態では、結合分子は、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する二重特異性抗体であり、配列番号６７又は配列番号６９のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖を含む。一実施形態では、重鎖は、配列番号６７又は配列番号６９のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、結合分子は、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する二重特異性抗体であり、配列番号６６又は配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６７又は配列番号６９のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【００３０】
一実施形態では、二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号６６を含むアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６７を含むアミノ酸配列を有する重鎖；又は
（ｂ）配列番号６８を含むアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６９を含むアミノ酸配列を有する重鎖
を含む。
【００３１】
さらに提供されるのは、本明細書に記載の結合分子又は二重特異性抗体又は断片を含むか又は産生する細胞である。
【００３２】
さらに提供されるのは、本明細書に記載の結合分子又は二重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドである。一実施形態では、本明細書に記載の結合分子又は二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
【００３３】
別の実施形態では、本明細書に記載の結合分子又は二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。
【００３４】
さらに、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のような結合分子又は二重特異性抗体又はその断片、及び薬学的に許容できる担体を含む組成物である。さらに提供されるのは、かかる組成物を含むキットである。別の実施形態では、被験者におけるＡ型インフルエンザウイルス又はＢ型インフルエンザウイルス感染を予防又は治療する方法であって、有効量のかかる組成物を被験者に投与するステップを含む、方法が提供される。
【００３５】
さらに本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のような結合分子又は二重特異性抗体又はその断片を作製するための方法である。一実施形態では、本方法は、宿主細胞を結合分子又は二重特異性抗体又はその断片の発現に適した条件下で培養するステップを含む。一実施形態では、本方法は、宿主細胞培養物から結合分子を単離するステップをさらに含む。
【００３６】
さらに提供されるのは、本明細書に記載の結合分子又は二重特異性抗体又はその断片を用いる方法である。一実施形態では、結合分子又は二重特異性抗体又はその断片は、被験者におけるＡ型インフルエンザ感染、Ｂ型インフルエンザ感染、又はそれらの組み合わせの予防又は治療において用いられる。
【００３７】
別の実施形態では、本明細書に記載の結合分子又は二重特異性抗体又はその断片は、被験者におけるＡ型インフルエンザ感染、Ｂ型インフルエンザ感染、又はそれらの組み合わせの予防又は治療のための薬剤の作製における使用に適する。一実施形態では、本明細書に記載の結合分子又は二重特異性抗体又はその断片は、被験者におけるＡ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザ感染の予防又は治療のための薬剤の作製において用いられる。一実施形態では、被験者におけるＡ型インフルエンザ感染、Ｂ型インフルエンザ感染、又はそれらの組み合わせの予防又は治療のための方法であって、本明細書に記載の結合分子又は二重特異性抗体又はその断片を有効量で被験者に投与するステップを含む、方法が提供される。
【００３８】
一実施形態では、被験者におけるＡ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザ感染の予防又は治療のための方法であって、本明細書に記載の結合分子又は二重特異性抗体又はその断片を有効量で被験者に投与するステップを含む、方法が提供される。
【００３９】
一実施形態では、本明細書に記載の結合分子又は二重特異性抗体又はその断片は、被験者におけるＡ型インフルエンザ感染、Ｂ型インフルエンザ感染、又はそれらの組み合わせのインビトロ診断に適する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】５つの異なる二重特異性抗体（ＢｉＳ）骨格の一般的構造形式であるＢｉＳ１、ＢｉＳ２、ＢｉＳ３、ＢｉＳ４、及びＢｉＳ５を示す。ｓｃＦｖは暗灰色で示され、ＩｇＧ  Ｆｖは明灰色で示される。
【図２】図２Ａ〜Ｄは、漸増量のＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５（Ｆｌｕ  ＢｉＳ）、ＧＬ２０、又はＦＢＣ３９の存在下でインキュベートされた一次ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のＡＤＣＣ活性を示す。（Ａ）Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９  Ｈ１Ｎ１、（Ｂ）Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／６８  Ｈ３Ｎ２、（Ｃ）Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４  ｖｉｃｔｏｒｉａ系統及び（Ｄ）Ｂ／Ｓｉｃｈｕａｎ／３７９／９９  ｙａｍａｇａｔａ系統に感染されたＡ５４９細胞の感染細胞死が乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出により測定された。
【図３】図３Ａ〜Ｃは、ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５（Ｆｌｕ  ＢｉＳ）、ＧＬ２０、又はＦＢＣ３９抗ＨＡ抗体のＡＤＣＰ及びＣＤＣ活性を示す。ＡＤＣＰ活性は、（Ａ）Ａ／Ｓｏｕｔｈ  Ｄａｋｏｔａ／６／２００７  Ｈ１Ｎ１及び（Ｂ）Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／６８  Ｈ３Ｎ２のＨＡタンパク質を発現するＭＤＣＫ標的細胞を貪食したヒトマクロファージの百分率によって表される。（Ｃ）ＣＤＣ媒介性細胞死は、仔ウサギ補体の存在下でのＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４に感染されたＭＤＣＫ細胞からのＬＤＨ放出により測定された。
【図４】図４Ａ〜Ｄは、致死量のＡ／Ｗｉｌｓｏｎ  Ｓｍｉｔｈ  Ｎ／３３  Ｈ１Ｎ１（Ａ及びＢ）、ｒＡ／ＨＫ／６８  Ｈ３Ｎ２（Ｃ及びＤ）インフルエンザウイルスへの感染の４時間前、ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５（Ｆｌｕ  ＢｉＳ）、ＧＬ２０、及び無関係対照抗体（Ｃｔｌ．ｍＡｂ）が異なる濃度でマウスに投与された時の試験の各群における生存率（Ａ及びＣ）及び感染後５日目の肺ウイルス力価（Ｂ及びＤ）を示す。
【図５】図５Ａ〜Ｄは、致死量の（Ａ及びＢ）Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６  ｙａｍａｇａｔａ系統及び（Ｃ及びＤ）Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４  ｖｉｃｔｏｒｉａ系統インフルエンザウイルスへの感染の４時間前、ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５（Ｆｌｕ  ＢｉＳ）、ＦＢＣ３９、及び無関係対照抗体（Ｃｔｌ．ｍＡｂ）が異なる濃度でマウスに投与された時の試験の各群における生存率（Ａ及びＣ）及び感染後５日目の肺ウイルス力価（Ｂ及びＤ）を示す。
【図６】図６Ａ〜Ｆは、試験の各群における生存率（Ａ及びＢ）、感染後５日目の肺ウイルス力価（Ｃ及びＤ）、及び感染後６日目のパルス酸素測定により測定された肺機能（Ｅ及びＦ）を示し、ここでマウスは致死量のＡ／Ｗｉｌｓｏｎ  Ｓｍｉｔｈ  Ｎ／３３  Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス（Ａ、Ｃ、Ｅ）又はＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６  ｙａｍａｇａｔａ系統ウイルス（Ｂ、Ｄ、Ｆ）の感染を受けた。５日間、１日２回（ＢＩＤ）、２５ｍｇ／ｋｇのオセルタミビル、１０ｍｇ／ｋｇのＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５（Ｆｌｕ  ＢｉＳ）、又は１０ｍｇ／ｋｇの無関係対照抗体（Ｃｔｌ．ｍＡｂ）での治療が様々な時点で（感染後１日目、２日目、３日目、４日目）開始された。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
導入
本明細書に記載されるのは、結合分子、例えば、限定はされないが、少なくとも２つの抗インフルエンザ結合ドメインを含む、二重特異性抗体、ヒト抗体、抗原結合断片、それらの誘導体若しくはコンジュゲートを含む抗体である。一実施形態では、結合分子は、Ａ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する第１の結合ドメイン及びＢ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する第２の結合ドメインを含む。Ａ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する抗体は、２０１３年１０月２日に出願された米国仮特許出願第６１／８８５，８０８号明細書及び２０１４年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／００２，４１４号明細書に記載され、またＢ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する抗体は、２０１４年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／０２４，８０４号明細書に記載され、ここで各々の開示はその全体が参照により本明細書中に援用される。
【００４２】
一実施形態では、第１の結合ドメインは、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）ストークに特異的に結合する。さらなる特定の実施形態では、第１の結合ドメインは、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）ストークに特異的に結合し、Ａ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのグループ１サブタイプ及び少なくとも１つのグループ２サブタイプを中和する。
【００４３】
一実施形態では、第２の結合ドメインは、Ｂ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に特異的に結合する。さらなる特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、Ｂ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に特異的に結合し、２つの系統学的に異なる系統におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する。一実施形態では、第２の結合ドメインは、Ｂ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に特異的に結合し、Ｙａｍａｇａｔａ及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統の双方におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する。別の実施形態では、第２の結合ドメインは、Ｂ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）及びＡ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に特異的に結合し、少なくとも１つのＹａｍａｇａｔａ系統のＢ型インフルエンザウイルス；少なくとも１つのＶｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルス；少なくとも１つのＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプ、及びそれらの組み合わせを中和する。
【００４４】
一実施形態では、結合分子は、１つ以上のＡ型インフルエンザウイルス株及び／又はＢ型インフルエンザウイルス株に対して、いずれかの親抗体と比べて増強された中和活性を有する二重特異性抗体である。一実施形態では、結合分子は、１つ以上のＡ型インフルエンザのグループ１株又はグループ２株に対して増強された中和活性を有する二重特異性抗体である。さらなる特定の実施形態では、結合分子は、サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７及びＨ１８から選択されるＡ型インフルエンザウイルスのグループ１株に対して増強された中和活性を有する二重特異性抗体である。さらなる特定の実施形態では、結合分子は、サブタイプＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、及びＨ１５から選択されるＡ型インフルエンザウイルスのグループ２株に対して増強された中和活性を有する二重特異性抗体である。一実施形態では、結合分子は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ９サブタイプに対して増強された中和活性を有する二重特異性抗体である。
【００４５】
本明細書で用いられるとき、用語「中和する」は、結合分子、例えば抗体、又はその抗原結合断片の、感染病原体、例えばＡ型インフルエンザ及び／又はＢ型インフルエンザウイルスに結合し、且つ感染病原体の生物学的活性、例えば病原性を低下させる能力を指す。一実施形態では、結合分子は、Ａ型インフルエンザウイルス；Ｂ型インフルエンザウイルス、又はそれらの組み合わせの少なくとも１つの特定のエピトープ又は抗原決定基に免疫特異的に結合する。結合分子は、感染病原体、例えばＡ型インフルエンザ及び／又はＢ型インフルエンザウイルスの活性を、ウイルスの生活環の期間中の様々な時点で中和し得る。例えば、抗体は、ウイルスと１つ以上の細胞表面受容体との相互作用に干渉することにより、ウイルスの標的細胞への付着に干渉し得る。或いは、抗体は、例えば、受容体媒介性エンドサイトーシスによるウイルス内部移行に干渉することにより、ウイルスとその受容体との１つ以上の付着後の相互作用に干渉し得る。
【００４６】
用語法
本発明を詳細に記載する前に、この発明が具体的な組成物又は方法ステップに限定されるものでなく、それ自体変わり得ることが理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上明確に別段の指示がない限り、複数形の指示対象を含むことに留意しなければならない。
【００４７】
用語「約」は、例えば、化合物、組成物、濃縮物又は製剤を作製するために用いられる典型的な測定及び処理手順を通じて；これらの手順における不注意なエラーを通じて；本方法やそれに類した検討事項を実施するのに用いられる出発物質又は成分の作製、ソース、又は純度における差異を通じて生じ得る数量における変動を指す。用語「約」はまた、化合物、組成物、濃縮物又は製剤の経年劣化に起因して特定の初期濃度又は混合物と異なる量、及び化合物、組成物、濃縮物又は製剤を混合又は処理することに起因して特定の初期濃度又は混合と異なる量を包含する。本明細書に添付される特許請求の範囲は、用語「約」によって修飾される場合、これらの量に対する等価物を含む。
【００４８】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ（２００２）２ｎｄ  ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．（１９９９）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；及びＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ（２０００）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓが、この発明において使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
【００４９】
アミノ酸は、本明細書中で、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により推奨される、その一般に公知の３文字記号又は１文字記号のいすれかによって指すことができる。同様に、ヌクレオチドは、その一般に認められた１文字コードによって指すことができる。
【００５０】
定義
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、限定はされないが、ヌクレオチドのポリマー、例えばＤＮＡ及びＲＮＡポリマー、及び修飾オリゴヌクレオチド、例えば、溶液中の生物学的ＲＮＡ又はＤＮＡに典型的でない塩基を有するオリゴヌクレオチド、例えば２’−Ｏ−メチル化オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチドのストリングに対応する単量体単位の任意の物理的ストリングを包含する。ポリヌクレオチドは、古典的ホスホジエステル結合又は非古典的結合、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）中に見出される、例えばアミド結合を含み得る。核酸は一本鎖又は二本鎖であり得る。別段の指示がない限り、核酸配列は、明示される配列に加えて相補的配列を包含する。
【００５１】
用語「遺伝子」は、生物学的機能に関連した核酸を指すように広範に用いられる。したがって、遺伝子は、その発現に必要とされるコード配列及び／又は制御配列を含む。用語「遺伝子」は、具体的なゲノム配列、並びにそのゲノム配列によってコードされるｃＤＮＡ又はｍＲＮＡに適用される。遺伝子はまた、例えば他のタンパク質に対する認識配列を形成する発現されない核酸配列を含む。発現されない制御配列は、隣接又は近隣配列の転写を生じさせる、転写因子などの調節タンパク質が結合する対象の「プロモーター」及び「エンハンサー」を含む。例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーター及び／又は１つ以上のコード領域に作動可能に結合した他の転写若しくは翻訳制御因子を含み得る。「作動可能に結合した」は、遺伝子産物の発現を制御配列の影響又は制御の下に置くように、１つ以上の制御配列に結合した遺伝子産物におけるコード領域を指す。「遺伝子の発現」又は「核酸の発現」は、文脈によって指定される通り、ＤＮＡのＲＮＡへの転写、ＲＮＡのポリペプチドへの翻訳、又は転写と翻訳の双方を指す。
【００５２】
本明細書で用いられるとき、用語「コード領域」は、アミノ酸に翻訳され得るコドンを含む核酸の一部を指す。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、一般にコード領域の一部であると考えられる。しかし、フランキング配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、及びイントロンは、コード領域の一部であると考えられない。ベクターは、単一のコード領域を含み得るか、又は２つ以上のコード領域を含み得る。加えて、ベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、目的の遺伝子産物、例えば、抗体、又は抗原結合断片、変異体、又はその誘導体をコードする核酸に融合されるか又は融合されない異種コード領域をコードし得る。異種コード領域は、限定はされないが、特定化された配列又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。
【００５３】
用語「ベクター」は、核酸が生物間、細胞間、又は細胞成分間で増殖及び／又は移動され得る手段を指す。ベクターは、限定はされないが、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、及び人工染色体を含み、自律的に複製するか又は宿主細胞の染色体に組み込む能力がある。ベクターはまた、限定はされないが、ネイキッドＲＮＡポリヌクレオチド、ネイキッドＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内にＤＮＡとＲＮＡの双方を含むポリヌクレオチド、ポリリジン結合ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ペプチド結合ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、リポソーム結合ＤＮＡを含み、自律的に複製することはない。「発現ベクター」は、ベクター、例えばプラスミドであり、それに組み込まれる核酸の発現及び複製を促進する能力がある。典型的には、発現されるべき核酸は、プロモーター及び／又はエンハンサーに「作動可能に連結され」、プロモーター及び／又はエンハンサーによる転写調節制御に従う。
【００５４】
用語「宿主細胞」は、異種核酸、例えばベクターを含む細胞を指し、核酸の複製及び／又は発現を支持する。宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）などの原核細胞、又は酵母、昆虫、両生類、鳥類若しくは哺乳類細胞、例えばヒト細胞、例えばＨＥｐ−２細胞及びＶｅｒｏ細胞などの真核細胞であり得る。
【００５５】
用語「導入される」は、異種核酸又は単離された核酸に言及するとき、核酸の真核細胞又は原核細胞への導入を指し、ここでは核酸が細胞のゲノム中に組み込まれ得るか、自律レプリコンに変換され得るか、又は一過性に発現され得る。同用語は、「感染」、「遺伝子導入」、「形質転換」及び「形質導入」などの方法を含む。限定はされないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、脂質介在性遺伝子導入、及びリポフェクションを含む、核酸を宿主細胞に導入するための種々の方法が利用可能である。
【００５６】
用語「発現」は、遺伝子からの情報が機能的遺伝子産物の合成において用いられる過程を指す。遺伝子産物は、タンパク質であることが多いが、機能的ＲＮＡでもあり得る。遺伝子発現は、対応するｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ及び／又はタンパク質レベルでの遺伝子産物の存在を判定することによって検出され得る。
【００５７】
「ポリペプチド」は、アミド結合（ペプチド結合としても公知）によって線状に結合される２つ以上のアミノ酸残基を含む分子、例えばペプチド又はタンパク質を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の１つ若しくは複数の鎖を指し、特定の長さの産物を指すことがない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は２つ以上のアミノ酸の１つ若しくは複数の鎖を指すために用いられる任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかと代替的又は互換的に用いることができる。用語「ポリペプチド」はまた、限定はされないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、又は非天然アミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことが意図される。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から誘導され得るか又は組換え技術によって生成され得、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるとは限らない。それは任意の様式で、例えば化学合成により作製され得る。ポリペプチドのアミノ酸残基は、天然又は非天然であり得、また非置換物、非修飾物、置換物又は修飾物であり得る。「アミノ酸配列」は、文脈に応じて、アミノ酸残基のポリマー、例えばタンパク質若しくはポリペプチド、又はアミノ酸ポリマーを表す文字列である。
【００５８】
本明細書で用いられるとき、用語「抗体」は、抗原の抗原決定基の特徴に対して相補的な内部表面形状及び電荷分布を伴う三次元結合空間を有するポリペプチド鎖のフォールディングから形成される少なくとも１つの結合ドメインを含むポリペプチド又はポリペプチドの基を指す。抗体は、典型的には、２つのポリペプチド鎖対を伴う四量体形態を有し、各対は１つの「軽」鎖及び１つの「重」鎖を有し、各軽鎖／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。典型的には、各軽鎖は重鎖に１つの共有ジスルフィド結合によって連結される一方、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変動する。重鎖及び軽鎖の各々はまた、規則的に隔てられた鎖間ジスルフィド架橋を有する。典型的には、各重鎖は、１つの末端に可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続いて幾つかの定常ドメイン（ＣＨ）を有し、各軽鎖は、１つの末端に可変ドメイン（ＶＬ）とそのもう一方の末端に定常ドメイン（ＣＬ）を有し、ここで軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと整列され、また軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列される。
【００５９】
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、本明細書で用いられるとき、（完全長モノクローナル抗体を含む）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合断片から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、ＣＤＲ移植、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ類抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、所望される生物学的活性を呈する抗体断片（例えば抗原結合部分）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、細胞内抗体、及びエピトープ結合断片、又は上記のいずれかの誘導体を包含する。特に、抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子（すなわち少なくとも１つの抗原結合部位を含む分子）の免疫学的に活性な断片を含む。免疫グロブリン分子は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、サブアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はアロタイプ（例えばＧｍ、例えば、Ｇ１ｍ（ｆ、ｚ、ａ若しくはｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂ、若しくはｃ）、Ａｍ、Ｅｍ、及びＫｍ（１、２若しくは３））であり得る。抗体は、限定はされないが、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスなどを含む任意の哺乳動物種、又はトリ（例えばニワトリ）などの他の動物に由来してもよい。抗体は、異種ポリペプチド配列、例えば精製を促進するためのタグに融合されてもよい。
【００６０】
用語「特異的に結合する」は、結合分子、例えば抗体又は断片、変異体、又はその誘導体が、エピトープに、その抗原結合ドメインを介してランダムな無関係のエピトープに結合する場合よりも容易に結合することを指す。用語「特異性」は、特定の結合分子が特定のエピトープに結合する上での相対的親和性について認定するため、本明細書で用いられる。
【００６１】
本明細書で用いられるとき、用語「親和性」は、個別のエピトープが免疫グロブリン分子の結合ドメインと結合する強さの尺度を指す。
【００６２】
用語「エピトープ」は、本明細書で用いられるとき、抗体結合ドメインに結合する能力があるタンパク質決定基を指す。エピトープは通常、アミノ酸又は糖の側鎖など、分子の化学的活性表面群（ｇｒｏｕｐｉｎｇｓ）を含み、また通常、特定の三次元構造特性、並びに特定の電荷特性を有する。立体構造エピトープと非立体構造（ｎｏｎ−ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）エピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒の存在下で失われるという点から区別される。
【００６３】
用語「単離された」は、生物学的材料、例えば核酸又はタンパク質を指し、それはその天然に存在する環境下で通常それに伴うか又はそれと相互作用する成分から実質的に遊離される。他方、単離された材料は、その材料とともにその天然環境下で見出されない材料を含んでもよい。例えば、材料がその天然環境下、例えば細胞内に存在する場合、材料は、その環境下で見出される材料に対して天然でない細胞内のある位置に置かれていてもよい。例えば、天然に存在する核酸は、天然に存在しない手段によりその核酸に対して天然でないゲノムのある遺伝子座に導入される場合、単離されたと考えることができる。かかる核酸はまた、「異種」核酸と称される。
【００６４】
用語「組換え」は、ヒト介入により人工的又は合成的に改変されている材料を指す。改変は、その天然環境若しくは状態に含まれるか又はそれから除外された材料に対して実施され得る。例えば、「組換え核酸」は、例えば、クローニング、ＤＮＡ混合若しくは他の手順の間、又は化学的突然変異誘発若しくは他の突然変異誘発により、核酸を組み換えることによって作製される核酸を指してもよく、「組換えポリペプチド」又は「組換えタンパク質」は、組換え核酸の発現によって生成されるポリペプチド又はタンパク質を指し得る。
【００６５】
本明細書で用いられるとき、用語「操作される」は、例えば、組換え技術、インビトロペプチド合成、ペプチドの酵素若しくは化学共役、又はそれらの組み合わせを含む合成手段による核酸又はポリペプチド分子の操作を含む。
【００６６】
本明細書で用いられるとき、用語「有効量」又は「治療有効量」は、所与の条件及び投与計画にとって所望される臨床成績を実現するのに必要又は十分な治療組成物の量、例えば被験者におけるインフルエンザ感染を予防又は治療する能力がある化合物の濃度を達成するのに十分な量を指す。かかる量及び濃度は、当業者によって決定され得る。実際に投与される治療組成物の量は、典型的には、限定はされないが、治療されるべき状態、選択される投与経路、投与される実際の化合物、個別患者の年齢、体重、及び応答、並びに患者の症状の重症度を含む関連する状況の観点から医師によって決定されることになる。
【００６７】
本明細書で用いられるとき、用語「治療組成物」は、治療用途を有する化合物又は組成物を指し、限定はされないが、生物学的化合物、例えば抗体、タンパク質及び核酸、並びに化学的に合成される小型の有機分子化合物を含む。
【００６８】
本明細書で用いられるとき、用語「医薬組成物」は、治療有効量の治療薬とともに薬学的に許容できる担体、また必要に応じて、１つ以上の希釈剤又は賦形剤を含む組成物を指す。本明細書で用いられるとき、用語「薬学的に許容できる」は、それが、哺乳類、より詳細にはヒトへの使用として、連邦又は州政府の規制当局によって認可されるか又は米国薬局方（Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ）、欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ）又は他の一般に認められた薬局方におけるリストに載ることを意味する。
【００６９】
用語「相乗効果」は、本明細書で用いられるとき、化合物の組み合わせによりもたらされる相加治療を上回る効果を指し、ここで組み合わせて得られる治療効果は、通常で化合物単独の個別投与から得られることになる相加効果を上回る。特定の実施形態は、Ａ型インフルエンザウイルス及び／又はＢ型インフルエンザウイルス感染の治療における相乗効果をもたらす方法を含み、ここで前記効果は、対応する相加効果よりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、又は少なくとも１０００％上回る。
【００７０】
本明細書で用いられるとき、用語「治療」又は「治療する」は、治療的処置と予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の双方を指し、その目的は、インフルエンザ感染の１つ以上の症状に対して安定化、予防、緩和若しくは軽減するか、又はインフルエンザ感染の進行を遅延、予防、若しくは阻止することである。治療はまた、被験者におけるＡ型インフルエンザ及び／又はＢ型インフルエンザなどの感染病原体の排除又は低減を指し得る。「治療」はまた、生存を、治療を受けない場合に想定される生存と比べて延長することを意味し得る。治療は、感染が完全に治癒されることを必ずしも意味しない。
【００７１】
本明細書で用いられるとき、用語「被験者」又は「患者」は、限定はされないが、ヒト及び他の霊長類、例えばチンパンジー及び他の類人猿及びサル種などの非ヒト霊長類を含む、脊索動物亜門（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ  ｃｏｒｄａｔａ）の任意のメンバーを指す。ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマなどの家畜；イヌ及びネコなどの家畜哺乳類；マウス、ラット及びモルモットなどの齧歯類を含む実験動物；トリ、例えば、飼い慣らされた鳥、野鳥及び狩猟鳥、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ及び他の家禽、アヒル、ガチョウなどもまた非限定例である。用語「哺乳類」及び「動物」はこの定義に含まれる。成体及び新生哺乳類の双方は包含されることが意図される。
【００７２】
結合分子
本明細書に記載されるのは、Ａ型インフルエンザウイルス及び／又はＢ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する結合分子である。本明細書で用いられるとき、用語「結合分子」は、標的分子又は抗原に、抗体の抗原への結合と類似する様式で結合する能力がある分子を指す。結合分子の例として、インタクト抗体、並びにかかる抗体の抗原結合断片、変異体、類似体、又は誘導体、例えば天然に存在する抗体又は免疫グロブリン分子又は改変された抗体分子又は断片、例えば二重特異性抗体などが挙げられる。結合分子は、１つ以上の結合ドメインを含み得る。結合分子は基準の抗体構造を含み得るが、結合分子によっては１つ以上の結合ドメインを含む他の構造を有し得る。一実施形態では、その結合分子は、少なくとも２つの結合ドメインと少なくとも２つの結合特異性を含む。
【００７３】
本明細書で用いられるとき、「結合ドメイン」は、標的分子又は抗原への特異的な結合に関与する結合分子の部分、領域、又は部位を指す。一実施形態では、結合ドメインは、抗体の可変断片（Ｆｖ）を含む。一実施形態では、結合ドメインは、抗体の可変重（ＶＨ）鎖配列及び可変軽（ＶＬ）鎖配列を含む。一実施形態では、結合ドメインは、好適なフレームワーク（ＦＲ）領域とともに位置づけられる抗体からの１つ以上、２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。結合ドメインは単一種に由来してもよく、又は結合ドメインは、例えばヒト化抗体などの場合、ある種からのＣＤＲと別の種からのフレームワーク配列を含んでもよい。
【００７４】
結合分子は、限定はされないがトリ及び哺乳類を含む、任意の動物起源から得られ得る。結合分子の抗体又はその断片は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、リャマ、ウマ、又はニワトリ抗体であり得る。本明細書で用いられるとき、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、またヒト免疫グロブリンライブラリーから単離される抗体、又は１つ以上のヒト免疫グロブリンに対してトランスジェニックであり且つ内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離される抗体を含む。
【００７５】
