(57)【要約】本開示は、細孔を含有する表面を通って細胞懸濁液を通過させるステップを含む、化合物を細胞内に送達するための方法およびデバイスであって、細孔が細胞を変形させ、それによってこの化合物が細胞に入るように細胞の摂動を生じ、細胞懸濁液が化合物と接触する、方法およびデバイスに関する。上記表面は、フィルター、膜、またはマイクロシーブであり得る。細胞の摂動は、細胞外からの物質が細胞内に移動することを可能にする細胞の破れ目であり得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細孔を含有する表面を通って細胞懸濁液を通過させるステップを含む、化合物を細胞内に送達するための方法であって、前記細孔が、前記細胞を変形させ、それによって前記化合物が前記細胞に入るように前記細胞の摂動が生じ、前記細胞懸濁液が、前記化合物と接触する、方法。
【請求項２】
前記表面が膜である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記表面がフィルターである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記表面が蛇行する経路の表面である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記表面が、ポリカーボネート、ポリマー、シリコン、ガラス、金属、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、グラファイト、およびセラミックの１つから選択される材料を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細孔への入口が、前記細孔よりも広いか、前記細孔よりも狭いか、または前記細孔と同じ幅である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記表面が、エッチング、トラックエッチング、リソグラフィー、レーザーアブレーション、スタンピング、微細孔パンチング、ポリマースポンジ、直接発泡成形、押出成形およびホットエンボス加工の方法から選択される方法を使用して製造される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細孔のサイズが、細胞径と相関している、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細孔の横断面の幅が、前記細胞径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９９％である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
表面の横断面の幅が、約１ｍｍから約１ｍの間の範囲である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細孔の横断面の幅が、約０．０１μｍから約３００μｍの範囲である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細孔の横断面の幅が、約０．０１から約３５μｍの範囲である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細孔の横断面の幅が、約０．４μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約８μｍ、約１０μｍ、約１２μｍ、または約１４μｍである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細孔の横断面の幅が、約２００μｍである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細孔のサイズが、不均質である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
不均質な細孔の横断面の幅が、１０から２０％の範囲で変動する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細孔のサイズが、均質である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細孔が、同一の入口角および出口角を有する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細孔が、異なる入口角および出口角を有する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細孔の横断面の形状が、環状、円形、四角形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形、および八角形の形状から選択される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細孔の横断面の形状が、円柱形または円錐形から選択される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細孔の縁が、滑らかである、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細孔の縁が、鋭い、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細孔の通路が、真っ直ぐである、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細孔の通路が、湾曲している、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細孔が、全表面積の約１０から８０％を構成する、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記表面が、合計約１．０×１０５から約１．０×１０３０個の細孔を含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記表面が、表面積１ｍｍ２当たり約１０から約１．０×１０１５個の細孔を含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細孔が、平行に分布している、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
複数の表面が、直列に分布している、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記細孔の分布が、規則正しい、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記細孔の分布が、ランダムである、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記表面の厚さが、均一である、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記表面の厚さが、均一ではない、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記表面が、約０．０１μｍから約５ｍの厚さである、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記表面が、約１０μｍの厚さである、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記表面が、材料で被覆されている、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記材料が、テフロン（登録商標）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記材料が、細胞に結合する接着性コーティングを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記材料が、界面活性剤を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記材料が、抗凝固剤を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記材料が、ポリペプチドを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記材料が、接着分子を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記材料が、抗体を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
前記材料が、細胞機能を調節する因子を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
前記材料が、核酸を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
前記材料が、脂質を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４８】
前記材料が、炭水化物を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４９】
前記材料が、複合体を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項５０】
前記複合体が、脂質−炭水化物複合体である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記材料が、膜貫通タンパク質を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項５２】
前記材料が、前記表面に共有結合している、請求項３７から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記材料が、前記表面に非共有結合している、請求項３７から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記表面が、親水性である、請求項１から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記表面が、疎水性である、請求項１から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記表面が、帯電している、請求項１から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞懸濁液が、哺乳動物細胞を含む、請求項１から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞懸濁液が、混成の細胞集団を含む、請求項１から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞懸濁液が、全血である、請求項１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞懸濁液が、リンパ液である、請求項１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞懸濁液が、末梢血単核球を含む、請求項１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞懸濁液が、精製された細胞集団を含む、請求項１から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞が、免疫細胞、細胞株の細胞、幹細胞、腫瘍細胞、線維芽細胞、皮膚細胞、神経細胞、または赤血球である、請求項１から５８または６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マスト細胞または好中球である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞が、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヤギ、またはウサギ細胞である、請求項１から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記化合物が、核酸を含む、請求項１から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記化合物が、核酸をコードするＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または自己増幅ｍＲＮＡを含む、請求項１から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記化合物が、プラスミドである、請求項１から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記化合物が、ポリペプチド−核酸複合体を含む、請求項１から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記化合物が、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む、請求項１から６６または７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記化合物が、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む、請求項１から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記化合物が、タンパク質またはペプチドを含む、請求項１から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記化合物が、ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＣＲＥリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｒリコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはトランスポザーゼを含む、請求項１から６６または７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記化合物が、抗体である、請求項１から６６または７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記化合物が、転写因子である、請求項１から６６または７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記化合物が、小分子である、請求項１から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記化合物が、ナノ粒子である、請求項１から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記化合物が、キメラ抗原受容体である、請求項１から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記化合物が、蛍光によりタグ付けされた分子である、請求項１から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記化合物が、リポソームである、請求項１から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記細胞懸濁液が、前記細孔を通って通過する前、それと同時またはその後に、前記化合物と接触する、請求項１から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
送達される前記化合物が、前記表面に被覆されている、請求項１から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
０℃から４５℃の間で実行される、請求項１から８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞が、正圧または負圧により前記細孔を通って通過する、請求項１から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記細胞が、定圧または可変圧により前記細孔を通って通過する、請求項１から８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
圧力が、注射器を使用して印加される、請求項１から８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
圧力が、ポンプを使用して印加される、請求項１から８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
圧力が、減圧を使用して印加される、請求項１から８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記細胞が、毛細管圧により前記細孔を通って通過する、請求項１から８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記細胞が、血圧により前記細孔を通って通過する、請求項１から８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記細胞が、ｇ-力により前記細孔を通って通過する、請求項１から８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記細胞が、約０．０５ｐｓｉから約５００ｐｓｉの範囲の圧力下で前記細孔を通って通過する、請求項１から９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記細胞が、約２ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、請求項１から９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記細胞が、約２．５ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、請求項１から９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記細胞が、約３ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、請求項１から９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記細胞が、約５ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、請求項１から９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記細胞が、約１０ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、請求項１から９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記細胞が、約２０ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、請求項１から９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
流体の流れにより前記細胞を前記細孔中に通過させる、請求項１から９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記細胞が前記細孔を通って通過する前、前記流体の流れが、乱流である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記細孔中を通る前記流体の流れが、層流である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記細胞が前記細孔を通って通過した後、前記流体の流れが、乱流である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
前記細胞が、均一な細胞速度で前記細孔を通って通過する、請求項１から１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記細胞が、変動する細胞速度で前記細孔を通って通過する、請求項１から１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記細胞が、約０．１ｍｍ／秒から約２０ｍ／秒の範囲の速度で前記細孔を通って通過する、請求項１から１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記表面が、より大きなモジュール内に含有されている、請求項１から１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記表面が、注射器内に含有されている、請求項１から１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記細胞懸濁液が、水溶液を含む、請求項１から１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記水溶液が、細胞培養培地、ＰＢＳ、塩、糖、増殖因子、動物由来産物、増量材、界面活性剤、潤滑剤、ビタミン、タンパク質、キレート剤、および／またはアクチン重合に影響を与える薬剤を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記アクチン重合に影響を与える薬剤が、ラトランクリンＡ、サイトカラシン、および／またはコルヒチンである、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記細胞培養培地が、ＤＭＥＭ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、またはＸ−ＶＩＶＯである、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１３】
前記細胞懸濁液の粘度が、約８．９×１０−４Ｐａ・秒から約４．０×１０−３Ｐａ・秒の範囲である、請求項１から１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記表面に近接する少なくとも１つの電極により発生する電界を通って前記細胞を通過させるステップをさらに含む、請求項１から１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
細孔を含有する表面を含む、細胞内に化合物を送達するためのデバイスであって、前記細孔が、溶液に懸濁された細胞が通過できるように構成されており、前記細孔が、前記細胞を変形させ、それによって前記化合物が前記細胞に入るように前記細胞の摂動が生じる、デバイス。
【請求項１１６】
前記表面が膜である、請求項１１５に記載のデバイス。
【請求項１１７】
前記表面がフィルターである、請求項１１５に記載のデバイス。
【請求項１１８】
前記表面が蛇行する経路の表面である、請求項１１５から１１７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１１９】
前記表面が、ポリカーボネート、ポリマー、シリコン、ガラス、金属、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、グラファイト、およびセラミックの１つから選択される材料を含む、請求項１１５から１１８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２０】
前記細孔への入口が、前記細孔よりも広いか、前記細孔よりも狭いか、または前記細孔と同じ幅である、請求項１１５から１１９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２１】
前記表面が、エッチング、トラックエッチング、リソグラフィー、レーザーアブレーション、スタンピング、微細孔パンチング、ポリマースポンジ、直接発泡成形、押出成形およびホットエンボス加工の方法から選択される方法を使用して製造される、請求項１１５から１２０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２２】
前記細孔のサイズが、細胞径と相関している、請求項１１５から１２１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２３】
前記細孔の横断面の幅が、前記細胞径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９９％である、請求項１１５から１２２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２４】
表面の横断面の幅が、約１ｍｍから約１ｍの間の範囲である、請求項１１５から１２３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２５】
前記細孔の横断面の幅が、約０．０１μｍから約３００μｍの範囲である、請求項１１５から１２４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２６】
前記細孔の横断面の幅が、約０．０１から約３５μｍの範囲である、請求項１１５から１２５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２７】
前記細孔の横断面の幅が、約０．４μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約８μｍ、約１０μｍ、約１２μｍ、または約１４μｍである、請求項１１５から１２６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２８】
前記細孔の横断面の幅が、約２００μｍである、請求項１１５から１２５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２９】
前記細孔のサイズが、不均質である、請求項１１５から１２８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１３０】
不均質な細孔の横断面の幅が、１０から２０％の範囲で変動する、請求項１１５から１２９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１３１】
前記細孔のサイズが、均質である、請求項１１５から１２８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１３２】
前記細孔が、同一の入口角および出口角を有する、請求項１１５から１３１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１３３】
前記細孔が、異なる入口角および出口角を有する、請求項１１５から１３１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１３４】
前記細孔の横断面の形状が、環状、円形、四角形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形、および八角形の形状から選択される、請求項１１５から１３３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１３５】
前記細孔の形状が、円柱形または円錐形から選択される、請求項１１５から１３３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１３６】
前記細孔の縁が、滑らかである、請求項１１５から１３５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１３７】
前記細孔の縁が、鋭い、請求項１１５から１３５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１３８】
前記細孔の通路が、真っ直ぐである、請求項１１５から１３７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１３９】
前記細孔の通路が、湾曲している、請求項１１５から１３７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１４０】
前記細孔が、全表面積の約１０から８０％を構成する、請求項１１５から１３９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１４１】
前記表面が、合計約１．０×１０５から約１．０×１０３０個の細孔を含む、請求項１１５から１４０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１４２】
前記表面が、表面積１ｍｍ２当たり約１０から約１．０×１０１５個の細孔を含む、請求項１１５から１４１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１４３】
前記細孔が、平行に分布している、請求項１１５から１４２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１４４】
複数の表面が、直列に分布している、請求項１１５から１４３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１４５】
前記細孔の分布が、規則正しい、請求項１１５から１４４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１４６】
前記細孔の分布が、ランダムである、請求項１１５から１４４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１４７】
前記表面の厚さが、均一である、請求項１１５から１４６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１４８】
前記表面の厚さが、均一ではない、請求項１１５から１４６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１４９】
前記表面が、約０．０１μｍから約５ｍの厚さである、請求項１１５から１４８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１５０】
前記表面が、約１０μｍの厚さである、請求項１１５から１４９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１５１】
前記表面が、材料で被覆されている、請求項１１５から１５０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１５２】
前記材料が、テフロン（登録商標）である、請求項１５１に記載のデバイス。
【請求項１５３】
前記材料が、細胞に結合する接着性コーティングを含む、請求項１５１に記載のデバイス。
【請求項１５４】
前記材料が、界面活性剤を含む、請求項１５１に記載のデバイス。
【請求項１５５】
前記材料が、抗凝固剤を含む、請求項１５１に記載のデバイス。
【請求項１５６】
前記材料が、ポリペプチドを含む、請求項１５１に記載のデバイス。
【請求項１５７】
前記材料が、接着分子を含む、請求項１５１に記載のデバイス。
【請求項１５８】
前記材料が、抗体を含む、請求項１５１に記載のデバイス。
【請求項１５９】
前記材料が、細胞機能を調節する因子を含む、請求項１５１に記載のデバイス。
【請求項１６０】
前記材料が、核酸を含む、請求項１５１に記載のデバイス。
【請求項１６１】
前記材料が、脂質を含む、請求項１５１に記載のデバイス。
【請求項１６２】
前記材料が、炭水化物を含む、請求項１５１に記載のデバイス。
【請求項１６３】
前記材料が、複合体を含む、請求項１５１に記載のデバイス。
【請求項１６４】
前記複合体が、脂質−炭水化物複合体である、請求項１６３に記載のデバイス。
【請求項１６５】
前記材料が、膜貫通タンパク質を含む、請求項１５１に記載のデバイス。
【請求項１６６】
前記材料が、前記表面に共有結合している、請求項１５１から１６５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１６７】
前記材料が、前記表面に非共有結合している、請求項１５１から１６５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１６８】
前記表面が、親水性である、請求項１１５から１６７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１６９】
前記表面が、疎水性である、請求項１１５から１６７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１７０】
前記表面が、帯電している、請求項１１５から１６９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１７１】
前記細胞懸濁液が、哺乳動物細胞を含む、請求項１１５から１７０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１７２】
前記細胞懸濁液が、混成の細胞集団を含む、請求項１１５から１７１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１７３】
前記細胞懸濁液が、全血である、請求項１１５から１７２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１７４】
前記細胞懸濁液が、リンパ液である、請求項１１５から１７２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１７５】
前記細胞懸濁液が、末梢血単核球を含む、請求項１１５から１７２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１７６】
前記細胞懸濁液が、精製された細胞集団を含む、請求項１１５から１７１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１７７】
前記細胞が、免疫細胞、細胞株の細胞、幹細胞、腫瘍細胞、線維芽細胞、皮膚細胞、神経細胞、または赤血球である、請求項１１５から１７２または１７６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１７８】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マスト細胞または好中球である、請求項１７７に記載のデバイス。
【請求項１７９】
前記細胞が、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヤギ、またはウサギ細胞である、請求項１１５から１７８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１８０】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１１５から１７８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１８１】
前記化合物が、核酸を含む、請求項１１５から１８０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１８２】
前記化合物が、核酸をコードするＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または自己増幅ｍＲＮＡを含む、請求項１１５から１８１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１８３】
前記化合物が、プラスミドである、請求項１１５から１８２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１８４】
前記化合物が、ポリペプチド−核酸複合体を含む、請求項１１５から１８０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１８５】
前記化合物が、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む、請求項１１５から１８０または１８４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１８６】
前記化合物が、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む、請求項１１５から１８１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１８７】
前記化合物が、タンパク質またはペプチドを含む、請求項１１５から１８０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１８８】
前記化合物が、ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＣＲＥリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｒリコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはトランスポザーゼを含む、請求項１１５から１８０または１８７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１８９】
前記化合物が、抗体である、請求項１１５から１８０または１８７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９０】
前記化合物が、転写因子である、請求項１１５から１８０または１８７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９１】
前記化合物が、小分子である、請求項１１５から１８０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９２】
