(57)【要約】  持続陽圧呼吸療法に対する応答を、それを必要とする対象においてインビトロで予測するための方法であって、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、ｍｉＲ．４８６．５ｐ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、心血管疾患を有する患者において差次的に発現する心血管系に機能的に関連するマイクロＲＮＡの発現レベルを、対象の単離試料において決定するステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
持続陽圧呼吸療法に対する応答を、それを必要とする対象においてインビトロで予測するための方法であって、
ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、ｍｉＲ．４８６．５ｐ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、心血管系に機能的に関連する及び心血管疾患に関連するマイクロＲＮＡの発現レベルを、前記対象の単離試料において決定するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記持続陽圧呼吸に対する応答が、治療前の初期血圧に対して少なくとも４．５ｍｍＨｇの血圧降下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マイクロＲＮＡの発現レベルが定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲによって検出され、式（Ｉ）に従って計算されたｄＣｔとして表される、請求項１又は２に記載の方法：
ｄＣｔ＝Ｃｔ  マイクロＲＮＡ−Ｃｔハウスキーピング遺伝子  （Ｉ）
式中、
・Ｃｔは、使用した蛍光シグナルが所定の閾値を越えるために必要とされる定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲアッセイにおけるサイクル数として特定されるサイクル閾値であり；
・ＣｔマイクロＲＮＡは、目的のマイクロＲＮＡのサイクル閾値レベルであり；
・Ｃｔハウスキーピング遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子のサイクル閾値レベルを表し；及び
・ｄＣｔは、２を底としたｌｏｇスケールでのマイクロＲＮＡのサイクル閾値レベルと、２を底としたｌｏｇスケールでのハウスキーピングＲＮＡのサイクル閾値レベルとの間の差である、
【請求項４】
ｍｉＲ．１００．５ｐの発現レベルを決定するステップを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐの発現レベル及びｍｉＲ．４８６．５ｐの発現レベルを決定するステップを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、及びｍｉＲ．４８６．５ｐの発現レベルを決定するステップを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２種のｍｉＲＮＡの発現レベルが決定され、且つ、前記方法は、
（ｉ）各マイクロＲＮＡの発現レベルを示す個別の離散スコアの合計から得られるＣＰＡＰに対する応答の確率スコア（Ｓ）を計算するステップ；及び
（ｉｉ）前記確率スコアが応答を示す確率スコアの範囲内にある場合、前記対象がＣＰＡＰに応答すると決定するステップ；
を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ及びｍｉＲ．４８６．５ｐの発現レベルが定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲによって決定され、これらが請求項３に記載の式（Ｉ）に従ってｄＣｔ値として表され；並びに
ＣＰＡＰに対する応答の確率スコア（Ｓ）が、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ及びｍｉＲ．４８６．５ｐの発現レベルを示す個別の離散スコアの合計から計算され、前記個別の離散スコアが以下の基準に従って各マイクロＲＮＡの発現レベルを示す、請求項７に記載の方法：
・式（Ｉ）に従ってｄＣｔ値として表されるｍｉＲ．４８６．５ｐのレベルが基準対照ｄＣｔ値よりも高い場合に１を加算する；
・式（Ｉ）に従ってｄＣｔ値として表されるｍｉＲ．３７８ａ．３ｐのレベルが基準対照ｄＣｔ値以下である場合に２を加える；及び
・２〜３の確率スコア（Ｓ）が、ＣＰＡＰに対する応答を示す。
【請求項９】
ｍｉＲ．４８６．５ｐのレベルの基準対照値がｄＣｔ値−７．２であり、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐのレベルの基準対照値がｄＣｔ値２．６であり、前記ｄＣｔ値が式（Ｉ）に従って計算され、ハウスキーピング遺伝子がＳＮＯＲＤ９５である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、およびｍｉＲ．４８６．５ｐの発現レベルが、定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲによって決定され、これらが請求項３に記載の式（Ｉ）に従ってｄＣｔ値として表され；並びに
ＣＰＡＰに対する応答の確率スコア（Ｓ）が、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、及びｍｉＲ．４８６．５ｐの発現レベルを示す個別の離散スコアの合計から計算され、前記個別の離散スコアが以下の基準に従って各マイクロＲＮＡの発現レベルを示す、請求項７に記載の方法：
・式（Ｉ）に従ってｄＣｔ値として表されるｍｉＲ．１００．５ｐのレベルが基準対照ｄＣｔ値よりも低い場合に１を加算する；
・式（Ｉ）に従ってｄＣｔ値として表されるｍｉＲ．４８６．５ｐのレベルが基準対照ｄＣｔ値より高い場合に２を加算する；
・式（Ｉ）に従ってｄＣｔ値として表されるｍｉＲ．３７８ａ．３ｐのレベルが基準値より低い場合に３を加算する；及び
・４〜６の確率スコア（Ｓ）が、ＣＰＡＰに対する応答を示す。
【請求項１１】
ｍｉＲ．１００．５ｐのレベルの基準対照値がｄＣｔ値０．４であり、ｍｉＲ．４８６．５ｐのレベルの基準対照値がｄＣｔ値−７．１であり、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐのレベルの基準対照値がｄＣｔ値２．６であり、前記ｄＣｔ値が式（Ｉ）に従って計算され、ハウスキーピング遺伝子がＳＮＯＲＤ９５である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が、閉塞性睡眠時無呼吸（ＯＳＡ：Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｓｌｅｅｐ  Ａｐｎｅａ）、抵抗性高血圧、及びこれらの疾患の混合からなる群から選択される心血管疾患又は心血管関連疾患を患う患者である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象が、抵抗性高血圧症を伴う閉塞性睡眠時無呼吸症候群の患者である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記単離試料が、血液、唾液、気管支肺胞洗浄液、及び尿からなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＰＡＰ療法の開始を、それを必要とする対象に選択又は推奨する方法であって、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、ｍｉＲ．４８６．５ｐ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、心血管系に機能的に関連する及び心血管疾患に関連するマイクロＲＮＡの発現レベルを、対象の単離試料において決定するステップを含み、
ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、ｍｉＲ．４８６．５ｐのいずれか１種の発現レベルがＣＰＡＰに対する応答を示す発現レベルの範囲内である場合に、ＣＰＡＰ療法を示す又は推奨する、方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法で持続陽圧呼吸（ＣＰＡＰ）療法に対する応答を予測するために、ポリメラーゼ連鎖反応試薬及び／又はノーザンブロット試薬からなる群から選択される、対象の単離試料においてマイクロＲＮＡの発現を検出するための手段の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、閉塞性睡眠時無呼吸（ＯＳＡ：Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｓｌｅｅｐ  Ａｐｎｅａ）を患う患者の、持続陽圧呼吸（ＣＰＡＰ：Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ａｉｒｗａｙ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ）による治療に対する応答をインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で予測する方法を提供する。これらの方法はまた、治療された患者の応答を追跡し得る。
