(57)【要約】  記載される発明は、改善された安定性およびバイオアベイラビリティを有する、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のポリペプチドまたはその機能的等価物を含む医薬製剤を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療量の、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリペプチドまたはその機能的等価物を含み、前記ポリペプチドの安定性およびバイオアベイラビリティの保存により特徴付けられる医薬製剤。
【請求項２】
微粒子医薬製剤である、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３】
エアロゾル化医薬製剤である、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項４】
噴霧乾燥のプロセスにより調製される、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項５】
１％ｗ／ｗ固体を含む、請求項２に記載の医薬製剤。
【請求項６】
５％ｗ／ｗ固体を含む、請求項２に記載の医薬製剤。
【請求項７】
トレハロースをさらに含む、請求項２に記載の医薬製剤。
【請求項８】
アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の前記ポリペプチドまたはその機能的等価物および前記トレハロースは、それぞれ、８０／２０の比である、請求項７に記載の医薬製剤。
【請求項９】
前記ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはその機能的等価物および前記トレハロースは、それぞれ、９２．５／７．５の比である、請求項７に記載の医薬製剤。
【請求項１０】
前記機能的等価物はタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）である第１のポリペプチドと治療ドメイン（ＴＤ）である第２のポリペプチドの間の融合により製造される、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項１１】
前記タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）は、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、およびＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）のポリペプチドからなる群より選択され、第２のポリペプチドは、アミノ酸配列ＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の治療ドメイン（ＴＤ）である、請求項１０に記載の医薬製剤。
【請求項１２】
前記医薬製剤は乾燥粉末吸入装置（ＤＰＩ）により対象に送達される、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項１３】
生理食塩水をさらに含む、請求項３に記載の医薬製剤。
【請求項１４】
前記生理食塩水はＮａＣｌである、請求項１３に記載の医薬製剤。
【請求項１５】
アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の前記ポリペプチドまたはその機能的等価物は０．７ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項１３に記載の医薬製剤。
【請求項１６】
アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の前記ポリペプチドまたはその機能的等価物は７．０ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項１３に記載の医薬製剤。
【請求項１７】
前記機能的等価物はタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）である第１のポリペプチドと治療ドメイン（ＴＤ）である第２のポリペプチドの間の融合により製造される、請求項３に記載の医薬製剤。
【請求項１８】
前記タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）は、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、およびＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）のポリペプチドからなる群より選択され、第２のポリペプチドは、アミノ酸配列ＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の治療ドメイン（ＴＤ）である、請求項１７に記載の医薬製剤。
【請求項１９】
対象にネブライザーにより送達される、請求項３に記載の医薬製剤。
【請求項２０】
アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリペプチドまたはその機能的等価物およびナノポリプレックスポリマーのイオン性複合体を含み、前記イオン性複合体は、細胞内ｐＨ条件により選択された細胞内区画における前記イオン性複合体の解離により特徴付けられ、そのため、前記ペプチドの生理活性および安定性が保存される、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項２１】
前記ナノポリプレックスポリマーは、アニオン性かつエンドソーム溶解性である、請求項２０に記載の医薬製剤。
【請求項２２】
前記ナノポリプレックスポリマーは、ポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）である、請求項２１に記載の医薬製剤。
【請求項２３】
１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：１．５、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９および１：１０からなる群より選択される、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の前記ポリペプチドまたはその機能的等価物対ＰＰＡＡのチャージ比（ＣＲ）を含む、請求項２０に記載の医薬製剤。
【請求項２４】
前記チャージ比（ＣＲ）は１：３である、請求項２３に記載の医薬製剤。
【請求項２５】
前記ナノポリプレックスポリマーは、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）である、請求項２１に記載の医薬製剤。
【請求項２６】
前記機能的等価物は、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）である第１のポリペプチドと治療ドメイン（ＴＤ）である第２のポリペプチドの間の融合により製造される、請求項２０に記載の医薬製剤。
【請求項２７】
前記タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）は、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、およびＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）のポリペプチドからなる群より選択され、第２のポリペプチドは、アミノ酸配列ＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の治療ドメイン（ＴＤ）である、請求項２６に記載の医薬製剤。
【請求項２８】
対象に埋め込み装置により送達される、請求項２０に記載の医薬製剤。
【請求項２９】
対象に局所的に送達される、請求項２０に記載の医薬製剤。
【請求項３０】
対象に非経口的に送達される、請求項２０に記載の医薬製剤。
【請求項３１】
そのような治療を必要とする対象において移植血管誘導内膜過形成を治療するための方法であって、治療量の、アミノ配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のポリペプチドまたはその機能的等価物、およびナノポリプレックスポリマーを含む、請求項２０に記載の医薬製剤を投与することを含み、
前記治療量は、
ＭＫ２を阻害し；ならびに
移植血管誘導内膜過形成を治療するのに有効である、方法。
【請求項３２】
前記ナノポリプレックスポリマーは、アニオン性かつエンドソーム溶解性である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ナノポリプレックスポリマーは、ポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記医薬製剤は、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：１．５、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９および１：１０からなる群より選択される、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の前記ポリペプチドまたはその機能的等価物対ＰＰＡＡのチャージ比（ＣＲ）を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記チャージ比（ＣＲ）は１：３である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ナノポリプレックスポリマーは、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記機能的等価物は、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）である第１のポリペプチドと治療ドメイン（ＴＤ）である第２のポリペプチドの間の融合により製造される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）は、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、およびＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）のポリペプチドからなる群より選択され、第２のポリペプチドはアミノ酸配列ＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の治療ドメイン（ＴＤ）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記投与は、埋め込み装置による、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記投与は、局所投与による、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
前記投与は、非経口投与による、請求項３１に記載の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる、２０１５年１月８日に出願された、“ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＭＫ２  ＩＮＨＩＢＩＴＯＲ  ＰＥＰＴＩＤＥＳ”と題する米国仮特許出願第６２／１０１，１９０号の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
記載された本発明は、細胞および分子生物学、ポリペプチド、医薬製剤ならびに治療的使用方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
キナーゼ
キナーゼは、リン酸ドナー（通常はアデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ））から受容体基質へのホスホリル転移反応を触媒する遍在的酵素群である。全てのキナーゼは、本質的に同じホスホリル転移反応を触媒するが、それらは、その基質特異性、構造、およびそれらが参加する経路において著しい多様性を示す。全ての利用可能なキナーゼ配列（およそ６０，０００配列）の近年の分類は、キナーゼが、相同的な（共通の祖先に由来することを意味する）タンパク質の２５のファミリーに群分けし得ることを示している。これらのキナーゼファミリーは、構造的折り畳みの類似性に基づいて１２の折り畳み群に分類される。さらに、２５ファミリーのうち２２（全配列のおよそ９８．８％）が、構造的折り畳みが既知である１０の折り畳み群に属している。他の３つのファミリーのうち、ポリリン酸キナーゼは別個の折り畳み群を形成し、残り２つのファミリーは両方とも膜内在キナーゼであり、最後の折り畳み群を含む。これらの折り畳み群は、最も広範囲に認められるタンパク質折り畳みの幾つか、例えばロスマン様折畳み（トポロジー順序β−α−β−α−βで２つのαヘリックスによって連結される３つ以上のパラレルβ鎖）、フェレドキシン様折畳み（シグネイチャーβαββαβ二次構造をその骨格に沿って有する一般的なα＋βタンパク質）、ＴＩＭバレル折り畳み（ペプチド骨格に沿って交互に入れ替わる８つのαヘリックスおよび８つのパラレルβ鎖からなる保存されたタンパク質折り畳みを意味する）、およびアンチパラレルβバレル折り畳み（ベータバレルは、ツイストおよびコイルにより閉鎖構造を形成する大きなベータシートであり、第一の鎖が最後の鎖と水素結合する）を含むだけでなく、タンパク質構造の全ての主要なクラス（全てα、全てβ、α＋β、α／β）を含む。折り畳み群の中で、各ファミリーのヌクレオチド結合ドメインのコアは同じ構造様式を有し、タンパク質コアのトポロジーは同一であるか、または環の並べ替えによって関連している。折り畳み群内のファミリー間の相同性は意味しない。
【０００４】
グループＩ（２３，１２４配列）キナーゼは、タンパク質Ｓ／Ｔ−Ｙキナーゼ、非典型プロテインキナーゼ、脂質キナーゼ、およびＡＴＰグラスプ酵素を含み、タンパク質Ｓ／Ｔ−Ｙキナーゼ、および非典型プロテインキナーゼファミリーをさらに含む（２２．０７４配列）。これらのキナーゼとしては、コリンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３２）；プロテインキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３７）；ホスホリラーゼキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３８）；ホモセリンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３９）；Ｉ−ホスファチジルイノシトール４−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．６７）；ストレプトマイシン６−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．７２）；エタノールアミンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．８２）；ストレプトマイシン３’−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．８７）；カナマイシンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．９５）；５−メチルチオリボースキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１００）；ビオマイシンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１０３）；［ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ２）］キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１０９）；タンパク質チロシンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１１２）；［イソサイトレートデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰＨ＋）］キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１１６）；［ミオシン軽鎖］キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１１７）；ヒグロマイシン−Ｂキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１１９）；カルシウム／カルモジュリン依存プロテインキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１２３）；ロドプシンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１２５）；［ベータ−アドレナリン作動性受容体］キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１２６）；［ミオシン重鎖］キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１２９）；［タウタンパク質］キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１３５）；マクロライド２’−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１３６）；Ｉ−ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１３７）；［ＲＮＡ−ポリメラーゼ］−サブユニットキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１４１）；ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート３−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１５３）；およびホスファチジルイノシトール−４−ホスフェート３−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１５４）が挙げられる。グループＩは、脂質キナーゼファミリー（３２１配列）をさらに含む。これらのキナーゼとしては、Ｉ−ホスファチジルイノシトール−４−ホスフェート５−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．６８）；ＩＤ−ミオ−イノシトール−トリホスフェート３−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１２７）；イノシトール−テトラキスホスフェート５−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１４０）；Ｉ−ホスファチジルイノシトール−５−ホスフェート４−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１４９）；Ｉ−ホスファチジルイノシトール−３−ホスフェート５−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１５０）；イノシトール−ポリホスフェートマルチキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１５１）；およびイノシトール−ヘキサキホスフェートキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４２１）が挙げられる。グループＩは、ＡＴＰ−グラスプキナーゼ（７２９配列）をさらに含み、このキナーゼとしてはイノシトール−テトラキホスフェートＩ−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１３４）；ピルベート、ホスフェート二キナーゼ（ＥＣ２．７．９．１）；およびピルベート、水ジキナーゼ（ＥＣ２．７．９．２）が挙げられる。
【０００５】
グループＩＩ（１７，０７１配列）キナーゼは、ロスマン様キナーゼを含む。グループＩＩは、Ｐ−ループキナーゼファミリー（７，７３２配列）を含む。これらには、グルコノキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１２）；ホスホリブロキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１９）；チミジンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．２１）；リボシルニコチンアミドキナーゼ（ＥＣ２．７．１．２２）；デホスホ−ＣｏＡキナーゼ（ＥＣ２．７．１．２４）；アデニリルスルフェートキナーゼ（ＥＣ２．７．１．２５）；パントテン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．３３）；プロテインキナーゼ（細菌性）（ＥＣ２．７．１．３７）；ウリジンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４８）；シキメートキナーゼ（ＥＣ２．７．１．７１）；デオキシシチジンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．７４）；デオキシアデノシンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．７６）；ポリヌクレオチド５’−ヒドロキシル−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．７８）；６−ホスフォフルクト−２−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１０５）；デオキシグアノシンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１１３）；テトラアシルジサッカリド４’−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１３０）；デオキシヌクレオシドキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１４５）；アデノシルコビンアミドキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１５６）；ポリホスフェートキナーゼ（ＥＣ２．７．４．１）；ホスホメバロネートキナーゼ（ＥＣ２．７．４．２）：アデニレートキナーゼ（ＥＣ２．７．４．３）；ヌクレオシド−ホスフェートキナーゼ（ＥＣ２．７．４．４）；グアニレートキナーゼ（ＥＣ２．７．４．８）；チミジレートキナーゼ（ＥＣ２．７．４．９）；ヌクレオシド−トリホスフェート−アデニレートキナーゼ（ＥＣ２．７．４．１０）；（デオキシ）ヌクレオシド−ホスフェートキナーゼ（ＥＣ２．７．４．１３）；シチジレートキナーゼ（ＥＣ２．７．４．１４）；およびウリジレートキナーゼ（ＥＣ２．７．４．２２）が挙げられる。グループＩＩは、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼファミリー（８１５配列）をさらに含む。これらの酵素には、プロテインキナーゼ（ＨＰｒキナーゼ／ホスファターゼ）（ＥＣ２．７．１．３７）；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＧＴＰ）（ＥＣ．４．１．１．３２）；およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＡＴＰ）（ＥＣ４．１．１．４９）が挙げられる。グループＩＩは、ホスホグリセレートキナーゼ（１，３５１配列）ファミリーをさらに含む。これらの酵素は、ホスホグリセレートキナーゼ（ＥＣ２．７．２．３）およびホスホグリセレートキナーゼ（ＧＴＰ）（ＥＣ２．７．２．１０）を含む。グループＩＩは、アスパルトキナーゼファミリー（２，１７１配列）をさらに含む。これらの酵素には、カルバメートキナーゼ（ＥＣ２．７．２．２）；アスパルテートキナーゼ（ＥＣ２．７．２．４）；アセチルグルタメートキナーゼ（ＥＣ２．７．２．８１）；グルタメート５−キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）およびウリジレートキナーゼ（ＥＣ２．７．４）が挙げられる。グループＩＩは、ホスホフルクトキナーゼ様キナーゼファミリー（１，９９８配列）をさらに含む。これらの酵素としては、６−ホスホフルクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１１）；ＮＡＤ（＋）キナーゼ（ＥＣ２．７．１．２３）；Ｉ−ホスホフルクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５６）；ジホスフェート−フルクトース−６−ホスフェートＩ−ホスホトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．１．９０）；スフィンガニンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．９１）；ジアシルグリセロールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１０７）；およびセラミドキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１３８）が挙げられる。グループＩＩは、リボキナーゼ様ファミリー（２，７２２配列）をさらに含む。これらの酵素としては、グルコキナーゼ（ＥＣ２．７．１．２）；ケトヘキソキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３）；フルクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４）；６−ホスホフルクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１１）；リボキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１５）；アデノシンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．２０）；ピリドキサルキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３５）；２−デヒドロ−デオキシグルコノキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４５）；ヒドロキシメチルピリミジンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４９）；ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５０）；Ｉ−ホスホフルクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５６）；イノシンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．７３）；５−デヒドロ−２−デオキシグルコノキナーゼ（ＥＣ２．７．１．９２）；タガトース−６−ホスフェートキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１４４）；ＡＤＰ−依存ホスホフルクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１４６）；ＡＤＰ−依存グルコキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１４７）；およびホスホメチルピリミジンキナーゼ（ＥＣ２．７．４．７）が挙げられる。グループＩＩは、チアミンピロホスホキナーゼ（ＥＣ２．７．６．２）を含むチアミンピロホスホキナーゼファミリー（１７５配列）をさらに含む。グループＩＩは、グリセレートキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３１）を含むグリセレートキナーゼファミリー（１０７配列）をさらに含む。
【０００６】
グループＩＩＩキナーゼ（１０，９７３配列）は、フェロドキシン様折り畳みキナーゼを含む。グループＩＩＩは、ヌクレオシド−ジホスフェートキナーゼファミリー（９２３配列）をさらに含む。これらの酵素は、ヌクレオシド−ジホスフェートキナーゼ（ＥＣ２．７．４．６）を含む。グループＩＩＩは、ＨＰＰＫキナーゼファミリー（６０９配列）をさらに含む。これらの酵素は、２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンピロホスホキナーゼ（ＥＣ２．７．６．３）を含む。グループＩＩＩは、グアニドキナーゼファミリー（３２４配列）をさらに含む。これらの酵素としては、グアニドアセテートキナーゼ（ＥＣ２．７．３．１）；クレアチンキナーゼ（ＥＣ２．７．３．２）；アルギニンキナーゼ（ＥＣ２．７．３．３）；およびロンブリシンキナーゼ（ＥＣ２．７．３．５）が挙げられる。グループＩＩＩは、ヒスチジンキナーゼファミリー（９，１１７配列）をさらに含む。これらの酵素としては、プロテインキナーゼ（ヒスチジンキナーゼ）（ＥＣ２．７．１．３７）；［ピルベートデヒドロゲナーゼ（リポアミド）］キナーゼ（ＥＣ２．７．１．９９）；および［３−メチル−２−オキシブタノエートデヒドロゲナーゼ（リポアミド）］キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１１５）が挙げられる。
【０００７】
グループＩＶキナーゼ（２，７６８配列）は、リボヌクレアーゼＨ様キナーゼを含む。これらの酵素としては、ヘキソキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１）；グルコキナーゼ（ＥＣ２．７．１．２）；フルクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４）；ラミュロキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５）；マンノキナーゼ（ＥＣ２．７．１．７）；グルコノキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１２）；Ｌ−リブロキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１６）；キシルロキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１７）；エリスリトールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．２７）；グリセロールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３０）；パントテン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．３３）；Ｄ−リブロキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４７）；Ｌ−フコロキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５１）；Ｌ−キシルロキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５３）；アロースキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５５）；２−デヒドロ−３−デオキシガラクトノキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５８）；Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５９）；Ｎ−アシルマンノサミンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６０）；ポリホスフェート−グルコースホスホトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．１．６３）；ベータ−グルコシドキナーゼ（ＥＣ２．７．１．８５）；アセテートキナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）；ブチレートキナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）；分枝鎖脂肪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１４）；およびプロピオン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１５）が挙げられる。
【０００８】
グループＶキナーゼ（１，１１９配列）は、ＴＩＭβ−バレルキナーゼを含む。これらの酵素は、ピルビン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）を含む。
【０００９】
グループＶＩキナーゼ（８８５配列）は、ＧＨＭＰキナーゼを含む。これらの酵素としては、ガラクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６）；メバロネートキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３６）；ホモセリンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３９）；Ｌ−アラビノキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４６）；フコキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５２）；シキメートキナーゼ（ＥＣ２．７．１．７１）；４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリオキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１４８）；およびホスホメバロネートキナーゼ（ＥＣ２．７．４．２）が挙げられる。
【００１０】
グループＶＩＩキナーゼ（１，８４３配列）は、ＡＩＲシンターゼ様キナーゼを含む。これらの酵素としては、チアミン−ホスフェートキナーゼ（ＥＣ２．７．４．１６）およびセレニド、水ジキナーゼ（ＥＣ２．７．９．３）が挙げられる。
【００１１】
グループＶＩＩＩキナーゼ（５６５配列）は、リボフラビンキナーゼ（５６５配列）を含む。これらの酵素は、リボフラビンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．２６）を含む。
【００１２】
グループＩＸキナーゼ（１９７配列）は、ジヒドロキシアセトンキナーゼを含む。これらの酵素は、グリセロンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．２９）を含む。
【００１３】
グループＸキナーゼ（１４８配列）は、推定グリセレートキナーゼを含む。これらの酵素は、グリセレートキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３１）を含む。
【００１４】
グループＸＩキナーゼ（４４６配列）は、ポリホスフェートキナーゼを含む。これらの酵素は、ポリホスフェートキナーゼ（ＥＣ２．７．４．１）を含む。
【００１５】
グループＸＩＩキナーゼ（２６３配列）は、膜内在キナーゼを含む。グループＸＩＩは、ドリコールキナーゼファミリーを含む。これらの酵素は、ドリコールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１０８）を含む。グループＸＩＩは、ウンデカプレノールキナーゼファミリーをさらに含む。これらの酵素は、ウンデカプレノールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６６）を含む。
【００１６】
キナーゼは多数の細胞代謝経路およびシグナル伝達経路で必須の役割を果たし、構造レベル、生化学レベルおよび細胞レベルで最もよく研究された酵素の１つである。全てのキナーゼが同じリン酸ドナー（ほとんどの場合ＡＴＰ）を用い、見かけ上同じホスホリル転移反応を触媒するという事実にもかかわらず、それらは、その構造的折り畳みおよび基質認識メカニズムにおいて顕著な多様性を示す。これはおそらく、主にそれらの基質の構造および特性の多様な性質のためである。
【００１７】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）活性化プロテインキナーゼ（ＭＫ２およびＭＫ３）
ＭＡＰＫ活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰ−ＫＡＰＫ）の異なる群が、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の下流で規定されてきた。これらの酵素は、ＭＡＰＫの直接的基質ではない標的タンパク質にシグナルを伝達し、それゆえＭＡＰＫカスケードによるリン酸化依存性シグナル伝達を多様な細胞機能に中継するように働く。これらの群の１つは、３つのＭＡＰＫＡＰＫ：即ち、ＭＫ２、ＭＫ３（３ｐＫとしても公知）およびＭＫ５（ＰＲＡＫとも称される）によって形成される。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２（「ＭＡＰＫＡＰＫ２」、「ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２」、「ＭＫ２」とも称される）は、セリン／トレオニン（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）プロテインキナーゼファミリーのキナーゼである。ＭＫ２は、ＭＫ３に対して高度に相同である（およそ７５％のアミノ酸同一性）。ＭＫ２およびＭＫ３のキナーゼドメインは、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（ＣａＭＫ）、ホスホリラーゼｂキナーゼ、およびリボソームＳ６キナーゼ（ＲＳＫ）アイソフォームのＣ−末端キナーゼドメイン（ＣＴＫＤ）と最も類似する（約３５％〜４０％同一）。ＭＫ２遺伝子は、２つの選択的にスプライスされる転写産物の３７０アミノ酸（ＭＫ２Ａ）および４００アミノ酸（ＭＫ２Ｂ）をコードする。ＭＫ３遺伝子は、３８２アミノ酸の１つの転写産物をコードする。ＭＫ２およびＭＫ３タンパク質は高度に相同であるが、ＭＫ２Ａはより短いＣ−末端領域を有する。ＭＫ２ＢのＣ−末端は、より短いＭＫ２Ａアイソフォームには存在しない、二つの部分に分かれる機能的な核局在化配列（ＮＬＳ）（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）を有しており、選択的スプライシングがＭＫ２アイソフォームの細胞内局在化を決定することを示している。ＭＫ３は、類似の核局在化配列を有する。ＭＫ２ＢおよびＭＫ３の両方で見出されるこの核局在化配列は、ｐ３８αおよびｐ３８βと、ＭＫ２ＢおよびＭＫ３との特異的な相互作用を媒介することが示されたＤドメイン（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）を包含する。ＭＫ２ＢおよびＭＫ３はまた、ＮＬＳおよびＤドメインに対してＮ−末端に位置する機能的な核外移送シグナル（ＮＥＳ）を有する。ＭＫ２Ｂ中のＮＥＳは、刺激に続く核外移送（レプトマイシンＢによって阻害され得る過程）を惹起するのに十分である。ＭＫ２およびＭＫ３の触媒ドメインに対してＮ−末端の配列は、プロリンに富み、１つ（ＭＫ３）または２つ（ＭＫ２）の推定Ｓｒｃ相同性３（ＳＨ３）ドメイン−結合部位を含み、複数の研究で、ＭＫ２がインビトロでｃ−Ａｂ１のＳＨ３ドメインへの結合を媒介することが示された。近年の研究は、このドメインがＭＫ２媒介性の細胞遊走に関与することを示唆する。
【００１８】
ＭＫ２ＢおよびＭＫ３は主に休止細胞の核に存在し、一方でＭＫ２Ａは細胞質に存在する。ＭＫ２ＢおよびＭＫ３の両方が、ストレス刺激時に染色体領域維持タンパク質（ＣＲＭ１）依存性メカニズムを介して細胞質に急速に移送される。キナーゼの活性化ループ内のＴｈｒ３３４のホスホミメティック突然変異はＭＫ２Ｂの細胞質局在化を増進するため、ＭＫ２Ｂの核外移送はキナーゼ活性化によって媒介されるようである。理論に拘束されるわけではないが、ＭＫ２ＢおよびＭＫ３は、構成的に活性な核局在化シグナル（ＮＬＳ）およびリン酸化で調節される核外移行シグナル（ＮＥＳ）を含み得ると考えられる。
【００１９】
ＭＫ２およびＭＫ３は普遍的に発現するようであるが、心臓、肺、腎臓、生殖器（乳房および精巣）、皮膚および骨格筋組織、ならびに免疫関連細胞、例えば白血球細胞／白血球および樹状細胞において相対的に発現が増加する。
【００２０】
活性化
ｐ３８αおよびｐ３８βの様々なアクチベーターが、ＭＫ２およびＭＫ３活性を強力に刺激する。ｐ３８は、４つのプロリン指定部位（Ｔｈｒ２５、Ｔｈｒ２２２、Ｓｅｒ２７２およびＴｈｒ３３４）でＭＫ２のインビトロおよびインビボリン酸化を媒介する。これらの部位のうち、Ｔｈｒ２５のみがＭＫ３で保存されていない。理論に拘束されるわけではないが、リン酸化Ｔｈｒ２５の機能は不明であるが、２つのＳＨ３ドメイン結合部位の間でのその位置は、それがタンパク質−タンパク質相互反応を調節する可能性があることを示唆している。ＭＫ２中のＴｈｒ２２２（ＭＫ３ではＴｈｒ２０１）は、キナーゼドメインの活性化ループ内に存在し、ＭＫ２およびＭＫ３キナーゼ活性のために必須であることが示された。ＭＫ２中のＴｈｒ３３４（ＭＫ３ではＴｈｒ３１３）は、触媒ドメインに対してＣ−末端に位置し、キナーゼ活性に必須である。ＭＫ２の結晶構造が解明されており、理論に拘束されるわけではないが、Ｔｈｒ３３４のリン酸化がＭＫ２の核内外移送のスイッチとして働き得ることを示唆する。Ｔｈｒ３３４のリン酸化はまた、触媒ドメインへのＭＫ２のＣ−末端の結合を弱めるかまたは妨害して、ＮＥＳを露出させて核外移送を促進できる。
【００２１】
ｐ３８は核内でＭＫ２およびＭＫ３を活性化できる一方で、実験的証拠から、ＭＫ２およびＭＫ３の活性化および核外移送が、ｐ３８の安定化および局在化も指令するリン酸化依存性立体構造スイッチと連動すること、ならびにｐ３８そのものの細胞内の位置はＭＫ２およびおそらくＭＫ３によって制御されると示唆されることが、複数の研究から示されている。さらに別の研究から、核のｐ３８が、ＭＫ２のリン酸化および活性化に続きＭＫ２との複合体中で細胞質へと移送されることが示された。ｐ３８レベルがＭＫ２欠乏細胞中で低く、触媒的に不活性なＭＫ２タンパク質の発現がｐ３８レベルを回復させることを、複数の研究が示しているため、ｐ３８とＭＫ２との間の相互作用はｐ３８の安定化のために重要であり得る。
【００２２】
基質および機能
ＭＫ２は、多くの基質をＭＫ３と共有する。両酵素は、同等の基質優先性を有し、ペプチド基質を類似の速度定数でリン酸化する。ＭＫ２による効率的なリン酸化に必要な最小の配列はＨｙｄ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−ｐＳｅｒ／ｐＴｈｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）であることが見出された（ここでＨｙｄは、大きな疎水性残基である）。
【００２３】
蓄積した研究により、ＭＫ２は様々なタンパク質をリン酸化することが示されており、それらとしては、５−リポオキシゲナーゼ（ＡＬＯＸ５）、細胞分裂周期２５ホモログＢ（ＣＤＣ２５Ｂ）、細胞分裂周期２５ホモログＣ（ＣＤＣ２５Ｃ）、胚致死性異常視覚ドロソフィラ様１（ＥＬＡＶＬ１）、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ａ０（ＨＮＲＮＰＡ０）、熱ショックファクタータンパク質１（ＨＳＦ１）、熱ショックタンパク質ベータ−１（ＨＳＰＢ１）、ケラチン１８（ＫＲＴ１８）、ケラチン２０（ＫＲＴ２０）、ＬＩＭドメインキナーゼ１（ＬＩＭＫ１）、リンパ球特異的タンパク質１（ＬＳＰ１）、ポリアデニル酸結合タンパク質１（ＰＡＢＰＣ１）、ポリ（Ａ）特異的リボヌクレアーゼ（ＰＡＲＮ）、ＣＡＭＰ特異的３’，５’−環状ホスホジエステラーゼ４Ａ（ＰＤＥ４Ａ）、ＲＣＳＤドメイン含有１（ＲＣＳＤ１）、リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ、９０ｋＤａ  ポリペプチド３（ＲＰＳ６ＫＡ３）、ＴＧＦ−ベータ活性化キナーゼ１／ＭＡＰ３Ｋ７結合タンパク質３（ＴＡＢ３）、およびトリステトラプロリン（ＴＴＰ／ＺＦＰ３６）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２４】
熱ショックタンパク質ベータ−１（ＨＳＰＢ１またはＨＳＰ２７とも称される）は、正常細胞中に普遍的に存在しており、低分子量熱ショックタンパク質ファミリーのメンバーであるストレス誘導性細胞質タンパク質である。ＨＳＰＢ１の合成は熱ショックおよび他の環境または病態生理学的ストレス、例えばＵＶ照射、低酸素および虚血により誘導される。熱耐性におけるその推定役割に加えて、ＨＳＰＢ１は、ストレス条件に曝露された細胞の生存および回復に関与する。
【００２５】
実験的証拠は、サイトカイン生合成および細胞遊走の調節におけるｐ３８の役割を支持している。マウスでのｍｋ２遺伝子の標的欠失は、ｐ３８が多くの類似のキナーゼの活性化を媒介するにもかかわらず、ＭＫ２がこれらのｐ３８依存性の生物学的過程を担う重要なキナーゼと思われることを示唆している。ＭＫ２の損失は、（ｉ）サイトカイン、例えば腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、およびガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ））のリポ多糖類（ＬＰＳ）誘導性の合成の欠如、ならびに（ｉｉ）マウス胚線維芽細胞、平滑筋細胞、および好中球の遊走における変化、をもたらす。
【００２６】
炎症および免疫応答におけるＭＫ２の役割と一致して、ＭＫ２欠損マウスは、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）感染に対する感受性の上昇および巣状虚血に続く炎症媒介性神経細胞死の減少を示した。ＭＫ２欠損細胞中でｐ３８タンパク質レベルはまた有意に低下するため、これらの表現型がＭＫ２の損失のみによるものか否かを識別する必要が有った。これを達成するために、ＭＫ２変異体をＭＫ２欠損細胞中で発現させ、その結果は、ＭＫ２の触媒活性はｐ３８レベルの回復に必要ではないが、サイトカイン生合成の調節には要求されることを示した。
【００２７】
ＭＫ２のノックアウトまたはノックダウン研究は、活性化ＭＫ２は、ＩＬ−６ｍＲＮＡの高ＡＵ−３’非翻訳領域と相互作用するタンパク質のリン酸化を介してＩＬ−６ｍＲＮＡの安定性を強化することを強く裏づける。特に、ＭＫ２は、ｈｎＲＮＰＡ０（ＩＬ−６  ＲＮＡを安定化するｍＲＮＡ結合タンパク質）のリン酸化を主に担うことが示された。加えて、多様な炎症疾患を究明する幾つかのさらに別の研究から、炎症促進性サイトカイン、例えばＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−８のレベルが、安定した慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の患者からの、または喫煙者の肺胞マクロファージからの誘発喀痰中で増加することが見出された（Ｋｅａｔｉｎｇｓ  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ，  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，  １９９６，  １５３：５３０−５３４；Ｌｉｍ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，  ２０００，  １６２：１３５５−１３６０）。
【００２８】
ｍＲＮＡ翻訳の調節
ＭＫ２ノックアウトマウスまたはＭＫ２欠損細胞を用いた過去の研究では、ＭＫ２がそのｍＲＮＡの翻訳速度を高めることによってＴＮＦ−α、ＩＬ−１およびＩＬ−６を含む炎症性サイトカインの生成を増加させることが示された。ＴＮＦ−αの転写、プロセシング、および放出における有意な減少は、ＭＫ２欠損マウスでは検出され得なかった。ｐ３８経路はｍＲＮＡ安定性の調節に重要な役割を果たすことが知られており、ＭＫ２は、それによってｐ３８がこの機能を媒介するおそらく標的である。ＭＫ２欠損マウスを利用する研究で、ＭＫ２の触媒活性がサイトカイン生成および遊走への影響に必要であることが示され、理論に拘束されるわけではないが、ＭＫ２は、ｍＲＮＡ安定性に関与する標的をリン酸化することが示唆される。これと一致して、ＭＫ２は、異種の核リボヌクレオタンパク質（ｈｎＲＮＰ）Ａ０、トリステトラプロリン（ＴＴＰ）、ポリ（Ａ）−結合タンパク質ＰＡＢＰ１、およびＨｕＲ（ＲＮＡ結合タンパク質のＥＬＡＶ（ドロソフィラ・メラノガスターでの胚致死性異常の視覚（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−Ｌｅｔｈａｌ  Ａｂｎｏｒｍａｌ  Ｖｉｓｕａｌ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ファミリーの遍在的に発現されるメンバー）に結合し、および／またはこれらをリン酸化することが示された。これらの基質は、その３’−非翻訳領域に高ＡＵ要素を含むｍＲＮＡに結合またはそれらと共精製されることが知られており、ＭＫ２がＴＮＦ−αなどの高ＡＵ  ｍＲＮＡの安定性を調節し得ることが示唆される。現在、ＭＫ３が類似の役割を果たすか否かは不明であるが、ＭＫ２欠損線維芽細胞のＬＰＳ処置はｈｎＲＮＰ  Ａ０のリン酸化を完全に消失させるため、ＭＫ３がＭＫ２の欠損を補填し得ないことが示唆される。
【００２９】
ＭＫ３は、ＭＫ２と一緒に真核細胞伸長因子２（ｅＥＦ２）キナーゼのリン酸化に加わる。ｅＥＦ２キナーゼは、ｅＥＦ２をリン酸化しこれを不活化する。ｅＥＦ２活性は、翻訳時のｍＲＮＡの伸長に必須であり、Ｔｈｒ５６上でのｅＥＦ２のリン酸化は、ｍＲＮＡ翻訳の終了をもたらす。Ｓｅｒ３７７上でのｅＥＦ２キナーゼのＭＫ２およびＭＫ３リン酸化は、これらの酵素がｅＥＦ２キナーゼ活性をモジュレートし、それによってｍＲＮＡ翻訳伸長を調節し得ることを示唆している。
【００３０】
ＭＫ２およびＭＫ３による転写調節
核内ＭＫ２は、多くのＭＫと同様に、ｃＡＭＰ応答配列結合（ＣＲＥＢ）、活性化転写因子−１（ＡＴＦ−１）、血清応答因子（ＳＲＦ）、および転写因子ＥＲ８１のリン酸化に寄与する。野生型細胞およびＭＫ２欠損細胞の比較によって、ＭＫ２がストレスによって誘発される主要なＳＲＦキナーゼであることが明らかになり、ストレス媒介性の即時初期応答におけるＭＫ２の役割が示唆される。ＭＫ２およびＭＫ３の両方が、インビボで塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス転写因子Ｅ４７と相互作用し、インビトロでＥ４７をリン酸化する。Ｅ４７のＭＫ２媒介リン酸化はＥ４７の転写活性を抑制しそれによってＥ４７依存性遺伝子発現を阻害することが見出されており、ＭＫ２およびＭＫ３が組織特異性遺伝子発現および細胞分化を調節し得ることが示唆される。
【００３１】
ＭＫ２およびＭＫ３の他の標的
幾つかの生物学的過程におけるＭＫ２およびＭＫ３の多様な機能を反映して、幾つかの他のＭＫ２およびＭＫ３の基質もまた同定されている。足場となるタンパク質１４−３−３ζは、生理学的なＭＫ２基質である。複数の研究から、１４−３−３ζがプロテインキナーゼ、ホスファターゼ、および転写因子を含む細胞シグナル伝達経路の多数の成分と相互作用することが示される。また別の研究では、Ｓｅｒ５８上での１４−３−３ζのＭＫ２媒介リン酸化がその結合活性を損なうことが示され、ＭＫ２が、通常は１４−３−３ζによって調節される幾つかのシグナル伝達分子の調節に影響を及ぼし得ることが示唆される。
【００３２】
さらに別の研究で、ＭＫ２がまた、Ｓｅｒ７７上で７員のＡｒｐ２およびＡｒｐ３複合体のｐ１６サブユニット（ｐ１６−Ａｒｃ）と相互作用し、これをリン酸化することが示された。ｐ１６−Ａｒｃはアクチン細胞骨格の調節において役割を有し、ＭＫ２がこの過程に関与し得ることが示唆される。さらなる研究により、低分子量熱ショックタンパク質ＨＳＰＢ１、リンパ球特異的タンパク質ＬＳＰ−１、およびビメンチンはＭＫ２によりリン酸化されることが示されている。ＨＳＰＢ１は特に興味深く、というのも、これは大きなオリゴマーを形成するからであり、これは分子シャペロンとして機能し、細胞を熱ショックおよび酸化ストレスから保護することができる。リン酸化されると、ＨＳＰＢ１は、その大きなオリゴマーを形成する能力を失い、アクチン重合をブロックすることができなくなり、ＨＳＰＢ１のＭＫ２媒介リン酸化は、そうでなければストレス中に不安定化されるであろうアクチンダイナミクスの調節を目的とする恒常性維持機能を果たすことが示唆される。ＭＫ３はまた、ＨＳＰＢ１をインビトロおよびインビボでリン酸化することが示されているが、ストレス条件中のその役割はまだ解明されていない。
【００３３】
ＨＳＰＢ１はポリユビキチン鎖に、および２６Ｓプロテアソームにインビトロおよびインビボで結合することもまた示された。ユビキチン−プロテアソーム経路はその主インヒビターであるＩカッパＢ−アルファ（ＩκＢ−α）を分解することにより転写因子ＮＦ−カッパＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化に関与し、ＨＳＰＢ１の過剰発現はＮＦ−カッパＢ（ＮＦ−κＢ）核再局在化、ＤＮＡ結合、およびエトポシド、ＴＮＦ−α、およびインターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）により誘導される転写活性を増加させることが示された。加えて、以前の研究により、ＨＳＰＢ１は、ストレス条件下で、ユビキチン化タンパク質、例えばリン酸化ＩカッパＢ−アルファ（ＩκＢ−α）の分解を促進すること；ならびにＨＳＰＢ１のこの機能がＮＦ−カッパＢ（ＮＦ−κＢ）活性の増強によるその抗アポトーシス特性の一因となっていることことが示唆される（Ｐａｒｃｅｌｌｉｅｒ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  ２３（１６）：  ５７９０−５８０２，  ２００３）。
【００３４】
ＭＫ２およびＭＫ３はまた、５−リポキシゲナーゼをリン酸化し得る。５−リポキシゲナーゼは、炎症媒介物質ロイコトリエンの形成における最初の過程を触媒する。チロシンヒドロキシラーゼ、グリコーゲンシンターゼ、およびＡｋｔもまた、ＭＫ２によってリン酸化されることが示された。最後に、ＭＫ２は、腫瘍サプレッサータンパク質ツベリンをＳｅｒ１２１０上でリン酸化し、１４−３−３ζのためのドッキング部位を生じる。通常ツベリンおよびハマルチンは機能的複合体を形成し、この複合体はｍＴＯＲ依存性シグナル伝達と拮抗することによって細胞成長を負の方向に調節することから、ＭＫ２のｐ３８媒介活性化は、ツベリンに結合する１４−３−３ζを増加させることによって細胞成長を調節し得ることが示唆される。
【００３５】
蓄積した研究により、ｐ３８ＭＡＰＫ−経路とシグナル伝達性転写因子３（ＳＴＡＴ３）媒介シグナル伝達の間の相互クロストークは、リポ多糖（ＬＰＳ）チャレンジモデルにおいて連続的に活性化される重大な軸を形成することが示唆されている。この軸の平衡活性化は炎症マクロファージ応答の誘導および伝播の両方ならびに消散期の制御には必須であり、これは、主にＩＬ−１０および持続ＳＴＡＴ３活性化により駆動されることが示された（Ｂｏｄｅ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，  ２４：  １１８５−１１９４，  ２０１２）。加えて、別の研究により、ＭＫ２は、ＬＰＳ誘導ｐ６５およびＩＲＦ３媒介シグナル伝達に対するＭＫ３の負制御効果を中和することにより、ＬＰＳ−誘導性ＩＦＮβ遺伝子発現およびその後のＳＴＡＴ３のＩＦＮβ媒介活性化を制御することが示される。研究により、ｍｋ２／３ノックアウトマクロファージでは、ＩＦＮβ依存性ＳＴＡＴ３活性化がＩＬ−１０とは独立して起こることがさらに示され、というのも、ＩＦＮβ−と対照的に、障害されたＩＬ−１０の発現は、ｍｋ２／３ノックアウトマクロファージにおいてＭＫ３の追加の欠失で保存されない（Ｅｈｌｔｉｎｇ、Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２８５（２７）：  ２４１１３−２４１２４）。
