(57)【要約】粘液浸透粒子（ＭＰＰ）は、１もしくはこれより多くのコアポリマー、１もしくはこれより多くの治療剤、予防剤、および／もしくは診断剤；ならびに１もしくはこれより多くの表面改変剤を含む。上記表面改変剤は、表面改変されていない同等のナノ粒子と比較して、粘膜全体への改変されたナノ粒子の拡散を増強するために十分な密度で上記粒子の表面を被覆する。ナノ粒子は、約０．１〜約１００分子／１００ｎｍ２、好ましくは約０．５〜約５０分子／１００ｎｍ２、より好ましくは約０．９〜約４５分子／１００ｎｍ２の表面密度で被覆され、１０ｋＤ〜４０ｋＤもしくはこれより高い分子量を有するポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）で十分密に被覆され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において粘膜を通ってその下にある上皮へと治療剤、予防剤、もしくは診断剤を送達するための粘液浸透粒子であって、前記粘膜浸透粒子は、
前記粒子を形成する１もしくはこれより多くのコアポリマー；
１もしくはこれより多くの治療剤、予防剤、および／もしくは診断剤；ならびに
ポリアルキレンオキシドポリマーを含み、かつ約５ｋＤａより大きく約１００ｋＤａ（両端を含む）の、好ましくは約１０ｋＤａ〜約４０ｋＤａの分子量を有する、１もしくはこれより多くの表面改変剤
を含み、ここで前記表面改変剤は、１Ｈ  ＮＭＲによって測定される場合に、約０．１〜約１００分子／１００ｎｍ２の十分な密度において存在して、
表面改変されていない粒子と比較して、改変された前記粒子の粘膜拡散を増強する、
粘膜浸透粒子。
【請求項２】
前記表面改変剤が、ポリ（エチレングリコール）、ポリエチレングリコール−ポリエチレンオキシドブロックコポリマー、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（アクリルアミド）およびこれらのコポリマーからなる群より選択される中性ポリマーである、請求項１に記載の粘液浸透粒子。
【請求項３】
１種の表面改変剤が、約５ｋＤａ〜約４０ｋＤａ（両端を含む）、より好ましくは約２０ｋＤａの分子量を有するポリ（エチレングリコール）である、請求項２に記載の粘液浸透粒子。
【請求項４】
前記ポリ（エチレングリコール）の表面密度が、１Ｈ  ＮＭＲによって測定される場合、約０．５〜約５０分子／１００  ｎｍ２、より好ましくは約０．９〜約４５分子／１００ｎｍ２である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の粘液浸透粒子。
【請求項５】
前記ポリ（エチレングリコール）の表面充填密度が、以下の式：
Γ／ＳＡ＝表面充填密度
の関数として測定される場合、１．５であるか、または１．５より大きく、
ここで、Γは、非拘束ポリ（エチレングリコール）によって網羅され得る全表面積であり、ＳＡは、ナノ粒子の全表面積である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の粘液浸透粒子。
【請求項６】
１もしくはこれより多くの表面変質物質が、前記粒子の表面電荷を、生理学的流体中で中性または本質的に中性にするために有効な量で存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の粘液浸透粒子。
【請求項７】
前記粒子が、約−１０ｍＶ〜１０ｍＶ（両端を含む）の間、好ましくは約−５ｍＶ〜５ｍＶ（両端を含む）の間、最も好ましくは約−２ｍＶ〜２ｍＶ（両端を含む）の間のゼータ電位を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の粘液浸透粒子。
【請求項８】
ポリ（カプロラクトン）、ポリヒドロキシ酸、ポリアミノ酸、ポリ無水物、およびポリオルトエステルからなる群より選択されるコアポリマーを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の粘液浸透粒子。
【請求項９】
前記コアポリマーが、ポリ（乳酸）、ポリ（Ｌ−乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ（Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＥＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＰＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）からなる群より選択されるポリヒドロキシ酸である、請求項８に記載の粘液浸透粒子。
【請求項１０】
前記コアポリマーが、表面改変物質に共有結合される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の粘液浸透粒子。
【請求項１１】
前記粒子が、約５０ｎｍ〜５００ｎｍ（両端を含む）の間、好ましくは約６０ｎｍ〜３００ｎｍ（両端を含む）の間の流体力学的直径を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の粘液浸透粒子。
【請求項１２】
経腸投与、非経口投与、もしくは局所投与からなる群より選択される経路を介して身体中にもしくは身体上に投与するための薬学的に受容可能な賦形剤とともに製剤化される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の粘液浸透粒子。
【請求項１３】
１もしくはこれより多くの治療剤、予防剤、および／もしくは診断剤を必要性のある被験体に投与する方法であって、前記方法は、前記被験体に、有効量の請求項１〜１２のいずれか１項に記載の粒子を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１４】
前記粒子が、経腸経路、非経口経路もしくは局所経路からなる群より選択される経路を介して投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記粒子が、腟上皮、結腸直腸路、眼上皮、気道、口腔およびこれらの組み合わせからなる群より選択される位置において粘膜上皮に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記粒子が、頸膣粘液、結腸直腸粘液、または上部気道もしくは下部気道における粘液へと投与される、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１５年１０月３０日に出願された米国仮出願第６２／２４８，４３２号（その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府により資金供与を受けた研究および開発に関する陳述
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによる契約Ｒ０１ＨＤ０６２８４４、５Ｒ２１／Ｒ３３ＡＩ０７９７４０、５Ｒ２１／Ｒ３３ＡＩ０９４５１９およびＵ１９ＡＩ１３３１２７の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
【０００４】
本発明は、ナノ粒子、特に、粘液の迅速な浸透を可能にするために高分子量ポリマーで密に被覆されたナノ粒子、ならびにその作製法および使用法の分野にある。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
生分解性ナノ粒子を介する治療剤の限局性送達はしばしば、低下した全身性副作用および標的部位での制御された薬物送達を含め、全身薬物投与を超える利点を提供する。しかし、粘膜表面での制御された薬物送達は、一般に、防御的な粘液層の存在によって制限される。
【０００６】
粘液は、全ての粘膜表面を覆う防御の最前線であり、微粒子物が粘液メッシュより大きい、および／または粘液メッシュに接着する場合、微粒子物が上皮表面に達することを効果的に防止する接着性の粘弾性ゲルである（Ｃｏｎｅ，  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  第３版  ２００５，  ４９−７２；Ｃｏｎｅ，  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ，  ２００９，  ６１，  ７５−８５；Ｌａｉら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  ２００７，  １０４，  １４８２−１４８７；Ｏｌｍｓｔｅｄら，  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ，  ２００１，  ８１，  １９３０−１９３７；Ｅｎｓｉｇｎ，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，  ２０１２，  ４，  １３８ｒａ１７９）。
【０００７】
粘膜は、上皮細胞の１もしくはこれより多くの層およびその下にある緩い結合組織の粘膜固有層から形成される上皮からなる。粘膜は、その下にある結合組織の粘膜固有層が粘液を分泌することによって湿ったままであることを確実にする。粘液は、立体的機構および接着機構の両方によって、外来粒子および微粒子物を効率的に捕らえ、迅速なクリアランスを促進し、薬物送達を妨げる。
【０００８】
粘液への薬物粒子および／または送達ビヒクルの接着は、薬物送達の効率を顕著に低下させ得る。例えば、粘膜表面へと局所送達される大部分の治療剤は、粘液ターンオーバーの結果としての不十分な保持および分布を欠点としてもつ。従って、「粘膜接着（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｏｎ）」は、膣、肺、および結腸直腸の組織を超えて粘膜へと直接送達される薬物の制限された分布を生じることが示された（Ｅｎｓｉｇｎ，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，  ２０１２，  ４，  １３８ｒａ１７９；  Ｅｎｓｉｇｎら，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２０１３，  ３４，  ６９２２−６９２９；Ｓｕｋら，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１４，  １７８，  ８−１７；Ｍａｉｓｅｌら，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１５，  １０，  １９７，  ４８−５７，  Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｎｏｖ  ４）。このことは、これら薬物の効力を激しく制限する。
【０００９】
薬物送達適用もしくは遺伝子送達適用のために、治療粒子は、迅速な粘液クリアランスを回避するために目的の粘膜表面を超えてかつ粘液バリアを効率的に横断する均一な分布を達成し、その下にある細胞へとそれらの治療剤ペイロードの有効な送達を確実にしなければならない（ｄａｓ  Ｎｅｖｅｓ  Ｊ  ＆  Ｂａｈｉａ  ＭＦ，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ，  ２００６，  ３１８，  １−１４；  Ｌａｉら，  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒ  Ｒｅｖ，  ２００９，  ６１，  １５８−１７１；  Ｅｎｓｉｇｎら，  Ｓｃ．  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，  ２０１２，  ４，  １３８ｒａｌ７９，  １−１０；  Ｅｙｌｅｓら，  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，  １９９５，  ４７，  ５６１−５６５）。
【００１０】
多くの要因が、ナノ粒子の粘膜接着特徴に寄与することが公知である（Ｌａｉら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  ２００７，  １０４，  １４８２−１４８７；  Ｅｎｓｉｇｎ，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，  ２０１２，  ４，  １３８ｒａ１７９）。代表的には、正に荷電した表面、および／または被覆されていない疎水性表面は、高度に粘膜接着性であると考えられる。ＰＥＧは、粘膜接着を増強するために使用されてきた（Ｐｅｐｐａｓ，  Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ，  １９９８，  ９，  ５３５−５４２；  Ｐｅｐｐａｓら，  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ，  ２００４，  ５６，  １６７５−１６８７；  Ｐｅｐｐａｓら，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  １９９６，  １７，  １５５３−１５６１；  Ｐｅｐｐａｓら，  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ，  ２００９，  ２０，  １−２０；  Ｓａｈｌｉｎら，  Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ，  １９９７，  ８，  ４２１−４３６；  Ｈｕａｎｇら，  Ｊ  Ｃｏｏｎｔｒｏ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０００，  ６５，  ６３−７１；  Ｓｍａｒｔら，  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ，  ２００５，  ５７，  １５５６−１５６８；  Ｓｅｒｒａら，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ，  ２００６，  ６３，  １１−１８）。高分子量ＰＥＧは、ムチン線維に互いに貫通しかつ絡み合う（Ｐｅｐｐａｓ，  Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ，  １９９８，  ９，  ５３５−５４２；  Ｐｅｐｐａｓ  ＆  Ｓａｈｌｉｎ，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  １９９６，  １７，  １５５３−１５６１）か、またはムチン線維の炭水化物領域へと水素結合を形成する（Ｄｅａｓｃｅｎｔｉｉｓら，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  １９９５，  ３３，  １９７−２０１；Ｐｅｐｐａｓ，  Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ，  １９９８，  ９，  ５３５−５４２；Ｐｅｐｐａｓ  ＆  Ｈｕａｎｇ，  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ，  ２００４，  ５６，  １６７５−１６８７；Ｐｅｐｐａｓ  ＆  Ｓａｈｌｉｎ，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  １９９６，  １７，  １５５３−１５６１；Ｐｅｐｐａｓら，  Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ，  ２００９，  ２０，  １−２０；Ｍａｒｔｉｎｉら，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，  １９９５，  １１３，  ２２３−２２９；Ｓａｈｌｉｎ  ＆  Ｐｅｐｐａｓ，  Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ，  １９９７，  ８，  ４２１−４３６；Ｈｕａｎｇら，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０００，  ６５，  ６３−７１）、粘膜接着性「接着剤（ｇｌｕｅ）」として作用すると記載されてきた。１０ｋＤａ程度の大きさの分子量のＰＥＧは、被覆された粒子の粘液浸透に対して一貫しない影響を有すると報告されてきた。例えば、２ｋＤａ  ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ  ２ｋＤａ）と匹敵する被覆密度の１０ｋＤａ  ＰＥＧは、粘膜接着を引き起こした（Ｗａｎｇら，  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ，  ２００８，  ４７，  ９７２６−９７２９）か、または被覆されていない粒子と類似の粘膜接着性能力を示した（Ｄｅａｓｃｅｎｔ���ｉｓら，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  １９９５，  ３３，  １９７−２０１）かのいずれかであった。別の例では、エマルジョン法を使用して形成されるＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子は、ゆっくりとした硬化プロセスの間にＰＥＧが粒子表面に分配することを可能にし、粘液浸透被覆のために１０ｋＤａまでのＰＥＧに関して十分に高い表面密度を生じた（Ｘｕら，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１３，  １７０，  ２７９−２８６）。