【背景技術】
【０００２】
持続陽圧呼吸（ＣＰＡＰ）は、睡眠中の上気道に対して空気の添え木（ｐｎｅｕｍａｔｉｃ  ｓｐｌｉｎｔ）として機能し、閉塞を矯正する。ＣＰＡＰは、治療又は療法として、気道を開いた状態に保つために軽い空気圧を使用する。ＣＰＡＰは、閉塞性睡眠時無呼吸（ＯＳＡ）のような呼吸障害を有する人々に使用される。ＣＰＡＰはＯＳＡに対する最も効果的且つ至適基準な治療であり、ＣＰＡＰによる軽い圧力が、気道の虚脱又は遮断を防止する。ＣＰＡＰ療法は、閉塞性睡眠時無呼吸の患者の日常療法である。ＯＳＡの診断及びＯＳＡ患者の管理は、公衆衛生システムにおける重要な経済的影響を表している。
【０００３】
ＯＳＡは、保健機関により現実問題としてみなされている、広く蔓延している慢性疾患である。ＯＳＡは、中高年の１０％が罹患しており、年齢と共に患者数は増加している。ＯＳＡは、夜間の上気道の虚脱又は閉塞エピソードを繰り返すことを特徴とする。これらのエピソードは、生活の質の悪化、過度の日中傾眠、事故、高血圧、心血管および脳血管の疾患に関連しており、心血管疾患による超過死亡率と関連している。
【０００４】
更に、抵抗性高血圧症（ＲＨ：Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）患者の７０％超がＯＳＡも患っている。ＲＨは、異なる薬物クラスに属する３種の降圧剤を同時に使用したにもかかわらず、依然として目標血圧を上回ったままである高血圧として定義される。一部の著者が示しているように、ＣＰＡＰ療法は、２４時間の平均血圧（ＢＰ）の有意な降下をもたらす（非特許文献１を参照）。
【０００５】
しかし、ＣＰＡＰに対する応答は非常に変化しやすく、治療の遵守に依存するだけでなく、遺伝的要因からも推測される。従って、一部のＯＳＡ患者では、良好な遵守があっても、ＣＰＡＰ療法に対する応答が全くない場合もある。
【０００６】
現在、ＣＰＡＰ療法に対する応答を予測する方法はない。他方で、ＣＰＡＰ療法は、多数の患者、特に任意の他の疾患により引き起こされた、又はその結果としてＯＳＡとなったＯＳＡ患者にとって高価な慢性治療である。
【０００７】
従って、心拍変動等の、ＣＰＡＰ療法中に変化し得るいくつかの心血管の臨床的変数又はパラメータを開示する文献が存在する（非特許文献２を参照）。
【０００８】
他の文献は、ＣＰＡＰマシンの使用が少なくなることと関連する、患者の初期問題（自動滴定）、最近の生活上の出来事又は生活様式（独居又は他の人との同居）により影響を受ける、治療に対する遵守に関する。例えば、非特許文献３である。Ｌｅｗｉｓらは、全ての初期変数に関して、ＣＰＡＰ療法の最初の夜の後の問題を報告することは、その後のマシン使用の最も重要な予測因子であると思われ、さらに、自動滴定直後の１回のスクリーニング質問表は、治療失敗のリスクが高い人々の特定に有用であると思われることを報告した。
【０００９】
従って、応答患者の生活の質を改善し、非応答患者の費用及び時間を回避する、ＣＰＡＰ療法に対する応答を予測するための新規でより良い方法が必要なことは明らかであり、この方法により他の代替療法、例えば、外科手術、ライフスタイルの変更（特に肥満の対象の場合）、及び下顎前方維持装置（ＭＡＤ：Ｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｄｅｖｉｃｅ）の使用を導き出すことができる。更に、ＣＰＡＰによる治療に適切に応答するであろう患者の早期検出は、これらの患者によるＣＰＡＰ療法の良好な遵守を確実にするために、臨床的及びモニタリング的な特異作用の開発を可能にする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ−２０１３，Ｖｏｌ．Ｎｏ．３１０（２２），ｐｐ．：２４０７−２４１５）
【非特許文献２】ＰｌｏｓＯｎｅ−２０１２，Ｖｏｌ．Ｎｏ．７（３），ｅ３３７６９
【非特許文献３】Ｓｌｅｅｐ−２００４，Ｖｏｌ．Ｎｏ．１，ｐｐ．：１３４−１３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、いくつかのマイクロＲＮＡが、ＣＰＡＰ療法に対する応答を、このような治療を必要とする患者において予測するためのマーカーとして使用できることを発見した。
【００１２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡと略す）は、ＲＮＡサイレンシング及び遺伝子発現の転写後調節において機能する、植物、動物、及びいくつかのウイルス中に見いだされる小型非コードＲＮＡ分子（約２２ヌクレオチドを含む）である。ｍｉＲＮＡは、植物及び動物では真核細胞の核ＤＮＡによりコードされ、ゲノムがＤＮＡに基づく特定のウイルスではウイルスＤＮＡによってコードされ、ｍＲＮＡ分子内の相補配列と塩基対を形成して機能する。
【００１３】
従って、本発明により、ＣＰＡＰを用いて治療された応答患者と非応答患者との間で差次的に発現される、検出されたマイクロＲＮＡの発現レベルの分析を伴う方法を提唱する。応答患者は、治療前の初期の血圧（ＢＰ）と比較して少なくとも４．５ｍｍＨｇのＢＰ降下を示す患者である。
【００１４】
本発明の方法は堅実な方法であり、高い感度及び特異性の値を提供する。更に、この方法は、応答するか否かの可能性を臨床医に知らせる定量的なスコアパラメータを提供するので、診療所に容易に適用可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
第１の態様において、本発明は、ＣＰＡＰ療法に対する応答を予測するためのインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の方法であって、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、ｍｉＲ．４８６．５ｐ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、心血管系に機能的に関連する及び心血管疾患に関連するマイクロＲＮＡの発現レベルを、対象の単離試料において決定するステップを含む方法に関する。
【００１６】
これら全てのマイクロＲＮＡの配列は、２０１４年６月のｍｉＲｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）Ｒｅｌｅａｓｅ２１から検索することができる。ホモサピエンスの配列及び他の索引付けされた種由来の配列を得ることができる。特に、本明細書に述べたマイクロＲＮＡのｍｉＲｂａｓｅ中の登録番号は、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ（ＭＩＭＡＴ００００７３２）、ｍｉＲ．１００．５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００００９８）およびｍｉＲ．４８６．５ｐ（ＭＩＭＡＴ０００２１７７）である。
【００１７】
従って、本発明は、ＣＰＡＰ療法に対する応答を前記治療により利益を得る可能性がある対象において予測するための、１又は複数の心血管疾患関連マイクロＲＮＡ及び前記マイクロＲＮＡの特定の組み合わせの発現レベルの関連を初めて提唱する。
【００１８】
以下の実施例に示されるように、本発明の方法は、ＣＰＡＰ療法に対する応答の可能性を、これを必要とする患者（対象）において非常に特異的且つ高感度な方法で予測する。従って、応答患者が同定される。
【００１９】
注目すべきは、ＣＰＡＰにより次に治療される応答及び非応答の患者／対象の間で差次的に発現されることが検出されているマイクロＲＮＡが、健康対象（心血管疾患または疾患のリスクのない対象）に対して心血管機能不全のリスクを有する患者又は既にいずれかの心血管不全を患っている患者においてやはり差次的に発現される全てのマイクロＲＮＡであることである。言い換えれば、それらは心疾患に最も関連性があるマイクロＲＮＡ又は心血管疾患に関連するマイクロＲＮＡである。ｍｉＲＮＡが、心臓の発達及び適切な機能に重要であることは、科学界によって確立されており、広く認められている（Ｓｍａｌｌら、「ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ａｄｄ  ａ  ｎｅｗ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｔｏ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ−２０１０年、Ｖｏｌ．Ｎｏ．１２１、１０２２１０３２頁を参照）。従って、例えば、ｍｉＲ．１００．５ｐは心筋症に関連しており、健康対象よりも上方制御されているか、又は高レベルであり（Ｄａ  Ｃｏｓｔａら、「ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ」、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｈ−２０１２年、Ｖｏｌ．Ｎｏ．９３、５６３−５７２頁を参照）；ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐは、心臓の状態に対する薬物の有効性を決定する能力と関連しており（国際公開第２０１２０８３００４号パンフレットを参照）；並びにｍｉＲ．４８６．５ｐは心血管疾患のマーカー（国際公開第２０１２０６５１１３号パンフレット及びＤａ  Ｃｏｓｔａら、上記を参照）、特に、胸部大動脈瘤、対象の拡張期心不全、拡張期心不全のない左室肥大、左室リモデリング、虚血再灌流、又はこれらの疾患の組み合わせの他のｍｉＲＮＡと併せてマーカーとして提唱されている。