前記化合物が、ナノ粒子である、請求項１１５から１８０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９３】
前記化合物が、キメラ抗原受容体である、請求項１１５から１８０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９４】
前記化合物が、蛍光によりタグ付けされた分子である、請求項１１５から１９３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９５】
前記化合物が、リポソームである、請求項１１５から１８０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９６】
前記細胞懸濁液が、前記細孔を通って通過する前、それと同時またはその後に、前記化合物と接触する、請求項１１５から１９５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９７】
送達される前記化合物が、前記表面に被覆されている、請求項１１５から１９５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９８】
前記デバイスは、０℃から４５℃の間である、請求項１１５から１９７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９９】
前記細胞が、正圧または負圧により前記細孔を通って通過する、請求項１１５から１９８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２００】
前記細胞が、定圧または可変圧により前記細孔を通って通過する、請求項１１５から１９９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２０１】
圧力が、注射器を使用して印加される、請求項１１５から２００のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２０２】
圧力が、ポンプを使用して印加される、請求項１１５から２００のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２０３】
圧力が、減圧を使用して印加される、請求項１１５から２００のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２０４】
前記細胞が、毛細管圧により前記細孔を通って通過する、請求項１１５から２００のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２０５】
前記細胞が、血圧により前記細孔を通って通過する、請求項１１５から２００のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２０６】
前記細胞が、ｇ−力により前記細孔を通って通過する、請求項１１５から２００のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２０７】
前記細胞が、約０．０５ｐｓｉから約５００ｐｓｉの範囲の圧力下で前記細孔を通って通過する、請求項１１５から２０６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２０８】
前記細胞が、約２ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、請求項１１５から２０７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２０９】
前記細胞が、約２．５ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、請求項１１５から２０７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２１０】
前記細胞が、約３ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、請求項１１５から２０７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２１１】
前記細胞が、約５ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、請求項１１５から２０７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２１２】
前記細胞が、約１０ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、請求項１１５から２０７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２１３】
前記細胞が、約２０ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、請求項１１５から２０７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２１４】
流体の流れにより前記細胞を前記細孔中に通過させる、請求項１１５から２１３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２１５】
前記細胞が前記細孔を通って通過する前、前記流体の流れが、乱流である、請求項２１４に記載のデバイス。
【請求項２１６】
前記細孔中を通る前記流体の流れが、層流である、請求項２１４に記載のデバイス。
【請求項２１７】
前記細胞が前記細孔を通って通過した後、前記流体の流れが、乱流である、請求項２１４に記載のデバイス。
【請求項２１８】
前記細胞が、均一な細胞速度で前記細孔を通って通過する、請求項１１５から２１７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２１９】
前記細胞が、変動する細胞速度で前記細孔を通って通過する、請求項１１５から２１７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２２０】
前記細胞が、約０．１ｍｍ／秒から約２０ｍ／秒の範囲の速度で前記細孔を通って通過する、請求項１１５から２１９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２２１】
前記表面が、より大きなモジュール内に含有されている、請求項１１５から２２０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２２２】
前記表面が、注射器内に含有されている、請求項１１５から２２１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２２３】
前記細胞懸濁液が、水溶液を含む、請求項１１５から２２２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２２４】
前記水溶液が、細胞培養培地、ＰＢＳ、塩、糖、増殖因子、動物由来産物、増量材、界面活性剤、潤滑剤、ビタミン、タンパク質、キレート剤、および／またはアクチン重合に影響を与える薬剤を含む、請求項２２３に記載のデバイス。
【請求項２２５】
前記アクチン重合に影響を与える薬剤が、ラトランクリンＡ、サイトカラシン、および／またはコルヒチンである、請求項２２４に記載のデバイス。
【請求項２２６】
前記細胞培養培地が、ＤＭＥＭ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、またはＸ−ＶＩＶＯである、請求項２２４に記載のデバイス。
【請求項２２７】
前記細胞懸濁液の粘度が、約８．９×１０−４Ｐａ・秒から約４．０×１０−３Ｐａ・秒の範囲である、請求項１１５から２２６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２２８】
複数の表面を含む、請求項１１５から２２７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２２９】
前記表面が、トランスウェルである、請求項１１５から２２８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２３０】
少なくとも１つの電極が、前記表面に近接して、電界を発生させる、請求項１１５から２２９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２３１】
摂動を含む細胞であって、前記細胞が、細孔を含有する表面を通って前記細胞を通過させることにより生成され、前記細孔が、前記細胞を変形させ、それによって化合物が前記細胞に入ることができるように摂動が生じる、細胞。
【請求項２３２】
前記表面が膜である、請求項２３１に記載の細胞。
【請求項２３３】
前記表面がフィルターである、請求項２３１に記載の細胞。
【請求項２３４】
前記表面が蛇行する経路の表面である、請求項２３１から２３３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２３５】
前記表面が、ポリカーボネート、ポリマー、シリコン、ガラス、金属、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、グラファイト、およびセラミックの１つから選択される材料を含む、請求項２３１から２３４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２３６】
前記細孔への入口が、前記細孔よりも広いか、前記細孔よりも狭いか、または前記細孔と同じ幅である、請求項２３１から２３５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２３７】
前記表面が、エッチング、トラックエッチング、リソグラフィー、レーザーアブレーション、スタンピング、微細孔パンチング、ポリマースポンジ、直接発泡成形、押出成形およびホットエンボス加工の方法から選択される方法を使用して製造される、請求項２３１から２３６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２３８】
前記細孔の横断面の幅が、細胞径と相関している、請求項２３１から２３７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２３９】
前記細孔の横断面の幅が、前記細胞径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９９％である、請求項２３１から２３８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４０】
表面の横断面の幅が、約１ｍｍから約１ｍの間の範囲である、請求項２３１から２３９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４１】
前記細孔の横断面の幅が、約０．０１μｍから約３００μｍの範囲である、請求項２３１から２４０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４２】
前記細孔の横断面の幅が、約０．０１から約３５μｍの範囲である、請求項２３１から２４１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４３】
前記細孔の横断面の幅が、約０．４μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約８μｍ、約１０μｍ、約１２μｍ、または約１４μｍである、請求項２３１から２４２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４４】
前記細孔の横断面の幅が、約２００μｍである、請求項２３１から２４１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４５】
前記細孔のサイズが、不均質である、請求項２３１から２４４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４６】
不均質な細孔の横断面の幅が、１０から２０％の範囲で変動する、請求項２３１から２４５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４７】
前記細孔のサイズが、均質である、請求項２３１から２４４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４８】
前記細孔が、同一の入口角および出口角を有する、請求項２３１から２４７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４９】
前記細孔が、異なる入口角および出口角を有する、請求項２３１から２４７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５０】
前記細孔の横断面の形状が、環状、円形、四角形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形、および八角形の形状から選択される、請求項２３１から２４９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５１】
前記細孔の形状が、円柱形または円錐形から選択される、請求項２３１から２４９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５２】
前記細孔の縁が、滑らかである、請求項２３１から２５１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５３】
前記細孔の縁が、鋭い、請求項２３１から２５１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５４】
前記細孔の通路が、真っ直ぐである、請求項２３１から２５３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５５】
前記細孔の通路が、湾曲している、請求項２３１から２５３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５６】
前記細孔が、全表面積の約１０から８０％を構成する、請求項２３１から２５５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５７】
前記表面が、合計約１．０×１０５から約１．０×１０３０個の細孔を含む、請求項２３１から２５６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５８】
前記表面が、表面積１ｍｍ２当たり約１０から約１．０×１０１５個の細孔を含む、請求項２３１から２５７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５９】
前記細孔が、平行に分布している、請求項２３１から２５８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２６０】
複数の表面が、直列に分布している、請求項２３１から２５９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２６１】
前記細孔の分布が、規則正しい、請求項２３１から２６０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２６２】
前記細孔の分布が、ランダムである、請求項２３１から２６０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２６３】
前記表面の厚さが、均一である、請求項２３１から２６２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２６４】
前記表面の厚さが、均一ではない、請求項２３１から２６２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２６５】
前記表面が、約０．０１μｍから約５ｍの厚さである、請求項２３１から２６４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２６６】
前記表面が、約１０μｍの厚さである、請求項２３１から２６５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２６７】
前記表面が、材料で被覆されている、請求項２３１から２６６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２６８】
前記材料が、テフロン（登録商標）である、請求項２６７に記載の細胞。
【請求項２６９】
前記材料が、細胞に結合する接着性コーティングを含む、請求項２６７に記載の細胞。
【請求項２７０】
前記材料が、界面活性剤を含む、請求項２６７に記載の細胞。
【請求項２７１】
前記材料が、抗凝固剤を含む、請求項２６７に記載の細胞。
【請求項２７２】
前記材料が、ポリペプチドを含む、請求項２６７に記載の細胞。
【請求項２７３】
前記材料が、接着分子を含む、請求項２６７に記載の細胞。
【請求項２７４】
前記材料が、抗体を含む、請求項２６７に記載の細胞。
【請求項２７５】
前記材料が、細胞機能を調節する因子を含む、請求項２６７に記載の細胞。
【請求項２７６】
前記材料が、核酸を含む、請求項２６７に記載の細胞。
【請求項２７７】
前記材料が、脂質を含む、請求項２６７に記載の細胞。
【請求項２７８】
前記材料が、炭水化物を含む、請求項２６７に記載の細胞。
【請求項２７９】
前記材料が、複合体を含む、請求項２６７に記載の細胞。
【請求項２８０】
前記複合体が、脂質−炭水化物複合体である、請求項２７９に記載の細胞。
【請求項２８１】
前記材料が、膜貫通タンパク質を含む、請求項２６７に記載の細胞。
【請求項２８２】
前記材料が、前記表面に共有結合している、請求項２６７から２８１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２８３】
前記材料が、前記表面に非共有結合している、請求項２６７から２８１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２８４】
前記表面が、親水性である、請求項２３１から２８３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２８５】
前記表面が、疎水性である、請求項２３１から２８３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２８６】
前記表面が、帯電している、請求項２３１から２８５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２８７】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項２３１から２８６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２８８】
前記細胞が、免疫細胞、細胞株の細胞、幹細胞、腫瘍細胞、線維芽細胞、皮膚細胞、神経細胞、または赤血球である、請求項２３１から２８７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２８９】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マスト細胞または好中球である、請求項２８８に記載の細胞。
【請求項２９０】
前記細胞が、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヤギ、またはウサギ細胞である、請求項２３１から２８９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２９１】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項２３１から２８９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２９２】
前記化合物が、核酸を含む、請求項２３１から２９１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２９３】
前記化合物が、核酸をコードするＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または自己増幅ｍＲＮＡを含む、請求項２３１から２９２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２９４】
前記化合物が、プラスミドである、請求項２３１から２９３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２９５】
前記化合物が、ポリペプチド−核酸複合体を含む、請求項２３１から２９１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２９６】
前記化合物が、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む、請求項２３１から２９１または２９５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２９７】
前記化合物が、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む、請求項２３１から２９２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２９８】
前記化合物が、タンパク質またはペプチドを含む、請求項２３１から２９１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２９９】
前記化合物が、ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＣＲＥリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｒリコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはトランスポザーゼを含む、請求項２３１から２９１または２９８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３００】
前記化合物が、抗体である、請求項２３１から２９１または２９８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３０１】
前記化合物が、転写因子である、請求項２３１から２９１または２９８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３０２】
前記化合物が、小分子である、請求項２３１から２９１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３０３】
前記化合物が、ナノ粒子である、請求項２３１から２９１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３０４】
前記化合物が、キメラ抗原受容体である、請求項２３１から２９１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３０５】
前記化合物が、蛍光によりタグ付けされた分子である、請求項２３１から３０４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３０６】
前記化合物が、リポソームである、請求項２３１から２９１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３０７】
前記細胞が、前記細孔を通って通過する前、それと同時またはその後に、前記化合物と接触する、請求項２３１から３０６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３０８】
送達される前記化合物が、前記表面に被覆されている、請求項２３１から３０６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３０９】
前記細胞が、０℃から４５℃の間で前記細孔を通って通過する、請求項２３１から３０８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３１０】
前記細胞が、正圧または負圧により前記細孔を通って通過する、請求項２３１から３０９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３１１】
前記細胞が、定圧または可変圧により前記細孔を通って通過する、請求項２３１から３１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３１２】
圧力が、注射器を使用して印加される、請求項２３１から３１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３１３】
圧力が、ポンプを使用して印加される、請求項２３１から３１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３１４】
圧力が、減圧を使用して印加される、請求項２３１から３１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３１５】
前記細胞が、毛細管圧により前記細孔を通って通過する、請求項２３１から３１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３１６】
前記細胞が、血圧により前記細孔を通って通過する、請求項２３１から３１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３１７】
前記細胞が、ｇ−力により前記細孔を通って通過する、請求項２３１から３１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３１８】
前記細胞が、約０．０５ｐｓｉから約５００ｐｓｉの範囲の圧力下で前記細孔を通って通過する、請求項２３１から３１７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３１９】
前記細胞が、約２ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、請求項２３１から３１８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３２０】
前記細胞が、約２．５ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、請求項２３１から３１８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３２１】
前記細胞が、約３ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、請求項２３１から３１８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３２２】
前記細胞が、約５ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、請求項２３１から３１８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３２３】
前記細胞が、約１０ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、請求項２３１から３１８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３２４】
前記細胞が、約２０ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、請求項２３１から３１８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３２５】
流体の流れにより前記細胞を前記細孔中に通過させる、請求項２３１から３２４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３２６】
前記細胞が前記細孔を通って通過する前、前記流体の流れが、乱流である、請求項３２５に記載の細胞。
【請求項３２７】
前記細孔中を通る前記流体の流れが、層流である、請求項３２５に記載の細胞。
【請求項３２８】
前記細胞が前記細孔を通って通過した後、前記流体の流れが、乱流である、請求項３２５に記載の細胞。
【請求項３２９】
前記細胞が、約０．１ｍｍ／秒から約２０ｍ／秒の範囲の速度で前記細孔を通って通過する、請求項２３１から３２８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３３０】
前記表面が、より大きなモジュール内に含有されている、請求項２３１から３２９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３３１】
前記表面が、注射器内に含有されている、請求項２３１から３３０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３３２】
前記細胞が、水溶液を含む細胞懸濁液中にある、請求項２３１から３３１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３３３】
前記水溶液が、細胞培養培地、ＰＢＳ、塩、糖、増殖因子、動物由来産物、増量材、界面活性剤、潤滑剤、ビタミン、タンパク質、キレート剤、および／またはアクチン重合に影響を与える薬剤を含む、請求項３３２に記載の細胞。
【請求項３３４】
前記アクチン重合に影響を与える薬剤が、ラトランクリンＡ、サイトカラシン、および／またはコルヒチンである、請求項３３３に記載の細胞。
【請求項３３５】
前記細胞培養培地が、ＤＭＥＭ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、またはＸ−ＶＩＶＯである、請求項３３３に記載の細胞。
【請求項３３６】
前記細胞が、前記表面に近接する少なくとも１つの電極により発生する電界を通ってさらに通過した、請求項２３１から３３５のいずれか一項に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年９月４日に出願された米国仮出願番号第６２／２１４，８２０号および２０１６年５月３日に出願された米国仮出願番号第６２／３３１，３６３号に基づく優先権を主張しており、これら仮出願のすべては、それらの全体が参考として本明細書によって援用される。
【０００２】
発明の分野
本開示は一般に、細孔を含有する表面を通って細胞懸濁液を通過させることによって化合物を細胞内に送達するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
細胞内送達は、新規の治療薬の研究および開発の中心的ステップである。分子の細胞内送達を目的としている既存の技術は、電界、ナノ粒子、または細孔形成化学物質に頼っている。しかし、これらの方法は、非特異的分子送達、ペイロード分子の改変もしくは損傷、高い細胞死、一般に安全な（ＧＲＡＳ）物質とみなされない可能性がある物質の使用、低いスループット、および／または困難な実施などの数多くの厄介な問題に悩まされている。さらに、これらの細胞内送達法は、一次免疫細胞および幹細胞などの感受性細胞型に分子を送達するには効果的ではない。したがって、種々の細胞型に所定の範囲の分子を送達するのに高度に効果的である細胞内送達技法の必要性が存在するが、いまだ満たされていない。さらに、迅速でハイスループットの細胞内送達を可能にする技法は、大規模な臨床的、製造的、および薬物スクリーニング応用に、より効果的に適用することができる。細胞に化合物を送達するためにチャネルを使用する方法を記載している参考文献は国際公開第２０１３／０５９３４３号および国際公開第２０１５／０２３９８２号を含む。
特許出願および公開を含む、本明細書に引用される参考文献は全て、その全体が参照として組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０５９３４３号
【特許文献２】国際公開第２０１５／０２３９８２号
【発明の概要】
【０００５】
発明の簡単な要旨
本開示のある特定の態様は、細孔を含有する表面を通って細胞懸濁液を通過させるステップを含む、化合物を細胞内に送達するための方法であって、前記細孔が、前記細胞を変形させ、それによって前記化合物が前記細胞に入るように前記細胞の摂動が生じ、前記細胞懸濁液が、前記化合物と接触する、方法を含む。一部の実施形態では、前記表面は膜である一部の実施形態では、前記表面はフィルターである。一部の実施形態では、前記表面はマイクロシーブである。一部の実施形態では、前記表面は蛇行する経路の表面である。一部の実施形態では、前記表面は、ポリカーボネート、ポリマー、シリコン、ガラス、金属、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、およびセラミックの１つから選択される材料を含む。一部の実施形態では、前記細孔への入口は、前記細孔よりも広いか、前記細孔よりも狭いか、または前記細孔と同じ幅である。一部の実施形態では、前記表面は、エッチング、トラックエッチング、リソグラフィー、レーザーアブレーション、スタンピング、微細孔パンチング、ポリマースポンジ、直接発泡成形、押出成形およびホットエンボス加工の方法から選択される方法を使用して製造される。
【０００６】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、前記細孔サイズは細胞径と相関している。一部の実施形態では、前記細孔サイズは、前記細胞径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９９％である。一部の実施形態では、表面の横断面の幅は、約１ｍｍから約１ｍの間の範囲である。一部の実施形態では、前記細孔の横断面の幅は、約０．０１μｍから約３００μｍの範囲である。一部の実施形態では、前記細孔の横断面の幅は、約０．０１から約３５μｍの範囲である。一部の実施形態では、前記細孔サイズは、約０．４μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約８μｍ、約１０μｍ、約１２μｍ、または約１４μｍである。一部の実施形態では、前記細孔サイズは、約２００μｍである。一部の実施形態では、前記細孔のサイズは、不均質である。一部の実施形態では、不均質な細孔のサイズは、１０から２０％の範囲で変動する。一部の実施形態では、前記細孔のサイズは、均質である。
【０００７】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、前記細孔は、同一の入口角および出口角を有する。一部の実施形態では、前記細孔は、異なる入口角および出口角を有する。一部の実施形態では、前記細孔の横断面の形状は、環状、円形、四角形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形、および八角形の形状から選択される。一部の実施形態では、前記細孔への入口での横断面の形状は細孔からの出口での横断面の形状とは異なっている（例えば、入口では環状および出口では四角形）。一部の実施形態では、前記細孔の横断面の形状は、円柱形または円錐形から選択される。一部の実施形態では、前記細孔の縁は、滑らかである。一部の実施形態では、前記細孔の縁は、鋭い。一部の実施形態では、前記細孔の通路は、真っ直ぐである。一部の実施形態では、前記細孔の通路は、湾曲している一部の実施形態では、前記細孔は、全表面積の約１０から８０％を構成する。一部の実施形態では、前記表面は、合計約１．０×１０５から約１．０×１０３０個の細孔を含む。一部の実施形態では、前記表面は、表面積１ｍｍ２当たり約１０から約１．０×１０１５個の細孔を含む。一部の実施形態では、前記細孔は、平行に分布している。一部の実施形態では、前記細孔を有する表面は互いの上に積み重なっている。一部の実施形態では、複数の表面は、直列に分布している。一部の実施形態では、前記細孔の分布は、規則正しい。一部の実施形態では、前記細孔の分布は、ランダムである。一部の実施形態では、前記表面の厚さは、均一である。一部の実施形態では、前記表面の厚さは、均一ではない。一部の実施形態では、前記表面は、約０．０１μｍから約５ｍの厚さである。一部の実施形態では、前記表面は、約１０μｍの厚さである。一部の実施形態では、表面は１μｍ未満の厚さである。
【０００８】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、前記表面は材料で被覆されている。一部の実施形態では、前記材料は、テフロン（登録商標）である。一部の実施形態では、前記材料は、細胞に結合する接着性コーティングを含む。一部の実施形態では、前記材料は、界面活性剤を含む。一部の実施形態では、前記材料は、抗凝固剤を含む。一部の実施形態では、前記材料は、タンパク質を含む。一部の実施形態では、前記材料は、接着分子を含む。一部の実施形態では、前記材料は、抗体を含む。一部の実施形態では、前記材料は、細胞機能を調節する因子を含む。一部の実施形態では、前記材料は、核酸を含む。一部の実施形態では、前記材料は、脂質を含む。一部の実施形態では、前記材料は、炭水化物を含む。一部の実施形態では、前記材料は、複合体を含む。一部の実施形態では、前記複合体は、脂質−炭水化物複合体である。一部の実施形態では、前記材料は、膜貫通タンパク質を含む。一部の実施形態では、前記材料は、前記表面に共有結合している。一部の実施形態では、前記材料は、前記表面に非共有結合している。一部の実施形態では、前記表面は、親水性である。一部の実施形態では、前記表面は、疎水性である。一部の実施形態では、前記表面は、帯電している。
