(57)【要約】  子宮筋腫の治療を必要とする対象において子宮筋腫を治療する方法が提供される。本方法は、対象に、治療有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を投与することによって、対象において子宮筋腫を治療することを含む。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮筋腫の治療を必要とする対象において子宮筋腫を治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を投与することによって、前記対象において前記子宮筋腫を治療することを含む、方法。
【請求項２】
子宮筋腫の治療を必要とする対象における子宮筋腫の治療用である、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を含む組成物。
【請求項３】
子宮筋腫の治療を必要とする対象における子宮筋腫の治療用に同定された医薬の製造における、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）の使用。
【請求項４】
前記ＰＥＤＦが、子宮内器具に装着されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法、組成物または使用。
【請求項５】
前記子宮筋腫が、複数の子宮筋腫を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法、組成物または使用。
【請求項６】
前記対象が、がんに罹患していない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法、組成物または使用。
【請求項７】
前記対象が、子宮筋腫関連不妊症に罹患していない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法、組成物または使用。
【請求項８】
前記対象が、不妊症と診断されていない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法、組成物または使用。
【請求項９】
前記対象が、５０歳以下である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法、組成物または使用。
【請求項１０】
前記対象が、５５歳以下である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法、組成物または使用。
【請求項１１】
前記対象が、妊娠可能である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法、組成物または使用。
【請求項１２】
前記対象が、３５〜５０歳である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法、組成物または使用。
【請求項１３】
前記対象が、３５〜５５歳である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法、組成物または使用。
【請求項１４】
前記子宮筋腫が、壁内筋腫である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法、組成物または使用。
【請求項１５】
前記子宮筋腫が、漿膜下筋腫である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法、組成物または使用。
【請求項１６】
前記子宮筋腫が、子宮頸部筋腫である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法、組成物または使用。
【請求項１７】
前記ＰＥＤＦが、局所投与用の処方である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法、組成物または使用。
【請求項１８】
前記局所投与が、子宮筋腫中への注射によるものである、請求項１７に記載の方法、組成物または使用。
【請求項１９】
前記局所投与が、子宮内器具（ＩＵＤ）に装着されているＰＥＤＦによるものである、請求項１７に記載の方法、組成物または使用。
【請求項２０】
前記ＰＥＤＦが、全身投与用の処方である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法、組成物または使用。
【請求項２１】
前記局所投与が、皮下投与または筋肉内投与である、請求項２０に記載の方法、組成物または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態では、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）および子宮筋腫の治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮筋腫（平滑筋腫）は、女性に最も多く見られる良性腫瘍である。子宮筋腫は、子宮の機能を妨害し、過度の子宮出血、貧血、不妊症、胚の不完全な着床、再発性妊娠喪失、早期分娩、分娩障害、骨盤の不快感および尿失禁を引き起こす。実際、子宮筋腫は、悪性腫瘍と同じ症状を示したり、または悪性腫瘍を隠してしまうこともある。子宮筋腫を除去するために、米国では、毎年およそ２００，０００件の子宮摘出術、３０，０００件の筋腫核出術および何千件もの選択的子宮動脈塞栓術および高密度焦点式超音波療法手順が実施される。これら腫瘍の年間の経済的負担は、５９億ドルから３４４億ドルの間であると推定される。
【０００３】
子宮筋腫は、子宮平滑筋組織（すなわち、子宮筋）から生じる。組織学的に、子宮筋腫は、過剰量の細胞外マトリクス中に埋もれた、異常な平滑筋細胞から構成される良性新生物である。子宮筋腫の驚くべき特徴は、卵巣ステロイドエストロゲンおよびプロゲステロンに対するその依存性である。卵巣活性は、子宮筋腫の成長にとって必須であり、ほとんどの子宮筋腫は、閉経後に縮小する。卵巣活性を抑制し、エストロゲンおよびプロゲステロンの循環レベルを低下させるゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）類似体は、子宮筋腫を縮小させ、関連子宮出血を低減する。
【０００４】
子宮筋腫は、血管形成の不均衡によって引き起こされた可能性が最も高い、十分に血管形成された子宮筋によって囲まれた無血管性コアからなる独特の血管構造を有する。研究者らは、サイズが小さく、内因性血液供給量が最小の前記腫瘍が、周囲の子宮筋の血管密度増大につながる血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）として、血管形成因子を放出し得ると示唆している。これは、次に、小さい子宮筋腫を血管形成化する毛細血管出芽を引き起こし、その成長および拡大を促進する。このような子宮筋の血管密度の増大が、子宮筋腫を有する女性において観察される月経過多の症状の主な原因となり得る。
【０００５】
色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）は、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）スーパーファミリーの非阻害的メンバーであり、初めは神経細胞の増殖を促進、支援することができる神経栄養因子として報告されたものである。その後に、神経栄養活性を有することに加えて、ＰＥＤＦは抗血管形成特性、抗炎症特性および抗酸化特性を有することが見出された。今日にいたるまでに、２つの異なるＰＥＤＦ受容体が提唱されている。すなわち、ＰＥＤＦ神経保護、生存促進機能に関与する８０ｋＤａのＰＥＤＦ推定受容体（ＰＥＤＦ−ＲＮ；ＰＮＰＬＡ２）、およびＰＥＤＦのアポトーシス促進、抗血管形成活性に関与する６０ｋＤａのＰＥＤＦ推定受容体（ＰＥＤＦ−ＲＡ；ラミニン受容体）［Ｍａｎａｌｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｐａｔ  （２０１１）：  ２１，  １２１−１３０、Ｙａｍａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ  （２００５）  ３２０：  ４３７−４４５］である。
【０００６】
ＰＥＤＦは、初めに、網膜色素上皮細胞の培養培地中で発見されたが、神経系、卵巣、子宮、肝臓および血漿など身体全体で広く発現されている。生殖系においてＰＥＤＦは顕著に発現するにもかかわらず、卵巣および子宮におけるその機能に関しては限られたデータしか存在しない［Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  ２００６．  １４７（９）：  ｐ．  ４１７９−９１、Ｃｈｕｄｅｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  （２０１３）  ９８：  Ｅ２５８−２６６、Ｃｈｕｄｅｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  （２０１３）  １９：  ７２−８１、Ｐｏｌｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ，  ２００８．  ７（１３）：  ｐ．  ２０５６−７０、Ｐａｌｍｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，  １９９９．  ２４７（１）：  ｐ．  １４２−７］。これまでの研究では、ＰＥＤＦを腫瘍の治療［Ｍａｎａｌｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｐａｔ  （２０１１）：  ２１、１２１−１３０］のみならず、子宮内膜症において（ＵＳ２０１３００５３３１２）］も使用することが示唆されてきた。
