(57)【要約】  ヒトパピローマウイルスまたはＨＰＶ抗原を認識する抗原特異的Ｔ細胞を生じさせる、安全、迅速かつ効率的な方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＰＶ抗原特異的Ｔ細胞を生じさせるプロセスであって、
（ａ）ナイーブ免疫細胞を含有する任意の細胞供給源からの単核球を数個の部分に分割することと；
（ｂ）前記の試料の第１の部分を、ＰＨＡまたは別のマイトジェンと、ＩＬ−２とで刺激して、次回の刺激中に抗原提示機能を提供するＡＴＣすなわち活性化Ｔ細胞（「ＡＴＣ」）を生じさせ、場合によって前記ＡＴＣを放射線または別の薬剤で処理してその増殖を抑制することと；
（ｃ）Ｔ細胞及びＴ細胞前駆細胞を樹状細胞及び樹状前駆細胞から分離することと；
（ｄ）前記Ｔ細胞及びＴ細胞前駆細胞を凍結保存あるいは保管することと；
（ｅ）第２の部分の中の前記樹状細胞及び樹状前駆細胞を、樹状細胞を生成及び成熟させるサイトカイン（複数可）またはその他の薬剤（複数可）と、少なくとも１つのＨＰＶペプチド抗原またはＨＰＶ抗原混合物とによって分化させて、少なくとも１つのＨＰＶペプチド抗原を提示する抗原提示樹状細胞を生じさせ、場合によって前記抗原提示樹状細胞を、その増殖を抑制するのに十分な放射線または別の薬剤で処理することと；
（ｆ）ＩＬ−７及びＩＬ−１５の存在下で、（ｄ）からの前記凍結保存あるいは保管されたＴ細胞及びＴ細胞前駆細胞を、（ｅ）で生じた前記樹状抗原提示細胞で刺激して、前記少なくとも１つのＨＰＶペプチド抗原を認識する抗原特異的Ｔ細胞を生じさせることと；
（ｇ）前記少なくとも１つのＨＰＶペプチド抗原の存在下で、場合によってＫ５６２細胞またはその他の補助細胞の存在下、ＩＬ−２及び／またはＩＬ−１５の存在下で、（ｆ）によって生じた抗原特異的Ｔ細胞を（ｂ）の前記ＡＴＣで刺激し；場合によって（ｇ）を１回以上繰り返することと；
（ｈ）少なくとも１つのペプチド抗原を認識する抗原特異的Ｔ細胞を回収することと
を含む、前記プロセス。
【請求項２】
（ａ）の前に、ナイーブＴ細胞を含有する単核球を分離することをさらに含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記単核球が臍帯血から得られるものである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記単核球が、前記少なくとも１つのＨＰＶペプチド抗原に対して未感作である造血幹細胞から得られるものである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
前記単核球が、幹細胞、前駆Ｔ細胞、または免疫系が前記少なくとも１つのＨＰＶペプチド抗原に対して未感作である被験体からのＴ細胞を含有する試料から得られるものである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
（ｂ）が、前記試料の第１の部分をＰＨＡとＩＬ−２とで刺激して活性化Ｔ細胞（「ＡＴＣ」）を生じさせることを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
（ｂ）において、およそ百万〜２千万個、好ましくは５百万〜１千５百万個、最も好ましくはおよそ８百万〜１千２百万個の単核臍帯血細胞をＰＨＡとＩＬ−２とで刺激することを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
（ｂ）が、ＰＨＡ芽球の代わりにＴ芽球、Ｂ芽球、リンパ芽球様細胞またはＣＤ３−ＣＤ２８芽球を活性化Ｔ細胞として生じさせることを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】
Ｔ細胞及びＴ細胞前駆細胞が、細胞培養用のプレートまたは装置に前記第２の部分の中の細胞が付着するのに十分な条件下でプラスチック付着により前記第２の部分を培養することと、その後にＴ細胞及びＴ細胞前駆細胞を前記細胞培養用のプレートまたは装置から移すことと、固形培地に付着した樹状細胞及び樹状前駆細胞を回収することとによって前記樹状細胞及び樹状前駆細胞から分離される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１０】
（ｅ）において前記樹状細胞及び樹状前駆細胞を、樹状細胞の分化及び維持に必要な、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦを非限定的に含むサイトカインの存在下で増殖させる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１１】
（ｅ）においてＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦと一緒に、ＬＰＳ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＧＥ−１、ＰＧＥ−２及びその他の免疫賦活剤のうちの１つ以上から構成される群から選択される樹状細胞成熟性のサイトカインまたは薬剤を使用して、前記樹状細胞及び樹状前駆細胞を成熟化に供する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１２】
（ｆ）において、または（ｆ）の前に、前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞を処理してＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を増殖させる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１３】
（ｆ）において、または（ｆ）の前に、前記Ｔ細胞及びＴ細胞前駆細胞を処理してＣＤ４５ＲＯ陽性細胞を除去する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの抗原が、ＨＰＶのタンパク質または抗原の全体にわたる一連の重複するペプチドを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１５】
院内で、もしくは医原的に罹患するか、または病院もしくは院内感染において被験体に伝染する、日和見ＨＰＶの少なくとも１つの抗原を、前記抗原特異的Ｔ細胞が認識する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのペプチド抗原が、ＨＰＶの抗原またはペプチドライブラリーを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのペプチド抗原が、ＨＰＶ  Ｅ１〜Ｅ５の抗原またはペプチドライブラリーを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのペプチド抗原が、ＨＰＶ  Ｅ６またはＥ７の抗原またはペプチドライブラリーを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのペプチド抗原が、ＨＰＶ  Ｌ１またはＬ２の抗原またはペプチドライブラリーを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのペプチド抗原が、ＨＰＶに感染した部位、組織または細胞から単離されたＴ細胞によって認識されるものである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２１】
請求項１に記載のプロセスによって生じる、抗原特異的Ｔ細胞を含む組成物。
【請求項２２】
種々の細胞供給源から単離された単核球と、
これと同じ前記供給源に由来する抗原提示細胞と、
前記細胞の生存能を維持する培地と、
任意での、Ｋ５６２細胞、またはその他のＴ細胞を共刺激する非自家細胞と
を含み、場合により前記細胞が、増殖を防止すべく処理されたものである、組成物。
【請求項２３】
組成物であって、
ｉ．樹状細胞及び樹状前駆細胞から分離された、ＨＰＶペプチド抗原に対して未感作であるＴ細胞及びＴ細胞前駆細胞と、
ｉｉ．培養期間の様々な時点においてＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５のうちの少なくとも１つを非限定的に含むサイトカインと、
ｉｉｉ．前記Ｔ細胞及びＴ細胞前駆細胞の生存能を維持する培地と