【０００９】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、細胞懸濁液は哺乳動物細胞を含む。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、混成の細胞集団を含む。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、全血である。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、リンパ液である。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、末梢血単核球を含む。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、精製された細胞集団を含む。一部の実施形態では、前記細胞は、免疫細胞、細胞株の細胞、幹細胞、腫瘍細胞、線維芽細胞、皮膚細胞、神経細胞、赤血球または血小板である。一部の実施形態では、前記免疫細胞は、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マスト細胞または好中球である。一部の実施形態では、前記細胞は、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヤギ、またはウサギの細胞である。一部の実施形態では、前記細胞は、ヒト細胞である。
【００１０】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、前記化合物は核酸を含む。一部の実施形態では、前記化合物は、核酸をコードするＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または自己増幅ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、前記化合物はペプチド核酸である。一部の実施形態では、前記化合物はトランスポゾンを含む。一部の実施形態では、前記化合物は、プラスミドである。一部の実施形態では、前記化合物は、タンパク質−核酸複合体を含む。一部の実施形態では、前記化合物は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む。一部の実施形態では、前記化合物は、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む。一部の実施形態では、前記化合物は、タンパク質またはペプチドを含む。一部の実施形態では、前記化合物は、ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＣＲＥリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｒリコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはトランスポザーゼを含む。一部の実施形態では、前記化合物は、抗体である。一部の実施形態では、前記化合物は、転写因子である。一部の実施形態では、前記化合物は、小分子である。一部の実施形態では、前記化合物は、ナノ粒子である。一部の実施形態では、前記化合物は、キメラ抗原受容体である。一部の実施形態では、前記化合物は、蛍光によりタグ付けされた分子である。一部の実施形態では、前記化合物は、リポソームである。一部の実施形態では、前記化合物は、ウイルスである。
【００１１】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は細孔を通って通過する前に、それと同時に、またはその後に化合物と接触する。一部の実施形態では、送達される前記化合物は、前記表面に被覆されている。一部の実施形態では、前記方法は、０℃から４５℃の間で実行される。一部の実施形態では、前記細胞は、正圧または負圧により前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、定圧または可変圧により前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、圧力は、注射器を使用して印加される。一部の実施形態では、圧力は、ポンプを使用して印加される。一部の実施形態では、圧力は、減圧を使用して印加される。一部の実施形態では、前記細胞は、毛細管圧により前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、細胞は静水圧により細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、血圧により前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、ｇ-力により前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約０．０５ｐｓｉから約５００ｐｓｉの範囲の圧力下で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約２ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約２．５ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約３ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約５ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約１０ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約２０ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、流体の流れにより前記細胞を前記細孔中に通過させる。一部の実施形態では、前記細胞が前記細孔を通って通過する前、前記流体の流れは、乱流である。一部の実施形態では、前記細孔中を通る前記流体の流れは、層流である。一部の実施形態では、前記細胞が前記細孔を通って通過した後、前記流体の流れは、乱流である。一部の実施形態では、前記細胞は、均一な細胞速度で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、変動する細胞速度で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約０．１ｍｍ／秒から約２０ｍ／秒の範囲の速度で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記表面は、より大きなモジュール内に含有されている。一部の実施形態では、前記表面は、注射器内に含有されている。
【００１２】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は水溶液を含む。一部の実施形態では、前記水溶液は、細胞培養培地、ＰＢＳ、塩、糖、増殖因子、動物由来産物、増量材、界面活性剤、潤滑剤、ビタミン、タンパク質、キレート剤、および／またはアクチン重合に影響を与える薬剤を含む。一部の実施形態では、前記アクチン重合に影響を与える薬剤は、ラトランクリンＡ、サイトカラシン、および／またはコルヒチンである。一部の実施形態では、前記細胞培養培地は、ＤＭＥＭ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、またはＸ−ＶＩＶＯである。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液の粘度は、約８．９×１０−４Ｐａ・秒から約４．０×１０−３Ｐａ・秒の範囲である。一部の実施形態では、前記方法は、前記表面に近接する少なくとも１つの電極により発生する電界を通って前記細胞を通過させるステップをさらに含む。
【００１３】
本開示のある特定の態様は、細孔を含有する表面を含む、細胞内に化合物を送達するためのデバイスであって、前記細孔が、溶液に懸濁された細胞が通過できるように構成されており、前記細孔が、前記細胞を変形させ、それによって前記化合物が前記細胞に入るように前記細胞の摂動が生じる、デバイスを含む。一部の実施形態では、前記表面は膜である。一部の実施形態では、前記表面はフィルターである。一部の実施形態では、前記表面は蛇行する経路の表面である。一部の実施形態では、前記表面は、ポリカーボネート、ポリマー、シリコン、ガラス、金属、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、およびセラミックの１つから選択される材料を含む。一部の実施形態では、前記細孔への入口は、前記細孔よりも広いか、前記細孔よりも狭いか、または前記細孔と同じ幅である。一部の実施形態では、前記表面は、エッチング、トラックエッチング、リソグラフィー、レーザーアブレーション、スタンピング、微細孔パンチング、ポリマースポンジ、直接発泡成形、押出成形およびホットエンボス加工の方法から選択される方法を使用して製造される。
【００１４】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、前記細孔のサイズは、細胞径と相関している。一部の実施形態では、前記細孔のサイズは、前記細胞径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９９％である。一部の実施形態では、表面の横断面の幅は、約１ｍｍから約１ｍの間の範囲である。一部の実施形態では、前記細孔の横断面の幅は、約０．０１μｍから約３００μｍの範囲である。一部の実施形態では、前記細孔の横断面の幅は、約０．０１から約３５μｍの範囲である。一部の実施形態では、前記細孔のサイズは、約０．４μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約８μｍ、約１０μｍ、約１２μｍ、または約１４μｍである。一部の実施形態では、前記細孔のサイズは、約２００μｍである。一部の実施形態では、前記細孔のサイズは、不均質である。一部の実施形態では、不均質な細孔のサイズは、１０から２０％の範囲で変動する。一部の実施形態では、前記細孔のサイズは、均質である。
【００１５】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、前記細孔が、同一の入口角および出口角を有する。一部の実施形態では、前記細孔は、異なる入口角および出口角を有する。一部の実施形態では、前記細孔の横断面の形状は、環状、円形、四角形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形、および八角形の形状から選択される。一部の実施形態では、前記細孔の横断面の形状は、円柱形または円錐形から選択される。一部の実施形態では、前記細孔の縁は、滑らかである。一部の実施形態では、前記細孔の縁は、鋭い。一部の実施形態では、前記細孔の通路は、真っ直ぐである。一部の実施形態では、前記細孔の通路は、湾曲している。一部の実施形態では、前記細孔は、全表面積の約１０から８０％を構成する。一部の実施形態では、前記表面は、合計約１．０×１０５から約１．０×１０３０個の細孔を含む。一部の実施形態では、前記表面は、表面積１ｍｍ２当たり約１０から約１．０×１０１５個の細孔を含む。一部の実施形態では、前記細孔は、平行に分布している。一部の実施形態では、細孔を有する表面は互いの上に積み重なっている。一部の実施形態では、複数の表面は、直列に分布している。一部の実施形態では、前記細孔の分布は、規則正しい。一部の実施形態では、前記細孔の分布は、ランダムである。一部の実施形態では、前記表面の厚さは、均一である。一部の実施形態では、前記表面の厚さは、均一ではない。一部の実施形態では、前記表面は、約０．０１μｍから約５ｍの厚さである。一部の実施形態では、前記表面は、約１０μｍの厚さである。
【００１６】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、表面は材料で被覆されている。一部の実施形態では、前記材料は、テフロン（登録商標）である。一部の実施形態では、前記材料は、細胞に結合する接着性コーティングを含む。一部の実施形態では、前記材料は、界面活性剤を含む。一部の実施形態では、前記材料は、抗凝固剤を含む。一部の実施形態では、前記材料は、タンパク質を含む。一部の実施形態では、前記材料は、接着分子を含む。一部の実施形態では、前記材料は、抗体を含む。一部の実施形態では、前記材料は、細胞機能を調節する因子を含む。一部の実施形態では、前記材料は、核酸を含む。一部の実施形態では、前記材料は、脂質を含む。一部の実施形態では、前記材料は、炭水化物を含む。一部の実施形態では、前記材料は、複合体を含む。一部の実施形態では、前記複合体は、脂質−炭水化物複合体である。一部の実施形態では、前記材料は、膜貫通タンパク質を含む。一部の実施形態では、前記材料は、前記表面に共有結合している。一部の実施形態では、前記材料は、前記表面に非共有結合している。一部の実施形態では、前記表面は、親水性である。一部の実施形態では、前記表面は、疎水性である。一部の実施形態では、前記表面は、帯電している。
【００１７】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、細胞懸濁液は哺乳動物細胞を含む。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、混成の細胞集団を含む。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、全血である。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、リンパ液である。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、末梢血単核球を含む。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は、精製された細胞集団を含む。一部の実施形態では、前記細胞は、免疫細胞、細胞株の細胞、幹細胞、腫瘍細胞、線維芽細胞、皮膚細胞、神経細胞、または赤血球である。一部の実施形態では、前記免疫細胞は、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マスト細胞または好中球である。一部の実施形態では、前記細胞は、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヤギ、またはウサギの細胞である。一部の実施形態では、前記細胞は、ヒト細胞である。
【００１８】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、化合物は核酸を含む。一部の実施形態では、前記化合物は、核酸をコードするＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または自己増幅ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、化合物はペプチド核酸である。一部の実施形態では、化合物はトランスポゾンを含む。一部の実施形態では、前記化合物は、プラスミドである。一部の実施形態では、前記化合物は、タンパク質−核酸複合体を含む。一部の実施形態では、前記化合物は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む。一部の実施形態では、前記化合物は、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む。一部の実施形態では、前記化合物は、タンパク質またはペプチドを含む。一部の実施形態では、前記化合物は、ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＣＲＥリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｒリコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはトランスポザーゼを含む。一部の実施形態では、前記化合物は、抗体である。一部の実施形態では、前記化合物は、転写因子である。一部の実施形態では、前記化合物は、小分子である。一部の実施形態では、前記化合物は、ナノ粒子である。一部の実施形態では、前記化合物は、キメラ抗原受容体である。一部の実施形態では、前記化合物は、蛍光によりタグ付けされた分子である。一部の実施形態では、前記化合物は、リポソームである。一部の実施形態では、前記化合物は、ウイルスである。
【００１９】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、前記細胞懸濁液は細孔を通って通過する前に、それと同時に、またはその後に化合物と接触する。一部の実施形態では、送達される前記化合物は、前記表面に被覆されている。一部の実施形態では、前記デバイスは、０℃から４５℃の間である。一部の実施形態では、前記細胞は、正圧または負圧により前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、定圧または可変圧により前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、圧力は、注射器を使用して印加される。一部の実施形態では、圧力は、ポンプを使用して印加される。一部の実施形態では、圧力は、減圧を使用して印加される。一部の実施形態では、前記細胞は、毛細管圧により前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、血圧により前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、ｇ−力により前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約０．０５ｐｓｉから約５００ｐｓｉの範囲の圧力下で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約２ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約２．５ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約３ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約５ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約１０ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約２０ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、流体の流れにより前記細胞を前記細孔中に通過させる。一部の実施形態では、前記細胞が前記細孔を通って通過する前、前記流体の流れは、乱流である。一部の実施形態では、前記細孔中を通る前記流体の流れは、層流である。一部の実施形態では、前記細胞が前記細孔を通って通過した後、前記流体の流れは、乱流である。一部の実施形態では、前記細胞は、均一な細胞速度で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、変動する細胞速度で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約０．１ｍｍ／秒から約２０ｍ／秒の範囲の速度で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記表面は、より大きなモジュール内に含有されている。一部の実施形態では、前記表面は、注射器内に含有されている。
【００２０】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、細胞懸濁液は水溶液を含む。一部の実施形態では、前記水溶液は、細胞培養培地、ＰＢＳ、塩、糖、増殖因子、動物由来産物、増量材、界面活性剤、潤滑剤、ビタミン、タンパク質、キレート剤、および／またはアクチン重合に影響を与える薬剤を含む。一部の実施形態では、前記アクチン重合に影響を与える薬剤は、ラトランクリンＡ、サイトカラシン、および／またはコルヒチンである。一部の実施形態では、前記細胞培養培地は、ＤＭＥＭ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、またはＸ−ＶＩＶＯである。一部の実施形態では、前記細胞懸濁液の粘度は、約８．９×１０−４Ｐａ・秒から約４．０×１０−３Ｐａ・秒の範囲である。一部の実施形態では、前記デバイスは、複数の表面を含む。一部の実施形態では、前記表面は、トランスウェルである。一部の実施形態では、少なくとも１つの電極は、前記表面に近接して、電界を発生させる。
【００２１】
本開示のある特定の態様は、摂動を含む細胞を含み、細胞が細孔を含有する表面を通って細胞を通過させることにより生成され、細孔が細胞を変形させ、それによって化合物が細胞に入ることができるように摂動が生じる。一部の実施形態では、前記表面は膜である。一部の実施形態では、前記表面はフィルターである。一部の実施形態では、前記表面は、蛇行する経路の表面である。一部の実施形態では、前記表面は、ポリカーボネート、ポリマー、シリコン、ガラス、金属、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、およびセラミックの１つから選択される材料を含む。一部の実施形態では、前記細孔への入口は、前記細孔よりも広いか、前記細孔よりも狭いか、または前記細孔と同じ幅である。一部の実施形態では、前記表面は、エッチング、トラックエッチング、リソグラフィー、レーザーアブレーション、スタンピング、微細孔パンチング、ポリマースポンジ、直接発泡成形、押出成形およびホットエンボス加工の方法から選択される方法を使用して製造される。
【００２２】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、細孔サイズは細胞径と相関している。一部の実施形態では、前記細孔サイズは、前記細胞径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９９％である。一部の実施形態では、表面の横断面の幅は、約１ｍｍから約１ｍの間の範囲である。一部の実施形態では、前記細孔の横断面の幅は、約０．０１μｍから約３００μｍの範囲である。一部の実施形態では、前記細孔の横断面の幅は、約０．０１から約３５μｍの範囲である。一部の実施形態では、前記細孔サイズは、約０．４μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約８μｍ、約１０μｍ、約１２μｍ、または約１４μｍである。一部の実施形態では、前記細孔サイズは、約２００μｍである。一部の実施形態では、前記細孔のサイズは、不均質である。一部の実施形態では、不均質な細孔サイズは、１０から２０％の範囲で変動する。一部の実施形態では、前記細孔のサイズは、均質である。
【００２３】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、細孔は同一の入口角および出口角を有する。一部の実施形態では、前記細孔は、異なる入口角および出口角を有する。一部の実施形態では、前記細孔の横断面の形状は、環状、円形、四角形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形、および八角形の形状から選択される。一部の実施形態では、前記細孔の横断面の形状は、円柱形または円錐形から選択される。一部の実施形態では、前記細孔の縁は、滑らかである。一部の実施形態では、前記細孔の縁は、鋭い。一部の実施形態では、前記細孔の通路は、真っ直ぐである。一部の実施形態では、前記細孔の通路は、湾曲している。一部の実施形態では、前記細孔は、全表面積の約１０から８０％を構成する。一部の実施形態では、前記表面は、合計約１．０×１０５から約１．０×１０３０個の細孔を含む。一部の実施形態では、前記表面は、表面積１ｍｍ２当たり約１０から約１．０×１０１５個の細孔を含む。一部の実施形態では、前記細孔は、平行に分布している。一部の実施形態では、細孔を有する表面は互いの上に積み重なっている。一部の実施形態では、複数の表面は、直列に分布している。一部の実施形態では、前記細孔の分布は、規則正しい。一部の実施形態では、前記細孔の分布は、ランダムである。一部の実施形態では、前記表面の厚さは、均一である。一部の実施形態では、前記表面の厚さは、均一ではない。一部の実施形態では、前記表面は、約０．０１μｍから約５ｍの厚さである。一部の実施形態では、前記表面は、約１０μｍの厚さである。
【００２４】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、表面は材料で被覆されている。一部の実施形態では、前記材料は、テフロン（登録商標）である。一部の実施形態では、前記材料は、細胞に結合する接着性コーティングを含む。一部の実施形態では、前記材料は、界面活性剤を含む。一部の実施形態では、前記材料は、抗凝固剤を含む。一部の実施形態では、前記材料は、タンパク質を含む。一部の実施形態では、前記材料は、接着分子を含む。一部の実施形態では、前記材料は、抗体を含む。一部の実施形態では、前記材料は、細胞機能を調節する因子を含む。一部の実施形態では、前記材料は、核酸を含む。一部の実施形態では、前記材料は、脂質を含む。一部の実施形態では、前記材料は、炭水化物を含む。一部の実施形態では、前記材料は、複合体を含む。一部の実施形態では、前記複合体は、脂質−炭水化物複合体である。一部の実施形態では、前記材料は、膜貫通タンパク質を含む。一部の実施形態では、前記材料は、前記表面に共有結合している。一部の実施形態では、前記材料は、前記表面に非共有結合している。一部の実施形態では、前記表面は、親水性である。一部の実施形態では、前記表面は、疎水性である。一部の実施形態では、前記表面は、帯電している。
【００２５】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、前記細胞は、免疫細胞、細胞株の細胞、幹細胞、腫瘍細胞、線維芽細胞、皮膚細胞、神経細胞、または赤血球である。一部の実施形態では、前記免疫細胞は、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マスト細胞または好中球である。一部の実施形態では、前記細胞は、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヤギ、またはウサギの細胞である。一部の実施形態では、前記細胞は、ヒト細胞である。
【００２６】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、化合物は核酸を含む。一部の実施形態では、前記化合物は、核酸をコードするＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または自己増幅ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、化合物はペプチド核酸である。一部の実施形態では、化合物はトランスポゾンを含む。一部の実施形態では、前記化合物は、プラスミドである。一部の実施形態では、前記化合物は、タンパク質−核酸複合体を含む。一部の実施形態では、化合物はＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む。一部の実施形態では、化合物はＣａｓタンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む。一部の実施形態では、前記化合物は、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む。一部の実施形態では、前記化合物は、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む。一部の実施形態では、前記化合物は、タンパク質またはペプチドを含む。一部の実施形態では、前記化合物は、ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＣＲＥリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｒリコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはトランスポザーゼを含む。一部の実施形態では、前記化合物は、抗体である。一部の実施形態では、前記化合物は、転写因子である。一部の実施形態では、前記化合物は、小分子である。一部の実施形態では、前記化合物は、ナノ粒子である。一部の実施形態では、前記化合物は、キメラ抗原受容体である。一部の実施形態では、前記化合物は、蛍光によりタグ付けされた分子である。一部の実施形態では、前記化合物は、リポソームである。一部の実施形態では、化合物はウイルスである。一部の実施形態では、細胞懸濁液は細胞壁を含む細胞を含む。一部の実施形態では、細胞は植物、酵母、真菌、藻類、または細菌細胞である。
【００２７】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、前記細胞は細孔を通って通過する前に、それと同時に、またはその後に化合物と接触する。一部の実施形態では、送達される前記化合物は、前記表面に被覆されている。一部の実施形態では、前記細胞は、０℃から４５℃の間で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、正圧または負圧により前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、定圧または可変圧により前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、圧力は、注射器を使用して印加される。一部の実施形態では、圧力は、ポンプを使用して印加される。一部の実施形態では、圧力は、減圧を使用して印加される。一部の実施形態では、前記細胞は、毛細管圧により前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、血圧により前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、ｇ−力により前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約０．０５ｐｓｉから約５００ｐｓｉの範囲の圧力下で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約２ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約２．５ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約３ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約５ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約１０ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記細胞は、約２０ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、流体の流れにより前記細胞を前記細孔中に通過させる。一部の実施形態では、前記細胞が前記細孔を通って通過する前、前記流体の流れは、乱流である。一部の実施形態では、前記細孔中を通る前記流体の流れは、層流である。一部の実施形態では、前記細胞が前記細孔を通って通過した後、前記流体の流れは、乱流である。一部の実施形態では、前記細胞は、約０．１ｍｍ／秒から約２０ｍ／秒の範囲の速度で前記細孔を通って通過する。一部の実施形態では、前記表面は、より大きなモジュール内に含有されている。一部の実施形態では、前記表面は、注射器内に含有されている。
【００２８】
前の実施形態と組み合わせることができる一部の実施形態では、細胞は水溶液を含む細胞懸濁液中にある。一部の実施形態では、前記水溶液は、細胞培養培地、ＰＢＳ、塩、糖、増殖因子、動物由来産物、増量材、界面活性剤、潤滑剤、ビタミン、タンパク質、キレート剤、および／またはアクチン重合に影響を与える薬剤を含む。一部の実施形態では、前記アクチン重合に影響を与える薬剤は、ラトランクリンＡ、サイトカラシン、および／またはコルヒチンである。一部の実施形態では、前記細胞培養培地は、ＤＭＥＭ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、またはＸ−ＶＩＶＯである。一部の実施形態では、前記細胞は、前記表面に近接する少なくとも１つの電極により発生する電界を通ってさらに通過した。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本開示は、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な記載と一緒にこれらの図面の１つまたは複数を参照することによってより深く理解することができる。
【００３０】
【図１】図１Ａは、記載した実施例で使用するための例示的なポリカーボネートフィルターの写真を示す。図１Ｂは、例示的なポリカーボネートフィルター細孔の写真を示す。
【００３１】
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａ〜Ｇは、８μｍ、１０μｍ、１２μｍまたは１４μｍサイズのフィルターの細孔を通した、３ｋＤａ  ＰａｃＢｌｕｅおよび１０ｋＤａ  Ａｌｅｘａ４８８デキストラン粒子のＨｅＬａ細胞（細胞２×１０６個／ｍＬ）への低圧（５ｐｓｉ、１０ｐｓｉまたは２０ｐｓｉ）での送達を実証する、例示的なＦＡＣＳプロットを示す。図２Ａ〜Ｃは、５ｐｓｉの圧力の下で１４μｍ（図２Ａ）、１２μｍ（図２Ｂ）および１０μｍ（図２Ｃ）サイズのフィルターの細孔を通過した細胞を表す。図２ＥとＧは、１０ｐｓｉ（図２Ｅ）および２０ｐｓｉ（図２Ｇ）の圧力の下で１２μｍのフィルター細孔を通過した細胞を表す。図２ＤとＦは、エンドサイトーシス対照（図２Ｄ）および陰性対照（図２Ｆ）のプロットを表す。
【図２Ｃ−Ｄ】図２Ａ〜Ｇは、８μｍ、１０μｍ、１２μｍまたは１４μｍサイズのフィルターの細孔を通した、３ｋＤａ  ＰａｃＢｌｕｅおよび１０ｋＤａ  Ａｌｅｘａ４８８デキストラン粒子のＨｅＬａ細胞（細胞２×１０６個／ｍＬ）への低圧（５ｐｓｉ、１０ｐｓｉまたは２０ｐｓｉ）での送達を実証する、例示的なＦＡＣＳプロットを示す。図２Ａ〜Ｃは、５ｐｓｉの圧力の下で１４μｍ（図２Ａ）、１２μｍ（図２Ｂ）および１０μｍ（図２Ｃ）サイズのフィルターの細孔を通過した細胞を表す。図２ＥとＧは、１０ｐｓｉ（図２Ｅ）および２０ｐｓｉ（図２Ｇ）の圧力の下で１２μｍのフィルター細孔を通過した細胞を表す。図２ＤとＦは、エンドサイトーシス対照（図２Ｄ）および陰性対照（図２Ｆ）のプロットを表す。
【図２Ｅ−Ｆ】図２Ａ〜Ｇは、８μｍ、１０μｍ、１２μｍまたは１４μｍサイズのフィルターの細孔を通した、３ｋＤａ  ＰａｃＢｌｕｅおよび１０ｋＤａ  Ａｌｅｘａ４８８デキストラン粒子のＨｅＬａ細胞（細胞２×１０６個／ｍＬ）への低圧（５ｐｓｉ、１０ｐｓｉまたは２０ｐｓｉ）での送達を実証する、例示的なＦＡＣＳプロットを示す。図２Ａ〜Ｃは、５ｐｓｉの圧力の下で１４μｍ（図２Ａ）、１２μｍ（図２Ｂ）および１０μｍ（図２Ｃ）サイズのフィルターの細孔を通過した細胞を表す。図２ＥとＧは、１０ｐｓｉ（図２Ｅ）および２０ｐｓｉ（図２Ｇ）の圧力の下で１２μｍのフィルター細孔を通過した細胞を表す。図２ＤとＦは、エンドサイトーシス対照（図２Ｄ）および陰性対照（図２Ｆ）のプロットを表す。
【図２Ｇ】図２Ａ〜Ｇは、８μｍ、１０μｍ、１２μｍまたは１４μｍサイズのフィルターの細孔を通した、３ｋＤａ  ＰａｃＢｌｕｅおよび１０ｋＤａ  Ａｌｅｘａ４８８デキストラン粒子のＨｅＬａ細胞（細胞２×１０６個／ｍＬ）への低圧（５ｐｓｉ、１０ｐｓｉまたは２０ｐｓｉ）での送達を実証する、例示的なＦＡＣＳプロットを示す。図２Ａ〜Ｃは、５ｐｓｉの圧力の下で１４μｍ（図２Ａ）、１２μｍ（図２Ｂ）および１０μｍ（図２Ｃ）サイズのフィルターの細孔を通過した細胞を表す。図２ＥとＧは、１０ｐｓｉ（図２Ｅ）および２０ｐｓｉ（図２Ｇ）の圧力の下で１２μｍのフィルター細孔を通過した細胞を表す。図２ＤとＦは、エンドサイトーシス対照（図２Ｄ）および陰性対照（図２Ｆ）のプロットを表す。
【００３２】
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、５μｍサイズのフィルターの細孔を通しての、３ｋＤａ  ＰａｃＢｌｕｅおよび１０ｋＤａ  Ａｌｅｘａ４８８デキストラン粒子の新たに単離したヒトＴ細胞（細胞４×１０６個／ｍＬ）への、シリンジにより手動で（図３Ａ）、または５ｐｓｉの定圧の下で（図３Ｂ）加えられた圧による送達を実証するＦＡＣＳプロットを示す。細胞生存頻度が示される。
【００３３】
【図４】図４は、市販（ＣＯＴＳ）フィルターまたは特注のシリンジフィルターによって媒介された、ＨｅＬａ細胞への３ｋＤａ  ＰａｃＢｌｕｅデキストラン粒子の送達後の送達効率および細胞生存度を示す。
【００３４】
【図５Ａ−Ｂ】図５ＡおよびＢは、３ｐｓｉでＣＯＴＳ（図５Ａ）または特注のシリンジフィルター（図５Ｂ）によって媒介された、ＨｅＬａ細胞への３ｋＤａ  ＰａｃＢｌｕｅデキストラン粒子の送達の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を実証する、代表的フローサイトメトリーヒストグラムプロットを示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、２ｐｓｉおよび３ｐｓｉでの、ＣＯＴＳまたは特注のシリンジフィルターによって媒介された、ＨｅＬａ細胞への３ｋＤａ  ＰａｃＢｌｕｅデキストラン粒子の送達の平均相対平均蛍光強度（ｒＭＦＩ）値を示す。
【００３５】
【図６】図６は、２ｐｓｉ、２．５ｐｓｉおよび３ｐｓｉでＣＯＴＳフィルターによって媒介された、ＨｅＬａ細胞への３ｋＤａ  ＰａｃＢｌｕｅデキストラン粒子およびＥＧＦＰ  ｍＲＮＡの送達後の送達効率、細胞生存度およびｒＭＦＩ値を示す。
【００３６】
【図７】図７ＡおよびＢは、エンドサイトーシス対照と比較して、ヒトＲＢＣへのＩｇＧ抗体（図７Ａ）およびデキストラン粒子（図７Ｂ）の圧縮媒介送達（ＳＱＺ）後の蛍光を表す例示的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを示す。
【００３７】
【図８】図８Ａは、ヒトＲＢＣへのＩｇＧ抗体およびデキストラン粒子の圧縮媒介送達後の送達効率を示す。図８Ｂは、ヒトＲＢＣへのＩｇＧ抗体およびデキストラン粒子の圧縮媒介送達後の推定細胞生存度を示す。
【００３８】
