(57)【要約】  本明細書では、１つ以上の相同アミノ酸リピートを含む組換えポリペプチド；ならびに１つ以上の相同アミノ酸リピートを含む組換えポリペプチド及び１つ以上の治療薬を含む非免疫原性バイオコンジュゲートを開示する。また、本明細書では、組換えポリペプチドを含む医薬組成物；及び癌または感染症の治療のために患者に組換えポリペプチドを投与する方法も開示する。【選択図】図１
2018521977.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
相同アミノ酸リピートを含む組換えポリペプチドであって、前記相同アミノ酸リピートが４つ以上のアミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基の１つがプロリンであり、前記アミノ酸残基の１つ以上がバリンであり、前記相同アミノ酸リピートとの少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有し、前記相同アミノ酸リピートが
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（配列番号１；ｉＴＥＰA）；
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号２  ｉＴＥＰB）；
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号３；ｉＴＥＰC）；
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号４；ｉＴＥＰD）；
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号５；ｉＴＥＰE）；
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号６）；
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号７）；
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号８）；
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号９）；
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号１０）；
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（配列番号１１）；
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１２）；
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１３）；
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１４）；または
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１５）
である前記組換えポリペプチド。
【請求項２】
前記プロリン及びバリンが互いに隣接している、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３】
前記プロリン及びバリンが互いに隣接していない、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４】
前記組換えポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方に位置する１つ以上の残基をさらに含み、前記１つ以上の残基がグリシン、アラニン、もしくはセリンまたはこれらの組合せである、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項５】
同定される分子量が１０〜１００ｋＤａである、請求項４に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６】
前記相同アミノ酸リピートがエラスチン由来である、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項７】
前記相同アミノ酸リピートがアミノ酸配列：Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号２８）を含まない、請求項２に記載の組換えポリペプチド。
【請求項８】
アミノ酸配列
Ｇｌｙ−（Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ）28−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２３）；
Ｇｌｙ−（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）70−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２４）；
Ｇｌｙ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）21−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２５）；
Ｇｌｙ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）96−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２６）
を含む、請求項４に記載の組換えポリペプチド。
【請求項９】
前記相同アミノ酸リピートの２つ以上をさらに含む、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１０】
前記相同アミノ酸リピートが１００以下のリピートを含む、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１１】
前記相同アミノ酸リピートが少なくとも２０のリピートを含む、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１２】
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘａａ1−Ｇｌｙ−Ｘａａ2−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
式中
Ｘａａ1はＬｅｕまたはＰｈｅ
Ｘａａ2はＡｌａまたはＶａｌ
である式に従うアミノ酸配列を含み、
前記アミノ酸配列が繰り返される組換えポリペプチド。
【請求項１３】
前記組換えポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方に位置する１つ以上の残基をさらに含み、前記１つ以上の残基がグリシン、アラニン、もしくはセリンまたはこれらの組合せである、請求項１２に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１４】
前記アミノ酸配列が
Ｇｌｙ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）21−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２５）；または
Ｇｌｙ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）96−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２６）
を含む、請求項１３に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１５】
相同アミノ酸リピートを含む組換えポリペプチド及び１つ以上の治療薬を含む非免疫原性バイオコンジュゲートであって、前記相同アミノ酸リピートが４つ以上のアミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基の１つがプロリンであり、前記アミノ酸残基の１つ以上がバリンであり、前記相同アミノ酸リピートが
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（配列番号１；ｉＴＥＰA）；
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号２  ｉＴＥＰB）；
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号３；ｉＴＥＰC）；
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号４；ｉＴＥＰD）；
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号５；ｉＴＥＰE）；
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号６）；
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号７）；
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号８）；
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号９）；
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号１０）；
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（配列番号１１）；
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１２）；
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１３）；
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１４）；または
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１５）
である前記非免疫原性バイオコンジュゲート。
【請求項１６】
１つ以上のリンカーをさらに含む、請求項１５に記載の非免疫原性バイオコンジュゲート。
【請求項１７】
１つ以上のスペーサー配列をさらに含む、請求項１５に記載の非免疫原性バイオコンジュゲート。
【請求項１８】
１つ以上のシステイン残基をさらに含む、請求項１５に記載の非免疫原性バイオコンジュゲート。
【請求項１９】
１つ以上のシステイン残基が１つ以上のスペーサー配列によって隔てられている、請求項１８に記載の非免疫原性バイオコンジュゲート。
【請求項２０】
前記組換えポリペプチド及び前記治療薬が１：１または１：３の比（組換えポリペプチド：治療薬）で存在する、請求項１５に記載の非免疫原性バイオコンジュゲート。
【請求項２１】
前記組換えポリペプチドが前記リンカーの１つと共有結合している、請求項１５に記載の非免疫原性バイオコンジュゲート。
【請求項２２】
前記共有結合が切断可能である、請求項２１に記載の非免疫原性バイオコンジュゲート。
【請求項２３】
前記プロリン及びバリンが互いに隣接している、請求項１５に記載の非免疫原性バイオコンジュゲート。
【請求項２４】
前記プロリン及びバリンが互いに隣接していない、請求項１５に記載の非免疫原性バイオコンジュゲート。
【請求項２５】
前記組換えポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方に位置する１つ以上の残基をさらに含み、前記１つ以上の残基がグリシン、アラニン、もしくはセリンまたはこれらの組合せである、請求項１に記載の非免疫原性バイオコンジュゲート。
【請求項２６】
前記相同アミノ酸リピートがアミノ酸配列
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（配列番号１；ｉＴＥＰA）；
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号２；ｉＴＥＰB）；
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号３；ｉＴＥＰC）；
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号４；ｉＴＥＰD）；
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号５；ｉＴＥＰE）；
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号６）；
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号７）；
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号８）；
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号９）；
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号１０）；
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（配列番号１１）；
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１２）；
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１３）；
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１４）；または
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１５）
を含む、請求項１５に記載の免疫原性バイオコンジュゲート。
【請求項２７】
前記治療薬が抗癌剤、ペプチド、核酸、または１つ以上の細胞である、請求項１５に記載の非免疫原性バイオコンジュゲート。
【請求項２８】
前記抗癌剤が癌幹細胞阻害剤である、請求項２７に記載の非免疫原性バイオコンジュゲート。
【請求項２９】
前記抗癌剤がサリノマイシンまたはパクリタキセルである、請求項２７に記載の非免疫原性バイオコンジュゲート。
【請求項３０】
前記１つ以上のリンカーが４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド塩酸塩である、請求項１６に記載の非免疫原性バイオコンジュゲート。
【請求項３１】
前記治療薬がワクチンである、請求項１５に記載の非免疫原性バイオコンジュゲート。
【請求項３２】
請求項１５に記載の非免疫原性バイオコンジュゲート及び医薬品として許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項３３】
静脈内投与のために製剤化されている、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
（ａ）治療を必要とする患者を特定すること；及び
（ｂ）前記患者に治療有効量の請求項３３に記載の医薬組成物を投与すること
を含む癌患者の治療方法。
【請求項３５】
前記患者がヒト患者である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記癌が原発性または続発性腫瘍である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記原発性または続発性腫瘍が前記患者の乳房、肺、結腸または卵巣内にある、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記癌が転移性である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記癌が癌幹細胞に関連している、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗癌剤が非免疫原性バイオコンジュゲートの一部として投与される場合に、前記抗癌剤が単独でまたは非免疫原性バイオコンジュゲートの一部としてではなく投与される場合と比較して、効果が増加する、または副作用が減少する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
請求項２６に記載の医薬組成物の投与が第２の異なる医薬組成物と組み合わされる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
（ａ）治療を必要とする患者を特定すること；及び
（ｂ）前記患者に治療有効量の請求項３３に記載の医薬組成物を投与すること
を含む感染症患者の治療方法。
【請求項４３】
請求項２６に記載の医薬組成物の投与が第２の異なる医薬組成物と組み合わされる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
相同アミノ酸リピートを含む組換えポリペプチドであって、前記相同アミノ酸リピートが４つ以上のアミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基の１つがプロリンであり、前記アミノ酸残基の１つ以上がバリンであり、前記相同アミノ酸リピートとの少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有し、前記相同アミノ酸リピートが
Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号２０；ｉＭＥＰＡ）；または
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号２１；ｉＭＥＰＢ）
である前記組換えポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年５月２９日に出願された米国仮出願第６２／２３０，１６０号；及び２０１６年３月１６日に出願された米国仮出願第６２／３０９，１１３号の出願日の利益を主張する。以前に申請されたこれらの出願の内容は、ここにその全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
配列表
２０１６年５月２３日に作成された８５，４０１バイトのサイズを有する「２１１０１＿０３１４Ｐ１＿ＳＬ」という名称のテキストファイルとして２０１６年５月２９日に提出した配列表を、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  §  １．５２（ｅ）（５）に従って、ここに参照により援用する。
【０００３】
連邦政府によって資金援助を受けた研究に関する言明
本発明は、米国国立衛生研究所によって締結された認可番号６Ｒ００ＣＡ１５３９２９の下、政府援助を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００４】
本発明は、エラスチン由来の組換えペプチド、より具体的には、免疫寛容を有し、例えば、感染症及び癌をはじめとする様々な疾患及び病態のための治療薬の送達システムとして有用な組換えエラスチン由来ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００５】
転移性の癌患者は、転移に対する有効な治療がないために依然として芳しくない予後と向き合っている。転移及び癌幹細胞（ＣＳＣ）には密接な関係があることが知られており、ＣＳＣは従来の化学療法及び放射線療法に耐性があると分かっている。有効な抗転移療法を生み出す１つの戦略はＣＳＣを標的とすることであるが、その理由は、これらの細胞が乳房腫瘍のものをはじめとする転移の発生及び促進に重要な役割を果たすためである。癌及び感染症に対する予防的及び治療的処置としてワクチンが開発されてきた。しかし、ワクチン、特に癌ワクチンの効果は改善される必要がある。癌及び感染症に対する有効な抗転移療法及び予防または治療モジュールへの代替的な治療アプローチが必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
癌幹細胞（ＣＳＣ）を減少させる効果的な方法は、ＣＳＣに対して特に毒性であり得る新規の薬剤の同定に依存する。本明細書では、ＥＬＰ設計の最初からＥＬＰの免疫原性に加えて物理化学的性質を強調する新規のエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）設計及び改変手法を開示する。この目的のために、ＥＬＰ（本明細書ではｉＴＥＰと呼ぶ）を設計して生成した。本明細書に開示のｉＴＥＰは体液性寛容であり、相転移特性も有する。さらに、実施例では、両親媒性ｉＴＥＰコポリマーはナノ粒子に自己組織化することができることを示す。このナノ粒子は、モデル細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）ペプチドワクチンを送達するために用いた場合に、遊離ペプチドまたはタンパク質形態のＣＴＬワクチンと比較してワクチンの効力を向上させた。
【０００７】
相同アミノ酸リピートを含む組換えポリペプチドであって、相同アミノ酸リピートが４つ以上のアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基の１つがプロリンであり、アミノ酸残基の１つ以上がバリンであり、相同アミノ酸リピートとの少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有し、相同アミノ酸リピートがＧｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（配列番号１；ｉＴＥＰA）；Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号２  ｉＴＥＰB）；Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号３；ｉＴＥＰC）；Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号４；ｉＴＥＰD）；Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号５；ｉＴＥＰE）；Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号６）；Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号７）；Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号８）；Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号９）；Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号１０）；Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（配列番号１１）；Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１２）；Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１３）；Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１４）；またはＧｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１５）である組換えポリペプチドを本明細書で開示する。
【０００８】
式：Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘａａ1−Ｇｌｙ−Ｘａａ2−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（式中、Ｘａａ1はＬｅｕまたはＰｈｅであり、Ｘａａ2はＡｌａまたはＶａｌである）（配列番号１６〜１９）に従うアミノ酸配列を含み、このアミノ酸配列が繰り返される組換えポリペプチドを本明細書で開示する。
【０００９】
相同アミノ酸リピートを含む組換えポリペプチド及び１つ以上の治療薬を含む非免疫原性バイオコンジュゲートであって、相同アミノ酸リピートが４つ以上のアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基の１つがプロリンであり、アミノ酸残基の１つ以上がバリンであり、相同アミノ酸リピートがＧｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（配列番号１；ｉＴＥＰA）；Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号２  ｉＴＥＰB）；Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号３；ｉＴＥＰC）；Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号４；ｉＴＥＰD）；Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号５；ｉＴＥＰE）；Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号６）；Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号７）；Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号８）；Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号９）；Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号１０）；Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（配列番号１１）；Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１２）；Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１３）；Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１４）；またはＧｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１５）である非免疫原性バイオコンジュゲートを本明細書で開示する。
【００１０】
相同アミノ酸リピートを含む組換えポリペプチドであって、相同アミノ酸リピートが４つ以上のアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基の１つがプロリンであり、アミノ酸残基の１つ以上がバリンであり、相同アミノ酸リピートとの少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有し、相同アミノ酸リピートがＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号２０；ｉＭＥＰＡ）；またはＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号２１；ｉＭＥＰＢ）である組換えポリペプチドを本明細書で開示する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】マウストロポエラスチンとヒトエラスチンとの間の相同性分析から得られるｉＴＥＰモノマーの概要である。青字及び赤字はそれぞれマウス及びヒトエラスチン由来のアミノ酸を示す。緑字は両種にわたって同じアミノ酸を示す。数字はそれらの親エラスチンタンパク質中のこれらのビルディングブロックの位置を示す。
【図２】図２Ａ〜ＣはｉＴＥＰのクローニング及び発現を示す。図２Ａは、ｉＴＥＰのコード遺伝子の長さを２倍にするアプローチを示す概略図である。図２Ｂは、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩによってｐＥＴ２５ｂ（＋）ベクターから切断した後のアガロースゲル上のｉＴＥＰコード遺伝子を示す。図２Ｃは、個々のｉＴＥＰのＭＷ及び純度を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図３】図３Ａ〜Ｅは、ｉＴＥＰの可逆的相転移を示す。図３Ａ〜Ｄは、２０℃と８０℃との間で加熱してから冷却したときのｉＴＥＰA、ｉＴＥＰB、ｉＴＥＰC、及びｉＴＥＰDの濁度プロファイル（ＯＤ３５０）を示す。図３Ｅは、温度の関数としての２．５Ｍ  ＮａＣｌ中のｉＴＥＰBの濁度プロファイルを示す。各曲線は３つの測定値の平均を表していた。
【図４】図４Ａ〜ＥはｉＴＥＰの体液性免疫原性を示す。図４Ａは免疫化スケジュール及び体液性応答の評価の時点を示す。図４ＢはＯＶＡ、ＭＳＡ、及びｉＴＥＰ免疫化マウスのＩｇＧ力価の要約を示す。各点は１匹のマウスの結果を表す。力価の中央値及び四分位数間領域を示す。図４Ｃ〜Ｆは、ｉＴＥＰA（Ｃ）、ｉＴＥＰB（Ｄ）、ｉＴＥＰC（Ｅ）、及びｉＴＥＰD（Ｆ）免疫化マウスから収集した血清の、希釈してＥＬＩＳＡによってアッセイした後の吸光度（ＯＤ４５０）を示す。各データ点は血清希釈当たり３つの吸光度測定値の平均値に相当する。各マウスのデータを線でつないだ。陽性の吸光度値のためのカットオフ範囲を青色の陰で示した。
【図５】図５Ａ〜ＥはｉＴＥＰ−ＣＴＬワクチン融合体から自己組織化したナノ粒子を示す。図５Ａは、ｉＴＥＰB−ｉＴＥＰA−ｐＯＶＡ融合体（配列番号５６）がナノ粒子（ＮＰ）に自己組織化することを示す概略図である。図５Ｂは、２つの融合体、ｉＴＥＰB−ｐＯＶＡ（配列番号５７）及びｉＴＥＰB-ｉＴＥＰA−ｐＯＶＡ（配列番号５６）のＭＷ及び純度を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。図５Ｃは、温度の関数としてのｉＴＥＰB−ｉＴＥＰA−ｐＯＶＡ融合体（配列番号５６）の濁度プロファイルを示す。図５Ｄは、ＤＬＳ測定から得られたｉＴＥＰB−ｐＯＶＡ（配列番号５７）及びｉＴＥＰB−ｉＴＥＰA−ｐＯＶＡ融合体（配列番号５６）（２５μＭ）のサイズ分布を示す。図５Ｅは、陰性染色したｉＴＥＰB−ｉＴＥＰA−ｐＯＶＡ融合体（配列番号５６）の代表的な顕微鏡写真であり、融合体のＮＰサイズが確認される。
【図６】図６Ａ〜Ｃは、ｉＴＥＰ−ｐＯＶＡナノ粒子（ＮＰ）によって誘発される免疫応答を示す。図６Ａは、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）がＯＶＡ、可溶性ｉＴＥＰB−ｐＯＶＡ（配列番号５７）、またはｉＴＥＰ−ｐＯＶＡ  ＮＰによって送達された後の、ＤＣ２．４細胞によるＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）の提示を示す。データは実験（ｎ≧４回の独立した実験）に用いた全ＤＣ集団の正規化ＭＦＩ±ＳＤの平均として表す。図６Ｂは、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）を提示したＤＣと共にインキュベートした後のＢ３Ｚ細胞の活性化を示す。ＤＣは図に示した異なる形態の抗原と共にプレインキュベートした。データは３回の独立した実験の平均±ＳＤとして表す。図６Ｃは、ＯＶＡ、遊離ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号２２）、またはｉＴＥＰ−ｐＯＶＡ  ＮＰで免疫化したマウス（ｎ＝３〜５）由来の活性化したＳＩＩＮＦＥＫＬ拘束性脾細胞のエクスビボ分析を示す。細胞の活性化はＩＮＦ−γベースのＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いることによって同定した。データはスポット形成単位（ＳＦＵ）／１００万細胞±ＳＤとして提示した。すべてのパネルについて、★は組にした処理間のｔ検定のｐ＜０．０５を示す。
【図７】図７Ａ〜Ｂは、希釈してＥＬＩＳＡによってアッセイした後の不溶性（Ａ）及び可溶性（Ｂ）ｉＴＥＰC免疫化マウス血清の吸光度（ＯＤ４５０）を示す。各データ点は、マウス毎、血清希釈毎に３回繰り返した測定の吸光度値の平均に相当する。各マウスのデータを線でつないだ。陽性の吸光度値のためのカットオフ範囲を青色の陰で示した。
