(57)【要約】  本開示は、膜融合による、高い搭載効率となる陰イオン性ペイロード(低分子、色素、核酸)のための、並びに親水性及び脂溶性ペイロードの非エンドサイトーシス送達のための融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子を記載している。本リポソーム被膜は、リガンドと官能基化ポリ(エチレングリコール)との間の共有結合化学により、標的化ペプチド又は抗体によりさらに修飾することができる。表面部分は、融合性取り込みによって、細胞膜表面に輸送され得る。本開示の組成物は、捕捉された/封入されたペイロードを送達することにより、疾患の処置に応用することができる。【選択図】図1A
2018519347.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の細孔を有するナノ構造化ケイ素含有コア物質及び
前記ケイ素含有コア物質の周囲の融合性リポソーム被膜
を含む、融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子であって、前記物質が、
(a)ケイ素含有コア、
(b)前記コアに化学的に連結している多孔質表面、
(c)ケイ素含有コア物質に物理的に結合している複数のカーゴ分子、及び
(d)金属ケイ酸塩
を含む、融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項２】
前記融合性リポソームが、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](DSPE-PEG)及び1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)を含む、請求項１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項３】
ケイ素含有コアが、実質的に又は完全に酸化されているケイ素である、請求項１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項４】
金属ケイ酸塩が、ケイ酸カルシウム又はケイ酸マグネシウムを含む、請求項１、２又は３に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項５】
金属ケイ酸塩が、ケイ素含有コア上でシェルを形成している、請求項４に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項６】
ケイ素含有コアとケイ酸カルシウム又はケイ酸マグネシウムのシェルとの間に隙間が存在しない、請求項５に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項７】
複数の細孔が、カーゴ分子を収容するように化学的又は物理的に構成されている、請求項１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項８】
ケイ酸カルシウム又はケイ酸マグネシウムのシェルの形成に伴う細孔表面の化学的酸化により、複数のカーゴ分子が物理的に捕捉される、請求項１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項９】
複数の細孔が薬物を含有している、請求項１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項１０】
複数の細孔が非薬物物質を含有している、請求項１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項１１】
ケイ素含有コアが、複数の細孔に物理的に吸着されている、若しくはこれらによって共有結合的に捕捉されている、又は複数の細孔に結合している分子を含み、ケイ素含有コアが、前記分子の存在下で、前記ホスト物質に添加されたカルシウムイオン又はマグネシウムイオンの水溶液の作用により形成される、カルシウム又はマグネシウム含有シェルによって被覆されている、請求項１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項１２】
融合性リポソームが、DMPC、DOTAP及びDSPE-PEG(メトキシ)の混合物を含む、請求項１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項１３】
融合性リポソームが、DMPC、DOTAP及びDSPE-PEG(カルボキシ)の混合物を含む、請求項１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項１４】
融合性リポソームが、DMPC、DOTAP及びDSPE-PEG(マレイミド)の混合物を含む、請求項１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項１５】
ケイ素含有コア物質が、約10〜100nmの範囲の流体力学的直径を有する、請求項１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項１６】
融合性リポソームが、約100〜400nmの範囲の流体力学的直径を有する、請求項１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項１７】
標的化分子が、融合性リポソーム被膜にコンジュゲートされている、請求項１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項１８】
抗体が、融合性リポソーム被膜にコンジュゲートされている、請求項１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項１９】
疎水性カーゴ分子が、融合性リポソーム被膜に搭載されている、請求項１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項２０】
親水性カーゴ分子が、ケイ素含有コアの複数の細孔内に捕捉されている、請求項１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項２１】
核酸カーゴ分子が、ケイ素含有コアの複数の細孔内に捕捉されている、請求項１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項２２】
低分子カーゴ分子が、多孔質ケイ素含有コアの複数の細孔内に捕捉されている、請求項１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子。
【請求項２３】
細胞に、請求項２１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子を接触させることを含む、細胞に核酸ペイロードを送達する方法。
【請求項２４】
眼内又は眼の表面に、請求項１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子を送達することを含む、眼の疾患又は障害を処置する方法。
【請求項２５】
身体に、請求項１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子を送達することを含む、がんを処置する方法。
【請求項２６】
身体に、請求項１に記載の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子を送達することを含む、細菌感染を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府により支援を受けた研究に関する記述
本発明は、米国国防高等研究計画局(Defense Advanced Research Projects Agency:DARPA)により授与された助成金番号HR0011-13-2-0017及び米国国立科学財団により授与された助成金番号DMR-1210417によって資金提供を受けた。米国政府は、本発明におけるある種の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C.§119の下、その開示が参照により本明細書に組み込まれている、2015年7月9日に出願の、仮特許出願第62/190,705号からの優先権を主張する。
【０００３】
本発明は、送達システム及び、より詳細には、標的細胞又は組織に薬物、核酸及びペプチドを送達するための融合性リポソームナノ粒子組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
インビボでの遺伝子送達は、効率が低いこと又は細胞毒性があるために、依然として難題である。細胞性エンドサイトーシスは、大部分のナノプラットフォームの主要な取り込み経路であり、遺伝性物質のリソソーム分解及び治療効力の低下をもたらす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、リポソーム-形質膜融合による、エンドサイトーシス取り込みを迂回することができる、生分解性リポソーム多孔質ケイ素ナノ粒子システムを提供する。そのペイロード(payload)のすべてのエンドサイトーシス取り込みを可能にする、最近研究されているナノ粒子送達システムとは異なり、膜融合により、リポソームのコアから細胞質へ親水性ペイロードを直接、放出すること、リポソーム二重層から細胞膜二重層に疎水性分子を輸送すること、及びリポソームの外側表面にコンジュゲートされている部分(抗体、低分子、ペプチドなど)を細胞膜表面に輸送することが可能になる。
【０００６】
リポソーム多孔質ケイ素粒子、及びその合成方法、及び用途が開示されている。リポソームには、脂溶性ペイロードを搭載することができ、かつポリ(エチレングリコール)(PEG)及び他の表面部分(標的化ペプチド、抗体、アプタマーなど)により官能基化されて、融合によりそれらを細胞膜内及び細胞膜表面に輸送することができる。多孔質ケイ素をベースとするコアは、多量のペイロード(低分子、タンパク質、核酸)を捕捉して、それらを標的細胞の細胞質に直接、送達することができる。細胞性エンドサイトーシスの迂回により、送達及び処置の治療効力を高めることができる。Lipofectamineの効率に匹敵する、インビトロでのノックダウン効率が実証された。
【０００７】
本開示は、複数の細孔を有するナノ構造化ケイ素含有コア物質及びケイ素含有コア物質の周囲の融合リポソーム被膜を含む、融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子であって、該物質が、(a)ケイ素含有コア、(b)該コアに化学的に連結している多孔質表面、(c)ケイ素含有コア物質と物理的に結合している複数のカーゴ分子、及び(d)金属ケイ酸塩を含む、融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子を提供する。一実施形態では、融合性リポソームは、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](DSPE-PEG)及び1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)を含む。別の実施形態では、ケイ素含有コアは、実質的に又は完全に酸化されているケイ素である。上述の実施形態のいずれかのさらに別の実施形態では、金属ケイ酸塩は、ケイ酸カルシウム又はケイ酸マグネシウムを含む。さらなる実施形態では、金属ケイ酸塩は、ケイ素含有コア上でシェルを形成する。さらに別の実施形態では、ケイ素含有コアとケイ酸カルシウム又はケイ酸マグネシウムのシェルとの間に隙間は存在しない。別の実施形態では、複数の細孔は、カーゴ分子を収容するよう、化学的又は物理的に構成されている。さらに別の実施形態では、ケイ酸カルシウム又はケイ酸マグネシウムのシェルの形成に伴う細孔表面の化学的酸化により、複数のカーゴ分子が物理的に捕捉される。さらに別の実施形態では、複数の細孔は、薬物を含有する。別の実施形態では、複数の細孔は、非薬物物質を含有する。別の実施形態では、ケイ素含有コアは、複数の細孔に物理的に吸着されている、若しくはこれらによって共有結合的に捕捉されている、又は複数の細孔に結合している分子を含み、ケイ素含有コアは、上記の分子の存在下で、前記ホスト物質に添加されたカルシウムイオン又はマグネシウムイオンの水溶液の作用により形成される、カルシウム又はマグネシウム含有シェルによって被覆されている。さらに別の実施形態では、融合性リポソームは、DMPC、DOTAP及びDSPE-PEG(メトキシ)の混合物を含む。別の実施形態では、融合性リポソームは、DMPC、DOTAP及びDSPE-PEG(カルボキシ)の混合物を含む。別の実施形態では、融合性リポソームは、DMPC、DOTAP及びDSPE-PEG(マレイミド)の混合物を含む。さらに別の実施形態では、ケイ素含有コア物質は、約10〜100nmの範囲の流体力学的直径を有する。別の実施形態では、融合性リポソームは、約100〜400nmの範囲の流体力学的直径を有する。またさらに別の実施形態では、標的化分子は、融合性リポソーム被膜にコンジュゲートされている。一実施形態では、抗体は、融合性リポソーム被膜にコンジュゲートされている。別の実施形態では、疎水性カーゴ分子は、融合性リポソーム被膜に搭載されている。さらに別の実施形態では、親水性カーゴ分子は、ケイ素含有コアの複数の細孔内に捕捉されている。さらに別の実施形態では、疎水性作用剤/カーゴ分子は、融合性被膜中に存在し、親水性作用剤/カーゴは、ケイ素含有コアの複数の細孔中に存在している。別の実施形態では、核酸カーゴ分子は、ケイ素含有コアの複数の細孔内に捕捉されている。別の実施形態では、低分子カーゴ分子は、多孔質ケイ素含有コアの複��の細孔内に捕捉されている。
