(57)【要約】本発明は、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、（ａ）ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞から事前に取得された出発材料の深層ろ過を行う工程であって、前記出発材料が、細胞溶解物および培養上清を含む群において選択される、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、（ｂ）ｒＡＡＶ含有清澄化組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第１の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、（ｃ）第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第２の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに少なくとも１回供する工程であって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、（ｄ）第２のｒＡＡＶ濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、を含む方法を説明する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞から事前に取得された出発材料の深層ろ過を行う工程であって、前記出発材料が、細胞溶解物および培養上清を含む群において選択される、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）前記ｒＡＡＶ含有清澄化組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第１の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）前記第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第２の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに少なくとも１回供する工程であって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｄ）前記第２のｒＡＡＶ濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、
を含む方法。
【請求項２】
工程（ｂ）において、５０ｍＭのＮａＣｌから０．５ＭのＮａＣｌまでというＮａＣｌの塩勾配をカラム体積の５〜３０倍、好ましくはカラム体積の１０〜２０倍、の範囲の勾配体積で用いることによって溶出が行われる、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｃ）における直線的な塩勾配の傾きが、工程（ｂ）における直線的な塩勾配の傾きと等しいか、それよりも小さい、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）において、５０ｍＭのＮａＣｌから０．３５ＭのＮａＣｌまでというＮａＣｌの塩勾配をカラム体積の５〜３０倍の範囲の勾配体積で用いることによって溶出が行われる、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）の終了時に、工程（ｂ）で使用されるクロマトグラフィー担体上におけるｒＡＡＶ粒子の最適な保持を確実にするために前記ｒＡＡＶ含有清澄化組成物のｐＨが塩基性のｐＨに調整される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）および／または工程（ｃ）におけるクロマトグラフィー担体が、モノリス型クロマトグラフィー担体である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｄ）が、５０ｋＤａ〜１５０ｋＤａの範囲の分子量カットオフ値を有するフィルター膜を用いて行われる、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびアカゲザル由来血清型（ＡＡＶｒｈ１０を含む）ならびにそれらの混合物からなる群において選択されるＡＡＶ血清型、特にＡＡＶ４およびＡＡＶ５、および好ましくはＡＡＶ５、に属する、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ｒＡＡＶ粒子が、ヒトＰＤＥ６βをコードする発現カセットを含むＤＮＡを含むｒＡＡＶ５粒子からなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｒＡＡＶ粒子が、ヒトＲＰＥ６５をコードする発現カセットを含むＤＮＡを含むｒＡＡＶ４粒子からなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記精製されたｒＡＡＶ粒子が、遺伝子治療のための使用に適している、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって得られるｒＡＡＶ粒子。
【請求項１３】
ヒトＰＤＥ６βをコードする発現カセットを含むＡＡＶプラスミド。
【請求項１４】
先行する請求項に記載のＡＡＶプラスミドでトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１５】
先行する請求項に記載の宿主細胞によって産生されるｒＡＡＶ粒子。
【請求項１６】
遺伝子治療に使用するための、先行する請求項に記載のｒＡＡＶ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）の精製の分野に関する。特に、本発明は、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法に関する。本発明はまた、前記方法を用いて得ることができる、精製されたｒＡＡＶ粒子およびその組成物にも関する。本発明はさらに、ＡＡＶプラスミド、および前記プラスミドでトランスフェクトされた宿主細胞、ならびに前記宿主細胞によって産生されるｒＡＡＶ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子送達は、後天性疾患および遺伝性疾患の処置のための有望な方法である。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を利用した系を含め、遺伝子導入を目的とするウイルスを利用した系がいくつか説明されている。ＡＡＶは、ディペンドウイルス属に属するヘルパー依存型ＤＮＡパルボウイルスである。増殖性感染が起こるためには、ＡＡＶは、無関係のヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニア）との同時感染を必要とする。ヘルパーウイルスの非存在下では、ＡＡＶは、そのゲノムを宿主細胞の染色体に挿入することにより潜伏状態を確立する。その後のヘルパーウイルスの感染が、組み込まれたウイルスゲノムをレスキューし、その後、このウイルスゲノムは複製して感染性のウイルス子孫を産生できる。
【０００３】
ＡＡＶは、幅広い宿主域を有し、好適なヘルパーウイルスの存在下で任意の種の細胞において複製することができる。例えば、ヒトＡＡＶは、イヌアデノウイルスと同時感染したイヌ細胞において複製するであろう。ＡＡＶは、いかなるヒトまたは動物の疾患とも関連付けられておらず、組み込み時に宿主細胞の生物学的特性を変化させるとは思われない。ＡＡＶの総説については、例えば、Ｂｅｒｎｓ  ａｎｄ  Ｂｏｈｅｎｚｋｙ（１９８７）  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）  ３２：２４３−３０７を参照のこと。
【０００４】
Ｌｅ  ｍｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（「Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｓｉｏｎ  ｉｎ  ＲＰＥ６５−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｂｒｉａｒｄ  ｄｏｇｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ＡＡＶ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ４  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ」；Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；Ｖｏｌ．１４，  ２９２−３０３；２００７）は、ＲＰＥ６５を欠損したイヌにおいて視力を回復させるためのｒＡＡＶの使用を教示する。
【０００５】
Ｐｅｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（「Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｄｅ６β−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｄｏｇ，  ａ  Ｌａｒｇｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｒｏｄ−ｃｏｎｅ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ」；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ；Ｖｏｌ．２０，  ｎｏ．１１，  ２０１９−２０３０；２０１２）は、ＰＤＥ６βを欠損したイヌにおいて視力を回復させるためのｒＡＡＶの使用を教示する。
【０００６】
これら全ての理由から、遺伝子治療のためのアデノ随伴ウイルスの使用が提唱されている。しかし、臨床用途に十分なだけの純度および／または感染力を有する調製物を必要とするため、未だに適用されていない。
【０００７】
従って、アデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を精製するための新規の方法が依然として必要とされている。特に、明確に定義されており、再現性があり、適正製造規範（ＧＭＰ）に従う管理された環境条件内にある、拡張可能な方法が依然として必要とされている。
【０００８】
特に、限られた数の工程を必要とする、アデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を精製するための方法が依然として必要とされている。
【０００９】
また、医薬としての使用および／または遺伝子治療に適しているアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を精製するための方法も依然として必要とされている。
【００１０】
従って、純度および感染力が高いｒＡＡＶ粒子およびその組成物を精製するための拡張可能な方法が依然として必要とされている。
【００１１】
アデノ随伴ウイルス粒子を精製するための方法は、先行技術において報告されている。しかし、それらの方法は、そのままで医薬としての使用および／または遺伝子治療に適しているｒＡＡＶ粒子の生産に関して必ずしも十分なものではない。
【００１２】
国際公開第２０１１／０９４１９８号は、イオン交換カラムクロマトグラフィーの工程とタンジェンシャルフローろ過の工程とを含む、ＡＡＶ粒子を精製するための方法を教示する。
【００１３】
国際公開第０３／０９７７９７号は、混入ＤＮＡのレベルが低下したウイルス粒子を精製するための方法を教示し、この方法は、細胞溶解、深層ろ過および／または遠心分離、超遠心分離、ヌクレアーゼ処理、陰イオン交換クロマトグラフィーならびにタンジェンシャルフローろ過の工程を含んでよい。
【００１４】
一方で、利用可能な技術の多くは、細胞抽出物の大規模な事前処理（密度勾配、クロマトグラフィー工程の前のヌクレアーゼと洗浄剤での処理を含む）を必要とするという欠点を有する。このような追加的処理は、プロセス全体を工業規模では不十分なものにする。
【００１５】
Ｂｒｕｍｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（「Ａ  Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ａｎｄ  Ｓｃａｌａｂｌｅ  Ｔｗｏ−Ｓｔｅｐ  Ｉｏｎ−Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ−２  ａｎｄ  −５」；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ；Ｖｏｌ．６，  Ｎｏ．５；２００２）は、陽イオン交換クロマトグラフィーの工程に続いて陰イオン交換クロマトグラフィーの工程を含む、ｒＡＡＶ２またはｒＡＡＶ５の精製のための二段階クロマトグラフィーのプロセスを教示する。
【００１６】
しかし、適正製造規範の事項に関してスケールアップでき、依然として経済的観点から許容でき、医薬としての使用または遺伝子治療に好適である、新規の方法が依然として必要とされている。
【００１７】
また、前記プロセスによってさらに精製でき、所与の宿主細胞におけるｒＡＡＶ粒子の産生に依然として好適である、それ自体としての、および／または医薬としての使用もしくは遺伝子治療のための、新規の精製されたｒＡＡＶ粒子およびその組成物も依然として必要とされている。
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞から事前に取得された出発材料の深層ろ過を行う工程であって、前記出発材料が、細胞溶解物および培養上清を含む群において選択される、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）ｒＡＡＶ含有清澄化組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第１の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第２の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに少なくとも１回供する工程であって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｄ）第２のｒＡＡＶ濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、
を含む方法に関する。
【００１９】
