(57)【要約】本発明は、膵臓癌の診断、特に、膵臓癌の診断に使用するための唾液ｍｉＲＮＡに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクのある対象を同定する方法であって、該対象から得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ及びｍｉＲ−２３ｂからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程を含む方法。
【請求項２】
唾液試料と参照値との間のｍｉＲＮＡの発現レベルにおける差を検出することが、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクがある対象を指し示す、唾液試料中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを参照値と比較することからなる工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
膵臓癌の予防又は治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、
ｉ）請求項１又は２のいずれか記載の方法を行うことによって、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクのある対象を同定する工程、及び
ｉｉ）膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクがある該対象を、膵臓癌の処置で処置する工程
を含む方法。
【請求項４】
膵臓癌に冒された対象の処置をモニタリングするための方法であって、
ｉ）請求項１又は２のいずれか記載の方法を行うことによる、該処置の前の膵臓癌の診断、
ｉｉ）請求項１又は２のいずれか記載の方法を行うことによって、該処置の後に膵臓癌の状態を判断すること、及び
ｉｉｉ）工程ｉ）で判定された結果を、工程ｉｉ）で判定された結果と比較すること（その際、該結果の間の差は、処置の有効性を指し示す）
からなる工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、膵臓癌の診断に関する。
【０００２】
発明の背景：
膵管腺癌（ＰＤＡＣ、膵臓癌）は、西側諸国における死亡原因の第４位であり、一般的に診断される癌の中で５年相対生存率（１）及び１年生存率（２）が最低である。膵臓癌は、処置の改善がなければ、２０２０年までに世界で癌の死亡原因の第２位になると予想されている（３）。現在、初期の膵臓癌の信頼できる診断手段はない。その結果、大多数の患者（８５％）は、進行した疾患を示し、それが、低い切除率を招き、４〜６ヶ月という散々な全生存期間の中央値に繋がる。
【０００３】
それゆえに、治癒手術を可能にするために膵臓癌の早期診断の手段を開発する緊急の必要性がある。したがって、膵臓癌の診断のための早期バイオマーカーの発見が、極めて望ましく、早期の患者管理及び予後診断に有利である。
【０００４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、最近、膵臓癌を含めた癌の診断のための新しいクラスの強固なバイオマーカーとして出現した（４）。これらの強力な遺伝子発現調節因子は、タンパク質及びメッセンジャーＲＮＡと比較してその固有の高い安定性のせいで、多様な組織及び液体中で詳細に定量することができる。重要なことに、ｍｉＲＮＡは、マイクロ生検を含めた非常に少量の材料及び高度に分解した試料から定量することができる。最近の報告から、生検中のｍｉＲＮＡのプロファイルは、正常膵臓組織と癌性膵臓組織をうまく区別することができ、処置に対する癌の予後又は応答も予測し得ることが広く実証された（４）。最近、血漿中のｍｉＲＮＡプロファイリングが、膵臓癌患者を健康な対照と区別することが実証されたので、ｍｉＲＮＡの安定性が再度強調されている（４）。このような結果は、不必要な生検を防ぐために、最低限の侵襲性膵臓癌バイオマーカーとして循環ｍｉＲＮＡを使用する道を開くものである。
【０００５】
尿、精液及び唾液などの、いくつかの他の体液は、最近、癌の診断のためのリポジトリとして見なされている（５、６）。唾液は、試料収集が簡単で、非侵襲的であり、患者側をほとんど不安にさせず、繰り返すことができることから、すぐれた利点を有する。唾液は、局所起源及び全身起源の両方由来のタンパク質／ペプチド、核酸、電解質、及びホルモンを含有することが実証されており、最近の研究は、唾液をバイオマーカー源として使用することに興味を駆られている。それゆえに、口腔疾患の検出のための唾液の使用が広く実証されており（７）、最近、唾液は、口腔癌の診断のための、ｈａｓ−ｍｉＲ−３１などのｍｉＲＮＡの豊富な供給源として浮上した（８〜１１）。他方で、全身疾患のための唾液の使用は、ほとんど不明である。
【０００６】
当技術分野において、初期膵臓癌の診断のための強固なバイオマーカー及び唾液ｍｉＲＮＡの使用の開示はない。
【０００７】
発明の概要：
本発明は、膵臓癌の診断に関する。
【０００８】
特に、本発明は、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクがある対象を同定する方法であって、該対象から得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２９ｃからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程を含む方法に関する。
【０００９】
発明の詳細な説明：
本発明者らによって、膵臓癌、前癌病変（膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ））、炎症性疾患（膵炎）を有する患者、及び無癌の患者からの唾液試料を使用して、膵臓癌における唾液ｍｉＲＮＡの発現プロファイルが研究された。本発明者らは、また、膵臓癌の実験モデルにおける唾液ｍｉＲＮＡの検出の動態を研究した。本発明者らは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃが、対照と比較して膵臓癌患者の唾液中で有意に調節解除されており、膵臓癌患者を無癌のドナーとうまく分けることを見出した。興味深いことに、本発明者らは、ｍｉＲ−２３ａ及びｍｉＲ２３ｂが膵臓癌の前駆病変を有する患者の唾液中に過剰発現されることも実証した。本発明者らは、膵臓癌の実験モデルにおいて、唾液ｍｉＲＮＡの検出が腫瘍量に先立つことも実証した。
【００１０】
本発明は、唾液に基づく診断のための、ｍｉＲＮＡの信頼できる内因性対照を樹立し、膵臓癌を有する患者由来の唾液と無腫瘍の患者由来の唾液との間のｍｉＲＮＡプロファイルにおける有意な差を示し、唾液ｍｉＲＮＡプロファイルが膵臓癌患者において区別的であることを指し示す。本発明は、膵臓癌の非侵襲的診断のための早期バイオマーカーとしての唾液ｍｉＲＮＡの使用のために生じる。
【００１１】
診断方法：
それゆえに、本発明は、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクがある対象を同定する方法であって、該対象から得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ及びｍｉＲ−２３ｂからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程を含む方法に関する。
【００１２】
さらなる態様では、本発明の方法は、対象から得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２９ｃからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程を含む。
【００１３】
典型的には、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２９ｃからなる群より選択される、１、２、３、又は４種のｍｉＲＮＡが測定される。
【００１４】
本明細書に使用される用語「ｍｉＲ」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、データベースhttp://microrna.sanger.ac.uk/sequences/からmiRBaseアクセッション番号で公的に入手可能なｍｉＲＮＡ配列を表す。本発明のｍｉＲＮＡを表Ａに挙げる：
【００１５】
【表１】
2018502567.tif 000002
【００１６】
本明細書に使用される用語「対象」は、哺乳類を意味する。本発明の好ましい実施態様では、本発明による対象は、膵臓癌に罹患した、又は罹患しやすい任意の対象（好ましくはヒト）を表す。本発明の一実施態様では、本発明による対象は、膵臓癌を発生するリスクのある臨床状況である膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）に罹患した任意の対象（好ましくはヒト）を表す。
【００１７】
用語「膵臓癌」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）も表す（１〜４、１５）。
【００１８】
用語「膵管内乳頭粘液性腫瘍」又は「ＩＰＭＮ」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、膵臓癌の非侵襲的前駆病変を表す（１５）。用語「膵管内乳頭粘液性腫瘍」又は「ＩＰＭＮ」も、膵臓癌の前駆病変に関する。
【００１９】
本明細書に使用される用語「唾液試料」は、核酸材料を含有する対象由来の唾液試料を表す。該唾液試料は、インビトロ評価のために得られる。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクのある対象を同定する方法であって、該対象から得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２３ａの発現レベルを測定する工程を含む方法に関する。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクのある対象を同定する方法であって、該対象から得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２３ｂの発現レベルを測定する工程を含む方法に関する。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクのある対象を同定する方法であって、該対象から得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２３ａ及びｍｉＲ−２３ｂの発現レベルを測定する工程を含む方法に関する。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクのある対象を同定する方法であって、該対象から得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ及びｍｉＲ−２３ｂからなる群の全てのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程を含む方法に関する。
