(57)【要約】  本発明は、薬剤として使用するための、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤とを含む組み合せ剤に関する。また、本発明は、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤とを含む医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤として使用するための、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤とを含む組み合わせ剤。
【請求項２】
癌の治療に使用するための、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤とを含む組み合わせ剤。
【請求項３】
前記癌が、膀胱癌、黒色腫、肺癌、前立腺癌、腎細胞癌、血液悪性腫瘍および卵巣癌、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）および胃腸膵臓神経内分泌腫瘍（ＧＥＰ−ＮＥＴ）から選択される、請求項２に記載の組合せ剤。
【請求項４】
膀胱癌の治療のための、請求項１〜３のいずれかに記載の組み合せ剤。
【請求項５】
非筋肉浸潤性膀胱癌、筋肉浸潤性膀胱癌または転移性尿路上皮膀胱癌の治療のための、請求項２〜４のいずれかに記載の組み合せ剤。
【請求項６】
ステージＩ、ステージＩＩまたはステージＩＩＩの膀胱癌の治療のための、請求項４または５に記載の組み合わせ剤。
【請求項７】
前記組み合わせ剤が無増悪生存期間および／または平均余命を改善する、請求項１〜６のいずれかに記載の組み合わせ剤。
【請求項８】
タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１抗体とが別々に、連続的にまたは同時に投与されるものである、請求項１〜７のいずれかに記載の組み合わせ剤。
【請求項９】
前記ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤がＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項１〜８のいずれかに記載の組み合わせ剤。
【請求項１０】
タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩と、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤とを含む医薬組成物。
【請求項１１】
前記ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤がＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
癌の治療のための同時使用、別々の使用又は連続的使用用の組み合わせ製剤としての、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤とを含む製品。
【請求項１３】
癌、特に膀胱癌の第一選択治療としての治療に使用するための、請求項１〜８のいずれかに記載の組み合わせ剤、または請求項９若しくは１０に記載の医薬組成物、または請求項１１に記載の製品。
【請求項１４】
癌細胞が高レベルのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１を発現する癌、特に癌細胞が検出可能な又は増加レベルのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１を発現する膀胱癌の治療に使用するための、請求項１〜８のいずれかに記載の組み合わせ剤、または請求項９若しくは１０に記載の医薬組成物、または請求項１１に記載の製品。
【請求項１５】
タスキニモドと、タスキニモドをＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤と併用して個体における癌を治療するための説明書を含む添付文書とを備えるキット。
【請求項１６】
治療が必要な患者にタスキニモドとＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤との有効量を投与することを含む、該患者の癌を治療する方法。
【請求項１７】
ＰＤ−１阻害剤を含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の組合せ剤、医薬組成物、製品、キットまたは方法。
【請求項１８】
ＰＤ−Ｌ１阻害剤を含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の組合せ、医薬組成物、製品、キットまたは方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤として使用するための、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤とを含む組み合わせ剤に関する。また、本発明は、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤とを含む医薬組成物、キットおよび治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
膀胱癌は、膀胱の上皮内層（すなわち、尿路上皮）から生じる数種の癌のいずれかである。ごくまれに、膀胱はリンパ腫や肉腫などの非上皮性癌を伴う。これは、異常細胞が膀胱内で制御不能に増殖する疾患である。最も一般的なタイプの膀胱癌は、尿路上皮の正常組織生成を繰り返すため、転移性細胞癌またはより適切には尿路上皮細胞癌として知られている。米国における５年生存率は約７７％である（ＳＥＥＲ  Ｓｔａｔ  Ｆａｃｔ  Ｓｈｅｅｔｓ：Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ．  ＮＣＩ、２０１４年６月１８日検索）。膀胱癌は、２０１２年に４３万の新規症例（世界がん報告書２０１４、世界保健機関、２０１４年、第１．１章、ＩＳＢＮ  ９２８３２０４２９８）および１６５，０００人の死亡者が発生した癌の第９番目の主因である。
【０００３】
過去３０年間において転移性尿路上皮膀胱癌（ＵＢＣ）の治療に大きな進歩はなかった。化学療法が依然として治療の基準である。患者の成果は、特に化学療法が有効でない又は耐容性が低い患者については依然として乏しい（Ｃｈｏｕｅｉｒｉ，Ｔ．Ｋ．外，Ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｄｏｃｅｔａｘｅｌ  ｐｌｕｓ  ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ  ｖｅｒｓｕｓ  ｄｏｃｅｔａｘｅｌ  ｐｌｕｓ  ｐｌａｃｅｂｏ  ｉｎ  ｐｌａｔｉｎｕｍ−ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ３０，  ５０７−５１２  （２０１２））；Ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｖｉｎｆｌｕｎｉｎｅ  ｐｌｕｓ  ｂｅｓｔ  ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ  ｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｂｅｓｔ  ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ  ｃａｒｅ  ａｌｏｎｅ  ａｆｔｅｒ  ａ  ｐｌａｔｉｎｕｍ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｍｅｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｔｒａｃｔ，Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．，  ２７，  ４４５４−４４６１（２００９））。
【０００４】
ＵＢＣの特徴の一つは、体細胞突然変異率が高いことである（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ．，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，  Ｎａｔｕｒｅ  ５０７，３１５−３２２  （２０１４）；Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｍ．Ｓ．外，Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｎｅｗ  ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ４９９，２１４−２１８（２０１３）；Ｋａｎｄｏｔｈ，Ｃ．外，Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ａｎｄ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ａｃｒｏｓｓ  １２  ｍａｊｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｙｐｅｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  ５０２，３３３−３３９（２０１３））。これらの変化は、抗原数の増加のため、宿主免疫系が腫瘍細胞を異物として認識する能力を増強する場合がある（Ｃｈｅｎ，Ｄ．Ｓ．＆Ｍｅｌｌｍａｎ，Ｉ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｍｅｅｔｓ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ−ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｃｙｃｌｅ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ３９，１−１０（２０１３））。
【０００５】
しかし、これらの癌は、腫瘍微小環境においてプログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１；ＣＤ２７４またはＢ７−Ｈ１とも呼ばれる）の発現を介して免疫監視および根絶を逃れる可能性がある（Ｃｈｅｎ外，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｗａｙｓ：  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−ｌｉｇａｎｄ  １  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１．Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１８，６５８０−６５８７（２０１２）；Ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ，Ｎ．外，Ｔｕｍｏｒ  ｅｘｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａｎ  ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｍｅｌａｎｏｍａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３１，ｅ４３９−ｅ４４２（２０１３））。
【０００６】
ＰＤ−Ｌ１は、有効なＴ細胞機能の阻害による免疫活性化の負の制御因子である。同時阻害性受容体プログラム死１（ＰＤ−１）およびそのリガンドは、広範囲の免疫応答における重要な調節因子であり、自己免疫および自己免疫のみならず癌免疫においても重要な役割を果たす。新たな証拠から、癌細胞が抗腫瘍免疫を回避するためにＰＤ−１／ＰＤ−リガンド（ＰＤＬ）経路を使用する可能性があることが示唆されている。この証拠に基づいて、現在、ＰＤ−１／ＰＤＬ経路を標的とする初期ヒト臨床試験が複数のヒト癌について進行中である。抗ＰＤ−Ｌ１抗体が転移性膀胱癌フェーズＩＩ開発段階にある（Ｐｏｗｌｅｓ外，ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１）ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ．２０１４  Ｎｏｖ  ２７；５１５（７５２８）：５５８−６２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３９０４．；Ｅｒｒｉｃｏ  Ａ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１  ａｘｉｓ：ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃａｎｃｅｒ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１５  Ｆｅｂ；１２（２）：６３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｃｌｉｎｏｎｃ．２０１４．２２１．Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｄｅｃ  ２３．；Ｍｕｅｎｓｔ  Ｓ外，Ｔｈｅ  ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１  ｐａｔｈｗａｙ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ．，２０１５  Ｆｅｂ；１９（２）：２０１−１１．ｄｏｉ：１０．１５１７／１４７２８２２２．２０１４．９８０２３５．，Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｄｅｃ  １０；Ｍ．Ｓ．Ｓｏｌｏｗａｙ．Ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．Ｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．１１（４）：６２３−６３５，１９８４）。
【０００７】
キノリン−３−カルボキシアミドアナログであるタスキニモド（ＴａｓＱとも呼ばれている）は、Ｓ１００Ａ９と呼ばれるタンパク質とその異なる受容体（ＴＬＲ４、ＲＡＧＥ、ＥＭＭＰＲＩＮ）との相互作用を阻害する。タスキニモドは、免疫調節性、抗血管新生性および抗転移活性を有する。Ｓ１００Ａ９を標的化することにより、タスキニモドは、骨髄由来抑制性細胞およびマクロファージを含めた抑制性骨髄性細胞を調節する（Ｓｈｅｎ  Ｌ外，Ｔａｓｑｕｉｎｉｍｏｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｏｄｅｌｓ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２０１４  Ｎｏｖ  ４．；Ｊｅｎｎｂａｃｋｅｎ  Ｋ外，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ  ｔａｓｑｕｉｎｉｍｏｄ（ＡＢＲ−２１５０５０），  Ｐｒｏｓｔａｔｅ．２０１２  Ｊｕｎ  １；７２（８）：９１３−２４，ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏｓ．２１４９５．Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｏｃｔ  ５；Ｉｓａａｃｓ外，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＢＲ−２１５０５０  ａｓ  ｌｅａｄ  ｓｅｃｏｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ  ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ，Ｐｒｏｓｔａｔｅ．２００６  Ｄｅｃ  １；６６（１６）：１７６８−７８）。タスキニモドは、前立腺癌および他の固形腫瘍の第ＩＩＩフェーズ臨床開発段階にある。
【０００８】
タスキニモドは、腫瘍微小環境を標的とし、調節性骨髄性細胞機能を調節し、免疫調節性、抗血管新生性および抗転移性を発揮する。タスキニモドは腫瘍低酸素応答も抑制し、その腫瘍微小環境に影響を及ぼすことに寄与する可能性がある。
【０００９】
Ｉｓａａｃｓ外（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７３（４）Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １５，２０１３）には、前臨床モデルに基づいて、タスキニモドがヒト前立腺、乳房、膀胱および結腸腫瘍異種移植片に対する単独療法剤として有効であり、その際、その効果は、腫瘍内皮細胞を選択的に死滅させる標的化タプシガルジンプロドラッグ（Ｇ２０２）と併用してさらに強化することができる可能性があることが記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者は、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤とが相乗的に腫瘍増殖をブロックし、かつ、これらを特に癌の治療、より具体的には膀胱癌の治療のための医薬として併用することができることを実証した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の説明
したがって、本発明は、薬剤として使用するための、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤とを含む組み合わせ剤に関する。
【００１２】
一実施形態では、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤は、抗体およびペプチドから選択される。
【００１３】
また、本発明は、薬剤として使用するための、タスキニモドまたは薬学的に許容されるその塩とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１抗体とを含む組み合わせ剤に関する。
【００１４】
