(57)【要約】  本発明は、細胞亜集団の増幅のための方法を記載している。細胞亜集団は、細胞亜集団の成長および濃縮を促進するための特定の培養条件において成長させることができる。この方法は、バイオマーカーを決定するために、およびがん患者の処置をガイドするために用いることができる。【選択図】図１９
2018511338.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）閉鎖環境チャンバー；および
ｂ）コントロールユニット
を含む細胞培養インキュベーターであって、
前記コントロールユニットは閉鎖環境チャンバーと動作可能に連結されており、前記コントロールユニットはその中にエンコードされたコンピュータ実行可能コードを持つコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラムプロダクトを含み、前記コンピュータ実行可能コードは：
（ｉ）閉鎖環境チャンバーの酸素レベルを制御するようにエンコードされ、閉鎖環境チャンバー中の酸素の除去をコントロールして閉鎖環境チャンバー内に低い酸素レベルを生成するようにエンコードされた酸素レベルモジュール；
（ｉｉ）閉鎖環境チャンバーの圧力を制御するようにエンコードされ、閉鎖環境チャンバー中に陽圧条件を生成するようにガスの追加をコントロールする圧力モジュール；
（ｉｉｉ）閉鎖環境チャンバーの温度を制御するようにエンコードされた温度モジュール；および
（ｉｖ）閉鎖環境チャンバーの湿度を制御するようにエンコードされた湿度モジュール
をエンコードするのに適合しており、
前記酸素レベル、圧力、温度および湿度の各々は細胞のインビボ微小環境を模倣しており、指示された酸素レベル、圧力、温度および湿度の各々の入力を受けて約２０分以内に指示された酸素レベル、圧力、温度および湿度の各々に達する、前記細胞培養インキュベーター。
【請求項２】
インビボ微小環境が腫瘍微小環境である、請求項１の細胞培養インキュベーター。
【請求項３】
細胞が幹細胞である、請求項１の細胞培養インキュベーター。
【請求項４】
細胞ががん細胞である、請求項１の細胞培養インキュベーター。
【請求項５】
細胞が循環腫瘍細胞である、請求項１の細胞培養インキュベーター。
【請求項６】
細胞が免疫細胞である、請求項１の細胞培養インキュベーター。
【請求項７】
細胞が生物学的試料から得られる、請求項１の細胞培養インキュベーター。
【請求項８】
生物学的試料が血液である、請求項７の細胞培養インキュベーター。
【請求項９】
生物学的試料が腫瘍である、請求項７の細胞培養インキュベーター。
【請求項１０】
生物学的試料が唾液である、請求項７の細胞培養インキュベーター。
【請求項１１】
生物学的試料が組織である、請求項７の細胞培養インキュベーター。
【請求項１２】
コントロールユニットがユーザによりコントロールされる、請求項１の細胞培養インキュベーター。
【請求項１３】
コントロールユニットが自動化されている、請求項１の細胞培養インキュベーター。
【請求項１４】
酸素モジュールが閉鎖環境チャンバー中で低い酸素レベルを維持するようにエンコードされている、請求項１の細胞培養インキュベーター。
【請求項１５】
圧力モジュールが環境チャンバー中で陽圧条件を維持するようにエンコードされている、請求項１の細胞培養インキュベーター。
【請求項１６】
酸素レベルモジュールが閉鎖環境チャンバー中の酸素レベルを約０．１％から約２１％で維持するようにエンコードされている、請求項１の細胞培養インキュベーター。
【請求項１７】
酸素レベルモジュールが閉鎖環境チャンバー中の酸素レベルを約２％で維持するようにエンコードされている、請求項１の細胞培養インキュベーター。
【請求項１８】
酸素レベルモジュールが閉鎖環境チャンバー中の酸素レベルを約０．１％で維持するようにエンコードされている、請求項１の細胞培養インキュベーター。
【請求項１９】
圧力モジュールが閉鎖環境チャンバー中の圧力を約１ＰＳＩＧから約５ＰＳＩＧで維持するようにエンコードされている、請求項１の細胞培養インキュベーター。
【請求項２０】
湿度モジュールが湿度を約８５％で維持するようにエンコードされている、請求項１の細胞培養インキュベーター。
【請求項２１】
コントロールユニットがその中にエンコードされたコンピュータ実行可能コードを持つコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラムプロダクトをさらに含み、前記コンピュータ実行可能コードは二酸化炭素モジュールをエンコードするのに適合しており、前記二酸化炭素モジュールは閉鎖環境チャンバーの二酸化炭素レベルを制御するようにエンコードされている、請求項１の細胞培養インキュベーター。
【請求項２２】
酸素レベルモジュールによりコントロールされるガス入口をさらに含む、請求項１の細胞培養インキュベーター。
【請求項２３】
圧力モジュールによりコントロールされるガス入口をさらに含む、請求項１の細胞培養インキュベーター。
【請求項２４】
湿度モジュールによりコントロールされる水分湿度トレイをさらに含む、請求項１の細胞培養インキュベーター。
【請求項２５】
温度モジュールによりコントロールされる加熱エレメントをさらに含む、請求項１の細胞培養インキュベーター。
【請求項２６】
細胞培養インキュベーターが細胞培養プレートを受け入れるように構成される、請求項１の細胞培養インキュベーター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１５年４月１７日に出願された米国仮出願第６２／１４９，２６８号の利益を主張するものであり、この文献は参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
細胞濃縮システムは、異なる細胞集団を濃縮して分離するために用いることができる。この細胞としては、例えばがん細胞、循環腫瘍細胞、幹細胞または免疫細胞が挙げられる。細胞濃縮システムを通じて誘起される異なる細胞タイプの分離および特性評価は、腫瘍の病因、転移の生物学、幹細胞分化、免疫細胞の増殖を理解するために、および腫瘍進行のバイオマーカーを提供するために用いることができる。
【０００３】
参照による組み込み
本出願において引用される各特許、刊行物および非特許文献は、各々が参照により個別に組み込まれたかのように、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
いくつかの実施形態において、本発明は、ａ）閉鎖環境チャンバー；およびｂ）コントロールユニットを含む細胞培養インキュベーターであって、前記コントロールユニットは閉鎖環境チャンバーと動作可能に連結されており、前記コントロールユニットはその中にエンコードされたコンピュータ実行可能コードを持つコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラムプロダクトを含み、前記コンピュータ実行可能コードは：（ｉ）閉鎖環境チャンバーの酸素レベルを制御するようにエンコードされ、閉鎖環境チャンバー中の酸素の除去をコントロールして閉鎖環境チャンバー内に低い酸素レベルを生成するようにエンコードされた酸素レベルモジュール；（ｉｉ）閉鎖環境チャンバーの圧力を制御するようにエンコードされ、閉鎖環境チャンバー中に陽圧条件を生成するようにガスの追加をコントロールする圧力モジュール；（ｉｉｉ）閉鎖環境チャンバーの温度を制御するようにエンコードされた温度モジュール；および（ｉｖ）閉鎖環境チャンバーの湿度を制御するようにエンコードされた湿度モジュールをエンコードするのに適合しており、前記酸素レベル、圧力、温度および湿度の各々は細胞のインビボ微小環境を模倣しており、指示された酸素レベル、圧力、温度および湿度の各々の入力を受けて約２０分以内に指示された酸素レベル、圧力、温度および湿度の各々に達する、前記細胞培養インキュベーターを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、代表的なＣＴＣクラスターの免疫蛍光画像である。
【図２】図２は、標的細胞亜集団の濃縮のための例示的なワークフローである。
【図３】図３は、本発明の方法を用いた標的細胞亜集団の濃縮および増幅を表現する。
【図４】図４は、本発明の方法と共に用いられることになる例示的なコンピュータシステムである。
【図５】図５は、前立腺がん細胞からのＣＴＣにおけるバイオマーカー評価の結果を表現する。
【図６】図６は、前立腺がん細胞についてのバイオマーカー決定の結果を示す。
【図７】図７は、神経増殖因子シグナル伝達経路についてのｍＲＮＡシーケンシング解析の結果を表示する。
【図８】図８は、Ａｕｒｏｒａ  Ａシグナル伝達経路についてのｍＲＮＡシーケンシング解析の結果を表示する。
【図９】図９は、Ｋｉｔ受容体シグナル伝達経路についてのｍＲＮＡシーケンシング解析の結果を表示する。
【図１０】図１０は、ＰＤＡＣ  ＣＴＣにおけるＥＰＣＡＭ発現についての免疫蛍光画像である。
【図１１】図１１は、ＰＤＡＣにおけるＮＡＮＯＧシグナル伝達経路発現の結果をｍＣＲＰＣ  ＣＴＣと対比して表現する。
【図１２】図１２は、ＰＤＡＣにおけるＷｎｔシグナル伝達経路発現の結果をｍＣＲＰＣ  ＣＴＣと対比して表現する。
【図１３】図１３は、ＣＴＣについてのＳＮＰおよびＩＮＤＥＬ解析の結果を表示する。
【図１４】図１４は、ＣＴＣについてのＳＮＰおよびＩＮＤＥＬ解析の結果を表示する。
【図１５】図１５は、本発明のシステムのための例示的なユーザインタフェースを表現する。
【図１６】図１６は、本発明のシステムのための例示的なユーザインタフェースを表現する。
【図１７】図１７は、本発明のシステムのための例示的なユーザインタフェースを表現する。
【図１８】図１８は、本発明のシステムのための例示的なユーザインタフェースを表現する。
【図１９】図１９は、本発明の例示的な細胞培養インキュベーターを表示する。
【図２０】図２０は、本発明の細胞培養インキュベーターのドア構成を表示する。
【図２１】図２１は、本発明の細胞培養インキュベーターのドア構成を表示する。
【図２２】図２２は、本発明の細胞培養インキュベーターのドアヒーターを表現する。
【図２３】図２３は、緑色蛍光タンパク質を用いた細胞トランスフェクション効率の増加を表現する。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明の方法
本発明の方法は、生物学的試料からＣＴＣおよび他の標的細胞亜集団を分離するために用いることができる。本発明の方法は、例えば細胞集団を分離するために、細胞集団を選択的に分けるために、細胞を分化または未分化状態で維持するために、細胞を強制的に分化させるために、細胞集団を濃縮するために、（増殖または選択的濃縮を通じて）細胞集団を拡大するために、細胞集団の機能を調節するために、細胞集団の形態を調節するために、エピジェネティック特性を調節するために、ならびに遺伝子およびタンパク質の発現プロファイルを調節するために用いることができる。本発明の方法は、例えば初代細胞、細胞株または微生物群集において用いることができる。
【０００７】
標的細胞亜集団としては、例えばＣＴＣ、がん幹細胞（ＣＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、前がん細胞、幹細胞、胎児幹細胞、未分化幹細胞、胎児細胞、骨髄細胞、前駆細胞、泡沫細胞、間葉系細胞、上皮細胞、上皮前駆細胞、内皮細胞、子宮内膜細胞、栄養芽細胞、がん細胞、赤血球細胞、白血球細胞、免疫系細胞、結合組織細胞、肝細胞、ニューロン、誘導多能性幹（ＩＰＳ）細胞またはそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。
【０００８】
本発明の方法は、例えば神経細胞を培養で維持するために、肝細胞を培養で維持するためにおよび毒性スクリーニングのために用いることができる。本発明は、ＩＰＳ細胞および幹細胞を、例えば中胚葉、外胚葉および内胚葉の細胞に分化させるために用いることができる。本発明の方法は、細胞をニューロン、心筋細胞、肝細胞、造血幹細胞、骨芽細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、星状細胞、脂肪細胞、免疫細胞、マスト細胞、赤血球、卵母細胞または精母細胞に分化させるために用いることができる。
【０００９】
