(57)【要約】  本発明は、第一および第二のデングワクチンを含むデングウイルスワクチン組成物であって、第一のデングワクチンが少なくとも１の弱毒化生デングウイルスまたは弱毒化生キメラデングウイルスを含み、および第二のデングワクチンが組換えデングサブユニットワクチン、ＤＮＡワクチン、コンジュゲートワクチンまたは不活化デングワクチンであり；弱毒化生デングウイルスまたは弱毒化生キメラデングウイルスのゲノムが３’非翻訳領域のＴＬ２ステムループ構造の３０ヌクレオチド欠失を含む、前記組成物に関する。本発明のデングウイルスワクチン組成物は、１または複数のアジュバントをさらに含み得る。本発明の好ましい実施形態において、第一および第二のデングワクチンは四価である。本発明はまた、デング感染を処置もしくは予防する、またはその臨床症状の発症もしくは進行を予防する、寛解させるもしくは遅延させるために本発明のデングウイルスワクチン組成物を用いる方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的有効量の：
（ａ）少なくとも１の弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１の弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含む弱毒化生デングワクチンであって、ＬＡＶおよびＬＡＣＶが３’非翻訳（ＵＴＲ）領域のＴＬ−２ステムループ構造に相当する約３０ヌクレオチドの欠失を含有するウイルスゲノムを含む、前記ワクチン；ならびに
（ｂ）非複製デングワクチン
を含む、デングウイルスワクチン組成物。
【請求項２】
非複製デングワクチンが、組換えデングサブユニットワクチンまたは不活化デングワクチンである、請求項１の組成物。
【請求項３】
非複製デングワクチンが、デングウイルス１型（ＤＥＮ１）、デングウイルス２型（ＤＥＮ２）、デングウイルス３型（ＤＥＮ３）およびデングウイルス４型（ＤＥＮ４）からのデングＥタンパク質またはその断片を含む四価のデングサブユニットワクチンである、請求項１または請求項２の組成物。
【請求項４】
Ｅタンパク質の各々が、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４の野生型Ｅの、そのＮ末端におけるアミノ酸残基１から始まる長さの約８０％を構成する、請求項３の組成物。
【請求項５】
アジュバントをさらに含む、請求項３または請求項４の組成物。
【請求項６】
アジュバントがアルミニウム塩アジュバントである、請求項５の組成物。
【請求項７】
組成物中のアルミニウム元素の量が約５０μｇから約１．２５ｍｇである、請求項６の組成物。
【請求項８】
組成物中のアルミニウム元素の量が約２００μｇから約８５０μｇである、請求項７の組成物。
【請求項９】
アジュバントがサポニン系アジュバントである、請求項５の組成物。
【請求項１０】
組成物中の各Ｅタンパク質の量が約０．５μｇから約５００μｇである、請求項３〜８のいずれかの組成物。
【請求項１１】
組成物中の中の各Ｅタンパク質の量が約１．０μｇから約１００μｇである、請求項１０の組成物。
【請求項１２】
ＤＥＮ４Ｅタンパク質の量がＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３Ｅタンパク質の量の約１．５倍から約２．５倍である、請求項１１の組成物。
【請求項１３】
各Ｅタンパク質が、昆虫宿主細胞内で組換え生産され、発現する、請求項１０〜１２のいずれかの組成物。
【請求項１４】
弱毒化生デングワクチンが四価である、請求項１〜１３のいずれかの組成物。
【請求項１５】
弱毒化生デングワクチンが、デング２型に対して免疫原性がある１つのＬＡＣＶならびにデング１、３および４型に対して免疫原性がある３つのＬＡＶを含む、請求項１〜１４のいずれかの組成物。
【請求項１６】
ＬＡＣＶのウイルスゲノムが、デング血清型２のプレメンブレン（ｐｒＭ）およびエンベロープ（Ｅ）遺伝子ならびに異なるデング血清型のカプシドおよび非構造遺伝子を含む、請求項１５の組成物。
【請求項１７】
異なるデング血清型がデング血清型４である、請求項１６の組成物。
【請求項１８】
弱毒化生デングワクチンがデング血清型３に対して免疫原性があるＬＡＶを含み、ＬＡＶのウイルスゲノムが３’ＵＴＲのＴＬ−３構造に相当するΔ３０欠失から上流にヌクレオチドの欠失をさらに含有する、請求項１〜１７のいずれかの組成物。
【請求項１９】
弱毒化生デングワクチンの効力が、１０から約１×１０７プラーク形成単位（ＰＦＵ）である、請求項１４〜１８のいずれかの組成物。
【請求項２０】
弱毒化生デングワクチンの効力が、約１×１０３から約１×１０５ＰＦＵである、請求項１９の組成物。
【請求項２１】
有効量の請求項１〜２０のいずれかのデングウイルスワクチン組成物を患者に投与することを含む、その必要がある患者においてデングに対する免疫応答を誘導する方法。
【請求項２２】
有効量の請求項１〜２０のいずれかのデングウイルスワクチン組成物を患者に投与することを含む、その必要がある患者においてデング感染の可能性を低減させる、またはその症候を予防するもしくは寛解させる方法。
【請求項２３】
（ａ）第一および第二のデングワクチンを混合することでデングウイルスワクチン組成物を形成させるステップであって、第一のデングワクチンが少なくとも１の弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１の弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含む弱毒化生デングワクチンであり、ＬＡＶおよびＬＡＣＶが３’非翻訳（ＵＴＲ）領域のＴＬ−２ステムループ構造に相当する約３０ヌクレオチドの欠失を含有するウイルスゲノムを含み；ならびに第二のデングワクチンが非複製デングワクチンである、前記ステップ；ならびに
（ｂ）ステップ（ａ）のデングウイルスワクチン組成物をその必要がある患者に投与するステップ
を含む、デング感染の可能性を低減させる、またはその症候を予防するもしくは寛解させる方法。
【請求項２４】
非複製デングワクチンが、組換えデングサブユニットワクチンまたは不活化デングワクチンである、請求項２３の方法。
【請求項２５】
第一のデングワクチンが四価であって、デング血清型１（ＤＥＮ１）に対して免疫原性がある成分、デング血清型２（ＤＥＮ２）に対して免疫原性がある成分、デング血清型３（ＤＥＮ３）に対して免疫原性がある成分およびデング血清型４（ＤＥＮ４）に対して免疫原性がある成分を含み、各成分が弱毒化生デングウイルスまたは弱毒化生キメラフラビウイルスのいずれかを含む、請求項２３または請求項２４の方法。
【請求項２６】
第二のデングワクチンが、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４からのデングＥタンパク質またはその断片を含む四価の組換えデングサブユニットワクチンである、請求項２４または２５の方法。
【請求項２７】
混合前に弱毒化生デングワクチンが凍結乾燥されていて、組換えサブユニットワクチンが液体である、請求項２６の方法。
【請求項２８】
ステップ（ａ）の混合が凍結乾燥ワクチンを液体ワクチンで再構成することを含む、請求項２７の方法。
【請求項２９】
ステップ（ａ）において、液体ワクチンとの混合の前に凍結乾燥ワクチンが滅菌希釈剤で再構成される、請求項２７の方法。
【請求項３０】
混合前に弱毒化生ワクチンおよび組換えサブユニットワクチンの両方が液体の形態である、請求項２６の方法。
【請求項３１】
Ｅタンパク質の各々が、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４の野生型Ｅの、そのＮ末端におけるアミノ酸残基１から始まる長さの約８０％を構成する、請求項２６〜３０のいずれかの方法。
【請求項３２】
弱毒化生デングワクチンが、デング血清型２に対して免疫原性がある１つのＬＡＣＶならびにデング血清型１、デング血清型３およびデング血清型４に対して免疫原性がある３つのＬＡＶを含み；ＬＡＣＶが、デング血清型２のプレメンブレンおよびエンベロープ遺伝子ならびにデング血清型４の非構造およびカプシド遺伝子を含むウイルスゲノムを含む、請求項２３の方法。
【請求項３３】
ＤＥＮ３に対して免疫原性があるＬＡＶが、３’ＵＴＲのＴＬ−３構造に相当するΔ３０欠失から上流にヌクレオチドの欠失をさらに含むウイルスゲノムを含有する、請求項３２の方法。
【請求項３４】
その必要がある患者におけるデング感染の可能性を低減させる方法であって、
（ａ）請求項１〜２０のいずれかの第一のデングウイルスワクチン組成物を患者に投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）の後に所定の時間の経過を待つステップ；
（ｃ）前記患者に第二の請求項１〜２０のいずれかのデングウイルスワクチン組成物を投与するステップ；を含み、
それにより前記患者においてデングが感染する可能性を低減させる、方法。
【請求項３５】
第一および第二のデングウイルスワクチン組成物が同じものである、請求項３４の方法。
【請求項３６】
ステップ（ｂ）における時間が、２ヶ月から２年である、請求項３４または３５の方法。
【請求項３７】
ステップ（ｂ）および（ｃ）を１または複数回繰り返すことをさらに含む、請求項３４〜３６のいずれかの方法。
【請求項３８】
第一および第二のデングウイルスワクチン組成物が筋肉内または皮下への注射により投与される、請求項３４〜３６のいずれかの方法。
【請求項３９】
デング感染に関連した疾患の処置または予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）のための、請求項１〜２０のいずれかのデングウイルスワクチン組成物の使用。
【請求項４０】
患者におけるデングウイルスに対する免疫応答の誘導のための、請求項１〜２０のいずれかのデングウイルスワクチン組成物の使用。
【請求項４１】
デング感染に関連した疾患の処置または予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）における使用のための、請求項１〜２０のいずれかのデングウイルスワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象におけるデングウイルス感染および／またはその臨床症状の予防および／または処置に有用な、デングウイルス感染に対する免疫学的応答を誘発する組成物に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１２月２２日に出願された米国仮出願第６２／０９５，３３１号の利益を主張するものであり、この仮出願は参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００３】
電子的に提出された配列表の参照
本出願の配列表は、ファイル名が「２３９１３ＷＯＰＣＴＳＥＱ．ＴＸＴ」、作成日が２０１５年１１月２３日およびサイズが１７．５ＫＢであるＡＳＣＩＩ形式の配列表として、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出される。ＥＦＳ−Ｗｅｂで提出される本配列表は明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
フラビウイルス科は、プロトタイプの黄熱病ウイルス（ＹＦ）、デングウイルスの４つの血清型（ＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３およびＤＥＮＶ−４）、日本脳炎ウイルス（ＪＥ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥ）、ウエストナイルウイルス（ＷＮ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥ）および約７０種の他の疾患の原因となるウイルスを包含する。フラビウイルスは、一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムを含有する小さなエンベロープウイルスである。１０個の遺伝子産物が単一のオープンリーディングフレームによりコードされ、カプシド（Ｃ）、「プレメンブレン」（ｐｒＭ、これは細胞からのビリオン放出直前に「膜」（Ｍ）へとプロセシングされる）、「エンベロープ」（Ｅ）、その後に非構造（ＮＳ）タンパク質ＮＳ１、ＮＳ２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂおよびＮＳ５の順番で組織化されたポリタンパク質として翻訳される（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｔ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９０）  ４４：６４９−６８８；Ｈｅｎｃｈａｌ，Ｅ．Ａ．  ａｎｄ  Ｐｕｔｎａｋ，Ｊ．Ｒ．，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．（１９９０）  ３：３７６−３９６中に概説されている）。個々のフラビウイルスタンパク質は、次いで、宿主によって、同様にウイルスがコードするプロテアーゼによって媒介される精密なプロセシングイベントを通じて産生される。
【０００５】
フラビウイルスのエンベロープは宿主細胞の膜に由来し、ウイルスがコードする膜をアンカリングする膜（Ｍ）およびエンベロープ（Ｅ）糖タンパク質を含有する。Ｅ糖タンパク質は、最も大きなウイルス構造タンパク質であり、細胞表面付着およびエンドソーム内融合活性に関与する機能的ドメインを含有する。これはまた、防御免疫に関連した、ウイルス中和抗体の生産を誘導する宿主免疫系の主要な標的でもある。
【０００６】
デングウイルスは、エデス（Ａｅｄｅｓ）属の蚊、主にＡ．エジプチ（Ａ．ａｅｇｙｐｔｉ）およびＡ．アルボピクツス（Ａ．ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）により、ヒトに伝染する。デングウイルスによる感染は、不顕性または軽い熱病から古典的なデング熱（ＤＦ）を経てデング出血熱／デングショック症候群（ＤＨＦ／ＤＳＳ）までの範囲にわたる多様な臨床像をもたらす。デング熱は、高熱、頭痛、関節および筋肉の痛み、発疹、リンパ節腫脹および白血球減少を特徴とする（Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｒ．Ｖ．  ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｖａｕｇｈｎ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００２）  ３２４：１５６３−１５６６）。ＤＨＦ／ＤＳＳは、小児においてより一般的な、より重篤な感染症形態であって、点状出血および斑状出血の存在から自然発症の重篤な出血および重度のショックまでの範囲にわたる血管透過および／または重篤な出血性徴候により特徴付けられる。診断および迅速な医学的介入がなければ、ＤＨＦ／ＤＳＳの突然の発症および急速な進行は処置されないと致命的であり得る。
【０００７】
デングウイルスは、世界的な罹患率および死亡率の点で最も著しい節足動物伝染性ウイルスのグループであり、少なくとも３６００万のデング熱症例および２５０，０００から５００，０００のＤＨＦ／ＤＳＳ症例を包含する、推測で１億のデング感染症を毎年発生させている（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９８）  １１：４８０−４９６；上記のＧｉｂｂｏｎｓ）。人口の世界的な増加、特に熱帯全体にわたる人口の都会化、および持続的な蚊防除手段の欠如によって、デングの蚊ベクターはその分布を熱帯、亜熱帯、およびいくつかの温帯にわたって拡大しており、世界人口の半分超にデング感染のリスクをもたらしている。現代のジェット機旅行およびヒトの移動はデング血清型の世界的分布を容易にしたことから、今や多くの地域において複数のデング血清型が地域流行している。ここ２０年以上の間、デング流行の頻度およびＤＨＦ／ＤＳＳの発生率は増加している。例えば、東南アジアにおいて、ＤＨＦ／ＤＳＳは小児の間で入院および死亡の主要な原因である（上記のＧｕｂｌｅｒ；上記のＧｉｂｂｏｎｓ  ａｎｄ  Ｖａｕｇｈｎ）。
【０００８】
