(57)【要約】  本開示は、DNA及びRNA等の核酸の可視化を増強するための色素として使用することができる、ブラジレインを含む組成物を提供する。樹皮出発原料からのブラジレインの抽出の単純で時間及び費用効率の高い方法も明細書に提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a.  ブラジレイン((6aS,11bR)-7,11b-ジヒドロ-6H-インデノ[2,1-c]クロメン-3,6a,9,10-テトロール);
b.  メタノール、エタノール、アセトン、及びその組合せからなる群から選択される少なくとも1種の溶媒;
c.  グリセロール、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、ジメチルスルホキシド、及びその組合せからなる群から選択される少なくとも1種の化合物
を含む、核酸の検出のための組成物。
【請求項２】
前記組成物中の前記溶媒重量パーセンテージが、ブラジレインを溶解するのに十分な量である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物におけるブラジレイン重量パーセンテージが、0.000284〜0.0284%の範囲にある、請求項1又は2に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物における塩化ナトリウム又は硫酸マグネシウム重量パーセンテージが、0.0001%〜0.001%の範囲にある、請求項1又は2に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物におけるグリセロール重量パーセンテージが、25.2〜37.8%の範囲にある、請求項1又は2に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物におけるジメチルスルホキシド重量パーセンテージが、70〜90%の範囲にある、請求項1又は2に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物におけるブラジレインの塩化ナトリウム又は硫酸マグネシウムに対するw/w比が、1:0.0035〜1:3.52の範囲にある、請求項1又は2に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物におけるブラジレインのグリセロールに対するw/w比が、1:887〜1:133098の範囲にある、請求項1又は2に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物におけるブラジレインのジメチルスルホキシドに対するw/w比が、1:2464〜1:316901の範囲にある、請求項1又は2に記載の組成物。
【請求項１０】
結晶性ブラジレイン((6aS,11bR)-7,11b-ジヒドロ-6H-インデノ[2,1-c]クロメン-3,6a,9,10-テトロール)を得る方法であって、
a.  スオウから樹皮を得る工程;
b.  前記樹皮を処理して粉末にした樹皮を得る工程;
c.  前記粉末にした樹皮を少なくとも1種の溶媒と接触させて第1の混合物を得る工程;
d.  前記第1の混合物を、前記第1の混合物の容量が80〜95%低下するまで20〜90℃の範囲の温度に供して第2の混合物を得る工程;
e.  前記第2の混合物を濾過して、
i.ブラジリン及びブラジレインの混合物を含む濾過物;並びに
ii.残留物
を得る工程;並びに
f.  前記濾過物を空気又は少なくとも1種の酸化剤に22〜85℃の範囲の温度で接触させて残留する溶媒を蒸発させて、結晶形のブラジレインを得る工程
を含む、方法。
【請求項１１】
スオウからの樹皮の含水量が、5〜15%の範囲にある、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶媒が、水、メタノール、エタノール、アセトン、及びその組合せからなる群から選択される、請求項10又は11に記載の方法。
【請求項１３】
工程(c)において、前記第1の混合物中の粉末にした樹皮の溶媒に対するw/w比が、1:5〜1:20の範囲にある、請求項10から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程(c)において、任意選択で、少なくとも1種の酸化剤を前記第1の混合物に接触させる工程を更に含む、請求項10から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
工程(e)(ii)からの前記残留物が:
a.  前記残留物を少なくとも1種の溶媒と接触させて第3の混合物を得る工程;
b.  前記第3の混合物を、前記第1の混合物の容量が80〜95%低下するまで20〜90℃の範囲の温度に供して第4の混合物を得る工程;
c.  前記第4の混合物を濾過して、
i.ブラジリン及びブラジレインの混合物を含む濾過物;並びに
ii.残留物
を得る工程、
d.  前記濾過物を空気又は少なくとも1種の酸化剤に22〜85℃の範囲の温度で接触させて残留する溶媒を蒸発させて、結晶形のブラジレインを得る工程
を含む反復抽出に供される、請求項10から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記反復抽出プロセスが、3〜5サイクル実行される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記粉末にした樹皮100グラム当たり15〜30gの結晶性ブラジレインを産出する、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
試料中の核酸の検出の方法であって、
a.  請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物を得る工程;及び
b.  前記組成物を前記試料と接触させる工程
を含む、方法。
【請求項１９】
ブラジレインが請求項10から17のいずれか一項に記載の方法によって得られる、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料中の少なくとも40pgの核酸を検出する、請求項18又は19に記載の方法。
【請求項２１】
試料中の核酸のin-vitro又はin-vivo検出における使用のための、請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物を含む核酸染色キット。
【請求項２３】
試料中の核酸のin-vitro又はin-vivo検出における使用のためのブラジレイン。
【請求項２４】
請求項10から17のいずれか一項に記載の方法によって調製される、請求項24に記載の使用のためのブラジレイン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、核酸の検出のための試薬の分野に関する。特に、本開示は、核酸の増強した検出のためのブラジレインを含む組成物を提供する。また、ブラジレインの単離及び精製の迅速で費用効率の高い方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
染色は、生体試料の同定、検出、可視化、標識化、ターゲティング、及び精製において使用される重要な補助的な技術である。加えて、染色は、微視的な画像においてコントラストを増強する顕微鏡観察においても広く使用される。特に、染料及び色素は、組織を検査する、細胞集団、又は個々の細胞内の細胞小器官を分類する等の様々な理由のため、組織中の構造を強調するため、核酸、タンパク質及び他の生体材料も可視化及び定量するため化学、生物学及び医学において頻繁に使用される。染料は、特定の標的と接触させた場合に、検出可能な反応を呈する化学的な化合物である。標的の非存在下では、染料は、検出可能な反応を呈さない。これらの特性のため、染料には、試料中の特定の標的の有無の検出において価値がある。検出可能な反応は、化合物、標的、及びアッセイパラメータに応じて、定性的又は定量的であり得る。
【０００３】
核酸(特にDNA)の検出及び定量化は、生物工学の研究において非常に一般的な作業である。早期の化学染料は、DNAを染色することに有効であるのみならずRNAの染色にも有効である。DNA及びRNAは、天然源から単離された場合に、しばしば一緒に得られる。DNAに関して選択的ではない染料は、単離されたDNAの定量化を困難にし、定量化の前に行われる精製工程が必要とされる。特殊な研究は、一本鎖の標準DNA、二本鎖の標準DNA及びプラスミドDNAのような異なるタイプの核酸の区別を必要とする。核酸スクリーニング用途には、安全性に妥協して毒性及び変異原性の現在利用可能な蛍光染料が使用される。そのプロセスには、煩雑な安全性プロトコール及び高価な処分手続きを伴う。特に、蛍光染料/色素は、アガロースゲル中のDNA/RNA断片を可視化する及び定量する核酸研究において広く使用される。臭化エチジウム(EtBr)は、低コストであり且つ感度が十分であることが理由で、数十年にわたり核酸スクリーニングに使用されてきた卓越した色素である。しかし、汚染除去及び廃棄物処分に関連する安全性ハザード及びコストがあるため、最終的には色素は、研7A76者及び環境に対して高価であり且つ安全でない。
【０００４】
Gel red、Gel green、Pico green、Dimeric cyanine等のSYBRグループの染料等の幾つかの代替染料は、高度に毒性のEtBrを置き換えるために開発された。例外なく、これらの全ての染料は、合成の芳香環構造であり、核酸を検出する感度が高い。それらの感度は高いにもかかわらず、それらは特定のレベルの毒性及び変異原性を発現する。これらの色素から見積もられる安全性クレームが、高度に毒性のEtBrと比較される。このように、生体試料又は核酸の安全なスクリーニングに利用可能な安全な蛍光染料は、存在しない。
【０００５】