一実施形態では、結合分子は、Ａ型インフルエンザウイルスに対して結合し且つ／又は中和する能力がある少なくとも１つの結合ドメインを含む。別の実施形態では、結合分子は、Ｂ型インフルエンザウイルスに対して結合し且つ／又は中和する能力がある少なくとも１つの結合ドメインを含む。一実施形態では、結合分子は、Ａ型インフルエンザウイルスに対して結合し且つ／又は中和する能力がある第１の結合ドメイン、及びＢ型インフルエンザウイルスに対して結合し且つ／又は中和する能力がある第２の結合ドメインを含む。さらなる特定の実施形態では、結合分子は、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、且つＡ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのグループ１サブタイプ及び少なくとも１つのグループ２サブタイプを中和する能力がある第１の結合ドメイン；並びにＢ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、且つ少なくとも２つの系統学的に異なる系統におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する能力がある第２の結合ドメインを含む。一実施形態では、第１の結合ドメインは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８及びそれらの変異体から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプ；並びにＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５及びそれらの変異体から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのグループ２サブタイプを中和する能力がある。一実施形態では、第２の結合ドメインは、Ｙａｍａｇａｔａ及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統の双方におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する能力がある。
【００７６】
抗体
結合分子は、完全長又はインタクト抗体、抗体断片、例えば抗原結合断片、ヒト、ヒト化、翻訳後修飾、キメラ又は融合抗体、免疫複合体、又はその機能断片などを含み得る。一実施形態では、結合分子は、完全長又はインタクト抗体、又は１つ以上の抗体断片、例えば抗原結合断片などを含む１つ以上の結合ドメインを含む。
【００７７】
抗体の「抗原結合断片」の例として、（ｉ）Ｆａｂ断片、つまり抗体のＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを含む一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、つまりヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含むＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを含むＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインを含むｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ．３４１：５４４−５４６）；及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術により、又はインタクトな免疫グロブリンの酵素的又は化学的切断により、産生することができる。
【００７８】
一実施形態では、抗原結合断片は、例えば「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」を含む、一本鎖抗体を含む。用語「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンの重鎖の少なくとも１つの可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の少なくとも１つの可変領域（ＶＬ）を含む融合タンパク質を指す。これらの一本鎖抗体断片は、当業者に公知の従来技術を用いて得ることができる。例えば、別々の遺伝子によってコードされるＦｖ断片のＶＨ及びＶＬドメインは、一価分子を形成するためにＶＬ及びＶＨ領域が対合した単一のポリペプチド鎖として構築されることを可能にする合成リンカーによる組換え法を用いて連結され得る（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）。一実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬ領域は、少なくとも約５、１０、１５若しくは２０アミノ酸であり、最大で約１０、１５、２０、２５若しくは３０アミノ酸の短いリンカーペプチドと接続される。ｓｃＦｖリンカーは、公知であり、（柔軟性のため）グリシンリッチなリンカーとともに、（溶解度のため）セリン又はトレオニンを含むリンカーを含む。一実施形態では、リンカーはＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と接続する。他の実施形態では、リンカーはＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端と接続する。一実施形態では、ｓｃＦｖは、定常領域の除去やリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。一本鎖Ｆｖを産生するための方法は、米国特許第４，９４６，７７８号明細書及び米国特許第５，２５８，４９８号明細書；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８；Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９；及びＳｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０に記載の方法を含む。
【００７９】
一実施形態では、結合分子は、抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合断片を含む少なくとも１つの結合ドメインを含む。別の実施形態では、結合分子は、抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合断片を含む少なくとも１つの結合ドメインを含む。さらなる特定の実施形態では、結合分子は、抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合断片を含む少なくとも１つの結合ドメイン及び抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合断片を含む少なくとも１つの結合ドメインを含む。
【００８０】
本明細書で用いられるとき、免疫グロブリンとしても知られる用語「抗体」は、モノクローナル抗体、例えば、完全長モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ類抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、所望される生物学的活性を有する抗体断片、例えば、抗原結合断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、細胞内抗体、及びそれらの抗原結合断片を包含する。
【００８１】
好適な免疫グロブリン分子は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、サブアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はアロタイプ（例えば、Ｇｍ、例えば、Ｇ１ｍ（ｆ、ｚ、ａ若しくはｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂ、若しくはｃ）、Ａｍ、Ｅｍ、及びＫｍ（１、２若しくは３））であり得る。免疫グロブリン分子は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいてλ鎖又はκ鎖のいずれかとして分類される軽鎖を含み得る。
【００８２】
典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、２つのポリペプチド鎖対（各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する）を含む、約１５０ｋＤの四量体である。典型的には、各軽鎖は重鎖に１つの共有ジスルフィド結合により連結されるが、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は変動し得る。各々の重鎖及び軽鎖はまた、規則的間隔の鎖間ジスルフィド架橋を有する。大部分の天然に存在する抗体では、ポリペプチド鎖の２対は同一である。しかし、改変された抗体では、例えば三機能抗体などの場合、ポリペプチド鎖の２対は必ずしも同一でない。
【００８３】
抗体の軽鎖及び重鎖の双方は、「定常」ドメイン及び「可変」ドメインに分割され得る。重鎖及び軽鎖のＣ末端部分は定常ドメインと称される。「ＣＨ１ドメイン」は、可変重（ＶＨ）ドメインとヒンジ領域との間に位置する重鎖免疫グロブリン定常ドメインを指す。「ＣＨ２ドメイン」は、ヒンジ領域とＣＨ３ドメインとの間に位置する重鎖免疫グロブリン定常ドメインを指す。「ＣＨ３ドメイン」は、ＣＨ２ドメインのＣ末端側に位置する重鎖免疫グロブリン定常ドメインを指す。「ＣＨ４ドメイン」は、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体におけるＣＨ３ドメインのＣ末端側に位置する重鎖免疫グロブリン定常ドメインを指す。用語「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連結する重鎖分子の一部を指す。「ＣＬドメイン」は、可変軽（ＶＬ）ドメインのＣ末端側に位置する軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを指す。
【００８４】
各々の重鎖及び軽鎖のＮ末端は、可変ドメインと称される三次元抗原結合部位の可変領域を規定する。軽（ＶＬ）及び重（ＶＨ）鎖の双方の可変ドメインは、約１００〜１１０若しくはそれより多くのアミノ酸を含み、主に抗原認識及び特異性に関与する。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２若しくはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤性移動度、Ｆｃ受容体結合、及び補体結合などの生物学的特性を与える。慣例により、定常領域ドメインの付番は、ドメインが抗体の抗原結合部位又はＮ末端から遠ざかる方に増加する。
【００８５】
本明細書で用いられるとき、用語「重鎖部分」は、ＶＨ、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、又はそれらの変異体若しくは断片のうちの少なくとも１つを含む、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を指す。本明細書で用いられるとき、用語「軽鎖部分」は、ＶＬ又はＣＬドメインのうちの少なくとも１つを含む、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を指す。
【００８６】
抗体可変領域
一実施形態では、結合分子は、可変断片（Ｆｖ）ドメインを含む少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、結合分子は、抗体重鎖の少なくとも１つのＶＨ及び抗体軽鎖の少なくとも１つのＶＬを含む少なくとも１つの結合ドメインを含む。さらなる特定の実施形態では、結合分子は、抗体重鎖の少なくとも１つのＶＨ及び抗体軽鎖の少なくとも１つのＶＬを含む第１の結合ドメイン、並びに抗体重鎖の少なくとも１つのＶＨ及び抗体軽鎖の少なくとも１つのＶＬを含む第２の結合ドメインを含む。一実施形態では、結合分子は、Ａ型インフルエンザウイルスに結合し、抗体重鎖の少なくとも１つのＶＨ及び抗体軽鎖の少なくとも１つのＶＬを含む第１の結合ドメイン、並びにＢ型インフルエンザウイルスに結合し、抗体重鎖の少なくとも１つのＶＨ及び抗体軽鎖の少なくとも１つのＶＬを含む第２の結合ドメインを含む。Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスに結合する、抗体の例示的なＶＨ及びＶＬドメインは各々、表１及び２に示される。
【００８７】
【表１】
2018518475.tif 000002
【００８８】
【表２】
2018518475.tif 000003
【００８９】
一実施形態では、結合分子は、表１及び２に開示されるＶＨ及び／又はＶＬ配列の１つ以上に対して少なくとも特定パーセントの同一性を有する１つ以上のＶＨ及び／又はＶＬドメインを含む。本明細書で用いられるとき、用語「パーセント（％）配列同一性」又は「相同性」は、配列同一性の一部として保存的置換を全く考慮せずに、最大のパーセント配列同一性を得るため、必要があれば、配列を整列し、ギャップを導入した後の参照配列内、例えば親抗体配列内のアミノ酸残基又はヌクレオチドと同一である候補配列内のアミノ酸残基又はヌクレオチドの百分率を指す。配列アラインメントは、手作業で、あるいはＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９８１）Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２又はＮｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３の相同性アルゴリズムを用いて、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４の類似性探索法を用いて、又はこれらのアルゴリズムの１つ以上に基づくコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  Ｎ及びＴＦＡＳＴＡ）を用いて生成されてもよい。
【００９０】
一実施形態では、結合分子は、本明細書に記載のＶＨアミノ酸配列（例えば表１又は２に示されるものを含む）に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有するＶＨアミノ酸配列を有する１つ以上の結合ドメインを含む。一実施形態では、結合分子は、本明細書に記載のＶＨアミノ酸配列（例えば表１又は２に示されるものを含む）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有するＶＨアミノ酸配列を有する１つ以上の結合ドメインを含む。
【００９１】
一実施形態では、結合分子は、本明細書に記載のＶＬアミノ酸配列（例えば表１又は２に示されるものを含む）に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有するＶＬアミノ酸配列を有する１つ以上の結合ドメインを含む。一実施形態では、結合分子は、本明細書に記載のＶＬアミノ酸配列（例えば表１又は２に示されるものを含む）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有するＶＬアミノ酸配列を有する１つ以上の結合ドメインを含む。
【００９２】
一実施形態では、結合分子は、本明細書に記載のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列（例えば表１又は２に示されるものを含む）の各々に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有するＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を有する１つ以上の結合ドメインを含む。一実施形態では、結合分子は、本明細書に記載のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列（例えば表１又は２に示されるものを含む）の各々に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有するＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を有する１つ以上の結合ドメインを含む。
【００９３】
一実施形態では、結合分子は、表１に示されるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列の各々に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有するＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を有する１つ以上の結合ドメインを含む。一実施形態では、結合分子は、表１に示されるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列の各々に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有するＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を有する１つ以上の結合ドメインを含む。
【００９４】
一実施形態では、結合分子は、表２に示されるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列の各々に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有するＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を有する１つ以上の結合ドメインを含む。一実施形態では、結合分子は、表２に示されるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列の各々に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有するＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を有する１つ以上の結合ドメインを含む。
【００９５】
一実施形態では、結合分子は、表１に示されるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列の各々に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有するＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を有する第１の結合ドメイン及び表２に示されるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列の各々に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有するＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を有する第２の結合ドメインを含む。一実施形態では、結合分子は、表１に示されるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列の各々に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有するＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を有する第１の結合ドメイン及び表２に示されるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列の各々に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有するＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を有する第２の結合ドメインを含む。
【００９６】
一実施形態では、結合分子の第１の結合ドメインは、配列番号７；及び配列番号１７から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨを含む。一実施形態では、結合分子の第１の結合ドメインは、配列番号２；及び配列番号１２のＶＬから選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬを含む。さらなる特定の実施形態では、結合分子の第１の結合ドメインは、配列番号７のＶＨ及び配列番号２のＶＬ；並びに配列番号１７のＶＨ及び配列番号１２のＶＬから選択されるＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列の各々に対して少なくとも７５％同一であるＶＨ及びＶＬを含む。一実施形態では、第１の結合ドメインは、配列番号７のＶＨ及び配列番号２のＶＬ；並びに配列番号１７のＶＨ及び配列番号１２のＶＬから選択されるＶＨ及びＶＬを含む。
【００９７】
相補性決定領域（ＣＤＲ）
天然に存在する抗体では、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と称されるアミノ酸の６つの短い非隣接配列は、各抗原結合ドメイン内に存在する。抗原結合ドメイン内のアミノ酸の残りは「フレームワーク」領域と称される。フレームワーク領域は、ＣＤＲを鎖間の非共有的相互作用により正確な配向性で位置づけるスキャフォールドとして機能する。重鎖の３つのＣＤＲは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３と名付けられ、また軽鎖の３つのＣＤＲは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３と名付けられる。
【００９８】
ＣＤＲ及びフレームワーク領域を構築するアミノ酸は、当業者によって容易に同定することができ、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”及びＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７により説明されている。Ｋａｂａｔら及びＣｈｏｔｈｉａらの定義は、重複アミノ酸残基を含む。Ｋａｂａｔら及びＣｈｏｔｈｉａらによって定義されたＣＤＲを包含するアミノ酸残基は、下の表３に示される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及びサイズに応じて変動し得る。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列として、どの残基が特定のＣＤＲ内に存在するかをルーチン的に判定することができる。
【００９９】
【表３】
2018518475.tif 000004
【０１００】
いずれかの定義の適用は、本明細書中での定義及び使用に応じて用語「ＣＤＲ」の範囲内に含まれることが意図される。しかし、特に指定されない限り、結合分子、抗体、抗原結合断片、変異体、又はその誘導体の中の特定のアミノ酸残基位置の付番については、本明細書ではＫａｂａｔらの付番システムに従う。
【０１０１】
一実施形態では、抗体の可変ドメイン、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）におけるアミノ酸は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．に従って同定される。残基のＫａｂａｔ付番は、所与の抗体に対して、抗体の配列の相同性領域での「標準の」Ｋａｂａｔ付番配列との整列化により決定してもよい。フレームワーク残基の最大整列化は、付番システムにおいて「スペーサー」残基の挿入を必要とし得る。さらに、任意の所与のＫａｂａｔ部位番号での特定の個別残基の同一性は、種間又は対立遺伝子の相違により、抗体鎖から抗体鎖にかけて変化する場合がある。
【０１０２】
Ｋａｂａｔらの付番システムによると、ＨＣＤＲ１は、約３１のアミノ酸（すなわち、最初のシステイン残基後の約９残基）で開始し、約５〜７のアミノ酸を含み、且つ次のチロシン残基で終結する。ＨＣＤＲ２は、ＣＤＲ−Ｈ１の末端後の１５の残基で開始し、約１６〜１９のアミノ酸を含み、次のアルギニン又はリジン残基で終結する。ＨＣＤＲ３は、ＨＣＤＲ２の末端後の約３３のアミノ酸残基で開始し、３〜２５のアミノ酸を含み、且つ配列Ｗ−Ｇ−Ｘ−Ｇ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）で終結する。ＬＣＤＲ１は、約２４の残基（すなわちシステイン残基の後）で開始し、約１０〜１７の残基を含み、次のチロシン残基で終結する。ＬＣＤＲ２は、ＬＣＤＲ１の末端後の約１６の残基で開始し、約７の残基を含む。ＬＣＤＲ３は、ＬＣＤＲ２の末端後の約３３の残基で開始し、約７〜１１の残基を含み、且つ配列Ｆ−Ｇ−Ｘ−Ｇ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）で終結する。ＣＤＲは抗体から抗体にかけて大幅に変化する（また定義によると、Ｋａｂａｔコンセンサス配列との相同性を呈することがない）。Ｋａｂａｔ系を用いて付番された本発明の抗体のＣＤＲ重鎖及び軽鎖配列は、下の表４及び５に示される。
【０１０３】
一実施形態では、結合分子は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つのＣＤＲを含む。一実施形態では、結合分子は、表４及び５に示される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）を含む。一実施形態では、結合分子は、表４及び５に示される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）を含む。一実施形態では、結合分子は、表４及び５に示される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つのＨＣＤＲ並びに表４及び５に示される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つのＬＣＤＲを含む。
【０１０４】
【表４】
2018518475.tif 000005
【０１０５】
【表５】
2018518475.tif 000006
【０１０６】
別の実施形態では、抗体の可変ドメイン、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）におけるアミノ酸は、免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５−７７）を用いて同定され得る。ＩＭＧＴデータベースは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）、Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子についての配列情報を用いて開発されたものであり、抗体λ及びκ軽鎖、重鎖及びＴ細胞受容体鎖を通じて付番を統一し、すべてであるが異常に長い挿入に対する挿入コードの使用を回避する。ＩＭＧＴではまた、Ｋａｂａｔらからのフレームワーク（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）の定義、Ｃｈｏｔｈｉａらからの超可変ループの特徴づけ、並びにＸ線回折試験から得られた構造データが考慮され、組み合わされる。ＩＭＧＴ系を用いて付番された、ＣＤＲ重鎖及び軽鎖配列は、下の表６に示される。
【０１０７】
【表６】
2018518475.tif 000007
【０１０８】
一実施形態では、結合分子は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３から選択される１つ以上、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つのＣＤＲを含む１つ以上の結合ドメインを含む。一実施形態では、結合分子は、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む１つ以上の結合ドメインを含み、ここでＣＤＲは、表４〜６に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲから選択される。別の実施形態では、結合分子は、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む１つ以上の結合ドメインを含み、ここでＣＤＲは、表４〜６に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、結合分子は、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む１つ以上の結合ドメインを含み、ここでＣＤＲは、表４〜６に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１０９】
一実施形態では、結合分子は、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む１つ以上の結合ドメインを含み、ここでＣＤＲは、表４に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲから選択される。別の実施形態では、結合分子は、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む１つ以上の結合ドメインを含み、ここでＣＤＲは、表４に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、結合分子は、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む１つ以上の結合ドメインを含み、ここでＣＤＲは、表４に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１１０】
一実施形態では、結合分子は、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む１つ以上の結合ドメインを含み、ここでＣＤＲは、表５及び６に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲから選択される。別の実施形態では、結合分子は、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む１つ以上の結合ドメインを含み、ここでＣＤＲは、表５及び６に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、結合分子は、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む１つ以上の結合ドメインを含み、ここでＣＤＲは、表５及び６に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１１１】
一実施形態では、結合分子は、表４に示される６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む第１の結合ドメイン、並びに表５及び６に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲから選択される６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む第２の結合ドメインを含む。別の実施形態では、結合分子は、表４に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む第１の結合ドメイン、並びに、表５及び６に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む第２の結合ドメインを含む。別の実施形態では、結合分子は、表４に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む第１の結合ドメイン、並びに、表５及び６に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む第２の結合ドメインを含む。
【０１１２】
一実施形態では、結合分子の第１の結合ドメインは、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、ここでＣＤＲは、
（ａ）配列番号８のＨＣＤＲ１、配列番号９のＨＣＤＲ２、配列番号１０のＨＣＤＲ３、配列番号３のＬＣＤＲ１、配列番号４のＬＣＤＲ２及び配列番号５のＬＣＤＲ３の各々；又は
（ｂ）配列番号１８のＨＣＤＲ１、配列番号１９のＨＣＤＲ２、配列番号２０のＨＣＤＲ３、配列番号１３のＬＣＤＲ１、配列番号１４のＬＣＤＲ２、配列番号１５のＬＣＤＲ３の各々
のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を個別に有する。
【０１１３】
一実施形態では、結合分子の第１の結合ドメインは、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、ここでＣＤＲは、
（ａ）配列番号８のＨＣＤＲ１、配列番号９のＨＣＤＲ２、配列番号１０のＨＣＤＲ３、配列番号３のＬＣＤＲ１、配列番号４のＬＣＤＲ２及び配列番号５のＬＣＤＲ３の各々；又は
（ｂ）配列番号１８のＨＣＤＲ１、配列番号１９のＨＣＤＲ２、配列番号２０のＨＣＤＲ３、配列番号１３のＬＣＤＲ１、配列番号１４のＬＣＤＲ２、配列番号１５のＬＣＤＲ３の各々
のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を個別に有する。
【０１１４】
一実施形態では、第２の結合ドメインは、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、ここでＣＤＲは、
（ａ）配列番号２８のＨＣＤＲ１、配列番号２９のＨＣＤＲ２、配列番号３０のＨＣＤＲ３、配列番号２３のＬＣＤＲ１、配列番号２４のＬＣＤＲ２及び配列番号２５のＬＣＤＲ３の各々；
（ｂ）配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２、配列番号４６のＨＣＤＲ３、配列番号３９のＬＣＤＲ１、配列番号４０のＬＣＤＲ２及び配列番号４１のＬＣＤＲ３の各々；又は
（ｃ）配列番号６０のＨＣＤＲ１、配列番号６１のＨＣＤＲ２、配列番号６２のＨＣＤＲ３、配列番号５５のＬＣＤＲ１、配列番号５６のＬＣＤＲ２、配列番号５７のＬＣＤＲ３の各々
のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を個別に有する。
【０１１５】
一実施形態では、第２の結合ドメインは、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、ここでＣＤＲは、
（ａ）配列番号２８のＨＣＤＲ１、配列番号２９のＨＣＤＲ２、配列番号３０のＨＣＤＲ３、配列番号２３のＬＣＤＲ１、配列番号２４のＬＣＤＲ２及び配列番号２５のＬＣＤＲ３の各々；
（ｂ）配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２、配列番号４６のＨＣＤＲ３、配列番号３９のＬＣＤＲ１、配列番号４０のＬＣＤＲ２及び配列番号４１のＬＣＤＲ３の各々；又は
（ｃ）配列番号６０のＨＣＤＲ１、配列番号６１のＨＣＤＲ２、配列番号６２のＨＣＤＲ３、配列番号５５のＬＣＤＲ１、配列番号５６のＬＣＤＲ２、配列番号５７のＬＣＤＲ３の各々
のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を個別に有する。
【０１１６】
フレームワーク領域
重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、可変ドメインのより高度に保存された部分である４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）を含む。重鎖の４つのＦＲは、ＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３及びＦＲＨ４と名付けられ、また軽鎖の４つのＦＲは、ＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３及びＦＲＬ４と名付けられる。Ｋａｂａｔ付番システムを使用して、ＦＲＨ１は、位置１で開始して約３０のアミノ酸で終結し、ＦＲＨ２は約３６〜４９のアミノ酸とし、ＦＲＨ３は約６６〜９４のアミノ酸とし、またＦＲＨ４は約１０３〜１１３のアミノ酸とする。一実施形態では、例えば、結合分子の１つ以上の結合ドメインのＡ型インフルエンザウイルス及び／又はＢ型インフルエンザウイルスに対する結合親和性を改善又は最適化するため、１つ以上のＦＲ残基の１つ以上の修飾、例えば置換、欠失又は挿入が導入されてもよい。修飾可能なフレームワーク領域残基の例として、抗原に直接的に非共有結合するもの（Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：７４７−７５３（１９８６））；ＣＤＲの立体構造に対して相互作用する／影響するもの（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７））；及び／又はＶＬ−ＶＨ界面に関与するもの（米国特許第５，２２５，５３９号明細書）が挙げられる。
【０１１７】
一実施形態では、結合分子の１つ以上の結合ドメインのＦＲは、「生殖系列化（ｇｅｒｍｌｉｎｉｎｇ）」を意図しての１つ以上のアミノ酸変化を含む。生殖系列化では、抗体の重鎖及び／又は軽鎖のアミノ酸配列が生殖系列の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列と比較される。重鎖及び／又は軽鎖の特定のフレームワーク残基が、例えばファージライブラリーを調製するために用いられる免疫グロブリン遺伝子の体細胞突然変異の結果として生殖系列の立体配置と異なる場合、改変されたフレームワーク残基を生殖系列の立体配置に「逆突然変異する」（すなわち、フレームワークアミノ酸配列を生殖系列フレームワークアミノ酸配列と同じであるように改変する）ことが望ましい場合がある。フレームワーク残基のかかる「逆突然変異」（又は「生殖系列化」）は、特異的突然変異（例えば部位特異的突然変異誘発；ＰＣＲ媒介性突然変異誘発など）を導入するための標準的な分子生物学的方法によって達成され得る。
【０１１８】
ジスルフィド結合
本明細書で用いられる用語「ジスルフィド結合」は、２つの硫黄原子間で形成される共有結合を指す。アミノ酸システインは、第２のチオール基とジスルフィド結合若しくは架橋を形成し得るチオール基を含む。大部分の天然に存在するＩｇＧ分子では、ＣＨ１及びＣＬ領域は、ジスルフィド結合により連結され、２つの重鎖は、ヒンジ領域（典型的にはＫａｂａｔ付番システムを用いると２３９及び２４２に対応する位置）として知られる重鎖の可動部において２つのジスルフィド結合により連結される。