これまでに、フラビウイルスワクチンの開発は、部分的な成功を経験している。フラビウイルスが原因となる疾患から保護するためのワクチン候補を生産する試みにおいて、４つの基本的アプローチ：弱毒化生ワクチン、不活化全粒子ワクチン、組換えサブユニットタンパク質ワクチン、およびＤＮＡベースのワクチンが実行されている。黄熱病ウイルスに対する弱毒化生ワクチンは何十年にもわたって利用可能であって、より近年は日本脳炎に対する弱毒化生ワクチンが世界中の様々な国において登録されている。不活化全粒子ワクチンの使用は、いくつかの利用可能な登録製品を用いてＴＢＥウイルスおよびＪＥウイルスについて実証されている。Ｈｅｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：４３０１−０６（２０１２）。
【０００９】
上で取り上げたＹＦワクチン、ＪＥワクチンおよびＴＢＥワクチンの成功にもかかわらず、デングウイルスに対するワクチンを開発するための弱毒化生ウイルスおよび不活化ウイルスの方法の使用は、重要な課題に遭遇している。デングウイルスには４つの血清型（ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４）があり、各血清型の株は世界のデング流行地域全体にわたって巡回していることが見出されている。自然感染は感染した血清型への長期持続性の免疫を付与するが、他のデング血清型への免疫は付与しない。疾患のより重篤な形態（ＤＨＦ／ＤＳＳ）は、ほとんどの場合は、１つの血清型のデングウイルスの感染の後に別の血清型の第二の感染が続いたときに、第二のデング感染の後に生じる。ＤＨＦおよびＤＳＳと第二のデング感染とのより高頻度の関連性は、１つのウイルス型の感染により誘導される、第二のデングウイルス型の感染力を増強する非中和抗体が原因であるという仮説が立てられている（抗体依存性増強−ＡＤＥ）。
【００１０】
これまでに臨床で試験されたワクチンの大部分は弱毒化生ワクチンである。非複製ワクチン候補の使用もまた探求されている。例えば、Ｉｖｙら（米国特許第６，４３２，４１１号）は、ＤＥＮ１−４  ８０％  Ｅ（ＤＥＮＶ−２エンベロープポリペプチドのアミノ酸１〜３９５に相当するＤＥＮ１〜４のペプチド領域）タンパク質を含む四価のサブユニットワクチンを開示している。上記のＩｖｙらはまた、ＤＥＮＶ１−４  ８０％  ＥおよびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントを含む組成物を報告している。Ｃｏｌｌｅｒら（ＷＯ２０１２／１５４２０２）は、ＤＥＮ１〜４のＤＥＮ１−４  ８０％  Ｅを含む四価製剤を開示している。不活化ウイルスも潜在的なワクチン候補として、または有効なワクチンの成分として用いられ得る（Ｐｕｔｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３：４４４２−４４５２（２００５）、ＵＳ６１９０８５９、ＵＳ６２５４８７３およびＳｔｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ＷＯ２００７／００２４７０）。弱毒化生デングウイルスワクチンおよび非複製デングワクチンを含む組成物は、国際特許出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ１４／０４２６２５（ＷＯ／２０１４／２０４８９２）中に開示されている。
【００１１】
しかしながら、デングワクチンを開発するための先の試みにもかかわらず、これまで、デングワクチンは現在登録されていない。それゆえに、デング感染および／またはデング関連疾患に対する防御免疫応答を誘導することができる、安定、安全で有効なワクチンへのニーズは未だ残っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６，４３２，４１１号
【特許文献２】ＷＯ２０１２／１５４２０２
【特許文献３】ＵＳ６１９０８５９
【特許文献４】ＵＳ６２５４８７３
【特許文献５】ＷＯ２００７／００２４７０
【特許文献６】ＷＯ／２０１４／２０４８９２
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｔ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９０）  ４４：６４９−６８８
【非特許文献２】Ｈｅｎｃｈａｌ，Ｅ．Ａ．  ａｎｄ  Ｐｕｔｎａｋ，Ｊ．Ｒ．，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．（１９９０）  ３：３７６−３９
【非特許文献３】Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｒ．Ｖ．  ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｖａｕｇｈｎ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００２）  ３２４：１５６３−１５６６
【非特許文献４】Ｇｕｂｌｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９８）  １１：４８０−４９６
【非特許文献５】Ｈｅｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：４３０１−０６（２０１２）
【非特許文献６】Ｐｕｔｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３：４４４２−４４５２（２００５）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、薬学的有効量の（ａ）少なくとも１の弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１の弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含む弱毒化生デングワクチンであって、ＬＡＶおよびＬＡＣＶが、ウイルスの複製能力を低減させる３’非翻訳（ＵＴＲ）領域のＴＬ−２ステムループ構造に相当する約３０ヌクレオチドの欠失を含有するウイルスゲノムを含む、前記ワクチンならびに（ｂ）非複製デングワクチンを含む、デングウイルスワクチン組成物に関する。弱毒化生ワクチンと同じ組成物中の非複製デングワクチンの存在は、生ウイルスの生存率に顕著に影響を与えず、それによって生および非複製のワクチンが同じ製剤（「共製剤」）中で投与されることを可能にすることが見出された。
【００１５】
いくつかの実施形態において、非複製デングワクチンは、組換えデングサブユニットワクチン、ＤＮＡワクチン、コンジュゲートワクチンまたは不活化デングワクチンから選択される。さらなる実施形態において、非複製デングワクチンは、組換えデングサブユニットワクチンまたは不活化デングワクチンのいずれかである。本発明のいくつかの実施形態において、非複製デングワクチンは、少なくとも１のデングエンベロープ（Ｅ）タンパク質またはその断片を含む組換えデングサブユニットワクチンである。本発明の好ましい実施形態において、組換えデングサブユニットワクチンは四価であって、各々がデングウイルス（「ＤＥＮＶ」あるいは「ＤＥＮ」）血清型１、別名ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４の野生型Ｅの、そのＮ末端におけるアミノ酸残基１から始まる長さの約８０％からなるトランケート型のデングＥタンパク質を含む。
【００１６】
本発明の付加的な実施形態において、弱毒化生デングワクチンは、四価のＬＡＶまたは「ＬＡＴＶ」である（すなわち、本明細書中に定義されているＤＥＮＶ１〜４からの弱毒化生デングウイルスもしくはＤＥＮＶ１〜４からの弱毒化生キメラフラビウイルスまたはそれらの組み合わせを含み、ＬＡＶまたはＬＡＣＶのうちの少なくとも１はΔ３０  ＬＡＶまたはΔ３０  ＬＡＣＶである）。本発明の付加的な実施形態において、弱毒化生デングワクチンは四価であって、少なくとも１のキメラフラビウイルスを含み；このキメラフラビウイルスは、単一のデングウイルス血清型のｐｒＭおよびＥタンパク質をコードするヌクレオチド配列ならびに異なるフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するウイルスゲノムを含み、このキメラフラビウイルスは弱毒化されている。本発明のいくつかの実施形態において、キメラフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質は、ｐｒＭおよびＥタンパク質と異なるデング血清型からのものである。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態において、弱毒化生デングワクチンは、ＤＥＮ１Δ３０ウイルス、ＤＥＮ２／４Δ３０ウイルス（ＤＥＮ４骨格上のＤＥＮ２Δ３０  ＬＡＣＶ）、ＤＥＮ３Δ３０ウイルスおよびＤＥＮ４Δ３０ウイルスを含む四価の弱毒化生ワクチンである。図１を参照されたい。
【００１８】
本発明はまた、弱毒化生デングワクチン、組換えデングサブユニットワクチンおよびアジュバントを含むデングウイルスワクチン組成物であって、弱毒化生デングワクチンが少なくとも１のΔ３０  ＬＡＶまたはΔ３０  ＬＡＣＶを含む、前記組成物に関する。本明細書中に記載されているいくつかの実施形態において、アジュバントは、アルミニウム塩アジュバントである。代替的実施形態において、アジュバントは、サポニン系アジュバントまたはｔｏｌｌ様受容体アゴニストアジュバントである。
【００１９】
本発明の他の態様は、薬学的有効量の本発明のデングウイルスワクチン組成物をその必要がある患者に投与することを含む、デング感染を予防するまたはその症候を予防するもしくは寛解させる方法を包含する。本発明のこの態様の付加的な実施形態において、組成物はプライム／ブースト投薬計画において投与されるものであって、ここでは第一の用量の組成物がその必要がある患者に投与され、所定の時間が経過したら、第二の用量の組成物が前記患者に投与される。各投薬の間に、所定の時間が経過した後で、追加用量を患者に投与してもよい。
【００２０】
付加的な実施形態において、本発明は、デング感染に対する免疫応答を誘導し、それによってデング感染の可能性を低減させる方法であって：
（ａ）第一のデングワクチンおよび第二のデングワクチンを混合することでデングウイルスワクチン組成物を形成させるステップであって、
第一のデングワクチンが、デング血清型１〜４の弱毒化生ウイルス（ＬＡＶ）もしくはデング血清型１〜４に対する免疫原性がある弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）またはそれらの組み合わせを含む四価の弱毒化生デングワクチンであり；少なくとも１のＬＡＶまたはＬＡＣＶが、Δ３０ＬＡＶまたはΔ３０ＬＡＣＶであり；
第二のデングワクチンが、四価の組換えデングサブユニットワクチンまたは四価の不活化デングワクチンであり；および四価の組換えデングサブユニットワクチンが、デング血清型１〜４のデングエンベロープ（Ｅ）タンパク質またはその断片を含む、ステップ；
（ｂ）混合後のステップ（ａ）のデングウイルスワクチン組成物をデングに対する免疫応答を誘導させる対象の患者に投与し、それによってデング感染の可能性を低減させるステップを含む、前記方法に関する。本発明の方法のいくつかの実施形態において、免疫応答は、デング感染を予防する、またはその症候を予防するもしくは寛解させる。本発明の付加的な実施形態において、所定の時間が経過した後に、第二の用量の組成物が患者に投与される。第二の用量の組成物のうちの第一のデングワクチンおよび第二のデングワクチンは、単一のバイアル中に製剤化することができ、または２つの別のバイアル中に製剤化して患者への投与前に合わせて混合することもできる。
【００２１】
本発明はまた、デング感染に関連した疾患、例えばデング熱、ＤＳＳまたはＤＨＦなどの処置または予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）のための、本発明のデングウイルスワクチン組成物の使用に関する。
【００２２】
明細書全体および添付の特許請求の範囲において用いられるように、単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が明確に他を規定しないかぎり、複数形の言及を包含する。
【００２３】
「または（ｏｒ）」への言及は、その内容が、指し示されたあり得るもののうちの１を明確に規定しないかぎり、いずれかまたは両方のあり得るものを指し示す。いくつかの場合において、「および／または」は、いずれかまたは両方のあり得るものを強調するために使用された。
【００２４】
明細書および添付の特許請求の範囲の全体で用いられるように、次の定義および略語が適用される：
用語「弱毒化生ウイルス」は、本明細書中で「ＬＡＶ」とも呼ばれ、生きた弱毒化されたデングウイルスを意味するものであり、このウイルスの疾患を引き起こす能力は野生型デングウイルスと比較して低減されている。
【００２５】
用語「弱毒化生キメラウイルス」（あるいは「弱毒化生キメラフラビウイルス」）または「ＬＡＣＶ」は、そのウイルスゲノムが第一のフラビウイルスの骨格（Ｃ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５遺伝子を包含するもの）ならびに第二のフラビウイルスのプレメンブレン（ｐｒＭ）およびエンベロープ（Ｅ）遺伝子を含む生きた弱毒化されたキメラウイルスをいい、ここで第二のフラビウイルスはＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３またはＤＥＮＶ４から選択される。第一のフラビウイルスは、異なるデング血清型であることができ、または別のフラビウイルス、例えば黄熱病ウイルスなどであることもできる。
【００２６】
用語「Δ３０  ＬＡＶ」は、生きた弱毒化されたＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４ウイルスであって、ウイルスの複製能力を低減させるヌクレオチド（ｎｔ）１４３辺りからｎｔ１７２辺りまでの３’非翻訳（ＵＴＲ）領域のＴＬ２ステムループ構造に相当する約３０ｎｔの欠失を含有するウイルスゲノムを含む、前記ウイルスをいう（ＷＯ０３／０９２５９２を参照されたい）。
【００２７】
用語「Δ３０  ＬＡＣＶ」は、ＤＥＮＶ１〜４からの生きた弱毒化されたキメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）であって、ウイルスの複製能力を低減させるｎｔ１４３辺りからｎｔ１７２辺りまでの３’ＵＴＲ領域のＴＬ２ステムループ構造に相当する約３０ｎｔの欠失を含有するウイルスゲノムを含む、前記ウイルスをいう（ＷＯ０３／０９２５９２を参照されたい）。
【００２８】
用語「Δ３０／Δ３１  ＬＡＶ」は、生きた弱毒化されたＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４ウイルスであって、そのウイルスゲノムが３’ＵＴＲのＴＬ２ステムループ構造の約３０ｎｔの欠失を含み、ならびにデング３’ＵＴＲのＴＬ−３相同構造の５’境界まで欠失が伸びるようにＴＬ−３相同構造までのおよびこれを包含する配列を除去する３’ＵＴＲの約３１ｎｔの別の非隣接の上流欠失をさらに含む、前記ウイルスをいう。Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、米国特許第８，３３７，８６０号を参照されたい。本発明の好ましい実施形態において、ＤＥＮ３  ＬＡＶはΔ３０／Δ３１変異を含む。
【００２９】
用語「Δ３０／Δ３１  ＬＡＣＶ」とは、上記の生きた弱毒化されたキメラＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４ウイルスであって、そのキメラウイルスのウイルスゲノムが３’ＵＴＲのＴＬ２ステムループ構造の３０ｎｔの欠失を含み、ならびに上記のＴＬ−３構造を欠失させる３’ＵＴＲの別の非隣接の上流３１ｎｔ欠失をさらに含む、前記ウイルスをいう。
【００３０】