また、本発明は、薬剤として使用するための、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩と抗体ではないＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤とを含む組み合わせ剤に関するものでもある。好ましくは、本発明は、薬剤として使用するための、タスキニモドまたは薬学的に許容されるその塩と、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤としてのペプチドとを含む組み合わせ剤に関するものでもある。
【００１５】
本発明の一実施形態では、阻害剤、抗体またはペプチドは、ＰＤ−Ｌ１を阻害する。別の実施形態では、阻害剤、抗体またはペプチドは、ＰＤ−１を阻害する。
【００１６】
また、本発明は、癌の治療に使用するための、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤とを含む組み合わせ剤に関する。
【００１７】
また、本発明は、癌の治療に使用するための、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１抗体とを含む組み合わせ剤に関する。
【００１８】
また、本発明は、癌の治療に使用するための、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩と抗体ではないＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤とを含む組み合わせ剤に関する。好ましくは、本発明は、癌の治療に使用するための、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩と、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１としてのペプチドとを含む組み合わせ剤に関するものでもある。
【００１９】
一実施形態では、この組み合わせ剤は、進行癌の治療に使用するためのものである。進行癌は、例えば、転移性癌または末期癌から選択できる。
【００２０】
特に、前記癌は、膀胱癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）などの肺癌、結腸直腸癌、乳癌、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、血液悪性腫瘍、特に進行性血液悪性腫瘍、卵巣癌、特に白金耐性卵巣癌、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）および胃腸膵臓神経内分泌腫瘍（ＧＥＰ−ＮＥＴ）から選択される。本発明の組み合わせ剤で治療される癌は、任意の段階、例えば初期または後期であることができる。いくつかの実施形態では、治療は、治療の終了後に個体において持続的な応答を生じる。いくつかの実施形態では、治療は、個体における完全な応答、部分的な応答、または不変を生じさせる。
【００２１】
好ましい実施形態では、本発明は、膀胱癌、メラノーマ、肺癌、前立腺癌、腎細胞癌、血液悪性腫瘍、特に進行性血液悪性腫瘍、卵巣癌、特に白金耐性卵巣癌、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）、特に胃腸膵臓神経内分泌腫瘍（ＧＥＰ−ＮＥＴ）の治療に使用するための、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤、特にＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１抗体とを含む組み合わせ剤に関するものでもある。
【００２２】
好ましい実施形態では、本発明は、膀胱癌、前立腺癌および腎細胞癌から選択される癌の治療に使用するための、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤、特にＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１抗体とを含む組み合わせ剤に関するものでもある。
【００２３】
特に、上記使用のための組み合わせ剤は、膀胱癌、特に非筋肉浸潤性膀胱癌、筋肉浸潤性膀胱癌並びに転移性および尿道膀胱癌の治療のためのものである。
【００２４】
一実施形態では、癌は膀胱癌である。
【００２５】
膀胱癌は、癌治療チームが、癌がどれだけ広がっているかを説明するための標準的な方法である病期分類システムによって定義される。膀胱癌のために最も頻繁に使用される病期分類システムは米国がん合同委員会（ＡＪＣＣ）ＴＮＭシステムであり、これは次の３つの重要な情報に基づく：
Ｔは、主な（原発）腫瘍が膀胱壁を通してどれだけ成長したか、およびそれが近くの組織にまで成長したかどうかを示す。
Ｎは、膀胱付近のリンパ節にまで広がった癌を示す。
Ｍは、癌が膀胱付近ではない他の器官又はリンパ節などの遠位部位にまで広がっている（転移）かどうかを示す。
【００２６】
Ｔ、Ｎ、Ｍの後には、これらの要因のそれぞれについての詳細を与えるための数字や文字が表示される。数値が高いほど癌が進行していることを意味する。
【００２７】
特に、Ｔカテゴリーは、主な腫瘍が膀胱の壁にまで（またはそれを越えて）どの程度成長したかを示す。
【００２８】
膀胱壁には４つの主要層がある。
・最も内側の内層は、尿路上皮または移行上皮と呼ばれる。
・尿路上皮の下には、結合組織、血管、神経の薄い層がある。
・次が厚い筋肉層である。
・この筋肉の外側では、脂肪結合組織の層が膀胱を他の近くの器官から隔てている。
【００２９】
ほぼ全ての膀胱癌は尿路上皮から始まる。癌は、膀胱内の他の層にまでまたは他の層を通って成長するにつれて進行性となる。
・ＴＸ：情報不足のため主な腫瘍を評価することができない
・Ｔ０：原発腫瘍の証拠がない
・Ｔａ：非侵襲性乳頭状癌
・Ｔｉｓ：非侵襲性扁平上皮癌（扁平上皮癌、ＣＩＳ）
・Ｔ１：腫瘍が膀胱を覆う細胞層から下にある結合組織にまで成長した。腫瘍は膀胱の筋肉層までには成長していない。
・Ｔ２：腫瘍が筋肉層にまで成長した。
・Ｔ２ａ：腫瘍が筋肉層の内側半分にのみ成長した。
・Ｔ２ｂ：腫瘍が筋肉層の外側半分にまで成長した。
・Ｔ３：腫瘍が膀胱の筋肉層を通してそれを取り囲む脂肪組織層にまで成長した。
・Ｔ３ａ：脂肪組織への広がりが顕微鏡を使用することによってのみ見ることができる。
・Ｔ３ｂ：脂肪組織への広がりが画像検査で見られる又は外科医が見る又は感じる程度に十分大きい。
・Ｔ４：腫瘍が脂肪組織を越えて近くの器官または構造にまで広がった。腫瘍が前立腺の間質（主組織）、精嚢、子宮、膣、骨盤壁、または腹壁のいずれかにまで成長している可能性がある。
・Ｔ４ａ：腫瘍が前立腺の間質（男性）あるいは子宮および／または膣（女性）に広がった。
・Ｔ４ｂ：腫瘍が骨盤壁または腹壁にまで広がった。
【００３０】
膀胱癌は膀胱の多くの領域に同時に影響を及ぼすことがある。複数の腫瘍が発見される場合には、文字ｍが適切なＴカテゴリーに追加される。
【００３１】
膀胱癌のＮカテゴリー
Ｎカテゴリーは、膀胱（真の骨盤内）付近のリンパ節および一般的な腸骨動脈と呼ばれる血管に沿ったリンパ節にのみ広がることを示す。これらのリンパ節は所属リンパ節と呼ばれる。他のリンパ節は遠位リンパ節とみなされる。遠位リンパ節への広がりは転移とみなされる（Ｍカテゴリーに記載）。リンパ節への癌の転移は、画像検査ではほとんど見られないため、手術が必要である。
・ＮＸ：情報不足のためリンパ節の評価ができない。
・Ｎ０：リンパ節転移がない。
・Ｎ１：癌が真の骨盤内の単一リンパ節に広がった。
・Ｎ２：真の骨盤内の２以上のリンパ節に広がった。
・Ｎ３：癌が総腸骨動脈に沿ってリンパ節に広がった。
【００３２】
膀胱癌のＭカテゴリー
・Ｍ０：遠位に広がる兆候がない。
・Ｍ１：癌が身体の遠位部分に広がった（最も一般的な部位は遠位リンパ節、骨、肺、肝臓である。）。
【００３３】
膀胱癌の病期
Ｔ、ＮおよびＭのカテゴリーを決定したら、この情報を組み合わせて癌ステージ全体を見出す。膀胱癌のステージは、０およびローマ数字Ｉ〜ＩＶ（１〜４）を用いて定義される。ステージ０は最も早いステージであり、ステージＩＶは最も進んだステージである。
【００３４】
・ステージ０ａ（Ｔａ、Ｎ０、Ｍ０）
癌は非侵襲性乳頭癌（Ｔａ）である。これは膀胱の中空中心に向かって成長しているが、膀胱壁の結合組織または筋肉には成長していない。これは近くのリンパ節（Ｎ０）または遠位部位（Ｍ０）には広がっていない。
【００３５】
・ステージ０ｉｓ（Ｔｉｓ、Ｎ０、Ｍ０）
この癌は平坦な非侵襲性癌腫（Ｔｉｓ）であり、平坦上皮内癌（ＣＩＳ）としても知られている。この癌は膀胱の内層でしか増殖していない。これは膀胱の中空部に向かって内側には成長しておらず、また膀胱壁の結合組織または筋肉には侵入していない。これは近くのリンパ節（Ｎ０）または遠位部位（Ｍ０）には広がっていない。
【００３６】
・ステージＩ（Ｔ１、Ｎ０、Ｍ０）
この癌は、膀胱の内層下の結合組織層にまで成長しているが、膀胱壁の筋肉層には達していない（Ｔ１）。この癌は、近くのリンパ節（Ｎ０）または遠位部位（Ｍ０）には広がっていない。
【００３７】
・ステージＩＩ（Ｔ２ａまたはＴ２ｂ、Ｎ０、Ｍ０）
この癌は膀胱壁の厚い筋肉層にまで成長しているが、膀胱を取り囲む脂肪組織層に達するまで筋肉を完全に貫通していない（Ｔ２）。この癌は、近くのリンパ節（Ｎ０）または遠位部位（Ｍ０）には広がっていない。
【００３８】
・ステージＩＩＩ（Ｔ３ａ、Ｔ３ｂ、またはＴ４ａ、Ｎ０、Ｍ０）
この癌は膀胱を取り囲む脂肪組織の層にまで成長している（Ｔ３ａまたはＴ３ｂ）。前立腺、子宮または膣に広がっている場合があるが、骨盤または腹壁には成長していない（Ｔ４ａ）。癌は近くのリンパ節（Ｎ０）または遠位部位（Ｍ０）には広がっていない。
【００３９】
・ステージＩＶ
次のいずれかが適用される：
Ｔ４ｂ、Ｎ０、Ｍ０：癌が膀胱壁を通って骨盤または腹壁にまで成長している（Ｔ４ｂ）。この癌は近くのリンパ節（Ｎ０）または遠位部位（Ｍ０）には広がっていない。
又は、
任意のＴ、Ｎ１〜Ｎ３、Ｍ０：癌は近くのリンパ節（Ｎ１−Ｎ３）には広がっているが遠位部位（Ｍ０）には広がっていない。
又は
任意のＴ、任意のＮ、Ｍ１：癌が遠位リンパ節または骨、肝臓若しくは肺（Ｍ１）などの部位に広がっている。
【００４０】
本発明の組み合わせ剤は、上記カテゴリーまたはステージのいずれか１つの膀胱癌の治療に使用するためのものである。好ましくは、ステージＩ以上の膀胱癌、ステージＩＩ以上の膀胱癌またはステージＩＩＩの膀胱癌の治療に使用するためのものである。
【００４１】
一実施形態では、本発明に係る使用のための組み合わせ剤は、無増悪生存期間および／または平均余命を改善する。
【００４２】
本発明に係る組み合わせ剤の一実施形態では、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤とは、別々に、連続的にまたは同時に投与される。
【００４３】
本発明に係る組み合わせ剤の一実施形態では、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１抗体とは、別々に、連続的にまたは同時に投与される。
【００４４】
本発明に係る組み合わせ剤の一実施形態では、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩と、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤として使用されるペプチドとは、別々に、連続的にまたは同時に投与される。
【００４５】
また、本発明は、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩と、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤とを含む医薬組成物に関する。
【００４６】
また、発明は、タスキニモドまたは薬学的に許容されるその塩と、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１抗体とを含む医薬組成物に関する。
【００４７】
また、本発明は、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩と、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１としてのペプチドとを含む医薬組成物に関する。
【００４８】
特に、該医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
【００４９】
また、本発明は、癌、特に膀胱癌の治療のための同時使用、別々の使用又は時間をかけた使用（すなわち、連続的使用）用の組み合わせ製剤としての、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩と、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤、特にＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１抗体とを含む製品に関するものでもある。別の好ましい実施形態では、本発明は、癌、特に例えば筋肉浸潤性膀胱癌および転移性尿路上皮膀胱癌および上記任意のカテゴリーまたはステージの膀胱癌を含めた膀胱癌の治療のために同時使用、別々に使用または時間をかけて使用するための組み合わせ製剤としての、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩と、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤としてのペプチドとを含む製品に関するものでもある。好ましくは、膀胱癌は、ステージＩ以上またはステージＩＩ以上またはステージＩＩＩの膀胱癌である。
【００５０】
さらに、本発明は、癌、特に膀胱癌の治療方法であって、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩と、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤、特にＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１抗体或いはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤としてのペプチドを含む組み合わせ剤の治療有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む方法に関する。
【００５１】
別の態様では、本発明は、癌に罹患している個体における癌を治療し又は癌の進行を遅延させるための、タスキニモドとＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤とを含むキットに関する。このキットは、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤と、タスキニモドとＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤を併用して個体における癌を治療しまたは癌の進行遅延させるための説明書を含む添付文書とを含むことができる。また、このキットは、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤と、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤をタスキニモドと併用して癌に罹患している個体において癌を治療または癌の進行を遅延させるための使用説明書とを含むこともできる。また、このキットは、タスキニモドと、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤と、タスキニモド並びにＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤を使用して個体において癌を治療しまたは癌の進行を遅延させるための使用説明書を含む添付文書とを含むことができる。
【００５２】
添付文書には、キットを使用して治療される癌が特定されている。本発明の実施形態では、膀胱癌としては、例えば、筋層非浸潤性膀胱癌、筋肉浸潤性膀胱癌および転移性尿路上皮膀胱癌並びに上記の任意のカテゴリーまたはステージの膀胱癌が挙げられる。好ましくは、膀胱癌は、ステージＩ以上またはステージＩＩ以上またはステージＩＩＩの膀胱癌である。
【００５３】
４−ヒドロキシ−５−メトキシ−Ｎ，１−ジメチル−２−オキソ−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，２−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（ＣＡＳ番号２５４９６４−６０−８）としても知られているタスキニモドは、次式（ＩT）の化合物である：
【化１】
2018511586.tif 000002
。  
【００５４】
この化合物並びにタスキニモド様化合物およびそれらの製造方法は、国際特許出願公開ＷＯ００／０３９９１号（特に実施例８）に記載されている。その内容は参照として援用される。
【００５５】
タスキニモド様化合物は、例えば、次の一般式（Ｉ）の化合物：
【化２】
2018511586.tif 000003
（式中、
Ａは水素及び−ＣＯＲA（ここで、Ａはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ネオペンチル、フェニル、ベンジルおよびフェネチルから選択される）から選択され；
Ｒ2は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチルおよびアリルから選択され；
Ｒ3はメチル、メトキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、トリフルオロメチルおよびＯＣＨxＦy（ここで、ｘ＝０〜２、ｙ＝１〜３であるが、但し、ｘ＋ｙ＝３であり、Ｒがメチルである場合にはＲ’は水素ではないものとする。）から選択され；
Ｒ4は水素、フルオロ及びクロロから選択されるが、但し、Ｒ4はＲ’がフルオロ及びクロロから選択される場合にのみフルオロ及びクロロから選択されるものとし；
Ｒ1はメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、クロロ、ブロモ、トリフルオロメチル、ジメチルアミノ、−ＯＣＨxＦyおよび−ＯＣＨ2ＣＨxＦy（ここで、ｘ＝０〜２、ｙ＝１〜３であるが、但しｘ＋ｙ＝３であるものとする）から選択される。）