を含む、前記組成物。
【請求項２４】
少なくともＨＰＶエピトープを認識し、かつ細胞表面表現型ＣＤ４＋ＣＤ８＋を有する、請求項１に記載のプロセスによって生じたＴ細胞。
【請求項２５】
少なくともＨＰＶエピトープを認識し、かつ細胞表面表現型ＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＯ＋及びＣＤ２７＋を有する、請求項１に記載のプロセスによって生じたＴ細胞。
【請求項２６】
少なくともＨＰＶエピトープを認識し、かつ細胞表面表現型ＣＤ２７＋及びＣＤ２８＋を有する、請求項１に記載のプロセスによって生じたＴ細胞。
【請求項２７】
ＨＰＶによる感染を防止または処置するための、請求項１に記載のプロセスによって生じたＴ細胞の用途。
【請求項２８】
請求項１に記載のプロセスによって生じたＨＰＶペプチド抗原を認識するＴ細胞の１つ以上の試料を、貯蔵用または凍結用の培地と組み合わせて収容する、バンクまたは細胞貯蔵設備であって；場合によって、前記１つ以上の試料が、
完全もしくは部分的なＤＮＡ配列情報、
主要組織適合性及び／もしくは副組織適合性の抗原もしくはマーカーを含めて前記１つ以上の試料の組織適合性について記載する情報、及び／または
前記１つ以上の試料が含有または認識するペプチド抗原についての情報
を含む前記１つ以上の試料の供給源について記載する情報によって関連付けられるか同定されるかまたは指標付けされる、前記バンクまたは細胞貯蔵設備。
【請求項２９】
請求項１に記載のプロセスによって生じた、凍結保存あるいは保管された生ＨＰＶ抗原特異的Ｔ細胞の多数の試料を含む、抗原特異的Ｔ細胞バンク。
【請求項３０】
キットであって、
ｉ．樹状細胞及び樹状前駆細胞から分離された、ＨＰＶペプチド抗原に対して未感作であるＴ細胞及びＴ細胞前駆細胞と、
ｉｉ．ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５のうちの少なくとも１つを非限定的に含むサイトカインと、
ｉｉｉ．前記Ｔ細胞及びＴ細胞前駆細胞の生存能を維持する培地と；
ｉｖ．前記Ｔ細胞及びＴ細胞前駆細胞から分離された樹状細胞または樹状前駆細胞と、
ｖ．前記樹状細胞または樹状前駆細胞の生存能を維持する培地と；
ｖｉ．場合によって増殖を防止すべく処理された、Ｋ５６２細胞、またはその他のＴ細胞を共刺激する非自家細胞と、
ｖｉｉ．少なくとも１つのＨＰＶペプチド抗原、またはＨＰＶペプチドの混合物と
を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／２４８，８１８号（これを参照により援用する）に基づく優先権を主張するものである。本願は、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｒ  ｏｔｈｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ａ  ｎａｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ」と題して２０１６年３月２１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／２３４１３（これは、２０１５年３月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／１３５，８５１号及び第６２／１３５，８８８号に基づく優先権を主張するものである）の関連出願であり；かつ、「Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＭＶ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ＣＭＶ−Ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｄｏｎｏｒｓ」と題して２０１４年１０月２８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／６２６９８（これは、２０１３年１０月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／８９６，２９６号に基づく優先権を主張するものである）の関連出願である。上記文献の全てを参照により援用する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本研究は、Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｍ．Ｂｏｌｌａｒｄ及びＥｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｊ．Ｓｈｐａｌｌに対して授与されたアメリカ国立衛生研究所のアメリカ国立がん研究所からの助成金（助成金番号：ＮＣＩ  ＰＯ１  ＣＡ１４８６００−０２）によって一部資金提供を受けた。
【背景技術】
【０００３】
発明の属する分野
本発明は、ヒトパピローマウイルス（すなわちＨＰＶ）抗原特異的Ｔ細胞及び、健常または未感作である提供者のＴ細胞からそれを製造する方法ならびに、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされるかまたはそれに関連する疾患、障害または症状を処置するための、これらのＨＰＶ特異的Ｔ細胞を使用する細胞に基づく療法に関する。
【０００４】
関連技術の記載
現在のＴ細胞に基づく免疫療法のいくつかは、Ｔ細胞及び前駆Ｔ細胞を含有する試料から増殖させた、ウイルス及び腫瘍に特異的はＴ細胞を使用する。ウイルス特異的Ｔ細胞は、幹細胞移植後のウイルス感染症に対して有効であることが示された。ウイルス特異的Ｔ細胞集団を使用するＴ細胞に基づく細胞療法は、ウイルス感染細胞からの防護を提供することができ、また、抗ウイルス薬よりも少ない副作用に関連する１。増殖させたウイルス特異集団を使用するＴ細胞に基づく療法は、ウイルス発現性の悪性腫瘍に対する活性を有しており２、３、循環している白血病性芽球を除去する移植片対白血病効果を誘導した４。
【０００５】
これらの免疫療法は、メモリー細胞集団の生成によって生涯にわたる防護を提供するという利点を有する３。メモリーＴ細胞を有する試料からの細胞は、生体外で簡単に増殖する、というのも、その供給元である提供者は以前にこれらの病原体に遭遇したことがあり、それゆえに生体外で迅速に増殖する既存のメモリーウイルス特異的Ｔ細胞が存在するからである５。さらに重要なことには、副作用を最小限としながらこれらのＴ細胞の治療有効性を媒介するのに単一のＨＬＡの一致で十分であることが研究によって示された。それゆえ、第三者細胞のバンクをそのような製品の市販用途のために生成及び維持することができる。
【０００６】
特定のウイルス感染症及びウイルス関連腫瘍については残念なことに、これらの細胞の潜在的供給源の全てが以前に病原体に曝露されたことがあるとは限らない。１つの重要な例はＨＰＶであり、それは、免疫低下状態の宿主におけるＨＰＶ感染６〜８、及び子宮頸癌のようなＨＰＶ関連悪性腫瘍９〜１４の原因となる。米国において、９種のＨＰＶのうちのいずれかの血清陽性率は女性では約４０％、男性では２０％に限られる。１５それゆえ、ほとんどの提供者はＨＰＶ抗原に対して未感作である。このことは、メモリーＴ細胞の欠如ゆえに、これらの試料からＨＰＶ認識Ｔ細胞を増殖させる上での障害となる。
【０００７】
これらのナイーブ細胞集団からの抗原特異的Ｔ細胞、例えば、未曝露／血清陰性である健常提供者からのナイーブＴ細胞または臍帯血からのＴ細胞を増殖させることは困難である、というのも、これらのＴ細胞は生体内で抗原による準備刺激を受けたことがないからである。そのような集団には、容易に増殖できる抗原特異的メモリーＴ細胞が欠如している。その他の場面において、未感作提供者からのそのような抗原特異的Ｔ細胞を増殖させるための提案される方法は、ウイルス、ウイルス感染細胞またはウイルス形質転換細胞を使用する１６、１７。
【０００８】
治療用途のための抗原特異的Ｔ細胞を生成するためにウイルスの使用を伴う方法は、臨床上のリスク上昇及び著しい規制上の困難に関連しているため、望ましくない。抗原特異的Ｔ細胞を増殖させるためにペプチドの形態での抗原が使用されているのはこのためである１８。
【０００９】
ＨＰＶ特異的Ｔ細胞を生成することを目的としたこれらのペプチドに基づく方法の適用は、成功例が非常に限られている１２。