【００３６】
キナーゼの阻害
真核細胞のプロテインキナーゼは、それらの触媒ドメインのおかげで関係する相同性タンパク質の最大のスーパーファミリーの１つを構成する。最も関係の深いプロテインキナーゼは、セリン／トレオニンリン酸化またはチロシンリン酸化のいずれかに特異的である。プロテインキナーゼは、細胞外刺激に対する細胞応答で不可欠の役割を果たす。したがって、プロテインキナーゼの刺激は、シグナル伝達系における最も一般的な活性化メカニズムの１つと考えられる。多くの基質が多数のプロテインキナーゼによってリン酸化を受けることが知られており、様々なプロテインキナーゼの触媒ドメインの一次配列に関するかなり多くの情報が発表されている。これらの配列は、ＡＴＰ結合、触媒、および構造的完全性の維持に関与する多数の残基を共有する。ほとんどのプロテインキナーゼは、よく保存された３０〜３２ｋＤａの触媒ドメインを有する。
【００３７】
複数の研究で、プロテインキナーゼの調節要素の同定および利用が試みられた。これらの調節要素としては、阻害剤、抗体、および遮断ペプチドが挙げられる。
【００３８】
阻害剤
酵素阻害剤は酵素と結合し、それによって酵素活性を低下させる分子である。阻害剤の結合は、基質の酵素活性部位への侵入を停止させ、そして／または酵素がその反応を触媒するのを妨害できる（キナーゼのＡＴＰ結合部位に対する阻害剤におけるように）。阻害剤の結合は、不可逆性または可逆性である。不可逆的阻害剤は通常、酵素と反応し、酵素がもはやその反応を触媒できないようにその酵素を化学的に変化させる（例えば、酵素活性に必要とされる重要なアミノ酸残基を修飾することによって）。対照的に、可逆性阻害剤は非共有結合によって結合し、これらの阻害剤が酵素、酵素−基質複合体、またはその両方を結合するか否かに応じて異なるタイプの阻害が生成される。
【００３９】
酵素阻害剤は多くの場合、その特異性および能力によって評価される。「特異性」という用語は、本明細書では、阻害剤の選択的結合または他のタンパク質へのその結合の欠如を指す。「能力」という用語は、本明細書では、酵素の阻害に必要とされる阻害剤の濃度を示す、阻害剤の解離定数を指す。
【００４０】
プロテインキナーゼの阻害剤は、プロテインキナーゼ活性調節のツールとして用いるために研究されてきた。阻害剤は、例えばサイクリン依存性（Ｃｄｋ）キナーゼ、ＭＡＰキナーゼ、セリン／トレオニンキナーゼ、Ｓｒｃファミリータンパク質チロシンキナーゼ、カルモジュリン（ＣａＭ）キナーゼ、カゼインキナーゼ、チェックポイントキナーゼ（Ｃｈｋｌ）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１（ＭＥＫ）、ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）、プロテインキナーゼＡ、Ａｋｔ（プロテインキナーゼＢ）、プロテインキナーゼＣ、プロテインキナーゼＧ、タンパク質チロシンキナーゼ、Ｒａｆキナーゼ、およびＲｈｏキナーゼと共に使用するために研究されてきた。
【００４１】
低分子ＭＫ２阻害剤
他のキナーゼに対して少なくとも中程度の選択性を有する、ＭＫ２を標的にする個々の阻害剤が設計されてきたが、有利な溶解度および透過性を有する化合物を作製することは困難であった。その結果、インビボ前臨床研究に進んだ生化学的に効率的なＭＫ２阻害剤は比較的まれである（Ｅｄｍｕｎｄｓ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｔａｌａｎｉａｎ，  ＭＡＰＫＡＰ  Ｋｉｎａｓｅ  ２  （ＭＫ２）  ａｓ  ａ  Ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．  Ｉｎ  Ｌｅｖｉｎ，  Ｊ  ａｎｄ  Ｌａｕｆｅｒ，  Ｓ  （Ｅｄ．），  ＲＳＣ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．  ２６，  ｐ  １５８−１７５，  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１２；その全体が参照により組み込まれる）。
【００４２】
開示されたＭＫ２阻害剤の大半は、結晶学的または生化学研究により明らかにされた古典的タイプＩ阻害剤である。そのようなものとして、それらはキナーゼのＡＴＰ部位に結合し、よって、細胞内ＡＴＰ（推定濃度１ｍＭ−５ｍＭ）と競合し、キナーゼのリン酸化および活性化を阻害する。低分子ＭＫ２阻害剤の代表例としては下記が挙げられるが、それらに限定されない：
【化１】
2018502860.tif 000003
【化２】
2018502860.tif 000004
【００４３】
遮断ペプチド
ペプチドは、２つ以上のアミノ酸の鎖で構成され、それによって鎖の中の１つのアミノ酸のカルボキシル基がペプチド結合を介して他のアミノ酸のアミノ基と連結された化合物である。ペプチドは、とりわけタンパク質の構造および機能の研究で用いられてきた。合成ペプチドは、とりわけタンパク質−ペプチド相互作用が生じる場所を知るプローブとして用いられる。阻害ペプチドは、とりわけプロテインキナーゼ、癌タンパク質および他の障害の阻害に及ぼすペプチドの影響を調べるために臨床研究で用いられる。
【００４４】
幾つかの遮断ペプチドの使用が、研究されてきた。例えば、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）である、ＭＡＰＫプロテインキナーゼは、細胞の増殖および分化に必須である。ＭＡＰＫの活性化はカスケードメカニズムを要求し、それによってＭＡＰＫが上流のＭＡＰＫＫ（ＭＥＫ）によってリン酸化され、このＭＥＫは今度は第三のキナーゼＭＡＰＫＫＫ（ＭＥＫＫ）によってリン酸化される。ＥＲＫ阻害ペプチドは、ＥＲＫに結合することによってＭＥＫデコイとして機能する。
【００４５】
他の遮断ペプチドには、オートカムチド−２関連阻害ペプチド（ＡＩＰ）が含まれる。この合成ペプチドは、Ｃａ2+／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）の高度に特異的で強力な阻害剤である。ＡＩＰは、ＣａＭＫＩＩのための高度に選択的なペプチド基質である、オートカムチド−２のリン酸化不能類似体である。ＡＩＰは、１００ｎＭのＩＣ５０（ＩＣ５０は５０％阻害を得るために必要な阻害剤の濃度である）でＣａＭＫＩＩを阻害する。ＡＩＰ阻害は、シンチド−２（ＣａＭＫＩＩペプチド基質）およびＡＴＰに関して非拮抗的であるが、オートカムチド−２に関しては拮抗的である。この阻害は、Ｃａ2+／カルモジュリンの有無によって影響されない。ＣａＭＫＩＩ活性はＡＩＰ（１μＭ）によって完全に阻害されるが、ＰＫＡ、ＰＫＣおよびＣａＭＫＩＶは、影響されない。
【００４６】
他の遮断ペプチドとしては、細胞分裂プロテインキナーゼ５（Ｃｄｋ５）阻害ペプチド（ＣＩＰ）が挙げられる。Ｃｄｋ５は、微小管タンパク質タウがｐ２５と結合する時、アルツハイマー病特異的ホスホ−エピトープにおいてこのタンパク質をリン酸化する。ｐ２５は、切り詰められたアクチベーターであり、これはアミロイドβペプチドへの暴露の際に生理学的Ｃｄｋ５アクチベーターｐ３５から生成される。ＣＩＰによるニューロンの感染の際に、ＣＩＰはｐ２５／Ｃｄｋ５活性を選択的に阻害し、皮質ニューロン中で異常なタウのリン酸化を抑制する。ＣＩＰが示すその特異性の理由は、完全には理解されていない。
【００４７】
さらに別の遮断ペプチドが、細胞外調節キナーゼ２（ＥＲＫ２）、ＥＲＫ３、ｐ３８／ＨＯＧ１、プロテインキナーゼＣ、カゼインキナーゼＩＩ、Ｃａ2+／カルモジュリンキナーゼＩＶ、カゼインキナーゼＩＩ、Ｃｄｋ４、Ｃｄｋ５、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）、セリン／トレオニン−プロテインキナーゼＰＡＫ３、ホスホイノシチド（ＰＩ）−３キナーゼ、ＰＩ−５キナーゼ、ＰＳＴＡＩＲＥ（ｃｄｋ高度保存配列）、リボソーム６キナーゼ、ＧＳＫ−４、胚中心キナーゼ（ＧＣＫ）、ＳＡＰＫ（ストレス活性化プロテインキナーゼ）、ＳＥＫＩ（ストレスシグナル伝達キナーゼ）、および巣状接着キナーゼ（ＦＡＫ）について研究されてきた。
【００４８】
タンパク質基質−競合的阻害剤
今日までに開発されたプロテインキナーゼ阻害剤の大部分はＡＴＰ競合剤である。このタイプの分子はキナーゼのＡＴＰ結合部位に対して競合し、しばしば、その特異性における重大な制限のために、オフターゲット効果を示す。これらの阻害剤の低い特異性は、ＡＴＰ結合部位は、多様なプロテインキナーゼの間で高度に保存されているという事実のためである。他方、ＡＴＰ非競合的阻害剤、例えば基質競合的阻害剤は、基質結合部位は、様々なプロテインキナーゼ間で、ある一定の程度の可変性を有するので、より特異的であることが予想される。
【００４９】
基質競合的阻害剤は、通常、インビトロで、標的酵素と弱い結合相互作用を有するが、研究により、化学修飾は基質阻害剤の特異的結合親和性およびインビボ効力を改善することができることが示されている（Ｅｌｄａｒ−Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １８０４（３）：５９８−６０３，  ２０１０）。加えて、基質競合的阻害剤は、多くの場合、無細胞条件よりも細胞において良好な効力を示す（ｖａｎ  Ｅｓ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｔ．  Ｄｅｖ．  １３：２８−３３，  ２００３）。
【００５０】
プロテインキナーゼ阻害における特異性および効力を増強させようとして、二基質阻害剤もまた開発された。二基質阻害剤は、２つのコンジュゲートされた断片から構成され、各々が二基質酵素の異なる結合部位を標的にするものであり、２つの天然基質／リガンドを模倣し、あるキナーゼの２つの領域と同時に結合するプロテインキナーゼ阻害剤の特別の群を形成する。二基質阻害剤の主な利点は、標的酵素とより多くの相互作用を生成させるそれらの能力であり、これにより、単一部位阻害剤と比べて、コンジュゲートの改善された親和性および選択性が得られる。二基質阻害剤の例としては、ヌクレオチド−ペプチドコンジュゲート、アデノシン誘導体−ペプチドコンジュゲート、およびペプチドの強力なＡＴＰ−競合的阻害剤とのコンジュゲートが挙げられるが、それらに限定されない。
【００５１】
タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）／細胞透過性タンパク質（ＣＰＰ）
細胞膜は、巨大分子の細胞中への導入に対し、強靭なバリアを提供する。ほぼ全ての治療薬がそれらの効果を発揮するには、少なくとも１つの細胞膜を横切らなければならない。従来の小分子医薬品開発はタンパク質機能をモジュレートする能力を有する膜透過性分子の偶然の発見に依存する。小分子は主要治療パラダイムを保持するが、これらの分子の多くは、特異性の欠如、副作用、および毒性に苦しむ。情報をふんだんに得ている巨大分子は、小分子よりもずっと優れたタンパク質調節機能を有し、分子、細胞、および構造データに基づく合理的薬物設計を使用して作製することができる。しかしながら、細胞膜は、５００Ｄａを超えるサイズのほとんどの分子に対し不透過性である。よって、細胞貫通ペプチド、例えば、転写トランスアクチベーター（Ｔａｔ）の塩基性ドメインの、細胞膜を横切り、巨大分子カーゴをインビボで送達する能力は、治療タンパク質、ペプチド、および核酸の合理的設計を著しく促進することができる。
【００５２】
タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）は、哺乳動物細胞の細胞膜を貫通し、膜を横断して多くのタイプおよび分子量の化合物を輸送し得るペプチドの一クラスである。これらの化合物には、タンパク質、ＤＮＡ、コンジュゲートペプチド、オリゴヌクレオチドなどのエフェクター分子、およびリポソームなどの小粒子が含まれる。ＰＴＤが、他のタンパク質へと化学的に連結または融合された場合、生じる融合ペプチドは、なおも細胞に侵入できる。形質導入の厳密なメカニズムは不明であるが、これらのタンパク質の内在化は、受容体媒介またはトランスポーター媒介であるとは考えられていない。ＰＴＤは一般的に１０〜１６アミノ酸長であり、例えばアルギニンおよび／またはリジンに富むペプチドなど、それらの組成にしたがって群分けされ得る。
【００５３】
細胞中にエフェクター分子を輸送できるＰＴＤの使用は、それらがカーゴ分子の細胞内取り込みを促進することから、薬物の設計においてますます魅力的になった。これらの細胞貫通ペプチドは、それらの配列にしたがって両親媒性（極性または非極性末端の両方を有することを意味する）または陽イオン性（正味の正電荷原子を含むことを意味する、またはそれに関係する）として一般に分類され、巨大分子のための非侵襲性送達技術を提供する。ＰＴＤは多くの場合、「トロージャンペプチド」、「膜輸送配列」、または「細胞透過性タンパク質（ＣＰＰ）」と称される。ＰＴＤはまた、新規なＨＳＰＢ１キナーゼ阻害剤の細胞膜貫通を支援するために用いることができる（出願の内容が参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、２００８年１月１０日出願の表題「Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ＨＳＰＢ１  Ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｆｏｒ」の米国特許出願第１１／９７２，４５９号、および２００８年８月７日出願出願の表題「Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」の同第１２／１８８，１０９号を参照）。
【００５４】
ウイルスＰＴＤ含有タンパク質
形質導入特性を有するとして記載されるべき第一のタンパク質は、ウイルス起源のものであった。これらのタンパク質はなおも、最も一般的に許容されるＰＴＤ作用のモデルである。ＨＩＶ−１転写トランスアクチベーター（Ｔａｔ）およびＨＳＶ−１  ＶＰ２２タンパク質はもっともよく特徴付けられたウイルスＰＴＤ含有タンパク質である。
【００５５】
Ｔａｔ（ＨＩＶ−１トランスアクチベーター遺伝子産物）は、８６アミノ酸のポリペプチドであり、組み込まれたＨＩＶ−１ゲノムの強力な転写因子として作用する。Ｔａｔはウイルスゲノム上で作用し、潜伏感染細胞内でウイルス複製を刺激する。Ｔａｔタンパク質の転座特性は、休止した感染細胞の活性化を可能にし、サイトカインを含む多くの細胞遺伝子を調節することによって、その後の感染のために非感染細胞のプライミングに関与できる。Ｔａｔの最小ＰＴＤは、９アミノ酸のタンパク質配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（Ｔａｔ４９−５７；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）である。Ｔａｔのより長い断片を用いた研究で、１２０ｋＤａまでの融合タンパク質の形質導入の成功が実証された。多数のＴａｔ−ＰＴＤおよび合成Ｔａｔ誘導体の付加が、膜における転座を媒介することが実証された。Ｔａｔ  ＰＴＤ含有融合タンパク質が、癌を含む実験、デスタンパク質（ｄｅａｔｈ−ｐｒｏｔｅｉｎ）を細胞に輸送する実験、および神経変性障害の疾患モデルで治療部分として用いられた。
【００５６】
細胞膜を透過するために形質導入ペプチドにより使用されるメカニズムは近年、研究者が形質導入の後の仕組みを理解することを求めてきたので、かなり関心をひく対象となっている。初期の報告は、非エンドサイトーシスメカニズムにより起きたＴａｔ形質導入は主に人為現象的として却下されたが、他の細胞貫通ペプチドは直接膜破壊により取り込まれ得ることを報告している。Ｔａｔおよび他のＰＴＤの形質導入は、エンドサイトーシスの特殊形態のマクロピノサイトーシスにより起こるという最近の所見は、これらのペプチドの研究における新しいパラダイムを作成した。形質導入のメカニズムの強化された知識により、臨床的成功を最終目的とする形質導入効率の改善が促進された（Ｓｎｙｄｅｒ  Ｅ．  ａｎｄ  Ｄｏｗｄｙ，  Ｓ．，  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．，  ２１（３）：３８９−３９３，  ２００４）。
【００５７】
Ｔａｔ媒介タンパク質形質導入の現在のモデルは、Ｔａｔの細胞表面への結合、マクロピノサイトーシスの刺激、Ｔａｔおよびカーゴのマクロピノソーム中への取込、ならびに細胞質中へのエンドソーム脱出を含む、多ステージプロセスである。第１の工程、細胞表面への結合は、細胞表面上の遍在的グリカン鎖によるものと考えられる。Ｔａｔによるマクロピノサイトーシスの刺激は、細胞表面タンパク質への結合を含み得る未知のメカニズムにより起こり、またはプロテオグリカンまたは糖脂質により起こる。全細胞型により使用される液相エンドサイトーシスの一形態であるマクロピノサイトーシスによる取込がＴａｔおよびポリアルギニン形質導入に必要とされる。Ｔａｔ形質導入における最終工程はマクロピノソームから細胞質中への脱出であり；このプロセスは、エンドソームにおけるｐＨ降下に依存する可能性があり、これは、他の因子と共に、Ｔａｔによる膜への影響ならびにＴａｔおよびそのカーゴ（すなわちペプチド、タンパク質または薬物など）の細胞質への放出を促進する（Ｓｎｙｄｅｒ  Ｅ．  ａｎｄ  Ｄｏｗｄｙ，  Ｓ．，  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．，  ２１（３）：３８９−３９３，  ２００４）。
【００５８】
ＶＰ２２は、ＨＳＶビリオンの構造部分である、ＨＳＶ−１外皮タンパク質である。ＶＰ２２は、受容体に依存せず転座でき、核中に蓄積される。ＶＰ２２のこの特性によって、タンパク質はＰＴＤ含有ペプチドとして分類される。完全長のＶＰ２２を含む融合タンパク質は、細胞膜を介して効率的に転座された。
【００５９】
細胞間転座特性を有するホメオタンパク質
ホメオタンパク質は、形態学的過程に関与する高度に保存されたトランス活性化する転写因子である。それらは、６０アミノ酸の特異的配列を介してＤＮＡに結合する。このＤＮＡ結合ホメオドメインは、ホメオタンパク質の最も高度に保存された配列である。幾つかのホメオタンパク質がＰＴＤ様活性を示すことが記載されており、それらは、細胞型特異性なしにエネルギー非依存的なおよびエンドサイトーシス非依存的な様式で細胞膜を介して効率的に転座できる。
【００６０】
アンテナペディアタンパク質（Ａｎｔｐ）は、細胞膜を介して転座できるトランス活性化する因子であり、転座が可能な最小配列は、タンパク質のホメオドメイン（ＨＤ）の第三ヘリックスに対応する１６アミノ酸ペプチドである。このヘリックスの内在化は４℃で起こり、この過程がエンドサイトーシス依存性ではないことを示唆する。ＡｎｔｐＨＤとの融合タンパク質として生成される１００アミノ酸までのペプチドは、細胞膜を貫通する。
【００６１】
転座が可能な他のホメオドメインとしては、フシタラズ（Ｆｔｚ）およびエングレイル（Ｅｎ）ホメオドメインが挙げられる。多くのホメオドメインが、高度に保存された第三のヘリックスを共有する。
【００６２】
ヒトＰＴＤ
ヒトＰＴＤは、ヒト患者への導入時に潜在的免疫原性問題を回避できる。ＰＴＤ配列を有するペプチドとしては、Ｈｏｘａ−５、Ｈｏｘ−Ａ４、Ｈｏｘ−Ｂ５、Ｈｏｘ−Ｂ６、Ｈｏｘ−Ｂ７、ＨＯＸ−Ｄ３、ＧＡＸ、ＭＯＸ−２、およびＦｔｚＰＴＤが挙げられる。これらのタンパク質は全て、ＡｎｔｐＰＴＤ中で見出される配列を共有する。他のＰＴＤとしては、エネルギー−、受容体−およびエンドサイトーシス−非依存性転座が可能な、Ｉｓｌｅｔ−１、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、およびカポジ線維芽細胞増殖因子または線維芽細胞増殖因子−４（ＦＧＦ−４）シグナルペプチド由来の疎水性配列が挙げられる。未確定ＰＴＤには、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバーが含まれる。ＦＧＦは多種多様な細胞の増殖および分化を制御するポリペプチド増殖因子である。いくつかの刊行物により、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）は、ＶＰ−２２、Ｔａｔ、およびホメオドメインと類似する通常とは異なる内在化を示すことが報告された。酸性ＦＧＦ（ＦＧＦ−１）は細胞膜を４℃もの低い温度で転座したことも報告された。しかしながら、融合タンパク質の内在化または転座特性の一因となるドメインについての決定的な証拠は存在しない（Ｂｅｅｒｅｎｓ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  ３（５）：４８６−４９４，  ２００３）。
【００６３】
合成ＰＴＤ
より強力なＰＴＤを作製しようとして、かつＰＴＤが細胞膜を横切ってタンパク質を輸送するメカニズムを解明しようとしていくつかのペプチドが合成されている。これらの合成ＰＴＤの多くが既存の、十分に裏付けされたペプチドに基づいているが、他のものは、ＰＴＤ機能に不可欠であると考えられる、それらの塩基性残基および／または正電荷のために選択される。これらの合成ＰＴＤの数個が既存のものよりも良好な転座特性を示した（Ｂｅｅｒｅｎｓ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  ３（５）：４８６−４９４，  ２００３）。例示的なＴａｔ由来合成ＰＴＤとしては、例えば、ＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩＫＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）；ＷＬＲＲＩＫＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）；ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）；ＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）；ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）；ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）；およびＨＲＲＩＫＡＷＬＫＫＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６４】
ＭＫ２阻害ペプチド治療ドメイン（ＴＤ）に融合されたＰＴＤを含む組成物
いくつかのＭＫ２阻害ペプチド（ＴＤ）が合成され、合成ＰＴＤに融合され、これらの融合ポリペプチドを含む組成物の使用が研究されている。これらのポリペプチドとしては、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１；ＭＭＩ−０１００）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＮＲＱＬＧＶＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９；ＭＭＩ−０２００）、ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３；ＭＭＩ−０３００）、ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４；ＭＭＩ−０４００）、ＨＲＲＩＫＡＷＬＫＫＩＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７；ＭＭＩ−０５００）、ＹＡＲＡＡＡＲＤＡＲＡＫＡＬＮＲＱＬＡＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３；ＭＭＩ−０６００）、およびＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＮＲＱＬＡＶＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４；ＭＭＩ−０６００−２）が挙げられるが、それらに限定されない。インビトロおよびインビボ研究の両方により、これらのポリペプチドは様々な疾患、障害および病状の治療において有用となり得ることが示されている。これらとしては、過形成および新生物（米国特許第８，５３６，３０３号および８，７４１，８４９号）、炎症性障害（米国出願第１２／６３４，４７６号および米国出願第１３／９３４，９３３号）、癒着（米国出願第１２／５８２５１６）、新生物による移植血管不全（米国出願第１３／１１４，８７２号）、回復神経突起伸長（米国出願第１２、８４４，８１５号）、皮膚瘢痕（米国出願第１３／８２９，８７６号）、冠動脈バイパス術移植血管不全（米国出願第１３／７００，０８７号）ならびに間質性肺疾患および肺線維症（米国出願第１３／４４５，７５９号）が挙げられるが、限定はされない。
【００６５】
ペプチド組成物は、多くの特別な問題を製剤科学者に提供する（Ｒ．  Ｗ．  Ｐａｙｎｅ  ａｎｄ  Ｍ．Ｃ．  Ｍａｎｎｉｎｇ，  “Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ：    ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，”  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ６４−６８  （２００９））。第１に、ペプチドは反応基を隔離することができる球状構造を有さないので、ペプチド内のほぼ全ての残基の側鎖は、完全に溶媒に曝露され、加水分解反応、例えば、酸化および脱アミドによる化学分解を示すことができる。第２に、水溶液中での高次構造は、受容体に結合した時に見られる構造に対してほとんど類似性を有し得ない。第３に、多くのペプチドは非常に低い濃度ではモノマーとなる傾向があるが、濃度が増加するにつれ、自己組織化し、高度に組織化された状態にあるかのように挙動することができるが、これらの構造は一過性または流動的であるので、長期安定性を増加させることができない。第４に、自己組織化するペプチドの傾向は、それらの強凝集体を形成する可能性を意味する、それらの物理的な不安定性と関連する。その上、ペプチド製剤中に存在する賦形剤は、化学的に分解し、様々な表面と製造中に相互作用し、容器またはクロージャと相互作用し、またはペプチド自体と相互作用し、よって、調製物の重大な特性に悪影響を与える（Ｌａｒｓ  Ｈｏｖｇａａｒｄ，  ａｎｄ  Ｓｖｅｎ  Ｆｒｏｋｊａｅｒ，  “Ｐｈａｒｍａｃｕｅｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  （２０１２）  ｐｐ．  ２１２−２１３）。
【００６６】
記載される発明は、ＭＫ２のペプチド系阻害剤に融合された細胞貫通ペプチドを含む有効な製剤を提供する。
【発明の概要】
【００６７】
１つの態様によれば、記載される発明は、治療量の、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリペプチドまたはその機能的等価物を含む医薬製剤を提供し、ここで、製剤は、ポリペプチドの安定性およびバイオアベイラビリティの保存により特徴付けられる。
【００６８】
１つの実施形態によれば、医薬製剤は微粒子医薬製剤である。別の実施形態によれば、医薬製剤はエアロゾル化医薬製剤である。別の実施形態によれば、製剤は噴霧乾燥のプロセスにより調製される。別の実施形態によれば、医薬製剤は、１％ｗ／ｗ固体を含む。別の実施形態によれば、医薬製剤は、５％ｗ／ｗ固体を含む。別の実施形態によれば、医薬製剤は、トレハロースをさらに含む。別の実施形態によれば、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリペプチドまたはその機能的等価物およびトレハロースは、それぞれ、８０／２０の比である。別の実施形態によれば、ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはその機能的等価物およびトレハロースは、それぞれ、９２．５／７．５の比である。別の実施形態によれば、医薬製剤は乾燥粉末吸入装置（ＤＰＩ）により対象に送達される。
【００６９】
１つの実施形態によれば、医薬製剤は、生理食塩水をさらに含む。別の実施形態によれば、生理食塩水はＮａＣｌである。別の実施形態によれば、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリペプチドまたはその機能的等価物は０．７ｍｇ／ｍＬの濃度である。別の実施形態によれば、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリペプチドまたはその機能的等価物は７．０ｍｇ／ｍＬの濃度である。別の実施形態によれば、医薬製剤はネブライザーにより対象に送達される。
【００７０】
１つの実施形態によれば、医薬製剤は、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリペプチドまたはその機能的等価物およびナノポリプレックスポリマーのイオン性複合体を含み、イオン性複合体は、細胞内ｐＨ条件により選択された細胞内区画におけるイオン性複合体の解離により特徴付けられ、そのため、ペプチドの生理活性および安定性が保存される。
【００７１】
別の態様によれば、記載される発明は、そのような治療を必要とする対象において移植血管誘導内膜過形成を治療するための方法を提供し、方法は、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリペプチドまたはその機能的等価物およびナノポリプレックスポリマーのイオン性複合体を含む医薬製剤を投与することを含み、イオン性複合体は、ペプチドの生理活性および安定性が保存されるように細胞内ｐＨ条件により選択された細胞内区画におけるイオン性複合体の解離により特徴付けられ、かつ、治療量の、アミノ配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のポリペプチドまたはその機能的等価物、およびナノポリプレックスポリマーを含み、ここで、治療量は、ＭＫ２を阻害する；ならびに、移植血管誘導内膜過形成を治療するのに有効である。
【００７２】
１つの実施形態によれば、ナノポリプレックスポリマーはアニオン性およびエンドソーム溶解性である。別の実施形態によれば、ナノポリプレックスポリマーは、ポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）である。別の実施形態によれば、ナノポリプレックスポリマーは、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）である。別の実施形態によれば、医薬製剤は、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：１．５、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９および１：１０からなる群より選択される、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリペプチドまたはその機能的等価物対ＰＰＡＡのチャージ比（ＣＲ）を含む。別の実施形態によれば、チャージ比（ＣＲ）は１：３である。別の実施形態によれば、医薬製剤は対象に埋め込み装置により送達される。別の実施形態によれば、医薬製剤は対象に局所的に送達される。別の実施形態によれば、医薬製剤は対象に非経口的に送達される。
【００７３】
１つの実施形態によれば、機能的等価物はタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）である第１のポリペプチドと治療ドメイン（ＴＤ）である第２のポリペプチドの間の融合から製造される。別の実施形態によれば、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）はアミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、およびＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）のポリペプチドからなる群より選択され、第２のポリペプチドはアミノ酸配列ＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の治療ドメイン（ＴＤ）である。
【００７４】
下記の図面の簡単な説明において、
図４６、図４８、図４９、図７１、図７２、図７３及び図７４の説明中の「&p」は
2018502860.tif 000005
を表し、
図５４の説明中の「&Ｐ」は
2018502860.tif 000006
を表し、
図５４の説明中の「&&P」は
2018502860.tif 000007
を表し、
図７１及び図７３の説明中の「&&ｐ」は
2018502860.tif 000008
を表し、
図７１の説明中の「&&&ｐ」は
2018502860.tif 000009
を表す。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】ブリスター施蓋−プッシュスルーの技術特性を示す。
【図２】Ｆｏｒｍｐａｃｋ（登録商標）−４ＰＬＹの技術特性を示す。
【図３】ＭＭＩ−０１００  ５％固体製剤に対する動的水蒸気吸着等温線を示す。
【図４】ＭＭＩ−０１００標準試薬のクロマトグラムを示す。
【図５】ＥＰＩＣ吸入器装置を示す。左側は組み立てられた装置（流路が取り付けられたベースユニット）である。吸入器は、電子装置を含む外部ドライブボックス（右側写真）につながれる。
【図６】１ｍｇおよび２ｍｇでのＭＭＩ−０１００  ５％製剤に対する初期エアロゾル性能結果の粒子サイズ分布プロットを示す。
【図７】ＭＭＩ−０１００  １％固体製剤に対する１０ｍｇまでの充填重量の粒子サイズ分布プロットを示す（最適化後）。
【図８】５〜１０ｍｇのＭＭＩ−０１００  １％固体製剤からの微粒子用量（ＦＰＤ）の直線プロットを示す。
【図９】ＭＭＩ−０１００／トレハロース変種製剤の粒子サイズ分布プロットを示す。
【図１０】ブリスター内、４０℃／７５％ＲＨでの４週間の保存後の、ＭＭＩ−０１００  １％固体製剤の粒子サイズ分布プロットを示す。
【図１１】４０℃／７５％相対湿度（ＲＨ）でのＭＭＩ−０１００  １％固体製剤についての回収薬物の粒子サイズ分布プロットを示す。
【図１２】２５℃／６０％ＲＨでのＭＭＩ−０１００  １％固体製剤についての回収薬物の粒子サイズ分布プロットを示す。
【図１３】４週間でのＭＭＩ−０１００  １％固体製剤についての回収薬物の粒子サイズ分布プロットを示す。
【図１４】４０℃／７５％相対湿度（ＲＨ）でのＭＭＩ−０１００  ５％固体製剤についての回収薬物の粒子サイズ分布プロットを示す。
【図１５】２５℃／６０％ＲＨでのＭＭＩ−０１００  ５％固体製剤についての回収薬物の粒子サイズ分布プロットを示す。
【図１６】４週間でのＭＭＩ−０１００  ５％固体製剤についての回収薬物の粒子サイズ分布プロットを示す。
【図１７】４０℃／７５％相対湿度（ＲＨ）でのＭＭＩ−０１００  １％固体、７．５％トレハロース製剤についての回収薬物の粒子サイズ分布プロットを示す。
【図１８】２５℃／６０％ＲＨでのＭＭＩ−０１００  １％固体、７．５％トレハロース製剤についての回収薬物の粒子サイズ分布プロットを示す。
【図１９】４週間でのＭＭＩ−０１００  １％固体、７．５％トレハロース製剤についての回収薬物の粒子サイズ分布プロットを示す。
【図２０】４０℃／７５％相対湿度（ＲＨ）でのＭＭＩ−０１００  １％固体、２０％トレハロース製剤についての回収薬物の粒子サイズ分布プロットを示す。
【図２１】２５℃／６０％ＲＨでのＭＭＩ−０１００  １％固体、２０％トレハロース製剤についての回収薬物の粒子サイズ分布プロットを示す。
【図２２】４週間でのＭＭＩ−０１００  １％固体、２０％トレハロース製剤についての回収薬物の粒子サイズ分布プロットを示す。
【図２３】試料溶媒のクロマトグラムを示す。
【図２４】定量下限（ＬＯＱ）のクロマトグラムを示す。
【図２５】１１μｇ／ｍＬ標準試薬のクロマトグラムを示す（実物大）。
【図２６】１１μｇ／ｍＬ標準試薬のクロマトグラムを示す（拡大スケール）。
【図２７】レーザ回折装置の概略図を示す。
【図２８】０．５、１、２、３および４時間の抽出時間後のＭＭＩ−０１００のパーセント回収率を表す棒グラフを示す。
【図２９】充填薬物量とネブライザータイプ１を使用して噴霧された送達用量（ＤＤ）（呼吸用量＜５μｍ）の間の線形相関を示す。
【図３０】充填薬物量とネブライザータイプ２を使用して噴霧された送達用量（ＤＤ）（呼吸用量＜５μｍ）の間の線形相関を示す。
【図３１】ネブライザータイプ１およびネブライザータイプ２を使用して噴霧された異なる充填体積および濃度の噴霧時間を表す棒グラフを示す。
【図３２】ネブライザータイプ１およびネブライザータイプ２を使用して噴霧された異なる充填体積および濃度の送達用量を表す棒グラフを示す。
【図３３】ネブライザータイプ１およびネブライザータイプ２を使用して噴霧された異なる充填体積および濃度の呼吸用量＜５μｍを表す棒グラフを示す。
【図３４】ｐ３８−ＭＫ２経路の概略図を示す。
【図３５】ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰ合成およびキャラクタリゼーションを示す。ａ）ＭＫ２ｉ−ＮＰ合成スキーム。ｂ）ＭＫ２ｉ−ＮＰを設計し、最適化し、エンドソーム脱出を媒介し、ペプチド治療薬を細胞内に放出させる。ｃ）処置比較概要：ＭＫ２ｉ−ＮＰを、エンドソーム溶解性ＰＰＡＡポリマーと共に製剤化し、一方、ＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰを、ＰＰＡＡに構造的に類似するが、そのより低いｐＫａのためにエンドソーム溶解性ではないＰＡＡポリマーと共に製剤化した。ＭＫ２ｉ−ＮＰおよびＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰはどちらも、示された配列（赤＝修飾ＴＡＴ模倣細胞貫通ペプチド配列、緑＝ＭＫ２阻害配列）を有するＭＫ２ｉペプチドを用いて作製した。ｄ）異なるチャージ比（［ＮＨ３＋］／［ＣＯＯ−］）で調製したポリプレックスのゼータ電位。イメージングおよび取込研究のために、Ａｌｅｘａ  ＮＰをＡｌｅｘａ−４８８フルオロフォアで標識したＭＫ２ｉペプチドから製剤化した。ＮＥ−ＮＰを非エンドソーム溶解性（ＮＥ）ＰＡＡポリマーと共に製剤化する。示される値は少なくとも３つの独立した測定の平均である。ｅ）ＭＫ２ｉ−ＮＰは、ＤＬＳ分析により証明されるように、エンドソームｐＨ範囲ではｐＨ誘発性解体を受ける。
【図３６】ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰ製剤はＭＫ２ｉの細胞取込を増加させ、細胞内保持を延長させ、エンドリソソーム共局在を低減させることを示す。ａ）蛍光標識されたＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）、ＭＫ２ｉ−ＮＰ、およびＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰの細胞取込および保持のフローサイトメトリー定量。ｎ＝３。ｂ）代表的なフローヒストグラムは、ＭＫ２ｉ−ＮＰにより送達される蛍光標識されたＭＫ２ｉペプチドの増加した細胞取込およびより長い細胞内保持を証明する。ｃ）赤血球溶血アッセイにより、ＭＫ２ｉ−ＮＰはＰＰＡＡポリマーと類似ｐＨ依存性膜破壊活性を有するが、ＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰおよびＭＫ２ｉペプチドの膜破壊は試験した範囲では無視できることが示される。ｄ）２時間の処置後２４時間での、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ赤を用いたＡｌｅｘａ−４８８標識ＭＫ２ｉ共局在の代表的な共焦点顕微鏡画像はＭＫ２ｉ−ＮＰは、エンドリソソーム共局在を低減させたことを証明する。スケールバー＝２０μｍ。ｅ）処置後０、１２、および２４時間での、エンドリソソーム染料Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ赤を用いたＭＫ２ｉペプチド共局在の定量、ｎ≧３独立画像。
【図３７】ＭＫ２−ＮＰによるエクスビボ処置は新生内膜形成を低減し、ヒト伏在静脈におけるＭＫ２の下流の分子のリン酸化を変化させることを示す。ａ）ＭＫ２ｉ−ＮＰ製剤はＡｌｅｘａ５６８−ＭＫ２ｉのＨＳＶ組織へのエクスビボでの送達を増加させた、スケールバー＝２００μｍ。ｂ）２時間処置し、器官培養で１４日間維持したＶｅｒｈｏｅｆｆ  Ｖａｎ−Ｇｉｅｓｏｎ（ＶＶＧ）染色ヒト伏在静脈切片の代表的な顕微鏡画像。ＭＫ２ｉ−ＮＰは新生内膜形成を強力にブロックした。赤色バーは内膜厚を画定する。スケールバー＝１００μｍ。ｃ）ＶＶＧ染色組織切片からの内膜厚の定量；測定値は、別々のドナー由来の少なくとも３つの静脈環からの６〜１２の放射状に平行な測定値の平均である。ｄ）ＭＫ２基質ｈｎＲＮＰ  Ａ０、ＣＲＥＢ、およびＨＳＰ２７のリン酸化を示す代表的なウエスタンブロット。ｅ−ｇ）ＭＫ２ｉ−ＮＰが、遊走および炎症に関与するＭＫ２の下流で活性化されるいくつかの因子のＭＫ２ｉ媒介阻害を増強したことを証明する、ｎ≧３の別々のドナー由来のウエスタンブロット分析の定量。
【図３８】ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰ製剤はＨＣＡＶＳＭＣにおいてＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）生理活性を増強することを示す。ａ）ＭＫ２ｉ−ＮＰ処置は、ＡＮＧ  ＩＩで刺激されたＨＣＡＶＳＭＣにおけるＴＮＦα産生をブロックした。全てのデータは細胞数に対して正規化される（補足図１１に示されるデータ）。ＮＴ＝処置なし、ｎ＝４。ｂ）ＭＫ２ｉ−ＮＰ処置は、ひっかき傷の形成後２４時間に、化学誘引物質ＰＤＧＦ−ＢＢ（５０ｎｇ／ｍＬ）で刺激されたヒト冠動脈血管平滑筋細胞（ＨＣＡＶＳＭＣ）における遊走をブロックした、ｎ＝３。ｃ）ＭＫ２ｉ−ＮＰは、膜上への播種後８時間、Ｂｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒアッセイにおいて、化学誘引物質ＰＤＧＦ−ＢＢに向かう細胞遊走を阻害した、ｎ＝７。ｄ）各処置群に対する染色トランズウェルインサート膜の代表的な顕微鏡画像。
【図３９】ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰを用いた術中処置は、移植した静脈グラフトにおいてインビボで、新生内膜形成および残留マクロファージを低減させることを示す。ａ）ＭＫ２ｉ−ＮＰ処置は、静脈グラフトのＶｅｒｈｏｅｆｆ  Ｖａｎ  Ｇｉｅｓｏｎ染色組織切片の代表的な画像において示されるように、新生内膜形成を低減させた。ｂ）術後２８日での、灌流固定された頸静脈間置グラフトにおける内膜厚の定量。一処置群あたりｎ≧７のグラフト。ｃ）ＭＫ２ｉ−ＮＰ処置はまた、静脈グラフトについてＲＡＭ−１１免疫組織化学を使用して示されるように、新生内膜における残留マクロファージを低減させた。矢印は陽染細胞を画定する。左柱状スケールバー＝１００μｍ、右柱状拡大図スケールバー＝５０μｍ。ｄ）頸静脈グラフト切片におけるＲＡＭ−１１陽性マクロファージ染色の定量、ｎ＝１６、一処置群あたり４つの静脈セグメントからの組織画像。
【図４０】ＨＰＬＣ−精製ＣＰＰ−ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）融合ペプチド（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＭＷ＝２２８３．６７ｇ／ｍｏｌ）についてのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）質量スペクトルを示す。質量スペクトルは、３つの主ピークを示し、各々が完全ペプチド配列の断片化に対応する。
【図４１】Ｄ6ＭＳＯ中でのＡ）ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）およびＢ）ポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）ホモポリマーの1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。分子量は、連鎖移動剤と関連するピーク面積（すなわちＰＡＡはピークｃ、ｄおよびＰＰＡＡはピークｂ）を関連するアクリル酸／プロピルアクリル酸のピーク（すなわち、ＰＡＡはピークａおよびＰＰＡＡはピークｃ）と比較することにより決定した：ＰＡＡ重合度＝１０６、ＰＰＡＡ重合度＝１９０。
【図４２】ＤＭＦ中での、Ａ）ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）：重合度＝１５０、ＰＤＩ＝１．２７、ｄη／ｄＣ＝０．０９（ｍＬ／ｇ）およびＢ）ポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）：重合度＝１９３、ＰＤＩ＝１．４７１、ｄη／ｄＣ＝０．０８７（ｍＬ／ｇ）ポリマーのゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）クロマトグラムを示す。トレースは重合で使用される４−シアノ−４−（エチルスルファニルチオカルボニル）スルファニルペンタン酸（ＥＣＴ）連鎖移動剤中に存在するトリチオカーボネート部分の特性吸収ピーク（３１０ｎｍ）でのＵＶ吸光度を示す。
【図４３】酢酸ウラニル対比染色されたＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰのＡ）動的光散乱分析およびＢ）代表的なＴＥＭ画像を示す。スケールバー＝１００ｎｍ。
【図４４】ｐＨ依存性赤血球膜破壊についての完全データセットを表す棒グラフを示す。赤血球溶血アッセイは、ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰは、ＰＰＡＡポリマーと同様のｐＨ依存的かつ用量依存的膜破壊活性を有するが、ＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰおよびＭＫ２ｉペプチド単独では有さないことを示す。
【図４５】異なるペプチド製剤による処置後２４時間での、ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）を含む細胞内区画の平均サイズを表す棒グラフを示す。区画面積をＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量した。*ｐ＜０．００１（対ＭＫ２）およびＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰ、ｎ＝５０の少なくとも３つの異なる画像からの小胞。
【図４６】２時間処置し、その後、器官培養で１４日間維持したヒト伏在静脈（ＨＳＶ）外植片の内膜厚測定値の完全用量応答データセットを表す棒グラフを示す、ｎ≧３（少なくとも３つの異なるドナーから）。*ｐ≦０．０１（処置なし対照（ＮＴ）と比べて）、**ｐ≦０．００１（ＮＴと比べて）、&ｐ≦０．０５。
【図４７】ＭＴＴアッセイにより評価した、２時間処置し、器官培養で１または１４日間維持したＨＳＶ環における組織生存率を表す棒グラフを示す。ｎ≧３の少なくとも３の別々のドナーからの静脈環。
【図４８】ＡＮＧ  ＩＩで６時間刺激され、ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰ、ＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰ、またはＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチド単独で２時間処置され、２４時間新鮮培地で培養されたＨＣＡＶＳＭＣにおけるＴＮＦα産生を表す棒グラフを示す。全てのデータは細胞数に対して正規化される。ＮＴ＝処置なし。*ｐ＜０．０５（ＮＴ＋ＴＮＦα群と比べて）、&ｐ＜０．０５（同じ濃度のＭＫ２ｉと比べて）、#ｐ＜０．０５（同じ濃度のＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰと比べて）、ｎ＝４。
【図４９】ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰがＨＣＡＶＳＭＣにおけるＩＬ−６産生のＴＮＦα誘導増加を部分的にブロックすることを表す棒グラフを示す。細胞をＴＮＦαで６時間刺激し、ＭＫ２ｉ−ＮＰまたはＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチド単独で２時間処置し、２４時間新鮮培地中で培養した。全てのデータは細胞数に対して正規化される。ＮＴ＝処置なし。*ｐ＜０．０５（ＮＴ＋ＴＮＦα群と比べて）、&ｐ＜０．０５（同じ濃度のＭＫ２ｉと比べて）、ｎ＝４。
【図５０】１０μＭ  ＡＮＧ  ＩＩで６時間刺激され、２時間ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰ、ＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰ、またはＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチド単独で処置され、２４時間新鮮培地中で培養されたＨＣＡＶＳＭＣにおける細胞生存率を表す棒グラフを示す。ＮＴ＝処置なし、ｎ＝４。
【図５１】ＴＮＦαで６時間刺激され、２時間、ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰまたはＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチド単独で処置され、２４時間新鮮培地中で培養されたＨＣＡＶＳＭＣにおける細胞生存率を表す棒グラフを示す。ｎ＝４。
【図５２】刺激され、３０分間ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチド単独、ＭＫ２ｉ−ＮＰ、またはＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰで処置され、２４時間新鮮培地中で、５０ｎｇ／ｍＬ  ＰＤＧＦ−ＢＢあり（＋）、またはなし（−）で培養されたＨＣＡＶＳＭＣにおける細胞増殖を表す棒グラフを示す。ＮＴ＝処置なし、ｎ＝４。
【図５３】各処置群に対するウサギ頸静脈グラフト外植片の代表的なＲＡＭ−１１染色画像を示す。矢印は陽染細胞を画定する。左柱状スケールバー＝１００μｍ、右柱状拡大図スケールバー＝５０μｍ。
【図５４】下記を示す。（Ａ）蛍光標識されたＭＫ２ｉ、ＭＫ２ｉ−ＮＰ、およびＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰのＨＣＡＶＳＭＣ取込および保持のフローサイトメトリー定量。データは平均±ＳＥＭである（ｎ＝３）。Ｐ値は一元配置ＡＮＯＶＡにより決定される。（Ｂ）処置除去後０および５日での、細胞内ペプチド蛍光の指数関数的減衰非線形回帰分析による細胞内ＭＫ２ｉ半減期（ｔ１／２）の定量。（ＣおよびＤ）遊離ＭＫ２ｉ、ＭＫ２ｉ−ＮＰ、またはＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰによる処置の除去後の、ＭＫ２ｉ内在化に対して陽性のＨＣＡＶＳＭＣのパーセンテージを計算するために使用される、縦断定量（Ｃ）ならびに代表的なフローヒストグラムおよびサブセット（Ｄ）。データは平均±ＳＥＭである（ｎ＝３）。*Ｐ＜０．０１、**Ｐ＜０．００１（対ＭＫ２ｉ）；&Ｐ＜０．０１、&&Ｐ＜０．００１（対ＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰ）；一元配置ＡＮＯＶＡ。
【図５５】下記を示す。（ＡおよびＢ）蛍光標識されたＭＫ２ｉ、ＭＫ２ｉ−ＮＰ、およびＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰの内皮細胞取込のフローサイトメトリー定量（Ａ）および代表的なフローヒストグラム（Ｂ）。データは平均±ＳＥＭである（ｎ＝３）。Ｐ値は一元配置ＡＮＯＶＡにより決定される。（Ｃ）処置除去の直後に、Ｂｏｙｄｅｎ  ｔｒａｎｓｗｅｌｌ遊走アッセイにより決定された、内皮細胞遊走の定量および代表的な画像。（Ｄ）化学誘引物質ＰＤＧＦ−ＢＢの存在下で、ＭＫ２ｉ−処置されたＶＳＭＣ遊走の定量。遊走は、インビトロでのひっかき傷適用後２４時間での、パーセント創傷閉鎖を計算することにより決定した。（ＣおよびＤ）データは平均±ＳＥＭである（ｎ＝３）。Ｐ値は一元配置ＡＮＯＶＡにより決定される。
【図５６】血管平滑筋および内皮単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）産生に対する、経時的なＭＫ２ｉ−ＮＰおよびＭＫ２ｉ処置効果を表す棒グラフを示す。（Ａ）血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）および（Ｂ）内皮細胞（ＥＣ）の両方における、未処置対照に対する経時的なＭＣＰ−１産生の定量。細胞を２時間処置しその後、ＭＫ２ｉ処置除去後新鮮培地中で培養した。３または５日後、細胞を、２０ｎｇ／ｍｌＴＮＦαで２４時間刺激し、上清をサイトカイン分析のために収集した。全ての処置は１０μＭ用量のＭＫ２ｉを使用した。データは平均±ＳＥＭである（ｎ＝４）。Ｐ値は一元配置ＡＮＯＶＡにより決定される。
【図５７】ＭＫ２ｉ−ＮＰ内在化を表す棒グラフを示す。ＭＫ２ｉ−ＮＰ内在化は、細胞外蛍光がトリパンブルーにより消光された、および／または、処置除去後、細胞スクラブバッファーで十分に洗浄され、全ての細胞外ＮＰが除去された、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）におけるＭＫ２ｉ−ＮＰ取込における違いが最小であることにより示されるように、膜結合型ＮＰにより影響されない。
【図５８】下記を示す。（Ａ）処置後０、１２、および２４時間でのエンドリソソーム染料のＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ赤を用いたＭＫ２ｉペプチド共局在の定量、ｎ≧３独立画像；（Ｂ）異なるペプチド製剤での処置後２４時間でのＭＫ２ｉを含む細胞内区画の平均サイズ。区画面積を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量した。ｎ＝５０の少なくとも３つの異なる画像からの小胞。
【図５９】（ａ）Ａｌｅｘａ−５６８標識ＭＫ２ｉ、ＭＫ２ｉ−ＮＰ、またはＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰで処置され（赤）、血管平滑筋マーカーα−平滑筋アクチンに対して染色した（緑）、α−平滑筋アクチンとのＭＫ２ｉ−ＮＰ共局在を示す、ヒト伏在静脈横断面の免疫蛍光顕微鏡画像；（ｂ）（ａ）における画像からの拡大挿入図；（ｃ）Ａｌｅｘａ−５６８標識ＭＫ２ｉ、ＭＫ２ｉ−ＮＰ、またはＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰで処置され（赤）、内皮マーカーＣＤ３１に対して染色され（緑）、内皮細胞とのＭＫ２ｉ共局在を示す、ヒト伏在静脈の拡大免疫蛍光顕微鏡画像；（ｄ）全ての処置群に対する血管壁へのＭＫ２ｉ透過を示す拡大挿入図；（ｅ）ＭＫ２ｉ−ＮＰで処置された血管内での増加したＭＫ２ｉ取込（赤色チャネル）を示す、（ａ）で示された画像の画素強度分布を示す。
【図６０】下記を示す。（ａ−ｂ）Ａｌｅｘａ−５６８標識ＭＫ２ｉ、ＭＫ２ｉ−ＮＰ、またはＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰで処置され（赤）、血管平滑筋細胞マーカーα−平滑筋アクチンに対して染色され（緑）、α−平滑筋アクチンとのＭＫ２ｉ−ＮＰ共局在を示すヒト伏在静脈の免疫蛍光顕微鏡画像；（ｃ）ＭＫ２ｉおよびＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰ処置血管に対して、ＭＫ２ｉ−ＮＰの血管壁中への増加した取込および透過を示す免疫蛍光顕微鏡法。
