(57)【要約】  目的の遺伝子（ＧＯＩ）およびＧＯＩに作動可能に連結されていない自己複製配列（ＡＲＳ）を含むエピソームプラスミドであって、ＡＲＳが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、もしくは配列番号６〜１１のいずれかとして同定されるヌクレオチド配列、またはそれらに対する少なくとも６０％の配列同一性を特徴とする上記配列のいずれかの機能的に活性な変異体を含むか、またはそれからなるエピソームプラスミド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の遺伝子（ＧＯＩ）およびＧＯＩに作動可能に連結されていない自己複製配列（ＡＲＳ）を含むエピソームプラスミドであって、ＡＲＳが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、もしくは配列番号６〜１１のいずれかとして同定されるヌクレオチド配列、またはそれらに対する少なくとも６０％の配列同一性を特徴とする前記配列のいずれかの機能的に活性な変異体を含むか、またはそれからなる、エピソームプラスミド。
【請求項２】
選択マーカーおよび任意選択で１つまたは複数の調節配列をさらに含む、請求項１に記載のエピソームプラスミド。
【請求項３】
前記ＧＯＩおよび前記ＧＯＩを発現するのに必要とされる調節配列を含む発現カセットを含む、請求項１または２に記載のエピソームプラスミド。
【請求項４】
前記ＧＯＩに作動可能に連結されるプロモーターを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のエピソームプラスミド。
【請求項５】
前記プロモーターが、調節可能または構成的なプロモーター、好ましくは、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＡＯＤ、ＡＯＸ２、ＤＡＳ１、ＤＡＳ２、ＥＮＯ１、ＦＬＤ１、ＦＭＤ、ＧＰＭ１、ＨＳＰ８２、ＩＣＬ１、ＩＬＶ５、ＫＡＲ２、ＫＥＸ２、ＰＥＴ９、ＰＥＸ８、ＰＧＫ１、ＰＨＯ８９／ＮＳＰ、ＳＳＡ４、ＴＥＦ１、ＴＨＩ１１、ＴＰＩ１、ＹＰＴ１、ＧＴＨ１、ＧＣＷ１４およびＧＵＴ１からなる群から選択されるプロモーターであり、前記プロモーターが、好ましくはピキア・パストリスのプロモーターであるか、または少なくとも６０％の配列同一性を特徴とし、またＰ．パストリス株におけるプロモーターとして機能的である前記プロモーターのいずれかの機能性変異体である、請求項４に記載のエピソームプラスミド。
【請求項６】
前記プロモーターが、配列番号４、もしくは配列番号５のいずれかのヌクレオチド配列、またはそれらに対する少なくとも６０％の配列同一性を特徴とする機能性変異体を含む、請求項４または５に記載のエピソームプラスミド。
【請求項７】
栄養要求性または化学的耐性に基づく選択マーカーを含み、好ましくは選択マーカーが、グリセロール利用、ショ糖利用、イヌリン利用、セロビオース利用、アミノ酸栄養要求性、チミジン栄養要求性、窒素供給源利用、フルオルアセトアミドに対する耐性、デオキシグルコースに対する耐性、ゼオシンまたは他の抗生物質に対する耐性、毒素をコードする遺伝子に対する耐性に基づく、請求項１〜６のいずれか一項に記載のエピソームプラスミド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のエピソームプラスミドを含む真核宿主細胞。
【請求項９】
前記宿主細胞が、酵母細胞であり、好ましくはピキア属の酵母細胞、好ましくはピキア・パストリス株の酵母細胞であり、これらは、野生型株であるか、または細胞培養液中で培養が可能な任意の突然変異株である、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
少なくとも２０世代中の前記エピソームプラスミドの含量に関してゲノム安定性であることを特徴とする、細胞培養液中の、請求項８または９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
ＧＯＩによってコードされる目的のタンパク質（ＰＯＩ）を産生する方法であって、前記ＧＯＩを発現させるための条件下で、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することによってなされる、方法。
【請求項１２】
前記ＰＯＩの発現が、機能性ＡＲＳを含有しない前記ＧＯＩを発現する比較可能な発現カセットのゲノム組込みを用いる前記ＰＯＩの発現と比較して、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも５倍または少なくとも１０倍増加する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記エピソームプラスミドの形質転換効率が、機能性ＡＲＳを含有しない前記ＧＯＩを発現する比較可能な発現カセットのゲノム組込みを用いる形質転換と比較して、少なくとも２０倍または少なくとも５０倍、好ましくは少なくとも１００倍、少なくとも２００倍または少なくとも３００倍、より好ましくは少なくとも５００倍増加する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のエピソームプラスミドのライブラリーであって、宿主細胞培養液中に、任意選択で同時発現されるプロモーター変異体のレパートリーおよび／またはＧＯＩ変異体のレパートリーを含む、ライブラリー。
【請求項１５】
ＧＯＩ発現の所望の収率に応じた宿主細胞を選択する方法であって、
ｉｖ．請求項１４に記載のエピソームプラスミドのライブラリーを含む複数の宿主細胞を接触させること、ここで前記ライブラリーは、プロモーター変異体のレパートリーを含み、前記ＧＯＩの前記発現レベルは、前記プロモーター変異体の関数である；
ｉｖ．前記複数の個々の宿主細胞における発現レベルを決定すること；および
ｖ．前記ＧＯＩの所望の発現レベルを特徴とする宿主細胞を選択すること
を含む方法。
【請求項１６】
選択した宿主細胞を培養すること、および前記ＧＯＩによってコードされるＰＯＩを産生することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
プロモーター変異体のレパートリー由来のプロモーター変異体をスクリーニングして、プロモーターを選択する方法であって、
ｖ．請求項１４に記載のエピソームプラスミドのライブラリーを含む複数の宿主細胞を接触させること、ここで前記ライブラリーは、プロモーター変異体のレパートリーおよびレポータータンパク質を含み、前記レポータータンパク質の発現レベル、形質転換効率またはクローン一様性のいずれかが、前記プロモーター変異体の関数である；
ｖｉ．前記複数の個々の宿主細胞における発現レベル、形質転換効率またはクローン一様性のいずれかにおける変化を決定すること；
ｖｉｉ．所望の発現レベル、形質転換効率またはクローン一様性を特徴とする宿主細胞を選択すること；および
ｖｉｉｉ．選択した宿主細胞由来のプロモーター変異体を同定すること
を含む方法。
【請求項１８】
ＧＯＩ変異体のレパートリーによってコードされるＰＯＩの変異体をスクリーニングする方法であって、
ｖ．請求項１４に記載のエピソームプラスミドのライブラリーを含む複数の宿主細胞を接触させること、ここで前記ライブラリーは、ＧＯＩ変異体のレパートリーを含み、ＧＯＩ発現レベル、形質転換効率またはクローン一様性のいずれかが、ＧＯＩ変異体の関数である；
ｖｉ．前記複数の個々の宿主細胞における発現レベル、形質転換効率またはクローン一様性のいずれかにおける変化を決定すること；
ｖｉｉ．所望の発現レベル、形質転換効率またはクローン一様性を特徴とする宿主細胞を選択すること；および
ｖｉｉｉ．選択した宿主細胞由来のＧＯＩ変異体を同定すること
を含む方法。
【請求項１９】
ピキア・パストリスのＫＵ７０欠失株である宿主細胞におけるエピソームプラスミドの生合成の方法であって、
ｉ．５’および３’末端にある組換え部位、ＡＲＳ、および任意選択でさらなる調節配列を含む直鎖状ベクターバックボーンを供給すること；
ｉｉ．ＧＯＩならびに前記組換え部位に対して相同的である５’および３’相同配列を含むベクター挿入片を供給すること；
ｉｉｉ．前記直鎖状ベクターバックボーンおよび前記挿入片を、前記宿主細胞へ導入して、相同組換えによって、前記ベクター挿入片を前記組換え部位と組み換えて、それにより前記ＧＯＩを含むエピソームプラスミドを産生すること
を含む方法。
【請求項２０】
前記直鎖状ベクターバックボーンおよび前記挿入片が、１：１〜１：１０のモル比で前記宿主細胞へ導入される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＡＲＳが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、または配列番号６〜１１のいずれかとして同定されるヌクレオチド配列、またはそれらに対する少なくとも６０％の配列同一性を特徴とする前記配列のいずれかの機能的に活性な変異体を含むか、またはそれからなる、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ベクターバックボーンが、栄養要求性または化学的耐性に基づく選択マーカーをさらに含み、好ましくは選択マーカーが、グリセロール利用、ショ糖利用、イヌリン利用、セロビオース利用、アミノ酸栄養要求性、チミジン栄養要求性、窒素供給源利用、フルオルアセトアミドに対する耐性、デオキシグルコースに対する耐性、ゼオシンまたは他の抗生物質に対する耐性、毒素をコードする遺伝子に対する耐性に基づく、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
５’および３’相同配列がそれぞれ、３０、５０、７０、１００、３００個の塩基対の少なくともいずれか１つを含むか、またはそれからなる、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のエピソームプラスミドを産生するための請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項２５】
請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法によって得られるエピソームプラスミド。
【請求項２６】
請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法を使用して、エピソームプラスミドのライブラリーを産生する方法であって、ライブラリーが、前記ＧＯＩの既定領域における少なくとも１つの点突然変異において異なるプラスミド変異体のレパートリーを含む、方法。
【請求項２７】
前記変異体が、前記ベクター挿入片の突然変異誘発によって産生される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２６または２７に記載の方法によって得られるエピソームプラスミドのライブラリーであって、１０Ｅ２、１０Ｅ３、１０Ｅ４、１０Ｅ５または１０Ｅ６種の異なる変異体の少なくともいずれかの多様性を特徴とする、ライブラリー。
【請求項２９】
少なくとも１０Ｅ６種の形質転換細胞、好ましくは少なくとも１０Ｅ７、１０Ｅ８または１０Ｅ９種の形質転換体へ組み込まれる、請求項２８に記載のライブラリー。
【請求項３０】
前記形質転換細胞が、ピキア属、好ましくはＰ．パストリス、またはＰ．パストリスのＫＵ７０欠失株の形質転換細胞である、請求項２９に記載のライブラリー。
【請求項３１】
前記ＧＯＩが、抗体、抗体断片、またはその抗原結合配列をコードしている、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載のライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的の遺伝子および自己複製配列（ＡＲＳ）を含み、任意選択でプロモーターおよび選択マーカーをさらに含むエピソームプラスミドベクター、ならびに目的のタンパク質および／またはタンパク質、プロモーターの発現ならびに代謝経路操作のために前記プラスミドベクターを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体触媒、およびさらにはバイオ医薬品などの多くの産業上意義のあるタンパク質は、異種遺伝子発現によって産生される。酵母ピキア・パストリス（Pichia pastoris）は、高い細胞密度のバイオリアクター培養、高い分泌能力および強力なプロモーターに関するその実現可能性に起因して、異種タンパク質産生のための最も一般的に使用される微生物宿主系の１つとして現れた（Ａｈｍａｄら  ２０１４年；Ｇａｓｓｅｒら  ２０１３年）。最近の分類学研究により、一般的に名付けられるピキア・パストリスは、例えば、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）および最も一般的に使用されるコマガタエラ・ファフィイ（Komagataella phaffii）株ＮＲＬＬ  Ｙ−１１４３０、ＣＢＳ７４３５、ＢＧ１０ならびに例えばＢＧ１１、およびＧＳ１１５、Ｘ３３およびＫＭ７１などのそれらの突然変異体などの多種多様な種を含むという結論に至る。最も一般的には、アルコールオキシダーゼ１遺伝子のメタノール誘導性プロモーター（ＰＡＯＸ１）は、異種遺伝子の発現を駆動するのに使用される（ＶｏｇｌおよびＧｌｉｅｄｅｒ、２０１３年）。ＰＡＯＸ１は、グルコースおよびグリセロールなどの炭素供給源上で堅固に抑制されており、メタノールによって、およそ１０００倍誘導される。この堅固な調節が、細胞生長を異種タンパク質産生から分離することを可能にする：最初に、Ｐ．パストリス（P. pastoris）は通常、グリセロール上で培養されて、高い細胞密度を獲得し、続いてメタノールで誘導されて、目的の遺伝子（ＧＯＩ）の遺伝子の発現を開始させる。それにより、有害または有毒なタンパク質でさえ、産生され得る。しかしながら、メタノールは、有毒であり、可燃性であり、特に大規模なバイオリアクターにおけるその使用を望ましくないものにさせる。
【０００３】
最近、カタラーゼ１遺伝子のプロモーター（ＰＣＡＴ１）は、別個の調節プロファイルを提供することが示された。ＰＣＡＴ１は、グルコースまたはグリセロール上で堅固に抑制されるＰＡＯＸ１に類似しているが、メタノール誘導を必要としない。培地中の炭素供給源がひとたび使い尽くされると、発現が始まり（「抑制解除」（Ｈａｒｔｎｅｒら  ２００８年））、小規模培養においてメタノール誘導性ＰＡＯＸ１の時空間収率のおよそ３０〜４０％に達する（ＧＯＩに応じて）。このカタラーゼ遺伝子はまた、ペルオキシソームカタラーゼｃｔａ１の遺伝子とも記載された。ＰＣＡＴ１はまた、メタノールおよびオレイン酸で誘導させることができ、ＰＡＯＸ１と類似した発現レベルに達する。抑制解除期は、合成ＰＡＯＸ１変異体を用いて実証されるように、バイオリアクター中でグリセロールまたはグルコースの限定量を供給することによって維持することができるため、抑制解除された調節プロファイルは、メタノールを含まない産生を可能にする（Ｈａｒｔｎｅｒら  ２００８年）。欧州特許第２８６２９３３Ａ２号は、双方向性発現カセットのライブラリーを開示しており、ペルオキシソームカタラーゼ遺伝子ＣＡＴ１のプロモーター配列に関する配列を含むピキア・パストリスの幾つかのプロモーター配列について記載した。
【０００４】
発現カセットは通常、メチロトローフ酵母のゲノムへ組み込まれて、非選択条件下でさえ安定な株をもたらす。例えば、Ｙｕｒｉｍｏｔｏら（Ｙｕｒｉｍｏｔｏら  ２００１年）は、Ｃ．ボイジニイ（C. boidinii）においてｕｒａ３遺伝子座で組み込まれるＡＯＤ１遺伝子のプロモーターの制御下でのＤ−アミノ酸オキシダーゼ発現について記載している。エピソームプラスミドは、非選択条件下での成長時に損失される。酵母において、自己複製配列（ＡＲＳ）は、エピソームプラスミドの安定な維持に必要である。酵母複製起点の構造および位置が研究され（Ｃｈｅｎら  １９９６年、Ｐｅｎｇ  Ｃｈｏｎｇら  ２０１５年）、様々なＡＲＳ配列が同定された（Ｌｉａｃｈｋｏら  ２０１４年Ａ、Ｌｉａｃｈｋｏら  ２０１４年Ｂ、Ｓｏｈｎら  １９９６年）。エピソームプラスミドは、低い安定性および低い発現割合に起因して、Ｐ．パストリスおよび他のメチロトローフ酵母において異種タンパク質発現にはほとんど使用されていない。エピソーム発現の数少ない用途が近年報告されており、これらの構築物は、検出可能な量のタンパク質を発現することが可能である。例えば、Ｌｅｅら（Ｌｅｅら  ２００１年）は、ＡＲＳを含むエピソームベクター、即ち、ＰＡＲＳ１、および目的の遺伝子を駆動するプロモーターｐＧＡＰおよび選択マーカーについて報告している。ベクターは、目的の遺伝子の突然変異体のライブラリーをスクリーニングするのにＰ．パストリスで使用される。しかしながら、形質転換細胞において安定に維持されて、高いタンパク質収率を可能にする高い形質転換効率を有するエピソームプラスミドベクターは、依然として必要とされる。さらに、低いクローン変動を伴う非常に再現性の高い生成物収率をもたらす信頼性の高い発現は、変異体ライブラリーのスクリーニングを含む操作戦略のための望ましい特色である。さらに、かかるエピソームプラスミドは、クローニングを容易にするために、また高い形質転換割合を得るために小さくすべきである。
【０００５】
さらに、ライブラリーは、形質転換前に発現ベクターへクローニングされる必要があり、効率的なクローニング方法は、確実に多様性が損失されないように使用される必要があるため、ピキア・パストリスにおいて通常適用される形質転換方法、即ち、ゲノムへの組込み用の直鎖状ＤＮＡによる、またはエピソーム複製用のスーパーコイル環状ＡＲＳプラスミドによる形質転換は概して、ライブラリーのスクリーニングにあまり適していない。
【０００６】
同時形質転換される断片のｉｎ  ｖｉｖｏでの組換え、即ち、相同組換えクローニング（ＨＲクローニング）を使用して、細胞内に最終的な発現ベクターを構築することができる。Ｐ．パストリスにおけるプラスミドの安定性およびｉｎ  ｖｉｖｏでの相同組換えは、非効率的であったため、この方法は、最近までピキア・パストリスでは使用されなかった。ＡＲＳプラスミドが、クローニングに関して酵母の組換え機構を利用する代替的な戦略を提供することが最近報告された。ＨＲクローニングは、ピキア・パストリスにおいてｐａｎＡＲＳベースのエピソームベクター（Ｃａｍａｔｔａｒｉら  ２０１６年）および非効率的な相同組換え由来の高いバックグラウンドを回避するためのスプリットマーカー遺伝子を用いることによって成功することが示された。この方法およびベクターにより、ＤＮＡ断片のクローニングが可能となるが、分子設計における効率および柔軟性は非常に制限される。
【０００７】
対比して、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組換えによるクローニング用の効率的な宿主として公知であり、ＨＲクローニングは、目的の遺伝子を発現ベクターへクローニングするために（Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇら  １９９７年）、また同様に、複数のＰＣＲ産物由来のベクター全体の複数の断片またはアセンブリーのクローニングのために（ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎら  ２０１５年、Ｊｏｓｋａら  ２０１４年）、サッカロミセス属（Saccharomyces）で使用されている。その高い効率および簡素な用途に起因して、それはまた、ライブラリーの創出（Ｖｉｎａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚら  ２０１６年）またはキメラＤＮＡの創出（Ａｒｅｎｈａｒｔら  ２０１６年）に使用されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前例にない技術的特徴を有する自己複製配列（ＡＲＳ）が同定された。驚くべきことに、同定されたＡＲＳが、推定上のプロモーター配列として検査されるＤＮＡ要素の一部として見出された。前記ＡＲＳ、プロモーターに作動可能に連結される目的の遺伝子および選択マーカーを含むエピソームプラスミドベクターは、前記目的の遺伝子、プロモーターおよび選択マーカーを含む直鎖状発現カセットと比較して、より効率的に形質転換された。選択条件下で使用される場合、本明細書に記載するプラスミドベクターは、ゲノム組込みと比較して、数倍増加した発現をもたらした。さらに、形質転換割合が増加し、形質転換体は、より一様な発現を示し、用いたＡＲＳは、転写ターミネーターとしてさらなる機能性を示した。驚くべきことに、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）由来の異種配列は、任意のこれまで公知の内因性ＡＲＳよりも良好な最良の技術的特徴を示した。本明細書に記載するプラスミドベクターは、タンパク質発現の方法において、ならびにタンパク質またはプロモーター操作および発見に必要とされる大きなライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。
【０００９】
非常に効率的なライブラリー生成が、ＣｂＡＲＳベースのベクターバックボーン単独を用いる場合に観察されるかなりのバックグラウンドを伴わずに、ＫＵ７０ピキア・パストリス欠失株およびある特定のモル比（挿入片：ベクターバックボーン）を有する比較的大量のＤＮＡと組み合わせて、効率的なＣｂＡＲＳベースのベクターバックボーン（即ち、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）のＡＲＳ配列を含むベクターバックボーン）を使用する、ピキア・パストリスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの相同組換えによって達成することができることは、驚きであった。驚くべきことに、スプリット選択マーカーは、分子設計における最大限の柔軟性を有するライブラリー構築用のかかる非常に効率的なアプローチに必要ではなく、ベクターバックボーンの任意の領域において相同組換え部位を設計することを可能にした。
【００１０】