化合物ブラジレインは、アジアにおいて広く見出される低木であるスオウ(Caesalpinia sappan)の樹皮に由来する。更に、スオウ種から単純なプロセスによってブラジレインを抽出し、良好な収率を得ることは、かなり煩雑で困難である。スオウ種(WO  2007066926  A1、WO/2007/066926)からのブラジリン及びブラジレイン化合物の抽出及び分離における報告が存在する。これらの方法の全ては、食物及び繊維の染剤として、ブラジレインの抽出及び特徴について説明する。しかし、ゲルに基づくシステム及び関連する用途におけるブラジレインの核酸染色特性は、試みの対象とはならなかった。更に、多くの異なる方法及び戦略が、スオウ(Caesalpenia)種からブラジレイン化合物を抽出すること及び精製することに使用されてきた。「ブラジレインを精製するための方法」との名称の中国特許第CN102241660(A)号において、参照発明は、ブラジルウッドからのブラジレインの抽出方法について説明する。本発明は、ブラジレインを抽出するため、エタノール、エチルエステルを含む溶媒の組合せを使用する。抽出プロトコールに従うカラム精製工程は、移動相としてアセトニトリル、リン酸、及びブラジレインを溶出するための濾過媒体としてシリカゲルも伴う。植物抽出物からブラジレインを精製するための分取HPLCも、その方法に使用される。この方法は、高価であり、2種の精製プロトコールを伴い、これは長く煩雑な手順をもたらす。
【０００６】
「スオウ材からブラジレインを抽出するための方法」との名称の中国特許第CN102219771A号において参照される発明は、スオウ材からブラジレインを抽出するための方法を特許請求する。その方法は、原材料を処置するための一次溶媒としてメタノール、続いてブラジレインを分離するためのマクロ孔質樹脂ベースの吸着を伴う。その方法は、ブラジレインを精製するための溶媒としてメタノールを使用するが、用いられる濃度、溶媒組合せ及びインキュベーション持続時間は異なり、更に方法は、分散のための水の添加、吸着のためのマクロ孔質樹脂の使用、メタノールを使用する勾配溶出、結晶の結晶化、結晶の洗浄及び溶解並びに最終的なエタノール及びエチルエステート中での再結晶化を含む、抽出のための幾つかの他の工程を使用する。
【０００７】
「スオウからのブラジレインの大量生産法」との名称のWO  2007066926  A1において、その発明は、大規模生産のためのアルコールベースのブラジレイン抽出法を特許請求する。しかし、抽出は二段階結晶化を伴い、アルコールがブラジレインを精製するための唯一の溶媒である。
【０００８】
「スオウからの高純度のブラジレインの急速で安価な大量生産法」との名称の韓国特許1020050120665号は、水又はアルコールを使用するブラジレインを抽出する方法を開示しているが、再結晶及び制御された条件及び長いインキュベーション期間の使用を必要とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO  2007066926  A1
【特許文献２】WO/2007/066926
【特許文献３】中国特許第CN102241660(A)号
【特許文献４】中国特許第CN102219771A号
【特許文献５】韓国特許1020050120665号
【発明の概要】
【００１０】
本開示の態様において:(a)ブラジレイン((6aS,11bR)-7,11b-ジヒドロ-6H-インデノ[2,1-c]クロメン-3,6a,9,10-テトロール);(b)少なくとも1種の溶媒;並びに(c)グリセロール、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、ジメチルスルホキシド、及びその組合せからなる群から選択される少なくとも1種の化合物を含む組成物が提供される。
【００１１】
本開示の態様において、結晶性ブラジレイン((6aS,11bR)-7,11b-ジヒドロ-6H-インデノ[2,1-c]クロメン-3,6a,9,10-テトロール)を得る方法が提供され、前記方法は:(a)スオウから樹皮を得る工程;(b)前記樹皮を処理して粉末にした樹皮を得る工程;(c)前記粉末にした樹皮を少なくとも1種の溶媒と接触させて第1の混合物を得る工程;(d)前記第1の混合物を、第1の混合物の容量が80〜95%低下するまで20〜90°Cの範囲の温度に供して第2の混合物を得る工程;(e)第2の混合物を濾過して、(i)ブラジリン及びブラジレインの混合物を含む濾過物;並びに(ii)残留物を得る工程;並びに(f)前記濾過物を空気又は少なくとも1種の酸化剤に22〜85°Cの範囲の温度で接触させて残留する溶媒を蒸発させて、結晶形のブラジレインを得る工程を含む。
【００１２】
本開示の態様において、試料中の核酸の検出の方法が提供され、前記方法は:(i)(a)ブラジレイン;(b)少なくとも1種の溶媒;及び(c)グリセロール、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、及びジメチルスルホキシドからなる群から選択される少なくとも1種の化合物を含む組成物を得る工程;並びに(ii)前記組成物を前記試料と接触させる工程を含む。
【００１３】
本開示の態様において:(a)ブラジレイン;(b)少なくとも1種の溶媒;並びに(c)試料中の核酸のin-vitro又はin-vivo検出における使用のための、グリセロール、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、及びジメチルスルホキシドからなる群から選択される少なくとも1種の化合物を含む組成物が提供される。
【００１４】
本開示の態様において、組成物を含む核酸染色キットが提供され、前記組成物は:(a)ブラジレイン((6aS,11bR)-7,11b-ジヒドロ-6H-インデノ[2,1-c]クロメン-3,6a,9,10-テトロール);(b)少なくとも1種の溶媒;並びに(c)グリセロール、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、及びジメチルスルホキシドからなる群から選択される少なくとも1種の化合物を含む。
【００１５】
本開示の態様において、試料中の核酸のin-vitro又はin-vivo検出における使用のためのブラジレインが提供される。
【００１６】
本主題のこれらの及び他の特性、態様、並びに利点は、以下の説明及び添付の特許請求の範囲を参照して、より良く理解されるであろう。この概要は、簡略化された形態において概念の選択を導入するため提供される。この概要は、特許請求された主題の鍵となる特性又は必須な特性を同定することは意図されず、特許請求された主題の範囲を限定するため使用されることも意図されない。
【００１７】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の態様を更に例証するために含まれる。開示は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組合せて図面を参照することによって、より良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１ａは、本開示の実施形態に従う、ブラジレインに対応するHPLCクロマトグラム中の単一ピークを図示する図である。図１ｂは、本開示の実施形態に従う、抽出されたブラジレインの純度が確認されるGC-MS中の優性なピークを図示する図である。図１ｃは、本開示の実施形態に従う、ブラジレインに対応する284mwのピークを示す質量分析プロファイルを図示する図である。
【図２】図２ａは、本開示の実施形態に従う、メタノール抽出物の450nm(励起波長340nm)で最大発光を有する蛍光発光スペクトルを図示する図である。図２ｂは、本開示の実施形態に従う、メタノール抽出物の560nm(励起波長491nm)で最大発光を有する蛍光発光スペクトルを図示する図である。
【図３ａ】本開示の実施形態に従う、臭化エチジウムによる様々な濃度でのDNAの染色を図示する図である。
【図３ｂ】本開示の実施形態に従う、SYBR(登録商標)Goldによる様々な濃度でのDNAの染色を図示する図である。
【図３ｃ】本開示の実施形態に従う、ブラジレインのメタノール性抽出物による様々な濃度でのDNAの染色を図示する図である。
【図３ｄ】本開示の実施形態に従う、ブラジレインのエタノール性抽出物による様々な濃度でのDNAの染色を図示する図である。
【図３ｅ】本開示の実施形態に従う、RNAにおけるブラジレインの染色能力を図示する図である。
【図３ｆ】本開示の実施形態に従う、PCRアンプリコンにおけるブラジレインの染色能力を図示する図である。
【図４ａ】本開示の実施形態に従う、染色されたプラスミドDNA(a)、ゲノムDNA(b)、ssDNA(c)、及びRNA(d)等の様々な核酸の電気泳動結果を図示する図であり、異なるタイプの核酸の染色におけるブラジレインの有効性を示す。
【図４ｂ】本開示の実施形態に従う、染色されたプラスミドDNA(a)、ゲノムDNA(b)、ssDNA(c)、及びRNA(d)等の様々な核酸の電気泳動結果を図示する図であり、異なるタイプの核酸の染色におけるブラジレインの有効性を示す。
【図４ｃ】本開示の実施形態に従う、染色されたプラスミドDNA(a)、ゲノムDNA(b)、ssDNA(c)、及びRNA(d)等の様々な核酸の電気泳動結果を図示する図であり、異なるタイプの核酸の染色におけるブラジレインの有効性を示す。
【図４ｄ】本開示の実施形態に従う、染色されたプラスミドDNA(a)、ゲノムDNA(b)、ssDNA(c)、及びRNA(d)等の様々な核酸の電気泳動結果を図示する図であり、異なるタイプの核酸の染色におけるブラジレインの有効性を示す。
【図５】図５ａは、本開示の実施形態に従う、1ngまで低いDNAの濃度を検出する、3種のブラジレイン抽出物(tm-メタノール、te-エタノール及びtw-水)の性能を図示する図である。図５ｂは、本開示の実施形態に従う、400pgまで低いDNAの濃度を検出する、3種のブラジレイン抽出物(tm-メタノール、te-エタノール及びtw-水)の性能を図示する図である。
【図６】図６ａは、本開示の実施形態に従う、ブラジレインのメタノール性(tm)又はエタノール性(te)抽出物の当量濃度と比べて臭化エチジウムの濃度依存的な蛍光スペクトルを図示する図である。図６ｂは、本開示の実施形態に従う、臭化エチジウムの濃度依存的な蛍光スペクトルを図示する図である。図６ｃは、本開示の実施形態に従う、ブラジレインのメタノール性抽出物の濃度依存的な蛍光スペクトルを図示する図である。
