(57)【要約】単一分子の標的を検出するように構成された電子センサー、ならびにこのような電子センサーを使用および製造する方法が開示される。センサーは、センサーギャップによって分離された第１の電極および第２の電極を含んでいてもよい。第１および第２の電極は、バイオポリマー架橋分子およびプローブを含み得るセンサー複合体によってカップリングされてもよい。プローブは、標的分子と相互作用し得、プローブと標的分子との相互作用は、標的分子の検出を提供するのに好適なシグナルを生成することができる。
2018522236.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の電極にカップリングされた第１の接触部；
第２の電極にカップリングされた第２の接触部；
前記第１の接触部および前記第１の電極のうち１つと前記第２の接触部および前記第２の電極のうち１つとの間に画定されたセンサーギャップ；および
第１の端部と第２の端部とを含む架橋分子
を含むセンサーであって、
前記架橋分子は、バイオポリマー架橋分子であり、
前記架橋分子は、前記第１の端部で前記第１の接触部にカップリングされており、前記第２の端部で前記第２の接触部にカップリングされている、センサー。
【請求項２】
基板表面の上にある第１の電極；
基板表面の上にある第２の電極；
前記第１の電極と前記第２の電極との間に画定されたセンサーギャップ；および
第１の端部と第２の端部とを含む架橋分子
を含むセンサーであって、
前記センサーギャップは、約５ｎｍから約３０ｎｍの間のセンサーギャップ寸法を含み、
前記架橋分子は、前記第１の端部で第１の接触部にカップリングされており、前記第２の端部で第２の接触部にカップリングされている、センサー。
【請求項３】
前記第１の端部が、第１の自己組織化アンカーを含み、前記第２の端部が、第２の自己組織化アンカーを含む、請求項１または２に記載のセンサー。
【請求項４】
前記架橋分子が、化学的に合成された架橋分子を含む、請求項２に記載のセンサー。
【請求項５】
前記架橋分子が、バイオポリマー架橋分子を含む、請求項２に記載のセンサー。
【請求項６】
前記架橋分子が、前記センサーギャップ寸法に近似するように構成された端部から端部までの長さを含む、請求項１または２に記載のセンサー。
【請求項７】
前記バイオポリマー架橋分子が、核酸二重鎖を含む、請求項１または４に記載のセンサー。
【請求項８】
前記核酸二重鎖が、ＤＮＡ二重鎖、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖、ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッド二重鎖、ＰＮＡ−ＰＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＬＮＡハイブリッド二重鎖の１つを含む、請求項７に記載のセンサー。
【請求項９】
前記核酸二重鎖が、内部のビオチンで改変されたヌクレオチドをさらに含む、請求項８に記載のセンサー。
【請求項１０】
前記架橋分子が、前記架橋分子を含む流動性の媒体が前記第１の接触部および前記第２の接触部の１つと接触したときに前記第１の接触部および前記第２の接触部に自己組織化して、架橋分子のコンフォメーションを生じるように構成されている、請求項１から９のいずれか一項に記載のセンサー。
【請求項１１】
プローブをさらに含み、前記プローブは、自己組織化リンカーによって前記架橋分子に付着するように構成されており、前記プローブは、単一の標的分子と連結されるように構成されている、請求項１から１０のいずれか一項に記載のセンサー。
【請求項１２】
前記標的分子が、複数の標的分子の特徴を含み、第１の標的分子の特徴は第１の位置にあり、第２の標的分子の特徴は第２の位置にあり、第ｎの標的分子の特徴は第ｎの位置にあることを含め、各標的分子の特徴は別個の位置を有する、請求項１１に記載のセンサー。
【請求項１３】
前記プローブが、複数の異なる標的分子を含む溶液中での反応の間に前記標的分子と連結されるように構成された酵素であり、前記反応は期間ｔを含み、前記標的分子を接触させることにより、前記複数の標的分子の特徴に応答して前記酵素における複数のコンフォメーション変化が生じ、複数の配置変化のそれぞれが、シグナルの特徴が生成されるように前記センサー中の電流を変調する、請求項１２に記載のセンサー。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれかに記載のセンサーを提供するステップ；
核酸鋳型をプローブと接触させるステップであって、前記プローブは、前記センサーの一部を含む架橋分子にカップリングされており、前記プローブは、ポリメラーゼを含む、ステップ；
前記センサーに電位を印加するステップ；
ヌクレオチド塩基ミックスを提供するステップ；
前記ポリメラーゼによって、前記ヌクレオチド塩基ミックスからのヌクレオチドを合成された核酸に取り込むことを含む取り込み事象を実行するステップ；
前記取り込み事象によって生成されたシグナルを検出するステップ
を含む方法。
【請求項１５】
期間ｔで実行される一連の取り込み事象をさらに含み、前記一連の取り込み事象は、シグナルの特徴の配列を含むシグナルトレースを生成し、各シグナルの特徴は、前記一連の取り込み事象の１つに対応する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
改変されていない鋳型ヌクレオチドに応答して生成された第１のシグナルの特徴と、改変された鋳型ヌクレオチドに応答して生成された第２のシグナルの特徴とを区別する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
生体分子感知デバイスを製造する方法であって、
基板表面上に第１の電極および第２の電極を形成するステップであって、前記第１の電極および前記第２の電極は、電極ギャップによって分離されている、ステップ；
前記第１の電極上に第１の接触部および前記第２の電極上に第２の接触部を設置するステップであって、前記第１の接触部および前記第２の接触部は、接触部ギャップによって分離されている、ステップ；ならびに
前記第１の接触部および前記第２の接触部に架橋分子を付着させるステップ
を含む方法。
【請求項１８】
前記第１の接触部および前記第２の接触部に前記架橋分子を付着させるステップが、自己組織化ステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記電極ギャップおよび前記接触部ギャップが、約５ｎｍから約３０ｎｍの間である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の電極および前記第２の電極に電子的にカップリングされた集積回路を製作するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記集積回路、前記第１の電極、および前記第２の電極が、ＣＭＯＳ製作方法を使用して製作される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１および第２の接触部が、ＣＭＯＳ製作方法を使用して製作される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１５年６月２５日に出願された“ＭＥＴＨＯＤＳ，ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ，ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ  ＡＮＤ  ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＥＬＥＣＴＲＯＮＩＣ  ＳＥＮＳＯＲＳ”と題する米国仮特許出願第６２／１８４，７７６号に基づく優先権を主張しており、その開示は参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（分野）
本開示は、電子センサーデバイスに関する。特に、本開示は、測定回路中に１つまたは複数の生体分子成分を含む電子センサーデバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
分子スケールで特性を測定することには、求められる感度、および多くの可能性のあるノイズソースの存在のために多数の課題がある。したがって、この目的のためにセンサーを説明する際、全ての測定エラーソースについて明らかにすることが有用である。一般的に、測定され得るあらゆるシステムまたは対象物に関して、測定された状態であるｍは、実際のシステム状態であるａの近似にしかならないこととなる。これは、例えばセンサーの操作、読み出しプロセス、またはシグナル解釈に起因するエラーを反映する不完全なシグナル解釈などのいくつかの要因のいずれかによる可能性があり、一部のケースにおいてセンサーをシステムに接触させることが、システムの状態を撹乱する場合があることが原因の可能性もある。測定された状態であるｍが実際の状態であるａと異なることは、センサー、読み出し、および解釈の組合せの測定エラーを反映する。理想的には、センサーシステムは、この測定エラーをできる限り小さくするように構築されることになる。
【０００４】
分子スケールで状態を測定するために、例えばＤＮＡ分子をシーケンシングするケースにおいて、センサーデバイスが好ましくは単一分子のスケールで目的の分子と接触する「プローブ」を有するが、一方でセンサーデバイスを製造するまたはそれらをシグナル変換システムへと統合する目的のために、センサーデバイスの他の特徴はより大きいナノまたはマイクロスケールであるセンサーシステムを作り出すことに、様々な努力が向けられてきた。
【０００５】
特に、バイオセンサーは、生物学的な認識成分をシグナル変換システムへと機能的に統合して、例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質などの生物学的に関連した分子の特性を測定する分析デバイスである。この集積は、生物学的な事象の検出可能な電気シグナルへの迅速で便利な変換を提供する。これまでに考案された様々な電気的バイオセンシング構成のなかでも、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）に基づくシステムが、標的分子（例えば、生体分子）とＦＥＴ表面との相互作用を検出可能な電気シグナルに直接転換できることから有望であると考えられる。典型的なＦＥＴデバイスにおいて、電流は、２つの電極（ソースおよびドレインとも称される）に接続されているチャネルに沿って流れる。ソースとドレインとの間のチャネルコンダクタンスは、薄い誘電性絶縁層を介してチャネルに容量的にカップリングされている第３の電極（ゲートとも称される）によって変調することができる。ＦＥＴは、様々な商業的な用途のために、標的化学物質を検出して化学物質の濃度を測定するのに使用することができる。従来の広く使用されている例は、水素イオン濃度を測定するのに使用されるＦＥＴベースのｐＨセンサーである。これは１９７０年代にＢｅｒｇｖｅｌｄによって導入され、ソリッドステートのｐＨセンサーで使用されている。イオン感度ＦＥＴ（ＩＳＦＥＴ）デバイスの一般的な分野は、他の化学物質濃度測定に関しても、その概念に基づいて拡張している。
【０００６】
現在のＦＥＴ型バイオセンサーシステムの限界は、それらの感度である。現在のバイオセンサーシステムは、単一分子の検出および識別を実行することができない。同様にそれらは、単一分子反応の動力学をモニターすることができない。ＦＥＴ型バイオセンサーのこれらの感度の限界のために、重要な生化学アッセイ、例えば単一分子シーケンシング反応などにおける検出器としてのそれらの使用が妨げられる。
【０００７】
ＦＥＴバイオセンサーの感度を向上させる一部の努力は、電極間にチャネルを形成するための、カーボンナノ構造、例えばカーボンナノチューブなどの使用に焦点を当ててきた。しかしながら、カーボンナノ構造は、バイオセンサーの機能化に関して様々な障害をもたらす。特に、機能的なまたは感知するプローブ分子を付着させる目的で、特異的な望ましい、原子の位置に付着部位を操作することはできない。加えて、カーボンナノ構造の合成の精度、制御、およびスケールにおける現在の限界は、個々のセンサーの感度と信頼できる生産、センサーの高密度の拡張可能なアレイの確立、およびセンサー製造の商業的な実現性に関してさらなる課題をもたらす。現在のカーボンナノチューブ合成方法は、典型的には長さが約１００ｎｍまたはそれより長いスケールで構造を生産するが、感度およびマルチセンサープラットフォームにおけるセンサー密度に関して、スケールが限界をもたらす可能性が高い。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、感度および精度の増加、信頼できるエイジニアリングに適合し、マルチセンサープラットフォーム上でのセンサー密度の増加を達成するための効率的で商業的に実現性のある製造方法にさらに適合する構成を有する分子スケール電子バイオセンサーデバイスが望ましい。同様に、このようなセンサーデバイスを製造する向上した方法も望ましい。
【０００９】
（要旨）
本開示は、一般的に、センサー、センサーを含むシステム、ならびにセンサーおよびシステムを形成するおよび使用する方法に関する。例示的なセンサーは、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他のオリゴヌクレオチドなどの分子をシーケンシングするのに使用することができる。以下で本開示の様々な実施形態が従来技術のセンサーの欠点に取り組む方法をより詳細に論じるが、本開示は、一般的に、製造が比較的簡単で廉価なセンサーを提供する。
【００１０】
本開示の種々の実施形態によれば、センサーは、第１の電極にカップリングされた第１の接触部、第２の電極にカップリングされた第２の接触部、前記第１の接触部および前記第１の電極のうち１つと前記第２の接触部および前記第２の電極のうち１つとの間に画定されたセンサーギャップ、および、第１の端部と第２の端部とを含む架橋分子を含み、前記架橋分子は、前記第１の端部で前記第１の接触部にカップリングされており、前記第２の端部で前記第２の接触部にカップリングされている。これらの実施形態の様々な態様によれば、架橋分子は、バイオポリマーであるか、または架橋分子は、化学的に合成される。追加の態様によれば、センサーは、第３のまたはゲート電極を含む。これらのケースにおいて、ゲート電極は、センサーデバイスを調整するおよび／または活性化するのに使用することができる。さらなる態様によれば、センサーギャップは、約５ｎｍから約３０ｎｍの間のセンサーギャップ寸法を有する。追加の態様によれば、第１の端部または架橋分子は、第１の自己組織化アンカーを含み、さらなる態様によれば、第２の端部は、第２の自己組織化アンカーを含む。例示的な架橋分子は、以下の特性：架橋分子は、直鎖状（例えば、直鎖状バイオポリマー）であり得ること、架橋分子の端部から端部までの長さは、架橋分子の持続長より短いこと、および架橋分子の端部から端部までの長さは、センサーギャップの寸法に近似するように構成されていることのうちの１つまたは複数を含み得る。例示的なセンサーとしては、架橋分子に付着したプローブが挙げられる。プローブは、単一の標的分子と連結されるように構成されていてもよい。例示的なプローブは、溶液中の反応の間に標的分子と連結されるように構成された酵素を含んでいてもよいし、またはそのような酵素であってもよい。