【０００８】
本開示はまた、細胞を、核酸を含有する本開示の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子に接触させることを含む、細胞に核酸ペイロードを送達する方法も提供する。
【０００９】
本開示はまた、眼内又は眼の表面に、本開示の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子を送達することを含む、眼の疾患又は障害を処置する方法も提供する。
【００１０】
本開示はまた、身体に、本開示の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子を送達することを含む、がんを処置する方法も提供する。
【００１１】
本開示はまた、身体に、本開示の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子を送達することを含む、細菌感染を処置する方法も提供する。
【００１２】
本発明の1つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明において説明されている。本発明の他の特徴、目的及び利点は、この説明及び図面から、並びに特許請求の範囲から明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】本開示の実施形態を表す概略図である。(A)は、本開示の融合性リポソーム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子の作用の概略図を示している。
【図１Ｂ】本開示の実施形態を表す概略図である。(B)は、陰イオン性ペイロードを有するカルシウム被覆多孔質ケイ素(pSi)の搭載を示している。陰イオン性ペイロード及び陽イオン性の金属ケイ酸塩が堆積されているpSiNPは、静電的相互作用によってクラスターを形成している。
【図１Ｃ】本開示の実施形態を表す概略図である。(C)は、陽イオン性リポソームに「搭載された」pSiの搭載を示している。ペイロード-pSiクラスターは、静電的相互作用及び機械的押し出しにより、陽イオン性融合性リポソームに封入されている。
【図１Ｄ】本開示の実施形態を表す概略図である。(D)は、標的化ペプチドを有するリポソームの修飾を図示している。標的化ペプチド又は抗体は、化学結合を介して、官能性PEGにコンジュゲートすることができる。
【図１Ｅ】本開示の実施形態を表す概略図である。(E)は、低倍率の粒子を示している。Tecnai TEMを使用して画像化された。陰性染色は、酢酸ウラニルによって行った。スケールバーは、500nmを示す。
【図１Ｆ】本開示の実施形態を表す概略図である。(F)は、粒子の高倍率化により、暗色及び濃厚な多孔質ケイ素をベースとするコアの周りに、ぼんやりとしたリポソーム被膜があることを示すことを示している。JEOL1200EX TEMを使用して画像化した。陰性染色は、2%のPTAによる。スケールバーは、200nmを示す。
【図１Ｇ】本開示の実施形態を表す概略図である。(G)DLS(n=3)によって測定された粒子サイズ及びゼータ電位の表である。
【図１Ｈ】本開示の実施形態を表す概略図である。(H)は、本開示の粒子の概略図を示している。
【図２】多孔質ケイ素ナノ粒子の薬物搭載の概略図である。
【図３】カーゴ搭載ケイ酸カルシウム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子(Ca-pSiNP)の概略図である。
【図４Ａ−Ｉ】共焦点顕微鏡及び透過型電子顕微鏡を示す図である。(A〜F)J771A.1の共焦点顕微鏡である。(A)DiIが搭載されているF-pSiと共に10分間のインキュベートをした後のJ771A.1である。(B)Lysotracker Redと共に1時間のインキュベートをした後、及びカルセインを有するF-pSiと共に10分間のインキュベートをした後のJ774a.1である。(C)DiIが搭載されている、MTP-FAMコンジュゲートF-pSiと共に5分間のインキュベートをした後のJ774a.1である。(D)DiIが搭載されているNF-pSiと共に10分間のインキュベートをした後のJ771A.1である。(E)Lysotracker Redと共に1時間のインキュベートをした後、及びカルセインを有するNF-pSiと共に10分間のインキュベートをした後のJ774a.1である。(F)DiIが搭載されている、MTP-FAMコンジュゲートNF2-pSiと共に5分間のインキュベートをした後のJ774a.1である。(G〜I)粒子と共に1時間のインキュベートをした後のHeLa細胞の透過型電子顕微鏡(TEM)である。(G)小胞(エンドソーム/リソソーム)に局在化されている非融合性リポソーム被覆粒子である。挿入図は、粒子のピノサイトーシス取り込みを示す。スケールバーは、1μmを示す。(H)細胞質に局在化している融合性リポソーム被覆粒子である。スケールバーは、500nmを示す。(I)細胞質に局在化している融合性リポソーム被覆粒子である。スケールバーは、1μmを示す。
【図５Ａ−Ｂ】粒子と共に1時間のインキュベートをした後のNeuro2a細胞の共焦点顕微鏡の図である。(A)融合性リポソームは、細胞膜においてDiIシグナルを示しており、融合性取り込みがあることを示している。(B)非融合性リポソームは、個々の濃いスポット中の細胞質においてDiIシグナルがあることを示しており、エンドサイトーシス取り込みがあることを示している。
【図６】融合性リポソーム被覆粒子による最大8時間のインキュベートをした、HeLa細胞の共焦点顕微鏡の図である。
【図７】非融合性リポソーム被覆粒子による最大8時間のインキュベートをした、HeLa細胞の共焦点顕微鏡の図である。
【図８Ａ】(A)0日目における感染後、及び1日目の治療剤注射(PBS、NF-siIRF5-MTP、F-siLuc-MTP及びF-siIRF5-MTP)後のマウス生存率を示すグラフである。各群は、n=6のマウスを有する。
【図８Ｂ】(B)0日目における感染後、及び1日目の治療剤注射後のマウスの生存の平均日数である。エラーバーは、標準偏差を示す。テューキーのHSD事後検定による一元配置ANOVA(α=0.05)により、F-siIRF5-MTPと3つの対照群(PBS、NF-siIRF5-MTP及びF-siLuc-MTP)との間に有意な差異があることが明らかになった。
【図９】DLSによる、融合性リポソーム被覆ケイ酸カルシウム多孔質ケイ素ナノ粒子(F-CapSi)、及びRVGコンジュゲートされている融合性リポソーム被覆ケイ酸カルシウム多孔質ケイ素ナノ粒子(RVG-F-CapSi)の平均流体力学的直径の1か月にわたる観察を示すグラフである。
【図１０】融合性リポソーム被覆ケイ酸カルシウム多孔質ケイ素ナノ粒子(F-Ca-pSi)及び被覆されていないケイ酸カルシウム多孔質ケイ素ナノ粒子(Ca-pSi)中に搭載されているカルセインの吸光度(点線)及び発光(実線)スペクトルを示すグラフである。
【図１１】pSiNP及びCaCl2(又はMgCl2)溶液の反応時間にわたり得られた、光ルミネッセンススペクトルを示すグラフである。
【図１２】粒子と共にインキュベートした後のNeuro2a細胞及びHeLa細胞の共焦点顕微鏡の図である;左上パネル:脂溶性蛍光色素であるDiIを搭載した融合性リポソーム被覆粒子と共に1時間のインキュベートをした後のNeuro2a細胞;右上パネル:細胞非透過性色素であるカルセインを搭載した融合性リポソーム被覆粒子と共に8時間のインキュベートをした後のHeLa細胞;左下パネル:脂溶性蛍光色素であるDiIを搭載した非融合性リポソーム被覆粒子と共に1時間のインキュベートをした後のNeuro2a細胞;右下パネル:細胞非透過性色素であるカルセインを搭載した非融合性リポソーム被覆粒子と共に8時間のインキュベートをした後のHeLa細胞。
【図１３Ａ−Ｂ】粒子と共に1時間のインキュベートをした後のNeuro2a細胞の共焦点顕微鏡の図である。(A)RVG-コンジュゲートされている融合性リポソーム(RVG-F)は、細胞へのRVG標的化が成功していること、及び融合染色が高いレベルにあることを示している。(B)RVGコンジュゲートされていない融合性リポソーム(F)は、RVG-コンジュゲートされている粒子と比べて、融合が比較的低いレベルであることを示している。
【図１４】Neuro2aマウス神経芽腫細胞中の粒子の48時間のインキュベートに由来する、siRNAノックダウンを示す図である。F-Ca-pSi-siPPIB:PPIBに対するsiRNAが搭載されている融合性リポソーム被覆ケイ酸カルシウム多孔質ケイ素ナノ粒子; NF-Ca-pSi-siPPIB:PPIBに対するsiRNAが搭載されている非融合性リポソーム被覆ケイ酸カルシウム多孔質ケイ素ナノ粒子;F-Ca-pSi-siLuc:ルシフェラーゼに対するsiRNAが搭載されている融合性リポソーム被覆ケイ酸カルシウム多孔質ケイ素ナノ粒子。
【図１５Ａ−Ｋ】ホモジナイズした、黄色ブドウ球菌(Staph.aureus)感染Balb/C肺におけるカルセイン蓄積のFACSの分析を示す図である。(A)PBS対カルセイン(Cal)が搭載され、かつ標的化ペプチド(MTP)にコンジュゲートされているNF-pSi;(B)PBS対標的化ペプチドを有していない、カルセインが搭載されているF-pSi。(C)PBS対カルセインが搭載され、MTPにコンジュゲートされているF-pSi;(D〜K)DiIを搭載した粒子の蛍光検出をするために画像化した、未染色の健常な肺又は感染肺の組織学的切片。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において、及び添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「一つの(a)」、「及び」及び「その(the)」は、文脈が特に明白に示さない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「一つの細孔(a pore)」と言う場合、複数のこのような細孔を含み、「その抗原(the antigen)」を言う場合、当業者に公知の1つ以上の抗原を言うことを含むなどである。
【００１５】
同様に、「又は」の使用は、特に明記しない限り、「及び/又は」を意味する。同様に、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、「含んでいる(comprising)」、「含む(include)」、「含む(includes)」及び「含んでいる(including)」は、互換性があり、限定を意図するものではない。
【００１６】
様々な実施形態の記載が、用語「含んでいる(comprising)」を使用している場合、当業者は、一部の具体的な例において、ある実施形態が、「から本質的になる(consisting essentially of)」又は「からなる(consisting of)」という言い回しを使用して代替的に記載され得ることを理解していると思われることをさらに理解されたい。
【００１７】
特に定義されない限り、本明細書において使用される技術的及び科学的用語はすべて、本開示が属する、当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものに類似の、又は等価な方法及び物質は、開示されている方法の実施及び組成物において使用され得るが、例示的な方法、装置及び物質が、本明細書に記載されている。