具体的には、本発明は、目的の遺伝子（ＧＯＩ）およびＧＯＩに作動可能に連結されていない自己複製配列（ＡＲＳ）を含むエピソームプラスミドであって、ＡＲＳが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、もしくは配列番号６〜１１のいずれかとして同定されるヌクレオチド配列、またはそれらに対する少なくとも６０％の配列同一性、具体的には７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性の少なくともいずれかを特徴とする前記のいずれかの機能的に活性な変異体を含むか、またはそれからなるエピソームプラスミドを提供する。エピソームプラスミドはまた、特許請求されるか、または本明細書中でさらに記載されるような構造的特徴によって規定され、宿主細胞において、例えばピキア属（Pichia）においてエピソームとして複製可能であるというその機能を特徴とするプラスミドとも称される。
【００１１】
具体的には、ＡＲＳは、ＧＯＩと天然には関連していない。
具体的には、ＡＲＳおよび／またはＧＯＩは、プラスミドに対して異種であるヌクレオチド配列である。具体的には、ＡＲＳおよびＧＯＩはともに、異種配列、より具体的には異なる供給源、株または種由来の異種配列である。
【００１２】
特定態様によれば、ＡＲＳおよび／またはＧＯＩはまた、宿主細胞に異種であり、それは、宿主細胞においてエピソームプラスミドを合成するように、またはエピソームプラスミドを宿主細胞へ導入するように操作されており、あるいはそれは、エピソームプラスミドを含み、ＧＯＩを発現するか、またはそうでなければＧＯＩを表示する宿主細胞培養液中で培養される。
【００１３】
配列番号３として同定されるヌクレオチド配列からなるＡＲＳは、配列番号２の機能的に活性な断片である。したがって、配列番号２の機能性変異体はまた、配列番号３を少なくとも含んでいる配列番号２の断片を含むであろう。
【００１４】
配列番号６〜１１のいずれかとして同定されるヌクレオチド配列からなるＡＲＳは、配列番号５の例示的な機能的に活性な変異体である。配列番号５に対する特定の配列同一性を特徴とするさらなる機能的に活性な変異体が、実現可能である。
【００１５】
具体的には、エピソームプラスミドは、選択マーカーおよび任意選択で１つまたは複数の調節配列をさらに含む。具体的には、ＧＯＩの発現を示すか、または調節する選択マーカーが使用される。ＧＯＩを発現するのに適した調節配列が、特に好ましい。
【００１６】
具体的な調節配列は、ＧＯＩの転写の終結を付与する。具体的には、ＡＲＳは、ＧＯＩの転写の終結を付与する。
具体的には、エピソームプラスミドは、ＡＲＳ配列、ＡＲＳとは別々のプロモーター配列、および転写ターミネーター配列を含み、それらは、７００塩基対未満にわたって、好ましくは５００塩基対未満にわたって、より好ましくは３００塩基対未満にわたって重複して配列される。
【００１７】
具体的には、エピソームプラスミドは、ＧＯＩおよび前記ＧＯＩを発現するのに必要とされる調節配列を含む発現カセットを含む。
具体的には、エピソームプラスミドは、ＧＯＩに作動可能に連結されるプロモーターを含む。具体的には、プロモーターは、ＡＲＳに隣接しておらず、および／またはＡＲＳとは別々の発現カセットにある。
【００１８】
具体的には、プロモーターは、調節可能または構成的なプロモーター、好ましくはＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＡＯＤ、ＡＯＸ２、ＤＡＳ１、ＤＡＳ２、ＥＮＯ１、ＦＬＤ１、ＦＭＤ、ＧＰＭ１、ＨＳＰ８２、ＩＣＬ１、ＩＬＶ５、ＫＡＲ２、ＫＥＸ２、ＰＥＴ９、ＰＥＸ８、ＰＧＫ１、ＰＨＯ８９／ＮＳＰ、ＳＳＡ４、ＴＥＦ１、ＴＨＩ１１、ＴＰＩ１、ＹＰＴ１、ＧＴＨ１、ＧＣＷ１４およびＧＵＴ１からなる群から選択されるプロモーターであり、プロモーターが、酵母のプロモーター、特にピキア・パストリス株のプロモーターであるか、または少なくとも６０％の配列同一性、具体的には７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性を特徴とし、Ｐ．パストリス株におけるプロモーターとして機能的である前記プロモーターのいずれかの機能性変異体である。具体的には、プロモーターは、別の酵母または種において天然に存在するＰ．パストリスプロモーターの類似体、または完全合成プロモーターである。
【００１９】
具体的には、配列番号６からなるＡＲＳ、ならびにＣＡＴ１、ＡＯＸ、ヒストンプロモーター、ＧＡＰおよびＤＡＳプロモーターからなる群から選択されるプロモーター、ならびに異種ＧＯＩを含む。
【００２０】
具体的には、プロモーターは、炭素供給源調節可能プロモーター、好ましくはグルコース欠乏時に抑制解除されるか、または炭素供給源などの誘導因子を細胞培養液に供給する際に誘導可能なプロモーターである。具体的には、プロモーターは、オレイン酸で誘導可能である。
【００２１】
具体的には、プロモーターは、ＣＡＴ１またはＡＯＤプロモーターである。
具体的には、プロモーターは、配列番号４、もしくは配列番号５のいずれかのヌクレオチド配列、配列番号４、もしくは配列番号５のいずれかの少なくとも６０％の配列同一性、具体的には、７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性の少なくともいずれかを特徴とする機能性変異体を含む。
【００２２】
具体的には、エピソームプラスミドは、栄養要求性または化学的耐性に基づく選択マーカーを含み、ここで、好ましくは、選択マーカーは、グリセロール利用、ショ糖利用、イヌリン利用、セロビオース利用、アミノ酸栄養要求性、チミジン栄養要求性、窒素供給源利用、フルオルアセトアミドに対する耐性、デオキシグルコースに対する耐性、ゼオシンまたは他の抗生物質に対する耐性、毒素をコードする遺伝子に対する耐性に基づく。選択マーカーは、例えば、ＧＯＩを含む宿主細胞またはプラスミドを選択するために、選択圧力下で、または選択条件下で、本明細書に記載するエピソームプラスミドを含む宿主細胞を培養することを提供する。
【００２３】
具体的には、選択マーカーは、ゼオシン、ジェネティシンまたはグリセロール利用に対する耐性を付与する。
特定態様によれば、本明細書に記載するエピソームプラスミドを含む真核宿主細胞が提供される。
【００２４】
具体的には、宿主細胞は、酵母細胞であり、好ましくはピキア属（Pichia）の酵母細胞、好ましくはピキア・パストリスの酵母細胞であり、これらは、野生型株であるか、または細胞培養液中で培養が可能な任意の突然変異株である。具体的には、突然変異株は、Ｐ．パストリスのｋｕ７０欠失株であり、ここで、ｋｕ７０遺伝子（配列番号８７、図３３で同定される）または類似したｋｕ７０遺伝子は、不活性化または阻害される。具体的には、ｋｕ７０遺伝子発現が欠乏している突然変異Ｐ．パストリス株は、本明細書に記載するようなエピソームプラスミドおよびエピソームプラスミドのライブラリーの生合成ならびに産生にとって好ましい。
【００２５】
具体的には、宿主細胞は、細胞培養中で供給され、ここで宿主細胞は、少なくとも２０世代中のエピソームプラスミドの含量に関してゲノム安定性であることを特徴とする。したがって、特定態様によれば、本明細書に記載する宿主細胞の細胞培養液は、バッチ培養、流加培養または連続培養に適切に使用される発酵槽および装置において供給される。
【００２６】
さらなる態様によれば、本発明は、ＧＯＩによってコードされる目的のタンパク質（ＰＯＩ）を産生する方法であって、前記ＧＯＩを発現させるための条件下で、本明細書に記載する宿主細胞を培養することによってなされる、方法を提供する。具体的には、宿主細胞は、選択条件下で培養される。具体的には、細胞培養液において、タンパク質発現は、炭素供給源および／またはその供給速度によって調節可能である。
【００２７】
具体的には、ＰＯＩの発現は、本明細書に記載するエピソームプラスミド中に含まれるような、機能性ＡＲＳを含有しない前記ＧＯＩを発現する比較可能な発現カセットのゲノム組込みを用いるＰＯＩの発現と比較して、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも５倍または少なくとも１０倍増加する。
【００２８】
具体的には、エピソームプラスミドの形質転換効率は、本明細書に記載するエピソームプラスミド中に含まれるような、機能性ＡＲＳを含有しない前記ＧＯＩを発現する比較可能な発現カセットのゲノム組込みを用いる形質転換と比較して、少なくとも２０倍または少なくとも５０倍、好ましくは少なくとも１００倍、少なくとも２００倍または少なくとも３００倍、より好ましくは少なくとも５００倍増加する。
【００２９】
さらなる態様によれば、本発明は、本明細書に記載するエピソームプラスミドのライブラリーであって、宿主細胞培養液中に、任意選択で同時発現されるプロモーター変異体のレパートリーおよび／またはＧＯＩ変異体のレパートリーを含む、ライブラリーを提供する。
【００３０】
具体的には、プロモーターライブラリーは、所望の、または改善された特性を有する親プロモーター配列の変異体を発見するのに使用され得る。
具体的には、ＧＯＩライブラリーは、所望の、または改善された特性を有するタンパク質もしくはポリペプチドの遺伝子変異体または親ＧＯＩ配列コード変異体を発見するのに使用され得る。
【００３１】
ライブラリーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのライブラリーとして、またはエピソームプラスミドのレパートリーを含む（ｅｘ  ｖｉｖｏでの）宿主細胞のライブラリーとして提供されてもよく、それらの宿主細胞は、任意の真核生物または原核生物種であり得る。
【００３２】
さらなる態様によれば、本発明は、ＧＯＩ発現の所望の収率に応じた宿主細胞を選択する方法であって、
ｉ．本明細書に記載するエピソームプラスミドのライブラリーを含む複数の宿主細胞を接触させること、ここでライブラリーは、プロモーター変異体のレパートリーを含み、前記ＧＯＩの発現レベルが、前記プロモーター変異体の関数である；
ｉｉ．前記複数の個々の宿主細胞における発現レベルを決定すること；および
ｉｉｉ．前記ＧＯＩの所望の発現レベルを特徴とする宿主細胞を選択すること
を含む方法を提供する。
【００３３】
具体的には、本方法は、選択した宿主細胞を培養すること、および前記ＧＯＩによってコードされるＰＯＩを産生することをさらに含む。
さらなる態様によれば、本発明は、プロモーター変異体のレパートリー由来のプロモーター変異体をスクリーニングして、プロモーターを選択する方法であって、
ｉ．本明細書に記載するエピソームプラスミドのライブラリーを含む複数の宿主細胞を接触させること、ここでライブラリーは、プロモーター変異体のレパートリーおよびレポータータンパク質を含み、前記レポータータンパク質の発現レベル、形質転換効率またはクローン一様性のいずれかが、前記プロモーター変異体の関数である；
ｉｉ．前記複数の個々の宿主細胞における発現レベル、形質転換効率またはクローン一様性のいずれかにおける変化を決定すること；
ｉｉｉ．所望の発現レベル、形質転換効率またはクローン一様性を特徴とする宿主細胞を選択すること；および
ｉｖ．選択した宿主細胞由来のプロモーター変異体を同定すること
を含む方法を提供する。
【００３４】
さらなる態様によれば、本発明は、ＧＯＩ変異体のレパートリーによってコードされるＰＯＩの変異体をスクリーニングする方法であって、
ｉ．本明細書に記載するエピソームプラスミドのライブラリーを含む複数の宿主細胞を接触させること、ここでライブラリーは、ＧＯＩ変異体のレパートリーを含み、ＧＯＩ発現レベル、形質転換効率またはクローン一様性のいずれかが、ＧＯＩ変異体の関数である；
ｉｉ．前記複数の個々の宿主細胞における発現レベル、形質転換効率またはクローン一様性のいずれかにおける変化を決定すること；
ｉｉｉ．所望の発現レベル、形質転換効率またはクローン一様性を特徴とする宿主細胞を選択すること；および
ｉｖ．選択した宿主細胞由来のＧＯＩ変異体を同定すること
を含む方法を提供する。
【００３５】
さらなる態様によれば、本発明は、ピキア・パストリスのＫＵ７０欠失株である宿主細胞におけるエピソームプラスミドの生合成の方法であって、
ｉ．５’および３’末端にある組換え部位、ＡＲＳ、および任意選択でさらなる調節配列を含む直鎖状ベクターバックボーンを供給すること；
ｉｉ．ＧＯＩならびに前記組換え部位に相同的である５’および３’相同配列を含むベクター挿入片を供給すること；
ｉｉｉ．前記直鎖状ベクターバックボーンおよび前記挿入片を、前記宿主細胞へ導入して、相同組換えによって、前記ベクター挿入片を前記組換え部位で組み換えて、それにより前記ＧＯＩを含むエピソームプラスミドを産生すること
を含む方法を提供する。
【００３６】
具体的には、前記直鎖状ベクターバックボーンおよび前記挿入片は、１：１〜１：１０のモル比で前記宿主細胞へ導入される。
具体的には、ＡＲＳは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、または配列番号６〜１１のいずれかとして同定されるヌクレオチド配列、またはそれらに対する少なくとも６０％の配列同一性を特徴とする上記配列のいずれかの機能的に活性な変異体を含むか、またはそれからなる。
【００３７】
具体的には、ベクターバックボーンは、栄養要求性または化学的耐性に基づく選択マーカーを含み、好ましくは選択マーカーが、グリセロール利用、ショ糖利用、イヌリン利用、セロビオース利用、アミノ酸栄養要求性、チミジン栄養要求性、窒素供給源利用、フルオルアセトアミドに対する耐性、デオキシグルコースに対する耐性、ゼオシンまたは他の抗生物質に対する耐性、毒素をコードする遺伝子に対する耐性に基づく。
【００３８】
具体的には、５’および３’相同配列はそれぞれ、３０、５０、７０、１００、３００個の塩基対の少なくともいずれか１つを含むか、またはそれからなる。
具体的には、５’および３’相同配列は、ＧＯＩに隣接しているか、またはＧＯＩの５’および３’に近接している。
【００３９】
具体的には、５’および３’相同配列は、挿入片の両方の末端に位置するか、または挿入片コア配列（これは、５’および３’相同配列を伴わない）の５’および３’末端に融合される。
【００４０】
さらなる態様によれば、本発明は、本明細書に記載するエピソームプラスミドを産生するための本明細書に記載する生合成方法の使用を提供する。
さらなる態様によれば、本発明は、本明細書に記載する生合成方法のいずれか１つによって得られるエピソームプラスミドを提供する。
【００４１】
さらなる態様によれば、本発明は、本明細書に記載する生合成方法を使用して、エピソームプラスミドのライブラリーを産生する方法であって、ライブラリーが、ＧＯＩの既定領域における少なくとも１つの点突然変異において異なるプラスミド変異体のレパートリーを含む方法を提供する。既定領域は通常、適切な突然変異誘発方法によって変動する領域（突然変異誘発の領域とも称される）である。
【００４２】
具体的には、変異体は、ベクター挿入片の突然変異誘発、特に突然変異誘発の領域の特定の突然変異誘発によって産生される。
さらなる態様によれば、本発明は、本明細書に記載する方法によって得られるエピソームプラスミドのライブラリーであって、１０Ｅ２、１０Ｅ３、１０Ｅ４、１０Ｅ５または１０Ｅ６種の異なる変異体の少なくともいずれかの多様性を有することを特徴とする、ライブラリーを提供する。ある特定の実施形態では、さらに高い多様性、例えば、１０Ｅ７、１０Ｅ８、１０Ｅ９、１０Ｅ１０または１０Ｅ１１種の異なる変異体の少なくともいずれかを産生することができる。
【００４３】
具体的には、ライブラリーは、少なくとも１０Ｅ６種の形質転換細胞、好ましくは少なくとも１０Ｅ７、１０Ｅ８または１０Ｅ９種の形質転換体へ組み込まれる。ある特定の実施形態では、例えばエピソームプラスミド変異体のレパートリーを網羅するように、さらに多数の形質転換体を産生することができる。
【００４４】
具体的には、形質転換細胞は、ピキア（Pichia）属の形質転換細胞、好ましくはＰ．パストリス、またはＰ．パストリスのＫＵ７０欠失株の形質転換細胞である。
特定態様によれば、ＧＯＩは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＶＨおよび／またはＶＬ、単一ＣＤＲ配列または一組のＣＤＲ配列、例えば３つのＣＤＲ配列などの抗体、抗体断片またはその抗原結合配列をコードしている。具体的には、例えば結合のエピトープ特異性または親和性の少なくとも１つが異なる抗原結合分子のレパートリーを産生するように、ＧＯＩ変異体は、１つまたは複数の可変領域または抗原結合配列の突然変異誘発によって産生される。あるいは、ＧＯＩ変異体は、例えば抗原結合分子の安定性またはＦｃ機能を改善するように、１つもしくは複数の定常またはフレームワーク配列の突然変異誘発によって産生される。
【００４５】
具体的には、それぞれが抗体またはその抗原結合配列をコードするＧＯＩ変異体のレパートリーを特徴とする抗体ライブラリーが提供される。
具体的には、ライブラリーは、それぞれが抗体またはその抗原結合配列を表すＰＯＩ変異体のレパートリーを発現している。ライブラリーは、例えば適切な宿主細胞培養液中で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの発現系によって適切に発現される。発現時に、ＰＯＩ変異体は、所望の結合または他の特色を有するＰＯＩ変異体を選択するのにスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ】ＣＡＴ１遺伝子の上流領域は、調節または発現強度に影響を及ぼさないＡＴリッチなＡＲＳを含有する。（Ａ）Ｐ．パストリスＣＡＴ１遺伝子のゲノム遺伝子座が、ＣＢＳ７４３５株のシーケンシングに基づく遺伝子アノテーションをともに示される（Ｋｕｂｅｒｌら  ２０１１年）。Ｌｉａｃｈｋｏらによるハイスループットディープシーケンシング（Ｌｉａｃｈｋｏら  ２０１４年）によって同定されるＡＲＳを示す。ＡＴ含有量は、ＢｉｔＧｅｎｅ（ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ：ｂｉｔｇｅｎｅ．ｃｏｍ／ｃｇｉ／ｇｅｎｅ＿ａｎａｌｙｓｉｓ．ｃｇｉ）を使用して、５０ｂｐのスライディングウィンドウを用いて算出した。この研究で使用されるプロモーター配列（ＰＣＡＴ１−１０００、ＰＣＡＴ１−６９２およびＰＣＡＴ１−５００）およびＰＣＡＴ１の推定上のＡＲＳ（ｐｕｔＡＲＳ−ＰＣＡＴ１、ＡＴ含有量に基づいて選択される）が示される。
【図１Ｂ】ＣＡＴ１遺伝子の上流領域は、調節または発現強度に影響を及ぼさないＡＴリッチなＡＲＳを含有する。（Ｂ）示されるプロモーター長は、ｅＧＦＰレポーター遺伝子の上流でクローニングされて、安定なゲノムＰ．パストリス形質転換体は、振とうフラスコ中で培養された。レポータータンパク質蛍光、ＯＤ６００およびグルコース濃度は、示した時点で測定した。生物学的三重反復の平均値および標準偏差を示す。培養は、４８時間後にメタノールで誘導された。０時間時に、フラスコにＯＤ６０００．０５になるように接種して、指数増殖期に達したら、まず測定を実施した。ｘ軸は、１〜１４時間に分割される。
【図２Ａ】ＰＣＡＴ１のＡＲＳは、バックグラウンド成長を引き起こして、非選択条件下で不安定であることを示す。（Ａ）ＰＣＡＴ１の示した長さを含有する環状または線状化プラスミドによるＰ．パストリス細胞の形質転換後の寒天プレートの写真。空のベクター対照は、ＰＣＡＴ１を含有しない未修飾ｐＰｐＴ４＿Ｓベクター（Ｎａａｔｓａａｒｉら  ２０１２年）である。環状プラスミドは、より高い形質転換割合を示し、したがって１０ｎｇのみが形質転換されて、形質転換反応全体を平板培養した。直鎖状プラスミドに関しては、１μｇを形質転換して、形質転換反応の５分の１を平板培養した。
【図２Ｂ】ＰＣＡＴ１のＡＲＳは、バックグラウンド成長を引き起こして、非選択条件下で不安定であることを示す。（Ｂ）液体培養液由来の選択（ＹＰＤ＋Ｚｅｏ）および非選択（ＹＰＤ）培地上での成長を決定することによるプラスミド安定性の評価。示したプラスミドおよびコロニーサイズの形質転換体の４つのコロニー（Ｔ１〜Ｔ４）を、選択（ＹＰＤ＋Ｚｅｏ）および非選択（ＹＰＤ）条件下で６０時間、液体培養液中に接種して、続いて選択および非選択寒天プレート上にスタンプした。（１：１０００希釈）。ゼオシン選択を検査するための野生型株である空のｐＰｐＴ４＿Ｓベクターは、安定なゲノム組込みに関する対照として含まれる。
【図２Ｃ】ＰＣＡＴ１のＡＲＳは、バックグラウンド成長を引き起こして、非選択条件下で不安定であることを示す。（Ｃ）選択および非選択条件下での単一コロニー分離形質転換体の安定性。ＰＣＡＴ１−６９２（代表的なＡＲＳ含有プラスミドとして）およびＰＣＡＴ１−５００（ＡＲＳを含まない対照）の４つの形質転換体（Ｔ１〜Ｔ４）からの単一コロニーを、選択（ＹＰＤ＋ゼオシン）および非選択（ＹＰＤ）条件で再度画線培養した。続いて単一コロニーを選択培地上に隣接して画線培養して、成長によるプラスミド損失をモニタリングした（２８℃で４８時間のインキュベーション後の写真）。ＰＣＡＴ１−６９２の場合には、線状化ベクター（大きなおよび小さなコロニー）および環状プラスミドの形質転換体を使用した。
【図３Ａ】ＰＣＡＴ１のＡＲＳを含有するエピソーム複製プラスミドは、ゲノム組込みと比較して、選択圧力下で発現の増加を示す。示したプラスミドおよびコロニーサイズのレポータータンパク質蛍光は、選択マーカー（Ａ）ゼオシン相補性を用いて測定した。株は、選択（ＹＰＤ＋Ｚｅｏ／Ｇｅｎ；ＢＭＧ（緩衝最小グリセロール））および非選択（ＹＰＤ、ＢＭＤ（緩衝最小デキストロース））培地中で６０時間成長させた（図２Ｂも参照）。空のベクター対照は、ゼオシンに関してはｐＰｐＴ４＿Ｓ、ジェネティシンに関してはｐＰｐＫａｎ＿Ｓ、そしてグリセロールに関しては、栄養要求性ｐＰｐＧＵＴ１であった（Ｎａａｔｓａａｒｉら  ２０１２年）。同様に、ＧＵＴ１相補性選択に関しては、栄養要求性親株が含まれた。７つの異なる形質転換体の平均値および標準偏差を示す。ジェネティシン選択の場合、任意の成長差は、コロニー間でほとんど顕著ではなく（図Ｓ３における写真を参照）、したがって、示した大きなおよび小さなコロニーは、単なる推定である。高い標準偏差に起因して、ジェネティシン上のＰＣＡＴ１−６９２の推定上の大きなコロニーに関して、同様に、各単一の形質転換体の蛍光値を入口として示す。
【図３Ｂ】ＰＣＡＴ１のＡＲＳを含有するエピソーム複製プラスミドは、ゲノム組込みと比較して、選択圧力下で発現の増加を示す。示したプラスミドおよびコロニーサイズのレポータータンパク質蛍光は、選択マーカー（Ｂ）ジェネティシン相補性を用いて測定した。株は、選択（ＹＰＤ＋Ｚｅｏ／Ｇｅｎ；ＢＭＧ（緩衝最小グリセロール））および非選択（ＹＰＤ、ＢＭＤ（緩衝最小デキストロース））培地中で６０時間成長させた（図２Ｂも参照）。空のベクター対照は、ゼオシンに関してはｐＰｐＴ４＿Ｓ、ジェネティシンに関してはｐＰｐＫａｎ＿Ｓ、そしてグリセロールに関しては、栄養要求性ｐＰｐＧＵＴ１であった（Ｎａａｔｓａａｒｉら  ２０１２年）。同様に、ＧＵＴ１相補性選択に関しては、栄養要求性親株が含まれた。７つの異なる形質転換体の平均値および標準偏差を示す。ジェネティシン選択の場合、任意の成長差は、コロニー間でほとんど顕著ではなく（図Ｓ３における写真を参照）、したがって、示した大きなおよび小さなコロニーは、単なる推定である。高い標準偏差に起因して、ジェネティシン上のＰＣＡＴ１−６９２の推定上の大きなコロニーに関して、同様に、各単一の形質転換体の蛍光値を入口として示す。