【００１１】
本開示の追加の実施形態によれば、センサーは、基板表面の上にある第１の電極、基板表面の上にある第２の電極、第１の電極と第２の電極との間に（または電極に付着した接触部間に）画定されたセンサーギャップ、および第１の端部と第２の端部とを含む架橋分子を含み、架橋分子は、第１の端部で第１の接触部にカップリングされており、第２の端部で第２の接触部にカップリングされている。センサーギャップは、約５ｎｍから約３０ｎｍの間のセンサーギャップ寸法を含み得る。これらの実施形態の様々な態様によれば、架橋分子は、バイオポリマーであるか、または架橋分子は、化学的に合成される。追加の態様によれば、センサーは、第３のまたはゲート電極を含む。これらのケースにおいて、ゲート電極は、センサーデバイスを調整するおよび／または活性化するのに使用することができる。追加の態様によれば、第１の端部または架橋分子は、第１の自己組織化アンカーを含み、さらなる態様によれば、第２の端部は、第２の自己組織化アンカーを含む。例示的な架橋分子は、本明細書で特筆された１つまたは複数の特性を含み得る。例示的なセンサーは、架橋分子に付着したプローブを含む。プローブは、単一の標的分子と連結されるように構成されていてもよい。例示的なプローブは、溶液中での反応の間に標的分子と連結されるように構成された酵素を含んでいてもよいし、またはそのような酵素であってもよい。
【００１２】
追加の例示的な実施形態によれば、システムは、本明細書で記載されるセンサーを含む。システムは、加えて、１つまたは複数の回路、例えばセンサーを形成するのに使用された基板または上にセンサーがある基板を使用して形成された回路などを含んでいてもよい。システムは、加えて、または代替として、例えばシグナルからノイズを除去したり、および／またはシグナルの解釈を補助したりするために、追加の回路および／またはデバイスを含んでいてもよい。
【００１３】
本開示のさらなる追加の実施形態によれば、方法は、センサー、例えば本明細書で記載されるセンサーなどを提供するステップ；核酸鋳型をポリメラーゼと接触させるステップであって、ポリメラーゼは、センサーの一部を構成する架橋分子にカップリングされている、ステップ；ヌクレオチド塩基ミックスを提供するステップ；ポリメラーゼによって、ヌクレオチド塩基ミックスからのヌクレオチドを合成された核酸に取り込むことを含む取り込み事象を実行するステップ；および取り込み事象によって生成されたシグナルを検出するステップを含む。これらの実施形態の様々な態様によれば、方法は、加えて、例えばセンサーを調整または活性化するために、センサーに電位を印加するステップを含んでいてもよい。さらなる態様によれば、ノイズは、シグナルから除去することができる。
【００１４】
本開示のさらなる追加の実施形態によれば、生体分子感知デバイスを製造する方法は、基板表面上に第１の電極および第２の電極を形成するステップであって、前記第１の電極および前記第２の電極は、電極ギャップによって分離されている、ステップ；前記第１の電極上に第１の接触部および前記第２の電極上に第２の接触部を設置するステップであって、前記第１の接触部および前記第２の接触部は、接触部ギャップによって分離されている、ステップ；ならびに前記第１の接触部および前記第２の接触部に架橋分子を付着させるステップを含む。例示的な方法は、プローブを架橋分子にカップリングするために、架橋分子をプローブと接触させるステップをさらに含んでいてもよい。
【００１５】
また、本開示のさらなる実施形態によれば、オリゴヌクレオチドをシーケンシングする方法は、本明細書で記載される１つまたは複数のセンサーを使用するステップを含む。
【００１６】
本開示の主題は、具体的に指摘され、明細書の終わりの部分で明確に特許請求される。しかしながら、図面を併用して検討すれば、詳細な説明および特許請求の範囲を参照することにより本開示のより完全な理解を十分に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、様々な実施形態によるセンサーの概略図を例示する。
【００１８】
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、様々な実施形態によるセンサーデバイスの図を例示する。
【００１９】
【図３】図３は、様々な実施形態によるセンサーの一部の側面図を例示する。
【００２０】
【図４】図４は、様々な実施形態によるバイオポリマー架橋分子を含むセンサーを例示する。
【００２１】
【図５】図５は、様々な実施形態によるバイオポリマー架橋分子を含むセンサーを例示する。
【００２２】
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、様々な実施形態によるセンサーデバイスの図を例示する。
【００２３】
【図７】図７は、様々な実施形態によるノイズ除去の前および後のシグナルトレースを例示する。
【００２４】
【図８】図８は、様々な実施形態によりＣＭＯＳ技術を使用して電極を製作する方法に関するプロセスフローを例示する。
【００２５】
【図９】図９は、様々な実施形態によりＣＭＯＳ技術を使用して接触部を製作する方法に関するプロセスフローを例示する。
【００２６】
【図１０】図１０は、様々な実施形態によりＣＭＯＳ技術および予め形成された接触部粒子の堆積を使用して接触部を製作する方法に関するプロセスフローを例示する。
【００２７】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、様々な実施形態によりＣＭＯＳ技術を使用して製作されたセンサーデバイスの図を例示する。
【００２８】
【図１２】図１２は、様々な実施形態によるバイオポリマー架橋の自己組織化後の接触部のアレイの走査型電子顕微鏡写真を例示する。
【００２９】
【図１３】図１３は、様々な実施形態によるセンサーのバイオポリマー架橋の自己組織化事象の間に生成されたシグナルトレースを例示する。
【００３０】
【図１４】図１４は、様々な実施形態によるセンサーのバイオポリマー架橋へのプローブ結合プロセスの間に生成されたシグナルトレースを例示する。
【００３１】
【図１５】図１５は、様々な実施形態によるプローブへの鋳型結合の間に生成されたシグナルトレースを例示する。
【００３２】
【図１６】図１６は、様々な実施形態によるプローブによる鋳型依存性の塩基取り込みの間に生成されたシグナルトレースを例示する。
【００３３】
【図１７】図１７は、様々な実施形態によるセンサーによる単一の鋳型依存性塩基取り込み事象によって生成されたシグナルトレースを例示する。
【００３４】
【図１８】図１８は、様々な実験条件下で様々な実施形態によるセンサーによって生成されたシグナルトレースを例示する。
【００３５】
【図１９】図１９は、様々な実施形態によるセンサーによって、様々な条件下で、改変されていないヌクレオチドおよび５−メチルシトシンで改変されたヌクレオチドを含む標的に応答して生成されたシグナルトレースを例示する。
【００３６】
【図２０】図２０は、様々な実施形態によるセンサーによって、様々な実験条件下で長い鋳型配列に応答して生成されたシグナルトレースを例示する。
【００３７】
【図２１】図２１は、様々な実施形態による化学的に合成された架橋分子を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
（詳細な説明）
本明細書における例示的な実施形態の詳細な説明は、例証として、およびそれらの最良の形態として例示的な実施形態を示す添付の図面を参照する。これらの例示的な実施形態は、当業者が本発明を実施できる程度に十分詳細に説明されるが、他の実施形態は実現可能であり、論理的な、化学的な、および機械的な変化が本発明の本質および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。したがって、本明細書の詳細な説明は、単に例示のために提示され、限定のためではない。例えば、別段の規定がない限り、方法またはプロセスの説明のいずれかで列挙されたステップは、任意の順番で実行されてもよく、必ずしも提示された順番に限定されない。さらに、いずれの単数形の言及も、複数形の実施形態を含み、いずれの１つより多くの要素またはステップの言及も、単数形の実施形態またはステップを含み得る。また、付着、固定、接続または同種のもののいずれの言及も、永続的な、取り外し可能な、一時的な、部分的な、完全なおよび／または他のあらゆる可能性のある付着の選択肢を含み得る。加えて、接触がない（または類似の成句）への任意の言及は、低減された接触または最小の接触も含み得る。
【００３９】
様々な実施形態において、単一分子バイオセンサーデバイスは、第１の電極および第２の電極を含んでいてもよい。第１の電極および第２の電極は、電極および／または電極に付着した接触部によって画定されたセンサーギャップによって分離されている。第１および第２の電極は、センサーギャップに架かる架橋分子によってカップリングされてもよい。架橋分子は、バイオポリマー、例えば核酸またはアミノ酸ポリマーなどを含んでいてもよい。架橋はまた、化学的に合成された分子を含んでいてもよく、このような分子としては、合成有機分子、バイオポリマー単量体の合成アナログを含むポリマー、または生体分子由来ではない他の全体的に合成の単量体を挙げることができる。架橋分子は、バイオポリマーまたは合成分子で構成されているかどうかにかかわらず、公知の原子的に正確な分子構造を有し得る。電極への架橋分子の付着は、接触部が介在していてもよい。プローブ分子または分子複合体は、架橋分子にカップリングされていてもよい。プローブは、生体分子、例えば単一の標的分子と相互作用するように構成された酵素などであり得る。様々な実施形態において、センサーデバイスは、並行に並べられた複数の単一分子バイオセンサーを含んでいてもよい。このようなマルチセンサーデバイスは、標的および他の分子の複合混合物において、複数の個々の標的分子の並行な検出、識別、および／または特徴付けもしくは識別を実行するのに使用することができる。
【００４０】
図１は、様々な実施形態によるセンサー１０１を含むセンサーデバイス１００の概略図を例示する。センサー１０１は、第１の電極１０２および第２の電極１０３を含む。センサー１０１はまた、以下でより詳細に記載されるようなゲート１０４を含んでいてもよい。センサー１０１は、第１の電極１０２および第２の電極１０３に機能的にカップリングされたセンサー複合体１０５をさらに含んでいてもよい。様々な実施形態において、センサー複合体は、それぞれの電極に付着した第１の接触部１０６および第２の接触部１０７を介して電極にカップリングされていてもよい。センサー複合体１０５は、複数の構成要素、例えば以下でより詳細に記載されるような架橋分子およびプローブ分子などを含んでいてもよい。センサー複合体１０５は、周囲の環境と相互作用し得、それによってセンサー１０１が感知機能を実行できるようになる。例えば、図１で例示されているように、センサー複合体１０５は、例えばＤＮＡ分子などの標的分子１０８と相互作用し得、センサーデバイスは、標的分子の存在および／または特性を検出するのに使用することができる。
【００４１】
様々な実施形態において、センサーデバイス１００およびセンサー１０１は、センサー１０１の電気特性の変化を検出するように、回路１２０に作動可能に接続されていてもよい。回路１２０は、好ましくはセンサー１０１にマイクロスケールで近接した集積回路であるが、回路１２０は、外部の電気計器、例えばベンチトップの電流計などとしても具体化することができる。センサーデバイス１００は、複数のセンサー１０１を含んでいてもよい。集積回路１２０は、ＣＭＯＳ製作方法を使用して製作できる回路構成を含んでいてもよい。集積回路１２０は、各センサー１０１につき、センサーの支持体を提供する同じチップ内に製作された電子測定回路を含んでいてもよい。言い方を変えれば、センサーデバイス１００は、集積超小型回路中にセンサー１０１および集積回路１２０を含んでいてもよい。集積回路１２０は、外部のシグナル処理システム１２１に接続するための、読み出し回路網および入力／出力特徴をさらに含んでいてもよい。
【００４２】
様々な実施形態において、センサー１０１と共通の半導体チップ上に存在する集積回路１２０を使用することで、巨視的な外部回路エレメントによって生成され得る、記録中における電子ノイズのソースを低減することができる。例えば、このような回路は、感度および読み出しに関する性能要件に応じて１から２００個の範囲の少数のトランジスタを含む混合シグナルのＣＭＯＳセンサーであり得る。このような回路は、様々な実施形態において、単一のセンサー１０１における電流を測定するように機能することができる。さらに、センサーデバイス１００は、同じ試料と接触する多数のセンサーの同時操作が支持されるように、センサー１０１のアレイごとにセンサー／読み出し回路を含む集積回路１２０を含んでいてもよい。
【００４３】
様々な実施形態において、センサー１０１と接触する試料は、液相試料を含む。試料を含む溶液は、センサーを使用して実行される電気測定中のノイズを低減するために、極限まで希釈され、低いイオン強度であってもよい。獲得したシグナルは、典型的には、センサー中の電極１０２と１０３との間を流れる電流であるが、例えば電極間の電圧、電極間の抵抗／コンダクタンス、またはゲート電圧などの関連する観察可能な電子パラメーターであってもよい。
【００４４】
様々な実施形態において、現行のＣＭＯＳ製作方法を使用した製作に適した集積マイクロチップチップフォーマットにおけるセンサー１０１および集積回路１２０の配置は、高度に小型化された構成を有するセンサーデバイスの生産を容易にすることができる。様々な実施形態において、センサーごとの集積回路は、センサーギャップの約１００μｍ以内、またはセンサーギャップの約５０μｍ以内、またはセンサーギャップの約２０μｍ以内、またはセンサーギャップの約１０μｍ以内、またはセンサーギャップの約５μｍ以内、またはセンサーギャップの約１μｍ以内に位置していてもよい。さらに、様々な実施形態において、センサーデバイスは、複数のセンサーを含んでいてもよく、各センサーは、上記で特定したパラメーター以内に配置された連結された集積回路を有する。
【００４５】
シグナル処理システム１２１は、センサーデバイス１００の電子制御を提供して、センサーデバイスおよびその中の各センサー１０１からシグナルを受け取り、保存し、受け取ったシグナルを分析するように構成されていてもよい。シグナル処理システム１２１は、各センサー１０１に印加される電圧および電流の制御などの電子制御機能を実行するように、ならびに各センサー１０１から受け取ったシグナルにつきシグナル処理機能を実行するように構成された、プロセッサーおよび／またはソフトウェアを有するコンピューターシステムを含んでいてもよい。
