(57)【要約】本開示は、CD137クラスター化および活性化をGPC3陽性腫瘍細胞へ方向づけるために役立ちうる、CD137とGPC3との両方に特異的な融合ポリペプチドを提供する。そのような融合ポリペプチドは、多くの薬学的応用、例えば抗がん作用物質および/または免疫調節物質として、さまざまな腫瘍などのヒト疾患の処置または防止のために使用することができる。本開示は、本明細書に記載の融合ポリペプチドを作製する方法ならびにそのような融合ポリペプチドを含む組成物に関する。本開示はさらに、そのような融合ポリペプチドをコードする核酸分子、ならびにそのような融合ポリペプチドおよび核酸分子の作製方法に関する。加えて本願は、そのような融合ポリペプチド、およびそのような融合ポリペプチドの1つまたは複数を含む組成物の、治療的および/または診断的使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも2つのサブユニットを任意の順序で含み、第1サブユニットはCD137に特異的であり、かつ第2サブユニットはGPC3に特異的である、CD137とGPC3との両方に結合する能力を有する融合ポリペプチド。
【請求項２】
第1サブユニットがCD137に対する結合特異性を有する完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインを含み、かつ第2サブユニットがGPC3に対する結合特異性を有するリポカリンムテインを含む、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
第1サブユニットがCD137に対する結合特異性を有するリポカリンムテインを含み、かつ第2サブユニットがGPC3に対する結合特異性を有するリポカリンムテインを含む、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
免疫グロブリン-Fcフラグメントをさらに含む、請求項3記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
CD137に特異的な第3サブユニットをさらに含む、請求項3記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
第3サブユニットが、CD137に対する結合特異性を有するリポカリンムテインを含む、請求項5記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
本質的に実施例3、実施例8または実施例15に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、少なくとも約5nMのEC50値でCD137に結合することができる、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
本質的に実施例8または実施例15に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、融合ポリペプチドに含まれるCD137に特異的なリポカリンムテインまたは抗体のEC50値と少なくとも同じかそれより優れたEC50値でCD137に結合することができる、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
本質的に実施例6、実施例11、または実施例18に記載するように表面プラズモン共鳴（SPR）分析によって測定した場合に、KDが少なくとも約5nMの親和性でCD137に結合することができる、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
本質的に実施例2、実施例7、実施例12または実施例14に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、少なくとも約5nMのEC50値でGPC3に結合することができる、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
本質的に実施例7、実施例12または実施例14に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、融合ポリペプチドに含まれるGPC3に特異的なリポカリンムテインのEC50値に匹敵するEC50値でGPC3に結合することができる、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
本質的に実施例5、実施例10、または実施例17に記載するように表面プラズモン共鳴（SPR）分析によって測定した場合に、KDが少なくとも約5nMである親和性でGPC3に結合することができる、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
本質的に実施例4、実施例9、実施例13または実施例16に記載するELISAアッセイにおいて測定した場合に、CD137およびGPC3に同時に結合する能力を有する、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
本質的に実施例4、実施例9、実施例13または実施例16に記載するELISAアッセイにおいて測定した場合に、少なくとも約10nMのEC50値でCD137およびGPC3に同時に結合する能力を有する、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
本質的に実施例19に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいてT細胞応答を共刺激する能力を有する、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
本質的に実施例19に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、T細胞刺激の存在下でIL-2生産を誘発することができる、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項１７】
本質的に実施例19に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、T細胞の抗CD3刺激の非存在下ではIL-2生産を誘発しない、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項１８】
本質的に実施例19に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、最適未満（suboptimal）の濃度の抗CD3抗体および抗CD28抗体で刺激されたT細胞の活性化を共刺激する能力を有する、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項１９】
本質的に実施例20に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいてT細胞応答を共刺激する能力を有する、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項２０】
本質的に実施例20に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいてIL-2生産を誘発することができる、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項２１】
本質的に実施例20に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、GPC3標的依存的にT細胞活性化を共刺激する能力を有する、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
GPC3特異的リポカリンムテインが、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の配列位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136および/または175に、少なくとも20個の変異アミノ酸残基を含む、請求項1〜21のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
GPC3特異的リポカリンムテインのアミノ酸配列が、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）との比較において、以下の変異アミノ酸残基
2018519803.tif 000029
のうちの少なくとも1つを含む、請求項1〜21のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項２４】
GPC3特異的リポカリンムテインのアミノ酸配列が、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の配列位置28に対応する配列位置に突然変異を含まない、請求項1〜23のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項２５】
GPC3特異的リポカリンムテインのアミノ酸配列に関して、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置65にある天然N-グリコシル化部位Asnが、該ムテインの対応する配列位置では除去されている、請求項1〜24のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項２６】
GPC3特異的リポカリンムテインのアミノ酸配列が、以下の組のアミノ酸置換
2018519803.tif 000030
2018519803.tif 000031
2018519803.tif 000032
のうちの1つを含む、請求項1〜25のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項２７】
GPC3特異的リポカリンムテインがN-グリコシル化部位を有しない、請求項1〜26のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項２８】
GPC3特異的リポカリンムテインが、SEQ ID NO:4〜17からなる群またはそのフラグメントもしくは変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、該フラグメントまたは変異体は請求項22〜28のいずれか一項記載のアミノ酸残基を含む、請求項1〜27のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項２９】
GPC3特異的リポカリンムテインが、SEQ ID NO:4〜17からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも85％の配列同一性を有する、請求項1〜27のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項３０】
CD137特異的リポカリンムテインが、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の配列位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に、少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含む、請求項1〜21のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項３１】
CD137特異的リポカリンムテインのアミノ酸配列が、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）との比較において、以下の変異アミノ酸残基
2018519803.tif 000033
2018519803.tif 000034
のうちの少なくとも1つを含む、請求項30記載の融合ポリペプチド。
【請求項３２】
CD137特異的リポカリンムテインのアミノ酸配列が、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）との比較において、以下の組のアミノ酸置換
2018519803.tif 000035
2018519803.tif 000036
のうちの1つを含む、請求項30または31のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項３３】
CD137特異的リポカリンムテインが、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の配列位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134に少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含む、請求項1〜21のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項３４】
CD137特異的リポカリンムテインのアミノ酸配列が、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）との比較において、以下の変異アミノ酸残基
2018519803.tif 000037
のうちの少なくとも1つを含む、請求項33記載の融合ポリペプチド。
【請求項３５】
CD137特異的リポカリンムテインのアミノ酸配列が以下の組のアミノ酸置換
2018519803.tif 000038
2018519803.tif 000039
2018519803.tif 000040
のうちの1つを含む、請求項33または34のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項３６】
CD137特異的リポカリンムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:18〜33からなる群またはそのフラグメントもしくは変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、該フラグメントまたは変異体は請求項30〜35のいずれか一項記載のアミノ酸残基を含む、請求項30〜35のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項３７】
前記ムテインのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:18〜33からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも85％の配列同一性を有する、請求項30〜35のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項３８】
1つのサブユニットが、本質的に図1に記載するように、リンカーを介して別のサブユニットに連結されていてよい、請求項1〜37のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項３９】
リンカーがペプチド結合である、請求項38記載の融合ポリペプチド。
【請求項４０】
ペプチド結合が、構造化されていない（G4S）3リンカーである、請求項39記載の融合ポリペプチド。
【請求項４１】
SEQ ID NO:48に示すアミノ酸またはSEQ ID NO:49に示すアミノ酸を含む、請求項1〜40のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項４２】
免疫グロブリンがモノクローナル抗体である、請求項1〜41のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項４３】
モノクローナル抗体がBMS-663513またはPF-05082566である、請求項1〜42のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項４４】
モノクローナル抗体が、SEQ ID NO:34および35によって与えられる重鎖および軽鎖を有する、請求項1〜42のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項４５】
モノクローナル抗体が、SEQ ID NO:51および52によって与えられる重鎖および軽鎖を有する、請求項1〜42のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項４６】
モノクローナル抗体がIgG4バックボーンを有する、請求項1〜45のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項４７】
IgG4バックボーンが、S228P、N297A、F234AおよびL235Aからなる群より選択される突然変異のいずれか1つを有する、請求項46記載の融合ポリペプチド。
【請求項４８】
モノクローナル抗体がIgG2バックボーンを有する、請求項1〜45のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項４９】
IgG2バックボーンが、N297A、F234AおよびL235Aからなる群より選択される突然変異のいずれか1つを有する、請求項46記載の融合ポリペプチド。
【請求項５０】
SEQ ID NO:36および37に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:38および39に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:40および41に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:42および43に示すアミノ酸、SEQ ID NO:44に示すアミノ酸、SEQ ID NO:45に示すアミノ酸、SEQ ID NO:46に示すアミノ酸、SEQ ID NO:47に示すアミノ酸、またはSEQ ID NO:53および54に示すアミノ酸を含む、請求項1〜45のいずれか一項記載の融合ポリペプチド。
【請求項５１】
請求項1〜50のいずれか一項記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項５２】
核酸分子の発現を可能にするための制御配列に機能的に連結されている、請求項51記載の核酸分子。
【請求項５３】
ベクターまたはファージミドベクターに含まれている、請求項51または52記載の核酸分子。
【請求項５４】
請求項51〜53のいずれか一項記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
【請求項５５】
請求項1〜50のいずれか一項記載の融合ポリペプチドを生産する方法であって、融合ポリペプチドが、前記ムテインをコードする核酸から出発して、遺伝子工学的方法を使って生産される、方法。
【請求項５６】
融合ポリペプチドが細菌宿主生物または真核宿主生物中で生産され、かつこの宿主生物またはその培養物から単離される、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
CD137の下流シグナリング経路を活性化し、同時にGPC3陽性腫瘍細胞に会合（engage）するための、請求項1〜50のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物の使用。
【請求項５８】
CD137の下流シグナリング経路を活性化し、同時にGPC3陽性腫瘍細胞に会合するための、請求項1〜50のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物の使用。
【請求項５９】
CD137の下流シグナリング経路を活性化し、同時にGPC3陽性腫瘍細胞に会合する方法であって、請求項1〜50のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
【請求項６０】
T細胞を共刺激し、同時にGPC3陽性腫瘍細胞に会合する方法であって、請求項1〜50のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
【請求項６１】
Tリンパ球増殖を誘発し、同時にGPC3陽性腫瘍細胞に会合する方法であって、請求項1〜50のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
【請求項６２】
T細胞でのCD137クラスター化および活性化をGPC3陽性腫瘍細胞へ方向づける方法であって、請求項1〜50のいずれか一項記載の融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドを含む組成物を適用する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
I.背景
グリピカン-3（GPC3）は、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型ヘパリン硫酸プロテオグリカンのグリピカンファミリーに属する癌胎児性抗原である。GPC3は、発生中に胎児の肝臓および胎盤において発現し、正常成人組織ではダウンレギュレートされるか、発現停止する。GPC3遺伝子中の突然変異およびGPC3遺伝子の枯渇（depletion）は、ヒトにおけるシンプソン・ゴラビ・ベーメル症候群またはシンプソン異形症症候群の原因になる。GPC3は、さまざまな癌、特に肝細胞癌（「HCC」）、黒色腫、メルケル細胞癌、ウィルムス腫瘍、および肝芽腫において発現する（He, H. et al Applied Immunohistochem Mol Morphol.17:40-6（2009）（非特許文献1）; Jakubovic and Jothy; Ex.Mol.Path.82:184-189（2007）（非特許文献2）; Nakatsura and Nishimura、Biodrugs 19（2）:71-77（2005）（非特許文献3））。HCCは全世界的な癌関連死因の第3位である。HCCは、毎年、約100万例の死亡原因になる（Nakatsura and Nishimura、Biodrugs 19（2）:71-77（2005）（非特許文献3））。
【０００２】
HCCなどのGPC3発現癌に対する効果的処置には、GPC3を標的とし、しかも抗腫瘍効果を生じる治療化合物が必要である。
【０００３】
CD137は、共刺激免疫受容体であり、腫瘍壊死因子受容体（TNFR）スーパーファミリーのメンバーである。これは主に、活性化CD4＋およびCD8＋ T細胞上、活性化B細胞上、ならびにナチュラルキラー（NK）細胞上に発現するが、休止単球および休止樹状細胞上（Li, S. Y. et al., Clin Pharmacol 2013 5（Suppl 1）:47-53（非特許文献4））または内皮細胞上（Snell, L. M. et al., Immunol Rev 2011 Nov; 244（1）:197-217（非特許文献5））にも見いだすことができる。CD137は免疫応答の制御に重要な役割を果たすので、がん免疫治療の標的である。CD137リガンド（CD137L）はCD137の唯一公知の天然リガンドであって、活性化B細胞、単球、および脾臓樹状細胞などの数タイプのAPC上に構成的に発現しており、Tリンパ球上に誘導されうる。
【０００４】
CD137Lは、膜結合型および可溶性変異体として存在する三量体型タンパク質である。しかし、可溶性CD137Lが持つ、CD137（例えばCD137発現リンパ球上のCD137）を活性化する能力は限られており、効果を引き出すには高い濃度が要求される（Wyzgol, A. et al., J Immunol 2009 Aug 1183（3）:1851-1861（非特許文献6））。CD137の天然の活性化は、CD137陽性細胞がCD137L陽性細胞と会合（engage）することによって起こる。次に、相対する細胞上のCD137Lによるクラスター化によってCD137活性化が誘発され、それがTRAF1、2および3を介したシグナリング（Snell, L. M. et al., Immunol Rev 2011 Nov; 244（1）:197-217（非特許文献5）、Yao, S. et al., Nat Rev Drug Disc 2013 Feb; 12（2）:130-146（非特許文献7））およびCD137陽性T細胞におけるさらなる付随下流効果につながると考えられている。各々のコグネイトターゲットを認識することによって活性化されたT細胞の場合、CD137の共刺激によって引き出される効果は、活性化のさらなる強化、生存および増殖の強化、炎症誘発性サイトカインの生産、ならびに殺能力の向上である。
【０００５】
がん細胞の排除にとってのCD137共刺激の利益は、いくつかの前臨床インビボモデルで証明されている。例えば腫瘍上にCD137Lを強制的に発現させると、腫瘍拒絶が起こる（Melero, I. et al., Eur J Immunol 1998 Mar; 28（3）:1116-1121（非特許文献8））。同様に、腫瘍上に抗CD137 scFvを強制的に発現させると、腫瘍のCD4＋T細胞およびNK細胞依存的排除が起こる（Ye, Z. et al., Nat Med 2002 Apr; 8（4）:343-348（非特許文献9）、Zhang, H. et al., Mol Canc Ther 2006 Jan; 5（1）:149-155（非特許文献10）、Yang, Y. et al., Canc Res 2007 Mar 1; 67（5）:2339-2344（非特許文献11））。抗CD137抗体を全身性に投与すると、腫瘍成長の遅延が起こることも証明されている（Martinet, O. et al., Gene Ther 2002 Jun; 9（12）:786-792（非特許文献12））。
【０００６】