【図６１】下記を示す。（ａ）膜上への播種後８時間で、Ｂｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒアッセイにおいて、ＭＫ２ｉ−ＮＰは、化学誘引物質ＰＤＧＦ−ＢＢに向かう血管平滑筋細胞遊走を阻害した。ＮＴ＝処置なし；（ｂ）ＭＫ２ｉ−ＮＰは、膜上への播種後８時間で、Ｂｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒアッセイにおいて、化学誘引物質ＶＥＧＦに向かう内皮細胞遊走を阻害した；（ｃ）ＭＫ２ｉ−ＮＰ処置はＡＮＧ  ＩＩで刺激されたＨＣＡＶＳＭＣにおいて、ＴＮＦα産生をブロックした（全てのデータは細胞数に対して正規化される）；（ｄ）ＭＫ２ｉ−ＮＰ処置は血管平滑筋および内皮細胞の両方においてＭＣＰ−１のＴＮＦαにより刺激された産生の持続性阻害を示したが、一方、遊離ＭＫ２ｉまたはＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰによる処置では示さなかった；（ｅ）ＭＫ２ｉ−ＮＰは処置除去後５日で、化学誘引物質ＰＤＧＦ−ＢＢに向かう血管平滑筋細胞遊走の持続性阻害を示した。
【図６２】下記を示す。（ａ）ＭＫ２ｉ−ＮＰ処置は、静脈グラフトのＶｅｒｈｏｅｆｆ  Ｖａｎ  Ｇｉｅｓｏｎ染色組織切片の代表的な画像に示されるように、新生内膜形成を低減させた；（ｂ）術後２８日での、灌流固定された頸静脈間置グラフトにおける内膜厚の定量。ｎ≧７グラフト／処置群；（ｃ）ＭＫ２ｉ−ＮＰ処置は、静脈グラフト上でｋｉ６７免疫組織化学を使用して示されるように、内膜細胞の増殖を低減させた；（ｄ）内膜核数に対して正規化された頸静脈グラフト切片におけるｋｉ６７陽性核染色の定量；（ｅ）ＭＫ２ｉ−ＮＰ処置は収縮性マーカーα−平滑筋アクチンのより高い内膜発現を維持した；（ｆ）内膜核数に対して正規化された頸静脈グラフト切片における内膜α−平滑筋アクチン陽性染色の定量；（ｇ）ＭＫ２ｉ−ＮＰ処置は合成血管平滑筋表現型マーカービメンチンの内膜発現を低減させた；（ｈ）内膜核数に対して正規化された頸静脈グラフト切片における内膜ビメンチン陽性染色の定量。
【図６３】下記を示す。（ａ）各処置群のウサギ頸静脈グラフト外植片の代表的なＲＡＭ−１１染色画像。矢印は陽染細胞を画定する。左柱状スケールバー＝１００μｍ、右柱状拡大図スケールバー＝５０μｍ；（ｂ）ウサギ頸静脈外植片の内膜における陽性ＲＡＭ−１１染色を定量するために使用されたカラーデコンボリューション方法からの画像例；（ｃ）頸静脈グラフト切片における内膜ＲＡＭ−１１陽性マクロファージ染色の定量、ｎ＝１６の、４つの静脈セグメント／処置群からの組織画像。
【図６４】ＨＰＬＣ−精製（Ａ）ＭＫ２ｉペプチド（配列：ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ−ＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ、ＭＷ＝２２８３．７ｇ／ｍｏｌ）および（Ｂ）ｐ−ＨＳＰ２０ペプチド（配列：ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ−ＷＬＲＲＡｓＡＰＬＰＧＬＫ、ＭＷ＝２７３１ｇ／ｍｏｌ）についてのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）質量スペクトルを示す。質量スペクトルは３つの主ピークを示し、各々が完全ペプチド配列の断片化に対応する。
【図６５】下記を示す。（Ａ）異なるチャージ比（ＣＲ＝［ＮＨ3+］MK2i：［ＣＯＯ-］PPAA）で調製したＭＫ２ｉ−ＮＰのＺ−平均直径（バー）およびゼータ電位（円）。アスタリスク（*）は単峰形サイズ分布を示し、白色バーは、最小サイズおよび多分散性を有する単峰形サイズ分布が得られたＭＫ２ｉ−ＮＰ製剤を表す；（Ｂ）リードＭＫ２ｉ−ＮＰ製剤（ＣＲ＝１：３）の代表的なＤＬＳトレース；（Ｃ）酢酸ウラニル染色ＭＫ２ｉ−ＮＰの代表的なＴＥＭ画像、スケールバー＝２００ｎｍ；（Ｄ）リードＭＫ２ｉ−ＮＰ製剤についての合成およびキャラクタリゼーション概要。ＣＲ＝チャージ比、Ｄh＝流体力学直径、ζ＝ゼータ電位。
【図６６】下記を示す。Ａ）異なるチャージ比（ＣＲ＝［ＮＨ3+］p-HSP20：［ＣＯＯ-］PPAA）で調製したｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰのＺ−平均直径（バー）およびゼータ電位（円）。アスタリスク（*）は単峰形サイズ分布を示し、白色バーは最小サイズおよび多分散性を有する単峰形サイズ分布が得られたｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰ製剤を表し；（Ｂ）リードｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰ製剤（ＣＲ＝３：１）の代表的なＤＬＳトレース；（Ｃ）酢酸ウラニル染色ｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰの代表的なＴＥＭ画像、スケールバー＝２００ｎｍ（Ｄ）リードｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰ製剤についての合成およびキャラクタリゼーション概要。ＣＲ＝チャージ比、Ｄh＝流体力学直径、ζ＝ゼータ電位。
【図６７】ＮＰ細胞適合性を表す棒グラフを示す。ＭＫ２ｉ−ＮＰおよびｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰの細胞毒性を、ＨＣＡＶＳＭＣにおける対応する用量の遊離ペプチドと比較した。細胞を２時間処置し、その後、新鮮培地中で２４時間インキュベートし、その後、細胞毒性アッセイを実行した。*ｐ＜０．０５（対ＮＴ）、ｎ＝４  平均±ＳＥＭ。
【図６８】ＮＰ取込および保持を示す。１０μＭ用量のペプチドでの３０分の処置後の、（Ａ）ＭＫ２ｉ−ＮＰ対ＭＫ２ｉおよび（Ｂ）ｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰ対ＨＳＰ２０のペプチド取込および保持のフローサイトメトリー定量。ＭＫ２ｉ−ＮＰは同じ濃度でのペプチド取込において約７０倍増加を達成し、一方、ｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰは、取込において約３５倍増加を達成した；（Ｃ、Ｄ）処置直後のＨＣＡＶＳＭＣの代表的なフローヒストグラムおよび（Ｅ、Ｆ）ＮＰ中への製剤化は、処置後３日の新鮮培地中での培養後のペプチド細胞保持を増加させたことを示す代表的なフローヒストグラム。Ａ−Ｂ上で上書きされたパーセンテージは処置後０日に対する３日での％保持を表す。
【図６９】ＮＰエンドソーム脱出およびサイトゾルペプチド送達を示す。（Ａ）ジギトニン半透過処理を用いた血管平滑筋細胞サイトゾルおよび細胞内小器官の分離のための実験設計。半透過処理のための条件を図７０に示されるように最適化した；（Ｂ）最適化ジギトニン半透過処理手順のウエスタンブロット妥当性確認により、エンドリソソームマーカー初期エンドソーム抗原１（ＥＥＡ１）およびリソソーム関連タンパク質１（ＬＡＭＰ１）からの細胞質タンパク質マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ１／２（ＭＥＫ１／２）およびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の分離を確認した；（ＣおよびＤ）ＮＰ製剤の増加したサイトゾル送達を示す、単独で、またはナノポリプレックスに製剤化して送達させた場合の（Ｃ）ＭＫ２ｉおよび（Ｄ）ｐ−ＨＳＰ２０ペプチドの細胞内分布の比較。エンドソーム酸性化阻害剤バフィロマイシンが添加された場合のＮＰ媒介サイトゾルペプチド送達の著しい阻害は、ＮＰのｐＨ依存性エンドソーム脱出メカニズムを証明した。
【図７０】ジギトニン半透過処理最適化を表す棒グラフを示す。細胞内小器官（すなわち、エンドリソソーム区画）からサイトゾル成分を分離するためのための条件を、様々な濃度のジギトニンとの０℃での、１００ＲＰＭで動作する回転式振盪機での１０分のインキュベーション後のＬＤＨ放出に基づいて最適化した。より高い濃度では、サイトゾルＬＤＨの放出の著しい増加が見られなかったので、２５μｇ／ｍＬジギトニンを最適条件として選択した。
【図７１】血管平滑筋細胞におけるＦ−アクチンストレスファイバー形成の阻害を示す。（Ａ）ｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰ、遊離ｐ−ＨＳＰ２０ペプチド、ＭＫ２ｉ−ＮＰまたは遊離ＭＫ２ｉで１時間前処置され、その後、ＡＮＧ  ＩＩで２時間刺激されたＨＣＡＶＳＭＣにおけるＦ−アクチンストレスファイバー定量。ストレスファイバーの数／細胞を、各処置群についてｎ≧１２の異なる細胞からのｎ≧３６ＲＯＩからの細胞極性に直角な軸から得た３つの強度プロファイルから計算した、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１（対ＮＴ＋ＡＮＧ  ＩＩ）；&ｐ＜０．１、&&ｐ＜０．０１、&&&ｐ＜０．００１（対遊離ペプチド（同じ濃度で））；（Ｂ）ＡＮＧ  ＩＩ−刺激ＨＣＡＶＳＭＣにおけるＦ−アクチンストレスファイバー形成の代表的な蛍光顕微鏡画像および画像で示される線から導かれる対応する強度プロファイル。アスタリスクは、示した強度プロファイルの左側を示す。利得設定を得られた全ての画像に対して一定に維持した。
【図７２】ＭＫ２ｉ−ＮＰによるＦ−アクチンストレスファイバー形成の阻害を示す。（Ａ）ＭＫ２ｉ−ＮＰまたは遊離ＭＫ２ｉで１時間前処置され、その後、ＡＮＧ  ＩＩで２時間刺激されたＨＣＡＶＳＭＣにおけるＦ−アクチンストレスファイバー定量。データは２つの別々の実験からのｎ≧１２細胞を表す：*ｐ＜０．０５（対ＮＴ＋ＡＮＧ  ＩＩ）**ｐ＜０．００１（対ＮＴ＋ＡＮＧ  ＩＩ）、&ｐ＜０．０５（対ＭＫ２ｉ（同じ濃度で））；（Ｂ）遊離ＭＫ２ｉまたはＭＫ２ｉ−ＮＰによる１時間処置後の、ＡＮＧ  ＩＩ−刺激ＨＣＡＶＳＭＣにおけるＦ−アクチンストレスファイバー形成の代表的な蛍光顕微鏡画像。
【図７３】ｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰによるＦ−アクチンストレスファイバー形成の阻害を示す。（Ａ）ｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰまたは遊離ｐ−ＨＳＰ２０で１時間前処置され、その後、ＡＮＧ  ＩＩで２時間刺激されたＨＣＡＶＳＭＣにおけるＦ−アクチンストレスファイバー定量。データは２つの別々の実験からのｎ≧１２細胞を表す：*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１（対ＮＴ＋ＡＮＧ  ＩＩ）、&ｐ＜０．０５、&&ｐ＜０．００１（対ｐ−ＨＳＰ２０（同じ濃度で））；（Ｂ）遊離ｐ−ＨＳＰ２０またはｐ−ＨＳＰ−２０−ＮＰによる１時間処置後の、ＡＮＧ  ＩＩ−刺激ＨＣＡＶＳＭＣにおけるＦ−アクチンストレスファイバー形成の代表的な蛍光顕微鏡画像。
【図７４】ＭＫ２ｉ−ＮＰ＆ｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰ処置は血管収縮を阻害し、血管弛緩を増強することを示す。（Ａ）収縮の阻害研究のための実験設計：ＨＳＶ環をＰＥで最初に収縮させ、その後弛緩させる。ＮＰ、遊離ペプチド、または対照での２時間の処置後、処置後収縮を測定する；（Ｂ）収縮のＭＫ２ｉおよびＭＫ２ｉ−ＮＰ媒介阻害の定量。最大用量のＭＫ２ｉ−ＮＰと等価のＰＰＡＡポリマーをビヒクル対照として含めた；（Ｃ）収縮のｐ−ＨＳＰ２０およびｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰ媒介阻害の定量；（Ｄ）血管弛緩研究のための実験設計：ＨＳＶ環をＰＥで最初に収縮させ、その後ＳＮＰで弛緩させる。ＨＳＶ環をその後、ＮＰ、遊離ペプチド、または対照で２時間処置し、その後、同じ条件下で収縮させ、弛緩させ、処置後弛緩を処置前弛緩と比較する；（Ｅ）ＭＫ２ｉおよびＭＫ２ｉ−ＮＰで増強された血管弛緩の定量。最大用量のＭＫ２ｉ−ＮＰと等価のＰＰＡＡポリマーをビヒクル対照として含めた；（Ｆ）ｐ−ＨＳＰ２０およびｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰで増強された血管弛緩の定量。Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆでは：&ｐ＜０．０５；*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．０１（対ＮＴ）、ｎ≧３の別々のドナー；（Ｇ）１００μＭ  ＭＫ２ｉまたはＭＫ２ｉ−ＮＰ、５００μＭ  ｐ−ＨＳＰ２０またはｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰで前処置され、その後ＡＮＧ−ＩＩで刺激された単一ドナー（ｎ＝１）から得られたヒト伏在静脈外植片のＡｌｅｘａ−４８８ファロイジン染色凍結切片におけるＦ−アクチン可視化。これによりＮＰ製剤で処置された試料における減少したＦ−アクチンの可視化が可能になる。
【図７５】アクチン媒介血管収縮および血管弛緩におけるＭＡＰＫＡＰキナーゼ２（ＭＫ２）および熱ショックタンパク質２０（ＨＳＰ２０）の作用メカニズムの概略図を示す。ＭＫ２はｐ３８ＭＡＰＫを介して細胞ストレス（例えば機械的外傷、サイトカイン、酸化ストレス、など）により活性化される。リン酸化ＭＫ２は多くの下流エフェクターを活性化する：１）熱ショックタンパク質２７（ＨＳＰ２７）のリン酸化により線維状アクチンのキャッピングが生じ、これにより、アクチン脱重合および血管弛緩が阻害される。２）Ｌｉｍキナーゼ（ＬＩＭＫ）のリン酸化により、アクチン分解を防止し、血管弛緩を阻害するコフィリンのリン酸化および非活性化が生じる。ＭＫ２阻害ペプチド（ＭＫ２ｉ）はＭＫに結合し、これらの下流エフェクターの活性化を防止し、血管弛緩を促進する。ＨＳＰ２０は環状ヌクレオチド依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡおよびＰＫＧ）によりリン酸化され、１４−３−３タンパク質への結合およびそれからのリン酸化コフィリンの置換が生じる。この置換により、コフィリンは、ホスファターゼ、例えばｓｌｉｎｇｓｈｏｔにより脱リン酸され、コフィリンの活性化および線維状アクチンの随伴性コフィリン媒介脱重合が生じる。ホスホ−ＨＳＰ２０ペプチド模倣物（ｐ−ＨＳＰ２０）はリン酸化ＨＳＰ２０の活性を再現し、最終的に血管弛緩を引き起こす。
【図７６】エンドソーム溶解性ナノポリプレックスサイトゾルペプチド送達のメカニズムの概略図を示す。
【図７７】希釈剤（Ａ）および１ｍｇ／ｍＬのＭＭＩ−０１００標準（Ｂ）のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図７８】ＭＭＩ−０１００濃度（ｍｇ／ｍＬ）対ピーク面積の直線プロットを示す。
【図７９】２５℃でのＭＭＩ−０１００アッセイ回収および不純物増大の概要である。（Ａ）７日および１４日でのｐＨ対パーセント（％）回収；（Ｂ）７日および１４日でのｐＨ対速度（パーセント（％）不純物増大／日）。
【図８０】４０℃でのＭＭＩ−０１００アッセイ回収および不純物増大の概要である。（Ａ）１日、２日、７日および１４日でのｐＨ対パーセント（％）回収；（Ｂ）１日、２日、７日および１４日でのｐＨ対速度（パーセント（％）不純物増大／日）。
【図８１】６０℃でのＭＭＩ−０１００アッセイ回収および不純物増大の概要である。（Ａ）１日、２日および７日でのｐＨ対パーセント（％）回収；（Ｂ）１日、２日および７日でのｐＨ対速度（パーセント（％）不純物増大／日）。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
用語集
「活性」という用語は、本明細書では、意図された治療効果の一因となる本発明の組成物の材料成分、成分または構成要素を示す。「活性材料成分」という用語（「ＡＩ」、「活性薬剤材料成分」、「ＡＰＩ」、または「バルク活性」）は、薬学的に活性である薬物中の物質である。本明細書では、「追加の活性材料成分」という句は、薬理学的な、または任意の他の有益な活性を果たす、記載される組成物の化合物以外の作用物質を示す。
【００７７】
「実ラベルクレーム（Ａｃｔｕａｌ  Ｌａｂｅｌ  Ｃｌａｉｍ）（ＡＬＣ）」という用語は、本明細書では、製剤の効力および標的充填重量に基づく存在する原薬の実際の量を示し；［（効力（％））／１００％］×（標的充填重量（ｍｇ））×（１，０００μｇ／ｍｇ）に等しい。
【００７８】
「作動」という用語は、本明細書では、推進の作用；作動するまたは動作させることを示す。
【００７９】
「混合物」または「ブレンド」という用語は、本明細書では一般には、２つ以上の異なる成分の物理的組み合わせを示す。
【００８０】
「投与する」または「投与すること」という用語は、本明細書では、与えることまたは適用することを意味し、インビボ投与、ならびに直接、組織へのエクスビボでの投与を含む。一般に、投与は、全身的、例えば、経口的、頬側、非経口的、局所的に、吸入もしくは吹送により（すなわち、口を介してまたは鼻を介して）、直腸に、従来の無毒性薬学的に許容される担体、アジュバント、およびビヒクルを要望通り含む用量単位製剤で、または局部的、例えば、限定はされないが、注射、埋め込み、移植、局所適用、または非経口的であってもよい。
【００８１】
「作用物質」という用語は、本明細書では一般に長時間作用性製剤中に、またはそれ上に含まれる化合物を示す。作用物質は、抗体または核酸または賦形剤あるいは、より一般的には、長時間作用性製剤中の任意の添加物を含み得る。「作用物質」は単一のそのような化合物を含み、複数のそのような化合物を含むことも意図される。
【００８２】
「アゴニスト」という用語は、本明細書では、受容体を活性化し、薬理学的応答を誘導することができる化学物質を示す。受容体は、内在性または外因性アゴニストおよびアンタゴニストにより活性化または不活性化することができ、生物学的応答が刺激または阻害される。生理的アゴニストは、同じ身体応答を生成させるが、同じ受容体に結合しない物質である。特定の受容体に対する内在性アゴニストは、その受容体に結合し、活性化する、身体により天然に生成される化合物である。スーパーアゴニストは標的受容体に対して内在性アゴニストよりも大きな最大応答を生成させることができ、よって、１００％を超える効率を有する化合物である。これは、内在性アゴニストより強力であることを必ずしも意味せず、むしろ、受容体結合後の細胞内で生成され得る最大可能応答の比較である。完全アゴニストは受容体に結合し、活性化し、その受容体で完全な効力を表す。部分アゴニストもまた、ある受容体に結合し、活性化するが、完全アゴニストに比べ、その受容体で部分的効力しか有さない。インバースアゴニストは、その受容体に対するアゴニストと同じ受容体結合部位に結合し、受容体の恒常的活性を逆転させる作用物質である。インバースアゴニストは受容体アゴニストの反対の薬理学的効果を果たす。不可逆的アゴニストは、受容体が永遠に活性化されるように、永遠に受容体に結合するタイプのアゴニストである。アゴニストの受容体への結合が可逆であるが、不可逆的アゴニストの受容体への結合は不可逆的であると考えられるという点で単なるアゴニストとは異なる。これにより、化合物はアゴニスト活性の一時的な高まりを生成させ、続いて、受容体の減感作および内在化が起こり、これにより、長期治療と共に、むしろアンタゴニストに近い効果が生成される。選択的アゴニストは１つのある一定のタイプの受容体に特異的である。
【００８３】
「アンダーセンカスケードインパクタ」（ＡＣＩ）という用語は、本明細書では、吸入された生成物の試験のために使用されるインパクタを示す。カスケードインパクタは慣性衝突に基づき動作する。インパクタの各ステージは一連のノズルまたはジェットを備え、これを介して、試料を含む空気が引き出され、全ての空中試料がその特定のステージのための捕集板の表面に向かって誘導される。特定の粒子がそのステージで衝突するかどうかは、その空気速度論的直径に依存する。十分な慣性を有する粒子はその特定ステージの捕集板に衝突し、より小さな粒子は気流中に同伴されたままであり、次のステージに移り、そこで、プロセスが繰り返される。ステージは、粒子サイズが減少する順に、通常、スタックまたは列で組み立てられる。ジェットが小さくなると、気流速度が増加し、より小さな粒子が捕集される。試験の終わりに、各ステージに関連する粒子量が好適な溶媒を用いて回収され、その後、通常ＨＰＬＣを使用して分析され、実際に存在する薬物の量が決定される。
【００８４】
「アンタゴニスト」という用語は、本明細書では、別の物質の効果と相互作用する物質を示す。機能的または生理的拮抗作用は、２つの物質が同じ生理的機能について反対の効果を生成させるときに生じる。化学的拮抗作用または不活性化は、２つの物質の間の反応であり、それらの効果が中和される。体内動態拮抗作用は物質の体内動態（その吸収、生体内分解、分布、または排泄）の変化であり、よって、標的に到達する作用物質がより少なくなり、そこにあるその残留物が低減される。物質に対する受容体での拮抗作用は、同じ部位に対して競合する適切なアンタゴニストによる、アンタゴニストの効果の遮断を伴う。
【００８５】
「生物活性剤」という用語は、本明細書では、いくつかの型の治療効果を提供する、またはいくつかのタイプの生物学的応答または活性を誘発する医薬または薬用目的のために使用される医薬製剤または剤形中またはそれ上に含まれる、興味深い化合物を示す。「生物活性剤」は単一のそのような作用物質を含み、また、例えば、２つ以上の生物活性剤の組み合わせを含む、複数の生物活性剤を含むことが意図される。
【００８６】
「生物が利用可能な」という用語は、本明細書では、活性成分が医薬品から吸収され、作用部位で利用可能になる速度および程度を示す。
【００８７】
「生体適合性」という用語は、本明細書では、一般にレシピエントに対し無毒性であり、対象に対し著しい有害効果を有さず、さらに、材料のいずれの代謝産物または分解産物も対象に対し無毒性である材料を示す。典型的には、「生体適合性」である物質は、生組織に対して、臨床的に関連する組織刺激作用、損傷、毒性反応、または免疫学的反応を引き起こさない。
【００８８】
「生分解性」という用語は、本明細書では、侵食されて可溶性種となり、または生理的条件で分解してより小さな単位または化学種となり、それらが、それ自体、対象に対して無毒性（生体適合性）であり、対象により代謝され、排除され、または排泄され得る材料を示す。
【００８９】
「生物模倣物」という用語は、本明細書では、生体により生成される天然材料をまねるまたは「模倣する」材料、物質、装置、プロセス、または系を示す。
【００９０】
「ブリスター」または「ブリスター包装」という用語は、本明細書では、通常、１つ以上の個々の用量を含む、形成された空洞から構築される単位用量パッケージを示す。
【００９１】
「％ブリスタークリアランス」という用語は、本明細書では、％で表される、作動中にブリスターから放出される粉末のパーセンテージを示し、［（初期重量−最終重量）／充填重量］*１００％に等しい。
【００９２】
「担体」という用語は、本明細書では、生物に対し著しい刺激作用を引き起こさず、記載される発明の組成物のペプチドの生物活性および特性を停止しない材料を示す。担体は処置される哺乳類への投与に好適なものとするために、十分高純度で、十分低い毒性を有するものでなければならない。担体は不活性とすることができ、あるいは、それは薬効を有することができる。「賦形剤」、「担体」、または「ビヒクル」という用語は同じ意味で使用され、本明細書で記載される、薬学的に許容される組成物の製剤化および投与に好適な担体材料を示す。本明細書で有用な担体およびビヒクルとしては、無毒性で、他の成分と相互作用しない、当技術分野で知られている、任意のそのような材料が挙げられる。
【００９３】
「成分」という用語は、本明細書では、構成部分、元素または材料成分を示す。
【００９４】
「組成物」という用語は、本明細書では、全ての活性および不活性材料成分を含む、記載される発明の生成物を示す。
【００９５】
「病状」という用語は、本明細書では、様々な健康状態を示し、任意の根底にあるメカニズムまたは障害、損傷、および健康な組織および器官の促進により引き起こされる障害または疾患を含むことが意味される。
【００９６】
「接触」という用語およびその全ての文法型は、本明細書では、触れることまたはすぐ近くまたは局所的近接の状態または条件を示す。
【００９７】
「制御放出」という用語は、本明細書では、製剤からの薬物放出の様式およびプロファイルが調節される、任意の薬物含有製剤を示す。これは、即時放出ならびに非即時放出製剤を示し、非即時放出製剤としては、持続放出および遅延放出製剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
「遅延放出」という用語は、本明細書では、その従来の意味で、製剤の投与とそれらの治療薬の放出の間に時間遅延がある製剤を示す。「遅延放出」は長期間にわたる治療薬の漸進的放出を含んでも、含まなくてもよく、よって「持続放出」であっても、なくてもよい。
【００９９】
「送達用量（ＤＤ）」という用語は、本明細書では、例えば、用量採取装置（ＤＳＡ）、用量均一性採取装置（ＤＵＳＡ）、アンダーセンカスケードインパクタ（ＡＣＩ）、または次世代医薬品インパクタ（ＮＧＩ）の抽出から回収した、ｍｇまたはμｇで表される原薬の量を示す。装置外の原薬の量に等しい（すなわち、ブリスターおよび／または流路に保持される原薬の量を含まない）。
【０１００】
「誘導送達用量（ＤＤＤ）」という用語は、本明細書では、送達用量均一性（ＤＤＵ）試験から得られた装置外の薬物の量とは対照的に、インパクタ試験から得られた、装置外の薬物の量を示す。
【０１０１】
「％送達用量」という用語は、本明細書では、実ラベルクレーム（ＡＬＣ）のパーセンテージを示し；（ＤＤ／ＡＬＣ）×１００％に等しい。
【０１０２】
「疾患」または「障害」という用語は、本明細書では、健康の機能障害または異常機能状態を示す。
【０１０３】
「配置された」という用語は、本明細書では、特定の様式で、置かれ、配列され、または分配されていることを示す。
【０１０４】
「薬物」という用語は、本明細書では、疾患の防止、診断、軽減、治療、または治癒において使用される、食品以外の治療薬または任意の物質を示す。
【０１０５】
「乾燥粉末吸入器」または「ＤＰＩ」という用語は、本明細書では、定量噴霧式吸入器と同様であるが、薬物が粉末形態である装置を示す。患者は十分に息を吐き出し、唇をマウスピースの周りに置き、その後、直ちに、粉末を吸い込む。乾燥粉末吸入器は、ＭＤＩで必要とされるタイミングおよび協調を必要としない。
【０１０６】
「有効量」という用語は、所望の生物学的効果を実現するのに必要とされる、または十分な量を示す。
【０１０７】
「賦形剤」という用語は、本明細書では、長時間作用性製剤に含めることができ、生物活性剤ではない、任意の他の作用物質または化合物を含む。そのようなものとして、賦形剤は薬学的にまたは生物学的に許容され、または関連しなければならない（例えば、賦形剤は、一般に対象に対して無毒性である）。「賦形剤」は単一のそのような化合物を含み、また、複数のそのような化合物を含むことが意図される。
【０１０８】
「充填重量」という用語は、本明細書では、作動前に各ブリスター中に秤量した粉末の実際の量（例えば、ｍｇまたはμｇで表される）を示す。
【０１０９】
「最終重量」という用語は、本明細書では、作動後の密閉ブリスターおよび粉末の重量を示す。
【０１１０】
「微粒子用量（ＦＰＤ）」という用語は、本明細書では、インパクタ（例えば、ＡＣＩまたはＮＧＩ）の特定のカットオフ直径未満で回収される原薬の量（例えば、ｍｇまたはμｇで表される）を示し；呼吸用量に等しい。
【０１１１】
「微粒子画分（実際）」という用語は、本明細書では、閉じたブリスター（複数可）中に存在する薬物の理論量に対して正規化されたＦＰＤを示し；（ＦＰＤ／［（充填重量）×（効力）］×１００％に等しい。
【０１１２】
「微粒子画分（名目ラベルクレーム）という用語は、本明細書では、ＮＬＣに対して正規化されたＦＰＤを示し；［（ＦＰＤ）／（ＮＬＣ）×１００％］に等しい。
【０１１３】
「微粒子画分（送達用量）という用語は、本明細書では、ＤＤに対して正規化されたＦＰＤを示し；［（ＦＰＤ）／（ＤＤ）×１００％］に等しい。
【０１１４】
「製剤」という用語は、本明細書では、特定の手順、式または規則に従い調製された混合物を示す。
【０１１５】
「機能的等価物」または「機能的に等価な」という用語は、本明細書では、互換的に用いられ、類似もしくは同一の作用または用途を有する物質、分子、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指す。ポリペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と機能的に等価なポリペプチドは、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の発現ポリペプチドと実質的に類似または同一の生物学的活性、例えば阻害活性、動態パラメータ、塩阻害、補因子依存性活性、および／または機能単位のサイズを有し得る。
【０１１６】
ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と機能的に等価なポリペプチドの例としては、アミノ酸配列ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のポリペプチド；アミノ酸配列ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）のポリペプチド；アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＡＶＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）のポリペプチド；アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）のポリペプチド、アミノ酸配列ＨＲＲＩＫＡＷＬＫＫＩＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）のポリペプチド、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＮＲＱＬＧＶＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）のポリペプチド、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＤＡＲＡＫＡＬＮＲＱＬＡＶＡＡのポリペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）およびアミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＮＲＱＬＡＶＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
本発明に記載のアミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のＭＭＩ−０１００ペプチドは、治療有効性を高めるために、治療ドメイン（ＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）にタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ；ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）が動作可能に連結された融合タンパク質を含む。
【０１１８】
ポリペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の治療ドメイン（ＴＤ；ＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２））と機能的に等価のポリペプチドの例としては、アミノ酸配列ＫＡＬＡＲＱＬＡＶＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）のポリペプチド、アミノ酸配列ＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）のポリペプチド、アミノ酸配列ＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）のポリペプチド、アミノ酸配列ＫＡＬＮＲＱＬＡＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）のポリペプチド、およびアミノ酸配列ＫＡＬＮＲＱＬＡＶＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
ポリペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ；ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）と機能的に等価なポリペプチドの例としては、アミノ酸配列ＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩＫＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）のポリペプチド、アミノ酸配列ＷＬＲＲＩＫＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）のポリペプチド、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）のポリペプチド、アミノ酸配列ＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）のポリペプチド、アミノ酸配列ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）のポリペプチド、アミノ酸配列ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）のポリペプチド、およびアミノ酸配列ＨＲＲＩＫＡＷＬＫＫＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
「遺伝子送達ビヒクル」という用語は、本明細書では、細胞におけるポリペプチドの発現のためのコード配列の細胞への送達を促進する成分を示す。遺伝子送達ビヒクルは、遺伝子またはｃＤＮＡの細胞、例えば、リポソーム、ウイルス粒子、または発現ベクターへの送達を達成することができる任意の成分またはビヒクルとすることができる。
【０１２１】
「幾何標準偏差（ＧＳＤ）」という用語は、本明細書では、空気速度論的中央粒子径（ＭＭＡＤ）と８４％または１６％の直径サイズ分布のいずれかとの間の比に等しい無次元数を示す（例えば、ＭＭＡＤ＝２ｐｍ；８４％＝４ｐｍ；ＧＳＤ＝４／２＝２．０）。ＭＭＡＤは、ＧＳＤと共に、粒子サイズ分布を示す。
【０１２２】
「肉芽形成」という用語は、本明細書では、小さな、赤い、粒子様突出物が治癒のプロセスにおいて、皮のむけた表面上で形成するプロセスを示す。
【０１２３】
「親水性」という用語は、本明細書では、極性物質、例えば水に対して親和性を有する材料または物質を示す。「親油性」という用語は、本明細書では、極性または水性環境に比べ非極性環境に対する親和性を好む、または有する材料または物質を示す。
【０１２４】
「吸入」という用語は、本明細書では、医薬が添加された蒸気を呼吸により吸い込む行為を示す。
【０１２５】
「吸入送達装置」という用語は、本明細書では、液体または乾燥粉末エアロゾル製剤から小滴またはエアロゾルを生成させ、例えば、溶液、粉末、などでの、薬物の肺投与を達成するための経口投与のために使用される、任意の装置を示す。吸入送達装置の例としては、ネブライザー、定量噴霧式吸入器、および乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１２６】
「吹送」という用語は、本明細書では、身体の腔または小室に加圧下で空気、気体、または粉末を送達する行為を指す。例えば鼻吹送は、加圧下で鼻から空気、気体または粉末を送達する行為に関する。
【０１２７】
「阻害すること」、「阻害する」または「阻害」という用語は、本明細書では、プロセスの量または速度を低減させる、プロセスを完全に中止させる、またはその作用または機能を減少、制限、またはブロックすることを示すために使用される。阻害は物質の量、速度、作用機能、またはプロセスの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％だけの低減または減少を含み得る。
【０１２８】
「阻害剤」という用語は、本明細書では、第１の分子に結合し、これにより、第１の分子の活性を低減させる第２の分子を示す。酵素阻害剤は、酵素に結合し、これにより、酵素活性を減少させる分子である。阻害剤の結合は、基質が酵素の活性部位に入ることを中止し、および／または酵素がその反応を触媒するのを妨げることができる。阻害剤結合は可逆かまたは不可逆的である。不可逆的阻害剤は通常、酵素と反応し、例えば、酵素活性に必要とされる主要アミノ酸残基を修飾することにより、これを化学的に変化させる。対照的に、可逆阻害剤は、非共有結合により結合し、これらの阻害剤が酵素、酵素−基質複合体、または両方に結合するかによって、異なるタイプの阻害を生成させる。酵素阻害剤はしばしば、それらの特異性および効力により評価される。
【０１２９】
「初期重量」という用語は、本明細書では、作動前に計量したブリスターおよび粉末の重量（例えば、ｍｇで表される）を示す。
【０１３０】
「損傷」という用語は、本明細書では、外的因子または力（物理的または化学的であり得る）によって引き起こされる、身体の構造または機能に対する傷害または損害を示す。
【０１３１】
「単離された」という用語は、本明細書では、（１）その天然に起こる環境で見出されるように通常それに付随するかまたはそれと相互作用する成分を実質的にまたは本質的に含まない、非限定的に核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質などの材料を指す。「実質的に含まない」または「本質的に含まない」という用語は、相当にもしくは顕著に含まれず、または約９５％よりも多く、または約９９％よりも多く排除されていることを指すために本明細書で用いられる。単離された材料は、その天然環境においてその材料と一緒に見出されない材料を場合により含み、または（２）材料がその天然の環境にある場合に、この材料は、組成物に対する人の意図的な介入によって合成で（非天然に）改変されており、そして／またはその環境で見出される材料にとって天然ではない細胞中のある場所（例えばゲノムまたは細胞内小器官）に配置されている。合成材料を得るための改変は、その天然状態にある材料に実施されるか、またはその天然状態から取り出された材料に実施される。
【０１３２】
「ＬＰＭ」または「Ｌ／分」という用語は、本明細書では、リットル毎分を示す。
【０１３３】
「マスバランス」という用語は、本明細書では、抽出物の各成分から回収された原薬の総量を示し、例えば、吸入器内に残された量を含む。マスバランスは、［（計量された用量）／（実際の充填重量×効力）］×１００％に等しい、実際の充填重量のパーセンテージとして表すことができる。
【０１３４】
「空気速度論的中央粒子径（ＭＭＡＤ）」という用語は、本明細書では、粒子の重量およびサイズに基づく、統計学的粒子サイズ分布を示す。例えば、重量で、５０％の粒子は、中央径より小さい（および、粒子の５０％は中央径よりも大きい）。
【０１３５】
「計量された用量」という用語は、本明細書では、特定の量の薬物の標的への送達を示す。例えば、エアロゾル化薬物の肺への送達。
【０１３６】
「定量噴霧式吸入器」、「ＭＤＩ」、または「パッファ」という用語は、本明細書では、噴射剤を使用して特定の量の医薬（「計量された用量」）を患者の肺に送達させる、加圧された、携帯式装置を示す。「噴射剤」という用語は、本明細書では、通常、収束、発散ノズルを介してガス圧により、物質を放出するために使用される材料を示す。圧力は、圧縮ガス、または化学反応により生成されたガスに由来してもよい。排出材料はガス、液体、プラズマ、あるいは、化学反応前は、固体、液体またはゲルであってもよい。加圧定量噴霧式吸入器において使用される噴射剤は液化ガス、伝統的にはクロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）であり、次第に、ヒドロフルオロアルカン（ＨＦＡ）である。好適な噴射剤としては、例えば、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、例えばトリクロロフルオロメタン（噴射剤１１とも呼ばれる）、ジクロロジフルオロメタン（噴射剤１２とも呼ばれる）、および１，２−ジクロロ−１，１，２，２−テトラフルオロエタン（噴射剤１１４とも呼ばれる）、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン（ＨＦＣ）、例えば１，１，１，２−テトラフルオロエタン（噴射剤１３４ａ、ＨＦＣ−１３４ａ、またはＨＦＡ−１３４ａとも呼ばれる）および１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（噴射剤２２７、ＨＦＣ−２２７、またはＨＦＡ−２２７とも呼ばれる）、二酸化炭素、ジメチルエーテル、ブタン、プロパン、またはそれらの混合物が挙げられる。他の実施形態では、噴射剤はクロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、またはそれらの混合物を含む。他の実施形態では、ヒドロフルオロカーボンが噴射剤として使用される。他の実施形態では、ＨＦＣ−２２７および／またはＨＦＣ−１３４ａが噴射剤として使用される。
【０１３７】
「ＭＫ２キナーゼ」または「ＭＫ２」という用語は、本明細書では、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２（「ＭＡＰＫＡＰＫ２」、「ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２」、「ＭＫ２」とも呼ばれる）を指し、それはセリン／トレオニン（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）プロテインキナーゼファミリーの１種である。
【０１３８】
「ＭＭＩ−０１００」、「ＭＭＩ−０１００ペプチド」、「ＭＭＩ−０１００ポリペプチド」、「ＭＫ２阻害剤」、「ＭＫ２ｉ」、「ＭＫ２ｉペプチド」、「ＭＫ２ｉポリペプチド」などという用語は本明細書で同じ意味で使用され、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を示す。
【０１３９】
「ネブライザー」という用語は、本明細書では、肺に吸引される霧の形態として液体医薬を投与するために用いられる装置を示す。
【０１４０】
「名目ラベルクレーム（ＮＬＣ）」という用語は、本明細書では、標的効力および標的ブリスター充填重量に基づく、作動あたりの存在する原薬の意図された量を示す。
【０１４１】
「核酸」という用語は、本明細書では、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指し、他に断りがなければ、天然由来ヌクレオチドと類似の様式で一本鎖核酸にハイブリダイズする、天然ヌクレオチドの本質的性質を有する公知の類似体（例えばペプチド核酸）も包含する。
【０１４２】
「ヌクレオチド」という用語は、複素環塩基、糖、および１つまたは複数のリン酸基からなる化合物を指すために本明細書で用いられる。最も一般的なヌクレオチドでは、塩基はプリンまたはピリミジンの誘導体であり、糖はペントースデオキシリボースまたはリボースである。ヌクレオチドは核酸のモノマーであり、３つ以上が一緒に結合して核酸を形成する。ヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、および非限定的にＣｏＡ、ＦＡＤ、ＤＭＮ、ＮＡＤ、およびＮＡＤＰを含むいくつかの補因子の構造単位である。プリンはアデニン（Ａ）、およびグアニン（Ｇ）を含み、ピリミジンはシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。
【０１４３】
以下の用語は、２つ以上の核酸またはポリヌクレオチド間の配列関係を記述するために本明細書で用いられる：（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較ウィンドウ」、（ｃ）「配列同一性」、（ｄ）「配列同一性％」、および（ｅ）「実質的同一性」。
【０１４４】
（ａ）「参照配列」という用語は、配列比較の基準として用いられる配列を指す。参照配列は、例えば、完全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全なｃＤＮＡもしくは遺伝子配列としての、特定した配列のサブセットまたは全体であり得る。
【０１４５】
（ｂ）「比較ウィンドウ」という用語は、ポリヌクレオチド配列の連続した特定のセグメントを指し、ここでポリヌクレオチド配列が参照配列と比較されてもよく、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分が、この２つの配列の最適なアラインメントのために参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（即ち、ギャップ）を含んでいてもよい。一般的に比較ウィンドウは、少なくとも２０の連続ヌクレオチド長であり、場合によって少なくとも３０連続ヌクレオチド長、少なくとも４０連続ヌクレオチド長、少なくとも５０連続ヌクレオチド長、少なくとも１００連続ヌクレオチド長であるか、またはそれより長くてよい。ポリヌクレオチド配列にギャップを含ませることによる参照配列に対する高度な類似性を回避するために、典型的にはギャップペナルティーが導入されマッチする数から差し引かれることは、当業者に理解されよう。
【０１４６】
比較のための配列アラインメントの方法は、当該技術分野で周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３（１９７０）の相同アラインメントアルゴリズムによって；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８５：２４４４（１９８８）の類似性のための検索方法によって；これらのアルゴリズムのコンピュータ化手段（非限定的にＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  Ｃａｌｉｆ．によるＰＣ／遺伝子プログラム中のＣＬＵＳＴＡＬ；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ），  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．，  ＵＳＡ内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡなど）によって実施され得、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４  （１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３  （１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６：１０８８１−９０  （１９８８）；Ｈｕａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ８：１５５−６５  （１９９２）、およびＰｅａｒｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２４：３０７−３３１（１９９４）によって十分に記載されている。データベースの類似性検索に用いられ得るプログラムのＢＬＡＳＴファミリーとしては、ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド照会配列のためのＢＬＡＳＴＮ；タンパク質データベース配列に対するヌクレオチド照会配列のためのＢＬＡＳＴＸ；タンパク質データベース配列に対するタンパク質照会配列のためのＢＬＡＳＴＰ；ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質照会配列のためのＴＢＬＡＳＴＮ；およびヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド照会配列のためのＴＢＬＡＳＴＸが挙げられる。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １９，  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）を参照されたい。
【０１４７】
他に断りがなければ、本明細書で提供される配列同一性／類似性の値は、規定値パラメータを利用するＢＬＡＳＴ２．０一式のプログラムを用いて得られた値を指す。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２（１９９７）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するソフトウェアは、例えばＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから、公的に入手できる。このアルゴリズムは、照会配列内で長さＷの短いワードを同定することにより高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを含み、それらのペアはデータベース内の同じ長さのワードを用いてアラインメントを実施した時に、幾つかの正の値の閾値スコアＴと一致または適合する。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．上掲書）。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを発見するために検索を開始するためのシードとして作用する。このワードヒットをその後、累積的アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（マッチ残基ペアの報奨スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア；常に＜０）を用いて算出する。アミノ酸残基については、スコアリングマトリックスを用いて、累積スコアを算出する。各方向におけるワードヒットの伸長は、累進アライメントスコアが最大達成値から量Ｘだけ減少した時；累積スコアが、負のスコアを与える１つもしくは複数の残基アラインメントの累積のために０以下になった時；またはいずれかの配列の末端に達した時に、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、規定値として１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、規定値として３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照されたい）。
【０１４８】
配列同一性％の計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ    Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７，  １９９３参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、それは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の一致が偶然によって生じる確率を示す。ＢＬＡＳＴ検索は、タンパク質がランダム配列としてモデル化され得ると仮定する。しかし、多くの現実のタンパク質は、非ランダム配列の領域を含み、それはホモポリマー域、短区間のリピート、または１つもしくは複数のアミノ酸に富む領域であり得る。そのような低複雑性領域は、このタンパク質の他の領域が完全に非類似であったとしても、無関係のタンパク質間でアラインメントされ得る。多くの低複雑性フィルタープログラムを用いて、そのような低複雑性アラインメントを減少させることができる。例えば、ＳＥＧ（Ｗｏｏｔｅｎ  ａｎｄ  Ｆｅｄｅｒｈｅｎ，  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｃｈｅｍ．，  １７：１４９−１６３（１９９３））およびＸＮＵ（Ｃｌａｖｅｒｉｅ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｅｓ，  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｃｈｅｍ．，  １７：１９１−２０１（１９９３））低複雑性フィルターを、単独でまたは組み合わせて利用してもよい。
【０１４９】
（ｃ）２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」という用語は、特定の比較ウィンドウ全体で最大一致のアラインメントを実施した時に同一である２つの配列中の残基を指す。配列同一性％が、タンパク質に対して用いられる場合、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって、即ち、アミノ酸残基が類似する化学的特性（例えば荷電または疎水性）を有する他のアミノ酸で置換され、したがってその分子の機能的特性が変わらない場合、しばしば異なることが認識される。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性％を上方に調整して、この置換の保存的性質について修正できる。そのような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調整を実施する手段は、当業者に周知である。典型的にはこれは、保存的置換を完全ミスマッチではなく部分的ミスマッチとして評価し、それによって配列同一性％を高めることを含む。したがって、例えば同一アミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換が０のスコアを与えられる場合、保存的置換は、０と１の間のスコアが与えられる。保存的置換の評価は、例えばＰＣ／ＧＥＮＥプログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  Ｃａｌｉｆ．，  ＵＳＡ）で履行されるように、例えばＭｅｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｓｃｉ．，  ４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズムにしたがって計算される。
【０１５０】
（ｄ）「配列同一性％」という用語は、最適にアラインメントされた２つの配列を、比較ウィンドウ全体で比較することによって決定される値を意味するために本明細書で用いられ、ここで比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（即ち、ギャップ）を含み得る。その％値は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列中に存在する位置の数を決定して一致する位置の数を得て、この一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割算し、その結果を１００倍して配列同一性の％値を得ることにより計算される。
【０１５１】