【００４６】
例えば、図１で例示されているように、センサー１０１を含むセンサーデバイス１００は、核酸のシーケンシング反応を実行するのに使用することができる。デバイスの操作中、電圧は、センサー１０１の第１の電極と第２の電極との間に印加されてもよく、センサーと標的との相互作用により、集積回路１２０およびシグナル処理システム１２１を使用して測定することができるバイオポリマー架橋分子（例えば図３の３３３を参照）を通る電流の流れの変調がもたらされる。センサー１０１は、時間ｔにわたりシグナルパターン１２２を生成することができ、シグナルの特徴１２３は、センサー複合体と標的分子１０８の特徴との相互作用に応答してセンサーにより生成される。シグナル処理システム１２１は、シグナルパターンを受け取り、処理して、シグナルパターンに応答する配列出力１２４を提供することができ、この文脈において、この配列出力はシグナルの解釈である。
【００４７】
様々な実施形態において、単一分子バイオセンサーは、電気回路中でチャネルまたは導電性通路として機能する、付着した架橋分子および／もしくはプローブ、および／またはこれらの成分に近接する標的分子および／もしくは液相分子を備えた、トランジスタ、例えば電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）などの形態をとることができる。このような実施形態において、単一のプローブ分子を含むセンサー複合体は、以下でより詳細に説明されるように単一の標的分子に結合するかまたはそれと相互作用するように構成されていてもよく、それによって単一分子感度を有するバイオセンサーが提供される。このようなトランジスタの実施形態は、２もしくは３端子トランジスタを含んでいてもよく、または例えばマルチゲートデバイスのケースのように可能であればそれより多くの端子を含んでいてもよい。
【００４８】
図２Ａおよび２Ｂは、様々な実施形態によるセンサーデバイス２００の図を例示する。例示されたセンサーデバイス２００の図には、センサー複合体は示されていない。センサーデバイス２００は、複数のセンサー２０１を含み、各センサーは第１の電極２０２および第２の電極２０３を含む。各センサーは、センサーギャップ２３９をさらに含んでいてもよい。例示された実施形態において、各センサーは、第１の電極に付着した第１の接触部２０６および第２の電極に付着した第２の接触部２０７を含む。様々な実施形態において、電極は、半導体基板表面上に配置されていてもよい。例えば、センサーデバイス２００は、二酸化ケイ素層２６１の上にある窒化ケイ素層２６０を含んでいてもよい。センサーデバイス２００は、上に電極が配置された半導体基板層の下に存在する埋め込まれたゲート２０４をさらに含んでいてもよい。上述した様々な構成要素は、例えばケイ素チップ２６３などの支持体上に製作することができる。図２Ａで模式的に例示したように、第１の電極２０１、第２の電極２０２、およびゲート２０４のそれぞれは、シグナル処理システム２２１に接続されていてもよく、このシステムは、図解に描写されているように外部の計器であってもよいが、代替として集積回路網であってもよい（詳細は示されていない）。
【００４９】
ここで図３を参照すれば、センサー３０１の一部およびセンサー複合体３０５の側面図がより詳細に例示される。センサー３０１は、第１の電極３０２および第２の電極３０３を含む。第１の電極３０２および第２の電極３０３は、基板３２０上に配置されていてもよい。様々な実施形態において、センサー３０１は、それぞれ第１の電極３０２および第２の電極３０３に作動可能にカップリングされた第１の接触部３０６および第２の接触部３０７をさらに含んでいてもよい。しかしながら、接触部は厳密には必要ではなく、本開示に係るセンサーは第１および第２の接触部を含んでいなくてもよい。第１の電極３０２および第２の電極３０３の末端は、電極ギャップ３３０を画定する。同様に、例えばセンサー３０１などの接触部を含むセンサーの場合、第１の接触部３０６と第２の接触部３０７との距離が、接触部ギャップ３３１を画定する。いずれか所与の第１の接触部および第２の接触部の場合の接触部ギャップの実際の寸法は、接触部と参照のために使用される接触部のポイントとの配置によって変化し得る。例えば、図３で例示される半球形の第１の接触部３０６および第２の接触部３０７の場合、接触部ギャップ３３１の寸法は、接触部の最も近いポイント間で、または中心から中心で測定され得る。様々な実施形態において、電極ギャップおよび接触部ギャップの１つ、または電極および／もしくは接触部によって集合的に、もしくはそれらの様々な組合せによって画定されたギャップは、センサーギャップと称する場合がある。
【００５０】
続けて図３を参照すれば、センサー３０１は、センサー複合体３０５をさらに含む。様々な実施形態において、センサー複合体３０５は、架橋分子３３３およびプローブ３３４を含んでいてもよい。プローブ３３４は、リンカー３３７を介して架橋分子３３３にカップリングされていてもよく、ここでリンカー３３７は、ストレプトアビジン−ビオチン複合体として示されており、ビオチンはＤＮＡ架橋３３３のヌクレオチドに共有結合で取り込まれ、ストレプトアビジンはポリメラーゼ３３４に化学的に共有結合で架橋されている。センサー複合体３０５の様々な構成要素のそれぞれは、以下でより詳細に説明される。
【００５１】
様々な実施形態において、架橋分子３３３は、化学的に合成された架橋分子またはバイオポリマー架橋分子を含んでいてもよい。化学的に合成された架橋分子またはバイオポリマー架橋分子は、構造的および機能的の両方でセンサーギャップに架かるように構成されていてもよい。例えば、化学的に合成された分子またはバイオポリマー分子は、公知のまたは予測可能な構造的パラメーターを有する架橋分子の構築をもたらす原子的に正確な分子のサブユニット（例えば、ポリマー性の架橋分子に取り込むためのモノマー単位）の選択および使用、接触部のポイントへの自己組織化および架橋分子へのプローブ分子の自己組織化を促進する特徴、ならびに電極の電気的な接続にとって好適な電気化学特性の取り込みによって構成されてもよい。
【００５２】
化学的に合成された架橋分子は、合成有機化学の分野における当業者によって組織化できる分子である。例えば、化学的に合成された分子は、ポリピロール、ポリアニリン、またはポリチオフェン骨格を含んでいてもよい。図２１を簡単に参照すれば、ポリチオフェンベースの化学的に合成された架橋分子２１００の一般構造の例が例示される。化学的に合成された架橋分子２１００は、架橋分子の骨格を形成するチオフェン環２１０１の鎖を含んでいてもよく、プローブ支持体部分２１０２のいずれかの側のｎ１およびｎ２チオフェン環は、架橋分子２１００中の特定の位置に構成されていてもよい。各チオフェン環２１０１が幅およそ０．３ｎｍであることから、約１０から約１００個の環を含む化学的に合成された架橋分子が、約３ｎｍから約３０ｎｍのギャップに架かるように構築することができる。化学的に合成された架橋分子の末端（例えば、Ａ１およびＡ２）は、チオールもしくはアミン基、または電極もしくは接触部材料に結合するように構成された他の基を含んでいてもよい。化学的に合成された架橋分子はまた、プローブ分子の付着を提供するのに好適なリンカー（例えば、Ｌ）と共に構成されていてもよい。当業者に現在公知の、または以降彼らによって考案され得るあらゆる好適な骨格部分で構成される他のあらゆる化学的に合成された架橋分子の配置が、本開示の様々な実施形態に従って使用することができる。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「バイオポリマー」は、生物によって産生され得る少なくとも１つのモノマー単位を含むあらゆる分子を含み得るが、バイオポリマーまたはポリマーそれ自身を含む実際のモノマー単位は、生物によって産生されていなくてもよく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができる。バイオポリマーの例としては、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および多糖類、例えばＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質などのこれらの周知の形態が挙げられる。バイオポリマーを含む架橋分子としては、コラーゲンタンパク質で生じるような単純な「コイルドコイル」配置における、または免疫グロブリン（immunoglobin）分子（例えばＩｇＧ）の場合などの重鎖および軽鎖のポリマー性タンパク質のより複雑なフォールディングにおける多鎖のポリマー性タンパク質を挙げることができる。バイオポリマーを含むこのような複合体としてはまた、一般的な核酸二重鎖ヘリックス、例えば、２つのＤＮＡ一本鎖分子が水素結合によってらせん状の二本鎖に結合したものであるＤＮＡ二重らせん、ＰＮＡ−ＰＮＡ二重鎖、ならびにＤＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＰＮＡ、およびＤＮＡ−ＬＮＡハイブリッド二重鎖なども挙げられる。バイオポリマー分子はバイオポリマーとして分類されるために、天然に存在するものでなくてもよいし、または生物によって産生されるものでなくてもよい。その代わりに、本開示の目的のために、用語「バイオポリマー」は、酵素的および非酵素的に合成される分子を含む場合があり、同様に、天然に存在するモノマー単位の合成アナログを含む分子を含み得る。例えば、バイオポリマーは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびロックト核酸（ＬＮＡ）、強化された安定性特性を有するＤＮＡおよびＲＮＡの合成アナログを含んでいてもよい。加えて、バイオポリマーは、分子に付加することができる様々な改変のいずれかを含んでいてもよい。バイオポリマー架橋分子の使用は、センサーの機能にとって好適なサイズおよび化学的性質を有する正確に制御された構造の合成などの様々な利益を提供することができ、このようなバイオポリマー架橋分子は、必然的にセンサーのための標的分子に対して適合性を有する（例えば、同じ液体緩衝媒体に適合性を有する）可能性があり、生物工学産業は、このような分子をデザインする、工学的に作製する、および合成する、ならびにそれらを経済的にかつ高品質の制御で製造する広範囲の能力を開発してきた。
【００５４】
架橋分子は、架橋分子と電極および／または接触部との間に電子的な通信を提供するのに好適な方式で、センサーギャップをつなぎ、センサーギャップのどちら側でも電極および／または接触部にカップリングされるように構成することができる。
【００５５】
様々な実施形態において、架橋分子は、直鎖状バイオポリマー、例えば二本鎖ＤＮＡへリックスまたはα−ヘリカルポリペプチドなどを含んでいてもよい。図３で例示されているように、架橋分子３３３は、第１の接触部３０６にカップリングされた第１の端部３３４と、第２の接触部３０７にカップリングされた第２の端部３３５とを有する二本鎖ＤＮＡ架橋分子である直鎖状バイオポリマーを含む。
【００５６】
様々な実施形態において、リジッドな架橋構造は、センサー複合体の組織化中およびその後に明確な配置をとることに関して利点を提供する可能性がある。理論に制限されることは望まないが、直鎖状バイオポリマーは、その曲げ剛性によって説明可能なセミフレキシブルなポリマーを含んでいてもよい。短尺のスケールでは、直鎖状バイオポリマーはリジッドなポリマーとして振る舞い、ポリマーを曲げるには強い力を必要とする可能性があるが、より長いスケールでは、直鎖状バイオポリマーは、より簡単に曲がったりまたは湾曲したりする可能性がある。ある特定の一連の環境条件において直鎖状バイオポリマーが本質的にリジッドな分子として振る舞う特徴的な曲げ長さの尺度は、持続長と称される。持続長は、ポリマーに曲げる力がかけられる環境条件に依存する可能性があり、例えば周囲環境の温度およびイオン性条件などの変数が持続長に影響を及ぼす。例えば二本鎖ＤＮＡなどの直鎖状バイオポリマーの持続長は、理論上のモデリングに基づいて推測することもできるし、または様々な実施形態によるデバイスが使用され得る予め決定された実験条件に対応する一連の環境条件に関して経験的に測定することもできる。例えば、本開示の様々な実施形態に従ってセンサーを使用できる条件の近似となることができる様々な条件で、二本鎖ＤＮＡの持続長は、約３０ｎｍから約８０ｎｍで計算されており、α−ヘリカルペプチドの持続長は、約８０ｎｍから約１００ｎｍで計算されている。したがって、様々な実施形態において、その長軸に沿って測定した場合、上述したそれぞれの持続長パラメーター未満の端部から端部までの長さを有する二本鎖ＤＮＡ分子またはα−ヘリカルペプチドは、本質的にリジッドなポリマーとして振る舞う可能性があり、それによってデバイスの組織化および性能に関してある特定の利点または利益が提供される。
【００５７】
様々な実施形態において、ＤＮＡまたはアミノ酸で構成される直鎖状バイオポリマーの使用は、バイオポリマーのモノマーの組成（すなわち、１次構造）に基づき予め決定された長さを有するナノスケールのセンサー構成要素のわかりやすい構築を可能にする。理論に制限されることは望まないが、持続長未満の端部から端部までの長さを有する直鎖状バイオポリマーの使用が、様々な実施形態による生体分子感知デバイス構築中の自己組織化ステップの効率を強化する可能性がある。このような直鎖状バイオポリマーの使用は、それらの微小機械特性が、曲がったりまたはフォールディングしたりする可能性があるより長い直鎖状バイオポリマーよりも予測可能なパラメーター内にバイオポリマー架橋分子の仕様を維持する能力を提供し、それによって、例えば、架橋分子合成、取り扱い、自己組織化、またはセンサー操作中の望ましくない確率論的な作用の影響が低減される。さらに、直鎖状バイオポリマーの使用は、理論上の構造的モデルの性能およびデバイスの向上を容易に試験し、漸進的な、よく制御された、経験的に試験可能な改変をもたらすさらなる能力を提供するセンサーギャップに対する架橋分子の長さの正確な仕様（すなわち、電極ギャップおよび／または接触部ギャップの寸法および構成）を可能にする。様々な実施形態において、センサーデバイスで使用されるスケール（例えば、約５ｎｍから約３０ｎｍの間の端部から端部までの長さ）で直鎖状バイオポリマー架橋分子は本質的にリジッドな性質であるため、直鎖状バイオポリマー架橋分子は、第１および第２の自己組織化アンカーにおける第１の自己組織化アンカーと、第１の接触部および第２の接触部の１つへの第２の端部の両方の誤ったカップリングの割合の低減をもたらすように構成されていてもよい。同様に、バイオポリマー架橋分子は、単一の端部のカップリングの割合の低減をもたらすように構成されていてもよい。これは、実質的にリジッドな架橋分子が、第１の接触部に一旦カップリングされたら、接触部の間隔のために第２の端部が望ましい第２の接触ポイントと近接した状態でより長い時間を過ごすように制限するため、望ましい第２のカップリング反応の割合を増加させるという結果をもたらすことができる。