CD137はヒト腫瘍における天然の腫瘍反応性T細胞の優れたマーカーであること（Ye, Q. et al., Clin Canc Res: 2014 Jan 1; 20（1）:44-55（非特許文献13））、そして養子T細胞治療に応用する目的でCD8＋黒色腫腫瘍浸潤性リンパ球の拡大および活性を改善するために、抗CD137抗体を使用できること（Chacon, J. A. et al., PloS One 2013 8（4）:e60031（非特許文献14））が示されている。
【０００７】
CD137共刺激の潜在的治療利益が前臨床的に証明されたことで、CD137を標的とする治療抗体BMS-663513（Jure-Kunkel, M.らの米国特許第7288638号（特許文献1））およびPF-05082566（Fisher, T.S. et al., Canc Immunol Immunother 2012 Oct; 61（10）:1721-1733（非特許文献15））の開発に拍車がかかった。これらはどちらも、現在、初期臨床治験中である。
【０００８】
しかし、三価の可溶性CD137Lが活性を欠くのと同様に、抗体のような二価CD137結合物質も、それだけでは、T細胞上またはNK細胞上のCD137をクラスター化して効率的な活性化をもたらすには十分でない可能性が理解されたのは、最近になってからである。前臨床マウスモデルを利用した最近の刊行物には、実際のところ、他の抗TNFR抗体の作用様式は、抗体がそのFc部分を介してFc-ガンマ受容体発現細胞上のFc-ガンマ受容体と相互作用することを必要とするという、インビボでの証拠が提示されている（Bulliard, Y. et al., J Exp Med 2013 Aug 26; 210（9）:1685-1693（非特許文献16）、Bulliard, Y. et al., Immunol Cell Biol 2014 Jul; 92（6）:475-480（非特許文献17））。それゆえに、現在臨床開発中の抗体の作用様式は、Fc-ガンマ受容体による非標的型（non-targeted）のクラスター化に支配される可能性があり、それは、腫瘍の近傍におけるFc-γ発現細胞の存在に、ほぼランダムに依存しうる。
【０００９】
したがって、腫瘍標的型（tumor-targeted）の特異的作用様式でCD137をクラスター化し活性化する治療薬の創製には、未充足のニーズがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第7288638号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】He, H. et al Applied Immunohistochem Mol Morphol.17:40-6（2009）
【非特許文献２】Jakubovic and Jothy; Ex.Mol.Path.82:184-189（2007）
【非特許文献３】Nakatsura and Nishimura、Biodrugs 19（2）:71-77（2005）
【非特許文献４】Li, S. Y. et al., Clin Pharmacol 2013 5（Suppl 1）:47-53
【非特許文献５】Snell, L. M. et al., Immunol Rev 2011 Nov; 244（1）:197-217
【非特許文献６】Wyzgol, A. et al., J Immunol 2009 Aug 1183（3）:1851-1861
【非特許文献７】Yao, S. et al., Nat Rev Drug Disc 2013 Feb; 12（2）:130-146
【非特許文献８】Melero, I. et al., Eur J Immunol 1998 Mar; 28（3）:1116-1121
【非特許文献９】Ye, Z. et al., Nat Med 2002 Apr; 8（4）:343-348
【非特許文献１０】Zhang, H. et al., Mol Canc Ther 2006 Jan; 5（1）:149-155
【非特許文献１１】Yang, Y. et al., Canc Res 2007 Mar 1; 67（5）:2339-2344
【非特許文献１２】Martinet, O. et al., Gene Ther 2002 Jun; 9（12）:786-792
【非特許文献１３】Ye, Q. et al., Clin Canc Res: 2014 Jan 1; 20（1）:44-55
【非特許文献１４】Chacon, J. A. et al., PloS One 2013 8（4）:e60031
【非特許文献１５】Fisher, T.S. et al., Canc Immunol Immunother 2012 Oct; 61（10）:1721-1733
【非特許文献１６】Bulliard, Y. et al., J Exp Med 2013 Aug 26; 210（9）:1685-1693
【非特許文献１７】Bulliard, Y. et al., Immunol Cell Biol 2014 Jul; 92（6）:475-480
【発明の概要】
【００１２】
この未充足のニーズを満たすために、本願は、以下の特性、すなわち
（a）CD137に対する結合特異性、および
（b）GPC3に対する結合特異性
を有する融合ペプチドによってCD137と腫瘍抗原GPC3とに同時に会合する新規なアプローチを提供する。
【００１３】
この融合ポリペプチドは、腫瘍細胞上に発現しているGPC3を介して、腫瘍標的依存的な、リンパ球上のCD137の活性化をもたらすように設計される。そのような分子は、GPC3陽性腫瘍の近傍に位置するT細胞および/またはNK細胞を、さらに活性化すると予想される。そのような二重特異性物質は、抗GPC3抗体または抗CD137抗体よりも改善された治療効果を呈しうる。
【００１４】
II.定義
以下の一覧では、本明細書の全体を通して使用される用語、語句、および略号を定義する。本明細書に列挙して定義する用語はいずれも、すべての文法形式を包含するものとする。
【００１５】
本明細書において使用する場合、別段の指定がある場合を除き、「CD137」はヒトCD137を意味し、これにはヒトCD137の変異体、アイソフォームおよび種ホモログが包含される。CD137は、「4-1BB」または「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9（TNFRSF9）」または「ILA（induced by lymphocyte activation）」としても公知である。ヒトCD137とは、UniProt Q07011によって規定される完全長タンパク質、そのフラグメント、またはその変異体を意味する。
【００１６】
本明細書において使用する場合、別段の指定がある場合を除き、「GPC3」とはヒトGPC3を意味し、これにはヒトGPC3の変異体、アイソフォームおよび種ホモログが包含される。GPC3は、「グリピカン-3」、「グリピカンプロテオグリカン3」、「GPC3」、「OTTHUMP00000062492」、「GTR2-2」、「SGB」、「DGSX」、「SDYS」、「SGBS」、「OCI-5」、および「SGBSI」としても公知であり、それらは相互可換的に使用される。ヒトGPC3とは、UniProt P51654によって規定される完全長タンパク質、そのフラグメント、またはその変異体を意味する。本明細書において使用する場合、「検出可能な親和性」とは、一般に少なくとも約10-5M以下の親和性定数で、選択された標的に結合する能力を意味する。これより低い親和性は、一般に、ELISAなどの一般的方法ではもはや測定することができず、それゆえに、あまり重要ではない。
【００１７】
本明細書において、選択された標的（この場合はCD137および/またはGPC3）に対する、本開示のタンパク質（例えばリポカリンのムテイン）またはその融合ポリペプチドの「結合親和性」は、当業者に公知の数多くの方法によって測定することができる（そしてそれによってムテイン-リガンド複合体のKD値が決定される）。そのような方法には、蛍光滴定、競合ELISA、等温滴定熱量測定（ITC）などの熱量測定法、および表面プラズモン共鳴（BIAcore）などがあるが、それらに限定されるわけではない。そのような方法は当技術分野において確立されており、その例を以下にも詳述する。
【００１８】
また、それぞれの結合物質とそのリガンドとの間の複合体形成は、それぞれの結合パートナーの濃度、競合物質の存在、使用する緩衝系のpHおよびイオン強度、ならびに解離定数KDの決定に使用される実験方法（例えば蛍光滴定、競合ELISAまたは表面プラズモン共鳴であるが、これらはほんの一例に過ぎない）、さらには実験データの評価に使用される数学的アルゴリズムなどといった、多種多様な因子の影響を受けることに注意されたい。
【００１９】
それゆえに、所与のリガンドに対する特定リポカリンムテインの親和性を決定するために使用される方法および実験装置に依存して、KD値（それぞれの結合物質とその標的/リガンドとの間に形成される複合体の解離定数）が一定の実験範囲内で変動しうることは、当業者にとっては明らかである。これは、例えばそのKD値が表面プラズモン共鳴（Biacore）で決定されたか、競合ELISAで決定されたか、または「直接ELISA」で決定されたかなどに依存して、測定されるKD値にはわずかな偏差、または許容誤差範囲が存在しうることを意味する。
【００２０】
本明細書にいう「ムテイン」、「変異（mutated）」実体（entity）（タンパク質であるか核酸であるかを問わない）、または「突然変異体（mutant）」とは、天然（野生型）の核酸またはタンパク質「リファレンス」スキャフォールドと比較した、1つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の交換、欠失、または挿入を指す。この用語は、本明細書に記載するムテインおよび変異体（variant）のフラグメントも包含する。本発明のリポカリンムテイン、そのフラグメントまたは変異体は、好ましくは、本明細書に記載するようにCD137および/またはGPC3に結合する機能を保っている。
【００２１】
本開示のムテインに関連して本明細書において使用する用語「フラグメント」は、N末および/またはC末が短縮された、すなわち少なくとも1つのN末および/またはC末アミノ酸を欠く、完全長成熟ヒト涙液リポカリンまたはヒトリポカリン2から誘導されるタンパク質またはペプチドに関する。そのようなフラグメントは、成熟リポカリンの一次配列のうちの少なくとも10個またはそれ以上、例えば20個もしくは30個またはそれ以上の連続アミノ酸を含むことができ、通常は、成熟リポカリンのイムノアッセイで検出可能である。一般に、本開示のリポカリンムテインの、または本開示による組み合わせの、または本明細書に記載する融合タンパク質の、対応タンパク質リガンドであるCD137および/またはGPC3に関連して本明細書において使用する用語「フラグメント」は、N末および/またはC末が短縮されたタンパク質またはペプチドリガンドであって、本開示のムテインによって認識されかつ/または結合されるという完全長リガンドの能力を保っているものに関する。
【００２２】
本明細書において使用する用語「突然変異誘発」は、成熟リポカリンの所与の配列位置に本来存在するアミノ酸を、それぞれの天然ポリペプチド配列中のその特定位置には存在しない少なくとも1つのアミノ酸で置換することができるように、実験条件が選ばれることを意味する。「突然変異誘発」という用語は、1つまたは複数のアミノ酸の欠失または挿入による配列セグメントの長さの（付加的）修飾も包含する。したがって、例えば、選ばれた配列位置にある1つのアミノ酸が、一続きになった3つのランダム突然変異で置き換えられて、野生型タンパク質のそれぞれのセグメントの長さと比較して2つのアミノ酸残基が挿入されたことになるのは、本開示の範囲内である。そのような挿入または欠失は、本開示において突然変異誘発の対象となりうるペプチドセグメントのいずれにおいても、互いに独立して導入されうる。本開示の例示的一態様では、数個の突然変異の挿入が、選ばれたリポカリンスキャフォールドのループAB中に導入されうる（国際特許出願WO 2005/019256参照。この特許出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
【００２３】
「ランダム突然変異誘発」という用語は、前もって決定された単一アミノ酸（突然変異）が一定の配列位置に存在するのではなくて、突然変異誘発中に所定の配列位置に少なくとも2種類のアミノ酸が一定の確率で組み込まれうることを意味する。
【００２４】
「同一性」とは、配列間の類似性または関係性を測る配列の一特性である。本開示において使用する「配列同一性」または「同一性」という用語は、本開示のポリペプチドの配列を問題の配列と（相同）アラインメントした後の、それら2つの配列のうちの長い方の残基数を基準とした、ペアごとの同一残基のパーセンテージを意味する。配列同一性は、同一アミノ酸残基の数を残基の総数で割り、その結果に100を掛けることによって測られる。
【００２５】
「相同性」という用語は、本明細書では、その通常の意味で使用され、本開示のポリペプチド（例えば本開示の任意のリポカリンムテイン）の直鎖アミノ酸配列において等価な位置にある同一アミノ酸ならびに保存的置換とみなされるアミノ酸（例えばアスパラギン酸残基によるグルタミン酸残基の交換）を包含する。
【００２６】
配列相同性または配列同一性のパーセンテージは、ここでは、例えばプログラムBLASTP、バージョンblastp 2.2.5（2002年11月16日; Altschul, S. F. et al.（1997）Nucl. Acids Res. 25, 3389-3参照）を使って決定することができる。この態様において、相同性のパーセンテージは、プロペプチド配列を含む全ポリペプチド配列のアラインメントに基づき（行列: BLOSUM 62; ギャップコスト: 11.1; カットオフ値は10-3に設定）、好ましくは野生型タンパク質スキャフォールドを、ペアワイズ比較におけるリファレンスとして使用する。これは、アラインメントのためにプログラムが選択したアミノ酸の総数で割った、BLASTPプログラム出力に結果として示される「ポジティブ（positive）」（相同アミノ酸）の数のパーセンテージとして計算される。
【００２７】
具体的には、野生型リポカリンとは異なるリポカリン（ムテイン）のアミノ酸配列のアミノ酸残基が、野生型リポカリンのアミノ酸中の一定の位置に対応するかどうかを決定するために、当業者は、例えば手作業によるアラインメント、またはBLAST2.0（Basic Local Alignment Search Toolの略）もしくはClustalWなどのコンピュータプログラム、または配列アラインメントを作成するのに適した他の任意の適切なプログラムを使ったアラインメントなど、当技術分野において周知の手段および方法を使用することができる。したがって、野生型リポカリンが「対象配列」または「リファレンス配列」となるのに対して、本明細書に記載する野生型リポカリンとは異なるリポカリンのアミノ酸配列は「クエリー配列」になる。「リファレンス配列」および「野生型配列」という用語は、本明細書では相互可換的に使用される。好ましい野生型リポカリンをSEQ ID NO:1（Tlc）またはSEQ ID NO:2（NGAL）にそれぞれ示す。本発明のリポカリンムテインがそれぞれTlcに基づくかNGALに基づくかに応じて、対応野生型リポカリンをリファレンス配列または野生型配列として使用しうる。
【００２８】
「ギャップ」とは、アミノ酸の付加または欠失の結果であるアラインメント中の空白をいう。したがって、厳密に同じ配列である2つのコピーは100％の同一性を有するが、それほど高度には保存されていなくて、欠失、付加、または置き換えを有する配列は、それより程度の低い配列同一性を有しうる。標準的なパラメータを使って配列同一性を決定するために、例えばBlast（Altschul, et al.（1997）Nucleic Acids Res. 25, 3389-3）、Blast2（Altschul, et al.（1990）J. Mol. Biol. 215, 403-3）、およびSmith-Waterman（Smith, et al.（1981）J. Mol. Biol. 147, 195-3）など、いくつかのコンピュータプログラムが利用可能であることは、当業者にはわかるであろう。
【００２９】
本開示において使用する用語「変異体」は、置換、欠失、挿入または化学修飾などによるアミノ酸配列の修飾を含む、タンパク質またはペプチドの誘導体に関する。そのような修飾は、いくつかの態様では、タンパク質またはペプチドの機能性を低減しない。そのような変異体には、1つまたは複数のアミノ酸が各々のD-立体異性体で置き換えられているか、20種類の天然アミノ酸以外のアミノ酸、例えばオルニチン、ヒドロキシプロリン、シトルリン、ホモセリン、ヒドロキシリジン、ノルバリンなどで置き換えられている、タンパク質が包含される。しかし、そのような置換は保存的であってもよく、すなわちアミノ酸残基は、化学的に類似するアミノ酸残基で置き換えられる。保存的置換の例は、以下のグループのメンバー間での置き換えである:1）アラニン、セリン、およびスレオニン; 2）アスパラギン酸およびグルタミン酸; 3）アスパラギンおよびグルタミン; 4）アルギニンおよびリジン; 5）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン;ならびに6）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。本開示のリポカリンムテインの、または本開示による組み合わせの、または本明細書に記載する融合タンパク質の、対応タンパク質リガンドであるCD137および/またはGPC3に関連して本明細書において使用する用語「変異体」は、それぞれ野生型CD137またはGPC3タンパク質、例えば本明細書に記載するとおりUniProtに登録されたCD137またはGPC3リファレンスタンパク質と比較して、1つまたは複数の、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、50、60、70、80個またはそれ以上の、アミノ酸の置換、欠失および/または挿入を有する、それぞれ、CD137またはそのフラグメントに関する。CD137変異体は、それぞれ、好ましくは、野生型ヒトCD137またはGPC3、例えば本明細書に記載するとおりUniProtに登録されたCD137またはGPC3リファレンスタンパク質に対して、少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％または95％のアミノ酸同一性を有する。
【００３０】
「ネイティブ配列」リポカリンとは、自然から得られる対応ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するリポカリンを意味する。したがってネイティブ配列リポカリンは、任意の生物からの、特に哺乳動物からの、それぞれの天然リポカリンのアミノ酸配列を有することができる。そのようなネイティブ配列ポリペプチドは、自然から単離するか、組換え手段または合成手段によって生産することができる。「ネイティブ配列」ポリペプチドという用語は、リポカリンの天然切断型または天然分泌型、リポカリンの天然変異体型、例えば選択的スプライス型または天然対立遺伝子変異体を、特に包含する。ポリペプチド「変異体」とは、ネイティブ配列ポリペプチドに対して少なくとも約50％、60％、70％、80％または少なくとも約85％のアミノ酸配列同一性を有する、生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば、ポリペプチドのN末またはC末において1つまたは複数のアミノ酸残基が付加されまたは欠失しているポリペプチドが含まれる。一般に変異体は、ネイティブ配列ポリペプチドに対して、少なくとも約70％の、例えば少なくとも約80％、例えば少なくとも約85％の、アミノ酸配列同一性、例えば少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有する。具体例として、本開示の涙液リポカリン（Tlc）ムテインでは、タンパク質の生物学的機能に影響を及ぼすことなく、N末の最初の4アミノ酸残基（His-His-Leu-Leu）およびC末の最後の2アミノ酸残基（Ser-Asp）を欠失させることができる。加えて、別の具体例として、本開示のリポカリン2（NGAL）ムテインでは、タンパク質の生物学的機能に影響を及ぼすことなく、一定のアミノ酸残基を、例えば（Lys-Asp-Pro、位置46〜48）を、欠失させることができる。
【００３１】
本開示において使用する場合、「位置」という用語は、本明細書に示すアミノ酸配列内でのアミノ酸の位置、または本明細書に示す核酸配列内でのヌクレオチドの位置を意味する。1つまたは複数のリポカリンムテインのアミノ酸配列位置との関連で本明細書において使用される「対応する」または「対応」という用語を理解するために、対応位置は、先行するヌクレオチド/アミノ酸の数だけでは決定されない。したがって、本開示によれば、置換されうる所与のアミノ酸の位置は、（突然変異体または野生型）リポカリン中の他のどこかにあるアミノ酸の欠失または付加ゆえに、変動しうる。同様に、本開示によれば、置換されうる所与のヌクレオチドの位置も、ムテインまたは野生型リポカリン5'-非翻訳領域（UTR）、例えばプロモーターおよび/または他の任意の制御配列もしくは制御遺伝子（エクソンおよびイントロンを含む）中の他のどこかにある欠失または追加ヌクレオチドゆえに、変動しうる。
【００３２】
このように、本開示による対応位置に関して、ヌクレオチド/アミノ酸の位置は、類似の隣接ヌクレオチド/アミノ酸とは、表示される数字の点で異なりうるが、交換、欠失または付加されうる該隣接ヌクレオチド/アミノ酸も、当該1つまたは複数の対応位置によって含まれると理解されることが好ましい。
【００３３】
加えて、本開示によるリファレンススキャフォールドに基づくリポカリンムテイン中の対応位置については、リポカリン間の高度に保存された全体的フォールディングパターンに照らして当業者には理解されるとおり、ヌクレオチド/アミノ酸の位置は、たとえそれらが表示される数字の点で異なっていたとしても、（突然変異体または野生型）リポカリン中の他のどこかにある位置と、構造的に対応していると理解されることが好ましい。
【００３４】
本明細書において使用する「検出する」、「検出」、「検出可能な」または「検出すること」という単語は、定量的レベルおよび定性的レベルの両方で、ならびにそれらの組み合わせで、理解される。したがってこれは、関心対象の分子の定量的、半定量的および定性的測定を包含する。
【００３５】
「対象」は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。「哺乳動物」という用語は、本明細書では、哺乳動物に分類される任意の動物を指すために使用され、ヒト、家畜および農用動物、ならびに動物園動物、スポーツ動物、またはペット動物、例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ラット、ブタ、サル、例えばカニクイザルなどを含むが、ここでは具体例をいくつか挙げただけで、これらに限定されるわけではない。好ましくは、本明細書における哺乳動物はヒトである。
【００３６】
「有効量」とは、有益な結果または所望の結果を達成するのに十分な量である。有効量は1回または複数回の投与で投与することができる。
【００３７】
「試料」は、任意の対象から採取された生物学的試料と定義される。生物学的試料には、血液、血清、尿、糞便、精液、または組織が包含されるが、それらに限定されるわけではない。
【００３８】
本明細書において開示する融合ポリペプチドの「サブユニット」は、当該ポリペプチドのうちの一続きのアミノ酸であって、その一続きが、該ポリペプチドのユニークな機能単位を規定しているもの、例えば標的に対する結合モチーフを与えるものと定義される。
【００３９】
本明細書に記載する「融合ポリペプチド」は、2つまたはそれ以上のサブユニットを含み、これらのサブユニットのうちの少なくとも1つはGPC3に結合し、もう一つのサブユニットはCD137に結合する。融合ポリペプチド内で、これらのサブユニットは、共有結合的連結または非共有結合的連結によって連結されうる。好ましくは、融合ポリペプチドは、前記2つまたはそれ以上のサブユニットの間の翻訳融合物である。翻訳融合物は、1つのサブユニットのコード配列をもう一つのサブユニットのコード配列とインフレームで遺伝子操作することによって作製しうる。両サブユニットの間にはリンカーをコードするヌクレオチド配列が挿入されていてもよい。ただし、本開示の融合ポリペプチドのサブユニットは、化学リンカー（chemical linker）によって連結されていてもよい。
【００４０】
本開示の融合ポリペプチドが含みうる「リンカー」は、本明細書に記載する融合ポリペプチドの2つまたはそれ以上のサブユニットを連結する。この連結は共有結合的または非共有結合的であることができる。好ましい共有結合的連結は、アミノ酸間のペプチド結合などといったペプチド結合によるものである。したがって好ましい一態様において該リンカーは、1つまたは複数のアミノ酸、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20個またはそれ以上のアミノ酸で構成される。好ましいリンカーを本明細書に記載する。他の好ましいリンカーは化学リンカーである。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
III.図面の説明
