(57)【要約】  本発明は、分子あたり、骨格のキシロース単位の１つに結合した少なくとも１つのアラビノース単位を含むアラビノキシロ−オリゴ糖組成物に関連し、少なくとも１つのアラビノース単位は、α−Ｌ−アラビノフラノシルであり、該組成物は、１〜１０の重合度を有するキシロ−オリゴ糖骨格を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子あたり、骨格のキシロース単位の１つに結合した少なくとも１つのアラビノース単位を含むアラビノキシロ−オリゴ糖組成物であって、前記少なくとも１つのアラビノース単位は、α−Ｌ−アラビノフラノシルであり、前記組成物は、１〜１０の重合度を有するキシロ−オリゴ糖骨格を備え、該組成物は、１０％以下の単糖及び／又は１０％以下のキシロオリゴ糖を含む、アラビノキシロ−オリゴ糖組成物。
【請求項２】
前記アラビノキシロ−オリゴ糖組成物は、０．２〜０．７、好ましくは０．３〜０．６、好ましくは０．３５〜０．５０、好ましくは０．４の平均アラビノース置換度を有する請求項１に記載のアラビノキシロ−オリゴ糖組成物。
【請求項３】
前記アラビノキシロ−オリゴ糖組成物は、ビフィドバクテリウムｓｐｐ（Bifidobacterium spp）の増殖を選択的に刺激するように適合される請求項１又は２に記載のアラビノキシロ−オリゴ糖組成物。
【請求項４】
前記ビフィドバクテリウムｓｐｐは、アラビノキシロ−オリゴ糖又はオリゴ糖上のアラビノース置換基を発酵させるのに適合した菌株に属する請求項３に記載のアラビノキシロ−オリゴ糖組成物。
【請求項５】
前記ビフィドバクテリウムｓｐｐは、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティスBifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・カテニュラタム（Bifidobacterium catenulatum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Bifidobacterium pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・ガリカム（Bifidobacterium gallicum）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・アングラタム（Bifidobacterium angulatum）又はビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）からなる群から選択される請求項３又は４に記載のアラビノキシロ−オリゴ糖組成物。
【請求項６】
前述の請求項のうちのいずれか１項に記載のアラビノキシロ−オリゴ糖組成物を含み、ビフィドバクテリウムｓｐｐをさらに含むシンバイオティクス調製物。
【請求項７】
胃腸内の問題を改善する治療のための、請求項６に記載のシンバイオティクス調製物。
【請求項８】
食品、飼料、飲料又は栄養補助食品からなる群から選択される製品の成分としての使用のための、請求項６又は７に記載のシンバイオティクス調製物。
【請求項９】
胃腸内の問題を改善する治療に使用するための、請求項１〜５に記載のアラビノキシロ−オリゴ糖組成物、又は請求項６〜８に記載のアラビノキシロ−オリゴ糖組成物を含むシンバイオティクス調製物。
【請求項１０】
穀粉からアラビノキシロ−オリゴ糖組成物を製造する方法であって、以下の工程を含む。
Ａ．  穀粉からの胚乳アラビノキシラン分画の抽出及び単離；
Ｂ．  工程Ａにて得られた生成物からのデンプン及びタンパク質の任意の除去；
Ｃ．  アラビノフラノシダーゼ、好ましくは二重置換のβ−（１→４）結合Ｄ−キシロピラノシル単位（ｄＸｙｌ）においてα−（１→３）結合Ｌ−アラビノフラノシルを除去できるものを用いる、工程Ａの胚乳アラビノキシラン又は工程Ｂの生成物の任意の処理；
Ｄ．  工程Ａ、工程Ｂ又は工程Ｃにて得られた生成物へのアラビノキシラナーゼの添加；及び
Ｅ．  工程Ｄにて得られた物質の乾燥。
【請求項１１】
ふすまからアラビノキシロ−オリゴ糖組成物を製造する方法であって、以下の工程を含む。
Ａ’．  ふすまからのデンプン及びタンパク質の除去；
Ｂ’．  Ａからの固相の回収；
Ｃ’．  可溶性相を提供するための、アルカリ性溶液、アルカリ性及び過酸化物溶液を用いる固相の処理、又は熱による固相の処理；
Ｄ’．  Ｃのアラビノキシランを含む可溶性相の中和、及びアラビノキシランを含む当該可溶性相の回収；
Ｅ’．  ０．２〜０．７、好ましくは０．３５〜０．５、好ましくは０．３８〜０．４５、好ましくは０．４のアラビノースとキシロースとのモル比が得られるように、アラビノフラノシダーゼ又は弱酸性溶液を用いる、工程Ｄの可溶性相を含むアラビノキシランからのアラビノースの除去；
Ｆ’．  好ましくは沈殿又は膜分離による、工程Ｅから得られたアラビノキシランを回収するための分離；
Ｇ’．  工程Ｆからの前記アラビノキシランへのアラビノキシラナーゼの添加；及び
Ｈ’．  工程Ｇにて得られた物質の乾燥。
【請求項１２】
前記アラビノキシロ−オリゴ糖組成物はアラビノキシラン特異的エンドキシラナーゼを用いて製造される、請求項１０〜１１のいずれか１項に記載のアラビノキシロ−オリゴ糖組成物を製造する方法。
【請求項１３】
前記アラビノキシラン特異的エンドキシラナーゼがアラビノキシラナーゼである、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のアラビノキシロ−オリゴ糖組成物を製造する方法。
【請求項１４】
前記工程Ｃ’は、アラビノキシロ−オリゴ糖の収率を増加させるためのアラビノフラノシダーゼを用いる任意の処理を含む、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のアラビノキシロ−オリゴ糖組成物を製造する方法。
【請求項１５】
前記工程Ａ’は、それぞれアミラーゼ及びプロテアーゼを用いるデンプン及びタンパク質の除去を含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のアラビノキシロ−オリゴ糖組成物を製造する方法。
【請求項１６】
前記工程Ｃ’は、水溶性アラビノキシラン含量を増加させるための任意の蒸気処理を用いるアルカリ及び過酸化物による抽出を含む、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のアラビノキシロ−オリゴ糖組成物を製造する方法。