【００５８】
上述したように、バイオポリマー架橋分子は、二本鎖ＤＮＡ分子を含んでいてもよい。様々な実施形態において、二本鎖ＤＮＡは、チオールで改変されたヌクレオチドまたは塩基を含む、チオールで改変されたオリゴを含んでいてもよい。チオールで改変されたヌクレオチドは、金のナノビーズまたは類似の表面の接触部に結合するように構成された自己組織化アンカーを含んでいてもよい。様々な実施形態において、自己組織化アンカーは、５’−チオールで改変されたヌクレオチドを含んでいてもよく、これは、オリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍に位置していてもよい。二本鎖ＤＮＡ分子は、相補的なオリゴヌクレオチド対を含んでいてもよく、各オリゴヌクレオチドは、組織化された二本鎖ＤＮＡが、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の末端に位置する自己組織化アンカーを含むように、５’−チオールで改変されたヌクレオチドを含む。例えば、様々な実施形態において、二本鎖ＤＮＡ分子は、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００５９】
５’−／５チオＭＣ６−Ｄ／ＴＧＣ  ＧＴＡ  ＣＧＴ  ＡＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＡ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＧＡＴ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＣＧＴ  ＣＧＣ  ＴＡＣ  ＴＧＣ  ＡＧＴ  ＡＣＴ−３’（配列番号１）、および
５’−／５チオＭＣ６−Ｄ／ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＧＣＡ  ＧＴＡ  ＧＣＧ  ＡＣＧ  ＴＣＡ  ＴＡＧ  ＧＡＣ  Ａ／ｉＢｉｏｄＴ／Ｃ  ＡＧＴ  ＣＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＴ  ＴＣＡ  ＴＧＡ  ＣＡＴ  ＡＣＧ  ＴＡＣ  ＧＣＡ−３’（配列番号２）
「／５チオＭＣ６−Ｄ／」は、５’−チオール調節剤を意味し、「／ｉＢｉｏｄＴ／」は、内部のビオチンで改変されたデオキシチミジンヌクレオチドを意味する（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）。これらのオリゴは、互いにアニールされると、分子の各末端に第１および第２の自己組織化アンカーとして５’−チオールで改変されたヌクレオチド（nucelotide）が位置する二本鎖ＤＮＡ分子を提供する。
二本鎖ＤＮＡ分子架橋はまた、相補的なアビジンタイプのリンカー成分を用いたプローブ分子の架橋への連結を容易にするビオチンリンカー成分をさらに含んでいてもよい。様々な実施形態において、および上述したリバースのオリゴヌクレオチド配列で例示されたように、ビオチンで改変されたオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ分子架橋のオリゴの１つに取り込まれていてもよい。様々な実施形態において、ビオチンで改変されたオリゴは、例えば改変チミジン残基（ビオチン−ｄＴ）を介した内部改変である。Ｃ６スペーサーを介したチミジンへの付着、トリエチレングリコールスペーサーを介した付着、光で切断可能なスペーサーアームを介した付着、二重のビオチン改変、デスチオビオチン改変、およびビオチンアジ化物での改変などの、様々なビオチン改変の配置を使用することができる。現在当業者に公知であるか、または以下で考案され得、プローブ分子へのリンケージを容易にするためにオリゴヌクレオチドにされ得る他の改変は、本開示の範囲内である。同様に、タンパク質結合パートナーを有する他の共通の小分子、例えばジゴキシゲニンは、このような架橋分子中の正確に原子的に特定されたポイントでプローブ分子にコンジュゲートさせる目的で、ビオチンの役割と類似した役割を果たす可能性がある。
【００６０】
様々な実施形態において、ペプチドバイオポリマー架橋分子は、様々な望ましい架橋分子の構造および性能特性、例えば電極または接触部の結合の特徴、構造的な特徴、電気的な性能特徴および同種のものを提供するのに好適な、様々な配置および／または特徴を含んでいてもよい。例えば、ペプチドバイオポリマー架橋は、例えば金、パラジウムまたは白金などの強いチオール結合で連結される特異的な金属接触部へのチオール−金属結合を介した自己組織化アンカーとして役立つように、アミノ末端とカルボキシル末端の一方または両方にＬ−システイン残基を含んでいてもよい。他の実施形態において、バイオポリマー架橋分子は、自己組織化および回路への電気機械的な接続の目的で金の接触部と選択的にかつ強く結合する公知の能力を有するペプチドを含んでいてもよい。具体的なこのようなペプチドとしては、以下のアミノ酸配列：ＭＨＧＫＴＱＡＴＳＧＴＩＱＳ（配列番号３）、ＶＳＧＳＳＰＤＳ（配列番号４）、およびＬＫＡＨＬＰＰＳＲＬＰＳ（配列番号５）を有するペプチドが挙げられる。このような特性に関して選択された他のペプチドも同様に、他の特異的な金属または材料の接触部に結合することができる。例えば、ＶＰＳＳＧＰＱＤＴＲＴＴ（配列番号６）は、公知のアルミニウム結合ペプチドであり、ＭＳＰＨＰＨＰＲＨＨＨＴ（配列番号７）は、公知の二酸化ケイ素結合ペプチドである。様々な他の実施形態において、バイオポリマー架橋分子は、直鎖状のリジッドな導電性架橋を提供する安定なアルファへリックスコンフォメーションの形成にとって有利であることが公知の以下のアミノ酸配列モチーフ：ＥＡＡＡＲ（配列番号８）、ＥＡＡＡＫ（配列番号９）、ＥＥＥＥＲＲＲＲ（配列番号１０）、およびＥＥＥＥＫＫＫＫ（配列番号１１）の１つから選択される１つまたは複数のアミノ酸モチーフの反復を含むペプチド配列を含んでいてもよい。このようなペプチドバイオポリマー架橋分子はまた、プローブ分子複合体へのアビジンベースのコンジュゲーションのための正確に原子的に画定された位置にコンジュゲーションポイントを提供するために、共有結合で付着したビオチンを有するリシン残基からなる改変されたアミノ酸を含んでいてもよい。改変されたリシンは、他の点でアルファへリックスの特性を維持するように、またはそのような特性を最低限にしか変更しないように、このようなペプチド配列モチーフにおける標準のリシンまたはアルギニン残基を置き換えることができる。
【００６１】
様々な実施形態において、バイオポリマー架橋分子は、他の配置を有していてもよい。例えば、図４で例示されているように、バイオポリマー架橋分子４３３は、曲げられた、フォールディングされた、またはある程度の２次構造を含む直鎖状の生体分子を含んでいてもよい。様々な実施形態において、バイオポリマー架橋分子は、球状タンパク質、抗体、およびマルチサブユニットのタンパク質複合体などの３次および／または４次構造を有する分子をさらに含んでいてもよい。図５にその例が例示されており、それによればバイオポリマー架橋分子５３３は、免疫グロブリンＧタンパク質（ＩｇＧ）を含む。例示された実施形態において、電気的な接触部（５０６、５０７）は金ナノ粒子であり、このような粒子に結合する特異的な親和性を有するＩｇＧが確立されている。
【００６２】
センサー３０１に類似して、図４および図５に例示される配置はそれぞれ、リンカー（それぞれ４３７および５３７）を介してバイオポリマー架橋分子にカップリングされたプローブ（それぞれ４３６および５３６）を含む。例示された実施形態は、異なる材料および配置を含む電極または接触部、例えば、異なる構造的配置の異なる金属または非金属の伝導性または半導性の接触部などにカップリングすることができる、可能性のあるバイオポリマー架橋分子の配置の範囲を例示することが意図される。様々な実施形態において、電極または接触部は、例えばＩｎｎｏｖａＣｏａｔ  ＧＯＬＤナノ粒子（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの製品を使用した架橋の組織化および／または付着を容易にするために、さらにコーティング、処理または誘導体化されていてもよい。
【００６３】
様々な実施形態によるプローブは、あらゆる好適な分子または多成分の分子複合体を含んでいてもよい。プローブは、センサーで検出しようとする分子またはモニターしようとする生化学反応に基づいて選択することができる。プローブの様々な例としては、ペプチド、タンパク質、酵素、核酸、リボザイム、触媒性ＤＮＡ、および同種のものが挙げられる。様々な実施形態において、酵素は、リゾチーム、キナーゼ、またはポリメラーゼを含み得る。基質または標的分子の結合または処理に応答して物理的、化学的、または電子的な配置において特異的な変化を示すあらゆる分子または複合体が、本開示の様々な実施形態に従ってプローブとして使用することができる。
【００６４】
様々な実施形態において、プローブは、個々のＤＮＡまたはＲＮＡ標的分子と相互作用するのに好適な、例えばポリメラーゼまたは逆転写酵素などの酵素を含み得る。成長中のオリゴヌクレオチド鎖へのヌクレオチド塩基の鋳型依存性の取り込みを触媒する酵素は、鋳型鎖の核酸塩基の逐次的な遭遇および／または鋳型によって特定される天然もしくは類似の塩基の取り込み（すなわち、取り込み事象）に応答してコンフォメーション変化を受ける。このようなコンフォメーション変化は、プローブをカップリングしている架橋分子を通る電流を変調することができ、それにより鋳型分子に依存する方式で配列特異的なシグナルパターンが提供され得る。上述したように、シグナルパターンは、シグナル処理システムによって検出され、配列データの出力に翻訳されてもよい。さらに、標的核酸配列中の改変されたヌクレオチドの存在は、センサーデバイスおよびシグナル処理システムが塩基１つごとに例えば標的配列中の塩基のメチル化を直接決定できるようにし得る、固有のコンフォメーション変化およびシグナルパターン中の対応するシグナルの特徴を生成し得る。このような標識を用いない直接配列決定方法は、ＤＮＡの全ての４つの塩基に対応する天然および／またはアナログ塩基の混合物を含むヌクレオチド塩基ミックスを使用するシーケンシング反応においてヌクレオチド特異的な取り込み事象の識別を可能にし得るが、連続的および／または周期的な様式で個々の天然またはアナログ塩基を逐次的に提供することを含むシーケンシングプロセスも使用できる。逆転写酵素をプローブ分子として使用することも同様に、中間のｃＤＮＡ変換ステップを必要とすることなくＲＮＡ分子の直接配列決定を可能にし得る。
【００６５】
様々な実施形態において、および上記で簡単に説明したように、プローブは、自己組織化リンカーを介して架橋分子に付着させることができる。自己組織化リンカーは、第１の生体分子を第２の生体分子に付着させるのに好適ないくつかの構造のいずれを含んでいてもよい。様々な実施形態において、自己組織化リンカーは、第１のリンカー成分と、第１のリンカー成分に相補的な第２のリンカー成分とを含んでいてもよい。第１のリンカー成分および第２のリンカー成分は、自己組織化により接合させて、第１のリンカー成分の第２のリンカー成分に対する親和性に基づき組織化したリンカーを形成してもよい。第１のリンカー成分は、例えば架橋分子と会合させることができ、第２のリンカー成分は、プローブと会合させることができる。プローブの架橋への自己組織化によって架橋分子上の予め決定された位置でプローブの架橋分子へのカップリングが起こるように、架橋分子と会合させたリンカー成分を、架橋分子中の特異的な部位に工学的に作製してもよい。プローブとの会合のために選択されたリンカー成分は、リンカー成分のサイズおよびそれがプローブにコンジュゲートされる位置の両方に関してプローブと標的との間の干渉を最小化するように構成されていてもよい。この方式で、相補的な第１および第２のリンカー成分を接合させることにより、プローブの架橋分子への機能的な付着を提供することができる。自己組織化リンカーは、アビジン（または他のアビジン様）タンパク質である第１のリンカー成分およびビオチン小分子である第２のリンカー成分を用いたビオチン−アビジンカップリングメカニズムを含んでいてもよく、これらの成分は、互いに強い非共有結合を形成する。他のアビジン様タンパク質としては、ストレプトアビジン、リザビジン（ｒｈｉｚａｖｉｄｉｎ）、ブラダビジン（ｂｒａｄａｖｉｄｉｎ）、ニュートラビジン、他の様々なアビジンまたはストレプトアビジンのアミノ酸が改変された形態、およびビオチンが結合する官能基を保持するこのようなアビジンの２価またはモノマーの誘導体が挙げられる。様々な実施形態において、例えば、ビオチンは、架橋分子にコンジュゲートしていてもよく、ストレプトアビジンは、プローブ分子にコンジュゲートしていてもよい。自己組織化リンカーはまた、バイオコンジュゲーションに関する周知の「クリックケミストリー」メカニズムを含んでいてもよい。自己組織化リンカーはまた、抗原−抗体カップリングを含んでいてもよく、例えば架橋分子上に存在する抗原は、プローブ分子にコンジュゲートした抗体にカップリングする。自己組織化リンカーはまた、例えば、第１のリンカー成分であるＳｐｙＣａｔｃｈｅｒペプチドおよび第２のリンカー成分であるＳｐｙＴａｇペプチドを含んでいてもよく、これら２つの成分は結合して、不可逆的な共有結合を形成する。当業者に現在公知の、または以降彼らによって考案され得るあらゆる配置における他のあらゆる自己組織化リンカーシステムが、プローブを架橋分子にカップリングするのに使用することができる。
【００６６】
様々な実施形態において、センサーは、架橋分子と異なるプローブ分子を含んでいなくてもよい。その代わりに、架橋分子それ自体は、標的分子によって作用を受けるように構成されていてもよい。例えば、架橋は、タンパク質結合部位、例えばキナーゼ結合部位などを含んでいてもよいし、標的タンパク質の架橋への結合および／または標的タンパク質による架橋の改変に基づいて、試料中の対応するタンパク質の存在および／または活性を検出するのに使用されてもよい。
【００６７】
ここで図６Ａおよび６Ｂを参照すれば、センサーのエンクロージャーを有するおよび有さない、部分的に製作されたセンサーデバイス６００の斜視図が例示される。センサーデバイス６００は、埋め込まれたゲート６４０を含む３端子センサーデバイスである。図６Ａに例示されているデバイス６００は、ＣＭＯＳ製作技術を使用して生産することができるセンサーデバイスの様々な特徴を含み、例えば、電極ギャップ６３０によって分離された第１の電極６０２および第２の電極６０３と共に、基板６４１および酸化物６４２の下に存在するゲート６４０などを含み、各電極には、接触部６０６／６０７が付着されている。架橋分子およびプローブを含む上述した様々なセンサー複合体成分の付着は、下流の自己組織化ステップで実行されてもよい。様々な実施形態において、および図６Ｂで例示されるように、センサーを架橋および／またはプローブ分子を含む溶液と接触させることによってセンサーの組織化を完了させる前に、センサーデバイス６００はまず、センサーギャップ６３０を囲ったりまたはセンサーギャップ６３０の周りにフローセルを形成したりするように構成されたエンクロージャー６４３と共に構成されてもよい。同様に、エンクロージャー６４３は、例えばシーケンシング反応などのアッセイを実行するのにも使用することができる。エンクロージャー６４３は、別々に形成されて、デバイス６００を含む構造に付着させてもよい。
