(57)【要約】【課題】屈折異常に対するＬおよびＭ錐体オプシン遺伝子におけるスプライシングエラーの影響は不明である。【解決手段】  オプシン遺伝子エクソン３スプライシング欠損の存在に基づいて屈折異常に対する対象の素因を判定するための方法および試薬が提供される。ある態様において、本発明は、屈折異常に対する対象の素因を判定するための方法であって、（ａ）１つ以上のオプシン遺伝子におけるエクソン３スプライシング欠損を判定するために対象から得られた生体試料を試験すること；および（ｂ）１つ以上のオプシン遺伝子におけるエクソン３スプライシング欠損を屈折異常に対する素因と相関させることを含む方法を提供する。【選択図】図１
2018512121.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
屈折異常に対する対象の素因を判定するための方法であって、
（ａ）１つ以上のオプシン遺伝子におけるエクソン３スプライシング欠損を判定するために前記対象から得られた生体試料を試験すること；および
（ｂ）１つ以上のオプシン遺伝子において前記エクソン３スプライシング欠損を屈折異常に対する素因と相関させること
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記試験することが、エクソン３−スキッピングオプシン遺伝子ｍＲＮＡ（「ＥＸ３（−）ｍＲＮＡ」）と比較した全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡの相対量を決定するために、前記対象から得られた前記生体試料を試験することを含み；
前記相関させることが、ＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対する前記全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡの相対量を屈折異常に対する素因と相関させることを含む、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、ＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対する全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡの相対量を決定することが、
（ｉ）前記生体試料中に存在するオプシン遺伝子ｍＲＮＡのｃＤＮＡから、エクソン３にまたがる増幅産物を生成させること；および
（ｉｉ）全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡに対応する増幅産物およびＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対応する増幅産物を検出すること
を含む、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記増幅産物を検出することが、エクソン３の末端に隣接した前記増幅産物に結合するプライマーを使用して、前記増幅産物からプライマー伸長産物を生成させることを含む、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記プライマー伸長産物がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦ質量分析により検出される、方法。
【請求項６】
請求項２に記載の方法であって、ＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対する全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡの相対量を決定することが、
（ｉ）前記生体試料中に存在するオプシン遺伝子ｍＲＮＡのｃＤＮＡを生成させること；および
（ｉｉ）全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡおよびＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを検出すること
を含む、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記検出することが、
（ｉ）前記ｃＤＮＡの増幅に適切な条件下で、エクソン３にまたがり、１つ以上のオプシン遺伝子を選択的に増幅可能であるプライマー対と前記ｃＤＮＡを接触させることおよび
（ｉｉ）全長ｃＤＮＡ増幅産物を含む増幅産物の第１の集団およびＥＸ３（−）増幅産物を含む増幅産物の第２の集団を生成させるために前記ｃＤＮＡを増幅させること
を含む、方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法であって、前記検出することが、（Ｉ）全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ；および（ＩＩ）ＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡの両方と相補的な全長配列を有するプローブと前記ｃＤＮＡを接触させることを含み、前記接触させることが、前記ｃＤＮＡへの前記プローブのハイブリッド形成に適切な条件下で行われる、方法。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載の方法であって、前記１つ以上のオプシン遺伝子がＬ−オプシン遺伝子を含む、方法。
【請求項１０】
請求項１〜８の何れか１項に記載の方法であって、前記１つ以上のオプシン遺伝子がＭ−オプシン遺伝子を含む、方法。
【請求項１１】
屈折異常に対する対象の素因を判定するための方法であって、
（ａ）ＬまたはＭオプシン遺伝子の位置１５３、１７１、１７４、１７８および１８０でコードされるアミノ酸に対するものとして指定されるＬＩＶＶＡ（配列番号１）を含むオプシン遺伝子変異体を同定するために、前記対象から得られた生体試料を試験すること；および
（ｂ）前記オプシン遺伝子変異体を屈折異常に対する素因と相関させること
を含む、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記オプシン遺伝子変異体がＬＩＶＶＡ（配列番号１）／ＧＣＧＡＴＣＧＧである、方法。
【請求項１３】
請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法であって、前記屈折異常が青錐体一色型色覚である、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法であって、前記屈折異常が近視である、方法。
【請求項１５】
請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法であって、前記屈折異常が強度近視である、方法。
【請求項１６】
請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法であって、前記屈折異常が若年発症型近視である、方法。
【請求項１７】
対象において屈折異常を処置する方法であって、
（ａ）請求項１〜１６の何れか１項に記載の方法に従い、屈折異常に対する対象の素因を判定すること；および
（ｂ）屈折異常の進行を遅くするために前記対象を処置すること
を含む、方法。
【請求項１８】
１つ以上のヒトオプシン遺伝子の検出可能部分を選択的に増幅可能なプライマー対を含むかまたはこれからなる組成物であって、前記検出可能部分がエクソン３を含む、組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組成物であって、前記プライマー対が、
（ａ）配列番号１４（エクソン２）ヌクレオチド１〜８１、８３〜１８７、１８９〜２１８、２２０〜２３２または２４４〜３０７の１２個以上の連続ヌクレオチドまたはその完全相補体を含む第１のプライマーと；
（ｂ）配列番号１５（エクソン４）ヌクレオチド１〜１１０または１２９〜１６６）の１２個以上の連続ヌクレオチドまたはその完全相補体を含む、第２のプライマー対と、
を含む、組成物。
【請求項２０】
請求項１８に記載の組成物であって、前記プライマー対が、
（ａ）配列番号１１（エクソン１）の１２個以上の連続ヌクレオチドまたはその完全相補体を含む第１のプライマーと；
（ｂ）配列番号１２（エクソン６）の１２個以上の連続ヌクレオチドまたはその完全相補体を含む第２のプライマー対と、
を含む、組成物。
【請求項２１】
請求項１８〜２０の何れか１項に記載の組成物であって、前記プライマー対または前記プローブが検出可能に標識される、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる、２０１５年２月２７日提出の米国特許仮出願第６２／１２６，２８４号明細書の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
多くのヒト疾患が、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび網膜色素変性症を含む、遺伝子−スプライシングエラーを含む。それぞれＯＰＮ１ＬＷおよびＯＰＮ１ＭＷと呼ばれるＬおよびＭ錐体オプシン遺伝子は、ＬおよびＭ感光色素をコードし、それぞれが、エクソン２、３および４の配列において変動性が高い。近年、Ｕｅｙａｍａら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４２４，１５２，２０１２）は、赤緑色覚異常と関連がある錐体オプシン遺伝子の変異体が、最終的なｍＲＮＡからエクソン３を欠如させるスプライシングエラーにつながったことを見出した。しかし屈折異常に対するＬおよびＭ錐体オプシン遺伝子におけるスプライシングエラーの影響は不明である。
【発明の概要】
【０００３】
ある態様において、本発明は、屈折異常に対する対象の素因を判定するための方法であって、
（ａ）１つ以上のオプシン遺伝子におけるエクソン３スプライシング欠損を判定するために前記対象から得られた生体試料を試験すること；および
（ｂ）１つ以上のオプシン遺伝子におけるエクソン３スプライシング欠損を屈折異常に対する素因と相関させること
を含む、方法を提供する。
【０００４】
ある実施形態において、試験することは、エクソン３−スキッピングオプシン遺伝子ｍＲＮＡ（「ＥＸ３（−）ｍＲＮＡ」）と比較した全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡの相対量を決定するために、対象から得られた生体試料を試験することを含み；相関させることは、ＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対する全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡの相対量を屈折異常に対する素因と相関させることを含む。さらなる実施形態において、ＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対する全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡの相対量を決定することは、（ｉ）生体試料中に存在するオプシン遺伝子ｍＲＮＡのｃＤＮＡから、エクソン３にまたがる増幅産物を生成させること；および（ｉｉ）全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡに対応する増幅産物およびＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対応する増幅産物を検出することを含む。さらなる実施形態において、増幅産物を検出することは、エクソン３の末端に隣接した増幅産物に結合するプライマーを使用して、増幅産物からプライマー伸長産物を生成させることを含む。