【００１１】
他の研究は、低分子量親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ  １ｋＤ）で密に被覆されたナノ粒子が、粘液バリアに浸透して、上皮表面に到達しかつ均一に被覆し得ることを確証した（Ｌａｉら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  ２００７，  １０４，  １４８２−１４８７；  Ｅｎｓｉｇｎ，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，  ２０１２，  ４，  １３８ｒａ１７９；  Ｓｕｋら，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１４，  １７８，  ８−１７；  Ｍａｉｓｅｌら，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１５，  １０，  １９７，  ４８−５７，  Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｎｏｖ  ４）。さらに、これらの粘液浸透ナノ粒子（ＭＰＰ）は、粘膜接着性微粒子物と比較して、頸膣路（ｃｅｒｖｉｃｏｖａｇｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ）および気道においてより長期間保持される（Ｅｎｓｉｇｎ，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，  ２０１２，  ４，  １３８ｒａ１７９；  Ｓｕｋら，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１４，  １７８，  ８−１７）。このことは、ＭＰＰが、薬物を上皮表面全体に分布させ、かつ長期の薬物保持を提供するためにより適切であり得ることを示す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｌａｉら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ（２００７）１０４、１４８２〜１４８７
【非特許文献２】Ｅｎｓｉｇｎ、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ（２０１２）４、１３８ｒａ１７９
【非特許文献３】Ｓｕｋら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ（２０１４）１７８、８〜１７
【非特許文献４】Ｍａｉｓｅｌら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ（２０１５）１０、１９７、４８〜５７（Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｎｏｖ  ４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記に記載されるとおりの粘液浸透特性の低下なしに広い範囲の薬物をナノ粒子へと被包し得る粘液浸透粒子の新たな調製法が必要である。注射を介して投与される製剤が同様に必要である。
【００１４】
従って、本発明の目的は、粒子の調製法、およびその得られた粒子を提供することであり、その粒子は、粘液浸透特性の低下なしに広い範囲の薬物を生分解性ナノ粒子へと被包し得る。
【００１５】
本発明の別の目的は、高い薬物負荷および表面変質物質の密な被覆を有する粒子（例えば、ナノ粒子およびマイクロ粒子）を提供して、粘膜表面を介する投与をふくめ、種々の投与経路を介する有効な薬物送達を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の要旨
粘液浸透粒子（ＭＰＰ）は、１もしくはこれより多くのコアポリマー、１もしくはこれより多くの治療剤、予防剤、および／もしくは診断剤；ならびに１もしくはこれより多くの表面改変剤（ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含む。上記表面改変剤は、表面改変されていない同等のナノ粒子と比較して、粘液を通る改変されたナノ粒子の拡散を増強するために十分な密度で粒子の表面を被覆する。ナノ粒子は、上記ナノ粒子をエキソビボおよびインビボで粘液を通って迅速に拡散させるために、１０，０００ダルトン〜４０，０００ダルトンもしくはこれより大きい分子量を有するポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）で十分密に被覆され得る。
【００１７】
粒子表面を粘液との相互作用から効果的に遮るために超えなければならない、ナノ粒子の表面における最小ＰＥＧ充填密度閾値が存在する。表面充填密度（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐａｃｋｉｎｇ  ｄｅｎｓｉｔｙ）が十分であるか不十分であるかの間にある幅は狭い。いくつかの実施形態において、上記表面改変剤は、約５ｋＤａより大きく約１００ｋＤａまで（両端を含む）の、好ましくは約１０ｋＤａ〜約４０ｋＤａ（両端を含む）の、より好ましくは約２０ｋＤａの分子量を有するポリ（エチレングリコール）である。上記粘液浸透ナノ粒子は、５〜１０ｋＤより大きい分子量を有するＰＥＧですら、粘液を通る拡散を可能にするために十分である密度において表面改変剤で被覆される。いくつかの実施形態において、上記表面改変剤の表面密度は、１Ｈ  ＮＭＲによって測定される。代表的には、ＰＥＧが表面改変剤である場合、ＭＰＰは、約０．１〜約１００分子／１００ｎｍ２、好ましくは約０．５〜約５０分子／１００ｎｍ２、より好ましくは約０．９〜約４５分子／１００ｎｍ２の表面密度で被覆される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、表面充填密度は、以下の式の関数として測定される：
Γ／ＳＡ＝表面充填密度
ここでΓは、粒子表面上のＰＥＧコンホメーションが非拘束であると仮定して、ＰＥＧ分子によって提供され得る全表面積被覆度（ｔｏｔａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｒｅａ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）であり、ＳＡは、ナノ粒子の全表面積である。ＰＥＧが上記表面改変剤である場合、ＭＰＰは、１．５もしくはこれより大きい表面充填密度で被覆される。いくつかの実施形態において、上記表面改変剤は、ＭＰＰの表面電荷を生理学的流体中で中性または本質的に中性にするために有効な量で存在する。例えば、いくつかの実施形態において、上記ナノ粒子は、約−１０ｍＶ〜１０ｍＶ（両端を含む）の間、好ましくは約−５ｍＶ〜５ｍＶ（両端を含む）の間、最も好ましくは約−２ｍＶ〜２ｍＶ（両端を含む）の間のゼータ電位を有する。
【００１９】
上記ＭＰＰは、代表的には、約５０ｎｍ〜５００ｎｍ（両端を含む）の間、好ましくは約６０ｎｍ〜３００ｎｍ（両端を含む）の間の流体力学的直径を有する。
【００２０】
いくつかの実施形態において、上記ナノ粒子は、身体中にまたは身体上に投与するための薬学的に受容可能な賦形剤を含む。例示的な薬学的組成物は、経腸投与、非経口投与、または局所投与による投与のために製剤化される。
【００２１】
粘液浸透ナノ粒子を作製するための方法もまた、提供される。上記方法は、ボレート緩衝液（ｐＨ７．４）中でコアポリマーナノ粒子を懸濁して、インキュベーション混合物を形成する工程；メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−アミンを上記インキュベーション混合物に添加する工程；上記メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−アミンを上記コアポリマーナノ粒子に共有結合的にカップリングする工程；および上記粘液浸透ナノ粒子を上記混合物から単離する工程を包含する。
【００２２】
ＭＰＰを使用して、１もしくはこれより多くの治療剤、予防剤、および／もしくは診断剤を必要性のある被験体に送達するための方法もまた、提供される。上記方法は、上記被験体に、所望の生物学的効果を達成するために有効な量のＭＰＰを投与する工程を包含する。例えば、いくつかの実施形態において、上記ＭＰＰは、疾患または障害の１もしくはこれより多くの症状を診断、防止または処置するために有効な量で存在する。一般に、ＭＰＰは、粘液に浸透し、被験体の粘膜上皮における上記粒子の均一な分布を提供するために有効な密度において上記表面改変剤で被覆される。例示的な粘膜上皮としては、腟上皮、結腸直腸路、眼上皮、気道、口腔およびこれらの組み合わせが挙げられる。特定の実施形態において、上記ＭＰＰは、頸膣粘液、結腸直腸粘液、気道粘液、またはこれらの組み合わせに浸透するために有効な密度において上記表面改変剤で被覆される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、水中での２００ｎｍナノ粒子の理論的ＭＳＤ（Ｗ）を含め、ボレート法またはＭＥＳ法を使用して、１０ｋＤａ  ＰＥＧで被覆された２００ｎｍ  ＰＳおよびＰＳ−ＰＥＧ  ＮＰに関する３秒間までの時間に関する集団平均二乗変位量（＜ＭＳＤ＞）を示す。データは、ｎ≧３サンプルの代表である。
【００２４】
【図２】図２Ａは、１秒間の時間的尺度において、２００ｎｍ  ＰＳの個々の粒子ＭＳＤの対数の分布を示す。図２Ｂは、１秒間の時間的尺度において、ＭＥＳ法を使用して１０ｋＤａ  ＰＥＧで被覆されたＰＳ−ＰＥＧ  ＮＰの個々の粒子ＭＳＤの対数の分布を示す。図２Ｃは、１秒間の時間的尺度において、ボレート法を使用して１０ｋＤａ  ＰＥＧで被覆されたＰＳ−ＰＥＧ  ＮＰの個々の粒子ＭＳＤの対数の分布を示す。
【００２５】
【図３】図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、ヒト頸膣粘液中での２００ｎｍ  ＰＳ（３Ａ）およびＰＳ−ＰＥＧ  ＮＰ（３Ｂ、３Ｃ）の３秒間の運動に関する代表的軌跡を示す。ＰＳ−ＰＥＧ  ＮＰを、ＭＥＳ法（３Ｂ）もしくはボレート法（３Ｃ）を使用して、１０ｋＤａ  ＰＥＧで被覆する。データは、ｎ≧３サンプルの代表である。
【００２６】
【図４】図４は、水中での２００ｎｍ粒子の理論的ＭＳＤ（Ｗ）を含め、２００ｎｍ  ＰＳ、およびボレート法を使用して５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、もしくは４０ｋＤａ  ＰＥＧで被覆されたＰＳ−ＰＥＧ  ＮＰに関する３秒間までの時間の関数として集団平均二乗変位量（＜ＭＳＤ＞）を示す。
【００２７】
【図５】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、および５Ｅは、ヒト頸膣粘液中での２００ｎｍ  ＰＳ（５Ａ）およびＰＳ−ＰＥＧ  ＮＰ（５Ｂ〜５Ｅ）の３秒間の運動に関する代表的軌跡を示す。図５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、および５Ｅは、ボレート法を使用して、それぞれ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、および４０ｋＤａ  ＰＥＧで被覆されたＰＳ−ＰＥＧ  ＮＰを示す。データは、ｎ≧３サンプルの代表である。
【００２８】
【図６】図６は、水中での１００ｎｍ粒子（ＰＳ−ＰＥＧ１０ｋＤａのサイズ）の理論的ＭＳＤ（Ｗ）を含め、１００ｎｍ  ＰＳおよびボレート法を使用して５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、もしくは４０ｋＤａ  ＰＥＧで被覆されたＰＳ−ＰＥＧ  ＮＰに関する時間の関数としてのヒト頸膣粘液中での集団平均二乗変位量（＜ＭＳＤ＞）を示す。
【００２９】
【図７】図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、および７Ｅは、ヒト頸膣粘液中での１００ｎｍ  ＰＳ（７Ａ）およびＰＳ−ＰＥＧ  ＮＰ（７Ｂ〜７Ｅ）の３秒間の運動に関する代表的軌跡を示す。図７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、および７Ｅは、ボレート法を使用して、それぞれ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、および４０ｋＤａ  ＰＥＧで被覆されたＰＳ−ＰＥＧ  ＮＰを示す。データは、ｎ≧３サンプルの代表である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
用語「ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）」とは、一般に、約１ｎｍから約１ミクロンまで（しかし１ミクロンを含まない）、より好ましくは約５ｎｍ〜約５００ｎｍ、最も好ましくは約５ｎｍ〜約１００ｎｍの直径を有する任意の形状の粒子をいう。球形を有するナノ粒子は、一般に、「ナノスフェア（ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ）」といわれる。
【００３１】
用語「平均粒子サイズ（ｍｅａｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅ）」とは、一般に、粒子集団中の粒子の統計的平均粒子サイズ（直径）に言及する。本質的に球状の粒子の直径は、物理的直径もしくは流体力学的直径といわれ得る。非球状粒子の直径は、優先的に流体力学的直径に言及し得る。使用される場合、非球状粒子の直径は、粒子の表面上の２点の間の最大直線距離をいい得る。平均粒子サイズは、当該分野で公知の方法（例えば、動的光散乱もしくは静的光散乱、Ｆａｓｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙなど）を使用して測定され得る。
【００３２】
用語「粘液（ｍｕｃｕｓ）」とは、主にムチン糖タンパク質および他の物質を含む粘弾性の天然物質であって、種々の器官／組織（呼吸器、鼻、頚腟部、消化管、直腸、視覚系および聴覚系を含む）の上皮表面を保護するものをいう。「痰（ｓｐｕｔｕｍ）」とは、本明細書で使用される場合、種々の高分子（例えば、ムチン糖タンパク質に加えて、死細胞から放出されたＤＮＡ、アクチンおよび他の細胞デブリ）からなる高度に粘弾性の粘液分泌物をいう。「痰」は、一般に、閉塞性肺疾患（喘息、ＣＯＰＤおよびＣＦが挙げられるが、これらに限定されない）に罹患した患者の病的な気道に存在する。「ＣＦ粘液（ＣＦ  ｍｕｃｕｓ）」および「ＣＦ痰（ＣＦ  ｓｐｕｔｕｍ）」とは、本明細書で使用される場合、それぞれ、嚢胞性線維症に罹患している患者に由来する粘液および痰をいう。
【００３３】
用語「組み込まれた（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）」および「被包された（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）」とは、望ましい適用において、活性薬剤の放出（例えば、徐放）を可能にする組成物の中におよび／またはその組成物上に、このような薬剤を組み込むこと、製剤化すること、または別の方法で含めることに言及する。この用語は、治療剤もしくは他の物質がポリマーマトリクスへと組み込まれる任意の様式（例えば、このようなポリマーのモノマーへと（共有結合的、イオン性の、もしくは他の結合相互作用によって）付着される、物理的混合、ポリマーの被覆層中に上記薬剤を包む、ポリマーへと組み込まれる、ポリマーマトリクス全体に分配される、ポリマーマトリクスの表面に付加される（共有結合的もしくは他の結合相互作用によって）、ポリマーマトリクス内部に被包されるなどが挙げられる）を企図する。用語「共組み込み（ｃｏ−ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）」または「共被包（ｃｏ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）」とは、対象の組成物中での治療剤または他の物質および少なくとも１種の他の治療剤または他の物質の組み込みをいう。