用語「ＬＡＴＶ」または「四価の弱毒化生ウイルス」または「ＬＡＴＶワクチン」とは、有効量のＤＥＮ１  ＬＡＶまたはＬＡＣＶ、ＤＥＮ２  ＬＡＶまたはＬＡＣＶ、ＤＥＮ３  ＬＡＶまたはＬＡＣＶおよびＤＥＮ４  ＬＡＶまたはＬＡＣＶを含むワクチンであって、デングＬＡＶまたはＬＡＣＶのうちの少なくとも１が、上におよびＷＯ０３／０９２５９２中に記載されているように３’ＵＴＲ中のＴＬ−２構造のΔ３０変異を含む、前記ワクチンをいう。いくつかの好ましい実施形態において、ＬＡＴＶは次の特徴を含む：（１）ｒＤＥＮ１Δ３０、これは、ＤＥＮＶ１ウイルスゲノムが３’ＵＴＲ中のＴＬ２ステムループ構造に相当する３０ｎｔ欠失を含むＤＥＮＶ１  ＬＡＶである；（２）ｒＤＥＮ２／４Δ３０、これは、ＤＥＮＶ４骨格上にＤＥＮＶ２  ｐｒＭおよびＥ遺伝子を含むＤＥＮＶ２  ＬＡＣＶであり、ここでＤＥＮ４骨格は３’ＵＴＲ中のＴＬ２ステムループ構造に相当する３０ｎｔ欠失を含む；（３）ｒＤＥＮ３Δ３０／Δ３１、これは、ＤＥＮＶ３ウイルスゲノムが３’ＵＴＲ中のＴＬ２ステムループ構造に相当する３０ｎｔ欠失および３’ＵＴＲのＴＬ−３構造に相当する別の非隣接の上流３１ｎｔ欠失を含むＤＥＮＶ３  ＬＡＶである；ならびに（４）ｒＤＥＮ４Δ３０、これは、ＤＥＮＶ４ウイルスゲノムが３’ＵＴＲ中のＴＬ２ステムループ構造に相当する３０ｎｔ欠失を含むＤＥＮＶ４  ＬＡＶである（図１を参照されたい）。
【００３１】
「非複製ワクチン」とは、組換えサブユニットワクチン、不活化ワクチン、コンジュゲートワクチンまたはＤＮＡワクチンから選択される、デングウイルス感染またはその臨床症候の予防または処置のためのデングウイルスワクチンをいう。
【００３２】
「不活化ワクチン」とは、有効量の死滅したまたは不活性な全粒子デングウイルスおよび薬学的に許容される担体を含むワクチンであって、ウイルスが化学物質、熱または放射線照射といった任意の手段により不活化されている前記ワクチンをいう。不活化ワクチンの不活化の後の残存感染力は低く、例として不活化後は＜５プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬである。好ましい実施形態において、不活化の後の残存感染力は非常に低く、例として≦４ＰＦＵ／ｍＬ、≦３ＰＦＵ／ｍＬまたは≦２ＰＦＵ’ｓ／ｍＬ、＜１ＰＦＵ／ｍＬ、≦０．５ＰＦＵ／ｍＬまたは≦０．１ＰＦＵ／ｍＬである。各別のワクチンのＰＦＵは、例えば、プラークアッセイ、免疫染色アッセイまたはウイルス感染力を検出することが当該技術分野で知られている他の方法を用いることにより決定され得る。
【００３３】
「コンジュゲートワクチン」とは、キャリアタンパク質に共有結合したデング抗原を含むワクチンをいう。
【００３４】
「ＤＮＡワクチン」は、デングタンパク質、デングタンパク質断片およびデング融合タンパク質ならびにそれらのバリアントといったデングタンパク質抗原をコードするヌクレオチドの配列を含むワクチンである。ＤＮＡワクチンは、プロモーターと作動可能に連結された目的抗原をコードするヌクレオチドの配列を含むプラスミド（例としてＤＮＡまたはウイルスのプラスミド）を含む。
【００３５】
「サブユニットワクチン」とは、完全なデングウイルスではないが１または複数のデング抗原成分、例えばデング免疫原性エピトープ、デングタンパク質、異なるデング血清型抗原の融合体といったデング抗原融合タンパク質またはデングタンパク質断片などを包含するワクチンをいう。本明細書中で用いられるサブユニットワクチンは、一価（単一のデング抗原を含むもの）であることができ、または多価（１より多い抗原成分を含むもの）であることもできる。好ましい実施形態において、サブユニットワクチンは四価である。
【００３６】
用語「共製剤プライム−ブースト」とは、上記のように、（１）その必要がある患者に、（ａ）少なくとも１の弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）であって、ＬＡＶまたはＬＡＣＶがウイルスゲノムの３’非翻訳領域中にΔ３０変異を含み、ならびにＬＡＣＶのウイルスゲノムが単一のデングウイルス血清型のｐｒＭおよびＥ遺伝子ならびに異なるフラビウイルスのＣおよび非構造遺伝子を含む前記ウイルス、（ｂ）非複製デングワクチンならびに（ｃ）薬学的に許容される担体を含むデングウイルスワクチン組成物を投与すること；（２）所定の時間の経過を待つこと；ならびに（３）前記患者に第二のデングウイルスワクチン組成物を投与することを含む治療計画をいう。いくつかの実施形態において、非複製デングワクチンは、サブユニットワクチンまたは不活化ワクチンである。第二のデングウイルスワクチン組成物は、本発明による弱毒化生デングワクチンおよび非複製デングワクチンを含むかぎり、第一のデングウイルスワクチン組成物と同じものであることも異なるものであることもできる。本発明の組成物中で用いられるデングウイルスワクチンは、ヒト患者において同族のデングウイルスへのウイルス中和抗体応答を誘導するのに有用である。
【００３７】
用語「処置」とは、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的手段の両方をいう。処置「の必要がある」個体または患者は、何らかの臨床症候が顕在化しているか否かにかかわらず既にデングに感染したもの、同様にデングに感染するリスクがあるものを包含する。本発明のデングワクチン組成物または共製剤での患者の処置は、次のもののうちの１または複数を包含する：患者においてデングに対する免疫応答を誘導する／向上させること、１または複数のデングウイルスに対するウイルス中和抗体応答を誘導すること、デングに感染している患者におけるデングの臨床症状の可能性を予防する、寛解させる、抑止するまたは低減させること、デング熱、ＤＨＦもしくはＤＳＳおよび／またはデング感染に関連した他の疾患もしくは合併症を発症する可能性を予防するまたは低減させること、デング感染および／またはデングに関連した他の疾患もしくは合併症の臨床症候の重症度または持続性を低減させること、ならびにデング感染の可能性を予防するまたは低減させること。
【００３８】
用語「薬学的有効量」または「有効量」は、所望の効果を生み出すために十分なワクチン組成物が患者に導入されることを意味し、この効果としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：患者においてデングに対する免疫応答を誘導する／向上させること、患者においてデングに対するウイルス中和抗体応答を誘導する／向上させること、デング感染の可能性を予防するもしくは低減させること、デング再発性感染の可能性を予防するもしくは低減させること、デングに感染している患者におけるデング感染の臨床症状を予防する、寛解させるもしくは抑止すること、デング熱、ＤＨＦおよび／もしくはＤＳＳを予防すること、またはデングに関連した疾患の重症度もしくは持続性を低減させること。当業者は、このレベルが変動し得ることを認識する。
【００３９】
用語「免疫応答」とは、細胞介在性（Ｔ細胞）免疫応答および／または抗体（Ｂ細胞）応答をいう。
【００４０】
用語「患者」とは、本明細書中に記載されているデングワクチン組成物／共製剤を受けることになる、デングウイルス、例えばＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４などに感染する能力がある哺乳類をいい、免疫適格性および免疫不全性の両方の個体を包含する。好ましい実施形態において、患者はヒトである。本明細書中で定義されている「患者」は、自然感染もしくはワクチン接種を通じて既にデングに感染しているもの、またはその後に曝露され得るものを包含する。
【００４１】
「ＭＡＡ」は、Ｍｅｒｃｋアルミニウムアジュバントを意味する。ＭＡＡは、非晶質のアルミニウムヒドロキシホスフェイト硫酸塩アジュバントである。
【００４２】
「ＩＳＣＯＭ様アジュバント」は、その機能に寄与する独特な球状のかご様構造を持つ、特徴的なケージ様粒子を共に形成するサポニン、コレステロールおよびリン脂質から構成される免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）を含むアジュバントである（概説のため、Ｂａｒｒ  ａｎｄ  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７４：８−２５（１９９６）を参照されたい）。この用語は、抗原を使用して生産され、ＩＳＣＯＭ（商標）粒子内に抗原を含むＩＳＣＯＭ（商標）アジュバント、および抗原なしで生産される中空のＩＳＣＯＭ型アジュバントであるＩＳＣＯＭ（商標）マトリックスアジュバントの両方を包含する。本明細書中で提供される組成物および方法の好ましい実施形態において、ＩＳＣＯＭ型アジュバントは、ＩＳＣＯＭ（商標）マトリックス粒子アジュバント、例えば抗原なしで製造されるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）などである（ＩＳＣＯＭ（商標）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）はＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，オーストラリアの登録商標である）。
【００４３】
名称「ｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５」とは、そのウイルスゲノムが（１）３’ＵＴＲのＴＬ２ステムループ構造の３０ｎｔ欠失および（２）Ｖｅｒｏ細胞における増殖にウイルスが適応した後に生じた１５４５位ヌクレオチドにおける置換を含む、組換えデング１ウイルスをいう。
【００４４】
名称「ｒＤＥＮ２／４  Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３」とは、そのウイルスゲノムが：（１）（ｉ）３’ＵＴＲのＴＬ２ステムループ構造の３０ｎｔ欠失ならびに（ｉｉ）Ｖｅｒｏ細胞における増殖にウイルスが適応した後に生じた１４９５位および７１６３位ヌクレオチドにおける置換を含むデング４の骨格（Ｃ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５遺伝子）ならびに（２）デング２のｐｒＭおよびＥ遺伝子を含む、組換えキメラデング２／４ウイルスをいう。
【００４５】
名称「ｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４」とは、そのウイルスゲノムが：（１）３’ＵＴＲのＴＬ２ステムループ構造の３０ｎｔ欠失、（２）ＴＬ−３構造を欠失させる、Δ３０変異の上流の３’ＵＴＲ中の別の３１ｎｔ欠失、および（３）Ｖｅｒｏ細胞における増殖にウイルスが適応した後に生じた７１６４位ヌクレオチドにおける置換を含む、組換えデング３ウイルスをいう。
【００４６】
名称「ｒＤＥＮ４Δ  ３０−７１３２，７１６３，８３０８」とは、そのウイルスゲノムが（１）３’ＵＴＲのＴＬ２ステムループ構造の３０ｎｔ欠失ならびに（２）Ｖｅｒｏ細胞における増殖にウイルスが適応した後に生じた７１３２位、７１６３位および８３０８位ヌクレオチドにおける置換を含む、組換えデング４ウイルスをいう。
【００４７】
「Ｖ１８０」とは、４つのデングウイルス血清型（ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４）の各々からのトランケート型のエンベロープ糖タンパク質（ＤＥＮ−８０Ｅ）から構成される四価のサブユニットワクチンをいい、ここでＥタンパク質は、宿主細胞内で組換え発現したときに前記Ｅタンパク質が増殖培地中に分泌可能であるように、各々がそのＮ末端におけるアミノ酸残基１から始まる野生型Ｅの長さの約８０％から構成される。Ｃｏｌｌｅｒら、ＷＯ２０１２／１５４２０２を参照されたい。
【００４８】
次の略語が本明細書中で用いられ、次の意味を持つ：Ｃはデングカプシド遺伝子であり、ＤＥＮ（あるいはＤＥＮＶ）はデングウイルスであり、ＤＦはデング熱であり、ＤＨＦはデング出血熱であり、ＤＳＳはデングショック症候群であり、ｈは時間であり、ＧＭＴは幾何平均力価であり、ＩＭは筋肉内であり、ＩＭＸはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ（商標）であり、ＪＥは日本脳炎であり、ＬＡＶは弱毒化生ウイルスであり、ＭＡＡはＭｅｒｃｋアルミニウムアジュバントであり、ＭＡＰＡはＭｅｒｃｋリン酸アルミニウムアジュバントであり、ＮＳ（ＮＳ１〜ＮＳ５において用いられる）は非構造性であり、ｎｔはヌクレオチドであり、ＰＦＵはプラーク形成単位であり、ｐｒＭはデングのプレメンブレン遺伝子であり、ＳＣは皮下であり、ＴＢＥはダニ媒介性脳炎であり、ＵＴＲは非翻訳領域であり、ＷＮ（あるいはＷＮＶ）はウエストナイルウイルスであり、ＹＦ（あるいはＹＦＶ）は黄熱病ウイルスであり、ｗｔは野生型である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、実施例１〜３において用いられるΔ３０  ＬＡＴＶ（Δ３０四価弱毒化生デングウイルスワクチン）の組成物の略図を提供する。
【図２】図２は、上におよび実施例１中に記載されているΔ３０  ＬＡＴＶにおけるデングウイルス１型（図の「ｒＤＥＮ１Δ３０」バー）、デングウイルス２型（「ｒＤＥＮ２／４Δ３０」バー）、デングウイルス３型（「ｒＤＥＮ３Δ３０」バー）およびデングウイルス４型（「ｒＤＥＮ４Δ３０」バー）のウイルス生存率に対する、指し示されたアジュバントおよびサブユニットデング抗原を混合することの効果を示す。ウイルス生存率（ＰＦＵ／ｍｌで表したウイルス力価として報告される）は、実施例２中に記載されているＶｅｒｏ細胞上でのインビトロプラークアッセイを用いて決定された。示されているのは、４℃で２４時間保存後の同混合物と比較した各試料についての最初の時点（０時間）の値である。
【図３】図３は、４週時（投薬１の４週間後、実施例３を参照されたい）においてアカゲザル中で誘導されたデング血清型中和抗体の力価（ＬｉＣｏｒ５０ＧＭＴ）を提供する。調査において用いられた免疫スケジュールおよび製剤は、表２中に示される。免疫力価は、実施例３中に記載されているＬｉＣｏｒベースのマイクロ中和アッセイを用いて決定された。
【図４】図４は、２０週時（投薬２の４週間後、実施例３を参照されたい）において、図３中にデータが提供されているのと同じアカゲザル中で誘導されたデング血清型中和抗体の力価（ＬｉＣｏｒ５０ＧＭＴ）を提供する。
【図５】図５は、実施例３中に記載されている全群についての、ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４に対する長期的な幾何平均中和力価を提供する。
【図６】図６は、４週時（投薬１の４週間後、実施例４を参照されたい）においてアカゲザル中で誘導されたデング血清型中和抗体の力価（ＬｉＣｏｒ５０ＧＭＴ）を提供する。調査において用いられた免疫スケジュールおよび製剤は、表３中に示される。免疫力価は、実施例３中に記載されているＬｉＣｏｒベースのマイクロ中和アッセイを用いて決定された。
【図７】図７は、２８週時（投薬２の４週間後、実施例４を参照されたい）において、図６中にデータが提供されているのと同じアカゲザル中で誘導されたデング血清型中和抗体の力価（ＬｉＣｏｒ５０ＧＭＴ）を提供する。
【図８】図８は、実施例４中に記載されている全群についての、ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４に対する長期的な幾何平均中和力価を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明は、薬学的有効量の（ａ）少なくとも１の弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１の弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含む弱毒化生デングワクチンであって、ＬＡＶおよびＬＡＣＶが、ウイルスの複製能力を低減させる３’非翻訳（ＵＴＲ）領域のＴＬ−２ステムループ構造に相当する約３０ヌクレオチドの欠失を含有するウイルスゲノムを含み、ＬＡＣＶのウイルスゲノムが単一のデング血清型のｐｒＭおよびＥタンパク質をコードするヌクレオチドの配列ならびに異なるフラビウイルスのＣおよび非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、前記ワクチン；ならびに（ｂ）非複製デングワクチンを含み、アジュバントをさらに含んでもよい、デングウイルスワクチン組成物に関する。ＬＡＶまたはＬＡＣＶおよび第二のワクチンは、同じバイアル中に製剤化され、または別のバイアル中に製剤化されて対象への投与の前に混ぜ合わされる。本発明の実施形態において、本発明による組成物は、プライム−ブースト処置計画において２回以上患者に投与される。
【００５１】