【００２０】
対象がＣＰＡＰ療法に対して応答者であるか否かを決定することにより、臨床医は、多くの重要な情報と併せて推奨すべき処置を決定することができる。
【００２１】
従って、第２の態様において、本発明は、ＣＰＡＰ療法の開始を選択又は推奨する方法であって、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、ｍｉＲ．４８６．５ｐ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、心血管系に機能的に関連する及び心血管疾患に関連するマイクロＲＮＡの発現レベルを、対象の単離試料において決定するステップを含み、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、ｍｉＲ．４８６．５ｐのいずれか１種の発現レベルがＣＰＡＰに対する応答を示す発現レベルの範囲内である場合にＣＰＡＰ療法を示す又は推奨する方法に関する。
【００２２】
これらの全ての方法の実施は、マイクロＲＮＡ発現を検出するための特定の手段を使用して行うことができる。従って、第３の態様において、本発明はまた、対象の単離試料においてマイクロＲＮＡの発現を検出するための手段の使用であって、上記の方法のいずれかで持続陽圧呼吸（ＣＰＡＰ）に対する応答を予測するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）試薬又はノーザンブロット試薬を含む手段の使用に関する。
【００２３】
対象の単離試料においてマイクロＲＮＡの発現レベルを検出するためのキットであって、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、及びｍｉＲ．４８６．５ｐの発現レベルを決定するための手段からなるキットも本発明の一部である。
【００２４】
更に、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、ｍｉＲ．４８６．５ｐ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡの発現レベルの、持続陽圧呼吸（ＣＰＡＰ）療法に対する応答をそれを必要とする対象において予測するためのマーカーとしての使用は、本発明の一部である。
【００２５】
注目すべきことに、本発明者らは、上記に開示された方法のいずれかによってＣＰＡＰに対する応答者として標識される対象における心血管のリスク減少を予測するために、これらのマイクロＲＮＡの発現レベルを使用することも提唱する。これは、ＣＰＡＰによる治療前のマイクロＲＮＡ発現レベルに従って応答者である可能性が高い対象では、その血圧が降下し、従って高血圧に関連する任意の心血管リスクもまた低下する可能性が高いためである。
【００２６】
治療を開始する前に対象がＣＰＡＰに応答するかどうかを決定することは、上記のように治療が実行不能且つ高価であるためだけでなく、治療への遵守が適切なものでない場合、多くの二次副作用又は有害効果をもたらすためであることから非常に価値がある。従って、対象が応答しそうにない場合、ＣＰＡＰが治療の選択肢から除外されれば、更なる合併症は回避される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＣＰＡＰに対する応答と関連させた、それぞれｍｉＲ１００．５ｐのレベル（ｄＣｔ  ｍｉＲ１００．５ｐとして）、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐのレベル（ｄＣｔ  ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐとして）、及びｍｉＲ．４８６．５ｐのレベル（ｄＣｔ  ｍｉＲ．４８６．５ｐ）（ＣＰＡＰに対する応答度を示すＸ軸の値の範囲として表す）に関する箱ひげ図を示す。
【図２】ＣＰＡＰに対する非応答者（Ａ）及び応答者（Ｂ）についてのｍｉＲ１００．５ｐレベル（ｄＣｔ  ｍｉＲ１００．５ｐとして）の箱ひげ図である。
【図３】ＣＰＡＰに対する非応答者（Ａ）及び応答者（Ｂ）についてのｍｉＲ．３７８ａ．３ｐレベル（ｄＣｔ  ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐとして）の箱ひげ図である。
【図４】単離試料由来のｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、及びｍｉＲ．４８６．５ｐのレベルを合わせたモデルを使用する、ＣＰＡＰに対する応答を予測する方法のＲＯＣ曲線を表す。Ｘ軸は１−特異性を示し、Ｙ軸は感度を示す。
【図５】ベースライン時の各ｄＣｔ  ｍｉＲＮＡのカットオフ点に関連して表される、初期ＭＢＰから最終ＭＢＰを差し引いた差として測定された平均血圧変化（ΔＭＢＰ）の箱ひげ図を示す。応答者を各グラフの右のボックスに、非応答者を各グラフの左のボックスに示す。矢印は中央値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書において使用する全ての用語は、他に記載がない限り、当該技術分野において公知の普通の意味で理解されるものとする。本出願において使用される特定の用語の他のより明確な定義は以下に述べるものであり、特に明示された定義がより広い定義を提供しない限り、明細書及び特許請求の範囲を通して一様に適用することを意図する。
【００２９】
本発明の意味において、用語「マイクロＲＮＡの発現のレベル」又は「マイクロＲＮＡ発現レベル」（交換可能に使用される）は、ＲＮＡの任意の分析手段、例えば定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により試料中に検出されたマイクロＲＮＡの量（一般にサイクル閾値（Ｃｔ）として表される）を包含する。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、逆転写酵素の使用を介して目的のＲＮＡをそのＤＮＡ相補体に逆転写することにより、発現された遺伝子をクローニングする。続いて、新たに合成したｃＤＮＡを増幅し、定量ＰＣＲを行う。ノーザンブロットのような他のＲＮＡ定量法と比較して、ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡレベルの検出のための最も強力で、感度が高く、定量的なアッセイであると考えられている。マイクロＲＮＡの発現レベルは、通常、試験に使用した蛍光シグナルが所定の閾値を越えるために必要とされるサイクル数であるサイクル閾値（Ｃｔ）によって表される。従って、Ｃｔは、蛍光シグナルがバックグラウンドレベルを超える値である。Ｃｔ値は２を底とする対数スケールで表され、単位はない。従って、特定のマイクロＲＮＡのＣｔは、試料中の数又はｍｉＲＮＡコピー（即ち、標的核酸の量）に反比例する。Ｃｔレベルが低いほど、試料中のｍｉＲＮＡの量が多くなる。ｍｉＲＮＡ発現の定量化は、技術的条件の変動性及び生物学的変動性によって影響を受けるので、通常Ｃｔ発現レベルの正規化は、ハウスキーピング遺伝子のＣｔ発現レベルを差し引くことによって実施される。ハウスキーピング遺伝子は、生体試料の中では発現の変動性が低い遺伝子であり、従って、発現の変動性を最小化するために有用である。ハウスキーピング遺伝子の一例はＳＮＯＲＤ９５遺伝子であり、これは実験及び生育の条件を通して一定であり、その変動性は技術的変動によってのみ影響を受けることが知られている（ＳＮＯＲＤ９５のＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号はＡＹ３４９５９４、バージョン１の１４．１１、２００３である）。
【００３０】
本発明の意味において、「心血管疾患」又は「心血管機能不全」又は「心血管機能不全リスク」（これらを同義語として使用する）という用語は、心臓若しくは血管のいずれか、又はその両方が最終的に心血管系に影響を与える疾患に関する。例として、心筋梗塞及び心筋虚血、不整脈、脳卒中、全身性高血圧（抵抗性高血圧を含む）、突然死、及び心不全が挙げられる。「心血管関連疾患」という用語は、心血管疾患の原因又は結果であり得る疾患を指す。これらの「心血管関連疾患」の中には、閉塞性睡眠時無呼吸があり、後者はまた、心血管疾患リスクを有する患者又は更に任意の心血管疾患を患う患者に関連する。
【００３１】
「基準対照値」は、本発明の文脈において、対象の群に由来する特定のマイクロＲＮＡのレベル又は量を意味し、対象由来の被験試料をＣＰＡＰ応答者群又はＣＰＡＰ非応答者群に分類可能にするレベル又は量である。また、本発明の文脈において、基準対照値は、試験試料をＣＰＡＰ療法が既に効力を有する群、又はＣＰＡＰ療法が未だ効力を発していない群に分類可能にするカットオフであってもよい。更に、本発明において、「基準外」という表現が用いられる場合、分析した特定のマイクロＲＮＡのレベル又は量が、前記マイクロＲＮＡについて決定されたカットオフを超えるか、又はそれ未満であると理解すべきである。試料は、ＣＰＡＰに対する特定の応答の有無、段階又は経過が以前に適切に行われたことがある対象又は対象群から採取されてもよい。この値は、分析されるべき状態が存在する対象を、このような状態が存在しない対象から判別するための閾値として使用される。基準対照値は、通常、対象の類似の特性（年齢、性別、人種等）を考慮して決定される。更に、基準対照値は、ＣＰＡＰ受容対象が前記ＣＰＡＰ療法に応答しているかどうかを決定する方法であるという特殊な場合、同じ対象からの値であるが、異なる時点で測定された値であってよい。当業者であれば、一般知識を利用して、本発明の方法のそれぞれについて基準対照レベルを得るためのより適切な対象又は対象群を選択することができる。選択された対象群から基準値を得る方法は、最新技術において周知である。