【００２４】
本発明のさらなる態様は、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクのある対象を同定する方法であって、該対象から得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２９ｃの発現レベルを測定する工程を含む方法に関する。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクのある対象を同定する方法であって、該対象から得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２３ａ及びｍｉＲ−２９ｃの発現レベルを測定する工程を含む方法に関する。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクのある対象を同定する方法であって、該対象から得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２９ｃの発現レベルを測定する工程を含む方法に関する。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクのある対象を同定する方法であって、該対象から得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ及びｍｉＲ−２９ｃの発現レベルを測定する工程を含む方法に関する。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクのある対象を同定する方法であって、該対象から得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２９ｃの発現レベルを測定する工程を含む方法に関する。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクのある対象を同定する方法であって、該対象から得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２９ｃの発現レベルを測定する工程を含む方法に関する。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクのある対象を同定する方法であって、該対象から得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２９ｃからなる群の全てのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程を含む方法に関する。
【００３１】
本発明の方法は、さらに、唾液試料中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを参照値と比較することからなる工程を含む場合があり、その際、唾液試料と参照値との間のｍｉＲＮＡの発現レベルにおける差を検出することは、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクがある対象を指し示す。
【００３２】
一態様では、参照値は、膵臓癌に罹患していない健康な対象に関連する唾液試料中から決定された発現レベルに対応し得る。それゆえに、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２９ｃからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの、参照値よりも高い発現レベルは、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクがある対象を指し示し、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２９ｃからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの、参照値以下の発現レベルは、膵臓癌を有さない、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクがない対象を指し示す。
【００３３】
別の実施態様では、参照値は、膵臓癌に罹患した対象に関連する唾液試料中から決定される発現レベルに対応し得る。それゆえに、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２９ｃからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの、参照値以上の発現レベルは、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクがある対象を指し示し、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２９ｃからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの、参照値未満の発現レベルは、膵臓癌を有さない、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクがない対象を指し示す。
【００３４】
本発明によると、対象から得られた唾液試料中から、本発明のｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２９ｃからなる群より選択されるｍｉＲＮＡの発現レベルを測定することは、多様な技法によって行うことができる。
【００３５】
例えば、試料（対象から調製された唾液）中に含有される核酸は、最初、標準方法により、例えば溶解酵素若しくは化学溶液を使用して抽出され、又は製造業者の説明書に従って核酸結合樹脂によって抽出される。唾液試料からＲＮＡを単離するための従来方法及び試薬は、High Pure miRNA Isolation Kit（Roche）、Trizol（Invitrogen）、チオシアン酸グアニジン-フェノール-クロロホルム抽出、PureLink（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット（Invitrogen）、PureLink Micro-to- Midi Total RNA Purification System（invitrogen）、RNeasyキット（Qiagen）、miRNeasyキット（Qiagen）、Oligotexキット（Qiagen）、フェノール抽出、フェノール-クロロホルム抽出、ＴＣＡ／アセトン沈殿、エタノール沈殿、カラム精製、シリカゲルメンブラン精製、PureYield（商標）RNA Midiprep（Promega）、PolyATtract System 1000（Promega）、Maxwell（登録商標）16 System（Promega）、SV Total RNA Isolation（Promega）、geneMAG-RNA/DNA Kit（Chemicell）、TRI Reagent（登録商標）（Ambion）、RNAqueous Kit（Ambion）、ToTALLY RNA（商標）Kit（Ambion）、Poly(A)Purist（商標）Kit（Ambion）及び市販されている又は市販されていない、当業者に公知の任意の他の方法を含む。
【００３６】
唾液試料中の１つ以上のｍｉＲＮＡの発現レベルは、任意の適切な方法により決定され得る。試料中のｍｉＲＮＡのレベル又は量を測定するための任意の信頼できる方法が使用され得る。一般的に、例えば、増幅に基づく方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ローリングサークル増幅など）、ハイブリダイゼーションに基づく方法（例えば、ハイブリダイゼーションアレイ（例えば、マイクロアレイ）、NanoString分析、ノーザンブロット分析、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）シグナル増幅、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなど）、及び配列決定に基づく方法（例えば、次世代配列決定法、例えば、Illumina又はIonTorrentプラットフォームを使用）を含めた、ｍＲＮＡについて公知の様々な方法によって、単離されたＲＮＡ試料などの唾液試料（その画分を含む）から、ｍｉＲＮＡを検出及び定量することができる。他の例示的な技法には、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）及び質量分析が含まれる。
【００３７】
一部の実施態様では、ＲＮＡは、分析前にＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換される。ｃＤＮＡは、従来技法を使用して、単離されたｍｉＲＮＡの逆転写によって生成させることができる。ｍｉＲＮＡの逆転写キットは、公知であり、市販されている。適切なキットの例には、非限定的に、mirVana TaqMan（登録商標）ｍｉＲＮＡ転写キット（Ambion, Austin, TX）、及びTaqMan（登録商標）ｍｉＲＮＡ転写キット（Applied Biosystems, Foster City, CA）が含まれる。ユニバーサルプライマー、又はｍｉＲＮＡ特異的ステムループプライマーを含めた特異的プライマーは、公知であり、例えばApplied Biosystemsから市販されている。一部の実施態様では、ｍｉＲＮＡは、測定前に増幅される。一部の実施態様では、ｍｉＲＮＡの発現レベルは、増幅工程の間に測定される。一部の実施態様では、ｍｉＲＮＡの発現レベルは、測定前に増幅されない。試料中からｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するために適したいくつかの例示的な方法を、以下により十分に説明する。これらの方法は、単に実例として提供されており、他の適切な方法が同様に使用され得ることが、当業者に明白である。