【図８】図８Ａ〜Ｃは、Ｓａｌｉ−ＡＢＡ及びＳａｌｉ−ＡＢＡ−ＭＰＢＨの合成スキーム及び同定を示す。図８ＡはＳａｌｉ−ＡＢＡ及びＳａｌｉ−ＡＢＡ−ＭＰＢＨの合成スキームを示す。図８ＢはＡＢＡとＳａｌｉとの間の精製した反応生成物のＥＳＩ−ＭＳスペクトルである。図８ＣはＳａｌｉ−ＡＢＡとＭＰＢＨとの間の精製した反応生成物のＥＳＩ−ＭＳスペクトルである。
【図９】図９Ａ〜Ｂは、異なる条件下での通常の４Ｔ１−ｌｕｃ細胞の生存率プロファイルを示す。図９Ａは、異なる濃度のＳａｌｉまたはＳａｌｉ−ＡＢＡに７２時間曝露した後の通常の４Ｔ１−ｌｕｃ細胞の生存率プロファイルを示す。図９Ｂは、異なる濃度のＳａｌｉ−ＡＢＡに７２時間曝露した後の腫瘍様塊４Ｔ１−ｌｕｃ細胞に対する通常の４Ｔ１−ｌｕｃ細胞の生存率プロファイルを示す。
【図１０】図１０Ａ〜ＤはｉＴＥＰ及びｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉコンジュゲートの特性を示す。図１０Ａは、１０回の精製後の精製ｉＴＥＰの銅染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真を示す。添加量は５０μｇ／ウェルであった。バンドを赤矢印で強調した。図１０Ｂは、ｐＨ＝５．０（０．１Ｍ酢酸塩バッファー）及びｐＨ＝７．０（ＰＢＳ）でのｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰのインビトロ放出プロファイルを示す。図１０Ｃは、異なる濃度のｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰまたはＳａｌｉ−ＡＢＡに７２時間曝露した後の通常の４Ｔ１−ｌｕｃ細胞の生存率プロファイルを示す。図１０Ｄは、異なる濃度のｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰに７２時間曝露した後の腫瘍様塊４Ｔ１−ｌｕｃ細胞に対する通常の４Ｔ１−ｌｕｃ細胞の生存率プロファイルを示す。図１０Ｅは、非コンジュゲートｉＴＥＰ（緑で塗りつぶした範囲）及びｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰ（赤で塗りつぶした範囲）の流体力学的径を示す。サンプル濃度は２５μＭであった。
【図１１】図１１Ａ〜Ｄは、ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉの薬物動態及び組織分布を示す。図１１Ａは、遊離形態またはｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰで投与した後のＳａｌｉ−ＡＢＡの血漿濃度を示す。図１１Ｂは、２０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与した後のＳａｌｉ−ＡＢＡの腫瘍蓄積を示す。図１１ＣはＳａｌｉ−ＡＢＡの心臓蓄積を示す。図１１Ｄは肝臓、脾臓、肺、及び腎臓におけるＳａｌｉ−ＡＢＡの蓄積を示す。
【図１２】図１２Ａ〜Ｃは、ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ−ＮＰによる原発性腫瘍成長及び転移の阻害を示す。図１２Ａは、ＰＢＳ、遊離Ｓａｌｉ−ＡＢＡ、またはｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰによって治療した後の４Ｔ１−ｌｕｃ同所性腫瘍の体積変化を示す。図１２Ｂは、図１２Ａに記載のように治療した後の４Ｔ１−ｌｕｃ同所性腫瘍を有するマウスの無転移生存率を示す。*は人道的エンドポイントに達したので何匹かのマウスを打ち切った時点を示す。図１２Ｃは図１２Ａに記載のマウスの全生存率プロファイルを示す。
【図１３】図１３Ａ〜Ｄは、ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰ及びＰＴＸ  ＮＰの併用療法が原発性腫瘍成長及び転移を阻害することを示す。図１３Ａは、ＰＴＸ  ＮＰで７２時間治療した後の通常の４Ｔ１−ｌｕｃ細胞及び腫瘍様塊４Ｔ１−ｌｕｃ細胞の生存率プロファイルを示す。図１３Ｂは、ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰ、ＰＴＸ  ＮＰ、または、ＰＴＸ  ＮＰ及びｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰの併用レジメンで治療した後の４Ｔ１−ｌｕｃ同所性腫瘍の体積変化を示す。図１３Ｃは、図１３Ｂに記載のように治療した後の４Ｔ１−ｌｕｃ同所性腫瘍を有するマウスの無転移生存率を示す。*は人道的エンドポイントに達したので何匹かのマウスを打ち切った時点を示す。図１３Ｄは、図１３Ｂに記載のマウスの全生存率プロファイルを示す。
【図１４】ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩによってｐＥＴ２５ｂ（＋）ベクターから切断した後の、アガロースゲル上のｉＴＥＰ−ワクチン融合体のコード遺伝子のバンドを示す。バンドにより、遺伝子のサイズはｉＴＥＰ融合体の予想されたサイズと一致することが確認された。
【図１５】Ｅ．ｃｏｌｉ細胞から精製した後のｉＴＥＰ−ワクチン融合体の分子量及び純度を確認したＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。
【図１６】図１６Ａ〜Ｄは、安定ｉＴＥＰ  ＮＰの設計及び生成を示す。図１６Ａは、ｉＴＥＰB70−ｉＴＥＰA28−ｐＯＶＡ（配列番号６４）及びｉＴＥＰB70−ｉＴＥＰA56−ｐＯＶＡ（配列番号６０）融合体がＭＳ−ＮＰ及びＳＴ−ＮＰに自己組織化することを示す概略図である。図１６Ｂは、３７℃での１６時間のインキュベーション前後の２つのＮＰの数分布による流体力学的径を示す。緑線はＭＳ−ＮＰであり、青線はＳＴ−ＮＰであった。図１６Ｃは、ｉＴＥＰB70−ｉＴＥＰA56-ｐＯＶＡ（ＳＴ−ＮＰ）（配列番号６０）の陰性染色サンプルの代表的なＴＥＭ顕微鏡写真であり、サンプルのＮＰ構造が確認される。３つの粒子が矢印で指示されている。図１６Ｄは、ｉＴＥＰ−ワクチン融合体のｌｏｇ１０濃度の関数としてプロットしたＩ1／Ｉ3、ピレン蛍光発光の２つのピーク［ピーク１（Ｉ370-373nm）；ピーク３（Ｉ381-384nm）］の間の比を示す。エラーバーは各データ点（ｎ＝３）の標準偏差を示す。ある融合体のシグモイドフィットの変曲点はその融合体のＣＭＣとして定義される。
【図１７】図１７Ａ〜Ｂは、ＤＬＳ測定からのサイズ対強度データを用いてＭＳ−ＮＰとＳＴ−ＮＰとの間の差を示す。図１７Ａは、ＭＳ−ＮＰ及びＳＴ−ＮＰの強度基準の流体力学的径を示す。データは、ＮＰを３７℃で１６時間インキュベートする前（０ｈ）及び後（１６ｈ）にＤＬＳによって収集した。緑線はＭＳ−ＮＰのサイズ分布を表す。青線はＳＴ−ＮＰである。インキュベーションの前では、ＭＳ−ＮＰ及びＳＴ−ＮＰの直径はそれぞれ１１１．９０±３５．０２ｎｍ及び７８．５６±２１．６０ｎｍであった。インキュベーションの後では、ＳＴ−ＮＰは７４．４５±１８．９９ｎｍの直径を有し、ＭＳ−ＮＰは２つのピーク：７５．４７±９．７５ｎｍ（９２．２％）及び８．８６±０．９０ｎｍ（７．８％）を有していた。図１７Ｂは、ＲＥＤ−ＮＰの強度基準の流体力学的径が、１６時間のインキュベーションの前後でそれぞれ７５．５５±１５．３２ｎｍ及び７０．９９±１７．５２ｎｍであったことを示す。赤破線及び赤実線は、それぞれインキュベーションの前後のＲＥＤ−ＮＰのサイズ分布を表す。
【図１８】図１８Ａ〜Ｄは、ＳＴ−ＮＰがＣＴＬワクチンに対するＭＳ−ＮＰの効果を拡張することができないこと、及びＤＣがＳＴ−ＮＰを内在化させることを示す。図１８Ａは、異なるＮＰでｐＯＶＡを送達させて細胞をインキュベートした後のＤＣ２．４細胞によるｐＯＶＡの提示を示す。データは、各処理におけるＤＣ細胞のＭＦＩ平均±ＳＤとして表し、各処理は３回繰り返した（Ｎ＝３）。★ｐ＜０．０５（ｔ検定）。グラフは４つの独立した実験から収集したデータを表す。図１８Ｂは、異なるＮＰと共にプレインキュベートしたＤＣ２．４細胞によるＢ３Ｚ細胞の活性化を示す。示した値は各処理のサンプル（Ｎ＝３）の平均ＯＤ±ＳＤである。これらの処理のＯＤ値はＮＰ不含処理の平均ＯＤに正規化されていた。★ｐ＜０．０５（ｔ検定）。グラフは３つの独立した実験から収集したデータを表す。図１８Ｃは、ＭＳ−ＮＰ及びＳＴ−ＮＰで免疫化したマウス（Ｎ＝５）由来の活性化したＳＩＩＮＦＥＫＬ拘束性脾細胞のエクスビボ分析を示す。データはスポット形成単位（ＳＦＵ）／１００万細胞±ＳＤとして表す。★ｐ＜０．０５（ｔ検定）。図１８Ｄは、ＤＣ及び様々な対照細胞によるＳＴ−ＮＰ及びＭＳ−ＮＰの取込みの比較を示す。この比のデータは比の平均±ＳＤ（Ｎ＝３）として表す。★ｐ＜０．０５（ｔ検定）。
【図１９】図１９Ａ〜Ｈは、還元環境反応型安定性を有するｉＴＥＰ  ＮＰ担体の生成の結果を示す。図１９Ａは、ｉＴＥＰB70−ｉＴＥＰA28−（Ｇ8Ｃ）4−ｐＯＶＡ（配列番号６１）融合体がＲＥＤ−ＮＰに自己組織化することを示す概略図である。図１９Ｂは、３７℃での１６時間のインキュベーション前後の２つのＮＰの数分布による流体力学的径を示す。図１９ＣはＲＥＤ−ＮＰの代表的なＴＥＭ顕微鏡写真である。３つの粒子を矢印で指示した。図１９Ｄ〜Ｆは、ＤＣ２．４細胞によって内在化されたＭＳ−ＮＰ（Ｄ）、ＳＴ−ＮＰ（Ｅ）及びＲＥＤ−ＮＰ（Ｆ）の蛍光顕微鏡検査を示す。図１９Ｇは、ＤＣ２．４細胞によるＭＳ−ＮＰ、ＳＴ−ＮＰ及びＲＥＤ−ＮＰの取込みを正規化した細胞のＭＦＩとして示す。データは平均ＭＦＩ±ＳＤ（Ｎ＝３）として表す。★ｐ＜０．０５（ｔ検定）。図１９Ｈは、ＤＣ及び様々な対照細胞によるＭＳ−ＮＰに対するＲＥＤ−ＮＰの取込みの比較を示す。データは図１８Ｄと同様に（Ｎ＝３）処理して提示した。★ｐ＜０．０５（ｔ検定）。
【図２０】図２０Ａ〜Ｂは、異なる濃度のＧＳＨで一晩処理した後のＲＥＤ−ＮＰ（Ａ）ならびにＭＳ−ＮＰ及びＳＴ−ＮＰ（Ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２１】図２１Ａ〜Ｃは、ＤＣ２．４細胞によって内在化されたＭＳ−ＮＰ（Ａ）、ＳＴ−ＮＰ（Ｂ）及びＲＥＤ−ＮＰ（Ｃ）の蛍光顕微鏡検査を示す。
【図２２】図２２Ａ〜Ｃは、ＲＥＤ−ＮＰがＳＴ−ＮＰまたはＭＳ−ＮＰよりも有効なワクチン担体であることを示す。図２２Ａは、細胞を３つのＮＰと共にインキュベートした後のＤＣ２．４細胞によるｐＯＶＡの提示である。データは、各処理におけるＤＣ細胞のＭＦＩ平均±ＳＤとして表し、各処理は３回繰り返した（Ｎ＝３）。★ｐ＜０．０５（ｔ検定）。グラフは３つの独立した実験から収集したデータを表す。図２２Ｂは、ＤＣを異なるＮＰと共にプレインキュベートした後のＤＣ２．４細胞によるＢ３Ｚ細胞の活性化の結果を示す。示した値は各処理のサンプル（Ｎ＝３）の平均ＯＤ±ＳＤである。★ｐ＜０．０５（ｔ検定）。グラフは３つの独立した実験から収集したデータを表す。図２２Ｃは、ＭＳ−ＮＰ及びＲＥＤ−ＮＰで免疫化したマウス（Ｎ＝５）由来の活性化したＳＩＩＮＦＥＫＬ拘束性脾細胞のエクスビボ分析を示す。データはスポット形成単位（ＳＦＵ）／１００万細胞±ＳＤとして表す。★ｐ＜０．０５（ｔ検定）。
【図２３】図２３Ａ〜Ｂは空の担体とのインキュベーションの結果を示す。図２３Ａは、細胞を空のｉＴＥＰ担体と共にインキュベートした後のＤＣ２．４細胞によるｐＯＶＡの提示を示す。データは各処理におけるＤＣ細胞のＭＦＩ平均±ＳＤとして表す。各処理は３回繰り返した（Ｎ＝３）。図２３Ｂは、空のｉＴＥＰ担体と共にプレインキュベートしたＤＣ２．４細胞によるＢ３Ｚ細胞の活性化の結果を示す。示した値は各処理のサンプル（Ｎ＝３）の平均ＯＤ±ＳＤである。
【図２４】図２４Ａ〜Ｄは、インビボにおいて、ＲＥＤ−ＮＰ２がＲＥＤ−ＮＰとほぼ同等であり、ＭＳ−ＮＰよりも優れていることを示す。図２４Ａは、３７℃で１６時間のインキュベーションの前後のＲＥＤ−ＮＰ２の数（上パネル）及び強度（下パネル）による流体力学的径分布を示す。図２４Ｂは、ＭＳ−ＮＰ及びＲＥＤ−ＮＰ２と共に細胞をインキュベートした後のＤＣ２．４細胞によるｐＯＶＡの提示を示す。データは各処理におけるＤＣ細胞のＭＦＩ平均±ＳＤとして表す。各処理は３回繰り返した（Ｎ＝３）。★ｐ＜０．０５（ｔ検定）。グラフは３つの独立した実験から収集したデータを表す。図２４Ｃは、ＭＳ−ＮＰ及びＲＥＤ−ＮＰ２と共にプレインキュベートしたＤＣ２．４細胞によるＢ３Ｚ細胞の活性化を示す。示した値は各処理のサンプル（Ｎ＝３）の平均ＯＤ±ＳＤである。★ｐ＜０．０５（ｔ検定）。グラフは３つの独立した実験から収集したデータを表す。図２４Ｄは、ＭＳ−ＮＰ及びＲＥＤＮＰ２で免疫化したマウス（Ｎ＝５）由来の活性化したＳＩＩＮＦＥＫＬ拘束性脾細胞のエクスビボ分析を示す。データはスポット形成単位（ＳＦＵ）／１００万細胞±ＳＤとして提示した。★ｐ＜０．０５（ｔ検定）。
【図２５】図２５Ａ〜Ｂは、ｉＴＥＰ−ワクチン融合体が細胞傷害性でないことを示す。図２５Ａは、様々なｉＴＥＰ−ワクチン融合体で処理した後のＤＣ２．４細胞の生存率を示す。図２５Ｂは、様々なｉＴＥＰ−ワクチン融合体で処理した後のＥＡ．ｈｙ９２６細胞の生存率を示す。緑点：ＭＳ−ＮＰ；青四角：ＳＴ−ＮＰ；赤三角：ＲＥＤ−ＮＰ。データは平均±ＳＤとして表す。各グラフは３つの独立した実験の結果を表す。
【図２６】図２６Ａ〜Ｂは、ＮＰがサイトゾルに到達することを示す。図２６Ａは、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡検査によって明らかとなったＤＣ２．４細胞中のＲＥＤ−ＮＰの細胞内分布を示す。赤色染料はＤＣ中の低ｐＨリソソーム区画を染色する。緑色染料はＲＥＤ−ＮＰを標識するために用いた。合成画像中の黄色染色はＲＥＤ−ＮＰ及びリソソームの共局在化を示していた。図２６Ｂは、細胞をＡｌｅｘａ−４８８標識ＲＥＤ−ＮＰと共に１時間インキュベートして洗浄した後のＤＣ２．４細胞ライセートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真である。
【図２７】図２７Ａ〜Ｃは生存率プロファイルを示す。図２７Ａは、細胞を異なる濃度のＳａｌｉ−ＡＢＡに７２時間曝露した後の、腫瘍様塊ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対する通常のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の生存率プロファイルを示す。図２７Ｂは、細胞を異なる濃度のＳａｌｉ−ＡＢＡに７２時間曝露した後の、腫瘍様塊ＨＣＴ−１５細胞に対する通常のＨＣＴ−１５細胞の生存率プロファイルを示す。図２７Ｃは、細胞を異なる濃度のＳａｌｉ−ＡＢＡに７２時間曝露した後の、腫瘍様塊ＰＣ−３細胞に対する通常のＰＣ−３細胞の生存率プロファイルを示す。
【図２８】異なる濃度のＳａｌｉ−ＡＢＡに７２時間曝露した後の２９３Ｔ細胞の生存率プロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書に含まれる以下の本発明の詳細な説明、図面及び実施例を参照することによって、本開示をより容易に理解することができる。
【００１３】
本方法及び組成物を開示及び記載する前に、それらは、特に明記しない限り、特定の合成方法に、または特に明記しない限り、特定の試薬に限定されず、そのため当然変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で用いる用語は、特定の態様を記述する目的のみのためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。本明細書に記載のものと類似または等価な任意の方法及び材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、例示的な方法及び材料をこれから記載する。
【００１４】
さらに、特に明記しない限り、本明細書に記載のいかなる方法も、決して、そのステップが特定の順序で実施される必要があると解釈されることを意図していないと理解されたい。したがって、方法の請求項でそのステップが従うべき順序を実際に述べていない、または特許請求の範囲もしくは明細書中でステップが特定の順序に限定されると別途明記していない場合、いかなる点においても、決して順序を推定することを意図していない。このことは、ステップの配列または作業フローに関する論理の問題、文法構成または句読法から得られる明白な意味、及び明細書に記載の態様の数または種類をはじめとする、あらゆる可能な非明示的な解釈の基礎を保つ。
【００１５】
本明細書で言及するすべての刊行物は、引用する刊行物が関連する方法及び／または材料を開示及び記載するために、参照により本明細書に援用する。本明細書で述べた刊行物は、本出願の出願日より前のその開示に関してのみが提供される。本明細書のいかなるものも、そのような刊行物が先行発明であるとして、本発明が先行する権利を有しないとする自認であると解釈されるべきではない。さらに、本明細書で提供する公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、個別の確認を必要とし得る。
【００１６】
定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明らかに分かる場合を除いて複数形の指示対象を含む。
【００１７】
本明細書で用いる場合、用語「または」は、特定のリストの任意の１つの要素を意味し、そのリストの要素の任意の組合せも含む。
【００１８】
本明細書において、範囲は、「約」もしくは「およそ」の１つの特定の値から、及び／または「約」もしくは「およそ」の別の特定の値までとして表すことができる。そのような範囲を表す場合、さらなる態様は、一方の特定の値から、及び／または他方の特定の値まで含む。同様に、先行語「約」または「およそ」の使用によって、値を近似として表す場合、特定の値がさらなる態様を形成すると理解されよう。各範囲の端点は、他方の端点と関連する場合及び他方の端点と独立している場合の両方において有意であることがさらに理解されよう。多数の値が本明細書に開示されており、各値は、その値自身に加えて、「約」その特定の値としても本明細書に開示されることも理解されるべきである。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」も開示される。２つの特定の単位の間の各単位も開示されることも理解されるべきである。例えば、１０及び１５が開示される場合、１１、１２、１３、及び１４も開示される。
【００１９】
本明細書で用いる場合、用語「任意の」または「任意に」は、その後に記載の事象または状況が起きても起きなくてもよいことを意味し、この記載はその事象または状況が起きる場合及び起きない場合を含むことを意味する。
【００２０】
本明細書で用いる場合、用語「サンプル」は、被検者由来の組織もしくは器官；細胞（被検者内にあるか、被検者から直接採取したか、もしくは培養状態を維持している、もしくは培養された細胞株由来の細胞）；細胞ライセート（もしくはライセート画分）もしくは細胞抽出物；または細胞もしくは細胞物質に由来する１つ以上の分子（例えばポリペプチドもしくは核酸）を含有する溶液を意味し、本明細書に記載のようにアッセイされる。サンプルは、細胞または細胞成分を含有する任意の体液または排泄物（例えば、限定はしないが血液、尿、便、唾液、涙、胆汁）でもあり得る。
【００２１】
本明細書で用いる場合、用語「被検者」は、投与の対象、例えばヒトのことをいう。したがって、本開示の方法の被検者は、脊椎動物、例えば哺乳類、魚類、鳥類、爬虫類、または両生類などとすることができる。用語「被検者」には、家庭動物（例えばネコ、イヌなど）、家畜（例えばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、及び実験動物（例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット、ショウジョウバエなど）も含まれる。一態様において、被検者は哺乳類である。別の態様において、被検者はヒトである。この用語は特定の年齢または性別を表さない。したがって、成人、小児、青年及び新生児の被検者、ならびに胎児が、男性または女性にかかわらず、含まれることを意図する。
【００２２】
本明細書で用いる場合、用語「患者」は、疾患または障害を患っている被検者のことをいう。用語「患者」にはヒト及び動物被検者が含まれる。本開示の方法のいくつかの態様において、「患者」は、例えば投与ステップの前などに、癌の治療が必要であると診断されている。
【００２３】
本明細書で用いる場合、用語「含む」は「からなる」及び「から本質的になる」の側面を含むことができる。
【００２４】
本明細書で用いる場合、用語「ｉＴＥＰ」は、免疫寛容なエラスチン様ポリペプチドのことをいい、これは相転移特性を有し、免疫寛容であるので、これまでに開示されたエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰと呼ぶ）とは異なる。
【００２５】
緒言
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘発するワクチンは、癌及び感染症に対する重要な予防または治療モジュールである。(1-3)抗原提示細胞へのこうしたワクチンの送達を促進するために担体を用いることが、ワクチンの効力を向上させるための戦略である。(4,5)ＣＴＬワクチン担体の構築材料として様々な天然及び合成材料が試験されてきたが、(6,7)ＣＴＬ応答を促進するための臨床用途に承認されたものはウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、(5)他の好適なワクチン担体材料を同定する必要性が浮き彫りにされた。
【００２６】
エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）及びＶＬＰは両方ともタンパク質である。ＶＬＰと同様に、ＥＬＰもほぼ同等のサイズのナノ粒子（ＮＰ）に自己組織化することができる。(8)ＶＬＰとのこれらの類似性の他に、ＥＬＰはワクチン送達にとって魅力的ないくつかの追加の特徴を有する：（１）タンパク質またはペプチドベースのＣＴＬワクチンは、潜在的に、遺伝子操作アプローチを用いてＥＬＰと融合させることができ、既存のＥＬＰ融合体に類似した、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の発現系で容易に複製することのできる融合タンパク質が得られる；(9,10)（２）本明細書に記載の遺伝子操作アプローチを用いてワクチンを担体に担持させた場合、ワクチンのコピー数及び担体からのそれらの切断部位が明確に定まり、ワクチンの効力を向上させるように正確に調節される；(11-13)ならびに（３）ＥＬＰの特徴―可逆的熱（またはイオン）誘発性逆相転移―は、ＥＬＰ−タンパク質融合体に、及びおそらくｉＴＥＰ−ワクチン融合体に伝達可能である。(14)したがって、融合体は転移サイクルを繰り返すことによって単純に精製することができる。これらの魅力的特徴を有するにもかかわらず、ＥＬＰはこれまでＣＴＬワクチン担体として報告されていなかった。本明細書では、ＣＴＬワクチン担体としてＥＬＰ（ｉＴＥＰと呼ぶ）ナノ粒子を用いる組成物及び方法を開示する。これまでの報告から、体液性免疫原性担体はそのＣＴＬワクチンペイロードの効力を損なうことが分かっている。(15-17)本明細書では、ＣＴＬワクチン担体としての体液性寛容ＥＬＰの使用について記載する。報告されたＥＬＰの中で、少数は免疫寛容と確認されているが、他は免疫原性と分かっている。(18-22)しかし、これらの免疫寛容ＥＬＰにはＮＰを形成するのに要求される疎水性及び長さがない。この制限から、ワクチン送達の必要性を満足する本明細書に記載の新規な免疫寛容ＥＬＰの設計及び生成に至る。
【００２７】
ポリペプチド材料は、ＥＬＰを含め、一般に発明され、物理化学的性質、例えば相転移特性などが最適化されているが、その物理化学的性質が確立された後でその免疫原性が考慮されていた。しかし、そのような慣行は、機能の特徴が十分に分かったＥＬＰが、後に発見される有害な免疫原性のために、実際には無価値になり得るリスクを抱えている。(23,24)したがって、本明細書に記載するように、開発の最初からＥＬＰの相転移特性に加えて免疫原性も同等に重要視した新規のＥＬＰ開発手法を用いた。
【００２８】
この新規の手法を用いて、ＥＬＰ（例えばｉＴＥＰ）を本明細書に記載する。各配列は典型的なＥＬＰ「Ｖ−Ｐ−Ｇ−Ｘ−Ｇ」（配列番号２９）モチーフに対して非カノニカルである。(25,26)本明細書で用いる場合、これらの新規なＥＬＰは、この新規ＥＬＰ改変手法を強調してｉＴＥＰと呼ぶ。本明細書に開示のｉＴＥＰは望ましい転移特性を有し、また、マウス体液性免疫に寛容された。両親媒性二元ブロックコポリマーまたは融合タンパク質を作製するために疎水性が反対であった２つの対形成したｉＴＥＰも本明細書に記載する。融合タンパク質は２つ以上のタンパク質同士を融合することによって生成することができる。２つのタンパク質の融合体を表現するために二元ブロックコポリマーを用いることができる。コポリマー（例えば融合タンパク質）は、モデルＣＴＬペプチドワクチンＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）と融合した場合、ＮＰに自己組織化した。ＮＰは樹状細胞（ＤＣ）によるワクチンの提示を向上させ、ワクチン誘発性ＣＴＬ応答の強度を増加させた。本明細書に開示する結果は、この新規手法を用いて開発されたｉＴＥＰがＣＴＬペプチドワクチン担体に適していることを示す。
【００２９】
組成物
組換えポリペプチド。本明細書で用いる場合、用語「組換えポリペプチド」は、組換え技術を含む様々な方法によって生成されたポリペプチドのことをいう。
【００３０】
ある態様において、組換えポリペプチドは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−（Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ）28−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２３）；Ｇｌｙ−（Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）70−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２４）；Ｇｌｙ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）21−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２５）；またはＧｌｙ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）96−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２６）を含む。
【００３１】
組換えポリペプチドは、２つ以上の相同アミノ酸リピートをさらに含むことができる。ある態様において、組換えポリペプチドは、二元ブロックコポリマーまたは融合タンパク質を含む。二元ブロックコポリマーまたは融合タンパク質は、共有結合によって互いに結合した２つまたは３つの相同アミノ酸リピートを含む。二元ブロックコポリマーまたは融合タンパク質と治療薬（例えばワクチン）またはプラスミド（例えばｐＯＶＡ）との間に、１つ以上のシステイン残基を挿入することができる。システイン残基の数は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、もしくはこれより多く、または間の任意の数とすることができる。ある態様において、システイン残基の数は４である。システイン残基は１つ以上のグリシン残基によって隔てることができる。グリシン残基の数は異なり、二元ブロックコポリマーとｐＯＶＡとの間に挿入されるシステイン残基の数に依存することができる。グリシン残基の数は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、もしくはこれより多く、または間の任意の数とすることができる。ある態様において、グリシン残基の数は８とすることができる。例えば、二元ブロックコポリマーとｐＯＶＡとの間に４つのシステイン残基が挿入される場合、８つのグリシン残基を挿入して隣接するシステイン残基を隔てることができる。ある態様において、二元ブロックコポリマーまたは融合タンパク質は両親媒性とすることができる。いくつかの態様において、二元ブロックコポリマーまたは融合タンパク質は治療薬（例えばワクチン）と融合させることができる。
【００３２】
本明細書では、式：Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘａａ1−Ｇｌｙ−Ｘａａ2−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（式中、Ｘａａ1はＬｅｕまたはＰｈｅであり、Ｘａａ2はＡｌａまたはＶａｌである）（配列番号１６〜１９）に従うアミノ酸配列を含み、このアミノ酸配列が繰り返される組換えポリペプチドも開示する。組換えポリペプチドは、組換えポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方に位置する１つ以上の残基をさらに含むことができる。ある態様において、１つ以上の残基はグリシン、アラニン、もしくはセリンまたはこれらの組合せである。ある態様において、組換えポリペプチドは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）21−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２５）；またはＧｌｙ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）96−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２６）；またはＸＸ−（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｘ−ＸＸ（配列番号２７）を含む。後述するように、「ＸＸ」はＣ末端及びＮ末端の両方における１つ以上のグリシン残基とすることができ、「ｘ」は２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００または間の任意の数とすることができる。
【００３３】
ある態様において、組換えポリペプチドの同定される分子量は１０〜１００ｋＤａとすることができる。
【００３４】
相同アミノ酸リピート。本明細書で用いる場合、用語「相同アミノ酸リピート」または「モノマー」は、２０種のタンパク質アミノ酸のいずれかを含むアミノ酸配列のことをいい、直線状に反復または複製されている。相同アミノ酸リピート配列は、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００回もしくはこれより多く、または間の任意の回数繰り返すことができる。ある態様において、相同アミノ酸リピートは１００以下のリピートを含む。別の態様において、相同アミノ酸リピートは少なくとも２０のリピートを含む。
【００３５】
ある態様において、相同アミノ酸リピートは、配列Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（配列番号１；ｉＴＥＰA）；Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号２；ｉＴＥＰB）；Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号３；ｉＴＥＰC）；Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号４；ｉＴＥＰD）；Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号５；ｉＴＥＰE）；Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号６）；Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号７）；Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号８）；Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号９）；Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号１０）；Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（配列番号１１）；Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１２）；Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１３）；Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１４）；またはＧｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１５）とすることができる。表１に相同アミノ酸リピート配列をリストする。