【００３４】
用語「生体適合性（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）とは、それ自体が宿主（例えば、動物もしくはヒト）に対して毒性ではなく、宿主において毒性濃度でモノマーもしくはオリゴマーサブユニットまたは他の副生成物を生じる速度で分解もしない（ポリマーが分解される場合）、１もしくはこれより多くの物質に言及する。
【００３５】
用語「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」または「治療上有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」とは、処置されている障害の１もしくはこれより多くの症状を処置、阻害、もしくは緩和するか、または所望の薬理学的および／もしくは生理学的効果を別の方法で提供するために十分な投与量を意味する。正確な投与量は、種々の要因（例えば、被験体依存性の変数（例えば、年齢、免疫系の健康状態など）、疾患もしくは障害、およびもたらされている処置）に従って変動する。
【００３６】
ＩＩ．粘液浸透ナノ粒子（ＭＰＰ）
粘膜表面への薬物の制御された送達は、防御的な粘液層の存在が原因で難問である。粘液浸透粒子（ＭＰＰ）は、表面密度が十分に高い場合には、５ｋＤを超える分子量を有する親水性ポリマーで粒子を被覆することが可能であるという発見に基づいて、改善された薬物分布、粘膜表面での保持および効力を示す。
【００３７】
Ａ．コアポリマー
生体適合性ポリマーの任意の数が、ナノ粒子を調製するために使用され得る。一実施形態において、生体適合性ポリマーは、生分解性である。別の実施形態において、上記粒子は、非分解性である。他の実施形態において、粒子は、分解性および非分解性の粒子の混合物である。
【００３８】
例示的ポリマーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ラクトンから調製されるポリマー（例えば、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ））、ポリヒドロキシ酸およびこれらのコポリマー（例えば、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＥＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＰＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、およびこれらのブレンド）、ポリアルキルシアノアクリレート（ｐｏｌｙａｌｋｙｌ  ｃｙａｎｏａｃｒａｌａｔｅ）、ポリウレタン、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ））、ポリ（吉草酸）、およびポリ−Ｌ−グルタミン酸、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、エチレンビニルアセテートポリマー（ＥＶＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル（例えば、ポリ（ビニル酢酸））、ポリビニルハライド（例えば、ポリ（ビニルクロリド）（ＰＶＣ））、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、セルロース（誘導体化セルロース（例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース）、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースが挙げられる）、アクリル酸のポリマー（例えば、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）（まとめて本明細書で「ポリアクリル酸（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）」といわれる））、ポリジオキサノンおよびそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ（酪酸）、トリメチレンカーボネート、ならびにポリホスファゼン。
【００３９】
好ましい実施形態において、ポリマーは、ＦＤＡ承認生分解性ポリマー（例えば、ヒドロキシ酸（ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＧＡ）、ポリ無水物もしくはポリヒドロキシアルカノエート（例えば、ポリ（３−ブチレート）またはポリ（４−ブチレート））またはこれらのコポリマーである。
【００４０】
上記のもののコポリマー（例えば、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、もしくはグラフトコポリマー）、または上記で列挙したポリマーのブレンドがまた、使用され得る。そのポリマー上の官能基は、ポリマーの特性を変質させる、および／または官能基の反応性を改変する（例えば、低減もしくは増大する）ためにキャップされ得る。例えば、
カルボン酸のカルボキシル末端は、ポリマー（例えば、ラクチド含有およびグリコリド含有ポリマー）を含み、例えば、エステル化によって、必要に応じてキャップされてもよく、ヒドロキシル末端は、例えば、エーテル化もしくはエステル化によって、必要に応じてキャップされてもよい。
【００４１】
重量平均分子量は、所定のポリマーに関して変動し得るが、一般に、約１ｋＤ〜１，０００ｋＤ、１ｋＤ〜５００ｋＤ、１ｋＤ〜２５０ｋＤ、１０ｋＤ〜１００ｋＤ、５ｋＤ〜１００ｋＤ、５ｋＤ〜７５ｋＤ、５ｋＤ〜５０ｋＤ、または５ｋＤより大きく２５ｋＤまでである。
【００４２】
Ｂ．表面改変剤
ナノ粒子は、好ましくは、１もしくはこれより多くの表面変質剤または表面変質物質で被覆されるか、またはその表面で形成される。用語「表面変質剤（ｓｕｒｆａｃｅ  ａｌｔｅｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」とは、表面に関して粒子の１もしくはこれより多くの特性を改変する（親水性（例えば、粒子の親水性を高くするかもしくは低くする）、表面電荷（例えば、表面を中性もしくはほぼ中性に、またはより負にもしくはより正にする）が挙げられるが、これらに限定されない）、ならびに／または体液および／もしくは組織（例えば、粘液）中のもしくはこれらを通る輸送を増強する薬剤または物質に言及する。最も好ましい物質は、ポリアルキレンオキシド（例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ））である。
【００４３】
好ましい実施形態において、粒子は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、例えば、少なくとも１０，０００ダルトンの分子量を有するＰＥＧで被覆されるかまたはこれを含む。
【００４４】
ＰＥＧ（ＣＡＳ番号２５３２２−６８−３）は、多くの有用な特性（例えば、生体適合性（Ｐｏｗｅｌｌ  ＧＭ．  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ．  Ｉｎ：  Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＲＬ，  ｅｄｉｔｏｒ．  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｗａｔｅｒ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｇｕｍｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｎｓ．  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ：  １９８０．
ｐｐ．  １８-３１）、水性および有機媒体中での溶解度、毒性がない、非常に低い免
疫原性および抗原性（Ｄｒｅｂｏｒｇら， Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃ
ａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ， １９９０，  ３１５-６５）、ならびに良好な排出動態（Ｙａｍａｏｋａら，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ， １９９４，  ８３：６０１-６）を有する直
線状のポリエーテルジオールである。例えば、ポリ−（エチレングリコール）は、治療用タンパク質およびペプチドを誘導体化し、薬物安定性および溶解度を増大させ、毒性を低下させ、半減期を増大させ（Ｃａｌｉｃｅｔｉら，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ  Ｒｅｖ
， ２００３，  ５５，  １２６１-７７）、クリアランスおよび免疫原性を低減するために使用されてきた。これらの利益は、誘導体化において分枝状ＰＥＧを使用して特に観察されてきた（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉら，Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ， １９９８，  ９，
４１８-５０）。
【００４５】
ＰＥＧ分子の分子量および構造は、具体的な目的のために調節され得る。好ましい実施形態において、ＰＥＧは、１０，０００ダルトン（ＰＥＧ−１０ｋＤａ）もしくはこれより大きい分子量を有する。
【００４６】
高分子量ＰＥＧもしくはその誘導体と上記で記載されるコアポリマーのうちのいずれかとのコポリマーは、ポリマー粒子を作製するために使用され得る。ある特定の実施形態において、ＰＥＧもしくは誘導体は、コポリマーの内側の位置に位置し得る。好ましくは、ＰＥＧもしくは誘導体は、コポリマーの末端位置付近にもしくは末端位置に位置し得る。例えば、上記のポリマーのうちの１もしくはこれより多くは、ポリエチレングリコールま
たはポリエチレンオキシドのブロック（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標））、ポリエチレングリコールおよびポリエチレンオキシドのブロックコポリマーで末端形成され得る。
【００４７】
いくつかの実施形態において、コアポリマーは、ペグ化ポリマーおよび非ペグ化ポリマーのブレンドであり、ここでベースポリマーは、同じである（例えば、ポリスチレン（ＰＳ）およびＰＳ−ＰＥＧ）か、または異なる（例えば、ＰＳ−ＰＥＧおよびポリ（乳酸））。
【００４８】
高分子量ＰＥＧは、粒子の表面上への被覆として適用され得る。ある特定の実施形態において、ナノ粒子は、ＰＥＧの領域を相分離するかまたはさもなければ粒子の表面に位置させる条件下で形成される。表面限局性ＰＥＧ領域のみが、表面変質剤の機能を発揮し得るか、または表面変質剤を含み得る。他の実施形態において、粒子は、表面変質物質としてのポリエチレングリコールのブロックで末端形成された１もしくはこれより多くのポリマーから調製される。ＰＥＧは、粒子を形成するために使用されるコアポリマーに、（例えば、内側に、または一方の末端もしくは両末端に）共有結合されたブロックの形態にあり得る。特定の実施形態において、粒子は、ＰＥＧを含むブロックコポリマーから形成される。より具体的な実施形態において、粒子は、ＰＥＧを含むブロックコポリマーから調製され、ここでＰＥＧは、ベースポリマーの末端に共有結合される。
【００４９】
粘液浸透粒子へと製剤化するための代表的なＰＥＧ分子量としては、１０，０００ダルトン（１０ｋＤａ）、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、１００ｋＤａ、２００ｋＤａ、５００ｋＤａ、および１ＭＤａ、ならびに１０ｋＤａ〜１ＭＤａの範囲内の全ての値を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、１０ｋＤａの、または１０ｋＤａより大きい（例えば、２０ｋＤａ〜１００ｋＤａ（両端を含む）、好ましくは２０ｋＤａ〜４０ｋＤａの分子量を有する。任意の所定の分子量のＰＥＧは、他の特徴（例えば、長さ、密度、および分枝）において変動し得る。
【００５０】
有用であり得る他のポリマーとしては、ポリ（ビニルピロリドン）、およびポリ（アクリルアミド）が挙げられる。
【００５１】
表面改変剤の密度
表面変質剤の密度は、ナノ粒子が粘液に浸透する能力を決定するにあたって鍵となるパラメーターであり、粘膜上皮への活性薬剤のインビボでの成功裡の送達に影響を与える。
【００５２】
種々の技術が、ナノ粒子上の表面ＰＥＧ密度を測定するために使用され得る（ナノ粒子の生理化学的特性（例えば、表面電荷および流体力学的直径）に対する変化を直接測定するものが挙げられる）。代表的には、表面密度を決定するための方法は、粒子表面１ｎｍ２あたりのＰＥＧ鎖の数についての定量的情報を提供する。
【００５３】
熱重量分析（ＴＧＡ）は、ＰＥＧ含有量を計算するために使用され得る。代表的には、ＴＧＡは、無機物質に制限され、比較的多量のサンプルの使用を必要とする。
【００５４】
機能性ＰＥＧへの色素および試薬（例えば、蛍光色素）の反応は、ＰＥＧ定量化のために使用され得る。これらの方法において、官能基（例えば、−ＳＨ、−ＮＨ２など）を有する未反応ＰＥＧ分子は、ある特定の試薬との反応後に蛍光アッセイもしくは比色定量化によって定量され、表面ＰＥＧ密度は、上清中の未反応ＰＥＧ部分を差し引くことによって決定される。しかし、これらの方法は、表面ＰＥＧ化および機能性ＰＥＧに制限される。上清中の未反応フルオレセイン−ＰＥＧのシグナルの測定によって、ＰＲＩＮＴナノ粒子上の表面ＰＥＧ密度を定量するために使用される類似の方法は、ＰＥＧでのナノ粒子の表面改変に制限される。これらの定量的アッセイは、ＰＥＧ含有ブロックコポリマー（例
えば、広く使用されるポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）およびポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ））から調製される生体分解性ナノ粒子上のＰＥＧ密度を決定するために適していない。
【００５５】
他の実施形態において、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法は、ＰＥＧ含有ポリマーナノ粒子上の表面ＰＥＧ密度を、定性的にも定量的にも評価するために使用される（ＰＥＧピークは、代表的には約３．６５ｐｐｍで観察される）。ナノ粒子がＮＭＲ溶媒であるＤ２Ｏ内に分散される場合、コア内に埋め込まれたＰＥＧではなく、表面ＰＥＧのみが、ＮＭＲによって直接検出され得る。従って、ＮＭＲは、ＰＥＧの表面密度を直接測定するための手段を提供する。
【００５６】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ表面密度は、ペグ化および非ペグ化粒子の混合物から粒子を調製することによって制御される。例えば、ＰＬＧＡナノ粒子上のＰＥＧの表面密度は、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）およびポリ（エチレングリコール）の混合物（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）から粒子を調製することによって正確に制御され得る。代表的には、定量的１Ｈ  ＮＭＲは、ナノ粒子上の表面ＰＥＧ密度を測定するために使用される。
【００５７】
以前に、低分子量ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ  ２ｋＤａ）の低密度被覆が、同じＰＥＧの高密度被覆と比較して、粘膜接着を引き起こし、低分子量ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ  ２ｋＤａ）に匹敵する被覆密度の高分子量ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ  １０ｋＤａ）が、粘膜接着を引き起こしたことが決定された（Ｗａｎｇら，  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ，  ２００８，  ４７，  ９７２６−９７２９）。高分子量ＰＥＧ粘液浸透ナノ粒子は、本明細書で記載される粘液バリアに浸透するために十分である密度で表面改変剤を含み、より高い分子量にも関わらず、粘液浸透性である。