【００１０】
ＨＰＶに対して特異的なＴ細胞を生成する最も成功している試みは、以前にＨＰＶ抗原に曝露された患者からの自家細胞を使用するものであった。１つのそのような研究では、１，２００倍超の増殖が認められたが、これは、大抵が子宮頸癌患者の８／１５６及び中咽頭癌の３３／５２に限られ、健常提供者のたった１／２０にすぎず、応答性提供者は以前にＨＰＶ抗原に曝露されたことがあると考えられる者であった１２。
【００１１】
第三者バンクの用途には、ＨＰＶ抗原に対する以前の曝露とは無関係に健常提供者からＨＰＶ特異的Ｔ細胞を生成することが必須である。
【発明の概要】
【００１２】
本発明に係る方法は、好都合なことに、ＨＰＶ認識Ｔ細胞またはＨＰＶ特異的Ｔ細胞の迅速かつ堅牢な増殖を可能とし、日和見ＨＰＶ感染及びＨＰＶ関連悪性腫瘍を標的として治療上重要な抗原を認識するＴ細胞を提供し、そして、生きたウイルスまたはウイルス形質転換細胞の使用を必要としない。ここで本発明者らは、これらの細胞をドナー由来または市販の製品として使用するために臨床適用できる方法でこれらの細胞を製造する新規な方法を教示する。本発明者らは、生体外でナイーブ細胞供給源からＴ細胞応答を生み出すことにおける経験を活用してＨＰＶ認識Ｔ細胞またはＨＰＶ特異的Ｔ細胞を作製した。ＨＰＶの免疫学的特性に基づいて本発明者らは、Ｔ細胞数の増大を支援すべく、抗原提示樹状細胞を生成するプロセスを改変し、Ｔ細胞の増殖に使用するサイトカインの濃度を改変し、そして人工ＡＰＣを使用した。
【００１３】
その実施形態の１つにおいて、本発明は、ＨＰＶ抗原特異的Ｔ細胞（またはＨＰＶ抗原認識Ｔ細胞）を生成する堅牢な方法を提供する。生成するＨＰＶ認識Ｔ細胞は、ＨＰＶ抗原の単一のエピトープ、単一のＨＰＶ抗原の数多くのエピトープ、または異なるＨＰＶ抗原上のエピトープを認識し得る。本方法は、樹状細胞、単球、Ｋ５６２細胞、人工抗原提示細胞、ＰＨＡ芽球、Ｂ芽球、リンパ芽球様細胞及びＣＤ３−２８芽球などの種々の抗原提示細胞に対して投与されるＨＰＶ抗原（複数可）の重複ペプチドライブラリーと、準備刺激用及び増殖用の種々のサイトカイン−−限定されないがＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５を含む−−と、種々の選抜方法（ＣＤ４５ＲＯ除去など）とを採用する。１６、１７その他の人工または代替の抗原提示細胞を使用してもよい。本発明によって生じた抗原特異的Ｔ細胞は、移植後ウイルス感染症及び腫瘍再発を処置するために使用することができる。これらの抗原特異的Ｔ細胞及びそれらの前駆体は、好都合なことに、特定の病原体または新生物症状に対するＴ細胞免疫性を必要とする被験体に後に投与するために預託または貯蔵することができる。
【００１４】
本発明は、大半がＨＰＶ血清陰性者であってそれゆえウイルス未感作のＴ細胞集団を有するであろう健常提供者の免疫系から、ＨＰＶ抗原特異的Ｔ細胞を特異的に生成するプロセスを含む。本発明は、移植後及びＨＰＶが問題となる可能性のあるその他のＨＰＶ関連悪性腫瘍のような免疫低下状況においてウイルス感染を防止することを目的とする、プロセス及びその用途である。本発明は、ナイーブＴ細胞から以前に行われたことのない臨床上適切な方法で、ナイーブＴ細胞から多ＨＰＶ抗原特異的Ｔ細胞を作る。
【００１５】
本発明自体はプロセス及び用途であるため、それを他の日和見ウイルス、限定されないが例えば、ＨＨＶ６及びＢＫウイルスに対するナイーブ集団からの抗原特異的応答を生み出すことに容易に適用することができる。それは、悪性腫瘍に関連する疾患、限定されないが例えばＥＢＶ及びＨＩＶに由来するウイルス特異的抗原を包含すべく拡張することができる。それは、他の細胞産物、リンパ球除去計画及びエピゲノム修飾薬と組み合わせることができる。その他の医学的用途としては、例えば、生着促進及び、移植前の免疫不全患者への療法提供が挙げられる。
【００１６】
本発明は、潜在的に異なる抗原提示細胞（樹状細胞、単球、Ｋ５６２細胞、ＰＨＡ芽球、Ｂ芽球、リンパ芽球様細胞及びＣＤ３−２８芽球）に対して投与される種々の重複ペプチドライブラリーと、準備刺激用及び増殖用の種々のサイトカイン（限定されないがＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５を含む）と、種々の選抜方法（ＣＤ４５ＲＯ除去など）とを使用してＨＰＶ特異的Ｔ細胞を生成する。その他の人工または代替の抗原提示細胞を同様に使用してもよい。本発明者らはさらに、ナイーブＴ細胞から作製された上記細胞の第三者バンクを教示するとともに、提供者に対する最良適合者を選択するプロセスを教示する。
【００１７】
本発明のプロセスは、安全、単純、迅速かつ再現可能であり、また、種々様々な患者のために医薬品等の製造管理及び品質管理に関する基準（ＧＭＰ）に準拠してＨＰＶ認識Ｔ細胞またはＨＰＶ特異的Ｔ細胞を生じさせるために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本明細書において開示される方法を用いて健常提供者（ｎ＝５）からＨＰＶを認識するＴ細胞を生成した。それは、無関係な抗原（自己タンパク質アクチン）と比較して特異的にＨＰＶ抗原Ｅ６及びＥ７を認識する。細胞単独（ＣＴＬ）からのバックグラウンド応答を示す。これは、本発明のプロセスによって健常提供者からＨＰＶ特異的Ｔ細胞が生成することを示している。
【図２】ＨＰＶを認識するＴ細胞（ｎ＝５）は、３つの刺激の後に臨床上適切な数に増殖させることができる。これは、本発明が臨床またはその他の用途のためにＨＰＶ認識Ｔ細胞またはＨＰＶ特異的Ｔ細胞を堅牢に作製することができる、ということを示している。
【図３】ＨＰＶを認識するＴ細胞（ｎ＝５）は混合表現型（ＣＤ４及びＣＤ８）を有しており、それは、Ｔ細胞点滴によるさらに良好な応答を促進することが示されている。細胞はさらに、共刺激受容体ＣＤ２７及びＣＤ２８を発現する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
「補助細胞」は、Ｔ細胞によるペプチド抗原の認識に共刺激を提供するかまたは、ペプチド抗原の存在下でＴ細胞が認識するか準備刺激を受けるかもしくは増殖するのを支援する、Ｋ５６２細胞などの細胞である。補助細胞は、その他の人工または代替の抗原提示細胞であってもよい。
【００２０】
「活性化Ｔ細胞」または「ＡＴＣ」は、臍帯血中またはナイーブ免疫細胞を含有する別の試料中の単核球をマイトジェン、例えばフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）及び／またはインターロイキン（ＩＬ）−２に曝露することによって得られる。
【００２１】
「抗原」は、免疫系、例えば免疫系の細胞性または液性のアームによって認識される、ポリペプチド、ペプチドまたはグリコペプチドもしくはリポペプチドなどの分子を包含する。「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子に結合するか、クラスＩもしくはＩＩのＭＨＣ複合体の一部を形成するか、または抗原提示分子との複合体形成のときに認識される、抗原決定基、例えば、アミノ酸残基６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２個またはそれ以上の長さを有するペプチドを包含する。
【００２２】
Ｔ細胞抗原／エピトープとは、Ｔ細胞における免疫応答によって認識されかつそれを誘発する、抗原またはエピトープ（例えば、主要組織適合性複合体分子（ＭＨＣ）に結合した抗原またはその一部の提示によりＴ細胞上のＴ細胞受容体によって特異的に認識される抗原）のことである。Ｔ細胞抗原は、通常はタンパク質またはペプチドである。この用語は、アルファ−ベータＴ細胞またはガンマ−デルタＴ細胞によって認識されるペプチド抗原及び、ガンマ−デルタＴ細胞によって認識され得る脂質、熱ショックタンパク質またはその他のストレス誘発性抗原を包含する。Ｔ細胞抗原は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答もしくはガンマデルタＴ細胞応答を刺激する抗原またはこれらの組み合わせを刺激する抗原であり得る。