【請求項１７】
前記工程Ｅ’は、アラビノキシロ−オリゴ糖の収率を増加させるためのアラビノフラノシダーゼ又は弱酸による任意の処理を含む、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載のアラビノキシロ−オリゴ糖組成物を製造する方法。
【請求項１８】
キシロ−オリゴ糖及びアラビノキシロ−オリゴ糖を含有する調整物におけるアラビノキシロ−オリゴ糖の生成を改善するためのアラビノキシラナーゼの使用。
【請求項１９】
キシロ−オリゴ糖及びアラビノキシロ−オリゴ糖の調製物が、ファミリ１１のキシラナーゼを用いて調製される、請求項１８に記載のアラビノキシラナーゼの使用。
【請求項２０】
前記アラビノキシラナーゼが、グリコシド加水分解酵素ファミリ５に属するキシラナーゼである、請求項１８に記載のアラビノキシラナーゼの使用。
【請求項２１】
前記アラビノキシロ−オリゴ糖は穀物繊維から生成される、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のアラビノキシラナーゼの使用。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれか１項に記載のアラビノキシラナーゼの使用であって、以下の工程を含む。
Ａ’．  穀類繊維からのデンプン及び任意のタンパク質の除去；
Ｂ’．  Ａからの固相の回収；
Ｃ’．  非水溶性のアラビノキシランを加水分解可能なキシラナーゼを用いる、工程Ｂからの前記固相の処理；
Ｄ’．  アラビノキシロ−オリゴ糖の生成を改善するために、工程Ｃへの高度に置換されたアラビノキシランを加水分解可能なアラビノキシラナーゼの添加；
Ｅ’．  オリゴ糖を含む工程Ｄからの可溶性相の回収；
Ｆ’．  工程Ｅからの当該可溶性相の任意の精製；
Ｇ’．  工程Ｆからの可溶性相の濃縮又は乾燥。
【請求項２３】
穀物繊維はライムギ、トウモロコシ、アワ、イネ、オオムギ、オートムギ又はコムギから得られる請求項１８〜２２のいずれか１項に記載のアラビノキシラナーゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
発明の分野
本発明は、食品又は飲料成分又は栄養補助食品として有用なアラビノキシロ−オリゴ糖を含む調製物、ならびにそのような調製物の製造方法に関する。さらに本発明は、キシロ−オリゴ糖とアラビノキシロ−オリゴ糖との混合物を含む確立されたプレバイオティクス製剤におけるアラビノキシロ−オリゴ糖の改良された生成にも関連する。
【０００２】
背景技術
キシランヘミセルロースは、セルロースの次に植物界において２番目に豊富な生体高分子である。高等植物における全てのキシランの共通の特徴は、β−（１→４）結合Ｄ−キシロピラノシル（Ｘｙｌｐ）残基の骨格である。キシロース以外の糖を含むキシランは、ヘテロキシランと呼ばれ、双子葉植物の二次細胞壁に見られるグルクロノキシラン（ＧＸ）、又は穀物の一次細胞壁に見られるアラビノキシラン（ＡＸ）に分けることができる。穀物中のＡＸ含有量及び組成は、植物源、品種及び組織によって異なる。大部分のＡＸは、外部ふすま組織（外部及び内部の果皮、種皮、珠心表皮及び関連アリューロン層）に見出されるが、デンプン胚乳にもかなりの量が含まれる。ＡＸは、水抽出性（ＷＥ−ＡＸ）又は水非抽出性（ＷＵ−ＡＸ）として分類することができる。水中可溶度は、他の細胞壁成分への共有及び／又は非共有結合によって制限される。容易に溶解するが、ＡＸは表面に弱く結合する。
【０００３】
一般に４つの主要な構成要素、Ｉ）無置換のＸｙｌｐ単位（ｕＸｙｌ）、ＩＩ）Ｘｙｌｐ単位（ｍＸｙｌ２）に結合したα−（１→２）結合Ｌ−アラビノフラノシル（Ａｒａｆ）、ＩＩＩ）Ｘｙｌｐ単位（ｍＸｙｌ３）に結合したα−（１→３）結合Ａｒａｆ、及びＩＶ）Ｘｙｌｐ単位（ｄＸｙｌ）に結合した二重α−（１→２）及びα−（１→３）結合Ａｒａｆが、穀物ＡＸ中に存在する。さらに、ガラクトース及びグルクロン酸は、外部の穀物組織由来のＡＸに存在し得る。主にフェルラ酸（ＦＡ）であるヒドロキシケイ皮酸誘導体は、少数のＡｒａｆ置換基上のＯ−５位置にエステル結合することができ、水中での酸化的ゲル化（ジヒドロジフェルラ酸の架橋）及び抗酸化特性を引き起こす。ＡＸにおけるアラビノースとキシロースのモル比（Ａ／Ｘ）は、胃腸管（ＧＩＴ）における酵素加水分解、溶解性及び発酵特性に関して重要な特性である。
【０００４】
短い糖ポリマーであるオリゴ糖は、熱／化学的又は酵素的方法のいずれかを用いてＡＸ骨格の部分的加水分解によって得ることができる。穀物由来のＡＸのみを考慮すると、オリゴ糖の２つの主要な群を酵素加水分解から得ることができ、それはキシロ−オリゴ糖（ＸＯＳ）及びアラビノキシロ−オリゴ糖（ＡＸＯＳ）である。ＸＯＳはキシロースオリゴマーであり、それは一般的な分子式C5nH8n+2 O4n+1（式中、ｎはキシロース単位の数２〜１０である）とのβ−（１→４）結合によって結合している。ＸＯＳは、Ｘ２：キシロビオース、Ｘ３：キシロトリオース、Ｘ４：キシロテトラオース、Ｘ５：キシロペンタオース、Ｘ６：キシロヘキサオース、Ｘ７：キシロヘプタオース、Ｘ８：キシロオクタオース、Ｘ９：キシロエンネアオース、及びＸ１０：キシロデカオースである。一方、ＡＸＯＳは、キシロース単位の１つに側鎖として結合した少なくとも１つのＡｒａｆ基を有する骨格としてのＸＯＳを有する。結合するＡｒａｆ基の数、どの残基へか、及び化学結合のタイプ（１→２）及び／又は（１→３）に応じて、ＡＸＯＳの多くの異なる組み合わせが可能である。アラビノキシラン−オリゴ糖（Ａ）ＸＯＳは、キシロ−オリゴ糖（ＸＯＳ）及びアラビノキシロ−オリゴ糖（ＡＸＯＳ）の両方の混合物を含み、市販のキシラナーゼによる酵素加水分解の後に得られる。
【０００５】
キシラナーゼは、例えばパルプ及び紙の処理、バイオ燃料の製造、ベーキング及び醸造産業並びに動物飼料の加工に使用される。これら酵素は、キシラン及びキシラン誘導オリゴ糖に見られるβ−（１→４）−キシロシド結合を加水分解することができる。使用されるキシラナーゼに応じて、異なるサイズのＸＯＳ及び構造のＡＸＯＳを生成することができる。ファミリ１０のキシラナーゼは、小さな最終生成物を産生することが知られている。これは、ＡＸ由来の主要な加水分解生成物としてのキシロース及びＸ２の産生と一致する。ファミリ１０のキシラナーゼによって産生される最小のＡＸＯＳは、三糖類（Ａ３Ｘ）である。ファミリ１１のキシラナーゼは、ファミリ１０と同様の触媒機構を有するが、活性は一般にオリゴマー基質よりもポリマー基質において高く、それらはファミリ１０と比較して不溶性基質に対してより高い活性を有する。ファミリ１１のキシラナーゼによる主要な加水分解生成物は、キシロース、Ｘ２及びＸ３であり、最小のＡＸＯＳは四糖類（Ａ３ＸＸ）である。