【０１１９】
一実施形態では、例えば、抗体のその抗原への結合を改善するため、１つ以上のアミノ酸置換がフレームワーク領域内でなされ得る。一実施形態では、例えば、１つ以上の鎖間ジスルフィド結合が欠如した結合分子を作製するため；１つ以上の追加的な鎖間ジスルフィド結合を有する結合分子を作製するため；又は１つ以上の鎖間ジスルフィド結合の位置を変化させるため、鎖間ジスルフィド結合に関与する１つ以上のシステイン残基のアミノ酸置換若しくは欠失を設けるようにフレームワーク領域のアミノ酸配列が修飾され得る。
【０１２０】
一実施形態では、結合分子は、１つ以上のｓｃＦｖを含む。一実施形態では、ｓｃＦｖは、第１の可変領域ドメインのＣ末端が第２の可変領域ドメインのＮ末端に可動性ペプチドリンカーを介して接続されるように、ＶＨ及びＶＬを含む。一実施形態では、可変重（ＶＨ）ドメインのＣ末端が可変軽（ＶＬ）ドメインのＮ末端に接続される。これは「ＶＨ−ＶＬ」又は「ＨＬ」配向性と称され得る。他の実施形態では、可変軽（ＶＬ）ドメインのＣ末端が可変重（ＶＨ）ドメインのＮ末端に接続される。これは「ＶＬ−ＶＨ」又は「ＬＨ」配向性と称され得る。ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬを連結するリンカー（ＬＳ）の長さは変化し得る。一実施形態では、リンカー（ＬＳ）は、［ＧＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは０、１、２、３、４、若しくは５）のアミノ酸配列（配列番号９３）を有する。別の実施形態では、リンカー（ＬＳ）は、［ＧＧＧＧ］ｎ（式中、ｎは０、１、２、３、４、若しくは５）のアミノ酸配列（配列番号１０６）を有する。他の実施形態では、リンカーは、２つの配列の組み合わせを含む。さらなる特定の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳのアミノ酸配列（配列番号９２）を含む。
【０１２１】
他の実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のジスルフィド結合の位置は、ｓｃＦｖにおける１つ以上のシステイン残基の位置を付加、除去、又は改変することにより変化し得る。一実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨは、（Ｋａｂａｔによる付番として）４３位、４４位、１００位、１０１位、１０５位、及びそれらの組み合わせにシステイン残基を含む。一実施形態では、ｓｃＦｖのＶＬは、（Ｋａｂａｔによる付番として）４３位、４４位、４６位、４９位、５０位、１００位、及びそれらの組み合わせにシステイン残基を含む。一実施形態では、ｓｃＦｖは、ＶＬ及びＶＨがＶＬ１００−ＶＨ４４、ＶＬ４３−ＶＨ１０５、ＶＬ４６−ＶＨ１０１、ＶＬ４９−ＶＨ１００、ＶＬ５０−ＶＨ１００、又はその組み合わせでジスルフィド結合により連結されるように、ＶＬ−ＶＨ配向性を有する。別の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＶＨ及びＶＬがＶＨ４４−ＶＬ１００、ＶＨ１００−ＶＬ４９、ＶＨ１００−ＶＬ５０、ＶＨ１０１−ＶＬ４６、ＶＨ１０５−ＶＬ４３、又はその組み合わせでジスルフィド結合により連結されるように、ＶＨ−ＶＬ配向性を有する。
【０１２２】
二重特異性抗体
一実施形態では、結合分子は、「二重特異性抗体」を含む。本明細書で用いられるとき、用語「二重特異性抗体」は、２つの異なる標的分子又は抗原に特異的に結合し得る２つ以上の結合ドメインを有する抗体又はその抗原結合断片を指す。一般に、二重特異性抗体は、「親抗体」と称される、１つ以上、しばしば少なくとも２つ、典型的には２つの異なるモノクローナル抗体の特異性及び特性を単一分子に組み込む。一部の二重特異性抗体は相乗活性を示す。一実施形態では、二重特異性抗体は、１つ以上のＡ型及び／又はＢ型インフルエンザ株に対して、親抗体と比べると増強された中和活性を示す。
【０１２３】
一実施形態では、本明細書に記載の二重特異性抗体は、単一のｍＡｂと比べて拡大された利用範囲を有し、さらにＡ型インフルエンザウイルスの１つ以上の株に対して増強された中和を示す場合がある。一実施形態では、結合分子は、１つ以上のＡ型インフルエンザグループ１又は２株に対して増強された中和活性を有する二重特異性抗体である。さらなる特定の実施形態では、結合分子は、サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７及びＨ１８）から選択される、Ａ型インフルエンザウイルスグループ１株に対して増強された中和活性を有する二重特異性抗体である。さらなる特定の実施形態では、結合分子は、サブタイプＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、及びＨ１５から選択される、Ａ型インフルエンザウイルスグループ２株に対して増強された中和活性を有する二重特異性抗体である。一実施形態では、結合分子は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ９サブタイプに対して増強された中和活性を有する二重特異性抗体である。
【０１２４】
一実施形態では、結合分子は、２つを超える結合価を有する二重特異性抗体を含む。例えば、一実施形態では、結合分子は三重特異性抗体を含む。三重特異性抗体は公知であり、当業者に公知の方法を用いて調製され得る（Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：６０）。
【０１２５】
二重特異性抗体は、トリオーマ及びハイブリッドハイブリドーマなどの細胞株により発現され得るか又は組換え手段により構築され得る（Ｓｔｒｏｅｈｌｅｉｎ  ａｎｄ  Ｈｅｉｓｓ，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ．６：１３８７−９４（２０１０）；Ｍａｂｒｙ  ａｎｄ  Ｓｎａｖｅｌｙ，ＩＤｒｕｇｓ．１３：５４３−９（２０１０））。
【０１２６】
一実施形態では、結合分子は、重鎖及び軽鎖の少なくとも２つの対を含む二重特異性抗体、又はその結合断片を含み、ここで第１の対は第１の「親」抗体に由来し、第１の結合特異性を有し、第２の対は第２の「親」抗体に由来し、第２の結合特異性を有する。一実施形態では、結合分子は、Ａ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する第１の重鎖及び軽鎖の対、又はその断片、並びにＢ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する第２の重鎖及び軽鎖の対、又はその断片を含む。一実施形態では、結合分子は、２つの異なる標的分子又は抗原に特異的な２つ以上の化学的に連結されたＦａｂ領域を含む二重特異性抗体を含む。さらなる特定の実施形態では、結合分子は、Ａ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する１つ以上のＦａｂ領域を含む。別の実施形態では、結合分子は、Ｂ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する１つ以上のＦａｂ領域を含む。別の実施形態では、結合分子は、１つ以上の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む二重特異性抗体を含む。一実施形態では、結合分子は、Ａ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する少なくとも１つのｓｃＦｖを含む。別の実施形態では、結合分子は、Ｂ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する少なくとも１つのｓｃＦｖを含む。
【０１２７】
一実施形態では、結合分子は、ＩｇＧ抗体と１つ以上の一本鎖結合ドメインを融合することによって形成される二重特異性抗体である。一実施形態では、結合分子は、抗体コア構造（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ）を保持する。他の実施形態では、抗体コア構造（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ）は、例えば、二重、三重又は四重特異性抗体、ミニボディ及び一本鎖形式（ｓｃＦｖ、ＢｉＳ−ｓｃＦｖ）において保持されない。別の実施形態では、二重特異性抗体は、２つ以上のＦａｂ断片が化学架橋剤と融合されるようなＦ（ａｂ）２融合体を含み得る。多数の二重特異性抗体形式では、例えば、抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ）を結合ドメイン（例えばｓｃＦｖ）又は２つ以上のＦａｂ断片若しくはｓｃＦｖｓに融合するため、１つ以上のリンカーが用いられる。一部の実施形態では、Ｆｃドメイン、ひいてはＦｃエフェクター機能は保持される。他の実施形態では、Ｆｃドメインは保持されない。
【０１２８】
一実施形態では、結合分子は、「Ｙ」形状分子を形成する２つの重鎖及び２つの軽鎖を有する非対称性ＩｇＧ様構造を含み、ここで抗体の第１の「アーム」は第１の抗原に特異的に結合し、且つ抗体の第２の「アーム」は第２の抗原に結合する。
【０１２９】
一実施形態では、結合分子は、１つ以上の重鎖可変領域（ＶＨ）を単独で又はヒンジ領域（Ｈ）、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインのいずれも不在か、一部若しくは全部と組み合わせて含む、及び／又は１つ以上の軽鎖可変領域（ＶＬ）を単独で又はＣＬドメインと組み合わせて含む、１つ以上の抗体断片、例えば一本鎖抗体を含む。
【０１３０】
一実施形態では、二重特異性抗体は、１つ以上の一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む。一実施形態では、二重特異性抗体は、２つ以上のｓｃＦｖを含む。別の実施形態では、二重特異性抗体は、１つ以上のＦｖドメイン、例えば１つ以上の重鎖及び１つ以上の軽鎖を含む、免疫グロブリンの「基本的」構造、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ構造の一部又は全部を含み、ここで１つ以上のｓｃＦｖは免疫グロブリンの「基本的」構造に融合される。さらなる特定の実施形態では、結合分子は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むＩｇＧ構造を含み、ここで１つ以上のｓｃＦｖはそれに融合される。
【０１３１】
一実施形態では、抗体の形式は、本明細書に開示される任意の形式であってもよい。別の実施形態では、形式は、ＢｉＳ１、ＢｉＳ２、ＢｉＳ３、ＢｉＳ４、又はＢｉＳ５のいずれか１つである。一実施形態では、第１の結合ドメインのＦｖドメインは、アミノ末端及びカルボキシ末端を有する重鎖（ＨＣ）並びにアミノ末端及びカルボキシ末端を有する軽鎖（ＬＣ）を含み、且つ第２の結合ドメインは、第１の結合ドメインのＨＣのカルボキシ末端に１つ若しくは２つのリンカーを用いて共有結合される。一実施形態では、第１の結合ドメインのＦｖドメインは、アミノ末端及びカルボキシ末端を有する重鎖（ＨＣ）並びにアミノ末端及びカルボキシ末端を有する軽鎖（ＬＣ）を含み、且つ第２の結合ドメインは、第１の結合ドメインのＨＣのカルボキシ末端に１つのリンカーを用いて共有結合される。一実施形態では、第１の結合ドメインのＦｖドメインは、アミノ末端及びカルボキシ末端を有する重鎖（ＨＣ）並びにアミノ末端及びカルボキシ末端を有する軽鎖（ＬＣ）を含み、且つ第２の結合ドメインは、第１の結合ドメインのＨＣのカルボキシ末端に２つのリンカーを用いて共有結合される。一実施形態では、第１の結合ドメインのＦｖドメインは、アミノ末端及びカルボキシ末端を有する重鎖（ＨＣ）並びにアミノ末端及びカルボキシ末端を有する軽鎖（ＬＣ）を含み、且つ第２の結合ドメインは、第１の結合ドメインのＨＣのアミノ末端に共有結合される。一実施形態では、第１の結合ドメインのＦｖドメインは、アミノ末端及びカルボキシ末端を有する重鎖（ＨＣ）並びにアミノ末端及びカルボキシ末端を有する軽鎖（ＬＣ）を含み、且つ第２の結合ドメインは、第１の結合ドメインのＬＣのアミノ末端に共有結合される。別の実施形態では、第１の結合ドメインのＦｖドメインは、アミノ末端及びカルボキシ末端を有する重鎖（ＨＣ）並びにアミノ末端及びカルボキシ末端を有する軽鎖（ＬＣ）を含み、且つ第２の結合ドメインは、第１の結合ドメインのＨＣのポリペプチド鎖に沿って共有結合的に挿入される。
【０１３２】
一実施形態では、結合分子は、式ＶＨ−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３（式中、ＶＨは重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は重鎖定常領域ドメイン１であり、Ｈはヒンジ領域であり、ＣＨ２は重鎖定常領域ドメイン２であり、且つＣＨ３は重鎖定常領域ドメイン３である）を有する抗体重鎖を含む二重特異性抗体を含む。一実施形態では、結合分子は、式ＶＬ−ＣＬ（式中、ＶＬは可変軽鎖ドメインであり、且つＣＬは軽鎖定常ドメインである）を有する抗体軽鎖を含む二重特異性抗体である。
【０１３３】
一実施形態では、結合分子は、Ｎ末端ドメインを有する抗体重鎖及びＮ末端ドメインを有する抗体軽鎖を含み、ここで抗体重鎖は、式ＶＨ−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３（式中、ＶＨは重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は重鎖定常領域ドメイン１であり、Ｈはヒンジ領域であり、ＣＨ２は重鎖定常領域ドメイン２であり、且つＣＨ３は重鎖定常領域ドメイン３である）を有し、ここで抗体軽鎖は、式ＶＬ−ＣＬ（式中、ＶＬは可変軽鎖ドメインであり、且つＣＬは軽鎖定常ドメインである）を有し、またここで１つ以上のｓｃＦｖ分子が、抗体重鎖又は抗体軽鎖の１つ以上のＮ末端ドメインに共有結合される（図１）。
【０１３４】
さらなる特定の実施形態では、抗体又はその断片のＮ末端ドメインは１つ以上のＦｖドメインを含み、１つ以上のｓｃＦｖ分子が抗体又はその断片の１つ以上のＦｖドメインに共有結合される（図１）。さらなる特定の実施形態では、１つ以上のｓｃＦｖ分子が、抗体又はその断片の１つ以上の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＮ末端ドメインに共有結合される（図１）。さらなる特定の実施形態では、結合分子は、式ｓｃＦｖ−Ｌ１−ＶＬ−ＣＬ（式中、ｓｃＦｖはｓｃＦｖ分子であり、Ｌ１はリンカーであり、ＶＬは軽鎖可変ドメインであり、ＶＬは軽鎖可変ドメインであり、且つＣＬは軽鎖定常ドメインである）を有する抗体軽鎖を含む（図１）。
【０１３５】
一実施形態では、１つ以上のｓｃＦｖ分子が、抗体又はその断片の１つ以上の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＮ末端ドメインに共有結合される（図１）。一実施形態では、重鎖は、式ｓｃＦｖ−Ｌ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（式中、ｓｃＦｖはｓｃＦｖ分子であり、Ｌ１はリンカーであり、ＶＨは重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は重鎖定常ドメインドメイン１であり、ＣＨ２は重鎖定常ドメインドメイン２であり、且つＣＨ３は重鎖定常ドメインドメイン３である）を有する（図１）。
【０１３６】
別の実施形態では、結合分子は、Ｃ末端ドメインを有する抗体又はその断片を含み、ここで１つ以上のｓｃＦｖ分子が、抗体又はその断片のＣ末端ドメインに共有結合される（図１）。一実施形態では、結合分子は、第１及び第２の重鎖と各々の第１及び第２のＣ末端ドメインを含み、ここで１つ以上のｓｃＦｖ分子が、第１の重鎖、第２の重鎖、又はその組み合わせのＣ末端ドメインに共有結合される（図１）。一実施形態では、１つ以上の重鎖は、式ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（式中、ＶＨは重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は重鎖定常ドメインドメイン１であり、ＣＨ２は重鎖定常ドメインドメイン２であり、且つＣＨ３は重鎖定常ドメインドメイン３である）を有する（図１）。一実施形態では、１つ以上の重鎖は、式ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｌ１−ｓｃＦｖ（式中、Ｌ１はリンカーであり、且つｓｃＦｖはｓｃＦｖ分子である）を有する（図１）。
【０１３７】
別の実施形態では、結合分子は、Ｃ末端ドメインを有する抗体又はその断片を含み、ここで１つ以上のｓｃＦｖ分子が、抗体又はその断片のＣ末端ドメインに共有結合される（図１）。一実施形態では、結合分子は、第１及び第２の重鎖と各々の第１及び第２のＣ末端ドメインを含み、ここで１つ以上のｓｃＦｖ分子が、第１の重鎖、第２の重鎖、又はその組み合わせのＣ末端ドメインに共有結合される（図１）。一実施形態では、１つ以上の重鎖は、式ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（式中、ＶＨは重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は重鎖定常ドメインドメイン１であり、ＣＨ２は重鎖定常ドメインドメイン２であり、且つＣＨ３は重鎖定常ドメインドメイン３である）を有する（図１）。一実施形態では、１つ以上の重鎖は、式ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｌ１−ｓｃＦｖＬ２（式中、Ｌ１及びＬ２は独立してリンカーであり、且つｓｃＦｖはｓｃＦｖ分子である）を有する（図１）。
【０１３８】
一実施形態では、結合分子は、１つ以上の重鎖定常ドメインを有する抗体又はその断片を含み、ここで１つ以上のｓｃＦｖ分子が、１つ以上の重鎖の１つ以上の重鎖定常ドメイン間に挿入される（図１）。一実施形態では、１つ以上の重鎖は、式ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（式中、ＶＨは重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は重鎖定常ドメインドメイン１であり、ＣＨ２は重鎖定常ドメインドメイン２であり、且つＣＨ３は重鎖定常ドメインドメイン３である）を有する（図１）。一実施形態では、１つ以上の重鎖は、式ＶＨ−ＣＨ１−Ｌ１−ｓｃＦｖ−Ｌ２−ＣＨ２−ＣＨ３（式中、Ｌ１及びＬ２は独立してリンカーであり、且つｓｃＦｖはｓｃＦｖ分子である）を有する（図１）。一実施形態では、１つ以上の重鎖は、式ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−Ｌ１−ｓｃＦｖ−Ｌ２−ＣＨ３（式中、Ｌ１及びＬ２は独立してリンカーであり、且つｓｃＦｖはｓｃＦｖ分子である）を有する。
【０１３９】
一実施形態では、結合分子は、免疫グロブリン構造、例えば１つ以上のＦｖドメインを有するＩｇＧ構造を含む。一実施形態では、Ｆｖドメインは、表１に示されるＶＨ又はＶＬ配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬ配列を含む。別の実施形態では、Ｆｖドメインは、表１に示されるＶＨ又はＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ配列を含む。一実施形態では、Ｆｖドメインは、表２に示されるＶＨ又はＶＬ配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬ配列を含む。別の実施形態では、Ｆｖドメインは、表２に示されるＶＨ又はＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ配列を含む。
【０１４０】
一実施形態では、結合分子は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３から選択される、１つ以上、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つのＣＤＲを含む１つ以上の結合ドメインを有する免疫グロブリン構造を含む。一実施形態では、結合分子は、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む１つ以上の結合ドメインを有する免疫グロブリン構造を含み、ここでＣＤＲは、表４〜６に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲから選択される。別の実施形態では、結合分子は、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む１つ以上の結合ドメインを有する免疫グロブリン構造を含み、ここでＣＤＲは、表４〜６に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、結合分子は、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む１つ以上の結合ドメインを有する免疫グロブリン構造を含み、ここでＣＤＲは、表４〜６に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１４１】
一実施形態では、結合分子は、式ＶＨ−ＬＳ−ＶＬ又は代替的にＶＬ−ＬＳ−ＶＨ（式中、ＬＳはリンカー配列である）を有する１つ以上のｓｃＦｖを含む。一実施形態では、ｓｃＦｖは、表１に示されるＶＨ又はＶＬ配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬ配列を含む。別の実施形態では、ｓｃＦｖは、表１に示されるＶＨ又はＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ配列を含む。一実施形態では、ｓｃＦｖは、表２に示されるＶＨ又はＶＬ配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬ配列を含む。別の実施形態では、ｓｃＦｖは、表２に示されるＶＨ又はＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ配列を含む。
【０１４２】
一実施形態では、結合分子は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３から選択される１つ以上、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つのＣＤＲを有する１つ以上のｓｃＦｖを含む。一実施形態では、結合分子は、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を有する１つ以上のｓｃＦｖを含み、ここでＣＤＲは、表４〜６に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲから選択される。別の実施形態では、結合分子は、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を有する１つ以上のｓｃＦｖを含み、ここでＣＤＲは、表４〜６に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、結合分子は、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を有する１つ以上のｓｃＦｖを含み、ここでＣＤＲは、表４〜６に示されるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１４３】
一実施形態では、リンカーＬＳは、（ａ）［ＧＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは０、１、２、３、４、若しくは５）（配列番号９３）、（ｂ）［ＧＧＧＧ］ｎ（式中、ｎは０、１、２、３、４、若しくは５）（配列番号１０６）又は（ａ）と（ｂ）の組み合わせのアミノ酸配列を有する。例えば、例示的なリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９２）を含む。一実施形態では、ｓｃＦｖは、免疫グロブリン構造、例えばＩｇＧ構造に、（ａ）［ＧＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは０、１、２、３、４、若しくは５）（配列番号９３）、（ｂ）［ＧＧＧＧ］ｎ（式中、ｎは０、１、２、３、４、若しくは５）（配列番号１０６）又は（ａ）と（ｂ）の組み合わせのアミノ酸配列を有する、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９２）のアミノ酸配列を含むリンカー（Ｌ１又はＬ２）を介して融合される。
【０１４４】
さらなる特定の実施形態では、結合分子は、表１に示されるＶＨ又はＶＬ配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬ配列、又は表１に示されるＶＨ又はＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ配列を含む１つ以上のＦｖドメインを有する免疫グロブリン構造、例えばＩｇＧ構造を含む。一実施形態では、式ＶＨ−ＬＳ−ＶＬ又は代替的にＶＬ−ＬＳ−ＶＨ（式中、ＬＳはリンカー配列である）を有する１つ以上のｓｃＦｖは、免疫グロブリン構造に融合され、ｓｃＦｖは、表２に示されるＶＨ又はＶＬ配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＨ及びＶＬ配列を含む。別の実施形態では、ｓｃＦｖは、表２に示されるＶＨ又はＶＬ配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性を有するＶＨ及びＶＬ配列を含む。一実施形態では、リンカーＬＳは、（ａ）［ＧＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは０、１、２、３、４、若しくは５）（配列番号９３）、（ｂ）［ＧＧＧＧ］ｎ（式中、ｎは０、１、２、３、４、若しくは５）（配列番号１０６）又は（ａ）と（ｂ）の組み合わせのアミノ酸配列を有する。例えば、例示的なリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９２）を含む。一実施形態では、ｓｃＦｖは、免疫グロブリン構造、例えばＩｇＧ構造に、（ａ）［ＧＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは０、１、２、３、４、若しくは５）（配列番号９３）、（ｂ）［ＧＧＧＧ］ｎ（式中、ｎは０、１、２、３、４、若しくは５）（配列番号１０６）又は（ａ）と（ｂ）の組み合わせのアミノ酸配列を有する、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９２）のアミノ酸配列を含むリンカー（Ｌ１又はＬ２）を介して融合される。
【０１４５】
一実施形態では、結合分子の第１の結合ドメインは、抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合断片を含む。一実施形態では、結合分子の第２の結合ドメインは、抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合断片を含む。一実施形態では、第１の結合ドメインは、抗Ａ型インフルエンザウイルスのＦｖドメインを含む。さらなる特定の実施形態では、結合分子は、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを有する可変断片（Ｆｖ）ドメインを含み、ここでＦｖは抗Ａ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する。一実施形態では、結合分子は、抗Ｂ型インフルエンザウイルスのｓｃＦｖ分子を含む１つ以上の結合ドメインを含む。一実施形態では、結合分子は、抗Ａ型インフルエンザウイルスのＦｖドメインを含む第１の結合ドメイン及び抗Ｂ型インフルエンザウイルスのｓｃＦｖ分子を含む第２の結合ドメインを含む。
【０１４６】
一実施形態では、結合分子は、配列番号６６又は配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。一実施形態では、結合分子は、配列番号６６又は配列番号６８のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【０１４７】
一実施形態では、結合分子は、配列番号６７又は配列番号６９のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖を有する、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する二重特異性抗体である。一実施形態では、結合分子は、配列番号６７又は配列番号６９のアミノ酸配列を有する重鎖を有する、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する二重特異性抗体である。
【０１４８】
一実施形態では、結合分子は、配列番号６６又は配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。一実施形態では、結合分子は、配列番号６７又は配列番号６９のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖を含む。一実施形態では、結合分子は、配列番号６６又は配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６７又は配列番号６９のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖を含む、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する二重特異性抗体である。
【０１４９】
一実施形態では、結合分子は、配列番号６６又は配列番号６８のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６７又は配列番号６９のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する二重特異性抗体である。一実施形態では、結合分子は、配列番号６６のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６７のアミノ酸配列を有する重鎖を有する二重特異性抗体である。一実施形態では、結合分子は、配列番号６８のアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６９のアミノ酸配列を有する重鎖を有する二重特異性抗体である。
【０１５０】
一実施形態では、ｓｃＦｖ分子は、３つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を有するＶＨドメインを含み、ここで３つのＣＤＲセットは、表５及び６に示されるＨＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、結合分子は、３つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を有するＶＨドメインを含み、ここで３つのＣＤＲセットは、表５及び６に示されるＨＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１５１】
一実施形態では、ｓｃＦｖ分子は、３つのＣＤＲセット：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を有するＶＬドメインを含み、ここで３つのＣＤＲセットは、表５及び６に示されるＬＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、結合分子は、３つのＣＤＲセット：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を有するＶＬドメインを含み、ここで３つのＣＤＲセットは、表５及び６に示されるＬＣＤＲのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１５２】
さらなる特定の実施形態では、結合分子は、配列番号３１、配列番号３４、配列番号４７、配列番号５０、及び配列番号６３で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有する１つ以上のｓｃＦｖを含む。一実施形態では、結合分子は、配列番号３１、配列番号３４、配列番号４７、配列番号５０、及び配列番号６３で示されるアミノ酸配列を有する１つ以上のｓｃＦｖを含む。
【０１５３】
Ａ型インフルエンザ結合ドメイン
一実施形態では、結合分子は、Ａ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つの特定エピトープに免疫特異的に結合する１つ以上の結合ドメインを含む。本明細書で用いられるとき、用語「結合ドメイン」又は「抗原結合ドメイン」は、抗原上のエピトープに特異的に結合する部位を含む。抗体の抗原結合ドメインは、典型的には、免疫グロブリン重鎖可変領域の少なくとも一部及び免疫グロブリン軽鎖可変領域の少なくとも一部を含み、ここでこれらの可変領域によって形成される結合部位は抗体の特異性を決定する。
【０１５４】
さらなる特定の実施形態では、結合分子は、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも１つの特定エピトープに免疫特異的に結合する１つ以上の結合ドメインを含む。用語「エピトープ」は、本明細書で用いられるとき、抗体に結合する能力があるタンパク質決定基を指す。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的活性表面のグルーピングを含み、通常、特定の三次元構造特性、並びに特定の荷電特性を有する。立体構造及び非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合が失われるが後者では失われない点で区別される。
【０１５５】
一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７若しくは全部のＡ型インフルエンザのサブタイプの中で保存されるエピトープに結合する。別の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７、及びＨ１８から選択される、１つ以上、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０のＡ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプ、並びにＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５から選択される、１つ以上、又は少なくとも１、２、３、４、５、若しくは６のグループ２サブタイプの中で保存されるエピトープに結合する。
【０１５６】
一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、若しくは１７又はすべてのＡ型インフルエンザのサブタイプに、約０．０１ｕｇ／ｍｌ〜約５ｕｇ／ｍｌの間、又は約０．０１ｕｇ／ｍｌ〜約０．５ｕｇ／ｍｌの間、又は約０．０１ｕｇ／ｍｌ〜約０．１ｕｇ／ｍｌの間、又は約５ｕｇ／ｍｌ未満、１ｕｇ／ｍｌ、０．５ｕｇ／ｍｌ、０．１ｕｇ／ｍｌ、若しくは０．０５ｕｇ／ｍｌのＥＣ５０で結合する。別の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７、及びＨ１８から選択される、１つ以上、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０のＡ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプ、並びにＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５から選択される、１つ以上、又は少なくとも１、２、３、４、５、若しくは６のグループ２サブタイプに、約０．０１ｕｇ／ｍｌ〜約５ｕｇ／ｍｌの間、又は約０．０１ｕｇ／ｍｌ〜約０．５ｕｇ／ｍｌの間、又は約０．０１ｕｇ／ｍｌ〜約０．１ｕｇ／ｍｌの間、又は約５ｕｇ／ｍｌ未満、１ｕｇ／ｍｌ、０．５ｕｇ／ｍｌ、０．１ｕｇ／ｍｌ、若しくは０．０５ｕｇ／ｍｌのＥＣ５０で結合する。
【０１５７】
一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、線形エピトープ又は連続エピトープのいずれかであるエピトープを認識する。別の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、非線形又は立体構造エピトープを認識する。一実施形態では、エピトープは、ＨＡ２の高度に保存されたストーク領域内に位置する。さらなる特定の実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、ＨＡ２の高度に保存されたストーク領域内の立体構造エピトープに結合する（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ．２８９：３６６−３７３）。一実施形態では、エピトープは、接触残基としてのＨＡ２のストーク領域内の１８、１９、４２、４５、１５６、及び１９６から選択される１つ以上のアミノ酸を含む。さらなる特定の実施形態では、エピトープは、接触残基としてのＨＡ２のストーク領域内の１８、１９、４２及び４５から選択される１つ以上のアミノ酸を含む。さらなる実施形態では、エピトープは、接触残基としてのＨＡ２のストーク領域内のアミノ酸１８、１９、４２及び４５を含む。さらなる実施形態では、エピトープは、接触残基としてのＨＡ２のストーク領域内のアミノ酸１８、１９、及び４２を含む。
【０１５８】
Ｂ型インフルエンザ結合ドメイン