（ｅ）ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、記載されたアラインメントプログラムの１つを用いて標準的なパラメータにより参照配列と比較して、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性および少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者であれば、これらの値を適宜調整して、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を、コドンの縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置などを考慮しながら決定できることを認識するであろう。これらの目的のためのアミノ酸配列の実質的同一性は、少なくとも６０％、または少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を意味する。ヌクレオチド配列が実質的に同一であることのもう１つの指標は、ストリンジェントな条件下で２つの分子が互いにハイブリダイズするか否かということである。しかし、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、なお実質的に同一である。このようなことは、例えば核酸のコピーが、遺伝子コードによって許容される最大のコドン縮重を用いて作製された場合に、生じ得る。２つの核酸配列が実質的に同一であることの１つの指標は、第一の核酸がコードするポリペプチドが、第二の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。
【０１５２】
「動作可能に連結される」という用語は、本明細書では、生じた融合ペプチドの各タンパク質ドメインまたはポリペプチドがその本来の機能を保持できるように、２つ以上のタンパク質ドメインまたはペプチドが、組換えＤＮＡ技術または化学反応により連結または合体された結合を指す。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、タンパク質形質導入ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）を治療ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と動作可能に連結して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６の細胞貫通機能およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＭＫ２キナーゼ阻害剤機能の両方を保有する融合ペプチドを作製することによって構築される。
【０１５３】
「粒子」という用語は、本明細書では、全体的にまたは部分的に本明細書で記載される少なくとも１つの治療薬を含み得る非常に小さな構成要素、例えば、ナノ粒子または微小粒子）を示す。「微小粒子」という用語は、一般に、約１０ｎｍ〜２０００ミクロン（２ミリメートル）のサイズを有する様々な実質的な構造を示すために本明細書で使用され、マイクロカプセル、ミクロスフェア、ナノ粒子、ナノカプセル、ナノスフェアならびに一般に、約２０００ミクロン（２ミリメートル）未満である粒子が含まれる。粒子はコーティングにより囲まれるコア中に治療薬（複数可）を含み得る。治療薬（複数可）はまた、粒子全体に分散され得る。治療薬（複数可）はまた、粒子中に吸着され得る。粒子は任意の次数の放出速度論を有することができ、０次放出、１次放出、２次放出、遅延放出、持続放出、即時放出、など、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。粒子は、治療薬（複数可）に加えて、薬学および医薬の分野でルーチン的に使用されるそれらの材料のうちのいずれか、例えば、限定はされないが、侵食性、非侵食性、生分解性、もしくは非生分解性材料またはそれらの組み合わせを含み得る。粒子は、活性剤を溶液または半固体状態で含むマイクロカプセルであってもよい。粒子は事実上任意の形状を有し得る。
【０１５４】
「薬学的に許容される塩」という用語は、適切な医学的判定の範囲内で、ヒトおよびより下等な動物の組織と接触する使用に適し、過度の毒性、刺激性、アレルギー反応などを有さず、合理的な利益／リスク比に関して釣合いがとれたそれらの塩を意味する。
【０１５５】
「医薬製剤」または「医薬組成物」という用語は、本明細書では、標的病状または疾患を防止する、強度を低減させる、治癒させるまたは別様に治療するために使用される製剤または組成物を示す。
【０１５６】
「防止」という用語は、本明細書では、イベント、行為または作用が生じる、起こる、または発生することがないように維持する、邪魔するまたは防ぐことを示す。
【０１５７】
「プロドラッグ」という用語は、本明細書では、不活性な形態であるが、対象への投与後、生物学的変換により活性な形態に変換されるペプチドまたは誘導体を意味する。
【０１５８】
「組換え」という用語は、本明細書では、遺伝子操作により生成される物質を示す。
【０１５９】
「低減させる」、「低減された」、「低減させるため」または「低減させること」という用語は、本明細書では、程度、強度、限度、サイズ、量、密度または数の縮小、減少、減弱または減退を示す。
【０１６０】
「類似」という用語は、用語：類似する、匹敵する、または似る、と互換的に用いられ、共通の特質または特徴を有することを意味する。
【０１６１】
医薬品の「安定性」という用語は、本明細書では、特定の製剤の、その物理、化学、微生物学、治療および毒性学仕様内にとどまる能力を示す。
【０１６２】
「しやすい」という用語は本明細書では、リスクのある集団の１種を示す。
【０１６３】
「対象」または「個体」または「患者」という用語は、非限定的にマウス、ラット、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ハムスター、フェレット、カモノハシ、ブタ、イヌ、モルモット、ウサギおよび霊長類、例えばサル、類人猿またはヒトを含む、哺乳動物起源の動物種の１種を指すために互換的に用いられる。
【０１６４】
「それを必要とする対象」という句は、本明細書では、その句の文脈および使用が別の意味を示さない限り、（ｉ）少なくとも１つの治療ペプチド薬を含む製剤が投与されるであろう、（ｉｉ）少なくとも１つの治療ペプチド薬を含む製剤を受けている；または（ｉｉｉ）少なくとも１つ治療薬を含む製剤を受けた患者を示す。
【０１６５】
「持続放出」という用語（「徐放」とも呼ばれる）は、本明細書では、長期間にわたる治療薬の漸進的放出を提供し、好ましくは、かならずではないが、長期間にわたり、実質的に一定レベルの作用物質が得られる、薬物製剤を示すその従来の意味で使用される。
【０１６６】
「症状」という用語は、本明細書では、特定の疾患または障害から生じる、およびこれに付随する、ならびにその徴候として機能する現象を示す。
【０１６７】
「症候群」という用語は本明細書では、いくつかの疾患または病状を示す症状のパターンを示す。
【０１６８】
「治療薬」という用語は、本明細書では、治療効果を提供する薬物、分子、核酸、タンパク質、組成物または他の物質を示す。「治療薬」および「活性剤」という用語は同じ意味で使用される。
【０１６９】
「治療成分」という用語は、本明細書では、集団の一定の割合において特定の疾患徴候の進行を排除し、低減させ、または防止する治療的に有効な投与量（すなわち、投与の用量および頻度）を示す。一般的に使用される治療成分の一例は、集団の５０％において特定の疾患徴候に対して治療的に有効となる特定の投与における用量を説明するＥＤ50である。
【０１７０】
「治療効果」という用語は、本明細書では、その結果が、望ましい、および有益であると判断される治療の成績を示す。治療効果は、直接的または間接的に、疾患徴候の停止、低減、または排除を含み得る。治療効果はまた、直接的または間接的に、疾患徴候の進行の停止、低減または排除を含み得る。
【０１７１】
１つ以上の活性剤の「治療的有効量」または「有効な量」という用語は、意図する処置利益を提供するのに十分な量である。使用することができる活性剤の有効量は一般に０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲とすることができる。しかしながら、投薬レベルは、損傷のタイプ、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、症状の重度、投与経路、および用いられる特定の活性剤を含む様々な因子に基づく。したがって投薬レジメンは広範囲に変動し得るが、外科医が標準的な方法を用いて日常的にこれを決定できる。
【０１７２】
「処置する」または「処置すること」という用語は、疾患、病状、障害または損傷の停止、実質的阻害、その進行の緩徐化または逆行、疾患、病状、障害または損傷の臨床的または美的症状の実質的寛解、疾患、病状、障害または損傷の臨床的または美的症状の出現の実質的防止、および有害または不快な症状の防御を包含する。「処置する」または「処置すること」という用語は本明細書ではさらには、以下の１つまたは複数の達成を示す：（ａ）疾患、病状、障害または損傷の重症度の低減；（ｂ）処置される疾患、病状、障害または損傷に特徴的な症状の発生の制限；（ｃ）処置される疾患、病状、障害または損傷に特徴的な症状の悪化の制限；（ｄ）過去に疾患、病状、障害または損傷を有した患者における疾患、病状、障害または損傷の再発の制限；ならびに（ｅ）過去に疾患、病状、障害または損傷に対して症候性であった患者における症状の再発の制限。
【０１７３】
用語「変種」、「変異体」、および「誘導体」は、参照ヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して実質的な同一性を有するヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指すために本明細書で用いられる。配列における相違は、配列または構造における、天然のまたは計画的な変化の結果であり得る。天然の変化は、特定の核酸配列に本質的な通常の複製または複写過程で生じ得る。計画的な変化は、特定の目的のために特別に設計され、配列に導入される。そのような特別な変化は、様々な変異誘発技術を用いてインビトロで実施され得る。特別に作製されたそのような配列変種は、本来の配列の「変異体」または「誘導体」と称することができる。
【０１７４】
当業者は、１つのまたは複数のアミノ酸置換、欠失、付加または交換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ）を有するが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と機能的に等価であるポリペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のポリペプチド変種を生成できる。これらの変種としては、とりわけ：（ａ）１つまたは複数のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸で置換された変種；（ｂ）１つまたは複数のアミノ酸が付加された変種；（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸が置換基を含む変種；（ｄ）ある種のアミノ酸残基が保存的または非保存的な位置で別の種の対応する残基と置換された変種；および（ｄ）標的タンパク質が別のペプチドまたはポリペプチド、例えば融合パートナー、タンパク質タグ、または他の化学的成分と融合されて、標的タンパク質に有用な特性（例えば抗体のためのエピトープ）を付与し得る変種、を挙げることができる。非限定的に遺伝的技術（抑制、欠失、変異など）、化学的技術、および酵素的技術を含む、そのような変種を得る技術は、当業者には公知である。本明細書で用いられるように、「変異」という用語は、親のタイプには見出されない新規な特徴もしくは特質の創出をもたらす生物の遺伝子もしくは染色体内のＤＮＡ配列の変化、またはそのような変化が、遺伝子をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列の改変を介して、もしくは染色体の物理的編成における変化を介して染色体内に生じる過程を指す。変異の３つのメカニズムは、置換（１つの塩基対と別の塩基対との交換）、付加（配列への１つまたは複数の塩基の挿入）、および欠失（１つまたは複数の塩基対の損失）を含む。
【０１７５】
「ビヒクル」という用語は、本明細書では、薬物の使用を容易にする物質または薬物と混合される他の材料を指す。
【０１７６】
１つの実施形態によれば、記載される発明は、ＭＫ２キナーゼの阻害剤を含む医薬製剤を提供する。別の実施形態によれば、ＭＫ２阻害剤はポリペプチドである。別の実施形態によれば、ポリペプチドとしては、ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１））またはその機能的等価物が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１７７】
１つの実施形態によれば、医薬製剤は、ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはその機能的等価物、５％ｗ／ｗ固体を含む、ニート噴霧乾燥分散物を含む。別の実施形態によれば、医薬製剤は、ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはその機能的等価物、１％ｗ／ｗ固体を含むニート噴霧乾燥分散物を含む。別の実施形態によれば、医薬製剤は、８０／２０のＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはその機能的等価物／トレハロースを含む噴霧乾燥分散物を含む。別の実施形態によれば、医薬製剤は、９２．５／７．５のＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはその機能的等価物／トレハロースを含む噴霧乾燥分散物を含む。
【０１７８】
噴霧乾燥分散物（ＳＤＤ）は、薬物を含むポリマーマトリックスの単相、アモルファス分子分散物である。これは、固体マトリックス中に「溶解された」化合物（例えば、薬物）分子を有する固体溶液である。ＳＤＤは、薬物およびポリマーを有機溶媒中で溶解させて溶液を得て、その後、溶液を噴霧乾燥させることにより得られる。医薬品用途のための噴霧乾燥の使用により、生物薬剤学分類システム（ＢＣＳ）クラスＩＩ（高透過性、低溶解度）およびクラスＩＶ（低透過性、低溶解度）薬物の溶解度が増加したアモルファス分散物が得られる。製剤およびプロセス条件は、溶媒が小滴から迅速に蒸発し、よって、相分離または結晶化に不十分な時間しか得られないように選択される。ＳＤＤは長期安定性および製造可能性を証明した。例えば、２年を超える有効期間が、ＳＤＤでは、一貫して証明された。ＳＤＤの利点としては下記が挙げられるが、それらに限定されない：水溶性が不十分な化合物の経口バイオアベイラビリティの増強、従来の固体剤形（例えば、錠剤およびカプセル）を用いた送達、再現でき、制御可能で、スケーラブルな製造プロセスおよび幅広い物理的性質を有する構造的に多様な不溶性化合物への幅広い適用性。
【０１７９】
１つの実施形態によれば、医薬製剤は、ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはその機能的等価物および０．９％ＮａＣｌ（生理食塩水）を含む。別の実施形態によれば、医薬製剤は、７ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、または１ｍｇ／ｍＬのＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはその機能的等価物を含む。別の実施形態によれば、医薬製剤は、０．９ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、または０．１ｍｇ／ｍＬのＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはその機能的等価物を含む。別の実施形態によれば、ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはその機能的等価物を含む製剤は液体製剤である。別の実施形態によれば、液体製剤はエアロゾル化される。
【０１８０】
１つの実施形態によれば、医薬製剤は、ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはその機能的等価物およびグリセリンを含む。
【０１８１】
１つの実施形態によれば、医薬製剤は、ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはその機能的等価物およびナノポリプレックスポリマーを含む。別の実施形態によれば、ナノポリプレックスポリマーは、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）である。別の実施形態によれば、ナノポリプレックスポリマーは、ポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）である。別の実施形態によれば、医薬製剤は、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：１．５、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９および１：１０からなる群より選択されるチャージ比（ＣＲ）のＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはその機能的等価物対ＰＰＡＡ（［ＮＨ3+］MK2i：［ＣＯＯ-］PPAA）を含む。別の実施形態によれば、医薬製剤は、１：３のチャージ比のＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはその機能的等価物対ＰＰＡＡ（［ＮＨ3+］MK2i：［ＣＯＯ-］PPAA）を含む。
【０１８２】
別の実施形態によれば、ポリペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＭＭＩ−０１００；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の機能的等価物は、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と実質的な配列同一性を有する。
【０１８３】
別の実施形態によれば、ポリペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＭＭＩ−０１００；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の機能的等価物は、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と少なくとも８０パーセントの配列同一性を有する。別の実施形態によれば、ポリペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＭＭＩ−０１００；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の機能的等価物は、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と少なくとも９０パーセントの配列同一性を有する。別の実施形態によれば、ポリペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＭＭＩ−０１００；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の機能的等価物は、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と少なくとも９５パーセントの配列同一性を有する。
【０１８４】
別の実施形態によれば、ポリペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＭＭＩ−０１００；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の機能的等価物はアミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＮＲＱＬＧＶＡ（ＭＭＩ−０２００；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）のポリペプチドである。
【０１８５】
別の実施形態によれば、ポリペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＭＭＩ−０１００；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の機能的等価物はアミノ酸配列ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＭＭＩ−０３００；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のポリペプチドである。
【０１８６】
別の実施形態によれば、ポリペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の機能的等価物はアミノ酸配列ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＭＭＩ−０４００；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）のポリペプチドである。
【０１８７】
別の実施形態によれば、ポリペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の機能的等価物はアミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＡＶＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）のポリペプチドである。
【０１８８】
別の実施形態によれば、ポリペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の機能的等価物はアミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）のポリペプチドである。
【０１８９】
別の実施形態によれば、ポリペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の機能的等価物はアミノ酸配列ＨＲＲＩＫＡＷＬＫＫＩＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＭＭＩ−０５００；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）のポリペプチドである。
【０１９０】
別の実施形態によれば、ポリペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の機能的等価物はアミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＮＲＱＬＡＶＡＡ（ＭＭＩ０６００、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）のポリペプチドである。
【０１９１】
別の実施形態によれば、ポリペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の機能的等価物はアミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＮＲＱＬＡＶＡ（ＭＭＩ０６００−２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）のポリペプチドである。
【０１９２】
別の実施形態によれば、ポリペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の機能的等価物は、第２のポリペプチドに動作可能に連結された第１のポリペプチドを含む融合ペプチドであり、ここで、第１のポリペプチドはアミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）を有し、第２のポリペプチドはその配列がアミノ酸配列ＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と実質的同一性を有する治療ドメインを含む。
【０１９３】
別の実施形態によれば、第２のポリペプチドは、アミノ酸配列ＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と少なくとも７０パーセントの配列同一性を有し、医薬製剤はマイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２（ＭＫ２）のキナーゼ活性を阻害する。別の実施形態によれば、第２のポリペプチドは、アミノ酸配列ＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と少なくとも８０パーセントの配列同一性を有し、医薬製剤はマイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２（ＭＫ２）のキナーゼ活性を阻害する。別の実施形態によれば、第２のポリペプチドは、アミノ酸配列ＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と少なくとも９０パーセントの配列同一性を有し、医薬製剤はマイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２（ＭＫ２）のキナーゼ活性を阻害する。別の実施形態によれば、第２のポリペプチドは、アミノ酸配列ＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と少なくとも９５パーセントの配列同一性を有し、医薬製剤はマイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２（ＭＫ２）のキナーゼ活性を阻害する。
【０１９４】
別の実施形態によれば、第２のポリペプチドはアミノ酸配列ＫＡＬＡＲＱＬＡＶＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）のポリペプチドである。
【０１９５】
別の実施形態によれば、第２のポリペプチドはアミノ酸配列ＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）のポリペプチドである。
【０１９６】
別の実施形態によれば、第２のポリペプチドはアミノ酸配列ＫＡＬＮＲＱＬＡＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）のポリペプチドである。
【０１９７】
別の実施形態によれば、第２のポリペプチドはアミノ酸配列ＫＡＬＮＲＱＬＡＶＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）のポリペプチドである。
【０１９８】
別の実施形態によれば、第２のポリペプチドはアミノ酸配列ＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）のポリペプチドであり；例えば、米国公開出願第２００９−０１９６９２７号、米国公開出願第２００９−０１４９３８９号、および米国公開出願第２０１０−０１５８９６８号（その各々がその全体として参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１９９】
別の実施形態によれば、ポリペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の機能的等価物は、第２のポリペプチドに動作可能に連結された第１のポリペプチドを含む融合ペプチドであり、第１のポリペプチドはＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）と機能的に等価なタンパク質形質導入ドメインを含み、第２のポリペプチドはアミノ酸配列ＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を有する。
【０２００】
別の実施形態によれば、第１のポリペプチドはアミノ酸配列ＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩＫＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）のポリペプチドである。
【０２０１】
別の実施形態によれば、第１のポリペプチドはアミノ酸配列ＷＬＲＲＩＫＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）のポリペプチドである。
【０２０２】
別の実施形態によれば、第１のポリペプチドはアミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）のポリペプチドである。
【０２０３】
別の実施形態によれば、第１のポリペプチドはアミノ酸配列ＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）。のポリペプチドである。
【０２０４】
別の実施形態によれば、第１のポリペプチドはアミノ酸配列ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）のポリペプチドである。
【０２０５】
別の実施形態によれば、第１のポリペプチドはアミノ酸配列ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）のポリペプチドである。
【０２０６】
別の実施形態によれば、第１のポリペプチドはアミノ酸配列ＨＲＲＩＫＡＷＬＫＫＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）のポリペプチドである。
【０２０７】
いくつかの実施形態によれば、薬物効力を増強させ、非標的組織でのポリペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはその機能的等価物の蓄積を防止するために、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の本発明のポリペプチドまたはその機能的等価物は、標的指向性部分に連結または結合させることができ、それは、このポリペプチドを特定の細胞型または組織に向かわせる。標的指向性部分の例としては、（ｉ）公知または未知の受容体のためのリガンドまたは（ｉｉ）特定の細胞型の表面上で発現される、特定の分子標的、例えば、ペプチドまたはまたは炭水化物に結合する化合物、ペプチド、またはモノクローナル抗体が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２０８】
いくつかの実施形態によれば、記載される発明のポリペプチドは化学的に合成される。固相、液相、またはペプチド縮合技術、またはそれらの任意の組み合わせのよく知られた技術を用いて調製された、そのような合成ポリペプチドは、天然および非天然アミノ酸を含み得る。ペプチド合成のために使用されるアミノ酸は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄのオリジナル固相手順の標準脱保護、中和、カップリングおよび洗浄プロトコルを伴う標準Ｂｏｃ（Ｎ−α−アミノ保護Ｎ−α−ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ酸樹脂（１９６３，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５：２１４９−２１５４）、またはＣａｒｐｉｎｏおよびＨａｎにより最初に記載された塩基不安定Ｎ−α−アミノ保護９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸（１９７２，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ３７：３４０３−３４０９）であってもよい。ＦｍｏｃおよびＢｏｃＮ−α−アミノ保護アミノ酸はどちらもＳｉｇｍａ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、または当業者によく知られている他の化学会社から入手することができる。加えて、ポリペプチドは当業者によく知られている他のＮ−α−保護基を用いて合成され得る。固相ペプチド合成は、当業者によく知られており、例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，  １９８４，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  第２版，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌ．；  Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｎｏｂｌｅ，  １９９０，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  ３５：１６１−２１４において提供される技術により、または自動合成機を使用して達成され得る（各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２０９】
いくつかの実施形態によれば、発明のポリペプチドは、Ｄ−アミノ酸（インビボでＬ−アミノ酸特異的プロテアーゼに対して耐性である）、Ｄ−およびＬ−アミノ酸の組み合わせ、ならびに様々な「デザイナー」アミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃ−α−メチルアミノ酸、およびＮ−α−メチルアミノ酸、など）を含み、特別な特性が伝達される。合成アミノ酸置換の例としては、リジンの代わりのオルニチン、およびロイシンまたはイソロイシンの代わりのノルロイシンが挙げられる。
【０２１０】
いくつかの実施形態によれば、ポリペプチドは、インビボでの半減期の増加を促進する他の化合物、例えばポリエチレングリコールまたはデキストランに連結させてもよい。そのような連結は、当業者に理解されるように共有結合または非共有結合とすることができる。いくつかの他の実施形態によれば、ポリペプチドはミセル、例えば、ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（ポリプロピレングリコール）またはポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリラクチドで作られたミセルに封入されてもよい。いくつかの他の実施形態によれば、ポリペプチドは、分解性ポリエステル、例えば、限定はされないが、ポリ乳酸、ポリグリコライド、およびポリカプロラクトンからなる分解性ナノまたはミクロ粒子に封入されてもよい。
【０２１１】
１つの実施形態によれば、記載される発明の医薬製剤は吸入装置により投与され得る。医薬製剤を投与するために使用することができる吸入装置の例としては、ネブライザー、定量噴霧式吸入器、乾燥粉末吸入器および水滴吸入器が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２１２】
ネブライザーは、液体製剤を能動的にエアロゾル化し、ロードされるとすぐに連続して動作し、圧縮空気または給電のいずれかを必要とする。例示的なネブライザーとしては、振動メッシュ式ネブライザー、ジェットネブライザー（アトマイザとしても知られている）および超音波ネブライザーが挙げられる。例示的な振動メッシュ式ネブライザーとしては、Ｒｅｓｐｉｒｏｎｉｃｓ  ｉ−Ｎｅｂ、Ｏｍｒｏｎ  ＭｉｃｒｏＡｉｒ、Ｂｅｕｒｅｒ  Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ  ＩＨ５０およびＡｅｒｏｇｅｎ  Ａｅｒｏｎｅｂが挙げられるが、それらに限定されない。Ａｃｏｒｎ−Ｉ、Ａｃｏｒｎ−ＩＩ、ＡｑｕａＴｏｗｅｒ、ＡＶＡ−ＮＥＢ、Ｃｉｒｒｈｕｓ、Ｄａｒｔ、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ  ６４６、Ｄｏｗｎｄｒａｆｔ、Ｆａｎ  Ｊｅｔ、ＭＢ−５、Ｍｉｓｔｙ  Ｎｅｂ、Ｓａｌｔｅｒ  Ｌａｂｓ  ８９００、Ｓｉｄｅｓｔｒｅａｍ、Ｕｐｄｒａｆｔ−ＩＩ、およびＷｈｉｓｐｅｒ  Ｊｅｔは、ジェットネブライザーの例である。例示的な超音波ネブライザーとしては、Ｏｍｒｏｎ  ＮＥ−Ｕ１７ネブライザーおよびＢｅｕｒｅｒ  Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ  ＩＨ３０が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２１３】
定量噴霧式吸入器（ＭＤＩ）は、一定体積の液体溶液または懸濁液を患者に、スプレーの形態で送達するために、噴射剤を使用する。
【０２１４】
乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）は、薬物が付着したずっと大きな粒子（例えば、ラクトース）を含む賦形剤と混合された活性薬物を含む。エアロゾル化中に、活性薬物は、担体粒子が口および喉に衝突し、摂取される間に、担体からはぎ取られ、吸入される。ＤＰＩは、薬物送達を吸入と同期させる。
【０２１５】
１つの実施形態によれば、記載される発明のポリペプチドは（それぞれ、口を介するまたは鼻を介する）吸入もしくは吹送による送達のために分散性乾燥粉末の形態であってもよい。乾燥粉末組成物は、当技術分野で知られているプロセス、例えば、国際特許公開第ＷＯ９１／１６０３８号で開示された、および米国特許第６，９２１，５２７号で開示された凍結乾燥およびジェットミリング（その開示内容は参照により組み込まれる）により調製され得る。記載される発明の組成物は、好適な投与容器内に、対象に単位投与量治療を提供するのに十分な量で入れられる。投与容器は、ガス流中に分散させることにより乾燥粉末組成物のエアロゾル化を可能にしてエアロゾルを形成する好適な吸入装置内に適合するものであり、その後、そのように生成されたエアロゾルは、治療を必要とする対象によるその後の吸入のために取り付けられたマウスピースを有するチャンバに捕集される。そのような投与容器は、組成物を封入する任意の容器、例えばゼラチンまたはプラスチックカプセルを、ガス（例えば、空気）流が、容器中に誘導され、乾燥粉末組成物を分散させることを可能にする取り外し可能な部分と共に含む。そのような容器は、米国特許第４，２２７，５２２号；米国特許第４，１９２，３０９号；および米国特許第４，１０５，０２７号で示されるものにより例示される。好適な容器はまた、ＧｌａｘｏのＶｅｎｔｏｌｉｎ（登録商標）Ｒｏｔｏｈａｌｅｒブランド粉末吸入器またはＦｉｓｏｎのＳｐｉｎｈａｌｅｒ（登録商標）ブランド粉末吸入器と併用して使用されるものを含む。優れた水分バリアを提供する別の好適な単位用量容器が、アルミ箔プラスチックラミネートから形成される。医薬品に基づく粉末は重量または体積に基づいて成形可能なくぼみに充填され、被覆箔−プラスチックラミネートで密閉される。粉末吸入装置と共に使用するためのそのような容器は、米国特許第４，７７８，０５４号に記載され、ＧｌａｘｏのＤｉｓｋｈａｌｅｒ（登録商標）（米国特許第４，６２７，４３２号；４，８１１，７３１号；および５，０３５，２３７号）と共に使用される。これらの参考文献は全て、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１６】
水滴吸入器（ＡＤＩ）は予め計量した用量の液体製剤を噴射剤を使用せずに送達する。ＡＤＩは液体を能動的にエアロゾル化し、微粒子のソフトミストを生成させる。Ｂｅｒｏｄｕａｌ  Ｒｅｓｐｉｍａｔ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｐｈａｒｍａ  Ｇｍｂｈ  ＆  Ｃｏ．）が例示的な水滴吸入器である。
【０２１７】
１つの実施形態によれば、記載される発明のポリペプチドは噴霧溶液の形態であってもよい。別の実施形態によれば、噴霧製剤はマンニトールを含まない。１つの実施形態によれば、噴霧溶液はネブライザーにより送達される。
【０２１８】
別の実施形態によれば、ポリペプチドは、固体形態（顆粒、粉末または坐薬を含む）または液体形態（例えば、溶液、懸濁液、またはエマルジョン）で調製され得る。
【０２１９】
別の実施形態によれば、記載される発明のポリペプチドはナノポリプレックスの形態であってもよい。１つの実施形態によれば、ナノポリプレックスポリマーはアニオン性である。別の実施形態によれば、ナノポリプレックスポリマーは、エンドソーム溶解性ポリマーである。例示的なナノポリプレックスポリマーとしては、キトサン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリ（オルガノホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）およびポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２２０】
１つの実施形態によれば、記載される発明の製剤は、生物医学装置を埋め込むことにより送達され得る。生物医学装置としては、グラフトが挙げられるが、それらに限定されない。別の実施形態によれば、製剤はグラフト上または中で配置され得る。別の実施形態によれば、グラフトとしては、移植血管が挙げられるが、それに限定されない。別の実施形態によれば、製剤は非経口的に送達され得る。別の実施形態によれば、製剤は局所的に送達され得る。
【０２２１】
別の実施形態によれば、記載された本発明の製剤は担体を含む。担体としては、制限されないが、放出剤、例えば持続放出性または遅延放出性担体が挙げられる。そのような実施形態によれば、担体は、より効率的な投与、例えばより少ない頻度および／またはポリペプチド投与量の削減、取り扱いの容易さの改善、および疾患、障害、病状、症候群などに及ぼす影響の延長または遅延を提供するために、ポリペプチドの持続または遅延放出を可能にする任意の材料であり得る。そのような担体の非限定的な例としてはリポソーム、マイクロスポンジ、ミクロスフェア、または天然および合成ポリマーのマイクロカプセルなどが挙げられる。リポソームは、限定はされないが、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンを含む様々なリン脂質から形成され得る。
【０２２２】
別の実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、様々な溶液中で適用できる。適切な製剤は、滅菌されており、十分量の治療ポリペプチドを溶解し、治療ポリペプチドの安定性を保存し、提案された適用について有害でない。例えば、記載された本発明の組成物は、活性材料成分（複数可）が水性懸濁物の製造に適した賦形剤との混合物中に存在する、水性懸濁物として製剤化され得る。
【０２２３】
そのような賦形剤としては、懸濁剤（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、およびアカシアゴム）、天然由来ホシファチドを含む分散剤または湿潤剤（例えばレシチン）、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えばステアリン酸ポリオキシエチレン）、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えばヘプタデカエチル−エンオキシセタノール）、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトールから得られる部分エステルとの縮合生成物（例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール）、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール無水物から得られる部分エステルとの縮合生成物（例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２４】
記載された本発明の組成物はまた、活性材料成分を植物油（例えばピーナツ油、オリーブ油、ゴマ油、ココナッツ油）中にまたは鉱物油（例えば流動パラフィン）中に懸濁させることによって油性懸濁物として製剤化され得る。油性懸濁物は、増粘剤（例えば蜜蝋、ハードパラフィンまたはセチルアルコール）を含み得る。
【０２２５】
記載された本発明の組成物はまた、水を添加して水性懸濁物を調製するのに適した分散性粉末または顆粒の形態で製剤化され得る。そのような粉末および顆粒中の活性材料成分は、分散または湿潤剤、懸濁剤、および１つまたは複数の防腐剤との混合物として提供される。適切な分散または湿潤剤および懸濁剤は、既に先に挙げられたものが具体例である。さらなる賦形剤もまた、存在し得る。
【０２２６】
記載された本発明の組成物はまた、エマルジョンの形態として存在し得る。エマルジョンは、２つの非混合性液体担体を組み合わせることによって調製される二相系であり、担体の一方は、他方の全体に均質分配され、最大コロイド粒子以上の直径を有する小球体からなる。小球体のサイズは重要であり、この系が最大の安定性を達成するようなものでなければならない。通常は、この２つの相の分離は、第三の物質（乳化剤）が組み込まれない限り起こらないであろう。したがって、基本的なエマルジョンは、少なくとも３つの成分（２つの非混合性液体担体および乳化剤）を活性材料成分と共に含む。ほとんどのエマルジョンは、非水相に水相を取り込む（またはその逆もある）。しかし、基本的に非水性であるエマルジョン、例えば非水性で非混合性の系のグリセリンおよびオリーブ油の陰イオン性および陽イオン性界面活性剤を調製することが可能である。したがって、本発明の組成物は、水中油エマルジョンの形態で存在し得る。油相は、植物油、例えばオリーブ油またはピーナッツ油、または鉱物油、例えば流動パラフィン、またはそれらの混合物であり得る。適切な乳化剤は、天然由来のゴム、例えばアカシアゴムまたはトラガカントゴム、天然由来のホスファチド、例えば大豆レシチン、ならびに脂肪酸およびヘキシトール無水物から得られるエステルまたは部分エステル、例えばモノオレイン酸ソルビタン、ならびに部分エステルとエチレンオキシドの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンであり得る。
【０２２７】
いくつかの実施形態によれば、記載される発明の医薬製剤はマイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２（ＭＫ２）のキナーゼ活性を阻害することができる。いくつかの実施形態によれば、記載される発明の医薬製剤はＭＫ２キナーゼのキナーゼ活性の少なくとも５０％を阻害する。いくつかの実施形態によれば、記載される発明の医薬製剤はＭＫ２キナーゼのキナーゼ活性の少なくとも５５％を阻害する。いくつかの実施形態によれば、記載される発明の医薬製剤はＭＫ２キナーゼのキナーゼ活性の少なくとも６０％を阻害する。いくつかの実施形態によれば、記載される発明の医薬製剤はＭＫ２キナーゼのキナーゼ活性の少なくとも６５％を阻害する。いくつかの実施形態によれば、記載される発明の医薬製剤はＭＫ２キナーゼのキナーゼ活性の少なくとも７０％を阻害する。いくつかの実施形態によれば、記載される発明の医薬製剤はＭＫ２キナーゼのキナーゼ活性の少なくとも７５％を阻害する。いくつかの実施形態によれば、記載される発明の医薬製剤はＭＫ２キナーゼのキナーゼ活性の少なくとも８０％を阻害する。いくつかの実施形態によれば、記載される発明の医薬製剤はＭＫ２キナーゼのキナーゼ活性の少なくとも８５％を阻害する。いくつかの実施形態によれば、記載される発明の医薬製剤はＭＫ２キナーゼのキナーゼ活性の少なくとも９０％を阻害する。いくつかの実施形態によれば、記載される発明の医薬製剤はＭＫ２キナーゼのキナーゼ活性の少なくとも９５％を阻害する。
【０２２８】
別の実施形態によれば、医薬製剤はマイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ３（ＭＫ３）のキナーゼ活性を阻害するのに有効である。いくつかのそのような実施形態によれば、医薬製剤はＭＫ３キナーゼのキナーゼ活性の少なくとも５０％を阻害する。いくつかのそのような実施形態によれば、医薬製剤はＭＫ３キナーゼのキナーゼ活性の少なくとも５５％を阻害する。いくつかのそのような実施形態によれば、医薬製剤はＭＫ３キナーゼのキナーゼ活性の少なくとも６０％を阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤はＭＫ３キナーゼのキナーゼ活性の少なくとも６５％を阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤はＭＫ３キナーゼのキナーゼ活性の少なくとも７０％を阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤はＭＫ３キナーゼのキナーゼ活性の少なくとも７５％を阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤はＭＫ３キナーゼのキナーゼ活性の少なくとも８０％を阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤はＭＫ３キナーゼのキナーゼ活性の少なくとも８５％を阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤はＭＫ３キナーゼのキナーゼ活性の少なくとも９０％を阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤はＭＫ３キナーゼのキナーゼ活性の少なくとも９５％を阻害する。
【０２２９】
別の実施形態によれば、医薬製剤は、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩ（ＣａＭＫＩ）のキナーゼ活性を阻害するのに有効である。いくつかのそのような実施形態によれば、医薬製剤はＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩ（ＣａＭＫＩ）のキナーゼ活性の少なくとも５０％をさらに阻害する。いくつかのそのような実施形態によれば、医薬製剤はＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩ（ＣａＭＫＩ）のキナーゼ活性の少なくとも５５％をさらに阻害する。いくつかのそのような実施形態によれば、医薬製剤はＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩ（ＣａＭＫＩ）のキナーゼ活性の少なくとも６０％をさらに阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤はＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩ（ＣａＭＫＩ）のキナーゼ活性の少なくとも６５％をさらに阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤はＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩ（ＣａＭＫＩ）のキナーゼ活性の少なくとも７０％をさらに阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤はＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩ（ＣａＭＫＩ）のキナーゼ活性の少なくとも７５％をさらに阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤はＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩ（ＣａＭＫＩ）のキナーゼ活性の少なくとも８０％をさらに阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤はＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩ（ＣａＭＫＩ）のキナーゼ活性の少なくとも８５％をさらに阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤はＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩ（ＣａＭＫＩ）のキナーゼ活性の少なくとも９０％をさらに阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤はＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩ（ＣａＭＫＩ）のキナーゼ活性の少なくとも９５％をさらに阻害する。
【０２３０】
別の実施形態によれば、医薬製剤はＢＤＮＦ／ＮＴ−３増殖因子受容体（ＴｒｋＢ）のキナーゼ活性を阻害することができる。いくつかのそのような実施形態によれば、医薬品は、ＢＤＮＦ／ＮＴ−３増殖因子受容体（ＴｒｋＢ）のキナーゼ活性の少なくとも５０％をさらに阻害する。いくつかのそのような実施形態によれば、医薬品は、ＢＤＮＦ／ＮＴ−３増殖因子受容体（ＴｒｋＢ）のキナーゼ活性の少なくとも５５％をさらに阻害する。いくつかのそのような実施形態によれば、医薬品は、ＢＤＮＦ／ＮＴ−３増殖因子受容体（ＴｒｋＢ）のキナーゼ活性の少なくとも６０％をさらに阻害する。別の実施形態によれば、医薬品は、ＢＤＮＦ／ＮＴ−３増殖因子受容体（ＴｒｋＢ）のキナーゼ活性の少なくとも６５％をさらに阻害する。別の実施形態によれば、医薬品は、ＢＤＮＦ／ＮＴ−３増殖因子受容体（ＴｒｋＢ）のキナーゼ活性の少なくとも７０％をさらに阻害する。別の実施形態によれば、医薬品は、ＢＤＮＦ／ＮＴ−３増殖因子受容体（ＴｒｋＢ）のキナーゼ活性の少なくとも７５％をさらに阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤はＢＤＮＦ／ＮＴ−３増殖因子受容体（ＴｒｋＢ）のキナーゼ活性の少なくとも８０％を阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤はＢＤＮＦ／ＮＴ−３増殖因子受容体（ＴｒｋＢ）のキナーゼ活性の少なくとも８５％を阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤はＢＤＮＦ／ＮＴ−３増殖因子受容体（ＴｒｋＢ）のキナーゼ活性の少なくとも９０％を阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤はＢＤＮＦ／ＮＴ−３増殖因子受容体（ＴｒｋＢ）のキナーゼ活性の少なくとも９５％を阻害する。
【０２３１】
別の実施形態によれば、医薬製剤は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２（ＭＫ２）のキナーゼ活性およびカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩ（ＣａＭＫＩ）のキナーゼ活性を阻害するのに有効である。
【０２３２】
別の実施形態によれば、医薬製剤は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２（ＭＫ２）のキナーゼ活性およびＢＤＮＦ／ＮＴ−３増殖因子受容体（ＴｒｋＢ）のキナーゼ活性を阻害するのに有効である。
【０２３３】
別の実施形態によれば、医薬製剤は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２（ＭＫ２）のキナーゼ活性、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩ（ＣａＭＫＩ）のキナーゼ活性、およびＢＤＮＦ／ＮＴ−３増殖因子受容体（ＴｒｋＢ）のキナーゼ活性を阻害するのに有効である。
【０２３４】
別の実施形態によれば、医薬製剤は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２（ＭＫ２）のキナーゼ活性の少なくとも６５％およびカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩ（ＣａＭＫＩ）のキナーゼ活性の少なくとも６５％を阻害する。
【０２３５】
別の実施形態によれば、医薬製剤は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２（ＭＫ２）のキナーゼ活性の少なくとも６５％およびＢＤＮＦ／ＮＴ−３増殖因子受容体（ＴｒｋＢ）のキナーゼ活性の少なくとも６５％を阻害する。
【０２３６】