【０００５】
別の実施形態において、ＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対する全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡの相対量を決定することは、（ｉ）生体試料中に存在するオプシン遺伝子ｍＲＮＡのｃＤＮＡを生成させること；および（ｉｉ）全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡおよびＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを検出することを含む。ある実施形態において、検出することは、（ｉ）ｃＤＮＡの増幅に適切な条件下で、エクソン３にまたがり、１つ以上のオプシン遺伝子を選択的に増幅可能であるプライマー対とｃＤＮＡを接触させることおよび（ｉｉ）全長ｃＤＮＡ増幅産物を含む増幅産物の第１の集団およびＥＸ３（−）増幅産物を含む増幅産物の第２の集団を生成させるためにｃＤＮＡを増幅させることを含む。別の実施形態において、検出することは、（Ｉ）全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ；および（ＩＩ）ＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡの両方と相補的な全長配列を有するプローブとｃＤＮＡを接触させることを含み、接触させることは、ｃＤＮＡへのプローブのハイブリッド形成に適切な条件下で行われる。
【０００６】
様々な実施形態において、１つ以上のオプシン遺伝子は、Ｌ−オプシン遺伝子、Ｍ−オプシン遺伝子または両方である。
【０００７】
別の態様において、本発明は、屈折異常に対する対象の素因を判定するための方法であって、
（ａ）ＬまたはＭオプシン遺伝子の位置１５３、１７１、１７４、１７８および１８０でコードされるアミノ酸に対するものとして指定されるＬＩＶＶＡ（配列番号１）を含むオプシン遺伝子変異体を同定するために、対象から得られた生体試料を試験すること；および
（ｂ）オプシン遺伝子変異体を屈折異常に対する素因と相関させること
を含む方法を提供する。
【０００８】
ある実施形態において、オプシン遺伝子変異体は、ＬＩＶＶＡ（配列番号１）／ＧＣＧＡＴＣＧＧを含む。
【０００９】
別の実施形態において、本方法は、（ａ）本発明の何れかの実施形態または実施形態の組み合わせの方法に従い、対象の屈折異常に対する素因を判定すること；および（ｂ）屈折異常の進行を遅くするために対象を処置することを含む、対象において屈折異常を処置することを含む。
【００１０】
別の態様において、本発明は、１つ以上のヒトオプシン遺伝子の検出可能部分を選択的に増幅可能なプライマー対を含むかまたはこれからなり、検出可能部分がエクソン３を含む、組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】通常のオプシン変異体がある対象（ｎ＝５）およびその唯一のＸ染色体オプシン遺伝子としてＬＩＡＶＡ（配列番号２）変異体がある対象の平均からの、オン−オフＬ／Ｍ錐体単独ＥＲＧ。
【図２】２名のＬＩＡＶＡ（配列番号２）対象に対する完全エクソン３スキッピング、２名のＬＶＡＶＡ（配列番号４）対象に対する両エクソン３包含およびスキッピングおよび対照対象に対する完全なエクソン３包含を示すミニ遺伝子アッセイ。
【図３】正常なオプシン遺伝子（ｎ＝５、黒色トレース）の対象の平均と比較した、唯一のＸ染色体オプシン遺伝子としてＬＶＡＶＡ（配列番号４）オプシン遺伝子がある２名の対象（ｎ＝２、灰色トレース）からの平均Ｌ／Ｍ−錐体単独オン・オフＥＲＧ。
【図４】Ａ．ＬＩＡＩＳ（配列番号５）変異体に対するヒトｃＤＮＡおよびＬＶＡＶＡ（配列番号４）変異体に対するヒトｃＤＮＡで内在マウスＸ−染色体オプシン遺伝子が置き換えられているマウスからのＬ／Ｍ錐体単独オン・オフＥＲＧ。各データ点は、１０匹のマウスに対する平均ＥＲＧｂ−波振幅である。１．５か月時点に対して使用したマウスを除き、データは、各変異体に対する、マウスの同じ群の長期的研究である。Ｂ．ＬＩＡＩＳ（配列番号５）対ＬＶＡＶＡ（配列番号４）マウスに対する強度応答機能。点線は、ＬＩＡＩＳ（配列番号５）対ＬＶＡＶＡ（配列番号４）マウスに対して６マイクロボルトの応答を引き出すために必要とされる光強度の相違を示し、これは、ＬＶＡＶＡ（配列番号４）変異体の機能不全の目安である。両パネルについて、黒色の印はＬＩＡＩＳ（配列番号５）マウスに対するものであり、灰色の印はＬＶＡＶＡ（配列番号４）マウスに対するものである。
【図５】ミニ遺伝子アッセイの結果、異なる変異体に対するエクソン３スキッピングの勾配が示される。＊バンドは全長とエクソン３スキッピングｍＲＮＡとの間のヘテロ２本鎖である。＊＊ｍＲＮＡはエクソン３を欠く。ＮＴＣはミニ遺伝子アッセイにおける鋳型なしの対照である。ＭＷは分子量マーカーである。
【図６】検討される全ＯＰＮ１ＬＷハプロタイプに対する、エクソン３スキッピングｍＲＮＡの推定パーセンテージのヒストグラム。
【図７】発明者らの正常色覚を有する対象のプールの対象により代表された試験した２名のハプロタイプのそれぞれに対する、エクソン３−スキッピングｍＲＮＡ２の推定パーセンテージを示すヒストグラム。発明者らのデータベースの１００５名の対象のうち、８９３名が、エクソン３を欠いたｍＲＮＡの割合を推定するためにミニ遺伝子およびＭＡＳＳＡＲＲＡＹ（登録商標）を使用して発明者らが試験したハプロタイプを有した。
【図８】本発明の方法により決定されるようなエクソン３スキッピングがある％Ｌ−オプシンｍＲＮＡと１８例の異なる一般的に存在するＬ−オプシンハプロタイプに対する屈折異常の量との間の関連。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
引用される全ての参考文献は、それらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに示されない限り、複数への言及を含む。「および（ａｎｄ）」は、本明細書中で使用される場合、明らかに述べられない限り、「または（ｏｒ）」と交換可能に使用される。
【００１３】
本発明のあらゆる態様の全ての実施形態は、文脈上明らかに示されない限り、組み合わせて使用され得る。
【００１４】
文脈上明らかに要求されない限り、本記載および特許請求の範囲を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの語は、排他的または網羅的な意味とは対照的に、包括的な意味で解釈されるべきものであり；すなわち、「含むが限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」という意味である。単数または複数を使用する語はまた、それぞれ複数および単数も含む。さらに、「本明細書中（ｈｅｒｅｉｎ）」、「上記で（ａｂｏｖｅ）」および「以下の（ｂｅｌｏｗ）」という語および同様の意味の語は、本願で使用される場合、全体として本願を指し、本願の何らかの特定の部分を指すものではないものとする。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、アミノ酸残基は次のように略称される：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）およびバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。
【００１６】
本開示の実施形態の記載は、網羅的なものまたは開示される正確な形態に対して開示を限定するものではない。本開示に対する具体的な実施形態および例を例示目的で本明細書中に記載する一方、当業者が認識するであろうように、本開示の範囲内で様々な同等の変更が可能である。
【００１７】
第１の態様において、本発明は、屈折異常に対する対象の素因を決定するための方法であって、
（ａ）１つ以上のオプシン遺伝子におけるエクソン３スプライシング欠損を判定するために前記対象から得られた生体試料を試験すること；および
（ｂ）１つ以上のオプシン遺伝子におけるエクソン３スプライシング欠損を屈折異常に対する素因と相関させること
を含む方法を提供する。
【００１８】
続く実施例で示されるように、発明者らは、ＬおよびＭ錐体オプシン遺伝子におけるエクソン３スプライシング欠損を判定するための方法を開発し、このようなエクソン３スプライシング欠損がヒト対象における屈折異常変化の予想外に高いパーセンテージを占めることを明らかにした。したがって、本方法は、屈折異常を発症するリスクがある対象を同定し、屈折異常の潜在的な重症度を予想し、このような対象に対して早期の処置を提供するために、および個々の対象に対して最も有効な処置についての意思決定を助けるために使用され得る。
【００１９】
対象はあらゆる対象、例えばヒト対象などであり得る。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「屈折異常」は、対象の眼による光の焦点調節におけるエラーであり、一般に眼の形態によるものである（眼球の長さ、角膜の形態変化、レンズの老化など）。本方法は、近視、遠視、老視、乱視および青錐体一色型色覚を含むが限定されない、何らかの屈折異常に対する素因を検出し得る。
【００２１】
ある具体的な実施形態において、屈折異常は近視（近眼）である。近視は、最も一般的には、近視の眼の過剰な正のジオプターを相殺する負の屈折力を有する補正レンズの使用を通じて補正される。「ジオプター」はレンズの屈折力の測定単位であり、焦点距離の逆数に等しい。負のジオプターは一般に、眼を補正するためのレンズの値なので、近視の重症度を記載するために使用される。ある実施形態において、本方法は、−６ジオプターまたはそれより悪いものとして定義される強度近視に対する素因を判定するために使用される。別の実施形態において、近視は若年発症型近視（すなわち１８歳に到達する前）である。
【００２２】
別の具体的な実施形態において、屈折異常は、男性でのみ発症するＸ連鎖性網膜障害であり、顕著な屈折異常につながる青錐体一色型色覚である。
【００２３】
「生体試料」という用語は、本明細書中で使用される場合、血液、唾液、頬部からの細胞、スワブ検体、皮膚の生検、羊水および様々な他の組織を含むが限定されない、何らかの適切なこのような試料を含み得る。具体的な実施形態において、生体試料は唾液または血液である。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「エクソン３スプライシング欠損」という語は、オプシン遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにおけるエクソン３全体のスキッピングを意味する。当業者により理解されるであろうように、このような欠損は、評価しているオプシン遺伝子のエクソン２および／または４など、他のエクソンのうち一部／全てのスキッピングを含み得る。
【００２５】