本発明はまた、上述される方法の実施によって得られる精製されたｒＡＡＶ粒子にも関する。本発明はさらに、上記で定義されるような精製されたｒＡＡＶ粒子を少なくとも１つ含む、精製されたｒＡＡＶ粒子の組成物に関する。
【００２０】
本発明はさらに、遺伝子治療に使用するための、および／または遺伝子治療に使用するための医薬の調製のための、前記精製されたｒＡＡＶ粒子およびその組成物に関する。
【００２１】
本発明はまた、ヒトＰＤＥ６βをコードする発現カセットを含むＡＡＶプラスミド、ならびに前記ＡＡＶプラスミドでトランスフェクトされた宿主細胞、さらには前記宿主細胞によって産生されるｒＡＡＶ粒子にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】ヒトＰＤＥ６βをコードするＡＡＶプラスミドの発現カセットの地図。ヒトＰＤＥ６βタンパク質をコードする核酸配列は、その５’末端でヒトロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーターに、その３’末端でウシ成長ホルモンポリアデニル化部位（ｂＧＨｐＡ）につながっており、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列に挟まれている。
【図１Ｂ】ヒトＲＰＥ６５をコードするＡＡＶプラスミドの発現カセットの地図。ヒトＲＰＥ６５タンパク質をコードする核酸配列は、その５’末端でヒトＲＰＥ６５プロモーターに、その３’末端でウシ成長ホルモンポリアデニル化部位（ｂＧＨｐＡ）につながっており、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列に挟まれている。
【図２】ヒトＰＤＥ６βをコードする発現カセットを含むＡＡＶプラスミド全体の地図。発現カセットは、図１で定義されるようなＩＴＲ配列によって区切られている。制限部位は、ＥｃｏＲＶ、ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩと定義されている。プラスミドは、カナマイシン（Ｋａｎ／ｎｅｏＲ）耐性マーカーおよびＣｏｌ１開始点をさらに含む。配列の方向は、標準的な命名法に従って矢印で示されている。
【図３Ａ】ｒＡＡＶ−５含有調製物からの第１の陰イオン交換クロマトグラフィー工程に該当する溶出相のクロマトグラフィープロファイル。曲線は２８０ｎｍ（Ａの線）および２６０ｎｍ（Ｂの線）における吸光度（左側の軸（ｍＡＵ））を表す。線Ｃは伝導率（ｍＳ／ｃｍ）を表す。空の四角は、ＡＡＶが溶出される箇所を示す。
【図３Ｂ】ｒＡＡＶ−５含有調製物からの第２の陰イオン交換クロマトグラフィー工程に該当する溶出相のクロマトグラフィープロファイル。曲線は２８０ｎｍ（Ａの線）および２６０ｎｍ（Ｂの線）における吸光度（左側の軸（ｍＡＵ））を表す。線Ｃは伝導率（ｍＳ／ｃｍ）（右側の軸）を表す。空の四角は、ＡＡＶ含有画分が溶出される箇所を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は前述の必要性に対処する。
【００２４】
本発明は、（１）種々のＡＡＶ血清型／カプシドバリアントの高純度精製に使用でき、そのままで臨床用途に好適である調製物を作製するのに適している、モジュール式プラットフォームプロセス；および（２）直線的な塩勾配を用いて実施される、少なくとも２つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含む、独特な順序のプロセスの工程；という、本発明を現在の「工業規格の」拡張可能なＡＡＶ粒子精製プロセスと区別する２つの独特な特徴を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の精製方法を提供する。
【００２５】
驚くべきことに、これらの特徴は、細胞溶解物または培養上清などの出発材料の精製に関して、予想外の拡張性をもたらす。特に、このプロセスは、最適な感染性を有し遺伝子治療に適している精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子を調製するためのｐＨの最適化に適しているという利点を有する。
【００２６】
いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、ｒＡＡＶ調製物のための所与の陰イオン交換クロマトグラフィー担体の選択性は、通過する生成物の品質に依存し、従って、よりきれいな生成物は、担体上における、より良好な化合物の分離をもたらすことになると発明者等は考えている。従って、２つ以上の、好ましくは連続した、陰イオンクロマトグラフィー工程の使用は、前記担体上における最適な化合物の分離をもたらすことになり、従って、改善された様式でｒＡＡＶ粒子を単離するのに適している。
【００２７】
有利なことに、組成物は、直線的な塩勾配を用いて陰イオン交換クロマトグラフィー担体上で溶出される。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、直線的な塩勾配は、段階的な塩勾配と比較して、より効率的な溶出種の分離をもたらすとも発明者等は考えている。その差は、より小さな勾配の傾きにあり、これが、塩濃度の穏やかな増加の形成を可能にし、従って、クロマトグラフィー担体内でのｒＡＡＶ粒子の最適な分離を可能にする。
【００２８】
発明者等の知る限り、これは、直線的な塩勾配を用いる二段階陰イオン交換クロマトグラフィーを伴う、臨床グレードのｒＡＡＶ粒子（特にＡＡＶ４および／またはＡＡＶ５の血清型に属するｒＡＡＶ粒子）を精製するための、初めて説明される「工業規格の」方法である。
【００２９】
また、プロセス終了時の残留ＤＮＡは、洗浄剤とヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅを含む）での処理を行わなくても、臨床基準に合致する。
【００３０】
従って、本発明は、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法に関し、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびアカゲザル由来血清型（ＡＡＶｒｈ１０を含む）ならびにそれらの混合物を含む群またはそれらからなる群において選択されるＡＡＶ血清型（特にＡＡＶ４およびＡＡＶ５、最も好ましくはＡＡＶ５）に属するｒＡＡＶ粒子を精製するのに特に適している。
【００３１】
第１の実施形態によれば、本発明は、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞から事前に取得された出発材料の深層ろ過を行う工程であって、前記出発材料が、細胞溶解物および培養上清を含む群において選択される、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）ｒＡＡＶ含有清澄化組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第１の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第２の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに少なくとも１回供する工程であって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｄ）第２のｒＡＡＶ濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、
を含む方法に関する。
【００３２】
出発材料は、ＡＡＶ４および／またはＡＡＶ５の血清型に属するｒＡＡＶ粒子を含め、１つの血清型に属するｒＡＡＶ粒子または複数の血清型に属するｒＡＡＶ粒子のいずれかを含んでよい。
【００３３】
代替的な実施形態によれば、本発明は、精製されたＡＡＶ４血清型の組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞から事前に取得された出発材料の深層ろ過を行う工程であって、前記出発材料が、細胞溶解物および培養上清を含む群において選択される、それによりｒＡＡＶ４含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）ｒＡＡＶ４含有清澄化組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ４含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第１の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ４濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）第１のｒＡＡＶ４濃縮組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ４含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第２の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに少なくとも１回供する工程であって、それにより第２のｒＡＡＶ４濃縮組成物が提供される工程と、
（ｄ）第２のｒＡＡＶ４濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製されたＡＡＶ４血清型の組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、
を含む方法に関する。
【００３４】
別の代替的な実施形態によれば、本発明は、精製されたＡＡＶ５血清型の組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞から事前に取得された出発材料の深層ろ過を行う工程であって、前記出発材料が、細胞溶解物および培養上清を含む群において選択される、それによりｒＡＡＶ５含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）ｒＡＡＶ５含有清澄化組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ５含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第１の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ５濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）第１のｒＡＡＶ５濃縮組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ５含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第２の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに少なくとも１回供する工程であって、それにより第２のｒＡＡＶ５濃縮組成物が提供される工程と、
（ｄ）第２のｒＡＡＶ５濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製されたＡＡＶ５血清型の組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、
を含む方法に関する。
【００３５】
本発明の精製されたｒＡＡＶ粒子は、所望の遺伝子産物をコードする異種核酸を含む。このような産物には、限定されるものではないが、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、リボザイム等が包含される。他の産物には、ホルモン、増殖受容体、リガンド、および遺伝子治療に有用なタンパク質、をコードする核酸が包含される。
【００３６】
第２の実施形態によれば、本発明は、上記で説明されるような方法の実施によって得られる精製されたｒＡＡＶ粒子、およびその組成物に関する。
【００３７】
第３の実施形態によれば、本発明は、遺伝子治療に使用するための、前記精製されたｒＡＡＶ粒子およびその組成物に関する。
【００３８】
第４の実施形態によれば、本発明は、ヒトＰＤＥ６βをコードする発現カセットを含むＡＡＶプラスミド、前記ＡＡＶプラスミドでトランスフェクトされた宿主細胞、および前記宿主細胞によって産生されるｒＡＡＶ粒子（それ自体、ならびに遺伝子治療に使用するためのもの）に関する。
【００３９】
本発明によれば、「工程を含む」などにおける「含む」なる表現は、「工程からなる」などにおける「からなる」とも理解される。
【００４０】
精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子を得るための方法
本発明は、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞から事前に取得された出発材料の深層ろ過を行う工程であって、前記出発材料が、細胞溶解物および培養上清を含む群において選択される、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）ｒＡＡＶ含有清澄化組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第１の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第２の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに少なくとも１回供する工程であって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｄ）第２のｒＡＡＶ濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、
を含む方法に関する。
【００４１】
一部の実施形態によれば、方法は、洗浄剤および／またはヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅを含む）での処理の工程を含まない。
【００４２】
一部の他の実施形態によれば、方法は、洗浄剤および／またはヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅを含む）での処理の工程を含む。
【００４３】
一実施形態によれば、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびアカゲザル由来血清型（ＡＡＶｒｈ１０を含む）ならびにそれらの混合物を含む群において選択されるＡＡＶ血清型（特にＡＡＶ４およびＡＡＶ５、最も好ましくはＡＡＶ５）に属する。
【００４４】
一実施形態によれば、ｒＡＡＶ粒子は、ヒトＰＤＥ６βまたはヒトＲＰＥ６５をコードする発現カセットを含むＤＮＡを含むｒＡＡＶ粒子からなる。
【００４５】