【図９Ａ】図９Ａは、マウスＲＢＣへのＩｇＧ抗体の圧縮媒介送達後の蛍光を表す例示的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを示す。
【図９Ｂ−Ｃ】図９Ｂは、マウスＲＢＣへのＩｇＧ抗体の圧縮媒介送達後の推定細胞生存度を示す。図９Ｃは、マウスＲＢＣへのＩｇＧ抗体の圧縮媒介送達後の送達効率を示す。
【００３９】
【図１０Ａ−Ｃ】図１０Ａ〜Ｉは、エンドサイトーシス（図１０Ａ）、陰性対照（図１０Ｂ）および無物質対照（図１０Ｃ）と比較した、２ｐｓｉ（図１０Ｄ）、４ｐｓｉ（図１０Ｅ）、６ｐｓｉ（図１０Ｆ）、１０ｐｓｉ（図１０Ｇ）、２０ｐｓｉ（図１０Ｈ）の下での、または手動でのシリンジ加圧（図１０Ｉ）を使用した、マウスＲＢＣへのデキストラン粒子の送達を実証する例示的なＦＡＣＳプロットを示す。
【図１０Ｄ−Ｆ】図１０Ａ〜Ｉは、エンドサイトーシス（図１０Ａ）、陰性対照（図１０Ｂ）および無物質対照（図１０Ｃ）と比較した、２ｐｓｉ（図１０Ｄ）、４ｐｓｉ（図１０Ｅ）、６ｐｓｉ（図１０Ｆ）、１０ｐｓｉ（図１０Ｇ）、２０ｐｓｉ（図１０Ｈ）の下での、または手動でのシリンジ加圧（図１０Ｉ）を使用した、マウスＲＢＣへのデキストラン粒子の送達を実証する例示的なＦＡＣＳプロットを示す。
【図１０Ｇ−Ｉ】図１０Ａ〜Ｉは、エンドサイトーシス（図１０Ａ）、陰性対照（図１０Ｂ）および無物質対照（図１０Ｃ）と比較した、２ｐｓｉ（図１０Ｄ）、４ｐｓｉ（図１０Ｅ）、６ｐｓｉ（図１０Ｆ）、１０ｐｓｉ（図１０Ｇ）、２０ｐｓｉ（図１０Ｈ）の下での、または手動でのシリンジ加圧（図１０Ｉ）を使用した、マウスＲＢＣへのデキストラン粒子の送達を実証する例示的なＦＡＣＳプロットを示す。
【００４０】
【図１１Ａ】図１１Ａは、マウスＲＢＣへのデキストラン粒子の圧縮媒介送達後の推定細胞生存度を示す。
【図１１Ｂ−Ｃ】図１１Ｂは、マウスＲＢＣへのＩｇＧ抗体またはデキストラン粒子の圧縮媒介送達後の送達効率を示す。図１１Ｃは、マウスＲＢＣへのＩｇＧ抗体またはデキストラン粒子の圧縮媒介送達後の幾何学的平均蛍光を示す。
【００４１】
【図１２Ａ−Ｂ】図１２Ａは、マウスＲＢＣへのデキストラン粒子の圧縮媒介送達後の蛍光を表す例示的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを示す。図１２Ｂは、マウスＲＢＣへのデキストラン粒子の圧縮媒介送達後の推定細胞生存度を示す。
【図１２Ｃ−Ｄ】図１２Ｃは、マウスＲＢＣへのデキストラン粒子の圧縮媒介送達後の送達効率を示す。図１２Ｄは、マウスＲＢＣへのデキストラン粒子の圧縮媒介送達後の幾何学的平均蛍光を示す。
【００４２】
【図１３Ａ−Ｂ】図１３Ａは、ＨｅＬａ細胞へのデキストラン粒子のマイクロシーブ媒介送達後の細胞生存度を示す。図１３Ｂは、ＨｅＬａ細胞へのデキストラン粒子のマイクロシーブ媒介送達後の送達効率を示す。
【図１３Ｃ−Ｄ】図１３Ｃおよび図１３Ｄは、ＡＱＵＡＭＡＲＩＪＮマイクロシーブ（図１３Ｃ）またはＳＴＥＲＬＩＴＥＣＨ（商標）マイクロシーブ（図１３Ｄ）を使用した、ＨｅＬａ細胞へのデキストラン粒子の圧縮媒介送達後の蛍光を表す例示的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを示す。
【００４３】
【図１４Ａ】図１４Ａは、Ｔ細胞へのデキストラン粒子のマイクロシーブ媒介送達後の細胞生存度および送達効率を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＡＱＵＡＭＡＲＩＪＮマイクロシーブを使用した、Ｔ細胞へのデキストラン粒子の圧縮媒介送達後の蛍光を表す例示的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
詳細な説明
本明細書に記載される開示のある特定の態様は、細孔を含有する表面を通って細胞懸濁液を通過させることにより化合物の細胞内送達が達成できるという驚くべき発見に基づいている。本開示のある特定の態様は、細孔を含有する表面を通って細胞懸濁液を通過させるステップを含む、化合物を細胞内に送達するための方法であって、前記細孔が細胞を変形させそれによって化合物が細胞に入るように細胞の摂動を生じ、前記細胞懸濁液が化合物と接触する方法に関する。本開示のある特定の態様は、細孔を含有する表面を含む、化合物を細胞内に送達するためのデバイスであって、前記細孔は溶液に懸濁された細胞が中を通過できるように構成され、前記細孔が細胞を変形させそれによって化合物が細胞に入るように細胞の摂動が生じるデバイスに関する。一部の実施形態では、表面はフィルターである。一部の実施形態では、表面は膜である。一部の実施形態では、表面はマイクロシーブである。
【００４５】
Ｉ．一般的技法
本明細書に記載されるまたは参照される技法および手順は、例えば、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual（Sambrookら、第４版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.、２０１２年）；Current  Protocols  in  Molecular  Biology（DOI:  １０．１００２／０４７１１４２７２７）；the  series  Methods  in  Enzymology（Academic  Press,  Inc.）；PCR  2：A  Practical  Approach（M.J.  MacPherson、B.D.  HamesおよびG.R.  Taylor編、１９９５年）；Antibodies、A  Laboratory  Manual（E.  A.  Greenfield編、２０１３年）；Culture  of  Animal  Cells：A  Manual  of  Basic  Technique  and  Specialized  Applications（R.I.  Freshney、第６版、J.  Wiley  and  Sons、２０１０年）；Oligonucleotides  and  Analogues（F.  Eckstein編、１９９２年）；Methods  in  Molecular  Biology、Humana  Press；Cell  Biology：A  Laboratory  Handbook  （J.E.  Celis編、Academic  Press、２００５年）；Introduction  to  Cell  and  Tissue  Culture  （J.P.  MatherおよびP.E.  Roberts、Springer、２０１３年）；Cell  and  Tissue  Culture:  Laboratory  Procedures（A.  Doyle、J.B.  Griffiths、およびD.G.  Newell編、J.  Wiley  and  Sons、１９９３〜８年）；Handbook  of  Experimental  Immunology（D.M.  WeirおよびC.C.  Blackwell編、１９９６年）；Gene  Transfer  Vectors  for  Mammalian  Cells（J.M.  MillerおよびM.P.  Calos編、１９８７年）；PCR：The  Polymerase  Chain  Reaction、（Mullisら編、１９９４年）；Current  Protocols  in  Immunology（DOI：１０．１００２／０４７１１４２７３５）；Short  Protocols  in  Molecular  Biology（Ausubelら編、J.  Wiley  and  Sons、２００２年）；Janeway'  s  Immunobiology（K.  MurphyおよびC.  Weaver、Garland  Science、２０１６年）；Antibodies（P.  Finch、１９９７年）；Antibodies：A  Practical  Approach（D.  Catty.編、IRL  Press、１９８８〜１９８９年）；Monoclonal  Antibodies：A  Practical  Approach（P.  ShepherdおよびC.  Dean編、Oxford  University  Press、２０００年）；Using  Antibodies：A  Laboratory  Manual（E.  HarlowおよびD.  Lane、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、１９９９年）；Making  and  Using  Antibodies：A  Practical  Handbook（G.C.  HowardおよびM.R.  Kaser編、CRC  Press、２０１３年）；The  Antibodies  １〜７巻（M.  ZanettiおよびJ.  D.  Capra編、Harwood  Academic  Publishers、１９９５〜２００７年）；およびCancer:  Principles  and  Practice  of  Oncology  （V.T.  DeVitaら編、J.B.  Lippincott  Company、２０１１年）に記載されて広く利用されている方法論など、当業者により一般によく理解され、従来の方法論を使用して通常用いられている。
【００４６】
ＩＩ．定義
本明細書を説明する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形も含み、逆の場合も同じである。下に記載されるいかなる定義も参照により本明細書に組み込まれているいずれの文書とも相容れない事象では、記載される定義が支配する。
【００４７】
本明細書で使用されているように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、特に示されない限り、複数の参照を含む。
【００４８】
本明細書に記載される開示の態様および実施形態は、態様および実施形態を「含む」、「からなる」、および「から本質的になる」を含むことが理解される。
【００４９】
本明細書に記載される全ての組成物、および本明細書に記載される組成物を使用する全ての方法では、組成物は列挙された成分もしくはステップを含むことができる、または列挙された成分もしくはステップ「から本質的になる」ことができる、のいずれかである。組成物が列挙された成分「から本質的になる」と記載されている場合は、組成物は列挙された成分を含有しており、開示された方法に実質的に影響を与えない他の成分を含有していてもよいが、明白に列挙されている成分以外の開示された方法に実質的に影響を与える他のいかなる成分も含有しない；または、組成物が開示された方法に実質的に影響を与える列挙された成分以外の余分な成分を確かに含有する場合は、組成物は開示された方法に実質的に影響を与えるほど十分な濃度または量の余分な成分を含有しない。方法が列挙されたステップ「から本質的になる」と記載されている場合は、方法は列挙されたステップを含有しており、開示された方法に実質的に影響を与えない他のステップを含有していてもよいが、方法は明白に列挙されているステップ以外の開示された方法に実質的に影響を与える他のいかなるステップも含有しない。非限定的具体例として、組成物が成分「から本質的になる」と記載されている場合は、組成物は任意の量の薬学的に許容される担体、ビヒクル、または希釈剤および開示された方法に実質的に影響を与えないような他の成分をさらに含有していてもよい。
【００５０】
本明細書で使用される用語「約」とは、本技術分野の当業者に容易に理解されるそれぞれの値の通常の誤差範囲のことである。本明細書での「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータそれ自体に向けられている実施形態を含む（および記載する）。
【００５１】
本明細書で使用される用語「細孔」とは、材料内の穴、裂け目、空洞、隙間、割れ目、間隙、または穿孔を限定せずに含むが、これらに限定されない開口のことである。一部の例では、（示されている場合）この用語は本開示の表面内の細孔のことである。他の例では、（示されている場合）細孔とは細胞膜中の細孔を指すことができる。
【００５２】
本明細書で使用される用語「膜」とは、細孔を含有する選択性の障壁またはシートのことである。この用語は、境界または裏打ちの機能を果たす柔軟なシート様構造体を含む。一部の例では、この用語は細孔を含有する表面またはフィルターのことである。この用語は用語「細胞膜」とははっきり異なっている。
【００５３】
本明細書で使用される用語「フィルター」とは、細孔中の選択的通過を可能にする多孔質物品のことである。一部の例では、この用語は細孔を含有する表面または膜のことである。
【００５４】
本明細書で使用される用語「不均質な」とは、構造または組成において混合されているまたは均一ではない物について言及する。一部の例では、この用語は所与の表面内で変化に富んだサイズ、形状または分布を有する細孔のことを指す。
【００５５】
本明細書で使用される用語「均質な」とは、構造または組成が全体にわたって一貫しているまたは均一である物について言及する。一部の例では、この用語は所与の表面内で一貫したサイズ、形状または分布を有する細孔のことを指す。
【００５６】
本明細書で使用される用語「異種の」とは、異なる生物に由来する分子について言及する。一部の例では、この用語は、所与の生物内では通常見出されないし、発現もされない核酸またはタンパク質について言及する。
【００５７】
本明細書で使用される用語「相同の」とは、同じ生物に由来する分子について言及する。一部の例では、この用語は、所与の生物内で通常見出されるまたは発現される核酸またはタンパク質について言及する。
【００５８】
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかのことである。したがって、この用語は、一本、二本もしくは多鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマー、または他の天然の、化学的にもしくは生化学的に改変された、非天然、もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドの骨格は糖およびリン酸基（典型的にはＲＮＡまたはＤＮＡに見出されることがある）、または改変されたもしくは置換された糖もしくはリン酸基を含むことができる。代わりに、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホロアミド酸などの合成サブユニットのポリマーを含むことができ、したがってオリゴデオキシヌクレオシドホスホロアミド酸（Ｐ−ＮＨ２）または混合ホスホロアミド酸−リン酸ジエステルオリゴマーであり得る。さらに、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成して適切な条件下で鎖をアニーリングすることにより、またはＤＮＡポリメラーゼを適切なプライマーと一緒に使用して相補鎖を新規に合成することにより、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から得ることができる。
【００５９】
用語「ポリペプチド」と「タンパク質」は互換的に使用されて、アミノ酸残基のポリマーのことを指し、最小長に限定されない。そのようなアミノ酸残基のポリマーは天然のまたは非天然のアミノ酸残基を含有することがあり、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基の二量体、三量体、および多量体を含むが、これらに限定されない。完全長タンパク質とその断片の両方が定義により包含される。この用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化、および同類の物も含む。さらに、本発明の目的のため、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持している限り、天然の配列への欠失、付加、および置換（一般に天然では保存的）などの改変を含むタンパク質のことである。これらの改変は、部位特異的突然変異誘発を通じてのような意図的であってもよく、またはタンパク質を産生する宿主の突然変異またはＰＣＲ増幅に起因するエラーを通じてなどの偶発的でもよい。
【００６０】
本明細書に記載される構造的特徴および機能的特徴のいずれでも、これらの特徴を決定する方法は当技術分野では公知である。
【００６１】
ＩＩＩ．細孔を有する表面
ある特定の態様では、本開示は、細孔を含有する表面を通って細胞懸濁液を通過させるステップを含む、化合物を細胞内に送達するための方法であって、細孔が細胞を変形して細胞の摂動が生じ、例えば、懸濁液中の細胞が細孔を通過する前に、その間にまたはその後で細胞懸濁液を化合物に接触させ、化合物が細胞に入る方法に関する。本明細書で開示される表面はいくつかの材料のうちのいずれか１つで作製され、いくつかの形態のうちのいずれか１つを取ることができる。一部の実施形態では、表面は膜である。一部の実施形態では、表面はフィルターである。フィルターおよび膜は通常、物質を溶液から分離し、それにより被保持物を得るのに使用される。表面がフィルターまたは膜である実施形態では、フィルターまたは膜は、細胞懸濁液をフィルターまたは膜細孔に通し、それによって化合物が細胞に入るように細胞の摂動を生じることにより化合物を細胞内に送達するために代替的に使用される。一部の実施形態では、表面はＳＴＥＲＬＩＴＥＣＨ（商標）ポリカーボネートフィルター（ＰＣＴ８０１３１００）である。一部の実施形態では、フィルターは接線流フィルターである。一部の実施形態では、表面はスポンジまたはスポンジ様マトリックスである。一部の実施形態では、表面はマトリックスである。一部の実施形態では、表面はマイクロシーブである。一部の実施形態では、表面は網ではない。
【００６２】
一部の実施形態では、表面は蛇行する経路の表面である。一部の実施形態では、蛇行する経路の表面は酢酸セルロースを含む。一部の実施形態では、表面は、合成または天然のポリマー、ポリカーボネート、シリコン、ガラス、金属、合金、ニトロセルロース、銀、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリプロピレン、ＰＶＤＦ、ポリテトラフルオロエチレン、混合セルロースエステル、磁器、グラファイト、およびセラミックから選択される材料を含むが、これらに限定されない。
【００６３】
本開示の表面は、エッチング、トラックエッチング、リソグラフィー、レーザーアブレーション、インジェクション成形、スタンピング、微細孔パンチング、ポリマースポンジ、直接発泡成形、押出成形およびホットエンボス加工を含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知の任意の技法を使用して製造してもよい。エッチングは、強酸などの化学物質を使用して所望のパターンで金属表面に切込みを入れる工程を含む。トラックエッチングされた膜は、固体フィルムに粒子を放射してフィルム中に損傷を受けた物質のトラックを形成させることにより形成される。次にフィルムは化学薬剤に晒されて、損傷を受けたトラックは選択的にエッチングされてフィルム中に穿孔が作られる。細孔の横断面の幅はフィルム上でのエッチング液のインキュベーション時間により制御できる。リソグラフィーは、マイクロリソグラフィー、ナノリソグラフィー、およびｘ線リソグラフィーを含むことができる。リソグラフィーでは、リソグラフィー装置は、所望のパターンを基材の標的部分上につける。例えば、ｘ線リソグラフィーでは、ｘ線を使用してパターンをマスクから所望の基材上の光感応化学フォトレジストに移す。フォトリソグラフィーでは、光を使用して所望のパターンをフォトマスクから基材上の光感応フォトレジストに移す。それに続く化学的塗布を使用してフォトレジストの真下の基材材料にパターンを刻み込む。レーザーアブレーションは、レーザービームで照射することにより固体表面から物質を取り除く工程であり、インジェクション成形は所望の型に材料を注入することを含み、次に型では材料が冷えて所望の構造に硬化する。スタンピングおよび微細孔パンチング法は道具を利用して所望の形態を基材材料に切込みを入れるまたは刻印する。セラミックフィルター膜を生成するためには、ポリマースポンジ法は、ポリマースポンジをセラミックスラリーで飽和し、次にこれを焼き尽くして多孔質セラミックを残すことを含む。直接発泡成形法では、所望のセラミック成分および有機物質を含有する化学的混合物を処理してガスを放出する。次に、物質中に気泡を生成し、発泡させる。次に、得られた多孔質キメラ物質を乾燥させ、焼成した。蜂巣状または細胞構造を生成するためには、押出成形と呼ばれる塑性形成法が使用され、セラミック粉体プラス添加剤の混合物が成形ダイを通して押し出される。ホットエンボス加工は、ポリマーの温度を、そのガラス遷移温度の直ぐ上まで上昇させることにより軟化させたポリマー中にパターンをスタンピングすることを含む。
【００６４】
一部の実施形態では、表面はナノ構造膜である。一部の実施形態では、相転移を使用してナノ構造膜を作製する。相転移法は、気相からの沈降、乾湿相反転、および熱誘導相分離を含むが、これらに限定されない。気相からの沈降法では、ポリマーと溶剤で構成されるキャストポリマー溶液は溶剤蒸気で飽和された非溶剤蒸気環境に導入される。飽和溶剤蒸気はフィルムからの溶剤の蒸発を抑制する。非溶剤分子はそれに続いてフィルム中に拡散し、ポリマーの硬化をもたらす。乾湿相反転法では、ポリマーと溶剤で構成されるポリマー溶液が調製される。溶液は適切な表面にキャスティングされ、溶剤の部分的蒸発後、キャストフィルムはゼラチンに浸漬される。次に、非溶剤は薄い固体層を通ってポリマー溶液フィルム中に拡散し、溶剤は外に拡散して多孔質膜を作り出す。熱誘導相分離法では、ポリマーは溶剤と高温で混合されて、ポリマー溶液はフィルムにキャスティングされる。溶液は、冷めると、溶解力がなくなるために非混和性領域に入り込む。
【００６５】
一部の実施形態では、表面はブロック共重合体である。ブロック共重合体は、共有結合で連結された異なる重合単量体の２つまたはそれよりも多いブロックで構成されている。ブロック共重合体成分は、ミクロ相分離して周期的なナノ構造を形成することができる。この工程では、ブロック間の不適合のためにブロック共重合体は相分離を受け、ナノメートルサイズの構造体を作り出す。
【００６６】
一部の実施形態では、表面はマイクロシーブである。一部の例では、マイクロシーブは細胞分離、ＣＴＣ単離または液滴乳化技法において使用される。一部の実施形態では、マイクロシーブの細孔は、シリコン支持体のあるセラミック基材上でフォトリソグラフィーにより作製される。一部の実施形態では、マイクロシーブはポリカーボネートで作られる。マイクロシーブはＡｑｕａｍａｒｉｊｎまたはＳｔｅｒｌｉｔｅｃｈから入手可能である。一部の実施形態では、マイクロシーブは約４μｍから約１０μｍの範囲の細孔サイズを有する。一部の実施形態では、マイクロシーブは約５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％のいずれかよりも大きい、または約５０％よりも大きい多孔度を有する。
【００６７】
本明細書で開示される表面は当技術分野で公知のいかなる形状、例えば、３次元形状を有することができる。表面の２次元形状は、環状、楕円形、円形、四角形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形、または八角形が可能であるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、表面は円形の形状をしている。一部の実施形態では、表面３次元形状は円柱形、円錐形、または立方形である。
【００６８】
用語「細孔サイズ」および「細孔横断面の幅」は互換的に使用され、本明細書で使用されているように、細孔を横切る最小の横断面の幅のことである。一部の実施形態では、細孔は環状またはほぼ環状であり、細孔サイズまたは細孔横断面の幅。一部の実施形態では、細孔は多角形の形状をしており（例えば、四角形、矩形、五角形、六角形、等）、細孔サイズまたは細孔横断面の幅は多角形の最小幅である。当業者であれば、三角形の細孔は幅がないことがあるが、むしろ底辺と高さの点から記載されることは理解されると考えられる。一部の実施形態では、三角形の細孔の細孔サイズまたは細孔横断面の幅は三角形の最小の高さ（底辺とその対頂角の間の最小の距離）である。
【００６９】
表面は種々の横断面の幅および厚さを有することができる。一部の実施形態では、表面横断面の幅は約１ｍｍから約３ｍの間、またはそれらの間の任意の横断面の幅もしくは範囲の横断面の幅である。一部の実施形態では、表面横断面の幅は約１ｍｍから約７５０ｍｍ、約１ｍｍから約５００ｍｍ、約１ｍｍから約２５０ｍｍ、約１ｍｍから約１００ｍｍ、約１ｍｍから約５０ｍｍ、約１ｍｍから約２５ｍｍ、約１ｍｍから約１０ｍｍ、約１ｍｍから約５ｍｍ、または約１ｍｍから約２．５ｍｍのうちのいずれか１つの間である。一部の実施形態では、表面横断面の幅は約５ｍｍから約１ｍ、約１０ｍｍから約１ｍ、約２５ｍｍから約１ｍ、約５０ｍｍから約１ｍ、約１００ｍｍから約１ｍ、約２５０ｍｍから約１ｍ、約５００ｍｍから約１ｍ、または約７５０ｍｍから約１ｍのうちのいずれか１つの間である。
【００７０】
一部の実施形態では、表面は既定の厚さを有する。一部の実施形態では、表面の厚さは均一である。一部の実施形態では、表面の厚さは不定である。例えば、一部の実施形態では、表面の部分は表面の他の部分よりも厚いまたは薄い。一部の実施形態では、表面の厚さは約１から９０％またはそれらの間の任意のパーセントもしくは範囲のパーセントで変動する。一部の実施形態では、表面の厚さは約１％から約９０％、約１％から約８０％、約１％から約７０％、約１％から約６０％、約１％から約５０％、約１％から約４０％、約１％から約３０％、約１％から約２０％、約１％から約１０％、または約１％から約５％のうちのいずれか１つで変動する。一部の実施形態では、表面の厚さは約５％から約９０％、約１０％から約９０％、約２０％から約９０％、約３０％から約９０％、約４０％から約９０％、約５０％から約９０％、約６０％から約９０％、約７０％から約９０％、または約８０％から約９０％のうちのいずれか１つで変動する。一部の実施形態では、表面は約０．０１μｍから約５ｍｍの厚さの間、またはそれらの間の任意の厚さもしくは範囲の厚さである。一部の実施形態では、表面は、約０．０１μｍから約５ｍｍ、約０．０１μｍから約２．５ｍｍ、約０．０１μｍから約１ｍｍ、約０．０１μｍから約７５０μｍ、約０．０１μｍから約５００μｍ、約０．０１μｍから約２５０μｍ、約０．０１μｍから約１００μｍ、約０．０１μｍから約９０μｍ、約０．０１μｍから約８０μｍ、約０．０１μｍから約７０μｍ、約０．０１μｍから約６０μｍ、約０．０１μｍから約５０μｍ、約０．０１μｍから約４０μｍ、約０．０１μｍから約３０μｍ、約０．０１ｕｍから約２０μｍ、約０．０１μｍから約１０μｍ、約０．０１μｍから約５μｍ、約０．０１μｍから約１μｍ、約０．０１μｍから約０．５μｍ、約０．０１μｍから約０．１μｍ、または約０．０１μｍから約０．０５μｍの厚さの間である。一部の実施形態では、表面は、約０．０１μｍから約５ｍｍ、約０．０５μｍから約５ｍｍ、約０．１μｍから約５ｍｍ、約０．５μｍから約５ｍｍ、約１μｍから約５ｍｍ、約５μｍから約５ｍｍ、約１０μｍから約５ｍｍ、約２０ｕｍから約５ｍｍ、約３０μｍから約５ｍｍ、約４０μｍから約５ｍｍ、約５０μｍから約５ｍｍ、約６０μｍから約５ｍｍ、約７０μｍから約５ｍｍ、約８０μｍから約５ｍｍ、約９０μｍから約５ｍｍ、約１００μｍから約５ｍｍ、約２５０μｍから約５ｍｍ、約５００μｍから約５ｍｍ、約７５０μｍから約５ｍｍ、約１ｍｍから約５ｍｍ、または約２．５ｍｍから約５ｍｍの厚さの間である。一部の実施形態では、表面は、約１０μｍの厚さである。
【００７１】
一部の実施形態では、表面を通過する流速は約０．００１ｍＬ／ｃｍ２／秒から約１００Ｌ／ｃｍ２／秒の間またはそれらの間の任意の速度もしくは範囲の速度である。一部の実施形態では、流速は、約０．００１ｍＬ／ｃｍ２／秒から約７５Ｌ／ｃｍ２／秒、約０．００１ｍＬ／ｃｍ２／秒から約５０Ｌ／ｃｍ２／秒、約０．００１ｍＬ／ｃｍ２／秒から約２５Ｌ／ｃｍ２／秒、約０．００１ｍＬ／ｃｍ２／秒から約１０Ｌ／ｃｍ２／秒、約０．００１ｍＬ／ｃｍ２／秒から約７．５Ｌ／ｃｍ２／秒、約０．００１ｍＬ／ｃｍ２／秒から約５．０Ｌ／ｃｍ２／秒、約０．００１ｍＬ／ｃｍ２／秒から約２．５Ｌ／ｃｍ２／秒、約０．００１ｍＬ／ｃｍ２／秒から約１Ｌ／ｃｍ２／秒、約０．００１ｍＬ／ｃｍ２／秒から約０．１Ｌ／ｃｍ２／秒、約０．００１ｍＬ／ｃｍ２／秒から約７５ｍＬ／ｃｍ２／秒、約０．００１ｍＬ／ｃｍ２／秒から約５０ｍＬ／ｃｍ２／秒、約０．００１ｍＬ／ｃｍ２／秒から約２５ｍＬ／ｃｍ２／秒、約０．００１ｍＬ／ｃｍ２／秒から約１０ｍＬ／ｃｍ２／秒、約０．００１ｍＬ／ｃｍ２／秒から約１ｍＬ／ｃｍ２／秒、約０．００１ｍＬ／ｃｍ２／秒から約０．１ｍＬ／ｃｍ２／秒、または約０．００１ｍＬ／ｃｍ２／秒から約０．０１ｍＬ／ｃｍ２／秒の間である。一部の実施形態では、流速は、約０．００１ｍＬ／ｃｍ２／秒から約１００Ｌ／ｃｍ２／秒、約０．０１ｍＬ／ｃｍ２／秒から約１００Ｌ／ｃｍ２／秒、約０．１ｍＬ／ｃｍ２／秒から約１００Ｌ／ｃｍ２／秒、約１ｍＬ／ｃｍ２／秒から約１００Ｌ／ｃｍ２／秒、約１０ｍＬ／ｃｍ２／秒から約１００Ｌ／ｃｍ２／秒、約５０ｍＬ／ｃｍ２／秒から約１００Ｌ／ｃｍ２／秒、約０．１Ｌ／ｃｍ２／秒から約１００Ｌ／ｃｍ２／秒、約０．５Ｌ／ｃｍ２／秒から約１００Ｌ／ｃｍ２／秒、約１Ｌ／ｃｍ２／秒から約１００Ｌ／ｃｍ２／秒、約２．５Ｌ／ｃｍ２／秒から約１００Ｌ／ｃｍ２／秒、約５Ｌ／ｃｍ２／秒から約１００Ｌ／ｃｍ２／秒、約７．５Ｌ／ｃｍ２／秒から約１００Ｌ／ｃｍ２／秒、約１０Ｌ／ｃｍ２／秒から約１００Ｌ／ｃｍ２／秒、約２５Ｌ／ｃｍ２／秒から約１００Ｌ／ｃｍ２／秒、約５０Ｌ／ｃｍ２／秒から約１００Ｌ／ｃｍ２／秒、または約７５Ｌ／ｃｍ２／秒から約１００Ｌ／ｃｍ２／秒の間である。
【００７２】
細孔の横断面の幅は処置される細胞の型に関係している。一部の実施形態では、細孔サイズは処置される細胞の直径と相関している。一部の実施形態では、細孔サイズは、細孔を通過すると細胞に摂動が与えられる程度のものである。一部の実施形態では、細孔サイズは細胞の直径未満である。一部の実施形態では、細孔サイズは細胞の直径の約２０から９０％である。一部の実施形態では、細孔サイズは細胞の直径の約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９９％またはそれらの間の任意の値のうちのいずれか１つである。最適な細孔サイズは適用および／または細胞型に基づいて変動することができる。多くの細胞は直径が約５から１５μｍの間であり、例えば、樹状細胞は直径が７から８μｍである。例えば、細孔の横断面の幅は単一細胞の処理のために約４．５、５、５．５、６または６．５μｍのうちのいずれか未満である。別の例では、ヒト卵子の処理のための細孔の横断面の幅は約６．２μｍから約８．４μｍの間であるが、より大きいおよびより小さな細孔は可能である（ヒト卵細胞の直径はおよそ１２０μｍである）。一部の実施形態では、細胞のクラスターが細孔を通過したときに破壊されないとすれば、細胞のクラスター（例えば、胚）は約１２μｍから約１７μｍの間の細孔横断面の幅を使用して処理される。一部の実施形態では、細孔横断面の幅は約０．０１μｍから約３００μｍまたはそれらの間の任意のサイズもしくは範囲のサイズである。一部の実施形態では、細孔横断面の幅のサイズは、約０．０１μｍから約２５０μｍ、約０．０１μｍから約２００μｍ、約０．０１μｍから約１５０μｍ、約０．０１μｍから約１００μｍ、約０．０１μｍから約５０μｍ、または約０．０１μｍから約２５μｍの範囲にある。一部の実施形態では、細孔横断面の幅は、約１μｍから約３００μｍ、約２５μｍから約３００μｍ、約５０μｍから約３００μｍ、約１００μｍから約３００μｍ、約１５０μｍから約３００μｍ、約２００μｍから約３００μｍまたは約２５０μｍから約３００μｍの範囲である。一部の実施形態では、細孔横断面の幅は、約０．０１から約３５μｍの範囲である。一部の実施形態では、細孔横断面の幅は約０．４μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約１２μｍ、または約１４μｍのいずれかまたはそれ未満である。一部の実施形態では、細孔横断面の幅は少なくとも約１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、または５μｍである。一部の実施形態では、細孔横断面の幅は約２００μｍまたはそれ未満である。一部の実施形態では、細孔は所与の表面を横切る横断面の幅が不均質であるまたは横断面の幅が均質である。一部の実施形態では、不均質な細孔横断面の幅は、１０から２０％またはそれらの間の任意のパーセントもしくは範囲のパーセントで変動する。一部の実施形態では、細孔は細胞を細胞の直径の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９９％またはそれらの間の任意の値のうちのいずれか１つまで変形させる。一部の実施形態では、細胞のサイズは懸濁液中の細胞のサイズである。
【００７３】
一部の実施形態では、細孔の横断面積は細胞の横断面積と相関している。一部の実施形態では、細孔の２次元形状は環状、楕円形、円形、四角形、矩形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形、または八角形であり、細孔の横断面積は細胞の横断面積と相関している。一部の実施形態では、細孔の横断面積は少なくとも約１μｍ２、４μｍ２、９μｍ２、１６μｍ２、２５μｍ２、５０μｍ２、１００μｍ２、１５０μｍ２、２００μｍ２、２５０μｍ２、５００μｍ２または１０００μｍ２である。一部の実施形態では、細孔は所与の表面を横切る横断面積が不均質であるまたは横断面積が均質である。一部の実施形態では、不均質な細孔横断面積は、１０から２０％またはそれらの間の任意のパーセントもしくは範囲のパーセントで変動する。一部の実施形態では、細孔は細胞を細胞の横断面積の約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９９％またはそれらの間の任意の値のうちのいずれか１つまで変形させる。一部の実施形態では、細胞のサイズは懸濁液中の細胞のサイズである。
【００７４】
細孔通路の入口および出口は種々の角度を有していてもよい。細孔角度は細胞が通過している間に細孔の目詰まりを最小化するように選択することができる。例えば、入口または出口部分の角度は約０から約９０度の間で可能である。一部の実施形態では、細孔は同一の入口および出口角を有する。一部の実施形態では、細孔は異なる入口および出口角を有する。一部の実施形態では、細孔の縁は滑らか、例えば、円形または曲線状である。滑らかな細孔の縁は連続して、平坦で、平らな表面を有し、隆起、突起、またはでこぼこの部分がない。一部の実施形態では、細孔の縁は鋭い。鋭い細孔の縁は尖っているまたは急角度である薄い縁を有する。一部の実施形態では、細孔通路は真っ直ぐである。直線の細孔通路は、曲線、屈曲、角、または他の不規則なものを含有しない。一部の実施形態では、細孔通路は湾曲している。曲線状の細孔通路は湾曲しているまたは直線から逸脱している。一部の実施形態では、細孔通路は複数の曲線、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多い曲線を有する。
【００７５】
細孔は、２次元または３次元形状を含む、当技術分野で公知のいかなる形状を有することができる。細孔形状（例えば、横断面の形状）は、環状、楕円形、円形、矩形、四角形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形、および八角形が可能であるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、細孔の横断面は形状が円形である。一部の実施形態では、細孔の３次元形状は円柱形または円錐形である。一部の実施形態では、細孔は溝付きの入口および出口形状を有する。一部の実施形態では、細孔形状は所与の表面内の細孔間で均質（すなわち、一貫しているまたは規則的）である。一部の実施形態では、細孔形状は所与の表面内の細孔間で不均質である（すなわち、混成であるかまたは様々である）。
【００７６】
本明細書に記載される表面は一定範囲の全細孔数を有することができる。一部の実施形態では、細孔は全表面積の約１０から８０％を包含する。一部の実施形態では、表面は約１．０×１０３から約１．０×１０３０の全細孔またはそれらの間の任意の数もしくは範囲の数を含有する。例えば、表面は少なくとも約１．０×１０３、１．０×１０４、１．０×１０５、１．０×１０６、１．０×１０７、１．０×１０８、１．０×１０９、１．０×１０１０、１．０×１０１５、１．０×１０２０、１．０×１０２５、１．０×１０３０個のいずれかまたはそれよりも多くの全細孔を含有してもよい。一部の実施形態では、表面は表面積１ｍｍ２当たり約１０から約１．０×１０１５個の間の細孔を含む。例えば、表面は表面積１ｍｍ２当たり約１．０×１０２から約１．０×１０１５、約１．０×１０３から約１．０×１０１５、約１．０×１０５から約１．０×１０１５、約１．０×１０７から約１．０×１０１５、約１．０×１０１０から約１．０×１０１５、約１．０×１０１２から約１．０×１０１５個の細孔を含有していてもよい。一部の実施形態では、表面は表面積１ｍｍ２当たり約１０から約１．０×１０１５、約１０から約１．０×１０１２、約１０から約１．０×１０１０、約１０から約１．０×１０７、約１０から約１．０×１０５、約１０から約１．０×１０３、または約１０から約１．０×１０２個の細孔を含有していてもよい。一部の実施形態では、半径１３ｍｍの表面は約６．０×１０５個の細孔を含む。
【００７７】
細孔は所与の表面内では多数の方法で分布させることができる。一部の実施形態では、細孔は所与の表面内では平行に分布している。一部の実施形態では、細孔を有する表面は互いの上に積み重なっている。１つのそのような例では、細孔は同じ方向に並んで分布しており、所与の表面内では同じ距離離れている。一部の実施形態では、細孔分布は規則正しいまたは均質である。１つのそのような例では、細孔は規則的、組織的パターンで分布している、または所与の表面内では同じ距離離れている。一部の実施形態では、細孔分布はランダムであるまたは不均質である。１つのそのような例では、細孔は不規則で無秩序なパターンで分布している、または所与の表面内では異なる距離離れている。一部の実施形態では、表面中の細孔は不規則なパターンで配置されている。一部の実施形態では、表面中の細孔はサイズが不均質である。一部の実施形態では、表面中の細孔は形状が不均質である。一部の実施形態では、表面中の細孔は不規則なパターンで配置され、サイズが不均質である。一部の実施形態では、表面中の細孔は不規則なパターンで配置され、形状が不均質である。一部の実施形態では、表面中の細孔はサイズが不均質であり、形状が不均質である。一部の実施形態では、表面中の細孔は不規則なパターンで配置され、サイズが不均質であり、形状が不均質である。
