(57)【要約】  この発明は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤を組み込んだ生分解性シリカハイドロゲルコンポジットを含むデポー製剤であって、該シリカハイドロゲルコンポジットが、ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤を含み、≦１０００μｍの最大直径を有する該シリカ粒子を、そのまま、または懸濁液として、シリカゾルと混合することにより得られ、該ハイドロゲルコンポジットが、静置保管時には非流動性でかつ構造的に安定であり、注入によりずり応力が適用される場合にはずり流動化性であるデポー製剤に関する。本発明はまた、慢性ウイルス感染の治療および慢性ウイルス再感染の予防のためのデポー製剤の使用に関する。本発明は、さらに上記デポー製剤を含むプレフィルドシリンジに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤を組み込んだ生分解性シリカハイドロゲルコンポジットを含むデポー製剤であって、該シリカハイドロゲルコンポジットが、
ａ）ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤を含み、≦１０００μｍの最大直径を有する該シリカ粒子を、そのまま、または懸濁液として、
ｂ）シリカゾル
と混合することにより得られ、
ｉ）前記シリカゾルの固形分が５ｗｔ％以下であり、
ii）前記シリカハイドロゲルコンポジットが８５ｗｔ％以下の前記シリカ粒子を含み、そして
iii）前記ハイドロゲルコンポジットが、静置保管時には非流動性でかつ構造的に安定であり、注入によりずり応力が適用される場合にはずり流動化性である
デポー製剤。
【請求項２】
シリカハイドロゲルコンポジットが、注入によりずり応力が適用された後３７℃で非流動性で構造的に安定なハイドロゲルである請求項１記載のデポー製剤。
【請求項３】
シリカゾルが、３ｗｔ％以下、好ましくは２ｗｔ％以下、最も好ましくは１ｗｔ％以下の固形分を有することを特徴とする請求項１または２記載のデポー製剤。
【請求項４】
シリカ粒子が、０．１〜７０ｗｔ％、好ましくは０．３〜５０ｗｔ％、最も好ましくは１〜１５ｗｔ％の組み込まれたヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のデポー製剤。
【請求項５】
シリカ粒子が、０．５μｍ〜３００μｍ、好ましくは０．５μｍ〜１００μｍ、より好ましくは０．５μｍ〜３０μｍ、最も好ましくは０．５μｍ〜２０μｍの直径を有するマイクロ粒子であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のデポー製剤。
【請求項６】
１μｍ未満の直径を有するシリカ粒子の体積分率が３％未満、好ましくは２％未満、最も好ましくは１ｖｏｌ％未満であることを特徴とする請求項５記載のデポー製剤。
【請求項７】
ハイドロゲルコンポジットが、８０ｗｔ％以下、好ましくは１０〜８０ｗｔ％、最も好ましくは２０〜６０ｗｔ％のシリカ粒子を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のデポー製剤。
【請求項８】
コンポジットの固形分が、１０ｗｔ％〜７５ｗｔ％、好ましくは１５ｗｔ％〜６０ｗｔ％、最も好ましくは２５ｗｔ％〜５５ｗｔ％であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のデポー製剤。
【請求項９】
線形粘弾性領域において小角振動ずりのもとで測定される複素弾性率が、２４００ｋＰａ未満、好ましくは１２００ｋＰａ未満、最も好ましくは６００ｋＰａ未満であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のデポー製剤。
【請求項１０】
損失係数、すなわち粘性率／弾性率が１未満、好ましくは０．８未満、最も好ましくは０．６未満であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のデポー製剤。
【請求項１１】
粘度が、１０〜５０ｓ-1のずり速度で測定されて１０〜５０Ｐａｓであり、２００〜２１０ｓ-1のずり速度で測定されて０．４〜１．５Ｐａｓであり、６００〜６１０ｓ-1のずり速度で測定されて０．１〜０．４Ｐａｓであることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載のデポー製剤。
【請求項１２】
デポー製剤のシリカ粒子がヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤を２つ以上含むことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載のデポー製剤。
【請求項１３】
シリカ粒子が、噴霧乾燥、シングルエマルジョン、ダブルエマルジョン、重合、コアセルベーション相分離および溶媒抽出法から選択される方法、好ましくは噴霧乾燥、最も好ましくはサイクロン分離器による連続粒子分離を備える噴霧乾燥で得られることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載のデポー製剤。
【請求項１４】
シリカ粒子は、噴霧乾燥自体により得られたシリカ粒子、シリカ繊維片、および成型または鋳造されたシリカ・モノリスそのものまたはその粉砕物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載のデポー製剤。
【請求項１５】
シリカ粒子に含まれるヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤が、ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤とシリカゾルとが連続的に分離したフローとして供給され、反応器内で合わせられる管型反応器内で連続プロセスを用いてシリカ粒子内に組み込まれ、その後、該管型反応器の外に、サイクロン分離器による連続的粒子分離を伴う連続的噴霧乾燥プロセス内に供給される請求項１３または１４記載のデポー製剤。
【請求項１６】
ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤がジデオキシヌクレオシドからなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１項に記載のデポー製剤。
【請求項１７】
ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤が、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、アバカルビル、エムトリシタビン、エンテカビル、テノホビル、アデホビル、アプリシタビン、エルブシタビン、アムドキソビルおよびラシビルからなる群より選択され、好ましくはエンテカビルであることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項に記載のデポー製剤。
【請求項１８】
ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤が、デオキシグアノシンアナログであり、好ましくはヒドロキシメチル（メチレンシクロフェニル）プリン類およびピリミジン類からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載のデポー製剤。
【請求項１９】
注入可能な製剤および移植可能な製剤、好ましくは注入可能な製剤からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜１８のいずれか１項に記載のデポー製剤。
【請求項２０】
製剤が、非経口、好ましくは皮下、筋肉内、腹腔内、眼内投与からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜１９のいずれか１項に記載のデポー製剤。
【請求項２１】
製剤が、週１回から年１回、好ましくは月１回から６ヵ月に１回、より好ましくは２ヵ月に１回から３ヵ月に１回、最も好ましくは３ヵ月に１回投与するためのものであることを特徴とする請求項１〜２０のいずれか１項に記載のデポー製剤。
【請求項２２】
製剤が、ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤が０．１〜２００ｍｇ、好ましくは２０ｍｇ〜１６０ｍｇ、より好ましくは３０ｍｇ〜１２０ｍｇ、最も好ましくは４０ｍｇ〜１００ｍｇであるデポー用量の投与用である請求項１〜２１のいずれか１項に記載のデポー製剤。
【請求項２３】
慢性ウイルス感染の治療および慢性ウイルス再感染の予防における使用のための請求項１〜２２のいずれか１項に記載のデポー製剤。
【請求項２４】
Ｂ型肝炎およびＨＩＶ感染からなる群より選択されるウイルス感染の治療およびウイルス再感染の予防における使用のための請求項２３記載のデポー製剤。
【請求項２５】
ウイルス感染がＢ型肝炎感染であることを特徴とするウイルス感染の治療およびウイルス再感染の予防における使用のための請求項２４記載のデポー製剤。
【請求項２６】
エンテカビルを含むことを特徴とするウイルス感染の治療およびウイルス再感染の予防における使用のための請求項２５記載のデポー製剤。
【請求項２７】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載のデポー製剤を含むことを特徴とするプレフィルドシリンジ。
【請求項２８】