或いは任意の互変異性体および/またはそれらの薬学的に許容される塩である。
【００５６】
このような化合物の例は次のものである：Ｎ−エチル−Ｎ−（３−フルオロフェニル）−１，２−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−５−クロロ−１−メチル−２−オキソキノリン−３−カルボキサミド；Ｎ−メチル−Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）−１，２−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−５−クロロ−１−メチル−２−オキソキノリン−３−カルボキサミド；Ｎ−メチル−Ｎ−（２，５−ジフルオロフェニル）−１，２−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−５−クロロ−１−メチル−２−オキソキノリン−３−カルボキサミド；Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メトキシフェニル）−１，２−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−５−エチル−１−メチル−２−オキソキノリン−３−カルボキサミド；Ｎ−メチル−Ｎ−（２，５−ジフルオロフェニル）−１，２−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−５−メトキシ−１−メチル−２−オキソキノリン−３−カルボキサミド；Ｎ−メチル−Ｎ−（４−トリフルオロメチルフェニル）−１，２−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−５−メトキシ−１−メチル−２−オキソキノリン−３−カルボキサミド；またはＮ−メチル−Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）−１，２−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−５，６−メチレンジオキシ−１−メチル−２−オキソキノリン−３−カルボキサミド。
【００５７】
タスキニモド様化合物は、好ましくは、次式（Ｉａ）の化合物：
【化３】
2018511586.tif 000004
またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
Ｒ1はＨ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、トリフルオロメチルおよびトリフルオロメトキシから選択され；
Ｒ2はＣ1〜Ｃ4アルキルであり；
Ｒ3はメチル、メトキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、トリフルオロメチルおよびトリフルオロメトキシから選択され；
Ｒ4は水素、フルオロおよびクロロから選択されるが、但し、Ｒ4はＲ3がフルオロおよびクロロから選択される場合にのみフルオロおよびクロロから選択される；
またはその薬学的に許容される塩である。
【００５８】
用語「Ｃ1〜Ｃ4アルキル」とは、１、２、３または４個の炭素原子を有する分岐または非分岐アルキル基、すなわちメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、イソブチルまたはｔ−ブチルをいう。
【００５９】
いくつかの実施形態では、Ｒ1は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、トリフルオロメチルおよびトリフルオロメトキシから選択される。いくつかの他の実施形態では、Ｒ1は、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、クロロ、ブロモ、トリフルオロメチルおよびトリフルオロメトキシから選択される。さらに他の実施形態では、Ｒ1は、エチル、メトキシ、クロロおよびトリフルオロメチルから選択される。いくつかの特定の実施形態では、Ｒ1はメトキシである。
【００６０】
部分Ｒ2はＣ1〜Ｃ4アルキル基であり、この基は分岐状または直鎖状であってよい。いくつかの実施形態では、Ｒ2はＣ1〜Ｃ3アルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｒ2はメチルまたはエチルである。いくつかの特定の実施形態では、Ｒ2はメチルである。
【００６１】
部分Ｒ3は、メチル、メトキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、トリフルオロメチルおよびトリフルオロメトキシから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ3は、メチル、メトキシ、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチルおよびトリフルオロメトキシから選択される。いくつかの特定の実施形態では、Ｒ3はトリフルオロメチルである。
【００６２】
Ｒ4は水素、フルオロ及びクロロから選択されるが、但し、Ｒ4はＲ3がフルオロ及びクロロから選択される場合にのみフルオロ及びクロロから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ4は水素またはフルオロである。いくつかの特定の実施形態では、Ｒ4は水素である。
【００６３】
いくつかの特定の実施形態では、式（Ｉａ）の化合物において、
Ｒ1およびＲ4は上で定義した通りであり；
Ｒ2はメチルまたはエチル、特にメチルであり；
Ｒ3はメチル、メトキシ、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチルおよびトリフルオロメトキシから選択される。
【００６４】
いくつかの他の特定の実施形態では、式（Ｉａ）の化合物において、
Ｒ1は上で定義した通りであり；
Ｒ2はメチルまたはエチル、特にメチルであり；
Ｒ3は、メチル、メトキシ、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチルおよびトリフルオロメトキシから選択され；
Ｒ4はＨである。
【００６５】
いくつかの実施形態では、Ｒ3はパラ位にある、すなわち式（Ｉａ）の化合物は次式（Ｉｂ）で表される：
【化４】
2018511586.tif 000005
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、上で定義した通りである。
【００６６】
例えば、式（Ｉｂ）の化合物のいくつかの実施形態では、
Ｒ1およびＲ4は上で定義した通りであり；
Ｒ2はメチルまたはエチル、特にメチルであり；
Ｒ3はメチル、メトキシ、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチルおよびトリフルオロメトキシから選択される。
いくつかの他の特定の実施形態では、式（Ｉｂ）の化合物において、
Ｒ1は上で定義した通りであり；
Ｒ2はメチルまたはエチル、特にメチルであり；
Ｒ3はメチル、メトキシ、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチルおよびトリフルオロメトキシから選択され；
Ｒ4はＨである。
【００６７】
上記のように、いくつかの実施形態では、Ｒ4は水素である。これらの実施形態では、式（Ｉａ）の化合物は、次式（Ｉｃ）によって表すことができる：
【化５】
2018511586.tif 000006
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、上で定義した通りである。
【００６８】
例えば、式（Ｉｃ）の化合物のいくつかの実施形態では、
Ｒ2はメチルまたはエチル、特にメチルであり；
Ｒ3はメチル、メトキシ、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチルおよびトリフルオロメトキシから選択され；
Ｒ1は上で定義した通りである。
【００６９】
式（Ｉａ）の化合物のいくつかの特定の実施形態では、Ｒ3はパラ位にあり、Ｒ4はＨであり、ここで定義される化合物は、次式（Ｉｄ）によって表すことができる：
【化６】
2018511586.tif 000007
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、上で定義した通りである。
【００７０】
式（Ｉｄ）の化合物のいくつかの特定の実施形態では、Ｒ2はメチルまたはエチル、特にメチルであり；Ｒ3はメチル、メトキシ、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチルおよびトリフルオロメトキシから選択され；Ｒ1はここで定義される通りである。
【００７１】
本発明の目的上、式（Ｉ）の化合物に対する言及は、特に示さない限り又は文脈から明らかな限り、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）（Ｉｃ）および（Ｉｄ）のいずれか一つの化合物に対する言及であると解すべきである。
【００７２】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）および（Ｉｄ）において上で定義されたタスキニモド様化合物のいずれかまたは全ては、癌の治療用のＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤と併用して相乗効果を示すことが予想される。したがって、本発明は、特に癌に使用するための、特に膀胱癌に使用するための薬剤としての使用のためのタスキニモド様化合物とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤との組み合わせ剤に関するものでもある。タスキニモドとＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤との組み合わせ剤について本明細書に記載される全ての実施形態は、タスキニモド様化合物とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤との組み合わせ剤についても同様に適用される。同様に、医薬組成物、製品、キット、治療方法および使用について本明細書に記載される全ての実施形態は、タスキニモド様化合物とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤との組み合わせ剤にも同様に適用される。
【００７３】
タスキニモドまたはタスキニモド様化合物の「薬学的に許容される塩」とは、化合物がその酸塩または塩基塩を生成することによって修飾されることを意味する。薬学的に許容される塩としては、化合物の従来の非毒性塩または第四級アンモニウム塩、例えば非毒性無機酸または有機酸が挙げられる。例えば、このような従来の非毒性塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸；及び酢酸、プロパン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、トルエンスルホン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸などの有機酸から誘導されたものが挙げられる。さらなる付加塩としては、トロメタミン、メグルミン、エポラミンなどのアンモニウム塩、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛またはマグネシウムなどの金属塩が挙げられる。タスキニモドの薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって親化合物から合成できる。一般に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸または遊離塩基形態と化学量論量の適切な塩基または酸とを、水中若しくは有機溶媒中またはその２種の混合物中で反応させることによって製造できる。一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。好適な塩のリストがＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８５，ｐ．１４１８に記載されている。
【００７４】
ＰＤ−１は、免疫グロブリンスーパーファミリーのＩ型膜貫通タンパク質であり（Ｉｓｈｉｄａ外，Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＰＤ−１，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｕｐｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １９９２；  １１（１１）：３８８７−９５）、その構造は、免疫グロブリンの可変領域に類似した細胞外ドメインを含み、その後膜貫通領域および細胞質テールを含む（Ｚｈａｎｇ外，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００４；  ２０（３）：３３７−４）。
【００７５】
このものは、Ｂ７タンパク質ファミリーに属するＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４）およびＰＤＬ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）として知られている２つのリガンドに結合する。ＰＤ−Ｌ１は、分化クラスター２７４（ＣＤ２７４）またはＢ７相同体１（Ｂ７−Ｈ１）としても知られており、ヒトにおいてはＣＤ２７４遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＰＤ−Ｌ１は、妊娠、組織同種移植、自己免疫疾患および肝炎などの他の疾患状態といった特定の事象中に免疫系を抑制するのに主要な役割を果たすと推測されている４０ｋＤａの１型膜貫通タンパク質である。通常、免疫系は外来抗原に反応し、その際、リンパ節または脾臓に蓄積し、これが抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の引き金となる。ＰＤ−１受容体／ＰＤ−Ｌ１またはＢ７．１受容体ＰＤ−Ｌ１リガンド複合体の形成がこれらのＣＤ８＋Ｔ細胞のリンパ節での増殖を減少させる阻害シグナルを伝達し、また、ＰＤ−１の補充も、Ｂｃｌ−２遺伝子のより低い調節によってさらに仲介されるアポトーシスによるリンパ節における外来抗原特異的Ｔ細胞の蓄積を制御することができる（Ｃｈｅｍｎｉｔｚ外，（２００４年７月）、ＳＨＰ−１  ａｎｄ  ＳＨＰ−２  ａｓｓｏｃｉａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｓｗｉｔｃｈ  ｍｏｔｉｆ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ  １  ｕｐｏｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，  ｂｕｔ  ｏｎｌｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７３  （２）：  ９４５−５４）。
【００７６】
「ＰＤ−１阻害剤」とは、ＰＤ−１の生物学的効果の任意の阻害剤またはアンタゴニスト、すなわちＰＤ−１とそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１およびＰＤＬ２との相互作用を遮断する分子を意味する。
【００７７】
「ＰＤ−Ｌ１阻害剤」とは、ＰＤ−Ｌ１の生物学的効果の任意の阻害剤またはアンタゴニスト、すなわちＰＤ−Ｌ１とその受容体または複数の受容体、例えばＰＤ−１および／またはＢ７．１（ＣＤ８０）との相互作用を遮断する分子を意味する。
【００７８】
ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤は、例えば、小分子、ペプチド、タンパク質、抗体、拮抗性核酸、例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどとすることができる。
【００７９】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明に係る使用のための組み合わせ剤、または本発明に係る医薬組成物、または本発明に係る製品若しくはキット、または本発明に係る方法において、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤は、抗体またはペプチドから選択される。
【００８０】
当業者であれば、化合物がＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤であるかどうかを適切なアッセイで試験することによって決定する方法が分かる。ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤＬ２に対する阻害剤の結合は、例えば、当該分野において周知のＥＬＩＳＡ型アッセイで測定できる。ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤＬ２阻害の生物学的効果を測定するためのバイオアッセイは当業者に周知である。例えば、「混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ」と呼ばれるアッセイが記載されている（ポスターＬＢ−２６６、米国癌学会２０１４年会議、ＡＡＣＲ２０１４で提示）。このアッセイでは、ヒトのドナーから単離された末梢血単球を樹状細胞（ＤＣ）に分化させ、次いで第２ドナーから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞と混合する。漸増濃度のＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤の存在下または非存在下で４８時間後にＩＬ−２レベルを成熟させ、阻害剤が抗体である場合にはアイソタイプ対照などの適切な対照と比較する。
【００８１】