ＣＴＣは、インビボでがん細胞および免疫細胞のヘテロなクラスターから構成されることができ、インビトロで免疫調節細胞および幹細胞のシグナル伝達経路の差次的発現を表すことができる。
【００１０】
図１は、精巣摘除抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）を有する対象からの循環腫瘍細胞クラスターについての免疫蛍光（ＩＦ）を表示する。ＩＦ画像は、ＣＴＣががん細胞および免疫細胞の両方を含有することができることを実証している。ＤＡＰＩ染色（卵形の細胞染色により指し示される）は、細胞の核を指し示す。白血球細胞（ＷＢＣ）抗体カクテルは、ＣＴＣクラスター中で例えばＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４５およびＣＤ５６を検出するために用いることができる（図１中の白色矢印）。サイトケラチン抗体カクテルは、ＣＴＣクラスター中で例えばＣＫ４、ＣＫ５、ＣＫ６、ＣＫ８、ＣＫ１０、ＣＫ１３およびＣＫ１８を検出するために用いることができる（図１中の卵形の核の中および周囲に見られる細線維状染色）。明るい白色の染色および卵形の核周囲の細線維状染色は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）および前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）タンパク質を指し示す。レジェンドの中の数字は、染料の励起のために用いられる波長（ｎｍ）を指し示す。
【００１１】
図２は、ヘテロな細胞集団から濃縮された細胞集団を得るために用いることができる例示的なワークフローを表現する。本発明の方法において用いられる細胞の供給源としては、例えば新鮮血、白血球細胞（ＷＢＣ）、遠心分離した血液の淡黄色の層、凍結保存された腫瘍および生検、白血球アフェレーシスのための試料、微細針吸引液、新鮮生検、尿または排泄物を挙げることができる。対象から試料を得た後、例えば血液試料を血漿、白血球細胞および血小板ならびに赤血球細胞へと分けるため、試料を細胞分離キットにおける使用のために調製することができる。ＣＴＣは、遠心分離した血液の白血球細胞および血小板の画分において見出すことができる。細胞分離ステップは、約３０分の長さであることができる。ヘテロな細胞集団を分離した後、細胞を生存ＣＴＣコロニーの増幅および濃縮のための集積培地（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｍｅｄｉｕｍ）に加えることができる。基材への細胞の接着は、数時間から数日かかることがある。細胞培養の際の増殖は、接着後約１から３日以内に観察することができ、その後に目的マーカーについて細胞コロニーに対する次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を実施することができる。次世代シーケンシング法としては、例えば全ゲノムシーケンシング、全ゲノムリシーケンシング、全エクソームシーケンシング、全トランスクリプトームｍＲＮＡシーケンシング、チップ−シーケンシングおよびバイオインフォマティクスを挙げることができる。
【００１２】
図３は、対象から回収されたヘテロな細胞集団の接着および増幅を表現する。最初に、細胞をプレートに加えることができ、このプレートは例えば増殖因子をしみ込ませたハイドロゲルなどの物質でコーティングすることができる。約３０分後、細胞はプレートに接着する。その後２時間をかけて、細胞はプレートに拡がり、増殖培地を交換し、これによりあらゆる残った白血球細胞（ＷＢＣ）の除去が可能になる。培地を合成培養培地で置き換えて、ＣＴＣコロニーの成長を促進させる。細胞を、生存ＣＴＣを得るために酸素または圧力レベルの変化を介して、例えば腫瘍微小環境を模倣するように調節することができる環境で成長させることができる。いくつかの実施形態において、細胞を低酸素条件で成長させる。
【００１３】
本発明は、試料から標的細胞亜集団を捕捉するために基材を用いることができる。ヘテロな細胞集団を、例えば標的細胞集団の成長および濃縮を促進することができる基材でコーティングした培養ディッシュに加えることができる。標的細胞亜集団は、他の細胞、例えば白血球細胞よりも高いアフィニティーで基材に接着することができる。基材に接着しない細胞は、培地で洗い流すことも、または培養中で維持することもできる。一度接着したら、細胞は基材上に拡がって分裂を開始することができる。
【００１４】
基材は、例えば１、２、３、４または５つの層を含むことができる。２つの基材の層間の距離は、約０．００１から約２０ｍｍまで、約１から約１０ｍｍまでまたは約１から約５ｍｍまでで変わり得て、各層は約０．００１、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１２、約１５、約１７または約２０ｍｍであることができる。
【００１５】
細胞は、例えばプラスチック、ガラス、ゼラチン、ポリアクリルアミドまたはそれらの任意の組み合わせから作られる材料上に播種することができる。細胞を播種するために用いられるディッシュは、例えば顕微鏡スライド、培養プレート、培養ディッシュ、ペトリディッシュ、顕微鏡カバーグラス、閉鎖環境チャンバー、密封培養ディッシュまたはマルチウェル培養ディッシュであることができる。
【００１６】
基材の結合表層は、捕捉した細胞と接触する基材の部分であることができる。いくつかの例において、結合表層は基層に隣接した唯一の層であるか、または１もしくは複数の中間層により基層と隔てられる。
【００１７】
基材の結合表層は、例えば細胞単層、細胞溶解液、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を伴う生物学的材料、ゼラチンまたはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【００１８】
ＥＣＭを伴う生物学的材料としては、例えばＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、レチクリン、ビメンチン、吸湿性分子、グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓｅ）、プロテオグリカン、ロテオグリカン（ｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）、多糖外被、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジンまたはポリ−Ｌ−オルニチンを挙げることができる。ゼラチンは、動物性供給源からのものであることができ、例えばゼラチンはブタまたはウシ由来であることができる。
【００１９】
基材中で用いられる細胞単層は、例えば哺乳動物細胞、内皮細胞、血管細胞、静脈細胞、毛細血管細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＬＭＶＥＣ）、ヒトケラチノサイト、ヒト間葉系幹細胞、ヒト骨髄間質細胞およびヒトアストログリア細胞であることができる。細胞株は、一次供給源から得ることも、または不死化細胞株から得ることもできる。細胞単層は、細胞老化を引き起こすために紫外光またはＸ線源により照射することができる。単層はまた、１または複数の異なる細胞タイプの混合物を含有することもできる。異なる細胞タイプは、一緒に共培養され得る。共培養の１つの非限定的な例は、遺伝子導入マウス胎仔線維芽細胞と共培養される初代ヒト内皮細胞の組み合わせであり、これらは混合されて単層を形成する。
【００２０】
基材の結合表層は、例えば細胞内成分の混合物を含有することができる。細胞内成分の混合物を得るために用いることができる１つの方法は、細胞の溶解ならびにサイトゾルおよび細胞骨格の成分の回収である。溶解される細胞は、初代であっても不死化されたものであってもよい。溶解される細胞は、単独培養または共培養のいずれに由来するものであることもできる。
【００２１】
基材の結合表層は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を伴う生物学的材料または例えばヒアルロン酸ハイドロゲルなどの結合部分を含有することができる。例えば、ゼラチンは、基材に結合表層を作るために細胞、結合部分、ＥＣＭを伴う生物学的材料またはそれらの任意の組み合わせと直接混合することができる。例えば、結合表層は、コラーゲンと混合されたゼラチンを含むことができる。
【００２２】
基材は、１または複数の中間層を持つことができる。基材の中間層は、１または複数の細胞単層であることができる。単層細胞は、様々な起源のものであることができる。例えば、基材の中間層は、基層上にマウス胎仔線維芽細胞のコンフルエントな単層を成長させ、次いでコンフルエントなマウス胎仔線維芽細胞の上部に細胞の別の層、例えば結合表層を成長させることにより作ることができる。
【００２３】
標的細胞亜集団の成長および濃縮のために基材中でフィーダー層を用いることができる。フィーダー層は、基層に隣接して位置することができ、基材の結合表層と隔てることができる。フィーダー層は、フィーダー細胞の単層であることができる。単層細胞は、様々な起源のものであることができる。例えば、フィーダー層は、基層上にヒト内皮細胞またはマウス胎仔線維芽細胞の単層を成長させることにより作ることができる。
【００２４】
基材の層の接合は、基層または中間層の上部に細胞を単層で成長させることにより行うことができる。層の接合はまた、表面を、正味の正電荷、正味の負電荷または正味の中性電荷のいずれかを持つ表面で前処理することにより行うこともできる。化学的部分、リンカー、タンパク質断片、ヌクレオチド断片またはそれらの任意の組み合わせにより、接合手法を補助することができる。
【００２５】
基材の構成および組成は、特定の標的細胞亜集団の濃縮のために適応させることができる。基材の組成は、例えば患者のタイプ、がん種、がんのステージ、患者の病歴ならびに患者腫瘍のゲノムおよびプロテオーム解析に基いて変わることができる。
【００２６】
細胞を成長させるために用いられる集積培地は、細胞培養物から回収された培養培地、血漿またはそれらの任意の組み合わせを補うことまたはこれらを使用して作ることができる。集積培地は、例えばＰｌａｔｉｎｇ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｔｙｐｅ  Ｒ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｔｙｐｅ  ＤＦ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｔｙｐｅ  Ｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＭｅｄｉｕｍおよびＭＥＦ−Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍまたはそれらの任意の組み合わせであることができる。集積培地は、例えば一次栄養源、動物血清、イオン、元素、カルシウム、グルタミン酸塩、マグネシウム、亜鉛、鉄、カリウム、ナトリウム、アミノ酸、ビタミン、グルコース、増殖因子、ホルモン、組織抽出物、タンパク質、低分子またはそれらの任意の組み合わせを含有することができる。
【００２７】
集積培地中で用いることができるアミノ酸の非限定的な例としては、必須アミノ酸、フェニルアラニン、バリン、スレオニン、トリプトファン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、リジンおよびヒスチジン、アルギニン、システイン、グリシン、グルタミン、プロリン、セリン、チロシン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００２８】
集積培地中で用いることができる増殖因子の非限定的な例としては、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、テストステロン、エストロゲン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、エイコサノイド、メラトニン、チロキシン、バソプレッシン、オキシトシンまたはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００２９】