７０℃で２週間保管後のシリンジの重量損失が、もとの重量の１０ｗｔ％未満、好ましくは５ｗｔ％未満、より好ましくは３ｗｔ％未満である請求項２７記載プレフィルドシリンジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤を組み込んだ生分解性シリカハイドロゲルコンポジットを含むデポー製剤に関し、このデポー製剤は、薬物送達に適したものである。本発明はまた、そのデポー製剤を含むプレフィルドシリンジに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景を説明するために本明細書中において使用される刊行物およびその他の文献、およびとりわけ実施に関する追加的な詳細を提供するケースは、参考文献として組み込まれる。
【０００３】
いくつかのウイルス感染は、主要な世界規模の公衆衛生問題である。一部のウイルスは慢性感染症を引き起こし、未処置の慢性感染保持者では、肝不全やがんなどの長期の合併症を発症するリスクが増大する。毎年百万人を超える慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症患者が、感染により生じた肝臓の合併症により亡くなっていると推定されている。インターフェロンならびに抗ウイルスヌクレオシドおよびヌクレオチドアナログが、治療のため、またはウイルスの複製活性を抑制して感染を不活性な状態に保持し、かつ合併症の進行を防ぐために使用されている。最も一般的な治療の選択肢には、毎日の傾向自己投与または毎日の注射（または数週毎の注射（several weekly injections））などがあげられる。長期間または一生の薬物療法のため、毎日の自己投与には、患者の強いコミットメントが必要とされる。これはまた、より長い治療期間により抗ウイルス薬耐性が促進され、抗ウイルス薬の抑制作用が除外された場合、再発が起こりやすくなるため、患者のコンプライアンスの観点からも一つの挑戦である。したがって、ウイルス感染の治療における長期デポー製剤、特に、比較的長期間の投与間隔を有する注入可能な製剤などの侵襲性の最も少ない製剤に関する要求は満たされていない。
【０００４】
シリカゲルは、制御された薬物送達のための担体材料として広く使用されており、それらは、種々の剤形に加工することができ、その種々の剤形を組み合わせて結果として特異的性質を有するシリカ−シリカコンポジットを生み出すことができる。カプセル化された薬物を有するゾル−ゲル誘導シリカマイクロ粒子は、シリカゾルと組み合わせて、抗ウイルス薬の制御された送達のための注入可能なハイドロゲルデポーコンポジットを形成することができる。
【０００５】
Jokinenらによる特許文献１は、カプセル化された薬剤を有する噴霧乾燥シリカマイクロ粒子とシリカゾルとから形成されるずり流動化複合ハイドロゲル組成物を開示している。
【０００６】
特許文献２は、エンテカビル被覆マイクロスフェアおよびその製造方法を開示している。
【０００７】
特許文献３は、エンテカビルマイクロスフェアおよびそれを含む非経口投与用医薬組成物を開示している。
【０００８】
近年、ジェネンテック／ロッシュにより、ペグ化したα−インターフェロンが開発され、慢性ＨＢＶ感染症の１週間に１度の注射療法のために発売が開始された。しかしながら、インターフェロン治療は、しばしば全身性の副作用を伴い、非代償性肝機能の患者には投与することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１４／２０７３０４号
【特許文献２】韓国公開特許第２０１２−０１３８９０８号公報
【特許文献３】国際公開第２０１５／０２０２４０号
【発明の概要】
【００１０】
本発明の課題の１つは、ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤を組み込んだ生分解性シリカハイドロゲルコンポジットを含むデポー製剤を提供することである。
【００１１】
本発明のもう１つの課題は、治療に使用するためにそのデポー製剤を提供することである。
【００１２】
本発明は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤を組み込んだ生分解性シリカハイドロゲルコンポジットを含むデポー製剤であって、該シリカハイドロゲルコンポジットが、
ａ）ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤を含み、≦１０００μｍの最大直径を有する該シリカ粒子を、そのまま、または懸濁液として、
ｂ）シリカゾル
と混合することにより得られ、
ｉ）前記シリカゾルの固形分が５ｗｔ％以下であり、
ii）前記シリカハイドロゲルコンポジットが８５ｗｔ％以下の前記シリカ粒子を含み、そして
iii）前記ハイドロゲルコンポジットが、静置保管時には非流動性でかつ構造的に安定であり、注入によりずり応力が適用される場合にはずり流動化性である
デポー製剤を提供する。
【００１３】
本発明はまた、慢性ウイルス感染の治療および慢性ウイルス再感染の予防における使用のためのデポー製剤を提供する。
【００１４】
本発明は、さらに上記デポー製剤を含むプレフィルドシリンジを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ハイドロゲルコンポジットからのエンテカビルの累積放出およびシリカの溶出を示す図である。
【図２】ハイドロゲルコンポジットの平均複素弾性率（Ｇ*）を保管時間の関数として示す図である。
【図３】ハイドロゲルコンポジットについて種々のずり速度での動的粘度によりずり流動化特性を示す図である。
【図４】損失係数（ｔａｎδ＝Ｇ''／Ｇ’）により注入前のハイドロゲルコンポジットの構造を示す図である。
【図５】損失係数（ｔａｎδ＝Ｇ''／Ｇ’）により注入後のハイドロゲルコンポジットの構造を示す図である。
【図６】ハイドロゲルコンポジットでエンテカビルを投与された雄性ビーグル犬における血漿エンテカビル濃度を示す図である。
【図７】ハイドロゲルコンポジットでエンテカビルを投与された雌性ビーグル犬における血漿エンテカビル濃度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明者らは、驚くべきことに、ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤がシリカマイクロ粒子に組み込まれ、シリカゲルに埋め込まれ、ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤を必要とする患者に送達するために注入可能なデポー製剤として卓越したパフォーマンスを示すシリカハイドロゲルコンポジットをもたらすということを証明した。
【００１７】
マイクロ粒子は、多種多様な方法により製造することができる。マイクロ粒子（たいていは球状粒子、マイクロスフェア）は、典型的にはマイクロメートル範囲（典型的には１μｍ〜１０００μｍ）の直径を有する小さな粒子である。噴霧乾燥（サイクロンにおける遠心分離を伴うことが多い）、シングルエマルジョン、ダブルエマルジョン、重合、コアセルベーション相分離、および溶媒抽出法などの、制御された粒子サイズ分布を有するマイクロ粒子を調製または製造するために一般に使用されるいくつかの直接的な技術がある。これらの技術を用いることにより、サブミクロン粒子（通常０．５〜１．０μｍ）の少量の画分が得られる産物に誘導され得るが、その割合は通常非常に低く、たいてい１容量％未満である。したがって、それらの効果、例えば放出制御マイクロ粒子製剤における効果は小さい。キャスティングすることにより、またはより大きな構造をマイクロ粒子に破壊することによりマイクロ粒子を製造することも可能であるが、その場合、得られる粒子のサイズと形状は、大きく異なり得、転動や粒度測定などの追加の製造工程が必要とされる。
【００１８】
シリカ−シリカコンポジットのシリカマイクロ粒子は、薬物の放出制御に関与し、ハイドロゲル構造は、得られるコンポジットの安定性と注入可能性との両方を保証する。静置時、例えばプレフィルドシリンジ中で保管されている場合に安定であっても、ハイドロゲルコンポジット構造は非常にルースなので、ハイドロゲルコンポジットが即時使用シリンジから細い針を通して注入される際にずり流動化する。このような特性の組み合わせにより、侵襲性の最も少ないウイルス感染の長期治療が提供される。
【００１９】
用語
本願の文脈において「ゲル」とは、少なくとも１つの固相と１つの液相との均質な混合物、すなわち、コロイド分散液と解されるべきであり、例えばシリカ自体および／または部分的または完全に加水分解されたシリカなどの固相が連続相であり、例えば水、エタノールおよびシリカ前駆体の残部などの液相がその構造中に均質に分散されている。ゲルは粘弾性でかつ弾性が優勢であり、これは小角振動ずりのもとでのレオロジー測定により示される。弾性が優勢であり、その構造は損失係数（または損失正接）、ｔａｎδ＝（Ｇ''／Ｇ’が１未満である場合流れない。弾性率Ｇ’および粘性率Ｇ''の複合効果は、複素弾性率（または複素せん断弾性率）の形式、Ｇ*＝Ｇ’＋ｉＧ''で表すこともできる。
【００２０】
「ハイドロゲル」とは、液相が水または水が５０重量％（ｗｔ％）よりも多い水系であるゲルと解されるべきである。典型的には、ハイドロゲルの液相は、水を６５ｗｔ％よりも多く、より典型的には９０ｗｔ％よりも多く、最も典型的には９５ｗｔ％よりも多く含む。液相はさらに、典型的には例えばエタノールなどの有機溶媒である、他の液体を含み得る。典型的には、例えばエタノールなどのこのような溶媒の濃度は、１０ｗｔ％未満、より典型的には３ｗｔ％未満、最も典型的には１ｗｔ％未満である。本発明の文脈において本発明のコンポジットは、ハイドロゲルの基本的な基準を満たすことからハイドロゲルであると考えられる。したがって、本発明のハイドロゲルコンポジットを引用する場合、その引用は本発明のコンポジットへの言及に等しい。本発明の文脈において本発明のシリカハイドロゲルコンポジットは、好ましくは２０〜８０ｗｔ％、より好ましくは３０〜７０ｗｔ％、最も好ましくは４０〜６０ｗｔ％の水を含む。