【００５８】
表面被覆の密度は、被覆剤自体の分子量とは対照的に、ナノ粒子が粘液に浸透する能力を媒介することが確証された。
【００５９】
表面充填密度は、全非拘束ＰＥＧ表面積被覆度（Γ）を全粒子表面積（ＳＡ）で除算したものとして表される：
（Γ／ＳＡ）＝充填密度
【００６０】
いくつかの実施形態において、ナノ粒子表面を粘液との相互作用から効果的に遮るために超えなければならない最小充填密度閾値が存在する。ある特定の実施形態において、被覆の充填密度は、十分であるか不十分であるかの間にある幅は狭い。
【００６１】
いくつかの実施形態において、１．３もしくは１．３未満の表面密度値（上記の式に従って決定される）は、頸膣粘液（ＣＶＭ）中での接着を生じる。従って、いくつかの実施形態において、粘液浸透ナノ粒子は、≧１．５の、例えば、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、もしくは２．５より大きいＰＥＧ表面密度（Γ／ＳＡ）を有する。
【００６２】
粘液浸透が起こる閾値表面充填密度値は、水中での類似のサイズにした粒子に関する理論的ＭＳＤ（ＭＳＤＷ）と比較した場合、実験的に、例えば、粘液における集団平均二乗変位量（ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ａｖｅｒａｇｅｄ  ｍｅａｎ  ｓｑｕａｒｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（ＭＳＤ）の分析によって、決定され得る。
【００６３】
代表的には、粒子表面積１００ｎｍ２あたりのＰＥＧ分子数は、ＰＥＧ  ＭＷが増大するにつれて低下する。これは、ＭＷが増大するにつれて、各ＰＥＧ鎖によって占有される
空間の量の増大にあるとされ得る；例えば、１つの非拘束５ｋＤａ  ＰＥＧ鎖によって占有される面積は、非拘束４０ｋＤａ  ＰＥＧ分子の約１８０ｎｍ２と比較すると、約２３ｎｍ２である。
【００６４】
生体分解性ナノ粒子上のＰＥＧの密な被覆は、粘液成分とナノ粒子との間の大いに低減した接着性相互作用が原因で、粘液を通じて迅速な浸透を可能にする。実施例で示されるように、ヒト粘液中での複数粒子追跡、ならびにマウス腟におけるムチン結合および組織分布の研究は、ＰＥＧ密度閾値が存在することを明らかにした。いくつかの実施形態において、１０，０００ダルトンの分子量を有するＰＥＧで結合体化したポリスチレン（ＰＳ）ナノ粒子に関しては、表面充填閾値は、粘液に浸透するにあたって有効であるために、およそ１〜５  ＰＥＧ鎖／１００ｎｍ２（両端を含む）、またはこれより大きい。
【００６５】
表面充填密度閾値は、種々の要因（粒子を調製するために使用されるコアポリマー、粒子サイズ、および／またはＰＥＧの分子量が挙げられる）に依存して変動し得る。
【００６６】
被覆の密度は、種々の要因（表面変質物質および粒子の組成が挙げられる）に基づいて変動され得る。一実施形態において、表面変質物質（例えば、ＰＥＧ）の密度は、１Ｈ  ＮＭＲによって測定される場合、１００ｎｍ２あたり少なくとも、０．１、０．２、０．５、０．８、０．９、１．０、１．２、１．５、１．８、２．０、２．９、３．０．、３．３、４．０、４．４、５．０、もしくは５．０より多い鎖である。上記の範囲は、０．１〜１００ユニット／ｎｍ２（両端を含む）の中の全ての値を含む。
【００６７】
特定の実施形態において、表面変質物質（例えば、ＰＥＧ）の密度は、約０．００１〜約２鎖／ｎｍ２、約０．０１〜約０．１鎖／ｎｍ２、約０．０５〜約０．５鎖／ｎｍ２、約０．１〜約０．２鎖／ｎｍ２、または約０．１５〜約０．２鎖／ｎｍ２である。表面変質物質（例えば、ＰＥＧ）の濃度も変動され得る。いくつかの実施形態において、表面変質物質（例えば、ＰＥＧ）の目標濃度は、少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、もしくは２５％またはこれより大きい。上記の範囲は、０．５％〜２５％の中の全ての値を含む。別の実施形態において、粒子における表面変質物質（例えば、ＰＥＧ）の濃度は、少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、もしくは２５％である。上記の範囲は、０．５％〜２５％の中の全ての値を含む。さらに他の実施形態において、粒子の表面上での表面変質物質含有量（例えば、ＰＥＧ）は、少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、もしくは２５％である。上記の範囲は、０．５％〜２５％の中の全ての値を含む。
【００６８】
特定の実施形態において、表面変質物質（例えば、ＰＥＧ）の密度は、表面変質物質（例えば、ＰＥＧ）が伸長したブラシ状構成をとるようなものである。
【００６９】
他の実施形態において、表面変質部分の質量は、粒子の質量のうちの少なくとも１／１０，０００、１／７５００、１／５０００、１／４０００、１／３４００、１／２５００、１／２０００、１／１５００、１／１０００、１／７５０、１／５００、１／２５０、１／２００、１／１５０、１／１００、１／７５、１／５０、１／２５、１／２０、１／５、１／２、または９／１０である。上記の範囲は、１／１０，０００〜９／１０の中の全ての値を含む。
【００７０】
代表的には、ＰＥＧ化後のナノ粒子の流体力学的直径は、ＰＥＧ  ＭＷが増大するにつれて増大する；例えば、ＰＥＧ鎖の密な充填は、伸長を引き起こすので、ＭＷ  ＰＥＧ鎖が多いほど、より厚い冠（ｃｏｒｏｎａ）を作る。
【００７１】
Ｃ．治療剤、予防剤、栄養補助剤（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）および／または診断剤
粘液浸透ナノ粒子（ＭＰＰ）は、粘膜表面への送達のために、１もしくはこれより多くの活性薬剤とともに製剤化され得る。代表的には、ＭＰＰは、１もしくはこれより多くの治療剤、予防剤、栄養補助剤および／または診断剤を含む。
【００７２】
１もしくはこれより多くの治療剤、予防剤、および／もしくは診断剤がポリマーナノ粒子内に被包されるおよび／またはナノ粒子の表面と会合される実施形態に関して、その％薬物負荷は、約１重量％〜約８０重量％、約１重量％〜約５０重量％、好ましくは約１重量％〜約４０重量％、より好ましくは約１重量％〜約２０重量％、最も好ましくは約１重量％〜約１０重量％である。上記の範囲は、１％〜８０％の中の全ての値を含む。薬剤がナノ粒子の表面と会合される実施形態に関して、％負荷は、薬物の量が被包化の方法によって制限されないので、より高くてもよい。いくつかの実施形態において、送達されるべき薬剤は、ナノ粒子内に被包されてもよく、粒子の表面と会合されてもよい。
【００７３】
例示的な活性薬剤は、以下でより詳細に考察される。
【００７４】
いくつかの実施形態において、粒子は、１もしくはこれより多くの治療剤がその中に被包されている、その中に分散されている、および／または表面と共有結合的もしくは非共有結合的に会合している。その治療剤は、小分子、タンパク質もしくはペプチド、糖もしくはポリサッカリド、核酸分子および／または脂質であり得る。
【００７５】
小分子治療剤の例示的クラスとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：鎮痛薬、抗炎症薬、解熱薬、抗鬱薬、鎮痙薬、抗精神病剤（ａｎｔｉｏｐｓｙｃｈｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、神経保護剤、抗増殖剤（例えば、抗がん剤）、抗感染剤（例えば、抗菌剤および抗真菌剤）、抗ヒスタミン薬、抗片頭痛薬、抗ムスカリン薬、抗不安薬、鎮静剤、催眠薬、抗精神病薬、気管支拡張薬、抗喘息薬、心血管薬、コルチコステロイド、ドパミン作動薬、電解質、胃腸薬、筋弛緩薬、栄養剤、ビタミン、副交感神経作用薬、刺激剤、食欲抑制薬および抗ナルコレプシー薬（ａｎｔｉ−ｎａｒｃｏｌｅｐｔｉｃｓ）。
【００７６】
例示的な予防剤としては、ワクチン抗原が挙げられる。
【００７７】
いくつかの実施形態において、その薬剤は、１もしくはこれより多くの核酸である。その核酸は、内因性の核酸配列を変質させ得るか、矯正し得るか、またはこれに置き換わり得る。その核酸は、がんを処置する、他の肺疾患および代謝疾患において遺伝子における欠陥を矯正するために使用される。
【００７８】
例示的な核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、化学改変された核酸、およびこれらの組み合わせが挙げられる。核酸半減期の安定性および酵素切断への抵抗性を増大させるための方法は、当該分野で公知である。
【００７９】
例示的な診断物質としては、常磁性分子、蛍光化合物、磁性分子、および放射性核種が挙げられる。適切な診断剤としては、ｘ線画像化剤および造影剤が挙げられるが、これらに限定されない。放射性核種はまた、画像化剤として使用され得る。他の適切な造影剤の例としては、ガスもしくはガス発生化合物（これらは放射線不透過性である）が挙げられる。ナノ粒子は、投与された粒子の位置を決定するために有用な薬剤をさらに含み得る。
この目的のために有用な薬剤としては、蛍光タグ、放射性核種および造影剤が挙げられる。
【００８０】
１もしくはこれより多くの治療剤、予防剤、および／もしくは診断剤がポリマーナノ粒子内に被包される、ならびに／またはナノ粒子の表面と会合される実施形態に関して、％薬物負荷は、約１重量％〜約８０重量％、約１重量％〜約５０重量％、好ましくは約１重量％〜約４０重量％、より好ましくは約１重量％〜約２０重量％、最も好ましくは約１重量％〜約１０重量％である。上記の範囲は、１％〜８０％の中の全ての値を含む。その薬剤が粒子の表面と会合される実施形態に関して、その％負荷は、薬物の量が被包化の方法によって制限されないので、より高くてもよい。いくつかの実施形態において、送達されるべき薬剤は、ナノ粒子内に被包され得、その粒子の表面と会合され得る。栄養補助物質もまた、組みこまれ得る。これらは、ビタミン、栄養補助食品（supplement）（例えば、カルシウムもしくはビオチン）、または天然成分（例えば、植物抽出物もしくは植物ホルモン）であり得る。
【００８１】
Ｄ．粒子の特性
粒子サイズ、ゼータ電位（ζ電位）、ＰＥＧ表面密度（ＰＥＧによって網羅される面積／全表面積、またはΓ／ＳＡ）は、ナノ粒子が粘液の中で動きかつ粘液を通って浸透する能力に影響を与え得る全ての要因である。粘液中の集団平均ＭＳＤ（＜ＭＳＤ＞）と水中での類似のサイズにした粒子の理論的ＭＳＤ（ＭＳＤｗ）との比較は、粘液中でのナノ粒子の動きがどの程度遅いかを示すために使用され得る（ＭＳＤｗ／＜ＭＳＤ＞）。
【００８２】
１．表面電荷および粒子サイズ
それらの粘液を通じての拡散を促進するために、ナノ粒子は、代表的には、中性に近い表面電荷を有する。ある特定の実施形態において、ナノ粒子は、約１０ｍＶ〜約−１０ｍＶ（両端を含む）の間、好ましくは約５ｍＶ〜約−５ｍＶの間、より好ましくは約３ｍＶ〜約−３ｍＶの間、最も好ましくは約２ｍＶ〜約−２ｍＶの間のζ電位を有する。
【００８３】
代表的には、表面変質物質（例えば、ＰＥＧ）は、正に荷電したもしくは負に荷電したコアポリマーを遮る冠を形成し、効果的に中性の表面をもたらすために十分な密度で存在しなければならない。
【００８４】
本明細書で記載される粒子がナノ粒子といわれるが、代表的には、１ｎｍから約１ミクロンまで（しかし１ミクロンを含まない）、より好ましくは約５０ｎｍ〜約９００ｎｍ、最も好ましくは約６０ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲の平均直径を有する。ある特定の実施形態において、粒子の平均直径は、約６０ｎｍ〜約３００ｎｍである。しかし、粒子は、ミクロン範囲のサイズにされて調製され得る。粒子を調製するために使用される条件および／または物質は、粒子のサイズを変化させるために変動され得る。
【００８５】
ある特定の実施形態において、ナノ粒子は、霧状にした後に、または４℃において少なくとも１ヶ月間、より好ましくは少なくとも２ヶ月間、最も好ましくは少なくとも３ヶ月間の貯蔵後に、それらの粒子サイズおよびζ電位を保持する。
【００８６】
例示的実施形態において、５〜４０ｋＤａ  ＰＥＧで被覆された２００ｎｍ  ポリスチレンナノ粒子（ＰＳ  ＮＰ）（ＰＳ−ＰＥＧ−ＮＰ）は、測定された平均二乗変位量（＜ＭＳＤ＞）値によって示される場合、頸膣粘液（ＣＶＭ）に迅速に浸透し、被覆されていないＰＳ  ＮＰとは全く対照的に、拡散性の挙動を示した（表１を参照のこと）。
【００８７】
ＩＩＩ．薬学的組成物
いくつかの実施形態において、粘液浸透ナノ粒子（ＭＰＰ）は、身体上もしくは身体中
への投与のために薬学的に受容可能な組成物へと製剤化される。
【００８８】
本明細書で記載される製剤は、粘膜表面への投与に適した薬学的キャリア中にナノ粒子（「ＭＰＰ」）の有効量を含む。
【００８９】
Ａ．液剤、エマルジョン、およびゲル
粒子は、薬学的に受容可能な製剤において投与され得る（例えば、滅菌食塩水、リン酸緩衝化食塩水または取り込みを増強する低張性溶液）。いくつかの実施形態において、その薬学的キャリアは、ある特定の所望の張度を有するように調節される。例えば、ある特定の実施形態において、その薬学的キャリアは、低張性になるように調節される。当業者は、処置されるべき所望の組織が一旦同定されれば、本明細書で記載される好ましい張度範囲に基づいて、薬学的キャリアの張度を慣用的に調節し得る。
【００９０】
張度は、「有効な質量オスモル濃度（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ）」であり、膜を横切る浸透力を発揮する能力を有する溶質の濃度の合計に等しい。多くの種々の物質が、張度を調節するために使用され得る。例えば、ＵＳＰ  ２９−ＮＦ  ２４は、「張度（ｔｏｎｉｃｉｔｙ）」薬剤として分類される５種の賦形剤を列挙する（デキストロース、グリセリン；塩化カリウム；マンニトール；および塩化ナトリウムが挙げられる）。例えば、以下を参照のこと：Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，  Ｉｎｃ．  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  ２９−Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  ２４．  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ：  Ｕ．Ｓ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，  Ｉｎｃ．；  ２００５：  ３２６１；  Ｄａｙ，  Ａ．  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ．  Ｉｎ：  Ｒｏｗｅ  ＲＣ，  Ｓｈｅｓｋｅｙ  ＰＪ  ａｎｄ  Ｏｗｅｎ  ＳＣ，  ｅｄｓ．  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ．  ５ｔｈ  ｅｄ．  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ：  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；  ２００５：  ２３１−２３３；  Ｐｒｉｃｅ  ＪＣ．
Ｇｌｙｃｅｒｉｎ．    Ｉｎ：  Ｒｏｗｅ  ＲＣ，  Ｓｈｅｓｋｅｙ  ＰＪ  ａｎｄ  Ｏｗｅｎ  ＳＣ，  ｅｄｓ．  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ．  ５ｔｈ  ｅｄ．  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ：  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；  ２００５：  ３０１−３０３；  Ｐｒｉｃｅ  ＪＣ．  Ｇｌｙｃｅｒｉｎ．  Ｉｎ：  Ｒｏｗｅ  ＲＣ，
Ｓｈｅｓｋｅｙ  ＰＪ  ａｎｄ  Ｏｗｅｎ  ＳＣ，  ｅｄｓ．  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ．  ５ｔｈ  ｅｄ．  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ：  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；  ２００５：  ３０１−３０３；  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  ＮＡ．  Ｍａｎｎｉｔｏｌ．  Ｉｎ：  Ｒｏｗｅ  ＲＣ，  Ｓｈｅｓｋｅｙ  ＰＪ  ａｎｄ  Ｏｗｅｎ