別の実施形態によれば、医薬製剤はマイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２（ＭＫ２）のキナーゼ活性の少なくとも６５％、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩ（ＣａＭＫＩ）のキナーゼ活性の少なくとも６５％、およびＢＤＮＦ／ＮＴ−３増殖因子受容体（ＴｒｋＢ）のキナーゼ活性の少なくとも６５％を阻害する。
【０２３７】
別の実施形態によれば、医薬製剤は、ＭＫ２、ＭＫ３、ＣａＭＫＩ、ＴｒｋＢの群から選択される少なくとも１つのキナーゼのキナーゼ活性を阻害し、本明細書の表１に列挙された残りの群からの１つまたは複数の他の選択されたキナーゼの活性を実質的に阻害しない。
【表１】
2018502860.tif 000010
2018502860.tif 000011
2018502860.tif 000012
2018502860.tif 000013
2018502860.tif 000014
2018502860.tif 000015
2018502860.tif 000016
【０２３８】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭＩ−０１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびその機能的等価物のインビボにおける阻害プロファイルは投与量、投与経路、およびこれらの阻害剤に応答する細胞型に依存する。
【０２３９】
いくつかの実施形態によれば、医薬製剤は選択されるその他のキナーゼ（複数可）のキナーゼ活性の６５％未満を阻害する。いくつかの実施形態によれば、医薬製剤は選択されるその他のキナーゼ（複数可）のキナーゼ活性の６０％未満を阻害する。いくつかの実施形態によれば、医薬製剤は選択されるその他のキナーゼ（複数可）のキナーゼ活性の５５％未満を阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤は選択されるその他のキナーゼ（複数可）のキナーゼ活性の５０％未満を阻害する。いくつかの実施形態によれば、医薬製剤は選択されるその他のキナーゼ（複数可）のキナーゼ活性の４５％未満を阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤は選択されるその他のキナーゼ（複数可）のキナーゼ活性の４０％未満を阻害する。いくつかの実施形態によれば、医薬製剤は選択されるその他のキナーゼ（複数可）のキナーゼ活性の３５％未満を阻害する。いくつかの実施形態によれば、医薬製剤は選択されるその他のキナーゼ（複数可）のキナーゼ活性の３０％未満を阻害する。いくつかの実施形態によれば、医薬製剤は選択されるその他のキナーゼ（複数可）のキナーゼ活性の２５％未満を阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤は選択されるその他のキナーゼ（複数可）のキナーゼ活性の２０％未満を阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤は選択されるその他のキナーゼ（複数可）のキナーゼ活性の１５％未満を阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤は選択されるその他のキナーゼ（複数可）のキナーゼ活性の１０％未満を阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤は選択されるその他のキナーゼ（複数可）のキナーゼ活性の５％未満を阻害する。別の実施形態によれば、医薬製剤は選択されるその他のキナーゼのキナーゼ活性を増加させる。
【０２４０】
直前の段落の実施形態によれば、実質的に阻害されない１つまたは複数の選択されるその他のキナーゼは、Ｃａ2+／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ、そのサブユニットＣａＭＫＩＩδを含む）、プロトオンコジーンセリン／トレオニンプロテインキナーゼ（ＰＩＭ−１）、細胞性肉腫（ｃ−ＳＲＣ）、脾臓チロシンキナーゼ、（ＳＹＫ）、ｃ−Ｓｒｃチロシンキナーゼ（ＣＳＫ）、およびインスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）の群から選択される。
【０２４１】
いくつかの実施形態によれば、本発明の少なくとも１つのＭＭＩ阻害剤（すなわち、ＭＭＩ−０１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＭＭＩ−０２００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、ＭＭＩ−０３００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＭＭＩ−０４００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、およびＭＭＩ−０５００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）の少なくとも１つ）により実質的に阻害されるキナーゼ（すなわち、そのキナーゼ活性が少なくとも６５％だけ阻害されるキナーゼ）は、下記からなる群より選択される：Ａｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）、Ａｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１（Ｔ３１５１）（Ａｂｌ（Ｔ３１５１））、Ａｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１（Ｙ２５３Ｆ）（Ａｂｌ（Ｙ２５３Ｆ））、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、Ａｂｅｌｓｏｎ関連遺伝子（Ａｒｇ）、５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ触媒サブユニットアルファ−１（ＡＭＰＫα１）、５’−ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ触媒サブユニットアルファ−２（ＡＭＰＫα２）、ＡＭＰＫ関連プロテインキナーゼ５（ＡＲＫ５）、アポトーシスシグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）、オーロラキナーゼＢ（Ａｕｒｏｒａ−Ｂ）、ＡＸＬ受容体チロシンキナーゼ（Ａｘｌ）、Ｘ染色体タンパク質中の骨髄チロシンキナーゼ遺伝子（Ｂｍｘ）、乳腺腫瘍キナーゼ（ＢＲＫ）、ブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）、ブルトンチロシンキナーゼ（Ｒ２８Ｈ）（ＢＴＫ（Ｒ２８Ｈ））、Ｃａ２+／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩ（ＣａＭＫＩ）、Ｃａ２+／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩβ（ＣａＭＩＩβ）、Ｃａ２+／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩγ（ＣａＭＫＩＩγ）、Ｃａ２+／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼδ（ＣａＭＫＩδ）、Ｃａ２+／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩδ（ＣａＭＫＩＩδ）、Ｃａ２+／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＶ（ＣａＭＫＩＶ）、細胞分裂キナーゼ２（ＣＤＫ２／サイクリンＥ）、細胞分裂キナーゼ３（ＣＤＫ３／サイクリンＥ）、細胞分裂キナーゼ６（ＣＤＫ６／サイクリンＤ３）、細胞分裂キナーゼ７（ＣＤＫ７／サイクリンＨ／ＭＡＴ１）、細胞分裂キナーゼ９（ＣＤＫ９／サイクリンＴ１）、チェックポイントキナーゼ２（ＣＨＫ２）、チェックポイントキナーゼ２（１１５７Ｔ）（ＣＨＫ２（１１５７Ｔ））、チェックポイントキナーゼ２（Ｒ１４５Ｗ）（ＣＨＫ２（Ｒ１４５Ｗ））、癌原遺伝子チロシン−プロテインキナーゼｃＫｉｔ（Ｄ８１６Ｖ）（ｃＫｉｔ（Ｄ８１６Ｖ））、Ｃ−ｓｒｃチロシンキナーゼ（ＣＳＫ）、Ｒａｆ癌原遺伝子セリン／スレオニンプロテインキナーゼ（ｃ−ＲＡＦ）、癌原遺伝子チロシン−プロテインキナーゼ（ｃＳＲＣ）、細胞死関連プロテインキナーゼ１（ＤＡＰＫ１）、細胞死関連プロテインキナーゼ２（ＤＡＰＫ２）、筋強直性ジストロフィー−プロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）、ＤＡＰキナーゼ関連アポトーシス誘導プロテインキナーゼ１（ＤＲＡＫ１）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ）、上皮増殖因子受容体Ｌ８６１Ｑ（ＥＧＦＲ（Ｌ８６１Ｑ））、Ｅｐｈ受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）（ＥｐｈＡ２）、Ｅｐｈ受容体Ａ３（ＥｐｈＡ３）、Ｅｐｈ受容体Ａ５（ＥｐｈＡ５）、Ｅｐｈ受容体Ｂ２（ＥｐｈＢ２）、Ｅｐｈ受容体Ｂ４（ＥｐｈＢ４）、赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４（ＥｒｂＢ４）、ｃ−Ｆｅｓタンパク質チロシンキナーゼ（Ｆｅｓ）、線維芽細胞増殖因子受容体２（ＦＧＦＲ２）、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体−３（Ｆｌｔ３）、ＦＭＳ癌原遺伝子（Ｆｍｓ）、一倍体胚細胞特異的核プロテインキナーゼ（Ｈａｓｐｉｎ）、インスリン受容体関連受容体（ＩＲＲ）、インターロイキン−１受容体関連キナーゼ１（ＩＲＡＫ１）、インターロイキン−１受容体関連キナーゼ４（ＩＲＡＫ４）、ＩＬ２−誘導性Ｔ−細胞キナーゼ（Ｉｔｋ）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、リンパ球特異的タンパク質−チロシンキナーゼ（Ｌｃｋ）、リンパ球指向性キナーゼ（ＬＯＫ）、Ｌｙｎチロシンプロテインキナーゼ（Ｌｙｎ）、ＭＡＰキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２（ＭＫ２）、ＭＡＰキナーゼ活性化プロテインキナーゼ３（ＭＫ３）、ＭＥＫ１、母性胚性ロイシンジッパーキナーゼ（ＭＥＬＫ）、ｃ−Ｍｅｒ癌原遺伝子チロシンキナーゼ（Ｍｅｒ）、ｃ−Ｍｅｔ癌原遺伝子チロシンキナーゼ（Ｍｅｔ）、ｃ−Ｍｅｔ癌原遺伝子チロシンキナーゼＤ１２４６Ｎ（Ｍｅｔ（Ｄ１２４６Ｎ））、ｃ−Ｍｅｔ癌原遺伝子チロシンキナーゼＹ１２４８Ｄ（ＭｅｔＹ１２４８Ｄ）、Ｍｉｓｓｈａｐｅｎ／ＮＩＫ関連キナーゼ（ＭＩＮＫ）、ＭＡＰキナーゼキナーゼ６（ＭＫＫ６）、ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）、混合系統キナーゼ１（ＭＬＫ１）、ＭＡＰキナーゼシグナル統合キナーゼ２（ＭｎＫ２）、筋緊張性ジストロフィーキナーゼ関連ＣＤＣ４２−結合キナーゼアルファ（ＭＲＣＫα）、筋緊張性ジストロフィーキナーゼ関連ＣＤＣ４２−結合キナーゼベータ（ＭＲＣＫβ）、マイトジェンおよびストレス活性化プロテインキナーゼ１（ＭＳＫ１）、マイトジェンおよびストレス活性化プロテインキナーゼ２（ＭＳＫ２）、筋特異的セリンキナーゼ１（ＭＳＳＫ１）、哺乳類ＳＴＥ２０様プロテインキナーゼ１（ＭＳＴ１）、哺乳類ＳＴＥ２０様プロテインキナーゼ２（ＭＳＴ２）、哺乳類ＳＴＥ２０様プロテインキナーゼ３（ＭＳＴ３）、筋肉、骨格受容体チロシン−プロテインキナーゼ（ＭｕＳＫ）、非有糸分裂（Ｎｅｖｅｒ  ｉｎ  ｍｉｔｏｓｉｓ）Ａ関連キナーゼ２（ＮＥＫ２）、非有糸分裂（Ｎｅｖｅｒ  ｉｎ  ｍｉｔｏｓｉｓ）Ａ関連キナーゼ３（ＮＥＫ３）、非有糸分裂（Ｎｅｖｅｒ  ｉｎ  ｍｉｔｏｓｉｓ）Ａ関連キナーゼ１１（ＮＥＫ１１）、７０ｋＤａリボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ１（ｐ７０Ｓ６Ｋ）、ＰＡＳドメイン含有セリン／スレオニンキナーゼ（ＰＡＳＫ）、ホスホリラーゼキナーゼサブユニットガンマ−２（ＰｈＫγ２）、Ｐｉｍ−１キナーゼ（Ｐｉｍ−１）、プロテインキナーゼＢアルファ（ＰＫＢα）、プロテインキナーゼＢベータ（ＰＫＢβ）、プロテインキナーゼＢガンマ（ＰＫＢγ）、プロテインキナーゼＣ、アルファ（ＰＫＣα）、プロテインキナーゼＣ、ベータ１（ＰＫＣβ１）、プロテインキナーゼＣ、ベータＩＩ（ＰＫＣβＩＩ）、プロテインキナーゼＣ、ガンマ（ＰＫＣγ）、プロテインキナーゼＣ、イプシロン（ＰＫＣε）、プロテインキナーゼＣ、イオタ（ＰＣＫι）、プロテインキナーゼＣ、ミュー（ＰＫＣμ）、プロテインキナーゼＣ、ゼータ（ＰＫＣζ）、プロテインキナーゼＤ２（ＰＫＤ２）、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ１アルファ（ＰＫＧ１α）、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ１ベータ（ＰＫＧ１β）、タンパク質−キナーゼＣ関連キナーゼ２（ＰＲＫ２）、プロリンリッチチロシンキナーゼ２（Ｐｙｋ２）、癌原遺伝子チロシン−プロテインキナーゼ受容体Ｒｅｔ  Ｖ８０４Ｌ（Ｒｅｔ（Ｖ８０４Ｌ））、受容体共役セリン−スレオニンキナーゼ２（ＲＩＰＫ２）、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼＩ（ＲＯＣＫ−Ｉ）、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼＩＩ（ＲＯＣＫ−ＩＩ）、リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ１（Ｒｓｋ１）、リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ２（Ｒｓｋ２）、リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ３（Ｒｓｋ３）、リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ４（Ｒｓｋ４）、ストレス活性化プロテインキナーゼ２Ａ  Ｔ１０６Ｍ（ＳＡＰＫ２ａ、Ｔ１０６Ｍ）、ストレス活性化プロテインキナーゼ３（ＳＡＰＫ３）、血清／グルココルチコイド制御キナーゼ（ＳＧＫ）、血清／グルココルチコイド制御キナーゼ２（ＳＧＫ２）、血清／グルココルチコイド−制御キナーゼ３（ＳＧＫ３）、癌原遺伝子チロシン−プロテインキナーゼＳｒｃ１−５３０（Ｓｒｃ、１−５３０）、セリン／スレオニン−プロテインキナーゼ３３（ＳＴＫ３３）、脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）、サウザンドアンドワン（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  ａｎｄ  ｏｎｅ）アミノ酸タンパク質１（ＴＡＯ１）、サウザンドアンドワン（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  ａｎｄ  ｏｎｅ）アミノ酸タンパク質２（ＴＡＯ２）、サウザンドアンドワン（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  ａｎｄ  ｏｎｅ）アミノ酸タンパク質３（ＴＡＯ３）、ＴＡＮＫ−結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）、Ｔｅｃタンパク質チロシンキナーゼ（Ｔｅｃ）、内膜内皮細胞キナーゼ２（Ｔｉｅ２）、チロシンキナーゼ受容体Ａ（ＴｒｋＡ）、ＢＤＮＦ／ＮＴ−３増殖因子受容体（ＴｒｋＢ）、ＴＸＫチロシンキナーゼ（Ｔｘｋ）、ＷＮＫリジン欠失プロテインキナーゼ２（ＷＮＫ２）、ＷＮＫリジン欠失プロテインキナーゼ３（ＷＮＫ３）、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ１（Ｙｅｓ）、ゼータ鎖（ＴＣＲ）関連プロテインキナーゼ７０ｋＤａ（ＺＡＰ−７０）、およびＺＩＰキナーゼ（ＺＩＰＫ）。
【０２４２】
いくつかの他の実施形態によれば、本発明の少なくとも２つのＭＭＩ阻害剤（すなわち、ＭＭＩ−０１００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＭＭＩ−０２００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、ＭＭＩ−０３００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＭＭＩ−０４００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、およびＭＭＩ−０５００（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）の少なくとも２つ）により実質的に阻害されるキナーゼ（すなわち、そのキナーゼ活性が少なくとも６５％だけ阻害されるキナーゼ）は、下記からなる群より選択される：未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、乳腺腫瘍キナーゼ（ＢＲＫ）、ブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）、Ｃａ2+／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩ（ＣａＭＫＩδを含む）、Ｃａ2+／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ、例えばＣａＭＫＩＩβ、ＣａＭＫＩＩδおよびＣａＭＫＩＩγ）、Ｃａ2+／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＶ（ＣａＭＫＩＶ）、チェックポイントキナーゼ２（ＣＨＫ２（Ｒ１４５Ｗ））、癌原遺伝子チロシン−プロテインキナーゼｃＫｉｔ（Ｄ８１６Ｖ）（ｃＫｉｔ（Ｄ８１６Ｖ））、Ｃ−ｓｒｃチロシンキナーゼ（ＣＳＫ）、癌原遺伝子チロシン−プロテインキナーゼ（ｃＳＲＣ）、細胞死関連プロテインキナーゼ１（ＤＡＰＫ１）、細胞死関連プロテインキナーゼ２（ＤＡＰＫ２）、ＤＡＰキナーゼ関連アポトーシス誘導プロテインキナーゼ１（ＤＲＡＫ１）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮増殖因子受容体Ｌ８６１Ｑ（ＥＧＦＲ（Ｌ８６１Ｑ））、Ｅｐｈ受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）、Ｅｐｈ受容体Ａ３（ＥｐｈＡ３）、Ｅｐｈ受容体Ａ５（ＥｐｈＡ５）、Ｅｐｈ受容体Ｂ２（ＥｐｈＢ２）、赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４（ＥｒｂＢ４）、ｃ−Ｆｅｓタンパク質チロシンキナーゼ（Ｆｅｓ）、線維芽細胞増殖因子受容体２（ＦＧＦＲ２）、線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）、および線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体−３（Ｆｌｔ３）、インスリン受容体関連受容体（ＩＲＲ）、リンパ球指向性キナーゼ（ＬＯＫ）、Ｌｙｎチロシンプロテインキナーゼ（Ｌｙｎ）、ＭＡＰキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２（ＭＫ２）、ＭＡＰキナーゼ活性化プロテインキナーゼ３（ＭＫ３）、母性胚性ロイシンジッパーキナーゼ（ＭＥＬＫ）、ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）、マイトジェンおよびストレス活性化プロテインキナーゼ（ＭＳＫ１）、哺乳類ＳＴＥ２０様プロテインキナーゼ１（ＭＳＴ１）、哺乳類ＳＴＥ２０様プロテインキナーゼ２（ＭＳＴ２）、非有糸分裂（Ｎｅｖｅｒ  ｉｎ  ｍｉｔｏｓｉｓ）Ａ関連キナーゼ１１（ＮＥＫ１１）、７０ｋＤａリボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ１（ｐ７０Ｓ６Ｋ）、ＰＡＳドメイン含有セリン／スレオニンキナーゼ（ＰＡＳＫ）、Ｐｉｍ−１キナーゼ（Ｐｉｍ−１）、プロテインキナーゼＢ、ガンマ（ＰＫＢγ）、プロテインキナーゼＣ、ミュー（ＰＫＣμ）、プロテインキナーゼＤ２（ＰＫＤ２）、タンパク質−キナーゼＣ関連キナーゼ２（ＰＲＫ２）、血清／グルココルチコイド−制御キナーゼ３（ＳＧＫ３）、癌原遺伝子チロシン−プロテインキナーゼＳｒｃ（Ｓｒｃ）、脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）、Ｔｅｃタンパク質チロシンキナーゼ（Ｔｅｃ）、内膜内皮細胞キナーゼ２（Ｔｉｅ２）、チロシンキナーゼ受容体Ａ（ＴｒｋＡ）、ＢＤＮＦ／ＮＴ−３増殖因子受容体（ＴｒｋＢ）、ゼータ鎖（ＴＣＲ）関連プロテインキナーゼ７０ｋＤａ（ＺＡＰ−７０）、およびＺＩＰキナーゼ（ＺＩＰＫ）。
【０２４３】
いくつかの実施形態によれば、医薬製剤は、限定はされないが、下記を含むＭＫ２の低分子阻害剤を含む：
【化３】
2018502860.tif 000017
【化４】
2018502860.tif 000018
【０２４４】
いくつかの実施形態によれば、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のポリペプチドおよびその機能的等価物は、ＴＧＦ−β発現のレベル、免疫調節性細胞の浸潤、または両方を低減させるのに有効である。
【０２４５】
別の実施形態によれば、記載される発明の医薬製剤は、１つ以上のタイプの炎症または幹細胞、例えば、限定はされないが、単球、線維細胞、マクロファージ、リンパ球、およびマストまたは樹状細胞の創傷中への浸潤を低減させるのに有効である。
【０２４６】
別の実施形態によれば、細胞型は、限定はされないが、ＣＤ４および／またはＣＤ８を含む細胞表面マーカー（複数可）の発現により特徴付けられる。
【０２４７】
いくつかの実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約０．００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ（または１００μｇ／ｋｇ）体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約１０ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約２ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約３ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約４ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約５ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約６０ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約７０ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約８０ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約９０ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約９０ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約８０ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約７０ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約６０ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約４０ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、治療���阻害ペプチドの治療量は、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約０．１ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約０．１ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重の量である。別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は、約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約０．００００１ｍｇ／ｋｇ体重の量である。
【０２４８】
いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は１μｇ／ｋｇ／日〜２５μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は１μｇ／ｋｇ／日〜２μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は２μｇ／ｋｇ／日〜３μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は３μｇ／ｋｇ／日〜４μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は４μｇ／ｋｇ／日〜５μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は５μｇ／ｋｇ／日〜６μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は６μｇ／ｋｇ／日〜７μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は７μｇ／ｋｇ／日〜８μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は８μｇ／ｋｇ／日〜９μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は９μｇ／ｋｇ／日〜１０μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は１μｇ／ｋｇ／日〜５μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は５μｇ／ｋｇ／日〜１０μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は１０μｇ／ｋｇ／日〜１５μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は１５μｇ／ｋｇ／日〜２０μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は２５μｇ／ｋｇ／日〜３０μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は３０μｇ／ｋｇ／日〜３５μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は３５μｇ／ｋｇ／日〜４０μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は４０μｇ／ｋｇ／日〜４５μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は４５μｇ／ｋｇ／日〜５０μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は５０μｇ／ｋｇ／日〜５５μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は５５μｇ／ｋｇ／日〜６０μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は６０μｇ／ｋｇ／日〜６５μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は６５μｇ／ｋｇ／日〜７０μｇ／ｋｇ／日の範囲であ���。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は７０μｇ／ｋｇ／日〜７５μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は８０μｇ／ｋｇ／日〜８５μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は８５μｇ／ｋｇ／日〜９０μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は９０μｇ／ｋｇ／日〜９５μｇ／ｋｇ／日の範囲である。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は９５μｇ／ｋｇ／日〜１００μｇ／ｋｇ／日の範囲である。
【０２４９】
別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は１μｇ／ｋｇ／日である。
【０２５０】
別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は２μｇ／ｋｇ／日である。
【０２５１】
別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は３μｇ／ｋｇ／日である。
【０２５２】
別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は４μｇ／ｋｇ／日である。
【０２５３】
別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は５μｇ／ｋｇ／日である。
【０２５４】
別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は６μｇ／ｋｇ／日である。
【０２５５】
別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は７μｇ／ｋｇ／日である。
【０２５６】
別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は８μｇ／ｋｇ／日である。
【０２５７】
別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は９μｇ／ｋｇ／日である。
【０２５８】
別の実施形態によれば、医薬製剤の治療用阻害ペプチドの治療量は１０μｇ／ｋｇ／日である。
【０２５９】
アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のポリペプチドまたはその機能的等価物は薬学的に許容される塩の形態で投与され得る。医薬中で使用される場合、塩は薬学的に許容されなければならないが、薬学的に許容されない塩はその薬学的に許容される塩を調製するために、都合よく使用され得る。そのような塩としては、下記酸から調製されるものが挙げられるが、それらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。また、そのような塩はカルボン酸基のアルカリ金属またはアルカリ土類塩、例えばナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩として調製され得る。薬学的に許容される塩はよく知られている。例えば、Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌらは、薬学的に許容される塩を、“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｕｓｅ”  （Ｗｉｌｅｙ  ＶＣＨ，  Ｚｕｒｉｃｈ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ：  ２００２）において詳細に説明している。塩は、記載される発明内で記載される化合物の最終単離および精製中にインサイチューで調製され得、または遊離塩基官能基を好適な有機酸と別個に反応させることにより調製され得る。代表的な酸付加塩としては下記が挙げられるが、それらに限定されない：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、ジグルコン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩（イセチオン酸塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、リン酸塩、グルタミン酸、重炭酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびウンデカン酸塩。また、塩基性窒素含有基は下記などの作用物質により四級化され得る：低級アルキルハロゲン化物、例えば塩化、臭化およびヨウ化メチル、エチル、プロピル、およびブチル；ジメチル、ジエチル、ジブチルおよびジアミル硫酸塩のようなジアルキル硫酸塩；長鎖ハロゲン化物、例えばデシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリルクロリド、ブロミドおよびヨージド；ベンジルおよびフェネチルブロミドのようなアリールアルキルハロゲン化物、など。これにより、水溶性もしくは油溶性または分散性生成物が得られる。薬学的に許容される酸付加塩を形成させるために使用され得る酸の例としては下記が挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸およびリン酸などの無機酸ならびにシュウ酸、マレイン酸、コハク酸およびクエン酸などの有機酸。塩基付加塩は、本発明内で記載される化合物の最終単離および精製中に、カルボン酸含有部分を好適な塩基、例えば、薬学的に許��される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩または重炭酸塩と、あるいはアンモニアまたは有機一級、二級もしくは三級アミンと反応させることにより、インサイチューで調製され得る。薬学的に許容される塩としては、アルカリ金属またはアルカリ土類金属に基づくカチオン、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよびアルミニウム塩など、ならびに無毒性四級アンモニアおよびアミンカチオン、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミンなどが挙げられるが、それらに限定されない。塩基付加塩の形成に有用な他の代表的な有機アミンとしては、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジンなどが挙げられる。薬学的に許容される塩はまた、当技術分野でよく知られた標準手順を用いて、例えば、アミンなどの塩基性化合物を、生理的に許容されるアニオンを生成する好適な酸と十分反応させることにより得ることができる。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウムもしくはリチウム）またはアルカリ土類金属（例えばカルシウムもしくはマグネシウム）塩もまた、生成され得る。
【０２６０】
製剤は便宜上、単位剤形で提供され得、薬学の分野で知られている方法により調製され得る。そのような方法は、治療薬（複数可）、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物（「活性化合物」）を１つ以上の補助剤を構成する担体と一緒にする工程を含む。一般に、製剤は、均一にかつ密接に、活性剤を液体担体または微細化固体担体または両方と一緒にし、その後、必要に応じて、生成物を、所望の製剤に成形することにより、調製される。
【０２６１】
いくつかの実施形態によれば、担体は制御放出担体である。「制御放出」という用語は、製剤からの薬物放出の様式およびプロファイルが制御される任意の薬物含有製剤を示すことが意図される。これは即時ならびに非即時放出製剤を含み、非即時放出製剤は、限定はされないが、持続放出および遅延放出製剤を含む。いくつかの実施形態によれば、医薬製剤の制御放出は温度の変化により媒介される。いくつかの他の実施形態によれば、医薬製剤の制御放出は、ｐＨの変化により媒介される。
【０２６２】
注射可能なデポー形態は、生分解性ポリマー、例えば、限定はされないが、ポリエステル（ポリグリコライド、ポリ乳酸およびそれらの組み合わせ）、ポリエステルポリエチレングリコールコポリマー、ポリアミノ由来生体高分子、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリフォスファゼン、スクロース酢酸イソブチル（ＳＡＩＢ）、光重合性生体高分子、天然起源生体高分子、タンパク質ポリマー、コラーゲン、および多糖中で治療薬／薬物のマイクロカプセル化マトリクスを形成させることにより製造され得る。薬物対ポリマーの比および使用される特定のポリマーの性質によって、薬物放出速度が制御され得る。そのような長時間作用製剤は好適なポリマーまたは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂を用いて、または難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として、製剤化され得る。注射可能なデポー製剤はまた、薬物を、体組織と適合するリポソームまたはマイクロエマルジョンに封入することにより調製される。
【０２６３】
いくつかの実施形態によれば、担体は遅延放出担体である。別の実施形態によれば、遅延放出担体は生分解性ポリマーを含む。別の実施形態によれば、生分解性ポリマーは合成ポリマーである。別の実施形態によれば、生分解性ポリマーは天然起源のポリマーである。
【０２６４】
いくつかの実施形態によれば、担体は持続放出担体である。別の実施形態によれば、持続放出担体は生分解性ポリマーを含む。別の実施形態によれば、生分解性ポリマーは合成ポリマーである。別の実施形態によれば、生分解性ポリマーは天然起源のポリマーである。
【０２６５】
いくつかの実施形態によれば、担体は短期放出担体である。「短期」放出という用語は、本明細書では、インプラントが治療レベルの活性材料成分を約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３時間の間送達するように構築および配置されていることを意味する。いくつかの他の実施形態によれば、短期放出担体は、治療レベルの活性材料成分を約１、２、３、または４日の間送達する。
【０２６６】
いくつかの実施形態によれば、担体は長期放出担体である。「長期」放出という用語は、本明細書では、インプラントが治療レベルの活性材料成分を少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４８、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０日の間送達するように構築および配置されていることを意味する。別の実施形態によれば、長期−放出担体は生分解性ポリマーを含む。別の実施形態によれば、生分解性ポリマーは合成ポリマーである。
【０２６７】
いくつかの実施形態によれば、担体は粒子を含む．いくつかの実施形態によれば、本明細書で記載される製剤は粒子中に含まれる。いくつかの実施形態によれば、本明細書で記載される製剤は粒子上に含まれる。いくつかの実施形態によれば、本明細書で記載される製剤は粒子中およびそれ上の両方に含まれる。
【０２６８】
製剤はまた、適切なアジュバントを含むことができ、限定はされないが、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤が挙げられる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌薬および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、などにより確実にされ得る。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むことが望ましい場合もある。注射可能な剤型の延長吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用により引き起こされ得る。
【０２６９】
いくつかの実施形態によれば、本発明のポリペプチドは共有結合により、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖へ付着させることができる。いくつかの他の実施形態によれば、本発明のポリペプチドは炭化水素と結合され、炭化水素結合ペプチドが生成され、これらは安定なαヘリックス構造を形成することができる（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ２０００，  １２２，  ５８９１−５８９２、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２７０】
いくつかの他の実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、安定性を増加させ、送達を延長し、またはペプチドの活性を変化させるために、ミクロスフェア、ナノカプセル、リポソーム、またはマイクロエマルジョン中にカプセル化され、または封入され、あるいは、ｄ−アミノ酸を含む。これらの技術は安定性を延長すると同時に、放出を数時間〜数日延長する、または、薬物の付近の細胞による取込を遅延させることができる。
【０２７１】
治療薬（複数可）の製剤は薬学的に許容される溶液中で投与され得、これは、ルーチン的に、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性担体、アジュバント、および任意で他の治療材料成分を含み得る。
【０２７２】
いくつかの実施形態によれば、医薬製剤は、少なくとも１つ追加の治療薬をさらに含む。
【０２７３】
いくつかのそのような実施形態によれば、追加の治療薬はＥＸＣ００１（結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）に対するアンチセンスＲＮＡ）、ＡＺＸ１００（熱ショックタンパク質２０（ＨＳＰ２０）のホスホペプチド類似体）、ＰＲＭ−１５１（組換えヒト血清アミロイドＰ／Ｐｅｎｔａｘｉｎ２）、ＰＸＬ０１（ヒトラクトフェリンに由来する合成ペプチド）、ＤＳＣ１２７（アンジオテンシン類似体）、ＲＸＩ−１０９（結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）を標的にする自己送達ＲＮＡｉ化合物）、ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）、ボツリヌス（Ｂｏｔｕｌｉｕｍ）毒素タイプＡ、またはそれらの組み合わせを含む。
【０２７４】
別の実施形態によれば、追加の治療薬は抗炎症薬である。
【０２７５】
いくつかの実施形態によれば、抗炎症薬はステロイド系抗炎症薬である。「ステロイド系抗炎症薬」という用語は、本明細書では、１７−炭素４−環系を含む多くの化合物の任意の１つを示し、ステロール、様々なホルモン（タンパク質同化ステロイドとして）、およびグリコシドを含む。ステロイド系抗炎症薬の代表例としては、下記が挙げられるが、それらに限定されない：コルチコステロイド、例えばヒドロコルチゾン、ヒドロキシルトリアムシノロン、α−メチルデキサメタゾン、リン酸デキサメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、吉草酸クロベタゾール、デソニド、デスオキシメタゾン、デスオキシコルチコステロン酢酸エステル、デキサメタゾン、ジクロリゾン、吉草酸ジフルコルトロン、フルアドレノロン、フルクロロロンアセトニド、ピバル酸フルメタゾン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルコルチンブチルエステル、フルオコルトロン、フルプレドニデン（フルプレドニリデン）酢酸エステル、フルランドレノロン、ハルシノニド、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフルオロゾン、フルラドレノロン、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフロロゾン、フルラドレノロンアセトニド、メドリゾン、アムシナフェル、アムシナフィド、ベタメタゾンおよびそのエステルの平衡物、クロロプレドニゾン、酢酸クロルプレドニゾン、クロコルテロン、クレスシノロン、ジクロリゾン、ジフルプレドナート、フルクロロニド、フルニソリド、フルオロメタロン、フルペロロン、フルプレドニソロン、吉草酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンプロピオン酸シクロペンチル、ヒドロコルタマート、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、トリアムシノロン、およびそれらの混合物。
【０２７６】
別の実施形態によれば、抗炎症薬は非ステロイド系抗炎症薬である。「非ステロイド系抗炎症薬」という用語は、本明細書では、それらの作用がアスピリン様である作用物質の大集団を示し、下記が挙げられるが、それらに限定されない：イブプロフェン（Ａｄｖｉｌ（登録商標））、ナプロキセンナトリウム（Ａｌｅｖｅ（登録商標））、およびアセトアミノフェン（タイレノール（登録商標））。記載される発明との関連で使用可能な非ステロイド系抗炎症薬の追加の例としては、下記が挙げられるが、それらに限定されない：オキシカム、例えばピロキシカム、イソキシカム、テノキシカム、スドキシカム、およびＣＰ−１４，３０４；ジサルシド、ベノリラート、トリリサート、サファピリン、ソルプリン、ジフルニサル、およびフェンドザール；酢酸誘導体、例えばジクロフェナク、フェンクロフェナック、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、イソキセパック、フロフェナク、チオピナク、ジドメタシン、アセマタシン、フェンチアザク、ゾメピラク、クリンダナク、オキセピナク、フェルビナク、およびケトロラク；フェナム酸、例えばメフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、ニフルム酸、およびトルフェナム酸；プロピオン酸誘導体、例えばベノキサプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、フェノプロフェン、フェンブフェン、インドプロフェン、ピルプロフェン、カルプロフェン、オキサプロジン、プラノプロフェン、ミロプロフェン、チオキサプロフェン、スプロフェン、アルミノプロフェン、およびチアプロフェン；ピラゾール、例えばフェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、フェプラゾン、アザプロパゾン、およびトリメタゾン。これらの非ステロイド系抗炎症薬混合物もまた、ならびにこれらの作用物質の皮膚科学的に許容される塩およびエステルも使用され得る。例えば、エトフェナマート、フルフェナム誘導体は特に局所適用に有用である。
【０２７７】
別の実施形態によれば、抗炎症薬は、限定はされないが、トランスフォーミング増殖因子−ベータ３（ＴＧＦ−β３）、抗腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）剤、またはそれらの組み合わせを含む。
【０２７８】
いくつかの実施形態によれば、追加の作用物質は鎮痛薬である。いくつかの実施形態によれば、鎮痛薬は、疼痛閾値を上昇させることにより、意識を障害させる、または他の感覚様式を変えることなく、疼痛を軽減する。いくつかのそのような実施形態によれば、鎮痛薬は非オピオイド性鎮痛薬である。「非オピオイド性鎮痛薬」は疼痛を低減させるが、オピオイド鎮痛薬ではない天然または合成物質である。非オピオイド性鎮痛薬の例としては、下記が挙げられるが、それらに限定されない：エトドラク、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、ナブメトン、ピロキシカム、アセトアミノフェン、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、オキサプロジン、アスピリン、コリンマグネシウムトリサリチル酸、ジフルニサル、メクロフェナム酸、メフェナム酸、およびフェニルブタゾン。いくつかの他の実施形態によれば、鎮痛薬はオピオイド鎮痛薬である。「オピオイド鎮痛薬」、「オピオイド」、または「麻薬性鎮痛薬」は、中枢神経系中のオピオイド受容体に結合し、アゴニスト作用を生成させる天然または合成物質である。オピオイド鎮痛薬の例としては、下記が挙げられるが、それらに限定されない：コデイン、フェンタニル、ヒドロモルホン、レボルファノール、メペリジン、メサドン、モルヒネ、オキシコドン、オキシモルフォン、プロポキシフェン、ブプレノルフィン、ブトルファノール、デゾシン、ナルブフィン、およびペンタゾシン。
【０２７９】
別の実施形態によれば、追加の作用物質は抗感染薬である。別の実施形態によれば、抗感染薬は抗生物質製剤である。「抗生物質製剤」という用語は、本明細書では、細菌、および他の微生物の増殖を阻害する、またはこれを破壊する能力を有し、主に感染性疾患の治療において使用される化学物質の群のいずれかを意味する。抗生物質製剤の例としては、下記が挙げられるが、それらに限定されない：ペニシリンＧ；メチシリン；ナフシリン；オキサシリン；クロキサシリン；ジクロキサシリン；アンピシリン；アモキシシリン；チカルシリン；カルベニシリン；メズロシリン；アズロシリン；ピペラシリン；イミペネム；アズトレオナム；セファロチン；セファクロル；セフォキシチン；セフロキシム；セフォニシド；セフメタゾール；セフォテタン；セフプロジル；ロラカルベフ；セフェタメト；セフォペラゾン；セフォタキシム；セフチゾキシム；セフトリアキソン；セフタジジム；セフェピム；セフィキシム；セフポドキシム；セフスロジン；フレロキサシン；ナリジクス酸；ノルフロキサシン；シプロフロキサシン；オフロキサシン；エノキサシン；ロメフロキサシン；シノキサシン；ドキシサイクリン；ミノサイクリン；テトラサイクリン；アミカシン；ゲンタマイシン；カナマイシン；ネチルマイシン；トブラマイシン；ストレプトマイシン；アジスロマイシン；クラリスロマイシン；エリスロマイシン；エリスロマイシンエストレート；エリスロマイシンエチルコハク酸エステル；エリスロマイシングルコヘプトン酸エステル；エリスロマイシンラクトビオン酸塩；ステアリン酸エリスロマイシン；バンコマイシン；テイコプラニン；クロラムフェニコール；クリンダマイシン；トリメトプリム；スルファメトキサゾール；ニトロフラントイン；リファンピン；ムピロシン；メトロニダゾール；セファレキシン；ロキシスロマイシン；コアモキシクラブアナート（Ｃｏ−ａｍｏｘｉｃｌａｖｕａｎａｔｅ）；ピペラシリンとタゾバクタムの組み合わせ；ならびにそれらの様々な塩、酸、塩基、および他の誘導体。抗菌抗生物質製剤としては、下記が挙げられるが、それらに限定されない：ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、カルバペネム、モノバクタム、アミノグリコシド、グリコペプチド、キノロン、テトラサイクリン、マクロライド、およびフルオロキノロン。
【０２８０】
少なくとも１つ追加の治療薬の他の例としては、下記が挙げられるが、それらに限定されない：ローズヒップ油、ビタミンＥ、５−フルオロウラシル、ブレオマイシン、タマネギエキス、ペントキシフィリン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ、ベラパミル、タクロリムス、タモキシフェン、トレチノイン、コルヒチン、カルシウム拮抗薬、トラニルスト（ｔｒａｎｉｌｓｔ）、亜鉛、抗生物質、およびそれらの組み合わせ。
【０２８１】
特に断りがなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載された方法および材料と類似する、または等価ないずれの方法および材料もまた、本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料をこれから記載する。本明細書に記載された全ての刊行物は、参照により本明細書に組み入れられ、引用された刊行物との関係で方法および／または材料を開示および記載する。
【０２８２】
ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限と下限の間に介在する各値（文脈が明確に示さない限り下限の１０分の１まで）、および任意の他の表記された値または表記範囲中に介在する値が、本発明に包含されることは理解されよう。これらより小さな範囲に独立して含まれ得るより小さな範囲の上限および下限もまた、本発明に包含されるが、ただし表記範囲中の特に排除された任意の限界を受ける。表記の範囲が一方または両方の限界を含む場合、それらの含まれる限界の一方または両方を排除した範囲もまた、本発明に含まれる。
【０２８３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる通り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにその他を記載しない限り、複数の対応物を含むことが特記されなければならない。本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は同じ意味を有する。
【０２８４】
本明細書で議論される刊行物は、その内容は参照により本明細書に組み入れられ、本出願の出願日前のそれらの開示内容を示すためにのみ提供される。それらのいずれも、記載された本発明が先行発明を理由にそのような刊行物に先行しないということを容認するものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の発行日とは異なることが有り、それは独立して確認されるべきであろう。
【０２８５】
記載される発明は、その精神またはその必須の属性から逸脱せずに、他の特定の形態で具体化され得、したがって、発明の範囲を示す場合、前記明細書ではなく、添付の特許請求の範囲に言及しなければならない。
【０２８６】
実施例
以下の実施例は、本発明の実施および使用の方法の完全な開示および記載を当業者に提供するために示されるものであり、本発明者らが本発明者らの発明とみなすものの範囲を制限しようとするものでもなく、また下記の実験が全てであること、あるいは実施された実験に過ぎないことを表すものでもない。使用する数値（例えば数、温度など）に関して正確さを確保するために努力を払ったが、若干の実験誤差および偏差が考慮されなければならない。他に断りがなければ、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧は大気圧または大気圧近辺である。
【０２８７】
材料および方法
Ａ．ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の乾燥粉末製剤
ＭＭＩ−０１００製剤：
ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、凍結乾燥（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）Ｌｏｔ番号１００４２９、製造日２０１０年６月２９日、５００ｍｇ。
ニート噴霧乾燥ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、５％ｗ／ｗ固体（Ｂｅｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｂｅｎｄ  ＯＲ）Ｌｏｔ番号ＢＲＥＣ００７０８−００３Ａ、製造日２０１２年７月２７日、１ｇ。
ニート噴霧乾燥ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、１％ｗ／ｗ固体（Ｂｅｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｂｅｎｄ  ＯＲ）Ｌｏｔ番号ＢＲＥＣ００７０８−００３Ｂ、製造日２０１２年７月２７日、１ｇ。