【図１】標的GPC3およびCD137に関して二重特異性である本願に記載の融合ポリペプチドの設計を概観した図である。3つの異なるアプローチを使用した。図1（A）において、1組目の融合ポリペプチドは、CD137に特異的な抗体（例えばSEQ ID NO:34および35の抗体）と、GPC3に特異的なリポカリンムテイン（例えばSEQ ID NO:10のリポカリンムテイン）とに基づく。生成するポリペプチドは、抗体の4つの末部のいずれか1つへのリポカリンムテインの単一融合物である。融合物はいずれも、フレキシブルな（G4S）3リンカー（例えばSEQ ID NO:49のリンカー）などのリンカーによって連結されている。図1（B）において、2組目の融合ポリペプチドは、工学的に操作されたIgG4-Fcフラグメント（SEQ ID NO:73）に融合された2つのリポカリンムテイン（例えばSEQ ID NO:10のGPC3特異的リポカリンムテインおよびSEQ ID NO:26のCD137特異的リポカリンムテイン）に基づく。また、図1（C）において、3組目の融合タンパク質は、（G4S）2リンカー（例えばSEQ ID NO:48のリンカー）などの1つまたは複数のリンカーによって連結された2つのリポカリンムテイン（例えばSEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:26）に基づき、ここでは、GPC3特異的リポカリンムテインがCD137特異的リポカリンムテインに融合されるか（例えばSEQ ID NO:46の場合）、GPC3特異的リポカリンムテインと2つのCD137特異的リポカリンムテインとが一つに融合される（例えばSEQ ID NO:47の場合）。
【図２】標的GPC3に対する、SEQ ID NO:36および37、SEQ ID NO:38および39、SEQ ID NO:40および41、ならびにSEQ ID NO:42および43の融合ポリペプチド、ならびにSEQ ID NO:10のリポカリンムテインの特異性を決定した、代表的実験を掲載する図である。GPC3をマイクロタイタープレートにコーティングし、被験分子をタイトレートした。実施例2に記載するように、結合した分子をHRP標識抗ヒトNGAL特異的抗体によって検出した。データの当てはめは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定して、1:1結合モデルで行った。その結果得られたEC50値を表1に掲載する。
【図３】標的CD137に対する、SEQ ID NO:36および37、SEQ ID NO:38および39、SEQ ID NO:40および41の融合ポリペプチド、ならびにSEQ ID NO:34および35の抗体の特異性を決定した、代表的実験を掲載する図である。ヒトCD137のFc融合物をマイクロタイタープレートにコーティングし、被験分子をタイトレートした。実施例3に記載するように、結合した分子をHRP標識抗ヒトIgG Fc抗体によって検出した。データの当てはめは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定して、1:1結合モデルで行った。その結果得られたEC50値を表2に掲載する。
【図４】SEQ ID NO:36および37、SEQ ID NO:38および39、SEQ ID NO:40および41の融合ポリペプチドの、GPC3およびCD137の両標的に同時に結合する能力を決定した、代表的実験を掲載する図である。組換えCD137-Fc融合タンパク質をマイクロタイタープレートにコーティングし、続いて融合タンパク質のタイトレーションを行った。次に、定濃度のビオチン化ヒトGPC3を加え、実施例4に記載するように、それをHRP標識エクストラビジンによって検出した。データの当てはめは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定して、1:1結合モデルで行った。その結果得られたEC50値を表3に掲載する。
【図５】標的GPC3に対するSEQ ID NO:36および37、SEQ ID NO:38および39、SEQ ID NO:40および41の融合ポリペプチド、ならびにリポカリンムテインSEQ ID NO:10の親和性を、表面プラズモン共鳴（SPR）によって決定した、代表的実験を掲載する図である。ビオチン化GPC3をセンサーチップ上に固定化し、実施例5に記載するように、融合ポリペプチドおよびリポカリンムテインの結合を複数の異なる濃度で分析した。その結果得られたKD値を表4に掲載する。
【図６】ビオチン化CD137-Fc融合物に対する、SEQ ID NO:36および37、SEQ ID NO:38および39、SEQ ID NO:40および41の融合ポリペプチド、ならびにSEQ ID NO:34および35の抗体の親和性を、表面プラズモン共鳴（SPR）によって決定した、代表的実験を掲載する図である。ビオチン化CD137-Fcをセンサーチップ上に固定化し、実施例6に記載するように、融合タンパク質の結合を複数の異なる濃度で分析した。その結果得られたKD値を表5に掲載する。
【図７】標的GPC3に対する、SEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45のリポカリンムテイン-Fc融合ポリペプチドならびにSEQ ID NO:10のリポカリンムテインの特異性を決定した、代表的実験を掲載する図である。GPC3をマイクロタイタープレートにコーティングし、被験分子をタイトレートした。実施例7に記載するように、結合した分子をHRP標識抗ヒトNGAL特異的抗体によって検出した。データの当てはめは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定して、1:1結合モデルで行った。その結果得られたEC50値を表6に掲載する。
【図８】CD137に対する、SEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45のリポカリンムテイン-Fc融合ポリペプチドならびにSEQ ID NO:26のリポカリンムテインの特異性を決定した、代表的実験を掲載する図である。ヒトCD137のFc融合物をマイクロタイタープレートにコーティングし、被験分子をタイトレートした。実施例8に記載するように、結合した分子をHRP標識抗ヒトIgG Fc抗体によって検出した。データの当てはめは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定して、1:1結合モデルで行った。その結果得られたEC50値を表7に掲載する。
【図９】SEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45のリポカリンムテイン-Fc融合ポリペプチドの、標的GPC3およびCD137に同時に結合する能力を決定した、代表的実験を掲載する図である。組換えCD137-Fc融合タンパク質をマイクロタイタープレートにコーティングし、続いてリポカリンムテイン-Fc融合ポリペプチドのタイトレーションを行った。次に、定濃度のビオチン化ヒトGPC3を加え、実施例9に記載するように、それをHRP標識エクストラビジンによって検出した。データの当てはめは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定して、1:1結合モデルで行った。その結果得られたEC50値を表8に掲載する。
【図１０】標的GPC3に対する、SEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45のリポカリンムテイン-Fc融合ポリペプチドならびにSEQ ID NO:10のリポカリンムテインの親和性を、表面プラズモン共鳴（SPR）によって決定した、代表的実験を掲載する図である。ビオチン化GPC3をセンサーチップ上に固定化し、融合ポリペプチドおよびリポカリンムテインの結合を複数の異なる濃度で分析した。その結果得られたKD値を表9に掲載する。
【図１１】ビオチン化CD137-Fcに対する、SEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45のリポカリンムテイン-Fc融合ポリペプチドならびにSEQ ID NO:26のリポカリンムテインの親和性を、表面プラズモン共鳴（SPR）によって決定した、代表的実験を掲載する図である。ビオチン化CD137-Fcをセンサーチップ上に固定化し、融合ポリペプチドおよびリポカリンムテインの結合を複数の異なる濃度で分析した。その結果得られたKD値を表10に掲載する。
【図１２】標的GPC3に対する、SEQ ID NO:53および54の融合ポリペプチドならびにSEQ ID NO:10のリポカリンムテインの特異性を決定した、代表的実験を掲載する図である。GPC3をマイクロタイタープレートにコーティングし、被験分子をタイトレートした。実施例12に記載するように、結合した分子をHRP標識抗ヒトNGAL特異的抗体によって検出した。データの当てはめは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定して、1:1結合モデルで行った。その結果得られたEC50値を表11に掲載する。
【図１３】SEQ ID NO:53および54の融合ポリペプチドの、GPC3およびCD137両標的に同時に結合する能力を決定した、代表的実験を掲載する図である。組換えCD137-Fc融合タンパク質をマイクロタイタープレートにコーティングし、続いて融合タンパク質のタイトレーションを行った。次に、定濃度のビオチン化ヒトGPC3を加え、実施例13に記載するように、それをHRP標識エクストラビジンによって検出した。データの当てはめは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定して、1:1結合モデルで行った。
【図１４】標的GPC3に対する、2つの二重特異性融合ポリペプチドSEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:47ならびにSEQ ID NO:8のリポカリンムテインの特異性を決定した、代表的実験を掲載する図である。GPC3をマイクロタイタープレートにコーティングし、被験分子をタイトレートした。実施例14に記載するように、結合した分子をHRP標識ヒトNGAL特異的抗体によって検出した。データの当てはめは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定して、1:1結合モデルで行った。その結果得られたEC50値を表12に掲載する。
【図１５】標的CD137に対する、SEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:47の2つの二重特異性融合ポリペプチドならびにSEQ ID NO:26のリポカリンムテインの特異性を決定した、代表的実験を掲載する図である。ヒトCD137のFc融合物をマイクロタイタープレートにコーティングし、被験分子をタイトレートした。実施例15に記載するように、結合した分子をHRP標識抗ヒトIgG Fc抗体によって検出した。データの当てはめは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定して、1:1結合モデルで行った。その結果得られたEC50値を表13に掲載する。
【図１６】SEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:47の2つの二重特異性融合ポリペプチドの、標的GPC3およびCD137に同時に結合する能力を決定した、代表的実験を掲載する図である。組換えCD137-Fc融合タンパク質をマイクロタイタープレートにコーティングし、続いて融合タンパク質のタイトレーションを行った。次に、定濃度のビオチン化ヒトGPC3を加え、実施例16に記載するように、それをHRP標識エクストラビジンによって検出した。データの当てはめは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定して、1:1結合モデルで行った。その結果得られたEC50値を表14に掲載する。
【図１７】標的GPC3に対する、SEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:47の2つの二重特異性融合ポリペプチドならびにSEQ ID NO:8のリポカリンムテインの親和性を表面プラズモン共鳴（SPR）によって決定した、代表的実験を掲載する図である。ビオチン化GPC3をセンサーチップ上に固定化し、融合ポリペプチドの結合を複数の異なる濃度で分析した。その結果得られたKD値を表15に掲載する。
【図１８】CD137-Fcに対する、SEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:47の2つの二重特異性融合ポリペプチドならびにリポカリンムテインSEQ ID NO:26の親和性を表面プラズモン共鳴（SPR）によって決定した、代表的実験を掲載する図である。ヒトCD137-Fcをセンサーチップ上に固定化し、融合タンパク質の結合を複数の異なる濃度で分析した。その結果得られたKD値を表16に掲載する。
【図１９】プラスチック製培養ディッシュにコーティングした場合の、SEQ ID NO:36および37、SEQ ID NO:38および39、SEQ ID NO:40および41、ならびにSEQ ID NO:42および43の融合ポリペプチドの、T細胞応答を共刺激する能力を調べた、代表的実験を掲載する図である。融合ポリペプチドを複数の異なる濃度で抗ヒトCD3抗体と共にプラスチック製ディッシュにコーティングし、次に、その被覆表面上、可溶性抗ヒトCD28抗体の存在下で、精製T細胞をインキュベートした。実施例19に記載するように、上清インターロイキン2（IL-2）レベルを電気化学ルミネセンス（ELC）アッセイで測定した。陰性対照として、ヒトIgG4アイソタイプ対照を利用した。
【図２０】SEQ ID NO:36および37、SEQ ID NO:44、ならびにSEQ ID NO:45の融合ポリペプチドの、T細胞活性化をGPC3標的依存的に共刺激する能力を調べた、代表的実験を掲載する図である。本発明者らは、対照として、SEQ ID NO:34および35の単一特異性CD137結合抗体を使用した。この実験では、抗ヒトCD3抗体（＋）またはアイソタイプ対照（-）をプラスチック製培養ディッシュにコーティングし、次にGPC3陽性HepG2細胞をそのディッシュ上で終夜培養した。翌日、その被覆表面上、1μg/mLのSEQ ID NO:36および37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45の二重特異性融合ポリペプチド、またはSEQ ID NO:34および35の対照抗体の存在下で、精製T細胞をインキュベートした。実施例20に記載するように、上清インターロイキン2（IL-2）レベルを電気化学ルミネセンス（ELC）アッセイで測定した。
【図２１】SEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45の融合ポリペプチドの、T細胞活性化をGPC3標的依存的に共刺激する能力を調べた、代表的実験を掲載する図である。この実験では、抗ヒトCD3抗体をプラスチック製培養ディッシュにコーティングし、次にそのディッシュ上でGPC3陽性Hep3B細胞を終夜培養した。翌日、その被覆表面上、さまざまな濃度のSEQ ID NO:44（A）およびSEQ ID NO:45（C）の二重特異性融合ポリペプチドの存在下で、精製T細胞をインキュベートした。上清インターロイキン2（IL-2）をELISAによって決定した。GPC3への二重特異性融合ポリペプチドの結合を阻止するために、この実験を、SEQ ID NO:44（B）およびSEQ ID NO:45（D）の両方について、過剰量のSEQ ID NO:10の存在下でも行った。データの当てはめは1:1結合モデルで行った。
【図２２】複数の異なる細胞株でT細胞活性化を共刺激する試験物の能力を調べた、代表的実験を掲載する図である。利用した細胞株はGPC3陽性のHepG2ならびにGPC3陰性のSKBR-3およびMCF7である。この実験では、抗ヒトCD3抗体をプラスチック製培養ディッシュにコーティングし、次に、試験対象の細胞株をそのディッシュ上で終夜培養した。翌日、その被覆表面上、さまざまな濃度の以下の二重特異性融合ポリペプチドの存在下で、精製T細胞を3日間インキュベートした:（A）SEQ ID NO:44（丸）、SEQ ID NO:45（四角）または対照抗体トラスツズマブ（三角）。（B）抗CD137抗体SEQ ID NO:74および75。電気化学ルミネセンスに基づくアッセイで上清インターロイキン2レベルを決定した。プロットされている相対IL-2応答は、試験物の存在下および非存在下（「バックグラウンド」）で得られた応答の比に相当する。
【図２３】二重特異性融合ポリペプチド、トラスツズマブである対照抗体、陽性対照キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）の、インビトロT細胞免疫原性評価の結果を掲載する図である。このアッセイは、32人のドナー、および世界人口における分布を反映したヒト白血球抗原（HLA）アロタイプで、実施例23に記載するように、PBMCに基づくフォーマットを使って行った:（A）刺激指数（試験物の存在下および非存在下での増殖の対比）。平均応答をバーとして示す。応答ドナーを規定するしきい（刺激指数＞2）を点線として示す。（B）応答者の数。
【図２４】実施例24および実施例25に記載するとおり、FcgRI、FcgRIIIおよびFcRnに対するポリペプチドの親和性に関する、代表的実験を掲載する図である。
【図２５】マウスにおける二重特異性融合ポリペプチドSEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45の薬物動態分析の結果を掲載する図である。雄CD-1マウス（各時点3匹）に融合ポリペプチドを10mg/kgの用量で静脈内注射した。薬物レベルは、完全な二重特異性コンストラクトを標的GPC3およびCD137によって検出するサンドイッチELISAを使って検出した。データの当てはめは2コンパートメントモデルを使って行った。
【図２６】カニクイザルにおける二重特異性融合ポリペプチドSEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45の薬物動態分析の結果を掲載する図である。雄カニクイザルに、試験物を、継続時間60分の静脈内注入として3mg/kgの用量で与えた。薬物レベルは、完全な二重特異性コンストラクトを標的GPC3およびCD137によって検出するサンドイッチELISAを使って検出した。データの当てはめは2コンパートメントモデルを使って行った。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
IV.開示の詳細な説明
いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、任意の順序で、少なくとも2つのサブユニット、すなわちGPC3に特異的な完全長免疫グロブリン、その抗原結合ドメイン、またはリポカリンムテインを含む第1サブユニットと、CD137に特異的な完全長免疫グロブリン、その抗原結合ドメイン、またはリポカリンムテインを含む第2サブユニットとを含有する。
【００４３】
いくつかの態様において、融合ポリペプチドは第3サブユニットも含有しうる。例えばポリペプチドはCD137に特異的なサブユニットを含有しうる。いくつかの態様において、該第3サブユニットはCD137に特異的なリポカリンムテインを含む。
【００４４】
いくつかの態様では、1つのサブユニットを、本質的に図1に記載するように、別のサブユニットに連結することができる。
【００４５】
図1Aに図示するように、例えば1つのリポカリンムテインを、ペプチド結合を介して、免疫グロブリン重鎖ドメイン（VH）のC末、VHのN末、免疫グロブリン軽鎖（VL）のC末、および/またはVLのN末に連結することができる。いくつかの特定態様では、リポカリンムテインサブユニットを、そのN末および/またはそのC末で、免疫グロブリンサブユニットに融合することができる。例えば、リポカリンムテインは、免疫グロブリンの重鎖定常領域（CH）のC末および/または軽鎖定常領域（CL）のC末に、ペプチド結合を介して連結しうる。いくつかのさらなる態様において、ペプチド結合は、リンカー、特に例えばSEQ ID NO:49に示すような、構造化されていない（G4S）3リンカーでありうる。
【００４６】
別の一具体例として、図1Bに図示するように、ペプチド結合を介して、1つのリポカリンムテインを免疫グロブリン-FcフラグメントのC末またはN末に連結することができる。
【００４７】
さらにもう一つの例として、図1Cに図示するように、ペプチド結合を介して、1つのリポカリンムテインを1つまたは複数の他のリポカリンムテインに連結することができる。
【００４８】
この点に関して、1つのサブユニットを、そのN末および/またはそのC末で、別のサブユニットに融合しうる。例えば、1つのサブユニットが完全長免疫グロブリンを含む場合は、別のサブユニットを、その第2サブユニットのN末および該免疫グロブリンの重鎖定常領域（CH）のC末へのペプチド結合を介して連結しうる。いくつかのさらなる態様では、第3サブユニットを、第3結合ドメインのN末および該免疫グロブリンの軽鎖定常領域（CL）のC末へのペプチド結合を介して連結しうる。いくつかのさらなる態様において、ペプチド結合は、リンカー、特に例えばSEQ ID NO:49に示すような構造化されていない（G4S）3リンカーであるか、例えばSEQ ID NO:48に示すような構造化されていない（G4S）2リンカーでありうる。
【００４９】
いくつかの態様において、第3サブユニットは、第3サブユニットのリポカリンムテインのN末および第1サブユニットの免疫グロブリンの軽鎖定常領域（CL）のC末へのペプチド結合を介して、第1サブユニットに連結される。
【００５０】
本開示の融合ポリペプチドであって、そのサブユニットの1つが完全長免疫グロブリンを含み、該ポリペプチドがGPC3およびCD137に同時に会合する融合ポリペプチドに関するいくつかの態様において、Fc受容体陽性細胞に対する完全長免疫グロブリンのFc領域のFc機能は、同時に保存されうる。
【００５１】
本開示の融合ポリペプチドであって、そのサブユニットの1つが完全長免疫グロブリンを含み、該ポリペプチドがGPC3およびCD137に同時に会合する融合ポリペプチドに関する他のいくつかの態様では、完全長免疫グロブリンのFc領域のFc機能、すなわちFcガンマ受容体陽性細胞またはFcRn受容体陽性細胞への結合を、タンパク質工学によって低減または完全に抑制しうる。これは、例えばFc-ガンマ受容体またはFcRn受容体と低い相互作用を示すIgG2またはIgG4などのバックボーンを使用することによって達成しうる。Fc-ガンマ受容体への残存結合を低減するために、F234A突然変異および/またはL235A突然変異などの突然変異を、IgGバックボーン中に導入しうる。加えて、IgG4バックボーンの場合は、IgG4半抗体の交換を最小限に抑えるために、S228P突然変異を導入しうる。いくつかのさらなる態様では、天然のグリコシル化モチーフを除去するために、追加のN297A突然変異が融合ポリペプチドの免疫グロブリン重鎖に存在しうる。
【００５２】
いくつかの態様では、腫瘍細胞上のGPC3と、免疫系のエフェクター細胞、例えばT細胞またはNK細胞の表面上のCD137への、同時結合の結果として、本開示の融合ポリペプチドは、GPC3依存的なエフェクター細胞活性化を呈することができ、それにより、免疫系のエフェクター細胞はGPC3発現腫瘍細胞を能動的に溶解する。
【００５３】
いくつかのさらなる態様において、融合ポリペプチドは、例えば本質的にChacon, J.A. et al., PloS one 2013 8（4）:e60031に記載されているように標的依存的な腫瘍浸潤性リンパ球拡大をエクスビボで証明するアッセイにおいて測定した場合に、当該融合ポリペプチドに含まれる免疫グロブリンに匹敵するかそれより優れたレベルのGPC3依存的CD137活性化を示す能力を有する。いくつかのさらなる態様において、融合ポリペプチドは、例えば本質的にKohrt, H. et al, J Clin Invest.2012 Mar;122（3）:1066-75に記載されているものと同様にして、ヒト肝細胞癌（「HCC」）、黒色腫、メルケル細胞癌、ウィルムス腫瘍、および肝芽腫のインビボ異種移植片モデルにおいて測定した場合に、当該融合ポリペプチドに含まれる免疫グロブリンに匹敵するかそれより優れたレベルのGPC3依存的CD137活性化を示す能力を有する。
【００５４】
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれる免疫グロブリンのFc部分は、体内での融合ポリペプチドの安定性および残留性にとって極めて重要な、融合ポリペプチドの血清中レベルの維持に貢献しうる。例えば、Fc部分が内皮細胞上および食細胞上のFc受容体に結合すると、融合ポリペプチドは細胞内に移行して、血流へと再循環されることで、体内でのその半減期を向上させうる。
【００５５】
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれるCD137特異的サブユニットは、SEQ ID NO:26のリポカリンムテインなど、CD137に特異的なリポカリンムテインでありうる。いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれるCD137特異的サブユニットは、CD137に特異的な完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメイン、例えばモノクローナル抗体（例えばSEQ ID NO:34および35の抗体またはSEQ ID NO:51および52の抗体）でありうる。
【００５６】
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれるGPC3特異的サブユニットは、GPC3に特異的なリポカリンムテイン、例えばSEQ ID NO:8のリポカリンムテインまたはSEQ ID NO:10のリポカリンムテインでありうる。いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれるCD137特異的サブユニットは、GPC3に特異的な完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインでありうる。