ＳＣ，  ｅｄｓ．  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ．  ５ｔｈ  ｅｄ．  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ：  Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；  ２００５：  ４４９−４５３；  Ｏｗｅｎ  ＳＣ．  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ．  Ｉｎ：  Ｒｏｗｅ  ＲＣ，  Ｓｈｅｓｋｅｙ  ＰＪ  ａｎｄ  Ｏｗｅｎ  ＳＣ，  ｅｄｓ．  Ｈａｎｄｂｏｏｋ
ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ．  ５ｔｈ  ｅｄ．  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ：  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；  ２００５：  ６７１−６７４。マンニトールは、欧州において食品添加物としての使用に関して認められたＧＲＡＳとして列挙された成分の例であり、ＦＤＡ  Ｉｎａｃｔｉｖｅ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＰ、ＩＭ、ＩＶ、およびＳＣ注射；注入；口内錠、経口錠剤および舌下錠、散剤およびカプセル剤；眼用調製物；局所液剤）の中に含まれ、英国において認可された非経口でない（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）および非経口医薬の中に含まれ、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｎａｔｕｒａ
ｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｄａｔａｂａｓｅの中に含まれる。５．０７％  ｗ／ｖ  水性溶液は、血清と等張性である。
【００９１】
最小限に低張性の製剤（好ましくは２０〜２２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲に及ぶ）は、上皮毒性の最小限のリスクで、膣表面全体へのＭＰＰの迅速かつ均一な送達を提供する。血漿のものを超える質量オスモル濃度を有するビヒクル（一般に、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇで等張性と考えられる）が、結腸における分布において改善をもたらすように、結腸ではより高い質量オスモル濃度が存在する。結腸における低張性ビヒクルでの改善された結腸分布の範囲は、製剤中の溶質の主要部分がＮａ＋イオンからなる場合、約２０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４５０ｍＯｓｍ／ｋｇである。なぜならこれらは、活発に上皮によって取り込まれ（吸収され）、たとえ血液に対して高浸透圧であるとしても、その製剤を効果的に低張性にするからである。
【００９２】
Ｂ．肺製剤
いくつかの実施形態において、粘液浸透ナノ粒子（ＭＰＰ）は、肺投与のために製剤化される。乾燥散剤および液体製剤の両方が、エアロゾル製剤を形成するために使用され得る。用語エアロゾルは、本明細書で使用される場合、粒子の微細な霧の任意の調製物に言及し、その粒子は、噴霧体を使用して生成されようがそうでなかろうが、液剤もしくは懸濁物中にあり得る。乾燥粉末製剤は、空気もしくは適切な噴霧体以外は、いかなるキャリアの利益がなくても患者に肺吸入を介して投与され得る。
【００９３】
薬学的キャリアは、増量剤または脂質もしくは界面活性剤を含み得る。天然の界面活性剤（例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ））は、最も好ましい。合成および動物由来の肺界面活性剤としては、以下が挙げられる：Ｅｘｏｓｕｒｆ（ＤＰＰＣとヘキサデカノールおよび展着剤として添加されるチロキサポールとの混合物）、Ｐｕｍａｃｔａｎｔ（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｌｕｎｇ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ＣｏｍｐｏｕｎｄもしくはＡＬＥＣ）（ＤＰＰＣおよびＰＧの混合物）、ＫＬ−４（ＤＰＰＣ、パルミトイル−オレオイルホスファチジルグリセロールおよびパルミチン酸から構成され、ＳＰ−Ｂの構造特徴を模倣する２１アミノ酸の合成ペプチドと合わせられる）、Ｖｅｎｔｉｃｕｔｅ（ＤＰＰＣ、ＰＧ、パルミチン酸および組換えＳＰ−Ｃ）、Ａｌｖｅｏｆａｃｔ（ウシ肺洗浄液から抽出）、Ｃｕｒｏｓｕｒｆ（切り刻んだブタ肺に由来する材料から抽出）、Ｉｎｆａｓｕｒｆ（仔牛肺洗浄液から抽出）、ならびにＳｕｒｖａｎｔａ（切り刻んだウシ肺から抽出し、ＤＰＰＣ、パルミチン酸およびトリパルミチンを添加）。Ｅｘｏｓｕｒｆ、Ｃｕｒｏｓｕｒｆ、Ｉｎｆａｓｕｒｆ、およびＳｕｒｖａｎｔａは、米国における使用に関して現在ＦＤＡが承認している界面活性剤である。
【００９４】
薬学的キャリアはまた、１もしくはこれより多くの安定化剤もしくは分散剤を含み得る。薬学的キャリアはまた、１もしくはこれより多くのｐＨ調節剤もしくは緩衝液を含み得る。適切な緩衝液としては、有機酸および塩基から調製される有機塩（例えば、クエン酸ナトリウムまたはアスコルビン酸ナトリウム）が挙げられる。薬学的キャリアはまた、１もしくはこれより多くの塩（例えば、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）を含み得る。乾燥粉末製剤は、代表的には、１もしくはこれより多くの粘液浸透ナノ粒子と１もしくはこれより多くの薬学的に受容可能なキャリアとをブレンドすることによって調製される。必要に応じて、さらなる活性薬剤が、以下で考察されるとおりの混合物へと組みこまれ得る。次いで、その混合物は、当該分野で公知の技術（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥、凝集、スプレーコーティング、コアセルベーション、低温注型（ｌｏｗ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｃａｓｔｉｎｇ）、製粉（例えば、空気摩擦ミル（ａｉｒ−ａｔｔｒｉｔｉｏｎ  ｍｉｌｌｉｎｇ）（ジェットミル）、ボールミル）、高圧ホモジナイゼーション、および／または超臨界流体結晶化）を使用して、肺投与に適した粒子へと形成される。
【００９５】
ある特定の実施形態において、粘液浸透ナノ粒子（ＭＰＰ）は、エアロゾルとしての投与のために製剤化される。上記で記載される乾燥粉末製剤および液体製剤は、肺投与のためのエアロゾル製剤を形成するために使用され得る。気道への治療剤および／または他の活性薬剤の送達のためのエアロゾルは、当該分野で公知である。用語エアロゾルは、本明細書で使用される場合、ガスの中に懸濁された固体もしくは液体の粒子の微細な霧の任意の調製物に言及する。いくつかの場合には、そのガスは、噴霧体であり得る；しかし、これは、必要ではない。エアロゾルは、多くの標準的技術（超音波処理もしくは高圧処理が挙げられる）を使用して生成され得る。
【００９６】
いくつかの場合には、デバイスが、肺へと製剤を投与するために使用される。適切なデバイスとしては、乾燥散剤吸入器、加圧式定量噴霧吸入器、ネブライザ、および電気流体力学的エアロゾルデバイス（ｅｌｅｃｔｒｏｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ａｅｒｏｓｏｌ
ｄｅｖｉｃｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。吸入は、患者の鼻および／または口腔を通じて起こり得る。投与は、吸入する間の製剤の自己投与によって、または人工呼吸器に繋がれた患者への人工呼吸器を介する製剤の投与によって、起こり得る。
【００９７】
Ｃ．局所製剤および眼用製剤
ある特定の実施形態において、粘液浸透ナノ粒子（ＭＰＰ）を、眼の粘膜表面への投与のために製剤化する。局所または経腸製剤は、当該分野で公知の技術を使用して、水性組成物として調製され得る。代表的には、このような組成物は、液剤もしくは懸濁物；注射前に再構成媒体の添加に際して液剤または懸濁物を調製するために使用するために適した固体形態；エマルジョン（例えば、油中水型（ｗ／ｏ）エマルジョン、水中油型（ｏ／ｗ）エマルジョン、およびこれらのマイクロエマルジョン）、リポソーム、エマルソーム、スプレー、ゲル、クリーム剤、または軟膏剤として調製され得る
【００９８】
キャリアは、溶媒または分散媒（例えば、水、エタノール、１もしくはこれより多くのポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、油（例えば、植物性油（例えば、ラッカセイ油、コーン油、ゴマ油など）、およびこれらの組み合わせ）を含む）であり得る。適切な流動性は、例えば、被覆（例えば、レシチン）の使用によって、分散物の場合には、必要とされる粒子サイズの維持によって、および／または界面活性剤の使用によって、維持され得る。多くの場合には、張度を調節するために薬剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含めることが好ましい。
【００９９】
遊離酸もしくは塩基としての活性化合物または薬理学的に受容可能なこれらの塩の液剤および分散物は、水または別の溶媒または分散媒（１もしくはこれより多くの薬学的に受容可能な賦形剤（界面活性剤、分散剤、乳化剤、ｐＨ改変剤、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）と適切に混合される）中に調製され得る。
【０１００】
適切な界面活性剤は、アニオン性、カチオン性、両性、または非イオン性の表面活性剤であり得る。適切なアニオン性界面活性剤としては、カルボキシレート、スルホネートおよびスルフェートイオンを含むものが挙げられるが、これらに限定されない。アニオン性界面活性剤の例としては、長鎖アルキルスルホネートおよびアルキルアリールスルホネートのナトリウム、カリウム、アンモニウム（例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム）；ジアルキルナトリウムスルホスクシネート（例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム）；ジアルキルナトリウムスルホスクシネート（例えば、ビス−（２−エチルチオキシル）−スルホコハク酸ナトリウム）；およびアルキルスルフェート（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）が挙げられる。カチオン性界面活性剤としては、４級アンモニウム化合物（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、臭化セトリモニウム（ｃｅｔｒｉｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、ステアリルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ポリオキシエチレンおよびココナッツアミン（ｃｏｃｏｎｕｔ  ａｍｉｎｅ
）が挙げられるが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤の例としては、エチレングリコールモノステアレート、プロピレングリコールミリステート、グリセリルモノステアレート、グリセリルステアレート、ポリグリセリル−４−オレエート、アシル化ソルビタン（ｓｏｒｂｉｔａｎ  ａｃｙｌａｔｅ）、アシル化スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ  ａｃｙｌａｔｅ）、ＰＥＧ−１５０ラウレート、ＰＥＧ−４００モノラウレート、ポリオキシエチレンモノラウレート、ポリソルベート、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ＰＥＧ−１０００セチルエーテル、ポリオキシエチレントリデシルエーテル、ポリプロピレングリコールブチルエーテル、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）  ４０１、ステアロイルモノイソプロパノールアミド、およびポリオキシエチレン水素化獣脂アミドが挙げられる。両性界面活性剤の例としては、Ｎ−ドデシル−β−アラニンナトリウム、Ｎ−ラウリル−β−イミノジプロピオン酸ナトリウム、ミリストアンホアセテート、ラルリルベタインおよびラウリルスルホベタインが挙げられる。
【０１０１】
製剤は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含み得る。適切な保存剤としては、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、およびチメロサールが挙げられるが、これらに限定されない。製剤はまた、活性薬剤の分解を防止するために抗酸化剤を含み得る。
【０１０２】
製剤は、代表的には、再構成に際して、投与のために３〜８のｐＨに緩衝化される。適切な緩衝液としては、ホスフェート緩衝液、アセテート緩衝液、およびシトレート緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
水溶性ポリマーはしばしば、薬学的製剤において使用される。適切な水溶性ポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、およびポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。滅菌液剤は、適切な溶媒もしくは分散媒中で必要とされる量にある活性化合物と、必要な場合に、上記で列挙される賦形剤のうちの１もしくはこれより多くとを組み込み、続いて、濾過滅菌によって調製され得る。一般に、分散物は、種々の滅菌した活性成分を、基本的な分散媒および上記で列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルの中に組み込むことによって調製される。滅菌注射用液剤を調製するための滅菌散剤の場合、好ましい調製法は、その予め滅菌濾過された溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術である。上記散剤は、粒子が本質的には多孔性であるような様式において調製され得る。これは、粒子の溶解を増大させ得る。多孔性粒子の作製法は、当該分野で周知である。
【０１０４】
眼投与のための薬学的製剤は、好ましくは、１もしくはこれより多くのポリマー−薬物結合体から形成される粒子の滅菌水性液剤または懸濁物の形態にある。受容可能な溶媒は、例えば、水、リンゲル溶液、浸透圧の（ｏｓｍｏｌａｒ）（ＰＢＳ）および等浸透圧の（ｉｓｏ−ｏｓｍｏｌａｒ）塩化ナトリウム溶液が挙げられ、これらは、次いで、浸透圧で誘導される水（涙液）の流れを観察するためにＭＰＰを使用して決定される場合に眼のために所望の低張性へと調節される。製剤はまた、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤もしくは溶媒（例えば、１，３−ブタンジオール）中の滅菌液剤、懸濁物、またはエマルジョンであり得る。
【０１０５】
場合によっては、製剤は、液体または半固体形態（例えば、液剤（点眼剤）、懸濁物、ゲル、クリーム剤または軟膏剤）において流通もしくはパッケージされる。あるいは、眼投与のための製剤は、固体として充填され得、例えば、適切な液体製剤の凍結乾燥によって得られ得る。その固体は、投与前に、適切なキャリアまたは希釈剤で再構成され得る。
【０１０６】
眼投与のための液剤、懸濁物、またはエマルジョンは、眼投与に適したｐＨを維持する
ために必要な有効量の緩衝液で緩衝化され得る。有用な緩衝液の例は、アセテート、ボレート、カーボネート、シトレートよびホスフェート緩衝液である。眼投与のための液剤、懸濁物、またはエマルジョンはまた、適度に低張性の範囲にあるように、製剤の張度を調節するために、１もしくはこれより多くの張度剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）を含み得る。適切な張度剤は、当該分野で周知であり、いくつかの例としては、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、および他の電解質が挙げられる。