【００６８】
生体分子の検出および核酸塩基の識別
様々な実施形態において、例えばデバイス１００（図１）などの単一分子感知デバイスの動力学および動態を検出するための方法が提供される。本明細書で記載されるセンサーデバイスをモニターするのに、架橋分子を含むセンサー１０１の電気的なコンダクタンスの変化を測定するためのあらゆる方法を使用することができる。様々な実施形態において、約１０Ｖ未満の電圧が生体分子架橋分子を含むセンサーに印加されてもよく、以下でより詳細に説明される様々な実施形態では、約０．５Ｖの電圧が印加される。センサーを介して流れる電流は、集積回路１２０を使用して時間の関数として測定することができる。センサー複合体１０５における標的結合および／またはプローブによる処理事象（すなわち、酵素的プローブのケースでは酵素活性）は、センサー１０１の伝導性に対する変化をもたらし、測定された電流を変調させて、シグナルの特徴１２３を含む時間ｔにわたるシグナルパターン１２２を生成することができる。このような事象、ならびに構造的、化学的および電子的な変化などの関連するコンフォメーション変化（すなわち、酵素、基板、および周囲の溶液における電荷分布）は、標的の結合および処理の動態的な特徴を含んでいてもよく、様々な事象が、当業界において公知のシグナル処理技術を使用して測定、記録、識別、分析または保存できるシグナルの特徴１２３を含む電流の変動をもたらす。シグナルの特徴は、三角形、正弦波の形状を有するウェーブレットなどの様々な可能性のある形態のいずれかを含む場合もあるし、または任意の数のフーリエ成分を有する場合もある。例えば、センサーでプローブとして使用されるポリメラーゼは、鋳型塩基との別々の相互作用（すなわち、標的分子の特徴）および／または鋳型依存性のヌクレオチド取り込み（すなわち、ポリメラーゼ動態のシグネチャーは、鋳型塩基依存性である）のそれぞれにつきポリメラーゼ動態のシグネチャーを提供することができ、核酸鋳型の標的は、標的分子中の別個の位置に標的分子の特徴の配列を含み（すなわち、第１の、第２の、および第ｎの標的分子位置の第１の、第２の、および第ｎの標的分子の特徴）、それぞれの標的分子の特徴は、本開示に係るセンサーによる検出の間に対応するシグナルの特徴を生成する。ｎ個の標的分子の特徴は、一本鎖ＤＮＡ鋳型分子（すなわち、標的）のｎ個の連続した塩基に対応し得るものであり、この鋳型分子は、ポリメラーゼ酵素によって処理されて、これらのｎ個の標的分子の特徴に相補的ヌクレオチドを逐次的に取り込む。一連のシグナルの特徴を含むシグナルパターンの振幅、持続時間、および形状は、標的特異的なセンサー応答をコードする可能性があり、このような応答は、シグナルパターンをシグナル解釈マップと比較して標的の種類を決定するために、シグナル処理システム１２１を使用して分析することができる。シグナルの検出および分析の時間分解能を増加させることで、プローブ−標的相互作用の動態の変化性、遷移、および中間状態をさらに解明する能力を提供することができる。
【００６９】
ヌクレオチド取り込みの忠実度は正確な核酸シーケンシングにとって重要であるため、様々な実施形態において、シーケンシングの方法は、鋳型ベースのヌクレオチド取り込みのコンフォメーション変化を増加させるアナログ塩基に頼ることがあり、それによってよりクリアなシグナルが生成され、および／またはそれ以外の方法でアナログ塩基の取り込みを識別する強化された能力が提供され、それによって強化されたシーケンシング精度が提供される。鋳型依存性ヌクレオチド取り込みの動態または動的な識別を強化するのに使用できる非標識のアナログ塩基が周知であり、そのようなものとしては、プリンおよびピリミジン塩基、ならびにヌクレオチドのデオキシリボースまたはリボースおよびリン酸部分の改変を挙げることができる。特に、これは、追加の基をヌクレオチドのガンマ−リン酸に付加することを含んでいてもよく、これは、取り込み中に切り離されるため成長中の鎖およびそのポリメラーゼとの相互作用に永続的に影響を与えない大きい多様な分子の改変を受け入れる。
【００７０】
様々な実施形態において、方法は、核酸鋳型配列における改変されていないヌクレオチド塩基および改変されたヌクレオチド塩基の検出を提供することができる。例えば、方法は、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ４−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−ホルミルシトシン、および５−カルボキシルシトシン塩基、ならびに損傷した鋳型配列の位置、例えば脱塩基部位などを含む改変された鋳型ヌクレオチドを区別するのに好適であり得る。理論に制限されることは望まないが、シーケンシング反応中に相補的核酸鎖へのヌクレオチドの取り込みを触媒するＤＮＡポリメラーゼは、鋳型鎖におけるヌクレオチドの種類に依存する方式で異なるポリメラーゼ動態を示す可能性がある。本開示に係るデバイスおよび方法を使用して、核酸鋳型におけるヌクレオチド塩基の種類は、取り込み事象に対応する電子シグネチャーの検出に基づきほぼリアルタイムで決定することができる。フルオロフォアで標識されたヌクレオチドの取り込みに関連する蛍光シグナルの検出に頼る他のシステムおよび方法とは異なり、蛍光ベースの検出試薬およびシグナル検出デバイスは必要なく、それによってコストとプロセスの複雑さが低減される。
【００７１】
様々な実施形態において、方法は、シグナルトレースからノイズを除去するステップを含んでいてもよい。ノイズを除去することは、例えば６０Ｈｚラインのノイズを除去するために、シグナルの処理を実行することを含んでいてもよい。シグナルトレースからノイズを除去することは、シグナルトレース解釈のエラーを低減することができる。図７に、シグナルから６０Ｈｚラインのノイズを除去する前（上のシグナルトレース）および除去した後（下のシグナルトレース）に、１２塩基の核酸鋳型をシーケンシングすることによって生成されたシグナルトレースの例を例示する。このようなノイズの特徴に応じて様々なノイズ除去方法を使用することができ、このような方法はシグナル処理分野の当業者に周知である。
【００７２】
様々な実施形態において、センサーに結合した標的の配列を決定するためのシグナルの処理は、正確な配列決定というより標的の種類の確率論的な決定を含んでいてもよい。実際の標的分子配列は、いくつかの可能性のある固有の配列の１つである可能性があり、それぞれの可能性のある固有の配列は、固有の理論上のシグナルを有する。標的分子配列の決定は、実験的に測定されたシグナルと、固有の理論上のシグナルのデータベースを含むシグナル解釈マップとの比較を必要とする場合がある。シグナル解釈マップは、公知の標的配列を使用して生成された訓練データセットまたはライブラリー、シグナルアーチファクト、例えばノイズ、不鮮明さ、ドリフトなどを低減させるための陽性および陰性対照の測定に基づくシグナルの処理、ならびに、機械学習および／または統計的方法、例えばニューラルネットワーク、クラスタリング、カーブフィッティング、モデルフィッティング、ベイズの推論などの適用に基づいて作成することができる。
【００７３】
センサーデバイスの製造および組織化
本開示の様々な実施形態において、本明細書で記載される分子バイオセンサーデバイスを生産する方法が提供される。分子バイオセンサーデバイスを生産する方法は、ＣＭＯＳ製作プロセスと分子生物学的方法との組合せを含んでいてもよい。ＣＭＯＳ製作プロセスは、当業界において周知であり、例えばＦＥＴなどのデバイスを含む集積回路の商業的な規模の生産に好適な高解像度光リソグラフィー方法を含んでいてもよい。様々な実施形態において、ＣＭＯＳ製作プロセスは、個々のセンサーを含む集積回路を生産するのに使用することができ、このようなセンサーは、半導体ベース上に堆積させた第１の電極および第２の電極を有し、第１の電極と第２の電極とは正確に画定されたセンサーギャップによって分離されている。好ましい実施形態において、ナノ電極、ギャップおよび接触部のデザインは、ＣＭＯＳプロセス中に完全に製造できるように選ばれる。特に、これらのエレメントについて特定の単純な幾何学的配置が選ばれる場合、それらは、特定の製作施設、例えば主要な鋳造会社（例えば、ＴＳＭＣまたはＧｌｏｂａｌＦｏｕｎｄｒｉｅｓ）の製作施設などによって具体化されるような、位相シフトマスク、複数のパターン形成、ならびに現在および未来の１６ｎｍノード、１４ｎｍノード、１０ｎｍノード、７ｎｍノードおよび５ｎｍノードなどの最も高解像度でのＣＭＯＳ製作ノードを達成するのに使用される他の技術と組み合わされた、高解像度光リソグラフィー方法、例えばエクストリームＵＶ（ＥＵＶ）およびディープＵＶ（ＤＵＶ）ソースなどを使用して製作することができる。このようなプロセスは、例えば直線のセグメント、直線のカット、および円形のスポットなどのある特定の具体的なパターン特徴を作製することについて他に類を見ない程に高い解像度を有する。ナノ電極、ナノ接触部、および／またはギャップの幾何学的配置のデザインにおけるこれらのプロセス特異的な幾何的エレメントの使用は、関連するＣＭＯＳプロセスでの様々な実施形態によるセンサーデバイスの製作を容易にすることができる。しかしながら、一般的に、採用される製造技術はまた、非ＣＭＯＳプロセス方法、例えばｅ−ビームリソグラフィー、ナノインプリントリソグラフィー、またはミリングおよびエッチング技術、例えば集束イオンビームでのミリングおよびプラズマエッチングなどを含み得る。分子生物学的な製作方法は、特別にデザインされた自己組織化反応プロセスにおける、原子の配置に対する正確な制御を用いた望ましい架橋分子の合成、ならびに生体分子と上流のＣＭＯＳまたは他の製作方法プロセスで生産された電子センサーの構成要素および／または他の生体分子との相互作用およびカップリングを可能にするのに好適な条件下での、液相中のこのような生体分子の溶液の送達を含み得る。
【００７４】
様々な実施形態において、本明細書に記載されるセンサーデバイスを製造する方法は、集積回路マイクロチップの製造、センサー電極および／または接触部の製作、架橋生体分子の合成、架橋生体分子の電極および／または接触部への組織化、プローブの架橋生体分子へのカップリング、ならびにセンサーデバイスのフローセルへの封入などのステップを含んでいてもよい。様々な実施形態において、センサーは、２端子の回路を含んでいてもよく、またはセンサーは、ゲートと共に３端子の回路を含んでいてもよい。様々な実施形態において、ゲートは、埋め込まれたゲート配置を有していてもよいが、横方向ゲートおよびｆｉｎＦＥＴ構造などの他のゲート配置も使用できる。
【００７５】
様々な実施形態において、電極、接触部、および／またはゲートは、導電性金属材料で構成されていてもよい。例えば、電極、接触部、および／またはゲートは、アルミニウム、チタン、クロム、銅、金、パラジウム、白金、および同種のものを含んでいてもよい。様々な実施形態において、電極、接触部、および／またはゲートは、半導体材料、例えばｎ型およびｐ型半導体電極を生産するのに使用できるドープ半導体材料などを含んでいてもよい。様々な実施形態において、電極および電極に付着した接触部は、同じ材料を含んでいてもよく、様々な他の実施形態において、接触部は、それが付着する電極と異なる材料を含んでいてもよい。
【００７６】
様々な実施形態において、電極は、あらゆる好適な構造的配置を有していてもよい。例えば、電極は全体的に長方形の断面を含んでいてもよいが、他の幾何学的および不規則な断面の輪郭が可能であり、本開示の範囲内である。様々な実施形態において、電極は、約３０ｎｍ未満、または約２５ｎｍ未満、または約２０ｎｍ未満、または約１５ｎｍ未満、または約１４ｎｍ未満、または約１３ｎｍ未満、または約１２ｎｍ未満、または約１１ｎｍ未満、または約１０ｎｍ未満、または約９ｎｍ未満、または約８ｎｍ未満、または約７ｎｍ未満、または約６ｎｍ未満、または約５ｎｍ未満、または約４ｎｍ未満、または約３ｎｍ未満の最大断面寸法（すなわち、電極の断面での電極の最大寸法）を有していてもよい。
【００７７】
同様に、様々な実施形態において、接触部は、あらゆる好適な構造的配置を有していてもよい。例えば、接触部は、全体的に半球状（ｓｅｍｉ−ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）または半球状（ｈｅｍｉ−ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）の断面の輪郭を含んでいてもよいが、他の幾何学的および不規則な断面の輪郭が可能であり、本開示の範囲内である。様々な実施形態において、接触部は、約２０ｎｍ未満、または約１５ｎｍ未満、または約１４ｎｍ未満、または約１３ｎｍ未満、または約１２ｎｍ未満、または約１１ｎｍ未満、または約１０ｎｍ未満、または約９ｎｍ未満、または約８ｎｍ未満、または約７ｎｍ未満、または約６ｎｍ未満、または約５ｎｍ未満、または約４ｎｍ未満、または約３ｎｍ未満の最大断面寸法（すなわち、接触部の断面での接触部の最大寸法）を有していてもよい。
【００７８】
様々な実施形態において、第１の電極および第２の電極は、交互にソースおよび／またはドレインと称することができ、様々な実施形態において、ソースおよび／またはドレインは、電極とは異なる構造的要素を含んでいてもよい。
【００７９】
製造方法は、基板表面上に第１の電極の位置および第２の電極の位置を画定するためにリソグラフィー方法を使用するステップを含んでいてもよい。第１の電極の配置および第２の電極の配置は、電極製作の完了時にそれらの間に正確に画定された電極ギャップが生じるように画定することができる。同様に、様々な実施形態において、製造方法は、第１の接触部の位置および第２の接触部の位置を画定するためにリソグラフィー方法を使用するステップを含んでいてもよい。第１の接触部の位置および第２の接触部の位置は、接触部の製作完了時にそれらの間に正確に画定された接触部ギャップが生じるように画定することができる。同様に、接触部は、画定された構造を用いて構成されていてもよい。バイオセンサーを製造するのに使用できる様々な方法は、以下でより詳細に説明される。
【００８０】