【図７】図７ａは、本開示の実施形態に従う、様々な濃度でのブラジレインの蛍光におけるpH5の効果を図示する図である。図７ｂは、本開示の実施形態に従う、様々な濃度でのブラジレインの蛍光におけるpH6の効果を図示する図である。図７ｃは、本開示の実施形態に従う、様々な濃度でのブラジレインの蛍光におけるpH7の効果を図示する図である。図７ｄは、本開示の実施形態に従う、様々な濃度でのブラジレインの蛍光におけるpH8の効果を図示する図である。図７ｅは、本開示の実施形態に従う、様々な濃度でのブラジレインの蛍光におけるpH9の効果を図示する図である。図７ｆは、本開示の実施形態に従う、様々な濃度でのブラジレインの蛍光におけるpH10の効果を図示する図である。
【図８】本開示の実施形態に従う、ブラジレインへのグリセロールの添加における、蛍光における増強した効果を図示する蛍光スペクトル画像を図示する図である。
【図９】本開示の実施形態に従う、ブラジレインのメタノール性抽出物の蛍光強度における、様々な金属イオンの効果を図示する図である。
【図１０】本開示の実施形態に従う、ブラジレインへの塩化ナトリウムの添加における、蛍光における増強した効果を図示する蛍光スペクトル画像を図示する図である。
【図１１】本開示の実施形態に従う、ブラジレインへの硫酸マグネシウムの添加における、蛍光における増強した効果を図示する蛍光スペクトル画像を図示する図である。
【図１２】図１２ａは、本開示の実施形態に従う、ブラジレインの水抽出物を含む様々な組成物の様々な濃度に曝露時のHeLa細胞の細胞生存率を図示する図である。図１２ｂは、本開示の実施形態に従う、ブラジレインのメタノール性抽出物を含む様々な組成物の様々な濃度に曝露時のHeLa細胞の細胞生存率を図示する図である。
【図１３】本開示の実施形態に従う、ブラジレインによるタマネギ上皮細胞核の染色を図示する図である。
【図１４】図１４ａは、本開示の実施形態に従う、ブラジレインなしの対照細胞のFACS分析を図示する図である。図１４ｂは、本開示の実施形態に従う、FACS分析によって確かめられる生細胞によるブラジレイン取り込みの有効性を図示する図である。
【図１５】図１５ａは、本開示の実施形態に従う、ブラジレインの添加時の生細胞中の核(緑色フィルター)の可視化を図示する図である。図１５ｂは、本開示の実施形態に従う、生きた酵母細胞の位相差画像を図示する図である。図１５ｃは、本開示の実施形態に従う、ブラジレインの添加時の生細胞中の核(赤色フィルター)の可視化を図示する図である。図１５ｄは、本開示の実施形態に従う、ブラジレインの添加時の生細胞中の核(遠赤外フィルター)の可視化を図示する図である。図１５ｅは、本開示の実施形態に従う、図15a〜図15dの統合した画像を図示する図である。
【図１６】本開示の実施形態に従う、DNA色素としてブラジレインを使用するFISH画像を図示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示が、具体的に記載されるもの以外の変形及び改変を施されることを当業者は認識するであろう。本開示は、全てのそのような変形及び改変を含むと理解されるべきである。開示は、個々に又は集団的に、本明細書に参照される又は示される、全てのそのような工程、特性、組成物及び化合物、及びそのような工程又は特性のいずれかの又は複数のいずれかの及び全ての組合せも含む。
【００２０】
定義
便宜上、本開示のさらなる説明の前に、明細書で用いられる特定の用語及び例は、ここに集められる。これらの定義は、開示の残りを踏まえて読み取られ、当業者によって理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、当業者によって認識され、知られている意味を有するが、しかし、便宜上及び完全性のため、特定の用語及びそれらの意味は、以下に記載される。
【００２１】
冠詞「a」、「an」及び「the」は、その冠詞の文法上の目的格の1つ又は2つ以上(すなわち、少なくとも1つ)を指すため使用される。
【００２２】
用語「ssDNA」は、一本鎖のDNAを指す。
【００２３】
用語「ssRNA」は、一本鎖のRNAを指す。
【００２４】
用語「tm」は、ブラジレインのメタノール性抽出物と互換的に使用することができる。
【００２５】
用語「tw」は、ブラジレインの水抽出物と互換的に使用することができる。
【００２６】
用語「te」は、ブラジレインのエタノール性抽出物と互換的に使用することができる。
【００２７】
用語「EtBr」は、臭化エチジウムを指し、互換的に使用することができる。
【００２８】
「相乗的な活性」を含む組成物又は「相乗的な組成物」は、個々の化合物の生物学的又は機能的な活性の非線形倍数(non-linear multiple)として、増加した生物学的又は機能的な活性を呈する、化合物の組合せである。換言すれば、試験される2以上の化合物の組合せた生物学的又は機能的な活性は、別々に試験される場合に、化合物の独立の効果に基づき予想される結果よりも有意に大きい。相乗作用は、いくらかの範囲又は濃度でのみ明らかであってもよい。また、化合物の相乗的な組合せは、試験される異なる種類の生物学的効果について異なってもよい。
【００２９】
用語「含む(comprise)」及び「含む(comprising)」は、追加の要素が含まれてもよい、包括的なオープンエンドの意味で使用される。「のみからなる(consists of only)」として解釈されることは意図されない。
【００３０】
この明細書全体にわたって、文脈上他の意味に解す必要がある場合を除き、「含む(comprise)」なる語、及び「含む(comprises)」及び「含む(comprising)」のような変形語は、記載された要素若しくは工程又は要素若しくは工程の群の包含を意味するが、任意の他の要素若しくは工程又は要素若しくは工程の群の排除を意味しないと理解されるであろう。
【００３１】
用語「含む(including)」は、「含むが、これらに限定されない(including but not limited to)」を意味するために使用される。「含む(including)」及び「含むが、これらに限定されない(including but not limited to)」は、互換的に使用される。
【００３２】
別段の定義が無い限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、この開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同様又は等価の任意の方法及び材料を開示の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料をここに記載する。本明細書で言及したすべての刊行物は、本明細書に参照によって組み込まれる。
【００３３】
本開示は、本明細書に記載される特定の実施形態による範囲に限定されず、例示のみの目的のため意図される。機能的に等価である製品、組成物、及び方法は、明らかに、本明細書に記載されるような、開示の範囲内である。
【００３４】
本開示の実施形態において:(a)ブラジレイン((6aS,11bR)-7,11b-ジヒドロ-6H-インデノ[2,1-c]クロメン-3,6a,9,10-テトロール);(b)少なくとも1種の溶媒;並びに(c)グリセロール、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、ジメチルスルホキシド、及びその組合せからなる群から選択される少なくとも1種の化合物を含む組成物が提供される。
【００３５】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるブラジレイン重量パーセンテージが0.000284〜0.0284%の範囲にある組成物が提供される。
【００３６】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるブラジレイン濃度が10μM〜1mMの範囲にある組成物が提供される。
【００３７】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるブラジレイン重量パーセンテージが0.0284%である組成物が提供される。
【００３８】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるブラジレイン濃度が1mMである組成物が提供される。
【００３９】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記溶媒が、水、メタノール、エタノール、アセトン、及びその組合せからなる群から選択される組成物が提供される。
【００４０】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物における前記溶媒重量パーセンテージがブラジレインを溶解するのに十分な量である組成物が提供される。
【００４１】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記化合物が塩化ナトリウムである組成物が提供される。
【００４２】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記化合物が硫酸マグネシウムである組成物が提供される。
【００４３】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記化合物がグリセロールである組成物が提供される。
【００４４】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記化合物がジメチルスルホキシド(DMSO)である組成物が提供される。
【００４５】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるブラジレインの塩化ナトリウムに対するw/w比が1:0.0035〜1:3.52の範囲にある組成物が提供される。
【００４６】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物における塩化ナトリウム重量パーセンテージが0.0001〜0.001%の範囲にある組成物が提供される。
【００４７】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物における塩化ナトリウム重量パーセンテージが0.001%である組成物が提供される。