【００３８】
ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、及びローリングサークル増幅を非限定的に含めた、多数の増幅に基づく方法が、ｍｉＲＮＡの核酸配列の発現レベルを検出するために存在する。他の増幅に基づく技法には、例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、多重ライゲーション可能プローブ（multiplex ligatable probe）増幅、インビトロ転写（ＩＶＴ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ＲＮＡ（Eberwine）増幅、及び当業者に公知の他の方法が含まれる。典型的なＰＣＲ反応には、標的核酸種を選択的に増幅する複数の段階又はサイクル：標的核酸が変性される変性段階；ＰＣＲプライマーのセット（すなわち、フォワードプライマー及びリバースプライマー）が相補的ＤＮＡ鎖とアニーリングするアニーリング段階、並びに熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸長させる伸長段階が含まれる。これらの段階を複数回繰り返すことによって、ＤＮＡフラグメントが増幅されて標的配列に対応するアンプリコンを産生する。典型的なＰＣＲ反応は、２０回以上の変性、アニーリング、及び伸長のサイクルを含む。多くの場合、アニーリング段階及び伸長段階を同時に行うことができ、その場合、サイクルは２段階だけを含有する。逆転写反応（ｍｉＲＮＡと相補性を有するｃＤＮＡ配列を産生する）が、ＰＣＲ増幅の前に実施され得る。逆転写反応は、例えば、ＲＮＡに基づくＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）及びプライマーの使用を含む。ｍｉＲＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲ用のキットは、公知であり、市販されている。適切なキットの例には、非限定的に、TaqMan（登録商標）ｍｉＲＮＡアッセイ（Applied Biosystems）及びmirVana（商標）ｑＲＴ−ＰＣＲ ｍｉＲＮＡ検出キット（Ambion）が含まれる。逆転写酵素の前に、ｍｉＲＮＡをユニバーサルプライマー配列、ポリアデニル化配列、又はアダプター配列を含有する一本鎖オリゴヌクレオチドにライゲーションし、ユニバーサルプライマー配列に相補的なプライマー、ポリ（Ｔ）プライマー、又はアダプター配列に相補的な配列を含むプライマーを使用して増幅することができる。一部の実施態様では、ｍｉＲＮＡレベルの決定のために、カスタムｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を開発することができる。例えば、延長された逆転写プライマー及びロックド核酸改変ＰＣＲを伴う方法を使用して、試料中のｍｉＲＮＡを測定するためのカスタムｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ法を開発することができる。カスタムｍｉＲＮＡアッセイ法は、標的配列に対応する、化学合成したｍｉＲＮＡの希釈系列を用いてアッセイ法を行うことによって検査することができる。これは、検出限界及び各アッセイ法の定量の直線範囲の決定を可能にする。さらに、標準曲線として使用する場合、これらのデータは、試料中から測定されたｍｉＲＮＡの絶対存在量の推定を可能にする。場合により増幅曲線をチェックして、Ｃｔ値が各増幅プロットの直線範囲内で判断されることを検証してもよい。典型的には、直線範囲は、数桁に及ぶ。アッセイされる各候補ｍｉＲＮＡについて、化学合成されたバージョンのｍｉＲＮＡを得て、希釈系列で分析し、アッセイ法の感度限界及び定量の直線範囲を決定することができる。相対発現レベルは、例えば、Livak et ah, Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-ΔΔ C(T)) Method. Methods (2001) Dec;25(4):402-8によって記載されているように、２（−ΔΔＣ（Ｔ））法により決定され得る。
【００３９】
一部の実施態様では、２つ以上のｍｉＲＮＡが単一反応体積で増幅される。例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲなどの多重ｑ−ＰＣＲは、１対を超えるプライマー及び／又は１つを超えるプローブを使用することによって、１つの反応体積で少なくとも２つの関心対象のｍｉＲＮＡの同時増幅及び定量を可能にする。プライマー対は、各ｍｉＲＮＡと特異的に結合する少なくとも１つの増幅プライマーを含み、互いに識別可能なようにプローブが標識されることで、複数のｍｉＲＮＡの同時定量が可能になる。
【００４０】
ローリングサークル増幅は、環状化オリゴヌクレオチドプローブを等温条件で線形又は幾何動態のいずれかで複製することができる、ＤＮＡポリメラーゼ駆動反応である（例えば、Lizardi et al., Nat. Gen. (1998) 19(3):225-232; Gusev et al, Am. J. Pathol. (2001) 159(l):63-69; Nallur et al, Nucleic Acids Res. (2001) 29(23):E118を参照されたい）。一方はＤＮＡの（＋）鎖にハイブリダイズし、他方が（−）鎖にハイブリダイズする、２つのプライマーの存在下で、鎖置換の複合パターンが、９０分以内に各ＤＮＡ分子の１０９個を超えるコピーの生成を招く。単一のプライマーを使用することによって、閉環状ＤＮＡ分子のタンデム連結コピーが形成し得る。マトリックスに結合したＤＮＡを使用して、工程を行うこともできる。ローリングサークル増幅のために使用される鋳型は、逆転写され得る。この方法を、ｍｉＲＮＡ配列及び非常に低いｍｉＲＮＡ濃度での発現レベルの高感度指示薬として使用することができる（例えば、Cheng et al., Angew Chem. Int. Ed. Engl. (2009) 48(18):3268-72; Neubacher et al, Chembiochem. (2009) 10(8): 1289-91参照）。
【００４１】
逆転写（ＲＴ）のためのステムループプライマーに続いてリアルタイムTaqMan（登録商標）プローブを使用することによって、ｍｉＲＮＡ定量方法が行われ得る。典型的には、該方法は、ステムループプライマーがｍｉＲＮＡ標的にアニーリングされ、逆転写酵素の存在下で延長される、第１の工程を含む。次に、ｍｉＲＮＡ特異的フォワードプライマー、TaqMan（登録商標）プローブ、及びリバースプライマーがＰＣＲ反応のために使用される。ｍｉＲＮＡの定量は、測定されたＣＴ値に基づき推定される。
【００４２】
多くのｍｉＲＮＡ定量アッセイ法が、Qiagen（S. A. Courtaboeuf, France）、Exiqon（Vedbaek, Denmark）又はApplied Biosystems（Foster City, USA）から市販されている。
【００４３】
ｍｉＲＮＡの発現レベルは、絶対発現レベル又は規準化発現レベルとして表現され得る。典型的には、発現レベルは、その発現を、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクがある対象を決定するために関連しないｍＲＮＡ、例えば、構成性発現されるハウスキーピングｍＲＮＡの発現と比較することによって、ｍｉＲＮＡの絶対発現レベルを補正することによって規準化される。規準化に適したｍＲＮＡには、Ｕ６、Ｕ２４、Ｕ４８及びＳ１８などのハウスキーピングｍＲＮＡが含まれる。この規準化は、１つの試料、例えば、対象試料と別の試料との、又は異なる起源の試料間の発現レベルの比較を可能にする。特定の実施態様では、発現レベルは、ｍｉＲＮＡの発現をｍｉＲ−９２ａなどの参照ｍｉＲＮＡの発現と比較することによって、その絶対発現レベルを補正することによって規準化される。
【００４４】
本明細書における関心対象のｍｉＲＮＡと相補的又は相同な配列を示す核酸は、ハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プライマーとしての有用性を見出す。そのような核酸は、同一である必要がないが、典型的には、匹敵するサイズの相同領域と少なくとも約８０％同一であり、より好ましくは８５％同一であり、なおより好ましくは９０〜９５％同一であることが理解されている。特定の実施態様では、ハイブリダイゼーションを検出するための検出可能な標識などの適切な手段と組み合わせて、核酸を使用することが有利である。蛍光リガンド、放射性リガンド、酵素リガンド又は他のリガンド（例えばアビジン／ビオチン）を含めた、多種多様な適切な指示薬が、当技術分野において公知である。
【００４５】
プローブ及びプライマーは、それらがハイブリダイズする、すなわちそれらが好ましくは高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件（最高の融解温度Ｔｍ、例えば、５０％ホルムアミド、５×〜６×ＳＣＣに対応。ＳＣＣは、０．１５M ＮａＣｌ、０．０１５M クエン酸Ｎａである）でハイブリダイズするｍｉＲＮＡに「特異的」である。
【００４６】
ｍｉＲＮＡは、非限定的に、ハイブリダイゼーションアレイ（例えば、マイクロアレイ）、NanoString分析、ノーザンブロット分析、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）シグナル増幅、及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含めた、ハイブリダイゼーションに基づく方法を使用して検出され得る。
【００４７】