１の時点での弱毒化生ワクチンの投与、その２週間から２年後の非複製デングワクチンの投与を含む慣用的な異種プライム−ブースト投薬計画は、用いることができる代替的アプローチであるが、このアプローチは、どのワクチン（弱毒化生ワクチンまたは非複製ワクチン）を一続きの中で最初に投与すべきかに関して混乱の原因となり得る。弱毒化生ワクチンおよび非複製ワクチンの適切な順番での投与は重要であり、その理由は、逆の順番（最初にサブユニットまたは不活化ワクチン、続いて弱毒化生ワクチン）は、それらが自然に感染するようになった場合、その人がより重篤なデング病になるリスクを増加させ得る劣った免疫応答を導くことがあるためである。それゆえに、患者への弱毒化生ワクチンおよび非複製ワクチンの共投与は、完全な処置計画の投与を簡単にする。プライム−ブースト投薬計画において投与されるとき、（１）弱毒化生ワクチンおよび（２）非複製ワクチンの共製剤は、プライムにおいて生ワクチンにより、およびブーストにおいて非複製ワクチンにより主に駆動される強い免疫応答を誘発すると考えられる。
【００５２】
本発明より前には、弱毒化生ウイルスを含むデングワクチン組成物中にサブユニット抗原もしくは不活化ワクチンおよび／またはアジュバントが存在することは、ウイルス力価の減少をもたらす、弱毒化生ウイルスを不活性化する潜在能力があると考えられていた。Ｍｉｎｋｅら（Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９（２０１１）  ４６０８−４６１２およびＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．  １１１（２００６）  ４７−５７）およびＧｕｔｈｒｉｅら（Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７（２００９）  ４４３４−４４３８）は、カルボマーアジュバント中で製剤化された、ＷＮＶ由来のｐｒＭ／Ｅ遺伝子を発現する改変された組換え生カナリアポックスウイルスを報告した。しかしながら、このワクチン組成物は別のウイルスサブユニット抗原を含有していなかった。
【００５３】
プライム−ブースト戦略における異なるデングウイルスワクチンの使用が試験されている。Ｓｉｍｍｏｎｓら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９６  ２８０−２８８（２０１０）；米国特許第８，４４０，２０２号および米国特許第８，２４１６３８号）は、動物を不活化ワクチンまたはＤＮＡベースのワクチンのいずれかの形態の非複製ワクチンでプライムし、その後に四価の弱毒化生ワクチンでブーストすることにより、アカゲザルにおいてデングのプライムブーストアプローチを試験した。Ｋａｎａｋａｔｔｅら（ＷＯ２００８１２７３０７）もまた、ＤＮＡ発現系、アデノウイルス発現ベクターまたはベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン系を含むプライミング免疫原および四価の弱毒化生ワクチンを含むブースティング免疫原を使用した、デングに対する異種のプライムブースト投薬計画を記載している。この方法において、ブースティング免疫原は、プライミング免疫原の投与の２週間から２か月の間に投与される。
【００５４】
Ｇｕｙら（ＷＯ２００８／０４７０２３）は、患者においてＤＥＮ１〜４からの保護を誘導する方法であって、（ａ）第一の投与シリーズの（ｉ）第一の血清型のワクチンデングウイルスの用量および第二の血清型のワクチンデングウイルスの用量ならびに（ｉｉ）第三の血清型のワクチンデングウイルスの用量および第四の血清型のワクチンデングウイルスの用量、ならびに（ｂ）第二の投与シリーズの用量（ｉ）および（ｉｉ）を投与することを含み、ここで用量（ｉ）および（ｉｉ）は別の解剖学的部位に同時に投与され、第二のシリーズは第一のシリーズの少なくとも３０日後から最大で１２ヶ月後に実行される、前記方法を報告している。それゆえに、デングに対するプライム／ブーストアプローチの先の報告は、ブースティング免疫原としてのＬＡＶの使用に集中しており、プライミング組成物の投与とＬＡＶの投与との間に数週間から数ヶ月の時間が経過することを必要とする。
【００５５】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明の組成物（共製剤）（Δ３０  ＬＡＴＶ＋Ｖ１８０）が免疫されたアカゲザルにおいて投薬１の４週後に測定された幾何平均中和力価は、Δ３０  ＬＡＴＶワクチンが単独で与えられたときに誘導されたものに匹敵することを、本明細書中に示した（実施例３を参照されたい）。これは、Δ３０  ＬＡＴＶワクチンとＶ１８０サブユニットワクチンおよびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）アジュバントとの共製剤は第一の用量の弱毒化生ウイルスワクチンへの応答に負の影響を与えないことを指し示している。
【００５６】
慣用的なプライムブースト（Δ３０  ＬＡＴＶプライム、その後にＶ１８０ブースト）および共製剤プライムブーストアプローチ（Δ３０  ＬＡＴＶ＋Ｖ１８０共製剤プライム、その後にΔ３０  ＬＡＴＶ＋Ｖ１８０共製剤ブースト）の両方とも、Δ３０  ＬＡＴＶワクチン単独と比較して、４つ全てのＤＥＮＶ型への優れた中和力価を誘導することが本明細書中にさらに示された。ブースター用量の４週後の共製剤群における中和応答は、慣用的なプライム−ブースト投薬計画を受けた群において誘導されたものよりも、良くはないにしても同等であった。これは、Δ３０  ＬＡＴＶワクチンとＶ１８０サブユニットワクチンおよびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）アジュバントとの共製剤はサブユニットブーストへの応答に負の影響を与えないことを指し示している。
【００５７】
それゆえに、異種のプライム／ブーストアプローチの利点は、
（ａ）その必要がある患者に（１）ウイルスゲノムを含む少なくとも１のＬＡＶまたはＬＡＣＶを含む弱毒化生デングワクチンであって、ウイルスゲノムが３’ＵＴＲ中のＴＬ−２ステムループ構造に相当する約３０ヌクレオチドの欠失を含む、前記ワクチンおよび（２）非複製デングワクチンを含む第一のデングワクチン組成物を投与すること；（ｂ）所定の時間を経過させること；ならびに（３）第二のデングウイルスワクチン組成物を前記患者に投与することを通じて達成され得る。本発明のいくつかの実施形態において、非複製ワクチンは、サブユニットデングワクチンおよび不活化デングワクチンから選択される。この実施形態において、本発明のデングワクチン組成物は、プライミング組成物およびブースティング組成物の両方として患者に投与される。本発明の実施形態において、第一のデングワクチン組成物および第二のデングワクチン組成物は、同じものである。代替的実施形態において、第一のデングワクチン組成物および第二のデングワクチン組成物は、異なるものである。
【００５８】
したがって、本発明は、デング感染の可能性を予防するもしくは低減させる、またはその臨床症状を予防する、処置するもしくは寛解させる方法であって：
（ａ）第一のデングウイルスワクチン組成物をその必要がある患者に投与すること、
（ｂ）ステップ（ａ）の後に所定の時間の経過を待つこと；および
（ｃ）前記患者に第二のデングウイルスワクチン組成物を投与すること
を含み、第一および第二のデングウイルスワクチン組成物が：
（ｉ）少なくとも１の弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含む弱毒化生デングワクチンであって、ＬＡＣＶが単一のデングウイルス血清型のｐｒＭおよびＥ遺伝子ならびに異なるフラビウイルスの骨格を含み、ならびにＬＡＶまたはＬＡＣＶが３’ＵＴＲ中のＴＬ−２ステムループ構造の３０ヌクレオチド欠失を含むウイルスゲノムを含む、前記ウイルス；ならびに
（ｉｉ）非複製デングワクチン
を含む、前記方法に関する。
【００５９】
上記方法のいくつかの実施形態において、非複製ワクチンは、デングサブユニットワクチンまたは不活化デングワクチンである。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態において、弱毒化生ワクチンおよび非複製デングワクチンは四価である（すなわちＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４成分を含む、またはＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４に対する免疫応答を誘導する）。
【００６１】
共製剤プライム−ブースト法のいくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）の第二のデングウイルスワクチン組成物は、ステップ（ａ）の第一のデングウイルスワクチン組成物と同じものである。代替的実施形態において、ステップ（ｃ）の組成物は、ステップ（ａ）の組成物と同じものではない。付加的な実施形態において、方法は、ステップ（ｂ）および（ｃ）を１または複数回繰り返すことを含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）および／またはステップ（ｃ）の第一のワクチンおよび第二のデングワクチンは、別のバイアル中に製剤化されて投与の前に混ぜ合わされる。プライム／ブースト投薬計画における本発明の組成物の使用は、プライム（第一の用量）において弱毒化生ワクチンにより、およびブースト（第二の用量）において非複製（例としてサブユニットまたは不活化ワクチン）により主に駆動される強い免疫応答を誘発すると考えられる。
【００６２】
したがって、本発明は、有効量の弱毒化生デングワクチンおよび非複製デングワクチンならびに薬学的に許容される担体を含むデングウイルスワクチン組成物であって、弱毒化生デングワクチンが少なくとも１の弱毒化生デングウイルス（ＬＡＶ）または少なくとも１の弱毒化生キメラフラビウイルス（ＬＡＣＶ）を含み、ＬＡＶまたはＬＡＣＶが３’ＵＴＲ中のＴＬ−２ステムループ構造の３０ヌクレオチド欠失を含むウイルスゲノムを含む、前記組成物に関する。本発明のいくつかの実施形態において、本発明のデングウイルスワクチン組成物の非複製デングワクチンは、組換えデングサブユニットワクチンまたは不活化デングワクチンから選択される。
【００６３】
本発明の医薬的または滅菌されたデングウイルスワクチン組成物を調製するため、本明細書中に記載されている弱毒化生デングワクチンおよび非複製デングワクチンは、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合される。あるいは、弱毒化生デングワクチンおよび非複製デングワクチンは、混合より前に薬学的に許容される担体を含んでおり、ワクチンを混合するときに追加の担体は必要とされない。例として、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＵ．Ｓ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）を参照されたい。薬学的に許容される担体としては、生理学的に適合性であるあらゆる全ての溶媒、分散媒、等張性剤および吸収遅延剤等が挙げられる。担体は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、直腸投与、脊髄投与または上皮投与（例として、注射または点滴によるもの）に適したものであることができる。
【００６４】
本明細書中で用いられる用語「薬学的に許容される担体」とは、本発明の活性成分（例として全粒子不活化ウイルス、弱毒化生ウイルス、弱毒化生キメラウイルス、ウイルスタンパク質、デング抗原タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含むプラスミドまたはデング抗原コンジュゲート）と混合される、ヒトへの投与に適している上記の物質をいう。本発明の実施形態において、薬学的に許容される担体は、それが天然に存在しないまたは物質の純度および／もしくは滅菌度が対応する天然の物質と同じではないため、同じ形態で天然に生じず、例としてこの物質は人造である。例えば、滅菌され、細胞を含まず、溶質を含まない蒸留水調製物である注射用滅菌水は、天然で生じず、薬学的に許容される担体と考えられる。いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、本明細書中に開示されている１または複数の活性成分（例として四価のＬＡＶ）および注射用滅菌水を含む。さらなる実施形態において、薬学的に許容される担体は、精製水、注射用水、滅菌精製水および注射用静菌水といった、医薬的または生物学的調製物のために適切であって天然に生じる水と同じではない別の形態の水であり得る。
【００６５】
医薬組成物は、典型的に、滅菌されていて、製造および保存条件下で安定であるべきである。治療薬および診断薬の製剤は、例として凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、懸濁物、マイクロエマルション、分散物、リポソームまたはワクチン製剤および投与に適した他の規則的構造の形態である、許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより調製され得る（例として、Ｈａｒｄｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９３）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）。
【００６６】
本発明のデングウイルスワクチン共製剤は、付加的な成分をさらに含み得るものであり、これらの成分としては、限定されるものではないが、上に論じられているアジュバント、バッファー、安定剤、可溶化剤、塩、抗微生物保存剤、界面活性剤、浸透圧調整剤、キレート剤、デキストラン、デキストラン硫酸、デキストランＴ４０、ジエタノールアミン、グアニジン、塩化カルシウム、クエン酸ナトリウム、アルブミン、ゼラチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、脂質およびヘパリンが挙げられる。当業者は、どの付加的賦形剤が所望のデングウイルスワクチン組成物または共製剤中に包含されるべきかを、製剤におけるその機能、同様に計画されている投与様式、投薬量、ならびに例えば組成物の予想される保存期間および温度などの他の因子に応じて決定することが可能である。当業者は、付加的賦形剤の量は変動し得るものであることを認識し、ヒトへの投与のために安全であり、かつ所望の機能のために有効でもある適量を容易に決定することができる。
【００６７】
弱毒化生デングウイルスワクチン
上で述べたように、本発明のデングウイルスワクチン組成物は、デングウイルス１型（ＤＥＮ１）、デングウイルス２型（ＤＥＮ２）、デングウイルス３型（ＤＥＮ３）およびデングウイルス４型（ＤＥＮ４）よりなる群から選択される少なくとも１のＬＡＶ、またはＬＡＣＶを含む弱毒化生デングワクチンを含み、ここでＬＡＶまたはＬＡＣＶは３’ＵＴＲ中のＴＬ−２  Δ３０改変を含むウイルスゲノムを含み、ＬＡＶまたはＬＡＣＶはデングに対する免疫応答を誘導する、デングに対するウイルス中和抗体応答を誘導する、感染の可能性から保護するもしくはこれを低減させる、またはその臨床症状の重症度もしくは持続性を低減させる。本発明の実施形態において、弱毒化生デングワクチンは、一価、二価、三価または四価である、すなわちＤＥＮ血清型１〜４のうちそれぞれ１、２、３または４つに対する免疫応答を誘導するまたはこれらから保護する。本発明の好ましい実施形態において、弱毒化生デングワクチンは四価である、すなわちＤＥＮ血清型１〜４に対する免疫応答を誘導するまたはこれらから保護するものであって、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４成分を含み、ここで各成分はＬＡＶまたはＬＡＣＶのいずれかである。