【００５７】
いくつかの態様では、本開示の融合ポリペプチドにおいて、CD137特異的サブユニットはGPC3特異的サブユニットに融合されている。
【００５８】
いくつかのより具体的な態様では、GPC3特異的サブユニットがリポカリンムテインを含み、CD137特異的サブユニットがモノクローナル抗体を含む。
【００５９】
いくつかのさらなる態様において、本開示の融合ポリペプチドは2つのGPC3特異的サブユニットおよび1つのCD137特異的サブユニットを有する。いくつかのより具体的な態様において、GPC3特異的サブユニットはそれぞれリポカリンムテインを含み、CD137特異的サブユニットはそれぞれモノクローナル抗体を含む。いくつかのさらなる態様では、2つのGPC3特異的サブユニットが同一である。いくつかのさらなる態様において、これら3つのサブユニットは、図1Aに構造を示すように、互いに融合される。いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、SEQ ID NO:36および37、38および39、40および41、または42および43からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６０】
他のいくつかの具体的態様において、GPC3特異的サブユニットはリポカリンムテインを含み、CD137特異的サブユニットはリポカリンムテインを含む。いくつかのさらなる態様において、これら2つのサブユニットは、図1Cに構造を示すように、互いに融合される。いくつかの態様において、融合ポリペプチドはSEQ ID NO:46のアミノ酸配列を含む。
【００６１】
いくつかのさらなる具体的態様において、本開示の融合ポリペプチドは、2つのCD137特異的サブユニットと1つのGPC3特異的サブユニットとを含む。いくつかのより具体的な態様では、GPC3特異的サブユニットがリポカリンムテインを含み、CD137特異的サブユニットがそれぞれリポカリンムテインを含む。いくつかのさらなる態様では、2つのCD137特異的サブユニットが同一である。いくつかのさらなる態様において、これら3つのサブユニットは、図1Cに構造を示すように、互いに融合される。いくつかの態様において、融合ポリペプチドはSEQ ID NO:47のアミノ酸配列を含む。
【００６２】
いくつかのさらなる態様では、本開示の融合ポリペプチドにおいて、GPC3特異的サブユニットはリポカリンムテインを含み、CD137特異的サブユニットはリポカリンムテインを含み、これら2つのサブユニットは免疫グロブリン-Fcフラグメントに融合される。いくつかのさらなる態様において、これら2つのサブユニットは、図1Bに構造を示すように、それぞれに、免疫グロブリン-Fcフラグメントに融合される。いくつかの特定態様において、免疫グロブリン-FcフラグメントはIgG4-Fcフラグメントである。いくつかのさらなる態様において、IgG4-Fcフラグメントは、S228P突然変異を有し、インビトロおよびインビボでIgG4半抗体交換が最小限に抑えられるように、工学的に操作されている。いくつかの態様において、IgG4-FcフラグメントはSEQ ID NO:73のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、SEQ ID NO:44のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:45のアミノ酸配列を含む。
【００６３】
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドに含まれる免疫グロブリンはIgG2バックボーンまたはIgG4バックボーンを有する。いくつかのさらなる態様において、IgG4バックボーンは、S228P、N297A、F234AおよびL235Aからなる群より選択される突然変異のいずれか1つを有する。いくつかのさらなる態様において、IgG2バックボーンは、N297A、F234AおよびL235Aからなる群より選択される突然変異のいずれか1つを有する。
【００６４】
いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、例えばポリペプチドを本質的に実施例3、実施例8または実施例15に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、少なくとも約5nMまたはそれ未満、例えば約1nM以下、約0.6nM以下、約0.5nM以下、約0.4nM以下、または約0.3nM以下のEC50値で、CD137に結合することができうる。
【００６５】
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、当該融合ポリペプチドに含まれるCD137に特異的なリポカリンムテイン、例えばSEQ ID NO:26のリポカリンムテインのEC50値、または当該融合ポリペプチドに含まれるCD137に特異的な抗体、例えばSEQ ID NO:34および35の抗体もしくはSEQ ID NO:51および52の抗体のEC50値と比べて、例えば該リポカリンムテインまたは抗体およびポリペプチドを本質的に実施例8または実施例15に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、少なくとも同じくらいかそれより優れたEC50値で、CD137に結合できうる。
【００６６】
いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、例えば本質的に実施例6、実施例11、または実施例18に記載するように表面プラズモン共鳴（SPR）分析によって測定した場合に、KDが少なくとも約5nMまたはそれ未満、例えば約1nM以下、約0.6nM以下、約0.5nM以下、約0.3nM以下、約200pM以下、約150pM以下、約100pM以下、または約70pM以下、または約2pM以下である親和性で、CD137に結合できうる。
【００６７】
もう一つの局面において、融合ポリペプチドは、例えばポリペプチドを本質的に実施例2、実施例7、実施例12または実施例14に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、少なくとも約5nMまたはそれ未満、例えば約1nM以下、約0.6nM以下、約0.5nM以下、約0.4nM以下、約0.3nM以下、または約0.2nM以下のEC50値で、GPC3に結合できうる。
【００６８】
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、当該融合ポリペプチドに含まれるGPC3に特異的なリポカリンムテイン、例えばSEQ ID NO:8のリポカリンムテインまたはSEQ ID NO:10のリポカリンムテインのEC50値と比べて、例えば該リポカリンムテインおよび融合ポリペプチドを本質的に実施例7、実施例12または実施例14に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、匹敵するEC50値でGPC3に結合できうる。
【００６９】
いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、例えば本質的に実施例5、実施例10、または実施例17に記載するように表面プラズモン共鳴（SPR）分析によって測定した場合に、KDが少なくとも約5nMまたはそれ未満、例えば約1nM、約0.3nM、約100pM、約50pM以下、約20pM以下、または約10pM以下である親和性で、GPC3に結合できうる。
【００７０】
いくつかの態様において、CD137とGPC3との両方に特異的な本開示の融合ポリペプチドは、例えば融合ポリペプチドを本質的に実施例4、実施例9、実施例13または実施例16に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、CD137およびGPC3に同時に結合する能力を有しうる。
【００７１】
いくつかの態様において、CD137とGPC3との両方に特異的な本開示の融合ポリペプチドは、例えば融合ポリペプチドを本質的に実施例4、実施例9、実施例13または実施例16に記載するようにELISAアッセイにおいて測定した場合に、少なくとも約10nMまたはそれ未満、例えば約8nM以下、約5nM以下、約2.5nM以下、約2nM以下、または約1.5nM以下のEC50値で、CD137およびGPC3に同時に結合する能力を有しうる。
【００７２】
いくつかの態様において、CD137とGPC3との両方に特異的な本開示の融合ポリペプチドは、本質的に実施例19に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、T細胞応答を共刺激する能力を有しうる。いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、本質的に実施例19に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、T細胞刺激の存在下でIL-2生産を誘発することができうることに加えて、コーティング濃度を高くするとIL-2誘導が強くなる傾向さえ示しうる。いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、本質的に実施例19に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、T細胞の抗CD3刺激の非存在下では、IL-2生産を誘発しない。いくつかのさらなる態様において、CD137とGPC3との両方に特異的な本開示の融合ポリペプチドは、本質的に実施例19に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、最適未満（suboptimal）の濃度の抗CD3および抗CD28抗体で刺激されたT細胞の活性化を共刺激する能力を有しうる。
【００７３】
いくつかの態様において、CD137とGPC3との両方に特異的な本開示の融合ポリペプチドは、本質的に実施例20に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、T細胞応答を共刺激する能力を有しうる。いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、本質的に実施例20に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、IL-2生産を誘発することができうる。いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、本質的に実施例20に記載する機能的T細胞活性化アッセイにおいて、GPC3標的依存的にT細胞活性化を共刺激する能力を有しうる。
【００７４】
A.融合ポリペプチドに含まれる例示的免疫グロブリン
いくつかの態様では、融合ポリペプチドに関して、第1結合ドメインは、GPC3またはCD137に特異的な完全長免疫グロブリンまたはその抗原結合ドメインを含む。免疫グロブリンは、例えばIgG1、IgG2またはIgG4でありうる。さらなる態様において、免疫グロブリンはGPC3またはCD137に対するモノクローナル抗体である。GPC3結合性免疫グロブリンの具体例は、GC33（Cancer Sci. 2014 Apr;105（4）:455-62）である。CD137結合性抗体の具体例はBMS-663513（Jure-Kunkel, M.らの米国特許第7288638号）およびPF-05082566（Fisher, T.S. et al., Canc Immunol Immunother 2012 Oct; 61（10）:1721-1733）である。
【００７５】
B.融合ポリペプチドに含まれる例示的GPC3特異的リポカリンムテイン
本開示の一局面は、KDで測って約1nM以下の親和性でヒトグリピカン-3（GPC3）に結合する能力を有するリポカリンムテインを提供する。より好ましくは、ムテインは、KDで測って約1nM以下または0.2nM以下の親和性を有しうる。
【００７６】
別の一態様において、本開示は、hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136および/または175に対応する1つまたは複数の位置に、置換、好ましくは本明細書に記載する置換を含むリポカリンムテインに関する。
【００７７】
特定の態様において、本開示のムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の配列位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136および/または175に対応する配列位置に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20個またはそれ以上、例えば21、22、23、24、25および26個の置換を含む。
【００７８】
さらなる特定態様において、本開示によるリポカリンムテインは、SEQ ID NO:4〜17からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。別の一態様において、ムテインは、成熟hNGALの配列（SEQ ID NO:2）に対して少なくとも70％の同一性を有する。好ましくは、該ムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の配列位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136および/または175に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20個またはそれ以上、例えば21、22、23、24、25および26個の変異アミノ酸残基を含む。
【００７９】
いくつかのさらなる態様では、真核細胞における発現を容易にするために、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置65における天然のN-グリコシル化部位Asnが、本開示によるリポカリンムテインの対応する配列位置において、例えば位置65におけるAsnからAspへの突然変異などによって除去される。さらにまた、N-グリコシル化部位（Asn-X-Ser/Thr）は本開示によるリポカリンムテインには存在しないことが好ましい。
【００８０】
他のいくつかの態様において、本開示によるリポカリンムテインは、例えば安定性をさらに改善するために、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の配列位置28に対応する配列位置に突然変異を含まない。
【００８１】
別の一態様において、本開示のムテインはGPC3のアンタゴニストである。
【００８２】
結合特異性は絶対的特性ではなく相対的特性であるため、本明細書において、本開示のリポカリンムテインは、ある標的（例えばGPC3）と1つまたは複数のリファレンス標的とを区別することができるのであれば、当該標的に「特異的に結合」する。「特異的結合」は、例えばウェスタンブロット、ELISA試験、RIA試験、ECL試験、IRMA試験、FACS、IHCおよびペプチドスキャンに従って決定することができる。
【００８３】
同様に、別の一局面において、本開示は、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132、および/または134に対応する1つまたは複数の位置に、置換、好ましくは本明細書に記載する置換を含む、hNGALムテインに関する。
【００８４】
代替的一局面において、本開示は、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136および/または175に対応する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20個またはそれ以上、例えば21、22、23、24、25および26個のアミノ酸位置に、置換、好ましくは本明細書に記載する置換を含むhNGALムテインを含むポリペプチドに関する。
【００８５】
同様に本開示は、4つのループにより一端においてペアワイズに接続されることで結合ポケットを規定している8つのβストランドを含む円柱状のβプリーツシート超二次構造領域を有するhNGALから誘導されるリポカリンムテインであって、前記4つのループのうちの少なくとも3つのそれぞれの少なくとも1つのアミノ酸が変異しており、該リポカリンが、与えられた非天然標的としてのGPC3に検出可能な親和性で結合するのに有効である、リポカリンムテインに関する。リポカリンムテインは、hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136および/または175にあるアミノ酸に対応する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸位置に、置換、好ましくは本明細書に記載する置換を含むと有利である。本開示は、これらのタンパク質をコードする核酸にも関係する。
【００８６】
こうして、上記を考慮すれば、当業者は、hNGAL以外のスキャフォールドのアミノ酸に、本明細書に記載するhNGALにおいて変異させたどのアミノ酸位置が対応するかを、容易に決定できる立場にある。具体的に述べると、当業者は、本明細書に記載するムテインのアミノ酸配列、特に本開示のhNGALムテインのアミノ酸配列を、異なるムテインのアミノ酸配列と整列することで、該異なるリポカリンのアミノ酸配列のそれぞれのアミノ酸には該ムテインのどのアミノ酸が対応するかを決定することができる。より具体的には、当業者はこうして、該異なるリポカリンのアミノ酸配列のどのアミノ酸が、hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136および/または175にあるアミノ酸に対応するかを、決定することができる。
【００８７】
GPC3へと方向づけられた、またはGPC3に特異的な、本開示のタンパク質は、明確なタンパク質スキャフォールドに基づく多くの特異的結合タンパク質ムテインを包含する。本明細書にいう「ムテイン」、「変異（mutated）」実体（entity）（タンパク質であるか核酸であるかを問わない）、または「突然変異体（mutant）」とは、天然（野生型）の核酸またはタンパク質「リファレンス」スキャフォールドと比較した、1つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の交換、欠失、または挿入を指す。交換され、欠失し、または挿入されるヌクレオチドまたはアミノ酸のそれぞれの数は、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20個またはそれ以上、例えば21、22、23、24、25および26個である。ただし、本開示のムテインは、依然として、GPC3に結合する能力を有することが好ましい。
【００８８】
いくつかの好ましい態様において、本開示のムテインは、約1nM以下、例えば0.5nM以下、0.3nM以下、および/または0.2nM以下のKDで、ヒトまたはマウスGPC3に結合する。本開示のムテインは、成熟し折りたたまれている生物活性型のGPC3の1つまたは複数の連続エピトープ、不連続エピトープまたはコンフォメーションエピトープに、特異的に結合しうる。
【００８９】
選択された標的（この場合はGPC3）に対する本開示のタンパク質（例えばリポカリンのムテイン）の結合親和性は、当業者に公知の数多くの方法によって測定することができる（そしてそれによってムテイン-リガンド複合体のKD値が決定される）。そのような方法には、蛍光滴定、競合ELISA、等温滴定熱量測定（ITC）などの熱量測定法、および表面プラズモン共鳴（BIAcore）などがあるが、それらに限定されるわけではない。そのような方法は当技術分野において確立されており、その例を以下にも詳述する。
【００９０】
本開示のムテインのアミノ酸配列は、成熟ヒトリポカリン2に対して高い配列同一性を有しうる。これに関連して、本開示のタンパク質は、例えばSEQ ID NO:4〜17からなる群より選択されるアミノ酸配列のムテインなど、SEQ ID NO:2の配列からなる群より選択されるタンパク質に対して、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも85％、少なくとも87％、少なくとも90％の同一性、例えば少なくとも95％の同一性を有しうる。
【００９１】
本開示は、SEQ ID NO:4〜17の配列からなる群より選択されるタンパク質の構造ホモログであって、それとの関連において約60％超、好ましくは65％超、70％超、75％超、80％超、85％超、90％超、92％超、最も好ましくは95％超のアミノ酸配列相同性または配列同一性を有するものも包含する。
【００９２】
上記に合致して、本開示のムテインは、好ましくは、GPC3のアンタゴニストとして作用する。いくつかの態様において、本開示のムテインは、GPC3分子が持つ、そのコグネイトリガンドに結合する能力またはそのコグネイトリガンドと他の形で相互作用する能力を阻害することにより、GPC3のアンタゴニストとして作用しうる。
【００９３】
さらに別の一局面において、本開示は、GPC3に特異的に結合するヒトリポカリン2のムテインを包含する。この意味で、GPC3は、野生型ヒトリポカリン2の非天然リガンドであるとみなすことができ、ここで「非天然リガンド」とは、生理的条件下でヒトリポカリン2に結合しない化合物を指す。ヒトリポカリン2などの野生型リポカリンを一定の配列位置における突然変異で工学的に操作することにより、本発明者らは、非天然リガンドに対する高い親和性および高い特異性が可能であることを証明した。一局面では、成熟ヒトリポカリン2の直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の配列位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136および/または175のいずれかをコードする少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19および/または20個のヌクレオチドトリプレットにおいて、これらの位置でヌクレオチドトリプレットの部分集合を置換させることによって、ランダム突然変異誘発を実行することができる。
【００９４】
さらに、リポカリンは、成熟ヒトリポカリン2の直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の配列位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136および/または175に対応する配列位置のうちの任意の1つまたは複数に、例えば少なくとも任意の2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個に、変異アミノ酸残基を有するムテインを作製するために使用することができる。
【００９５】
配列位置36における置換は、例えば置換Leu36→ValまたはArgでありうる。配列位置40における置換は、例えば置換Ala40→Leu、ValまたはGlyでありうる。配列位置41における置換は、例えば置換Ile41→Leu、Arg、Met、GlyまたはAlaでありうる。配列位置49における置換は、例えば置換Gln49→ProまたはLeuでありうる。配列位置52における置換は、例えば置換Tyr52→ArgまたはTrpでありうる。配列位置68における置換は、例えば置換Asn65→Aspでありうる。配列位置68における置換は、例えば置換Ser68→Val、Gly、AsnまたはAlaでありうる。配列位置70における置換は、例えば置換Leu70→Arg、Ser、AlaまたはValでありうる。配列位置72における置換は、例えば置換Arg72→Asp、Trp、Ala、またはGlyでありうる。配列位置73における置換は、例えば置換Lys73→Gly、Arg、Asn、GluまたはSerでありうる。配列位置76における置換は、例えば置換Cys76→ValまたはIleでありうる。配列位置77における置換は、例えば置換Asp77→His、Met、Val、Leu、ThrまたはLysでありうる。配列位置79における置換は、例えば置換Trp79→Lys、SerまたはThrでありうる。配列位置81における置換は、例えば置換Arg81→Glyでありうる。配列位置81における置換は、例えば置換Cys87→Serでありうる。配列位置96における置換は、例えば置換Asn96→Arg、Asp、GlnまたはProでありうる。配列位置100における置換は、例えば置換Tyr100→Gly、Glu、ProまたはGlnでありうる。配列位置103における置換は、例えば置換Leu103→Glu、Gln、Asn、Gly、SerまたはTyrでありうる。配列位置106における置換は、例えば置換Ser105→Alaでありうる。配列位置106における置換は、例えば置換Tyr106→Asn、SerまたはThrでありうる。配列位置125における置換は、例えば置換Lys125→Gluでありうる。配列位置127における置換は、例えば置換Ser127→ArgまたはTyrでありうる。配列位置132における置換は、例えば置換Tyr132→TrpまたはIleでありうる。配列位置134における置換は、例えば置換Lys134→AlaまたはPheでありうる。配列位置134における置換は、例えば置換Thr136→Ileでありうる。配列位置175における置換は、例えば置換Cys175→Alaでありうる。リファレンス配列中の対応アミノ酸を置換するアミノ酸はいずれも、対応する保存的アミノ酸と交換できることは、注目に値する。特に、保存的置換は、以下の群のメンバー間での置き換えである:1）アラニン、セリン、およびスレオニン; 2）アスパラギン酸およびグルタミン酸; 3）アスパラギンおよびグルタミン; 4）アルギニンおよびリジン; 5）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン;ならびに6）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。