マイクロアレイを使用して、多数のｍｉＲＮＡの発現レベルを同時に測定することができる。先細ピンを用いたガラススライド上へのプリント、予備製造されたマスクを使用するフォトリソグラフィー、ダイナミックマイクロミラーデバイス（dynamic micromirror device）を使用するフォトリソグラフィー、インクジェットプリント、又は微小電極アレイを用いた電気化学を含めた多様な技法を使用して、マイクロアレイを製作することができる。マイクロ流体ｑＲＴ−ＰＣＲ反応のアレイに基づくマイクロ流体TaqMan Low-Density Array及び関連するｑＲＴ−ＰＣＲに基づくマイクロ流体法も有用である。マイクロアレイ検出の一例では、ヒトセンスｍｉＲＮＡ配列に対応する様々なオリゴヌクレオチド（例えば、２００＋  ５’−アミノ改変−Ｃ６オリゴ）が、終濃度約２０μMで三次元CodeLinkスライド（GE Health/ Amersham Biosciences）上にスポットされ、製造業者の推奨に従って処理される。TRIzol精製総ＲＮＡ ２０μgから合成された第１鎖ｃＤＮＡは、Enzo BioArray末端標識キット（Enzo Life Sciences Inc.）を使用して、ビオチン化ｄｄＵＴＰで標識される。改変Affymetrix Antisenseゲノムアレイプロトコールに従って、ハイブリダイゼーション、染色、及び洗浄を行うことができる。Axon B-4000スキャナー及びGene-Pix Pro 4.0ソフトウェア又は他の適切なソフトウェアを使用して、画像をスキャンすることができる。バックグラウンド除去後の非陽性スポット及びＥＳＤ手順によって検出された外れ値が、除去される。結果として生じたシグナル強度値は、チップあたりの中央値に対して規準化され、次に、各ｍｉＲＮＡについての幾何平均及び標準誤差を得るために使用される。各ｍｉＲＮＡシグナルを対数の底２に変換することができ、一標本ｔ検定を実施することができる。データの強固性を上げるために各ｍｉＲＮＡを複数回スポットして、各試料について独立したハイブリダイゼーションをチップ上で行うことができる。
【００４８】
ｍｉＲＮＡの発現プロファイリングのためにマイクロアレイを使用することができる。例えば、ＲＮＡを試料から抽出することができ、場合により、ｍｉＲＮＡが総ＲＮＡからサイズ選択される。オリゴヌクレオチドリンカーをｍｉＲＮＡの５’及び３’末端に結合させることができ、結果として生じたライゲーション産物が、ＲＴ−ＰＣＲ反応用のテンプレートとして使用される。センス鎖ＰＣＲプライマーは、その５’末端にフルオロフォアを結合させることによって、ＰＣＲ産物のセンス鎖を標識することができる。ＰＣＲ産物は、変性され、次にマイクロアレイにハイブリダイズされる。標的核酸と呼ばれる、アレイ上の対応するｍｉＲＮＡ捕捉プローブ配列に相補的なＰＣＲ産物は、捕捉プローブが付着（affix）しているスポットに塩基対形成を介してハイブリダイズする。次に、スポットは、マイクロアレイレーザスキャナーを使用して励起されると、蛍光を発する。次に、いくつかの陽性及び陰性対照並びにアレイデータ規準化法を使用して、各スポットの蛍光強度が特定のｍｉＲＮＡのコピー数に関して評価され、その結果、特定のｍｉＲＮＡの発現レベルの判断が生じる。ｍｉＲＮＡをサイズ選択せずに、試料から抽出されたｍｉＲＮＡを含有する総ＲＮＡを直接使用することもできる。例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ及びフルオロフォア標識短鎖ＲＮＡリンカーを使用して、ＲＮＡを３’末端標識することができる。アレイ上の対応するｍｉＲＮＡ捕捉プローブ配列に相補的なフルオロフォア標識ｍｉＲＮＡは、捕捉プローブが付着しているスポットに塩基対形成を介してハイブリダイズする。次に、いくつかの陽性及び陰性対照並びにアレイデータ正規化法を使用して、各スポットの蛍光強度が特定のｍｉＲＮＡのコピー数に関して評価され、その結果、特定のｍｉＲＮＡの発現レベルの判断が生じる。スポットされたオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、予め製作されたオリゴヌクレオチドマイクロアレイ又はスポットされた長鎖オリゴヌクレオチドアレイを非限定的に含めた、いくつかの種類のマイクロアレイを採用することができる。
【００４９】
それゆえに、核酸プローブは、例えば、開示されたプローブを使用する標的核酸分子の検出を可能にする、１つ以上の標識を含む。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション手順などの様々な適用では、核酸プローブは、標識（例えば、検出可能な標識）を含む。「検出可能な標識」は、試料中のプローブ（特に、結合又はハイブリダイズしたプローブ）の存在又は濃度を指し示す、検出可能なシグナルを産生するために使用することができる分子又は材料である。したがって、標識化核酸分子は、試料中の標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）（そこに独特に特異的な標識核酸分子が結合又はハイブリダイズされる）の存在又は濃度の指示薬を提供する。１つ以上の核酸分子に関連する標識（開示された方法によって生成されたプローブなど）を、直接的又は間接的のいずれかで検出することができる。光子（ラジオ波周波数、マイクロ波周波数、赤外周波数、可視周波数及び紫外周波数の光子を含む）の吸収、放射及び／又は散乱を含めた、任意の公知の又はまだ発見されていないメカニズムによって、標識を検出することができる。検出可能な標識には、着色、蛍光、リン光及び発光性の分子及び材料、１つの物質を別の物質に変換して（無色物質を着色物質に変換すること若しくはその逆を行うことによる、又は沈殿を産生させる若しくは試料の濁度を増加させることによる）検出可能な差を提供する触媒（酵素など）、抗体結合相互作用により検出することができるハプテン、並びに常磁性及び磁性の分子又は材料が含まれる。
【００５０】
検出可能な標識の特定の例には、蛍光分子（又は蛍光色素）が含まれる。多数の蛍光色素が、当業者に公知であり、例えばLife Technologies（以前のInvitrogen）（例えば、The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologiesを参照されたい）より選択することができる。核酸分子（独特に特異的な結合領域など）に結合（例えば、化学的にコンジュゲート）させることができる特定のフルオロフォアの例は、Nazarenkoらの米国特許第５，８６６，３６６号に提供され、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジン及びアクリジンイソチオシアナートなどのアクリジン並びに誘導体、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホナート（Lucifer Yellow VS）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド（antl1ranilamide）、ブリリアントイエロー、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン120）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（couluarin）（クマリン１５１）などのクマリン及び誘導体；シアノシン；４’，６−ジアミジノ（diarninidino）−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５”ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸（disulfor1ic acid）；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアナート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシン及びエオシンイソチオシアナートなどのエオシン並びに誘導体；エリスロシンＢ及びエリスロシンイソチオシアナートなどのエリスロシン並びに誘導体；エチジウム；５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６ジクロロ（dicl1loro）トリアジン−２−イルアミノ（yDarnino）フルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、及びＱＦＩＴＣ Ｑ（ＲＩＴＣ）などのフルオレセイン並びに誘導体；２’，７’−ジフルオロフルオレセイン（OREGON GREEN（登録商標））；フルオレサミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアナート；４−メチルウンベリフェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレン、ピレン酪酸及びスクシンイミジル１−ピレン酪酸などのピレン並びに誘導体；リアクティブレッド（Reactive Reｄ）４（シバクロンブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒ��ｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアナート、ローダミングリーン、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１及びスルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（Texas Red）などのローダミン及び誘導体；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸及びテルビウムキレート誘導体などである。他の適切なフルオロフォアには、およそ６１７mnで発光するチオール反応性ユーロピウムキレート（Heyduk and Heyduk, Analyt. Biochem. 248:216-27, 1997; J. Biol. Chem. 274:3315-22, 1999）に加えて、ＧＦＰ、リサミン（商標）、ジエチルアミノクマリン、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、４，７−ジクロロローダミン及びキサンテン（Leeらの米国特許第５，８００，９９６号に記載）及びそれらの誘導体が含まれる。当業者に公知の他のフルオロフォア、例えば、Life Technologies（Invitrogen; Molecular Probes（Eugene, Oreg.））から入手可能なフルオロフォア、並びにALEXA FLUOR（登録商標）シリーズの色素（例えば、米国特許第５，６９６，１５７号、同第６，１３０，１０１号及び同第６，７１６，９７９号に記載のもの）、ＢＯＤＩＰＹシリーズの色素（ジピロメテンボロンジフルオリド色素、例えば、米国特許第４，７７４，３３９号、同第５，１８７，２８８号、同第５，２４８，７８２号、同第５，２７４，１１３号、同第５，３３８，８５４号、同第５，４５１，６６３号及び同第５，４３３，８９６号に記載のもの）、Cascade Blue（米国特許第５，１３２，４３２号に記載のスルホン化ピレンのアミン反応性誘導体）及びMarina Blue（米国特許第５，８３０，９１２号）を含めたフルオロフォアも使用することができる。