【０００６】
ＸＯＳ及びＡＸＯＳには、「ＧＩ微生物相の組成及び／又は活性において特異的な変化をもたらし、従って宿主の健康に有益な効果を付与する、選択的に発酵された成分」として定義される、新たなプレバイオティクスとしての商業的関心がある。これらの化合物のプレバイオティクス特性の少なからぬ証拠は、プレバイオティクスの全ての基準を満たすことを実証した生体内及び生体外試験に基づいて現在利用可能である。ＸＯＳ及びＡＸＯＳは、健康を促進する短鎖脂肪酸酢酸、乳酸、プロピオン酸及び酪酸を産生する糞便の微生物によって発酵される。オリゴ糖のサイズに応じて、異なる代謝酸が産生される。ＸＯＳ及びＡＸＯＳのプレバイオティクス効果は、オリゴ糖及びアラビノース置換のサイズに密接に関連し、ビフィズス菌が炭素源として利用されるためには、大部分のビフィズス菌には小さなサイズが必要である。従って、ＡＸＯＳに結合したＡｒａｆ基は、細菌を利用する全てのＸＯＳがＡＸＯＳを利用できるわけではないため、胃腸管（ＧＩＴ）における発酵特性に関して重要な特徴である。
【０００７】
ビフィズス菌は、免疫システムの発達を刺激し、ビタミンを産生し、病原体を抑制し、血中のアンモニアとコレステロールを減少させ、抗生物質治療後の健全な腸に回復させる能力のために、有益な細菌の最も重要な群の１つであると考えられている。ＸＯＳ及び／又はＡＸＯＳを使用するビフィズス菌の能力は、菌株依存性であり、菌株はそれらの炭水化物選好度に基づいて分類することができることを意味する。ビフィズス菌は、アラビノース、キシロース、ＸＯＳ又はＡＸＯＳを発酵させる能力に基づいて、５つの異なる群（Ｉ〜Ｖ）にクラスター化することができる。クラスターＩにおいて、菌株はＸＯＳ又はＡＸＯＳを用いることができない。クラスターＩＩの菌株は、ＡＸＯＳ上に存在するアラビノース置換基を発酵させることができる。クラスターＩＩＩは、ＸＯＳ骨格をキシロテトラオースまで発酵させることができるが、ＡＸＯＳの消費はより制限された菌株を含む。クラスターＩＶ及びＶにおいて、菌株はＸＯＳ及びＡＸＯＳの両方の広範な分解を有する。
【０００８】
ＡＸ由来のプレバイオティクスの当業技術の調製は、ＡＸ又はＡＸ含有物質のキシラナーゼ加水分解によって得られるＸＯＳ及びＡＸＯＳの両方の混合物を含む（Ａ）ＸＯＳ生成物を含む。EP2265127において、プレバイオティクス（Ａ）ＸＯＳ調製物は、ファミリ１０及び／又はファミリ１１のキシラナーゼを用いてコムギふすまから調製される。この出願は、Swennenらによる方法（２００６）に基づいており、最終調製物は、低いＡ／Ｘ比０．２５〜０．２６によって示される比較的少ないアラビノース含量を有する、ＸＯＳとＡＸＯＳとの混合物（Swennenら、２００６，図２ａ）である。これら調製物はキシロースも含み、それはプレバイオティクスとして考慮されてない、及び好ましくは最終生成物において回避される。従って、EP2265127及び現在の科学文献に記載されているＡＸ由来の全てのプレバイオティクス調製物は、十分に確立されたファミリ１０及び／又は１１のキシラナーゼによる酵素加水分解が常にキシロース、ＸＯＳ及びＡＸＯＳを生成するという事実により、キシロース、ＸＯＳ及びＡＸＯＳの混合物であることは明らかである。従って、現在の技術の限界は、キシロースとＸＯＳとの共形成が全くないか又は非常に少ない純粋なプレバイオティクスＡＸＯＳ組成物を製造することである。先行技術では、アラビノ−キシロオリゴ糖調製物が見出され得るが、ＡＸＯＳからより純粋で特異的なプレバイオティクスの調製が必要である。
【０００９】
発明の概要
本発明は、プレバイオティクスＡＸＯＳを、キシロース及びＸＯＳを生成することなく、アラビノキシラナーゼを用いてＡＸからどのように生成するかを記述する。この調製物は、キシロース及びＸＯＳを含まないオリゴ糖を含有するアラビノースの組成において特別である。ビフィズス菌の特定の菌株を特異的に刺激するそれらの能力は、それらをより選択的なプレバイオティクスとして有用にする。１つの実施形態において、本発明は、分子あたり、骨格のキシロース単位の１つに結合した少なくとも１つのアラビノース単位を含むＡＸＯＳ組成物であって、前記少なくとも１つのアラビノース単位は、α−Ｌ−アラビノフラノシルであり、前記組成物は、１〜１０の重合度を有するＸＯＳ骨格を備える組成物に関連する。別の実施形態において、ＡＸＯＳ組成物は、０．３〜０．６の平均アラビノース置換度を有する。さらに別の実施形態において、ＡＸＯＳ組成物は、０．２〜０．７の平均アラビノース置換度を有する。純粋なＡＸＯＳの適用は、ビフィズス菌の特定の群を選択的に刺激することである。このような調製物は、ビフィズス菌を添加し、又は添加することなく、食品又は飲料の成分において、又は栄養補助食品として使用することができる。１つの実施形態において、ＡＸＯＳ組成物は、ビフィドバクテリウムｓｐｐ（Bifidobacterium spp）の増殖を選択的に刺激するように適合される。別の実施形態において、ビフィドバクテリウムｓｐｐは、ＡＸＯＳ又はオリゴ糖上のアラビノース置換基を発酵させるのに適合した菌株に属する。さらに別の実施形態において、ビフィドバクテリウムｓｐｐは、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・カテニュラタム（Bifidobacterium catenulatum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Bifidobacterium pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・ガリカム（Bifidobacterium gallicum）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・アングラタム（Bifidobacterium angulatum）又はビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）からなる群から選択される。さらに本発明は、ＸＯＳとＡＸＯＳとの混合物を含む確立されたプレバイオティクス（Ａ）ＸＯＳ製剤におけるＡＸＯＳの改善された生成にも関連する。１つの実施形態において、本発明は、ＡＸＯＳ組成物を含み、ビフィドバクテリウムｓｐｐをさらに含むシンバイオティクス調製物である。別の実施形態において、シンバイオティクス調製物は、胃腸内の問題を改善する治療のためである。さらに別の実施形態において、シンバイオティクス調製物は、食品、飼料、飲料又は栄養補助食品からなる群から選択される製品の成分としての使用のためである。さらに別の実施形態において、本発明は、胃腸内の問題を改善する治療に使用するための、ＡＸＯＳ組成物、又はＡＸＯＳ組成物を含むシンバイオティクス調製物である。