一実施形態では、結合分子は、Ｂ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つの特定エピトープに免疫特異的に結合する１つ以上の結合ドメインを含む。さらなる特定の実施形態では、結合分子は、Ｂ型インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の少なくとも１つの特定エピトープに免疫特異的に結合する１つ以上の結合ドメインを含む。一実施形態では、結合分子は、少なくとも２つの系統学的に異なるＢ型インフルエンザ系統に提示されるエピトープに特異的に結合する１つ以上の結合ドメインを含む。さらなる特定の実施形態では、結合分子は、少なくとも１つのＢ型インフルエンザＹａｍａｇａｔａ株及び少なくとも１つのＢ型インフルエンザＶｉｃｔｏｒｉａ株に提示されるエピトープに結合する１つ以上の結合ドメインを含む。一実施形態では、結合分子は、Ｙａｍａｇａｔａ系統及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統の双方のＢ型インフルエンザウイルスに提示されるエピトープに結合する１つ以上の結合ドメインを含む。一実施形態では、結合メンバーは、Ｙａｍａｇａｔａ系統及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統の双方のＢ型インフルエンザの中に保存されるエピトープに結合する１つ以上の結合ドメインを含む。
【０１５９】
一実施形態では、結合分子は、少なくとも１つのＢ型インフルエンザＹａｍａｇａｔａ株及び少なくとも１つのＢ型インフルエンザＶｉｃｔｏｒｉａ株に、約１ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ〜約２５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約５００ｎｇ／ｍｌ未満、２５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、若しくは１５μｇ／ｍｌの最大半量有効濃度（ＥＣ５０）で結合する１つ以上の結合ドメインを含む。別の実施形態では、結合分子は、Ｙａｍａｇａｔａ及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルスに、約１ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ〜約２５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約５００ｎｇ／ｍｌ未満、２５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、若しくは１５μｇ／ｍｌのＥＣ５０で結合する１つ以上の結合ドメインを含む。一実施形態では、結合分子は、Ｙａｍａｇａｔａ系統及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統の双方のＢ型インフルエンザウイルスに提示されるエピトープに、約１ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ〜約２５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約５００ｎｇ／ｍｌ未満、２５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、若しくは１５μｇ／ｍｌのＥＣ５０で結合する１つ以上の結合ドメインを含む。
【０１６０】
一実施形態では、結合分子は、Ｂ型インフルエンザＹａｍａｇａｔａ系統に提示されるエピトープに、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの間、１ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ〜約２５ｎｇ／ｍｌの間、又は約５０ｎｇ／ｍｌ若しくは２５ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で；Ｂ型インフルエンザＶｉｃｔｏｒｉａ系統に提示されるエピトープに、約１ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ〜約２５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約５００ｎｇ／ｍｌ未満、２５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ若しくは５０ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０で結合する１つ以上の結合ドメインを含む。
【０１６１】
別の実施形態では、結合分子は、Ｂ型インフルエンザＹａｍａｍｏｔｏ系統に提示されるエピトープに、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの間、１ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ〜約２５ｎｇ／ｍｌの間、又は約５０ｎｇ／ｍｌ若しくは２５ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で；Ｂ型インフルエンザＶｉｃｔｏｒｉａ系統に提示されるエピトープに、約１ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ〜約２５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約５００ｎｇ／ｍｌ未満、２５０ｎｇ／ｍｌ若しくは１００ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０で；並びにＡ型インフルエンザＨＡ上のエピトープに、約１μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの間、又は約５０μｇ／ｍｌ未満、２５μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ若しくは１０μｇ／ｍｌのＥＣ５０で結合する１つ以上の結合ドメインを含む。別の実施形態では、結合分子は、Ｂ型インフルエンザＹａｍａｇａｔａ系統に提示されるエピトープに、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの間、１ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ〜約２５ｎｇ／ｍｌの間、又は約５０ｎｇ／ｍｌ若しくは２５ｎｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で；Ｂ型インフルエンザＶｉｃｔｏｒｉａ系統に提示されるエピトープに、約１ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ〜約２５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌの間、又は約５００ｎｇ／ｍｌ未満、２５０ｎｇ／ｍｌ若しくは１００ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０で；並びにＡ型インフルエンザＨ９  ＨＡ上のエピトープに、約１μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの間、又は約５０μｇ／ｍｌ未満、２５μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ若しくは１０μｇ／ｍｌのＥＣ５０で結合する１つ以上の結合ドメインを含む。
【０１６２】
一実施形態では、結合分子は、線形エピトープ又は連続エピトープのいずれかのエピトープを認識する１つ以上の結合ドメインを含む。別の実施形態では、結合分子は、非線形又は立体構造エピトープを認識する１つ以上の結合ドメインを含む。一実施形態では、エピトープは、Ｂ型インフルエンザのヘマグルチニン（ＨＡ）糖タンパク質上に位置する。さらなる特定の実施形態では、エピトープは、Ｂ型インフルエンザのＨＡ糖タンパク質の頭部領域に位置する。一実施形態では、エピトープは、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２（６）：３０１１−２０に記載のようなＨ３付番システムに従って付番される、接触残基としてのＢ型インフルエンザＨＡの頭部領域内の１２８位、１４１位、１５０位若しくは２３５位に１つ以上のアミノ酸を含む。一実施形態では、エピトープは、接触残基としてのＢ型インフルエンザＨＡの頭部領域の配列のアミノ酸１２８を含む。別の実施形態では、エピトープは、接触残基としてのＢ型インフルエンザＨＡの頭部領域の配列のアミノ酸１４１、１５０及び２３５を含む。
【０１６３】
交差反応
一実施形態では、結合分子は、結合分子が認識するか又は特異的に結合する抗原のエピトープ又は部分の観点で説明又は特定され得る。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的分子の部分は、「エピトープ」又は「抗原決定基」と称される。標的抗原は、サイズ、立体構造、及び抗原タイプに応じて任意の数のエピトープを含み得る。一実施形態では、結合分子は、本明細書に記載の抗体の１つ以上と同じエピトープに特異的に結合し、及び／又は本明細書に記載の抗体をエピトープへの結合から競合的に阻害することになる。
【０１６４】
一実施形態では、結合分子の１つ以上の結合ドメインは、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスとの交差反応性を呈する。本明細書で用いられるとき、用語「交差反応性」は、１つの抗原に特異的な結合分子の結合ドメインが第２の抗原と反応する能力を指す。したがって、結合分子は、その形成を誘導したエピトープ以外のエピトープに結合する場合、交差反応性がある。
【０１６５】
Ｆｃ領域
一実施形態では、結合分子は、所望されるエフェクター機能又は血清半減期を提供するようにＦｃ領域内で修飾される抗体である。一実施形態では、Ｆｃ領域は、例えば、抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介して、又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）における補体を動員することにより、又はＡ型インフルエンザ及び／又はＢ型インフルエンザウイルスでの結合抗体を認識し、その後、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）における細胞の食作用を引き起こす１つ以上のエフェクターリガンドを発現する非特異的細胞傷害性細胞を動員することにより、又は一部の他の機構により、細胞傷害性を誘導し得る。他の実施形態では、副作用又は治療合併症を最小化するため、エフェクター機能を除去するか又は低下させることが望ましい場合がある。Ｆｃエフェクター機能を増強するとともに、低下させるか又は除去するための方法は公知である。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃＲｎに対する結合親和性を増加させ、ひいては血清半減期を延長するように修飾され得る。さらに他の実施形態では、Ｆｃ領域は、血清半減期を延長するため、ＰＥＧ又はアルブミンに複合され得る。Ｆｃ変異体は、２０１３年１０月２日に出願された米国仮特許出願第６１／８８５，８０８号明細書、２０１４年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／００２，４１４号明細書、及び２０１４年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／０２４，８０４号明細書（それらの開示は本明細書でそれら全体が参照により本明細書中に援用される）により十分に記載されている。
【０１６６】
結合特性
本明細書に記載される結合分子は、Ａ型インフルエンザウイルス及び／又はＢ型インフルエンザウイルスのタンパク質、ペプチド、サブユニット、断片、部分又はそれらの任意の組み合わせの少なくとも１つの特定のエピトープ又は抗原決定基に、他のポリペプチドに対して排他的又は優先的に、免疫特異的に結合する。用語「エピトープ」又は「抗原決定基」は、本明細書で用いられるとき、抗体に結合することが可能なタンパク質決定基を指す。一実施形態では、用語「結合」は、本明細書中で特異的結合に関する。これらのタンパク質決定基又はエピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的活性表面グルーピングを含み、通常は特定の三次元構造特性、並びに特定の電荷特性を有する。立体構造的及び非立体構造的エピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒の存在下で失われるという点で区別される。用語「不連続エピトープ」は、本明細書で用いられるとき、タンパク質の一次配列内の少なくとも２つの分離領域から形成されるタンパク質抗原上の立体構造的エピトープを指す。
【０１６７】
抗原と抗体の間の相互作用は、他の非共有結合的なタンパク質−タンパク質相互作用の場合と同じである。一般に、４種の結合相互作用、すなわち、（ｉ）水素結合、（ｉｉ）分散力、（ｉｉｉ）ルイス酸とルイス塩基の間の静電力、及び（ｉｖ）疎水性相互作用が、抗原と抗体の間に存在する。疎水性相互作用は、抗体−抗原相互作用における主な駆動力であり、また分子間引力ではなく非極性基による水の反発に基づくものである（Ｔａｎｆｏｒｄ（１９７８）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００：１０１２−８）。しかし、特定の物理的力はまた、抗原−抗体結合、例えば異なる抗体結合部位を有するエピトープ形状のフィット又は優遇（ｆｉｔ  ｏｒ  ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）に寄与する。さらに、他の材料及び抗原は、抗体と交差反応し、それによって利用可能な遊離抗体と競合し得る。
【０１６８】
抗原と抗体との間の結合の親和性定数及び特異性の測定は、本明細書に記載される結合分子を用いる予防、治療、診断及び研究方法の有効性を判定するのを補助し得る。「結合親和性」は、一般にある分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間での非共有相互作用全体の力を指す。特に指示されない限り、本明細書で用いられるとき、「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば抗体及び抗原）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般に、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出される平衡解離定数（Ｋｄ）によって表され得る。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１を参照のこと。低親和性抗体は一般に、抗原に徐々に結合し且つ容易に解離する傾向がある一方、高親和性抗体は一般に、抗原により迅速に結合し且つ結合状態をより長く維持する傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法は当該技術分野で公知である。
【０１６９】
一実施形態では、結合分子は、抗体の可変領域の１つ以上に導入される、１つ以上のアミノ酸改変、例えば、１つ以上の置換、欠失及び／又は付加を含む。別の実施形態では、アミノ酸改変は、フレームワーク領域に導入される。フレームワーク領域残基の１つ以上の変化は、結合分子の抗原に対する結合親和性における改善をもたらす場合がある。一実施形態では、約１〜約５のフレームワーク残基が改変されてもよい。
【０１７０】
結合親和性を決定するための一方法は、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１によって記載の目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって解離定数「Ｋｄ」を測定することを含む。あるいは、Ｋｄ値は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを用いることにより測定してもよい。オンレートが表面プラズモン共鳴アッセイにより１０６Ｍ−１Ｓ−１を超える場合、オンレートは、漸増濃度の抗原の存在下での蛍光発光強度の増加及び低下を測定する蛍光クエンチング技術を用いることにより決定され得る。「オンレート」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」はまた、上記と同じ表面プラズモン共鳴技術を用いて決定され得る。
【０１７１】
結合分子の結合特性の判定に適した方法及び試薬は、当該技術分野で公知であり、及び／又は市販されている（米国特許第６，８４９，４２５号明細書；同第６，６３２，９２６号明細書；同第６，２９４，３９１号明細書；同第６，１４３，５７４号明細書）。さらに、かかる動力学分析のために設計された機器及びソフトウェアは市販されている（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ａ１００、及びＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００機器；Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。
【０１７２】
一実施形態では、結合分子（その抗原結合断片又は変異体を含む）は、それらのＡ型インフルエンザウイルス；Ｂ型インフルエンザウイルス；又はそれらの組み合わせに対する結合親和性の観点で説明又は特定してもよい。典型的には、高親和性を有する抗体は、１０−７Ｍ未満のＫｄを有する。一実施形態では、結合分子又はその抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザウイルス；Ｂ型インフルエンザウイルス；その断片又は変異体；又はそれらの組み合わせに、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ若しくは１０−１５Ｍ以下の解離定数すなわちＫｄで結合する。より特定の実施形態では、結合分子又はその抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザウイルス；Ｂ型インフルエンザウイルス、その断片又は変異体；又はその組み合わせに、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ若しくは１０−１２Ｍ以下の解離定数すなわちＫｄで結合する。本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス；Ｂ型インフルエンザウイルス；又はそれらの組み合わせに、個別の列挙される値のいずれかの間の範囲内にある解離定数すなわちＫｄで結合する結合分子又はその抗原結合断片を包含する。
【０１７３】
別の実施形態では、結合分子又はその抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザウイルス；Ｂ型インフルエンザウイルス；その断片又は変異体；又はそれらの組み合わせに、５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×１０−３秒−１若しくは１０−３秒−１、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１、若しくは１０−５秒−１、５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１若しくは１０−７秒−１以下のオフレート（ｋｏｆｆ）で結合する。より特定の実施形態では、結合分子又はその抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザポリペプチド又はその断片若しくは変異体に、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１、若しくは１０−５秒−１、５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１若しくは１０−７秒−１以下のオフレート（ｋｏｆｆ）で結合する。本発明はまた、Ａ型インフルエンザウイルス；Ｂ型インフルエンザウイルス；又はそれらの組み合わせに、個々の列挙される値のいずれかの間の範囲内にあるオフレート（ｋｏｆｆ）で結合する結合分子又はその抗原結合断片を包含する。
【０１７４】
別の実施形態では、結合分子又はその抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザウイルス；Ｂ型インフルエンザウイルス；その断片又は変異体；又はそれらの組み合わせに、１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１、５×１０４Ｍ−１秒−１、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、５×１０６Ｍ−１秒−１、１０７Ｍ−１秒−１、若しくは５×１０７Ｍ−１秒−１以上のオンレート（ｋｏｎ）で結合する。より特定の実施形態では、結合分子又はその抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザウイルス；Ｂ型インフルエンザウイルス；その断片又は変異体；又はそれらの組み合わせに、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、５×１０６Ｍ−１秒−１、１０７Ｍ−１秒−１若しくは５×１０７Ｍ−１秒−１以上のオンレート（ｋｏｎ）で結合する。本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス；Ｂ型インフルエンザウイルス；又はそれらの組み合わせに、個別の列挙される値のいずれかの間の範囲内にあるオンレート（ｋｏｎ）で結合する抗体を包含する。
【０１７５】
一実施形態では、結合アッセイは、直接結合アッセイ又は競合結合アッセイのいずれかとして実施してもよい。結合は、標準ＥＬＩＳＡ又は標準フローサイトメトリーアッセイを用いて検出され得る。直接結合アッセイでは、候補の結合分子又は抗体が、その同族抗原への結合について試験される。他方、競合結合アッセイでは、候補の結合分子又は抗体が特定の抗原、例えばＡ型インフルエンザウイルスＨＡ又はＢ型インフルエンザウイルスＨＡに結合する既知の抗体又は他の化合物と競合する能力が評価される。一般に、本明細書に開示される結合分子の結合特性を検出及び測定するため、結合分子と検出可能なＡ型インフルエンザウイルスＨＡ及び／又はＢ型インフルエンザウイルスＨＡとの結合を可能にする任意の方法を用いることができる。
【０１７６】
一実施形態では、結合分子は、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡ及び／又はＢ型インフルエンザウイルスＨＡに免疫特異的に結合する能力があり、Ａ型インフルエンザウイルス及び／又はＢ型インフルエンザウイルス感染を中和する能力がある。
【０１７７】
一実施形態では、結合分子の少なくとも１つの結合ドメインは、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡに免疫特異的に結合する能力があり、Ａ型インフルエンザウイルス感染を中和する能力がある。Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンサブタイプは、サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７、及びＨ１８を含むグループ１並びにサブタイプＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、及びＨ１５を含むグループ２として同定された、２つの主要な系統学的なグルーピングに該当する。一実施形態では、結合分子又はその結合断片の少なくとも１つの結合ドメインは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７、及びＨ１８から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプ及びその変異体に対して結合及び／又は中和する能力がある。別の実施形態では、結合分子又はその結合断片の少なくとも１つの結合ドメインは、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのグループ２サブタイプ及びその変異体に対して結合及び／又は中和する能力がある。一実施形態では、結合分子は、Ａ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプＨ９に免疫特異的に結合する能力がある１つ以上の結合ドメインを含む。一実施形態では、結合分子は、Ａ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプＨ９に対して免疫特異的に結合し且つ中和する能力がある１つ以上の結合ドメインを含む。
【０１７８】
一実施形態では、結合分子の少なくとも１つの結合ドメインは、少なくとも１つのＹａｍａｇａｔａ系統のＢ型インフルエンザウイルス及び少なくとも１つのＶｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ型インフルエンザウイルスに対して免疫特異的に結合し且つ中和する能力がある。別の実施形態では、結合分子の少なくとも１つの結合ドメインは、Ｙａｍａｇａｔａ系統及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統の双方のＢ型インフルエンザウイルスに対して免疫特異的に結合し且つ中和する。
【０１７９】
一実施形態では、結合分子又はその抗原結合断片の少なくとも１つの結合ドメインは、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡ及びＢ型インフルエンザウイルスＨＡの双方に免疫特異的に結合し、且つＡ型インフルエンザウイルス感染及びＢ型インフルエンザウイルス感染の双方を中和する能力がある。中和アッセイは、当該技術分野で公知の方法を用いて実施され得る。用語「阻害濃度５０％」（「ＩＣ５０」と略記される）は、Ａ型インフルエンザウイルス及び／又はＢ型インフルエンザウイルスの５０％の中和のために必要とされる阻害剤（例えば本明細書で記載される結合分子）の濃度を表す。より低いＩＣ５０値がより強力な阻害剤に対応することは当業者によって理解されるであろう。
【０１８０】
一実施形態では、結合分子又はその結合断片は、マイクロ中和アッセイにおける約０．００１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌの範囲内、又は抗体での約０．００１μｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌの範囲内、又は５μｇ／ｍｌ未満、２μｇ／ｍｌ未満、１μｇ／ｍｌ未満、０．５μｇ／ｍｌ未満、０．１μｇ／ｍｌ未満、０．０５μｇ／ｍｌ未満若しくは０．０１μｇ／ｍｌ未満の、Ａ型インフルエンザウイルス及び／又はＢ型インフルエンザウイルスを中和するためのＩＣ５０を有する。
【０１８１】
一実施形態では、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片は、マイクロ中和アッセイにおける、約０．００１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌの範囲内、又は抗体の約０．００１μｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌの範囲内、又は５μｇ／ｍｌ未満、２μｇ／ｍｌ未満、１μｇ／ｍｌ未満、０．５μｇ／ｍｌ未満、０．１μｇ／ｍｌ未満、０．０５μｇ／ｍｌ未満若しくは０．０１μｇ／ｍｌ未満の、Ｂ型インフルエンザウイルスを中和するためのＩＣ５０；及び、マイクロ中和アッセイにおけるＡ型インフルエンザウイルスの中和のための、約０．１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌの範囲内、又は抗体の約０．１μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌの範囲内、又は５μｇ／ｍｌ未満、２μｇ／ｍｌ未満、１μｇ／ｍｌ未満、若しくは０．５μｇ／ｍｌ未満の、Ａ型インフルエンザウイルスを中和するためのＩＣ５０を有する。
【０１８２】
一実施形態では、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片は、マイクロ中和アッセイにおける、約０．００１μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの範囲内、又は抗体の約０．００１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌの範囲内、又は抗体の約０．００１μｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌの範囲内、又は１０μｇ／ｍｌ未満、５μｇ／ｍｌ未満、１μｇ／ｍｌ未満、０．５μｇ／ｍｌ未満、０．１μｇ／ｍｌ未満、０．０５μｇ／ｍｌ若しくは０．０１μｇ／ｍｌ未満の、Ｂ型インフルエンザウイルスを中和するためのＩＣ５０；及び、マイクロ中和アッセイにおけるＡ型インフルエンザウイルスの中和のための、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの範囲内、又は抗体の約０．０５μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌの範囲内、又は抗体の約０．１μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌの範囲内、又は５０μｇ／ｍｌ未満、２５μｇ／ｍｌ未満、１０μｇ／ｍｌ未満、５μｇ／ｍｌ未満、又は２μｇ／ｍｌ未満の、Ａ型インフルエンザウイルスを中和するためのＩＣ５０を有する。
【０１８３】
特定の実施形態では、本明細書に記載される結合分子は、細胞死を誘導しうる。「細胞死を誘導する」抗体は、生細胞を生育不能に至らしめるものである。細胞死は、補体及び免疫エフェクター細胞の不在下でインビトロで測定し、抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）によって誘導される細胞死を区別することができる。従って、細胞死用のアッセイは、熱不活化血清を用いて（すなわち補体の不在下で）且つ免疫エフェクター細胞の不在下で実施してもよい。抗体が細胞死を誘導することができるか否かを判定するため、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：１−１１を参照のこと）、７ＡＡＤの取り込み又は当該技術分野で周知の方法によって評価される膜完全性の欠損は、未処理細胞と比べて評価することができる。
【０１８４】
一実施形態では、結合分子は、アポトーシスを介して細胞死を誘導し得る。「アポトーシスを誘導する」結合分子は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞断片化、及び／又は（アポトーシス体と呼ばれる）膜小胞の形成によって判定されるプログラム細胞死を誘導するものである。アポトーシスに関連した細胞事象を評価するための様々な方法が利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）転座は、アネキシンの結合によって測定可能であり、ＤＮＡ断片化は、ＤＮＡラダリングを通じて評価可能であり、またＤＮＡ断片化に伴う核／クロマチン凝縮は、低二倍体細胞での任意の増加によって評価可能である。一実施形態では、アポトーシスを誘導する抗体は、アネキシン結合アッセイにおいて、未処理細胞と比べて約２〜５０倍、一実施形態では約５〜５０倍、また一実施形態では約１０〜５０倍のアネキシン結合の誘導をもたらすものである。
【０１８５】
別の実施形態では、本明細書に記載される結合分子は、抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）及び／又は抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）を介して細胞死を誘導し得る。ヒトＩｇＧ１サブクラス抗体のＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性の発現は、一般に、抗体のＦｃ領域の、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞又は活性化マクロファージなどのエフェクター細胞の表面上に存在する抗体に対する受容体（以降「ＦｃγＲ」と称される）への結合を含む。様々な補体成分が結合され得る。その結合に関しては、抗体のヒンジ領域内の数個のアミノ酸残基及びＣ領域の２番目のドメイン（以降「Ｃγ２ドメイン」と称される）が重要であり（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３（５）：１０９８−１０４；Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．８６（２）：３１９−３２４；Ｃｌａｒｋ，Ｍ．（１９９７）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．６５：８８−１１０）、Ｃγ２ドメイン内の糖鎖（Ｃｌａｒｋ，Ｍ．（１９９７）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．６５：８８−１１０）もまた重要であることが示唆されている。
【０１８６】
ＡＤＣＣ活性を評価するため、インビトロＡＤＣＣアッセイ、例えば米国特許第５，５００，３６２号明細書に記載のものを用いることができる。同アッセイはまた、市販のキット、例えばＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施してもよい。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞として、限定はされないが、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びＮＫ細胞株が挙げられる。トランスジェニックＦｃ受容体（例えばＣＤ１６）及び関連のシグナル伝達ポリペプチド（例えばＦＣεＲＩ−γ）を発現するＮＫ細胞株は、エフェクター細胞としても役立ち得る（国際公開第２００６／０２３１４８号パンフレット）。一実施形態では、ＮＫ細胞株は、ＣＤ１６を含み、且つＮＦＡＴプロモーター下でルシフェラーゼを有し、細胞溶解又は細胞死ではなくＮＫ細胞活性化を測定するために用いることができる。ＮＫ細胞の代わりにＪｕｒｋａｔ細胞を用いる類似の技術が、Ｐｒｏｍｅｇａにより販売されている（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ＃Ｇ７０１０）。例えば、任意の特定の抗体が補体活性化及び／又はＡＤＣＣにより溶解を媒介する能力はアッセイ可能である。目的の細胞はインビトロで成長し、標識され、結合分子は、抗原抗体複合体により活性化され得る免疫細胞、すなわちＡＤＣＣ応答に関与するエフェクター細胞と組み合わせて細胞培養物に添加される。結合分子はまた、補体活性化について試験され得る。いずれの場合でも、細胞溶解は溶解細胞からの標識の放出により検出される。細胞溶解の程度はまた、細胞質タンパク質（例えばＬＤＨ）の上清への放出を検出することにより判定してもよい。事実、抗体は、患者自身の血清を補体及び／又は免疫細胞の供給源として用いてスクリーニング可能である。次に、インビトロ試験においてヒトＡＤＣＣを媒介することが可能な結合分子は、その特定の患者において治療的に用いることができる。結合分子のＡＤＣＣ活性はまた、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：６５２−６５６に開示されたものなどの動物モデルで、インビボで評価され得る。さらに、抗体のＡＤＣＣ、及び任意選択的にはＣＤＣ活性のレベルを調節する（すなわち増加又は低下させる）ための技術は、当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書；米国特許第６，１９４，５５１号明細書；米国特許第７，３１７，０９１号明細書）。本明細書に記載される結合分子は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを誘導する能力があり得るか、又はその能力を有するように修飾されていてもよい。ＡＤＣＣ機能を判定するためのアッセイは、ヒトＡＤＣＣ機能を評価するため、ヒトエフェクター細胞を用いて実行され得る。かかるアッセイはまた、壊死及び／又はアポトーシス機構により細胞死を誘導、媒介、増強、遮断する抗体についてスクリーニングするように意図されたものを含み得る。生存可能な色素を利用するアッセイ、カスパーゼを検出し、分析する方法、及びＤＮＡ切断を測定するアッセイを含むかかる方法は、目的の抗体とともにインビトロで培養された細胞のアポトーシス活性を評価するため、用いることができる。
【０１８７】
ポリヌクレオチド
さらに本明細書に提供されるのは、アミノ酸配列に対応し、本明細書に記載の結合分子をコードするヌクレオチド配列である。一実施形態では、本発明は、例えば、ＣＤＲ及びＦＲを含むＶＨ及びＶＬ領域をコードするポリヌクレオチド配列並びに細胞（例えば哺乳動物細胞）内での効率的発現のための発現ベクターを含む、本明細書に記載の結合分子又はその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドを用いて結合分子を作製する方法は公知であり、後に簡潔に説明される。
【０１８８】
さらに含まれるのは、例えば本明細書で定義される通り、本明細書に記載の結合分子又はその断片をコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな又はより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドである。用語「ストリンジェンシー」は、本明細書で用いられるとき、プローブとフィルタ結合核酸との間の相同性の程度を表すためのハイブリダイゼーション実験の実験条件（例えば温度及び塩濃度）を指し、ストリンジェンシーが高まると、プローブとフィルタ結合核酸との間のパーセント相同性が高まる。