【００２３】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、免疫系の特異的エフェクター細胞によって認識されることができるペプチド−ＭＨＣ複合体のかたちで１つ以上の抗原を提示すること、したがって提示されている１つ以上の抗原に対する有効な細胞性免疫応答を誘導することができる、細胞の部類を指す。クラスＩまたはＩＩのＭＨＣ分子を発現しているいかなる細胞も潜在的にはペプチド抗原を提示できるが、プロフェッショナルＡＰＣの例は、樹状細胞及びマクロファージである。
【００２４】
「対照」は、試験試料または試験被験体との比較目的のために用いられる、基準としての試料または被験体である。陽性対照は、予期される応答を測るものであり、陰性対照は、応答が全く予期されないかまたはバックグラウンド応答が予期される場合の試料の基準点を提供するものである。
【００２５】
「臍帯血」は、当該技術分野におけるその通常の意味を有し、出産後に胎盤中及び臍帯中に残存して造血幹細胞を含有している血液を指す。臍帯血は、新鮮なものであっても、凍結保存されたものであっても、臍帯血バンクから得たものであってもよい。
【００２６】
「サイトカイン」という用語は、当該技術分野におけるその通常の意味を有する。本発明において使用するサイトカインの例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５が挙げられる。
【００２７】
「樹状細胞」または「ＤＣ」という用語は、様々なリンパ組織及び非リンパ組織において見受けられる形態学的に類似した細胞型の多様な集団を表す。Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１−２９６（１９９１）を参照のこと。１９本発明のいくつかの実施形態には、臍帯血に由来する樹状細胞及び樹状細胞前駆体が関係する。
【００２８】
「エフェクター細胞」という用語は、抗原に結合することができるかあるいは抗原を認識することができかつ免疫応答を媒介することができる、細胞を表す。抗原特異的Ｔ細胞は、エフェクター細胞である。
【００２９】
「ヒトパピローマウイルス」は、ヒトに感染するパピローマウイルス科のＤＮＡウイルスである。少なくとも１７０種の亜型が知られており、その多くが性的接触によって伝染する。１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、７３及び８２型は、発癌性「高リスク」性感染症ＨＰＶであり、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、陰茎上皮内腫瘍（ＰＩＮ）及び／または肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）の発症につながり得る。６、８、２０〜２２
【００３０】
ＨＰＶは尋常性疣贅に関係する−ＨＰＶ２型及び４型（最も一般的）；また、１、３、２６、２９及び５７型なども。癌及び生殖器異形成−「高リスク」ＨＰＶ型は、癌、特に子宮頸癌に関係し、何らかの外陰部、膣、陰茎、肛門の癌及び何らかの中咽頭の癌の原因となる可能性もある。「低リスク」型は、疣贅またはその他の症状に関係する。高リスク：１６、１８（大部分の子宮頸癌の原因）；また、３１、３３、３５、３９、４５、５２、５８、５９なども。足底疣贅（ミルメシア）−ＨＰＶ１型（最も一般的）；２、３、４、２７、２８及び５８型なども。肛門性器疣贅（尖圭コンジローマまたは性器疣贅）−ＨＰＶ６型及び１１型（最も一般的）；また、４２、４４型なども。低リスク：６、１１（最も一般的）；また、１３、４４、４０、４３、４２、５４、６１、７２、８１、８９なども。扁平疣贅−ＨＰＶ３型、１０型及び２８型。ブッチャーズ疣贅−ＨＰＶ７型。ヘック病（限局性上皮肥厚）−ＨＰＶ１３型及び３２型。６、８、２０〜２２
【００３１】
「浸潤リンパ球」は、特定の生体区画または組織、粘膜層（例えば、上皮、粘膜固有層）または皮膚層（例えば、角質層、透明層、顆粒層、有棘層、基底層及び真皮）の中に進入したものである。これらには、新生物、腫瘍または、子宮頸癌、肛門癌、陰茎癌、中咽頭癌、外陰癌もしくは膣癌に浸潤しているものを含む。それは、扁平上皮乳頭腫、内反性乳頭腫、尿路上皮乳頭腫、乳管内乳頭腫または疣贅、例えば足底疣贅もしくは陰部疣贅に浸潤したリンパ球を包含する。浸潤リンパ球によって認識される抗原は、特定組織におけるＨＰＶ関連症状に対する特異性を有するＴ細胞を誘導するように選択され得る。
【００３２】
「単離された」という用語は、物質に普通に結び付いている成分から分離されることを意味し、例えば、単離された臍帯血単核球は、臍帯血の赤血球、血漿及び／またはその他の成分から分離されたものであることができる。
【００３３】
「ｍｕｃｏｓａ（粘膜）」すなわちｍｕｃｏｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（粘膜）は、それらの一般的な解剖学的及び生理学的な意味を有する。これらは、眼粘膜、鼻粘膜、嗅粘膜、口腔粘膜、気管支粘膜及び声帯ひだの内層、食道粘膜、胃粘膜、腸粘膜、肛門粘膜、陰茎粘膜ならびに、膣粘膜及び子宮の粘膜である子宮内膜を包含する。粘膜はＨＰＶによる感染を受けやすい。
【００３４】
「ナイーブ」Ｔ細胞またはその他の免疫エフェクター細胞とは、抗原または、抗原提示細胞を活性化することのできるペプチド抗原を提示している抗原提示細胞に対して、曝露がなされたことのないもののことである。
【００３５】
本願の趣意範囲内において、「ペプチドライブラリー」または「重複ペプチドライブラリー」とは、全体としてタンパク質抗原、とりわけ日和見ウイルスのタンパク質抗原の部分的または完全な配列を網羅する、ペプチドの複合混合物のことである。混合物の中で連続したペプチドは互いに重複し、例えば、ペプチドライブラリーは、ライブラリー内の隣のペプチドと１１アミノ酸残基だけ重複しておりなおかつタンパク質抗原の全長または抗原の選択部分に及ぶことができる、長さ１５アミノ酸のペプチドから構成され得る。ペプチドライブラリーは市販されており、特定の抗原のためにあつらえてもよい。抗原提示細胞を接触させるか、投与するか、または負荷させる方法は、周知であり、Ｎｇｏ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）の参照により援用する。２３
【００３６】
「前駆細胞」という用語は、別の種類の細胞へと分化、成熟あるいは形質転換されることができる細胞を指す。例えば、「Ｔ細胞前駆細胞」は、Ｔ細胞へと分化することができ、「樹状前駆細胞」は、樹状細胞へと分化することができる。
【００３７】
「被験体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物としては、限定されないが例えば、ヒト、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ネズミ、その他の家畜、競技用動物または愛玩動物が挙げられる。「被験体」は、抗原特異的Ｔ細胞を必要とする者、例えば、リンパ球減少症を有する者、免疫系切除を受けた者、移植及び／もしくは免疫抑制計画を受けている者、新生児などの未感作もしくは発達途中の免疫系を有する者、または臍帯血もしくは幹細胞の移植を受けている者を包含する。
【００３８】
ＨＰＶ１６のＥ６／Ｅ７に特異的なＴ細胞の生成
ＨＰＶ１６−Ｅ６（タンパク質ＩＤ  Ｐ０３１２６）及びＨＰＶ１６−Ｅ７（Ｐ０３１２９）の重複ペプチドライブラリー（１１アミノ酸だけ重複している１５量体）をＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で戻した。
【００３９】
単球は、ＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用するＣＤ１４選抜によってＰＢＭＣから単離し、２４ウェルプレート（１×１０６細胞／ウェル）においてＤＣ培地［ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ  ＧｍｂＨ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び１％アラニルグルタミン（ＧｌｕｔａＭＡＸ；Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）］中で８００Ｕ／ｍＬの顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）及び１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に培養した。