【００５１】
上記蛍光色素に加えて、蛍光標識は、半導体ナノ結晶、例えば、QUANTUM DOT（商標）（例えばLife Technologies（QuantumDot Corp, Invitrogen Nanocrystal Technologies, Eugene, Oreg.）から得られたもの；米国特許第６，８１５，０６４号；同第６，６８２，５９６号；及び同第６，６４９，１３８号も参照されたい）などの蛍光ナノ粒子であり得る。半導体ナノ結晶は、サイズ依存性光学特性及び／又は電気特性を有する微細粒子である。半導体ナノ結晶に、一次エネルギー源が照射された場合、半導体ナノ結晶に使用される半導体材料のバンドギャップに対応する周波数のエネルギーの二次放射が起こる。この放射を、特定の波長又は蛍光の色光として検出することができる。異なるスペクトル特徴を有する半導体ナノ結晶は、例えば、米国特許第６，６０２，６７１号に記載されている。例えば、半導体ナノ結晶は、Bruchez et al., Science 281 :20132016, 1998; Chan et al., Science 281:2016-2018, 1998；及び米国特許第６，２７４，３２３号に記載されている技法によって、多様な生物学的分子（ｄＮＴＰ及び／若しくは核酸を含む）又は基材にカップリングさせることができる。様々な組成の半導体ナノ結晶の形成は、例えば、米国特許第６，９２７，０６９号；同第６，９１４，２５６号；同第６，８５５，２０２号；同第６，７０９，９２９号；同第６，６８９，３３８号；同第６，５００，６２２号；同第６，３０６，７３６号；同第６，２２５，１９８号；同第６，２０７，３９２号；同第６，１１４，０３８号；同第６，０４８，６１６号；同第５，９９０，４７９号；同第５，６９０，８０７号；同第５，５７１，０１８号；同第５，５０５，９２８号；同第５，２６２，３５７号及び米国特許出願公開第２００３／０１６５９５１号並びにＰＣＴ公報第９９／２６２９９号（１９９９年５月２７日に公開）に開示されている。異なるスペクトル特性に基づき同定可能な、半導体ナノ結晶の別々の集団を産生させることができる。例えば、組成、サイズ又はサイズ及び組成に基づき異なる色の光を放射する半導体ナノ結晶を産生することができる。例えば、本明細書開示のプローブにおける蛍光標識として適切な、サイズに基づき異なる波長の光（５６５mn、６５５mn、７０５mn、又は８００mnの放射波長）を放射する量子ドットは、Life Technologies（Carlshad, Calif.）から入手可能である。
【００５２】
ＲＴ−ＰＣＲは、典型的には、各試料に特定波長の光線を照射し、励起したフルオロフォアによって放射される蛍光を検出する能力を有するサーマルサイクラーで実施される。サーマルサイクラーは、また、試料を急速に加熱及び冷却することによって、核酸及びサーマルポリメラーゼの物理化学特性を利用することができる。大部分の市販のサーモサイクラーが、今や類似の特徴を提供している。典型的には、サーモサイクラーは、ガラスキャピラリー、プラスチック製チューブ、９６ウェルプレート又は３８４ウェルプレートの形式を伴う。サーモサイクラーは、ソフトウェア解析も伴う。
【００５３】
増幅せずにnCounter Analysis System（NanoString Technologies, Seattle, WA）を使用してｍｉＲＮＡを検出することもできる。この技法は、溶液中でハイブリダイズする２つの核酸系プローブ（例えば、レポータープローブ及び捕捉プローブ）を採用している。ハイブリダイゼーション後に、過剰のプローブが除去され、製造業者のプロトコールに従ってプローブ／標的複合体が分析される。nCounter miRNAアッセイキットは、NanoString Technologiesから入手可能であり、高度に類似したｍｉＲＮＡを高い特異性で識別することができる。nCounter（登録商標）分析システムの基礎は、アッセイされるべき各核酸標的に割り当てられた独自のコードである（国際公開公報第０８／１２４８４７号、米国特許第８，４１５，１０２号及びGeiss et al. Nature Biotechnology. 2008. 26(3): 317-325；これらの内容は、それぞれその全体で参照により本明細書に組み入れられる）。コードは、アッセイされるべき各標的にとって独自のバーコードを作り出す着色蛍光スポットの順序系列から構成される。プローブ対は、各ＤＮＡ又はＲＮＡ標的、ビオチン化捕捉プローブ及び蛍光バーコードを有するレポータープローブについて設計される。このシステムは、本明細書において、ナノレポーターコードシステムとも呼ばれる。特異的レポーター及び捕捉プローブは、各標的に対して合成される。レポータープローブは、第１のシグナルを構成する光を放射する１つ以上の標識モノマーが結合している、少なくとも第１の標識結合領域；第２のシグナルを構成する光を放射する１つ以上の標識モノマーが結合している、第１の標識結合領域とオーバーラップしない少なくとも第２の標識結合領域；及び第１の標的特異的配列を含むことができる。好ましくは、各配列特異的レポータープローブは、わずか１つの遺伝子とハイブリダイズすることができる標的特異的配列を含み、場合により、少なくとも３つ又は少なくとも４つの標的結合領域を含み、光を放射する１つ以上の標識モノマーを含む該結合領域は、それぞれ少なくとも第３のシグナル又は少なくとも第４のシグナルを構成する。捕捉プローブは、第２の標的特異的配列及び第１の親和性タグを含み得る。一部の実施態様では、捕捉プローブは、１つ以上の標識結合領域も含むことができる。好ましくは、レポータープローブの第１の標的特異的配列及び捕捉プローブの第２の標的特異的配列は、検出されるべき同じ遺伝子の異なる領域とハイブリダイズする。レポータープローブ及び捕捉プローブは、全て、単一のハイブリダイゼーション混合物である「プローブライブラリー」にプールされる。各標的の相対存在量は、単一の多重ハイブリダイゼーション反応で測定される。方法は、腫瘍試料をプローブライブラリーと接触させることを含み、その結果、試料中の標的の存在により、プローブ対−標的複合体が生じる。次に、複合体が精製される。より具体的には、試料がプローブライブラリーと混合され、溶液中でハイブリダイゼーションが起こる。ハイブリダイゼーション後に、捕捉プローブ及びレポータープローブに存在するユニバーサル配列と相補的なオリゴヌクレオチドと連結した磁気ビーズを使用して、三成分（tripartite）ハイブリダイズ複合体（プローブ対及び標的）が、二段階手順で精製される。この二重精製���程は、大過剰の標的特異的プローブを用いてハイブリダイゼーション反応を完了まで推進させ、そのとき標的特異的プローブは最終的に除去されるので、試料の結合及びイメージングを妨害しない。全てのハイブリダイゼーション後段階は、カスタム液体取り扱いロボット（Prep Station, NanoString Technologies）を用いてロボットにより取り扱われる。精製された反応物は、典型的には、試料カートリッジの個別のフローセル中にPrep Stationによってデポジットされ、捕捉プローブを介してストレプトアビジン被覆表面に結合され、レポータープローブを伸長するために電気泳動され、固定化される。処理後に、試料カートリッジが完全自動化イメージング-データ取得デバイス（Digital Analyzer, NanoString Technologies）に送られる。各試料をイメージングし、その標的についてのコードが検出される回数を計数することによって、標的の発現レベルが測定される。各試料について、典型的には、結合表面およそ１０mm2に相当する６００視野（ＦＯＶ）がイメージングされる（１３７６×１０２４ピクセル）。典型的なイメージング密度は、多重化度、試料インプット量、及び全体的な標的存在量に応じて、１視野あたり１００〜１２００の計数されたレポーターである。１試料あたり、１標的あたりの計数が挙げられた簡単なスプレッドシート形式でデータがアウトプットされる。ナノレポーターと共にこのシステムを使用することができる。ナノレポーターに関する追加的な開示は、国際公開公報第０７／０７６１２９号及び同第０７／０７６１３２号及び米国特許出願公開第２０１０／００１５６０７号及び同第２０１０／０２６１０２６号に見出すことができ、これらの内容は、その全体で本明細書に組み入れられる。さらに、核酸プローブ及びナノレポーターという用語は、その全体で参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第２０１０／０１９８２６号及び米国特許出願公開第２０１０／００４７９２４号に記載された、合理的に設計されたもの（例えば、合成配列）を含むことができる。
【００５４】