表１．相同アミノ酸リピート配列
2018521977.tif 000003
【００３６】
別の態様において、相同アミノ酸リピートはアミノ酸配列：Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号２８）ではない。
【００３７】
ある態様において、相同アミノ酸リピート配列は４つ以上のアミノ酸残基を含む。ある態様において、アミノ酸残基の１つはプロリンであり、アミノ酸残基の１つ以上はバリンである。プロリン及びバリン残基は互いに隣接させることができる。あるいは、プロリン及びバリン残基は互いに隣接していない。いくつかの態様において、ただ１つのプロリンが相同アミノ酸リピート中に存在する。相同アミノ酸リピート配列はエラスチンにおける自然発生配列として存在することができる。相同アミノ酸リピート配列は、Ｎ末端及びＣ末端の両方に１つ以上のグリシン残基が天然で隣接していてもよい。
【００３８】
ある態様において、相同アミノ酸リピートはエラスチン由来とすることができる。相同アミノ酸リピート配列はマウス及び／またはヒトエラスチンに由来することができる。相同アミノ酸リピート配列は、Ｃ末端及びＮ末端の両方に１つ以上のグリシン残基がさらに隣接することができるマウス及び／またはヒトエラスチンに由来することができる。ある態様において、相同アミノ酸リピートは、配列番号１〜１５などのうちの１つ以上である相同アミノ酸リピートに対してある程度の同一性または相同性を示すことができる。同一度は異なり、当業者にとって公知の方法によって確認することができる。用語「相同性」及び「同一性」はそれぞれ、２つのポリペプチド配列の間の配列類似性のことをいう。相同性及び同一性はそれぞれ、比較のためにアラインメントすることのできる各配列中の位置を比較することによって確認することができる。比較した配列中の位置が同じアミノ酸残基によって占められている場合、ポリペプチドはその位置で同一と呼ぶことができ、相当部位が同じアミノ酸（例えば同一）または類似のアミノ酸（例えば立体的及び／または電子的性質が類似）によって占められている場合、分子はその位置で相同と呼ぶことができる。配列間の相同率または一致率は、配列によって共有される一致または相同な位置の数の関数である。本明細書に記載の組換えポリペプチドの相同アミノ酸リピートは、配列番号１〜１５などのうちの１つ以上である相同アミノ酸リピートとの少なくともまたは約２５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性または相同性を有することができる。
【００３９】
ある態様において、本明細書に記載の組換えポリペプチドは、組換えポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方に位置する１つ以上の残基をさらに含むことができる。１つ以上の残基はグリシン、アラニン、もしくはセリンまたはこれらの組合せとすることができる。本明細書に記載の１つ以上の残基は免疫原性を減少させる任意の残基とすることができる。
【００４０】
ある態様において、組換えポリペプチドは免疫原性とすることができる。例えば、組換えポリペプチドは、マウスに対して免疫原性とすることができ、可溶性単一分子相と不溶性凝集体相との間の熱及びイオン誘発性可逆的逆相転移を有することができる。この群のポリペプチドを本明細書では免疫原性エラスチン様ポリペプチド（ｉＭＥＰ）と呼ぶ。
【００４１】
ある態様において、相同アミノ酸リピートは、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号２０；ｉＭＥＰＡ）；及びＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号２１；ｉＭＥＰＢ）である。
【００４２】
ある態様において、本明細書に開示のｉＭＥＰは、例えば１つ以上のｉＴＥＰに対する対照材料として用いることができる。それらは、免疫原性担体が所望される場合に薬物担体として用いることもできる。多くの態様において、本明細書に開示のｉＭＥＰは、本明細書でｉＴＥＰについて規定するように作製して使用することができる。さらに、多くの態様において、ｉＴＥＰに関する開示はｉＭＥＰにも適用することができる。
【００４３】
非免疫原性バイオコンジュゲートの作製方法
本明細書で用いる場合、用語「非免疫原性バイオコンジュゲート」は、本明細書に記載の組換えポリペプチド及び１つ以上の治療薬を含むタンパク質のことをいう。
【００４４】
本明細書に記載の非免疫原性バイオコンジュゲートの生成に用いることができる技術を本明細書で開示する。
【００４５】
設計。ある態様において、本明細書に記載の組換えポリペプチド（例えばｉＴＥＰ）は、エラスチンに由来するペプチドのポリマーとして設計することができる。組換えポリペプチドはマウス及びヒトにおいて体液性寛容とすべきであり、Ｂ細胞受容体に結合する１つ以上のエピトープ、及びＭＨＣクラスＩＩ複合体に結合し、続いてＴ細胞受容体（例えばＣＤ４＋Ｔ細胞）と結合する１つ以上のエピトープを含有する。選択される組換えポリペプチド配列は自己免疫応答を内因的に誘発すべきではない（すなわち配列はＢ細胞またはＴ細胞受容体に内因的に結合すべきではない）。
【００４６】
免疫原性である組換えポリペプチドを生成する可能性を減少させるために、２つの戦略を用いることができる。第１に、外因性接合配列の生成を制限するために、ヒト及びマウスエラスチン中の通常の既存のペプチドリピートを相同アミノ酸リピートのコンポーネントとして用いることができる。第２に、１つ以上の外因性接合配列が生成された場合には、相同アミノ酸リピートは４残基以上でエラスチン由来とし、１つ以上のグリシン残基がＮ及びＣ末端で隣接しているべきである。短いものではなく長い相同アミノ酸リピートを用いることによって、外因性接合配列の数を減少させることができる。外因性接合配列を減少または排除することが、組換えポリペプチドまたは相同アミノ酸リピートの免疫原性を減少し得る。
【００４７】
いくつかの態様において、相同アミノ酸リピートが相転移特性を有するために、１つのプロリン残基及び１つ以上のバリン残基を有するように設計することができる。
【００４８】
非免疫原性コンジュゲートとして有用なポリペプチドは、核酸からタンパク質を生成するために定型的に用いられる合成方法及び組換え技術によって生成することができる。ポリペプチドは、後で使用するまで未精製または単離もしくは実質的に精製された形態で保存することができる。
【００４９】
非免疫原性バイオコンジュゲート。いくつかの態様において、本明細書に開示の組換えポリペプチドは組換え融合タンパク質または二元ブロックポリマーである。これは、様々な発現系（例えばＥ．ｃｏｌｉ、酵母、昆虫細胞、及び哺乳類細胞培養物；ならびに植物）で発現させることができる。簡潔に述べると、組換え融合タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを上記の発現系のいずれかの細胞内に形質移入することができる。融合タンパク質（例えばｉＴＥＰB−ｉＴＥＰA）がこれらの系のいずれか１つにおいて産生された後、それらを精製、凍結乾燥して使用するまで保存することもできる。
【００５０】
治療薬。多種多様な治療薬を非免疫原性バイオコンジュゲートに組込み、会合、または連結することができる。治療薬は、化学化合物、タンパク質、ペプチド、低分子または細胞とすることができる。治療薬の例としては、ペプチドワクチン、抗体、核酸（例えばｓｉＲＮＡ）及び細胞ベースの作用物質（例えば幹細胞、ＣＡＲ−Ｔ細胞）が挙げられる。いくつかの態様において、治療薬のうちの１つ以上は抗癌剤とすることができる。抗癌剤は抗癌特性を有する作用物質、ワクチンまたは薬物とすることができる。ある態様において、抗癌剤は抗微生物または抗ウイルス特性を有する。ある態様において、抗癌剤は癌幹細胞阻害剤とすることができる。抗癌剤の例は、サリノマイシン及びパクリタキセルまたはそれらの任意のアナログである。
【００５１】
本明細書に記載の組換えポリペプチドは、例えば細胞接着及び成長のための、スキャホールド材料用の担体として用いることもでき、そのため、組織修復または細胞ベース療法に用いることができる。組換えポリペプチドは、例えば、インビトロ及びインビボでの細胞成長を促進するためのマトリックスゲルとして、及びアジュバントとして用いることもできる。
【００５２】
リンカー。本明細書に記載の非免疫原性バイオコンジュゲートは１つ以上のリンカーをさらに含むことができる。本明細書に開示の組成物中の所与のリンカーは、切断可能な結合（例えばチオエステル結合）をもたらすことができる。結合に利用可能な部位は、本明細書に記載の組換えポリペプチド上に見出すことができる。本非免疫原性バイオコンジュゲートにおいて有用なリンカーは、治療薬またはワクチンを結合させる組換えポリペプチド上の一級アミンと反応する基を含むことができる。有用なリンカーは民間の供給元から入手可能である。ある態様において、リンカーは４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド塩酸塩（ＭＰＢＨ）とすることができる。当業者は適切なリンカーを選択することができる。
【００５３】
リンカーは共有結合とすることができる。共有結合を形成するために、例えば、多種多様な活性カルボキシル基（例えばエステル）を有する化学反応性基を用いることができるが、この場合、組換えポリペプチドを修飾するのに必要なレベルでヒドロキシル部分が生理学的に許容可能である。
【００５４】
本明細書に記載の、非免疫原性コンジュゲートに組み込まれる組換えポリペプチドのいずれも、本明細書に記載のリンカーと化学相互作用するように、またはそれを含むように修飾することができる。こうした修飾組換えポリペプチド及びペプチド−リンカーコンストラクトは本開示の範囲内であり、治療薬へのコンジュゲーションのプロセスを完了するための使用説明書と共にキットの構成要素としてパッケージ化することができる。組換えポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、または両方でシステイン残基または他のチオ含有部分（例えばＣ−ＳＨ）を含むように修飾することができる。
【００５５】
ある態様において、当業者にとって公知の方法を用いて、治療薬（例えばパクリタキセル）を組換えポリペプチド上にカプセル化または担持することができる。カプセル化した治療薬は高速液体クロマトグラフィーによって確認することができる。
【００５６】
構成。組換えポリペプチド、治療薬、及びリンカーをはじめとする非免疫原性バイオコンジュゲートの各部分は、独立して選択することができる。構成部分は融和性があるように関連している必要があることを当業者であれば理解しよう。癌及び感染症の治療のために、非免疫原性バイオコンジュゲートを用いて患者に治療薬を送達することができる。非免疫原性バイオコンジュゲート当たりの治療薬の数は、さらなるｉＴＥＰ（例えば二元ブロックポリマー、融合タンパク質）を追加することによって制御することができる。１つ以上のシステイン残基をｉＴＥＰの末端の一方に付加することができ、１つ以上の治療薬のためのコンジュゲーション部位として用いることができる。例えば、８つのシステイン残基を付加して、８つの治療薬のための８つのコンジュゲーション部位を得ることができる。治療薬は同じか、異なるか、または任意のその組合せとすることができる。２つのシステイン残基を本明細書に記載の組換えポリペプチド（例えばｉＴＥＰ）の末端に付加する場合、１つ以上のスペーサー（例えばグリシン残基）を、例えば、２つのシステイン残基の間に挿入することができる。スペーサーの数は、付加したシステイン残基の数または所望の治療薬分子の数に応じて調節することができる。スペーサーは、２つ以上の治療薬を収容するのに十分な間隔をもたらす役割を果たす。スペーサーは、１つ以上のグリシンもしくはセリンまたはこれらの組合せとすることができる。
【００５７】
したがって、いくつかの態様において、治療薬は２つ以上とすることができる。他の実施形態において、本明細書に記載の組換えポリペプチド（例えばｉＴＥＰ）及び治療薬は、１：１（組換えポリペプチド：治療薬）の比で存在する。組換えポリペプチド：治療薬の比は、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０または任意の他のこれらの組合せとすることもできる。本明細書に記載の組換えポリペプチドに結合させることのできる治療薬の数は、所与のポリペプチドに付加されるコンジュゲーション部位（例えばシステイン残基）の数によって決定することができる。
【００５８】
本明細書に記載の組換えポリペプチドの間（例えば２つのｉＴＥＰ分子間）に１つ以上のシステイン残基を付加することができる。システイン残基は、２つ以上のスペーサー（例えばグリシン残基）を付加することによってさらに隔てることができる。例えば、二元ブロックポリマー（またはコポリマーもしくは融合タンパク質）とプラスミド（例えばｐＯＶＡ）との間に、４つのシステイン残基を挿入することができる。これらのシステイン残基は、例えば、８つのグリシン残基の付加によってさらに隔てることができる。
【００５９】
標識。本明細書に記載の組換えポリペプチドは、１つ以上の標識または検出タグをさらに含むことができる。（例えばＦＬＡＧ（商標）タグ、エピトープまたはタンパク質タグ、例えばｍｙｃタグ、６Ｈｉｓ、及び蛍光融合タンパク質など）。ある態様において、標識（例えばＦＬＡＧ（商標）タグ）を組換えポリペプチドに融合する。ある態様において、開示の方法及び組成物は、融合タンパク質、またはそれをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。様々な態様において、融合タンパク質は少なくとも１つのエピトープ付与アミノ酸配列（例えば「エピトープタグ」）を含み、エピトープタグは、ｉ）タンパク質（例えば組換えポリペプチド）のＮ及び／またはＣ末端に付加されるエピトープタグ；またはｉｉ）タンパク質（例えば組換えポリペプチド）のある領域に挿入されるエピトープタグ、及びタンパク質（例えば組換えポリペプチド）中のいくつかのアミノ酸を置換するエピトープタグから選択される。
【００６０】
エピトープタグは、短い一連のアミノ酸であり、これに対して特異的抗体を産生させることができ、いくつかの態様において、生体または培養細胞に添加されたタグ付きタンパク質を特異的に同定して追跡することを可能にする。タグ付き分子の検出は複数の異なる技術を用いて達成することができる。そのような技術の例としては、免疫組織化学、免疫沈降、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査、ＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング（「ウエスタンブロッティング」）、及びアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。エピトープタグは、対象タンパク質上に既知のエピトープ（例えば抗体結合部位）を付加して、既知の及び多くの場合、高アフィニティーの抗体の結合をもたらし、これにより、生体または培養細胞に添加されたタグ付きタンパク質を特異的に同定して追跡することが可能となる。エピトープタグの例としては、ｍｙｃ、Ｔ７、ＧＳＴ、ＧＦＰ、ＨＡ（ヘマグルチニン）、Ｖ５及びＦＬＡＧタグが挙げられるが、これらに限定されない。最初の４つの例は現存する分子に由来するエピトープである。対照的に、ＦＬＡＧは高い抗原性のために設計された合成エピトープタグである（例えば、米国特許第４，７０３，００４号及び第４，８５１，３４１号を参照）。エピトープタグは、抗体による認識以外に１つ以上の追加の機能を有することができる。
【００６１】
ある態様において、開示の方法及び組成物はエピトープタグを含み、エピトープタグは６〜１５アミノ酸の長さを有する。代替的な態様において、エピトープタグは９〜１１アミノ酸の長さを有する。開示の方法及び組成物は、間隔があいているか、または直接連なった２つ以上のエピトープタグを含む融合タンパク質を含むこともできる。さらに、開示の方法及び組成物は、融合タンパク質がその生物活性（複数可）（例えば「機能的な」）を維持する限り、２、３、４、５、さらにはこれよりも多くのエピトープタグを含むことができる。
【００６２】
ある態様において、エピトープタグは、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＣＤタグ、カルモジュリン結合ペプチドタグ、Ｓタグ、Ａｖｉｔａｇ、ＳＦ−ＴＡＰタグ、ｓｔｒｅｐタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｔ７タグ、ＨＡ（ヘマグルチニン）タグ、Ｈｉｓタグ、Ｓタグ、ＧＳＴタグ、またはＧＦＰタグである。これらのタグの配列は文献に記載されており、当業者にとって公知である。
【００６３】
本明細書に記載の「免疫学的結合」は、抗原のエピトープ（例えばエピトープタグ）と抗体またはその断片の抗原特異的部分との間の非共有結合形態の結合である。抗体はモノクローナルであることが好ましく、用いられるエピトープタグ（複数可）のそれぞれに特異的でなければならない。抗体としては、マウス、ヒト及びヒト化抗体が挙げられる。抗体断片は当業者にとって公知であり、中でも、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ断片）及びＦａｂ断片が挙げられる。抗体は、通常のハイブリドーマ及び／または組換え技術によって生成することができる。多くの抗体は市販されている。
【００６４】
既知のタンパク質のドメインから、またはタンパク質全体もしくはタンパク質及びペプチドからの融合タンパク質の構築は公知である。一般に、遺伝子操作技術を用いて、所望のタンパク質及び／またはペプチド部分をコードする核酸分子を接合し、単一の作用可能に連結した融合オリゴヌクレオチドを作製する。適切な分子生物学的技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  ＵＳＡ，  １９８９）に見出すことができる。遺伝子操作マルチドメインタンパク質の例としては、様々なリンカーによって接合されたもの、及びペプチドタグを含有するものが挙げられ、以下の特許文献に見出すことができる：米国特許第５，９９４，１０４号（“Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ”）；米国特許第５，９８１，１７７号（“Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ”）；米国特許第５，９１４，２５４号（“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄ  ｏｕｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”）；米国特許第５，８５６，４５６号（“Ｌｉｎｋｅｒ  ｆｏｒ  ｌｉｎｋｅｄ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ”）；米国特許第５，７６７，２６０号（“Ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”）；米国特許第５，６９６，２３７号（“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔｏｘｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ”）；米国特許第５，５８７，４５５号（“Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ”）；米国特許第４，８５１，３４１号（“Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ”）；米国特許第４，７０３，００４号（“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ”）；及びＷＯ  ９８／３６０８７（“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  ＨＩＶ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ”）。
【００６５】
対象融合タンパク質中の機能化ペプチド部分（エピトープタグ）の配置は、機能化ペプチド部分の活性、及び融合体において融合タンパク質、例えばＴＣＲなどの生物活性の少なくとも大部分を維持する必要性によって影響され得る。機能化ペプチドの配置のための２つの方法は、Ｎ末端、及び挿入可能性を示すタンパク質部分中の位置への配置である。これらのみが機能化ペプチドを挿入することができる位置ではないが、これらは良い例となり、例示として用いられよう。他の適切な挿入位置は、配列（例えばＦＬＡＧペプチドをコードする配列）をコードする試験ペプチドを異なる位置でコンストラクト中に挿入し、その後、融合体を構築するために用いた特定の部分にとって適切なアッセイを用いて、適切な生物活性及び機能化ペプチド活性について得られた融合体をアッセイすることによって特定することができる。対象タンパク質の活性は、本明細書に記載のものを含め、様々な公知の技術のいずれかを用いて測定することができる。
【００６６】
本明細書に開示の非免疫原性バイオコンジュゲートを生成するプロセスに関する本明細書に開示の方法は、非免疫原性バイオコンジュゲートの医薬品として許容可能な塩を生成するように容易に変更することができる。そのような塩を含む医薬組成物及びその投与方法は本開示の範囲内である。
【００６７】
医薬組成物
上記の非免疫原性バイオコンジュゲート（及び組換えポリペプチド）ならびに医薬品として許容可能な担体を含む医薬組成物を本明細書に開示する。いくつかの態様において、治療薬は抗癌剤または抗微生物剤もしくは抗ウイルス剤であり、医薬組成物は静脈内投与のために製剤化される。本開示の組成物は、治療有効量の本明細書に記載の非免疫原性バイオコンジュゲートも含有する。組成物は、様々な投与経路のいずれかによる投与のために製剤化することができ、１つ以上の生理学的に許容可能な添加物を含むことができ、これは投与経路に応じて変更することができる。本明細書で用いる場合、用語「添加物」は任意の化合物または物質を意味し、「担体」または「希釈剤」と呼ぶこともできるものを含む。医薬品として及び生理学的に許容可能な組成物の調製は当該技術分野においては定型的なものと考えられており、したがって、当業者は必要であれば教示について多数の権威を参照することができる。
【００６８】
本明細書に開示の医薬組成物は、経口または腸管外投与のために調整することができる。腸管外投与のために調製された医薬組成物としては、静脈内（もしくは動脈内）、筋肉内、皮下、腹腔内、経粘膜（例えば鼻腔内、膣内、もしくは経直腸）、または経皮（例えば外用）投与のために調製されたものが挙げられる。エアゾール吸入も非免疫原性バイオコンジュゲートを送達するために用いることができる。したがって、組成物は、限定はしないが水性担体、例えば水、緩衝水、生理食塩水、緩衝生理食塩水（例えばＰＢＳ）などをはじめとする許容可能な担体中に溶解または懸濁した非免疫原性バイオコンジュゲートを含む腸管外投与のために調製することができる。含まれる添加物の１つ以上、例えばｐＨ調節及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、界面活性剤などは、生理的条件に近づけるのに役立つことができる。組成物が固形成分を含む場合（経口投与用の場合のように）、添加物の１つ以上は結合剤または増量剤（例えば錠剤、カプセルなどの製剤化用）として機能することができる。組成物が皮膚または粘膜表面への適用のために製剤化される場合、添加物の１つ以上は、クリーム、軟膏などの製剤化のための溶媒または乳化剤とすることができる。
【００６９】
医薬組成物は無菌とすることができ、従来の滅菌技術によって滅菌するか、または滅菌濾過することができる。水溶液をそのまま使用するためにパッケージ化することができるか、または凍結乾燥することができ、凍結乾燥調製物は、本開示に包含されるが、投与前に滅菌水性担体と混合することができる。医薬組成物のｐＨは典型的に３〜１１（例えば約５〜９）または６〜８（例えば約７〜８）になるであろう。固体形態の得られる組成物は複数の単回投与単位にパッケージ化することができ、それぞれ、錠剤またはカプセルの密封パッケージにおけるように、上述の作用物質または複数の作用物質を一定量含有する。固体形態の組成物は、外用クリームまたは軟膏用に設計されたスクイーズチューブにおけるように、量の融通が利く容器中にパッケージ化することもできる。
【００７０】
治療方法
癌患者の治療方法を本明細書に開示するが、この方法は、（ａ）治療を必要とする患者を特定すること；ならびに（ｂ）４つ以上のアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基の１つがプロリンであり、アミノ酸残基の１つ以上がバリンである相同アミノ酸リピートを含む組換えポリペプチド；及び治療薬を含む非免疫原性バイオコンジュゲート、ならびに医薬品として許容可能な担体を含む治療有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む。
【００７１】
感染症患者の治療方法を本明細書に開示するが、この方法は、（ａ）治療を必要とする患者を特定すること；ならびに（ｂ）４つ以上のアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基の１つがプロリンであり、アミノ酸残基の１つ以上がバリンである相同アミノ酸リピートを含む組換えポリペプチド；及び治療薬を含む非免疫原性バイオコンジュゲート、ならびに医薬品として許容可能な担体を含む治療有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む。
【００７２】
上記の医薬組成物は、治療有効量の非免疫原性バイオコンジュゲートを含むように製剤化することができる。治療的投与は予防的適用を包含する。遺伝子検査及び他の予後予測方法に基づいて、患者を診察している医師は、ある種の癌または感染症の臨床的に判定された疾病素質を有するか、または罹病性が増加している（場合によっては、罹病性が大幅に増加している）場合に、予防的投与を選択することができる。
【００７３】
本明細書に記載の医薬組成物は、臨床疾患の発症を遅延、軽減、または好ましくは防止するのに十分な量で被検者（例えばヒト患者）に投与することができる。したがって、いくつかの態様において、患者はヒト患者である。治療用途において、すでに癌（もしくは感染症）があるか、または癌（もしくは感染症）と診断された被検者（例えばヒト患者）に、徴候もしくは症状を少なくとも部分的に改善するのに、または病態、その合併症、及び結果の症状の進行を抑制する（及び好ましくは阻止する）のに十分な量で組成物を投与することができる。これを達成するのに十分な量を「治療有効量」と定義する。医薬組成物の治療有効量は治癒を達成する量とすることができるが、このアウトカムは達成することのできる複数のうちの１つにすぎない。述べたように、治療有効量としては、癌（もしくは感染症）の発症もしくは進行を遅延、阻害、もしくは防止するか、または癌（もしくは感染症）もしくは癌（もしくは感染症）の症状を寛解させる治療をもたらす量が挙げられる。症状の１つ以上はそれほど重度でなくてもよい。治療した個体では回復が加速し得る。
【００７４】
いくつかの態様において、癌は原発性または続発性腫瘍である。他の態様において、原発性または続発性腫瘍は患者の乳房、肺、結腸または卵巣内にある。
【００７５】
癌患者の治療方法を本明細書に開示する。癌は任意の癌とすることができる。いくつかの態様において、癌は乳癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、または胃癌である。ある態様において、癌は転移性である。いくつかの態様において、癌は癌幹細胞に関連している。
【００７６】
この用途に有効な量は、癌の重症度ならびに被検者の体重及び全身健康状態に依存し得るが、一般に被検者当たり１投与ごとの免疫原性バイオコンジュゲートの範囲は約０．０５μｇ〜約１０００μｇ（例えば０．５〜１００μｇ）の当量である。初期投与及び追加投与のための好適なレジームとしては、初期投与とこれに続く１時間、１日、１週間、または１か月に１回以上の間隔でのその後の投与による繰り返し投与が代表的である。例えば、被検者は、１週間に１回以上（例えば１週間に２、３、４、５、６、もしくは７回またはこれより多く）の投与ごとに、非結合または遊離治療薬（複数可）と比較して約０．０５〜１，０００μｇ等価用量の範囲で免疫原性バイオコンジュゲート（または組換えポリペプチド）を受けることができる。例えば、被検者は、１週間に０．１〜２，５００μｇ（例えば２，０００、１，５００、１，０００、５００、１００、１０、１、０．５、または０．１μｇ）の投与量を受けることができる。被検者は、２週間または３週間に１回、投与ごとに０．１〜３，０００μｇの範囲で免疫原性バイオコンジュゲート（または組換えポリペプチド）を受けることもできる。被検者は毎週２ｍｇ／ｋｇを受けることもできる（重量は免疫原性バイオコンジュゲートまたは免疫原性バイオコンジュゲートの任意の部分もしくはコンポーネントの重量に基づいて計算される）。
【００７７】
本明細書に開示の医薬組成物中の免疫原性バイオコンジュゲート（または組換えポリペプチド）の全有効量は、ボーラスとしてか、もしくは比較的短時間の間の注入によって単回投与量として哺乳類に投与することができるか、またはより長期間にわたって複数回投与される分割治療プロトコール（例えば４〜６、８〜１２、１４〜１６、もしくは１８〜２４時間に、もしくは２〜４日に、１〜２週間に１回の投与、もしくは１か月に１回）を用いて投与することができる。あるいは、血中の治療有効濃度を維持するのに十分な連続静脈内注入も本開示の範囲内である。
【００７８】
本明細書に記載の組成物中に存在し、哺乳類（例えばヒト）に適用される本明細書に開示の方法において用いられる１つ以上の治療薬の治療有効量は、当業者であれば、年齢、体重、及び他の全身状態（上述の通り）の個体差を考慮して決定することができる。
【００７９】
本開示の免疫原性バイオコンジュゲートは血清及び血流中で、ならびに場合によってはより特異的に安定であり得るので、任意の個々のコンポーネントを含む免疫原性バイオコンジュゲートの投与量は、結合していない場合の任意の個々のコンポーネントの有効投与量よりも低く（または高く）することができる。したがって、いくつかの態様において、投与された抗癌剤は、免疫原性バイオコンジュゲートの一部として投与された場合に、抗癌剤が単独でまたは免疫原性バイオコンジュゲートの一部としてではなく投与された場合と比較して、効果が増加している、または副作用が減少している。
【実施例】
【００８０】
実施例１：免疫寛容エラスチン様ポリペプチド（ｉＴＥＰ）の設計
ｉＴＥＰ発現プラスミドの構築。いくつかの改変について報告された方法(27)を用いて、ｉＴＥＰをコードする遺伝子を改変ｐＥＴ２５ｂ（＋）ベクター上に合成した。第１に、ベクターのＸｂａＩ及びＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位に二本鎖ＤＮＡを挿入することによってｐＥＴ２５ｂ（＋）ベクターを改変した。挿入したＤＮＡは、２つの相補的オリゴヌクレオチド、ｐＥＴ２５−Ｆ及びｐＥＴ２５−Ｒ（表２）（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ＵＳＡ）を互いにアニーリングすることによって組み立てた。このＤＮＡの挿入により、ｐＥＴ２５ｂ（＋）ベクターにＢｓｅＲＩ及びＡｃｕＩに対する２つの新しい制限部位、ならびにインフレーム終止コドンが導入された。第２に、ｉＴＥＰA：（ＧＶＬＰＧＶＧ）4（配列番号３０）、ｉＴＥＰB：（ＧＡＧＶＰＧ）5（配列番号３１）、ｉＴＥＰC：（ＶＰＧＦＧＡＧＡＧ）3（配列番号３２）、及びｉＴＥＰD：（ＶＰＧＬＧＡＧＡＧ）3（配列番号３３）のサブユニットをコードする遺伝子を、これらの遺伝子のセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチド（表２）を互いにアニーリングすることによって生成した。第３に、これらのｉＴＥＰ遺伝子を改変ｐＥＴ２５ｂ（＋）ベクターのＢｓｅＲＩ部位に挿入した。最後に、ｉＴＥＰ遺伝子を以下の方法によって所望の長さに伸長した。具体的には、ｉＴＥＰ遺伝子を含有する改変ベクターをそれぞれ２セットの酵素によって消化した。第１セットはＡｃｕＩ、ＡｐａＩ、及びＢｇｌＩを含み、第２セットはＢｓｅＲＩ及びＡｐａＩを含む。その後、２セットの消化からのものであり、ｉＴＥＰ遺伝子を含有していた２つのＤＮＡ断片を単離し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて互いに連結して新たなｉＴＥＰ発現ベクターを作製した。ベクターを増幅のためにＤＨ５αに形質転換した。ｉＴＥＰビルディングブロックのリピート数を決定するｉＴＥＰ遺伝子の長さは、ＸｂａＩ及びＢａｍＨ  Ｉによる二重消化ならびにその後のアガロースゲル分析によって確認した。このＰＲｅ−ＲＤＬプロセスを所望により繰り返して、設計した長さを有するｉＴＥＰ遺伝子を生成した。最終ｉＴＥＰ遺伝子は、エンドヌクレアーゼ消化アプローチと組み合わせたＤＮＡシーケンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ，  ＵＳＡ）によって検証した。