【０１８９】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、限定はされないが、約４５℃、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのフィルタ結合ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションとその後の約５０〜６５℃、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄、高度にストリンジェントな条件、例えば、約４５℃、６×ＳＳＣ中でのフィルタ結合ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションとその後の約６５℃、０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳでの１回以上の洗浄、又は当業者に公知の任意の他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を含む（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．及びＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ６．３．１  ｔｏ  ６．３．６  ａｎｄ  ２．１０．３を参照）。
【０１９０】
実質的に同一な配列は、多形配列、すなわち、集団内の代替配列又は対立遺伝子を含む。対立遺伝子の差異は、１つの塩基対と同程度に小さくてもよい。実質的に同一な配列はまた、サイレント突然変異を有する配列を含む突然変異誘発配列を含んでもよい。突然変異は、１つ以上の残基変化、１つ以上の残基の欠失、又は１つ以上のさらなる残基の挿入を含んでもよい。
【０１９１】
当該技術分野で公知の任意の方法により、ポリヌクレオチドを入手し、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定してもよい。例えば、結合分子のヌクレオチド配列が公知である場合、結合分子をコードするポリヌクレオチドは、化学合成されたオリゴヌクレオチドから構築されてもよい（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１７：２４２に記載の通り）、つまり、結合分子をコードする配列の部分を含むオーバーラップオリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリング及びライゲーション、それに続く連結されたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅を含む。
【０１９２】
結合分子をコードするポリヌクレオチドはまた、好適な供給源由来の核酸から作製されてもよい。特定の結合分子をコードする核酸を含むクローンが利用可能でないが、結合分子の配列が公知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成されるか、又は好適な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、又はそれから作製されるｃＤＮＡライブラリー、又は抗体を発現する任意の組織若しくは細胞、例えば抗体を発現するために選択されたハイブリドーマ細胞から単離された核酸、一実施形態ではポリＡ＋ＲＮＡ）から、配列の３’及び５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いるＰＣＲ増幅により、若しくは例えば抗体をコードするｃＤＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡクローンを同定するための特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるクローニングにより入手されてもよい。次に、ＰＣＲにより生成される増幅された核酸は、当該技術分野で周知の任意の方法を用いて複製可能なクローニングベクターにクローン化されてもよい。
【０１９３】
一旦結合分子のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列が決定されると、結合分子のヌクレオチド配列は、異なるアミノ酸配列を有する結合分子を作製するため、例えばアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を作出するため、ヌクレオチド配列の操作のための当該技術分野で周知の方法、例えば組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなどを用いて操作されてもよい（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載の技術を参照）。
【０１９４】
結合分子の作製
ポリペプチド、例えば本明細書に記載の結合分子を作製し、それについてスクリーニングするための組換えＤＮＡ法は、ルーチン的であり、当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。結合分子又はその断片をコードするＤＮＡ、例えば、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ｓｃＦｖ、又はその組み合わせをコードするＤＮＡは、結合分子を得るため、好適な発現ベクターに挿入され得、次に好適な宿主細胞、例えば大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は通常では抗体タンパク質を産生しない骨髄腫細胞に遺伝子導入される。
【０１９５】
一実施形態では、プロモーターに作動可能に連結された、結合分子、結合分子若しくはその結合ドメインの重鎖若しくは軽鎖、結合ドメインの重鎖若しくは軽鎖可変ドメイン、又は重鎖又は軽鎖ＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクター。かかるベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでもよく（例えば、米国特許第５，９８１，２１６号明細書；米国特許第５，５９１，６３９号明細書；米国特許第５，６５８，７５９号明細書及び米国特許第５，１２２，４６４号明細書を参照）、また抗体の可変ドメインは、全重鎖、全軽鎖、又は全重鎖及び全軽鎖の双方の発現のため、かかるベクターにクローン化されてもよい。
【０１９６】
発現ベクターを従来の技術により宿主細胞に導入し、遺伝子導入細胞を従来の技術により培養することで、結合分子を作製することができる。一実施形態では、異種プロモーターに作動可能に連結される、結合分子又はその断片、又はその重鎖又は軽鎖、又はその部分、又は一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを有する宿主細胞が提供される。
【０１９７】
組換え抗体の発現用宿主として適する哺乳類細胞株は、当該技術分野において周知されており、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株、限定はされないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラー細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、ヒト上皮腎２９３細胞、及び数多くの他の細胞株が挙げられる。異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾について特徴的で特異的な機構を有する。発現させた抗体又はその一部分の正しい修飾及びプロセシングが確実となるように、適切な細胞株又は宿主系を選択することができる。このため、適切な一次転写物のプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が用いられ得る。かかる哺乳類宿主細胞としては、限定はされないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ヒーラー、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２Ｏ及びＴ４７Ｄ、ＮＳ０（いかなる機能性免疫グロブリン鎖も内因的に産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＳＰ２０、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ及びＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられる。ヒトリンパ球を不死化することにより開発されたヒト細胞株を使用してモノクローナル抗体を組換え産生することができる。ヒト細胞株ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）．（Ｃｒｕｃｅｌｌ，オランダ）を使用してモノクローナル抗体を組換え産生することができる。
【０１９８】
組換え抗体の発現用宿主として用いられ得るさらなる細胞株としては、限定はされないが、昆虫細胞（例えばＳｆ２１／Ｓｆ９、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）Ｂｔｉ−Ｔｎ５ｂ１−４）又は酵母細胞（例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、米国特許第７３２６６８１号明細書；他）、植物細胞（米国特許出願公開第２００８００６６２００号明細書）；及びニワトリ細胞（国際公開第２００８１４２１２４号パンフレット）が挙げられる。
【０１９９】
一実施形態では、結合分子は、細胞株で安定して発現させる。安定発現は、組換えタンパク質の長期高収率産生に用いることができる。安定発現のために、宿主細胞を、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）と、選択可能なマーカー遺伝子とを含む適切に操作されたベクターで形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、細胞を１〜２日間強化培地で成長させ、次に選択培地に切り換える。組換えプラスミドにおける選択可能なマーカーが選択に対する耐性を付与し、プラスミドをその染色体に安定的に組み込んだ細胞の成長及びフォーカスの形成を可能にすることで、次にはそのフォーカスをクローニングし、細胞株へと拡大することができる。安定細胞株を高収率で作製する方法は当該技術分野において周知されており、概して試薬が市販されている。
【０２００】
一実施形態では、結合分子は、細胞株で一過性に発現させる。一過性トランスフェクションは、細胞に導入された核酸が当該細胞のゲノム又は染色体ＤＮＡに組み込まれないプロセスであり、染色体外要素、例えばエピソームとして細胞に維持される。
【０２０１】
細胞株は、安定的にトランスフェクトされるものも、或いは一過性にトランスフェクトされるものも、結合分子の発現及び産生をもたらす当該技術分野において公知の細胞培養培地及び条件に維持される。特定の実施形態では、哺乳類細胞培養培地は、例えばＤＭＥＭ又はＨａｍ  Ｆ１２を含む市販の培地製剤をベースとする。他の実施形態では、細胞培養培地は、細胞成長及び生物学的タンパク質発現の両方の増加を支援するように修飾される。本明細書で使用されるとき、用語「細胞培養培地」、「培養培地」、及び「培地製剤」は、多細胞生物又は組織の外部の人工インビトロ環境で細胞を維持し、成長させ、増殖させ、又は拡大するための栄養溶液を指す。細胞培養培地は、例えば、細胞の成長を促進するように配合された細胞培養成長培地、又は組換えタンパク質産生を促進するように配合された細胞培養産生培地を含め、特定の細胞培養用途に最適化され得る。用語の栄養素、成分、及び構成成分は、本明細書では、細胞培養培地を構成する構成物を指して同義的に使用される。
【０２０２】
一実施形態では、細胞株は流加法を用いて維持される。本明細書で使用されるとき、「流加法」は、初めに基礎培地でインキュベートされた後、細胞培養物にさらなる栄養素が供給される方法を指す。例えば、流加法は、所与の時間内に所定の補給スケジュールに従い補足培地を添加することを含み得る。従って、「流加細胞培養物」は、細胞、典型的には哺乳類細胞、及び培養培地が培養槽に最初に供給され、且つ培養終了前の定期的な細胞及び／又は産物の回収を伴い、又は伴わずさらなる培養栄養素が培養中に培養物に対して連続的に、又は不連続に徐々に補給される細胞培養物を指す。
【０２０３】
細胞培養培地及びそこに含まれる栄養素は、当業者に周知されている。一実施形態では、細胞培養培地は、基礎培地と、少なくとも１つの加水分解物、例えば、大豆ベースの加水分解物、酵母ベースの加水分解物、又はこれらの２種類の加水分解物の組み合わせとを含むことで、変法基礎培地をもたらす。別の実施形態では、さらなる栄養素は、濃縮基礎培地など、基礎培地のみを含んでもよく、又は加水分解物、若しくは濃縮加水分解物のみを含んでもよい。好適な基礎培地としては、限定はされないが、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥ／Ｆ１２、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、α−最小必須培地（α−ＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ−ＭＥＭ）、ＰＦ  ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯタンパク質不含培地（Ｓｉｇｍａ）又はＣＨＯ細胞用タンパク質不含ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）３２５  ＰＦ  ＣＨＯ無血清培地（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を参照のこと、及びイスコフ改変ダルベッコ培地が挙げられる。本発明において用いられ得る基礎培地の他の例としては、ＢＭＥ基礎培地（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｅａｇｌｅ，Ｈ（１９６５）Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．８９，３６もまた参照のこと）；ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、粉末）（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（＃３１６００）；Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｍａｎ（１９５９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．８：３９６；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９６０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１２：１８５．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ６：２，９３もまた参照のこと）；ＣＭＲＬ  １０６６培地（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（＃１１５３０）；Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９５７）Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，５：３０３もまた参照のこと）が挙げられる。
【０２０４】
基礎培地は無血清、つまり培地は血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウマ血清、ヤギ血清、又は当業者に公知の任意の他の動物由来血清）を含有しないか、又は動物性タンパク質不含培地又は化学限定培地であってもよい。
【０２０５】
基礎培地は、様々な無機及び有機緩衝剤、１つ又は複数の界面活性剤、及び塩化ナトリウムなどの、標準的な基礎培地に見られる特定の非栄養成分を除去するため、修飾され得る。基礎細胞培地からかかる構成成分を除去することにより、残りの栄養成分の濃度を高めることができ、細胞成長及びタンパク質発現が全体的に向上し得る。加えて、取り除いた構成成分を、細胞培養条件の要件に応じて、変法基礎細胞培地を含有する細胞培養培地に加え戻してもよい。特定の実施形態では、細胞培養培地は、変法基礎細胞培地と、以下の栄養素、すなわち、鉄源、組換え成長因子；緩衝剤；界面活性剤；容量オスモル濃度調節因子；エネルギー源；及び非動物性加水分解物の少なくとも１つとを含有する。加えて、変法基礎細胞培地は、場合により、アミノ酸、ビタミン、又はアミノ酸とビタミンとの両方の組み合わせを含有し得る。別の実施形態では、変法基礎培地は、グルタミン、例えば、Ｌ−グルタミン、及び／又はメトトレキサートをさらに含有する。
【０２０６】
精製及び単離
結合分子は、産生された後、当該技術分野において公知の免疫グロブリン分子を精製する任意の方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特に特異的抗原プロテインＡ又はプロテインＧに対する親和性によるもの、及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心、溶解度の差によるか、又は任意の他の標準的なタンパク質精製技法により精製され得る。さらに、精製を促進するため、本発明の抗体又はその断片は、異種ポリペプチド配列（本明細書中で「タグ」と称される）に融合されてもよい。
【０２０７】
一実施形態では、実質的に精製／単離された結合分子が提供される。一実施形態では、これらの単離／精製された組換え的に発現された結合分子は、予防又は治療効果を媒介するため、患者に投与してもよい。予防は、薬物療法であるか、又は疾患、障害若しくは感染を発症から予防するように設計され、用いられる治療である。治療は、特定の疾患、障害又は感染の治療に特異的に関連する。治療量は、特定の疾患、障害又は感染を治療するのに要求される量である。別の実施形態では、これらの単離／精製された抗体は、インフルエンザウイルス感染、例えばＡ型インフルエンザウイルス感染、Ｂ型インフルエンザウイルス感染、又はその組み合わせを診断するのに用いてもよい。
【０２０８】
グリコシル化
グリコシル化が抗体のエフェクター機能を改変する能力に加えて、可変領域の修飾されたグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を改変することができる。一実施形態では、本抗体の可変領域におけるグリコシル化パターンが修飾される。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、この抗体はグリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば抗原に対する抗体の親和性が増加するように改変することができる。かかる炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を改変して達成することができる。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらし、それにより当該の部位のグリコシル化を除去する１つ以上のアミノ酸置換を作製することができる。かかる非グリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性が増加し得る。かかる手法は、米国特許第５，７１４，３５０号明細書及び同第６，３５０，８６１号明細書にさらに詳細に記載されている。Ｆｃ領域に存在するグリコシル化部位（例えば、ＩｇＧのアスパラギン２９７）の除去をもたらす１つ以上のアミノ酸置換もまた作製することができる。さらには、非グリコシル化抗体は、必須のグリコシル化機構を欠く細菌細胞において産生され得る。
【０２０９】
変異体及びコンジュゲート
一実施形態では、結合分子は、可変軽（ＶＬ）ドメイン及び／又は可変重（ＶＨ）ドメイン及び／又はＦｃ領域における１つ以上のアミノ酸残基及び／又はポリペプチドの置換、付加及び／又は欠失並びに翻訳後修飾を含む１つ以上の結合ドメインを含む。一実施形態では、結合分子は、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む。保存的アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性における類似性に基づいて設けられてもよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンを含み；極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンを含み；陽性荷電（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、及びヒスチジンを含み；また陰性荷電（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。さらに、グリシン及びプロリンは、鎖配向性に影響を及ぼし得る残基である。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを伴うことになる。さらに、必要に応じて、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸類似体が抗体配列に置換又は付加として導入され得る。非古典的アミノ酸として、限定はされないが、一般に、共通アミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、及びアミノ酸類似体、が挙げられる。
【０２１０】
一実施形態では、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を阻止するため、１つ以上のシステイン残基が、一般にセリンと置換されてもよい。逆に、システイン結合が抗体に、その安定性を改善するため、添加されてもよい（特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）。
【０２１１】
一実施形態では、１つ以上の突然変異が抗体分子の１つ以上のフレームワーク領域内に導入される。別の実施形態では、１つ以上の突然変異が抗体分子の１つ以上のＣＤＲ領域内に導入される。
【０２１２】
一実施形態では、結合分子は、当該技術分野で公知の方法を用いて、異種アミノ酸配列又は他の部分若しくは物質に複合又は共有結合される。一実施形態では、結合される物質は、治療剤、検出可能標識（本明細書ではレポーター分子とも称される）又は固体支持体である。抗体との結合に好適な物質としては、限定はされないが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、薬物、ホルモン、脂質、脂質集合体、合成高分子、高分子マイクロパーティクル、生体細胞、ウイルス、フルオロフォア、発色団、色素、毒素、酵素、抗体、抗体断片、放射性同位元素、固体マトリックス、半固体マトリックス及びそれらの組み合わせが挙げられる。別の物質を抗体にコンジュゲート又は共有結合する方法は、公知である。
【０２１３】
一実施形態では、結合分子は固体支持体にコンジュゲートされる。結合分子は、スクリーニング及び／又は精製及び／又は製造プロセスの一部として固体支持体にコンジュゲートされてもよい。或いは結合分子は、診断方法又は組成物の一部として固体支持体にコンジュゲートされてもよい。固体支持体は、典型的には液相に対して実質的に不溶性である。多数の支持体が利用可能であり、当業者には周知されている。
【０２１４】
一実施形態では、結合分子は、診断及び他のアッセイを目的として標識に複合され、結合分子及び／又はその関連リガンドは検出され得る。標識は、２８０ｎｍより大きい波長で吸収最大を示す任意の化学的部分（有機又は無機）を含み、結合分子に共有結合されるとき、そのスペクトル特性を保持する。標識として、限定はされないが、発色団、フルオロフォア、蛍光タンパク質、りん光色素、タンデム色素、粒子、ハプテン、酵素及び放射性同位元素が挙げられる。
【０２１５】
特定の実施形態では、標識は酵素である。酵素は、アッセイ感受性の増強をもたらす検出可能なシグナルの増幅が得られ得ることから標識として望ましい場合がある。酵素は、検出可能なシグナルの増幅を達成することができ、アッセイ感度の増加がもたらされるため、望ましい標識である。酵素それ自体は検出可能な反応を生じないが、適切な基質を接触させると基質を分解する働きをし、それにより変換された基質が蛍光、比色又は発光シグナルを生じる。標識試薬の一つの酵素が複数の基質についての検出可能なシグナルへの変換をもたらし得るため、酵素は検出可能なシグナルを増幅する。酵素基質は、好ましい計測可能な生成物、例えば比色、蛍光又は化学発光生成物が得られるように選択される。かかる基質は当該技術分野で広範に用いられており、当業者には周知されている。
【０２１６】
別の実施形態では、標識は、ビオチンなどのハプテンである。ビオチンは、酵素系において検出可能なシグナルをさらに増幅するよう機能することができ、且つ単離目的でアフィニティークロマトグラフィーにおいて使用するタグとして機能することができるため、有用である。検出目的では、アビジン−ＨＲＰなどの、ビオチンに対して親和性を有する酵素コンジュゲートが用いられる。続いてペルオキシダーゼ基質を添加すると、検出可能なシグナルが生成される。ハプテンにはまた、ホルモン、天然に存在する及び合成の薬物、汚染物、アレルゲン、作用因子分子、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、アミノ酸、ペプチド、化学的中間体、ヌクレオチドなども含まれる。
【０２１７】
特定の実施形態では、蛍光タンパク質が標識として用いられてもよい。蛍光タンパク質の例として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びフィコビリンタンパク質並びにそれらのの誘導体が挙げられる。
【０２１８】
特定の実施形態では、標識は放射性同位体である。好適な放射性物質の例としては、限定はされないが、ヨウ素（１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３５Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ，１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ及び９７Ｒｕが挙げられる。
【０２１９】
治療及び使用
本明細書に記載の結合分子及びその抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザウイルス感染及び／又はＢ型インフルエンザウイルス感染の治療のため、Ａ型インフルエンザウイルス感染及び／又はＢ型インフルエンザウイルス感染の予防のため、Ａ型インフルエンザウイルス感染及び／又はＢ型インフルエンザウイルス感染の検出、診断及び／又は予後のため、又はそれらの組み合わせのため、用いられてもよい。
【０２２０】
診断の方法は、結合分子又はその断片を試料に接触させることを含んでもよい。かかる試料は、例えば、鼻道、洞腔（ｓｉｎｕｓ  ｃａｖｉｔｉｅｓ）、唾液腺、肺、肝臓、膵臓、腎臓、耳、目、胎盤、消化管、心臓、卵巣、下垂体、副腎、甲状腺、脳又は皮膚から採取された組織試料であってもよい。検出、診断、及び／又は予後の方法もまた、抗原／抗体複合体の検出を含んでもよい。
【０２２１】
一実施形態では、結合分子又はその結合断片、あるいは結合分子又はその結合断片を含む医薬組成物を有効量で被験者に投与することにより被験者を治療する方法を提供する。一実施形態では、結合分子又はその結合断片は、実質的に精製される（すなわち、その効果を制限するか又は望ましくない副作用をもたらす物質から実質的に遊離される）。一実施形態では、本発明の結合分子又はその結合断片は、曝露後、すなわち被験者がＡ型インフルエンザウイルス及び／若しくはＢ型インフルエンザウイルスに曝露されてから又はＡ型インフルエンザウイルス及び／若しくはＢ型インフルエンザウイルスに感染後、投与される。別の実施形態では、結合分子又はその結合断片は、曝露前に投与されるか、又はＡ型インフルエンザウイルス及び／若しくはＢ型インフルエンザウイルスにまだ曝露されていないか又はＡ型インフルエンザウイルス及び／若しくはＢ型インフルエンザウイルスの感染をまだ受けていない被験者に投与される。
【０２２２】
一実施形態では、結合分子又はその結合断片は、１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプ及び／又はＢ型インフルエンザウイルス株について血清陰性である被験者に投与される。別の実施形態では、結合分子又はその抗原結合断片は、１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプ及び／又はＢ型インフルエンザウイルス株について血清陽性である被験者に投与される。一実施形態では、結合分子又はその結合断片は、感染又は症状発症から１、２、３、４、５日以内に被験者に投与される。別の実施形態では、結合分子又はその結合断片は、感染又は症状発症から１、２、３、４、５、６、若しくは７日後、及び２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０日以内に被験者に投与される。
【０２２３】
一実施形態では、本方法は、被験者におけるＡ型インフルエンザウイルス及び／又はＢ型インフルエンザウイルス感染を低減する。別の実施形態では、本方法は、被験者におけるＡ型インフルエンザウイルス及び／又はＢ型インフルエンザウイルス感染を予防するか、そのリスクを低減するか又は遅延させる。一実施形態では、被験者は動物である。一実施形態では、被験者は亜門網（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ  ｃｏｒｄａｔａ）であり、例えばヒト及び他の霊長類、例えば非ヒト霊長類、例えばチンパンジー及び他の類人猿及びサル種などである。別の実施形態では、被験者は、家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマ；飼育動物、例えばイヌ及びネコ；実験動物、例えば齧歯類、マウス、ラット及びモルモットなど；トリ、例えば、飼い慣らされた鳥、野鳥及び狩猟鳥、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ及び他の野禽、アヒル、ガチョウなどである。一実施形態では、被験者は、限定はされないが、Ａ型インフルエンザウイルス及び／又はＢ型インフルエンザウイルス感染に対して特にリスクがあるか又は罹りやすい者、例えば易感染性被験者を含む。
【０２２４】
治療は単回用量スケジュール又は複数回用量スケジュールであり得、また結合分子又はその結合断片は、受動免疫又は能動ワクチン接種において用いることができる。
【０２２５】
一実施形態では、結合分子又はその結合断片は、１つ以上の抗ウイルス薬と組み合わせて被験者に投与される。一実施形態では、結合分子又はその結合断片は、１つ以上の小分子抗ウイルス薬、例えば限定はされないが、ノイラミニダーゼ阻害剤、例えば、オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標））、ザナミビル（ＲＥＬＥＮＺＡ（登録商標））及びアダマンタン、例えばアマンタジン及びリマンタジンなどと組み合わせて被験者に投与される。
【０２２６】
別の実施形態では、Ａ型インフルエンザウイルス及び／又はＢ型インフルエンザウイルス感染の予防又は治療のための薬剤として用いられる組成物が提供される。別の実施形態では、結合分子又はその結合断片及び／又は結合分子若しくはその抗原結合断片が結合するエピトープを有するタンパク質が、被験者の治療及び／又は被験者における診断のための薬剤の製造において用いられる。
【０２２７】
本明細書に記載のような結合分子及びその断片もまた、Ａ型インフルエンザウイルス感染；Ｂ型インフルエンザウイルス感染；又はその組み合わせの診断用のキットにおいて用いられてもよい。本明細書に記載のような結合分子、抗体断片、又はその変異体及び誘導体はまた、ワクチン免疫原性を監視するためのキットにおいて用いられてもよい。
【０２２８】
一実施形態では、医薬組成物を調製する方法であって、本明細書に記載の結合分子を１つ以上の薬学的に許容できる担体と混合するステップを含む、方法が提供される。
【０２２９】
限定はされないが、リポソーム、微小粒子、及びマイクロカプセル中の被包、結合分子若しくは断片を発現する能力がある組換え細胞、受容体介在性エンドサイトーシス、エレクトロポレーション、レトロウイルス若しくは他のベクターの一部としての核酸の作成などを含む、様々な送達系は公知であり、本明細書に記載の結合分子又はその結合断片を投与するために用いることができる。導入方法は、限定はされないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路を含む。一実施形態では、結合分子は、結合分子をコードするＤＮＡ又はＲＮＡを有するプラスミドとして、例えばエレクトロポレーションにより投与され得る。組成物は、限定はされないが小分子抗ウイルス性組成物を含む他の生物活性剤とともに投与されてもよい。投与は、全身性又は局所性であり得る。経肺投与はまた、例えば、吸入器又は噴霧器の使用、及びエアロゾル化剤との調合により用いることができる。さらに別の実施形態では、組成物は、徐放システムにおいて送達され得る。
【０２３０】
結合分子又はその結合断片、及び薬学的に許容できる担体を治療有効量で含む医薬組成物もまた、本明細書で提供される。用語「薬学的に許容できる」は、本明細書で使用されるとき、動物、より詳細にはヒトで使用するため、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって認可されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められている薬局方において収載されていることを意味する。用語「担体」は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は媒体を指す。かかる薬学的担体は、滅菌液体、例えば水及び油、例えば石油、動物、植物又は合成起源のもの、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等であり得る。水は、医薬組成物が静脈内投与される場合に好ましい担体である。生理食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール溶液もまた、特に注射可能溶液用に、液体担体として使用することができる。好適な薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等を含む。組成物はまた、必要に応じて、少量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤等の形態をとることができる。組成物は、坐剤として、従来型の結合剤及びトリグリセリドなどの担体と配合することができる。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等などの標準担体を含み得る。一実施形態では、医薬組成物は、患者に対する適切な投与のための形態を提供するように、治療有効量の抗体又はその抗原結合断片を、適量の担体とともに、好ましくは精製形態で含有する。製剤は、投与方法に適合させるべきである。典型的には、抗体治療薬においては、患者に投与される用量は、患者の体重に対して約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。
【０２３１】
キット
一実施形態では、少なくとも本明細書に記載のような結合分子を含む製品、例えば滅菌剤形及びキットが提供される。例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットにおけるインビトロでのインフルエンザウイルスの検出及び定量のための結合分子を含むキットが提供され得る。検出にとって有用な結合分子は、蛍光又は放射標識などの標識とともに提供されてもよい。
【０２３２】
例示的な実施形態
１．（ａ）Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、且つＡ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのグループ１サブタイプ及び少なくとも１つのグループ２サブタイプを中和する能力がある第１の結合ドメイン；及び
（ｂ）Ｂ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に結合し、且つ少なくとも２つの系統学的に異なる系統におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する能力がある第２の結合ドメイン
を含む、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する単離された結合分子。
２．前記第１の結合ドメインが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８及びそれらの変異体から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプ；並びにＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５及びそれらの変異体から選択される１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのグループ２サブタイプを中和する能力がある、請求項１に記載の単離された結合分子。
３．前記第２の結合ドメインがＹａｍａｇａｔａ及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統の双方におけるＢ型インフルエンザウイルスを中和する能力がある、請求項１に記載の単離された結合分子。
４．前記第１の結合ドメインが抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
