(57)【要約】糖タンパク質に対して特異性を有する新クラスの抗体を記載する。本抗体が、真菌によって産生されるタンパク質等のマンノシル化タンパク質に感度良くかつ特異的に結合することを示す。試料中の糖タンパク質の存在のモニタリングのためにこれらの抗糖タンパク質抗体を用いるアッセイを提供する。該方法を用いて、所望ポリペプチドの産生及び／または精製方法をモニターすることができ、精製産物内で産生される及び／または精製タンパク質中に存在するグリコシル化ポリペプチドの量を変える（例えば、減らすかまたは増やす）ためのプロセスパラメーターを変えることができる。ポリペプチドの発現及び分泌のレベルを検出するための対象抗体の使用方法、ならびに試料から糖タンパク質を精製するかまたは枯渇させるための対象抗体の使用方法をも提供する。例示実施形態では、所望ポリペプチドは、マルチサブユニットタンパク質、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ等の酵母内で産生され得る抗体であり得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖タンパク質上の、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、もしくはＡｂ５から選択される抗糖タンパク質抗体と同一または重複する線形もしくは立体構造エピトープ（複数可）に特異的に結合し、及び／あるいは糖タンパク質上の、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、もしくはＡｂ５から選択される抗糖タンパク質抗体と同一または重複する線形もしくは立体構造エピトープ（複数可）への結合について競合する、抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメント。
【請求項２】
（ａ）前記抗体または抗体フラグメントが、糖タンパク質上の、前記抗糖タンパク質抗体Ａｂ１と同一または重複する線形もしくは立体構造エピトープ（複数可）に特異的に結合し、及び／あるいは前記抗糖タンパク質抗体Ａｂ１と同一または重複する線形もしくは立体構造エピトープ（複数可）への結合について競合し、
（ｂ）前記抗体フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一価抗体、またはｍｅｔＭａｂから選択され、
（ｃ）前記抗体フラグメントがＦａｂフラグメントであり、
（ｄ）前記抗体または抗体フラグメントが、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、またはＡｂ５から選択される抗糖タンパク質抗体と同一の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、
（ｅ）前記抗体または抗体フラグメントが、配列番号４のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列、及び配列番号８のＣＤＲ３配列を含む可変重（ＶＨ）鎖、ならびに／または配列番号２４のＣＤＲ１配列、配列番号２６のＣＤＲ２配列、及び配列番号２８のＣＤＲ３配列を含む可変軽（ＶＬ）鎖を含むＦａｂフラグメントを含み、
（ｆ）前記抗体または抗体フラグメントが、前記ＶＬ及び前記ＶＨ領域のそれぞれに、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、またはＡｂ５から選択される抗糖タンパク質抗体に含まれるものと同一である少なくとも２つのＣＤＲを含み、
（ｇ）前記抗体または抗体フラグメントが、ヒト化、単鎖、またはキメラ抗体を含み、
（ｈ）前記抗体または抗体フラグメントが、ウサギ抗体または抗体フラグメントであり、
（ｉ）前記抗体または抗体フラグメントが、担体に結合しており、
（ｊ）前記抗体または抗体フラグメントが、宿主動物から単離された抗体または抗体フラグメントと比較して１つ以上のアミノ酸配列修飾を含み、及び／または
（ｋ）前記抗体または抗体フラグメントが、直接もしくは間接的に検出可能標識または治療薬に付着している、
請求項１に記載の抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメント。
【請求項３】
（ａ）配列番号２、４２、８２、１２２、もしくは１６２から選択されるＶＨポリペプチド配列、またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を示すその変異体；及び／または配列番号２２、６２、１０２、１４２、もしくは１８２から選択されるＶＬポリペプチド配列、またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を示すその変異体
を含む単離抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントであって、
前記抗糖タンパク質抗体が１つ以上の糖タンパク質抗体と特異的に結合するか、または
（ｂ）配列番号２、４２、８２、１２２、もしくは１６２から選択されるＶＨポリペプチド配列、またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を示すその変異体；及び／または配列番号２２、６２、１０２、１４２、もしくは１８２から選択されるＶＬポリペプチド配列、またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を示すその変異体
を含む単離抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントであって、
前記ＶＨまたはＶＬポリペプチド中のフレームワーク（ＦＲ）またはＣＤＲ残基の１つ以上が別のアミノ酸残基で置換され、結果として１つ以上の糖タンパク質抗体と特異的に結合する抗糖タンパク質抗体になっている、
前記単離抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメント。
【請求項４】
前記抗体または抗体フラグメントの１つ以上のフレームワーク（ＦＲ）残基が、前記ＶＨまたはＶＬポリペプチドに含まれる前記ＣＤＲが由来した親ウサギ抗糖タンパク質抗体の対応部位に存在するアミノ酸で置換されているか、または保存的アミノ酸置換によって置換されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントであって、場合により、
（ａ）前記ＶＬポリペプチド配列の前記ＣＤＲ中の前記残基の最大で１または２個が修飾され、
（ｂ）前記ＶＨポリペプチド配列の前記ＣＤＲ中の前記残基の最大で１または２個が修飾され、
（ｃ）前記抗体がヒト化され、
（ｄ）前記抗体がキメラであり、
（ｅ）前記抗体が単鎖抗体を含み、
（ｆ）前記抗体がヒトＦｃを含み、及び／または
（ｇ）前記抗体が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４由来の１つ以上のフレームワーク及び／または定常ドメイン配列を含む、
前記単離抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメント。
【請求項５】
前記抗体が、１つ以上の糖タンパク質に特異的に結合し、場合により、前記抗体が、１つ以上のマンノシル化タンパク質に特異的に結合するかまたはマンノシル化抗体重鎖もしくは軽鎖に特異的に結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメント。
【請求項６】
前記抗体が、配列番号２０１、２０５、もしくは２０９の配列を有する重鎖定常ポリペプチドまたはそのマンノシル化フラグメント及び／あるいは配列番号２０３、２０７、もしくは２１１の配列を含むマンノシル化ヒトＩｇＧ１抗体軽鎖定常ポリペプチドまたはそのマンノシル化フラグメントを含むマンノシル化ヒトＩｇＧ１抗体または抗体フラグメントに特異的に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメント。
【請求項７】
前記抗体が、下記：
（ａ）酵母種；
（ｂ）Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ．（Ｏｇａｔａｅａ  ｓｐｐ．）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）から成る群より選択される酵母種；
（ｃ）糸状真菌種；
（ｄ）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｍｉｅｈｅｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、及びＦｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍから成る群より選択される糸状真菌種；または
（ｅ）Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ
内で産生される１つ以上のマンノシル化抗体または抗体フラグメントに特異的に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメント。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントをコードする核酸配列（複数可）、または前記核酸配列（複数可）を含み、場合によりプラスミドもしくは組換えウイルスベクターであるベクター。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体または抗体フラグメントを発現する培養または組換え細胞であって、場合により前記細胞が、
（ａ）哺乳類、酵母、細菌、真菌、または昆虫細胞から選択され、
（ｂ）酵母細胞であり、
（ｃ）二倍体酵母細胞であり、
（ｄ）ピキア属の酵母細胞であり、及び／または
（ｅ）Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである、
前記細胞。
【請求項１０】
試料中の糖タンパク質の検出方法であって、前記試料を抗糖タンパク質抗体と接触させ、前記糖タンパク質の前記抗糖タンパク質抗体との結合を検出することを含み、場合により前記糖タンパク質がマンノシル化糖タンパク質である、前記方法。
【請求項１１】
前記抗糖タンパク質抗体が、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗糖タンパク質抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記糖タンパク質が、
（ａ）酵母種内で産生され、
（ｂ）Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ．（Ｏｇａｔａｅａ  ｓｐｐ．）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）から成る群より選択される酵母種内で産生され、
（ｃ）糸状真菌種内で産生され、
（ｄ）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｍｉｅｈｅｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、及びＦｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍから成る群より選択される糸状真菌種内で産生され、または
（ｅ）Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ内で産生される、
請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記糖タンパク質の前記抗糖タンパク質抗体との結合の前記検出ステップが、
（ａ）ＥＬＩＳＡアッセイを含み、場合により前記ＥＬＩＳＡアッセイが西洋ワサビペルオキシダーゼまたはユーロピウム検出を利用し、
（ｂ）前記抗糖タンパク質抗体が担体に結合しており、
（ｃ）前記検出ステップが、タンパク質−タンパク質相互作用モニタリングプロセスを使用し、及び／または
（ｄ）前記検出ステップが、光干渉法、二重偏光干渉法、静的光散乱法、動的光散乱法、多角光散乱法、表面プラズモン共鳴法、ＥＬＩＳＡ、化学発光ＥＬＩＳＡ、ユーロピウムＥＬＩＳＡ、ファーウエスタン法、または電界発光法を用いるタンパク質−タンパク質相互作用モニタリングプロセスを使用する、
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
精製カラムからの複数画分に対して行う、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法であって、糖タンパク質の検出レベルに基づいて、複数画分をプールして、
（ａ）前記抗糖タンパク質抗体に結合する糖タンパク質が枯渇した精製産物を生じさせ、前記精製産物は、場合により医薬品投与に適しており、または
（ｂ）前記抗糖タンパク質抗体に結合する糖タンパク質に富んだ精製産物を生じさせ、前記精製産物は、場合により医薬品投与に適しており、
場合により、ポリペプチドの総質量の百分率としてグリコシル化ポリペプチドの質量を測定することによって純度を決定する、前記方法。
【請求項１５】
（ａ）前記検出される糖タンパク質が、Ｏ結合型グリコシル化の結果であり、
（ｂ）前記検出される糖タンパク質が、ポリペプチドの糖変異体であり、
（ｃ）前記検出される糖タンパク質が、ホルモン、成長因子、受容体、抗体、サイトカイン、受容体リガンド、転写因子または酵素であり、
（ｄ）前記検出される糖タンパク質が、抗体または抗体フラグメントを含み、場合により、重鎖ポリペプチド及び／または軽鎖ポリペプチドの総質量の百分率としてグリコシル化重鎖ポリペプチド及び／またはグリコシル化軽鎖ポリペプチドの質量を測定することによって純度を決定し、
（ｅ）前記検出される糖タンパク質が、ヒト抗体もしくはヒト化抗体またはそのフラグメントを含み、
（ｆ）前記検出される糖タンパク質が、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、またはウシ起源の抗体を含み、
（ｇ）前記検出される糖タンパク質が、ウサギ起源の抗体を含み、
（ｈ）前記検出される糖タンパク質が、一価、二価、または多価抗体を含み、及び／または
（ｉ）前記検出される糖タンパク質が、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＢＡＦＦ、ＣＸＣＬ１３、ＩＰ−１０、ＣＢＰ、アンジオテンシン、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩ、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＰＯ、ＥＧＦ、ＦＳＨ、ＴＳＨ、ｈＣＧ、ＣＧＲＰ、ＮＧＦ、ＴＮＦ、ＨＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＰＣＳＫ９またはＨＲＧに特異的に結合する抗体を含む、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）１０％未満の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールし、
（ｂ）５％未満の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールし、
（ｃ）１％未満の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールし、及び／または
（ｄ）０．５％未満の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールする、
請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）９０％超の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールし、
（ｂ）９５％超の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールし、
（ｃ）９９％超の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールし、または
（ｄ）９９．５％超の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールする、
請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１８】
所望ポリペプチドの純度に基づいて、異なる試料もしくは溶出液またはその画分をプールすることをさらに含み、場合により、
（ａ）９１％超の純度を有する試料もしくは溶出液またはその画分をプールし、
（ｂ）９７％超の純度を有する試料もしくは溶出液またはその画分をプールし、または
（ｃ）９９％超の純度を有する試料もしくは溶出液またはその画分をプールする、
請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１９】
場合により、
（ａ）アフィニティーリガンド、
（ｂ）タンパク質Ａ及び／またはタンパク質Ｇ、
（ｃ）レクチン、
（ｄ）混合モードクロマトグラフィー担体、
（ｅ）セラミックヒドロキシアパタイト、セラミックフルオロアパタイト、結晶性ヒドロキシアパタイト、結晶性フルオロアパタイト、ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ、ＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、ＰＰＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ及びＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＭＸ−Ｔｒｐ−６５０Ｍから選択される混合モードクロマトグラフィー担体、
（ｆ）セラミックヒドロキシアパタイトを含む混合モードクロマトグラフィー担体、
（ｇ）疎水性相互作用クロマトグラフィー担体、
（ｈ）Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦＦ、Ｂｕｔｙｌ−Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦＦ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＢＢ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦ  Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦ  Ｌｏｗ  Ｓｕｂ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５ＥＴＨ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５ＩＳＯ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５ＰＨＥ、Ｃａｐｔｏ  Ｐｈｅｎｙｌ、Ｃａｐｔｏ  Ｂｕｔｙｌ、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ  Ｐｈｅｎｙｌ、ＴＳＫ  Ｅｔｈｅｒ  ５ＰＷ（２０ｕｍ及び３０ｕｍ）、ＴＳＫ  Ｐｈｅｎｙｌ  ５ＰＷ（２０ｕｍ及び３０ｕｍ）、Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ、Ｍ、及びＣ、Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｓ、Ｍ及びＣ、Ｈｅｘｙｌ−６５０Ｍ及びＣ、Ｅｔｈｅｒ−６５０Ｓ及びＭ、Ｂｕｔｙｌ−６００Ｍ、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｕｔｙｌ−５５０Ｃ、Ｐｈｅｎｙｌ−６００Ｍ、ＰＰＧ−６００Ｍ；孔径１２０、２００、３００Ａを有するＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｏｃｔｙｌ  Ｃｏｌｕｍｎｓ−３、５、１０Ｐ、１５及び２５ｕｍ、孔径１２０、２００及び３００Ａを有するＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｃｏｌｕｍｎｓ−３、５、１０Ｐ、１５及び２５ｕｍ、孔径１２０、２００及び３００Ａを有するＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｂｕｔｙｌ  Ｃｏｌｕｍｎｓ−３、５、１０Ｐ、１５及び２５ｕｍ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｂｕｔｙｌ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｏｃｔｙｌ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｐｈｅｎｙｌ；ＷＰ  ＨＩ−Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）；Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ｔ−ＢｕｔｙｌまたはＭａｃｒｏｐｒｅｐ  ｍｅｔｈｙｌ；及びＨｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｐｈｅｎｙｌ−ＨＰ２  ２０ｕｍから選択される疎水性相互作用クロマトグラフィー担体、及び／または
（ｉ）ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）６００ＭまたはＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰを含む疎水性相互作用クロマトグラフィー担体
を含む、クロマトグラフィー担体を用いて前記所望ポリペプチドを精製する、
請求項１０〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
不純物をモニターするためのサイズ排除クロマトグラフィーによる１つ以上の試料の分析をさらに含み、場合により、前記サイズ排除クロマトグラフィー担体がＧＳ３０００ＳＷである、請求項１０〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
試料中の糖タンパク質濃度の低減方法であって、
（ｉ）前記試料を抗糖タンパク質抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させ、それによって前記抗体またはフラグメントを前記糖タンパク質に結合させ、（ｉｉ）前記抗体またはフラグメント及びそれに結合した前記糖タンパク質を前記試料の残余から分離し、それによって前記試料中の糖タンパク質濃度を低減させることを含み、場合により前記試料が、インビボ投与に適した調剤試薬を含み、及び／または場合により前記方法が、精製カラムからプールされた画分に対して行われる、前記方法。
【請求項２２】
前記抗糖タンパク質抗体が、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗糖タンパク質抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）酵母種内で行われ、
（ｂ）Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ．（Ｏｇａｔａｅａ  ｓｐｐ．）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）から成る群より選択される酵母種内で行われ、
（ｃ）糸状真菌種内で行われ、
（ｄ）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｍｉｅｈｅｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、及びＦｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍから成る群より選択される糸状真菌種内で行われ、または
（ｅ）Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ内で行われる、
請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）前記抗糖タンパク質抗体が担体に結合し、
（ｂ）前記抗糖タンパク質抗体が樹脂を含む担体に結合し、または
（ｃ）前記抗糖タンパク質抗体が、アガロース、架橋アガロース、ポリアクリルアミド、その誘導体を含む樹脂、または官能基、ペプチド、もしくはタンパク質を固定化できる別の樹脂もしくはポリマーを含む担体に結合する、
請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）前記検出される糖タンパク質が、Ｏ結合型グリコシル化の結果であり、
（ｂ）前記検出される糖タンパク質が、ポリペプチドの糖変異体であり、
（ｃ）前記検出される糖タンパク質が、ホルモン、成長因子、受容体、抗体、サイトカイン、受容体リガンド、転写因子または酵素であり、
（ｄ）前記検出される糖タンパク質が、抗体または抗体フラグメントを含み、場合により、重鎖ポリペプチド及び／または軽鎖ポリペプチドの総質量の百分率としてグリコシル化重鎖ポリペプチド及び／またはグリコシル化軽鎖ポリペプチドの質量を測定することによって純度を決定し、
（ｅ）前記検出される糖タンパク質が、ヒト抗体もしくはヒト化抗体またはそのフラグメントを含み、
（ｆ）前記検出される糖タンパク質が、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、またはウシ起源の抗体を含み、
（ｇ）前記検出される糖タンパク質が、ウサギ起源の抗体を含み、
（ｈ）前記検出される糖タンパク質が、一価、二価、または多価抗体を含み、及び／または
（ｉ）前記検出される糖タンパク質が、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ-α、ＩＦＮ-γ、ＢＡＦＦ、ＣＸＣＬ１３、ＩＰ−１０、ＣＢＰ、アンジオテンシン、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩ、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＰＯ、ＥＧＦ、ＦＳＨ、ＴＳＨ、ｈＣＧ、ＣＧＲＰ、ＮＧＦ、ＴＮＦ、ＨＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＰＣＳＫ９またはＨＲＧに特異的に結合する抗体を含む、
請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）前記試料中の糖タンパク質濃度が、前記試料中の総タンパク質の１０％未満に低減し、
（ｂ）前記試料中の糖タンパク質濃度が、前記試料中の総タンパク質の５％未満に低減し、
（ｃ）前記試料中の糖タンパク質濃度が、前記試料中の総タンパク質の１％未満に低減し、
（ｄ）前記試料中の糖タンパク質濃度が、前記試料中の総タンパク質の０．５％未満に低減し、
（ｅ）前記試料中の糖タンパク質濃度が、前記試料中の総タンパク質の０．１０％未満に低減し、
（ｆ）前記試料中の糖タンパク質濃度が、前記試料中の総タンパク質の０．０１％未満に低減し、
場合により、前記試料中のポリペプチドの総質量の百分率としてグリコシル化ポリペプチドの質量を測定することによって前記試料中の糖タンパク質濃度を決定する、
請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
場合により、
（ａ）アフィニティーリガンド、
（ｂ）タンパク質Ａ及び／またはタンパク質Ｇ、
（ｃ）レクチン、
（ｄ）混合モードクロマトグラフィー担体、
（ｅ）セラミックヒドロキシアパタイト、セラミックフルオロアパタイト、結晶性ヒドロキシアパタイト、結晶性フルオロアパタイト、ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ、ＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、ＰＰＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ及びＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＭＸ−Ｔｒｐ−６５０Ｍから選択される混合モードクロマトグラフィー担体、
（ｆ）セラミックヒドロキシアパタイトを含む混合モードクロマトグラフィー担体、
（ｇ）疎水性相互作用クロマトグラフィー担体、
（ｈ）Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦＦ、Ｂｕｔｙｌ−Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦＦ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＢＢ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦ  Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦ  Ｌｏｗ  Ｓｕｂ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５ＥＴＨ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５ＩＳＯ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５ＰＨＥ、Ｃａｐｔｏ  Ｐｈｅｎｙｌ、Ｃａｐｔｏ  Ｂｕｔｙｌ、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ  Ｐｈｅｎｙｌ、ＴＳＫ  Ｅｔｈｅｒ  ５ＰＷ（２０ｕｍ及び３０ｕｍ）、ＴＳＫ  Ｐｈｅｎｙｌ  ５ＰＷ（２０ｕｍ及び３０ｕｍ）、Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ、Ｍ、及びＣ、Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｓ、Ｍ及びＣ、Ｈｅｘｙｌ−６５０Ｍ及びＣ、Ｅｔｈｅｒ−６５０Ｓ及びＭ、Ｂｕｔｙｌ−６００Ｍ、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｕｔｙｌ−５５０Ｃ、Ｐｈｅｎｙｌ−６００Ｍ、ＰＰＧ−６００Ｍ；孔径１２０、２００、３００Ａを有するＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｏｃｔｙｌ  Ｃｏｌｕｍｎｓ−３、５、１０Ｐ、１５及び２５ｕｍ、孔径１２０、２００及び３００Ａを有するＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｃｏｌｕｍｎｓ−３、５、１０Ｐ、１５及び２５ｕｍ、孔径１２０、２００及び３００Ａを有するＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｂｕｔｙｌ  Ｃｏｌｕｍｎｓ−３、５、１０Ｐ、１５及び２５ｕｍ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｂｕｔｙｌ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｏｃｔｙｌ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｐｈｅｎｙｌ；ＷＰ  ＨＩ−Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）；Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ｔ−ＢｕｔｙｌまたはＭａｃｒｏｐｒｅｐ  ｍｅｔｈｙｌ；及びＨｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｐｈｅｎｙｌ−ＨＰ２  ２０ｕｍから選択される疎水性相互作用クロマトグラフィー担体、及び／または
（ｉ）ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）６００ＭまたはＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰを含む疎水性相互作用クロマトグラフィー担体
を含むクロマトグラフィー担体を用いて前記所望ポリペプチドを精製する、
請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
不純物をモニターするためのサイズ排除クロマトグラフィーによる１つ以上の試料の分析をさらに含み、場合により前記サイズ排除クロマトグラフィー担体がＧＳ３０００ＳＷである、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
細胞による分泌ポリペプチドの発現レベルの検出方法であって、（ｉ）捕捉試薬を前記細胞に結合させ、（ｉｉ）前記細胞を培養し、それによって前記細胞から前記分泌ポリペプチドが発現及び分泌され、（ｉｉｉ）前記分泌ポリペプチドに結合する検出試薬と前記細胞を接触させ、（ｉｖ）前記検出試薬を検出し、その結果、前記細胞による前記分泌ポリペプチドの発現レベルを検出する、前記方法。
【請求項３０】
前記捕捉試薬が、前記細胞に不可逆的に結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記捕捉試薬が、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗糖タンパク質抗体を含む、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記捕捉試薬が、前記分泌ポリペプチドに結合する結合部分をさらに含み、場合により、
（ａ）前記分泌ポリペプチドに特異的な抗体を含み、または
（ｂ）抗Ｆｃ抗体を含み、この場合、前記分泌ポリペプチドは、前記結合部分が特異的に結合するＦｃ領域もしくはそのフラグメントを含み、または
（ｃ）ビオチンを含む、
請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記捕捉試薬がビオチンを含み、かつ前記結合部分がアビジンもしくはストレプトアビジンを含むか、または前記捕捉試薬がアビジンもしくはストレプトアビジンを含み、かつ前記結合部分がビオチンを含み、前記捕捉試薬及び前記結合部分が、前記アビジンとビオチンの相互作用と共に結合する、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
（ａ）前記細胞が酵母細胞であり、
（ｂ）前記細胞が、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ．（Ｏｇａｔａｅａ  ｓｐｐ．）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）から成る群より選択される種の酵母細胞であり、または
（ｃ）前記細胞がＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである、
請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
（ａ）前記分泌ポリペプチドが、Ｏ結合型グリコシル化の結果であり、
（ｂ）前記分泌ポリペプチドが、ポリペプチドの糖変異体であり、
（ｃ）前記分泌ポリペプチドが、ホルモン、成長因子、受容体、抗体、サイトカイン、受容体リガンド、転写因子または酵素であり、
（ｄ）前記分泌ポリペプチドが抗体または抗体フラグメントを含み、場合により、重鎖ポリペプチド及び／または軽鎖ポリペプチドの総質量の百分率としてグリコシル化重鎖ポリペプチド及び／またはグリコシル化軽鎖ポリペプチドの質量を測定することによって純度を決定し、
（ｅ）前記分泌ポリペプチドが、ヒト抗体もしくはヒト化抗体またはそのフラグメントを含み、
（ｆ）前記分泌ポリペプチドが、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、またはウシ起源の抗体を含み、
（ｇ）前記分泌ポリペプチドが、ウサギ起源の抗体を含み、
（ｈ）前記分泌ポリペプチドが、一価、二価、または多価抗体を含み、及び／または
（ｉ）前記分泌ポリペプチドが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＢＡＦＦ、ＣＸＣＬ１３、ＩＰ−１０、ＣＢＰ、アンジオテンシン、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩ、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＰＯ、ＥＧＦ、ＦＳＨ、ＴＳＨ、ｈＣＧ、ＣＧＲＰ、ＮＧＦ、ＴＮＦ、ＨＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＰＣＳＫ９またはＨＲＧに特異的に結合する抗体を含む、
請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ｉｉ）が、ポリエチレングリコールまたは別の分子クラウディング薬を含む媒体内で行われ、場合により、
（ａ）前記ポリエチレングリコールが、約１０００Ｄａ〜約１００ｋＤａの平均分子量のものであり、
（ｂ）前記ポリエチレングリコールが、約５０００Ｄａ〜約１５ｋＤａの平均分子量のものであり、
（ｃ）前記ポリエチレングリコールが、約７０００Ｄａ〜約９０００Ｄａの平均分子量のものであり、または
（ｄ）前記ポリエチレングリコールが、約８０００Ｄａの平均分子量のものである、
請求項２９〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
（ａ）前記ポリエチレングリコールが、約１％〜約２０％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、
（ｂ）前記ポリエチレングリコールが、約５％〜約１５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、
（ｃ）前記ポリエチレングリコールが、約８％〜約１２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、または
（ｄ）前記ポリエチレングリコールが、約１０％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、
請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（ｉｉ）が、デキストラン、フィコール、及び／またはＢＳＡの１つ以上を含む媒体内で行われる、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記検出試薬が蛍光成分を含む、請求項２９〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
ステップ（ｉｖ）が、蛍光活性化細胞選別によって前記検出試薬を検出することを含む、請求項２９〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
異種細胞集団に対して行われ、かつ場合により上昇レベルの前記分泌ポリペプチドを発現する細胞に対して前記異種細胞集団を富化することをさらに含む、請求項２９〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記異種細胞集団が、遺伝子修飾細胞を含み、場合により、
（ａ）前記遺伝子修飾細胞が、化学的、放射線学的、または挿入突然変異誘発によって突然変異を起こされた細胞を含み、
（ｂ）前記遺伝子修飾細胞が、遺伝子ノックアウト細胞のライブラリーを含み、
（ｃ）前記遺伝子修飾細胞が、プラスミドライブラリーで形質転換された細胞を含み、
（ｄ）前記遺伝子修飾細胞が、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換された細胞を含み、
（ｅ）前記遺伝子修飾細胞が、高発現プロモーターに作動可能に連結されたｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドを含むｃＤＮＡライブラリーで形質転換された細胞を含み、
（ｆ）前記遺伝子修飾細胞が、高コピープラスミドを含むｃＤＮＡライブラリーで形質転換された細胞を含み、及び／または
（ｇ）前記遺伝子修飾細胞が、酵母種から得られたゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡを含むプラスミドライブラリーで形質転換された細胞を含む、
請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記酵母種がＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
上昇レベルの分泌ポリペプチドを発現する細胞であって、請求項２９〜４３のいずれか１項に記載の方法で検出される、前記細胞。
【請求項４５】
分泌ポリペプチドの発現レベルを高める遺伝子修飾を含む細胞であって、請求項２９〜４３のいずれか１項に記載の方法で検出される遺伝子修飾を含有する、前記細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１月１６日に出願され、発明の名称が「抗糖タンパク質抗体及びその使用（ＡＮＴＩ−ＧＬＹＣＯＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ）」である米国仮特許出願第６２／１０４，４０７号（代理人整理番号４３２５７．４８０２）の利益を主張し、上記出願は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の開示
本出願は、その開示の一部として、名称が「４３２５７ｏ４８１３．ｔｘｔ」であり、サイズが１３６，７０７バイトであり、２０１６年１月１５日に作成した電子的生物配列表テキストファイルを包含し、この電子的生物配列表テキストファイルは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
発明の分野
本開示は、一般的に抗糖タンパク質抗体に関する。例示抗体は、微生物系、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓで産生され得るマンノシル化タンパク質に特異的に結合する。本抗体は、タンパク質の精製またはモニタリング、例えばマンノシル化タンパク質について枯渇させるかもしくは富化するか、またはマンノシル化タンパク質を検出するかもしくはその存在量を決定するために使用可能である。
【背景技術】
【０００４】
背景
タンパク質の大規模な経済的精製は、バイオテクノロジー産業において益々重要な関心事である。一般的に、タンパク質は、当該タンパク質に関する遺伝子を含む組換えプラスミドの挿入によって、興味あるタンパク質を産生するように操作した原核生物、例えば、細菌、または真核生物、例えば、哺乳類もしくは真菌の細胞株を細胞培養することによって生成される。使用する細胞株は生きている生物なので、それらは、動物血清の調製物から供給されることもある、糖、アミノ酸、及び成長因子を含む複雑な成長培地で育てなければならない。ヒトの治療用としての使用に十分な純度まで、細胞に供給された化合物の混合物から及び細胞自体が産生した副産物から所望タンパク質を分離することは、厄介な難題をもたらす。
【０００５】
均一ポリマーとしてまたは不均一ポリマーとして存在するかに関係なく、多量体タンパク質は、生物分子に見られる最も複雑な構造組織の一部に相当する。構成要素であるポリペプチド鎖は（二次構造及び三次ドメインへ）折り畳めなければならないのみならず、それらは、安定したサブユニットの相互作用を可能にする相補的界面をも形成しなければならない。これらの相互作用は非常に特異的であり、同一サブユニット間または異なるサブユニット間であり得る。
【０００６】
特に、通常の抗体は、２つの同一軽鎖と２つの同一重鎖で構成された四量体タンパク質である。特殊タイプの純粋なヒト抗体は、多くの目的に十分な量で天然源から精製するのが困難なことがある。結果として、バイオテクノロジー及び製薬会社は、組換えＤＮＡに基づく方法に頼って大規模に抗体を調製してきた。現在、数百の治療用モノクロナール抗体（ｍＡｂ）が市場にあるかまたは開発中である。機能性抗体（機能性抗体フラグメントを含めて）の生産は、一般的に２つのポリペプチドの合成、ならびにＮ末端分泌シグナル配列のタンパク質分解プロセシング；ポリペプチドの四量体への適切な折り畳み及びアセンブリー；ジスルフィド結合の形成を含めたいくつかの翻訳後イベントに関係があり、典型的には特異的なＮ結合型グリコシル化を含む。
【０００７】
さらに、免疫系及び造血系の増殖、分化、ならびに他の細胞機能を制御する多面的調節因子としてのサイトカインは、広範な感染症及び自己免疫疾患の治療用途の可能性を有する。抗体によく似て、組換え発現法を用いて、研究及び医薬品用途におけるその後の使用のために組換えサイトカインを発現させることが多い。
【０００８】
該タンパク質の組換え合成は、生物学的に活性な物質を生成するため、より高等な真核細胞の培養に頼ることが多く、培養哺乳類細胞がとてもよく使用されている。しかしながら、哺乳類組織培養に基づく産生系は、微生物発酵法に比べて顕著な追加費用及び複雑な事態を招く。さらに、哺乳類細胞培養由来産物は、培養細胞または血清等の培養に用いた動物由来産物に存在し得る哺乳類病原（ウイルスを含めて）が確実にないようにするために追加の安全性試験を必要とすることがある。
【０００９】
従来の研究は、研究、診断、及び治療用途に適する可能性のある機能性タンパク質を生産するための対費用効果の高いプラットフォームとして酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを確立するのに役立った。参照によってそれぞれその全体をここに援用する共有の米国特許第７，９３５，３４０号；第７，９２７，８６３号及び第８，２６８，５８２号を参照されたい。文献では、組換えタンパク質の発現用のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発酵のデザイン方法も知られており、細胞密度、ブロス体積、基質供給速度、及び反応の各期の長さを含めたパラメーターに関して最適化が記載されている。参照によってそれぞれその全体をここに援用するＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ”ｉｎ  Ｃｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．，Ｅｄ．，２００７，Ｐｉｃｈｉａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３８９，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，ｐｇｓ．４３−６３を参照されたい。また、参照によってそれぞれその全体をここに援用するＵＳ２０１３００４５８８８、及びＵＳ２０１２０２７７４０８をも参照されたい。
【００１０】
培養細胞から組換えタンパク質を産生させ得るが、望ましくない副産物が産生されることもある。例えば、培養細胞は、望ましくないかまたは異常なグリコシル化を有するタンパク質と共に所望タンパク質を産生することがある。さらに、培養細胞は、間違った化学量論を有し、生産コスト増加の可能性があり、所望複合体の総収率を下げ得る追加の精製ステップを必要とする遊離モノマー及び複合体と共にマルチサブユニットタンパク質を産生することがある。さらに、精製後でさえ、懸念を生じさせる量で望ましくない副産物が存在することがある。例えば、グリコシル化副産物は、安定性、半減期、及び特異的活性等の特性に悪影響を及ぼす量で存在することがある一方で、異常な複合体または凝集体は、特異的活性を低下させることがあり、免疫原性の可能性があることもある。
【発明の概要】
【００１１】
概要
本開示は、特異的にマンノシル化ポリペプチドに結合する、本明細書で実証する新クラスの抗糖タンパク質抗体、ならびにその抗原結合性フラグメント及び変異体、及びそれらをコードするポリヌクレオチド、及びそれらを含むベクターを提供する。本開示の例示抗糖タンパク質抗体としては、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、ならびにそのフラグメント及び変異体が挙げられる。
【００１２】
別の態様では、本開示は、１つ以上の試料から（例えば、発酵プロセスから）の所望ポリペプチドの精製プロセスであって、例えば、Ｏ結合型グリコシル化及び／またはＮ結合型グリコシル化に起因する所望ポリペプチドの糖変異体等の前記グリコシル化不純物に結合する抗体を用いて、試料（複数可）中のグリコシル化不純物の量及び／またはタイプを検出することを含むプロセスを提供する。本プロセスは、組換えポリペプチドの発現及び場合により組換えポリペプチドの分泌をもたらす条件下で所望細胞または微生物を培養することをも含む。
【００１３】
別の態様では、本開示は、例えば、酵母または糸状真菌細胞内で発現される所望ポリペプチドの産生及び／または精製プロセスであって、抗糖タンパク質抗体を用いてグリコシル化ポリペプチドを検出することを含むプロセスを提供する。結果として、産生プロセス及び／または精製方法を調整して、グリコシル化ポリペプチドの量を増減して、例えば、望ましくない糖タンパク質を減少させるかまたは排除することができる。例示実施形態では、所望タンパク質は、抗体等のマルチサブユニットタンパク質であり、宿主細胞は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ等の酵母細胞であり、グリコシル化ポリペプチドは、所望ポリペプチドの糖変異体、例えばＮ結合型及び／またはＯ結合型糖変異体である。
【００１４】
さらに別の態様では、本開示は、糖タンパク質上の、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、もしくはＡｂ５から選択される抗糖タンパク質抗体と同一または重複する線形もしくは立体構造エピトープ（複数可）に特異的に結合し、及び／あるいは、糖タンパク質上の、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、もしくはＡｂ５から選択される抗糖タンパク質抗体と同一または重複する線形もしくは立体構造エピトープ（複数可）への結合について競合する、抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントを提供する。抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントは、糖タンパク質上の、抗糖タンパク質Ａｂ１と同一または重複する線形もしくは立体構造エピトープ（複数可）に特異的に結合し、及び／あるいは、抗糖タンパク質Ａｂ１と同一または重複する線形もしくは立体構造エピトープ（複数可）への結合について競合する。前記フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一価抗体、またはｍｅｔＭａｂ、例えば、Ｆａｂフラグメントから選択され得る。抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントは、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、またはＡｂ５から選択される抗糖タンパク質抗体と同じＣＤＲを含み得る。
【００１５】
Ｆａｂフラグメントは、配列番号４のＣＤＲ１配列、配列番号６のＣＤＲ２配列、及び配列番号８のＣＤＲ３配列を含む可変重鎖、ならびに／または配列番号２４のＣＤＲ１配列、配列番号２６のＣＤＲ２配列、及び配列番号２８のＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖を含み得る。
【００１６】
抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントは、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、またはＡｂ５から選択される抗糖タンパク質抗体に含まれるものと同一の可変軽鎖及び可変重鎖領域のそれぞれに少なくとも２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。
【００１７】
抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントは、ヒト化抗体、単鎖抗体、またはキメラ抗体であってよい。抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントは、１つ以上の糖タンパク質に特異的に結合し得る。抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントは、１つ以上のマンノシル化タンパク質に特異的に結合し得る。抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントは、マンノシル化抗体の重鎖または軽鎖に特異的に結合し得る。
【００１８】
抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントは、配列番号２０１、２０５、もしくは２０９の配列を有する重鎖定常ポリペプチドまたはそのマンノシル化フラグメント及び／あるいは配列番号２０３、２０７、もしくは２１１の配列を含むマンノシル化ヒトＩｇＧ１抗体軽鎖定常ポリペプチドまたはそのマンノシル化フラグメントを含むマンノシル化ヒトＩｇＧ１抗体または抗体フラグメントに特異的に結合し得る。
【００１９】
前記マンノシル化タンパク質は、酵母種、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ．（Ｏｇａｔａｅａ  ｓｐｐ．）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）から成る群より選択される酵母種内で産生され得る。
【００２０】
前記マンノシル化タンパク質は、糸状真菌種、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｍｉｅｈｅｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、及びＦｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍから成る群より選択される糸状真菌種内で産生され得る。
【００２１】
前記マンノシル化タンパク質は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ内で産生され得る。
【００２２】
抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントは、検出可能標識または治療薬に直接または間接的に付着可能である。
【００２３】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントをコードする、例えば、糖タンパク質上の、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、もしくはＡｂ５から選択される抗糖タンパク質抗体と同一または重複する線形もしくは立体構造エピトープ（複数可）に特異的に結合し、及び／あるいは、糖タンパク質上の、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、もしくはＡｂ５から選択される抗糖タンパク質抗体と同一または重複する線形もしくは立体構造エピトープ（複数可）への結合について競合する、抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントをコードする核酸配列（複数可）を提供する。別の態様では、本開示は、前記核酸配列（複数可）を含むベクター、例えば、プラスミドまたは組換えウイルスベクターを提供する。
【００２４】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の抗体または抗体フラグメントを発現する、例えば、糖タンパク質上の、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、もしくはＡｂ５から選択される抗糖タンパク質抗体と同一または重複する線形もしくは立体構造エピトープ（複数可）に特異的に結合し、及び／あるいは、糖タンパク質上の、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、もしくはＡｂ５から選択される抗糖タンパク質抗体と同一または重複する線形もしくは立体構造エピトープ（複数可）への結合について競合する、抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントを発現する培養細胞または組換え細胞を提供する。細胞は、哺乳類、酵母、細菌、真菌、または昆虫細胞であってよい。例えば、細胞は、二倍体酵母細胞等の酵母細胞であり得る。細胞は、Ｐｉｃｈｉａ属、例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの細胞であってよい。
【００２５】
別の態様では、本開示は、配列番号２、４２、８２、１２２、もしくは１６２から選択されるＶＨポリペプチド配列、またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を示すその変異体；及び／あるいは配列番号２２、６２、１０２、１４２、もしくは１８２から選択されるＶＬポリペプチド配列、またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を示すその変異体を含む単離抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントであって、前記抗糖タンパク質抗体が、１つ以上の糖タンパク質と特異的に結合する、単離抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントを提供する。
【００２６】
別の態様では、本開示は、配列番号２、４２、８２、１２２、もしくは１６２から選択されるＶＨポリペプチド配列、またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を示すその変異体；及び／あるいは配列番号２２、６２、１０２、１４２、もしくは１８２から選択されるＶＬポリペプチド配列、またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を示すその変異体を含む単離抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントであって、前記ＶＨまたはＶＬポリペプチドの１つ以上のフレームワーク（ＦＲ）またはＣＤＲ残基の１つ以上が、別のアミノ酸残基で置換され、結果として１つ以上の糖タンパク質抗体と特異的に結合する抗糖タンパク質抗体になっている、単離抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントを提供する。
【００２７】
前記抗体または抗体フラグメントの１つ以上のフレームワーク（ＦＲ）残基は、前記ＶＨまたはＶＬポリペプチドに含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）が由来した親ウサギ抗糖タンパク質抗体の対応部位に存在するアミノ酸で置換されていてよく、または保存的アミノ酸置換によることもある。
【００２８】
例えば、前記ＶＬポリペプチド配列のＣＤＲの最大で１または２個の残基が修飾され得る。さらなる例としては、前記ＶＨポリペプチド配列のＣＤＲの最大で１または２個の残基が修飾され得る。
【００２９】
前記抗体はヒト化され得る。前記抗体はキメラであり得る。前記抗体は単鎖抗体を含んでよい。前記抗体は、ヒトＦｃ、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４の定常領域、またはその変異体もしくは修飾型を含み得る。
【００３０】
前記抗体は、１つ以上のマンノシル化タンパク質、例えばマンノシル化抗体の重鎖または軽鎖に特異的に結合し得る。
【００３１】
前記抗体は、配列番号２０１、２０５、もしくは２０９の配列を有する重鎖定常ポリペプチドまたはそのマンノシル化フラグメント及び／あるいは配列番号２０３、２０７、もしくは２１１の配列を含むマンノシル化ヒトＩｇＧ１抗体軽鎖定常ポリペプチドまたはそのマンノシル化フラグメントを含むマンノシル化ヒトＩｇＧ１抗体もしくは抗体フラグメントに特異的に結合し得る。
【００３２】
前記マンノシル化タンパク質は、酵母種または糸状真菌種で産生可能である。
【００３３】
別の態様では、本開示は、試料中の糖タンパク質の検出方法であって、前記試料を抗糖タンパク質抗体と接触させ、前記糖タンパク質の前記抗糖タンパク質抗体との結合を検出することを含む方法を提供する。前記抗糖タンパク質抗体は、本明細書に記載の抗糖タンパク質抗体、例えば、糖タンパク質上の、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、もしくはＡｂ５から選択される抗糖タンパク質抗体と同一または重複する線形もしくは立体構造エピトープ（複数可）に特異的に結合し、及び／あるいは、糖タンパク質上の、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、もしくはＡｂ５から選択される抗糖タンパク質抗体と同一または重複する線形もしくは立体構造エピトープ（複数可）への結合について競合する、抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントであってよい。
【００３４】
前記マンノシル化タンパク質は、酵母種、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ．（Ｏｇａｔａｅａ  ｓｐｐ．）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）から成る群より選択される酵母種内で産生可能である。
【００３５】
前記マンノシル化タンパク質は、糸状真菌種、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｍｉｅｈｅｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、及びＦｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍから成る群より選択される糸状真菌種内で産生可能である。
【００３６】
前記マンノシル化タンパク質は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ内で産生可能である。
【００３７】
前記糖タンパク質の前記抗糖タンパク質抗体との結合を検出する前記ステップは、ＥＬＩＳＡアッセイ、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼまたはユーロピウム検出を利用するＥＬＩＳＡアッセイを含んでよい。
【００３８】
前記抗糖タンパク質抗体が担体に結合していてよい。
【００３９】
試料中の糖タンパク質の検出方法は、精製カラムからの複数画分に対して行ってよく、糖タンパク質の検出レベルに基づいて、複数画分をプールして、前記抗糖タンパク質抗体に結合する糖タンパク質が枯渇した精製産物を生じさせる。
【００４０】
試料中の糖タンパク質の検出方法は、精製カラムからの複数画分に対して行ってよく、糖タンパク質の検出レベルに基づいて、複数画分をプールして、前記抗糖タンパク質抗体に結合する糖タンパク質が富化した精製産物を生じさせる。
【００４１】
前記検出ステップは、タンパク質−タンパク質相互作用モニタリングプロセス、例えば光干渉法、二重偏光干渉法（ｄｕａｌ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）、静的光散乱法、動的光散乱法、多角度光散乱法、表面プラズモン共鳴法、ＥＬＩＳＡ、化学発光ＥＬＩＳＡ、ユーロピウムＥＬＩＳＡ、ファーウエスタン法、または電界発光法を用いるタンパク質−タンパク質相互作用モニタリングプロセスを使用してよい。
【００４２】
検出される糖タンパク質は、Ｏ結合型グリコシル化の結果であり得る。
【００４３】
試料は、所望ポリペプチドを含み得る。
【００４４】
検出される糖タンパク質は、所望ポリペプチドの糖変異体であり得る。
【００４５】
所望ポリペプチドは、ホルモン、成長因子、受容体、抗体、サイトカイン、受容体リガンド、転写因子または酵素であり得る。
【００４６】
所望ポリペプチドは、所望抗体または所望抗体フラグメント、例えば所望ヒト抗体もしくは所望ヒト化抗体またはそのフラグメントであり得る。
【００４７】
前記所望ヒト化抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、またはウシ起源、例えば、ウサギ起源のものであってよい。
【００４８】
前記所望抗体または所望抗体フラグメントは、所望の一価、二価、または多価抗体を含んでよい。
【００４９】