【００６８】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のＬＡＴＶの各ＬＡＶまたはＬＡＣＶ成分は、独立してウイルスゲノムの３’ＵＴＲ中のＴＬ−２  Δ３０改変を含む弱毒化キメラフラビウイルスまたは弱毒化デングウイルスのいずれかである、弱毒化生ウイルスを含む。デングウイルスの弱毒化は、ＴＬ−２  Δ３０改変を通じて達成される。しかしながら、付加的な弱毒化変異もまたワクチンの１または複数の成分中に包含され得るものであり、これらの変異としては、限定されるものではないが、１４９５位、１５４５位、７１３２位、７１６３位、７１６４位および８３０８位における変異が挙げられる。弱毒化変異は、当該技術分野で公知である方法を包含する異なる技術により、例えば組織培養の連続継代を通じて、またはより定義付けされている遺伝子操作などを通じて、達成することができる。デングウイルスおよびキメラデングウイルスを弱毒化するのに有用な変異は、当該技術分野で公知である。例としてＷＯ０２／０９５０７５、ＷＯ２００６／４４８５７、米国特許第７，１８９，４０３号、米国特許第８，３３７，８６０号、ＷＯ２００３／１０３５７１、ＷＯ２０００／０１４２４５およびＷＯ２００８／０２２１９６を参照されたい。公知の弱毒化デング株もまた本明細書中の組成物において用いることができ、これらは例えばＷＯ０６／１３４４３３、ＷＯ２００６／１３４４４３、ＷＯ２００７／１４１２５９、ＷＯ９６／４０９３３、ＷＯ２０００／０５７９０７、ＷＯ２０００／０５７９０８、ＷＯ２０００／０５７９０９、ＷＯ２０００／０５７９１０およびＷＯ２００７／０１５７８３中に記載されている株などである。
【００６９】
本発明の組成物の好ましい実施形態は、四価の弱毒化生デングワクチン（ＬＡＴＶ）を含む。かかる四価弱毒化生ワクチンは、４つの弱毒化デングウイルス（ＬＡＶ）、３つのＬＡＶおよび１つの弱毒化キメラフラビウイルス株（ＬＡＣＶ）、２つのデングＬＡＶおよび２つのＬＡＣＶ、１つのデングＬＡＶおよび３つのＬＡＣＶ、または４つのＬＡＣＶを含むことができる。
【００７０】
好ましい実施形態において、ＬＡＴＶは次の特徴を含む：（１）ｒＤＥＮ１Δ３０、これは、ＤＥＮＶ１ウイルスゲノムが３’ＵＴＲ中のＴＬ２ステムループ構造に相当する３０ｎｔ欠失を含むＤＥＮＶ１  ＬＡＶである；（２）ｒＤＥＮ２／４Δ３０、これは、ＤＥＮＶ４骨格上にＤＥＮＶ２  ｐｒＭおよびＥ遺伝子を含むＤＥＮＶ２  ＬＡＣＶであり、ここでＤＥＮ４骨格は３’ＵＴＲ中のＴＬ２ステムループ構造に相当する３０ｎｔ欠失を含む；（３）ｒＤＥＮ３Δ３０／Δ３１、これは、ＤＥＮＶ３ウイルスゲノムが３’ＵＴＲ中のＴＬ２ステムループ構造に相当する３０ｎｔ欠失および３’ＵＴＲのＴＬ−３構造に相当する別の非隣接の上流３１ｎｔ欠失を含むＤＥＮＶ３  ＬＡＶである；ならびに（４）ｒＤＥＮ４Δ３０、これは、ＤＥＮＶ４ウイルスゲノムが３’ＵＴＲ中のＴＬ２ステムループ構造に相当する３０ｎｔ欠失を含むＤＥＮＶ４  ＬＡＶである。
【００７１】
キメラフラビウイルスを含む本発明の実施形態において、各キメラフラビウイルスは、単一のデングウイルス血清型のｐｒＭおよびＥタンパク質をコードするヌクレオチド配列ならびに異なるフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質（すなわち「骨格」）をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムを含み、ここで各々のキメラフラビウイルスは弱毒化されている。組換え弱毒化生フラビウイルス株を構築する方法は、ベースとしての公知の弱毒株の使用を含み得るものであり、この方法は、目的の関連ウイルスからの適切な遺伝子（ｐｒＭおよびＥ）でベースウイルスの等価の遺伝子を置換することを含む。例えば、このアプローチはＷＮＶのために用いられており、ここでキメラウイルスはＷＮＶのｐｒＭおよびＥ遺伝子を含む弱毒化ＤＥＮ−４株をベースとした内部型キメラである（Ｂｒａｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）  ７０：４１６２−４１６６；Ｃｈｅｎ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）  ６９：５１８６−５１９０；Ｂｒａｙ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｌａｉ，Ｃ．−Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）  ８８：１０３４２−１０３４６；Ｌａｉ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）  １０：１７３−１７９）。
【００７２】
別のアプローチは、組換えキメラワクチンを開発するためのベースとしてのＹＦ  １７Ｄ弱毒化黄熱病株の使用であり、これは以前にＪＥウイルス、ＤＥＮウイルスおよびＷＮウイルスのために用いられた。キメラの黄熱病ワクチンは、任意の黄熱病株、例えばＹＦＶ  １７ＤからのｐｒＭおよびＥタンパク質をコードする遺伝子を、デング血清型のそれで置き換えることにより黄熱病骨格を含んで構築することができる。ＤＮＡクローニングの後、ＲＮＡを転写し、Ｖｅｒｏ細胞内にトランスフェクトすることで、ＹＦＶ  １７Ｄ複製機構および関連デングウイルスの外被を有するキメラウイルスが得られる。Ｇｕｉｒａｋｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７４（１２）：５４７７−５４８５（２０００）；Ｇｕｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８：６３２−６４９（２０１０）；Ｍｏｎａｔｈ  Ｔ．Ｐ．  Ａｄｖ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ（２００３）  ６１：４６９−５０９；Ｍｏｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００６）  １０３：６６９４；およびＷＯ９８／３７９１１を参照されたい。それゆえに、本発明のいくつかの実施形態において、弱毒化生デングワクチンは、（１）単一のデング血清型のｐｒＭおよびＥタンパク質ならびに黄熱病骨格を含む少なくとも１のキメラフラビウイルス、ならびに（２）３’ＵＴＲのＴＬ−２ステムループ構造の３０ヌクレオチド欠失を含むウイルスゲノムを含む少なくとも１のＬＡＶまたはＬＡＣＶを含む。
【００７３】
本発明の組成物中で有用なキメラの弱毒化生フラビウイルスはまた、そのウイルスゲノムが単一のデングウイルス血清型のｐｒＭおよびＥ遺伝子ならびに異なるデングウイルス血清型のカプシドおよび非構造遺伝子を含むデングキメラウイルスを含み得る。キメラウイルスが第二のデング血清型からの骨格を含む実施形態において、デング骨格は、ＴＬ−２ステムループ構造に相当する３’ＵＴＲの約３０ヌクレオチドの欠失を含み、付加的な弱毒化変異を含んでもよい。任意の弱毒化デングウイルスまたは野生型デングウイルスを、弱毒化デング骨格または野生型デングウイルス骨格へのＴＬ−２ステムループ構造の３０ヌクレオチド欠失の導入によりキメラウイルスの骨格として用いることができる。デングウイルス骨格の弱毒化は、連続継代を通じて、定義付けされている遺伝子変異の導入を通じて、または公知の弱毒化デング株の使用を通じて達成することができる。デングキメラワクチンは、例えば、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．  ＷＯ０３／０９２５９２中に記載されている。本発明のいくつかの実施形態において、弱毒化生ワクチンは、カプシドおよび非構造タンパク質がｐｒＭおよびＥタンパク質と異なるデング血清型からのものである、キメラのフラビウイルスを含む。
【００７４】
本発明のデングウイルスワクチン組成物は、有効量の弱毒化生ウイルスワクチンを含む。本発明のいくつかの実施形態において、弱毒化生デングワクチンの効力は、１０から約１×１０７プラーク形成単位（ＰＦＵ）である。代替的実施形態において、弱毒化生デングワクチンの効力は、約１×１０２から約１×１０６ＰＦＵである。他の実施形態において、弱毒化生デングワクチンの効力は、約１×１０３から約１×１０５ＰＦＵである。
【００７５】
デングサブユニットワクチン
本発明のいくつかの実施形態において、組成物は、１または複数のデング抗原タンパク質を含む組換えデングサブユニットワクチンを含む。本発明のこの態様の好ましい実施形態において、組換えデングサブユニットワクチンは、１または複数のデングタンパク質、融合タンパク質またはその断片（１または複数）を含む。さらに好ましい実施形態において、組換えデングサブユニットワクチンは、デングのエンベロープつまりＥタンパク質またはその断片を含む。
【００７６】
さらに好ましい実施形態において、組換えデングサブユニットワクチンは四価である、すなわち４つ全てのデング血清型に対する免疫応答を標的としている。組換えデングサブユニットワクチンは、４つの組換えデングタンパク質または４つより少ないもの、例として組換えＤＥＮ１タンパク質、組換えＤＥＮ２タンパク質および組換えＤＥＮ３／４融合タンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態において、組換えデングサブユニットワクチンは、組換え発現系を用いて産生されて分泌されるＤＥＮ１〜４のデングウイルスエンベロープ糖タンパク質またはその断片（例としてＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０Ｅ、ＤＥＮ４−８０ＥまたはＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ）を含む。前記サブユニットワクチンは、アジュバントを含んでもよく、これはより十分に下に記載されている。
【００７７】
本発明のこの態様のいくつかの実施形態において、組換えデングサブユニットワクチンは、１または複数の精製されたデングウイルスエンベロープ（「Ｅ」）タンパク質、薬学的に許容される賦形剤を含み、ここでＥタンパク質は、宿主細胞内で組換え発現したときに前記Ｅタンパク質が増殖培地中に分泌可能であるように、各々がそのＮ末端におけるアミノ酸残基１から始まる野生型Ｅの長さの約８０％から構成され、およびここで組成物はヒト対象において中和抗体の産生を誘導する。本発明のいくつかの実施形態において、組換えデングサブユニットワクチンは、有効量のアジュバントをさらに含む。本発明のいくつかの実施形態において、ＤＥＮ−４  Ｅタンパク質は、ＵＳ６，７４９，８５７およびＷＯ２０１２／１５４２０２中に記載されているように、二量体（「ＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐ」）である。
【００７８】
本発明のこの態様のいくつかの実施形態において、上記の組成物中のＥタンパク質は、昆虫宿主細胞内で組換え生産され、発現する。さらに好ましい実施形態において、Ｅタンパク質は、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のＳｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２（Ｓ２）宿主細胞内で組換え生産され、発現する。
【００７９】
本発明の組換えデングウイルスＥタンパク質は、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＳｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２（Ｓ２）細胞を用いる細胞培養発現系を使って生産することができる。この系は、天然様の構造を維持した組換えデングエンベロープタンパク質を産生することが実証されている（Ｃｕｚｚｕｂｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）  ８：１１５０−５５；Ｍｏｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００３）  １００：６９８６−９１；Ｍｏｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００４）  ４２７：３１３−９；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２００４）  １２（９）：１６０７−１８）。この発現系はまた、他のフラビウイルス、例えばウエストナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびダニ媒介性脳炎ウイルスなどからの他の組換えエンベロープタンパク質を発現することが示されている。組換えデングエンベロープタンパク質は、Ｃ末端において、天然のエンベロープタンパク質の８０％を残してトランケートされ得る（「８０Ｅ」）。それゆえに、８０Ｅは、そのＮ末端のアミノ酸１において始まるＥタンパク質の連続したアミノ酸の最初の約８０％として定義される。
【００８０】
上で述べたように、本発明のこの態様のいくつかの実施形態は、そのＮ末端においてアミノ酸残基１から始まる野生型Ｅの長さの約８０％からなるトランケート型の８０Ｅタンパク質を含む。本発明のいくつかの実施形態において用いられるＥタンパク質は、そのタンパク質の膜アンカー部（Ｅのカルボキシ末端における最後の約１０％）を欠失している。言い換えれば、本発明の特定の実施形態において使用されるトランケート型の８０Ｅタンパク質は、そのＮ末端のアミノ酸１において始まるＥの連続したアミノ酸の最初の９０％までからなり、それゆえに細胞外の培地中に分泌されることが可能になり、回収が容易になる。トランケーションは、８０Ｅ部を膜アンカー部とつなぐＥタンパク質の「ステム」部をさらに欠失させ得るものであり；ステム部は注目すべき抗原性エピトープを含有しないがゆえに、好ましい抗原であるＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０Ｅ、ＤＥＮ４−８０ＥまたはＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐの中に包含されない。Ｅタンパク質の９０％超であるが１００％未満はクローニングされて分泌されることができる、すなわちこのタンパク質は９０％＋の長さのカルボキシトランケート型であることができ、トランケート型Ｅタンパク質が分泌可能であるかぎり、膜貫通ドメイン部分を包含することができる。「分泌可能」は、発現系中の形質転換細胞から分泌されることが可能であること、典型的には分泌されることを意味する。それゆえに、当業者は、本発明の組成物および方法において有用なデングＥタンパク質は、このタンパク質が分泌可能であるかぎり、本明細書中で例示される８０％から変動し得ることを認識する。本発明の各態様の好ましい実施形態において、ＤＥＮ  Ｅタンパク質は、エンベロープタンパク質のＮ末端アミノ酸から始まって３９３番目から４０１番目のアミノ酸の範囲内のアミノ酸において終わる約８０％の長さであり、例えばデングウイルス２型のアミノ酸１からアミノ酸３９５である。本発明の各態様の代替的実施形態において、デングＥタンパク質は、そのＮ末端のアミノ酸１において始まるＥの連続したアミノ酸の約７５％、約８５％、約９０％、約９５％または約９８％であり得る。本明細書中の発明の態様の例示的な実施形態において、ＤＥＮ  Ｅタンパク質は、そのＮ末端のアミノ酸１において始まるＥタンパク質の連続したアミノ酸の約８０％であり；例えば、配列番号１に規定のＤＥＮ１−８０Ｅ、配列番号２に規定のＤＥＮ２−８０Ｅ、配列番号３に規定のＤＥＮ３−８０Ｅおよび配列番号４に規定のＤＥＮ４−８０Ｅなどである。
【００８１】
分泌されるＥタンパク質は、組換えタンパク質の免疫原性がさらに増強されるように、例えばＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐタンパク質などの中の二量体化を促進するドメインをさらに含有し得る。例示的なＤＥＮ４−８０ＥＺｉｐタンパク質は、配列番号５に規定のアミノ酸配列を含む。本発明のこの態様のいくつかの実施形態において、組成物中に包含されるＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３の８０Ｅ抗原は単量体であり、ＤＥＮ４  ８０Ｅ抗原は二量体である。
【００８２】
本発明のこの態様の代替的実施形態において、組成物中のＤＥＮ１−８０Ｅ、ＤＥＮ２−８０Ｅ、ＤＥＮ３−８０ＥおよびＤＥＮ４−８０Ｅタンパク質は、単量体である。かかる実施形態において、ＤＥＮ４成分は、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３タンパク質の個々の量の約１．５倍から約３倍、好ましくはＤＥＮ１、ＤＥＮ２およびＤＥＮ３成分（タンパク質）の量の約２倍の量で存在する。本発明のこの態様の好ましい実施形態において、組成物中のＤＥＮ１：ＤＥＮ２：ＤＥＮ３：ＤＥＮ４抗原の比は、約１：１：１：２である。
