(57)【要約】  癌を治療する方法であって、Ｈｏｍ−１ポリペプチド又はＨｏｍ−１ホメオボックスドメインを含むそのフラグメントをコードする核酸配列を含む、遺伝子改変されたマクロファージ又は単球を準備することであって、ここで、核酸配列が異種性プロモーターに作動可能に連結され、改変されたマクロファージ又は単球がＨｏｍ−１ポリペプチド又はそのフラグメントを発現することと、癌を有する被験体に改変されたマクロファージ又は単球を投与することとを含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を治療する方法であって、
Ｈｏｍ−１ポリペプチド又はＨｏｍ−１ホメオボックスドメインを含むそのフラグメントをコードする核酸配列を含む、遺伝子改変されたマクロファージ又は単球を準備することであって、ここで、前記核酸配列が異種性プロモーターに作動可能に連結され、前記改変されたマクロファージ又は単球がＨｏｍ−１ポリペプチド又はそのフラグメントを発現することと、
癌を有する被験体に前記改変されたマクロファージ又は単球を投与することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記改変されたマクロファージ又は単球が、前記被験体又は別の被験体に由来するマクロファージ又は単球に外因性の発現コンストラクトを導入することにより生成される、請求項２に記載の方法。
【請求項３】
前記プロモーターが構成的プロモーターである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記改変されたマクロファージがＭ１表現型を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記投与工程に先立って、対照と比較して、前記被験体において腫瘍関連マクロファージにおけるより低いレベルのＨｏｍ−１発現を検出することを更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
癌を治療する方法であって、
マクロファージ又は単球を、Ｈｏｍ−１の発現を誘導する１以上の薬剤と接触させることであって、前記接触により、前記マクロファージ又は単球における内因性Ｈｏｍ−１の発現レベルが、前記接触工程前よりも高くなることと、
そのように接触された前記マクロファージ又は単球を、癌を有する被験体に投与することと、
を含む、方法。
【請求項８】
前記マクロファージ又は単球が、前記被験体に対して自己由来又は異種性である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記接触工程及び投与工程が、少なくとも一回繰り返される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
癌を治療する方法であって、
マクロファージ又は単球を、Ｍ１遺伝子の発現を誘導する薬剤、又はＭ２遺伝子の発現を阻害する薬剤と接触させることであって、前記接触によりＭ１表現型を示すマクロファージを生成することと、
そのようにして生成された前記マクロファージを、癌を有する被験体に投与することと、
を含む、方法。
【請求項１１】
前記マクロファージ又は単球が、前記被験体に対して自己由来又は異種性である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
被験体において癌を同定する方法であって、
癌であることが疑わしい組織領域の微小環境に由来するマクロファージにおける遺伝子の発現レベルを検出することを含み、
前記遺伝子がＨｏｍ−１遺伝子、Ｍ１遺伝子、又はＭ２遺伝子であり、ここで、対応する対照のレベルと比較して、
（ｉ）より低いレベルのＨｏｍ−１遺伝子若しくはＭ１遺伝子、又は、
（ｉｉ）より高い発現レベルのＭ２遺伝子、
の検出が、前記疑わしい組織領域が癌である、又は癌になるリスクがあることを示す、方法。
【請求項１３】
癌の治療に対する候補化合物を同定する方法であって、
試験細胞と試験化合物とを接触させることであって、ここで、前記試験細胞がマクロファージ又は単球であることと、
前記試験細胞において、（ｉ）Ｈｏｍ−１、（ｉｉ）Ｈｏｍ−１プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子、（ｉｉｉ）Ｍ１遺伝子、又は（ｉｖ）Ｍ２遺伝子の発現レベルを検出することと、
対応する対照と比較して、発現レベルを変更する試験化合物を選択することであって、
ここで、選択された前記化合物が癌の治療に対する候補化合物であることと、
を含む、方法。
【請求項１４】
腫瘍促進マクロファージと選択された前記化合物とを接触させることと、
そのように接触された前記腫瘍促進マクロファージを抗腫瘍活性についてアッセイすることと、