１つ以上のオプシン遺伝子（Ｌオプシンおよび／またはＭオプシン遺伝子）におけるエクソン３スプライシング欠損について生体試料を試験するための何らかの適切な手段が本発明の方法において使用され得る。本方法は試料中で行われ得るか、または試料中の核酸を精製もしくは部分精製し得る。本発明の方法での使用のために生体試料からオプシン遺伝子を含む核酸を精製または部分精製するための方法は当技術分野で公知である。本核酸は例えばゲノムＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。
【００２６】
ある実施形態において、試験することは、エクソン３−スキッピングオプシン遺伝子ｍＲＮＡ（「ＥＸ３（−）ｍＲＮＡ」）と比較した全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡの相対量を決定するために、前記対象から得られる生体試料を試験することを含み；
相関させることは、ＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対する全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡの相対量を屈折異常に対する素因と相関させることを含む。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、ＥＸ３（−）ｍＲＮＡは、オプシン遺伝子中のエクソン３によりコードされる領域を完全に欠く１つ以上のオプシン遺伝子からのｍＲＮＡを意味する。この実施形態において、屈折異常に対する素因を判定するために、全長オプシンｍＲＮＡの相対量をＥＸ３（−）ｍＲＮＡと比較する。ＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対する全長の相対量を決定するための何らかの適切な方法を使用し得る。ある実施形態において、ＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対する全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡの相対量を決定することは、
（ｉ）生体試料中に存在するオプシン遺伝子ｍＲＮＡのｃＤＮＡから、エクソン３にまたがる増幅産物を生成させること；および
（ｉｉ）全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡに対応する増幅産物およびＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対応する増幅産物を検出すること
を含む。
【００２８】
この実施形態において、オプシン遺伝子ｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを生成させ、ＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対する全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡの相対量の検出を可能にするために、これをさらに増幅させる。このような検出は何れかの適切な手段により行い得る。ある代表的な実施形態において、増幅産物を検出することは、エクソン３の末端に隣接する増幅産物に結合するプライマーを使用して、増幅産物からプライマー伸長産物を生成させることを含む。この実施形態において、使用されるプライマーがｃＤＮＡに結合し、プライマー伸長アッセイ中にポリメラーゼがプライマーを伸長させる場合、付加されるヌクレオチドは、エクソン３（全長）またはエクソン４がエクソン２にスプライシングされる（（ＥＸ３（−））か否かを示すようになる。本明細書中で使用される場合、「隣接」は、その位置からのプライマー伸長が全長またはＥＸ３（−）オプシンｍＲＮＡの両方を検出可能である位置を意味する。様々な実施形態において、プライマーは、オプシン遺伝子の、エクソン２とエクソン３との間またはエクソン４とエクソン３との間の連結部の１または２個のヌクレオチド内で、エクソン２またはエクソン４における増幅産物に結合する。プライマー伸長アッセイにおいて使用されるプライマーは、以下でより詳細に記載するように、例えば、エクソン２または４の保存領域と相補的であり得る。
【００２９】
得られるプライマー伸長産物は何らかの適切な技術により検出し得る。ある実施形態において、プライマー伸長産物は、質量分析、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦ質量分析などにより検出される。例えば、増幅産物上の第１の情報価値のある位置（すなわち増幅産物におけるエクソン３の有無を区別する第１のヌクレオチド）に直接隣接してアニーリングするプライマーの一塩基伸長。プライマー伸長産物は、鋳型配列におけるエクソン３の有無に依存し、その結果、伸長産物間の質量が異なる。
【００３０】
非限定例として、プライマー伸長のために使用されるプライマーは、適切なエクソン：エクソン連結の何れかの側であり得る（すなわち：エクソン２はエクソン４にスプライシングされ（エクソン３スキッピング）；エクソン２はエクソン３にスプライシングされ（スキッピングなし）；エクソン３はエクソン４にスプライシングされる（スキッピングなし）。）。エクソン２がエクソン４にスプライシングされる場合、下記の配列は、得られるｃＤＮＡを示し、エクソン：エクソン連結部は｜｜により示す。ある実施形態において、プライマーがエクソン／エクソン連結部を横断し、エクソン３にスプライシングされるエクソン２とエクソン４にスプライシングされるエクソン２との間で異なる連結部の後の第１の位置の前に１個の塩基（太字および幾分大きいフォントで示す。）に伸長する限り、プライマー伸長のために、連結部の何れかの側の下線領域を使用し得る。伸長段階は、プライマーがエクソン２からエクソン３／４に向かって伸長する場合は太字および斜字体の塩基（下記で示される例ではＴ）を組み込まねばならず、またはプライマーがエクソン４からエクソン２／３に向かって伸長する場合は、太字および大きいフォントの塩基（下記で示される例でこれもまたＴ）に対する相補塩基を組み込まねばならない。
【化１】
2018512121.tif 000003
【００３１】
したがって、ある実施形態において、伸長プライマーは、次の配列（配列番号７）の少なくとも１２個の連続する３’残基（下線）に対してその全長にわたり示される配列に対応し得る。
【化２】
2018512121.tif 000004
様々なさらなる実施形態において、プライマーは、その全長にわたり、下線の配列または配列番号１６の少なくとも１５、２０、２５、３０、３５または完全な配列に対して相補的である：
【化３】
2018512121.tif 000005
配列の二重下線の部分は、エクソン４からエクソン３／２への伸長プライマーに対する相補体である。
【００３２】
これらの実施形態において、ポリメラーゼが１個のヌクレオチドを付加し、２個の可能な得られる生成物が、
【化４】
2018512121.tif 000006
【化５】
2018512121.tif 000007
（Ｅｘ３（−）オプシンｍＲＮＡに相当）となるように、アッセイを設計する。プライマーは太字ヌクレオチドのすぐ上流に結合し、これは、配列において示されるものに対応し、したがって相補鎖に結合し、示される太字ヌクレオチドを組み込み、ポリメラーゼが太字ヌクレオチドを組み込むようにする。本アッセイは定方向であり、したがって、エクソン２からエクソン３／４に向かうための唯一の可能な方法およびエクソン４からエクソン３／２へ向かうための唯一の可能な方法がある。
【００３３】
別の実施形態において、プライマーは、その全長にわたり、次の配列（配列番号１０）、
【化６】
2018512121.tif 000008
の少なくとも１２個の連続する３’残基（下線部）に相補的であり得る。様々なさらなる実施形態において、プライマーは、その全長から少なくとも１５、２０、２５、３０、３５にわたりるか、または配列番号１０の完全配列である。
【００３４】
別の実施形態において、ＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対する全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡの相対量を決定することは、
（ｉ）生体試料中に存在するオプシン遺伝子ｍＲＮＡのｃＤＮＡを生成させること；および
（ｉｉ）全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡおよびＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを検出すること
を含む。
【００３５】
この実施形態において、ＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対する全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡの相対量の検出を可能にするために、オプシン遺伝子ｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを生成させる。このような検出は何らかの適切な手段によって行い得る。ある代表的な実施形態において、増幅産物を検出することは、
（ｉ）ｃＤＮＡの増幅に適切な条件下で、エクソン３にまたがり、ｃＤＮＡを選択的に増幅可能である１つ以上のプライマー対とｃＤＮＡを接触させることおよび
（ｉｉ）全長ｃＤＮＡ増幅産物を含む増幅産物の第１の集団およびＥＸ３（−）増幅産物を含む増幅産物の第２の集団を生成させるためにｃＤＮＡを増幅させること
を含む。
【００３６】
この実施形態において、当業者により理解されるであろうように、ｃＤＮＡ中に存在するならばエクソン３を増幅するプライマー対が使用され、プライマー対は、オプシン遺伝子中の保存的配列と塩基対形成するように設計される。この実施形態において、ＥＸ３（−）ｍＲＮＡと比較した全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡの相対量を決定することは、増幅産物の第１の集団および第２の集団の相対量を決定することを含む。
【００３７】
１つ以上のオプシン遺伝子の一部を増幅させるために、様々なアッセイ（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴＱ−ＰＣＲ、ｓｐＰＣＲ、ｑＰＣＲおよび対立遺伝子特異的ＰＣＲなど）において、本プライマー対を使用し得る。本プライマー対は、「フォワード」および「リバース」プライマーの両方を含み、一方がセンス鎖に相補的であり、一方が「アンチセンス」鎖に相補的であり、増幅条件に供された場合にｃＤＮＡから、エクソン３（存在するならば）にまたがる検出可能な増幅産物を生成可能にするように、１つ以上のオプシン遺伝子とハイブリッド形成させるために設計される。様々な実施形態において、プライマー対の各メンバーは、１つ以上のオプシン遺伝子の保存領域に完全に相補的である、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上のヌクレオチド長の、１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。別の実施形態において、オプシン遺伝子の全ての可能なアイソフォームを列挙して、それらの相対的存在量を推定し、エクソンスキッピングおよび伸長エクソンスキッピングを検出するために、次世代配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）を使用し得る。この実施形態において、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、ｃＤＮＡライブラリを作製し、次世代配列決定に供する。