【００８３】
デングＥタンパク質を含む本発明の実施形態において、組成物中の各Ｅタンパク質の量は、約０．５μｇから約５００μｇである。代替的実施形態において、各Ｅタンパク質の量は、約０．５μｇから約４５０μｇ、０．５μｇから約４００μｇ、０．５μｇから約３５０μｇ、０．５μｇから約３００μｇ、０．５μｇから約２５０μｇ、０．５μｇから約２００μｇ、０．５μｇから約１５０μｇ、０．５μｇから約１００μｇ、０．５μｇから約５０μｇ、５．０μｇから約５００μｇ、５．０μｇから約４５０μｇ、５．０μｇから約４００μｇ、５．０μｇから約３５０μｇ、５．０μｇから約３００μｇ、５．０μｇから約２５０μｇ、５．０μｇから約２００μｇ、５．０μｇから約１５０μｇ、５．０μｇから約１００μｇ、５．０μｇから約５０μｇ、１０μｇから約５００μｇ、１０μｇから約４５０μｇ、１０μｇから約４００μｇ、１０μｇから約３５０μｇ、１０μｇから約３００μｇ、１０μｇから約２５０μｇ、１０μｇから約２００μｇ、１０μｇから約１５０μｇ、１０μｇから約１００μｇ、１０μｇから約５０μｇ、２５μｇから約５００μｇ、２５μｇから約４５０μｇ、２５μｇから約４００μｇ、２５μｇから約３５０μｇ、２５μｇから約３００μｇ、２５μｇから約２５０μｇ、２５μｇから約２００μｇ、２５μｇから約１５０μｇ、２５μｇから約１００μｇまたは２５μｇから約５０μｇである。さらに好ましい実施形態において、組成物中の各Ｅタンパク質の量は、約１．０μｇから約１００μｇである。なおさらなる実施形態において、組成物中の各Ｅタンパク質の量は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００μｇから選択される。
【００８４】
不活化デングワクチン
本発明のデングワクチン共製剤におけるデングサブユニットワクチンの代わりに、全粒子の不活化デングワクチンまたは不活化デングキメラワクチンも用いられ得る。本明細書中の共製剤の不活化デングワクチンは、１もしくは複数の全粒子不活化デングウイルスおよび／または１もしくは複数の不活化デングキメラウイルスを含む。本発明のこの態様のいくつかの実施形態において、不活化デングワクチンは四価であって、全粒子の不活化ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４を含む。代替的実施形態において、不活化ワクチンは、４つの不活化キメラデングウイルスを含む。なお他の実施形態において、不活化ワクチンは四価であって、１または複数の全粒子の不活化デングウイルスおよび１または複数の不活化デングキメラウイルスを、例として不活化全粒子ＤＥＮ１ウイルス、不活化全粒子ＤＥＮ２ウイルス、不活化ＤＥＮ３キメラウイルスおよび不活化ＤＥＮ４キメラウイルスを含む。当業者は、ワクチン組成物が４つ全てのデング血清型を標的とするかぎり、不活化された全粒子またはキメラのＤＥＮウイルスの任意の組み合わせが本発明の四価の組成物および方法中で用いられ得ることを理解する。
【００８５】
本発明の組成物および方法において有用な不活化デングワクチンは、Ｐｕｔｎａｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３：４４４２−４４５２（２００５）、ＵＳ６１９０８５９、ＵＳ６２５４８７３およびＳｔｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ＷＯ２００７／００２４７０中に記載されている。あるいは、デングウイルス株およびキメラデング株／キメラフラビウイルス株は、当該技術分野で公知の方法、例として化学物質、加熱または放射線照射を通じて、本発明の組成物および方法における使用のために不活化することができる。
【００８６】
アジュバント
ワクチンと、目的抗原に対する免疫応答を増強することができるアジュバントとして知られる化合物との共投与は、広範に研究されている。目的抗原に対する免疫応答を増大させることに加えて、いくつかのアジュバントは、所望の免疫応答を誘発するために必要とされる抗原の量を減少させるために、または長い間持続する免疫応答を誘導して疾患からの保護を提供するための臨床治療計画において必要な注射の回数を減少させるために用いられ得る。
【００８７】
そのため、本発明のデングウイルスワクチン共製剤は、アジュバントを使う。本明細書中に記載されている共製剤のアジュバントは、上記の所望の機能を果たし、組成物のＬＡＶまたはＬＡＣＶの力価に著しい影響を与えない任意のアジュバントであることができる。
【００８８】
アルミニウム系化合物は、６０年以上前にアジュバント活性を有することが決定された（概説のため、Ｌｉｎｄｂｌａｄ，Ｅ．Ｂ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ８２：４９７−５０５（２００４）；Ｂａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：Ｓ１８−Ｓ２３（２００２）を参照されたい）。アルミニウムアジュバントは、適切な投与量で用いられるときは、安全であると一般に考えられている。多くのものが、世界中の規制当局によりヒトへの投与について承認されている。
【００８９】
したがって、アルミニウム系化合物、例えば水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）、アルミニウムヒドロキシホスフェイト（ＡｌＰＯ４）、非晶質アルミニウムヒドロキシホスフェイト硫酸塩（ＡＡＨＳ）またはいわゆる「アルム（ａｌｕｍ）」（ＫＡｌ（ＳＯ４）・１２Ｈ２Ｏ）（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｂｙ  Ａｌ  ＭＡＳ  ＮＭＲ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．  ８９（３）：３１１−２１（２０００）を参照されたい）は、本明細書中に提供される組成物と組み合わされ得る。本明細書中に提供される発明の例示的な実施形態において、アルミニウムアジュバントは、アルミニウムヒドロキシホスフェイトまたはＡＡＨＳであり、ＡＡＨＳはあるいは「ＭＡＡ」とも呼ばれる。代替的実施形態において、アルミニウムアジュバントはリン酸アルミニウムアジュバントであり、本明細書中で「ＭＡＰＡ」と呼ばれる。他の実施形態において、アジュバントは水酸化アルミニウムである。
【００９０】
当業者は、安全であり、かつ標的デングウイルスへの免疫応答を増大させることに有効でもあるアルミニウムアジュバントの最適投与量を決定することが可能である。アルミニウムの安全性プロファイル、同様にＦＤＡ認可ワクチン中に包含されるアルミニウムの量の議論のため、Ｂａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：Ｓ１８−Ｓ２３（２００２）を参照されたい。一般に、アルミニウムアジュバントの有効かつ安全な用量は、１用量あたり５０μｇから１．２５ｍｇのアルミニウム元素（１００μｇ／ｍＬから２．５ｍｇ／ｍＬの濃度）で変動する。
【００９１】
それゆえに、本発明の特定の実施形態は、本明細書中の任意の実施形態において記載されている弱毒化生デングウイルスワクチンおよび非複製ワクチンを含みアルミニウムアジュバントをさらに含む組成物を包含する。いくつかの実施形態において、非複製ワクチンは、組換えデングサブユニットワクチンまたは不活化デングワクチンから選択される。本発明の実施形態において、デング組成物は、ワクチンの１用量あたり約５０μｇから約１．２５ｍｇのアルミニウム元素を含むアジュバントを含む。他の実施形態において、ワクチン組成物の１用量あたりのアルミニウムアジュバントは、約１００μｇから約１．０ｍｇ、約１００μｇから約９００μｇ、約１００μｇから約８５０μｇ、約１００μｇから約８００μｇ、約１００μｇから約７００μｇ、約１００μｇから約６００μｇ、約１００μｇから約５００μｇ、約１００μｇから約４００μｇ、約１００μｇから約３００μｇ、約１００から約２５０μｇ、約２００μｇから約１．２５ｍｇ、約２００μｇから約１．０ｍｇ、約２００μｇから約９００μｇ、約２００μｇから約８５０μｇ、約２００μｇから約８００μｇ、約２００μｇから約７００μｇ、約２００μｇから約６００μｇ、約２００μｇから約５００μｇ、約２００μｇから約４００μｇ、約２００μｇから約３００μｇ、約３００μｇから約１．２５ｍｇ、約３００μｇから約１．０ｍｇ、約３００μｇから約９００μｇ、約３００μｇから約８５０μｇ、約３００μｇから約８００μｇ、約３００μｇから約７００μｇ、約３００μｇから約６００μｇ、約３００μｇから約５００μｇ、約３００μｇから約４００μｇ、約４００μｇから約１．２５ｍｇ、約４００μｇから約１．０ｍｇ、約４００μｇから約９００μｇ、約４００μｇから約８５０μｇ、約４００μｇから約８００μｇ、約４００μｇから約７００μｇ、約４００μｇから約６００μｇ、約４００μｇから約５００μｇ、約５００μｇから約１．２５ｍｇ、約５００μｇから約１．０ｍｇ、約５００μｇから約９００μｇ、約５００μｇから約８５０μｇ、約５００μｇから約８００μｇ、約５００μｇから約７００μｇ、約５００μｇから約６００μｇ、約６００μｇから約１．２５ｍｇ、約６００μｇから約１．０ｍｇ、約６００μｇから約９００μｇ、約６００μｇから約８５０μｇ、約６００μｇから約８００μｇまたは約６００μｇから約７００μｇの範囲の量のアルミニウム元素を含む。
【００９２】
本発明のデングウイルスワクチン組成物と一緒に用いられ得る他のアジュバントとしては、限定されるものではないが、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、またはリポ多糖、モノホスホリルリピドＡおよびアミノアルキルグルコサミニド４−リン酸といったｔｏｌｌ様受容体、例えばＴＬＲ４およびＴＬＲ９などに対して作用する他の分子を含有するアジュバントが挙げられる（概説のため、Ｄａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．  ９（１）：４５−５２（２００７）；Ｄｕｔｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２３９（１）：１７８−１９６（２０１１）；Ｈｅｄａｙａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３２（２）：２９４−３２５（２０１２）を参照されたい）。本発明の組成物中で有用な付加的なアジュバントとしては、免疫賦活性オリゴヌクレオチド（ＩＭＯ；例としてＵ．Ｓ．７，７１３，５３５およびＵ．Ｓ．７，４７０，６７４を参照されたい）；ヘルパーＴ細胞エピトープ、リピド−Ａおよびその誘導体またはバリアント、リポソーム、リン酸カルシウム、サイトカイン（例として顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、Ｆｌｔ−３Ｌ）、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＣＤ７０、ＩＬ−１２、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）９０、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７、ＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴ、非イオン性ブロックコポリマー、不完全フロイントアジュバント、ケモカイン、コレラ毒素；Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン；百日咳毒素；ムラミルジペプチド、ムラミルペプチドアナログ、ＭＦ５９、ＳＡＦ、免疫賦活複合体、生分解性マイクロスフェア、ポリホスファゼン；合成ポリヌクレオチドが挙げられる。
【００９３】
本明細書中に記載されている組成物と共に使用するための付加的なアジュバントは、サポニン（例としてＱＳ２１）を単独で、またはＩＳＣＯＭ（「免疫刺激複合体」、概説のため、Ｂａｒｒ  ａｎｄ  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７４：８−２５（１９９６）；およびＳｋｅｎｅ  ａｎｄ  Ｓｕｔｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４０：５３−５９（２００６）を参照されたい）の特徴的形態でコレステロールおよびリン脂質と組み合わせて含有するアジュバントである。かかるアジュバントは、本明細書中で「サポニン系アジュバント」と呼ばれる。本明細書中に提供される組成物および方法の特定の実施形態において、変異体毒素および／または毒素タンパク質は、ＩＳＣＯＭマトリックス粒子アジュバントであるＩＳＣＯＭ型アジュバントまたは「ＩＳＣＯＭ」、例えば抗原なしで製造されるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）などと組み合わされる（ＩＳＣＯＭ（商標）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）はＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａの登録商標である）。
【００９４】
使用方法
本発明の実施形態はまた、（ｉ）以下における使用のための、（ｉｉ）以下のための薬剤もしくは組成物としての使用のための、または（ｉｉｉ）以下のための薬剤の調製における使用のための、本明細書中に記載されているデングワクチン共製剤のうちの１または複数を包含する：（ａ）治療（例としてヒトの体の）；（ｂ）医薬；（ｃ）ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３および／もしくはＤＥＮ４を包含するデングウイルスの複製の阻害；（ｄ）ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３および／もしくはＤＥＮ４のうちの１もしくは複数に対する免疫応答もしくは予防的免疫応答の誘導；（ｅ）１もしくは複数の型のデングに対するウイルス中和抗体応答の誘導；（ｆ）デングウイルスによる感染の処置もしくは予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）；（ｇ）デングウイルス感染の再発の予防；（ｈ）デングウイルス感染に関連した病的症候の進行、発症もしくは重症度の低減、および／もしくはデングウイルス感染の可能性の低減、または（ｉ）限定されるものではないがデング熱、デング出血熱およびデングショック症候群といったデング関連疾患（１または複数）の処置、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）、もしくは発症、重症度もしくは進行の遅延。これらの使用において、デングワクチン組成物は、１または複数のアジュバント（例としてＭＡＡ、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、例えばＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）など、または他のアルミニウム塩アジュバント、サポニン系アジュバント、例えばＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（ＣＳＬ，Ｌｔｄ．）など、ＴＬＲアゴニストまたは脂質ナノ粒子であり、これらは本明細書中に記載されている）と組み合わせて使ってもよい。
【００９５】
したがって、本発明は、本発明の共製剤のうちの１または複数を処置の必要がある患者に投与することを含む、デングウイルス感染またはデング関連疾患の予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）および／または治療的な処置の方法を提供する。
【００９６】