【００２１】
「ゾル」とは、少なくとも１つの液相と１つの固相との均質な混合物、すなわち、コロイド分散液と解されるべきであり、例えば水、エタノールおよびシリカ前駆体の残部などの液相は連続相であり、例えばシリカおよび／または部分的または完全に加水分解されたシリカのコロイド粒子、および／またはこれら粒子の凝集体などの固相が、上述の液相中に均質に分散されており、ゾルは明らかな流動性を有し液相が優勢であることを特徴とする。「懸濁液」も、特に固体粒子が直径１μｍ未満のコロイド状である場合には「ゾル」と呼ばれることもある。しかしながら、本発明の文脈においては、ゾルという用語は、固体粒子が５０ｎｍ未満であるコロイド分散液のことをいい、懸濁液という語は、固体粒子が５０ｎｍよりも大きい分散液のことをいう。
【００２２】
本願の文脈において「注入可能なゲルまたはハイドロゲル」とは、組成物のレオロジー特性である。例えば室温（２０〜２５℃）または冷蔵室内（３〜６℃）など、３７℃度未満の温度でシリンジおよび／またはアルミニウム箔に保管されている注入前は、組成物はゲルであり、すなわち弾性率（小角振動ずりの下で測定）Ｇ’は粘性率Ｇ''よりも大きく、損失係数、ｔａｎδ＝（Ｇ''／Ｇ’）が１未満である。ハイドロゲルコンポジットの構造は、ゲル様構造をとり、そのコンポジットの構造は、静置保管時には安定かつ非流動性なままであるが、そのゲル構造は、非常にルースなので、ずり応力が、例えばシリンジから針を通した注射の形態で、例えば２５Ｇ針（０．５０ｍｍ×２５ｍｍ）を用いて印加されるとずり流動化する。
【００２３】
「注入可能な」とは、本発明の文脈においては、例えば針、カテーテルまたはそれらの組み合わせなどの外科的投与装置を介して投与可能であるということを意味する。
【００２４】
「ずり流動化性」とは、本願の文脈においては、組成物のレオロジー特性である。そのような組成物のずり応力またはずり速度が変更される場合はいつでも、組成物は徐々にその新たな平衡状態に向かって移動し、低いずり速度ではずり流動化性の組成物はより粘性が高く、高いずり速度では粘性が低い。ゆえにずり流動化性とは、流体の粘性、すなわち流体の流れに対する抵抗の測定値が、ずり応力の上昇率に伴い低下する作用のことをいう。
【００２５】
本願において言及される「デポー製剤」は、活性剤が長期間、即ち数日から数か月間、作用できかつ体内に放出されるように、徐放および段階的な吸収を可能とする持続作用薬（活性剤）製剤の投与であると定義される。デポー製剤は、非経口的に、皮下、筋肉内、腹膜、または眼内移植または注入のいずれかにより投与される。
【００２６】
用語「シリカ」は、好ましくはゾル−ゲル法により調製されるアモルファスＳｉＯを意味する。ゾル−ゲル誘導シリカは、ゾル−ゲル工程により製造されたシリカのことをいい、シリカは、アルコキシド、アルキルアルコキシド、アミノアルコキシドまたは無機ケイ酸塩溶液などの液相前駆体であって、加水分解反応および縮合反応により、ゲルに変わるか安定なゾルを形成するゾルを形成する液相前駆体から製造される。安定なシリカゾル中の液体は蒸発され、典型的にはコロイド状のシリカ粒子からなる粉末を形成することができる。得られたゲル／粒子は、任意にはエージング、乾燥および熱処理されてもよく、熱処理される場合には、好ましくは７００℃未満で熱処理される。７００℃未満で製造されたゾル−ゲル誘導シリカは、一般に非晶質である。熱処理は、ゲルが薬物や活性医薬成分などの生物学的に活性な薬剤を含有する場合には省略される。形成されたゲルは、その後、典型的にはエージング（典型的には≦４０℃で）および乾燥（典型的には≦４０℃で）のみ行われる。ゾルは、形状付与のためにモールド中でゲルにされ得る。ゾル−ゲル誘導シリカは、ゲル化、エージング、乾燥および形状付与、例えば噴霧乾燥してマイクロ粒子にする、浸漬／排出／スピンコーティングしてフィルムにする、押出によりモノリシック構造にする、または紡糸により繊維にするなどにより、異なるモルフォロジーへ加工することによって製造することもできる。
【００２７】
用語「シリカゾル」は、懸濁液、すなわち液体（連続相）と固相（分散層）との混合物を意味し、固相はシリカ粒子および／または凝集したシリカ粒子を含み、そのシリカ粒子および／または凝集体の粒径は、通常１μｍ未満、すなわちシリカ粒子および／または粒子凝集体はコロイド状である。シリカゾルは、通常、加水分解により、部分的に加水分解されたシリカ種、または完全に加水分化された珪酸のいずれかを形成するアルコキシドまたは無機ケイ酸塩から製造される。液相は、通常、水およびエタノールなどの加水分解産物および縮合産物を含む。後続のＳｉＯＨ−含有種の縮合反応は、シロキサン結合の増加した、より大きなシリカ種の生成をもたらす。これらの種は、ナノサイズのコロイド状粒子および／または粒子凝集体を形成する。条件に応じて、シリカゾルは、安定なコロイド状懸濁液のままでいるか、またはゲルに変化する。
【００２８】
用語「生分解」は、浸食、すなわちマトリクス材料、例えばシリカなどの体内における緩やかな分解を意味する。分解は、好ましくは体液への溶解により生じる。
【００２９】
「カプセル化された薬剤」は、ゾル−ゲル誘導シリカ材料内にある薬剤、活性医薬成分（ＡＰＩ）および他の機能的、治療的および生物学的に活性な薬剤であると解されるべきである。
【００３０】
「ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤」は、ＨＩＶ感染またはＡＩＤＳおよびＢ型肝炎の治療に使用される抗レトロウイルス薬の１つの分類を意味する。ＲＴＩｓは、逆転写酵素、ＨＩＶおよび他のレトロウイルスの複製に必要とされるウイルス性ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害する。５’位でリン酸化されているヌクレオシドアナログは、しばしばヌクレオチドアナログと言われる。
【００３１】
「ゲル化点」は、流動性のゾルが粘弾性でありかつ弾性が支配的であるゲルへと変わる時点を意味するものと解されるべきであり、これは小角振動ずりのもとでのレオロジー測定において、弾性率Ｇ’が粘性率よりも大きく、損失係数が１未満であることにより示される。粘弾性質は一般に、レオメータ（ひずみ、ずり応力および時間の相関を決定するための測定装置）を用いて、ずり応力が小さい（ひずみ角度が小さい）振動ずりによって測定される。小振動ずりでの合計抵抗は、複素弾性率（Ｇ*）により表される。複素弾性率（または複素せん断率）は、２つの要素を含む（Ｇ*＝Ｇ’＋ｉＧ''）。１）弾性率Ｇ’、貯蔵率とも呼ばれ、物質が、固体物質に特徴的ないくらかの弾性性質を有することを示す。すなわち、ゲル系は、運動がゲル構造を破壊しない限りは振動動作からエネルギーを得る。このエネルギーは試料中に貯蔵され、弾性率により示される。２）粘性率Ｇ''、損失率とも呼ばれ、流動性質を示す。すなわち、シリカゾルなどの系は、例えば振動ずりにおいて粘性散逸として失われるエネルギーの部分を説明するゾルの成分間の運動を生じる。Ｇ*＝Ｇ’のとき物質は弾性であり、Ｇ*＝Ｇ''のとき物質は粘性である。ゲル化点で、弾性率Ｇ’が粘性率Ｇ''よりも大きくなる。Ｇ’がＧ''よりも大きい場合、粘弾性物質は半固体と呼ばれ、対してＧ''がＧ’よりも大きい場合、粘弾性物質は半液体と呼ばれる。弾性率および粘性率の大きさはずり応力に依存し、ずり応力は加えられるひずみ（小角ひずみ）および（振動ずりの）周波数に依存する。測定は、特定の測定系に対する適切なシグナルを確実にすることによって行われ、すなわち、レオメータ系に対する適切なシグナルおよび線形粘弾性領域を見つけるために、一般には一定の周波数でひずみ掃引が行われ、その後、実際の測定は、周波数を変えながら一定のひずみで行われる。周波数の変動が弾性率および粘性率の変動をもたらし、測定は、固相と液相のいずれが支配的であるかを示す。また、周囲条件が顕著に変わらない場合、弾性率はゲル化点後に速く上昇するということも典型的であり、例えば、ゲルに変わるｐＨ＝２でのＲ１５ゾル（Ｒ＝アルコキシドに対する水のモル比）など、室温に近い酸性ゾルから形成されたゲルでは、ゲル化点後数分でＧ’が１００〜７００倍増える。Ｒ１５０およびＲ４００などのより大きなＲ値では、弾性率Ｇ’はゲル化点後も低いままであり、Ｇ’の増加は速くなく、これにより細い針で注入可能なままのゲル構造を有することが可能である。規定のゲル化点後のゲルの形状においては固体状態が優勢となるが、系は依然として可変量の液体を含み、材料は、典型的には乾燥前は柔らかく粘弾性で、十分に乾燥されると固く脆くなる。ゾルの形状においては、液体状態が優勢であるが、系は可変量の固相を含み、系は依然として流動性である。ゲル化点前は、動粘度および弾性率に急激な増加が観察されるのが典型的であって、これはゲル化点後も構造が発達するにつれて上昇し続ける。本発明の文脈において本発明のコンポジットのゲル化点は、本発明の注入可能なゲルを取得するよりも前に到達されている。
【００３２】
「静置保管時には非流動性かつ構造的に安定」とは、シリカハイドロゲル内にシリカ粒子を含む安定なコンポジットハイドロゲル構造を意味する。安定性は、小角振動ずりのもとでのレオロジー測定において、弾性率Ｇ’が粘性率よりも大きく、損失係数が１未満であることにより示される。弾性率が粘性率よりも大きく、損失係数が１未満である場合、その構造は非流動である。非流動性構造は、シリカ粒子の総分離を防ぐことにより、コンポジットハイドロゲル構造の安定性を確保する。言い換えれば、シリカ粒子はシリカハイドロゲルに埋まっており、それらは、例えばシリンジなどのハイドロゲルコンポジットが通常２５℃以下で保管される容器の底に沈殿したり分離したりしない。コンポジットハイドロゲル構造は、例えばプレフィルド、即時使用シリンジにおける静置保管時に非流動性であるが、構造は非常にルースでずり流動化性であり、したがって、ずり応力が注入によりハイドロゲルコンポジットに適用されるので、細い針を通して注入可能である。