【００４８】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるブラジレインの塩化ナトリウムに対するw/w比が1:0.352である組成物が提供される。
【００４９】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるブラジレイン重量パーセンテージが0.0284%及び前記組成物における塩化ナトリウム重量パーセンテージが0.001%である組成物が提供される。
【００５０】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるブラジレインの硫酸マグネシウムに対するw/w比が1:0.0035〜1:3.52の範囲にある組成物が提供される。
【００５１】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物における塩化マグネシウム重量パーセンテージが0.0001〜0.001%の範囲にある組成物が提供される。
【００５２】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物における塩化マグネシウム重量パーセンテージが0.001%である組成物が提供される。
【００５３】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるブラジレインの硫酸マグネシウムに対するw/w比が1:0.352である組成物が提供される。
【００５４】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるブラジレイン重量パーセンテージが0.0284%及び前記組成物における硫酸マグネシウム重量パーセンテージが0.001%である組成物が提供される。
【００５５】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるブラジレインのグリセロールに対するw/w比が1:887〜1:133098の範囲にある組成物が提供される。
【００５６】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるグリセロール重量パーセンテージが25.2〜37.8%の範囲にある組成物が提供される。
【００５７】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるグリセロール重量パーセンテージが25.2%である組成物が提供される。
【００５８】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるグリセロール重量パーセンテージが37.8%である組成物が提供される。
【００５９】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるブラジレインのグリセロールに対するw/w比が1:887.3である組成物が提供される。
【００６０】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるブラジレインのグリセロールに対するw/w比が1:1330.9である組成物が提供される。
【００６１】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるブラジレイン重量パーセンテージが0.0284%及び前記組成物におけるグリセロール重量パーセンテージが25.2%である組成物が提供される。
【００６２】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるブラジレイン重量パーセンテージが0.0284%及び前記組成物におけるグリセロール重量パーセンテージが37.8%である組成物が提供される。
【００６３】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるブラジレインのジメチルスルホキシドに対するw/w比が1:2464〜1:316901の範囲にある組成物が提供される。
【００６４】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるDMSO重量パーセンテージが70〜90%の範囲にある組成物が提供される。
【００６５】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるDMSO重量パーセンテージが70%である組成物が提供される。
【００６６】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるDMSO重量パーセンテージが90%である組成物が提供される。
【００６７】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるブラジレインのジメチルスルホキシドに対するw/w比が1:2464.7である組成物が提供される。
【００６８】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるブラジレインのジメチルスルホキシドに対するw/w比が1:3169である組成物が提供される。
【００６９】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるブラジレイン重量パーセンテージが0.0284%及び前記組成物におけるDMSO重量パーセンテージが70%である組成物が提供される。
【００７０】
本開示の実施形態において、本明細書中に記載される通りの組成物であって、前記組成物におけるブラジレイン重量パーセンテージが0.0284%及び前記組成物におけるDMSO重量パーセンテージが90%である組成物が提供される。
【００７１】
本開示の実施形態において、結晶性ブラジレイン((6aS,11bR)-7,11b-ジヒドロ-6H-インデノ[2,1-c]クロメン-3,6a,9,10-テトロール)を得る方法が提供され、前記方法は:(a)スオウから樹皮を得る工程;(b)前記樹皮を処理して粉末にした樹皮を得る工程;(c)前記粉末にした樹皮を少なくとも1種の溶媒と接触させて第1の混合物を得る工程;(d)前記第1の混合物を、第1の混合物の容量が80〜95%低下するまで20〜90℃の範囲の温度に供して第2の混合物を得る工程;(e)第2の混合物を濾過して、(i)ブラジリン及びブラジレインの混合物を含む濾過物;並びに(ii)残留物を得る工程;並びに(f)前記濾過物を空気又は少なくとも1種の酸化剤に22〜85℃の範囲の温度で接触させて残留する溶媒を蒸発させて、結晶形のブラジレインを得る工程を含む。
【００７２】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、スオウ(C.sappan)からの樹皮の含水量が5〜15%の範囲にある方法が提供される。
【００７３】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、スオウからの樹皮の含水量が5〜14%の範囲にある方法が提供される。
【００７４】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、スオウからの樹皮の含水量が5〜12%の範囲にある方法が提供される。
【００７５】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、スオウからの樹皮の含水量が5〜10%の範囲にある方法が提供される。
【００７６】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、スオウからの樹皮の含水量が5〜8%の範囲にある方法が提供される。
【００７７】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、スオウからの樹皮の含水量が5〜6%の範囲にある方法が提供される。
【００７８】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記溶媒が、水、メタノール、エタノール、アセトン、及びその組合せからなる群から選択される方法が提供される。
【００７９】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記溶媒が水である方法が提供される。
【００８０】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記溶媒がエタノールである方法が提供される。
【００８１】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記溶媒がメタノールである方法が提供される。
【００８２】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記溶媒がアセトンである方法が提供される。
【００８３】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記溶媒がメタノール及びエタノールの組合せである方法が提供される。
【００８４】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記溶媒が1:1のv/v比でのメタノール及びエタノールの組合せである方法が提供される。
【００８５】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記溶媒がメタノール及び水の組合せである方法が提供される。
【００８６】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記溶媒が4:1のv/v比でのメタノール及び水の組合せである方法が提供される。
【００８７】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記溶媒がエタノール及び水の組合せである方法が提供される。
【００８８】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記溶媒が4:1のv/v比でのエタノール及び水の組合せである方法が提供される。