【００３８】
オプシン遺伝子中のエクソンの核酸配列を下記で示し；核酸配列中で完全に保存されるエクソンにはそのように記し、一方で、ある遺伝子／変異体から別のものへと変化するエクソンの領域を同定する（ＩＵＢコードで）。ＬおよびＭ遺伝子は、約４０キロ塩基対（ｋｂ）の長さにわたりほぼ同一である。各遺伝子は６個のエクソンを有する。ヒトにおいて、第１および第６番目のエクソンは、ＬおよびＭ遺伝子間で同一である。エクソン５は、これらの遺伝子の間で、よく見られるように異なり、Ｌ色素とＭ色素との間のスペクトルの相違の大部分の原因となるアミノ酸の相違を特定することによって、コードされる色素がＬであるかまたはＭであるかを機能的に判定する。エクソン２、３および４は、ＬおよびＭオプシン遺伝子間で変動するが、それは、交換突然変異体を生成する組み換え機序によるものであり；異なる領域は下記のものである。
エクソン１：（変異なし）
【化７】
2018512121.tif 000009
【化８】
2018512121.tif 000010
【化９】
2018512121.tif 000011
【化１０】
2018512121.tif 000012
【化１１】
2018512121.tif 000013
【００３９】
下線付きの一続きの核酸は保存され、本発明のこの実施形態の方法において、下線領域（またはそれらの相補領域）内でそれらの長さに沿ってハイブリッド形成するプライマー対を使用し得る。したがって、ある非限定的実施形態において、プライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、フォワードまたはリバースプライマーの一方がその全長に沿って、オプシン遺伝子のエクソン１中の保存領域と塩基対形成し、他方がその全長に沿って、オプシン遺伝子のエクソン６中の保存領域と塩基対形成する。別の実施形態において、フォワードまたはリバースプライマーのうち一方はその全長に沿って、オプシン遺伝子のエクソン１中の保存領域と塩基対形成し、他方はその全長に沿って、オプシン遺伝子のエクソン４中の保存領域と塩基対形成する。さらなる実施形態において、フォワードまたはリバースプライマーのうち一方はその全長に沿って、オプシン遺伝子のエクソン２中の保存領域と塩基対形成し、他方はその全長に沿って、オプシン遺伝子のエクソン６中の保存領域と塩基対形成する。またさらなる実施形態において、フォワードまたはリバースプライマーのうち一方はその全長に沿って、オプシン遺伝子のエクソン２中の保存領域と塩基対形成し、他方はその全長に沿って、オプシン遺伝子のエクソン４中の保存領域と塩基対形成する。
【表１】
2018512121.tif 000014
【００４０】
リアルタイムｑＰＣＲ、質量分析など）を含むが限定されない何らかの適切な技術によって、得られる増幅産物の相対量を直接比較し得；このような技術は、本明細書の教示に基づき、十分に当技術分野の技術レベル内である。
【００４１】
別の実施形態において、ＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対する全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡの相対量を決定することは、（Ｉ）全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ；および（ＩＩ）ＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡの両方と相補的な全長配列を有する１つ以上のプローブとｃＤＮＡを接触させることを含み、この接触は、ｃＤＮＡへのプローブの選択的ハイブリッド形成に適切な条件下で行われる。本明細書中で使用される場合、「選択的ハイブリッド形成」は、１つ以上のプローブが、ハイブリッド形成条件下で検出可能なハイブリッド形成複合体を形成させるようにオプシン遺伝子標的の少なくとも一部と完全に相補的であることを意味し、得られるハイブリッド形成複合体は、他の核酸とともに生じ得る何らかのハイブリッド形成からは区別可能である。使用される特異的なハイブリッド形成条件は、使用されるオリゴヌクレオチドプローブの長さ、それらのＧＣ含量ならびに当業者にとって周知であるような様々な他の因子に依存する。本発明の実施形態での使用のためのプローブは、特にエクソン１、２、４および６におけるオプシン遺伝子標的の保存領域と選択的にハイブリッド形成する何れかのものであり得；このような領域は上記で開示される。定量的ハイブリッド形成技術を含むが限定されない何らかの適切な技術によって、この実施形態において、ＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対する全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡの相対量を直接比較し得；このような技術は、本明細書の教示に基づき、十分に当技術分野の技術レベル内である。
【００４２】
これらの実施形態および実施形態の組み合わせの全てにおいて、本方法は、１つ以上のオプシン遺伝子におけるエクソン３スプライシング欠損を屈折異常に対する素因と相関させることが可能となる。続く実施形態で明らかにされるように、エクソン３スキッピングと屈折異常との間の相関は８９％である。すなわち、大量のエクソン３スキッピングがある個体の場合、（８０％超がスキッピング）殆ど全てのそれらの非常に高度の屈折異常（すなわち強度近視）はスキッピングゆえである。発明者らは、このような大量のエクソン３スキッピングがある個体は、集団の１％の２分の１に相当すると推定する（２００人中１人）。さらに、ｍＲＮＡの１２〜５０％がエクソン３を欠くＬオプシン遺伝子変異体は、この集団で非常により高い頻度で発生し、男性の２０％および女性の３６％または集団全体の２８％で起こると推測される。これらの変異体は、一般的な若年発症型近視の場合、屈折異常の変化の５０％超を占め、母集団中の近視のリスクが顕著に上昇することとなる。
【００４３】
ある実施形態において、１つ以上のオプシン遺伝子はＬオプシン遺伝子であり；別の実施形態においてはＭオプシン遺伝子であり；さらなる実施形態においてはＬオプシン遺伝子およびＭオプシン遺伝子の両方である。
【００４４】
別の態様において、本発明は、屈折異常に対する対象の素因を判定するための方法であって、
（ａ）ＬまたはＭオプシン遺伝子の位置１５３、１７１、１７４、１７８および１８０でコードされるアミノ酸に対するものとして指定されるオプシン遺伝子変異体ＬＩＶＶＡ（配列番号１）を同定するために対象から得られた生体試料を試験すること；および
（ｂ）オプシン遺伝子変異体を屈折異常に対する素因と相関させること
を含む方法を提供する。
【００４５】
発明者らは、驚くべきことに、列挙されるオプシン遺伝子変異体が屈折異常に対する素因を有する対象に対する予後徴候であることを発見した。新しく発見されたＬＩＶＶＡ（配列番号１）変異体は、最大のエクソン−３スキッピング変異体であることが分かった。本方法は、近視、遠視、老視、乱視、青錐体一色型色覚および失明障害を含むが限定されない何らかの屈折異常に対する素因を検出し得る。生体試料は、上記のような何らかの適切な試料であり得る。本方法での使用のために生体試料から（必要に応じて）核酸を精製または部分精製するための方法は当技術分野で周知である。核酸は例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。
【００４６】
ある実施形態において、オプシン遺伝子変異体は、ＬＩＶＶＡ（配列番号１）／ＧＣＧＡＴＣＧＧ（エクソン３（以下）において、ＩＵＢコードの可変位置ＲＭＳＲＫＹＲＫは順番にＧＣＧＡＴＣＧＧ（ＬＩＶＶＡ）に対応する。）を含む。
【化１２】
2018512121.tif 000015
【００４７】
本発明の各態様の別の実施形態において、本方法は、本発明の何らかの実施形態または実施形態の組み合わせの方法に従い、対象の屈折異常に対する素因を判定することおよび屈折異常の進行を遅らせるために対象を処置することを含む。眼鏡もしくはコンタクトレンズを処方することおよび屈折矯正手術によるものを含むが限定されない、対象を処置するための何らかの適切な方法を使用し得る。ある一定の実施形態において、本方法は、例えば国際公開第２０１０／０７５３１９号パンフレットに記載のような、ブラー誘導（ｂｌｕｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）レンズを提供することを含む。ある実施形態において、装置はブラー誘導（ｂｌｕｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）レンズを含む眼鏡であり、このブラー（ｂｌｕｒ）は、異常に長くなるように眼を刺激するシグナルを生じさせることが本明細書中で示された網膜の隣接錐体光受容体間の相対的活性を低下させるように設計されている。ブラー誘導（ｂｌｕｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）レンズは、例えば、レンズの片面または両面における小さな隆起または陥凹の１つ以上：レンズ材料とは異なる材料がレンズ内に含まれること；レンズにおけるより高レベルの収差の取り込み；および、レンズの片面または両面に適用される、光散乱、拡散または回折によりブラー（ｂｌｕｒ）を誘導するコーティングまたはフィルムによって、ぼやけを誘導するように作られ得る
【００４８】
別の実施形態において、ブラー誘導（ｂｌｕｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）レンズはコンタクトレンズである。ブラー誘導（ｂｌｕｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）コンタクトレンズは、例えば、レンズ材料とは異なる材料がレンズ内に含まれること；レンズにおけるより高レベルの収差の取り込み；レンズの中心からレンズの底部に、一方または両方のレンズにおいて漸進的なの負の補正を提供すること；およびレンズの片面または両面に適用される光散乱、拡散または回折によりブラー（ｂｌｕｒ）を誘導するコーティングまたはフィルムのうち１つ以上によって、ブラー（ｂｌｕｒ）を誘導するために作製され得る。
【００４９】
別の実施形態において、処置は、対象の眼に入る前にディスプレイスクリーンから発散される赤色光を優先的に阻害し、それにより対象の眼での屈折異常の導入を制限することが可能な、波長依存性のフィルターを含む治療用光学装置を対象が装着することを含む。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「処置する」とは、（ａ）対象の眼における屈折異常導入の発生率を低下させること；（ｂ）対象の眼においてその後に発症する屈折異常の重症度を軽減すること；および／または（ｃ）対象の眼における屈折異常の特徴的な症状の発症を制限または予防することのうち１つ以上を意味する。
【００５１】
別の態様において、本発明は、１つ以上のヒトオプシン遺伝子の検出可能部分を選択的に増幅可能なプライマー対を含むかまたはそれからなり、検出可能部分がエクソン３を含む組成物を提供する。例えば本発明の方法においてプライマー対を使用し得る。本プライマー対は、「フォワード」および「リバース」プライマーの両方を含み、一方がセンス鎖に相補的であり、一方が「アンチセンス」鎖に相補的であり、増幅条件に供される場合、ｃＤＮＡから、（存在するならば）エクソン３にまたがる検出可能な増幅産物を生成可能となるように、１つ以上のオプシン遺伝子とハイブリッド形成するように設計される。様々な実施形態において、プライマー対の各メンバーは、１つ以上のオプシン遺伝子の保存領域に完全に相補的である、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上のヌクレオチド長の１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。様々なさらなる実施形態において、プライマーは５０、４５、４０、３５または３０ヌクレオチド長以下である。