【００７８】
一部の実施形態では、複数の表面が直列に分布している。複数の表面は、表面サイズ、形状、および／または粗さが均質であるまたは不均質であり得る。複数の表面は、均質なまたは不均質な細孔サイズ、形状、および／または数を有する細孔をさらに含有することができ、それによって一定範囲の化合物の異なる細胞型への同時送達を可能にする。一部の実施形態では、複数の表面は積み重なっている。一部の実施形態では、細胞懸濁液は複数の表面を通過する。
【００７９】
一部の実施形態では、個々の細孔は均一な幅寸法（すなわち、細孔通路の長さに沿って一定の幅）を有する。一部の実施形態では、個々の細孔は可変幅（すなわち、細孔通路の長さに沿って増加するまたは減少する幅）を有する。一部の実施形態では、所与の表面内の細孔は同じ個々の細孔深度を有する。一部の実施形態では、所与の表面内の細孔は異なる個々の細孔深度を有する。一部の実施形態では、細孔は互いにすぐに隣接している。一部の実施形態では、細孔は距離により互いに分離されている。一部の実施形態では、細孔は約０．００１μｍから約３０ｍｍの距離もしくはそれらの間の任意の距離もしくは範囲の距離により互いに分離されている。例えば、細孔は、約０．００１μｍから３０ｍｍ、約０．０１μｍから約３０ｍｍ、約０．０５μｍから約３０ｍｍ、約０．１μｍから約３０ｍｍ、約０．５μｍから約３０ｍｍ、約１μｍから約３０ｍｍ、約５μｍから約３０ｍｍ、約１０μｍから約３０ｍｍ、約５０μｍから約３０ｍｍ、約１００μｍから約３０ｍｍ、約２５０μｍから約３０ｍｍ、約５００μｍから約３０ｍｍ、約１ｍｍから約３０ｍｍ、約１０ｍｍから約３０ｍｍ、または約２０ｍｍから約３０ｍｍのいずれか一つの間の距離により互いに分離されていてもよい。一部の実施形態では、細孔は、約０．００１μｍから０．０１μｍ、約０．００１μｍから約０．０５μｍ、約０．００１μｍから約０．１μｍ、約０．００１μｍから約０．５μｍ、約０．００１μｍから約１μｍ、約０．００１μｍから約５μｍ、約０．００１μｍから約１０μｍ、約０．００１μｍから約５０μｍ、約０．００１μｍから約１００μｍ、約０．００１μｍから約２５０μｍ、約０．００１μｍから約５００μｍ、約０．００１μｍから約１ｍｍ、約０．００１μｍから約１０ｍｍ、または約０．００１μｍから約２０ｍｍのいずれか一つの間の距離により互いに分離されていてもよい。
【００８０】
一部の実施形態では、表面は材料で被覆されている。材料は、テフロン（登録商標）、接着性コーティング、界面活性剤、ヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、およびシュウ酸塩などの抗凝固剤、タンパク質、接着分子、抗体、細胞機能を調節する因子、核酸、脂質、炭水化物、脂質−炭水化物複合体などの複合体、または膜貫通タンパク質を含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知のいかなる材料からも選択することができる。一部の実施形態では、表面はポリビニルピロリドンで被覆される。一部の実施形態では、材料は表面に共有結合している。一部の実施形態では、材料は表面に非共有結合している。一部の実施形態では、表面分子は細胞が細孔を通過するときに放出される。
【００８１】
一部の実施形態では、表面は改変された化学的特性を有する。一部の実施形態では、表面は親水性である。一部の実施形態では、表面は疎水性である。一部の実施形態では、表面は帯電している。一部の実施形態では、表面は正および／または負に帯電している。一部の実施形態では、表面は一部の領域では正に帯電しており、他の領域では負に帯電している。一部の実施形態では、表面は全体的に正または全体的負電荷を有する。一部の実施形態では、表面は滑面、電解研磨、粗面、またはプラズマ処理のうちのいずれか１つが可能である。一部の実施形態では、表面は双極イオンまたは双極子化合物を含む。
【００８２】
ＩＶ．細胞懸濁液
ある特定の態様では、本開示は細孔を含有する表面を通って細胞懸濁液を通過させることに関する。一部の実施形態では、細胞懸濁液は動物細胞を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁液はカエル、ニワトリ、昆虫、または線虫細胞を含む。一部の実施形態では、細胞懸濁液は哺乳動物細胞を含む。一部の実施形態では、細胞はマウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヤギまたはウサギ細胞である。一部の実施形態では、細胞はヒト細胞である。
【００８３】
一部の実施形態では、細胞懸濁液は細胞壁を含む細胞を含む。一部の実施形態では、細胞は植物、酵母、真菌、藻類、または細菌細胞である。一部の実施形態では、細胞は植物細胞である。一部の実施形態では、植物細胞は作物、モデル、観賞植物、野菜、マメ科、針葉樹、またはイネ科植物細胞である。一部の実施形態では、細胞は酵母細胞である。一部の実施形態では、酵母細胞はＣａｎｄｉｄａまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞である。一部の実施形態では、細胞は真菌細胞である。一部の実施形態では、真菌細胞はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ細胞である。一部の実施形態では、細胞は藻類細胞である。一部の実施形態では、藻類細胞はＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、またはＣｈｌｏｒｅｌｌａ細胞である。一部の実施形態では、細胞懸濁液は細菌細胞を含む。一部の実施形態では、細菌細胞はグラム陽性菌細胞である。一部の実施形態では、グラム陽性菌は厚いペプチドグリカン層を含む細胞壁を有する。一部の実施形態では、細菌細胞はグラム陰性菌細胞である。グラム陰性菌は内部細胞質細胞膜と外膜の間に薄いペプチドグリカン層を含む細胞壁を有する。一部の実施形態では、細菌細胞はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞である。
【００８４】
細胞懸濁液は混合されたまたは精製された細胞集団でもよい。一部の実施形態では、細胞懸濁液は、全血、リンパ液、および／または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）などの混合された細胞集団である。一部の実施形態では、細胞懸濁液は精製された細胞集団である。一部の実施形態では、細胞は一次細胞または細胞株の細胞である。一部の実施形態では、細胞は血液細胞である。一部の実施形態では、血液細胞は免疫細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はリンパ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、ＮＫＴ細胞、マスト細胞、単球、マクロファージ、好塩基球、好酸球、好中球、またはＤＣ２．４樹状細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は一次ヒトＴ細胞である。一部の実施形態では、血液細胞は赤血球である。一部の実施形態では、細胞はがん細胞である。一部の実施形態では、がん細胞はＨｅＬａ細胞などのがん細胞株の細胞である。一部の実施形態では、がん細胞は腫瘍細胞である。一部の実施形態では、がん細胞は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）である。一部の実施形態では、細胞は幹細胞である。例となる幹細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、肝幹細胞、心筋幹細胞、神経幹細胞、および造血幹細胞を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、細胞は、一次線維芽細胞または新生児ヒト包皮線維芽細胞（Ｎｕｆｆ細胞）などの線維芽細胞である。一部の実施形態では、細胞はＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞などの不死化細胞株の細胞である。一部の実施形態では、細胞は皮膚細胞である。一部の実施形態では、細胞は卵母細胞、卵細胞、または接合体などの生殖細胞である。一部の実施形態では、細胞は神経細胞である。一部の実施形態では、細胞のクラスターが細孔を通過するときに破壊されないとすれば、細胞は胚などの細胞のクラスターである。
【００８５】
細胞懸濁液の組成（例えば、モル浸透圧濃度、塩濃度、血清含有量、細胞濃度、ｐＨ、等）は化合物の送達に影響を与えることがある。一部の実施形態では、懸濁液は全血を含む。代わりに、細胞懸濁液は生理食塩水または血液以外の生理的媒体中の細胞の混合物である。一部の実施形態では、細胞懸濁液は水溶液を含む。一部の実施形態では、水溶液は細胞培養培地、ＰＢＳ、塩、糖、増殖因子、動物由来産物、増量材、界面活性剤、潤滑剤、ビタミン、タンパク質、キレート剤、および／またはアクチン重合に影響を与える薬剤を含む。一部の実施形態では、細胞培養培地はＤＭＥＭ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、またはＸ−ＶＩＶＯである。さらに、溶液緩衝剤は、表面の目詰まりを減少するまたは取り除き細胞生存率を改善するように設計することができる１つまたは複数の潤滑剤（プルロニックまたは他の界面活性剤）を含むことができる。例となる界面活性剤は、ポロキサマー、ポリソルベート、マンニトールなどの糖、動物由来血清、およびアルブミンタンパク質を含むが、これらに限定されない。
【００８６】
ある種の細胞を用いた一部の構成では、細胞は、細胞の内部に化合物を送達するのに役立つ１つまたは複数の溶液でインキュベートすることができる。一部の実施形態では、水溶液はアクチン重合に影響を与える薬剤を含む。一部の実施形態では、アクチン重合に影響を与える薬剤は、ラトランクリンＡ、サイトカラシン、および／またはコルヒチンである。例えば、細胞は、送達に先立って１時間ラトランクリンＡ（Lantrunculin  A）などの脱重合溶液（０．１μｇ／ｍｌ）でインキュベートしてアクチン細胞骨格を脱重合することができる。追加の例として、細胞は、送達に先立って２時間、１０μＭのコルヒチン（Ｓｉｇｍａ）でインキュベートして微小管ネットワークを脱重合することができる。
【００８７】
細胞懸濁液の粘度も本明細書に開示される方法に影響を与え得る。一部の実施形態では、細胞懸濁液の粘度は、約８．９×１０−４Ｐａ・秒から約４．０×１０−３Ｐａ・秒またはそれらの間の任意の値もしくは範囲の値に及ぶ。一部の実施形態では、粘度は約８．９×１０−４Ｐａ・秒から約４．０×１０−３Ｐａ・秒、約８．９×１０−４Ｐａ・秒から約３．０×１０−３Ｐａ・秒、約８．９×１０−４Ｐａ・秒から約２．０×１０−３Ｐａ・秒、または約８．９×１０−３Ｐａ・秒から約１．０×１０−３Ｐａ・秒のうちのいずれか１つの間の範囲である。一部の実施形態では、粘度は約０．８９ｃＰから約４．０ｃＰ、約０．８９ｃＰから約３．０ｃＰ、約０．８９ｃＰから約２．０ｃＰ、または約０．８９ｃＰから約１．０ｃＰのうちのいずれか１つの間の範囲である。一部の実施形態では、細胞懸濁液の粘度が剪断歪みの条件下で減少する剪断減粘効果が観察される。粘度はガラス毛細管粘度計またはレオメータなどの粘度計を含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知のいかなる方法でも測定することができる。粘度計は１つの流れ条件下で粘度を測定し、レオメータは流れ条件により変動する粘度を測定するのに使用される。一部の実施形態では、粘度は血液などの剪断減粘溶液について測定される。一部の実施形態では、粘度は約０℃から約４５℃の間で測定される。例えば、粘度は室温（例えば、約２０℃）、生理的温度（例えば、約３７℃）、生理的温度よりも高い（例えば、約３７℃よりも高く４５℃またはそれよりも高い）、低下した温度（例えば、約０℃から約４℃まで）、またはこれらの例となる温度の間の温度で測定される。
【００８８】
Ｖ．送達する化合物
ある特定の態様では、本開示は化合物を細胞内に送達するための方法に関する。一部の実施形態では、化合物は単一化合物である。一部の実施形態では、化合物は化合物の混合物である。一部の実施形態では、化合物は核酸を含む。一部の実施形態では、化合物は核酸である。例となる核酸は、組換え核酸、ＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、自己増殖ｍＲＮＡ、およびペプチド核酸を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、核酸は細胞内の核酸に相同である。一部の実施形態では、核酸は細胞内の核酸とは異種である。一部の実施形態では、核酸はトランスポゾン、および、任意選択でトランスポザーゼをコードする配列を含む。一部の実施形態では、化合物はプラスミドである。一部の実施形態では、核酸は治療核酸である。一部の実施形態では、核酸は治療ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、核酸はレポーターまたは選択可能マーカーをコードする。例となるレポーターマーカーは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、エクオリン（auquorin）、ベータガラクトシダーゼ、ウロポルフィリノーゲン（ｕｒｏｇｅｎ）ＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（ＵＭＴ）、およびルシフェラーゼを含むが、これらに限定されない。例となる選択可能マーカーは、ブラストサイジン、Ｇ４１８／ジェネテシン、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン、ゼオシン、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびチミジンキナーゼを含むが、これらに限定されない。
【００８９】
一部の実施形態では、化合物はタンパク質−核酸複合体を含む。一部の実施形態では、化合物はタンパク質−核酸複合体である。一部の実施形態では、クラスター化され規則的に間隔を置いた短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ；ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓ９などのタンパク質−核酸複合体はゲノム編集応用において使用される。これらの複合体は配列特異的ＤＮＡ結合ドメインを非特異的ＤＮＡ切断ヌクレアーゼと組み合わせて含有している。これらの複合体は、特定の遺伝子の配列の付加、破壊、または交換を含む標的にされたゲノム編集を可能にする。一部の実施形態では、機能しないＣＲＩＳＰＲを使用して標的遺伝子の転写を遮断するまたは誘導する。一部の実施形態では、化合物はＣａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含有する。一部の実施形態では、化合物はＣａｓ９タンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む。一部の実施形態では、化合物はトランスポザーゼタンパク質およびトランスポゾンを含む核酸を含む。
【００９０】
一部の実施形態では、化合物はタンパク質またはポリペプチドを含む。一部の実施形態では、化合物はタンパク質またはポリペプチドである。一部の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは治療タンパク質、抗体、融合タンパク質、抗原、合成タンパク質、レポーターマーカー、または選択可能マーカーである。一部の実施形態では、タンパク質は遺伝子編集タンパク質またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ＣＲＥリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｒリコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはトランスポザーゼなどのヌクレアーゼである。一部の実施形態では、融合タンパク質は、抗体薬物コンジュゲートなどのキメラタンパク質薬物またはＧＳＴもしくはストレプトアビジンでタグ付けされたタンパク質などの組換え融合タンパク質を含むことができるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、化合物は転写因子である。例となる転写因子は、Ｏｃｔ５、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ−４、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＦｏｘＰ３、およびＲＯＲγｔを含むが、これらに限定されない。
【００９１】
一部の実施形態では、化合物は抗原を含む。一部の実施形態では、化合物は抗原である。抗原は、細胞または抗体媒介免疫応答などの特定の免疫応答を刺激する物質である。抗原は、特定の抗原に特異的であるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などの免疫細胞が発現する受容体に結合する。それに続いて、抗原−受容体結合は細胞内シグナル伝達経路を誘発し、細胞活性化、サイトカイン産生、細胞遊走、細胞毒性因子分泌、および抗体産生などの下流免疫エフェクター経路をもたらす。一部の実施形態では、抗原は細菌、真菌、ウイルス、またはアレルゲンなどの外来源に由来する。一部の実施形態では、抗原はがん細胞または自己タンパク質（すなわち、自己抗原）などの内部源に由来する。自己抗原は生物自身の細胞上に存在する抗原である。自己抗原は、通常、免疫応答を刺激しないが、Ｉ型糖尿病または関節リウマチなどの自己免疫疾患という状況では免疫応答を刺激することがある。一部の実施形態では、抗原は新抗原である。新抗原は、正常なヒトゲノムにはないが、新規のタンパク質配列を形成する腫瘍特異的ＤＮＡ改変の結果として発がん性細胞内で作り出される抗原である。
【００９２】
一部の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドはレポーターまたは選択可能マーカーである。例となるレポーターマーカーは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、エクオリン、ベータガラクトシダーゼ、ウロポルフィリノーゲン（ｕｒｏｇｅｎ）ＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（ＵＭＴ）、およびルシフェラーゼを含むが、これらに限定されない。例となる選択可能マーカーは、ブラストサイジン、Ｇ４１８／ジェネテシン、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン、ゼオシン、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびチミジンキナーゼを含むが、これらに限定されない。
【００９３】
一部の実施形態では、化合物は抗体を含む。一部の実施形態では、化合物は抗体である。一部の実施形態では、抗体は完全長抗体または抗体断片である。本開示で使用するための抗体は、ヒトまたはヒト化抗体、抗体変異体、標識された抗体、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２断片などの抗体断片、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、多特異的抗体、抗体融合タンパク質、およびイムノアドヘシンを含むが、これらに限定されない。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭを含む当技術分野で公知のアイソタイプでもよい。
【００９４】
一部の実施形態では、化合物は小分子を含む。一部の実施形態では、化合物は小分子である。例となる小分子は、蛍光カーカー、色素、医薬品、代謝物、アジュバント、または放射性ヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、医薬品は治療薬物および／または細胞傷害性薬物である。一部の実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧ、オリゴデオキシヌクレオチド、Ｒ８４８、リポ多糖（ＬＰＳ）、ｒｈＩＬ−２、抗ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−１２、環状ジヌクレオチドおよびインターフェロン遺伝子刺激因子（stimulator  of  interferon  genes；ＳＴＩＮＧ）アゴニストを含むが、これらに限定されない。
【００９５】
一部の実施形態では、化合物はナノ粒子を含む。ナノ粒子の例は、金ナノ粒子、量子ドット、カーボンナノチューブ、ナノシェル、デンドリマー、およびリポソームを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は治療分子を含有する。一部の実施形態では、ナノ粒子はｍＲＮＡなどの核酸を含有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は蛍光または放射性標識などの標識を含有する。
【００９６】
一部の実施形態では、化合物はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。一部の実施形態では、化合物はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。一部の実施形態では、ＣＡＲは細胞外認識ドメイン（例えば、抗原結合ドメイン）、膜貫通ドメイン、および１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインの融合物である。抗原結合すると、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達部分は、サイトカインまたは細胞溶解分子の放出などの免疫細胞での活性化関連応答を開始することができる。一部の実施形態では、ＣＡＲはキメラＴ細胞抗原受容体である。一部の実施形態では、ＣＡＲは腫瘍抗原に特異的な抗原結合ドメインを含有する。一部の実施形態では、ＣＡＲ抗原結合ドメインは一本鎖抗体可変断片（ｓｃＦｖ）である。
【００９７】
一部の実施形態では、化合物は蛍光によりタグ付けされた分子を含む。一部の実施形態では、化合物はパシフィックブルー、Ａｌｅｘａ２８８、Ｃｙ５、またはカスケードブルーなどの蛍光色素でタグ付けされた分子などの蛍光によりタグ付けされた分子である。一部の実施形態では、化合物は放射性ヌクレオチド、デキストラン粒子、磁気ビーズ、または不透過性色素である。一部の実施形態では、化合物はＰａｃＢｌｕｅで標識された３ｋＤａのデキストラン粒子である。一部の実施形態では、化合物はＡｌｅｘａ４８８で標識された１０ｋＤａのデキストラン粒子である。一部の実施形態では、化合物は小分子フルオロフォアタグ付きタンパク質である。一部の実施形態では、化合物はＡｌｅｘａ６４７でタグ付けされた小分子である。
【００９８】
一部の実施形態では、化合物はウイルスまたはウイルス様粒子を含む。一部の実施形態では、化合物はウイルスまたはウイルス様粒子である。一部の実施形態では、ウイルスはレトロウイルスである。一部の実施形態では、ウイルスは治療ウイルスである。一部の実施形態では、ウイルスは腫瘍溶解性ウイルスである。一部の実施形態では、ウイルスまたはウイルス様粒子は、治療ポリペプチドなどの治療分子をコードする核酸を含有する。
【００９９】
一部の実施形態では、送達される化合物は精製される。一部の実施形態では、化合物は少なくとも約６０重量％（乾燥重量）の目的化合物である。一部の実施形態では、精製された化合物は少なくとも約７５％、９０％、または９９％目的の化合物である。一部の実施形態では、精製された化合物は少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９８％、９９％、または１００％（ｗ／ｗ）目的の化合物である。純度は、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ分析、ＮＭＲ、質量分析、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥを含むが、これらに限定されない、いかなる公知の方法でも決定される。精製されたＤＮＡまたはＲＮＡは外来性核酸、炭水化物、および脂質のないＤＮＡまたはＲＮＡとして定義される。
【０１００】
ＶＩ．細胞摂動
ある特定の態様では、本開示は、細孔を含有する表面を通って細胞懸濁液を通過させて、細孔により細胞を変形させて細胞の摂動を生じさせることに関する。変形は、例えば、機械的歪みおよび／または剪断力によって誘導される圧が引き起こすことができる。細胞の摂動は、細胞外からの物質が細胞内に移動することを可能にする細胞の破れ目である（例えば、穴、断裂、空洞、開口部、細孔、切断、ギャップ、穿孔）。一部の実施形態では、摂動は細胞膜の中の摂動である。一部の実施形態では、摂動は一過性である。一部の実施形態では、細胞摂動は、約１．０×１０−９秒から約２時間、またはその間の任意の時間もしくは時間の範囲の間持続する。一部の実施形態では、細胞摂動は、約１．０×１０−９秒間から約１秒間、約１秒間から約１分間、または約１分間から約１時間持続する。一部の実施形態では、細胞摂動は、約１．０×１０−９から約１．０×１０−１、約１．０×１０−９から約１．０×１０−２、約１．０×１０−９から約１．０×１０−３、約１．０×１０−９から約１．０×１０−４、約１．０×１０−９から約１．０×１０−５、約１．０×１０−９から約１．０×１０−６、約１．０×１０−９から約１．０×１０−７、または約１．０×１０−９から約１．０×１０−８秒のうちのいずれか１つの間にわたって持続する。一部の実施形態では、細胞摂動は、約１．０×１０−８から約１．０×１０−１、約１．０×１０−７から約１．０×１０−１、約１．０×１０−６から約１．０×１０−１、約１．０×１０−５から約１．０×１０−１、約１．０×１０−４から約１．０×１０−１、約１．０×１０−３から約１．０×１０−１、または約１．０×１０−２から約１．０×１０−１秒のうちのいずれか１つにわたって持続する。本明細書に記載される方法によって生じる細胞摂動（例えば、細孔または穴）は、多量体の多孔構造、例えば補体または細菌性溶血素によって生じるものを形成するタンパク質サブユニットの集合の結果として形成されない。
【０１０１】
細胞が表面の細孔を通過するにしたがい、変形は、摂動による物質の受動拡散を引き起こす損傷を細胞膜に一時的に付与する。一部の実施形態では、細胞シグナル伝達機構を通してアポトーシス経路を活性化する可能性を最小にするために、細胞はおよそ１００μ秒の短時間だけ変形されるが、他の持続時間も可能である（例えば、ナノ秒から数時間の範囲内）。一部の実施形態では、細胞は、約１．０×１０−９秒から約２時間、またはその間の任意の時間もしくは時間の範囲の間変形される。一部の実施形態では、細胞は、約１．０×１０−９秒から約１秒、約１秒から約１分、または約１分から約１時間の間変形される。一部の実施形態では、細胞は、約１．０×１０−９から約１．０×１０−１、約１．０×１０−９から約１．０×１０−２、約１．０×１０−９から約１．０×１０−３、約１．０×１０−９から約１．０×１０−４、約１．０×１０−９から約１．０×１０−５、約１．０×１０−９から約１．０×１０−６、約１．０×１０−９から約１．０×１０−７、または約１．０×１０−９から約１．０×１０−８秒のいずれか一つの間変形される。一部の実施形態では、細胞は、約１．０×１０−８から約１．０×１０−１、約１．０×１０−７から約１．０×１０−１、約１．０×１０−６から約１．０×１０−１、約１．０×１０−５から約１．０×１０−１、約１．０×１０−４から約１．０×１０−１、約１．０×１０−３から約１．０×１０−１、または約１．０×１０−２から約１．０×１０−１秒のいずれか一つの間変形される。一部の実施形態では、細胞を変形させることは、限定されずに約１μ秒から約７５０ミリ秒の範囲内の時間、例えば、少なくとも約１μ秒、１０μ秒、５０μ秒、１００μ秒、５００μ秒または７５０μ秒の間、細胞を変形させることを含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、細胞内への化合物の通過は、細孔および／または細胞の摂動を通しての細胞の通過と同時に起こる。一部の実施形態では、細胞内への化合物の通過は、細胞が細孔を通過してから起こる。一部の実施形態では、細胞内への化合物の通過は、細胞が表面の細孔を通過してからおよそ数分後に起こる。一部の実施形態では、細胞内への化合物の通過は、細胞が細孔を通過してから約１．０×１０−２秒から約３０分後に起こる。例えば、細胞内への化合物の通過は、細胞が細孔を通過してから約１．０×１０−２秒から約１秒、約１秒から約１分または約１分から約３０分後に起こる。一部の実施形態では、細胞内への化合物の通過は、細胞が細孔を通過してから約１．０×１０−２秒から約１０分、約１．０×１０−２秒から約５分、約１．０×１０−２秒から約１分、約１．０×１０−２秒から約５０秒、約１．０×１０−２秒から約１０秒、約１．０×１０−２秒から約１秒、または約１．０×１０−２秒から約０．１秒後に起こる。一部の実施形態では、細胞内への化合物の通過は、細胞が細孔を通過してから約１．０×１０−１秒から約１０分、約１秒から約１０分、約１０秒から約１０分、約５０秒から約１０分、約１分から約１０分、または約５分から約１０分後に起こる。一部の実施形態では、それが細孔を通過した後の細胞の摂動は、細胞が細孔を通過してからおよそ約５分後以内に修正される。
【０１０３】
一部の実施形態では、表面の細孔を通過した後の細胞生存度は、約１０から約１００％である。一部の実施形態では、細孔を通過した後の細胞生存度は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％である。一部の実施形態では、細胞生存度は、細胞が細孔を通過してから約１．０×１０−２秒から約１０日後に測定される。例えば、細胞生存度は、細胞が細孔を通過してから約１．０×１０−２秒から約１秒、約１秒から約１分、約１分から約３０分、または約３０分から約２時間後に測定される。一部の実施形態では、細胞生存度は、細胞が細孔を通過してから約１．０×１０−２秒から約２時間、約１．０×１０−２秒から約１時間、約１．０×１０−２秒から約３０分、約１．０×１０−２秒から約１分、約１．０×１０−２秒から約３０秒、約１．０×１０−２秒から約１秒、または約１．０×１０−２秒から約０．１秒後に測定される。一部の実施形態では、細胞生存度は、細胞が細孔を通過してから約１．５時間から約２時間、約１時間から約２時間、約３０分から約２時間、約１５分から約２時間、約１分から約２時間、約３０秒から約２時間、または約１秒から約２時間後に測定される。一部の実施形態では、細胞生存度は、細胞が細孔を通過してから約２時間から約５時間、約５時間から約１２時間、約１２時間から約２４時間または約２４時間から約１０日後に測定される。
【０１０４】
ＶＩＩ．送達パラメータ
ある特定の態様では、本開示は、細胞内に化合物を送達するための方法であって、細孔を含有する表面を通って細胞懸濁液を通過させるステップであって、細孔が細胞を変形させ、細胞の摂動を生じさせる、ステップ、および細胞懸濁液を化合物と接触させるステップを含む方法に関する。細胞懸濁液は、細孔を通過する前、並行してまたは後に、化合物と接触させることができる。細胞は、送達する化合物を含む溶液に懸濁される細孔を通過できるが、化合物は細胞が細孔を通過してから細胞懸濁液に加えることができる。一部の実施形態では、送達される化合物は、表面にコーティングされる。
【０１０５】
いくつかのパラメータが、細胞内への化合物の送達に影響することができる。例えば、細孔の寸法、細孔の入口角度、細孔の表面特性（例えば、粗さ、化学的改変、親水性、疎水性など）、操作流速（例えば、細孔への細胞移行時間）、細胞濃度、細胞懸濁液中の化合物の濃度、および細孔を通過した後に細胞が回復するかまたはインキュベートする時間が、細胞内へ送達された化合物の通過に影響することができる。細胞内への化合物の送達に影響するさらなるパラメータには、細孔における細胞の速度、細孔における剪断速度、流速と直角をなす速度成分、および細孔内での時間を含めることができる。そのようなパラメータは、化合物の送達を制御するように設計することができる。一部の実施形態では、細胞濃度は、細胞約１０から約１０１２個／ｍｌの範囲内、またはその間の任意の濃度もしくは濃度の範囲である。例えば、細胞濃度は、細胞約１０から約１０１０個／ｍｌ、細胞約１０から約１０８個／ｍｌ、細胞約１０から約１０６個／ｍｌ、細胞約１０から約１０４個／ｍｌまたは細胞約１０から約１０２個／ｍｌの範囲内である。一部の実施形態では、細胞濃度は、細胞約１０２から約１０１２個／ｍｌ、細胞約１０４から約１０１２個／ｍｌ、細胞約１０６から約１０１２個／ｍｌ、細胞約１０８から約１０１２個／ｍｌまたは細胞約１０１０から約１０１２個／ｍｌの範囲内である。送達化合物濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍＬの範囲内、またはその間の任意の濃度もしくは濃度の範囲であってよい。例えば、化合物濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌから約５００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌから約２５０ｍｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌから約５００μｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌから約２５０μｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌから約１μｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌから約２５０ｎｇ／ｍｌ、または約１０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌの範囲であってよい。一部の実施形態では、化合物濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌ、約２５０μｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌ、約２５０ｍｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌ、約５００ｍｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌ、または約７５０ｍｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌの範囲であってよい。送達化合物濃度は、約１ｐＭから約２Ｍの範囲であってよい。例えば、化合物濃度は、約１ｐＭから約１Ｍ、約１ｐＭから約５００ｍＭ、約１ｐＭから約２５０ｍＭ、約１ｐＭから約１ｍＭ、約１ｐＭから約５００μＭ、約１ｐＭから約２５０μＭ、約１ｐＭから約１μＭ、約１ｐＭから約５００ｎＭ、約１ｐＭから約２５０ｎＭ、約１ｐＭから約１００ｎＭ、約１ｐＭから約１０ｎＭ、約１ｐＭから約５ｎＭ、約１ｐＭから約１ｎＭ、約１ｐＭから約７５０ｐＭ、約１ｐＭから約５００ｐＭ、約１ｐＭから約２５０ｐＭ、約１ｐＭから約１００ｐＭ、約１ｐＭから約５０ｐＭ、約１ｐＭから約２５ｐＭ、または約１ｐＭから約１０ｐＭの範囲であってよい。一部の実施形態では、化合物濃度は、約５ｐＭから約２Ｍ、約１０ｐＭから約２Ｍ、約２５ｐＭから約２Ｍ、約５０ｐＭから約２Ｍ、約１００ｐＭから約２Ｍ、約２５０ｐＭから約２Ｍ、約５００ｐＭから約２Ｍ、約７５０ｐＭから約２Ｍ、約１ｎＭから約２Ｍ、約１０ｎＭから約２Ｍ、約１００ｎＭから約２Ｍ、約５００ｎＭから約２Ｍ、約１μＭから約２Ｍ、約５００μＭから約２Ｍ、約１ｍＭから約２Ｍ、または約５００ｍＭから約２Ｍの範囲であってよい。
【０１０６】
本開示の方法で使用される温度は、化合物の送達および細胞生存度に影響するように調整することができる。一部の実施形態では、本方法は、約−５℃から約４５℃の間で実行される。例えば、本方法は、室温（例えば、約２０℃）、生理的温度（例えば、約３７℃）、生理的温度より高い温度（例えば、約３７℃より高く４５℃まで、またはそれより高い）または低い温度（例えば、約−５℃から約４℃）、またはこれらの例示的な温度の間の温度で実行することができる。
【０１０７】
細孔を通して細胞を推進するために、様々な方法を利用することができる。例えば、入口側でポンプ（例えば、ガスシリンダーまたは圧縮器）によって圧を加えることができ、出口側で減圧を減圧ポンプで作用させることができ、チューブを通して毛管作用を加えることができ、および／またはシステムに重力を供給することができる。置換をベースとしたフローシステムを使用することもできる（例えば、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、手動によるシリンジまたはピペット、ピストンなど）。一部の実施形態では、陽圧または陰圧によって細胞を細孔に通過させる。一部の実施形態では、定圧または可変圧によって細胞を細孔に通過させる。一部の実施形態では、圧は、シリンジを使用して加えられる。一部の実施形態では、圧は、ポンプを使用して加えられる。一部の実施形態では、ポンプは、蠕動ポンプである。一部の実施形態では、圧は、減圧を使用して加えられる。一部の実施形態では、毛管圧によって細胞を細孔に通過させる。一部の実施形態では、血圧によって細胞を細孔に通過させる。一部の実施形態では、ｇ力によって細胞を細孔に通過させる。一部の実施形態では、約０．０５ｐｓｉから約５００ｐｓｉの範囲内、またはその間の任意の圧もしくは圧の範囲の圧力差の下で細胞を細孔に通過させる。一部の実施形態では、約０．０５ｐｓｉから約５００ｐｓｉ、約０．０５ｐｓｉから約４００ｐｓｉ、約０．０５ｐｓｉから約３００ｐｓｉ、約０．０５ｐｓｉから約２００ｐｓｉ、約０．０５ｐｓｉから約１００ｐｓｉ、約０．０５ｐｓｉから約５０ｐｓｉ、約０．０５ｐｓｉから約２５ｐｓｉ、約０．０５ｐｓｉから約１０ｐｓｉ、約０．０５ｐｓｉから約５ｐｓｉ、または約０．０５ｐｓｉから約１ｐｓｉの間の範囲の圧力差の下で細胞を細孔に通過させる。一部の実施形態では、少なくとも約５ｐｓｉ、少なくとも約１０ｐｓｉ、もしくは少なくとも約２０ｐｓｉ、または約５ｐｓｉ未満、約１０ｐｓｉ未満、もしくは約２０ｐｓｉ未満の圧力差の下で細胞を細孔に通す。一部の実施形態では、少なくとも約２ｐｓｉ、少なくとも約２．５ｐｓｉもしくは少なくとも約３ｐｓｉ、または約２ｐｓｉ未満、約２．５ｐｓｉ未満もしくは約３ｐｓｉ未満の圧力差の下で細胞を細孔に通す。