【０００７】
さらなる関連背景技術としては、下記の文献が挙げられる。
米国特許出願公開第２００３０２１６２８６号、
米国特許出願公開第２００７００８７９６７号、
米国特許出願公開第２００４００７１６５９号、
米国特許出願公開第２００９０１１８１９１号、
Ｎｅｌｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．  ［Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３１，  ２０１３  （ｓｕｐｐｌ  ６；  ａｂｓｔｒ  １７３）］、
Ｍａ  ａｎｄ  Ｗａｘｍａｎ  ［Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  （２００８）  ７（１２）：  ３６７０−３６８４］、
Ｊｉａ  ａｎｄ  Ｗａｘｍａｎ  ［Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  （２０１３）  ３３０（２）：２４１−９］、
Ｃｈｕｄｅｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ３９０：８５−９２、
Ｆｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  ６：２７３−２８６  （２００７）。
【発明の概要】
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、子宮筋腫の治療を必要とする対象において子宮筋腫を治療する方法であって、対象に、治療有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を投与することによって、対象において子宮筋腫を治療することを含む、方法が提供される。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、子宮筋腫の治療を必要とする対象における子宮筋腫の治療用である、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を含む組成物が提供される。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、子宮筋腫の治療を必要とする対象における子宮筋腫の治療のために同定された医薬の製造における、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）の使用が提供される。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＥＤＦは、子宮内器具に装着されている。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、子宮筋腫は、複数の子宮筋腫を含む。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象は、がんに罹患していない。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象は、子宮筋腫関連不妊症に罹患していない。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象は、不妊症と診断されていない。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象は、５５歳以下である。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象は、５０歳以下である。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象は、妊娠可能である。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象は、３５〜５５歳である。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象は、３５〜５０歳である。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、子宮筋腫は、壁内筋腫である。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、子宮筋腫は、漿膜下筋腫である。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、子宮筋腫は、子宮頸部筋腫である。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、子宮筋腫は、粘膜下筋腫ではない。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＥＤＦは、局所投与用の処方である。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、局所投与は、子宮筋腫への注射である。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、局所投与は、ＰＥＤＦ装着子宮内器具（ＩＵＤ）によるものである。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＥＤＦは、全身投与用の処方である。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、局所投与は、皮下または筋肉内投与である。
【００３０】
特に定義のない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および／または科学用語は、本発明が属する当業界における通常の知識を有する者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似するか、または等価である方法および材料を、本発明の実施形態の実施または試験において用いることができるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含め本特許明細書が制御するものとする。さらに、材料、方法、および実施例は例示に過ぎず限定を意図するものではない。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態を、添付の図面を参照しながら、単に例示としてここで説明する。ここで図面に特に詳細に参照するが、ここで示す詳細は例示に過ぎず、本発明の実施形態の例示的考察のためだけのものであることを強調する。これに関して、下記説明を図面と共に考慮することで、本発明の実施形態をどのように実施することができるかが当業者に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１のＡ〜Ｂは、Ｅｋｅｒラット子宮平滑筋腫ＥＬＴ−３細胞におけるＰＥＤＦ受容体の発現を示す図である。図１のＡは、ＥＬＴ−３細胞およびＬＨラット顆粒膜（ｇｒａｎｕｌｏｓｅ）細胞株（陽性対照）のそれぞれににおける、ラミニン受容体（ＬＲ）およびＰＮＰＬＡ２のｍＲＮＡ発現を示す代表的なＰＣＲ分析のオートラジオグラフである。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現は、内部対照となる。図１Ｂは、抗ＬＲ抗体および抗ＰＮＰＬＡ２抗体をそれぞれ使用した、ＥＬＴ−３細胞におけるＬＲおよびＰＮＰＬＡ２のタンパク質レベルを示す代表的なウエスタンブロット写真である。
【図２】図２は、ＰＥＤＦが、ＥＬＴ−３細胞においてＥＲＫのリン酸化を活性化することを示すグラフである。ＥＬＴ−３細胞を血清飢餓させ、次いで、ｒＰＥＤＦ（１または１００ｎＭ）またはＴｒｉｓ（対照）を用いて、記載の期間処理した。ｙ軸は、ウエスタンブロット解析によって評価した、一般的なＥＲＫに対するリン酸化ＥＲＫレベルをである。
【図３】図３は、低酸素条件下のＥＬＴ−３細胞において、ＰＥＤＦがＶＥＧＦ  ｍＲＮＡレベルを低下させることを示すグラフである。ＥＬＴ−３細胞を、ＣｏＣｌ２（１００μＭ）の存在下で培養し、次いで、ｒＰＥＤＦ（２０ｎＭ）またはＴｒｉｓ（対照）を用いて処理した。ｙ軸は、ｑＰＣＲによって評価した、ＨＰＲＴ  ｍＲＮＡレベルに対するＶＥＧＦ  ｍＲＮＡレベルである。バーは、３つの独立した実験を表す。各処理と対照との比を、平均±ＳＥＭとしてプロットした（＊  Ｐ＜０．０５）−対照値とは有意に異なる。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｃは、使用したｉｎ  ｖｉｖｏ子宮筋腫マウスモデルを示す。図４Ａは、実験設定の概略図を示す図である。エストロゲンを用いて同期化した（−２日目）雌のＳＣＩＤマウスに、ＥＬＴ−３細胞を側腹部にＳＣ注射した（０日目）。８、１３、２２、２８および２９日目に、子宮筋腫を超音波によって可視化し、測定した。２９日目に、マウスを屠殺し、子宮筋腫を切り出した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａに示した設定に従って処理した代表的なマウスにおいて評価した、子宮筋腫容積および重量を示す図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、図４Ａに示した設定に従って処理した代表的なマウスから得た子宮筋腫の写真である。