【図３Ｃ】ＰＣＡＴ１のＡＲＳを含有するエピソーム複製プラスミドは、ゲノム組込みと比較して、選択圧力下で発現の増加を示す。示したプラスミドおよびコロニーサイズのレポータータンパク質蛍光は、選択マーカー（Ｃ）ＧＵＴ１相補性を用いて測定した。株は、選択（ＹＰＤ＋Ｚｅｏ／Ｇｅｎ；ＢＭＧ（緩衝最小グリセロール））および非選択（ＹＰＤ、ＢＭＤ（緩衝最小デキストロース））培地中で６０時間成長させた（図２Ｂも参照）。空のベクター対照は、ゼオシンに関してはｐＰｐＴ４＿Ｓ、ジェネティシンに関してはｐＰｐＫａｎ＿Ｓ、そしてグリセロールに関しては、栄養要求性ｐＰｐＧＵＴ１であった（Ｎａａｔｓａａｒｉら  ２０１２年）。同様に、ＧＵＴ１相補性選択に関しては、栄養要求性親株が含まれた。７つの異なる形質転換体の平均値および標準偏差を示す。ジェネティシン選択の場合、任意の成長差は、コロニー間でほとんど顕著ではなく（図Ｓ３における写真を参照）、したがって、示した大きなおよび小さなコロニーは、単なる推定である。高い標準偏差に起因して、ジェネティシン上のＰＣＡＴ１−６９２の推定上の大きなコロニーに関して、同様に、各単一の形質転換体の蛍光値を入口として示す。
【図４Ａ】ＣＡＴ１−６９２プロモーターおよびその内因性ＡＲＳの組合せは、生体触媒ＭｅＨＮＬおよびＬｕＨＮＬに関して、４．９倍高い収率をもたらし、形質転換体は、最大３．５倍のより一様な発現を示す。ＭｅＨＮＬ（Ａ、Ｂ）およびＬｕＨＮＬ（Ｃ、Ｄ）は、ＰＣＡＴ１−６９２（Ａ、Ｃ）を保有する環状プラスミドまたはＰＣＡＴ１−５００（Ｂ、Ｄ）を保有する線状化プラスミドから発現された。ＭｅＨＮＬおよびＬｕＨＮＬ活性は、選択条件（グリセロール）下で６０時間の成長後に測定した。ＬｕＨＮＬ培養には、フォールディングに必要とされる硫酸亜鉛を補充した。４２個の形質転換体を、グリセロール上の９６ウェルディープウェルプレートにおける６０時間の成長後に構築物について比較した。構築物についての全ての形質転換体の平均値（ＭＶ）および標準偏差（ＳＤ）を各パネルの左側に示す。ＳＤはまた、ＭＶのパーセントとして提供される。
【図４Ｂ】ＣＡＴ１−６９２プロモーターおよびその内因性ＡＲＳの組合せは、生体触媒ＭｅＨＮＬおよびＬｕＨＮＬに関して、４．９倍高い収率をもたらし、形質転換体は、最大３．５倍のより一様な発現を示す。ＭｅＨＮＬ（Ａ、Ｂ）およびＬｕＨＮＬ（Ｃ、Ｄ）は、ＰＣＡＴ１−６９２（Ａ、Ｃ）を保有する環状プラスミドまたはＰＣＡＴ１−５００（Ｂ、Ｄ）を保有する線状化プラスミドから発現された。ＭｅＨＮＬおよびＬｕＨＮＬ活性は、選択条件（グリセロール）下で６０時間の成長後に測定した。ＬｕＨＮＬ培養には、フォールディングに必要とされる硫酸亜鉛を補充した。４２個の形質転換体を、グリセロール上の９６ウェルディープウェルプレートにおける６０時間の成長後に構築物について比較した。構築物についての全ての形質転換体の平均値（ＭＶ）および標準偏差（ＳＤ）を各パネルの左側に示す。ＳＤはまた、ＭＶのパーセントとして提供される。
【図４Ｃ】ＣＡＴ１−６９２プロモーターおよびその内因性ＡＲＳの組合せは、生体触媒ＭｅＨＮＬおよびＬｕＨＮＬに関して、４．９倍高い収率をもたらし、形質転換体は、最大３．５倍のより一様な発現を示す。ＭｅＨＮＬ（Ａ、Ｂ）およびＬｕＨＮＬ（Ｃ、Ｄ）は、ＰＣＡＴ１−６９２（Ａ、Ｃ）を保有する環状プラスミドまたはＰＣＡＴ１−５００（Ｂ、Ｄ）を保有する線状化プラスミドから発現された。ＭｅＨＮＬおよびＬｕＨＮＬ活性は、選択条件（グリセロール）下で６０時間の成長後に測定した。ＬｕＨＮＬ培養には、フォールディングに必要とされる硫酸亜鉛を補充した。４２個の形質転換体を、グリセロール上の９６ウェルディープウェルプレートにおける６０時間の成長後に構築物について比較した。構築物についての全ての形質転換体の平均値（ＭＶ）および標準偏差（ＳＤ）を各パネルの左側に示す。ＳＤはまた、ＭＶのパーセントとして提供される。
【図４Ｄ】ＣＡＴ１−６９２プロモーターおよびその内因性ＡＲＳの組合せは、生体触媒ＭｅＨＮＬおよびＬｕＨＮＬに関して、４．９倍高い収率をもたらし、形質転換体は、最大３．５倍のより一様な発現を示す。ＭｅＨＮＬ（Ａ、Ｂ）およびＬｕＨＮＬ（Ｃ、Ｄ）は、ＰＣＡＴ１−６９２（Ａ、Ｃ）を保有する環状プラスミドまたはＰＣＡＴ１−５００（Ｂ、Ｄ）を保有する線状化プラスミドから発現された。ＭｅＨＮＬおよびＬｕＨＮＬ活性は、選択条件（グリセロール）下で６０時間の成長後に測定した。ＬｕＨＮＬ培養には、フォールディングに必要とされる硫酸亜鉛を補充した。４２個の形質転換体を、グリセロール上の９６ウェルディープウェルプレートにおける６０時間の成長後に構築物について比較した。構築物についての全ての形質転換体の平均値（ＭＶ）および標準偏差（ＳＤ）を各パネルの左側に示す。ＳＤはまた、ＭＶのパーセントとして提供される。
【図５】Ｐ．パストリスにおけるＰＣＡＴ１−６９２エピソームプラスミドベクターは、ゲノム組込みを標的とする直鎖状カセットよりもおよそ１０８倍高い形質転換効率を示す。環状ＡＲＳプラスミドＰＣＡＴ１−６９２１０ｎｇおよびＰＣＡＴ１−５００プラスミド（ゲノム組込みを標的とするために線状化）１μｇを形質転換した。形質転換効率は、ＤＮＡ１μｇ当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）として算出した。ＡＲＳプラスミドおよびゲノム組込みに関する四重反復の平均値および標準偏差を算出した（ＭｅＨＮＬおよびＬｕＨＮＬ構築物の形質転換の単一値を同様に示す）。
【図６Ａ】プラスミド損失の影響は、グリセロールストックから接種した場合に、さらに一層深刻である。（Ａ）９６ウェルグリセロールストックからの接種を用いて、図２Ｂに示すのと同じ実験を繰り返した。図２Ｂおよび図３Ａで示すＹＰＤ培養の９６ウェルマイクロタイタープレートにおけるグリセロールストックを使用して、選択（ＹＰＤ＋Ｚｅｏ）および非選択（ＹＰＤ）培地を接種した。したがって、示したプラスミドおよびコロニーサイズの図２Ｂに示すのと同じ形質転換体（Ｔ１〜Ｔ４）を使用した。６０時間の培養後、培養を１：１０００に希釈して、選択および非選択寒天プレート上にスタンプした。ゼオシン選択を検査するための野生型株である空のｐＰｐＴ４＿Ｓベクターは、安定なゲノム組込みに関する対照として含まれる。
【図６Ｂ】プラスミド損失の影響は、グリセロールストックから接種した場合に、さらに一層深刻である。（Ｂ）グリセロールストックから接種されるのを除いて、同一の図３ＡのパネルＡに記載する培養の蛍光測定。
【図７Ａ】ゼオシン選択を用いて検査したＰＣＡＴ１−６９２を保有する環状プラスミドおよびＰＣＡＴ１−５００を保有する線状化プラスミドからのＭｅＨＮＬ発現は、ＧＵＴ１選択を用いた場合に得られるのと類似した結果（図４を参照）を示す。ＡＲＳを用いた場合の活性の平均値は、ゲノム組込みよりも約３．９倍高い。プラスミドがゼオシン耐性遺伝子を含有し、培養をＹＰＤ−Ｚｅｏ完全培地中で実施したことを除いて、図４と同じ実験。
【図７Ｂ】ゼオシン選択を用いて検査したＰＣＡＴ１−６９２を保有する環状プラスミドおよびＰＣＡＴ１−５００を保有する線状化プラスミドからのＭｅＨＮＬ発現は、ＧＵＴ１選択を用いた場合に得られるのと類似した結果（図４を参照）を示す。ＡＲＳを用いた場合の活性の平均値は、ゲノム組込みよりも約３．９倍高い。プラスミドがゼオシン耐性遺伝子を含有し、培養をＹＰＤ−Ｚｅｏ完全培地中で実施したことを除いて、図４と同じ実験。
【図８】線状化ＰＣＡＴ１−５００プラスミドのＤＮＡ量をおよそ１０００ｎｇに低減させることにより、ＭｅＨＮＬ（Ａ）およびＬｕＨＮＬ（Ｂ）活性に関して景観の一様性を改善した（図４Ｂ、図４Ｄと比較）。ほんの１０００ｎｇに等しい量のｐＰｐＴ４Ｓベクター（Ｎａａｔｓａａｒｉら  ２０１２年）が形質転換されたことを除いて、図４と同じ実験。景観の一様性は、ＭｅＨＮＬに関しては標準偏差８８％（図４Ｂ）から５７％（Ａ）へ、ＬｕＨＮＬに関しては６９％（図４Ｄ）から７６％（Ｂ）へ変化する。さらに、形質転換するＤＮＡ量を低減させることは、形質転換体の数の低減を費やして一様性の改善をもたらすことができる。
【図９】ＰＣＡＴ１−６９２の配列（配列番号１）。
【図１０】ｐｕｔＡＲＳ−ＰＣＡＴの配列（配列番号２）。
【図１１】ＰＣＡＴ５００−６９２の配列（配列番号３）。
【図１２】ＡＲＳ配列を伴わないＣＡＴ１−５００プロモーターの配列（配列番号４）。
【図１３】ＣｂＡＯＤ１プロモーターＡＲＳの配列（配列番号５）。
【図１４】ＡＯＤ−Ｆ１の配列（配列番号６）。
【図１５】ＡＯＤ−Ｆ２の配列（配列番号７）。
【図１６】ＡＯＤ−Ｆ３の配列（配列番号８）。
【図１７】ＡＯＤ−Ｆ４の配列（配列番号９）。
【図１８】ＡＯＤ−Ｆ５の配列（配列番号１０）。
【図１９】ＡＯＤ−Ｆ６の配列（配列番号１１）。
【図２０】ｐＣＡＴ１ｎｏＣｏｒｅの配列（配列番号１２）。
【図２１】ＳａｐＩクローニングスタッファーの配列（配列番号１３）。
【図２２】培養の６０時間後のｅＧＦＰ発現値を示す。ＡＯＤ−Ｆｕｌｌは、ＡＲＳ／ターミネーター要素およびその異なる断片に関するＦ（配列番号６〜１１）を含むＣ．ボイジニイ（C. boidinii）ＰＡＯＤ１（配列番号５）を表す。ＣＡＴ１−５００＝配列番号４、ｐＣＡＴ１−６９２＝配列番号１、ＣＡＴ１−ＡＲＳ＝配列番号３。
【図２３】最良の公知のＰ．パストリスターミネーター配列（ＴＴ）と比較して、ＡＲＳ断片の転写ターミネーター効率を示す。培養の６０＋４８時間後のｅＧＦＰ発現値。ＢＭＤにおける６０時間の培養および９６ウェルプレート実験におけるＭｅＯＨによる４８時間の誘導。Ｐ．パストリスＡＯＤ１遺伝子ＡＯＤ＿ＴＴのターミネーター（ＪＱ５１９６９０  ２３６０〜２８３５ｂｐに存在する）は、典型的なピキア属（Pichia）組込みベクターにおける選択マーカーカセットの標準的な要素であり（Ｎａａｔｓａａｒｉら  ２０１２年）、これらの実験においてベンチマークとして使用される。２つの新たなＡＲＳ配列はともに、転写ターミネーターとして機能的である。驚くべきことに、Ｃ．ボイジニイ（C. boidinii）由来の異種ＡＲＳ配列は、これまでに知られているＡＲＳ１配列として、またＰ．パストリスＡＯＤ１遺伝子の頻繁に使用されるターミネーターよりも、さらに強力な影響を示した。
【図２４】先の増幅および大腸菌（E. coli）からの単離を伴わない、Ｐ．パストリスから単離したプラスミドＤＮＡによる直接的な形質転換由来の形質転換体を示す。
【図２５Ａ】種々の配列部分（ＰＡＲＳ１を伴うＡ、Ｂ、二官能性ＡＲＳとして使用されるＣｂＡＲＳを伴うＣ＆Ｄ（ポリヌクレオチド配列番号６からなるＡＲＳを使用した）および選択マーカー用のターミネーター配列（選択圧力を伴って、および伴わずに））および自己プラスミド複製を有するエピソームプラスミドを使用した、ＰＣＡＴ１プロモーターの制御下にある個々の形質転換体のｅＧＦＰ発現を示す。図２５Ａ、ＰＡＲＳ１  ＹＰＤ；ｅＧＦＰ発現値は、６０時間の培養時間後に測定した。新たな異種ＡＲＳと対比して、Ｐ．パストリスＰＡＲＳ１は、二官能性ＡＲＳおよびＴＴ  ＤＮＡ部分として使用される場合に安定でなかった（選択圧力を伴わない場合の非常に低い発現、さらにＣｂＡＲＳと比較して、ゼオシンを用いた場合のより低い発現レベル）。
【図２５Ｂ】種々の配列部分（ＰＡＲＳ１を伴うＡ、Ｂ、二官能性ＡＲＳとして使用されるＣｂＡＲＳを伴うＣ＆Ｄ（ポリヌクレオチド配列番号６からなるＡＲＳを使用した）および選択マーカー用のターミネーター配列（選択圧力を伴って、および伴わずに））および自己プラスミド複製を有するエピソームプラスミドを使用した、ＰＣＡＴ１プロモーターの制御下にある個々の形質転換体のｅＧＦＰ発現を示す。図２５Ｂ、ＰＡＲＳ１  ＹＰＤ−Ｚｅｏ；ｅＧＦＰ発現値は、６０時間の培養時間後に測定した。新たな異種ＡＲＳと対比して、Ｐ．パストリスＰＡＲＳ１は、二官能性ＡＲＳおよびＴＴ  ＤＮＡ部分として使用される場合に安定でなかった（選択圧力を伴わない場合の非常に低い発現、さらにＣｂＡＲＳと比較して、ゼオシンを用いた場合のより低い発現レベル）。
【図２５Ｃ】種々の配列部分（ＰＡＲＳ１を伴うＡ、Ｂ、二官能性ＡＲＳとして使用されるＣｂＡＲＳを伴うＣ＆Ｄ（ポリヌクレオチド配列番号６からなるＡＲＳを使用した）および選択マーカー用のターミネーター配列（選択圧力を伴って、および伴わずに））および自己プラスミド複製を有するエピソームプラスミドを使用した、ＰＣＡＴ１プロモーターの制御下にある個々の形質転換体のｅＧＦＰ発現を示す。図２５Ｃ、ＣｂＡＲＳ  ＹＰＤ；ｅＧＦＰ発現値は、６０時間の培養時間後に測定した。新たな異種ＡＲＳと対比して、Ｐ．パストリスＰＡＲＳ１は、二官能性ＡＲＳおよびＴＴ  ＤＮＡ部分として使用される場合に安定でなかった（選択圧力を伴わない場合の非常に低い発現、さらにＣｂＡＲＳと比較して、ゼオシンを用いた場合のより低い発現レベル）。
【図２５Ｄ】種々の配列部分（ＰＡＲＳ１を伴うＡ、Ｂ、二官能性ＡＲＳとして使用されるＣｂＡＲＳを伴うＣ＆Ｄ（ポリヌクレオチド配列番号６からなるＡＲＳを使用した）および選択マーカー用のターミネーター配列（選択圧力を伴って、および伴わずに））および自己プラスミド複製を有するエピソームプラスミドを使用した、ＰＣＡＴ１プロモーターの制御下にある個々の形質転換体のｅＧＦＰ発現を示す。図２５Ｄ、ＣｂＡＲＳ−Ｚｅｏ；ｅＧＦＰ発現値は、６０時間の培養時間後に測定した。新たな異種ＡＲＳと対比して、Ｐ．パストリスＰＡＲＳ１は、二官能性ＡＲＳおよびＴＴ  ＤＮＡ部分として使用される場合に安定でなかった（選択圧力を伴わない場合の非常に低い発現、さらにＣｂＡＲＳと比較して、ゼオシンを用いた場合のより低い発現レベル）。
【図２６】２１個の個々の形質転換体のＧＡＰプロモーター駆動ｅＧＦＰ発現を示す。
【図２７】ＣＡＴ１−５００プロモーター（ＡＲＳ要素を伴わない）およびＣＡＴ１＿６９２要素（ＡＲＳ配列を伴う）を含有する線状化（脱リン酸化を伴って、および伴わずに）ならびに環状プラスミドによる、Ｋ．ファフィイ（K. phaffii）株ＢＳＹＢＧ１１（野生型として示される）およびＫＵ７０欠失変異体ＢＳＹ１１ｄＫＵ７０の形質転換効率を示す。ＫＵ７０欠失株は、ｗｔ株と比較して、より遅い成長に起因して、かなり少数の形質転換体およびより小さなコロニーを示した。
【図２８】種々の長さの重複領域を用いたＨＲクローニング。ベクターバックボーン５０ｎｇおよびモル比３：１の挿入片：ベクターを形質転換に使用し、再生した形質転換体１００μｌを選択培地上へ平板培養した。Ａ：５０ｂｐ、Ｂ：１００ｂｐ、Ｃ：２５０ｂｐ、Ｄ：５００ｂｐ。
【図２９】細胞１つ当たりの複数の挿入片の取込み。種々の量のベクターバックボーンおよび２倍多い挿入片（２５０ｂｐの重複領域を有するｅＧＦＰおよびｓＴｏｍａｔｏの１：１ミックス）を形質転換に使用し、複数の変異体の取込みに関して検査した。
【図３０】挿入片としてシグナル配列およびプロモーターを含むハーセプチンＣＤＳ（構築物１ｃ）によるＨＲクローニング形質転換効率検査。ベクターバックボーン５０ｎｇとともに種々の長さの相同領域（ＨＲ２５０＝２５０ｂｐ）およびモル比（５：１＝挿入片：ベクターバックボーンの比）を使用した。ＨＲ後の数は、重複長さを示す。
【図３１】非選択および選択培地におけるＨＲクローニングによって生成される形質転換体の培養。ＨＲ後の数は、ベクターバックボーンに対する相同領域の長さを示す。小さなおよび大きなコロニーは、培養に関して選択した。完全に構築された環状ＣｂＡＲＳベースの発現ベクターは、陽性対照として機能を果たした。１つのサイズおよび重複長につき２１個の形質転換体を検査し、総計１６８個であった。
【図３２】挿入片としてＩｇＧ軽鎖の可変領域を使用したＨＲクローニング。ベクターバックボーン１μｇおよび挿入片２μｇを、Ｐ．パストリスＢＳＹ１１ｄＫＵ７０の形質転換に使用した。３つの個々の形質転換から再生された形質転換体を、適正な希釈後に選択培地上へ平板培養して、ＣＦＵを計数して、ベクターバックボーン１μｇに対して標準化した。
【図３３−１】配列番号７２：実施例において使用するベクター配列。
【図３３−２】配列番号８５：実施例において使用するベクター配列。
【図３３−３】配列番号８５：実施例において使用するベクター配列。
【図３３−４】配列番号８６：実施例において使用するベクター配列。
【図３３−５】配列番号８６：実施例において使用するベクター配列。
【図３３−６】配列番号８７：Ｐ．パストリスのｋｕ７０遺伝子、＞ｇｉｌ３２８３５２５７６：１５９８１０１−１５９９９６３  ピキア・パストリスＣＢＳ  ７４３５  ３番染色体、完全レプリコン配列。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明は具体的には、目的の遺伝子および自己複製配列（ＡＲＳ）を含み、任意選択でプロモーターおよび選択マーカーをさらに含むエピソームプラスミドベクターに関し、ここで目的の遺伝子は、前記プロモーターの転写制御下にあり、前記ＡＲＳは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、または配列番号６〜１１のヌクレオチド配列、または上記のいずれかの機能的に活性な変異体を含む。
【００４８】
さらに、Ｐ．パストリスにおいて相同組換えを使用してエピソームプラスミドベクターを産生する方法が、本明細書に記載される。
明細書全体にわたって使用される場合の特定用語は、下記の意味を有する。
【００４９】
「目的の遺伝子（ＧＯＩ）」という用語は、本明細書中で使用する場合、任意選択で高レベルでの、例えば、宿主細胞において発現されることが望ましい目的のタンパク質（ＰＯＩ）またはその断片をコードする任意の非コードおよびコード遺伝子または部分的コード遺伝子、または非コードＲＮＡを指す。目的の遺伝子として、酵素（例えば、プロセス酵素）、生体触媒、抗体およびその断片、抗原結合ペプチド、免疫原性タンパク質、調節タンパク質、細胞シグナル伝達およびリガンド結合タンパク質、サイトカイン、ホルモン、タンパク質抗生物質、ペプチドホルモン、阻害剤ペプチド、バイオサーファクタントを含有するペプチド、構造タンパク質、血清アルブミン、ゼラチンまたはコラーゲン、ヒト増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、毒素（複数／単数）、融合タンパク質、あるいは将来性のある商業用途を有する任意の他のタンパク質またはペプチド、例えば、部分的もしくは全体的な代謝経路を触媒する酵素などの治療的、診断的または薬学的な重要性を有するものをコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。ＧＯＩの特定の例は、抗体、免疫グロブリン、またはそれらの抗原結合領域もしくは断片、特にｓｃＦｖまたはＦａｂ、ヒドロラーゼ、酸化還元酵素、イソメラーゼ、リアーゼまたはリガーゼなどの酵素をコードしている。ＧＯＩは通常、ＰＯＩをコードする非コードヌクレオチド配列または遺伝子の２０、３０、４０または５０個の連続ヌクレオチドの少なくともいずれかを含むか、またはそれらからなる。
【００５０】
特に、「遺伝子」という用語は、遺伝子のＤＮＡ断片、特に部分的な遺伝子であるものも含む。断片はまた、幾つかのオープンリーディングフレーム、同じＯＲＦまたは異なるＯＲＦの繰り返しのいずれかを含有し得る。この用語は具体的には、全体的にまたは部分的に、非コードの、例えば非転写もしくは非翻訳配列、またはコードポリペプチドであるヌクレオチド配列を含む。例示的な非コード「遺伝子」は、調節遺伝子またはプロモーター配列である。したがって、ＧＯＩ変異体の具体例は、抗体、抗体断片もしくはペプチド性／ポリペプチド性抗原結合分子などのポリペプチドまたはタンパク質をコードするプロモーター変異体および遺伝子変異体に関する。
【００５１】
ＰＯＩの具体例は、抗体またはその断片などの抗原結合分子である。特定ＰＯＩには、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、免疫グロブリン（Ｉｇ）または免疫グロブリンクラスＧ（ＩｇＧ）、重鎖抗体（ＨｃＡｂ）、または抗原結合性の断片（Ｆａｂ）、Ｆｄ、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）などのそれらの断片、または例えばＦｖ二量体（二重特異性抗体）、Ｆｖ三量体（三重特異性抗体）、Ｆｖ四量体などのそれらの操作変異体、あるいはミニボディおよびＶＨまたはＶＨＨまたはＶ−ＮＡＲのような単一ドメイン抗体などの抗体である。さらに、抗原結合分子は、例えば、操作クニッツドメイン、Ａｄｎｅｃｔｉｎ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ、ＡｎｔｉｃａｌｉｎおよびＤＡＲＰｉｎなどの（代替的な）スカフォールドタンパク質から選択される。「スカフォールド」という用語は、抗原結合分子の生成に関する出発点として機能を果たす、サイズ、構造および起源が異なる小型でかつ安定的にフォールディングされたタンパク質の多面的な群について記載する。抗体（免疫グロブリン）の構造−機能の関連性に始まって、かかる代替的なタンパク質スカフォールドは、所定の（生体）分子標的の緊密かつ特異的な認識に関して再成形され得る相互作用部位を支持する頑強な保存構造のフレームワークを提供する。
【００５２】
本明細書に記載するプラスミドおよび方法を用いて発現される目的のタンパク質は、分泌されなくてもよく、または分泌されてもよい（細胞壁に、もしくは細胞表面上に組み込まれるか、または結合されるタンパク質を含む）。ＡＲＳプラスミドから転写される非コードＲＮＡは例えば、調節特性を有し得る。特殊の目的の非コードＲＮＡは、ｓｎＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイムである。
【００５３】