【００８９】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記溶媒がメタノール及びアセトンの組合せである方法が提供される。
【００９０】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記溶媒が1:1のv/v比でのメタノール及びアセトンの組合せである方法が提供される。
【００９１】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記溶媒がアセトン及び水の組合せである方法が提供される。
【００９２】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記溶媒が1:1のv/v比でのアセトン及び水の組合せである方法が提供される。
【００９３】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、工程(c)において、前記第1の混合物中の粉末にした樹皮の溶媒に対するw/w比が1:5〜1:20の範囲にある方法が提供される。
【００９４】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、工程(c)において、前記第1の混合物中の粉末にした樹皮の溶媒に対するw/w比が1:20である方法が提供される。
【００９５】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、工程(c)において、粉末にした樹皮量が5gである及び溶媒容量が100mlである方法が提供される。
【００９６】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、工程(c)において、任意選択で、少なくとも1種の酸化剤を第1の混合物に接触させる工程を更に含む方法が提供される。
【００９７】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、工程(c)において、少なくとも1種の酸化剤を第1の混合物に接触させる工程を更に含む方法が提供される。
【００９８】
本開示の実施形態において、結晶性ブラジレイン((6aS,11bR)-7,11b-ジヒドロ-6H-インデノ[2,1-c]クロメン-3,6a,9,10-テトロール)を得る方法が提供され、前記方法は:(a)スオウから樹皮を得る工程;(b)前記樹皮を処理して粉末にした樹皮を得る工程;(c)前記粉末にした樹皮を少なくとも1種の溶媒及び少なくとも1種の酸化剤と接触させて第1の混合物を得る工程;(d)前記第1の混合物を、第1の混合物の容量が80〜95%低下するまで20〜90℃の範囲の温度に供して第2の混合物を得る工程;(e)第2の混合物を濾過して、(i)ブラジリン及びブラジレインの混合物を含む濾過物;並びに(ii)残留物を得る工程;並びに(f)前記濾過物を空気又は少なくとも1種の酸化剤に22〜85℃の範囲の温度で接触させて残留する溶媒を蒸発させて、結晶形のブラジレインを得る工程を含む。
【００９９】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記酸化剤がアセトンである方法が提供される。
【０１００】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、工程(e)(ii)からの前記残留物が:(a)前記残留物を少なくとも1種の溶媒に接触させて第3の混合物を得る工程;(b)第3の混合物を、第1の混合物の容量が80〜95%低下するまで20〜90℃の範囲の温度に供して第4の混合物を得る工程;(c)第4の混合物を濾過して、(i)ブラジリン及びブラジレインの混合物を含む濾過物;並びに(ii)残留物を得る工程;(d)前記濾過物を空気又は少なくとも1種の酸化剤に22〜85℃の範囲の温度で接触させて残留する溶媒を蒸発させて、結晶形のブラジレインを得る工程を含む反復抽出に供される方法が提供される。
【０１０１】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記反復抽出プロセスが3〜5サイクル実行される方法が提供される。
【０１０２】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記反復抽出プロセスが3サイクル実行される方法が提供される。
【０１０３】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記反復抽出プロセスが4サイクル実行される方法が提供される。
【０１０４】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記反復抽出プロセスが5サイクル実行される方法が提供される。
【０１０５】
本開示の実施形態において、結晶性ブラジレインを得る方法が提供され、前記方法は:(a)スオウから樹皮を得る工程;(b)前記樹皮を処理して粉末にした樹皮を得る工程;(c)前記粉末にした樹皮を少なくとも1種の溶媒と接触させて第1の混合物を得る工程;(d)前記第1の混合物を、第1の混合物の容量が80〜95%低下するまで20〜90℃の範囲の温度に供して第2の混合物を得る工程;(e)第2の混合物を濾過して、(i)ブラジリン及びブラジレインの混合物を含む濾過物;並びに(ii)残留物を得る工程;(f)残留物を工程(c)から(i)の3〜5サイクルの抽出に供する工程;(g)濾過物を各抽出サイクルからプールする工程;並びに(f)前記濾過物を空気又は少なくとも1種の酸化剤に22〜85℃の範囲の温度で接触させて残留する溶媒を蒸発させて、結晶形のブラジレインを得る工程を含む。
【０１０６】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記方法が前記粉末にした樹皮100グラム当たり15〜30gの結晶性ブラジレインを産出する方法が提供される。
【０１０７】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記方法が粉末にした樹皮100g当たり20gのブラジレインを産出し、前記溶媒がメタノールである方法が提供される。
【０１０８】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記方法が粉末にした樹皮100g当たり21.5gのブラジレインを産出し、前記溶媒が1:1のv/v比でのメタノール及びエタノールである方法が提供される。
【０１０９】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記方法が粉末にした樹皮100g当たり19gのブラジレインを産出し、前記溶媒が4:1のv/v比でのメタノール及び水である方法が提供される。
【０１１０】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記方法が粉末にした樹皮100g当たり22gのブラジレインを産出し、前記溶媒が4:1のv/v比でのエタノール及び水である方法が提供される。
【０１１１】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記方法が粉末にした樹皮100g当たり18gのブラジレインを産出し、前記溶媒が水である方法が提供される。
【０１１２】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記方法が粉末にした樹皮100g当たり25gのブラジレインを産出し、前記溶媒がエタノールである方法が提供される。
【０１１３】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記方法が粉末にした樹皮100g当たり28.5gのブラジレインを産出し、前記溶媒がアセトンである方法が提供される。
【０１１４】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記方法が粉末にした樹皮100g当たり25gのブラジレインを産出し、前記溶媒が1:1のv/v比でのメタノール及びアセトンである方法が提供される。
【０１１５】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの結晶性ブラジレインを得る方法であって、前記方法が粉末にした樹皮100g当たり26gのブラジレインを産出し、前記溶媒が1:1のv/v比でのアセトン及び水である方法が提供される。
【０１１６】
本開示の実施形態において、試料中の核酸の検出の方法が提供され、前記方法は:(a)本明細書に記載される通りの組成物を得る工程;及び(b)前記組成物を前記試料と接触させる工程を含む。
【０１１７】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの核酸の検出の方法であって、ブラジレインが本明細書に記載される通りのプロセスによって得られる方法が提供される。
【０１１８】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの核酸の検出の方法であって、前記方法は前記試料中の少なくとも500pgのDNAが検出される方法が提供される。
【０１１９】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの核酸の検出の方法であって、前記方法は前記試料中の少なくとも40pgのRNAが検出される方法が提供される。
【０１２０】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの核酸の検出の方法であって、前記方法はDNAの検出に適切である方法が提供される。
【０１２１】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの核酸の検出の方法であって、前記方法はRNAの検出に適切である方法が提供される。
【０１２２】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの核酸の検出の方法であって、前記方法はssDNAの検出に適切である方法が提供される。