【０１０８】
一部の実施形態では、液流は、細胞を細孔に通させる。一部の実施形態では、液流は、細胞が細孔を通過する前に乱流である。乱流は、所与の時点での速度が大きさおよび方向において不規則に異なる液流である。一部の実施形態では、細孔を通しての液流は、層流である。層流は、いずれの時点でも流動の方向が一定のままである固体境界付近の流体中の不断の流動を含む。一部の実施形態では、液流は、細胞が細孔を通過した後に乱流である。
【０１０９】
細胞が細孔を通過する速度は、様々であってよい。一部の実施形態では、細胞は、均一な細胞速度で細孔を通過する。一部の実施形態では、細胞は、変動する細胞速度で細孔を通過する。細胞は、少なくとも約０．１ｍｍ／秒から約５ｍ／秒の速度、またはその間の任意の速度もしくは速度の範囲で細孔を通過する。一部の実施形態では、細胞は、約０．１ｍｍ／秒から約５ｍ／秒、約１ｍｍ／秒から約５ｍ／秒、または約１ｍ／秒から約５ｍ／秒の範囲で細孔を通過する。一部の実施形態では、細胞は、約０．１ｍｍ／秒から約４ｍ／秒、約０．１ｍｍ／秒から約３ｍ／秒、約０．１ｍｍ／秒から約２ｍ／秒、約０．１ｍｍ／秒から約１ｍ／秒、約０．１ｍｍ／秒から約７５０ｍｍ／秒、約０．１ｍｍ／秒から約５００ｍｍ／秒、約０．１ｍｍ／秒から約２５０ｍｍ／秒または約０．１ｍｍ／秒から約１ｍｍ／秒の範囲で細孔を通過する。一部の実施形態では、細胞は、約５ｍ／秒より速い速度で細孔を通過することができる。細胞スループットは、細孔当たり細胞約１個／秒未満から細孔当たり細胞約１０２０個／秒より多くの間まで、変動することができる。一部の実施形態では、表面は、１秒または１分当たり細胞およそ数十億個のハイスループット細胞プロセシングを可能にする。
【０１１０】
一部の実施形態では、細胞は、一方向で細孔を通過する。一部の実施形態では、細胞は、１つより多い方向で細孔を通過する。例えば、例えばシリンジを使用して細胞を吸引により細孔を通過させ、次に細孔を通してそれらを放出することによって、細胞は１つの方向で細孔を強制的に通過させることができ、次に別の方向で細孔を強制的に通過させることができる。一部の実施形態では、細胞は、１回より多く細孔を有する表面を通過させる。
【０１１１】
一部の実施形態では、表面は、より大きいモジュールの中に含有される。一部の実施形態では、表面は、プラスチックまたはガラスシリンジなどのシリンジの中に含有される。一部の実施形態では、表面は、プラスチックフィルターホルダーの中に含有される。一部の実施形態では、表面は、ピペットチップの中に含有される。
【０１１２】
ＶＩＩＩ．応用
一部の実施形態では、化合物または化合物の混合物は、細胞に送達されて所望の効果を生じる。一部の実施形態では、従来の刺激方法と比較して改善された活性レベルを有するプロフェッショナル抗原提示細胞、例えば樹状細胞を生産するために、抗原および／または免疫刺激性分子が細胞に送達される。一部の実施形態では、抗原の混合物が細胞に送達される。一部の実施形態では、樹状細胞、Ｔ細胞またはＢ細胞を、細孔を含有する表面を通って通過させ、標的抗原を含む溶液と接触させる。細孔を含有する表面を通過する前、その間および／または後に、細胞を抗原と接触させることができる。一部の実施形態では、標的抗原は、がん細胞抗原またはがん細胞抗原の混合物である。一部の実施形態では、抗原は、感染性疾患の抗原である。一部の実施形態では、抗原は、自己タンパク質抗原である。例えば、送達される抗原は、特定の疾患と関連することが知られている一般的に発現されるタンパク質、または生検から得られる患者特異的抗原であってよい。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法によって生産される抗原提示細胞は、標的抗原に対するＴおよびＢ細胞媒介免疫のレベルの増加に寄与する。したがって、そのような方法は、がんもしくは感染症に応答した免疫系を活性化する手段として、またはワクチン開発において用いられる可能性がある。本対象発明の一実施形態は、患者の血液から単離される樹状細胞、Ｔ細胞またはＢ細胞が、特定の抗原に対してそれらを活性化し、次に患者の血流に再導入するために、本開示の方法によってｅｘ  ｖｉｖｏで処理される系を含む。一部の実施形態では、がん抗原は、Ｂ細胞リンパ腫などの血液がん、またはメラノーマもしくは膵臓がんなどのがんの患者からのものである。一部の実施形態では、がん抗原をＤＣ細胞質に直接的に送達し、それによってＭＨＣ−Ｉ抗原提示経路を活用し、患者で細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を誘導する。これらの活性化Ｔ細胞は、次に標的抗原を発現するあらゆるがん性細胞を探し出して破壊する。一部の実施形態では、本方法は、一般的な病院検査室において最小限に訓練された技術者が実行することができる。一部の実施形態では、患者が操作する処置システムを使用することができる。一部の実施形態では、本方法は、血液が患者から直接的に転送され、細孔を含有する表面を通過して血液細胞への化合物の送達がもたらされ、処置後に患者に注入により直接的に戻される、インライン血液処置システムを使用して実行される。
【０１１３】
本開示の方法は、遺伝子療法への応用に有益である可能性がある。一部の実施形態では、本開示の方法は、遺伝病を直すために、欠陥遺伝子生成物を交換するために、または治療的核酸を提供するために使用される。一部の実施形態では、遺伝子療法は、突然変異した遺伝子を置き換えるために、機能的、治療的遺伝子をコードする核酸を細胞内に送達することを含む。遺伝子は、有益であると認知されている任意の遺伝子である。代表的な例には、例えば、タンパク質または有益なＲＮＡ；ヘルペスチミジンキナーゼなどのウイルスタンパク質、および細胞傷害性療法のための細菌コレラトキシンをコードする、哺乳動物起源の遺伝子が含まれる。一部の実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸が細胞に送達される。幹細胞、初代細胞および免疫細胞などの送達困難な細胞内に核酸を送達することができる。核酸には、小さい核酸または非常に大きい核酸、例えばプラスミドまたは染色体を含めることができる。目的の遺伝子の発現レベルを研究するための遺伝子構築物の既知量の細胞内への定量的送達、および濃度へのその感度を、容易に達成することもできる。一部の実施形態では、より効率的な安定した送達、相同組換えおよび部位特異的突然変異を達成するために、ＤＮＡ組換えを強化する既知量の酵素と一緒にＤＮＡ配列の既知量の送達を使用することができる。
【０１１４】
本明細書に記載される方法およびデバイスは、より効率的で決定的なＲＮＡ研究のために、ＲＮＡの定量的送達のためにも有益である可能性がある。一部の実施形態は、細胞の細胞質への低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達を含む。一部の実施形態では、リポソームを必要とせずにＲＮＡサイレンシングのためにＲＮＡを細胞内に送達することができる。異なる状態の複数の細胞株にわたって標準化された効率的なＲＮＡレベルを達成するために、既知量のダイサー分子と一緒の既知量のＲＮＡ分子を送達することができる。一部の実施形態では、転写後レベルで調節される遺伝子発現の態様を研究するために、ｍＲＮＡを細胞内に送達することができる。一部の実施形態では、細胞におけるＲＮＡの半減期を研究するために、細胞に送達される既知量の標識ＲＮＡを使用することができる。一部の実施形態では、自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）が細胞に送達される。ｓａＲＮＡは、宿主ゲノムに組み込むことなくそれらの配列を細胞質的に複製することによって、目的のタンパク質を発現する。一部の実施形態では、送達されるｓａＲＮＡは、目的の抗原（複数可）をコードする。一部の実施形態では、例えば阻害性、刺激性または抗アポトーシス性のタンパク質の発現を通して細胞機能を継続して改変するために、ｓａＲＮＡ（複数可）が使用される。
【０１１５】
スクリーニング、画像化または診断目的のために、本開示の方法は、細胞を標識するために使用することができる。一部の実施形態では、細胞環境でタンパク質間相互作用を研究するために、既知量のタグ付きタンパク質を送達することができる。免疫染色および蛍光ベースのウェスタンブロッティングのために、生細胞内への標識抗体の送達を達成することができる。細孔を含有する表面を通って細胞を通過させ、検出可能なマーカーを含む溶液と細胞を接触させることによって、細胞を標識する方法が実行される。一部の実施形態では、検出可能なマーカーは、蛍光分子、放射性核種、量子ドット、金ナノ粒子または磁気ビーズを含む。一部の実施形態では、生細胞画像化への応用のために、工学的に操作されたナノ材料が送達される。一部の実施形態では、化合物は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイで使用するための、蛍光標識でタグ付けられた小分子である。薬物発見への応用のためにタンパク相互作用を測定するために、ＦＲＥＴアッセイを使用することができる。
【０１１６】
一部の実施形態では、細胞再プログラミングを誘導して、ｉＰＳＣ、トランスジェニック幹細胞株またはトランスジェニック生物体を生産するために、タンパク質、ｍＲＮＡ、ＤＮＡおよび／または増殖因子を導入することによって標的化細胞分化が達成される。本明細書に記載される方法、例えば、細孔を含有する表面を通しての人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの幹細胞または前駆体細胞の通過は、そのような細胞内に分化因子を送達するために使用することができる。一部の実施形態では、導入された因子の取込みの後、細胞は、導入された因子によって決定付けられる分化経路を進む。
【０１１７】
一部の実施形態では、卵母細胞などの細胞の凍結保存を改善するために、糖が細胞内に送達される。
【０１１８】
ＩＸ．さらなる実施形態
上記の方法のいずれも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実行される。ｉｎ  ｖｉｖｏ応用のために、血管内腔にデバイス、例えば、動脈または静脈中のインラインステントを植え込むことができる。一部の実施形態では、本方法は、患者細胞のｅｘ−ｖｉｖｏ処置および患者への細胞の即時再導入のためのベッドサイドシステムの一部として使用される。
【０１１９】
他の実施形態では、組合せ処置、例えば、本明細書に記載される方法と、その後か、またはその前のエレクトロポレーション（細胞膜に一時的な穴を作り出し、核酸または巨大分子の侵入を可能にするために電流が使用されるタイプの浸透圧性トランスフェクション）が使用される。一部の実施形態では、細胞は、表面に近接した少なくとも１つの電極によって生成される電界を通過する。一部の実施形態では、電極は表面の１つの側に位置する。一部の実施形態では、電極は表面の両側に位置する。一部の実施形態では、電界は、約０．１ｋＶ／ｍから約１００ＭＶ／ｍの間、またはその間の任意の数字もしくは数字の範囲である。一部の実施形態では、電極を作動させるために電気シグナルを送るために、集積回路が使用される。一部の実施形態では、細胞は、約１ナノ秒から約１秒の間のパルス幅の、および約１００ナノ秒から約１０秒の間、またはその間の任意の時間もしくは時間の範囲の期間、電界に曝露させられる。
【０１２０】
様々な前処置および選別後アッセイ技術を利用することもでき、このように、薬物スクリーニングおよび診断法のための連続的ハイスループットアッセイの開発を可能にする。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）モジュールと連続して実行することができる。これは、同じシステムで所望の細胞のリアルタイムの送達および選別を可能にすることができる。例えば、本明細書に開示される方法およびデバイスは、ソーターおよび／またはセンサーモジュール（例えば、光学式、電気式および磁気式）を含むこともできる。一部の実施形態では、それらが表面を通過する前に細胞を分離するために、ストレーナーまたはサイズソーターが表面の上流に置かれる。例えば、本明細書に記載される表面は、血液試料から白血球を分離する白血球泳動デバイスと一列に並ぶことができる。さらなる実施形態では、本明細書に開示される表面は、液体ハンドラーまたはピペットの中に組み込むことができる。一部の実施形態では、表面は、細胞の培養および／または生体分子の製造のためのバイオリアクターフォーマットで実施される。本開示の方法によって改変される細胞は、薬物または他の治療的分子の生体生産で使用することができる。
【０１２１】
一部の実施形態では、表面は、その中を細胞懸濁液が流れるチューブ内に成形される。一部の実施形態では、チューブ内に成形される表面は、その長さに沿って細孔サイズの勾配を含有し、細胞懸濁液が流れるときの異なる細胞型への選択的送達を可能にする、
【０１２２】
本開示の一部の態様は、細孔を含有する表面を通って細胞を通過させることによって生産される、摂動を含む細胞であって、細孔が細胞を変形させ、それによって化合物が細胞に入ることが可能なように摂動が生じる、細胞を含む。一部の実施形態では、細胞は、表面に近接した少なくとも１つの電極によって生成される電界を通過する。
【０１２３】
Ｘ．デバイスおよびキット
本開示の一部の態様は、細孔を含有する表面を含む、細胞内に化合物を送達するデバイスであって、前記細孔は、溶液中に懸濁する細胞が通過できるように構成され、前記細孔は、細胞を変形させ、それによって化合物が細胞に入るように細胞の摂動が生じる、デバイスを含む。デバイスは、細孔を有する表面、細胞懸濁液、細胞摂動、送達パラメータおよび／または応用などを含む、上に開示される方法のために記載される任意の実施形態を含むことができる。一部の実施形態では、電界を生成するために、少なくとも１つの電極が表面に近接している。
【０１２４】
一部の実施形態では、デバイスはＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（商標）または浸透性支持体である。一部の実施形態では、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（商標）は、ハイスループットスクリーニングへの応用で使用することができる。例えば、異なる候補薬物化合物を特定の機能または治療エンドポイントについてスクリーニングするために、マルチウェルＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（商標）フィルターシステムを使用することができる。一部の実施形態では、各ウェルは、異なる試験される化合物を含有する。細胞は、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（商標）フィルター細孔を通過し、それにより細胞摂動が生じ、その後、送達される化合物または化合物の混合物を含有する溶液の側底面に入る。これらの方法は、新規の処置を同定したりまたは疾患の機構を理解したりするために、潜在的治療化合物をスクリーニングするハイスループット方法として利用できる可能性がある。例えば、本開示の方法を通してハイスループットスクリーニングを実行するために、９６ウェルＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（商標）フォーマットを使用することができる。
【０１２５】
一部の実施形態では、デバイスは連続した複数の表面を含有する。複数の表面は、サイズ、形および細孔の寸法および／または数が均一であってもまたは不均一であってもよく、それによって異なる細胞型への様々な化合物の同時送達を可能にする。
【０１２６】
本明細書に開示される方法で使用するためのキットまたは製造品も提供される。一部の実施形態では、キットは、適するパッケージング中の本明細書に記載される組成物（例えば、細孔を含有する表面、細胞懸濁液および／または送達する化合物）を含む。適する包装材料は当技術分野で公知であり、例えば、バイアル（密封バイアルなど）、容器、アンプル、ボトル、ジャー、フレキシブルパッケージング（例えば、密封されたマイラーまたはプラスチックバッグ）などが含まれる。これらの製造品は、さらに滅菌および／または密封することができる。
【０１２７】
本開示は、本明細書に記載される方法の要素を含むキットであって、前記方法を実行するための説明書（複数可）をさらに含むことができる、キットも提供する。本明細書に記載されるキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび本明細書に記載される任意の方法を実行するための説明書を含む添付文書を含む、他の材料をさらに含むことができる。
【０１２８】
ＸＩ．例示的な実施形態
実施形態１。  細孔を含有する表面を通って細胞懸濁液を通過させるステップを含む、化合物を細胞内に送達するための方法であって、前記細孔が、前記細胞を変形させ、それによって前記化合物が前記細胞に入るように前記細胞の摂動が生じ、前記細胞懸濁液が、前記化合物と接触する、方法。
【０１２９】
実施形態２。  前記表面が膜である、実施形態１に記載の方法。
【０１３０】
実施形態３。  前記表面がフィルターである、実施形態１に記載の方法。
【０１３１】
実施形態４。  前記表面が蛇行する経路の表面である、実施形態１から３のいずれか一つに記載の方法。
【０１３２】
実施形態５。  前記表面が、ポリカーボネート、ポリマー、シリコン、ガラス、金属、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、グラファイト、およびセラミックの１つから選択される材料を含む、実施形態１から４のいずれか一つに記載の方法。
【０１３３】
実施形態６。  前記細孔への入口が、前記細孔よりも広いか、前記細孔よりも狭いか、または前記細孔と同じ幅である、実施形態１から５のいずれか一つに記載の方法。
【０１３４】
実施形態７。  前記表面が、エッチング、トラックエッチング、リソグラフィー、レーザーアブレーション、スタンピング、微細孔パンチング、ポリマースポンジ、直接発泡成形、押出成形およびホットエンボス加工の方法から選択される方法を使用して製造される、実施形態１から６のいずれか一つに記載の方法。
【０１３５】
実施形態８。  前記細孔のサイズが、細胞径と相関している、実施形態１から７のいずれか一つに記載の方法。
【０１３６】
実施形態９。  前記細孔の横断面の幅が、前記細胞径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９９％である、実施形態１から８のいずれか一つに記載の方法。
【０１３７】
実施形態１０。  表面の横断面の幅が、約１ｍｍから約１ｍの間の範囲である、実施形態１から９のいずれか一つに記載の方法。
【０１３８】
実施形態１１。  前記細孔の横断面の幅が、約０．０１μｍから約３００μｍの範囲である、実施形態１から１０のいずれか一つに記載の方法。
【０１３９】
実施形態１２。  前記細孔の横断面の幅が、約０．０１から約３５μｍの範囲である、実施形態１から１１のいずれか一つに記載の方法。
【０１４０】
実施形態１３。  前記細孔の横断面の幅が、約０．４μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約８μｍ、約１０μｍ、約１２μｍ、または約１４μｍである、実施形態１から１２のいずれか一つに記載の方法。
【０１４１】
実施形態１４。  前記細孔の横断面の幅が、約２００μｍである、実施形態１から１１のいずれか一つに記載の方法。
【０１４２】
実施形態１５。  前記細孔のサイズが、不均質である、実施形態１から１４のいずれか一つに記載の方法。
【０１４３】
実施形態１６。  不均質な細孔の横断面の幅が、１０から２０％の範囲で変動する、実施形態１から１５のいずれか一つに記載の方法。
【０１４４】
実施形態１７。  前記細孔のサイズが、均質である、実施形態１から１４のいずれか一つに記載の方法。
【０１４５】
実施形態１８。  前記細孔が、同一の入口角および出口角を有する、実施形態１から１７のいずれか一つに記載の方法。
【０１４６】
実施形態１９。  前記細孔が、異なる入口角および出口角を有する、実施形態１から１７のいずれか一つに記載の方法。
【０１４７】
実施形態２０。  前記細孔の横断面の形状が、環状、円形、四角形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形、および八角形の形状から選択される、実施形態１から１９のいずれか一つに記載の方法。
【０１４８】
実施形態２１。  前記細孔の横断面の形状が、円柱形または円錐形から選択される、実施形態１から１９のいずれか一つに記載の方法。
【０１４９】
実施形態２２。  前記細孔の縁が、滑らかである、実施形態１から２１のいずれか一つに記載の方法。
【０１５０】
実施形態２３。  前記細孔の縁が、鋭い、実施形態１から２１のいずれか一つに記載の方法。
【０１５１】
実施形態２４。  前記細孔の通路が、真っ直ぐである、実施形態１から２３のいずれか一つに記載の方法。
【０１５２】
実施形態２５。  前記細孔の通路が、湾曲している、実施形態１から２３のいずれか一つに記載の方法。
【０１５３】
実施形態２６。  前記細孔が、全表面積の約１０から８０％を構成する、実施形態１から２５のいずれか一つに記載の方法。
【０１５４】
実施形態２７。  前記表面が、合計約１．０×１０５から約１．０×１０３０個の細孔を含む、実施形態１から２６のいずれか一つに記載の方法。
【０１５５】
実施形態２８。  前記表面が、表面積１ｍｍ２当たり約１０から約１．０×１０１５個の細孔を含む、実施形態１から２７のいずれか一つに記載の方法。
【０１５６】
実施形態２９。  前記細孔が、平行に分布している、実施形態１から２８のいずれか一つに記載の方法。
【０１５７】
実施形態３０。  複数の表面が、直列に分布している、実施形態１から２９のいずれか一つに記載の方法。
【０１５８】
実施形態３１。  前記細孔の分布が、規則正しい、実施形態１から３０のいずれか一つに記載の方法。
【０１５９】
実施形態３２。  前記細孔の分布が、ランダムである、実施形態１から３０のいずれか一つに記載の方法。
【０１６０】
実施形態３３。  前記表面の厚さが、均一である、実施形態１から３２のいずれか一つに記載の方法。
【０１６１】
実施形態３４。  前記表面の厚さが、均一ではない、実施形態１から３２のいずれか一つに記載の方法。
【０１６２】
実施形態３５。  前記表面が、約０．０１μｍから約５ｍの厚さである、実施形態１から３４のいずれか一つに記載の方法。
【０１６３】
実施形態３６。  前記表面が、約１０μｍの厚さである、実施形態１から３５のいずれか一つに記載の方法。
【０１６４】
実施形態３７。  前記表面が、材料で被覆されている、実施形態１から３６のいずれか一つに記載の方法。
【０１６５】
実施形態３８。  前記材料が、テフロン（登録商標）である、実施形態３７に記載の方法。
【０１６６】
実施形態３９。  前記材料が、細胞に結合する接着性コーティングを含む、実施形態３７に記載の方法。
【０１６７】
実施形態４０。  前記材料が、界面活性剤を含む、実施形態３７に記載の方法。
【０１６８】
実施形態４１。  前記材料が、抗凝固剤を含む、実施形態３７に記載の方法。
【０１６９】
実施形態４２。  前記材料が、ポリペプチドを含む、実施形態３７に記載の方法。
【０１７０】
実施形態４３。  前記材料が、接着分子を含む、実施形態３７に記載の方法。
【０１７１】
実施形態４４。  前記材料が、抗体を含む、実施形態３７に記載の方法。
【０１７２】
実施形態４５。  前記材料が、細胞機能を調節する因子を含む、実施形態３７に記載の方法。
【０１７３】
実施形態４６。  前記材料が、核酸を含む、実施形態３７に記載の方法。
【０１７４】
実施形態４７。  前記材料が、脂質を含む、実施形態３７に記載の方法。
【０１７５】
実施形態４８。  前記材料が、炭水化物を含む、実施形態３７に記載の方法。
【０１７６】
実施形態４９。  前記材料が、複合体を含む、実施形態３７に記載の方法。
【０１７７】
実施形態５０。  前記複合体が、脂質−炭水化物複合体である、実施形態４９に記載の方法。
【０１７８】
実施形態５１。  前記材料が、膜貫通タンパク質を含む、実施形態３７に記載の方法。
【０１７９】
実施形態５２。  前記材料が、前記表面に共有結合している、実施形態３７から５１のいずれか一つに記載の方法。
【０１８０】
実施形態５３。  前記材料が、前記表面に非共有結合している、実施形態３７から５１のいずれか一つに記載の方法。
【０１８１】
実施形態５４。  前記表面が、親水性である、実施形態１から５３のいずれか一つに記載の方法。
【０１８２】
実施形態５５。  前記表面が、疎水性である、実施形態１から５３のいずれか一つに記載の方法。
【０１８３】
実施形態５６。  前記表面が、帯電している、実施形態１から５５のいずれか一つに記載の方法。
【０１８４】
実施形態５７。  前記細胞懸濁液が、哺乳動物細胞を含む、実施形態１から５６のいずれか一つに記載の方法。
【０１８５】
実施形態５８。  前記細胞懸濁液が、混成の細胞集団を含む、実施形態１から５７のいずれか一つに記載の方法。
【０１８６】
実施形態５９。  前記細胞懸濁液が、全血である、実施形態１から５８のいずれか一つに記載の方法。
【０１８７】
実施形態６０。  前記細胞懸濁液が、リンパ液である、実施形態１から５８のいずれか一つに記載の方法。
【０１８８】
実施形態６１。  前記細胞懸濁液が、末梢血単核球を含む、実施形態１から５８のいずれか一つに記載の方法。
【０１８９】
実施形態６２。  前記細胞懸濁液が、精製された細胞集団を含む、実施形態１から５７のいずれか一つに記載の方法。
【０１９０】
実施形態６３。  前記細胞が、免疫細胞、細胞株の細胞、幹細胞、腫瘍細胞、線維芽細胞、皮膚細胞、神経細胞、または赤血球である、実施形態１から５８または６２のいずれか一つに記載の方法。
【０１９１】
実施形態６４。  前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マスト細胞または好中球である、実施形態６３に記載の方法。
【０１９２】
実施形態６５。  前記細胞が、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヤギ、またはウサギ細胞である、実施形態１から６４のいずれか一つに記載の方法。
【０１９３】
実施形態６６。  前記細胞が、ヒト細胞である、実施形態１から６４のいずれか一つに記載の方法。
【０１９４】
実施形態６７。  前記化合物が、核酸を含む、実施形態１から６６のいずれか一つに記載の方法。
【０１９５】
実施形態６８。  前記化合物が、核酸をコードするＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または自己増幅ｍＲＮＡを含む、実施形態１から６７のいずれか一つに記載の方法。
【０１９６】
実施形態６９。  前記化合物が、プラスミドである、実施形態１から６８のいずれか一つに記載の方法。
【０１９７】
実施形態７０。  前記化合物が、ポリペプチド−核酸複合体を含む、実施形態１から６６のいずれか一つに記載の方法。
【０１９８】
実施形態７１。  前記化合物が、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む、実施形態１から６６または７０のいずれか一つに記載の方法。
【０１９９】
実施形態７２。  前記化合物が、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む、実施形態１から６７のいずれか一つに記載の方法。
【０２００】
実施形態７３。  前記化合物が、タンパク質またはペプチドを含む、実施形態１から６６のいずれか一つに記載の方法。
【０２０１】
実施形態７４。  前記化合物が、ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＣＲＥリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｒリコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはトランスポザーゼを含む、実施形態１から６６または７３のいずれか一つに記載の方法。
【０２０２】
実施形態７５。  前記化合物が、抗体である、実施形態１から６６または７３のいずれか一つに記載の方法。
【０２０３】
実施形態７６。  前記化合物が、転写因子である、実施形態１から６６または７３のいずれか一つに記載の方法。
【０２０４】
実施形態７７。  前記化合物が、小分子である、実施形態１から６６のいずれか一つに記載の方法。
【０２０５】
実施形態７８。  前記化合物が、ナノ粒子である、実施形態１から６６のいずれか一つに記載の方法。
【０２０６】
実施形態７９。  前記化合物が、キメラ抗原受容体である、実施形態１から６６のいずれか一つに記載の方法。
【０２０７】
実施形態８０。  前記化合物が、蛍光によりタグ付けされた分子である、実施形態１から７９のいずれか一つに記載の方法。
【０２０８】
実施形態８１。  前記化合物が、リポソームである、実施形態１から６６のいずれか一つに記載の方法。
【０２０９】
実施形態８２。  前記細胞懸濁液が、前記細孔を通って通過する前、それと同時またはその後に、前記化合物と接触する、実施形態１から８１のいずれか一つに記載の方法。
【０２１０】
実施形態８３。  送達される前記化合物が、前記表面に被覆されている、実施形態１から８１のいずれか一つに記載の方法。
【０２１１】
実施形態８４。  ０℃から４５℃の間で実行される、実施形態１から８３のいずれか一つに記載の方法。
【０２１２】
実施形態８５。  前記細胞が、正圧または負圧により前記細孔を通って通過する、実施形態１から８４のいずれか一つに記載の方法。
【０２１３】
実施形態８６。  前記細胞が、定圧または可変圧により前記細孔を通って通過する、実施形態１から８５のいずれか一つに記載の方法。
【０２１４】
実施形態８７。  圧力が、注射器を使用して印加される、実施形態１から８６のいずれか一つに記載の方法。
【０２１５】
実施形態８８。  圧力が、ポンプを使用して印加される、実施形態１から８６のいずれか一つに記載の方法。
【０２１６】
実施形態８９。  圧力が、減圧を使用して印加される、実施形態１から８６のいずれか一つに記載の方法。
【０２１７】
実施形態９０。  前記細胞が、毛細管圧により前記細孔を通って通過する、実施形態１から８６のいずれか一つに記載の方法。
【０２１８】
実施形態９１。  前記細胞が、血圧により前記細孔を通って通過する、実施形態１から８６のいずれか一つに記載の方法。
【０２１９】
実施形態９２。  前記細胞が、ｇ-力により前記細孔を通って通過する、実施形態１から８６のいずれか一つに記載の方法。
【０２２０】
実施形態９３。  前記細胞が、約０．０５ｐｓｉから約５００ｐｓｉの範囲の圧力下で前記細孔を通って通過する、実施形態１から９２のいずれか一つに記載の方法。
【０２２１】
実施形態９４。  前記細胞が、約２ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、実施形態１から９３のいずれか一つに記載の方法。
【０２２２】
実施形態９５。  前記細胞が、約２．５ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、実施形態１から９３のいずれか一つに記載の方法。
【０２２３】
実施形態９６。  前記細胞が、約３ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、実施形態１から９３のいずれか一つに記載の方法。
【０２２４】
実施形態９７。  前記細胞が、約５ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、実施形態１から９３のいずれか一つに記載の方法。
【０２２５】
実施形態９８。  前記細胞が、約１０ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、実施形態１から９３のいずれか一つに記載の方法。
【０２２６】
実施形態９９。  前記細胞が、約２０ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、実施形態１から９３のいずれか一つに記載の方法。
【０２２７】
実施形態１００。  流体の流れにより前記細胞を前記細孔中に通過させる、実施形態１から９９のいずれか一つに記載の方法。
【０２２８】
実施形態１０１。  前記細胞が前記細孔を通って通過する前、前記流体の流れが、乱流である、実施形態１００に記載の方法。
【０２２９】
実施形態１０２。  前記細孔中を通る前記流体の流れが、層流である、実施形態１００に記載の方法。
【０２３０】
実施形態１０３。  前記細胞が前記細孔を通って通過した後、前記流体の流れが、乱流である、実施形態１００に記載の方法。
【０２３１】
実施形態１０４。  前記細胞が、均一な細胞速度で前記細孔を通って通過する、実施形態１から１０３のいずれか一つに記載の方法。
【０２３２】
実施形態１０５。  前記細胞が、変動する細胞速度で前記細孔を通って通過する、実施形態１から１０３のいずれか一つに記載の方法。
【０２３３】
実施形態１０６。  前記細胞が、約０．１ｍｍ／秒から約２０ｍ／秒の範囲の速度で前記細孔を通って通過する、実施形態１から１０５のいずれか一つに記載の方法。
【０２３４】
実施形態１０７。  前記表面が、より大きなモジュール内に含有されている、実施形態１から１０６のいずれか一つに記載の方法。
【０２３５】
実施形態１０８。  前記表面が、注射器内に含有されている、実施形態１から１０７のいずれか一つに記載の方法。
【０２３６】
実施形態１０９。  前記細胞懸濁液が、水溶液を含む、実施形態１から１０８のいずれか一つに記載の方法。
【０２３７】
実施形態１１０。  前記水溶液が、細胞培養培地、ＰＢＳ、塩、糖、増殖因子、動物由来産物、増量材、界面活性剤、潤滑剤、ビタミン、タンパク質、キレート剤、および／またはアクチン重合に影響を与える薬剤を含む、実施形態１０９に記載の方法。
【０２３８】
実施形態１１１。  前記アクチン重合に影響を与える薬剤が、ラトランクリンＡ、サイトカラシン、および／またはコルヒチンである、実施形態１１０に記載の方法。
【０２３９】
実施形態１１２。  前記細胞培養培地が、ＤＭＥＭ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、またはＸ−ＶＩＶＯである、実施形態１１０に記載の方法。
【０２４０】
実施形態１１３。  前記細胞懸濁液の粘度が、約８．９×１０−４Ｐａ・秒から約４．０×１０−３Ｐａ・秒の範囲である、実施形態１から１１２のいずれか一つに記載の方法。
【０２４１】
実施形態１１４。  前記表面に近接する少なくとも１つの電極により発生する電界を通って前記細胞を通過させるステップをさらに含む、実施形態１から１１３のいずれか一つに記載の方法。
【０２４２】
実施形態１１５。  細孔を含有する表面を含む、細胞内に化合物を送達するためのデバイスであって、前記細孔が、溶液に懸濁された細胞が通過できるように構成されており、前記細孔が、前記細胞を変形させ、それによって前記化合物が前記細胞に入るように前記細胞の摂動が生じる、デバイス。
【０２４３】
実施形態１１６。  前記表面が膜である、実施形態１１５に記載のデバイス。
【０２４４】
実施形態１１７。  前記表面がフィルターである、実施形態１１５に記載のデバイス。
【０２４５】
実施形態１１８。  前記表面が蛇行する経路の表面である、実施形態１１５から１１７のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２４６】
実施形態１１９。  前記表面が、ポリカーボネート、ポリマー、シリコン、ガラス、金属、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、グラファイト、およびセラミックの１つから選択される材料を含む、実施形態１１５から１１８のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２４７】
実施形態１２０。  前記細孔への入口が、前記細孔よりも広いか、前記細孔よりも狭いか、または前記細孔と同じ幅である、実施形態１１５から１１９のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２４８】
実施形態１２１。  前記表面が、エッチング、トラックエッチング、リソグラフィー、レーザーアブレーション、スタンピング、微細孔パンチング、ポリマースポンジ、直接発泡成形、押出成形およびホットエンボス加工の方法から選択される方法を使用して製造される、実施形態１１５から１２０のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２４９】
実施形態１２２。  前記細孔のサイズが、細胞径と相関している、実施形態１１５から１２１のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２５０】
実施形態１２３。  前記細孔の横断面の幅が、前記細胞径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９９％である、実施形態１１５から１２２のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２５１】