本明細書に記載するタンパク質の例は、非限定的であり、真核生物において、即ち酵母において発現させることが可能な任意のタンパク質またはペプチドまたはポリペプチドは、本明細書に記載するエピソームプラスミドベクター、宿主細胞および方法を用いて発現させることができる。上述の目的のタンパク質は、任意の種（例えば、哺乳動物またはヒトタンパク質）に由来し得る。具体的には、「ＰＯＩ」という用語は、本明細書中で使用する場合、宿主細胞における、組換えポリペプチドまたは組換え技術を用いて産生されるタンパク質を指す。より具体的には、タンパク質は、宿主細胞において天然に存在しないポリペプチド、即ち異種タンパク質であってもよく、あるいは宿主細胞にとって天然、即ち宿主細胞に対して相同タンパク質であってもよいが、例えば、ＰＯＩをコードする核酸配列を含有する自己複製ベクターによる形質転換によって、またはＰＯＩをコードする核酸配列の１つまたは複数のコピーの組換え技法による宿主細胞のゲノムへの組込み時に、または例えばプロモーター配列のＰＯＩをコードする遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節配列の組換え修飾によって産生される。幾つかの場合では、ＰＯＩという用語はまた、本明細書中で使用する場合、組換え的に発現されるタンパク質によって媒介されるような宿主細胞による任意の代謝産物を指す。
【００５４】
本明細書中で使用する場合、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、交換可能に使用されて、ペプチド結合によって連結されるアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指す。アミノ酸に関する従来の１文字または３文字コードを本明細書中で使用する。ポリペプチドは、ジスルフィド結合、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、アミド化または任意の他の修飾を含み得る。「機能性タンパク質」または「機能性ポリペプチド」とは、タンパク質またはポリペプチドが、その意図される目的のために作動することを意図する。例えば、機能性酵素は、特定反応を触媒する。
【００５５】
「組換え」という用語は、本明細書中で使用する場合、「遺伝子操作によって調製されることまたは遺伝子操作の結果」を意味する。したがって、組換え微生物または宿主細胞は、少なくとも１つの「組換え核酸」を含む。組換え微生物は具体的には、発現ベクターまたはクローニングベクターを含み、あるいはそれは、組換え核酸配列を含有するように遺伝子操作されている。「組換えタンパク質」は、宿主において各々の組換え核酸を発現することによって産生される。「組換えプロモーター」は、本明細書に記載するような機能的に活性なプロモーターとしてのその使用に適した、遺伝的に操作される非コードヌクレオチド配列である。
【００５６】
本発明のプロモーターなどの核酸に関する「単離される」という用語は、本明細書中で使用する場合、「実質的に純粋な」形態で存在するように、天然において結びついている環境から十分に分離されているような化合物を指す。「単離される」は、他の化合物もしくは材料との人工または合成混合物、あるいは基礎的な活性を妨害せず、例えば不完全な精製に起因して存在し得る不純物の存在の排除を必ずしも意味しない。特に、本発明の単離核酸分子はまた、化学的に合成されるものを含むと意図される。この用語は具体的には、それが起源とされる生物の天然に存在するゲノムにおいてすぐに近接している配列から分離されるＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離プロモーター」は、プラスミドなどのベクターへ挿入されるか、または宿主生物のゲノムＤＮＡへ組み込まれるＤＮＡ分子を含んでもよい。単離プロモーターはさらに、生物学的または合成的手段によって直接産生されて、その産生中に存在する他の構成成分から分離される分子を表し得る。
【００５７】
本明細書に記載するエピソームプラスミドまたはエピソームプラスミドのライブラリーは、単離形態で供給することができ、それは、かかるエピソームプラスミドを組み込む組換え宿主をさらに操作するためのツールとして利便性よく使用されることが十分理解される。
【００５８】
「プラスミド」は、本明細書中で使用する場合、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現に関して宿主細胞を形質転換するのに使用される核酸構築物であるベクターとして定義され、ベクターは、それが形質転換する宿主細胞において、事実上見出されない。「プラスミドベクター」とも称されるプラスミドまたはベクターは具体的には、染色体ＤＮＡから特に物理的に分離される染色体外核酸として理解される。プラスミドは、適切な宿主生物における、クローニングされる組換えヌクレオチド配列の、即ち組換え遺伝子の転写およびそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列を含んでもよく、または含まなくてもよい。プラスミドベクターは通常、宿主細胞における自己複製用の起点、選択可能なマーカー、多数の制限酵素切断部位、適切なプロモーター配列および転写ターミネーターを含み、これらの構成成分は、一緒に作動可能に連結される。ＧＯＩ変異体のレパートリーを含むプラスミドのライブラリーが産生されるように、プラスミドは、同様にＧＯＩの担体および突然変異誘発によって産生されるＧＯＩの変異体として機能を果たし得る。ある特定の実施形態によれば、本明細書に記載するプラスミドは、ピキア属（Pichia）プラスミド、特にＰ．パストリス細胞培養液中でＧＯＩを複製および発現することが可能であるＰ．パストリスプラスミドである。
【００５９】
本明細書に記載するプラスミドは、天然に存在するヌクレオチド配列を含有し得るが、プラスミドは、プラスミドに対して異種（外来）であるプロモーターまたはＧＯＩなどの異種配列を含む。したがって、本明細書に記載するプラスミドは、生合成方法によって得ることが可能であるが、合成産物、即ち、天然に産生されず、人造設計である人工的に創出されるヌクレオチド配列とみなされる。
【００６０】
「エピソーム」であるプラスミドまたはベクターは、本明細書中では、宿主細胞染色体とは無関係に複製しており、また好適には数世代にわたって培養する場合に、それが宿主細胞染色体へ著しく組み込まれないように、宿主細胞の培養液中で染色体外ベクターとして維持されるエピソープ的にまたは自己的に複製するプラスミドとして理解される。エピソームプラスミドベクターを含む組換え宿主細胞は、好適には（ゲノム的に）安定であり、ここでエピソームプラスミドは、多くの世代に関して存続する。不安定である場合、エピソームプラスミドは、連続的な細胞分裂によって集団から徐々に希釈される。安定なエピソーム的に複製するプラスミドは、選択圧力によって細胞集団において（例えば、抗生物質の存在下で）維持され得る。本明細書に記載するエピソームプラスミドの使用は、染色体を組み込んでいるプラスミドの使用よりも高いトランスフェクション効率をもたらす。さらに、エピソームプラスミドは、一連の真核宿主細胞へ導入されて、染色体外構築物として複製し得る。
【００６１】
エピソームプラスミドは、宿主細胞において安定に維持され得る。安定性は、本明細書に記載し、また当該技術分野で公知の方法によって、例えば宿主細胞ゲノムを配列決定することによって、決定することができる。特に、エピソームプラスミドを含む宿主細胞のゲノム安定性は、宿主細胞培養液中で宿主細胞を培養する際に決定することができ、安定性は、例えば、培養の約１０、１５または２０世代を反映する時間後に決定される。
【００６２】
「ベクターバックボーン」という用語は、本明細書中で使用する場合、遺伝子操作手順における細胞の形質転換に使用される核酸構築物を指す。ベクターバックボーンは通常、選択可能なマーカー、制限酵素切断部位を含み、形質転換されるべき宿主細胞に特異的な特性を付与する、タンパク質分子を発現するのに必要なポリヌクレオチド配列、および／またはタンパク質発現に関する各々の制御配列、例えばプロモーター配列および転写ターミネーター配列などの調節配列を含む。人工ベクターは、制限酵素を使用して種々の供給源からＤＮＡ分子を切断すること、ポリヌクレオチドポリメラーゼ反応または人工ＤＮＡ合成を使用した個々のＤＮＡ分子の構築およびリガーゼを使用してかかるＤＮＡ分子を結合させることなどの様々な分子生物学技法によって構築され得る。ベクターバックボーンは、発現ベクターの全ての要素を含有し得るが、ＧＯＩを伴わない。
【００６３】
「挿入片」という用語は、本明細書中で使用する場合、例えば、相同組換えを通じて、ベクターバックボーンへ組み込むのに適した直鎖状核酸分子であるベクター挿入片を指す。
【００６４】
本明細書に記載するベクター挿入片は具体的には、ＧＯＩ、特にＧＯＩの変異体を産生するための突然変異誘発の遺伝子の断片または選択領域の断片を含む。さらに、挿入片は、ベクターの領域に対して相同的である挿入片の５’および３’末端にある配列（本明細書中では、５’および３’相同配列と称される）、特にベクター挿入片を組み込むのに標的とされるベクターの組換え部位を含む。５’および３’相同配列は、組換え部位に対して同一であるか、または少なくとも相同であるとみなされる配列同一性を有するＤＮＡの断片である。５’および３’相同配列は好ましくは、前記ＧＯＩに隣接しており、特に前記ＧＯＩに対してすぐ近接しているか、またはＧＯＩの上流もしくは下流に位置される。ベクター挿入片は、例えば、線状化ベクターの３’末端による挿入片の５’末端の相同組換え、および線状化ベクターの５’末端による挿入片の３’末端の相同組換えによって、環状または直鎖状ベクター要素、特に線状化ベクターへ利便性よく挿入される。組換え時に、ＧＯＩは、ベクターに挿入されて、組み込まれる。
【００６５】
幾つかの実施形態では、５’および３’相同配列は、挿入片に、特にＧＯＩの両側で（例えば、人工配列を、ＧＯＩの５’および３’末端に、またはＧＯＩ配列を伸長するヌクレオチド配列にライゲートすることによって）付加される人工配列である。幾つかの実施形態では、５’および３’相同配列は、ＧＯＩの内因性配列またはＧＯＩを含む発現カセットである。かかる実施形態では、５’および３’相同配列は、タンパク質コード配列の、または上流および下流調節要素の一部であり得る。
【００６６】
ベクター挿入片の５’および３’相同配列および／またはベクターバックボーンの組換え部位はそれぞれ、３０、５０、７０、１００、１３０、１５０、２５０、または５００個の少なくともいずれか、例えば少なくとも３０個、および利便性良く、最大１０００、５００または３００個のいずれかを含み得るか、またはそれからなり得る。
【００６７】
「レパートリー」は本明細書中で使用する場合、言及されるヌクレオチド配列の突然変異誘発によって産生される核酸の変異体である多様な分子の集団を指す。ＧＯＩのレパートリーは具体的に、親ＧＯＩの変異体の集団を含み、ここで変異体は、ＧＯＩ内で既定の位置にあるか、または無作為に配置される少なくとも１つの点突然変異において異なる。
【００６８】
幾つかの実施形態では、親ＧＯＩの変異体は、ＧＯＩのレパートリーを得るように産生されてもよく、ここで変異体はそれぞれ、ある特定の配列同一性、例えば、親ＧＯＩに対する少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％の配列同一性のいずれか１つを有する。幾つかの実施形態では、ＧＯＩのレパートリーにおける親ＧＯＩの変異体はそれぞれ、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、５０、１００個のヌクレオチドのいずれか１つにおいて、親ＧＯＩと異なる。
【００６９】
ベクター挿入片のレパートリーが産生されてもよく、ここで挿入片は、５’および３’相同領域以外であるＧＯＩを表すヌクレオチド配列において含まれる可変領域を有する。可変領域は具体的には、５’および３’相同領域を変化されないままで、可変領域内の少なくとも１つの位置（点突然変異）が異なるＧＯＩ変異体を産生するための突然変異誘発を受ける。突然変異誘発の結果として、ベクター挿入片のライブラリーが産生され、それは、それらのヌクレオチド配列、特にＧＯＩヌクレオチド配列が異なる直鎖状ヌクレオチド構築物の集団または多様性を含む。
【００７０】
「突然変異誘発」という用語は、本発明の状況で使用する場合、例えば１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換によって、非コードまたはコード領域において少なくとも１つの変化を有するそれらの変異体を得るように、ヌクレオチド配列の突然変異体を提供する方法を指す。突然変異誘発は、無作為、半無作為または部位特異的突然変異によるものであり得る。具体的なＧＯＩ変異体は、親ＧＯＩに由来し、それは、例えば宿主生物において天然に存在する野生型ＧＯＩである。突然変異誘発方法は特に、核酸を操作する方法または鋳型として親ＧＯＩ情報を使用してヌクレオチド配列をデノボで合成する方法を包含する。具体的な突然変異誘発方法は、変異体の合理的な操作を適用する。
【００７１】
具体的な突然変異誘発方法は、例えばプロモーターのヌクレオチド配列内の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多い連続したヌクレオチドを変化させるための、配列における１つまたは複数のヌクレオチドの点突然変異、特にタンデム点突然変異を提供する。かかる突然変異は通常、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、挿入および／または置換の少なくとも１つである。
【００７２】
「相同組換え」（ＨＲ）は、本明細書中で使用する場合、相同ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列（特に、ＤＮＡ鎖）が交換されて、それにより結合される遺伝子組換えのタイプを指す。
【００７３】
「組換え部位（複数可）」は、本明細書中で使用する場合、相同組換えが２つのヌクレオチド化合物間で起きるのを可能にするための、第２のヌクレオチド化合物上の配列に対して相同的または十分に相同的である第１のヌクレオチド化合物上の１つまたは複数の配列を指す。
【００７４】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載するベクターバックボーンは、２つまたは複数の相同性組換え部位（複数可）を含む。組換え部位（複数可）は、プロモーター配列、転写ターミネーター配列、選択マーカー、ＧＯＩをコードする配列またはかかる要素を結合させるベクターバックボーンの配列などの、ベクターバックボーン上に存在する配列要素の一部／それらとの重複であり得る。幾つかの実施形態では、ベクターバックボーンは、２つの組換え部位（例えば、直鎖状ベクターバックボーンの各末端上の１つの組換え部位）を含む。幾つかの実施形態では、ベクターバックボーンは、２つの組換え部位を含み、ここで２つの組換え部位は、近接配列の分割部分である。例えば、ベックボーン上のＧＯＩ配列内の近接配列は、２つの部分に分割されて、２つの部分は、直鎖状ベクターバックボーンの２つの末端（例えば、環状ベクターバックボーン上の近接配列が、前記配列内で切断されて、それにより２つの部分を生成する）に位置し、続いて、第１の部分に対する、即ち第１の組換え部位に対する相同配列は、ＧＯＩに対する５’相同（隣接）配列として付加されて、第２の部分に対する、即ち第２の組換え部位に対する相同配列は、ＧＯＩに対する３’相同（隣接）配列として付加される。かかる組換え部位を含むベクターバックボーンおよび各々の隣接配列を有するＧＯＩを含む挿入片の形質転換時に、ＧＯＩは、ＧＯＩ配列の連続した配列内に組み込まれる。幾つかの実施形態では、ベクターバックボーンは、互いに独立している２つの組換え部位を含み、例えば、第１の組換え部位は、ＧＯＩの配列が続くプロモーター配列内の配列であり、第２の組換え部位は、ＧＯＩの３’末端に続く転写終結配列内の配列である。それぞれ、第１および第２の相同部位に対して相同的である５’および３’相同（隣接）領域による、ＧＯＩの変異体を含む挿入片と一緒にかかる直鎖状ベクターバックボーン（両端で組換え部位を含む）の形質転換時に、変異体ＧＯＩは、ベクターバックボーンに挿入されて、それにより元のＧＯＩを置き換える。
【００７５】
「プロモーター」という用語は、本明細書中で使用する場合、コード配列または機能性ＲＮＡの転写を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。本発明のプロモーターは具体的には、コードＤＮＡの発現を開始させるか、調節するか、または他の場合では媒介もしくは制御する。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され、それは続いて、転写を開始させる。したがって、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによって直接結合されるか、またはＲＮＡポリメラーゼの漸増に関与されるＤＮＡ配列を含有する。プロモーターＤＮＡおよびコードＤＮＡは、同じ遺伝子由来であってもよく、または異なる遺伝子由来であってもよく、また同じか、または異なる生物に由来し得る。プロモーターは、タンパク質発現に使用する宿主細胞と同じか、または異なる種（例えば、酵母種）に由来し得る。プロモーターはまた、合成プロモーター、即ち天然に産生されず、人造設計である人工的に創出されるヌクレオチド配列であり得る。
【００７６】
プロモーターは、１つまたは複数の転写エンハンサー要素を含むが、これらに限定されない転写の直接的な開始に対する認識部位として作用するＴＡＴＡボックス配列を含んでもよい。エンハンサー配列（即ち、プロモーター活性を刺激することができる調節要素）は、ＴＡＴＡボックス配列に対して近位または遠位であってもよく、標準的な５’から３’への配向で存在してもよく、または３’から５’への配向で存在してもよい。エンハンサー配列は、プロモーター配列にとって天然のエンハンサー要素であってもよく、またはそれは、発現ベクター構築物に挿入される異種（即ち、その組合せは、天然においては起こらない）エンハンサー要素であってもよい。
【００７７】
プロモーターは、構成的または調節可能であり得る。構成的プロモーターは、その発現が、標準的な培養条件下で一定であるプロモーターであると理解される。したがって、構成的プロモーターは、誘導の必要性、または抑圧の可能性を伴わずに発現を制御する。構成的プロモーターは、幾つかの誘導活性を有し得るが、プロモーターを用いて得られる最大活性は、誘導性ではない。
【００７８】
調節可能なプロモーターは、１つまたは複数の誘導のきっかけに応答性を有するプロモーターである。例えば、プロモーターは、化学的に調節され得る（例えば、その転写活性が、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属、もしくは他の小分子などの化学的誘導剤の存在または非存在によって調節されるプロモーター）か、または物理的に調節される（例えば、その転写活性が、光または高温もしくは低温などの物理的誘導物質の存在または非存在によって調節される）。調節可能なプロモーターはまた、化学的または物理的なきっかけによって、それ自体が直接調節される１つまたは複数の転写因子によって、間接的に活性化または抑圧され得る。
【００７９】
幾つかの実施形態では、調節可能なプロモーターは、炭素供給源調節可能なプロモーターである。幾つかの実施形態では、プロモーターは、特定炭素供給源の存在またはある特定の濃度によって、例えば、メタノール、ラクトース、ガラクトース、グリセロール、グルコース、ショ糖、クエン酸塩、ギ酸塩（formiate）、乳酸塩または酢酸塩の存在によって活性化され得る。あるいは、プロモーターは、他の物質、例えば金属イオンまたはテトラサイクリンによって調節され得る。幾つかの実施形態では、プロモーターは、過剰量の炭素供給源の存在下で（例えば、細胞培養液の成長相中）真核細胞において抑圧されてもよく、また強力なプロモーター活性を発揮するために限られた量の特定炭素供給源の存在下で（例えば、流加プロセスで培養される培養液に対する成長限定炭素供給源の供給時などの、一定量の炭素の低減時に、細胞培養液の産生相において）抑制解除されてもよい。これに関して、「調節可能な炭素供給源」は、非代謝炭素供給源が、直接的に抑制物質ではない場合に、炭素（例えば、グルコースまたはグリセロール）消費、低減、欠陥もしくは欠如による、または炭素供給源が細胞によって容易に消費されるような炭素供給源の限られた添加による、または抑圧性代謝産物へのゆっくりとした変換によるプロモーターの抑制解除を指す。したがって、抑制解除の影響を誘導する方法の１つは、グリセロールキナーゼ（ＧＵＴ１）ノックアウト株または代替的なプロモーターまたはあまり効率的ではないＧＵＴ１遺伝子変異体によって引き起こされるＧＵＴ１活性の低減を伴う株の使用であってもよく、それは、グリセロールを、もはや抑圧性リン酸グリセロールへ効率的に代謝することができない。抑圧性グリセロール３−リン酸への代謝の低減はまた、グリセロールトランスポーター活性の欠失またはダウンレギュレーションによって得られ得る。
【００８０】
幾つかの実施形態では、調節可能なプロモーターは、オレイン酸で誘導性のプロモーターなどの脂肪酸誘導性プロモーターである。
幾つかの実施形態では、プロモーターは、酵母ピキア属（Pichia）、カンジダ属（Candida）、トルロプシス属（Torulopsis）、アルクスラ属（Arxula）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、ヤロウイア属（Yarrowia）、クリベロマイセス属（Kluyveromyces）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、コマガタエラ属（Komagataella）由来のプロモーターなどの真菌または酵母プロモーターである。好ましくは、プロモーターは、酵母ピキア・パストリス由来のプロモーターである。
【００８１】
本明細書に記載するプラスミドおよび方法において使用され得る例示的なプロモーターとして、ＣＡＴ１、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＡＯＤ、ＡＯＸ２、ＤＡＳ１、ＤＡＳ２、ＥＮＯ１、ＦＬＤ１、ＦＭＤ、ＧＰＭ１、ＨＳＰ８２、ＩＣＬ１、ＩＬＶ５、ＫＡＲ２、ＫＥＸ２、ＰＥＴ９、ＰＥＸ８、ＰＧＫ１、ＰＨＯ８９／ＮＳＰ、ＳＳＡ４、ＴＥＦ１、ＴＨＩ１１、ＴＰＩ１、ＹＰＴ１、ＧＴＨ１、ＧＣＷ１４およびＧＵＴ１または例えば少なくとも６０％、もしくは７０％、８０％、９０％もしくは９５％の少なくともいずれかのある特定の配列同一性を特徴とするそれらの機能的に活性な変異体、あるいはそれらの類似したプロモーター配列（即ち、別の種における各々のプロモーター配列）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