【００３３】
本発明の特徴
本発明、シリカハイドロゲルに包埋されたシリカマイクロ粒子（カプセル化された活性医薬成分を有する）を含む注入可能なシリカ−シリカコンポジットデポーは、マイクロ粒子に基づく薬物送達の典型的で実際的な課題に取り組むものである。ウイルス感染の長期治療において特に重要なものである他の課題、すなわち患者のコンプライアンスや切れ目のない抗ウイルス薬治療の重要性もまた、抗ウイルス療法に使用される任意の他の医薬品よりもより少ない頻度でシリンジから細い針を通してコンポジットを注入することが可能であることから侵襲性の最も少ないものである使いやすくかつすぐに使えるコンポジットを提供することによる本発明に見合ったものである。
【００３４】
マイクロ粒子（典型的なサイズ１μｍ〜１０００μｍ）は、大きいため、例えば、連続相として水系溶液を用いる典型的なマイクロ粒子懸濁液は比較的速く不安定化するであろう。コロイド状粒子（サイズ１〜１０００ｎｍ）は、ブラウン運動により影響を受け、比較的安定な懸濁液を形成しやすいが、その効果はマイクロ粒子にはほとんど影響を及ぼさない。相分離は、通常、マイクロ粒子の沈降により起こるか、またはマイクロ粒子密度が液体の密度よりも明らかに低い場合は、マイクロ粒子は表面上に浮くことも可能である。分離速度は、多くの因子；マイクロ粒子サイズ、マイクロ粒子および連続相（液体）の密度、液体におけるマイクロ粒子濃度および連続相の動的粘度などに依存する。粒子サイズ１μｍ付近で、水系懸濁液における典型的なポリマーまたはセラミック粒子は数日から数週間以内に分離し、粒子サイズが１０μｍより大きい場合、分離は、粒子間密度差および連続相（液体）の粘度により数分から数日以内に起こる。したがって、生理食塩水や緩衝液などの一般的な水系溶液で長持ちする安定なマイクロ粒子懸濁液を形成することは難しい。一般的な方法は、連続相（液体）の粘度を増加させて分離を遅らせることである。しかしながら、粘度を増加させたにもかかわらず、連続相が多かれ少なかれ常に流動性である液体の場合に長期保管における分離の危険性は常にある。長い保管寿命が期待される場合（薬物製剤に通常要求される）、これは、考慮すべき重要な課題である。
【００３５】
マイクロ粒子および液体が投与直前に組み合わされる系を設計することも可能であるが、これは投与前に成分を混合することに関連するリスクのため望ましい選択肢ではない。液体中へのマイクロ粒子の良好な混合は、安全性および注入可能性の両面について極めて重要である。懸濁液がよく混合されておらず、安定性が十分でない場合、懸濁液の正確な用量と注入可能性の両方が危険にさらされる。
【００３６】
本発明は、具体的に侵襲性の最も少ない投与のために設計されるため、ハイドロゲルコンポジットデポーは、即時使用製剤として設計される。液体の代わりに連続相としてハイドロゲルを使用する（シリカマイクロ粒子がハイドロゲルに包埋される）ことは、長期のコンポジット安定性、注入可能性および正確な用量を保証する。しかしながら、これは別の課題をもたらす。ハイドロゲルコンポジットは、安定性を確保するために、静置時（保管状態）にはその非流動性ゲル構造を保持しなければならないが、同時に注入可能でなければならない。例えば、シリンジから細い針を通してハイドロゲルコンポジットを注入できなければならない。ハイドロゲルコンポジットは、ずり応力が適用される場合、例えば注入により、ずり流動化（動的粘度（ＳＩ−単位Ｐａｓ）は、レオメータの回転測定モードにおけるずり速度の増加とともに減少した。）されなければならない。
【００３７】
したがって、本発明は、静置時には非流動性であるが、ずり流動化性であり、ずり応力が適用されるとずり流動性となるシリカ−シリカハイドロゲルコンポジットを発表する。これは、十分にルースなハイドロゲル構造であるため可能であり、４〜２５℃の保管温度で６〜２４時間は安定な非流動性ゲル構造を保持するが、２５Ｇ針（針の内径：０．５０ｍｍ）などの針を通して容易に注入できる。２５Ｇ針は、エンテカビルなどのヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤の主要な投与経路である皮下および筋肉内投与において侵襲性が最も少ない。
【００３８】
安定で非流動性のハイドロゲル構造（静置時、例えばプレフィルドシリンジ内では安定を保持する）を形成するシリカマイクロ粒子とシリカゾルとの複合組成物は、ずり流動化性であり、３７℃でのずり（例えば、細い針を通しての注入による）および短い回復時間後、複合組成物は再び安定で非流動性のハイドロゲルに変化するか高い粘度のゆっくりとした流動性剤形に変化する。好ましい安定で非流動性のハイドロゲル構造は、シリカマイクロ粒子がハイドロゲル内において１つの三次元実体に堅く集まる状態を維持する構造により、バースト（初期の速い放出）の減少に良好な可能性を提供する。
【００３９】
微細粒子などの外来物質は、認識され、そして白血球の貪食により組織から排除される。典型的には、認識は、炎症反応にも関与し、例えば、薬物の皮下注射に用いられる制御された薬物放出システムにとって望ましいものではない。シリカハイドロゲルに包埋されているシリカマイクロ粒子は、シリカマイクロ粒子単独よりもヒト白血球により認識されることがより難しく、すなわち、シリカハイドロゲルは、シリカマイクロ粒により誘導されるヒト白血球の活性化を阻害する。したがって、シリカマイクロ粒子およびシリカゾルから製造される複合ハイドロゲル組成物は、組織に局所的に注入された場合のシリカデポー製剤の耐性および安全性に正の効果を有する。
【００４０】
本発明のシリカ−シリカハイドロゲルコンポジットにはまた別の恩恵もあり、それはシリカの低溶解性に基づく。ゾル−ゲル誘導シリカマイクロ粒子としてのアモルファスシリカと本発明のシリカハイドロゲルとは、中性の水で１３０〜１５０ｐｐｍ（ｍｇ／Ｌ）（そして、例えば、ｐＨ５で約１０〜２０％だけ高い）の溶解性を有し、したがって、擬似体液でも体液でも同様である。これは、シリカマイクロ粒子が、ハイドロゲルの水相にごく少量しか溶解しないということを意味する。系に存在する任意の水相は、シリカで素早く飽和されシリカの溶解が停止する。カプセル化されるエンテカビルなどの活性医薬成分（ＡＰＩ）のカプセル化効率は、本発明のシリカマイクロ粒子において良好である。すなわち、エンテカビルの放出は、主に溶出（水相への溶解による分解）に基づき、ＡＰＩはシリカマイクロ粒子からシリカハイドロゲルの水相に、例えば保管中放出されないことを意味する。ＡＰＩがわずかしか放出されないことは、水が遊離相としては存在せず、液相の制限された運動性を有する分散構造（ハイドロゲル）の一部として存在するという事実によってもさらに支持される。これは、シリカマイクロ粒子がＡＰＩの組織における放出を制御することを保証する。組織では体液が流れ、したがって低い溶解性は問題ではなく、シリカハイドロゲルの主な役割は、長期安定性と取り扱いやすさ、および最少の侵襲性特性を保証することである。
【００４１】
本発明において、連続報またはフロー法および連続反応器（フロー反応器ともいう）、特に管状反応器における連続法は、シリカ加工やヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤などの活性医薬成分（ＡＰＩ）のシリカへカプセル化を良好に制御するために、噴霧乾燥などの形状を与える前に利用される。典型的なケースでは、シリカゾルとカプセル化させるべきＡＰＩ（液体、通常ｐＨを調整した水またはエタノール−水溶液に溶解または分散）を別々のフローとして２つのフローが組み合わされる反応器にポンプで入れる。シリカの前駆体、通常、テトラエトキシシラン（テトラエチルオルトシリケート、ＴＥＯＳともいう）などのアルコキシシランまたは無機ケイ酸塩溶液、およびＡＰＩを１つのフローにポンプで入れ、別のフローにｐＨを調整した水を入れるということも可能である。フローの組成物は、ＡＰＩの安定性と良好なカプセル化を保証するためにＡＰＩの性質に依存して調整される。連続反応器は、連続的に攪拌されるタンク反応器（ＣＳＴＲ）、例えば、一定の流入および流出または対応物を有する別個の撹拌もしくはアジテーターシステムを備えたビーカー、または混合の無い管状反応器、すなわち、層流（横方向の混合を伴わない流れ）もしくは対応物を備えたプラグ−フロー反応器（ＰＦＲ）、または混合を備えた環状反応器（混合は、渦などの乱流（流れの方向に垂直な交差電流）生成により、または管状反応器に統合された別個の混合エレメントにより生じ得る）であり得る。連続反応器を使用することにより、非連続反応器、例えばバッチ式反応器（ＢＲ）よりもシリカ前駆体およびシリカ種の、種々の反応および凝集速度を良好に調整できる。ＢＲでは、すべての反応が、通常撹拌下で生じるが、所望の反応が起こる前に供給（流入および流出）はない。本発明の典型的なケースでは、連続管状反応器は、シリカゾルとＡＰＩとの接触時間を一定かつＡＰＩの溶解性および／形状付与前にシリカ種の反応と凝集を所望の程度とするのに充分短く保つことを保証するために使用される。形状付与工程は時間がかかり、あるｐＨのシリカゾルが、別のｐＨのＡＰＩとバッチ式反応器で混合され、その後噴霧乾燥などの形状付与工程に運ばれる場合、シリカゾルとＡＰＩとの間の接触時間は、バッチ内で変化する。仮に噴霧乾燥法に３０分かかる場合、最初に噴霧乾燥されたマイクロ粒子は、最後のマイクロ粒子よりもシリカゾルとＡＰＩとの接触時間３０分短く形成される。任意の物質の溶解性は、通常、ｐＨに依存するが、接触時間も全系の安定性に影響する。なぜならシリカゾルにおけるシリカ種は時間とともに反応し、凝集するためである。シリカゾル（例えば、形状付与後、シリカ剤形の所望の生分解率について）とＡＰＩの最適なｐＨは、しばしば互いに異なり、連続反応器は、これらの性質をよりよく適合させ、良好なカプセル化およびカプセル化されたＡＰＩの所望の放出プロファイルをもたらす選択肢を提供する。