【００１０】
１つの実施形態において、本発明は、ＡＸＯＳ又はＡＸＯＳ分子に結合したアラビノース置換基を発酵させるのに適したビフィズス菌の群に属している腸内細菌の特定の群のための選択的プレバイオティクスを含む。得られたＡＸＯＳの１つの実施形態において、本発明によれば、ＸＯＳを通常使用することができる腸内細菌の他の群に対しビフィズス菌の増殖を選択的に刺激することができる。別の実施形態において、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶからなる群から選択されるクラスター由来の菌株は、ＡＸＯＳのみを含む調製物を用いて選択的に刺激される。別の、より具体的な実施形態において、ビフィズス菌の菌株は、ビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム DSMZ 20219（Bifidobacterium longum subsp. Longum DSMZ 20219）（クラスター２）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス DSMZ 20083（Bifidobacterium adolescentis DSMZ 20083）（クラスター３）、ビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム CCUG15137（Bifidobacterium longum subsp. longum CCUG 15137）（クラスター４）、又はビフィドバクテリウム・カテニュラタム DSMZ 16992（Bifidobacterium catenulatum DSMZ 16992）（クラスター５）からなる群から選択される。
【００１１】
本発明は、様々な出発点、従って様々な出発物質が、本発明によるＡＸＯＳ組成物を製造する方法において使用することができることを含意する。１つの実施形態において、胚乳ＡＸが出発物質として使用される。別の実施形態において、ふすまが出発物質として使用される。様々な種類の穀粉分画又はふすまが考えられ、本発明は出発物質の選択によって制限されていると見なすべきではない。１つの実施形態において、出発物質は、胚乳ＡＸ、ふすま、殻又はわらからなる群から選択される。別の、より具体的な実施形態において、ふすま出発物質は、ライムギ、トウモロコシ、アワ、イネ、オオムギ、オートムギ又はコムギのような穀物の群から選択されるが、これらに限定されない。他の可能な出発物質は、これらに限定されないが、キノア（quinoa）、アマランス（amaranth）又はソバのような擬穀粉（pseudocereals）である。好ましくは、出発物質は、上記の植物のいずれか由来の穀粉又はふすまである。１つの実施形態において、出発物質は胚乳ＡＸを含む穀粉である。
【００１２】
従って、本発明の別の側面は、穀粉からＡＸＯＳ組成物を製造する方法であって、以下の工程を含む。
【００１３】
Ａ．  穀粉からの胚乳アラビノキシラン分画の抽出及び単離；
Ｂ．  工程Ａにて得られた生成物からのデンプン及びタンパク質の任意の除去；
Ｃ．  アラビノフラノシダーゼ、好ましくは二重置換のβ−（１→４）結合Ｄ−キシロピラノシル単位（ｄＸｙｌ）においてα−（１→３）結合Ｌ−アラビノフラノシルを除去できるものを用いる、工程Ａの胚乳アラビノキシラン又は工程Ｂの生成物の任意の処理；
Ｄ．  工程Ａ、工程Ｂ又は工程Ｃにて得られた生成物へのアラビノキシラナーゼの添加；及び
Ｅ．  工程Ｄにて得られた物質の乾燥。
【００１４】
１つの実施形態において、工程Ｃは、弱酸の添加を含む。１つの実施形態において、出発物質が穀粉である場合、Ａ／Ｘ比は０．２〜０．７、好ましくは０．２８〜０．６５、好ましくは０．３５〜０．５０、好ましくは０．３８〜０．４５、好ましくは０．４である。１つの実施形態において、本発明は、胚乳ＡＸがアラビノフラノシダーゼで酵素的に処理される工程を含む。１つの実施形態において、アラビノフラノシダーゼは、アラビノキシランアラビノフラノハイドロラーゼの群から選択され、好ましくはアラビノキシランアラビノフラノハイドロラーゼ−Ｄ３又はアラビノキシランアラビノフラノハイドロラーゼ−ｍ２，３からなる群から選択される。酵素処理の目的は、ＡＸＯＳの収率を改善するために、Ａｒａｆ基の分画を除去することである。別の実施形態において、本発明は、ふすまからＡＸＯＳ組成物を製造する方法であって、以下の工程を含む。
【００１５】
Ａ’．  ふすまからのデンプン及びタンパク質の除去；
Ｂ’．  Ａからの固相の回収；
Ｃ’．  可溶性相を提供するための、アルカリ性溶液、アルカリ性及び過酸化物溶液を用いる固相の処理、又は熱による固相の処理；
Ｄ’．  Ｃのアラビノキシランを含む可溶性相の中和、及びアラビノキシランを含む当該可溶性相の回収；
Ｅ’．  ０．２〜０．７、好ましくは０．３５〜０．５、好ましくは０．３８〜０．４５、好ましくは０．４のアラビノースとキシロースとのモル比が得られるように、アラビノフラノシダーゼ又は弱酸性溶液を用いる、工程Ｄの可溶性相を含むアラビノキシランからのアラビノースの除去；
Ｆ’．  好ましくは沈殿又は膜分離による、工程Ｅから得られたアラビノキシランを回収するための分離；
Ｇ’．  工程Ｆからの前記アラビノキシランへのアラビノキシラナーゼの添加；及び
Ｈ’．  工程Ｇにて得られた物質の乾燥。
【００１６】
１つの実施形態において、Ａ／Ｘ比は０．２〜０．７、好ましくは０．２８〜０．６５、好ましくは０．３５〜０．５、好ましくは０．３８〜０．４５、好ましくは０．４である。別の実施形態において、Ａ／Ｘ比は０．４である。さらに別の実施形態において、本発明は、ＡＸＯＳ組成物を製造する方法であって、ＡＸＯＳ組成物はアラビノキシラン特異的エンドキシラナーゼを用いて製造される。別の、より具体的な実施形態において、本発明は、ＡＸＯＳ組成物を製造する方法であって、アラビノキシラン特異的エンドキシラナーゼがアラビノキシラナーゼである。