【図５】図５のＡ〜Ｃは、子宮筋腫に対する、ｒＰＥＤＦのｉｎ  ｖｉｖｏ治療効果を示す図である。図４Ａに示した設定に従って処理した代表的なマウスを、ｒＰＥＤＦ（１０ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝４）またはＴｒｉｓ（対照；ｎ＝２）を用いて、０日目以降３日に１回処理した。図５のＡおよびＢは、処理したマウスにおける子宮筋腫容積（図５のＡ）および子宮筋腫重量（図５のＢ）を示す棒グラフである。図５のＣは、ｒＰＥＤＦ処理マウスから単離した代表的な子宮筋腫を、Ｔｒｉｓ処理（対照）マウスと比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、そのいくつかの実施形態では、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を含む組成物および子宮筋腫の治療におけるその使用に関する。
【００３４】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明が、その適用において、以下の説明に記載されるか、または実施例によって例示される詳細に限定されないことを理解するべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実践もしくは遂行されることが可能である。
【００３５】
子宮筋腫（平滑筋腫）は、女性に最も多く見られる良性腫瘍である。子宮筋腫は、子宮の機能を妨害し、過度の子宮出血、貧血、不妊症、胚の不完全な着床、再発性妊娠喪失、早期分娩、分娩障害、骨盤不快感および尿失禁を引き起こし、実際、子宮筋腫は、悪性腫瘍と同じ症状を示したり、または悪性腫瘍を隠してしまうこともある。卵巣の活性を抑制し、エストロゲンおよびプロゲステロンの循環レベルを低下させるゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）類似体は、子宮筋腫を縮小させ、関連子宮出血を低減させる。
【００３６】
現在利用可能な子宮筋腫の治療は、主に、外科的処置からなる。薬理学的選択肢は、ホルモン治療であるが、これは、一時的には役立ち得るが、その効果は制限されており、例えば、受胎可能ではない。
【００３７】
ＰＥＤＦは、身体中で遍在的に発現される、神経栄養特性、抗血管形成特性、抗炎症特性および抗酸化特性を持つ多機能因子である。生殖系における顕著な発現にもかかわらず、卵巣および子宮におけるＰＥＤＦ機能に関するデータは限られている。これまでの研究では、ＰＥＤＦの直接的な抗腫瘍形成効果および抗血管形成効果によって、腫瘍の治療におけるＰＥＤＦの使用が示唆されてきた。しかし、子宮筋腫の保護または治療におけるＰＥＤＦの役割は開示されていない。
【００３８】
本発明の実施化にあたり、本発明者らは、ＰＥＤＦの投与が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて子宮筋腫細胞の機能に影響を及ぼし、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて子宮筋腫の成長を減衰化し得ることをここで明らかにした。これらは、子宮筋腫の治療におけるＰＥＤＦの使用を示唆するものである。
【００３９】
本明細書で以下に例示されるように（実施例１並びに図１のＡ〜Ｂ、図２および図３）、本発明者らは、ラット子宮筋腫ＥＬＴ−３細胞が、ＰＥＤＦ受容体ＰＮＰＬＡ２およびラミニン受容体を発現し、組換えＰＥＤＦ（ｒＰＥＤＦ）によって一旦刺激されると、ストレスおよびアポトーシスシグナル伝達の活性化を示すＥＲＫのリン酸化およびＶＥＧＦ発現の低減を示すことを見出した。さらに、本発明者らは、子宮筋腫マウスモデルを確立し（実施例２、図４Ａ〜図４Ｃ）、ｒＰＥＤＦの投与が、子宮筋腫容積および重量を大幅に低減することを示した（実施例２、図５のＡ〜Ｃ）。
【００４０】
したがって、本発明の態様によれば、子宮筋腫の治療を必要とする対象において子宮筋腫を治療する方法であって、対象に、治療有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を投与することによって、対象において子宮筋腫を治療することを含む方法が提供される。
【００４１】
本発明の別の態様によれば、子宮筋腫の治療を必要とする対象における子宮筋腫の治療用である、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を含む組成物が提供される。
【００４２】
本発明のさらに別の態様によれば、子宮筋腫の治療を必要とする対象における子宮筋腫の治療のために同定された医薬の製造における、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）の使用が提供される。
【００４３】
「色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）」はまた、セルピンＦ１、ＥＰＣ−１、細胞増殖誘導遺伝子３５タンパク質およびＰＩＧ３５としても知られる。特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦタンパク質とは、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｍ７６９７９（配列番号１）、ＮＭ＿００２６１５（配列番号２）またはＮＰ＿００２６０６（配列番号３）で提供されるものなどの、ヒトタンパク質を指す。ＰＥＤＦは、本発明のいくつかの実施形態によれば、子宮筋腫の成長の減衰化において機能的である。ＰＥＤＦはまた、少なくともＰＥＤＦ受容体の活性化、ＶＥＧＦシグナル伝達に対する干渉、並びに生存促進シグナル、抗血管形成シグナル、抗炎症シグナル、抗腫瘍形成シグナルおよび／または抗酸化シグナルの誘導において機能を有し得る。本発明で使用するためのＰＥＤＦの定量方法は、当業界で周知である（そのいくつかは実施例に記載されており、例えば、ＥＲＫリン酸化に対する効果、低酸素条件下での子宮筋腫細胞におけるＶＥＧＦ発現に対する効果、子宮筋腫動物モデルにおける子宮筋腫容積、重量および／または増殖に対する効果などである）。
【００４４】
ＰＥＤＦという用語は、非修飾または修飾ＰＥＤＦを指す。特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦは、リン酸化ＰＥＤＦである。ＰＥＤＦは、３つの異なる部位でリン酸化され、そのうちＳｅｒ２４およびＳｅｒ１１４はカゼインキナーゼ２（ＣＫ２）により、Ｓｅｒ２２７はタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）によりリン酸化される。具体的には、三リン酸化ＰＥＤＦの使用が企図される。米国特許出願公開第２００８０２７４９６７号は、ＣＫ２およびＰＫＡを用いたＰＥＤＦのリン酸化を教示しており、当該公報の内容は、本明細書に完全に組み込まれる。ＰＥＤＦは、組換え型（真核生物発現系または原核生物発現系のものであり、発現系には、酵母系、植物系、昆虫系、哺乳動物系または細菌系が含まれるが、これらに限定されるものではない）でもよいし、Ｙａｎａｇｉｓｈｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６  Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ９１：２４４７−２４５０に記載のように精製したものでもよい。また、ＰＥＤＦは、例えば、Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ  Ｉｎｃ．から市販されている。
【００４５】
本発明はまた、全長ＰＥＤＦの生物活性を保持するＰＥＤＦペプチドの使用、即ち、子宮筋腫の治療のための使用も企図し、上記使用とは、例えば、米国特許出願公開第２００９００６９２４１号、米国特許出願公開第２０１２０２４５０９７号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４０２３００７号およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３１８４９８６号に開示されたものであり、これらは、参照により本明細書に完全に組み込まれるものとする。
【００４６】
本明細書で使用する、「ＰＥＤＦ受容体」、「ＰＥＤＦＲ」または「ＰＥＤＦ−Ｒ」とは、細胞表面分子であって、ＰＥＤＦと結合し、ＦａｓＬ経路、ＣＤ９５経路、Ｒａｓ経路、Ｒａｆ経路、Ｍｅｋｋ１経路、Ｍｅｋ経路、Ｅｒｋ経路、ＪＮＫ経路、ＩＰ３経路、Ａｋｔ経路、ＩＫＫ経路、ＮＦ−カッパ−Ｂ経路、ＰＬＡ２経路、およびＰＰＡＲ−γ経路などを介するシグナル伝達を開始するものを指す。
【００４７】
特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦ受容体は、ＰＥＤＦ−ＲＮと呼ばれる８０ｋＤａのＰＥＤＦ受容体であり、これは、ＰＥＤＦ神経保護機能や、生存促進機能に関与するＰＮＰＬＡ２である。
【００４８】
さらなる、または代替的な実施形態によれば、ＰＥＤＦ受容体は、ＰＥＤＦ−ＲＡと呼ばれる、６０ｋＤａのＰＥＤＦ受容体であり、これはＰＥＤＦアポトーシス促進活性や、抗血管形成活性に関与するラミニン受容体である。
【００４９】
特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦは、ＰＥＤＦ−ＲＮまたはＰＮＰＬＡ２と呼ばれる８０ｋＤａのＰＥＤＦ受容体を介してその機能を発揮する。
【００５０】