【００１８】
上記及び本文を通じて議論されている出版物は、本出願の出願日の前のそれらの開示を単に提示しているに過ぎない。本明細書において、本発明者らは先行開示によって、このような開示を先行するものとして認めることを承認するものと解釈すべきではない。
【００１９】
インビボでの治療剤の遺伝子送達システムは、効率が低いこと又は細胞毒性があるために、依然として難題である。細胞性エンドサイトーシスは、大部分のナノプラットフォームの主要な取り込み経路であり、遺伝性物質のリソソーム分解及び治療効力の低下をもたらす。
【００２０】
多孔質ケイ素及び酸化ケイ素は、その無機的性質及び生分解性性質のために、多数の用途において、候補薬物の送達用ビヒクル物質として研究されてきた。多孔質ナノ構造は、治療剤、診断剤又は他の有益物質(本明細書では、「ペイロード」と称することがある)を保持することができる。しかし、投与前又は投与後のどちらか一方での、これらのペイロードの早すぎる放出は、所期の目的にとって望ましいものとはなり得ない。さらに、標的部位以外の部位における、水性条件中の多孔質ケイ素又は多孔質酸化ケイ素の分解は、多孔質ケイ素コア周辺の保護被覆から恩恵を受けることができる、持続薬物送達、インビボ又はインビトロでの画像化及びバイオセンサー用途にとって、深刻な問題を引き起こす。
【００２１】
脂質をベースとするナノ粒子は、Doxil(登録商標)という、ドキソルビシン封入リポソームの形態で、30年前に、最初に米国食品医薬品局(FDA)により承認された。急性リンパ芽球性白血病用のビンクリスチン硫酸塩のリポソーム製剤であるMarquibo(登録商標)は、2012年という最近に承認され、EndoTag-1及びSPI-077などのいくつかのパクリタキセル及びシスプラチン製剤が臨床試験中である。リポソーム製剤にこのような絶え間ない投資が行われている理由は、その主な利点である、生体適合性、合成の容易さ及び表面改質性に起因している。
【００２２】
脂質ナノ粒子は、搭載効率の低いこと及びリソソーム分解率が高いことにより、遺伝物質を送達するのは困難である。低分子干渉RNA(siRNA)を搭載した脂質ナノ粒子は、クラスリン媒介性エンドサイトーシス、及びプロトンポンプによるマクロ/マイクロピノサイトーシス、mTOR並びにカテプシン活性化により、細胞によって取り込まれる。取り込まれた後、内在化したsiRNAのおよそ70%は、ナノ粒子を含む脂質が、ニーマン-ピックタイプC1(NPC1)調節により、エンドソーム/リソソーム後期段階において再利用された後、細胞の外にエキソサイトーシスされる。siRNAのわずか1〜2%だけが、早期エンドソームからサイトゾルに逃れることが可能である。したがって、エンドソーム/リソソームの後期における脂質の再利用を迂回する送達システムは、高い治療効力を達成するのに重要である。
【００２３】
ナノ、マイクロ、メソ及びマクロ多孔質ケイ素の電気化学的手段又は化学的手段による調製は、これらの物質の対応するナノ、マイクロ、メソ及びマクロ多孔質酸化ケイ素への部分的な又は完全な変換のいずれかと同様に、十分に確立されている。さらに、リポソームは当分野において公知であり、認識されている。
【００２４】
本開示は、リポソーム-形質膜融合による、エンドサイトーシス取り込みを迂回することができる、生分解性リポソーム多孔質ケイ素(pSi)ナノ粒子システムを提供する(例えば、図1Aを参照されたい)。膜融合により、リポソームのコアから細胞質への親水性ペイロードの直接的な放出、及びリポソーム二重層から細胞膜二重層への疎水性分子の輸送が可能となる。さらに、リポソーム多孔質ケイ素ナノ粒子システムにより、リポソームの外側表面にコンジュゲートされている部分(抗体、低分子、ペプチドなど)の細胞膜の表面への輸送が可能になる。多孔質ケイ素コアは、これらの粒子を時間ゲート化ルミネッセンス画像化を使用する追跡ツールとして使用可能とする、光ルミネッセンス特性を有する。さらに、多孔質ケイ素により、高度に陰イオン性の遺伝物質を小さなクラスターに縮合することが可能になり、これにより、リポソームは、粒子及び粒子の細孔中に含まれる任意のペイロードを容易に封入することが可能になる。本開示は、融合性リポソーム被覆pSi粒子が、細胞の膜と融合して、様々なペイロードを細胞に輸送することを実証する。例えば、本開示は、融合性リポソーム被覆pSi粒子が、Neuro2aマウスの神経芽細胞と首尾よく融合し、リポソーム膜から細胞膜へ、脂溶性DiI色素を輸送することを実証する。対照的に、非融合性pSi粒子は、エンドソームの取り込み及びリソソームの局在化を示す、小さなグループの細胞中に見いだされた。さらに、Neuro2aを標的とする部分である、狂犬病ウイルスグリコタンパク質(RVG)の表面コンジュゲートにより、リポソームpSiの融合速度を加速することができた。総合的に、リポソーム多孔質ケイ素ナノ粒子は、非常に有効な送達用ビヒクルとしての可能性を実証している。
【００２５】
本明細書で使用する場合、用語「マイクロ粒子」又は「ナノ粒子」、「マイクロ及び/又はナノ粒子」、「LPSiNP」及び「pSiNP」は、二酸化ケイ素を少なくとも一部含んでおり、かつ数ナノメートルから100マイクロメートルの範囲のサイズを有する多孔質ケイ素物質を指す。通常、このサイズは、約10〜20nmから1マイクロメートルである。多孔質ケイ素物質/粒子の形状は、球状、楕円形、正方形、長方形、立方形などであってよい。
【００２６】
本明細書では、「多孔質酸化ケイ素」とは、一般的な化学量論式SiOxとなるケイ素及び酸素を含有する物質を指し、xは、0.01まで小さくてもよく、2まで大きくてもよいこと、及び「多孔質ケイ素」とは、水素、酸素又は炭素含有種を含有する表面を有する、元素性ケイ素(その結晶状態又はアモルファス状態のいずれか)で構成される物質を指すことを理解すべきである。本明細書では、用語「多孔質ケイ素」又は「多孔質酸化ケイ素」は、マイクロ細孔(細孔サイズは、通常、約2nm未満である)、メソ細孔(細孔サイズは、通常、約2〜50nmの範囲である)、又はマクロ細孔(細孔サイズは、約50nm超である)、又は3種の細孔タイプの任意の2種又は全部の組合せを含有する物質を指す。さらに、内部細孔壁の表面を含めた、多孔質物質の表面は、水素、酸素又は炭素含有種を含有してもよいことを理解すべきである。
【００２７】
本開示は、細胞又は組織に送達される1つ以上の分子を運搬することができる、多孔質ケイ素マイクロ粒子及び/又はナノ粒子(pSiNP)を提供する。分子は、診断剤及び/又は治療剤とすることができる。一部の実施形態では、分子は、抗がん剤、抗炎症剤、低分子薬、ペプチド、ポリペプチド、核酸(例えば、siRNA)などである。
【００２８】
さらに、多数のマイクロ物質及びナノ物質(例えば、カーボンナノチューブ(CNT)、金ナノ粒子(GN)及び量子ドット(QD))とは対照的に、pSiNPは、毒性の形跡がほとんど又はまったくなしに、比較的短い期間で、腎臓でクリアランスされる構成成分に分解する。さらに、多数の生物学的に誘導された送達システムとは対照的に、ナノ粒子は単独(添加される活性化複合体又は分子を含まない)で、免疫応答を誘発しない。
【００２９】
所望のペイロード(例えば、核酸、ペプチド、低分子など)を含有する多孔質ケイ素マイクロ粒子及び/又はナノ粒子は、リポソーム(融合性又は非融合性)に封入することができる。リポソームは、標的に特異的となるよう修飾され得るか、又は修飾され得ない(例えば、図1を参照されたい)。
【００３０】
したがって、本開示は、リポソームの小胞に封入されたケイ素物質を含む生分解性多孔質マイクロ構造及び/又はナノ構造を提供する。一実施形態では、ケイ素物質は、二酸化ケイ素物質を含む。別の実施形態では、ケイ素物質は、ケイ素物質と二酸化ケイ素物質の両方を含む。別の実施形態では、生分解性/生体適合性多孔質ナノ構造は、約0.01μm〜1μmの間の微粒子サイズを含む。さらに別の実施形態では、生分解性/生体適合性多孔質構造は、非毒性と特徴付けることができる。さらに別の実施形態では、多孔質ケイ素物質は、「ペイロード」物質が搭載されている。ペイロード物質は、薬物、低分子、診断剤、治療剤、ペプチド、抗体、抗体断片、ポリペプチド、核酸(例えば、siRNA)などとすることができる。
【００３１】
本開示はまた、(1)シリコンウェハを電気化学的にエッチングして、多孔質構造化フィルムを生成すること、(2)上記のシリコンウェハ基材から前記多孔質構造化フィルムを剥がすこと、(3)この多孔質フィルムを破壊して、10ナノメートル〜1000ナノメートルの間のサイズのマイクロ粒子及び/又はナノ粒子を生成すること、並びに(4)水溶液中でこの構造を活性化させることを含む、多孔質ケイ素粒子を調製する方法を提供する。一実施形態では、水溶液は純水を含む。一実施形態では、水溶液は、水酸化ナトリウム、過酸化水素又はホウ酸塩を含む。
【００３２】
例えば、多孔質ケイ素ナノ粒子(pSiNP)は、Qinら(その開示が参照により本明細書に組み込まれている、Part. Part. Syst. Charact. 31巻(2号):252〜256頁、2014年)によって記載されている通りに調製することができる。手短に言えば、多孔質ケイ素は、結晶性シリコンウェハの定電流陽極エッチングにより調製される。エッチングされた平面に沿った穿孔が、長期間の定電流エッチングの間に、高電流の低周期パルスによって導入され、高多孔度と低多孔度の交互層が生成する。多孔質ケイ素の層は、希水性HF中、低電流密度のパルスを適用することによりウェハから取り出され、得られた自立性フィルムは、超音波照射によって破壊される。これにより、所定の多孔度及び平均細孔サイズの多孔質ナノ粒子となる。多孔度及び細孔サイズの調節可能性は、その後のペイロード搭載過程の効率を決定する際に有用となる。
【００３３】
ペイロードを用いる実施形態では、多孔質ケイ素粒子は、ペイロード、及び1M以上の濃度の、例えば、塩化カルシウム(CaCl2)溶液を含有する水溶液中に入れることができる。この溶液を混合して、遠心分離により精製すると、カーゴが搭載されたケイ酸カルシウム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子(Ca-pSiNP-カーゴ)となる。対照として、ペイロードを含まない、ケイ酸カルシウム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子(Ca-pSiNP)は、上記と同じ方法であるが、ペイロード溶液の添加を除外して調製することができる。図1B、2〜3は、カーゴ搭載ケイ酸カルシウム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子を例示している。
【００３４】
他の実施形態は、Ca-pSiNPを生成するために使用されてもよいことは当業者に明白であり、一例は、使用された電気化学的エッチングを化学的ステインエッチングに置きかえて多孔質ケイ素コアを生成するものを含み、別の例は、ナノ構造化酸化ケイ素の化学的還元により調製される多孔質ケイ素コアを利用するものである。ステインエッチング法は、ケイ素前駆体としてシリコンウェハの代わりにケイ素粉末、及び電気出力の代わりに化学的酸化剤を使用し、電気化学反応を推進する。いくつかの場合、塩化カルシウムを、硝酸カルシウム、亜硝酸カルシウム、グルコン酸カルシウム又は他のカルシウムイオン源に置きかえることが望ましいことがある。硝酸カルシウム又は亜硝酸カルシウムは、硝酸イオン及び亜硝酸イオンの酸化的性質があるために、塩化カルシウムよりも迅速に多孔質ケイ素を酸化することができる。
【００３５】
一実施形態では、多孔質ケイ素粒子は、発光性とすることができる。本開示は、発光性多孔質Siナノ粒子(LPSiNP)を生成する方法を提供する。本方法は、水性HF/エタノール電解質中に、約200mA/cm2の一定電流密度を適用することによって、p型シリコンウェハの電気化学的エッチングを行うことを含む。得られた、多孔質ケイ素ナノ構造の自立性フィルムは、次に、水性HF/エタノール電解質中で約4mA/cm2の電流パルスを適用することにより結晶性ケイ素基材から取り出される。自立性水素末端多孔質ケイ素フィルムは、続いて、例えば、音波照射により破壊されて、次いでろ過すると、所望の粒子サイズが得られる。ナノ粒子のサイズを選別する他の方法は、遠心分離及びクロマトグラフィーによって行うことができる。ナノ粒子は、脱イオン(DI)水中、又は例えば、ホウ酸塩の水性緩衝液などの他の酸化的水性環境中でさらにインキュベートされて、そのルミネッセンス(例えば、一実施形態では、近赤外の範囲)が活性化される。酸化性の様々な水性緩衝液(又は、中性から塩基性)を使用することができる。一部の実施形態では、水性緩衝液は、水性ホウ酸塩緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水及び水酸化ナトリウムからなる群から選択される。例えば、一実施形態では、ホウ酸塩水性緩衝液が有用である。次に、得られたLPSiNPは、所望の薬剤又は他の因子によりさらに修飾され得るか、又はこれらが搭載され得る。搭載された又は修飾されたLPSiNPは、次に、リポソームにより/リポソーム内に封入され得る。