【００４２】
本発明のデポー製剤は、注入可能なハイドロゲルコンポジットを安定に保つためにシリンジに保管される。好ましいシリンジはハイドロゲルコンポジットの蒸気の漏れを防ぎ（高い防湿バリアを提供する）、保管のあいだハイドロゲルコンポジットの安定な注入可能性および放出特性を保証する。本発明のシリンジは、ガラス、プラスチック、またはコンポジット製であり、ガラスが好ましい。
【００４３】
好ましい実施形態
本発明の好ましいデポー製剤では、シリカハイドロゲルコンポジットは、注入によりずり応力が適用された後３７℃で非流動性で構造的に安定なハイドロゲルである。
【００４４】
本発明の好ましいデポー製剤では、シリカゾルは、３ｗｔ％以下、好ましくは２ｗｔ％以下、最も好ましくは１ｗｔ％以下の固形分を有する。
【００４５】
本発明の好ましいデポー製剤では、シリカ粒子は、０．１〜７０ｗｔ％、好ましくは０．３〜５０ｗｔ％、最も好ましくは１〜１５ｗｔ％の組み込まれたヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤を含む。
【００４６】
通常、本発明のシリカ粒子は、０．５μｍ〜３００μｍ、好ましくは０．５μｍ〜１００μｍ、より好ましくは０．５μｍ〜３０μｍ、最も好ましくは０．５μｍ〜２０μｍの直径を有するマイクロ粒子である。１μｍ未満の直径を有するシリカ粒子の体積分率は、通常、３％未満、好ましくは２％未満、最も好ましくは１ｖｏｌ％未満である。
【００４７】
本発明のデポー製剤のハイドロゲルコンポジットは、通常、８０ｗｔ％以下、好ましくは１０〜８０ｗｔ％、最も好ましくは２０〜６０ｗｔ％のシリカ粒子を含む。
【００４８】
本発明のデポー製剤のコンポジットの固形分は、通常、１０ｗｔ％〜７５ｗｔ％、好ましくは１５ｗｔ％〜６０ｗｔ％、最も好ましくは２５ｗｔ％〜５５ｗｔ％である。
【００４９】
線形粘弾性領域における小角振動ずりのもとで測定される本発明のデポー製剤の複素弾性率は、２４００ｋＰａ未満、好ましくは１２００ｋＰａ未満、最も好ましくは６００ｋＰａ未満である。
【００５０】
本発明のデポー製剤の損失係数、すなわち粘性率／弾性率は、通常、１未満、好ましくは０．８未満、最も好ましくは０．６未満である。
【００５１】
本発明のデポー製剤の測定された粘度は、通常、採用されるずり速度に依存する。典型的には、粘度は、１０〜５０ｓ-1のずり速度で測定されて１０〜５０Ｐａｓであり、２００〜２１０ｓ-1のずり速度で測定されて０．４〜１．５Ｐａｓであり、６００〜６１０ｓ-1のずり速度で測定されて０．１〜０．４Ｐａｓである。
【００５２】
デポー製剤のシリカ粒子はヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤を２つ以上含むことができる。
【００５３】
本発明のデポー製剤のシリカ粒子は、種々の方法で得ることができる。採用される方法は、通常、噴霧乾燥、シングルエマルジョン、ダブルエマルジョン、重合、コアセルベーション相分離および溶媒抽出法から選択され、好ましくは噴霧乾燥、最も好ましくはサイクロン分離器による連続粒子分離を備える噴霧乾燥である。
【００５４】
本発明のデポー製剤のシリカ粒子は、噴霧乾燥自体により得られたシリカ粒子、シリカ繊維片、および成型または鋳造されたシリカ・モノリスそのものまたはその粉砕物からなる群から選択することができる。
【００５５】
本発明のデポー製剤のシリカ粒子に含まれるヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤は、通常、ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤とシリカゾルとが連続的に分離したフローとして供給され、反応器内で合わせられる管型反応器内で連続プロセスを用いてシリカ粒子内に組み込まれ、その後、該管型反応器の外に、サイクロン分離器による連続的粒子分離を伴う連続的噴霧乾燥プロセス内に供給される。
【００５６】
本発明のデポー製剤のシリカ粒子に含まれるヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤は、本発明のいくつかの実施形態において、ジデオキシヌクレオシドからなる群より選択される。
【００５７】
本発明のデポー製剤のシリカ粒子に含まれるヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤は、本発明のいくつかの実施形態において、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、アバカルビル、エムトリシタビン、エンテカビル、テノホビル、アデホビル、アプリシタビン、エルブシタビン、アムドキソビルおよびラシビルからなる群より選択され、好ましくはエンテカビルである。
【００５８】
本発明のデポー製剤のシリカ粒子に含まれるヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤は、本発明のいくつかの実施形態において、デオキシグアノシンアナログであり、好ましくはヒドロキシメチル（メチレンシクロフェニル）プリン類およびピリミジン類からなる群より選択される。
【００５９】
本発明のデポー製剤は、通常、注入可能な製剤および移植可能な製剤からなる群より選択され、好ましくは注入可能な製剤である。
【００６０】
本発明のデポー製剤は、通常、非経口、好ましくは皮下、筋肉内、腹腔内、眼内投与からなる群より選択される。
【００６１】
本発明のデポー製剤は、通常、週１回から年１回、好ましくは月１回から６ヵ月に１回、より好ましくは、２ヵ月に１回から３ヵ月に１回、最も好ましくは３ヵ月に１回投与するためのものである。
【００６２】
本発明のデポー製剤は、通常、ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤が０．１〜２００ｍｇ、好ましくは２０ｍｇ〜１６０ｍｇ、より好ましくは３０ｍｇ〜１２０ｍｇ、最も好ましくは４０ｍｇ〜１００ｍｇであるデポー用量の投与用である。
【００６３】
本発明のデポー製剤の使用は、通常、慢性ウイルス感染の治療および慢性ウイルス再感染の予防のためのものである。本発明のデポー製剤の好ましい使用は、Ｂ型肝炎およびＨＩＶ感染からなる群より選択されるウイルス感染、最も好ましくはＢ型肝炎感染からなる群のためのものである。最も好ましくは、慢性ウイルス感染の治療および慢性ウイルス再感染の予防に使用されるデポー製剤は、エンテカビルを含む。
【００６４】
本発明の好ましいプレフィルドシリンジにおいて、７０℃で２週間保管後のシリンジの重量損失が、もとの重量の１０ｗｔ％未満、好ましくは５ｗｔ％未満、より好ましくは３ｗｔ％未満である。
【００６５】
図面
図１は、２５℃、相対湿度６０％でアルミ箔の密封包装したプレフィルドシリンジにおいて３ヵ月保管後のハイドロゲルコンポジットからのエンテカビルの累積放出とシリカの溶出を説明する。
【００６６】
図２は、ハイドロゲルコンポジットに対する平均複素弾性率（Ｇ*）を保管（２５℃／６０％）時間の関数として説明する。
【００６７】
図３は、シリカマイクロ粒子Ｒ１０−１２０  ＭＰ（エンテカビルの７％（ｗ／ｗ）負荷）およびシリカゾルＲ４００（１ｍｌのＲ４００ゾル中に１ｇのＲ１０−１２０  ＭＰ）から形成されるハイドロゲルコンポジットについての動的粘度を、ずり速度の関数として説明する（Ａ＝新鮮（＝０ヵ月）、２５℃、相対湿度６０％でアルミ箔の密封包装したプレフィルドシリンジ内において、Ｂ＝保管３ヵ月、およびＣ＝保管６ヵ月）。
【００６８】
図４は、注入前のシリンジ内での構造をシミュレートするＲ４００シリカゾル１ｍｌ中の０．５ｇおよび１．０ｇシリカマイクロ粒子から調製される混合ハイドロゲル組成物についての注入後の構造をシミュレートする応力（一定ずり）後の損失係数（ｔａｎδ＝Ｇ''／Ｇ’）を説明する。
【００６９】
図５は、Ｒ４００シリカゾル１ｍｌ中の０．５ｇおよび１．０ｇシリカマイクロ粒子から調製される混合ハイドロゲル組成物についての注入後の構造をシミュレートする応力（一定ずり）後の損失係数（ｔａｎδ＝Ｇ''／Ｇ’）を説明する。
【００７０】
図６は、Ｒ１５−１２０マイクロ粒子とＲ４００シリカゾルとのハイドロゲルコンポジット中の３６ｍｇのエンテカビルを投与された雄性ビーグル犬６匹における個々の血漿エンテカビル濃度（ｎｇ／ｍｌ）を時間ごとに説明する。
【００７１】
図７は、Ｒ１５−１２０マイクロ粒子とＲ４００シリカゾルとのハイドロゲルコンポジット中の３６ｍｇのエンテカビルを投与された雌性ビーグル犬６匹における個々の血漿エンテカビル濃度（ｎｇ／ｍｌ）を時間ごとに説明する。
【実施例】
【００７２】
以下の実験セクションにおいて、実施例を挙げて本発明を説明する。
【００７３】
実施例１
カプセル化されたエンテカビルを有する注入可能なハイドロゲルコンポジットの、シリカマイクロ粒子（ＭＰ）および種々のシリカゾル（ＳＳ）からの調製