ペプチドである好適なＰＤ−Ｌ１阻害剤の例は、例えば、  ＷＯ２０１３／１４４７０４号に記載されているペプチド、特に、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ：ＡＡＣＲ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ２０１４；Ａｐｒｉｌ  ５−９，２０１４；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡに記載されかつＰＤ−Ｌ１活性およびＰＬＤ２活性の両方に拮抗する、ＡＵＲ−０１２と呼ばれるペプチドである。
【００８２】
「ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１抗体」とは、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１経路を、好ましくはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との結合を阻害することにより遮断することができる抗体を意味する。このような抗体は当業者に知られている。例としては、ＯＮＯ−４５３８、ＢＭＳ−９３６５５８またはＭＤＸ１１０６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）としても知られているニボルマブ、商品名Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）が挙げられる。ニボルマブはＩｇＧ４であり、ＰＤ−１を阻害する。さらなる例は、ＭＫ−３４７５（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．）としても知られているペンブロリズマブ、ＣＴ−０１１（ＣｕｒｅＴｅｃｈ）としても知られているのみならずＰＤ−１を阻害するピジリズマブである。ＰＤ−Ｌ１抗体の例は、例えば、ＢＭＳ９３６５５９、完全ヒト化ＩＧＧ４抗体、またはＭＰＤＬ３２８０Ａ若しくはＭＥＤＩ４７３６（両方ともヒトＩｇＧ１抗体）である。ＡＭＰ−２２４は、ＰＤ−１受容体を競合的に遮断することができるＢ７−ＤＣ−Ｆｃ融合タンパク質である。ＡＭＰ−２２４などの融合タンパク質は、本発明の組み合わせ剤、医薬組成物、生成物、キットまたは方法において使用することができるＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ（ＭＤＸ−１１０６）、ペンブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ３４７５）およびＣＴ−０１１よりなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤はイムノアドヘシン、例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域などの定常領域に融合されたＰＤ−Ｌ１またはＰＤＬ２の細胞外またはＰＤ−１結合部分を含むイムノアドヘシンである。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤はＡＭＰ−２２４である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ）およびＭＤＸ−１１０５よりなる群から選択される。ＢＭＳ−９３６５５９としても知られているＭＤＸ−１１０５は、ＷＯ２００７／００５８７４号に記載されている抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０は、ＷＯ２０１０／０７７６３４号に記載されている抗ＰＤ−Ｌ１である。ＭＤＸ−１１０６−０４、ＯＮＯ−４５３８またはＢＭＳ−９３６５５８としても知られているＭＤＸ−１１０６は、ＷＯ２００６／１２１１６８号に記載されている抗ＰＤ１抗体である。ＭＫ−３４７５またはＳＣＨ−９００４７５としても知られているＭｅｒｃｋ３７４５は、ＷＯ２００９／１１４３３５号に記載されている抗ＰＤ−１抗体である。ｈＢＡＴまたはｈＢＡＴ−１としても知られているＣＴ−０１１は、ＷＯ２００９／１０１６１号に記載されている抗ＰＤ−１抗体である。Ｂ７−ＤＣＩｇとしても知られているＡＭＰ−２２４は、ＷＯ２０１０／０２７８２７号およびＷＯ２０１１／０６６３４２号に記載されているＰＤＬ２−Ｆｃ融合可溶性受容体である。アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）は、転移性膀胱癌において有望な結果を示したため、本発明の枠内での使用に好ましい抗体である。特に、アテゾリズマブの製造元であるＲｏｃｈｅは、２０１５年７月に次の点を公開した：
・このフェーズ１ａ試験においてＰＤ−Ｌ１発現レベルが最も高い患者の半数以上（５７％）が１年生存していた；
・完全応答（ＣＲ）が２０％の人々で観察された；
・結果は、ＰＤ−Ｌ１の発現が、以前にアテゾリズマブによる治療を受けた転移性膀胱癌の人々とよく相関することを示した。
【００８４】
本発明の一実施形態では、本発明に係る使用のための組み合わせ剤、または本発明に係る医薬組成物、または本発明に係る製品、または本発明に係る方法において、好ましいＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１抗体は、ペンブロリズマブおよびニボルマブである。本発明の範囲内で使用するための別の好ましい抗体はアテゾリズマブである。
【００８５】
本発明の一実施形態では、本発明に係る使用のための組み合わせ剤、または本発明に係る医薬組成物、または本発明に係る製品、または本発明に係る方法は、タスキニモドまたはその任意の薬学的に許容される塩、およびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体としてのペンブロリズマブを含む。
【００８６】
本発明の一実施形態では、本発明に係る使用のための組み合わせ剤、または本発明に係る医薬組成物、または本発明に係る製品、または本発明に係る方法は、タスキニモドまたはその任意の薬学的に許容される塩、およびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体としてのピジリズマブを含む。
【００８７】
本発明の一実施形態では、本発明に係る使用のための組み合わせ剤、または本発明に係る医薬組成物、または本発明に係る製品、または本発明に係る方法は、タスキニモドまたはその任意の薬学的に許容される塩及びＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体としてのニボルマブを含む。
【００８８】
本発明の一実施形態では、本発明に係る使用のための組み合わせ剤、または本発明に係る医薬組成物、または本発明に係る製品、または本発明に係る方法は、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩及びＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体としてのアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）を含む。
【００８９】
本発明の一実施形態では、本発明に係る使用のための組み合わせ剤、または本発明に係る医薬組成物、または本発明に係る製品、または本発明に係る方法は、タスキニモドまたはその任意の薬学的に許容される塩及びＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体としてのＢＭＳ９３６５５９を含む。
【００９０】
本発明の一実施形態では、本発明に係る使用のための組み合わせ剤、または本発明に係る医薬組成物、または本発明に係る製品、または本発明に係る方法は、タスキニモドまたはその任意の薬学的に許容される塩およびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１阻害剤としてのＡＵＲ−０１２を含む。
【００９１】
「抗体」は、２つの重鎖がジスルフィド結合によって互いに結合し、各重鎖がジスルフィド結合によって軽鎖に結合した天然または従来の抗体とすることができる。軽鎖にはラムダ（ｌ）とカッパ（ｋ）の２種類がある。抗体分子の機能活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（または同位体）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥがあり、それぞれα、δ、ε、γおよびμと称する重鎖を有する。γおよびαクラスは、ＣＨ配列および機能の比較的わずかな相違に基づいてさらにサブクラスに分類され、例えば、ヒトは次のサブクラスを発現する：ＩｇＧ配列、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２。各鎖は異なる配列ドメインを含む。軽鎖は、２つのドメインまたは領域、すなわち可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、すなわち１個の可変ドメイン（ＶＨ）および３個の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、まとめてＣＨと呼ばれる）を含む。軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原に対する結合認識および特異性を決定する。軽（ＣＬ）鎖および重（ＣＨ）鎖の定常領域ドメインは、抗体鎖会合、分泌、終胎盤移動性、補体結合およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）に対する結合などの重要な生物学的特性を付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、かつ、１個の軽鎖および１個の重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性に帰する。抗体結合部位は、主として超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基から構成される。非高頻度可変領域またはフレームワーク領域（ＦＲ）由来の残基がドメイン構造全体、そのため結合部位に影響を及ぼす場合がある。相補性決定領域またはＣＤＲとは、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を共に規定するアミノ酸配列をいう。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれＣＤＲ１−Ｌ、ＣＤＲ２−Ｌ、ＣＤＲ３−ＬおよびＣＤＲ１−Ｈ、ＣＤＲ２−Ｈ、ＣＤＲ３−Ｈと呼ばれる３つのＣＤＲを有する。したがって、従来の抗体抗原結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域のそれぞれからのＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを有する。
【００９２】
「フレームワーク領域」（ＦＲ）とは、ＣＤＲ間、すなわち、単一種の異なる免疫グロブリン間で比較的保存されている免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域の部分に挟まれたアミノ酸配列をいう。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれＦＲ１−Ｌ、ＦＲ２−Ｌ、ＦＲ３−Ｌ、ＦＲ４−ＬおよびＦＲ１−Ｈ、ＦＲ２−Ｈ、ＦＲ３−Ｈ、ＦＲ４−Ｈと呼ばれる４つのＦＲを有する。
【００９３】
本明細書で使用するときに、「ヒトフレームワーク領域」は、天然型ヒト抗体のフレームワーク領域と実質的に同一である（約８５％以上、特に９０％、９５％、９７％、９９％または１００％）であるフレームワーク領域である。
【００９４】
本明細書で使用するときに、用語「抗体」とは、従来の抗体およびそのフラグメント、並びに単一ドメイン抗体およびそのフラグメント、特に単一ドメイン抗体の可変重鎖およびキメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体をいう。
【００９５】
本明細書で使用するときに、抗体または免疫グロブリンには、直近で記載しかつ相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体である「単一ドメイン抗体」も含まれる。単一ドメイン抗体の例としては、重鎖抗体、軽鎖が天然には存在しない抗体、従来の４本鎖抗体から誘導される単一ドメイン抗体、操作された単一ドメイン抗体が挙げられる。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギおよびウシ（これらに限定されない）を含めた任意の種に由来することができる。単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠く重鎖抗体として知られている天然に存在する単一ドメイン抗体でとすることができる。特に、ラクダ科の種、例えばラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカおよびグアナコは、軽鎖を天然に欠く重鎖抗体を産生する。ラクダ科の重鎖抗体は、ＣＨ１ドメインも欠失している。
【００９６】
軽鎖を欠くこれらの単一ドメイン抗体の可変重鎖は、当該技術分野では「ＶＨＨ」または「ナノボディ」として知られている。従来のＶＨドメインと同様に、ＶＨＨは４つのＦＲおよび３つのＣＤＲを含む。ナノボディは、従来の抗体を超える利点がある：これらは、ＩｇＧ分子の約１０分の１であり、その結果、適切に折りたたまれた機能的なナノボディを試験管内発現によって産生できると共に高い収率を達成することができる。さらに、ナノボディは非常に安定であり、プロテアーゼの作用に耐性がある。ナノボディの特性および産生は、Ｈａｒｍｓｅｎ及びＤｅ  Ｈａａｒｄ  ＨＪによって概説されている（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７  Ｎｏｖ；７７（１）：１３−２２）。
【００９７】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体とすることができる。該モノクローナル抗体はヒト化されていてもよい。別の例では、抗体は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディおよびＶＨＨよりなる群から選択されるフラグメントとすることができる。
【００９８】
本明細書で使用するときに、用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」とは、特定の抗原に対して指向される単一アミノ酸組成の抗体分子をいい、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとは解釈されない。モノクローナル抗体は、Ｂ細胞またはハイブリドーマの単一のクローンによって産生され得るが、組換え、すなわちタンパク質工学によって産生されてもよい。
【００９９】
用語「キメラ抗体」とは、その最も広い意味において、１種の抗体からの１以上の領域および１種以上の他の抗体からの１以上の領域を含む操作された抗体をいう。特に、キメラ抗体は、別の抗体、特にヒト抗体のＣＨドメインおよびＣＬドメインに関して、非ヒト動物由来の抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む。非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等の任意の動物を使用することができる。また、キメラ抗体は、少なくとも２種の異なる抗原に対する特異性を有する多重特異性抗体を示すこともできる。一実施形態では、キメラ抗体は、マウス由来の可変ドメインおよびヒト由来の定常ドメインを有する。
【０１００】
用語「ヒト化抗体」とは、最初は完全にまたは部分的に非ヒト起源であり、かつ、ヒトにおける免疫応答を回避する又は最小化するために、特に重鎖および軽鎖のフレームワーク領域内における所定のアミノ酸を置換するように改変された抗体をいう。ヒト化抗体の定常ドメインは、ほとんどの場合、ヒトＣＨおよびＣＬドメインである。一実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト由来の定常ドメインを有する。
【０１０１】
抗体の「フラグメント」は、完全な抗体の一部、特に完全な抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、抗体フラグメントから形成されるＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディ、二重特異性抗体および多重特異性抗体が挙げられる。抗体のフラグメントは、重鎖抗体またはＶＨＨなどの単一ドメイン抗体であってもよい。
【０１０２】
用語「Ｆａｂ」とは、約５０，０００Ｄａの分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、ＩｇＧをプロテアーゼであるパパインで処理したフラグメントのうち、Ｈ鎖のＮ末端側およびＬ鎖全体の約半分がジスルフィド結合で結合しているものをいう。
【０１０３】
用語「Ｆ（ａｂ’）２」は、約１００，０００Ｄａの分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、ＩｇＧをプロテアーゼのペプシンで処理することによって得られたフラグメントのうち、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたＦａｂよりもわずかに大きいものをいう。
【０１０４】
用語「Ｆａｂ’」とは、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる、約５０，０００Ｄａの分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントをいう。
【０１０５】
一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドコードリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬコード遺伝子を含めた遺伝子融合体から通常発現される、共有結合ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。本発明のヒトｓｃＦｖフラグメントは、特に遺伝子組換え技術を使用することにより、適切なコンフォメーションで保持されるＣＤＲを含む。二価および多価抗体フラグメントは、一価ｓｃＦｖの会合によって自発的に形成できる又は二価ｓｃ（Ｆｖ）2などのペプチドリンカーによって一価ｓｃＦｖを結合させることによって生成できる。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合によって安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。