【０１０７】
眼投与のための液剤、懸濁物、またはエマルジョンはまた、眼用調製物の細菌汚染を防止するために、１もしくはこれより多くの保存剤を含み得る。適切な保存剤は、当該分野で公知であり、ポリヘキサメチレンビグアニジン（ＰＨＭＢ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）、安定化オキシクロロ錯体（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｘｙｃｈｌｏｒｏ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）（別名Ｐｕｒｉｔｅ（登録商標）として公知）、酢酸フェニル水銀、クロロブタノール、ソルビン酸、クロルヘキシミド、ベンジルアルコール、パラベン、チメロサール、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１０８】
眼投与のための液剤、懸濁物、またはエマルジョンはまた、１もしくはこれより多くの当該分野で公知の賦形剤（例えば、分散剤、湿潤剤、および懸濁剤）を含み得る。
【０１０９】
さらに他の実施形態において、ナノ粒子は、粘膜への局所投与のために製剤化される。局所投与に適した剤形としては、クリーム剤、軟膏剤、膏薬（ｓａｌｖｅ）、スプレー、ゲル、ローション剤、およびエマルジョンが挙げられる。
【０１１０】
製剤は、１もしくはこれより多くの賦形剤（例えば、皮膚軟化剤、界面活性剤、および乳化剤）を含み得る。「皮膚軟化剤（ｅｍｏｌｌｉｅｎｔ）」とは、皮膚を柔らかくするかまたは滑らかにする外用薬剤であり、当該分野で一般に公知であり、便覧（例えば、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」，  第４版，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００３）に列挙される。これらとしては、アーモンド油、ヒマシ油、イナゴ豆抽出物、セトステアロイルアルコール、セチルアルコール、セチルエステルワックス、コレステロール、綿実油、シクロメチコン、エチレングリコールパルミトステアレート、グリセリン、グリセリンモノステアレート、グリセリルモノオレエート、イソプロピルミリステート、イソプロピルパルミテート、ラノリン、レシチン、軽鉱油（ｌｉｇｈｔ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｏｉｌ）、中鎖トリグリセリド、鉱油とラノリンアルコール、ワセリン、ワセリンとラノリンアルコール、ダイズ油、デンプン、ステアリルアルコール、ひまわり油、キシリトールおよびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、皮膚軟化剤は、エチルヘキシルステアレートおよびエチルヘキシルパルミテートである。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、粘液浸透ナノ粒子は、１もしくはこれより多くの界面活性剤とともに製剤化される。界面活性剤は、表面張力を低下させ、それによって生成物の乳化、発泡、分散、拡がり、および湿潤特性を増大させる表面活性剤である。適切な非イオン性界面活性剤としては、乳化ワックス、グリセリルモノオレエート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリソルベート、ソルビタンエステル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、シクロデキストリン、グリセリンモノステアレート、ポロキサマー、ポビドンおよびこれらの組み合わせが挙げられる。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、ステアリルアルコールである。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、粘液浸透ナノ粒子は、１もしくはこれより多くの乳化剤とともに製剤化される。乳化剤は、一方の液体を別の液体中に懸濁することを促進しかつ油および水の安定な混合物、またはエマルジョンの形成を促進する表面活性物質である。一般的な乳化剤は、以下である：金属石鹸、ある特定の動物性および植物性の油、ならび
に種々の極性化合物。適切な乳化剤としては、以下が挙げられる：アカシア、アニオン性乳化ワックス、ステアリン酸カルシウム、カルボマー、セトステアロイルアルコール、セチルアルコール、コレステロール、ジエタノールアミン、エチレングリコールパルミトステアレート、グリセリンモノステアレート、グリセリルモノオレエート、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒプロメロース、ラノリン、含水、ラノリンアルコール、レシチン、中鎖トリグリセリド、メチルセルロース、鉱油およびラノリンアルコール、一塩基性リン酸ナトリウム、モノエタノールアミン、非イオン性乳化ワックス、オレイン酸、ポロキサマー、ポロキサマー類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンステアレート、プロピレングリコールアルギネート、自己乳化グリセリルモノステアレート、クエン酸ナトリウム無水物（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、ラウリル硫酸ナトリウム、ソルビタンエステル、ステアリン酸、ひまわり油、トラガカント、トリエタノールアミン、キサンタンガムおよびこれらの組み合わせ。一実施形態において、乳化剤は、グリセロールステアレートである。
【０１１３】
浸透増強剤の適切なクラスは、当該分野で公知であり、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、脂肪酸、脂肪アルコールエーテル、アミノ酸、リン脂質、レシチン、コール酸塩、酵素、アミンおよびアミド、錯化剤（リポソーム、シクロデキストリン、改変セルロース、およびジイミド）、大環状化合物（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ）（例えば、大環状ラクトン、ケトン、および無水物ならびに環式尿素）、界面活性剤、Ｎ−メチルピロリドンおよびその誘導体、ＤＭＳＯおよび関連化合物、イオン性化合物、アゾンおよび関連化合物、ならびに溶媒（例えば、アルコール、ケトン、アミド、ポリオール（例えば、グリコール））が挙げられるが、これらに限定されない。これらクラスの例は、当該分野で公知である。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、粘液浸透ナノ粒子は、「油（ｏｉｌ）」として製剤化される。油は、少なくとも９５重量％の親油性物質を含む組成物である。親油性物質の例としては、天然に存在するおよび合成の油、脂肪、脂肪酸、レシチン、トリグリセリド、ならびにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
「連続相（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｐｈａｓｅ）」とは、固体が懸濁されているかまたは別の液体の液滴が分散されている液体に言及し、ときおり外部相（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｐｈａｓｅ）といわれる。これはまた、固体もしくは流体の粒子が分配されるコロイドの流体相に言及する。その連続相が水（または別の親水性溶媒）である場合、水溶性または親水性の薬物は、連続相の中に溶解する（分散されるのとは対照的に）。多相製剤（例えば、エマルジョン）において、不連続相（ｄｉｓｃｒｅｅｔ  ｐｈａｓｅ）は、連続相の中に懸濁または分散される。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、粘液浸透ナノ粒子は、エマルジョンとともに製剤化される。エマルジョンは、一緒に均質にブレンドされた非混和性の構成要素の混合物を含む組成物である。特定の実施形態において、非混和性の構成要素は、親油性構成要素および水性構成要素を含む。エマルジョンは、第２の液体全体にわたって小さな小滴で分配される一方の液体の調製物である。分散された液体は、不連続相であり、分散媒は、連続相である。油が分散された液体であり、水性溶液が連続相である場合には、それは、水中油型エマルジョンとして公知であるのに対して、水または水性溶液が分散された相でありかつ油または油性の物質が連続相である場合には、それは、油中水型エマルジョンとして公知である。油相および水性相のいずれかまたは両方が、１もしくはこれより多くの界面活性剤、乳化剤、エマルジョン安定化剤、緩衝液、および他の賦形剤を含み得る。好ましい賦形剤としては、界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤；乳化剤、特に乳化ワックス；および液体不揮発性非水性物質、特にグリコール（例えば、プロピレングリコール）が挙げら
れる。油相は、他の油性の薬学的に承認された賦形剤を含み得る。例えば、ヒドロキシル化ヒマシ油またはゴマ油のような物質が、界面活性剤または乳化剤として油相において使用され得る。
【０１１７】
エマルジョンの部分セットは、自己乳化系である。これらの薬物送達系は、代表的には、界面活性剤および親油性液体（例えば、油もしくは他の水に非混和性の液体）の混合物中に分散または溶解された薬物から構成されるカプセル剤（硬質シェルまたは軟質シェル）である。カプセル剤が水性環境に曝され、外側のゼラチンシェルが溶解する場合、水性媒体とカプセル内容物との間の接触は、非常に小さなエマルジョン液滴を即座に生成する。これらは、代表的には、ミセルまたはナノ粒子のサイズ範囲にある。代表的には、エマルジョン製剤化プロセスにおける場合のようにエマルジョンを生成するために混合力は必要とされない。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、粘液浸透ナノ粒子は、ローション剤として製剤化される。ローション剤は、低粘性〜中程度の粘性の液体製剤である。ローション剤は、懸濁剤および分散剤の使用を通じて、分散媒中に溶解した状態の微細に粉末化した物質を含み得る。あるいは、ローション剤は、分散相として、ビヒクルと非混和性であり、かつ通常は、乳化剤もしくは他の適切な安定化剤によって分散されている液体物質を有し得る。一実施形態において、ローション剤は、１００〜１０００センチストークスの間の粘性を有するエマルジョンの形態にある。ローション剤の流動性は、広い表面積を覆う迅速かつ均一な適用を可能にする。ローション剤は、代表的には、皮膚上で乾燥させ、皮膚表面上にそれら医療的構成要素の薄い被覆を残すことが意図される。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、粘液浸透ナノ粒子は、クリーム剤として製剤化される。クリーム剤は、「水中油」型または「油中水」型のいずれかの粘性の液体もしくは半固体のエマルジョンである。クリーム剤は、乳化剤および／または他の安定化剤を含み得る。一実施形態において、その製剤は、１０００センチストークスより大きい、代表的には、２０，０００〜５０，０００センチストークスの範囲の粘性を有するクリーム剤の形態にある。クリーム剤はしばしば、一般に拡げやすくかつ除去しやすいので軟膏剤より好ましい。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、粘液浸透ナノ粒子は、軟膏剤として製剤化される。軟膏剤は、軟膏基剤および必要に応じて１もしくはこれより多くの活性薬剤を含む半固体調製物である。適切な軟膏基剤の例としては、炭化水素基剤（例えば、ワセリン、白色ワセリン、黄色軟膏（ｙｅｌｌｏｗ  ｏｉｎｍｅｎｔ）、および鉱油）；吸収基剤（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｂａｓｅ）（親水性ワセリン、無水ラノリン、ラノリン、およびコールドクリーム）；水で除去可能な基剤（ｗａｔｅｒ−ｒｅｍｏｖａｂｌｅ  ｂａｓｅ）（例えば、親水性軟膏剤）、および水溶性基剤（例えば、ポリエチレングリコール軟膏剤）が挙げられる。パスタ剤（ｐａｓｔｅ）は、代表的には、より大きなパーセンテージの固体を含むという点で、軟膏剤とは異なる。パスタ剤は、代表的には、同じ構成要素で調製された軟膏剤より吸収性が大きくかつ脂っぽくない。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、粘液浸透ナノ粒子は、ゲルとして製剤化される。ゲルは、液体ビヒクル中に溶解または懸濁される増粘剤またはポリマー物質の作用によって半固体にされる、液体ビヒクル中に小分子または大型分子の分散物を含む半固体系である。液体は、親油性構成要素、水性構成要素または両方を含み得る。いくらかのエマルジョンは、ゲルであってもよいし、さもなければゲル構成要素を含んでいてもよい。しかし、いくらかのゲルは、エマルジョンではない。なぜならゲルが非混和性構成要素の均質化されたブレンドを含まないからである。適切なゲル化剤としては、改変セルロース（例えば、ヒドロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロース）；Ｃａｒｂｏｐｏｌホ
モポリマーおよびコポリマー；ならびにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。液体ビヒクル中の適切な溶媒としては、ジグリコールモノエチルエーテル；アルキレングリコール（ａｌｋｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）（例えば、プロピレングリコール）；ジメチルイソソルビド；アルコール（例えば、イソプロピルアルコールおよびエタノール）が挙げられるが、これらに限定されない。溶媒は、代表的には、薬物を溶解するその能力に関して選択される。他の添加剤（これは皮膚の感触および／または製剤の軟化性を改善する）がまた、組みこまれ得る。このような添加剤の例としては、イソプロピルミリステート、酢酸エチル、Ｃ１２−Ｃ１５アルキルベンゾエート、鉱油、スクアラン、シクロメチコン、カプリン酸／カプリル酸トリグリセリド、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、粘液浸透ナノ粒子は、泡状物（ｆｏａｍ）として製剤化される。泡状物は、ガスの噴霧体またはガスを放出する構成要素との組み合わせでのエマルジョンからなる。いくつかの実施形態において、粘液浸透ナノ粒子は、組成物のｐＨを制御するために使用される１もしくはこれより多くの緩衝液とともに製剤化される。好ましくは、緩衝液は、ｐＨ約４〜ｐＨ約７．５、より好ましくはｐＨ約４〜ｐＨ約７、および最も好ましくはｐＨ約５〜ｐＨ約７の組成物を緩衝化する。
【０１２３】
Ｄ．経腸製剤
いくつかの実施形態において、粘液浸透ナノ粒子は、経腸投与のために製剤化される。適切な経口剤形としては、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁物、シロップ剤、およびロゼンジが挙げられる。錠剤は、当該分野で周知の圧縮または成形技術を使用して作製され得る。ゼラチンまたは非ゼラチンのカプセル剤が、硬質または軟質のカプセルシェルとして調製され得、これらは、液体、固体、および半固体の充填材料を、当該分野で周知の技術を使用して被包し得る。製剤は、１もしくはこれより多くの薬学的に受容可能な賦形剤（希釈剤、保存剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、膨潤剤、充填剤、安定化剤、およびこれらの組み合わせが挙げられる）を使用して調製され得る。
【０１２４】
賦形剤（可塑剤、顔料、着色料、安定化剤、および流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）が挙げられる）はまた、経腸投与のための被覆された組成物を形成するために使用され得る。放出遅延投与製剤は、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ  ｔａｂｌｅｔｓ」，  ｅｄｓ．  Ｌｉｂｅｒｍａｎら（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  １９８９）、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  -  Ｔｈｅ  ｓｃｉ
ｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ」，  第２０版，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  ＭＤ，  ２０００、および「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍｓ
ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ」，  第６版，  Ａｎｓｅｌら，  （Ｍｅｄｉａ，  ＰＡ：  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  １９９５）のような標準的な参考文献中で記載されるように調製され得る。これらの参考文献は、錠剤およびカプセル剤、ならびに錠剤、カプセル剤および顆粒剤の放出遅延剤形を調製するための賦形剤、材料、装置およびプロセスに関する情報を提供する。
【０１２５】
カプセル剤は、例えば、粒子が一旦胃の酸性環境を通過した後に、放出を遅延させるために被覆され得る。適切な被覆物質の例としては、セルロースポリマー（例えば、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート）；ポリビニルアセテートフタレート、アクリル酸ポリマーおよびコポリマー、ならびに商品名ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）の下で市販されるメタクリル樹脂（Ｒｏｔｈ  Ｐｈａｒｍａ，  Ｗｅｓｔｅｒｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ））、ゼイン、シェラック、およびポリサッカリドが挙げられるが、これらに
限定されない。
【０１２６】
ＩＶ．作製法
ナノ粒子を作製するための技術は、当該分野で公知であり、溶媒エバポレーション、溶媒除去、噴霧乾燥、相反転（ｐｈａｓｅ  ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）、低温注型、およびナノ沈殿（例えば、ＷＯ／２０１３／１１００２８に記載されるとおり）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、１もしくはこれより多くのコアポリマー、１もしくはこれより多くの表面変質物質、および１もしくはこれより多くの低分子量乳化剤のエマルジョンによって形成される。例えば、いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、１もしくはこれより多くのコアポリマーを有機溶媒中に溶解し、１もしくはこれより多くのコアポリマーの溶液を、乳化剤の水性溶液もしくは懸濁物に添加して、エマルジョンを形成し、次いで、そのエマルジョンを、乳化剤の第２の溶液もしくは懸濁物に添加して、ナノ粒子の形成をもたらすことによって作製される。
【０１２８】
薬学的に受容可能な賦形剤（ｐＨ改変剤、崩壊剤、保存剤、および抗酸化剤が挙げられる）は、必要に応じて、粒子形成の間に、粒子へと組みこまれ得る。上記のように、１もしくはこれより多くのさらなる活性薬剤はまた、粒子形成の間に、ナノ粒子へと組みこまれ得る。１もしくはこれより多くの表面改変剤はまた、粒子形成の間に粒子へと組み込まれる、および／または粒子の表面にその後付着されるのいずれかである。
【０１２９】
Ｖ．使用法
高分子量ポリ（エチレン）グリコールで密に被覆されたナノ粒子は被験体への治療剤、予防剤、栄養補助剤および／または診断剤の送達のために粘液に浸透し得ることが確証された。
【０１３０】
ＭＰＰは、被験体の特異的な身体位置へと直接投与される。例えば、いくつかの実施形態において、ＭＰＰは、眼、腟、消化管、結腸、直腸、口腔、鼻、耳もしくは肺の粘膜表面へと直接送達される。いくつかの実施形態において、ＭＰＰは、局所投与することによって、粘膜上にもしくは粘膜の中へと直接投与される。さらなる実施形態において、投与経路は、ＭＰＰを、特異的な器官に直接向ける。
【０１３１】
ＭＰＰを含む薬学的組成物は、局所投与もしくは全身投与が望ましいか否かに依存して、および処置されるべき領域に依存して、種々の様式で投与され得る。
【０１３２】
ＭＰＰの組成物は、疾患の症状の開始の前、その間もしくはその後の期間の間に、または１もしくはこれより多くの疾患の症状の開始の前、その間もしくはその後の期間の任意の組み合わせで投与され得る。
【０１３３】
用語「有効量」または「治療上有効な量」は、処置されている障害の１もしくはこれより多くの症状を処置、阻害、もしくは緩和するか、または所望の薬理学的および／もしくは予防的効果を別の方法で提供するために十分な投与量を意味する。正確な投与量は、種々の要因（例えば、被験体に依存する変数（例えば、年齢、免疫系の健康状態など）、疾患または障害、およびもたらされている処置）に従って変動する。
【０１３４】
ＭＰＰの効果は、コントロールと比較され得る。適切なコントロールは、当該分野で公知であり、例えば、非処理細胞または非処置被験体が挙げられる。いくつかの実施形態において、そのコントロールは、処置される被験体に由来するかまたは非処置被験体に由来する、非処置組織である。好ましくは、コントロールの細胞または組織は、処理された細
胞または組織と同じ組織に由来する。いくつかの実施形態において、非処置コントロール被験体は、処置される被験体と同じ疾患もしくは状態に罹患しているか、またはその疾患もしくは状態に由来するリスクがある。例えば、いくつかの実施形態において、非処置コントロール被験体は、ＭＰＰによって与えられる望ましい治療効果、予防効果もしくは診断効果を受けていない。
【０１３５】
本発明は、以下の非限定的実施例を参照することによってさらに理解される。
【実施例】
【０１３６】
実施例１．反応緩衝液は、高分子量ＰＥＧの被覆密度に影響を及ぼす
材料および方法
ナノ粒子（ＮＰ）被覆法
【０１３７】
ＰＥＧ被覆ナノ粒子を、以前に記載された２つの方法を使用して合成した（Ｎａｎｃｅら，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，  ２０１２，  ４，  １４９−１１９）。「ＭＥＳ緩衝液法」に関しては、過剰のメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）−アミン（１０ｋＤａ）を、５０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（Ｓｉｇｍａ）（ｐＨ６）中に溶解した。２００ｎｍサイズを有するカルボキシレート改変ポリスチレン（ＰＳ）ナノ粒子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、ＭＥＳ／ＰＥＧ溶液に添加し、１０分間超音波処理した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ、Ｓｉｇｍａ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ、Ｓｉｇｍａ）を、０．１：１：１：１  ＣＯＯＨ：ＰＥＧ：ＥＤＣ：ＮＨＳの比で添加した。その混合物を、３７℃において一晩インキュベートし、次いで、そのナノ粒子を遠心分離によって集め、ＤＩ水で２回洗浄した。「ボレート緩衝液法」に関しては、４０ｎｍ、１００ｎｍ、または２００ｎｍのカルボキシレート改変ＰＳナノ粒子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、または４０ｋＤａの分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で被覆した。ＰＳナノ粒子を、２００ｍＭ  ボレート緩衝液（ｐＨ７．４）中に懸濁し、メトキシ−ＰＥＧ−アミンを過剰に添加した。過剰量のＮＨＳおよびＥＤＣを添加した。そのナノ粒子混合物を、室温で一晩インキュベートし、その後、ＤＩ水で２回洗浄した。
【０１３８】
製剤化されたナノ粒子の特徴付け
ナノ粒子を、１０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液中に懸濁し、サイズおよびζ電位に関して、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、それぞれ、動的光散乱（ＤＬＳ）およびレーザードプラ流速計で特徴付けした。ＤＬＳを９０°散乱角で行い、全ての測定値を、機器設定に従って２５℃で取得した。
【０１３９】
結果
ＰＳナノ粒子（ＰＳ  ＮＰ）の表面への１０ｋＤ  ＰＥＧのグラフト（ｇｒａｆｔｉｎｇ）において、ＭＥＳおよびボレート緩衝液の反応緩衝液を比較した。ＭＥＳ法を使用して１０ｋＤａ  ＰＥＧで被覆されたＰＳ  ＮＰ（ＰＳ−ＰＥＧＭＥＳ、２２０±１０ｎｍ；−１２±０．４ｍＶ）は、ＣＶＭ中で接着して固定化された；ＰＳ−ＰＥＧＭＥＳ  ＮＰの集団平均二乗変位量（＜ＭＳＤ＞）は、水中での類似のサイズにしたナノ粒子の理論的拡散速度と比較して、粘液中で＞１０，０００倍遅かった（表１）。対照的に、ボレート法を使用して１０ｋＤａ  ＰＥＧで被覆された同じＰＳ  ＮＰ（ＰＳ−ＰＥＧボレート、２６０±７ｎｍ；−０．７±０．５ｍＶ）は、ＣＶＭに迅速に拡散した。ＰＳ−ＰＥＧボレート  ＮＰの集団平均二乗変位量＜ＭＳＤ＞は、水中でのそれらの理論的拡散速度、ＭＳＤｗと比較して、ＣＶＭ中で１１倍遅かった過ぎず（表１、図１）、非被覆ＰＳ  ＮＰ（１８０±１ｎｍ；−５９±２ｍＶ）またはＰＳ−ＰＥＧＭＥＳ（図１、表１）のいずれかより約１，０００倍高かった。ＰＳ−ＰＥＧＭＥＳ  ＮＰに関する＜ＭＳＤ＞（図１
）および個々のＭＳＤ値の対数分布（図２Ａ、図２Ｂ）は、本発明者らが以前報告した（Ｗａｎｇら，  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ，  ２００８，  ４７，
９７２６−９７２９）ように、非被覆ＰＳナノ粒子と同様であった。ＰＳ−ＰＥＧボレート  ＮＰに関する個々のＭＳＤ値の対数分布は、非被覆ＰＳナノ粒子およびＰＳ−ＰＥＧＭＥＳ  ＮＰより遙かに大きかった（図２Ｃ）。ＣＶＭ中での３秒間の動きを代表するナノ粒子軌跡は、移動挙動における差異をさらに強調する。なぜならＰＳ−ＰＥＧボレート  ＮＰの運動は、拡散運動を反映した一方で、ＰＳおよびＰＳ−ＰＥＧＭＥＳ  ＮＰの軌跡は、高度に拘束されたからである（図３Ａ〜３Ｃ）。
【表１】
2018533579.tif 000002
【０１４０】
実施例２．ＰＳ  ＮＰの表面上で被覆された１０ｋＤ  ＰＥＧの密度
材料および方法
ＰＥＧ表面密度の測定
【０１４１】
ＰＥＧ密度を、以前に記載されたように計算した（Ｎａｎｃｅら，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，  ２０１２，  ４，  １４９−１１９；  Ｘｕら，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ
Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１３，  １７０，  ２７９−２８６）。簡潔には、ナノ粒子を、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３，  Ｓｉｇｍａ）、トリフルオロ酢酸−ｄ（ＴＦＡｄ，  Ｓｉｇｍａ）、および既知濃度のテトラメチルシラン（ＴＭＳ，  １％  ｗ／ｖ）中に完全に溶解した。Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ  ＲＥＭ４００を使用して４００ｍＨｚで得た。ＰＥＧ密度、すなわちΓ／ＳＡを、ＰＥＧピーク（３．６ｐｐｍ）および内部標準ＴＭＳピーク（０ｐｐｍ）の積分から計算した。各粒子上でＰＥＧ鎖によって占有される面積を計算するために、ランダムウォーク統計モデルを使用して、ある特定の長さのＰＥＧによって占有される面積を見出した。これらの計算は、直径ｄ＝０．７６（ｍｂ）０．５を有する球を生じる（ここでｍｂは、問題のＰＥＧの分子量であり、Ａ＝π（ｄ／２）２というＰＥＧによって占有される面積を生じる（Ｂｏｙｌａｎら，  Ｊ
Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１２，  １５７，  ７２−７９））。次いで、占有される面積を使用して、１００ｎｍ２あたりのＰＥＧ鎖の数およびＰＥＧ鎖によって占有される面積／全粒子表面積（Γ／ＳＡ）を計算した。ＰＥＧ  ５ｋＤａを、溶液中のＰＥＧ濃度を較正するために使用した。ＰＥＧ表面密度計算のために、ナノ粒子の表面が滑らかでありかつそれらの直径がＤＬＳによって測定されるものに等しいと仮定した。
【０１４２】
結果
ＰＳ−ＰＥＧ  ＮＰ上のＰＥＧ表面密度の定量化において、定量的ＮＭＲ法を使用して、充填密度（Γ／ＳＡ、ここでΓは、グラフトされたＰＥＧ鎖によって網羅される非拘束表面積であり、ＳＡは、ナノ粒子の全表面積である）に基づいてＰＥＧ鎖の物理的コンホメーションを推論した（Ｎａｎｃｅら，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，  ２０１２，
４，  １４９−１１９；  Ｘｕら，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１３，  １７０，  ２７９−２８６）。そのＰＳ−ＰＥＧボレート  ＮＰに関するΓ／ＳＡ（１．５±０．０）は、ＰＳ−ＰＥＧＭＥＳ  ＮＰに関する１．３±０．１と比較して増大した（表１）。これは、ＰＥＧ鎖がＰＳ−ＰＥＧボレート  ＮＰの表面上により密に充填されたことを示す。そのΓ／ＳＡ値は、ＰＳ−ＰＥＧＭＥＳ  ＮＰに関する１００ｎｍ２あたりの２．９±０．３  １０ｋＤａ  ＰＥＧ鎖と比較して、ＰＳ−ＰＥＧボレート  ＮＰに関する１００ｎｍ２あたりの３．３±０．１  １０ｋＤａ  ＰＥＧ鎖鎖に相当する。以前に、ＰＥＧ結合体化の後にナノ粒子表面上に残っている未反応カルボン酸基への蛍光色素の結合体化をともなうＰＥＧ表面密度を定量するための間接的方法が使用された（Ｗａｎｇら，  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ，  ２００８，  ４７，
９７２６−９７２９）。この間接的方法において、ＰＳ  ＮＰ表面上のカルボン酸基のうちのおよそ約６９％が、２ｋＤａ  ＰＥＧに結合体化され、ＰＳ  ＮＰ表面上のカルボン酸基のうちの約６５％が、１０ｋＤａ  ＰＥＧに結合体化された（Ｗａｎｇら，  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ，  ２００８，  ４７，  ９７２６−９７２９）。
【０１４３】
定量的ＮＭＲ法および計算からの結果は、ＰＳ  ＮＰ表面をＣＶＭとの相互作用から効果的に遮るために超えなければならない最小ＰＥＧ密度閾値が存在し、かつ被覆が十分であるか不十分であるかの間にある幅は狭いことを暗示する。
【０１４４】
同様に、Ｎａｎｃｅら，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，  ２０１２，  ４，  １４９−１１９からの結果は、ＰＥＧ被覆の必要とされる密度がまた、ナノ粒子サイズおよびＰＥＧ  ＭＷに依存することをさらに暗示する。少なくとも２．０のΓ／ＳＡは、脳細胞
外マトリクスを通じて効果的に浸透するために、５ｋＤａ  ＰＥＧで被覆された１００ｎｍ  ＰＳ  ナノ粒子に関して必要とされた（Ｎａｎｃｅら，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，  ２０１２，  ４，  １４９−１１９）のに対して、Γ／ＳＡ＝１．７は、不十分な被覆であった。
【０１４５】
ＰＥＧ被覆密度は、反応のプロセスおよび基質に依存して、異なるレベルで達成される。Ｘｕら，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１３，  １７０，  ２７９−２８６は、ＰＥＧ（１０ｋＤａ程度の大きさのＭＷ）およびポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）のブロックコポリマー（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）から構成される生体分解性ナノ粒子が、ヒトＣＶＭにおける迅速な拡散を可能にするためにＰＥＧで十分に密に被覆されることを観察した。ＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子は、予め形成されたナノ粒子の表面上にＰＥＧをグラフトする間ではなく、遅い硬化プロセスの間に、ＰＥＧがナノ粒子表面に分配することを可能にしたエマルジョン方法を使用して形成されたので、２．３およびこれより大きいΓ／ＳＡ値（１０ｋＤａ  ＰＥＧに関してΓ／ＳＡ＝３．０）が達成された（Ｘｕら，
Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１３，  １７０，  ２７９−２８６）。
【０１４６】
実施例３．密な被覆にある高分子量（ＨＭＷ）ＰＥＧが粒子の粘液浸透を促進する
材料および方法
ナノ粒子（ＮＰ）被覆製剤
【０１４７】
ナノ粒子を、Ｎａｎｃｅら，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，  ２０１２，  ４，  １４９−１１９；  Ｌａｉら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，
２００７，  １０４，  １４８２−１４８７によって記載されるとおりに調製した。簡潔には、４０ｎｍ、１００ｎｍおよび２００ｎｍのカルボキシレート改変ポリスチレン（ＰＳ）ビーズを、明記された緩衝液を使用して、５ｋＤａから４０ｋＤａまでのメトキシ−ＰＥＧ−アミンで被覆した。
【０１４８】
ヒト頸膣粘液中での複数粒子追跡
ヒト頸膣粘液（ＣＶＭ）サンプルを、以前に記載されるとおりに得た（Ｌａｉら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  ２００７，  １０４，  １４８２−１４８７；  Ｂｏｓｋｅｙら，  Ｓｅｘ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｄｉｓ，  ２００３，  ３０，  １０７−１０９）。簡潔には、正常な膣微生物叢を有する女性に由来する非希釈ＣＶＭを、ジョンズホプキンス医療機関の治験審査委員会によって承認されたプロトコルに従って、月経液採取デバイス（ｍｅｎｓｔｒｕａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ）での自己採取法を使用して得た。粘液サンプルを、使用前に４℃で貯蔵し、採取から４時間以内に使用した。２μＬまでの粒子溶液（０．０２〜０．０８％  ｗ／ｖ）を、特注のウェルの中で容積３０μＬ  ＣＶＭに添加した。ウェルを、強力接着剤を付着させたカバースリップでシールした。倒立落射蛍光顕微鏡セットアップ（Ｚｅｉｓｓ
Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ）の一部としてＥＭＣＣＤカメラ（Ｅｖｏｌｖｅ  ５１２；  Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）を介して、１００×／１．４６  ＮＡ  油浸対物レンズで動画を得た。２０ｓにつき６６．７ｍｓの時間分解能でＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で動画を獲得した。ナノ粒子軌跡および平均二乗変位量（ＭＳＤ）を、各粒子につき追跡された最小３０フレームを用いてＭＡＴＬＡＢ（Ｓｃｈｕｓｔｅｒら，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１３，  ３４，  ３４３９−３４４６）を使用して得、ＭＳＤを、＜Δｒ２（τ）＞＝［ｘ（ｔ＋τ）−ｘ（ｔ）］２＋［ｙ（ｔ＋τ）−ｙ（ｔ）］２（τ＝時間的尺度もしくはタイムラグ）として計算した（Ｌａｉら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  ２００７，  １０４，  １４８２−１４８７；  Ｓｕｈら，  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ，  ２００５，  ５７，  ６３−７８；  Ｄａｗｓｏｎら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，  ２００４，  ２０，  ８５１−８５７）。少なくとも１５０個の粒子を、ｎ＝
３の独立したサンプルにおいて追跡した。本発明者らの以前の研究は、静的誤差が、２０ｎｍ未満であると概算され得、平均粒子変位量より遙かに小さいことを示した（Ｓｕｈら，  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ，  ２００５，  ５７，  ６３−７８；  Ｓｕｋら，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１４，  １７８，  ８−１７）。
【０１４９】
結果
ボレート法を使用して５〜４０ｋＤａ  ＰＥＧで被覆された２００ｎｍ  ＰＳ  ＮＰ（ＰＳ−ＰＥＧ５−４０ｋＤａ、最終サイズ２３０〜３００ｎｍ、表１）は、測定された高い＜ＭＳＤ＞値によって示されるように、  ＣＶＭに迅速に浸透できた（図４）。さらに、全ＰＳ−ＰＥＧ５−４０ｋＤａ  ＮＰの３秒間軌跡は、非被覆ＰＳ  ＮＰとは全く対照的に、拡散性の挙動を反映した（図５Ａ〜５Ｅ）。ＰＳ−ＰＥＧ５−４０ｋＤａ  ＮＰはまた、高ＰＥＧ密度、Γ／ＳＡ≧１．５を有した（表１）。１００ｎｍ２あたりのＰＥＧ分子数がＰＥＧ  ＭＷが増大するにつれて低下することは明らかであった。このことは、ＭＷが増大するにつれて各ＰＥＧ鎖によって占有される空間の増大した量にあるとされ得る；１つの非拘束５ｋＤａ  ＰＥＧ鎖によって占有される面積は、非拘束４０ｋＤａ  ＰＥＧ分子に関して約１８０ｎｍ２と比較して、約２３ｎｍ２である。さらに、ＰＥＧ化後のナノ粒子の流体力学的直径は、ＰＥＧ  ＭＷが増大するにつれて増大した；ＰＥＧ鎖の密な充填は、ＭＷ  ＰＥＧ鎖が大きくなるほど、より厚い冠を作り出すように、伸長を引き起こす。
【０１５０】
ナノ粒子表面上にＰＥＧ鎖を密に充填することによって、ＰＥＧ  ＭＷに関わらず、ＰＥＧは整列された状態になりかつムチンゲルへの浸透から立体的に制限されると仮定される。接着は、ＰＥＧ鎖の動きに依存することが示されたので、鎖が十分に拘束される場合、それらは、粘液メッシュと互いに貫通することができず、粘膜接着の低減をもたらす（Ｈｕａｎｇら，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０００，  ６５，  ６３−７１）。
【０１５１】
Ｙａｎｇおよび共同研究者らは、２０ｋＤａまでのＰＥＧで被覆されたナノ粒子のうちの＜２０％が、Γ／ＳＡ＞２．８のために、全身循環から一掃されることを見出した。このＰＥＧ表面密度において、彼らは、粒子表面をタンパク質吸着に曝し得る、隣り合うＰＥＧ鎖が伸長した構成に同時に達する可能性はありそうもないことを決定した。さらに、彼らは、ＰＥＧ密度の僅かな低下すら、＜２時間への全身循環時間の減少をもたらすことを見出した（Ｙａｎｇら，  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ，  ２０１４，  １１，１２５０−１２５８）。同様に、本発明者らは、ナノ粒子ＰＥＧ表面密度の小さな減少が、粘膜非接着性表面特性から粘膜接着性表面特性への移行を生じることを見出した。
【０１５２】
実施例４．ナノ粒子のコアサイズは、ＰＥＧ被覆密度および粘液浸透に影響を及ぼす
材料および方法
【０１５３】
ナノ粒子を、Ｎａｎｃｅら，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，  ２０１２，  ４，  １４９−１１９；  Ｌａｉら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，
２００７，  １０４，  １４８２−１４８７によって記載されるとおりに調製した。簡潔には、４０ｎｍ、１００ｎｍおよび２００ｎｍのカルボキシレート改変ポリスチレン（ＰＳ）ビーズを、明記された緩衝液を使用して、５ｋＤａから４０ｋＤａまでのメトキシ−ＰＥＧ−アミンで被覆した。
【０１５４】
結果
１００ｎｍ  ＰＳ  ＮＰを、ボレート法を使用して５ｋＤａ〜４０ｋＤａ  ＰＥＧで被覆した（ＰＳ−ＰＥＧ５−４０ｋＤａ、最終サイズ１１０〜１７０ｎｍ）。表１および図
６は、Γ／ＳＡ値が１００ｎｍ  ＰＳ−ＰＥＧ５−４０ｋＤａ  ＮＰに関して全て＞２であり、ＣＶＭを通る迅速なＮＰ拡散を生じたことを示す。ＰＥＧ被覆ナノ粒子軌跡は、非被覆ＰＳとは全く対照的に、拡散運動を反映した（図７Ａ〜７Ｅ）。１００ｎｍおよび２００ｎｍのＰＳ−ＰＥＧ５−４０ｋＤａ  ＮＰ製剤は全て、水中でのそれらの理論的拡散速度と比較して、ＣＶＭ中で＜２０倍遅かった（表１）。
【０１５５】
ナノ粒子表面上でＰＥＧ鎖を密に充填することによって、ＰＥＧ  ＭＷに関わらず、ＰＥＧは整列された状態になりかつムチンゲルへの浸透から立体的に制限されると仮定される。接着は、ＰＥＧ鎖の動きに依存することが示されたので、鎖が十分に拘束される場合、それらは、粘液メッシュと互いに貫通することができず、粘膜接着の低減をもたらす（Ｈｕａｎｇら，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０００，  ６５，  ６３−７１）。
【０１５６】
実施例５．インビボでの被覆粒子の分布に対するＰＥＧ  ＭＷの影響
材料および方法
【０１５７】
雌性ＣＦ−１マウス（６〜８週齢）を、逆の明サイクル施設（１２時間明、１２時間暗）において１週間収容して、順化させた。膣分布に関して、マウスを、以前に記載された（Ｃｈａｍｐｌｉｎら，  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ，  １９７３，  ８，  ４９１−４９４）ように、それらの腟口の外観によって、天然で循環している発情期に関して選択した。発情期にあるマウスの膣は、ヒトの膣に最も類似しており（Ａｓｓｃｈｅｒら，  Ｊ  Ａｎａｔ，  １９５６，  ９０，  ５４７−５５２；  Ｓｍｉｔｈら，  Ａｍ  Ｊ  Ａｎａｔ，  １９３４，  ５４，  ２７−８５）、それらの頸膣粘液は、ヒトＣＶＭに類似のバリア特性を有する（Ｅｎｓｉｇｎら，  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ，  ２０１３，  １０，  ２１７６−２１８２）。結腸直腸分布に関して、マウスを、２４時間絶食させた。なぜなら、このことは、より頻度の少ない、より柔らかいペレットをもたらすからである（Ｍａｉｓｅｌら，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１５，  １０，  １９７，
４８−５７，  Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｎｏｖ  ４）。マウスにイソフルランを使用して麻酔をかけ、ＤＩ水中０．０２％  ｗ／ｖの１００ｎｍ（腟内）または４０ｎｍ（直腸内）のナノ粒子を、５μＬ（腟内）または２０μＬ（直腸内）投与した（Ｍａｉｓｅｌら，
Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１５，  １０，  １９７，  ４８−５７，  Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｎｏｖ  ４；  Ｅｎｓｉｇｎら，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，  ２０１２，  ４，  １３８−１７９；  Ｍａｉｓｅｌら，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ
Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１５，  ２０９，  ２８０−２８７）、５〜１０分後マウスを屠殺し、組織を摘出し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  Ｏ．Ｃ．Ｔ．  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ中で急速凍結した。組織を、膣および結腸直腸の全長に沿って、Ｌｅｉｃａ  ＣＭ−３０５０−Ｓクリオスタットで６μｍスライスへと切片にした。スライスを、１０％  ホルマリンで固定し、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  ａｎｔｉｆａｄｅ（登録商標）試薬とＤＡＰＩとを使用して染色して、核を染色し、粒子蛍光を保持した。倒立落射蛍光顕微鏡セットアップ（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ）を使用して画像を得た。全ての実験は、ジョンズホプキンス大学動物実験委員会によって承認された。
【０１５８】
結果
種々のＭＷ  ＰＥＧ（５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、４０ｋＤａ）で密に被覆されたＰＳ−ＰＥＧ  ＮＰは、被覆ＰＳ−ＰＥＧ  ＮＰを含む溶液の投与から５〜１０分後に得た膣および結腸直腸組織の横断低温切片において観察されるように、マウスの頸膣路および結腸直腸において均一に分布された。出願人が以前に観察した適切なサイズの投与したＰＳ−ＰＥＧ  ＮＰは、十分よくＰＥＧ化されかつ上皮による流体吸収を誘導する低張性ビヒクルにおいて投与される場合、マウス膣（約１００ｎｍ）および結腸直腸（約４０ｎｍ）において均一に分布する（Ｅｎｓｉｇｎら，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，
２０１２，  ４，  １３８−１７９；  Ｅｎｓｉｇｎら，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２０１３，  ３４，  ６９２２−６９２９；  Ｍａｉｓｅｌら，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１５，  １０，  １９７，  ４８−５７，  Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｎｏｖ  ４；  Ｍａｉｓｅｌら，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１５，  ２０９，  ２８０−２８７）。出願人の以前の観察と同様に、非被覆ＰＳ  ＮＰは、管腔粘液層において凝集したが、エキソビボ粘液サンプル中での拡散のために十分に密なＰＥＧ被覆を有する全てのＰＳ−ＰＥＧ ＮＰ製剤（ＰＳ−ＰＥＧ５−４０ｋＤａ）は、インビボで膣および結腸直腸上皮表面に迅速にかつ均一に輸送された。この結果は、エキソビボでの粘液中のナノ粒子の拡散が、インビボでの粘膜表面における観察された分布と十分に相関するという以前の観察と一致する。すなわち、エキソビボで粘液中に迅速／妨害されずに拡散する粒子はまた、粘膜表面にわたってはるかにより均一に分布し、次いで、これらが粘膜組織へと局所投与される場合により長く持続する。改善されたナノ粒子分布は、粘膜部位での疾患のより効果的な処置および防止（頸膣路におけるヘルペス（ＨＳＶ−２）感染の防止、喘息誘導性肺炎症の防止、および子宮頚がんの処置が挙げられる（Ｅｎｓｉｇｎら，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，  ２０１２，  ４，  １３８−１７９；  Ｓｕｋら，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１４，  １７８，
８−１７；  Ｙａｎｇら，  Ａｄｖ  Ｈｅａｌｔｈｃ  Ｍａｔｅｒ，  ２０１４，  ３，  １０４４−１０５２；  ｄａ  Ｓｉｌｖａら，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１４，  １８０，  １２５−１３３））を提供する。
【図１】
2018533579.tif 000003
【図２】
2018533579.tif 000004
【図３】
2018533579.tif 000005
【図４】
2018533579.tif 000006
【図５Ａ】
2018533579.tif 000007
【図５Ｂ】
2018533579.tif 000008
【図５Ｃ】
2018533579.tif 000009
【図５Ｄ】
2018533579.tif 000010
【図５Ｅ】
2018533579.tif 000011
【図６】
2018533579.tif 000012
【図７Ａ】
2018533579.tif 000013
【図７Ｂ】
2018533579.tif 000014
【図７Ｃ】
2018533579.tif 000015
【図７Ｄ】
2018533579.tif 000016
【図７Ｅ】
2018533579.tif 000017
【国際調査報告】
2018533579.tif 000018
2018533579.tif 000019
2018533579.tif 000020
2018533579.tif 000021