ゾル−ゲル誘導シリカマイクロ粒子（ＭＰ）は、ＴＥＯＳ（テトラエチルオルトシリケート＝テトラエトキシシラン、シグマ−アルドリッチ）をシリカの前駆体として使用して調製した。７ｗｔ−％のカプセル化したエンテカビルを有するシリカマイクロ粒子の調製は、初期ゾル（ｐＨ２で、モル比Ｒ＝Ｈ2Ｏ／ＴＥＯＳ＝３、１０または１５、ＨＣｌをｐＨ調整のために用いた）での調製により開始した。ＴＥＯＳの加水分解は、連続的な混合下、室温（２１〜２３℃）で２５〜３０分間行った。次に、シリカゾルをゲル形成を回避するために０℃まで冷却した。シリカゾルおよびエンテカビル溶液（ｐＨはＮａＯＨを用いて９．７〜１０．１に調製した）を、加水分解後７５〜１１０分以内に初期ゾル（Ｒ３、Ｒ１０またはＲ１）およびエンテカビル溶液を、混合したフローが噴霧乾燥機（ＧＥＡ  Ｍｏｂｉｌｅ  Ｍｉｎｏｒ）のノズルに達する前に、混合下の別れた容器にまたは円柱管にポンプで送り込むことにより混合した。フローの混合後、全ての製剤について、最終モル比  Ｒ＝Ｈ2Ｏ／ＴＥＯＳは１２０であり、ｐＨは５．８〜６．０であった（エンテカビル溶液の水のため、モル比は増加した。したがって、最終製剤は、Ｒ３−１２０、Ｒ１０−１２０およびＲ１５−１２０と表した。）。シリカゾルおよびエンテカビル溶液は、ノズルに到達する前に約４〜６分接触した（例えば、Ｒ３−１２０と７％（ｗ／ｗ）エンテカビル（４分）またはＲ３−１２０と７％（ｗ／ｗ）エンテカビル（６分））。混合したフローを噴霧乾燥し、カプセル化したエンテカビルを７ｗｔ％有するシリカマイクロ粒子とした（噴霧乾燥機のパラメータ；ＧＥＡＭｏｂｉｌｅ  Ｍｉｎｏｒ：流入温度：１８０〜１８２℃；排出温度：８０〜８３℃；アスピレータ：８０ｋｇ／ｈ（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ）；噴霧化圧  １．５Ｂａｒ、噴霧流１１．０ｋｇ／ｈ）。
【００７４】
併流二液ノズル：ノズル：１．０ｍｍ；ノズルキャップ：５．０ｍｍおよびスペーサー：媒体；Ｂｕｅｃｈｉ  Ｂ−１９１：流入温度：１２０℃；排出温度：５９〜６７℃；アスピレータ３２ｍ3／ｈ；供給流３．４ｍｌ／分；噴霧流：７００Ｌ／ｈ（空気））。
【００７５】
噴霧乾燥されたシリカマイクロ粒子と混合されるべきシリカゾル（ＳＳ）は、前駆体として、ＴＥＯＳ（テトラエチルオルトシリケート＝テトラエトキシシラン、シグマ−アルドリッチ）を用いて調製した。シリカ約０．９ｗｔ％に相当するＲ＝Ｈ2Ｏ／ＴＥＯＳ（モル比）＝４００のシリカゾルを調製し、計算し、全ての試料における初期ｐＨがｐＨ２であった（ｐＨを調整するためにＨＣｌを使用した）。加水分解は、ゾルの冷却（０℃まで）とｐＨ調整の前に連続的な混合下、室温（２１〜２３℃）で２５〜６５分間行った。連続撹拌下、ｐＨを０．１Ｍ  ＮａＯＨを添加することにより６．２まで上昇させた。ｐＨ調整の後、シリカゾルは、噴霧乾燥させたマイクロ粒子と５〜１０分間以内で混合した。
【００７６】
シリカマイクロ粒子およびシリカゾルは、泡形成を避けるために軽く撹拌しながら混合した。シリカゾル（ＳＳ）におけるシリカマイクロ粒子（ＭＰ）の濃度は１．０ｇ／ｍｌであった。シリカマイクロ粒子とシリカゾルとから形成された懸濁液（流動性の形態での混合組成物）は、１ｍｌまたは１０ｍｌの混合組成物のシリンジ（針を用いない）への直接吸引により、またはルアーロックアダプタを用いることにより、プラスチックまたはガラスシリンジ（ＢＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｇｅｒｒｅｓｈｅｉｍｅｒ）に移され、起こり得る気泡を取り除いた。混合組成物は数分以内に、ある場合には充填後数時間以内にハイドロゲルに変化した。ゲル形成に数時間かかった場合、混合組成物は、回転式ミキサーにおいて穏やかに混合することにより安定に保持した。
【００７７】
実施例２
ハイドロゲルコンポジットおよび素シリカマイクロ粒子からのエンテカビルのインビトロ放出とシリカの溶出
カプセル化されたエンテカビル７％（ｗ／ｗ）とＲ４００のシリカゾルを有するハイドロゲルコンポジットＲ１０−１２０からのエンテカビルの放出（インビトロで）およびシリカの溶解を、２０〜３０ｍｇのコンポジットを５０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝溶液（ｐＨ７．４、３７℃）に浸漬することにより調べた。研究は、シンク（sink）条件、すなわち、ｃ（ＳｉＯ2）が３０ｐｐｍ未満、すなわち、同じ条件で特定のＳｉＯ2の溶解度の２０％未満であるｃ（ＳｉＯ2）で行われた。アルミホイルで密閉包装したプレフィルドシリンジ（ルアーロックを備えるガラスシリンジ、１ｍｌ、Ｇｅｒｒｅｓｈｅｉｍｅｒ）に保管されたハイドロゲルコンポジットについて、２５℃および相対湿度６０％で３ヵ月保管後の累積放出率を図１に示す。結果は、エンテカビルの放出率が約０．２５％／ｈであり、これは約１７日以内に１００％に到達することを示している。これは、皮下、筋肉内および腹腔内投与において、シリカからの放出に関する共通インビボ−インビトロ相関係数が１０であることが観察されているため、約１７０日間、すなわち５〜６ヵ月のインビトロでの放出率を予測する。エンテカビルのバースト（初期の速い放出）放出後、エンテカビルの放出とシリカの溶解は、ほぼ同じ速度で進み、エンテカビルがシリカ内に良好にカプセル化されていることを示す。
【００７８】
実施例３
噴霧乾燥シリカマイクロ粒子（Ｒ１０−１２０と７％（ｗ／ｗ）エンテカビル）の粒子サイズ分布
粒子サイズ分布は、ウェットセルキュベット（レンズ  Ｒ３（０．５〜１７５μｍ）；分散剤  エタノール；超音波処理時間  ３０秒（１００％出力）；光学密度  １５〜２０％；測定時間  ２０秒；撹拌速度  最大（１０００））を備えたＳｙｍｐａｔｅｃ（ＨＥＬＯＳ  Ｈ２２９６）を用いるか、またはＣＵＶＥＴＴＥ分散機および０．５／０．９〜１７５μｍのＲ３レンズを装備したＳｙｍｐａｔｅｃ  ＨＥＬＯＳ  Ｈ２３７０を用いて測定した。溶媒としてエタノールを用いてＰａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ（ＰＩＬ）法を採用した。数ミリグラムの試料を試料バイアルから採取し、約１０〜２０ｍｌのエタノールの濃縮ストック懸濁液に分散した。ＣＵＶＥＴＴＥ分散機のチャンバーをエタノールでみたし、マグネチックスターラー（１０００ｒｐｍ）をキュベッとの底に設置した。参照ベースライン測定はエタノールのみで行った。測定において、適切な試料を体積ピペットでストック懸濁液から採取し、１５〜２５％の光学濃度を得るためにＣＵＶＥＴＴＥ分離機に入れた。測定を開始する場合、試料を３０秒間自動的に超音波処理し、測定開始時に停止した。測定を２０秒間続け、粒径分布を生成する。３つの平行試料をストック溶液から採取し、上記方法により分析した。結果を表１にまとめる。
【００７９】
【表１】
2018531270.tif 000002
【００８０】
実施例４
シリンジ内における安定なハイドロゲル構造とずり下でのずり流動化性挙動との両方を示す、注入可能なカプセル化されたエンテカビルを有するシリカマイクロ粒子およびシリカゾルのハイドロゲルコンポジットについてのレオロジー測定試験および注入可能性試験
レオロジー測定は、形状を測定するＨＰＰ２０ＴＣを備えた平行板を装備した単一回転式レオメータ（ＴｈｅｒｍｏＨａａｋｅ  ＲＳ  ３００）で行った（Ｄ＝２０ｍｍ）。このシステムは、全ての材料を測定するために使用した。０．３ｍｍのギャップと２５℃で０．１０００  １／ｓ〜１０００  １／ｓのずり速度を有するＣＳ／ＣＲ回転ランプ−プログラムを動的粘性を測定するために使用した。振動検査（損失因子および弾性率および粘性率について）は、２５℃で０．４ｍｍのギャップと周波数範囲０．０１〜１０Ｈｚの周波数掃引により行った。さらに、検査は、振幅掃引プログラムで既に決定した０．００２にひずみを設定した制御されたひずみのもとで行った。
【００８１】
振動測定は、プレフィルドシリンジにおけるハイドロゲルコンポジット（７ｗｔ％のカプセル化されたエンテカビルを有するＲ１０−１２０シリカマイクロスフェアとＲ４００シリカゾル、シリカゾル１ｍｌ中に１ｇのマイクロスフェア）の安定性を、保管時間（０〜６ヵ月）の関数として示すために行い、製品の即時使用性を示した。レオロジー測定のための試料をシリンジ内の３つの異なる場所から採取した。振動測定における応力とずれが最少であるため、動的粘性測定は、振動測定において使用した同じ試料で、振動測定直後の動的粘性について回転ずりで継続することにより行った。すべての測定は２５℃で行った。レオロジー測定は、新鮮なハイドロゲルコンポジット（０ヵ月）、および２５℃、相対湿度６０％で１、２、３および６ヵ月保管した後のアルミ箔の密封包装したプレフィルドシリンジ（ガラスシリンジ、１ｍｌ、Ｇｅｒｒｅｓｈｅｉｍｅｒ）に保管したハイドロゲルコンポジットについて行った。粘性率（Ｇ''）および弾性率（Ｇ’）の比、損失係数（損失正接、ｔａｎδ＝Ｇ''／Ｇ’）および複素弾性率（Ｇ*）を表２および図２に示す。コンポジットのゲル様構造（弾性率が粘性率よりも大きく、損失係数が１未満である。）が分かる。粘弾材料については、１よりも大きい損失係数は、材料がより液体のようにふるまうことを示し、１未満の損失係数は、材料がより固体のように、たとえばゲルのようにふるまうことを示す。ハイドロゲルコンポジットについては、すべての損失係数は明らかに１未満である。ゲル様構造は、マイクロ粒子がシリンジ内に沈殿とならず、コンポジットが安定なままでいることを保証する。
【００８２】
【表２】
2018531270.tif 000003
【００８３】
ハイドロゲルコンポジット構造はゲル様構造であり、保管時に安定なままであるが、下ゲル様構造は非常にルースであるため、表２に示すように内径０．５０ｍｍおよび０．５５ｍｍの細い針（２４Ｇ：０．５５ｍｍ×２５ｍｍ、２５Ｇ：０．５０ｍｍ×２５ｍｍ、テルモ）を通して注入することができる。これはまた、異なるずり速度での動的粘性測定において観察される明確なずり流動化挙動によって支持される（表３および図３）。ずり流動化挙動は、新鮮な試料（０ヵ月）についても、２５℃、相対湿度６０％で３および６ヵ月保管した後のアルミ箔の密封包装したプレフィルドシリンジで保管した試料についても明らかである。