５．前記第２の結合ドメインが抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の結合分子。
６．抗体重鎖の少なくとも１つのＶＨ及び抗体軽鎖の少なくとも１つのＶＬを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の結合分子。
７．前記第１の結合ドメインが抗体重鎖の少なくとも１つのＶＨ及び抗体軽鎖の少なくとも１つのＶＬを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の結合分子。
８．前記第２の結合ドメインが抗体重鎖の少なくとも１つのＶＨ及び抗体軽鎖の少なくとも１つのＶＬを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の結合分子。
９．前記第１の結合ドメインが、
（ａ）配列番号８のＨＣＤＲ１、配列番号９のＨＣＤＲ２、配列番号１０のＨＣＤＲ３、配列番号３のＬＣＤＲ１、配列番号４のＬＣＤＲ２及び配列番号５のＬＣＤＲ３に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号８のＨＣＤＲ１、配列番号９のＨＣＤＲ２、配列番号１０のＨＣＤＲ３、配列番号３のＬＣＤＲ１、配列番号４のＬＣＤＲ２及び配列番号５のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１８のＨＣＤＲ１、配列番号１９のＨＣＤＲ２、配列番号２０のＨＣＤＲ３、配列番号１３のＬＣＤＲ１、配列番号１４のＬＣＤＲ２、配列番号１５のＬＣＤＲ３に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；並びに
（ｄ）配列番号１８のＨＣＤＲ１、配列番号１９のＨＣＤＲ２、配列番号２０のＨＣＤＲ３、配列番号１３のＬＣＤＲ１、配列番号１４のＬＣＤＲ２、配列番号１５のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を有する６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離された結合分子。
１０．前記第１の結合ドメインが、
（ａ）配列番号７のＶＨ；及び
（ｂ）配列番号１７のＶＨ
から選択されるＶＨのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離された結合分子。
１１．前記第１の結合ドメインが、
（ａ）配列番号２のＶＬ；及び
（ｂ）配列番号１２のＶＬ
から選択されるＶＬのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離された結合分子。
１２．前記第１の結合ドメインが、
（ａ）配列番号７のＶＨ及び配列番号２のＶＬ；及び
（ｂ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ
から選択されるＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列の各々に対して少なくとも７５％同一であるＶＨ及びＶＬを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離された結合分子。
１３．前記第１の結合ドメインが、
（ａ）配列番号７のＶＨ及び配列番号２のＶＬ；及び
（ｂ）配列番号１７のＶＨ及び配列番号１２のＶＬ
から選択されるＶＨ及びＶＬを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離された結合分子。
１４．前記第２の結合ドメインが、６つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、ここで６つのＣＤＲセットが、
（ａ）配列番号２８のＨＣＤＲ１、配列番号２９のＨＣＤＲ２、配列番号３０のＨＣＤＲ３、配列番号２３のＬＣＤＲ１、配列番号２４のＬＣＤＲ２及び配列番号２５のＬＣＤＲ３に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２８のＨＣＤＲ１、配列番号２９のＨＣＤＲ２、配列番号３０のＨＣＤＲ３、配列番号２３のＬＣＤＲ１、配列番号２４のＬＣＤＲ２及び配列番号２５のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２、配列番号４６のＨＣＤＲ３、配列番号３９のＬＣＤＲ１、配列番号４０のＬＣＤＲ２及び配列番号４１のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２、配列番号４６のＨＣＤＲ３、配列番号３９のＬＣＤＲ１、配列番号４０のＬＣＤＲ２及び配列番号４１のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号６０のＨＣＤＲ１、配列番号６１のＨＣＤＲ２、配列番号６２のＨＣＤＲ３、配列番号５５のＬＣＤＲ１、配列番号５６のＬＣＤＲ２、配列番号５７のＬＣＤＲ３に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；及び
（ｆ）配列番号６０のＨＣＤＲ１、配列番号６１のＨＣＤＲ２、配列番号６２のＨＣＤＲ３、配列番号５５のＬＣＤＲ１、配列番号５６のＬＣＤＲ２、配列番号５７のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離された結合分子。
１５．前記第２の結合ドメインが、
（ａ）配列番号２７のＶＨ；
（ｂ）配列番号３３のＶＨ；
（ｃ）配列番号３６のＶＨ；
（ｄ）配列番号４３のＶＨ；
（ｅ）配列番号４９のＶＨ；
（ｆ）配列番号５２のＶＨ；
（ｇ）配列番号５９のＶＨ；及び
（ｈ）配列番号６５のＶＨ
から選択されるＶＨのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離された結合分子。
１６．前記第２の結合ドメインが、
（ａ）配列番号２２のＶＬ；
（ｂ）配列番号３２のＶＬ；
（ｃ）配列番号３５のＶＬ；
（ｄ）配列番号３８のＶＬ；
（ｅ）配列番号４８のＶＬ；
（ｆ）配列番号５１のＶＬ；
（ｇ）配列番号５４のＶＬ；及び
（ｈ）配列番号６４のＶＬ
から選択されるＶＬのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離された結合分子。
１７．前記第２の結合ドメインが、
（ａ）配列番号２７のＶＨ及び配列番号２２のＶＬ；
（ｂ）配列番号３３のＶＨ及び配列番号３２のＶＬ；
（ｃ）配列番号３６のＶＨ及び配列番号３５のＶＬ；
（ｄ）配列番号４３のＶＨ及び配列番号３８のＶＬ；
（ｅ）配列番号４９のＶＨ及び配列番号４８のＶＬ；
（ｆ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ；
（ｇ）配列番号５９のＶＨ及び配列番号５４のＶＬ；並びに
（ｈ）配列番号６５のＶＨ及び配列番号６４のＶＬ
から選択されるＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列の各々に対して少なくとも７５％同一であるＶＨ及びＶＬを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の単離された結合分子。
１８．前記第２の結合ドメインが、
（ａ）配列番号２７のＶＨ及び配列番号２２のＶＬ；
（ｂ）配列番号３３のＶＨ及び配列番号３２のＶＬ；
（ｃ）配列番号３６のＶＨ及び配列番号３５のＶＬ；
（ｄ）配列番号４３のＶＨ及び配列番号３８のＶＬ；
（ｅ）配列番号４９のＶＨ及び配列番号４８のＶＬ；
（ｆ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ；
（ｇ）配列番号５９のＶＨ及び配列番号５４のＶＬ；並びに
（ｈ）配列番号６５のＶＨ及び配列番号６４のＶＬ
から選択されるＶＨ及びＶＬを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の単離された結合分子。
１９．二重特異性抗体を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の結合分子。
２０．１つ以上の結合ドメインが可変断片（Ｆｖ）ドメインを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の結合分子。
２１．１つ以上の結合ドメインがｓｃＦｖ分子を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の結合分子。
２２．１つ以上の結合ドメインがＦｖドメインを含み、且つ１つ以上の結合ドメインがｓｃＦｖ分子を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の結合分子。
２３．前記第１の結合ドメインが抗Ａ型インフルエンザウイルスのＦｖドメインを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の結合分子。
２４．２つの抗体重鎖及び２つの抗体軽鎖を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の結合分子。
２５．抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを含むＦｖドメインを含み、Ｆｖが抗Ａ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の結合分子。
２６．前記第２の結合ドメインが抗Ｂ型インフルエンザウイルスのｓｃＦｖ分子を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の結合分子。
２７．前記第１の結合ドメインが抗Ａ型インフルエンザウイルスのＦｖドメインを含み、且つ前記第２の結合ドメインが抗Ｂ型インフルエンザウイルスのｓｃＦｖ分子を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の結合分子。
２８．前記第１の結合ドメインの前記Ｆｖドメインが、アミノ末端及びカルボキシ末端を有するポリペプチド鎖を含む重鎖（ＨＣ）並びにアミノ末端及びカルボキシ末端を有するポリペプチド鎖を含む軽鎖（ＬＣ）を含み、
（ａ）前記第２の結合ドメインは前記第１の結合ドメインのＨＣのカルボキシ末端に共有結合されるか；
（ｂ）前記第２の結合ドメインは前記第１の結合ドメインのＨＣのアミノ末端に共有結合されるか；
（ｃ）前記第２の結合ドメインは前記第１の結合ドメインのＬＣのアミノ末端に共有結合されるか；又は
（ｄ）前記第２の結合ドメインは前記第１の結合ドメインのＨＣのポリペプチド鎖内で共有結合的にインターカレートされる
請求項２７に記載の結合分子。
２９．前記結合分子が、式ｓｃＦｖ−Ｌ１−ＶＬ−ＣＬ（式中、ｓｃＦｖはｓｃＦｖ分子であり、Ｌ１はリンカーであり、ＶＬは軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、且つＶＬは軽鎖可変ドメインである）を有する抗体軽鎖を含む抗体又はその断片を含む、請求項２８に記載の結合分子。
３０．前記重鎖が、式ｓｃＦｖ−Ｌ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（式中、ｓｃＦｖはｓｃＦｖ分子であり、Ｌ１はリンカーであり、ＶＨは重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は重鎖定常ドメインドメイン１であり、ＣＨ２は重鎖定常ドメインドメイン２であり、且つＣＨ３は重鎖定常ドメインドメイン３である）を含む、請求項２８に記載の結合分子。
３１．配列番号７及び配列番号１７から選択されるアミノ酸ＶＨドメイン配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の結合分子。
３２．配列番号２及び配列番号１２から選択されるアミノ酸ＶＬドメイン配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の結合分子。
３３．第１及び第２のＣ末端ドメインを各々有する第１及び第２の重鎖を含み、ここで１つ以上のｓｃＦｖ分子が第１の重鎖、第２の重鎖、又はその組み合わせのＣ末端ドメインに共有結合される、請求項２８に記載の結合分子。
３４．１つ以上の重鎖が、式ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（式中、ＶＨは重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は重鎖定常ドメインドメイン１であり、ＣＨ２は重鎖定常ドメインドメイン２であり、且つＣＨ３は重鎖定常ドメイン３である）を含む、請求項２８に記載の結合分子。
３５．１つ以上の重鎖が、式ＶＨ−ＣＨ１−Ｌ１−ｓｃＦｖ−Ｌ２−ＣＨ２−ＣＨ３（式中、Ｌ１及びＬ２は独立してリンカーであり、且つｓｃＦｖはｓｃＦｖ分子である）を含む、請求項３４に記載の結合分子。
３６．１つ以上の重鎖が、式ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−Ｌ１−ｓｃＦｖ−Ｌ２−ＣＨ３（式中、Ｌ１及びＬ２は独立してリンカーであり、且つｓｃＦｖはｓｃＦｖ分子である）を含む、請求項３４に記載の結合分子。
３７．１つ以上の重鎖が、式ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｌ１−ｓｃＦｖ−Ｌ２−ＣＨ３（式中、Ｌ１及びＬ２は独立してリンカーであり、且つｓｃＦｖはｓｃＦｖ分子である）を含む、請求項３４に記載の結合分子。
３８．Ｌ１及びＬ２が、独立して、（ａ）［ＧＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは０、１、２、３、４、若しくは５である）、（ｂ）［ＧＧＧＧ］ｎ（式中、ｎは０、１、２、３、４、若しくは５である）、又は（ａ）及び（ｂ）の組み合わせを含む、請求項３５、３６、又は３７に記載の結合分子。
３９．ｓｃＦｖが式ＶＨ−ＬＳ−ＶＬ（式中、ＶＨは重鎖可変ドメインであり、ＬＳはリンカーであり、且つＶＬは軽鎖可変ドメインである）を含む、請求項２１〜３８に記載の結合分子。
４０．ＬＳが、（ａ）［ＧＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは０、１、２、３、４、若しくは５である）、（ｂ）［ＧＧＧＧ］ｎ（式中、ｎは０、１、２、３、４、若しくは５である）、又は（ａ）及び（ｂ）の組み合わせを含む、請求項３９に記載の結合分子。
４１．前記第２の結合ドメインの重鎖及び軽鎖が１つ以上のジスルフィド結合によって連結される、請求項２８に記載の結合分子。
４２．前記第２の結合ドメインのｓｃＦｖが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ｓｃＦｖのＶＨが、４３位、４４位、１００位、１０１位、１０５位、及びこれらの組み合わせから選択される位置にシステイン残基を含み、且つｓｃＦｖのＶＬが、４３位、４４位、４６位、４９位、５０位、１００位、及びこれらの組み合わせから選択される位置にシステイン残基を含む、請求項４１に記載の結合分子。
４３．前記ｓｃＦｖのＶＬ及びＶＨが、ＶＬ１００−ＶＨ４４、ＶＬ４３−ＶＨ１０５、ＶＬ４６−ＶＨ１０１、ＶＬ４９−ＶＨ１００、ＶＬ５０−ＶＨ１００、及びこれらの組み合わせから選択されるジスルフィド結合によって連結される、請求項４２に記載の結合分子。
４４．前記ｓｃＦｖのＶＬ及びＶＨが、ＶＨ４４−ＶＬ１００、ＶＨ１００−ＶＬ４９、ＶＨ１００−ＶＬ５０、ＶＨ１０１−ＶＬ４６、ＶＨ１０５−ＶＬ４３、及びこれらの組み合わせから選択されるジスルフィド結合によって連結される、請求項４２に記載の結合分子。
４５．ＶＨが、３つのＣＤＲセット：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、ここで３つのＣＤＲセットが、
（ａ）配列番号２８のＨＣＤＲ１、配列番号２９のＨＣＤＲ２、配列番号３０のＨＣＤＲ３に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２８のＨＣＤＲ１、配列番号２９のＨＣＤＲ２、配列番号３０のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２、配列番号４６のＨＣＤＲ３に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４４のＨＣＤＲ１、配列番号４５のＨＣＤＲ２、配列番号４６のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号６０のＨＣＤＲ１、配列番号６１のＨＣＤＲ２、配列番号６２のＨＣＤＲ３に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；並びに
（ｆ）配列番号６０のＨＣＤＲ１、配列番号６１のＨＣＤＲ２、配列番号６２のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
から選択される、請求項３９に記載の結合分子。
４６．ＶＬが、３つのＣＤＲセット：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、ここで３つのＣＤＲセットが、
（ａ）配列番号２３のＬＣＤＲ１、配列番号２４のＬＣＤＲ２及び配列番号２５のＬＣＤＲ３に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２３のＬＣＤＲ１、配列番号２４のＬＣＤＲ２及び配列番号２５のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３９のＬＣＤＲ１、配列番号４０のＬＣＤＲ２及び配列番号４１のＬＣＤＲ３に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号３９のＬＣＤＲ１、配列番号４０のＬＣＤＲ２及び配列番号４１のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号５５のＬＣＤＲ１、配列番号５６のＬＣＤＲ２、配列番号５７のＬＣＤＲ３に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列；並びに
（ｆ）配列番号５５のＬＣＤＲ１、配列番号５６のＬＣＤＲ２、配列番号５７のＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
から選択される、請求項３９に記載の結合分子。
４７．前記ｓｃＦｖが、配列番号３１、配列番号３４、配列番号４７、配列番号５０、配列番号６３から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２１〜４６のいずれか一項に記載の結合分子。
４８．Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する二重特異性抗体であって、配列番号６６又は配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの軽鎖を含む、二重特異性抗体。
４９．配列番号６６又は配列番号６８を含むアミノ酸配列を有する少なくとも１つの軽鎖を含む、請求項４８に記載の二重特異性抗体。
５０．Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する二重特異性抗体であって、配列番号６７又は配列番号６９のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの重鎖を含む、二重特異性抗体。
５１．配列番号６７又は配列番号６９を含むアミノ酸配列を有する少なくとも１つの重鎖を含む、請求項５０に記載の二重特異性抗体。
５２．Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する二重特異性抗体であって、配列番号６６又は配列番号６８のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの軽鎖及び配列番号６７又は配列番号６９のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの重鎖を含む、二重特異性抗体。
５３．（ａ）配列番号６６を含むアミノ酸配列を有する少なくとも１つの軽鎖及び配列番号６７を含むアミノ酸配列を有する少なくとも１つの重鎖；又は
（ｂ）配列番号６８を含むアミノ酸配列を有する少なくとも１つの軽鎖及び配列番号６９を含むアミノ酸配列を有する少なくとも１つの重鎖
を含む、請求項５２に記載の二重特異性抗体。
５４．請求項１〜４７のいずれか一項に記載の結合分子、請求項４８〜５３に記載の二重特異性抗体若しくはその断片、又はそれらの任意の組み合わせを含むか又は産生する細胞。
５５．請求項１〜４７のいずれか一項に記載の結合分子又は請求項４８〜５３記載の二重特異性抗体若しくはその断片をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチド。
５６．請求項５５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
５７．請求項５５に記載のポリヌクレオチド又は請求項５６に記載のベクターを含む宿主細胞。
５８．請求項１〜４７のいずれか一項に記載の結合分子、請求項４８〜５３に記載の二重特異性抗体若しくはその断片、及び薬学的に許容できる担体を含む組成物。
５９．請求項５８に記載の組成物を含むキット。
６０．被験者におけるＡ型インフルエンザウイルス又はＢ型インフルエンザウイルス感染を予防又は治療する方法であって、それを必要とする被験者に有効量の請求項５８に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
６１．請求項１〜４７のいずれか一項に記載の結合分子又は請求項４８〜５３に記載の二重特異性抗体若しくはその断片を作製するための方法であって、請求項５７に記載の宿主細胞を結合分子又は二重特異性抗体又はその断片の発現に適した条件下で培養するステップを含む、方法。
６２．宿主細胞培養物から結合分子を単離するステップをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
６３．被験者におけるＡ型インフルエンザ感染、Ｂ型インフルエンザ感染、又はそれらの組み合わせの予防又は治療において用いるための、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の結合分子又は請求項４８〜５３に記載の二重特異性抗体若しくはその断片。
６４．被験者におけるＡ型インフルエンザ感染、Ｂ型インフルエンザ感染、又はそれらの組み合わせの予防又は治療のための薬剤の作製における請求項１〜４７のいずれか一項に記載の結合分子又は請求項４８〜５３に記載の二重特異性抗体若しくはその断片の使用。
６５．被験者におけるＡ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザ感染の予防又は治療のための薬剤の作製における請求項１〜４７のいずれか一項に記載の結合分子又は請求項４８〜５３に記載の二重特異性抗体若しくはその断片の使用。
６６．被験者におけるＡ型インフルエンザ感染、Ｂ型インフルエンザ感染、又はそれらの組み合わせの予防又は治療のための方法であって、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の結合分子又は請求項４８〜５３に記載の二重特異性抗体若しくはその断片を有効量で被験者に投与するステップを含む、方法。
６７．被験者におけるＡ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザ感染の予防又は治療のための方法であって、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の結合分子又は請求項４８〜５３に記載の二重特異性抗体若しくはその断片を有効量で被験者に投与するステップを含む、方法。
６８．被験者におけるＡ型インフルエンザ感染、Ｂ型インフルエンザ感染、又はそれらの組み合わせのインビトロ診断のための請求項１〜４７のいずれか一項に記載の結合分子又は請求項４８〜５３に記載の二重特異性抗体若しくはその断片の使用。
【実施例】
【０２３３】
実施例１．二重特異性抗体構築物の調製
Ａ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する抗ＨＡ  ＩｇＧ抗体は、２０１３年１０月２日に出願された米国仮特許出願第６１／８８５，８０８号明細書及び２０１４年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／００２，４１４号明細書に記載され、またＢ型インフルエンザウイルスに特異的に結合する抗ＨＡ  ＩｇＧ抗体は、２０１４年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／０２４，８０４号明細書に記載されている。つまり、これらの抗体は、広義には、Ａ型インフルエンザウイルスを認識する交差反応性抗体（ＦＹ１及びＧＬ２０）及びＢ型インフルエンザウイルスを認識する交差反応性抗体（ＦＢＤ９４、ＦＢＣ３９、及びＦＢＣ３９ＦＴＬ）である。一連の二重特異性（ＢｉＳ）抗体は、これらの抗体のＩｇＧ  ＶＨ及びＶＬ遺伝子配列を用いて構築した。得られた二重特異性抗体は、すべてのＡ型及びＢ型インフルエンザ株を中和する能力がある単一の抗体様分子を作出するため、異なる抗Ａ型インフルエンザ又は抗Ｂ型インフルエンザＨＡ  ｍＡｂの相補的活性を組み合わせている。
【０２３４】
図１は、５つの異なるＢｉＳ骨格の配向性の模式図を示す。例えば作製したＢｉＳ−Ｆｌｕ  Ａ＋Ｂ抗体では、抗Ａ型インフルエンザ抗体（ＦＹ１又はその最適化された形態のＧＬ２０）をＩｇＧとして用い、抗Ｂ型インフルエンザ抗体（ＦＢＤ９４、ＦＢＣ３９又はその最適化された形態のＦＢＣ３９ＦＴＬ）をｓｃＦｖとして用い、ｓｃＦｖは異なるＢｉＳ形式におけるＩｇＧ構造に沿う異なる位置に挿入した。ＢｉＳ構築物は、ＢｉＳ抗体の由来元である２つのＩｇＧの略称を用いて名付け、その後にＢｉＳ形式を用い、次いでその後、ｓｃＦｖにおける安定化ジスルフィド結合を形成するため、２つのシステイン残基のアミノ酸位置を用いた。
【０２３５】
Ａ．ＦＹ１／３９  ＢｉＳ２  １００／４４
ＦＹ１／３９  ＢｉＳ２  １００／４４軽鎖（配列番号１０７）及びＦＹ１／３９  ＢｉＳ２  １００／４４重鎖（配列番号１０８）を含むＦＹ１／３９  ＢｉＳ２  １００／４４構築物を作製するため、以下の方法を用いた。つまり、ＦＹ１  ＶＨ及びＶＬ配列を含むベクター（ｐＯＥ−ＦＹ１ベクター）をＢｓｓＨＩＩ／ＢｓｉＷＩで消化し、ＦＹ１  ＶＬ  ＤＮＡ（配列番号１）を得た。次に、ＦＹ１  ＶＬ  ＤＮＡ（配列番号１）をゲル精製し、ＢｓｓＨＩＩ／ＢｓｉＷＩで消化した、軽鎖、ｓｃＦｖ及び重鎖配列を含むベクター（ＢｉＳ２ベクター）にクローン化し、ＦＹ１  ＬＣ−ＢｉＳ２ベクターを形成した。
【０２３６】
ＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ−ＦＹ１  ＶＨ  ＤＮＡ（配列番号１１１）は、Ｇｅｎｅａｒｔにより合成し、５’及び３’末端にＢｓｒＧＩ／Ｓａｌｌに対する認識配列を有する以下のプライマー、すなわち、
フォワードプライマー：
【化１】
2018518475.tif 000008
リバースプライマー：
【化２】
2018518475.tif 000009
を用いてＰＣＲ増幅した。
【０２３７】
ＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ−ＦＹ１  ＶＨ  ＤＮＡ（配列番号１１１）の増幅を検証し、ＤＮＡをゲル精製した。
【０２３８】
次に、ＦＹ１−ＬＣ−ＢｉＳ２ベクターをＢｓｒＧＩ／ＳａｌＩで消化し、ベクターバンドをゲル精製した。精製したＦＹ１−ＬＣ−ＢｉＳ２ベクターに、ＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ−ＦＹ１  ＶＨ（配列番号１１１）ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標））を用いて注入し、ＦＹ１／３９  ＢｉＳ２  １００／４４構築物を作製した。Ｓｔｅｌｌａｒコンピテント細胞をＦＹ１／３９  ＢｉＳ２  １００／４４構築物で形質転換し、コロニーにおける正確なＦＹ１  ＶＬ、ＶＨ及びＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ配列について配列決定した。
【０２３９】
Ｂ．ＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  １００／４４
ＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  １００／４４軽鎖（配列番号１０９）及びＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  １００／４４重鎖（配列番号１１０）を含むＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  １００／４４構築物を作製するため、同様の方法を用いた。つまり、ｐＯＥ−ＦＹ１−ＶＬベクターをＢｓｓＨＩＩ／ＢｓｉＷＩで消化し、ＦＹ１  ＶＬ  ＤＮＡ（配列番号１）を得た。次に、ＦＹ１  ＶＬ  ＤＮＡ（配列番号１）をゲル精製し、ＢｓｓＨＩＩ／ＢｓｉＷＩで消化した、軽鎖、ＶＨ、ＣＨ１、ｓｃＦｖ、ＣＨ２及びＣＨ３配列を含むベクター（ＢｉＳ４ベクター）にクローン化し、ＦＹ１−ＬＣ  ＢｉＳ４ベクターを形成した。
【０２４０】
ＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ  ＤＮＡ（配列番号１１２）は、Ｇｅｎｅａｒｔにより合成したＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ−ＦＹ１  ＶＨ  ＤＮＡ（配列番号１１１）から、以下のプライマー：
フォワードプライマー：
ＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号７２）
リバースプライマー：
【化３】
2018518475.tif 000010
を用いて増幅した。
【０２４１】
次に、ＦＹ１−ＬＣ−ＢｉＳ４ベクターをＢｓｒＧＩ／ＳａｌＩで消化し、ベクターバンドをゲル精製した。ＦＹ１  ＶＬ及びＶＨ配列を含むベクター（ｐＯＥ−ＦＹ１）をＢｓｒＧＩ／ＳａｌＩで消化し、ＦＹ１  ＶＨ（配列番号６）を得た。
【０２４２】
次に、ＦＹ１−ＬＣ−ＢｉＳ４ベクター（ＢｓｒＧＩ／ＳａｌＩで消化、５及び６行目に記載）をＦＹ１  ＶＨ（配列番号６）と連結し、ベクターＢｉＳ４−ＦＹ１を得て、それをＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製した。次に、精製したＢｉＳ４−ＦＹ１ベクターに、上で得られたＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ  ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標））を用いて注入し、ＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  １００／４４構築物を得た。Ｓｔｅｌｌａｒコンピテント細胞をＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  １００／４４構築物で形質転換し、コロニーにおける正確なＦＹ１  ＶＬ、ＶＨ及びＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ配列について配列決定した。
【０２４３】
Ｃ．ＦＹ１／３９  ＢｉＳ１  １００／４４
ＦＹ１／３９  ＢｉＳ１  １００／４４軽鎖（配列番号１１３）及びＦＹ１／３９  ＢｉＳ１  １００／４４重鎖（配列番号１１４）を含むＦＹ１／３９  ＢｉＳ１  １００／４４構築物を作出するため、同様の方法を用いた。
【０２４４】
ＦＹ１  ＶＬを、上記のＦＹ１／ＦＢＣ３９  ＢｉＳ４  １００／４４（配列番号１０９）から、以下のプライマー：
ＢｉＳ１  ＦＹ１−ＶＬフォワードプライマー：
ＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＴＧＡＴＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣ（配列番号７６）
ＢｉＳ１  ＦＹ１−ＶＬリバースプライマー：
ＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＡＧＴＧＣＣＣ（配列番号７７）
を用いて増幅した。
【０２４５】
ＦＢＣ３９  ｓｃＦｖを、Ｇｅｎｅａｒｔにより合成したＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ−ＦＹ１  ＶＨ  ＤＮＡ（配列番号１１１）から、以下のプライマー：
ＢｉＳ１  ＦＢＣ３９フォワードプライマー：
ＣＴＧＧＣＴＣＣＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＣＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣ（配列番号７４）
ＢｉＳ１  ＦＢＣ３９リバースプライマー：
ＣＣＣＣＴＣＣＧＣＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＴＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣ（配列番号７５）
を用いて増幅した。
【０２４６】
ＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ及びＦＹ１−ＶＬのＰＣＲバンドをゲル精製した。
【０２４７】
ＦＹ１／ＦＢＣ３９  ＢｉＳ４  １００／４４をＢｓｒＧＩ／ＳａｌＩで消化し、ＦＹ１  ＶＨを得て、ＦＹ１  ＶＨバンドをゲル精製した。ＦＹ１  ＶＨ（配列番号６）は、さらにＢｓｒＧＩ／ＳａｌＩで消化した、ｓｃＦｖ、ＬＣ及びＨＣ配列を含むベクター（ＢｉＳ１ベクター）と連結した。
【０２４８】
次に、得られたベクターＦＹ１  ＨＣ  ＢｉＳ１をＢｓｓＨＩＩ／ＢｓｉＷＩで消化し、ベクターバンドはゲル精製し、ＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ及びＦＹ１  ＶＬのＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標））を用いて注入し、ＦＹ１／３９  ＢｉＳ１  １００／４４構築物を形成した。Ｓｔｅｌｌａｒコンピテント細胞をＦＹ１／３９  ＢｉＳ１  １００／４４構築物で形質転換し、コロニーにおける正確なＦＹ１  ＶＬ、ＶＨ及びＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ配列について配列決定した。
【０２４９】
Ｄ．ＦＹ１／３９  ＢｉＳ３  １００／４４
ＦＹ１／３９  ＢｉＳ３  １００／４４軽鎖（配列番号１１５）及びＦＹ１／３９  ＢｉＳ３  １００／４４重鎖（配列番号１１６）を有するＦＹ１／３９  ＢｉＳ３  １００／４４構築物を、同様の方法で構築した。
【０２５０】
Ｇｅｎｅａｒｔにより合成したＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ−ＦＹ１  ＶＨ  ＤＮＡ（配列番号１１１）からＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ（配列番号１１２）を増幅するため、以下のプライマー：
フォワードプライマー：
【化４】
2018518475.tif 000011
リバースプライマー：
ＴＣＡＡＴＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣ（配列番号７９）
を用いた。
【０２５１】
ＦＢＣ  ｓｃＦｖ  ＤＮＡの増幅を検証し、ゲル精製した。
【０２５２】
ＦＹ１／ＦＢＣ３９  ＢｉＳ４  １００／４４をＢｓｓＨＩＩ／ＳａｌＩで消化し、ＦＹ１  ＬＣ／ＶＨを得た。ＦＹ１  ＬＣ／ＶＨバンドはゲル精製し、さらにＢｓｓＨＩＩ／ＳａｌＩで消化した、ＬＣ、ＨＣ及びｓｃＦｖ配列を含むベクター（ＢｉＳ３ベクター）と連結し、ＦＹ１  ＢｉＳ３ベクターを形成した。
【０２５３】
次に、ＦＹ１  ＢｉＳ３ベクターをＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製した。精製したＦＹ１  ＢｉＳ３ベクターに、ＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ（配列番号１１２）ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標））システムを用いて注入し、ＦＹ１／３９  ＢｉＳ３  １００／４４構築物を形成した。Ｓｔｅｌｌａｒコンピテント細胞をＦＹ１／３９  ＢｉＳ３  １００／４４構築物で形質転換し、コロニーにおける正確なＦＹ１  ＶＬ、ＶＨ及びＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ配列について配列決定した。
【０２５４】
Ｅ．ＦＹ１／９４  ＢｉＳ２  １００／４４
ＦＹ１／９４  ＢｉＳ２  １００／４４軽鎖（配列番号１１７）及びＦＹ１／９４  ＢｉＳ２  １００／４４重鎖（配列番号１１８）を有するＦＹ１／９４  ＢｉＳ２  １００／４４を次のように構築した。
【０２５５】
ＦＢＤ９４  ｓｃＦｖ  ＤＮＡ（配列番号１１９）をＥｕｒｏｆｉｎにより合成し、ＢｉＳ２ベクターへの挿入のため、以下のプライマー：
フォワードプライマー：
ＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＴＣＣＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号８０）
リバースプライマー：
ＣＣＣＣＴＣＣＧＣＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＴＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣ（配列番号８１）