【００５２】
オプシン遺伝子中のエクソンの核酸配列は以下に示し；核酸配列中で完全に保存されるエクソンをそのように記し、一方で、遺伝子／変異体によって変動するエクソンの領域を同定する（ＩＵＢコード）。下線を付している一続きの核酸は保存され、本発明のこの実施形態の方法において、下線領域（またはそれらの相補領域）内でそれらの長さに沿ってハイブリッド形成するプライマー対を使用し得る。
エクソン１：（変異なし）
【化１３】
2018512121.tif 000016
【化１４】
2018512121.tif 000017
【化１５】
2018512121.tif 000018
【化１６】
2018512121.tif 000019
【００５３】
下線を付している一続きの核酸は保存され、本発明のこの実施形態の方法において、下線領域（またはそれらの相補領域）内でそれらの長さに沿ってハイブリッド形成するプライマー対を使用し得る。したがって、ある非限定的な実施形態において、本プライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、フォワードまたはリバースプライマーのうち一方はその全長に沿って、オプシン遺伝子のエクソン１中の保存領域（すなわち：エクソン１中の何らかの一続きの少なくとも１２連続ヌクレオチド）と塩基対形成し、他方はその全長に沿って、オプシン遺伝子のエクソン６中の保存領域（すなわち：エクソン６中の何らかの一続きの少なくとも１２連続ヌクレオチド）と塩基対形成する。別の実施形態において、フォワードまたはリバースプライマーのうち一方はその全長に沿って、オプシン遺伝子のエクソン１中の保存領域と塩基対形成し、他方はその全長に沿って、オプシン遺伝子のエクソン４中の保存領域（すなわち：ヌクレオチド１〜１１０または１２９〜１６６の間のエクソン４中の何らかの一続きの少なくとも１２連続ヌクレオチド）と塩基対形成する。さらなる実施形態において、フォワードまたはリバースプライマーのうち一方はその全長に沿って、オプシン遺伝子のエクソン２中の保存領域（すなわち：ヌクレオチド１〜８１、８３〜１８７、１８９〜２１８、２２０〜２３２または２４４〜３０７の間のエクソン２中の何らかの一続きの少なくとも１２連続ヌクレオチド）と塩基対形成し、他方はその全長に沿って、オプシン遺伝子のエクソン６中の保存領域と塩基対形成する。またさらなる実施形態において、フォワードまたはリバースプライマーのうち一方はその全長に沿って、オプシン遺伝子のエクソン２中の保存領域と塩基対形成し、他方はその全長に沿って、オプシン遺伝子のエクソン４中の保存領域と塩基対形成する。
【００５４】
ある非限定的な実施形態において、本プライマー対は、
（ａ）配列番号１４（エクソン２）ヌクレオチド１〜８１、８３〜１８７、１８９〜２１８、２２０〜２３２または２４４〜３０７の１２個以上の連続ヌクレオチドまたはその全ヌクレオチドを含む第１のプライマー；および
（ｂ）配列番号１５（エクソン４）ヌクレオチド１〜１１０または１２９〜１６６）の１２個以上の連続ヌクレオチドまたはその全ヌクレオチドを含む第２のプライマー対
を含む。
【００５５】
別の非限定的な実施形態において、本プライマー対は、
（ａ）配列番号１１（エクソン１）の１２個以上の連続ヌクレオチドまたはその全ヌクレオチドを含む第１のプライマー；および
（ｂ）配列番号１２（エクソン６）の１２個以上の連続ヌクレオチドまたはその全ヌクレオチドを含む第２のプライマー対
を含む。
【００５６】
さらなる実施形態において、本プライマー対は検出可能に標識され得る。何らかの適切な標識を使用し得る。様々な非限定的な実施形態において、有用な検出可能な標識としては、３２Ｐ、３Ｈおよび１４Ｃなどの放射性標識；蛍光色素、例えばフルオレセインイソチイオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ランタニド蛍光体およびテキサスレッド、ＡＬＥＸＩＳ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ）、ＣＹ（登録商標）色素（Ａｍｅｒｓｈａｍ）；電子密度の高い試薬、例えば金など；酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびアルカリホスファターゼなど；比色標識、例えば金コロイドなど；磁気標識、例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）という商標で販売されるものなど；ビオチン；ジオキシゲニン（ｄｉｏｘｉｇｅｎｉｎ）；または抗血清もしくはモノクローナル抗体が入手可能であるハプテンおよびタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。この標識はプライマーに直接組み込まれ得るか、またはこれを、プライマーとハイブリッド形成するかもしくはそれに結合するプローブまたは抗体に連結させ得る。当業者にとって公知の何らかの適切な手段によって、プライマーに標識をカップリングさせ得る。様々な実施形態において、ニック翻訳、ＰＣＲまたはランダムプライマー伸長を使用してプライマーを標識する（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照）。
【００５７】
実施例
導入
嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび網膜色素変性症を含め、多くのヒト疾患は遺伝子スプライシングエラーを含む。近年、Ｕｅｙａｍａら（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，４２４，１５２，２０１２）は、赤緑色覚異常に関連する錐体オプシン遺伝子の変異体が、最終的なｍＲＮＡからのエクソン３が欠如するスプライシングエラーにつながったことを見出した。ヒトＬおよびＭオプシン遺伝子は非常に変化し易く、発明者らは、オプシン遺伝子変異体を調べて、エクソン３スプライシング欠損と関連するものを同定するためにアッセイを設計した。さらに、発明者らは、エクソンスキッピングと関連する変異体の中でも、エクソン３がスキッピングされたメッセージと比較して、正常な全長メッセージを含有するｍＲＮＡの断片を定量しようとした。
【００５８】
発明者らは、２つのフランキングエクソン３を除き、イントロンが除去された全長オプシン配列を含有するプラスミドをＨＥＫ２９３細胞に遺伝子移入する、ミニ遺伝子試験を設計した。ｍＲＮＡを回収し、それを使用してｃＤＮＡを作製した。次の段階に対して、発明者らは、対立遺伝子特異的なプライマー伸長とそれに続く質量分析によって一ヌクレオチドレベルの遺伝子分析を行うためにＭＡＳＳアレイ（登録商標）機器を使用した。エクソン３を欠いたＬオプシンｍＲＮＡの断片を定量するためにアッセイを設計した。アッセイを最初に試験し、全長およびエクソンスキッピングｃＤＮＡの既知の混合物で較正した。次いで、これを使用して、Ｌオプシンエクソン３の全１２８個の変異体にわたりエクソンスキッピングを探索した。発明者らは、質量分析の、エクソン３スキッピングオプシンｍＲＮＡに対する全長の相対量を定量する能力を利用した。しかし、これは、本方法の可能性がある１つの実行に過ぎず；２つのｍＲＮＡ種の相対量を決定可能な何らかの定量的方法を使用し得る。
【００５９】
エクソンスキッピングアッセイは５％以内の誤差であることが分かった。全てのエクソン３オプシン変異体にわたり、驚くべき数のものが、ある量のｍＲＮＡがエクソン３を欠いたエクソン３スプライシング欠損と関連していた。試験した全ての変異体にわたり、エクソン３がスキッピングされたｍＲＮＡの中央値割合は９％であり、平均２５％であった。ＬＩＡＶＡ（配列番号２）、ＬＶＡＶＡ（配列番号４）およびＬＩＶＶＡ（配列番号１）をコードするハプロタイプは、最大のスキッピング変異であることが分かった。位置１７８でイソロイシンの代わりにバリンをコードする配列の場合のように（４４％対６％）、位置１８０でセリンの代わりにアラニンをコードする配列は、平均してより多くスキッピングが起こっていた（３８％対１１％）。
【００６０】
最大スキッピングハプロタイプであったＬＩＡＶＡ（配列番号２）、ＬＶＡＶＡ（配列番号４）およびＬＩＶＶＡ（配列番号１）ハプロタイプは全て、極めて強度の近視と関連する。特定のオプシン遺伝子ハプロタイプと屈折異常との間の関連性が以前に報告されているが、光受容体の細胞生物学における異なる変異体の影響は未知であった。したがって、どのハプロタイプが屈折異常を獲得し易くさせるかを事前に予想する方法はなかった。現在、屈折異常がスプライシング欠損と関連するという発見から、発明者らがエクソン３スキッピングオプシンｍＲＮＡに対する全長の相対量を定量するために開発したアッセイを使用することにより、何らかの個々のハプロタイプによって屈折異常を有し易くなるか否かが判定可能になる。
【００６１】
罹患し易い小児において屈折異常の進行を遅くする利用可能な最新の処置があり、いくつかのさらなる治療法が開発中である。処置の効果を最大にするために、何らかの屈折異常が出現する前に、罹患し易い小児を同定することが必要である。発明者らが開発した方法はこのニーズを満たす。
【００６２】
背景
赤緑色覚異常がＸｑ２８でのＸ−染色体における錐体感光色素遺伝子の再編成の結果であるという発見は、Ｘ−染色体オプシン遺伝子アレイにおける突然変異と色覚異常との間の遺伝子型−表現型の相関に対する過去数十年にわたる広範囲の研究につながった（概説については［１］を参照）。長（Ｌ）および中（Ｍ）波長の錐体は、人間の錐体の９５％を占め、非常に低い光レベルを除き、杆体が活性である場合、全視覚が錐体に基づく。したがって、色を見分けることだけではなく、視力の全ての態様は、ＬおよびＭ錐体感光色素に依存する。それぞれＯＰＮ１ＬＷおよびＯＰＮ１ＭＷと呼ばれるＬおよびＭ錐体オプシン遺伝子は、エクソン２、３および４の配列において非常にばらつきがある。視覚および、視覚誘導性の眼の成長などの他の過程における感光色素の必須の役割のために、これらの遺伝子における遺伝的変異は、現代人を悩ませる一般的な眼の障害に対する重要なリスク因子である。発明者らは、オプシンの位置１５３、１７１、１７４、１７８および１８０でコードされるアミノ酸について、ＬＩＡＶＡ（配列番号２）およびＬＶＡＶＡ（配列番号４）と呼ばれる２個のオプシン遺伝子変異体を詳細に研究した。発明者らは、これらのオプシン遺伝子変異体が光受容体機能不全および重篤な視力障害と関連することを発見した［２〜６］。これらの変異体は、色覚異常、強度近視、錐体ジストロフィー、青錐体一色型色覚、ボルンホルム眼疾患および緑内障にわたる臨床診断がある患者において見られる。これらの変異体は視力欠陥がない個体では観察されない。
【００６３】