ＲＮａｓｅマッピングを使用してｍｉＲＮＡを定量するために、質量分析を使用することができる。単離されたＲＮＡを、ＭＳ又はタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）アプローチによるそれらの分析前に、高い特異性を有するＲＮＡエンドヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）（例えば、全ての未改変グアノシン残基の３’側で切断するＲＮａｓｅ Ｔｌ）で酵素的に消化することができる。開発された第１のアプローチは、ＥＳＴＭＳに直接カップリングした逆相ＨＰＬＣによるエンドヌクレアーゼ消化物のオンラインクロマトグラフィー分離を利用した。ＲＮＡ配列に基づき予想される質量からの質量シフトによって、転写後修飾の存在を明らかにすることができる。次に、異常な質量／電荷値のイオンをタンデムＭＳ配列決定のために単離して、転写後改変ヌクレオシドの配列の配置を突き止めることができる。マトリックス支援レーザ脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）も、転写後改変ヌクレオシドに関する情報を得るための分析アプローチとして使用されている。ＭＡＬＤＩに基づくアプローチは、分離段階でＥＳＴに基づくアプローチと区別することができる。ＭＡＬＤＩ−ＭＳでは、質量分析計が使用され、ｍｉＲＮＡが分離される。限られた量の無傷ｍｉＲＮＡを分析するために、カスタム製造ナノスプレーイオン源、Nanovolume Valve（Valco Instruments）、及びスプリットレスナノＨＰＬＣシステム（DiNa, KYA Technologies）を備える、リニアイオントラップ-オービトラップハイブリット質量分析計（LTQ Orbitrap XL, Thermo Fisher Scientific）又はタンデム四重極型飛行時間型質量分析計（QSTAR（登録商標） XL, Applied Biosystems）を使用することによって、ナノＥＳＩ−ＭＳとカップリングしたキャピラリーＬＣシステムを採用することができる。分析物／ＴＥＡＡがナノ−ＬＣトラップカラムにロードされ、脱塩され、次に濃縮される。無傷のｍｉＲＮＡがトラップカラムから溶出され、ＣＩ８キャピラリーカラムに直接注入され、漸増する極性の溶媒勾配を使用するＲＰ−ＨＰＬＣによってクロマトグラフィー分離される。ネガティブ極性モードでイオンをスキャン可能にするイオン化電圧を使用して、キャピラリーカラムに結合したスプレイヤー先端からクロマトグラフィー溶出液がスプレーされる。
【００５５】
ｍｉＲＮＡの検出及び測定のための追加的な方法には、例えば、ストランド侵入アッセイ法（Third Wave Technologies, Inc.）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、ｃＤＮＡ、ＭＴＤＮＡ（メタリックＤＮＡ; Advance Technologies, Saskatoon, SK）、及びUS Genomicsによって開発された方法などの一分子方法が含まれる。表面酵素反応をナノ粒子増幅ＳＰＲイメージング（ＳＰＲＩ）と組み合わせる新規なアプローチを使用するマイクロアレイ形式で、複数のｍｉＲＮＡを検出することができる。ポリ（Ａ）ポリメラーゼの表面反応は、ロックド核酸（ＬＮＡ）マイクロアレイ上にハイブリダイズされたｍｉＲＮＡにポリ（Ａ）尾部を作り出す。次に、ＤＮＡ改変ナノ粒子がポリ（Ａ）尾部に吸着され、ＳＰＲＩで検出される。この超高感度ナノ粒子増幅ＳＰＲＩ方法をアトモルレベルのｍｉＲＮＡプロファイリングのために使用することができる。分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）シグナル増幅を使用しても、ｍｉＲＮＡを検出することができる（例えば、Urdea, Nature Biotechnology (1994), 12:926-928を参照されたい）。ｂＤＮＡシグナル増幅に基づくｍｉＲＮＡアッセイ法が市販されている。そのようなアッセイ法の１つは、QuantiGene（登録商標）2.0 ｍｉＲＮＡアッセイ法（Affymetrix, Santa Clara, CA）である。ノーザンブロット及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して、ｍｉＲＮＡを検出してもよい。ノーザンブロット及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行うための適切な方法が、当技術分野において公知である。先端的配列決定法も、利用可能であれば同様に使用することができる。例えば、Illumina（登録商標）次世代シーケンシング（例えば、HiSeq、HiScan、GenomeAnalyzer、又はMiSeqシステム（Illumina, Inc., San Diego, CA）を使用する、例えば、Sequencing-By-Synthesis又はTruSeq法）を使用してｍｉＲＮＡを検出することができる。Ion Torrent Sequencing（Ion Torrent Systems, Inc., Gulliford, CT）又は他の適切な半導体配列決定法を使用して、ｍｉＲＮＡを検出することもできる。
【００５６】
一実施態様では、本発明は、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクのある対象を同定する方法であって：
ｉ）対象から唾液試料を提供する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ及びｍｉＲ−２３ｂからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で測定された該発現レベルを参照値と比較する工程であって、唾液試料と参照値との間の該発現レベルにおける差を検出することが、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクがある対象を指し示す工程
を含む方法に関する。
【００５７】
さらなる態様では、本発明の膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクのある対象を同定する方法は、対象から得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２９ｃからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程を含む。
【００５８】
本発明のさらなる態様は、膵臓癌の予防又は治療を、それを必要とする対象において行う方法であって：
ｉ）対象から唾液試料を提供する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ及びｍｉＲ−２３ｂからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で測定された該発現レベルを参照値と比較する工程であって、唾液試料と参照値との間の該発現レベルにおける差を検出することが、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクがある対象を指し示す工程、並びに
ｉｖ）膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクがある該対象を膵臓癌の処置で処置する工程
を含む方法に関する。
【００５９】
さらなる態様では、本発明の膵臓癌を予防又は治療する方法は、対象から得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２９ｃからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程を含む。
【００６０】
本発明のさらなる態様は、膵臓癌のための処置を必要とする対象において、その処置の有効性をモニタリングするための方法に関する。
【００６１】
本発明の方法は、対象の処置（例えば、薬物化合物）をモニタリングするために適用され得る。例えば、本発明によるｍｉＲＮＡの発現レベルに影響するための薬剤の有効性は、膵臓癌の処置を受けている対象の処置の間にモニタリングされ得る。
【００６２】
用語「膵臓癌の処置」は、膵臓癌の外科的切除、ゲムシタビン、フルオロウラシル、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ（フルオロウラシル、イリノテカン、オキサリプラチン、及びロイコボリン）、ｎａｂ−パクリタキセル、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）の阻害剤、ＰＤ−１リガンドＰＤ−Ｌ１の阻害剤、抗ＣＬＡ４抗体、エルロチニブなどのＥＧＦＲ阻害剤、化学放射線治療、ＰＡＲＰ阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤、遺伝子療法及び放射線療法を含めた、膵臓癌の対象が受ける任意の種類の膵臓癌の治療を表す。
【００６３】
それゆえに、本発明は、膵臓癌に冒された対象の処置をモニタリングするための方法であって：
ｉ）本発明の方法を行うことによる、該処置の前の膵臓癌の診断、
ｉｉ）本発明の方法を行うことによって、該処置の後に膵臓癌の状態を判断すること、及び
ｉｉｉ）工程ｉ）で決定された結果を、工程ｉｉ）で決定された結果と比較すること（その際、該結果の間の差は、処置の有効性を指し示す）
からなる工程を含む方法に関する。
【００６４】
キット：
本発明は、また、本発明の方法を行うためのキットであって、対象から得られた唾液試料中から本発明のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するための手段を含むキットにも関する。キットは、上記のプローブ、プライマー、マクロアレイ又はマイクロアレイを含み得る。
【００６５】
例えば、キットは、通常ＤＮＡでできており、場合により予備標識された、上に定義されるようなｍｉＲＮＡプローブのセットを含み得る。あるいは、プローブは、未標識の場合があり、標識用の成分は、キットの中の別々の容器中に含まれ得る。キットは、さらに、ハイブリダイゼーション試薬、又は該当する場合、固相マトリックスを含めた特定のハイブリダイゼーションプロトコールに必要な他の適切にパッケージされた試薬及び材料、並びに標準を含み得る。
【００６６】
あるいは、本発明のキットは、予備標識され得る、又はアフィニティー精製若しくは結合部分を含有し得る増幅プライマー（例えばステムループプライマー）を含み得る。キットは、さらに、増幅試薬並びに特定の増幅プロトコールに必要な他の適切にパッケージされた試薬及び材料も含み得る。
【００６７】
特定の実施態様では、本発明は、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクのある対象を同定するためのキットであって、該対象から得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ及びｍｉＲ−２３ｂからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するための手段を含むキットに関する。
【００６８】
さらなる態様では、本発明のキットは、該対象から得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２９ｃからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するための手段を含む。
【００６９】