前記所望抗体または所望抗体フラグメントは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＢＡＦＦ、ＣＸＣＬ１３、ＩＰ−１０、ＣＢＰ、アンジオテンシン、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩ、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＰＯ、ＥＧＦ、ＦＳＨ、ＴＳＨ、ｈＣＧ、ＣＧＲＰ、ＮＧＦ、ＴＮＦ、ＨＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＰＣＳＫ９またはＨＲＧに特異的に結合し得る。
【００５０】
場合により、１０％未満の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールしてよく、あるいは５％未満の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールし、あるいは１％未満の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールし、あるいは０．５％未満の糖タンパク質を含むその画分をプールする。
【００５１】
場合により、９０％超の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールし、あるいは９５％超の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールし、あるいは９９％超の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールし、あるいは９９．５％超の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールする。
【００５２】
本方法は、所望ポリペプチドの純度に基づいて異なる試料もしくは溶出液またはその画分をプールすることをさらに含んでよく、例えば、９０％、９１％、９７％、または９９％超の純度を有する試料もしくは溶出液またはその画分をプールする。
【００５３】
純度は、重鎖ポリペプチド及び／または軽鎖ポリペプチドの総質量の百分率としてグリコシル化重鎖ポリペプチド及び／またはグリコシル化軽鎖ポリペプチドの質量を測定することによって決定可能である。
【００５４】
所望ポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィー担体を用いて精製可能である。アフィニティークロマトグラフィー担体は、免疫親和性リガンド、例えば、タンパク質Ａまたはレクチンを含んでよい。アフィニティークロマトグラフィー担体は、混合モードクロマトグラフィー担体、例えばセラミックヒドロキシアパタイト、セラミックフルオロアパタイト、結晶性ヒドロキシアパタイト、結晶性フルオロアパタイト、ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ、ＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、ＰＰＡ  ＨｙｐｅｒｃｅｌまたはＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＭＸ−Ｔｒｐ−６５０Ｍ、例えばセラミックヒドロキシアパタイトを含んでよい。
【００５５】
アフィニティークロマトグラフィー担体は、疎水性相互作用クロマトグラフィー担体、例えばＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４  ＦＦ、Ｂｕｔｙｌ−Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ、Ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４  ＦＦ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＢＢ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  ＦＦ  Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  ＦＦ  Ｌｏｗ  Ｓｕｂ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５ＥＴＨ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５ＩＳＯ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５ＰＨＥ、Ｃａｐｔｏ  Ｐｈｅｎｙｌ、Ｃａｐｔｏ  Ｂｕｔｙｌ、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ  Ｐｈｅｎｙｌ、ＴＳＫ  Ｅｔｈｅｒ  ５ＰＷ（２０ｕｍ及び３０ｕｍ）、ＴＳＫ  Ｐｈｅｎｙｌ  ５ＰＷ（２０ｕｍ及び３０ｕｍ）、Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ、Ｍ、及びＣ、Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｓ、Ｍ及びＣ、Ｈｅｘｙｌ−６５０Ｍ及びＣ、Ｅｔｈｅｒ−６５０Ｓ及びＭ、Ｂｕｔｙｌ−６００Ｍ、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｕｔｙｌ−５５０Ｃ、Ｐｈｅｎｙｌ−６００Ｍ、ＰＰＧ−６００Ｍ；孔径１２０、２００、３００Ａを有するＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｏｃｔｙｌ  Ｃｏｌｕｍｎｓ−３、５、１０Ｐ、１５及び２５ｕｍ、孔径１２０、２００及び３００Ａを有するＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｃｏｌｕｍｎｓ−３、５、１０Ｐ、１５及び２５ｕｍ、孔径１２０、２００及び３００Ａを有するＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｂｕｔｙｌ  Ｃｏｌｕｍｎｓ−３、５、１０Ｐ、１５及び２５ｕｍ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｂｕｔｙｌ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｏｃｔｙｌ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｐｈｅｎｙｌ；ＷＰ  ＨＩ−Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）；Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ｔ−ＢｕｔｙｌもしくはＭａｃｒｏｐｒｅｐメチル；またはＨｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｐｈｅｎｙｌ−ＨＰ２  ２０ｕｍ、例えばポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）６００ＭまたはＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰを含んでよい。
【００５６】
サイズ排除クロマトグラフィーを行って不純物をモニターしてもよい。サイズ排除クロマトグラフィー担体は、ＧＳ３０００ＳＷを含んでよい。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１Ａ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図１Ｂ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図１Ｃ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図１Ｄ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図１Ｅ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図１Ｆ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図１Ｇ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図２Ａ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図２Ｂ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図２Ｃ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図２Ｄ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図３Ａ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図３Ｂ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図３Ｃ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図３Ｄ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図３Ｅ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図３Ｆ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図３Ｇ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図３Ｈ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図３Ｉ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図３Ｊ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図３Ｋ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図３Ｌ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図３Ｍ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図３Ｎ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図３Ｏ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図３Ｐ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図３Ｑ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図３Ｒ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図３Ｓ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図４Ａ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図４Ｂ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図４Ｃ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図４Ｄ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図４Ｅ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図４Ｆ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図４Ｇ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図４Ｈ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図４Ｉ】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図５】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図６】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図７】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図８】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図９】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図１０】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図１１】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図１２】抗糖タンパク質抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を、完全重鎖及び軽鎖、可変重鎖及び軽鎖、ＣＤＲ、フレームワーク領域、及び定常領域を含めて提供し、ならびに抗体のこれら個々の部分の部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）及び配列番号を提供する。
【図１３】Ａｂ１及びＡｂ２を用いて抗体Ａｂ−Ａの異なるロットのグリコシル化を検出するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。アッセイ形式は、抗糖変異体（ＡＧＶ）抗体が置かれたものであり、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）検出によるものである。滴定した異なるＡｂ−Ａロットを有するストレプトアビジンプレートにビオチン化抗体を結合させた。２つの抗体Ａｂ１及びＡｂ２は、各試験試料に対して同様に反応した。このアッセイ形式では、Ａｂ１及びＡｂ２の感度は比較的類似し、プレート上に置かれた抗体及び溶液中のマルチポイントマンノシル化Ａｂ−Ａによる「スーパーアビディティー」効果に起因すると思われる。
【図１４】Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５を用いて抗体Ａｂ−Ａ及びＡｂ−Ｃの異なるロットのグリコシル化を検出するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。アッセイ形式は、ビオチン化抗原がストレプトアビジンプレート上に置かれたものであり、抗糖変異体（ＡＧＶ）抗体を滴定した。抗体は、異なる抗原に対して同様に（アフィニティーの差に起因し得るいくらかの差異はあるが）反応した。
【図１５】Ａｂ１を用いて抗体Ａｂ−Ａの様々なロットのグリコシル化を検出するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。アッセイ形式は、抗糖変異体（ＡＧＶ）抗体が置かれたものであり、それぞれ、左パネル及び右パネルで西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはユーロピウム（Ｅｕｒｏ）検出によるものである。ビオチン化抗体は、滴定した異なるＡｂ−Ａロットを有するストレプトアビジンプレートに結合した。右パネルでは、Ａｂ−Ａ（ヒト定常ドメインを含む）と結合するが、Ａｂ１（ウサギ定常ドメインを含む）と結合しないユーロピウム標識抗体で検出した。検出のためのユーロピウムの使用は、ＨＲＰより大きいシグナルをもたらした。
【図１６】ＤＣ−ＳＩＧＮのＡｂ−Ａロット２被覆バイオセンサー（灰色）への結合がＡｂ１の存在によって妨げられる（黒色）ことを示す。結果として、Ａｂ１が結合するエピトープが、ＤＣ−ＳＩＧＮ用の結合部位と少なくとも重複することを実証する。
【図１７Ａ】図１７Ａ〜Ｂは、精製画分中の糖タンパク質レベルを定量化するためのハイスループットアッセイ（ＨＴＲＦ）におけるＡＧＶ抗体Ａｂ１の使用を示す。Ａｂ−Ｂ（図１７Ａ）及びＡｂ−Ｄ（図１７Ｂ）をカラム精製にかけ、（横軸に番号を付した）選択した画分をＡＧＶ抗体を用いてアッセイして糖タンパク質の相対量を決定した。抗体の量は、対照の百分率（ＰＯＣ）、詳細には、Ａｂ−Ａの糖タンパク質富化調製物（Ａｂ−Ａロット２）に対する糖タンパク質の量として表す。参考のため、Ａｂ−Ａロット１（相対的に低い量の糖タンパク質を含有する）に含まれる糖タンパク質の量を横線で示してあり、これは対照の約２５％のレベルであった。この測定に基づいて画分を選択またはプールして、所望通りに糖タンパク質富化または糖タンパク質枯渇調製物を得ることができる。
【図１７Ｂ】図１７Ａ〜Ｂは、精製画分中の糖タンパク質レベルを定量化するためのハイスループットアッセイ（ＨＴＲＦ）におけるＡＧＶ抗体Ａｂ１の使用を示す。Ａｂ−Ｂ（図１７Ａ）及びＡｂ−Ｄ（図１７Ｂ）をカラム精製にかけ、（横軸に番号を付した）選択した画分をＡＧＶ抗体を用いてアッセイして糖タンパク質の相対量を決定した。抗体の量は、対照の百分率（ＰＯＣ）、詳細には、Ａｂ−Ａの糖タンパク質富化調製物（Ａｂ−Ａロット２）に対する糖タンパク質の量として表す。参考のため、Ａｂ−Ａロット１（相対的に低い量の糖タンパク質を含有する）に含まれる糖タンパク質の量を横線で示してあり、これは対照の約２５％のレベルであった。この測定に基づいて画分を選択またはプールして、所望通りに糖タンパク質富化または糖タンパク質枯渇調製物を得ることができる。
【図１８Ａ】ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）カラムから溶出されたＡｂ−Ａの画分に含まれる糖タンパク質の定量化を示す。Ａｂ１及びＧＮＡを用いて各画分に含まれる糖タンパク質の相対量（対照の百分率、ＰＯＣとして表される）を評価した。各画分に含まれるタンパク質質量も相対単位（質量ＲＵ）で示す。Ａｂ１及びＧＮＡを用いる検出で同様パターンの反応性が見られた。
【図１８Ｂ】低範囲においてより詳細に示すために縦軸を拡大して０〜２３のＰＯＣ値に切り詰めた図１８Ａの拡大バージョンである。
【図１９Ａ】図１９Ａ〜Ｄは、図１８Ａ〜Ｂに示す精製からプールした画分の糖タンパク質分析の結果を示す。図１９Ａは、図１５（Ａｂ１はプレート上に置かれ、０．３μｇ／ｍＬのＡｂ−Ａ試料は溶液中）と同様のユーロピウムに基づく抗体ダウンＥＬＳＡアッセイでＡＧＶ抗体Ａｂ１を用いる異なる調製物中の糖タンパク質のＥＬＩＳＡ検出を示す。図１９Ｂは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて検出した糖タンパク質の検出レベルを対照試料の百分率（ＰＯＣ）としてグラフに示す。図１９Ｃ〜Ｄは、それぞれＧＮＡまたはＤＣ−ＳＩＧＮを用いて決定した同試料中の糖タンパク質の検出レベルを示す。表示「ｆｘｎ１２−２１」及び「ｆｘｎ４−２３」は、それぞれ図１８Ａ〜１８Ｂに示す精製からの１２〜２１または４〜２３の番号を付した画分のプーリングを示す。これらの試料に対してＡＧＶ抗体、ＧＮＡ、及びＤＣ−ＳＩＧＮアッセイで非常に類似したプロファイルが見られた。
【図１９Ｂ】図１９Ａ〜Ｄは、図１８Ａ〜Ｂに示す精製からプールした画分の糖タンパク質分析の結果を示す。図１９Ａは、図１５（Ａｂ１はプレート上に置かれ、０．３μｇ／ｍＬのＡｂ−Ａ試料は溶液中）と同様のユーロピウムに基づく抗体ダウンＥＬＳＡアッセイでＡＧＶ抗体Ａｂ１を用いる異なる調製物中の糖タンパク質のＥＬＩＳＡ検出を示す。図１９Ｂは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて検出した糖タンパク質の検出レベルを対照試料の百分率（ＰＯＣ）としてグラフに示す。図１９Ｃ〜Ｄは、それぞれＧＮＡまたはＤＣ−ＳＩＧＮを用いて決定した同試料中の糖タンパク質の検出レベルを示す。表示「ｆｘｎ１２−２１」及び「ｆｘｎ４−２３」は、それぞれ図１８Ａ〜１８Ｂに示す精製からの１２〜２１または４〜２３の番号を付した画分のプーリングを示す。これらの試料に対してＡＧＶ抗体、ＧＮＡ、及びＤＣ−ＳＩＧＮアッセイで非常に類似したプロファイルが見られた。
【図１９Ｃ】図１９Ａ〜Ｄは、図１８Ａ〜Ｂに示す精製からプールした画分の糖タンパク質分析の結果を示す。図１９Ａは、図１５（Ａｂ１はプレート上に置かれ、０．３μｇ／ｍＬのＡｂ−Ａ試料は溶液中）と同様のユーロピウムに基づく抗体ダウンＥＬＳＡアッセイでＡＧＶ抗体Ａｂ１を用いる異なる調製物中の糖タンパク質のＥＬＩＳＡ検出を示す。図１９Ｂは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて検出した糖タンパク質の検出レベルを対照試料の百分率（ＰＯＣ）としてグラフに示す。図１９Ｃ〜Ｄは、それぞれＧＮＡまたはＤＣ−ＳＩＧＮを用いて決定した同試料中の糖タンパク質の検出レベルを示す。表示「ｆｘｎ１２−２１」及び「ｆｘｎ４−２３」は、それぞれ図１８Ａ〜１８Ｂに示す精製からの１２〜２１または４〜２３の番号を付した画分のプーリングを示す。これらの試料に対してＡＧＶ抗体、ＧＮＡ、及びＤＣ−ＳＩＧＮアッセイで非常に類似したプロファイルが見られた。
【図１９Ｄ】図１９Ａ〜Ｄは、図１８Ａ〜Ｂに示す精製からプールした画分の糖タンパク質分析の結果を示す。図１９Ａは、図１５（Ａｂ１はプレート上に置かれ、０．３μｇ／ｍＬのＡｂ−Ａ試料は溶液中）と同様のユーロピウムに基づく抗体ダウンＥＬＳＡアッセイでＡＧＶ抗体Ａｂ１を用いる異なる調製物中の糖タンパク質のＥＬＩＳＡ検出を示す。図１９Ｂは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて検出した糖タンパク質の検出レベルを対照試料の百分率（ＰＯＣ）としてグラフに示す。図１９Ｃ〜Ｄは、それぞれＧＮＡまたはＤＣ−ＳＩＧＮを用いて決定した同試料中の糖タンパク質の検出レベルを示す。表示「ｆｘｎ１２−２１」及び「ｆｘｎ４−２３」は、それぞれ図１８Ａ〜１８Ｂに示す精製からの１２〜２１または４〜２３の番号を付した画分のプーリングを示す。これらの試料に対してＡＧＶ抗体、ＧＮＡ、及びＤＣ−ＳＩＧＮアッセイで非常に類似したプロファイルが見られた。
【図２０】ＥＬＩＳＡ検出（左パネル）またはＧＮＡアッセイ（右パネル）を用いた抗体調製物の糖タンパク質分析の結果を示し、それぞれ対照試料の百分率（ＰＯＣ）として表す。結果は、６つの試験ロットにわたって定性的に類似しており、相対ピーク高さはそれぞれについて類似パターンを形成した。
【図２１】ＡＧＶ、ＧＮＡ、及びＤＣ−ＳＩＧＮからのシグナルに関するＯ糖型組成分析の結果を示す。結果は、ＡＧＶ  ｍＡｂ（Ａｂ１）、ＧＮＡ、及びＤＣ−ＳＩＧＮ結合アッセイから得られたシグナルが互いに相関し、Ａｂ１上のマンノースの量と相関することを示す。表は、ＧＮＡ、Ａｂ１及びＤＣ−ＳＩＧＮシグナルと比較した糖アルコールの相対単位を示す。
【図２２】実施例１０の実験で用いた捕捉試薬の配置の概略図を示す。
【図２３Ａ】細胞に捕捉試薬を連結するために用いたＧＮＡに結合した細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。ＧＮＡの使用は、捕捉蛍光を非標識細胞に移動させた。
【図２３Ｂ】細胞に捕捉試薬を連結するために用いた抗糖タンパク質抗体Ａｂ１に結合した細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。Ａｂ１の結合は、より安定的であり、蛍光シグナルを保持させた。
【図２４Ａ】持続時間を変えるために培養した細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。対照非産生性「ヌル株（ｎｕｌｌ  ｓｔｒａｉｎ）」は、０、０．５、または２時間の時点にわたって如何なるシグナルの増加をも示さなかった。
【図２４Ｂ】持続時間を変えるために培養した細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。０、０．５、または２時間後に処理した抗体発現細胞の試料ではインキュベーション時間の増加に伴って一貫して増加するシグナルが実証された。
【図２５Ａ】共培養した抗体産生性株及び抗体非産生性「ヌル」株のフローサイトメトリープロファイルを示す。従来の培地を用いて、標識抗体分泌性「産生株」とマトリックス標識非産生性ヌル株の交差結合を観察した。
【図２５Ｂ】共培養した抗体産生性株及び抗体非産生性「ヌル」株フローサイトメトリープロファイルを示す。１０％のＰＥＧ８０００の補充は、生産性に悪影響を与えることなく交差結合を制限することが分かった。
【図２５Ｃ】共培養した抗体産生性株及び抗体非産生性「ヌル」株フローサイトメトリープロファイルを示す。１０％のＰＥＧ８０００の補充は、生産性に悪影響を与えることなく交差連結を制限することが分かった。
【図２６】図２６Ａ−Ｂは、個々に培養した（図２６Ａ）または共培養した（図２６Ｂ）高産生性株及び低産生性株のフローサイトメトリープロファイルを示す。培養の０または２時間後に細胞を処理することによって個々の株による抗体産生を特徴づけ（図２６Ａ）、このアッセイが、培養時間にわたって増加する高産生性株と低産生性株との間の蛍光シグナルの差を検出したことを確証した。高産生性株と低産生性株の混合培地を表面捕捉マトリックスで標識し、１０％ＰＥＧ８０００補充培地内で抗体を分泌させ、洗浄し、検出抗体で染色し、フローサイトメトリーを用いて、最も高い蛍光シグナルを有する細胞のトップ０．２５％を集団から単離した（図２６Ｂ）。
【図２７】個々に０時間及び２時間培養した高産生性株及び低産生性株のフローサイトメトリープロファイルを示し、これらの株間及び細胞培養の持続時間にわたる抗体産生レベルの予想された差の検出を実証する。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
詳細な説明
本開示は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓから産生された糖タンパク質に特異的に結合するが、哺乳類細胞から産生された同糖タンパク質には結合しない糖タンパク質結合抗体を提供し、該抗体は、マンノシル化タンパク質に特異的に結合することを示している。
【００５９】
さらに、本開示は、宿主細胞または微生物により発現されるポリペプチド（例えば、組換えポリペプチド）の産生及び精製プロセスを提供する。特に、本開示は、酵母または糸状真菌細胞内で発現されるポリペプチド、例えばホモポリマーまたはヘテロポリマーポリペプチド（例えば、抗体）の産生及び精製プロセスを提供する。本方法は、産生及び／または精製プロセスを改変して所望タンパク質の収率を最大にし、グリコシル化不純物の存在を減らせるように、グリコシル化不純物の定量的指標として抗体結合を組み込む。
【００６０】
さらに、本プロセスは、望ましくない産物関連不純物、例えばグリコシル化不純物（例えば、糖変異体）、核酸及び凝集体／脱凝集体から所望ポリペプチドを実質的に精製するために発酵プロセスからの試料のクロマトグラフ分離を含む精製プロセスを包含する。一部の実施形態では、異なるクロマトグラフィーステップからの溶出液または画分を抗糖タンパク質（例えば、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、またはＡｂ５）結合活性についてモニターして、グリコシル化不純物のタイプ及び／または量を検出する。検出したグリコシル化不純物の量及び／またはタイプに基づいて、発酵プロセスからのある特定の試料及び／またはクロマトグラフ精製からの画分を廃棄し、処理し、及び／またはさらなる精製用に選択的にプールする。
【００６１】
例示実施形態では、所望タンパク質は、抗体または抗体結合フラグメントであり、酵母細胞は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓであり、グリコシル化不純物は、所望ポリペプチドの糖変異体、例えばＮ結合型及び／またはＯ結合型糖変異体であり、抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、またはＡｂ５を用いてグリコシル化不純物を検出する。
【００６２】
好ましい実施形態では、所望タンパク質は、２つの重鎖サブユニットと２つの軽鎖サブユニットで構成された抗体または抗体フラグメント、例えばヒト化またはヒト抗体である。好ましい真菌細胞には酵母が含まれ、特に好ましい酵母としては、メチロトローフ酵母株、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｒｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｉｎｏｓｉｔｏｖｅｒａ等が挙げられる（例えば、それぞれ参照によってその全体を援用する米国特許第４，８１２，４０５号、第４，８１８，７００号、第４，９２９，５５５号、第５，７３６，３８３号、第５，９５５，３４９号、第５，８８８，７６８号、及び第６，２５８，５５９号を参照されたい）。酵母細胞は、当該技術分野で既知の方法で産生可能である。例えば、種々のコピー数の個々のサブユニット遺伝子を含有する細胞を交配（交配に先だってコピー数が分かるのが好ましい）させることによって遺伝子コピー数の異なる組合せを含む二倍体または四倍体酵母細胞のパネルが産生され得る。
【００６３】
出願人らは、酵母または糸状真菌細胞内で産生されるタンパク質の産生及び精製に有用な抗体を発見した。特に、本明細書で開示するプロセスは、タンパク質産生及び／または精製スキームに純度モニタリングステップを組み込んで、例えば、組換えポリペプチドの量に対する検出されたグリコシル化不純物の量及び／またはタイプに基づいて、産生及び／または精製スキームからある特定の画分を選択的に廃棄、処理及び／または精製することによって、興味ある主タンパク質産物からの産物関連不純物、例えば、グリコシル化不純物の除去を改善する。実施例は、該産生及び精製モニタリング方法の利用が、高収率の所望タンパク質産物を維持しながら、高レベルの産物精製をもたらすことを実証する。
【００６４】
一実施形態では、本方法は、所望ポリペプチドを産生させるための発酵プロセス及び発酵培地から所望ポリペプチドを精製することを含む。一般的に、所望ポリペプチドならびに１種以上の不純物の発酵培地への発現及び分泌をもたらす条件下で酵母細胞または微生物を培養し、例えば、発酵実行中または実行後に、試料を収集し、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、もしくはＡｂ５等の抗糖タンパク質抗体を用いて、試料（複数可）中のグリコシル化不純物の量及び／またはタイプをモニターし、その結果、検出されたグリコシル化不純物に基づいて、発酵プロセスのパラメーター、例えば、温度、ｐＨ、ガス構成要素（例えば、酸素レベル、圧力、流速）、供給構成要素（例えば、グルコースレベルまたは速度）、撹拌、エアレーション、消泡剤（例えば、タイプまたは濃度）及び持続時間を修正することができる。
【００６５】
別の実施形態では、本方法は、所望ポリペプチド及び１種以上の不純物の発酵培地への発現及び分泌をもたらす条件下で所望の細胞または微生物を培養することを含む発酵プロセスに起因する１つ以上の試料から所望ポリペプチドを、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、またはＡｂ５等の抗糖タンパク質抗体を用いて、試料（複数可）中のグリコシル化不純物の量及び／またはタイプを検出することによって精製するプロセスを含む。発明者らは、抗糖タンパク質抗体結合アッセイがグリコシル化不純物の定量的または半定量的尺度を与え、その結果、不純物の検出レベル及びタイプに応じて精製プロセスを調整できると判断した。
【００６６】
特定の実施形態では、精製プロセスは、宿主酵母または糸状真菌細胞内で発現した、発酵プロセス（例えば所望タンパク質、例えば抗体を含有する発酵培地）からの１つ以上の試料及び不純物を少なくとも１つのクロマトグラフィー担体と接触させてから所望ポリペプチドを選択的に溶出することをさらに含む。例えば、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、またはＡｂ５等の抗糖タンパク質抗体への結合を検出し、検出したグリコシル化不純物のタイプ及び／または量に応じて、アフィニティークロマトグラフィー担体（例えば、タンパク質Ａまたはレクチン）、混合モードクロマトグラフィー担体（例えば、セラミックヒドロキシアパタイト）及び疎水性相互作用クロマトグラフィー担体（例えば、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）６００Ｍ）と接触させるアッセイを用いて、グリコシル化不純物について試料を試験することができる。各クロマトグラフィー担体から、所望タンパク質を分離、例えば、選択的に溶出した後に次のクロマトグラフィー担体と接触させると、疎水性相互作用クロマトグラフィー担体からの溶出液または画分は、実質的に精製された所望タンパク質を含むことになる。
【００６７】
本方法は、場合により、発酵プロセスの試料ならびに／またはアフィニティークロマトグラフィー担体、混合モードクロマトグラフィー担体及び疎水性相互作用クロマトグラフィー担体の少なくとも１つからの溶出液もしくはその画分を、少なくとも１種の産物関連不純物、例えば真菌細胞タンパク質、真菌細胞核酸、外来性ウイルス、内在性ウイルス、内毒素、凝集体、脱凝集体、または所望タンパク質に対して少なくとも１つの修飾（例えば、アミノ酸置換、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ミスマッチＳ−Ｓ結合、折り畳み、トランケーション、凝集、多量体解離、変性、アセチル化、脂肪アシル化、脱アミド、酸化、カルバミル化、カルボキシル化、ホルミル化、ガンマ−カルボキシグルタミン酸化、グリコシル化、メチル化、リン酸化、硫酸化、ＰＥＧ化及びユビキチン化）を含む望ましくないタンパク質等の存在についてモニタリングすることをさらに含む。特に、産生及び精製プロセスは、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて試料または画分中の凝集及び／または脱凝集不純物の量を検出することを含み得る。
【００６８】
所望タンパク質またはマルチサブユニット複合体に関して「実質的に精製された」は、試料が少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９８．５％の所望タンパク質を含み、不純物、すなわち、凝集体、変異体及び低分子量産物が３％未満、２．５％未満、２％未満、１．５％未満または１％未満であることを意味する。一実施形態では、実質的に精製されたタンパク質は、１０ｎｇ／ｍｇ未満、好ましくは５ｎｇ／ｍｇ未満、またはさらに好ましくは２ｎｇ／ｍｇ未満の真菌細胞のタンパク質；及び／または１０ｎｇ／ｍｇ未満、または好ましくは５ｎｇ／ｍｇ未満の核酸を含む。
【００６９】
本開示の多くは、抗体の産生について記載するが、本明細書に記載の方法は、他のマルチサブユニット複合体ならびに単一サブユニットタンパク質に容易に適合できる。本明細書で開示する方法は、組換えにより発現させてもそうでなくてもよいいずれの単一サブユニットもしくはマルチサブユニット複合体の収率及び／または純度をも改善するために容易に利用可能である。さらに、本方法は、タンパク質複合体の産生に限定されず、テロメラーゼ、ｈｎＲＮＰ、リボソーム、ｓｎＲＮＰ、シグナル認識粒子、原核生物及び真核生物のＲＮａｓｅ  Ｐ複合体、ならびに複数タンパク質及び／またはＲＮＡサブユニットを含有するいずれの他の複合体をも含めた、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体と共に使用するために容易に適合させることもできる。さらに、マルチサブユニット複合体を発現する細胞は、当該技術分野で既知の方法で産生可能である。例えば、種々のコピー数の個々のサブユニット遺伝子を含有する細胞を交配（交配に先だってコピー数が分かるのが好ましい）させることによって遺伝子コピー数の異なる組合せを含む二倍体または四倍体酵母細胞のパネルが産生され得る。
【００７０】
抗体ポリペプチド配列
抗体Ａｂ１
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記配列を含むかまたは下記配列から成る重鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＱＥＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＡＳＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＳＦＳＮＴＮＹＭＣＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＧＣＭＰＶＧＦＩＡＳＴＦＹＡＴＷＡＫＧＲＳＡＩＳＫＳＳＳＴＡＶＴＬＱＭＴＳＬＴＶＡＤＴＡＴＹＦＣＡＲＥＳＧＳＧＷＡＬＮＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴＣＰＰＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＤＤＰＥＶＱＦＴＷＹＩＮＮＥＱＶＲＴＡＲＰＰＬＲＥＱＱＦＮＳＴＩＲＶＶＳＴＬＰＩＡＨＱＤＷＬＲＧＫＥＦＫＣＫＶＨＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＲＧＱＰＬＥＰＫＶＹＴＭＧＰＰＲＥＥＬＳＳＲＳＶＳＬＴＣＭＩＮＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＫＮＧＫＡＥＤＮＹＫＴＴＰＡＶＬＤＳＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＰＴＳＥＷＱＲＧＤＶＦＴＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＩＳＲＳＰＧＫ（配列番号１）。
【００７１】
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記配列を含むかまたは下記配列から成る可変重鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＱＥＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＡＳＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＳＦＳＮＴＮＹＭＣＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＧＣＭＰＶＧＦＩＡＳＴＦＹＡＴＷＡＫＧＲＳＡＩＳＫＳＳＳＴＡＶＴＬＱＭＴＳＬＴＶＡＤＴＡＴＹＦＣＡＲＥＳＧＳＧＷＡＬＮＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２）。
【００７２】
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつＡｂ１と同じエピトープ特異性を有し、下記配列を含むかまたは下記配列から成る定常重鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴＣＰＰＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＤＤＰＥＶＱＦＴＷＹＩＮＮＥＱＶＲＴＡＲＰＰＬＲＥＱＱＦＮＳＴＩＲＶＶＳＴＬＰＩＡＨＱＤＷＬＲＧＫＥＦＫＣＫＶＨＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＲＧＱＰＬＥＰＫＶＹＴＭＧＰＰＲＥＥＬＳＳＲＳＶＳＬＴＣＭＩＮＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＫＮＧＫＡＥＤＮＹＫＴＴＰＡＶＬＤＳＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＰＴＳＥＷＱＲＧＤＶＦＴＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＩＳＲＳＰＧＫ（配列番号１０）。
【００７３】
別の実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記配列を含むかまたは下記配列から成る軽鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＤＰＶＬＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＳＣＱＡＳＥＳＶＥＳＧＮＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＹＴＳＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＡＨＦＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＱＧＡＦＹＧＶＮＴＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＲＴＰＶＡＰＴＶＬＬＦＰＰＳＳＤＥＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＳＲＫＮＣ（配列番号２１）。
【００７４】
別の実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記可変軽鎖配列を含むかまたは下記可変軽鎖配列から成る軽鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＤＰＶＬＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＳＣＱＡＳＥＳＶＥＳＧＮＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＹＴＳＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＡＨＦＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＱＧＡＦＹＧＶＮＴＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫ（配列番号２２）。
【００７５】
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつＡｂ１と同じエピトープ特異性を有し、下記配列を含むかまたは下記配列から成る定常軽鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＲＴＰＶＡＰＴＶＬＬＦＰＰＳＳＤＥＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＳＲＫＮＣ（配列番号３０）。
【００７６】
別の実施形態では、本発明は、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合し、かつ配列番号１の重鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号４；配列番号６；及び配列番号８のポリペプチド配列の１、２、もしくは３つを含み、または配列番号２の可変重鎖配列を含み、ならびに／あるいは配列番号２１の軽鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号２４；配列番号２６；及び配列番号２８のポリペプチド配列の１、２、または３つをさらに含み、または配列番号２２の可変軽鎖配列を含む抗体または抗体フラグメント、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である配列の組合せを含有する抗体または抗体フラグメントを包含する。本発明の別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、上述した例示可変重鎖及び可変軽鎖配列、もしくは重鎖及び軽鎖配列、またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列の１つ以上の組合せを含むか、あるいは該組合せから成る。
【００７７】
本発明は、配列番号１の重鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号３；配列番号５；配列番号７；及び配列番号９のポリペプチド配列の１、２、３、もしくは４つ、または配列番号２の可変重鎖配列、ならびに／または配列番号２１の軽鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号２３；配列番号２５；配列番号２７；及び配列番号２９のポリペプチド配列の１、２、３、もしくは４つ、または配列番号２２の可変軽鎖配列、またはこれらのポリペプチド配列またはそれらと少なくとも８０％、９０％もしくは９５％同一である配列の組合せを含む抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントをさらに企図する。
【００７８】
本発明の別の実施形態では、本発明の抗体または抗体フラグメントは、上記ＦＲ、ＣＤＲ、可変重鎖及び可変軽鎖配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列の、それらの全てまたはそれらと少なくとも９０％または９５％同一である配列を含めた１つ以上の組合せを含むか、あるいはこれらから成る。
【００７９】
本発明の別の実施形態では、本発明の抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントは、配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチド配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一であるポリペプチドを含むか、あるいはそれらから成る。本発明の別の実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、配列番号２１もしくは配列番号２２のポリペプチド配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一であるポリペプチドを含むか、あるいはそれらから成る。
【００８０】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体または抗体フラグメントは、配列番号１の重鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号４；配列番号６；及び配列番号８のポリペプチド配列の１、２、もしくは３つまたは配列番号２の可変重鎖配列、またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらから成る。
【００８１】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体または抗体フラグメントは、配列番号２１の軽鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号２４；配列番号２６；及び配列番号２８のポリペプチド配列の１、２、もしくは３つまたは配列番号２２の可変軽鎖配列またそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらから成る。
【００８２】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体または抗体フラグメントは、配列番号１の重鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号３；配列番号５；配列番号７；及び配列番号９のポリペプチド配列の１、２、３、もしくは４つまたは配列番号２の可変重鎖配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらから成る。
【００８３】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する対象抗体または抗体フラグメントは、配列番号２１の軽鎖配列の可変軽鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号２３；配列番号２５；配列番号２７；及び配列番号２９のポリペプチド配列の１、２、３、もしくは４つまたは配列番号２２の可変軽鎖配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらから成る。
【００８４】
本発明は、本明細書に記載の１つ以上の抗体フラグメントを含む抗体またはそのフラグメントをも企図する。本発明の一実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体のフラグメントは、下記抗体フラグメント：配列番号２の可変重鎖領域；配列番号２２の可変軽鎖領域；配列番号２の可変重鎖領域の相補性決定領域（配列番号４；配列番号６；及び配列番号８）；及び配列番号２２の可変軽鎖領域の相補性決定領域（配列番号２４；配列番号２６；及び配列番号２８）またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列の全てを含め、その１、２、３もしくはそれより多くの抗体フラグメントを含むか、あるいはそれらから成る。
【００８５】
本発明は、本明細書に記載の１つ以上の抗体フラグメントを含む抗体またはそのフラグメントをも企図する。本発明の一実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体のフラグメントは、下記抗体フラグメント：配列番号２の可変重鎖領域；配列番号２２の可変軽鎖領域；配列番号２の可変重鎖領域のフレームワーク領域（配列番号３；配列番号５；配列番号７；及び配列番号９）；及び配列番号２２の可変軽鎖領域のフレームワーク領域（配列番号２３；配列番号２５；配列番号２７；及び配列番号２９）の全てを含め、その１、２、３もしくはそれより多くの抗体フラグメントを含むか、あるいはそれらから成る。
【００８６】
本発明の特に好ましい実施形態では、抗糖タンパク質抗体は、配列番号１及び配列番号２１を含むか、もしくはそれらから成るＡｂ１であるか、またはＡｂ１のＣＤＲを含み、かつ本明細書に記載の少なくとも１つの生物活性を有する抗体もしくは抗体フラグメントであるか、または糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）との結合についてＡｂ１と競合する抗糖タンパク質抗体、好ましくはＡｂ１の配列もしくは糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）上のＡｂ１と同一もしくは重複するエピトープ（複数可）に結合する抗体の配列と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含有するものである。
【００８７】
本発明のさらに特に好ましい実施形態では、抗体フラグメントは、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）に対して結合特異性を有するＦａｂ（抗原結合性フラグメント）フラグメントを含むか、またはそれから成る。抗体Ａｂ１に関して、Ｆａｂフラグメントは、好ましくは、配列番号２の可変重鎖配列及び配列番号２２の可変軽鎖配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含む。本発明のこの実施形態は、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）に対する結合特異性を保持する配列番号２及び／または配列番号２２の付加、欠失、もしくは変異体を含有するＦａｂをさらに包含する。
【００８８】
本明細書に記載（以下に）の発明の一実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、Ａｂ１の酵素消化（例えば、パパイン）によって産生され得る。本発明の別の実施形態では、Ａｂ１等の抗糖タンパク質抗体またはそのＦａｂフラグメントは、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳＯもしくはヒト腎細胞、真菌、昆虫、または微生物系、例えば酵母細胞（例えば一倍体または二倍体酵母、例えば一倍体または二倍体ピキア）及び他の酵母株における発現によって産生され得る。適切なピキア種としては、限定するものではないが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【００８９】
さらなる実施形態では、本発明はさらに、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）に対して結合特異性を有し、Ａｂ１の重鎖及び／または軽鎖ならびに、上記フラグメント、変異体、１つ以上のＦＲ、ＣＤＲ、可変重鎖及び可変軽鎖配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列の組合せを、それら全てまたはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含めて包含する抗体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００９０】
抗体Ａｂ２
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記配列を含むかまたは下記配列から成る重鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＱＳＬＥＥＳＧＧＧＬＶＫＰＥＧＳＬＴＬＴＣＫＡＳＧＦＳＦＴＧＡＨＹＭＣＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＡＣＩＹＧＧＳＶＤＩＴＦＹＡＳＷＡＫＧＲＦＡＩＳＫＳＳＳＴＡＶＴＬＱＭＴＳＬＴＡＡＤＴＡＴＹＶＣＡＲＥＳＧＳＧＷＡＬＮＬＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴＣＰＰＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＤＤＰＥＶＱＦＴＷＹＩＮＮＥＱＶＲＴＡＲＰＰＬＲＥＱＱＦＮＳＴＩＲＶＶＳＴＬＰＩＡＨＱＤＷＬＲＧＫＥＦＫＣＫＶＨＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＲＧＱＰＬＥＰＫＶＹＴＭＧＰＰＲＥＥＬＳＳＲＳＶＳＬＴＣＭＩＮＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＫＮＧＫＡＥＤＮＹＫＴＴＰＡＶＬＤＳＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＰＴＳＥＷＱＲＧＤＶＦＴＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＩＳＲＳＰＧＫ（配列番号４１）。
【００９１】
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記可変重鎖配列を含むかまたは下記可変重鎖配列から成る重鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＱＳＬＥＥＳＧＧＧＬＶＫＰＥＧＳＬＴＬＴＣＫＡＳＧＦＳＦＴＧＡＨＹＭＣＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＡＣＩＹＧＧＳＶＤＩＴＦＹＡＳＷＡＫＧＲＦＡＩＳＫＳＳＳＴＡＶＴＬＱＭＴＳＬＴＡＡＤＴＡＴＹＶＣＡＲＥＳＧＳＧＷＡＬＮＬＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４２）。
【００９２】
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつＡｂ２と同じエピトープ特異性を有し、下記配列を含むかまたは下記配列から成る定常重鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴＣＰＰＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＤＤＰＥＶＱＦＴＷＹＩＮＮＥＱＶＲＴＡＲＰＰＬＲＥＱＱＦＮＳＴＩＲＶＶＳＴＬＰＩＡＨＱＤＷＬＲＧＫＥＦＫＣＫＶＨＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＲＧＱＰＬＥＰＫＶＹＴＭＧＰＰＲＥＥＬＳＳＲＳＶＳＬＴＣＭＩＮＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＫＮＧＫＡＥＤＮＹＫＴＴＰＡＶＬＤＳＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＰＴＳＥＷＱＲＧＤＶＦＴＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＩＳＲＳＰＧＫ（配列番号５０）。
【００９３】
別の実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記配列を含むかまたは下記配列から成る軽鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＱＶＬＴＱＴＡＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＳＣＱＳＳＱＳＶＥＮＧＮＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＬＡＳＴＬＥＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＱＧＡＹＳＧＩＮＶＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＲＴＰＶＡＰＴＶＬＬＦＰＰＳＳＤＥＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＳＲＫＮＣ（配列番号６１）。
【００９４】
別の実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記可変軽鎖配列を含むかまたは下記可変軽鎖配列から成る軽鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＱＶＬＴＱＴＡＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＳＣＱＳＳＱＳＶＥＮＧＮＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＬＡＳＴＬＥＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＱＧＡＹＳＧＩＮＶＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫ（配列番号６２）。
【００９５】
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつＡｂ２と同じエピトープ特異性を有し、下記配列を含むかまたは下記配列から成る定常軽鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＲＴＰＶＡＰＴＶＬＬＦＰＰＳＳＤＥＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＳＲＫＮＣ（配列番号７０）。
【００９６】
別の実施形態では、本発明は、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合し、かつ配列番号４１の重鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号４４；配列番号４６；及び配列番号４８のポリペプチド配列の１、２、もしくは３つを含み、または配列番号４２の可変重鎖配列を含み、ならびに／あるいは配列番号６１の軽鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号６４；配列番号６６；及び配列番号６８のポリペプチド配列の１、２、または３つをさらに含み、または配列番号６２の可変軽鎖配列を含む抗体または抗体フラグメント、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である配列の組合せを含有する抗体または抗体フラグメントを包含する。本発明の別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、上述した例示可変重鎖及び可変軽鎖配列、もしくは重鎖及び軽鎖配列、またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列の１つ以上の組合せを含むか、あるいは該組合せから成る。
【００９７】
本発明は、配列番号４１の重鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号４３；配列番号４５；配列番号４７；及び配列番号４９のポリペプチド配列の１、２、３、もしくは４つまたは配列番号４２の可変重鎖配列、ならびに／あるいは配列番号６１の軽鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号６３；配列番号６５；配列番号６７；及び配列番号６９のポリペプチド配列の１、２、３、もしくは４つまたは配列番号６２の可変軽鎖配列、あるいはこれらのポリペプチド配列またはそれらと少なくとも８０％、９０％もしくは９５％同一である配列の組合せを含む抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントをさらに企図する。
【００９８】
本発明の別の実施形態では、本発明の抗体または抗体フラグメントは、上記ＦＲ、ＣＤＲ、可変重鎖及び可変軽鎖配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列の１つ以上の組合せを、それらの全てまたはそれらと少なくとも９０％または９５％同一である配列を含めて含むか、あるいはこれらから成る。
【００９９】
本発明の別の実施形態では、本発明の抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントは、配列番号４１もしくは配列番号４２のポリペプチド配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一であるポリペプチドを含むか、あるいはそれらから成る。本発明の別の実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、配列番号６１もしくは配列番号６２のポリペプチド配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一であるポリペプチドを含むか、あるいはそれらから成る。
【０１００】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体または抗体フラグメントは、配列番号４１の重鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号４４；配列番号４６；及び配列番号４８のポリペプチド配列の１、２、もしくは３つまたは配列番号４２の可変重鎖配列、またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらから成る。
【０１０１】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体または抗体フラグメントは、配列番号６１の軽鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号６４；配列番号６６；及び配列番号６８のポリペプチド配列の１、２、もしくは３つまたは配列番号６２の可変軽鎖配列、またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらから成る。
【０１０２】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体または抗体フラグメントは、配列番号４１の重鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号４３；配列番号４５；配列番号４７；及び配列番号４９のポリペプチド配列の１、２、３、もしくは４つまたは配列番号４２の可変重鎖配列、またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらから成る。
【０１０３】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する対象抗体または抗体フラグメントは、配列番号６１の軽鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する、配列番号６３；配列番号６５；配列番号６７；及び配列番号６９のポリペプチド配列の１、２、３、もしくは４つまたは配列番号６２の可変軽鎖配列、またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらから成る。
【０１０４】