【０１２３】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの核酸の検出の方法であって、前記方法はssRNAの検出に適切である方法が提供される。
【０１２４】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの核酸の検出の方法であって、前記方法はプラスミドDNAの検出に適切である方法が提供される。
【０１２５】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの核酸の検出の方法であって、前記方法は線状化プラスミドDNAの検出に適切である方法が提供される。
【０１２６】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの核酸の検出の方法であって、前記方法はPCRアンプリコンの検出に適切である方法が提供される。
【０１２７】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの核酸の検出の方法であって、前記方法は生細胞中のDNAの検出に適切である方法が提供される。
【０１２８】
本開示の実施形態において、本明細書中に記載される通りの核酸の検出の方法であって、前記方法はリアルタイムPCRに適切である方法が提供される。
【０１２９】
本開示の実施形態において、試料中の核酸のin-vitro検出における使用のための、本明細書に記載される通りの組成物が提供される。
【０１３０】
本開示の実施形態において、試料中のDNAのin-vitro検出における使用のための、本明細書に記載される通りの組成物が提供される。
【０１３１】
本開示の実施形態において、試料中のRNAのin-vitro検出における使用のための、本明細書に記載される通りの組成物が提供される。
【０１３２】
本開示の実施形態において、試料中のプラスミドDNAのin-vitro検出における使用のための、本明細書に記載される通りの組成物が提供される。
【０１３３】
本開示の実施形態において、試料中の線状化プラスミドDNAのin-vitro検出における使用のための、本明細書に記載される通りの組成物が提供される。
【０１３４】
本開示の実施形態において、試料中のssDNAのin-vitro検出における使用のための、本明細書に記載される通りの組成物が提供される。
【０１３５】
本開示の実施形態において、PCRアンプリコンのin-vitro検出における使用のための、本明細書に記載される通りの組成物が提供される。
【０１３６】
本開示の実施形態において、リアルタイムPCR増幅のin-vitro検出における使用のための、本明細書に記載される通りの組成物が提供される。
【０１３７】
本開示の実施形態において、試料中の核酸のin-vivo検出における使用のための、本明細書に記載される通りの組成物が提供される。
【０１３８】
本開示の実施形態において、生細胞中のDNAのin-vivo検出における使用のための、本明細書に記載される通りの組成物が提供される。
【０１３９】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの組成物であって、前記組成物が細胞に対して非毒性である組成物が提供される。
【０１４０】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される組成物を含む核酸染色キットが提供される。
【０１４１】
本開示の実施形態において、更に指示書を含む、本明細書に記載される通りの核酸染色キットが提供される。
【０１４２】
本開示の実施形態において、核酸染色キットが提供され、前記キットは本明細書に記載される通りの組成物及び指示書を含む。
【０１４３】
本開示の実施形態において、試料中の核酸のin-vitro又はin-vivo検出における使用のためのブラジレインが提供される。
【０１４４】
本開示の実施形態において、DNAの検出における使用のためのブラジレインが提供される。
【０１４５】
本開示の実施形態において、RNAの検出における使用のためのブラジレインが提供される。
【０１４６】
本開示の実施形態において、プラスミドDNAの検出における使用のためのブラジレインが提供される。
【０１４７】
本開示の実施形態において、PCRアンプリコンの検出における使用のためのブラジレインが提供される。
【０１４８】
本開示の実施形態において、線状化DNAの検出における使用のためのブラジレインが提供される。
【０１４９】
本開示の実施形態において、一本鎖のDNAの検出における使用のためのブラジレインが提供される。
【０１５０】
本開示の実施形態において、共焦点顕微鏡を使用する核酸の検出における使用のためのブラジレインが提供される。
【０１５１】
本開示の実施形態において、蛍光活性化セルソーティングにおける使用のためのブラジレインが提供される。
【０１５２】
本開示の実施形態において、蛍光in situハイブリダイゼーションにおける使用のためのブラジレインが提供される。
【０１５３】
本開示の実施形態において、本明細書に記載される通りの核酸の検出における使用のためのブラジレインが提供され、ここで、ブラジレインは本明細書に記載される通りの方法によって調製される。
【０１５４】
主題は、その特定の好ましい実施形態に関連して、かなり詳細に記載してきたが、他の実施形態も可能である。
【実施例】
【０１５５】
開示はここに実施例によって例証され、これは開示の実施を例証することが意図され、本開示の範囲における何らかの限定を意味するように制限的に解釈することは意図されない。別段の定義が無い限り、本明細書において使用されるすべての技術的及び科学的用語は、この開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同様又は等価の方法及び材料を開示された方法及び組成物の実施において使用することができるが、例示的な方法、装置及び材料が本明細書に記載される。方法及び条件は変動しうるため、この開示が、記載された特定の方法及び実験条件に限定されないことが理解されるべきである。
【０１５６】
(実施例1)
様々な溶媒を使用するスオウ樹皮からのブラジレインの単離。
100グラムの陰干ししたスオウ樹皮組織を、ブラジレイン抽出のための供給源/原材料として使用した。樹皮組織を、機械的に粉末にし、引き続いて溶媒としての蒸留水中に混合し(500〜2000ml)、総溶液容量を初期容量の20%まで低下するまで加熱(約80℃)した。この溶液を、濾紙又はモスリン布等を使用すること等の単純な濾過技術によって濾過して濾過物及び残留物を得た。濾過物を、収集し、ブラジリンからブラジレインに酸化させるため、3から5日間室温(22〜30℃)で放置した。溶媒を、加熱すること又は3から5日間放置することのいずれかによる蒸発によって除去し、ブラジリンからブラジレインに完全に酸化させた。この期間の間、酸化型ブラジレインも乾燥させて結晶性粉末を形成させた。ブラジレイン抽出を最大にするために、濾過後に得られた残留物に上述の通り反復抽出を供して第2の濾過物を得た。この反復抽出を3〜5回実行して複数の濾過物を得て、これを引き続いて酸化型ブラジレインの単離のためにプールした。
【０１５７】
上述の通りのプロセスを、溶媒(上で示した通り水)を(a)メタノール;又は(b)1:1のv/v比でのメタノール及びエタノールの混合物;又は(c)4:1のv/v比でのメタノール及び水の混合物;又は(d)4:1のv/v比でのエタノール及び水の混合物;又は(e)エタノール;又は(f)アセトン;又は(g)1:1のv/v比でのアセトン及びメタノールの混合物;又は(h)1:1のv/v比でのアセトン及び水の混合物で置換することによっても実行した。
【０１５８】
様々なプロセスを使用する単離後のブラジレイン収率は、以下のTable 1(表1)に示される通りである。Table 1(表1)は、加熱時間も提供する。粉末にした樹皮の溶媒に対するw/v比を、20:1に保った。加熱時間は、溶媒の容量及び選択に応じて変動することが理解される。
【０１５９】
【表１】
2018521645.tif 000002
【０１６０】
上記Table 1(表1)において認められる通り、様々な溶媒を使用する収率は、粉末にした樹皮100g当たり18〜28.5gの範囲である。最大の収率はブラジレインのアセトン抽出物の場合に認められうる、それによって100gの粉末にした樹皮は28.5gのブラジレインを提供する。
【０１６１】
ブラジレインの純度及び熱安定性を、20ulの参照容量を使用するHPLC(図1a、ブラジレインの水抽出物)及びGC分析(図1b、ブラジレインのメタノール抽出物)で確認した。精製した結晶を、溶媒中に再度溶解させ、HPLC、GC-MS及びMS-MS(図1c)に供し、ブラジレインの分子量に対応する単一の主要なピークがもたらされた。HPLCプロファイル中の各ピークの面積積分を使用して生産濃度を見積った。精製した化合物の構造を、示される通りGC及び質量スペクトル分析によって確認した。
【０１６２】
(実施例2)
ブラジレインの蛍光発光スペクトル
図2aにおいて認められる通り、ブラジレインのメタノール性抽出物は、450nm(励起波長340nm)で最大発光を有する蛍光発光スペクトルを有する。図2bは、ブラジレインのメタノール性抽出物は、560nm(励起波長491nm)で最大発光を有する蛍光発光スペクトルを有することを示す。これらのデータは、ブラジレインを使用する核酸検出が、UVトランスイルミネーター及びゲルドキュメンテーションシステム等の現存の技術を使用して効果的に捕捉できることを示唆する。蛍光スペクトルは、in vivoイメージング及び共焦点顕微鏡観察においての用途も見出すことができる。
【０１６３】
(実施例3)
ブラジレインの核酸染色活性
DNAの蛍光支援可視化におけるブラジレインの有用性を確かめるため、50〜250ngの範囲の様々な量のDNAラダーを、臭化エチジウム(EtBr)(50μg/50mlの染色容量)(図3a)、又はSYBR(登録商標)Gold(図3b)、又はtm(ブラジレインのメタノール性抽出物)(1mMブラジレイン)(図3c)、又はte(ブラジレインのエタノール性抽出物)(1mMブラジレイン)(図3d)で染色した。tm又はteが、100〜250ngのDNA濃度で、EtBr又はSYBR(登録商標)Goldよりもより鮮明にDNAを染色することを図3a〜図3dから推測することができる。しかし、te及びtmは、EtBr又はSYBR(登録商標)Goldによって染色されない25〜50ngのDNA濃度も効果的に染色でき、このことは試験した濃度でブラジレインはDNAの蛍光可視化に関してDNAを染色することに有効であるのみならず、試験した濃度でEtBr又はSYBR(登録商標)Goldよりもより感度が高いとの事実を示唆する。