【００３６】
別の実施形態では、LPSiNP物質は、2〜100nmの細孔サイズの範囲(例えば、5〜10nm、10〜20nm、20〜30nmなど)を有するケイ素の層を最初に生成させることにより生成することができる。ケイ素の層は、エタノール性HF溶液中で、単結晶シリコン基材にエッチングされる。多孔質ナノ構造全体が、電流パルスの適用によって、Si基材から取り出される。自立性水素末端多孔質ケイ素フィルムは、次に、水溶液中に入れられ、例えば、終夜の超音波照射によって、マルチサイズの粒子にまで破壊される。これらの粒子は、所望の場合、次に、ろ過されて(例えば、0.22μmの多孔質ろ過膜、又は他のサイズの分離装置により)、多孔質ケイ素ナノ粒子を得ることができる。例えば、LPSiNPの分離又はサイズ制御は、物理的なフィルターにコロイド状懸濁液を通すことよって、懸濁液の遠心分離によって、電気泳動によって、サイズ排除クロマトグラフィーによって、又は静電的沈殿によって達成することができる。ナノ粒子は、水性の酸化性溶液中でインキュベートされて、そのルミネッセンスが活性化される。
【００３７】
ルミネッセンスの活性化は、水溶液中で行われる。活性化の間に、酸化ケイ素は水素末端多孔質ケイ素表面上で成長し、量子封じ込め効果及びSi/SiO2界面に局在化した欠損に起因する、顕著なルミネッセンスが生じる。ナノ粒子の調製条件は、許容可能な分解速度を維持しながら、治療剤の搭載及び所望のインビボでの循環時間に好適な細孔体積及び表面積をもたらすよう、最適化することができる。
【００３８】
所与のフィルムの厚さ、細孔サイズ及び多孔度は、電流密度、エッチングサイクルの期間、及びエッチング溶液の組成によって制御される。さらに、多孔質ケイ素フィルムは、鋳型として使用されて、生体適合性又は生体再吸収性物質のインプリントを生成することができる。多孔質ケイ素フィルム又はそのインプリントは、正弦曲線状に様々な多孔度勾配を有し、細孔内に捕捉された化学物質の存在又は非存在をモニタリングするために使用することができる、光学反射スペクトルにおいて、際立った特徴をもたらす。
【００３９】
インビボ用途の場合、粒子形態の多孔質Siを調製するのが望ましいことが多い。多孔質層は、「電解研磨」又は「リフトオフ(lift-off)」と一般に呼ばれる手順を用いて、Si基材から取り出すことができる。エッチング用電解質は、低濃度のHFを含有するものに置きかえられ、電流パルスが数秒間適用される。HF濃度がより低いことによって、細孔が増殖できるよりも速く、結晶性Si/多孔質Si界面からケイ素を除去する拡散制限状況をもたらす。結果は、多孔質層のアンダーカットであり、Si基材から多孔質層を放つ。自立性多孔質Siフィルムは、次に、ピンセット又は激しい洗浄によって取り出すことができる。次に、このフィルムは、超音波破壊によってマイクロ粒子に変換することができる。より均一な形状を有する粒子が望ましい場合、慣用的なリソグラフィー法又はマイクロ液滴パターン形成法も使用することができる。
【００４０】
電気化学的エッチング間に細孔サイズ及び体積を容易に調節する能力は、薬物送達用途にとって非常に有用な多孔質Siの特有の特性である。他の多孔質物質には、一般に、細孔サイズを制御するために、一層複雑な設計プロトコルが必要とされ、その場合でさえも、入手可能な細孔サイズは、限定された範囲に及ぶ傾向がある。電気化学的に調製された多孔質Siの場合、多孔度及び細孔サイズの制御は、エッチング中の電流設定を調節することにより得られる。通常、電流密度が大きいほど、より大きな細孔を生成する。細孔内にかなり大きな分子又は薬物を取り込ませる場合、大きな細孔が望ましい。細孔サイズ及び多孔度は、薬物搭載にとって重要なばかりではなく、多孔質Siホストマトリックスの分解速度も決定づける。
【００４１】
細孔が小さいほどより広い表面積をもたらし、水性媒体の攻撃に、より多くの部位がさらされる。フィルム内部のより小さな多孔質フィラメントは、より大きな溶出速度をもたらし、多孔質Siホストの分解速度を制御する従来的な手段を実現する。
【００４２】
多孔質Siの表面積が大きい場合、多孔質Siは、空気又は水による酸化を特に受けやすい。一旦酸化されると、ナノ相のSiO2は、水性媒体に容易に溶解し、界面活性剤又は求核剤は、この過程を促進する。Si-O結合は、酸化によって、多孔質Si上で容易に調製され、様々な化学酸化剤又は電気化学酸化剤を使用することができる。空気中の熱酸化は、特に、反応が>600℃で行われる場合、比較的安定な酸化物を生成する傾向がある。通常、室温で行われるオゾン酸化は、水性媒体に速やかに溶解する、より水和された酸化物を形成する。
【００４３】
ジメチルスルホキシド(DMSO)による多孔質Si表面のゆっくりとした酸化は、HFによって新規に形成される酸化物の溶出に関わる場合、多孔質Siフィルム中の細孔を大きくする温和な手段となる。KOHなどの塩基の水溶液を使用して、エッチング後に、細孔を大きくすることもできる。多孔質Si試料がH2SO4などの無機酸の存在下で陽極酸化される、電気化学的酸化は、かなり安定な酸化物を生じる。酸化により、多孔質構造に親水性が付与され、これにより、細孔内への親水性薬物又はバイオ分子の取り込み及び吸着が可能になる。Ca2+を含めた様々なイオンの存在下での水中での酸化により、生物活性を示し、かつインビボ用途にとって特に関心のもたれる多孔質Siの石灰化形態が生じる。石灰化は、直流電流の適用によって増強することができる。
【００４４】
本開示の融合性リポソーム被覆ナノ粒子は、薬物送達向け、並びに組織及び疾患(例えば、腫瘍)のモニタリング用の装置及び方法を提供する。融合性リポソーム被覆ナノ粒子組成物の薬物送達は、状態、組織又は処置されるがんのタイプに応じて、いかなる数の候補薬物も含むことができる。候補薬物は、ケイ素粒子の細孔内に「物理的に」捕捉されてもよく、又は細孔自体が、化学的に修飾されて候補薬物に結合してもよい。このような薬物は、一般的な意味において、ペプチド、ポリペプチド、低分子作用剤、核酸及びそれらの組合せを含むことができる。
【００４５】
より具体的には、「物理的な捕捉」とは、瓶中で船を建築することに似ており、この場合、「船」は候補薬物であり、「瓶」は、多孔質Si粒子中のナノメートルスケールの細孔である。低分子は、この分子の周辺の多孔質Siを酸化することによって多孔質マトリックス中に捕捉され得る。ケイ素の酸化により、物質にSi原子あたり2個の酸素原子が付与されるので、酸化時にマトリックスの体積が顕著に増加する。これは、細孔壁の膨潤効果及び細孔内部の自由体積の収縮効果を有しており、適切な条件下では、細孔中に存在する分子は、酸化の間に、酸化物マトリックス中に捕捉されるようになる。捕捉過程の一実施形態は、捕捉過程の間に起こる活性成分の濃度の向上である。結晶は、負に帯電している環境を提供し、タンパク質及び別の薬物などの活性成分は、結晶中では、溶液中の活性成分の自由濃度よりもかなり高いレベルにまで濃縮され得る。結晶を伴う場合、これは、10〜100倍又はそれ以上の活性成分の濃度の上昇をもたらし得る。酸化は、層化酸化を行うことにより、時間間隔を繰り返して行うことができる。例えば、生物剤又は薬物は、酸化物を制御して添加することにより、細孔中に捕捉され得る。新しく調製された(水素化物末端)多孔質Si物質の酸化は、細孔の効率的な収縮をもたらす。これは、形成される酸化ケイ素が、Si出発原料よりも大きな体積を有するために起こる。薬物が、酸化剤を含有する溶液中にやはり存在している場合、この薬物は細孔中に捕捉された状態になる。さらに、多孔質酸化ケイ素は、酸化されていないSiヒドリド物質よりも、高い濃度の生物剤又は薬物を含むことができる。
【００４６】
多孔質Siフィルム中の自由体積は、通常、50〜80%の間である。酸化は、この値をいくらか低下させるはずであるが、自由体積は、かなり高いままであることが予想される。現在の薬物送達用物質の大部分は、密度の高い固体であり、重量基準で少量の割合の薬物を送達することが可能である。
【００４７】
多孔質Siホストに分子ペイロードを搭載するための様々な手法が探索されており、それらは、以下の一般的な分類:共有結合、物理的捕捉及び吸着に分類することができる。
【００４８】
共有結合は、バイオセンサー用途の場合に、多孔質Siの細孔の内壁に生体分子の捕捉プローブを連結させる従来的な手段を提供し、この手法はまた、薬物分子、ペプチドなどを結合するために使用することもできる。本明細書のどこかに記載されている通り、Si-C結合を介したバイオ分子の連結は、Si-O種が求核攻撃を受けやすいために、Si-O結合を使用するよりも安定な経路となる傾向がある。
【００４９】
より一般的な手法の1つは、末端アルケンの遠位末端上にカルボキシル種を含有する有機分子をグラフトすることである。アルケン末端は、ヒドロシリル化反応に関与し、Si表面に結合して、さらなる化学修飾のためのカルボキシ末端をそのまま残す。このようなリンカー分子の1つはウンデシレン酸であり、この酸は、炭素10個の疎水性脂肪族鎖をもたらし、多孔質Si表面からリンカーを隔離する。薬物ペイロードは、アルケンのカルボキシ基に直接、結合することができ、又はPEGリンカーにより、表面からさらに隔離することもできる。Si-C結合の安定性のために、ヒドロシリル化は、多孔質Siにペイロードを結合させる良好な方法である。共有結合が切断されるか、又は支持多孔質Siマトリックスが分解すると、ペイロードだけが放出される。
【００５０】
さらに別の実施形態では、静電的吸着、すなわち分子を一層弱く保持する実質的なイオン交換機構を使用することができる。静電気は、数日、数週又は数カ月の期間にわたり薬物を放出する共有結合手法又は物理的捕捉手法とは反対に、一層迅速な薬物送達をもたらす有用な手段である。
【００５１】
特定の分子に対する多孔質Si粒子の親和性は、表面化学により制御され得る。酸化された多孔質Siの表面は、pHが約2では電荷ゼロの点を有しており、そうして、対象とする大部分の水溶液に、負に帯電している表面を提供する。この方法において、適切なpHでは、多孔質SiO2は、血清アルブミン、フィブリノーゲン、タンパク質A、免疫グロブリンG(IgG)又はホースラディッシュペルオキシダーゼなどの正に帯電しているタンパク質を自発的に吸着して、それらを濃縮する。
【００５２】
ケイ酸カルシウム多孔質ケイ素コアは、高い搭載効率を有する陰イオン性の遺伝子のペイロードの濃縮と、粒子追跡を可能にする光ルミネッセンスの発光という2つの役割をもたらすのに有用である。ケイ酸カルシウムは陽イオン性であり、これにより、陰イオン性ヌクレオチドとの強力な静電相互作用が可能になり、遺伝子及び粒子の安定なクラスターが形成される。ケイ酸カルシウムpSiNPの別の態様は、リポソームの被覆が、取り込み時に膜融合によって剥がされる際の、細胞内の環境における迅速な分散及び分解である。細胞は異物を不能なものと認識するので、ヌクレオチドペイロードからの濃縮物の遅延分離又は分解により、クラスター全体の排出が起こり得る。データより、コアケイ酸カルシウムpSiを含有する融合性粒子は、細胞質中にリポソームの保護がないと、急速に分解して光ルミネッセンスを喪失することが実証された。一方、非融合性粒子は、エンドソーム及びリソソーム内で無傷のままとなって、pSi光ルミネッセンスを保持する。ケイ酸カルシウムpSiNPの急速な分解により、例えば、siRNAが細胞質に放出されて、RNA干渉及び遺伝子サイレンシングを受けることが可能になる。
【００５３】
多孔質Siはまた、疎水性とすることができ、ステロイドであるデキサメタサゾン又は血清アルブミンなどの疎水性分子は、これらのナノ構造に搭載することができる。親水性分子はまた、適切な界面活性剤の補助によって、このような物質に搭載することもできる。多孔質Siの天然の水素化物表面は疎水性である。このような技法は、短期間の搭載及び放出に使用されてきた。水は、これらの疎水性表面から排除されるので、水による分解及びリーチング反応は遅くなる傾向がある。ヒドロシリル化による表面へのアルカンのグラフト化は、生体媒体中で安定な物質を調製するために一般に使用される。この安定性は、大部分が、水又は溶解している求核剤を局所的に排除する疎水性部分の能力に由来している。