用語「治療する」とは、病理（疾患、障害、もしくは病態）の発達を阻害または停止させること、および／または病理の軽減、寛解、もしくは退縮を引き起こすことを指す。当業者であれば、様々な方法およびアッセイを用いて病理の発達を評価し、同様に、様々な方法およびアッセイを用いて、病理の軽減、寛解または退縮を評価可能であることを理解できる。特定の実施形態では、治療は、予防または予防することを指す。
【００５１】
本明細書で使用する用語「予防する」とは、発症のリスクを有し得るが、発症したとまだ診断されていない対象において、疾患、障害または病態が生じないようにすることを指す。特定の実施形態によれば、方法または使用は、薬剤（すなわち、性腺毒性を誘導する薬剤）または子宮誘導毒性を示す薬剤、例えば、タモキシフェン、を当該対象に投与することをさらに含む。
【００５２】
本明細書で使用する、語句「子宮筋腫の治療を必要とする対象」とは、子宮筋腫と診断されている哺乳動物の雌の対象（例えば、ヒト）を指す。特定の実施形態では、この用語は、子宮筋腫を発生するリスクにある個体を包含する。対象は、典型的には生殖年齢にあるが、生殖年齢未満または生殖年齢を超えた年齢の雌の対象の治療において用いることもできる。獣医学的使用も企図される。
【００５３】
本明細書で使用する用語「生殖年齢」とは、対象が自然に、または介入により妊娠可能な有性生殖を行うことができる年齢を指す。特定の実施形態によれば、対象は、生殖年齢にある。
【００５４】
特定の実施形態によれば、対象は閉経前の期間にある。ヒトにおいては、閉経は、１２カ月にわたり月経期間がない状態と定義され、多くの女性の場合、閉経後の期間は４５〜５５歳に始まる。
【００５５】
特定の実施形態によれば、対象は、５５歳以下である。
【００５６】
特定の実施形態によれば、対象は、５０歳以下である。
【００５７】
特定の実施形態によれば、対象は、３５〜５５歳である。
【００５８】
特定の実施形態によれば、対象は、３５〜５０歳である。
【００５９】
特定の実施形態によれば、対象は、がんに罹患していない。
【００６０】
子宮筋腫（筋腫症または平滑筋腫とも呼ばれる）は、過剰量の細胞外マトリクス中に埋もれた、異常な平滑筋細胞から構成される良性の非癌性新生物である。
【００６１】
特定の実施形態によれば、用語「子宮筋腫」、「筋腫」は、複数の子宮筋腫を含む。
【００６２】
子宮筋腫を有する対象は、通常、主に病変の位置およびその大きさに応じて変わる以下の症状を示す。
【００６３】
主要な症状として、異常な婦人科出血、重いまたは有痛性の生理、腹部不快感または腹部膨満、有痛性排便、背部痛、尿意頻数または尿閉が挙げられ、いくつかの稀な症例として、貧血や不妊症が挙げられる。
【００６４】
特定の実施形態によれば、対象は、子宮筋腫関連不妊症を患っていない。
【００６５】
特定の実施形態によれば、対象は、不妊症と診断されていない。
【００６６】
特定の実施形態によれば、対象は、妊娠可能である。
【００６７】
妊娠中の場合、子宮筋腫は流産、出血、早期分娩または胎児の位置の障害の原因となり得る。
【００６８】
特定の実施形態によれば、子宮筋腫は、壁内筋腫である。
【００６９】
本明細書で使用する用語「壁内筋腫」とは、子宮壁（すなわち、ミオメトリウム）の内側に局在する子宮筋腫を指す。
【００７０】
特定の実施形態によれば、子宮筋腫は、漿膜下筋腫である。
【００７１】
本明細書で使用する用語「漿膜下筋腫」とは、子宮の外層中に局在する子宮筋腫を指す。
【００７２】
特定の実施形態によれば、子宮筋腫は、子宮頸部筋腫である。
【００７３】
本明細書で使用する用語「子宮頸部筋腫」とは、子宮頸部の壁中に局在する子宮筋腫を指す。
【００７４】
特定の実施形態によれば、子宮筋腫は、粘膜下位置に局在しない。
【００７５】
本明細書で使用する用語「粘膜下子宮筋腫」とは、子宮内膜に隣接する子宮腔の内側に局在する子宮筋腫を指す。
【００７６】
特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦは、単独で、または手術およびホルモン療法（例えば、ＧｎＲＨ）などの子宮筋腫を治療するための他の確立された、もしくは実験的な治療レジメンと組み合わせて使用することができる。
【００７７】
ＰＥＤＦは、それ自体で、または好適な担体もしくは賦形剤のそれぞれもしくは両方と混合した医薬組成物として、対象に投与することができる。
【００７８】
本明細書で使用する、「医薬組成物」とは、本明細書に記載の活性成分を、生理的に好適な担体および賦形剤など他の化学的成分と共に含む製剤を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【００７９】
ここで、用語「活性成分」とは、生物学的効果を生じうる得るＰＥＤＦを指す。
【００８０】
以降、「生理的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」とは、互換使用可能な語句であって、生物に対して顕著な刺激を引き起こさず、投与される化合物の生物活性および特性を無効化しない担体または希釈剤を指す。補助剤は、これらの語句に含まれる。
【００８１】
ここで、用語「賦形剤」とは、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン型、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油ならびにポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８２】
薬物の処方および投与のための技術は、参照により本明細書に組み込まれる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，最新版に見出すことができる。
【００８３】
ＰＥＤＦは、子宮内器具（ＩＵＤ）に装着されていてもよい。特定の実施形態下では、このような配置によって、（例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて）ＰＥＤＦの持続放出が可能になる。
【００８４】
好適な投与経路は、例えば、経口投与、直腸投与、経粘膜投与、特に、経鼻投与、経腸送達または非経口送達、例えば、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射ならびにくも膜下注射、直接脳室内注射、例えば、右心室腔または左心室腔への心臓内注射、共通冠動脈注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射、または眼内注射を含んでもよい。
【００８５】
特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦは、皮下に投与される（または投与のために処方される）。
【００８６】
特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦは、筋肉内に投与される（または投与のために処方される）。
【００８７】
特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦは、静脈内に投与される（または投与のために処方される）。
【００８８】
あるいは、全身よりもむしろ局所法で、例えば、画像誘導法（例えば、超音波）などによる、患者の組織領域（例えば、性腺）への医薬組成物の直接の注射によって医薬組成物を投与してもよい。
【００８９】
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物を、当業界で周知のプロセスにより、例えば、公知の混合プロセス、溶解プロセス、顆粒化プロセス、糖衣錠作製プロセス、微粒子化プロセス、乳化プロセス、カプセル化プロセス、捕捉化プロセス凍結乾燥プロセスなどの手段により製造することができる。
【００９０】
かくして、本発明のいくつかの実施形態における使用のための医薬組成物は、賦形剤および補助剤を含む、活性成分の製剤への調製を容易にし、薬学的に使用可能な製剤をもたらす１種または複数種の生理的に許容される担体を用いて、公知の方法で処方することができる。適切な処方は、選択される投与経路に依存する。
【００９１】
注射用には、医薬組成物の活性成分を、水性溶液、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩緩衝液などの生理的に適合可能な緩衝液の溶液として処方することができる。経粘膜投与用には、透過させようとする障壁に適した浸透剤が処方に用いられる。そのような浸透剤は、当業界で一般的に知られている。
【００９２】
経口投与用には、活性化合物と当業界で周知の薬学的に許容される担体とを混合することによって、医薬組成物を容易に処方することができる。そのような担体は、医薬組成物を患者による経口摂取のための錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などへの処方を可能にする。経口使用のための薬理学的製剤は、固体賦形剤を用いて作製可能であり、場合により、得られる混合物を粉砕し、得られた顆粒に必要に応じて好適な補助剤を添加した後、混合物を加工して、錠剤または糖衣錠のコアを得ることができる。好適な賦形剤は、特に充填剤であり、充填剤は、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖、もろこしデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウムなどのセルロース製剤、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理的に許容されるポリマーである。必要に応じて崩壊剤を添加することができ、その例として、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウム、などが挙げられる。