ホルモンの非限定的な例としては、ペプチドホルモン、インスリン、ステロイドホルモン、ヒドロコルチゾン、プロゲステロン、テストステロン、エストロゲン、ジヒドロテストステロンまたはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００３０】
組織抽出物の非限定的な例としては、脳下垂体抽出物が挙げられる。低分子添加物の非限定的な例としては、ピルビン酸ナトリウム、エンドセリン−１、トランスフェリン、コレステロールまたはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００３１】
集積培地中で用いることができる他の成分の非限定的な例としては、ピペコリン酸、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、グルタチオン、ヒトアルファ−フェトプロテイン、ウシアルファ−フェトプロテイン、ヒトホロ−トランスフェリンまたはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００３２】
集積培地中で用いることができる塩の非限定的な例としては、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、クエン酸塩、リン酸カリウム、リン酸ナトリウムまたはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００３３】
いくつかの実施形態において、集積培地は、ピペコリン酸、ＧＡＢＡ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦβ−１、ヒトインスリン、ヒトホロ−トランスフェリン、ヒト血清アルブミンおよび還元グルタチオンを含有する。
【００３４】
集積培地中で用いることができるアミノ酸、増殖因子、ホルモン、組織抽出物、塩または任意の他の成分は、例えば、約０．００１ｎＭ、約０．００５ｎＭ、約０．０１ｎＭ、約０．０１５ｎＭ、約０．０２ｎＭ、約０．２５ｎＭ、約０．０３ｎＭ、約０．０３５ｎＭ、約０．０４ｎＭ、約０．０４５ｎＭ、約０．０５ｎＭ、約０．０５５ｎＭ、約０．０６ｎＭ、約０．０６５ｎＭ、約０．０７ｎＭ、約０．０７５ｎＭ、約０．０８ｎＭ、約０．０８５ｎＭ、約０．０９ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．０１５ｎＭ、約０．２ｎＭ、約０．２５ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．３５ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．４５ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．５５ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．６５ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．７５ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．８５ｎＭ、約０．９ｎＭ、約０．９５ｎＭ、約０．００１μＭ、約０．００５μＭ、約０．０１μＭ、約０．０１５μＭ、約０．０２μＭ、約０．０２５μＭ、約０．０３μＭ、約０．０３５μＭ、約０．０４μＭ、約０．０４５μＭ、約０．０５μＭ、約０．０５５μＭ、約０．０６μＭ、約０．０６５μＭ、約０．０７μＭ、約０．０７５μＭ、約０．０８μＭ、約０．０８５μＭ、約０．０９μＭ、約０．０８５μＭ、約０．０９μＭ、約０．０８５μＭ、約０．０９μＭ、約０．０８５μＭ、約０．０９μＭ、約０．０８５μＭ、約０．０９μＭ、約０．０８５μＭ、約０．０９μＭ、約０．０８５μＭ、約０．０９μＭ、約０．０９５μＭ、約０．１μＭ、約０．１５μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．３５μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．６５μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．８５μＭ、約０．９μＭ、約０．９５μＭ、約０．００１ｍＭ、約０．００５ｎＭ、約０．０１ｍＭ、約０．０１５ｍＭ、約０．０２ｍＭ、約０．０２５ｍＭ、約０．０３ｍＭ、約０．０３５ｍＭ、約０．０４ｍＭ、約０．０４５ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．０５５ｍＭ、約０．０６ｍＭ、約０．０６５ｍＭ、約０．０７ｍＭ、約０．０７５ｍＭ、約０．０８ｍＭ、約０．０８５ｍＭ、約０．０９ｍＭ、約０．０９５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．１５ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．２５ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．３５ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．４５ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．５５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．６５ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．７５ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．８５ｍＭ、約０．９ｍＭ、約０．９５ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｎＭ、約９００ｍＭおよび約１Ｍの濃度であることができる。
【００３５】
本発明の方法における培養条件は、所望の細胞集団の回収を促進するため、特定の微小環境において見出される酸素および圧力レベルをシミュレートするように調整することができる。微小環境は、例えば腫瘍微小環境、骨転移環境、脈管構造環境または脳微小環境であることができる。培養条件の間にまたは細胞インキュベーター中で用いられる酸素レベルは、例えばインキュベーター中で約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％または約２５％の酸素であることができる。いくつかの実施形態において、細胞を低酸素条件下で成長させることができる。
【００３６】
本発明の方法における培養条件は、例えばＣＴＣの回収、腫瘍生検の維持または腫瘍生検の拡大を促進するため、腫瘍微小環境において見出される圧力をシミュレートするように調整することができる。培養条件の間に用いられる圧力は、ＰＳＩゲージ（ＰＳＩＧ）示度で、例えば、約０．５ＰＳＩＧ、約０．６ＰＳＩＧ、約０．７ＰＳＩＧ、約０．８ＰＳＩＧ、約０．９ＰＳＩＧ、約１ＰＳＩＧ、約１．１ＰＳＩＧ、約１．２ＰＳＩＧ、約１．３ＰＳＩＧ、約１．４ＰＳＩＧ、約１．５ＰＳＩＧ、約１．６ＰＳＩＧ、約１．７ＰＳＩＧ、約１．８ＰＳＩＧ、約１．９ＰＳＩＧ、約２ＰＳＩＧ、約２．５ＰＳＩＧ、約３ＰＳＩＧ、約３．５ＰＳＩＧ、約４ＰＳＩＧ、約４．５ＰＳＩＧ、約５ＰＳＩＧ、約６ＰＳＩＧ、約７ＰＳＩＧ、約８ＰＳＩＧ、約９ＰＳＩＧ、約１０ＰＳＩＧ、約１５ＰＳＩＧ、約２０ＰＳＩＧ、約２５ＰＳＩＧ、約３０ＰＳＩＧ、約３５ＰＳＩＧ、約４０ＰＳＩＧ、約４５ＰＳＩＧ、約５０ＰＳＩＧまたは約５５ＰＳＩＧであることができる。
【００３７】
培養条件の間に用いられる圧力は、例えば約３．４５ｋＰａ、約４．１４ｋＰａ、約４．８３ｋＰａ、約５．５２ｋＰａ、約６．２１ｋＰａ、約６．８９ｋＰａ、約７．５８ｋＰａ、約８．２７ｋＰａ、約８．９６ｋＰａ、約９．６５ｋＰａ、約１０．３ｋＰａ、約１１ｋＰａ、約１１．７ｋＰａ、約１２．４ｋＰａ、約１３．１ｋＰａ、約１３．８ｋＰａ、約１７．２ｋＰａ、約２０．７ｋＰａ、約２４．１ｋＰａ、約２７．６ｋＰａ、約３１ｋＰａ、約３４．４ｋＰａ、約４１．４ｋＰａ、約４８．３ｋＰａ、約５５．２ｋＰａ、約６２．１ｋＰａ、約６８．９ｋＰａ、約１０３ｋＰａ、約１３８ｋＰａ、約１７２ｋＰａ、約２０７ｋＰａ、約２４１ｋＰａ、約２７６ｋＰａ、約３１０ｋＰａ、約３４５ｋＰａまたは約３７９ｋＰａであることができる。
【００３８】
本発明の方法において用いられる集積培地のｐＨは、例えば、約２、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．５５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５、約５．５、約６、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０、約１０．５または約１１ｐＨ単位であることができる。
【００３９】
集積培地の粘度は、培養される細胞タイプに応じて、例えば少なくとも０．００１パスカル秒（Ｐａ．ｓ）、少なくとも０．００１Ｐａ．ｓ、少なくとも０．０００９Ｐａ．ｓ、少なくとも０．０００８Ｐａ．ｓ、少なくとも０．０００７Ｐａ．ｓ、少なくとも０．０００６Ｐａ．ｓ、少なくとも０．０００５Ｐａ．ｓ、少なくとも０．０００４Ｐａ．ｓ、少なくとも０．０００３Ｐａ．ｓ、少なくとも０．０００２Ｐａ．ｓ、少なくとも０．０００１Ｐａ．ｓ、少なくとも０．００００５Ｐａ．ｓまたは少なくとも０．００００１Ｐａ．ｓずつ調整することができる。
【００４０】
集積培地の酸素溶解度は、例えば約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％であることができる。
【００４１】
本発明の方法は、細胞および細胞タンパク質の表面への結合を促進するために、細胞接着のための表面を特定の媒体組成物でコーティングすることをさらに含むことができる。表面は、例えば細胞培養プレート、複数のウェルを有する細胞培養プレート、ペトリディッシュ、ガラススライド、カバーガラスまたはガラスディッシュであることができる。細胞接着表面のコーティングのために用いられる媒体としては、例えば、３−（アミノプロピル）トリメトキシシラン、（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン、Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン、（３−グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン、［３−（２−アミノエチルアミノ）プロピル］トリメトキシシラン、トリメトキシ［３−（メチルアミノ）プロピル］シラン、３−アミノプロピル（ジエトキシ）メチルシランまたはグルタルアルデヒドを挙げることができる。
【００４２】
表面コーティングは、細胞結合を容易にするために、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）混合物をさらに含むことができる。混合物としては、例えばコラーゲン、基底膜タンパク質、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ビメンチン、腫瘍由来細胞外マトリックスタンパク質または不活性な自己集合性ペプチド系を挙げることができる。用いられる成分は、動物由来またはヒト由来であることができる。ＥＣＭ混合物は、例えば、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、Ｌ−グリシン、ＤＭＥＭ粉末、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）またはＰＢＳを用いて約４から約１０のｐＨに希釈することができる。ＥＣＭ混合物は、例えばヒト血漿または動物由来血清をさらに補うことができる。動物由来血清は、例えばウシ血清またはウシ胎仔血清であることができる。
【００４３】