【００５４】
本開示の多孔質ケイ素粒子と共に使用することができる別の薬物(例えば、カーゴ)又は「活性成分」は、以下の、血管新生カスケードにおける、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ペガプタニブ及び他の化合物などの抗血管新生化合物のうちのいずれか1つ又は任意の組合せを含むが、これらに限定されない。例えば、化学治療的化合物及び/又はその誘導体(例えば、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、シスプラチン、ドキシルビシン(doxyrubicin)、アドリアマイシン、タモシフェンなど)などの抗がん薬。同様に、デキサメタサゾン、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノロンアセトニドなどのグルココルチコステロイド、並びにコルチコステロイド及びコルチセン(cortisene)ファミリーにおける他の同等な化合物も含まれる。同様に、制酸薬、抗炎症性物質、冠動脈拡張薬、脳血管拡張薬(cerebral dilator)、末梢血管拡張薬、抗感染薬、向精神薬、抗躁薬、刺激薬、抗ヒスタミン、緩下剤、充血除去薬、ビタミン剤、胃腸鎮静薬、止瀉調製物、抗狭心症薬、血管拡張薬、抗不整脈薬、抗高血圧薬、血管収縮薬及び偏頭痛処置剤、抗凝固剤及び血小板凝集阻害薬、鎮痛剤、解熱剤、催眠薬、鎮静薬、制吐薬、抗嘔吐薬、抗けいれん薬、神経筋薬(neuromuscular drug)、血糖上昇剤及び血糖下降剤、甲状腺及び抗甲状腺調製物、利尿薬、鎮痙薬、子宮弛緩薬、ミネラル及び栄養添加剤、抗肥満症薬、同化薬、エリスロポエチン薬、抗喘息薬、気管支拡張薬、去痰薬、鎮咳薬、粘液溶解薬、石灰化及び骨のターンオーバーに影響を及ぼす薬物並びに抗尿酸血症薬などの化合物が含まれる。特定の薬物には、メトクロプラミド及び臭化プロパンテリンなどの胃腸鎮静薬;三ケイ酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ラニチジン及びシメチジンなどの制酸薬;フェニルブタゾン、インドメタシン、ナプロキセン、イブプロフェン、フルルビプロフェン、ジクロフェナク、デキサメタサゾン、プレドニゾン及びプレドニゾロンなどの抗炎症性薬;三硝酸グリセリル、二硝酸イソソルビド及び四硝酸ペンタエリスリトールなどの冠動脈拡張薬;ソロクチジルム、ビンカミン、シュウ酸ナフチドロフリル、メシル酸コデルゴクリン(co-dergocrine mesylate)、シクランデレート、パパベリン及びニコチン酸などの末梢血管及び脳血管拡張薬;エリスロマイシンステアリン酸塩、セファレキシン、ナリジクス酸、テトラサイクリン塩酸塩、アンピシリン、フルクロキサシリンナトリウム、ヘキサミンマンデル酸塩及びヘキサミン馬尿酸塩などの抗感染薬;フルラゼパム、ジアゼパム、テマゼパム、アミトリプチリン、ドキセピン、炭酸リチウム、硫酸リチウム、クロルプロマジン、チオリダジン、トリフルペラジン、フルフェナジン、ピペロチアジン、ハロペリドール、マプロチリン塩酸塩、イミプラミン及びデスメチルイミプラミンなどの神経弛緩薬;メチルフェニデート、エフェドリン、エピネフリン、イソプロテレノール、アンフェタミン硫酸塩及びアンフェタミン塩酸塩などの中枢神経刺激薬;ジフェンヒドラミン、ジフェニルピラリン、クロルフェニラミン及びブロムフェニラミンなどの抗ヒスタミン薬;ビサコジル及び水酸化マグネシウムなどの止瀉薬;緩下薬であるスルホコハク酸ジオクチルナトリウム;アスコルビン酸、アルファトコフェロール、チアミン及びピリドキシンなどの栄養補助剤;ジシクロミン及びジフェノキシレートなどの鎮痙薬;ベラパミル、ニフェジピン、ジルチアゼム、プロカインアミド、ジソピラミド、トシル酸ブレチリウム、キニジン硫酸塩及びキニジングルコン酸塩などの心臓の心拍に影響を及ぼす薬物;プロプラノロール塩酸塩、グアネチジン一硫酸塩、メチルドーパ、オキシプレノロール塩酸塩、カプトプリル及びヒドララジンなどの高血圧の処置に使用される薬物;エラゴタミンなどの偏頭痛の処置に使用される薬物;イプシロンアミノカプロン酸及びプロタミン硫酸塩などの血液の凝固性に影響を及ぼす薬物;アセチルサリチル酸、アセトアミノフェン、コデインリン酸塩、コデイン硫酸塩、オキシコドン、ジヒドロコデイン酒石酸塩、オキシコデイノン、モルフィネ、ヘロイン、ナルブフィン、ブトルファノール酒石酸塩、ペンタゾシン塩酸塩、シクラザシン、ペチジン、ブプレノルフィン、スコポラミン及びメフェナム酸などの鎮痛薬;フェニトインナトリウム及びバルプロ酸ナトリウムなどの抗てんかん薬;ダントロレンナトリウムなどの神経筋薬;トルブタミド、ジスベナーゼグルカゴン(disbenase glucagon)及びインスリンなどの糖尿病の処置に使用される物質;トリヨードチロニン、チロキシン及びプロピルチオウラシルなどの甲状腺機能不全の処置に使用される薬剤;フロセミド、クロルタリドン、ヒドロクロルチアジド、スピロノラクトン及びトリアムテレンなどの利尿薬;子宮弛緩薬であるリトドリン;フェンフルラミン塩酸塩、フェンテルミン及びジエチルプロプリオン塩酸塩などの食欲抑制剤;アミノフィリン、テオフィリン、サルブタモール、オルシプレナリン硫酸塩及びテルブタリン硫酸塩などの抗喘息薬又は気管支拡張薬;グアイフェネシンなどの去痰薬;デキストロメトルファン及びノスカピンなどの制咳剤;カルボシステインなどの粘液溶解薬;塩化セチルピリジニウム、チロトリシン及びクロルヘキシジンなどの消毒薬;フェニルプロパノールアミン及びシュードエフェドリンなどの充血除去薬;ジクロラールフェナゾン及びニトラゼパムなどの睡眠薬;プロメタジンテオクレートなどの抗嘔吐薬;硫酸第一鉄、葉酸及びグルコン酸カルシウムなどの造血薬;スルフィンピラゾン、アロプリノール及びプロベネシドなどの尿酸排泄促進薬;並びにビホスホネート、例えばエチドロネート、パミドロネート、アレンドロネート、レシドロネート、テルドロネート、クロドロネート及びアロンドロネートなどの石灰化作用剤が含まれる。
【００５５】
本開示が実質的に無制限の数の薬物を含めて企図される限り、インビトロでの薬物動態検討を使用して、各薬物に対する多孔質ケイ素粒子の適切な形態を決定することができる。薬物をコンジュゲートしたケイ素粒子は、一旦、対象に送達されると、モニタリングすることができる。例えば、発光性ケイ素ナノ粒子(LPSiNP)からの光の強度は、低出力分光光度計を使用して測定することができる。このような方法を使用して、薬物及び/又はLPSiNPの半減期、送達及び集積をモニタリングすることができる。
【００５６】
粒子の識別に使用されるルミネッセンススペクトルは、CCD分光計又はダイオードレーザー干渉計などの高価ではない携帯用機器を用いて容易に測定することができる。LPSiNPからの薬物の除去は、スペクトルにおける波長のシフトとして、LPSiNPのルミネッセンスの変化をもたらすことができる。このような技法を使用して、不透明な組織の非侵襲的検出を可能にすることができる。
【００５７】
上述の実施形態のいずれかにおいて、カーゴ(例えば、薬物若しくは作用剤が搭載されるか又はそれらに結合された)を運搬するケイ素粒子又はいかなる作用剤も含まないケイ素粒子、及び/あるいは粒子が蛍光性又は非蛍光性であるケイ素粒子は、細胞膜との融合に好適なリポソームに封入される(例えば、融合性リポソーム)。さらに、これらのリポソームは、修飾されていてもよく、又は修飾されていなくてもよい。修飾されている場合、この修飾は、本明細書においてさらに記載されている通り、標的化部分を含むことができる。
【００５８】
融合性リポソーム製剤は、任意の数の既知の脂質から調製することができる。リポソームの小胞は、複数の脂質から作製することができ、この場合、リポソームは、10〜500nmの間の直径、又はそれらの間の任意の直径(例えば、20〜400、50〜300、60〜250、100〜200、120〜180、140〜160nmなど)を有する。さらなる実施形態では、リポソームは、単層ラメラリポソーム又はミセルである。別の実施形態では、リポソームは、多層ラメラリポソームである。別の実施形態では、複数の脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルコリン、及び/又はそれらの任意の誘導体から選択されるリン脂質を含む。さらに別の実施形態では、リン脂質誘導体は、1,2-ジ-(3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート、1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジリノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1'-rac-グリセロール)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、L-α-ホスファチジル-DL-グリセロール、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール、卵スフィンゴミエリン、卵PC、水素化卵PC、水素化大豆PC、1-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-ミリストイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ3-ホスホコリン、1-ミリストイル-2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-パルミトイル-2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール、1-パルミトイル-2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-ステアロイル-2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-ステアロイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、及び/又は1-ステアロイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-��スホコリンから選択される。さらなる実施形態では、リポソームは、コレステロールをさらに含む。さらに別の実施形態では、リポソームは、ポリエチレングリコールをさらに含む。例えば、一実施形態では、融合性リポソーム製剤は、76.2:3.8:20のモル比の1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](DSPE-PEG)及び1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)から調製することができる。実験対照に関しては、非融合性製剤は、同じ方法であるが、80:0:20(すなわち、PEGがない)のモル比で合成することができる。DSPE-PEG(メトキシ)は、標的化部分などによりさらに表面修飾するための、カルボン酸-(DSPE-PEG(カルボキシ))又はマレイミド-(DSPE-PEG(マレイミド))官能基化PEG脂質を用いて、同じモル比で置きかえることができる。例えば、DSPE-PEG(カルボキシ)又はDSPE-PEG(マレイミド)の使用は、それぞれ、抗体又は標的化ペプチドにより修飾するのに有用である。別の実施形態では、リポソームは、1つ以上の部位標的化部分をさらに含む。部位標的化部分の例には、以下に限定されないが、ペプチド、アプタマー、抗体及び抗体断片(例えば、F(ab')2、Fab及びscFv)が含まれる。
【００５９】
用語「脂質」は、脂質物質の疎水性部分が二層の方向に向く一方、親水性部分が水相の方向に向くよう、二層となる任意の好適な物質を指す。両親媒性脂質は、一次脂質小胞の構造上の要素として使用される。親水特性は、ホスファト基、カルボン酸基、スルファト基、アミノ基、スルフィドリル基、ニトロ基及び他の同様の基の存在から誘導される。疎水性は、以下に限定されないが、長鎖の飽和及び不飽和脂肪族炭化水素基、及び1つ以上の芳香族、脂環式又は複素環式基により置換されているこのような基を含む基を含ませることによって付与され得る。典型的な両親媒性化合物は、ホスホグリセリド及びスフィンゴ脂質であり、これらの代表例は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン又はジリノレオイルホスファチジルコリンを含む。スフィンゴ脂質及び糖スフィンゴ脂質ファミリーなどのリンのない他の化合物も、脂質として表される群の範囲内にある。さらに、上記の両親媒性脂質は、トリグリセリド及びステロールを含めた他の脂質と混合されてもよい。