幾つかの実施形態では、プロモーターは、ＣＡＴ１プロモーター、即ちペルオキシソームカタラーゼ遺伝子の転写を駆動するプロモーターである。幾つかの実施形態では、ＣＡＴ１プロモーターは、Ｐ．パストリス（P. pastolis）のＣＡＴ１プロモーターである。幾つかの実施形態では、ＣＡＴ１プロモーターは、別の酵母または真菌のＣＡＴ１プロモーター、例えば、酵母Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）、ピチア・スティピティス（Pichia stipitis）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosacharomyces pombe）、またはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、ペニシリウム属（Penicillium）、トリコデルマ属（Trichoderma）などの糸状菌類（filamentous fungi）のＣＡＴ１プロモーターである。幾つかの実施形態では、プロモーターは、配列番号４のヌクレオチド配列を含むＣＡＴ１プロモーターまたはその機能的に活性な変異体である。
【００８３】
幾つかの実施形態では、プロモーターは、ＡＯＤプロモーター、即ち、アルコールオキシダーゼ遺伝子の転写を駆動するプロモーターである。幾つかの実施形態では、ＡＯＤプロモーターは、カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）（Ｃ．ボイジニイ（C. boidinii））のＡＯＤプロモーターである。幾つかの実施形態では、プロモーターは、配列番号５のヌクレオチド配列を含むＡＯＤプロモーターである。
【００８４】
「自己複製配列」または「ＡＲＳ」は、真核生物染色体上でＤＮＡの複製起点として機能を果たす配列である。ＡＲＳは、ＤＮＡ分子に組み込まれると、ＤＮＡを巻き戻して、複製するタンパク質複合体を結合することによって、ＤＮＡ分子の複製を支持する。ＡＲＳは、所定の宿主において自己複製してないＤＮＡ分子へ配列を組み込むこと、およびＡＲＳが存在する場合にのみ、ＤＮＡ分子が宿主において自己複製することを実証することによって、確認することができ、即ち機能的に確証させることができる。
【００８５】
幾つかの実施形態では、ＡＲＳは、配列番号２のヌクレオチド配列またはその機能的変態体を含む。幾つかの実施形態では、ＡＲＳは、配列番号３のヌクレオチド配列またはその機能的変異体を含む。幾つかの実施形態では、ＡＲＳは、配列番号５のヌクレオチド配列またはその機能的変異体を含む。幾つかの実施形態では、ＡＲＳは、配列番６〜１１のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその機能的変異体を含む。
【００８６】
幾つかの実施形態では、ＡＲＳは、転写ターミネーター配列を含む。「転写ターミネーター」または「転写ターミネーター配列」という用語は、本明細書中で使用する場合、プロモーターから開始される核酸配列の転写の停止を引き起こすか、または開始させる配列を意味することが意図される。転写ターミネーター配列は、転写物のポリアデニル化を引き起こす、例えば、１つもしくは複数のポリアデニル化シグナル配列、または１つもしくは複数のポリアデニル化結合配列を含む配列をさらに含んでもよい。
【００８７】
ＡＲＳまたはプロモーター配列の「機能的に活性な」変異体は、本明細書中で使用する場合、具体的には、例えば配列内の、または配列の遠位末端の一方もしくは両方にある１つもしくは複数のヌクレオチドの挿入、欠失または置換による親配列の修飾に起因する突然変異体配列を意味し、この修飾は、この配列の活性に影響を及ぼさないか、またはそれを損なわない。機能的に活性な変異体は、組換え操作、突然変異誘発によって、または化学的合成によって生成され得る。
【００８８】
幾つかの実施形態では、本明細書中に開示するプロモーターまたはＡＲＳ配列の機能的に活性な変異体は、親配列の断片、例えば、親配列の長さの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含む断片である。かかる断片は、親配列の５’末端および／または３’末端にある親配列の欠失（複数可）によって生成され得る。
【００８９】
本明細書中に開示するプロモーター配列の機能的に活性な変異体は、プロモーター活性を崩壊させない微量の変動を有する。機能的に活性なプロモーター変異体として、本明細書中に開示するプロモーター配列および／または類似のプロモーター配列（例えば、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）のＣＡＴ１プロモーターなどの他の酵母種の各々のプロモーター配列）に対して、少なくとも約６０％ヌクレオチド配列同一性、または７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性の少なくともいずれかを有するプロモーター配列を含む。機能的に活性な変異体はまた、操作されたプロモーター変異体、即ち、天然のプロモーター配列の突然変異誘発、置換、挿入または欠失によって生成される変異体を含む。
【００９０】
「機能的に活性なプロモーター」または「機能的に活性なプロモーター変異体」とは、プロモーターまたはプロモーター変異体が、転写を開始または増強すると意図される。プロモーターの機能性は、作動可能に連結されるヌクレオチド配列がプロモーターの存在下で転写されるかどうかによって容易に決定されることは、当業者に理解される。転写および翻訳が起きるかどうかを決定する方法は、当該技術分野で周知であり、目的のタンパク質に関するコード配列が、プロモーターの制御下に置かれる場合に起きるｍＲＮＡ産生またはタンパク質産生を測定することを含む。必然的に、転写または翻訳を誘導することができないプロモーター配列は、非機能的である。
【００９１】
プロモーター活性は、標準的な手段によって、例えばマイクロアレイ、ノーザンブロット、ＲＮＡシーケンシングまたはｑＲＴ−ＰＣＲ、デジタルＰＣＲを用いて、例えば発現産物の量または転写物の量を測定することによって、あるいは他の場合では、細胞培養液中で、例えば組換え細胞における各々の遺伝子発現産物の量を測定することによって決定され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。あるいは、プロモーター断片または変異体プロモーター配列の制御下で産生される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等などのレポーター遺伝子のレベルを測定することができる。例えば、Ａｓｔｏｌａら（２００３年）；Ｈｗａｎｇら（２００３年）；Ｋｉｍら（２０００年）；Ｖｏｌｃｋａｅｒｔら（１９９４年）を参照されたい。プロモーターの生物活性は、プロモーターから発現されるポリペプチドの活性および／またはレベルを測定するように具体的に設計されたアッセイを使用して測定することができる。かかるアッセイは、当該技術分野で公知である。
【００９２】
「機能的に活性なＡＲＳ」または「機能的に活性なＡＲＳ変異体」は、ＤＮＡ構築物へのＡＲＳの挿入時に、非自己複製ＤＮＡ構築物を、自己複製ＤＮＡ構築物へ形質転換することが可能であるＡＲＳを指す。ＡＲＳ活性は、本明細書に記載する方法または当該技術分野で公知のアッセイによって決定され得る。通常、酵母におけるＡＲＳ機能は、（ＬｉａｃｈｋｏおよびＤｕｎｈａｍ、２０１３年；Ｌｉａｃｈｋｏら  ２０１０年、２０１４年；Ｌｉａｃｈｋｏら  ２０１３年；Ｐｅｎｇら  ２０１５年）によって実証されるように環状プラスミドを形質転換することによって容易に検査することができる。例えば、実施例２および図２Ｃに示すようにＡＲＳが存在する場合の選択培地上での単一コロニーの成長。通常、ＡＲＳを有さないプラスミドは、形質転換体を付与しないか、または非常に少数の形質転換体を付与するのに対して、ＡＲＳ含有プラスミドは、顕著な成長を示し、コロニーサイズは、ＡＲＳの効率に依存し得る。さらに、ＡＲＳ機能は、２Ｄゲル分析によって複製中間体を研究することによって、分子レベルで実証することができる。
【００９３】
本明細書中に開示するＡＲＳ配列の機能的に活性なＡＲＳ変異体、即ち、配列番号２、配列番号３または配列番号５〜１１のヌクレオチド配列を含むＡＲＳ配列の機能的に活性なＡＲＳ変異体は、ＡＲＳ活性を崩壊しない微量の変動を有する。機能的に活性なＡＲＳ変異体は、本明細書中に開示するＡＲＳ配列に対する少なくとも約６０％のヌクレオチド配列同一性を有するＡＲＳ配列および／または類似のＡＲＳ配列あるいはこれらの配列の切断バージョンを含む。幾つかの実施形態では、本明細書中に開示するＡＲＳ配列のいずれか１つの機能的に活性なＡＲＳ変異体は、配列番号２、３、５〜１１のいずれか１つに対する少なくとも６０％または７０％の配列同一性、８０％の配列同一性、９０％の配列同一性、または９５％の配列同一性の少なくともいずれか１つを示す。幾つかの実施形態では、本明細書中に開示するＡＲＳ配列のいずれか１つの機能的に活性なＡＲＳ変異体は、配列番号２、３、５〜１１の各々のＡＲＳ配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９から１０までのヌクレオチドの置換（複数可）、挿入（複数可）および／または欠失（複数可）を有するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
【００９４】
「相同性」または「相同的な」という用語は、本明細書中で使用する場合、２つまたはそれ以上のヌクレオチド配列が、ある程度の度合いまで、最大１００％近くの度合いまで、相当する位置で同じか、または保存される塩基対を有することを示す。本発明の相同配列は通常、少なくとも約６０％のヌクレオチド配列同一性、好ましくは少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、より好ましくは少なくとも約９８％または９９％の同一性を有する。具体的には、「相同的な」という用語は、２つのヌクレオチド配列または親配列と比較した変異体を特徴付けており、２つまたはそれ以上のヌクレオチド配列が、ある程度の度合いまで、最大１００％または１００％に近い度合いまで、相当する位置で同じか、または保存される塩基対を有するという点で、配列同一性の度合い（相同性）を示す。
【００９５】
本明細書に記載するような相同的なプロモーター配列またはＡＲＳ配列は、好ましくはＰ．パストリスの天然のプロモーターもしくはＡＲＳヌクレオチド配列のいずれかに対して、またはヌクレオチド配列の少なくとも特異的な部分における異種Ｃ．ボイジニイ（C. boidinii）ＡＲＳに対して、ある特定の相同性を有する。
【００９６】
遺伝子のヌクレオチド配列に関する「同一性パーセント（％）」は、配列を整列させて、必要であれば、比較される配列の完全長にわたって最大の配列同一性パーセントを達成するためにギャップを導入した後に、ＤＮＡ配列においてヌクレオチドと同一である候補ＤＮＡ配列におけるヌクレオチドのパーセントとして定義され、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない。ヌクレオチド配列同一性パーセントを決定する目的での整列は、当業者の範囲内にある様々な方法で、例えば、公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大の整列を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するのに適したパラメーターを決定することができる。
【００９７】
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列もしくはタンパク質に関する「異種」という用語は、本明細書中で使用する場合、所定のプラスミドもしくは宿主細胞に対して外来である、即ち「外因性である」、例えば天然において見出されない化合物、または所定のプラスミドもしくは宿主細胞において天然に見出される、例えば、「内因性である」が、異種構築物の状況、例えば異種核酸を用いる状況においてである、化合物を指す。内因性に見出されるような異種ヌクレオチド配列はまた、細胞において、不自然な、例えば予想よりも多いか、または天然に見出されるよりも多い量で産生され得る。異種ヌクレオチド配列、または異種ヌクレオチド配列を含む核酸は、場合によっては内因性ヌクレオチド配列由来の配列が異なるが、内因性に見出されるのと同じタンパク質をコードする。具体的には、異種ヌクレオチド配列は、天然における宿主細胞に対するのと同じ関係性では見出されないものである。任意の組換えまたは人工ヌクレオチド配列は、異種であると理解される。異種ポリヌクレオチドの例は、例えば、本明細書に記載するようなハイブリッドプラスミド、またはＧＯＩに作動可能に連結される異種プロモーターを得るために、本明細書に記載するようなベクターバックボーンの要素と天然には結合していないＧＯＩである。結果として、ハイブリッドまたはキメラポリヌクレオチドが得られ得る。異種化合物のさらなる例は、内因性の天然に存在するＰＯＩコード配列が、通常は作動可能に連結されない転写制御要素、例えば本明細書に記載するプロモーターに作動可能に連結されるＰＯＩコードポリヌクレオチドである。
【００９８】
異種配列の特定実施形態は、種または株に由来し、元の（親）株または種とは異なる別の株または種に移行される。Ｐ．パストリス以外の種、例えば他の酵母種に由来する本発明の異種プロモーターまたはＡＲＳ配列のいずれかが、相同配列、即ち、本明細書に記載するようなある特定の相同性を有する配列を含み得ることは明らかに理解される。したがって、「相同的な」という用語はまた、異種配列を含み得る。他方で、本発明はまた、ある特定の相同性を含む異種配列およびそれらのホモログを指す。
【００９９】
「作動可能に連結される」という用語は、本明細書中で使用する場合、１つまたは複数のヌクレオチド配列の機能が、前記核酸分子上に存在する少なくとも１つの他のヌクレオチド配列によって影響されるような様式で、単一核酸分子、例えばベクター上でヌクレオチド配列を結合することを指す。例えば、プロモーターは、それが、当該コード配列の発現を達成することが可能である場合に、組換え遺伝子またはＧＯＩのコード配列と作動可能に連結される。さらなる例として、シグナルペプチドをコードする核酸は、それが、成熟タンパク質の前形態または成熟タンパク質などの分泌形態でのタンパク質を発現することが可能である場合に、ＰＯＩをコードする核酸配列に作動可能に連結される。具体的には、互いに作動可能に連結されるかかる核酸は、即座に、即ち、シグナルペプチドをコードする核酸と、ＰＯＩをコードする核酸配列との間にさらなる要素または核酸配列を伴わずに連結され得る。
【０１００】
プロモーター配列は通常、プロモーターがコード配列の転写を制御する場合に、コード配列に作動可能に連結される。プロモーター配列が、コード配列と天然において結合していない場合、その転写は、天然の（野生型）細胞において当該プロモーターによって制御されないか、または当該配列は、異なる連続した配列で組み換えられる。
【０１０１】
本明細書に記載するエピソームプラスミド中に含まれるＡＲＳは、ＧＯＩまたはＧＯＩに作動可能に連結される任意のプロモーターに作動可能に連結されないことを特徴とする。したがって、ＡＲＳは、ＧＯＩ発現またはＧＯＩ発現を制御する各々のプロモーターとは無関係にその機能を発現しているヌクレオチド配列とみなされる。ＡＲＳは、天然のプロモーター配列に由来し得るが、本明細書に記載するエピソームプラスミドにおけるその機能は、ＧＯＩの発現を制御するプロモーターの機能ではない。特定の場合において、ＡＲＳは、ＧＯＩを含む発現カセットの外側に位置することが好ましい。
【０１０２】
「選択可能なマーカー」または「選択マーカー」は、選択条件下で遺伝子を発現する生物を生存させることが可能な表現型を付与する遺伝子（またはコードポリペプチド）を指す。選択可能なマーカーは概して、細胞中に存在するか、または細胞において発現される場合に、選択的利点（または不利点）を、マーカーを含有する細胞に提供する分子である。例えば、形質転換体の選択のための遺伝子マーカーは、他の場合では細胞を死滅させる作用物質の存在下で成長する能力、特定の栄養素の非存在下で成長する能力、欠損および非形質転換細胞によって産生することができない必須栄養素の欠如している培地上で、形質転換細胞を成長させることが可能な選択マーカー、欠損および非形質転換細胞によって使用／代謝することができない培地、例えばエネルギー供給源上で、形質転換細胞を成長させることが可能な選択マーカー、または発色基質が知られている酵素をコードする選択マーカーを含む。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、選択マーカーは、Ｇ４１８／ジェネティシン、ヌルセオトリシン（Ｎａｔ）、ゼオシン、ブラストサイジン、ハイグロマイシン、フルオロアセトアミドおよび２−デオキシグルコースを含むが、これらに限定されない薬物に対する耐性を提供する。幾つかの実施形態では、選択マーカーは、キラー毒素またはリボヌクレアーゼＭａｚＦなどの細胞死を引き起こすタンパク質をコードする遺伝子に対する耐性を提供する。
【０１０４】
選択可能なマーカーは、栄養要求性突然変異体Ｐ．パストリス宿主株および宿主の欠陥を補足する野生型遺伝子を含んでもよく、本明細書中では、栄養要求性に基づく選択マーカーと称される。かかる選択可能なマーカー系の例として、アルギニン、メチオニンもしくはヒスチジン栄養要求性などのアミノ酸栄養要求性またはウラシル要求性もしくはチミジン栄養要求性などのヌクレオチド生合成栄養要求性が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
選択可能なマーカー系は、ある特定の栄養素を使用することが不可能である野生型または突然変異体Ｐ．パストリス宿主株および宿主の欠陥を補足する遺伝子を含み得る。かかる選択可能なマーカー系の例として、グリセロール利用、ショ糖利用、メタノール利用、イヌリン利用、セロビオース利用、および窒素供給源利用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
幾つかの実施形態では、選択マーカーは、グリセロール利用に基づき、ここで細胞は、グリセロールを効率的に代謝して、成長のための炭素供給源として使用することが不可能である。例えば、Ｐ．パストリスｇｕｔ−１ノックアウト株などの遺伝子コードグリセロールキナーゼであるＧＵＴ１を欠損している細胞は、野生型ＧＵＴ１遺伝子を含有する相補性プラスミドで形質転換されない限り、グリセロールの存在下では良好に成長しない。幾つかの実施形態では、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）またはＰ．パストリスＨＩＳ４遺伝子は、ｈｉｓ４ピキア属（Pichia）突然変異体株を補足するのに使用される。幾つかの実施形態では、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）またはＰ．パストリスＡＲＧ４遺伝子は、Ｐ．パストリスａｒｇ突然変異体を補足するのに使用される。また、ｍｅｔ２、ａｄｅ１、ｕｒａ３およびｕｒａ５栄養要求性も、各々の野生型遺伝子ＭＥＴ２、ＡＤＥ１、ＵＲＡ３およびＵＲＡ５を使用して補足することができる。
【０１０７】
本明細書に記載するエピソームプラスミドベクターは具体的には、配列番号２、配列番号３、配列番号５、もしくは配列番号６〜１１のＡＲＳ、または上記のいずれかの機能性変異体を含む。幾つかの実施形態では、エピソームプラスミドベクターは、Ｐ．パストリスの遺伝子ＣＡＴ１、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＡＯＤ、ＡＯＸ２、ＤＡＳ１、ＤＡＳ２、ＥＮＯ１、ＦＬＤ１、ＦＭＤ、ＧＰＭ１、ＨＳＰ８２、ＩＣＬ１、ＩＬＶ５、ＫＡＲ２、ＫＥＸ２、ＰＥＴ９、ＰＥＸ８、ＰＧＫ１、ＰＨＯ８９／ＮＳＰ、ＳＳＡ４、ＴＥＦ１、ＴＨＩ１１、ＴＰＩ１、ＹＰＴ１、ＧＴＨ１、ＧＣＷ１４およびＧＵＴ１もしくはそれらの機能的に活性な変異体に連結される上流配列または他の生物由来のこれらの遺伝子のホモログおよび／もしくは類似体に連結される（異種）プロモーター配列を含むが、これらに限定されないプロモーター配列（例えば、真菌または酵母プロモーター配列）をさらに含む。例えば、エピソームプラスミドベクターは、Ｐ．パストリスもしくは他の酵母のＣＡＴプロモーターまたはＣ．ボイジニイ（C. boidinii）もしくは他の酵母のアルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーターを含む。幾つかの実施形態では、エピソームプラスミドベクターは、配列番号２もしくは配列番号３のＡＲＳ、または配列番号２もしくは配列番号３の機能的に活性な変異体、あるいは配列番号５のＡＲＳまたはその機能的に活性な変異体およびＣＡＴ１プロモーター配列（例えば、Ｐ．パストリス、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）またはＡ．ニデュランス（A. nidulans）のＣＡＴ１プロモーター配列などの真菌または酵母ＣＡＴ１プロモーター配列）またはそれらの機能的に活性な変異体、あるいはＣ．ボイジニイ（C. boidinii）ＡＯＤプロモーター配列（配列番号５）または配列番号６〜１１などのそれらの変異体を含む。好ましい実施形態は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、もしくは配列番号６〜１１、またはそれらの機能的に活性な変異体と、ＣＡＴ１プロモーターとの、またはＡＯＸ１プロモーターとの、またはヒストンプロモーターとの、またはＧＡＰプロモーターとの、またはＤＡＳプロモーターとの、またはそれらの機能的に活性な変異体との任意の組合せである。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、プラスミドは、７００塩基対未満の配列にわたって重複して配置されるＡＲＳ配列（即ち、配列番号２、配列番号３、もしくは配列番号５、または配列番号６〜１１のＡＲＳなどの上記のいずれかの機能的に活性な変異体）、プロモーター配列および転写ターミネーター配列を含む。「重複して」は本明細書中で使用する場合、ＡＲＳ、プロモーターおよび／またはターミネーター配列が、共通して１つまたは複数のヌクレオチド位置（例えば、少なくとも５、１０、１５、２５、５０、１００、２００）を有することを示す。例えば、プロモーター配列の５’末端にある１つまたは複数のヌクレオチド位置（例えば、少なくとも５、１０、１５、２５、５０、１００、２００）は、ＡＲＳ配列の一部であってもよく、ＡＲＳおよび転写ターミネーターは、完全に重複してもよい（参考文献：Ｃｈｅｎら、ＮＡＲ  １９９６年）。