ここで図８を参照すると、電極を製作するためのリソグラフ方法８００が例示される。様々な実施形態において、製作方法は、マイクロチップ基板、例えば酸化ケイ素層８８１およびレジスト層８８２が重ねられたケイ素基板８８０から始めることができる。レジスト層は、あらゆる好適なレジスト材料、例えばポリ（メタクリル酸メチル）などを含んでいてもよい。本開示に係る製作プロセスにおいて、接着促進剤が使用されてもよい。例示された実施形態では、ｅ−ビームリソグラフィーを使用して、レジスト層を露光し、レジスト層中に第１の電極トラック８８３および第２の電極トラック８８４を画定する（ステップ８１０）。リソグラフィーステップの後、レジストを現像して（ステップ８２０）、リソグラフィーステップで画定された領域中のレジストを除去する。次に、堆積ステップ（ステップ８３０）を実行して、基板表面上に第１の電極８０２および第２の電極８０３を形成してもよい。例えば金属スパッタコーティングなどのあらゆる好適な材料および堆積方法を使用することができる。同様に、あらゆる好適な基板表面処理、例えば電極と基板との間に好適な結合を提供するための中間付着層の適用などを、堆積ステップの実行前に実行してもよい。様々な実施形態において、第１および第２の電極は、スパッタリング堆積方法を使用して金から製作される。堆積ステップ後、リフトオフステップ（ステップ８４０）を実行し、残存したレジストを除去して、基板表面上に配置された第１の電極および第２の電極を残す。
【００８１】
様々な実施形態において、例えば方法８００などのナノ電極を製作するためのリソグラフ方法は、高度に正確な電極の配置を達成することができる。例えば、電極を、一貫した長さ、幅、および厚さの仕様で構成することができる。様々な実施形態において、電極は、約１０ｎｍから約４０ｎｍの間の幅、例えば約２０ｎｍの幅を有していてもよい。同様に、第１の電極および第２の電極によって画定された電極ギャップを、正確な電極ギャップ寸法で構成することができる。様々な実施形態において、電極ギャップ寸法は、約３ｎｍから約３０ｎｍの間であり得る。例えば、様々な実施形態によるセンサーにおける電極対ごとの電極ギャップは、約３ｎｍから約３０ｎｍの間、または約４ｎｍから約２５ｎｍの間、または約５ｎｍから約２０ｎｍの間、または約６ｎｍから約１７ｎｍの間、または約７ｎｍから約１５ｎｍの間であり得る。様々な実施形態において、電極ギャップは、約３ｎｍ、約４ｎｍ、約５ｎｍ、約６ｎｍ、約７ｎｍ、約８ｎｍ、約９ｎｍ、約１０ｎｍ、約１１ｎｍ、約１２ｎｍ、約１３ｎｍ、約１４ｎｍ、または約１５ｎｍの寸法で製作することができる。当業者には明らかであるように、上述した様々な方法のステップは、ＣＭＯＳ製作および／または他のミクロ電子工学による製作方法を使用したセンサーデバイスの商業的なスケールでの生産に適したプロセスで、高密度かつ高度に正確な物理的な仕様で、複数の電極対を並行に生産するのに使用することができる。
【００８２】
理論に制限されることは望まないが、電極ギャップ（またはセンサーギャップ）を上述したような電極ギャップ寸法で有するセンサーを提供することは、センサーの性能および／または製作に関して様々な利点を提供することができる。例えば、約３ｎｍ未満の寸法を有する電極ギャップの場合、溶液（すなわち、試料環境）およびバルクを通る電流伝導の疑似的なソースが増加し始め、追加のノイズを生じる。加えて、このようなギャップは、例えば酵素などの様々な目的のプローブ分子を収容するほど十分に大きくない可能性がある。さらに、このようなギャップは、現在のＣＭＯＳ製造能に適合しない。例えばバイオポリマーまたは化学的に合成された分子を使用することによって約３０ｎｍより大きい電極ギャップにとって原子的に正確な仕様を有する架橋分子を製造するコストと複雑さは実質的に高まり、様々な架橋分子の剛性は、長さが約３０ｎｍを超えると共に減少する可能性がある。同様に、多くの分子の伝導性が、それらの長さを超えると実質的に有用なパラメーター未満に低下し、それより大きい長さもまた高密度アレイにセンサーを緊密にパッキングする能力を制限する。したがって、約３ｎｍから３０ｎｍの範囲の電極ギャップを有するセンサーが、センサーデバイスの機能、製造可能性、拡張性および経済性に関してある特定の利点をもたらす可能性がある。
【００８３】
図１１Ａ〜１１Ｃに、上述した方法に従って製作されたセンサーデバイスの例を例示し、それぞれ３７倍、５０００倍、および５０，０００倍の倍率でのセンサーデバイス１０００の表面の走査型電子顕微鏡写真を示す。センサーデバイス１０００は、２０個のセンサーごとのナノ電極およびナノ接触部、ならびに外部の電流計に接続するためのリードおよびパッドを含む。図１１Ａにおいて、基板表面上に位置するパッドおよびリードが明確に視認できる。センサー電極は、図１１Ｂの中心でより明るい垂直のバンドとして現れる。図１１Ｃにおいて、第１の電極１１０２および第２の電極１１０３は、第１の電極と第２の電極との間に画定された電極ギャップ１１２０と共に明確に見ることができる。
【００８４】
様々な実施形態において、およびここで図９を参照して、生体分子感知デバイスを製造する方法は、接触部の位置を製作および／または決定するためのリソグラフ方法９００を含んでいてもよい。様々な実施形態において、製作方法は、その上に第１の電極８０２および第２の電極８０３が配置された基板を含むマイクロチップから始めることができる。マイクロチップは、酸化ケイ素層８８１および好適なレジスト層９８２が重ねられたケイ素基板８８０を含んでいてもよい。例示された実施形態では、ｅ−ビームリソグラフィーを使用して、レジスト層を露光して、レジスト層中に第１の接触部の位置９８５および第２の接触部の位置９８６を画定する（ステップ９１０）。様々な実施形態において、接触部の位置は、例えば電極ギャップに隣接する電極の遠位端付近に第１の電極および第２の電極の一方が重ねられるように画定することができる。接触部に関して画定されたサイズおよびパターンは、後述するような後続のプロセスステップで形成される接触部のサイズおよび形状の決定に寄与する可能性がある。リソグラフィーステップの後、レジストを現像して（ステップ９２０）、リソグラフィーステップで画定された接触部の位置中のレジストを除去する。次に、堆積ステップ（ステップ９３０）を実行して、第１および第２の電極表面上に第１の接触部９０６および第２の接触部９０７を形成してもよい。電極の場合と同様に、あらゆる好適な材料および堆積方法を使用することができる。同様に、あらゆる好適な基板表面処理、例えば電極と基板との間に好適な結合を提供するための中間付着層の適用などを、堆積ステップの実行前に実行することができる。接触部は、電極とは異なる材料を含んでいてもよいし、または接触部は、電極を製作するのに使用される同じ材料を含んでいてもよい。様々な実施形態において、第１および第２の接触部は、電気化学析出法を使用して金から製作される。堆積ステップ後、リフトオフステップ（ステップ９４０）を実行し、残存したレジストを除去して、第１および第２の電極の表面上に配置された第１の接触部および第２の接触部を残す。
【００８５】
交互に、様々な実施形態において、接触部を製作するための方法は、予め形成された接触部のナノ粒子の堆積を含んでいてもよい。予め形成された接触部のナノ粒子は、レジスト層中に形成され、接触部のナノ粒子を受け入れてそれを接触部の位置に配置させるように構成された空隙に堆積させてもよいし、または接触部のナノ粒子は、接触部の位置での付着を達成するための化学的誘導体化層を使用して堆積させてもよい。
【００８６】
図１０に例示されているように、レジスト層中に形成された空隙に予め形成された接触部粒子を堆積させる方法１０００は、ステップ９１０および９２０に関して、方法９００について上述した同じステップを含んでいてもよい。予め形成された接触部粒子を受け入れるように構成された空隙を作り出した後、複数の予め形成された接触部粒子１０８７を含む溶液をデバイスと接触させ（ステップ１０３０）、圧力、混合、表面張力、浮力、遠心力、または空隙に粒子を導入する他の方法を使用して粒子を空隙に堆積させることができる。粒子の堆積後、過量の溶液および粒子を除去してもよい。ステップ９４０に関して上述したように残存したレジストを除去するためにリフトオフステップを実行してもよいし、それに続いて、強く付着した第１および第２の接触部（１００６、１００７）を形成するために必要に応じて、予め形成された接触部粒子を任意選択で電極にアニールさせてもよい。
【００８７】
代替として、化学的誘導体化処理を使用して予め形成された接触部のナノ粒子を堆積させる方法は、図９に例示した方法に関して上述したステップ９１０および９２０に類似したステップを含んでいてもよい。例えば、ケイ素基板表面に適合する１つのこのような広く使用されている表面誘導体化は、シラン化であり、これは、基板表面を、例えばアミノシラン（例えば、ＡＰＴＥＳ）またはメルカプトシラン（例えば、ＭＰＴＥＳ）などの分子でコーティングすることを含み得る。これらの分子はケイ素表面に接着し、次いでそれらの露出した末端が、例えば金ナノ粒子などの他の材料と容易に架橋を形成して、それらを表面に結合させる。次いで、ステップ９３０に類似したステップにおいて、接触部の金属または他の材料を堆積させることよりも、このような誘導体化処理を適用することができる。ステップ９４０に類似したリフトオフステップを実行した後、第１の電極および第２の電極は、第１の接触部および第２の接触部の付着が意図された位置に表面誘導体化を含むようになる。誘導体化された電極表面を含むデバイスは、複数の予め形成された接触部粒子を含む溶液と接触させることができる。粒子は、誘導体化された電極表面に相補的であるか、またはそれ以外の方法で特異的に結合する表面またはコーティングを有していてもよく、それによって接触部粒子は、画定された接触部の位置に配置される。必要に応じて、誘導体化処理およびあらゆる粒子コーティングを除去ステップで除去して、予め形成された接触部粒子を上述したように電極にアニールさせてもよい。このアプローチの例は、金ナノ粒子に特異的に結合させるためのＡＰＴＥＳでコーティングされたケイ素表面の使用である。
【００８８】
様々な実施形態において、接触部の構造は、例えば原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）の使用によって、または過量のビーズの堆積とそれに続く不要なビーズのＡＦＭ除去によって、金ナノ粒子ビーズを電極上に位置させることなどの様々な直接的な手段によって作り出すことができる。
【００８９】
様々な他の実施形態において、接触部の構造および／または電極ギャップは、例えば集束イオンビーム（ＦＩＢ）ミリングを使用することによる材料の除去を介してその場で形成することができる。例えば、電極ギャップを、ＦＩＢを使用して前もって確立した連続的な金属ナノワイヤーに刻み付け、それによって電極ギャップの形成と同時に第１の電極および第２の電極を作り出すことができる。
【００９０】
センサーまたはセンサーアレイの電極および接触部を製作した後、センサーに液状の溶液を制御して導入することを可能にするのに好適なフローセルまたは類似のデバイスに、センサーを封入してもよい。センサーチップをフローセルに封入することは、典型的にはＰＤＭＳまたは他のポリマーもしくはプラスチックからフローセルを成形すること、およびこれを使用してチップを包み込むことによってなされ、それにより、製作された電極および接触部は、架橋およびプローブの組織化、ならびにそれに続く完成したセンサーを使用したアッセイに好適に曝露されたままになる。様々な実施形態において、表面の不動態化処理を基板表面および曝露された電極の一部に適用して、液体試料との接触により生じる可能性がある電気的なノイズを低減することができる。不動態化処理は、電極および／または接触部を未処理のセンサーギャップ領域中に残すのに適用される場合がある。例えば様々な実施形態において、センサーギャップが並べられた幅３０ｎｍの領域が未処理のままであってもよい。不動態化処理は、センサーチップをフローセルで封入する前に実行されてもよい。様々な実施形態によるセンサーは、約０．５Ｖの電圧が印加される場合、約１ｐＡ未満、または約０．９ｐＡ未満、または約０．８ｐＡ未満、または約０．７ｐＡ未満、または約０．６ｐＡ未満、または約０．５ｐＡ未満、または約０．４ｐＡ未満、または約０．３ｐＡ未満、または約０．２ｐＡ未満の電子ノイズを有していてもよく、センサーは、別の状況では酵素、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ酵素の活性を支持するのに好適な低いイオン強度の緩衝溶液に浸される。
【００９１】
バイオポリマー架橋の製作は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの合成方法、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素による合成方法、化学合成方法、またはそれらのあらゆる組合せなどのバイオポリマー分子を合成するのに使用できる様々な方法のいずれかによって実行することができる。本開示に従って架橋分子として使用するのに好適なバイオポリマー分子を生産するための様々な方法は、当業者に周知である。同様に、バイオポリマー架橋分子を誘導体化または改変して、本明細書に記載されるようなアンカーまたはリンカー成分を提供するための方法も、同様に周知である。本明細書に記載される様々な特異的なバイオポリマー架橋分子は、一例として提供されたものであり、本の開示の範囲を限定すると解釈されるべきではなく、合成架橋分子は、本開示の様々な実施形態に従って使用することができる。
【００９２】
様々な実施形態において、バイオポリマー架橋分子のプローブへの付着は、自己組織化の化学反応によって実行され得る。同様に、バイオポリマー架橋分子の電極または接触部への付着も、自己組織化の化学反応によって実行され得る。このような自己組織化反応は、付着させようとする２つの成分を、成分の少なくとも１つを含む溶液を介して互いに接触した状態にすることによって実行され得る。様々な実施形態において、バイオポリマー架橋のプローブへの付着は、電極または接触部への架橋の付着の前、その後、またはそれと同時に実行されてもよい。類似の検討が、合成化学によって生産された架橋分子に適用される。
【００９３】
様々な実施形態において、センサーデバイスを作製する方法は、バイオポリマー架橋分子を第１の電極および第２の電極に組織化するステップを含む。架橋分子の組織化ステップは、自己組織化ステップを含んでいてもよい。自己組織化は、第１および第２の電極を含む部分的に構築されたセンサーデバイスを、架橋分子を含む溶液と接触させることによって実行されてもよい。架橋分子は、架橋分子の第１の端部および第２の端部と第１の電極および第２の電極との間の親和性に基づき、第１の電極および第２の電極に自己組織化する（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅ  ｔｏ）ことができる。様々な実施形態において、実施例２で後述するように、および図１３〜１５を参照すれば、センサー構成要素の自己組織化は、センサーデバイスによって電子的にモニターすることができる。電子的なモニタリングは、品質制御機能を提供して、適切に組織化したデバイス中のセンサーを確認するのに役立つ可能性がある。予め決定されたパラメーター内の組織化プロセスシグナルを提供しないセンサー回路からのシグナルは、例えばそのデバイスで実行されるシーケンシング分析などの下流の分析で無視される場合がある。
【実施例】
【００９４】
（実施例１）
バイオポリマー架橋の自己組織化