本発明は、本明細書に記載の１つ以上の抗体フラグメントを含む抗体またはそのフラグメントをも企図する。本発明の一実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体のフラグメントは、下記抗体フラグメント：配列番号４２の可変重鎖領域；配列番号６２の可変軽鎖領域；配列番号４２の可変重鎖領域の相補性決定領域（配列番号４４；配列番号４６；及び配列番号４８）；及び配列番号６２の可変軽鎖領域の相補性決定領域（配列番号６４；配列番号６６；及び配列番号６８）またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列の全てを含む抗体フラグメントの１、２、３もしくはそれより多くの抗体フラグメントを含むか、あるいはそれらから成る。
【０１０５】
本発明は、本明細書に記載の１つ以上の抗体フラグメントを含む抗体またはそのフラグメントをも企図する。本発明の一実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体のフラグメントは、下記抗体フラグメント：配列番号４２の可変重鎖領域；配列番号６２の可変軽鎖領域；配列番号４２の可変重鎖領域のフレームワーク領域（配列番号４３；配列番号４５；配列番号４７；及び配列番号４９）；及び配列番号６２の可変軽鎖領域のフレームワーク領域（配列番号６３；配列番号６５；配列番号６７；及び配列番号６９）の全てを含む抗体フラグメントの１、２、３もしくはそれより多くの抗体フラグメントを含むか、あるいはそれらから成る。
【０１０６】
本発明の特に好ましい実施形態では、抗糖タンパク質抗体は、配列番号４１及び配列番号６１を含むか、もしくはそれらから成るＡｂ２であるか、またはＡｂ２のＣＤＲを含み、かつ本明細書に記載の少なくとも１つの生物活性を有する抗体もしくは抗体フラグメントであるか、または糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）との結合についてＡｂ２と競合する抗糖タンパク質抗体、好ましくはＡｂ２の配列もしくは糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）上のＡｂ２と同一もしくは重複するエピトープ（複数可）に結合する抗体の配列と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含有するものである。
【０１０７】
本発明のさらに特に好ましい実施形態では、抗体フラグメントは、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）に対して結合特異性を有するＦａｂ（抗原結合性フラグメント）フラグメントを含むか、あるいはそれから成る。抗体Ａｂ２に関して、Ｆａｂフラグメントは、好ましくは、配列番号４２の可変重鎖配列及び配列番号６２の可変軽鎖配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含む。本発明のこの実施形態は、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）に対する結合特異性を保持する配列番号４２及び／または配列番号６２の付加、欠失、もしくは変異体を含有するＦａｂをさらに包含する。
【０１０８】
本明細書に記載（以下に）の発明の一実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、Ａｂ２の酵素消化（例えば、パパイン）によって産生され得る。本発明の別の実施形態では、Ａｂ２等の抗糖タンパク質抗体またはそのＦａｂフラグメントは、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳＯもしくはヒト腎細胞、真菌、昆虫、または微生物系、例えば酵母細胞（例えば一倍体または二倍体酵母、例えば一倍体または二倍体ピキア）及び他の酵母株における発現によって産生され得る。適切なピキア種としては、限定するものではないが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１０９】
さらなる実施形態では、本発明はさらに、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）に対して結合特異性を有し、Ａｂ２の重鎖及び／または軽鎖ならびに、上記フラグメント、変異体、１つ以上のＦＲ、ＣＤＲ、可変重鎖及び可変軽鎖配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列の組合せを、それら全てまたはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含めて包含する抗体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【０１１０】
抗体Ａｂ３
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記配列を含むかまたは下記配列から成る重鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＱＳＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＰＥＧＳＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＦＦＳＧＡＨＹＭＣＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＣＴＹＧＧＳＶＤＩＴＦＹＡＳＷＡＫＧＲＦＡＩＳＫＴＳＳＴＴＶＴＬＱＬＴＳＬＴＡＡＤＴＡＴＹＶＣＡＲＥＳＧＳＧＷＡＬＮＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴＣＰＰＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＤＤＰＥＶＱＦＴＷＹＩＮＮＥＱＶＲＴＡＲＰＰＬＲＥＱＱＦＮＳＴＩＲＶＶＳＴＬＰＩＡＨＱＤＷＬＲＧＫＥＦＫＣＫＶＨＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＲＧＱＰＬＥＰＫＶＹＴＭＧＰＰＲＥＥＬＳＳＲＳＶＳＬＴＣＭＩＮＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＫＮＧＫＡＥＤＮＹＫＴＴＰＡＶＬＤＳＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＰＴＳＥＷＱＲＧＤＶＦＴＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＩＳＲＳＰＧＫ（配列番号８１）。
【０１１１】
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記可変重鎖配列を含むかまたは下記可変重鎖配列から成る重鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＱＳＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＰＥＧＳＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＦＦＳＧＡＨＹＭＣＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＣＴＹＧＧＳＶＤＩＴＦＹＡＳＷＡＫＧＲＦＡＩＳＫＴＳＳＴＴＶＴＬＱＬＴＳＬＴＡＡＤＴＡＴＹＶＣＡＲＥＳＧＳＧＷＡＬＮＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８２）。
【０１１２】
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつＡｂ３と同じエピトープ特異性を有し、下記配列を含むかまたは下記配列から成る定常重鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴＣＰＰＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＤＤＰＥＶＱＦＴＷＹＩＮＮＥＱＶＲＴＡＲＰＰＬＲＥＱＱＦＮＳＴＩＲＶＶＳＴＬＰＩＡＨＱＤＷＬＲＧＫＥＦＫＣＫＶＨＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＲＧＱＰＬＥＰＫＶＹＴＭＧＰＰＲＥＥＬＳＳＲＳＶＳＬＴＣＭＩＮＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＫＮＧＫＡＥＤＮＹＫＴＴＰＡＶＬＤＳＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＰＴＳＥＷＱＲＧＤＶＦＴＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＩＳＲＳＰＧＫ（配列番号９０）。
【０１１３】
別の実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記配列を含むかまたは下記配列から成る軽鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＱＶＬＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＡＶＴＩＮＣＱＳＳＱＳＶＥＮＧＮＷＬＧＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＬＡＳＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＴＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＱＧＡＹＳＧＩＮＡＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＲＴＰＶＡＰＴＶＬＬＦＰＰＳＳＤＥＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＳＲＫＮＣ（配列番号１０１）。
【０１１４】
別の実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記可変軽鎖配列を含むかまたは下記可変軽鎖配列から成る軽鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＱＶＬＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＡＶＴＩＮＣＱＳＳＱＳＶＥＮＧＮＷＬＧＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＬＡＳＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＴＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＱＧＡＹＳＧＩＮＡＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫ（配列番号１０２）。
【０１１５】
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつＡｂ３と同じエピトープ特異性を有し、かつ下記配列を含むかまたは下記配列から成る定常軽鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＲＴＰＶＡＰＴＶＬＬＦＰＰＳＳＤＥＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＳＲＫＮＣ（配列番号１１０）。
【０１１６】
別の実施形態では、本発明は、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合し、かつ配列番号８１の重鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号８４；配列番号８６；及び配列番号８８のポリペプチド配列の１、２、もしくは３つを含み、または配列番号８２の可変重鎖配列を含み、ならびに／あるいは配列番号１０１の軽鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号１０４；配列番号１０６；及び配列番号１０８のポリペプチド配列の１、２、または３つをさらに含み、または配列番号１０２の可変軽鎖配列を含む抗体または抗体フラグメント、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である配列の組合せを含有する抗体または抗体フラグメントを包含する。本発明の別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、上述した例示可変重鎖及び可変軽鎖配列、もしくは重鎖及び軽鎖配列、またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列の１つ以上の組合せを含むか、あるいは該組合せから成る。
【０１１７】
本発明は、配列番号８１の重鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号８３；配列番号８５；配列番号８７；及び配列番号８９のポリペプチド配列の１、２、３、もしくは４つまたは配列番号８２の可変重鎖配列、ならびに／あるいは配列番号１０１の軽鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号１０３；配列番号１０５；配列番号１０７；及び配列番号１０９のポリペプチド配列の１、２、３、もしくは４つまたは配列番号１０２の可変軽鎖配列、あるいはこれらのポリペプチド配列またはそれらと少なくとも８０％、９０％もしくは９５％同一である配列の組合せを含む抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントをさらに企図する。
【０１１８】
本発明の別の実施形態では、本発明の抗体または抗体フラグメントは、上記ＦＲ、ＣＤＲ、可変重鎖及び可変軽鎖配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列の１つ以上の組合せを、それらの全てまたはそれらと少なくとも９０％または９５％同一である配列を含めて含むか、あるいはこれらから成る。
【０１１９】
本発明の別の実施形態では、本発明の抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントは、配列番号８１もしくは配列番号８２のポリペプチド配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一であるポリペプチドを含むか、あるいはそれらから成る。本発明の別の実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、配列番号１０１もしくは配列番号１０２のポリペプチド配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一であるポリペプチドを含むか、あるいはそれらから成る。
【０１２０】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体または抗体フラグメントは、配列番号８１の重鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号８４；配列番号８６；及び配列番号８８のポリペプチド配列の１、２、もしくは３つまたは配列番号８２の可変重鎖配列、またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらから成る。
【０１２１】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体または抗体フラグメントは、配列番号１０１の軽鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号１０４；配列番号１０６；及び配列番号１０８のポリペプチド配列の１、２、もしくは３つまたは配列番号１０２の可変軽鎖配列、またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらから成る。
【０１２２】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体または抗体フラグメントは、配列番号８１の重鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号８３；配列番号８５；配列番号８７；及び配列番号８９のポリペプチド配列の１、２、３、もしくは４つまたは配列番号８２の可変重鎖配列、またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらから成る。
【０１２３】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する対象抗体または抗体フラグメントは、配列番号１０１の軽鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号１０３；配列番号１０５；配列番号１０７；及び配列番号１０９のポリペプチド配列の１、２、３、もしくは４つまたは配列番号１０２の可変軽鎖配列、またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらから成る。
【０１２４】
本発明は、本明細書に記載の１つ以上の抗体フラグメントを含む抗体またはそのフラグメントをも企図する。本発明の一実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体のフラグメントは、下記抗体フラグメント：配列番号８２の可変重鎖領域；配列番号１０２の可変軽鎖領域；配列番号８２の可変重鎖領域の相補性決定領域（配列番号８４；配列番号８６；及び配列番号８８）；及び配列番号１０２の可変軽鎖領域の相補性決定領域（配列番号１０４；配列番号１０６；及び配列番号１０８）またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列の全てを含む抗体フラグメントの１、２、３もしくはそれより多くの抗体フラグメントを含むか、あるいはそれらから成る。
【０１２５】
本発明は、本明細書に記載の１つ以上の抗体フラグメントを含む抗体またはそのフラグメントをも企図する。本発明の一実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体のフラグメントは、下記抗体フラグメント：配列番号８２の可変重鎖領域；配列番号１０２の可変軽鎖領域；配列番号８２の可変重鎖領域のフレームワーク領域（配列番号８３；配列番号８５；配列番号８７；及び配列番号８９）；及び配列番号１０２の可変軽鎖領域のフレームワーク領域（配列番号１０３；配列番号１０５；配列番号１０７；及び配列番号１０９）の全てを含む抗体フラグメントの１、２、３もしくはそれより多くの抗体フラグメントを含むか、あるいはそれらから成る。
【０１２６】
本発明の特に好ましい実施形態では、抗糖タンパク質抗体は、配列番号８１及び配列番号１０１を含むか、もしくはそれらから成るＡｂ３であるか、またはＡｂ３のＣＤＲを含み、かつ本明細書に記載の少なくとも１つの生物活性を有する抗体もしくは抗体フラグメントであるか、または糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）との結合についてＡｂ３と競合する抗糖タンパク質抗体、好ましくはＡｂ３の配列もしくは糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）上のＡｂ３と同一もしくは重複するエピトープ（複数可）に結合する抗体の配列と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含有するものである。
【０１２７】
本発明のさらに特に好ましい実施形態では、抗体フラグメントは、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）に対して結合特異性を有するＦａｂ（抗原結合性フラグメント）フラグメントを含むか、あるいはそれらから成る。抗体Ａｂ３に関して、Ｆａｂフラグメントは、好ましくは、配列番号８２の可変重鎖配列及び配列番号１０２の可変軽鎖配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含む。本発明のこの実施形態は、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）に対する結合特異性を保持する配列番号８２及び／または配列番号１０２の付加、欠失、もしくは変異体を含有するＦａｂをさらに包含する。
【０１２８】
本明細書に記載（以下に）の発明の一実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、Ａｂ３の酵素消化（例えば、パパイン）によって産生され得る。本発明の別の実施形態では、Ａｂ３等の抗糖タンパク質抗体またはそのＦａｂフラグメントは、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳＯもしくはヒト腎細胞、真菌、昆虫、または微生物系、例えば酵母細胞（例えば一倍体または二倍体酵母、例えば一倍体または二倍体ピキア）及び他の酵母株における発現によって産生され得る。適切なピキア種としては、限定するものではないが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１２９】
さらなる実施形態では、本発明はさらに、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）に対して結合特異性を有し、Ａｂ３の重鎖及び／または軽鎖ならびに、上記フラグメント、変異体、１つ以上のＦＲ、ＣＤＲ、可変重鎖及び可変軽鎖配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列の組合せを、それら全てまたはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含めて包含する抗体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【０１３０】
抗体Ａｂ４
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記配列を含むかまたは下記配列から成る重鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＱＳＬＥＥＳＧＧＤＬＶＫＰＧＡＳＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＳＦＳＳＧＹＤＭＣＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＡＣＩＹＰＮＮＰＶＴＹＹＡＳＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＳＴＴＶＴＬＱＭＴＳＬＴＡＡＤＴＡＴＹＦＣＧＲＳＤＳＮＧＨＴＦＮＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴＣＰＰＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＤＤＰＥＶＱＦＴＷＹＩＮＮＥＱＶＲＴＡＲＰＰＬＲＥＱＱＦＮＳＴＩＲＶＶＳＴＬＰＩＡＨＱＤＷＬＲＧＫＥＦＫＣＫＶＨＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＲＧＱＰＬＥＰＫＶＹＴＭＧＰＰＲＥＥＬＳＳＲＳＶＳＬＴＣＭＩＮＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＫＮＧＫＡＥＤＮＹＫＴＴＰＡＶＬＤＳＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＰＴＳＥＷＱＲＧＤＶＦＴＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＩＳＲＳＰＧＫ（配列番号１２１）。
【０１３１】
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記可変重鎖配列を含むかまたは下記可変重鎖配列から成る重鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＱＳＬＥＥＳＧＧＤＬＶＫＰＧＡＳＬＴＬＴＣＴＡＳＧＦＳＦＳＳＧＹＤＭＣＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＡＣＩＹＰＮＮＰＶＴＹＹＡＳＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＳＴＴＶＴＬＱＭＴＳＬＴＡＡＤＴＡＴＹＦＣＧＲＳＤＳＮＧＨＴＦＮＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１２２）。
【０１３２】
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつＡｂ４と同じエピトープ特異性を有し、下記配列を含むかまたは下記配列から成る定常重鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴＣＰＰＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＤＤＰＥＶＱＦＴＷＹＩＮＮＥＱＶＲＴＡＲＰＰＬＲＥＱＱＦＮＳＴＩＲＶＶＳＴＬＰＩＡＨＱＤＷＬＲＧＫＥＦＫＣＫＶＨＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＲＧＱＰＬＥＰＫＶＹＴＭＧＰＰＲＥＥＬＳＳＲＳＶＳＬＴＣＭＩＮＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＫＮＧＫＡＥＤＮＹＫＴＴＰＡＶＬＤＳＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＰＴＳＥＷＱＲＧＤＶＦＴＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＩＳＲＳＰＧＫ（配列番号１３０）。
【０１３３】
別の実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記配列を含むかまたは下記配列から成る軽鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＤＰＶＭＴＱＴＰＳＳＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＮＣＱＳＳＱＳＶＮＱＮＤＬＳＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＲＬＩＹＹＡＳＴＬＡＳＧＶＳＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＤＭＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＱＧＳＦＲＶＳＧＷＹＷＡＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＲＴＰＶＡＰＴＶＬＬＦＰＰＳＳＤＥＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＳＲＫＮＣ（配列番号１４１）。
【０１３４】
別の実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記可変軽鎖配列を含むかまたは下記可変軽鎖配列から成る軽鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＤＰＶＭＴＱＴＰＳＳＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＮＣＱＳＳＱＳＶＮＱＮＤＬＳＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＲＬＩＹＹＡＳＴＬＡＳＧＶＳＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＤＭＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＱＧＳＦＲＶＳＧＷＹＷＡＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫ（配列番号１４２）。
【０１３５】
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつＡｂ４と同じエピトープ特異性を有し、下記配列を含むかまたは下記配列から成る定常軽鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＲＴＰＶＡＰＴＶＬＬＦＰＰＳＳＤＥＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＳＲＫＮＣ（配列番号１５０）。
【０１３６】
別の実施形態では、本発明は、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合し、かつ配列番号１２１の重鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号１２４；配列番号１２６；及び配列番号１２８のポリペプチド配列の１、２、もしくは３つを含み、または配列番号１２２の可変重鎖配列を含み、ならびに／または配列番号１４１の軽鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号１４４；配列番号１４６；及び配列番号１４８のポリペプチド配列の１、２、または３つをさらに含み、または配列番号１４２の可変軽鎖配列を含む抗体または抗体フラグメント、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である配列の組合せを含有する抗体または抗体フラグメントを包含する。本発明の別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、上述した例示可変重鎖及び可変軽鎖配列、もしくは重鎖及び軽鎖配列、またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列の１つ以上の組合せを含むか、あるいは該組合せから成る。
【０１３７】
本発明は、配列番号１２１の重鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号１２３；配列番号１２５；配列番号１２７；及び配列番号１２９のポリペプチド配列の１、２、３、もしくは４つまたは配列番号１２２の可変重鎖配列、ならびに／あるいは配列番号１４１の軽鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号１４３；配列番号１４５；配列番号１４７；及び配列番号１４９のポリペプチド配列の１、２、３、もしくは４つまたは配列番号１４２の可変軽鎖配列、あるいはこれらのポリペプチド配列またはそれらと少なくとも８０％、９０％もしくは９５％同一である配列の組合せを含む抗体または抗体フラグメントをさらに企図する。
【０１３８】
本発明の別の実施形態では、本発明の抗体または抗体フラグメントは、上記ＦＲ、ＣＤＲ、可変重鎖及び可変軽鎖配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列の１つ以上の組合せを、それらの全てまたはそれらと少なくとも９０％または９５％同一である配列を含めて含むか、あるいはこれらから成る。
【０１３９】
本発明の別の実施形態では、本発明の抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントは、配列番号１２１もしくは配列番号１２２のポリペプチド配列またはそれと少なくとも９０％もしくは９５％同一であるポリペプチドを含むか、あるいはそれらから成る。本発明の別の実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、配列番号１４１もしくは配列番号１４２のポリペプチド配列またはそれと少なくとも９０％もしくは９５％同一であるポリペプチドを含むか、あるいはそれらから成る。
【０１４０】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体または抗体フラグメントは、配列番号１２１の重鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号１２４；配列番号１２６；及び配列番号１２８のポリペプチド配列の１、２、もしくは３つまたは配列番号１２２の可変重鎖配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらから成る。
【０１４１】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体または抗体フラグメントは、配列番号１４１の軽鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号１４４；配列番号１４６；及び配列番号１４８のポリペプチド配列の１、２、もしくは３つまたは配列番号１４２の可変軽鎖配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらから成る。
【０１４２】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体または抗体フラグメントは、配列番号１２１の重鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号１２３；配列番号１２５；配列番号１２７；及び配列番号１２９のポリペプチド配列の１、２、３、もしくは４つまたは配列番号１２２の可変重鎖配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらから成る。
【０１４３】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する対象である抗体または抗体フラグメントは、配列番号１４１の軽鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号１４３；配列番号１４５；配列番号１４７；及び配列番号１４９のポリペプチド配列の１、２、３、もしくは４つまたは配列番号１４２の可変軽鎖配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらから成る。
【０１４４】
本発明は、本明細書に記載の１つ以上の抗体フラグメントを含む抗体またはそのフラグメントをも企図する。本発明の一実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体のフラグメントは、下記抗体フラグメント：配列番号１２２の可変重鎖領域；配列番号１４２の可変軽鎖領域；配列番号１２２の可変重鎖領域の相補性決定領域（配列番号１２４；配列番号１２６；及び配列番号１２８）；及び配列番号１４２の可変軽鎖領域の相補性決定領域（配列番号１４４；配列番号１４６；及び配列番号１４８）またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列の全てを含む抗体フラグメントの１、２、３もしくはそれより多くの抗体フラグメントを含むか、あるいはそれらから成る。
【０１４５】
本発明は、本明細書に記載の１つ以上の抗体フラグメントを含む抗体またはそのフラグメントをも企図する。本発明の一実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体のフラグメントは、下記抗体フラグメント：配列番号１２２の可変重鎖領域；配列番号１４２の可変軽鎖領域；配列番号１２２の可変重鎖領域のフレームワーク領域（配列番号１２３；配列番号１２５；配列番号１２７；及び配列番号１２９）；及び配列番号１４２の可変軽鎖領域のフレームワーク領域（配列番号１４３；配列番号１４５；配列番号１４７；及び配列番号１４９）の全てを含む抗体フラグメントの１、２、３もしくはそれより多くの抗体フラグメントを含むか、あるいはそれらから成る。
【０１４６】
本発明の特に好ましい実施形態では、抗糖タンパク質抗体は、配列番号１２１及び配列番号１４１を含むか、もしくはそれらから成るＡｂ４であるか、またはＡｂ４のＣＤＲを含み、かつ本明細書に記載の少なくとも１つの生物活性を有する抗体もしくは抗体フラグメントであるか、または糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）との結合についてＡｂ４と競合する抗糖タンパク質抗体、好ましくはＡｂ４の配列もしくは糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）上のＡｂ４と同一もしくは重複するエピトープ（複数可）に結合する抗体の配列と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含有するものである。
【０１４７】
本発明のさらに特に好ましい実施形態では、抗体フラグメントは、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）に対して結合特異性を有するＦａｂ（抗原結合性フラグメント）フラグメントを含むか、またはそれらから成る。抗体Ａｂ４に関して、Ｆａｂフラグメントは、好ましくは、配列番号１２２の可変重鎖配列及び配列番号１４２の可変軽鎖配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含む。本発明のこの実施形態は、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）に対する結合特異性を保持する配列番号１２２及び／または配列番号１４２の付加、欠失、もしくは変異体を含有するＦａｂをさらに包含する。
【０１４８】
本明細書に記載（以下に）の発明の一実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、Ａｂ４の酵素消化（例えば、パパイン）によって産生され得る。本発明の別の実施形態では、Ａｂ４等の抗糖タンパク質抗体またはそのＦａｂフラグメントは、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳＯもしくはヒト腎細胞、真菌、昆虫、または微生物系、例えば酵母細胞（例えば一倍体または二倍体酵母、例えば一倍体または二倍体ピキア）及び他の酵母株における発現によって産生され得る。適切なピキア種としては、限定するものではないが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１４９】
さらなる実施形態では、本発明はさらに、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）に対して結合特異性を有し、Ａｂ４の重鎖及び／または軽鎖ならびに、上記フラグメント、変異体、１つ以上のＦＲ、ＣＤＲ、可変重鎖及び可変軽鎖配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列の組合せを、それら全てまたはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含めて包含する抗体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【０１５０】
抗体Ａｂ５
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記配列を含むかまたは下記配列から成る重鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＱＱＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＥＧＳＬＡＬＴＣＴＡＳＧＦＳＦＳＳＧＹＤＭＣＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＶＧＣＩＹＳＧＤＤＮＤＩＴＹＹＡＳＷＡＲＧＲＦＴＩＳＮＰＳＳＴＴＶＴＬＱＭＴＳＬＴＶＡＤＴＡＴＹＦＣＡＲＧＨＡＩＹＤＮＹＤＳＶＨＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴＣＰＰＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＤＤＰＥＶＱＦＴＷＹＩＮＮＥＱＶＲＴＡＲＰＰＬＲＥＱＱＦＮＳＴＩＲＶＶＳＴＬＰＩＡＨＱＤＷＬＲＧＫＥＦＫＣＫＶＨＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＲＧＱＰＬＥＰＫＶＹＴＭＧＰＰＲＥＥＬＳＳＲＳＶＳＬＴＣＭＩＮＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＫＮＧＫＡＥＤＮＹＫＴＴＰＡＶＬＤＳＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＰＴＳＥＷＱＲＧＤＶＦＴＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＩＳＲＳＰＧＫ（配列番号１６１）。
【０１５１】
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記可変重鎖配列を含むかまたは下記可変重鎖配列から成る重鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＱＱＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＥＧＳＬＡＬＴＣＴＡＳＧＦＳＦＳＳＧＹＤＭＣＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＶＧＣＩＹＳＧＤＤＮＤＩＴＹＹＡＳＷＡＲＧＲＦＴＩＳＮＰＳＳＴＴＶＴＬＱＭＴＳＬＴＶＡＤＴＡＴＹＦＣＡＲＧＨＡＩＹＤＮＹＤＳＶＨＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６２）。
【０１５２】
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつＡｂ５と同じエピトープ特異性を有し、下記配列を含むかまたは下記配列から成る定常重鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴＣＰＰＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＤＤＰＥＶＱＦＴＷＹＩＮＮＥＱＶＲＴＡＲＰＰＬＲＥＱＱＦＮＳＴＩＲＶＶＳＴＬＰＩＡＨＱＤＷＬＲＧＫＥＦＫＣＫＶＨＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＲＧＱＰＬＥＰＫＶＹＴＭＧＰＰＲＥＥＬＳＳＲＳＶＳＬＴＣＭＩＮＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＫＮＧＫＡＥＤＮＹＫＴＴＰＡＶＬＤＳＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＰＴＳＥＷＱＲＧＤＶＦＴＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＩＳＲＳＰＧＫ（配列番号１７０）。
【０１５３】
別の実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記配列を含むかまたは下記配列から成る軽鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＩＶＭＴＱＴＰＳＳＲＳＶＰＶＧＧＴＶＴＩＮＣＱＡＳＥＩＶＮＲＮＮＲＬＡＷＦＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＭＹＬＡＳＴＰＡＳＧＶＰＳＲＦＲＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＤＶＶＣＤＤＡＡＴＹＹＣＴＡＹＫＳＳＮＴＤＧＩＡＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＲＴＰＶＡＰＴＶＬＬＦＰＰＳＳＤＥＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＳＲＫＮＣ（配列番号１８１）。
【０１５４】
別の実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記可変軽鎖配列を含むかまたは下記可変軽鎖配列から成る軽鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＩＶＭＴＱＴＰＳＳＲＳＶＰＶＧＧＴＶＴＩＮＣＱＡＳＥＩＶＮＲＮＮＲＬＡＷＦＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＭＹＬＡＳＴＰＡＳＧＶＰＳＲＦＲＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＤＶＶＣＤＤＡＡＴＹＹＣＴＡＹＫＳＳＮＴＤＧＩＡＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫ（配列番号１８２）。
【０１５５】
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつＡｂ５と同じエピトープ特異性を有し、下記配列を含むかまたは下記配列から成る定常軽鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する：
ＲＴＰＶＡＰＴＶＬＬＦＰＰＳＳＤＥＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＳＲＫＮＣ（配列番号１９０）。
【０１５６】
別の実施形態では、本発明は、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合し、かつ配列番号１６１の重鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号１６４；配列番号１６６；及び配列番号１６８のポリペプチド配列の１、２、もしくは３つを含むかまたは配列番号１６２の可変重鎖配列を含み、ならびに／あるいは配列番号１８１の軽鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号１８４；配列番号１８６；及び配列番号１８８のポリペプチド配列の１、２、または３つをさらに含むかまたは配列番号１８２の可変軽鎖配列を含む抗体または抗体フラグメント、あるいはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である配列の組合せを含有する抗体または抗体フラグメントを包含する。本発明の別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、上述した例示可変重鎖及び可変軽鎖配列、もしくは重鎖及び軽鎖配列、またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列の１つ以上の組合せを含むか、あるいは該組合せから成る。
【０１５７】
本発明は、配列番号１６１の重鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号１６３；配列番号１６５；配列番号１６７；及び配列番号１６９のポリペプチド配列の１、２、３、もしくは４つまたは配列番号１６２の可変重鎖配列、ならびに／あるいは配列番号１８１の軽鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号１８３；配列番号１８５；配列番号１８７；及び配列番号１８９のポリペプチド配列の１、２、３、もしくは４つまたは配列番号１８２の可変軽鎖配列、あるいはこれらのポリペプチド配列またはそれらと少なくとも８０％、９０％もしくは９５％同一である配列の組合せを含む抗体または抗体フラグメントをさらに企図する。
【０１５８】
本発明の別の実施形態では、本発明の抗体または抗体フラグメントは、上記ＦＲ、ＣＤＲ、可変重鎖及び可変軽鎖配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列の、それらの全てまたはそれらと少なくとも９０％または９５％同一である配列を含めた１つ以上の組合せを含むか、あるいはこれらから成る。
【０１５９】
本発明の別の実施形態では、本発明の抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントは、配列番号１６１もしくは配列番号１６２のポリペプチド配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一であるポリペプチドを含むか、あるいはそれらから成る。本発明の別の実施形態では、本発明の抗体フラグメントは、配列番号１８１もしくは配列番号１８２のポリペプチド配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一であるポリペプチドを含むか、あるいはそれらから成る。
【０１６０】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体または抗体フラグメントは、配列番号１６１の重鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号１６４；配列番号１６６；及び配列番号１６８のポリペプチド配列の１、２、もしくは３つまたは配列番号１６２の可変重鎖配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらから成る。
【０１６１】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体または抗体フラグメントは、配列番号１８１の軽鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号１８４；配列番号１８６；及び配列番号１８８のポリペプチド配列の１、２、もしくは３つまたは配列番号１８２の可変軽鎖配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらから成る。
【０１６２】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体または抗体フラグメントは、配列番号１６１の重鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号１６３；配列番号１６５；配列番号１６７；及び配列番号１６９のポリペプチド配列の１、２、３、もしくは４つまたは配列番号１６２の可変重鎖配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらから成る。
【０１６３】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する対象である抗体または抗体フラグメントは、配列番号１８１の軽鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号１８３；配列番号１８５；配列番号１８７；及び配列番号１８９のポリペプチド配列の１、２、３、もしくは４つまたは配列番号１８２の可変軽鎖配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらから成る。
【０１６４】
本発明は、本明細書に記載の１つ以上の抗体フラグメントを含む抗体またはそのフラグメントをも企図する。本発明の一実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体のフラグメントは、下記抗体フラグメント：配列番号１６２の可変重鎖領域；配列番号１８２の可変軽鎖領域；配列番号１６２の可変重鎖領域の相補性決定領域（配列番号１６４；配列番号１６６；及び配列番号１６８）；及び配列番号１８２の可変軽鎖領域の相補性決定領域（配列番号１８４；配列番号１８６；及び配列番号１８８）またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列の全てを含む抗体のフラグメントの１、２、３もしくはそれより多くの抗体フラグメントを含むか、あるいはそれらから成る。
【０１６５】
本発明は、本明細書に記載の１つ以上の抗体フラグメントを含む抗体またはそのフラグメントをも企図する。本発明の一実施形態では、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）と特異的に結合する抗体のフラグメントは、下記抗体フラグメント：配列番号１６２の可変重鎖領域；配列番号１８２の可変軽鎖領域；配列番号１６２の可変重鎖領域のフレームワーク領域（配列番号１６３；配列番号１６５；配列番号１６７；及び配列番号１６９）；及び配列番号１８２の可変軽鎖領域のフレームワーク領域（配列番号１８３；配列番号１８５；配列番号１８７；及び配列番号１８９）の全てを含む抗体のフラグメントの１、２、３もしくはそれより多くの抗体フラグメントを含むか、あるいはそれらから成る。
【０１６６】
本発明の特に好ましい実施形態では、抗糖タンパク質抗体は、配列番号１６１及び配列番号１８１を含むか、もしくはそれらから成るＡｂ５であるか、またはＡｂ５のＣＤＲを含み、かつ本明細書に記載の少なくとも１つの生物活性を有する抗体もしくは抗体フラグメントであるか、または糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）との結合についてＡｂ５と競合する抗糖タンパク質抗体、好ましくはＡｂ５の配列もしくは糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）上のＡｂ５と同一もしくは重複するエピトープ（複数可）に結合する抗体の配列と少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含有するものである。
【０１６７】
本発明のさらに特に好ましい実施形態では、抗体フラグメントは、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）に対して結合特異性を有するＦａｂ（抗原結合性フラグメント）フラグメントを含むか、またはそれらから成る。抗体Ａｂ５に関して、Ｆａｂフラグメントは、好ましくは、配列番号１６２の可変重鎖配列及び配列番号１８２の可変軽鎖配列またはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含む。本発明のこの実施形態は、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）に対する結合特異性を保持する配列番号１６２及び／または配列番号１８２の付加、欠失、もしくは変異体を含有するＦａｂをさらに包含する。
【０１６８】
本明細書に記載（以下に）の発明の一実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、Ａｂ５の酵素消化（例えば、パパイン）によって産生され得る。本発明の別の実施形態では、Ａｂ５等の抗糖タンパク質抗体またはそのＦａｂフラグメントは、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳＯもしくはヒト腎細胞、真菌、昆虫、または微生物系、例えば酵母細胞（例えば一倍体または二倍体酵母、例えば一倍体または二倍体ピキア）及び他の酵母株における発現によって産生され得る。適切なピキア種としては、限定するものではないが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１６９】
さらなる実施形態では、本発明はさらに、糖タンパク質（例えばマンノシル化タンパク質）に対して結合特異性を有し、Ａｂ５の重鎖及び／または軽鎖ならびに、上記フラグメント、変異体、１つ以上のＦＲ、ＣＤＲ、可変重鎖及び可変軽鎖配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列の組合せを、それら全てまたはそれらと少なくとも９０％もしくは９５％同一である配列を含めて包含する抗体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【０１７０】
抗体ポリヌクレオチド配列
抗体Ａｂ１
一実施形態では、本発明はさらに、糖タンパク質への結合特異性を有する抗体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明の一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の重鎖配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｃａｇｇａｇｃａｇｔｔｇｇｔｇｇａｇｔｃｃｇｇｇｇｇａｇｇｃｃｔｇｇｔｃｃａｇｃｃｔｇｇｇｇｃａｔｃｃｃｔｇａｃａｃｔｃａｃｃｔｇｃａｃａｇｃｔｔｃｔｇｇａｔｔｃｔｃｃｔｔｃａｇｔａａｃａｃｃａａｔｔａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇｇｔｃｃｇｃｃａｇｇｃｔｃｃａｇｇｇａｇｇｇｇｃｃｔｇｇａｇｔｇｇｇｔｃｇｇａｔｇｃａｔｇｃｃｃｇｔｔｇｇｔｔｔｔａｔｔｇｃｃａｇｃａｃｔｔｔｃｔａｃｇｃｇａｃｃｔｇｇｇｃｇａａａｇｇｃｃｇａｔｃｃｇｃｃａｔｃｔｃｃａａｇｔｃｃｔｃｇｔｃｇａｃｃｇｃｇｇｔｇａｃｔｃｔｇｃａａａｔｇａｃｃａｇｔｃｔｇａｃａｇｔｃｇｃｇｇａｃａｃｇｇｃｃａｃｃｔａｔｔｔｃｔｇｔｇｃｇａｇａｇａａａｇｃｇｇｔａｇｔｇｇｃｔｇｇｇｃｇｃｔｔａａｃｔｔｇｔｇｇｇｇｃｃａａｇｇｇａｃｃｃｔｇｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｇａｇｃｇｇｇｃａａｃｃｔａａｇｇｃｔｃｃａｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｃａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｔｇｃｔｇｃｇｇｇｇａｃａｃａｃｃｃｔｃｔａｇｃａｃｇｇｔｇａｃｃｔｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔａｃｃｔｃｃｃｇｇａｇｃｃａｇｔｇａｃｃｇｔｇａｃｃｔｇｇａａｃｔｃｇｇｇｃａｃｃｃｔｃａｃｃａａｔｇｇｇｇｔａｃｇｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｔｃｃｇｔｃｃｇｇｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇｃｃｔｃｔａｃｔｃｇｃｔｇａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｇｃｇｔｇａｃｃｔｃａａｇｃａｇｃｃａｇｃｃｃｇｔｃａｃｃｔｇｃａａｃｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｇｃｃａｃｃａａｃａｃｃａａａｇｔｇｇａｃａａｇａｃｃｇｔｔｇｃｇｃｃｃｔｃｇａｃａｔｇｃａｇｃａａｇｃｃｃａｃｇｔｇｃｃｃａｃｃｃｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃａｃｇｃａｃｃｃｃｃｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｇｇａｔｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇｔｔｃａｃａｔｇｇｔａｃａｔａａａｃａａｃｇａｇｃａｇｇｔｇｃｇｃａｃｃｇｃｃｃｇｇｃｃｇｃｃｇｃｔａｃｇｇｇａｇｃａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇａｔｃｃｇｃｇｔｇｇｔｃａｇｃａｃｃｃｔｃｃｃｃａｔｃｇｃｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａｇｇｇｇｃａａｇｇａｇｔｔｃａａｇｔｇｃａａａｇｔｃｃａｃａａｃａａｇｇｃａｃｔｃｃｃｇｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａｇａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｔｇｇａｇｃｃｇａａｇｇｔｃｔａｃａｃｃａｔｇｇｇｃｃｃｔｃｃｃｃｇｇｇａｇｇａｇｃｔｇａｇｃａｇｃａｇｇｔｃｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃａｔｇａｔｃａａｃｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｔｔｃｃｇａｃａｔｃｔｃｇｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａａｇａａｃｇｇｇａａｇｇｃａｇａｇｇａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｇｇｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔａｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃｔｃａｇｔｇｃｃｃａｃｇａｇｔｇａｇｔｇｇｃａｇｃｇｇｇｇｃｇａｃｇｔｃｔｔｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇｔｃｃａｔｃｔｃｃｃｇｃｔｃｔｃｃｇｇｇｔａａａ（配列番号１１）。
【０１７１】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２の可変重鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｃａｇｇａｇｃａｇｔｔｇｇｔｇｇａｇｔｃｃｇｇｇｇｇａｇｇｃｃｔｇｇｔｃｃａｇｃｃｔｇｇｇｇｃａｔｃｃｃｔｇａｃａｃｔｃａｃｃｔｇｃａｃａｇｃｔｔｃｔｇｇａｔｔｃｔｃｃｔｔｃａｇｔａａｃａｃｃａａｔｔａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇｇｔｃｃｇｃｃａｇｇｃｔｃｃａｇｇｇａｇｇｇｇｃｃｔｇｇａｇｔｇｇｇｔｃｇｇａｔｇｃａｔｇｃｃｃｇｔｔｇｇｔｔｔｔａｔｔｇｃｃａｇｃａｃｔｔｔｃｔａｃｇｃｇａｃｃｔｇｇｇｃｇａａａｇｇｃｃｇａｔｃｃｇｃｃａｔｃｔｃｃａａｇｔｃｃｔｃｇｔｃｇａｃｃｇｃｇｇｔｇａｃｔｃｔｇｃａａａｔｇａｃｃａｇｔｃｔｇａｃａｇｔｃｇｃｇｇａｃａｃｇｇｃｃａｃｃｔａｔｔｔｃｔｇｔｇｃｇａｇａｇａａａｇｃｇｇｔａｇｔｇｇｃｔｇｇｇｃｇｃｔｔａａｃｔｔｇｔｇｇｇｇｃｃａａｇｇｇａｃｃｃｔｇｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｇａｇｃ（配列番号１２）。
【０１７２】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１０の定常重鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｇｇｇｃａａｃｃｔａａｇｇｃｔｃｃａｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｃａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｔｇｃｔｇｃｇｇｇｇａｃａｃａｃｃｃｔｃｔａｇｃａｃｇｇｔｇａｃｃｔｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔａｃｃｔｃｃｃｇｇａｇｃｃａｇｔｇａｃｃｇｔｇａｃｃｔｇｇａａｃｔｃｇｇｇｃａｃｃｃｔｃａｃｃａａｔｇｇｇｇｔａｃｇｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｔｃｃｇｔｃｃｇｇｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇｃｃｔｃｔａｃｔｃｇｃｔｇａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｇｃｇｔｇａｃｃｔｃａａｇｃａｇｃｃａｇｃｃｃｇｔｃａｃｃｔｇｃａａｃｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｇｃｃａｃｃａａｃａｃｃａａａｇｔｇｇａｃａａｇａｃｃｇｔｔｇｃｇｃｃｃｔｃｇａｃａｔｇｃａｇｃａａｇｃｃｃａｃｇｔｇｃｃｃａｃｃｃｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃａｃｇｃａｃｃｃｃｃｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｇｇａｔｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇｔｔｃａｃａｔｇｇｔａｃａｔａａａｃａａｃｇａｇｃａｇｇｔｇｃｇｃａｃｃｇｃｃｃｇｇｃｃｇｃｃｇｃｔａｃｇｇｇａｇｃａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇａｔｃｃｇｃｇｔｇｇｔｃａｇｃａｃｃｃｔｃｃｃｃａｔｃｇｃｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａｇｇｇｇｃａａｇｇａｇｔｔｃａａｇｔｇｃａａａｇｔｃｃａｃａａｃａａｇｇｃａｃｔｃｃｃｇｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａｇａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｔｇｇａｇｃｃｇａａｇｇｔｃｔａｃａｃｃａｔｇｇｇｃｃｃｔｃｃｃｃｇｇｇａｇｇａｇｃｔｇａｇｃａｇｃａｇｇｔｃｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃａｔｇａｔｃａａｃｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｔｔｃｃｇａｃａｔｃｔｃｇｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａａｇａａｃｇｇｇａａｇｇｃａｇａｇｇａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｇｇｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔａｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃｔｃａｇｔｇｃｃｃａｃｇａｇｔｇａｇｔｇｇｃａｇｃｇｇｇｇｃｇａｃｇｔｃｔｔｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇｔｃｃａｔｃｔｃｃｃｇｃｔｃｔｃｃｇｇｇｔａａａ（配列番号２０）。