【００９６】
一態様において、GPC3に結合する本開示のムテインは、以下のアミノ酸の置き換えを含む。
2018519803.tif 000002
2018519803.tif 000003
【００９７】
ナンバリングは、好ましくは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）との関連においてなされる。したがって、本開示の教示内容を考慮すれば、当業者は、成熟hNGALの好ましいリファレンス配列（SEQ ID NO:2）中のどのアミノ酸が上記（a）〜（l）に記載したものに対応するかを容易に決定して、リファレンス配列中の該アミノ酸を突然変異させることができる。
【００９８】
C.融合ポリペプチドに含まれる例示的CD137特異的リポカリンムテイン
一局面において、本開示は、CD137に結合するヒトリポカリンムテイン、およびその有用な応用を提供する。本開示は、本明細書に記載するCD137結合タンパク質を作製する方法、ならびにそのようなタンパク質を含む組成物も提供する。本開示のCD137結合タンパク質およびその組成物は、試料中のCD137を検出する方法において、または対象におけるCD137の結合方法において、使用されうる。本開示が提供する用途に付随するこれらの特徴を有するそのようなヒトリポカリンムテインが、以前に記載されたことはなかった。
【００９９】
本開示のもう一つの態様は、CD137に結合することによってCD137の下流シグナリング経路を活性化する能力を有するリポカリンムテインを提供する。
【０１００】
一態様において、本開示は、CD137結合性ヒト涙液リポカリンムテインを提供する。
【０１０１】
この点に関して、本開示は、KDで測って約300nM以下、さらには約100nM以下の親和性で、CD137に結合する能力を有する1つまたは複数のTlcムテインを提供する。
【０１０２】
いくつかの態様において、そのようなTlcムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に対応する1つまたは複数の位置に、変異アミノ酸残基を含む。
【０１０３】
いくつかの特定態様において、そのようなTlcムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列の位置26〜34、55〜58、60〜61、65、104〜106および108に対応する1つまたは複数の位置に、変異アミノ酸残基を含有しうる。
【０１０４】
さらなる特定態様において、そのようなTlcムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列の位置101、111、114および153に対応する1つまたは複数の位置に、変異アミノ酸残基をさらに含みうる。
【０１０５】
別の特定態様において、Tlcは、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列の位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に対応する1つまたは複数の位置に変異アミノ酸残基を含有しうる。
【０１０６】
いくつかのさらなる態様において、Tlcムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列の配列位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に対応する1つまたは複数の配列位置に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26個、またはさらにそれ以上の変異アミノ酸残基を含むことができ、ここで該ポリペプチドは、CD137、特にヒトCD137に結合する。
【０１０７】
いくつかのさらなる態様において、本開示は、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列との比較において、配列位置526〜34、55〜58、60〜61、65、104〜106、および108に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個、またはさらにそれ以上の変異アミノ酸残基を含むTlcムテインであり、かつCD137、特にヒトCD137に結合する、ポリペプチドに関する。
【０１０８】
いくつかの態様において、本開示によるリポカリンムテインは、ネイティブシステイン残基の、例えばセリン残基によるアミノ酸置換を、少なくとも1つは含みうる。いくつかの態様において、本開示によるTlcムテインは、位置61および/または153にあるネイティブシステイン残基の、セリン残基などの別のアミノ酸によるアミノ酸置換を含む。これとの関連において、システイン残基61および153によって形成される野生型涙液リポカリンの構造ジスルフィド結合（Breustedt, et al., 2005,前掲参照）の（それぞれのナイーブ核酸ライブラリーのレベルでの）除去が、安定にフォールディングされるだけでなく、所与の非天然リガンドに高い親和性で結合することもできる涙液リポカリンムテインを与えうることがわかっていることに注目されたい。いくつかの特定態様において、本開示によるTlcムテインは、アミノ酸置換Cys61→Ala、Phe、Lys、Arg、Thr、Asn、Gly、Gln、Asp、Asn、Leu、Tyr、Met、Ser、ProまたはTrp、およびCys153→SerまたはAlaを含む。そのような置換は、Cys61とCys153とを連結する天然ジスルフィド架橋の形成を防止するのに有用であり、よってムテインの取り扱いを容易にすることが判明している。ただし、CD137に結合し、かつCys61とCys153との間に形成されたジスルフィド架橋を有する涙液リポカリンムテインも、本発明の一部である。
【０１０９】
いくつかの態様では、構造ジスルフィド結合の排除により、本開示のムテインへの非天然人工ジスルフィド結合の（自発的）生成または計画的導入が可能になり、それによってムテインの安定性が増加するという、さらなる利点が得られうる。例えば、いくつかの態様では、位置61、101および153にあるシステインコドンの2つまたは3つすべてが、別のアミノ酸のコドンで置き換えられる。さらに、いくつかの態様において、本開示によるTlcムテインは、位置101にあるネイティブシステイン残基の、セリン残基またはヒスチジン残基によるアミノ酸置換を含む。
【０１１０】
いくつかの態様において、本開示によるムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンのアミノ酸配列に関して位置28または105に、システイン残基によるネイティブアミノ酸のアミノ酸置換を含む。
【０１１１】
さらに、いくつかの態様において、本開示によるムテインは、位置111にあるネイティブアルギニン残基の、プロリン残基によるアミノ酸置換を含む。さらに、いくつかの態様において、本開示によるムテインは、位置114にあるネイティブリジン残基の、トリプトファン残基またはグルタミン酸によるアミノ酸置換を含む。
【０１１２】
いくつかの態様において、本発明によるCD137結合性Tlcムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:1）の位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153に対応する1つまたは複数の位置に、以下の変異アミノ酸残基:
2018519803.tif 000004
のうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様において、本開示によるTlcムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンのこれらの配列位置における変異アミノ酸残基を、2つ以上、例えば3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個、さらにはそれ以上、例えば13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26個、またはすべて含む。
【０１１３】
いくつかのさらなる態様において、CD137に結合するTlcムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下の組のアミノ酸置換:
2018519803.tif 000005
2018519803.tif 000006
のうちの1つを含む。
【０１１４】
残りの領域、すなわち配列位置5、26〜31、33〜34、42、46、52、56、58、60〜61、65、71、85、94、101、104〜106、108、111、114、121、133、148、150および153とは異なる領域において、本開示のTlcムテインは、変異アミノ酸配列位置以外では、野生型（天然）アミノ酸配列を含みうる。
【０１１５】
さらなる態様において、本開示によるTlcムテインは、成熟ヒト涙液リポカリンの配列（SEQ ID NO:1）に対して、少なくとも70％の配列同一性または少なくとも70％の配列相同性を有する。
【０１１６】
本開示によるTlcムテインは、天然型のヒト涙液リポカリンの突然変異誘発を使って得ることができる。突然変異誘発のいくつかの態様において、置換（すなわち置き換え）は保存的置換である。しかしながら、リポカリンムテインがCD137に結合するその能力を保っており、かつ/または、それが、成熟ヒト涙液リポカリンのアミノ酸配列（SWISS-PROTデータバンクアクセッション番号P31025）に対する少なくとも60％、例えば少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％またはそれ以上の配列同一性であるという点においてそのとき置換される配列に対して配列同一性を有する限り、非保存的置換、または下記の例示的置換からの1つまたは複数を含む、任意の置換が想定される。
【０１１７】
別の一局面において、本開示は、CD137へと方向づけられた、またはCD137に特異的な、新規特異的結合性hNGALムテインに関する。
【０１１８】
この点に関して、本開示は、KDで測って200nM以下、約140nM以下、約50nM以下、さらには約10nM以下の親和性で、CD137に結合する能力を有する1つまたは複数のhNGALムテインを提供する。より好ましくは、hNGALムテインは、KDで測って約5nM以下の親和性を有することができる。
【０１１９】
いくつかの態様において、本開示のhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134に対応する1つまたは複数の位置に、置換を含む。
【０１２０】
特定の態様において、本開示のリポカリンムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SWISS-PROTデータバンクアクセッション番号P80188; SEQ ID NO:2）の配列位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134に対応する配列位置に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21個、またはさらにそれ以上の置換を含む。好ましくは、本開示は、成熟ヒトNGALの直鎖ポリペプチド配列の位置36、87および/または96に対応する位置における1つまたは複数の置換に加えて、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列の位置28、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、94、100、103、106、125、127、132および134に対応する1つまたは複数の位置に置換を含む、リポカリンムテインに関すると想定される
【０１２１】
いくつかのさらなる態様において、本開示は、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SWISS-PROTデータバンクアクセッション番号P80188; SEQ ID NO:2）との比較において、配列位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132および134に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個、さらにはそれ以上の変異アミノ酸残基を含むhNGALムテインであって、CD137、特にヒトCD137に結合する、ポリペプチドに関する。
【０１２２】
いくつかの態様において、本開示のCD137結合性hNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の配列位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134のうちの任意の1つまたは複数に、以下の変異アミノ酸残基:
2018519803.tif 000007
のうちの1つまたは複数を含む。
【０１２３】
いくつかの態様において、本開示のhNGALムテインは、成熟hNGALのこれらの配列位置における変異アミノ酸残基を、2つ以上、例えば3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個、さらにはそれ以上、例えば13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24個、またはすべて含む。
【０１２４】
いくつかのさらなる態様において、CD137に結合する本開示のhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列との比較において、以下のアミノ酸の置き換えを含む。
2018519803.tif 000008
2018519803.tif 000009
【０１２５】
残りの領域、すなわち配列位置28、36、40〜41、49、52、65、68、70、72〜73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132および134とは異なる領域において、本開示のhNGALムテインは、変異アミノ酸配列位置以外では、野生型（天然）アミノ酸配列を含みうる。
【０１２６】
別の一態様において、hNGALムテインは、成熟ヒトリポカリン2のアミノ酸配列（SWISS-PROTデータバンクアクセッション番号P80188）に対して、少なくとも70％、またはさらに高い配列同一性を有する。
【０１２７】
さらなる特定の態様において、本開示によるCD137結合性リポカリンムテインは、SEQ ID NO:18〜33からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。
【０１２８】
本開示のCD137結合性リポカリンムテインのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:18〜33からなる群より選択される配列に対して、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも82％、少なくとも85％、少なくとも87％、少なくとも90％の同一性、例えば少なくとも95％の同一性など、高い配列同一性を有しうる。
【０１２９】
本開示は、SEQ ID NO:18〜33からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するリポカリンムテインの構造ホモログであって、該ムテインとの関係において、約60％超、好ましくは65％超、70％超、75％超、80％超、85％超、90％超、92％超、最も好ましくは95％超のアミノ酸配列相同性または配列同一性を有する構造ホモログも包含する。
【０１３０】
D.融合物の例示的な使用、応用、および生産
いくつかの態様において、本開示の融合ポリペプチドは、CD137およびGPC3の二重ターゲティングによる相乗効果をもたらしうる。
【０１３１】
それゆえに、本開示の融合ポリペプチドには、医学において、数多くの可能な応用が存在する。
【０１３２】
一局面において、本開示は、試料中のCD137およびGPC3を検出するための、本明細書において開示する融合ポリペプチドの使用、ならびにそれぞれの診断方法に関する。
【０１３３】
別の一局面において、本開示は、CD137およびGPC3の同時結合のための、本明細書において開示する1つまたは複数の融合ポリペプチドの使用、またはそのようなポリペプチドを含む1つまたは複数の組成物の使用を特徴とする。
【０１３４】
本開示は、CD137およびGPC3との複合体形成のための、ここに記載する1つまたは複数の融合ポリペプチドの使用にも関係する。
【０１３５】
それゆえに、本開示のさらなる一局面において、ここに開示する1つまたは複数の融合ポリペプチドは、CD137およびGPC3の検出に使用される。そのような使用は、1つまたは複数の該融合ポリペプチドを、適切な条件下で、CD137およびGPC3を含有すると疑われる試料と接触させ、それによって融合ポリペプチドとCD137およびGPC3との間の複合体の形成を可能にする工程、および適切なシグナルによって複合体を検出する工程を含みうる。検出可能なシグナルは、上で説明したように、標識によって引き起こされるか、結合、すなわち複合体形成そのものによる物理的特性の変化によって引き起こされうる。一例は表面プラズモン共鳴であり、その値は、結合パートナー同士（そのうちの一方は、金箔などの表面に固定化されている）の結合中に変化する。
【０１３６】
本明細書において開示する融合ポリペプチドは、CD137およびGPC3の分離にも使用しうる。そのような使用は、1つまたは複数の該融合ポリペプチドを、適切な条件下で、CD137およびGPC3を含有すると思われる試料と接触させ、それによって、融合ポリペプチドとCD137およびGPC3との間の複合体の形成を可能にする工程、および複合体を試料から分離する工程を含みうる。
【０１３７】
さらに別の一局面において、本開示は、本開示による融合ポリペプチドを含む診断キットまたは分析キットを特徴とする。
【０１３８】
さらに別の一局面において、本開示では、診断におけるそれらの使用に加えて、本開示の融合ポリペプチドと薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物も考えられる。
【０１３９】
さらにまた本開示は、抗がん作用物質および免疫調節物質として使用するためのCD137およびGPC3に同時に結合する融合ポリペプチドを提供する。したがって、本開示の融合ポリペプチドは、肝細胞癌（「HCC」）、黒色腫、メルケル細胞癌、ウィルムス腫瘍、および肝芽腫を含むさまざまな腫瘍などのヒト疾患を処置または防止する方法において使用されることが想定される。したがって、肝細胞癌（「HCC」）、黒色腫、メルケル細胞癌、ウィルムス腫瘍、および肝芽腫を含むさまざまな腫瘍などのヒト疾患を処置または防止する必要がある対象において、前記ヒト疾患を処置または防止する方法であって、該対象に治療有効量の1つまたは複数の本開示の融合ポリペプチドを投与する工程を含む方法も提供される。
【０１４０】
本開示の融合ポリペプチドは、肝細胞癌（「HCC」）、黒色腫、メルケル細胞癌、ウィルムス腫瘍、および肝芽腫などといった、GPC3が発現している腫瘍細胞を標的とすると同時に、そのような腫瘍細胞に近接する宿主の自然免疫系におけるナチュラルキラー（NK）細胞または適応免疫系のT細胞を活性化することにより、標的抗腫瘍リンパ球細胞活性を増加させ、抗腫瘍免疫を強化し、それと同時に、腫瘍成長に対する直接的阻害効果を有し、それによって相乗的抗腫瘍結果をもたらしうる。加えて、本開示の融合ポリペプチドは、局所的に癌遺伝子活性を阻害し、NK細胞および/またはT細胞による細胞媒介性細胞傷害を誘発することにより、健常細胞に対するエフェクターリンパ球の副作用、すなわちオフターゲット毒性を低減しうる。
【０１４１】
T細胞において、CD137媒介性シグナリングは、TRAFファミリーメンバーの動員、ならびにASK-1、MKK、MAPK3/MAPK4、p38、およびJNK/SAPKを含むいくつかのキナーゼの活性化につながる。次に、キナーゼの活性化に続いて、ATF-2、Jun、およびNF-κBを含むいくつかの転写因子の活性化および核移行が起こる。CD137媒介性シグナリングは、最適未満のT細胞受容体（TCR）誘発性増殖を増強することに加えて、T細胞、特にCD8＋ T細胞を、活性化誘導細胞死（AICD）から保護する。
【０１４２】
本開示は、肝細胞癌（「HCC」）、黒色腫、メルケル細胞癌、ウィルムス腫瘍、および肝芽腫などといったGPC3が発現している腫瘍細胞に会合したときに、T細胞を共刺激し、かつ/またはCD137の下流シグナリング経路を活性化するための、本開示の融合ポリペプチドの使用、またはそのような融合ポリペプチドを含む組成物の使用を包含する。
【０１４３】
本開示は、肝細胞癌（「HCC」）、黒色腫、メルケル細胞癌、ウィルムス腫瘍、および肝芽腫などといったGPC3が発現している腫瘍細胞に会合したときに、T細胞を共刺激し、かつ/またはCD137の下流シグナリング経路を活性化する方法であって、1つまたは複数の、本開示の融合ポリペプチド、またはそのような融合ポリペプチドを含む1つまたは複数の組成物を適用する工程を含む方法も特徴とする。
【０１４４】
さらにまた本開示は、肝細胞癌（「HCC」）、黒色腫、メルケル細胞癌、ウィルムス腫瘍、および肝芽腫などといったGPC3が発現している腫瘍細胞に会合したときに、CD137の下流シグナリング経路を活性化する方法であって、1つまたは複数の本開示の融合ポリペプチド、またはそのような融合ポリペプチドを含む1つまたは複数の組成物を適用する工程を含む方法に関係する。
【０１４５】
本開示では、肝細胞癌（「HCC」）、黒色腫、メルケル細胞癌、ウィルムス腫瘍、および肝芽腫などといったGPC3が発現している腫瘍細胞に会合したときに、Tリンパ球増殖を誘発する方法であって、1つまたは複数の本開示の融合ポリペプチド、またはそのような融合ポリペプチドを含む1つまたは複数の組成物を適用する工程を含む方法も考えられる。
【０１４６】
本開示は、T細胞でのCD137クラスター化および活性化を、肝細胞癌（「HCC」）、黒色腫、メルケル細胞癌、ウィルムス腫瘍、および肝芽腫などといったGPC3が発現している腫瘍細胞に向かわせるための、本開示の融合ポリペプチドの使用、またはそのような融合ポリペプチドを含む組成物の使用を包含する。
【０１４７】
別の一態様において、本開示は、本明細書において開示する融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（DNAおよびRNA）にも関係する。さらに別の一態様において、本開示は、該核酸分子を含有する宿主細胞を包含する。遺伝コードの縮重は、同じアミノ酸を指定する別のコドンによる一定のコドンの置換を可能にするので、本開示は、融合ポリペプチドをコードする本明細書記載の具体的核酸分子に限定されず、機能的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むすべての核酸分子を包含する。この点に関して、本開示は、本開示の融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にも関係する。
【０１４８】
いくつかの態様において、本願において開示するリポカリンムテインをコードする核酸分子、例えばDNAは、本明細書において開示する融合ポリペプチドの発現を可能にするために、本開示の免疫グロブリンをコードする別の核酸分子に「機能的に連結され」うる。この点に関して、作動的連結とは、ある核酸分子の配列要素と別の核酸分子の配列要素とが、単一ポリペプチドとしての融合ポリペプチドの発現を可能にするような形で接続される連結である。
【０１４９】
本開示は、本開示の融合ポリペプチドの生産方法であって、該融合ポリペプチドが、該ポリペプチドまたはその中の任意のサブユニットをコードする核酸から出発して、遺伝子工学的方法を使って生産される方法にも関係する。いくつかの態様において、本方法は、インビボで実行することができ、ポリペプチドを、例えば細菌宿主生物または真核宿主生物中で生産し、次に、その宿主生物またはその培養物から単離することができる。本開示の融合ポリペプチドをインビトロで、例えばインビトロ翻訳系を使って生産することも可能である。
【０１５０】
融合ポリペプチドをインビボで生産する場合は、そのようなポリペプチドをコードする核酸を、組換えDNA技術（上で既に概説したもの）を使って、適切な細菌宿主生物または真核宿主生物中に導入する。この目的には、まず、確立された標準的方法を使って、本明細書に記載する融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含むクローニングベクターで宿主細胞を形質転換する。次に、異種DNAの発現が可能な、したがって対応ポリペプチドの合成が可能な条件下で、宿主細胞を培養する。次に、ポリペプチドを細胞から、または培養培地から、回収する。
【０１５１】
本開示の一態様において、本方法は、hNGALをコードする少なくとも1つの核酸分子を、hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO:2）の配列位置28、40〜52、60、68、65、70、71〜81、87、89、96、98、100〜106、114、118、120、125〜137および145に対応する配列位置のうちの少なくとも1つ、ときそれ以上をコードするヌクレオチドトリプレットにおける突然変異誘発に供する工程を含む。
【０１５２】
加えて、いくつかの態様において、Cys76とCys175との間の天然ジスルフィド結合は、本開示のhNGALムテインでは除去しうる。したがって、そのようなムテインは、還元性の酸化還元環境を有する細胞コンパートメント、例えばグラム陰性菌の細胞質中で、生産することができる。