【００９３】
糖衣錠のコアは、好適なコーティングと共に提供される。この目的のために、濃縮糖溶液を用いることができ、所望により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい。染料または色素を、識別のため、または活性化合物用量の異なる組合せを特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加することができる。
【００９４】
経口的に用いることができる医薬組成物は、ゼラチンから作られた押し込み式カプセルならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤とから作られた軟質密封カプセルを含む。押し込み式カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および場合により安定化剤、と混合した活性成分を含有してもよい。軟質カプセル中では、活性成分を、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解または懸濁することができる。さらに、安定化剤を添加することができる。経口投与のための全ての処方は、選択された投与経路に好適な用量にあるべきである。
【００９５】
口腔内投与用には、組成物は、公知の方法で処方した錠剤またはロゼンジ剤の形態を取ってもよい。
【００９６】
鼻吸入による投与用には、本発明のいくつかの実施形態における使用のための活性成分を、好適な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンもしくは二酸化炭素を使用した加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー形状で、容易に送達される。加圧式のエアロゾルの場合、一定量を送達するためのバルブを提供することにより、用量単位を決定することができる。当該化合物と、ラクトースまたはスターチなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含有する、ディスペンサー中で使用するための、例えばゼラチンからなるカプセルやカートリッジに処方することができる。
【００９７】
本明細書に記載の医薬組成物を、例えば、ボーラス注射または連続輸注による非経口投与用に処方することができる。注射用の処方は、単位用量形態、例えば、アンプルに封入して、または複数用量容器で、所望により保存剤を添加して提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳液であってもよく、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの処方剤を含有してもよい。
【００９８】
非経口投与用の医薬組成物は、水溶性形態の活性製剤の水性溶液を含む。さらに、活性成分の懸濁液を、適切な油性または水系の注射用懸濁液として調製することができる。好適な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルなどの合成脂肪酸エステル、トリグリセリドまたはリポソームを含む。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。場合により、懸濁液はまた、好適な安定化剤、または活性成分の溶解度を高めて高濃縮溶液の調製を可能にするための薬剤を含有してもよい。
【００９９】
あるいは、活性成分は粉末形態でもよく、使用前に好適なビヒクル、例えば、滅菌済みでパイロジェンを含まない水系溶液を用いて構成させることができる。
【０１００】
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物を、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの公知の坐剤基剤を用いて、坐剤または停留浣腸などの直腸用組成物に処方することもできる。
【０１０１】
本発明の範囲内での使用に好適な医薬組成物は、意図される目的を達成するのに有効な量の活性成分を含有する組成物を含む。
【０１０２】
本明細書で用いられる語句「治療有効量」とは、障害（すなわち、子宮筋腫）の予防、軽減、もしくは改善、または治療される対象の生存期間を延長するのに有効な活性成分（すなわち、ＰＥＤＦ）の量を指す。
【０１０３】
特に、本明細書の提供する詳細な開示に照らせば、当業者の能力の範囲内において治療有効量を決定することが十分可能である。
【０１０４】
本発明の方法において用いられる製剤について、治療有効量または用量は、最初に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび細胞培養アッセイから見積もることができる。例えば、所望の濃度または力価を達成するための用量を、動物モデルにおいて処方することができる。そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【０１０５】
本明細書に記載の活性成分の毒性および治療効能を、（以下の実施例に記載のように）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、培養細胞中で、または実験動物によって、標準的な薬学的手順によって決定することができる。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび細胞培養アッセイならびに動物試験から得られたデータを、ヒトにおける使用のための用量範囲を処方する際に用いることができる。用量は、用いられる剤形および利用する投与経路に応じて変化させてもよい。医師はそれぞれ、患者の病態を鑑みて、正確な処方、投与経路および用量を選択することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９７５，  “Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”、Ｃｈ．  １  ｐ．１を参照されたい）。
【０１０６】
投与量および投与間隔を個別に調整して、生物学的効果を誘導するか、または抑制するのに十分な活性成分のレベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）を提供することができる。ＭＥＣは、それぞれの製剤について変化するが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのデータから見積もることができる。ＭＥＣを達成するのに必要な用量は、個体の特徴および投与経路に依存する。検出アッセイを用いて、血漿濃度を決定することができる。
【０１０７】
治療される病態の重症度および応答性に応じて、投薬は単回または複数回のいずれであってもよく、治療過程は、数日から数週間、または治癒が達成されるまで、または疾患状態の縮小が達成されるまで続く。
【０１０８】
ＰＥＤＦの例示的用量を、以下に提供する：
０．０２〜０．４ｍｇ／ｋｇ／日、０．１６２〜０．３２ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１〜０．２ｍｇ／ｋｇ／日、０．１〜０．４ｍｇ／ｋｇ／日、０．２〜０．４ｍｇ／ｋｇ／日または０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇ／日などである。
【０１０９】
特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦは０．０２〜０．４ｍｇ／ｋｇ／日の用量範囲内で投与される。
【０１１０】
別の特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦは０．１６２〜０．３２ｍｇ／ｋｇ／日の用量範囲内で投与される。
【０１１１】
投与される組成物の量は、勿論、治療される対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方する医師の判断などに依存する。
【０１１２】
本発明の組成物を、必要に応じて、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有してもよい、パックまたはディスペンサー装置、例えば、ＦＤＡ認可済キットとして提供することができる。パックは、例えば、ブリスターパックなどの、金属またはプラスチックホイルを含んでもよい。パックまたはディスペンサー装置に、投与のための指示書を添付してもよい。パックまたはディスペンサーには、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関が規定した形態で容器と関連した通知書が収容されていてもよく、当該通知書は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与が機関によって認可されていることを示す。そのような通知書は、例えば、処方薬について米国食品医薬品局により認可されたラベルまたは認可された製品挿入物のものであってもよい。上述したように、適合する薬学的な担体を用いて処方した本発明の製剤を含む組成物を調製し、適切な容器に入れ、示された病態の治療のためであるというラベルを付けることもできる。
【０１１３】
本明細書で使用する用語「約」とは、±１０％を指す。