【００４０】
ＤＣには、３日目にＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を供給した。５日目の朝、１ｍｌの培地をウェルから除去し、１μＬのペプチド混合物（Ｅ６及びＥ７）を各ウェルに加えた。少なくとも１時間後の５日目の午後、１ウェルあたり１ｍＬのＤＣ培地を以下の終濃度のサイトカインと共に加えることによってＤＣを成熟させた：１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１μｇ／ｍＬのプロスタグランジンＥ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、８００Ｕ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ、１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−４、及び３０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ。
【００４１】
７日目にＤＣを採取し、１×１０５細胞／ｍＬでＣＴＬ培地［４５％のクリック培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ）、４５％のＲＰＭＩ−１６４０（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１０％のヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｅｓｔ  Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）及び１％のＧｌｕｔａＭＡＸ］の中に再懸濁させた。ＣＤ１４陰性ＰＢＭＣを解凍し、１×１０６細胞／ｍＬでＣＴＬ培地中に再懸濁させた。１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含んだＣＴＬ培地中で、１：１０（ＤＣ：ＣＤ１４−）の比でのペプチド負荷ＤＣにより細胞を刺激した。
【００４２】
初回刺激から９〜１２日後にＴ細胞を採取し、計数を行い、ＣＴＬ培地中１×１０６細胞／ｍＬ（２４ウェルプレートのウェル１つにつき１×１０６細胞／ｍＬ）の濃度で、新たに調製したペプチド負荷ＤＣとＩＬ−７とＩＬ−１５とで（あるいは、ＩＬ−７とＩＬ−１２とＩＬ−１５とで、またはＩＬ−６とＩＬ−７とＩＬ−１２とＩＬ−１５とで）再度刺激した。必要に応じて細胞培養物にＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した。
【００４３】
２回目の刺激から７日後にＴ細胞を採取し、計数を行い、２．５×１０５／ｍＬで再懸濁させ、新たに調製したペプチド負荷ＤＣとＩＬ−２とＩＬ−１５とで３回目の刺激を行った。必要に応じて細胞培養物にＩＬ−２またはＩＬ１５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を交互に補充した。あるいは、上記の他の抗原提示細胞−ペプチド負荷もされたもの−を細胞に与える。
【００４４】
この方法によって生じたＨＰＶ特異的Ｔ細胞を、図１〜３に示すとおり評価した。これらの図は、本明細書において開示される方法によって、ＨＰＶに感染していない健常提供者から得られかつＨＰＶのＥ６及びＥ７抗原を認識する細胞からＴ細胞が生成する、ということを示している。これらの細胞は、本明細書に記載のとおり増殖させることができ、混合表現型（ＣＤ４及びＣＤ８）を有する細胞表面マーカーを呈する。混合表現型は、Ｔ細胞点滴によるさらに良好な応答を促進することが示されている。細胞はさらに、共刺激受容体ＣＤ２７及びＣＤ２８を発現する。
【００４５】
混合ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞表面マーカーの発現は、感染性病原体、例えば過去の潜伏性の高持続性レベルの感染性病原体に対する適応免疫応答の誘導に関連付けられている。ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗ウイルス免疫応答に関与するＴ細胞集団の認知幅を広げる（Ｎａｃｉｍｂｅｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００４  １０４：４７８−４８６）。本明細書に記載の方法は、ＨＰＶを認識する数多くの混合ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成し、また、他の細胞表面表現型を有するＴ細胞よりも抗ＨＰＶ免疫性の優れるエフェクターとしての役割を果たす潜在性を有し得る。
【００４６】
ＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＯ＋及びＣＤ２７＋Ｔ細胞マーカーの発現は、ＨＰＶの持続性の低下及びＨＰＶ感染に対する抵抗性と関係がある（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１１  Ｆｅｂ  １；１２８（３）：５９７−６０７）。本明細書において開示される方法によって生じたＨＰＶ特異的Ｔ細胞は、持続性ＨＰＶ感染を有するかまたはそれに罹患するリスクがある被験体を防護するために使用される潜在性を有し得る。リスクがあるこれらの被験体としては、例えば、喫煙者、タバコ喫煙者もしくは噛みタバコ使用者、中咽頭癌のリスクが高く口腔衛生状態が悪い者、弱化した免疫系（ＨＩＶのような疾患を含む）を有する者、免疫抑制薬もしくは免疫抑制計画を受けている者、例えば、癌患者または、輸血もしくは組織移植を受けている被験体、及び子宮頸癌のより高いリスクを有する者（多くの子供を有する女性、経口避妊薬を（特に長期間）使用している女性を含む）が挙げられる。慢性炎症を特徴とする疾患、障害もしくは症状を有する被験体、または老齢個体（例えば、５０、６０、７０または８０歳以上）も、持続性ＨＰＶ感染のリスクが正常被験体よりも高い。
【００４７】
本明細書において開示される方法によって生成するＴ細胞はさらに、図３に示すように、共刺激受容体ＣＤ２７及びＣＤ２８を高い頻度またはレベルで含有する。
【００４８】
ＣＤ２７を発現しているＴ細胞は、ＣＤ２７を介して共刺激されることができる。ウイルスは、宿主免疫系を逃れる手段としてＣＤ２７の発現を調節することが知られている。ＣＤ２７を発現しているＴ細胞の生成は、急性または持続性のウイルス感染の間のこれらの細胞によるウイルス特異的免疫性の誘導のための手段を提供する（Ｗｅｌｔｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０１３  Ｊｕｎ；８７（１２）：６８５１−６５）。本明細書において開示される方法は、ＨＰＶ抗原を認識しかつＣＤ２７＋である、ＣＤ２７を介した共刺激が可能となる数多くのＴ細胞を生じさせる。Ｔ細胞持続性は、ＣＤ２７共刺激によって促進され、また、被験体（例えば、ＨＰＶに感染したかまたは持続性ＨＰＶ感染を有する者）の養子免疫療法の臨床上の有効性を向上させ得る。生体内でのＣＤ２７介在性ヒトＴ細胞生存を説明する機序としては、例えば、生体内での、抗アポトーシス分子の上方制御、指令下でのＣＤ４支援、及びＣＤ８＋Ｔ細胞によるオートクリンＩＬ−２産生が挙げられる（Ｓｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１２  Ｊｕｌ  １；１（４）：５４７−５４９）。
【００４９】
ＣＤ２８を発現しているＴ細胞は、抗ウイルスＴ細胞応答のエフェクター段階の間にＣＤ２８を介して共刺激されることができる。ＣＤ２８を発現しないかまたはＣＤ２８受容体が遮断されたＴ細胞は、ウイルスに対して低い応答を呈し、その結果、アポトーシスが増加し、ウイルスクリアランスが低下する（Ｄｏｌｆｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１  Ａｐｒ  １５；１８６（８）：４５９９−６０８）。本明細書において開示される方法は、ＨＰＶ抗原を認識しかつＣＤ２８＋である、ＣＤ２８を介した共刺激が可能となる数多くのＴ細胞を生じさせる。
【００５０】