【００３２】
選択された対象群から基準値を得る方法は、最新技術（Ｂｕｒｔｉｓ  Ｃ．Ａ．ら、２００８年、１４章「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｖａｌｕｅｓ」の項）において周知である。特定の場合、基準対照値は、従来のＲＯＣ解析（受信者動作特性解析）によって定義されたカットオフ値である。
【００３３】
上記のように、本発明は、持続陽圧呼吸（ＣＰＡＰ）療法に対する応答を、これを必要とする対象において予測するインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での方法であって、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、ｍｉＲ．４８６．５ｐ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、新血管系に機能的に関連する及び心血管疾患に関連するマイクロＲＮＡ（心血管機能不全または心血管機能不全のリスクのある患者において差次的に発現することが知られているマイクロＲＮＡ）の発現レベルを、対象の単離試料において決定するステップを含む方法を包含する。
【００３４】
本発明の第１の態様の特定の実施形態において、場合により以下の任意の実施形態と組み合わせて、持続陽圧呼吸に対する応答は、初期血圧からＣＰＡＰ後の最終血圧を差し引いた差として表される血圧の降下である。より特定の実施形態において、持続陽圧呼吸に対する応答は、治療前の初期血圧に対して少なくとも４．５ｍｍＨｇの血圧降下である。
【００３５】
別のより特定の実施形態において、持続陽圧呼吸に対する応答は、治療前の初期血圧に対して少なくとも４．５ｍｍＨｇの血圧降下であり、それを必要とする対象は、閉塞性睡眠時無呼吸（ＯＳＡ）、抵抗性高血圧、及びこれらの疾患の混合からなる群から選択される、心血管疾患又は心血管関連疾患を患う患者である。
【００３６】
本発明の第１の態様の別の特定の実施形態において、場合により以下の任意の実施形態と組み合わせて、目的のマイクロＲＮＡの発現レベルは定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲによって検出され、式（Ｉ）に従って計算されたｄＣｔ値として表される。
【００３７】
ｄＣｔ＝Ｃｔ  マイクロＲＮＡ−Ｃｔハウスキーピング遺伝子  （Ｉ）
【００３８】
式中、
・Ｃｔは、使用した蛍光シグナルが所定の閾値を越えるために必要とされる定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲアッセイにおけるサイクル数として特定されるサイクル閾値であり、
・ＣｔマイクロＲＮＡは、目的のマイクロＲＮＡのサイクル閾値レベルであり、
・Ｃｔハウスキーピング遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子のサイクル閾値レベルを表し、
・ｄＣｔは、２を底としたｌｏｇスケールでのマイクロＲＮＡのサイクル閾値レベルと、２を底としたｌｏｇスケールでのハウスキーピングＲＮＡのサイクル閾値レベルとの間の差である。
【００３９】
従って、特定の単離試料について、目的の各ｍｉＲＮＡについてのｄＣｔは、式（Ｉ）を用いて計算され、この値が基準対照ｄＣｔ値と対比される。
【００４０】
より特定の実施形態において、ハウスキーピング遺伝子は、核小体低分子ＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ＲＮＡ）９５（ＳＮＯＲＤ９５）として知られているＲＮＡをコードする遺伝子である。
【００４１】
本発明の第１の態様の特定の実施形態において、ｍｉＲ．１００．５ｐの発現レベルを決定する。更により特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡの発現レベルは、式（Ｉ）に従って計算したｄＣｔ値によって決定され、ｍｉＲ．１００．５ｐのｄＣｔが基準対照値よりも低い場合、ＣＰＡＰに対する応答を示す。
【００４２】
最も特定の実施形態において、ｍｉＲ．１００．５ｐの基準対照はｄＣｔ値０．７５であり、ハウスキーピング遺伝子はＳＮＯＲＤ９５である。
【００４３】
ｍｉＲ．１００．５ｐの発現レベルの単変量解析により、良好な応答者である対象を極度の非応答者である対象から良好に分離することができる。良好な応答者とは、ＣＰＡＰの受容により対象が急速に反応し、ＢＰが降下することを意味する。他方で、極度の非応答者は、ＣＰＡＰの受容によりＢＰの減少が全く観察されない対象である。
【００４４】
ｄＣｔ（ｍｉＲ．１００．５ｐ）として表されるｍｉＲ．１００．５ｐのマイクロＲＮＡ量が０．７５より高いか低いかにより、ＲＯＣの曲線下面積９１．７％で、ＣＰＡＰに対する良好な応答患者を、極度の非応答患者から分類することができる。
【００４５】
発明者らは、ＣＰＡＰに対する良好な応答及び不十分な応答の全ての種類を有する対象を、高い感度及び特異性で分類することを可能にする、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ及びｍｉＲ．４８６．５ｐの両方の発現レベルを使用するモデルも開発した。従って、このモデルは、良好な応答者ほどには早く応答しないと思われる応答者を、極度の非応答者ではないが非応答者として臨床的に標識された非応答者から良好に分類することができる。
【００４６】
より特定の実施形態において、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ及びｍｉＲ．４８６．５ｐの発現レベルも、式（Ｉ）に従ってそれぞれｄＣｔ値を計算することによって決定される。更により特定の実施形態において、式（Ｉ）のハウスキーピング遺伝子はＳＮＯＲＤ９５である。
【００４７】
従って、本発明の第１の態様のより特定の実施形態において、本方法は、少なくとも２種のｍｉＲＮＡの発現レベルを決定するステップ、並びに
（ｉ）各マイクロＲＮＡの発現レベルを示す個別の離散スコアの合計から得られるＣＰＡＰに対する応答の確率スコア（Ｓ）を計算するステップ、及び
（ｉｉ）この確率スコアが応答を示す確率スコアの範囲内にある場合、対象がＣＰＡＰに応答すると決定するステップ、を含む。
【００４８】
複数のｍｉＲＮＡが決定され、特にｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ及びｍｉＲ．４８６．５ｐの発現レベルが決定される場合、本発明の第１の態様の方法は、
（ｉ）各マイクロＲＮＡの発現レベルを示す個別の離散スコアの合計から得られる、ＣＰＡＰに対する応答の確率スコア（Ｓ）を計算するステップ、及び
（ｉｉ）この確率スコアが応答を示す確率スコアの範囲内にある場合、対象がＣＰＡＰに応答すると決定するステップを更に含む。
【００４９】
ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ及びｍｉＲ．４８６．５ｐの両方のレベルが決定される場合、以下の実施例に示されるように、ＣＰＡＰに対する応答対象と非応答対象との間の高い判別能力（ＡＵＣ＝０．８８）が得られる。より特定の実施形態において、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ及びｍｉＲ．４８６．５ｐのレベルは、定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲによって決定され、これらは上記定義の式（Ｉ）に従ってｄＣｔ値として表され、ＣＰＡＰに対する応答の確率スコア（Ｓ）は、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐおよびｍｉＲ．４８６．５ｐの発現レベルを示す個別の離散スコアの合計から計算され、前記個別の離散スコアは以下の基準に従ってマイクロＲＮＡの各発現レベルを示す：
・式（Ｉ）に従ってｄＣｔ値として表されるｍｉＲ．４８６．５ｐのレベルが基準対照ｄＣｔ値よりも高い場合、最も特別にはｄＣｔ値−７．２より高い場合に１を加算する；
・式（Ｉ）に従ってｄＣｔ値として表されるｍｉＲ．３７８ａ．３ｐのレベルが基準対照ｄＣｔ値以下、最も特別にはｄＣｔ値２．６以下である場合に２を加算する；並びに、２〜３の確率スコアが、ＣＰＡＰに対する応答を示す。
【００５０】
ハウスキーピング遺伝子がＳＮＯＲＤ９５である場合、式（Ｉ）に従って計算される特定のｄＣｔ値は−７．２及び２．６である。
【００５１】
従って、特定の実施形態において、まずｍｉＲ．１００．５ｐの発現レベルを決定することが提唱され、より高い判別能力が所望される場合、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ及びｍｉＲ．４８６．５ｐの発現レベルのさらなる解析が実施される。
【００５２】