【０１６４】
ブラジレイン(tm)は、図3eに示す通りRNA(最小RNA濃度40ng、320ngまで)も染色することができる。更に、図3eにおいて認められる通り、臭化エチジウムの染色感度と比べて、tmが(1mM)RNAをより強く染色することが認められうる(RNAは、TRIZOL法を使用して大腸菌(E.coli)から単離された;A260/A280=2.04;量=3000ng/ml)。
【０１６５】
ブラジレインの様々な抽出物(1mM/50mlの染色容量)(tw:ブラジレインの水抽出物;te:ブラジレインのエタノール性抽出物;tm:ブラジレインのメタノール性抽出物)はまた、図3fに示される通りPCRにより又はPCRから生成されるDNA断片を効率的に染色することができる。図3fにおいて認められる通り、ブラジレインの様々な抽出物(tw、又はte、又はtm)は、100〜300ngの範囲の濃度で2kb単位複製配列を(標準で(at par))染色でき、これは臭化エチジウムの染色効能に匹敵する。
【０１６６】
図4a〜図4cに示す通り、ブラジレインはまた、核酸の様々なタイプ/形態を染色することができる。図4aは、0.2〜1mg/mlの範囲のDNA濃度でのプラスミドDNAの染色を示す。図4bは、ブラジレインがゲノムDNA(250〜500ng試験)を効果的に染色することができることを示す。図4cに示す通り、ブラジレインはまた、ssDNAを染色することができる。更に、図4dに示す通り、ブラジレイン(1μlの1mMブラジレインストック溶液/50mlの染色溶液)はまた、RNAを染色することができる(レーン当たり200μg RNA。サイズの差は2つの異なるRNA調製に起因する)。使用したブラジレイン色素の量は、1mMであった。
【０１６７】
(実施例4)
ブラジレインの染色感度
本開示において前に記載された通り、アガロースゲル中のブラジレインの染色感度を、メタノール(tm)、エタノール(te)、又は水(tw)を使用して抽出されたブラジレインを使用してアガロースゲル中で200pg〜4ngの範囲の様々な量のDNA断片を染色することによって決定した。
【０１６８】
図5aにおいて認められる通り、te(1mM)(ブラジレインのエタノール抽出物)、及びtw (ブラジレインの水抽出物)は、1ng DNAを検出できる。しかし、ブラジレインのメタノール抽出物(tm)は、1ngのDNAを検出できない。
【０１６９】
より低いDNA濃度、200〜800pgの範囲(図5b)で、バンドは、tm、te、又はtwに関して400pgまで低いDNA濃度について目視可能であったが、より低い濃度での染色は信頼性がなく、色素の感度が約200pgであることを示唆している。
【０１７０】
(実施例5)
ブラジレイン及び臭化エチジウム(EtBr)の蛍光比較
広く一般に使用される化合物である、EtBrと比較してDNA可視化剤としてのブラジレインの優位性を確かめるため及び確立するため、様々なブラジレイン抽出物及びEtBrの濃度依存的な蛍光を評価した。
【０１７１】
図6aは、1〜20μMの範囲の濃度でのEtBrの蛍光強度を示し、その結果は、以下のTable 2(表2)に表形式で提示される。
【０１７２】
【表２】
2018521645.tif 000003
【０１７３】
図6bは、1〜20μMの範囲の濃度でのブラジレインのメタノール性抽出物の蛍光強度を示し、その結果は、以下のTable 3(表3)に表形式で提示される。
【０１７４】
【表３】
2018521645.tif 000004
【０１７５】
図6cは、1〜20μMの範囲の濃度でのブラジレインのエタノール性抽出物の蛍光強度を示し、その結果は、以下のTable 4(表4)に表形式で提示される。
【０１７６】
【表４】
2018521645.tif 000005
【０１７７】
図6a〜図6c及びTable 2(表2)〜Table 4(表4)から認められる通り、臭化エチジウムに匹敵する濃度でのブラジレインにより、有意に高い蛍光強度を与えることを容易に理解することができ、ブラジレインが臭化エチジウムに対する優れた代替物であることを示唆している。
【０１７８】
(実施例6)
ブラジレイン蛍光におけるpHの効果
様々なpH条件下で、色素としてのブラジレインの用途を決定するため、蛍光強度における5〜10の範囲の様々なpHの効果を研究した(図7a〜図7f)。
【０１７９】
図7aは、5のpHでのブラジレイン(te)の抽出物の様々な濃度(5〜25μM)の蛍光強度を図示する。図7aにおいて認められる通り、pH5で、teの蛍光強度は、試験した全ての濃度で非常に乏しく、ブラジレインが、少なくとも試験した様々な濃度で5のpHでインジケーター色素として信頼性をもって使用することはできないことを示唆している。
【０１８０】
図7bは、6のpHでのブラジレイン(te)のエタノール性抽出物の様々な濃度(5〜25μM)の蛍光強度を図示する。図7bにおいて認められる通り、pH6で、25μMの濃度で、teに関して約40AUの最大の強度が観察された。teは20μM濃度で約30AUの蛍光強度を示すが、残りは強度<20AUを示す。
【０１８１】
図7cは、7のpHでのブラジレイン(te)のエタノール性抽出物の様々な濃度(5〜25μM)の蛍光強度を図示する。図7cにおいて認められる通り、teは25μM濃度で約110AUの強度を示すが、teは20μM濃度の濃度で約80AUの強度を示す。
【０１８２】
図7dは、8のpHでのブラジレイン(te)のエタノール性抽出物の様々な濃度(5〜25μM)の蛍光強度を図示する。図7dにおいて認められる通り、teは25μM濃度で約250AUの強度を示すが、teは20μMの濃度で約180AUの強度を示す。teは15μMの濃度で約120AUの強度を示す。
【０１８３】
図7eは、9のpHでのブラジレイン(te)のエタノール性抽出物の様々な濃度(5〜25μM)の蛍光強度を図示する。図7eにおいて認められる通り、teは25μM濃度で約450AUの強度を示すが、teは20μMの濃度で約350AUの強度を示す。teは15μMの濃度で約250AUの強度を示すが、teは10μMの濃度で約150AUの強度を示す。
【０１８４】
図7fは、10のpHでのブラジレイン(te)のエタノール性抽出物の様々な濃度(5〜25μM)の蛍光強度を図示する。図7fにおいて認められる通り、teは25μMの濃度で約200AUの強度を示すが、teは20μMの濃度で約150AUの強度を示し、teは15μMの濃度で約110AUの強度を示す。
【０１８５】
全体的に、図7a〜図7fに基づき、ブラジレイン(te)が、5〜10の範囲の広範囲のpHにわたって、20〜25μMの濃度での使用に適切な蛍光色素であることを理解することができる。ブラジレインは、7〜9の範囲のpHで最も有効であり、それによって高い蛍光強度が、試験した通り、より低い濃度でさえも観察される。
【０１８６】
(実施例7)
ブラジレインの増強した蛍光活性
グリセロール、又はナトリウム塩若しくはマグネシウム塩等の特定の分子の存在によって、蛍光強度が増強することは、驚くべき予想外の発見であった。図8において認められる通り、5μMのブラジレインのメタノール性抽出物(tm)は、約200AUの最大蛍光強度をもたらしたが、tmの組合せ(ブラジレインのメタノール性抽出物及びグリセロール、ここで、wt%(wt % age)が約25%であり、ブラジレインwt%が約0.00003%である)で、観察された蛍光強度は約550AUであり、これはブラジレイン単独の効果よりも約2.75倍高い。グリセロール単独では、DNAの検出に関して何らかの有意な蛍光活性を有さないため、この観察された増強は予想外であり驚くべきことである。
【０１８７】
金属イオンが、安定な複合体を形成すること又は電荷を変化させることによって、アジュバントとして作用すること及び分子における蛍光を増強させることが知られているため、様々な金属イオンを、ブラジレインの蛍光強度における、それらの効果についても評価した。図9において認められる通り、(1mM)の濃度でのブラジレインと共に、100μMの濃度で試験された様々な金属イオンの中で、ナトリウム及びマグネシウムを除き、試験した他のイオンのいずれもが、tm(ブラジレインのメタノール性抽出物)の蛍光活性を増強しないことが観察された。実際に、他のイオンの存在が作用してブラジレインの蛍光強度を阻害することを理解することができる。
【０１８８】
図10においてより明らかに認められる通り、10μMの濃度でのナトリウムイオン(塩化ナトリウム)の存在によって、ブラジレイン(tm:ブラジレインのメタノール性抽出物)濃度が1mMで、蛍光強度は約3倍高い。同様に、図11に示す通りマグネシウムイオン(硫酸マグネシウム)の存在下で、蛍光強度は、tm(ブラジレインのメタノール性抽出物)単独によって生成される強度と比べて、約4倍超高い。ナトリウム又はカリウムが、核酸の検出において補助となりうる何らかの有意な蛍光特性を授けることは知られていない。
【０１８９】
これらの図は、集団的に、グリセロール又はナトリウム若しくはカリウムイオンの存在が、予想外に且つ驚くべきことに、ブラジレインの蛍光強度において明らかな相乗的増加をもたらすことを示す。
【０１９０】
(実施例8)
ブラジレインの細胞毒性
変異誘発物質である臭化エチジウムに対する適切な代替物としてのブラジレインの安全性を評価するため、様々な濃度のブラジレイン又はグリセロール若しくは金属イオンとの組合せを、HeLa細胞生存率において試験した。
【０１９１】