特定の実施態様では、本発明は、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクのある対象を同定するためのキットであって、該対象から得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２３ａ及びｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２１及びｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−２３ａ及びｍｉＲ−２９ｃ、又はｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２９ｃの発現レベルを測定するための手段を含むキットに関する。
【００７０】
特定の実施態様では、本発明は、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクのある対象を同定するためのキットであって、該対象から得られた唾液試料中から、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ及びｍｉＲ−２３ｂの発現レベル、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ及びｍｉＲ−２９ｃの発現レベル、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２３ｂの発現レベル、又はｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ及びｍｉＲ−２９ｃの発現レベルを測定するための手段を含むキットに関する。
【００７１】
特定の実施態様では、本発明のキットは、さらに、唾液試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルを参照値と比較するための手段を含むキットであって、唾液試料と参照値との間のｍｉＲＮＡの発現レベルにおける差を検出することが、膵臓癌を有する、又は膵臓癌を有する若しくは発生するリスクがある対象を指し示すキットに関する。
【００７２】
オリゴヌクレオチド配列：
＞ｈｓａ−ｍｉＲ−２１  ＭＩ０００００７７（プレ−ｍｉＲＮＡ）についての配列番号：１
【００７３】
【化１】
2018502567.tif 000003
【００７４】
＞ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ  ＭＩ０００００７９（プレ−ｍｉＲＮＡ）についての配列番号：２
【００７５】
【化２】
2018502567.tif 000004
【００７６】
＞ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ  ＭＩ００００４３９（プレ−ｍｉＲＮＡ）についての配列番号：３
【００７７】
【化３】
2018502567.tif 000005
【００７８】
＞ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ  ＭＩＭＡＴ０００００７６（成熟ｍｉＲＮＡ）についての配列番号：４
【００７９】
【化４】
2018502567.tif 000006
【００８０】
＞ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ  ＭＩＭＡＴ０００４４９４（成熟ｍｉＲＮＡ）についての配列番号：５
【００８１】
【化５】
2018502567.tif 000007
【００８２】
＞ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ  ＭＩＭＡＴ０００４４９６（成熟ｍｉＲＮＡ）についての配列番号：６
【００８３】
【化６】
2018502567.tif 000008
【００８４】
＞ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ  ＭＩＭＡＴ０００００７８（成熟ｍｉＲＮＡ）についての配列番号：７
【００８５】
【化７】
2018502567.tif 000009
【００８６】
＞ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ−５ｐ  ＭＩＭＡＴ０００４５８７（成熟ｍｉＲＮＡ）についての配列番号：８
【化８】
2018502567.tif 000010
【００８７】
＞ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ  ＭＩＭＡＴ００００４１８（成熟ｍｉＲＮＡ）についての配列番号：９
【００８８】
【化９】
2018502567.tif 000011
【００８９】
＞ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ  ＭＩ００００７３５（プレ−ｍｉＲＮＡ）についての配列番号：１０
【００９０】
【化１０】
2018502567.tif 000012
【００９１】
＞ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ  ＭＩＭＡＴ０００４６７３（成熟ｍｉＲＮＡ）についての配列番号：１１
【００９２】
【化１１】
2018502567.tif 000013
【００９３】
＞ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ  ＭＩＭＡＴ００００６８１（成熟ｍｉＲＮＡ）についての配列番号：１２
【００９４】
【化１２】
2018502567.tif 000014
【００９５】
以下の図面及び実施例により本発明をさらに例証する。しかし、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】膵臓癌患者における唾液ｍｉＲＮＡプロファイル。膵臓癌を有する患者（ｎ＝７）又は無癌の患者（ｎ＝４）からの唾液試料中のｍｉＲＮＡプロファイルの分析。結果は、三回行ったΔＣｑの平均±Ｓ．Ｄ．である：（関心対象のｍｉＲＮＡのＣｑ  −  ｍｉＲ−９２ａのＣｑ）。＊、Ｐ＜０．０５。
【図２】膵臓癌及び膵炎患者における唾液ｍｉＲＮＡプロファイル。膵臓癌を有する患者（ｎ＝７）又は膵炎を有する患者（ｎ＝４）からの唾液試料中のｍｉＲＮＡプロファイルの分析。結果は、三回行ったΔＣｑの平均±Ｓ．Ｄ．である：（関心対象のｍｉＲＮＡのＣｑ  −  ｍｉＲ−９２ａのＣｑ）。
【図３】膵臓癌の実験モデルにおける唾液ｍｉＲＮＡプロファイル。腫瘍誘導後の表示時間にMia PACA-2 Lucia細胞を異種移植されたマウスにおける唾液ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂレベル及びLucia血液レベルの分析。結果は、三回の実験で行われた６つの生物学的反復の平均±Ｓ．Ｄ．である。ｍｉＲＮＡレベルをＣｑとして表現し、Luciaレベルを相対受光量（ｒ．ｌ．ｕ．）として表現する。グレーゾーンは、分泌されたLuciaを使用してモニタリングした腫瘍量に対応する。
【００９７】
実施例
実施例１：
材料及び方法
患者
本プロトコールは、倫理委員会（Comite de Protection des Personnes Sud-Ouest et Outre Mer N°1, number 1-10-21）によって承認された。血液の汚染を避けるために、患者に、試料収集前の４５分以内は歯を磨かないよう要請した。プロポフォールを用いた全身麻酔下で内視鏡検査する間に、無菌チップ及びマイクロピペットを使用して、唾液を収集した。等体積の唾液保護試薬（Qiagen）を含有する、予冷した１．５mlマイクロ遠心チューブ中に唾液を直ちに入れ、使用の準備が整うまで−８０℃で保存した。本発明において、本発明者らは、書面のインフォームドコンセントを与えられた、年齢＞１８歳の患者を算入した。他の算入基準は、全身麻酔又は超音波内視鏡検査について禁忌がないことであった。膵炎又は膵臓癌の組織診、細胞診及び分子的（ＫＲＡＳ活性化変異分析（１２））診断のために細針吸引材料を使用した。本研究に患者２１人（７人は膵臓癌を有すると診断され、４人は膵炎（急性又は慢性のいずれか）を有すると診断され、４人は無関係の消化器疾患を有した（対照群））を算入した（表１）。診断を有さない患者（ｎ＝２）、他の消化器癌と診断された患者（ｎ＝２）、又は膵管内乳頭粘液性腫瘍と診断された患者（ｎ＝２）を研究から除外した。
【００９８】
【表２】
2018502567.tif 000015
【００９９】
実験プロトコール
全ての動物実験は、実験研究のための国の倫理指針に従って行い、プロトコールは動物実験についての地域倫理委員会に承認されたものであり、実験動物の管理と使用に関する指針（US National Institutes of Health)に従って行った。分泌型Luciaルシフェラーゼを発現している、ヒト膵臓癌由来Mia PACA-2細胞（１３、１４）を、１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、抗生物質、抗真菌剤カクテル（Life Technologies）、及びPlasmocin（登録商標）（InvivoGen）を補充したＲＰＭＩ培地中で、３７℃の加湿インキュベーターに入れて５％ ＣＯ２の中で成長させる。２週齢雌性ｎｕ／ｎｕマウス６匹を、０．９％ ＮａＣｌ中に希釈したペントバルビタール（８０mg/kg）の腹腔内注射に酸素／イソフルラン（isofluorane）（２．５混合物）を使用する口からの麻酔を補充することによって麻酔し、以前に記載されたように、Mia PACA-2 Lucia細胞を膵尾に移植した（１３、１４）。唾液分泌をピロカルピンによって刺激しなかった。マイクロピペットにより口腔から唾液を得て、直ちに、等体積の唾液保護試薬（Qiagen）を含有する予冷１．５mlマイクロ遠心チューブ内に入れた。２０分で収集を完了し、試料を分析まで−８０℃で保存した。腫瘍成長の非侵襲的追跡のために、血液を眼窩後方収集により採取し、ＥＤＴＡで処理したマイクロ遠心チューブ中で１０００×ｇで１０分間遠心分離した。基質としてセレンテラジン（５０μM）を使用して、血漿５μl中でLuciaの産生を測定した。ｍｉＲＮＡ定量研究のために、腫瘍を液体窒素中で凍結し、使用まで−８０℃で保存した。
【０１００】
ＲＮＡの抽出