細胞は、集積培地中または細胞培養インキュベーター中で約１分間、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間、約１０分間、約１５分間、約２０分間、約２５分間、約３０分間、約４０分間、約５０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約２ヶ月間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約８ヶ月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、約１年間、約１．５年間、約２年間、約２．５年間または約３年間、培養することができる。
【００４４】
特定のタイプのがんにおいて広く認められる遺伝的変異に関する情報を含有するデータベースは、本発明を用いて得られた標的亜集団の遺伝子プロファイルまたはバイオマーカー発現を公知の変異と比較するために用いることができる。比較のために用いることができるデータベースの非限定的な例としては、ＣＯＳＭＩＣ、ｃＢｉｏ  Ｐｏｒｔａｌ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＨＧＭＤ  ＴＭ）、ＧＷＡＳ  ｃｅｎｔｒａｌおよびＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅが挙げられる。
【００４５】
細胞培養インキュベーター
本発明はさらに、細胞培養インキュベーターを提供する。細胞培養インキュベーターは、閉鎖環境チャンバーを含むことができる。細胞培養インキュベーターは、閉鎖環境チャンバーのガス組成、閉鎖環境チャンバーの気圧、閉鎖環境チャンバーの湿度、二酸化炭素レベル、酸素レベルおよび内部環境温度を維持するように設定することができる。細胞培養インキュベーターはコントロールユニットを含みことができ、このコントロールユニットはガス組成、気圧、湿度、二酸化炭素レベル、酸素レベルまたは内部環境温度のうちの少なくとも１つを維持するように設定することができる。コントロールユニットは、閉鎖環境チャンバーと動作可能に連結することができる。コントロールユニットは、ガス組成、気圧、湿度、二酸化炭素レベル、酸素レベルおよび内部環境温度のうちの少なくとも２つを維持するように設定することができる。コントロールユニットは、ガス組成、気圧、湿度、二酸化炭素レベル、酸素レベルおよび内部環境温度を維持するように設定することができる。細胞培養インキュベーターのコントロールユニットは、ユーザがコントロールすることができ、または細胞培養インキュベーター中のセンサに基づいて自動化することができる。コントロールユニットは、時間の関数としての動的なガス組成、気圧、湿度、二酸化炭素レベル、酸素レベルおよび内部環境温度を生み出すように設定することができる。コントロールユニットは、時間の関数としてのいくつかの異なるガス組成、気圧、湿度レベル、二酸化炭素レベル、酸素レベルおよび内部環境温度の間を循環するように設定することができ、これは確率論的または周期的であることができる。
【００４６】
ガス組成、気圧、湿度、二酸化炭素レベル、酸素レベルおよび内部環境温度のうちの少なくとも１つは、非標的初代細胞亜集団と比較した標的初代細胞亜集団の選択的増殖のために設定することができる。標的細胞亜集団の選択的増殖は、例えば、非標的初代細胞亜集団の増殖速度と比較した標的初代細胞亜集団の増殖速度の２倍の増加により証明することができる。ガス組成、気圧、湿度、二酸化炭素レベル、酸素レベルおよび内部環境温度のうちの少なくとも１つは、非標的初代細胞亜集団と比較した標的初代細胞亜集団の選択的接着のために設定することができる。標的初代細胞亜集団の選択的接着は、例えば、非標的初代細胞亜集団の接着と比較した標的初代細胞亜集団の接着の２倍の増加により証明することができる。ガス組成、気圧、湿度、二酸化炭素レベル、酸素レベルおよび内部環境温度のうちの少なくとも１つは、非標的初代細胞亜集団のコロニー形成と比較した標的初代細胞亜集団の選択的コロニー形成を促進するように設定することができる。選択的コロニー形成は、非標的初代細胞亜集団のコロニー形成と比較した標的初代細胞亜集団のコロニー形成の２倍の増加により証明することができる。コロニー形成は、二次元または三次元のコロニー形成であることができる。
【００４７】
細胞培養インキュベートにおけるガス組成は、約０．１から約２１％の間の酸素レベルを含むことができる。いくつかの実施形態において、細胞培養インキュベーターは、約５％未満の閉鎖環境チャンバーの酸素レベルを維持する。いくつかの実施形態において、細胞培養インキュベーターは、約２％未満の閉鎖環境チャンバーの酸素レベルを維持する。いくつかの実施形態において、細胞培養インキュベーターは、約１％未満の閉鎖環境チャンバーの酸素レベルを維持する。
【００４８】
細胞培養インキュベーターは、約１ＰＳＩＧ（６．８９ｋＰａ）またはそれより大きい、ユーザによりコントロールされたまたは自動化された閉鎖環境チャンバー気圧を維持することができる。いくつかの実施形態において、細胞培養インキュベーターは、約２ＰＳＩＧ（１３．８ｋＰａ）またはそれより大きい、ユーザによりコントロールされた閉鎖環境チャンバー気圧を維持する。いくつかの実施形態において、細胞培養インキュベーターは、約５ＰＳＩＧ（３４．５ｋＰａ）の、ユーザによりコントロールされた閉鎖環境チャンバー気圧を維持する。細胞培養インキュベーターは、入口ガス圧をコントロールすることにより閉鎖環境チャンバー気圧を維持することができる。
【００４９】
細胞培養インキュベーターは、ユーザインタフェースを含むことができる。ユーザインタフェースは、ユーザがガス組成、酸素レベル、二酸化炭素レベル、湿度、気圧または内部環境温度をコントロールできるように構成することができる。ユーザインタフェースは、ユーザへのガス組成の表示を備えるように構成することができる。ユーザインタフェースは、ユーザへの酸素レベル、二酸化炭素レベル、湿度、閉鎖環境チャンバー気圧および内部環境温度の表示を備えるように構成することができる。細胞培養インキュベーターは、閉鎖環境チャンバーの内部湿度を維持するように設定することができる。閉鎖環境チャンバーは、棚、圧力センサ、酸素センサ、二酸化炭素センサ、温度センサまたは酸素除去触媒を含むことができる。閉鎖環境チャンバーの中の棚は、例えばステンレス鋼、銀、金または銅で作ることができる。いくつかの実施形態において、閉鎖環境チャンバーの棚は銅製の棚である。
【００５０】
細胞培養インキュベーターは、ガスタンクと動作可能に連結することができる。ガスタンクは、ＣＯ２タンク、窒素ガスタンク、酸素ガスタンク、１もしくは複数のガスの規定混合物を含むガスタンクまたはそれらの組み合わせを含むことができる。細胞培養インキュベーターは、圧力調整ポンプまたは圧力センサ（例として、圧力ゲージ）を介してガスタンクと動作可能に連結することができる。圧力調整ポンプまたは圧力センサは、ガスタンクから細胞培養インキュベーターの閉鎖環境チャンバーへのコントロールされたガス流を維持することができる。１または複数のタンクからのコントロールされたガス流はセットされた入口圧を持つことができ、１または複数のタンクのこのセットされた入口圧は所望の閉鎖環境チャンバー内部ガス組成または内部気圧を維持するように設定される。閉鎖環境チャンバーは、閉鎖環境チャンバーのドア上に真空シールを持つことができる。閉鎖環境チャンバーは、可膨張性シールにより密封することができる。
【００５１】
インキュベーターは、圧力調整ドアを含むことができる。いくつかの実施形態において、インキュベーターは、外部圧力調整ドアおよび内部圧力調整ドアを含む。外部圧力調整ドアおよび／または内部圧力調整ドアは、例として二重壁のドアであることができる。二重壁のドアは、真空シールされたラッチを持つことができる。外部圧力調整ドアは、ドア上に集積化圧力センサを包含し得る。インキュベーターは、ドアエントリを含むことができる。ドアエントリは、閉鎖環境チャンバーへの入り口を備えることができる。ドアエントリ開口部の寸法は、圧力調整ドアより小さいものであることができる。ドアエントリは、ゴムガスケットを含むことができる。ゴムガスケットは、圧力調整シールを生み出すことができる。細胞培養インキュベーターは、集積化圧力センサを含むことができる。集積化圧力センサは、多様な圧力センサであることができる。集積化圧力センサは、水系またはシリコン系の圧力センサであることができる。インキュベーターは、滅菌ユニットを含むことができる。滅菌ユニットは、ＵＶ系の滅菌ユニットであることができる。ＵＶ系の滅菌ユニットは、インキュベーターの閉鎖環境チャンバーの空間に紫外線を与えるように設定することができる。インキュベーターは、ＣＯ２センサを含むことができる。ＣＯ２センサは、閉鎖環境チャンバーの規定ＣＯ２レベルから＋／−０．５％逸脱すると検出可能なアラームを出すように設定することができる。インキュベーターは、閉鎖環境チャンバーを含むことができる。インキュベーターは、水分湿度トレイ（ｗａｔｅｒ  ｈｕｍｉｄｉｔｙ  ｔｒａｙ）を含むことができる。水分湿度トレイは、閉鎖環境チャンバーの無菌性を増進させることができる。水分湿度トレイは、湿度センサまたはレギュレータに直接係留し得る。インキュベーターは、エアジャケットを含むことができる。エアジャケットは、最適な温度および適切なガス制御を維持することができる。エアジャケットは、物理的に別の区画であることができる。エアジャケットは、電気コントローラおよび回路基板を収容し得る。インキュベーターは、酸素除去触媒および酸素レベルを制御するためのセンサをインキュベーター内に含むことができる。
【００５２】
インキュベーターは、加熱エレメントまたは温度コントロールを含むことができる。加熱エレメントまたは温度コントロールは、静音ファン系の加熱エレメントを含むことができる。静音ファン系の加熱エレメントは、一定流の加熱空気をエアジャケット区画内に分配することができる。受動加熱は次いで、内部チャンバーを均等に分布した一定の様式で温めることができる。インキュベーターは、規定のガス組成および内部気圧を与えるように設定された圧力調整ポンプおよびレギュレータを含むことができる。モータ系ポンプは、チャンバー圧およびガス組成レベル（例として、１％酸素、５％  ＣＯ２、９４％  Ｎ２）を維持するように規定のガス混合物を分配することができる。インキュベーターは、ユーザインタフェースを含むことができる。ユーザは、ガスレベルおよび圧力をセットするためにユーザインタフェースを用いることができる。ユーザインタフェースは、直接的コントロールのためにセンサおよびポンプと一体化することができる。圧力調整ポンプおよびレギュレータは、ガス入口を含むことができる。ガス入口は、任意のガス流を閉鎖環境チャンバー内に入れることができる。例えば、ガス入口は、酸素タンクに接続することができる。ガス入口は、ＣＯ２タンクに接続することができる。ガス入口は、窒素タンクに接続することができる。いくつかの実施形態において、インキュベーターは、酸素タンクに接続されたガス入口、ＣＯ２タンクに接続されたガス入口および窒素タンクに接続されたガス入口を含む。ガス入口は、カスタムのガス混合物を含有するタンクに接続することができる。いくつかの実施形態において、ユーザは、任意のガス入口を介してガス流をコントロールすることができる。ガス入口のいずれか１つは、流量計に接続され得る。流量計は、入口ガス圧を制御することができる。細胞培養インキュベーターは、湿度コントロールユニット／センサを含むことができる。湿度コントロールユニット／センサは、水分湿度トレイに直接接続することができる。
【００５３】
細胞培養インキュベーターの閉鎖環境チャンバーは滅菌ユニットを含むことができ、これはＵＶ滅菌ユニットであることができる。閉鎖環境チャンバーは、圧力調整ドアを含むことができる。閉鎖環境チャンバーは、ユーザ所望の酸素レベルから約±０．５％より大きく異なった閉鎖環境チャンバーの酸素レベルを検出すると検出可能なアラームを出すセンサを含むことができる。閉鎖環境チャンバーは、ユーザ所望の気圧から約±０．５％より大きく異なった閉鎖環境チャンバーの気圧を検出すると検出可能なアラームを出すセンサを含むことができる。閉鎖環境チャンバーは、閉鎖環境チャンバーの気圧レベルを表示するユーザディスプレイを含むことができる。いくつかの実施形態において、閉鎖環境チャンバーは、閉鎖環境チャンバーのＯ２レベルを表示するユーザディスプレイを含む。いくつかの実施形態において、閉鎖環境チャンバーは、閉鎖環境チャンバーのＣＯ２レベルを表示するユーザディスプレイを含む。いくつかの実施形態において、閉鎖環境チャンバーは、閉鎖環境チャンバーの温度レベルを表示するユーザディスプレイを含む。