表２．クローニング用のプライマーの配列
2018521977.tif 000004
【００８１】
代表として用いたｉＴＥＰは、ＧＶＬＰＧＶＧを２８リピート有するｉＴＥＰA（配列番号５０）、ＧＡＧＶＰＧを７０リピート有するｉＴＥＰB（配列番号５１）、ＶＰＧＦＧＡＧＡＧを２１リピート有するｉＴＥＰC（配列番号５２）、及びＶＰＧＬＧＡＧＡＧを９６リピート有するｉＴＥＰD（配列番号５３）であった。奇数のリピートを有するｉＴＥＰCが予期せず生成された。上記の長さを有するｉＴＥＰをこの研究に用いたが、その理由は、Ｅ．ｃｏｌｉから発現させることができ、転移温度が、塩有りまたは無しで、周囲温度と６０℃との間であるので、転移サイクルを繰り返すことによって精製することが操作上可能なためである。さらに、これらのサイズのｉＴＥＰは天然タンパク質の範囲内であり、ペプチドではなくタンパク質としてｉＴＥＰの免疫原性の研究及び分析を可能にする。
【００８２】
両親媒性融合体ｉＴＥＰB−ｉＴＥＰA（配列番号５４）をコードする遺伝子は、ＰＲｅ−ＲＤＬ法(27)を用いてｉＴＥＰB及びｉＴＥＰA遺伝子を互いに連結させることによって生成した。融合体ｉＴＥＰB−ｉＴＥＰA−ｐＯＶＡ（配列番号５６）をコードする遺伝子は、ｐＯＶＡの遺伝子（表２）を用いて同様に生成した。ｐＯＶＡが２コピーのＣＴＬエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）を有することに注目すべきである。(28)ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）の両側に１つの天然隣接残基があった。ｐＯＶＡの実際のアミノ酸配列はＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴ（配列番号５５）であった。
【００８３】
結果。ｉＴＥＰがエラスチンに由来するペプチドのポリマーとして設計された。これらのｉＴＥＰの１つの評価基準は、前臨床及び臨床への適用を容易にすることができる特徴の、マウス及びヒトの両方において体液性寛容であるということである。ポリペプチドが体液性免疫原性となるためには、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）と結合する少なくとも１つのエピトープ、及び最初にＭＨＣクラスＩＩ複合体と、その後にＣＤ４＋  Ｔ細胞上の同種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と結合する別のエピトープを含有することができる。(34-36)同様の理由で、体液性寛容ポリペプチドはＴＣＲまたはＢＣＲエピトープを含有すべきではない。ヒトエラスチンとマウスエラスチンとの間の相同ペプチド配列をｉＴＥＰのモノマー（例えば相同アミノ酸リピート）として選択した。これらの相同配列は内因的にはヒト及びマウスのＢＣＲ及びＴＣＲと結合しないはずであり、さもなければ自己免疫応答を誘発していたであろう（図１）。
【００８４】
ｉＴＥＰはエラスチン由来ペプチドのポリマーであるので、重合はヒト及びマウスに対して外因性である接合配列を導入する場合があり、こうした接合配列は潜在的に体液性免疫原性であり得る。免疫原性の可能性を減少させるために、２つの戦略を活用した。第１に、ｉＴＥＰ中に外因性接合配列がないように、ｉＴＥＰ（図１のｉＴＥＰC及びｉＴＥＰDを参照）のモノマー（例えば相同アミノ酸リピート）としてヒト及びマウスエラスチン中で繰り返される相同ペプチドを用いた。さらに、リピートは１８残基を有し、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＴＣＲエピトープ（１３〜１７残基）及び直線状ＢＣＲエピトープ（４〜６残基）の典型的な長さ(37,38)よりも長い。したがって、リピート（例えば相同アミノ酸リピート）は、リンパ球発生中にそれらと結合するＢＣＲ及びＴＣＲをネガティブセレクションして除去するために、天然で用いるのに十分長い。(39)その結果、ヒト及びマウスＢＣＲまたはＴＣＲはこれらのリピート（例えば相同アミノ酸リピート）と結合しないはずである。したがって、これらのリピート（例えば相同アミノ酸リピート）から重合されたｉＴＥＰは、低または非免疫原性とすることができる。
【００８５】
外因性接合配列が不可避であった場合には第２の戦略を適用した。この場合、ｉＴＥＰのモノマーに対する２つの評価基準が、１、エラスチン由来の長い相同ペプチドであること；２、両端にＧｌｙが隣接していること（ｉＴＥＰA及びｉＴＥＰB：図１）であった。短いものではなく長いモノマー（例えば相同アミノ酸リピート）を用いることによって、ｉＴＥＰ中の接合配列の数が少なくなった。免疫応答の強度にはエピトープ密度が重要な要因であるので、(40-42)この変化により、ｉＴＥＰの免疫原性を潜在的に減少することができた。Ｇｌｙ隣接モノマーは接合配列中に高頻度のＧｌｙをもたらし、ＧｌｙはＢＣＲエピトープを沈黙させることが分かっているので、(43,44)接合配列の免疫原性を緩和することができた。第２の戦略を用いると、ｉＴＥＰは低免疫原性を有することが予想される。
【００８６】
本明細書に記載のｉＴＥＰがＥＬＰの相転移特性を有するために、１つのプロリン及び少なくとも１つのバリンを含有するようにｉＴＥＰのすべてのモノマー（例えば相同アミノ酸リピート）を設計した（図１）。公開されているＥＬＰ配列のこれまでの研究(21)に基づいて、この基準はｉＴＥＰに転移特性を付与するのに十分となり得ると仮定した。本明細書に開示のｉＴＥＰモノマー（例えば相同アミノ酸リピート）のいずれもＥＬＰのカノニカルモチーフＶＰＧＸＧ（配列番号２９）を有することができないが、(45)カノニカルモチーフは上記のｉＴＥＰ設計基準の一部でないので、これは予期していないことではない。
【００８７】
ＥＬＰ設計の最初からＥＬＰの免疫原性に加えて物理化学的性質を強調する新規のＥＬＰ設計及び改変手法を試験したことについて、本明細書に記載する。ｉＴＥＰと称する新規のＥＬＰを設計及び生成した。本明細書に記載のｉＴＥＰは体液性寛容であり、相転移特性を有する。本明細書に開示する結果は、両親媒性ｉＴＥＰコポリマーがナノ粒子に自己組織化することを実証する（下記の実施例を参照）。このナノ粒子は、モデルＣＴＬペプチドワクチンを送達するために用いた場合に、遊離ペプチドまたはタンパク質形態のＣＴＬワクチンと比較してワクチンの効力を向上させた。
【００８８】
ペプチド及びタンパク質材料の有害な免疫原性は、標的との材料の相互作用を遮断することによってその機能を損ない、半減期を短縮し、(52,53)生物学的利用能を減少させる(54)おそれがある。免疫原性は命に関わる場合もある。(54)ＣＴＬワクチン送達の場合、ワクチン担体に対する体液性応答がワクチンペイロードの効果を阻害することが示された。(55,56)この研究における本発明者らの動機はＣＴＬワクチン担体としてのＥＬＰの潜在性を調査することであるので、ｉＴＥＰは、これらのポリペプチドの免疫原性が担体としてのその使用の障害とならないように作製した。異なる配列を有するＥＬＰは、プラスミドＤＮＡと複合体化した場合に、非常に異なった体液性免疫原性を示すことが分かったつい最近の報告によって、ｉＴＥＰを作製する必要性が実証された。(22)ｉＴＥＰを作製するために、設計に機能及び免疫原性両方の基準を取り入れた、従来とは異なるポリペプチド設計及び改変手法を用いた。機能の特徴が十分に分かっている材料が、後で発見された有害な免疫原性のために無価値となり得るリスクを最小限にするために、この手法を用いた。この手法は実際に有益であると証明された。本明細書に開示するように、望ましい低免疫原性を有するｉＴＥＰが生成された。
【００８９】
新規ＥＬＰ開発手法の原理証明に加えて、これらのｉＴＥＰの生成に成功したことは実用的な意義がある。これらのｉＴＥＰは異なっており、一般的ではなく、前臨床及び臨床用途において他の報告されているＥＬＰよりもおそらく有益であるが、その理由は、マウス及びヒトの両方に対して免疫寛容な材料として設計されたためであり、これには前例がない。(18-21)マウスにおけるｉＴＥＰの免疫寛容が確認された。ｉＴＥＰをマウス及びヒトに対して免疫寛容とするための根底にある概念は同じであるので、試験した場合にこれらのｉＴＥＰがヒト免疫によって寛容され得るとするのは妥当である。
【００９０】
実施例２：ｉＴＥＰのクローニング及び発現
ｉＴＥＰ及びｉＴＥＰ融合体の産生及び精製。コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．  ＵＳＡ）を、ｉＴＥＰまたはｉＴＥＰ融合体遺伝子を含有するｐＥＴ２５ｂ（＋）発現ベクターで形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＢ培地中で単一コロニー形質転換体を２４時間３７℃で成長させた。成長後、２５分間、４，８１６×ｇ及び４℃での遠心分離によってＥ．ｃｏｌｉ細胞をペレットとして収集した。次に、細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁し、３分間／Ｌ培養物の超音波処理によって溶解した（超音波処理パルス周波数：１０秒オン及び３０秒オフ）。その後、１０％のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を細胞ライセートに添加してＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡを沈殿させ、１５分間、２１，０００×ｇ及び４℃の遠心分離によって沈殿剤を除去した。最後に、ｉＴＥＰまたはｉＴＥＰ融合を前述したような逆転移サイクル（ＩＴＣ）によって上清から精製した。(29)ｉＴＥＰの純度は銅染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ(30)によって評価した。
【００９１】
ｉＴＥＰ及びｉＴＥＰ融合体のエンドトキシン除去。Ｐｉｅｒｃｅ高容量エンドトキシン除去樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  ＵＳＡ）を用いて製造業者の指示に従い、ｉＴＥＰ及びｉＴＥＰ融合体のエンドトキシンを除去した。エンドトキシンレベルは、カブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）ＰＹＲＯＧＥＮＴ単一試験バイアル（Ｌｏｎｚａ，  ＵＳＡ）によって測定した。これらのサンプル中の最終エンドトキシンレベルはタンパク質１ｍｇ当たり０．２５ＥＵ未満であった。
【００９２】
結果。ｉＴＥＰがＥ．ｃｏｌｉから組換えタンパク質として産生及び精製された。修正したＰｒｅ−ＲＤＬ法（図２Ａ）(27)を用いて、ｉＴＥＰのコード遺伝子を構築及び伸長した。コード遺伝子はエンドヌクレアーゼ消化アプローチと組み合わせたＤＮＡシーケンシングによって確認した。アガロースゲルの結果（図２Ｂ）により、コード遺伝子のサイズが確認された：ｉＴＥＰA（６００ｂｐ）、ｉＴＥＰB（１２７２ｂｐ）、ｉＴＥＰC（５７９ｂｐ）、及びｉＴＥＰD（２６０４ｂｐ）。これらのｉＴＥＰ遺伝子のサイズにより、適切な長さを有することが確認され、これらの遺伝子が予想される長さのｉＴＥＰをコードすることを示していた。精製後のｉＴＥＰの純度及びサイズをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した（図２Ｃ）。ｉＴＥＰBは他のｉＴＥＰと同様にはネガティブ染色されなかったことは注目に値するが、これはおそらく親水性でありながら無電荷の性質（下）のためであり、これにより、ｉＴＥＰの周りのＳＤＳの乳化が妨げられる可能性があり、そのため、ｉＴＥＰはゲル上で良好に集中することも、インサイチュでの銅錯体の形成を防止するのに十分なＳＤＳを有することもできない。(46,47)その結果、このｉＴＥＰは銅染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でスメアとして現れる。
【００９３】
実施例３：ｉＴＥＰの熱誘発性可逆的相転移
ｉＴＥＰ及びｉＴＥＰB−ｉＴＥＰA−ｐＯＶＡ融合体の熱誘発性可逆的逆相転移の特性評価。ｉＴＥＰまたはｉＴＥＰ融合体の相転移は、温度の関数としてのサンプル溶液の濁度変化によって特性評価した。具体的には、サンプル溶液の３５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ350）を、マルチセル熱電温度コントローラを備えたＵＶ−可視分光光度計（Ｃａｒｙ  ３００，  Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ，  ＣＡ）を用いて、溶液を１℃／ｍｉｎの速度で２０℃から８０℃まで加熱し、その後、２０℃に冷却しながら監視した。サンプルの濁度曲線の最大一次導関数を特定した。サンプルの転移温度（Ｔｔ）は最大導関数に対応する温度である。
【００９４】
結果。試験したすべてのｉＴＥＰセットは、異なる相転移特性を示す（図３Ａ〜Ｅ）。これらのｉＴＥＰの対応する逆転移温度（Ｔｔ）は、それらの配列及び分子量と共に表３にまとめてある。ｉＴＥＰBは他の３つのｉＴＥＰよりも高いＴｔを示した。具体的には、ｉＴＥＰBは、Ｈ2Ｏ中の試験した温度範囲（２０〜８０℃）ではコアセルベートを形成しなかったが、他は２９〜３８℃でコアセルベートを形成した（図３Ｂ対図３Ａ、Ｃ、Ｄ）。ｉＴＥＰBの熱誘発性相転移を達成するために、２．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する溶液中で実験を行った（図３Ｆ）。ｉＴＥＰBの高いＴｔは、他の３つのｉＴＥＰよりもはるかに親水性が高いことを示す。したがって、４セットのｉＴＥＰの中から、親水性及び疎水性両方のものが得られた（表３）。
表３．ｉＴＥＰの配列、ＭＷ、転移温度
2018521977.tif 000005
【００９５】
ｉＴＥＰC及びｉＴＥＰDのＴｔ（図３Ｃ及びＤ）を２つの異なる濃度、５及び２５μＭで比較した場合に、興味深い観察結果が得られた。２５μＭでは、３８．６℃に対して３５．７℃と、ｉＴＥＰCはｉＴＥＰDよりも低い（加熱）Ｔｔを有していたが、５μＭでは、４２．３℃に対して５０．５℃と、ｉＴＥＰCはｉＴＥＰDよりも高いＴｔを示した。これらの２つのｉＴＥＰは互いに類似しているが、（１）それらの反復単位の４番目の残基がｉＴＥＰCではＰｈｅであるのに対してｉＴＥＰDではＬｅｕ（図１）、及び（２）反復単位の数がｉＴＥＰCでは２１であるのに対してｉＴＥＰDでは９６（表１）という２つの違いがある。第１の違いはｉＴＥＰCにｉＴＥＰDよりも低いＴｔの傾向を与えるが、第２の違いはｉＴＥＰCにｉＴＥＰDよりも高いＴｔの傾向を与える。(48,49)２５μＭでは、４番目の残基の違いの影響が反復数の違いの影響に明らかに勝っていたと見られ、５μＭではその逆である。したがって、これらのデータは、ｉＴＥＰの濃度変化により、２つの差異が生じる要因の影響を異なるスケールではあるが変化させることができることを示す。
【００９６】
本明細書に記載のｉＴＥＰは、ＥＬＰの典型的なＶＰＧＸＧ（配列番号２９）モチーフを有することなく、ＥＬＰの相転移特性を有する。一方では、ｉＴＥＰ設計はこのモチーフに限定されていなかったので合理的である。ヒト及びマウスの両方にとって免疫寛容なＥＬＰを生成することの方が、このモチーフに適合するＥＬＰを生成することよりも重要であったが、これらの２つの要求は必ずしも相互に排他的ではない。他方では、この結果は、ＶＰＧＸＧ（配列番号２９）モチーフと相転移との間の関係(59)についてのパラダイムシフトにつながり得る。本明細書に記載の設計戦略を用いたので、新規ＥＬＰは従来のＶＰＧＸＧ（配列番号２９）モチーフ以外で生成され、新規かつ機能的なＥＬＰを作製する大きな自由度と能力を可能にした。
【００９７】
実施例４：ｉＴＥＰの体液性免疫原性
ｉＴＥＰの免疫化及び免疫血清の収集。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを１００μｇ／マウスの投与量のｉＴＥＰにより右飛節で２回免疫化した。２回の免疫化には２週間の間隔をあけた。２回目の免疫化の１週間後、各免疫化マウスから１００μＬの血液を収集した。血液サンプルを室温で３０分〜１時間静置して凝固させた。サンプルを１０分間、１４，０００ｒｐｍ、４℃で遠心した後、血液サンプルから血清を収集した。ｉＴＥＰ特異的ＩｇＧの力価の分析前に血清を−８０℃に維持した。
【００９８】
ＥＬＩＳＡによるＩｇＧ力価の測定。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを１００μｌ／ウェルの捕捉抗原（２０μｇ／ｍｌのそれぞれのｉＴＥＰ、オボアルブミン（ＯＶＡ）またはＭＳＡ）により４℃で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ−０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）バッファーで洗浄し、２００μＬ／ウェルの１％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴバッファーにより室温で１時間ブロッキングした。マウス血清をＰＢＳＴ−１％ＢＳＡバッファー中に逐次希釈し、９６ウェルプレート中に１００μＬ／ウェルで添加した。プレートを４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳＴで完全に洗浄した後、１μｇ／ｍＬの検出抗体（ホースラディッシュパーオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ）を１００μＬ／ウェル添加し、プレートを連続的に振とうさせながら室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄した後、１５〜３０分間連続的に振とうさせながら１００μＬ／ウェルのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液を添加した。１００μＬ／ウェルの１Ｍ  Ｈ2ＳＯ4で反応を停止させた。プレートをＯＤ４５０ｎｍ（波長補正のために５７０ｎｍを引いた）で読み取った。
【００９９】
血清ＩｇＧの終点力価は、ＥＬＩＳＡアッセイからのＯＤ値が統計的に有効なカットオフよりも高い血清希釈の高い方の逆数として定義した。力価の結果は各サンプルについてのＩｇＧ力価（Ｌｏｇ１０）として表した。カットオフは所与の捕捉抗原を用いる個々のＥＬＩＳＡアッセイについて設定したので、異なる捕捉抗原についてカットオフは異なり得る。具体的には、ＰＢＳ（陰性対照）免疫化血清を用いて、それぞれの抗原コーティングウェルでＥＬＩＳＡを実施することによって、カットオフを得た。カットオフの値は以下の式を用いて計算した。(31)
2018521977.tif 000006
式中、
2018521977.tif 000007
は独立したＰＢＳ対照血清の平均吸光度読取値であり、ＳＤは読取値の標準偏差であり、ｎは独立したＰＢＳ対照（マウスサンプル）の数であり、ｔはｖ＝ｎ−１の自由度の片側ｔ分布の（１−α）パーセンタイルである。
【０１００】
結果。４つのｉＴＥＰ、陽性対照（ＯＶＡ）、及び陰性対照（マウス血清アルブミン、ＭＳＡ）（図４Ａ）でマウスを免疫化した。予想した通り、ＯＶＡ免疫化マウスはＯＶＡに対して強い体液性応答を示し、抗体力価中央値が２．６×１０7であり、ＭＳＡ処理マウスは非常に低い体液性応答を示したが、これは６．２×１０2の抗体力価中央値によって立証される（図４Ｂ）。４つのｉＴＥＰの中で、ｉＴＥＰA、ｉＴＥＰC、及びｉＴＥＰD処理マウスの血漿は、血漿を１００倍以上に希釈した後で、ｉＴＥＰ特異的抗体に対して陰性であったため（図４Ｃ、４Ｅ、４Ｆ）、それらの力価中央値は１００以下のはずである（図４Ｂ）。ｉＴＥＰB処理マウスの血漿は４．５×１０2の抗体力価中央値を有していた（図４Ｂ、４Ｄ）。ｉＴＥＰの力価はすべてＭＳＡのものとは差がないが、ＯＶＡの力価とは有意差があるので、すべてのｉＴＥＰはマウスによってＭＳＡのように体液性免疫寛容されると結論付けられた。
【０１０１】
ペプチド及びタンパク質の凝集は体液性免疫原性を大幅に増加させ得ることが報告されている。(50,51)しかし、ｉＴＥＰの凝集状態は免疫原性に影響を及ぼさないと思われた。第１に、ｉＴＥＰCの可溶性及び凝集形態は異なる免疫原性を示さなかった（図７）。第２に、免疫化のために、ｉＴＥＰA、ｉＴＥＰC、及びｉＴＥＰDは凝集体として注入され、一方で、ｉＴＥＰBは可溶性分子として注入されたという事実にもかかわらず、すべての試験したｉＴＥＰは非免疫原性である。
【０１０２】
実施例５：ｉＴＥＰ−ＣＴＬワクチン融合体から自己組織化したＮＰ
ｉＴＥＰB−ｐＯＶＡ及びｉＴＥＰB−ｉＴＥＰA−ｐＯＶＡ融合体のサイズの特性評価。以前に記載したように、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ計測器（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｍａｌｖｅｒｎ，  ＵＫ）を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）によって、ｉＴＥＰ融合体の粒径分布を測定した。(29)融合体をＰＢＳ中に５μＭ及び２５μＭで調製し、測定のために３７℃で平衡化した。報告した結果は数平均粒径を表していた。
【０１０３】
ｉＴＥＰB−ｉＴＥＰA−ｐＯＶＡ融合体のネガティブ染色透過型電子顕微鏡検査。集合した粒子の小さな３．５μＬアリコート（５０μＭ）を連続的なカーボンサポートフィルム（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，  Ｒｅｄｄｉｎｇ，  ＣＡ）に塗布した。サンプルを蒸留水で簡単に洗浄し、その後、１％酢酸ウラニル水溶液で染色した。ＪＥＯＬ  ２２００ＦＳ顕微鏡において公称倍率３０，０００（１ピクセル当たり１．７２Å）、加速電圧２００ｋｅＶで、５１２０×３８４０  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅ（ＤＤＤ（登録商標））センサーを備えたＤＥ−２０カメラ（Ｄｉｒｅｃｔ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，  ＬＰ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）に顕微鏡写真を記録した。
【０１０４】
結果。疎水性ｉＴＥＰA、親水性ｉＴＥＰB、及びｐＯＶＡは、互いに融合して両親媒性ｉＴＥＰコポリマーまたは融合体：ｉＴＥＰB−ｉＴＥＰA−ｐＯＶＡ（配列番号５６）を形成した（図５Ａ）。このペアのｉＴＥＰを用いて両親媒体を構築したが、その理由は、両方のｉＴＥＰとも良好な収量が得られたので、両親媒体も良好な収量が得られるであろうと予想されたためである。
【０１０５】
実際に、１リットルの培養物から約２００ｍｇの両親媒性融合体が精製された（図５Ｂ）。溶液は７０℃に濁度の急激な増加を有し、その温度での凝集体の形成を示している。その前に、ゆっくりとした緩やかな濁度の増加があり、ミセルの形成を示唆している。(8)融合体はミセル様ＮＰ構造を示したが、これは２段階相転移プロファイル（図５Ｃ）によって立証される。(8)融合体のＮＰ構造は、ＤＬＳ（図５Ｄ）、及び電子顕微鏡検査（図５Ｅ）によっても確認された。ＤＬＳデータによると、ＮＰは５μＭで８１．２±１４．２ｎｍ及び２５μＭで７１．９±２０．８ｎｍの平均直径を有する（図５Ｄ）。これに反して、親水性ｉＴＥＰB及びワクチンの融合体ｉＴＥＰB−ｐＯＶＡは可溶性であり、粒子を形成しない。この融合体のサイズはＤＬＳによって測定した場合で１０ｎｍ未満である（図５Ｄ）。
【０１０６】
実施例６：ｉＴＥＰ−ｐＯＶＡ  ＮＰによって誘発される免疫応答
ＤＣによるＣＴＬエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬの提示。マウスＤＣ株（ＤＣ２．４、Ｋ．  Ｒｏｃｋからの寄贈物）(32)の細胞を２．５×１０5／５００μＬ／ウェルで２４ウェルプレートに播種した。５００μＬのＯＶＡ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号２２）、またはｉＴＥＰB−ｉＴＥＰA−ｐＯＶＡ  ＮＰ（配列番号５６）（以下ｉＴＥＰ−ｐＯＶＡ  ＮＰ）を細胞培養培地中に溶解させ、ＤＣを含有するウェルに加えた。細胞をさらに１６時間、３７℃、５％ＣＯ2で培養した後、収集してＰＢＳで洗浄した。ＤＣ表面上に提示されたＭＨＣクラスＩ複合体Ｈ−２ｋb／ＳＩＩＮＦＥＫＬを、ＰＥタグ付きモノクローナル抗体２５−Ｄ１．１６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：１００希釈）で染色し、フローサイトメトリーで定量した（サンプル当たり５×１０4イベントを収集）。データは未処理のＤＣ２．４細胞のＭＦＩに対して正規化したＭＦＩとして表す。
【０１０７】
Ｂ３Ｚ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞ハイブリドーマ活性化アッセイ。Ｂ３Ｚ細胞（Ｎ．  Ｓｈａｓｔｒｉからの寄贈物）は、Ｔ細胞受容体がＳＩＩＮＦＥＫＬ：Ｈ２Ｋb複合体と結合するとβ−ガラクトシダーゼを分泌するように改変されたＣＤ８＋  Ｔ細胞ハイブリドーマである。(33)このアッセイをするために、１×１０5ＤＣ２．４細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種した。指定の濃度のＯＶＡ、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号２２）、及びｉＴＥＰ−ｐＯＶＡ  ＮＰ（配列番号５６）を細胞培養中に１６時間添加し、その後、洗浄した。１×１０5Ｂ３Ｚ細胞／ウェルをＤＣ２．４細胞培養に加え、ＤＣ２．４細胞と２４時間共培養した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、１００μＬの溶解バッファー（１００ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、９ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．１２５％  ＮＰ−４０を含むＰＢＳ）を０．１５ｍＭクロロフェノールレッドβ−ガラクトシドと共にウェルに加えた。プレートを３７℃で４時間インキュベートした後、５０μＬ／ウェルの１５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び３００ｍＭグリシンで反応を停止させた。５７０ｎｍのＯＤを測定し、６３０ｎｍのＯＤを参照として用いた。ＯＤをＢ３Ｚ細胞の活性化状態の指標として用いた。
【０１０８】
ＥＬＩＳＰＯＴ  ＩＦＮ−γアッセイによるインビボＣＴＬ応答。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ；  Ｓｉｇｍａ，  ＵＳＡ）と共に各免疫原（マウス当たり２ｎｍｏｌ  ＳＩＩＮＦＥＫＬ当量）で、左側腹部において皮下免疫化した。１週間後に右側腹部で免疫化を繰り返した。２回目の免疫化の１０日後にマウスを屠殺して脾臓を採取した。屠殺したマウスの脾臓を単一細胞懸濁物に掻き裂き、ナイロンメッシュ（４０μｍ）に通して濾過した。赤血球を塩化アンモニウム−カリウム（ＡＣＫ）溶解バッファーによって溶解した。洗浄及び再懸濁した単一細胞を、Ｃｏｎｔｅｓｓ（商標）自動セルカウンター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＵＳＡ）を用いて計数した。１４ｍＬポリプロピレン組織培養チューブ中、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００ユニット／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補添したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＵＳＡ）で、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号２２）（２．５μｇ／ｍＬ）有りまたは無しで、脾細胞（８×１０6／ｍＬ）を４８時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄して再計数した。その後、１００μＬ培地中２×１０5生細胞を、５ｍｇ／ｍＬの捕捉抗マウスＩＦＮ−γ  ｍＡｂ（クローン：Ｒ４−６Ａ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，  ＵＳＡ）でコーティングした９６ウェル濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  ＵＳＡ）のウェル中に添加した。各条件に対して３部準備した。培養の２４時間後に細胞を廃棄し、ウェルを２ｍｇ／ｍＬの検出ビオチン化抗マウスＩＦＮ−γ  ｍＡｂ（クローン：ＸＭＧ１．２−ビオチン、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，  ＵＳＡ）で一晩インキュベートした。未結合の抗体をウェルから洗浄した後、３−アミノ−９−エチル−カルバゾール（ＡＥＣ）基質（Ｓｉｇｍａ，  ＵＳＡ）と共にホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰアビジン、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，  ＵＳＡ）を用いて、結合した抗体を検出した。ウェルの底の膜を剥がし、膜上のカラースポットをスキャンした。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてスポットを自動計数した。
【０１０９】
結果。まず、ｉＴＥＰ−ｐＯＶＡ  ＮＰがＤＣによるＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）のプロセシング及び提示を促進するかどうか試験するために実験を行った。ＮＰ、可溶性ｉＴＥＰB−ｐＯＶＡ融合体（配列番号５７）、及びＯＶＡをそれぞれＤＣと共にインキュベートした。ＳＩＩＮＦＥＫＬ／Ｈ−２Ｋb複合体を認識することができる抗体によって、ＤＣによるＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）の表面提示を検出した。上記のインキュベーションのすべてがＤＣの表面上におけるエピトープの提示につながったが、ＮＰと共にインキュベートしたＤＣは、ＯＶＡまたはｉＴＥＰB−ｐＯＶＡ（配列番号５７）でのＤＣ（図６Ａ）よりも著しく多くのＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）エピトープを提示した。遊離ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号２２）での結果は、ＤＣによるＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）提示が、ＮＰ、ＯＶＡ、またはｉＴＥＰB−ｐＯＶＡ融合体（配列番号５７）よりもはるかに強かった（データは図示せず）。この結果はおそらく、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）とＤＣの表面上に元々存在していたエピトープとの間の直接交換に起因していた。したがって、ＤＣによる遊離ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号２２）の提示は細胞による抗原プロセシングを必要としない。それゆえに、遊離ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号２２）の結果は、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）が提示される前に抗原プロセシングを必要とする他の形態のＳＩＩＮＦＥＫＬ含有抗原の結果と比較できない。