【００１７】
さらに、別の実施形態において、本発明はＡＸＯＳ組成物を製造する方法であって、工程Ｃ’は１０〜１００％、より好ましくは５０〜１００％、さらにより好ましくは７０〜１００％、よりさらにより好ましくは８５〜１００％、最も好ましくは１００％のＡＸＯＳの収率に増加させるアラビノフラノシダーゼによる任意の処理を含む。１つの実施形態において、増加した収率は９５〜９９％である。
【００１８】
ふすまＡＸからＡＸＯＳ組成物を調製する場合、追加の工程が可能である。１つの実施形態において、本発明は、ＡＸＯＳ組成物を製造する方法であって、工程Ａ’は、それぞれアミラーゼ及びプロテアーゼを用いるデンプン及びタンパク質の除去を含む方法に関連する。別の実施形態において、本発明は、ＡＸＯＳ組成物を製造する方法であって、工程Ｃ’は、抽出の他の手段を用いる任意の、アルカリ及び過酸化物による抽出を含む方法に関連する。熱処理の様々な手段が、工程Ｃ’では可能である。１つの実施形態において、工程Ｃ’は、水溶性ＡＸ含量を増加させるための蒸気処理を含む。別の実施形態において、工程Ｃ’は、加圧水処理を含む。さらに別の実施形態において、本発明は、ＡＸＯＳ組成物を製造する方法であって、工程Ｅは、ＡＸＯＳの収率を増加させるための任意の処理を含む。１つの実施形態において、工程Ｅは、アラビノフラノシダーゼによる任意の処理を含む。別の実施形態において、工程Ｅは、限定されないが、無機酸、好ましくは塩酸、好ましくは硫酸、好ましくはリン酸又は好ましくは硝酸のような弱酸溶液による任意の処理を含む。
【００１９】
本発明の別の側面は、ＸＯＳ及びＡＸＯＳを含有する調製物におけるＡＸＯＳの生成を改善するためのアラビノキシラナーゼの使用に関連する。１つの実施形態において、本発明は、（Ａ）ＸＯＳにおけるＡＸＯＳの生成を改善するためのアラビノキシラナーゼの使用であって、ＸＯＳ及びＡＸＯＳの調製物が、ファミリ１０又は１１のキシラナーゼを用いて調製される使用に関連する。本発明の１つの側面は、分子あたり、骨格のキシロース単位の１つに結合した少なくとも１つのアラビノース単位を含むアラビノキシロ−オリゴ糖組成物に関し、少なくとも１つのアラビノース単位は、α−Ｌ−アラビノフラノシルであり、該組成物は、１〜１０の重合度を有するキシロ−オリゴ糖骨格を備え、該組成物は、１０％以下の単糖及び／又は１０％以下のキシロオリゴ糖を含む。
【００２０】
１つの実施形態において、本発明による組成物は、２０％以下、１５％以下、１０％以下、８％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１．６％以下、１％以下、０．１％以下、又は０．０１％以下の量で存在する単糖類を含んでもよい。１つの実施形態において、本発明による組成物は、０．０１〜２０％、０．０５〜１０％、０．０１〜５％、０．０５〜５％、０．０５〜２％、０．０１〜０．１％、０．０１〜１％、０．０５〜１．８％又は０．０５〜１．５％の量で存在する単糖類を含んでもよい。
【００２１】
１つの実施形態において、本発明による組成物は、２０％以下、１５％以下、１０％以下、８％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１．６％以下、１％以下、０．１％以下、又は０．０１％以下の量で存在するキシロオリゴ糖を含んでもよい。１つの実施形態において、本発明による組成物は、０．０１〜２０％、０．０５〜１０％、０．０１〜５％、０．０５〜５％、０．０５〜２％、０．０１〜０．１％、０．０１〜１％、０．０５〜１．８％又は０．０５〜１．５％の量で存在するキシロオリゴ糖を含んでもよい。
【００２２】
１つの実施形態において、単糖類はアラビノースを含んでもよい。１つの実施形態において、単糖類はキシロースを含んでもよい。１つの実施形態において、本明細書中の単糖及び／又はキシロオリゴ糖の量は、調製物の乾燥重量％に基づく。
【００２３】
さらに別の側面は、キシロ−オリゴ糖及びアラビノキシロ−オリゴ糖を含む調製物におけるアラビノキシロ−オリゴ糖の生成を改善するためのアラビノキシラナーゼの使用に関連する。１つの実施形態において、キシロ−オリゴ糖及びアラビノキシロ−オリゴ糖の調製物が、ファミリ１１のキシラナーゼを用いて調製される。別において、アラビノキシラナーゼが、グリコシド加水分解酵素ファミリ５に属するキシラナーゼである。別の実施形態において、アラビノキシロ−オリゴ糖は穀物繊維から生成される。別の実施形態において、本発明によるアラビノキシラナーゼの使用は、以下の工程を含む。
【００２４】
Ａ’．  穀類繊維からのデンプン及び任意のタンパク質の除去；
Ｂ’．  Ａからの固相の回収；
Ｃ’．  非水溶性のアラビノキシランを加水分解可能なキシラナーゼを用いる、工程Ｂからの固相の処理；
Ｄ’．  アラビノキシロ−オリゴ糖の生成を改善するために、工程Ｃへの高度に置換されたアラビノキシランを加水分解可能なアラビノキシラナーゼの添加；
Ｅ’．  オリゴ糖を含む工程Ｄからの可溶性相の回収；
Ｆ’．  工程Ｅからの当該可溶性相の任意の精製；
Ｇ’．  工程Ｆからの可溶性相の濃縮又は乾燥。  
別の実施形態において、穀物繊維はライムギ、トウモロコシ、アワ、イネ、オオムギ、オートムギ又はコムギから得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】アラビノキシラナーゼによって生成されるＡＸＯＳは、異なる保持時間（表１）によって見られるように、得られた異なる生成物によって示されるファミリ１０及び１１のキシラナーゼによって得られるＸＯＳ及びＡＸＯＳ混合物とは異なる。
【図２】下部クロマトグラム：コムギ胚乳ＡＸから生成した主要なＡＸＯＳ（ピーク１〜１３）、及び上部クロマトグラム：キシロース及びＸＯＳ骨格を露出させるためにアラビノフラノシダーゼ処理した試料。Ｘ：キシロース、Ｘ２：キシロビオース、Ｘ３：キシロトリオース、Ｘ４：キシロテトラオース、Ｘ５：キシロペンタース、Ｘ６：キシロヘキサオース、Ｘ７：キシロヘプタオース、及びＸ８：キシロオクタオース。
【図３】下部クロマトグラム：ライムギ胚乳ＡＸから生成した主要なＡＸＯＳ（ピーク１〜１３）、及び上部クロマトグラム：キシロース及びＸＯＳ骨格を露出させるためにＨＣｌ処理した試料。Ｘ：キシロース、Ｘ２：キシロビオース、Ｘ３：キシロトリオース、Ｘ４：キシロテトラオース、Ｘ５：キシロペンタオース、Ｘ６：キシロヘキサオース、Ｘ７：キシロヘプタオース、Ｘ８：キシロオクタオース、Ｘ９：キシロエンネアオース、及びＸ１０：キシロデカオース。