【０１７３】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２１の軽鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｇａｃｃｃｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃａｇａｃｔｃｃａｔｃｃｃｃｃｇｔｇｔｃｔｇｃａｇｃｔｇｔｇｇｇａｇｇｃａｃａｇｔｃａｃｃａｔｃａｇｔｔｇｃｃａｇｇｃｃａｇｔｇａｇａｇｔｇｔｔｇａｇａｇｔｇｇｃａａｃｔｇｇｔｔａｇｃｃｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃａｇｇｇｃａｇｃｃｔｃｃｃａａｇｃｔｃｃｔｇａｔｃｔａｔｔａｔａｃａｔｃｃａｃｔｃｔｇｇｃａｔｃｔｇｇｇｇｔｃｃｃａｔｃｇｃｇｇｔｔｃａａａｇｇｃａｇｔｇｇａｔｃｔｇｇｇｇｃａｃａｃｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃｇｇｃｇｔｇｃａｇｔｇｔｇａｃｇａｔｇｃｔｇｃｃａｃｔｔａｃｔａｃｔｇｔｃａａｇｇｃｇｃｔｔｔｔｔａｔｇｇｔｇｔｇａａｔａｃｔｔｔｃｇｇｃｇｇａｇｇｇａｃｃｇａｇｇｔｇｇｔｇｇｔｃａａａｃｇｔａｃｇｃｃａｇｔｔｇｃａｃｃｔａｃｔｇｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃａｃｃａｔｃｔａｇｃｇａｔｇａｇｇｔｇｇｃａａｃｔｇｇａａｃａｇｔｃａｃｃａｔｃｇｔｇｔｇｔｇｔｇｇｃｇａａｔａａａｔａｃｔｔｔｃｃｃｇａｔｇｔｃａｃｃｇｔｃａｃｃｔｇｇｇａｇｇｔｇｇａｔｇｇｃａｃｃａｃｃｃａａａｃａａｃｔｇｇｃａｔｃｇａｇａａｃａｇｔａａａａｃａｃｃｇｃａｇａａｔｔｃｔｇｃａｇａｔｔｇｔａｃｃｔａｃａａｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｔｃｔｇａｃａｃｔｇａｃｃａｇｃａｃａｃａｇｔａｃａａｃａｇｃｃａｃａａａｇａｇｔａｃａｃｃｔｇｃａａｇｇｔｇａｃｃｃａｇｇｇｃａｃｇａｃｃｔｃａｇｔｃｇｔｃｃａｇａｇｃｔｔｃａｇｔａｇｇａａｇａａｃｔｇｔ（配列番号３１）。
【０１７４】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２２の可変軽鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｇａｃｃｃｔｇｔｇｃｔｇａｃｃｃａｇａｃｔｃｃａｔｃｃｃｃｃｇｔｇｔｃｔｇｃａｇｃｔｇｔｇｇｇａｇｇｃａｃａｇｔｃａｃｃａｔｃａｇｔｔｇｃｃａｇｇｃｃａｇｔｇａｇａｇｔｇｔｔｇａｇａｇｔｇｇｃａａｃｔｇｇｔｔａｇｃｃｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃａｇｇｇｃａｇｃｃｔｃｃｃａａｇｃｔｃｃｔｇａｔｃｔａｔｔａｔａｃａｔｃｃａｃｔｃｔｇｇｃａｔｃｔｇｇｇｇｔｃｃｃａｔｃｇｃｇｇｔｔｃａａａｇｇｃａｇｔｇｇａｔｃｔｇｇｇｇｃａｃａｃｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃｇｇｃｇｔｇｃａｇｔｇｔｇａｃｇａｔｇｃｔｇｃｃａｃｔｔａｃｔａｃｔｇｔｃａａｇｇｃｇｃｔｔｔｔｔａｔｇｇｔｇｔｇａａｔａｃｔｔｔｃｇｇｃｇｇａｇｇｇａｃｃｇａｇｇｔｇｇｔｇｇｔｃａａａ（配列番号３２）。
【０１７５】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３０の定常軽鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｃｇｔａｃｇｃｃａｇｔｔｇｃａｃｃｔａｃｔｇｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃａｃｃａｔｃｔａｇｃｇａｔｇａｇｇｔｇｇｃａａｃｔｇｇａａｃａｇｔｃａｃｃａｔｃｇｔｇｔｇｔｇｔｇｇｃｇａａｔａａａｔａｃｔｔｔｃｃｃｇａｔｇｔｃａｃｃｇｔｃａｃｃｔｇｇｇａｇｇｔｇｇａｔｇｇｃａｃｃａｃｃｃａａａｃａａｃｔｇｇｃａｔｃｇａｇａａｃａｇｔａａａａｃａｃｃｇｃａｇａａｔｔｃｔｇｃａｇａｔｔｇｔａｃｃｔａｃａａｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｔｃｔｇａｃａｃｔｇａｃｃａｇｃａｃａｃａｇｔａｃａａｃａｇｃｃａｃａａａｇａｇｔａｃａｃｃｔｇｃａａｇｇｔｇａｃｃｃａｇｇｇｃａｃｇａｃｃｔｃａｇｔｃｇｔｃｃａｇａｇｃｔｔｃａｇｔａｇｇａａｇａａｃｔｇｔ（配列番号４０）。
【０１７６】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１の重鎖配列もしくは配列番号２の可変重鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）をコードするポリヌクレオチドに対応する配列番号１４；配列番号１６；及び配列番号１８のポリヌクレオチド配列の１つ以上、ならびに／または配列番号２１の軽鎖配列もしくは配列番号２２の可変軽鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号３４；配列番号３６；及び配列番号３８のポリヌクレオチド配列の１つ以上、またはこれらのポリヌクレオチド配列の組合せを含むか、あるいはそれらから成る。本発明の別の実施形態では、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、上記ＣＤＲ、可変重鎖及び可変軽鎖配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列の全てを含め、それらの１つ以上をコードするポリヌクレオチドの組合せを含むか、あるいは該組合せから成る。
【０１７７】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１の重鎖配列もしくは配列番号２の可変重鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）をコードするポリヌクレオチドに対応する配列番号１３；配列番号１５；配列番号１７；及び配列番号１９のポリヌクレオチド配列の１つ以上、ならびに／または配列番号２１の軽鎖配列もしくは配列番号２２の可変軽鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号３３；配列番号３５；配列番号３７；及び配列番号３９のポリヌクレオチド配列の１つ以上、またはこれらのポリヌクレオチド配列の組合せを含むか、あるいはそれらから成る。本発明の別の実施形態では、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、上記ＦＲ、可変重鎖及び可変軽鎖配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列の全てを含め、それらの１つ以上の組合せを含むか、あるいは該組合せから成る。
【０１７８】
本発明は、本明細書に記載の抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列の１つ以上を含むポリヌクレオチド配列をも企図する。本発明の一実施形態では、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、抗体フラグメントをコードする下記ポリヌクレオチド：配列番号１の重鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号１１；配列番号２の可変重鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号１２；配列番号２１の軽鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号３１：配列番号２２の可変軽鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号３２；配列番号１の重鎖配列または配列番号２の可変重鎖配列の相補性決定領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号１４；配列番号１６；及び配列番号１８）；配列番号２１の軽鎖配列または配列番号２２の可変軽鎖配列の相補性決定領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号３４；配列番号３６；及び配列番号３８）；配列番号１の重鎖配列または配列番号２の可変重鎖配列のフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号１３；配列番号１５；配列番号１７；及び配列番号１９）；ならびに配列番号２１の軽鎖配列または配列番号２２の可変軽鎖配列のフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号３３；配列番号３５；配列番号３７；及び配列番号３９）の全てを含め、それらの１、２、３またはそれより多くを含むか、あるいはそれらから成る。
【０１７９】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、糖タンパク質に対して結合特異性を有するＦａｂ（抗原結合性フラグメント）フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいは該ポリヌクレオチドから成る。抗体Ａｂ１に関して、全長Ａｂ１抗体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１の重鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号１１及び配列番号２１の軽鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号３１を含むか、あるいはそれらから成る。
【０１８０】
本発明の別の実施形態は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳＯ、ヒト腎細胞等、または真菌、昆虫、または微生物系、例えば酵母ピキア等の酵母細胞における発現のための発現ベクターに組み込まれるこれらのポリヌクレオチドを企図する。適切なピキア種としては、限定するものではないが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。本明細書に記載（以下に）の発明の一実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、適切な宿主における全長ポリヌクレオチドの発現後のＡｂ１の酵素消化（例えば、パパイン）によって産生され得る。本発明の別の実施形態では、Ａｂ１等の抗糖タンパク質抗体またはそのＦａｂフラグメントは、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳＯもしくはヒト腎細胞等、真菌、昆虫、または微生物系、例えば酵母細胞（例えば二倍体酵母、例えば二倍体ピキア）及び他の酵母株におけるＡｂ１ポリヌクレオチドの発現によって産生され得る。適切なピキア種としては、限定するものではないが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１８１】
抗体Ａｂ２
一実施形態では、本発明はさらに、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明の一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号４１の重鎖配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｃａｇｔｃｇｔｔｇｇａｇｇａｇｔｃｃｇｇｇｇｇａｇｇｃｃｔｇｇｔｃａａｇｃｃｔｇａｇｇｇａｔｃｃｃｔｇａｃａｃｔｃａｃｃｔｇｃａａａｇｃｃｔｃｔｇｇａｔｔｃｔｃｃｔｔｃａｃｔｇｇｃｇｃｃｃａｃｔａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇｇｔｃｃｇｃｃａｇｇｃｔｃｃａｇｇｇａａｇｇｇｇｃｔｇｇａｇｔｇｇａｔｃｇｃａｔｇｔａｔｔｔａｔｇｇｔｇｇｔａｇｔｇｔｔｇａｔａｔａａｃｔｔｔｃｔａｃｇｃｇａｇｃｔｇｇｇｃｇａａａｇｇｃｃｇａｔｔｃｇｃｃａｔｃｔｃｃａａｇｔｃｃｔｃｇｔｃｇａｃｃｇｃｇｇｔｇａｃｔｃｔｇｃａａａｔｇａｃｃａｇｔｃｔｇａｃａｇｃｃｇｃｇｇａｃａｃｇｇｃｃａｃｃｔａｔｇｔｃｔｇｔｇｃｇａｇａｇａａａｇｃｇｇｔａｇｔｇｇｃｔｇｇｇｃｇｃｔｔａａｃｔｔｇｔｇｇｇｇｃｃｃｇｇｇｇａｃｃｃｔａｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｇａｇｃｇｇｇｃａａｃｃｔａａｇｇｃｔｃｃａｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｃａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｔｇｃｔｇｃｇｇｇｇａｃａｃａｃｃｃｔｃｔａｇｃａｃｇｇｔｇａｃｃｔｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔａｃｃｔｃｃｃｇｇａｇｃｃａｇｔｇａｃｃｇｔｇａｃｃｔｇｇａａｃｔｃｇｇｇｃａｃｃｃｔｃａｃｃａａｔｇｇｇｇｔａｃｇｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｔｃｃｇｔｃｃｇｇｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇｃｃｔｃｔａｃｔｃｇｃｔｇａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｇｃｇｔｇａｃｃｔｃａａｇｃａｇｃｃａｇｃｃｃｇｔｃａｃｃｔｇｃａａｃｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｇｃｃａｃｃａａｃａｃｃａａａｇｔｇｇａｃａａｇａｃｃｇｔｔｇｃｇｃｃｃｔｃｇａｃａｔｇｃａｇｃａａｇｃｃｃａｃｇｔｇｃｃｃａｃｃｃｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃａｃｇｃａｃｃｃｃｃｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｇｇａｔｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇｔｔｃａｃａｔｇｇｔａｃａｔａａａｃａａｃｇａｇｃａｇｇｔｇｃｇｃａｃｃｇｃｃｃｇｇｃｃｇｃｃｇｃｔａｃｇｇｇａｇｃａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇａｔｃｃｇｃｇｔｇｇｔｃａｇｃａｃｃｃｔｃｃｃｃａｔｃｇｃｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａｇｇｇｇｃａａｇｇａｇｔｔｃａａｇｔｇｃａａａｇｔｃｃａｃａａｃａａｇｇｃａｃｔｃｃｃｇｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａｇａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｔｇｇａｇｃｃｇａａｇｇｔｃｔａｃａｃｃａｔｇｇｇｃｃｃｔｃｃｃｃｇｇｇａｇｇａｇｃｔｇａｇｃａｇｃａｇｇｔｃｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃａｔｇａｔｃａａｃｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｔｔｃｃｇａｃａｔｃｔｃｇｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａａｇａａｃｇｇｇａａｇｇｃａｇａｇｇａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｇｇｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔａｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃｔｃａｇｔｇｃｃｃａｃｇａｇｔｇａｇｔｇｇｃａｇｃｇｇｇｇｃｇａｃｇｔｃｔｔｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇｔｃｃａｔｃｔｃｃｃｇｃｔｃｔｃｃｇｇｇｔａａａ（配列番号５１）。
【０１８２】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号４２の可変重鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｃａｇｔｃｇｔｔｇｇａｇｇａｇｔｃｃｇｇｇｇｇａｇｇｃｃｔｇｇｔｃａａｇｃｃｔｇａｇｇｇａｔｃｃｃｔｇａｃａｃｔｃａｃｃｔｇｃａａａｇｃｃｔｃｔｇｇａｔｔｃｔｃｃｔｔｃａｃｔｇｇｃｇｃｃｃａｃｔａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇｇｔｃｃｇｃｃａｇｇｃｔｃｃａｇｇｇａａｇｇｇｇｃｔｇｇａｇｔｇｇａｔｃｇｃａｔｇｔａｔｔｔａｔｇｇｔｇｇｔａｇｔｇｔｔｇａｔａｔａａｃｔｔｔｃｔａｃｇｃｇａｇｃｔｇｇｇｃｇａａａｇｇｃｃｇａｔｔｃｇｃｃａｔｃｔｃｃａａｇｔｃｃｔｃｇｔｃｇａｃｃｇｃｇｇｔｇａｃｔｃｔｇｃａａａｔｇａｃｃａｇｔｃｔｇａｃａｇｃｃｇｃｇｇａｃａｃｇｇｃｃａｃｃｔａｔｇｔｃｔｇｔｇｃｇａｇａｇａａａｇｃｇｇｔａｇｔｇｇｃｔｇｇｇｃｇｃｔｔａａｃｔｔｇｔｇｇｇｇｃｃｃｇｇｇｇａｃｃｃｔａｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｇａｇｃ（配列番号５２）。
【０１８３】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号５０の定常重鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｇｇｇｃａａｃｃｔａａｇｇｃｔｃｃａｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｃａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｔｇｃｔｇｃｇｇｇｇａｃａｃａｃｃｃｔｃｔａｇｃａｃｇｇｔｇａｃｃｔｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔａｃｃｔｃｃｃｇｇａｇｃｃａｇｔｇａｃｃｇｔｇａｃｃｔｇｇａａｃｔｃｇｇｇｃａｃｃｃｔｃａｃｃａａｔｇｇｇｇｔａｃｇｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｔｃｃｇｔｃｃｇｇｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇｃｃｔｃｔａｃｔｃｇｃｔｇａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｇｃｇｔｇａｃｃｔｃａａｇｃａｇｃｃａｇｃｃｃｇｔｃａｃｃｔｇｃａａｃｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｇｃｃａｃｃａａｃａｃｃａａａｇｔｇｇａｃａａｇａｃｃｇｔｔｇｃｇｃｃｃｔｃｇａｃａｔｇｃａｇｃａａｇｃｃｃａｃｇｔｇｃｃｃａｃｃｃｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃａｃｇｃａｃｃｃｃｃｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｇｇａｔｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇｔｔｃａｃａｔｇｇｔａｃａｔａａａｃａａｃｇａｇｃａｇｇｔｇｃｇｃａｃｃｇｃｃｃｇｇｃｃｇｃｃｇｃｔａｃｇｇｇａｇｃａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇａｔｃｃｇｃｇｔｇｇｔｃａｇｃａｃｃｃｔｃｃｃｃａｔｃｇｃｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａｇｇｇｇｃａａｇｇａｇｔｔｃａａｇｔｇｃａａａｇｔｃｃａｃａａｃａａｇｇｃａｃｔｃｃｃｇｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａｇａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｔｇｇａｇｃｃｇａａｇｇｔｃｔａｃａｃｃａｔｇｇｇｃｃｃｔｃｃｃｃｇｇｇａｇｇａｇｃｔｇａｇｃａｇｃａｇｇｔｃｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃａｔｇａｔｃａａｃｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｔｔｃｃｇａｃａｔｃｔｃｇｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａａｇａａｃｇｇｇａａｇｇｃａｇａｇｇａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｇｇｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔａｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃｔｃａｇｔｇｃｃｃａｃｇａｇｔｇａｇｔｇｇｃａｇｃｇｇｇｇｃｇａｃｇｔｃｔｔｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇｔｃｃａｔｃｔｃｃｃｇｃｔｃｔｃｃｇｇｇｔａａａ（配列番号６０）。
【０１８４】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号６１の軽鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｃａａｇｔｇｃｔｇａｃｃｃａｇａｃｔｇｃａｔｃｇｃｃｃｇｔｇｔｃｔｇｃｃｇｃｔｇｔｇｇｇａｇｇｃａｃａｇｔｃａｃｃａｔｃａｇｔｔｇｃｃａｇｔｃｃａｇｔｃａｇａｇｔｇｔｔｇａｇａａｔｇｇｃａａｃｔｇｇｔｔａｇｃｃｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃａｇｇｇｃａｇｃｃｔｃｃｃａａｇｃｔｃｃｔｇａｔｃｔａｔｃｔｇｇｃａｔｃｃａｃｔｃｔｇｇａａｔｃｔｇｇｇｇｔｃｃｃａｔｃｇｃｇｇｔｔｃａａａｇｇｃａｇｔｇｇａｔｃｔｇｇｇａｃａｃａｇｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃｇｇｃｇｔａｃａｇｔｇｔｇａｃｇａｔｇｃｔｇｃｃａｃｔｔａｃｔａｃｔｇｔｃａｇｇｇｃｇｃｔｔａｔａｇｔｇｇｔａｔｔａａｔｇｔｔｔｔｃｇｇｃｇｇａｇｇｇａｃｃｇａｇｇｔｇｇｔｇｇｔｃａａａｃｇｔａｃｇｃｃａｇｔｔｇｃａｃｃｔａｃｔｇｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃａｃｃａｔｃｔａｇｃｇａｔｇａｇｇｔｇｇｃａａｃｔｇｇａａｃａｇｔｃａｃｃａｔｃｇｔｇｔｇｔｇｔｇｇｃｇａａｔａａａｔａｃｔｔｔｃｃｃｇａｔｇｔｃａｃｃｇｔｃａｃｃｔｇｇｇａｇｇｔｇｇａｔｇｇｃａｃｃａｃｃｃａａａｃａａｃｔｇｇｃａｔｃｇａｇａａｃａｇｔａａａａｃａｃｃｇｃａｇａａｔｔｃｔｇｃａｇａｔｔｇｔａｃｃｔａｃａａｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｔｃｔｇａｃａｃｔｇａｃｃａｇｃａｃａｃａｇｔａｃａａｃａｇｃｃａｃａａａｇａｇｔａｃａｃｃｔｇｃａａｇｇｔｇａｃｃｃａｇｇｇｃａｃｇａｃｃｔｃａｇｔｃｇｔｃｃａｇａｇｃｔｔｃａｇｔａｇｇａａｇａａｃｔｇｔ（配列番号７１）。
【０１８５】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号６２の可変軽鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｃａａｇｔｇｃｔｇａｃｃｃａｇａｃｔｇｃａｔｃｇｃｃｃｇｔｇｔｃｔｇｃｃｇｃｔｇｔｇｇｇａｇｇｃａｃａｇｔｃａｃｃａｔｃａｇｔｔｇｃｃａｇｔｃｃａｇｔｃａｇａｇｔｇｔｔｇａｇａａｔｇｇｃａａｃｔｇｇｔｔａｇｃｃｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃａｇｇｇｃａｇｃｃｔｃｃｃａａｇｃｔｃｃｔｇａｔｃｔａｔｃｔｇｇｃａｔｃｃａｃｔｃｔｇｇａａｔｃｔｇｇｇｇｔｃｃｃａｔｃｇｃｇｇｔｔｃａａａｇｇｃａｇｔｇｇａｔｃｔｇｇｇａｃａｃａｇｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃｇｇｃｇｔａｃａｇｔｇｔｇａｃｇａｔｇｃｔｇｃｃａｃｔｔａｃｔａｃｔｇｔｃａｇｇｇｃｇｃｔｔａｔａｇｔｇｇｔａｔｔａａｔｇｔｔｔｔｃｇｇｃｇｇａｇｇｇａｃｃｇａｇｇｔｇｇｔｇｇｔｃａａａ（配列番号７２）。
【０１８６】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号７０の定常軽鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｃｇｔａｃｇｃｃａｇｔｔｇｃａｃｃｔａｃｔｇｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃａｃｃａｔｃｔａｇｃｇａｔｇａｇｇｔｇｇｃａａｃｔｇｇａａｃａｇｔｃａｃｃａｔｃｇｔｇｔｇｔｇｔｇｇｃｇａａｔａａａｔａｃｔｔｔｃｃｃｇａｔｇｔｃａｃｃｇｔｃａｃｃｔｇｇｇａｇｇｔｇｇａｔｇｇｃａｃｃａｃｃｃａａａｃａａｃｔｇｇｃａｔｃｇａｇａａｃａｇｔａａａａｃａｃｃｇｃａｇａａｔｔｃｔｇｃａｇａｔｔｇｔａｃｃｔａｃａａｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｔｃｔｇａｃａｃｔｇａｃｃａｇｃａｃａｃａｇｔａｃａａｃａｇｃｃａｃａａａｇａｇｔａｃａｃｃｔｇｃａａｇｇｔｇａｃｃｃａｇｇｇｃａｃｇａｃｃｔｃａｇｔｃｇｔｃｃａｇａｇｃｔｔｃａｇｔａｇｇａａｇａａｃｔｇｔ（配列番号８０）。
【０１８７】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４１の重鎖配列もしくは配列番号４２の可変重鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）をコードするポリヌクレオチドに対応する配列番号５４；配列番号５６；及び配列番号５８のポリヌクレオチド配列の１つ以上、ならびに／または配列番号６１の軽鎖配列もしくは配列番号６２の可変軽鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号７４；配列番号７６；及び配列番号７８のポリヌクレオチド配列の１つ以上、またはこれらのポリヌクレオチド配列の組合せを含むか、あるいはそれらから成る。本発明の別の実施形態では、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、上記ＣＤＲ、可変重鎖及び可変軽鎖配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列の全てを含め、それらの１つ以上をコードするポリヌクレオチドの組合せを含むか、あるいは該組合せから成る。
【０１８８】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４１の重鎖配列もしくは配列番号４２の可変重鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）をコードするポリヌクレオチドに対応する配列番号５３；配列番号５５；配列番号５７；及び配列番号５９のポリヌクレオチド配列の１つ以上、ならびに／または配列番号６１の軽鎖配列もしくは配列番号６２の可変軽鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号７３；配列番号７５；配列番号７７；及び配列番号７９のポリヌクレオチド配列の１つ以上、またはこれらのポリヌクレオチド配列の組合せを含むか、あるいはそれらから成る。本発明の別の実施形態では、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、上記ＦＲ、可変重鎖及び可変軽鎖配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列の全てを含め、それらの１つ以上の組合せを含むか、あるいは該組合せから成る。
【０１８９】
本発明は、本明細書に記載の抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列の１つ以上を含むポリヌクレオチド配列をも企図する。本発明の一実施形態では、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、抗体フラグメントをコードする下記ポリヌクレオチド：配列番号４１の重鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号５１；配列番号４２の可変重鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号５２；配列番号６１の軽鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号７１：配列番号６２の可変軽鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号７２；配列番号４１の重鎖配列もしくは配列番号４２の可変重鎖配列の相補性決定領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号５４；配列番号５６；及び配列番号５８）；配列番号６１の軽鎖配列もしくは配列番号６２の可変軽鎖配列の相補性決定領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号７４；配列番号７６；及び配列番号７８）；配列番号４１の重鎖配列もしくは配列番号４２の可変重鎖配列のフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号５３；配列番号５５；配列番号５７；及び配列番号５９）；ならびに配列番号６１の軽鎖配列もしくは配列番号６２の可変軽鎖配列のフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号７３；配列番号７５；配列番号７７；及び配列番号７９）の全てを含め、それらの１、２、３またはそれより多くを含むか、あるいはそれらから成る。
【０１９０】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、糖タンパク質に対して結合特異性を有するＦａｂ（抗原結合性フラグメント）フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいは該ポリヌクレオチドから成る。抗体Ａｂ２に関して、全長Ａｂ２抗体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４１の重鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号５１及び配列番号６１の軽鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号７１を含むか、あるいはそれらから成る。
【０１９１】
本発明の別の実施形態は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳＯ、ヒト腎細胞等、または真菌、昆虫、または微生物系、例えば酵母ピキア等の酵母細胞における発現のための発現ベクターに組み込まれるこれらのポリヌクレオチドを企図する。適切なピキア種としては、限定するものではないが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。本明細書に記載（以下に）の発明の一実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、適切な宿主における全長ポリヌクレオチドの発現後のＡｂ２の酵素消化（例えば、パパイン）によって産生され得る。本発明の別の実施形態では、Ａｂ２等の抗糖タンパク質抗体またはそのＦａｂフラグメントは、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳＯもしくはヒト腎細胞等、真菌、昆虫、または微生物系、例えば酵母細胞（例えば二倍体酵母、例えば二倍体ピキア）及び他の酵母株におけるＡｂ２ポリヌクレオチドの発現によって産生され得る。適切なピキア種としては、限定するものではないが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１９２】
抗体Ａｂ３
一実施形態では、本発明はさらに、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明の一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号８１の重鎖配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｃａｇｔｃｇｔｔｇｇａｇｇａｇｔｃｃｇｇｇｇｇａｇｇｃｃｔｇｇｔｃｃａｇｃｃｔｇａｇｇｇａｔｃｃｃｔｇａｃａｃｔｃａｃｃｔｇｔａｃａｇｃｃｔｃｔｇｇａｔｔｃｔｔｃｔｔｃａｇｔｇｇｃｇｃｃｃａｃｔａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇｇｔｃｃｇｃｃａｇｇｃｔｃｃａｇｇｇｃａｇｇｇｇｃｔｇｇａｇｔｇｇａｔｃｇｇａｔｇｃａｃｔｔａｔｇｇｔｇｇｔａｇｔｇｔｔｇａｔａｔｃａｃｔｔｔｃｔａｃｇｃｇａｇｃｔｇｇｇｃｇａａａｇｇｃｃｇａｔｔｃｇｃｃａｔｃｔｃｃａａａａｃｃｔｃｇｔｃｇａｃｃａｃｇｇｔｇａｃｔｃｔｇｃａａｃｔｇａｃｃａｇｔｃｔｇａｃａｇｃｃｇｃｇｇａｃａｃｇｇｃｃａｃｃｔａｔｇｔｃｔｇｔｇｃｇａｇａｇａａａｇｃｇｇｔａｇｔｇｇｃｔｇｇｇｃａｃｔｔａａｃｔｔｇｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｇａｃｃｃｔｃｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｇａｇｃｇｇｇｃａａｃｃｔａａｇｇｃｔｃｃａｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｃａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｔｇｃｔｇｃｇｇｇｇａｃａｃａｃｃｃｔｃｔａｇｃａｃｇｇｔｇａｃｃｔｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔａｃｃｔｃｃｃｇｇａｇｃｃａｇｔｇａｃｃｇｔｇａｃｃｔｇｇａａｃｔｃｇｇｇｃａｃｃｃｔｃａｃｃａａｔｇｇｇｇｔａｃｇｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｔｃｃｇｔｃｃｇｇｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇｃｃｔｃｔａｃｔｃｇｃｔｇａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｇｃｇｔｇａｃｃｔｃａａｇｃａｇｃｃａｇｃｃｃｇｔｃａｃｃｔｇｃａａｃｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｇｃｃａｃｃａａｃａｃｃａａａｇｔｇｇａｃａａｇａｃｃｇｔｔｇｃｇｃｃｃｔｃｇａｃａｔｇｃａｇｃａａｇｃｃｃａｃｇｔｇｃｃｃａｃｃｃｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃａｃｇｃａｃｃｃｃｃｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｇｇａｔｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇｔｔｃａｃａｔｇｇｔａｃａｔａａａｃａａｃｇａｇｃａｇｇｔｇｃｇｃａｃｃｇｃｃｃｇｇｃｃｇｃｃｇｃｔａｃｇｇｇａｇｃａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇａｔｃｃｇｃｇｔｇｇｔｃａｇｃａｃｃｃｔｃｃｃｃａｔｃｇｃｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａｇｇｇｇｃａａｇｇａｇｔｔｃａａｇｔｇｃａａａｇｔｃｃａｃａａｃａａｇｇｃａｃｔｃｃｃｇｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａｇａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｔｇｇａｇｃｃｇａａｇｇｔｃｔａｃａｃｃａｔｇｇｇｃｃｃｔｃｃｃｃｇｇｇａｇｇａｇｃｔｇａｇｃａｇｃａｇｇｔｃｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃａｔｇａｔｃａａｃｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｔｔｃｃｇａｃａｔｃｔｃｇｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａａｇａａｃｇｇｇａａｇｇｃａｇａｇｇａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｇｇｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔａｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃｔｃａｇｔｇｃｃｃａｃｇａｇｔｇａｇｔｇｇｃａｇｃｇｇｇｇｃｇａｃｇｔｃｔｔｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇｔｃｃａｔｃｔｃｃｃｇｃｔｃｔｃｃｇｇｇｔａａａ（配列番号９１）。
【０１９３】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号８２の可変重鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｃａｇｔｃｇｔｔｇｇａｇｇａｇｔｃｃｇｇｇｇｇａｇｇｃｃｔｇｇｔｃｃａｇｃｃｔｇａｇｇｇａｔｃｃｃｔｇａｃａｃｔｃａｃｃｔｇｔａｃａｇｃｃｔｃｔｇｇａｔｔｃｔｔｃｔｔｃａｇｔｇｇｃｇｃｃｃａｃｔａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇｇｔｃｃｇｃｃａｇｇｃｔｃｃａｇｇｇｃａｇｇｇｇｃｔｇｇａｇｔｇｇａｔｃｇｇａｔｇｃａｃｔｔａｔｇｇｔｇｇｔａｇｔｇｔｔｇａｔａｔｃａｃｔｔｔｃｔａｃｇｃｇａｇｃｔｇｇｇｃｇａａａｇｇｃｃｇａｔｔｃｇｃｃａｔｃｔｃｃａａａａｃｃｔｃｇｔｃｇａｃｃａｃｇｇｔｇａｃｔｃｔｇｃａａｃｔｇａｃｃａｇｔｃｔｇａｃａｇｃｃｇｃｇｇａｃａｃｇｇｃｃａｃｃｔａｔｇｔｃｔｇｔｇｃｇａｇａｇａａａｇｃｇｇｔａｇｔｇｇｃｔｇｇｇｃａｃｔｔａａｃｔｔｇｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｇａｃｃｃｔｃｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｇａｇｃ（配列番号９２）。
【０１９４】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号９０の定常重鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｇｇｇｃａａｃｃｔａａｇｇｃｔｃｃａｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｃａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｔｇｃｔｇｃｇｇｇｇａｃａｃａｃｃｃｔｃｔａｇｃａｃｇｇｔｇａｃｃｔｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔａｃｃｔｃｃｃｇｇａｇｃｃａｇｔｇａｃｃｇｔｇａｃｃｔｇｇａａｃｔｃｇｇｇｃａｃｃｃｔｃａｃｃａａｔｇｇｇｇｔａｃｇｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｔｃｃｇｔｃｃｇｇｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇｃｃｔｃｔａｃｔｃｇｃｔｇａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｇｃｇｔｇａｃｃｔｃａａｇｃａｇｃｃａｇｃｃｃｇｔｃａｃｃｔｇｃａａｃｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｇｃｃａｃｃａａｃａｃｃａａａｇｔｇｇａｃａａｇａｃｃｇｔｔｇｃｇｃｃｃｔｃｇａｃａｔｇｃａｇｃａａｇｃｃｃａｃｇｔｇｃｃｃａｃｃｃｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃａｃｇｃａｃｃｃｃｃｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｇｇａｔｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇｔｔｃａｃａｔｇｇｔａｃａｔａａａｃａａｃｇａｇｃａｇｇｔｇｃｇｃａｃｃｇｃｃｃｇｇｃｃｇｃｃｇｃｔａｃｇｇｇａｇｃａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇａｔｃｃｇｃｇｔｇｇｔｃａｇｃａｃｃｃｔｃｃｃｃａｔｃｇｃｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａｇｇｇｇｃａａｇｇａｇｔｔｃａａｇｔｇｃａａａｇｔｃｃａｃａａｃａａｇｇｃａｃｔｃｃｃｇｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａｇａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｔｇｇａｇｃｃｇａａｇｇｔｃｔａｃａｃｃａｔｇｇｇｃｃｃｔｃｃｃｃｇｇｇａｇｇａｇｃｔｇａｇｃａｇｃａｇｇｔｃｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃａｔｇａｔｃａａｃｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｔｔｃｃｇａｃａｔｃｔｃｇｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａａｇａａｃｇｇｇａａｇｇｃａｇａｇｇａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｇｇｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔａｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃｔｃａｇｔｇｃｃｃａｃｇａｇｔｇａｇｔｇｇｃａｇｃｇｇｇｇｃｇａｃｇｔｃｔｔｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇｔｃｃａｔｃｔｃｃｃｇｃｔｃｔｃｃｇｇｇｔａａａ（配列番号１００）。
【０１９５】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１０１の軽鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｃａｇｇｔｇｃｔｇａｃｃｃａｇａｃｔｃｃａｔｃｃｃｃｃｇｔｇｔｃｔｇｃａｇｃｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｇｃａｇｔｃａｃｃａｔｃａａｔｔｇｃｃａｇｔｃｃａｇｔｃａｇａｇｔｇｔｔｇａｇａａｔｇｇｃａａｃｔｇｇｔｔａｇｇｃｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃａｇｇｇｃａｇｃｃｔｃｃｃａａｇｃｔｃｃｔｇａｔｃｔａｔｃｔｇｇｃａｔｃｃａｃｔｃｔｇｇｃａｔｃｔｇｇｇｇｔｃｃｃｔｔｃｇｃｇｇｔｔｃａｃｃｇｇｃａｇｃｇｇａｔｃｔｇｇｇａｃａｃａｇｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃｇｇｃｇｔｇｃａｇｔｇｔｇａｃｇａｔｇｃｔｇｃｃａｃｔｔａｃｔａｔｔｇｔｃａａｇｇｃｇｃｔｔａｔａｇｔｇｇｔａｔｔａａｔｇｃｔｔｔｃｇｇｃｇｇａｇｇｇａｃｃｇａｇｇｔｇｇｔｇｇｔｃａａａｃｇｔａｃｇｃｃａｇｔｔｇｃａｃｃｔａｃｔｇｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃａｃｃａｔｃｔａｇｃｇａｔｇａｇｇｔｇｇｃａａｃｔｇｇａａｃａｇｔｃａｃｃａｔｃｇｔｇｔｇｔｇｔｇｇｃｇａａｔａａａｔａｃｔｔｔｃｃｃｇａｔｇｔｃａｃｃｇｔｃａｃｃｔｇｇｇａｇｇｔｇｇａｔｇｇｃａｃｃａｃｃｃａａａｃａａｃｔｇｇｃａｔｃｇａｇａａｃａｇｔａａａａｃａｃｃｇｃａｇａａｔｔｃｔｇｃａｇａｔｔｇｔａｃｃｔａｃａａｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｔｃｔｇａｃａｃｔｇａｃｃａｇｃａｃａｃａｇｔａｃａａｃａｇｃｃａｃａａａｇａｇｔａｃａｃｃｔｇｃａａｇｇｔｇａｃｃｃａｇｇｇｃａｃｇａｃｃｔｃａｇｔｃｇｔｃｃａｇａｇｃｔｔｃａｇｔａｇｇａａｇａａｃｔｇｔ（配列番号１１１）。
【０１９６】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１０２の可変軽鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｃａｇｇｔｇｃｔｇａｃｃｃａｇａｃｔｃｃａｔｃｃｃｃｃｇｔｇｔｃｔｇｃａｇｃｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｇｃａｇｔｃａｃｃａｔｃａａｔｔｇｃｃａｇｔｃｃａｇｔｃａｇａｇｔｇｔｔｇａｇａａｔｇｇｃａａｃｔｇｇｔｔａｇｇｃｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃａｇｇｇｃａｇｃｃｔｃｃｃａａｇｃｔｃｃｔｇａｔｃｔａｔｃｔｇｇｃａｔｃｃａｃｔｃｔｇｇｃａｔｃｔｇｇｇｇｔｃｃｃｔｔｃｇｃｇｇｔｔｃａｃｃｇｇｃａｇｃｇｇａｔｃｔｇｇｇａｃａｃａｇｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃｇｇｃｇｔｇｃａｇｔｇｔｇａｃｇａｔｇｃｔｇｃｃａｃｔｔａｃｔａｔｔｇｔｃａａｇｇｃｇｃｔｔａｔａｇｔｇｇｔａｔｔａａｔｇｃｔｔｔｃｇｇｃｇｇａｇｇｇａｃｃｇａｇｇｔｇｇｔｇｇｔｃａａａ（配列番号１１２）。
【０１９７】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１１０の定常軽鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該下記ポリヌクレオチド配列から成る：
ｃｇｔａｃｇｃｃａｇｔｔｇｃａｃｃｔａｃｔｇｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃａｃｃａｔｃｔａｇｃｇａｔｇａｇｇｔｇｇｃａａｃｔｇｇａａｃａｇｔｃａｃｃａｔｃｇｔｇｔｇｔｇｔｇｇｃｇａａｔａａａｔａｃｔｔｔｃｃｃｇａｔｇｔｃａｃｃｇｔｃａｃｃｔｇｇｇａｇｇｔｇｇａｔｇｇｃａｃｃａｃｃｃａａａｃａａｃｔｇｇｃａｔｃｇａｇａａｃａｇｔａａａａｃａｃｃｇｃａｇａａｔｔｃｔｇｃａｇａｔｔｇｔａｃｃｔａｃａａｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｔｃｔｇａｃａｃｔｇａｃｃａｇｃａｃａｃａｇｔａｃａａｃａｇｃｃａｃａａａｇａｇｔａｃａｃｃｔｇｃａａｇｇｔｇａｃｃｃａｇｇｇｃａｃｇａｃｃｔｃａｇｔｃｇｔｃｃａｇａｇｃｔｔｃａｇｔａｇｇａａｇａａｃｔｇｔ（配列番号１２０）。
【０１９８】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８１の重鎖配列もしくは配列番号８２の可変重鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）をコードするポリヌクレオチドに対応する配列番号９４；配列番号９６；及び配列番号９８のポリヌクレオチド配列の１つ以上、ならびに／または配列番号１０１の軽鎖配列もしくは配列番号１０２の可変軽鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号１１４；配列番号１１６；及び配列番号１１８のポリヌクレオチド配列の１つ以上、またはこれらのポリヌクレオチド配列の組合せを含むか、あるいはそれらから成る。本発明の別の実施形態では、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、上記ＣＤＲ、可変重鎖及び可変軽鎖配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列の全てを含め、それらの１つ以上をコードするポリヌクレオチドの組合せを含むか、あるいは該組合せから成る。
【０１９９】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８１の重鎖配列もしくは配列番号８２の可変重鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）をコードするポリヌクレオチドに対応する配列番号９３；配列番号９５；配列番号９７；及び配列番号９９のポリヌクレオチド配列の１つ以上、ならびに／または配列番号１０１の軽鎖配列もしくは配列番号１０２の可変軽鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号１１３；配列番号１１５；配列番号１１７；及び配列番号１１９のポリヌクレオチド配列の１つ以上、またはこれらのポリヌクレオチド配列の組合せを含むか、あるいはそれらから成る。本発明の別の実施形態では、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、上記ＦＲ、可変重鎖及び可変軽鎖配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列の全てを含め、それらの１つ以上の組合せを含むか、あるいは該組合せから成る。
【０２００】
本発明は、本明細書に記載の抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列の１つ以上を含むポリヌクレオチド配列をも企図する。本発明の一実施形態では、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、抗体フラグメントをコードする下記ポリヌクレオチド：配列番号８１の重鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号９１；配列番号８２の可変重鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号９２；配列番号１０１の軽鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号１１１：配列番号１０２の可変軽鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号１１２；配列番号８１の重鎖配列もしくは配列番号８２の可変重鎖配列の相補性決定領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号９４；配列番号９６；及び配列番号９８）；配列番号１０１の軽鎖配列もしくは配列番号１０２の可変軽鎖配列の相補性決定領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号１１４；配列番号１１６；及び配列番号１１８）；配列番号８１の重鎖配列もしくは配列番号８２の可変重鎖配列のフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号９３；配列番号９５；配列番号９７；及び配列番号９９）；ならびに配列番号１０１の軽鎖配列もしくは配列番号１０２の可変軽鎖配列のフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号１１３；配列番号１１５；配列番号１１７；及び配列番号１１９）の全てを含め、それらの１、２、３またはそれより多くを含むか、あるいはそれらから成る。
【０２０１】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、糖タンパク質に対して結合特異性を有するＦａｂ（抗原結合性フラグメント）フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいは該ポリヌクレオチドから成る。抗体Ａｂ３に関して、全長Ａｂ３抗体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８１の重鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号９１及び配列番号１０１の軽鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号１１１を含むか、あるいはそれらから成る。
【０２０２】
本発明の別の実施形態は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳＯ、ヒト腎細胞等、または真菌、昆虫、または微生物系、例えば酵母ピキア等の酵母細胞における発現のための発現ベクターに組み込まれるこれらのポリヌクレオチドを企図する。適切なピキア種としては、限定するものではないが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。本明細書に記載（以下に）の発明の一実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、適切な宿主における全長ポリヌクレオチドの発現後のＡｂ３の酵素消化（例えば、パパイン）によって産生され得る。本発明の別の実施形態では、Ａｂ３等の抗糖タンパク質抗体またはそのＦａｂフラグメントは、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳＯもしくはヒト腎細胞等、真菌、昆虫、または微生物系、例えば酵母細胞（例えば二倍体酵母、例えば二倍体ピキア）及び他の酵母株におけるＡｂ３ポリヌクレオチドの発現によって産生され得る。適切なピキア種としては、限定するものではないが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０２０３】
抗体Ａｂ４
一実施形態では、本発明はさらに、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明の一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１２１の重鎖配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｃａｇｔｃｇｔｔｇｇａｇｇａｇｔｃｃｇｇｇｇｇａｇａｃｃｔｇｇｔｃａａｇｃｃｔｇｇｇｇｃａｔｃｃｃｔｇａｃａｃｔｃａｃｃｔｇｃａｃａｇｃｃｔｃｔｇｇａｔｔｃｔｃｃｔｔｃａｇｔａｇｃｇｇｃｔａｃｇａｃａｔｇｔｇｔｔｇｇｇｔｃｃｇｃｃａｇｇｃｔｃｃａｇｇｇａａｇｇｇｇｃｔｇｇａｇｔｇｇａｔｃｇｃｃｔｇｔａｔｔｔａｃｃｃｔａａｔａａｔｃｃｔｇｔｃａｃｔｔａｃｔａｃｇｃｇａｇｃｔｇｇｇｃｇａａａｇｇｃｃｇａｔｔｃａｃｃａｔｃｔｃｃａａａａｃｃｔｃｇｔｃｇａｃｃａｃｇｇｔｇａｃｔｃｔｇｃａａａｔｇａｃｃａｇｔｃｔｇａｃａｇｃｃｇｃｇｇａｃａｃｇｇｃｃａｃｃｔａｔｔｔｃｔｇｔｇｇｇａｇａｔｃｔｇａｔａｇｔａａｔｇｇｔｃａｔａｃｃｔｔｔａａｃｔｔｇｔｇｇｇｇｃｃａａｇｇｃａｃｃｃｔｃｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｇａｇｃｇｇｇｃａａｃｃｔａａｇｇｃｔｃｃａｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｃａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｔｇｃｔｇｃｇｇｇｇａｃａｃａｃｃｃｔｃｔａｇｃａｃｇｇｔｇａｃｃｔｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔａｃｃｔｃｃｃｇｇａｇｃｃａｇｔｇａｃｃｇｔｇａｃｃｔｇｇａａｃｔｃｇｇｇｃａｃｃｃｔｃａｃｃａａｔｇｇｇｇｔａｃｇｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｔｃｃｇｔｃｃｇｇｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇｃｃｔｃｔａｃｔｃｇｃｔｇａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｇｃｇｔｇａｃｃｔｃａａｇｃａｇｃｃａｇｃｃｃｇｔｃａｃｃｔｇｃａａｃｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｇｃｃａｃｃａａｃａｃｃａａａｇｔｇｇａｃａａｇａｃｃｇｔｔｇｃｇｃｃｃｔｃｇａｃａｔｇｃａｇｃａａｇｃｃｃａｃｇｔｇｃｃｃａｃｃｃｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃａｃｇｃａｃｃｃｃｃｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｇｇａｔｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇｔｔｃａｃａｔｇｇｔａｃａｔａａａｃａａｃｇａｇｃａｇｇｔｇｃｇｃａｃｃｇｃｃｃｇｇｃｃｇｃｃｇｃｔａｃｇｇｇａｇｃａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇａｔｃｃｇｃｇｔｇｇｔｃａｇｃａｃｃｃｔｃｃｃｃａｔｃｇｃｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａｇｇｇｇｃａａｇｇａｇｔｔｃａａｇｔｇｃａａａｇｔｃｃａｃａａｃａａｇｇｃａｃｔｃｃｃｇｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａｇａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｔｇｇａｇｃｃｇａａｇｇｔｃｔａｃａｃｃａｔｇｇｇｃｃｃｔｃｃｃｃｇｇｇａｇｇａｇｃｔｇａｇｃａｇｃａｇｇｔｃｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃａｔｇａｔｃａａｃｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｔｔｃｃｇａｃａｔｃｔｃｇｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａａｇａａｃｇｇｇａａｇｇｃａｇａｇｇａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｇｇｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔａｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃｔｃａｇｔｇｃｃｃａｃｇａｇｔｇａｇｔｇｇｃａｇｃｇｇｇｇｃｇａｃｇｔｃｔｔｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇｔｃｃａｔｃｔｃｃｃｇｃｔｃｔｃｃｇｇｇｔａａａ（配列番号１３１）。
【０２０４】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１２２の可変重鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｃａｇｔｃｇｔｔｇｇａｇｇａｇｔｃｃｇｇｇｇｇａｇａｃｃｔｇｇｔｃａａｇｃｃｔｇｇｇｇｃａｔｃｃｃｔｇａｃａｃｔｃａｃｃｔｇｃａｃａｇｃｃｔｃｔｇｇａｔｔｃｔｃｃｔｔｃａｇｔａｇｃｇｇｃｔａｃｇａｃａｔｇｔｇｔｔｇｇｇｔｃｃｇｃｃａｇｇｃｔｃｃａｇｇｇａａｇｇｇｇｃｔｇｇａｇｔｇｇａｔｃｇｃｃｔｇｔａｔｔｔａｃｃｃｔａａｔａａｔｃｃｔｇｔｃａｃｔｔａｃｔａｃｇｃｇａｇｃｔｇｇｇｃｇａａａｇｇｃｃｇａｔｔｃａｃｃａｔｃｔｃｃａａａａｃｃｔｃｇｔｃｇａｃｃａｃｇｇｔｇａｃｔｃｔｇｃａａａｔｇａｃｃａｇｔｃｔｇａｃａｇｃｃｇｃｇｇａｃａｃｇｇｃｃａｃｃｔａｔｔｔｃｔｇｔｇｇｇａｇａｔｃｔｇａｔａｇｔａａｔｇｇｔｃａｔａｃｃｔｔｔａａｃｔｔｇｔｇｇｇｇｃｃａａｇｇｃａｃｃｃｔｃｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｇａｇｃ（配列番号１３２）。
【０２０５】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１３０の定常重鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｇｇｇｃａａｃｃｔａａｇｇｃｔｃｃａｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｃａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｔｇｃｔｇｃｇｇｇｇａｃａｃａｃｃｃｔｃｔａｇｃａｃｇｇｔｇａｃｃｔｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔａｃｃｔｃｃｃｇｇａｇｃｃａｇｔｇａｃｃｇｔｇａｃｃｔｇｇａａｃｔｃｇｇｇｃａｃｃｃｔｃａｃｃａａｔｇｇｇｇｔａｃｇｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｔｃｃｇｔｃｃｇｇｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇｃｃｔｃｔａｃｔｃｇｃｔｇａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｇｃｇｔｇａｃｃｔｃａａｇｃａｇｃｃａｇｃｃｃｇｔｃａｃｃｔｇｃａａｃｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｇｃｃａｃｃａａｃａｃｃａａａｇｔｇｇａｃａａｇａｃｃｇｔｔｇｃｇｃｃｃｔｃｇａｃａｔｇｃａｇｃａａｇｃｃｃａｃｇｔｇｃｃｃａｃｃｃｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃａｃｇｃａｃｃｃｃｃｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｇｇａｔｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇｔｔｃａｃａｔｇｇｔａｃａｔａａａｃａａｃｇａｇｃａｇｇｔｇｃｇｃａｃｃｇｃｃｃｇｇｃｃｇｃｃｇｃｔａｃｇｇｇａｇｃａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇａｔｃｃｇｃｇｔｇｇｔｃａｇｃａｃｃｃｔｃｃｃｃａｔｃｇｃｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａｇｇｇｇｃａａｇｇａｇｔｔｃａａｇｔｇｃａａａｇｔｃｃａｃａａｃａａｇｇｃａｃｔｃｃｃｇｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａｇａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｔｇｇａｇｃｃｇａａｇｇｔｃｔａｃａｃｃａｔｇｇｇｃｃｃｔｃｃｃｃｇｇｇａｇｇａｇｃｔｇａｇｃａｇｃａｇｇｔｃｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃａｔｇａｔｃａａｃｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｔｔｃｃｇａｃａｔｃｔｃｇｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａａｇａａｃｇｇｇａａｇｇｃａｇａｇｇａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｇｇｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔａｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃｔｃａｇｔｇｃｃｃａｃｇａｇｔｇａｇｔｇｇｃａｇｃｇｇｇｇｃｇａｃｇｔｃｔｔｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇｔｃｃａｔｃｔｃｃｃｇｃｔｃｔｃｃｇｇｇｔａａａ（配列番号１４０）。