を用いて増幅した。
【０２５６】
ＦＹ１  ＶＨ（配列番号６）を、ＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  １００／４４（配列番号１１０）から、以下のプライマー：
フォワードプライマー：
ＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＴＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＣ（配列番号８２）
リバースプライマー：
ＧＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣＧＣＧＣＴＴＧＡＣＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＴＡＧＴＣ（配列番号８３）
を用いてＰＣＲ増幅した。
【０２５７】
ＰＣＲ産物のＦＢＤ９４  ｓｃＦｖ  ＤＮＡ（配列番号１１９）及びＦＹ１  ＶＨ（配列番号６）の増幅を検証し、ＰＣＲ産物をゲル精製した。ＢｉＳ２−ＦＹ１−ＬＣベクターは、ＢｓｒＧＩ／ＳａｌＩでの消化により直線化し、ＦＢＤ９４  ｓｃＦｖ  ＤＮＡ（配列番号１１９）及びＦＹ１  ＶＨ（配列番号６）を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標））を用いて注入した。ベクター内部のＰＣＲ産物の配向性は、ベクターとの重複配列を有するプライマーを用いて制御した。Ｓｔｅｌｌａｒコンピテント細胞をＦＹ１／９４  ＢｉＳ２  １００／４４構築物で形質転換し、コロニーにおける正確なＦＹ１  ＶＬ、ＶＨ及びＦＢＤ９４  ｓｃＦｖ配列について配列決定した。
【０２５８】
Ｆ．ＦＹ１／９４  ＢｉＳ４  １００／４４
ＦＹ１／９４  ＢｉＳ４  １００／４４を次のように構築した。
【０２５９】
ＦＢＤ９４  ｓｃＦｖ（配列番号１１９）をＥｕｒｏｆｉｎにより合成し、軽鎖、ＶＨ、ＣＨ１、ｓｃＦｖ、ＣＨ２及びＣＨ３配列を含むベクター（ＢｉＳ４ベクター）への挿入のため、以下のプライマー：
フォワードプライマー：
ＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号８４）
リバースプライマー：
【化５】
2018518475.tif 000012
を用いて増幅した。
【０２６０】
ＰＣＲ産物の増幅を検証し、ＦＢＤ９４をゲル精製した。
【０２６１】
ＢｉＳ４−ＦＹ１ベクター（上記）は、ＢａｍＨＩを用いて直線化し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標））を用いてＦＢＤ９４を注入した。Ｓｔｅｌｌａｒコンピテント細胞をＦＹ１／９４  ＢｉＳ４  １００／４４構築物で形質転換し、コロニーにおける正確なＦＹ１  ＶＬ、ＶＨ及びＦＢＤ９４  ｓｃＦｖ配列について配列決定した。
【０２６２】
Ｇ．ＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５
ＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５軽鎖（配列番号１２０）及びＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５重鎖（配列番号１２１）を有するＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５を次のように構築した。
【０２６３】
ＦＢＣ３９−４３／１０５  ｓｃＦｖ  ＤＮＡをＥｕｒｏｆｉｎにより合成し、ＢｉＳ４ベクターへの挿入のため、以下のプライマー：
フォワードプライマー：
ＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号８６）
リバースプライマー：
【化６】
2018518475.tif 000013
を用いて増幅した。
【０２６４】
ＰＣＲ産物の増幅を検証し、ゲル精製した。
【０２６５】
ＢｉＳ４−ＦＹ１ベクターは、ＢａｍＨＩを用いて直線化し、上で得られたＦＢＣ３９−４３／１０５  ｓｃＦｖ  ＤＮＡ（配列番号１２４）を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標））を用いて注入した。Ｓｔｅｌｌａｒコンピテント細胞をＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５構築物で形質転換し、コロニーにおける正確なＦＹ１  ＶＬ、ＶＨ及びＦＢＣ３９−４３／１０５  ｓｃＦｖ配列について配列決定した。
【０２６６】
Ｈ．ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  １００／４４
ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  １００／４４重鎖（配列番号６６）及びＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  １００／４４軽鎖（配列番号６７）を含むＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  １００／４４を同様の方法で構築した。
【０２６７】
ＦＹ−ＧＬ２０  ＬＣ及びＨＣを含むベクター（ｐＯＥ−ＦＹ１−ＧＬ２０）をＢｓｓＨＩＩ／ＳａｌＩで消化し、ＧＬ２０  ＬＣ（ＶＬ−ＣＬ）及びＶＨ（配列番号１２３）を得て、それをゲル精製した。ＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  １００／４４ベクターをＢｓｓＨＩＩ／ＳａｌＩで消化し、ＧＬ２０  ＬＣ／ＶＨ（配列番号１２３）と連結した。コロニーにおける正確なＧＬ２０  ＶＬ、ＶＨ及びＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ配列について配列決定した。
【０２６８】
Ｉ．ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５
ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５重鎖（配列番号６８）及びＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５軽鎖（配列番号６９）を含むＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５を同様の方法で構築した。ｐＯＥ−ＦＹ１−ＧＬ２０をＢｓｓＨＩＩ／ＳａｌＩで消化し、ＧＬ２０  ＬＣ／ＶＨ（配列番号１２３）を得て、それをゲル精製した。ＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５軽鎖（配列番号１２０）をＢｓｓＨＩＩ／ＳａｌＩで消化し、ＧＬ２０  ＬＣ／ＶＨ（配列番号１２３）と連結した。コロニーにおける正確なＧＬ２０  ＶＬ、ＶＨ及びＦＢＣ３９−４３／１０５  ｓｃＦｖ配列について配列決定した。
【０２６９】
Ｊ．ＧＬ２０／３９ＦＴＬ  ＢｉＳ４  １００／４４
ＧＬ２０／３９ＦＴＬ  ＢｉＳ４  １００／４４を同様の方法で構築した。
【０２７０】
ＦＢＣ３９ＦＴＬ  ｓｃＦｖ  ＤＮＡ（配列番号１２４）をＥｕｒｏｆｉｎにより合成し、ＢｉＳ４ベクターへの挿入のため、以下のプライマー：
フォワードプライマー：
ＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号８８）
リバースプライマー：
【化７】
2018518475.tif 000014
を用いて増幅した。
【０２７１】
ＰＣＲ産物の増幅を検証し、ＦＢＣ３９ＦＴＬ  ｓｃＦｖ  ＤＮＡ（配列番号１２４）を精製した。ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５ベクターは、ＢａｍＨＩを用いて直線化し、ＦＢＣ３９ＦＴＬ  ｓｃＦｖ  ＤＮＡ（配列番号１２４）を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標））を用いて注入した。コロニーにおける正確なＧＬ２０  ＶＬ、ＶＨ及びＦＢＣ３９ＦＴＬ  ｓｃＦｖ配列について配列決定した。
【０２７２】
Ｋ．ＧＬ２０／３９ＦＴＬ  ＢｉＳ４  ４３／１０５
ＧＬ２０／３９ＦＴＬ  ＢｉＳ４  ４３／１０５軽鎖（配列番号１２５）及びＧＬ２０／３９ＦＴＬ  ＢｉＳ４  ４３／１０５重鎖（配列番号１２６）を含むＧＬ２０／３９ＦＴＬ  ＢｉＳ４  ４３／１０５を同様の方法で構築した。
【０２７３】
ＦＢＣ３９ＦＴＬ４３／１０５  ｓｃＦｖ  ＤＮＡ（配列番号１２７）をＥｕｒｏｆｉｎにより合成し、ＢｉＳ４ベクターへの挿入のため、以下のプライマー：
フォワードプライマー：
ＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号９０）
リバースプライマー：
【化８】
2018518475.tif 000015
を用いて増幅した。
【０２７４】
増幅されたＰＣＲ産物は、精製し、（ＢａｍＨＩで消化した）直線化したＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５ベクターを注入し、コロニーにおける正確なＧＬ２０  ＶＬ、ＶＨ及びＦＢＣ３９ＦＴＬ−４３／１０５  ｓｃＦｖ配列について配列決定した。
【０２７５】
Ｌ．ＢｉＳ５  ＧＬ２０−ＦＢＣ３９
【化９】
2018518475.tif 000016
【０２７６】
【化１０】
2018518475.tif 000017
【０２７７】
Ｍ．ＢｉＳ５  ＧＬ２０−ＦＢＣ３９−４３−１０５
【化１１】
2018518475.tif 000018
【０２７８】
【化１２】
2018518475.tif 000019
【０２７９】
実施例２：ＢｉＳ構築物の発現
２９３Ｆ又はＣＨＯ細胞に由来する哺乳動物細胞株の一過性遺伝子導入により、組換え抗体を産生した。培養の７〜１０日後、遺伝子導入細胞からの上清を収集した。プロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰ）を用いて精製を実施した。単量体含量をＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析により測定し、凝集体をサイズ排除クロマトグラフィーにより除去した。
【０２８０】
実施例３：ＢｉＳ４構築物の最適化
依然として活性のある高度な単量体発現構築物を作出するため、ＦＹ１／３９  ＢｉＳ４構築物を、ｓｃＦｖの最適化に対する骨格として用いた。これらの試験においては、ｓｃＦｖの配向性をＶＬ／ＶＨからＶＨ／ＶＬに変化させ、ｓｃＦｖリンカー長を２０アミノ酸から１０、１５、若しくは２５アミノ酸に変化させ、安定化ジスルフィド結合を除去するか又は１００／４４から４つの異なる位置へ位置を変化させ、ＦＢＣ３９のフレームワーク領域を完全に生殖系列化した。表７は、構築物についての具体的な情報を提供する。
【０２８１】
【表７】
2018518475.tif 000020
【０２８２】
これらの最適化されたＢｉＳ４構築物の発現及び活性は、リンカー長による影響をあまり受けなかった。しかし、ジスルフィド結合の位置は、発現と活性の双方にとって重要であった。最高の発現特性が、ジスルフィド結合を全く有しないか、４３／１０５、４６／１０１若しくは４９／１００に変化したジスルフィド結合位置を有する構築物、又はジスルフィド結合１００／４４を有する生殖系列化されたＦＢＣ３９構築物において認められた。しかし、発現が改善されたとはいえ、これらのクローンの多くが、実施例４及び５に後述する通り、ＨＡ結合及び中和により測定される抗ウイルス活性を失った。１つの構築物（ＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５）が、ＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  １００／４４より優れた発現特性を示し、機能的な抗ウイルス性活性を維持した。これらの２つの構築物（ＦＹ１／ＦＢＣ３９  ＢｉＳ４  １００／４４及びＢｉＳ  ４３／１０５）が優れた発現とともに優れた機能的活性を示したことから、最適化されたＢｉＳクローン（ＧＬ２０／ＦＢＣ３９  ＢｉＳ）が、ＢｉＳ４  １００／４４及びＢｉＳ  ４３／１０５の配向性を各々伴って構築された。
【０２８３】
実施例４．Ａ型及びＢ型インフルエンザのＢｉＳ構築物はＡ型及びＢ型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質に結合する
Ａ型及びＢ型インフルエンザのＢｉＳ構築物を、親ＩｇＧ構築物の特異性を保持するか否かを判定するため、ＨＡ交差反応性ＥＬＩＳＡ結合アッセイを用いて試験した。３８４ウェルのＭａｘｉｓｏｒｂ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、ＰＢＳ中、Ａ型インフルエンザ株としてのＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９  Ｈ１Ｎ１（Ａ／ＣＡ／０９）及びＡ／Ｐｅｒｔｈ／２００９  Ｈ３Ｎ２（Ａ／ＰＴＨ／０９）、並びにＢ型インフルエンザ株としてのＹａｍａｇａｔａ系統のＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（Ｂ／ＦＬＡ／０６）及びＶｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８（Ｂ／ＢＮＥ／０８）に由来する１ｕｇ／ｍｌの組換えＨＡで、４℃で一晩コーティングした。未コートタンパク質を除去するため、プレートを、０．１％ｖ／ｖツイーン２０を含有するＰＢＳで洗浄し、１％（ｗ／ｖ）カゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するブロッキング溶液を室温で１時間添加した。ブロッキング溶液を廃棄し、ＰＢＳ中の抗ＨＡ  ＩｇＧ及びＢｉＳ抗体各々の３倍連続希釈物を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、結合されたＩｇＧ及びＢｉＳ抗体を、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＫＰＬ）を用いて検出した。結合活性を、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）一成分基質（ＫＰＬ）とのインキュベーション後に４５０ｎｍでの色変化を測定することにより計算し、その後、２Ｎ硫酸を添加し、反応を停止した。
【０２８４】
表８は、結合曲線から計算したＥＣ５０値を示す。想定通り、Ａ型インフルエンザＩｇＧ  ｍＡｂ（ＦＹ１及びＧＬ２０）が両方のＡ型インフルエンザＨＡタンパク質に結合し、３つのＢ型インフルエンザＩｇＧ  ｍＡｂ（ＦＢＤ９４、ＦＢＣ３９及びＦＢＣ３９ＦＴＬ）がＢ型インフルエンザＨＡタンパク質に結合した。すべてのＢｉＳ構築物がＡ型及びＢ型に属する４つすべてのインフルエンザＨＡタンパク質に結合した。ＦＢＣ３９及びＦＢＤ９４におけるＢｉＳ４構築物が最良の全体的な結合性を示した。最適化されたＩｇＧを１００／４４若しくは４３／１０５にジスルフィド結合を有するＢｉＳ４構築物中に設けるとき、ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５が最良の全体的な結合性を示し、ＥＣ５０値は、Ａ／ＣＡ／０９、Ａ／ＰＴＨ／０９、及びＢ／ＦＬ／０６に対して＜１ｎＭであり、Ｂ／ＢＮＥ／０８に結合するのがより困難な場合に１０ｎＭ未満であった。
【０２８５】
【表８】
2018518475.tif 000021
【０２８６】
結合相互作用の動力学をさらに特徴づけるため、傾斜した３８４ウェルプレートを用いるＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ３８４  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いて親和性測定を実施した。すべての試薬をＯｃｔｅｔ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で希釈した。異なるインフルエンザウイルス：Ａ型インフルエンザサブタイプＨ１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／０４（Ｈ１Ｎ１））、Ａ型インフルエンザサブタイプＨ３（Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／０９（Ｈ３Ｎ２））、Ｂ型インフルエンザ系統Ｖｉｃｔｏｒｉａ（Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８（Ｖｉｃｔｏｒｉａ））、及びＢ型インフルエンザ系統Ｙａｍａｇａｔａ（Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（Ｙａｍａｇａｔａ））のＨｉｓタグ化ＨＡを、８μｇ／ｍＬで抗Ｈｉｓ  Ｎｉ−ＮＴＡセンサー上に固定化した。次に、抗ＨＡ  ｍＡｂの会合／解離を、ｍＡｂ対照とともに、１００ｎＭからの２倍希釈下で監視した。会合及び解離の生データを、ｍＡｂ対照における任意のドリフトに対して補正し、次に親和性カーブフィッティングのためにＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に送った。データを、＞５×１０−６ｓｅｃ−１の課せられた制限下でのグローバルな会合／解離方程式を用いてフィットさせた。表９に示すように、両方のＢｉＳ構築物は、Ａ型及びＢ型インフルエンザ株に属する４つすべてのＨＡタンパク質に対して高い親和性結合を示した。
【０２８７】
【表９】
2018518475.tif 000022
【０２８８】
実施例５．Ａ型及びＢ型インフルエンザのＢｉＳ構築物のインビトロ中和活性
改良されたマイクロ中和アッセイは、読み取りとしてノイラミニダーゼ活性（ＮＡ）を用いる前述の高速化されたウイルス阻害アッセイに基づいた（Ｈａｓｓａｎｔｏｕｆｉｇｈｉ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８：７９０）。つまり、抗生物質、グルタミン（完全ＭＥＭ培地）及び１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を添加したＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養したＭＤＣＫ細胞に対してアッセイを実施した。６０ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染用量）のウイルスを、３８４ウェルプレート内、０．７５ｕｇ／ｍｌのＴＰＣＫトリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を含有するＭＥＭ培地中の３倍希釈した抗体に二連ウェルで添加した。室温で３０分のインキュベーション後、２×１０４個の細胞／ウェルをプレートに添加した。５％ＣＯ２インキュベーター内、３３℃で約４０時間のインキュベーション後、蛍光標識基質のメチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ΜＵ−ＮＡＮＡ）（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加することによりＮＡ活性を測定し、３７℃で１時間インキュベートした。ＮＡ活性によって表されるウイルス複製を、励起３５５ｎｍ、放射４６０ｎｍ；１０フラッシュ／ウェルの設定を用いるＥｎｖｉｓｉｏｎ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて蛍光を読み取ることによって定量化した。中和力価（５０％阻害濃度［ＩＣ５０］）は、蛍光シグナルを細胞対照ウェルと比べて５０％低下させる最終抗体濃度として表した。
【０２８９】
表１０及び１１で用いられるＡ型及びＢ型インフルエンザウイルス株は、以下に列挙する通りである。
【０２９０】
表１０では、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ａ／Ｗｉｌｓｏｎ  Ｓｍｉｔｈ  Ｎ／３３（Ｈ１Ｎ１））；Ａ／ＢＪ／９５（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５（Ｈ１Ｎ１））；Ａ／ＳＩ／０６（Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１））；Ａ／ＣＡ／０９（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１））；Ａ／ＨＫ／６８（Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／６８（Ｈ３Ｎ２））；Ａ／ＶＩＣ／７５（Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／７５（Ｈ３Ｎ２））；Ａ／ＳＤ／９３（Ａ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／９／９３（Ｈ３Ｎ３））；Ａ／Ｐａｎ／９９（低温適応（ｃａ）Ａ／Ｐａｎａｍａ／／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２））；Ｂ／ＢＪ／９７（ｃａ  Ｂ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２４３／９７（Ｖｉｃ））；Ｂ／ＨＫ／０１（Ｂ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／３３０／２００１（Ｖｉｃ））；Ｂ／ＭＹ／０４（Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４（Ｖｉｃ））；Ｂ／ＯＨ／０５（Ｂ／Ｏｈｉｏ／１／２００５（Ｖｉｃ））；Ｂ／ＹＩ／９８（Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８（Ｙａｍ））；Ｂ／ＳＩＣ／９９（Ｂ／Ｓｉｃｈｕａｎ／３７９／９９（Ｙａｍ））；及びＢ／ＦＬＡ／０６（Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（Ｙａｍ））。
【０２９１】
表１１では、Ａ／ＷＳＮ／３３  Ｈ１（Ａ／Ｗｉｌｓｏｎ  Ｓｍｉｔｈ  Ｎ／３３（Ｈ１Ｎ１））；Ａ／ＰＲ／３４  Ｈ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１））；Ａ／ＦＭ／４７  Ｈ１（Ａ／Ｆｏｒｔ  Ｍｏｎｍｏｕｔｈ／１／４７（Ｈ１Ｎ１））；Ａ／ＢＪ／９５  Ｈ１（ｃａ  Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５（Ｈ１Ｎ１））；Ａ／ＳＺ／９５  Ｈ１（Ａ／Ｓｈｅｎｚｈｅｎ／２２７／９５（Ｈ１Ｎ１））；Ａ／ＮＣ／９９  Ｈ１（ｃａ  Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））；Ａ／ＳＩ／０６  Ｈ１（Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１））；Ａ／ＳＤ／０７  Ｈ１（ｃａ  Ａ／Ｓｏｕｔｈ  Ｄａｋｏｔａ／６／２００７（Ｈ１Ｎ１））；Ａ／ＣＡ／０９  Ｈ１（ｃａ  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１））；Ａ／ＢＳ／１０  Ｈ１（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２０１０（Ｈ１Ｎ１））；Ａ／ＨＫ／１０  Ｈ１（Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／２２１２／２０１０（Ｈ１Ｎ１））；Ａ／ＮＨ／１０  Ｈ１（Ａ／Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ／０４／２０１０（Ｈ１Ｎ１））；Ａ／ＷＳ／１２  Ｈ１（Ａ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／２４／２０１２（Ｈ１Ｎ１））；Ａ／ＮＹ／１２  Ｈ１（Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／３６／２０１２（Ｈ１Ｎ１））；Ａ／ＢＯ／１３  Ｈ１（Ａ／Ｂｏｌｉｖｉａ／５５９／２０１３（Ｈ１Ｎ１））；Ａ／Ｊａｐ／５７  Ｈ２（ｃａ  Ａ／Ｊａｐａｎ／５７（Ｈ２Ｎ２））；Ａ／ＶＮ／０４  Ｈ５（ｃａ  Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１））；Ａ／Ａｌｂ／８５  Ｈ６（ｃａ  Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／Ａｌｂｅｒｔａ／８９／８５（Ｈ６Ｎ２））；Ａ／ＨＫ／９７  Ｈ９（ｃａ  Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／Ｇ９／９７（Ｈ９Ｎ２））；Ａ／ＨＫ／６８  Ｈ３（Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／６８（Ｈ３Ｎ２））；Ａ／Ｖｉｃ／７５  Ｈ３（Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／７５（Ｈ３Ｎ２））；Ａ／ＳＤ／９３  Ｈ３（Ａ／Ｓｈａｎ  ｄｏｎｇ／９／９３（Ｈ３Ｎ２））；Ａ／ＷＨ／９５  Ｈ３（ｃａ  Ａ／Ｗｕｈａｎ／３５９／９５（Ｈ３Ｎ２））；Ａ／ＳＹ／９７  Ｈ３（ｃａ  Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７（Ｈ３Ｎ２））；ＡＰＡ／９９  Ｈ３（ｃａ  Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２））；Ａ／ＣＡ／０４  Ｈ３（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００４（Ｈ３Ｎ２））；Ａ／ＷＳ／０５  Ｈ３（Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２））；Ａ／Ｐｅｒｔｈ／０９  Ｈ３（ｃａ  Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）），Ａ／ＶＣ／１１  Ｈ３（Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２））；Ａ／ＢＲ／１１  Ｈ３（Ａ／Ｂｅｒｌｉｎ／９３／２０１１（Ｈ３Ｎ２））；Ａ／ＮＹ／１２  Ｈ３Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／３９／２０１２（Ｈ３Ｎ２））；Ａ／Ｘ／１２  Ｈ３（Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２））；Ａ／ＡＳ／１３  Ｈ３（Ａ／ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｍｏａ／４７８６／２０１３（Ｈ３Ｎ２））；Ａ／ＳＷ／１３  Ｈ３（Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／２０１３（Ｈ３Ｎ２））；Ａ／ＰＵ／１４  Ｈ３（Ａ／Ｐａｌａｕ／６７５９／２０１４（Ｈ３Ｎ２））；Ａ／ＮＣ／１４  Ｈ３（Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／７１／２０１４（Ｈ３Ｎ２））；Ａ／ＩＮ／１１  Ｈ３ｖ（Ａ／Ｉｎｄｉａｎａ／１０／２０１１（Ｈ３Ｎ２ｖ））；Ａ／ＭＮ／１０  Ｈ３ｖ（Ａ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／１１／２０１０（Ｈ３Ｎ２ｖ））；Ａ／ＢＣ／０４  Ｈ７（ｃａ  Ａ／Ｂｒｉｔ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ／ＣＮ−６／０４（Ｈ７Ｎ３−ＬＰ）；Ｂ／Ｌｅｅ／４０（Ｂ／Ｌｅｅ／４０）；Ｂ／ＡＡ／６６（ｃａ  Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６）；Ｂ／ＨＫ／７２（Ｂ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／５／７２）；Ｂ／ＢＪ／９７（ｃａ  Ｂ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２４３／９７（ｖｉｃｔｏｒｉａ）），Ｂ／ＨＫ／０１（Ｂ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／３３０／２００１（ｖｉｃｔｏｒｉａ））；Ｂ／ＭＹ／０４（Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４（ｖｉｃｔｏｒｉａ））；Ｂ／ＯＨ／０５（Ｂ／Ｏｈｉｏ／１／２００５（ｖｉｃｔｏｒｉａ））；Ｂ／ＢＮＥ／０８（ｃａ  Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８（ｖｉｃｔｏｒｉａ））；Ｂ／ＮＶ／１１（Ｂ／Ｎｅｖａｄａ／３／２０１１（ｖｉｃｔｏｒｉａ））；Ｂ／ＮＪ／１２（Ｂ／Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ／０１／２０１２（ｖｉｃｔｏｒｉａ））；Ｂ／ＴＸ／１３（Ｂ／Ｔｅｘａｓ／２／２０１３（ｖｉｃｔｏｒｉａ））；Ｂ／Ｗｉｓ／１３（Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／５／２０１３（ｖｉｃｔｏｒｉａ））；Ｂ／Ｙａｍ／８８（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ＡＡ／９４（ｃａ  Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／２／９４（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ｇｅｏ／９８（ｃａ  Ｂ／Ｇｅｏｒｇｉａ／０２／９８（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ＹＳＩ／９８（ｃａ  Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／Ｊｏｈ／９９（ｃａ  Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／Ｓｉｃ／９９（Ｂ／Ｓｉｃｈｕａｎ／３７９／９９（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／Ｖｉｃ／００（ｃａ  Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／５０４／２０００（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／Ｓｈｇ／０２（Ｂ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／３６１／０２（ｙａｍａｇａｔａ））；及びＢ／ＦＬ／０６（Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ＷＳ／１０（Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／Ｍａｓｓ／１２（Ｂ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ＡＺ／１３（Ｂ／Ａｒｉｚｏｎａ／８／２０１３（ｙａｍａｇａｔａ））；Ｂ／ＰＨ／１３（Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３（ｙａｍａｇａｔａ））。
【０２９２】
【表１０】
2018518475.tif 000023
【０２９３】
表１０は、２つの独立実験からの平均ＩＣ５０値を示す。親ＩｇＧ  ＦＹ１及びＧＬ２０がすべてのＡ型インフルエンザ株を中和し、試験したＢ型インフルエンザ株との交差反応を全く示さなかった。想定通り、ＦＢＤ９４、ＦＢＣ３９及びＦＢＣ３９  ＬＴＬ  ＩｇＧが、すべてのＢ型インフルエンザ株を中和し、試験したＡ型インフルエンザ株に対する活性を全く伴わなかった。しかし、結合実験と同様、ＢｉＳ４構築物は、試験したすべてのＡ型インフルエンザ株及びすべてのＢ型インフルエンザ株に対する中和活性とともに最高の全体的な中和特性を示した。最適化された抗体クローンＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  １００／４４及びＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５を用いて作製したＢｉＳ４構築物は、試験したすべての株に対する親ＢｉＳ４を上回る全体的な中和の改善を示した。ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５は、試験した１５すべてのＡ型及びＢ型インフルエンザウイルスにおいてＩＣ５０値＜５０ｎＭをもたらした。
【０２９４】
最適化されたＢｉＳ４構築物において適用範囲が維持されたことを確認するため、３９のＡ型インフルエンザウイルス及び２５のＢ型インフルエンザウイルスのより大きいパネルでの中和について試験した。表１１は、２つの独立実験からの平均ＩＣ５０値を示す。ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  １００／４４及びＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５は、試験したすべてのウイルスに対して中和活性を示した。Ａ型インフルエンザウイルスにおける平均ＩＣ５０（ｎＭ）は、ＧＬ２０  ＩｇＧ、ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  １００／４４、及びＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５において各々、８．２、８．０、及び７．５であり、ＢｉＳ構築物が親ＩｇＧの全体的な中和活性を維持することを示した。Ｂ型インフルエンザウイルスに対する平均ＩＣ５０は、ＦＢＣ３９  ＩｇＧ、ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  １００／４４、及びＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５において各々、０．４、１３．９、及び９．０であった。ＢｉＳ構築物は、Ｂ型ウイルスに対して親ＩｇＧ  ｍＡｂと比べて１０倍を超える活性低下を示したが、全体的な中和活性はＡ型インフルエンザウイルスに対する場合と類似するレベルで維持された。ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  １００／４４、及びＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５の双方のＢｉＳ構築物が類似する特性を示したが、ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５は、より優れた全体的な中和特性を示し、すべてのウイルスに対してＩＣ５０値＜５０ｎＭであった。前述の通り、Ａ型インフルエンザｍＡｂ  ＧＬ２０のように、ＦＢＣ３９  ｍＡｂは、Ｂ型インフルエンザ株に加えて、インフルエンザＡ／ＨＫ／９７  Ｈ９株を中和することができた。ＢｉＳ４抗体は、ＢｉＳ４形式に構築されるとき、Ａ／ＨＫ／９７  Ｈ９に対していずれかの親ｍＡｂと比べて増強された中和活性を示し、ＩＣ５０値（ｎＭ）は、ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  １００／４４及びＧＬ／２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５において各々、１．６及び１．１であり、ＧＬ２０及びＦＢＣ３９において各々、３．０及び１３．３であった。
【０２９５】
【表１１】
2018518475.tif 000024
【０２９６】
【表１２】
2018518475.tif 000025
【０２９７】
実施例６．赤血球凝集阻害活性
ＢｉＳ構築物のＢ型インフルエンザｍＡｂ部分はＨＡタンパク質の球状頭部に結合し、ウイルスの宿主細胞への侵入を阻害する。この同じ作用機序がＢｉＳ構築物のＢ型インフルエンザへの機能性にとって重要であるか否かを判定するため、我々はＢ型インフルエンザウイルス株の多様な群を用いて赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイを予め構築した。ＨＡＩアッセイでは、ウイルス受容体の細胞表面に発現されるシアル酸との会合を遮断する抗体を、ウイルス媒介性の赤血球凝集の阻害を測定することにより検出する。Ｂ型インフルエンザウイルス（実施例５で記載のように略記）を、抗体の不在下での０．０５％シチメンチョウ赤血球（Ｌａｍｐｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とのインキュベーションにより決定される４ＨＡ単位に調節した。９６ウェルのＵ底プレート内で、ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  １００／４４、ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５、及びＦＢＣ３９  ＩｇＧを、２倍連続希釈し、希釈したウイルスをウェルに添加した。３０〜６０分のインキュベーション後、５０ｕｌの０．０５％シチメンチョウ赤血球を添加した。プレートをさらに３０〜６０分インキュベートし、凝集について観察した。ＨＡＩ力価が、凝集を完全に阻害する抗体の最小有効濃度（ｎＭ）であると判定した。表１２は、両方のＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４構築物が試験したすべてのＢ型インフルエンザ株に対するＨＡＩ活性を有したことを示し、ＢｉＳ構築物がＢ型インフルエンザＨＡの球状頭部に結合するという証拠を提供した。ＨＡＩ活性の全体的効力は２つの構築物間で変動し、ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５はＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  １００／４４よりも強力な阻害をもたらすとともに、試験した多数のウイルスに対する活性がＦＢＣ３９親ｍＡｂと類似していた。