【０１１０】
次の一連の実験では、ｉＴＥＰ−ｐＯＶＡ  ＮＰ処理ＤＣによるＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）の提示の向上が、ＳＩＩＮＦＥＫＬ拘束性ＣＤ８細胞のより効率的な活性化につながることができるかどうか調べた。Ｂ３Ｚ細胞を標的細胞として用いてＣＤ８＋  Ｔ細胞活性化アッセイを実施した。ＮＰ前処理ＤＣ２．４細胞で共培養したＢ３Ｚ細胞は、他の抗原で前処理したＤＣ２．４細胞で共培養したＢ３Ｚ細胞よりも数倍活性が高かった。具体的には、ＮＰ／ＤＣ処理Ｂ３Ｚ細胞は、ＤＣ処理Ｂ３Ｚ細胞、ＯＶＡ／ＤＣ処理Ｂ３Ｚ細胞、ｉＴＥＰB−ｐＯＶＡ／ＤＣ処理Ｂ３Ｚ細胞よりもそれぞれ４．３８、３．８１、または２．９倍活性が高かった（図６Ｂ）。陽性対照として、遊離ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号２２）でプレパルスしたＤＣ２．４細胞と共培養したＢ３Ｚ細胞は、すべての処理の中で最も高い活性を示した（図６Ｂ）。この結果は、ペプチドを遊離形態でＤＣと共にインキュベートした場合に、ＤＣがはるかに効率的にＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）を提示した観察結果と一貫性がある。
【０１１１】
次に、ｉＴＥＰ−ｐＯＶＡ  ＮＰ（配列番号５６）によって引き起こされるワクチン提示及びＣＴＬ活性化の強化が、インビボでのＣＴＬ応答の向上につながることができるかどうか調べるために実験を行った。この目的のために、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスをＰＢＳ、ＯＶＡ、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）ペプチド、またはＮＰで２回皮下免疫化し、これらのマウスから脾細胞を収集した。次に、ＳＩＩＮＦＥＫＬ拘束性活性化脾細胞をＩＮＦ−γベースのＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて定量した。ＩＮＦ−γを放出した脾細胞はＳＩＩＮＦＥＫＬ拘束性ＣＴＬのはずである。ＯＶＡ及び遊離ペプチド両方での免疫化は、ＰＢＳ対照と比較してＣＴＬの数の増加につながる。しかし、ＮＰ免疫化マウスは、ＯＶＡ及びＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド免疫化マウスの両方（それぞれ、播種した脾細胞１００万当たり平均６１及び６０スポット）よりもはるかに多くの数のＣＴＬを有していた（播種した脾細胞１００万当たり平均１０５スポット）（図６Ｃ）。細胞の活性化はＩＮＦ−γベースのＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いることによって同定した。遊離ペプチドはインビトロでは最も高い応答を有していたにもかかわらず、インビボでは最も強いＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＴＬ応答を誘発しなかったことは興味深く、ＣＴＬペプチドワクチンは支持担体を必要とすることを示唆している。遊離ペプチドワクチンの欠陥はおそらく免疫化後のペプチドの急速なクリアランスに起因し、したがって、樹状細胞及び他の抗原提示細胞に到達したワクチンは非常に限られていた。
【０１１２】
本明細書に記載したように、非免疫原性ポリペプチドを設計する基準が確認された。本明細書に記載の試験したｉＴＥＰは、その凝集状態またはその反復配列としての性質という、ポリペプチド及びタンパク質の免疫原性を増加させる可能性があると報告されていた２つの補助的要因(51,57,58)にかかわらず、非免疫原性であることが判明した。この結果は、ｉＴＥＰはおそらくＢＣＲもしくはＴＣＲエピトープ、または両方を含有しないであろうという考えに合致する。ポリペプチドがＢＣＲまたはＴＣＲエピトープからなっていなければ、これらの補助的要因が体液性応答の誘発に有利な場合でも、ポリペプチドは体液性応答を誘発しないはずである。より重要なことには、ｉＴＥＰの接合配列の潜在的な免疫原性を減少させるために２つの異なる戦略を用いたので、ｉＴＥＰの免疫原性に関するこれらの結果は、両方の戦略が有効であり、他の免疫寛容ポリペプチドを生成するのに有用であり得るということも示している。
【０１１３】
ＥＬＰは生物医学的用途において広く試験されており、ワクチンの良好な担体となり得るナノ構造に集合することができる。(26,60-67)しかし、ＥＬＰはＣＴＬワクチン担体として用いられていない。これらの結果は、ｉＴＥＰ  ＮＰが送達したワクチンの効力を実際に増加させたことを示しており、ワクチン及び免疫療法にＥＬＰを利用するための新たな役割を示唆している。ＥＬＰの免疫原性をその潜在的用途に応じて確立することができれば、この推論はさらに実証され得る。例えば、免疫原性及び非免疫原性ＥＬＰの両方ならびにそれらの対応する担体が生成された場合、これらの他の点では非常に類似している担体のペアは、まだ明らかにされていない、担体の免疫原性がどのようにワクチンまたは他の免疫療法薬ペイロードの効力に影響を及ぼすかということを解明するために用いられ得る。つまり、ＥＬＰの免疫原性及び機能性を正確に制御可能であることは、免疫療法薬の送達にこうした材料を用いることにおいて重要であるが、これはまだ黎明期にある。(68)
【０１１４】
結論として、逆相転移特性を有し、マウスによって免疫寛容される非カノニカルＥＬＰ（ｉＴＥＰ）の作製に成功した。この成功によって、ＥＬＰの相転移及び免疫原性に関する機構の理解が確認された。これらのｉＴＥＰは、ＥＬＰの多くの報告されている生物医学的用途に用いることができ、非免疫原性であることの利点を有する。重要なことに、これらの結果は、ＥＬＰをＣＴＬワクチン担体として用いることができるということを初めて実証している。最も重要なことに、機能性及び免疫原性に同等に設計の重点を置く本明細書に記載の新規なポリペプチド開発手法を用いることは、免疫原性であると分かり、機能的なＥＬＰ開発の努力を無駄にしてしまうことを避けるのに役立つことができる。
【０１１５】
実施例７：Ｓａｌｉ−ＡＢＡ及びＳａｌｉ−ＡＢＡ−ＭＰＢＨコンジュゲートの合成及び特性評価
材料。すべての化学薬品は、別途記載しない限り、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（ＭＡ，  ＵＳＡ）から生物学的グレードで購入した。アセトニトリル（ＡＣＮ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、イソプロパノール、及びメタノールをはじめとする有機溶媒は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（ＭＡ，  ＵＳＡ）からＨＰＬＣグレードで購入した。ＬＢ及びＴＢ培地は、標準的な配合を用いて本発明者らの研究室で調製した。すべての細胞培養プレートはＣｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．（ＮＹ，  ＵＳＡ）から購入した。ＲＰＭＩ−１６４０（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン含有）、及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）をはじめとする細胞培養培地及びサプリメントは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．（ＣＡ，  ＵＳＡ）から購入した。
【０１１６】
Ｂａｌｂ／ｃマウスの自発性同系乳癌に由来する高転移性マウス細胞株である４Ｔ１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＭＤ，  ＵＳＡ）から購入した。ホタルルシフェラーゼを安定発現した４Ｔ１細胞株である４Ｔ１−ｌｕｃは、公開されている方法（Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ，  ２００８；  ８（１）：２２８）を用いて研究所内で生成した。４Ｔ１及び４Ｔ１−ｌｕｃ細胞は両方とも１０％ＦＢＳを補添したＲＰＭＩ−１６４０培地での単層培養で維持した。５％ＣＯ2を含む３７℃の加湿雰囲気で細胞を維持した。
【０１１７】
２４〜２８日齢（１８〜１９ｇ）の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）から購入した。すべての動物実験プロトコールはｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈの動物実験委員会によって承認された。
【０１１８】
Ｓａｌｉ−ＡＢＡの合成。サリノマイシン（Ｓａｌｉ；９．５０ｇ、１２．６７ｍｍｏｌ）、（４−（１，３−ジオキソラン−２−イル）フェニル）メタンアミン（Ｓａｌｉへのコンジュゲーション前のＡＢＡの化学名；（４−（１，３−ジオキソラン−２−イル）フェニル）メタンアミンはＳａｌｉへのコンジュゲーション後のＡＢＡの化学薬品である）（３．４０ｇ、１８．９７ｍｍｏｌ）、及び１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（２．３９ｇ、１８．９７ｍｍｏｌ）を１５０ｍＬの乾燥ＤＣＭに一緒に溶解した。この撹拌した混合物に、１０ｍＬの乾燥ＤＭＦ中に溶解した１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２．０５ｇ、１５．１７ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。得られた混合物をさらに２４時間撹拌した後、室温まで上昇させた。その後、混合物をさらに２４時間攪拌した。その後、混合物を２００ｍＬのブラインでクエンチし、反応生成物及び未消費の反応物質を１００ｍＬのＤＣＭで３回抽出した。合一したＤＣＭ溶液を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、真空下で濃縮し、シリカゲル（２００〜３００メッシュ）でのフラッシュクロマトグラフィーによって残渣を精製した。精製したコンジュゲーション生成物は白色固体であった。
【０１１９】
コンジュゲーション生成物（Ｓａｌｉ−ＡＢＡ）のアルデヒド基を脱保護するために、生成物を２２ｍＬのＴＨＦに溶解させ、これに２ＮのＨＣｌ（２２．７２ｍＬ）を添加した。混合物を室温で６時間攪拌した。その後、反応物をＮａＨＣＯ3水溶液（２００ｍＬ）でクエンチし、ＤＣＭ（１００ｍＬ、２回）で抽出した。合一したＤＣＭ溶液を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣をシリカゲル（２００〜３００メッシュ）でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。精製した脱保護Ｓａｌｉ−ＡＢＡは白色固体であった（６．６８ｇ、収率６１％）。Ｓａｌｉ−ＡＢＡの存在は1Ｈ  ＮＭＲによって確認した。1Ｈ  ＮＭＲはＣＤＣｌ3中で実施し、Ｂｒｕｋｅｒ  ４００ＭＨｚで測定した。化学シフトを分析して積分した。1Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ3， ４００ ＭＨｚ） δ ０．７５−０．８１ （ｍ， ４Ｈ）， ０．８１−０．８６ （ｍ， ５Ｈ）， ０．８６−０．９１ （ｍ， ６Ｈ）， ０．９１−０．９９ （ｍ， ８Ｈ）， １．１４ （ｓ， ３Ｈ）， １．１９−１．２７ （ｍ， ８Ｈ）， １．４６−１．５５ （ｍ， ４Ｈ）， １．８０−１．８８ （ｍ， ５Ｈ）， ２．０２−２．０６ （ｍ， １Ｈ）， ２．１８−２．４５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６２−２．７３ （ｍ， １Ｈ）， ２．７４−３．１３ （ｍ， ８Ｈ）， ３．３７−３．４７ （ｍ， １Ｈ）， ３．５３ （ｓ， １Ｈ）， ３．６０−３．８４ （ｍ， ６Ｈ）， ３．８５−３．９５ （ｍ， １Ｈ）， ４．０３−４．２０ （ｍ， ３Ｈ）， ４．４３−４．５９ （ｍ， １Ｈ）， ４．６３−４．７８ （ｍ， １Ｈ）， ６．２３−６．２９ （ｍ， １Ｈ）， ６．６３−６．７７ （ｍ， １Ｈ）， ７．１４ （ｄ， Ｊ ＝ ４．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５２ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．８１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ９．９５ （ｓ， １Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ分析のために、０．１％ＴＦＡを含有する５０％アセトニトリル水溶液中に精製した反応生成物を溶解させ、シナピン酸マトリックス上に担持させ、窒素レーザー（３３７ｎｍ）を備えたＱＴＯＦ  ２質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）を用いて検査した。
【０１２０】
Ｓａｌｉ−ＡＢＡ−ＭＰＢＨの合成。アルゴン雰囲気下で、乾燥イソプロパノール／メタノール（２０ｍＬ／２０ｍＬ）中にＳａｌｉ−ＡＢＡ（１．７０ｇ、１．９６ｍｍｏｌ）、ＭＰＢＨ−ＨＣｌ（０．９１ｇ、２．９７ｍｍｏｌ）、及び４Åモレキュラーシーブ（１ｇ）の混合物を調製し、４０℃で一晩撹拌した。混合物を濾過して溶媒を蒸発させた後、残渣をシリカゲル（２００〜３００メッシュ）でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。精製したコンジュゲーション生成物は淡黄色固体であった。収率は４１％であった。収集したコンジュゲーション生成物の純度はＨＰＬＣによって確認した。Ｓａｌｉ−ＡＢＡ−ＭＰＢＨコンジュゲートの存在は1Ｈ  ＮＭＲによって確認した。1Ｈ  ＮＭＲはＣＤＣｌ3中で実施し、Ｂｒｕｋｅｒ  ４００ＭＨｚで測定した。化学シフトを分析して積分した。1Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ3， ４００ ＭＨｚ） δ ０．７６−０．８２ （ｍ， ４Ｈ）， ０．８２−０．８７ （ｍ， ６Ｈ）， ０．８７−０．９３ （ｍ， ８Ｈ）， ０．９３−１．００ （ｍ， ７Ｈ）， １．１４ （ｓ， ３Ｈ）， １．１９−１．２７ （ｍ， １１Ｈ）， ２．０１−２．０７ （ｍ， ５Ｈ）， ２．１７−２．３６ （ｍ， ３Ｈ）， ２．６３−２．７７ （ｍ， ６Ｈ）， ２．７７−３．１３ （ｍ， ８Ｈ）， ３．３７−３．５３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５３−３．６３ （ｍ， １Ｈ）， ３．６４−３．７４ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７５−３．８４ （ｍ， ２Ｈ）， ３．８６−３．９７ （ｍ， １Ｈ）， ４．０５−４．１９ （ｍ， ３Ｈ）， ４．２２−４．３２ （ｍ， １Ｈ）， ４．３６−４．５１ （ｍ， １Ｈ）， ４．５６−４．７３ （ｍ， １Ｈ）， ６．２０−６．３２ （ｍ， １Ｈ）， ６．４５−６．６０ （ｍ， １Ｈ）， ６．８１−６．９０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．０５−７．１３ （ｍ， １Ｈ）， ７．２０−７．２８ （ｍ， ２Ｈ）， ７．３０−７．４１ （ｍ， ４Ｈ）， ７．４５−７．５４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．６９ （ｓ， １Ｈ）， ９．３８−９．６２ （ｍ， １Ｈ）。反応生成物を上記のようにＥＳＩ−ＭＳによって分析した。
【０１２１】
Ｓａｌｉ−ＡＢＡとＭＰＢＨ−ＨＣｌとの間のヒドラゾン結合の形成は室温では遅い。この温度での反応の４８時間後に検出することができる生成物はわずかである。この問題に対処するために、反応温度を４０℃に上げ、モレキュラーシーブを加えてこの反応を促進させた。
【０１２２】
ｉＴＥＰの発現及び精製。ｉＴＥＰをコードする遺伝子を以前に記載したように生成した。ｉＴＥＰの産生及び精製は以前に記載したのと同様であった（Ｚｈａｏ，  ｅｔ  ａｌ；  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ，  ２０１４；  １１（８）：２７０３−１２）。
【０１２３】
ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉの合成。ｉＴＥＰ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉを以前に記載したように合成した（Ｚｈａｏ，  ｅｔ  ａｌ；  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ，  ２０１４；  １１（８）：２７０３−１２）。リン酸バッファー（ｐＨ＝７．００、１Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中でＴＣＥＰ還元ｉＴＥＰをＳａｌｉ−ＡＢＡ−ＭＰＢＨと反応させた。精製後、ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉコンジュゲートの純度をＨＰＬＣによって確認した。精製後、ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉコンジュゲートを凍結乾燥して−２０℃で保管した。ｉＴＥＰへのＳａｌｉ−ＡＢＡ−ＭＰＢＨのコンジュゲーション効率をエルマン試薬法によって求めた。この目的のために、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ；エルマン試薬、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，  ＵＳＡ）を用いて、チオール基の数を測定することによってコンジュゲーション率を定量した。製造業者のプロトコールに従って定量を行い、異なる濃度の一連のシステイン溶液の標準曲線にデータをフィッティングすることによってチオール基の濃度を求めた。吸収は４１０ｎｍで測定した。
【０１２４】
結果。切断可能な化学結合を介してＳａｌｉをｉＴＥＰに結合させるために、Ｓａｌｉに小さな分子ＡＢＡを付加することによって修飾Ｓａｌｉをまず修飾し、次に、得られたＳａｌｉ−ＡＢＡをｉＴＥＰに二官能性リンカーＭＰＢＨを介して結合させた。Ｓａｌｉ−ＡＢＡとＭＰＢＨとの間の結合は切断可能なヒドラゾン結合である（図８Ａ）。Ｓａｌｉ−ＡＢＡコンジュゲーション生成物を精製した後、ＨＣｌを用いてＡＢＡの保護基を除去し、生成物上に活性なアルデヒド基を生成した。精製した脱保護生成物のＭＳスペクトルは、いくつかの主要な分子イオンピーク（ラベル付けした）を示しており、生成物が期待されていたコンジュゲートＳａｌｉ−ＡＢＡであったことを確認した（図８Ｂ）。脱保護Ｓａｌｉ−ＡＢＡの収率は６１％であった。
【０１２５】
Ｓａｌｉ−ＡＢＡ及びＭＰＢＨを、２つの分子上のアルデヒド基及びヒドラジド基を介して互いに結合させた（図８Ａ）。精製したコンジュゲーション生成物のＭＳスペクトル（図８Ｃ）及び1ＨＮＭＲピークデータは、この反応でＳａｌｉ−ＡＢＡ−ＭＰＢＨが形成したことを示していた。この挿入はＳａｌｉ−ＡＢＡ−ＭＰＢＨコンジュゲートの期待された化学構造である。Ｓａｌｉ−ＡＢＡ−ＭＰＢＨのＭＷに一致するピークは明らかであった。この精製コンジュゲートのＭＰＢＨ及びＳａｌｉ−ＡＢＡのピークの存在は、コンジュゲート中のヒドラゾン結合がＥＳＩ−ＭＳ実験条件の下で安定でないことを示す。Ｓａｌｉ−ＡＢＡ−ＭＰＢＨの収率は４１％であった。
【０１２６】
次に、通常の４Ｔ１−ｌｕｃ細胞に対してＳａｌｉ−ＡＢＡ及びＳａｌｉの毒性を比較した（図９Ａ）。Ｓａｌｉ−ＡＢＡのＩＣ50は１６．４μＭ（９５％ＣＩ＝１４．３〜１８．８μＭ）；ＳａｌｉのＩＣ50は４．４μＭ（９５％ＣＩ＝２．３〜１１．２μＭ）であり、Ｓａｌｉ及びＳａｌｉ−ＡＢＡのＩＣ50は統計的に差があった（Ｐ＜０．０００１、ｔ検定）。したがって、Ｓａｌｉ−ＡＢＡの毒性はＳａｌｉよりも有意に低かった。Ｓａｌｉ−ＡＢＡの毒性の方が低いことは、Ｓａｌｉ単独と比較してマウスにおいて寛容される投与量が大きいことと合致した（データは図示せず）。その後、通常の４Ｔ１−ｌｕｃ細胞、及び４Ｔ１腫瘍のＣＳＣとして一般に用いられる細胞集団である４Ｔ１−ｌｕｃ腫瘍様塊（Ｇｕｐｔａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ２００９；  １３８（４）：６４５）から収集した細胞に対して、Ｓａｌｉ−ＡＢＡの毒性を比較した。腫瘍様塊４Ｔ１−ｌｕｃ細胞に対するＳａｌｉ−ＡＢＡのＩＣ50は１．９μＭ（９５％ＣＩ＝１．７〜２．２μＭ）（図９Ｂ）であったが、これは通常の４Ｔ１−ｌｕｃ細胞のものよりも有意に低く、通常の４Ｔ１−ｌｕｃ及び腫瘍様塊４Ｔ１−ｌｕｃに対するＳａｌｉ−ＡＢＡのＩＣ50は統計的に差がある（Ｐ＜０．０００１  ｔ検定）。したがって、Ｓａｌｉ−ＡＢＡはＣＳＣに対するＳａｌｉの選択的毒性を維持していた。
【０１２７】
実施例８：ｉＴＥＰ及びｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉコンジュゲートの生成及び特性評価
動的光散乱（ＤＬＳ）測定。測定は以前に記載したように実施した。Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏシステム（Ｍａｌｖｅｒｎ，  Ｃｈｅｓｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｙ，  ＰＡ，  ＵＳＡ）を用いて、ｉＴＥＰ、ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉコンジュゲート、またはＰＴＸ  ＮＰを３７℃にてＰＢＳ中２５μＭで測定した。
【０１２８】
結果。ナノ担体はＥＰＲ効果によってその薬物ペイロードの腫瘍蓄積を促進するので（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６：  ４６  （１２  Ｐａｒｔ  １）：６３８７−６３９２；  Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．，  ２０１１；  ６３（３）：１３６−５１）、次の一連の実験は、ナノ担体を生成し、それを用いてＳａｌｉ−ＡＢＡを腫瘍に送達することを目的とした。これまでの結果では、親水性のｉＴＥＰ及び疎水性のＳａｌｉ（ＭａｒｖｉｎＳｋｅｔｃｈによるｐＨ７．４でのＬｏｇＤ  ３．２４）からなる両親媒性コンジュゲートは、そのセグメント化された両親媒性によって誘導されるＮＰに自己組織化することが示されていた（Ｚｈａｏ，  ｅｔ  ａｌ；  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ，  ２０１４；  １１（８）：２７０３−１２）。Ｓａｌｉ−ＡＢＡ（ＬｏｇＤ  ７．３４、ｐＨ７．４）はＳａｌｉよりも疎水性であることから、親水性ｉＴＥＰとＳａｌｉ−ＡＢＡ−ＭＰＢＨとの間のコンジュゲートも十分にセグメント化された両親媒性を有し、ＮＰ構造を呈するかどうか試験するために、以前に確立したｉＴＥＰを改変して、ＮＨ２−（ＧＡＧＶＰＧ）70−（ＣＧＧＧＧＧＧＧＧ）8−ＣＯＯＨ（配列番号５８）の配列を有する新規親水性ｉＴＥＰを得た。８つのシステインはｉＴＥＰの一端にＳａｌｉ−ＡＢＡ−ＭＰＢＨへの８つのコンジュゲーション部位をもたらした。各システインがＳａｌｉ−ＡＢＡ−ＭＰＢＨ分子を収容するのに十分な間隔を有するように、８グリシンスペーサーを２つの隣接するシステインの間に挿入した。新規ｉＴＥＰはＥ．ｃｏｌｉ細胞から組換えタンパク質として生成した。精製した新規ｉＴＥＰは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で３０ｋＤａと４６ｋＤａマーカーとの間のバンドとして泳動したが、これはｉＴＥＰの理論分子量３５．２ＫＤａに合致していた（図１０Ａ）。
【０１２９】
ＭＰＢＨを介して新規ｉＴＥＰをＳａｌｉ−ＡＢＡと結合させた。精製ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉコンジュゲート中のＳａｌｉ−ＡＢＡ−ＭＢＰＨとｉＴＥＰとの間の比は３：１と推定された。コンジュゲートからのＳａｌｉ−ＡＢＡの放出半減期は、ｐＨ５．０で１２．１５時間（９５％ＣＩ＝９．９８〜１５．５２時間）であった（図１０Ｂ）。対照的に、中性ｐＨではＳａｌｉ−ＡＢＡ−ＭＰＢＨの放出は監視した１００時間以内の間に検出されなかった。異なるｐＨでの異なる放出速度は、Ｓａｌｉ−ＡＢＡとＭＰＢＨ−ｉＴＥＰとの間のヒドラゾン結合がコンジュゲートからのＳａｌｉ−ＡＢＡのｐＨ依存的制御放出を可能にしたことを示していた。
【０１３０】
通常の４Ｔ１−ｌｕｃ細胞を処理するのに用いた場合に、ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−ＳａｌｉはＳａｌｉ−ＡＢＡ−ＭＰＢＨ単独よりも２．６倍低い細胞傷害性を有していた（図１０Ｃ）。ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ及びＳａｌｉ−ＡＢＡのＩＣ50は、それぞれ４２．２μＭ（９５％ＣＩ  ３９．０〜４５．６μＭ）及び１６．４μＭ（９５％ＣＩ＝１４．３〜１８．８）であり、通常の４Ｔ１−ｌｕｃ細胞に対するｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰ及びＳａｌｉ−ＡＢＡのＩＣ50は、統計的に差がある（Ｐ＜０．０００１、ｔ検定）。しかし、ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉは、通常の４Ｔ１−ｌｕｃ細胞よりも腫瘍様塊４Ｔ１−ｌｕｃ細胞（ＣＳＣ）に対して毒性が約８倍高く、Ｓａｌｉ−ＡＢＡ及びＳａｌｉの選択的毒性に類似していた（図１０Ｄ）。これらの２種類の細胞は統計的に差のあるＩＣ50（Ｐ＜０．０００１、ｔ検定）を有する。腫瘍様塊４Ｔ１−ｌｕｃ細胞に対するｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−ＳａｌｉのＩＣ50は５．８μＭ（９５％ＣＩ＝５．４〜６．２μＭ）であり、通常の４Ｔ１−ｌｕｃ細胞の値は４２．２μＭであった。
【０１３１】
ＤＬＳ分析によると、未改変ｉＴＥＰは３７℃で６．６３±１．２５ｎｍの流体力学的径を有しており（図１０Ｅ）、ｉＴＥＰは水溶液中でモノマーのままであるという予想に合致していた。一方で、ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉは５１．２±１８．２ｎｍの直径を示し、コンジュゲートが設計通りＮＰ構造を呈したことを示唆していた。非コンジュゲートｉＴＥＰは測定前に１００ｍＭのＴＣＥＰ溶液で一晩還元した。ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉの大きさはＥＰＲ効果による腫瘍中での蓄積にも適している（Ｐｅｔｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，  ２０１０；  ９（８）：６１５−２７）。
【０１３２】
実施例９：ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉの薬物動態及び組織分布
インビトロＳａｌｉ−ＡＢＡ放出アッセイ。ＮＰを３７℃のＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）または０．１Ｍ酢酸ナトリウム／酢酸バッファー（ｐＨ＝５）中でインキュベートした後、ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰからのＳａｌｉ−ＡＢＡの放出を測定した。各混合物の複数のリピートを個別のエッペンドルフチューブ中に確保し、３７℃において１００ｒｐｍで振とうした。所定の時点で、１本のチューブのサンプル中の遊離Ｓａｌｉ−ＡＢＡをＨＰＬＣによってＳａｌｉ−ＡＢＡの標準曲線に基づいて測定した。標準曲線は２８０ｎｍで作成した。ＨＰＬＣ設定は本明細書に記載したものと同じであった。
【０１３３】
以下の式及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｖ５．０を用いて、Ｓａｌｉ−ＡＢＡ放出のパーセンテージ（Ｆ）と時間（ｔ）との関係をフィッティングした。
2018521977.tif 000008
Ｋは放出速度定数である。
2018521977.tif 000009
【０１３４】
薬物動態及び生体内分布調査。血中及び組織中のＳａｌｉ−ＡＢＡ濃度を分析したが、これらの濃度は以前に記載したように分析した（Ｚｈａｏ，  ｅｔ  ａｌ；  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ，  ２０１４；  １１（８）：２７０３−１２）。
【０１３５】
細胞傷害性調査。細胞傷害性を以前に記載したように測定した（Ｚｈａｏ，  ｅｔ  ａｌ；  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ，  ２０１４；  １１（８）：２７０３−１２）。インキュベーション時間は７２時間であった。４Ｔ１−ｌｕ腫瘍様塊細胞を以前に記載したように生成した（Ｚｈａｏ，  ｅｔ  ａｌ；  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ，  ２０１４；  １１（８）：２７０３−１２）。
【０１３６】
結果。２０ｍｇ／Ｋｇ  Ｓａｌｉ−ＡＢＡ当量の投与量でマウスに静脈内投与した後、Ｓａｌｉ−ＡＢＡ及びｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉの薬物動態を比較した。各製剤の投与後のＳａｌｉ−ＡＢＡの血漿濃度を２４時間まで監視した（図１１Ａ）。濃度の時間変化を２コンパートメント薬物動態モデルにフィッティングした。フィッティング結果によると、ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ投与から得られたＳａｌｉ−ＡＢＡのＡＵＣは２９６７．０μＭ／時（９５％ＣＩ＝２２４４．０〜３５０９．０μＭ／時）であったが、これは、遊離Ｓａｌｉ−ＡＢＡ−ＭＰＢＨ投与から得られたＡＵＣ（９９．９μＭ／時（９５％ＣＩ＝４７．１〜１３２．２μＭ／時）よりもおよそ３０倍高かった。同様に、ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ投与後のＳａｌｉ−ＡＢＡの排泄半減期は、遊離Ｓａｌｉ−ＡＢＡ投与よりも３５倍長かった（０．４時間、９５％ＣＩ＝０．２〜４．１に対して１３．９時間、９５％ＣＩ＝９．９〜２４．８）。つまり、これらの比較結果は、ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−ＳａｌｉがＳａｌｉ−ＡＢＡの全身クリアランスを有意に遅延させたという見解を実証している。
【０１３７】
ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉの上述の遅いクリアランス及び粒径によって、コンジュゲートはＥＰＲ効果を活用することができ、そのため、より効率的に腫瘍に蓄積することが可能となり得た。実際に、４Ｔ１−ｌｕｃ腫瘍化マウスへの遊離Ｓａｌｉ−ＡＢＡまたはｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰの投与の２４時間後、ＮＰでは、遊離Ｓａｌｉ−ＡＢＡよりも３．４倍多くＳａｌｉ−ＡＢＡが腫瘍に蓄積する結果となった（０．９±０．１ＩＤ％／グラムに対して３．１±０．１ＩＤ％／グラム、図１１Ｂ）。腫瘍及びすべての以下の器官サンプルは投与の２４時間後に収集した。Ｓａｌｉ−ＡＢＡの量は、器官の重量で正規化した初期投与量のパーセンテージＩＤ％／グラムとして表した。データは一元配置ＡＮＯＶＡによって分析した。Ｐ値が図中に示してあり、*は有意差を表す。同時に、ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰを遊離Ｓａｌｉと比較した場合に、心臓においてＳａｌｉ−ＡＢＡ蓄積の減少があったが、差は統計的に有意でなかった（０．８６±０．１１ＩＤ％／グラムに対して０．５７±０．１８ＩＤ％／グラム、図１１Ｃ）。データは一元配置ＡＮＯＶＡによって分析した。Ｐ値を図中に示す。心臓はＳａｌｉに対して感受性が高い器官であるので、この減少はＮＰの毒性プロファイルに有利となり得る（Ｂａｓｔｉａｎｅｌｌｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｓ  Ａｆｒ  Ｖｅｔ  Ａｓｓｏｃ，  １９９６；  ６７（１）：３８−４１）。肝臓、脾臓、肺及び腎臓におけるＳａｌｉ−ＡＢＡ蓄積は、ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ−ＡＢＡ  ＮＰによって様々に増加した（図１１Ｄ）。データは一元配置ＡＮＯＶＡによって分析した。Ｐ値が図中に示してあり、*は有意差を表す。
【０１３８】
実施例１０：ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ−ＮＰによる原発性腫瘍成長及び転移の阻害
腫瘍成長調査。Ｂａｌｂ／ｃマウスの＃９乳腺に５０μＬのＰＢＳ中１０6の４Ｔ１−ｌｕｃ細胞を皮下接種した。すべての腫瘍の体積が１００ｍｍ3に達したか、またはこれを超えた接種の７日後、マウスを図１２及び１３に記載の群にランダムに割り付けた。投与及び投与スケジュールは以下の通りである。
１．ＰＢＳ対照（３日おき）；Ｓａｌｉ−ＡＢＡ（２０ｍｇ／ＫｇＢＷ、３日おき）、
２．ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰ（２０ｍｇ／ＫｇＢＷ、３日おき）、
３．ＰＴＸ  ＮＰ（１０ｍｇ／ＫｇＢＷ、３日おき）、
４．ＰＴＸ  ＮＰ及びｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ併用、１日目にｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰ（２０ｍｇ／ＫｇＢＷ）、２日目にＰＴＸ  ＮＰ（１０ｍｇ／ＫｇＢＷ）、その後、２日おき。
【０１３９】
合計７回静脈内投与した。腫瘍の長さ及び幅寸法を１日おきにキャリパーで測定した。腫瘍体積は式：腫瘍体積＝（長さ×幅2／２）を用いて推定した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２０１２；  ３３（２）：６７９−９１）。また、腫瘍サイズを測定した同じ日にマウスの体重を記録した。ＰＴＸ  ＮＰ及び併用療法での治療は、最初の３つの治療群の結果を得た後に行った。
【０１４０】
さらに、転移を監視するために、４Ｔ１−ｌｕｃ細胞から放出された生物発光シグナルを以前に記載されたように監視した（Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ，  ２００８；  ８（１）：２２８）。具体的には、所定の時点（毎週２回、３〜４日おき）で、１００μｌのＤ−ルシフェリン（１５ｍｇ／ｍｌ）を実験用マウスに腹腔内注入した。ルシフェリン注入の１５分後、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  ２００生体光画像撮影装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，  Ｉｎｃ．，  ＭＡ，  ＵＳＡ）中で麻酔下にてマウスの画像を撮影した。生物発光強度は、被検者からの光子放出または放射輝度を用いて光子／ｓｅｃ／ｃｍ2／ｓｒ（ステラジアン）の単位で表された。すべての生物発光画像の強度スケールは、１×１０6光子／ｓｅｃ／ｃｍ2／ｓｒ〜約１×１０7光子／ｓｅｃ／ｃｍ2／ｓｒに設定した。転移は、所定のサイズで原発性腫瘍の領域の外にあり、１×１０6光子／ｓｅｃ／ｃｍ2／ｓｒを超える平均放射輝度を有する領域と定義した。腫瘍接種とマウスに転移が観察された最初の日との間の日数を無転移生存時間として指定した。全生存時間を腫瘍接種とマウス屠殺との間の日数として数えた。無転移生存率及び全生存率をカプランマイヤー法によって分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｖ５．０でログランク検定を用いて各群の生存期間中央値を比較した。
【０１４１】
結果。ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰを４Ｔ１−ｌｕｃ同所性腫瘍の成長及び転移の阻害について評価したところ、結果は、ＮＰが原発性腫瘍成長を遅延させたことを示していた。ＮＰによって治療した腫瘍は、治療後２日目（腫瘍接種後９日目）からＰＢＳ治療腫瘍よりも常に小さかった（図１２Ａ、Ｐ＜０．０５、ｔ検定）。一方で、遊離Ｓａｌｉ−ＡＢＡ（２０ｍｇ／ＫＧ）は腫瘍成長を遅延させることができなかった。
【０１４２】
ＮＰは４Ｔ１−ｌｕｃ腫瘍の転移を効果的に阻害したが、これは、ＰＢＳ治療と比較した無転移生存率の劇的な改善によって立証される（Ｐ＝０．００７、ログランク；図１２Ｂ）。ＮＰ治療群のマウスで屠殺する前に転移が発生したものはいなかった。対照的に、ＰＢＳ治療マウスの無転移生存期間中央値はわずか２３日であった。遊離Ｓａｌｉ−ＡＢＡでも、この群のマウスで転移が発生したのは半数未満であり、マウスを屠殺する前にはこの群の無転移生存期間中央値に達しなかったので、転移が阻害された。しかし、Ｓａｌｉ−ＡＢＡ治療マウスの中には転移が発生したものがいたので、Ｓａｌｉ−ＡＢＡの阻害効果はＮＰのものよりも弱かった。さらに、ＰＢＳ対照群及びＳａｌｉ−ＡＢＡ群の生存率には統計的に差がなかった（Ｐ＝０．２５２）。
【０１４３】
ＰＢＳ及びＳａｌｉ−ＡＢＡ治療マウスの全生存率は互いに差がなく、両方とも２４日の生存期間中央値を有していた（図１２Ｃ）。しかし、ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉは全生存率を有意に改善し、生存期間中央値は３９日であった（ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ対ＰＢＳ、Ｐ＝０．００１２；ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ対ＰＢＳ  ｐ＝０．００１１）。
【０１４４】
ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰは原発性腫瘍成長及び転移の両方を阻害したが、この阻害は原発性腫瘍の安定化または縮小につながるのに十分でなかった。実際に、大きな原発性腫瘍負荷のためにＮＰ治療マウスを屠殺した。ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰのこの効果を克服するために、Ｓａｌｉ及びパクリタキセル（ＰＴＸ）を一緒に取り入れた併用療法を開発した。
【０１４５】
実施例１１：ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰ及びＰＴＸ  ＮＰの併用療法による原発性腫瘍成長及び転移の阻害
ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰ中へのＰＴＸの担持。以前に記載されたように、ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰ中にＰＴＸを担持させた（Ｚｈａｏ，  ｅｔ  ａｌ；  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ，  ２０１４；  １１（８）：２７０３−１２）。１０ｍｇのｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ、５ｍｇのＰＴＸ及び２．５ｍｇのα−トコフェロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）を１２５μＬのＤＭＦ中に共溶解した。カプセル化ＰＴＸを２８０ｎｍでの吸光度及びＰＴＸの標準曲線に基づいてＨＰＬＣによって測定した。標準曲線はＨＰＬＣで逐次希釈ＰＴＸの吸光度を測定することによって作成した。ＨＰＬＣのカラムは、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８カラム（１００Å、３．５μｍ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）であり、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ−１２６０  ＬＣシステム（ＣＡ，  ＵＳＡ）に接続した。水（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（溶媒Ｂ）（０．０５％ＴＦＡ）を用いて１．０ｍＬ／ｍｉｎの流量で分析を実施した。グラジエントは０から２０分まで８０％Ｂから１００％Ｂへと徐々に増加させた。担持効率は以下の式で定義した。
担持効率（％）＝１００×（カプセル化ＰＴＸ）／（供給ＰＴＸ）
【０１４６】
インビトロＰＴＸ放出アッセイ。以前に記載された透析法にわずかな変更を施して、ＰＴＸ  ＮＰからのＰＴＸのインビトロ放出プロファイルを測定した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２０１２；  ３３（２）：６７９−９１）。４％ＢＳＡを含有する０．５ｍＬのＭｉｌｉＱ水中にＰＴＸ  ＮＰを希釈し、バッグ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．  ＣＡ，  ＵＳＡ、ＭＷカットオフ＝８，０００Ｄａ）に入れた。バッグを１００ｍＬのＰＢＳ溶液（ｐＨ＝７．４）で透析し、３７℃において１００ｒｐｍで振とうした。所定の時点で、サンプルをよく混合した後、バッグからサンプルを１０μＬ収集した。１０μＬのサンプル中のＰＴＸを本明細書に記載のようにＨＰＬＣによって測定し、未放出ＰＴＸとみなした。放出カイネティクスを本明細書に記載のように求めた。
【０１４７】
結果。ナノ担体によって送達されるＰＴＸは遊離ＰＴＸよりも優れた効果を有するので（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ，  ２０１３；  １０（３）：３２５−４０）、ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰはＰＴＸをカプセル化形態で送達するはずであった。得られたＮＰは、ＰＴＸ  ＮＰと称するが、６．６対１の比でＰＴＸ及びＳａｌｉ−ＡＢＡを有していた。Ｓａｌｉ−ＡＢＡはＰＴＸよりも通常の４Ｔ１細胞に対して毒性がはるかに低いことを考慮すると（ＩＣ50：１６．４μＭ対６．３ｎＭ）、担体としてのｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰの毒性はＰＴＸに比べて無視できるものであった。ＰＴＸは８４．６±１．２５％（ｎ＝３）の効率でＮＰに担持された。ＰＴＸ  ＮＰは８５．０９±３１．６４ｎｍの平均直径を有し（図２７）、４．６７時間の半減期でＰＴＸを放出した（９５％ＣＩ＝４．０３〜５．５５時間、図２８）。例えば、図２６は以下のことを示す：通常の細胞におけるＳａｌｉ−ＡＢＡのＩＣ50値が腫瘍様塊細胞におけるものよりも有意に高かったこと（０．６μＭ、９５％ＣＩ＝０．３〜１．２μＭに対して６．４μＭ、９５％ＣＩ＝３．８〜１０．９μＭ、Ｐ＜０．０００１、ｔ検定）；通常の細胞におけるＳａｌｉ−ＡＢＡのＩＣ50値が腫瘍様塊細胞におけるものよりも有意に高かったこと（１．０μＭ、９５％ＣＩ＝０．６〜１．６μＭに対して５．６μＭ、９５％ＣＩ＝３．１〜１０．４μＭ、Ｐ＜０．０００１、ｔ検定）；及び通常の細胞におけるＳａｌｉ−ＡＢＡのＩＣ50値が腫瘍様塊細胞におけるものよりも有意に高いこと（１７．０μＭ、９５％ＣＩ＝３．８〜７６．６μＭに対して４２．６μＭ、９５％ＣＩ＝１９．７〜９１．８μＭ、Ｐ＜０．０００１、ｔ検定）。図２８は、Ｓａｌｉ−ＡＢＡのＩＣ50値が３４．３μＭ（９５％ＣＩ＝１６．１〜７３．３μＭ）であり、４Ｔ１−ｌｕｃ細胞の値よりも高かったことを示す。さらに、ＰＴＸ  ＮＰ治療マウスは、遊離ＰＴＸ治療マウスと比較した場合に、体重減少が少なかった（データは図示せず）。最後に、インビトロ細胞傷害性調査の結果は、ＰＴＸ  ＮＰが腫瘍様塊４Ｔ１−ｌｕｃ細胞よりも通常の４Ｔ１−ｌｕｃ細胞に対して大きな細胞傷害性を有することを示していた（図１３Ａ）。この２種類の細胞に対するＰＴＸ  ＮＰのＩＣ50は、それぞれ６．３２ｎＭ（％９５ＣＩ＝５．５〜７．３ｎＭ）及び４４．６ｎＭ（％９５ＣＩ＝３７．８〜５２．６ｎＭ）であった。２つのＩＣ50には統計的に差があった（Ｐ＜０．０００１、ｔ検定）。
【０１４８】
ＰＴＸ  ＮＰ及びｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰは原発性腫瘍成長に対して同レベルの阻害を発揮した。これらの２つの治療を受けるマウスの平均腫瘍サイズには、腫瘍接種後１５日目〜２５日目以外は、互いに有意差がなかった（Ｐ＜０．０５、ｔ検定、図１３Ｂ）。ＰＴＸ  ＮＰ治療マウスの無転移生存期間中央値は３７日であり、ＰＴＸ  ＮＰの転移阻害効果はｉＴＥＰ−  ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰほど効果的でなかったことを示しているが、その理由は、後者の治療の結果、３９日間の観察期間中の転移が０であったためである（図１３Ｃ）。実際に、２つの治療群の無転移生存率には統計的に差があった（Ｐ＝０．００２）。
【０１４９】
ｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰ及びＰＴＸ  ＮＰの両方からなる併用療法は、腫瘍接種後２９日目から、ＰＴＸ  ＮＰまたはｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰ単独療法よりも原発性腫瘍に対して優れた阻害を示した（図１３Ｂ）。併用療法はＰＴＸ  ＮＰ単独療法よりも転移を阻害するのにより効果的である（Ｐ＝０．００１）。併用療法によって治療した１４匹のマウスのうち１１匹が腫瘍接種６９日後の調査の最後にも無転移のままであった。しかし、併用療法は転移の阻害においてｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰより優れていなかった。
【０１５０】
併用療法はさらに、ＰＴＸ  ＮＰ単独療法及びｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰ単独療法と比較して、治療したマウスの全生存期間を延長することができた。併用療法群の全生存期間中央値は６９日であったが、ＰＴＸ  ＮＰ及びｉＴＥＰ−ＭＰＢＨ−ＡＢＡ−Ｓａｌｉ  ＮＰ療法群の生存期間は、わずか４１日及び３９日であった（図１３Ｄ、いずれの比較もＰ＜０．００１）。
【０１５１】
実施例１２：安定ｉＴＥＰ  ＮＰの設計及び生成
細胞株及びマウス。ＤＣ２．４  ＤＣ株（Ｈ−２Ｋb）は、Ｄｒ．  Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｒｏｃｋ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，  ＵＳＡ）によって快く提供された。１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１％非必須アミノ酸、１％Ｈｅｐｅｓ、５０μＭβ−メルカプトエタノール、１００ユニット／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補添したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＵＳＡ）でＤＣ２．４細胞を培養した。Ｈ−２Ｋb：ＯＶＡ257-264（ＳＩＩＦＥＫＬ；配列番号２２）に特異的なＢ３Ｚ  Ｔ細胞ハイブリドーマは、Ｄｒ．  Ｎｉｌａｂｈ  Ｓｈａｓｔｒｉ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ＵＳＡ）によって快く提供された。１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸、５０μＭ  β−メルカプトエタノール、１００ユニット／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補添したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＵＳＡ）でＢ３Ｚ細胞を培養した。ＥＡ．ｈｙ９２６、ｂＥｎｄ．３及び３Ｔ３細胞をＡＴＣＣから入手し、１０％熱不活性化ウシ胎児血清を補添したＤＭＥＭ培地中で維持した。６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。
【０１５２】
ｉＴＥＰ−ワクチン融合体の発現プラスミドの構築。以前に記載された方法を用いて、ｉＴＥＰワクチンをコードする遺伝子を改変ｐＥＴ２５ｂ（＋）ベクター上に合成した（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，  ２０１５，  ｐ．１−１２）。具体的には、ｉＴＥＰA（ＧＶＬＰＧＶＧ）4（配列番号３０）及びｉＴＥＰB（ＧＡＧＶＰＧ）5（配列番号３１）のサブユニットをコードした遺伝子を、これらの遺伝子のセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを互いにアニーリングすることによって生成した（表２を参照）。その後、これらのアニーリングしたｉＴＥＰ遺伝子をベクターのＢｓｅＲＩ部位に挿入した。最後に、所望の長さのｉＴＥＰ遺伝子が得られるまで、ｉＴＥＰ遺伝子をＰＲｅ−ＲＤＬ法によって重合した。ｉＴＥＰAはＧＶＬＰＧＶＧ（配列番号１）を２８リピート含有しており、ｉＴＥＰA28（配列番号５０）と命名した。ｉＴＥＰBはＧＡＧＶＰＧ（配列番号２）を７０リピート有しており、ｉＴＥＰB70（配列番号３１）と命名した。ｉＴＥＰB70−ｉＴＥＰA28（配列番号５４）、ｉＴＥＰB70−ｉＴＥＰA56（配列番号５９）、ｉＴＥＰB70−ｉＴＥＰA28−ｐＯＶＡ（配列番号５６）、ｉＴＥＰB70−ｉＴＥＰA56−ｐＯＶＡ（配列番号６０）、ｉＴＥＰB70−ｉＴＥＰA28−（Ｇ8Ｃ）4−ｐＯＶＡ（配列番号６１）及びｉＴＥＰB70−ｉＴＥＰA28−（Ｇ1Ｃ）4−ｐＯＶＡ（配列番号６２）の融合体をコードする遺伝子を同様に生成した。これらの遺伝子を構築するのに用いたオリゴヌクレオチドの配列を表２に記載する。ｐＯＶＡ融合体の配列は、２コピーのＣＴＬエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）、及びＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）の両側の１つの天然隣接残基を有していた。得られた発現ベクターを増幅のためにＤＨ５α中に形質転換した後、コード遺伝子の長さをＸｂａ  Ｉ及びＢａｍＨ  Ｉによる二重消化ならびにその後のアガロースゲル分析によって確認した（図１４）。これらの遺伝子のサイズは予想された融合体の残基数と合致する。コード遺伝子はＤＮＡシーケンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ，  ＵＳＡ）によっても検証した。
【０１５３】
ｉＴＥＰ−ワクチン融合体及びｉＴＥＰの産生及び精製。融合体及びｉＴＥＰを以前に記載されたように産生及び精製した（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，  ２０１５，  ｐ．１−１２）。Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ  Ｍｏｄｅｌ  ５００（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で超音波処理を行った。エンドトキシンも以前に記載されたように除去した（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，  ２０１５，  ｐ．１−１２）。融合体及びｉＴＥＰの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した（図１５）。
【０１５４】
還元環境反応性ｉＴＥＰ−ワクチン融合体の調製。還元条件を維持するために、１０ｍＭのＴＣＥＰ−ＨＣｌを含むＰＢＳ中、ｐＨ７．０で、ｉＴＥＰB70−ｉＴＥＰA28−（Ｇ1Ｃ）4−ｐＯＶＡ（配列番号６２）及びｉＴＥＰB70−ｉＴＥＰA28−（Ｇ8Ｃ）4−ｐＯＶＡ（配列番号６１）のタンパク質精製を行った。最終精製タンパク質を水中に溶解させてから凍結乾燥した。その後、精製タンパク質を酸化のために３７℃で１５分間０．３％Ｈ2Ｏ2で処理してジスルフィド結合安定化粒子を生成した。その後、Ｈ2Ｏ2をＡｍｉｃｏｎ遠心式フィルターデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  ＵＳＡ）によって除去した。
【０１５５】
ｉＴＥＰ−ワクチン融合体の流体力学的径の特性評価。以前に記載したようにＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ計測器（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｍａｌｖｅｒｎ，  ＵＫ）を用いて、動的光散乱（ＤＬＳ）によってｉＴＥＰ−ワクチン融合体の流体力学的径を測定した（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ，  ２０１４；  １１（８）：２７０３−１２）。サンプルをＰＢＳ中に５、２５、５０、及び１００μＭの濃度で再懸濁し、測定前に一晩室温で静置した。いくつかのサンプルをＤＬＳ測定前に５％ＣＯ２、３７℃で１６時間維持した。用いたサンプル濃度に影響されなかったので、５μＭの濃度のサンプルの流体力学的径の結果を報告した。個数基準サイズ分布アプローチを用いて流体力学的径を示した。しかし、Ｚ平均値及び強度基準サイズデータも報告した。
【０１５６】
ｉＴＥＰ−ワクチン融合体のネガティブ染色透過電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）。以前に記載されたようにＴＥＭを行った（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，  ２０１５；  ｐ１−１２）。
【０１５７】
ピレンアッセイによるｉＴＥＰ−ワクチン融合体の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の測定。以前に記載されたものに若干の調整を施して、ピレンを疎水性蛍光プローブとして用いることによって、蛍光スペクトルからｉＴＥＰ−ワクチン融合体（ＮＰ）のＣＭＣを測定した（Ｏｈｙａｎａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，  ２０１１；  ４１（５）；７１８−２２；  Ｄｒｅｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，  ２００８；  １３０（２）：６８７−９４）。簡潔に述べると、９６ウェル黒色透明底プレートにおいて、融合体を２５０μＭから開始してＰＢＳ中に逐次２倍希釈した。各希釈の最終体積は１５０μＬであった。エタノール中３０μＭピレンの原液３μＬを各ウェルに加えてよく混合した。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  ＰＲＯプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｔｒａｄｉｎｇ  ＡＧ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をＥｘ：１０ｎｍのスリットで３３４ｎｍ、Ｅｍ：２．５ｎｍのスリットで３６０〜４００ｎｍの範囲の設定で用いて、これらのサンプルの蛍光をスキャンした。３６０〜４００ｎｍ間のピレンの４つのピークを記録した。ピレンの発光ピーク番号１（Ｉ1；３７０〜３７３ｎｍ）及び発光ピーク番号３（Ｉ3；３８１〜３８４ｎｍ）の比（Ｉ1／Ｉ3）をｉＴＥＰ濃度の関数としてプロットした。データ点をシグモイド型用量反応曲線にフィッティングし、ＣＭＣを曲線の変曲点として定義した。
【０１５８】
結果。以前に、遊離ワクチンペプチドまたは可溶性オボアルブミンタンパク質として送達したワクチンと比較した場合に、ＣＴＬペプチドワクチンＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）の効力を向上させるｉＴＥＰ  ＮＰであるｉＴＥＰB70−ｉＴＥＰA28−ｐＯＶＡ（配列番号６４）（図１６Ａの概略図）を生成した（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，  ２０１５；  ｐ  １−１２）。しかし、このＮＰは安定ではなかった。１６時間３７℃で５％ＣＯ2中に維持した後、ＮＰ構造は溶解した。０時間では、ＮＰサンプルの流体力学的径は、ＤＬＳ測定（数分布による主要なピーク）によると７１．９４±２０．８１ｎｍであり、１６時間のインキュベーションの後では、サンプルの流体力学的径は８．３９±１．２０ｎｍとなったが、これは可溶性ｉＴＥＰの直径とほぼ同等であった（図１６Ｂ）（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，  ２０１５；  ｐ  １−１２）。このＮＰを限界安定ＮＰ（ＭＳ−ＮＰ）と呼ぶ。
【０１５９】
より安定なＮＰを用いた場合にＭＳ−ＮＰの効果を拡張することができるかどうか試験するために、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）ワクチンと融合した新規両親媒性ｉＴＥＰ二元ブロックコポリマーｉＴＥＰB70−ｉＴＥＰA56−ｐＯＶＡ（配列番号６０）（図１６Ａ）を生成した。この新規融合体は、ｉＴＥＰA28に対してｉＴＥＰA56と、ＭＳ−ＮＰに用いた融合体よりも長い疎水性ブロックを有していた。ＤＬＳ分析によると、ｉＴＥＰB70−ｉＴＥＰA56−ｐＯＶＡ（配列番号６０）は、５６．０１±１３．５４ｎｍ（数分布による主要なピーク）の流体力学的径を有するＮＰを形成した（図１６Ｂ）。このＮＰのサイズはＭＳ−ＮＰに匹敵する。この新規融合体のＴＥＭ画像でもその粒子構造を確認した（図１６Ｃ）。新規融合体は、５％ＣＯ2、３７℃で１６時間の細胞培養培地中でのインキュベーション後、その粒子構造を維持し（直径５５．３６±１２．８８ｎｍ）（図１６Ｂ）、新規融合体の粒子がＭＳ−ＮＰよりも安定であることを示した。この新規融合体のＮＰを安定ＮＰまたはＳＴ−ＮＰと呼ぶ。測定値はＤＬＳによって得た。ＭＳ−ＮＰ及びＳＴ−ＮＰのＺ平均はインキュベーション前で１０１．００ｎｍ及び７４．５９ｎｍであった。ＭＳ−ＮＰ及びＳＴ−ＮＰのＺ平均はインキュベーション後で４２２．９０ｎｍ及び７０．４２ｎｍであった。ＤＬＳ測定からの強度基準サイズデータを分析に用いたところ、ＭＳ−ＮＰとＳＴ−ＮＰとの間の差が確認された（図１７）。データは、ＮＰを３７℃で１６時間インキュベートする前（０ｈ）及び後（１６ｈ）にＤＬＳによって収集した。インキュベーションの前では、ＭＳ−ＮＰ及びＳＴ−ＮＰの直径はそれぞれ１１１．９０±３５．０２ｎｍ及び７８．５６±２１．６０ｎｍであった。インキュベーションの後では、ＳＴ−ＮＰは７４．４５±１８．９９ｎｍの直径を有し、ＭＳ−ＮＰは２つのピーク：７５．４７±９．７５ｎｍ（９２．２％）及び８．８６±０．９０ｎｍ（７．８％）を有していた。ＭＳ−ＮＰ及びＳＴ−ＮＰの安定性をさらに比較するために、それらの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）をピレンアッセイによって測定した。アッセイの結果、ＭＳ−ＮＰのＣＭＣは１２０．６μＭであり、ＳＴ−ＮＰのＣＭＣは２３．９４μＭであることが明らかとなった（図１６Ｄ）。ＣＭＣ結果は、ＳＴ−ＮＰがＭＳ−ＮＰよりも安定であることも示した。
【０１６０】
実施例１３：ＳＴ−ＮＰはＣＴＬワクチンに対するＭＳ−ＮＰの効果を拡張することができず、ＤＣはＳＴ−ＮＰを内在化させる
ｉＴＥＰ−ワクチン融合体の蛍光標識化。フローサイトメトリー調査のために、スクシンイミジルエステルを介してアミン反応性クマリン、７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸で融合体を標識して、青色蛍光バイオコンジュゲートを形成した。顕微鏡ベースの細胞内取込調査及び細胞分解調査のために、融合体をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏ  ４８８  ５−ＳＤＰエステル（Ａｌｅｘａ−４８８）で標識して、緑色蛍光バイオコンジュゲートを形成した。製造業者の指示（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に基づいて反応を実施した。簡潔に述べると、０．１Ｍの炭酸水素ナトリウムバッファー中、ｐＨ８．３、最終体積１ｍＬで、１０ｍｇのｉＴＥＰを１ｍｇのクマリンまたは０．２ｍｇのＡｌｅｘａ−４８８と反応させた。暗所において室温で１．５時間、連続的に撹拌させながら反応を行った。タンパク質−色素コンジュゲートをＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ１−５（１０ｋ）遠心式フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて精製した。２０５ｎｍ（Ａ205）及び４３３ｎｍ（Ａ433、クマリンのλｍａｘ）でクマリンコンジュゲートの吸光度を測定し、Ａｌｅｘａ−４８８コンジュゲートは２０５ｎｍ及び４９５ｎｍ（Ａ495、Ａｌｅｘａ−４８８のλｍａｘ）で測定した。ｉＴＥＰ−ワクチン融合体濃度及び標識度（ＤＯＬ）を以下の式に基づいて計算した。
2018521977.tif 000010
2018521977.tif 000011
2018521977.tif 000012
式中、εは吸光係数（ｃｍ-1Ｍ-1）である。クマリンコンジュゲートのＤＯＬクマリンは８〜１０％であり、使用前に対応する非標識ｉＴＥＰ−ワクチン融合体を加えることによって３％に調整した。Ａｌｅｘａ−４８８コンジュゲートのＤＯＬAlexa-488は０．０２〜０．０３％であり、使用前に０．０２％に調整した。
【０１６１】
ＤＣによるＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープワクチンの提示。以前に記載されたように提示について調査した（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，  ２０１５；  ｐ１−１２）。この実験に用いたｉＴＥＰ−ワクチン融合体（ＮＰ）の濃度は５μＭであった。提示の結果は、所与の処理における５０００の処理済生細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として、未処理ＤＣ２．４細胞のＭＦＩ値に対して正規化して示した。
【０１６２】
Ｂ３Ｚハイブリドーマ（ＣＤ８＋  Ｔ）細胞の活性化。このアッセイは以前に記載されたプロトコールで行った（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，  ２０１５；  ｐ  １−１２）。
【０１６３】
ｉＴＥＰ−ワクチン融合体の細胞内取込。ＤＣ２．４、ＥＡ．ｈｙ９２６、ｂＥｎｄ．３、３Ｔ３細胞を１．５×１０5／５００μＬ／ウェルで２４ウェルプレートに播種した。細胞がプレートの底に付着したら（４時間または一晩）、培地を５μＭのクマリン標識ｉＴＥＰ−ワクチン融合体含有または非含有の５００μＬの新鮮な培地と交換した。４時間、３７℃、５％ＣＯ2で培養した後、細胞を収集してＰＢＳで２回洗浄した。細胞の蛍光をフローサイトメトリーによって測定した（サンプル当たり５×１０4イベントを収集）。
【０１６４】