本発明に適している発現カセットの例は、以下でさらに開示される。
【００４６】
特定の一実施形態によれば、ｒＡＡＶ粒子は、ヒトＰＤＥ６βをコードする発現カセットを含むＤＮＡを含むｒＡＡＶ５粒子からなる。
【００４７】
前記実施形態によれば、前記発現カセットは配列番号１のものである。
【００４８】
一実施形態によれば、ｒＡＡＶ５粒子は、配列番号２を含むＤＮＡを含む。
【００４９】
特定の一実施形態によれば、ｒＡＡＶ粒子は、ヒトＲＰＥ６５をコードする発現カセットを含むＤＮＡを含むｒＡＡＶ４粒子からなる。
【００５０】
「組換えＡＡＶビリオン」、「ｒＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶ粒子」、「完全なカプシド」および「完全な粒子」なる用語は、本明細書では、両側にＡＡＶのＩＴＲが隣接している目的の異種ヌクレオチド配列をカプシドで包んでいる、ＡＡＶのタンパク質の殻を含む感染性の複製欠損ウイルスと定義される。ｒＡＡＶビリオンは、その中にＡＡＶヘルパー機能およびアクセサリー機能が導入された、ＡＡＶプラスミドを指定する配列を有している好適な宿主細胞において産生される。このようにして、宿主細胞は、ＡＡＶプラスミド（目的の組換えヌクレオチド配列を含む）を後の遺伝子送達のための感染性組換えビリオン粒子にパッケージングするのに必要とされるＡＡＶのポリペプチドをコードすることができるようになる。
【００５１】
「組換えウイルス」は、例えば粒子内への異種核酸コンストラクトの添加または挿入によって、遺伝学的に改変されているウイルスを意味する。
【００５２】
「ＡＡＶビリオン」は、野生型（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子（ＡＡＶカプシドタンパク質外被と結合した直線状の一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含む）など、完全なウイルス粒子を意味する。この点に関して、相補的センス（例えば、「センス」鎖または「アンチセンス」鎖）のいずれかの一本鎖ＡＡＶ核酸分子が、任意の１つのＡＡＶビリオンにパッケージングされてよく、両方の鎖は、同等に感染性である。
【００５３】
「宿主細胞」なる用語は、例えば、ＡＡＶヘルパーコンストラクト、ＡＡＶプラスミド、アクセサリー機能プラスミドまたは他の導入ＤＮＡの一時的または永久的な安定産生細胞株レシピエントとして使用できるか使用されている微生物、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を意味する。この用語には、トランスフェクトされた最初の細胞の子孫が包含される。従って、本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は一般に、外因性のＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指す。１つの親細胞の子孫は、天然の、偶然の、または意図的な変異に起因して、形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡの相補物が必ずしも元の親と完全に同一であるわけではない可能性があるということが理解される。
【００５４】
「ｒＡＡＶ含有清澄化組成物」なる用語は、細胞溶解物または培養上清などの出発材料の深層ろ過の工程の後に得られる、ｒＡＡＶ粒子を含む任意の組成物を包含する。「ｒＡＡＶ含有清澄化組成物」は、「ｒＡＡＶ濃縮組成物」および／または精製されたｒＡＡＶ粒子とは異なる。
【００５５】
従って、「ｒＡＡＶ含有清澄化組成物」は、深層ろ過された出発材料（細胞溶解物または培養上清など）から直接得られる、濃縮および／または精製の工程にさらに供されていない、ｒＡＡＶ粒子を含む任意の組成物（イオン（例えば陽イオン）交換クロマトグラフィーの工程にさらに供されていないものを含む）を包含してよい。
【００５６】
前記実施形態によれば、本発明は、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、
（ａ）細胞溶解物および／または培養上清の深層ろ過を行う工程であって、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）ｒＡＡＶ含有清澄化組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第１の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第２の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに少なくとも１回供する工程であって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｄ）第２のｒＡＡＶ濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、
を含む方法に関する。
【００５７】
別の実施形態によれば、本発明は、本発明の精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、第１の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに供されるｒＡＡＶ含有清澄化組成物が、工程（ａ）の終了時に直接得られる組成物である、方法に関する。従って、前記実施形態によれば、工程（ａ）と工程（ｂ）は、連続した工程である。
【００５８】
「連続した工程」は、クロマトグラフィー（特にイオン（陽イオン）交換クロマトグラフィー）のステップという中間工程は除外される、第１の工程の後に来る任意の工程を意味する。一方、別段の記載がない限り、「連続した工程」は、前記組成物の緩衝液の条件（すなわち、塩濃度、ｐＨ）を改変することを目的とした、緩衝液の交換および／または希釈の工程を除外しない。
【００５９】
一実施形態によれば、本発明の方法は、陽イオン交換クロマトグラフィーの工程を含まない。
【００６０】
一実施形態によれば、本発明の方法は、アパタイトクロマトグラフィーの工程を含まない。
【００６１】
好ましい一実施形態によれば、本発明は、本発明の精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、陰イオン交換クロマトグラフィーの工程が、連続した工程である、方法に関する。従って、前記実施形態によれば、工程（ｂ）と工程（ｃ）は、連続した工程である。
【００６２】
別の実施形態によれば、工程（ｃ）と工程（ｄ）は連続している。
【００６３】
別の実施形態によれば、工程（ｂ）と工程（ｃ）と工程（ｄ）は連続している。
【００６４】
別の実施形態によれば、工程（ａ）と工程（ｂ）と工程（ｃ）は連続している。
【００６５】
別の実施形態によれば、工程（ａ）と工程（ｂ）と工程（ｃ）と工程（ｄ）は連続している。
【００６６】
前記実施形態によれば、本発明は、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞から事前に取得された出発材料の深層ろ過を行う工程であって、前記出発材料が、細胞溶解物および培養上清を含む群において選択される、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られたｒＡＡＶ含有清澄化組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第１の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第２の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに少なくとも１回供する工程であって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた第２のｒＡＡＶ濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、
を含む方法に関する。
【００６７】
別の実施形態によれば、工程（ａ）と工程（ｂ）と工程（ｃ）と工程（ｄ）は連続しており、工程（ａ）における出発材料は、細胞溶解物または培養上清から直接得られる。
【００６８】
前記実施形態によれば、本発明は、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法であって、
（ａ）細胞溶解物および／または培養上清の深層ろ過を行う工程であって、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られたｒＡＡＶ含有清澄化組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第１の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第２の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに少なくとも１回供する工程であって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた第２のｒＡＡＶ濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）が提供される工程と、
を含む方法に関する。
【００６９】
上述の方法は全て、少なくとも（１）１回の出発材料の深層ろ過の工程、（２）第１の陰イオン交換クロマトグラフィーの工程、（３）第２の陰イオン交換クロマトグラフィーの工程、および（４）タンジェンシャルフローろ過の工程を含む。個々の工程はそれぞれ、以下でさらに定義される。
【００７０】
追加的工程はそれぞれ、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子の拡張性および高純度に寄与するとも発明者等は考えている。
【００７１】
深層ろ過
深層ろ過の工程は、混入したＤＮＡおよびタンパク質の大部分を排除することを可能にする。この工程は、ｒＡＡＶ含有清澄化組成物から直接、陰イオン交換クロマトグラフィーによってｒＡＡＶ粒子を精製することを可能にする。
【００７２】
一実施形態によれば、工程（ａ）で使用される出発材料は、ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞の培養物を、少なくとも洗浄剤または界面活性剤（好ましくは洗浄剤）を含む組成物と接触させることによって得られる細胞溶解物である。
【００７３】
一実施形態によれば、工程（ａ）で使用される出発材料は、ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞の培養物を、洗浄剤または界面活性剤を含んでも含まなくてもよい組成物と接触させることによって得られる細胞溶解物であるが、この細胞溶解物は、ＤＮＡｓｅなどのヌクレアーゼで処理されない。
【００７４】
細胞溶解のための好適な洗浄剤の例としては、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、ＮＰ−４０、Ｂｒｉｊ−３５、Ｂｒｉｊ−５８、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳおよびＣＨＡＰＳＯが挙げられる。
【００７５】
好ましい一実施形態によれば、工程（ａ）は、ホウケイ酸ガラスのマイクロファイバーの層とセルロースの混合エステルの層とを含むデプスフィルター膜を用いて行われる。
【００７６】
例示的な一実施形態によれば、工程（ａ）は、Ｐｏｌｙｓｅｐ（商標）  ＩＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））フィルターを用いて行われる。
【００７７】
陰イオン交換クロマトグラフィー
本発明で使用するための好適な陰イオン交換体がいくつか知られており、これらには、限定されるものではないが、ＭＡＣＲＯ  ＰＲＥＰ  Ｑ（ＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能な強力な陰イオン交換体）、ＵＮＯＳＰＨＥＲＥ  Ｑ（ＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能な強力な陰イオン交換体）、ＰＯＲＯＳ  ５０ＨＱ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能な強力な陰イオン交換体）、ＰＯＲＯＳ  ５０Ｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能な弱い陰イオン交換体）、ＰＯＲＯＳ  ５０ＰＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能な弱い陰イオン交換体）、ＳＯＵＲＣＥ  ３０Ｑ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｎ．Ｊ．）から入手可能な強力な陰イオン交換体）、ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）から入手可能な弱い陰イオン交換体）、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）から入手可能な強力な陰イオン交換体）、Ｃａｐｔｏ  ＱおよびＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｎ．Ｊ．）が包含される。
【００７８】
一部の実施形態によれば、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法は、３つ以上の陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含み、これには、特に３つまたは４つの陰イオンクロマトグラフィー工程が包含される。方法が３つ以上の陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含む場合、前述の工程は、同種の担体上または異なる担体上で達成されてよい。
【００７９】
好ましい実施形態によれば、工程（ｂ）で使用されるクロマトグラフィー担体は、工程（ｃ）で使用されるクロマトグラフィー担体と同じである。
【００８０】
例示的な実施形態によれば、工程（ｂ）および／または工程（ｃ）におけるクロマトグラフィー担体は、モノリス型クロマトグラフィー担体である。
【００８１】
好適なモノリス型クロマトグラフィー担体の例は、当技術分野で公知であり、これらには、非限定的ではあるが、モノリス型カラムＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）  ＱＡ、ＣＩＭ（登録商標）  ＱＡ、ＣＩＭ  ＤＥＡＥおよびＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）  ＤＥＡＥ（Ｂｉａ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）が包含される。