正確には、本発明の方法の感度及び特異性を向上させるために、本発明者らは、本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態において、場合により下記又は上記の任意の実施形態と組み合わせて、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、及びｍｉＲ．４８６．５ｐの発現レベルを決定することを提唱する。
【００５３】
３種のｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、及びｍｉＲ．４８６．５ｐの発現レベルが決定された時に、本方法を診療所でより実行可能に適用できるようにするために（容易な臨床実装）、本発明の第１の態様によるＣＰＡＰ応答を予測する方法は、
（ｉ）ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、及びｍｉＲ．４８６．５ｐそれぞれの発現レベルを示す個別の離散スコアの合計から計算された、ＣＰＡＰに対する応答の確率スコア（Ｓ）を得るステップ、及び
（ｉｉ）計算された確率スコア（Ｓ）が応答を示す確率スコアの範囲内にある場合、対象がＣＰＡＰに応答すると決定するステップ、を含む。
【００５４】
確率スコアを計算するより好ましい実施形態において、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、及びｍｉＲ．４８６．５ｐの発現レベルは、定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲによって決定され、これらは上記定義の式（Ｉ）に従ってｄＣｔ値として表され、ＣＰＡＰに対する応答の確率スコア（Ｓ）は、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、及びｍｉＲ．４８６．５ｐの各発現レベルを示す個別の離散スコアの合計から計算され、前記個別の離散スコアは以下の基準に従って各マイクロＲＮＡの発現レベルを示す：
・式（Ｉ）に従ってｄＣｔ値として表されるｍｉＲ．１００．５ｐのレベルが基準対照ｄＣｔ値よりも高い場合に１を加算する；
・式（Ｉ）に従ってｄＣｔ値として表されるｍｉＲ．４８６．５ｐのレベルが基準対照ｄＣｔ値より高い場合に２を加算する；
・式（Ｉ）に従ってｄＣｔ値として表されるｍｉＲ．３７８ａ．３ｐのレベルが基準対照ｄＣｔ値より低い場合に３を加算する；及び、
４〜６の確率スコア（Ｓ）が、ＣＰＡＰに対する応答を示す。
【００５５】
特に、４〜６の確率スコアは、８４％〜１００％の確率のＣＰＡＰに対する応答を示す。０〜１までの確率スコアは、８５．７％〜９６．２％の確率のＣＰＡＰに対する非応答を示す。
【００５６】
好ましい実施形態において、ＣＰＡＰに対する応答の確率スコアを計算する場合、ｍｉＲ．１００．５ｐ発現（ｄＣｔｍｉＲ．１００．５ｐ）の基準ｄＣｔ値は０．４であり、ｄＣｔｍｉＲ．１００．５ｐが０．４未満である場合にそのスコアに１を加算する。別の好ましい実施形態において、場合により上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、ｍｉＲ．４８６．５ｐ発現（ｄＣｔｍｉＲ．４８６．５ｐ）の基準ｄＣｔ値は−７．１であり、ｄＣｔｍｉＲ．４８６．５ｐが−７．１より高い場合にスコアに２を加算する。別の好ましい実施形態において、場合により上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ発現（ｄＣｔ  ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ）の基準ｄＣｔ値は２．６であり、ｄＣｔｍｉＲ．４８６．５ｐ  が２．６未満である場合、スコアに３を加算する。
【００５７】
ハウスキーピング遺伝子がＳＮＯＲＤ９５である場合、式（Ｉ）に従って計算される特定のｄＣｔ値は０．４、−７．１、及び２．６である。
【００５８】
３種のｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、及びｍｉＲ．４８６．５ｐの発現レベルを決定するステップ、並びにＣＰＡＰに対する応答の確率スコアを得るステップを更に含むこのモデルを使用することにより、確率スコアが０〜１である場合、ＣＰＡＰ療法に対する応答確率は３〜１５％であり、確率スコアが２〜３である場合、ＣＰＡＰ療法に対する応答確率は４０％〜８０％である。
【００５９】
３種のｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、及びｍｉＲ．４８６．５ｐの発現レベルが決定されると、下記の実施例に表すように、ＣＰＡＰの応答対象と非応答対象との間の高い判別能力が得られる（ＲＯＣ  ＡＵＣ＝０．９１）。更に、このモデルは、全ての対象タイプ（極度に良好な応答者、良好な応答者、無応答者、極度に不十分な応答者）に適用でき、従って、応答の程度とは独立した良好な分類が得られる。下記の実施例に表すように、３種のｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、及びｍｉＲ．４８６．５ｐの少なくとも発現の決定を使用するこのモデルは、ＣＰＡＰに対して異なる応答度を有するサンプルのコホートから得られるが、このモデルを別のコホートにおいてさらに検証した。
【００６０】
本発明の態様及び実施形態のいずれかの特定の実施形態において、対象は、閉塞性睡眠時無呼吸（ＯＳＡ）、抵抗性高血圧、心筋梗塞、心筋虚血、不整脈、脳卒中、心不全、及びこれらの疾患の混合からなる群から選択される心血管疾患又は心血管関連疾患を患う患者である。より特定の実施形態において、対象は、閉塞性睡眠時無呼吸（ＯＳＡ）、抵抗性高血圧、及びこれらの疾患の混合からなる群から選択される心血管疾患又は心血管関連疾患を患う患者である。
【００６１】
最も特定の実施形態において、場合により上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、患者は、閉塞性睡眠時無呼吸を患う患者、より詳細には抵抗性高血圧を伴う閉塞性睡眠時無呼吸を患う患者である。
【００６２】
別の特定の実施形態において、場合により上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、単離試料は、血液（血清、血漿、又は全血から選択され得る）、唾液、気管支肺胞洗浄液、及び尿からなる群から選択される。
【００６３】
別の特定の実施形態において、場合により上記又は下記の任意の実施形態と組み合わせて、ＣＰＡＰに対する応答は、ＣＰＡＰを用いた治療前の初期の血圧（ＢＰ）に対して≦４．５ｍｍＨｇのＢＰ降下を意味する（少なくとも４．５ｍｍＨｇ、０．６ｋＰａに等しい）。
【００６４】
本発明はまた、閉塞性睡眠時無呼吸（ＯＳＡ）、抵抗性高血圧、心筋梗塞、心筋虚血、不整脈、脳卒中、心不全、及びこれらの疾患の混合からなる群より選択される心血管疾患又は心血管関連疾患を患う患者にＣＰＡＰ療法の開始を選択又は推奨する方法であって、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、ｍｉＲ．４８６．５ｐ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、心血管系に機能的に関連する及び心血管疾患に関連するマイクロＲＮＡの発現レベルを、患者の単離試料において決定するステップを含み、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、ｍｉＲ４８６．５ｐのいずれか１種の発現レベルが、高い確率、特に８４％から１００％の確率で応答が起こることを意味する、ＣＰＡＰに対する応答を示す発現レベルの範囲内である場合、ＣＰＡＰ療法が示される又は推奨される方法に関する。
【００６５】
ＣＰＡＰ療法の開始を選択又は推奨するためのこれらの方法の好ましい実施形態において、単離試料はまた、血液（血清、血漿、又は全血から順に選択することができる）、唾液、気管支肺胞洗浄液、及び尿からなる群から選択される。いずれにしても、マイクロＲＮＡを単離することができる細胞又は体液を含む、対象由来の試料が有用である。
【００６６】
上記で定義した方法において持続陽圧呼吸（ＣＰＡＰ）に対する応答を予測する目的で対象の単離試料中のマイクロＲＮＡの発現を検出するために使用される特定の手段の中には、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、又はｍｉＲ．４８６．５ｐのいずれか１つを検出するための適切なプローブ、プライマー、及びバッファーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれ得る。より具体的な手段は、実際に、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、又はｍｉＲ．４８６．５ｐの増幅のためのプライマーであり、これらは、別々に提供されても、あるいは一組のプライマー対で提供されてもよい。これらの手段は全て、前記マイクロＲＮＡを検出するための全ての試薬及び指示書を含むキット又はアレイの一部を形成してもよい。前記アレイの一例は、心血管疾患を患っていない対象及び発症中の対象に対して心血管疾患の間に発現の変化を示すことが知られている８４個のｍｉＲＮＡの発現をプロファイルするＱｉａｇｅｎ（登録商標）ヒト心血管疾患ｍｉＲＮＡ  ＰＣＲアレイ、ＭＩＨＳ−１１３Ｚである。
【００６７】