蛍光顕微鏡検査のために、ＤＣ２．４細胞を１２ｍｍガラスカバースリップ底の２４ウェルプレート上に、完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中、１ウェル当たり２５０，０００で播種した。細胞が８０％コンフルエンスに達したら、温培地で洗浄し、その後、３７℃で１〜４時間、５μＭのｉＴＥＰ−ワクチン融合体と共にインキュベーションした。次に、細胞を温培地で２回リンスし、７５ｎＭのＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＤＮＤ−９９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＵＳＡ）と共にインキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドで固定した。細胞をスライドガラス上に載せ、Ｎｉｋｏｎ  ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｔｉ（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，  ＵＳＡ）を用いて画像化した。
【０１６５】
動物免疫化。左側腹部への２ｎｍｏｌのｉＴＥＰ  ＮＰワクチン及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ；  Ｓｉｇｍａ，  ＵＳＡ）の皮下注入によって、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫化した。１週間後に右側腹部で免疫化を繰り返した。２回目の免疫化後１０日目にマウスを屠殺して脾臓を採取した。
【０１６６】
結果。ＳＴ−ＮＰ及びＭＳ−ＮＰによって送達されたＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）ワクチンのインビトロ及びインビボ活性を比較した。第１に、細胞をＳＴ−ＮＰまたはＭＳ−ＮＰで処理した後、ＤＣによるＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）エピトープ提示を評価した。評価の結果は、ＳＴ−ＮＰがＭＳ−ＮＰよりも有意に弱い提示につながることを示していた（図１８Ａ）。第２に、ＳＴ−ＮＰまたはＭＳ−ＮＰのいずれかで前処理したＤＣと共にインキュベートした後のＢ３Ｚ細胞の活性化を比較した。Ｂ３Ｚ細胞は、Ｈ−２Ｋb／ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体に拘束性の遺伝子操作ＣＤ８＋  Ｔ細胞ハイブリドーマ株である（Ｋａｒｔｔｕｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  １９９２；  ８９（１３）：６０２０−４）。結果は、ＳＴ−ＮＰはＭＳ−ＮＰよりもＢ３Ｚ細胞の活性化がはるかに弱いことを示す（図１８Ｂ）。最後に、ＳＴ−ＮＰまたはＭＳ−ＮＰのいずれかを用いてＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫化し、その後、ＮＰが誘発したＳＩＩＮＦＥＬＫＬ特異的ＣＴＬ応答を調べた。ＳＴ−ＮＰは確かに応答を誘発した。しかし、その応答はＭＳ−ＮＰによって誘発されたものよりも有意に弱かった（図１８Ｃ）。細胞の活性化をＩＮＦγベースのＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価した。ＭＳ−ＮＰは、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）提示、Ｂ３Ｚ活性化、及びインビボＣＴＬ応答の促進において、ＳＴ−ＮＰよりも優れていたが、ＣＴＬ応答における優位性は、提示及びＢ３Ｚ活性化よりもはるかに弱いことが観察された（図１８Ａまたは１８Ｂに対して図１８Ｃ）。インビトロ結果とインビボ結果との間の相違は、ＳＴ−ＮＰがインビボにおいてＭＳ−ＮＰに勝る何らかの明らかにされていない利点を有し得ることを示唆していた。ＳＴ−ＮＰの利点の１つは、ＤＣがＭＳ−ＮＰよりもＳＴ−ＮＰをよく取り込むことであると仮定した。ＤＣ及び他の細胞によるＭＳ−ＮＰ及びＳＴ−ＮＰの取込みを比較した。結果は、ＤＣがＳＴ−ＮＰをＭＳ−ＮＰの２倍内在化したことを示す（図１８Ｄ）。所与の細胞型によるＳＴ−ＮＰとＭＳ−ＮＰとの間の取込み比を、それぞれ蛍光標識ＳＴ−ＮＰ及びＭＳ−ＮＰと共にインキュベートした後の細胞のＭＦＩ比として表す。対照的に、内皮細胞（ＥＡ．ｈｙ９２６及びｂＥｎｄ．３）ならびに線維芽細胞（３Ｔ３）は、ＭＳ−ＮＰと同じか、または少ない量のＳＴ−ＮＰを内在化した。これらの観察結果は、ＤＣは粒子の取込みに有利であったが、体内の一般的な細胞では異なることを示していた。ＳＴ−ＮＰはＭＳ−ＮＰよりも安定であり、そのため、ＳＴ−ＮＰサンプルは、上記の取込み調査の際にＭＳ−ＮＰサンプルよりも多くのＮＰ構造のｉＴＥＰ−ワクチン融合体分子を有していたはずであり、ＭＳ−ＮＰサンプルよりも多くのＳＴ−ＮＰサンプルの取込みをもたらした。実際に、ＮＰ構造は受動的ＤＣ標的化効果を発揮する。
【０１６７】
ＳＴ−ＮＰはＭＳ−ＮＰよりもＤＣ取込みが優れていたので、ＳＴ−ＮＰに関連する低いＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）提示及びＢ３Ｚ活性化は、ＤＣ内でのＮＰの非効率的なプロセシングに起因するに違いない。安定性がＳＴ−ＮＰとＭＳ−ＮＰとの間の主な違いなので、ＳＴ−ＮＰの細胞内プロセシングの阻害をＮＰの高い安定性と関連付けるのは妥当である。高い安定性がＤＣ内でのＮＰの解離を妨げる可能性がある。ｐＯＶＡはＳＴ−ＮＰの疎水性コア中にあるので、解離しなければ、ｐＯＶＡとｉＴＥＰとの間の結合がＤＣ内でｓ−プロテアソーム及び免疫プロテアソームに曝露さることはない。したがって、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）エピトープはＳＴ−ＮＰから効果的に放出されることができない。
【０１６８】
実施例１４：還元環境反応型安定性を有するｉＴＥＰ  ＮＰ担体の生成
還元処理後のＲＥＤ−ＮＰの遊離スルフヒドリル基の定量。２０ｍｇのＲＥＤ−ＮＰを２ｍＬのＨ2Ｏに溶解させ、１ｍＭのＧＳＨで１６時間処理した。その後、溶液を４℃で２４時間脱イオン水中に透析した（膜カットオフＭＷ：３，５００ダルトン）。その後、Ａｍｉｃｏｎ遠心式フィルターデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  ＵＳＡ）を用いて、サンプルを０．５ｍＬに濃縮した。ＲＥＤ−ＮＰの遊離スルフヒドリル基の数をエルマン法によって求めた。簡潔に述べると、２５０μＬのサンプル及び５０μＬのエルマン試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  ＵＳＡ）を２．５ｍＬの反応バッファー（０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に添加した。室温での１５分間のインキュベーションの後、ＯＤ412を測定した。遊離スルフヒドリル基の標準曲線を作成するために、システイン塩酸塩一水和物の逐次希釈液のＯＤ412を測定した。逐次のＯＤ412値をシステイン塩酸塩一水和物の濃度に対してプロットして標準曲線を作成した。ＲＥＤ−ＮＰサンプル中の遊離スルフヒドリル基の濃度を標準曲線から求め、ｉＴＥＰ−ワクチン融合体分子当たりの遊離スルフヒドリル基の数を計算するために用いた。
【０１６９】
結果。ＳＴ−ＮＰとＭＳ−ＮＰとの間の比較に基づいて、ＣＴＬペプチドワクチンのより効果的な担体は、体循環中にはＳＴ−ＮＰと同等に安定であるが、ＤＣによる内在化の後にはＭＳ−ＮＰと同等に不安定になるもののはずであると考えられた。そのような担体を生成するために、ＮＰ中にジスルフィド結合を形成し、ＮＰを安定化させるためにこの結合を用いることによってＭＳ−ＮＰを改変した（図１９Ａ）。新規ＮＰは、そのジスルフィド結合がサイトゾルなどの還元環境で還元されない限り、安定なＮＰとして振る舞うことが予想された（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，  １９９６；  １４０（１）：１−１２；  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｕｔｒ，  ２００４；  １３４（３）：４８９−９２）。具体的には、両親媒性コポリマーｉＴＥＰB70−ｉＴＥＰA28（配列番号５４）とｐＯＶＡとの間に４つのシステインを挿入し、隣接するシステインを８つのグリシンによって隔てた。得られたｉＴＥＰ融合体ｉＴＥＰB70−ｉＴＥＰA28−（Ｇ8Ｃ）4−ｐＯＶＡ（配列番号６１）は、融合体のＤＬＳ測定によるとＮＰに自己組織化した（図１９Ｂ）。ＮＰは６１．９４±１２．７１ｎｍの流体力学的径（数分布による主要なピーク）を有しており、５％ＣＯ2、３７℃における細胞培養培地中での一晩のインキュベーション後にその粒子構造を維持した。インキュベーション後の流体力学的径は５３．０５±１２．３８ｎｍであった（図１９Ｂ）。インキュベーション前後のＲＥＤ−ＮＰのＺ平均は、それぞれ８７．５９ｎｍ及び７６．８９ｎｍであった。強度基準サイズデータを分析に用いたところ、同じ結論に至った（図１７Ｂ）。ｉＴＥＰB70−ｉＴＥＰA28−（Ｇ8Ｃ）4−ｐＯＶＡ融合体（配列番号６１）のＴＥＭ画像でも融合体の粒子構造が確認された（図１９Ｃ）。
【０１７０】
次の一連の実験では、新規ＮＰ中のジスルフィド結合が還元可能であるかどうか、及びＮＰ構造がサイトゾル（グルタチオン、ＧＳＨ  １〜１０ｍＭ）（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，  １９９６；  １４０（１）：１−１２；  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｕｔｒ，  ２００４；  １３４（３）：４８９−９２）のような還元環境において分解可能であるかどうか試験した。２つの濃度のＧＳＨを用いて、新規ＮＰ及びＳＴ−ＮＰを３７℃で一晩処理し、その後、ＤＬＳによって両方のＮＰの粒子構造変化を分析した。これらの濃度は、細胞質（ＧＳＨ  １〜１０ｍＭ）または細胞外（ＧＳＨ  １〜１０μＭ）環境のいずれかにおけるＧＳＨ濃度を模倣している（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，  １９９６；  １４０（１）：１−１２；  Ｃａｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  （１９８５），  １９８７，  ６３（１）：１５２−７；  Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ，  １９９８；  ２７５（２）：１７５−８４）。両方のＮＰとも１０μＭのＧＳＨで安定であった。新規ＮＰは１ｍＭのＧＳＨで処理した後に粒子構造を失った（表４）。この結果と合致して、１ｍＭのＧＳＨの処理の後、遊離スルフヒドリル基は、平均してｉＴＥＰ分子当たり０からｉＴＥＰ分子当たり２に増加した。対照的に、対照としてのＳＴ−ＮＰは、ＧＳＨのいかなる濃度でのインキュベーションにもかかわらず、その粒子構造を維持した。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を還元剤として用いた場合に同様の結果が生じたが、ただしこの場合、新規ｉＴＥＰ−ＮＰは１０μＭのＤＴＴで安定ではなかった（表４）。新規ＮＰとＳＴ−ＮＰとの間の劇的な差は、新規ＮＰが還元環境に反応性のある安定性を有することを示唆していた。この新規ＮＰを還元環境依存ＮＰまたはＲＥＤ−ＮＰと命名した。
表４．ＳＴ−ＮＰ及びＲＥＤ−ＮＰの還元剤に対する反応についての比較
2018521977.tif 000013
【０１７１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて１ｍＭのＧＳＨでの処理に対するＲＥＤ−ＮＰ、ＭＳ−ＮＰ、及びＳＴ−ＮＰの反応を分析した。１ｍＭのＧＳＨはＲＥＤ−ＮＰ中のジスルフィド結合を還元したが、１０μＭでは還元しなかった。ＲＥＤ−ＮＰ融合体（ｉＴＥＰB70−ｉＴＥＰA28−（Ｇ8Ｃ）4−ｐＯＶＡ；（配列番号６１））の大部分のポリマーが１ｍＭのＧＳＨでの処理によってモノマーになったが、これはゲル上の５０−ｋＤａバンドとして示される。対照的に、ＧＳＨはＭＳ−ＮＰ及びＳＴ−ＮＰの融合体の重合状態に影響を及ぼさなかった。非還元性ゲル及び２５μｇの各融合体を分析に用いた。結果は、１ｍＭのＧＳＨによってＲＥＤ−ＮＰを還元することができるが、１０μＭではできないことを示す（図２０）。対照的に、ＭＳ−ＮＰ及びＳＴ−ＮＰは処理に反応しなかった（図２０）。この結果は上述の結論を強固なものとした。
【０１７２】
最後に、次の一連の実験では、ＤＣによるＲＥＤ−ＮＰの内在化がＳＴ−ＮＰと同じくらい効率的か、またはＭＳ−ＮＰと同じくらい非効率的かどうか調査した。結果は、蛍光顕微鏡検査結果（４時間の取込みについては図１９Ｄ〜Ｆ、及び１時間の取込みについては図２１；画像化前にＡｌｅｘａ−４８８標識ＮＰをＤＣと共に４時間インキュベートした）ならびにフローサイトメトリー結果（図１９Ｇ）の両方によると、ＤＣへのＲＥＤ−ＮＰの内在化はＳＴ−ＮＰと同じくらい効率的であり、ＭＳ−ＮＰよりも強力であったことを示す。さらに、ＤＣはＭＳ−ＮＰに対して優先的にＲＥＤ−ＮＰを内在化したが、内皮細胞及び線維芽細胞では異なっており（図１９Ｈ）、これはＳＴ−ＮＰ（図１８Ｄ）と同様であった。したがって、ＲＥＤ−ＮＰは、まさにＳＴ−ＮＰのように受動的ＤＣ標的化能力を有する。
【０１７３】
実施例１５：ＲＥＤ−ＮＰはＳＴ−ＮＰ及びＭＳ−ＮＰの両方よりも有効なワクチン担体である
以下に記載の結果を得るのに用いた方法は本明細書に記載されている。
【０１７４】
結果。ＤＣによるＣＴＬエピトープ提示に対するＲＥＤ−ＮＰ、ＭＳ−ＮＰ、及びＳＴ−ＮＰの効果を比較した。ＲＥＤ−ＮＰによって送達されたＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）エピトープはＭＳ−ＮＰによって送達されたときほど良好に提示されなかったが、ＲＥＤ−ＮＰから得られた提示はＳＴ−ＮＰのものよりも有意に優れていた（図２２Ａ）。比較結果は、ＲＥＤ−ＮＰの環境依存的安定性がＤＣによるワクチンペイロードのプロセシング及び提示を促進したことを意味していた。一方で、ＲＥＤ−ＮＰ及びＭＳ−ＮＰの提示結果の間には差があったが、これは、ＲＥＤ−ＮＰ中のジスルフィド結合の還元が完全ではなかった可能性があり、そのためすべてのＲＥＤ−ＮＰがＭＳ−ＮＰのように振る舞ったわけではないことを示していた。提示結果と合致して、ＲＥＤ−ＮＰはＭＳ−ＮＰほど効果的にＢ３Ｚ細胞を活性化することができなかったが、この場合もＳＴ−ＮＰよりも良好となった（図２２Ｂ）。空の担体ＮＰとＤＣ及びＢ３Ｚ細胞とのインキュベーションはいかなる抗原提示またはＴ細胞活性化にもつながらなかったので（図２３）、すべてのこれらのＤＣ提示及びＢ３Ｚ活性化の結果がＳＩＩＮＦＥＫＬワクチン特異的であったということは注目に値する。
【０１７５】
ＲＥＤ−ＮＰまたはＭＳ−ＮＰのいずれかでマウスを免疫化し、それらによって誘発されたＣＴＬ応答を比較したところ、ＲＥＤ−ＮＰはＭＳ−ＮＰの効果を上回り、ＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープ（配列番号２２）に対してより強いＣＴＬ応答を誘発したことが判明した（図２２Ｃ）。別の還元環境依存ＮＰのＲＥＤ−ＮＰ２（融合体ｉＴＥＰB70−ｉＴＥＰA28−（Ｇ1Ｃ）4−ｐＯＶＡから集合した）（配列番号６２）がＲＥＤ−ＮＰと同様の結果をもたらし、また、インビボでＭＳ−ＮＰよりも優れていたことは注目に値した（図２４）。例えば、流体力学的径の値はインキュベーション前で、４２．４９±１０．２３ｎｍ（個数基準）、５９．１５±１５．３２ｎｍ（強度基準）、及び８９．２５（Ｚ平均）であり、これらの値はインキュベーション後で、３６．７５±９．５６ｎｍ（個数基準）、５８．９５±１９．５３ｎｍ（強度基準）、及び５４．８１（Ｚ平均）であった。
【０１７６】
表５に３つのｉＴＥＰ  ＮＰの安定性、取込み、及びＣＴＬ応答をまとめる。ＮＰの中で、細胞外非還元環境とサイトゾル還元環境との間で変化可能な安定性を有していたものであるＲＥＤ−ＮＰが、ＣＴＬペプチドワクチンの送達において最も効果的であった。すべての３つのＮＰはワクチンと共に安全であることが注目された。それらは５０μＭでもＤＣ２．４細胞またはＥＡ．ｈｙ９２６細胞に対して毒性ではなかった（図２５）。それらは長期のワクチン接種調査の間にいかなる有害反応も引き起こさなかった。
表５．３つの異なるｉＴＥＰの安定性、取込み及びＣＴＬ応答の一覧
2018521977.tif 000014
【０１７７】
実施例１６：ＲＥＤ−ＮＰはサイトゾルに輸送されて分解される
ＲＥＤ−ＮＰは還元環境に対して安定な反応を有し、ワクチン送達においてＳＴ−ＮＰよりも良好に働いたので、ＲＥＤ−ＮＰは細胞内輸送の間に還元性のサイトゾルに到達してサイトゾルの還元環境を活用した可能性が非常に高い。次の一連の実験では、ＲＥＤ−ＮＰがサイトゾルに輸送されて分解されたかどうか試験した。この調査を行うために、ＤＣによって内在化された後のＲＥＤ−ＮＰの細胞内分配を評価した。
【０１７８】
結果。ＤＣとのＲＥＤ−ＮＰの１時間のインキュベーションの後、相当な割合の内在化ＮＰがサイトゾルに到達していた一方で、残りのＮＰはファゴリソソーム中にあった（図２６Ａ）。この観察結果は、ＤＣのファゴリソソームからサイトゾルへのＮＰのまずまずの速さの脱出を示す。ＲＥＤ−ＮＰのプロセシング及び分解がＤＣ中で素早く生じたことも分かった。ＮＰをＤＣと共に１時間インキュベートした後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる細胞内ＲＥＤ−ＮＰの完全性を分析した（図２６Ｂ）。インキュベーション後の異なる時点で細胞ライセートを収集した。ＲＥＤ−ＮＰのｉＴＥＰ−ワクチン融合体は、インキュベーションの直後にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に約５０ｋＤａのバンドを示した。しかし、このバンドはインキュベーション後３０分以内にほとんど消えた。インキュベーションの１時間後、このバンドは完全に消えた。ペプチド分解のためのｓ−プロテアソーム及び免疫プロテアソームはサイトゾル中にあるので、素早い分解は、ファゴリソソームからサイトゾルへの素早い輸送と一貫性がある（Ｙｅｗｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｂｅｎｎｉｎｋ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２００１；  １３（１）：１３−８；  Ｋｌｏｅｔｚｅｌ  ａｎｄ  Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４；  １６（１）：７６−８１；及びＢｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ２０００；  ３４６（Ｐｔ  １）：１５５−６１）。一方で、エピトープ含有タンパク質の効率的な生分解はＭＨＣクラスＩ抗原提示経路を促進する（Ｋｒｕｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｌｏｅｔｚｅｌ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２０１２；  ２４（１）：７７−８３；  Ｙｅｗｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｂｅｎｎｉｎｋ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２００１；及びＡｍｉｇｏｒｅｎａ  ａｎｄ  Ｓａｖｉｎａ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２０１０；  ２２（１）：１０９−１７）。
【０１７９】
参考文献
１．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｈ．  Ｌ．，  Ａｍａｒａ，  Ｒ．  Ｒ．，  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  （２００５）；１１，  ｓ２５−ｓ３２．
２．Ｅｐｓｔｅｉｎ，  Ｊ．  Ｅ．，  Ｔｅｗａｒｉ，  Ｋ．，  Ｌｙｋｅ，  Ｋ．  Ｅ．，  Ｓｉｍ，  Ｂ．  Ｋ．  Ｌ．，  Ｂｉｌｌｉｎｇｓｌｅｙ，  Ｐ．  Ｆ．，  Ｌａｕｒｅｎｓ，  Ｍ．  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｉｖｅ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｍａｌａｒｉａ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｈｅｐａｔｉｃ  ＣＤ８＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２０１１）；３３４，  ４７５−４８０．
３．Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ，  Ｃ．  Ａ．，  Ａｃｑｕａｖｅｌｌａ，  Ｎ．，  Ｙｕ，  Ｚ．，  Ｒｅｓｔｉｆｏ，  Ｎ．  Ｐ．，  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：  ａｒｅ  ｗｅ  ｔｈｅｒｅ  ｙｅｔ？  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  （２０１１）；２３９，  ２７−４４．
４．Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，  Ｒ．，  Ａｍａｃｋｅｒ，  Ｍ．，  Ｎｅｕｈａｕｓ，  Ｄ．，  Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，  Ｒ．，  Ｇｒｏｅｐｅｒ，  Ｃ．，  Ｈｅｂｅｒｅｒ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ＨＬＡ−Ａ０２０１  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ，  ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，  Ｌ（２７）Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１（２６−３５）  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｖｉｒｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｖａｃｃｉｎｅ  （２００５）；２３，  ５５７２−５５８２．
５．Ｐｌｕｍｍｅｒ，  Ｅ．  Ｍ．，  Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，  Ｍ．，  Ｖｉｒａｌ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ：  ｐｌａｔｆｏｒｍｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ＷＩＲＥｓ  Ｎａｎｏｍｅｄ  Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （２０１１）；３，  １７４−１９６．
６．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓ．，  Ｉｍｍｕｎｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｈｏｗ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｎ  Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｃｅｌｌ  （２０１５）；１６１，  ２０１−２０４．
７．Ｓａｈｄｅｖ，  Ｐ．，  Ｏｃｈｙｌ，  Ｌ．，  Ｍｏｏｎ，  Ｊ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  （２０１４）；３１，  ２５６３−２５８２．
８．Ｄｒｅｈｅｒ，  Ｍ．  Ｒ．，  Ｓｉｍｎｉｃｋ，  Ａ．  Ｊ．，  Ｆｉｓｃｈｅｒ，  Ｋ．，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｒ．  Ｊ．，  Ｐａｔｅｌ，  Ａ．，  Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  （２００８）；１３０，  ６８７−６９４．
９．Ｈａｓｓｏｕｎｅｈ，  Ｗ．，  Ｆｉｓｃｈｅｒ，  Ｋ．，  ＭａｃＥｗａｎ，  Ｓ．  Ｒ．，  Ｂｒａｎｓｃｈｅｉｄ，  Ｒ．，  Ｆｕ，  Ｃ．  Ｌ．，  Ｌｉｕ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｅｌａｓｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  （２０１２）；１３，  １５９８−１６０５．
１０．Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，  Ｊ．，  Ｌｅｐｓ，  Ｍ．，  Ｃｏｎｒａｄ，  Ｕ．，  Ｆｏｒｃｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｓｅｅｄｓ  ｂｙ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｏ  ｅｌａｓｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｐｌａｎｔ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｊｏｕｒｎａｌ  （２００６）；４，  ２４３−２４９．
１１．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，  Ｊ．，  Ｏｓｅｒｏｆｆ，  Ｃ．，  Ｄａｈｌｂｅｒｇ，  Ｃ．，  Ｑｉｎ，  Ｍ．，  Ｉｓｈｉｏｋａ，  Ｇ．，  Ｂｅｅｂｅ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｄｅｃａｅｐｉｔｏｐｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＣＤ８＋  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ａｎｄ  Ｔｈ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ：  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｅｐｉｔｏｐｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ａ  ｍｏｄｅ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  （２００２）；１６８，  ６１８９−６１９８．
１２．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，  Ｂ．  Ｄ．，  Ｎｅｗｍａｎ，  Ｍ．，  Ｃｒｉｍｉ，  Ｃ．，  ＭｃＫｉｎｎｅｙ，  Ｄ．，  Ｃｈｅｓｎｕｔ，  Ｒ．，  Ｓｅｔｔｅ，  Ａ．，  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｅｐｉｔｏｐｅ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ  （２００１）；１９，  ４６５２−４６６０．
１３．Ｔｈｏｍｓｏｎ，  Ｓ．  Ａ．，  Ｋｈａｎｎａ，  Ｒ．，  Ｇａｒｄｎｅｒ，  Ｊ．，  Ｂｕｒｒｏｗｓ，  Ｓ．  Ｒ．，  Ｃｏｕｐａｒ，  Ｂ．，  Ｍｏｓｓ，  Ｄ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｒｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｔｏ  ＣＤ８＋  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  （１９９５）；９２，  ５８４５−５８４９．
１４．Ｈａｓｓｏｕｎｅｈ，  Ｗ．，  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，  Ｔ．，  Ｃｈｉｌｋｏｔｉ，  Ａ．，  Ｅｌａｓｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ａ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔａｇ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ／  ｅｄｉｔｏｒｉａｌ  ｂｏａｒｄ，  Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ  ．．．  ［ｅｔ  ａｌ．］  （２０１０）；Ｃｈａｐｔｅｒ  ６，  Ｕｎｉｔ  ６  １１．
１５．Ｄａ  Ｓｉｌｖａ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｐａｓｔｒａｎａ，  Ｄ．  Ｖ．，  Ｓｃｈｉｌｌｅｒ，  Ｊ．  Ｔ．，  Ｋａｓｔ，  Ｗ．  Ｍ．，  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  （２００１）；２９０，  ３５０−３６０．
１６．Ｒｕｅｄｌ，  Ｃ．，  Ｓｃｈｗａｒｚ，  Ｋ．，  Ｊｅｇｅｒｌｅｈｎｅｒ，  Ａ．，  Ｓｔｏｒｎｉ，  Ｔ．，  Ｍａｎｏｌｏｖａ，  Ｖ．，  Ｂａｃｈｍａｎｎ，  Ｍ．  Ｆ．，  Ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ：  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｂｙ  ｃａｒｒｉｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  （２００５）；７９，  ７１７−７２４．
１７．Ｌｉｕ，  Ｘ．  Ｓ．，  Ｘｕ，  Ｙ．，  Ｈａｒｄｙ，  Ｌ．，  Ｋｈａｍｍａｎｉｖｏｎｇ，  Ｖ．，  Ｚｈａｏ，  Ｗ．，  Ｆｅｒｎａｎｄｏ，  Ｇ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＩＬ−１０  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｖｉｒａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｉｎ  ａ  ｐｒｉｍｅｄ  ｈｏｓｔ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  （２００３）；１７１，  ４７６５−４７７２．
１８．Ｕｒｒｙ，  Ｄ．  Ｗ．，  Ｐａｒｋｅｒ，  Ｔ．  Ｍ．，  Ｒｅｉｄ，  Ｍ．  Ｃ．，  Ｇｏｗｄａ，  Ｄ．  Ｃ．，  Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｅｌａｓｔｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  Ｐｏｌｙ（ＧＶＧＶＰ）  ａｎｄ  Ｉｔｓ  γ−Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｍａｔｒｉｘ：  Ｓｕｍｍａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｓｔ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  （１９９１）；６，  ２６３−２８２．