【００８２】
クロマトグラフィーモノリスは、融合したマイクロメートルサイズのシリカの小球、またはクロマトグラフィーチューブ内で直接合成できる有機ポリマー、でできた一体型の多孔質固体である。このおかげで、この担体は、非常に耐久性があり、すぐに使用でき、パッケージパラメータ（package parameters）のばらつきがない。
【００８３】
モノリスは、相互につながっている流路（perfusion channel）からなる、連続した多孔質ベッドのマトリックスを有する均一なカラムである。これらの流路は、充填ベッド粒子を利用したクロマトグラフィーの典型的な孔径（５〜１００ｎｍ）と比較すると、比較的大きい（１〜５μｍ）。これの１つの利点は、接触可能な表面が大きいために、それが、ウイルスなどの巨大分子の潜在的結合容量を増加させるということである。これらの担体は、高流速および低いずり速度においてさえ、低い逆圧を生じさせる。
【００８４】
充填ベッドカラムと比較すると、モノリス型担体の向上した物質輸送は、巨大分子の効率的な分離をもたらす。
【００８５】
実用的観点からすると、これらのカラムの使用は、流速とは関係なく高い結合容量および良好な分解能を伴いつつ、充填ベッドカラムと比較して高流速でウイルス産物（それが細胞溶解物である場合でも）を扱うことを可能にする。これらの担体の高分解能は、精製工程の削減およびプロセス全体の拡張性に寄与する。
【００８６】
一部の実施形態によれば、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）（血清型４または５に属するｒＡＡＶ粒子など）を得るための方法は、モノリス型クロマトグラフィー担体上における２つまたは３つの陰イオンクロマトグラフィー工程に続いて、以下でさらに説明されるようなタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）の工程を含む。
【００８７】
陰イオン交換カラムはまず、標準的な緩衝液を用いて、製造業者の仕様書に従って平衡化される。例えば、カラムは、例えば５〜５０ｍＭの、好ましくは７〜２０ｍＭ（２０ｍＭなど）の、Ｔｒｉｓ緩衝液で平衡化されてよい。次に、サンプルがロードされ、２種類の溶出緩衝液（１種類の低塩濃度緩衝液および１種類の高塩濃度緩衝液）が使用される。
【００８８】
塩勾配を生じさせる低塩濃度緩衝液と高塩濃度緩衝液の漸進的混合（progressive mix）に沿って画分が回収され、それらの画分において、溶出された物質が標準的な技術（２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収のモニタリングなど）を用いて検出される。陰イオン交換体を用いる場合、低塩濃度の溶出液に由来するタンパク質のピークはＡＡＶの空のカプシドを含み、高塩濃度の画分はＡＡＶ粒子を含む。
【００８９】
特に、陰イオン交換カラム上において、ＡＡＶ粒子は、約ｐＨ５〜ｐＨ１２の、好ましくはｐＨ６〜ｐＨ１０の、さらに好ましくはｐＨ７〜ｐＨ９．５（ｐＨ７．１、７．２、７．３、７．４〜８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５〜９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５など）のｐＨの、または上記の範囲内の任意のｐＨの、適切な緩衝液を用いてさらに精製されてよい。
【００９０】
陰イオン交換カラムで使用するための適切な緩衝液は、当技術分野で周知であり、一般的には陽イオン性または双性イオン性である。このような緩衝液には、限定されるものではないが、以下の緩衝イオンを有する緩衝液が包含される：Ｎ−メチルピペラジン、ピペラジン、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、トリエタノールアミン、Ｔｒｉｓ、Ｎ−メチルジエタノールアミン、１，３−ジアミノプロパン、エタノールアミン、酢酸等。サンプルを溶出するために、適切なｐＨで塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸塩、ギ酸塩または酢酸塩など）を用いて開始緩衝液のイオン強度が高められる。
【００９１】
有利なことに、陰イオン交換クロマトグラフィーの間、前または後に使用される緩衝液は全て、緩衝液組成物の総体積の０．０００１％〜０．１％（ｖ／ｖ）の範囲の量で非イオン性界面活性剤（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）  Ｆ−６８（Ｇｉｂｃｏ））を含み、当該量には、緩衝液組成物の総体積の０．０００５％〜０．００５％（ｖ／ｖ）の範囲の量が包含され、当該量には、緩衝液組成物の総体積の０．００１％（ｖ／ｖ）が包含される。
【００９２】
上記で定義されるような、および他の工程における、非イオン性界面活性剤の使用はさらに、方法の効率および拡張性に寄与する。特に、上記で定義されるような、非イオン性界面活性剤の使用は、精製の前、間および後に、ｒＡＡＶ粒子の凝集または接着を防止する。
【００９３】
使用される樹脂（すなわち、強力な、または弱い、イオン交換体）の性質ならびに、塩濃度、使用される緩衝液およびｐＨについての条件は、ＡＡＶカプシドバリアント（すなわち、ＡＡＶカプシドの血清型または偽型）によって異なるであろう。公知のＡＡＶカプシドバリアントは全て、サイズおよび形状などの特徴が共通しているが、分子トポロジーおよび表面電荷分布という細部において異なる。従って、全てのカプシドバリアントが、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製に適していると予想され、妥当な方法は、クロマトグラフィーの樹脂および緩衝液のスクリーニング実験を用いて体系的に決定できるが、効率的なＡＡＶ粒子の精製を達成するには、ＡＡＶカプシドバリアントごとに異なる条件が必要となるであろう。このような条件の決定は、当業者には明白である。
【００９４】
有利なことに、工程（ａ）の終了時に、ｒＡＡＶ含有清澄化組成物のｐＨは、工程（ｂ）で使用されるクロマトグラフィー担体上におけるｒＡＡＶ粒子の最適な保持を確実にするために、塩基性のｐＨに調整される。
【００９５】
クロマトグラフィー担体への結合のために工程（ｂ）または工程（ｃ）で使用されるｐＨは、好ましくは、溶出中に使用されるｐＨよりも高い。
【００９６】
好ましくは、クロマトグラフィー担体上における溶出のｐＨは、精製されるｒＡＡＶ粒子に応じて調整される。最適ｐＨでの溶出は、所与のベクターの最適な感染力を維持するという利点を有する。
【００９７】
特定の実施形態によれば、工程（ａ）の終了時に、ｒＡＡＶ含有清澄化組成物の最適ｐＨは、ｐＨ８に調整される。
【００９８】
特定の実施形態によれば、工程（ｂ）または工程（ｃ）におけるクロマトグラフィー担体へのｒＡＡＶ粒子の結合のための最適ｐＨは、溶出に使用される最適ｐＨよりも高い。
【００９９】
例示的な実施形態によれば、結合のための最適ｐＨは、溶出に使用されるｐＨよりも約０．５〜１ｐＨ単位高いｐＨである。
【０１００】
従って、工程（ｂ）または工程（ｃ）におけるクロマトグラフィー担体からのｒＡＡＶ粒子の溶出（特に、ｒＡＡＶ５粒子の溶出）は、ｐＨ８に調整されてよい。
【０１０１】
前記実施形態によれば、クロマトグラフィー担体へのｒＡＡＶ粒子の結合は、ｐＨ８．５に調整されてよい。
【０１０２】
陰イオン交換カラムで使用するための適切な緩衝液は、当技術分野で周知であり、一般的には陽イオン性または双性イオン性である。このような緩衝液には、限定されるものではないが、以下の緩衝イオンを有する緩衝液が包含される：Ｎ−メチルピペラジン、ピペラジン、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、トリエタノールアミン、Ｔｒｉｓ、Ｎ−メチルジエタノールアミン、１，３−ジアミノプロパン、エタノールアミン、酢酸等。サンプルを溶出するために、適切なｐＨで塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸塩、ギ酸塩または酢酸塩など）を用いて開始緩衝液のイオン強度が高められる。
【０１０３】
特に、クロマトグラフィー担体上における溶出は、直線的な塩勾配を用いて行われる。塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸塩、ギ酸塩および酢酸塩からなる群より選択されてよく、好ましくはＮａＣｌであってよい。
【０１０４】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、溶出工程に一般的に使用される塩濃度よりも低い塩濃度で担体または陰イオン交換カラムを処理する第１の工程を含んでよい。このような処理は、本明細書では「第１のプレ溶出」工程と呼称されることもある。
【０１０５】
従って、本発明の一実施形態では、陰イオン交換カラムはまず、低塩濃度（例えば、１０〜１００ｍＭの塩；特に１０〜１００ｍＭのＮａＣｌ；１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５〜１００ｍＭ、またはこれらの範囲内の任意の濃度など）で処理される。例えば、「第１のプレ溶出工程」における塩濃度は、最初は、ロード後にｒＡＡＶ粒子をカラムに結合させるために使用される緩衝液の塩濃度と一致してよい。
【０１０６】
最初の処理の後、次に、不純物を溶出させるために、より高いＮａＣｌ濃度など、より高い塩濃度で、またはより大きなイオン強度を有する別の緩衝液で、カラムが処理される。第２の緩衝液としての使用の一例は、酢酸ナトリウム緩衝液またはＴｒｉｓ系緩衝液である。この追加的工程はまた、本明細書では「第２のプレ溶出」工程と呼称されることもある。この場合、塩濃度は、カラムからＡＡＶ粒子を溶出させない程度に十分に低いままであるように注意される可能性がある。
【０１０７】
さらなる不純物をカラムから溶出させた後、次に、溶出工程において、より高い塩濃度を用いてＡＡＶ粒子を回収できる。
【０１０８】
「直線的な塩勾配の傾き」なる用語は、直線的勾配の２つの点（Ａ，Ｂ）の間の傾きを指し、以下の式に従って、クロマトグラフィー担体中の塩濃度および経時的に溶出されるカラム体積（ＣＶ）の両方に依存する。
傾き（Ａ，Ｂ）＝（Ｂにおける塩濃度−Ａにおける塩濃度）／（Ｂにおけるカラム体積−Ａにおけるカラム体積）
【０１０９】
従って、直線的な塩勾配の傾きは、Ｍ／ＣＶまたはｍＭ／ＣＶで表すことができ、好ましくは、標準的なプロトコルに従った緩やかな塩勾配である。
【０１１０】
一実施形態によれば、工程（ｃ）における直線的な塩勾配の傾きは、工程（ｂ）における直線的な塩勾配の傾きと等しいか、それよりも小さい。
【０１１１】
一実施形態によれば、工程（ｃ）における直線的な塩勾配の傾きは、工程（ｂ）における直線的な塩勾配の傾きの約半分であるか、それよりも小さい。従って、工程（ｃ）における直線的な塩勾配の傾きは、工程（ｂ）における直線的な塩勾配の傾きの１〜７０％の範囲であってよく、これには、工程（ｂ）における直線的な塩勾配の傾きの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０％が包含される。
【０１１２】
一実施形態によれば、工程（ｂ）における傾きは、０．１Ｍ／ＣＶ以下であり、特に０．０１５〜０．０９Ｍ／ＣＶの範囲である。
【０１１３】
一実施形態によれば、工程（ｃ）における傾きは、０．０７Ｍ／ＣＶ以下であり、特に０．０１〜０．０６Ｍ／ＣＶの範囲である。
【０１１４】
前記勾配は、同じプロセス中で有利に組み合わされてよい。
【０１１５】
従って、一実施形態によれば、工程（ｃ）における直線的な塩勾配の傾きは、工程（ｂ）における直線的な塩勾配の傾きと等しいか、それよりも小さく、ここで、工程（ｂ）における傾きは０．１Ｍ／ＣＶ以下であり、工程（ｃ）における傾きは０．０７Ｍ／ＣＶ以下である。
【０１１６】
一実施形態によれば、（Ｎ＋１）回目の陰イオン交換クロマトグラフィー工程の直線的な塩勾配の傾きは、Ｎ回目の陰イオン交換クロマトグラフィー工程の直線的な塩勾配の傾きと等しいか、それよりも小さくてよく、ここで、Ｎ回目の陰イオン交換クロマトグラフィー工程の傾きは０．１Ｍ／ＣＶ以下であり、（Ｎ＋１）回目の陰イオン交換クロマトグラフィー工程の傾きは０．０７Ｍ／ＣＶ以下である。
【０１１７】
例示的な一実施形態によれば、工程（ｂ）における溶出は、５０ｍＭのＮａＣｌから０．５ＭのＮａＣｌまでというＮａＣｌの塩勾配をカラム体積の５〜３０倍（好ましくはカラム体積の１０〜２０倍）の範囲の勾配体積（gradient volume）で用いることによって行われる。
【０１１８】
例示的な一実施形態によれば、工程（ｃ）における溶出は、５０ｍＭのＮａＣｌから０．３５ＭのＮａＣｌまでというＮａＣｌの塩勾配をカラム体積の５〜３０倍（好ましくはカラム体積の１０〜２０倍）の範囲の勾配体積で用いることによって行われる。
【０１１９】
一実施形態によれば、工程（ｃ）において、第１のｒＡＡＶ濃縮組成物は、少なくとも２回の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに供され、これには、２回以上の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップが包含され、これには、複数回の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップが包含される。従って、特定の一実施形態によれば、工程（ｃ）において、第１のｒＡＡＶ濃縮組成物は、２回の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに供されてよく、これには、２回、３回もしくは４回または５回以上のクロマトグラフィーのステップが包含される。
【０１２０】
有利なことに、該方法は、少なくとも１回の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップの前または後にｒＡＡＶ濃縮組成物の希釈という追加的工程を含んでよい。希釈の工程は、例えば、緩衝液の交換の工程の形態であってよい。
【０１２１】
前記実施形態によれば、工程（ｃ）で行われる陰イオン交換クロマトグラフィーのステップのそれぞれは、同一であっても異なっていてもよい。好ましくは、工程（ｃ）で行われる陰イオン交換クロマトグラフィーのステップのそれぞれは、工程（ｂ）における直線的な塩勾配の傾きと等しいかそれよりも小さい傾きを有する直線的な塩勾配を用いて行われる。
【０１２２】