【０１０６】
「（ｄｓＦｖ）２」とは、ペプチドリンカーによって結合した２個のｄｓＦｖをいう。
【０１０７】
用語「二重特異性抗体」または「ＢｓＡｂ」とは、単一分子内の２つの抗体の抗原結合部位を組み合わせた抗体をいう。したがって、ＢｓＡｂは２つの異なる抗原に同時に結合することができる。例えば欧州特許出願公開第２００５０７６４号明細書に記載されているように、所望の結合特性およびエフェクター機能のセットを有する抗体または抗体誘導体を設計、修飾および産生するために遺伝子工学がますます使用されている。
【０１０８】
用語「多重特異性抗体」とは、単一分子内の２つ以上の抗体の抗原結合部位を組み合わせた抗体をいう。
【０１０９】
用語「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントであって、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結されたものをいう。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合し、２つの抗原結合部位を形成する。
【０１１０】
典型的には、抗体は従来の方法に従って調製される。モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５）の方法を使用して生成できる。本発明に有用なモノクローナル抗体を調製するために、マウスまたは他の適切な宿主動物を、適切な抗原形態を用いて好適な間隔（例えば、週２回、週１回、月２回または月に２回）で免疫化する。この動物に、犠牲の１週間以内に抗原の最終的な「追加免疫」を投与することができる。免疫化の間に免疫アジュバントを使用することが望ましい場合が多い。好適な免疫アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、Ｒｉｂｉアジュバント、ハンターのＴｉｔｅｒｍａｘ、サポニンアジュバント、例えばＱＳ２１若しくはＱｕｉｌＡ、またはＣｐＧ含有免疫刺激性オリゴヌクレオチドが挙げられる。他の好適なアジュバントは当該分野において周知である。動物を、皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、鼻腔内または他の経路によって免疫化できる。所定の動物は、複数の経路によって抗原の複数の形態で免疫化可能である。
【０１１１】
本発明は、所定の実施形態において、抗体のヒト化形態を含む組成物および方法を提供する。ヒト化の方法としては、米国特許第４，８１６，５６７号、同第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号及び同第５，８５９，２０５号に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。これらの文献は参照により本明細書において援用する。また、上記米国特許第５，５８５，０８９号および第５，６９３，７６１号並びにＷＯ９０／０７８６１号は、ヒト化抗体を設計する際に使用できる４つの可能な基準を提案する。第１の提案は、受容体について、ヒト化されるドナー免疫グロブリンに対して著しく相同的である特定のヒト免疫グロブリン由来のフレームワークを使用すること、または多くのヒト抗体由来のコンセンサスフレームワークを使用することであった。第２の提案は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク中のアミノ酸が異常であり、その位置のドナーアミノ酸がヒト配列に典型的である場合に、アクセプターではなくドナーアミノ酸を選択することができることであった。第３の提案は、ヒト化免疫グロブリン鎖中の３つのＣＤＲにすぐ隣接する位置において、アクセプターアミノ酸ではなくドナーアミノ酸を選択することができることであった。第４の提案は、アミノ酸が抗体の３次元モデルにおいてＣＤＲの３Ａ以内に側鎖原子を有すると予測され、かつ、ＣＤＲと相互作用することができると予測されるフレームワーク位置にドナーアミノ酸残基を使用することであった。上記の方法は、当業者がヒト化抗体を作製するために使用することができる方法のいくつかの単なる例示である。当業者であれば、抗体ヒト化のための他の方法に精通しているであろう。
【０１１２】
抗体のヒト化形態の一実施形態では、ＣＤＲ領域の外側にあるアミノ酸のいくつか、ほとんどまたは全てがヒト免疫グロブリン分子由来のアミノ酸で置換されているが、１以上のＣＤＲ領域内のいくつか、ほとんどまたは全てのアミノ酸は変更されていない。所定の抗原に結合する抗体の能力を無効にしない限りにおいて、アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換または修飾が許容される。好適なヒト免疫グロブリン分子としては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＭ分子が挙げられるであろう。「ヒト化」抗体は、元の抗体と同様の抗原特異性を保持する。しかしながら、所定のヒト化方法を使用して、抗体の結合の親和性および／または特異性をＷｕ外，／．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１，１９９９に記載されるような「指向進化」の方法を用いて増大させることができる。この文献の内容を参照により本明細書において援用する。
【０１１３】
また、完全ヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックマウスを免疫することによって調製することもできる。例えば、米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５９８，３６９号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５４５，８０７号、同第６，１５０，５８４号およびこれらで引用された文献を参照されたい。これらの文献は本明細書において参照により援用する。これらの動物は、内因性（例えば、マウス）抗体の産生において機能的欠失が存在するように遺伝子改変されている。さらに、これらの動物は、これらの動物の免疫感作により目的の抗原に対する完全なヒト抗体が産生されるように、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含むように改変される。これらのマウス（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ）、ＨｕＭＡｂマウス（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＧｅｎＰｈａｒｍ））の免疫化後に、モノクローナル抗体を標準的なハイブリドーマ技術に従って調製することができる。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有するので、ヒトに投与した際にヒト抗マウス抗体（ＫＡＭＡ）応答を引き起こさない。
【０１１４】
ヒト抗体を産生するために試験管内方法も存在する。これらの方法としては、ファージディスプレイ技術（米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号）並びにヒトＢ細胞の試験管内刺激（米国特許第５，２２９，２７５号および同第５，５６７，６１０号）が挙げられる。これらの特許文献の内容を参照により本明細書において援用する。
【０１１５】
一実施形態では、本発明の抗体は、抗体が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）機能を仲介する能力を低減又は阻害するように改変される（すなわち、Ｆｃエフェクター機能が低下した抗体）。特に、本発明の抗体はＦｃ部分を有さずまたはＦｃγＲＩおよびＣ１ｑに結合しないＦｃ部分を有する。一実施形態では、抗体のＦｃ部分はＦｃγＲＩ、Ｃ１ｑまたはＦｃγＲＩＩＩに結合しない。このような機能を有する抗体は一般的に知られている。このような抗体、例えばＩｇＧ４のＦｃ領域を有する抗体が天然に存在する。抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）機能を排除するために遺伝的にまたは化学的に改変されたＦｃ部分を有する抗体も存在する。
【０１１６】
本明細書で使用するときに、用語「治療する」、「治療される」または「治療」は、被験体の症状を無くすまたは軽減する治療的処置をいう。有益なまたは望ましい臨床結果としては、症状の消失、症状の緩和、状態の程度の減少、状態の安定化（すなわち悪化しない）状態、状態の進行の遅延または遅延が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
本明細書で使用するときに、他に定義されない限り、「癌」とは、体内の異常な細胞の増殖、分裂または増殖をいう。本明細書に記載した組み合わせ剤、医薬組成物、製品および方法で治療することができる癌としては、膀胱癌、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）などの肺癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、腎細胞癌、血液系腫瘍、特に進行性血液系腫瘍、卵巣癌、特に白金耐性卵巣癌、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）および胃腸膵臓神経内分泌腫瘍（ＧＥＰ−ＮＥＴ）が挙げられるが、これらに限定されない。特に、上記のように、本発明に従って治療できる癌の１つは、膀胱癌、例えば非筋肉浸潤性膀胱癌、筋肉浸潤性膀胱癌および転移性尿路上皮膀胱癌である。
【０１１８】
本発明は、上で詳細に説明した膀胱癌のカテゴリーおよび／またはステージのいずれか、特にステージＩ以上の進行期またはステージＩＩ以上の進行期またはステージＩＩＩの治療に関する。
【０１１９】
以下の実施例２に示すように、実験的腫瘍モデルからのデータは、タスキニモドによる癌の治療が、タスキニモドの抗腫瘍効果を減弱させる場合がある骨髄細胞上でのＰＤ−Ｌ１レベルを増加させる可能性があることを示す。したがって、タスキニモドにＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１阻害剤を添加すると、タスキニモドの抗腫瘍活性を増強することができる。
【０１２０】
このデータを考慮すると、本発明は、癌細胞がＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤＬ２の検出可能なまたは増加したレベルを発現する癌に罹患している患者を、タスキニモドとＰＤ−１および／またはＰＬＤ１阻害剤との組み合わせ剤の治療上有効な量をその治療を必要とする患者に投与することによって治療する方法に関するものでもある。
【０１２１】
一実施形態では、まず、患者を第１期間にわたってタスキニモドで治療し、その後、第２期間にわたって本発明に係る組み合わせ剤で治療する。第１期間は、例えば、患者由来の癌細胞が検出可能なレベルのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤＬ２を発現しない期間とすることができる。第２期間は、例えば、患者由来の癌細胞が検出可能なレベルのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤＬ２を発現する期間とすることができる。
【０１２２】
結果として、本発明は、癌細胞が検出可能な又は増加レベルのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤＬ２を発現する癌の治療に使用するための、本発明に係る使用のための組み合わせ剤、または本発明に係る医薬組成物、または本発明に係る製品（キットを含む）に関するものでもある。例えば、本発明の組み合わせ剤は、癌細胞が検出可能なレベルのＰＤ−Ｌ１を発現する膀胱癌の治療に使用することができる。
【０１２３】
さらに、本発明は、癌、例えば膀胱癌に罹患している患者であって、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤とを含む組み合わせ剤による治療によって最も利益を受ける可能性が高い患者を同定するための方法であって、該方法は、
（ｉ）該患者から得られた試料において、癌細胞によって発現されたＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤＬ２の発現レベルを決定すること
を含み、基準値と比較した、該患者から得られた試料におけるＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤＬ２の検出可能なまたは増加したレベルは、該患者が該組み合わせ剤による治療から最も利益を受ける可能性が高いことを示す方法に関するものでもある。
【０１２４】
ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤＬ２の発現レベルは、例えば、当業者に知られている任意の方法、例えば、ＰＣＲによるＲＮＡ発現分析、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ、またはイムノアッセイ、例えば酵素結合免疫吸着測定法、またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析の分析方法、例えば、質量分析（ＭＳ）、キャピラリー電気泳動質量分析法（ＣＥ−ＭＳ）、質量分析計に結合された液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）などによって決定できる。
【０１２５】
本発明に従って使用される「イムノアッセイ」という用語には、競合、直接反応またはサンドイッチ型アッセイが含まれる。このようなアッセイとしては、凝集試験、酵素標識および仲介イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ビオチン／アビジン型アッセイ、放射免疫測定法、免疫電気泳動法、および免疫沈降法などが挙げられるがこれらに限定されず、また、より直接的にはＥＬＩＳＡに関連する。
【０１２６】
質量分析（ＭＳ）、キャピラリー電気泳動質量分析（ＣＥ−ＭＳ）、質量分析に結合した液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）は、全て当業者に周知の分析方法である。
【０１２７】
上で引用した技術は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤＬ２のレベルを測定するための適切な方法として記載されているが、本発明の範囲はこれらの例には限定されない。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤＬ２の発現レベルを検出するための当業者に知られている他の方法を使用することができる。
【０１２８】
本明細書で使用するときに、用語「試料」とは、生物起源の物質を意味する。生物学的試料の例としては、血液、血漿、血清、生検または唾液が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の生物学的試料は、当業者に知られている任意の適切なサンプリング手段によって被験体から得ることができる。
【０１２９】
癌細胞におけるＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤＬ２の発現レベルを決定するために、試料は、好ましくは腫瘍、例えば膀胱腫瘍の生検である。
【０１３０】
好ましくは、基準値は、上記の方法の工程（ｉ）の患者の試料と同じ組織由来の試料で測定される。
【０１３１】
好ましくは、「基準値」は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤＬ２の正常レベルに対応する。
【０１３２】
本明細書の目的上、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤＬ２の「正常レベル」とは、試料中のＰＤ−Ｌ１のレベルが、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤＬ２についての標準カットオフ値内にあることを意味する。標準は、試料の種類および試料中におけるＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤＬ２のレベルを測定するために使用される方法に依存する。特に、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤＬ２の基準値は、正常細胞におけるＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤＬ２の発現の非存在または基礎レベルに相当し得る。
【０１３３】
検出可能な発現レベルは、患者の生物学的試料中におけるＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤＬ２の発現レベルがＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤＬ２の検出不可能レベルから検出可能レベルにまで増加した場合に統計学的に有意であると考えられる。患者の生物学的試料中におけるＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤＬ２の発現レベルが、発現レベルの基準値と比較して少なくとも１０または１５または２０または２５または３０または３５または４０又は４５または５０％のオーダーで増加した場合に、発現レベルの増加は統計学的に有意であると考えられる。
【０１３４】