MTTアッセイを、標準プロトコールにより行った。一番最初に、培養したHeLa細胞を、トリプシン処理後に培地中に収集した。培養を、別の20ml培地で希釈して細胞数を、およそ100μL当たり10000細胞まで低下させた。細胞を、血球計数器を使用して計数した。100μLの培養物を、96ウェルプレートの各ウェルに採取し、一晩付着させた。次の日、HeLa細胞を、異なる濃度のブラジレイン(0.152〜10μM)で24h、続いてMTT(3-(4-5ジメチルチオゾール-2-イル)2-5ジフェニル-テトラゾリウムブロミド)処理(4mg/mL)で4h、37℃で処理した。紫色結晶の出現を観察し、穏やかに培地をウェルから吸引した。200μLのDMSOを添加して、結晶を溶解させた。暗所での15分間のインキュベート後、吸光度測定をUV可視分光光度計において540nmで行った。細胞生存率パーセントを、使用した色素の濃度に対して各セット(未処理及び処理)についてプロットした。
【０１９２】
図12aにおいて、twはブラジレインの水抽出物を指し、tw(gly)はブラジレインの水抽出物及びグリセロールを指し、tw+Naはブラジレインの水抽出物及びナトリウム塩を指し、一方、tw+Mgはブラジレインの水抽出物及びマグネシウム塩を指す。図12aにおいて認められる通り、様々な組合せを、0.156〜10μMの範囲の濃度で試験した。試験した最高濃度(10μM)でさえも、試験した全ての組合せが安全であること及び細胞生存率に有意に影響しないことを観察することができる。
【０１９３】
図12bにおいて、tmはブラジレインのメタノール性抽出物を指し、tm(gly)はブラジレインのメタノール性抽出物及びグリセロールを指し、tm+Naはブラジレインのメタノール性抽出物及びナトリウム塩を指し、一方、tm+Mgはブラジレインのメタノール性抽出物及びマグネシウム塩を指す。図12bにおいて認められる通り、様々な組合せを、0.156〜10μMの範囲の濃度で試験した。試験した最高濃度(10μM)でさえも、試験した全ての組合せが安全であること及び細胞生存率に有意に影響しないことを観察することができる。図12a〜図12bに示す通りのデータは、ブラジレインが、安全な色素であり、試験した濃度で、何らかの細胞毒性効果なく、使用することができることを示す。
【０１９４】
(実施例9)
生体試料の染色の方法
本開示に記載される通りのブラジレイン組成物(染料)は、uvトランスイルミネーターシステム(UV)における可視化に関して、アガロースゲル中のDNAの染色に使用されてもよい。染色は、染料を負荷前のDNAに直接的に負荷すること;又は、染料をゲル化前のアガロースに添加すること;又は、染料を電気泳動後にゲルに添加することのいずれかによって実行することができる。染料(500ng/ml)がDNA移動後のゲルに添加されたときに、可視化はインキュベーションの30〜60秒以内に実行することができ、これは有効なDNA結合のためどこででも10〜30分間かかる臭化エチジウムよりも有意に速いことが観察された。負荷前のDNAに直接的に添加される場合にDNAに結合するため必要とされる最適な染料の量は、50ng/250pgDNAになることが見出された。
【０１９５】
(実施例10)
蛍光/共焦点顕微鏡
蛍光顕微鏡を、タマネギ上皮細胞におけるブラジレインでの生細胞染色を分析することに使用した。手短に述べると、タマネギの皮を、丁寧にむき、透過化処理細胞及び非透過化処理細胞の2つの部分に分けた。非透過化処理については細胞を水に10分間浸漬したが、透過化処理については細胞をホルマリンに10分間浸漬した。皮をとり、異なる濃度のブラジレインのメタノール抽出物(500nM〜1mM)に浸し、暗所で15分間インキュベートした。インキュベートした試料を取り、スライドガラスに配置し、カバーガラスをその上に配置し、シールして試料の乾燥を回避した。スライドを、蛍光顕微鏡下で可視化した。図13において認められる通り、10μMブラジレインは、タマネギ上皮細胞の核を染色でき、これは、ブラジレインが、細胞に浸透し、最小のバックグラウンドで、特異的に細胞の核を均一に且つ信頼性をもって染色することができることを示す。ブラジレインが非透過化処理細胞においても核を染色できるため、細胞透過化処理が必須の要件ではないことが更に観察された。更に、ブラジレインの全ての抽出物(前に記載された通り、水、エタノール、アセトン、又はその組合せ)は、細胞中の核を染色でき、図13の代表的な画像は、最良の結果を示す、ブラジレインのメタノール性抽出物を図示する。細胞の核の染色のため必要とされるブラジレインの濃度に関しては、10μMブラジレインが最適であると推定された。10μMを下回る濃度によりかすかな蛍光シグナルがもたらされるが、10μMよりも高い濃度により、より高いノイズ及びバックグラウンドがもたらされる。
【０１９６】
(実施例11)
蛍光活性化セルソーティング(FACS)
細胞周期研究において適用可能であるので、FACS分析を使用して固定された及び未固定の細胞への色素の侵入を分析した。サルモネラ(Salmonella)細胞を、トリプシンを使用して適切な様式で採取した。細胞培養中のトリプシン処理した細胞を、1300rpmで5分間遠心分離して細胞をペレットダウンした。細胞を固定するため、70%冷エタノールを、細胞に添加した。固定を、30分間4℃で行った。200μlのブラジレイン(メタノール性抽出物)(50μg/ストック溶液mlから)。細胞を再び1300rpmで5分間室温で回転させ、上清をデカントした。細胞を透過化処理するため、1Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)及びサポニン(0.1%)の混合物を添加し、5分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、PBSを細胞に与えることで洗浄してサポニンを除去した。細胞を、リボヌクレアーゼ(100μg/mL)の1μg/mL作業濃度で処理して、RNAではなく、DNAのみが染色されることを確実にした。エタノール及びサポニンの細胞への添加を除き、未固定の細胞も同じプロセスに従った。異なる濃度のブラジレイン(500nΜ〜10μM)を添加し、15分間室温でインキュベートし、チューブをFACS分析に供した。図14bに示す通りのデータは、ブラジレイン(5μM)(飽和濃度)が生きた細菌細胞全体の96.8%に侵入したことを明らかにし、したがってFACS研究についてブラジレインを使用することの有効性を示している(図14aは対照細胞であり、何らかの色素で処理されていない)。
【０１９７】
(実施例12)
ブラジレインを使用する生細胞染色
生細胞の染色におけるブラジレインの有用性を決定するため、酵母細胞を、1mMブラジレインで染色し、共焦点顕微鏡下で40Xの拡大率で観察した。細胞を、最適な可視化条件を確かめるため、様々なフィルター下で可視化した。図15aに示す通り、緑色フィルターは、細胞の核の物質のかすかな可視化を示す。図15bは、細胞の位相差画像である。図15cは赤色フィルターを使用する細胞可視化を図示するが、図15dは遠赤外フィルターを使用して細胞を図示する。図15a、図15c、及び図15dから、赤色フィルターが、細胞(核の物質)を可視化するのに最も適切であることが示唆される。図15eは、図15a〜図15dの統合した画像である。全体的に、これらのセットの図は、ブラジレインが、生細胞中の核を染色するための色素として使用できること及び共焦点顕微鏡の赤色チャンネルにおいて可視化できることを明らかにする。
【０１９８】
(実施例13)
蛍光in-situハイブリダイゼーション(FISH)
図16に示す通り、ブラジレインは、FISH(当技術分野において知られている標準プロトコール)についても使用することができる。図16から推測される通り、10μMブラジレインは、ヒト細胞の染色体を効果的に染色することができる。
【０１９９】
全体的に、本開示は、ゲル染色、生細胞染色、FISH、FACS、及び蛍光顕微鏡等の種々の方法を使用する、DNA及びRNA等の核酸の可視化のための色素としての使用のためのブラジレインを提供する。本開示はまた、有用な供給源であると先行技術において報告されてこなかった、スオウの樹皮からのブラジレインの溶媒媒介抽出の費用及び時間効率の高い方法を提供する。加えて、驚くべき且つ予想外のことに、ブラジレインは、グリセロール、DMSO、又は金属塩等の特定の添加物の存在下では、その蛍光強度が相乗的に増強することも観察され、本明細書に開示された。本明細書に開示された通りの核酸色素としてのブラジレインは、非毒性で感度が高く、DNA可視化のため生細胞において使用することができ、生存可能であり、既知の変異誘発物質である臭化エチジウム等の他の染料又は同様に変異誘発物質であり且つ高価であるSYBR(登録商標)Gold等の染料の優れた代替物である。したがって、本開示の組成物は、安全で且つより感度の高い代替物である。
【図１】
2018521645.tif 000006
【図２】
2018521645.tif 000007
【図３ａ】
2018521645.tif 000008
【図３ｂ】
2018521645.tif 000009
【図３ｃ】
2018521645.tif 000010
【図３ｄ】
2018521645.tif 000011
【図３ｅ】
2018521645.tif 000012
【図３ｆ】
2018521645.tif 000013
【図４ａ】
2018521645.tif 000014
【図４ｂ】
2018521645.tif 000015
【図４ｃ】
2018521645.tif 000016
【図４ｄ】
2018521645.tif 000017
【図５】
2018521645.tif 000018
【図６】
2018521645.tif 000019
【図７】
2018521645.tif 000020
【図８】
2018521645.tif 000021
【図９】
2018521645.tif 000022
【図１０】
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【図１１】
2018521645.tif 000024
【図１２】
2018521645.tif 000025
【図１３】
2018521645.tif 000026
【図１４】
2018521645.tif 000027
【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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2018521645.tif 000031
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