【００６０】
用語「中性脂質」は、生理的pHにおいて、電荷を帯びていないか又は中性の双性イオン形態で存在する、いくつかの脂質種のいずれかを指す。このような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン及びセレブロシドが含まれる。
【００６１】
用語「非陽イオン性脂質」とは、上記の任意の中性脂質、及び陰イオン性脂質を指す。陰イオン性脂質の例には、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン及びジアシルホスファチジン酸が含まれる。
【００６２】
用語「陽イオン性脂質」は、生理的pHにおいて、正味の正電荷を有する、いくつかの脂質種のいずれかを指す。このような脂質には、以下に限定されないが、DODAC、DOTMA、DDAB、DOTAP、DC-Chol及びDMRIEが含まれる。さらに、本開示において使用することができる陽イオン性脂質のいくつかの商業的調製物が入手可能である。これらの担体は、PEG修飾された脂質、特に、PEG修飾されたセラミド脂質の添加によって改善される。PEG修飾脂質の添加は、粒子の凝集を防止し、循環寿命を向上する、及び標的細胞への脂質-核酸粒子の送達を向上する手段をもたらす。さらに、陽イオン性脂質は、標的細胞とより容易に融合し、したがって、電荷が中性のPEG修飾セラミド脂質を添加しても、担体であるリポソームの正電荷をマスク又は減少させないことが見いだされた。
【００６３】
リポソームの製剤に有用な例示的な脂質は、以下を含むが、以下に限定されない:
【００６４】
【化１】
2018519347.tif 000003
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)、
【００６５】
【化２】
2018519347.tif 000004
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、
【００６６】
【化３】
2018519347.tif 000005
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](PE-PEG2000(メトキシ))、
【００６７】
【化４】
2018519347.tif 000006
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[マレイミド(ポリエチレングリコール)-2000](DSPE-PEG2000(マレイミド))、
【００６８】
【化５】
2018519347.tif 000007
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[カルボキシ(ポリエチレングリコール)-2000](DSPE-PEG2000(カルボキシ))。
【００６９】
一般に、クロロホルムに溶解した脂質を混合し、溶媒を蒸発させて、乾燥フィルムを生成する。疎水性ペイロードがリポソーム膜に埋め込まれる実施形態では、疎水性ペイロード溶液は、一緒にフィルムに乾燥されることになる脂質溶液と混合される。ペイロードが捕捉された多孔質ケイ素をベースとするコアを使用して、穏やかなピペット操作により、融合性リポソームフィルムを水和させる。この混合物は、リポソームの形成を示す、濁りに転じる。一部の実施形態では、この混合物は、約40℃で10分間加熱した後、例えば、200nmの細孔を有するポリカーボネート膜により、20回、機械的な押出成形を受けることができる。過剰のペイロードは、脱イオン水を用いて遠心分離によって3回洗い落とされる。図1B〜Dは、リポソーム多孔質ケイ素ナノ粒子の合成の概略図を例示している。図1Eは、本開示の融合性リポソーム多孔質ケイ素マイクロ粒子及び/又はナノ粒子組成物の概略図を図示している。
【００７０】
通常、リポソーム被膜は、前融合性(pro-fusogenic)脂質及び部分で構成される。例えば、DMPCは、比較的低い相転移温度(Tm=24℃)を有する、リポソームの構造主鎖として働くことができる。低い転移温度は、室温及び身体温度において、Lα液晶相をもたらす。Lα相は、押し出したリポソーム被膜を幅広いサイズ範囲(100〜400nm)にすること、及び融合可能性を一層容易にすることを可能にする、一層流動性のある動的な透過性構造である。DOTAPは、陰イオン性形質膜に対する静電引力に有用な陽イオン性脂質である。PEG化脂質はまた、融合に有用であった。PEGの正確な機械的役割は、依然として知られてないが、PEGは、静電的に水分子と結合して、脂質の頭部基から水分を取り除くと仮説が立てられ、これにより、脂質配列における構造的な非対称性がもたらされ、SNAREタンパク質が固定される方法に類似したエネルギー的に有利な経路として、二重葉状から単一葉状の融合を推進し、小胞を形質膜と内生的に合体させる。実際、ニューロンのSNAREは、PEG媒介性融合を促進することが観察された。
【００７１】
ケイ素粒子を封入するリポソームの層は、リポソームの層の表面又はその中に、標的化部分(ペプチド、アプタマー、抗体、抗体断片、糖又は糖脂質)を拘束することにより、部位標的化するよう適合させることができ、これにより、ケイ素粒子及びそのカーゴは、選択的に所望の部位に導かれ、これにより、局所薬物送達及び治療効果を促進することができることが、本明細書においてさらに企図される。例えば、スルフィドリル反応性基、マレイミド、ハロアセチル、ピリジルジスルフィド、チオスルホネート及びビニルスルホン;カルボキシルからアミン反応性基(カルボジイミドなど(例えば、EDC));アミン反応性基(NHSエステル、イミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ヒドロキシルメチルホスフィンなど);アルデヒド反応性基(ヒドラジド及びアルコキシアミンなど);光反応性基(ジアジニン及びアリールアジドなど);及びヒドロキシル(非水性)反応性基(イソシアネートなど)などの、様々な反応性基を使用して、本明細書において開示されているリポソームを構成する脂質に標的化基を拘束することができる。
【００７２】
リポソームの表面に結合された標的化部分は、約125〜200ダルトンの分子量の小さなハプテンから、少なくとも約6kDであるが一般には106kD未満の分子量を有するより大きな抗原までと様々であってもよい。タンパク質性のリガンド及び受容体について特に関心がもたれる。リポソームに含有されているケイ素粒子に取り込まれた薬剤/カーゴは、その作用において、細胞タイプに関して無差別となり得るので、標的化送達システムは、無作為に注射される非特異的リポソームよりも顕著な改善をもたらす。
【００７３】
いくつかの手順を使用して、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のどちらかをリポソーム二重層に共有結合させることができる。抗体標的化リポソームは、標的細胞上の抗原性エピトープに効率的に結合する限り、モノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体、又はscFV、Fab若しくはF(ab')2などのそれらの断片を含むことができる。
【００７４】
上記の通り、本開示はまた、融合性リポソーム被覆ナノ粒子が標的化部分/分子を含む実施形態も提供する。標的化部分/分子は、以下に限定されないが、その対応する標的、例えば細胞表面上の受容体又は抗原に特異的に結合するリガンド又は抗体(抗体断片を含む)を含むことができる。したがって、例えば、標的化分子が抗体又はその断片である場合、融合性リポソーム被覆ナノ粒子は、抗体又は抗体断片が向けられるエピトープを有する細胞及び組織に特異的に結合する(標的とする)ことになろう。したがって、標的化分子は一般に、標的細胞上の受容体又はポリペプチド(例えば、それは同族対である)と反応するか、又はそうでない場合、それらを認識する若しくはそれらに結合することが可能なすべての分子を指す。任意の公知のリガンド又は標的化分子を使用することができる。融合性リポソーム被覆ナノ粒子を生成するよう操作されてクローニングされ得る、又は融合性リポソーム被覆ナノ粒子を生成するよう連結され得る、標的化ペプチドの例は、文献中にたくさんある。一般に、リガンドの受容体結合性シークエンスに基づく、いかなるペプチドリガンド又はその断片も使用することができる。免疫学では、このようなペプチドドメインはエピトープと呼ばれ、エピトープという用語は、受容体により認識されるリガンドを指すために本明細書において使用することができる。例えば、リガンドは、便宜上、受容体と呼ばれる、標的細胞の表面上の結合パートナーによって認識されるタンパク質又はペプチドのシークエンスを含む。しかし、本開示の目的のために、用語「受容体」は、シグナル伝達受容体(例えば、ホルモン、ステロイド、サイトカイン、インスリン及び他の増殖因子の受容体)、認識分子(例えば、MHC分子、B-又はT-細胞受容体)、栄養素取り込み受容体(トランスフェリン受容体など)、レクチン、イオンチャネル、接着性分子、標的細胞の表面に局在して接近可能な細胞外マトリックス結合タンパク質などを包含することを理解すべきである。
【００７５】
様々な細胞タイプが標的とされ得る。例えば、白血球を含む抗原提示細胞(APC)は、APC上の標的を認識する標的化分子を含む、融合性リポソーム被覆ナノ粒子を作製することにより標的とされ得る。操作では、融合性リポソーム被覆ナノ粒子は、標的物に結合し、膜と融合し、細胞により内在化され、ナノ粒子の内容物を細胞内に放出する。標的とされ得る、又は標的化部分として使用することができる受容体の例は、例えば、以下の受容体、又は以下のための受容体を含む:E-セレクチン、CD3、CD4、CD8、CD11、CD14、CD34、CD123、CD45Ra、CD64、E-カドヘリン、ICAM-1、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、E-カドヘリン、Fc、MCH、CD36及び他のインテグリン、ケモカイン、マクロファージマンノース受容体、並びに他のレクチン受容体、B7、CD40、CD50、CD80、CD86、並びに他の共刺激分子、Dec-205、スカベンジャー受容体及びtoll受容体。Guermonprezら(Annu. Rev. Immunol.、2002年)も参照されたい。
【００７６】
本明細書において提供される様々な実施形態は、一般に、ウイルス及び細菌感染、がん、腫瘍、並びに他の細胞増殖性疾患及び障害、炎症性疾患及び障害、並びに組織損傷を含めた、様々な疾患若しくは障害の処置又は診断用のカーゴを送達することができる、薬物送達装置を製造するためのシステム及び方法を対象としている。さらに、本開示は、薬物送達を向上させる、又は薬物作用を促進する、又は本開示のケイ素ナノ粒子と関連する免疫原プロセッシングを改善する免疫化技法を提供する。このような方法は、樹状細胞及び他の炎症性細胞の活性化、並びに免疫応答の刺激を含むことができる。
【００７７】
ケイ素ナノ粒子及び/又はマイクロ粒子を封入するリポソームを含む組成物は、経腸送達用、非経口送達用、局所送達用、又は吸入用に製剤化され得る。本開示のリポソーム含有ケイ素粒子は、当分野において公知の技法を使用して、インビトロ及びインビボで投与するために製剤化することができる。
【００７８】
本開示の医薬組成物は、その所期の投与経路と適合するよう製剤化される。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口(例えば、吸入)、経皮(局所)、経粘膜及び直腸投与が含まれる。非経口、皮内又は皮下施用するために使用される溶液又は懸濁液は、以下の構成成分:注射用水、生理食塩水溶液、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤;ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤;アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤;酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝剤及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張度を調節するための作用剤を含むことができる。pHは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基を用いて調節することができる。非経口調製物は、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ又は多回用量バイアル中に入れることができる。