【００５４】
ユーザは、細胞培養インキュベーターを、例えば生理的条件、腫瘍微小環境条件、低酸素条件、高圧条件、低圧条件または超生理的条件を模倣するようにプログラムすることができる。細胞培養インキュベーターは、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、約２０分、約２１分、約２２分、約２３分、約２４分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分または約１時間以内にユーザによりセットされた条件へと較正するように設定することができる。いくつかの実施形態において、細胞培養インキュベーターは、約２０分未満でユーザによりセットされた所望の条件に達することができる。いくつかの実施形態において、細胞培養インキュベーターは、約２０分でユーザによりセットされた所望の条件に達することができる。いくつかの実施形態において、細胞培養インキュベーターは、２０分以内にユーザによりセットされた所望の条件に達することができる。
【００５５】
いくつかの実施形態において、閉鎖環境チャンバーが占拠する空間は、わずか６立方フィートである。いくつかの実施形態において、閉鎖環境チャンバーが占拠する空間は、わずか３．５立方フィートである。いくつかの実施形態において、閉鎖環境チャンバーが占拠する空間は、わずか２立方フィートである。いくつかの実施形態において、閉鎖環境チャンバーが占拠する空間は、わずか１．５立方フィートである。いくつかの実施形態において、閉鎖環境チャンバーが占拠する空間は、わずか１立方フィートである。いくつかの実施形態において、閉鎖環境チャンバーが占拠する空間は、１立方フィート未満である。
【００５６】
いくつかの実施形態において、細胞培養プレートは、１、６、１２、２４、４８、９６、３８４、１０５６、１５３６または３４５６個のウェルを含む。
【００５７】
本発明の方法は、標的細胞集団を培養するための細胞培養インキュベーターを使うことができる。図１９は、本発明のシステムにおいて用いることができる細胞培養インキュベーターの具体例を提供する。１９０１は、細胞培養物をインキュベーターの中に入れるために開くことができるインキュベーターのドアである。１９０２は、例えば温度、湿度、酸素レベル、二酸化炭素レベル、インキュベーション時間、窒素レベルおよびチャンバー圧といったパラメータを用いて細胞培養インキュベーターをプログラムするために用いることができるコントロールユニットである。１９０３は、細胞培養インキュベーターにデータを入力するまたはこれからデータを抽出するために用いることができるＵＳＢポートである。
【００５８】
図２０は、細胞培養インキュベーターの前部の図である。図２０は、ドア、ドアハンドルラッチを用いて密着させることができるドア縁部周囲のゴムガスケット、保持リップ、ドア用の開閉ボタン、タッチ画面、ロータリーアクチュエータまたはモータおよびインキュベーターのチャンバーを表現する。図２１は、ドアが閉まった（２１０１）および開いた（２１０２）細胞培養インキュベーターを示す。図２２は、本発明のシステムにおいて用いることができるドアヒータを表現する。この図は、細胞培養インキュベーターを所望の温度まで加熱するために用いられる前板、加熱エレメント、ポロン断熱材、背板、マイカワッシャー、銅板、精密中空シャフトおよびパドルを示す。
【００５９】
細胞培養インキュベーターの高さ、幅、深さまたは長さは、例えば約６ｉｎ、約６．５ｉｎ、約７ｉｎ、約７．５ｉｎ、約８ｉｎ、約８．５ｉｎ、約９ｉｎ、約９．５ｉｎ、約１０ｉｎ、約１０．５ｉｎ、約１１ｉｎ、約１１．５ｉｎ、約１２ｉｎ、約１２．１ｉｎ、約１２．２ｉｎ、約１２．３ｉｎ、約１２．４ｉｎ、約１２．５ｉｎ、約１２．６ｉｎ、約１２．７ｉｎ、約１２．８ｉｎ、約１２．９ｉｎ、約１３ｉｎ、約１３．１ｉｎ、約１３．２ｉｎ、約１３．３ｉｎ、約１３．４ｉｎ、約１３．５ｉｎ、約１３．６ｉｎ、約１３．７ｉｎ、約１３．８ｉｎ、約１３．９ｉｎ、約１４ｉｎ、約１４．５ｉｎ、約１５ｉｎ、約１５．５ｉｎ、約１６ｉｎ、約１６．５ｉｎ、約１７ｉｎ、約１７．５ｉｎ、約１８ｉｎ、約１８．５ｉｎ、約１９ｉｎ、約１９．５ｉｎ、約２０ｉｎ、約２０．５ｉｎ、約２１ｉｎ、約２１．５ｉｎ、約２２ｉｎ、約２２．５ｉｎ、約２３ｉｎ、約２３．５ｉｎ、約２４ｉｎ、約２４．５ｉｎ、約２５ｉｎ、約２５．５ｉｎ、約２６ｉｎ、約２６．５ｉｎ、約２７ｉｎ、約２７．５ｉｎ、約２８ｉｎ、約２８．５ｉｎ、約２９ｉｎ、約２９．５ｉｎ、約３０ｉｎ、約３０．５ｉｎ、約３１ｉｎ、約３１．５ｉｎ、約３２ｉｎ、約３２．５ｉｎ、約３３ｉｎ、約３３．５ｉｎ、約３４ｉｎ、約３４．５ｉｎ、約３５ｉｎ、約３５．５ｉｎ、約３６ｉｎ、約３６．５ｉｎ、約３７ｉｎ、約３７．５ｉｎ、約３８ｉｎ、約３８．５ｉｎ、約３９ｉｎ、約３９．５ｉｎ、約４０ｉｎ、約４０．５ｉｎ、約４１ｉｎ、約４１．５ｉｎ、約４２ｉｎ、約４２．５ｉｎ、約４３ｉｎ、約４３．５ｉｎ、約４４ｉｎ、約４４．５ｉｎ、約４５ｉｎ、約４５．５ｉｎ、約４６ｉｎ、約４６．５ｉｎ、約４７ｉｎ、約４７．５ｉｎ、約４８ｉｎ、約４８．５ｉｎ、約４９ｉｎ、約４９．５ｉｎ、約５０ｉｎ、約５０．５ｉｎ、約５１ｉｎ、約５１．５ｉｎ、約５２ｉｎ、約５２．５ｉｎ、約５３ｉｎ、約５３．５ｉｎ、約５４ｉｎ、約５４．５ｉｎ、約５５ｉｎ、約５５．５ｉｎ、約５６ｉｎ、約５６．５ｉｎ、約５７ｉｎ、約５７．５ｉｎ、約５８ｉｎ、約５８．５ｉｎ、約５９ｉｎ、約５９．５ｉｎ、約６０ｉｎまたはそれらの任意の組み合わせであることができる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、細胞培養インキュベーターの高さは１２ｉｎである。いくつかの実施形態において、細胞培養インキュベーターの幅は１３．５ｉｎである。いくつかの実施形態において、細胞培養インキュベーターの深さは１３．１ｉｎである。
【００６１】
閉鎖環境チャンバーの容積は、例えば約１００インチ３、約１１０インチ３、約１２０インチ３、約１３０インチ３、約１４０インチ３、約１５０インチ３、約１６０インチ３、約１７０インチ３、約１８０インチ３、約１９０インチ３、約２００インチ３、約２０５インチ３、約２１０インチ３、約２１１インチ３、約２１２インチ３、約２１３インチ３、約２１４インチ３、約２１５インチ３、  約２１６インチ３、約２１７インチ３、約２１８インチ３、約２１９インチ３、約２２０インチ３、約２２１インチ３、約２２２インチ３、約２２３インチ３、約２２４インチ３、約２２５インチ３、約２２６インチ３、約２２７インチ３、約２２８インチ３、約２２９インチ３、  約２３０インチ３、約２４０インチ３、約２５０インチ３、約２６０インチ３、約２７０インチ３、約２８０インチ３、約２９０インチ３、約３００インチ３、約３１０インチ３、約３２０インチ３、約３３０インチ３、約３４０インチ３、約３４０インチ３、約３５０インチ３、約３６０インチ３、約３７０インチ３、約３８０インチ３、約３９０インチ３、約４００インチ３、約４２０インチ３、約４４０インチ３、約４６０インチ３、約４８０インチ３または約５００インチ３であることができる。いくつかの実施形態において、閉鎖環境チャンバーの容積は約２２０インチ３である。いくつかの実施形態において、閉鎖環境チャンバーの容積は約２２１インチ３である。いくつかの実施形態において、閉鎖環境チャンバーの容積は約２２２インチ３である。いくつかの実施形態において、閉鎖環境チャンバーの容積は約２２３インチ３である。いくつかの実施形態において、閉鎖環境チャンバーの容積は約２２４インチ３である。いくつかの実施形態において、閉鎖環境チャンバーの容積は２２４インチ３である。
【００６２】
細胞培養インキュベーターの製造において用いることができる材料としては、例えばステンレス鋼、ガラス、銅、銀、金、プラスチック、ブランケット中綿、ハードボード断熱材またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。閉鎖環境チャンバーは、例えば銅またはステンレス鋼で作ることができる。いくつかの実施形態において、閉鎖環境チャンバーは、銅で作られる。
【００６３】
細胞培養インキュベーターは、所望の湿度レベルで維持することができる。湿度レベルは、例えば約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９０．５％、約９１％、約９１．５％、約９２％、約９２．５％、約９３％、約９３．５％、約９４％、約９４．５％、約９５％、約９５．５％、約９６％、約９６．５％、約９７％、約９７．５％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％または約９９．９％であることができる。
【００６４】
細胞培養インキュベーター中のＣＯ２レベルは、例えば約１０％、約９．５％、約９％、約８．５％、約８％、約７．５％、約７％、約６．９％、約６．８％、約６．７％、約６．６％、約６．５％、約６．４％、約６．３％、約６．２％、約６．１％、約６％、約５．９％、約５．８％、約５．７％、約５．６％、約５．５％、約５．４％、約５．３％、約５．２％、約５．１％、約５％、約４．９％、約４．８％、約４．７％、約４．６％、約４．５％、約４．４％、約４．３％、約４．２％、約４．１％、約４％、約３．９％、約３．８％、約３．７％、約３．６％、約３．５％、約３．４％、約３．３％、約３．２％、約３．１％、約３％、約２．９％、約２．８％、約２．７％、約２．６％、約２．５％、約２．４％、約２．３％、約２．２％、約２．１％、約２％、約１．９％、約１．８％、約１．７％、約１．６％、約１．５％、約１．４％、約１．３％、約１．２％、約１．１％、約１％、約０．９％、約０．８％、約０．７％、約０．６％、約０．５％、約０．４％、約０．３％、約０．２％または約０．１％であることができる。
【００６５】
細胞培養インキュベーターは、例えば特定の細胞集団を分離するために、細胞中で変化を誘導するために、細胞に外因性材料を導入するために、バイオマーカー発現を決定するためにおよび患者のための診断ツールとして、本明細書中に記載されている培養条件と組み合わせて用いることができる。
【００６６】
本発明の方法は、例えば細胞におけるトランスフェクションおよび形質導入の効率を上昇させるために用いることができる。形質導入は、例えばウイルスベクターを細胞の中に導入するために用いることができる。ウイルス性の核酸送達系は、遺伝子治療のための核酸を送達するために組換えウイルスを用いることができる。核酸を送達するために用いることができるウイルスの非限定的な例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、レオウイルス、ワクシニア、ポックスウイルスおよび麻疹ウイルスが挙げられる。
【００６７】
本発明の方法と共に用いることができるトランスフェクション方法としては、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、化学的トランスフェクション、ポリマー性トランスフェクション、遺伝子銃、マグネトフェクションまたはソノポレーションが挙げられる。トランスフェクションは、安定的または一過性のトランスフェクションであることができる。トランスフェクションは、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたは任意の核酸をトランスフェクトするために用いることができる。プラスミドは、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、選択マーカーおよび他の目的タンパク質をコードすることができる。選択マーカーは、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシンおよびブラスチシジンへの抵抗性を与えることができる。本発明の方法と共に用いられるトランスフェクション方法はさらに、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムをコードするベクター系を細胞内に導入することができる。
【００６８】
本発明の方法は、トランスフェクションまたは形質導入効率を、例えば約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１２倍、約１４倍、約１６倍、約１８倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍または約１００倍上昇させることができる。