噴霧乾燥８０／２０ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）／トレハロース（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．  Ｄａｌｌａｓ  ＴＸ）、１％ｗ／ｗ固体（Ｂｅｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｂｅｎｄ  ＯＲ）Ｌｏｔ番号ＢＲＥＣ００７０８−０１１Ｃ、製造日ｗ／ｃ２０１２年９月１０日、５００ｍｇ。
噴霧乾燥９２．５／７．５ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）／トレハロース（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．  Ｄａｌｌａｓ  ＴＸ）、１％ｗ／ｗ固体（Ｂｅｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｂｅｎｄ  ＯＲ）Ｌｏｔ番号ＢＲＥＣ００７０８−０１１Ｆ、製造日ｗ／ｃ２０１２年９月１０日、５００ｍｇ。
【０２８８】
迅速ＨＰＬＣおよびＮＧＩ試料抽出方法
材料および機器
水、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅまたは等価物
アセトニトリル、ＨＰＬＣグレード
メタノール、ＨＰＬＣグレード
トリフルオロ酢酸
Ｔｗｅｅｎ２０
ＭＭＩ−０１００ニート凍結乾燥原薬
微量天秤（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ，  Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  ＯＨ）
次世代インパクタ（ＮＧＩ）（ＭＳＰ  Ｃｏｒｐ，  Ｓｈｏｒｅｖｉｅｗ  ＭＮ）
用量単位採取装置（Ｃｏｐｌｅｙ，  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  ＵＫ）
ＴＰＫ制御装置（Ｃｏｐｌｅｙ，  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  ＵＫ）
ＨＰＬＣシステム
ＨＰＬＣ機器（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５，  Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）、サーモスタット制御されたカラム区画またはカラムオーブンおよび試料区画を有する
カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ペプチドＥＳ−Ｃ１８、５０×４．６ｍｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）
流速：１．５ｍＬ／分
注入体積：４０ＩＬＬ
カラム温度：４０℃
試料温度：５℃
検出器波長：２１５ｎｍ
移動相Ａ：０．１％ＩＴＡを含む水（７２％）
移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡを含む１：１メタノール：アセトニトリル（２８％）
ランタイム：３分。ＭＭＩ−０１００の保持時間は約２．３５分である。
【０２８９】
溶液調製
移動相Ａ：０．１％ＴＦＡを含む水
２．０ｍＬのＴＦＡを２Ｌメスフラスコ中の１０００ｍＬの水中にピペッティングし、水で希釈して一定体積にする。混合し、脱気する。代替用の量を調製してもよいが、割合は等しく維持される。
【０２９０】
移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡを含む１：１メタノール：アセトニトリル
１．０ｍＬのＴＦＡを、１Ｌメスフラスコ中の５００ｍＬのメタノール中にピペッティングし、メタノールで希釈して一定体積にする。混合し、脱気する。代替用の量を調製してもよいが、割合は等しく維持される。１．０ｍＬのＴＦＡを、１Ｌメスフラスコ中の５００ｍＬのアセトニトリル中にピペッティングし、アセトニトリルで希釈して一定体積にする。混合し、脱気する。代替用の量を調製してもよいが、割合は等しく維持される。２，０００ｍＬの移動相のために上記調製された溶液を混合する。
【０２９１】
試料溶媒：０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む水
目盛り付き広口ＴＣピペットを使用して、０．８ｍＬのＴｗｅｅｎ２０をおよそ３，０００ｍＬの水を含む４，０００ｍＬメスフラスコ中に移す。Ｔｗｅｅｎ２０は粘性である。必ず、数回、水でピペットをすすいでフラスコに入れ、ピペットからＴｗｅｅｎ２０をフラッシングする。水で希釈して一定体積にする。よく混合する。
【０２９２】
コーティング溶液：５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むメタノール
目盛り付き広口ＴＣピペットを使用して５ｍＬのＴｗｅｅｎ２０を、およそ７５ｍＬのメタノールを含む１００．０ｍＬメスフラスコ中に移す。Ｔｗｅｅｎ２０は粘性である。必ず、数回、ピペットをメタノールですすいでフラスコに入れ、Ｔｗｅｅｎ２０をピペットからフラッシングする。メタノールで希釈して一定体積にする。よく混合する。
【０２９３】
注：ＭＭＩ−０１００は吸湿性である。ニート原薬の取扱は全て５％相対湿度で維持されたグローブボックス内で実施されなければならない。
【０２９４】
注：凍結乾燥ＭＭＩ−０１００は−１０℃〜−２０℃で保存される。使用前に、凍結乾燥ＭＭＩ−０１００はデシケーターまたは５％相対湿度で維持されたグローブボックスで少なくとも２時間の間解凍されなければならない。
【０２９５】
標準原液−１．１ｍｇ／ｍＬ
１１ｍｇの純粋ＭＭＩ−０１００と等価な量のＭＭＩ−０１００を適切な計量容器中に秤量する。必要とされる実際の重量は、１１ｍｇを分析証明書に報告されている純度係数で割ることにより計算することができる。実際に秤量したＭＭＩ−０１００の量は、この計算重量の±０．２５０ｍｇでなければならない。ＭＭＩ−０１００（そのまま）の重量＋計量容器をＷiとして記録する。ＭＭＩ−０１００を１０．０ｍＬメスフラスコに移す。空の計量容器を天秤上に置き、重量（Ｗf）を記録する。標準量はＷi−Ｗfに等しい。およそ６ｍＬの試料溶媒を添加する。メスフラスコを回転させて溶解させ、試料溶媒で希釈して一定体積にする。よく混合し、直ちに、溶液をポリプロピレン遠心管に移す。チェック標準原液のための第２の溶液を調製する。
【０２９６】
標準試薬溶液−１１０μｇ／ｍＬ
５．０ｍＬの標準原液を５０ｍＬメスフラスコ中にピペッティングする。試料溶媒で希釈して一定体積にし、直ちに、溶液をポリプロピレン遠心管に移す。最終濃度：１１０μｇ／ｍＬ。
【０２９７】
標準試薬溶液−１１μｇ／ｍＬ
５．０ｍＬの標準原液を５０ｍＬメスフラスコ中にピペッティングする。試料溶媒で希釈して一定体積にする。最終濃度：１１μｇ／ｍＬ。
【０２９８】
定量下限（ＬＯＱ）溶液
１．０ｍＬの１１０μｇ／ｍＬ標準試薬溶液を５０ｍＬメスフラスコ中にピペッティングする。試料溶媒で希釈して一定体積にする。最終濃度：２．２μｇ／ｍＬ。
【０２９９】
手順
安定なシグナルが達成されるまで、ＨＰＬＣを移動相で平衡化させる。下記配列の１つを、必要に応じて使用して、システム適合性および試料注入を実施する。
【０３００】
注：ＨＰＬＣオートサンプラー温度は、５℃で維持される。ＭＭＩ−０１００試料溶液は、調製直後にＨＰＬＣに移されなくてはならず、注入前少なくとも１０−１５分の間熱平衡化される。
【０３０１】
注：ガラスはＭＭＩ−０１００ペプチドを溶液から吸収するであろう。ポリプロピレンＨＰＬＣバイアルのみが分析に使用されるべきである。
【０３０２】
ＮＧＩ試料
試料溶媒（１×）
ＬＯＱ溶液（６×）
１１μｇ／ｍＬ標準試薬（５×）
１１μｇ／ｍＬチェック標準（１×）
ＮＧＩ試料−１複製、ブリスターからＭＯＣまで（それぞれ１×）
１１μｇ／ｍＬ標準試薬（１×）
ＮＧＩ試料の追加の複製
１１μｇ／ｍＬ標準試薬（各ＮＧＩ複製後１×）
【０３０３】
下記標的要求が満たされた場合、システム適合性は達成される。
試料溶媒ピーク：ＭＭＩ−０１００の保持時間で検出されない
ＬＯＱ溶液：ｎ＝６注入について％ＲＳＤ（相対標準偏差）が＜１０％でなければならない
最初、ｎ＝５の標準試薬の注入：
％ＲＳＤは、＜１．５％でなければならない
テーリング係数は、＜２．０でなければならない
ｋ’は、＞２．０でなければならない。ボイドタイムについては、溶媒前端における第１のピークを使用する。
【０３０４】
理論段数は、情報のみのために記録されなければならない。
チェック標準：９８．０−１０２．０％
実行による標準試薬注入：全ての標準試薬注入の％ＲＳＤは、＜２．０％でなければならない
【０３０５】
ＮＧＩ試料調製
ＮＧＩ分析のためのブリスターは、研究で使用される吸入器のために標準使用説明書に従い、投与されなければならない。
【０３０６】
ブリスター、流路、スロート、およびＮＧＩインパクションカップは、表２で列挙される抽出体積を用いて、ステージに対する標準ｌａｂ業務を使用して、試料溶媒で抽出されなければならない。
【表２】
2018502860.tif 000019
【０３０７】
ＮＧＩインパクションカップは、混合中、被覆される必要はない。混合時間は、３分でなければならない。
【０３０８】
プレセパレーター抽出
プレセパレーターは容積測定ガラス容器中に抽出されない。
【０３０９】
プレセパレータートップ：プレセパレータートップは抽出されない。
【０３１０】
プレセパレーターインサート：プレセパレーターインサートは投与中に中央カップに添加された１０．０ｍＬの試料溶媒を有する。この溶液は、短時間でピペットにより、中央カップ中で混合され、その後、ＨＰＬＣバイアルに追加の希釈なしで移される。
【０３１１】
プレセパレーターベース：プレセパレーターベースを栓でしっかり閉じる。１０．０ｍＬの試料溶媒をベースの平坦部分に添加する。平坦部分の表面積全体を数回、ピペットによりすすぐ。この同じ試料溶液を使用して、ベースの基部の内壁をすすぐ。試料溶液をピペットにより混合する。
【０３１２】
計算
下記式を使用してチェック標準精度を計算する：
（Ａチェック標準）（Ｃ標準）（１００％）／（Ａ標準）（Ｃチェック標準）
ここで：
Ａチェック標準＝チェック標準溶液におけるＭＭＩ−０１００ピークのピーク面積
Ｃ標準＝標準試薬溶液中のＭＭＩ−０１００の濃度
Ａ標準＝標準試薬溶液の第１の５つの（５）注入におけるＭＭＩ−０１００ピークの平均ピーク面積
Ｃチェック標準＝チェック標準溶液におけるＭＭＩ−０１００の濃度
個々の試験溶液中のＭＭＩ−０１００の量をμｇで、下記式を用いて計算する：
（Ａ試料）（Ｃ標準）（Ｖ試料）（Ｐ）／（Ａ標準）
ここで：
Ａ試料＝試験溶液中のＭＭＩ−０１００ピークのピーク面積
Ｃ標準＝標準試薬溶液中のＭＭＩ−０１００の濃度
Ｐ＝参照物質（適用可能な場合）の効力係数
Ａ標準＝標準試薬溶液の第１の５つの（５）注入におけるＭＭＩ−０１００ピークの平均ピーク面積
【０３１３】
表３で列挙されるブリスターおよび装置パラメータをエアロゾル性能の最適化のための起点として使用した。
【表３】
2018502860.tif 000020
【０３１４】
Ｂ．ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のネブライザー製剤
ＭＭＩ−０１００製剤：
製剤Ａ：７ｍｇ／ｍＬ；２００ｍＬの０．９％生理食塩水を含むメスフラスコ中に秤量された、１．８ｇの凍結乾燥ペプチド。
製剤Ｂ：０．７ｍｇ／ｍＬ；２００ｍＬの０．９％生理食塩水を含むメスフラスコ中に秤量された、０．１８ｇの凍結乾燥ペプチド。
【０３１５】
機器：
Ｍａｌｖｅｒｎ  ＭａｓｔｅｒＳｉｚｅｒ  Ｘ  Ｖ２．１５：Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｍｂＨ，  Ｍuｎｃｈｅｎ  ＩＩ
カラムオーブンを備えたＨＰＬＣ  Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５、２４８７二重吸光度検出器およびクロマトグラフィーデータシステム（Ｅｍｐｏｗｅｒ３）；Ｗａｔｅｒｓ
マスフロー制御装置０〜３０ｌ／分、例えばＰＲ４０００；ＭＫＳ
相対湿度および温度のための測定システム、例えば、ｔｅｓｔｏ６４５
デジタルマノメーター、例えば、ｔｅｓｔｏ５２５
精密天秤、例えばＥｘｃｅｌｌｅｎｃｅ  ＸＳ６０３Ｓ  ＤＲ、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ
調整システム
気泡流量計、例えばＧｉｌｉｂｒａｔｏｒ２、Ｇｉｌｌｉａｎ
呼吸シミュレータＺ
フィルタパッド（ポリプロピレン）
フィルタケーシング
研究室振盪機、例えば３０１５、ＩＫＡ  Ｗｅｒｋｅ
温度／湿度センサ、例えばＴｅｓｔｏ６４５、Ｔｅｓｔｏ
ガスメータ、Ｇ４、Ｅｌｓｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｏｍｅｔ
Ｐｉｐｅｔｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１０００、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ
Ｍｕｌｔｉｐｅｔｔｅストリーム、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ
Ｗａｔｅｒｂａｔｈ、例えばＦ１２；Ｊｕｌａｂｏ
マグネットスターラー、例えばＩＫＡ  ＲＣＴベーシック
レオメータ、例えばＲｈｅｏｓｔｒｅｓｓｌ、Ｈａａｋｅ
テンシオメータ、例えばｓｃｉｅｎｃｅ  ｌｉｎｅ  ｔ６０、ＳｉｔａＭｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ
Ｏｓｍｏｍａｔ、例えばＧｏｎｏｔｅｃ  ａｕｔｏ
【０３１６】
Ｃ．ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のナノポリプレックス製剤
細胞貫通ＭＫ２阻害ペプチドの合成
ＭＫ２阻害ペプチド（ＭＫ２ｉ）ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を、ＰＳ３ペプチドシンセサイザー（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．  Ｔｕｃｓｏｎ，  ＡＺ）上で、標準Ｆｍｏｃ化学を用いて合成した。Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ、Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を溶媒として全てのペプチド合成において使用した。ＨＣＴＵ（１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５クロロ−，ヘキサフルオロホスフェート（１−），３−オキシド）をアクチベーター（Ｃｈｅｍｐｅｐ、Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ、ＦＬ）として、Ｎ−メチルモルホリンの存在下で使用した。全てのアミノ酸を収率および純度を最大にするために、ダブルカップリングさせた。ペプチドをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／フェノール／Ｈ2Ｏ／トリイソプロピルシラン（８８／５／５／２）中で、切断／脱保護させた。ペプチドをその後、逆相ＨＰＬＣにより、延長フローキット、Ｗａｔｅｒｓ２４８９ＵＶ／可視検出器、およびｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）ＡＸＩＡ充填カラム（１００Ａ、２５０×２１．２ｍｍ、５ミクロン）が装備されたＷａｔｅｒｓ  １５２５バイナリＨＰＬＣポンプ上でさらに精製した。Ａ）０．０５％ギ酸を有するＨＰＬＣグレード水およびＢ）ＨＰＬＣグレードアセトニトリルを移動相として使用し、ペプチドを９０％Ａ〜９０％Ｂ勾配を使用して２５分（１６ｍＬ／分）にわたり精製した。アセトニトリルを精製画分から、ロータリー・エバポレーターを用いて除去し、精製画分をその後凍結乾燥させた。ペプチド純度をエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により、Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｎａｐｔ  ＥＳＩ−ＭＳ上で確認した。
【０３１７】
モノマーおよびポリマー合成
全ての試薬はＳｉｇｍａから購入し、それらは別記されない限り分析グレードを有した。２−プロピルアクリル酸をＦｅｒｒｉｔｏら（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  １１，５９−６２  （１９９２））により概説される手順に従い、プロピルマロン酸ジエチル（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を前駆体として使用して合成した。４−シアノ−４−（エチルスルファニルチオカルボニル）スルファニルペンタン酸（ＥＣＴ）連鎖移動剤（ＣＴＡ）をＣｏｎｖｅｒｔｉｎｅら（Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １３３，２２１−２２９  （２００９））により記載されるように合成した。ポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）ホモポリマーの可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合を、窒素雰囲気下、７０℃で４８時間、２，２’−アゾ−ビス−イソブチリルニトリル（ＡＩＢＮ）をフリーラジカル開始剤として使用して、バルクで実施した。反応混合物を３回の凍結−真空−解凍サイクルに通し、３０分間窒素でパージし、その後、重合させた。連鎖移動剤（ＣＴＡ）対ＡＩＢＮのモル比は１対１であり、モノマー対ＣＴＡ比は、１９０の重合度（ＤＰ）が１００％変換で達成されるように設定した。重合後、得られたポリマーをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ、エーテル中に５回沈殿させ、その後、一晩真空で乾燥させた。ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）ホモポリマーのＲＡＦＴ重合を、蒸留ジオキサン中で窒素雰囲気下、７０℃で１８時間、ＡＩＢＮをフリーラジカル開始剤として使用して実施した。反応混合物を３０分間窒素でパージし、その後、重合させた。ＣＴＡ対ＡＩＢＮのモル比は５対１であり、モノマー対ＣＴＡ比は、１５０の重合度が１００％変換で達成されるように設定した。重合後、得られたポリマーをジオキサンに溶解させ、エーテル中に５回沈殿させ、その後、一晩真空で乾燥させた。ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、０．１％ＬｉＢｒを含むＨＰＬＣ−グレードＤＭＦを６０℃で移動相として使用して、ＰＰＡＡおよびＰＡＡホモポリマーの分子量および多分散性（Ｍw／Ｍn、ＰＤＩ）を決定した。分子量計算は、ＡＳＴＲＡ  Ｖソフトウェア（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて実施し、これらは、屈折率検出器によるポリマーのオフライン注入により決定された、実験的に決定したｄｎ／ｄｃ値に基づいた（計算されたＰＰＡＡｄｎ／ｄｃ＝０．０８７ｍＬ／ｇ、ＤＰ＝１９３（ＧＰＣ）、ＰＤＩ＝１．４７（ＧＰＣ）；計算されたＰＡＡｄｎ／ｄｃ＝０．０９ｍＬ／ｇ、ＤＰ＝１５０（ＧＰＣ）、ＰＤＩ＝１．２７（ＧＰＣ））。ポリマー純度および分子量は核磁気共鳴分光法によりＤ6ＭＳＯを溶媒として使用して確認した（ＰＰＡＡ  ＤＰ＝１９０（Ｈ1  ＮＭＲ）；ＰＡＡ  ＤＰ＝１０６（Ｈ1  ＮＭＲ））。
【０３１８】
ＭＭＩ−０１００ナノポリプレックス（ＭＫ２ｉ−ＮＰ）および蛍光体−ＨＳＰ２０ナノプレックス（ＨＳＰ２０−ＮＰ）合成およびキャラクタリゼーション
ＰＰＡＡを１Ｍ  ＮａＯＨに溶解し、リン酸バッファー（ｐＨ８）中に希釈し、原液を得た。精製ＭＭＩ−０１００ペプチドをリン酸バッファー（ｐＨ８）に溶解した。ＭＭＩ−０１００ペプチドおよびＰＰＡＡポリマーを［ＮＨ3+］：［ＣＯＯ-］＝１０：１〜１：１０の範囲のチャージ比（ＣＲ）で混合し、ＭＫ２ｉ−ＮＰを形成させた。得られたポリプレックスを、０．４５μＭポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）フィルタを通してシリンジ濾過し、流体力学直径およびζ電位を、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ上で再利用可能なディップ細胞キット（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．，  Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，  Ｕ．Ｋ．）を用いて特徴付けた。
【０３１９】
１：３のＣＲをその後、最適ＭＫ２ｉ−ＮＰ製剤として選択し、一方、３：１のチャージ比をリードｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰ製剤として選択した。これらの製剤を、その後のインビトロ、エクスビボ、およびインビボ研究において使用した。同じＣＲで非エンドソーム溶解性ポリマーＰＡＡを用いて製剤化したナノポリプレックス（すなわち、ＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰ）を、動的光散乱（ＤＬＳ）により分析し、ビヒクル対照として全てのその後の研究で使用した。ＤＬＳ分析により示されたサイズを確認するために、ＭＫ２ｉ−ＮＰおよびＨＳＰ２０−ＮＰを、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）イメージングにより可視化した。ＴＥＭ試料を、炭素フィルムで裏打ちされた銅グリッド（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ）を水性ポリプレックス懸濁液（１ｍｇ／ｍＬ）の２０μＬ滴上にふせることにより調製し、ブロットして、乾燥させた。全ての試料をその後、３％酢酸ウラニルの２０μＬ滴上にふせ、２分間染色した。試料をブロッティングして乾燥させた後、試料を真空で２時間乾燥させ、その後、２００ｋＶで動作するＰｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ２０システム上でイメージングさせた。画像をＡＭＴ画像取込エンジンソフトウェアを備えた電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｄａｎｖｅｒｓ，  ＭＡ）を用いて収集した。１：３のＣＲでのポリペックス（ｐｏｌｙｐｅｘｅｓ）のｐＨ依存性サイズ変化をその後、ＤＬＳ分析により様々なｐＨ値で、ＰＢＳ−／−において（すなわちｐＨ７．４、６．８、６．２、および５．６）定量した。
【０３２０】
ｐＨ依存性膜破壊溶血アッセイ
ＭＫ２ｉ−ＮＰのエンドソーム破壊電位を評価するために、赤血球溶血アッセイをＨｅｎｒｙら（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ７，２４０７−２４１４  （２００６））により前に記載されるように使用して、脂質二重層のＭＫ２ｉ−ＮＰｐＨ依存性破壊を測定した。全ヒト血液を匿名ドナーから引き出し、血漿を遠心分離および生理食塩水洗浄により除去した。残りの赤血球を３回、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄し、生理的（ｐＨ７．４）、初期エンドソーム（ｐＨ６．８）、初期／後期エンドソーム（ｐＨ６．２）、および後期エンドソーム／リソソーム（ｐＨ５．８）環境に対応するリン酸バッファー中に再懸濁させた。ＭＫ２ｉ−ＮＰ、ＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰ、ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチド単独（１〜４０μｇ／ｍＬ）、ＰＢＳ（陰性対照）、または１％トリトンＸ−１００（陽性対照）を赤血球懸濁液に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。無傷の赤血球を遠心分離によりペレット化し、上清を新しい９６−ウェルプレートに移した。上清内のヘモグロビン含量をその後、５４１ｎｍでの吸光度により測定した。パーセント溶血をトリトンＸ−１００およびＰＢＳ対照に対して決定した。
【０３２１】
細胞培養
初代ヒト冠動脈血管平滑筋細胞（ＨＣＡＶＳＭＣ）をＬｏｎｚａから入手した。ＨＣＡＶＳＭＣを、完全増殖培地［５％ＦＢＳ、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、５ｎｇ／ｍＬ）、ヒトインスリン（５μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ）、Ｌ−グルタミン（１０ｍＭ）、ヒト上皮増殖因子（ＥＧＦ、５ｎｇ／ｍＬ）、および１％ペニシリン−ストレプトマイシンが補充された血管細胞基本培地（ＡＴＣＣ）］で培養した。
【０３２２】
全ての培養物を、７５ｃｍ2ポリスチレン組織培養フラスコ中、３７℃および５％ＣＯ2環境において、細胞培地を一日おきに新しくして維持した。細胞を、８０〜９０％コンフルエンスまで増殖させ、その後、回収し、継代培養した。全ての細胞を、必要に応じて個々の特定の実験に対し、２０，０００〜３０，０００細胞／ｃｍ2の密度で播種した。初期継代からの細胞（番号３〜８）のみを実験で使用した。
【０３２３】
炎症性サイトカイン分析
２００μＬの細胞懸濁液（１０，０００細胞／ウェル）を９６−ウェルプレート上に播種し、およそ７０％コンフルエンス／ウェルを得た。細胞をプレートに一晩接着させた。
【０３２４】
腫瘍壊死因子−α  ＥＬＩＳＡ
ＨＣＡＶＳＭＣを、低血清培地（ＤＭＥＭ、１％ＦＢＳ、および１％Ｐ／Ｓ、細胞静止状態を達成するため）中で、１０μＭ  ＡＮＧ−ＩＩを用いて４時間処置し、続いて、ＭＫ２ｉ−ＮＰ、ＭＫ２ｉ、またはＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰを用いて２時間処置した。処置後、各ウェルを吸引し、新鮮培地を補充した。２４時間後、１００μＬの上清を回収し、サイトカイン分析を実施するまで、−８０℃で凍結させた。ヒトＴＮＦ−α（ｃａｔ＃９００−Ｋ２５）ＥＬＩＳＡ発色キット（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；  Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，  ＮＪ）を使用して、製造者のプロトコルに従い、処置された細胞から回収された上清中のサイトカインレベルを測定した。簡単に言うと、ポリクローナル捕捉抗体をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；  Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、ｃａｔ．  ＃  １４２００−０７５）（１Ｘ、ｐＨ７．２０）で、１μｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、１００μＬの希釈捕捉抗体をマイクロタイタープレートの各ウェルに添加することにより、マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ，  ｃａｔ．  ＃  ４３９４５４）を調製した。プレートを密閉し、一晩、室温でインキュベートした。インキュベーション後、ウェルを吸引し、４回、３００μＬの洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．＃Ｐ７９４９）を含むＰＢＳ）／ウェルで洗浄した。次に、３００μＬのブロッキングバッファー（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．＃Ａ−７０３０）を含むＰＢＳ）を各ウェルに添加し、マイクロタイタープレートを１時間室温でインキュベートした。インキュベーション後、ウェルを吸引し、４回、３００μＬの洗浄バッファー／ウェルで洗浄した。次に、ＴＮＦ−α標準を０．０１μｇ／ｍＬから０μｇ／ｍＬまで、希釈剤（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で段階希釈した。希釈した標準および試料（１００μＬ／ウェル）をマイクロタイタープレートに３連で添加し、プレートを２時間室温でインキュベートした。ウェルを吸引し、プレートを４回、洗浄バッファーで洗浄した。洗浄後、１００μＬのビオチン化検出抗体（０．５μｇ／ｍＬの濃度で；希釈剤中５００ｎｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、マイクロタイタープレートを２時間室温でインキュベートした。インキュベーション後、ウェルを吸引し、４回、洗浄バッファーで洗浄した。アビジン−ＨＲＰコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．＃Ａ−７４１９）を希釈剤中１：２０００で希釈し、プレートの各ウェルに添加した（１００μＬ／ウェル）。プレートを３０分間室温でインキュベートした。インキュベーション後、ウェルを吸引し、プレートを４回、洗浄バッファーで洗浄した。次に、１００μＬのＡＢＴＳ液体基質溶液（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．＃Ａ３２１９）を各ウェルに添加し、プレートを発色のために室温でインキュベートした。プレートをプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、４０５ｎｍ（６５０ｎｍ波長補正）で読み取った。全てのデータをその後、ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、製造者のプロトコルに従い決定された細胞生���率に対して正規化した。簡単に言うと、２００μＬのＨＣＡＶＳＭＣ細胞懸濁液を（１０，０００細胞／ウェルで）、９６−ウェルプレート上に播種し、およそ７０％コンフルエンス／ウェルを得た。細胞を、一晩プレートに接着させた。次に、プレートを２２℃におよそ３０分の間平衡化させた。平衡化後、２００μＬのＹｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）試薬を各ウェルに添加し、プレートを３０秒間振盪させ、その後、１０分間２２℃でインキュベートした。インキュベーション後、１００μＬの停止液を各ウェルに添加し、プレートを１０秒間振盪させ、蛍光を５６０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長でプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて記録した。
【０３２５】
インターロイキン−６ＥＬＩＳＡ
ＨＣＡＶＳＭＣを、２０ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−αを含む低血清培地中で、４時間処置し、続いて、ＭＫ２ｉ−ＮＰ、ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）、またはＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰを用いて２時間処置した。処置後、各ウェルを吸引し、新鮮培地を補充した。２４時間後、１００μＬの上清を回収し、サイトカイン分析が実施できるまで、−８０℃で凍結させた。ヒトＩＬ−６（ｃａｔ＃９００−Ｋ１６）ＥＬＩＳＡ発色キット（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；  Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）を使用して、製造者のプロトコルに従い、処置された細胞から回収された上清中のサイトカインレベルを測定した。簡単に言うと、ポリクローナル捕捉抗体をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；  Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、ｃａｔ．  ＃  １４２００−０７５）（１Ｘ、ｐＨ７．２０）で、１μｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、１００μＬの希釈捕捉抗体をマイクロタイタープレートの各ウェルに添加することにより、マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ，  ｃａｔ．  ＃  ４３９４５４）を調製した。プレートを密閉し、一晩、室温でインキュベートした。インキュベーション後、ウェルを吸引し、４回、３００μＬの洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．＃Ｐ７９４９）を含むＰＢＳ）／ウェルで洗浄した。次に、３００μＬのブロッキングバッファー（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．＃Ａ−７０３０）を含むＰＢＳ）を各ウェルに添加し、マイクロタイタープレートを１時間室温でインキュベートした。インキュベーション後、ウェルを吸引し、４回、３００μＬの洗浄バッファー／ウェルで洗浄した。次に、ＩＬ−６標準を、０．０１μｇ／ｍＬから０μｇ／ｍＬまで、希釈剤（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で段階希釈した。希釈した標準および試料（１００μＬ／ウェル）をマイクロタイタープレートに３連で添加し、プレートを２時間室温でインキュベートした。ウェルを吸引し、プレートを４回、洗浄バッファーで洗浄した。洗浄後、１００μＬのビオチン化検出抗体（０．５μｇ／ｍＬの濃度で；希釈剤中５００ｎｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、マイクロタイタープレートを２時間室温でインキュベートした。インキュベーション後、ウェルを吸引し、４回、洗浄バッファーで洗浄した。アビジン−ＨＲＰコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．＃Ａ−７４１９）を希釈剤中１：２０００で希釈し、プレートの各ウェルに添加した（１００μＬ／ウェル）。プレートを３０分間室温でインキュベートした。インキュベーション後、ウェルを吸引し、プレートを４回、洗浄バッファーで洗浄した。次に、１００μＬのＡＢＴＳ液体基質溶液（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．＃Ａ３２１９）を各ウェルに添加し、プレートを発色のために室温でインキュベートした。プレートをプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、４０５ｎｍ（６５０ｎｍ波長補正）で読み取った。全てのデータをその後、ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、製造者のプロトコルに従い決定された細胞生存率に対して正規化した。
【０３２６】
単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）ＥＬＩＳＡ
ＨＣＡＶＳＭＣを低血清培地中で、ＭＫ２ｉ−ＮＰ、ＭＫ２ｉ、またはＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰを用いて２時間処置した。処置後、各ウェルを吸引し、新鮮培地を補充した。３または５日後、細胞をＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。刺激後、１００μＬの上清を回収し、サイトカイン分析が実施できるまで、−８０℃で凍結させた。ヒト単球走化性タンパク質−１（ｃａｔ＃ＥＨ２ＭＣＰ１）ＥＬＩＳＡ発色キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）を使用して、製造者のプロトコルに従い、処置された細胞から回収された上清中のサイトカインレベルを測定した。簡単に言うと、５０μＬの標準希釈剤を、抗ヒトＭＣＰ−１プレコート９６−ウェルストリッププレートの各ウェルに添加した。次に、５０μＬの標準または試料をストリッププレートに２連で添加し、ストリッププレートを粘着プレートシーラーで被覆し、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ストリッププレートを３回、洗浄バッファーで洗浄した。洗浄後、１００μＬのビオチン化抗体試薬をストリッププレートの各ウェルに添加し、プレートを粘着プレートシーラーで被覆し、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ストリッププレートを３回、洗浄バッファーで洗浄した。次に、１００μＬのストレプトアビジン−ＨＲＰ溶液をストリッププレートの各ウェルに添加し、ストリッププレートを粘着プレートシーラーで被覆し、室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ストリッププレートを３回、洗浄バッファーで洗浄した。洗浄後、１００μＬのＴＭＢ基質溶液をストリッププレートの各ウェルに添加し、ストリッププレートを室温で２０分間発色させた。次に、１００μＬの停止液をストリッププレートの各ウェルに添加した。吸光度をプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上、４５０ｎｍ（５５０ｎｍ波長補正）で測定し、結果をカーブフィッティング統計ソフトウェアを用いて計算した
【０３２７】
遊走アッセイ
ひっかき傷ケモキネシスアッセイ
ＨＣＡＶＳＭＣをＬａｂ−ＴＥＫ  ＩＩ８ウェルチャンバカバーガラスにおいて２０，０００細胞／ウェルの密度で２５０μｌ低血清増殖培地中に播種し、一晩接着させ、ほぼコンフルエント（９０〜９５％）単層を達成させた。細胞をＭＫ２ｉ−ＮＰ、ＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰ、ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチドまたはＰＢＳ−／−で３０分間処置した。処置後、ひっかき傷を、１０μＬピペットチップを用いて各細胞単層の中央から作った。培地をその後、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ  ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）染料（インビトロジェン）を含む低血清増殖培地と、製造者のプロトコルに従い、３０分間交換し、遊走細胞の可視化を可能にした。染料による処置後、培地を、５０ｎｇ／ｍｌ血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）を含む低血清増殖培地と（または、陰性対照のためのＰＢＳ−／−と）交換した。ひっかき傷領域をその後、０、３、６、１２、および２４時間でＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ倒立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ，  Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，  ＮＹ）を使用して、ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓイメージングソフトウェアを用いて画像化した。創傷閉鎖をｉｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、遊走細胞の外縁周りのひっかき傷面積を定量することにより計算し、元のひっかき傷面積に対して正規化した。各処置群に対するひっかき傷アッセイを、３つの独立した実験で実施した。
【０３２８】
Ｂｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒ走化性アッセイ
ＨＣＡＶＳＭＣを２４ウェルプレートにおいて３０，０００細胞／ウェルの密度で低血清培地（ＤＭＥＭ、１％ＦＢＳ、および１％Ｐ／Ｓ）中に播種し、一晩接着させた。細胞を３０分間ＭＫ２ｉ−ＮＰ、ＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰ、ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチド、またはＰＢＳで処置した。処置後、各ウェルを２回、ＰＢＳ−／−で洗浄し、トリプシン処理し、１００μｌ低血清増殖培地中に再懸濁させ、下側チャンバ中の５０ｎｇ／ｍｌＰＤＧＦ−ＢＢ（または陰性対照のためのＰＢＳ−／−）を含む６００μｌ低血清増殖培地を有する２４ウェルプレートにおける、６．５ｍｍ、８μｍポアポリカーボネートインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に播種した。細胞を８時間遊走させ、その後、各インサートの上側の細胞を綿スワブで優しく除去した。各インサートの下側の細胞をその後、固定し、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｇｉｅｍｓａ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｑｕｉｋ  Ｓｔａｉｎキット（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて染色した。インサートを溶液Ａ中で少なくとも１０秒間固定し、５回、溶液Ｂに浸漬させ、その後５回、溶液Ｃに浸漬させた。染色後、４つの画像を各インサートの４つの四分円から撮像し、細胞の数／高倍率視野を、ＩｍａｇｅＪにおいて、各画像を閾値化し、細胞を手動計数することにより定量した。各処置を３連で実施し、平均細胞数／視野を計算した。
【０３２９】
細胞増殖アッセイ
ＨＣＡＶＳＭＣを、９６ウェルプレートにおいて１０，０００細胞／ウェルで、低血清培地（ＤＭＥＭ、１％ＦＢＳ、および１％Ｐ／Ｓ）中に播種し、一晩接着させた。細胞を３０分間ＭＫ２ｉ−ＮＰ、ＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰ、ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチドまたはＰＢＳ−／−（陽性および陰性対照のため）で処置した。各処置をその後、吸引し、１００μｌ低血清増殖培地±５０ｎｇ／ｍＬＰＤＧＦ−ＢＢと交換した。２４時間のインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者のプロトコルに従い実施した。簡単に言うと、１００μｌフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）溶液を、２．０ｍｌ  ＭＴＳ溶液に添加し、混合した。２０μｌのＰＭＳ／ＭＴＳ溶液をその後、１００μｌ培地を含む９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、プレートを４時間、３７℃で、加湿、５％ＣＯ2雰囲気にてインキュベートした。インキュベーション後、各ウェルの吸光度を４９０ｎｍでＴＥＣＡＮ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  Ｐｒｏプレートリーダーを用いて記録し、全ての処置群の相対増殖速度を決定した。
【０３３０】
細胞取込および細胞内輸送の顕微鏡分析
アミン反応性Ａｌｅｘａ−４８８スクシンイミジルエステルをＤＭＳＯに溶解し、１対３モル比で、ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチドと、１００ｍＭ重炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ＝８．３）中で混合した。未反応フルオロフォアおよび有機溶媒をＰＤ−１０  ｍｉｄｉｔｒａｐ  Ｇ−１０脱塩カラムを用いて除去し、蛍光標識されたペプチドを凍結乾燥させた。ＰＰＡＡおよびＰＡＡポリマーを蛍光標識されたＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチドと［ＮＨ3+］／［ＣＯＯ-］＝１：３のＣＲで混合し、０．４５μｍＰＴＦＥフィルタを通してシリンジ濾過し、それぞれ、蛍光ＭＫ２ｉ−ＮＰおよび対照ＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰを形成させた。蛍光ＭＫ２ｉ−ＮＰおよびＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰ流体力学直径および表面電荷を、それぞれ、ＤＬＳおよびゼータ電位分析により測定した。蛍光ＭＫ２ｉ−ＮＰ、ＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰ、またはＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチド単独をＬａｂ−ＴＥＫ  ＩＩ８ウェルチャンバカバーガラス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎｕｎｃ）上で増殖させたＨＣＡＶＳＭＣに、１％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓが補充されたＤＭＥＭ培地中、１０μＭ  ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチドの濃度で適用させた。細胞を２時間処置し、２回、ＰＢＳ−／−で洗浄し、培地を交換させた。細胞をその後、追加の０、２、４、１０、または２２時間の間、新鮮培地中でインキュベートした。インキュベーションの最後の２時間の間、５０ｎＭ  Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＤＮＤ−９９（インビトロジェン）を、細胞内の酸性エンド／リソソーム小胞を可視化するために、各ウェルに添加した。インキュベーション後、細胞を、０．１％トリパンブルーで１分洗浄し、細胞外蛍光を消光させ、続いて、２回、ＰＢＳ−／−で追加の洗浄を実施した。細胞をその後、ＬＳＭ  ７１０  ＭＥＴＡ蛍光顕微鏡を使用して、ＺＥＮイメージングソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，  ＮＹ）を用いて画像化した。利得設定を獲得した全ての画像について一定に維持した。
【０３３１】
全ての画像をＩｍａｇｅＪを使用して処理し、共局在をＪｕｓｔ  Ａｎｏｔｈｅｒ  Ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｌｕｇｉｎ（ＪＡＣｏＰ）（６２）を用いて分析した。マンダーのオーバーラップ係数（両方の蛍光チャネルにおける正の画素値を有する画素の割合）をその後、各処置群について、ｎ≧３の別々の画像に対し計算し、共局在を定量した。ペプチドが見出された区画のサイズに対する処置効果を決定するために、ＩｍａｇｅＪにおけるフリーハンド選択ツールを使用して、各処置群についてｎ≧５０の個々の細胞内区画の輪郭を描き、各々の面積を定量化し、平均化した。
【０３３２】
細胞内取込および保持のフローサイトメトリー定量
ＨＣＡＶＳＭＣを、８０−９０％コンフルエンスまで増殖させ、回収し、２４ウェルプレートにおいて２０，０００細胞／ウェルで播種し、低血清培地（ＤＭＥＭ、１％ＦＢＳ、および１％Ｐ／Ｓ）中で一晩接着させた。蛍光ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチド、ＭＫ２ｉ−ＮＰ、およびＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰを顕微鏡分析のために上述されたように合成し、ＨＣＡＶＳＭＣを１０μＭ  ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）の濃度で２時間処置した。処置後、細胞を、ＰＢＳ−／−で洗浄し、ＣｅｌｌＳｃｒｕｂバッファー（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）で１０分間室温で洗浄し、細胞外ポリプレックスおよび／またはペプチドを除去し、２回、ＰＢＳ−／−で洗浄し、新鮮完全増殖培地を与えた。細胞をその後、さらに０、１２、２４、７２、または１２０時間の間インキュベートした。細胞をその後ＰＢＳ−／−で洗浄し、トリプシン処理し、０．１％トリパンブルーを含むＰＢＳ（−／−）中に再懸濁させ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で、ＢＤ  ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）Ｐｒｏソフトウェア（Ｖ５．２）を用い、分析を実施した。データをエクスポートし、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｖ７．６．４）で分析した。全ての試料を３連で実行した。
【０３３３】
ＭＫ２ｉ−ＮＰおよびＨＳＰ２０−ＮＰ研究では、アミン反応性Ａｌｅｘａ−４８８スクシンイミジルエステル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＤＭＳＯに溶解し、１対３モル比でＭＫ２ｉまたはｐ−ＨＳＰ２０ペプチドと１００ｍＭ重炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ＝８．３）中で混合し、３時間反応させた。未反応フルオロフォアおよび有機溶媒をＰＤ−１０  ｍｉｄｉｔｒａｐ  Ｇ−１０脱塩カラムを用いて除去し、蛍光標識されたＭＫ２ｉおよびｐ−ＨＳＰ２０ペプチドを凍結乾燥させた。ＰＰＡＡポリマーを蛍光標識されたＭＫ２ｉペプチドと［ＮＨ3+］／［ＣＯＯ-］＝１：３のＣＲで混合し、０．４５μｍＰＴＦＥフィルタを通してシリンジ濾過し、蛍光ＭＫ２ｉ−ＮＰを形成させた。同様に、ＰＰＡＡを蛍光標識されたｐ−ＨＳＰ２０と［ＮＨ3+］／［ＣＯＯ-］＝１：３のＣＲで混合し、０．４５μｍＰＴＦＥフィルタを通してシリンジ濾過し、蛍光ＨＳＰ２０−ＮＰを形成させた。ＨＣＡＶＳＭＣを、８０〜９０％コンフルエンスまで増殖させ、回収し、２０，０００細胞／ウェルで２４ウェルプレートにおいて播種し、一晩接着させた。ＨＣＡＶＳＭＣを蛍光ＭＫ２ｉペプチド、ＭＫ２ｉ−ＮＰ、ｐ−ＨＳＰ２０ペプチド、ｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰ、または対照としてのＰＢＳで、１０μＭペプチドの濃度で１％ペニシリン−ストレプトマイシンが補充されたＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地中において、３０分間処置した。処置後、細胞を２回、ＰＢＳ中で洗浄し、直ちに回収し、あるいは完全増殖培地中でさらに７２時間インキュベートした。細胞を０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて回収し、遠心分離し、０．１％トリパンブルーを含むＰＢＳ（−／−）中に懸濁させ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でＢＤＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）Ｐｒｏソフトウェア（Ｖ５．２）を用い、分析を実施した。データをエクスポートし、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｖ７．６．４）で分析した。全ての試料を３連で実行した。
【０３３４】
細胞内ＭＫ２ｉ半減期（ｔ1/2）を、細胞内ペプチド蛍光の指数関数的減衰非線形回帰分析により、処置除去後０および５日に、指数関数的減衰関数を使用して計算した［ここで、Ｎ＝細胞内蛍光およびλ＝減衰率］：
【数１】
2018502860.tif 000021
各指数関数的減衰関数の減衰定数からのｔ1/2の計算は下記の通りである：
【数２】
2018502860.tif 000022
【０３３５】
ヒト伏在静脈（ＨＳＶ）
ＨＳＶの匿名化され、廃棄されたセグメントを、冠動脈または末梢血管バイパス術を受ける同意した患者から収集した。外科的切除後、ＨＳＶセグメントを外科手技の終わりまで生理食塩水中で保存し、その時点で、それらを冷たい移植片回収バッファー（１００ｍＭラクトビオン酸カリウム、２５ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、５ｍＭ  ＭｇＳＯ4、３０ｍＭラフィノース、５ｍＭアデノシン、３ｍＭグルタチオン、１ｍＭアロプリノール、５０ｇ／Ｌヒドロキシエチルデンプン、ｐＨ７．４）に入れた。全てのＨＳＶセグメントを回収の２４時間以内に使用した。無菌培養フードにおいて無菌技術を使用して、ＨＳＶセグメントを、６０ｍｍペトリ皿に移した。各セグメント（０．５ｍｍ）の端をブレードで除去し、過剰の外膜および脂肪組織を最小操作で除去した。ＨＳＶセグメントを切断し、およそ１．０ｍｍの幅の連続した環とし、器官培養実験に使用した。各セグメント由来の２つの環を直ちに１０％ホルマリン中で、３７℃にて３０分間固定し、前培養内膜厚測定値を得た。
【０３３６】
実験前に、ＨＳＶ生存率を確認した。ＨＳＶ環を秤量し、それらの長さを記録した。ＨＳＶ環をその後、９５％Ｏ２および５％ＣＯ２と３７℃で平衡化させた重炭酸塩バッファー（１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭグルコース、１．５ｍＭＣａＣｌ２、および２５ｍＭ  Ｎａ２ＨＣＯ３、ｐＨ７．４）を含む筋肉浴に懸濁させた。環を伸展させ、最大張力４９が得られるまで長さを漸進的に調節した。各血管セグメントに対して受動的長さ−張力関係を決定することにより、正規化された反応性が得られた。環を１ｇの静止張力で維持し（前に決定されるように、収縮性アゴニストに対して最大応答を生成させる）、２時間バッファー中で平衡化させた。力測定値をＰｏｗｅｒｌａｂデータ取得システムおよびＬａｂＣｈａｒｔソフトウェア（ＡＤ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，  ＣＯ）とインターフェースさせたＲａｄｎｏｔｉ  Ｇｌａｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｏｎｒｏｖｉａ、ＣＡ）力トランスデューサー（１５９９０１Ａ）を用いて取得した。
【０３３７】
ＨＳＶ環を最初、１１０ｍＭ  ＫＣｌ（重炭酸塩バッファー中ＮａＣｌの等モル置換）で等尺性で収縮させ、発生した力を測定した。１１０ｍＭ  ＫＣｌは、膜脱分極を引き起こし、機能的に生存可能な平滑筋を含む血管の収縮に至らしめる。血管生存率を複数回のＫＣｌチャレンジにより確認した後、追加の環を切断し、平滑筋生理学実験において、およびＦ−アクチン染色のために使用した。
【０３３８】
ＨＳＶ平滑筋生理学研究
ＨＳＶ収縮の阻害
生存ＨＳＶ環を洗浄し、重炭酸塩溶液中で３０分間平衡化させ、その後、フェニレフリン（ＰＥ、１μＭ）で収縮させた。全ての環を洗浄し、新鮮バッファー中で平衡化させ、ベースライン収縮が達成されるまで弛緩させた。環をその後、ＭＫ２ｉペプチド、ＭＫ２ｉ−ＮＰ、ｐ−ＨＳＰ２０ペプチド、ｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰ、またはバッファー単独のいずれかと共に２時間インキュベートした。処置したＨＳＶ環をその後、同じ用量のＰＥで収縮させ、発生した力を再び記録した。測定された力を環重量および長さについて正規化し、収縮のパーセント阻害を、処置後収縮力を処置前収縮力で割ることにより計算し；１μＭＰＥで発生した処置前力を１００％収縮として設定した。データは、ｎ≧３の別々の患者由来のＨＳＶにおいて取得した。
【０３３９】
増強されたＨＳＶ血管弛緩