【００７９】
注射可能な使用に好適な医薬組成物は、滅菌用注射溶液又は分散液の即時調製用の滅菌水溶液(水に可溶な場合)又は分散液及び滅菌粉末を含む。静脈内投与の場合、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL(商標)(BASF、Parsippany、N.J.)又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む。すべての場合において、本組成物は滅菌でなければならず、シリンジによって投与するのが容易な程度の流体であるべきである。本組成物は、製造及び保管の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から守られねばならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど)、及び好適なそれらの混合物を含有する溶媒又は分散媒体とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用により、分散液の場合、必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、組成物中に、糖、マニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを含ませるのが有用である。注射可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる作用剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを本組成物中に含ませることにより引き起こすことができる。
【００８０】
滅菌用注射溶液は、リポソームケイ素粒子組成物、例えば、本明細書に開示されている組成物を、上で列挙した成分の1つ又は組合せとともに、適切な溶媒中に必要な量で、組み込み、必要に応じて、ろ過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散液は、基礎分散媒体及び上で列挙されているものからの必要な他の成分を含有する、滅菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことにより調製される。滅菌用注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、活性成分と既に滅菌ろ過されているその溶液に由来する任意の追加的な所望の成分との粉末を生じる、真空乾燥及び凍結乾燥である。
【００８１】
特定の実施形態では、本開示の1つ以上のリポソーム製剤は、ポリエチレングリコール、インプラント及びマイクロ封入された送達システムの使用を含めた、放出制御製剤などの、身体から迅速に排出されることから化合物を保護する担体と一緒に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の調製方法は、当業者に明白であるはずである。これらの物質は、Alza Corporation及びNova Pharmaceuticals,Inc.から商業的に入手することもできる。
【００８２】
細胞培養物アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための範囲の投与量を策定するのに使用することができる。用量は、動物モデルにおいて製剤化されて、細胞培養物において決定されるIC50(例えば、症状の半数阻害を実現する試験化合物の濃度)を含む、循環血漿中濃度の範囲を実現することができる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量を一層正確に決定するために使用することができる。本開示の方法及び組成物は、幅広い範囲の種、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラット及びマウスに適用可能である。
【００８３】
本明細書において開示されているリポソームケイ素粒子組成物及び製剤は、前記製剤を含む医薬組成物を含めて、細胞に、ペプチド、低分子、核酸(例えば、siRNA)の送達を必要とする任意の数の疾患又は障害を処置するために使用することができる。
【実施例】
【００８４】
以下の実施例は、本発明を例示するために提示されており、限定するためではない。これらの実施例において使用される科学的方法の様々なパラメータは、以下に詳細に記載されており、一般に、本発明を実施するための指針を提供する。
【００８５】
融合性ケイ素ナノ粒子の合成
融合性リポソームフィルムは、1.25mg/mlの(2Z)-2-[(E)-3-(3,3-ジメチル-1-オクタデシルインドール-1-イウム-2-イル)プロプ-2-エニリデン]-3,3-ジメチル-1-オクタデシルインドール(DiI)21μLを一緒に添加して、76.2:3.8:20のモル比のDMPC:DSPE-PEG:DOTAPの混合物の脂質溶液を用いて作製した。
【００８６】
多孔質ケイ素ナノ粒子(pSiNP)は、エタノール性HF水溶液中で単結晶シリコンウェハを電気化学的にエッチングし、次いで、多孔質層の除去及び超音波破壊をすることにより調製した。
【００８７】
このリポソームの混合物を乾燥してフィルムにし、多孔質ケイ素、又はケイ酸カルシウムを堆積させた多孔質ケイ素ナノ粒子の溶液により水和した。水和した懸濁液を磁気撹拌下、20分間、40℃まで加熱し、200nmの細孔を有するポリカーボネート膜により、20回、機械的に押し出した。
【００８８】
図1B〜Hは、粒子の合成の概略図及び特徴付けデータを示している。融合性リポソーム被覆pSi(F-pSi)の散乱データ及び顕微鏡データにより、流体力学的直径がおよそ190nmであることが確認される。図1E〜Fは、透過型電子顕微鏡(TEM)による粒子の特徴付けを示す。
【００８９】
多孔質ケイ素粒子への薬物搭載
siRNAペイロードは、ケイ酸カルシウムの封入化学により、およそ20重量%の搭載効率までpSiコアクラスター内に搭載した。脂質をベースとするナノ粒子及びメソ多孔質シリカ-ポリマーハイブリッド系などの、他のオリゴヌクレオチドを搭載したナノプラットフォームは、平均で1〜14重量%の搭載効率を有する(表1)。特に、同等のサイズである200nmの粒子は、これらの物質中に5重量%未満しか搭載することができない。したがって、本開示の融合性多孔質ケイ素粒子は、オリゴヌクレオチドの搭載効率が4倍、増加していることを実証しており、ひいては、これにより、細胞の遺伝子ノックダウン有効性が増強され得る。
【００９０】
【表１】
2018519347.tif 000008
【００９１】
融合性粒子のインビトロでの取り込み挙動
Neuro2a細胞は、融合性リポソーム及び非融合性リポソームと共に1時間、インキュベートし、共焦点顕微鏡下で視覚化した。融合性粒子は、リポソーム膜から形質膜に脂溶性DiIを輸送して、細胞の輪郭を染色する一方、非融合性リポソームは、細胞質中の別個の群に局在化することが分かり、これは、エンドソーム又はリソソームの区画化の特徴である。
【００９２】
粒子に親水性色素(カルセイン)又は脂溶性(DiI)色素を搭載して、色素の局在化の差異、すなわち粒子の取り込みを評価した(図4)。カルセインは、siRNAの挙動に非常によく似て、通常、細胞膜を透過することができない陰イオン性色素であるので、モデルsiRNAペイロードとして選択した。一方、DiIはリポソーム二重層に搭載される脂溶性色素であるので、融合性取り込みを確認する方法としてDiIを使用した。粒子が取り込み時に融合すると、DiIは、リポソーム二重層から形質膜二重層に輸送されて広がると思われる。
【００９３】
リポソーム膜中のDiIが搭載されているF-pSiは、細胞膜にDiIを首尾よく輸送し、細胞質全体にカルセインのシグナルが分散され、これにより、膜融合による取り込みが示される。さらに、pSiNPからの最小の光ルミネッセンスシグナルが検出された。これは、融合後に、リポソームの保護なしに急速に分解していることに起因する。一方、DiI又はカルセインを搭載した非融合性リポソームpSi(NF-pSi)は、細胞質内で局在化した高密度のクラスターであり、これは、エンドサイトーシスであることを示している。さらに、カルセインのシグナルは、濃いスポット中でpSi光ルミネッセンスシグナルと共局在化した。pSiシグナルは、コアがリポソームの保護により、エンドソーム/リソソーム中でカルセイン色素に対して依然として影響を受けていないことを示している。膜融合は起こらなかったので、本発明者らは、リポソーム被覆pSi粒子はエンドサイトーシスされていると仮定する。
【００９４】
LysoTracker Redを使用して、図4(b)及び(e)において示されている通り、リソソームの細胞内コンパートメントを染色した。融合性粒子及び非融合性粒子にカルセインを搭載し、細胞に適用した。結果により、融合性粒子はリソソームと共局在化しなかった分散したカルセインシグナルがあったことを示している一方、非融合性粒子は、カルセインがリソソームコンパートメントと共局在化していることを示していることが示された。さらに、DiIを搭載した、マクロファージ標的化ペプチド(MTP)によりコンジュゲートされている融合性粒子及び非融合性粒子を調製し、マクロファージに処置した。MTPはまた、蛍光のモニタリングを可能にする、6-FAM色素により標識を付けた。融合性粒子は、MTP-FAMシグナルがやはり共局在化している細胞膜の特異的部分に沿って融合したことが示され、このことは、MTP-FAMが、この粒子を特異的マクロファージ膜受容体に首尾よく固定して、局在化した融合を可能にすることを示している。MTPは、融合の同等レベルを実現するのに半分のインキュベート時間しか必要としないので、細胞膜の表面に粒子を速やかに固定することにより、融合過程を促進するように思われることも留意されたい。MTP-FAMによりコンジュゲートされている非融合性粒子は、MTPのない同じ粒子のように、同じ局在化をしていることを実証した。MTP-FAM及びDiIシグナルは、細胞質内のクラスター中で共局在化しており、エンドソーム及びリソソーム区画化を示している。
【００９５】
細胞質の染色のために細胞非透過性色素を搭載した粒子
カルセインは、陰イオン性の細胞非透過性蛍光色素である。その強力な負電荷により、カルセインは、核酸ペイロードと同じ塩化カルシウム相互作用を使用して、多孔質ケイ素ナノ粒子に捕捉され得る。カルセイン及び1M以上の濃度のCaCl2溶液を含有する水溶液中に、多孔質ケイ素粒子を入れた。この溶液を混合して、遠心分離により精製すると、カルセインが搭載されたケイ酸カルシウム被覆多孔質ケイ素ナノ粒子又はpSiNP(Ca-pSi-カルセイン)となる。非搭載カルセインは、脱イオン水中、遠心分離により3回、洗い落とした。
【００９６】
HeLa細胞を融合性リポソーム被覆粒子及び非融合性リポソーム被覆粒子と共にインキュベートし、以下の時間間隔:30分間、1時間、2時間、4時間及び8時間にわたり、共焦点顕微鏡下で視覚化した。融合性リポソーム被覆粒子は、細胞質にカルセインを直接、放出し、細胞全体にカルセインを分散させることが観察された。多孔質ケイ素からの赤色ルミネッセンスシグナルの喪失は、融合性取り込みに由来して、リポソーム被膜による保護が喪失したことで、細胞内環境中に速やかに溶出していることを示している(図6)。対照的に、非融合性リポソーム被覆粒子は、細胞質中の濃いスポットに、カルセインシグナルと共局在化した。その観察により、非融合性リポソーム被覆粒子は、全体として、細胞にエンドサイトーシスされたこと、及び多孔質ケイ素をベースとするコアの周辺にリポソーム被膜が維持されたことにより、コア溶出及びルミネッセンスの喪失が阻止されたことが示される(図7)。
【００９７】
インビボでの遺伝子ノックダウン及び治療効果