これに関連して、癌、例えば膀胱癌に罹患している患者であってタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤とを含む組み合わせ剤による治療から最も利益を受ける可能性の高い患者を同定するための方法は、キットを使用して実施できる。このキットは、例えば、患者試料中におけるＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１を検出するための薬剤を含むことができる。ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤は、好ましくは抗体である。患者試料は、治療される腫瘍についての任意の適切な試料、例えば、膀胱壁由来の血液、尿または生検から選択される。このキットは、患者を治療するために使用されるタスキニモドとＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤とをさらに含むことができる。
【０１３５】
本明細書で使用するときに、用語「患者」とは、本明細書に記載される１以上の疾患および状態に罹患している又はそれに罹患している可能性がある哺乳動物、特にヒトの男性または女性などの温血動物をいう。
【０１３６】
本明細書で使用するときに、「治療有効量」とは、本明細書に記載の疾患および状態の症状を軽減し、無くし、治療しまたは制御するのに有効な量をいう。「有効量」は、少なくとも、特定の疾患の測定可能な改善または予防を達成するのに必要な最小濃度である。本明細書における有効量は、患者の疾患状態、年齢、性別、および体重並びに個体において所望の応答を誘発する抗体の能力などの因子によって変化する場合がある。また、有効量は、治療の毒性または有害な影響を治療上有益な効果が上回る量である。予防的使用について、有益なまたは望ましい結果としては、リスクの排除しまたは減少させること、重症度の軽減させること、または疾患の発生中に現れる疾患の生化学的、組織学的および／または行動的症状、その合併症および中間病理学的表現型を含めた疾患の発症を遅延させることなどの結果が挙げられる。治療的使用について、有益なまたは望ましい結果としては、疾患に起因する１以上の症状を減少させること、疾患に罹患している人々の生活の質を向上させること、疾患を治療するのに必要な他の薬物の用量を減少させること、例えば標的化を介して別の薬物の効果を増強させること、疾患の進行を遅延させること、および／または生存を延長することなどの結果が挙げられる。癌または腫瘍の場合には、薬物の有効量が癌細胞の数を減少させる；腫瘍のサイズを減少させる；末梢器官への癌細胞浸潤を阻害する（すなわち、ある程度減速させるまたは望ましく停止させる）；腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度減速させ、望ましくは停止させる）；腫瘍増殖をある程度阻害する；および／または障害に関連する症状の１以上をある程度緩和することに影響を及ぼすことができる。有効量を１回以上の投与で投与することができる。本発明の目的上、薬剤、化合物、若しくは医薬組成物またはそれらの組み合わせの有効量は、予防的または治療的処置を直接的または間接的に達成するのに十分な量である。また、２種以上の治療剤を投与する状況における「有効量」とは、１種以上の他の薬剤と併せて望ましい結果が達成され得るまたは達成される場合には、単一の薬剤の量をいう。
【０１３７】
「制御する」という用語は、本明細書に記載の疾患および状態の進行を減速させ、遅延し、中断し、阻止しまたは停止させることができる全てのプロセスをいうことを意図するが、ただし必ずしも全ての疾患及び症状を完全に無くすことを示しているわけではなく、予防的治療および慢性的使用を含むことを意図する。
【０１３８】
本明細書で使用するときに、「薬学的に許容される賦形剤」とは、哺乳動物、特にヒトに適切に投与されたときに、有害なアレルギー性その他の有害な反応を生じさせない分子物質および組成物をいう。薬学的に許容される賦形剤は、任意のタイプの非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料または製剤助剤をいう。
【０１３９】
一実施形態では、本発明に係る使用のための組み合わせ剤、または本発明に係る医薬組成物、または本発明による製品を使用して、化学療法がまだ臨床的に示されていない患者の膀胱癌を治療する。
【０１４０】
したがって、本発明は、癌、特に膀胱癌の第一選択治療としての治療に使用するための、本発明に係る使用のための組み合わせ剤、または本発明に係る医薬組成物、または本発明に係る製品に関するものでもある。
【０１４１】
また、本発明は、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤、特に抗体とを含む組み合わせ剤が第一選択治療である、本発明に係る治療方法に関するものでもある。
【０１４２】
本発明において、「第一選択治療」または「第一選択療法」とは、癌、特に膀胱癌を治療するために与えられる最初の治療を意味する。これは手術及び放射線などの標準的な治療法の一部とすることができる。また、これはそれ自体でも使用できる。また、これは誘導療法または一次療法と呼ばれることもある。
【０１４３】
別の実施形態では、本発明に係る使用のための組み合わせ剤、または本発明に係る医薬組成物、または本発明に係る製品は、他の療法が以前の治療として示された患者の癌、特に膀胱癌を治療するために使用される。このような治療とは、手術、マイトマイシンＣなどの化学療法、シスプラチン系の化学療法、ゲムシタビン＋シスプラチンまたはメトトレキセート、ビンフルニン、ビンブラスチンまたはドキソルビシン、または放射線療法が挙げられる。
【０１４４】
したがって、本発明は、癌、特に膀胱癌の第二、第三又は第四選択治療としての治療に使用するための、本発明に係る使用のための組み合わせ剤、または本発明に係る医薬組成物、または本発明に係る製品に関するものでもある。
【０１４５】
また、本発明は、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩とＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１抗体とを含む組み合わせ剤が、第二、第三または第四選択治療である、本発明に係る治療方法に関する。
【０１４６】
「第二選択治療」または「第二選択療法」とは、化学療法（第一選択治療）などの初期治療が機能しない、または機能しなった場合に行われる治療を意味する。
【０１４７】
「第三選択治療」または「第三選択療法」とは、化学療法（第一選択治療）などの初期治療およびその後の治療（第二選択治療）の両方が機能しないまたは機能しなくなった場合に行われる治療を意味する。
【０１４８】
「第四選択治療」または「第四選択療法」とは、化学療法（第一選択治療）などの初期治療およびその後の治療（第二及び第三選択治療）の両方が機能しない又は機能しなくなった場合に行われる治療を意味する。
【０１４９】
一実施形態では、本発明に係る使用のための組み合わせ剤は、タスキニモドまたは薬学的に許容されるその塩と、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１抗体、特にペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）、ＭＫ−３４７５、Ｍｅｒｃｋ社）またはニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）またはアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）とからなる。
【０１５０】
本発明の組み合わせ剤、医薬組成物および製品の化合物は、様々な合成経路によって製造できる。試薬および出発物質は、市販されておりまたは当業者によって周知の技術で容易に合成される。
【０１５１】
本明細書に記載の疾患および状態の治療を必要とする被験体の同定は、当業者の能力および知識の範囲内にある。当業者であれば、臨床試験の使用により、身体検査および医療歴／家族歴、このような治療を必要とする被験体を容易に同定することができる。
【０１５２】
治療有効量は、当業者としての主治医または診断医によって、従来技術の使用によって、および同様の状況下で得られた結果を観察することによって容易に決定できる。治療有効量を決定する際には、主治医または診断医によって多くの要因が考慮される：例えば、被験体の種；そのサイズ、年齢、および一般的な健康状態；関与する特定の疾患；疾患の程度または重症度；個々の被験体の応答；投与される特定の化合物；投与の様式；投与される製剤の生物学的利用能特性；選択された投与計画；付随する薬剤の使用；他の関連する状況が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５３】
所望の生物学的効果を達成するために必要とされる本発明の組み合わせ剤、医薬組成物および製品の各化合物の量は、投与される薬剤の容量、使用される化合物の化学的特性（例えば疎水性）、化合物の効力、疾患のタイプ、患者の疾患状態、および投与経路を含めて、多数の要因に依存して変化し得る。
【０１５４】
特に、本発明に係る使用のための組み合わせ剤、または本発明に係る医薬組成物、または本発明に係る製品は、治療される疾患、特に癌においてＰＤ−１阻害剤および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤に対して活性なものとして知られている用量を含む。
【０１５５】
特に、本発明に係る使用のための組み合わせ剤、または本発明に係る医薬組成物、または本発明に係る製品は、０．００１〜５０、特に０．０１〜２０、好ましい実施形態では０．１〜５ｍｇ／日のタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩を含む。一実施形態では、タスキニモドは、本発明の枠内において約０．２５ｍｇまたは約０．５ｍｇまたは約１．０ｍｇ、好ましくは毎日、好ましくは経口で使用される。
【０１５６】
特に、本発明に係る使用のための組み合わせ剤、または本発明に係る医薬組成物、または本発明に係る製品は、０．１〜１または５ｍｇ／日のタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩と、治療される疾患、特に癌におけるＰＤ−１阻害剤および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤の活性用量に相当する用量とを含む。
【０１５７】
本発明に係る組み合わせ剤の各化合物は、別々に、連続的にまたは同時に投与できる。同時に投与される場合には、本発明の組み合わせ剤の化合物は、例えば、単一の医薬組成物で製剤化できる。あるいは、各化合物を製剤化して独立して投与することができる。
【０１５８】
したがって、本発明は、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩と、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤とを別々に、連続的にまたは同時に投与する、上記使用のための組み合わせ剤に関するものでもある。
【０１５９】
連続的に投与される場合には、投与の順序は柔軟性がある。例えば、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤は、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩の投与前に投与できる。あるいは、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩の投与は、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤の投与に先行することができる。
【０１６０】
一実施形態では、本発明の組み合わせ剤は、約０．５ｍｇのタスキニモドと約５ｍｇ／ｋｇのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤、例えば、ニボルマブ、イピリムマブまたはアテゾリズマブとを含む。
【０１６１】
一実施形態では、本発明の組み合わせ剤は、約０．２５ｍｇのタスキニモドと約３ｍｇ／ｋｇのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤、例えば、ニボルマブ、イピリムマブまたはアテゾリズマブとを含む。
【０１６２】
他の実施形態では、本発明の組み合わせ剤は、約０．１ｍｇのタスキニモドと約１ｍｇ／ｋｇのＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤、例えばニボルマブ、イピリムマブまたはアテゾリズマブとを含む。
【０１６３】
別々に投与される場合には、同一のまたは異なる投与様式によって投与できる。投与様式の例としては、非経口、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、並びに経口投与が挙げられる。本発明の一実施形態では、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤は非経口投与され、タスキニモドは経口投与される。
【０１６４】
別の実施形態では、本発明に係る使用のための組み合わせ剤、または本発明に係る医薬組成物、または本発明に係る製品は、経口投与のためのものである。
【０１６５】
上で定義した組み合わせ剤、医薬組成物および組成物の化合物を別々に、連続的にまたは同時に投与するかどうかにかかわらず、該組成物、組み合わせ剤および製品は様々な形態をとることができる。これらのものは、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２０版；Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｅｄ．；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２０００に記載されているように、製薬業界で周知の方法のいずれかによって調製できる。薬学的に相溶性のある結合剤および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含めることができる。経口組成物は、一般に、不活性希釈剤キャリアまたは食用キャリアを含む。これらのものは、単位用量形態で投与でき、ここで、用語「単位用量」とは、活性化合物自体を含む物理的および化学的に安定な単位用量としてまたは薬学的に許容される組成物として残る、患者に投与することができかつ容易に取り扱うことや包装することができる単回用量を意味する。
【０１６６】
ここで提供される化合物は、１種以上の薬学的に許容される賦形剤と混合することによって、医薬組成物に製剤化できる。このような組成物は、経口投与、特に錠剤またはカプセル剤、特に口腔内（ｌｙｏｃ）錠剤の形態又は非経口投与、特に液体溶液、懸濁液またはエマルジョンの形態での使用のために調製できる。
【０１６７】
特に、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１抗体は、注射用の形態で処方される。特に、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１抗体は、２週間または３週間ごとに投与される。例えば、ペンブロリズマブは、注射用の凍結乾燥粉末で処方され、３週間毎に２ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。ニボルマブは、注射用の液体形態で処方され、２週間ごとに３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０１６８】
特に、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩は、特に０．１〜１０ｍｇ、具体的には０．２〜１．５ｍｇのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩を含む錠剤または硬質ゼラチンカプセル剤の形態で、例えば該化合物の０．２５、０．５または１ｍｇの錠剤で処方される。特に、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩は、１日２回投与される。
【０１６９】
錠剤、丸薬、粉末剤、カプセル剤、トローチなどは、次の成分の１種以上、または類似の性質の化合物を含むことができる：微結晶性セルロースまたはトラガカントガムなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの希釈剤；デンプンおよびセルロース誘導体などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミントやサリチル酸メチルなどの香味剤。カプセル剤は、硬質カプセル剤または軟質カプセル剤の形態であってもよく、これらは一般に、可塑剤とブレンドされていてよいゼラチンブレンド並びにデンプンカプセル剤から作製される。さらに、投与単位形態は、投与単位の物理的形態を改変する様々な他の材料、例えば、糖、シェラック、または腸溶性物質の被覆剤を含むことができる。他の経口剤形シロップまたはエリキシル剤は、甘味剤、防腐剤、染料、着色剤および香味料を含むことができる。さらに、活性化合物は、速溶性、調節放出または徐放性製剤および処方物に取り入れることができ、このような徐放性製剤は好ましくはバイモーダルである。
【０１７０】
例えば、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩は、錠剤または硬質ゼラチンカプセル剤の形態で製剤化できる。
【０１７１】
例えば、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤は、注射による投与のために再構成および／または希釈された液体または凍結乾燥粉末の形態で製剤化できる。
【０１７２】
投与用の液体製剤としては、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。また、液体組成物は、結合剤、緩衝剤、保存剤、キレート剤、甘味剤、香味剤および着色剤などを含むことができる。非水性溶媒としては、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、アクリレート共重合体、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの有機エステルが挙げられる。
【０１７３】