生存ＨＳＶ環を洗浄し、重炭酸塩溶液中で３０分間平衡化させ、その後、フェニレフリン（ＰＥ、１μＭ）で収縮させた。環を累積対数用量のニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ、０．１−１０μＭ）、一酸化窒素ドナーで弛緩させ、得られた収縮力の減少を経時的に記録した。全ての環を再び洗浄し、バッファー中で１５分間平衡化させた。環をその後、ＭＫ２ｉペプチド、ＭＫ２ｉ−ＮＰ、ｐ−ＨＳＰ２０、ｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰ、またはバッファー単独のいずれかと共に２時間インキュベートし、続いて、同じ用量のＰＥおよびＳＮＰで処置した。発生した力を再び記録し、測定された力を環重量および長さについて正規化し、パーセント弛緩を計算し；１００μＭ  ＰＥで発生した力を、０％弛緩として設定した。データは、ｎ≧３の別々の患者由来のＨＳＶにおいて取得した。
【０３４０】
アンジオテンシンＩＩ刺激ＨＳＶのアクチン染色
生存ＨＳＶ環を２４ウェルプレートにおいて、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ培地中に入れ、インキュベーター中で、３７℃および５％ＣＯ2にて数時間の間平衡化させた。ＨＳＶ環をその後、１００μＭ  ＭＫ２ｉペプチド、１００μＭ  ＭＫ２ｉ−ＮＰ、５００μＭ  ｐ−ＨＳＰ２０、または５００μＭ  ｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰまたは陰性対照としてのＰＢＳ−／−で３０分間、１％ペニシリン−ストレプトマイシンが補充されたＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地において処置し、その後、２回、ＰＢＳ−／−で洗浄した。その後、処置したＨＳＶ環を１０μＭアンジオテンシンＩＩで２時間刺激し、その後、２回、ＰＢＳ−／−で洗浄した。ＨＳＶ環をその後、直ちに４％パラホルムアルデヒド中で４時間、３７℃にて固定した。ＨＳＶ環をその後、一晩、３０％スクロースを含む１×ＰＢＳ−／−中でインキュベートした。ＨＳＶ環を２回、ＰＢＳ−／−で洗浄し、ＯＣＴに埋め込み、凍結させた。１０ミクロンの凍結切片を各ＨＳＶ環の中央部から切断し、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に置いた。スライドをその後、上記Ｆ−アクチンストレスファイバーアッセイセクションで述べられた手順に従い、染色し、画像化した。全部のＨＳＶ切片をＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアにおける画像つなぎ合わせ能によりまとめた。
【０３４１】
ＨＳＶ器官培養およびエクスビボ内膜過形成（ＩＨ）のためのアッセイ
器官培養実験の前に、ＨＳＶ生存率を確認した。ＨＳＶ環を秤量し、それらの長さを記録した。ＨＳＶ環をその後、重炭酸塩バッファー（１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．０ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１．０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭグルコース、１．５ｍＭＣａＣｌ2、および２５ｍＭ  Ｎａ2ＨＣＯ3、ｐＨ７．４）を含む筋肉浴に懸濁させ、９５％Ｏ2および５％ＣＯ2と、３７℃で平衡化させた。環を伸展させ、最大張力が得られるまで長さを漸進的に調節した。各血管セグメントに対して受動的長さ−張力関係を決定することにより、正規化された反応性が得られた。環を１ｇの静止張力で維持し（前に決定されるように、収縮性アゴニストに対して最大応答を生成させる）、２時間バッファー中で平衡化させた。力測定値をＰｏｗｅｒｌａｂデータ取得システムおよびＣｈａｒｔソフトウェア（ＡＤ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，  ＣＯ）とインターフェースさせたＲａｄｎｏｔｉ  Ｇｌａｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｏｎｒｏｖｉａ、ＣＡ）力トランスデューサー（１５９９０１Ａ）を用いて取得した。
【０３４２】
ＨＳＶ環を最初、１１０ｍＭ  ＫＣｌ（重炭酸塩バッファー中ＮａＣｌの等モル置換）で収縮させ、発生した力を測定した。１１０ｍＭ  ＫＣｌは、膜脱分極を引き起こし、機能的に生存可能な平滑筋を含む血管の収縮に至らしめる。血管生存率を複数回のＫＣｌチャレンジにより確認した後、追加の環を切断し、２４ウェルプレートに入れ、３０％ＦＢＳ、１％Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中で、１４日間、３７℃で、５％ＣＯ２を含む空気の雰囲気中で維持した。環は、処置せず、ＭＫ２ｉ−ＮＰ、ＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰ、ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチド、またはバッファー単独で２時間処置し、洗浄し、新鮮培地を与えた。処置なし培地を２日毎に１４日間交換した。
【０３４３】
ＨＳＶ生存率
処置が組織生存率に影響しないことを確認するために、細胞生存率を評価するためのＭＴＴアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ＨＳＶ環に処置後１および１４日で実施した。ＨＳＶ環を調製し、上述のように処置し、１または１４日の器官培養後、ＨＳＶ環を秤量し、その後、２５０μＬの、ＤＰＢＳに溶解された０．０１％メチルテトラゾリウムに入れた。環を３７℃インキュベーターに１時間入れた。反応を、環を蒸留水中に入れることにより停止させた。環をその後、１ｍＬのＣｅｌｌｏＳｏｌｖｅに入れ、３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、環を溶液中で混合し、ＣｅｌｌｏＳｏｌｖｅを抽出し、キュベットに入れ、そこで、５７０ｎｍでの光学密度が決定された。相対生存率計算は、環の湿重量に対して正規化された光学密度に基づいた。
【０３４４】
血管形態計測
１４日の器官培養後、静脈セグメントを０．５ｍＬの１０％ホルマリン中、３７℃で３０分間固定し、切片作製のためにパラフィンに埋め込んだ。各環の中央部から開始して、５つの横断切片を、５μｍ離して、各標本から切断した。切片をその後、Ｖｅｒｈｏｅｆｆ−ｖａｎ  Ｇｉｅｓｏｎ染色を用いて染色した。組織学的切片をＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ倒立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ，  Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，  ＮＹ）を用いて画像化し、内膜および中膜厚さの６つの放射状に平行な測定値をランダムに、各切片からＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓイメージングソフトウェアを用いて取得した（合計６〜１２の測定／環、ｎ≧３の環／別々のドナー由来の処置群）。内膜は内弾性板の管腔側上の組織またはその中に含まれる細胞の無秩序な組織化として規定され、一方、中膜層は内膜層と外弾性板の間に含まれた。内膜および中膜肥厚を各切片について、１０×拡大率で顕微鏡のコンピュータ化された画像解析ソフトウェアを用いて測定した。
【０３４５】
ＨＳＶへのＭＫ２ｉ送達の顕微鏡分析
生存を確認した後、ＨＳＶ環をＡｌｅｘａ−５６８標識ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチド、ＭＫ２ｉ−ＮＰ、またはＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰで３０分間処置し、２回、ＰＢＳ−／−で洗浄し、直ちに、最適切断温度（ＯＣＴ）化合物（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に埋め込み、ドライアイス上で凍結させた。５μｍ凍結切片を、各処置血管の中央部から切断し、顕微鏡スライド上に、血管壁中へのペプチド送達の分析のために載置した。蛍光免疫染色をその後、ＣＤ３１およびα−ＳＭＡ一次抗体およびＦＡＭ標識二次抗体を用いて実施した。顕微鏡画像を、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ倒立蛍光顕微鏡またはＬＳＭ７１０メタ蛍光顕微鏡を使用し、ＺＥＮイメージングソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，  ＮＹ）を用いて取得した。利得設定を、全ての処置群に対して獲得した全ての画像について一定に維持し、画像をＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐでつなぎ合わせ、ＨＳＶ環の全切片の巨視的画像を提供した。
【０３４６】
ウエスタンブロット分析
ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチドによる２時間の処置後、処置したＨＳＶ環の一部を液体窒素で瞬間凍結し、微粉砕し、尿素−ＤＴＴ−ＣＨＡＰＳバッファーを使用してホモジナイズさせた。ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ａ０（ｈｎＲＮＰ  Ａ０）リン酸化の分析のために、処置したＨＳＶ環を新鮮培地中での器官培養において２４時間維持し、その後ホモジナイズした。ＣＲＥＢおよびＨＳＰ２７リン酸化の分析のために、ＨＳＶ環を２時間処置後に凍結させた。ライセートを遠心分離し（６０００ｇ、２０分）、上清をｈｎＲＮＰ  Ａ０、ｃＡＭＰ応答配列結合（ＣＲＥＢ）タンパク質、および熱ショックタンパク質２７（ＨＳＰ２７）リン酸化の評価のために回収した。等量のタンパク質（２０μｇ／レーン）を、１５、１０、または４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードし；タンパク質を電気泳動的に分離させ、その後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）に転写した。ｈｎＲＮＰ  Ａ０リン酸化では、メンブレンを一晩４℃で、ホスホ−ｈｎＲＮＰ  Ａ０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および非リン酸化ｈｎＲＮＰ  Ａ０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）のための一次抗体でプロービングした。ＣＲＥＢリン酸化では、メンブレンを一晩４℃で、ホスホ−ＣＲＥＢ（ａｂｃａｍ）および非リン酸化ＣＲＥＢ（ａｂｃａｍ）のための一次抗体でプロービングした。ＨＳＰ２７リン酸化では、メンブレンを一晩４℃で、ホスホ−ＨＳＰ２７（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ）および非リン酸化ＨＳＰ２７（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）のための一次抗体でプロービングした。洗浄後、メンブレンを適切な二次抗体（Ｌｉ−Ｃｏｒ）と１時間室温でインキュベートした。二次抗体を、Ｏｄｙｓｓｅｙ直接赤外蛍光イメージングシステム（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を使用して画像化し、ＬｉＣｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙソフトウェアｖ２．１を８００および６８０ｎｍ波長で用いてデンシトメトリーにより定量した。各生物学的反復のために、全ての処置試料を、未処置対照組織に対して正規化した。
【０３４７】
ＭＫ２ｉ−ＮＰおよびＨＳＰ２０−ＮＰ研究では、ジギトニン半透過処理手順からのサイトゾルおよび小器官画分のウエスタンブロット分析を実施した。簡単に言うと、サイトゾルおよび小器官画分を、遠心分離機上で、Ｖｉｖａｃｏｎ  ５００  ＤＮＡ濃縮装置（２０００ＭＷＣＯ）を用いて濃縮した。等量のタンパク質（２０μｇ／レーン）を、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードし；タンパク質を電気泳動的に分離させ、その後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎメンブレンに移した。メンブレンをその後、一晩４℃で、細胞質タンパク質マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ１／２（ＭＥＫ１／２）およびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびエンドリソソームマーカー初期エンドソーム抗原１（ＥＥＡ１）およびリソソーム関連タンパク質１（ＬＡＭＰ１）のための一次抗体でプロービングした。全ての抗体をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。洗浄後、メンブレンを適切な二次抗体（Ｌｉ−Ｃｏｒ）と１時間室温でインキュベートした。二次抗体を、Ｏｄｙｓｓｅｙ直接赤外蛍光イメージングシステムを使用して画像化し、デンシトメトリーにより、ＬｉＣｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙソフトウェアｖ２．１を８００および６８０ｎｍの波長で用いて定量した。
【０３４８】
ウサギ両側性頸静脈グラフト間置モデル
雄ニュージーランドホワイトウサギ（３．０〜３．５ｋｇ；ｎ＝２４）をケタミン塩酸塩（１．４ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（０．２ｍｇ／ｋｇ）を用いた筋肉内注射により、麻酔した。麻酔を気管内挿管および吸入されたイソフルラン（２．０〜５．０％）により維持した。高用量ＩＶヘパリンボーラス（２５０Ｕ／ｋｇ）を、頸動脈クロスクランプの直前に投与した。操作手順を無菌技術により、光学拡大率（拡大率×２．５）下で実施した。
【０３４９】
静脈バイパスグラフトをＪｉａｎｇら（Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．  Ｐｈｙｉｓｏｌ．  ２８６，Ｈ２４０−２４５  （２１００４）により記載される吻合カフ技術を用いて構築した。簡単に言うと、２．０−ｍｍ本体ループからなるポリマーカフを４−Ｆｒイントロデューサシース（Ｔｅｒｕｍｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ，  Ｅｌｋｔｏｎ，  ＭＤ）から作った。より小さな分岐血管の結紮後、総頸動脈中への間置グラフトの作製のために、外頸静脈を回収した（３．０〜４．０ｃｍの長さ）。頸静脈端をカフに通し、裏返し、６−０絹で固定した。静脈グラフトをその後、３０分間、３０μＭ  ＭＫ２ｉ−ＮＰ、３０μＭ  ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチド、またはＰＢＳ（処置なし）のいずれかを含む２ｍＬのヘパリンプラズマライト溶液中で処置した。処置後、頸動脈管腔を２．０−ｃｍ動脈切開術で露出させ、カフ付きの、逆転させた静脈端を挿入した。３−０絹を使用して、動脈をカフの周りに固定した。最後に、１．０ｃｍの頸動脈後壁をカフ間で切り取り、静脈グラフト伸張を可能にした。
【０３５０】
ウサギを術後２８日に安楽死させ、静脈グラフトを、１０％中性緩衝ホルマリンで、約５０ｍｍＨｇ圧力下、ローラーポンプを用いてインサイチューで灌流固定させた。静脈グラフトをその後切除し、４つのセグメントに切開し、グラフトの長さに沿った形態学的な変化の評価を可能にするために、カフに重なる組織を回避した。組織切片を調製し、内膜および中膜厚を、各血管切片の各四分円から３つの測定値をとることにより定量した（１２測定／セグメント＝４８測定／グラフト）。別々の切片をウサギマクロファージ抗体ＲＡＭ−１１（Ｄａｋｏ）で染色し、免疫細胞の各グラフトの内膜中への浸潤に対する処置効果を評価した。内膜におけるマクロファージ陽性染色を、染色グラフト切片の内膜中の陽染細胞の数を手作業で計数することにより定量した。４つの異なるグラフト切片からの１６の組織画像を各処置群について分析した。
【０３５１】
細胞毒性アッセイ
２００μＬの細胞懸濁液（１０，０００細胞／ウェルで）を９６−ウェルプレート上に播種し、およそ７０％コンフルエンス／ウェルを得た。細胞をプレートに一晩接着させた。細胞をその後、１０、５０、１００、および５００μＭ用量のＭＫ２ｉ−ＮＰ、ｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰ、ＭＫ２ｉペプチド、ｐ−ＨＳＰ２０ペプチド、または対照処置としてのＰＢＳで２時間、１％ペニシリン−ストレプトマイシンが補充されたＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地中で処置した。処置をその後除去し、細胞を、新鮮完全増殖培地で２４時間培養した。細胞をその後、２回ＰＢＳ＋／＋で洗浄し、細胞生存率をその後、ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により製造者のプロトコルに従い決定した。簡単に言うと、１００μＬのＡｍｂｉｏｎ  ＫＤａｌｅｒｔ溶解バッファーを各ウェルに添加し、その後、１００μＬの新たに調製したＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ試薬を各ウェルに添加した。１０分のインキュベーション後、５０μＬの停止液を添加し、各ウェルの蛍光（λex＝５６０ｎｍ、λem＝５９０ｎｍ）を、ＴＥＣＡＮ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  Ｐｒｏプレートリーダーにより測定した。
【０３５２】
Ｆ−アクチンストレスファイバーアッセイ
ＨＣＡＶＳＭＣをＬａｂ−ＴＥＫ  ＩＩ８ウェルチャンバカバーガラス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎｕｎｃ）において１５，０００細胞／ウェルで播種し、一晩接着させた。細胞をその後、低血清培地（Ｏｐｔｉｍｅｍ、１％ＦＢＳ、および１％Ｐ／Ｓ）中、ＭＫ２ｉ−ＮＰ、ｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰ、ＭＫ２ｉペプチド、ｐ−ＨＳＰ２０ペプチドで、または１０、２５、および５０μＭ（対照としてのＰＢＳ−／−）の濃度で１時間、処置した。処置後、細胞を２回、ＰＢＳ−／−で洗浄し、その後１μＭアンジオテンシンＩＩ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）またはＰＢＳ−／−（陰性対照）で２時間処置した。ＡＮＧ−ＩＩ刺激後、細胞を２回、ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中で５分間固定し、０．４％トリトン−Ｘ１００で１０分間透過処理し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−／−で１５分間ブロックした。細胞をその後、Ｈｏｅｃｈｓｔ溶液（ＰＢＳ−／−中１／５０００希釈）で１０分間染色し、続いて、Ａｌｅｘａ−４８８−Ｐｈａｌｌｏｄｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３０分間、製造者の指示に従い染色した。染色したカバースリップをその後、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ封入剤（インビトロジェン）を用いて、ガラスカバースライド上に伏せた。スライドを２４時間乾燥させ、その後、シーリングし、イメージングした。処置細胞を、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ倒立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ，  Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，  ＮＹ）を使用して、ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓイメージングソフトウェアを用いて画像化した。利得設定および露光時間を撮影した全ての画像について一定に維持した。ストレスファイバーの数／細胞を前に記載されるように48定量した。簡単に言うと、ＮＩＳ  ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアにおいて、３つの別々の強度プロファイルを細胞の極性に垂直な染色細胞の軸を横切って作成させた。画像解析の前に、７０画素の半径を有するローリングボールバックグラウンド除去フィルタを用いて、各画像からの暗雑音を除去した。２０００ＲＦＵの蛍光レベルを、陽性Ｆ−アクチンファイバ染色に対する閾値として設定した。というのも、染色細胞の外側のバックグラウンド蛍光は、この値を決して超えなかったからである。ストレスファイバー／細胞をその後、各処置群に対して２つの別々の実験からのｎ≧６の細胞からの３つの強度プロファイルの平均から定量した（各処置群に対して合計ｎ≧３６のＲＯＩ）。細胞Ｆ−アクチン含量の相対定量を、さらにｉｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量し、個々の細胞を自由選択し、各処置群に対する２つの別々の実験からのｎ≧１２の細胞の相対蛍光強度を計算した。
【０３５３】
半透過処理によるサイトゾル対小器官結合ペプチドの定量
ＭＫ２ｉおよびＨＳＰ２０ペプチドのサイトゾルバイオアベイラビリティを定量するために、サイトゾルおよび小器官結合（すなわち、エンドソーム、リソソーム、ゴルジ、など）ペプチドを分離するための方法をＬｉｕら４０により開発された方法から適合させた。手順を様々な濃度のジギトニン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含むバッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ  ＤＴＴおよび２ｍＭ  ＭｇＣＬ２）で、氷上にて１０分間、１００ＲＰＭで動作する回転式振盪機（補足図３）上で処置したＨＣＡＶＳＭＣからのＬＤＨ放出に基づいて、この実験のために最適化した。２５μｇ／ｍＬの濃度をその後、ＨＣＡＶＳＭＣ膜の選択半透過処理のための最適ジギトニン濃度として選択し、その後、細胞内ペプチド分布の分析のために使用した。
【０３５４】
ＭＫ２ｉおよびｐ−ＨＳＰ２０ペプチドの細胞内分布を定量するために、ＨＣＡＶＳＭＣを９６ウェルプレート中に、２０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、完全増殖培地中で一晩接着させた。細胞の一部を５００ｎＭバフィロマイシンＡ１（Ｓｉｇｍａ）で３０分間前処置し、バフィロマイシンをその後のペプチド／ＮＰ処置および処置後インキュベーション相に含め、エンドソーム酸性化を阻害した。細胞をその後、Ａｌｅｘａ−４８８標識ＭＫ２ｉペプチド、ＭＫ２ｉ−ＮＰ、ｐ−ＨＳＰ２０ペプチド、ｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰで、１０μＭペプチド（または対照としてのＰＢＳ−／−）の濃度で、１％ペニシリン−ストレプトマイシンが補充されたＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地において、５００ｎＭバフィロマイシンＡ１ありまたはなしで３０分間処置した。処置を除去し、細胞を新鮮培地中で、５００ｎＭバフィロマイシンＡ１ありまたはなしで６時間インキュベートした。各ウェルをその後、１回氷冷ＰＢＳ＋／＋で洗浄し、それからその後、２０μＬの２５μｇ／ｍＬジギトニン溶液と共に０℃で（氷上で）、１００ＲＰＭで動作する回転式振盪機上にて１０分間インキュベートした。各ウェルからの上清をその後新しい９６ウェルプレートに移し、各ウェルを８０μＬの氷冷ＰＢＳ＋／＋で洗浄し、これをその後、ジギトニン（サイトゾル）画分を含む９６ウェルプレートに移した。１００μＬの１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳ−／−をその後、各ウェルに添加し、全ての非サイトゾル（すなわち小器官結合）細胞成分を含む９６ウェルプレートを得、各ウェルの蛍光（λｅｘ＝４９５ｎｍ、λｅｍ＝５１９ｎｍ）をＴＥＣＡＮ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  Ｐｒｏプレートリーダーで決定した。読み値を、ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により製造者のプロトコル（セクション４．５）に従い決定した、細胞数およびサイトゾル含量に対して正規化した。
【０３５５】
統計
統計解析を一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ事後検定を用いて実施し、実験群を比較した。解析をＯｒｉｇｉｎＰｒｏ８ソフトウェア（Ｏｒｉｇｉｎｌａｂ，  Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，  ＭＡ）またはＭｉｎｉｔａｂ１６ソフトウェア（Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，  ＰＡ）を用いて実施した。統計学的有意性は９５％信頼限界内で認められた。結果を算術平均±ＳＥＭとしてグラフにより提示し、ｐ値は図面内、または図説明文中に含まれる。
【０３５６】
実施例１．ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の乾燥粉末製剤
１および２ｍｇのニート噴霧乾燥ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）５％固体製剤を充填したブリスターの重量測定クリアランス試験を使用してエアロゾル性能を最適化し、決定した。ブリスターを、グローブボックスの内側で、４−５％相対湿度において充填した。ブリスターのシーリングは、グローブボックスの内側で、ベンチトップヒートシーラーを用いて実施した。ＥＰＩＣスタイル吸入器を関数発生器と結合させ、全てのエアロゾル試験を実施した。表３は最終（最適）ブリスター、装置および試験条件についての情報を含む。
【０３５７】
噴霧乾燥製剤による水の取込を調べた。動的水蒸気吸着（ＤＶＳ）等温線は、％相対湿度（ＲＨ）が時間に伴て増加した時に噴霧乾燥製剤における水の迅速な取込を確認した（図３）。製剤中３％未満の水を維持するために、ＤＶＳにより、材料は、２０％ＲＨ未満で取り扱われなければならないことが示された（図３）。加えて、制御された電荷放散ユニットをグローブボックスの内側に設置し、正電荷を持つ充填ステーション（すなわち、グローブボックスのポリカーボネート構成による）を中和した。正電荷を中和するために充填近く辺りで、パルスＤＣ制御装置により、負イオンを放出させた。
【０３５８】
迅速ＨＰＬＣ法を、例えば、製剤不純物および製剤に含まれるＭＭＩ−０１００の濃度を決定するために開発した。簡単に言うと、Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ペプチドＥＳ−Ｃ１８カラムを使用した。流速、カラム温度、および移動相を３分のランタイムを与えるように調整した。迅速ＨＰＬＣ法の線形性の評価により、１０．８μｇ／ｍＬ標準試薬に対する平均応答係数の％応答係数に基づいて６．５〜３２ｍｇ／ｍＬの間で許容される線形性が示された（平均応答係数の９７．０〜１０１．４％）。線形性の減少が、２．２μｇ／ｍＬで観察されたが、しかしながら、この減少は、定量下限（ＬＯＱ）については、低堆積次世代インパクタ（ＮＧＩ）ステージ（例えば、マイクロオリフィスコレクタ（ＭＯＣ））を定量するのに、許容されるレベルであった。標準試薬のクロマトグラム例を図４に示す。最終ＨＰＬＣ法パラメータの概要を以下に列挙する：
カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ペプチドＥＳ−Ｃ１８、５０×４．６ｍｍ、２．７Ｊｉｍ
流速：１．５ｍＬ／分
注入体積：４０μＬ
カラム温度：４０℃
試料温度：５℃
検出器波長：２１５ｎｍ
移動相Ａ：０．１％ＴＦＡを含む水（７２％）
移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡを含む１：１メタノール：アセトニトリル（２８％）。
【０３５９】
次世代インパクタ（ＮＧＩ）法を開発した。ＮＧＩカップを、５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むメタノールでコートした。製剤ニート噴霧乾燥ＭＭＩ−０１００  ５％ｗ／ｗ固体で充填したブリスターを、１５Ｌ／分でＥＰＩＣ装置を使用して表３で概説されるように投与した。プレセパレーターの使用は、非ラクトース系製剤には典型的には必要とされないが、可能性のある大きな強凝集体を収集するために含められた。全てのＮＧＩ成分は最初に、試料溶媒としての、１０ｍＬの０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含む水で抽出された。抽出体積の調整は、充填重量およびインパクタ中に投与されるＭＭＩ−０１００の量に基づき、プロジェクトを通して変動した。回収物を評価し、８５％を超える回収を維持するために、方法変更を開発した。
【０３６０】
エアロゾル性能を評価し、図５に示される装置と類似するＥＰＩＣ吸入器を用いて最適化した。関数発生器設定を使用し、駆動スキーム開発において、より大きな柔軟性が得られた。１および２ｍｇの５％固体ならびに２ｍｇの１％固体製剤で充填したブリスターを、ブリスターおよび装置からの粉末クリアランスを評価する重量測定クリアランスについて評価した。２．０秒持続期間の単一パルスからなる駆動スキームを標準ＥＰＩＣ流路を有するＥＰＩＣ吸入器と共に使用した。ベースラインクリアランス結果は許容されたので（＞８０％質量がブリスターから除去された）、ＮＧＩ試験は、空気力学的粒子サイズ分布（ＰＳＤ）を評価するために実施した。表４はエアロゾル結果概要を含む。図６は粒子サイズ分布プロットを示す。
【表４】
2018502860.tif 000023
【０３６１】
初期エアロゾル性能試験の結果は、５％および１％固体製剤は吸入器から良好な効率で分配させることができ、２μｍの標的により近いＭＭＡＤ値を低減するための最適化のための良好な起点を提供したことを示した。１．０ｍｇ充填重量での結果は、３．２μｍで、標的ＭＭＡＤに最も近かった。２ｍｇ用量レベルでは、１％固体製剤はより高い微粒子用量（ＦＰＤ）＜３．０μｍにより示されるより微細な分布およびＮＧＩのステージ５を中心とする粒子サイズ分布を提供した（図６）。追加の最適化により、１％固体製剤は、プロジェクトの開始で規定されたエアロゾル性能標的を満たす可能性が高く、よって、前進するリード製剤として選択された。
【０３６２】
充填重量を２ｍｇを超えて増加させようとして、吸入器の既存の流路を改善し、ブリスターの穿孔された穴を越える気流速度を増加させた。理論に縛られないが、気流速度の増加は、ブリスターからの粒子のクリアランス速度を増加させると考えられる。１０ｍｇまでの１％固体製剤で充填したブリスターの重量測定クリアランスは、２５Ｌ／分の流速では許容される（＞９０％）ことが見出された。３つのＮＧＩ試験は、５および８ｍｇの充填重量で実施し、単一のＮＧＩを、１０ｍｇを投与する実現可能性を評価するために実施した。これらの結果を、表５および図７にまとめて示す。エラーバーは５および８ｍｇ充填重量について含める。５ｍｇエアロゾル性能試験は高度に再現性があった。
【表５】
2018502860.tif 000024
【０３６３】
装置最適化により、増加した微粒子用量（ＦＰＤ）、減少したＭＭＡＤ、ならびに減少したスロートおよびプレセパレータ保持により示される効率的な製剤分散物が得られた。２．１〜２．２μｍの得られたＭＭＡＤはプロジェクト標的を満たし、１０ｍｇの製剤の成功した送達により４．７ｍｇの微粒子用量＜３．０μｍが得られる。５〜１０ｍｇからの結果により、用量線形性も示され、これは、要求される臨床用量を達成するためのブリスターの充填重量および数の両方の調整を可能にする（線形性プロットのための図８を参照されたい）。
【０３６４】
同一の装置条件を使用して、７．５および２０％トレハロース（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．  Ｄａｌｌａｓ  ＴＸ）と共噴霧乾燥させた製剤を、５ｍｇの充填重量で各々について単一ＮＧＩを実施することにより、エアロゾル性能についてスクリーニングした。結果を表６および図９において、５ｍｇで、まとめて示し、ニート製剤と比較した。
【表６】
2018502860.tif 000025
【０３６５】
７．５および２０％のトレハロース変種はニート製剤と比べて同じ充填重量で、非常に類似したエアロゾル分布を示した。これにより、ＭＭＩ−０１００はトレハロースとうまく共噴霧乾燥させ、吸入器から効率的に分散させることができ、ニート製剤に比べ性能の変化はほとんど、あるいは全くないことが証明された。
【０３６６】
２つの安定性研究を、ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）製剤のエアロゾル性能および不純物に対する様々な条件の効果を評価するために実施した。ブリスターを、５ｍｇの、４つの製剤（ニートスプレーＭＭＩ−０１００  ５％ｗ／ｗ固体；ニートスプレーＭＭＩ−０１００  １％ｗ／ｗ固体；噴霧乾燥８０／２０ＭＭＩ−０１００／トレハロース１％ｗ／ｗ固体；噴霧乾燥９２／５／７．５ＭＭＩ−０１００／トレハロース１％ｗ／ｗ固体）の各々で充填した。ブリスターを１×５ブリスターホルダーに入れ、アルミニウムパウチに密閉した。パウチブリスターを、表７に従い、保存し、取り出し、エアロゾル性能について試験した（ｎ＝３のＮＧＩ試験／取り出し条件）。
【表７】
2018502860.tif 000026
【０３６７】
ブリスターにおける化学安定性を、５％固体ニートＭＭＩ−０１００製剤を用いて試験した。ブリスターを１０ｍｇで充填し、１×５ブリスターホルダーに入れ、アルミニウムパウチに密閉した。パウチに入れたブリスターを４０℃／７５％相対湿度で保存し、２および４週間で取り出し、アッセイおよび不純物のために試験した。
【０３６８】
バルク安定性を、およそ５０ｍｇの１％および５％固体ＭＭＩ−０１００製剤を使用して試験した。製剤を、琥珀ガラスバイアルに移し、キャップをパラフィルムで包み、バイアル全体をアルミニウムオーバーラップパウチ中に入れ、密閉した。トレハロース変種では、オリジナルのガラス瓶を、同様に処置した。各バイアルを４０℃／７５％相対湿度の安定性チャンバに入れ、４週間後に、アッセイおよび不純物試験のために取り出した。
【０３６９】
単回投与ブリスター中で、オーバーラップパウチを用いて５ｍｇ充填重量で保存した４つ全ての製剤についてのエアロゾル性能（ｎ＝３  ＮＧＩ）に関する安定性結果を表８、表９、および表１０で提示する。
【表８】
2018502860.tif 000027
【表９】
2018502860.tif 000028
【表１０】
2018502860.tif 000029
【０３７０】
結果から、５％固体製剤（１０．７％変化）以外の全ての製剤変種について、初期時間点からのエアロゾル性能の１０％未満の変化が示される。１％固体を含む３つのＭＭＩ−０１００製剤は、４週間までの間、４０℃／７５％ＲＨで安定であり、オーバーラップパウチ中においた場合、周囲条件で３−４ヶ月の効果的な有効期間が与えられる。トレハロースを製剤に７．５％または２０％の変種いずれかで添加しても、エアロゾル性能の観点から、性能には本質的に差はなかった。４０℃／７５％ＲＨでの４週間の保存後の、１％固体／０％トレハロース製剤からの代表的な粒子サイズ分布プロットを図１０に示す。各安定性条件で０、２、および４週間での製剤の各々についての粒子サイズ分布ならびにエアロゾル結果の完全な一覧が図１１〜２２において見出され得る。５％固体製剤についての不純物およびＭＭＩ−０１００含量もまた、単回投与ブリスター中、箔オーバーラップパウチ内で保存した後、４０℃／７５％ＲＨで２および４週間後に、評価した。５％製剤を、材料の使用可能な残りの供給に基づき、この研究のために使用した。結果を、表１１にまとめて示す。
【表１１】
2018502860.tif 000030
【０３７１】
４０℃／７５％ＲＨで、４週間後アッセイ含量においてわずかな減少があり（１００．６から９９．４％）、不純物プロファイルにおいて１つの余分な未同定ピークが検出された。不純物プロファイルおよび％含量は全ての他の時間点および条件で安定であった。このデータはまた、５％固体製剤について、周囲条件での３〜４ヶ月の効果的な有効期間を支持する。
【０３７２】
ガラス瓶中バルクで保存した製剤の、４０℃／７５％ＲＨで４週間保存後の、アッセイおよび不純物プロファイルを、表１２にまとめて示す。（時間点後に、ブリスターを充填し、投与することにより）、バルクで保存した試料のエアロゾル性能を決定するのに十分使用可能な製剤はなかった。また、製剤の制限されたストックのために、トレハロース含有製剤は、初期時間点では評価しなかった。ニート製剤についての初期結果を、アッセイ／不純物法の方法の移行中に決定した。試料は、同じように取扱／調製した。
【表１２】
2018502860.tif 000031
【０３７３】
ガラス瓶中で保存した１％固体製剤についての安定性結果は、初期結果からほとんど変化を示さなかった。５％固体製剤は、０．９から１．４％まで、不純物含量にいくらかの増加を示したが、アッセイ含量が１００．６から９８．７％まで対応した減少を示し、観察されたピークの数が増加した（６から７）。トレハロース含有製剤は、初期には試験しなかったが、４週間後の結果は、総不純物およびピークの数の観点から、１％ニート製剤に対して得られた結果の範囲にある。理論に縛られないが、バルクでガラス内に保存した場合の、１％ニート製剤の改善された安定性に基づくと、１％製剤はまた、化学安定性の観点から（ブリスター中の５％ニート製剤についてのデータに基づく）、ブリスターで安定であることが可能である。
【０３７４】
実施例２．ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のネブライザー製剤
この研究では、２つの濃度のＭＭＩ−０１００吸入製剤のエアロゾル化を、３μｍおよび４μｍの細孔サイズ（それぞれ、タイプ１およびタイプ２）を有する振動メッシュを含む電子ネブライザーを用いて特徴付けた。レーザ回折（Ｌａｓｅｒ  ｄｅｆｒａｃｔｉｏｎ）測定を使用して滴サイズ分布を決定した。呼吸シミュレーション実験を実施し、送達用量および噴霧時間を決定した。加えて、物理化学的パラメータ（例えば、粘度、表面張力、浸透圧および密度）を決定した。研究設計を表１３で概説する。
【表１３】
2018502860.tif 000032
【０３７５】
幾何学的滴サイズ分布の評価をレーザ回折（Ｍａｌｖｅｒｎ  ＭａｓｔｅｒＳｉｚｅｒＸ）により実施した。図２７はレーザ回折試験設定の概略図を示す。充填体積を各試験溶液について２ｍＬとした。製剤の試験前に、ネブライザーを０．９％ＮａＣｌ（生理食塩水）溶液で試験した。レーザ回折測定の結果を、表１４に示す。
【表１４】
2018502860.tif 000033
【０３７６】
フィルタ回収を、０．９％生理食塩水を用い、吸入フィルタからの試料抽出について決定した。簡単に言うと、およそ１，０００ｍｇの製剤Ａ（７．０ｍｇ／ｍＬ）を、一定の気流をポンプによりフィルタに適用しながら、吸入フィルタ（ｎ＝３）上に噴霧した。製剤Ａの適用後、フィルタパッドを３０ｍＬの０．９％生理食塩水を含む５０ｍＬ円錐管に入れ、２５０ｒｐｍで４時間までの間振盪させた。試料（およそ８００μＬ）を０．５、１、２、３および４時間後に収集した。フィルタ回収実験の結果を、表１５に示し、図２８でグラフ表示する。
【表１５】
2018502860.tif 000034
【０３７７】
最大、おおよそ９６％回収が０．５時間の抽出時間後に達成された。より長い抽出時間（１、２、３および４時間）で回収は改善されなかった。
【０３７８】
呼吸シミュレーションを、成人呼吸パターン（一回呼吸量：５００ｍＬ、１分あたりの呼吸：１５；吸入／呼気比：５０：５０）を使用して実施した。表１６は、５〜２００μｇ／ｋｇの所望の呼吸用量（７０ｋｇの平均体重を仮定）を満たすために選択した充填体積を含む。
【表１６】
2018502860.tif 000035
【０３７９】
充填体積を副鼻腔ポンプ（ｓｉｎｕｓ  ｐｕｍｐ）に接続されたネブライザーの薬物カップ中にロードした。吸気フィルタをネブライザー（マウスピースを含む）とポンプの間に取り付け、ゴムコネクタで固定した。製剤を充填したネブライザーを、自動遮断が装置を停止させるまで駆動した。ＭＭＩ−０１００含有エアロゾルを吸入ポリプロピレン吸入フィルタ上で回収した。噴霧後、吸入フィルタをフィルタケーシングから、鉗子を用いて除去し、プラスチックねじキャップを有するガラスバイアル中に入れた。フィルタケーシングを０．９％生理食塩水ですすぎ、生理食塩水を５０ｍＬ円錐管中に回収した。対応するフィルタを、０．９％生理食塩水を含む円錐管に移し、２５０ｒｐｍで０．５時間振盪させた。０．５時間後、ＨＰＬＣ分析を使用して、フィルタから抽出されたＭＭＩ−０１００を決定した。ネブライザーを数回０．９％生理食塩水ですすぎ、生理食塩水をガラスビーカー中に回収した。
【０３８０】
生理食塩水試料のペプチド含量をグラジエントＨＰＬＣにより線形標準較正を用いて決定した。ＨＰＬＣ機器および設定は下記の通りとした：
カラムオーブン、ＵＶ検出器およびクロマトグラフィーデータシステムを有するＨＰＬＣ；
Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ、３．５μｍ、１５０×３．０ｍｍ（Ｌ×ＩＤ）カラム（または等価物）；
カラム温度：２５℃；
試料温度：４℃；
流速：０．５ｍＬ／分；
移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水；
移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル／メタノール（５０：５０）；
注入体積：２０μＬ；
ランタイム：１５分；および
検出器波長：２１５ｎｍ。
【０３８１】
使用したＨＰＬＣ勾配を、表１７に示す。
【表１７】
2018502860.tif 000036
【０３８２】
回収による正確さおよび方法精度実験を、実施した。ＭＭＩ−０１００を秤量し、０．９％生理食塩水に溶解し、記載されるＨＰＬＣ法により決定した。回収による正確さ実験からの試料２および４をそれぞれ、６つの（６）バイアルに分け、方法精度実験で使用した。これらの実験の結果を、表１８および１９に示す。このＨＰＬＣ法は１２〜６００μｇ／ｍＬの範囲のＭＭＩ−０１００ペプチド含量を決定することができた。
【表１８】
2018502860.tif 000037
【表１９】
2018502860.tif 000038
【０３８３】
呼吸シミュレーション実験の結果を、表２０および２１ならびに図２９〜３３にまとめて示す。
【表２０】
2018502860.tif 000039
【表２１】
2018502860.tif 000040
【０３８４】
送達用量（ＤＤ［ｍｇ］または［％］）は、特定の呼吸パターンを仮定して、患者に送達されるＭＭＩ−０１００の量を表す。呼吸用量＜ｘｐｍ（ＲＤ＜ｘμｍ［ｍｇ］または［％］）は、小滴＜ｘｐｍの部分に含まれるＭＭＩ−０１００の量を与える。滴サイズはエアロゾルクラウド中の粒子が堆積する可能性がある場所を規定する。理論に縛られないが、処置的に有効となるには、粒子は、肺中で堆積するためには１〜５μｍの範囲になければならないと考えられる。対照的に、＞５μｍを有する粒子は一般に中咽頭で衝突し、嚥下され、一方、＜１μｍ未満の粒子は気流中に取り込まれたままで、吐き出される。呼吸用量はＤＤ［ｍｇ］に、レーザ回折測定により決定される呼吸画分のパーセンテージ（ＲＦ［％］］）をかけることにより計算される。
【０３８５】
図２９および３０は、充填薬物量と送達される薬物の量（ＤＤ［ｍｇ］）ならびに呼吸用量＜５μｍ（ＲＤ＜５μｍ）として与えられる肺中に呼吸される量の間に線形相関があることを示す。直線が両方のネブライザー装置（ネブライザータイプ１およびネブライザータイプ２）について与えられる。結果に基づき、噴霧性能は製剤濃度に依存しないと考えられる。
【０３８６】
物理化学的キャラクタリゼーションを、両方のＭＭＩ−０１００製剤について、浸透圧、粘度、表面張力および密度に関して実施した。各実験の結果を、表２２に示す。
【表２２】
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【０３８７】
これらの実験の結果により、製剤Ａについての質量中央径（ＭＭＤ）（ネブライザータイプ１＝３．０μｍ；ネブライザータイプ２＝４．０μｍ）は、製剤Ｂ（ネブライザータイプ１＝３．３μｍ；ネブライザータイプ２＝４．４μｍ）よりもわずかに小さかったことが示される。これらの値は純粋０．９％生理食塩水について測定したデータに匹敵した。同様に、幾何標準偏差（ＧＳＤ）、呼吸画分（ＲＦ）および総出力速度（ＴＯＲ）値もまた、製剤Ａでは、製剤Ｂと比べてわずかに小さかった。線形相関が、送達用量（呼吸用量＜５μｍ）と充填ＭＭＩ−０１００量の間に存在することが見出された。理論に縛られないが、この相関は、ネブライザー装置により患者に投与されるＭＭＩ−０１００の量を計算するために使用することができる。
【０３８８】
実施例３．ＭＭＩ−０１００（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のナノポリプレックス（ＮＰ）製剤
ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰの合成および物理化学的キャラクタリゼーション
アニオン性、エンドソーム溶解性ポリマーのポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）を有する、正電荷を持つ、ＣＰＰに基づくＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチドの製剤を、ペプチドエンドリソソーム脱出（ｅｎｄｏｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｅｓｃａｐｅ）および処置有効性を増強させるための方法として概念化した。このアプローチは、核酸の非ウイルス性送達に対する慣習により引き出され、これはアニオン性核酸と正電荷を持つＣＰＰ配列、脂質、または取込およびエンドソーム脱出を増強させるポリマートランスフェクション剤の間でのポリプレックスの静電形成に基づく（Ｋ．  Ａ．  Ｍｉｓｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３，  １２３４９−１２３５４  （１９９６）；  Ｊ．  Ｐ．  Ｒｉｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０，  １５３００−１５３０６  （２００５）；  Ｃ．  Ｅ．  Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ７，  ８８７０−８８８０  （２０１３））。
【０３８９】
ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチド（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を固相合成により合成し、純度をエレクトロスプレーイオン化質量分析により確認した（図４０）。可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合を使用して、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）［ＤＰ＝１５０（ＧＰＣ）、ＤＰ＝１０６（Ｈ1  ＮＭＲ）、ＰＤＩ＝１．２７（ＧＰＣ）図４１Ａおよび４２Ａ］およびポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）［ＤＰ＝１９３（ＧＰＣ）、ＤＰ＝１９０（Ｈ1  ＮＭＲ）、ＰＤＩ＝１．４７（ＧＰＣ）図４１Ｂおよび４２Ｂ］を合成した。ＮＰをＰＡＡまたはＰＰＡＡホモポリマーをＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチドとＰＢＳ中ｐＨ８．０（ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチド上に存在する一級アミンと、ＰＰＡＡポリマー中のカルボン酸部分のｐＫａ値の間である）で単純混合することにより形成させ；これにより、両方の分子上の最適溶解度および正味荷電が確保される（図３５Ａ）。その明確に定義されたｐＨ依存性膜破壊活性（Ｒ．  Ａ．  Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３７２，  ６５−７５  （２００３）；  Ｃ．Ａ．  Ｌａｃｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３，  ９９６−１００１  （２００２）；    Ｎ  ．  Ｍｕｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ６１，  １３７−１４３  （１９９９）；  Ｓ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２１，  ２２０１５−２２１２  （２０１０））および動物モデルにおける以前の安全な使用（Ｓ．  Ｆｏｓｔｅｒ    ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２１，  ２２０５−２２１２  （２０１０）；  Ｅ．  Ｃｒｏｗｎｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １５５，  １６７−１７４  （２０１１）のために、ＰＰＡＡを使用した（図３５Ｂ）。ＰＡＡをベクター対照として使用した。というのも、これは、ＰＰＡＡと構造類似性を有するアニオン性ポリマーであるが、そのより低いｐＫａのために（ｐＫａ約４．３）生理的に適切な範囲においてｐＨ−応答を欠くからである（図３５Ｃ）。
【０３９０】
最適ナノ粒子製剤条件を決定するために、ＭＫ２ｉ−ＮＰのライブラリをある範囲のチャージ比［すなわち、ＣＲ＝（［ＮＨ3+］MK2i：［ＣＯＯ-］PPAA）］で調製し、サイズ分布および粒子表面電荷を、それぞれ、動的光散乱（ＤＬＳ）およびζ電位分析により特徴付けた。表２３は、ＤＬＳ分析により決定される異なるチャージ比で調製したＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰのサイズ概要を含む。予想通りに、ＭＫ２ｉ−ＮＰζ電位はＣＲに正比例し、見かけの等電点はＣＲ約２：１にあった（図３５Ｄ）。ＣＲはまた著しく、ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰサイズに影響し、狭い範囲のＣＲしか単峰形サイズ分布が得られなかった（すなわち、ＣＲ＝１：２および１：３、補足表１）。１：３のＣＲを最適製剤として選択した。というのも、この比では一貫して最小粒子サイズおよび多分散性を有する単峰形サイズ分布が得られたからである（ｄh＝１１９±２８ｎｍ、ζ＝−１１．９±３．２ｍＶ）。非エンドソーム溶解性ＭＫ２ｉナノポリプレックス（ＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰ）を、生物学的研究のためのビヒクル対照としてのＰＡＡと共に製剤化した。ＣＲ＝１：３で、ＰＡＡを用いて調製したＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰは、エンドソーム溶解性ＭＫ２ｉ−ＮＰ（ｄh＝１１４±３８ｎｍ、ζ＝−１６．４±５．１ｍＶ）と統計学的に等価なサイズおよびζ電位を有した。蛍光ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰおよびＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰを、細胞内トラッキングを可能にするために、Ａｌｅｘａ−４８８コンジュゲートＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチドを用いて１：３のＣＲで調製し、非標識ＮＰと類似するサイズおよび電荷を得た。ＣＲ＝１：３で調製したＮＰはまた、ＴＥＭイメージング（図４３）により特徴付け、これは、ＤＬＳ結果と一致した。ＰＰＡＡ−ＭＫ２ｉ製剤により、正味の負電荷を持つＮＰが得られた。
【表２３】
2018502860.tif 000042
＊マルチモーダルサイズ分布（複数ピーク）を示す。
１：３（Ａｌｅｘａ）ポリプレックスを、Ａｌｅｘａ４８８−コンジュゲートＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチドを用いて製剤化し、細胞取込研究において使用した。１：３（ＮＥ）ポリプレックスを、エンドソームｐＨ範囲においてｐＨ依存性膜破壊活性を示さない非エンドソーム溶解性（ＮＥ）ポリ（アクリル酸）ポリマーを、ビヒクル対照として用いて製剤化した。
【０３９１】
エンドリソソーム条件下でのＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰアンパッケージング（ｕｎｐａｃｋａｇｉｎｇ）を、ＤＬＳを用いてある範囲のｐＨで評価し、ＭＫ２ｉ−ＮＰは、ｐＨがＰＰＡＡ上で、細胞外ｐＨからカルボン酸のｐＫａ（ｐＨ約６．７）に向かって低下するにつれ（これはまた、初期エンドソーム条件に対応する）、解離したことを明らかにした（Ａ．  Ｓｏｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３，  ６００−６１４  （２００２））（図３５Ｅ）。理論に縛られないが、より低いｐＨでは、ＰＰＡＡポリマーはプロトン化／脱イオン化され、ペプチド上の正味の正電荷は静電反発およびＭＫ２ｉ−ＮＰの解体を引き起こすことが、仮定される。初期エンドソーム様条件下でのＮＰ解体は、ペプチド生理活性および／またはＰＰＡＡエンドソーム膜破壊機能が、ポリマー−ペプチド相互作用により立体障害される可能性を低減させる。
【０３９２】
ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰ細胞内在化、エンドソーム脱出、および細胞内保持
経時的なＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰ取込および細胞内保持の量を、２時間処置し、洗浄し、新鮮培地中で５日間維持したヒト冠動脈血管平滑筋細胞（ＨＣＡＶＳＭＣ）のフローサイトメトリー分析により評価した。ＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰおよびＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）に比べ、ＭＫ２ｉ−ＮＰ処置細胞において、ペプチド取込における１桁を越える増加を測定した（図３６Ａおよび図５４Ａ）。ＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰ取込は遊離ペプチドと等価であるので、これらのデータにより、細胞内在化の差は、ＮＰ製剤によるものであり、粒子形態および電荷とは独立していることが示される。ＭＫ２ｉ−ＮＰ製剤による増強されたペプチド送達はまた、内皮細胞上での類似の研究でも検出され、これは細胞型特異的観察ではないことが示唆される（図５６）。半減期計算（図５４Ｂ）により、ＭＫ２ｉ−ＮＰは４日から５８日で、１桁分を越てＭＫ２ｉペプチドの細胞内半減期を増加させたことが示された。加えて、ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰで処置されたＨＣＡＶＳＭＣは、ＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰおよびＭＫ２ｉ処置細胞と比べ、より長いペプチド細胞内保持を証明した。おそらく、エンドリソソーム経路および／または細胞からの開口分泌リサイクリングにおけるより高いペプチド分解速度のためである（Ｉ．Ｒ．  Ｒｕｔｔｅｋｏｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ  ９，  １０７７−１０８６  （２０１２））（図３６Ｂ）。興味深いことに、ＭＫ２ｉ−ＮＰは、処置／洗浄後、最初の７２時間のインキュベーションにわたって蛍光の増加を示した。この効果は細胞の外膜に結合されたＭＫ２ｉ−ＮＰの遅延内在化によるものではなく、この蛍光の増加はＡｌｅｘａ−４８８自己消光メカニズムによるものであり（Ｗ．  Ｈ．  ｔ．  Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４２４，  １７８−１８３  （２０１２））；経時的な蛍光の増加は、ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）がＮＰから細胞内にアンパッケージされるにつれ、減少した消光によるものであり得る（図５７）ことが確認された。