本発明に係るプロセスの範囲は幅広い。例えば、それを用いて同種異系の幹細胞移植後におけるＨＰＶ関連の症状を防止することができ、または、それを用いて子宮頸癌のようなＨＰＶ悪性腫瘍の再発を防止することができる。これより、本発明の具体的かつ非限定的な実施形態についてさらに記載する。
【００５１】
一実施形態において、本発明は、ＨＰＶ抗原特異的Ｔ細胞を生じさせるプロセスであって、（ａ）ナイーブ免疫細胞を含有する任意の細胞供給源からの単核球を数個の部分に分割することと；（ｂ）上記の試料の一部を、ＰＨＡまたは別のマイトジェンと、ＩＬ−２とで刺激して、次回の刺激中に抗原提示機能を提供するＡＴＣすなわち活性化Ｔ細胞（「ＡＴＣ」）を生じさせ、場合によってＡＴＣを放射線または別の薬剤で処理してその増殖を抑制することと；（ｃ）Ｔ細胞及びＴ細胞前駆細胞（例えば、非付着性細胞、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１４−細胞）を樹状細胞及び樹状前駆細胞（例えば、付着性細胞、ＣＤ１１Ｃ＋またはＣＤ１４＋細胞）から分離することと；（ｄ）Ｔ細胞及びＴ細胞前駆細胞を凍結保存あるいは保管することと；（ｅ）第２の部分の中の樹状細胞及び樹状前駆細胞を、樹状細胞を生成及び成熟させるサイトカイン（複数可）またはその他の薬剤（複数可）と、少なくとも１つのＨＰＶペプチド抗原またはＨＰＶ抗原混合物とによって分化させて、少なくとも１つのＨＰＶペプチド抗原を提示する抗原提示樹状細胞を生じさせ、場合によって上記抗原提示樹状細胞を、その増殖を抑制するのに十分な放射線または別の薬剤で処理することと；（ｆ）ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５の任意の組み合わせまたは全ての存在下で、（ｄ）からの凍結保存あるいは保管されたＴ細胞及びＴ細胞前駆細胞を、（ｅ）で生じた前記樹状抗原提示細胞で刺激して、少なくとも１つのＨＰＶペプチド抗原を認識する抗原特異的Ｔ細胞を生じさせることと；（ｇ）少なくとも１つのＨＰＶペプチド抗原の存在下、場合によっては潜在的な人工もしくは代替の抗原提示細胞または、ＩＬ−２及び／もしくはＩＬ−１５の存在下にあるその他の補助細胞の存在下で、（ｆ）によって生じた抗原特異的Ｔ細胞を（ｂ）のＡＴＣで刺激し；場合によって（ｇ）を１回以上繰り返することと；（ｈ）少なくとも１つのペプチド抗原を認識する抗原特異的Ｔ細胞を回収することとを含む、当該プロセスを含む。
【００５２】
ＨＰＶ抗原を認識するＴ細胞は、細胞表面マーカーに基づいてさらに単離または精製してもよい。Ｔ細胞表現型としては、例えば、以下のマーカーのうちの１つ以上を有する細胞が挙げられる：ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋及び／またはＰＤ１。Ｔ細胞表現型としては、例えば、ＣＤ４＋ＣＤ８＋；ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋ならびに、ＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＯ＋及びＣＤ２７＋が挙げられる。望ましくない表現型を有する細胞は、当該技術分野において既知の方法を用いて所望のＨＰＶ認識Ｔ細胞から除去または分離され得る。
【００５３】
本発明に係る方法では、Ｔ細胞認識性ＨＰＶ抗原を生成するために生ウイルスを使用する必要はない。上記の例では、いずれかのＴ細胞を生じさせるのにＨＰＶの系統もいかなる生きたウイルスも使用しなかった。抗原はＪＰＴからのものであった：Ｅ６及びＥ７抗原を使用した。それにもかかわらず、本明細書に記載の方法は、ウイルス感染細胞溶解物、完全ウイルスタンパク質及び、ＨＰＶ抗原をコードするプラスミドまたはＤＮＡ配列またはウイルスベクターなど、他の供給源からのＨＰＶ抗原を使用して実施することができる。
【００５４】
上記実施形態において記載したプロセスはさらに、（ａ）の前に、ナイーブＴ細胞を含有する単核球を分離することを含み得る。このプロセスで使用する単核球は、ＨＰＶ抗原に対して未感作であるかまたは特定のＨＰＶ系統もしくは特定のＨＰＶ抗原に対して未感作である、臍帯血、幹細胞またはその他の細胞供給源から得られ得る。したがって、このプロセスで使用する単核球は、少なくとも１つのＨＰＶペプチド抗原に対して未感作である造血幹細胞から；または、幹細胞、前駆Ｔ細胞、もしくは免疫系が少なくとも１つのＨＰＶペプチド抗原に対して未感作である被験体からのＴ細胞を含有する試料から得られ得る。
【００５５】
本発明に係るプロセスは、（ｂ）上記試料の第１の部分をＰＨＡとＩＬ−２とで刺激して活性化Ｔ細胞（「ＡＴＣ」）を生じさせることを含み得る。これらのＡＴＣは、後の使用のために凍結保存あるいは預託されていてもよいし、即時に使用してもよい。好ましくは、ＡＴＣも抗原特異的Ｔ細胞も凍結保存させる必要なく、ＡＴＣを新鮮な状態で使用し、（ｆ）で生じた抗原特異的Ｔ細胞と混合する。例えば、（ｂ）で調製したＰＨＡ芽球は、（ｆ）で生じた抗原特異的Ｔ細胞に２回目の刺激を提供するプロセスの開始から１４〜１６日後に使用することができる。
【００５６】
当業者であれば、本発明に係るプロセスにおいて使用するための適切な数の細胞を選択し得、そのようなプロセスは、（ｂ）において、およそ百万〜２千万個、好ましくは５百万〜１千５百万個、最も好ましくはおよそ８百万〜１千２百万個の単核臍帯血細胞をＰＨＡとＩＬ−２とで刺激することを含む。当業者であれば、細胞の数またはその他のプロセス条件を必要に応じて調節して、ＨＰＶペプチド抗原を認識するＴ細胞を生じさせるプロセスをスケールアップまたはスケールダウンし得る。本発明に係るプロセスにおいて、（ｂ）は、ＰＨＡ芽球の代わりにＴ芽球、Ｂ芽球、リンパ芽球様細胞またはＣＤ３−ＣＤ２８芽球を活性化Ｔ細胞として生じさせることを含み得る。
【００５７】
そのようなプロセスは、細胞培養用のプレートまたは装置に第２の部分の中の細胞が付着するのに十分な条件下でプラスチック付着により第２の部分を培養することと、その後にＴ細胞及びＴ細胞前駆細胞を細胞培養用のプレートまたは装置から移すことと、固形培地に付着した樹状細胞及び樹状前駆細胞を回収することとによって樹状細胞及び樹状前駆細胞から分離された、Ｔ細胞及び／またはＴ細胞前駆細胞を使用してもよい。あるいは、これらの２つの細胞集団は、各集団を特異的に認識する抗体の使用、ＣＤ１４に基づく選抜（例えば、ＭＡＣビーズを使用するもの）、またはその他の既知の細胞選別方法によって、磁気的に分離してもよい。別々の細胞集団は、後の使用のために凍結保存あるいは預託してもよいし、Ｔ細胞または樹状細胞を生じさせるために即時に使用してもよい。これらの集団はまた、本明細書において記載されている、ペプチド抗原を負荷した成熟樹状細胞または抗原特異的Ｔ細胞を生じさせる後の処理ステップの後に、凍結保存あるいは預託してもよい。
【００５８】
本発明のプロセスでは、（ｅ）において樹状細胞及び樹状前駆細胞を、樹状細胞の分化及び維持に必要な、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦを非限定的に含むサイトカインの存在下で増殖させることができ；また、（ｅ）においてＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦと一緒に、限定されないが次のＬＰＳ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＰＧＥ−１、ＰＧＥ−２及びその他の免疫賦活剤（例えば、オリゴヌクレオチド）のうちの１つ以上から構成される群から選択される樹状細胞成熟性のサイトカインまたは薬剤を使用して、樹状細胞及び樹状前駆細胞を成熟化に供してもよい。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態では、（ｆ）において、もしくは（ｆ）の前に、Ｔ細胞もしくはＴ細胞前駆細胞を処理してＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を増殖させてもよいし；または、（ｆ）において、もしくは（ｆ）の前に、Ｔ細胞及びＴ細胞前駆細胞を処理してＣＤ４５ＲＯ陽性細胞を除去してもよい。特定のマーカーを有するその他のＴ細胞を処理して、特定の細胞表面表現型、例えば本明細書に記載のそれらの表現型のいずれかを有するＨＰＶ認識Ｔ細胞を増殖または除去してもよい。
【００６０】