端部から端部までの長さが約２０ｎｍの二本鎖ＤＮＡバイオポリマー架橋分子を、５’−チオール改変を含む配列番号１に記載のオリゴと、５’−チオール改変および内部のビオチン改変を含む配列番号２に記載のオリゴとを使用して構築した。架橋分子を、可視化の目的でストレプトアビジン−金タグを使用して標識した。接触部の対がそれぞれ中心から中心に約２０ｎｍの接触部ギャップを画定する金接触部の対を堆積させるために、ｅ−ビームリソグラフィー技術を使用して、金ナノ粒子接触部の試験アレイ１２００（図１２）を製作した。金で標識した架橋分子を含む緩衝液を、金ナノ粒子接触部の試験アレイと接触させて置いた。短いインキュベーション期間の後、過量の溶液を除去し、アレイを洗浄して、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）によって画像化した。図１２に、金接触部１２７０および金タグ１２７１のアレンジメントを示すＳＥＭ画像を例示する。数個の接触部対（矢印で示される）につき、金タグ１２７１が接触部対間に配置されているのがわかり、これは、接触部対への生体分子架橋分子の自己組織化が成功していることを示す。
【００９５】
（実施例２）
自己組織化ステップの検出
中心から中心に約２０ｎｍの接触部ギャップを有する電極に付着した金接触部を含む単一のセンサーを有するセンサーデバイスを、ｅ−ビームリソグラフィー技術を使用して製作した。フローセル内部の第１の端部への液体の導入およびフローセルの第２の端部からの液体の除去が許容されるようにいずれの端部も開いていた幅１ｍｍ×高さ０．４ｍｍのチャネル、ならびにセルをセンサーと接触させる溶液を含むＰＤＭＳフローセルに、センサーを封入した。フローセルチャネルを、センサーを含む電極の方向に対して直角に配向し、センサーは、フローセルチャネルの長さのおよそ中央に位置させた。フローセルに低いイオン強度の緩衝溶液を導入し、それに続く二本鎖ＤＮＡ架橋分子の導入および自己組織化（実施例１で上述した通り、ただし金タグなしで）（図１３）、ストレプトアビジンタグを有するクレノー断片の導入および結合（図１４）、５０塩基のプライミングされた一本鎖ＤＮＡ分子の導入および結合（図１５）、ならびにクレノー断片による鋳型ベースの合成を開始させるためのｄＮＴＰミックスの導入（図１６）の連続的なステップにわたり、センサーに０．５Ｖの電位を印加した。ＤＮＡ鋳型分子の配列は、ポリＡ領域を特徴とする以下のオリゴ配列：
【００９６】
５’−ｃｇｃ  ｃｇｃ  ｇｇａ  ｇｃｃ  ａａｇ  ａａａ  ａａａ  ａａａ  ａａａ  ａａａ  ａａａ  ａａ  ｔｔｇｃａｔｇｔｃｃｔｇｔｇａ−３’
を含み、
【００９７】
使用されたプライマーは、
【００９８】
３’−ａａｃ  ｇｔａ  ｃａｇ  ｇａｃ  ａｃｔ−５’
であった。
【００９９】
加えて、ポリＡトラクトがポリＣ、Ｇ、およびＴトラクトで置き換えられた類似の配列を使用して、異なる鋳型塩基の作用を調査した。
【０１００】
図１３に例示されているように、測定された電流は、３秒間にわたり上昇する。シグナルトレースにおける２つの屈曲点（ＡおよびＢ）は、５’−チオールで改変された末端塩基アンカーの第１および第２の接触部への結合に対応すると考えられる。ストレプトアビジンタグを有するクレノー断片を含む溶液を導入した後のシグナルトレース（図１４）は、約１．５秒で電流の鋭い増加を示し、これは、クレノー断片酵素のストレプトアビジンリンカー成分がバイオポリマー架橋のビオチンリンカー成分と接触および結合することに対応する可能性が高い。図１５において、鋳型鎖をフローセルに導入した後に、シグナルトレース中に鋭いシグナルピークが存在し、このピークは、クレノー断片による鋳型結合に対応すると解釈される。ＤＮＡ塩基に関する全てを含むｄＮＴＰミックスの導入後に測定されたシグナルトレースは、図１６で例示されており、同様に約１秒で別個のシグナルの特徴を示す。これは、ポリメラーゼ酵素からの合成された二重鎖の解離を表す可能性があり、約０．７秒から約０．９５秒のシグナルトレースは、結合した鋳型ＤＮＡに基づくヌクレオチド取り込みに応答してセンサーによって生成された動態のシグネチャーに対応する可能性がある。
【０１０１】
（実施例３）
ヌクレオチド塩基取り込みの検出
バイオポリマー架橋分子およびクレノー断片プローブを含むセンサーデバイスを、実施例２で上述したように製作して組織化した。センサーデバイスを使用して、様々な長さおよび配列組成の一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して実行されたＤＮＡ合成反応に応答するシグナルトレースを生成した。図１７は、単一塩基の取り込みを提供する鋳型配列に関するシグナルトレースを例示する。０．５秒におけるシグナルの特徴は、クレノー断片の鋳型依存性活性および塩基取り込みに対応すると解釈され、０．６秒の直後のそれよりかなり弱いシグナルの特徴は、システム中のノイズのある形態または疑似的なシグナルに対応すると解釈される。図１８は、様々な鋳型トラクトのシグナルトレースを例示する。例示された反応には、実施例２で上述した鋳型およびプライマーを使用した。
【０１０２】
上および下のシグナルトレースは、センサーにｄＮＴＰ非含有の緩衝液が導入される対照実験である。第２、第３、および第４のシグナルトレース（上から下へ）は、生成されたシグナルが２０、３、および１２の取り込み事象に起因するように、溶液へのｄＴＴＰ導入（鋳型の２０Ａ塩基によって指示される２０の取り込み事象が起こることが予測される）、それに続くｄＣＴＰの添加（３’から５’への鋳型中のＧＡＡの三つ組によって指示される別の３つの取り込みが予測される）、それに続くｄＮＴＰの添加（鋳型の残存する１２塩基を指示された通り重合させることが予測される）に応答して生成された。各シグナルトレースにつき矢印間に位置するシグナルの特徴を含むシグナルトレースは、鋳型依存性酵素活性によるシグナル変調に対応すると解釈される。これらの撹乱されたシグナル領域の相対的な持続時間は、予測される２０：３：１２の比率であり、第３のこのようなトラクトは、１２の別々の取り込み事象に対応する可能性がある明確なスパイクを示す。図７は、上述したデバイスおよび上述した鋳型を１２の対になっていない鋳型塩基と共に使用して実行されたＤＮＡ合成反応によって生成されたシグナルトレースの追加の例を例示する。これらの結果は、様々な実施形態によるセンサーが、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼプローブ活性に応答したシグナルの特徴を含むシグナルトレースを生成できることを実証する。これもまた、シグナルの明瞭化におけるノイズ除去の価値を実証しており、図７の上のパネルは、未加工の測定されたシグナルであり、下のパネルは、ノイズを除去するためのシグナルの処理を受けたものであり、このケースでは特定の６０Ｈｚラインのノイズがバンドパスフィルターで消去された。
【０１０３】
（実施例４）
メチル化された鋳型塩基の検出
バイオポリマー架橋分子およびクレノー断片プローブを含むセンサーデバイスを、実施例２で上述したように製作して組織化した。センサーデバイスを使用して、シトシンおよび５−メチルシトシンで改変されたヌクレオチドの両方を含む一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して実行されたＤＮＡ合成に応答するシグナルトレースを生成した。鋳型配列は、配列５’−１３×（Ｎ）−５×（ＧｍＣ）−５×（ＧＣ）−Ｇ−３’（すなわち、５’−ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＧｍＣ  ＧｍＣＧ  ｍＣＧｍＣ  ＧｍＣＧ  ＣＧＣ  ＧＣＧ  ＣＧＣ  Ｇ−３’（配列番号１２）、式中Ｎは、任意の標準ヌクレオチドであり、ｍＣは、５−メチルシトシンである）を有する対になっていない塩基ヌクレオチドを含んでいた。この鋳型配列は、配列５’−Ｃ−５×（ＧＣ）−５×（ＧＣ）−１３×（Ｎ）−３’（すなわち、５’−ＣＧＣ  ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  Ｎ−３’（配列番号１３））を有する相補的な合成鎖を生成するようにデザインされ、下線で示したグアノシン塩基は、鋳型鎖中の５−メチルシトシンで改変されたヌクレオチドの位置に対応する。センサーに０．５Ｖを印加し、水、緩衝液、ｄＣＴＰの緩衝液、ｄＧＴＰの緩衝液、および４つ全てのｄＮＴＰ塩基のミックスを含む緩衝液の逐次的な導入およびそれらとのインキュベーションの経過にわたり電流を測定した。この予測される結果は、単一のｄＣＴＰ取り込み事象、次いで２０個のｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ取り込み事象であり、２０個の取り込み事象のうち最初の１０個は、改変されていないシトシン塩基に対するものであり、後者の１０個は、５−メチルシトシンで改変されたヌクレオチドに対するものである。メチル化の検出は、これらの２０個の事象のうち第２の１０個におけるシグナルの異なる特徴として出現する。
【０１０４】
図１９に、各試薬とのインキュベーション中に生成されたシグナルトレースを例示する。水および緩衝液とのインキュベーションは、極めて低いベースラインの電流を生成し、変動はほとんどなかった。ｄＣＴＰを含む溶液の添加は、鋳型リード塩基Ｇに対するｄＣＴＰの単一の塩基取り込みに対応する鋭い配列特徴を生成した。ｄＧＴＰの添加は、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの両方を含む溶液を作り出し、鋳型鎖における、改変されていないヌクレオチドに対応する１０個の塩基取り込みを介した合成、それに続く５−メチルシトシン塩基に対応する１０個の塩基取り込みを介した合成を許容した。このインキュベーション期間中に生成されたシグナルトレースは、約０．３５秒から約０．５秒にわたるより高い電流を有するシグナルの特徴、それに続く約０．５秒から約０．６５秒にわたるより低い電流を有するシグナルの特徴を示す。このシグナル振幅のシフトは、ポリメラーゼに対する鋳型配列のメチル化状態の作用とその結果生じるシグナル変調に応答するセンサーシグナルにおける別個の変化として解釈される。この証拠は、シーケンシング反応の間に標的配列中の改変されたヌクレオチドの存在を直接区別する本開示の様々な実施形態によるセンサーの能力を裏付ける。
【０１０５】
（実施例５）
長いＤＮＡ鎖読取りにわたるシグナルの検出
バイオポリマー架橋分子およびクレノー断片プローブを含むセンサーデバイスを、実施例２で上述したように製作して組織化した。センサーデバイスを使用して、ファイＸ１７４バクテリオファージのゲノム由来のおよそ５４００ｂｐの鋳型配列を含む一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して実行されたＤＮＡ合成に応答するシグナルトレースを生成した。実験的シーケンシング反応にはｄＮＴＰミックスを供給し、一方で対照反応にはｄｄＮＴＰ（ジデオキシヌクレオチド三リン酸）ミックスを供給した。ｄｄＮＴＰミックスは、このようなジデオキシターミネーターの１つの取り込み後に重合プロセスを終わらせるため、本質的にシーケンシングの感知シグナルは生じないはずである。時間２０ミリ秒のサンプリング分解能でデータを獲得した。これは、個々の取り込みスパイクを観察するには粗すぎるが、１秒当たりおよそ２０塩基の予測される酵素速度で重合プロセス全体を観察するには十分な長さの３００秒にわたるタイマー期間でデータを収集することができた。
【０１０６】
図２０は、ｄＮＴＰミックスを用いた実験反応によって生成されたシグナルトレース（上のシグナルトレース）の、ｄｄＮＴＰミックスを使用した対照反応のシグナルトレース（下のトレース）との比較を例示する。実験的なシーケンシング試行のシグナルトレースは、対照反応には存在しないいくつかの別個のグロスのシグナルの特徴（矢印で指摘）を含んでおり、対照反応より高い電流も生成した。示された１００秒間にわたり生成されたシグナルトレースから、本開示の様々な実施形態によるセンサーは、長い鋳型配列の場合の長期のシーケンシング試行の経過にわたり、ＤＮＡポリメラーゼプローブの鋳型ベースのヌクレオチド取り込み活性に応答して検出可能なシグナルを生成するのに好適であり得ることが示唆される。したがって、このようなセンサーが処理できる長さまたは鋳型に対する直接的な制限がない。
【０１０７】
追加の例
本開示の追加の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる。
【０１０８】
１．第１の電極にカップリングされた第１の接触部；
第２の電極にカップリングされた第２の接触部；
前記第１の接触部および前記第１の電極のうち１つと前記第２の接触部および前記第２の電極のうち１つとの間に画定されたセンサーギャップ；および
第１の端部と第２の端部とを含む架橋分子
を含むセンサーであって、
前記架橋分子は、バイオポリマー架橋分子であり、
前記架橋分子は、前記第１の端部で前記第１の接触部にカップリングされており、前記第２の端部で前記第２の接触部にカップリングされている、センサー。
【０１０９】
２．基板表面の上にある第１の電極；
基板表面の上にある第２の電極；
前記第１の電極と前記第２の電極との間に画定されたセンサーギャップ；および
第１の端部と第２の端部とを含む架橋分子
を含むセンサーであって、
前記センサーギャップは、約５ｎｍから約３０ｎｍの間のセンサーギャップ寸法を含み、
前記架橋分子は、前記第１の端部で第１の接触部にカップリングされており、前記第２の端部で第２の接触部にカップリングされている、センサー。
【０１１０】
３．ゲート電極をさらに含む、例１または２に記載のセンサー。
【０１１１】
４．センサーギャップが、約５ｎｍから約３０ｎｍの間のセンサーギャップ寸法を有する、例１に記載のセンサー。
【０１１２】
５．前記第１の端部が、第１の自己組織化アンカーを含み、かつ／または前記第２の端部が、第２の自己組織化アンカーを含む、例１または２に記載のセンサー。
【０１１３】
６．前記架橋分子が、化学的に合成された架橋分子を含む、例２に記載のセンサー。
【０１１４】
７．架橋分子が、化学的に合成された架橋分子を含む、例１〜６のいずれかに記載のセンサー。
【０１１５】
８．架橋分子が、直鎖状バイオポリマーを含む、例１〜７のいずれかに記載のセンサー。
【０１１６】
９．架橋分子が、架橋分子の持続長未満の端部から端部までの長さを含む、例１〜８のいずれかに記載のセンサー。
【０１１７】
１０．前記架橋分子が、前記センサーギャップ寸法に近似するように構成された端部から端部までの長さを含む、例１〜９のいずれかに記載のセンサー。
【０１１８】
１１．前記バイオポリマー架橋分子が、核酸二重鎖を含む、例１〜１０のいずれかに記載のセンサー。
【０１１９】