工程（ｃ）において２回以上の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップが行われる場合、個々の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップのそれぞれについての直線的な塩勾配の傾きは、同一であっても異なっていてもよい。
【０１２３】
従って、一実施形態によれば、１回目の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップは、５０ｍＭのＮａＣｌから０．３５ＭのＮａＣｌまでというＮａＣｌの塩勾配をカラム体積の５〜３０倍（好ましくはカラム体積の１０〜２０倍）の範囲の勾配体積で用いることによって行われる。次に、２回目の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップは、５０ｍＭのＮａＣｌから０．３５ＭのＮａＣｌまでというＮａＣｌの塩勾配をカラム体積の５〜３０倍（好ましくはカラム体積の１０〜２０倍）の範囲の勾配体積で用いることによって行われる。
【０１２４】
好ましい一実施形態によれば、工程（ｂ）の終了時に、第１のｒＡＡＶ濃縮組成物は、工程（ｃ）の実施のために使用するまで凍結された形態で保存される。
【０１２５】
タンジェンシャルフローろ過およびその後の工程
タンジェンシャルフローろ過は、フィルターの細孔を介した濃縮とダイアフィルトレーションのサイクルによって小さな粒子関連の不純物を排除することを可能にする洗練工程である。この洗練工程は、溶出画分の緩衝液の変更およびＡＡＶの濃縮に適しているという別の利点を有する。
【０１２６】
タンジェンシャルフローろ過は、好ましくは、フィルターとして中空糸フィルターを用いて達成される。
【０１２７】
一実施形態によれば、工程（ｄ）は、１５０ｋＤａ以下（特に５０ｋＤａ〜１５０ｋＤａの範囲）の分子量カットオフ値を有するフィルター膜を用いて行われる。
【０１２８】
当業者であれば、精製されるｒＡＡＶ粒子のタイプ、溶出の条件、および特に溶出のｐＨ、に応じて分子量カットオフが調整されなければならないということを理解するであろう。
【０１２９】
一部の実施形態によれば、塩および／または洗浄剤および／または界面活性剤および／またはヌクレアーゼが、タンジェンシャルフローろ過の間、前または後（特にタンジェンシャルフローろ過の間または前）に添加されてよい。
【０１３０】
一実施形態によれば、方法は、タンジェンシャルフローろ過の間、前または後に、洗浄剤および／またはヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅを含む）での処理の工程をさらに含んでよい。
【０１３１】
一実施形態によれば、工程（ｃ）または工程（ｄ）で得られる精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）は、追加的な勾配に供され、これは分画遠心法の工程を包含し、これは密度勾配を包含し、特に、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配遠心分離、イオジキサノール勾配遠心分離、スクロース勾配遠心分離から選択される。
【０１３２】
好ましい一実施形態によれば、方法は、前記追加的な勾配の後に、追加的なタンジェンシャルフローろ過の工程をさらに含んでよい。
【０１３３】
一実施形態によれば、工程（ｄ）で得られる精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）は、滅菌される。
【０１３４】
一実施形態によれば、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）は、０．２μｍ以下の孔径を有するフィルター膜による滅菌ろ過の工程に供される。
【０１３５】
従って、本発明はまた、上記で定義されるような方法の実施によって得られる精製されたｒＡＡＶ粒子にも関する。
【０１３６】
精製されたｒＡＡＶ粒子の特性評価
有利なことに、上述の方法は、遺伝子治療、および／または遺伝子治療のための医薬の調製、に適している精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るために用いることができる。
【０１３７】
好ましい一実施形態によれば、前記精製されたｒＡＡＶ粒子は、遺伝子治療に使用するのに適している。
【０１３８】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子調製物の純度はまた、臨床上の遺伝子導入の安全性および有効性の両方に関して重要な意味を有する。
【０１３９】
ｒＡＡＶ粒子を精製するために用いられる方法は、宿主細胞のタンパク質の混入の量および完全な粒子／全粒子の比という点で調製物の純度に劇的に影響し得る。
【０１４０】
ベクター粒子の濃度は、実施例１に示されるように、定量的ＰＣＲ（ゲノム含有粒子）またはＥＬＩＳＡ（全ベクター粒子）によって評価できる。
【０１４１】
調製物の純度は、最も一般的には、実施例１に示されるように、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって評価される。
【０１４２】
ウイルスの構造（カプシド）タンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に対応するバンドは染色後に可視化されてよく、それらのサイズおよび相対強度が、混入したタンパク質に対して評価される。参考までに、ＡＡＶ４およびＡＡＶ５の血清型に属するＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする核酸は、配列番号１０〜１５の配列のものである。
【０１４３】
ＡＡＶ４血清型に属するＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする核酸は、それぞれ配列番号１０〜１２の配列のものであってよい。
【０１４４】
ＡＡＶ５血清型に属するＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする核酸は、それぞれ配列番号１３〜１５の配列のものであってよい。
【０１４５】
上述の配列は、参考として提示されている。
【０１４６】
従って、「純度」なる用語は、一般的不純物が存在しないことを指す。純度は、パーセンテージとして表され、クマシーブルーで染色されたポリアクリルアミドゲルにおいて検出されるタンパク質の総量と比較したＶＰ１タンパク質、ＶＰ２タンパク質およびＶＰ３タンパク質の総量に関する。
【０１４７】
「一般的不純物」なる用語は、出発材料中に存在したが粒子関連の不純物とはみなされない不純物を指す。従って、一般的不純物は、宿主細胞に由来するがＡＡＶ粒子ではない不純物を包含する。
【０１４８】
「粒子関連の不純物」なる用語は、真正の組換えＡＡＶ粒子以外の全てのタイプのＡＡＶ粒子を指す。粒子関連の不純物には、空のＡＡＶカプシド（「空のもの（empties）」または「空の粒子」とも呼称される）、および意図される粒子ゲノム以外のポリヌクレオチド配列を含むＡＡＶ粒子（本明細書では「ＡＡＶのカプシドで包まれた核酸の不純物」または「ＡＡＶのカプシドで包まれたＤＮＡの不純物」とも呼称される）が包含される。
【０１４９】
残留ＤＮＡまたは宿主細胞のＤＮＡは、ｒＡＡＶ調製物中に混入物として存在し得る。残留ＤＮＡは悪影響を与え得るため、製造業者は、宿主細胞から得られる最終産物が含む残留ＤＮＡが必ず許容レベルであるようにしなければならない。
【０１５０】
残留ＤＮＡ試験は、実施例１で説明されるプロトコルを用いて、定量的ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲを含む）により評価できる。残留ＤＮＡは、１用量あたりのｎｇで表される。
【０１５１】
好ましくは、残留ＤＮＡは、ｑＰＣＲによって、既知量のＥ１ＡアンプリコンＤＮＡを用いて確立された検量線と比較して組成物中のＥ１ＡアンプリコンＤＮＡの相対量を決定することにより決定される。
【０１５２】
「用量」は、１×１０１２個のベクターゲノム（ｖｇ）に相当する調製物の量と定義される。
【０１５３】
有利なことに、本発明の組成物はさらに、それらの空のｒＡＡＶ粒子／完全なｒＡＡＶ粒子の比を特徴とし得る。
【０１５４】
「空のカプシド」および「空の粒子」なる用語は、ＡＡＶのタンパク質の殻を含むが、両側にＡＡＶのＩＴＲが隣接している目的の異種ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトの全体または一部を欠いている、ＡＡＶビリオンを指す。従って、空のカプシドは、目的の遺伝子を宿主細胞中に導入するようには機能しない。
【０１５５】
空のｒＡＡＶ粒子／完全なｒＡＡＶ粒子の比は、実施例１で説明されるプロトコルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより評価できる。
【０１５６】
感染性粒子の濃度はまた、実施例１で説明されるＩＣＡのプロトコルを用いて評価できる。
【０１５７】
従って、本発明の組成物は、上述の方法のうちのいずれか１つを用いた少なくとも１つの精製されたｒＡＡＶ粒子を含み、好ましくは、以下の特徴のうちの少なくとも１つを有する：
・９０％以上（好ましくは９９％超または１００％）の純度；
・１用量あたり５０ｎｇ以下の細胞性残留ＤＮＡの量。
【０１５８】
１用量あたり５０ｎｇ以下の細胞性残留ＤＮＡの量には、１用量あたり５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６または５ｎｇ以下が包含される。
【０１５９】
特に、本発明の組成物は、上述の方法のうちのいずれか１つを用いた少なくとも１つの精製されたｒＡＡＶ粒子を含み、以下の特徴を有する：
・９９％以上または１００％の純度；および
・１用量あたり１０ｎｇ以下の細胞性残留ＤＮＡの量
【０１６０】
最も好ましくは、組成物の純度は９９％超であり、これには１００％の純度が包含される。
【０１６１】
例示的な実施形態によれば、組成物は、上述の方法のうちの１つから直接得られる。
【０１６２】
一実施形態によれば、本発明の精製されたｒＡＡＶ粒子の組成物は、任意選択で非イオン性界面活性剤を追加されていてもよい、本発明に従って精製されたｒＡＡＶ粒子を含む眼用塩類溶液（Saline Ocular Solution）である。
【０１６３】
本発明に適している眼用塩類溶液は、ＢＤ  Ｍｅｄｉｃａｌから入手されてよい（例えばＢＤ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＳｏｌｕｔｉｏｎまたはＢＤ  Ａｑｕｅｏ  Ｐｒｅｍｉｕｍ（商標）など）。
【０１６４】
前記例示的な実施形態によれば、非イオン性界面活性剤は、好ましくはＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）  Ｆ−６８（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））である。
【０１６５】
非イオン性界面活性剤（すなわち、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）  Ｆ−６８）は、組成物の総体積の０．０００１％〜０．１％（ｖ／ｖ）の範囲の量で存在してよく、これには、組成物の総体積の０．０００５％〜０．００５％（ｖ／ｖ）の範囲の量が包含され、これには、組成物の総体積の約０．００１％（ｖ／ｖ）が包含される。
【０１６６】
投与用組成物および／または遺伝子治療に使用される組成物を含め、以下でさらに説明されるような本発明の組成物は、好ましくは無菌である。
【０１６７】
遺伝子治療に使用するためのｒＡＡＶ粒子
本発明はさらに、遺伝子治療に使用するための、および／または遺伝子治療に好適な医薬の調製に使用するための、精製された組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）を得るための方法に関する。
【０１６８】
有利なことに、このようなｒＡＡＶ粒子およびその組成物はまた、それ自体が、遺伝子治療のための使用および／または遺伝子治療に好適な医薬の調製のための使用に適している。
【０１６９】
「遺伝子治療」は、疾患の発生の可能性を処置および／または防止および／または低減するために核酸配列を個体に投与することを意味する。当技術分野では、いくつかのアプローチが提唱されている。上記を考慮すると、ｒＡＡＶ粒子は、処置される個体に前記核酸配列を送達するための媒体として使用される。
【０１７０】
疾患を引き起こす変異した遺伝子を健全な遺伝子のコピーで置き換える可能性がある。
【０１７１】
不適切に機能している変異した遺伝子を不活化（ノックアウト）する可能性がある。
【０１７２】
疾患の発生の可能性を処置および／または防止および／または低減するために新しい遺伝子を体内に導入する可能性がある。
【０１７３】
報告される方法およびプラスミドは、眼疾患（失明、より具体的には桿体特異的な欠損に起因する桿体錐体ジストロフィー、を含む）のための医薬の調製のための使用に特に効果的である。
【０１７４】
特に、前記疾患は、ホスホジエステラーゼ６（ＰＤＥ６）関連疾患（ＰＤＥ６β関連疾患を含む）および網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（Retinal Pigment Epithelium-specific 65 kDa protein）（ＲＰＥ６５）関連疾患から選択されてよい。
【０１７５】
ＲＰＥ６５関連疾患には、レーバー先天性黒内障および網膜色素変性症が包含される。ＰＤＥ６関連疾患には、桿体錐体ジストロフィーおよび網膜色素変性症が包含される。
【０１７６】
処置される個体には、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物が包含される。
【０１７７】
ＡＡＶ粒子およびその組成物は、局所投与または非経口投与されてよく、これには、眼窩内投与および眼内投与が包含される。さらに、眼内投与には、硝子体内投与、網膜下投与および角膜内投与が包含される。
【０１７８】
従って、前記ＡＡＶ粒子を含む組成物は、好ましくは、局所投与または非経口投与に適しており、これには、眼内投与（好ましくは硝子体内投与および網膜下投与）および角膜内投与が包含される。
【０１７９】
本発明のｒＡＡＶ粒子は、好ましくは、以下でさらに説明されるような、ヒトＰＤＥ６β遺伝子またはヒトＲＰＥ６５遺伝子をコードする発現カセット（それぞれ配列番号１および配列番号７の配列のもの）を含む。
【０１８０】
好ましい一実施形態によれば、精製されたｒＡＡＶ粒子は、本明細書で説明される方法のうちのいずれか１つを実施することによって得ることができる。精製されたｒＡＡＶ粒子の組成物は、前記精製されたｒＡＡＶ粒子のうちの少なくとも１つを含む。精製されたｒＡＡＶ粒子およびその組成物は、遺伝子治療のための使用に適している。
【０１８１】
ＡＡＶプラスミド
前記ｒＡＡＶ粒子の生産のためのＡＡＶプラスミドが、さらに開示される。