【図４】アラビノキシラナーゼＡＸＯＳの最適収率は、０．３５〜０．６１の範囲であり、０．４３が最も高い収率として示されている。
【図５】上部クロマトグラム：より短いオリゴ糖への保持時間のシフトとして示されたように、アラビノキシラナーゼの添加を用いる混合物を含むＸＯＳ及びＡＸＯＳにおけるＡＸＯＳの改善された生成（白い矢印）、及び最初の組成物におけるＡＸＯＳピーク（黒い矢印）の消失（下部クロマトグラム）。
【図６】消失ピーク１〜６に示されるように、ライムギ胚乳ＡＸ由来のアラビノキシラナーゼ誘導ＡＸＯＳのビフィドバクテリウム・アドレスセンティスの利用。
【図７】ラクトバシルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）は、残りのピーク１〜６によって示されるような、ライムギ胚乳ＡＸ由来のアラビノキシラナーゼ誘導ＡＸＯＳを利用しない。
【００２６】
発明の詳細な説明  
アラビノキシラナーゼは、無置換のキシランを攻撃しないので、ＡＸに対する特異性が独特である。これらの酵素によって生成されたオリゴ糖は、還元末端Ｘｙｌｐ単位に結合した少なくとも１つの（１→３）Ａｒａｆ基を含む。この酵素の群は、ＡＸ又はＡＸ含有物質由来のプレバイオティクスＡＸＯＳの製造において以前は使用されていないか、又は考慮されていなかった。本発明において、アラビノキシラナーゼが、ＡＸ含有物質からＡＸＯＳを製造するために使用される。アラビノキシラナーゼによって得られるこれらＡＸＯＳ調製物は、キシロース及びＸＯＳが欠如し、それらＡＸＯＳ組成物中の独特なプレバイオティクスである。ＡＸからプレバイオティクスを製造するために使用された当業技術のキシラナーゼとの比較は、得られた加水分解生成物の差異を明らかに示している（図１及び表１）。ＡＸＯＳの生成は、０．２〜０．７、好ましくは０．２８〜０．６５、好ましくは０．３５〜０．５、好ましくは０．３８〜０．４５、好ましくは０．４のＡ／Ｘ比を選択することによってさらに最適化される。ＡＸＯＳ調製物は、ＡＸＯＳ又はＡＸＯＳ分子に結合したアラビノース置換基を発酵させるのに適したビフィズス菌群に属する腸内細菌の特定の群のための選択的プレバイオティクスとして特に有用である。
【表１】
2018522816.tif 000003
【００２７】
第１の例において、ＡＸＯＳは、コムギ及びライムギ由来の胚乳（穀粉）ＡＸから生成されるが、これらコムギ及びライムギに限定されない。胚乳ＡＸは、ＡＸＯＳの収率を改善するために、必要に応じてアラビノフラノシダーゼを用いて酵素的に処理され、Ａｒａｆ基の分画を除去する。胚乳ＡＸから生成された純粋なＡＸＯＳは、コムギについては図２に、ライムギについては図３に示されている。このデータは、調製物中にキシロース又はＸＯＳが形成されない（乾燥重量基準において０．１％未満）ということを示す。アラビノフラノシダーゼ又は塩化水素酸を用いて得られたＡＸＯＳに結合した全てのＡｒａｆ基の除去後のみに、キシロース及びＸＯＳ骨格が露出される。これは、得られたオリゴ糖の全てがキシロース及びＸＯＳの形成がない、又はほとんどないＡＸＯＳであることを確認する。全てのＡｒａｆ基の除去後のＸＯＳ骨格の分析から、ＡＸＯＳの骨格重合度（ＤＰ）がコムギ胚乳ＡＸについては１〜８（図２）、ライムギ胚乳ＡＸについては１〜１０（図３）であることが決定される。コムギ及びライムギ胚乳ＡＸ由来のＡＸＯＳの大部分は、平均骨格が３であった（表２）。
【表２】
2018522816.tif 000004
【００２８】
さらに、アラビノキシラナーゼによるＡＸＯＳの生成について決定された、ＡＸ基質におけるアラビノース含量の影響があった。ＡＸから得られたＡＸＯＳの最高収率は、０．４３のＡ／Ｘ（図４）を用いて達成され、ＡＸＯＳの最適な生成が、Ａ／Ｘ＝０．６１〜０．３５の範囲内にあり、０．４３が最適に最も近いことを示している。このことの重要性は、アラビノキシラナーゼ処理の前又は最中にＡＸ基質から、Ａｒａｆ基を部分的に除去することによるＡＸＯＳの最適化生成にある。
【００２９】
この技術の別の適用は、ＸＯＳとＡＸＯＳの両方を含む混合物中のＡＸＯＳの改良された生成において実証されている。ファミリ１１のキシラナーゼ由来の（Ａ）ＸＯＳ混合物へのアラビノキシラナーゼの添加により、新しいＡＸＯＳが、ファミリ１１のキシラナーゼによって加水分解されていないポリ及びオリゴ糖を分解することにより形成される（図５）。これらＸＯＳ及びＡＸＯＳ混合物は、当業技術のキシラナーゼ処理を用いて得ることができ、アラビノキシラナーゼの添加は、そのような調製物におけるＡＸＯＳの生成を改善する方法である。調製物は、ＸＯＳ及びＡＸＯＳを含有するこのような製品のプレバイオティクス特性を改善するために、EP2265127B1に記載されたものと類似する。
【００３０】
第２の例において、コムギふすまは、アラビノキシラナーゼによってＡＸＯＳを製造するのに適したＡＸの異なる分画を製造するための基質として用いられる。当該分画は、最初にデンプン及びタンパク質の除去、続くふすま材料からのＡＸ成分の抽出によって、ふすま材料から単離される。続いて、アラビノキシラナーゼを用いて異なるＡＸＯＳ組成物を製造するために使用することができる、異なるＡ／Ｘ比（表３）を有する分画を得るために、アラビノフラノシダーゼ又は酸処理してＡＸをその後酵素的に処理する。
【００３１】
第３の例において、得られたＡＸＯＳは、キシロース又はＸＯＳを通常用いることができる腸内細菌の他の群に対しビフィズス菌の増殖を選択的に刺激するために用いることができるということが示されている（図６及び７）。その理由は、得られたＡＸＯＳは通常、例えばラクトバシルス・ブレビスによって利用され得るキシロースもＸＯＳも含まないということである。異なるビフィズス菌株の炭水化物選好にも違いもあるということが、ＡＸＯＳをビフィズス菌の特定の菌株を刺激するために使用することができるということを意味する。クラスターＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶのいずれか由来の菌株は、ＡＸＯＳのみを含む組成物を用いて選択的に刺激することができた。
【００３２】
クラスターＩＩ〜Ｖ由来の代表的な菌株は、以下のビフィズス菌の菌株であるが、これらに限定されない：
・ビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム DSMZ 20219 (クラスター２)
・ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス DSMZ 20083 (クラスター３)
・ビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム 15137 (クラスター４)
・ビフィドバクテリウム・カテニュラタム DSMZ 16992 (クラスター５)
特にクラスター４及び５に属している菌株は、ＡＸＯＳ全体を効率的に利用することができ、かつ得られたＡＸＯＳと組み合わせることが特に興味深い。しかしながら、ＡＸＯＳ上に存在するアラビノース置換基を開裂することができる、又はＡＸＯＳ全体を利用することができる、全てのビフィズス菌は、刺激することが可能である。
【００３３】
例
例１：アラビノキシラナーゼＡＸＯＳの調製
材料及び方法
クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）（CtXyl5A）由来のアラビノキシラナーゼを、Nzytech（リスボン、ポルトガル）から購入した。ロードサーマス・マリナス（Rhodothermus marinus）（RmXyn10A）由来のファミリ１０のキシラナーゼを、Falckら（２０１３）に記載されたように調製した。ペントパンモノbg（Pentopan mono bg）、市販のファミリ１１のキシラナーゼを、ノボザイム（Novozymes）（バウスベア、デンマーク）から得た。セロビブリオ・ジャポニカス（Cellvibrio japonicus）由来の高純度組換えα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（E-ABFCJ）を、メガザイム（Megazyme）（ウィックロー、アイルランド）から購入した。コムギ（P-WAXYM、P-EDWAX30、P-ADWAX26、P-ADWAX22）及びライムギ（P-RAXY）からアルカリによって抽出された胚乳ＡＸを、メガザイムから購入した。ＡＸ基質を５０ｍＬのＭＱ水中に製造指示により１０ｇ／Ｌ溶解し、ｐＨを８ＭのＨＣｌを用いて７に調整した。ファミリ５由来のアラビノキシラナーゼと、ファミリ１０及び１１由来のキシラナーゼとを、質量比１：１０００の酵素対基質比で添加した。アラビノキシラナーゼ反応において、２ｍＭのＣａＣｌ２を、酵素を安定化させるために用いた。全ての反応を、サーモブロック（thermoblock）又は水浴のいずれかを用いて、５０℃で２４時間行った。酵素を、９５℃で３０分間試料をインキュベートすることにより不活性化した。
【００３４】
アラビノキシラナーゼと、ファミリ１０及び１１のキシラナーゼとの比較（図１）を、０．４３のＡ／Ｘに等しい３０％アラビノース含量によるコムギ胚乳ＡＸ（P-EDWAX30）を用いて行なった。ＡＸを、バクテロイデス・オバタス（Bacteroides ovatus）由来のアラビノフラノシダーゼを用いて処理し、二重置換Ｘｙｌｐ単位（ｄＸｙｌ）における全てのα−（１→３）結合Ａｒａｆを除去した。アラビノキシラナーゼ試料におけるキシロース及びＸＯＳのＡＸＯＳ骨格のキャラクタリゼーション（図２）を、それぞれ（１→２）又は（１→３）単一置換されたＸｙｌｐ単位、ｍＸｙｌ２及びｍＸｙｌ３からＡｒａｆを除去するアラビノフラノシダーゼ（Ｅ−ＡＢＦＣＪ）を用いて、０．５Ｕ／（ｍｇ  ＡＸＯＳ）で行なった。反応を、５０℃で２４時間、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を用いてｐＨ５．８で行なった。この処理により、ＡＸＯＳからＡｒａｆが完全に除去された（図２）。ライムギ胚乳ＡＸを、アラビノキシラナーゼ反応を４８時間行なったことを除いて、コムギと同様に処理した。得られたＡＸＯＳから全ての一置換及び二置換Ａｒａｆ基を除去するために、弱酸処理を用いた。ｐＨを、希釈したＨＣｌ溶液を用いて２．８に設定し、試料（５ｍＬ）を９０℃で２４時間インキュベートし、その結果ＡＸＯＳから全てのＡｒａｆ基をほぼ完全に除去した（図３）。
【００３５】
アラビノース含量と、アラビノキシラナーゼ生成ＡＸＯＳの収率との関係を、異なるアラビノース含有量を有するコムギ胚乳を用いて決定した。アラビノース含量はそれぞれ３８％、３０％、２６％及び２２％、又はそれぞれＡ／Ｘ０．６１、０．４３、０．３５及び０．２８に基づくP-WAXYM、P-EDWAX30、P-ADWAX26及びP-ADWAX22である（図４）。反応を、２ｍＬの反応容量及び０．２ｇ／Ｌの基質濃度の基質濃縮物を用いてガラスバイアル中で行なった。アラビノキシラナーゼを、ペントパン（pentopan）生成（Ａ）ＸＯＳを処理するために使用し、キシラナーゼ反応について前述したものと同じ反応条件を用いて、ＸＯＳ及びＡＸＯＳ混合物（図５）中により多い及びより短いＡＸＯＳを生成した。
【００３６】
ＡＸＯＳとＸＯＳのキャラクタリゼーション  
得られたＡＸＯＳ分画及びＸＯＳ骨格の分析を、同じ材料のCarboPac PA200カラム（２５０ｍｍ×３ｍｍ，５．５μｍ）及びガードカラム（５０ｍｍ×３ｍｍ）と、０〜１２０ｍＭの酢酸ナトリウム（シグマ（Sigma））の直線勾配（０〜３０分）及び０．５ｍＬ／分における１００ｍＭのＮａＯＨの移動相とを用い、（ＩＣＳ−５０００）を用いるパルス電気化学的検出と結合した高性能アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）により行った。使用した単糖及びキシロオリゴ糖標準は以下の通りであった：アラビノース及びキシロース（シグマ）、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオース及びキシロヘキサオース（メガザイム）。全ての試料を０．２２μｍフィルタで濾過し、分析前に０．２ｇ／Ｌの最終濃度に希釈した。
【００３７】
例２：ふすま由来の異なるＡ／Ｘ比を有するＡＸ基質の調製
材料及び方法