【００６９】
治療的使用
対象は、例えば、高齢者、成人、思春期の若年者、思春期前の若年者、子供（ｃｈｉｌｄ）、幼児（ｔｏｄｄｌｅｒ）、小児（ｉｎｆａｎｔ）であることができる。対象は非ヒト動物であることができ、例えば、対象はマウス、ラット、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコまたはヤギであることができる。対象は、患者であることができる。
【００７０】
本発明の方法は、例えば対象においてがんを処置または診断するために用いることができる。本発明の方法は、がんに対する治療薬、バイオマーカー、遺伝的変異、エピジェネティックマーカーまたは治療標的を同定するために用いることができる。本発明の方法はまた、がんにおいて見出される遺伝的変異のライブラリーまたはデータベースを開発するために用いることもできる。本発明の方法は、個別化医療のために用いることができる。本発明の方法は、特定の細胞タイプに対する治療薬の効果を決定するために用いることができる。
【００７１】
本発明の方法は、例えば特定の細胞集団を濃縮するため、または特定の遺伝子、例えばバイオマーカーまたはエピジェネティックマーカーの発現を誘導するために用いることができる。本発明の方法は、例えば幹細胞または体細胞の潜在能に影響を及ぼすために用いることができる。例えば、本発明の方法は、例えば全能性から例えば多能性、少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）または単能性までに及ぶ幹細胞の能力を試験するために用いることができる。
【００７２】
遺伝子発現の変化は、例えば細胞の量、細胞形態、細胞成長、細胞運動性、細胞浸潤または細胞接着に影響を及ぼすことができる。
【００７３】
ゲノム解析、プロテオーム解析および代謝解析は、例えば、がん治療法の開発、医薬品開発、がんワクチン、がんのスクリーニング、診断薬、個別化抗体の開発、造血幹細胞移植、臓器移植または心血管疾患の処置のために用いることができるバイオマーカーを同定するために、培養細胞に対して実施することができる。
【００７４】
本発明の方法において解析することができるがんの非限定的な例としては、以下が挙げられる：急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、例えば小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視路および視床下部の神経膠腫など、乳がん、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、原発不明癌腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、子宮頸がん、小児がん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸がん、皮膚性Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、ユーイング肉腫、生殖細胞腫瘍、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、神経膠腫、ヘアリー細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼球内黒色腫、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭がん、口唇および口腔のがん、脂肪肉腫、肝臓がん、肺がん、例えば非小細胞および小細胞肺がんなど、リンパ腫、白血病、マクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、潜在性原発を有する転移性扁平上皮頸部がん、口腔がん（ｍｏｕｔｈ  ｃａｎｃｅｒ）、多発性内分泌新生物症候群、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、鼻腔および副鼻腔がん、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞がん、口腔がん（ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、中咽頭がん、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣生殖細胞腫瘍、膵臓がん、膵臓がん膵島細胞、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん（ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚細胞腫、脳下垂体腺腫、胸膜肺芽腫、形質細胞新生物、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞癌、腎盂および輸尿管の移行上皮がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん、皮膚癌メルケル細胞、小腸がん、軟組織肉腫、扁平上皮癌、胃がん、Ｔ細胞リンパ腫、咽頭がん（ｔｈｒｏａｔ  ｃａｎｃｅｒ）、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺がん、絨毛性腫瘍（妊娠性）、原発部位不明のがん、尿道がん、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、ワルデンストレーム型マクログロブリン血症およびウィルムス腫瘍。
【００７５】
細胞表面マーカー分子、例えばＥＰＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２またはＣＤ２０などを、細胞集団を同定するために用いることができる。いくつかの実施形態において、細胞表面マーカーまたは細胞表面マーカーの痕跡（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）の組み合わせを、細胞集団を同定するために用いることができる。いくつかの実施形態において、細胞表面マーカーおよび／または細胞表面マーカー痕跡を、医学的診断において用いることができる。
【００７６】
本発明の方法を用いて評価することができるエピジェネティックマーカーとしては、例えば、ＤＮＡメチル化、シトシンメチル化、ヒドロキシメチル化、ヒストンメチル化、リジンアセチル化、リジンメチル化、アルギニンメチル化、セリンリン酸化、スレオニンリン酸化、タンパク質リン酸化、タンパク質ユビキチン化、タンパク質ＳＵＭＯ化、５−メチルシトシンの存在、ヒストンＨ３アセチル化またはヒストンＨ４アセチル化が挙げられる。
【００７７】
生物学的マーカーの存在を決定するために用いることができる方法としては、例えばｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫蛍光、免疫組織化学、ウエスタンブロッティング、ハイスループットシーケンシング、ＥＬＩＳＡまたはｍＲＮＡシーケンシングが挙げられる。
【００７８】
標的細胞亜集団は、個別化医療のために用いることができる。例えば、ＣＴＣおよびＣＳＣは化学療法感受性試験のために用いることができ、この試験により化学療法レジメンを培養ＣＴＣに対して試験することができる。例えば細胞生存率および細胞分裂といった、ＣＴＣに対する化学療法薬剤の効果の評価は、所与の薬剤の効力を決定するために行うことができる。
【００７９】
本発明の方法は、処置の経過と共に対象のＣＴＣ集団を連続的にモニターすることによって、実施された所与のがん治療法に対する対象の応答をモニターするために用いることができる。血液試料は、ＣＴＣ生存率を評価するために、処置の前、最中および後に定期的に分析することができる。
【００８０】
本発明の方法は、がん再発の可能性を調べるために現在寛解にある対象をモニターするために用いることができる。ＣＴＣについての対象血液の連続的な試験を、がん再発の可能性または見込みを決定するために定期的に実施することができる。いくつかの場合において、連続的な試験は、より早い再発の検出をもたらすことができる。連続的な試験は、長期の縦断的研究のために用いることもできる。
【００８１】
本発明の方法は、臨床試験の際の患者階層化のための患者に関するデータを収集するために用いることができる。例えば、患者のＣＴＣにおいて見出された特定のバイオマーカーの存在は、その患者を適当な臨床試験群に配置するために用いることができ、または他の臨床試験群のための除外判断基準として用いることができる。
【００８２】
本明細書中に記載されている発明は、医療従事者が患者を処置するために用いることができるデータを提供することができる。患者の処置としては、診断、予後推定またはセラノシス（ｔｈｅｒａｎｏｓｉｓ  ｔｈｅｒａｇｎｏｓｉｓ）を挙げることができる。診断は、患者の状態を決定することを含むことができる。診断は、一時点においてまたは継続的に実施することができる。例えば、患者をがんと診断することができる。別の例において、がんの再発が起こったかを決定するため、寛解にあるがん患者を日常的にスクリーニングすることができる。予後推定は、患者の疾患の転帰、回復のチャンスまたはその疾患がどのように進行するかを決定することを含むことができる。例えば、ある一定のタイプのＣＴＣを同定することは、それに基いて予後を推定することができる情報を提供することができる。セラノシスは、治療処置を決定することを含むことができる。例えば、患者のがん治療処置としては、化学療法、放射線照射、薬剤処置、無処置またはそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。患者は、患者が処置を受ける前、その最中および後のＣＴＣ集団を測定するために、例えば連続的な血液試験によりモニターすることができる。治療に対する肯定的応答は、ＣＴＣ生存率の減少および細胞分裂速度の低下をもたらすことができる。
【００８３】
コンピュータシステム
本発明の方法は、例えば回収された標的細胞亜集団をシーケンシングする、イメージングするまたは特性評価するために用いることができる。さらなる方法はＰＣＴ／ＵＳ１４／１３０４８中に見出すことができ、この文献はその全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【００８４】
本発明は、本開示の方法を遂行するように設定されたコンピュータシステムを提供する。システムは、本明細書中に記載されている方法を遂行するようにプログラムされたコンピュータサーバ（「サーバ」）を包含することができる。図４は、ユーザが細胞の画像を検出、解析および処理し、細胞をシーケンシングすることを可能にするように適合させたシステム４００を表現する。システム４００は、本明細書中に記載されている例示的方法を遂行するようにプログラムされたセントラルコンピュータサーバ４０１を包含する。サーバ４０１は、シングルコアプロセッサ、マルチコアプロセッサまたは並列処理のための複数のプロセッサであることができる中央処理装置（ＣＰＵ、「プロセッサ」とも）４０５を包含する。サーバ４０１はまた、メモリ４１０（例としてランダムアクセスメモリ、リードオンリメモリ、フラッシュメモリ）；電子記憶装置４１５（例としてハードディスク）；１または複数の他のシステムとの通信のための通信インターフェース４２０（例としてネットワークアダプタ）；および周辺装置４２５を包含し、この周辺装置４２５としてはキャッシュ、他のメモリ、データストレージおよび／または電子ディスプレイアダプタが挙げられ得る。メモリ４１０、記憶装置４１５、インターフェース４２０および周辺装置４２５は、通信バス（実線）、例えばマザーボードなどを介してプロセッサ４０５と通信する。記憶装置４１５は、データを保存するためのデータ記憶装置であることができる。サーバ４０１は、通信インターフェース４２０を利用してコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）４３０と作動的に連結される。ネットワーク４３０は、インターネット、イントラネットおよび／もしくはエクストラネット、インターネットと通信するイントラネットおよび／もしくはエクストラネット、テレコミュニケーションまたはデータネットワークであることができる。ネットワーク４３０は、いくつかの場合において、サーバ４０１を利用してピアツーピアネットワークを遂行することができ、これはサーバ４０１に連結された装置がクライアントまたはサーバとして機能することを可能にし得る。顕微鏡およびマイクロマニピュレータは、周辺装置４２５またはリモートコンピュータシステム４４０であることができる。