【０１５３】
本開示は、表示した実験的突然変異誘発の配列位置以外に追加の突然変異を含む、本開示のリポカリンムテインをコードする核酸分子も包含する。そのような突然変異は許容されることが多く、例えばそれらがリポカリンムテインのフォールディング効率、血清中安定性、熱安定性またはリガンド結合親和性の改善に寄与するのであれば、有利であると判明する場合さえある。
【０１５４】
本願において開示する核酸分子は、この核酸分子の発現を可能にするための1つ（または複数の）制御配列に「機能的に連結され」うる。
【０１５５】
DNAなどの核酸分子は、それが、転写制御および/または翻訳制御に関する情報を含有する配列要素を含み、そのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「機能的に連結され」ているのであれば、「核酸分子を発現する能力を有する」または「ヌクレオチド配列の発現を可能にする」能力を有するという。機能的連結とは、制御配列要素と発現すべき配列とが遺伝子発現を可能にするような形で接続されている連結である。遺伝子発現に必要な制御領域の正確な性質は種間で変動しうるが、一般にこれらの領域はプロモーターを含み、原核生物の場合、それは、プロモーターそのもの、すなわち転写の開始を指示するDNA要素と、RNAに転写されたときに翻訳開始のシグナルを出すことになるDNA要素との両方を含有する。そのようなプロモーター領域は通常、転写および翻訳の開始に関与する5'非コード配列、例えば原核生物における-35/-10ボックスおよびシャイン・ダルガノ配列、または真核生物におけるTATAボックス、CAAT配列、および5'キャッピング要素を含む。これらの領域は、エンハンサー要素またはリプレッサー要素、ならびにネイティブポリペプチドを宿主細胞の特定コンパートメントに導くための、翻訳されるシグナル配列およびリーダー配列も含むことができる。
【０１５６】
加えて、3'非コード配列は、転写終結、ポリアデニル化などに関与する制御要素を含有しうる。ただし、これらの終結配列が特定の宿主細胞において十分に機能しない場合には、それらをその細胞において機能的なシグナルで置換しうる。
【０１５７】
それゆえに、本開示の核酸分子は、プロモーター配列などの制御配列を含むことができる。いくつかの態様において、本開示の核酸分子はプロモーター配列および転写終結配列を含む。適切な原核生物プロモーターには、例えばtetプロモーター、lacUV5プロモーターまたはT7プロモーターなどがある。真核細胞における発現に有用なプロモーターの例は、SV40プロモーターまたはCMVプロモーターである。
【０１５８】
本開示の核酸分子は、ベクター、または他の任意の種類のクローニング媒体、例えばプラスミド、ファージミド、ファージ、バキュロウイルス、コスミド、もしくは人工染色体の一部であることもできる。
【０１５９】
一態様では、核酸分子がファージミドに含まれる。ファージミドベクターとは、関心対象のcDNAに融合された、M13またはf1などの溶原性ファージの遺伝子間領域またはそれらの機能的部分をコードするベクターを表す。そのようなファージミドベクターと適当なヘルパーファージ（例えばM13K07、VCS-M13またはR408）とによる細菌宿主細胞の重感染後に、インタクトなファージ粒子が生産され、それによって、コードされている異種cDNAを、ファージ表面にディスプレイされたその対応ポリペプチドに物理的にカップリングすることが可能になる（例えばLowman, H.B.（1997）Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 401-3、またはRodi, D.J., and Makowski, L.（1999）Curr. Opin. Biotechnol. 10, 87-93参照）。
【０１６０】
そのようなクローニング媒体は、上述の制御配列および本明細書に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸配列の他にも、発現に使用される宿主細胞に適合する種に由来する複製配列およびコントロール配列、ならびに形質転換細胞またはトランスフェクト細胞に選択可能な表現型を付与する選択マーカーを含むことができる。当技術分野では数多くの適切なクローニングベクターが公知であり、市販されている。
【０１６１】
本明細書に記載する融合ポリペプチドをコードするDNA分子（例えばSEQ ID NO:20および31）、そして特に、そのようなポリペプチドのコード配列を含有するクローニングベクターは、当該遺伝子を発現させる能力を有する宿主細胞中に形質転換することができる。形質転換は標準的技法を使って行うことができる。したがって本開示は、本明細書に開示する核酸分子を含有する宿主細胞にも向けられる。
【０１６２】
形質転換細胞は、本開示の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現に適した条件下で培養される。適切な宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌（Escherichia coli）（E. coli）もしくは枯草菌（Bacillus subtilis）、または真核細胞、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、SF9またはHigh5昆虫細胞、不死化哺乳動物細胞株（例えばHeLa細胞またはCHO細胞）または初代哺乳動物細胞であることができる。
【０１６３】
本開示のリポカリンムテイン（本明細書において開示する融合ポリペプチドに含まれるものを含む）が分子内ジスルフィド結合を含むいくつかの態様では、適当なシグナル配列を使って、酸化性の酸化還元環境を有する細胞コンパートメントに新生ポリペプチドを向かわせることが好ましいであろう。そのような酸化性環境は、大腸菌などのグラム陰性菌のペリプラズムによって、またはグラム陽性菌の細胞外環境において、または真核細胞の小胞体の内腔において提供されうるものであり、通常は構造的ジスルフィド結合の形成に有利である。
【０１６４】
いくつかの態様では、宿主細胞の、好ましくは大腸菌の、サイトゾルにおいて本開示の融合ポリペプチドを生産することも可能である。その場合は、ポリペプチドを可溶性の折りたたまれた状態で直接的に得るか、封入体の形態で回収した後、インビトロで復元させることができる。さらなる選択肢は、酸化性の細胞内環境を有し、それゆえに、サイトゾルにおけるジスルフィド結合の形成を可能としうる、特別な宿主株の使用である（Venturi et al.（2002）J. Mol. Biol. 315, 1-8）。
【０１６５】
いくつかの態様において、本明細書に記載する本開示の融合ポリペプチドは、必ずしも、遺伝子工学だけを使って作製または生産されるとは限らない。むしろ、そのようなポリペプチドは、メリフィールド固相ポリペプチド合成などの化学合成によって得るか、インビトロでの転写および翻訳によって得ることもできる。例えば、分子モデリングを使って有望な突然変異を同定した後、求めている（設計した）ムテインまたはポリペプチドをインビトロで合成し、関心対象の標的に対する結合活性を調べることが可能である。タンパク質の固相および/または液相合成法は当技術分野において周知である（例えばBruckdorfer, T. et al.（2004）Curr. Pharm. Biotechnol. 5, 29-3参照）。
【０１６６】
別の一態様では、当業者に公知の確立された方法を使用するインビトロ転写/翻訳によって、本開示の融合ポリペプチドを生産しうる。
【０１６７】
本開示によって考慮されているがそのタンパク質配列または核酸配列が本明細書において明示的には開示されていない融合ポリペプチドを調製するのに役立つ方法は、当業者には理解されるであろう。概要として、アミノ酸配列のそのような修飾には、例えば、一定の制限酵素のための切断部位を組み入れることによってポリペプチド遺伝子またはそのパーツのサブクローニングを簡単にするための、単一アミノ酸位置の指定突然変異誘発が含まれる。加えて、融合ポリペプチドのその標的（例えばCD137およびGPC3）に対する親和性をさらに改善するために、これらの突然変異を組み入れることもできる。さらにまた、必要であれば、フォールディング安定性、血清中安定性、タンパク質耐性または水溶性を改善するため、または凝集傾向を低減するためなど、ポリペプチドの一定の特徴を調節するために、突然変異を導入することができる。例えばジスルフィド架橋形成を防止するために、天然のシステイン残基を別のアミノ酸に変異させうる。
【０１６８】
この開示のさらなる目的、利点、および特徴は、限定を意図しない以下の実施例および添付するその図面を検討すれば、当業者には明白になるであろう。したがって、例示的態様および随意の特徴によって本開示を具体的に開示するが、当業者は、本明細書に開示する、そこに体現されている開示の変更態様および変形態様を採用することができ、そのような変更態様および変形態様はこの開示の範囲内にあるとみなされることを理解すべきである。
【実施例】
【０１６９】
V.実施例
実施例1:抗体-リポカリンムテイン融合ポリペプチドの発現および分析
本発明者らは、標的であるGPC3およびCD137に同時に結合することができる二重特異性コンストラクトを作製するために、3つのアプローチを使用した。
【０１７０】
第1のアプローチでは、CD137特異的抗体、例えばSEQ ID NO:34および35によって与えられる重鎖および軽鎖を有するものと、GPC3リポカリンムテイン、例えばSEQ ID NO:10のものとに基づく抗体-リポカリンムテイン融合ポリペプチドを作製した。いずれの場合も、構造化されていないプロテアーゼ非感受性（G4S）3リンカー（SEQ ID NO:49）を使って、タンパク質を互いに融合した。設計した複数の異なるフォーマットを図1Aに示す。作製した変異体は、半抗体交換を最小限に抑えるために突然変異（S228P突然変異、SEQ ID NO:34参照）を施したIgG4バックボーンを含有する抗体の4つの末部のいずれか一つへのリポカリンムテインの融合物、すなわちSEQ ID NO:36および37、SEQ ID NO:38および39、SEQ ID NO:40および41、SEQ ID NO:42および43である。
【０１７１】
第2のアプローチでは、インビトロおよびインビボでのIgG4半抗体交換を最小限に抑えるためのS228P突然変異（Silva 2015参照）ならびにFc-ガンマ受容体相互作用を低減するためのF234AおよびL235A突然変異（Alegre 1992）を含有する工学的に操作されたIgG4-Fcフラグメント（SEQ ID NO:73）への2つのリポカリンムテイン（GPC3に結合するSEQ ID NO:10およびCD137に結合するSEQ ID NO:26）の融合物を作製した。結果として生じる融合ポリペプチド（SEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45）の構造を図1Bに図示する。
【０１７２】
第1のアプローチと第2のアプローチのコンストラクトを遺伝子合成によって作製し、哺乳類発現ベクターにクローニングした。次に、それらをCHO細胞において一過性に発現させた。細胞培養培地中の抗体-リポカリンムテイン融合ポリペプチドの濃度およびIgG4Fc-リポカリンムテイン融合ポリペプチドの濃度は、ForteBioプロテインAセンサー（Pall Corp.）を使って測定し、ヒトIgG1標準を使って定量した（データ省略）。
【０１７３】
第3のアプローチでは、図1Cに図示する2つの異なる設計を使って、1つまたは複数の（G4S）2リンカー（SEQ ID NO:48）によって連結された2つのリポカリンムテイン（SEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:26）の融合物を作製した。第1のデザインでは、SEQ ID NO:26をSEQ ID NO:10にC末融合することで、SEQ ID NO:46の融合ポリペプチドを得た。第2のデザインでは、2コピーのSEQ ID NO:26をSEQ ID NO:10にC末融合することで、SEQ ID NO:47の融合ポリペプチドを得た。これらのコンストラクトはアフィニティークロマトグラフィー精製用のStrep-tag（SEQ ID NO:50）を含有した。これらのコンストラクトを、標準的方法を使ってクローニングし、ペリプラズム分泌を利用して大腸菌において発現させた。
【０１７４】
プロテインAクロマトグラフィーを使用し、続いて10mMヒスチジン pH5.5、150mM NaClまたはPBS、pH7.4中でサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を行うことにより、抗体-リポカリンムテイン融合ポリペプチドおよびIgG4Fcフラグメント-リポカリンムテイン融合ポリペプチドを精製した。SEC精製後に、単量体型タンパク質を含有するフラクションをプールし、分析用SECを使って再び分析した。この分析によれば、融合ポリペプチドは、検出可能な多量体種や凝集物がなく、完全に単量体であった（データ省略）。
【０１７５】
実施例2:GPC3に対する融合ポリペプチドの特異性
本発明者らはELISAアッセイを使って、組換えヒトGPC3（R&D Systems #2119-GP-050/CF）に対する、SEQ ID NO:36および37、SEQ ID NO:38および39、SEQ ID NO:40および41、ならびにSEQ ID NO:42および43の融合ポリペプチドの特異性を決定した。標的をPBSに溶解し（1μg/mL）、マイクロタイタープレートに4℃で終夜コーティングした。各インキュベーション工程後に、0.1％（v/v）Tween 20を補足したPBS（PBS-T）100μLで、プレートを5回洗浄した。プレートを、PBS-T中の2％BSA（w/v）により、室温で1時間ブロッキングした後、洗浄した。リポカリンムテイン（SEQ ID NO:10）または融合ポリペプチドを複数の異なる濃度でウェルに加え、室温で1時間インキュベートした後、洗浄工程を行った。2％（w/v）BSAを補足したPBS-T（PBS-TB）中で、HRPにコンジュゲートされた抗ヒトNGAL抗体（1:1000希釈）と共にインキュベートした後、結合している融合タンパク質またはリポカリンムテインを検出した。追加洗浄工程後に、蛍光原性HRP基質（QuantaBlu、Thermo）を各ウェルに加え、蛍光マイクロプレートリーダーを使って蛍光強度を検出した。
【０１７６】
実験の結果を、1:1結合シグモイドフィット（ここでは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定した）から得られた当てはめ曲線と一緒に、図2に図示する。その結果得られたEC50値を、データのシグモイドフィットの誤差を含めて（これは本明細書の表に要約したすべてのデータについて当てはまる）、表1に掲載する。観察されたEC50値は、すべての抗体-リポカリンムテイン融合ポリペプチドについて類似する範囲にあり（0.25〜0.28nM）、0.55nMであったリポカリンムテイン（SEQ ID NO:10）と比べると、いずれもわずかながら良好であった。この実験は、上述の融合ポリペプチドに含めるのであれば、リポカリンムテインは、GPC3に対する活性を失うことなく、抗体の4つの末部のいずれか一つに融合されうることを示している。
【０１７７】
（表１）GPC3結合に関するELISAデータ
2018519803.tif 000010
【０１７８】
実施例3:ヒトCD137に対する融合ポリペプチドの特異性
本発明者らはELISAアッセイを使って、組換えCD137-Fc融合タンパク質（#838-4B-100、R&D Systems）に対するSEQ ID NO:36および37、SEQ ID NO:38および39、SEQ ID NO:40および41、ならびにSEQ ID NO:42および43の融合ポリペプチドの特異性を決定した。SEQ ID NO:34および35の抗体を陽性対照とした。標的をPBSに溶解し（1μg/mL）、マイクロタイタープレートに4℃で終夜コーティングした。各インキュベーション工程後に、100μLのPBS-Tでプレートを5回洗浄した。プレートを、PBS-T中の2％BSA（w/v）により、室温で1時間ブロッキングした後、洗浄した。CD137特異的抗体または融合ポリペプチドを複数の異なる濃度でウェルに加え、室温で1時間インキュベートした後、洗浄工程を行った。PBS-TB中で、HRPにコンジュゲートされたマウス抗ヒトIgG Fab抗体（Jackson Laboratories）（1:5000希釈）と共に室温で1時間インキュベートした後、結合している融合タンパク質を検出した。追加洗浄工程後に、蛍光原性HRP基質（QuantaBlu、Thermo）を各ウェルに加え、蛍光マイクロプレートリーダーを使って蛍光強度を検出した。
【０１７９】
実験の結果を、1:1結合シグモイドフィット（ここでは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定した）から得られた当てはめ曲線と一緒に、図3に図示する。その結果得られたEC50値を表2に掲載する。観察されたEC50値はすべての被験分子についてよく似ており、1.5nM〜2.3nMの範囲にあった。この実験は、上述の融合ポリペプチドに含めるのであれば、抗体は、CD137に対する活性を失うことなく、抗体の4つの末部のいずれか一つにおいて、リポカリンムテインと融合されうることを示している。
【０１８０】
（表２）CD137結合に関するELISAデータ
2018519803.tif 000011
【０１８１】
実施例4: ELISAにおける融合タンパク質の同時標的結合の証明
GPC3とCD137との両方への、SEQ ID NO:36および37、SEQ ID NO:38および39、SEQ ID NO:40および41、ならびにSEQ ID NO:42および43の融合ポリペプチドの同時結合を証明するために、二重結合ELISAフォーマットを使用した。PBS中の組換えヒトCD137-Fc融合タンパク質（R&D Systems）（1μg/mL）をマイクロタイタープレートに4℃で終夜コーティングした。各インキュベーション工程後に、100μLのPBS-Tで、プレートを5回洗浄した。プレートを、PBS-T中の2％BSA（w/v）により、室温で1時間ブロッキングした後、再び洗浄した。融合ポリペプチドを複数の異なる濃度でウェルに加え、室温で1時間インキュベートした後、洗浄工程を行った。次に、ビオチン化ヒトGPC3を、PBS-TB中1μg/mLの定濃度で1時間加えた。洗浄後にExtravidin-HRP（Sigma-Adrich、PBS-TB中に1:5000）をウェルに1時間加えた。追加洗浄工程後に、蛍光原性HRP基質（QuantaBlu、Thermo）を各ウェルに加え、蛍光マイクロプレートリーダーを使って蛍光強度を検出した。
【０１８２】
実験の結果を、1:1結合シグモイドフィット（ここでは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定した）から得られた当てはめ曲線と一緒に、図4に図示する。その結果得られたEC50値を表3に掲載する。融合ポリペプチドはいずれも、EC50値が1.7〜2.1nMの範囲にある明確な結合シグナルを示したことから、これらの融合ポリペプチドはGPC3およびCD137に同時に会合できることが証明された。
【０１８３】
（表３）同時標的結合に関するELISAデータ
2018519803.tif 000012
【０１８４】
実施例5:ヒトGPC3に対する抗体および融合ポリペプチドの親和性
組換えヒトGPC3（R&D Systems #2119-GP-050/CF）に対する、SEQ ID NO:10のリポカリンムテインの結合親和性と、SEQ ID NO:36および37、SEQ ID NO:38および39、SEQ ID NO:40および41、ならびにSEQ ID NO:42および43の融合ポリペプチドの結合親和性を、表面プラズモン共鳴（SPR）により、Biacore T200計器（GE Healthcare）で決定した。このSPR親和性アッセイでは、ビオチンCAPtureキット（Biotin CAPture Kit）（GE Healthcare）を使ってセンサーチップ（「CAPチップ」）上にビオチン化GPC3を捕捉した。センサーチップCAPはssDNAオリゴでプレ固定化処理（pre-immobilize）される。無希釈のビオチンCAPture試薬（相補的ssDNAオリゴとコンジュゲートされたストレプトアビジン）を、2μL/分の流速で300秒、適用した。リポカリンムテインの分析には濃度1μg/mLのビオチン化GPC3を使用し、融合タンパク質には0.25μg/mLのビオチン化GPC3を使用した。ビオチン化GPC3は5μL/分の流速で300秒適用した。GPC3は、EZ-Link（登録商標）NHS-PEG4-ビオチン（5倍モル過剰（Thermo Scientific））と共に室温で2時間インキュベートすることによってビオチン化した。反応混合物をZeba（商標）スピン脱塩プレート（Thermo Scientific）にローディングすることにより、反応しなかった過剰のビオチン試薬を除去した。リファレンスチャネルにはビオチンCAPture試薬だけをローディングした。
【０１８５】
親和性を決定するために、GCP3をチップ表面に固定化し、各被験作用物質（融合ポリペプチドまたはリポカリンムテイン）を、4つの異なる濃度（11.1、3.7、1.2および0.4nM）でランニングバッファー（10mM HEPES、150mM NaCl、0.05％v/v Surfactant P20、3mM EDTA、pH7.4（GE Healthcare））中に調製し、チップ表面に適用した。30μL/分の流速を適用して、試料接触時間は180秒、解離時間は1200秒とした。すべての測定を25℃で行った。センサーチップCAP表面の再生は、0.25M NaOHを含む6Mグアニジニウム-HClを注入した後、ランニング緩衝液で追加洗浄を行い、120秒の安定化期間を経ることによって達成した。タンパク質測定の前に、コンディショニングのために、再生を3サイクル行った。データはBiacore T200評価ソフトウェア（V2.0）で評価した。二重参照を使用し、1:1結合モデルを使って生データを当てはめた。
【０１８６】
データを図5に図示し、当てはめの結果を表4に要約する。このデータから、これらの融合ポリペプチドは、SEQ ID NO:10のリポカリンムテインとよく似た親和性でGPC3に結合すると結論することができる。融合ポリペプチドの場合、見掛けの結合親和性は17〜30pMの範囲にあり、SEQ ID NO:10のリポカリンムテインの場合、見掛けの親和性は12pMであった。
【０１８７】
（表４）GPC3に対する結合親和性
2018519803.tif 000013
【０１８８】
実施例6:ヒトCD137に対する抗体および融合ポリペプチドの親和性
組換えヒトCD137-Fc融合タンパク質（#838-4B-100、R&D Systems）に対する、SEQ ID NO:34および35の抗体の結合親和性と、SEQ ID NO:36および37、SEQ ID NO:38および39、SEQ ID NO:40および41、ならびにSEQ ID NO:42および43の融合ポリペプチドの結合親和性を、実施例5と同様に、表面プラズモン共鳴（SPR）によって決定した。簡単に述べると、ビオチン化CD137-FcをセンサーチップCAP上に捕捉し、各被験作用物質（融合タンパク質またはSEQ ID NO:34および35）の4つの希釈液（20、5、1.3および0.3nM）をランニング緩衝液中に調製し、チップ表面に適用した。30μL/分の流速を適用して、試料接触時間は180秒、解離時間は600秒とした。その他は、すべての測定を実施例5に記載するように行い、分析した。
【０１８９】
結果を表5に要約する。このデータは、融合ポリペプチドが、抗体とよく似た親和性でCD137に結合することを示している。融合タンパク質の場合、見掛けの結合親和性は71〜179pMの範囲にあり、抗体20H4.9（SEQ ID NO:34および35）の場合、見掛けの結合親和性は92pMであった。
【０１９０】
（表５）CD137に対する結合親和性
2018519803.tif 000014
【０１９１】
実施例7:GPC3に対するリポカリンムテインFc融合ポリペプチドの特異性
本発明者らは、実施例2に記載するようにELISAアッセイを使って、組換えヒトGPC3に対する融合ポリペプチドSEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45の特異性を決定した。
【０１９２】
実験の結果を、1:1結合シグモイドフィット（ここでは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定した）から得られた当てはめ曲線と一緒に、図7に図示する。その結果得られたEC50値を表6に掲載する。リポカリンムテインFc融合ポリペプチドについて観察されたEC50値はどちらも、GPC3結合性リポカリンムテイン（SEQ ID NO:10）よりも良好だった。
【０１９３】
（表６）GPC3結合に関するELISAデータ
2018519803.tif 000015
【０１９４】
実施例8:ヒトCD137に対するリポカリンムテインFc融合ポリペプチドの特異性
本発明者らは、実施例3に記載するように、ELISAアッセイを使って、組換えCD137-Fc融合ポリペプチドに対するSEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45のリポカリンムテインFc融合ポリペプチドの特異性を決定した。
【０１９５】