【００８４】
【表３】
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【００８５】
実施例５
細い針注入のためのシリカマイクロ粒子（ＭＰ）および種々のシリカゾル（ＳＳ）から調製される注入可能なハイドロゲルコンポジットの製造
プラセボ組成物（ハイドロゲルコンポジット）は、実施例１に記載された対応する方法により作製した。プラセボシリカマイクロ中止の製造は、初期ゾル（ｐＨ２で、モル比Ｒ＝Ｈ2Ｏ／ＴＥＯＳ＝１０、ＨＣｌをｐＨ調整のために用いた）調製により開始した。加水分解後、初期シリカゾル（Ｒ１０）およびエタノール（９９％）を、混合したフローが噴霧乾燥機（ＧＥＡ  Ｍｏｂｉｌｅ  Ｍｉｎｏｒ）のノズルに達する前に、円柱管にポンプで送り込んだ。シリカゾルおよびエタノールをノズルに到達する前に４分間接触させた。フローの混合後、最終モル比はＲ＝Ｈ2Ｏ／ＴＥＯＳ＝５０に対応した（すなわち、最終製剤はＲ１０−５０であり；初期Ｒ１０からＲ５０を得るために水が必要とされるので、同体積のエタノールを使用した）。プラセボ製剤を、シリカマイクロ粒子製剤Ｒ１０−１２０＋７ｗｔ％カプセル化エンテカビルに対して参照材料となるように、すなわちＲ１０−１２０＋７ｗｔ％カプセル化エンテカビルについてと同じ溶出（生分解）率を得るために設計した。
【００８６】
噴霧乾燥されたシリカマイクロ粒子と混合されるべきシリカゾル（ＳＳ）は、実施例１と同様の方法で製造した。シリカゾルのＲ＝Ｈ2Ｏ／ＴＥＯＳ（モル比）は、Ｒ３００〜４００（Ｒ３００、Ｒ３５０、Ｒ４００）の間で変化し、全ての試料の初期ｐＨはｐＨ２であった（ＨＣｌをｐＨ調整のために用いた）。加水分解は、連続的な混合下、室温（２１〜２３℃）で２５分間なされた。連続的な撹拌下、ｐＨを０．１Ｍ  ＮａＯＨを加えて６．２まで上げた。ｐＨ調整後、シリカゾルを５〜１５分以内に噴霧乾燥されたマイクロ粒子と混合するか、または混合の前に４０℃で３時間エージングした。
【００８７】
シリカマイクロ粒子とシリカゾルとを、泡形成を回避するために軽く攪拌しながら混合した。シリカゾル（ＳＳ）中のシリカマイクロ粒子（ＭＰ）の濃度は、０．１５〜１．０ｇ／ｍｌの間で変化する。シリカマイクロ粒子とシリカゾルとから形成される懸濁液（流動形態の混合組成物）は、混合組成物を直接吸引することによりガラスシリンジに移され（針を用いないで）、起こり得る気泡を取り除いた。混合組成物は、充填後数時間以内にハイドロゲルに変化した。ゲル形成の前、混合組成物を回転式ミキサーにおいて穏やかに混合することにより安定に保持した。
【００８８】
０．５〜１．０ｇ／ｍｌの間で変化するシリカゾル（ＳＳ）中のシリカマイクロ粒子（ＭＰ）の濃度のみがハイドロゲルを形成した。０．５ｇ／ｍｌの濃度では、混合組成物を２７Ｇ針（０．４×２０ｍｍ）を通して注入することが可能であったが、ハイドロゲルコンポジットの構造は、部分的に崩壊した。最も良い結果である３０Ｇ針（０．３×１３ｍｍ）を通した注入が、Ｒ４００シリカゾル（ＳＳ）中のシリカマイクロ粒子（ＭＰ）０．７５ｇ／ｍｌで得られた。
【００８９】
実施例６
シリンジ内における安定なハイドロゲル構造、ずり下でのずり流動性挙動、およびずりおよび回復後の安定なハイドロゲルまたは流動構造の両方を示す、カプセル化されたエンテカビルを有するシリカマイクロ粒子とシリカゾルとから調製される注入可能なハイドロゲルコンポジットに関するレオロジー測定
７ｗｔ％のカプセル化されたエンテカビルを有するＲ３−１２０シリカマイクロ粒子とシリカマイクロ粒子と混合されるべきシリカゾルとは、実施例１に記載されたように製造した。Ｒ＝Ｈ2Ｏ／ＴＥＯＳ（モル比）＝４００の新鮮な（エージングされていない）シリカゾルが使用され、そのシリカマイクロ粒子の濃度は、Ｒ４００シリカゾル１ｍｌ中に０．５ｇおよび１．０ｇであった。Ｒ４００シリカゾルにおけるシリカマイクロ粒子の混合組成物はなお流動性であるので、それらは、Ｇｅｒｒｅｓｈｅｉｍｅｒの１ｍｌルアーロックガラスシリンジに移された。混合組成物は、マイクロ粒子の沈降を回避するために２４時間、回転式ミキサーにおいて穏やかな混合下に保持した。混合組成物は、回転式ミキサーにおける２４時間のあいだハイドロゲルに変化した。
【００９０】
レオロジー測定は、形状を測定する平行板（Ｄ＝２０ｍｍ）および０．３ｍｍのギャップを装備した単一回転式レオメータ（ＴｈｅｒｍｏＨａａｋｅ  ＲＳ  ３００）で行った。応力のかけられていない材料（シリンジ内の混合組成物）に対するレオロジー測定は２５℃で、応力のかけられた（細い針を通した注入をシミュレートする一定のずり速度）材料に対しては３７℃で行った。シリンジ内の安定なハイドロゲル構造を示すため、線形粘弾性領域（ひずみ０．００２）内での振動検査（損失係数、弾性率および粘性率について）を、２５℃で周波数範囲０．０１〜１０Ｈｚの周波数掃引により行った。Ｒ４００シリカゾル１ｍｌ中に０．５ｇおよび１．０ｇのシリカマイクロ粒子の混合組成物の両方について粘性率（Ｇ''）および弾性率（Ｇ’）の比、損失係数（損失正接、ｔａｎδ＝Ｇ''／Ｇ’）は、明らかに１より小さく（図４に示された３つの平行測定の平均）、安定で非流動性のハイドロゲル構造を示す。
【００９１】
その後、混合組成物は、制御されたずり速度プログラム（均質化のため５０  １／ｓを１０秒間、その後注入をシミュレートするために５０００  １／ｓを３０秒間、その後回復のために１．０  １／ｓを１０秒間）のもと応力がかけられた。回復の直後、線形粘弾性領域（ひずみ０．００２）内での別の振動検査（損失係数、弾性率および粘性率について）を、３７℃で周波数範囲０．０１〜１．０Ｈｚの周波数掃引により行った。Ｒ４００シリカゾル１ｍｌ中に１．０ｇのシリカマイクロ粒子の混合組成物については損失係数は明らかに１より小さかったが、Ｒ４００シリカゾル１ｍｌ中に０．５ｇのシリカマイクロ粒子の混合組成物については損失係数が１よりも大きかった（図５に示された３つの平行測定の平均）。Ｒ４００シリカゾル１ｍｌ中に１．０ｇのシリカマイクロ粒子の混合組成物は、注入をシミュレートする応力（一定のずり）後も安定なハイドロゲル構造であるが、Ｒ４００シリカゾル１ｍｌ中に０．５ｇのシリカマイクロ粒子の混合組成物は、粘度の高い流動性の組成物に変化する。
【００９２】
実施例７
シリカマイクロ粒子とシリカゾルとの混合組成物（ハイドロゲルコンポジット）からのインビボでのエンテカビルの放出
プレフィルドシリンジにおける、７％（ｗ／ｗ）のエンテカビルを有するＲ１５−１２０のマイクロスフェアとＲ４００シリカゾルとの混合組成物（ハイドロゲルコンポジット）（最終ハイドロゲルコンポジットに３６ｍｇ／ｍｌのエンテカビル）は、１２匹（６匹の雄と６匹の雌）のビーグル犬に皮下投与された。充填容積１ｍｌの即時使用シリンジを単回用量３６ｍｇエンテカビルの薬物動態を調べるために用いた。投与後、動物を９１日間追跡した。頸静脈からの血液試料を動物から回収し、投与前、１日目には３０分、１時間、２時間、４時間、８時間および２４時間、および３日目、５日目、７日目、１１日目、１５日目、２９日目、４３日目、５７日目、７１日目、８５日目および９１日目に１回エンテカビルの血漿レベルを測定した。イヌＫ２−ＥＤＴＡ血漿試料はタンパク質沈殿およびリン脂質除去を行うことにより分析のために調製した。凍結血漿試料は、解凍し、室温まで上げられた。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｐｌａｔｅｓを試料の抽出のために使用した。血漿試料をピペッティングする前に、各ウェルを１ｍｌのアセトニトリルで活性化した。アセトニトリルは真空により溶出した。次いで、２００μｌの血漿試料をウェルに移した。４０μｌの内部標準溶液（ラミブジン、１００ｎｇ／ｍｌ）を加えた。次に、７６０μｌのアセトニトリルを加え、プレートをパラフィルムで覆った。プレートを水平面で２分間振とうした。試料を真空により溶出し、抽出物を試料回収ウェルプレート内で、窒素の穏やかな気流下、５０℃で蒸発乾固した。残渣を、０．１％ギ酸を含むＤＭＳＯおよび水の混合物（１０：９０、ｖ／ｖ）２００μｌに溶解した。プレートを水平に１０分間振とうした。オートサンプラーバイアルのインサートに移した後、試料を微小遠心機において２０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。最後に、試料をＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに注入した（１０μｌ）。
【００９３】