実際に、特定の実施形態において、本発明の方法を実施するために使用する手段は、ＲＴ−ＰＣＲに基づく技術に用いられるＰＣＲ試薬を含み、ｑＰＣＲアプローチと組み合わせた場合、定量的であるという利点を有し得る。ＲＴ−ｑＰＣＲは、ｍＲＮＡの発現の研究に一般的に使用される。
【００６８】
対象の単離試料においてマイクロＲＮＡの発現レベルを検出するためのキットであって、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、及びｍｉＲ．４８６．５ｐの発現レベルを決定するための手段からなるキットも本発明の一部である。好ましい実施形態において、このキットは、ＰＣＲにおけるｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、及びｍｉＲ．４８６．５ｐの増幅並びに増幅の視覚化のための（場合により蛍光発光分子で標識された）プライマー及びプローブを含む。
【００６９】
明細書及び特許請求の範囲を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語及びその変形語は、他の技術的特徴、添加物、構成要素、又はステップを排除することを意図しない。更に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」の場合を包含する。本発明の追加の目的、有利性、及び特徴は、本明細書の検討の際に当業者に明らかになるか、又は本発明の実践によって習得され得る。以下の実施例は例示のために提供され、本発明を限定する意図のものではない。更に、本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態及び好ましい実施形態の全ての可能な組み合わせを包含する。
【実施例】
【００７０】
Ａ．対象の特徴及びマイクロＲＮＡの解析、実験データの統計解析
閉塞性睡眠時無呼吸（ＯＳＡ）及び抵抗性高血圧（ＲＨ）を有するが、緊急治療を必要とする無力化過眠症を有さない患者（エプワース睡眠尺度（ＥＳＳ：Ｅｐｗｏｒｔｈ  ｓｌｅｅｐ  ｓｃａｌｅ）≦１８）におけるＣＰＡＰによる治療に対する応答の予測にｍｉＲＮＡ発現が寄与する可能性の評価のために、ＨＩＰＡＲＣＯにおいてＣＰＡＰに対してランダム化された患者の生体試料（ＥＤＴＡおよび抗凝固剤を含むチューブに回収された血漿）を得た（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｇａｒｃiａら、２０１３、上記を参照）。
【００７１】
ＣＰＡＰに対する応答は、４．５ｍｍＨｇを超える平均血圧の変化（初期と終了時の差によって計算される）として定義する。
【００７２】
より詳細には、３ヶ月のＣＰＡＰ療法の遵守（＞４．５時間／夜）の前後で評価された患者のより大きな前向き介入試験から、ＲＨを有する４１名の男性ＯＳＡ患者が同定された。ＣＰＡＰに対する応答は、４．５ｍｍＨｇを超えるＢＰ変化として定義した。４１人の患者のうち２０人が平均ＢＰの降下（平均±ＳＤ、１１．５±５ｍｍＨｇ）を示し（応答者群（これによりＲＧまたはＢとする））、２１人の患者において、平均ＢＰの有意な降下はなかった（−１．５±４．７ｍｍＨｇ）（非応答者群（これによりＮＲＧまたはＡとする））。４１人の患者の早朝空腹時血漿からｍｉＲＮＡを単離し、心血管系に焦点を当てたｍｉＲＮＡの発現プロファイリングを、カスタムアレイ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実施し、次いでｑＲＴ−ＰＣＲにより検証した。ロジスティック回帰モデルを適合させ、好ましいＢＰ応答を予測するｍｉＲＮＡを同定した。較正、判別、純再分類指数、及び交差検証を評価した。
【００７３】
マイクロＲＮＡレベルの解析及びＣＰＡＰに対する応答／非応答との相関のために、参加者を３つのグループ、即ち、ＣＰＡＰに対して非常に良好な応答を示すグループ（グループＢ）及びＣＰＡＰに対して非常に低い応答のグループ（極度の非応答者、グループＡ）として選択された各１２人の患者の２つのグループ並びに残りの患者による第３のグループに分けた。１２人のメンバー（Ａ及びＢからの）のグループは、トレーニングコホートとして、又は主要な違いを検出するための単純化されたグループとして使用された。
【００７４】
その後、全サンプルサイズ（ｎ＝４１）を検証に使用した。得られたモデルを、以下に示す統計的検定を使用してさらに検証した。
【００７５】
上記のように、ＣＰＡＰ療法前の心血管系に焦点を当てたｍｉＲＮＡの各メンバーの発現プロファイリングを、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ヒト心血管疾患ｍｉＲＮＡ  ＰＣＲアレイ、ＭＩＨＳ−１１３Ｚ（８４個のｍｉＲＮＡの発現をプロファイルする）を用いて決定した。
【００７６】
次の表１は、単純化のために解析対象の１２人のグループの特徴を示す。
【００７７】
【表１】
2018502570.tif 000002
【００７８】
略語：ＣＨＤ：冠状動脈性心疾患；エプワース：エプワーステスト値で評価した日中傾眠；ＳＢＰ：収縮期血圧；Ｐｏｔ．Ｓａ／抗アルドステロン：体位性起立性頻脈症候群血清アルドステロン。ＣＲＰ：Ｃ−反応性タンパク質；ＡＨＩ：無呼吸−低呼吸指数；ＣＴ９０：酸素飽和度が９０％未満の時間のパーセンテージ。
【００７９】
平均血圧の変化との線形及び非線形の関係をグラフで評価するために、２つの追加のカットオフ点を、グループＡ及びＢにおいて観察された中央値に基底で加え、平均血圧の変化の間隔を≦０．５、（０．５，４．５］、（４．５，１１．５］および＞１１．５の間隔に拡げた。
【００８０】
グループ間の比較は、２及び３つのグループ間の量的特徴の比較のためにそれぞれマン・ホイットニー及びクラスカル・ウォリス検定を使用し、質的変数のためにフィッシャー検定を使用して評価した（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ  Ｍ、Ｗｏｌｆｅ  ＤＡ（１９７３）Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  ６８〜７５頁（２サンプル）、１１５〜１２０を参照）。ロジスティック回帰モデルを適合させて、治療前データに基づいてＣＰＡＰに対する応答を予測した（Ｈｏｓｍｅｒ  ＤＷ、Ｌｅｍｅｓｈｏｗ  Ｓ（１９８９年）Ａｐｐｌｉｅｄ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ．８〜１０、５８、６０、８５〜８６頁を参照）。ＡＵＣによって測定された、モデルの判別能力を最大化する変数は、尤度比検定に従ってそれらの統計的に有意な寄与が実証された場合に該モデルに含まれる（Ｈｏｓｍｅｒ  ＤＷ、Ｌｅｍｅｓｈｏｗ  Ｓ（２０１３年）Ａｐｐｌｉｅｄ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ．の１２、１４〜１５、１８、３９〜４１、８６、１１１、１１４〜１１５、１２５、２３１、２６１〜２６２、２７６、２８０、２９５、３４５、３５０、３５３頁を参照）。各量的変数のカットオフ点候補は、サンプルを少なくとも１０人の応答者又は非応答者の２つのカテゴリーに分けたものから選択した。モデルの較正を試験するためにホスマー・レメショウ検定を使用し、多変量ロジスティック回帰モデルに統計的に有意な寄与はしないがＡＵＣを改善する変数の包含を決定するために、連続純再分類指数を使用した（Ｈｏｓｍｅｒ  ＤＷ，Ｌｅｍｅｓｈｏｗ  Ｓ（１９８９）「Ａｐｐｌｉｅｄ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓの１５８〜１６４、２０４、３５４；および１７３〜１８２、２０６頁を参照）。最終的なモデルを、使いやすいスコアシステム（整数値の合計）に変換した。各カットオフ点候補の感度及び特異性を推定した。正確な二項分布を使用して、比率に対する９５％信頼区間を推定した。Ｒソフトウェア及び５％の有意水準を使用した。
【００８１】
Ｂ．予測目的のためのマイクロＲＮＡレベルの分析（ＣＰＡＰ療法に対する応答の予測）
ほとんど全てのｍｉＲＮＡについて、６人の比較的高い応答者の間の発現は、非応答者の発現より大きい。発現の解析により、８種の候補ｍｉＲＮＡのサブセット（ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．２９ａ．３ｐ、ｍｉＲ．１４４．３ｐ、ｍｉＲ．１５０．５ｐ、ｍｉＲ．７．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、ｍｉＲ．９２ａ、及びｍｉＲ４８６．５ｐ）を同定することができた。最も低い変動性を示したため、ハウスキーピングＳＮＯＲＤ９５を選択した。このハウスキーピングを使用して、式（Ｉ）に従って各ｍｉＲＮＡのｄＣｔを推定した。
【００８２】
ｄＣｔ＝Ｃｔ（ｍｉＲ）−Ｃｔ（ＳＮＯＲＤ９５）（Ｉ）
【００８３】
各１２人のグループＡ及びＢ、並びに更に検証された全患者（ｎ＝４１）におけるマイクロＲＮＡ発現レベルの解析から、本発明者らは、ｍｉＲ．１００．５ｐの発現レベルが、対象がＣＰＡＰに対して極度に良好な応答者及び極度に不十分な応答者である場合に、応答者と非応答者を判別することができると結論した（９１．７％のＲＯＣ曲線下面積、データ非掲載）。このデータは、例えば、図２から導き出され、１２人の解析グループのうち６人の最も非応答な者及び６人の最も良好な応答者の値の解析から得られた。
【００８４】