１９．Ｕｒｒｙ，  Ｄ．  Ｗ．，  Ｐａｔｔａｎａｉｋ，  Ａ．，  Ａｃｃａｖｉｔｔｉ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｌｕａｎ，  Ｃ．，  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｄ．  Ｔ．，  Ｘｕ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，  Ａ．  Ｊ．  Ｄｏｍｂ，  Ｊ．  Ｋｏｓｔ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｗｉｓｅｍａｎ，  Ｅｄｓ．  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９８）．
２０．ＣＨＲＩＳＴＩＡＮＳＥＮ，  Ｍ．，  ＭＡＴＳＯＮ，  Ｍ．，  ＢＲＡＺＧ，  Ｒ．  Ｌ．，  ＧＥＯＲＧＯＰＯＵＬＯＳ，  Ｌ．，  ＡＲＮＯＬＤ，  Ｓ．，  ＫＲＡＭＥＲ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｗｅｅｋｌｙ  Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｄｏｓｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｍｅｒａ  （ＰＢ１０２３）  ａ  Ｎｏｖｅｌ  ＧＬＰ−１  Ａｎａｌｏｇｕｅ  Ｒｅｄｕｃｅ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  Ｄｏｓｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ．  （Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，  ２０１２），
２１．Ｃａｐｐｅｌｌｏ，  Ｊ．，  ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，  Ａ．  Ｊ．  Ｄｏｍｂ；，  Ｊ．  Ｋｏｓｔ；，  Ｄ．  Ｍ．  Ｗｉｓｅｍａｎ，  Ｅｄｓ．  （Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，  １９９７），  ｐｐ．  ３８７−４１６．
２２．Ｎｏｕｒｉ，  Ｆ．，  Ｗａｎｇ，  Ｘ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｘ．，  Ｈａｔｅｆｉ，  Ａ．，  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｖｉｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｅｃｔｏｒ／ＤＮＡ  Ｎａｎｏｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｂｙ  Ｅｌａｓｔｉｎ−Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  （２０１５），  １−１１．
２３．Ｍｏｒｅｌａｎｄ，  Ｌ．  Ｗ．，  ＭｃＣａｂｅ，  Ｄ．  Ｐ．，  Ｃａｌｄｗｅｌｌ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｓａｃｋ，  Ｍ．，  Ｗｅｉｓｍａｎ，  Ｍ．，  Ｈｅｎｒｙ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ｄｉｍｅｒ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｔｉｖｅ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  （２０００）；２７，  ６０１−６０９．
２４．Ｒａｕ，  Ｒ．，  Ｓａｎｄｅｒ，  Ｏ．，  ｖａｎ  Ｒｉｅｌ，  Ｐ．，  ｖａｎ  ｄｅ  Ｐｕｔｔｅ，  Ｌ．，  Ｈａｓｌｅｒ，  Ｆ．，  Ｚａｕｇ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐ５５−Ｆｃ  ＩｇＧ１  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｏ  ４５−２０８１  （ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ）：  ａ  ｄｏｕｂｌｅ  ｂｌｉｎｄ，  ｐｌａｃｅｂｏ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｄｏｓｅ−ｆｉｎｄｉｎｇ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  （２００３）；３０，  ６８０−６９０．
２５．Ｕｒｒｙ，  Ｄ．  Ｗ．，  Ｆｒｅｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｉｎｖｅｒｓｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９２）；５７，  ２３−５７．
２６．ＭａｃＥｗａｎ，  Ｓ．  Ｒ．，  Ｃｈｉｌｋｏｔｉ，  Ａ．，  Ｅｌａｓｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｕｎａｂｌｅ  ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２０１０）；９４，  ６０−７７．
２７．ＭｃＤａｎｉｅｌ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｍａｃｋａｙ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｑｕｉｒｏｚ，  Ｆ．  Ｇ．，  Ｃｈｉｌｋｏｔｉ，  Ａ．，  Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｌｌｏｗｓ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅａｍｌｅｓｓ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｇｅｎｅｓ  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  （２０１０）；１１，  ９４４−９５２．
２８．Ｒｏｃｋ，  Ｋ．  Ｌ．，  Ｆｌｅｉｓｃｈａｃｋｅｒ，  Ｃ．，  Ｇａｍｂｌｅ，  Ｓ．，  Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｆ  ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｕｓｉｎｇ  ｂｅｔａ  ２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｓ  ａｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９９３）；１５０，  １２４４−１２５２．
２９．Ｚｈａｏ，  Ｐ．，  Ｄｏｎｇ，  Ｓ．，  Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ，  Ｊ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｍ．，  ｉＴＥＰ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄｉｓｐｌａｙｓ  ａｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｔｏ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｔｕｍｏｒｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  （２０１４）．
３０．Ｌｅｅ，  Ｃ．，  Ｌｅｖｉｎ，  Ａ．，  Ｂｒａｎｔｏｎ，  Ｄ．，  Ｃｏｐｐｅｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ：  ａ  ｆｉｖｅ−ｍｉｎｕｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｉｎ  ｆｏｒ  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌｓ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９８７）；１６６，  ３０８−３１２．
３１．Ｆｒｅｙ，  Ａ．，  Ｄｉ  Ｃａｎｚｉｏ，  Ｊ．，  Ｚｕｒａｋｏｗｓｋｉ，  Ｄ．，  Ａ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ｔｉｔｅｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９９８）；２２１，  ３５−４１．
３２．Ｓｈｅｎ，  Ｚ．，  Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，  Ｇ．，  Ｄｒａｎｏｆｆ，  Ｇ．，  Ｒｏｃｋ，  Ｋ．  Ｌ．，  Ｃｌｏｎｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｎ  ｂｏｔｈ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９９７）；１５８，  ２７２３−２７３０．
３３．Ｋａｒｔｔｕｎｅｎ，  Ｊ．，  Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｓ．，  Ｓｈａｓｔｒｉ，  Ｎ．，  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｒｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｌａｃＺ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （１９９２）；８９，  ６０２０−６０２４．
３４．Ｂｅｒｎａｒｄ，  Ａ．，  Ｃｏｉｔｏｔ，  Ｓ．，  Ｂｒｅｍｏｎｔ，  Ａ．，  Ｂｅｒｎａｒｄ，  Ｇ．，  Ｔ  ａｎｄ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ：  ａ  ｄａｎｃｅ  ｏｆ  ｌｉｆｅ  ａｎｄ  ｄｅａｔｈ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  （２００５）；７９，  Ｓ８−Ｓ１１．
３５．Ｐａｒｋｅｒ，  Ｄ．  Ｃ．，  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９９３）；１１，  ３３１−３６０．
３６．Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｋ．，  ｉｎ  Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０１２）．
３７．ＶａｎＲｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ，  Ｍ．  Ｈ．，  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，  Ｍ．  Ｈ．  ＶａｎＲｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ，  Ｅｄ．  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９２），  ｐｐ．  １−２８．
３８．Ｍ．，  Ｓ．，  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ：  ｓｏｍｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｐｅｃｔｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９６９）；１６６．
３９．Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｋ．，  ｉｎ  Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．  （Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０１２），  ｐｐ．  ８８８．
４０．Ｌｉｕ，  Ｗ．，  Ｐｅｎｇ，  Ｚ．，  Ｌｉｕ，  Ｚ．，  Ｌｕ，  Ｙ．，  Ｄｉｎｇ，  Ｊ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｙ．  Ｈ．，  Ｈｉｇｈ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｉｎ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  Ｍ２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｖａｃｃｉｎｅ  （２００４）；２３，  ３６６−３７１．
４１．Ｋｏｖａｃｓ−Ｎｏｌａｎ，  Ｊ．，  Ｍｉｎｅ，  Ｙ．，  Ｔａｎｄｅｍ  ｃｏｐｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ＶＰ８  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｃａｎ  ｉｎｄｕｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｉｃｅ  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ  （２００６）；１７６０，  １８８４−１８９３．
４２．Ｐａｒｔｉｄｏｓ，  Ｃ．，  Ｓｔａｎｌｅｙ，  Ｃ．，  Ｓｔｅｗａｒｄ，  Ｍ．，  Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｃｏｐｉｅｓ  ｏｆ  Ｔ  ａｎｄ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９９２）；２２，  ２６７５−２６８０．  
４３．Ｏｎｄａ，  Ｍ．，  Ｂｅｅｒｓ，  Ｒ．，  Ｘｉａｎｇ，  Ｌ．，  Ｎａｇａｔａ，  Ｓ．，  Ｗａｎｇ，  Ｑ．  Ｃ．，  Ｐａｓｔａｎ，  Ｉ．，  Ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｗｉｔｈ  ｇｒｅａｔｌｙ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  （２００８）；１０５，  １１３１１−１１３１６．
４４．Ｏｎｄａ，  Ｍ．，  Ｎａｇａｔａ，  Ｓ．，  ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｂｅｅｒｓ，  Ｒ．，  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｒ．  Ｊ．，  Ｖｉｎｃｅｎｔ，  Ｊ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ  （ＰＥ３８）  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｍａｋｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍｄ．  ：  １９５０）  （２００６）；１７７，  ８８２２−８８３４．
４５．ＭａｃＥｗａｎ，  Ｓ．  Ｒ．，  Ｃｈｉｌｋｏｔｉ，  Ａ．，  Ｅｌａｓｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ：  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｕｎａｂｌｅ  ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  （２０１０）；９４，  ６０−７７．
４６．Ｓｍｅｊｋａｌ，  Ｇ．  Ｂ．，  Ｔｈｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｃｈｒｏｎｉｃｌｅｓ：  ｐａｓｔ，  ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｅｘｐｅｒｔ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  （２００４）；１，  ３８１−３８７．
４７．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｔ．  Ｅ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  （Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９３）．
４８．Ｕｒｒｙ，  Ｄ．  Ｗ．，  Ｌｕａｎ，  Ｃ．  Ｈ．，  Ｐａｒｋｅｒ，  Ｔ．  Ｍ．，  Ｇｏｗｄａ，  Ｄ．  Ｃ．，  Ｐｒａｓａｄ，  Ｋ．  Ｕ．，  Ｒｅｉｄ，  Ｍ．  Ｃ．，  Ｓａｆａｖｙ，  Ａ．，  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｖｅｒｓｅ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  Ｍｅａｎ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ  Ｊ．  Ａｍ．  ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  （１９９１）；１１３，  ３．
４９．Ｍｅｙｅｒ，  Ｄ．  Ｅ．，  Ｃｈｉｌｋｏｔｉ，  Ａ．，  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｈａｉｎ  ｌｅｎｇｔｈ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｅｌａｓｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  （２００４）；５，  ８４６−８５１．
５０．Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，  Ｒ．，  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ，  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｍＡｂｓ  （２０１１）；３，  ５０３−５０４．
５１．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，  Ａ．  Ｓ．，  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ：  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｔｈｅ  ＡＡＰＳ  ｊｏｕｒｎａｌ  （２００６）；８，  Ｅ５０１−５０７．
５２．Ｚｈｏｕ，  Ｌ．，  Ｈｏｏｆｒｉｎｇ，  Ｓ．，  Ｗｕ，  Ｙ．，  Ｖｕ，  Ｔ．，  Ｍａ，  Ｐ．，  Ｓｗａｎｓｏｎ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ｂｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｅｖｅｌ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａｎ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｔｈｅ  ＡＡＰＳ  ｊｏｕｒｎａｌ  （２０１３）；１５，  ３０−４０．
５３．Ｋｏｎｔｏｓ，  Ｓ．，  Ｈｕｂｂｅｌｌ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：  ｌｏｎｇｅｒ−ｌｉｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ  （２０１２）；４１，  ２６８６−２６９５．
５４．Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ，  Ａ．  Ｓ．，  Ｓｃｏｔｔ，  Ｄ．  Ｗ．，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （２００７）；２８，  ４８２−４９０．
５５．Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  （２０１３）．
５６．Ｓｈａｎｋａｒ，  Ｇ．，  Ｓｈｏｒｅｓ，  Ｅ．，  Ｗａｇｎｅｒ，  Ｃ．，  Ｍｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ，  Ａ．，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （２００６）；２４，  ２７４−２８０．
５７．Ｂａｃｈｍａｎｎ，  Ｍ．  Ｆ．，  Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ，  Ｒ．  Ｍ．，  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｂ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９９７）；１５，  ２３５−２７０．
５８．Ｆｅｌｄｍａｎｎ，  Ｍ．，  Ｂａｓｔｅｎ，  Ａ．，  Ｔｈｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｔｈｅ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  Ｆｏｒ  Ｔｈｙｍｕｓ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （１９７１）；１３４，  １０３−１１９．
５９．Ｕｒｒｙ，  Ｄ．  Ｗ．，  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｆｒｅｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｉｎ  Ａｓ  Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ  ｂｙ  Ｅｌａｓｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂ  （１９９７）；１０１，  １１００７−１１０２８．
６０．Ｃｈｉｌｋｏｔｉ，  Ａ．，  Ｄｒｅｈｅｒ，  Ｍ．  Ｒ．，  Ｍｅｙｅｒ，  Ｄ．  Ｅ．，  Ｒａｕｃｈｅｒ，  Ｄ．，  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｂｙ  ｔｈｅｒｍａｌｌｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  （２００２）；５４，  ６１３−６３０．
６１．Ｌｉｕ，  Ｊ．，  Ｂａｕｅｒ，  Ｈ．，  Ｃａｌｌａｈａｎ，  Ｊ．，  Ｋｏｐｅｃｋｏｖａ，  Ｐ．，  Ｐａｎ，  Ｈ．，  Ｋｏｐｅｃｅｋ，  Ｊ．，  Ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ａ  ｌａｒｇｅ  ａｒｒａｙ  ｏｆ  ＨＰＭＡ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ：  Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  （２０１０）；１４３，  ７１−７９．
６２．ＭａｃＫａｙ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｍ．，  ＭｃＤａｎｉｅｌ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｌｉｕ，  Ｗ．，  Ｓｉｍｎｉｃｋ，  Ａ．  Ｊ．，  Ｃｈｉｌｋｏｔｉ，  Ａ．，  Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｔｈａｔ  ａｂｏｌｉｓｈ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ａｆｔｅｒ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ  （２００９）；８，  ９９３−９９９．
６３．Ｓｈｉ，  Ｐ．，  Ａｌｕｒｉ，  Ｓ．，  Ｌｉｎ，  Ｙ．  Ａ．，  Ｓｈａｈ，  Ｍ．，  Ｅｄｍａｎ，  Ｍ．，  Ｄｈａｎｄｈｕｋｉａ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｌａｓｔｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｄｒｕｇ  ａｔ  ｂｏｔｈ  ｃｏｒｏｎａ  ａｎｄ  ｃｏｒｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  （２０１３）；１７１，  ３３０−３３８．
６４．Ｂｉｄｗｅｌｌ，  Ｇ．  Ｌ．，  ３ｒｄ，  Ｐｅｒｋｉｎｓ，  Ｅ．，  Ｈｕｇｈｅｓ，  Ｊ．，  Ｋｈａｎ，  Ｍ．，  Ｊａｍｅｓ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｒａｕｃｈｅｒ，  Ｄ．，  Ｔｈｅｒｍａｌｌｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｃ−Ｍｙｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｄｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｇｌｉｏｍａ  ｍｏｄｅｌ  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  （２０１３）；８，  ｅ５５１０４．
６５．Ｋａｓｐａｒ，  Ａ．  Ａ．，  Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｆｕｔｕｒｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｔｏｄａｙ  （２０１３）；１８，  ８０７−８１７．
６６．Ｌｅ，  Ｄ．  Ｈ．，  Ｈａｎａｍｕｒａ，  Ｒ．，  Ｐｈａｍ，  Ｄ．  Ｈ．，  Ｋａｔｏ，  Ｍ．，  Ｔｉｒｒｅｌｌ，  Ｄ．  Ａ．，  Ｏｋｕｂｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｅｌａｓｔｉｎ−ｍｉｍｅｔｉｃ  ｄｏｕｂｌｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  （２０１３）；１４，  １０２８−１０３４．
６７．Ｂｅｎｉｔｅｚ，  Ｐ．  Ｌ．，  Ｓｗｅｅｔ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｆｉｎｋ，  Ｈ．，  Ｃｈｅｎｎａｚｈｉ，  Ｋ．  Ｐ．，  Ｎａｉｒ，  Ｓ．  Ｖ．，  Ｅｎｅｊｄｅｒ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ，  ｅｌａｓｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｎａｔｉｖｅ−ｌｉｋｅ  ｍｅｃｈａｎｉｃｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  （２０１３）；２，  １１４−１１８．
６８．Ｇａｒｃｉａ−Ａｒｅｖａｌｏ，  Ｃ．，  Ｂｅｒｍｅｊｏ−Ｍａｒｔｉｎ，  Ｊ．  Ｆ．，  Ｒｉｃｏ，  Ｌ．，  Ｉｇｌｅｓｉａｓ，  Ｖ．，  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｌ．，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｃａｂｅｌｌｏ，  Ｊ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｅｌａｓｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｍｅｒｓ：  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  （２０１３）；１０，  ５８６−５９７．
【図１】
2018521977.tif 000015
【図２】
2018521977.tif 000016
【図３−１】
2018521977.tif 000017
【図３−２】
2018521977.tif 000018
【図３−３】
2018521977.tif 000019
【図４−１】
2018521977.tif 000020
【図４−２】
2018521977.tif 000021
【図４−３】
2018521977.tif 000022
【図５−１】
2018521977.tif 000023
【図５−２】
2018521977.tif 000024
【図６−１】
2018521977.tif 000025
【図６−２】
2018521977.tif 000026
【図７】
2018521977.tif 000027
【図８−１】
2018521977.tif 000028
【図８−２】
2018521977.tif 000029
【図９】
2018521977.tif 000030
【図１０−１】
2018521977.tif 000031
【図１０−２】
2018521977.tif 000032
【図１０−３】
2018521977.tif 000033
【図１１−１】
2018521977.tif 000034
【図１１−２】
2018521977.tif 000035
【図１２−１】
2018521977.tif 000036
【図１２−２】
2018521977.tif 000037
【図１３−１】
2018521977.tif 000038
【図１３−２】
2018521977.tif 000039
【図１４】
2018521977.tif 000040
【図１５】
2018521977.tif 000041
【図１６−１】
2018521977.tif 000042
【図１６−２】
2018521977.tif 000043
【図１７Ａ】
2018521977.tif 000044
【図１７Ｂ】
2018521977.tif 000045
【図１８−１】
2018521977.tif 000046
【図１８−２】
2018521977.tif 000047
【図１９−１】
2018521977.tif 000048
【図１９−２】
2018521977.tif 000049
【図１９−３】
2018521977.tif 000050
【図２０】
2018521977.tif 000051
【図２１】
2018521977.tif 000052
【図２２−１】
2018521977.tif 000053
【図２２−２】
2018521977.tif 000054
【図２３】
2018521977.tif 000055
【図２４−１】
2018521977.tif 000056
【図２４−２】
2018521977.tif 000057
【図２５】
2018521977.tif 000058
【図２６】
2018521977.tif 000059
【図２７】
2018521977.tif 000060
【図２８】
2018521977.tif 000061
【配列表】
2018521977000001.app
【国際調査報告】
2018521977.tif 000062
2018521977.tif 000063
2018521977.tif 000064
2018521977.tif 000065
2018521977.tif 000066