水性キャリアとしては、アルコールと水の混合物、ヒドロゲル、緩衝媒体、および生理食塩水が挙げられる。特に、生体適合性で生分解性のラクチド重合体、ラクチド／グリコリド共重合体、またはポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン共重合体は、活性化合物の放出を制御するのに有用な賦形剤であることができる。静脈内ビヒクルとしては、液体および栄養補充剤、電解質補充剤、例えばリンガーデキストロースをベースとするものなどを挙げることができる。
【０１７４】
本発明の使用、医薬組成物、製品、キットまたは治療方法の組み合わせを、癌、例えば進行性膀胱癌などの膀胱癌の適切な追加治療、例えば化学療法または膀胱切除とさらに組み合わせることができる。
【０１７５】
本発明を、次の図面および実施例によってさらに例示する。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】タスキニモドとＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせ剤は単独療法と比較して抗腫瘍効果を相乗的に増幅する。
【図２】腫瘍接種後１０日目から１日２回３０ｍｇ／ｋｇのタスキニモドの経口投与で治療したマウスに由来するＭＢＴ−２腫瘍における遺伝子発現プロファイリング。タスキニモド治療を１０日間実施した。データは、対照腫瘍と比較した治療腫瘍の倍数変化として表される。
【図３】タスキニモドで治療した腫瘍を有するマウス由来のＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＰＤ−Ｌ１のメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）。マウスを腫瘍接種後１０日目から毎日２回３０ｍｇ／ｋｇのタスキニモド経口投与で治療した。タスキニモド治療を７日間実施した。この分析はサイトメトリーにより行った。
【図４】タスキニモドによる治療は、確立されたＭＢＴ−２腫瘍増殖に影響を及ぼさず、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸のプロファイルの変化を誘導した。腫瘍細胞接種後１１日目（ｎ＝１２）の無作為化後の３０ｍｇ／ｋｇ（経口強制栄養法、１日２回）のタスキニモドで治療したＭＢＴ−２腫瘍の（Ａ）増殖曲線および（Ｂ）腫瘍重量。マウスを犠牲にした。腫瘍を採取し、消化し、次いで表面染色した。（Ｃ）ビヒクル（対照）またはタスキニモド３０ｍｇ／ｋｇで１５日目に治療した骨髄細胞でのＰＤ−Ｌ１発現。（Ｄ）浸潤骨髄細胞ＣＤ１１ｂ＋（*、Ｐ＜０．０５；Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、群あたりｎ＝５のマウス）でゲートされたＰＤ−Ｌ１のメジアン蛍光強度の定量データ。
【図５】１０6個のＭＢＴ−２細胞をＣ３Ｈ／ＨｅＮＲｊマウスに皮下注射した。動物を抗ＰＤ−Ｌ１またはそのアイソタイプ（ＩｇＧ２Ｂ）で腹腔内注射により２００μｇの用量で治療した。治療は（Ａ）１日目（スチューデント試験；左のパネル：*、Ｐ＝０．０２２３）または（Ｂ）腫瘍細胞接種後１１日目に開始した。腫瘍重量の対応する平均±ＳＥＭを右のパネルに示す：（Ａ）１日目：抗ＰＤ−Ｌ１  ４４８±２５８．３ｍｇ対ＩｇＧ２Ｂ  １５３５±２８９．９ｍｇ（スチューデント試験；右のパネル：*、Ｐ＝０．０１８８）；（Ｂ）１１日目：抗ＰＤ−Ｌ１  ８０６±４００．２ｍｇ対ＩｇＧ２Ｂ  １１８０±３６７．４ｍｇ。
【図６】タスキニモドと抗ＰＤ−Ｌ１療法との組み合わせは腫瘍増殖を相乗的に減少させる。（Ａ）試験設計：皮下ＭＢＴ−２腫瘍を、平均サイズが５０〜１００ｍｍ3（８日目）に達するまで増殖させた。マウス（ｎ＝１６）をＩｇＧ２Ｂ（対照）、抗ＰＤ−Ｌ１、タスキニモドまたはタスキニモド＋抗ＰＤ−Ｌ１の組み合わせ剤で治療した。（Ｂ）腫瘍増殖曲線は、連続カリパス測定値を表す。エラーバーは、平均±ＳＥＭ（一元配置ＡＮＯＶＡ；**、Ｐ＜０．００５、***、Ｐ＜０．００１）を示す。終了点（１５日目）での腫瘍重量を（Ｃ）に示す（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験；*、Ｐ＜０．０５、**、Ｐ＜０．００５、***、Ｐ＜０．００１）。実験を少なくとも４回繰り返した。１つの代表的な実験の結果を示す。
【図７】タスキニモドと抗ＰＤ−Ｌ１との組み合わせ剤は細胞傷害性Ｔ細胞活性を増加させる。（Ａ）治療後１５日目の腫瘍浸潤ＣＤ８＋細胞の割合の定量データ（ｎ＝６）。（Ｂ）左のパネル：対照または治療群からの腫瘍におけるグランザイムＢ（褐色染色）の免疫染色を示す代表的な画像。元の倍率：Ｘ２００、挿入図：腫瘍の概要。スケールバー：５０μｍ。右のパネル：グランザイムＢに対する抗体を用いた全細胞のパーセンテージとして表した腫瘍切片上のグランザイムＢ陽性細胞の定量化（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定；*、Ｐ＝０．０３２６）。（Ｃ）各群からの腫瘍溶解物中における次のサイトカイン：ＩＬ−１β、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（Ｐ７０）およびＩＬ−１５の濃度レベル（ｐｇ／ｍｌ）をルミネックス技術を使用して定量した（ｎ＝５）。（Ｄ）各群の脾細胞（ｎ＝５）をブレフェルジンＡの存在下でＰＭＡ／イオノマイシンで刺激した。ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生を細胞内染色によって調べた。代表的なデータ（平均±ＳＥＭ）は、フローサイトメトリーによって分析されたＣＤ８＋でゲートされた異なるサイトカインのパーセンテージを示した。アスタリスクは一元配置ＡＮＯＶＡ（*、Ｐ＜０．０５；**、Ｐ＜０．００５）を使用した統計的有意性を示す。（Ｅ）棒グラフは、各治療群の１０匹のマウスの血清中におけるＩＦＮ−γ濃度を表す。Ｐ値は、異なる群間でのＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定に基づいて算出した（*、Ｐ＜０．０５；**、Ｐ＜０．００５）。
【図８】浸潤性骨髄系細胞の調節因子とＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸の阻害因子を組み合わせることにより、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞産生ＩＦＮ−γが増加する。骨髄細胞ＣＤ１１ｂ＋を、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して腫瘍から単離した。Ｔ細胞を、マウス汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｅｉ）を使用してナイーブマウスの脾臓から単離した。ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ比１：１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で刺激した。刺激されたＴ細胞をＣＤ１１ｂ＋（１：１のＣＤ１１ｂ：Ｔ細胞比）で培養し、３７℃で７２時間にわたってインキュベートした。（Ａ）ＣＤ８＋でゲートされたＣＦＳＥ−Ｔ細胞の蛍光強度を示すＦＡＣＳ分析によって得られた代表的なヒストグラム。（Ｂ）異なる治療群からの増殖ＣＤ８＋細胞のパーセンテージを示す。（Ｃ）共培養物の上清中のＩＦＮ−γ分泌を、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用して３７℃でのインキュベーションの７２時間後に測定する。実験を２回繰り返した（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、*、Ｐ＜０．０５）。
【図９】ＭＢＴ−２腫瘍細胞を雌のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスに同所的に注射した。簡単に説明すると、４時間の脱水後、ケタミンとキシラジンの混合物を使用してマウスに麻酔をした。カテーテル（参照：３８１２１２  ２４Ｇ、ＢＤ  Ｉｎｓｙｔｅ）を尿道から膀胱に挿入し、３０μＬの０．１Ｎ  ＨＣｌを１５秒間注入し、次いで３０μＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨで１５秒間にわたって置換した。ＭＢＴ−２腫瘍細胞（２×１０6）を４５分間にわたって膀胱に注入した。治療を３日目に開始した。タスキニモドを経口胃管栄養法により３０ｍｇ／ｋｇの投与量で２１日間連続して１日２回投与した。抗ＰＤ１（クローン：ＲＭＰ１−１４）またはそのアイソタイプ対照（クローン２Ａ３）を１０ｍｇ／ｋｇの用量で２週間連続して週２回（４日目、７日目、１１日目および１４日目に）腹腔内経路で注射した。抗ＰＤ１、タスキニモド、組み合わせ剤、またはＩｇＧ対照で治療したＭＢＴ−２腫瘍保持マウスの生存率を図９に示す（ｎ＝１３）。Ｄｕｎｎｅｔ−Ｈｓｕ試験を使用して群間の全生存率を比較した。
【実施例】
【０１７７】
例１：癌マウスモデルにおける腫瘍体積の減少に及ぼすタスキニモドとＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせ剤の相乗効果
タスキニモドとＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせ剤の効果を評価するための初期研究を次のとおりに実施した。
【０１７８】
実験手順
マウスおよび細胞株
６〜７週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮ雄マウスをＪＡＮＶＩＥＲ  Ｌａｂｓから購入した。ＭＢＴ−２のマウス膀胱癌細胞株（Ｍ．Ｓ．Ｓｏｌｏｗａｙ．，Ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ，Ｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．１１（４）：６２３−６３５，１９８４）を、ＪＣＲＢ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋから入手し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充したイーグル最小必須培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。
【０１７９】
腫瘍の成長及び治療
１×１０6個の細胞をマウスの横腹に皮下注射し、腫瘍が４０〜１３０ｍｍ3の体積に達するまで増殖させた（腫瘍細胞接種後約１０〜１１日）。次いで、腫瘍を有する動物を、表１に示した４つの異なる群に無作為化した。
【０１８０】
【表１】
2018511586.tif 000008
【０１８１】
腫瘍体積（ｍｍ3）をキャリパー測定によって評価し、式＝（幅）2×長さ／２で算出した。
【０１８２】
表２に示すように、マウスをタスキニモド（３０ｍｇ／ｋｇ）でｐ．ｏ（口当たり、すなわち経口投与）により１日２回治療する。ＰＤ−Ｌ１の遮断のために、２００μｇのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体（クローン１０Ｆ．９Ｇ２；Ｂｉｏ−ＸＣｅｌｌ）を（腹腔内に）３日ごとにマウスにｉ．ｐ．（腹腔内）投与した。全ての研究は、ＩＰＳＥＮの生物倫理委員会（ＣＥ２Ａ）およびフランス農林水産省の獣医学サービスによって認可された。
【０１８３】
【表２】
2018511586.tif 000009
【０１８４】
結果
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体またはタスキニモド単独は、ＭＢＴ−２腫瘍の腫瘍増殖にわずかな非有意な影響を及ぼした（表３および図１参照）。
これに対し、両方の化合物の組み合わせによるマウスの治療は腫瘍増殖を効果的に制御した。
【０１８５】
【表３】
2018511586.tif 000010
【０１８６】
結論
上記のように、タスキニモドとＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせ剤による治療は、マウスにおける抗腫瘍活性を相乗的に促進する。
【０１８７】
例２：腫瘍における遺伝子発現プロファイリングおよびタスキニモドで治療したマウス由来の骨髄細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現
方法
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
マウスを例１に記載したとおりに治療した。タスキニモドによる治療の１０日後、すなわち腫瘍接種２０日後に、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して１００μｍのＯＣＴ包埋腫瘍凍結切片から腫瘍由来のＲＮＡを単離した。ＲＮＡ濃度および純度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計を用いてＡ２６０／Ａ２８０比を測定することによって決定した。ＲＮＡの完全性を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して確認した。高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造者の指示に従ってｃＤＮＡを調製した。ｑ−ＰＣＲを、Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して３ステップＰＣＲプロトコールで実施した（９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間、そして６０℃で１分間の４０サイクル）。発現レベルを、標的遺伝子とＴａｑｍａｎ技術に関する２つの「ハウスキーピング」ＨｍｂｓおよびシクロフィリンＡとの間の正規化ΔＣｔ発現値として算出した。データを、対照腫瘍と比較した治療腫瘍の誘導倍率（２ΔΔＣｔ）として示した。実験で使用したプローブは次のとおりである。
【０１８８】
【表４】
2018511586.tif 000011
【０１８９】
ＦＡＣＳ分析
マウスを例１に記載したとおりに治療した。タスキニモドによる治療の７日後、すなわち腫瘍接種の１７日後に、単一細胞懸濁液を、切断して小片にした腫瘍を８ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ型（ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および０．１％ＤＮアーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中において３７℃で４５分間インキュベートすることによって調製した。腫瘍を７０μｍの細胞ストレーナで捕捉した。細胞をＦｃ−ブロッカー（クローン２．４Ｇ２；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でブロックし、次いでそれぞれＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入したＣＤ１１ｂ  ＡＰＣ（クローンＭ１／７０）およびＣＤ２７４  ＰＥ  Ｃｙ７（クローンＭＩＨ５）で染色した。細胞をＦｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。
【０１９０】
結果
Ｍ２マクロファージマーカーであるＣＤ２０６の発現の低下、およびマクロファージＭ１によって放出されることが知られているｎｏｓ２およびＩｌ−１２ｂの発現の増加が観察された（図２）。タスキニモドによって誘導されたこのマクロファージのＭ２からＭ１への表現型転換は、腫瘍微小環境におけるＣｄ２７４のｍＲＮＡ発現の増加と関連していた。興味深いことにかつ予想外のことに、本発明者は、タスキニモドで治療した腫瘍を有するマウスの骨髄細胞で発現されたＰＤ−Ｌ１のメジアン蛍光強度が増加することも見出した（図３）。本発明者の知見は、タスキニモドが腫瘍において局部的な前炎症環境を誘導し、これが次にＰＤ−Ｌ１の発現を誘導する可能性があることを強く示唆するものである。このタスキニモド治療後のＰＤ−Ｌ１増加は、その抗腫瘍免疫応答を減弱させ、かつ、活動的な膀胱癌においてタスキニモドと抗ＰＤ−Ｌ１とを組み合わせてその抗腫瘍活性を増強することの理論的根拠の洞察を与える。
【０１９１】
例３：タスキニモド治療後の腫瘍組織においてＰＤ−Ｌ１の発現が増加する
また、本発明者は、タスキニモドが腫瘍移植後の後の時点で与えられたときに、確立された腫瘍で腫瘍の進行を阻害できるかどうかを調査した。この目的のために、ＭＢＴ−２腫瘍が５０〜１００ｍｍ3の範囲の腫瘍体積に達したときに動物を治療した（図４ＡおよびＢ）。この状況において、驚くべきことに、タスキニモド（３０ｍｇ／ｋｇ）は、腫瘍成長を阻害する能力を失った。依然として維持されていたタスキニモドの免疫刺激効果にもかかわらず（表Ｓ１）、原発腫瘍を根絶するための適応免疫応答の最適な活性化は損なわれているようである。本発明者は、このタスキニモド治療に対する耐性がＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸などのＴ細胞阻害経路の誘導に起因する可能性があるとの仮説をたてた。実際に、タスキニモドで治療したＭＢＴ−２腫瘍において、ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ発現が増加することが見出された（表Ｓ１）。さらに、本発明者は、ＭＢＴ−２腫瘍由来の単球性ＭＤＳＣを含めたＣＤ１１ｂ＋細胞でゲートされたＰＤ−Ｌ１の発現が増加することを観察した（図４ＣおよびＤ）。ＰＤ−１の発現レベルは、タスキニモド治療の結果として変化しなかった（図示せず）。これらのデータから、ＰＤ−Ｌ１発現の変化がタスキニモド治療を受けた確立されたＭＢＴ−２腫瘍における腫瘍増殖阻害の欠如の原因となる可能性があることが示唆される。本発明者の知見は、腫瘍がタスキニモド治療の効果を逃れる潜在的な耐性機構として骨髄細胞のＰＤ−Ｌ１発現の上昇を確認するものであった。これらの知見は、タスキニモド及びＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１軸遮断を含めた併用治療計画を使用することで、この耐性を克服することができることを示している。
【０１９２】
表Ｓ１：タスキニモド治療後のｍＲＮＡ発現の差異