【０１８２】
感染性の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの構築は説明されている。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開第９２／０１０７０号（１９９２年１月２３日公開）および同第９３／０３７６９号（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  ８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５８：９７−１２９；ならびにＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１を参照のこと。
【０１８３】
「ＡＡＶプラスミド」は、限定されるものではないがＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７およびＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０ならびにアカゲザル由来血清型（ＡＡＶｒｈ１０を含む）を含む、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するプラスミドを意味する。ＡＡＶプラスミドは、ＡＡＶの野生型遺伝子のうちの１つ以上（好ましくはｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子）が全体的または部分的に欠失していてよいが、機能的なフランキングＩＴＲ配列を保持する。機能的なＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングに必要である。従って、ＡＡＶプラスミドは、本明細書では、少なくとも、ウイルスの複製およびパッケージングにｃｉｓに必要とされるこれらの配列（例えば、機能的なＩＴＲ）を含むと定義される。ＩＴＲは、野生型のヌクレオチド配列である必要はなく、その配列が機能的なレスキュー、複製およびパッケージングをもたらす限りにおいて、例えばヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更されてよい。また、「ＡＡＶ粒子」は、標的細胞の核への核酸の送達のための効果的な媒体を提供する、タンパク質の殻またはカプシドを意味する。
【０１８４】
好ましくは、前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ４またはＡＡＶ５から選択されるアデノ随伴ウイルスに由来する。
【０１８５】
「ＡＡＶヘルパー機能」は、発現してＡＡＶの遺伝子産物をもたらすことができ、次に当該遺伝子産物が増殖性のＡＡＶの複製のためにｔｒａｎｓに機能する、ＡＡＶ由来のコード配列を指す。従って、ＡＡＶヘルパー機能には、主要なＡＡＶのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であるｒｅｐおよびｃａｐの両方が包含される。Ｒｅｐの発現産物は、多くの機能（特に、ＡＡＶのＤＮＡ複製開始点の認識、結合およびニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；ならびにＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む）を有することが示されている。Ｃａｐの発現産物は、必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書では、ＡＡＶプラスミドが失っているＡＡＶ機能をｔｒａｎｓに補完するために用いられる。
【０１８６】
「ＡＡＶヘルパーコンストラクト」なる用語は、一般的には、目的のヌクレオチド配列の送達のための形質導入プラスミドを作製するために使用されるべきＡＡＶプラスミドから除去されたＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。ＡＡＶヘルパーコンストラクトは一般に、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子の一過性または安定な発現を提供してＡＡＶの複製に必要である失われたＡＡＶ機能を補完するために用いられる。しかし、ヘルパーコンストラクトは、ＡＡＶのＩＴＲを欠いており、自身を複製することもパッケージングすることもできない。ＡＡＶヘルパーコンストラクトは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはビリオンの形態であってよい。一般に使用されるプラスミドである、ＲｅｐおよびＣａｐの発現産物の両方をコードするｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐＩＭ２９＋４５など、いくつかのＡＡＶヘルパーコンストラクトが説明されている。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６３：３８２２−３８２８およびＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６５：２９３６−２９４５を参照のこと。Ｒｅｐおよび／またはＣａｐの発現産物をコードする、いくつかの他のプラスミドが説明されている。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号および同第６，３７６，２３７号を参照のこと。
【０１８７】
「トランスフェクション」なる用語は、細胞による外来性のＤＮＡの取り込みを指すために使用され、外因性のＤＮＡが細胞膜の内側に導入された場合、細胞は「トランスフェクトされ」ている。当技術分野では、いくつかのトランスフェクション技術が一般的に知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）  Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照のこと。このような技術を用いて、好適な宿主細胞内に１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を導入できる。
【０１８８】
「核酸」、「ヌクレオチド配列」または「ポリヌクレオチド配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列を指す。当該用語は、限定されるものではないが４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（beta-D-mannosylqueosine）、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル（uracil-5-oxyacetic acid methylester）、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン（oxybutoxosine）、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｂウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシンおよび２，６−ジアミノプリンなど、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基類似体のうちのいずれかを含む配列を包含する
【０１８９】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合にｉｎ  ｖｉｖｏで、転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）、核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列に対して３’側に転写終結配列が位置する可能性がある。
【０１９０】
ＤＮＡ「制御配列」なる用語は、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写および翻訳を集合的にもたらす、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン（upstream regulatory domain）、複製開始点、配列内リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサー等を集合的に指す。選択されたコード配列が適切な宿主細胞において複製、転写および翻訳されることが可能である限り、これらの制御配列の全てが常に存在する必要があるわけではない。「プロモーター」なる用語は、本明細書では、その通常の意味で使用され、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチドの領域を指し、ここで、この調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼと結合して下流（３−方向）のコード配列の転写を開始することが可能である遺伝子に由来する。転写プロモーターには、（そのプロモーターに機能可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現がアナライト、コファクター、調節タンパク質等によって誘導される）「誘導性プロモーター」、（そのプロモーターに機能可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現がアナライト、コファクター、調節タンパク質等によって誘導される）「抑制性プロモーター」および「恒常的プロモーター」が包含され得る。
【０１９１】
「異種」なる用語は、通常はつながっていない、および／または特定の細胞と通常は関連していない、配列を表す。従って、核酸コンストラクトまたはプラスミドの「異種」領域は、天然では他方の分子と結び付いて見出されることのない別の核酸分子内の、またはそれに結合した、核酸のセグメントである。異種核酸を含む導入遺伝子は、いくつかの有用な産物をコードし得る。これらには、例えばｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子およびｍｉＲＮＡが包含され得る。あるいは、導入遺伝子は、ホルモンならびに増殖因子および分化因子をコードし得る。
【０１９２】
ＡＡＶプラスミドは、ＡＡＶゲノムの内部部分を全体的または部分的に除去してＩＴＲとＩＴＲの間に目的のＤＮＡ配列を挿入することによって目的の異種ヌクレオチド配列（例えば、治療用タンパク質、アンチセンス核酸分子、リボザイム、ｍｉＲＮＡ等をコードする選択された遺伝子）を保持するように改変されてよい。このようなプラスミドにおいて、ＩＴＲは機能を有したままであり、目的の異種ヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする。異種ヌクレオチド配列はまた、典型的には、特定の条件下で患者の標的細胞において遺伝子発現を駆動することが可能なプロモーター配列に連結されている。ポリアデニル化部位などの終結シグナルもプラスミドに含まれ得る。
【０１９３】
「発現カセット」なる用語は、少なくとも１つの目的の遺伝子、１つのオープンリーディングフレームおよび３’非翻訳領域（通常、真核生物ではポリアデニル化部位を含む）を含むＤＮＡ核酸配列を指す。
【０１９４】
従って、一般的な実施形態によれば、本発明による発現カセットは、一般式：
［５’ＩＴＲ］−［目的の遺伝子］−［ＰｏｌｙＡ］ｚ−［３’ＩＴＲ］−
を有するＤＮＡ核酸配列を含むか、からなる可能性があり、式中、
［５’ＩＴＲ］および［３’ＩＴＲ］は逆方向末端反復（ＩＴＲ）であり、
［目的の遺伝子］は、目的のタンパク質をコードする任意の遺伝子であり、
［ＰｏｌｙＡ］はポリアデニル化シグナルであり、ｚは０または１であり、
［５’ＩＴＲ］、［目的の遺伝子］、［ＰｏｌｙＡ］および［３’ＩＴＲ］はそれぞれ、任意選択で、１つの追加的なリンカー配列で隔てられていてもよい。
【０１９５】
本発明の意味において、「目的のタンパク質をコードする遺伝子」は、目的のタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列、および好ましくは少なくとも１つのプロモーター、を含む。
【０１９６】
好ましくは、目的の遺伝子は、ヒトＰＤＥ−６βまたはヒトＲＰＥ６５をコードする核酸である。
【０１９７】
一実施形態によれば、ＡＡＶプラスミドは、配列番号１の、ヒトＰＤＥ−６βをコードする核酸を含む発現カセットを含む。
【０１９８】
代替的な一実施形態によれば、ＡＡＶプラスミドは、配列番号７の、ヒトＲＰＥ６５をコードする核酸を含む発現カセットを含む。
【０１９９】
特定の一実施形態によれば、ＡＡＶプラスミドは、配列番号２の、ヒトＰＤＥ−６βをコードする核酸を含む。
【０２００】
特定の一実施形態によれば、ＡＡＶプラスミドは、配列番号７の、ヒトＲＰＥ６５をコードする核酸を含む。一実施形態によれば、［５’ＩＴＲ］および［３’ＩＴＲ］は、ＡＡＶ−２に由来する逆方向末端反復（特に、それぞれ配列番号３および配列番号４の配列の逆方向末端反復）である。
【０２０１】
有利なことに、ＡＡＶプラスミドは、ポリアデニル化部位とＡＡＶ２に由来するＩＴＲとヒトＰＤＥ６βをコードする発現カセットとを含む。
【０２０２】
好ましくは、ヒトＰＤＥ６β遺伝子の発現は、好ましくは配列番号５の配列の、ロドプシンキナーゼのプロモーターの制御下にある。
【０２０３】
代替的な実施形態によれば、ＡＡＶプラスミドは、ポリアデニル化部位とＡＡＶ２に由来するＩＴＲとヒトＲＰＥ６５をコードする発現カセットとを含む。
【０２０４】
好ましくは、ヒトＲＰＥ６５遺伝子の発現は、好ましくは配列番号８の配列の、ＲＰＥ６５プロモーターの制御下にある。
【０２０５】
一実施形態によれば、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）に由来し、好ましくは配列番号６の配列のものである。
【０２０６】
上述の実施形態は、個別に、または組み合わせて、考慮されてよい。
【０２０７】
最も好ましい一実施形態によれば、ＡＡＶプラスミドは、上記で開示されるような、および図１Ａに示されるような、ＰＤＥ６βをコードする核酸を含む発現カセットを含む。
【０２０８】
代替的な一実施形態によれば、ＡＡＶプラスミドは、上記で開示されるような、および図１Ｂに示されるような、ＲＰＥ６５をコードする核酸を含む発現カセットを含む。
【０２０９】
本発明はさらに、上記で定義されるようなＡＡＶプラスミドでトランスフェクトされた宿主細胞、および前記宿主細胞によって産生されるｒＡＡＶ粒子に関する。
【０２１０】
本発明はさらに、遺伝子治療に使用するための、宿主細胞によって産生されるｒＡＡＶ粒子に関する。
【０２１１】