【０１０９】
本明細書中で使用する場合、「近接ＤＮＡ配列」は、指定要素（例えば、ＡＲＳおよびプロモーター配列）を含むＤＮＡ配列であり、それらの要素は、指定されていない要素によって実質的に中断されない。
【０１１０】
「細胞」または「宿主細胞」という用語は、本明細書中で使用する場合、長期間にわたって増殖する能力を獲得した特定の細胞型の細胞または樹立されたクローンを指す。宿主細胞は特に、例えば、組換え遺伝子または産物を発現するように操作された組換え構築物を含む。「宿主細胞」という用語はまた、目的のタンパク質（ＰＯＩ）または細胞代謝産物などの産生プロセスの産物を得るためのバイオリアクター中での培養にすぐに使用できる産生細胞株を含む、ポリペプチドまたはかかるポリペプチドによって媒介される細胞代謝産物を産生するための代謝経路の遺伝子または産物を発現するのに使用されるような組換え細胞株を指す。細胞は具体的には、原核生物であっても、または真核生物であってもよく、哺乳動物、昆虫、酵母、糸状菌類（filamentous fungi）および植物細胞を含む。幾つかの実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞、具体的には、酵母ピキア属（Pichia）、カンジダ属（Candida）、トルロプシス属（Torulopsis）、アルクスラ属（Arxula）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、ヤロウイア属（Yarrowia）、クリベロマイセス属（Kluyveromyces）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、コマガタエラ属（Komagataella）である。好ましくは、宿主細胞は、Ｐ．パストリス細胞、特に野生型株または突然変異株、好ましくはＰ．パストリスのＫＵ７０欠失株である。
【０１１１】
Ｐ．パストリス株は、野生株またはノックアウト株などの遺伝子操作された株であり得る（Ｎａａｔｓａａｒｉら  ２０１２年）。幾つかの実施形態では、ＧＵＴ１ノックアウト株が利用される。
【０１１２】
本明細書に記載する宿主細胞に関する「発酵」とも称される「細胞培養」または「培養」という用語は、具体的には、産業において公知の方法に従う制御されたバイオリアクターにおける細胞の活性または静止状態での成長、分化、タンパク質発現または継続的な生存度に好適な条件下での人工的な、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでの環境における細胞の維持を意味する。具体的に宿主細胞培養が、ＧＯＩを発現して、ＰＯＩを産生するのに実施される場合、宿主細胞培養は、バッチ培養、流加培養または連続的な培養であってもよい。
【０１１３】
「バッチ培養」という用語は、本明細書中で使用する場合、培地ならびに細胞自体を含む、細胞を培養するのに最終的に使用される構成成分全てが、培養プロセスの開始時に供給される、細胞を培養する方法を指す。バッチ培養は通常、幾つかの時点で停止させて、培地中の細胞および／または構成成分を収集して、任意選択で精製する。
【０１１４】
「流加培養」という用語は、本明細書中で使用する場合、さらなる構成成分が、培養プロセスの開始後の幾つかの時期に培養液へ、定期的にまたは連続的に供給される、細胞を培養する方法を指す。供給される構成成分は通常、培養プロセス中に枯渇された細胞のための栄養補助品を含む。流加戦略は通常、バイオリアクターにおいて高細胞密度に達するように、バイオ産業プロセスにおいて使用される。栄養構成成分、例えば炭素基質の制御された添加は、培養の成長速度に直接的に影響を及ぼし、オーバーフロー代謝または望ましくない代謝副生成物の形成を回避するのを助長する。流加培養は通常、幾つかの時点で停止されて、培地中の細胞および／構成成分は通常、収集されて、任意選択で精製される。
【０１１５】
流加プロセスは、培養液への、成長を限定する栄養基質（例えば、炭素供給源）の供給に基づき得る。例えば、炭素供給源限定栄養素条件下では、炭素供給源は具体的に、流加プロセスのフィードにおいて含有され得る。それにより、炭素基質は、限定量で供給される。
【０１１６】
「連続的な培養」は、液体栄養素フィードの連続的な流入および連続的な液体流出の両方を特徴とする培養を記載するのに使用される。また、連続的な培養では、成長速度は、しっかりと制御することができる。
【０１１７】
「炭素供給源」という用語は、本明細書中で使用する場合、精製形態での、最小培地中での、または原材料で供給される、宿主生物または細胞培養液によって代謝させることが可能なエネルギー供給源として適した発酵可能な炭素基質、通常、供給源炭水化物、特に単糖（例えば、グルコース、フルクトース、ソルビトール、ガラクトースまたはマンノース）、二糖（例えば、ショ糖）、オリゴ糖、多糖、グリセロール、メタノールおよびエタノールを含むアルコールからなる群から選択される供給源を意味する。炭素供給源は、単一炭素供給源として、またはグルコースなどの六単糖、およびグリセロールもしくはエタノールなどのアルコールの混合物などの種々の炭素供給源の混合物として使用され得る。
【０１１８】
本明細書中で使用する場合、「発現」という用語は、ポリペプチドが、遺伝子の核酸配列に基づいて産生されるプロセスを指す。このプロセスは概して、転写および翻訳の両方を含む。発現は、ノーザンハイブリダイゼーション分析、逆転写ベースの定量的ＰＣＲアッセイ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイ分析、ウェスタンブロット、イムノアッセイ、レポータータンパク質もしくはタグ付けしたタンパク質の蛍光、またはタンパク質の生物活性に基づくアッセイ（例えば、酵素アッセイ）を含む、当該技術分野で公知の方法を使用して、タンパク質または核酸レベルで決定することができる。
【０１１９】
例えば、キャッサバ（Manihot esculenta）由来のヒドロキシニトリルリアーゼ（ＭｅＨＮＬ）およびアマ（Linum usitatissimum）由来のヒドロキシニトリルリアーゼ（ＬｕＨＮＬ）などの生体触媒の活性は、シアノヒドリンの切断に基づくアッセイを使用して決定され得る。かかるアッセイは、当該技術分野で周知である。
【０１２０】
ＬｕＨＮＬ活性は、溶解産物上清またはクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０、５０ｍＭ）によるそれらの希釈、およびクエン酸（１００ｍＭ）中に溶解させた基質アセトンシアノヒドリン（３００ｍＭ）を混合することによって測定され得る。試料を１０分間インキュベートして、続いてＮ−クロロスクシンイミド（１００ｍＭ）およびスクシンイミド（１Ｍ）を添加して、反応を停止させる（５分間インキュベートする）。０．２Ｍ  ＮａＯＨ中のバルビツール酸（１２５ｍＭ）およびイソニコチン酸（６５ｍＭ）を発色用に添加して、それを６００ｎｍで１０分間測定する。０．０２５〜０．２ｍＭの範囲のシアン化カリウム（ＫＣＮ）を用いた較正曲線を使用して、絶対活性を決定する。
【０１２１】
ＭｅＨＮＬ活性は、最終マンデロニトリル濃度１５ｍＭを使用して、文献（Ｗｉｅｄｎｅｒら  ２０１４年）に記載されるマンデロニトリルシアン形成を使用して決定され得る。
【０１２２】
ｅＧＦＰなどの蛍光レポータータンパク質の発現レベルは、（Ｖｏｇｌら  ２０１４）に記載されるように、主な励起／発光波長（励起／発光でのｅＧＦＰに関して、ｅｘ．／ｅｍ．、４８８／５０７ｎｍの波長）および吸収（６００ｎｍ、ＯＤ６００）で蛍光を測定することによって決定され得る。
【０１２３】
本明細書中で使用する場合、「形質転換」という用語は、プラスミドベクターまたはベクターバックボーンおよび／または挿入片の、細胞への導入を指す。したがって、プラスミドベクターが導入された細胞は、「形質転換体」とみなされる。
【０１２４】
形質転換効率は、形質転換したＤＮＡ１μｇ当たりのコロニー形成単位を算出することによって決定され得る。形質転換割合は、使用するベクターまたはベクターバックボーンおよびＤＮＡの用いる量に特異的であり、他のベクターまたはＤＮＡ濃度が使用される場合には多様であり得る。例えば、形質転換割合は通常、ベクターのサイズの増加、および形質転換に使用するより大量のＤＮＡによって低下する。より少量のＤＮＡが使用される場合は（例えば、１０ｎｇ／形質転換１回）、形質転換割合は、ＤＮＡ１μｇに対して算出されて、関連付けられる。これは、ＤＮＡ１μｇによる直接的な形質転換から得られる割合と比較して、より速い形質転換割合をもたらし得る。
【０１２５】
「一様な」タンパク質発現という用語は、本明細書中で使用する場合、異なる形質転換体間での、または同じ形質転換体を接種した異なる培養液間での、ＰＯＩのあまり可変的でない発現レベルを指す。
【０１２６】
本明細書に記載するように、驚くべきことに、本明細書に記載するプラスミドベクターは、目的のタンパク質の安定かつ増加された発現を可能にする。さらに、本明細書に記載するプラスミドベクターによる真核細胞の形質転換は、増加された形質転換効率および個々の形質転換体間での一様なタンパク質発現をもたらす。
【０１２７】
Ｐ．パストリスをエピソームプラスミドで形質転換し、かかるプラスミドをＰ．パストリスから単離し、およびコンピテントＰ．パストリス細胞を再び形質転換するためにかかる単離を直接使用する方法が、本明細書中に提供される。かかる方法は、ピキア属（Pichia）の形質転換用にプラスミドＤＮＡを増幅させるのに大腸菌（E. coli）を当てにせず、宿主としてＰ．パストリスを用いて、例えば定方向酵素進化または抗体操作のために繁殖サイクルを加速させる。
【０１２８】
本明細書に記載するようなプラスミドベクターを使用して、真核細胞においてＰＯＩを発現する方法が、本明細書中に提供される。幾つかの実施形態では、細胞は、選択条件下、例えば、本明細書に記載するようなプラスミドベクターで形質転換されない細胞によって、許容／代謝されないゼオシンもしくはジェネティシンなどの薬物または栄養素の存在下で培養される。
【０１２９】
幾つかの実施形態では、ＰＯＩの発現は、ＰＯＩをコードする目的の遺伝子を含む直鎖状発現カセットのゲノム組込みを使用した同じＰＯＩのタンパク質発現と比較して、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも５倍または少なくとも１０倍増加する。
【０１３０】
幾つかの実施形態では、目的の遺伝子を含む本明細書に記載するプラスミドベクターの形質転換効率は、前記目的の遺伝子を含む直鎖状発現カセットの形質転換効率と比較して、少なくとも２０倍増加する。幾つかの実施形態では、形質転換は、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも５００倍増加する。
【０１３１】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載するようなエピソームプラスミドベクターによる個々の形質転換体におけるＰＯＩのタンパク質発現は、前記ＰＯＩをコードする目的の遺伝子を含む直鎖状発現カセットのゲノム組込みを使用したタンパク質発現と比較して、少なくとも１．５倍一様である。
【０１３２】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載するエピソームプラスミドベクターを用いて得られる個々の形質転換体のタンパク質発現は、ＰＯＩをコードする目的の遺伝子を含む発現カセットを有する従来技術のＰ．パストリスＡＲＳ１ベースのプラスミドの状態を用いてエピソームプラスミドベースの発現を使用したタンパク質発現と比較して、少なくとも１．２倍一様である。
【０１３３】
本明細書に記載する方法およびエピソームプラスミドを使用したタンパク質発現および／または形質転換効率は、選択マーカーのタイプによって影響／調節される可能性があり、また選択マーカーまたは選択マーカーの転写を駆動する代替的なプロモーターもしくはターミネーターの変異体が使用される場合には多様であり得る。例えば、特定のＰＯＩのタンパク質発現は、ゼオシン耐性を使用することと比較して、選択マーカーとしてジェネティシンを使用して増加され得る。各々の発現レベルを比較するためにタンパク質発現を決定する方法は、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載する。
【０１３４】
細胞において維持されるプラスミドコピー数は、選択圧力が適用される場合、用いる選択マーカーに応じて多様である可能性があり、また選択に使用する物質の濃度の依存の点で多様であり得る。プラスミドコピー数を決定するための分析方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、サザンブロッティングまたは他のハイブリダイゼーション技法を含む。
【０１３５】
本明細書に記載する方法およびプラスミドを使用したタンパク質発現および／または形質転換効率はまた、例えば、栄養素のタイプ、栄養素の供給速度および／もしくは濃度ならびに／または選択圧力を調整するために培地に添加される化合物の濃度などの、培養方法によっても影響され得る。
【０１３６】
さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでの相同組換えを使用して、ピキア・パストリスにおいてエピソームプラスミドベクターを生成する方法が、本明細書中で提供される。具体的には、本発明者らは、ピキア・パストリスのＫＵ７０欠失株へ、（ｉ）相同組換え部位（複数可）を含むＡＲＳベースのベクター（特に、配列番号５〜１１を含む配列などのＣ．ボイジニイ（C. boidinii）のＡＲＳ配列を含むベクター）を、（ｉｉ）ベクター上の組換え部位（複数可）に対して相同的である５’および３’隣接配列を有するＧＯＩを含む挿入片と一緒に形質転換することにより、ＧＯＩを含むエピソームプラスミドを生じることを見出した。とりわけ、Ｐ．パストリス以外の酵母由来のＡＲＳ配列を含むベクターは、ピキア・パストリスにおいて機能的である。
【０１３７】
「ピキア・パストリス」という用語は、本明細書中で使用する場合、ピキア属（Pichia）またはコマガタエラ属（Komagataella）、例えばピキア・パストリスもしくはコマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）、またはＫ．ファフィイ（K. phaffii）、またはＫ．シュードパストリス（K. pseudopastoris）などに由来する幾つかの異なる種を含むメチロトローフ酵母を指す。Ｐ．パストリス株の例は、ＣＢＳ  ７０４（＝ＮＲＲＬ  Ｙ−１６０３＝ＤＳＭＺ  ７０３８２）、ＣＢＳ  ２６１２（＝ＮＲＲＬ  Ｙ−７５５６）、ＣＢＳ  ７４３５（＝ＮＲＲＬ  Ｙ−１１４３０）、ＣＢＳ  ９１７３−９１８９（ＣＢＳ株：ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、ユトレヒト、オランダ）、およびＤＳＭＺ  ７０８７７（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）を含むが、Ｘ−３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１およびＳＭＤ１１６８などのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの株、またはＢＧ１０およびその突然変異体、例えばＢＧ１１などのＢｉｏＧｒａｍｍａｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．からの株も含む。
【０１３８】
「ピキア・パストリスＫＵ７０欠失株」という用語は、本明細書中で使用する場合、ピキア・パストリス株（例えば、野生型株ＣＢＳ７４３５（ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０、ＡＴＣＣ  ７６２７３）またはｋｕ７０遺伝子のピキア・パストリスホモログ（例えば、受託番号ＸＭ＿００２４９２５０１．１；ＦＲ８３９６３０、領域１５９８１０１−１５９９９６３を有するＰ．パストリスのｋｕ７０遺伝子））が機能的なＫＵ７０活性を排除するように、例えば、活性または機能性を阻害するようにゲノムレベルで修飾された（例えば、欠失または崩壊された）ＧＳ１１５株を指す。これは、遺伝子（プロモーター、オープンリーディングフレームおよびターミネーターを含む）の完全または部分的欠失；それぞれ、遺伝子もしくはコードされるｍＲＮＡの転写または翻訳を変更させる１つまたは複数の突然変異の導入；およびタンパク質活性を不活性化する１つまたは複数の突然変異の導入を含むが、これらに限定されない。タンパク質活性／機能性が抑止または崩壊され得る例として、１）遺伝子の発現を制御する上流もしくは下流の調節配列の欠失または崩壊、２）遺伝子を非機能的にさせるためのタンパク質活性をコードする遺伝子の突然変異（ここで、「突然変異」は、遺伝子に、活性の能力をなくさせるための欠失、置換、挿入または付加を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
幾つかの実施形態では、ＫＵ７０欠失株は、ｋｕ７０遺伝子の部分的な欠失を有する、部分的に欠失されたｋｕ７０遺伝子を含むＰ．パストリス株であり、それにより、遺伝子またはその発現産物を不活性化させる。幾つかの実施形態では、ＫＵ７０欠失株は、Ｎａａｔｓａａｒｉら  ２０１２年に記載されるように、Ｐ．パストリスのＫＵ７０ホモログの遺伝子欠失を有するＰ．パストリス株である。Ｐ．パストリスのＫＵ７０ホモログは、図３３で同定される配列情報を特徴とする（配列番号８７）。
【０１４０】
驚くべきことに、本明細書に記載する目的で使用するＫＵ７０欠失株は、生合成に適しており、長期間にわたって、本明細書に記載するエピソームプラスミドを安定に維持していた。
【実施例】
【０１４１】
下記実施例は、本発明の理解を助長するために記載されるが、いかなる場合においても本発明の範囲を限定するとは意図されず、そのように解釈されるべきではない。実施例は、従来の方法の詳細な説明、例えば微生物宿主細胞においてタンパク質を過剰発現させる方法のクローニング、トランスフェクションおよび基礎的な態様を含まない。かかる方法は、当業者に周知である。
【０１４２】
材料および方法
株、材料、培地および培養条件
クローニングおよびプラスミド繁殖に関して、大腸菌（Escherichia coli）Ｔｏｐ１０  Ｆの株を使用した。Ｐ．パストリス形質転換は、主にＣＢＳ７４３５野生型株およびそのＡＯＸ１欠失変異体を用いて実施した（Ｎａａｔｓａａｒｉら  ２０１２年）。あるいは、ＮＲＬＬ−Ｙ−１１４３０ｗｔ株およびＢＧ１１の誘導体を含まないキラープラスミドであるＰ．パストリスＢＧ１０、そのＡＯＸ１欠失変異体を使用した（両方の株が、ｂｉｓｙ  ｅ．Ｕ．、ホーフシュテッテン、オーストリアから入手される）。ＧＵＴ１相補性プラスミド（Ｎａａｔｓａａｒｉら  ２０１２年）を、ＣＢＳ７４３５ｗｔ株のｇｕｔ１ノックアウト変異体に形質転換した。プラスミド単離、ゲル精製およびクローニング用の酵素に関するキットは、最近記載されているように使用した（Ｖｏｇｌら  ２０１４年）。Ｇｉｂｓｏｎアッセンブリーは、標準的な手順に倣って、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（イプスウィッチ、ＭＡ、米国）からのＴ５エキソヌクレアーゼおよびＴａｑ  ＤＮＡリガーゼならびにＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ウォルサム、ＭＡ、米国）からのＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを使用して実施した（Ｇｉｂｓｏｎら  ２００９年）。Ｓａｎｇｅｒシーケンシングは、ＬＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ（ベルリン、ドイツ）およびＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ  ＡＧ（バルガッハ、スイス）によって実施された。培地は、Ｗｅｉｓら（２００４年）によって概説されるように、１％（ｗ／ｖ）のグルコース／デキストロース（ＢＭＤ）を有する乏しい標準的な緩衝最小培地中で調製され、完全培地（酵母抽出物、ペプトン、２％グルコース；ＹＰＤ）を使用した。さらに、１％（ｗ／ｖ）のグリセロール（ＢＭＧ）を有する緩衝最小培地もまた使用した（Ｎａａｔｓａａｒｉら  ２０１２年）。下記の抗生物質濃度を使用した：大腸菌（E. coli）：２５μｇ／ｍｌのゼオシン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地；Ｐ．パストリス：１００μｇ／ｍｌのゼオシン、３００μｇ／ｍｌのジェネティシン。液体最小ＢＭＤ培地におけるゼオシン選択を試みたが失敗した（おそらく、ｐＨまたは高いイオン強度のため）。したがって、本発明者らは、ゼオシンおよびジェネティシン選択実験に関して、完全培地を使用した。ディープウェルプレート培養をこれまでに記載されるように実施した（Ｗｅｉｓら  ２００４年）が、メタノール誘導は、ＰＣＡＴ１駆動型発現に必要とされず、したがって、プロトコールは、グルコース上での成長およびその枯渇後に停止した。振とうフラスコ培養は、開始ＯＤ６００  ０．０５で、２５０ｍｌのバッフル付フラスコ（ＢＭＤ開始容量２５ｍｌ）中で実施した。４８時間後に、フラスコをＢＭＭ２（最終濃度０．５％を達成するために１％メタノールｖ／ｖ）で誘導し、最初の誘導の１２時間後、２４時間後に、ＢＭＭ１０（５％メタノールｖ／ｖ）で誘導した（Ｗｅｉｓら  ２００４年）。ヘキソキナーゼ法ベースのキット（グルコースＵＶキット、ＤＩＰＲＯｍｅｄ（ウィーン、オーストリア））を使用して、グルコース濃度を測定した。
【０１４３】
プラスミド構築
種々の選択マーカーを有するｅＧＦＰレポーター遺伝子構築物は、Ｎａａｔｓａａｒｉら（２０１２年）によって報告されるシャトルベクターに基づく。ゼオシン選択に関して、本発明者らは、これまでに報告されている制限部位を含まないクローニング（ＲＳＦＣ）ベクターｐＰｐＴ４ｍｕｔＺｅｏＭｌｙｌ−ｉｎｔＡｒｇ４−ｅＧＦＰ−Ｂｍｒｌｓｔｕｆｆｅｒを使用した（Ｖｏｇｌら  ２０１５年。ｐＰｐＴ４＿Ｓベクター（Ｎａａｔｓａａｒｉら、２０１２年）に基づく）。ＰＣＡＴ１−１０００、ＰＣＡＴ１−６９２およびＰＣＡＴ１−５００ベクターは、これまでの研究から入手可能であった。