「患者」（あるいは本明細書中で「対象」とも呼ばれる）とは、デングウイルス、例えばＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４などに感染する能力がある哺乳類をいう。好ましい実施形態において、患者はヒトである。患者は、予防的に（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａｌｌｙ）または治療的に処置されることができる。予防的処置（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、デング感染またはその作用、例えばデング熱などの可能性または重症度を低減させるために十分な防御免疫を提供する。治療的処置は、デング感染もしくはその臨床的作用の重症度を低減させるまたはこれらの再発を予防するために実施することができる。
【００９７】
予防的処置（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、本明細書中に記載されている本発明のデングウイルスワクチン組成物を用いて実施することができる。本発明の組成物は、一般集団に、またはデング感染のリスクが増加している人、例としてエデス（Ａｅｄｅｓ）属の蚊が蔓延している世界の地域に住んでいるまたは旅行する予定がある人に投与することができる。
【００９８】
「処置の必要がある」ものは、既にデング感染を有するもの（例としてＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４のうちの１または複数に感染したもの）、同様に感染しやすいもの、または感染の可能性の低減が望まれるあらゆる人を包含する。
【００９９】
本発明のデングウイルスワクチン組成物は、当該技術分野で周知の技術を用いて製剤化して患者に投与することができる。一般的な医薬投与のためのガイドラインは、例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｅｄｓ．  Ｐｌｏｔｋｉｎ  ａｎｄ  Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９９；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００；およびＭｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｓ．  Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｒｈｏｄｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０中に提供されている。
【０１００】
したがって、本発明は、患者に免疫学的有効量の本明細書中に記載されているデングウイルスワクチン組成物のうちのいずれかを投与するステップを含む、患者においてデング感染に対する防御免疫応答を誘導する方法を提供する。
【０１０１】
また本発明により提供されるのは、デング感染を処置するまたはデング感染に関連した任意の病態を処置する方法であり、かかる処置は、感染の予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）および臨床症候の重症度の低減、疾患の進行の遅延もしくは予防および／または感染もしくはその臨床症候の可能性の低減を包含し；この方法は、患者に免疫学的有効量の本明細書中に記載されているワクチン組成物のうちのいずれかを投与するステップを含む。
【０１０２】
本発明の付加的な実施形態は、プライム／ブースト投薬計画における、本発明の２以上の組成物の患者への投与を含む。したがって、本発明は、その必要がある患者においてデング感染を予防するまたはデング感染の可能性を低減させる方法であって：
（ａ）本発明の第一のデングウイルスワクチン組成物を患者に投与するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）の後に所定の時間の経過を待つステップ；
（ｃ）前記患者に本発明の第二のデングウイルスワクチン組成物を投与するステップ；ならびに
（ｄ）任意選択でステップ（ｂ）および（ｃ）を繰り返すステップ
を含み、これにより患者においてデング感染が予防されるまたはデングに感染する可能性が低減される、前記方法に関する。
【０１０３】
上の方法の実施形態において、本発明のデングウイルスワクチン組成物は、液体の形態である（すなわち弱毒化生デングワクチンおよび非複製デングワクチンは、同じバイアルまたは他の容器中で液体として一緒に製剤化される）。代替的実施形態において、デングウイルスワクチン組成物は凍結乾燥され（すなわち弱毒化生デングワクチンおよび非複製デングワクチンは一緒に製剤化されて同じバイアルまたは他の容器中で凍結乾燥され）、患者への投与の前に滅菌希釈剤で再構成される。付加的な実施形態において、弱毒化生デングワクチンおよび非複製デングワクチンは、別のバイアルまたは容器中に供給され、臨床医により患者に投与される前に混ぜ合わされる。かかる実施形態において、弱毒化生デングワクチンおよび非複製デングワクチンは、（１）両方が液体の形態である、（２）両方が凍結乾燥されている、または（３）１つのワクチンは液体の形態で、１つのワクチンは凍結乾燥されていることができる。１つのワクチンが液体の形態で１つのワクチンが凍結乾燥されているとき、凍結乾燥ワクチンを液体ワクチンで再構成して本発明のデングウイルスワクチン組成物を形成させることができ、または凍結乾燥ワクチンを滅菌希釈剤で再構成して、次いで液体ワクチンと混合することで本発明のデングウイルスワクチン組成物を形成させることができる。
【０１０４】
本発明のデングウイルスワクチン組成物の第一の用量および本発明のデングウイルスワクチン組成物の第二の用量、またはその後の任意の用量の間の時間は、約２週間から約２年間である。本発明の好ましい実施形態において、複数の投与の間で２ヶ月から１２ヶ月の時間を経過させることが可能である。本発明のこの態様の代替的実施形態において、ワクチン組成物の各用量の各投与の間の時間は、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月および２４ヶ月よりなる群から独立して選択される。
【０１０５】
本発明のいくつかの実施形態において、第一および第二のデングウイルスワクチン組成物は同じものである。代替的実施形態において、第一および第二のデングウイルスワクチン組成物は同じものではない。
【０１０６】
本発明のデングウイルスワクチン組成物は、異なる経路により投与することができる。本発明の好ましい実施形態において、本発明の組成物は、非経口的に、すなわち皮内、皮下または筋肉内の注射により投与される。皮下および筋肉内投与は、例えば針またはジェット式注射器を用いて実施することができる。
【０１０７】
本明細書中に記載されている組成物は、投与製剤に適合した様式で、デング感染を処置するおよび／またはデング感染の可能性を低減させるために免疫学的に有効であるような量で投与され得る。本発明との関連での患者に投与される用量は、時間とともに患者において有益な応答、例えばデングウイルスのレベルの低減などに影響を及ぼすために、またはデングによる感染の可能性を低減させるために十分であるべきである。投与されることになるデングウイルスワクチンの量は、その年齢、性別、体重および全身健康状態を含めて、処置されることになる対象次第であり得る。この点において、投与されることが必要となるワクチンの正確な量は、専門家の判断に委ねられる。デング感染に対する処置または予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）において投与されることになるワクチンの有効量を決定する際、医師は、循環血漿レベル、疾患の進行および抗デング抗体の生産を評価し得る。いずれにしても、本発明の免疫原性組成物の好適な投薬量は、当業者により容易に決定され得る。
【０１０８】
好適な投薬計画は、好ましくは、患者の年齢、体重、性別および医学的状態；投与の経路；所望の効果；使われる具体的な組成物といった当該技術分野で周知の因子を考慮に入れて決定される。投薬のタイミングは当該技術分野で周知の因子に応じ、２週間から２４ヶ月の範囲にわたることができる。最初の投与の後、抗体力価を維持および／またはブーストするため、１または複数の付加的な用量が投与され得る。
【０１０９】
本発明はまた、デング感染を予防する、またはその症候を予防するもしくは寛解させる方法であって：（ａ）弱毒化生デングワクチンおよび非複製デングワクチンを混合することでデングウイルスワクチン組成物を形成させるステップであって、第一のワクチンが少なくとも１のデングＬＡＶまたはＬＡＣＶを含み、ＬＡＶまたはＬＡＣＶが３’ＵＴＲのＴＬ−２ステムループ構造に相当する約３０ヌクレオチドの欠失を含む、前記ステップ；ならびに（ｂ）ステップ（ａ）のデングウイルスワクチン組成物の用量を、デング感染またはその症候が予防または寛解されることになる患者に投与するステップを含む、前記方法に関する。この方法において、デングウイルスワクチン組成物は、混合後、それが安定な状態のままである時間内に、例として２４時間以内に患者に投与される。本発明のこの態様のいくつかの実施形態において、非複製デングワクチンは、組換えデングサブユニットワクチンまたは不活化デングワクチンである。
【０１１０】
本発明のこの態様のさらなる実施形態は、（ｃ）デングウイルスワクチン組成物の投与後に所定の時間を経過させること、および（ｄ）本発明の組成物の第二の用量を投与することを含む。前記実施形態において、ステップ（ｃ）および（ｄ）は、１または複数回繰り返してもよい。
【０１１１】
上記の方法において、第一のデングワクチンは好ましくは四価であって、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４成分を含み、ここで各成分は、本明細書中に記載されている弱毒化生デングウイルスまたは弱毒化生キメラフラビウイルスのいずれかを含む。例示的な実施形態において、弱毒化生デングワクチンは４つのキメラフラビウイルスを含み；ここで各々のキメラフラビウイルスは単一のデングウイルス血清型のｐｒＭおよびＥタンパク質ならびに異なるフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質を含み、ここで各々のキメラフラビウイルスは弱毒化されている。ある実施形態において、４つのキメラフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質は、黄熱病ウイルスからのものである。代替的実施形態において、４つのキメラフラビウイルスの各々のカプシドおよび非構造タンパク質は、ｐｒＭおよびＥタンパク質と異なるデング血清型からのものである。
【０１１２】
本発明のこの態様のいくつかの実施形態において、第二のデングワクチンは、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４からのデングＥタンパク質またはその断片を含む四価の組換えデングサブユニットワクチンである。本発明のこの方法において有用なサブユニットワクチンは、本明細書中に記載されている。好ましい実施形態において、Ｅタンパク質は、各々がＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４の野生型Ｅの、そのＮ末端においてアミノ酸残基１から始まる長さの約８０％を構成する。
【０１１３】
上記の方法のある実施形態において、混合前は、弱毒化生デングワクチンは凍結乾燥されており、組換えサブユニットワクチンは液体である。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）の混合は、凍結乾燥ワクチンを液体ワクチンで再構成することを含む。代替的実施形態において、凍結乾燥ワクチンは、ステップ（ａ）における液体ワクチンとの混合の前に滅菌希釈剤で再構成される。
【０１１４】
本明細書中で言及される全ての刊行物は、本発明に関連して用いられ得る方法論および材料を記載し開示する目的のために、参照により組み込まれる。
【０１１５】
添付の図面を参照して本明細書中の発明の異なる実施形態を記載していることから、本発明はまさにその実施形態に限定されるものではなく、それらにおける様々な変更および改変が、当業者によって、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく実行され得ることが理解されるものである。
【０１１６】
［実施例］
実施例１
アジュバントおよび／またはデング抗原（四価のＤＥＮ−８０Ｅ）の存在下での弱毒化生デングウイルスの適合性／安定性試験のための製剤の調製
四価のＤＥＮ−８０Ｅ（１〜４）サブユニットワクチン（Ｖ１８０）単独と組み合わせて共製剤化したときの、またはこれとＭＡＡもしくはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（ＩＭＸ）を組み合わせたものと組み合わせて共製剤化したときの、組換えΔ３０弱毒化生ウイルス（ｒＤＥＮ１〜４）の適合性／安定性を評価するための調査を実施した。
【０１１７】
全ての製剤は、無菌技術を用いてバイオセーフティキャビネット内で調製した。試験用の試料は、ダルベッコＰＢＳ中で所望のアジュバント、デング抗原（１または複数）またはアジュバント／抗原（１または複数）の組み合わせと共に製剤化して、２ｍｌ滅菌ＩＳＯバイアル中に入れてＦＬＵＲＯＴＥＣ（登録商標）（Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ）ストッパーで封をした。この調査において試験したアジュバント／抗原試料は以下であった：（１）ＰＢＳ単独；（２）四価のＤＥＮ−８０Ｅ（ＤＥＮ１−８０Ｅ＋ＤＥＮ２−８０Ｅ＋ＤＥＮ３−８０Ｅ＋ＤＥＮ４−８０Ｅ）；（３）四価のＤＥＮ−８０Ｅ＋ＭＡＡ；（４）四価のＤＥＮ−８０Ｅ＋３×ＭＡＡおよび（５）四価のＤＥＮ−８０Ｅ＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）アジュバント（ＩＭＸ）。アジュバント／抗原試料は、下に記載されているように１：１の比で弱毒化生デングウイルスと現場配合（ｆｉｅｌｄ−ｍｉｘ）した。Δ３０弱毒化生デングウイルス（実施例２中に記載されているもの）との現場配合の前および後の試料の用量および濃度は、表１に示すとおりであった。
【０１１８】
表１．四価の試験試料の濃度
【表１】
2018502080.tif 000003
【０１１９】
全ての製剤は、ＬＡＶとの現場配合前に２〜８℃で保存した。
【０１２０】
実施例２
アジュバントおよび／またはデング抗原（四価のＤＥＮ−８０Ｅ）の存在下でのΔ３０デング弱毒化生ウイルスとの共製剤の適合性／安定性試験のための製剤の調製
実施例１中で調製した抗原／アジュバント試料をΔ３０デング弱毒化生ウイルスと現場配合し、下に記載されているようにＶｅｒｏ細胞上でのインビトロプラークアッセイを用いてウイルス生存率を試験した。これらの調査において用いた弱毒化生デングウイルスは（ｒＤＥＮ１−ｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５；ｒＤＥＮ２−ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３；ｒＤＥＮ３−ｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４；およびｒＤＥＮ４−ｒＤＥＮ４Δ３０−７１３２，７１６３，８３０８）であった。Δ３０  ＬＡＶとの現場配合後のデング抗原およびアジュバントの濃度を表１中に提供する。
【０１２１】
２４ウェルプレートに４×１０５個のＶｅｒｏ細胞／ウェルをシードした。Ｖｅｒｏ細胞の継代レベルはＰ１４４であった。プラークアッセイ用のウイルス試料を希釈するため（Ｔ＝０時の時点）、１ｍＬ分量の各々のΔ３０  ＬＡＶ（ｒＤＥＮ１〜４）を２２℃の水浴中で解凍した。ウイルスの希釈を２％の１９９培地中で実施して、ウイルス力価が２×１０５ＰＦＵ／ｍＬである希釈ストックを作った。この希釈ストックから、０．５ｍＬのウイルスを新たなチューブへと分取し、０．５ｍＬの実施例１中に記載のアジュバント／抗原製剤のうちの１つと混合して１：１希釈物を与えた。得られた総液量は１ｍＬであり、このうち０．５ｍＬをＴ＝０時のプラークアッセイのために、０．５ｍＬをＴ＝２４時点のプラークアッセイにおける使用のために４℃で保存した。
【０１２２】