【０１１４】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびその同根語は、「含むが、限定されるものではない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味する。
【０１１５】
用語「からなる」は、「含み、それに限定される」を意味する。
【０１１６】
用語「から実質的になる」は、組成物、方法または構造がさらなる成分、ステップおよび／または部分を含んでもよいことを意味するが、さらなる成分、ステップおよび／または部分が特許請求された組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にのみである。
【０１１７】
本明細書で使用する、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈において別途明確に指示しない限り、複数の参照を含む。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１つの化合物（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」は、その混合物を含む、複数の化合物を含んでもよい。
【０１１８】
本出願を通して、本発明の様々な実施形態を、範囲形式で提示することができる。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔性のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定と解釈するべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、全ての可能なサブ範囲ならびにその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものと考えるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのサブ範囲、ならびにその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、３、４、５、および６を具体的に開示したものと考えるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【０１１９】
本明細書において数値範囲を示す場合、それは常にその示した範囲内の任意の数値（小数または整数）を含むことを意味する。第１の指示数と第２の指示数との「間の範囲」という語句、および第１の指示数「から」第２の指示数「までの範囲」という語句は、本明細書では互換使用可能であり、第１および第２の指示数ならびにその間の全ての小数および整数を含むことを意味する。
【０１２０】
本明細書で使用する用語「方法」とは、所与の任務を達成するための様式、手段、技術および手順を意味し、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の当業界の従事者にとって公知の様式、手段、技術および手順、または公知の様式、手段、技術および手順から容易に開発される様式、手段、技術および手順を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２１】
特定の配列表を参照する場合、そのような参照は、その相補配列に実質的に対応する配列も包含し、軽微な配列の変異、例えば、シーケンシングの誤り、クローニングの誤り、または塩基置換、塩基欠失もしくは塩基付加をもたらす他の改変による変異も含まれることを理解されたい。当該変異の頻度は５０ヌクレオチドに１個未満、あるいは、１００ヌクレオチドに１個未満、あるいは、２００ヌクレオチドに１個未満、あるいは、５００ヌクレオチドに１個未満、あるいは、１０００ヌクレオチドに１個未満、あるいは、５，０００ヌクレオチドに１個未満、あるいは、１０，０００ヌクレオチドに１個未満とする。
【０１２２】
明確さを目的として、個別の実施形態の文脈の中で説明されている本発明の複数の特徴は、１つの実施形態の中に組み合わせて設けることもでき、上の説明は、このような組合せが明示的に記載されているものと解釈すべきことを理解されたい。逆に、簡潔さを目的として、１つの実施形態の文脈の中で説明されている本発明の様々な特徴は、個別に設ける、または適切な部分組合せとして設ける、または本発明の任意の他の説明されている実施形態において適切に設けることもでき、上の説明は、このような個別の実施形態が明示的に記載されているものと解釈すべきである。様々な実施形態の文脈の中で説明されている特徴は、実施形態がそれらの要素なしでは動作・機能しない場合を除いて、それらの実施形態の本質的な特徴とはみなさないものとする。
【０１２３】
上記および添付の特許請求の範囲に記載された本発明の種々の実施形態および態様は、以下の実施例において実験的に支持される。
【０１２４】
上記説明と共に、本発明のいくつかの実施形態を限定することなく例示する実施例を、以下に参照する。
【０１２５】
実施例
一般に、本明細書で用いられる命名法および本発明で用いられる実験手順は、分子技術、生化学的技術、微生物学的技術および組換えＤＮＡ技術を含む。そのような技術は、文献中に余すところなく説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”,  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”,  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．  Ｍ．，  ｅｄ．  （１９９４）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”,  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ  （１９８９）、Ｐｅｒｂａｌ，  “Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”,  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”,  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ）  “Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”,  Ｖｏｌｓ．  １−４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第４，８０１，５３１号、米国特許第５，１９２，６５９号および米国特許第５，２７２，０５７号に記載の方法；“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”,  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．  Ｅ．，  ｅｄ．  （１９９４）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”,  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．  Ｅ．，  ｅｄ．  （１９９４）、Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ），  “Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  （８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，  Ｎｏｒｗａｌｋ，  ＣＴ  （１９９４）、Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ  （ｅｄｓ），  “Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”,  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８０）；利用可能なイムノアッセイは、特許文献および科学文献に広く記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、米国特許第３，８３９，１５３号、米国特許第３，８５０，７５２号、米国特許第３，８５０，５７８号、米国特許第３，８５３，９８７号、米国特許第３，８６７，５１７号、米国特許第３，８７９，２６２号、米国特許第３，９０１，６５４号、米国特許第３，９３５，０７４号、米国特許第３，９８４，５３３号、米国特許第３，９９６，３４５号、米国特許第４，０３４，０７４号、米国特許第４，０９８，８７６号、米国特許第４，８７９，２１９号、米国特許第５，０１１，７７１号および米国特許第５，２８１，５２１号を参照されたい；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”,  Ｇａｉｔ，  Ｍ．  Ｊ．，  ｅｄ．  （１９８４）、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”,  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．，  ｅｄｓ．  （１９８５）、“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”,  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．，  Ｅｄｓ．  （１９８４）、“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”,  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．  Ｉ．，  ｅｄ．  （１９８６）、“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”,  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８６）、“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”,  Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．，  （１９８４）,  “Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”、Ｖｏｌ．  １−３１７，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”,  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０）、Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”,  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９６）を参照されたい。これらの全ては、参照により、本明細書に完全に記載されたように組み込まれる。他の一般的な参考文献は、本明細書を通して提供する。これらに記載の手順は、当業者には周知であると考えられ、読者の便宜のために提供する。これらに含まれる情報は全て、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【０１２６】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏの子宮筋腫に対するＰＥＤＦの効果
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養系を使用して、子宮筋層細胞の増殖の減衰における組換えＰＥＤＦ（ｒＰＥＤＦ）の有効性を試験した。子宮筋層細胞：ラットＥＬＴ−３細胞；げっ歯類初代細胞；ＨｕＬＭ；ＵＴＳＭ；初代子宮平滑筋細胞、正常、ヒト（ＡＴＣＣ（登録商標）ＰＣＳ−４６０−０１１（商標））またはその他。
【０１２７】
試験した有効性パラメータは、以下の通りである：
（Ａ）ＰＥＤＦ受容体の特性決定、
（Ｂ）ストレスおよびアポトーシスシグナル伝達を仲介する既知のＰＥＤＦ基質であるＰ３８、ＥＲＫおよびＪＮＫに対する、ｒＰＥＤＦの効果を評価することによる、ｒＰＥＤＦ活性のモニタリング、および
（Ｃ）細胞増殖およびアポトーシス誘導に対する、ｒＰＥＤＦの有効性の評価、
（Ｄ）ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの低減に対する、ｒＰＥＤＦの有効性の評価。
【０１２８】
材料および方法
ＲＮＡの単離、逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）− ＥＬＴ−３細胞を、（Ｈｏｗｅ  ＳＲ，ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．  １９９５；  １４６（６）：１５６８−１５７９に記載の）１０％ＣＳ−ＦＢＳ  ＤＦ８培地中で培養した。総ＲＮＡをＥＬＴ−３細胞から、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を製造業者の指示書に従って使用して単離し、Ｎａｎｏ−Ｄｒｏｐ分光光度計（ＮＤ−１０００；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて定量した。大容量ｃＤＮＡ逆転写酵素キット（米国、カリフォルニア州、カールスバッド、Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  （ＡＢＩ）社製）およびランダムプライマー（ＡＢＩ社製）を使用するＲＴによって第１鎖ｃＤＮＡを生成した。ＰＣＲについては、ＬＲ、ＰＮＰＬＡ２およびＧＡＰＤＨ（対照）に対する特異的プライマーを使用して、ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）混合物（米国、ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ社製）によって、ＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物（４０×サイクル、Ｔｍ＝５６）を、１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離し、臭化エチジウム染色によって可視化した。陽性対照として、ＬＨラット顆粒膜細胞株を使用した。
【０１２９】
ｑＰＣＲ：  ｍＲＮＡの発現のレベルの変化を、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（米国、カリフォルニア州、フォスターシティ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で、１５ｎｇのｃＤＮＡおよび特異的プライマーと共にＳＹＢＲグリーン試薬（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、米国、カリフォルニア州、カールスバッド、ＡＢＩ社製；４０×サイクル）によって検出した。
【０１３０】
【表１】
2018502061.tif 000003
【０１３１】
ウエスタンブロット分析 − ＥＬＴ−３細胞を、冷えた溶解バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．２％Ｉｇｅｐａｌ；Ｓｉｇｍａ社製）中でホモジェナイズし、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。タンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、１０％、イスラエル国、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により分離した。分離したタンパク質を、ミニタンク移動ユニット（ＴＥ２２、英国、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）中のニトロセルロース膜（ドイツ連邦共和国、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧｍｂＨ製）上に移した。近似分子量を、予め染色しておいたタンパク質標準品（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）の移動度との比較により決定した。ブロットは、５％脱脂乳（米国、ニューヨーク州、Ａｌｂａ社製）を含有するＴＢＳＴ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）中で１時間ブロッキングし、続いて、一次抗体：抗ＰＮＰＬＡ２抗体（ＡＢＤ６６、米国、カリフォルニア州、テメキュラ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、抗ラミニン受容体（ＬＲ）抗体（ｓｃ−２０９７９；米国、カリフォルニア州、サンタクルズ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗ホスホＥＲＫ抗体および一般的なＥＲＫ抗体（それぞれ、Ｍ９６９２およびＭ５６７０；米国、ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ社製）と共に４℃で一晩インキュベートした。ブロットを、ＴＢＳＴ中で３回洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ結合二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。免疫反応性のバンドを、製造業者の指針に従って、増強化学発光（ＥＣＬ；米国、イリノイ州、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により可視化した。タンパク質バンドの強度を、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ソフトウェア（ＮＩＨ）により定量した。
【０１３２】
ＥＲＫのリン酸化の分析 − ＥＬＴ−３細胞を、ＤＦ８フェノール不含飢餓培地（０．１％  ＣＳ−ＦＢＳ）中で１６時間インキュベートし、次いで、ｒＰＥＤＦ（１または１００ｎＭ）またはＴｒｉｓ（対照）を用いて、短時間（１５、３０、６０および１２０分）刺激した。細胞を溶解し、そのタンパク質を、抗ホスホＥＲＫ抗体を用い、負荷対照として一般的なＥＲＫを使用して、上記のようにウエスタンブロットした。
【０１３３】
ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ発現の分析 − ＥＬＴ−３細胞を、ＣｏＣｌ２（１００μＭ）を添加したフェノール不含およびインスリン不含ＤＦ８培地中で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、さらなる２４時間のインキュベーションのために、新鮮なＣｏＣｌ２およびｒＰＥＤＦ（２０ｎＭ）またはＴｒｉｓを添加した新鮮なフェノール不含およびインスリン不含飢餓培地（０．１％  ＣＳ−ＦＢＳ）で、培養培地を交換した。特異的プライマーを用いるｑＰＣＲ分析によって、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡのレベルの変化を測定し、上記のようにＨＰＲＴを用いて較正した。