更に、ＣＰＡＰに対する応答とｍｉＲＮＡ発現との間の関係で図２及び図３（非応答者（Ａ）及び応答者（Ｂ）についてのｍｉＲ１００．５ｐレベル及びｍｉＲ．３７８ａ．３ｐレベルの箱ひげ図）から見て分かるように、ｍｉＲ．１００．５ｐとは別に、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐに統計的に有意な傾向があった。従って、両方のｍｉＲＮＡは、ＣＰＡＰに対する応答が高い患者ほど低いｄＣｔを示した。
【００８５】
感度及び特異性を改善し、応答者及び非応答者が極度に良好でも悪くもない応答者の場合の分類を可能にするモデル又は方法を得るために、本発明者らは、マイクロＲＮＡの発現レベルの解析から、マイクロＲＮＡの特定の組み合わせが良好なアプローチであると結論付けた。
【００８６】
図１（パネルＡ〜Ｃ）は、ＣＰＡＰに対する応答と関連させた、４１の単離試料のそれぞれｍｉＲ１００．５ｐのレベル（ｄＣｔ  ｍｉＲ１００．５ｐとして）、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐのレベル（ｄＣｔ  ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐとして）、及びｍｉＲ．４８６．５ｐのレベル（ｄＣｔｍｉＲ．４８６．５ｐ）（ＣＰＡＰに対する応答度を示す値の範囲として表す）に関する箱ひげ図を示す。図１は、３種のマイクロＲＮＡのレベルを併せて見ると、意味のある情報を提供していることを明確に示している。グラフ（Ａ）及び（Ｂ）の２つの右の箱ひげ図は、それぞれのグラフの２つの左の箱ひげ図の中央値と意味のある異なる中央値を有する。
【００８７】
トレーニングセットにおいて、平均血圧の変化とｍｉＲＮＡ  １００．５ｐ及び３７８ａ．３ｐの正規化された発現（ハウスキーピングＳＮＯＲＤ９５を基準としたｄＣｔ）との間に統計的に有意な線形相関がある。ｍｉＲＮＡ  ４８６．５ｐの正規化された発現とは線形相関がない。スピアマン係数に基づいてほぼ同じ結果が示される。
【００８８】
ｄＣｔ  ｍｉＲＮＡ  １００．５ｐ：
ピアソン相関  ｒ＝−０．４９、ｐ値＝０．０１４
スピアマン相関  ｓ＝−０．４８、ｐ値＝０．０１６
【００８９】
ｄＣｔ  ｍｉＲＮＡ  ３７８ａ．３ｐ：
ピアソン相関  ｒ＝−０．５６、ｐ値＝０．００７
スピアマン相関  ｓ＝−０．５３、ｐ値＝０．０１１
【００９０】
ｄＣｔ  ｍｉＲＮＡ  ４８６．５ｐ：
ピアソン相関  ｒ＝０．１７、ｐ値＝０．４１４
スピアマン相関  ｓ＝０．１９、ｐ値＝０．３８７
【００９１】
ｄＣｔ  ｍｉＲＮＡ  ４８６．５ｐに対して有意な線形相関がないにもかかわらず、これらのｍｉＲＮＡ発現についてベースライン（治療前）で定義された全てのカットオフ点は、図５（Ａ〜Ｃ）に例示するように１０ｍｍＨｇを超える平均血圧の正の中央値変化を示し、初期ＭＢＰから最終ＭＢＰを引いた差として測定された平均血圧の変化（ΔＭＢＰ）の箱ひげ図は、応答者および非応答者のベースラインにおける各ｄＣｔ  ｍｉＲＮＡとの関連で表される。いずれのグラフにおいても、ベースラインにおいて、非応答者（各グラフの左のボックス）における提唱されたカットオフポイントは応答者（各グラフの右のボックス）より低いΔＭＢＰを示すことが分かる。矢印は中央値を示す。
【００９２】
ｍｉＲＮＡ  ４８６．５ｐの正規化された発現の有利性は、ｍｉＲＮＡ  １００．５ｐ（ｒ＝−０．１０、ｐ＝０．６３）ともｍｉＲＮＡ  ３７８ａ．３ｐ（ｒ＝０．０５、ｐ値＝０．８４）とも正規化された発現が有意に相関しなかったことである。対照的に、ｄＣｔ  ｍｉＲＮＡ  １００．５ｐとｄＣｔ  ｍｉＲ  ３７８ａ．３ｐとの正規化された発現は、ｒ＝０．５０及びｐ値＝０．０１７で有意に相関している。ｄＣｔ  ｍｉＲＮＡ  ４８６．５ｐの有意性は、一度ｄＣｔ  ｍｉＲＮＡ  ３７８ａ．３ｐによって調整されたモデルへのその有意な寄与によって裏付けられる（下記参照）。
【００９３】
本発明者らは、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、ｍｉＲ．４８６．５ｐ、及びｍｉＲ．１００．５ｐのそれぞれについて判別値を決定した。従って、ｄＣｔ値＜２．６であると決定されたｍｉＲ．３７８ａ．３ｐの発現は、単変量モデル（未処理または未調整）においてｐ＝０．００５２で統計学的に有意であった。ｄＣｔ値＞−７．１と決定されたｍｉＲ．４８６．５ｐの発現も、単変量モデルにおいてｐ＝０．０３２７で統計的に有意であった。最後に、ｄＣｔ値＜０．４と決定されたｍｉＲ．１００．５ｐの発現も、単変量モデルにおいてｐ＝０．０３２７で統計的に有意であった。
【００９４】
従って、これらの３種のマーカーの解析により、対象はＣＰＡＰに対する応答レベルに従って分けることができる。
【００９５】
適合させたロジスティック回帰モデル（Ｈｏｓｍｅｒ  ＤＷ、Ｌｅｍｅｓｈｏｗ  Ｓ（１９８９）、上記）に提示されたデータから、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ及びｍｉＲ．４８６．５ｐの発現レベルの両方を使用してＣＰＡＰに対する応答を予測するモデルを作り込んだ。ＣＰＡＰに対する応答を予測するために使用されたｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ及びｍｉＲ．４８６．５ｐを有するモデルは、ＡＵＣ＝０．８８，９５％  ＣＩ＝［０．７８，０．９８］を示した。
【００９６】
次の表２は、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ及びｍｉＲ．４８６．５ｐのｄＣｔ値に適用される離散化基準及び応答の確率スコア（Ｓ）を計算する方法を示す。更に、予測される応答の確率、並びに関連する感度及び特異性を列挙する。
【００９７】
【表２】
2018502570.tif 000003
【００９８】
応答の確率スコア（Ｓ）０〜３（即ち、ＢＰの変化＞４．５ｍｍＨｇの確率）は、以下のように計算する：
Ｓ＝１＊＋２＊＊
（式中、＊は、ｄＣｔｍｉＲ．４８６．５ｐ＞−７．２の場合１を加算することを意味し、＊＊は、ｄＣｔｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ≦２．６の場合２を加算することを意味するが、これはｄＣｔｍｉＲ．４８６．５ｐ＞−７．２の場合は個別の離散スコア１をとってそれがＳの計算に加えられ、ｄＣｔｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ≦２．６の場合は個別の離散スコアの値２をとってそれがＳの計算に加えられることと同じである）。
【００９９】
ｍｉＲ．４８６．５ｐ及びｍｉＲ．３７８ａ．３ｐの各ｄＣｔ値が独立して、それぞれ、＞−７．２及び≦２．６であるという基準に合致しない場合、そのｍｉＲＮＡについての離散スコアは、Ｓを計算する式に加えられない。
【０１００】
ホスマー・レメショウ検定（表２）は、統計学的に有意な適合の欠如を示さなかった（ｐ値＝０．９９９６）。ｍｉＲ．４８６．５ｐの（ｄＣｔにより定量された）発現が−７．２を超えておらず、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐの発現が少なくとも２．６である場合、ＣＰＡＰに対する予測応答確率はほぼゼロ（推定０．０７３）であり、一方、反対の場合の確率は０．９９０と推定された。
【０１０１】
更に、ｍｉＲ．１００．５ｐは、連続純再分類指数（ＮＲＩ）を０．７３８６、９５％ＣＩ  ［０．１２４−１．３５３１］及びｐ値０．０１８５に有意に改善した。ＮＲＩは、Ｐｅｎｃｉｎａ  ＭＪ、Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ  ＲＢ  Ｓｒ、  Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ  ＲＢ  Ｊｒ、Ｖａｓａｎ  ＲＳ、  「Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｄｄｅｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｍａｒｋｅｒ：  ｆｒｏｍ  ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ＲＯＣ  ｃｕｒｖｅ  ｔｏ  ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ」、  Ｓｔａｔ  Ｍｅｄ  −  ２００８年；２７（２）：１５７〜７２頁；考察２０７〜１２頁に開示されたように推定される。更に、ｍｉＲ．１００．５ｐを加えることによりＡＵＣ０．９１、９５％ＣＩ［０．８２，０．９９］に達し、有意な適合の欠如は認められなかった（ＨＬ検定  ｐ値＝０．９９）。ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、及びｍｉＲ．４８６．５ｐのレベルを使用するデータを表３に示す。表３は、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、及びｍｉＲ．４８６．５ｐを有するモデルのホスマー・レメショウ適合度検定から得られたデータを示す。表３は、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、及びｍｉＲ．４８６．５ｐのｄＣｔ値の離散化から計算可能な、ＣＰＡＰに対する応答の確率スコアと予測応答確率（％）との関係を示す。これらの結果に対応するＲＯＣ曲線も図４に見ることができる。