本発明に係るプロセスにおいて、少なくとも１つの抗原は、ＨＰＶタンパク質またはＨＰＶ抗原の全体にわたる一連の重複するペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、院内で、もしくは医原的に罹患するか、または病院（例えば、院内感染）において被験体に伝染するか、または本発明の特定の形態によって（例えば、粘膜もしくは皮膚との直接接触または性的接触によって）伝染する、日和見ＨＰＶの少なくとも１つの抗原を認識するように、抗原特異的Ｔ細胞が選抜され得る。少なくとも１つのペプチド抗原は、ＨＰＶの抗原またはペプチドライブラリー、例えば、ＨＰＶ  Ｅ１〜Ｅ５の抗原もしくはペプチドライブラリー；ＨＰＶ  Ｅ６もしくはＥ７の抗原もしくはペプチドライブラリー；ＨＰＶ  Ｌ１もしくはＬ２の抗原もしくはペプチドライブラリー；またはそれらの混合物を含み得る。
【００６１】
少なくとも１つのペプチド抗原は、ＨＰＶに感染した部位、組織または細胞から単離されたＴ細胞によって認識されるものであり得る。
【００６２】
本発明の別の実施形態は、本発明に係るプロセスによって生じた抗原特異的Ｔ細胞を含む組成物に関する。そのような抗原特異的Ｔ細胞は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のＨＰＶ株、血清型、抗原またはエピトープを認識し得る。そのような組成物は、ナイーブ免疫細胞を含有する試料を大部分が非限定的に含んでいることが好ましい、種々の細胞供給源から単離された単核球と、これと同じ供給源に由来する抗原提示細胞、例えば細胞樹状細胞やＰＨＡ芽球（それは、ＰＨＡまたは別のマイトジェンやＩＬ−２を中に含有する）と、上記細胞の生存能を維持する培地と、任意での、Ｋ５６２細胞、またはその他のＴ細胞を共刺激する非自家細胞（人工または代替の抗原提示細胞を包含する）とを含み得、場合により上記細胞は、増殖を防止すべく処理されたものである。
【００６３】
別の実施形態では、組成物は、樹状細胞及び樹状前駆細胞（例えば、付着性細胞、ＣＤ１１Ｃ＋またはＣＤ１４＋細胞）から分離された、ＨＰＶペプチド抗原に対して未感作であるＴ細胞及びＴ細胞前駆細胞（例えば、非付着性細胞、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１４−細胞）と；培養期間の様々な時点においてＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５のうちの少なくとも１つを非限定的に含むサイトカインと；上記Ｔ細胞及びＴ細胞前駆細胞の生存能を維持する培地とを含み得る。
【００６４】
本発明の他の実施形態は、実施形態１のプロセスによって生じたＨＰＶペプチド抗原を認識するＴ細胞の１つ以上の試料を、貯蔵用または凍結用の培地と組み合わせて収容する、バンクまたは細胞貯蔵設備であって；場合によって、前記１つ以上の試料が、完全もしくは部分的なＤＮＡ配列情報、主要組織適合性及び／もしくは副組織適合性の抗原もしくはマーカーを含めて当該１つ以上の試料の組織適合性について記載する情報、及び／または当該１つ以上の試料が含有または認識するペプチド抗原についての情報を含む前記１つ以上の試料の供給源について記載する情報によって関連付けられるか同定されるかまたは指標付けされる、当該バンクまたは細胞貯蔵設備を含む。そのような抗原特異的Ｔ細胞バンクは、実施形態１のプロセスによって生じた、凍結保存あるいは保管された生ＨＰＶ抗原特異的Ｔ細胞の多数の試料を含み得る。
【００６５】
本発明の別の実施形態は、キットであって、樹状細胞及び樹状前駆細胞（例えば、付着性細胞、ＣＤ１１Ｃ＋またはＣＤ１４＋細胞）から分離された、ＨＰＶペプチド抗原に対して未感作であるＴ細胞及びＴ細胞前駆細胞（例えば、非付着性細胞、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１４−細胞）と；ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５のうちの少なくとも１つを非限定的に含むサイトカインと；上記Ｔ細胞及びＴ細胞前駆細胞の生存能を維持する培地と；上記Ｔ細胞及びＴ細胞前駆細胞から分離された樹状細胞または樹状前駆細胞と；上記樹状細胞または樹状前駆細胞の生存能を維持する培地と；場合によって増殖を防止すべく処理された、Ｋ５６２細胞、人工もしくは代替の抗原提示細胞、またはその他のＴ細胞を共刺激する非自家細胞と、少なくとも１つのＨＰＶペプチド抗原、またはＨＰＶペプチドの混合物とを含む、当該キットを構成する。
【００６６】
上記の記載は、特定の実施形態を開示するものである。当業者には理解されようことであるが、本明細書において記載された手法、方法、技法、材料、装置などは、当業者によって理解されるとおり別の実施形態で具現化されてもよく、本願は、そのような変化形態を包含し含むことを意図している。したがって、この記載は例示的なものであり、また、以下の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。本明細書中の引用文献は、とりわけ言及した主題または同一もしくは隣接する段落もしくは節における主題を具体的に説明することを目的として、参照により援用される。
【００６７】
参考文献
１．Ｌｅｅｎ  Ａ．Ｍ．，  Ｂｏｌｌａｒｄ  ＣＭ，  Ｍｅｎｄｉｚａｂａｌ  ＡＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｂａｎｋｅｄ  ｔｈｉｒｄ−ｐａｒｔｙ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｔｒｅａｔ  ｓｅｖｅｒｅ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２１：５１１３−５１２３。
２．Ｆｏｓｔｅｒ  ＡＥ，  Ｄｏｔｔｉ  Ｇ，  Ｌｕ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＥＢＶ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．２００８；３１：５００−５０５。
３．Ｈｅｓｌｏｐ  ＨＥ，  Ｓｌｏｂｏｄ  ＫＳ，  Ｐｕｌｅ  ＭＡ，ｅｔ  ａｌ．  Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ＥＢＶ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ  ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｏｒ  ｔｒｅａｔ  ＥＢＶ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．  Ｂｌｏｏｄ．２０１０；１１５：９２５−９３５。
４．Ｍｅｌｅｎｈｏｒｓｔ  ＪＪ，  Ｃａｓｔｉｌｌｏ  Ｐ，  Ｈａｎｌｅｙ  ＰＪ，  ｅｔ  ａｌ．Ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｍｕｌｔｉｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１５；２３：１７９−１８３。
５．Ｒｏｏｎｅｙ  ＣＭ，  Ｌｅｅｎ  ＡＭ，  Ｖｅｒａ  ＪＦ，  Ｈｅｓｌｏｐ  ＨＥ．  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｎａｔｉｖｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ．２０１４；２５７：３９−５５。
６．Ｓｔａｎｌｅｙ  ＭＡ，  Ｐｅｔｔ  ＭＲ，  Ｃｏｌｅｍａｎ  Ｎ．  ＨＰＶ：  ｆｒｏｍ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ．２００７；３５：１４５６−１４６０。
７．Ｓｔａｎｌｅｙ  ＭＡ，  Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＪＣ．  Ｈｏｓｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ｉｎ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．２０１４；４５：５８−７４。