【０１３４】
結果
ＰＥＤＦ受容体であるＰＮＰＬＡ２は、子宮筋腫細胞において発現されている
本発明者らはこれまでに、卵巣におけるＰＥＤＦ活性を特徴付けており、顆粒膜細胞の初代細胞および細胞株の両方がＰＥＤＦ受容体を発現すること、およびＰＥＤＦがＶＥＧＦ活性を直接調節し得ることを見い出した（Ｂａｒ−Ｊｏｓｅｐｈ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ．  ２０１４；  １０２（３）：８９１−８９８  ｅ８９３）。Ｅｋｅｒラット子宮平滑筋腫ＥＬＴ−３細胞におけるＰＥＤＦ受容体、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質２（ＰＮＰＬＡ２）およびラミニン受容体（ＬＲ）の発現を、タンパク質およびｍＲＮＡレベルで評価した。図１のＡ〜Ｂにおいて示されるように、ＥＬＴ−３細胞は、ＰＮＰＬＡ２およびＬＲのｍＲＮＡ（図１のＡ）およびタンパク質（図１のＢ）の両方を発現する。
【０１３５】
外因性ＰＥＤＦは、子宮筋腫細胞中のＥＲＫを活性化した
ＥＬＴ−３細胞がＰＥＤＦ受容体を発現したことが示されたので、ＰＥＤＦ受容体の、組換えＰＥＤＦ（ｒＰＥＤＦ）シグナルをＥＬＴ−３細胞に伝達する能力を調べた。この目的で、血清飢餓させたＥＬＴ−３細胞を、１ｎＭまたは１００ｎＭのｒＰＥＤＦを用いて種々の期間刺激した。結果は、ｒＰＥＤＦによる刺激が、ＰＥＤＦの基質の１種であるＥＲＫの活性化を誘導することを示し、これはｒＰＥＤＦ処理から１５分後に始まるＥＲＫのリン酸化の延長によって示されている（図２）。
【０１３６】
外因性ＰＥＤＦは、子宮筋腫細胞において低酸素条件下でＶＥＧＦ発現を調節した
低酸素状態は、子宮筋腫の特徴の１つである。したがって、ｒＰＥＤＦがＶＥＧＦ発現を調節する能力を、ＣｏＣｌ２を用いた低酸素条件下で調べた。
【０１３７】
ＥＬＴ−３細胞を、ＣｏＣｌ２（１００μＭ）を添加したフェノール不含およびインスリン不含ＤＦ８培地中で２４時間インキュベートした。次いで、さらなる２４時間のインキュベーションのために、培養培地を、新鮮なＣｏＣｌ２およびｒＰＥＤＦ（２０ｎＭ）またはＴｒｉｓを添加した新鮮なフェノール不含およびインスリン不含飢餓培地（０．１％  ＣＳ−ＦＢＳ）と交換した。特異的プライマーを用いるｑＰＣＲ分析によって、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡのレベルの変化を測定し、ＨＰＲＴを用いて較正した。バーは、３つの独立した実験を表す。
【０１３８】
結果は、ｒＰＥＤＦを用いる刺激は、低酸素誘導されたＥＬＴ−３細胞においてＶＥＧＦ  ｍＲＮＡレベルを有意に低下させることを示した（図３）。
【０１３９】
これらをまとめると、ラット子宮筋腫細胞は、ＰＥＤＦ受容体を発現し、ラット子宮筋腫細胞は、一度ｒＰＥＤＦによって刺激されると、ＥＲＫのリン酸化およびＶＥＧＦの発現低下を示す。
【実施例２】
【０１４０】
ＰＥＤＦは、動物モデルにおいて子宮筋腫の成長の減衰において効果的である
げっ歯類子宮筋腫モデル：  Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎｓ雌ラットまたは免疫不全ＳＣＩＤマウスにおいて、ＥＬＴ−３細胞の注射によって子宮筋腫の発生を誘導する。誘導したげっ歯類を無作為に２群に分けて、組換えＰＥＤＦ（ｒＰＥＤＦ）処理の有効性を評価する：対照（ＴＲＩＳ）および処理（ｒＰＥＤＦ）群。子宮筋腫を切り出し、秤量し、保存する。保存された腫瘍および臓器を病理評価および生化学的分析に付す。
【０１４１】
材料および方法
雌のＳＣＩＤマウスを、エストロゲン（−２日目に２μｇ）を用いて同期化させ、１５０万個のＥＬＴ−３細胞（１００μｌ）（０日目）を用いて側腹部にＳＣ注射した（Ｈａｌｄｅｒ  ＳＫ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ．  ２０１４；  ２１（９）：１１０８−１１１９；およびＶａｅｚｙ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ．  ２０００；  １８３（１）：６−１１に記載のとおり）。マウスを、ｒＰＥＤＦ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＴｒｉｓ（対照）を用いて、０日目以降、３日に１回処理した。８、１３、２２、２８および２９日目に、子宮筋腫を、超音波（ＵＳ；Ｖｅｖｏ  ２１００；カナダ国、トロント、Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｏｎｉｃｓ社製）によって写しだし、測定した。２９日目に、マウスを屠殺し、子宮筋腫を切り出し、秤量し（ｍｇ）、カリパス測定を行った（ｍｍ３）。
【０１４２】
結果
第１のステップでは、子宮筋腫のｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルを確立した。確立したモデルは、エストロゲンを用いて同期化され、ＥＬＴ−３細胞を注射された雌のＳＣＩＤマウスであった。確立したモデルの模式図および子宮筋腫の特徴を、図４Ａ〜図４Ｃに示した。
【０１４３】
Ｉｎ  ｖｉｖｏでのｒＰＥＤＦの治療効果を評価するために、誘導された子宮筋腫を有するマウスを、１０ｍｇ／ｋｇのｒＰＥＤＦまたはＴｒｉｓ（対照）を用いて処理した。結果は、子宮筋腫が処理に対して劇的に応答することを示した（図５のＡ〜Ｃ）。具体的には、ｒＰＥＤＦによる処理は、腫瘍容積（図５のＡおよびＣ）および重量（図５のＢ）を減少させた。細胞増殖指数は、対照と比較して、ｒＰＥＤＦによって示唆され、これは、抗Ｋｉ６７抗体、抗ＰＣＮＡ抗体または抗ＭＣＭ２抗体を用いる免疫組織化学によって測定することができる（その他のマーカーについては、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  ６：９９−１０６も参照のこと）。
【０１４４】
本発明をその特定の実施形態と共に記載してきたが、多数の代替、改変および変種が当業者に明らかとなることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲内に含まれるそれらの代替、改変および変種の全てを包含することが意図される。
【０１４５】
それぞれの出版物、特許および特許出願が、参照により本明細書に援用されるように具体的かつ個々に示されるのと同程度に、本明細書に記載の全ての出版物、特許および特許出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。さらに、本出願における参考文献の引用または同定は、かかる参考文献が従来技術として本発明に利用可能であるという許可として、解釈すべきではない。セクションの表題が用いられる範囲内で、それらが必ずしも制限されると解釈すべきではない。
【配列表フリーテキスト】
【０１４６】
配列番号４：  １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号５：  １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号６：  １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号７：  １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号８：  １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号９：  １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１０：  １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１１：  １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１２：  １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１３：  １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
【図１】
2018502061.tif 000004
【図２】
2018502061.tif 000005
【図３】
2018502061.tif 000006
【図４Ａ】
2018502061.tif 000007
【図４Ｂ】
2018502061.tif 000008
【図４Ｃ】
2018502061.tif 000009
【図５】
2018502061.tif 000010
【配列表】
2018502061000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年7月3日(2017.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018502061000001.app
【国際調査報告】
2018502061.tif 000011
2018502061.tif 000012
2018502061.tif 000013
2018502061.tif 000014