【００８５】
記憶装置４１５は、例えば個々の画像、微速度撮影画像、個々の細胞、細胞コロニーに関するデータまたは本発明に関連した任意の見地のデータなどのファイルを保存することができる。データ記憶装置４１５は、仮想グリッド中の細胞の位置に関係するデータと連結され得る。
【００８６】
サーバは、ネットワーク４３０を介して１または複数のリモートコンピュータシステムと通信することができる。１または複数のリモートコンピュータシステムは、例えばパーソナルコンピュータ、ラップトップ、タブレット、電話、スマートフォンまたは携帯情報端末であり得る。
【００８７】
いくつかの状況において、システム４００は、単一のサーバ４０１を包含する。他の状況において、システムは、イントラネット、エクストラネットおよび／またはインターネットを介して互いに通信する複数のサーバを包含する。
【００８８】
サーバ４０１は、細胞プロファイル情報、例えば細胞のサイズ、形態、形状、遊走能、増殖能力、運動学的性質および／または潜在的な関連性のある他の情報などを保存するように適合させることができる。かかる情報は記憶装置４１５またはサーバ４０１上に保存することができ、かかるデータはネットワークを介して送信することができる。
【００８９】
本明細書中に記載されている方法は、サーバ４０１の電子記憶位置、例えばメモリ４１０または電子記憶装置４１５などに保存されたマシン（例として、コンピュータプロセッサ）コンピュータ可読媒体（またはソフトウェア）を通じて遂行することができる。使用の際、コードをプロセッサ４０５により実行することができる。いくつかの場合において、コードを記憶装置４１５から検索して、プロセッサ４０５による迅速なアクセスのためにメモリ４１０上に保存することができる。いくつかの状況において、電子記憶装置４１５を除外することができ、マシン実行可能命令はメモリ４１０上に保存される。あるいは、コードを第二のコンピュータシステム４４０上で実行することができる。
【００９０】
本明細書中で提供されているシステムおよび方法の態様、例えばサーバ４０１などは、プログラミング中で具現化することができる。技術の様々な面が、典型的にはある種のマシン可読媒体（例として、コンピュータ可読媒体）中で行われるまたは具現化されるマシン（またはプロセッサ）実行可能コードおよび／または関連データの形態である「製品」または「製造物品」と考えられ得る。マシン実行可能コードは、電子記憶装置、そのようなメモリ（例として、リードオンリメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスク上に保存することができる。「記憶」型媒体としては、コンピュータ、プロセッサなどのあらゆる全ての有形メモリまたはその関連モジュール、例えば様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどを挙げることができ、これらはソフトウェアプログラミングのために非一時的なストレージを適宜提供し得る。ソフトウェアの全体または一部は、ときにインターネットまたは様々な他のテレコミュニケーションネットワークを介して通信され得る。かかる通信は、例えば、１つのコンピュータまたはプロセッサから別のものへの、例えば管理サーバまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのローディングを可能にし得る。したがって、ソフトウェア要素を担い得る別のタイプの媒体としては、光波、電波および電磁波が挙げられ、これらは例えばローカルデバイス間の物理インターフェースを横断して、有線および光学式の固定電話ネットワークを介して、ならびに様々なエアリンク（ａｉｒ−ｌｉｎｋ）にわたって用いられる。かかる波を運搬する物理的要素、例えば有線または無線の同様のもの、光学式リンクなどもまた、ソフトウェアを担う媒体として考えられ得る。本明細書中で用いられるように、非一時的な有形「記憶」媒体に限定されないかぎり、例えばコンピュータまたはマシン「可読媒体」などの用語は、実行のためのプロセッサに対する命令を与えることに関与する任意の媒体を指す。
【００９１】
よって、マシン可読媒体、例えばコンピュータ実行可能コードなどは多くの形態を取り得るものであって、これらとしては限定されるものではないが、有形記憶媒体、搬送波媒体または物理的伝送媒体が挙げられる。不揮発性記憶媒体としては、例えば光学式または磁気式のディスク、例えば任意のコンピュータ（１または複数）における任意の記憶装置などを挙げることができ、このようなものがシステムを遂行するために用いられ得る。有形伝送媒体としては：同軸ケーブル、銅線および光ファイバ（コンピュータシステム内のバスを構成する線を包含する）を挙げることができる。搬送波伝送媒体は、電子信号もしくは電磁信号、または音波もしくは光波、例えば無線周波数（ＲＦ）および赤外線（ＩＲ）データ通信の際に生成されるものなどの形態を取り得る。コンピュータ可読媒体の通例的な形態としては、それゆえに、例えば：フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、任意の他の光学式媒体、パンチカード、ペーパーテーム（ｐａｐｅｒ  ｔａｍｅ）、穴のパターンを有する任意の他の物理的記録媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップもしくはカートリッジ、搬送波移送データもしくは命令、ケーブル、もしくはかかる搬送波を移送するリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／もしくはデータを読み取り得る任意の他の媒体が挙げられる。これらの形態のコンピュータ可読媒体のうちの多くは、実行のためのプロセッサに対する１または複数の命令の１または複数のシーケンスを搬送することに関わり得る。
【実施例】
【００９２】
実施例１：前立腺がん関連マーカーの同定
図５は、前立腺がんを有する患者の試料から得られたＣＴＣ試料を用いてがん関連タンパク質の発現レベルを測定した実験の結果を示す。本発明の方法に従ってＣＴＣを成長させて培養することで、濃縮されたＣＴＣ集団を得た。前立腺がんに関連した様々なマーカーの遺伝子発現をｑＰＣＲを用いて評価した。ＣＤ４５発現は、２名の対象、４３−Ｂおよび４５−Ｃについて免疫蛍光によって評価した。白色の矢印はＣＤ４５についての染色を指し示し、黒色の矢印はＥＰＣＡＭ（上皮細胞接着分子）／ＰＳＭＡについての染色を指し示す。上のパネルはＣＤ４５染色のみを含有している。評価されたマーカーは、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、アンドロゲン受容体スプライスバリアント７（ＡＲ−Ｖ７）、ＥＰＣＡＭ、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰＳ）、前立腺特異的抗原（ＫＬＫ３／ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＦＯＬＨ１／ＰＳＭＡ）、ｖ−ｅｔｓ鳥類赤芽球症ウイルスＥ２６癌遺伝子ホモログ（ＥＲＧ）、前立腺がん抗原３（ＰＣＡ３）、Ｎｋ３ホメオボックス１（ＮＫＸ３−１）およびクロモグラニンＡまたは副甲状腺分泌タンパク質１（ＣＨＧＡ）を包含した。
【００９３】
結果は、ＰＡＰＳは全ての前立腺腫瘍試料において発現していることを指し示した。他の前立腺がんマーカーの発現は試料間で異なっており、このことはＣＴＣコロニーは対象間で遺伝的に多様であり得ることを指し示す。
【００９４】
実施例２：前立腺がん関連マーカーの同定
前立腺ＣＴＣコロニーが発現することができる免疫治療標的および幹細胞マーカーを同定するため、転移性ＣＲＰＣ（ｍＣＲＰＣ）を有する患者３０名超から１０から２０ｍＬの末梢血を採取した。図２〜３中に記載されているように、対象試料のうちの８つが、本発明の方法を用いて培養した後にＣＴＣコロニーを生じた。図６中に示すように試料のうちの４つをいくつかのマーカーのｑＰＣＲ解析のために用いてＬＮＣａＰ（前立腺腺癌）およびＰＣ−３（前立腺腺癌）細胞株と比較したが、これらは図１について記載されているものと同じ染色パターンを含有している。
【００９５】
図１にあるようなＤＡＰＩ、ＷＢＣ、サイトケラチンおよびＰＳＭＡ／ＰＳＡ染色を有する代表的な免疫蛍光画像を示す。結果は、患者試料および細胞株のいくつかは免疫治療標的であるプログラム死リガンド１（ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１）および細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）ならびに幹細胞マーカーであるオクタマー結合転写因子４（ＰＵＳＦ１／Ｏｃｔ４）、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス２（ＳＯＸ２）、Ｉ型ケラチン１８（ＫＲＴ１８）およびＩ型ケラチン１４（ＫＲＴ１４）を発現していること、ならびにＯｃｔ４、ＳＯＸ２およびＰＤ−Ｌ１のアップレギュレーションがあることを指し示した。
【００９６】
実施例３：前立腺がんＣＴＣコロニーのＲＮＡシーケンシング
図７〜９は、対象試料から得られたＣＴＣコロニーの間での特定のシグナル伝達経路の差次的発現を決定するためのｍＲＮＡシーケンシング解析の結果を表示している。ＣＴＣコロニーは、図２〜３中に記載されている方法を用いて得た。細胞のＲＮＡ配列を特定の遺伝子にマッピングし、試料コレクションを横断して遺伝子のカウントを正規化した。ノンパラメトリックな濃縮アルゴリズムを用いて統計的検定を実施し、各試料における相対的な高発現に関連した経路を検出した。偽陽性率は、大きな経路コレクションを横断して算出した。図７〜９中に見られるように、各前立腺試料ＲＮＡプロファイルについて、濃縮検定結果をＸ軸上に偽陽性率として表した。異なる経路における遺伝子発現の濃縮は試料中で異なった。前立腺ＣＴＣコロニーの濃縮を示す経路としては、神経増殖因子受容体シグナル伝達（図７）、Ａｕｒｏｒａ  Ａシグナル伝達（図８）およびＫｉｔ受容体シグナル伝達（図９）が挙げられた。
【００９７】
実施例４：膵臓ＣＴＣコロニーのＥＰＣＡＭ発現
膵臓ＣＴＣコロニーにおけるＥＰＣＡＭ発現を決定するため、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を有する６名の患者をプロファイルした。アフェレーシスされた血液試料を回収して培養することで、ＣＴＣコロニーを生じた。図１０に示すように、細胞をサイトケラチン１９（ＣＫ１９；左上パネル、および右パネル中の円形の染色）およびＥＰＣＡＭ（左下パネル中の細胞周囲の点状の染色、および右パネル中に白色矢印により指し示される周辺の染色）について染色した。ＣＴＣの培養のために用いられたコラーゲン系基材への細胞の結合は、ＥＰＣＡＭ発現の増加を導いた。
【００９８】
実施例５：膵臓ＣＴＣコロニーが呈する変異
ＣＯＳＭＩＣ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ）データベースから決定された膵臓がんにおいて見出される変異について、６つの膵臓ＣＴＣコロニー試料を解析した。ＰＤＡＣ腫瘍についてのＣＯＳＭＩＣデータベース中では、ＫＲＡＳの変異率は６９％、ｐ５３は５１％、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）は２３％、ＳＭＡＤ４は２１％、ＡＴ−リッチ相互作用ドメイン含有タンパク質１Ａ（ＡＲＩＤ１Ａ）は６％、ベータ−カテニン（ＣＴＮＮＢ１）は２％である。培養後に得られたＣＴＣコロニーの場合、２／６のコロニーがＫＲＡＳの変異を表し、１／６のコロニーがｐ５３、ＣＤＫ２ＮＡおよびＣＴＮＮＢ１の変異を表した。
【００９９】
実施例６：膵臓およびｍＣＲＰＣ  ＣＴＣコロニーにおける遺伝子発現