分離は、統合Ｗａｔｅｒｓ  ＸＳｅｌｅｃｔ（登録商標）  ＨＳＳ  Ｔ３  ２．１×１０ｍｍガードカートリッジを備えたＷａｔｅｒｓ  ＸＳｅｌｅｃｔ（登録商標）  ＨＳＳ  Ｔ３  ２．１×１５０ｍｍ（３．５μｍ）カラムで行った。２つの溶離液からなる移動相：Ａは、水中０．１％ギ酸であり、Ｂは、メタノール中０．１％ギ酸であった。グラジエントでのクロマトグラフィーの実行が使用された：０分→１分  Ａが９２．５％（アイソクラチック）；１分から２分  Ａは９２．５％から５％まで減少、２分から３分  Ａは５％（アイソクラチック）；３分から４分  Ａは５％から９２．５％まで増加；最後  Ａは４分から７分まで９２．５％で一定に保った。カラムオーブンは、＋２５℃に設定した。質量分析検出は、Ｔｕｒｂｏ  Ｉｏｎ  Ｓｐｒａｙ（ＴＩＳ）陽イオン化および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードを備えたＡＰＩ  Ｓｃｉｅｘ  ４０００  ＱＴｒａｐ質量分析計を用いて実施した。ＴＩＳ温度は＋５０５℃であった。ネブライザーガス（ガス１）設定は５０、ターボガス（ガス２）設定は５０であった。ＴＩＳ電圧設定は４９００Ｖであった。デクラスタリング電位はエンテカビルに対して６０Ｖ、内部標準に対して５９Ｖであった。入口電位は両分子に対して１０Ｖに設定した。コリジョンエネルギーはエンテカビルに対して２５Ｖ、内部標準に対して２４Ｖであった。カーテンガス（窒素）は、値１０に設定し、コリジョンガス（窒素）は、値５．０に設定した。前駆体イオン−検出されたフラグメントイオン対は、エンテカビルについてｍ／ｚ２７８．１−１５２．０であり、内部標準についてｍ／ｚ２３０．０−１１１．９であった。両分子の滞在時間は２５０ｍｓｅｃであった。ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析からのデータは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｎａｌｙｓｔ  １．６．１ソフトウェアを用いて集めた。ピーク積分、較正曲線および定量は、同じソフトウェアで作製した。統計は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１０ソフトウェアで計算した。標準曲線は重み付け（１／ｘ2）線形回帰を用いて作製した。血漿濃度データは、非区画分析を用いてＰｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  ６．４ソフトウェア（Ｃｅｒｔａｒａ  Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）でモデル化された。
【００９４】
時間に対する個々の濃度の曲線を図６および７に記す。エンテカビルの注入部位からの初期の吸収は、シリカデポー製剤として投与した場合急速で、Ｃmaxは注入後３０〜６０分で観察された。その後、血漿エンテカビル濃度は、平均２９日で１ｎｇ／ｍｌレベル付近まで減少した。この時点後、明らかな持続放出相が次の２ヵ月間（９１日まで）、血漿エンテカビル濃度を徐々に減少させながら観察された。
【００９５】
実施例８
カプセル化されたエンテカビルを有するシリカマイクロ粒子とシリカゾルから調製される注入可能なヒドロゲルコンポジットを安定に保つプレフィルドシリンジ
Ｒ４００シリカゾル１ｍｌにおける７ｗｔ％のカプセル化されたエンテカビルを有するシリカマイクロ粒子（Ｒ３−１００）１．０ｇの混合組成物と、Ｒ４００シリカゾルそのものの安定性は、２つの異なる種類のシリンジ系において調べた。形成された注入可能なハイドロゲルコンポジットは、アルミ箔の密封包装したプレフィルドシリンジ（ルアーロックとゴムの別のプランジャストッパーを備えたガラスシリンジ、１ｍｌ、ＣｌｅａｒＪｅｃｔシリンジ、Ｇｅｒｒｅｓｈｅｉｍｅｒ  Ｂｕｅｎｄｅ  ＧｍｂＨ）に（４℃、２５℃／６０％および４０℃／６５％）で６ヵ月保管した（一般的な構造（視覚観察）、注入およびエンテカビル放出特性をわずかに変化した）。同じハイドロゲルコンポジットを、アルミ箔の密封包装したプレフィルドプラスチックシリンジ（ＢＤ  １ｍｌ  プラスチックのＭｏｎｏｊｅｃｔ（商標）  Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｔｉｐ  ＣａｐｓでシールしたＳｙｒｉｎｇｅ  Ｌｕｅｒ−Ｌｏｋ（商標）Ｔｉｐ，Ｃｏｖｉｄｅｎ  ＩＩｃ）に（４０℃／６５％）で２ヵ月間保存した場合、ハイドロゲルコンポジットは、シリンジ内で乾燥し、細い針を通して物質を注入することは不可能であった。
【００９６】
一連の別の試験において、５００マイクロリットルのＲ４００シリカゾルを３つの異なる種類のシリンジ系に注入した：
−ガラスシリンジ：ＣｌｅａｒＪｅｃｔ  １ｍｌシリンジ、Ｇｅｒｒｅｓｈｅｉｍｅｒ  Ｂｕｅｎｄｅ  ＧｍｂＨ
−プラスチックシリンジ：Ｐｌａｊｅｘ（商標）  １ｍｌシリンジ、テルモ
−プラスチックシリンジ：ＢＤ  １ｍｌ  Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｌｕｅｒ−Ｌｏｋ（商標）Ｔｉｐ、Ｍｏｎｏｊｅｃｔ（商標）  Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｔｉｐ  Ｃａｐｓ，Ｃｏｖｉｄｅｎ  ＩＩｃ
【００９７】
シリンジを強化された条件、７０℃で２週間で保持し、シリンジ質量を時間の関数としてモニターし、上記がシリンジから外に漏れないか調べた。２週間後、Ｇｅｒｒｅｓｈｅｉｍｅｒのガラスシリンジは、もとの質量の９８％を保持しており、テルモのプラスチックシリンジは９６．８％であり、ＢＤのプラスチックシリンジは８３．５％であった。結果は、Ｇｅｒｒｅｓｈｅｉｍｅｒのガラスシリンジなどのより少ない蒸気の漏れ（高い湿度バリア）を有するシリンジは、シリカマイクロ粒子とシリカゾルとを含む注入可能なハイドロゲルコンポジットの安定性を確保するために重要である。
【００９８】
実施例９
シリカハイドロゲルは、シリカマイクロ粒子によるヒト白血球活性化を阻害する
ヒト末梢血白血球とシリカマイクロ粒子との相互作用を調べた。シリカプラセボマイクロ粒子は、実施例１および５に記載されたように製造した。末梢血は、健康な成人ドナーから抗凝固剤としてＥＤＴＡを用い、静脈穿刺により得た。白血球画分は、デキストラン沈殿（９ｍｌ血液中に６％デキストリン１ｍｌ）を用いて室温で分離した。白血球の多い血漿層は、０．１％ゼラチンを補足したＣａ2+およびＭｇ2+不含ＨＢＳＳ−緩衝液（ＣＭＦ−ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、最後に約１ｍｌのＣＭＦ−ＨＢＳＳに再懸濁した。ブルカーチャンバーおよび顕微鏡を用いて白血球濃度を測定した。ルミノール強化化学発光（ＣＬ）法を用いて白血球とシリカマイクロ粒子間の反応を調べた。ＣＬ応答をＶｉｃｔｏｒ2マルチラベルカウンタを用いて、９６ウェルブラックプラスチックプレートにおいて３７℃で６０分間、４２５ｎｍで測定した。通常、反応混合物は３０００００個の白血球と０．２ｍｌのゲル−ＨＢＳＳ緩衝液中の０．５ｍＭルミノールとを、シリカマイクロ粒子の有無いずれかで含む。シリカマイクロ粒子は、白血球において明確に用量依存的ＣＬ応答を誘導する。最も高い活性化は、シリカマイクロ粒子濃度１〜１０ｍｇ／ｍｌで見られ、典型的には、活性化の刺激なない同じ細胞のＣＬ応答よりも１００〜１０００倍高かった。
【００９９】
シリカマイクロ粒子誘導白血球ＣＬに対するシリカハイドロゲルの効果を調べるために、Ｒ４００シリカハイドロゲルを実施例１に記載されているように製造し、７日間エージングさせ、その後、最分散させ、そしてシリカマイクロ粒子との混合を行った。ＣＬ反応混合物における２５％濃度でのＲ４００ハイドロゲルは、１．２５および６．２５ｍｇ／ｍｌのシリカマイクロ粒子により誘発された白血球ＣＬ応答を平均３０〜４０％阻害したことが分かった。
【０１００】
実施例１０
シリカハイドロゲルがヒト白血球によるシリカマイクロ粒子の取り込みを阻害する
ヒト白血球によるシリカマイクロ粒子の貪食を調べるため、末梢血を健康な成人ボランティアから採取し、白血球を実施例９に記載のように単離した。シリカマイクロ粒子の貪食を測定するために、実施例９に記載されているように製造したマイクロ粒子は、フルオレセインを載せた。フルオレセインは、４８８ｎｍレーザー光で誘発させた場合、５３０ｎｍの蛍光を発光する。白血球（３０００００細胞個）を１．２５ｍｇ／ｍｌのフルオレセイン搭載シリカマイクロ粒子と０．５ｍｌのゲル−ＨＢＳＳ緩衝液において３７℃で６０分までインキュベートし、種々の時点で氷浴で試料を素早く冷却して貪食反応を停止させた。試料はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーを用いて分析した。多形核白血球画分を、Ｆｃガンマ３型受容体を発現する食細胞白血球を認識する、フィコエリトリン標識抗−ＣＤ１６モノクローナル抗体の助けをかりてゲートした。ＣＤ１６陽性細胞のみを貪食について分析した。各試料について、１００００個の細胞を回収し、シリカマイクロ粒子中のフルオレセイン由来の蛍光シグナルを分析した。通常、フルオレセインシリカマイクロ粒子との６０分間のインキュベーション後、分析した細胞の４０％超がマイクロ粒子を結合していた。
【０１０１】
実施例９に記載されたように調製したＲ４００シリカハイドロゲルが貪食反応混合物中に加えられ（１．５６％濃度）、細胞に結合するマイクロ粒子の割合は、約２０％まで減少し、シリカマイクロ粒子を認識する細胞においては約５０％の減少であることを示す。これは、Ｒ４００シリカハイドロゲルが、ヒト白血球によるシリカマイクロ粒子の認識を妨げることができるということを示す。それにより、組織に局所的に注入した場合のシリカデポー製剤の耐性および安全性に正の効果を有する。
【０１０２】
他の好ましい実施形態
当然のことながら、本発明のコンポジットおよび方法は、様々な実施形態で具体化することが可能であり、本明細書に開示されているのはそのうちの数例のみに過ぎないことが理解されるだろう。例えば、コンポジットおよび方法の実施形態がそれぞれに、対応する方法およびコンポジットを有することは当業者にとって明らかである。この分野の当業者にとって、他の実施形態が存在し、そして本発明の意図から逸脱することがないことは明らかである。ゆえに、記載された実施形態は、例示的であって、限定的であると解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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