次世代配列決定技術の出現とともに、疾患関連遺伝子において同定されるゲノム配列変異の数が爆発的に増加している。これらの配列変異の病態生理学を理解しようとすることにおける第１の焦点は、タンパク質コード領域を変化させるかまたは遺伝子発現に影響を及ぼすプロモーターおよび特徴がよく分かっているコアスプライシングシグナルを変化させる非同義変異におけるものである。他の配列変異は、無視されるかまたは中立的なものとして分類されることが多く、また、サイレントまたはミスセンス突然変異の病態生理学的影響は、主要な影響が異常なスプライシングである場合にはタンパク質機能のレベルで発揮されると考えられている多くの例がある［９〜１１］。ゲノム変異がスプライシング、タンパク質機能または両方に影響を及ぼすか否かを知ることは、有効な処置が開発されるべき場合に非常に重要である。
【００６４】
ＯＰＮ１ＬＷおよびＯＰＮ１ＭＷ遺伝子における変異を生じさせる特有の突然変異機序への洞察。殆どの旧世界ザルおよび類人猿は、Ｘ−染色体上に２個の感光色素遺伝子、１個のＬおよび１個のＭを有する。発明者らは、祖先から現代人が、旧世界霊長類と同様のＸ−染色体遺伝子アレイを有したと仮定する。ＯＰＮ１ＬＷおよびＯＰＮ１ＭＷ遺伝子の再編成は、ヒトにおける赤緑色覚異常に関与する（概説については［１］を参照）。２個のＸ染色体上のオプシン遺伝子間の不等な相同組み換えにより、色覚異常の基礎となる新しい遺伝子編成が生じる。現代人における色覚異常に対する選択の緩和によって、集団中の保因者の頻度が上昇している。女性の保因者において、「色覚異常アレイ」と正常なアレイとの間の不等な相同組み換えによって、男性において正常な色覚の根底にあるが、交換突然変異体遺伝子を有するアレイが生成され得る。現代の集団において、女性の約１５％が保因者であり、正常と色覚異常アレイとの間の組み換えに対する多くの機会をもたらし、交換突然変異体遺伝子を伴うオプシン遺伝子アレイを生じさせる。ＯＰＮ１ＬＷおよびＯＰＮ１ＭＷ遺伝子における遺伝的変異性の度合いは現代人に特有である。旧世界ザルおよび類人猿は、ありふれたＬおよびＭオプシン遺伝子を有し、おそらく、ヒトの祖先は、旧世界霊長類と同様であった。したがって、ＯＰＮ１ＬＷおよびＯＰＮ１ＭＷ遺伝子を混合することは、色覚欠損に対する選択減少の結果から生じる、ヒト進化の特有の生成物である変性過程である。
【００６５】
ＯＰＮ１ＬＷおよびＯＰＮ１ＭＷ遺伝子は、約４０キロ塩基対（ｋｂ）の長さにわたりほぼ同一である。各遺伝子は６個のエクソンを有する。ヒトにおいて、第１および第６のエクソンは、ＯＰＮ１ＬＷおよびＯＰＮ１ＭＷ遺伝子の間で同一である。エクソン５は、これらの遺伝子間で、よくあるように異なり、Ｌ色素とＭ色素との間のスペクトルの相違の大部分の原因となるアミノ酸の相違を特定することによって、コードされる色素がＬであるかまたはＭであるかを機能的に決定する［１７］。エクソン２、３および４は、ＬとＭオプシン遺伝子間で変動するが、それは、交換突然変異体を生じさせる組み換え機序によるものである。正常な色覚を有する男性の集団におけるＯＰＮ１ＬＷおよびＯＰＮ１ＭＷ遺伝子の大部分は「Ｌ／Ｍ交換突然変異体」である。発明者らは、それらを稀なランダム突然変異と区別するために、これらの遺伝子変異体を「Ｌ／Ｍ交換突然変異体」と呼ぶ。
【００６６】
高頻度。ＬＶＡＶＡ（配列番号４）変異体は、よりよく知られている稀なランダムミスセンス突然変異と比較して、高頻度交換突然変異体の例となり得る。任意抽出の女性の試料をスクリーニングすることにより、発明者らは、この突然変異体が４００個のＸ−染色体ごとに１を超える比率で起こるという予備的な推定を得た。ＲＰ  ＵＳ集団の１２％を占める、北米で最も高頻度で見られるロドプシン突然変異Ｐｒｏ２３Ｈｉｓとこれを比較した［２６］。ＲＰは世界で５０００人に１人で起こるが、米国において幾分頻度が高い［２７］。したがって、米国で最もよく見られるロドプシン突然変異は、４０，０００人に約１人の比率で起こるか、または８０，０００個あたり１個の染色体−３で起こる。有病率が４００人に１人であるＬＶＡＶＡ（配列番号４）錐体オプシン突然変異体は、約２００倍多く見られる。これらの突然変異の頻度により、それらが視覚障害に対する非常に重要な寄与体となる。
【００６７】
非常に短いリードを与え、したがってＯＰＮ１ＬＷまたはＯＰＮ１ＭＷに属するものとしてエクソン２、３および４の配列が同定され得ない、次世代配列決定法を使用して作製された公開データベースを調べることによって、これらの遺伝子での変異性の度合いの理解を発展させることはできない。ＯＰＮ１ＬＷからのみである場合、１０００個のゲノムプロジェクト（ＵＣＳＣゲノムブラウザウェブサイト）で提示されるエクソン２、３および４データは、必然的に、両遺伝子からの配列の混合物に相当するものでなければならない。さらに、根底にある仮定、例えばＯＰＮ１ＬＷからのエクソン３が位置１８０で常にセリンを特定し、したがってＬＩＡＶＡ（配列番号２）またはＬＶＡＶＡ（配列番号４）の保有率に関する情報を全く提供しないという仮定によって、データセットが異様に歪められる。発明者らの試料において、１５８名の対象（〜４０％）は、位置１８０でアラニンを特定するＯＰＮ１ＬＷ遺伝子を有した。それにもかかわらず、１０００個のゲノムプロジェクトにおいて、単Ｘ−染色体オプシン遺伝子を有する男性の青錐体一色型色覚の根底にあることが以前に報告された組み合わせＬＩＡＶＳ（配列番号３）［５、２８］は、１６５９個のＸ染色体中で頻度１で見出され、これは、ＡＤＲＰにおけるＰｒｏ２３Ｈｉｓ突然変異よりも４０倍超よく見られる。まとめると、視力障害に関与するＯＰＮ１ＬＷおよびＯＰＮ１ＭＷエクソン３ハプロタイプは高頻度で起こる。他の公開データベース全てが、個々のＳＮＰの頻度しか報告しておらず、組み合わせについては報告されず、当然ではあるが、組み合わせは、視力の病的状態における役割を理解するために必須である。
【００６８】
錐体オプシン遺伝子におけるコード配列突然変異は、異常なスプライシング、異常なタンパク質構造／機能または両方を通じて光受容体および視覚に対して有害な影響を及ぼし得る。発明者らは、ＬＩＡＶＡ（配列番号２）およびＬＶＡＶＡ（配列番号４）変異体について、スプライシングおよびタンパク質機能の両方を調べた。両変異体について、発明者らは、発明者らが開発した錐体単独オン・オフＥＲＧ［２９］および色覚の行動試験を使用して、単Ｘ−染色体錐体オプシン遺伝子を有した視覚障害のある者を調べた。発明者らは、ＬＩＡＶＡ（配列番号２）、ＬＶＡＶＡ（配列番号４）または対照ＬＩＡＩＳ（配列番号５）変異体の何れかをコードするｃＤＮＡで内在性Ｘ−染色体錐体オプシン遺伝子を置き換えることによって発明者らが作製した遺伝子改変マウスも試験した。イントロン１をスプライシングして除去するためにのみ改変マウス遺伝子座を必要とし、他のイントロンは既に除去されており、したがって、これらのマウスによって、発明者らは、スプライシング欠損を分離して、オプシン機能を評価できるようになった。発明者らは、Ｓオプシンノックアウト系列も作製し、標的置換マウスをＳオプシンノックアウトと交配させて、Ｌ／Ｍ光受容体においてＳオプシン発現のマウス特異的な交絡因子なく、Ｌオプシンの影響を調べ得るようになった［３０］。最後に、発明者らは、ＬＩＡＶＡ（配列番号２）およびＬＶＡＶＡ（配列番号４）変異体がある発明者らのヒト対象から、およびＬＩＡＩＳ（配列番号５）変異体がある対照正常対象からミニ遺伝子を作製した。発明者らは、スプライシングに対する影響を評価するために、１個の変異体あたり少なくとも２名の異なる対象からのＤＮＡを使用して、２つ組でミニ遺伝子アッセイを行った。発明者らは、これらの試験の結果を以下で要約する。
【００６９】
ＬＩＡＶＡ（配列番号２）。発明者らがＯＰＮ１ＬＷまたはＯＰＮ１ＭＷ遺伝子のＬＩＡＶＡ（配列番号２）変異体を有することを示したヒトは、対応する錐体の機能の完全な欠如を示すが、それらのＳ錐体および他のＬ／Ｍ錐体の機能を保持する［２〜４］。正常なＬオプシンおよびＬＩＡＶＡ（配列番号２）Ｍオプシンを有した二色型色覚者の適応光学イメージングから、ＬＩＡＶＡ（配列番号２）錐体が生存し、光受容体モザイクの画像において暗黒空間として識別可能であるが、錐体が、導波路として作用しないので「不可視」であることが示唆される［４］。さらに、この対象の錐体モザイクは、元の画像で見られる全ての錐体が８年後に得られた画像で見られたという点において、長期にわたり安定であった（Ｃａｒｒｏｌｌら、未公開データ）。発明者らは、唯一発現されたＸ−染色体オプシン遺伝子としてＬＩＡＶＡ（配列番号２）変異体がある青色錐体単色性色覚者において、Ｌ／Ｍ−およびＳ−錐体単独オン・オフＥＲＧを行った。Ｌ／Ｍ錐体−単独ＥＲＧにおいて典型的なＥＲＧ波形は検出されなかったが（図１）、Ｓ−錐体単独ＥＲＧは正常であった。発明者らは、ＬＩＡＶＡ（配列番号２）／ＧＣＧＡＴＣＧＧ（配列番号２）変異体を有した２名の対象および対照ＬＩＡＩＳ（配列番号５）／ＧＣＧＡＴＣＡＴ変異体を有した２名の対象からのＤＮＡを使用して、ミニ遺伝子を作製した。ミニ遺伝子間の唯一の相違は、エクソン３の配列にあった。ミニ遺伝子をＨＥＫ２９３細胞に遺伝子移入し、ｍＲＮＡを回収し、逆転写酵素ＰＣＲで分析した。さらに、発明者らは、ＭａｓｓＡｒｒａｙ機器を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦ遺伝子型判定を使用して、エクソン３ありおよびなしのＰＣＲ産物の相対量を定量するためのアッセイを開発した（スペースの制限によりアッセイを記載せず。）。図２で示されるように、ミニ遺伝子は、エクソン３を欠いたｍＲＮＡを生じさせた。一方で、対照ＬＩＡＩＳ（配列番号５）ミニ遺伝子は全長ｍＲＮＡしか生じさせなかった。
【００７０】
発明者らは、遺伝子改変マウスにおいてＬＩＡＶＡ（配列番号２）オプシンのアミノ酸配列が錐体機能に影響を及ぼしたか否かも評価した。Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら［３０  １９７１］は、改変オプシン遺伝子座の構造を記載する。約１６カ月齢まで、ＬＩＡＶＡマウスは、ＬＩＡＩＳ（配列番号５）変異体を有した対照マウスと比較して、錐体機能に違いがなかった（データは示さない。）。ＬＩＡＶＡ（配列番号２）マウスから得られたＥＲＧおよび免疫組織化学データから、老齢マウスにおける光受容体機能および形態に対するＬＩＡＶＡ（配列番号２）変異体のアミノ酸配列の軽度の有害な影響があり得ることが示唆される。
【００７１】
まとめると、これらの結果から、ＬＩＡＶＡ（配列番号２）／ＧＣＧＡＴＣＧＡオプシン変異体により示されるスプライシング欠損は、完全にヒト表現型の主要因であることが示される。スプライシング欠損は、完全またはほぼ完全であると思われ、ポリメラーゼ連鎖反応で観察される検出可能な全長ｍＲＮＡはない。ＬＩＡＶＡ（配列番号２）変異体に対するプレｍＲＮＡは、エクソン／エクソン連結部の５０ヌクレオチド内の翻訳終結コドンを含有し、これは過度に長い３’非翻訳領域を有する。これらの特性によって、異常にスプライシングされたｍＲＮＡがナンセンス介在性の減衰経路に向けられ、それによってこれらの翻訳が妨げられ、したがって異常なタンパク質がヒト表現型に関与する可能性は低い。ヒトＥＲＧデータからＳ錐体が機能的であることが示されるので、視覚に対するＬＩＡＶＡ（配列番号２）変異体の有害な結果は細胞自律的であると思われる。
【００７２】