【０２０６】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１４１の軽鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｇａｃｃｃｔｇｔｇａｔｇａｃｃｃａｇａｃｔｃｃａｔｃｃｔｃｃｇｔｇｔｃｔｇｃａｇｃｔｇｔｇｇｇａｇｇｃａｃａｇｔｃａｃｃａｔｃａａｔｔｇｃｃａｇｔｃｃａｇｔｃａｇａｇｔｇｔｔａａｔｃａｇａａｃｇａｃｔｔａｔｃｃｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃａｇｇｇｃａｇｃｃｔｃｃｃａａｇｃｇｃｃｔｇａｔｃｔａｔｔａｔｇｃａｔｃｃａｃｔｃｔｇｇｃａｔｃｔｇｇｇｇｔｃｔｃａｔｃｇｃｇｇｔｔｃａａａｇｇｃａｇｔｇｇａｔｃｔｇｇｇａｃａｃａｇｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃｇａｃａｔｇｃａｇｔｇｔｇａｃｇａｔｇｃｔｇｃｃａｃｔｔａｃｔａｃｔｇｔｃａａｇｇｃａｇｔｔｔｔｃｇｔｇｔｔａｇｔｇｇｔｔｇｇｔａｃｔｇｇｇｃｔｔｔｃｇｇｃｇｇａｇｇｇａｃｃｇａｇｇｔｇｇｔｇｇｔｃａａａｃｇｔａｃｇｃｃａｇｔｔｇｃａｃｃｔａｃｔｇｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃａｃｃａｔｃｔａｇｃｇａｔｇａｇｇｔｇｇｃａａｃｔｇｇａａｃａｇｔｃａｃｃａｔｃｇｔｇｔｇｔｇｔｇｇｃｇａａｔａａａｔａｃｔｔｔｃｃｃｇａｔｇｔｃａｃｃｇｔｃａｃｃｔｇｇｇａｇｇｔｇｇａｔｇｇｃａｃｃａｃｃｃａａａｃａａｃｔｇｇｃａｔｃｇａｇａａｃａｇｔａａａａｃａｃｃｇｃａｇａａｔｔｃｔｇｃａｇａｔｔｇｔａｃｃｔａｃａａｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｔｃｔｇａｃａｃｔｇａｃｃａｇｃａｃａｃａｇｔａｃａａｃａｇｃｃａｃａａａｇａｇｔａｃａｃｃｔｇｃａａｇｇｔｇａｃｃｃａｇｇｇｃａｃｇａｃｃｔｃａｇｔｃｇｔｃｃａｇａｇｃｔｔｃａｇｔａｇｇａａｇａａｃｔｇｔ（配列番号１５１）。
【０２０７】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１４２の可変軽鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｇａｃｃｃｔｇｔｇａｔｇａｃｃｃａｇａｃｔｃｃａｔｃｃｔｃｃｇｔｇｔｃｔｇｃａｇｃｔｇｔｇｇｇａｇｇｃａｃａｇｔｃａｃｃａｔｃａａｔｔｇｃｃａｇｔｃｃａｇｔｃａｇａｇｔｇｔｔａａｔｃａｇａａｃｇａｃｔｔａｔｃｃｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃａｇｇｇｃａｇｃｃｔｃｃｃａａｇｃｇｃｃｔｇａｔｃｔａｔｔａｔｇｃａｔｃｃａｃｔｃｔｇｇｃａｔｃｔｇｇｇｇｔｃｔｃａｔｃｇｃｇｇｔｔｃａａａｇｇｃａｇｔｇｇａｔｃｔｇｇｇａｃａｃａｇｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃｇａｃａｔｇｃａｇｔｇｔｇａｃｇａｔｇｃｔｇｃｃａｃｔｔａｃｔａｃｔｇｔｃａａｇｇｃａｇｔｔｔｔｃｇｔｇｔｔａｇｔｇｇｔｔｇｇｔａｃｔｇｇｇｃｔｔｔｃｇｇｃｇｇａｇｇｇａｃｃｇａｇｇｔｇｇｔｇｇｔｃａａａ（配列番号１５２）。
【０２０８】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１５０の定常軽鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｃｇｔａｃｇｃｃａｇｔｔｇｃａｃｃｔａｃｔｇｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃａｃｃａｔｃｔａｇｃｇａｔｇａｇｇｔｇｇｃａａｃｔｇｇａａｃａｇｔｃａｃｃａｔｃｇｔｇｔｇｔｇｔｇｇｃｇａａｔａａａｔａｃｔｔｔｃｃｃｇａｔｇｔｃａｃｃｇｔｃａｃｃｔｇｇｇａｇｇｔｇｇａｔｇｇｃａｃｃａｃｃｃａａａｃａａｃｔｇｇｃａｔｃｇａｇａａｃａｇｔａａａａｃａｃｃｇｃａｇａａｔｔｃｔｇｃａｇａｔｔｇｔａｃｃｔａｃａａｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｔｃｔｇａｃａｃｔｇａｃｃａｇｃａｃａｃａｇｔａｃａａｃａｇｃｃａｃａａａｇａｇｔａｃａｃｃｔｇｃａａｇｇｔｇａｃｃｃａｇｇｇｃａｃｇａｃｃｔｃａｇｔｃｇｔｃｃａｇａｇｃｔｔｃａｇｔａｇｇａａｇａａｃｔｇｔ（配列番号１６０）。
【０２０９】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２１の重鎖配列もしくは配列番号１２２の可変重鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）をコードするポリヌクレオチドに対応する配列番号１３４；配列番号１３６；及び配列番号１３８のポリヌクレオチド配列の１つ以上、ならびに／または配列番号１４１の軽鎖配列もしくは配列番号１４２の可変軽鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号１５４；配列番号１５６；及び配列番号１５８のポリヌクレオチド配列の１つ以上、またはこれらのポリヌクレオチド配列の組合せを含むか、あるいはそれらから成る。本発明の別の実施形態では、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、上記ＣＤＲ、可変重鎖及び可変軽鎖配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列の全てを含め、それらの１つ以上をコードするポリヌクレオチドの組合せを含むか、あるいは該組合せから成る。
【０２１０】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２１の重鎖配列もしくは配列番号１２２の可変重鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）をコードするポリヌクレオチドに対応する配列番号１３３；配列番号１３５；配列番号１３７；及び配列番号１３９のポリヌクレオチド配列の１つ以上、ならびに／または配列番号１４１の軽鎖配列もしくは配列番号１４２の可変軽鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号１５３；配列番号１５５；配列番号１５７；及び配列番号１５９のポリヌクレオチド配列の１つ以上、またはこれらのポリヌクレオチド配列の組合せを含むか、あるいはそれらから成る。本発明の別の実施形態では、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、上記ＦＲ、可変重鎖及び可変軽鎖配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列の全てを含め、それらの１つ以上の組合せを含むか、あるいは該組合せから成る。
【０２１１】
本発明は、本明細書に記載の抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列の１つ以上を含むポリヌクレオチド配列をも企図する。本発明の一実施形態では、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、抗体フラグメントをコードする下記ポリヌクレオチド：配列番号１２１の重鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号１３１；配列番号１２２の可変重鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号１３２；配列番号１４１の軽鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号１５１：配列番号１４２の可変軽鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号１５２；配列番号１２１の重鎖配列もしくは配列番号１２２の可変重鎖配列の相補性決定領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号１３４；配列番号１３６；及び配列番号１３８）；配列番号１４１の軽鎖配列もしくは配列番号１４２の可変軽鎖配列の相補性決定領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５４；配列番号１５６；及び配列番号１５８）；配列番号１２１の重鎖配列もしくは配列番号１２２の可変重鎖配列のフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号１３３；配列番号１３５；配列番号１３７；及び配列番号１３９）；ならびに配列番号１４１の軽鎖配列もしくは配列番号１４２の可変軽鎖配列のフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５３；配列番号１５５；配列番号１５７；及び配列番号１５９）の全てを含め、それらの１、２、３またはそれより多くを含むか、あるいはそれらから成る。
【０２１２】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、糖タンパク質に対して結合特異性を有するＦａｂ（抗原結合性フラグメント）フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいは該ポリヌクレオチドから成る。抗体Ａｂ４に関して、全長Ａｂ４抗体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２１の重鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号１３１及び配列番号１４１の軽鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号１５１を含むか、あるいはそれらから成る。
【０２１３】
本発明の別の実施形態は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳＯ、ヒト腎細胞等、または真菌、昆虫、または微生物系、例えば酵母ピキア等の酵母細胞における発現のための発現ベクターに組み込まれるこれらのポリヌクレオチドを企図する。適切なピキア種としては、限定するものではないが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。本明細書に記載（以下に）の発明の一実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、適切な宿主における全長ポリヌクレオチドの発現後のＡｂ４の酵素消化（例えば、パパイン）によって産生され得る。本発明の別の実施形態では、Ａｂ４等の抗糖タンパク質抗体またはそのＦａｂフラグメントは、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳＯもしくはヒト腎細胞等、真菌、昆虫、または微生物系、例えば酵母細胞（例えば二倍体酵母、例えば二倍体ピキア）及び他の酵母株におけるＡｂ４ポリヌクレオチドの発現によって産生され得る。適切なピキア種としては、限定するものではないが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０２１４】
抗体Ａｂ５
一実施形態では、本発明はさらに、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明の一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１６１の重鎖配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｃａｇｃａｇｃａｇｔｔｇｃｔｇｇａｇｔｃｃｇｇｇｇｇａｇｇｃｃｔｇｇｔｃｃａｇｃｃｔｇａｇｇｇａｔｃｃｃｔｇｇｃａｃｔｃａｃｃｔｇｃａｃａｇｃｔｔｃｔｇｇａｔｔｃｔｃｃｔｔｃａｇｔａｇｃｇｇｃｔａｃｇａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇｇｔｃｃｇｃｃａｇｃｃｔｃｃａｇｇｇａａｇｇｇｇｃｔｇｇａｇｔｇｇｇｔｃｇｇｃｔｇｃａｔｔｔａｔａｇｔｇｇｔｇａｔｇａｔａａｔｇａｔａｔｔａｃｔｔａｔｔａｃｇｃｇａｇｃｔｇｇｇｃｇａｇａｇｇｃｃｇａｔｔｃａｃｃａｔｃｔｃｃａａｃｃｃｃｔｃｇｔｃｇａｃｃａｃｔｇｔｇａｃｔｃｔｇｃａａａｔｇａｃｃａｇｔｃｔｇａｃａｇｔｃｇｃｇｇａｃａｃｇｇｃｃａｃｃｔａｔｔｔｃｔｇｔｇｃｇｃｇａｇｇｔｃａｔｇｃｔａｔｔｔａｔｇａｔａａｔｔａｔｇａｔａｇｔｇｔｃｃａｃｔｔｇｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｇａｃｃｃｔｃｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｇａｇｃｇｇｇｃａａｃｃｔａａｇｇｃｔｃｃａｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｃａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｔｇｃｔｇｃｇｇｇｇａｃａｃａｃｃｃｔｃｔａｇｃａｃｇｇｔｇａｃｃｔｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔａｃｃｔｃｃｃｇｇａｇｃｃａｇｔｇａｃｃｇｔｇａｃｃｔｇｇａａｃｔｃｇｇｇｃａｃｃｃｔｃａｃｃａａｔｇｇｇｇｔａｃｇｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｔｃｃｇｔｃｃｇｇｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇｃｃｔｃｔａｃｔｃｇｃｔｇａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｇｃｇｔｇａｃｃｔｃａａｇｃａｇｃｃａｇｃｃｃｇｔｃａｃｃｔｇｃａａｃｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｇｃｃａｃｃａａｃａｃｃａａａｇｔｇｇａｃａａｇａｃｃｇｔｔｇｃｇｃｃｃｔｃｇａｃａｔｇｃａｇｃａａｇｃｃｃａｃｇｔｇｃｃｃａｃｃｃｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃａｃｇｃａｃｃｃｃｃｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｇｇａｔｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇｔｔｃａｃａｔｇｇｔａｃａｔａａａｃａａｃｇａｇｃａｇｇｔｇｃｇｃａｃｃｇｃｃｃｇｇｃｃｇｃｃｇｃｔａｃｇｇｇａｇｃａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇａｔｃｃｇｃｇｔｇｇｔｃａｇｃａｃｃｃｔｃｃｃｃａｔｃｇｃｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａｇｇｇｇｃａａｇｇａｇｔｔｃａａｇｔｇｃａａａｇｔｃｃａｃａａｃａａｇｇｃａｃｔｃｃｃｇｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａｇａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｔｇｇａｇｃｃｇａａｇｇｔｃｔａｃａｃｃａｔｇｇｇｃｃｃｔｃｃｃｃｇｇｇａｇｇａｇｃｔｇａｇｃａｇｃａｇｇｔｃｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃａｔｇａｔｃａａｃｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｔｔｃｃｇａｃａｔｃｔｃｇｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａａｇａａｃｇｇｇａａｇｇｃａｇａｇｇａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｇｇｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔａｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃｔｃａｇｔｇｃｃｃａｃｇａｇｔｇａｇｔｇｇｃａｇｃｇｇｇｇｃｇａｃｇｔｃｔｔｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇｔｃｃａｔｃｔｃｃｃｇｃｔｃｔｃｃｇｇｇｔａａａ（配列番号１７１）。
【０２１５】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１６２の可変重鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｃａｇｃａｇｃａｇｔｔｇｃｔｇｇａｇｔｃｃｇｇｇｇｇａｇｇｃｃｔｇｇｔｃｃａｇｃｃｔｇａｇｇｇａｔｃｃｃｔｇｇｃａｃｔｃａｃｃｔｇｃａｃａｇｃｔｔｃｔｇｇａｔｔｃｔｃｃｔｔｃａｇｔａｇｃｇｇｃｔａｃｇａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇｇｔｃｃｇｃｃａｇｃｃｔｃｃａｇｇｇａａｇｇｇｇｃｔｇｇａｇｔｇｇｇｔｃｇｇｃｔｇｃａｔｔｔａｔａｇｔｇｇｔｇａｔｇａｔａａｔｇａｔａｔｔａｃｔｔａｔｔａｃｇｃｇａｇｃｔｇｇｇｃｇａｇａｇｇｃｃｇａｔｔｃａｃｃａｔｃｔｃｃａａｃｃｃｃｔｃｇｔｃｇａｃｃａｃｔｇｔｇａｃｔｃｔｇｃａａａｔｇａｃｃａｇｔｃｔｇａｃａｇｔｃｇｃｇｇａｃａｃｇｇｃｃａｃｃｔａｔｔｔｃｔｇｔｇｃｇｃｇａｇｇｔｃａｔｇｃｔａｔｔｔａｔｇａｔａａｔｔａｔｇａｔａｇｔｇｔｃｃａｃｔｔｇｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｇａｃｃｃｔｃｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｇａｇｃ（配列番号１７２）。
【０２１６】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１７０の定常重鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｇｇｇｃａａｃｃｔａａｇｇｃｔｃｃａｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｃａｃｔｇｇｃｃｃｃｃｔｇｃｔｇｃｇｇｇｇａｃａｃａｃｃｃｔｃｔａｇｃａｃｇｇｔｇａｃｃｔｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔａｃｃｔｃｃｃｇｇａｇｃｃａｇｔｇａｃｃｇｔｇａｃｃｔｇｇａａｃｔｃｇｇｇｃａｃｃｃｔｃａｃｃａａｔｇｇｇｇｔａｃｇｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｔｃｃｇｔｃｃｇｇｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇｃｃｔｃｔａｃｔｃｇｃｔｇａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｇｃｇｔｇａｃｃｔｃａａｇｃａｇｃｃａｇｃｃｃｇｔｃａｃｃｔｇｃａａｃｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｇｃｃａｃｃａａｃａｃｃａａａｇｔｇｇａｃａａｇａｃｃｇｔｔｇｃｇｃｃｃｔｃｇａｃａｔｇｃａｇｃａａｇｃｃｃａｃｇｔｇｃｃｃａｃｃｃｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃａｃｇｃａｃｃｃｃｃｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｇｇａｔｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇｔｔｃａｃａｔｇｇｔａｃａｔａａａｃａａｃｇａｇｃａｇｇｔｇｃｇｃａｃｃｇｃｃｃｇｇｃｃｇｃｃｇｃｔａｃｇｇｇａｇｃａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇａｔｃｃｇｃｇｔｇｇｔｃａｇｃａｃｃｃｔｃｃｃｃａｔｃｇｃｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａｇｇｇｇｃａａｇｇａｇｔｔｃａａｇｔｇｃａａａｇｔｃｃａｃａａｃａａｇｇｃａｃｔｃｃｃｇｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａｇａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｔｇｇａｇｃｃｇａａｇｇｔｃｔａｃａｃｃａｔｇｇｇｃｃｃｔｃｃｃｃｇｇｇａｇｇａｇｃｔｇａｇｃａｇｃａｇｇｔｃｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃａｔｇａｔｃａａｃｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｔｔｃｃｇａｃａｔｃｔｃｇｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａａｇａａｃｇｇｇａａｇｇｃａｇａｇｇａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｇｇｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃａｇｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔａｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃｔｃａｇｔｇｃｃｃａｃｇａｇｔｇａｇｔｇｇｃａｇｃｇｇｇｇｃｇａｃｇｔｃｔｔｃａｃｃｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇｔｃｃａｔｃｔｃｃｃｇｃｔｃｔｃｃｇｇｇｔａａａ（配列番号１８０）。
【０２１７】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１８１の軽鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ａｔｃｇｔｇａｔｇａｃｃｃａｇａｃｔｃｃａｔｃｔｔｃｃａｇｇｔｃｔｇｔｃｃｃｔｇｔｇｇｇａｇｇｃａｃａｇｔｃａｃｃａｔｃａａｔｔｇｃｃａｇｇｃｃａｇｔｇａａａｔｔｇｔｔａａｔａｇａａａｃａａｃｃｇｃｔｔａｇｃｃｔｇｇｔｔｔｃａａｃａｇａａａｃｃａｇｇｇｃａｇｃｃｔｃｃｃａａｇｃｔｃｃｔｇａｔｇｔａｔｃｔｇｇｃｔｔｃｃａｃｔｃｃｇｇｃａｔｃｔｇｇｇｇｔｃｃｃａｔｃｇｃｇｇｔｔｔａｇａｇｇｃａｇｔｇｇａｔｃｔｇｇｇａｃａｃａｇｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃｇａｔｇｔｇｇｔｇｔｇｔｇａｃｇａｔｇｃｔｇｃｃａｃｔｔａｔｔａｔｔｇｔａｃａｇｃａｔａｔａａｇａｇｔａｇｔａａｔａｃｔｇａｔｇｇｔａｔｔｇｃｔｔｔｃｇｇｃｇｇａｇｇｇａｃｃｇａｇｇｔｇｇｔｇｇｔｃａａａｃｇｔａｃｇｃｃａｇｔｔｇｃａｃｃｔａｃｔｇｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃａｃｃａｔｃｔａｇｃｇａｔｇａｇｇｔｇｇｃａａｃｔｇｇａａｃａｇｔｃａｃｃａｔｃｇｔｇｔｇｔｇｔｇｇｃｇａａｔａａａｔａｃｔｔｔｃｃｃｇａｔｇｔｃａｃｃｇｔｃａｃｃｔｇｇｇａｇｇｔｇｇａｔｇｇｃａｃｃａｃｃｃａａａｃａａｃｔｇｇｃａｔｃｇａｇａａｃａｇｔａａａａｃａｃｃｇｃａｇａａｔｔｃｔｇｃａｇａｔｔｇｔａｃｃｔａｃａａｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｔｃｔｇａｃａｃｔｇａｃｃａｇｃａｃａｃａｇｔａｃａａｃａｇｃｃａｃａａａｇａｇｔａｃａｃｃｔｇｃａａｇｇｔｇａｃｃｃａｇｇｇｃａｃｇａｃｃｔｃａｇｔｃｇｔｃｃａｇａｇｃｔｔｃａｇｔａｇｇａａｇａａｃｔｇｔ（配列番号１９１）。
【０２１８】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１８２の可変軽鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ａｔｃｇｔｇａｔｇａｃｃｃａｇａｃｔｃｃａｔｃｔｔｃｃａｇｇｔｃｔｇｔｃｃｃｔｇｔｇｇｇａｇｇｃａｃａｇｔｃａｃｃａｔｃａａｔｔｇｃｃａｇｇｃｃａｇｔｇａａａｔｔｇｔｔａａｔａｇａａａｃａａｃｃｇｃｔｔａｇｃｃｔｇｇｔｔｔｃａａｃａｇａａａｃｃａｇｇｇｃａｇｃｃｔｃｃｃａａｇｃｔｃｃｔｇａｔｇｔａｔｃｔｇｇｃｔｔｃｃａｃｔｃｃｇｇｃａｔｃｔｇｇｇｇｔｃｃｃａｔｃｇｃｇｇｔｔｔａｇａｇｇｃａｇｔｇｇａｔｃｔｇｇｇａｃａｃａｇｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃｇａｔｇｔｇｇｔｇｔｇｔｇａｃｇａｔｇｃｔｇｃｃａｃｔｔａｔｔａｔｔｇｔａｃａｇｃａｔａｔａａｇａｇｔａｇｔａａｔａｃｔｇａｔｇｇｔａｔｔｇｃｔｔｔｃｇｇｃｇｇａｇｇｇａｃｃｇａｇｇｔｇｇｔｇｇｔｃａａａ（配列番号１９２）。
【０２１９】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１９０の定常軽鎖ポリペプチド配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る：
ｃｇｔａｃｇｃｃａｇｔｔｇｃａｃｃｔａｃｔｇｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃａｃｃａｔｃｔａｇｃｇａｔｇａｇｇｔｇｇｃａａｃｔｇｇａａｃａｇｔｃａｃｃａｔｃｇｔｇｔｇｔｇｔｇｇｃｇａａｔａａａｔａｃｔｔｔｃｃｃｇａｔｇｔｃａｃｃｇｔｃａｃｃｔｇｇｇａｇｇｔｇｇａｔｇｇｃａｃｃａｃｃｃａａａｃａａｃｔｇｇｃａｔｃｇａｇａａｃａｇｔａａａａｃａｃｃｇｃａｇａａｔｔｃｔｇｃａｇａｔｔｇｔａｃｃｔａｃａａｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｔｃｔｇａｃａｃｔｇａｃｃａｇｃａｃａｃａｇｔａｃａａｃａｇｃｃａｃａａａｇａｇｔａｃａｃｃｔｇｃａａｇｇｔｇａｃｃｃａｇｇｇｃａｃｇａｃｃｔｃａｇｔｃｇｔｃｃａｇａｇｃｔｔｃａｇｔａｇｇａａｇａａｃｔｇｔ（配列番号２００）。
【０２２０】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６１の重鎖配列もしくは配列番号１６２の可変重鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）をコードするポリヌクレオチドに対応する配列番号１７４；配列番号１７６；及び配列番号１７８のポリヌクレオチド配列の１つ以上、ならびに／または配列番号１８１の軽鎖配列もしくは配列番号１８２の可変軽鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち超可変領域）に対応する配列番号１９４；配列番号１９６；及び配列番号１９８のポリヌクレオチド配列の１つ以上、またはこれらのポリヌクレオチド配列の組合せを含むか、あるいはそれらから成る。本発明の別の実施形態では、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、上記ＣＤＲ、可変重鎖及び可変軽鎖配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列の全てを含め、それらの１つ以上をコードするポリヌクレオチドの組合せを含むか、あるいは該組合せから成る。
【０２２１】
本発明のさらなる実施形態では、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６１の重鎖配列もしくは配列番号１６２の可変重鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）をコードするポリヌクレオチドに対応する配列番号１７３；配列番号１７５；配列番号１７７；及び配列番号１７９のポリヌクレオチド配列の１つ以上、ならびに／または配列番号１８１の軽鎖配列もしくは配列番号１８２の可変軽鎖配列のフレームワーク領域（ＦＲまたは定常領域）に対応する配列番号１９３；配列番号１９５；配列番号１９７；及び配列番号１９９のポリヌクレオチド配列の１つ以上、またはこれらのポリヌクレオチド配列の組合せを含むか、あるいはそれらから成る。本発明の別の実施形態では、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、上記ＦＲ、可変重鎖及び可変軽鎖配列、ならびに重鎖及び軽鎖配列の全てを含め、それらの１つ以上の組合せを含むか、あるいは該組合せから成る。
【０２２２】
本発明は、本明細書に記載の抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列の１つ以上を含むポリヌクレオチド配列をも企図する。本発明の一実施形態では、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、抗体フラグメントをコードする下記ポリヌクレオチド：配列番号１６１の重鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号１７１；配列番号１６２の可変重鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号１７２；配列番号１８１の軽鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号１９１：配列番号１８２の可変軽鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号１９２；配列番号１６１の重鎖配列もしくは配列番号１６２の可変重鎖配列の相補性決定領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号１７４；配列番号１７６；及び配列番号１７８）；配列番号１８１の軽鎖配列もしくは配列番号１８２の可変軽鎖配列の相補性決定領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号１９４；配列番号１９６；及び配列番号１９８）；配列番号１６１の重鎖配列もしくは配列番号１６２の可変重鎖配列のフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号１７３；配列番号１７５；配列番号１７７；及び配列番号１７９）；ならびに配列番号１８１の軽鎖配列もしくは配列番号１８２の可変軽鎖配列のフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号１９３；配列番号１９５；配列番号１９７；及び配列番号１９９）の全てを含め、それらの１、２、３またはそれより多くを含むか、あるいはそれらから成る。
【０２２３】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、糖タンパク質に対して結合特異性を有するＦａｂ（抗原結合性フラグメント）フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいは該ポリヌクレオチドから成る。抗体Ａｂ５に関して、全長Ａｂ５抗体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６１の重鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号１７１及び配列番号１８１の軽鎖配列をコードするポリヌクレオチド配列番号１９１を含むか、あるいはそれらから成る。
【０２２４】
本発明の別の実施形態は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳＯ、ヒト腎細胞等、または真菌、昆虫、または微生物系、例えば酵母ピキア等の酵母細胞における発現のための発現ベクターに組み込まれるこれらのポリヌクレオチドを企図する。適切なピキア種としては、限定するものではないが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。本明細書に記載（以下に）の発明の一実施形態では、Ｆａｂフラグメントは、適切な宿主における全長ポリヌクレオチドの発現後のＡｂ５の酵素消化（例えば、パパイン）によって産生され得る。本発明の別の実施形態では、Ａｂ５等の抗糖タンパク質抗体またはそのＦａｂフラグメントは、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳＯもしくはヒト腎細胞等、真菌、昆虫、または微生物系、例えば酵母細胞（例えば二倍体酵母、例えば二倍体ピキア）及び他の酵母株におけるＡｂ５ポリヌクレオチドの発現によって産生され得る。適切なピキア種としては、限定するものではないが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０２２５】
所望タンパク質の発現
ホモポリマーまたはヘテロポリマーポリペプチドを含めた所望タンパク質（例えば、組換えタンパク質）、例えば抗体または抗体フラグメントは、酵母及び糸状真菌細胞内で発現し得る。一実施形態では、所望タンパク質は、酵母内で組換えにより発現し、特に好ましい酵母としては、メチロトローフ酵母株、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｒｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｉｎｏｓｉｔｏｖｅｒａ等が挙げられる（例えば、参照によってそれぞれの全体を援用する米国特許第４，８１２，４０５号、第４，８１８，７００号、第４，９２９，５５５号、第５，７３６，３８３号、第５，９５５，３４９号、第５，８８８，７６８号、及び第６，２５８，５５９号を参照されたい）。他の酵母例としては、Ａｒｘｉｏｚｙｍａ；Ａｓｃｏｂｏｔｒｙｏｚｙｍａ；Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ；Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ；Ｄｅｋｋｅｒａ；Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ；Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ；Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ；Ｋｏｄａｍａｅａ；Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ；Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ；Ｐｉｃｈｉａ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒａ；Ｔｅｔｒａｐｉｓｉｓｐｏｒａ；Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ；Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ；Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｙａｒｒｏｗｉａ；Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ；Ｆｉｌｏｂａｓｉｕｍ；Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ；Ｂｕｌｌｅｒａ；Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ及びＦｉｌｏｂａｓｉｄｅｌｌａが挙げられる。
【０２２６】
酵母細胞は、当該技術分野で既知の方法で産生され得る。例えば、種々のコピー数の個々のサブユニット遺伝子を含有する細胞を交配（交配に先だってコピー数が分かるのが好ましい）させることによって遺伝子コピー数の異なる組合せを含む二倍体または四倍体酵母細胞のパネルが産生され得る。
【０２２７】
一実施形態では、酵母細胞は、所望タンパク質または所望マルチサブユニットタンパク質のサブユニットをコードする遺伝子の１つ以上の複数コピーを含み得る。例えば、サブユニット遺伝子の複数コピーを１つ以上の染色体座にタンデムに組み込むことができる。タンデムに組み込まれた遺伝子のコピーは、好ましくは所望のタンパク質またはマルチサブユニット複合体の産生のための培養中に安定したコピー数で保持される。例えば、本出願人らが記載した従前の研究においては、遺伝子コピー数は、一般的に３〜４個のタンデムに組み込まれた軽鎖及び重鎖抗体遺伝子のコピーを含有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株で安定していた（Ｕ．Ｓ．２０１３００４５８８８参照）。
【０２２８】
所望タンパク質またはそのサブユニットをコードする１つ以上の遺伝子を真菌細胞の１つ以上の染色体座に組み込むのが好ましい。遺伝子間配列、プロモーター配列、コーディング配列、終結配列、制御配列等を含め、いずれの適切な染色体座をも組込みに利用可能である。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて使用し得る例示染色体座としては、ＰｐＵＲＡ５；ＯＣＨ１；ＡＯＸ１；ＨＩＳ４；及びＧＡＰが挙げられる。標的にするのではなく、１つ以上のランダムな染色体座にコード化遺伝子を組み込んでもよい。好ましい実施形態では、染色体座は、ｐＧＡＰ座、３’ＡＯＸ  ＴＴ座及びＨＩＳ４  ＴＴ座から成る群より選択される。さらなる例示実施形態では、異種タンパク質サブユニットをコードする遺伝子を１つ以上の染色体外要素、例えば１つ以上のプラスミドまたは人工染色体に含めてよい。
【０２２９】
例示実施形態では、所望タンパク質は、例えば、２、３、４、５、６、もしくはそれより多くの同一及び／または非同一サブユニットを含むマルチサブユニットタンパク質であってよい。さらに、各サブユニットは、各マルチサブユニットタンパク質に１回以上存在してよい。例えば、マルチサブユニットタンパク質は、２つの非同一軽鎖と２つの非同一重鎖を含む二重特異性抗体のような多重特異性抗体であってよい。種々のコピー数の個々のサブユニット遺伝子を含有する細胞を交配させることによって、遺伝子コピー数の異なる組合せを含む二倍体または四倍体酵母細胞のパネルが速やかに産生され得る。次にパネル内の各株からの抗体産生を評価して、所望マルチサブユニットタンパク質の収率または望ましくない副産物に対する所望マルチサブユニットタンパク質の純度等の特性に基づいて、さらに使用する株を同定することができる。
【０２３０】
マルチサブユニットタンパク質のサブユニットは、モノシストロニック遺伝子、ポリシストロニック遺伝子、またはその任意の組合せから発現し得る。各ポリシストロニック遺伝子は、同一サブユニットの複数コピーを含んでよく、またはそれぞれ異なるサブユニットの１つ以上のコピーを含んでよい。
【０２３１】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの操作に利用可能な典型的方法（培養、形質転換、及び交配方法を含めて）は、Ｕ．Ｓ．２００８０００３６４３、Ｕ．Ｓ．２００７０２９８５００、及びＵ．Ｓ．２００６０２７００４５を含む公開された出願、ならびにＨｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｃｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．，Ｅｄｓ．１９９８．Ｐｉｃｈｉａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．、及びＣｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．，Ｅｄ．，２００７，Ｐｉｃｈｉａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．に開示されている。これらはそれぞれ、参照によってその全体が援用される。
【０２３２】
利用し得る典型的発現カセットは、分泌シグナル、次いで発現すべき遺伝子の配列、次いでＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓアルコールオキシダーゼＩ遺伝子（ＡＯＸ１）由来のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ転写終結シグナルをコードする配列に融合したグリセルアルデヒドデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＡＰ遺伝子）プロモーターで構成される。Ｚｅｏｃｉｎ耐性マーカー遺伝子は、より高いレベルのＺｅｏｃｉｎに耐性である形質転換体について選択することによって、株内に発現ベクターの複数の組み込まれたコピーを含む株の富化手段を提供することができる。同様に、Ｇ４１８またはカナマイシン耐性マーカー遺伝子を用いて、より高いレベルのジェネテシンまたはカナマイシンに耐性である形質転換体について選択することによって、株内に発現ベクターの複数の組み込まれたコピーを含む株の富化手段を提供することができる。
【０２３３】
利用できる酵母株としては、栄養要求性Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたは他のピキア株、例えば、ｍｅｔ１、ｌｙｓ３、ｕｒａ３及びａｄｅ１または他の栄養要求性関連遺伝子に突然変異を有する株が挙げられる。好ましい突然変異は、いずれの認識できる頻度でも復帰変異体を生じさせる能力がなく、好ましくは部分的、さらに好ましくは完全な欠失変異体である。好ましくは、栄養要求性株の補完セットを交配させることによって、原栄養の二倍体または四倍体株を生成する。
【０２３４】
形質転換前に、標的ゲノム座（例えば、ＧＡＰプロモーター配列）に相同性の領域内で制限酵素切断によって各発現ベクターを直線化して、真菌細胞内の標的座へのベクターの組込みを方向づけることができる。次にエレクトロポレーションまたは他の方法で各ベクターの試料を個々に所望株の培養中に形質転換させて、成功した形質転換体を選択可能マーカー、例えば、抗生物質耐性または栄養要求性の補完を利用して選択することができる。分離菌を摘み、単一コロニーのために選択的条件下で画線培養してから調査して、各株から抽出されたゲノムＤＮＡについてのサザンブロットまたはＰＣＲアッセイによって所望タンパク質またはマルチサブユニット複合体（例えば所望抗体）のサブユニットをコードする遺伝子のコピー数を確認することができる。場合により、例えば、ＦＡＣＳ、ウエスタンブロット、コロニーリフト及び免疫ブロット、及び他の当該技術分野で既知の手段によって、予想したサブユニット遺伝子産物の発現を確認してよい。場合により、追加の異種遺伝子、例えば、異なる座に組み込まれた同一サブユニットの追加コピー及び／または異なるサブユニットのコピーを導入するために一倍体分離菌を追加回数形質転換させる。次に一倍体株を交配させて、多タンパク質複合体を合成できる二倍体株（またはさらに高い倍数の株）を作り出す。サザンブロット法、ＰＣＲ、及び他の当該技術分野で既知の検出手段によって各予測サブユニット遺伝子の存在を確認し得る。所望多タンパク質複合体が抗体である場合、その発現は、コロニーリフト／免疫ブロット法（Ｗｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２１  ８０８−８１２（１９９６））及び／またはＦＡＣＳでも確認可能である。
【０２３５】
場合により、この形質転換プロトコルを繰り返して、第１座への標的にしたのと同一遺伝子または異なる遺伝子であってよい異種遺伝子を第２座への標的にする。第２座に組み込むべきコンストラクトが第１座によりコードされた配列と同一または非常に類似するタンパク質をコードするときは、その配列を変えて、第１座への望ましくない組込みの可能性を減らしてよい。例えば、第２座に組み込むべき配列は、プロモーター配列、終結配列、コドン利用、及び／または第１座に組み込まれた配列に対して容認できる他の配列の差異を有してよい。
【０２３６】
一倍体Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の形質転換及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ性周期の遺伝子操作は、前出のＰｉｃｈｉａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９９８、２００７）に記載されている通りに行ってよい。
【０２３７】
本発明に用いる発現ベクターはさらに、形質転換した酵母株を同定するための選択可能な栄養要求性または薬物マーカーを含めた酵母特異性配列を含んでよい。薬物マーカーをさらに用いて、例えば上昇濃度の薬物中で細胞集団を培養し、それによって上昇レベルの耐性遺伝子を発現する形質転換体を選択することによって、酵母細胞内のベクターのコピー数を増幅することができる。
【０２３８】
興味あるポリペプチドコーディング配列は、典型的に、酵母細胞におけるポリペプチドの発現をもたらす転写制御配列及び翻訳制御配列に作動可能に連結される。これらのベクター成分としては、限定するものではないが、以下の１つ以上が挙げられる：エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。ポリペプチドの分泌のための配列には、例えば、シグナル配列等も含まれ得る。発現ベクターが酵母ゲノムに組み込まれることが多いので、酵母の複製開始点は任意的である。
【０２３９】
例示実施形態では、所望のタンパク質またはそのサブユニットをコードする遺伝子の１つ以上を誘導性プロモーターに連結する。適切な例示プロモーターとしては、アルコールオキシダーゼ１遺伝子プロモーター、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＦＬＤ；米国特許公開第２００７／０２９８５００号参照）、及び当該技術分野で既知の他の誘導性プロモーターが挙げられる。アルコールオキシダーゼ１遺伝子プロモーターは、グルコース、グリセロール、またはエタノール等の多くの一般的な炭素源上での酵母の成長中は厳重に抑圧されるが、メタノール上での成長中は非常に誘発される（Ｔｓｃｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｓｔｒｏｍａｎ，Ｄ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌに対する米国特許第４，８５５，２３１号）。外来タンパク質の産生では、株は最初に抑圧性炭素源上で成長してバイオマスを作り出してから、単独（主要）炭素及びエネルギー源としてのメタノールに移動して外来遺伝子の発現を誘発する。この制御系の１つの利点は、抑圧条件下で成長させることによって、発現産物が細胞に毒性である外来遺伝子で形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を維持できることである。
【０２４０】
別の例示実施形態では、１つ以上の所望遺伝子を制御プロモーターに結合させて、適切な条件下でその発現レベルを上方制御することができる。ピキア由来の適切なプロモーターの例としては、ＣＵＰ１（培地内の銅レベルによって誘導される）、テトラサイクリン誘導性プロモーター、チアミン誘導性プロモーター、ＡＯＸ１プロモーター（Ｃｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：１３１６−１３２３）；ＩＣＬ１プロモーター（Ｍｅｎｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｙｅａｓｔ  ２０（１３）：１０９７−１０８）；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ＧＡＰ）（Ｗａｔｅｒｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｅ  １８６（１）：３７−４４）；及びＦＬＤ１プロモーター（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅ  ２１６（１）：９３−１０２）が挙げられる。ＧＡＰプロモーターは、強力な構成的プロモーターであり、ＣＵＰ１、ＡＯＸ及びＦＬＤ１プロモーターは誘導性である。前述の各参考文献は、参照によってその全体が本明細書に援用される。
【０２４１】
他の酵母プロモーターとしては、ＡＤＨ１、アルコールデヒドロゲナーゼＩＩ、ＧＡＬ４、ＰＨＯ３、ＰＨＯ５、Ｐｙｋ、及びそれら由来のキメラプロモーターが挙げられる。さらに、本発明では、哺乳類、昆虫、植物、爬虫類、両生類、ウイルス、及び鳥類プロモーター等の非酵母プロモーターを使用し得る。最も典型的には、プロモーターは哺乳類プロモーター（発現遺伝子に内在性の可能性がある）を含むかまたは酵母系での有効な転写をもたらす酵母もしくはウイルスプロモーターを含むであろう。
【０２４２】
興味あるポリペプチドは、直接的のみならず、異種ポリペプチド、例えばシグナル配列または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換えによって産生され得る。一般に、シグナル配列は、ベクターの成分であってよく、またはシグナル配列は、ベクターに挿入されるポリペプチドコーディング配列の一部であってよい。選択される異種シグナル配列は、好ましくは真菌細胞内で利用可能な標準的経路の１つを経て認識及び処理されるものである。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓからの種々の組換えタンパク質の分泌において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子プレプロシグナルが有効であることが分かった。他の酵母シグナル配列としては、アルファ交配因子シグナル配列、インベルターゼシグナル配列、及び他の分泌酵母ポリペプチド由来のシグナル配列が挙げられる。さらに、これらのシグナルペプチド配列を操作して、二倍体酵母発現系における分泌を高めることができる。興味ある他の分泌シグナルとしては、哺乳類シグナル配列もあり、分泌されるタンパク質に対して異種であるか、または分泌されるタンパク質にとって未変性配列であり得る。シグナル配列は、プレペプチド配列を含み、場合によっては、プロペプチド配列を含むことがある。多くの該シグナル配列は当該技術分野で既知であり、免疫グロブリン鎖に見られるシグナル配列、例えば、Ｋ２８プレプロトキシン配列、ＰＨＡ−Ｅ、ＦＡＣＥ、ヒトＭＣＰ−１、ヒト血清アルブミンシグナル配列、ヒトＩｇ重鎖、ヒトＩｇ軽鎖等が挙げられる。例えば、それぞれ参照によってその全体をここに援用するＨａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ．  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １１（２）  ７５（１９９８）；及びＫｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ．  ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  ２（４）２５７（１９９８）を参照されたい。
【０２４３】
転写活性化因子配列をベクターに挿入することによって転写を増加させ得る。これらの活性化因子は、ＤＮＡのシス作用性エレメントであり、通常は約１０〜３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増加させる。転写エンハンサーは、比較的配向及び位置非依存的であり、イントロン内ならびにコーディング配列自体内では、転写単位に対して５’及び３’であることが分かっている。エンハンサーは、コーディング配列に対して位置５’または３’で発現ベクター中にスプライス可能であるが、プロモーターからの部位５’に位置するのが好ましい。
【０２４４】
任意であるが、一実施形態では、培地への発現ポリペプチドの分泌をもたらす分泌配列に、所望のタンパク質もしくはマルチサブユニット複合体の１つ以上のサブユニットを作動可能に連結、または融合させると、所望のタンパク質もしくはマルチサブユニット複合体の採取及び精製を促進することができる。なおさらに好ましくは、好ましいコドンを選択し、及び／またはコドン選択によりＡＴ塩基対の割合を変えることを介してのように、分泌配列は、真菌細胞（例えば、酵母二倍体細胞）からのポリペプチドの最適化分泌を可能にする。分泌の効率及び／または安定性は、分泌配列の選択によって影響を受け得ること及び最適分泌配列は様々なタンパク質間で異なり得ることは当該技術分野で既知である（例えば、参照によってその全体をここに援用するＫｏｇａｎｅｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ２００１  Ｓｅｐ；１４（９）：７０５−１０を参照されたい）。可能性のある多くの適切な分泌シグナルは当該技術分野で既知であり、特定の所望タンパク質もしくはマルチサブユニット複合体の収率及び／または純度に及ぼすそれらの効果について容易に試験することができる。いずれの分泌配列も利用できる可能性があり、酵母及び他の種の分泌タンパク質に存在するものならびに、操作された分泌配列が含まれる。それぞれ参照によってその全体をここに援用するＨａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｏｌ．１１  ｎｏ．２  ｐｐ．７５−７７，１９９８；Ｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９  Ｎｏｖ；６３（１１）：１９７７−８３；Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５（２００５）１０７９−１０９６；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００５  Ｄｅｃ；４２（６）：１３５５−６３；Ｒａｅｍａｅｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９  Ｏｃｔ  １；２６５（１）：３９４−４０３；Ｋｏｇａｎｅｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．（２００１）１４（９）：７０５−７１０；Ｄａｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．２００６  Ａｐｒ；４６（２）：４５６−６７；及びＤａｍａｓｃｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００７）７４：３８１−３８９；及びＦｅｌｇｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０  Ａｕｇ  ２５；１８（１６）：４９２７を参照されたい。
【０２４５】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれると「作動可能に連結」される。例えば、シグナル配列のためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質としてそれが発現される場合に該ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーターまたはエンハンサーは、それが該配列の転写に影響を及ぼす場合にコーディング配列に作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列が近接しており、また、分泌リーダーの場合は、近接し、かつ読み枠内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、近接している必要がない。便利な制限部位でのライゲーションによってかあるいは当業者によく知られているＰＣＲ／組換え法によってリンキングを達成することができる（Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  Ｃａｌｉｆ．）。該部位が存在しない場合、従来の慣例に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用してよい。（作動可能に連結された配列を含む核酸を含めて）所望核酸を化学合成によって生成してもよい。
【０２４６】
分泌シグナルに作動可能に連結または融合させずに、培地中にタンパク質を分泌させてもよい。例えば、分泌シグナルに連結または融合されていなくてもＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ内で発現されると、いくつかの所望ポリペプチドは培地中に分泌されることが実証された。さらに、当該技術分野で既知の方法を用いて真菌細胞からタンパク質を精製することができる（これは、例えば、タンパク質が十分に分泌されない場合に好ましいことがある）。
【０２４７】
当然のことながら、本発明は、記載した特定の方法論、プロトコル、細胞系、動物種または動物属、及び試薬に限定されず、これらは変わる可能性があるからである。また、当然のことながら、本明細書で使用する用語法は、特定の実施形態のみを記述することを目的とし、本発明の範囲を制限する意図ではなく、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることになる。
【０２４８】
本明細書で使用する場合、単数形の「ａ」、「ａｎｄ（及び）」、「ｔｈｅ」には、文脈が明白にそうでないと指示していない限り、複数の参照対象が含まれる。従って、例えば、「ａ  ｃｅｌｌ（細胞）」への言及には、複数の該細胞が含まれ、「ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（タンパク質）」への言及には、１つ以上のタンパク質及び当該技術分野で既知のその等価物が含まれる等である。本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、別段の明白な指示がない限り、本発明が属する技術の当業者が一般的に解釈するのと同じ意味を有する。
【０２４９】
本明細書で使用する場合、用語「糸状真菌細胞」、「糸状真菌宿主細胞」、及び「糸状真菌」は、互換的に使用され、属Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ及びＣｌａｖｉｃｅｐｓからのいずれの種由来のいずれの細胞をも意味するものとする。糸状真菌としては、限定するものではないが、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｍｉｅｈｅｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、及びＦｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍが挙げられる。本発明では、これは、培養で成長可能ないずれの糸状真菌細胞をも広く包含する意図である。
【０２５０】
本明細書で使用する場合、用語「酵母細胞」は、属Ａｒｘｉｏｚｙｍａ；Ａｓｃｏｂｏｔｒｙｏｚｙｍａ；Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ；Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ；Ｄｅｋｋｅｒａ；Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ；Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ；Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ；Ｋｏｄａｍａｅａ；Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ；Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ；Ｐｉｃｈｉａ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒａ；Ｔｅｔｒａｐｉｓｉｓｐｏｒａ；Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ；Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ；Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｙａｒｒｏｗｉａ；Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ；Ｆｉｌｏｂａｓｉｕｍ；Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ；Ｂｕｌｌｅｒａ；Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ及びＦｉｌｏｂａｓｉｄｅｌｌａからのいずれの種由来のいずれの細胞をも指す。酵母としては、限定するものではないが、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ．（Ｏｇａｔａｅａ  ｓｐｐ．）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。本発明では、これは、培養で成長可能ないずれの酵母細胞をも広く包含する意図である。
【０２５１】
本発明の好ましい実施形態では、酵母細胞は、Ｐｉｃｈｉａ属または別のメチロトローフのメンバーである。本発明のさらに好ましい実施形態では、Ｐｉｃｈｉａ属の真菌細胞は、下記種の１つである：Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、及びＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）。本発明の特に好ましい実施形態では、Ｐｉｃｈｉａ属の真菌細胞は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ種である。
【０２５２】
該種は、一倍体、二倍体、または他の倍数体型で存在し得る。所与の倍数性の細胞は、適切な条件下で、当該型で不確定世代数にわたって増殖し得る。二倍体細胞は、胞子形成して一倍体細胞を形成することもできる。逐次交配は、二倍体株のさらなる交配または融合を経て四倍体株をもたらし得る。本発明は、一倍体酵母ならびに、例えば、交配または融合（例えば、スフェロプラスト融合）によって生成される二倍体または他の倍数体酵母細胞の使用を企図する。
【０２５３】
本明細書で使用する場合、「一倍体酵母細胞」は、その正常ゲノム（染色体）補体の各遺伝子の単一コピーを有する細胞を指す。
【０２５４】
本明細書で使用する場合、「倍数体酵母細胞」は、その正常ゲノム（染色体）補体の１つより多くのコピーを有する細胞を指す。
【０２５５】
本明細書で使用する場合、「二倍体酵母細胞」は、典型的に２つの一倍体細胞の融合（交配）プロセスによって形成される、その正常ゲノム補体の基本的にあらゆる遺伝子の２つのコピー（アレル）を有する細胞を指す。
【０２５６】
本明細書で使用する場合、「四倍体酵母細胞」は、２つの二倍体細胞の融合（交配）プロセスによって形成される、その正常ゲノム補体の基本的にあらゆる遺伝子の４つのコピー（アレル）を有する細胞を指す。四倍体は、２、３、４、またはそれより多くの異なる発現カセットを保有し得る。該四倍体は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるホモ接合性雌雄異型ａ／ａ及びアルファ／アルファ二倍体の選択的交配によって、ならびにピキアにおける栄養要求性二倍体を得るための一倍体の逐次交配によって得てよい。例えば、［ｍｅｔ  ｈｉｓ］一倍体を［ａｄｅ  ｈｉｓ］一倍体と交配させて二倍体［ｈｉｓ］を得ることができ；［ｍｅｔ  ａｒｇ］一倍体を［ａｄｅ  ａｒｇ］一倍体と交配させて二倍体［ａｒｇ］を得ることができ；次に二倍体［ｈｉｓ］を二倍体［ａｒｇ］と交配させて四倍体原栄養株を得ることができる。当業者には当然のことながら、二倍体細胞の利益及び用途は、四倍体細胞にも当てはまり得る。
【０２５７】
本明細書で使用する場合、「酵母交配」は、２つの酵母細胞が融合して単一の酵母細胞を形成するプロセスを指す。融合される細胞は、一倍体またはより高い倍数性の細胞であり得る（例えば、四倍体細胞を生成するための２つの二倍体細胞の交配）。