実施形態１２４。  表面の横断面の幅が、約１ｍｍから約１ｍの間の範囲である、実施形態１１５から１２３のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２５２】
実施形態１２５。  前記細孔の横断面の幅が、約０．０１μｍから約３００μｍの範囲である、実施形態１１５から１２４のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２５３】
実施形態１２６。  前記細孔の横断面の幅が、約０．０１から約３５μｍの範囲である、実施形態１１５から１２５のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２５４】
実施形態１２７。  前記細孔の横断面の幅が、約０．４μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約８μｍ、約１０μｍ、約１２μｍ、または約１４μｍである、実施形態１１５から１２６のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２５５】
実施形態１２８。  前記細孔の横断面の幅が、約２００μｍである、実施形態１１５から１２５のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２５６】
実施形態１２９。  前記細孔のサイズが、不均質である、実施形態１１５から１２８のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２５７】
実施形態１３０。  不均質な細孔の横断面の幅が、１０から２０％の範囲で変動する、実施形態１１５から１２９のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２５８】
実施形態１３１。  前記細孔のサイズが、均質である、実施形態１１５から１２８のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２５９】
実施形態１３２。  前記細孔が、同一の入口角および出口角を有する、実施形態１１５から１３１のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２６０】
実施形態１３３。  前記細孔が、異なる入口角および出口角を有する、実施形態１１５から１３１のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２６１】
実施形態１３４。  前記細孔の横断面の形状が、環状、円形、四角形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形、および八角形の形状から選択される、実施形態１１５から１３３のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２６２】
実施形態１３５。  前記細孔の形状が、円柱形または円錐形から選択される、実施形態１１５から１３３のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２６３】
実施形態１３６。  前記細孔の縁が、滑らかである、実施形態１１５から１３５のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２６４】
実施形態１３７。  前記細孔の縁が、鋭い、実施形態１１５から１３５のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２６５】
実施形態１３８。  前記細孔の通路が、真っ直ぐである、実施形態１１５から１３７のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２６６】
実施形態１３９。  前記細孔の通路が、湾曲している、実施形態１１５から１３７のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２６７】
実施形態１４０。  前記細孔が、全表面積の約１０から８０％を構成する、実施形態１１５から１３９のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２６８】
実施形態１４１。  前記表面が、合計約１．０×１０５から約１．０×１０３０個の細孔を含む、実施形態１１５から１４０のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２６９】
実施形態１４２。  前記表面が、表面積１ｍｍ２当たり約１０から約１．０×１０１５個の細孔を含む、実施形態１１５から１４１のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２７０】
実施形態１４３。  前記細孔が、平行に分布している、実施形態１１５から１４２のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２７１】
実施形態１４４。  複数の表面が、直列に分布している、実施形態１１５から１４３のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２７２】
実施形態１４５。  前記細孔の分布が、規則正しい、実施形態１１５から１４４のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２７３】
実施形態１４６。  前記細孔の分布が、ランダムである、実施形態１１５から１４４のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２７４】
実施形態１４７。  前記表面の厚さが、均一である、実施形態１１５から１４６のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２７５】
実施形態１４８。  前記表面の厚さが、均一ではない、実施形態１１５から１４６のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２７６】
実施形態１４９。  前記表面が、約０．０１μｍから約５ｍの厚さである、実施形態１１５から１４８のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２７７】
実施形態１５０。  前記表面が、約１０μｍの厚さである、実施形態１１５から１４９のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２７８】
実施形態１５１。  前記表面が、材料で被覆されている、実施形態１１５から１５０のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２７９】
実施形態１５２。  前記材料が、テフロン（登録商標）である、実施形態１５１に記載のデバイス。
【０２８０】
実施形態１５３。  前記材料が、細胞に結合する接着性コーティングを含む、実施形態１５１に記載のデバイス。
【０２８１】
実施形態１５４。  前記材料が、界面活性剤を含む、実施形態１５１に記載のデバイス。
【０２８２】
実施形態１５５。  前記材料が、抗凝固剤を含む、実施形態１５１に記載のデバイス。
【０２８３】
実施形態１５６。  前記材料が、ポリペプチドを含む、実施形態１５１に記載のデバイス。
【０２８４】
実施形態１５７。  前記材料が、接着分子を含む、実施形態１５１に記載のデバイス。
【０２８５】
実施形態１５８。  前記材料が、抗体を含む、実施形態１５１に記載のデバイス。
【０２８６】
実施形態１５９。  前記材料が、細胞機能を調節する因子を含む、実施形態１５１に記載のデバイス。
【０２８７】
実施形態１６０。  前記材料が、核酸を含む、実施形態１５１に記載のデバイス。
【０２８８】
実施形態１６１。  前記材料が、脂質を含む、実施形態１５１に記載のデバイス。
【０２８９】
実施形態１６２。  前記材料が、炭水化物を含む、実施形態１５１に記載のデバイス。
【０２９０】
実施形態１６３。  前記材料が、複合体を含む、実施形態１５１に記載のデバイス。
【０２９１】
実施形態１６４。  前記複合体が、脂質−炭水化物複合体である、実施形態１６３に記載のデバイス。
【０２９２】
実施形態１６５。  前記材料が、膜貫通タンパク質を含む、実施形態１５１に記載のデバイス。
【０２９３】
実施形態１６６。  前記材料が、前記表面に共有結合している、実施形態１５１から１６５のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２９４】
実施形態１６７。  前記材料が、前記表面に非共有結合している、実施形態１５１から１６５のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２９５】
実施形態１６８。  前記表面が、親水性である、実施形態１１５から１６７のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２９６】
実施形態１６９。  前記表面が、疎水性である、実施形態１１５から１６７のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２９７】
実施形態１７０。  前記表面が、帯電している、実施形態１１５から１６９のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２９８】
実施形態１７１。  前記細胞懸濁液が、哺乳動物細胞を含む、実施形態１１５から１７０のいずれか一つに記載のデバイス。
【０２９９】
実施形態１７２。  前記細胞懸濁液が、混成の細胞集団を含む、実施形態１１５から１７１のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３００】
実施形態１７３。  前記細胞懸濁液が、全血である、実施形態１１５から１７２のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３０１】
実施形態１７４。  前記細胞懸濁液が、リンパ液である、実施形態１１５から１７２のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３０２】
実施形態１７５。  前記細胞懸濁液が、末梢血単核球を含む、実施形態１１５から１７２のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３０３】
実施形態１７６。  前記細胞懸濁液が、精製された細胞集団を含む、実施形態１１５から１７１のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３０４】
実施形態１７７。  前記細胞が、免疫細胞、細胞株の細胞、幹細胞、腫瘍細胞、線維芽細胞、皮膚細胞、神経細胞、または赤血球である、実施形態１１５から１７２または１７６のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３０５】
実施形態１７８。  前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マスト細胞または好中球である、実施形態１７７に記載のデバイス。
【０３０６】
実施形態１７９。  前記細胞が、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヤギ、またはウサギ細胞である、実施形態１１５から１７８のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３０７】
実施形態１８０。  前記細胞が、ヒト細胞である、実施形態１１５から１７８のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３０８】
実施形態１８１。  前記化合物が、核酸を含む、実施形態１１５から１８０のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３０９】
実施形態１８２。  前記化合物が、核酸をコードするＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または自己増幅ｍＲＮＡを含む、実施形態１１５から１８１のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３１０】
実施形態１８３。  前記化合物が、プラスミドである、実施形態１１５から１８２のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３１１】
実施形態１８４。  前記化合物が、ポリペプチド−核酸複合体を含む、実施形態１１５から１８０のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３１２】
実施形態１８５。  前記化合物が、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む、実施形態１１５から１８０または１８４のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３１３】
実施形態１８６。  前記化合物が、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む、実施形態１１５から１８１のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３１４】
実施形態１８７。  前記化合物が、タンパク質またはペプチドを含む、実施形態１１５から１８０のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３１５】
実施形態１８８。  前記化合物が、ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＣＲＥリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｒリコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはトランスポザーゼを含む、実施形態１１５から１８０または１８７のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３１６】
実施形態１８９。  前記化合物が、抗体である、実施形態１１５から１８０または１８７のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３１７】
実施形態１９０。  前記化合物が、転写因子である、実施形態１１５から１８０または１８７のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３１８】
実施形態１９１。  前記化合物が、小分子である、実施形態１１５から１８０のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３１９】
実施形態１９２。  前記化合物が、ナノ粒子である、実施形態１１５から１８０のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３２０】
実施形態１９３。  前記化合物が、キメラ抗原受容体である、実施形態１１５から１８０のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３２１】
実施形態１９４。  前記化合物が、蛍光によりタグ付けされた分子である、実施形態１１５から１９３のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３２２】
実施形態１９５。  前記化合物が、リポソームである、実施形態１１５から１８０のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３２３】
実施形態１９６。  前記細胞懸濁液が、前記細孔を通って通過する前、それと同時またはその後に、前記化合物と接触する、実施形態１１５から１９５のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３２４】
実施形態１９７。  送達される前記化合物が、前記表面に被覆されている、実施形態１１５から１９５のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３２５】
実施形態１９８。  前記デバイスは、０℃から４５℃の間である、実施形態１１５から１９７のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３２６】
実施形態１９９。  前記細胞が、正圧または負圧により前記細孔を通って通過する、実施形態１１５から１９８のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３２７】
実施形態２００。  前記細胞が、定圧または可変圧により前記細孔を通って通過する、実施形態１１５から１９９のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３２８】
実施形態２０１。  圧力が、注射器を使用して印加される、実施形態１１５から２００のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３２９】
実施形態２０２。  圧力が、ポンプを使用して印加される、実施形態１１５から２００のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３３０】
実施形態２０３。  圧力が、減圧を使用して印加される、実施形態１１５から２００のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３３１】
実施形態２０４。  前記細胞が、毛細管圧により前記細孔を通って通過する、実施形態１１５から２００のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３３２】
実施形態２０５。  前記細胞が、血圧により前記細孔を通って通過する、実施形態１１５から２００のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３３３】
実施形態２０６。  前記細胞が、ｇ−力により前記細孔を通って通過する、実施形態１１５から２００のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３３４】
実施形態２０７。  前記細胞が、約０．０５ｐｓｉから約５００ｐｓｉの範囲の圧力下で前記細孔を通って通過する、実施形態１１５から２０６のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３３５】
実施形態２０８。  前記細胞が、約２ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、実施形態１１５から２０７のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３３６】
実施形態２０９。  前記細胞が、約２．５ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、実施形態１１５から２０７のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３３７】
実施形態２１０。  前記細胞が、約３ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、実施形態１１５から２０７のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３３８】
実施形態２１１。  前記細胞が、約５ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、実施形態１１５から２０７のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３３９】
実施形態２１２。  前記細胞が、約１０ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、実施形態１１５から２０７のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３４０】
実施形態２１３。  前記細胞が、約２０ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、実施形態１１５から２０７のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３４１】
実施形態２１４。  流体の流れにより前記細胞を前記細孔中に通過させる、実施形態１１５から２１３のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３４２】
実施形態２１５。  前記細胞が前記細孔を通って通過する前、前記流体の流れが、乱流である、実施形態２１４に記載のデバイス。
【０３４３】
実施形態２１６。  前記細孔中を通る前記流体の流れが、層流である、実施形態２１４に記載のデバイス。
【０３４４】
実施形態２１７。  前記細胞が前記細孔を通って通過した後、前記流体の流れが、乱流である、実施形態２１４に記載のデバイス。
【０３４５】
実施形態２１８。  前記細胞が、均一な細胞速度で前記細孔を通って通過する、実施形態１１５から２１７のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３４６】
実施形態２１９。  前記細胞が、変動する細胞速度で前記細孔を通って通過する、実施形態１１５から２１７のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３４７】
実施形態２２０。  前記細胞が、約０．１ｍｍ／秒から約２０ｍ／秒の範囲の速度で前記細孔を通って通過する、実施形態１１５から２１９のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３４８】
実施形態２２１。  前記表面が、より大きなモジュール内に含有されている、実施形態１１５から２２０のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３４９】
実施形態２２２。  前記表面が、注射器内に含有されている、実施形態１１５から２２１のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３５０】
実施形態２２３。  前記細胞懸濁液が、水溶液を含む、実施形態１１５から２２２のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３５１】
実施形態２２４。  前記水溶液が、細胞培養培地、ＰＢＳ、塩、糖、増殖因子、動物由来産物、増量材、界面活性剤、潤滑剤、ビタミン、タンパク質、キレート剤、および／またはアクチン重合に影響を与える薬剤を含む、実施形態２２３に記載のデバイス。
【０３５２】
実施形態２２５。  前記アクチン重合に影響を与える薬剤が、ラトランクリンＡ、サイトカラシン、および／またはコルヒチンである、実施形態２２４に記載のデバイス。
【０３５３】
実施形態２２６。  前記細胞培養培地が、ＤＭＥＭ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、またはＸ−ＶＩＶＯである、実施形態２２４に記載のデバイス。
【０３５４】
実施形態２２７。  前記細胞懸濁液の粘度が、約８．９×１０−４Ｐａ・秒から約４．０×１０−３Ｐａ・秒の範囲である、実施形態１１５から２２６のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３５５】
実施形態２２８。  複数の表面を含む、実施形態１１５から２２７のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３５６】
実施形態２２９。  前記表面が、トランスウェルである、実施形態１１５から２２８のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３５７】
実施形態２３０。  少なくとも１つの電極が、前記表面に近接して、電界を発生させる、実施形態１１５から２２９のいずれか一つに記載のデバイス。
【０３５８】
実施形態２３１。  摂動を含む細胞であって、前記細胞が、細孔を含有する表面を通って前記細胞を通過させることにより生成され、前記細孔が、前記細胞を変形させ、それによって化合物が前記細胞に入ることができるように摂動が生じる、細胞。
【０３５９】
実施形態２３２。  前記表面が膜である、実施形態２３１に記載の細胞。
【０３６０】
実施形態２３３。  前記表面がフィルターである、実施形態２３１に記載の細胞。
【０３６１】
実施形態２３４。  前記表面が蛇行する経路の表面である、実施形態２３１から２３３のいずれか一つに記載の細胞。
【０３６２】
実施形態２３５。  前記表面が、ポリカーボネート、ポリマー、シリコン、ガラス、金属、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、グラファイト、およびセラミックの１つから選択される材料を含む、実施形態２３１から２３４のいずれか一つに記載の細胞。
【０３６３】
実施形態２３６。  前記細孔への入口が、前記細孔よりも広いか、前記細孔よりも狭いか、または前記細孔と同じ幅である、実施形態２３１から２３５のいずれか一つに記載の細胞。
【０３６４】
実施形態２３７。  前記表面が、エッチング、トラックエッチング、リソグラフィー、レーザーアブレーション、スタンピング、微細孔パンチング、ポリマースポンジ、直接発泡成形、押出成形およびホットエンボス加工の方法から選択される方法を使用して製造される、実施形態２３１から２３６のいずれか一つに記載の細胞。
【０３６５】
実施形態２３８。  前記細孔の横断面の幅が、細胞径と相関している、実施形態２３１から２３７のいずれか一つに記載の細胞。
【０３６６】
実施形態２３９。  前記細孔の横断面の幅が、前記細胞径の約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９９％である、実施形態２３１から２３８のいずれか一つに記載の細胞。
【０３６７】
実施形態２４０。  表面の横断面の幅が、約１ｍｍから約１ｍの間の範囲である、実施形態２３１から２３９のいずれか一つに記載の細胞。
【０３６８】
実施形態２４１。  前記細孔の横断面の幅が、約０．０１μｍから約３００μｍの範囲である、実施形態２３１から２４０のいずれか一つに記載の細胞。
【０３６９】
実施形態２４２。  前記細孔の横断面の幅が、約０．０１から約３５μｍの範囲である、実施形態２３１から２４１のいずれか一つに記載の細胞。
【０３７０】
実施形態２４３。  前記細孔の横断面の幅が、約０．４μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約８μｍ、約１０μｍ、約１２μｍ、または約１４μｍである、実施形態２３１から２４２のいずれか一つに記載の細胞。
【０３７１】
実施形態２４４。  前記細孔の横断面の幅が、約２００μｍである、実施形態２３１から２４１のいずれか一つに記載の細胞。
【０３７２】
実施形態２４５。  前記細孔のサイズが、不均質である、実施形態２３１から２４４のいずれか一つに記載の細胞。
【０３７３】
実施形態２４６。  不均質な細孔の横断面の幅が、１０から２０％の範囲で変動する、実施形態２３１から２４５のいずれか一つに記載の細胞。
【０３７４】
実施形態２４７。  前記細孔のサイズが、均質である、実施形態２３１から２４４のいずれか一つに記載の細胞。
【０３７５】
実施形態２４８。  前記細孔が、同一の入口角および出口角を有する、実施形態２３１から２４７のいずれか一つに記載の細胞。
【０３７６】
実施形態２４９。  前記細孔が、異なる入口角および出口角を有する、実施形態２３１から２４７のいずれか一つに記載の細胞。
【０３７７】
実施形態２５０。  前記細孔の横断面の形状が、環状、円形、四角形、星形、三角形、多角形、五角形、六角形、七角形、および八角形の形状から選択される、実施形態２３１から２４９のいずれか一つに記載の細胞。
【０３７８】
実施形態２５１。  前記細孔の形状が、円柱形または円錐形から選択される、実施形態２３１から２４９のいずれか一つに記載の細胞。
【０３７９】
実施形態２５２。  前記細孔の縁が、滑らかである、実施形態２３１から２５１のいずれか一つに記載の細胞。
【０３８０】
実施形態２５３。  前記細孔の縁が、鋭い、実施形態２３１から２５１のいずれか一つに記載の細胞。
【０３８１】
実施形態２５４。  前記細孔の通路が、真っ直ぐである、実施形態２３１から２５３のいずれか一つに記載の細胞。
【０３８２】
実施形態２５５。  前記細孔の通路が、湾曲している、実施形態２３１から２５３のいずれか一つに記載の細胞。
【０３８３】
実施形態２５６。  前記細孔が、全表面積の約１０から８０％を構成する、実施形態２３１から２５５のいずれか一つに記載の細胞。
【０３８４】
実施形態２５７。  前記表面が、合計約１．０×１０５から約１．０×１０３０個の細孔を含む、実施形態２３１から２５６のいずれか一つに記載の細胞。
【０３８５】
実施形態２５８。  前記表面が、表面積１ｍｍ２当たり約１０から約１．０×１０１５個の細孔を含む、実施形態２３１から２５７のいずれか一つに記載の細胞。
【０３８６】
実施形態２５９。  前記細孔が、平行に分布している、実施形態２３１から２５８のいずれか一つに記載の細胞。
【０３８７】
実施形態２６０。  複数の表面が、直列に分布している、実施形態２３１から２５９のいずれか一つに記載の細胞。
【０３８８】
実施形態２６１。  前記細孔の分布が、規則正しい、実施形態２３１から２６０のいずれか一つに記載の細胞。
【０３８９】
実施形態２６２。  前記細孔の分布が、ランダムである、実施形態２３１から２６０のいずれか一つに記載の細胞。
【０３９０】
実施形態２６３。  前記表面の厚さが、均一である、実施形態２３１から２６２のいずれか一つに記載の細胞。
【０３９１】
実施形態２６４。  前記表面の厚さが、均一ではない、実施形態２３１から２６２のいずれか一つに記載の細胞。
【０３９２】
実施形態２６５。  前記表面が、約０．０１μｍから約５ｍの厚さである、実施形態２３１から２６４のいずれか一つに記載の細胞。
【０３９３】
実施形態２６６。  前記表面が、約１０μｍの厚さである、実施形態２３１から２６５のいずれか一つに記載の細胞。
【０３９４】
実施形態２６７。  前記表面が、材料で被覆されている、実施形態２３１から２６６のいずれか一つに記載の細胞。
【０３９５】
実施形態２６８。  前記材料が、テフロン（登録商標）である、実施形態２６７に記載の細胞。
【０３９６】
実施形態２６９。  前記材料が、細胞に結合する接着性コーティングを含む、実施形態２６７に記載の細胞。
【０３９７】
実施形態２７０。  前記材料が、界面活性剤を含む、実施形態２６７に記載の細胞。
【０３９８】
実施形態２７１。  前記材料が、抗凝固剤を含む、実施形態２６７に記載の細胞。
【０３９９】
実施形態２７２。  前記材料が、ポリペプチドを含む、実施形態２６７に記載の細胞。
【０４００】
実施形態２７３。  前記材料が、接着分子を含む、実施形態２６７に記載の細胞。
【０４０１】
実施形態２７４。  前記材料が、抗体を含む、実施形態２６７に記載の細胞。
【０４０２】
実施形態２７５。  前記材料が、細胞機能を調節する因子を含む、実施形態２６７に記載の細胞。
【０４０３】
実施形態２７６。  前記材料が、核酸を含む、実施形態２６７に記載の細胞。
【０４０４】
実施形態２７７。  前記材料が、脂質を含む、実施形態２６７に記載の細胞。
【０４０５】
実施形態２７８。  前記材料が、炭水化物を含む、実施形態２６７に記載の細胞。
【０４０６】
実施形態２７９。  前記材料が、複合体を含む、実施形態２６７に記載の細胞。
【０４０７】
実施形態２８０。  前記複合体が、脂質−炭水化物複合体である、実施形態２７９に記載の細胞。
【０４０８】
実施形態２８１。  前記材料が、膜貫通タンパク質を含む、実施形態２６７に記載の細胞。
【０４０９】
実施形態２８２。  前記材料が、前記表面に共有結合している、実施形態２６７から２８１のいずれか一つに記載の細胞。
【０４１０】
実施形態２８３。  前記材料が、前記表面に非共有結合している、実施形態２６７から２８１のいずれか一つに記載の細胞。
【０４１１】
実施形態２８４。  前記表面が、親水性である、実施形態２３１から２８３のいずれか一つに記載の細胞。
【０４１２】
実施形態２８５。  前記表面が、疎水性である、実施形態２３１から２８３のいずれか一つに記載の細胞。
【０４１３】
実施形態２８６。  前記表面が、帯電している、実施形態２３１から２８５のいずれか一つに記載の細胞。
【０４１４】
実施形態２８７。  前記細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態２３１から２８６のいずれか一つに記載の細胞。
【０４１５】
実施形態２８８。  前記細胞が、免疫細胞、細胞株の細胞、幹細胞、腫瘍細胞、線維芽細胞、皮膚細胞、神経細胞、または赤血球である、実施形態２３１から２８７のいずれか一つに記載の細胞。
【０４１６】
実施形態２８９。  前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マスト細胞または好中球である、実施形態２８８に記載の細胞。
【０４１７】
実施形態２９０。  前記細胞が、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、ヤギ、またはウサギ細胞である、実施形態２３１から２８９のいずれか一つに記載の細胞。
【０４１８】
実施形態２９１。  前記細胞が、ヒト細胞である、実施形態２３１から２８９のいずれか一つに記載の細胞。
【０４１９】
実施形態２９２。  前記化合物が、核酸を含む、実施形態２３１から２９１のいずれか一つに記載の細胞。
【０４２０】
実施形態２９３。  前記化合物が、核酸をコードするＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または自己増幅ｍＲＮＡを含む、実施形態２３１から２９２のいずれか一つに記載の細胞。
【０４２１】
実施形態２９４。  前記化合物が、プラスミドである、実施形態２３１から２９３のいずれか一つに記載の細胞。
【０４２２】
実施形態２９５。  前記化合物が、ポリペプチド−核酸複合体を含む、実施形態２３１から２９１のいずれか一つに記載の細胞。
【０４２３】
実施形態２９６。  前記化合物が、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む、実施形態２３１から２９１または２９５のいずれか一つに記載の細胞。
【０４２４】
実施形態２９７。  前記化合物が、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡまたはドナーＤＮＡを含む、実施形態２３１から２９２のいずれか一つに記載の細胞。
【０４２５】
実施形態２９８。  前記化合物が、タンパク質またはペプチドを含む、実施形態２３１から２９１のいずれか一つに記載の細胞。
【０４２６】
実施形態２９９。  前記化合物が、ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＣＲＥリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｒリコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはトランスポザーゼを含む、実施形態２３１から２９１または２９８のいずれか一つに記載の細胞。
【０４２７】
実施形態３００。  前記化合物が、抗体である、実施形態２３１から２９１または２９８のいずれか一つに記載の細胞。
【０４２８】
実施形態３０１。  前記化合物が、転写因子である、実施形態２３１から２９１または２９８のいずれか一つに記載の細胞。
【０４２９】
実施形態３０２。  前記化合物が、小分子である、実施形態２３１から２９１のいずれか一つに記載の細胞。
【０４３０】
実施形態３０３。  前記化合物が、ナノ粒子である、実施形態２３１から２９１のいずれか一つに記載の細胞。
【０４３１】
実施形態３０４。  前記化合物が、キメラ抗原受容体である、実施形態２３１から２９１のいずれか一つに記載の細胞。
【０４３２】
実施形態３０５。  前記化合物が、蛍光によりタグ付けされた分子である、実施形態２３１から３０４のいずれか一つに記載の細胞。
【０４３３】
実施形態３０６。  前記化合物が、リポソームである、実施形態２３１から２９１のいずれか一つに記載の細胞。
【０４３４】
実施形態３０７。  前記細胞が、前記細孔を通って通過する前、それと同時またはその後に、前記化合物と接触する、実施形態２３１から３０６のいずれか一つに記載の細胞。
【０４３５】
実施形態３０８。  送達される前記化合物が、前記表面に被覆されている、実施形態２３１から３０６のいずれか一つに記載の細胞。
【０４３６】
実施形態３０９。  前記細胞が、０℃から４５℃の間で前記細孔を通って通過する、実施形態２３１から３０８のいずれか一つに記載の細胞。
【０４３７】
実施形態３１０。  前記細胞が、正圧または負圧により前記細孔を通って通過する、実施形態２３１から３０９のいずれか一つに記載の細胞。
【０４３８】
実施形態３１１。  前記細胞が、定圧または可変圧により前記細孔を通って通過する、実施形態２３１から３１０のいずれか一つに記載の細胞。
【０４３９】
実施形態３１２。  圧力が、注射器を使用して印加される、実施形態２３１から３１１のいずれか一つに記載の細胞。
【０４４０】
実施形態３１３。  圧力が、ポンプを使用して印加される、実施形態２３１から３１１のいずれか一つに記載の細胞。
【０４４１】
実施形態３１４。  圧力が、減圧を使用して印加される、実施形態２３１から３１１のいずれか一つに記載の細胞。
【０４４２】
実施形態３１５。  前記細胞が、毛細管圧により前記細孔を通って通過する、実施形態２３１から３１１のいずれか一つに記載の細胞。
【０４４３】
実施形態３１６。  前記細胞が、血圧により前記細孔を通って通過する、実施形態２３１から３１１のいずれか一つに記載の細胞。
【０４４４】
実施形態３１７。  前記細胞が、ｇ−力により前記細孔を通って通過する、実施形態２３１から３１１のいずれか一つに記載の細胞。