１：１  Δ３０ＬＡＶ：アジュバント／抗原試料のさらなる希釈物を、１９９培地を用いて９６ウェルプレート内に調製し、各試験試料の１：１０、１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、１：１００，０００および１：１，０００，０００希釈物を与えた。アッセイを実施するため、Ｖｅｒｏ細胞の単層をＰＢＳで洗浄し、７５μｌの各希釈試料（２連）をプレートの各ウェルに加えた。ウイルス接種物をウェル内の細胞上に広げ、プレートをインキュベーター内に置いた。１時間の間、プレートを１０〜１５分毎にゆすって接種物を均等に広げた。１時間の吸着の後、各ウェルに１ｍｌの培養培地中１％メチルセルロースを加えることにより細胞を重層し、５％  ＣＯ２％で３７℃においてインキュベートした。
【０１２３】
６日間のインキュベーション後、各ウェルからメチルセルロースの重層を吸引して除き、細胞単層を、汎フラビウイルスモノクローナル抗体４Ｇ２を用いた免疫染色に供した（Ｈｅｎｃｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ｇｒｏｕｐ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｙｇｉｅｎｅ  ３１（４）：８３０−８３６（１９８２））。免疫染色手順の後、適切なウイルス希釈物でプラークの数をカウントすることによりウイルス力価を決定した。
【０１２４】
２４時間後、上の手順を繰り返して、保存後の各試料のウイルス力価を決定した。試料は上記のように調製した。結果は、試験したアジュバント、サブユニット抗原の単独またはアジュバント／抗原製剤のうちのいずれも、Ｔ＝０におけるΔ３０  ＬＡＶのウイルス力価に対して何ら効果がなかったことを指し示す（図２を参照されたい）。結果はさらに、Δ３０  ＬＡＶは、４℃で２４時間のインキュベーション後でもサブユニット抗原単独でおよびこれにアジュバントを伴って安定であったことを指し示す。
【０１２５】
実施例３
マカカ・ムラッタ（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）におけるデングプライム−ブーストワクチン接種戦略の評価
アカゲザルにおいて実行されたこの非ＧＬＰ調査の目的は、共製剤プライム−ブーストワクチン接種戦略を評価し、これを慣用的プライムブースト戦略と比較することであった。この調査のため、２つのワクチン候補、四価組換えデングサブユニットワクチン候補（Ｖ１８０）およびΔ３０四価デング弱毒化生ワクチン（Δ３０  ＬＡＶ）を異なる投薬計画を用いて投与した。四価Ｖ１８０候補は、４つのデングウイルス血清型（デングウイルス（ＤＥＮＶ）１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４）の各々からのトランケート型のエンベロープ糖タンパク質（ＤＥＮ−８０Ｅ）を含んでいた。Δ３０  四価ＬＡＶは、デング１〜４型の弱毒化生デングウイルス（ｒＤＥＮ１−ｒＤＥＮ１Δ３０−１５４５；ｒＤＥＮ２−ｒＤＥＮ２／４Δ３０（ＭＥ）−１４９５，７１６３；ｒＤＥＮ３−ｒＤＥＮ３Δ３０／３１−７１６４；およびｒＤＥＮ４−ｒＤＥＮ４Δ３０−７１３２，７１６３，８３０８）を含んでいた。
【０１２６】
体重が３ｋｇ超で、ＥＬＩＳＡによりフラビウイルス（ＤＥＮＶ１、２、３および４ならびにウエストナイルウイルス）抗体陰性であった、いずれかの性別の健常なインドアカゲザルの成体（ｎ＝４／群）を本調査において使用した。ワクチンを表２中に記載されているように投与した。調査のため、群１は、０および１６週においてΔ３０  ＬＡＶワクチンを皮下（ＳＣ）に受けた。群２は、０週においてΔ３０  ＬＡＶワクチンが与えられる慣用的なプライムブーストを受け、その後に１６週においてＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）（Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｓｕｎｄ，ＤＫ）と製剤化されたＶ１８０を受けた。群３は、０および１６週においてΔ３０  ＬＡＶワクチンおよびＶ１８０／Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）の共製剤を受けた（共製剤プライムブースト）。全てのワクチンは、１用量あたり０．５ｍＬで投与した。ワクチン接種の後、接種部位における何らかの変化、またはワクチンへの有害反応を指し示し得る行動もしくは摂食習性における他の変化について、動物を毎日観察した。
【０１２７】
表２．アカゲザル免疫原性調査において用いたスケジュールおよび製剤
【表２】
2018502080.tif 000004
【０１２８】
ウイルス中和活性は、ＬｉＣｏｒベースのマイクロ中和試験アッセイを用いて、２０週の調査を通じて４週毎に決定した。ＬｉＣｏｒアッセイのため、Ｖｅｒｏ細胞を平底９６ウェル組織培養プレート内の１００μｌの１０％  １９９培地中において、１．５×１０４個の細胞／ウェルで一晩シードした。別の９６ウェルプレート中に、血清試料を、１：１０で開始する８つの希釈のため、２連で連続的に２倍希釈した。エンドポイント滴定への到達に失敗した試料については、より高度の希釈物で開始して試料を再試験した。血清を、５０ｐｆｕ／ウェルに希釈した等量のウイルスとインキュベートした。全てのアッセイの希釈は、２％の１９９培地中で実施した。混合物を３７℃＋５％  ＣＯ２で１時間インキュベートした。中和後、全混合物を播種されたＶｅｒｏ細胞上に加え、３７℃＋５％  ＣＯ２で４日間インキュベートした。培養培地の除去後、細胞をＰＢＳ中３．７％のホルムアルデヒドで３０分間固定した。プレートを２００μｌの０．１％  Ｔｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで５分間ずつ２回洗浄した。プレートを５０ｕｌの２．８μｇ／ｍｌ  ４Ｇ２抗体で染色した。ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧを次いで７．５μｇ／ｍｌで加え、その後にＩＲＤｙｅ（登録商標）  ８００ＣＷストレプトアビジン（１：１０００）およびＤＲＡＱ５蛍光プローブ（１：１０，０００）のカクテルを加えた。プレートは、この最後の展開のために暗所で維持した。抗体および試薬は、０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０を添加したＯｄｙｓｓｅｙ  Ｂｌｏｃｋバッファー中で希釈した。プレートを、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳを用いて抗体交換の間に３回洗浄した。インキュベーションステップは、室温で１時間実施した。洗浄および分注ステップは、ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）ＥＬ４０６プレート洗浄システム（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて自動化した。プレートを風乾し、赤外Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）Ｓａイメージングシステム（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でスキャンした。生データをＥｘｃｅｌ加工ワークシートへとインポートした。２連のウェルを平均し、血清エンドポイント中和力価を、各アッセイプレート上に包含されるウイルス対照と比較したときに８００ｎｍ／７００ｎｍ蛍光の積分強度比を≧５０％低減させる最も高度の血清希釈の逆数として規定した。Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて結果をプロットした。全ての試料は１：１０希釈での開始を設定した。試料がこの希釈で中和に失敗した場合、１：５の力価を割り当てた。
【０１２９】
４週（投薬１の４週後）の全ての群についてのＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４に対する幾何平均中和力価を図３中にまとめる。この時点において、ウイルス中和抗体応答は、群２中のＤＥＮＶ４に応答しなかった１匹の動物を除く全ての免疫動物において検出された。４週の結果からの重要な結論は以下である：
・投薬１の４週後に共製剤群（群３）において測定された中和応答は、Δ３０  ＬＡＴＶワクチンを単独で与えられたときに誘導されたもの（群１および２）に匹敵した。これは、Δ３０  ＬＡＴＶワクチンとＶ１８０サブユニットワクチンおよびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）アジュバントとの共製剤は弱毒化生ウイルスワクチンの第一の用量への応答に負の影響を与えないことを指し示す。
【０１３０】
２０週（投薬２の４週後）の全ての群についてのＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４に対する幾何平均中和力価を図４中にまとめる。この時点において、ウイルス中和抗体応答は全ての免疫動物において検出された。２０週の結果からの重要な結論は以下である：
・慣用的なプライムブースト（群２）および共製剤プライムブーストアプローチ（群３）のいずれも、Δ３０  ＬＡＴＶワクチン（群１）と比較して４つ全てのＤＥＮＶ型への優れた中和力価を誘導した。力価は、ＤＥＮＶの型に応じて、１．７倍から６．７倍高い範囲にあった。
【０１３１】
・投薬２の４週後に共製剤群（群３）において測定された中和応答は、慣用的なプライム−ブースト投薬計画を受けた群（群２）において誘導されたものよりも、良くはないにしても同等であった。これは、Δ３０  ＬＡＴＶワクチンとＶ１８０サブユニットワクチンおよびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）アジュバントとの共製剤はサブユニットブーストへの応答に負の影響を与えないことを指し示す。
【０１３２】
全ての群についてのＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４の長期的な幾何平均中和力価を図５中に示す。全体的に、このデータは、共製剤プライムブースト投薬計画が慣用的なプライムブーストアプローチに匹敵する応答を誘発すること、およびその応答が同族のワクチンとして与えられたΔ３０  ＬＡＴＶより優れていることを実証する。
【０１３３】
実施例４
マカカ・ムラッタにおけるデングプライム−ブースト用量依存的ワクチン接種戦略の評価
アカゲザルにおいて実行されたこの非ＧＬＰ調査の目的は、異なる共製剤用量のサブユニットワクチンおよびデング弱毒化生ワクチンを用いた共製剤プライム−ブーストワクチン接種戦略を評価することであった。この調査のため、実施例３中に記載されている２つのワクチン候補を用いた。
【０１３４】
体重が４ｋｇ超で、ＥＬＩＳＡによりフラビウイルス（ＤＥＮＶ１、２、３および４ならびにウエストナイルウイルス）抗体陰性であった、いずれかの性別の健常なインドアカゲザルの成体（ｎ＝５／群）を本調査において使用した。ワクチンを表３中に記載されているように投与した。調査のため、群１は、０および２４週においてΔ３０  ＬＡＶワクチン（１０ｅ５  ｐｆｕの各ＬＡＶ）を皮下（ＳＣ）に受けた。群２は、０および２４週においてΔ３０  ＬＡＶワクチン（１０ｅ５  ｐｆｕの各ＬＡＶ）およびＶ１８０（１０、１０、１０、２０μｇの各８０Ｅ）／Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）（Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｓｕｎｄ，ＤＫ）の共製剤を受けた（共製剤プライムブースト）。群３は、０および２４週においてΔ３０  ＬＡＶワクチン（１０ｅ５  ｐｆｕの各ＬＡＶ）およびＶ１８０（３、３、３、６μｇの各８０Ｅ）／Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）の共製剤を受けた（共製剤プライムブースト）。群４は、０および２４週においてΔ３０  ＬＡＶワクチン（１０ｅ３  ｐｆｕの各ＬＡＶ）およびＶ１８０（１０、１０、１０、２０μｇの各８０Ｅ）／Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）の共製剤を受けた（共製剤プライムブースト）。全てのワクチンは、１用量あたり０．５ｍＬで投与した。ワクチン接種の後、接種部位における何らかの変化、またはワクチンへの有害反応を指し示し得る行動もしくは摂食習性における他の変化について、動物を毎日観察した。
【０１３５】
表３．アカゲザル免疫原性調査において用いたスケジュールおよび製剤
【表３】
2018502080.tif 000005
【０１３６】
2018502080.tif 000006
【０１３７】
ウイルス中和活性は、実施例３中に上記されているように、ＬｉＣｏｒベースのマイクロ中和試験アッセイを用いて、２８週の調査を通じて４週毎に決定した。
【０１３８】
４週（投薬１の４週後）の全ての群についてのＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４に対する幾何平均中和力価を図６中にまとめる。この時点において、ウイルス中和抗体応答は、ＤＥＮＶ１に応答しなかった群１中の１匹の動物および群４中の１匹の動物を除く全ての免疫動物において検出された。４週の結果からの重要な結論は以下である：
・投薬１の４週後に共製剤群（群２、３および４）において測定された中和応答は、Δ３０  ＬＡＴＶワクチンを単独で与えられたときに誘導されたもの（群１）に匹敵した。これは、Δ３０  ＬＡＴＶワクチンとＶ１８０サブユニットワクチンおよびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）アジュバントとの共製剤は弱毒化生ウイルスワクチンの第一の用量への応答に負の影響を与えないことを指し示す。
【０１３９】
・高用量（１０ｅ５  ｐｆｕの各ウイルス）のΔ３０  ＬＡＴＶ（群２）または低用量（１０ｅ３  ｐｆｕの各ウイルス）のΔ３０  ＬＡＴＶ（群４）を受けた共製剤群における中和応答は同等であった。これは、低用量のΔ３０  ＬＡＴＶワクチンはＶ１８０サブユニットワクチンおよびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）との共製剤により負の影響を受けないことを指し示す。
【０１４０】
２８週（投薬２の４週後）の全ての群についてのＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４に対する幾何平均中和力価を図７中にまとめる。この時点において、ウイルス中和抗体応答は全ての免疫動物において検出された。２８週の結果からの重要な結論は以下である：
・全ての共製剤群（群２、３および４）は、投薬２の４週後において、Δ３０  ＬＡＴＶのみの群（群２）において見られたものより優れた、ＬｉＣｏｒ中和力価の強いブーストを実証した。これは、Δ３０  ＬＡＴＶワクチンとＶ１８０サブユニットワクチンおよびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）アジュバントとの共製剤はサブユニットブーストへの応答に負の影響を与えないことを指し示す。
【０１４１】
・低用量Ｖ１８０を含有する共製剤（群３）は、高用量Ｖ１８０を含有する共製剤（群２）と同様にブーストした。
【０１４２】
・低用量（１０ｅ３  ｐｆｕの各ウイルス）のΔ３０  ＬＡＴＶを含有する共製剤（群４）は、高用量（１０ｅ５  ｐｆｕの各ウイルス）のΔ３０  ＬＡＴＶを含有する共製剤（群２）と同様にブーストした。
【０１４３】
全ての群についてのＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４の長期的な幾何平均中和力価を図８中に示す。全体的に、このデータは、共製剤プライムブースト投薬計画が慣用的なプライムブーストアプローチに匹敵する応答を誘発すること、およびその応答が同族のワクチンとして与えられたΔ３０  ＬＡＴＶより優れていることを実証する。
【図１】
2018502080.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2018502080.tif 000014
【配列表】
2018502080000001.app
【国際調査報告】
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2018502080.tif 000016
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