ＬＶＡＶＡ（配列番号４）。発明者らは、唯一のＸ−染色体錐体オプシン遺伝子としてＬＩＡＶＡ（配列番号２）／ＧＣＧＧＧＣＧＧ対立遺伝子を有する２名の男性の特徴を調べた［５］。その男性の両方が、小児期から進行性の視力喪失を自己報告した。若年成人時に、この２名の男性は、ＬＶＡＶＡ（配列番号４）突然変異体の結果、進行性の錐体機能喪失が起こることを示す錐体−杆体ジストロフィーと診断された。この両対象とも、視力が約２０／２００である、疾患の後期ステージであると思われた。このステージにおいて、補償光学系を伴うイメージングからの結果は、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）欠失などの突然変異が機能的なＬまたはＭ錐体の早期完全喪失を引き起こすＢＣＭ表現型とは区別できなかった［５、３１］。両対象は、残存Ｌ／Ｍ錐体機能を保持していたが（図３）、測定可能な（ｍｅａｓｕｒｅａｂｌｅ）Ｓ錐体機能（データを示さない。）はなかった。イメージングデータから、錐体密度が最大である中心網膜において、錐体を含有するＬＶＡＶＡ−オプシン（配列番号４）の変性に加えて、近くの杆体およびＳ錐体の非細胞自律的な変性もあることが示唆される［５］。光受容体モザイクの破壊は、より末梢である位置においてはるかに少なかった。これらの対象のＬＶＡＶＡ（配列番号４）／ＧＣＧＧＧＣＧＧオプシン遺伝子から作製されたミニ遺伝子から、エクソン３を欠くｍＲＮＡおよび正常な全長ｍＲＮＡが生じた。ＬＩＡＶＡ（配列番号２）オプシン遺伝子に関しては、エクソン３を欠くｍＲＮＡがナンセンス介在性減衰へと向けられる可能性があるが、全長ｍＲＮＡは翻訳されなければならず、残存Ｌ／Ｍ錐体機能に関与する（図２）。遺伝子改変マウスにおけるＬ／Ｍ錐体独立オン−オフＥＲＧの縦断研究から、調べた全時間点（生後１．５週および３か月間隔で３〜１６カ月）で、対照マウスと比較して、ＬＶＡＶＡ（配列番号４）感光色素を有するマウスの錐体機能が低下していた（図４）ことが示された。対照マウスにおける改変遺伝子座は、エクソン３の配列（ＬＩＡＩＳ（配列番号５）／ＧＣＧＡＴＣＡＧ）においてのみ、ＬＶＡＶＡ（配列番号４）マウスと異なっていた。まとめると、これらの結果から、ＬＶＡＶＡ（配列番号４）オプシン遺伝子対立遺伝子に関連するヒト表現型は、異常なタンパク質機能ゆえであり、スプライス欠損のための錐体における感光色素の量が正常を下回ることによって、おそらく一層悪化することが示唆される。
【００７３】
上述のように、発明者らは、最近、青色錐体単色性色覚者の兄弟において変異体ＬＩＶＶＡ（配列番号１）／ＧＣＧＡＴＣＧＧ（配列番号２）を同定し、異常なスプライシングを明らかにした。発明者らは、錐体モザイクが重度に破壊された患者においてＬＶＶＶＡ（配列番号９）／ＧＣＧＧＧＧＧＧを以前に報告し［５」、最近、対象ＤＮＡを用いてミニ遺伝子を作製し、顕著なエクソン３スキッピングを見出した。Ｍ．Ｍｉｃｈａｅｌｉｄｅｓとの共同研究において、発明者らは、２個のＯＰＮ１ＬＷ遺伝子を有し、１個がＬＩＡＶＡ（配列番号２）をコードし、他方がＭＩＡＶＡ（配列番号８）をコードした、青錐体一色型色覚異常と診断された女性において見出された、ＭＩＡＶＡ（配列番号８）／ＡＡＣＡＴＣＧＧおよびＭＩＡＶＡ（配列番号８）であった単ＯＰＮ１ＭＷ変異体を同定し、ＭＩＡＶＡ（配列番号８）がエクソン３スキッピングを引き起こすことを示し；Ｇａｒｄｎｅｒら、２０１４は、独立にこれを検証した［７］。最終的に、ＬＩＡＶＳ（配列番号３）／ＧＣＧＡＴＣＧＴは、青錐体一色型色覚と関連することが以前に発見されており、エクソン３スキッピングを引き起こすことが明らかにされた［５、８、２８］。図５は、これらの変異体に対する、発明者らのミニ遺伝子アッセイ結果を示すゲルの画像であり、エクソン３のほぼ完全な排除および完全な包含によって挟まれる、エクソン３スキッピングの勾配があることを示す。全長ｍＲＮＡならびにエクソン３−スキッピングメッセージを生じさせる変異体は、網膜構造の最重度の破壊と関連すると思われる。これが、変異体におけるタンパク質構造／機能変化ゆえの、エクソン３−スキッピングｍＲＮＡの翻訳、異常に低量のオプシン／感光色素またはこれらの可能性のある組み合わせゆえの、有害な影響ゆえであるか否かを明らかにすることは今後の課題である。
【００７４】
発明者らは、エクソン３−スキッピングｍＲＮＡと比較した全長ｍＲＮＡの相対量を定量的に推定するためにアッセイを確立しようとした。発明者らが開発したアッセイは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と、続くプライマー伸長およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦ質量分析を用いた生成物の分析に基づく。このために、発明者らは、ＭＡＳＳＡＲＲＡＹ（登録商標）機器を使用してきた。しかし、多くの代替的な方法により定量を行い得る。
【００７５】
一般的方法
血液または唾液試料を対象から回収した。製造者の説明書に従い、市販のＤＮＡ抽出キットを使用して、ゲノムＤＮＡを単離した。発明者らは、参考文献２に記載の詳細な手順（Ｎｅｉｔｚら、２００４）に従い、ＯＰＮ１ＬＷおよびＯＰＮ１ＭＷ遺伝子を増幅する。参考文献８に記載のように、ＰＣＲ産物を哺乳動物発現ベクターｐＣＭＶ５ａにクローニングし、またこれも参考文献８に記載のように、ＨＥＫ２９３または他の適切な細胞に遺伝子移入した。遺伝子移入から２４〜４８時間後にｍＲＮＡを細胞培養物から単離した。市販のキットを使用して、製造者の説明書に従い、ｍＲＮＡを抽出し、逆転写した。スプライシングされる領域にまたがるプライマーとともにＰＣＲで使用したｃＤＮＡ。リバースＰＣＲプライマーは、５’ＣＡＴＧＴＡＡＧＡＣＴＧＣＡＣＣＣＣＧＧ（配列番号２０）である。伸長プライマーは５’ＡＧＧＣＣＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＴＡＣＣ（配列番号２１）である。以下はＰＣＲおよび伸長プライマーのマップである。
【００７６】
以下は、エクソン４にスプライシングされる（ＥＸ３（−））エクソン２である。エクソン２は斜字体で示し、エクソン４は斜字体ではなく太字で示す。フォワードＰＣＲプライマーは、エクソン２における斜字体の大きな文字の配列に対応する（５’ＡＡＣＣＡＧＧＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＣＴＴ３’）（配列番号１９）。リバースプライマーは、エクソン４における太字の大きな文字の配列の逆相補体に対応する（ＣＣＧＧＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＴＡＣＡＴＧ）（配列番号２２）。伸長プライマーは、エクソン／エクソン連結部にまたがる下線の配列の逆相補体であり、｜｜で標識される（Ｇ｜｜Ｇ  ＴＡＣＴＧＧＣＣＣＣＡＣＧＧＣＣＴ）（配列番号２３）。伸長プライマーに対するポリメラーゼによって、エクソン／エクソン連結部の上流の第１のＴヌクレオチド上流の相補体（Ｔは以下で大きい文字である。）が付加される場合、ｍＲＮＡが（ＥＸ３（−））であることが示される。
【化１７】
2018512121.tif 000020
【００７７】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＭＡＳＳＡＲＲＡＹ（登録商標）（Ａｇｅｎａ）プライマー伸長プロトコールにおいて使用し、製造者の説明書に従い精製した。プライマー伸長産物をＭＡＳＳＡＲＲＡＹ（登録商標）チップ上にスポットし、質量分析計上で分析した。この機器ソフトウェアは、検出される産物のそれぞれに対する曲線下面積を報告する。分離されたＰＣＲ産物に対する曲線下面積の比率を計算し、正確におよび不正確にスプライシングされるｍＲＮＡの比率の推定値とする。
【００７８】
発明者らは、エクソン３および全長ｃＤＮＡを欠く、発明者らが作製したｃＤＮＡを使用して標準曲線作成を行うことによって、アッセイを検証した。発明者らは、既知の比率でこれらを混合し、ＭＡＳＳＡＲＲＡＹ（登録商標）アッセイを使用して比率を推定した。本アッセイの誤差は５％以内であった。
【００７９】
発明者らは、エクソン３におけるＳＮＰの１２８種類の可能な組み合わせについて、エクソン２ＳＮＰが、ｃ．１９４Ｃ、ｃ．３００Ａ、ｃ．３３１Ａ、ｃ．３６２Ｃであり、エクソン４ＳＮＰがｃ．６８９Ｃ、ｃ．６９７Ｇ、ｃ．６９８Ｃ、ｃ．６９９Ｔ、ｃ．７０６Ａである、ＯＰＮ１ＬＷに対するミニ遺伝子を作製した。エクソン３ハプロタイプは、参照位置：ｃ．４５３、ｃ．４５７、ｃ．４６５、ｃ．５１１、ｃ．５１２、ｃ．５１３、ｃ．５２１、ｃ．５３２、ｃ．５３８のコード配列（翻訳開始をｃ．１とする。）で見出されるヌクレオチドの全ての可能な組み合わせであった。平均を計算するために使用される反復数は、２、３または４であった。発明者らは、色覚が正常な１００５名のデータベースを有し、これらのうち８９３名が、発明者らがミニ遺伝子アッセイで試験したハプロタイプを有した。
【００８０】
図６および７はミニ遺伝子の知見をまとめる。図６は、エクソン３スキッピングがあるｍＲＮＡの平均パーセンテージ（ｘ軸）とハプロタイプ数（ｙ軸）を示す、生成データのヒストグラムである。図６は、試験したハプロタイプのうち４３個が５％エクソン３−スキッピングｍＲＮＡをもたらしたことを示す。試験したハプロタイプのうち７個のみがエクソン３−スキッピングｍＲＮＡをもたらし、このハプロタイプのうち５個は検出可能なレベルでエクソン３をスキッピングしなかった。図７は、８９３名におけるエクソン３スキッピングの頻度を示す。
【００８１】
まとめると、図６〜８におけるデータから、発明者らが、ミニ遺伝子アッセイにおいてエクソン３−スキッピングがあるｍＲＮＡの相対量を推定するためにアッセイを開発したことが明らかになる。次に、発明者らは、エクソン３−スキッピングを示すハプロタイプと若年発症型近視との間の関連性を評価するために、このデータを使用する。
【００８２】
近視。近眼は最もよく見られる慢性障害である。これは、世界中および米国で深刻さを増す問題となっており；正常な視覚で出生したにもかかわらず、小児の３分の１超がその学校生活中に近眼になる。この状態は、眼鏡またはコンタクトレンズを装着することにより、および屈折矯正手術により補正され得るが、処置を必要とする者が非常に多いので、この処置は社会に対する莫大な損失となる。本処置は、感染および手術合併症などの副作用も有し得る。しかし、最も重篤な問題は、現在利用可能な解決策は全て、近眼に関連する屈折異常は補正するが、根底にある問題には対処しないことである。近視の一般的な形態は、発生中の眼の異常な伸長により引き起こされており、レンズおよび角膜によって形成される画像が網膜の前に焦点化されるようになる。異常な眼の成長によって、近眼のより重篤な形態がある者は、網膜剥離、緑内障、白内障および網膜変性に対するリスクがある状況に置かれる。
【００８３】
発明者らは、屈折異常があることが分かっている成人について判定した１８個のＬ−オプシンハプロタイプにおいて上記のエクソン３スキッピングアッセイを試験した。この結果から、変化の８９％がエクソンスキッピングに起因することが示される。このことから、本明細書中に記載のエクソンスキッピングアッセイが近視に対する素因を判定するための非常に有効な方法であることが明らかになる。
【００８４】
インビトロミニ遺伝子アッセイにおいて、ＬＩＡＶＡ（配列番号２）変異体がある患者からのエクソン３があるミニ遺伝子から、エクソン３を欠いたｍＲＮＡが生じた。ＬＶＡＶＡ（配列番号４）変異体がある患者からのエクソン３があるミニ遺伝子から、２つのあるいはスプライシングされたアイソフォーム、正常な全長ｍＲＮＡおよびエクソン３を欠くｍＲＮＡが生じた。対照ＬＩＡＩＳ（配列番号５）変異体がある正常な患者からのエクソン３があるミニ遺伝子からは、正常な全長ｍＲＮＡのみが生じた。発明者らのデータから、エクソン３多型の様々な組み合わせが全長ｍＲＮＡとエクソン３スキッピングｍＲＮＡとの間の均衡を変化させることが示され、このことから、この変異体が、このエクソンのスプライシングを調節する基礎的な機序を解明することにおいて非常に有用なものとなるスプライシング欠損の勾配を形成することが示唆される。