唾液試料を使用する前に、それらを氷上で解凍し、２６００×ｇで４℃にて１５分間遠心分離した。無細胞上清をペレットから収集し、直ちに次の工程に使用した。Trizol LS試薬（Life technologies）及びmiRNAeasy抽出キット（Qiagen）を使用して、それぞれ唾液上清２５０μL及び腫瘍から総ＲＮＡを単離した。DNase I処理（DNase I, Qiagen）を使用して、ＲＮＡ抽出の間に混入しているＤＮＡを除去した。Nanodrop N-100を使用して総ＲＮＡの濃度を測定した。
【０１０１】
ｍｉＲＮＡの定量
Universal cDNA合成キット（Exiqon）を使用して、総唾液ＲＮＡ、細胞ＲＮＡ又は腫瘍ＲＮＡ（２０ng）を逆転写及び予備増幅し、続いてTaqMan（登録商標）PreAmp Master Mix（Life technologies）及びプールされた９４個のマイクロＲＮＡのLNA（商標）ＰＣＲプライマーセット（Exiqon）を使用して特異的標的増幅（ＳＴＡ）を行った。１５回の予備増幅サイクルの後に、ＳＴＡ反応物をヌクレアーゼ不含水に１：１０希釈した。ｑＰＣＲアッセイ混合物は、TaqMan（登録商標）遺伝子発現マスター混合物（Life technologies）、ＤＮＡ結合色素試料ロード試薬（Fluidigm）、EvaGreen（Biorad）、フォワード及びリバースプライマー混合物（Exiqon）並びにアッセイロード試薬からなり、それらを製造業者の推奨により調製した。試料及び試料混合物をFluidigmチップ（Fluidgm）にロードし、Fluidigmプラットフォーム（Fluidgm）上で定量リアルタイムＰＣＲ反応を、９５℃で１０分間、続いて９５℃で１０秒間及び６０℃で１分間を３０サイクルで行った。定量サイクル（Ｃｑ）値は、一定の閾値を超える蛍光発光におけるサイクル数として定義される。Ｃｑ１５〜３０を高発現と見なし、Ｃｑ３５を低発現と見なす。４０を超えるＣｑ値を、検出不能のｍｉＲＮＡと見なした。ｍｉＲＮＡ定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）実験について、ｈａｓ−ｍｉＲ−９２ａをヒト唾液試料における参照遺伝子として使用した。本発明者らは、各候補ｍｉＲＮＡバイオマーカーのＣｑ値から参照ｍｉＲＮＡ（ｈａｓ−ｍｉＲ−９２ａ）のＣｑ値を差し引くことによってΔＣｑを計算した。Applied BiosystemsからのRQ manager 1.2.1及びData Assist v3.0を使用してデータの規準化を行った。
【０１０２】
統計解析
種々の群間のｑＰＣＲに基づく遺伝子発現値を、ノンパラメトリックＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して比較した。次に、候補バイオマーカーのｍｉＲＮＡを、Ｐ＜０．０５に基づき選択した。
【０１０３】
結果
膵臓癌特異的唾液ｍｉＲＮＡの同定
本発明において、文献から以下のような９４個のｍｉＲＮＡを選択した：以前に報告された癌バイオマーカー、以前に報告された膵臓癌バイオマーカー、癌を有する患者の血液から検出された、又は癌を有する患者の唾液中から検出された。候補ｍｉＲＮＡの発現を、膵臓癌を有する患者（ｎ＝７）、良性膵炎を有する患者（ｎ＝４）、又は癌のない患者（ｎ＝４）においてBiomark Fluidgmを使用するｑ（ＲＴ）ＰＣＲによってスクリーニングした。
【０１０４】
９４種のｍｉＲＮＡのうち、２３種のｍｉＲＮＡは全ての被験試料で検出不能であった。他方で、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐは、膵臓癌患者及び対照患者の唾液中に高レベル発現されていた。Ｇｅｎｏｒｍソフトウェアを使用して、本発明者らは、本試験についての参照ｍｉＲＮＡとしてｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａを選択した。本発明者らは、３種のｍｉＲＮＡ（ｈａｓ−ｍｉＲ−２１、ｈａｓ−ｍｉＲ２３ａ及びｈａｓ−ｍｉＲ−２３ｂ）が、対照患者（ｎ＝４；Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定、Ｐ＜０．０５）と比較して膵臓癌を有する患者（ｎ＝７）由来の唾液中で示差的に発現されたことを見出した（表２及び図１）。候補ｍｉＲＮＡの発現は、無癌の患者由来の唾液試料中での発現と比較して、腫瘍を有する患者由来の唾液試料中の方が高かった（平均３８４４倍）（表２）。重要なことには、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１及びｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａは、膵臓癌に厳密に特異的（１００％）であり、すばらしい感度を有した（それぞれ７１．４％及び８５．７％）。ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−２１０は、膵臓癌と良性膵炎患者との間の区別的ｍｉＲＮＡとしての傾向を示した（０．０９＞Ｐ＞０．０５）（表３）。まとめると、本発明は、唾液ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂが、膵臓癌の診断についての新規な非侵襲性バイオマーカーであることを実証している。
【０１０５】
【表３】
2018502567.tif 000016
【０１０６】
膵臓癌を有する患者（ｎ＝７）由来の全唾液中のｍｉＲＮＡの発現を、癌を有さない患者（ｎ＝４）由来の全唾液中のｍｉＲＮＡの発現と比較した。
【０１０７】
【表４】
2018502567.tif 000017
【０１０８】
膵臓癌を有する患者（ｎ＝７）由来の全唾液中のｍｉＲＮＡの発現を、膵炎を有する患者（ｎ＝４）由来の全唾液中のｍｉＲＮＡの発現と比較した。
【０１０９】
膵臓癌の実験モデルにおいて唾液ｍｉＲＮＡは腫瘍量に先立つ
本発明者らは、次に、膵臓癌の実験モデルにおける唾液ｍｉＲＮＡ検出の動態を研究した。Ｍｉａ  ＰＡＣＡ−２ヒト由来膵臓癌細胞を無胸腺マウス（ｎ＝６）の膵臓に移植した。本発明者らは、これらの細胞及び結果として生じた異種移植片が、高レベルのｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ及びｈａｓ−ｍｉＲ−２９ｃを発現することを見出した。これらの細胞は、非侵襲性腫瘍モニタリングのために分泌型ルシフェラーゼを発現するように操作されていたので（１３、１４）、膵臓癌の腫瘍が、腫瘍細胞の生着の２５日後及び触知可能になる前に検出された（図３）。
【０１１０】
興味深いことに、腫瘍誘導の早くも１４日後に、担腫瘍マウス由来の唾液中からｈｓａ−ｍｉＲ−２１が容易に検出され（図３）、一方、無腫瘍動物の唾液中からは検出不能であった。加えて、唾液ｈｓａ−ｍｉＲ−２１の発現は、実験の経過中に上昇を維持した（図３）。他方で、唾液ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ及びｈａｓ−ｍｉＲ−２９ｃは、低レベル検出された（図３）。したがって、本発明者らは、膵臓癌の本実験モデルにおいてｈｓａ−ｍｉＲ−２１が唾液バイオマーカーを有することを検証し、加えて、本発明者らの結果は、唾液ｍｉＲＮＡを膵臓癌の早期診断のために使用できることを強く実証するものである。
【０１１１】
実施例２：
本発明者らは、本発明において、外科手術に不適格な膵臓腫瘍（切除不能の膵臓癌）を有する患者、前癌病変（膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ））を有する患者、炎症性疾患（膵炎）を有する患者又は無癌の患者の間の唾液マイクロＲＮＡプロファイルにおける差を早期診断ツールとして調査した。
【０１１２】
表１に記載された患者に加えて、本発明者らは、試験に、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）を有すると診断された患者（ｎ＝２）を算入した（表４）。
【０１１３】
【表５】
2018502567.tif 000018
【０１１４】
結果
本発明において、９４種のｍｉＲＮＡを選択した。候補ｍｉＲＮＡの発現を、膵臓癌を有する患者（ｎ＝７）、膵炎を有する患者（ｎ＝４）、膵管内乳頭粘液性腫瘍を有する患者（ＩＰＭＮ、ｎ＝２）又は癌を有さない患者（ｎ＝４）（表１及び表４）においてBiomark Fluidgmを使用するｑ（ＲＴ）ＰＣＲによってスクリーニングした。
【０１１５】
９４種のｍｉＲＮＡのうち、２３種のｍｉＲＮＡは、全ての被験試料で検出不能であった。本発明者らは、４種のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ）が、膵臓癌を有する患者（ｎ＝７）由来の唾液において有意に発現され、一方で対照患者（ｎ＝４；Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定、０．００１＜ｐ＜０．０３）の唾液中で検出不能であったことを見出した（表５）。候補ｍｉＲＮＡの発現は、すばらしい感度（５７％〜８６％の範囲、表５）で膵臓癌に厳密に特異的（１００％）であった。ｈａｓ−ｍｉＲ−２３ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂは、十分に特徴付けられたＰＤＡＣの前駆病変であるＩＰＭＮを有すると診断された患者の唾液中から検出された。
【０１１６】
【表６】
2018502567.tif 000019
【０１１７】
ＰＤＡＣを有する患者（ｎ＝７）由来の全唾液中のｍｉＲＮＡの発現を、癌を有さない患者（ｎ＝４）由来の全唾液中のｍｉＲＮＡの発現と比較した。ｐ値（ノンパラメトリックWilcoxon順位和検定）を示す。
【０１１８】
参考文献：
本出願にわたり、様々な参考文献が、本発明が属する技術の水準を説明している。これらの参考文献の開示は、参照により、本明細書に組み入れられる。
【０１１９】
【表７】
2018502567.tif 000020
2018502567.tif 000021
【図１】
2018502567.tif 000022
【図２】
2018502567.tif 000023
【図３】
2018502567.tif 000024
【配列表】
2018502567000001.app
【国際調査報告】
2018502567.tif 000025
2018502567.tif 000026
2018502567.tif 000027
2018502567.tif 000028
2018502567.tif 000029