市販のコムギふすま（ラントマンネンミルマルモ（Lantmaennen Mill Malmoe（当該aeはaのウムラウト表記であり、当該oeはoのウムラウト表記である。））、スウェーデン）を、Ａ／Ｘとして定義された異なるアラビノース含量を有するＡＸの調製物のための出発物質として使用した。２．５ＬのＤＩ水中のコムギふすま２５０ｇの懸濁液（１：９ｗ／ｖ）を、８ＭのＨＣｌでｐＨ６．０に調整し、９０℃で９０分間熱安定性α−アミラーゼ０．１２Ｕ／ｇ（サーマミル（Thermamyl）、シグマアルドリッチ（SIGMA−ALDRICH））を処理し、デンプンを加水分解した。続いて、ふすまを熱い水道水ですすぎ、クリアな透過物が得られるまで可溶物を除去した。水中の新しい懸濁液（１：９ｗ／ｖ）を、５０℃で４時間、プロテアーゼ０．０３５Ｕ／ｇ（ニュートラルス 0.8L（Neutralse 0.8L）、シグマアルドリッチ）を用いてインキュベートすることによって、タンパク質を除去して調製した。その後、ふすまを熱い水道水、次いでＤＩ水ですすぎ、続いて真空乾燥した。脱デンプン及び脱タンパクされたコムギふすまを、２％過酸化水素を含有する過酸化水素のｐＨ１１．５の希アルカリ溶液（ＮａＯＨ）を用いて６０℃で４時間、２００ｒｐｍで撹拌して抽出し、可溶性ＡＸを得た。消泡剤トリトンX-100（TRITON X-100）を添加し、発泡を減少させた。抽出後、固体を濾過により除去し、溶液を６０００ｇで２０分間遠心分離した（シグマ）。上澄みを８ＭのＨＣｌで中和し、セイヨウワサビペルオキシダーゼを添加し、残留している過酸化水素を除去した。抽出物を６０００ｇで２０分間、再び遠心分離した。上澄みを分離し、５０ｍＬを８ＭのＨＣｌでｐＨ６に調整し、３７℃で２４時間試料をインキュベートすることにより、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（メガザイム、E-AFAM2）由来の５Ｕのアラビノフラノシダーゼで処理した。上澄みは、２００ｒｐｍの磁性プレート攪拌機上で、９０℃、ｐＨ２．５で弱ＨＣｌ酸によって脱分岐した酸でもあった。試料（５０ｍＬ）を取り出し、３．４、５．１、６．８及び８．６時間後に１ＭのＮａＯＨで中和した。全ての分画を3500 Da Mwカットオフを用いる透析バッグ（SpectrumLab,USA）により脱塩した。透析を５ＬのＤＩ水で２度実施し、続いて全ての試料を凍結乾燥した。
【００３８】
単離した調製物のキャラクタリゼーション  
ＡＸ分画の単糖組成物を、１１０℃で６０分間、２ＭのＴＦＡを用いて試料を加水分解した後、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより分析した。試料中の総アラビノキシラン含量を、遊離アラビノースを除いた後に０．８８倍（％アラビノース＋％キシロース）して計算した。
【００３９】
得られた単糖類の分析を、同じ材料のCarboPac PA20カラム（２５０ｍｍ×３ｍｍ，５．５μｍ）及びガードカラム（５０ｍｍ×３ｍｍ）、並びに０．１５ｍＭ／分における１００ｍＭの塩基のポストカラム添加を用いる０．５ｍＬ／分における０．７５ｍＭのＮａＯＨの移動相を用いるＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより行った。単糖類（シグマ）は以下の通りであった。：アラビノース、ガラクトース、グルコース及びキシロース。結果として得られたＡ／Ｘ分画を表３に示す。
【表３】
2018522816.tif 000005
【００４０】
例３：アラビノキシラナーゼＡＸＯＳによる腸内細菌の選択的増殖
材料及び方法
ライムギ胚乳ＡＸから得られたＡＸＯＳの発酵性を試験するために使用した細菌株は、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂ．アドレセンティス）（B.adolescentis）ATCC 15703及びラクトバシルス・ブレビス（Ｌ．ブレビス）（L. brevis）DSMZ 1269であった。Ｂ．アドレセンティス、Ｌ．ブレビスを、炭素源として５ｇ／Ｌのグルコースを用いて、２度全て予備培養した。Ｂ．アドレセンティスを、３７℃及びｐＨ６．８でビフィドバクテリウム培地に接種した。当該培地は、それぞれリットル当たり１２．５ｇのカゼインペプトン（casein peptone）、トリプシン消化物、６．２５ｇの酵母抽出物、６．２５ｇの肉抽出物、６．２５ｇのバクトソイトン(bacto soytone)、２．５ｇのＫ２ＰＯ４、０．２５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０６２５ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、６．２５ｇのＮａＣｌ、及び１．２５ｍＬのツイン80（Tween 80）を含んだ。この溶液へ、それぞれリットル当たり０．２５ｇのＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ、０．５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇのＫ２ＨＰＯ４、１ｇのＫＨ２ＰＯ４、１０ｇのＮａＨＣＯ３、及び２ｇのＮａＣｌを含有する５０ｍＬの塩溶液とともに、５ｍＬのレザズリン（resazurin）溶液（２５ｍｇ／１００ｍＬ）を添加した。その後、培地を煮沸し、続いてＮ２ガス下で冷却した。システインを０．６２５ｇ／Ｌの濃度へ添加し、ＮａＯＨを用いてｐＨ６．８に調整した。Ｌ．ブレビスを３７℃の嫌気性条件下、ｐＨ６．５でＭＲＳ培養液中で嫌気的に増殖した。培養試験のための全ての培地、培養液並びに寒天を１２１℃で１５分間オートクレーブ処理した。嫌気性増殖に使用した全ての培養培地を、窒素ガスを用いる嫌気性試験管の酸素の置換により脱気した。続いて、全ての試験管を金属キャップで閉じ、１２１℃で１５分間オートクレーブ処理した。各炭素源グルコース及びＡＸＯＳを、０．４５μｍフィルタを通して濾過滅菌し、最終濃度５ｇ／Ｌ及び総量５ｍＬで培地に添加した。発酵試験を、２％ｖｏｌ．／ｖｏｌ．の接種材料を用いる第２の予備培養から開始し、試料を２４及び４８時間後に採取した。光学濃度及びｐＨを０、２４及び４８時間後に測定し、一方オリゴ糖の消費を、オリゴ糖分析について記載した同様の条件によるＨＰＡＥＣ−ＰＡＤを用いて４８時間後に分析した。Ｂ．アドレセンティスは、ライムギ胚乳ＡＸから生成されたアラビノキシラナーゼＡＸＯＳで増殖でき、一方Ｌ．ブレビスは、調製物がキシロース又はＸＯＳ分子を含まないという事実のために増殖できなかった（各図６及び７）。
【表４】
2018522816.tif 000006
【００４１】
参考文献  
【表５】
2018522816.tif 000007
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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