特に、本発明はさらに、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびアカゲザル由来血清型（ＡＡＶｒｈ１０を含む）から選択されるｒＡＡＶ粒子に関する。好ましくは、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ４および／またはＡＡＶ５の血清型に属するｒＡＡＶ粒子から選択される。
【０２１２】
特に、本発明は、上記で定義されるようなヒトＰＤＥ６βをコードする発現カセットを含むＤＮＡを含むｒＡＡＶ５粒子に関する。
【実施例】
【０２１３】
実施例１：ｒＡＡＶ５粒子を精製するための二段階陰イオン交換クロマトグラフィー
【０２１４】
Ａ．材料および方法
【０２１５】
Ａ１．細胞溶解物の回収
【０２１６】
トランスフェクトされた細胞を、ＣｅｌｌＳｔａｃｋ  １０（ＣＳ１０）の全ての面を軽くたたくことによってトランスフェクションから９６±５時間後に回収する。全懸濁液をＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ（ＢＰＣ）に移す。ウイルス粒子の大部分は上清中に放出される。
【０２１７】
Ａ２．細胞溶解物の清澄化
【０２１８】
２０個のＣＳ１０を用いて得られた全懸濁液を１２００ｍＬ／分の流速でＭｉｌｌｉｐｏｒｅのデプスフィルターＰｏｌｙｓｅｐ  ＩＩ  １／０．５μｍ−３０’’−に通してろ過し、細胞の残骸を排除する。ろ過工程の終了時に、空気で押すことによってろ過ユニットを空にする。ろ過ユニットを１５Ｌの緩衝液（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ９）でリンスし、この緩衝液を、ろ過した溶解物と合わせる。これが清澄化溶解物である。この工程の間に、ＤＮＡおよび可溶性タンパク質の大部分が同様に排除される。パラメータ（ｐＨおよび伝導率）を正しい結合条件に調整するために、清澄化溶解物を３０Ｌの緩衝液（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ８．５）で希釈する。インジェクション用緩衝液と比較して、決定的なパラメータ（ｐＨおよび伝導率）を制御する（ｐＨ８．５、伝導率６±１ｍＳ）。
【０２１９】
これらの条件は、このカラムへのＡＡＶ５ベクターの結合に最適であると決定された。
【０２２０】
Ａ３．第１の陰イオン交換クロマトグラフィー精製工程
【０２２１】
この工程は、Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアによって制御されるＡｋｔａ  Ｐｉｌｏｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実現される。１００ＬのＢＰＣ中の希釈産物６７Ｌを４００ｍＬ／分の流速で注入して、緩衝液１（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ８．５）で平衡化したＭｏｎｏｌｉｔｈ  ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ  ＱＡ（８００ｍＬ）に通す。この工程の間に、ＡＡＶおよび一部の不純物がカラムに結合する。大部分の不純物はカラムに結合せず、フロースルー中に排除される。次に、非特異的に結合した粒子を洗浄するために、１５ＣＶ（カラム体積）の緩衝液１でカラムをリンスする。溶出工程は、緩衝液２（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ８．０）と緩衝液３（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １Ｍ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ８．０）との混合の結果である、非常に緩やかな傾きを有するＮａＣｌの塩勾配である。勾配の傾きは、１５ＣＶにおいて５０％の緩衝液３を得るのに適している。塩の緩徐な増加は、ＡＡＶおよび他の不純物を徐々に溶出させることを可能にする。
【０２２２】
ｐＨ８．５での結合とは対照的に、カラムに結合した化学種（ＡＡＶを含む）の溶出は、８．０というｐＨで行われる。このｐＨは、精製工程と精製工程の間の凍結保存中にベクターの感染性を維持するために調整された（ｐＨ８．５は、ＡＡＶ５の感染性に対して特に有害であった）。
【０２２３】
溶出画分をポリプロピレンのボトルに回収し、次の工程まで−６５℃未満または−８０℃未満で保存する（通常、約１週間）。この期間中に、ウイルス粒子の存在について、回収した画分をスクリーニングする。
【０２２４】
Ａ４．第２の陰イオン交換クロマトグラフィー精製工程
【０２２５】
第２のクロマトグラフィー工程は、勾配がより緩やかであることを除き、第１のものと同様である。この工程の効果は、不純物からＡＡＶをさらに分離することである。
【０２２６】
ＡＡＶ粒子を含む、第１のクロマトグラフィー工程からの選択された画分をプールする（１．５〜２Ｌ）。パラメータ（ｐＨおよび伝導率）を正しい結合条件に調整するために、４ＬのＴｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ８．５および２ｌのＴｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ８．５で画分のプールを希釈する。緩衝液１と比較して、パラメータを制御する。溶出が、１５ＣＶにおいて３０％の緩衝液３を得る勾配であることを除き、第１のクロマトグラフィー分離の全ての工程が、同じカラムであるＭｏｎｏｌｉｔｈ  ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ  ＱＡ（８００ｍＬ）で繰り返される。溶出画分をポリプロピレンのボトルに回収し、次の精製工程まで−６５℃未満または−８０℃未満で保存する（通常、約２週間）。この期間中に、ウイルス粒子の存在について、回収した画分をスクリーニングする。
【０２２７】
Ａ５．タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）
【０２２８】
ＡＡＶ粒子を含む第２のクロマトグラフィー工程からの選択された画分をプールする（約１Ｌ）。１００ＫＤａのカットオフを有するｍＰＥＳ中空糸を用いてＴＦＦを行う。ＡＡＶを眼用塩類溶液（ＳＳ０）に対してダイアフィルトレーションおよび濃縮する。
【０２２９】
プールされた画分をまず、僅かに濃縮し、１０容量の緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、最後に、期待される濃度に達するように濃縮する。ＴＦＦは、残っている小さな不純物を排除すること、ならびに注射用の正しい緩衝液中にウイルスベクターを配合すること、および正しいレベルまで濃縮すること、を可能にする。ろ過、精製および濃縮されたウイルスベクターは、力価測定まで−６５℃未満または−８０℃未満で保存する。
【０２３０】
Ａ６．滅菌ろ過
【０２３１】
患者への注射に必要とされる正確な濃度を得るためにＡＡＶをＳＯＳ（眼用塩類溶液）で希釈し、期待される量に従って最終的な容器に分注する前に０．２μｍのＰＥＳフィルターで滅菌ろ過する。用量は、注射まで−６５℃未満または−８０℃未満で保存する。
【０２３２】
Ａ７．ｑＰＣＲによるベクターゲノムの濃度（ｖｇ／ｍＬ）
【０２３３】
この方法は、導入遺伝子の発現カセット（導入遺伝子、ポリ（Ａ）、ＩＴＲまたはプロモーター）を標的とする定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるゲノム含有粒子の定量にある。ｒＡＡＶのサンプルをまず、カプシドで包まれていないＤＮＡを排除するためにＤＮａｓｅで消化する。その後、プロテイナーゼＫでの処理により、ＡＡＶカプシドを分解し、その後のｑＰＣＲによる定量化のためのウイルスＤＮＡを放出させる。
【０２３４】
標的とされるアンプリコンを含むベクタープラスミドを用いてｑＰＣＲ用の検量線を生成する。各アッセイにおいて検量線の安定性および再現性を確実にするために、このプラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ消化によって線状化され、分注され、−１８℃以下で保存される。
【０２３５】
１ｅ１０コピーのアンプリコンの算出は、以下の式に基づく：
ＤＮＡの量（ｇ）＝（６６０×プラスミドのサイズ（ｂｐ）×１ｅ１０コピー）／（６．０２×１０ｅ２３）
【０２３６】
ベクターゲノムＤＮＡの相対量は、既知量のアンプリコンＤＮＡを含む検量線から反応あたりのコピー数を外挿することによって割り当てる。
【０２３７】
結果は、１ｍＬあたりのベクターゲノムで表す。
【０２３８】
Ａ８．ＩＣＡによる感染性粒子の濃度（ｉｐ／ｍＬ）
【０２３９】
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）は、ｒＡＡＶのロット中の感染性粒子の定量化を可能にする。このアッセイは、増加する段階希釈のｒＡＡＶベクターで、および野生型のアデノウイルス（５型）で、ＡＡＶ２のｒｅｐおよびｃａｐの配列を安定に保持する許容細胞株（ＨｅＬａＲＣ３２、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２９７２）を感染させることを伴う。従って、細胞内に侵入する感染性のｒＡＡＶ粒子は複製可能であることになる。次に、複製イベントを、導入遺伝子に特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーションの後に化学発光によって検出し、定量化する（Ｓａｌｖｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，  １９９８）。
【０２４０】
感染から２６時間後に、細胞を回収し、溶解し、ナイロンメンブレン上にブロットする。フルオレセインで標識した特異的な導入遺伝子用プローブを用いてハイブリダイゼーションを行う。次に、アルカリホスファターゼを結合させた抗フルオレセイン抗体でシグナルを増幅し、化学発光によって検出する。
【０２４１】
最後に、Ｘ線撮影用フィルムへの露光の後にドットを計数することによって複製イベントを定量化する。
【０２４２】
Ａ９．ＥＬＩＳＡによるベクター粒子の濃度（ｖｐ／ｍＬ）
【０２４３】
ｒＡＡＶの全ＡＡＶ５カプシド濃度を、市販のサンドイッチＥＬＩＳＡ法（Ｐｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．＃  ＰＲＡＡＶ５）によって決定する。
【０２４４】
組換えＡＡＶ５ビリオン、またはアデノ随伴ウイルス５の集合した完全な空のカプシド、の定量化のために、独特なマイクロタイタープレート酵素免疫測定法を用いる。捕捉抗体は、集合していないカプシドタンパク質上には存在しない立体構造エピトープを検出する。
【０２４５】
製剤をまず、希釈し、モノクローナル抗体で被覆したウェルに適用する。次に、ビオチンをコンジュゲートしたモノクローナル抗体を添加した後、ストレプトアビジンとペルオキシダーゼのコンジュゲートおよびＴＭＢ発色基質（テトラメチルベンジジン）を添加することによって、捕捉されたＡＡＶ５粒子を検出する。特異的に結合した完全なカプシド粒子に比例する得られた呈色反応の生成物を４５０ｎｍにて測光法で測定する。
【０２４６】
サンプル中に存在するＡＡＶ５カプシドの濃度を検量線から外挿し、適切な希釈係数について補正し、１ｍＬあたりのベクター粒子で表す。
【０２４７】
Ａ１０．ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によるベクターカプシドの純度および識別
【０２４８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法は、タンパク質とサンプルの他の構成成分とを、それらの分子量およびそれらの電荷に応じて分離する、変性条件下でのポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動である。
【０２４９】
電気泳動の後、サンプル中のタンパク質だけを定量化するためにクマシーブルー（Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ）でゲルを染色する。ｒＡＡＶのタンパク質の識別は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３と呼称されるＡＡＶの３種のカプシドタンパク質の存在によって確認される。ｒＡＡＶのタンパク質の純度は、サンプル中に存在するタンパク質の総量と比較したカプシドタンパク質の相対量として算出される。
【０２５０】
クマシーブルー染色の後に、ＣＣＤカメラを有する発光画像分析器によって電気泳動ゲルを分析する。タンパク質のバンドはそれぞれ、ピークとして検出され、シグナルは分析器によって積分される。次に、各ピークの面積が算出される。１００％の純度の生成物は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の３種のタンパク質のバンドしか含まない。
【０２５１】
Ａ１１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によるベクター粒子の定量化
【０２５２】
Ｈｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎ  ａｎｄ  Ｄｅｒｎｉｃｋ（Ｈｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎ  ａｎｄ  Ｄｅｒｎｉｃｋ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  １９８５）の方法論に基づく銀染色は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離されたタンパク質および核酸の検出を可能にする。
【０２５３】
検量線に使用されるｒＡＡＶと同じゲル上にサンプルをロードする。ｒＡＡＶ８ＲＳＭ（Ａｙｕｓｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１４）と同じように作製および特徴付けされ、１００％の完全な粒子を含む、参照対象のｒＡＡＶのロットを用いて検量線を生成する。
【０２５４】
電気泳動の後、ＣＣＤカメラを有する画像分析器を用いてゲルを分析し、ＶＰ３に対応するバンドのシグナルをレーンごとに積分する。サンプル中に存在する全カプシドの量を検量線から外挿し、１ｍＬあたりの粒子で表す。
【０２５５】
完全な粒子／全粒子の比は、以下の計算に基づく：
１ｍＬあたりのベクターゲノムの力価／１ｍＬあたりの粒子の力価
【０２５６】