８．Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｍ．  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＨＰＶ  ａｎｄ  ＨＰＶ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２００８；１０９：Ｓ１５−２１。
９．Ｆｕｒｎｉｓｓ  ＣＳ，  ＭｃＣｌｅａｎ  ＭＤ，  Ｓｍｉｔｈ  ＪＦ，ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  １６  ａｎｄ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．２００７；１２０：２３８６−２３９２。
１０．Ｐｓｙｒｒｉ  Ａ，  ＤｉＭａｉｏ  Ｄ．  Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ａｎｄ  ｈｅａｄ−ａｎｄ−ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２００８；５：２４−３１。
１１．Ｍｉｒａｌｌｅｓ−Ｇｕｒｉ  Ｃ，  Ｂｒｕｎｉ  Ｌ，  Ｃｕｂｉｌｌａ  ＡＬ，  Ｃａｓｔｅｌｌｓａｇｕｅ  Ｘ，  Ｂｏｓｃｈ  ＦＸ，  ｄｅ  Ｓａｎｊｏｓｅ  Ｓ．  Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｅｎｉｌｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２００９；６２：８７０−８７８。
１２．Ｒａｍｏｓ  ＣＡ，  Ｎａｒａｌａ  Ｎ，  Ｖｙａｓ  ＧＭ，ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６  Ｅ６／Ｅ７−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｏｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ＨＰＶ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１３；３６：６６−７６。
１３．ｄｅ  Ｊｏｎｇ  Ａ，  ｖａｎ  Ｐｏｅｌｇｅｅｓｔ  ＭＩ，  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｕｌｓｔ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ＣＤ４＋  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅａｒｌｙ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  Ｅ２  ａｎｄ  Ｅ６．  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００４；６４：５４４９−５４５５。
１４．Ｈｏｏｔｓ  ＢＥ，  Ｐａｌｅｆｓｋｙ  ＪＭ，  Ｐｉｍｅｎｔａ  ＪＭ，  Ｓｍｉｔｈ  ＪＳ．  Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ａｎａｌ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｌｅｓｉｏｎｓ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．２００９；１２４：２３７５−２３８３。
１５．Ｌｉｕ  Ｇ，  Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ  ＬＥ，  Ｈａｒｉｒｉ  Ｓ，  Ｐａｎｉｃｋｅｒ  Ｇ，  Ｕｎｇｅｒ  ＥＲ．  Ｓｅｒｏｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ９  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，２００５−２００６．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．２０１５。
１６．Ｈａｎｌｅｙ  ＰＪ，  Ｍｅｌｅｎｈｏｒｓｔ  ＪＪ，  Ｎｉｋｉｆｏｒｏｗ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．  ＣＭＶ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｎａｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ａｎｄ  ｍａｙ  ｂｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１５；７：２８５ｒａ２６３。
１７．Ｈａｎｌｅｙ  ＰＪ，  Ｌａｍ  Ｓ，  Ｓｈｐａｌｌ  ＥＪ，  Ｂｏｌｌａｒｄ  ＣＭ．  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｔｈａｔ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ，  ａｎｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：ＪｏＶＥ．２０１２：ｅ３６２７。
１８．Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｕ  Ａ，  Ｇｅｒｄｅｍａｎｎ  Ｕ，  Ｋａｔａｒｉ  ＵＬ，ｅｔ  ａｌ．  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ＡｄＶ，ＥＢＶ，ＣＭＶ，ＢＫＶ，ａｎｄ  ＨＨＶ６  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ＨＳＣＴ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１４；６：２４２ｒａ２８３。
１９．Ｓｔｅｉｎｍａｎ  ＲＭ．  Ｔｈｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．  Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９９１；９：２７１−２９６。
２０．Ｍｏｏｄｌｅｙ  Ｍ．  Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ＆  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ．２００５；１７：６１−６４。
２１．Ｃｏｏｐｅｒ  Ｋ，  ＭｃＧｅｅ  ＪＯ．  Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ：ａ  ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：ＭＰ．１９９７；５０：１−３。
２２．Ｌｏｗｙ  ＤＲ，  Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ＪＴ．  Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ．１９９６：１４１−１４３。
２３．Ｎｇｏ  ＭＣ，  Ａｎｄｏ  Ｊ，  Ｌｅｅｎ  ＡＭ，ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｂｒｏａｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１４；３７：１９３−２０３。
【図１】
2018531618.tif 000003
【図２】
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【図３】
2018531618.tif 000005
【国際調査報告】
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2018531618.tif 000008