【０２５８】
本明細書で使用する場合、「減数分裂」は、二倍体酵母細胞が、減少的分割を受けて４つの一倍体胞子産物を形成するプロセスを指す。次に各胞子が発芽して、植物のように成長する一倍体細胞系を形成し得る。
【０２５９】
本明細書で使用する場合、「折り畳み」は、ポリペプチド及びタンパク質の三次元構造を指し、アミノ酸残基間の相互作用が作用して該構造を安定化する。構造を決定する際には非共有結合性相互作用が重要であるが、通常は興味あるタンパク質は、２つのシステイン残基によって形成される分子内及び／または分子間ジスルフィド共有結合を有するであろう。天然に存在するタンパク質及びポリペプチドまたはその誘導体及び変異体については、適切な折り畳みは、典型的に最適生物活性をもたらす配置であり、活性、例えばリガンド結合性、酵素活性等についてのアッセイにより簡単にモニタリング可能である。
【０２６０】
場合によっては、例えば所望産物が合成起源である場合、生物活性に基づくアッセイはあまり意味がないであろう。該分子の適切な折り畳みは、物理的性質、エネルギー性考慮、モデル化研究等に基づいて決定可能である。
【０２６１】
折り畳み及びジスルフィド結合形成を増強する１つ以上の酵素、すなわち、フォルダーゼ、シャペロニン等をコードする配列の導入によって発現宿主をさらに修飾することができる。該配列は、当該技術分野で既知なように、ベクター、マーカー等を用いて構成的または誘導的に酵母宿主細胞内で発現され得る。所望パターンの発現に十分な転写制御エレメントを含めた配列を標的方法論により安定的に酵母ゲノムに組み込むのが好ましい。
【０２６２】
例えば、真核生物のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）は、タンパク質システイン酸化及びジスルフィド結合異性化の効率的触媒であるのみならず、シャペロン活性をも示す。ＰＤＩの同時発現は、複数のジスルフィド結合を有する活性タンパク質の産生を促進することができる。ＢＩＰ（免疫グロブリン重鎖結合タンパク質）；シクロフィリン等の発現も興味がある。本発明の一実施形態では、各一倍体親株が別個の折り畳み酵素を発現する、例えば一方の株がＢＩＰを発現し、他方の株がＰＤＩを発現することができ、またはその組合せである交配によって生成された酵母株から所望のタンパク質またはマルチサブユニット複合体を発現させ得る。
【０２６３】
用語「所望タンパク質」及び「所望ポリペプチド」は互換的に使用され、一般的に、特定の一次構造（すなわち、配列）を含む宿主酵母または糸状真菌細胞内で発現されるタンパク質（典型的に異種または組換えによって発現されるタンパク質）を指す。所望タンパク質は、ホモポリマーまたはヘテロポリマーマルチサブユニットタンパク質複合体であってよい。例示多量体組換えタンパク質としては、限定するものではないが、多量体ホルモン（すなわち、インスリンファミリー、リラキシンファミリー及び他のペプチドホルモン）、成長因子、受容体、抗体、サイトカイン、受容体リガンド、転写因子または酵素が挙げられる。
【０２６４】
好ましくは、所望タンパク質は、抗体または抗体フラグメント、例えばヒト化もしくはヒト抗体またはその結合部分であってよい。一態様では、ヒト化抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、またはウシ起源である。好ましくは、ヒト化抗体は、ウサギ起源である。別の態様では、抗体または抗体フラグメントは、一価、二価、または多価抗体を含む。さらに別の態様では、抗体または抗体フラグメントは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＢＡＦＦ、ＣＸＣＬ１３、ＩＰ−１０、ＣＢＰ、アンジオテンシン（アンジオテンシンＩ及びアンジオテンシンＩＩ）、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＰＯ、ＥＧＦ、ＦＳＨ、ＴＳＨ、ｈＣＧ、ＣＧＲＰ、ＮＧＦ、ＴＮＦ、ＨＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＰＣＳＫ９またはＨＲＧに特異的に結合する。
【０２６５】
本明細書で使用する場合、用語「分子クラウディング薬」は、利用できる溶媒の体積を減らすことができる薬剤を指し、これには巨大分子クラウディング薬及びコスモトロピック分子クラウディング薬がある。分子クラウディング薬には、溶質がより小さい体積に制限されるように、体積排除をもたらす立体的反発に起因する溶質の有効濃度を大いに上昇させ得る体積占有剤が含まれる。さらなる例示分子クラウディング薬としては、体積排除効果をもたらす構造水によって作動すると考えられるより低分子量の薬剤（すなわち、コスモトロープ）がある。より大きい分子は、分子クラウディング薬分子または構造水間の空間にうまく収まらないので、体積排除効果の影響は、典型的に溶質の大きさに伴って増加する。分子クラウディング薬は、薬剤の有効濃度上昇の結果として反応速度論が大いに変わり得る細胞内条件を模倣すると文献に記載されている（例えば、それぞれ参照によってその全体をここに援用するＣｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００５  Ｍａｒ  ２９；１０２（１３）：４７５３−８；Ｅｌｌｉｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．２００１  Ｏｃｔ；２６（１０）：５９７−６０４；及びＥｌｌｉｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．２００１  Ｆｅｂ；１１（１）：１１４−９参照）。理論によって限定する意図ではないが、分子クラウディング薬の存在が、細胞から排出されたポリペプチド（例えば抗体）が細胞表面で分子（例えば捕捉試薬）と相互作用できる速度を高めることができ、それによって、排出されたポリペプチドを排出した特定細胞による該ポリペプチドの捕捉速度を高めると考えられる。やはり理論によって限定する意図ではないが、分子クラウディング薬は、細胞から排出されたポリペプチドが異なる細胞の近くに拡散できる速度を減じることができ、ある細胞から排出されたポリペプチドが別の細胞の表面で捕捉試薬に結合できるであろう「交差結合」効果を減じることになると考えられる。分子クラウディング薬には、天然及び合成分子がある。例示巨大分子クラウディング薬としては、巨大分子、例えばポリマー（限定ではなく、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリビニルアルコールが挙げられる）、ヘモグロビン、血清アルブミン（とりわけ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が挙げられる）、卵白アルブミン、デキストラン（例えばデキストラン７０）、及びＦｉｃｏｌｌ（商標）が挙げられる。Ｆｉｃｏｌｌ（商標）は、中性の高度に分岐した高質量の親水性多糖類を指し、典型的に不活性かつ極性であり、一般的にタンパク質と相互作用しない。例示Ｆｉｃｏｌｌ（商標）は、７４ｋＤａの平均分子量を有するスクロースエピクロロヒドリンコポリマーである、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）７０である。さらに、述べたように、分子クラウディング薬としては、水−水相互作用の安定性及び構造を高め得るコスモトロピック分子、例えば、ＣＯ２−３、ＳＯ２−４、ＨＰＯ２−４、マグネシウム（２＋）、リチウム（１＋）、亜鉛（２＋）及びアルミニウム（＋３）、ならびにそれらの塩を含めたイオン性コスモトロープならびに、糖（例えばトレハロース及びグルコース）ならびにプ��リン及びｔｅｒｔ−ブタノールを含めた非イオン性コスモトロープが挙げられる。巨大分子クラウディング薬は、約５％〜約５０％ｗ／ｖ（例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、もしくは約５０％ｗ／ｖ、またはこれらの間の任意の範囲）の量で組成物中に含めることができる。「交差結合」効果を減じることができる所与の分子クラウディング薬の濃度は、ルーチン的実験により、例えば本明細書の実施例１０に記載の実験方法論を用いて決定可能である。
【０２６６】
用語「抗体」には、エピトープに適合してそれを認識する特異形状を有するいずれのポリペプチド鎖含有分子構造も含まれ、１つ以上の非共有結合性相互作用が、分子構造とエピトープの間の複合体を安定化する。原型抗体分子は免疫グロブリンであり、全ての起源、例えばヒト、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、他の哺乳類、ニワトリ、他の鳥類等由来の全ての型の免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等を「抗体」とみなす。本発明の出発物質として有用な抗体を産生させるための好ましい起源はウサギである。多数の抗体コーディング配列が記載されており、また、当該技術分野で既知の方法で他の抗体を産生させ得る。その例としては、キメラ抗体、ヒト抗体及び他の非ヒト哺乳類抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、例えばｓｃＦｖ、キャメルボディー（ｃａｍｅｌｂｏｄｉｅｓ）、ナノボディー（ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）、ＩｇＮＡＲ（サメ由来の単鎖抗体）、小モジュラー免疫医薬（ｓｍａｌｌ−ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（ＳＭＩＰ）、及び抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等が挙げられる。Ｓｔｒｅｌｔｓｏｖ  Ｖ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｓｈａｒｋ  ＩｇＮＡＲ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  ｅａｒｌｙ−ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｉｓｏｔｙｐｅ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ２００５  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；１４（１１）：２９０１−９．Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｓｅｐ．３０；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｔｈａｔ  ｕｎｄｅｒｇｏｅｓ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｈａｒｋｓ，Ｎａｔｕｒｅ．  １９９５  Ｍａｒ．  ９；３７４（６５１８）：１６８−７３；Ｎｕｔｔａｌｌ  Ｓ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｒｏｍ  ｗｏｂｂｅｇｏｎｇ  ｓｈａｒｋｓ，ａｎｄ  ｕｓｅ  ａｓ  ａ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｏｏｐ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  Ａｕｇｕｓｔ；３８（４）：３１３−２６；Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｅｖｏｉｄ  ｏｆ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ．１９９３  Ｊｕｎ．３；３６３（６４２８）：４４６−８；Ｇｉｌｌ  Ｄ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；１７（６）：６５３−８．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｏｃｔ．１９を参照されたい。前述の各参考文献は、参照によってその全体がここに援用される。
【０２６７】
例えば、抗体または抗原結合性フラグメントは、遺伝子操作によって生成可能である。この技術では、他の方法と同様に、抗体産生性細胞を所望抗原または免疫原に対して感作させる。抗体産生性細胞から単離したメッセンジャーＲＮＡを鋳型として用いて、ＰＣＲ増幅を利用してｃＤＮＡを作製する。増幅された免疫グロブリンｃＤＮＡの適切な切片の発現ベクターへの挿入によって、最初の抗原特異性を保持するそれぞれ１つの重鎖遺伝子と１つの軽鎖遺伝子を含有するベクターのライブラリーを生成する。重鎖遺伝子ライブラリーを軽鎖遺伝子ライブラリーと組合せることによってコンビナトリアルライブラリーを作成する。これが重鎖と軽鎖を同時発現するクローンのライブラリーをもたらす（抗体分子のＦａｂフラグメントまたは抗原結合性フラグメントに似ている）。これらの遺伝子を運ぶベクターを宿主細胞に同時導入する。この遺伝子導入された宿主において抗体遺伝子合成を誘導すると、重鎖及び軽鎖タンパクが自己組織化して活性抗体を生成し、これは抗原または免疫原による分泌によって検出可能である。
【０２６８】
興味ある抗体コーディング配列には、未変性配列によってコードされるものならびに、遺伝子コードの縮重のため、開示核酸に対して配列が同一でない核酸及びその変異体も含まれる。変異体ポリペプチドは、アミノ酸（ａａ）の置換、付加または欠失を含み得る。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であるかあるいはグリコシル化部位を変えるため、または機能にとって必要ない１つ以上のシステイン残基の置換もしくは欠失による誤った折り畳みを最小限にするため等の非必須アミノ酸を排除するための置換であり得る。タンパク質の特定領域（例えば、機能性ドメイン、触媒性アミノ酸残基等）の増強された生物活性を保持または有するように変異体をデザインすることができる。変異体は、本明細書に開示するポリペプチドのフラグメント、特に生物活性フラグメント及び／または機能性ドメインに対応するフラグメントをも包含する。クローン化遺伝子のインビトロ突然変異誘発のための技術は知られている。本発明には、タンパク質分解に対する耐性を改善するかまたは溶解特性を最適化するかまたは治療薬としてさらに適するものにするように、通常の分子生物学技術を用いて修飾したポリペプチドも含まれる。
【０２６９】
キメラ抗体は、組換え手段により、１種の抗体産生性細胞から得た可変軽鎖及び重鎖領域（ＶＬ及びＶＨ）を、別の種から得た定常軽鎖及び重鎖領域と組合せることによって作製可能である。典型的にキメラ抗体は、主にヒトドメインを有する抗体を生成するため、げっ歯類またはウサギの可変領域及びヒトの定常領域を利用する。該キメラ抗体の生成は当該技術分野で既知であり、標準的手段により達成可能である（例えば、参照によってその全体をここに援用する米国特許第５，６２４，６５９号に記載されているように）。さらに、本発明のキメラ抗体のヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４定常領域から選択され得ることを企図する。
【０２７０】
さらに多くのヒト様免疫グロブリンドメインを含有し、動物由来抗体の相補性決定領域のみを組み込むようにヒト化抗体を操作する。これは、モノクロナール抗体の可変領域の超可変ループの配列を慎重に調査し、それらをヒト抗体鎖の構造に適合させることによって達成される。表面的に複雑であるが、このプロセスは実際には簡単である。例えば、参照によって全体をここに援用する米国特許第６，１８７，２８７号を参照されたい。抗体のヒト化方法は、発行された米国特許第７９３５３４０号に以前に記載されており、この開示全体は参照によってここに援用される。場合によっては、活性を維持するために追加のウサギフレームワーク残基が必要かどうかを決定する必要がある。場合によっては、ヒト化抗体はさらに、親和性または活性の損失を最小限にするために保持すべきいくつかの重大な意味を持つウサギフレームワーク残基を必要とする。これらの場合、所望活性を有するためには、ヒト生殖系列配列からの単一または複数のフレームワークアミノ酸を変えて本来のウサギアミノ酸に戻すことが必要である。これらの変化を実験的に決定して、親和性及び活性を保存するためにどのウサギ残基が必要かを同定する。
【０２７１】
全免疫グロブリン（またはそれらの組換え対応物）に加えて、エピトープ結合部位を含む免疫グロブリンフラグメント（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または他のフラグメント）を合成することができる。組換え免疫グロブリン技術を利用して「フラグメント」、または最小免疫グロブリンをデザインすることができる。例えば、本発明に用いる「Ｆｖ」免疫グロブリンは、融合可変軽鎖領域及び可変重鎖領域を合成することによって生成可能である。抗体の組合せ、例えば、２つの別個のＦｖ特異性を含む二重特異性抗体にも興味がある。本発明の別の実施形態では、免疫グロブリンフラグメントによってＳＭＩＰ（小分子免疫医薬）、キャメルボディー、ナノボディー、及びＩｇＮＡＲが包含される。
【０２７２】
免疫グロブリン及びそのフラグメントを翻訳後に修飾して、例えば、化学リンカー等のエフェクター成分、検出可能成分、例えば蛍光色素、酵素、毒素、基質、生物発光物質、放射性物質、化学発光部分等を加えることができる、または特異的結合部分、例えばストレプトアビジン、アビジン、もしくはビオチン等を本発明の方法及び組成物に利用することができる。追加エフェクター分子の例については以下に提供する。
【０２７３】
本明細書で使用する場合、「半抗体」、「半抗体種」または「Ｈ１Ｌ１」は、単一の抗体重鎖及び単一の抗体軽鎖を含むが、第２の抗体重鎖及び抗体軽鎖への共有結合がないタンパク質複合体を指す。２つの半抗体は、（完全抗体に類似の挙動、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定される見掛けの分子量を与え得る）いくつかの条件下では非共有結合により会合したままであり得る。同様に、Ｈ２Ｌ１は、２つの抗体重鎖と単一の抗体軽鎖を含むが、第２の抗体軽鎖への共有結合がないタンパク質複合体を指し；これらの複合体も、別の抗体軽鎖と非共有結合的に会合し得る（及び同様に完全抗体に類似の挙動を与える）。完全抗体のように、半抗体種及びＨ２Ｌ１種は、還元条件下で個々の重鎖及び軽鎖に解離し得る。半抗体種及びＨ２Ｌ１種は、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて完全抗体より低い見掛けの分子量で遊走する種として検出可能であり、例えば、Ｈ１Ｌ１は、完全抗体の見掛けの分子量（例えば、約７５ｋＤａ）の約半分で遊走する。
【０２７４】
本明細書で使用する場合、「所望ポリペプチドを安定的に発現するかまたは長期間にわたって発現する倍数体酵母」は、少なくとも数日〜１週間、さらに好ましくは少なくとも１カ月間、さらに好ましくは少なくとも１〜６カ月間、なおさらに好ましくは１年より長く閾値発現レベル、典型的に少なくとも５０〜５００ｍｇ／リットル（培養の約９０時間後）、好ましくは実質的により大きいレベルで前記ポリペプチドを分泌する酵母培養を指す。
【０２７５】
本明細書で使用する場合、「所望量の所望ポリペプチドを分泌する倍数体酵母培養」は、安定的にまたは長期間にわたって少なくとも５０〜５００ｍｇ／リットル、最も好ましくは５００〜１０００ｍｇ／リットル以上で分泌する培養を指す。
【０２７６】
ポリヌクレオチド配列は、遺伝子コードに従うポリヌクレオチド配列の翻訳がポリペプチド配列をもたらす（すなわち、該ポリヌクレオチド配列が該ポリペプチド配列を「コードする）場合に、ポリペプチド配列に「対応し」、２つのポリヌクレオチド配列が同一のポリペプチド配列をコードする場合に、あるポリヌクレオチド配列は別のポリヌクレオチド配列に「対応する」。
【０２７７】
ＤＮＡコンストラクトの「異種」領域またはドメインは、より大きいＤＮＡ分子内のＤＮＡの同定可能セグメントであり、そのより大きい分子を伴っては自然界に見られない。従って、異種領域が哺乳類遺伝子をコードすると、該遺伝子は通常は、起源生物のゲノム内の哺乳類ゲノムＤＮＡと隣接しないＤＮＡと隣接することになる。異種領域の別の例は、コーディング配列自体が自然界に見られないコンストラクト（例えば、ゲノムコーディング配列がイントロン、または天然遺伝子と異なるコドンを有する合成配列を含有するｃＤＮＡ）である。アレル変異または自然に起こる突然変異事象は、本明細書で定義するＤＮＡの異種領域を生じさせない。
【０２７８】
「コーディング配列」は、（遺伝子コードを考慮して）タンパク質もしくはペプチド配列に対応するかまたはタンパク質もしくはペプチド配列をコードするコドンのインフレーム配列である。２つのコーディング配列は、該配列またはそれらの相補的配列が同じアミノ酸配列をコードする場合、互いに対応する。適切な制御配列を伴うコーディング配列が転写または翻訳されてポリペプチドになり得る。ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は、通常はコーディング配列に対して３’に位置することになる。「プロモーター配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼと結合して、下流（３’方向）のコーディング配列の転写を惹起することができるＤＮＡ制御領域である。プロモーター配列は、典型的に、コーディング配列の転写に影響を与える制御分子（例えば、転写因子）の結合のためのさらなる部位を含有する。コーディング配列は、プロモーター配列の「制御下」にあるか、または細胞内でＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列と結合し、コーディング配列をｍＲＮＡに転写すると、プロモーターに「作動可能に連結」されており、結果として、ｍＲＮＡは、コーディング配列によってコードされたタンパク質に翻訳される。
【０２７９】
ベクターを用いて、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質等の外来物質を生物または宿主細胞に導入する。典型的なベクターには、組換えウイルス（ポリヌクレオチドのため）及びリポソーム（ポリペプチドのため）がある。「ＤＮＡベクター」は、別のポリヌクレオチドセグメントを付着させて、付着セグメントの複製をもたらすようにし得るレプリコン、例えばプラスミド、ファージまたはコスミド等である。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞によるポリペプチド合成を方向づけることになる制御配列を含有するＤＮＡベクターである。これは通常は、プロモーターがＲＮＡポリメラーゼと結合して、ｍＲＮＡならびに、リボソーム結合部位の転写を惹起し、開始シグナルがｍＲＮＡのポリペプチド（複数可）への翻訳を方向づけることを意味する。適切な部位及び正しい読み枠内におけるポリヌクレオチド配列の発現ベクターへの組込み後の該ベクターによる適切な宿主細胞の形質転換により、前記ポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの生成が可能になる。
【０２８０】
ポリヌクレオチド配列の「増幅」は、特定の核酸配列の複数コピーのインビトロ生成である。増幅配列は、通常はＤＮＡの形態である。該増幅を行うための種々の技術が、それぞれ参照によってその全体をここに援用する下記総説に記載されている：Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ  １９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，８（４）：２９１−２９４；及びＧｉｌｌ  ａｎｄ  Ｇｈａｅｍｉ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．２００８  Ｍａｒ；２７（３）：２２４−４３。ポリメラーゼ連鎖反応すなわちＰＣＲは核酸増幅の原型であり、本明細書におけるＰＣＲの使用は、他の適切な増幅技術の例示と考えるべきである。
【０２８１】
多くの脊椎動物（哺乳動物を含めて）の抗体の一般的構造は、今やよく理解されている（Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９０：５（１９７１））。通常の抗体は、２つの約２３，０００ダルトンの分子量の同一のポリペプチド軽鎖（「軽鎖」））と、分子量５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖（「重鎖」）から成る。これらの４つの鎖がジスルフィド結合によって「Ｙ」配置で結合しており、軽鎖は、「Ｙ」配置の口部で開始する重鎖を両脇に置いている。「Ｙ」配置の「枝」部はＦａｂ領域と呼ばれ；「Ｙ」配置のステム部はＦＣ領域と呼ばれる。「Ｙ」配置頂部のＮ末端からアミノ酸配列の配向性が各鎖の下部のＣ末端に向かう。Ｎ末端は、それを誘発した抗原に対する特異性を有し、かつ約１００アミノ酸長である可変領域を有する。Ｎ末端は、軽鎖と重鎖との間で、かつ抗体毎にわずかに変化する。
【０２８２】
可変領域は、鎖の残余長に伸びて特定クラスの抗体内では抗体の特異性（すなわち、それを誘発する抗原）で変化しない定常領域に互いに連結している。免疫グロブリン分子のクラスを決める定常領域の５つの既知の主クラス（ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、及びイプシロン重鎖定常領域に対応するＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）がある。定常領域またはクラスは、補体の活性化を含めた抗体のその後のエフェクター機能（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｐ．４１３−４３６，Ｈｏｌｔ，Ｒｉｎｅｈａｒｔ，Ｗｉｎｓｔｏｎ（１９７６））、及び他の細胞応答（Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｄ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ  １−１８，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ（１９８０）；Ｋｏｈｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４８：１８７（１９８３））を決定し；一方で可変領域は、それが反応することになる抗原を決定する。軽鎖は、カッパまたはラムダに分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のどちらかと対にされ得る。免疫グロブリンがハイブリドーマまたはＢ細胞によって産生されると、軽鎖と重鎖は互いに共有結合し、２つの重鎖の「尾」部がジスフィド共有結合によって互いに結び付く。
【０２８３】
表現「可変領域」または「ＶＲ」は、抗体の抗原への結合に直接関与する、抗体の軽鎖と重鎖の各対内のドメインである。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を持ち、続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）及びその他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１定常ドメインと並び、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並んでいる。
【０２８４】
表現「相補性決定領域」、「超可変領域」、または「ＣＤＲ」は、抗体の軽鎖または重鎖の可変領域に見られる１つ以上の超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）を指す（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，（１９８７）参照）。これらの表現には、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．によって定義された超可変領域（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｋａｂａｔ  Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）または抗体の三次元構造内の超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１９６  ９０１−９１７（１９８７））が含まれる。各鎖内のＣＤＲは、フレームワーク領域にごく接近して維持され、他の鎖のＣＤＲと共に、抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲ内には、抗体−抗原相互作用においてＣＤＲにより用いられる重大な意味を持つ接触残基に相当する選択性決定領域（ＳＤＲ）として記載されている選択アミノ酸がある（Ｋａｓｈｍｉｒｉ，Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６：２５−３４（２００５））。
【０２８５】
表現「フレームワーク領域」または「ＦＲ」は、抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域内の１つ以上のフレームワーク領域を指す（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，（１９８７）参照）。これらの表現には、抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域内のＣＤＲ間に介在する当該アミノ酸配列領域が含まれる。
【０２８６】
表現「安定コピー数」は、長期間にわたって（例えば少なくとも１日、少なくとも１週間、もしくは少なくとも１カ月、またはそれより長く）または持続的繁殖世代数（例えば、少なくとも３０、４０、５０、７５、１００、２００、５００、もしくは１０００世代、またはそれより多く）にわたって遺伝子（例えば抗体鎖遺伝子）のコピー数を実質的に維持する宿主細胞を指す。例えば、所与の時点または世代数で、培養において少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、またはそれより多くの細胞が、出発細胞におけるのと同コピー数の遺伝子を維持し得る。好ましい実施形態では、宿主細胞は、所望タンパク質をコードするかまたは所望マルチサブユニット複合体（例えば、抗体）の各サブユニットをコードする遺伝子を安定コピー数含有する。
【０２８７】
表現「安定的に発現する」は、長期間にわたって（例えば少なくとも１日、少なくとも１週間、もしくは少なくとも１カ月、またはそれより長く）または持続的繁殖世代数（例えば、少なくとも３０、４０、５０、７５、１００、２００、５００、もしくは１０００世代、またはそれより多く）にわたって遺伝子もしくはタンパク質（例えば抗体）の類似レベルの発現を維持する宿主細胞を指す。例えば、所与の時点または世代数で、遺伝子もしくはタンパク質の産生速度または収率が、初期産生速度の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、またはそれより高くてよい。好ましい実施形態では、宿主細胞は、所望のタンパク質またはマルチサブユニット複合体（例えば、抗体）を安定的に発現する。
【０２８８】
所望タンパク質の回収及び精製
モノクロナール抗体は卓越した治療薬になったが、それらの精製プロセスは、ヒトに用いるのに適した産物を確実かつ予想通りに生成する必要がある。典型的には、所望抗体産物の許容収率を維持しながら、不純物、例えば宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、外来性及び内在性ウイルス、内毒素、凝集体及び他の種、例えば糖変異体を制御する。さらに、精製プロセス中に導入された不純物（例えば、浸出タンパク質Ａ、樹脂及びフィルターからの抽出可能物、プロセス緩衝液及び薬剤、例えば界面活性剤）も除去した後に抗体を治療薬として使用することができる。
【０２８９】
一次回収プロセス
細胞培養からの抗体の回収の第１ステップは採取である。細胞及び細胞デブリを除去し、クロマトグラフィーに適した浄化濾過液、すなわち、採取細胞培養液（ｈａｒｖｅｓｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｌｕｉｄ）（ＨＣＣＦ）を得る。一次回収の例示方法としては、遠心分離、深層濾過及び無菌濾過、凝集法、沈殿法ならびに／または規模及び施設容量に応じて適用可能な手法がある。
【０２９０】
遠心分離
一実施形態では、細胞及び凝集デブリをブロスから遠心分離により除去する。遠心分離は、パイロット及び商業規模製造に使用可能である。好ましくは、大規模製造で遠心分離を用いて、＞３％の固体パーセントで細胞培養から採取細胞培養液を与える（すなわち、サブミクロンデブリのレベル上昇）。
【０２９１】
標準的な非気密性ディスクスタック遠心機も完全気密性遠心機も細胞及び大きい細胞デブリを除去できるが、完全気密性遠心機は、オーバーフローを防止し、せん断を最小限にすることによって、この装置の操作中に受ける細胞溶解の量を顕著に、例えば、少なくとも５０％減らすことができる。
【０２９２】
遠心分離プロセスの浄化効率は、遠心機供給速度、Ｇ力、ボウル形状、操作圧力、放電周波数及び細胞培養液を遠心機に移すために用いる付属機器等の採取パラメーターの影響を受ける。細胞培養プロセス特性、例えばピーク細胞密度、総細胞密度及び培養プロセス中及び採取時の培養生存能も分離性能に影響し得る。遠心機において供給速度のスケーリング係数（Ｑ）及び等沈降面積（Σ）を用いて遠心分離プロセスを最適化して供給速度及びボウル回転速度を選択することができる。最適化プロセスは、サブミクロン粒子の沈降及び産物収率を最大にしながら、細胞溶解及びデブリ生成を最小限にすることができる。
【０２９３】
濾過
細胞採取に接線流微量濾過を利用することもできる。特に、細胞培養液は微細孔膜に接線方向に流れ、圧力駆動濾液流は、より大きい不溶デブリから可溶産物を分離する。膜ファウリングは、慣性揚力及び膜表面を横切る乱流により生じるせん断誘導拡散によって制限される。
【０２９４】
一連の濃縮及びダイアフィルトレーションステップによって高収率採取が達成可能である。前者の場合は、細胞培養液の体積を減らし、固体質量の濃縮をもたらす。次にダイアフィルトレーションステップは、濃縮細胞培養液混合物から産物を洗浄する。
【０２９５】
例として、ＴＦＦ膜がさらに浄化する必要のない（クロマトグラフィーに適した）目標品質の採取細胞培養液を生成するように、ＴＦＦ膜に０．２２μｍ孔径を利用してよい。あるいは、ＴＦＦバリアにおいてさらに開いた孔径を用いてファウリングをより良く管理し得るが、さらに開いた孔径では、ＴＦＦ系の下流で追加の浄化ステップ（例えば、通常流動深層濾過）が必要なことがある。好ましくは、＜３％の固体パーセントの細胞培養にはＴＦＦを使用する。
【０２９６】
細胞培養ブロスの浄化にデプスフィルターを用いて膜フィルター上の容量を維持するかまたはクロマトグラフィーカラムもしくはウイルスフィルターを保護することもできる。デプスフィルターは、例えば、セルロース、多孔性フィルター助剤、例えば珪藻土、イオン荷電樹脂結合剤及び結合性樹脂（小重量パーセントで存在して、異種構成物質と一緒に共有結合し、結果として生じる媒体に湿潤強度を与え、媒体表面に正電荷を与える）で構成可能である。デプスフィルターは、サイズ排除と吸着結合の両方に頼って分離を達成する。例示デプスフィルターは約２〜４ｍｍの厚さである。
【０２９７】
採取用途では、デプスフィルターを直接全細胞ブロスに適用するか、または一次分離、例えば、ＴＦＦもしくは遠心分離と併用することができる。例えば、全細胞ブロスにデプスフィルター採取を使用するときは、濾過列は、下記３段階のフィルターを含む：（１）全細胞及び大型粒子を除去するための１０μｍまでの孔径を有する粗いまたは開いたデプスフィルターによる第１段階；（２）コロイド粒子及びサブミクロン粒子を排除するためのより緻密なデプスフィルターによる第２段階；及び（３）０．２μｍ孔径膜フィルターによる第３段階。濾過プロセスは一般的に線形的に調整するが、各段階で１．５×〜＞３×の安全係数を利用して、十分なフィルター容量を確保することができる。
【０２９８】
一実施形態では、例えば、遠心分離で除去できる粒径には実際の下限があるので、デプスフィルターを遠心分離後に用いて採取ブロスをさらに浄化する。例えば、デプスフィルターは、２つの別個の層（上流ゾーンは、下流ゾーンに比べて粗いグレードである）を含み、０．１〜４μｍの範囲の孔径を有し得る。より大きい粒子は粗いグレードのフィルター媒体に捕捉され、より小さい粒子はより緻密な媒体に捕捉され、早過ぎる詰まりを減じて濾過能力を高める。
【０２９９】
フィルタータイプ、孔径、表面積及び流束の最適化を実験台スケールで行ってから、例えば、遠心分離液濁度及び粒径分布に基づいてパイロットスケールにスケールアップすることができる。デプスフィルターサイジング実験は一般的に、濾過段階のいずれか１つまたは組合せで圧力終点を用いる定常流束で行われる。好ましくは、０．２２μｍグレードフィルターを用いて、採取プロセス最後に上清を濾過して生物汚染度を制御する。０．２２μｍ濾過上清は、抗体産物関連変異プロファイルを変えることなく、２〜８℃で数日間以上貯蔵可能である。
【０３００】
理論によって拘束されるものではないが、デプスフィルターの吸着機構が種々多様のプロセス汚染物及び不純物を除去するための精製ツールとしてのそれらの広範囲の使用を可能にすると考えられる。特に、デプスフィルターの正電荷とＤＮＡ分子との間の静電相互作用ならびにデプスフィルター媒体とＤＮＡ分子との間の疎水性相互作用が、ＤＮＡの吸着減少に重要な役割を果たし得る。例えば、荷電デプスフィルターを用いてＤＮＡを除去し、Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ（登録商標）（Ｃｕｎｏ）９０ＳＰ上の電荷レベルをそのＤＮＡを除去する能力と関連づけた。さらに、例として、正に荷電したデプスフィルターを用いて、フィルターの平均孔径より多数倍小さいＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来及び他の内在性内毒素ならびにウイルスを除去し、Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ（登録商標）（Ｃｕｎｏ）ＶＲシリーズのデプスフィルターは、吸着によりエンベロープ型レトロウイルス及び非エンベロープ型パルボウイルスと結合することが分かった。デプス濾過を利用して、免疫グロブリン溶液からスパイクしたプリオンを除去することもできる。さらに、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム前の宿主細胞タンパク質のデプス濾過による除去は、タンパク質ＡプールのｐＨ調整中の沈殿を顕著に減らすことが分かった。
【０３０１】
凝集及び沈殿法
一実施形態では、沈殿／凝集に基づく前処理ステップを用いて、細胞培養液中の細胞デブリ及びコロイドの量を減らし、既存の濾過列機器能力を超えることができる。凝集法は、ポリマー吸着、例えば、カチオン性、中性及びアニオン性ポリマーによる細胞及び細胞デブリへの静電引力を伴って細胞汚染物を排除し、浄化効率の改善及び高回収率をもたらす。凝集試薬、例えば、塩化カルシウム及びリン酸カリウムは、超低レベル、例えば、２０〜６０ｍＭの塩化カルシウムと、リン酸カルシウムを形成するために添加される等モル量のリン酸で、リン酸カルシウムと細胞、細胞デブリ及び不純物の共沈殿に寄与すると考えられる。
【０３０２】
一実施形態では、開示精製プロセスは、全細胞ブロスのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）による３ｍＭ最終濃度への処理及び凝集剤を用いて、引き続く細胞及び凝集デブリの遠心分離による除去、その後のデプス及び０．２μｍフィルターによる浄化を含む。
【０３０３】
クロマトグラフィー
バイオ医薬品業界では、クロマトグラフィーは、その高い分解能のため、重大な意味を持ち、広く用いられる分離及び精製技術である。クロマトグラフィーは、生体分子間の物理的及び化学的差異を分離に活用する。例えば、タンパク質Ａクロマトグラフィーを採取後に行って、小割合のプロセス関連不純物及び産物関連不純物のみの除去を必要とする比較的純粋な産物を得ることができる。次に１または２つのさらなるクロマトグラフィーステップ、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー及び／またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを組み入れて仕上げステップとして利用することができる。これらのステップは、追加のウイルス、宿主細胞タンパク質及びＤＮＡクリアランスを可能にし、ならびに、凝集体、望まれない産物変異種及び他の少量の汚染物を除去することができる。最後に、精製産物を濃縮及び透析濾過して最終処方緩衝液とすることができる。
【０３０４】
抗体精製は、血清（ポリクロナール抗体）、腹水液もしくは細胞系（モノクロナール抗体）の細胞培養上清からの抗体の選択的富化または特異的単離を包含する。精製方法は、非常に粗いから高度に特異的までに及び、以下のように分類することができる。
【０３０５】
物理化学的分画−典型的試料中の抗体のサイズ、電荷もしくは他の共有化学的特性に基づく免疫グロブリンの示差沈殿、サイズ排除または固相結合。これは、免疫グロブリンを含む試料タンパク質のサブセットを単離する。
【０３０６】
アフィニティー分画−特定の抗体クラス（例えば、ＩｇＧ）の免疫グロブリンに対して特異的アフィニティーを有する固定化生物リガンド（例えば、タンパク質）による結合（抗原特異性に関係なく標的クラスの全ての抗体を精製する）または試料中の、それらの抗原結合性ドメインを介して特定抗原分子に結合する当該抗体のみのアフィニティー精製（抗体クラスまたはアイソタイプに関係なく、該抗原と結合する全ての抗体を精製する）。
【０３０７】
血清免疫グロブリンの主クラス（例えば、ＩｇＧ及びＩｇＭ）は、全体的なアミノ酸組成及び溶解度特性を含め、同じ一般構造を共有する。これらの一般的特性は、血清、例えば、アルブミン及びトランスフェリン中の多くの他の大量のタンパク質とは十分に異なり、これらの差別化物理化学特性に基づいて免疫グロブリンを選択し、富化することができる。
【０３０８】
物理化学的分画抗体精製
硫酸アンモニウム沈殿法
硫酸アンモニウム沈殿法は、血清、腹水液または細胞培養上清から抗体を富化及び濃縮するために頻繁に使用される。リオトロピック塩の濃度が試料中で増加するにつれて、タンパク質及び他の巨大分子はそれらが沈殿するまで漸進的に溶解しにくくなる。すなわち、リオトロピック効果は「塩析」と呼ばれる。抗体は、多くの他のタンパク質及び血清成分より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿する。
【０３０９】
約４０〜約５０％の硫酸アンモニウム飽和（１００％飽和は４．３２Ｍに等しい）で、免疫グロブリンは沈殿するが、他のタンパク質は溶液中に残る。例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．（１９８８）．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．（１９９６）を参照されたい。例として、等体積の硫酸アンモニウム飽和溶液をゆっくり中和抗体試料に添加した後、数時間室温または４℃でインキュベートする。遠心分離及び上清の除去後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液に抗体ペレットを溶かす。
【０３１０】
沈殿の選択性、収率、純度及び再現性は、それぞれいくつかの因子によって決まり、因子には、限定するものではないが、時間、温度、ｐＨ及び塩の添加速度がある。例えば、Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．Ｓ．（１９９６），Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖａｌｉｄａｔｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺを参照されたい。硫酸アンモニウム沈殿法は、いくつかの抗体用途には十分な精製をもたらし得るが、カラムクロマトグラフィーまたは他の精製方法の前の予備ステップとして行われることが多い。部分的精製抗体試料を用いると、アフィニティーカラムの性能を改善し、その寿命を延ばすことができる。
【０３１１】
抗体精製状況に適した硫酸アンモニウム以外の試薬には、例として、オクトン酸（ｏｃｔｏｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリエチレングリコール及びエタクリジンがある。
【０３１２】
特定状況において多くの化学に基づく固相クロマトグラフ法を適合かつ最適化して抗体精製を達成することができる。
【０３１３】
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）は、所与の緩衝系（ｐＨ）におけるタンパク質の正味の電荷に基づいてタンパク質と結合する正または負に荷電した樹脂を用いる。高度の特異性で標的抗体と結合して放出するＩＥＣ条件を決定することができ、これはモノクロナール抗体の生産を伴う商業的運用において特に重要であり得る。反対に、抗体以外の全ての他の試料成分とほとんど結合する条件を見つけることができる。一旦最適化すれば、ＩＥＣは、対費用効果が高く、穏やかで信頼できる抗体精製方法である。
【０３１４】
アニオン交換クロマトグラフィーは、樹脂に固定化された正に荷電した基を使用する。例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）もしくはジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）等の弱塩基性基、または四級アミノエチル（Ｑ）もしくはトリメチルアンモニウムエチル（ＴＭＡＥ）もしくは四級アミノエチル（ＱＡＥ）等の強塩基性基をアニオン交換に使用することができる。例示アニオン交換媒体としては、限定するものではないが、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＢＢ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＸＬ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰ、Ｍｉｎｉ  Ｑ、Ｍｏｎｏ  Ｑ、Ｍｏｎｏ  Ｐ、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑ、Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｑ、Ｃａｐｔｏ  Ｑ、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ＤＥＡＥ、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ＱＸＬ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｏｒｏｓ  ＨＱ  １０及び２０ｕｍセルフパック、Ｐｏｒｏｓ  ＨＱ  ２０及び５０ｕｍ、Ｐｏｒｏｓ  ＰＩ  ２０及び５０ｕｍ、Ｐｏｒｏｓ  Ｄ  ５０ｕｍ；Ｔｏｓｏｈａａｓ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＤＥＡＥ  ６５０Ｓ  Ｍ及びＣ、Ｓｕｐｅｒ  Ｑ  ６５０、ＱＡＥ  ５５０Ｃ；Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＤＥＡＥ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、Ｑ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ膜吸収剤；Ｍｅｒｃｋ  ＫＧ２Ａ  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＤＭＡＥ、ＦｒａｃｔｏＰｒｅｐ  ＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｐｒｅｐ  ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ；Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ  Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ膜吸収剤が挙げられる。
【０３１５】
アニオン交換は、プロセス関連不純物（例えば、宿主細胞タンパク質、内在性レトロウイルス及び外来性ウイルス、例えばパルボウイルスもしくは仮性狂犬病ウイルス、ＤＮＡ、内毒素及び浸出タンパク質Ａ）ならびに産物関連不純物（例えば、二量体／凝集体）の除去に特に有用である。アニオン交換は、除去すべき抗体及び不純物のｐＩによって決まるフロースルーモードまたは結合及び溶出モードのいずれでも使用可能である。例えば、７．５超のｐＩを有する抗体、例えば、多くのヒト化またはヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ２抗体由来の不純物は、樹脂に結合し、興味ある産物は通過して流れるので、該不純物を除去するためにはフロースルーモードを使用するのが好ましい。カラム負荷容量、すなわち、樹脂の質量に対する抗体の質量は、樹脂上の結合部位が不純物によってだけ占有されるのでかなり高い可能性がある。宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、浸出タンパク質Ａ及び種々のウイルス等の残存不純物を除去するための２または３単位操作によりデザインされるモノクロナール抗体精製プロセスの仕上げステップとしてアニオン交換クロマトグラフィーをフロースルーモードで使用してもよい。例として、操作ｐＨは約８〜約８．２であり、産物負荷及び平衡ならびに洗浄緩衝液の伝導率は１０ｍＳ／ｃｍまでである。
【０３１６】
あるいは、結合及び溶出モードを用いて、酸性乃至中性範囲のｐＩを有する抗体、例えば、多くのヒト化またはヒトＩｇＧ４由来のプロセス関連及び産物関連不純物を除去するのが好ましい。結合及び溶出モードでは、抗体産物プールを最初にアニオン交換カラム上に負荷してから、より高い塩濃度を用いて興味ある産物をステップグラジエントまたは直線グラジエントで溶出し、不純物の大部分をカラムに結合したまま残す。不純物は、カラムから洗浄または再生ステップ中に溶出される。一般的に、抗体分子の表面上の正味の負電荷数またはさらに高い負の電荷数を得るため、ひいては、クロマトグラフィーステップ中により高い結合能を達成するために操作ｐＨは、産物のｐＩより高いかたまたは近くなければならない。同様に、負荷のためのイオン強度が低範囲内であるのが好ましく、ｐＨ９未満のｐＨが好ましい。
【０３１７】
さらに、弱分配クロマトグラフィー（ＷＰＣ）を用いて、タンパク質Ａ及びアニオン交換を含む二クロマトグラフィー回収プロセスを可能にし得る。一般的に、このプロセスは、均一濃度（フロースルークロマトグラフィーと同様に）で行われるが、産物と不純物の両方の結合を増強し（フロースルーモードとは対照的に）、０．１〜２０、好ましくは１〜３の抗体分配係数（Ｋｐ）を得るように伝導率及びｐＨを選択する。抗体も不純物もアニオン交換樹脂に結合するが、不純物は、フロースルーモードよりずっと堅固に結合し、不純物除去の向上につながり得る。弱分配モードにおける産物収率は、負荷の最後に短時間洗浄を含めることによって最大に、例えば、臨床生産では平均して９０％にすることができる。
【０３１８】
カチオン交換クロマトグラフィーは、負に荷電した官能基で変性した樹脂を使用する。例えば、強酸性リガンド（例えば、スルホプロピル、スルホエチル及びスルホイソブチル基）または弱酸性リガンド（例えば、カルボキシ基）をカチオン交換に使用可能である。例示カチオン交換樹脂としては、限定するものではないが、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＢＢ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＸＬ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰ、Ｍｉｎｉ  Ｓ、Ｍｏｎｏ  Ｓ、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓ、Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ、Ｃａｐｔｏ  Ｓ、ＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰ、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ＳＰ−ＸＬ、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ＣＳＴ−１；Ｔｏｓｏｈａａｓ  Ｒｅｓｉｎｓ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｍｅｇａ  Ｃａｐ  ＴＩ  ＳＰ−５５０  ＥＣ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｇｉｇａ  Ｃａｐ  Ｓ−６５０Ｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）６５０Ｓ、Ｍ及びＣ、Ｔｏｙｏｐｅａｌ  ＳＰ６５０Ｓ、Ｍ、及びＣ、Ｔｏｙｏｐｅａｌ  ＳＰ５５０Ｃ；ＪＴ  Ｂａｋｅｒ  Ｒｅｓｉｎｓ  Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｓｕｌｐｈｏｎ−５、１５及び４０ｕｍ、Ｓｕｌｆｏｎｉｃ−５、１５、及び４０ｕｍ；ＹＭＣ  ＢｉｏＰｒｏ  Ｓ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｏｒｏｓ  ＨＳ  ２０及び５０ｕｍ、Ｐｏｒｏｓ  Ｓ  １０及び２０ｕｍ；Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ  Ｓ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＣＭ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ；Ｍｅｒｃｋ  ＫＧｇＡ  Ｒｅｓｉｎｓ  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＳＯ３、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＣＯＯ−、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉｃａｐ、Ｆｒａｃｔｏ  Ｐｒｅｐ  ＳＯ３；Ｅｓｈｍｕｎｏ  Ｓ；Ｂｉｏｒａｄ  Ｒｅｓｉｎ  Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｓ膜吸収剤が挙げられる。
【０３１９】
カチオン交換クロマトグラフィーは、中性乃至塩基性の範囲のｐＩ値を有する多くのモノクロナール抗体、例えば、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ１及びＩｇＧ２サブクラスの精製プロセスに特に適している。一般に、負荷ステップ中に樹脂上に抗体を結合させ、溶出緩衝液の伝導率を高くするかまたはｐＨを高くすることによって抗体を溶出させる。多くの負に荷電したプロセス関連不純物、例えばＤＮＡ、いくつかの宿主細胞タンパク質、浸出タンパク質Ａ及び内毒素等は、負荷及び洗浄画分に除去される。カチオン交換クロマトグラフィーは、標的抗体産物からの抗体変異体、例えば脱アミド産物、酸化種及びＮ末端切断型、ならびに高分子量種を減らすこともできる。
【０３２０】
達成される最大結合能は、＞１００ｇ／Ｌの樹脂体積ほど高いことがあり、負荷条件、樹脂のリガンド及び密度によって決まるが、不純物除去は負荷密度に非常に左右される。溶出プログラムの展開に関するアニオン交換クロマトグラフィーについて記述された同原理は、カチオン交換クロマトグラフィーにも同様に当てはまる。
【０３２１】
溶出条件の展開は、不純物除去及びその後の単位操作で容易に処理できる産物プールの特徴づけに関連づけられる。一般的に、塩またはｐＨの直線グラジエント溶出プログラムを実施して最良の溶出条件を決定することができる。例えば、直線グラジエント溶出条件は、ｐＨ６で５ｍＭ〜２５０ｍＭの範囲のＮａＣｌであってよく、ｐＨ直線グラジエント溶出実行はｐＨ６〜ｐＨ８の範囲であり得る。
【０３２２】
固定化金属キレートクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）
固定化金属キレートクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）は、キレート固定化二価金属イオン（例えば、ニッケルＮｉ２＋）を用いて、３つ以上の連続ヒスチジン残基のクラスターを含有するタンパク質またはペプチドに結合させる。この方略は、末端６ｘＨｉｓ融合タグを含有するように操作された組換えタンパク質の精製に特に有用であり得る。哺乳類ＩｇＧは、固定化ニッケルによって結合され得るヒスチジンクラスターを有する、血清（またはモノクロナール細胞培養上清）中の数少ない豊富タンパク質の１つである。ＩＥＣのように、結合及び溶出のためのＩＭＡＣ条件を特定試料について最適化して、穏やかで信頼できる抗体精製を提供することができる。例えば、標識手順後にＩＭＡＣを用いて、ＡＰ標識またはＨＲＰ標識（酵素複合）抗体を過剰の非複合酵素から分離することができる。
【０３２３】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、タンパク質をそれらの疎水性に基づいて分離し、電荷、サイズまたはアフィニティーに基づいてタンパク質を分離する他の技術を補完する。例えば、高塩緩衝液中のＨＩＣカラム上に試料を負荷すると、高塩緩衝液が溶液中におけるタンパク質分子の溶媒和を低減させ、それによって試料タンパク質分子の疎水性領域を露出させ、これが結果的にＨＩＣ樹脂に結合する。一般的に、分子の疎水性が高いほど、結合を促進するために必要な塩が少ない。そこで、塩濃度を下げるグラジエントを用いて、ＨＩＣカラムから試料を溶出させ得る。特に、イオン強度が下がるにつれて、分子の親水性領域の露出が増え、疎水性が増大する順にカラムから分子が溶出する。
【０３２４】
フロースルーモードのＨＩＣは、比較的高い収率で大きい割合の凝集体を除去するのに有効であり得る。結合及び溶出モードのＨＩＣは、抗体産物からプロセス関連及び産物関連不純物の有効な分離を可能にする。特に、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ及び凝集体の大部分は、溶出緩衝液中の適切な塩濃度の選択またはグラジエント溶出法の利用を通じて抗体産物から除去可能である。
【０３２５】
例示ＨＩＣ樹脂としては、限定するものではないが、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＨＩＣ  Ｒｅｓｉｎｓ（Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４  ＦＦ、Ｂｕｔｙｌ−Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ、Ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４  ＦＦ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＢＢ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  ＦＦ  Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  ＦＦ  Ｌｏｗ  Ｓｕｂ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５ＥＴＨ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５ＩＳＯ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５ＰＨＥ、Ｃａｐｔｏ  Ｐｈｅｎｙｌ、Ｃａｐｔｏ  Ｂｕｔｙｌ、Ｓｒｅａｍｌｉｎｅ  Ｐｈｅｎｙｌ）；Ｔｏｓｏｈａａｓ  ＨＩＣ  Ｒｅｓｉｎｓ（ＴＳＫ  Ｅｔｈｅｒ  ５ＰＷ  （２０ｕｍ及び３０ｕｍ）、ＴＳＫ  Ｐｈｅｎｙｌ  ５ＰＷ（２０ｕｍ及び３０ｕｍ）、Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０Ｓ、Ｍ、及びＣ、Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｓ、Ｍ及びＣ、Ｈｅｘｙｌ−６５０Ｍ及びＣ、Ｅｔｈｅｒ−６５０Ｓ及びＭ、Ｂｕｔｙｌ−６００Ｍ、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｕｔｙｌ−５５０Ｃ、Ｐｈｅｎｙｌ−６００Ｍ；ＰＰＧ−６００Ｍ）；Ｗａｔｅｒｓ  ＨＩＣ  Ｒｅｓｉｎｓ（孔径１２０、２００、３００Ａを有するＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｏｃｔｙｌ  Ｃｏｌｕｍｎｓ−３、５、１０Ｐ、１５及び２５ｕｍ、孔径１２０、２００及び３００Ａを有するＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｃｏｌｕｍｎｓ−３、５、１０Ｐ、１５及び２５ｕｍ、孔径１２０、２００及び３００Ａを有するＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｂｕｔｙｌ  Ｃｏｌｕｍｎｓ−３、５、１０Ｐ、１５及び２５ｕｍ）；ＣＨＩＳＳＯ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＨＩＣ  Ｒｅｓｉｎｓ（Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｂｕｔｙｌ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｏｃｔｙｌ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｐｈｅｎｙｌ）；ＪＴ  Ｂａｋｅｒ  ＨＩＣ  Ｒｅｓｉｎ  （ＷＰ  ＨＩ−Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３））；Ｂｉｏｒａｄ  ＨＩＣ  Ｒｅｓｉｎｓ（Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ｔ−Ｂｕｔｙｌ、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ｍｅｔｈｙｌ）；及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＨＩＣ  Ｒｅｓｉｎ（Ｈｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｐｈｅｎｙｌ−ＨＰ２  ２０ｕｍ）が挙げられる。例えば、ＰＰＧ  ６００−Ｍは、約８×１０５ダルトンの排除限界分子量、ポリプロピレングリコールＰＰＧリガンド、４５〜９０μｍの粒径、エーテル＞ＰＰＧ＞フェニルの関係によって与えられる疎水性、及び３８ｍｇ／ｍＬのゲルの動的結合能（ＭＡｂ：Ａｎｔｉ  ＬＨ）を特徴とする。
【０３２６】
一実施形態では、開示精製プロセスは、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、タンパク質Ａ）及び混合モードクロマトグラフィー（例えば、ヒドロキシアパタイト）後の仕上げ精製ステップとして疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を利用する。図１を参照されたい。好ましくは、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ−６００Ｍ）またはＰｈｅｎｙｌ−６００ＭがＨＩＣ樹脂である。一実施形態では、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７、緩衝液中の約０．７Ｍ〜０Ｍの硫酸ナトリウムの直線グラジエント（０〜１００％）として溶出を行う。場合により、溶出液のＯＤ２８０をモニターし、一連の画分、例えば、収集体積の約１／３をさらなる純度分析のために収集する。好ましくは、収集画分は、上昇部上の０．１ＯＤ〜下降部上の０．１ＯＤを包含する。
【０３２７】
疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）
疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）は、低ｐＨでイオン化するリガンドのｐＨ依存性挙動に基づいている。この技術は、高濃度のリオトロピック塩を必要とせずに疎水性相互作用によって吸着が起こるように、高密度でヘテロ環リガンドを利用する。ＨＣＩＣにおける脱着は、ｐＨを下げてイオン性リガンドと結合タンパク質との間に電荷反発を引き起こすことによって促進される。代表的な市販ＨＣＩＣ樹脂は、ＭＥＰ−Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）であり、官能基として４−メルカプトエチルピリジンを有するセルロースに基づく媒体である。このリガンドは、低ｐＨで正電荷を得るＮヘテロ環を有する疎水性部分である。
【０３２８】
硫黄親和性（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ）吸着
硫黄親和性吸着は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の特性と、チオエーテルに近接したスルホン基へのタンパク質の結合を伴う硫酸アンモニウム沈殿法の特性（すなわち、リオトロピック効果）を併せ持つ高度選択的タイプのタンパク質−リガンド相互作用である。厳密なＨＩＣとは対照的に、硫黄親和性吸着は、高濃度のリオトロピック塩（例えば、塩化ナトリウムに対立するものとして硫酸カリウム）に依存する。例えば、結合は、硫酸カリウムと平衡化させた典型的抗体試料にかなり特異的である。非結合成分を洗い流した後、抗体は、穏やかな溶出条件（例えば、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７〜８）で容易に回収される。硫黄親和性吸着剤（Ｔ−Ｇｅｌとも呼ばれる）は、スルホン−チオエーテルリガンドを含むように修飾された６％のビーズ状（ｂｅａｄｅｄ）アガロースであり、種々の動物種由来の免疫グロブリンに対して高い結合能及び広い特異性を有する。
【０３２９】
抗体のアフィニティー精製
アフィニティークロマトグラフィー（アフィニティー精製とも呼ばれる）は、分子間の特異的結合の相互作用を利用する。一般的に、特定リガンドは、固体担体に化学的に固定化または「共役」している。その結果、複合混合物がカラムを通過するとき、リガンドに特異的な結合親和性を有する分子が結合するようになる。他の試料成分を洗い流した後、結合分子を担体から取り除くと、最初の試料からのその精製ということになる。
【０３３０】
担体
アフィニティー精製は、静止物質（固定相）に固定化しているリガンドとの結合相互作用の差異に基づいた溶液（移動相）中分子の分離を伴う。アフィニティー精製における担体またはマトリックスは、生体分子特異的リガンドが共有結合するいずれの物質でもある。典型的に、アフィニティーマトリックスとして使用すべき物質は、標的分子が見られる系に不溶性である。通常は、常にではないが、不溶性マトリックスは固体である。
【０３３１】
有用なアフィニティー担体は、高い表面積対体積比、リガンドの共有結合のために容易に修飾できる化学基、最小限の非特異的結合特性、良い流動特性ならびに機械的及び化学的安定性を有するものである。
【０３３２】
固定化リガンドまたは活性化アフィニティー担体の化学は、いくつかの異なる形式での使用に利用可能であり、該形式としては、架橋ビーズ状アガロースまたはポリアクリルアミド樹脂及びポリスチレンマイクロプレートが挙げられる。
【０３３３】
多孔性ゲル担体は、試料分子が固定化リガンドの高表面積を自由に流れ過ぎることができる緩いマトリックスを提供し、これはタンパク質のアフィニティー精製にも有用である。これらのタイプの担体は、溶液中で（すなわち、水和した）５０〜１５０μｍ径ビーズとして生成される通常は糖に基づくかまたはアクリルアミドに基づくポリマー樹脂である。ビーズ状形式は、これらの樹脂を湿潤スラリーとして供給できるようにする。湿潤スラリーは、いずれのサイズの樹脂床を有するカラムにも満たされ、「詰められる」ように容易に分配可能である。ビーズは極端に多孔性であり、十分に大きいので、生体分子（タンパク質等）は、ビーズ表面の間及び周囲を流れることができるように、自由にビーズの中に流れ、ビーズを通って流れることができる。リガンドを種々の手段でビーズポリマー（外面及び内面）に共有結合させる。
【０３３４】
例えば、架橋ビーズ状アガロースは、典型的に４％及び６％の密度（すなわち、１ｍｌの樹脂床は、９０体積％超が水である）で利用可能である。ビーズ状アガロースは、重力流、低速遠心分離、及び低圧手順に適し得る。あるいは、ポリアクリルアミドに基づくビーズ状樹脂は一般的に圧縮せず、ぜん動ポンプを用いる中圧用途または他の液体クロマトグラフィーシステムで使用可能である。両タイプの多孔性担体は、一般的に低い非特異性結合特性を有する。これらのアフィニティークロマトグラフィー樹脂の物理的特性の概要を下表１に示す。
【０３３５】
【表１】
2018511300.tif 000002
【０３３６】
磁気粒子はさらに別のタイプの固体アフィニティー担体である。それらはずっと小さく（典型的に１〜４μｍの直径）、有効なリガンド固定化及びアフィニティー精製に必要な十分の表面積対体積比を与える。磁気粒子によるアフィニティー精製はバッチ形式で行い、例えば、数マイクロリットルのビーズをルーズスラリーとして数百マイクロリットルの試料と混合する。混合中に、ビーズは試料溶液に懸濁したままであり、アフィニティー相互作用が固定化リガンドと起こるようにする。結合に十分な時間を与えた後、強力磁石を用いて試料からビーズを収集かつ分離する。典型的に、微量遠心管で簡単なベンチトップ手順を行い、適切な磁石を有する管の底部または側面の適所に磁気ビーズを維持しながら、ピペット操作またはデカンテーション（または溶液を洗浄する等）を利用して試料を取り出す。
【０３３７】
磁気粒子は、ハイスループットオートメーションに特に良く適合し、多孔性樹脂とは異なり、細胞分離手順の代わりに使用可能である。
【０３３８】
各特異的アフィニティー系は、それ自体の条件セットを必要とし、所与の研究目的に関するそれ自体の独特の難題を提示する。しかしながら、アフィニティー精製は、一般的に下記ステップを伴う。
１．粗試料をアフィニティー担体と共にインキュベートして、試料中の標的分子が固定化リガンドに結合できるようにする；
２．担体から非結合試料成分を洗い流す；及び
３．結合相互作用がもはや起こらないように緩衝液条件を変えることによって、固定化リガンドから標的分子を溶出させる（解離させて回収する）。
【０３３９】
一般クラスのタンパク質（例えば、抗体）または通常用いられる融合タンパク質タグ（例えば、６ｘＨｉｓ）に結合するリガンドは、アフィニティー精製にすぐに使えるプレ固定化形態で市販されている。あるいは、より特殊なリガンド、例えば興味ある特異性抗体または抗原は、いくつかの市販の活性化アフィニティー担体を用いて固定化可能であり；例えば、ペプチド抗原を担体に固定化して用いて、該ペプチドを認識する抗体を精製することができる。
【０３４０】
最も一般的には、リガンド上の特定官能基（例えば、一級アミン、スルフヒドリル、カルボン酸、アルデヒド）と、担体上の反応基との間の共有化学結合の形成によって、リガンドを直接固体担体物質に固定化または「共役」させる。しかしながら、間接的なカップリング手法も可能である。例えば、ＧＳＴ標的融合タンパク質を最初にグルタチオン担体にグルタチオン−ＧＳＴアフィニティー相互作用を介して捕捉させてから二次的にそれを化学的に架橋させて固定化することができる。次に固定化ＧＳＴタグ付き融合タンパク質を用いて、融合タンパク質の結合相手（複数可）をアフィニティー精製することができる。
【０３４１】
アフィニティー精製用の結合緩衝液及び溶出緩衝液
タンパク質：リガンド相互作用を伴う多くのアフィニティー精製手順は、特に抗体：抗原または天然タンパク質：タンパク質相互作用がアフィニティー精製の基礎であるときは、生理的ｐＨ及びイオン強度の結合緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を使用する。結合相互作用が起こったらすぐに、担体を追加緩衝液で洗浄して試料の非結合成分を除去する。低レベルの界面活性剤の添加によるかまたは結合緩衝液及び／もしくは洗浄緩衝液の塩濃度に対する適度な調整によって、非特異的（例えば、単純なイオン）結合相互作用を最小限にすることができる。最後に、溶出緩衝液（例えば、０．１Ｍのグリシン・ＨＣｌ、ｐＨ２．５〜３．０）を添加して結合相互作用を破壊し（タンパク質構造に永久に影響を与えることなく）、目標分子を遊離させ、次に目標分子をその精製形態で収集する。溶出緩衝液は、結合相手を極端なｐＨ（低いかまたは高い）、高塩（イオン強度）、分子の一方または両方を変性させる界面活性剤もしくはカオトロピック剤の使用、カウンターリガンドとの結合要因の排除または競合によって結合相手を解離させ得る。場合によっては、溶出緩衝液から貯蔵もしくは下流処理にさらに適した緩衝液に精製タンパク質を交換するために引き続き透析または脱塩が必要なことがある。
【０３４２】
さらに、低ｐＨにより損傷を受ける抗体及びタンパク質もあるので、即座に１／１０体積のアルカリ性緩衝液、例えば、１ＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ８．５の添加によって溶出タンパク質画分を中和すべきである。タンパク質のアフィニティー精製用の他の例示溶出緩衝液を下表２に示す。
【０３４３】
【表２】
2018511300.tif 000003
【０３４４】
抗体精製のいくつかの方法は、アフィニティー精製技術を伴う。アフィニティー精製への代表的手法には、硫酸アンモニウムによる沈殿（他の血清タンパク質からの全免疫グロブリンの粗精製）；結合＆溶出モードで固定化タンパク質Ａ、Ｇ、Ａ／ＧまたはＬ（ＩｇＧのほとんどの種及びサブクラスに結合する）または組換えタンパク質Ａ、Ｇ、Ａ／ＧまたはＬ誘導体によるアフィニティー精製；及び結合＆溶出モードで固定化抗原（粗試料から特異性抗体を単離するためのアフィニティー担体に共有結合により固定化した精製抗原）によるアフィニティー精製が含まれる。
【０３４５】
タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ及びタンパク質Ｌは、その抗体結合特性がよく特徴づけられている３つの細菌タンパク質である。これらのタンパク質は組換えにより生成され、様々な種由来の重要な抗体型のアフィニティー精製のためにルーチン的に使用されている。これらのタンパク質のほとんどの市販の組換え型は、不要な配列が除去され（例えば、タンパク質ＧからのＨＳＡ結合ドメイン）、従ってそれらの天然のカウンターパートより小さい。タンパク質Ａ及びタンパク質Ｇの遺伝子操作された組換え型は、タンパク質Ａ／Ｇとも呼ばれ、これも利用可能である。全ての４つの組換えＩｇ結合タンパク質は、多数の免疫検出及び免疫アフィニティー用途で研究者によってルーチン的に使用されている。
【０３４６】
抗体精製を達成するため、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ／Ｇを担体、例えば、多孔性樹脂（例えばビーズ状アガロース）または磁気ビーズ上に共有結合によって固定化する。これらのタンパク質はいくつかの抗体結合ドメインを含有するので、ほとんどあらゆる個々の固定化分子は、その配向性を問わずに、少なくとも１つの機能性かつ非ヒンダード結合ドメインを維持する。さらに、タンパク質は、抗原結合ドメイン以外の部位で抗体に結合するので、これらのタンパク質の固定化型を免疫沈降法等の精製スキームに使用することができる。このスキームでは、抗体結合性タンパク質を用いて、抗体を結合させることによって、抗体がその抗原に結合し、同時に抗原を試料から精製する。
【０３４７】
ＩｇＧ型抗体のＦｃ領域に対するタンパク質Ａの高いアフィニティーがＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント及びサブクラスの精製の基礎である。一般的に、タンパク質Ａクロマトグラフィーは、抗体が結合し、望まれない成分、例えば、宿主細胞タンパク質、細胞培地成分及び推定上のウイルスがカラムを通過するように、約６．０〜約８．０のｐＨでカラムを横切る浄化細胞培養上清の通路を必要とする。任意的な中間洗浄ステップを行って、非特異的に結合した不純物をカラムから除去した後に、ｐＨ約２．５〜約ｐＨ４．０で産物の溶出を行ってよい。直線グラジエント法もしくはステップ法またはグラジエント法とステップ法の組合せとして溶出ステップを行ってもよい。一実施形態では、溶出液を即座に中和緩衝液（例えば１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８）で中和してから、例えば、５％塩酸または１Ｍの水酸化ナトリウムを用いて最終ｐＨを６．５に調整する。好ましくは、その後のクロマトグラフィーの前に中和溶出液を濾過する。一実施形態では、その後のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーステップの前に中和溶出液を０．２μｍフィルターに通す。
【０３４８】
その高い選択性、高い流速及び対費用効果の高い結合能ならびに宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、細胞培地成分ならびに内在性及び外来性ウイルス粒子等のプロセス関連不純物の広範な除去のその能力のため、抗体精製プロセスの第１ステップとしてタンパク質Ａクロマトグラフィーが典型的に用いられる。このステップの後は、分解を引き起こし得るプロテアーゼ及び他の培地成分の排除のため抗体産物は高度に純粋であり、さらに安定している。
【０３４９】
現在、それらの樹脂骨格組成に基づいて分類されている３つの主タイプのタンパク質Ａ樹脂がある：ガラスまたはシリカに基づく、例えば、ＡｂＳｏｌｕｔｅ  ＨｉＣａｐ（ＮｏｖａＳｅｐ）、Ｐｒｏｓｅｐ  ｖＡ、Ｐｒｏｓｅｐ  ｖＡ  Ｕｌｔｒａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；アガロースに基づく、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ及びＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；及び有機ポリマーに基づく、例えば、ポリスチレンジビニルベンゼンＰｏｒｏｓ  Ａ及びＭａｂＣａｐｔｕｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。好ましくは、タンパク質Ａ樹脂は、アガロースに基づく樹脂、すなわち、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ樹脂である。全ての３タイプの樹脂は、高濃度のグアニジニウム塩酸塩、尿素、還元剤及び低ｐＨに耐性である。
【０３５０】
大規模で利用するカラム床高さは１０〜３０ｃｍであり、樹脂粒子特性、例えば、孔径、粒径及び圧縮性によって決まる。好ましくは、カラム床高さは約２５ｃｍである。流速及びカラム寸法によりカラム上の抗体滞留時間が決まる。一実施形態では、タンパク質Ａに用いる線速度は、約１５０〜約５００ｃｍ／時、好ましくは約２００ｃｍ／時〜約４００ｃｍ／時、さらに好ましくは約２００ｃｍ／時〜約３００ｃｍ／時、最も好ましくは約２５０ｃｍ／時である。動的結合能は、樹脂１リットル当たり１５〜５０ｇの抗体であり、流速、精製すべき特定抗体ならびに、使用するタンパク質Ａマトリックスによって決まる。好ましくは、樹脂１リットル当たり４５ｇ以下の抗体をカラムに負荷する。タンパク質Ａ樹脂の動的結合能の決定方法については、Ｆａｈｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  ＢｉｏＣｈｅｍ．３０：１２１−１２８（１９９９）に記載されている。より低い負荷流速は、抗体滞留時間を増やし、より高い結合能を促し得る。また、より低い負荷流速は、サイクル毎の処理時間を長くし、必要サイクルを少なくし、採取細胞培養液のバッチ毎の緩衝液の消費を少なくする。
【０３５１】
アフィニティー精製への他の代表的な手法としては、レクチンアフィニティークロマトグラフィーがあり、フロースルーモード（望ましくないグリコシル化を有する産物は担体に結合するが、望ましくないグリコシル化のない産物は担体を通過する）かまたは結合＆溶出モード（所望のグリコシル化を有する産物は担体に結合するが、所望のグリコシル化のない産物は担体を通過する）で行うことができる。
【０３５２】
下等真核生物、例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ内で発現されるタンパク質は、Ｏオリゴ糖のみで修飾可能であり、または主にマンノース（Ｍａｎ）残基で構成され得る。さらに、下等真核生物、例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ内で発現されるタンパク質は、Ｎオリゴ糖で修飾可能である。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ及び他の真菌内のＮ−グリコシル化は、より高等の真核生物と異なる。真菌内でさえ、Ｎグリコシル化は異なる。特に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ内のＮ結合型グリコシル化経路は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで見られるものと実質的に異なり、より短いＭａｎ（アルファ１，６）がコアＭａｎ８ＧＮ２まで伸長し、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ内のＮ結合型グリカンの主プロセシング様式に相当する重要なＭａｎ（アルファ１，３）付加を明らかに欠いている。いくつかの点で、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓは、典型的哺乳類の高マンノースグリコシル化パターンに近い可能性がある。さらに、ピキア及び他の真菌を操作して「ヒト化糖タンパク質」を生成し得る（すなわち、酵母株を遺伝子修飾して、ガラクトシル化等の哺乳類に見られる必須のグリコシル化経路を複製できる）。
【０３５３】
タンパク質産物の所望もしくは望ましくないＯ結合型及び／またはＮ結合型グリコシル化修飾に基づいて、フロースルーモードまたは結合＆溶出モードでのアフィニティークロマトグラフィー用に１つ以上のレクチンを選択することができる。例えば、所望タンパク質が特定のＯ結合型及び／またはＮ結合型マンノース修飾を欠いている（すなわち、所望タンパク質が修飾されていない）場合、所望の非修飾産物が担体を通過し、さらなる精製またはプロセシングに利用できるように、マンノース部分に結合するレクチン、例えば、Ｃｏｎ  Ａ、ＬＣＨ、ＧＮＡ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＬ−ＳＩＧＮをフロースルーモードのアフィニティー精製用に選択することができる。反対に、所望タンパク質が特定のＯ結合型及び／またはＮ結合型マンノース修飾を含む（すなわち、所望タンパク質が修飾されていない）場合、所望の修飾産物は担体に結合し、望ましくない非修飾産物は通過するように、マンノース部分に結合するレクチン、例えば、Ｃｏｎ  Ａ、ＬＣＨ、ＧＮＡ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＬ−ＳＩＧＮを結合＆溶出モードのアフィニティー精製用に選択することができる。後の例では、フロースルーは廃棄し得るが、所望の修飾産物は、さらなる精製またはプロセシングのために担体から溶出される。同原理は、真菌発現系により導入された他のグリコシル化修飾を含む組換えタンパク質産物に当てはまる。
【０３５４】
別の偽アフィニティー精製ツールは、「混合モード」クロマトグラフィーである。本明細書で使用する場合、用語「混合モードクロマトグラフィー」は、固定相と分析物との間の１より多くの型の相互作用をそれらの分離を達成するために利用するクロマトグラフ法を指し、例えば、混合モードクロマトグラフィーにおける二次相互作用は、溶質の保持に寄与する。混合モードクロマトグラフィーの利点は、高い選択性、例えば、正、負及び中性物質を単一実施、及びより高い負荷能力で分離可能である。
【０３５５】
混合モードクロマトグラフィーは、セラミックまたは結晶性アパタイト媒体、例えばヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィー及びフルオロアパタイト（ＦＡ）クロマトグラフィーで行うことができる。他の混合モード樹脂としては、限定するものではないが、ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；ＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ、及びＰＰＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（Ｐａｌｌ）；及びＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＭＸ−Ｔｒｐ−６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）が挙げられる。これらのクロマトグラフィー樹脂は、より伝統的なイオン交換または疎水性相互作用技術に対して補完的な生体分子選択性を提供する。
【０３５６】
セラミックヒドロキシアパタイト（Ｃａ５（ＰＯ４）３ＯＨ）２は、タンパク質、酵素、核酸、ウイルス及び他の巨大分子の分離及び精製に使用できる形態のリン酸カルシウムである。ヒドロキシアパタイトは、ユニークな分離特性ならび優れた選択性及び分解能を有する。例えば、それは多くの場合、他のクロマトグラフィー及び電気泳動技術により同種と思われるタンパク質を分離する。塩化ナトリウムまたはリン酸ナトリウムグラジエント溶出によるセラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）クロマトグラフィーは、二量体、凝集体及び浸出タンパク質Ａを除去するためのモノクロナール抗体精製プロセスの仕上げステップとして使用可能である。
【０３５７】
Ｉ型及びＩＩ型の例示ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）吸着剤は、セラミック及び結晶性物質から選択される。ＨＡ吸着剤は様々な粒径で利用可能である（例えば、１型、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。例示実施形態では、ＨＡ吸着剤の粒径は、約１０μｍ〜約２００μｍ、約２０μｍ〜約１００μｍまたは約３０μｍ〜５０μｍである。特定例では、ＨＡ吸着剤の粒径は、約４０μｍである（例えば、ＣＨＴ、Ｔｙｐｅ  Ｉ）。
【０３５８】
代表的なＩ型及びＩＩ型フルオロアパタイト（ＦＡ）吸着剤は、セラミック（例えば、ビーズ様粒子）及び結晶性物質から選択される。セラミックＦＡ吸着剤は様々な粒径で利用可能である（例えば１型及び２型、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。例示実施形態では、セラミックＦＡ吸着剤の粒径は、約２０μｍ〜約１８０μｍ、好ましくは約２０〜約１００μｍ、さらに好ましくは約２０μｍ〜約８０μｍである。一例では、セラミックＦＡ媒体の粒径は、約４０μｍ（例えば、１型セラミックＦＡ）である。別の例では、ＦＡ媒体は、ＦＡに加えてＨＡを含む。
【０３５９】
試料をヒドロキシアパタイトまたはフルオロアパタイトカラムに負荷するために用いる流速、ならびに溶出流速の選択はヒドロキシアパタイトまたはフルオロアパタイト吸着剤の型及びカラム形状によって決まる。１つの例示実施形態では、プロセス規模で、負荷流速は、約５０〜約９００ｃｍ／時、約１００〜約５００ｃｍ／時、好ましくは約１５０〜約３００ｃｍ／時、さらに好ましくは約２００ｃｍ／時から選択される。
【０３６０】
例示実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ５〜約ｐＨ９、好ましくは約ｐＨ６〜約ｐＨ８、さらに好ましくは約ｐＨ６．５から選択される。
【０３６１】
一実施形態では、開示精製プロセスは、タンパク質Ａクロマトグラフィー後にＣＨＴ樹脂上でのヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーを利用する。好ましくは、５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中約０Ｍ〜１．５Ｍの塩化ナトリウムの直線グラジエント（０〜１００％）としてｐＨ６．５で溶出を行う。溶出液のＯＤ２８０をモニターすることができる。一実施形態では、溶出中に、上昇部の０．１ＯＤからピーク最大への単一画分を収集してから、一連の画分、例えば、カラム体積の約１／３をピーク最大から０．１ＯＤまで下降部でさらなる純度分析用に収集する。別の好ましい実施形態では、約５ｍＭ〜０．２５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液の直線グラジエント（０〜１００％）としてｐＨ６．５で溶出を行う。溶出液のＯＤ２８０をモニターすることができる。溶出中、約１／２ＣＶの画分を上昇部の０．１ＯＤから下降部の０．１ＯＤまでさらなる純度分析用に収集することができる。
【０３６２】
ポリクローナル抗体（例えば血清試料）は、非特異性免疫グロブリンの同時精製を妨げるために抗原特異性アフィニティー精製を必要とする。例えば、マウス血清中の全ＩｇＧの一般的に２〜５％のみが該動物の免疫化に用いる抗原に対して特異的である。使用可能な抗体を得るために必要な精製のタイプ（複数可）及び度合は、該抗体の意図した用途（複数可）によって決まる。しかしながら、細胞株、例えば、ハイブリドーマまたは組換え発現系を用いて作成した、及び腹水液または細胞培養上清として産生されたモノクロナール抗体は、標的抗体が（多くの実際の目的で）生成試料中の免疫グロブリンのみなので、抗原特異性アフィニティー法を使用しないで完全に精製可能である。
【０３６３】
不純物のモニタリング
バイオ医薬製品ならびにそれらの関連中間体及び賦形剤中の不純物のプロファイリングは規制上求められているものである。例えば、ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ  ａｎｄ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃ  Ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓを参照されたい。このガイダンスは、どのようにこれらの不純物の安全性及び曝露閾値を評価するかについての推奨を行う。Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ａｇｅｎｃｙ’ｓ（ＥＭＥＡ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ（ＣＨＭＰ）もＧｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ  Ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓを公表した。これは、欧州当局により新製剤に適用され、場合によっては医薬品開発における原薬にも適用されている。これらの指針は、さらに一般的なアプローチで不純物に取り組む、産業のための調和国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＩＣＨ）ガイダンス：Ｑ３Ａ（Ｒ２）Ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ，Ｑ３Ｂ（Ｒ２）Ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ａｎｄ  Ｑ３Ｃ（Ｒ３）Ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ：Ｒｅｓｉｄｕａｌ  Ｓｏｌｖｅｎｔｓを増強する。
【０３６４】
一部の不純物は製剤に関わるが（すなわち、産物関連変異体）、他は合成、処理、及び製造中に加えられる。これらの不純物はいくつかの広いクラスに分類される：産物関連変異体；上流で導入されるプロセス関連物質；プロセス全体にわたる残留不純物；下流で導入されるプロセス関連残留不純物；ディスポーザブル品から導入される残留不純物。
【０３６５】
本明細書で使用する場合、「産物関連変異体」は、所望産物の調製物中に存在し、所望産物に関連する、所望産物（例えば、所望マルチサブユニット複合体）以外の産物を指す。例示産物関連変異体としては、切断型または伸長ペプチド、所望グリコシル化とは異なるグリコシル化を有する産物（例えば、非グリコシル化産物が望ましい場合に、いずれのグリコシル化産物をも産物関連変異体とみなすものとする）、異常な化学量論、不適切なアセンブリー、異常なジスルフィド結合、異常もしくは不完全な折り畳み、凝集、プロテアーゼ切断、または他の異常を有する複合体が挙げられる。例示産物関連変異体は、分子質量（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーにより検出される）、等電点（例えば、等電点電気泳動により検出される）、電気泳動移動度（例えば、ゲル電気泳動により検出される）、リン酸化状態（例えば質量分析により検出される）、電荷対質量比（例えば、質量分析により検出される）、タンパク質分解フラグメントの質量もしくは同一性（例えば、質量分析またはゲル電気泳動により検出される）、疎水性（例えば、ＨＰＬＣにより検出される）、電荷（例えば、イオン交換クロマトグラフィーにより検出される）、アフィニティー（例えば、抗体の場合、所望抗体が結合するタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、及び／またはエピトープへの結合により検出される）、及びグリコシル化状態（例えば、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、またはＡｂ５等の抗糖タンパク質抗体への結合により検出される）の１つ以上の変化を示し得る。所望タンパク質が抗体である場合、産物関連変異体という用語には、糖重（ｇｌｙｃｏ−ｈｅａｖｙ）変異体及び／または半抗体種（後述する）を含めてよい。
【０３６６】
例示産物関連変異体には、異常なジスルフィド結合を含む異型が含まれる。例えば、ほとんどのＩｇＧ１抗体分子は、全部で１６個の鎖内及び鎖間ジスルフィド架橋によって安定化され、これらが重鎖及び軽鎖の両方のＩｇＧドメインの折り畳みを安定化し、さらに鎖内ジスルフィド架橋は重鎖と軽鎖との間の関連性を安定化する。他の抗体型は、同様に鎖内及び鎖間ジスルフィド結合を安定化する特性を含有する。さらに、一部の抗体（本明細書で開示するＡｂ−Ａを含めて）は、非標準ジスルフィド結合と呼ばれる追加のジスルフィド結合を含有する。従って、安定化させる共有結合、及び／または追加サブユニットへのジスルフィド結合の非存在のため、異常な鎖間ジスルフィド結合が異常な複合体化学量論をもたらすことがある。さらに、異常なジスルフィド結合（鎖間であれ鎖内であれ）が抗体の構造安定性を低減させることがあり、これが活性低下、安定性低下、凝集体形成傾向増加、及び／または免疫原生増加をもたらし得る。異常なジスルフィドを含有する産物関連変異体は、非還元型変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、キャピラリー電気泳動、ｃＩＥＸ、質量分析（場合により化学修飾を用いて遊離システインの質量シフトを引き起こして）、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、光散乱の変化、及び当該技術分野で既知の他の任意の適切な方法を含めた種々の方法で検出可能である。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ２００２，Ｐａｒｔ  Ｖ，５８１−５８３，ＤＯＩ：１０．１３８５／１−５９２５９−１６９−８：５８１参照されたい。
【０３６７】
一般的に、透析、脱塩及びダイアフィルトレーションを用いて抗体を特定緩衝液に交換して望ましくない低分子量（ＭＷ）成分を除去することができる。特に、透析膜、サイズ排除樹脂、及び高分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を特徴とするダイアフィルトレーション装置を用いて免疫グロブリン（＞１４０ｋＤａ）を小さいタンパク質及びペプチドから分離することができる。例えば、Ｇｒｏｄｚｋｉ，Ａ．Ｃ．ａｎｄ  Ｂｅｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．（２０１０）．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｃ．Ｏｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｃ．Ｊａｍｕｒ（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５８８：１５−２６．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ．を参照されたい。
【０３６８】
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて抗体凝集体、モノマー、及びフラグメントを検出することができる。さらに、質量分析連動サイズ排除クロマトグラフィーを用いて抗体、抗体複合体、ならびに抗体軽鎖及び重鎖の分子量を測定することができる。
【０３６９】
精製及び純度モニタリング法に用いる例示サイズ排除樹脂としては、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）からのＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ及びＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌ；Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）からのＳｈｏｄｅｘ  ＫＷ−８０４、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  ３００ＳＷ、及びＢｉｏＳｕｉｔｅ  ２５０；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）からのＭＡｂＰａｃ（商標）ＳＥＣ−１及びＭＡｂＰａｃ（商標）ＳＣＸ−１０が挙げられる。
【０３７０】
一実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、精製プロセス中の不純物分離をモニターする。例として、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）からのＴＳＫｇｅｌ  Ｇｕａｒｄ  ＳＷ×１６×４０ｍｍと接続した平衡化ＴＳＫｇｅｌ  ＧＳ３０００ＳＷ  １７．８×３００ｍｍカラムに、１００ｍＭの硫酸ナトリウム、２００ｍＭの塩化ナトリウムを含むＳＥ−ＨＰＬＣ緩衝液ｐＨ６．５を移動相として０．５ｍＬ／分の流速で均一濃度モードで用いて試料を負荷することができる。ＵＶ検出機器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）１２００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣを用いて、ＵＶ２１５ｎｍで吸光度をモニターすることができる。次に試料を収集し、所望濃度、例えば、１ｍｇ／ｍＬに希釈することができる。次に希釈試料の画分、例えば、３０μＬをＳＥ−ＨＰＬＣカラムに負荷することができる。好ましくは、ゲル濾過標準物質（例えば、ＢｉｏＲａｄ）を用いてカラム性能をモニターする。
【０３７１】
産物関連変異体には、糖変異体が含まれる。本明細書で使用する場合、「糖変異体」は、抗体調製物中に存在することがあり、少なくとも部分的Ｆｃ配列を含有するグリコシル化産物関連変異体を指す。糖変異体は、所望タンパク質のポリペプチド側鎖に共有結合しているグリカンを含有する。糖変異体は、所望タンパク質産物に比べて「糖重」または「糖軽」変異体であってよく、すなわち、それぞれ、所望タンパク質に比べて追加のグリコシル化修飾を含むかまたは所望タンパク質より少ないグリコシル化修飾を含む。例示グリコシル化修飾としては、限定するものではないが、Ｎ結合型グリコシル化、Ｏ結合型グリコシル化、Ｃグリコシル化及びホスホグリコシル化が挙げられる。
【０３７２】
糖変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察可能な電気泳動移動度の増加または減少（正常ポリペプチド鎖に対して）、レクチン結合アフィニティー、抗Ｆｃ抗体に結合する抗糖タンパク質抗体（例えばＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、またはＡｂ５）への結合、及び該糖変異体を含有する抗体複合体のサイズ排除クロマトグラフィーにより決定した場合のより高いかまたはより低い見掛けの分子量を特徴とする。例えば、参照によってその全体をここに援用する２０１１年８月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／５２５，３０７号を参照されたい。
【０３７３】
本明細書で使用する場合、「グリコシル化不純物」は、所望タンパク質とは異なるグリコシル化パターンを有する物質を指す。グリコシル化不純物は、所望タンパク質と同一または異なる一次、二次、三次及び／または四次構造を含有し得る。従って、糖変異体は、ある種のグリコシル化不純物である。
【０３７４】
バイオプロセス条件は、例えば、高マンノース型、切断型の変動、４分岐型（ｔｅｔｒａ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）構造の減少ならびに３分岐型及び２分岐型構造の増加、より少ないシアル化グリカン及びより少ないグリコシル化を引き起こし得るので、ｍＡｂのグリコシル化のモニタリングのための分析方法は重要である。試料中の糖変異体の存在は、当該技術分野で既知の分析手段、例えばグリカン染色もしくは標識、質量分析及び／または糖タンパク質精製もしくは富化によるグルコプロテオーム及びグライコーム（ｇｌｙｃｏｍｅ）分析等によってモニタリング可能である。一実施形態では、糖変異体を抗糖タンパク質抗体（例えばＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、またはＡｂ５）結合アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、光干渉法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ（登録商標）を用いて行える）、二重偏光干渉法（Ｆａｒｆｉｅｌｄ  ＡｎａＬｉｇｈｔ（登録商標）を用いて行える）、静的光散乱法（Ｗｙａｔｔ  ＤｙｎａＰｒｏ  ＮａｎｏＳｔａｒ（商標）を用いて行える）、動的光鎖散乱法（Ｗｙａｔｔ  ＤｙｎａＰｒｏ  ＮａｎｏＳｔａｒ（商標）を用いて行える）、組成グラジエント多角光散乱法（Ｗｙａｔｔ  Ｃａｌｙｐｓｏ  ＩＩを用いて行える）、表面プラズモン共鳴法（ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６またはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を用いて行える）、ユーロピウムＥＬＩＳＡ、化学電界発光（ｃｈｅｍｏｅｌｅｃｔｒｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）ＥＬＩＳＡ、ファーウエスタン分析、電界化学発光（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙを用いて行える）、または他の結合アッセイを用いて分析する。
【０３７５】
一実施形態では、グリカン染色または標識を用いて糖変異体を検出する。例えば、グリカン糖基を過ヨウ素酸で化学的に再構築して糖の隣位ヒドロキシルをアルデヒドもしくはケトンに酸化することができ、その結果、それらは色素、例えば、過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）染色に反応して、所与試料中の糖タンパク質を検出及び定量化する。過ヨウ素酸を用いて、検出または精製のための標識分子（例えば、ビオチン）または固定化担体（例えば、ストレプトアビジン）に共有結合できる架橋剤に対して糖を反応性にすることもできる。
【０３７６】
別の実施形態では、質量分析を用いて試料中の糖変異体を同定及び定量化する。例えば、酵素消化を用いて免疫糖タンパク質からオリゴ糖を遊離させて、続いてオリゴ糖を蛍光モディファイヤーで誘導体化し、蛍光検出連動順相クロマトグラフィーにより分割し、質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）で解析することができる。グライコプロテオミクス（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃ）解析の基本原理は、糖タンパク質または糖ペプチドの富化、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）による多次元分離、タンデム質量分析及びバイオインフォマティクスによるデータ解析を包含する。
【０３７７】
グリカンの酵素的切断の前または後に、例えば、実験に応じてエンドグリカナーゼ（ｅｎｄｏｇｌｙｃａｎａｓｅ）Ｈ（ｅｎｄｏ  Ｈ）またはペプチド−Ｎ４−（Ｎ−アセチル−ベータ−グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼ（ＰＮＧａｓｅ）によって、分光分析を行うことができる。さらに、定量的比較グライコプロテオーム解析は、培養細胞内のアミノ酸による安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ）試薬を用いる差次的標識によって実施可能である。さらに、同位体的標識した「重い」参照ペプチドを用いて標的糖タンパク質について、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）による絶対的定量化を行うことができる。
【０３７８】
一実施形態では、アフィニティー精製用のレクチンは、精製プロセス中に所望タンパク質の糖変異体を枯渇させるかまたは選択的に富化する。レクチンは、別個の糖部分に対して高い特異性を有するグリカン結合性タンパク質である。市販レクチンの非限定リストを下表３に示す。
【０３７９】
【表３−１】
2018511300.tif 000004
【表３−２】
2018511300.tif 000005
【０３８０】
一実施形態では、実験中または実験完了後に発酵プロセスから得られる試料を抗糖タンパク質抗体（例えば、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、またはＡｂ５）結合アッセイにかけて試料（複数可）中のグリコシル化不純物の量及び／または型を検出する。同様に、他の実施形態では、精製プロセスは、所望タンパク質を精製する試料中のグリコシル化不純物の量及び／または型を検出することを含む。例えば、特定の実施形態では、精製プロセスの少なくとも１つのクロマトグラフィーステップからの溶出液の一部またはその画分を抗糖タンパク質抗体（例えばＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、またはＡｂ５）に接触させてよい。
【０３８１】
抗糖タンパク質抗体（例えばＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、またはＡｂ５）結合のレベルは、典型的に溶出液またはその画分中に存在する産物関連糖変異体不純物のレベル（通常のサイズ排除クロマトグラフ法に基づいて）と相関し、その結果、糖変異体不純物の含量に基づいて、さらなる精製及びプロセシングのために溶出液の１つ以上の画分を選択することができ、例えば、１０％未満の糖変異体を含む溶出液の画分をさらなるクロマトグラフ精製のために選択することができる。一部の実施形態では、複数の抗糖タンパク質抗体（例えばＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、またはＡｂ５）（すなわち、その２種以上）を用いて産物関連糖変異体不純物をモニターすることができる。
【０３８２】
代替実施形態では、検出されたグリコシル化不純物の量及び／または型に基づいて、ある特定の試料もしくは溶出液またはその画分を廃棄する。さらに別の実施形態では、検出されたグリコシル化不純物の量及び／または型に基づいて、特定試料または画分を処理してグリコシル化不純物を低減させ及び／または除去する。例示処理としては、以下の１つ以上が挙げられる：（ｉ）グリコシル化を除去する酵素または他の化学成分の添加、（ｉｉ）１つ以上のレクチン結合ステップを行うことによるグリコシル化不純物の除去、（ｉｉｉ）サイズ排除クロマトグラフィーを行ってグリコシル化不純物を除去すること。
【０３８３】
特定の実施形態では、抗糖タンパク質抗体（例えばＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、またはＡｂ５）をプローブに結合させてから担体に固定化する。担体は、バッチ形式またはカラム、例えばＨＰＬＣ用カラムに詰めてよい。例示プローブとしては、ビオチン、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ、フルオレセイン（フルオレセインイソチオシアナート、ＦＩＴＣ）及びローダミン（テトラメチルローダミンイソチオシアナート、ＴＲＩＴＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びフィコビリタンパク質（例えば、アロフィコシアニン、フィコシアニン、フィコエリトリン及びフィコエリトロシアニン）がある。例示担体としては、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン（脱グリコシル化アビジン）及び磁気ビーズが挙げられる。本発明は、カップリング化学に限定されないことに留意すべきである。好ましくは、抗糖タンパク質抗体（例えばＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、またはＡｂ５）をビオチン化し、ストレプトアビジンセンサー上に固定化する。
【０３８４】
標準的なタンパク質−タンパク質相互作用モニタリングプロセスを用いて、精製プロセスの種々のステップからの試料中の抗糖タンパク質抗体（例えばＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、またはＡｂ５）とグリコシル化不純物との間の相互作用を解析することができる。代表的なタンパク質−タンパク質相互作用モニタリングプロセスとしては、限定するものではないが、光干渉法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ（登録商標）を用いて行える）、二重偏光干渉法（Ｆａｒｆｉｅｌｄ  ＡｎａＬｉｇｈｔ（登録商標）を用いて行える）、静的光散乱法（Ｗｙａｔｔ  ＤｙｎａＰｒｏ  ＮａｎｏＳｔａｒ（商標）を用いて行える）、動的光鎖散乱法（Ｗｙａｔｔ  ＤｙｎａＰｒｏ  ＮａｎｏＳｔａｒ（商標）を用いて行える）、組成グラジエント多角光散乱法（Ｗｙａｔｔ  Ｃａｌｙｐｓｏ  ＩＩを用いて行える）、表面プラズモン共鳴法（ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６またはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を用いて行える）、ＥＬＩＳＡ、化学電界発光ＥＬＩＳＡ、ユーロピウムＥＬＩＳＡ、ファーウエスタン分析、電界化学発光（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙを用いて行える）または他の結合アッセイが挙げられる。
【０３８５】
光干渉法は、２つの表面（バイオセンサー先端上の固定化タンパク質の層、及び内部基準層）から反射される白色光の干渉パターンを解析して、干渉パターンのシフト（すなわち、バイオセンサー先端に結合する分子数の変化により引き起こされる）に基づいてリアルタイムで生体分子の相互作用を測定し、それによって結合特異性、会合及び解離速度、または濃度についての情報を与える、光分析技術である。
【０３８６】
二重偏光干渉法は、交互直角偏光レーザービームで照らされる上部検知導波路ならびに下部光学基準導波路を有するデュアルスラブ導波路センサーチップに基づいている。２つの異なる導波路モード、詳細には、横磁界（ＴＭ）モード及び横電界（ＴＥ）モードが作り出される。両モードは、頂部検知導波路にエバネセント場をもたらし、この表面と接触する物質を探索する。物質がセンサー表面と相互作用すると、干渉縞に相変化をもたらす。次に、各モードについての干渉縞パターンを数学的にＲＩ値と厚さ値に分解する。このようにして、センサーは、センサー表面上の極端にわずかな分子変化を測定することができる。
【０３８７】
静的光散乱法（ＳＬＳ）は、溶液中のタンパク質試料の絶対分子質量を低強度レーザー光（６９０ｎｍ）への暴露を通じて５％より良い精度まで実験的に決定し得る非侵襲性技術である。散乱光の強度を角度の関数として測定し、モル質量、平均二乗半径、及び第２ビリアル係数（Ａ２）を得るように解析することができる。ＳＬＳ実験結果は、溶液オリゴマー状態（モノマー／ダイマー等）の決定に加えて、タンパク質調製物の品質管理として（例えば、構造研究のため）使用可能である。ＳＬＳ実験は、バッチモードでもクロマトグラフィーモードでも実施し得る。
【０３８８】
動的光散乱法（準弾性光散乱法、ＱＥＬＳ、または光子相関分光法、ＰＣＳとしても知られる）は、リアルタイム強度（静的光散乱法により測定される時間平均強度に比べて）に基づいて分子及びサブミクロン粒子の水力学的サイズを測定するための技術である。媒体中の粒子からの散乱光のゆらぎ（典型的にμ秒〜ｍ秒の時間尺度での経時的変動）を記録し、相関遅延時間ドメインにおいて解析する。粒子は、懸濁液中の固体粒子（例えば、金属酸化物、鉱物デブリ、及びラテックス粒子）もしくは軟性粒子（例えば、ベシクル及びミセル）、または溶液中の巨大分子鎖（例えば、合成ポリマー及びバイオマテリアル）であり得る。粒子の拡散速度は所与の環境におけるそれらのサイズによって決まるので、それらのサイズについての情報は、散乱光のゆらぎ速度に含まれる。
【０３８９】
小分子の散乱強度は、分子量の二乗に比例する。そのため、動的及び静的光散乱技術は、タンパク質凝集の発生及び他の、条件のわずかな変化から生じるタンパク質構造の変化に非常に敏感である。
【０３９０】
組成勾配多角光散乱法（ＣＧ−ＭＡＬＳ）は、巨大分子相互作用、例えばタンパク質の可逆的自己会合及びヘテロ会合、反応速度及び非可逆的凝集のアフィニティー、またはビリアル係数を特徴づけるために、異なる組成または濃度の一連の未分画試料を利用する。該測定は、特異的な可逆的複合体結合についての情報（例えば、Ｋｄ、化学量論、自己及び／またはヘテロ会合）、非特異的相互作用についての情報（例えば、自己及びクロスビリアル係数）、凝集及び他の時間依存性反応についての情報（例えば、ストップ・フロー反応速度論及びｔ）及びＺｉｍｍプロットについての情報（例えば、ＭＷ、Ａ２、Ａ３（第２及び第３ビリアル係数）、またはｒｇを決定するための濃度勾配）を提供する。
【０３９１】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象は、全反射条件下で、異なる屈折率の媒体（すなわち、センサー表面のガラス（高屈折率）及び緩衝液（低屈折率））間の界面にて偏光が導電性（例えば、金）層に衝突すると起こる。ある範囲の入射角をカバーする偏光のくさびがセンサー表面のガラス面に向けられる。光がガラスに衝突するときに生じる電場強度（すなわち、エバネセント波）が金層内の自由電子クラウドと相互作用し、それにより吸収され、プラズモンと呼ばれる電子電荷密度波を作り出し、反射光の強度低下をもたらす。この強度の最小が生じる共鳴角度は、センサー表面の反対面上の金層に近い溶液の屈折率の関数である。反射光は、モニタリング装置、例えば、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６またはＢｉａｃｏｒｅシステム内で検出される。プラズモン読み出しに基づいて反応速度論（すなわち、複合体形成速度（ｋａ）及び解離速度（ｋｄ））、アフィニティー（例えば、ＫＤ）、及び濃度情報を決定することができる。
【０３９２】
これら及び他のタンパク質−タンパク質相互作用モニタリングプロセスから得た情報を用いて、例えば、酵素／インヒビターもしくは抗体／抗原相互作用または糖タンパク質／レクチン相互作用の結合アフィニティー及び化学量論を定量化し；タンパク質−タンパク質相互作用への小分子の影響を研究し；緩衝液パラメーターを調整して処方物の安定性及び粘度を改善し；抗体精製を最適化し、処方物への大きい賦形剤の効果を理解し；溶媒のイオン強度、ｐＨ、または賦形剤が重合またはタンパク質会合に及ぼす影響を定量化し；自己アセンブリー及び凝集の反応速度論を測定し；ならびに多種多様な緩衝液組成、時間、及び温度尺度にわたる巨大分子結合アフィニティー及び会合複合体化学量論を特徴づけることができる。
【０３９３】
好ましい実施形態では、ＥＬＩＳＡを用いて、場合により西洋ワサビペルオキシダーゼまたはユーロピウム検出により抗糖タンパク質抗体（例えばＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、またはＡｂ５）結合レベル（糖変異体不純物の量と相関する）を決定する。
【０３９４】
上流で導入される例示プロセス関連不純物としては、細胞溶解後に興味あるタンパク質と共に見られる不要細胞成分である核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が挙げられる。これらのプロセス関連不純物には、細菌汚染を制御し、宿主生物における選択的圧力を維持するために細胞培地に上流で加えられる抗生物質も含まれる。例示抗生物質としては、カナマイシン、アンピシリン、ペニシリン、アムホテリシンＢ、テトラシリン、硫酸ゲンタマイシン、ヒグロマイシンＢ、及びプラスモシンが挙げられる。
【０３９５】
プロセス全体を通して生じる例示残留不純物としては、プロセス向上剤または触媒も含まれ、これらはプロセス全体を通して、いくつかのステップをより効率的にし、産物の収率を高めるために添加される。例えば、グアニジン及び尿素は、発酵生産物の可溶化のために添加され、グルタチオン及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）は、タンパク質の還元及び再折り畳み中に使用される。
【０３９６】
下流で導入される例示プロセス関連不純物としては、プロセスから除去しなければならない、標的タンパク質のクロマトグラフ精製に必要な化学薬品及び試薬（例えば、アルコール及びグリコール）ならびに、液液界面での吸着による界面張力を下げることによって、プロセス流からのタンパク質、ペプチド、及び核酸の分離を助けるための下流処理中に添加される界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、Ａｎｔｉｆｏａｍ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｔｗｅｅｎ、またはＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）がある。
【０３９７】
ディスポーザブル品から導入される例示残留不純物としては、過度な条件下（例えば、刺激の強い溶媒また高温で）成分から抽出でき、製剤を汚染する可能性がある化合物である「抽出可能物」、及び通常条件または時には加速条件下で処方物との直接接触の結果として成分から製剤処方物中に浸出する化合物である「浸出物」がある。浸出物は、抽出可能物の一部であり得る。抽出可能物は、使用成分が適切である程度まで制御されなければならない。浸出物は、製剤が質を落とさないように制御されなければならない。
【０３９８】
上記本発明をさらに明瞭にするため、下記非限定実施例を提供する。
【実施例】
【０３９９】
実施例
下記実施例は、対象発明をどのように作り、使用するかの完全な開示及び記述を当業者に提供するために示すものであり、発明とみなされるものの範囲を限定する意図ではない。使用した数（例えば、量、温度、濃度等）に関する正確さを確保する努力を行ったが、いくらかの実験誤差及び偏差を許容すべきである。特に指定のない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはその近傍である。
【０４００】
実施例１：抗糖タンパク質抗体を生成するためのウサギの免疫化
Ａｂ−Ａは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（さらに下記実施例で述べる）で発現されたヒト化ＩｇＧ１抗体である。利用した培養条件及び精製ステップによって左右されるＡｂ−Ａのいくつかの調製物は、異なる検出可能レベルのマンノシル化Ａｂ−Ａを含むことが観察された。さらに後述するように、これらのマンノシル化抗体は、レクチンに基づく結合アッセイを用いて、または本明細書で開示する抗糖タンパク質抗体を用いて検出可能だった。
【０４０１】
Ａｂ−Ａ糖変異体について高度に富化された抗体調製物を生成するためにＡｂ−Ａロット２を調製した。浄化発酵ブロスをタンパク質Ａアフィニティー精製、次にセラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）クロマトグラフィーにかけた。分析ＳＥ−ＨＰＬＣによって画分を評価して相対的糖変異体含量を決定した（ＳＥ−ＨＰＬＣステップからの画分を定量化することによってマンノシル化抗体が高度に富化されていることが分かる）。糖変異体について富化されたＣＨＴ画分をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上で均一濃度溶出緩衝液としてＤＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を用いて分取ゲル濾過クロマトグラフィーにより糖変異体についてさらに富化した。
【０４０２】
次にＡｂ−Ａロット２をウサギに免疫化する。免疫化は、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）（Ｓｉｇｍａ）中で１００μｇのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と混合した１００μｇの抗原の第１皮下（ｓｃ）注射後に、２週間間隔で、それぞれフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）（Ｓｉｇｍａ）中で５０μｇと混合した５０μｇの抗原を含有する２回の追加免疫から成る。５５日目に動物の採血を行い、血清力価をＥＬＩＳＡ（抗原認識）で決定する。
【０４０３】
抗体選択力価評価
マンノシル化タンパク質に結合する抗体を同定及び特徴づけるために、抗体含有溶液をＥＬＩＳＡで試験する。簡潔に述べると、ＥＬＩＳＡ緩衝液（ＰＢＳ中０．５％の魚皮膚ゼラチン、ｐＨ７．４）で希釈したビオチン化マンノシル化抗体（ウェル毎に５０μＬ、１μｇ／ｍＬ）でニュートラアビジン被覆プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を室温で約１時間または代わりに４℃で一晩被覆する。次にプレートをＥＬＩＳＡ緩衝液で１時間室温でさらに遮断し、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％のツイーン２０）を用いて洗浄する。試験した血清試料をＥＬＩＳＡ緩衝液を用いて段階希釈する。希釈血清試料の５０マイクロリットルをウェル上に移し、１時間室温でインキュベートする。このインキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄する。成長のため、ヤギ抗ウサギＦｃ特異性ＨＲＰ結合型ポリクローナル抗体（ＥＬＩＳＡ緩衝液に１：５０００希釈）をウェル上に添加し、４５分間ＲＴでインキュベートする。洗浄溶液による３回の洗浄ステップ後、ＴＭＢ基質を用いて２分間室温でプレートを成長させ、０．５ＭのＨＣｌを用いて反応をクエンチする。ウェル吸光度を４５０ｎｍで読み取る。
【０４０４】
組織採取
許容可能な力価が達成されたら、ウサギ（複数可）を屠殺する。脾臓、リンパ節、及び全血を採取して以下のように処理する。
【０４０５】
組織を切り離し、２０ｃｃ注射器のプランジャーで７０ｕｍの無菌金網（Ｆｉｓｈｅｒ）を通して押すことによって脾臓及びリンパ節を単細胞懸濁液に処理する。細胞をＰＢＳに収集する。細胞を２回遠心分離で洗浄する。最後の洗浄後、トリパンブルーにより細胞密度を決定する。細胞を１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ；上清を捨てる。ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ）の適切な体積に細胞を再懸濁し、１ｍｌ／バイアルで分配する。バイアルを緩慢凍結チャンバー内で２４時間−７０℃で貯蔵し、液体窒素内で貯蔵する。
【０４０６】
全血をＦＢＳのない等部の上記低グルコース培地と混合することによって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離する。３５ｍｌの全血混合物を慎重に８ｍｌのＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ  Ｒａｂｂｉｔ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）上に層化し、４５ｍｌのコニカル管（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に入れ、３０分、２５００ｒｐｍで室温にて中断せずに遠心分離にかける。遠心分離後、ガラス製パスツールピペット（ＶＷＲ）を用いてＰＢＭＣ層を慎重に除去し、混ぜ合わせ、きれいな５０ｍｌのバイアルに入れる。１５００ｒｐｍでの１０分間の室温での遠心分離により細胞を上記改変培地で２回洗浄し、トリパンブルー染色により細胞密度を決定する。最後の洗浄後、細胞を適切な体積の１０％ＤＭＳＯ／ＦＢＳ培地に再懸濁し、上述したように凍結させる。
【０４０７】
Ｂ細胞選択、富化及び培養条件
Ｂ細胞培養設置の日に、ＰＢＭＣ、脾細胞、またはリンパ節バイアルを解凍させて用いる。バイアルをＬＮ２タンクから取り出して３７℃の水浴内に解凍するまで置く。バイアルの中身を１５ｍｌのコニカル遠心管（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移し、１０ｍｌの上記変性ＲＰＭＩを管にゆっくり加える。細胞を５分間２０００ＲＰＭで遠心分離にかけ、上清を捨てる。細胞を１０ｍｌの新鮮培地に再懸濁する。細胞密度及び生存率をトリパンブルーにより決定する。
【０４０８】
以下のように細胞をビオチン化マンノシル化タンパク質と予混合する。細胞を再び洗浄し、１Ｅ０７細胞／８０μＬ培地で再懸濁する。ビオチン化マンノシル化タンパク質を細胞懸濁液に５μｇ／ｍＬの最終濃度で加え、３０分間４℃でインキュベートする。ＰＢＦ（Ｃａ／ＭｇフリーＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ−ビオチンフリー））を用いて２回１０ｍｌの洗浄を行って非結合ビオチン化マンノシル化タンパク質を除去する。２回目の洗浄後、細胞を１Ｅ０７細胞／８０μＬのＰＢＦで再懸濁し、１０Ｅ７細胞当たり２０μＬのＭＡＣＳ（登録商標）ストレプトアビジンビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ  Ｃａｌｉｆ．）を細胞懸濁液に添加する。細胞及びビーズを４℃で１５分間インキュベートし、１０Ｅ７細胞当たり２ｍｌのＰＢＦで１回洗浄する。
【０４０９】
あるいは、マンノシル化タンパク質をストレプトアビジンビーズ上に以下のように前負荷する。７５マイクロリットルのストレプトアビジンビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ  Ｃａｌｉｆ．）をＮ末端ビオチン化マンノシル化タンパク質（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）及び３００μＬのＰＢＦと混合する。この混合物を４℃で３０分間インキュベートし、ＭＡＣＳ（登録商標）分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、非結合物質を除去するための１ｍｌのリンスで非結合マンノシル化タンパク質を除去する。次に物質を押し出し、それを用いて上記細胞を１Ｅ７細胞当たり１００ｕ１に再懸濁してから混合物を４℃で３０分間インキュベートし、１０ｍｌのＰＢＦで１回洗浄する。
【０４１０】
両プロトコルでは下記を適用する：洗浄後、細胞を５００μＬのＰＢＦに再懸濁して横に置く。ＭＡＣＳ（登録商標）ＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ  Ｃａｌｉｆ．）を磁気台（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）上で５００ｍｌのＰＢＦを用いて予洗する。プレフィルターを通して細胞懸濁液をカラムにかけ、非結合画分を収集する。カラムを２．５ｍｌのＰＢＦ緩衝液で洗浄する。カラムを磁気台から取り出し、きれいな無菌の１．５ｍｌのエッペンドルフ管上に置く。１ｍｌのＰＢＦ緩衝液をカラムトップに加え、ポジティブ選択細胞を収集する。ポジティブ細胞画分の収率及び生存率をトリパンブルー染色により決定する。ポジティブ選択は、出発細胞濃度の平均１％をもたらした。
【０４１１】