【０３９３】
ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰを介して送達されたペプチドの改善された細胞内保持のメカニズムを明確にするために、赤血球溶血アッセイ（（Ｂ．  Ｃ．  Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ，  ｅ５０１６６  （２０１３））および顕微鏡法／共局在研究を使用して、ＭＫ２ｉ−ＮＰのｐＨ依存性膜破壊活性およびエンドソーム脱出を評価した。ＰＰＡＡは、そのｐＫａ（約６．７）以下のｐＨで赤血球膜を破壊する（図３６Ｃ）。細胞外（７．４）および初期エンドソーム（６．８）ｐＨでは、ＭＫ２ｉ−ＮＰはほとんど膜破壊活性を示さなかった。しかしながら、後期エンドソーム（６．２）およびリソソーム（５．６）を代表するｐＨでは、溶血の著しい増加が観察された。後期エンドソーム／リソソームｐＨでのＭＫ２ｉ−ＮＰの溶血挙動はポリマー濃度に正比例し（図４４）、＞９０％赤血球溶解が４０μｇ／ｍＬのＭＫ２ｉ−ＮＰで、ｐＨ５．６にて起きた。ＭＫ２ｉ−ＮＰはＰＰＡＡポリマーの固有の膜破壊活性を保持するが、ＮＰへの製剤化は遊離ＰＰＡＡに比べ、ｐＨ６．８で、膜破壊活性を部分的にマスクした。予想通りに、ＭＫ２ｉペプチド単独も非エンドソーム溶解性ＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰ製剤もエンドリソソームｐＨ範囲では膜破壊活性を示さなかった。
【０３９４】
ＭＫ２ｉ−ＮＰエンドソーム脱出をＨＣＡＶＳＭＣにおいてインビトロで画像化し、定量した（図３６Ｄ）。遊離ペプチドとして、またはＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰを介して送達されたおよそ９０％のＭＫ２ｉはＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ染料と共局在化し、一方、ＭＫ２ｉ−ＮＰ製剤は著しく、ＭＫ２ｉエンドリソソーム共局在を低減させた。２時間処置および洗浄後のＭＫ２ｉ／Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ共局在の縦断定量は、全ての時間点でのＭＫ２ｉ−ＮＰ製剤についての著しく低減されたＭＫ２ｉ／Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ共局在を明らかにした（図３６Ｅ）。興味深いことに、区画サイズの定量により、ＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰまたはＭＫ２ｉ処置細胞はエンドソームを代表するより小さな小胞内でＭＫ２ｉ局在を示し、一方、ＭＫ２ｉ−ＮＰにより送達されるＭＫ２ｉは、サイトゾルまたは破壊された小胞を潜在的に代表するより大きな区画内で見出されたことが明らかになった（図４５および５８Ｂ）。
【０３９５】
ＮＰ製剤は、遊離のＣＰＰに基づくＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチドに比べ、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）によるペプチド取込を著しく増加させた（図３６Ａ）。理論に縛られないが、図３５に示されるＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰおよびＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰのインビトロ比較により、高レベルのＭＫ２ｉ−ＮＰ細胞内在化は、ＮＰ形態および表面電荷により純粋に決定されるより、むしろ、ＰＰＡＡの特定の製剤に依存したことが示唆される。プロピル部分のα−アルキル置換によりＰＰＡＡはアクリル酸に比べより親油性／疎水性となり、取込における観察された差は、ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰの細胞膜との増加した疎水性相互作用の結果であり得ることが示唆される。疎水性相互作用はＭＫ２ｉ−ＮＰ細胞内在化を非特異的に誘発する可能性があり、またはＭＫ２ｉ−ＮＰ内在化は、血管ストレスの設定において上方制御され、負電荷を持つ／疎水性粒子（例えば、ＬＤＬ）をインターナライズするＶＳＭＣスカベンジャー受容体により媒介され得る。
【０３９６】
効率的な細胞内在化に加えて、エンドリソソーム分解および細胞外リサイクリングを回避することが処置効力およびサイトゾル活性ペプチドの作用の寿命を最適化するのに必須である（Ｃ．  Ｌ．  Ｄｕｖａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  ７，  ４６８−４７６  （２０１０））。この持続性処置効果は、ペプチドに基づく静脈グラフト治療にとって非常に重要である。この場合、１回の、術中処置で、移植後炎症および治癒相を通して延長された生理活性が達成されなければならない。この目的を達成するために、ＭＫ２ｉ−ＮＰ製剤はＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチドの細胞内保持を著しく改善した（図３６ＡおよびＢ）。この増強された保持は、ＰＰＡＡのｐＨ依存性膜破壊活性により達成され、これはエンドリソソーム脱出（ｅｎｄｏｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｅｓｃａｐｅ）を誘導するために理想的に調整される（図３６Ｃ〜Ｅ）。細胞イメージング研究はＰＰＡＡのエンドソーム溶解機能を支持し、ＭＫ２ｉ−ＮＰにより送達されるペプチドはエンドリソソーム染料との共局在を著しく減少させたことを示した（図３６Ｄ、Ｅ）。エンドソーム封入の回避は、細胞内ペプチド保持の増加した寿命と関連した。処置除去後０および５日での細胞内ペプチド蛍光の指数関数的減衰非線形回帰分析に基づく、ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）の細胞内半減期（Τ1/2）の推定により、ＭＫ２ｉ−ＮＰへの組み込みにより細胞内Τ1/2は１４倍増加したことが明らかになった（ＭＫ２ｉ−ＮＰ  Τ1/2＝５７．８日対ＭＫ２ｉ  Τ1/2＝４．１日）（データ示さず）。
【０３９７】
ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰは、用量反応曲線のシフトに基づき、ペプチド効力を改善した（すなわち、ほとんどのアッセイにおいて効力を約１０倍増加させた、図３８）。しかしながら、ＮＰ製剤によるＭＫ２ｉペプチドのより長い細胞内半減期はまた、優れた作用寿命を可能にし、例えば、長期グラフト開存性を改善し得る。理論に縛られないが、ＮＰにより送達されるＭＭＩ−０１００（ＭＫｉ）の細胞内半減期は、処置的に関連することが予想され、というのも、ＴＧＦ−β媒介分化転換およびｐ３８ＭＡＰＫ経路により媒介される細胞遊走は、移植後３５日までの病理学的静脈グラフトリモデリングに寄与することが見出されたからである（Ａ．  Ｖ．  Ｂａｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１５，  ３１９３−３２０６  （２００２））。ウサギおよびイヌモデルにおける内膜過形成（ＩＨ）発病の速度論に関する他の研究は、第１週中の細胞増殖の初期バースト、続いて、第１２週までには定常状態に到達する連続グラフト適応を検出した（Ｍ．  Ｋａｌｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ３７，  ５７６−５８４  （２０００）；  Ｒ．  Ｍ．  Ｚｗｏｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  ５，  １２６−１３６  （１９８７））。ＭＫ２ｉ−ＮＰによって延長された半減期は、例えば、埋め込み前の単一処置後に、根底にあるシグナル経路を阻害し、炎症の消散および定常状態に到達するのに必要とされる時間を加速することにより、著しく改善された長期性能を与えることが予想される。
【０３９８】
ペプチドの無傷のヒト伏在静脈（ＨＳＶ）中へのＭＫ２ｉ−ＮＰ送達もまた、評価した。この実験の結果により、取込は内皮と平滑筋細胞の両方において起きることが示唆された。予想通りに、ＭＫ２ｉ−ＮＰおよび対照は、拡散バリアとして機能する管腔および外膜表面でより濃縮された取込を示した（図５９）。内膜および中膜層中へのＭＫ２ｉ貫通を、平滑筋マーカーα−ＳＭＡとの共局在により確認した（図６０ａ〜ｂ）。さらに、インビトロ結果によれば、ＭＫ２ｉ−ＮＰは血管壁内でのペプチド取込全体を増加させた（図６０ｃ；図５９ｅ）。
【０３９９】
内膜過形成の阻害（ヒト伏在静脈（ＨＳＶ）におけるＩＨ
３次元ヒト移植血管組織における効率的な送達およびＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰ生理活性を確認するために、静脈ＩＨのエクスビボ器官培養モデルを、ヒト伏在静脈（ＨＳＶ）を用いて完成した。ＨＳＶ環を、筋肉浴中でのＫＣｌチャレンジへの収縮応答に基づき生存していることが確認されたＨＳＶ試料から切断した。環を２時間処置し、洗浄し、新生内膜形成を加速する高血清条件で維持した。Ａｌｅｘａ−５６８コンジュゲートＭＫ２ｉペプチドを使用して、処置の直後の血管壁へのペプチド送達を可視化し、インビトロ結果と同様に、ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰは、遊離ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）と比べ、一貫してペプチド送達を増加させた（図３７Ａ）。１４日の培養後、弾性ラミナのＶｅｒｈｏｅｆｆ−Ｖａｎ  Ｇｉｅｓｏｎ（ＶＶＧ）染色を組織切片に対して実施した（図３７Ｂ）。複数のヒトドナーからの試料の内膜厚の定量により、ＭＫ２ｉ−ＮＰは用量依存的に、かつ遊離ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）よりも１桁分低いペプチド用量でＩＨを著しく阻害したことが明らかになった（図３７Ｃおよび図４６）。さらに、１００μＭのＭＫ２ｉでのＭＫ２ｉ−ＮＰ療法は、ＩＨを完全に抑制した唯一の処置であり、回収直後に組織構造のために調製した対照組織と統計学的に等価な内膜厚が得られた（ｐ＝０．４９）。ＭＴＴアッセイを、処置後１および１４日に実施し、器官培養結果は組織生存率に対する処置効果に影響されなかったことを確認した（図４７）。ヒト伏在静脈の１００μＭ  ＭＫ２ｉ−ＮＰによる処置は、ＩＨのエクスビボ器官培養モデルにおいて２週間にわたって、新生内膜増殖を完全に抑制した。
【０４００】
ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰ生理活性の機構的解明
ＭＫ２ｉ−ＮＰがヒト静脈においてＩＨを低減させたメカニズムを解明するために、ｈｎＲＮＰ  Ａ０およびＣＲＥＢのリン酸化を、ウエスタンブロット分析を使用して最初に評価した。ＭＫ２の下流では、ｈｎＲＮＰ  Ａ０はｍＲＮＡを安定化し、炎症性サイトカインの翻訳を増加させ（Ｓ．  Ｒｏｕｓｓｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ  ２１，  ６５０５−６５１４  （２００２）；  Ｎ．  Ｒｏｎｋｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ８０，  １９１５−１９２０  （２０１０）；  Ｅ．  Ｈｉｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２６，  ２３９９−２４０７  （２００６））、ＣＲＥＢは、ｃＡＭＰ−応答配列に結合し、平滑筋細胞遊走（Ｓ．  Ｊａｌｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １００，  １２９２−１２９９  （２００７）；  Ｈ．  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌ  Ｔｈｒｏｍ  Ｖａｓ  ２４，  １６３４−１６３９  （２００４））、増殖（Ｐ．  Ｍｏｌｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｓｉｇｎａｌ  ８，  ２９−３７  （２０１４）；  Ｋ．  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ５７，  １８２−Ｕ２５４  （２０１３））、およびＩＬ−６などの炎症性サイトカインの産生（Ｇ．  Ｌ．  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌ  Ｔｈｒｏｍ  Ｖａｓ  ３２，  ２７５１−＋（２０１２））を誘導する遺伝子の発現を促進する。ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰは、ＨＳＶにおけるｈｎＲＮＰ  Ａ０およびＣＲＥＢリン酸化の両方を著しく低減させた（図３７Ｄ、Ｅ）。このメカニズムをさらに支持して、ＭＫ２ｉ−ＮＰはまた、アンジオテンシン−ＩＩ刺激ＨＣＡＶＳＭＣにおいて、インビトロで一次ｈｎＲＮＰ  Ａ０標的ＴＮＦαの分泌を著しく阻害した（Ｓ．  Ｒｏｕｓｓｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ  ２１，  ６５０５−６５１４  （２００２））（図３８Ａ、図４８）。この研究では、ＭＫ２ｉ−ＮＰは、ＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰおよびＭＫ２ｉと等価なＴＮＦα阻害を１桁分低い用量で達成し（すなわち１０μＭのＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）が１００μＭのＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）と等価な効果を生成し）、１００μＭ  ＭＫ２ｉ−ＮＰは、アンジオテンシンＩＩ−刺激ＴＮＦα産生を完全に抑制した。ＭＫ２ｉ−ＮＰは、ＴＮＦα刺激ＨＣＡＶＳＭＣにおいて、ＩＬ−６、ＣＲＥＢ標的遺伝子の産生を著しく低減させたこともまた確認された（Ｇ．  Ｌ．  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌ  Ｔｈｒｏｍ  Ｖａｓ  ３２，  ２７５１−＋（２０１２））。この研究により、ＭＫ２ｉ−ＮＰは、遊離ＭＫ２ｉより著しく生理活性が高かったことも示された（図４９）。インビトロ処置のいずれにおいても、未処置対照と比べ、処置後１および１４日に、組織生存率により評価される著しい毒性は得られなかった（図５０および５１）。
【０４０１】
ＭＫ２ｉ−ＮＰはＨＳＰ−２７のリン酸化を著しく減少させたこともまた確認され（図３７Ｄ、Ｆ）、これは、ＣＲＥＢと共に、ＩＨに特徴的な病理学的血管平滑筋細胞遊走を促進すると考えられる（Ｔ．  Ｚａｒｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １５，  １１−１８  （２００５）；  Ｈ．  Ｆ．  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３２７，  １−６  （２００９）；  Ｌ．  Ｂ．  Ｌｏｐｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  ５２，  １５９６−１６０７  （２０１０））。
【０４０２】
ケモカインＰＤＧＦ−ＢＢの存在下でのＨＣＡＶＳＭＣ遊走に対するＭＫ２ｉ−ＮＰの効果もまた、インビトロで、ひっかき傷ケモキネシスおよびＢｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒ走化性遊走アッセイの両方を使用して調査した（図３８Ｂ、−Ｄ）。ＭＫ２ｉ−ＮＰは細胞遊走を著しく阻害し、遊離ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチドよりも１桁分低い用量で阻害した。ＭＫ２ｉ−ＮＰは、ＨＣＡＶＳＭＣ増殖に著しく影響せず、これらの結果は細胞増殖に対する処置効果に起因しなかったことが確認された（図５２）。加えて、ＭＫ２ｉ−ＮＰは、血管平滑筋（ＶＳＭＣ）および内皮細胞（ＥＣ）遊走の両方を強力に阻害し（図６１ａ〜ｄ）、ＭＫ２ｉ−ＮＰは、遊離ＭＫ２ｉペプチドに比べ、ＶＳＭＣ遊走を阻害することについて著しくより強力であった（図６１ａ）。これらの結果はヒト血管組織において検出されるＣＲＥＢおよびＨＳＰ２７リン酸化のＭＫ２ｉ−ＮＰ阻害と相関した。
【０４０３】
ＨＳＶにおけるＩＨのエクスビボ器官培養モデルはまた、ＭＫ２ｉ−ＮＰは新生内膜形成を用量依存的様式で、遊離ＭＫ２ｉよりも１桁分低いペプチド用量で著しく阻害したことを明らかにした（図３７ｂおよびｃ；図４８〜５１）。
【０４０４】
これらの研究により、ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰの広い抗炎症および抗遊走作用機序も確認され（図３８）、ＩＨ発病の根底にある複数の因子を阻害するためにｐ３８−ＭＫ２経路を標的にする有用性も確認された。ＭＫ２ｉ−ＮＰは、ｈｎＲＮＰ  Ａ０およびＣＲＥＢなどのＭＫ２の下流で活性化される炎症促進性媒介物質を調節することが示された。ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰは、ヒト組織においてｈｎＲＮＰ  Ａ０リン酸化を減少させ、これは炎症性サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−６のインビトロでのアンジオテンシン−ＩＩ刺激産生の減少と相関した。ＭＫ２ｉ−ＮＰはまた、ＨＳＰ２７のリン酸化（遊走および線維性筋線維芽細胞表現型へのＶＳＭＣ移行を誘発し、静脈グラフト血管収縮を引き起こす）の低減により証明される、ヒト組織における遊走関連経路を調節することが示されている。ＨＳＰ２７の効果は細胞骨格動力学の調節により媒介され、これは、アンジオテンシンＩＩおよびＰＤＧＦなどの病理学的に関連する刺激に向かう遊走に影響を与える。加えて、ＭＫ２ｉ−ＮＰは、ＶＳＭＣ遊走の一因となり、ＩＨに特徴的な病理学的ＶＳＭＣ表現型に至らしめることも知られているＣＲＥＢ転写因子のリン酸化を減少させる（例えば、  Ｈ．Ｆ．  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３２７，  １−６  （２００９）；  Ｋ．  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ５７，  １８２−Ｕ２５４  （２０１３）；  Ｇ．  Ｌ．  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌ  Ｔｈｒｏｍ  Ｖａｓ  ３２，  ２７５１−＋  （２０１２）；  Ｌ．  Ｃ．  Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ−Ｒｅｇ  Ｉ  ２７９，  Ｒ４９２−Ｒ４９８  （２０００）を参照されたい）。ＨＳＰ２７およびＣＲＥＢの活性化の阻害はインビトロでのＰＤＧＦに向かうＶＳＭＣ遊走の低減と相関した。
【０４０５】
ＭＫ２ｉ−ＮＰにより送達された場合、ＭＫ２ｉの細胞内半減期は、著しくより高くなったので、インビトロ生理活性アッセイをまた、処置後３および５日に実施し、ＮＰ製剤のペプチド処置作用の寿命に対する影響を評価した。我々の細胞内半減期計算と一致して、遊離ＭＫ２ｉペプチドの単球走化性タンパク質−１（ｈｎＲＮＰ  Ａ０およびＴＮＦαの両方により上方制御されるＭＣＰ−１）の産生を阻害する（Ｒｏｕｓｓｅａｕ  Ｓ，  Ｍｏｒｒｉｃｅ  Ｎ，  Ｐｅｇｇｉｅ  Ｍ，  Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＤＧ，  Ｇａｅｓｔｅｌ  Ｍ，  Ｃｏｈｅｎ  Ｐ．  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓａｐｋ２ａ／ｐ３８  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｈｎｒｎｐ  ａ０  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍａｐｋａｐ−ｋ２  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｍｒｎａｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２００２；２１：６５０５−６５１４；  Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｌ，  ｖｏｎ  Ｓｅｇｇｅｒｎ  Ｌ，  Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  Ｊ，  Ｇｏｕｍａｓ  Ｆ，  Ｗｉｌｍｓ  Ｃ，  Ｂｒａｕｎ  Ｆ，  Ｂｒｏｅｒｉｎｇ  ＤＣ．  Ｔｎｆ−ａｌｐｈａ  ｓｉｍｉｌａｒｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｉｌ−６  ａｎｄ  ｍｃｐ−１  ｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０１０；３９７：５８６−５９１）および静脈グラフト内膜過形成（ＩＨ）に関与する（Ｓｔａｒｋ  ＶＫ，  Ｈｏｃｈ  ＪＲ，  Ｗａｒｎｅｒ  ＴＦ，  Ｈｕｌｌｅｔｔ  ＤＡ．  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖｅｉｎ  ｇｒａｆｔ  ｉｎｔｉｍａｌ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ．  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌ  Ｔｈｒｏｍ  Ｖａｓ．  １９９７；１７：１６１４−１６２１）能力は、処置後３および５日に、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）および内皮細胞（ＥＣ）の両方において著しく減少した（図６１ｆ〜ｇ）。対照的に、ＭＫ２ｉ−ＮＰは、処置後５日に両方の細胞型において持続性阻害生理活性を証明した。その上、ＭＫ２ｉ−ＮＰは、処置後５日にＶＳＭＣ遊走の著しい阻害を証明し、一方、遊離ＭＫ２ｉまたはＮＥ−ＭＫ２ｉ−ＮＰは最小の効果を示した（図６１ｈ〜ｉ）。第３日と第５日の間の抗炎症および抗遊走活性の減少は、遊離ＭＫ２ｉペプチドの計算された細胞内半減期と一致した。
【０４０６】
これらの結果から、無傷の、ヒト血管組織における、ＭＫ２と下流炎症促進および遊走促進因子ｈｎＲＮＰ  Ａ０、ＣＲＥＢ、およびＨＳＰ２７の間の関係が確立される。ＭＫ２ｉ−ＮＰの集合的な抗炎症および抗遊走作用は、細胞増殖、遊走、炎症、およびマトリックス合成の複雑な相互作用が関与する、例えば、ＩＨのような多因子性プロセスに対するこの療法の有用性を強調する。この翻訳関連のＭＫ２ｉ−ＮＰ製剤（単純混合により形成される；複雑な合成、コンジュゲーション、または精製は必要とされない）はＩＨに関与する複数の因子を包括的に標的にするので、これは、より狭い作用メカニズムを有する前の治療候補の不足分を克服する可能性を有する。
【０４０７】
ウサギ静脈グラフト間置モデルにおけるインビボ生理活性
ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰのインビボでの処置効果を、ポリマーカフ法を使用して、激しい血流を誘導し、グラフトＩＨを加速する、ウサギ両側性頸静脈グラフト間置移植モデルにおいて評価した。このモデルでは、頸静脈グラフトを、３０分間（グラフトがヒト血行再建手順中に外植される時間量を代表する）エクスビボで処置し、またはビヒクル対照を与えた。グラフトを術後２８日に回収し、ＶＶＧ染色組織切片を内膜厚定量のために使用した（図３９Ａおよび図６２ａ）。３０μＭのＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）−ＮＰによる処置は未処置対照および遊離ＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）ペプチド（試験した３０μＭ用量では、ビヒクル対照に比べ、新生内膜形成において著しい変化を生成させなかった）の両方と比べ、新生内膜形成を著しく阻害した（図３９Ｂおよび図６２ｂ）。
【０４０８】
インビボで、新生内膜肥厚のＭＫ２ｉ−ＮＰ媒介阻害の根底にある細胞に基づくメカニズムを評価するために、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）、およびビメンチン染色組織切片を使用して、細胞増殖および血管平滑筋細胞表現型を分析した。内膜ＰＣＮＡ染色は、ＭＫ２ｉ−ＮＰで処置したグラフトでは約１７倍著しく減少し、一方、遊離ＭＫ２ｉによる処置は未処置グラフトに類似した（図６２ｃ〜ｄ）。ＭＫ２ｉ−ＮＰ処置グラフトはまた、未処置グラフトまたは遊離ＭＫ２ｉで処置したグラフトに比べ、収縮性ＳＭＣ表現型に対するマーカーであるα−ＳＭＡについて増加した染色強度を証明した（Ｒｅｎｓｅｎ  ＳＳＭ，  Ｄｏｅｖｅｎｄａｎｓ  ＰＡＦＭ，  ｖａｎ  Ｅｙｓ  ＧＪＪＭ．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．  Ｎｅｔｈ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．  ２００７；１５：１００−１０８）（図６２ｆ）。α−ＳＭＡ免疫染色切片の画像は、未処置および遊離ＭＫ２ｉ処置群は、低密度の内膜染色を示すことを明らかにし（図６２ｅ）、収縮性ＶＳＭＣ表現型の損失および／または細胞外マトリクスタンパク質の過剰産生（どちらも、静脈グラフトＩＨに関与する）が示された。増加した収縮性マーカー発現に一致して、合成ＶＳＭＣマーカービメンチンの内膜発現もまた、ＭＫ２ｉ−ＮＰ処置グラフトで減少したが、遊離ＭＫ２ｉペプチドで処置したグラフトでは減少しなかった（図６２ｇ〜ｈ）。
【０４０９】
移植後２８日において静脈グラフトの内膜中に存在する残留炎症細胞の数を、組織切片において、ウサギマクロファージ特異抗体、ＲＡＭ−１１を使用して評価した（図３９Ｃ、図５３および図６３）。著しく少ない内膜マクロファージがＭＫ２ｉ−ＮＰ処置グラフトにおいて検出され、ＭＫ２ｉ−ＮＰは、局所マクロファージ動員および／または残留を鈍らせたことが示唆された（図３９Ｄ）。このメカニズムは、マクロファージ炎症性タンパク質２（ＭＩＰ−２、ＣＸＣＬ２としても知られている）および／または単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の減少した分泌により潜在的に媒介され（Ａ．  Ｍｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｓｃｕｌ  Ｐａｈｒｍａｃｏｌ  ５６，  ４７−５５  （２０１２））、それらはどちらも炎症細胞を誘引し、直接的または間接的にｈｎＲＮＰ  Ａ０により上方制御される（Ｓ．  Ｒｏｕｓｓｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ  ２１，  ６５０５−６５１４  （２００２）；  Ｌ．  Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３９７，  ５８６−５９１  （２０１０）；  Ｒ．  Ｎ．  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  １００，  ９６７−９７８  （２００７））。ＭＫ２ｉ−ＮＰが平滑筋および内皮細胞の両方においてＭＣＰ−１産生を阻害したということを示す我々のインビトロ研究結果はこのメカニズムを支持する。炎症反応は主に２８−日に全ての試料において解決されたが、未処置試料における残留マクロファージは、ＭＣＰ−１は静脈移植後８週間であっても、上昇し、単球の局所動員およびＩＨの発病となることがあるという以前の観察結果と一致する（Ｖ．  Ｋ．  Ｓｔａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌ  Ｔｈｒｏｍ  Ｖａｓ  １７，  １６１４−１６２１  （１９９７））。１００μＭのＭＫ２ｉ−ＮＰによる処置は、２週間にわたり、ウサギ移植モデルにおいて新生内膜増殖を完全に抑制した。３０μＭのＭＫ２ｉ−ＮＰによる術中処置は、移植後４週間で、グラフトにおいてマクロファージの数およびＩＨの程度を著しく低減させた（図３９）。
【０４１０】
実施例４．ＭＫ２ｉ−ＮＰおよびｐ−ＨＳｐ２０−ＮＰの合成、キャラクタリゼーションおよび最適化
配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ−ＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を有するＭＫ２ｉペプチドおよび配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ−ＷＬＲＲＡｓＡＰＬＰＧＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）を有するｐ−ＨＳＰ２０ペプチドを固相合成により合成し、純度をエレクトロスプレーイオン化質量分析により確認した（図６４）。可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合を使用して、ポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）を合成した［ＤＰ＝１９３（ＧＰＣ）、ＤＰ＝１９０（Ｈ1  ＮＭＲ）、ＰＤＩ＝１．４７（ＧＰＣ）］。ＮＰをＰＰＡＡホモポリマーとＭＫ２ｉまたはｐ−ＨＳＰ２０ペプチドとの、ＰＢＳ中、ｐＨ８．０（ペプチド上に存在する一級アミンのｐＫａ値（ｐＫａ約９〜１２、アミノ酸残基に依存）とＰＰＡＡポリマー中のカルボン酸部分（ｐＫａ約６．７）の間である）での単純混合により形成させ；これにより、最適溶解度および両方の分子上の静電複合体形成を促進する正味荷電が確保される。
【０４１１】
ナノ粒子製剤条件の影響を評価するために、一連のＭＫ２ｉ−ＮＰおよびｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰをある範囲のチャージ比［すなわちＣＲ＝（［ＮＨ3+］MK2i/p-HSP20：［ＣＯＯ-］PPAA）］で調製し、サイズ分布および粒子表面電荷を、それぞれ、動的光散乱（ＤＬＳ）およびζ電位分析により特徴付けた。予想通りに、ＭＫ２ｉ−ＮＰおよびｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰζ電位はＣＲに正比例した（図６５Ａ、６６Ａ）。ＣＲはまた、ＮＰサイズに著しく影響し、狭い範囲のＣＲにより、単峰型サイズ分布が得られた（すなわち、ＭＫ２ｉ−ＮＰではＣＲ＝１：２および１：３（表２４）およびｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰではＣＲ＝３：１（表２５）。１：３のＣＲをＭＫ２ｉ−ＮＰ製剤ついてのその後の研究で使用し、３：１のＣＲをｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰ製剤について使用し；これらのチャージ比により一貫して、最小粒子サイズおよび多分散性を有する単峰型サイズ分布が得られた（ＭＫ２ｉ−ＮＰ  ｄh＝１１９±２８ｎｍ、ζ＝−１１．９±３．２ｍＶ、図６５Ｂ；ｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰ  ｄh＝１４１±６ｎｍ、ζ＝−７．５±２．８ｍＶ、図６６Ｂ）。２つのペプチド間の単峰形粒子を生成させたこのチャージ比の差は、ペプチドサイズ、電荷分布、配列疎水性、または二次構造の差に起因する可能性があり、これらの製剤の構造−機能関係をよりよく理解するには、より広いライブラリのペプチドの将来の分析が必要とされるであろう。興味深いことに、どちらの最適ＮＰ製剤も、負のζ電位を証明し、カチオン性ペプチドがナノポリプレックスのコア中に隔離され、アニオン性ＰＰＡＡポリマーはより優先的に粒子表面に局在されることが示される。リードＭＫ２ｉ−ＮＰおよびｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰ製剤はまた、ＴＥＭイメージングにより特徴付けられ（図６５Ｃ、６６Ｃ）、これにより、ＤＬＳ結果によるサイズ分布を有するナノ構造の存在が確認された。その後のインビトロおよびエクスビボ研究では、これらのリードＮＰ製剤（図６５Ｄ、６６Ｄ）を対応する遊離ペプチドと比較した。
【表２４】
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【表２５】
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【０４１２】
実施例５．ＮＰインビトロ生体適合性、取込、保持、輸送および生理活性
リード候補ＭＫ２ｉ−ＮＰおよびＨＳＰ２０−ＮＰ製剤の生体適合性を、対応する遊離ペプチドと、ある範囲の用量（１０−５００μＭペプチド）で、ヒト冠動脈血管平滑筋細胞（ＨＣＡＶＳＭＣ）においてインビトロで比較した。ＨＣＡＶＳＭＣを２時間処置し、その後、新鮮培地中で２４時間インキュベートし、その後、細胞毒性アッセイを実行した。著しい細胞毒性はＭＫ２ｉ−ＮＰについては試験した全ての濃度で明らかにならなかったが、一方、遊離ＭＫ２ｉペプチドは試験した最高用量で弱い毒性を示した（５００μＭで７６％細胞生存率、図６７）。ＨＳＰ２０−ＮＰおよびＨＳＰ２０ペプチドは、５００μＭで検出された弱い細胞毒性を除いて、生体適合性であることが見出された（それぞれ、ｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰおよび遊離ｐ−ＨＳＰ２０ペプチドについて６０％および７７％生存率）。
【０４１３】
経時的なＭＫ２ｉ−ＮＰおよびｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰ取込の量および細胞内保持を、３０分間処置し、洗浄し、新鮮培地中で０または３日間維持したＨＣＡＶＳＭＣのフローサイトメトリー分析により評価した。ＮＰに組み込まれた場合、取込の１桁を越える増加（ＭＫ２ｉ取込の約７０倍増加およびｐ−ＨＳＰ２０取込の約３５倍増加）が両方ペプチドについて検出された（図６８）。両方のＮＰ製剤の負のζ電位は、ＰＰＡＡポリマーがＮＰ表面上で主として露出されでいることを示し、この取込の増加はおそらく、ｐＨ応答性ポリマーにより促進される。より特定的には、プロピル部分のα−アルキル置換がＰＰＡＡに親油性／疎水性の特徴を与えており、取込の観察された差は、ＮＰの細胞膜との増加した疎水性相互作用の結果であり得ることが示唆される。増加した取込に加えて、ＭＫ２ｉ−ＮＰまたはｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰで処置したＨＣＡＶＳＭＣは、処置除去後３日に、遊離ＭＫ２ｉまたはｐ−ＨＳＰ２０ペプチドと比べて増加した細胞内ペプチド保持を示した（ＭＫ２ｉ−ＮＰ対遊離ＭＫ２ｉについて初期の取込が残存した８２％対５４％、図４Ａ、Ｅ；ｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰ対遊離ｐ−ＨＳＰ２０の７０％対３５％保持、図６８Ｂ、Ｆ）。生理活性カーゴの細胞内保持は、無傷のペプチドのエキソサイトーシスを低減させる、かつ／または酸性エンドリソソーム区画内でのペプチドの分解を低減させることにより改善させることができる１８、３５。これらの最適化ＮＰ製剤は、意図的に、エンドリソソーム輸送経路において遭遇する減少したｐＨに応答し、サイトゾルペプチド送達を促進するように設計される。というのも、ＰＰＡＡポリマーは明確に定義されたｐＨ依存性エンドソーム溶解活性を有し３６、３７、以前に動物モデルにおいて生体適合性を証明しており３８、ＰＰＡＡポリマーのペプチドへのストレプトアビジンリンカーを介する多段階生体共役反応により、アポトーシス促進性抗癌ペプチドの細胞内送達のために適用されている３９からである。よって、これらの研究では、単純な静電複合体形成アプローチを使用して、ＰＰＡＡポリマーを組み入れ、治療的エンドソーム脱出および保持を促進した：ＰＰＡＡは、生理的ｐＨでのイオン化され、伸長された高次構造から、酸性／エンドソーム条件でのつぶれた、疎水性球状高次構造への移行を受ける。この移行により、エンドソーム膜中の脂質との疎水性相互作用が得られ、最終的にはエンドソーム脱出、ならびに治療ペプチドカーゴの改善された細胞内保持および生理活性が得られる。
【０４１４】
ＮＰ製剤を介して送達されたペプチドの増加したペプチド細胞内保持とエンドソーム脱出の間の関係を調査するために、ジギトニンに基づく、半透過処理技術４０を適合させ、最適化し、ＮＰおよび遊離ペプチド処置ＨＣＡＶＳＭＣについてサイトゾルおよび小胞結合ペプチドの相対量を測定した（図６９Ａ）。ジギトニンは非イオン性洗浄剤であり、最適化条件下で、細胞内小器官（例えば、エンドソームおよびリソソーム）は無傷のままで、細胞膜の選択的半透過処理が得られる。最適化された半透過処理手順を、ある範囲の濃度のジギトニンと共に１０分間氷上でインキュベートしたＨＣＡＶＳＭＣからの「サイトゾル」および「小器官」画分中のＬＤＨ（サイトゾルに局在化することが知られている）量を測定することにより決定した（図７０）。最適化半透過処理プロトコルを使用して集めたサイトゾルおよび小器官画分のウエスタンブロット分析により、エンドリソソームマーカー初期エンドソーム抗原１（ＥＥＡ１）およびリソソーム関連タンパク質１（ＬＡＭＰ１、図６９Ｂ）からの細胞質タンパク質マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ１／２（ＭＥＫ１／２）およびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の有効な分離を確認した。蛍光標識されたＭＫ２ｉおよびｐ−ＨＳＰ２０ペプチドを使用することにより、それらの遊離形態での、対ＮＰ製剤を介する送達後の両方のペプチドの細胞内分布の定量が可能になった。この分析により、ＮＰ中への製剤化は、ペプチド取込を増加させただけでなく、サイトゾル中に内在化したペプチドの画分を著しく増加させたことが確認され；正味の効果はサイトゾルＭＫ２ｉ送達のおよそ８倍増加およびサイトゾルｐ−ＨＳＰ２０送達の約２９倍増加となった（図６９Ｃ、Ｄ）。増加したサイトゾルペプチド送達がＮＰ製剤中のＰＰＡＡのｐＨ依存性膜破壊活性により促進されることを確認するために、細胞を液胞型Ｈ＋ＡＴＰアーゼ阻害剤バフィロマイシンＡ１の存在下にて、ＮＰで処置し、エンド−リソソーム酸性化を防止した。エンドソーム酸性化を防止すると、両方のＮＰ製剤について、サイトゾル中に内在化したペプチドの画分が著しく低減し、エンドソームからのＮＰ脱出のメカニズムはｐＨ依存性であることが確認された（図６９Ｃ、Ｄ）。バフィロマイシン処置は、内在化した遊離ＭＫ２ｉまたはｐ−ＨＳＰ２０ペプチドのサイトゾル画分に無視できる効果しか有さないことが見出された（データ示さず：ＭＫ２ｉ：９．６４％±８．１７％サイトゾル、ｐ−ＨＳＰ２０：７．３６％±８．２８％サイトゾル）。
【０４１５】
Ｆ−アクチンストレスファイバー形成のＭＫ２ｉ−ＮＰおよびｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰ媒介阻害の効力を、アンジオテンシン−ＩＩ（ＡＮＧ  ＩＩ）刺激ＨＣＡＶＳＭＣにおいて定量した。両方のＮＰ製剤は、細胞当たりのストレスファイバーの平均数の著しい減少により測定されるように、ペプチド機能生理活性を増強した（図７１Ａ）。定性的に、ＮＰ製剤およびＡＮＧ  ＩＩで処置されたＨＣＡＶＳＭＣは、未刺激対照細胞と一致する細胞形態および染色を示し、一方、遊離ペプチドで処置されたＨＣＡＶＳＭＣは、ＡＮＧ  ＩＩ刺激対照細胞に類似するストレスファイバー形成を示した（図７１Ｂ）。細胞当たりのＦ−アクチンの総量もまた、球状ではなく、線維状アクチンに選択的に結合する染色剤のＡｌｅｘａ−４８８ファロイジンを用いて定量した（図７２および７３）。この分析は、細胞当たりのストレスファイバーの数の定量と一致し、ＮＰ中への製剤化は、両方ペプチドのストレスファイバー阻害活性を著しく増強させたことを明らかにした。
【０４１６】
実施例６．ヒト血管組織における平滑筋生理機能に対するＮＰ効果
血管攣縮のための可能性のある処置として、これらの製剤を評価するために、ＭＫ２ｉ−ＮＰおよびｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰ製剤の、ヒト血管組織における平滑筋生理機能への効果を評価した。これらの研究では、ヒト伏在静脈（ＨＳＶ）を、バイパス移植術を受けている、同意した患者から回収し、切開して環とした。筋肉浴においてＫＣＬチャレンジにより生存を確認した後、各ＮＰ製剤のフェニレフリン（ＰＥ）誘導血管収縮を阻害する能力をＨＳＶ環において、力トランスデューサーが装備された臓器浴システムを用いて測定した。血管が収縮され、弛緩され、処置され、その後、再び収縮される実験設計では、未処置対照ＨＳＶ環は初期収縮に比べ、２回目のＰＥ誘導収縮において何の変化も示さなかった。しかしながら、ＭＫ２ｉまたはｐ−ＨＳＰ２０ペプチドによる中間処置は２回目のＰＥ誘導ＨＳＶ収縮を著しく阻害した（図７４Ａ〜Ｃ）。インビトロＦ−アクチンストレスファイバー結果と一致して、ＮＰ製剤により送達される等価用量のペプチドは、遊離ペプチドに比べ、収縮の著しく増強されたペプチド媒介阻害を示した（図７４Ｃ）。特に、投与される最高ＮＰ用量と等価の用量の遊離ＰＰＡＡポリマーによる処置では、ＰＥ誘導ＨＳＶ収縮について無視できる効果しか示されず（図７４Ｂ）、増強された阻害活性はペプチド生理活性の増強により媒介され、エンドソーム溶解性ポリマー担体の非特異的効果ではないことが示される。ペプチド−ＮＰの、血管収縮を強力に阻害するこの能力は、これらの製剤の、冠動脈血管または末梢血管バイパス移植などの適用における血管攣縮を防止する予防的アプローチとしての翻訳に関する可能性を証明する。
【０４１７】
これらのＮＰ製剤の予防療法としての効力を試験することに加えて、ＭＫ２ｉ−およびｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰのニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）誘導血管弛緩を増強させる能力を、可能性のある有益な処置介入として（例えば、ＳＡＨ誘導血管攣縮を処置する）、生存ＨＳＶ外植片において評価した（図７４Ｄ）。再び、両方のＮＰ製剤は試験した全ての濃度で、ＳＮＰ誘導血管弛緩を促進する増強された能力を証明し（図７４Ｅ、Ｆ）、一方、未処置ＨＳＶまたはＰＰＡＡポリマー単独で処置されたＨＳＶは血管弛緩において無視できる差しか示さなかった（図７４Ｅ）。ＭＫ２ｉ−ＮＰおよびｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰ製剤は、別個の分子メカニズムを介して血管弛緩を誘発するので、両方のペプチドを合わせてＮＰ製剤にすると、将来の研究のための有望なアプローチが表される。というのも、より低いペプチド用量で処置効果を生成させる相乗効果を達成し得るからである。
【０４１８】
ヒト組織において、Ｆ−アクチンストレスファイバー形成の平滑筋生理学的結果との相関を定性的に評価するために、ＨＳＶ環を、遊離ペプチドまたはＮＰ製剤で前処置し、それからその後で、Ａｌｅｘａ−４８８ファロイジンによるＦ−アクチン染色前にＡＮＧ  ＩＩで刺激した（図７４Ｇ）。平滑筋生理学結果によれば、ＮＰ製剤で処置されたＨＳＶ環は遊離ペプチドで処置されたと比べて、減少したファロイジン染色を示した。まとめると、これらの結果から、ＭＫ２ｉ−およびｐ−ＨＳＰ２０−ＮＰは、ヒト平滑筋組織におけるアクチンダイナミクスを調節することにより、ＭＫ２ｉおよびｐ−ＨＳＰ２０ペプチドの血管収縮を阻害し、血管弛緩を促進する能力を著しく増強することが示される。
【０４１９】
上記で明記される実験の結果は、治療ペプチド、例えばＭＭＩ−０１００（ＭＫ２ｉ）の細胞および組織送達、生理活性、および細胞内薬物動態を増強する、ナノテクノロジーの可能性のある使用を確立する。一般に、ＣＰＰは高カチオン性であり、よって、ＰＰＡＡとの複合体形成は潜在的に、治療ペプチドの細胞内送達を促進する、一般化プラットフォームバイオテクノロジーとして機能する。
【０４２０】
実施例７．溶液中のＭＭＩ−０１００のアッセイおよび純度決定のためのＨＰＬＣ法
この研究の目的は、とりわけ、カラム洗浄工程、溶離勾配、精度（注入反復性）および線形性を評価することにより、溶液中のＭＭＩ−０１００のアッセイおよび純度決定のためのＨＰＬＣ法を評価し、最適化することであった。
【０４２１】
使用したＨＰＬＣ法条件は表２６で列挙される。
【表２６】
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【０４２２】
多数の製剤を用いる清浄なカラムを維持するために、カラム洗浄工程（４２〜４５分）を７分だけ延長した（４２から５２分）。したがって、カラム平衡化工程を２分だけ増加させた（４７〜５５分から５４〜６４分）。ＭＭＩ−０１００が溶離する溶離条件を変化させた（例えば０〜４０分）。最適化勾配を表２に列挙する。
【表２７】
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【０４２３】
希釈剤および１ｍｇ／ｍＬのＭＭＩ−０１００標準の代表的なＨＰＬＣクロマトグラムをそれぞれ、図７７ＡおよびＢに示す。
【０４２４】
精度
精度（または注入反復性）を、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０中に１．１ｍｇ／ｍＬのＭＭＩ−０１００を含む溶液をＨＰＬＣ上に合計６回の連続注入で注入することにより評価した。ＭＭＩ−０１００ピークについての保持時間（ＲＴ）、ピーク面積、テーリング係数および理論段数を各注入について記録し、それらの個々の相対標準偏差（ＲＳＤ）を計算した。精度試験結果を、表２８に示す。６回の注入からのＲＴおよび応答係数についてのＲＳＤは２％未満であり、この方法は精度／注入反復性試験判断基準を満たすことが示される。
【表２８】
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【０４２５】
線形性
線形性試験溶液をＭＭＩ−０１００の原液を使用し段階希釈して調製した。ＭＭＩ−０１００の原液を１．９ｍｇ／ｍＬで調製した（１．１ｍｇ／ｍＬの名目濃度の１６７％）。
【０４２６】
実際のストック調製：
（２４．０ｍｇのＭＭＩ−０１００）*（ＣｏＡ０．７７４からのペプチド含量）／（１０ｍＬメスフラスコ）。
【０４２７】
線形性溶液調製は表２９に詳述する。線形性試験結果を、表３０および図７８に示す。図７８はＭＭＩ−０１００濃度対ピーク面積の線形性プロットを示す。Ｙ切片バイアスを式（ｙ−ｉｎｔ）／（１００％名目濃度についての平均ピーク面積）*１００を使用して０．５％であると計算した（６２．３３９／１２２４２＊１００＝０．５％）。線形性については、許容される相関係数（Ｒ2）値は規定範囲内で＞０．９９５であり、ｙ切片バイアスは、名目濃度で得られたピーク面積の≦５％でなければならない。得られた線形性試験結果はＲ2およびｙ切片試験判断基準を満たす（表３０および図７８）。
【表２９】
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【表３０】
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【０４２８】
実施例８．４〜８のｐＨ範囲を有する様々なバッファー中でのＭＭＩ−０１００の熱加速安定性研究
この研究の目的は、ｐＨ−安定性プロファイルＭＭＩ−０１００を作成すること、選択バッファー中５．５．ｍｇ／ｍＬでのＭＭＩ−０１００の溶解度を決定すること、ｐＨmax（ＭＭＩ−０１００が最も安定であるｐＨ）を決定すること、ｐＨmaxで不純物プロファイルを作成すること、室温および２〜８℃での長期予想または安定性を維持するために凍結乾燥が必要かどうかを決定すること、どちらがＭＭＩ−０１００に対してより良好な溶解度および安定性を提供するかを決定するためＤＩ水とバッファーを比較すること、ならびに５．５ｍｇ／ｍＬでのＭＭＩ−０１００の全ての見かけの粘度変化またはゲル化を観察することであった。
【０４２９】
調製し、試験したＭＭＩ−０１００製剤を表３１で列挙する。
【表３１】
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【０４３０】
０．４ｍＬの各ＭＭＩ−０１００製剤をＨＰＬＣバイアル中に充填させ（各組成物あたり合計５つのバイアル）、表３２に記載される安定性を行った。
【表３２】
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【０４３１】
安定性試料の試験はｐＨ（初期のみ）、外観、ＨＰＬＣアッセイおよび不純物を含んだ。結果を、表３３〜４９に示す。ＣＣ＝透明および無色。
【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
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【０４３２】
クエン酸塩を含むｐＨ６．５、リン酸塩を含むｐＨ７、０．９％ＮａＣｌを含むｐＨ７およびＬ−リジンを含むｐＨ８のＭＭＩ−０１００製剤溶液は曇りを示し、沈殿物の存在が示される。
【０４３３】
図７９ＡおよびＢは２５℃でのアッセイ回収および不純物増大の概要を示す。図８０ＡおよびＢは、４０℃でのアッセイ回収および不純物増大の概要を示す。図８１ＡおよびＢは、６０℃でのアッセイ回収および不純物増大の概要を示す。
【０４３４】
この研究の結果は、下記を示した：
ｉ．ＭＭＩ−０１００は、ｐＨ７で最も安定である；
ｉｉ．リン酸塩およびＮａＣｌは、ｐＨ７でＭＭＩ−０１００の沈殿を誘導した；
ｉｉｉ．クエン酸塩は、ｐＨ６．５でＭＭＩ−０１００の沈殿を誘導した；
ｉｖ．クエン酸塩中では、ＭＭＩ−０１００は、ｐＨ６で最も安定である；
ｖ．ＭＭＩ−０１００についてのｐＨmaxはｐＨ７であり、ＤＩ水（すなわち、バッファーなし）が、最良溶液であった；
ｖｉ．Ｔ−５では、０．２％を越える５つの不純物が初期（Ｔ＝０）試験で検出された；
ｖｉｉ．Ｔ−５では（バッファーなしでｐＨ７）、アッセイ回収は、４０℃で１４日後ほぼ１００％であり、６０℃で７日後９３％であり、有効期間（Ｔ90により規定）が２５℃で２年または５℃で２年である可能性が示される；
ｖｉｉｉ．Ｔ−５がＴ90（例えば１０％アッセイ損失）に到達した場合、７つの不純物は増大して、０．１％を超え得る（上位３つの不純物はＲＲＴ＝１．１４、ＲＲＴ＝０．９４およびＲＲＴ＝０．７０であった）；
ｉｘ．Ｔ−５において６０℃で７日後、アッセイ損失は７％であり、総不純物は２．１２％であり、不純物は２１５ｎｍの検出波長ではより低い消衰係数を有し得ることが示される；ならびに
ｘ．理論により制限されないが、ＲＲＴ＝１．１４、ＲＲＴ＝０．９４不純物は、脱アミノ生成物（Ｇｌｎ8およびＧｌｎ17）であり、ＲＲＴ＝０．７０不純物は加水分解生成物であることが疑われる。
【０４３５】
実施例９．様々な浸透圧剤および／またはリオプロテクタント（Ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含むＤＩ水中、ｐＨ７の複数のＭＭＩ−０１００製剤溶液の安定性の評価
この研究の目的は非緩衝０．７ｍｇ／ｍＬおよび７ｍｇ／ｍＬ水溶液のｐＨ７での浸透圧を決定し、安定性に基づいて浸透圧剤（複数可）を選択し、等浸透圧に到達するのに必要とされる浸透圧剤（複数可）の濃度を計算することであった（例えば、吸入のためのグリセリンＩＩＬ限界は７．３％であり；吸入のためのラクトースＩＩＬ限界は９％である）。
【０４３６】
ＭＭＩ−０１００製剤溶液を表５０に記載されるように調製した。
【表５０】
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【０４３７】
５ｇの各ＭＭＩ−０１００製剤溶液を調製した。０．７ｍＬの各製剤溶液を、ＨＰＬＣガラスバイアルに添加した（それぞれ、５つのバイアル）。１つのＨＰＬＣバイアルをＴ＝０として使用した。残り４つのＨＰＬＣバイアルを６０℃で保存し、０、１、２および４週間に試験した。結果を、表５１〜５９に示す。
【表５１】
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【表５２】
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【表５３】
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【表５４】
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【表５５】
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【表５６】
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【表５７】
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【表５８】
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【表５９】
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【０４３８】
この研究の結果は、下記を示した：
ｉ．バッファーなしでｐＨ７のＭＭＩ−０１００製剤溶液は、高濃度（７ｍｇ／ｍＬ）で、そのｐＨを７で維持することができたが、一方、ｐＨはより低い濃度では（０．７ｍｇ／ｍＬ）約８までドリフトし、７ｍｇ／ｍＬ強度では、ｐＨバッファーは必要とされないことが示される；
ｉｉ．ラクトースの添加により、ｐＨドリフトが得られ（約６まで）、より多くのＭＭＩ−０１００の分解が引き起こされると考えられた；
ｉｉｉ．グリセリンの添加は高濃度製剤においてｐＨドリフトを引き起こさず、よって、グリセリンはラクトースよりも好ましい；
ｉｖ．グリセリンのＭＭＩ−０１００製剤溶液への添加はまた、浸透圧剤を有さない製剤溶液（Ｆ−２）よりも、わずかに多いＭＭＩ−０１００の分解（Ｆ−３）を引き起こし、等張性製剤が必要ない場合、Ｆ−２製剤溶液が好ましいであろう。
【０４３９】
記載された本発明は、その具体的な実施形態を参照しながら記載されたが、本発明の真の主旨および範囲を逸脱することなく様々な変更を実施し得ること、および等価物で代用し得ることは、当業者には理解されるはずである。加えて、記載された本発明の目的とする主旨および範囲に対して、多くの改変を実施して、個々の状況、材料、物質組成、工程、工程ステップまたは複数のステップを採用することが可能である。そのような改変の全てが、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９−１】
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【図５９−２】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018502860.tif 000162