【０４４５】
実施形態３１８。  前記細胞が、約０．０５ｐｓｉから約５００ｐｓｉの範囲の圧力下で前記細孔を通って通過する、実施形態２３１から３１７のいずれか一つに記載の細胞。
【０４４６】
実施形態３１９。  前記細胞が、約２ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、実施形態２３１から３１８のいずれか一つに記載の細胞。
【０４４７】
実施形態３２０。  前記細胞が、約２．５ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、実施形態２３１から３１８のいずれか一つに記載の細胞。
【０４４８】
実施形態３２１。  前記細胞が、約３ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、実施形態２３１から３１８のいずれか一つに記載の細胞。
【０４４９】
実施形態３２２。  前記細胞が、約５ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、実施形態２３１から３１８のいずれか一つに記載の細胞。
【０４５０】
実施形態３２３。  前記細胞が、約１０ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、実施形態２３１から３１８のいずれか一つに記載の細胞。
【０４５１】
実施形態３２４。  前記細胞が、約２０ｐｓｉの圧力下で前記細孔を通って通過する、実施形態２３１から３１８のいずれか一つに記載の細胞。
【０４５２】
実施形態３２５。  流体の流れにより前記細胞を前記細孔中に通過させる、実施形態２３１から３２４のいずれか一つに記載の細胞。
【０４５３】
実施形態３２６。  前記細胞が前記細孔を通って通過する前、前記流体の流れが、乱流である、実施形態３２５に記載の細胞。
【０４５４】
実施形態３２７。  前記細孔中を通る前記流体の流れが、層流である、実施形態３２５に記載の細胞。
【０４５５】
実施形態３２８。  前記細胞が前記細孔を通って通過した後、前記流体の流れが、乱流である、実施形態３２５に記載の細胞。
【０４５６】
実施形態３２９。  前記細胞が、約０．１ｍｍ／秒から約５ｍ／秒の範囲の速度で前記細孔を通って通過する、実施形態２３１から３２８のいずれか一つに記載の細胞。
【０４５７】
実施形態３３０。  前記表面が、より大きなモジュール内に含有されている、実施形態２３１から３２９のいずれか一つに記載の細胞。
【０４５８】
実施形態３３１。  前記表面が、注射器内に含有されている、実施形態２３１から３３０のいずれか一つに記載の細胞。
【０４５９】
実施形態３３２。  前記細胞が、水溶液を含む細胞懸濁液中にある、実施形態２３１から３３１のいずれか一つに記載の細胞。
【０４６０】
実施形態３３３。  前記水溶液が、細胞培養培地、ＰＢＳ、塩、糖、増殖因子、動物由来産物、増量材、界面活性剤、潤滑剤、ビタミン、タンパク質、キレート剤、および／またはアクチン重合に影響を与える薬剤を含む、実施形態３３２に記載の細胞。
【０４６１】
実施形態３３４。  前記アクチン重合に影響を与える薬剤が、ラトランクリンＡ、サイトカラシン、および／またはコルヒチンである、実施形態３３３に記載の細胞。
【０４６２】
実施形態３３５。  前記細胞培養培地が、ＤＭＥＭ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、またはＸ−ＶＩＶＯである、実施形態３３３に記載の細胞。
【０４６３】
実施形態３３６。  前記細胞が、前記表面に近接する少なくとも１つの電極により発生する電界を通ってさらに通過した、実施形態２３１から３３５のいずれか一つに記載の細胞。
【実施例】
【０４６４】
以下の実施例は本開示の様々な実施形態を図示するために与えられ、決して本開示を限定するものでない。目的を実行し、指摘した結末および利点、ならびに本明細書に内在する目的、結末および利点を得るのに本開示が好適であることを、当業者は容易に理解する。請求項の範囲によって規定される本開示の趣旨の範囲内に包含されるその中の変更および他の使用は、当業者であれば想到されるものである。
【０４６５】
（実施例１）
ＨｅＬａ細胞へのデキストラン粒子の送達
序論
細胞内への分子のフィルター媒介送達を評価するために、規定サイズの細孔を含有するフィルターを通って、蛍光性デキストラン粒子と混合されたＨｅＬａ細胞を通過させ、細胞内粒子送達をＦＡＣＳ分析により評価した。
【０４６６】
材料および方法
ポリカーボネートメンブレンフィルターは、ＳＴＥＲＬＩＴＥＣＨ（商標）（ＰＣＴ８０１３１００）から得られた。比較的均一な細孔サイズであるがランダム分布の細孔を生じさせるために核リアクター内で帯電粒子にカーボネートフィルムを曝露させることによって、これらのポリカーボネートフィルターは生成される。その結果としての細孔の直径は、０．０１０μｍから３５μｍの範囲内であった。フィルター細孔は、概ね１０μｍの厚さであった。ポリカーボネートフィルターおよびフィルター細孔の例示的な画像を、図１ＡおよびＢに示す。本明細書に記載される研究において、８μｍ、１０μｍ、１２μｍおよび１４μｍの細孔サイズを有するフィルターを使用した。フィルター送達実験で使用したさらなる材料を、表１に列挙する。
【表１】
2018531592.tif 000003
【０４６７】
ＨｅＬａ細胞を、細胞４×１０６個／ｍＬでｏｐｔｉＭＥＭ培地に懸濁した。陰性対照としての使用のために、１００μｌの細胞をピペットで吸い出した。メンブレンフィルターを濡らすために、鉗子を使用してポリカーボネートメンブレンフィルターをＰＢＳに懸濁した。プラスチックフィルターホルダーのキャップを取り、輝く側を上にしてフィルターを内部表面の上に置き、フィルターホルダーに再びキャップをした。デキストラン粒子と混合した２００μｌの細胞を、フィルターホルダーに加えた。細胞４×１０６個／ｍＬの５ｍＬの細胞に、デキストランを０．２ｍｇ／ｍＬで懸濁した。定圧送達のために、圧力調整器を備えた窒素ガス送達システムを使用した。２４ウェルプレートまたはＦＡＣＳチューブに、フィルターフロースルーを収集した。ＦＡＣＳ分析の前に、４℃で４分の間、全ての試料を４００ｒｃｆで３回遠心分離、洗浄し、細胞外デキストランを除去した。ＦＡＣＳ分析の準備をするために、以下のステップをとった。最初に、ＦＡＣＳ緩衝液を調製し（ＰＢＳ＋最終濃度：１％ＦＢＳ＋２ｎＭ  ＥＤＴＡ）、使用直前にヨウ化プロピジウムを加えた（１：１００希釈）。チューブ当たり４００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を加え、細胞を再懸濁した。全細胞事象を可視化するようにフローサイトメトリーの前方散乱、側方散乱および蛍光チャネル電圧を調整し、試料当たり１０，０００事象を記録した。デキストラン粒子と混合したがフィルターを通過しなかった細胞は、エンドサイトーシスによる粒子送達のための対照として使用した。これらの細胞は色素と接触したが、フィルターを通過しなかった。全ての他のステップは、エンドサイトーシス対照の場合と同じであった。陰性対照試料は色素と接触しなかったが、実験試料と同じステップにかけられた。
【０４６８】
結果
８μｍ、１０μｍ、１２μｍおよび１４μｍサイズのフィルターの細孔を通るＨｅＬａ細胞へのデキストラン粒子の送達効率。
３ｋＤａ  ＰａｃＢｌｕｅおよび１０ｋＤａ  Ａｌｅｘａ４８８デキストラン粒子と混合したＨｅＬａ細胞を、８μｍ、１０μｍ、１２μｍおよび１４μｍサイズのフィルターの細孔に低圧（５ｐｓｉ、１０ｐｓｉまたは２０ｐｓｉ）で通過させた。送達後の細胞を表す例示的なフローサイトメトリープロットを、図２Ａ〜Ｇに示す。図２Ａ〜Ｃは、５ｐｓｉの下で１４μｍ（図２Ａ）、１２μｍ（図２Ｂ）および１０μｍ（図２Ｃ）サイズのフィルターの細孔を通過した細胞を表す。図２ＥとＧは、１０ｐｓｉ（図２Ｅ）および２０ｐｓｉ（図２Ｇ）の下で１２μｍのフィルターの細孔を通過した細胞を表す。図２ＤとＦは、エンドサイトーシス対照（図２Ｄ）および陰性対照（図２Ｆ）のプロットを表す。フィルター送達後に３ｋＤａおよび１０ｋＤａの両方のデキストラン粒子を含有する細胞は、ＰａｃＢｌｕｅおよびＡｌｅｘａ４８８（Ｑ２象限）のための二重陽性細胞染色によって示される。フィルター送達後の３ｋＤａおよび１０ｋＤａの両方のデキストラン粒子に陽性の細胞の百分率によって示される送達効率を、下の表２に示す。デキストラン粒子の送達効率は細孔サイズおよび圧変動によって予想通り異なり、最も高い送達（８６％）は５ｐｓｉで、８μｍ孔で観察された。
【表２】
2018531592.tif 000004
【０４６９】
細胞生存度は、フィルター送達後に測定した。フィルター送達後の生細胞の百分率によって示される細胞生存度は、下の表３に示す。フィルターを通過した細胞の細胞生存度は加えた圧の増加に伴って減少し、各細孔サイズについて５ｐｓｉが最も高い細胞生存度をもたらした。エンドサイトーシス対照と比較してフィルターを通過した細胞で、細胞生存度は減少した。細胞生存度は、細孔サイズおよび圧変動によって予想通り異なった。
【表３】
2018531592.tif 000005
【０４７０】
（実施例２）
５μｍサイズのフィルターの細孔を通るヒトＴ細胞へのデキストラン粒子の送達
序論
一次免疫細胞内への分子のフィルター媒介送達を評価するために、５μｍサイズのフィルターの細孔に、蛍光性デキストラン粒子と混合された一次ヒトＴ細胞を通し、細胞内粒子送達を、ＦＡＣＳ分析により判定した。手動でのシリンジ加圧または定圧の下での、一次ヒトＴ細胞へのデキストラン粒子のフィルター媒介送達を比較した。
【０４７１】
材料および方法
フィコール分離を通して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を新鮮なヒト血液から先ず単離した。磁気カラムを使用した負の選択によって、Ｔ細胞をＰＢＭＣから次に分離した。Ｔ細胞を、細胞４×１０６個／ｍＬでｏｐｔｉＭＥＭ培地に懸濁した。陰性対照としての使用のために、１００μｌの細胞をピペットで吸い出した。メンブレンフィルターを濡らすために、鉗子を使用してポリカーボネートメンブレンフィルターをＰＢＳに懸濁した。プラスチックフィルターホルダーのキャップを取り、輝く側を上にしてフィルターを内部表面の上に置き、フィルターホルダーに再びキャップをした。デキストラン粒子と混合した２００μｌの細胞を、フィルターホルダーに加えた。細胞４×１０６個／ｍＬの５ｍＬの細胞に、デキストランを０．２ｍｇ／ｍＬで懸濁した。定圧送達のために、圧力調整器を備えた窒素ガス送達システムを使用した。２４ウェルプレートまたはＦＡＣＳチューブに、フィルターフロースルーを収集した。ＦＡＣＳ分析の前に、４℃で４分の間、全ての試料を４００ｒｃｆで３回遠心分離、洗浄し、細胞外デキストランを除去した。ＦＡＣＳ分析の準備をするために、以下のステップをとった。最初に、ＦＡＣＳ緩衝液を調製し（ＰＢＳ＋最終濃度：１％ＦＢＳ＋２ｎＭ  ＥＤＴＡ）、使用直前にヨウ化プロピジウムを加えた（１：１００希釈）。チューブ当たり４００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を加え、細胞を再懸濁した。全細胞事象を可視化するようにフローサイトメトリーの前方散乱、側方散乱および蛍光チャネル電圧を調整し、試料当たり１０，０００事象を記録した。デキストラン粒子と混合したがフィルターを通過しなかった細胞は、エンドサイトーシスによる粒子送達のための対照として使用した。これらの細胞は色素と接触したが、フィルターを通過しなかった。全ての他のステップは、エンドサイトーシス対照の場合と同じであった。陰性対照試料は色素と接触しなかったが、実験試料と同じステップにかけられた。
【０４７２】
結果
３ｋＤａ  ＰａｃＢｌｕｅおよび１０ｋＤａ  Ａｌｅｘａ４８８デキストラン粒子と混合した一次ヒトＴ細胞を、手動でのシリンジ加圧または５ｐｓｉの定圧の下で５μｍサイズのフィルター細孔に通した。ＰａｃＢｌｕｅおよびＡｌｅｘａ４８８（Ｑ２象限）のための二重陽性細胞染色によって示されるように、手動でのシリンジ加圧（図３Ａ）の下で通過した細胞の８．６０％、および５ｐｓｉの定圧（図３Ｂ）の下で通過した細胞の１８．９％は、フィルター送達後に３ｋＤａおよび１０ｋＤａの両方のデキストラン粒子を含有した。手動でのシリンジ加圧（図３Ａ）の下で通過した細胞の８５．４％および５ｐｓｉの定圧（図３Ｂ）の下で通過した細胞の８３．１％は、送達後に生存能力があった。
【０４７３】
（実施例３）
２ｐｓｉおよび３ｐｓｉでのＨｅＬａ細胞へのデキストラン粒子の送達
序論
細胞内への分子のフィルター媒介送達を評価するために、規定サイズの細孔を含有するフィルターを通って、蛍光性デキストラン粒子と混合されたＨｅＬａ細胞を通し、細胞内粒子送達をＦＡＣＳ分析により評価した。
【０４７４】
材料および方法
ポリカーボネートメンブレンフィルターは、ＳＴＥＲＬＩＴＥＣＨ（商標）から得られた。本明細書に記載される研究では、１０μｍの細孔サイズを有するフィルターを使用した。ＨｅＬａ細胞を細胞２．５×１０６個／ｍＬでＯｐｔｉＭＥＭ培地に懸濁し、３ｋＤａデキストラン粒子を０．１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で加えた。メンブレンフィルターおよびプラスチックフィルターホルダーを、実施例１に記載されているように調製した。デキストラン粒子と混合した２００μｌの細胞を、フィルターホルダーに加えた。定圧送達のために、圧力調整器を備えた窒素ガス送達システムを使用した。２４ウェルプレートまたはＦＡＣＳチューブに、フィルターフロースルーを収集した。ＦＡＣＳ分析の前に、４℃で４分の間、全ての試料を４００相対遠心力（ｒｃｆ）で３回遠心分離、洗浄し、細胞外デキストランを除去した。ＦＡＣＳ分析の準備をするために、以下のステップをとった。最初に、ＦＡＣＳ緩衝液を調製し（ＰＢＳ＋最終濃度：１％ＦＢＳ＋２ｎＭ  ＥＤＴＡ）、使用直前にヨウ化プロピジウムを加えた（１：１００希釈）。チューブ当たり４００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を加え、細胞を再懸濁した。全細胞事象を可視化するようにフローサイトメトリーの前方散乱、側方散乱および蛍光チャネル電圧を調整し、試料当たり１０，０００事象を記録した。デキストラン粒子と混合したがフィルターを通過しなかった細胞は、エンドサイトーシスによる粒子送達のための対照として使用した。これらの細胞は色素と接触したが、フィルターを通過しなかった。全ての他のステップは、エンドサイトーシス対照の場合と同じであった。陰性対照試料は色素と接触しなかったが、実験試料と同じステップにかけられた。３つのフィルターを各圧（２ｐｓｉおよび３ｐｓｉ）で使用し、実験ごとに３つの試料が各フィルターを流れた。実験は別個の３日間にわたって繰り返し、各圧で合計２７回実行された。
【０４７５】
結果
２ｐｓｉおよび３ｐｓｉでの１０μｍサイズのフィルターの細孔を通したＨｅＬａ細胞へのデキストラン粒子の送達効率。
３ｋＤａ  ＰａｃＢｌｕｅデキストラン粒子と混合されたＨｅＬａ細胞を、２ｐｓｉおよび３ｐｓｉで１０μｍサイズのフィルター細孔に通した。３ｋＤａデキストラン粒子に陽性の細胞の百分率によって示される送達効率、フィルター送達後の生細胞の百分率によって示される細胞生存度、および、フローサイトメトリーによる相対平均蛍光強度（ｒＭＦＩ）を、下の表４（２ｐｓｉ）および表５（３ｐｓｉ）に示す。送達効率、生存度およびｒＭＦＩ値は再現可能で、実験全体で有意であった。２ｐｓｉでは、細胞生存度および送達効率は約８０％であった。３ｐｓｉでは、細胞生存度は約６０〜７０％であったが、送達効率は約９０％であった。
【表４】
2018531592.tif 000006
【表５】
2018531592.tif 000007
【０４７６】
（実施例４）
市販のまたは特注のシリンジフィルターによって媒介されるＨｅＬａ細胞へのデキストラン粒子の送達
序論
細胞内への分子のフィルター媒介送達を評価するために、市販または特注のシリンジフィルターを通って、蛍光性デキストラン粒子と混合されたＨｅＬａ細胞を通過され、細胞内粒子送達をＦＡＣＳ分析により評価した。
【０４７７】
材料および方法
市販のフィルターおよびホルダー組合せを有する１０μｍの細孔を有するポリカーボネートメンブレンフィルター（ＣＯＴＳフィルター）を、ＳＴＥＲＬＩＴＥＣＨ（商標）から得た。１０μｍの細孔を有する特注のシリンジフィルターも使用した。
【０４７８】
ＨｅＬａ細胞を細胞３×１０６個／ｍＬでＯｐｔｉＭＥＭ培地に懸濁し、３ｋＤａデキストラン粒子を０．１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で加えた。メンブレンフィルターおよびプラスチックフィルターホルダーを、実施例１に記載されているように調製した。デキストラン粒子と混合した２００μｌの細胞を、フィルターホルダーに加えた。定圧送達のために、圧力調整器を備えた窒素ガス送達システムを使用した。２４ウェルプレートまたはＦＡＣＳチューブに、フィルターフロースルーを収集した。ＦＡＣＳ分析の前に、４℃で４分の間、全ての試料を４００ｒｃｆで３回遠心分離、洗浄し、細胞外デキストランを除去した。ＦＡＣＳ分析の準備をするために、以下のステップをとった。最初に、ＦＡＣＳ緩衝液を調製し（ＰＢＳ＋最終濃度：１％ＦＢＳ＋２ｎＭ  ＥＤＴＡ）、使用直前にヨウ化プロピジウムを加えた（１：１００希釈）。チューブ当たり４００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を加え、細胞を再懸濁した。全細胞事象を可視化するようにフローサイトメトリーの前方散乱、側方散乱および蛍光チャネル電圧を調整し、試料当たり１０，０００事象を記録した。デキストラン粒子と混合したがフィルターを通過しなかった細胞は、エンドサイトーシスによる粒子送達のための対照として使用した。これらの細胞は色素と接触したが、フィルターを通過しなかった。全ての他のステップは、エンドサイトーシス対照の場合と同じであった。陰性対照試料は色素と接触しなかったが、実験試料と同じステップにかけられた。１つのフィルターを各圧（２ｐｓｉおよび３ｐｓｉ）で使用し、実験ごとに３つの試料が各フィルターを流れた。実験は別個の２日間にわたって繰り返し、各圧で合計６回実行された。
【０４７９】
結果
市販または特注のフィルターを通したＨｅＬａ細胞へのデキストラン粒子の送達効率
３ｋＤａ  ＰａｃＢｌｕｅデキストラン粒子と混合されたＨｅＬａ細胞を、２ｐｓｉおよび３ｐｓｉで１０μｍサイズのフィルター細孔に通した。ＣＯＴＳフィルターおよび特注のフィルターからの結果を比較した。３ｋＤａデキストラン粒子に陽性の細胞の百分率によって示される送達効率、およびフィルター送達後の生細胞の百分率によって示される細胞生存度を、表４に示す。３ｐｓｉで３回の実行の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を実証する代表的フローサイトメトリーヒストグラムプロットを、図５Ａ（ＣＯＴＳフィルター）および図５Ｂ（特注のシリンジフィルター）に示す。実行全体での平均相対平均蛍光強度（ｒＭＦＩ）値を、図５Ｃに示す。２日目に実行された実験の間のメッシュインサートの除去は、送達効率にも細胞生存度にも影響しなかった。ＣＯＴＳフィルターと比較して特注のフィルターを使用したとき、死容積低減の結果として利点は観察されなかった。全体として、ＣＯＴＳフィルターおよび特注のシリンジフィルターは、同等の細胞生存度および送達効率をもたらした。以降の実験は、ＣＯＴＳフィルターを使用して実行された。
【０４８０】
（実施例５）
ＨｅＬａ細胞へのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡのフィルター媒介送達
序論
分子のフィルター媒介送達後の細胞の機能性を評価するために、蛍光性デキストラン粒子およびＥＧＦＰ  ｍＲＮＡと混合されたＨｅＬａ細胞を１０μｍの細孔サイズを有するＣＯＴＳフィルターに通し、細胞内粒子送達およびｍＲＮＡ発現をＦＡＣＳ分析により評価した。
【０４８１】
材料および方法
市販の既製の（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ−ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ：ＣＯＴＳ）フィルターおよびホルダー組合せを有する１０μｍの細孔サイズを有するポリカーボネートメンブレンフィルターを、ＳＴＥＲＬＩＴＥＣＨ（商標）から得た。ＨｅＬａ細胞を細胞２×１０６個／ｍＬでＯｐｔｉＭＥＭ培地に懸濁し、３ｋＤａデキストラン粒子を０．１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で加え、ＥＧＦＰをコードするｍＲＮＡを０．１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で加えた。メンブレンフィルターおよびプラスチックフィルターホルダーを、実施例１に記載されているように調製した。デキストラン粒子と混合した２００μｌの細胞をフィルターホルダーに加え、２ｐｓｉ、２．５ｐｓｉまたは３ｐｓｉでフィルターを通過させた。定圧送達のために、圧力調整器を備えた窒素ガス送達システムを使用した。２４ウェルプレートまたはＦＡＣＳチューブに、フロースルーを収集した。
【０４８２】
ＦＡＣＳ分析の前に、４℃で４分の間、全ての試料を４００ｒｃｆで３回遠心分離、洗浄し、細胞外デキストランを除去した。ＦＡＣＳ分析の準備をするために、以下のステップをとった。最初に、ＦＡＣＳ緩衝液を調製し（ＰＢＳ＋最終濃度：１％ＦＢＳ＋２ｎＭ  ＥＤＴＡ）、使用直前にヨウ化プロピジウムを加えた（１：１００希釈）。チューブ当たり４００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を加え、細胞を再懸濁した。全細胞事象を可視化するようにフローサイトメトリーの前方散乱、側方散乱および蛍光チャネル電圧を調整し、試料当たり１０，０００事象を記録した。デキストラン粒子またはＥＧＦＰ  ｍＲＮＡと混合したがフィルターを通過しなかった細胞は、エンドサイトーシスによる送達のための対照として使用した。これらの細胞は色素またはＥＧＦＰ  ｍＲＮＡと接触したが、フィルターを通過しなかった。全ての他のステップは、エンドサイトーシス対照の場合と同じであった。陰性対照試料は色素ともＥＧＦＰ  ｍＲＮＡとも接触しなかったが、実験試料と同じステップにかけられた。各圧（２ｐｓｉ、２．５ｐｓｉまたは３ｐｓｉ）で、４つの試料を、フィルターを通して流した。
【０４８３】
結果
３ｋＤａ  ＰａｃＢｌｕｅデキストラン粒子およびＥＧＦＰ  ｍＲＮＡと混合されたＨｅＬａ細胞を、２ｐｓｉ、２．５ｐｓｉまたは３ｐｓｉで１０μｍサイズのフィルター細孔に通した。３ｋＤａデキストラン粒子に陽性の細胞の百分率またはＧＦＰ発現細胞の百分率によって示される送達効率、フィルター送達後の生細胞の百分率によって示される細胞生存度、および、フローサイトメトリーによる相対平均蛍光強度（ｒＭＦＩ）を、下の図６および表６〜８に示す。２．５ｐｓｉおよび３ｐｓｉで同等の送達効率および細胞生存度が観察され、２ｐｓｉと比較してより高い送達が観察された。持続した生存度およびＧＦＰ発現によって示されるように、細胞は、デキストラン粒子およびＥＧＦＰ  ｍＲＮＡの同時送達の２４時間後に機能を保持した。
【表６】
2018531592.tif 000008
【表７】
2018531592.tif 000009
【表８】
2018531592.tif 000010
【０４８４】
（実施例６）
ヒトＲＢＣへのデキストランおよびＩｇＧ抗体の圧縮媒介送達
序論
無核細胞内への分子のフィルター媒介送達を評価するために、規定サイズの細孔を含有するシリンジフィルターを通って、蛍光性デキストラン粒子またはＩｇＧ抗体と混合されたヒトＲＢＣを通過させ、細胞内粒子送達をＦＡＣＳ分析により評価した。
【０４８５】
材料および方法
市販のフィルターとホルダーの組合せを有する２μｍ孔直径を有するポリカーボネートメンブレンフィルター（ＣＯＴＳフィルター）を、ＳＴＥＲＬＩＴＥＣＨ（商標）から得た。Ｆｉｃｏｌｌ勾配分離法を使用して、全血または白血球低減カラーからヒトＲＢＣを分離し、Ｏｐｔｉｍｅｍに所望の濃度（５０〜５００Ｍ／ｍＬ）で再懸濁させた。メンブレンフィルターを濡らすために、鉗子を使用してポリカーボネートメンブレンフィルターをＯｐｔｉｍｅｍに懸濁した。プラスチックフィルターホルダーのキャップを取り、輝く側を上にしてフィルターを内部表面の上に置き、フィルターホルダーに再びキャップをした。デキストラン粒子およびＩｇＧ抗体を、０．１ｍｇ／ｍＬで懸濁した。デキストラン粒子またはＩｇＧ抗体と混合した１ｍＬの細胞を、室温でフィルターホルダーに加えた。細胞をフィルターに通すために、指でシリンジをプッシュすることを使用した。１５ｍｌのファルコンチューブまたはＦＡＣＳチューブに、フィルターフロースルーを収集した。ＦＡＣＳ分析の前に、４℃で４分の間、全ての試料を４００ｒｃｆで３回遠心分離、洗浄し、細胞外デキストランを除去した。ＦＡＣＳ分析の準備をするために、以下のステップをとった。ＦＡＣＳ緩衝液を調製し（ＰＢＳ＋最終濃度：１％ＦＢＳ＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ）、チューブ当たり４００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を加え、細胞を再懸濁した。全細胞事象を可視化するようにフローサイトメトリーの前方散乱、側方散乱および蛍光チャネル電圧を調整し、試料当たり≧１０，０００事象を記録した。デキストラン粒子またはＩｇＧ抗体と混合したがフィルターを通過しなかった細胞は、エンドサイトーシスによる送達のための対照として使用した。これらの細胞は色素と接触したが、フィルターを通過しなかった。全ての他のステップは、エンドサイトーシス対照の場合と同じであった。
【０４８６】
結果
１０ｋＤａ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７デキストラン粒子またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７とコンジュゲートした１５０ｋＤａ  ＩｇＧ抗体と混合したＲＢＣを、２μｍサイズのフィルター細孔に通した。エンドサイトーシス対照に対して圧縮媒介送達（ＳＱＺ）後の蛍光を表す例示的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを、図７ＡおよびＢに示す。フィルター送達後のＩｇＧ抗体のデキストラン粒子に陽性の細胞の百分率によって示される送達効率を、図８Ａに示す。フィルター送達後にＩｇＧ抗体の送達効率は８８．６％であって、デキストラン粒子の送達効率は９５．６％であった。
【０４８７】
細胞生存度は、フィルター送達後に測定した。フィルター送達後にＦＳＣおよびＳＳＣゲート内に存在する細胞の百分率によって示される推定細胞生存度を、図８Ｂに示す。フィルター送達後のＩｇＧ抗体を送達された細胞の推定生存度は６８．８％であって、デキストラン粒子を送達された細胞の推定生存度は６３．３％であった。
【０４８８】
ヒトＲＢＣ内へのデキストラン粒子およびＩｇＧ抗体の圧縮媒介送達が達成された。
【０４８９】
（実施例７）
マウスＲＢＣへのデキストランおよびＩｇＧ抗体の圧縮媒介送達
序論
無核細胞内への分子のフィルター媒介送達を評価するために、規定サイズの細孔を含有するシリンジフィルターを通って、蛍光性デキストラン粒子またはＩｇＧ抗体と混合されたマウスＲＢＣを通過させ、細胞内粒子送達をＦＡＣＳ分析により評価した。
【０４９０】
材料および方法
市販のフィルターおよびホルダー組合せを有する１μｍおよび２μｍの孔直径を有するポリカーボネートメンブレンフィルター（ＣＯＴＳフィルター）を、ＳＴＥＲＬＩＴＥＣＨ（商標）から得た。全血を遠心回転し、細胞をＯｐｔｉｍｅｍに所望の濃度（１００〜５００Ｍ／ｍｌ）で再懸濁させた。メンブレンフィルターを濡らすために、鉗子を使用してポリカーボネートメンブレンフィルターをＯｐｔｉｍｅｍに懸濁した。プラスチックフィルターホルダーのキャップを取り、輝く側を上にしてフィルターを内部表面の上に置き、フィルターホルダーに再びキャップをした。デキストラン粒子およびＩｇＧ抗体を、０．１ｍｇ／ｍＬで懸濁した。デキストラン粒子またはＩｇＧ抗体と混合した１ｍＬの細胞を、室温でフィルターホルダーに加えた。細胞をフィルターに通すために、指でシリンジをプッシュすることを使用した。あるいは、デキストラン粒子またはＩｇＧ抗体と混合された２００μＬの細胞をフィルターに通すために、制御圧力システムが使用される。１５ｍｌのファルコンチューブまたはＦＡＣＳチューブに、フィルターフロースルーを収集した。ＦＡＣＳ分析の前に、２４℃で１０分の間、全ての試料を１０００ｒｃｆで３回遠心分離、洗浄し、細胞外デキストランを除去した。ＦＡＣＳ分析の準備をするために、以下のステップをとった。ＦＡＣＳ緩衝液を調製し（ＰＢＳ＋最終濃度：１％ＦＢＳ＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ）、チューブ当たり４００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を加え、細胞を再懸濁した。全細胞事象を可視化するようにフローサイトメトリーの前方散乱、側方散乱および蛍光チャネル電圧を調整し、試料当たり≧１０，０００事象を記録した。デキストラン粒子またはＩｇＧ抗体と混合したがフィルターを通過しなかった細胞は、エンドサイトーシスによる送達のための対照として使用した。これらの細胞は色素と接触したが、フィルターを通過しなかった。全ての他のステップは、エンドサイトーシス対照の場合と同じであった。ＮＣ（無接触）試料は色素と接触しなかったが、実験試料と同じステップにかけられたが、フィルターに通過しなかった。
【０４９１】
結果
手動でのシリンジ加圧を使用して、ＩｇＧ抗体（１５０ｋＤａ）と混合されたマウスＲＢＣを１μｍおよび２μｍサイズのフィルター細孔に通した。エンドサイトーシス（Ｅｎｄｏ）、陰性（ＮＣ）および無材料の対照に対して圧縮媒介送達（ＳＱＺ）後の蛍光を表す例示的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを、図９Ａに示す。「無材料」対照はＩｇＧ抗体と接触しなかったが、実験試料と同じステップにかけられ、フィルターを通過させた。
【０４９２】
細胞生存度は、フィルター送達後に測定した。手動でのシリンジ加圧を使用したＩｇＧ抗体のフィルター送達後にＦＳＣおよびＳＳＣゲート内に存在する細胞の百分率によって示される推定細胞生存度を、図９Ｂに示す。手動でのシリンジ加圧を使用したフィルター送達後のＩｇＧ抗体に陽性の細胞の百分率によって示されるＩｇＧ抗体の送達効率を、図９Ｃに示す。
【０４９３】
２ｐｓｉ、４ｐｓｉ、６ｐｓｉ、１０ｐｓｉ、２０ｐｓｉの下の制御圧力システムを使用して、または手動でのシリンジ加圧を使用して、７０ｋＤａ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８デキストラン粒子またはＩｇＧ抗体（１５０ｋＤａ）と混合したＲＢＣを、２μｍサイズのフィルター細孔に通した。エンドサイトーシス（Ｅｎｄｏ）、陰性（ＮＣ）および無材料の対照に対して圧縮媒介送達（ＳＱＺ）後の蛍光を表す例示的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを、図１０Ａ〜Ｉに示す。細胞生存度は、フィルター送達後に測定した。デキストラン粒子のフィルター送達後にＦＳＣおよびＳＳＣゲート内に存在する細胞の百分率によって示される推定細胞生存度を、図１１Ａに示す。フィルター送達後のデキストラン粒子またはＩｇＧ抗体に陽性の細胞の百分率によって示される送達効率を、図１１Ｂに示す。デキストラン粒子またはＩｇＧ抗体のフィルター送達後の幾何平均蛍光を、図１１Ｃに示す。
【０４９４】
１０ｐｓｉ、１２ｐｓｉ、１４ｐｓｉ、１６ｐｓｉまたは１８ｐｓｉの下の制御圧力システムを使用して、７０ｋＤａ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８デキストラン粒子と混合したＲＢＣを、２μｍサイズのフィルター細孔に通した。エンドサイトーシス（Ｅｎｄｏ）および陰性（ＮＣ）対照に対して圧縮媒介送達（ＳＱＺ）後の蛍光を表す例示的なフローサイトメトリーヒストグラムプロットを、図１２Ａに示す。細胞生存度は、フィルター送達後に測定した。デキストラン粒子のフィルター送達後にＦＳＣおよびＳＳＣゲート内に存在する細胞の百分率によって示される推定細胞生存度を、図１２Ｂに示す。フィルター送達後のデキストラン粒子に陽性の細胞の百分率によって示される送達効率を、図１２Ｃに示す。デキストラン粒子のフィルター送達後の幾何平均蛍光を、図１２Ｄに示す。
【０４９５】
マウスＲＢＣ内へのデキストラン粒子およびＩｇＧ抗体の圧縮媒介送達が達成された。
【０４９６】
（実施例８）
ＨｅＬａ細胞およびＴ細胞へのマイクロシーブ送達
分子のマイクロシーブ媒介送達を評価するために、蛍光性デキストラン粒子と混合されたＨｅＬａ細胞またはＴ細胞をマイクロシーブに通し、細胞内粒子送達をＦＡＣＳ分析により評価した。
【０４９７】
材料および方法
ＳＴＥＲＬＩＴＥＣＨ（商標）からの１０μｍの細孔サイズを有するポリカーボネートマイクロシーブ（空隙率８％）またはＡＱＵＡＭＡＲＩＪＮからの１０μｍの細孔サイズを有するシリコン／セラミックマイクロシーブ（空隙率３６．３％）を、ＨｅＬａ細胞のために使用した。ＨｅＬａ細胞を細胞５×１０６個／ｍＬでＯｐｔｉＭＥＭ培地に懸濁し、３ｋＤａデキストラン粒子を１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で加えた。デキストラン粒子と混合した２００μｌの細胞をマイクロシーブに加え、室温の３〜７ｐｓｉでマイクロシーブに通過させた。回収は、３７℃においてであった。
【０４９８】
ナイーブＴ細胞を細胞１０×１０６個／ｍＬでＯｐｔｉＭＥＭ培地に懸濁し、３ｋＤａデキストラン粒子を１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で加えた。デキストラン粒子と混合した２００μｌの細胞を、氷上の６〜８ｐｓｉで４μｍフィルターまたは４μｍマイクロシーブに通過させた。回収は、室温においてであった。
【０４９９】
ＦＡＣＳ分析の前に、４℃で４分の間、全ての試料を４００ｒｃｆで３回遠心分離、洗浄し、細胞外デキストランを除去した。ＦＡＣＳ分析の準備をするために、以下のステップをとった。最初に、ＦＡＣＳ緩衝液を調製し（ＰＢＳ＋最終濃度：１％ＦＢＳ＋２ｎＭ  ＥＤＴＡ）、使用直前にヨウ化プロピジウムを加えた（１：１００希釈）。チューブ当たり４００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を加え、細胞を再懸濁した。全細胞事象を可視化するようにフローサイトメトリーの前方散乱、側方散乱および蛍光チャネル電圧を調整し、試料当たり１０，０００事象を記録した。デキストラン粒子と混合したがフィルターを通過しなかった細胞は、エンドサイトーシスによる送達のための対照として使用した。これらの細胞は色素またはＥＧＦＰ  ｍＲＮＡと接触したが、フィルターを通過しなかった。全ての他のステップは、エンドサイトーシス対照の場合と同じであった。陰性対照試料は色素ともＥＧＦＰ  ｍＲＮＡとも接触しなかったが、実験試料と同じステップにかけられた。
【０５００】
結果
ＨｅＬａ細胞へのデキストランのマイクロシーブ媒介送達の結果を、図１３Ａ〜１３Ｄに示す。ＳＴＥＲＬＩＴＥＣＨ（商標）およびＡＱＵＡＭＡＲＩＪＮマイクロシーブのための細胞生存度は図１３Ａに示し、デキストランの送達は図１３Ｂに示す。ＡＱＵＡＭＡＲＩＪＮおよびＳＴＥＲＬＩＴＥＣＨ（商標）マイクロシーブのための代表的ヒストグラムは、図１３Ｃおよび１３Ｄにそれぞれ示す。
【０５０１】
Ｔ細胞へのデキストランのマイクロシーブ媒介送達の結果を、図１４Ａおよび１４Ｂに示す。ＡＱＵＡＭＡＲＩＪＮマイクロシーブのための細胞生存度およびデキストランの送達を、図１４Ａに示す。ＡＱＵＡＭＡＲＩＪＮマイクロシーブのための代表的フローサイトメトリーヒストグラムを、図１４Ｂに示す。結果は、フィルター媒介送達と同等であった。
【０５０２】
結果は、ＨｅＬａ細胞およびＴ細胞へのデキストランのマイクロシーブ送達の後の、優れた送達および生存度の最小限の減少を示す。
【０５０３】
本明細書で開示および請求される組成物および／または方法の全ては、本開示を考慮して過度の実験なしで作製および実行することができる。本開示の組成物および方法は実施形態の点から記載されたが、本開示の概念、趣旨および範囲を逸脱せずに、組成物および／または方法に、ならびに本明細書に記載される方法のステップまたはステップの順序に変更を加えることができることは、当業者に明らかである。より具体的には、同じか類似した結果を達成しつつ、化学的および生理的に関連したある特定の薬剤を本明細書に記載される薬剤の代わりに置換することができることが明白である。当業者に明らかな全てのそのような類似した代替物および改変は、添付の請求項によって規定される本開示の趣旨、範囲および概念内にあるとみなされる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ−Ｄ】
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【図２Ｅ−Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ−Ｃ】
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【図１０Ａ−Ｃ】
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【図１０Ｄ−Ｆ】
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【図１０Ｇ−Ｉ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ−Ｃ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１２Ｃ−Ｄ】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１３Ｃ−Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【国際調査報告】
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