【０１４４】
ＰＣＡＴ１−６９２プロモーター断片において同定される２６４ｂｐの推定ＡＲＳ（ｐｕｔＡＲＳ−ＰＣＡＴ１）は、プライマーｉｎｔＡＲＧ４−ｐＣＡＴ１−７６４−ＧｉｂおよびｅＧＦＰ−ｐＣＡＴ１−５０１ｒｅｖ−Ｇｉｂを使用したＰＣＲ増幅後に、スタッファー断片をＧｉｂｓｏｎアッセンブリーで置き換えることによって、上述のｅＧＦＰ  ＲＳＦＣレポーターベクターへクローニングし（表１を参照）、続いて配列検証を行った。
【０１４５】
【表１】
2018533932.tif 000002
【０１４６】
ＡＲＳおよびＰＣＡＴ１の一片の組合せ（ＰＣＡＴ１−６９２）はまた、代替的な選択マーカージェネティシンおよびｇｕｔ１相補性を用いて検査した（Ｎａａｔｓａａｒｉら、２０１２年）。ジェネティシン選択に関して、ゼオシンベクターの耐性カセットは、ｐＰｐＫａｎ＿Ｓ由来のカナマイシン／ジェネティシンカセットで置き換えた（Ｎａａｔｓａａｒｉら、２０１２年）（このカセットは、大腸菌（E. coli）におけるカナマイシンおよびＰ．パストリスにおけるジェネティシンに対する耐性を付与する）。ＧＵＴ１カセットは、ｐＰｐＧＵＴ１ｒから増幅した（Ｎａａｔｓａａｒｉら、２０１２年）（Ｐ．パストリスに関してはグリセロール相補性、大腸菌（E. coli）に関してはアンピシリン）。
【０１４７】
ＰＣＡＴ１−６９２を含有するゼオシンベースのレポーターベクターは、ＢａｍＨｌおよびＰｓｔｌで消化して、バックボーンをゲル精製した。Ｋａｎ／Ｇｅｎ耐性カセットは、プライマーＡＯＸ１ＴＴ−ＢａｍＨＩ−ｐｌＬＶ５−Ｇｉｂｓｏｎ＋ｐＵＣ−Ｏｒｉ−Ｐｓｔｌ−ＡＯＤＴＴ−Ｇｉｂｓｏｎを使用してｐＰｐＫａｎ＿Ｓから増幅して、Ｇｉｂｓｏｎアッセンブリーによってベクターバックボーンに組み込んだ。ＧＵＴ１カセットは、プライマーＡＯＸ１ＴＴ−ＢａｍＨＩ−ｐＧＵＴ１−ＧｉｂｓｏｎおよびＡｍｐＲ−ＧＵＴ１ＴＴ−Ｇｉｂｓｏｎを使用して、アンピシリンカセットは、プライマーＧＵＴ１ＴＴ−ＡｍｐＲ−ＧｉｂｓｏｎおよびｐＵＣ−Ｏｒｉ−ＡｍｐＲ−Ｇｉｂｓｏｎを用いて、ｐＰｐＧＵＴ１から増幅した。２つのＰＧＲ断片は、上述のＢａｍＨｌおよびＰｓｔｌバックボーンを用いて構築された。
【０１４８】
形質転換、蛍光測定およびｇｕｔ１株
コンピテントＰ．パストリス細胞は、Ｌｉｎ−Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら（Ｌｉｎ−Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら、２００５年）の簡約されたプロトコールを使用して調製および形質転換した。適用可能である場合、プラスミドは、Ｓｗａｌで線状化して、１μｇを形質転換し、環状プラスミドに関しては１０ｎｇを形質転換した。切断されていない環状形態を有する線状化プラスミドの混入を回避するために、線状化反応をアガロースゲル上に負荷して、線状化形態に相当するバンドを切り出して、精製した。
【０１４９】
ｅＧＦＰ蛍光（ｅｘ．／ｅｍ．４８８／５０７ｎｍ）および吸収（６００ｎｍ、ＯＤ６００）は、これまでに概要されるように（Ｖｏｇｌら、２０１４年）、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＭＸプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、ウィヌースキー、ＶＴ、米国）を使用して測定および標準化した。
【０１５０】
これまでに報告されている（Ｎａａｔｓａａｒｉら  ２０１２年）ｇｕｔ１ノックアウト株は、ｋｕ７０ノックアウト株において達成された。本発明者らは、野生型株バックグラウンドを使用することを目標として、Ｎａａｔｓａａｒｉら（２０１２年）と類似した戦略に倣ってｇｕｔ１ノックアウトを創出した。株は、グリセロール上の破壊された成長に関して、ＹＰＤ＋Ｚｅｏ培地上で得られる形質転換体をスクリーニングすることによって同定された。
【０１５１】
［実施例１］
ＰＣＡＴ１のＡＲＳ領域のマッピング
これまでに使用されたＰＣＡＴ１長は、ＣＡＴ１遺伝子の開始コドンから上流へ、隣接する遺伝子ＬＣＰ５の末端まで選択され、６９２ｂｐの断片を生じた（ＰＣＡＴ１−６９２；図１Ａ）。プロモーター配列の分析により、ＰＣＡＴ１−６９２の５’末端におけるＡＴリッチなストレッチが明らかとなった（図１Ａ）。プロモーターを５００ｂｐ長に短縮すること（ＰＣＡＴ１−５００）により、ＡＴリッチなストレッチが除去される。ＡＴリッチな配列は、転写ターミネーターおよびＡＲＳの共通の形質である（Ｃｈｅｎ、Ｒｅｇｅｒ、Ｍｉｌｌｅｒ、＆Ｈｙｍａｎ、１９９６年）。最近、Ｐ．パストリスのＡＲＳは、ディープシーケンシングに基づくハイスループットスクリーン（Ｌｉａｃｈｋｏら  ２０１４年）によってマッピングされた（ＡＲＳ−ｓｅｑ．（Ｌｉａｃｈｋｏら  ２０１３年））。Ｌｉａｃｈｋｏら（２０１４年）はそれにより、ＰＣＡＴ１においてＡＲＳを同定して、機能性コアを３８８ｂｐの断片へとマッピングした（図１Ａ）。さらなる機能分析は、Ｌｉａｃｈｋｏらによっては実施されなかった。
【０１５２】
本発明者らは、ＰＣＡＴ１の種々の断片を、増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）レポーター遺伝子を含有するベクターへクローニングして、ＰＣＡＴ１におけるこのＡＲＳが、特に形質転換または凍結／解凍サイクルなどのストレス状況の場合に、株不安定性およびバックグラウンド成長（小さなコロニー）を引き起こしているかどうかを検査した。ＰＣＡＴ１−１０００、ＰＣＡＴ１−６９２およびＰＣＡＴ１−５００は、種々の長さのプロモーターを提供し、Ｌｉａｃｈｋｏらの機能性コアよりも短い長さを有するＡＴリッチなストレッチ（２６４ｂｐ）をＰＣＡＴ１の推定ＡＲＳ（ｐｕｔＡＲＳ−ＰＣＡＴ１）として選択した（図１Ａ）。
【０１５３】
Ｐ．パストリス細胞は、これらのベクターの環状形態および線状化形態の両方で形質転換した（図２Ａ）。プラスミドの線状化は、酵母における環状形態と比較して、ゲノム組込み割合を劇的に増加させる、高度組換えＤＮＡ末端を生じる（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ、Ｓｚｏｓｔａｋ、＆Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、１９８１年）。標準的なＰ．パストリスベクターは、ＡＲＳを含有せず、エピソーム的に複製することができない。したがって、対照として空のベクターの環状形態による細胞の形質転換は、いかなるコロニーも付与しなかった（図２Ａ）。しかしながら、ＰＣＡＴ１−１０００、ＰＣＡＴ１−６９２およびｐｕｔＡＲＳ−ＰＣＡＴ１の循環形態による形質転換は、顕著な成長を示した一方で、ＰＣＡＴ１−５００は、全く成長を示さなかった。線状化形態のプラスミドによる形質転換は、プラスミド全てに関して形質転換体を生じた。これらの結果により、ＡＲＳとしてのＰＣＡＴ１のＡＴリッチなストレッチの機能が確認される。
【０１５４】
検査した任意のプロモーター長の安定なゲノム組込みを有する形質転換体は、同一のレポーター蛍光を示し（図１Ｂ、図３Ａ）、ＡＲＳ部分の長さが、ＰＣＡＴ１の強度に影響を及ぼしていないことを示唆した。また、調節プロフィール（抑圧／抑制／誘導）は、一連の時間内で３つの異なるプロモーター長を比較することによって実証されるように、影響されなかった（図１Ｂ）。これらの配列は同一に挙動したため、ＡＲＳは、いかなる手段によってもＰＣＡＴ１の転写調節に必要とされないと結論付けた。
【０１５５】
［実施例２］
ＰＣＡＴ１のＡＲＳを保有するベクターは、線状化後でさえ、エピソーム的に複製することができる。
【０１５６】
線状化ＡＲＳ含有配列（ＰＣＡＴ１−１０００、ＰＣＡＴ１−６９２およびｐｕｔＡＲＳ−ＰＣＡＴ１）による形質転換に関して、２つの別個のタイプのコロニーが認められ得る：大きなコロニー（空のベクター対照およびＰＣＡＴ１−５００と類似したサイズの）およびより小さなコロニー（図２Ａ）。細胞をより長期にインキュベートする場合、コロニー間の差は、あまり顕著にはならず、異なる成長速度を示唆する。
【０１５７】
小さなコロニーが、環状プラスミドの形質転換体と類似して、これらのベクターのエピソーム的な、非ゲノム組込みのバージョンであり得るかどうかを決定するために、構築物の大きなコロニーおよび小さなコロニーを、選択（ＹＰＤ＋ゼオシン）および非選択条件（ＹＰＤ）下で９６ウェルディープウェルプレートにおいて液体培養液中で成長させて、続いて、選択および非選択培地にスタンプした（図２Ｂ）。任意の構築物の大きなコロニーは、培養条件とは無関係に、一様な成長を示し、サイズは、空のベクターのコロニーに匹敵した。小さなコロニーは、非選択培地上での大きなコロニーと同一の成長を示した。しかし、小さなコロニーが、非選択培地から選択培地に移行された場合、それらは、環状プラスミドに類似した弱い成長を示した。これは、エピソームプラスミドに関して予測される結末である：非選択条件下で、プラスミドは、効率的に繁殖されず、単に細胞集団のサブセットにおいて維持され、より弱い成長をもたらす。小さなコロニーまたは環状プラスミドが、選択条件下で予め成長される場合、プラスミド損失は、実験条件に依存している：非選択条件下よりもあまり深刻ではない（図２Ｂ）か、または完全に救済されており（図６）、選択条件下では完全に成長を回復させている。
【０１５８】
液体培養液からのスタンピングは、細胞の混合集団を含むため、大きなコロニーおよび小さなコロニーは、線状化ＰＣＡＴ１−６９２から画線培養され、同様にコロニーは、選択および非選択寒天プレート上で環状形質転換から画線培養された。続いて、単一コロニーを採取して、選択培地上で画線培養した（図２Ｃ）。予想通り、大きなコロニーは、任意の条件下で成長を維持した（ＰＣＡＴ１−５００と同一）一方で、小さなコロニーおよび環状プラスミドは、非選択条件下で予め培養された場合、選択培地上で成長する能力を損失した。
【０１５９】
これらの結果から、大きなコロニーは、ゲノムにおいて安定に組み込まれたカセットを含有する一方で、小さなコロニーは、エピソーム的に複製するプラスミドを保有し、これまでに観察される安定性の問題に関して説明を提供すると結論付けられた。この効果は、ゼオシンによる選択に特異的ではなく、ジェネティシンおよびグリセロール代謝の欠乏を示す相補性ｇｕｔ１ノックアウト株でも起こった。
【０１６０】
特に、空のベクターおよびＰＣＡＴ１−５００は、単に小さなさらなるコロニーを示している（図２Ａ）。プレートをより長期間インキュベートしたとしても、これらのコロニーは、サイズを増加させず、また再び選択培地上で画線培養した場合も、成長しない。空のベクターおよびＰＣＡＴ１−５００の環状形態の形質転換が、いかなる成長も示していないため、本発明者らは、小さなコロニーが、ＡＲＳに関連付けられず、異なる現象によって引き起こされると仮定する。
【０１６１】
［実施例３］
ＰＣＡＴ１のＡＲＳは、選択圧力下で高いエピソーム発現を可能にする
図２Ｂのスタンピング実験の他に、ｅＧＦＰレポーターの蛍光も、種々の長さおよびコロニーサイズのＰＣＡＴ１から測定した（図３Ａ）。驚くべきことに、小さなコロニーおよび大きなコロニーは、非選択条件下で培養される場合に、類似したレポーター蛍光を示し、（図２Ｂ、図２Ｃ）で観察されるプラスミド損失の効果は、完全培地中でディープウェルプレートにおける成長時に、レポータータンパク質蛍光に激しく影響を及ぼしていないことを示唆した。しかしながら、エピソームプラスミド（線状化の小さなコロニー、環状）を保有する株は、非選択条件よりも、またはゲノム組込み（任意の大きなコロニー、ＰＣＡＴ１−５００）と比較して、選択培地上で５倍高いレポータータンパク質蛍光を示した（図３Ａ）。この効果は、種々の選択マーカー（ジェネティシン）を用いた場合にさらに顕著であり、７倍を上回る増加をもたらした。
【０１６２】
これらの結果は、選択圧力下でのエピソーム的に複製するプラスミドが、発現を増加させるための簡素なツールであることを示唆する。
収率の増加にもかかわらず、多くの場合で、ゼオシンまたはジェネティシン（２つは、比較的高価な抗生物質である）を使用したより大規模な培養において選択圧力を維持することは、経済的に実現不可能であった。したがって、ＡＲＳは、グリセロール利用による選択と組み合わせた。ここで、グリセロールを効率的に代謝することが不可能なグリセロールキナーゼ１（ｇｕｔ１）ノックアウト株を使用して、それ自体のプロモーターおよびターミネーターを有する野生型ＧＵＴ１遺伝子を含有する相補性プラスミド（Ｎａａｔｓａａｒｉら  ２０１２年）およびｅＧＦＰレポーター遺伝子の発現を駆動させるＰＣＡＴ１−６９２で形質転換した。ＰＣＡＴ１−６９２およびＰＣＡＴ１−１０００は、培地中でゼオシンの存在下で同一の挙動を示すため、代替的な選択マーカーは、より短いプロモーター変異体ＰＣＡＴ１−６９４のみを用いて検査した。また、ゼオシンまたはジェネティシン増強発現に類似して、選択条件（唯一の炭素供給源としてグリセロール）下で４．４倍を上回って増加したレポータータンパク質蛍光が得られ（図３Ｃ）、炭素供給源ベースの選択もまた、エピソームプラスミド由来の発現を強力に増加させるのに適していることを提供する。
【０１６３】
不安定性の問題は、グリセロールストックからのＰＣＡＴ１ＡＲＳ含有プラスミドを再培養した場合に、これまで特に注目されてきた。したがって、図２Ｂおよび図３Ａに示す培養のグリセロールストックを使用して、選択および非選択培地を接種した（図６）。選択および非選択培地上でのスタンピングアッセイによって決定されるプラスミド損失は、直接的な接種よりもさらに厳しかった（図６Ａ対図２Ｂ）。興味深いことに、この場合、プラスミド保有構築物の蛍光はまた、非選択条件下で強力に減少し、ほぼ完全なプラスミド損失を示唆した（図６Ｂ対図３Ａ）。これらの結果は、ＡＲＳプラスミドが、凍結および再培養などのストレス条件下で、より損失する傾向にあることを暗示している。
【０１６４】
［実施例４］
ＰＣＡＴ１およびその内因性ＡＲＳの組合せは、形質転換割合の改善、収率の増加およびより高い景観の一様性を伴うスクリーニング系を提供する
環状ＡＲＳプラスミドの形質転換効率は、ゲノム組込みに必要とされる線状化発現カセットを使用するよりも、平均して１０８倍高かった（図５）。高い形質転換効率は、タンパク質工学を実施して、変異体の大きなランダムライブラリーをスクリーニングする際に必要とされる。しかしながら、かかるスクリーニング系は、結果に対してさらなるバイアスを加えてはならない。変異体間の差は、専ら目的の遺伝子における突然変異から生じるはずであり、種々のコピー数または組込み事象のために生じるものではない。エピソームＰＣＡＴ１プラスミドは、産業上関連ある生体触媒（キャッサバ（Manihot esculenta）由来のヒドロキシニトリルリアーゼ（ＭｅＨＮＬ）およびアマ（Linum usitatissimum）由来のヒドロキシニトリルリアーゼ（ＬｕＨＮＬ））の発現に関して検査した。多数の形質転換体をスクリーニングして、エピソーム複製（ＰＣＡＴ１−６９２）およびゲノム組込み（ＰＣＡＴ１−５００）の発現景観の一様性を比較した（図４）。ｅＧＦＰレポーター遺伝子に関して（図３）、選択圧力下でエピソームプラスミドから発現されるＭｅＨＮＬおよびＬｕＨＮＬもまた、ゲノム組込みと比較して、発現の増加を示した（景観全体値の平均値を比較して、３．５倍および４．９倍）。したがって、ｅＧＦＰをフォールドして、維持することの容易さの有益な効果はまた、より複雑な酵素に関しても再現させることができる。より高い形質転換効率に起因して、かなり少量のプラスミド（１０ｎｇ）を使用して、線状化カセットの類似した数の形質転換体を達成することができる。さらに、制限エンドヌクレアーゼ消化および精製／脱塩ステップは、ＡＲＳプラスミドに関して、実験時間を短縮するのに、およびコストを低減させるのに必要とされない。
【０１６５】
エピソームＰＣＡＴ１プラスミドはまた、ゲノム組込みよりも最大３．５倍一様な発現をもたらした（パーセントでの標準偏差を比較して）。ＭｅＨＮＬに関して、ゲノム組込み由来の最高の活性を有する形質転換体は、平均的なＡＲＳ形質転換体と類似した活性に達した。ＬｕＨＮＬに関して、最良のゲノム組込みの形質転換体は、最悪のエピソーム形質転換体に匹敵する活性にのみ達する。幾つかのゲノム組込みの形質転換体は、いかなる検出可能な活性も示さなかったのに対して、エピソーム形質転換体は全て、活性であった。ゲノム組込みのクローン可変性は、Ｐ．パストリスに関して公知であり（Ｃｒｅｇｇら  ２００９年）、コピー数またはゲノム組込みの位置の差に起因し得る。Ｐ．パストリスは、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）よりも低い割合の相同組換えを有し、線状化カセットは、０．１％未満から最大３０％の間の割合で組み込む（Ｎａａｔｓａａｒｉ  ２０１２年）。また、比較的大量の線状化ＤＮＡ（３．５μｇ）を使用して、多コピー株を得て、それは、景観のより高い可変性を引き起こし得る。この目的で、単一コピー組込みのみを通常生じる少量のプラスミドもまた形質転換されて、景観の一様性の改善をもたらした（図８）。多数の個々の形質転換体を有するライブラリーを得るために、形質転換のためのより大量のＤＮＡの使用が好ましい場合がある。少数のＤＮＡが用いられる場合、幾つかの形質転換が成されなくてはならず、形質転換体をプールする必要がある。
【０１６６】
［実施例５］
高い発現レベルは、新たなＡＲＳおよびその切断型変異体を用いて得ることができる。
種々のＡＲＳ（受託：Ｍ１１１９９、配列番号３、５、６、７、８、９、１０、１１および１２）を、選択マーカーの転写ターミネーターと大腸菌（E. coli）起源との間で、組込み対照としても機能を果たすｐＰｐＴ４ｍｕｔＺｅｏＭｌｙｌ−ｉｎｔＡｒｇ４−ＥＧＦＰ−ｐＣＡＴ１−５００へクローニングした。ＡＲＳは、表２に列挙するプライマーを使用してＰＣＲ増幅して、Ｇｉｂｓｏｎアッセンブリーを用いてＰｓｔＩ線状化ベクターへクローニングした（Ｇｉｂｓｏｎら  ２００９年）。ＡＯＤ−Ｆ６は、プライマーＡＯＤＴＴ−Ｐｓｔｌ−ＣｂＡＯＤ１ＡＲＳ−Ｆ３−ＧｉｂおよびｐＵＣ  Ｏｒｉ−Ｋｐｎｌ−ＣｂＡＯＤ１ＡＲＳ−Ｆ５−Ｇｉｂを使用して増幅した。ＡＯＤ−Ｆｕｌｌは、プライマーＡＯＤＴＴ−Ｐｓｔｌ−ＣｂＡＯＤ１ＡＲＳ−Ｆ１−ＧｉｂおよびｐＵＣ  Ｏｒｉ−Ｋｐｎｌ−ＣｂＡＯＤ１ＡＲＳ−Ｆ５−Ｇｉｂを使用して増幅した。その後、構築物を、配列検証した。
【０１６７】
環状プラスミドの、Ｐ．パストリスＢＧ１０への形質転換後、各構築物の７つの個々の形質転換体を、スクリーニング用に採取した。同じ形質転換体を、ＹＰＤおよび５０ｍｇ／Ｌのゼオシンを有するＹＰＤにおいて培養した。第１のスクリーニング後に、同じ形質転換体はまた、種々のゼオシン濃度を用いたスクリーニングに使用され、ＣＡＴ１−６９２プロモーター（上述するようなプラスミド）もまた含まれた。組込み対照に関して、再スクリーニングによって同定される１つの代表的なクローンを、生物学的に七重反復で使用した。
【０１６８】
【表２】
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【０１６９】
高い発現レベルは、培養および発現中に適用される選択圧力を用いて、新たなＡＲＳおよび同様にその切断型断片に関して得ることができる。より高い発現レベルは、ゼオシン濃度の増加によって得られた（図２２）一方で、それは、組込み対照（ＣＡＲ１−５００）に関しては一定のままであった。特に、より低いゼオシン濃度で、新たなＡＲＳは、Ｐ．パストリス由来のこれまでに公知のＡＲＳ１配列よりも高い発現を示した。
【０１７０】
種々の成長条件下で、個々のＡＲＳプラスミドに関して、および同じプラスミドに関して細胞のプラスミド含有量を定量化するために実施したデジタルＰＣＲ実験により、ＣｂＡＲＳベースのプラスミドに関して、ＣＡＴ１−ＡＲＳベースのプラスミドと比較して、また３００ｍｇ／Ｌのゼオシンの存在下で成長させた細胞に関して、５０ｍｇ／Ｌと比較して、より高いプラスミド含有量が確認された。
【０１７１】
［実施例６］
ＡＲＳおよび転写のターミネーターとしてのＡＲＳの二機能性活性の分析
Ｃ．ボイジニイ（C. boidinii）ＰＡＯＤ１（Ｆ１）、ＰＡＲＳ１、ＣＡＴ１−ＡＲＳおよびＰＣＡＴ１の６９２ｂｐ長のバージョンからの最良の断片、ならびにコアプロモーターを有さないプロモーター（配列番号１３；最後の７８ｂｐ、ＴＡＴＡｂｏｘによる始まりが欠失された）を、転写化ターミネーターとしてそれらの活性に関して検査した。それらは、ｐＰｐＴ４＿ＳおよびｐＰｐＧＵＴＩベクター中に存在する選択マーカーに関するターミネーター、および最良のインハウスターミネーター（異種および相同的）と比較した。
【０１７２】
したがって、ターミネーターレポータープラスミドは、ＰＡＯＸ１およびｅＧＦＰレポーター遺伝子を含有するｐＰｐＴ４＿Ｓベクター（Ｎａａｔｓａａｒｉら  ２０１２年）に基づいて構築された（Ｖｏｇｌら  ２０１４年に報告されている）。存在するＡＯＸ１＊ターミネーターを、スタッファー断片で置き換えた。したがって、ベクターをＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで切断した。スタッファーとしてこれまでにすでに使用されているＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）由来のＴＨＩ５配列（Ｖｏｇｌら  ２０１５年）を再びスタッファー断片として使用し、プライマーｅＧＦＰ−ＳｃＴＨＩ５ｆｗｄ−ＧｉｂおよびｐＩＬＶ５−ＳｃＴＨＩ５ｒｅｖ−Ｇｉｂを使用して増幅させた。この場合、スタッファーは、ＢｍｒＩ部位に隣接せず（ＰＡＯＸ１がＢｍｒＩ部位を含有するため）、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ部位に隣接される。ＰＣＲ断片は、Ｇｉｂｓｏｎアッセンブリーによって（Ｇｉｂｓｏｎら  ２００９年）、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化したベクターバックボーンへクローニングされて、プライマーｓｅｑＥＧＦＰ−５２０．．５４３−ｆｗｄおよびｓｅｑ−ｐＩＬＶ５−１５０．．１７３−ｒｅｖを使用して配列決定することによって確認した。
【０１７３】