１２．前記核酸二重鎖が、ＤＮＡ二重鎖、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖、ＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッド二重鎖、ＰＮＡ−ＰＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＬＮＡハイブリッド二重鎖の１つを含む、例１１に記載のセンサー。
【０１２０】
１３．核酸二重鎖が、チオールで改変されたオリゴを含む、例１１に記載のセンサー。
【０１２１】
１４．第１の自己組織化アンカーおよび第２の自己組織化アンカーの１つが、５’−チオール改変ヌクレオチドを含む、例６〜１３のいずれかに記載のセンサー。
【０１２２】
１５．前記核酸二重鎖が、内部のビオチンで改変されたヌクレオチドをさらに含む、例１１に記載のセンサー。
【０１２３】
１６．架橋分子が、ペプチド配列を含み、第１の自己組織化アンカーおよび第２の自己組織化アンカーの１つは、Ｌ−システイン残基を含む、例１〜１５のいずれかに記載のセンサー。
【０１２４】
１７．前記架橋分子が、前記架橋分子を含む流動性の媒体が前記第１の接触部および前記第２の接触部の１つと接触したときに自己組織化して、架橋分子のコンフォメーションを生じるように構成されている、例１から１６のいずれか一項に記載のセンサー。
【０１２５】
１８．プローブをさらに含み、前記プローブは、前記架橋分子に付着している、例１から１７のいずれか一項に記載のセンサー。
【０１２６】
１９．架橋分子に付着したリンカーをさらに含む、例１〜１８のいずれか１つに記載のセンサー。
【０１２７】
２０．プローブが、単一の標的分子と連結されるように構成されている、例１８〜１９のいずれか１つに記載のセンサー。
【０１２８】
２１．分子架橋および／またはプローブが、酵素を含む、例１〜２０のいずれかに記載のセンサー。
【０１２９】
２２．酵素が、ポリメラーゼおよび逆転写酵素の１つである、例２１に記載のセンサー。
【０１３０】
２３．前記標的分子が、複数の標的分子の特徴を含み、第１の標的分子の特徴は第１の位置にあり、第２の標的分子の特徴は第２の位置にあり、第ｎの標的分子の特徴は第ｎの位置にあることを含め、各標的分子の特徴は別個の位置を有する、例２０〜２２のいずれかに記載のセンサー。
【０１３１】
２４．前記プローブが、複数の異なる標的分子を含む溶液中での反応の間に前記標的分子と連結されるように構成された酵素であり、前記反応は期間ｔを含み、前記標的分子を接触させることにより、前記複数の標的分子の特徴に応答して前記酵素における複数のコンフォメーション変化が生じ、複数の配置変化のそれぞれが、シグナルの特徴が生成されるように前記センサー中の電流を変調する、例１８に記載のセンサー。
【０１３２】
２５．例１〜２４のいずれかに記載のセンサーを含むシステム。
【０１３３】
２６．センサーにカップリングされ、シグナルの特徴を検出するように構成された、シグナル処理システムをさらに含む、請求項２５に記載のシステム。
【０１３４】
２７．センサーが、期間ｔにわたり検出された複数のシグナルの特徴を含むシグナルトレースを生成するように構成されている、例２５〜２６のいずれかに記載のシステムまたは例１〜２４のいずれかに記載のセンサー。
【０１３５】
２８．シグナル解釈デバイスをさらに含む、例２５〜２７のいずれかに記載のシステム。
【０１３６】
２９．シグナル解釈デバイスが、シグナル解釈マップを含む、例２８に記載のシステム。
【０１３７】
３０．シグナル解釈マップが、公知の標的配列からのシグナルトレースに対して較正される、例２８〜２９のいずれかに記載のシステム。
【０１３８】
３１．シグナル解釈デバイスが、標的配列によって生成されたシグナルトレースに応答してシグナル解釈を戻すように構成されている、例２８〜３０のいずれかに記載のシステム。
【０１３９】
３２．シグナル解釈が、シグナルトレース解釈が可能性のある実際の配列と一致する見込みの確率論的な評価を含む、例２８〜３１のいずれかに記載のシステム。
【０１４０】
３３．例１から２４、２７のいずれかに記載のセンサーを提供するステップ；
核酸鋳型をポリメラーゼと接触させるステップであって、前記ポリメラーゼは、センサーの一部を含む架橋分子にカップリングされている、ステップ；
任意選択で、前記センサーに電位を印加するステップ；
ヌクレオチド塩基ミックスを提供するステップ；
前記ポリメラーゼによって、前記ヌクレオチド塩基ミックスからのヌクレオチドを合成された核酸に取り込むことを含む取り込み事象を実行するステップ；および
前記取り込み事象によって生成されたシグナルを検出するステップ
を含む方法。
【０１４１】
３４．期間ｔで実行される一連の取り込み事象をさらに含み、前記一連の取り込み事象は、シグナルの特徴の配列を含むシグナルトレースを生成する、例３３に記載の方法。
【０１４２】
３５．各シグナルの特徴が、一連の取り込み事象の１つに対応する、例３４に記載の方法。
【０１４３】
３６．シグナルトレースが、ノイズをさらに含み、方法が、シグナルトレースからノイズを除去することをさらに含む、例３４〜３５のいずれかに記載の方法。
【０１４４】
３７．各取り込み事象が、鋳型塩基依存性のポリメラーゼの動態シグネチャーを生成する、例３４〜３６のいずれかに記載の方法。
【０１４５】
３８．ポリメラーゼの動態シグネチャーが、シグナルの特徴に寄与する、例３４〜３７のいずれかに記載の方法。
【０１４６】
３９．改変されていない鋳型ヌクレオチドに応答して生成された第１のシグナルの特徴と、改変された鋳型ヌクレオチドに応答して生成された第２のシグナルの特徴とを区別するのに好適な、例３３〜３８のいずれかに記載の方法。
【０１４７】
４０．改変された鋳型ヌクレオチドが、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ４−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−ホルミルシトシン、および５−カルボキシルシトシンの１つである、例３９に記載の方法。
【０１４８】
４１．改変された鋳型ヌクレオチドが、脱塩基部位である、例３９に記載の方法。
【０１４９】
４２．生体分子感知デバイスを製造する方法であって、
基板表面上に第１の電極および第２の電極を形成するステップであって、前記第１の電極および前記第２の電極は、電極ギャップによって分離されている、ステップ；
前記第１の電極上に第１の接触部および前記第２の電極上に第２の接触部を設置するステップであって、前記第１の接触部および前記第２の接触部は、接触部ギャップによって分離されている、ステップ；ならびに
前記第１の接触部および前記第２の接触部に架橋分子を付着させるステップ
を含む方法。
【０１５０】
４３．架橋分子をプローブと接触させて、プローブを架橋分子にカップリングするステップをさらに含み、プローブは、自己組織化によって架橋分子にカップリングされている、例４２に記載の方法。
【０１５１】
４４．前記第１の接触部および前記第２の接触部に前記架橋分子を付着させるステップが、自己組織化ステップを含む、例４２〜４３のいずれかに記載の方法。
【０１５２】
４５．前記電極ギャップおよび／または前記接触部ギャップが、約５ｎｍから約３０ｎｍの間である、例４２〜４４のいずれかに記載の方法。
【０１５３】
４６．第１の接触部および／または第２の接触部が、約５ｎｍの直径を有する金ナノ粒子を含む、例４２〜４５のいずれかに記載の方法。
【０１５４】
４７．第１の接触部の位置および／または第２の接触部の位置が、リソグラフィー方法を使用して決定される、例４２〜４６のいずれかに記載の方法。
【０１５５】
４８．第１の電極および第２の電極を含む基板表面上にフォトレジスト層を設置するステップ、およびリソグラフィー方法を使用して第１の接触部の位置および第２の接触部の位置を画定するステップをさらに含む、例４２〜４７のいずれかに記載の方法。
【０１５６】
４９．第１の接触部の位置および第２の接触部の位置における基板表面への表面誘導体化処理を適用するステップをさらに含む、例４２〜４８のいずれかに記載の方法。
【０１５７】
５０．表面誘導体化処理が、シラン化を含む、例４９に記載の方法。
【０１５８】
５１．金の層を堆積させるステップ、およびリフトオフステップを実行して、第１の電極上に配置された第１の金接触部および／または第２の電極上に配置された第２の金接触部を残すステップをさらに含む、例４２〜５０のいずれかに記載の方法。
【０１５９】
５２．デバイスを複数の金ナノ粒子を含む溶液と接触させるステップ、ならびに第１の接触部の位置に第１の金ナノ粒子および／または第２の接触部の位置に第２の金粒子を導入するステップをさらに含む、例４２〜５１のいずれかに記載の方法。
【０１６０】
５３．架橋分子をプローブ／前記プローブと接触させる前に、架橋分子を自己組織化によって第１の接触部および第２の接触部に付着させる、例４２〜５２のいずれかに記載の方法。
【０１６１】
５４．架橋分子を自己組織化によって第１の接触部および第２の接触部に付着させる前に、架橋分子をプローブと接触させて、自己組織化によってセンサー複合体を生成する、例４２〜５３のいずれかに記載の方法。
【０１６２】
５５．前記第１の電極および前記第２の電極に電子的にカップリングされた集積回路を製作するステップをさらに含む、例５２〜５４のいずれかに記載の方法。
【０１６３】
５６．集積回路、第１の電極、および第２の電極が、混成のシグナル集積回路を含む、例５５に記載の方法。
【０１６４】
５７．前記集積回路、前記第１の電極、および前記第２の電極が、ＣＭＯＳ製作方法を使用して製作される、例５６に記載の方法。
【０１６５】
５８．前記第１および第２の接触部が、ＣＭＯＳ製作方法を使用して製作される、例４２〜５７のいずれかに記載の方法。
【０１６６】
５９．集積回路、第１の電極、および第２の電極が、電界効果トランジスタを生産するのに好適な製作方法を使用して製作される、例５５〜５８のいずれかに記載の方法。
【０１６７】
本明細書において、利益、他の利点、および問題に対する解決法を具体的な実施形態に関して説明した。さらに、本明細書に含有される様々な図面に示された接続ラインは、様々なエレメント間の例示的な機能的関係および／または物理的なカップリングを表すことが意図される。多くの代替物または追加の機能的関係または物理的な接続が、実用的なシステムに存在する場合があることに注目すべきである。しかしながら、利益、利点、問題に対する解決法、およびあらゆる利益、利点、もしくは解決法をもたらし得るまたはそれらをより顕著にし得るあらゆるエレメントが、重要な、必要な、または必須の本発明の特徴またはエレメントとして解釈されないものとする。したがって本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものとし、それにおける単数形のエレメントの言及は、明示的にそのように述べられていない限り「唯一の」を意味することは意図されず、「１つまたは複数の」を意味することが意図される。さらに、特許請求の範囲で「Ａ、Ｂ、またはＣの少なくとも１つ」に類似した成句が使用される場合、その成句が、ある実施形態でＡ単独が存在し得ること、ある実施形態でＢ単独が存在し得ること、ある実施形態でＣ単独が存在し得ることを意味するか、または単一の実施形態でエレメントＡ、ＢおよびＣのあらゆる組合せ、例えば、ＡおよびＢ、ＡおよびＣ、ＢおよびＣ、もしくはＡおよびＢおよびＣが存在し得ることを意味すると解釈されることが意図される。図面にわたり、異なる斜交平行線の陰影が異なる部品を意味するのに使用されているが、必ずしも同一または異なる材料を意味するわけではない。
【０１６８】
システム、方法および装置が本明細書で提供される。本明細書の詳細な説明において、「一実施形態」、「ある実施形態」、「例示的な実施形態」などへの言及は、記載される実施形態が、特定の特徴、構造、または特徴を含み得るが、全ての実施形態が、必ずしも特定の特徴、構造、または特徴を含むとは限らないことを示す。さらに、このような成句は、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らない。さらに、ある実施形態に関連して特定の特徴、構造、または特徴が記載される場合、明示的に記載されているかどうかにかかわらず、他の実施形態に関連するこのような特徴、構造、または特徴に影響を与えることは、当業者の知見の範囲内であることが提起される。本明細書に記載される様々な実施例および実施形態は、核酸標的に関するシグナルの検出方法を指すが、本開示のデバイスおよび方法は、核酸の検出およびシーケンシングを含む適用に決して限定されない。同様に、本明細書に記載される様々な実施例および実施形態は、バイオポリマー架橋分子を含むセンサーを指すが、化学的に合成された架橋分子は、本開示の範囲内である。この記載を読めば、関連分野の当業者には、代替の実施形態においてどのように本開示を実施するか明らかである。
【０１６９】
さらに、本開示におけるエレメント、成分、または方法のステップは、エレメント、成分、または方法のステップが明示的に特許請求の範囲に列挙されているかどうかに関係なく、一般に提供されることは意図されない。本明細書の特許請求されるエレメントはいずれも、そのエレメントが成句「〜するための手段」を使用して明確に列挙されない限り、合衆国法典第３５巻第１１２条（ｆ）の規定に基づき解釈されないものとする。本明細書で使用される場合、用語「含む」、「含むこと」、またはそれらの他のあらゆる変化形は、エレメントの列挙を含むプロセス、方法、物品、または装置が、そのようなエレメントだけを含むのではなく、明確に列挙されていない、またはこのようなプロセス、方法、物品、もしくは装置に固有の他のエレメントを含み得るように、非排他的な包含を網羅することが意図される。
【図１】
2018522236.tif 000003
【図２Ａ】
2018522236.tif 000004
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
2018522236.tif 000009
【図６Ｂ】
2018522236.tif 000010
【図７】
2018522236.tif 000011
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2018522236.tif 000014
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
2018522236.tif 000016
【図１１Ｃ】
2018522236.tif 000017
【図１２】
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【図１３】
2018522236.tif 000019
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年3月15日(2018.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018522236000001.app
【国際調査報告】
2018522236.tif 000028
2018522236.tif 000029