【００８５】
引用文献
1.     Neitz, J., and Neitz, M. (2011). The Genetics of Normaland Defective Color Vision. Vision Research 51, 633-651.
2.     Neitz, M., Carroll, J., Renner, A., Knau, H., Werner, J.S., and Neitz, J. (2004). Variety of genotypes in males diagnosed as dichromatic on a conventional clinical anomaloscope. Visual Neuroscience 21, 205-216.
3.     Crognale, M.A., Fry, M., Highsmith, J., Haegerstrom-Portnoy, G., Neitz, J., Neitz, M., and Webster, M.A. (2004). Characterization of a novel form of X-linked incomplete achromatopsia. Visual Neuroscience 21, 197-204.
4.     Carroll, J., Neitz, M., Hofer, H., Neitz, J., and Williams, D.R. (2004). Functional photoreceptor loss revealed with adaptive optics:  An alternate cause of color blindness. Proceedings of the National Academyof Sciences of the United   States of America 101, 8461-8466.
5.     Carroll, J., Dubra, A., Gardner, J.C., Mizrahi-Meissonnier, L., Cooper, R.F., Dubis, A.M., Nordgren, R., Genead, M., Connor, T.B., Jr., Stepien, K.E., et al. (2012). The effect of cone opsin mutations on retinal structure and the integrity of the photoreceptor mosaic. Invest Ophthalmol Vis Sci 53, 8006-8015.
6.     McClements, M., Davies, W.I., Michaelides, M., Young, T., Neitz, M., MacLaren, R.E., Moore, A.T., and Hunt, D.M. (2013). Variations in opsin coding sequences cause x-linked cone dysfunction syndrome with myopia and dichromacy. Invest Ophthalmol Vis Sci 54, 1361-1369.
7.     Gardner, J.C., Liew, G., Quan, Y.H., Ermetal, B., Ueyama, H., Davidson, A.E., Schwarz, N., Kanuga, N., Chana, R., Maher, E.R., et al. (2014). Three different cone opsin gene array mutational mechanisms with genotype-phenotype correlation and functional investigation of cone opsin variants. Human mutation 35, 1354-1362.
8.     Ueyama, H., Muraki-Oda, S., Yamade, S., Tanabe, S., Yamashita, T., Shichida, Y., and Ogita, H. (2012). Unique haplotype in exon 3 of cone opsin mRNA affects splicing of its precursor, leading to congenital color vision defect. Biochem Biophys Res Commun 424, 152-157.
9.     Pagani, F., Stuani, C., Tzetis, M., Kanavakis, E., Efthymiadou, A., Doudounakis, S., Casals, T., and Baralle, F.E. (2003). New type of disease causing mutations: the example of the composite exonic regulatory elements of splicing in CFTR exon 12. Hum Mol Genet 12, 1111-1120.
10.     Teraoka, S.N., Telatar, M., Becker-Catania, S., Liang, T., Onengut, S., Tolun, A., Chessa, L., Sanal, O., Bernatowska, E., Gatti, R.A., et al. (1999). Splicing defects in the ataxia-telangiectasia gene, ATM: underlying mutations and consequences. Am J Hum Genet 64, 1617-1631.
11.     Ars, E., Serra, E., Garcia, J., Kruyer, H., Gaona, A., Lazaro, C., and Estivill, X. (2000). Mutations affecting mRNA splicing are the most common molecular defects in patients with neurofibromatosis type 1. Hum Mol Genet 9, 237-247.
12.     Pagani, F., and Baralle, F.E. (2004). Genomic variants in exons and introns: identifying the splicing spoilers. Nat Rev Genet 5, 389-396.
13.     Ward, A.J., and Cooper, T.A. (2010). The pathobiology of splicing. The Journal of pathology 220, 152-163.
14.     Cooper, T.A., Wan, L., and Dreyfuss, G. (2009). RNA and disease. Cell 136, 777-793.
15.     Blencowe, B.J. (2000). Exonic splicing enhancers: mechanism of action, diversity and role in human genetic diseases. Trends Biochem Sci 25, 106-110.
16.     Zhang, C., Li, W.H., Krainer, A.R., and Zhang, M.Q. (2008). RNA landscape of evolution for optimal exon and intron discrimination. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 5797-5802.
17.     Neitz, M., Neitz, J., and Jacobs, G.H. (1991). Spectral tuning of pigments underlying red-green color vision. Science 252, 971-974.
18.     McClements, M., Neitz, M., Moore, A., and Hunt, D.M. (2010). BornholmEye Disease Arises From a Specific Combination of Amino Acid Changes Encoded by Exon 3 of the L/M Cone Opsin Gene. Invest Ophthalmol Vis Sci, ARVO E-Abstract 2609.
19.     McClements, M., Davies, W.I., Michaelides, M., Young, T., Neitz, M., Maclaren, R.E., Moore, A.T., and Hunt, D.M. (2013). Variations in opsin coding sequences cause X-linked cone dysfunction syndrome with myopia and dichromacy. Invest Ophthalmol Vis Sci.
20.     Cartegni, L., Wang, J., Zhu, Z., Zhang, M.Q., and Krainer, A.R. (2003). ESEfinder: A web resource to identify exonic splicing enhancers. Nucleic Acids Res 31, 3568-3571.
21.     Desmet, F.O., Hamroun, D., Lalande, M., Collod-Beroud, G., Claustres, M., and Beroud, C. (2009). Human Splicing Finder: an online bioinformatics tool to predict splicing signals. Nucleic Acids Res 37, e67.
22.     Fairbrother, W.G., Yeh, R.F., Sharp, P.A., and Burge, C.B. (2002). Predictive identification of exonic splicing enhancers in human genes. Science 297, 1007-1013.
23.     Sironi, M., Menozzi, G., Riva, L., Cagliani, R., Comi, G.P., Bresolin, N., Giorda, R., and Pozzoli, U. (2004). Silencer elements as possible inhibitors of pseudoexon splicing. Nucleic Acids Res 32, 1783-1791.
24.     Wang, Z., Rolish, M.E., Yeo, G., Tung, V., Mawson, M., and Burge, C.B. (2004). Systematic identification and analysis of exonic splicing silencers. Cell 119, 831-845.
25.     Zhang, X.H., and Chasin, L.A. (2004). Computational definition of sequence motifs governing constitutive exon splicing. Genes & development 18, 1241-1250.
26.     Oh, K.T., Longmuir, R., Oh, D.M., Stone, E.M., Kopp, K., Brown, J., Fishman, G.A., Sonkin, P., Gehrs, K.M., and Weleber, R.G. (2003). Comparison of the clinical expression of retinitis pigmentosa associated with rhodopsin mutations at codon 347 and codon 23. American Journal of Ophthalmology 136, 306-313.
27.     Weleber, R.G., and Gregory-Evans, K. (2001). Retinitis pigmentosa and allied disorders, (St. Louis: Mosby).
28.     Mizrahi-Meissonnier, L., Merin, S., Banin, E., and Sharon, D. (2010). Variable retinal phenotypes caused by mutations in the X-linked photopigment gene array. Investigative Ophthalmology and Visual Science 51, 3884-3892.
29.     Kuchenbecker, J.A., Greenwald, S., Neitz, M., and Neitz, J. (2014). Cone-isolating ON-OFF electroretinogram for studying chromatic pathways in the retina. Journal of the optical Society of America A 31, A208-A213.
30.     Greenwald, S., Kuchenbecker, J.A., Roberson, R.K., Neitz, M., and Neitz, J. (2014). S-opsin knockout mice with the endogenous M-opsin gene replaced by an L-opsin variant. Visual Neuroscience 31, 25-37.
31.     Carroll, J., Rossi, E., Porter, J., Neitz, J., Roorda, A., Williams, D., and Neitz, M. (2010). Deletion of the X-linked opsin gene array locus control region (LCR) results in disruption of the cone mosaic. Vision Research 50, 1989-1999.
【図１】
2018512121.tif 000021
【図２】
2018512121.tif 000022
【図３】
2018512121.tif 000023
【図４】
2018512121.tif 000024
【図５】
2018512121.tif 000025
【図６】
2018512121.tif 000026
【図７】
2018512121.tif 000027
【図８】
2018512121.tif 000028
【配列表】
2018512121000001.app
【国際調査報告】
2018512121.tif 000029
2018512121.tif 000030
2018512121.tif 000031