パイロット細胞スクリーンを設置して培養の播種レベルに関する情報を得る。プレートに１０、２５、５０、１００、または２００富化Ｂ細胞／ウェルで播種する。さらに、各ウェルは、最終体積２５０μＬ／ウェルの高グルコース改変ＲＰＭＩ培地に５０，０００細胞／ウェルの照射ＥＬ−４．Ｂ５細胞（５，０００Ｒａｄ）及び適切なレベルの活性化ウサギＴ細胞上清を含有した（米国特許出願公開第２００７０２６９８６８号参照）（調製物に応じて１〜５％の範囲）。３７℃、４％ＣＯ２内で５〜７日間培養をインキュベートした。
【０４１２】
抗原認識（ＥＬＩＳＡ）によるＢ細胞培養スクリーニング
マンノシル化タンパク質に特異性の抗体を産生するウェルを同定するため、２ステップ手順を用いた。第１ステップでは、抗原認識（ＥＬＩＳＡ）による血清試料の力価決定についての記載と同じプロトコルを以下の点を変えて利用する。簡潔に述べると、ニュートラアビジン被覆プレートをビオチン化マンノシル化タンパク質（ウェル毎に５０μＬ、それぞれ１μｇ／ｍＬ）で被覆する。Ｂ細胞上清試料（５０μＬ）を前希釈せずに試験する。第２ステップでは、第１ステップで用いたのと同一の配列であるが、マンノースを含まない配列のビオチン化タンパク質を用いてニュートラアビジンプレートを被覆する。マンノシル化のないタンパク質は、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ヒト腎細胞、その他）を用いるかまたは細菌発現系を用いて生成可能である。第２アッセイにおける反応性は、抗体特異性がマンノース構造よりはむしろタンパク質に対することを示すことになるので、該抗体を捨てることとなる。
【０４１３】
抗原特性Ｂ細胞の単離
興味あるウェルを含有するプレートを−７０℃から取り出し、ウェル当たり２００マイクロリットルの培地（１０％の完全ＲＰＭＩ、５５μＭのＢＭＥ）で５回洗浄することにより各ウェルから細胞を回収する。回収した細胞を遠心分離によりペレット化し、上清を慎重に除去する。ペレット化細胞を１００μＬの培地に再懸濁する。抗体を発現する細胞を同定するため、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｍ２８０  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＮ末端及びＣ末端の両ビオチン化マンノシル化タンパク質の組合せで被覆する。個々のビオチン化マンノシル化タンパク質ロットを段階希釈により最適化する。次に約４ｘ１０Ｅ７被覆ビーズを含有する１００マイクロリットルを再懸濁細胞と混合する。この混合物に、培地に１：１００希釈した１５マイクロリットルのヤギ抗ウサギＨ＆Ｌ  ＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を加える。
【０４１４】
２０マイクロリットルの細胞／ビーズ／抗ウサギＨ＆Ｌ懸濁液を除去し、予めＳｉｇｍａｃｏｔｅ（Ｓｉｇｍａ）で処理した１ウェルスライドガラス上にマイクロリットル液滴をスライド当たり全部で３５〜４０液滴分配する。パラフィンオイル（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）の不浸透性バリアを利用して液滴を浸し、暗所にて４％ＣＯ２インキュベーター内で９０分間３７℃でスライドをインキュベートする。
【０４１５】
抗体を産生する特異性Ｂ細胞は、抗体分泌により生成される細胞周囲の蛍光環、ビーズ付随ビオチン化抗原の認識、及びその後の蛍光ＩｇＧ検出試薬による検出によって同定可能である。興味ある細胞が同定されたら、それをマイクロマニピュレーター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）により回収する。抗体を合成及び分泌する単細胞を微量遠心管に移し、ドライアイスを用いて凍結させて−７０℃で貯蔵する。
【０４１６】
抗原特異性Ｂ細胞からの抗体配列の増幅及び配列決定
単離された単一のＢ細胞から複合ＲＴ−ＰＣＲに基づく方法を用いて抗体配列を回収する。制限酵素を含有するプライマーをデザインして、標的免疫グロブリン遺伝子の保存領域及び定常領域（重鎖及び軽鎖）、例えばウサギ免疫グロブリン配列にアニールし、２ステップネステッドＰＣＲ回収を利用して抗体配列を増幅する。各ウェルからのアンプリコンを回収及びサイズの完全性について解析する。結果として生じるフラグメントを次にＡｌｕＩで消化して配列クローン性を鑑別する。同一配列は、それらの電気泳動解析で共通のフラグメンテーションパターンを示した。次にＰＣＲプライマー内に含まれる制限酵素部位を用いて元の重鎖及び軽鎖アンプリコンフラグメントを消化し、発現ベクターにクローン化する。サブクローン化ＤＮＡフラグメントを含有するベクターを増幅させて精製する。サブクローン化重鎖及び軽鎖の配列を発現前に検証する。
【０４１７】
所望の抗原特異性及び／または機能特性のモノクロナール抗体組換え産生
特異性Ｂ細胞から回収した抗体の抗原特異性及び機能特性を決定するため、所望の対を成す重鎖及び軽鎖配列の発現を駆り立てるベクターをＣＨＯ細胞、ヒト腎細胞または他の哺乳類細胞に移す。
【０４１８】
ＥＬＩＳＡによる組換え抗体の抗原認識
組換え発現抗体のマンノシル化ポリペプチドに結合する能力を特徴づけるため、抗体含有溶液をＥＬＩＳＡにより試験する。全てのインキュベーションは室温で行う。簡潔に述べると、ニュートラアビジンプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をマンノシル化ポリペプチド含有溶液（ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬ）で２時間被覆する。次にマンノシル化ビオチン化ポリペプチド被覆プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄する。次に遮断溶液（ＰＢＳ、０．５％の魚皮膚ゼラチン、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）を用いて約１時間プレートを遮断する。次に遮断溶液を除去してから、試験する抗体の希釈系列と共にプレートを約１時間インキュベートする。このインキュベーションの最後に、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、さらに二次抗体含有溶液（ペルオキシダーゼ結合型アフィニピュアＦｃフラグメント特異性ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に約４５分間インキュベートし、３回洗浄する。当該時点で基質溶液（ＴＭＢペルオキシダーゼ基質、ＢｉｏＦｘ）と３〜５分間暗所でインキュベートする。ＨＣｌ含有溶液（０．５Ｍ）を添加して反応を停止させ、プレートリーダーで４５０ｎｍにてプレートを読み取る。
【０４１９】
実施例２：５つの抗糖タンパク質抗体のクローン化及び配列決定
５つのウサギ抗糖タンパク質抗体の可変重鎖及び軽鎖を単離ウサギＢ細胞から増幅させ、それぞれウサギＩｇＧ定常ドメインとインフレームでクローン化した。５つの抗糖タンパク質抗体を本明細書ではＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５と称し；それらの重鎖及び軽鎖のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を図１〜４に提供し、これらの配列ならびに可変領域、フレームワーク領域（ＦＲ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び定常ドメインの配列番号を図５〜１２に提供してある。全長Ａｂ１ポリペプチドは、配列番号１の重鎖ポリペプチド及び配列番号２１の軽鎖ポリペプチドで構成される。全長Ａｂ２ポリペプチドは、配列番号４１の重鎖ポリペプチド及び配列番号６１の軽鎖ポリペプチドで構成される。全長Ａｂ３ポリペプチドは、配列番号８１の重鎖ポリペプチド及び配列番号１０１の軽鎖ポリペプチドで構成される。全長Ａｂ４ポリペプチドは、配列番号１２１の重鎖ポリペプチド及び配列番号１４１の軽鎖ポリペプチドで構成される。全長Ａｂ５ポリペプチドは、配列番号１６１の重鎖ポリペプチド及び配列番号１８１の軽鎖ポリペプチドで構成される。
【０４２０】
実施例３：抗糖タンパク質抗体の発現
抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５を、培養哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ヒト腎細胞株等）で発現させる。さらに、基本的に以下のようにこれらの抗体をＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓで発現させる。適切なプロモーターの制御下でそれぞれの抗体の重鎖及び軽鎖をコードする組込み遺伝子を含有し、場合により各遺伝子の複数コピーを含有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を調製する（参照によってその全体をここに援用する米国特許出願公開第２０１３／００４５８８８号参照）。組込みの正しさはサザンブロット法により検証し、抗体の発現及び分泌はウエスタンブロット法により検証する。抗体産生のため、下記栄養素（％ｗ／ｖ）を含有する培地を用いて種菌を増やす：酵母エキス３％、無水ブドウ糖４％、ＹＮＢ  １．３４％、ビオチン０．００４％及び１００ｍＭのリン酸カリウム。発酵用種菌を作り出すため、３０℃及び３００ｒｐｍで振盪するインキュベーター内で約２４時間細胞を増やす。次に１Ｌの無菌成長培地を含有するＬａｂｆｏｒｓの２．５Ｌの作業容積容器に１０％の種菌を加える。成長培地は下記栄養素を含有する：硫酸カリウム１８．２ｇ／Ｌ、第一リン酸アンモニウム３６．４ｇ／Ｌ、リン酸二カリウム１２．８ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物３．７２ｇ／Ｌ、クエン酸ナトリウム二水和物１０ｇ／Ｌ、グリセロール４０ｇ／Ｌ、酵母エキス３０ｇ／Ｌ、ＰＴＭ１微量金属４．３５ｍＬ／Ｌ、及び消泡剤２０４  １．６７ｍＬ／Ｌ。ＰＴＭ１微量金属溶液は下記成分を含有する：硫酸銅六水和物６ｇ／Ｌ、ヨウ化ナトリウム０．０８ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム水和物３ｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム二水和物０．２ｇ／Ｌ、ホウ酸０．０２ｇ／Ｌ、塩化コバルト０．５ｇ／Ｌ、塩化亜鉛２０ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物６５ｇ／Ｌ、ビオチン０．２ｇ／Ｌ、及び硫酸５ｍＬ／Ｌ。
【０４２１】
バイオリアクタープロセス制御パラメーターを以下のように設定する：撹拌１０００ｒｐｍ、エアフロー毎分１．３５標準リットル、温度２８℃。ｐＨは水酸化アンモニウムを用いて（６で）制御する。酸素補給は行わない。
【０４２２】
溶解酸素スパイクにより初期グリセロールの消費が示されるまで発酵培養を約１２〜１６時間成長させる。場合により溶解酸素スパイクの約３時間後培養を飢餓状態にする。この任意的な飢餓時間後、ボーラス添加のエタノールを１％エタノール（ｗ／ｖ）に達するまで反応器に加える。場合により発酵培養を１５〜３０分間平衡させ、その後にフィード添加を開始し、４０分間１ｍＬ／分の一定速度に設定してから、エタノール検知プローブ（Ｒａｖｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて残りの試験のためにエタノール濃度を１％に維持するエタノールセンサーによりフィードポンプを制御する。フィードは下記成分で構成される：酵母エキス５０ｇ／Ｌ、ブドウ糖一水和物５００ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物３ｇ／Ｌ、及びＰＴＭ１微量金属１２ｍＬ／Ｌ。場合により、クエン酸ナトリウム二水和物（０．５ｇ／Ｌ）をもフィードに加える。総発酵時間は約８０〜９０時間である。
【０４２３】
次に抗体をタンパク質Ａアフィニティーにより精製する。採取した発酵培養または他の細胞培養ブロスからの浄化上清を同体積の平衡化緩衝液（２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６）で希釈する。次にこの希釈ブロスから、予め平衡化した１ｍＬのＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅカラム（ＧＥ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に２０ｍＬを負荷する。続いて２０カラム体積（ＣＶ）のＤＰＢＳを用いてカラムを洗浄する。カラム上に結合した抗体を２ＣＶグラジエントを用いて溶出し、１００％溶出緩衝液（１００ｍＭのクエン酸ｐＨ３．０）中８ＣＶで保持する。１ＣＶ画分を収集し、即座に２ＭのＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０を用いて中和する。２８０ｎＭにおける吸光度を測定することによってタンパク質含有画分を決定し、タンパク質含有画分をプールし、ＤＰＢＳに透析する。
【０４２４】
場合により抗体純度をサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）で決定する。簡潔に述べると、ＵＶ検出機器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）１２００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣを使用する。試料調製のためには、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）からのＴＳＫｇｅｌ  Ｇｕａｒｄ  ＳＷｘｌ  ６ｘ４０ｍＭと接続したＴＳＫｇｅｌ  ＧＳ３０００ＳＷ  ｌ  ７．８ｘ３００ｍＭカラムを使用する。１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２００ｍＭの塩化ナトリウムｐＨ６．５を均一濃度モードで移動相として流速０．５ｍＬ／分で使用し、ＵＶ２１５ｎｍにおける吸光度をモニターする。試料の注入前に、安定ベースラインが達成されるまでカラムを平衡化する。移動相を用いて試料を１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、３０μＬの体積を注入する。カラム性能をモニターするため、ＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）ゲル濾過標準物質を使用する。
【０４２５】
実施例４：抗糖タンパク質抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイ
この実施例は、ＥＬＩＳＡアッセイにおける糖タンパク質（特に、マンノース含有抗体）の検出のための抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５の使用について述べる。結果は、マンノシル化抗体の高感度検出を実証し、Ａｂ１は最高の感度を示し、ユーロピウムに基づく検出は、ＨＲＰに基づく検出より大きいシグナル伝達を示す。
【０４２６】
方法
抗原ダウンＨＲＰ  ＥＬＩＳＡ
簡潔に述べると、ストレプトアビジンプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をビオチン化抗原溶液（多様なマンノシル化の対照抗体、ＰＢＳ中１ｕｇ／ｍＬ）で１時間被覆した。次に抗原被覆プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。次に遮断溶液（ＰＢＳ、０．５％の魚皮膚ゼラチン、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）を用いてプレートを約１時間遮断した。次に遮断溶液を除去してから、試験する抗体の希釈系列と共に約１時間インキュベートした。このインキュベーションの最後に、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、さらに二次抗体含有溶液（ペルオキシダーゼ結合型アフィニピュア抗ウサギＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異性（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に約４５分間インキュベートし、３回洗浄した。当該時点で基質溶液（ＴＭＢペルオキシダーゼ基質、ＢｉｏＦｘ）を加え、３〜５分間暗所でインキュベートした。０．５ＭのＨＣｌを添加して反応を停止させ、プレートリーダーで４５０ｎｍにてプレートを読み取った。
【０４２７】
ＡＧＶ抗体ダウン西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）ＥＬＩＳＡ
簡潔に述べると、ストレプトアビジンプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をビオチン化抗体溶液（Ａｂ１〜５、ＰＢＳ中１ｕｇ／ｍＬ）で１時間被覆した。次に抗体被覆プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。次に遮断溶液（ＰＢＳ、０．５％の魚皮膚ゼラチン、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）を用いてプレートを約１時間遮断した。次に遮断溶液を除去してから、試験する抗原の希釈系列と共に約１時間インキュベートした。このインキュベーションの最後に、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、さらに二次抗体含有溶液（ペルオキシダーゼ結合型アフィニピュアＦ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異性（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に約４５分間インキュベートし、３回洗浄した。当該時点で基質溶液（ＴＭＢペルオキシダーゼ基質、ＢｉｏＦｘ）を加え、３〜５分間暗所でインキュベートした。０．５ＭのＨＣｌを添加して反応を停止させ、プレートリーダーで４５０ｎｍにてプレートを読み取った。
【０４２８】
抗体ダウンユーロピウムＥＬＩＳＡ
簡潔に述べると、白色ストレプトアビジンプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をビオチン化抗体溶液（Ａｂ１〜５、ＰＢＳ中１ｕｇ／ｍＬ）で１時間被覆した。次に抗体被覆プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。次に遮断溶液（ＰＢＳ、０．５％の魚皮膚ゼラチン、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）を用いてプレートを約１時間遮断した。次に遮断溶液を除去してから、試験する抗原の希釈系列と共に約１時間インキュベートした。このインキュベーションの最後に、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、さらに二次抗体含有溶液（ユーロピウム結合型抗ヒトＩｇＧ（Ｃｉｓｂｉｏ）と共に約４５分間インキュベートし、３回洗浄した。当該時点で２００μｌのＨＴＲＦ緩衝液（Ｃｉｓｂｉｏ）を加え、３３０での励起／６２０ｎｍでの発光を用いてプレートを読み取った。
【０４２９】
この実施例で試験した抗体は、Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｂ、及びＡｂ−Ｃであり、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ内で発現された３つの異なるヒト化ＩｇＧ１抗体である。これらの実施例で試験した各ヒト化抗体は、異なる免疫原に対して産生され、他の分子とは異なる標的分子に特異的に結合する。
【０４３０】
結果
図１３は、Ａｂ１及びＡｂ２を用いて抗体Ａｂ−Ａの異なるロットのグリコシル化を検出するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。アッセイ形式は、抗糖変異体（ＡＧＶ）抗体が置かれたものであり、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）検出によるものであった。滴定した異なるＡｂ−Ａロットを有するストレプトアビジンプレートにビオチン化抗体を結合させた。２つの抗体Ａｂ１及びＡｂ２は各試験試料に対して同様に反応した。このアッセイ形式では、Ａｂ１とＡｂ２の感度は比較的類似し、プレート上に置かれた抗体及び溶液中のマルチポイントマンノシル化Ａｂ−Ａによる「スーパーアビディティー」効果に起因する可能性がある。
【０４３１】
図１４は、Ａｂ３、Ａｂ４、及びＡｂ５を用いて抗体Ａｂ−Ａ及びＡｂ−Ｃの異なるロットのグリコシル化を検出するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。アッセイ形式は、ビオチン化抗原がストレプトアビジンプレート上に置かれたものであり、抗糖変異体（ＡＧＶ）抗体を滴定した。抗体は、異なる抗原に対して同様に（アフィニティーの差に起因し得るいくらかの差異はあるが）反応した。
【０４３２】
図１５は、抗体Ａｂ−Ａの異なるロットのグリコシル化を検出するためにＡｂ１を用いたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。アッセイ形式は、抗糖変異体（ＡＧＶ）抗体が置かれたものであり、それぞれ、左パネル及び右パネルで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはユーロピウム（Ｅｕｒｏ）検出によるものである。滴定した異なるＡｂ−Ａロットを有するストレプトアビジンプレートにビオチン化抗体を結合させた。右パネルでは、検出は、Ａｂ−Ａ（ヒト定常ドメインを含有する）と結合するが、Ａｂ１（ウサギ定常ドメインを含有する）と結合しないユーロピウム標識抗体によった。検出のためのユーロピウムの使用は、ＨＲＰより高い感度をもたらした。
【０４３３】
実施例５：Ａｂ１は、結合についてレクチンＤＣ−ＳＩＧＮと競合する
この実施例は、Ａｂ１が、糖タンパク質（特に、マンノシル化抗体）への結合についてレクチンＤＣ−ＳＩＧＮと競合したことを実証する。結果は、Ａｂ１が結合するエピトープが、ＤＣ−ＳＩＧＮに対する結合部位と少なくとも重複することを実証する。
【０４３４】
Ａｂ１で遮断されるＤＣ−ＳＩＧＮ
Ａｂ−Ａロット２の試料（その調製については実施例１で上述してある糖タンパク質富化抗体試料）をＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２１３３８）でビオチン化し、ストレプトアビジンセンサー（Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏカタログ番号１８−５０１９）に１５０秒間１０ｕｇ／ｍｌで結合させてから、Ａｂ１を用いて１×キネティクス緩衝液中２０ｕｇ／ｍｌまたは０ｕｇ／ｍｌで１５００秒間前処理を施して飽和を達成した。次に前処理シグナル（図示せず）をＸ軸とＹ軸の両方についてゼロに正規化した。実験の次ステップは、２０ｕｇ／ｍｌ及び０ｕｇ／ｍｌという同Ａｂ１濃度を維持したが、１５ｕｇ／ｍｌでＤＣ−ＳＩＧＮ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号１６１−ＤＣ−０５０）を含めた。これらの条件を５００秒間保持した。２０ｕｇ／ｍｌでＡｂ１を前処理した条件では明白なＤＣ−ＳＩＧＮ結合シグナルは観察されなかった。Ａｂ１処理なしのＤＣ−ＳＩＧＮ条件では強いシグナルが観察された。次にセンサーを１×キネティクス緩衝液内での解離条件に動かした。ＤＣ−ＳＩＧＮは結合したままに見えたが、前処理で結合したＡｂ１を有する条件では、シグナルは、その以前のレベルから減衰することが観察された。
【０４３５】
結果
図１６に示すように、ＤＣ−ＳＩＧＮのＡｂ−Ａロット２被覆バイオセンサーへの結合（上部灰色線）は、Ａｂ１前処理によって妨げられる（下黒色線）。これらの結果は、Ａｂ１がマンノシル化タンパク質上で結合するエピトープは、ＤＣ−ＳＩＧＮに対する結合部位と少なくとも重複することを実証する。
【０４３６】
実施例６：糖タンパク質検出のためのハイスループットアッセイ
このアッセイは、糖タンパク質検出のためのハイスループットＨＴＲＦベースアッセイについて述べる。
【０４３７】
方法
ＡＧＶ  ＨＴＲＦアッセイ
簡潔に述べると、ハーフエリア白色９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて抗体／抗原相互作用を読み取った。抗体（３ｎＭ）、抗原（１ｎＭ）、ユーロピウム標識抗ウサギＦｃ（１ｎＭのドナー−Ｃｉｓｂｉｏ）、及び抗ヒトＸＬ６６５（３０ｎＭのアクセプター−Ｃｉｓｂｉｏ）をアッセイ緩衝液（Ｃｉｓｂｉｏ）中ウェル毎に６０μｌで混ぜ合わせる。試料を室温で１時間インキュベートする。インキュベーションしたら、励起３３０ｎｍ、発光６２０／６６５ｎｍで３００マイクロ秒遅延によりプレートを読み取る。データは６６５／６２０の比として報告してある。この実施例で試験した抗体はＡｂ−Ｂ及びＡｂ−Ｄであり、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ内で発現された２つの異なるヒト化ＩｇＧ１抗体である。これらの実施例で試験した各ヒト化抗体は、異なる免疫原に対して産生され、他の分子とは異なる標的分子に特異的に結合する。
【０４３８】
結果
図１７Ａ〜Ｂは、精製画分中の糖タンパク質レベルを定量化するためのハイスループットアッセイ（ＨＴＲＦ）におけるＡＧＶ抗体Ａｂ１の使用を示す。Ａｂ−Ｂ（図１７Ａ）及びＡｂ−Ｄ（図１７Ｂ）をカラム精製にかけ、ＡＧＶ抗体を用いて（横軸に番号を付した）あらゆる他の収集画分をアッセイして糖タンパク質の相対量を決定した。抗体の量は、対照の百分率（ＰＯＣ）、詳細には、Ａｂ−Ａの糖タンパク質富化調製物（Ａｂ−Ａロット２）に対する糖タンパク質の量として表す。参考のため、Ａｂ−Ａロット１（相対的に低い量の糖タンパク質を含有する）に含まれる糖タンパク質の量を横線で示してあり、これは対照の約２５％のレベルであった。
【０４３９】
このアッセイを利用して、画分を選択またはプールして、所望通りに糖タンパク質富化または糖タンパク質枯渇調製物を得ることができる。
【０４４０】
実施例７：精製画分中の糖タンパク質の相対的定量化
この実施例は、糖タンパク質含有抗体のクロマトグラフ精製画分の糖タンパク質分析を実証する。抗糖タンパク質抗体Ａｂ１またはＧＮＡを用いて糖タンパク質を検出した。
【０４４１】
方法
ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）カラムから溶出されたＡｂ−Ａのクロマトグラフ画分にＡｂ１またはＧＮＡを用いる糖タンパク質分析を施した。Ａｂ１に基づく検出は、実施例６に記載のＨＴＲＦ法により行った。
【０４４２】
ＧＮＡ分析のためには、ビオチン化Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ凝集素を有するストレプトアビジンバイオセンサーを用いて、標準物質に対する溶液中の糖変異体の濃度を決定した。特に、ビオチン化Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓレクチン（ＧＮＬ、ＧＮＡとも呼ばれる、カタログＢ−１２４５，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で機能化されたストレプトアビジンバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を備えたＯｃｔｅｔ干渉計（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いて、標準物質に対する溶液中の生体分子の活性レベルを決定した。簡潔に述べると、１×キネティクス緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，品番：１８−５０３２からの１０×キネティクス緩衝液のダルベッコリン酸緩衝食塩水中１：１０希釈液）で予め濡らすことによってセンサーを機能化してからビオチン化ＧＮＬレクチンの希釈液に浸漬し、所定の長さの時間、振盪プラットフォーム上に置いた。
【０４４３】
試料の貯蔵及び取扱い：試料及び標準物質は、既存の安定性データに応じて４℃または−２０℃で貯蔵した。アッセイを準備しながら、試料を氷上で保持した。キネティクス緩衝液（Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏカタログ番号１８−５０３２、１０×及び１×、ＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡ、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０及び０．０５％のアジ化ナトリウムを含有）は４℃で貯蔵した。ＧＮＬは４℃で貯蔵する。
【０４４４】
センサーの機能化：ストレプトアビジンセンサー（Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏカタログ番号１８−５０１９、ストレプトアビジンで被覆した９６個のバイオセンサーのトレイ）を１×キネティクス緩衝液に少なくとも５分間浸漬した。ビオチン化ＧＮＬを１×キネティクス緩衝液で１／１０００に希釈して、下記ステップで計算される体積を得た。１×キネティクス緩衝液を１０×キネティクス緩衝液及びＨｙｃｌｏｎｅ  ＤＰＢＳ  ＋Ｃａ  ＋Ｍｇから調製した。必要とされる各センサーについてウェル当たり１２０ｕｌのキネティクス緩衝液をハーフエリア黒色プレート、例えば、９６−ウェルＢｌａｃｋ  Ｈａｌｆ  Ａｒｅａ  Ｐｌａｔｅｓ  Ｍｅｄｉｕｍ＆Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅカタログ６７５０７６またはＶＷＲカタログ８２０５０−０４４）に等分した。ビオチン化ＧＮＬを有するプレートにセンサーを移し、プレートを振盪させながら少なくとも３０分間インキュベートした。
【０４４５】
センサー及び試料の調製：センサーの先端への損傷（例えば、引っ掻き）はアッセイ結果に影響し得るので、センサーの先端に特に注意を払いながらマルチチャネルピペッターでセンサーを取り扱った。センサートレイを有するセンサーには中結合黒色プレートを用いた。試料と標準物質には別々の黒色プレートを用いた。未知物質、対照及び標準物質についてウェル当たり１５０μｌ添加した。場合により培地ブランクまたは既知糖変異体濃度を含む溶液を対照試料として含め得る。アッセイの各標準物質ウェルに対して新しいセンサーを用いた。各センサーを使用前に１×キネティクス緩衝液ですすいだ。標準曲線のためには二通りの８点の３倍希釈系列で十分だった。希釈は、１×キネティクス緩衝液を用いて行った。１×キネティクス緩衝液は、ブランク試料としても使用した。
【０４４６】
Ｏｃｔｅｔ条件を以下のように設定した：定量時間（秒）２５０；振盪速度１０００ｒｐｍ。試料ウェル及びセンサーを割り当てることによってプレートを定義した。特に、試料に対応するウェルを選択し、それらの独自性を入力する、例えば、「未知」には希釈倍数を入力し、または「標準物質」には既知濃度を入力することによって試料ウェルを割り当てた。このアッセイではセンサーを再利用しなかった。プログラムには、場合により試料の処理前に遅延及び／または振盪を含めた（例えば、プレートを３００秒間２００ＲＰＭで振盪させながら３０℃まで平衡化した）。
【０４４７】
測定用の標準物質、未知物質及び対照を１×キネティクス緩衝液で希釈し、黒色マイクロタイタープレートに整列させ、必要に応じて複製した。Ｏｃｔｅｔで、製造業者（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）による記載通りにＧＮＬ機能化センサー及び標準的な定量化アッセイ法（例えばタンパク質Ａセンサーのための）を利用して、試料希釈液を有するプレートを読み取った。
【０４４８】
ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアモジュールを用いてデータ解析を行った。既知試料の標準曲線の直線性及び再現性を評価した。ウェルの活性レベルを試料濃度／希釈倍数に合わせて適宜調整して、相対単位（ＲＵ）または対照のパーセント（ＰＯＣ）と称する質量正規化特異的活性レベルを決定した。
【０４４９】
結果
図１８Ａ〜Ｂは、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）カラムから溶出されたＡｂ−Ａの画分に含まれる糖タンパク質の定量化を示す。Ａｂ１及びＧＮＡを用いて、各画分に含まれる糖タンパク質の相対量（対照の百分率、ＰＯＣとして表される）を評価した。各画分に含まれるタンパク質質量も相対単位（質量ＲＵ）で示す。Ａｂ１及びＧＮＡを用いた検出で同様パターンの反応性が見られた。
【０４５０】
結果はＡｂ１及びＧＮＡで類似しており、精製画分中の糖タンパク質の存在を検出する実行可能な検出方法をＡｂ１が提供することを示している。
【０４５１】
実施例８：糖タンパク質検出のためのＡｂ１、ＧＮＡ、及びＤＣ−ＳＩＧＮのヘッドトゥーヘッド比較
この実施例は、Ａｂ１、ＧＮＡ、及びＤＣ−ＳＩＧＮ検出方法による抗体の複数ロットにおける糖タンパク質の検出を示す。各方法で検出された糖タンパク質の相対レベルは同様であり、糖タンパク質の存在を検出するためのＡｂ１を用いる方法の適合性がさらに確証された。
【０４５２】
方法
試料の貯蔵及び取扱い：試料及び標準物質は、既存の安定性データに応じて４℃または−２０℃で貯蔵した。アッセイを準備しながら、試料を氷上で保持した。キネティクス緩衝液（Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏカタログ番号１８−５０３２、１０×及び１×、ＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡ、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０及び０．０５％のアジ化ナトリウムを含有）は４℃で貯蔵した。ＧＮＬは４℃で貯蔵する。
【０４５３】
センサーの機能化：ストレプトアビジンセンサー（Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏカタログ番号１８−５０１９、ストレプトアビジンで被覆した９６個のバイオセンサーのトレイ）を１×キネティクス緩衝液に少なくとも５分間浸漬した。ビオチン化ＧＮＬを１×キネティクス緩衝液で１／１０００に希釈して、下記ステップで計算される体積を得た。１×キネティクス緩衝液を１０×キネティクス緩衝液及びＨｙｃｌｏｎｅ  ＤＰＢＳ  ＋Ｃａ  ＋Ｍｇから調製した。必要とされる各センサーについてウェル当たり１２０ｕｌのキネティクス緩衝液をハーフエリア黒色プレート、例えば、９６−ウェルＢｌａｃｋ  Ｈａｌｆ  Ａｒｅａ  Ｐｌａｔｅｓ  Ｍｅｄｉｕｍ＆Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅカタログ６７５０７６またはＶＷＲカタログ８２０５０−０４４）に等分した。ビオチン化ＧＮＬを有するプレートにセンサーを移し、プレートを振盪させながら少なくとも３０分間インキュベートした。
【０４５４】
センサー及び試料の調製：センサーの先端への損傷（例えば、引っ掻き）はアッセイ結果に影響し得るので、センサーの先端に特に注意を払いながらマルチチャネルピペッターでセンサーを取り扱った。センサートレイを有するセンサーには中結合黒色プレートを用いた。試料と標準物質には別々の黒色プレートを用いた。未知物質、対照及び標準物質についてウェル当たり１５０μｌ添加した。場合により培地ブランクまたは既知糖変異体濃度を含む溶液を対照試料として含め得る。アッセイの各標準物質ウェルに対して新しいセンサーを用いた。各センサーを使用前に１×キネティクス緩衝液ですすいだ。標準曲線のためには二通りの８点の３倍希釈系列で十分だった。希釈は、１×キネティクス緩衝液を用いて行った。１×キネティクス緩衝液は、ブランク試料としても使用した。
【０４５５】
Ｏｃｔｅｔ条件を以下のように設定した：定量時間（秒）２５０；振盪速度１０００ｒｐｍ。試料ウェル及びセンサーを割り当てることによってプレートを定義した。特に、試料に対応するウェルを選択し、それらの独自性を入力する、例えば、「未知」には希釈倍数を入力し、または「標準物質」には既知濃度を入力することによって試料ウェルを割り当てた。このアッセイではセンサーを再利用しなかった。プログラムには、場合により試料の処理前に遅延及び／または振盪を含めた（例えば、プレートを３００秒間２００ＲＰＭで振盪させながら３０℃まで平衡化した）。
【０４５６】
異なるレクチン、ＤＣ−ＳＩＧＮ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号１６１−ＤＣ−０５０）をＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２１３３８）でビオチン化し、これを用いてストレプトアビジンセンサーを機能化し、上記と同様のアッセイに利用した。
【０４５７】
結果
図１９Ａ〜Ｄは、図１８Ａ〜Ｂに示す精製からプールした画分の糖タンパク質解析の結果を示す。図１９Ａは、図１５（Ａｂ１はプレート上に置かれ、０．３μｇ／ｍＬのＡｂ−Ａ試料は溶液中）と同様のユーロピウムに基づく抗体ダウンＥＬＩＳＡアッセイでＡＧＶ抗体Ａｂ１を用いる異なる調製物中の糖タンパク質のＥＬＩＳＡ検出を示す。図１９Ｂは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて検出した糖タンパク質の検出レベルを対照試料の百分率（ＰＯＣ）としてグラフに示す。図１９Ｃ〜Ｄは、それぞれＧＮＡまたはＤＣ−ＳＩＧＮを用いて決定した同試料中の糖タンパク質の検出レベルを示す。表示「ｆｘｎ１２−２１」及び「ｆｘｎ４−２３」は、それぞれ図１８Ａ〜Ｂに示す精製からの１２〜２１または４〜２３の番号を付した画分のプーリングを示す。
【０４５８】
図２０は、ＥＬＩＳＡ検出（左パネル）またはＧＮＡアッセイ（右パネル）を用いた抗体調製物の糖タンパク質解析の結果を示し、それぞれ対照試料の百分率（ＰＯＣ）として表す。結果は、６つの試験ロットにわたって定性的に類似しており、相対ピーク高さはそれぞれについて類似パターンを形成した。
【０４５９】
これらの試料に対してＡＧＶ抗体、ＧＮＡ、及びＤＣ−ＳＩＧＮアッセイでは非常に類似したプロファイルが見られた。絶対ピーク高さ（対照値の百分率として表される）のいくらかの差異にもかかわらず、これらの結果は、糖タンパク質の検出のためのＡｂ１の使用が正当であることをさらに確証する。
【０４６０】
実施例９：Ｏ糖型組成解析
この実施例は、抗体Ａｂ１、ＧＮＡ、及びＤＣ−ＳＩＧＮを用いて得たシグナルとマンノースの量との間の相関性を示す。
【０４６１】
方法
Ａｂ−Ａの３つのロットにＯ糖型解析を施した。一般的にＳｔａｄｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｕｓｅ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｗｉｔｈ  ｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００８  ３：１０２６に記載されているように、各調製物に含まれるモノマンノース、ジマンノース、及びトリマンノースの相対量を決定した。実施例７に記載のようにＧＮＡを使用し、実施例８に記載のようにＤＣ−ＳＩＧＮを用いて、各ロットに糖タンパク質解析を施した。さらに、各ロットについて、実施例６に記載のＨＴＲＦ法によって、Ａｂ１を用いる糖タンパク質解析を行った。各検出法のシグナルを対照の百分率（ＰＯＣ）として数量化した。
【０４６２】
結果
図２１は、ＡＧＶ、ＧＮＡ、及びＤＣ−ＳＩＧＮからのシグナルに関するＯ糖型組成の結果を示す。表は、糖アルコールの相対単位、詳細には各試料についてのモノマンノース、ジマンノース、及びトリマンノース、ならびにＧＮＡ、Ａｂ１及びＤＣ−ＳＩＧＮシグナルのレベルを示す。
【０４６３】
これらの結果は、ＡＧＶ  ｍＡｂ（Ａｂ１）、ＧＮＡ、及びＤＣ−ＳＩＧＮ結合アッセイから得られるシグナルが互いに相関し、かつＡｂ−Ａ上のマンノースの量と相関することを示す。
【０４６４】
実施例１０：Ａｂ１を用いる酵母株の富化及びスクリーニング
序論
細胞の低い生産性は、組換えタンパク質生産の制限因子となり得る。高性能株を単離することは、生産性を高めるための強力な手法となる。変異誘発（無作為または半合理的）及び組換えＤＮＡ法を含めたいくつかの分子生物学技術を用いて遺伝的多様性を作り出すことができ、あるいは自発発生的な株を使用することもできる。該技術により作り出されるライブラリーサイズは一般的に非常に大きく（＞１０５）、所望変異体の単離を典型的な「無駄骨を折る」問題にする。ハイスループットスクリーニングを利用して、向上した生産性等の所望特性を有する変異体を富化することができる。
【０４６５】
この実施例は、高産生性細胞を富化するための細胞表面アフィニティー（または「捕捉」）マトリックスの使用について記載する。操作の一般原理は、分泌された抗体を、分泌している細胞の表面上に保持（抗体の「捕捉」）することができ、抗体のその後の検出を可能にすることである。蛍光検出試薬の使用により、細胞選別による高産生性細胞の富化が可能になる。例示される捕捉マトリックスは、強力なビオチン−アビジン相互作用を利用する。細胞表面をビオチン複合型細胞結合因子、特に、抗糖タンパク質抗体で標識する。ビオチン化抗糖タンパク質抗体で標識した細胞を次に、分泌産物と結合できるビオチン化「捕捉抗体」を取り付けるための架橋を与えるアビジン（またはストレプトアビジン）と混合する。その後、細胞は規定条件下でそれらの産物を分泌することができ、結果として、細胞表面捕捉マトリックスによって分泌産物を保持（捕捉）することになる。次に細胞を洗浄し、染色し、フローサイトメトリーを用いて分泌産物についてアッセイすることができる。
【０４６６】
方法
下記試薬を用いた：ＦＡＣＳ緩衝液（２％のＦＢＳを含むＰＢＳ）；ビオチン化Ａｂ１（上記実施例に記載）、１ｍｇ／ｍｌ濃度のストック溶液として；ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号０１６−０００−０８４）、５ｍｇ／ｍｌ濃度のストック溶液として；ビオチン化ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＭＬ＊「捕捉抗体」（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号７０９−０６５−１４９、１ｍｇ／ｍｌ濃度のストック溶液として）；蛍光標識ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＭＬ＊「検出抗体」：（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号７０９−５４５−１４９）、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度のストック溶液として；ヨウ化プロピジウム５０ｕｇ／ｍｌ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ５１−６６２１１Ｅ）；及び１０％のＰＥＧ８０００を補充した無酸培地（ＡＦＭ）。
【０４６７】
ＢＹＥＧ培地内で一晩３０℃で細胞を成長させた。分光計を用いて６００ｎｍにおける光学密度を測定することによって細胞密度を決定した。線形範囲（０．１〜０．９ＯＤ）の濃度を得るために必要な場合は希釈した。ＯＤ６００に希釈倍数５×１０９を掛けることによって細胞密度を計算して概略の細胞／ｍｌを得た。３０００ｒｐｍでの５分間の遠心分離により細胞を遠心沈降させた。細胞ペレットを２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、遠心分離にかけ、これを２回繰り返した。細胞に１μｌのビオチン化Ａｂ１（１ｍｇ／ｍｌ）を加えて氷上で１５分間インキュベートした。３０００ｒｐｍで５分間細胞を遠心沈降させ、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、これを２回繰り返した。細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。次に１μｌのストレプトアビジン（５ｍｇ／ｍｌ）を加えて氷上で１５分間インキュベートした。細胞を再び３０００ｒｐｍで５分間遠心沈降させ、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、これを２回繰り返した。細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。次に１０μｌの「捕捉抗体」（１ｍｇ／ｍｌ）を加えて氷上で３０分間インキュベートした。細胞を３０００ｒｐｍで５分間遠心沈降させ、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、これを２回繰り返した。１０％のＰＥＧ８０００で補充した２００μｌのＡＦＭ培地に細胞を再懸濁し、２つの管に分けた（管Ａ及びＢ）。管Ａを即座に遠心沈降させ、出発時点（「０時間」）試料として用いて即座に処理した。管Ｂについては、培地を２４ウェル低ウェルプレート（ＬＷＰ）に移して振盪せずに３０℃で２時間または４時間までインキュベートして抗体分泌を可能にした。場合によっては、より高いシグナル蓄積を可能にするため、より長い持続時間を用いた。この場合、培地をヒドロキシ尿素で最終濃度０．２Ｍまで補充して細胞の成長を抑制した。
【０４６８】
次に細胞を以下のように処理した。細胞を３０００ｒｐｍで５分間遠心沈降させ、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、これを２回繰り返した。細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。次に３０μｌの検出抗体（０．５ｍｇ／ｍｌ）を加えて氷上で２０分間インキュベートした。次に細胞を３０００ｒｐｍで５分間遠心沈降させ、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、これを２回繰り返した。細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。最後の洗浄後、０．５μｌのヨウ化プロピジウムを加えた。管をボルテックスし、氷上で保持し、ＦＡＣＳ解析／選別までカバーをかけた。
【０４６９】
細胞選別は、４８８ｎｍ励起用の２００ｍＷのアルゴンレーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）及び９６ウェルプレートまたはＦＡＣＳ管への選別用の自動細胞捕集装置を備えたＢＤ  Ｉｎｆｌｕｘフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で行った。ＦＩＴＣ蛍光は、Ｆｌ１で標準５２８ＢＰフィルターを用いて測定し、ヨウ化プロピジウム蛍光は、Ｆｌ３で６１０ＢＰフィルターを用いて測定した。データ収集及び解析は、ＢＤソフトウェア及びＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて行った。
【０４７０】
結果
この実施例で用いた捕捉試薬の配置を図２２に示す。細胞表面をビオチン化するために以下の２つの異なる細胞結合因子を試験した：ビオチン化Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ凝集素（ＧＮＡ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、及びマンノシル化タンパク質に結合するビオチン化抗体（Ａｂ１）。ＧＮＡによる細胞表面の標識化は、相互作用が相対的に弱く、非標識細胞と混合すると、ＧＮＡが標識細胞から非標識細胞に遊走し、結果としてフローサイトメトリープロファイルにおいて蛍光シグナルが単一ピークになる（図２３Ａ）という欠点を有することが分かった。対照的に、Ａｂ１は、細胞に強くかつ本質的に不可逆的に結合し、２つの出発細胞集団に対応する２つの蛍光シグナルピークをもたらす（図２３Ｂ）。従って、Ａｂ１等の抗糖タンパク質抗体の使用は、安定した捕捉マトリックスの構築を可能にする。
【０４７１】
市販のビオチン化ポリクローナル抗ヒト抗血清（ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号７０９−０６５−１４９）を「捕捉抗体」として、それを細胞表面上のビオチン化Ａｂ１と連結するための架橋としてのストレプトアビジンと共に使用した。次に標識細胞を生産培地に移し、異なる量の時間Ａｂ−Ａを分泌させた。分泌され、蛍光標識「検出抗体」（ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＭＬ＊，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号７０９−５４５−１４９）で捕捉されたＡｂ−Ａのその後の検出においては、０、０．５、または２時間後に処理された試料について、インキュベーション時間と共に一貫して増加するシグナルが観察された（図２４Ｂ）。対照である非産生性「ヌル株」は、同時点にわたってシグナルのいずれの増加も示さなかった（図２４Ａ）。これらの結果は、分泌産物の首尾よい捕捉への蛍光シグナルの依存性を実証する。
【０４７２】
分泌抗体の交差結合の軽減
「産生株」を分泌するマトリックス標識Ａｂ−Ａをマトリックス標識非産生性ヌル株と混合すると、分泌産物の交差結合が観察された（図２５Ａ）。これらの結果から、高産生性細胞から分泌され（かつマトリックスによって捕捉されない）抗体は、拡散し、低または非分泌性細胞上の捕捉マトリックスに結合することができ、結果としてフローサイトメトリープロファイルにおける蛍光シグナルが単一ピークになると推定した。該交差結合には、培地の浸透性を下げることによって対処した。１つの試験薬はゼラチンであったが、ゼラチンの補充は、１０％ほどの低濃度でさえ、細胞の生存率及び生産性に深刻な悪影響を及ぼすことが観察された（データ示さず）。ゼラチンは、酸素及び栄養素の取込みに悪影響を及ぼすと仮定した。分子クラウディング薬、特に１０〜１５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）による培地の補充を試験した。デキストラン、フィコール、ＢＳＡ等の他の分子クラウディング薬で交差結合の阻止が達成可能であることを企図する。異なる分子量または異なる濃度のＰＥＧ分子をも使用可能であろう。１０％のＰＥＧ８０００による補充は、生産性に悪影響を与えることなく交差結合を制限することが分かった（図２５Ｂ及び図２５Ｃ）。１０％のＰＥＧ８０００を含有する培地で非産生性株（「ヌル株」）と抗体産生性株（「産生株」）との混合物を培養することから生じる結果は、抗体産生性細胞からヌル細胞への抗体の遊走の制限を示唆する。等数のヌル細胞と産生細胞の混合物（「５０：５０混合  ヌル及び産生」）は、フローサイトメトリープロファイルにおいて２つの蛍光シグナルピークをもたらしたが（図２５Ｂ）、９０％のヌル細胞と１０％の産生細胞との混合物（「９０＿１０混合ｗ−ＰＥＧ」）は、産生株から得られるピーク蛍光強度に類似の蛍光強度を示す細胞の低いピークまたは肩部を含む蛍光シグナル分布を生じさせた（図２５Ｃ）。これらの結果は、１０％のＰＥＧ８０００を含めると、所与の細胞に関するシグナルのレベルが当該個々の細胞による抗体産生のレベルをさらに密接に反映するように、細胞間の抗体の遊走を減らしたことを示す。
【０４７３】
高産生性株の富化
上述のフローサイトメトリーを可能にした細胞表面捕捉マトリックス手法を２つの概念証明実験において利用して、混合培地内の高産生性細胞を富化した。これらの実験では、異なるヒト化ＩｇＧ１抗体（Ａｂ−Ａ、Ａｂ−Ｄ、Ａｂ−Ｅ、及びＡｂ−Ｆの中から２つの抗体）を産生する細胞を規定比で混合し、上記方法を用いて高産生性株を捕捉し、染色し、富化した。この実験では、高産生性株が約２０倍〜約１５０倍に富化された。この結果は、高産生性株の首尾よい富化は、高生産性細胞を単離するためのスクリーニングアッセイとの関連で遂行できたことを示している。
【０４７４】
第１の実験では、「高産生性」Ａｂ−Ｅ分泌酵母細胞を「低産生性」Ａｂ−Ｆ分泌細胞数の約９９倍添加することによって、９９：１混合株培養を調製した。Ａｂ−Ｅ分泌細胞は、Ａｂ−Ｆ分泌細胞よりずっと高レベルの抗体を分泌することが以前に観察された。この生産量の差をこの実施例で用いた捕捉及び選別アッセイで検出可能であることを確証するため、培養の０または２時間後に細胞を処理することによって、個々の株による抗体産生量を特徴づけた（図２６Ａ）。結果は、Ａｂ−Ｅ産生性細胞が各時点でより高い蛍光強度を示すことを実証し、このアッセイでＡｂ−Ｅによる高い産生量が検出可能であることを確証した。混合培地を表面捕捉マトリックスで標識し、１０％ＰＥＧ８０００補充培地内で抗体を分泌させ、洗浄し、検出抗体で染色した。フローサイトメトリーを用いて、最も高いの蛍光シグナルを有する細胞のトップ０．２５％を集団から単離した（図２６Ｂ）。この選択した亜集団を次に、下記：ｉ）両株（全細胞）の成長を可能にする、抗生物質なし；ｉｉ）Ａｂ−Ｆ株の成長を可能にする３５０ｍｇ／ＬのＧ４１８；及びｉｉｉ）Ａｂ−Ｅ株の成長を可能にする２００ｍｇ／ＬのＺｅｏｃｉｎのどれかで補充したＹＰＤＳプレート上に置いた。これらの蒔いた細胞を数えることに基づいて、各抗体を発現する細胞数及び総細胞数を決定した。フローサイトメトリーにおいて、Ａｂ−Ｅ分泌細胞の比率は、総細胞の比率として、＜１％から約２０％まで増加することが分かった（表４）。これは、２０倍の富化に相当する。
【０４７５】
【表４】
2018511300.tif 000006
【０４７６】
第２の実験では、高産生性Ａｂ−Ｄ分泌細胞を、培養に添加することによって、９９．９：０．１比の混合培養を調製し、低産生性Ａｂ−Ａ分泌細胞数の約９９９倍の数含有する。Ａｂ−Ｄ分泌細胞は、Ａｂ−Ａ分泌細胞よりずっと高レベルの抗体を分泌することが以前に観察された。この生産量の差をこの実施例で用いた捕捉及び選別アッセイで検出可能であることを確証するため、培養の０または２時間後に細胞を処理することによって、個々の株による抗体生産量を特徴づけた（図２７）。結果は、Ａｂ−Ｄ産生性細胞が各時点でより高い蛍光強度を示すことを実証し、このアッセイでＡｂ−Ｄによる高い生産量が検出可能であることを確証した。混合培地を表面捕捉マトリックスで同様に標識し、１０％ＰＥＧ８０００補充培地内で抗体を分泌させた後に洗浄及び染色した。しかしながら、最も高い蛍光シグナルを有する細胞のトップ０．０２５％のみを選択することよってフローサイトメトリー選択基準をさらに厳密にした。厳密な選択基準はさらに大きい富化をもたらすと仮定した。選択した亜集団を次に、下記：ｉ）両株（全細胞）の成長を可能にする、抗生物質なし；ｉｉ）Ａｂ−Ａ株の成長を可能にする３５０ｍｇ／ＬのＧ４１８；またはｉｉｉ）Ａｂ−Ｄ株の成長を可能にする２００ｍｇ／ＬのＺｅｏｃｉｎのどれかで補充したＹＰＤＳプレート上に置いた。これらの蒔いた細胞を数えることに基づいて、各抗体を発現する細胞数及び総細胞数を決定した。フローサイトメトリー選別においては、Ａｂ−Ｄ分泌細胞の比率は、総細胞の比率として、＜０．１％から約１５％まで増加することが分かり、１５０倍の富化に相当する（表５）。この結果は、さらに厳密なゲーティング基準でさえ、さらに大きい倍数の富化をもたらすことができ、高産生性株が出発細胞集団の０．１％未満として存在するときでさえ、有効であり得ることを確証した。
【０４７７】
【表５】
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【０４７８】
結論
結果は、高産生性株の首尾よい富化は、抗体捕捉方略後に抗体検出及び細胞選別においてＡｂ−１等の抗糖タンパク質抗体を用いて実現可能であることを示している。これらの概念証明実験では、既知の高産生性及び低産生性株を混合し、その結果、出発株の富化を検出することによって容易に富化を定量化できた（抗生物質耐性マーカーによって区別した）。ある実験では、高産生性株が出発集団の１％未満から選別後の最終集団の約２０％まで富化され、約２０倍の富化を示した。別の実験では、高産生性株が出発集団の０．１％未満から選別後の最終集団の約１５％まで富化され、約１５０倍の富化を示した。これらの結果から、これらの方法は、高産生性細胞を単離するためのスクリーニングアッセイとの関連で実現可能であると推測される。遺伝的変異は、化学的突然変異誘発、発現ライブラリーによる形質転換、系統的または無作為的遺伝子ノックアウトによってのように、集団に導入可能である。発現レベル上昇をもたらす細胞を回収し、さらに処理することができる。遺伝的に同種の集団を作り出すために単一コロニーから高産生性細胞を成長させてよく、あるいは富化細胞の混合集団を用いてもよい。発現レベル上昇は、結果として生じる細胞の発現レベルを出発細胞または他の既知標準物質と比べて直接測定することによって確証可能である。発現上昇をもたらす規定遺伝子差異を有する細胞を生成するために、出発細胞からの遺伝的差異を決定し、産生株に導入することができる。
【０４７９】
対象方法を用いて、異なる処理が産生レベルに及ぼす効果を測定することもできる。例えば、細胞に、化学的処理、成長条件、または産生レベルに影響する可能性について試験すべき他の条件の差異を施し、差次的に標識し、混合してから上記捕捉及び選別方法を施すことができる。差次的に標識した細胞の相対比率は、処理（複数可）が抗体産生に及ぼす効果を示している。
【０４８０】
実施例１１：糖変異体レベルを低減させるための抗糖タンパク質抗体の使用
クロマトグラフィーステップで抗体を用いて糖変異体レベルを減らすかまたは排除するためにＡｂ−１等のＡＧＶ抗体を使用する可能性を評価するため、２つの異なる方法を用いてクロマトグラフィー樹脂上にＡｂ−１を固定化した。次にこれらのアフィニティー樹脂を用いてＡｂ−Ａのロット（ロット９）における糖変異体レベルの低減を評価した。
【０４８１】
方法
ＧＥ  ＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂
製造業者のガイドラインに従い、１ｍＭの冷却ＨＣｌを用いて樹脂を活性化することによってプレ活性化樹脂を調製し、室温で５時間までの穏やかな撹拌を伴うインキュベーションによってＡｂ−１との共有結合により機能化した。Ｔｒｉｓ  ｐＨ８を最終濃度０．１Ｍで添加してカップリング反応を停止させた。この機能化樹脂を０．１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８及び０．１ＭのアルギニンｐＨ４の交互洗浄によりすすいでいずれの非結合タンパク質をも除去した。カップリングに用いたＡｂ−１の量は、定着樹脂１ミリリットル当たり０．７〜２５ミリグラムの抗体の範囲であった。
【０４８２】
ＰｉｅｒｃｅストレプトアビジンプラスＵｌｔｒａｌｉｎｋ樹脂
製造業者のガイドラインと同様の手順で樹脂（ビーズ状ポリアクリルアミドで構成）を調製した。樹脂をＤＰＢＳ（カルシウムまたはマグネシウムなし）ですすいだ。２０：１または４０：１モル比のビオチン：抗体でＰｉｅｒｃｅスルホＮＨＳビオチンを用いてＡｂ−１をビオチン化し、製造業者の推奨によって緩衝液を交換して遊離ビオチンを除去した。室温で約１時間もしくは４℃で一晩の撹拌を利用するかまたは室温と４℃のインキュベーションの組合せでビオチン化Ａｂ−１をストレプトアビジン樹脂とインキュベートした。カップリングに用いたＡｂ−１の量は、定着樹脂１ミリリットル当たり約１ミリグラムであった。
【０４８３】
上記実施例６で述べたように、ＡＧＶ  ＨＴＲＦアッセイを用いて試料中の糖変異体レベルを測定した。
【０４８４】
結果
第１の実験では、２０ミリグラムのＡｂ−Ａロット９（セラミックヒドロキシアパタイトカラムからの溶出液）をＤＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌまで希釈し、２ｍｌのＡｂ−１機能化ＮＨＳ樹脂を詰めた０．３ｍｌ／分の流速のＤＰＢＳ平衡化カラムにかけた。第２の実験では、セラミックヒドロキシアパタイトカラムからの２０ミリグラムのＡｂ−Ａロット９溶出液をＤＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌまで希釈し、２．２ｍｌのＡｂ−１機能化Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ樹脂を詰めた０．３ｍｌ／分の流速のＤＰＢＳ平衡化カラムにかけた。これらの両樹脂はフロースルーモードで使用した。フロースルー画分をプールし、ＡＧＶ  ＨＴＲＦアッセイを用いて負荷物質（Ａｂ−Ａロット９）の糖変異体シグナルに対する糖変異体シグナルを決定した。
【０４８５】
表６に示すように、両実験では、固定化Ａｂ−１を含有するカラムにＡｂ−Ａロット９の物質を通した後に糖変異体シグナルの顕著な低減があった。これらの結果は、ピキア内で産生された抗体の調製物中の糖変異体のレベルを低減させるためにクロマトグラフィーステップにおいてＡｂ−１を使用することの実現可能性を実証する。これらの実験ではＡｂ−１抗体の無傷型を用いたが、無傷抗体の代わりにＡｂ−１のＦａｂまたはｓｃＦｖ型を用いてもこの手法を取ることができた。異なるＡＧＶ抗体を用いてもこの手法を取ることができた。
【０４８６】
【表６】
2018511300.tif 000008
【０４８７】
本発明の種々の例示実施形態の上記記述は、網羅的であると、または開示した正確な形態に本発明を限定する意図ではない。本明細書には、本発明の具体的実施形態、及び本発明のための実施例を例示目的で記載しているが、当業者が認めるように、本発明の範囲内では種々の等価な変更が可能である。本明細書で提供した本発明の教示は、上記実施例以外に、他の目的に適用可能である。
【０４８８】
本発明は、前述の説明及び実施例で特に記載したもの以外の方法で実施可能である。上記教示を考慮して本発明の多数の変更及び変形が可能であり、従って、それらは添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【０４８９】
上記詳細な説明を考慮して、これら及び他の変更を本発明に加えることができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用する用語は、本明細書及び特許請求の範囲で開示する特定の実施形態に本発明を限定するように解釈すべきでない。従って、本発明は、本開示により限定されるのではなく、代わりに、下記特許請求の範囲によって完全に判断されるべきである。
【０４９０】
抗原特異性Ｂ細胞のクローン集団を得る方法に関するある特定の教示は、参照によってそれぞれその開示全体をここに援用する２００６年５月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／８０１，４１２号、及び米国特許出願公開第２０１２／０１４１９８２号に開示された。
【０４９１】
ウサギ由来モノクロナール抗体のヒト化及び抗原結合アフィニティーを維持するための好ましい配列修飾に関するある特定の教示は、参照によってその開示全体をここに援用する２００８年５月２１日に出願され、発明の名称が「新規ウサギ抗体ヒト化方法及びヒト化ウサギ抗体（Ｎｏｖｅｌ  Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｕｍａｎｉｚａｉｔｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」である国際公開第ＷＯ／２００８／１４４７５７号に相当する国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４４２１号に開示された。
【０４９２】
交配コンピテント酵母を用いた抗体またはそのフラグメントの産生及び対応方法に関するある特定の教示は、参照によってその開示全体をここに援用する２００６年５月８日に出願された米国特許出願第１１／４２９，０５３号（米国特許出願公開第ＵＳ２００６／０２７００４５号）に開示された。
【０４９３】
背景、概要、詳細な説明、及び実施例セクションで引用した各文書を含め、本明細書で引用した各文書（特許、特許出願、雑誌論文、抄録、マニュアル、書籍、または他の開示物を含めて）の全開示は、参照によってその全体がここに援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図３Ｏ】
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【図３Ｐ】
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【図３Ｑ】
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【図３Ｒ】
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【図３Ｓ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６】
2018511300.tif 000079
【図２７】
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【配列表】
2018511300000001.app
【国際調査報告】
2018511300.tif 000081
2018511300.tif 000082
2018511300.tif 000083
2018511300.tif 000084