融合及び抗菌性治療剤としてのIRF5ノックダウン有効性を試験するため、様々な製剤を用いて、感染マウスを試験した。生理食塩水(PBS)、治療剤のsiRNAを搭載した標的化非融合性粒子(NF-siIRF5-MTP)、対照となる非治療剤のsiRNAを搭載した標的化融合性粒子(F-siLuc-MTP)、又は治療剤のsiRNAを搭載した標的化融合性粒子(F-siIRF5-MTP)を尾部静脈に静脈内注射する24時間前に、6週齢の雌のBalb/Cマウスに黄色ブドウ球菌の細菌を気管内感染させた。処置後、7日間、生存に関してマウスを観察して集約し、図8Aに示されている結果を得た。
【００９８】
図8Bは、各処置群からの生存の平均日数、及び統計的有意性を示している。一元ANOVA、及びテューキーのHSD検定を使用する事後比較から、これらのデータは、F-siIRF5-MTP粒子を注射されたマウスは、他の製剤である、PBS、NF-siIRF5-MTP及びF-siLuc-MTPのどれよりも平均生存日数が有意に多かったことを示している(pレベル<0.05、[F(3,20)=8.78、p=0.001])。
【００９９】
すべての処置群の中で、4日を超えて生存したマウスは、正常で健常な挙動を示し、疲労又は疾病の目視可能な外的徴候を示さなかった。
【０１００】
融合性ケイ素粒子の安定性
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中での粒子の安定性を、DLSにより流体力学的直径の変化を測定することにより、28日間、観察した(図9)。融合性リポソーム被覆粒子(F-CapSi)を押出成形して、およそ140nmの初期平均流体力学的直径にした。マレイミド末端PEGへのRVGコンジュゲート(RVG-F-CapSi)はおよそ180nmまでサイズを拡張した。このサイズは、次の3週間にわたり徐々に増加するまでの、最初の7日間、かなり安定のままであった。
【０１０１】
抗体コンジュゲート粒子
抗体は、標的化ペプチドコンジュゲーションを使用する類似のPEG相互作用によって、リポソームの表面にコンジュゲートすることができる。融合性リポソームフィルムは、76.2:3.8:20のモル比で、DMPC:DSPE-PEG(カルボキシ):DOTAPの混合物から作製した。この混合物を乾燥してフィルムにし、多孔質ケイ素又は金属(Ca)ケイ酸塩が堆積された多孔質ケイ素ナノ粒子溶液で水和した。この水和懸濁液を磁気撹拌下、20分間、40℃まで加熱し、200nmの細孔を有するポリカーボネート膜により、20回、機械的に押し出した。この抗体のFc領域のリジン残基上のアミン基を、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド/スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド(EDC/スルホ-NHS)化学により、カルボキシル末端PEGにコンジュゲートして、アミド結合を形成させた。
【０１０２】
膜融合によって細胞の取り込みを確認するために、脂溶性の(2Z)-2-[(E)-3-(3,3-ジメチル-1-オクタデシルインドール-1-イウム-2-イル)プロプ-2-エニリデン]-3,3-ジメチル-1-オクタデシルインドール(DiI)蛍光色素をリポソーム膜に搭載した。粒子は、Neuro2a細胞に処置して、細胞の取り込みのために、1時間、インキュベートした。融合性粒子は、リポソーム膜から形質膜に脂溶性DiIを首尾よく輸送することができた一方、非融合性リポソームにより被覆されている粒子は、細胞質中の別個の群に局在化していることが分かり、これは、エンドソーム/リソソームの取り込みの特徴である(図12、左のパネル)。
【０１０３】
次に、親水性ペイロードの細胞内局在化における、融合性リポソーム被膜と非融合性リポソーム被膜の間の差異を検討した。高度に陰イオン性の細胞非透過性色素であるカルセインを、塩化カルシウム捕捉を使用して、多孔質ケイ素コア内に搭載し、融合性リポソーム及び非融合性リポソームに封入した。図10は、リポソーム被覆粒子中に搭載したカルセインの吸光度及び蛍光スペクトルを示している。カルセインを搭載した粒子のリポソーム封入により、蛍光発光が脱消光した。
【０１０４】
ケイ酸カルシウム被覆粒子の光ルミネッセンスも検討した。ケイ酸カルシウム/酸化ケイ素のシェル又はケイ酸マグネシウム/酸化ケイ素のシェルは、ケイ素ナノ構造の表面を強力に不動態化することができることを示し、この物質からの固有の光ルミネッセンスが向上した。図11は、pSiNPとCaCl2(又はMgCl2)溶液の間の反応の経過の間の様々な時間で得られた光ルミネッセンススペクトルを示している。反応中に、pSiNP表面上における非発光性のキャリアトラップの不動態化に起因して、光ルミネッセンスの強度が徐々に向上した。さらに、光ルミネッセンスのピーク波長は、反応が進行するにつれて、顕著な青色のシフトを示した。これらの現象のどちら(光ルミネッセンス強度の向上及び光ルミネッセンススペクトルの青色シフト)も、ケイ素ナノ結晶上の不動態化表面層が成長していることを示している。観察された青色シフトは、発光波長がサイズに大きく依存して、量子が封じ込められたケイ素領域がより小さくなるにつれて青色にシフトすることが予期される、量子が封じ込められたナノ粒子に典型的である。ナノ構築体は、ホストのケイ素マトリックスにしっかりと拘束されるので、その固有の光ルミネッセンスは、マトリックスの分解、及び推測として、インビトロ又はインビボ実験におけるペイロードの放出をモニタリングするために使用することができる。
【０１０５】
粒子をHeLa細胞に処置し、経時的に共焦点顕微鏡下で可視化した。図12の右のパネルは、8時間のインキュベート後の粒子の細胞取り込みを示している。融合性リポソーム被覆粒子は、細胞質にカルセインペイロードを放出し、細胞全体にカルセインを分散させることが観察された。ケイ酸カルシウム被覆多孔質ケイ素に由来するルミネッセンスシグナルの欠如は、リポソームが融合したことによって保護がなくなるために、細胞内環境で、ケイ酸カルシウム被覆多孔質ケイ素が速やかに溶出することを示している。対照的に、非融合性リポソーム被覆粒子は、細胞質中の濃いスポットに、カルセインシグナルと共局在化した。その観察により、非融合性リポソーム被覆粒子は、全体として、細胞にエンドサイトーシスされ、多孔質ケイ素をベースとするコアの周辺にリポソーム被膜を維持することにより、コア溶出が阻止されたことが示される。
【０１０６】
標的化ペプチドコンジュゲート粒子
狂犬病ウイルスグリコタンパク質(RVG、(CCGG)YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG(配列番号1))は、Neuro2aマウスの神経芽細胞を標的とするペプチドであり、このペプチドは、マレイミド-チオール/システイン共有結合の相互作用を介して、リポソーム被膜のマレイミド末端PEGにコンジュゲートされている。共焦点顕微鏡下での細胞との相互作用を観察するため、RVGペプチドに5-FAM色素、及び脂溶性DiIを有するリポソーム膜で標識を付けた。標的化ペプチドコンジュゲートは、リポソーム被膜の融合性に影響を及ぼしていないように思われ、標的化ペプチドのない融合性リポソーム被覆粒子と比べて、融合及び取り込み速度を加速することしか観察されなかった。
【０１０７】
遺伝子ノックダウンのためのsiRNA搭載粒子
低分子干渉RNA(siRNA)カーゴは、多孔質ケイ素粒子を脱イオン水及び3M CaCl2に溶解したsiRNAと混合して遠心分離により洗浄することにより、多孔質ケイ素コアに搭載した。
【０１０８】
Neuro2a細胞におけるsiRNAノックダウン試験に関しては、ペプチジルプロリルイソメラーゼB(PPIB/siPPIB)を標的遺伝子として選択した(図14)。siPPIBを搭載したF-pSiは、100nMにおいて、およそ95%のノックダウン効率を実証した。対照的に、一般的なトランスフェクト剤であるlipofectamineは、同様の条件下で90%のノックダウン効率しか実現しなかった。非融合性対照ナノ粒子NF-pSiは、大きな変動を伴い、100nMにおいて30%のノックダウンしか実証しなかった。
【０１０９】
インビボでのマクロファージ標的化及び感染のホーミング
Balb/Cマウスに、黄色ブドウ球菌を気管内感染させて、肺感染を誘発した。マクロファージ/単球を標的とするペプチドは、カルセイン及びDiIを搭載したF/NF-pSiに結合し、これらの製剤を黄色ブドウ球菌に感染しているマウスに静脈内注射により投与し、マクロファージへの標的化有効性及び感染肺へのマクロファージホーミングについて観察した(図15)。カルセインを搭載した粒子を注射されたマウスの採取した肺を、図15(a〜c)に示されている通り、感染肺中のカルセイン蓄積をFACS定量するためにホモジナイズした。DiIを搭載した粒子を注射されたマウスの肺を、図15(d〜k)に示されている通り、蛍光組織学評価するために固定化した。標的化ペプチドが結合しているにもかかわらず、NF-pSiは、カルセイン搭載FACsデータとDiIを搭載した蛍光組織学評価の両方において、肺への目視可能なホーミングがないことを示した。標的化ペプチドを有していないF-pSiは、どちらの評価においても最小限の蓄積を示した一方、標的化ペプチドを有するF-pSiは、FACSと蛍光組織学のどちらも、マクロファージへのはっきりとした標的化、及びその後の感染肺へのホーミングがあることを実証した。したがって、マクロファージ標的化ペプチドは、ナノ粒子のマクロファージへのインビボでのホーミングに必要である。
【０１１０】
本明細書に記載されている、MTP標的化ペプチドコンジュゲートを用いることにより、カルセイン又はDiIのどちらか一方が搭載されているナノ粒子は、感染肺に首尾よくホーミングすることができる一方、MTPペプチドを有さない粒子及び非融合性粒子は、ホーミングすることができなかった。健常な肺はまた、動員されたマクロファージがほとんど存在しなかったので、目視可能なホーミングをまったく示さなかった。感染肺におけるMTPペプチドのホーミングという評価を用いて、治療剤のsiIRF5を搭載した製剤を治療効力に関して試験した。
【０１１１】
本開示は、融合性リポソーム被覆pSi系が、エンドサイトーシスを迂回して、非融合性製剤と比べて、より大きな遺伝子ノックダウン効力を実現することができることを実証している。さらに、マクロファージ/単球へのインビボ標的化が首尾よく実証され、ペイロードが送達されたマクロファージ/単球は、感染肺に効果的にホーミングした。マクロファージへのM1表現型抑制siRNA送達の場合、それらのデータは、可能性としてより高い食細胞活性、炎症緩和及び組織治癒により、この融合性システムが、感染症の改善された有効な免疫原性クリアランスを実現できることを示している。
【０１１２】
本発明のいくつかの実施形態を記載した。とはいえ、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な改変を行うことができることが理解されよう。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。
【図１Ａ】
2018519347.tif 000009
【図１Ｂ】
2018519347.tif 000010
【図１Ｃ】
2018519347.tif 000011
【図１Ｄ】
2018519347.tif 000012
【図１Ｅ】
2018519347.tif 000013
【図１Ｆ】
2018519347.tif 000014
【図１Ｇ】
2018519347.tif 000015
【図１Ｈ】
2018519347.tif 000016
【図２】
2018519347.tif 000017
【図３】
2018519347.tif 000018
【図４Ａ−Ｉ】
2018519347.tif 000019
【図５Ａ−Ｂ】
2018519347.tif 000020
【図６】
2018519347.tif 000021
【図７】
2018519347.tif 000022
【図８Ａ】
2018519347.tif 000023
【図８Ｂ】
2018519347.tif 000024
【図９】
2018519347.tif 000025
【図１０】
2018519347.tif 000026
【図１１】
2018519347.tif 000027
【図１２】
2018519347.tif 000028
【図１３Ａ−Ｂ】
2018519347.tif 000029
【図１４】
2018519347.tif 000030
【図１５Ａ−Ｋ】
2018519347.tif 000031
【配列表】
2018519347000001.app
【国際調査報告】
2018519347.tif 000032