【０１０２】
【表３】
2018502570.tif 000004
【０１０３】
ｄＣｔｍｉＲ．１００．５ｐが＜０．４の場合１を、ｄＣｔｍｉＲ．４８６．５ｐが＞−７．１の場合２を、及びｄＣｔｍｉＲ．３７８ａ．３ｐが＜２．６の場合３を加算することによってモデルの係数をスコアに変換し、これにより、予測確率の同じ順序を正確に維持しながら、モデルの使用を単純化することができる。
【０１０４】
従って、３種のｍｉＲＮＡを有するモデルにおいて、応答の確率スコア（Ｓ）０〜６（すなわち、ＢＰの変化＞４．５ｍｍＨｇの確率）は、以下のように計算する：
Ｓ＝１＊＋２＊＊＋３＊＊＊；
（式中、＊は、ｄＣｔｍｉＲ．１００．５ｐ＜０．４の場合１を加算することを意味し、＊＊は、ｄＣｔｍｉＲ．４８６．５ｐ＞−７．１の場合２を加算することを意味し、＊＊＊は、ｄＣｔｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ≦２．６の場合３を加算することを意味する）。
【０１０５】
２種のｍｉＲＮＡを有するモデルについて上述したように、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．４８６．５ｐ、及びｍｉＲ．３７８ａ．３ｐの各ｄＣｔ値が独立して、それぞれ＜０．４、＞−７．１、及び≦２．６であるという基準に合致しない場合、そのｍｉＲＮＡの離散スコアはＳを計算するための式に加算されない。
【０１０６】
表４は、スコア（Ｓ）の各カットオフ点候補に基づく判定則の感度及び特異性を示す。
【０１０７】
【表４】
2018502570.tif 000005
【０１０８】
抵抗性高血圧を有する患者の中でＣＰＡＰに対する応答の確率が５０％である場合、感度が１００％と推定されるので、スコア＞０の患者のみを治療することにより、不要な治療の推定５０％をしなくて済み、コストもかからない。サンプルサイズによって導入された不確実性を考慮して、正確な二項分布を使用することによって、集団内で予想される特異性及び感度の欠如に対する９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を推定した。従って、サンプルにおいて得られた５０％の特異性及び１００％の感度を前提として、スコアを９５％の信頼度で適用することによって、不要な治療の２６〜７４％が節約され、ＣＰＡＰ療法から利益を受ける患者の０％〜２０％が誤った治療を受けることがないであろう。
【０１０９】
抵抗性高血圧患者の安全性と潜在的利益のために、ＣＰＡＰによる治療は実際に全員に施行されているため、この治療から利益を受ける者及び利益を受けない者を同定する時に、１００％の感度（９５％信頼区間、８０％〜１００％の間）を維持しながら、不必要に治療された患者の数を５０％（９５％信頼区間、２６〜７４％）に減らすことが本発明の優れた特性である。従って、偽陽性の患者（最初は応答者として分類され、最終的にはそうでない者）は、現在、全てのＨＲ患者がＣＰＡＰで治療されているので、何の不利益も示さない。従って、有用でない治療の５０％が回避できれば、真に有利であると言える。
【０１１０】
実施例のデータは、対象の単離試料中のｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ａ．３ｐ、及びｍｉＲ．４８６．５ｐのレベルのいずれかが、高い感度及び特異性で、ＣＰＡＰに対する応答を、それを必要とする対象において予測するためのマーカーとして使用可能であると結論付けることができる。更に、これらのマーカーの特定の組み合わせは、ＣＰＡＰに対する応答を予測する方法の感度を改善するか、あるいは更に、ＣＰＡＰに対する応答の程度又は応答がないことに関係なく良好な分類が可能なので、普遍的な方法を表す。
【０１１１】
更に、マイクロＲＮＡのレベルをスコアリングする確率により、診療所で容易に適用できる方法が更に提唱され、従って、応答の確率を示すか又はそれと相関する値をもたらす。この値は、臨床医がＣＰＡＰ療法を推奨するか否かの助けになり得、コスト及び患者にとって非効果的で不快な状況を避けることができる。
【０１１２】
本出願に引用された参考文献
−Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｇａｒｃｉａら、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＣＰＡＰ  ｏｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｓｌｅｅｐ  Ａｐｎｅａ  ａｎｄ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ−  ２０１３年、Ｖｏｌ．Ｎｏ．３１０（２２）、２４０７〜２４１５頁。
−Ｌｅｗｉｓら、「Ｅａｒｌｙ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ＣＰＡＰ  Ｕｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｓｌｅｅｐ  Ａｐｎｅａ」、Ｓｌｅｅｐ−２００４年、Ｖｏｌ．Ｎｏ．１、１３４〜１３８頁
−Ｓｍａｌｌら、「ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ａｄｄ  ａ  ｎｅｗ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｔｏ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ−２０１０年、Ｖｏｌ．Ｎｏ．１２１、１０２２〜１０３２頁
−Ｂｕｒｔｉｓ  Ｃ．Ａ．ら、２００８年、Ｃｈａｐｔｅｒ  １４、ｓｅｃｔｉｏｎ「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｖａｌｕｅｓ」
−国際公開第２０１２０８３００４号パンフレット
−国際公開第２０１２０６５１１３号パンフレット
−Ｄａ  Ｃｏｓｔａら、「ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ」、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｈ−２０１２年、Ｖｏｌ．Ｎｏ．９３、５６３〜５７２頁
−Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ  Ｍ，  Ｗｏｌｆｅ  ＤＡ（１９７３）Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ．６８〜７５頁（ｔｗｏ  ｓａｍｐｌｅｓ）、１１５〜１２０。
−Ｈｏｓｍｅｒ  ＤＷ、Ｌｅｍｅｓｈｏｗ  Ｓ（１９８９）Ａｐｐｌｉｅｄ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ．８〜１０、５８、６０、８５〜８６頁
−Ｈｏｓｍｅｒ  ＤＷ、Ｌｅｍｅｓｈｏｗ  Ｓ（１９８９）Ａｐｐｌｉｅｄ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１５８〜１６４、２０４、３５４；および１７３〜１８２、２０６頁。
−Ｈｏｓｍｅｒ  ＤＷ、Ｌｅｍｅｓｈｏｗ  Ｓ（２０１３）Ａｐｐｌｉｅｄ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ．１２、１４〜１５、１８、３９〜４１、８６、１１１、１１４〜１１５、１２５、２３１、２６１〜２６２、２７６、２８０、２９５、３４５、３５０、３５３頁。
−Ｐｅｎｃｉｎａ  ＭＪ、  Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ  ＲＢ  Ｓｒ、Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ  ＲＢ  Ｊｒ、Ｖａｓａｎ  ＲＳ．Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｄｄｅｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｍａｒｋｅｒ：ｆｒｏｍ  ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ＲＯＣ  ｃｕｒｖｅ  ｔｏ  ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ．Ｓｔａｔ  Ｍｅｄ．２００８年；２７（２）：１５７〜７２頁；考察２０７〜１２頁。
【図１（Ａ）】
2018502570.tif 000006
【図１（Ｂ）】
2018502570.tif 000007
【図１（Ｃ）】
2018502570.tif 000008
【図２】
2018502570.tif 000009
【図３】
2018502570.tif 000010
【図４】
2018502570.tif 000011
【図５−１】
2018502570.tif 000012
【図５−２】
2018502570.tif 000013
【国際調査報告】
2018502570.tif 000014
2018502570.tif 000015
2018502570.tif 000016
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