参考用：Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｌｖｅｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｓｉｌｖｅｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ６（１９８５）  １０３−１１２，  Ｈｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎ，Ｊ．  ａｎｄ  Ｄｅｒｎｉｃｋ，Ｒ．）およびＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ８  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｍａｔｅｒｉａｌ，  Ａｙｕｓｏ  ｅｔ  ａｌ，（Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１４  Ｏｃｔ  ２）。
【０２５７】
Ａ１２．ｑＰＣＲによる残留宿主細胞ＤＮＡ（ＨＥＫ２９３細胞に由来するアルブミンおよびＥ１Ａ）
【０２５８】
ヒトアルブミン遺伝子またはアデノウイルス５型Ｅ１Ａ遺伝子を標的とするリアルタイム定量的ＰＣＲ法を用いて、残留ヒト宿主細胞ＤＮＡを定量する。
【０２５９】
特定のアンプリコン（アルブミンおよびＥ１Ａ）を含むプラスミドを用いてｑＰＣＲ用の検量線を生成する。各アッセイにおいて検量線の安定性および再現性を確実にするために、このプラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ消化によって線状化され、充填され、−１８℃以下で保存される。１ｅ１０コピーのアルブミン遺伝子配列の算出は、以下の計算に基づく：
ＤＮＡの量（ｇ）＝（６６０×プラスミドのサイズ（ｂｐ）×１ｅ１０コピー）／（６．０２×１０ｅ２３）
【０２６０】
アルブミンまたはＥ１ＡのアンプリコンＤＮＡの相対量は、既知量のアルブミンまたはＥ１ＡのアンプリコンＤＮＡを含む検量線から反応あたりのコピー数を外挿することによって割り当てる。
【０２６１】
第２の検量線は、１ウェルあたり５０ｐｇ〜５ｎｇのＨＥＫ２９３細胞株由来ゲノムＤＮＡを用いて実施される。この検量線は、アルブミンまたはＥ１Ａのコピーの量と対応するＨＥＫ２９３のＤＮＡの量（ｎｇ）との間の相関を指し示す。
【０２６２】
Ｂ．結果
【０２６３】
Ｂ１．大規模バッチの開発
【０２６４】
図３Ａおよび図３Ｂは、それぞれ第１の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップ（図３Ａを参照のこと）および第２の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップ（図３Ｂを参照のこと）からの、ＡＡＶ５粒子を含む清澄化上清の溶出プロファイルを示す。
【０２６５】
精製法は、大規模（２２Ｌ）で達成される。各工程におけるベクターゲノムの力価測定および最終産物の特性評価は、上述のプロトコルに従って確立され、以下の表に要約される。
【０２６６】
【表１】
2018518164.tif 000002
【０２６７】
【表２】
2018518164.tif 000003
【０２６８】
結論：このプロトコルは再現性があり、大規模かつ良好な収率で清澄化上清から臨床グレードのＡＡＶ５調製物を精製するのに効果的である。有利なことに、連続する第２の陰イオン交換カラムクロマトグラフィー工程は、ベクターゲノムの力価に中程度に影響するに過ぎない。
【０２６９】
Ｂ２．種々のＡＡＶ５ウイルスベクターへの適用
【０２７０】
このプロセスを、異なる導入遺伝子を含む種々のＡＡＶ５ウイルスベクターに適用した。
【０２７１】
材料および方法のセクションにおいて上述された条件と同じ条件で、各ＡＡＶ５（異なる３種の導入遺伝子）について、２．２リットルの２つの小規模バッチを作製し、精製した。
【０２７２】
結果を以下の表３に要約する。ベクターは全て、９０％超の純度である。
【０２７３】
【表３】
2018518164.tif 000004
【０２７４】
結論：このプロセスのロバスト性は、最終産物の品質を同じにしつつ、異なる導入遺伝子を含む種々のＡＡＶ５血清型にプロセスを適用することを可能にする。
【０２７５】
実施例２：ｒＡＡＶ４粒子を精製するための二段階陰イオン交換クロマトグラフィー
【０２７６】
Ａ．材料および方法
【０２７７】
Ａ１．細胞溶解物の回収
【０２７８】
トランスフェクトされた細胞を、ＣｅｌｌＳｔａｃｋ  １０（ＣＳ１０）の全ての面を軽くたたくことによってトランスフェクションから９７時間後に回収する。室温にて１時間、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（終濃度１％ｖ／ｖ）で全懸濁液を処理して、細胞から粒子を放出させるとともに（処理前の上清中のＡＡＶは８０％、処理後は９８％）、深層ろ過の工程を促進する（より良好な深層ろ過工程の回収率）。
【０２７９】
Ａ２．細胞溶解物の清澄化
【０２８０】
得られた細胞懸濁液を９０ｍＬ／分の流速でＭｉｌｌｉｐｏｒｅのデプスフィルターＰｏｌｙｓｅｐ  ＩＩ  １／０．５μｍ−２’’−に通してろ過し、細胞の残骸を排除する。ろ過工程の終了時に、空気で押すことによってろ過ユニットを空にする。ろ過ユニットを６００ｍＬの緩衝液（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ８）でリンスし、この緩衝液を、ろ過した溶解物と合わせる。これが清澄化溶解物である。この工程の間に、ＤＮＡおよび可溶性タンパク質の大部分が同様に排除される。パラメータ（ｐＨおよび伝導率）を正しい結合条件に調整するために、清澄化溶解物を１．４Ｌの緩衝液（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ８）で希釈する。インジェクション用緩衝液と比較して、決定的なパラメータ（ｐＨおよび伝導率）を制御する（ｐＨ８．０、伝導率６±１ｍＳ）。
【０２８１】
Ａ３．第１の陰イオン交換クロマトグラフィー精製工程
【０２８２】
この工程は、Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアによって制御されるＡｋｔａ  Ｐｉｌｏｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実現される。３Ｌの希釈産物を１００ｍＬ／分の流速で注入して、緩衝液１（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ８）で平衡化したＭｏｎｏｌｉｔｈ  ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ  ＱＡ（８０ｍＬ）に通す。この工程の間に、ＡＡＶおよび一部の不純物がカラムに結合する。大部分の不純物はカラムに結合せず、フロースルー中に排除される。次に、非特異的に結合した粒子を洗浄するために、吸光度が安定なレベルになるまで緩衝液１でカラムをリンスする。溶出工程は、緩衝液１と緩衝液２（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ８）との混合の結果である、非常に緩やかな傾きを有するＮａＣｌの塩勾配である。溶出は、１０ＣＶにおいて１００％の緩衝液２を得るように実現される。塩の緩徐な増加は、ＡＡＶおよび他の不純物を徐々に溶出させることを可能にする。
【０２８３】
溶出画分をポリプロピレンのチューブに回収し、次の工程まで−８０℃未満で保存する。ウイルス粒子の存在について、回収した画分をスクリーニングする。
【０２８４】
Ａ４．第２の陰イオン交換クロマトグラフィー精製工程
【０２８５】
第２のクロマトグラフィー工程は、勾配がより緩やかであることを除き、第１のものと同様である。この工程の効果は、不純物からＡＡＶをさらに分離することである。
【０２８６】
ＡＡＶ粒子を含む、第１のクロマトグラフィー工程からの選択された画分をプールする（３５０ｍＬ）。パラメータ（ｐＨおよび伝導率）を正しい結合条件に調整するために、９００ｍＬのＴｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ｐＨ８で画分のプールを希釈する。緩衝液１と比較して、パラメータを制御する。溶出が、４０ＣＶにおいて１００％の緩衝液２を得る勾配であることを除き、第１のクロマトグラフィー分離の全ての工程が、同じカラムであるＭｏｎｏｌｉｔｈ  ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ  ＱＡ（８０ｍＬ）で繰り返される。溶出画分をポリプロピレンのボトルに回収し、次の精製工程まで−８０℃未満で保存する。ウイルス粒子の存在について、回収した画分をスクリーニングする。
【０２８７】
Ａ５．タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）
【０２８８】
ＡＡＶを含む第２のクロマトグラフィー工程からの選択された画分をプールする（約７００ｍＬ）。５０ＫＤａのカットオフを有するｍＰＥＳ中空糸を用いてＴＦＦを行う。ＡＡＶを眼用塩類溶液（ＳＯＳ）に対してダイアフィルトレーションおよび濃縮する。
【０２８９】
プールされた画分をまず、僅かに濃縮し、１０容量の緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、最後に、期待される濃度に達するように濃縮する。ろ過、精製および濃縮されたウイルスベクターは、力価測定まで−８０℃未満で保存する。
【０２９０】
Ｂ．結果
【０２９１】
この実施例のＡＡＶ４について得られた結果を以下の表４に要約する。
【０２９２】
各工程におけるベクターゲノムの力価測定は、上述のプロトコルに従って確立される。
【０２９３】
【表４】
2018518164.tif 000005
【０２９４】
【表５】
2018518164.tif 000006
【図１Ａ】
2018518164.tif 000007
【図１Ｂ】
2018518164.tif 000008
【図２】
2018518164.tif 000009
【図３Ａ】
2018518164.tif 000010
【図３Ｂ】
2018518164.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成29年11月10日(2017.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を得るための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶ粒子を産生する細胞から事前に取得された出発材料の深層ろ過を行う工程であって、前記出発材料が細胞溶解物および／または培養上清を含む、それによりｒＡＡＶ含有清澄化組成物が提供される工程と、
（ｂ）前記ｒＡＡＶ含有清澄化組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第１の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに供する工程であって、それにより第１のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｃ）前記第１のｒＡＡＶ濃縮組成物を、直線的な塩勾配を用いて溶出が行われｒＡＡＶ含有画分が回収される、クロマトグラフィー担体上における第２の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップに少なくとも１回供する工程であって、それにより第２のｒＡＡＶ濃縮組成物が提供される工程と、
（ｄ）前記第２のｒＡＡＶ濃縮組成物をタンジェンシャルフローろ過のステップに供する工程であって、それにより、精製された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子が提供される工程と、
を含む方法。
【請求項２】
工程（ｂ）において、５０ｍＭのＮａＣｌから０．５ＭのＮａＣｌまでというＮａＣｌの塩勾配をカラム体積の５〜３０倍、好ましくはカラム体積の１０〜２０倍、の範囲の勾配体積で用いることによって溶出が行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｃ）における直線的な塩勾配の傾きが、工程（ｂ）における直線的な塩勾配の傾きと等しいか、それよりも小さい、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）において、５０ｍＭのＮａＣｌから０．３５ＭのＮａＣｌまでというＮａＣｌの塩勾配をカラム体積の５〜３０倍の範囲の勾配体積で用いることによって溶出が行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）の終了時に、工程（ｂ）で使用されるクロマトグラフィー担体上におけるｒＡＡＶ粒子の最適な保持を確実にするために前記ｒＡＡＶ含有清澄化組成物のｐＨが塩基性のｐＨに調整される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）および／または工程（ｃ）におけるクロマトグラフィー担体が、モノリス型クロマトグラフィー担体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｄ）が、５０ｋＤａ〜１５０ｋＤａの範囲の分子量カットオフ値を有するフィルター膜を用いて行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびアカゲザル由来血清型（ＡＡＶｒｈ１０を含む）ならびにそれらの混合物からなる群より選択されるＡＡＶ血清型に属する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ５に属する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ｒＡＡＶ粒子が、ヒトＰＤＥ６βをコードする発現カセットを含むＤＮＡを含むｒＡＡＶ５粒子からなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ４に属する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ｒＡＡＶ粒子が、ヒトＲＰＥ６５をコードする発現カセットを含むＤＮＡを含むｒＡＡＶ４粒子からなる、請求項１〜８または１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記精製されたｒＡＡＶ粒子が、遺伝子治療における使用に適している、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018518164000001.app
【国際調査報告】
2018518164.tif 000012
2018518164.tif 000013
2018518164.tif 000014
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