異なる遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現を、対照群と比較してタスキニモドを用いた治療動物のＭＢＴ−２腫瘍で調査した。治療は腫瘍細胞接種後１１日目に開始し、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を１５日目に行った。結果を対照と比較した平均倍数変化として表す。Ｐ値を、スチューデント試験を使用して評価した。
【０１９３】
【表５】
2018511586.tif 000012
【０１９４】
例４：タスキニモド／抗ＰＤ−Ｌ１の組み合わせ剤の治療はＢＣａにおける抗腫瘍効果を向上させる
ＭＢＴ−２腫瘍モデルにおけるタスキニモド治療で観察されるように、抗ＰＤ−Ｌ１は、腫瘍細胞接種後１日目に単薬として投与される場合に腫瘍発生を阻害した（図５Ａ）。しかし、抗ＰＤ−Ｌ１単独の抗腫瘍活性は、潜在的には腫瘍負荷の増加のため、確立された腫瘍の治療の際に失われた（図６Ｂおよび５Ａ）。したがって、本発明者は、骨髄性細胞機能のモジュレーターと免疫チェックポイント阻害剤とを組み合わせることによって、抗腫瘍応答が増強され得るかどうかを調査した（図６Ａ）。その結果から、タスキニモドと抗ＰＤ−Ｌ１とを組み合わせて治療したマウスは、単一治療または対照群と比較して、腫瘍増殖および腫瘍重量（図６Ｃ）の有意な減速を示すことが示された（図６Ｂ；対照４１３±５１ｍｍ3；ＰＤ−Ｌ１  ３２５±５２ｍｍ3；タスキニモド３４３±６７；組み合わせ剤１２９±１５ｍｍ3）。本発明者は、抗腫瘍応答を発揮する際にいずれの薬剤による単独療法よりも優れていることを実証した。
【０１９５】
例５：治療の組み合せはＴ細胞の活性化を増大させる
次に、本発明者は、併用療法が適応免疫応答を活性化できるかどうかを調査した。本発明者は、ＴＩＬの割合およびそれらのエフェクターサイトカイン放出能を分析した。タスキニモドと抗ＰＤ−Ｌ１との組み合わせ剤は、ＣＤ８＋ＴＩＬの２．７倍の増加を誘導した（図７Ａ）。並行して、対照と比較すると併用処置群においてもグランザイムＢを産生するリンパ球の割合が有意に増加ずることが観察された（図７Ｂ）。また、本発明者は、７日間にわたる治療を受けた腫瘍におけるサイトカイン発現プロファイルも分析した（図７Ｃ）。ＩＬ−２スーパーファミリーに属するＩＬ−７およびＩＬ−１５は、ＩＬ−２．３１よりもＴ細胞の生存率および細胞傷害効果をより大きく増大させることが報告されている。対照と比較して、タスキニモドと抗ＰＤ−Ｌ１との組み合わせ剤で治療した腫瘍においてＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−１２の産生の顕著な増加が見られた（図７Ｃ）。これらのサイトカインは、単一治療群では有意には増加しなかった。
【０１９６】
ＭＢＴ−２腫瘍モデルにおいてタスキニモドと抗ＰＤ−Ｌ１との組み合わせ剤によって誘導された免疫応答をさらに調査するために、腫瘍を有するマウスから脾細胞を単離し、ＰＭＡ／イオノマイシンで４時間にわたって刺激した。対照と比較して、ＣＤ８＋でゲートされたＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの細胞内発現が増加することが対照群で見られた（図７Ｄ）。また、抗ＰＤ−Ｌ１単独で治療した腫瘍においてもＣＤ８＋産生ＩＦＮ−γが増加した。さらに、単剤または対照群と比較して、併用療法で治療したマウスの血清中への多量のＩＦＮ−γが見られた（図７Ｅ）。これらのデータは、全て、タスキニモドと抗ＰＤ−Ｌ１治療との組み合わせが適応免疫系を活性化して細胞傷害性免疫応答を発揮することを示すものであった。
【０１９７】
例６：強力な免疫応答を誘導するためには自然免疫細胞および適応免疫細胞の両方の活性化が必要である
併用群において観察された細胞傷害性サイトカインを産生するＣＤ８＋細胞の増加の基礎をなす機構をさらに理解するために、本発明者は、治療を受けた腫瘍に由来する骨髄細胞がＴ細胞と直接相互作用してそれらの機能に影響を及ぼす可能性があると仮定した。この目的のために、本発明者は、腫瘍から骨髄細胞ＣＤ１１ｂ＋を単離し、未処置マウスの脾臓に由来するＴ細胞を培養液に入れた。
【０１９８】
タスキニモドで治療された確立された腫瘍に由来するＣＤ１１ｂ＋の免疫調節は、生体外で刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖増加能を制限した（図８ＡおよびＢ）。さらに、抗ＰＤ−Ｌ１治療腫瘍に由来するＣＤ１１ｂ＋中のＰＤ−Ｌ１の遮断も生体外でＴ細胞を活性化する中等度の能力を有していた。重要なことに、骨髄細胞およびＴ細胞阻害機能の両方のモジュレーターを組み合わせることで、増殖ＣＤ８＋細胞の割合が大きく増加した。これは、対照、タスキニモド単独または抗ＰＤ−Ｌ１単独（図８Ｃ）と比較して、上清中へのＩＦＮ−γの強力な分泌を伴う。まとめると、本発明者は、ＭＢＴ−２腫瘍におけるタスキニモドと抗ＰＤ−Ｌ１との組み合わせ剤が、ＣＤ８陽性Ｔ細胞増殖およびＩＦＮ−γの産生に影響を与える免疫抑制性骨髄細胞を調節することを見出した。さらに、これらのデータは、骨髄性細胞とＴ細胞との間の相乗的相互作用をさらに確証し、先天性および適応性の免疫系の両方の細胞集団間の連絡を調節することを目的とする抗腫瘍介入治療を示唆する。
【０１９９】
例７：タスキニモドと抗ＰＤ−１抗体の組み合わせ剤は単独で使用されるいずれの薬剤による治療後の生存を有意に超えて腫瘍モデルにおけるマウスの生存を延長する
３０ｍｇ／ｋｇの用量でのタスキニモド単独では、対照マウスについての２９日間（図９）と比較して、マウスのメジアン生存期間を延長させることができなかった（２７日間）。しかしながら、抗ＰＤ−１治療はマウスの生存期間の中央値を４３日まで延長させることができるにもかかわらず、タスキニモドと抗ＰＤ−１との組み合わせ剤は単独で使用されたいずれの薬剤よりも極めて優れていた。
【０２００】
材料および方法
細胞株
ＭＢＴ−２をＪＣＲＢ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋから購入し、１０％ウシ胎仔血清を補充したＥＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。ＡＹ−２７をＯｎｃｏｄｅｓｉｇｎ（Ｄｉｊｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手し、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ  １６４０中で維持した。これらの細胞株にマイコプラズマ汚染はなかった。他の認証アッセイは実施しなかった。
【０２０１】
生体内実験
６〜７週齢の雄のＣ３Ｈ／ＨｅＮＲｊマウスをＪＡＮＶＩＥＲ  Ｌａｂｓから購入した。５〜６週齢の雌フィッシャー３４４（Ｆ３４４／ＩｃｏＣｒｌ）ラットをＣＨＡＲＬＥＳ  ＲＩＶＥＲから得た。
【０２０２】
ＭＢＴ−２細胞（１×１０6）をマウスの脇腹に皮下注射し、得られた腫瘍を２１日間にわたって成長させた。腫瘍をキャリパーで測定し、腫瘍体積（ｍｍ3）を、式＝（幅）2×長さ／２の式を用いて算出した。
【０２０３】
動物を経口胃管栄養法により異なる用量のタスキニモド（０、１、１、１０および３０ｍｇ／ｋｇ）で１日２回１０ｍｌ／ｋｇの量で２１日間治療した。ＰＤ−Ｌ１をブロックするために、抗ＰＤ−Ｌ１（１０Ｆ．９Ｇ２；ＢｉｏＸＣｅｌｌ）またはそのアイソタイプ対照（ＬＴＦ−２；ＢｉｏＸＣｅｌｌ）２００μｇをマウスに腹腔内経路で１００μｌの容量で３日間毎に各実験について合計３〜４回の注射で投与する。
【０２０４】
膀胱内ＡＹ−２７癌モデルの手順を、Ｏｎｃｏｄｅｓｉｇｎ（フランスＤｉｊｏｎ）によって実施した。腫瘍細胞（１×１０6）を膀胱壁の内面に同所的に注射した。タスキニモドによる治療は、４日目に２ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回、２８日連続して開始した。腫瘍細胞の接種後４日目から７日ごとに１日１回、シスプラチン（ＣＤＤＰ、ＥＢＥＶＥ）を２ｍｇ／ｋｇで投与した。全ての磁気共鳴画像（ＭＲＩ）を、ＰａｒａＶｉｓｉｏｎ（登録商標）（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ）を使用して行った。
【０２０５】
動物を使用する全ての手順は、Ｏｎｃｏｄｅｓｉｇｎ（Ｏｎｃｏｍｅｔｓ）の動物管理および使用委員会並びにＩＰＳＥＮ（Ｃ２ＥＡ）によって検証され、フランス研究省によって認可された。
【０２０６】
ＦＡＣＳ分析
小片にクロスカットした腫瘍を８ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および０．１％ＤＮアーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中において３７℃で４５分間インキュベートすることによって、腫瘍から単一細胞懸濁液を調製した。細胞をＦｃ−ブロッカー（２．４Ｇ２）でブロックし、その後、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅおよびＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入したＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、Ｆ４／８０（クローンＢＭ８）、ＣＤ２０６（Ｃ０６８Ｃ２）、Ｌｙ６Ｃ（ＡＬ−２１）、Ｌｙ６Ｇ（１Ａ８）、ＣＤ４  （ＲＭ４−５）、ＣＤ３ε（１４５−２Ｃ１１）、ＮＫ−１．１（ＰＫ１３６）及びＣＤ８ａ（５３−６．７）に対する様々な抗体で染色した。サイトカイン染色については、細胞をＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で４時間にわたって白血球活性化カクテルにより試験管内で刺激し、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して浸透させて固定し、次いでｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した抗ＩＬ−２（ＪＥＳ６−５Ｈ４）、抗ＴＮＦ−α（ＭＰ６−ＸＴ２２）および抗ＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２）抗体で染色した。フローサイトメトリー分析を、ＢＤ  ＦｏｒｔｅｓｓａＸ−２０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）を使用してデータを分析した。ＣＤ１１ｂ＋選別を、キューリー研究所コア施設（フランスＯｒｓａｙ）の支援を受けて、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施したところ、到達した最終純度は９５％を超えた。あるいは、ＣＤ１１ｂ＋細胞を、ＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して分離した。この手順により、ＦＡＣＳ分析によって評価したときに主として８０％を超える純度のＣＤ１１ｂ＋細胞が得られた。
【０２０７】
生体外Ｔ細胞増殖アッセイ
Ｔ細胞（１×１０5）を、汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してナイーブマウスの脾臓から単離した。Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ細胞増殖キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）マウスＴ−アクティベーターＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって１：１のビーズ対細胞比で活性化した。腫瘍由来の単離ＣＤ１１ｂ＋細胞（１×１０5）を１：１のＣＤ１１ｂ：Ｔ細胞比で標識Ｔ細胞に添加し、７２時間にわたって培養液中でインキュベートした。
【０２０８】
サイトカイン誘導アッセイ
脾細胞（１×１０6）をＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下でＰＭＡとイオノマイシンとの混合物により４時間刺激した。細胞を採取し、表面マーカーについて染色し、その後透過性にし、固定し、そして抗ＩＬ−２（ＪＥＳ６−５Ｈ４）、抗ＴＮＦ−α（ＭＰ６−ＸＴ２２）および抗ＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１）により細胞内サイトカインに対して染色した。
【０２０９】
免疫化学
Ｓ１００Ａ９染色を、複数の癌組織（がん実態調査、ＡｓｔｅｒａｎｄからのＯｒｉｇｅｎおよびＴｏｐ４多発腫瘍）またはＢＣａ腫瘍（ＦＦＰＥ  ＴＭＡ、＃ＢＬＣ２４１および膀胱癌腫切片＃ＨｕＣＡＴ４１６、Ｕｓｂｉｏｍａｘ）からなるヒト組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）からのＦＦＰＥで実施した。低ｐＨ溶液（Ｄａｋｏ）およびペルオキシダーゼ／ジアミノベンジジン反応で抗原回収した後、腫瘍切片をＳ１００Ａ９に対する抗体（１：５０００；Ａｂｃａｍ＃ａｂ９２５０７）と共にインキュベートした。染色強度を半定量的に評価した。
【０２１０】
動物の腫瘍をサンプリングし、２片に切断し、そしてＯＣＴ化合物に包埋し、又はホルマリンに２４時間浸漬固定し、そしてパラフィンに包埋した。ＦＦＰＥ切片（５μｍ）を、低ｐＨ溶液（Ｄａｋｏ）中で抗原回収した後にグランザイムＢ（１：１００；Ａｂｃａｍ＃ａｂ４０５９）、Ｓ１００Ａ９（１：１０００；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ＃ＡＦ２０６５／Ａｂｃａｍ＃ａｂ６２２２７）またはＣＤ８（１：２００；ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ＃ＭＣＡ４８Ｒ）と共にインキュベートした。ペルオキシダーゼ／ジアミノベンジジン反応により染色が明らかになった。画像解析を、Ｈａｌｏソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ  ｌａｂｓ）を使用してスライドスキャンで行った。グランザイムＢ染色細胞を計数し、腫瘍切片中の細胞の総数に関して報告した。
【０２１１】
多重アッセイによるサイトカイン測定
サイトカインを、凍結ＯＣＴ化合物（フランスＶＷＲ）包埋腫瘍の厚さ１ｍｍの切片から抽出した。ＰＢＳで３回洗浄した後、ペレットをＰＢＳ＋プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）に再懸濁し、ホモジナイザー（Ｆａｓｔｐｒｅｐ（登録商標）、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）中においてセラミックビーズで粉砕した。異なる試料についてタンパク質濃度をアッセイした。サイトカインを、多重免疫アッセイキット（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、製造者の指示に従って測定した。シグナル検出をＬｕｍｉｎｅｘ  ２００（Ｌｕｍｉｎｅｘ）で行い、メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を記録した。
【０２１２】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
がん実態調査ｃＤＮＡアレイをＯｒｉｇｅｎｅから購入し、これは正常領域または疾患領域のいずれかの１７種のヒト組織型からの３８１ｃＤＮＡ（２〜３ｎｇ／ウェル）を含むものであった。
【０２１３】
マウスＣＤ１１ｂ＋のＲＮＡ抽出を、ＰｉｃｏＰｕｒｅ（登録商標）ＲＮＡ単離キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行った。腫瘍中のＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＯＣＴ包埋腫瘍の厚さ１００μｍの凍結切片から単離した。高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者の指示に従って使用してｃＤＮＡを調製した。ＣＤ１１ｂ＋単離細胞由来のｃＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ  ＰｒｅＡｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して予備増幅した（１４サイクル）。リアルタイムＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ）を、Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して２段階ＰＣＲプロトコール（９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間、そして６０℃で１分間の４０サイクル）で実施した。使用したプローブを表Ｓ２に示す。Ｈｍｂｓを「ハウスキーピング」遺伝子として使用し、この遺伝子の発現は、他のハウスキーピング定量化遺伝子（例えば、シクロフィリンＡ）と相関があった。発現レベルを、標的遺伝子と「ハウスキーピング」遺伝子との間の正規化ΔＣｔ発現値として算出した。
【０２１４】
【表６】
2018511586.tif 000013
【０２１５】
統計
Ｐｒｉｓｍ６．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用してデータを分析し、生物統計学者が検証した。実験を必要に応じて２〜４回繰り返した。データ正規分布を、Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ検定を使用して評価した。その際、Ｐ値をスチューデントｔ検定または分散分析（ＡＮＯＶＡ）のいずれかによって評価した。他のデータ分布については、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙまたはＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を使用した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意であるとみなした（*、Ｐ＜０．０５；**、Ｐ＜０．０１；***、Ｐ＜０．００１）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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