ターミネーターおよびＡＲＳは、表３に列挙されるプライマーを使用してＰＣＲ増幅され、ＧｉｂｓｏｎアッセンブリーまたはＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨＩＦＩ  ＤＮＡアッセンブリーキットによって、レポーターベクターへクローニングされた。あるいは、ＣＡＴ１−ＡＲＳは、二重鎖ＤＮＡ断片として指示されて、ベクターとの融合のために直接使用された（表３）。ターミネーターのシームレスな融合は、組換えクローニング手順によって制限部位除去に依存して達成された。ターミネーターは、プライマーｓｅｑＥＧＦＰ−５２０．．５４３−ｆｗｄおよびｓｅｑ−ｐＩＬＶ５−１５０．．１７３−ｒｅｖを使用して配列決定した。
【０１７４】
【表３】
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【０１７５】
Ｐ．パストリス形質転換に関して、構築物は、ゲノム組込みを容易にするために線状化されたＳｗａＩであった。スクリーニングの第１のラウンド後に、８０個を上回るクローンの発現景観の中央からの４つの代表的なクローンを、再スクリーニング用に選択して、単一コロニーに関して再度画線培養した。再スクリーニング後に、各構築物に関する１つの代表的なクローンが選択されて、構築物は全て、生物学的な七重反復で、１つの９６ウェルディープウェルプレートにおいて一緒に培養した。
【０１７６】
［実施例７］
ＡＲＳプラスミドに関する比較上の形質転換効率および発現収率
新たな異種Ｃ．ボイジニイ（C. Boidinii）ＡＲＳが、二重機能（ＡＲＳおよび転写ターミネーター）を有する短いＤＮＡ要素として使用される本発明者らの新たなエピソームＰ．パストリスプラスミドの形質転換効率を検査するために、コンピテントＰ．パストリスＢＧ１０による形質転換割合を、自己複製用の従来技術のＡＲＳ１配列の状態を用いるプラスミドと比較して決定した。
【０１７７】
２つのＡＲＳは、ＣＡＴ１−５００プロモーターを含有するｐＰｐＴ４＿Ｓへクローニングされた。ＡＯＤターミネーターは、ＳａｐＩおよびＫｐｎＩでベクターを消化することによって除去され、表ＸＹからのプライマーを用いてそれらを増幅させた後に、２つのＡＲＳは、組換えクローニングにより選択マーカーの後でシームレスにクローニングしされた（Ｇｉｂｓｏｎら  ２００９年）。
【０１７８】
多重クローニング部位は、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩでベクトルベクターを消化することによって除去されて、クローニングを容易にするスタッファーＤＮＡ断片としてｓｃＴＨＩ５の一部を含有するスタッファー断片（配列番号１４）およびＳａｐＩクローニングを可能にする制限部位で交換した。スタッファー断片は、表４に列挙したプライマーを使用して増幅され、Ｇｉｂｓｏｎアッセンブリーでクローニングした。その後、ｅＧＦＰは、ＳａｐＩクローニングを使用してベクターへクローニングされた。
【０１７９】
【表４】
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【０１８０】
形質転換効率を検査するために、ＰＡＲＳ１およびＣｂＡＲＳを含有するプラスミドならびにｐＰｐＴ４−Ｓ（線状化または環状）を１００ｎｇ／μｌに希釈して、エレクトロコンピテントＰ．パストリスＢＧ１０細胞へ形質転換した。１μｌを形質転換して、種々の希釈物１００μｌ（また、ｐＰｐＴ４−Ｓプラスミドに関しては、１０００μｌ）をＹＰＤ−Ｚｅｏプレート上へ平板培養した。
【０１８１】
表５は、Ｐ．パストリスＢＧ１０における高い形質転換割合を示す（９．５×１０５ｃｆｕ／μｇ）。選択マーカーカセットに関して同様にターミネーター（ＴＴ）としてＡＲＳおよびＣＡＴ１プロモーターの下流にあるレポーター遺伝子としてｅＧＦＰを含有する最終的なＡＲＳベクターに関して結果を示す。
【０１８２】
【表５】
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【０１８３】
形質転換効率は、異種Ｃ．ボイジニイ（C. Boidinii）ＡＲＳ  ＣｂＡＲＳに関して最も高かった。高い形質転換効率でさえ、ザイモリアーゼおよびミニプレップキットによる簡素なプラスミド単離後に、ピキア属（Pichia）の再形質転換を可能にする。より高いプラスミドコピー数を得るために、ピキア属（Pichia）からのプラスミド単離は、３００ｍｇ／Ｌのゼオシンを有するＹＰＤ中で成長させた５ｍｌのＯＮＣから実施した。ＯＣＮを収集して、ペレットを、酵母溶解緩衝液（１Ｍ  ソルビトール、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、１４ｍＭ  β−メルカプトエタノール）１ｍｌ中に再懸濁させた。その後、ザイモリアーゼストック（１０００Ｕ／ｍｌ）１００μｌを添加して、反応ミックスを３０℃で１時間インキュベートした。次に、最大速度で５分間の遠心分離によって、スフェロブラストを収集し、上清を除去して、ＧｅｎｅＪＥＴ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して、プラスミドを単離した。ＤＮＡをｄｄＨ２Ｏ  ２２μｌで溶出させて、ミニプレップ全体を、ピキア属（Pichia）形質転換に使用して、８４個の個々の形質転換体の培養液のｅＧＦＰ測定により、正確なプラスミドの存在が証明された。
【０１８４】
従来の増幅および大腸菌（E. coli）からの単離を伴わないピキア・パストリスから単離されるプラスミドＤＮＡによる直接的な形質転換からの形質転換体を図２４に示す。
選択マーカーに関して二機能性ＡＲＳおよびターミネーター配列として使用される種々の配列部分（ＡＲＳ１を有するＡ、Ｂ、ＣｂＡＲＳを有するＣ＆Ｄ）を有するエピソームプラスミドを使用したＰＣＡＴプロモーターの制御下にある個々の形質転換体のｅＧＦＰ発現（選択圧力を伴う、および伴わない）および自己プラスミド複製を図２５に示す。
【０１８５】
［実施例８］
ＣｂＡＲＳプラスミドベースの発現株の信頼性。
新たなエピソームプラスミドを用いるタンパク質発現の信頼性を検査するために、頻繁に使用される強力な構成的ＧＡＰプロモーター（ＰＧＡＰ）を使用して、新たな異種ＣｂＡＲＳ部分と組み合わせてｅＧＦＰ発現を駆動した。非常に一様でかつ高い発現レベルは、ＰＧＡＰおよびＣｂＡＲＳを含有するＺｅｏ  ＡＲＳプラスミドを用いて得られた。
【０１８６】
ＰＧＡＰは、ベクターおよびプロモーターのＰＣＲ産物（ｐＵＣｏｒｉ−ＳｗａＩ−ｐＧＡＰおよびｐＧＡＰｒｅｖ）を、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化することによって、実験７に記載するＳａｐＩクローニングベクターへクローニングされた後、ライゲーションを行った。その後、ｅＧＦＰは、ＳａｐＩクローニングを使用してベクターへクローニングされた。
【０１８７】
【表６】
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【０１８８】
環状プラスミドＤＮＡ  １０ｎｇを、Ｐ．パストリスＢＧ１０へ形質転換して、２１個の個々の形質転換体のＧＡＰプロモーター駆動型ｅＧＦＰ発現は、５０ｍｇ／Ｌのゼオシンを有するＹＰＤを使用した９６ウェルディープウェルプレートにおける６０時間の培養後に測定した。（図２６を参照）。
【０１８９】
［実施例９］
線状化および環状プラスミドＤＮＡによるＰ．パストリスの形質転換に関する株の比較
種々のＰ．パストリスプラットフォーム株の形質転換効率を評価するために、ＡＯＸ１遺伝子が崩壊されたコマガタエラ・ファフィイ（Komagataella phaffii）の野生型様株（ＷＴ）（Ｎａａｔｓａａｒｉら  ２０１２年に記載される株）およびさらにＫＵ７０遺伝子が崩壊されたＫ．ファフィイ（K. phaffii）株（ＢＳＹ１１ｄＫＵ７０）を、ＡＲＳ要素（ＰＣＡＴ１＿６９２）を有するか、または（ＰＣＡＴ１＿５００）を有さない、ＣＡＴ１プロモーターを含有する線状化（脱リン酸化を伴う、および伴わない）（異所的組込み用に非相同領域において切断される）および環状プラスミドＤＮＡによる形質転換に使用した。
【０１９０】
図２７に示すように、ＷＴ株において線状化プラスミド（脱リン酸化を伴う、および伴わない）を含有するＡＲＳを有する多数の形質転換体が観察されたのに対して、ＫＵ７０欠失株における形質転換体の数は、著しく低かった。したがって、本発明者らは、環状エピソームプラスミドへのベクターリレゲーションは、ＫＵ７０欠失株と比較して、ＷＴ株においてより高いと結論付けた。
【０１９１】
［実施例１０］
ピキア・パストリスにおける相同組換え（ＨＲ）クローニング
ピキア属（Pichia）においてＨＲクローニングのためにＣｂＡＲＳを使用する可能性を評価するために、ＰＧＡＰおよび選択用のゼオシン耐性遺伝子を含有する構成的発現ベクターを使用した。
【０１９２】
レポータータンパク質（ｅＧＦＰ）は、種々の長さの、５０〜５００ｂｐの範囲のベクターバックボーンに対する相同領域を用いて増幅させた。
ベクターバックボーン５ｎｇおよび３倍モル過剰の挿入片を、Ｐ．パストリスｄＫＵ７０株ＢＳＹ１１ｄＫＵ７０の同時形質転換に使用した（図２８）。
【０１９３】
ピキア属（Pichia）において非常に一般的であり、かつ断片の異所的組込みを引き起こす非相同的な末端結合が、この株において損なわれるため、ＫＵ７０欠失を有する株は、線状化ＤＮＡ断片の組込みを最低限に抑えるのに使用した（６）。ＧＯＩもまた、どこかでゲノムへ組み込むことができるため、ベクターベックボーンの、ゲノムへの組込みはまた、発現を示さずに、または低発現で、ゼオシン耐性を有するコロニーを発生させる可能性がある。
【０１９４】
図２８に示すように、ＨＲクローニングは、ちょうど５０ｂｐの短いオーバーハングと連動したが、より長い重複領域により形質転換効率の増加を示した。５００ｂｐへの増加は、いかなる改善も示さなかったため、２５０ｂｐの相同領域は、この設定では理想的であるようであった。この設定を用いて、およそ１０５ＣＦＵ／μｇに達した。再ライゲートされたベクターバックボーンを含有するまさに最小のバックグラウンドが観察された。
【０１９５】
発現ベクターの考え得る組込みを評価するために、形質転換体を、選択圧力ありおよびなしで（即ち、５０μｇ／ｍｌのゼオシンを有するＹＰＤ（ＹＰＤ−Ｚｅｏ）およびゼオシンを有さないＹＰＤ）、ディープウェルプレート（ＤＷＰ）中で培養および比較した。エピソーム的に発現プラスミドを保有する形質転換体は、多コピーに起因して、およびプラスミドが選択圧力を有さずに損失するようになるため、選択圧力下で発現レベルの上昇を示すべきである。発現カセットを組み込んだ形質転換体は、両方の条件下で類似して挙動すべきである。
【０１９６】
検査したコロニー（ｎ＝１８６、１つの重複長当たり４２）の１００％は、選択条件下で、非常により高いｅＧＦＰ発現レベルを示した。バックグラウンド対照からの形質転換体（即ち、形質転換に使用されるまさにベクターバックボーン）は、いかなる蛍光も示さなかった。したがって、本発明者らは、エピソーム発現プラスミドを含有すると結論付けた。
【０１９７】
環状ＡＲＳプラスミドが大量に形質転換で使用される場合の細胞１つ当たりの多重プラスミドの取込みは、これまでにすでに観察された。これは、ライブラリーを生成およびスクリーニングするのに望ましくない影響であり得るため、大量のＤＮＡおよび２５０ｂｐのベクターに対する相同領域を有する２つの異なるレポータータンパク質（ｅＧＦＰおよびｓＴｏｍａｔｏ）の形質転換を検査した（図２９）。
【０１９８】
種々の量のベクターバックボーンおよび２倍の量の挿入片を形質転換に使用した。
ＤＮＡ３μｇ（ベクターバックボーン１μｇおよび挿入片２μｇ）を用いた場合でさえ、形質転換体のちょうど３０％が、両方のレポータータンパク質の発現を示した。この大量のＤＮＡを用いた場合、最大５×１０６ＣＦＵ／μｇのベクターバックボーンに達した（図２９）。
【０１９９】
両方のプラスミドを保有する形質転換体を再度画線培養して、単一コロニーを、別のラウンドの培養に使用した。第２のラウンドでは、コロニーのいずれかに関して両方のレポータータンパク質の存在が検出されなかった。
【０２００】
これにより、数世代後に、単一細胞中にたった１つの変異体が存在するに過ぎないことが示される。
実験の詳細：
ｅＧＦＰおよびｓＴｏｍａｔｏを有するＨＲクローニングは、配列番号７２に記載するベクターを用いて実施した。ベクターは、ＳａｐＩで線状化して、ＨＲクローニングのためにゲル精製した。配列番号６として同定されるＡＲＳを使用した。
【０２０１】
種々の長さのベクターに対する相同領域を有するｅＧＦＰおよびｓＴｏｍａｔｏは、このベクターバックボーンのプロモーターおよびターミネーター領域において結合するプライマーを用いて増幅させた（表７）。レポータータンパク質に関する鋳型を生成するために、ｅＧＦＰおよびｓＴｏｍａｔｏを、ＳｐａＩクローニングを使用して、ＳａｐＩ線状化バックボーンへシームレスでクローニングした。
【０２０２】
ベクターバックボーンに対する重複領域を有する切断バックボーンおよび増幅挿入片を、同時形質転換に使用した。バックボーン５０ｎｇおよび３：１のモル比（挿入片：ベクター）を第１の検査に使用した。
【０２０３】
続く評価に関して、１つを上回る変異体が１つの細胞より採取される場合、２つの挿入片（即ち、２５０ｂｐの重複領域を有するｅＧＰＦおよびｓＴｏｍａｔｏ）を等量で混合し、混合物を、切断バックボーンによる同時形質転換に使用した。最大１μｇのバックボーンおよび２μｇの挿入片を有するより大量のＤＮＡを形質転換に使用した。
【０２０４】
ＰＣＲ産物は全て、形質転換前にゲル精製した。
【０２０５】
【表７】
2018533932.tif 000008
【０２０６】
［実施例１１］
抗体ライブラリーの生成
ｅＧＦＰを用いた検査後に、ＩｇＧ抗体（ハーセプチン、トラスツズマブ、Ｒｏｃｈｅ）発現ベクターに関する系の実現可能性を評価した。最大５：１の種々のモル比（挿入片：ベクター）およびより長い相同領域を使用したが、ＤＮＡの量は、ベクターバックボーン５０μｇを用いた場合、依然として低いままであった（図３０）。株ＢＳＹ１１ｄＫＵ７０は、上述するようにＨＲクローニングに使用した。
【０２０７】
より多くの挿入片の使用により、形質転換効率が増加し、２５０ｂｐ以上の長さの増加により、これ以上効率は改善されず、１０００ｂｐの非常に長い相同領域に関しては、さらには効率が減少したため、重複長に関する第１のプレ検査からの結果が確認された（図３０）。
【０２０８】
概して、形質転換後に、種々のサイズのコロニーが観察され（データは示していない）、したがって重複領域の各長さに関して大きなコロニーおよび小さなコロニーを、培養に関して選択した（図３１）。
【０２０９】
エピソームベクターとしての存在はまた、プラスミドをピキア属（Pichia）コロニーから単離すること、大腸菌（E. coli）を形質転換すること、続く制限分析、および配列決定することによって検査した（データは示していない）。検査した２４個のクローンは全て、正確なプラスミドを含有し、突然変異が重複領域に存在しなかったため、それらのちょうど２つが、おそらくＰＣＲ誤差に起因して、単一の点突然変異を保有した。
【０２１０】
抗体発現カセットの正確な組込みは、プラスミドを２４個の形質転換体から単離すること、続く挿入片の存在を調べるための制限分析、および組換えの領域を配列決定することによって調べた。検査したベクターは全て、陽性であり、それらのちょうど２つが、単一の点突然変異を含有し、それは、重複領域において位置されず、したがって、バックボーンおよび挿入片を増幅させる際にＰＣＲ誤差に起因して最も確かであった（データは示していない）。
【０２１１】
この見識を用いて、ＨＲクローニング系は、それが、抗体ライブラリー生成およびスクリーニングすること、挿入片としての２５０ｂｐ重複を有する抗体軽鎖（ＬＣ）の可変領域および重鎖の可変領域、定常領域などの他の抗体遺伝子を含有する発現ベクターの残余を用いることに関する最終的な用途で使用することができるように、スケールアップした。大きなライブラリーが、抗体変異体／突然変異体ＣＤＲ結合領域／突然変異体ＶＨまたはＶＬ配列の発見に必要とされるため、ベクターバックボーン１μｇおよび挿入片２μｇを形質転換に使用した。この系およびＢｉｏｇｒａｍｍａｔｉｃｓの凍結コンピテント細胞を用いて、３．５×１０６ＣＦＵ／ベクター１μｇの形質転換効率、およびまさにほとんど全ての１７０分の１の形質転換体を含有する再度ライゲートされたベクターが慣例的に何度も繰り返し達成された。
【０２１２】
この設定はまた、プレ検査において、常に小さなベクターバックボーンが使用されるために、より大きなベクターバックボーンが使用される場合に、形質転換効率が減少するが、最終的な用途では、効率はさらに高かったということは確かではない。
【０２１３】
大きなライブラリーが、抗体発見に必要とされるため、ベクターバックボーン１μｇおよび挿入片２μｇを形質転換に使用した。この系およびＢｉｏｇｒａｍｍａｔｉｃｓの凍結コンピテント細胞を用いた場合、３．５×１０６ＣＦＵ／ベクター１μｇの形質転換効率、およびまさにほとんど全ての１７０分の１の形質転換体を含有する再度ライゲートされたベクターが慣例的に何度も繰り返し達成された。
【０２１４】
実験の詳細
抗体構築物に関する初期ＨＲクローニング実験は、ベクターに対して種々の長さのオーバーハングを有する双方向的なプロモーターおよびシグナル配列も含むＩｇＧの全ＣＤＳを増幅すること（鋳型としての配列番号８５および表８に示すプライマー）によって実施した。同様に、ベクターバックボーンを、表８に列挙するプライマーおよび鋳型として配列番号８５に記載するベクターを使用してＰＣＲ増幅させた。バックボーン５０ｎｇおよび種々のモル比（１：１、３：１および５：１）の挿入片：ベクターバックボーンを形質転換に使用した。２５０〜１０００ｂｐの重複領域を試した。レポータータンパク質としてｅＧＦＰに関してすでにわかっているように、２５０ｂｐ以上の増加は、形質転換効率をさらに改善しなかったが、より多くの挿入片を使用した場合に、それは有意に高かった。
【０２１５】
この見識を用いて、その大量の挿入片により、本発明者らが試した効率が改善されて、大量のＤＮＡを使用することと、ＩｇＧの軽鎖のまさに可変領域を交換することによって、系を最終的な用途（即ち、抗体ライブラリーの生成）にとって実現可能にさせた。
【０２１６】
原理のこの最終的な証明は、軽鎖の可変領域（ベクターに対して適切な２５０ｂｐ長のオーバーハングを有する）およびベクターバックボーンを、表９に列挙するプライマーおよび鋳型として配列番号８６に記載するベクターを使用して増幅することによって実行した。
【０２１７】
バックボーン１μｇおよび挿入片２μｇを、Ｐ．パストリスＢＳＹ１１ｄＫＵ７０の同時形質転換に使用した。この設定を用いた場合、３×１０６ＣＦＵ／μｇを上回る形質転換効率が、慣例的に達成された（図３２）。
【０２１８】
ＰＣＲ産物は全て、形質転換前にゲル精製した。
【０２１９】
【表８】
2018533932.tif 000009
【０２２０】
【表９】
2018533932.tif 000010
【０２２１】
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【図１Ａ】
2018533932.tif 000011
【図１Ｂ】
2018533932.tif 000012
【図２Ａ】
2018533932.tif 000013
【図２Ｂ】
2018533932.tif 000014
【図２Ｃ】
2018533932.tif 000015
【図３Ａ】
2018533932.tif 000016
【図３Ｂ】
2018533932.tif 000017
【図３Ｃ】
2018533932.tif 000018
【図４Ａ】
2018533932.tif 000019
【図４Ｂ】
2018533932.tif 000020
【図４Ｃ】
2018533932.tif 000021
【図４Ｄ】
2018533932.tif 000022
【図５】
2018533932.tif 000023
【図６Ａ】
2018533932.tif 000024
【図６Ｂ】
2018533932.tif 000025
【図７Ａ】
2018533932.tif 000026
【図７Ｂ】
2018533932.tif 000027
【図８】
2018533932.tif 000028
【図９】
2018533932.tif 000029
【図１０】
2018533932.tif 000030
【図１１】
2018533932.tif 000031
【図１２】
2018533932.tif 000032
【図１３】
2018533932.tif 000033
【図１４】
2018533932.tif 000034
【図１５】
2018533932.tif 000035
【図１６】
2018533932.tif 000036
【図１７】
2018533932.tif 000037
【図１８】
2018533932.tif 000038
【図１９】
2018533932.tif 000039
【図２０】
2018533932.tif 000040
【図２１】
2018533932.tif 000041
【図２２】
2018533932.tif 000042
【図２３】
2018533932.tif 000043
【図２４】
2018533932.tif 000044
【図２５Ａ】
2018533932.tif 000045
【図２５Ｂ】
2018533932.tif 000046
【図２５Ｃ】
2018533932.tif 000047
【図２５Ｄ】
2018533932.tif 000048
【図２６】
2018533932.tif 000049
【図２７】
2018533932.tif 000050
【図２８】
2018533932.tif 000051
【図２９】
2018533932.tif 000052
【図３０】
2018533932.tif 000053
【図３１】
2018533932.tif 000054
【図３２】
2018533932.tif 000055
【図３３−１】
2018533932.tif 000056
【図３３−２】
2018533932.tif 000057
【図３３−３】
2018533932.tif 000058
【図３３−４】
2018533932.tif 000059
【図３３−５】
2018533932.tif 000060
【図３３−６】
2018533932.tif 000061
【国際調査報告】
2018533932.tif 000062
2018533932.tif 000063
2018533932.tif 000064
2018533932.tif 000065
2018533932.tif 000066
2018533932.tif 000067
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