【０２９８】
【表１３】
2018518475.tif 000026
【０２９９】
実施例７．Ａ型及びＢ型インフルエンザＢｉＳ構築物のインビトロでのＦｃエフェクター機能
インフルエンザＨＡモノクローナル抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、及び補体依存性死滅（ＣＤＣ）などのＦｃエフェクター機能を通じて、ウイルス感染細胞を排除する可能性を有する。ＢｉＳ構築物がこれらのエフェクター機能をそれらの親ＩｇＧ  ｍＡｂと類似するレベルで示したことを確認するため、我々は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣ活性を測定するための３つの異なるインビトロアッセイでそれらを試験した。ＡＤＣＣアッセイでは、一次ヒトＮＫ細胞が抗体によって活性化されるときにインフルエンザ感染細胞を殺滅する能力を測定する。Ａ５４９細胞を、１０の感染多重度（ＭＯＩ）でＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９  Ｈ１Ｎ１、１０のＭＯＩでＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／６８  Ｈ３Ｎ２、２０のＭＯＩでＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４  ｖｉｃｔｏｒｉａ系統及び１０のＭＯＩでＢ／Ｓｉｃｈｕａｎ／３７９／９９  ｙａｍａｇａｔａ系統に感染させ、３７℃で１５時間インキュベートした。感染細胞をＧＬ２０、ＦＢＣ３９、又はＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５の希釈系列とともにインキュベートし、次に６：１のエフェクター対標的比でヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）から正に選択された精製ＮＫ細胞とともにインキュベートした。感染細胞、抗体、及びＮＫ細胞を４時間インキュベートし、細胞死をＬＤＨ放出により測定した（Ｒｏｃｈｅ）。図２は、ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５が、Ａ型インフルエンザ感染Ａ５４９細胞の用量依存性死滅をＧＬ２０と比べて約３倍低下させることを示したとともに、ＧＬ２０及びＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５におけるＩＣ５０値（ｎＭ）が各々、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９  Ｈ１Ｎ１に対して０．０２４及び０．０８６であり、Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／６８  Ｈ３Ｎ２に対して０．０１８及び０．０５２であったことを示す（Ａ及びＢ）。ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５は、ＦＢＣ３９  ＩｇＧと同じ用量依存性応答を示したとともに、ＦＢＣ３９及びＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５における算出されたＩＣ５０値（ｎＭ）は各々、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４  ｖｉｃｔｏｒｉａに対して１．４５及び１．５０であり、Ｂ／Ｓｉｃｈｕａｎ／３７９／９９  ｙａｍａｇａｔａに対して０．８５及び０．４２であった（Ｃ及びＤ）。
【０３００】
抗ＨＡＢｉＳ抗体がＡＤＣＰアッセイにおける食作用を媒介する能力を測定するため、我々は、標的細胞としてのＡ／Ｓｏｕｔｈ  Ｄａｋｏｔａ／６／２００７  Ｈ１Ｎ１及びＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／６８  Ｈ３Ｎ２に各々由来するＨＡタンパク質が遺伝子導入されたＭＤＣＫ細胞の安定性を用いた。ヒト単球をＰＢＭＣから単離し、Ｍ−ＣＳＦの存在下で７日間培養し、マクロファージに分化させた。ヒトマクロファージ及びＨＡを発現する標的細胞を各々、青紫色及び緑色に蛍光標識した（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ又はＣＳＦＥ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。標識したエフェクター及び標的細胞を、６：１の比でＩｇＧ又はＢｉＳ抗体の希釈系列の存在下で２時間インキュベートし、次にフローサイトメトリーによって分析した。パーセント食作用を、緑色標的細胞についても陽性（二重陽性）である青紫色で染色されたマクロファージのパーセントとして測定した。図３は、ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５がＨ１発現細胞及びＨ３発現細胞に対してＧＬ２０  ＩｇＧと類似するＡＤＣＰ活性を有し、想定通り、ＦＢＣ３９  ＩｇＧがＡ型インフルエンザ発現細胞の食作用を全く示さなかったことを示す。
【０３０１】
抗ＨＡ  ＢｉＳ抗体媒介性の補体依存性細胞死を測定するため、我々はインフルエンザ感染性ＭＤＣＫ細胞を標的として用いた。このＣＤＣアッセイでは、ＭＤＣＫ細胞を、２のＭＯＩでＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４に感染させ、１：１８のエフェクター対標的比で、ウサギ由来の補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）の存在下で、ＧＬ２０  ＩｇＧ、ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５、又は無関係対照ｍＡｂの希釈系列とともにインキュベートした。細胞死をＬＤＨ放出により測定した（Ｒｏｃｈｅ）。図３Ｃは、ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ  ４３／１０５がＧＬ２０  ＩｇＧと類似レベルの細胞殺滅能を示したことを示す。
【０３０２】
実施例８．Ａ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザ感染の致死マウスモデルにおけるＡ型及びＢ型インフルエンザＢｉＳ構築物のインビボでの予防的保護
予防的有効性を試験するため、６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）マウスに、ＧＬ２０  ＩｇＧの単回腹腔内注射（ＩＰ）を、３、０．３、若しくは０．０３ｍｇ／ｋｇ又はＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５相当の等モルで１００μｌの容量で施した。投与後４時間を経て、Ａ型インフルエンザ感染モデルにおける試験では、５０μｌの容量で２．５倍の５０％マウス致死量（２．５ＭＬＤ５０）のＡ／Ｗｉｌｓｏｎ  Ｓｍｉｔｈ  Ｎ／３３  Ｈ１Ｎ１（Ａ／ＷＳＮ／３３）若しくは７ＭＬＤ５０のＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４：Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／６８が７：１のＨＡリアソータント（ｒＡ／ＨＫ／６８）を；又はＢ型インフルエンザ感染モデルを用いる試験では、５０μｌの容量で７ＭＬＤ５０のＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６  ｙａｍａｇａｔａ系統（Ｂ／ＦＬＡ／０６）若しくは１０ＭＬＤ５０のＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／／２５０６／２００４  ｖｉｃｔｏｒｉａ系統（Ｂ／ＭＡＬ／０４）を、マウス鼻腔内に接種した。８〜１０匹のマウス群は、ウイルス負荷日に秤量し、体重減少及び生存について１４日間毎日監視した（体重減少≧２５％を有するマウスは安楽死させた）。さらに、ウイルスタイトレーションのため、感染後５日目、さらなる動物４匹から肺を採取した。肺を１０％ｗ／ｖ溶液中、Ｔｅｅｎ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ａ及びＦａｓｔｐｒｅｐ２４ホモジナイザーを用いて均質化した。ＴＣＩＤ５０の定量を、３８４ウェルの黒色壁組織培養プレート内の連続希釈した肺ホモジネートに対して４連で実施した。次に、トリプシン処理したＭＤＣＫ細胞を２．０×１０４個の細胞／ウェルでホモジネートに添加し、プレートを５％ＣＯ２下、３３℃で約４０時間インキュベートした。ウイルス複製を、上記のように４０μＭのΜＵ−ＮＡＮＡの添加により測定した。感染性ウイルス力価をＫａｒｂｅｒ法（Ｋａｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９３１  Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｋ．１６２：４８０−３）を用いて計算し、陽性試料を、細胞単独の平均値を超える１０より大きい標準偏差を示すものと定義した。
【０３０３】
Ａ型インフルエンザ感染に対する予防的活性
ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５と親ＩｇＧ  ＧＬ２０の双方が、マウスに類似の用量依存性様式でのＡ型インフルエンザの致死性負荷からの保護を提供した。ＧＬ２０のように、ＢｉＳ分子の３ｍｇ／ｋｇ相当のＩＰ注射がＡ／ＷＳＮ／３３  Ｈ１ウイルスを負荷した動物の１００％を保護し、３及び０．３ｍｇ／ｋｇ相当のＩＰ注射がｒＡ／ＨＫ／６８  Ｈ３ウイルスを負荷した動物の１００％における致死を阻止した（図４Ａ及びＣ）。感染後５日目に採取した肺においてウイルス力価を評価した時、両方の抗体分子は肺のウイルス力価を低下させ、３ｍｇ／ｋｇ相当用量での低下がより明白であった。ＢｉＳをＩｇＧと比べると、我々は、Ｈ１モデルにおいてやや低下したウイルス力価を有するＧＬ２０治療動物を有する２群中で類似するウイルス力価の低下を認める一方、ＢｉＳはＨ３モデルにおいてより低いウイルス力価を示した（図４Ｂ及びＤ）。全体としてこれらのデータは、ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５が、ＧＬ２０  ＩｇＧと同程度まで、致死を阻止し、肺でのウイルス複製を低下させ得ることを示す。
【０３０４】
Ｂ型インフルエンザ感染に対する予防的活性
ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５と親ＦＢＣ３９  ＩｇＧの双方が、用量依存性様式で致死性のＢ型インフルエンザ感染に対する保護を与えた。ＢｉＳ分子の３ｍｇ／ｋｇ相当のＩＰ注射が、Ｂ／ＦＬＡ／０６  ｙａｍａｇａｔａ系統及びＢ／ＭＡＬ／０４  ｖｉｃｔｏｒｉａ系統ウイルスを負荷した動物の１００％を保護した（図５Ａ及びＣの実線）。ＢｉＳ及びＦＢＣ３９は３ｍｇ／ｋｇ用量で１００％の生存率で完全な保護をもたらしたが、ＦＢＣ３９は、両方のＢ型インフルエンザ感染モデルにおいて０．３ｍｇ／ｋｇの用量レベルでＦＢＣ３９よりも優れた保護を示した。肺におけるウイルス力価を感染後５日目に評価した時、両方の抗体分子が肺ウイルス力価を低下させ、それは３ｍｇ／ｋｇ相当用量で最も明白であった。ＢｉＳをＩｇＧと比べると、我々は、Ｂ／ＦＬＡ／０６  ｙａｍａｇａｔａ感染モデルにおいて類似するウイルス力価の低下を認めるが、ＢｉＳは、Ｂ／Ｍａｌ／０４  ｖｉｃｔｏｒｉａ株に感染させたマウスにおいて、肺ウイルス力価低下ではＦＢＣ３９ほど有効ではなかった（図５Ｂ及びＤ）。まとめると、図４及び５でのこれらのデータは、ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５が、Ａ型及びＢ型インフルエンザ致死感染モデルの双方において致死を有効に阻止し、肺でのウイルス複製を低下させ得ることを示す。
【０３０５】
実施例９．Ａ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザ感染の致死マウスモデルにおけるＡ型及びＢ型インフルエンザＢｉＳ構築物のオセルタミビルと比べてのインビボでの治療的保護
ＢｉＳ分子の治療効果を小分子ＮＡ阻害剤のオセルタミビルと直接的に比較するため、我々はＡ型及びＢ型インフルエンザ感染のインフルエンザマウスモデルを用いた。
【０３０６】
ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５とオセルタミビルの治療的比較（図５）
マウスに２．５ＭＬＤ５０のＡ／ＷＳＮ／３３  Ｈ１ウイルス又は７ＭＬＤ５０のＢ／ＦＬＡ／０６  ｙａｍａｇａｔａ系統ウイルスを接種し、次に、感染後１日目、２日目、３日目、又は４日目のいずれかに開始した５日間のオセルタミビルの、ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５の１０ｍｇ／ｋｇ相当（１４．１ｍｇ／ｋｇ）又は１日２回の２５ｍｇ／ｋｇでの単回静注投与量で経口的に治療した。１群あたり動物１０匹における体重減少及び生存について監視し、動物４匹を屠殺し、肺ウイルス力価を上記のように測定した。さらに、肺機能の非浸潤的な読み取りとして、１群あたり動物４匹に対する感染後６日目、血液酸素飽和レベルをパルス酸素測定（マウスｏｘ）を用いて測定した。
【０３０７】
ＢｉＳ分子を用いる治療は、感染後２日目の投与時、マウスの１００％をＡ／ＷＳＮ／３３又はＢ／ＦＬＡ／０６での致死感染から保護した（図６Ａ及びＢ）。ＢｉＳ分子は、治療が感染後３日目まで遅延した時でさえ、Ａ型又はＢ型インフルエンザウイルスのいずれかを感染させた動物の５０％における致死を依然として阻止した。Ａ型インフルエンザ感染モデルでは、１日目又はそれより以降に治療を行った時、オセルタミビルは保護を全く示さなかったが、それは優れた保護をもたらし、Ｂ型インフルエンザ感染後１日目又は２日目に投与を開始した時、生存率は９０〜１００％であった。オセルタミビルはＢ型インフルエンザモデルにおいて十分に保護したが、ＢｉＳは、より優れた保護への傾向を示し、感染後２日目、３日目及び４日目に投与した時、生存率がオセルタミビルより高まった（図６Ａ及びＢ）。
【０３０８】
図６（Ｃ及びＤ）は、感染後５日目にＢｉＳ又はオセルタミビルで治療したマウスにおける肺ウイルス力価を示した。Ａ／ＷＳＮ／３３  Ｈ１Ｎ１ウイルスでの感染後の様々な時点でＢｉＳ分子を用いる治療は、肺でのウイルス複製を、感染後１日目の治療開始時の３より大きいｌｏｇのウイルス低下から感染後４日目の治療開始時の１ｌｏｇのウイルス力価低下まで時間依存性様式で阻害した（図６Ｃ）。オセルタミビルと比べて、ＢｉＳ分子は、感染後２日目、３日目又は４日目の治療開始時、１〜２ｌｏｇのより大きい低下を示した。
【０３０９】
肺機能に対する異なる治療の効果を評価するため、酸素飽和レベルをパルス酸素測定により測定した（図６Ｅ及びＦ）。無関係対照ｍＡｂのみで治療した感染動物は、ナイーブ動物における９８％と比べて、Ａ／ＷＳＮ／３３に対して８０％及び感染後６日目での７８％までのパーセント酸素飽和における低下を示した。ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５を用いる治療は、治療が感染後４日目まで遅延した時でさえ、酸素飽和レベルを９０％未満への低下から阻止した一方、オセルタミビルで治療した動物は、無関係対照ｍＡｂで治療した場合と類似するレベルで酸素飽和の低下を示した（図６Ｅ）。マウスをＢ／ＦＬＡ／０６に感染させ、次にＢｉＳ又はオセルタミビルで治療した時、両方の薬剤は肺機能を保護し、感染後１日目の治療開始時、ＢｉＳ治療動物はややより高い酸素飽和レベルを有した（図６Ｆ）。感染後２日目の治療開始時、ＢｉＳ治療動物は、４匹中３匹の治療動物においてオセルタミビル治療動物よりも有意に改善した肺機能を示した（平均９２％対８６％）。全体として、これら２つの試験によると、ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５が、Ａ型及びＢ型インフルエンザに致死量で感染した動物において、感染後３日目までの治療開始時、致死を阻止し、ウイルス力価を減少させ、肺機能を保護することが示される。
【０３１０】
参照による援用
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書中で引用されるすべての参考文献や、それらの中で引用される参考文献は、それらがまだ引用されない限り、本明細書でそれら全体が参照により本明細書中に援用される。
【０３１１】
配列
配列番号１  （ＦＹ１  ＶＬ核酸配列）
【化１３】
2018518475.tif 000027
配列番号２  （ＦＹ１  ＶＬアミノ酸配列）
【化１４】
2018518475.tif 000028
配列番号３  ＬＣＤＲ１  ＲＴＳＱＳＬＳＳＹＬＨ
配列番号４  ＬＣＤＲ２  ＡＡＳＳＬＱＳ
配列番号５  ＬＣＤＲ３  ＱＱＳＲＴ
配列番号６  （ＦＹ１  ＶＨ核酸配列）
【化１５】
2018518475.tif 000029
配列番号７  （ＦＹ１  ＶＨアミノ酸配列）
【化１６】
2018518475.tif 000030
配列番号８  ＨＣＤＲ１  ＳＮＮＡＶＷＮ
配列番号９  ＨＣＤＲ２  ＲＴＹＹＲＳＫＷＹＮＤＹＡＥＳＶＫＳ
配列番号１０  ＨＣＤＲ３  ＳＧＨＩＴＶＦＧＶＮＶＤＡＦＤＭ
配列番号１１  （ＧＬ２０  ＶＬ核酸配列）
【化１７】
2018518475.tif 000031
配列番号１２  （ＧＬ２０  ＶＬアミノ酸配列）
【化１８】
2018518475.tif 000032
配列番号１３  ＬＣＤＲ１  ＲＴＳＱＳＬＳＳＹＴＨ
配列番号１４  ＬＣＤＲ２  ＡＡＳＳＲＧＳ
配列番号１５  ＬＣＤＲ３  ＱＱＳＲＴ
配列番号１６  （ＧＬ２０  ＶＨ核酸配列）
【化１９】
2018518475.tif 000033
配列番号１７  （ＧＬ２０  ＶＨアミノ酸配列）
【化２０】
2018518475.tif 000034
配列番号１８  ＨＣＤＲ１  ＳＹＮＡＶＷＮ
配列番号１９  ＨＣＤＲ２  ＲＴＹＹＲＳＧＷＹＮＤＹＡＥＳＶＫＳ
配列番号２０  ＨＣＤＲ３  ＳＧＨＩＴＶＦＧＶＮＶＤＡＦＤＭ
配列番号２１  （ＦＢＣ３９  ＶＬ  ＤＮＡ）
【化２１】
2018518475.tif 000035
配列番号２２  （ＦＢＣ３９  ＶＬタンパク質）
【化２２】
2018518475.tif 000036
配列番号２３  （ＦＢＣ３９  ＬＣＤＲ−１−Ｋａｂａｔ）：ＲＡＳＱＤＩＳＴＷＬＡ
配列番号２４  （ＦＢＣ３９  ＬＣＤＲ−２−Ｋａｂａｔ）：ＡＡＳＳＬＱＳ
配列番号２５  （ＦＢＣ３９  ＬＣＤＲ−３−Ｋａｂａｔ）：ＱＱＡＮＳＦＰＰＴ
配列番号２６  （ＦＢＣ３９  ＶＨ  ＤＮＡ）
【化２３】
2018518475.tif 000037
配列番号２７  （ＦＢＣ３９  ＶＨタンパク質）
【化２４】
2018518475.tif 000038
配列番号２８  （ＦＢＣ３９  ＨＣＤＲ−１−Ｋａｂａｔ）：ＮＡＷＭＳ
配列番号２９  （ＦＢＣ３９  ＨＣＤＲ−２−Ｋａｂａｔ）：ＲＩＫＳＮＴＤＧＧＴＴＤＹＡＡＰＶＫＧ
配列番号３０  （ＦＢＣ３９  ＨＣＤＲ−３−Ｋａｂａｔ）：ＤＧＰＹＳＤＤＦＲＳＧＹＡＡＲＹＲＹＦＧＭＤＶ
配列番号３１  （ＦＢＣ３９  ｓｃＦｖアミノ酸配列）：
【化２５】
2018518475.tif 000039
配列番号３２  （ＦＢＣ３９  ＶＬタンパク質−ｓｃＦｖ）
【化２６】
2018518475.tif 000040
配列番号３３  （ＦＢＣ３９  ＶＨタンパク質−ｓｃＦｖ）
【化２７】
2018518475.tif 000041
配列番号３４  （ＦＢＣ３９−４３／１０５  ｓｃＦｖアミノ酸配列）：
【化２８】
2018518475.tif 000042
配列番号３５  （ＦＢＣ３９  ＶＬタンパク質−ｓｃＦｖ４３／１０５）
【化２９】
2018518475.tif 000043
配列番号３６  （ＦＢＣ３９  ＶＨタンパク質−ｓｃＦｖ４３／１０５）
【化３０】
2018518475.tif 000044
配列番号３７  （ＦＢＣ３９  ＦＴＬ  ＶＬ  ＤＮＡ）
【化３１】
2018518475.tif 000045
配列番号３８  （ＦＢＣ３９  ＦＴＬ  ＶＬタンパク質）
【化３２】
2018518475.tif 000046
配列番号３９  （ＦＢＣ３９  ＦＴＬ  ＬＣＤＲ−１−Ｋａｂａｔ）：ＲＡＳＱＤＩＳＴＷＬＡ
配列番号４０  （ＦＢＣ３９  ＦＴＬ  ＬＣＤＲ−２−Ｋａｂａｔ）：ＡＡＳＳＬＱＳ
配列番号４１  （ＦＢＣ３９  ＦＴＬ  ＬＣＤＲ−３−Ｋａｂａｔ）：ＱＱＡＮＳＦＰＰＴ
配列番号４２  （ＦＢＣ３９  ＦＴＬ  ＶＨ  ＤＮＡ）
【化３３】
2018518475.tif 000047
配列番号４３  （ＦＢＣ３９  ＦＴＬ  ＶＨタンパク質）
【化３４】
2018518475.tif 000048
配列番号４４  （ＦＢＣ３９  ＦＴＬ  ＨＣＤＲ−１−Ｋａｂａｔ）：ＮＡＷＭＳ
配列番号４５  （ＦＢＣ３９  ＦＴＬ  ＨＣＤＲ−２−Ｋａｂａｔ）：ＲＩＫＳＮＴＤＧＧＴＴＤＹＡＡＰＶＫＧ
配列番号４６  （ＦＢＣ３９  ＦＴＬ  ＨＣＤＲ−３−Ｋａｂａｔ）：ＤＧＰＹＳＤＤＦＲＳＧＹＡＡＲＹＲＹＦＧＭＤＶ
配列番号４７  （ＦＢＣ３９  ＦＴＬ  ｓｃＦｖアミノ酸配列）：
【化３５】
2018518475.tif 000049
配列番号４８  （ＦＢＣ３９  ＦＴＬ  ＶＬタンパク質−ｓｃＦｖ）
【化３６】
2018518475.tif 000050
配列番号４９  （ＦＢＣ３９  ＦＴＬ  ＶＨタンパク質−ｓｃＦｖ）
【化３７】
2018518475.tif 000051
配列番号５０  （ＦＢＣ３９ＦＴＬ−４３／１０５  ｓｃＦｖアミノ酸配列）：
【化３８】
2018518475.tif 000052
配列番号５１  （ＦＢＣ３９  ＦＴＬ  ＶＬタンパク質−ｓｃＦｖ４３／１０５）
【化３９】
2018518475.tif 000053
配列番号５２  （ＦＢＣ３９  ＦＴＬ  ＶＨタンパク質−ｓｃＦｖ４３／１０５）
【化４０】
2018518475.tif 000054
配列番号５３  （ＦＢＤ９４  ＶＬ  ＤＮＡ）
【化４１】
2018518475.tif 000055
配列番号５４  （ＦＢＤ９４  ＶＬタンパク質）
【化４２】
2018518475.tif 000056
配列番号５５  （ＦＢＤ９４  ＬＣＤＲ−１−Ｋａｂａｔ）：ＲＡＳＲＳＩＴＴＦＬＡ
配列番号５６  （ＦＢＤ９４  ＬＣＤＲ−２−Ｋａｂａｔ）：ＤＡＳＮＲＡＴ
配列番号５７  （ＦＢＤ９４  ＬＣＤＲ−３−Ｋａｂａｔ）：ＱＱＲＤＨＷＰＰＩ
配列番号５８  （ＦＢＤ９４  ＶＨ  ＤＮＡ）
【化４３】
2018518475.tif 000057
配列番号５９  （ＦＢＤ９４  ＶＨタンパク質）
【化４４】
2018518475.tif 000058
配列番号６０  （ＦＢＤ９４  ＨＣＤＲ−１−Ｋａｂａｔ）：ＤＹＡＩＮ
配列番号６１  （ＦＢＤ９４  ＨＣＤＲ−２−Ｋａｂａｔ）：ＩＩＳＷＤＳＧＲＩＧＹＡＤＳＶＲＧ
配列番号６２  （ＦＢＤ９４  ＨＣＤＲ−３−Ｋａｂａｔ）：ＤＭＬＡＹＹＹＤＧＳＧＩＲＹＮＬＹＧＭＤＶ
配列番号６３  （ＦＢＤ９４  ｓｃＦｖアミノ酸配列）：
【化４５】
2018518475.tif 000059
配列番号６４  （ＦＢＤ９４  ＶＬタンパク質−ｓｃＦｖ）
【化４６】
2018518475.tif 000060
配列番号６５  （ＦＢＤ９４  ＶＨタンパク質−ｓｃＦｖ）
【化４７】
2018518475.tif 000061
配列番号６６  （ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  １００／４４軽鎖）：
【化４８】
2018518475.tif 000062
配列番号６７  （ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  １００／４４重鎖）：
【化４９】
2018518475.tif 000063
配列番号６８  （ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５軽鎖）：
【化５０】
2018518475.tif 000064
配列番号６９  （ＧＬ２０／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５重鎖）：
【化５１】
2018518475.tif 000065
配列番号７０  （ＦＹ１／３９  ＢｉＳ２  １００／４４フォワードプライマーにおけるＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ−ＦＹ１  ＶＨ  ＤＮＡ）
ＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＴＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣ
配列番号７１  （ＦＹ１／３９  ＢｉＳ２  １００／４４リバースプライマーにおけるＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ−ＦＹ１  ＶＨ  ＤＮＡ）
ＧＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣＧＣＧＣＴＴＧＡＣＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＴＡＧＴＣ
配列番号７２  （ＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ  ＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  １００／４４フォワードプライマー）
ＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧｇｇａｔｃｃＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣ
配列番号７３  （ＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ  ＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  １００／４４リバースプライマー）
【化５２】
2018518475.tif 000066
配列番号７４  （ＢｉＳ１  ＦＢＣ３９フォワードプライマー）：
ＣＴＧＧＣＴＣＣＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＣＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣ
配列番号７５  （ＢｉＳ１  ＦＢＣ３９リバースプライマー）：
ＣＣＣＣＴＣＣＧＣＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＴＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣ
配列番号７６  （ＢｉＤ１  ＦＹ１−ＶＬフォワードプライマー）：
ＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＴＧＡＴＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣ
配列番号７７  （ＢｉＳ１  ＦＹ１−ＶＬリバースプライマー）：
ＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＡＧＴＧＣＣＣ
配列番号７８  （ＦＹ１／３９  ＢｉＳ３  １００／４４−ＦＢＣ３９  ｓｃＦｖフォワードプライマー）：
【化５３】
2018518475.tif 000067
配列番号７９  （ＦＹ１／３９  ＢｉＳ３  １００／４４−ＦＢＣ３９  ｓｃＦｖリバースプライマー）：
ＴＣＡＡＴＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣ
配列番号８０  （ＦＹ１／９４  ＢｉＳ２  １００／４４−ＦＢＤ９４  ｓｃＦｖフォワードプライマー）：
ＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＴＣＣＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣ
配列番号８１  （ＦＹ１／９４  ＢｉＳ２  １００／４４−ＦＢＤ９４  ｓｃＦｖリバースプライマー）：
ＣＣＣＣＴＣＣＧＣＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＴＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣ
配列番号８２  （ＦＹ１／９４  ＢｉＳ２  １００／４４−ＦＹ１  ＶＨフォワードプライマー）：
ＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＴＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＣ
配列番号８３  （ＦＹ１／９４  ＢｉＳ２  １００／４４−ＦＹ１  ＶＨリバースプライマー）：
ＧＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣＧＣＧＣＴＴＧＡＣＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＴＡＧＴＣ
配列番号８４  （ＦＹ１／９４  ＢｉＳ４  １００／４４−ＦＢＤ９４  ｓｃＦｖフォワードプライマー）：
ＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣ
配列番号８５  （ＦＹ１／９４  ＢｉＳ４  １００／４４−ＦＢＤ９４  ｓｃＦｖリバースプライマー）：
【化５４】
2018518475.tif 000068
配列番号８６  （ＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５−ＦＢＣ３９−４３／１０５  ｓｃＦｖフォワードプライマー）：
ＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧｇｇａｔｃｃＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣ
配列番号８７  （ＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５−ＦＢＣ３９−４３／１０５  ｓｃＦｖリバースプライマー）：
【化５５】
2018518475.tif 000069
配列番号８８  （ＧＬ２０／３９ＦＴＬ  ＢｉＳ４  １００／４４−ＦＢＣ３９ＦＴＬ  ｓｃＦｖフォワードプライマー）：
ＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣ
配列番号８９  （ＧＬ２０／３９ＦＴＬ  ＢｉＳ４  １００／４４−ＦＢＣ３９ＦＴＬ  ｓｃＦｖリバースプライマー）：
【化５６】
2018518475.tif 000070
配列番号９０  （ＧＬ２０／３９ＦＴＬ  ＢｉＳ４  ４３／１０５−ＦＢＣ３９ＦＴＬ４３／１０５  ｓｃＦｖフォワードプライマー）：
ＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧｇｇａｔｃｃＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣ
配列番号９１  （ＧＬ２０／３９ＦＴＬ  ＢｉＳ４  ４３／１０５−ＦＢＣ３９ＦＴＬ４３／１０５  ｓｃＦｖリバースプライマー）：
【化５７】
2018518475.tif 000071
配列番号９２  （Ｇｌｙ／ｓｅｒリンカー）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号９３  （Ｇｌｙ／ｓｅｒリンカー）
［ＧＧＧＧＳ］ｎ（式中、ｎは０、１、２、３、４、若しくは５）
配列番号９４  （ＦＢＣ−３９  ＬＣＤＲ−１−ＩＭＧＴ）：ＱＤＩＳＴＷ
配列番号９５  （ＦＢＣ−３９  ＬＣＤＲ−２−ＩＭＧＴ）：ＡＡＳ
配列番号９６  （ＦＢＣ−３９  ＬＣＤＲ−３−ＩＭＧＴ）：ＱＱＡＮＳＦＰＰＴ
配列番号９７  （ＦＢＣ−３９  ＨＣＤＲ−１−ＩＭＧＴ）：ＧＬＳＦＬＮＡＷ
配列番号９８  （ＦＢＣ−３９  ＨＣＤＲ−２−ＩＭＧＴ）：ＩＫＳＮＴＤＧＧＴＴ
配列番号９９  （ＦＢＣ−３９  ＨＣＤＲ−３−ＩＭＧＴ）：ＴＤＧＰＹＳＤＤＦＲＳＧＹＡＡＲＹＲＹＦＧＭＤＶＷ
配列番号１００  （ＦＢＣ−３９  ＦＴＬ  ＬＣＤＲ−１−ＩＭＧＴ）：ＱＤＩＳＴＷ
配列番号１０１  （ＦＢＣ−３９  ＦＴＬ  ＬＣＤＲ−２−ＩＭＧＴ）：ＡＡＳ
配列番号１０２  （ＦＢＣ−３９  ＦＴＬ  ＬＣＤＲ−３−ＩＭＧＴ）：ＱＱＡＮＳＦＰＰＴ
配列番号１０３  （ＦＢＣ−３９  ＦＴＬ  ＨＣＤＲ−１−ＩＭＧＴ）：ＧＦＴＦＬＮＡＷ
配列番号１０４  （ＦＢＣ−３９  ＦＴＬ  ＨＣＤＲ−２−ＩＭＧＴ）：ＩＫＳＮＴＤＧＧＴＴ
配列番号１０５  （ＦＢＣ−３９  ＦＴＬ  ＨＣＤＲ−３−ＩＭＧＴ）：ＴＴＤＧＰＹＳＤＤＦＲＳＧＹＡＡＲＹＲＹＦＧＭＤＶ
配列番号１０６  （Ｇｌｙ／ｓｅｒリンカー）
［ＧＧＧＧ］ｎ（式中、ｎは０、１、２、３、４、若しくは５）
配列番号１０７  （ＦＹ１／３９  ＢｉＳ２  １００／４４軽鎖）
【化５８】
2018518475.tif 000072
配列番号１０８  （ＦＹ１／３９  ＢｉＳ２  １００／４４重鎖）
【化５９】
2018518475.tif 000073
配列番号１０９  （ＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  １００／４４軽鎖）
【化６０】
2018518475.tif 000074
配列番号１１０  （ＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  １００／４４重鎖）
【化６１】
2018518475.tif 000075
配列番号１１１  （ＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ−ＦＹ１  ＶＨ  ＤＮＡ）：
【化６２】
2018518475.tif 000076
配列番号１１２  （ＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ  ＤＮＡ）：
【化６３】
2018518475.tif 000077
配列番号１１３  （ＦＹ１／３９  ＢｉＳ１  １００／４４軽鎖）
【化６４】
2018518475.tif 000078
配列番号１１４  （ＦＹ１／３９  ＢｉＳ１  １００／４４重鎖）
【化６５】
2018518475.tif 000079
配列番号１１５  （ＦＹ１／３９  ＢｉＳ３  １００／４４軽鎖）
【化６６】
2018518475.tif 000080
配列番号１１６  （ＦＹ１／３９  ＢｉＳ３  １００／４４重鎖）
【化６７】
2018518475.tif 000081
配列番号１１７  （ＦＹ１／９４  ＢｉＳ２  １００／４４軽鎖）
【化６８】
2018518475.tif 000082
配列番号１１８  （ＦＹ１／９４  ＢｉＳ２  １００／４４重鎖）
【化６９】
2018518475.tif 000083
配列番号１１９  （ＦＢＤ９４  ｓｃＦｖ  ＤＮＡ）：
【化７０】
2018518475.tif 000084
配列番号１２０  （ＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５軽鎖）
【化７１】
2018518475.tif 000085
配列番号１２１  （ＦＹ１／３９  ＢｉＳ４  ４３／１０５重鎖）
【化７２】
2018518475.tif 000086
配列番号１２２  （ＦＢＣ３９−４３／１０５  ｓｃＦｖ  ＤＮＡ）：
【化７３】
2018518475.tif 000087
配列番号１２３  （ＧＬ２０  ＬＣ／ＶＨ）：
【化７４】
2018518475.tif 000088
配列番号１２４  （ＦＢＣ３９ＦＴＬ  ｓｃＦｖ  ＤＮＡ）：
【化７５】
2018518475.tif 000089
配列番号１２５  （ＧＬ２０／３９ＦＴＬ  ＢｉＳ４  ４３／１０５軽鎖）
【化７６】
2018518475.tif 000090
配列番号１２６  （ＧＬ２０／３９ＦＴＬ  ＢｉＳ４  ４３／１０５重鎖）
【化７７】
2018518475.tif 000091
配列番号１２７  （ＦＢＣ３９ＦＴＬ４３／１０５  ｓｃＦｖ  ＤＮＡ）：
【化７８】
2018518475.tif 000092
配列番号１２８  （ＧＬ２０／３９ＦＴＬ  ＢｉＳ５  ４３／１０５軽鎖）
【化７９】
2018518475.tif 000093
配列番号１２９  （ＧＬ２０−ＦＢＣ３９  ＢｉＳ５−ＧＬ２０ＶＨ−Ｆｃ（ＣＨ３−）−リンカー−ＦＢＣ３９  ｓｃＦｖ−リンカー−Ｆｃ（−ＣＨ３））
【化８０】
2018518475.tif 000094
配列番号１３０  （ＧＬ２０／３９ＦＴＬ  ＢｉＳ５  ４３／１０５軽鎖）
【化８１】
2018518475.tif 000095
配列番号１３１  （ＧＬ２０ＶＨ  ＢｉＳ５−Ｆｃ（ＣＨ３−）−リンカー−ＦＢＣ３９（４３−１０５）ｓｃＦｖ−リンカー−Ｆｃ（−ＣＨ３））
【化８２】
2018518475.tif 000096
【図１】
2018518475.tif 000097
【図２】
2018518475.tif 000098
【図３】
2018518475.tif 000099
【図４】
2018518475.tif 000100
【図５】
2018518475.tif 000101
【図６】
2018518475.tif 000102
【配列表】
2018518475000001.app
【国際調査報告】
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