実験の結果を、1:1結合シグモイドフィット（ここでは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定した）から得られた当てはめ曲線と一緒に、図8に示す。その結果得られたEC50値を表7に掲載する。リポカリンムテインFc融合ポリペプチドについて観察されたEC50値はどちらも、CD137結合性リポカリンムテイン（SEQ ID NO:26）について観察されたEC50値より良好であった。
【０１９６】
（表７）CD137結合に関するELISAデータ
2018519803.tif 000016
【０１９７】
実施例9:ELISAにおけるリポカリンムテインFc融合ポリペプチドの同時標的結合の証明
GPC3およびCD137へのSEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45の融合ポリペプチドの同時結合を証明するために、実施例4と同様に、二重結合ELISAフォーマットを使用した。
【０１９８】
実験の結果を、1:1結合シグモイドフィット（ここでは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定した）から得られた当てはめ曲線と一緒に、図9に図示する。その結果得られたEC50値を表8に掲載する。どちらの融合ポリペプチドも、EC50値が1.7nMに近い明確な結合シグナルを示したことから、これらの融合ポリペプチドはGPC3およびCD137に同時に会合できることが証明された。
【０１９９】
（表８）同時標的結合に関するELISAデータ
2018519803.tif 000017
【０２００】
実施例10:ヒトGPC3に対する抗体および融合ポリペプチドの親和性
組換えヒトGPC3に対する、SEQ ID NO:10のGPC3結合性リポカリンムテインならびにSEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45の融合ポリペプチドの結合親和性を、実施例5に記載するように、表面プラズモン共鳴によって決定した。
【０２０１】
データを図10に図示し、当てはめによるKD値を表9に要約する。このデータは、融合ポリペプチドがリポカリンムテインとよく似た親和性でGPC3に結合することを示している。リポカリンムテインでは見掛けの結合親和性が33pMであるのに対し、融合ポリペプチドの場合、見掛けの結合親和性は、それぞれ23pMおよび29pMである。
【０２０２】
（表９）GPC3に対する結合親和性
2018519803.tif 000018
【０２０３】
実施例11:ヒトCD137に対する抗体および融合ポリペプチドの親和性
組換えヒトCD137-Fc融合タンパク質にSEQ ID NO:26のCD137結合性リポカリンムテインおよびSEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45の融合ポリペプチドの結合親和性を実施例6と同様に決定した。
【０２０４】
SEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45の融合ポリペプチドに関するデータを図11に図示し、当てはめによるKD値を、すべての被験分子について、表10に示す。このデータは、融合ポリペプチドが、2.3nMの値を有するリポカリンムテインのKD値より優れたそれぞれ1nMまたは1.1nMの親和性で、CD137に結合することを示している。
【０２０５】
（表１０）CD137に対する結合親和性
2018519803.tif 000019
【０２０６】
実施例12: GPC3に対する融合ポリペプチドの特異性
本発明者らは、SEQ ID NO:51および52のCD137結合性抗体とSEQ ID NO:10のGPC3結合性リポカリンムテインとに基づく追加の融合ポリペプチドを作製した。（G4S）3リンカーを使ってリポカリンムテインを重鎖にC末融合することにより、SEQ ID NO:53および54の融合ポリペプチドを得た。
【０２０７】
本発明者らは、実施例2に記載するようにELISAアッセイを使って、組換えヒトGPC3に対するSEQ ID NO:53および54の融合ポリペプチドの特異性を決定した。
【０２０８】
実験の結果を、1:1結合シグモイドフィット（ここでは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定した）から得られた当てはめ曲線と一緒に、図12に図示する。その結果得られたEC50値を表11に掲載する。GPC3に対するEC50は、融合ポリペプチドおよびリポカリンムテインにおいて同等である。このデータは、融合ポリペプチドに含めるのであれば、リポカリンムテインは、GPC3に対する活性を失うことなく、抗体に融合されうることを示している。
【０２０９】
（表１１）GPC3結合に関するELISAデータ
2018519803.tif 000020
【０２１０】
実施例13:ELISAにおける融合ポリペプチドの同時標的結合の証明
GPC3とCD137との両方へのSEQ ID NO:53および54の融合ポリペプチドの同時結合を証明するために、実施例4と同様に、二重結合ELISAフォーマットを使用した。
【０２１１】
実験の結果を、1:1結合シグモイドフィット（ここでは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定した）から得られた当てはめ曲線と一緒に、図13に図示する。融合ポリペプチドは、EC50値が4.66±0.65nMである明確な結合シグナルを示したことから、このポリペプチドはGPC3およびCD137に同時に会合できることが証明された。
【０２１２】
実施例14: GPC3に対する融合ポリペプチドの特異性
本発明者らは、実施例2に記載するようにELISAアッセイを使って、組換えヒトGPC3に対する、SEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:47の二重特異性融合ポリペプチドならびにSEQ ID NO:8のリポカリンムテインの特異性を決定した。
【０２１３】
実験の結果を、1:1結合シグモイドフィット（ここでは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定した）から得られた当てはめ曲線と一緒に、図14に図示する。その結果得られたEC50値を表12に掲載する。融合ポリペプチドのEC50値は、リポカリンムテインのEC50値と少なくとも同じくらいかそれより優れている。このデータは、これら2つの融合ポリペプチドに含めるのであれば、リポカリンムテインは、GPC3に対する活性を失うことなく、抗体に融合されうることを証明している。
【０２１４】
（表１２）GPC3結合に関するELISAデータ
2018519803.tif 000021
【０２１５】
実施例15:ヒトCD137に対する融合ポリペプチドの特異性
本発明者らは、ELISAアッセイを使って、実施例3に記載するように組換えCD137-Fc融合タンパク質に対するSEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:47の二重特異性ポリペプチドならびにSEQ ID NO:26のリポカリンムテインの特異性を決定した。
【０２１６】
実験の結果を、1:1結合シグモイドフィット（ここでは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定した）から得られた当てはめ曲線と一緒に、図15にプロットする。その結果得られたEC50値を表13に掲載する。融合ポリペプチドのEC50値は、リポカリンムテインのEC50値と少なくとも同じくらいか、それより優れている。このデータは、これら2つの融合ポリペプチドに含めるのであれば、抗体は、CD137に対する活性を失うことなく、リポカリンムテインに融合されうることを証明している。
【０２１７】
（表１３）CD137結合に関するELISAデータ
2018519803.tif 000022
【０２１８】
実施例16: ELISAにおける融合ポリペプチドの同時標的結合の証明
GPC3およびCD137への、SEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:47の二重特異性ポリペプチドの同時結合を証明するために、実施例4と同様に、二重結合ELISAフォーマットを使用した。
【０２１９】
実験の結果を、1:1結合シグモイドフィット（ここでは、EC50値および最大シグナルを自由パラメータとし、傾きを1に固定した）から得られた当てはめ曲線と一緒に、図16に図示する。どちらの融合ポリペプチドも、EC50値が7.3〜7.5nMである明確な結合シグナルを示したことから、どちらの融合ポリペプチドもGPC3およびCD137に同時に会合できることが証明された。
【０２２０】
（表１４）同時標的結合に関するELISAデータ
2018519803.tif 000023
【０２２１】
実施例17:ヒトGPC3に対する融合ポリペプチドの親和性
組換えヒトGPC3および組換えヒトCD137に対する、GPC3結合性リポカリンムテインならびにSEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:47の二重特異性ポリペプチドの結合親和性を、実施例5に記載の手順と同様にして、表面プラズモン共鳴により、Biacore T200計器（GE Healthcare）で、ランニング緩衝液としてHBS-EP＋（1×; BR-1006-69; GE Healthcare）を使って決定した。
【０２２２】
ビオチンCAPtureキット（GE Healthcare）を使って、チップ表面上にビオチン化二重特異性ポリペプチドを固定化した。標準的なNHSケミストリーを使って二重特異性ポリペプチドをビオチン化した。無希釈のビオチンCAPture試薬（相補的ssDNAオリゴとコンジュゲートされたストレプトアビジン）を、相補的ssDNAオリゴがプレ固定化されたセンサーチップCAP上に捕捉した。その後、1μg/mlのビオチン化ムテインを5μL/分の流速で300秒適用した。
【０２２３】
4つの濃度（300nM、100nM、33nMおよび11nM）のGPC3を30μL/分の流速で適用した。GPC3を180秒注入し、続く解離時間は1200秒に設定した。チップ表面の再生は、6Mグアニジニウム-HCl＋0.25M NaOHを10μL/分の流速で注入（120秒）することによって達成した。再生溶液の注入後に、HBS-EP＋（1×; BR-1006-69; GE Healthcare）ランニング緩衝液による追加洗浄工程と、120秒の安定化期間を設けた。
【０２２４】
データは、結合応答から、対照チャネル（ビオチンCAPture試薬だけを負荷したもの）で測定される対応シグナルを差し引き、緩衝液注入を差し引くことによって、二重参照した。データ処理および速度論的当てはめにBiacore T200評価ソフトウェアV2.0を使用して、結合反応に関する会合速度定数kaおよび解離速度定数kdを決定した。
【０２２５】
それぞれのセンサーグラムを図17に示す。結果を表15に要約する。このデータは、これらの二重特異性ポリペプチドが、それぞれ4.3nM（SEQ ID NO:46）および3.5nM（SEQ ID NO:47）の親和性でGPC3に結合することを示している。
【０２２６】
（表１５）GPC3に対する結合親和性
2018519803.tif 000024
【０２２７】
実施例18: ヒトCD137に対する融合ポリペプチドの親和性
組換えヒトCD137-Fc融合タンパク質（#838-4B-100、R&D Systems）に対する、CD137結合性リポカリンムテインならびにSEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:47の二重特異性ポリペプチドの結合親和性を、実施例6と同様に、表面プラズモン共鳴により、Biacore T200計器（GE Healthcare）を使って決定した。SPR親和性アッセイに先だって、ヒト抗体捕捉キット（Human Antibody Capture Kit）（GE Healthcare #BR-1008-39）を製造者の説明書に従って使用することにより、CM5センサーチップを抗ヒトFc抗体で誘導体化した。
【０２２８】
親和性を決定するために、ヒトCD137-Fc融合タンパク質を、濃度0.25mg/lm、流速10μL/分および接触時間180で、チップ上に固定化した。二重特異性ポリペプチドをランニング緩衝液（10mM HEPES、150mM NaCl、0.05％v/v Surfactant P20、3mM EDTA、pH7.4（GE Healthcare））中に4つの異なる濃度（1000nM、200nM、40nMおよび8nM）で調製し、チップ表面に適用した。30μL/分の流速を適用し、試料接触時間は180秒、解離時間は600秒とした。すべての測定を25℃で行った。センサーチップ表面の再生は、10mMグリシンpH1.7の注入後に、ランニング緩衝液による追加洗浄を行い、120秒の安定化期間を経ることによって達成した。タンパク質測定の前に、コンディショニングのために、再生を3サイクル行った。データはBiacore T200評価ソフトウェア（V2.0）で評価した。二重参照を使用し、1:1結合モデルを使って生データを当てはめた。
【０２２９】
結果を図18に示し、表16に要約する。このデータは、これらの二重特異性ポリペプチドが、CD137に対するリポカリンムテインの親和性と少なくとも同じぐらいの親和性でCD137に結合することを示している。
【０２３０】
（表１６）CD137に対する結合親和性
2018519803.tif 000025
【０２３１】
実施例19:被覆融合ポリペプチドを使った機能的T細胞活性化アッセイ
本発明者らは、T細胞活性化アッセイを使って、SEQ ID NO:36および37、SEQ ID NO:38および39、SEQ ID NO:40および41、ならびにSEQ ID NO:42および43の融合ポリペプチドの、T細胞応答を共刺激する能力を評価した。この目的のために、融合ポリペプチドを複数の異なる濃度で抗ヒトCD3抗体（OKT3, eBioscience）と一緒にプラスチック製ディッシュにコーティングし、次にその被覆表面上、可溶性抗ヒトCD28抗体（クローン28.2; eBioscience）の存在下で、精製T細胞をインキュベートした。本発明者らは、読み出し情報として、上清インターロイキン2（IL-2）レベルを測定した。陰性対照として、ヒトIgG4アイソタイプを陰性対照として利用した。以下にこの実験を詳細に説明する。
【０２３２】
ポリスクロース密度勾配（BiochromのBiocoll 1.077g/mL）による遠心分離をBiochromのプロトコールに従って行うことにより、健常ボランティアドナーのヒト末梢血単核球（PBMC）をバフィーコートから単離した。結果として得られたPBMCから、Pan T細胞精製キット（Miltenyi Biotec GmbH）と製造者のプロトコールとを使って、Tリンパ球を単離した。精製されたT細胞を90％FCSおよび10％DMSOからなる緩衝液に再懸濁し、液体窒素を使って直ちに凍結し、さらなる使用まで液体窒素中で保存した。アッセイのために、T細胞を16時間融解し、10％FCSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Life Technologies）を補足した培養培地（RPMI 1640、Life Technologies）中で培養した。
【０２３３】
以下の手順を実験条件ごとに三連で行った。0.5μg/mL抗CD3抗体とSEQ ID NO:36および37、SEQ ID NO:38および39、SEQ ID NO:40および41、ならびにSEQ ID NO:42および43の融合ポリペプチドの希釈系列（25μg/mL、2.5μg/mL、および0.25μg/mL）との混合物またはIgG4アイソタイプ陰性対照（25μg/mL）200μLを使って、平底組織培養プレートを、4℃で終夜コーティングした。実験条件が同じもう一つの設定では、抗CD3抗体の代わりに（さらにもう一つの陰性対照として）IgG1アイソタイプと一緒に、融合ポリペプチドをコーティングした。次の日、PBSで2回洗浄し、2μg/mL抗hCD28抗体を補足した培養培地中のT細胞懸濁液100μL（5×104個のT細胞に相当）を各ウェルに加えた。プレートをガス透過性シール（4titude）で覆い、湿潤5％CO2雰囲気下、37℃で3日間インキュベートした。次に、上清中のIL-2濃度および細胞増殖を評価した。
【０２３４】
プールした細胞培養上清中のヒトIL-2レベルは、R&D SystemsのIL-2 DuoSet DuoSetキットを使って定量した。以下に記載する手順を実行した。第1工程では、PBSに希釈した1μg/mLの「ヒトIL-2捕捉抗体（Human IL-2 Capture Antibody）」（R&D System）を使って、384ウェルプレートを室温で2時間、コーティングした。次に、Biotek EL405 select CW洗浄機（Biotek）を使って、ウェルを80μlのPBS-T（0.05％Tween20を含有するPBS）で5回洗浄した。1％カゼイン（w/w）を追加含有するPBS-T中で1時間ブロッキングを行った後、プールした上清および培養培地に希釈したIL-2標準の濃度系列を、384ウェルプレート中、4℃で終夜、インキュベートした。捕捉されたIL-2の検出および定量が可能になるように、100ng/mLビオチン化ヤギ抗hIL-2-Bio検出抗体（R&D System）と1μg/mL Sulfotag標識ストレプトアビジン（Mesoscale Discovery）との混合物を、0.5％カゼインを含有するPBS-Tに入れて加え、室温で1時間インキュベートした。洗浄後に、25μLの読み取り緩衝液を各ウェルに加え、Mesoscale Discoveryリーダーを使って各ウェルの電気化学ルミネセンス（ECL）シグナルを読み取った。分析および定量はMesoscale Discoveryソフトウェアを使って行った。
【０２３５】
実験の結果を図19に図示する。4つの融合ポリペプチド（SEQ ID NO:36および37、SEQ ID NO:38および39、SEQ ID NO:40および41、ならびにSEQ ID NO:42および43）のすべてについて、陰性対照アイソタイプIgG4と比較して、使用したT細胞によるIL-2生産の明確な誘発がある。このデータはさらに、ポリペプチド融合物のコーティング濃度を高くすると、IL-2誘導が強くなる傾向も示している。T細胞の抗CD3刺激が存在しない場合、融合ポリペプチドはT細胞によるIL-2生産を誘発しなかった。これは、融合ポリペプチドが、最適未満の濃度の抗CD3抗体および抗CD28抗体で刺激されたT細胞の活性化を共刺激する能力を有することを証明している。
【０２３６】
実施例20:腫瘍細胞に結合した融合ポリペプチドを使った機能的T細胞活性化アッセイ
本発明者らは、標的細胞依存的T細胞活性化アッセイを使って、CD137およびGPC3を同時に結合する能力を有するSEQ ID NO:36および37、SEQ ID NO:44、ならびにSEQ ID NO:45の融合ポリペプチドの、GPC3陽性細胞株上に固定化された場合のT細胞応答共刺激能力を評価した。本発明者らは、陰性対照として、SEQ ID NO:34および35の単一特異性CD137結合抗体を使用した。この実験では、抗ヒトCD3抗体（OKT3、eBioscience）をプラスチック製培養ディッシュにコーティングした後、GPC3陽性HepG2細胞をそのディッシュ上で終夜培養した。翌日、その被覆表面上、1μg/mLのSEQ ID NO:36および37、SEQ ID NO:44、ならびにSEQ ID NO:45の融合ポリペプチド、またはSEQ ID NO:34および35の対照抗体の存在下で、精製T細胞をインキュベートした。本発明者らは、読み出し情報として、上清インターロイキン2（IL-2））レベルを測定した。以下にこの実験を詳述する。
【０２３７】
ポリスクロース密度勾配（BiochromのBiocoll 1.077g/mL）による遠心分離をBiochromのプロトコールに従って行うことにより、健常ボランティアドナーのヒト末梢血単核球（PBMC）をバフィーコートから単離した。結果として得られたPBMCから、Pan T細胞精製キット（Miltenyi Biotec GmbH）と製造者のプロトコールとを使って、Tリンパ球を単離した。精製されたT細胞を90％FCSおよび10％DMSOからなる緩衝液に再懸濁し、液体窒素を使って直ちに凍結し、さらなる使用まで液体窒素中で保存した。アッセイのために、T細胞を16時間融解し、10％FCSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Life Technologies）を補足した培養培地（RPMI 1640、Life Technologies）中で培養した。
【０２３８】
以下の手順を実験条件ごとに三連で行った。平底組織培養プレートはプレコーティングを行わないか、200μLの0.25μg/mL抗CD3抗体を使って、37℃で1時間、プレコーティングした。次に、プレートをPBSで2回洗浄した。1ウェルあたり1.25×104個のHepG2腫瘍細胞をプレーティングし、湿潤5％CO2雰囲気下、37℃で終夜接着させた。HepG2細胞は前もって標準的条件下での培養で成長させ、Accutaseを使って剥離し、培養培地に再懸濁しておいた。
【０２３９】
翌日、腫瘍細胞の増殖を阻止するために、腫瘍細胞を、濃度10μg/mlのマイトマイシンC（Sigma Aldrich）により、37℃で2時間処理した。プレートをPBSで2回洗浄し、100μLのT細胞懸濁液（5×104個のT細胞に相当）と、濃度1μg/mLの融合ポリペプチドまたは陰性対照とを、各ウェルに加えた。プレートをガス透過性シール（4titude）で覆い、湿潤5％CO2雰囲気下、37℃で3日間インキュベートした。次に、上清中のIL-2濃度を下記のとおり評価した。
【０２４０】
細胞培養上清中のヒトIL-2レベルは、R&D SystemsのIL-2 DuoSetキットを使って定量した。以下に記載する手順を実行する。第1工程では、PBSに希釈した1μg/mLの「ヒトIL-2捕捉抗体」（R&D System）を使って、384ウェルプレートを室温で2時間、コーティングした。次に、Biotek EL405 select CW洗浄機（Biotek）を使って、ウェルを80μlのPBS-T（0.05％Tween20を含有するPBS）で5回洗浄した。1％カゼイン（w/w）を追加含有するPBS-T中で1時間ブロッキングを行った後、プールした上清および培養培地に希釈したIL-2標準の濃度系列を、384ウェルプレート中、4℃で終夜、インキュベートした。捕捉されたIL-2の検出および定量が可能になるように、100ng/mLビオチン化ヤギ抗hIL-2-Bio検出抗体（R&D System）と1μg/mL Sulfotag標識ストレプトアビジン（Mesoscale Discovery）との混合物を、0.5％カゼインを含有するPBS-Tに入れて加え、室温で1時間インキュベートした。洗浄後に、25μLの読み取り緩衝液を各ウェルに加え、Mesoscale Discoveryリーダーを使って各ウェルの電気化学ルミネセンス（ECL）シグナルを読み取った。分析および定量はMesoscale Discoveryソフトウェアを使って行った。
【０２４１】
実験の結果を図20に図示する。SEQ ID NO:36および37、SEQ ID NO:44、ならびにSEQ ID NO:45の3つの融合ポリペプチドの場合、SEQ ID NO:34および35の対照抗体と比較して、使用したT細胞によるIL-2生産の明確な誘発がある。これは、GPC3結合性融合ポリペプチドが対照抗体より高いレベルのIL-2生産を呈することが証拠となるとおり、本開示の融合ポリペプチドが標的依存的にT細胞活性化を共刺激する能力を有することを示している。
【０２４２】
実施例21:二重特異性結合の遮断を伴う、および伴わない、腫瘍細胞に結合した融合ポリペプチドを使った機能的T細胞活性化アッセイ
本発明者らは、実施例20に記載した実験と同様の標的細胞依存的T細胞活性化アッセイを使って、CD137およびGPC3に同時に結合する能力を有するSEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45の融合ポリペプチドの、GPC3陽性細胞株に結合したときのT細胞応答共刺激能力を評価した。対照として、GPC3陽性細胞に結合している二重特異性コンストラクトSEQ ID NO:44またはSEQ ID NO:45を追い出すために、過剰量のSEQ ID NO:10の単一特異性GPC3結合性アンチカリンの存在下で、実験を行った。この実験では、抗ヒトCD3抗体（OKT3、eBioscience）をプラスチック製培養ディッシュにコーティングした後、GPC3陽性Hep3B細胞をそのディッシュ上で終夜培養した。翌日、その被覆表面上、4つの濃度のSEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45の融合ポリペプチド（1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL、0.001μg/mL）の存在下で、精製T細胞をインキュベートした。並行して、過剰量のSEQ ID NO:10（1mg/mL）を添加して、実験を行った。本発明者らは、読み出し情報として、上清インターロイキン2（IL-2）レベルを測定した。以下にこの実験を詳述する。
【０２４３】
ポリスクロース密度勾配（BiochromのBiocoll 1.077g/mL）による遠心分離をBiochromのプロトコールに従って行うことにより、健常ボランティアドナーのヒト末梢血単核球（PBMC）をバフィーコートから単離した。結果として得られたPBMCから、Pan T細胞精製キット（Miltenyi Biotec GmbH）と製造者のプロトコールとを使って、Tリンパ球を単離した。精製されたT細胞を、10％FCSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Life Technologies）を補足した培養培地（RPMI 1640、Life Technologies）中で培養した。