異なる腫瘍から得られたＣＴＣ間に差次的発現があるかを決定するため、ＰＤＡＣ  ＣＴＣをｍＣＲＰＣ  ＣＴＣと比較した。膵臓ＣＴＣは、ＮＡＮＯＧ、Ｗｎｔ、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦＲ１）、ＦＯＸＰ１およびＡＲシグナル伝達経路において遺伝子発現の増加を呈した。細胞のＲＮＡ配列を特定の遺伝子にマッピングし、試料コレクションを横断して遺伝子のカウントを正規化した。ノンパラメトリックな濃縮アルゴリズムを用いて統計的検定を実施し、各試料における相対的な高発現に関連した経路を検出した。偽陽性率は、大きな経路コレクションを横断して算出した。図１１および１２中に見られるように、各前立腺試料ＲＮＡプロファイルについて、濃縮検定結果をＸ軸上に偽陽性率として表した。異なる経路における遺伝子発現の濃縮は試料中で異なった。前立腺がんＣＴＣと比べて膵臓ＣＴＣコロニーにおいて濃縮を示す経路としては、ＮＡＮＯＧシグナル伝達経路（図１１）およびＷｎｔシグナル伝達経路（図１２）が挙げられた。樹状細胞、肺細胞およびＴ細胞が対照として用いられ、残りの試料は対象から得られたＣＴＣであった。
【０１００】
実施例７：ＳＮＰ／ＩＮＤＥＬ変異解析
ＣＴＣ画分が全血液細胞対照より多くの遺伝的変異を表すかを決定するため、ステージ４のＰＤＡＣを有する６名の患者について一塩基多型（ＳＮＰ）および挿入／欠失（ＩＮＤＥＬ）を解析した。図１３は、ＳＮＰおよびＩＮＤＥＬ解析の結果を表現しており、総イベント数（左パネル）およびイベントを有する遺伝子の総数（右パネル）のいずれの点においてもＣＴＣ試料は全血液細胞対照と比較してより多くの遺伝的変異を明らかにすることが可能であったことを指し示す。
【０１０１】
ターゲットシーケンシング法を用いて、ＰＤＡＣに関連した２３８個の遺伝子について患者試料を評価した。図１４は、シーケンシング解析の結果を図解しており、ＣＴＣ（左側）は特定の遺伝子について全血液細胞対照と比較して約２０〜３０倍多いＳＮＰおよびＩＮＤＥＬを見せたことを示す。チャート上部の数字は、試料が得られた患者を意味している。
【０１０２】
実施例８：本発明のシステムにおけるディスプレイのためのユーザインタフェース
図１５は、本発明のシステムの初期設定においてユーザが見るグラフィカルインターフェースを表現している。左上のコーナーにおいて、ユーザは自分のユーザ識別コードを入力する。右上のコーナーにおいて、ユーザは所望のオプションを選ぶ。左下コーナーの４分の１区は、所望の操作の進行を指し示す。右下のコーナーは、ユーザがシステム用の自分のパスワードを入力することを可能にする。図１６は、本発明のシステムにログインするとシステムが表示することができる追加のユーザインタフェースを表現している。図１６のユーザインタフェースは、例えば最小持続時間の間、ハードウェアの接続が確かめられるまで、およびユーザが開始ボタンを押すまで表示されるように設定することができる。
【０１０３】
図１７は、培養チャンバーの中の酸素レベル（％）、チャンバー圧（ＰＳＩ）、温度（℃）および二酸化炭素レベル（％）の状態を表示する画面である。画面はさらに相対的湿度および残りの実験時間を表示している。ユーザはさらに画面下のアイコンを用いてアラーム設定および時刻設定を入力することができる。このシナリオにおいて、酸素レベルは２０．０％、チャンバー圧は３．７ＰＳＩＧ、温度は３４．２℃、二酸化炭素レベルは６．３％であった。相対的湿度は９０％、残りの実験時間は２時間３８分２０秒であった。
【０１０４】
図１８は、特定のパラメータを選択すると、ユーザは矢印をタッチしてそのパラメータを所望の値に減少または増加させることができることを示している。ユーザは矢印をタップすることで値を少しずつ増やして変えることができ、または矢印を押さえつけることで値を大きく増やして変えることもできる。ユーザが所望の値に達したら、ユーザはその値にタッチし、所望の値が確定する。
【０１０５】
実施例９：細胞接着のためのコーティングプロセス
細胞タンパク質の共有結合のための表面を調製するため、ガラススライドを、スライドを０．１Ｍ塩酸（ＨＣｌ）と共に２時間から一晩、室温でインキュベートすることにより調製した。次いで、ガラススライドを０．１Ｍ  ＮａＯＨと共に２時間から一晩、室温でインキュベートした。スライドを次いで０．５〜５％（３−アミノプロピル）トリメトキシシランと共に２時間から一晩、室温でインキュベートした。次いで、スライドを０．５〜５％グルタルアルデヒド（ＰＢＳ中で希釈）と共に２時間から一晩、室温でインキュベートした。ガラススライドを次いで水で一晩すすぎ、ＵＶ光下で１時間滅菌し、次いで室温で乾燥保存した。
【０１０６】
スライドを次いでさらに細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を含有する混合物を用いて処理して、細胞の結合を容易にした。ＥＣＭ混合物は、約０．１から約３ｍｇ／ｍＬのコラーゲン、約０．１から約１０μｇ／ｍＬのフィブロネクチンおよび約０．１から約１０μｇ／ｍＬの基底膜カクテルを含有した。ＥＣＭ混合物は、細胞の用途に応じて、ｐＨ１０のグリシンバッファーまたはｐＨ７のＤＭＥＭバッファーのいずれかで希釈した。
【０１０７】
実施例１０：本発明の方法を用いたトランスフェクション効率
エレクトロポレーションを用いて、ＤＵ１４５（ヒト前立腺がん）細胞にＧＦＰプラスミドをトランスフェクトした。５×１０６細胞／ｍＬを、５０ｎｇ  ＤＮＡプラスミド／μＬの細胞再懸濁液を使用して、１２６０Ｖで２０ｍｓを２回のプロトコールを用いてエレクトロポレーションした。トランスフェクション後、細胞を別々の３５ｍｍ細胞培養プレートに分けた。１つのプレートを標準的なＣＯ２インキュベーターの中に入れ、他のプレートを本発明のインキュベーターの中に入れた。第二のプレートのインキュベーターは、１％  Ｏ２および２ＰＳＩＧにセットした。４８時間後、細胞を固定し、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ発現についてイメージングした。図２３中に示されるデータは、低酸素および高圧でインキュベートされた細胞（下段パネル）は、明るい細胞の数がより多いことによって表現されているように、標準的条件でインキュベートされた細胞（上段パネル）よりも高いトランスフェクション効率を示したことを指し示す。
【０１０８】
実施形態
次の非限定的な実施形態は、本発明の具体例を提供するものであるが、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１０９】
実施形態１．  ａ）閉鎖環境チャンバー；およびｂ）コントロールユニットを含む細胞培養インキュベーターであって、前記コントロールユニットは閉鎖環境チャンバーと動作可能に連結されており、前記コントロールユニットはその中にエンコードされたコンピュータ実行可能コードを持つコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラムプロダクトを含み、前記コンピュータ実行可能コードは：（ｉ）閉鎖環境チャンバーの酸素レベルを制御するようにエンコードされ、閉鎖環境チャンバー中の酸素の除去をコントロールして閉鎖環境チャンバー内に低い酸素レベルを生成するようにエンコードされた酸素レベルモジュール；（ｉｉ）閉鎖環境チャンバーの圧力を制御するようにエンコードされ、閉鎖環境チャンバー中に陽圧条件を生成するようにガスの追加をコントロールする圧力モジュール；（ｉｉｉ）閉鎖環境チャンバーの温度を制御するようにエンコードされた温度モジュール；および（ｉｖ）閉鎖環境チャンバーの湿度を制御するようにエンコードされた湿度モジュールをエンコードするのに適合しており、前記酸素レベル、圧力、温度および湿度の各々は細胞のインビボ微小環境を模倣しており、指示された酸素レベル、圧力、温度および湿度の各々の入力を受けて約２０分以内に指示された酸素レベル、圧力、温度および湿度の各々に達する、前記細胞培養インキュベーター。
【０１１０】
実施形態２．  インビボ微小環境が腫瘍微小環境である、実施形態１の細胞培養インキュベーター。
【０１１１】
実施形態３．  細胞が幹細胞である、実施形態１〜２のいずれか１の細胞培養インキュベーター。
【０１１２】
実施形態４．  細胞ががん細胞である、実施形態１〜２のいずれか１の細胞培養インキュベーター。
【０１１３】
実施形態５．  細胞が循環腫瘍細胞である、実施形態１〜２のいずれか１の細胞培養インキュベーター。
【０１１４】
実施形態６．  細胞が免疫細胞である、実施形態１〜２のいずれか１の細胞培養インキュベーター。
【０１１５】
実施形態７．  細胞が生物学的試料から得られる、実施形態１〜６のいずれか１の細胞培養インキュベーター。
【０１１６】
実施形態８．  生物学的試料が血液である、実施形態７の細胞培養インキュベーター。
【０１１７】
実施形態９．  生物学的試料が腫瘍である、実施形態７の細胞培養インキュベーター。
【０１１８】
実施形態１０．  生物学的試料が唾液である、実施形態７の細胞培養インキュベーター。
【０１１９】
実施形態１１．  生物学的試料が組織である、実施形態７の細胞培養インキュベーター。
【０１２０】
実施形態１２．  コントロールユニットがユーザによりコントロールされる、実施形態１〜１１のいずれか１の細胞培養インキュベーター。
【０１２１】
実施形態１３．  コントロールユニットが自動化されている、実施形態１〜１１のいずれか１の細胞培養インキュベーター。
【０１２２】
実施形態１４．  酸素モジュールが低い酸素レベルを維持するようにエンコードされている、実施形態１〜１３のいずれか１の細胞培養インキュベーター。
【０１２３】
実施形態１５．  圧力モジュールが陽圧条件を維持するようにエンコードされている、実施形態１〜１４のいずれか１の細胞培養インキュベーター。
【０１２４】
実施形態１６．  酸素レベルモジュールが閉鎖環境チャンバー中の酸素レベルを約０．１％から約２１％で維持するようにエンコードされている、実施形態１〜１５のいずれか１の細胞培養インキュベーター。
【０１２５】
実施形態１７．  酸素レベルモジュールが閉鎖環境チャンバー中の酸素レベルを約２％で維持するようにエンコードされている、実施形態１〜１６のいずれか１の細胞培養インキュベーター。
【０１２６】
実施形態１８．  酸素レベルモジュールが閉鎖環境チャンバー中の酸素レベルを約０．１％で維持するようにエンコードされている、実施形態１〜１７のいずれか１の細胞培養インキュベーター。
【０１２７】
実施形態１９．  圧力モジュールが閉鎖環境チャンバー中の圧力を約１ＰＳＩＧから約５ＰＳＩＧで維持するようにエンコードされている、実施形態１〜１８のいずれか１の細胞培養インキュベーター。
【０１２８】
実施形態２０．  湿度モジュールが閉鎖環境チャンバー中の湿度を約８５％で維持するようにエンコードされている、実施形態１〜１９のいずれか１の細胞培養インキュベーター。
【０１２９】
実施形態２１．  コントロールユニットがその中にエンコードされたコンピュータ実行可能コードを持つコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラムプロダクトをさらに含み、前記コンピュータ実行可能コードは二酸化炭素モジュールをエンコードするのに適合しており、前記二酸化炭素モジュールは閉鎖環境チャンバーの二酸化炭素レベルを制御するようにエンコードされている、実施形態１〜２０のいずれか１の細胞培養インキュベーター。
【０１３０】
実施形態２２．  酸素レベルモジュールによりコントロールされるガス入口をさらに含む、実施形態１〜２１のいずれか１の細胞培養インキュベーター。
【０１３１】
実施形態２３．  圧力モジュールによりコントロールされるガス入口をさらに含む、実施形態１〜２２のいずれか１の細胞培養インキュベーター。
【０１３２】
実施形態２４．  湿度モジュールによりコントロールされる水分湿度トレイをさらに含む、実施形態１〜２３のいずれか１の細胞培養インキュベーター。
【０１３３】
実施形態２５．  温度モジュールによりコントロールされる加熱エレメントをさらに含む、実施形態１〜２４のいずれか１の細胞培養インキュベーター。
【０１３４】
実施形態２６．  細胞培養インキュベーターが細胞培養プレートを受け入れるように構成されている、実施形態１〜２５のいずれか１の細胞培養インキュベーター。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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