【０２４４】
以下の手順を実験条件ごとに三連で行った。200μLの0.25μg/mL抗CD3抗体を使って、平底組織培養プレートを37℃で1時間プレコーティングした。次に、プレートをPBSで2回洗浄した。1ウェルあたり1.25×104個のHep3B腫瘍細胞をプレーティングし、湿潤5％CO2雰囲気下、37℃で終夜接着させた。Hep3B細胞は前もって標準的条件下での培養で成長させ、Accutaseを使って剥離し、培養培地に再懸濁しておいた。
【０２４５】
翌日、腫瘍細胞の増殖を阻止するために、腫瘍細胞を、濃度10μg/mlのマイトマイシンC（Sigma Aldrich）により、37℃で2時間処理した。プレートをPBSで2回洗浄し、100μLのT細胞懸濁液（5×104個のT細胞に相当）と、濃度1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL、0.001μg/mLのSEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45の融合ポリペプチドとを、過剰量のSEQ ID NO:10（1mg/mL）の存在下または非存在下で加えた。プレートをガス透過性シール（4titude）で覆い、湿潤5％CO2雰囲気下、37℃で3日間インキュベートした。次に、BD BioscienceのヒトIL-2 ELISAセットを製造者の説明書に従って使用することにより、上清中のIL-2濃度を決定した。
【０２４６】
実験の結果を図21に図示する。SEQ ID NO:44（図21A）およびSEQ ID NO:45（図21C）の2つの融合ポリペプチドの場合、使用したT細胞によるIL-2生産の明確な誘発があり、その生産は濃度の上昇と共に増加する。対照的に、Hep3B細胞への二重特異性物質SEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45の結合を阻害する過剰量のSEQ ID NO:10の存在下では、IL-2生産の誘発は消滅する。これは、本開示の融合ポリペプチドが標的依存的にT細胞活性化を共刺激する能力を有することを示している。
【０２４７】
注目すべきことに、誘導されるIL-2の量はSEQ ID NO:45と比較してSEQ ID NO:44の方が高く、このことは、二重特異性GPC3/CD137融合物の幾何学的配置（geometry）がT細胞活性化の強さを決定するのに重要な役割を果たすことを示している。
【０２４８】
実施例22:GPC3レベルが高い腫瘍細胞およびGPC3レベルが低い腫瘍細胞を使った機能的T細胞活性化アッセイ
本発明者らは、実施例20に記載する実験と同様の標的細胞依存的T細胞活性化アッセイを使って、SEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45の融合ポリペプチドの、使用した細胞株のGPC3レベルに依存してT細胞応答を共刺激する能力を評価した。本発明者らは、陰性対照として、HER2結合性抗体トラスツズマブを使用した。比較のために、本発明者らは、SEQ ID NO:74および75のリファレンス抗CD137モノクローナル抗体の挙動を調べた。この実験では抗ヒトCD3抗体（OKT3、eBioscience）をプラスチック製培養ディッシュにコーティングした後、そのディッシュで、HepG2、SKBR3またはMCF7細胞を別々に終夜培養した。翌日、その被覆表面上、さまざまな濃度のSEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45の融合ポリペプチド、リファレンス抗体SEQ ID NO:74および75、ならびに陰性対照トラスツズマブおよび媒体（すなわち試験物の添加なし）の存在下で、精製T細胞をインキュベートした。本発明者らは、読み出し情報として、上清インターロイキン2（IL-2）レベルを測定した。以下にこの実験を詳述する。
【０２４９】
ポリスクロース密度勾配（BiochromのBiocoll 1.077g/mL）による遠心分離をBiochromのプロトコールに従って行うことにより、健常ボランティアドナーのヒト末梢血単核球（PBMC）をバフィーコートから単離した。結果として得られたPBMCから、Pan T細胞精製キット（Miltenyi Biotec GmbH）と製造者のプロトコールとを使って、Tリンパ球を単離した。精製されたT細胞を90％FCSおよび10％DMSOからなる緩衝液に再懸濁し、液体窒素を使って直ちに凍結し、さらなる使用まで液体窒素中で保存した。アッセイのために、T細胞を16時間融解し、10％FCSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Life Technologies）を補足した培養培地（RPMI 1640、Life Technologies）中で培養した。
【０２５０】
以下の手順を実験条件ごとに三連で行った。200μLの0.25μg/mL抗CD3抗体を使って、平底組織培養プレートを37℃で1時間、プレコーティングした。次にプレートをPBSで2回洗浄した。1ウェルあたり5×104個の標的腫瘍細胞をプレーティングし、湿潤5％CO2雰囲気下、37℃で終夜接着させた。標的細胞は前もって標準的条件下での培養で成長させ、Accutaseを使って剥離し、培養培地に再懸濁しておいた。
【０２５１】
翌日、腫瘍細胞の増殖を阻止するために、腫瘍細胞を、濃度30μg/mlのマイトマイシンC（Sigma Aldrich）により、37℃で2時間処理した。プレートをPBSで2回洗浄し、100μLのT細胞懸濁液（5×104個のT細胞に相当）を、濃度範囲0.05nM〜5nMの試験物SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、リファレンス抗体 SEQ ID NO:74および75、ならびに陰性対照トラスツズマブと一緒に、各ウェルに加えた。プレートをガス透過性シール（4titude）で覆い、湿潤5％CO2雰囲気下、37℃で3日間インキュベートした。次に上清中のIL-2濃度を下記のように評価した。
【０２５２】
細胞培養上清中のヒトIL-2レベルは、R&D SystemsのIL-2 DuoSetキットを使って定量した。以下に記載する手順を実行する。第1工程では、PBSに希釈した1μg/mLの「ヒトIL-2捕捉抗体」（R&D System）を使って、384ウェルプレートを室温で2時間、コーティングした。次に、Biotek EL405 select CW洗浄機（Biotek）を使って、ウェルを80μlのPBS-T（0.05％Tween20を含有するPBS）で5回洗浄した。1％カゼイン（w/w）を追加含有するPBS-T中で1時間ブロッキングを行った後、プールした上清および培養培地に希釈したIL-2標準の濃度系列を、384ウェルプレート中、4℃で終夜、インキュベートした。捕捉されたIL-2の検出および定量が可能になるように、100ng/mLビオチン化ヤギ抗hIL-2-Bio検出抗体（R&D System）と1μg/mL Sulfotag標識ストレプトアビジン（Mesoscale Discovery）との混合物を、0.5％カゼインを含有するPBS-Tに入れて加え、室温で1時間インキュベートした。洗浄後に、25μLの読み取り緩衝液を各ウェルに加え、Mesoscale Discoveryリーダーを使って各ウェルの電気化学ルミネセンス（ECL）シグナルを読み取った。分析および定量はMesoscale Discoveryソフトウェアを使って行った。
【０２５３】
代表的実験の結果を図22に図示する。この図において、値は、試験物の非存在下でのバックグラウンドIL-2生産との対比でプロットされており、それゆえに、バックグラウンドと比較した倍率変化を表している。陰性対照トラスツズマブ（図22A、三角）が3つの細胞株のいずれにおいてもT細胞でのIL-2誘導につながらないのに対し、二重特異性融合ポリペプチドSEQ ID NO:44（図22A、丸）およびSEQ ID NO:45（図22A、四角）の濃度上昇は、GPC3発現HepG2細胞の存在下で、T細胞にIL-2を生産させる。しかし、SEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45によるIL-2の増加は、GPC3陰性のSKBR3細胞およびMCF7細胞では明白でない（図22）。この挙動は、3つすべての細胞株の存在下でT細胞においてIL-2を誘導する抗CD137抗体SEQ ID NO:74および75とは著しく異なる（図22B）。
【０２５４】
この実験は、SEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45が、標的細胞上のGPC3の存在に依存する形でT細胞を活性化することを、明確に証明している。GPC3陽性HepG2細胞株はIL-2生産によって測定される明確なT細胞活性化を示すが、この効果は、検出可能なレベルのGPC3を発現しないSKBR3細胞およびMCF7細胞では認められない。この効果はGPC3の存在に起因するのであって、試験対象の細胞のGPC3陰性細胞株が潜在的にCD137シグナリングを無効にすることに起因するのではないと考えられることは、抗CD137抗体SEQ ID NO:74および75が3つの細胞タイプのすべてにおいてCD137シグナリングを介してT細胞を活性化する能力を有するという事実によって明らかになる。
【０２５５】
実施例23:融合ポリペプチドのエクスビボT細胞免疫原性評価
人間における抗薬物抗体形成のリスクを調べるために、二重特異性融合ポリペプチドSEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45、対照抗体トラスツズマブおよび陽性対照キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）のインビトロT細胞免疫原性評価を行った。この実験を行うために、世界人口における分布を反映するHLAアロタイプをカバーするように選択された32人のドナーのPBMCを融解し、洗浄し、1ウェルあたり3×105細胞の密度で96ウェルプレート上に播種した。アッセイ培地に希釈した試験物を、30μg/mLの濃度で細胞に加えた。ブランクとしてはアッセイ培地のみを使用し、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）をナイーブ陽性対照として使用した。PBMCを、湿潤雰囲気中、37℃および5％CO2で、7日間インキュベートした。7日目に、PBMCを表面表現型CD3＋マーカーおよびCD4＋マーカーについて標識すると共に、DNAに取り込まれたEdU（5-エチニル-2'デオキシウリジン）（細胞増殖マーカーとして使用）について標識した。Guava easyCyte 8HTフローサイトメーターを使ってCD3＋CD4＋EdU＋増殖細胞のパーセンテージを測定し、GuavaSoft InCyteソフトウェアを使って分析した。
【０２５６】
図23に、32人すべてのドナーおよび試験対象の全試験分子について、このアッセイの結果を掲載する。図23Aでは、試験物の存在下と非存在下とを対比した増殖の比によって得られる刺激指数をプロットした。応答ドナーを規定するしきい（刺激指数＞2）を点線で示す。図23Bでは、このしきいによって規定される応答ドナーの数をプロットした。リファレンスであるトラスツズマブに応答するドナーの数は1にとどまっていて小さく、一方、陽性対照KLHに対しては、32人のドナーはすべてが、しきいを上回る強い増殖で応答することは、明らかである。二重特異性融合ポリペプチドSEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45についても、応答ドナーの数は、どちらの場合も1にとどまっている。
【０２５７】
それゆえに、この実験は、二重特異性融合ポリペプチドがインビトロT細胞免疫原性評価では応答をほとんど誘発しないことを証明しており、これは、免疫原性応答を誘発するリスクが低いことを示している。
【０２５８】
実施例24:Fc-ガンマ受容体hFcγRI/CD64およびhFcγRIIIA/CD16aに対する親和性
工学的に操作されたIgG4に基づくバックボーンを持つポリペプチド融合物（SEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45）の、Fc-ガンマ受容体hFcγRI/CD64（R&D Systems）およびhFcγRIIIA/CD16a（R&D Systems）に対する結合親和性を測定するために、表面プラズモン共鳴（SPR）に基づくアッセイを使用した。トラスツズマブを、IgG1バックボーンを持つ単一特異性抗体の対照とした。このSPR親和性アッセイでは、ポリペプチド融合物をビオチン化し、ビオチンCAPtureキット（GE Healthcare）を使ってセンサーチップCAP上に捕捉した。センサーチップCAPをssDNAオリゴでプレ固定化処理した。無希釈のビオチンCAPture試薬（相補的ssDNAオリゴヌクレオチドとコンジュゲートされたストレプトアビジン）を、2μL/分の流速で300秒、適用した。次に10μg/mLのビオチン化ポリペプチド融合物を、5μL/分の流速で300秒、適用した。トラスツズマブおよびポリペプチド融合物は、EZ-Link（登録商標）NHS-PEG4-ビオチン（Thermo Scientific）と共に室温で2時間インキュベートすることによってビオチン化した。反応混合物をZeba（商標）スピン脱塩プレート（Thermo Scientific）にローディングすることにより、反応しなかった過剰のビオチン試薬を除去した。リファレンスチャネルにはビオチンCAPture試薬だけをローディングした。
【０２５９】
親和性を決定するために、hFcγRI/CD64の4つの希釈液（100、25、6.25および1.6nM）またはhFcγRIIIA/CD16aの4〜5つの希釈液（1000、333、111、37および12nM）をランニング緩衝液（10mM HEPES、150mM NaCl、0.05％v/v Surfactant P20、3mM EDTA、pH7.4（GE Healthcare））中に調製し、チップ表面に適用した。30μL/分の流速を適用して、試料接触時間は180秒、解離時間はhFcγRI/CD64の場合で1800/2700秒、またはhFcγRIIIA/CD16aの場合で300秒とした。すべての測定を25℃で行った。センサーチップCAP表面の再生は、0.25M NaOHを含む6M Gua-HClを注入した後、ランニング緩衝液で追加洗浄を行い、120秒の安定化期間を経ることによって達成した。タンパク質測定の前に、コンディショニングのために、再生を3サイクル行った。データはBiacore T200評価ソフトウェア（V2.0）で評価した。二重参照を使用した。hFcγRI/CD64については、1:1結合モデルを使って生データを当てはめた。hFcγRIIIA/CD16aについては定常状態親和性モデルを使って生データを当てはめた。
【０２６０】
表17に、hFcγRI/CD64に関するデータの当てはめの結果を示す。IgG1に基づく試験物トラスツズマブは0.3nMの親和性を呈した。ポリペプチド融合物SEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45は、hFcγRI/CD64への検出可能な結合を示さなかった。これらのデータは、アイソタイプをIgG1から工学的に操作されたIgG4へと切り替えることによって、hFcγRI/CD64への結合を問題にならないレベルまで低減できることを証明している。
【０２６１】
（表１７）
2018519803.tif 000026
【０２６２】
表18に、hFcγRIIIA/CD16aに関するデータの当てはめの結果を示す。結果として得られた、IgG1に基づく試験物トラスツズマブのhFcγRIIIA/CD16aに対する結合親和性が350nM前後であったのに対し、ポリペプチド融合物SEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45はhFcγRIIIA/CD16aへの検出可能な結合を示さなかった。これらのデータは、アイソタイプをIgG1から工学的に操作されたIgG4へと切り替えることによって、hFcγRI/CD64への結合を問題にならないレベルまで低減できることを証明している。
【０２６３】
（表１８）
2018519803.tif 000027
【０２６４】
実施例25:新生児型Fc受容体に対する親和性
工学的に操作されたIgG4に基づくバックボーンを持つポリペプチド融合物（SEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45）の、新生児型Fc受容体（FcRn、Sino Biologicals、#CT009-H08H）に対する結合親和性を測定するために、表面プラズモン共鳴（SPR）に基づくアッセイを使用した。トラスツズマブを、IgG1バックボーンを持つ単一特異性抗体の対照とした。このSPR親和性アッセイでは、FcRnをCM5センサーチップ（GE Healthcare）上に製造者の説明書に従って共有結合で固定化した。簡単に述べると、デキストランマトリックスのカルボキシル基を、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド（EDC）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）で活性化した後、FcRnタンパク質の1級アミンを、シグナルが約200RUに達するまで表面上のNHSエステルと反応させた。最後に、表面を横切るように1Mエタノールアミンの溶液を通すことによって、未反応のNHSエステルをブロッキングした。固定化手順中の流速は常に10μl/分とした。
【０２６５】
親和性を決定するために、すべてのコンストラクトについて、6つの希釈液（1000nM、333nM、111nM、37nM、12nMおよび4nM）をランニング緩衝液（10mM HEPES、150mM NaCl、0.05％v/v Surfactant P20、3mM EDTA、pH6.0）中に調製し、チップ表面に適用した。30μL/分の流速を適用して、試料接触時間は180秒、解離時間は30秒とした。すべての測定を25℃で行った。センサーチップCAP表面の再生は、10mMグリシンpH3.0の注入で達成した。タンパク質測定の前に、コンディショニングのために、再生を3サイクル行う。データは、Biacore T200評価ソフトウェア（V2.0）により、二重参照で評価した。定常状態親和性モデルを使って生データを当てはめた。
【０２６６】
表19に反映されているように、結果として得られた、FcRnに対するポリペプチド融合物の結合親和性はいずれも2μM前後であった。これは、アイソタイプをIgG1から工学的に操作されたIgG4バックボーンに切り替えても、FcRn結合には検出可能な影響がないことを証明している。
【０２６７】
（表１９）
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【０２６８】
実施例26:マウスにおける融合ポリペプチドの薬物動態
SEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45によって規定される融合ポリペプチドの薬物動態の分析を、マウスにおいて行った。およそ5週齢の雄CD-1マウス（1時点あたり3匹; Charles River Laboratories, Research Models and Services, Germany GmbH）の尾静脈に10mg/kgの用量で融合ポリペプチドを注射した。試験物は5mL/kgの体積を使ってボーラスとして投与した。5分、1時間、2時間、4時間、8時間、24時間、48時間、4日、8日および14日の時点において、マウスから血漿試料を得た。各動物および各時点について少なくとも100μLのLi-ヘパリン血漿が得られるように、十分な全血（イソフルラン麻酔下で採血）を収集した。薬物レベルは、完全な二重特異性コンストラクトを標的GPC3およびCD137によって検出するサンドイッチELISAを使って検出した。Prism GraphPad 5ソフトウェアを使用し、2コンパートメントモデルを使って、データを当てはめた。
【０２６９】
図25に、コンストラクトSEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45について、経時的な血漿中濃度のプロットを示す。挿入図は同じデータを半対数プロットで示している。どちらの場合も薬物動態は類似しているように見えた。150μg/mL前後の血漿中濃度から出発して、血漿中レベルは、約100時間以内に、バックグラウンドレベルまで低下した。2コンパートメントモデルの双指数関数的減衰を適用することでこのデータを正確に記述することができた。このモデルを使ったデータの当てはめ（図25）は、結果として、SEQ ID NO:44については13.7時間、SEQ ID NO:45については10.0時間の終末半減期を与えた。
【０２７０】
このデータは、二重特異性融合物が、Fc融合タンパク質に予想されうる中程度の範囲の半減期を有することを証明している。
【０２７１】
実施例27:カニクイザルにおける融合ポリペプチドの薬物動態
SEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45によって規定される融合ポリペプチドの薬物動態の分析を、カニクイザルにおいて行った。雄カニクイザルに、用量3mg/kgの試験物を、60分かけて静脈内注入した。15分、2時間、4時間、8時間、24時間、48時間、3日、4日、5日、6日、7日、9日、11日、14日、18日、および24日の時点において、カニクイザルから血漿試料を得た。薬物レベルは、標的HER2およびCD137によって完全な二重特異性コンストラクトを検出するサンドイッチELISAを使って決定した。トラスツズマブの血漿中レベルは、標的HER2およびヒトFcによるサンドイッチELISAを使って決定した。Prism GraphPad 5ソフトウェアを使用し、2コンパートメントモデルを使って、データを当てはめた。
【０２７２】
図26に、コンストラクトSEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45について、経時的な血漿中濃度のプロットを示す。挿入図は同じデータを半対数プロットで示している。どちらの場合も薬物動態は類似しているように見え、SEQ ID NO:44の方が明らかに長い半減期を呈した。70μg/mL前後の血漿中濃度から出発して、血漿中レベルは200時間の時間経過を経てゼロに近いレベルまで低下する。2コンパートメントモデルの双指数関数的減衰を適用することでこのデータを正確に記述することができた。このモデルを使ったデータの当てはめ（図26）は、結果として、それぞれ39時間（SEQ ID NO:44）および24.1時間（SEQ ID NO:45）の終末半減期を与えた。
【０２７３】
それゆえにこのデータは、二重特異性融合物が、カニクイザルにおいて、マウスにおける半減期と比べて増加した、そして生物学的治療薬にとって妥当な範囲の、終末半減期を有することを証明している。
【０２７４】
本明細書に例示的に記載した態様は、本明細書において具体的に開示しない任意の1つまたは複数の要素、1つまたは複数の限定が存在しなくても、適切に実施しうる。したがって例えば「含む（comprising）」、「包含する（including）」、「含有する（containing）」などの用語は、拡大的、非限定的に解釈されるべきである。加えて、本明細書において使用する用語および表現は、説明のために使用されているのであって、限定のために使用されているのではなく、そのような用語および表現の使用には、示され記載された特徴またはその部分のいずれの等価物も排除しようという意図はなく、さまざまな変更態様が本願発明の範囲内で可能であると認識される。したがって、本態様を好ましい態様および随意の特徴によって具体的に開示したが、当業者はその変更態様および変形態様を採ることができ、そのような変更態様および変形態様は本発明の範囲内にあるとみなされると理解すべきである。本明細書において記載した特許、特許出願、教科書および査読付き刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。さらにまた、参照により本明細書に組み入れられた参考文献における用語の定義または用法が、本明細書に掲載した当該用語の定義と一致しないか相反する場合は、本明細書に掲載した当該用語の定義が適用され、参考文献における当該用語の定義は適用されない。一般的開示に含まれる狭い種概念および下位類概念群のそれぞれも、本発明の一部を形成する。これには、削除される事項が本明細書に具体的に陳述されているかどうかに関わらず、類概念から任意の内容を除去するただし書きまたは消極的限定の付いた本発明の一般的記述が包含される。加えて、特徴がマーカッシュ群で記載される場合、それによって本開示がそのマーカッシュ群の任意の個々の要素または任意の要素の部分群についても記載されることは、当業者にはわかるであろう。さらなる態様は、以下の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【０２７５】
等価物:当業者は、本明細書に記載した本発明の具体的態様に対する多くの等価物を認識するか、せいぜい日常的な実験を使って確かめることができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。この明細書において言及した刊行物、特許および特許出願はすべて、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願が参照により本明細書に組み込まれることを具体的かつ個別に示したかのように、それと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018519803.tif 000068
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