を更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記腫瘍促進マクロファージが、腫瘍関連マクロファージ又はＭ２マクロファージである、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記接触工程が、癌試料を含む共培養物において試験細胞により行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記試験細胞と前記癌試料とが互いに直接接触、又は間接接触する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記試験細胞が、Ｍ１マクロファージ、Ｍ２マクロファージ、腫瘍関連マクロファージ、組織マクロファージ、又は単球由来マクロファージである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
癌の治療に対する候補化合物を同定する方法であって、
試験細胞と癌試料とを含む共培養物を準備することであって、前記試験細胞がマクロファージ又は単球であることと、
前記共培養物に試験化合物を添加することと、
対応する対照と比較して、（ｉ）前記癌試料を阻害する、（ｉｉ）前記試験細胞においてＨｏｍ−１若しくはＨｏｍ−１プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子の発現レベルを増加させる、（ｉｉｉ）前記試験細胞においてＭ１遺伝子の発現を増加させる、（ｉｖ）前記試験細胞においてＭ２遺伝子の発現を減少させる、又は（ｖ）前記試験細胞においてＨｏｍ−１若しくはＨｏｍ−１プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子の発現レベルの著しい減少を阻害する、試験化合物を選択することと、
を含み、ここで、選択された化合物が癌の治療に対する候補化合物である、方法。
【請求項２０】
前記癌試料が癌組織試料である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記試験細胞と癌試料とが互いに直接接触、又は間接接触する、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記試験細胞が、Ｍ１マクロファージ、Ｍ２マクロファージ、腫瘍関連マクロファージ、組織マクロファージ、又は単球由来マクロファージである、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１５年１１月１１日付で出願された米国仮特許出願第６２／２５３，８３６号に対する優先権を主張するものであり、その内容全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【背景技術】
【０００２】
発癌における免疫の役割が、より一層理解されつつある。マクロファージは、自然免疫と獲得免疫の両方の実行者であり、腫瘍及び腫瘍の微小環境の主要成分として認識されている。広範囲な調査により、ほぼ全ての腫瘍の成長、浸潤及び転移における腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の役割が示唆された。循環単球に由来するＴＡＭは、選択された初期の腫瘍におけるＭ１様表現型から最も進行した腫瘍におけるＭ２様表現型に亘る広範囲な表現型を提示する。腫瘍形成の促進におけるその役割と一致して、Ｍ２様ＴＡＭは、ＩＬ−１０、ＩＬ４、ＭＭＰ、及びＶＥＧＦの発現上昇を示すが、炎症促進性サイトカイン、並びに細胞毒性ｉＮＯｓ及びＲＯＩの発現減少という特徴的な表現型を示し、それらは殺腫瘍活性と関係があるとされる。腫瘍形成の促進におけるその固有の機能の他に、ＴＡＭはまた、腫瘍微小環境におけるＴ細胞の応答及びバランスを代替する（alternating）ことにより、抗腫瘍免疫の抑制に寄与する。ＴＡＭの機能的可塑性が、十分に認識された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、腫瘍治療において標的とされるＴＡＭの有効性及び可能性のある適用は、ＴＡＭ可塑性が細胞内因子によってどのように制御されるかについての理解が限定的であるため制限されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様では、癌を治療する方法が本明細書において提供される。該方法は、Ｈｏｍ−１ポリペプチド又はＨｏｍ−１ホメオボックスドメインを含むそのフラグメントをコードする核酸配列を含む、遺伝子改変されたマクロファージ又は単球を準備することであって、ここで、核酸配列が異種性プロモーターに作動可能に連結され、改変されたマクロファージ又は単球がＨｏｍ−１ポリペプチド又はそのフラグメントを発現することと、癌を有する被験体に改変されたマクロファージ又は単球を投与することとを含む。一実施の形態では、改変されたマクロファージ又は単球が、被験体又は別の被験体に由来するマクロファージ又は単球に外因性の発現コンストラクトを導入することにより生成される。改変されたマクロファージがＭ１表現型を示す。上記方法は、投与工程に先立って、対照と比較して、被験体において腫瘍関連マクロファージにおけるより低いレベルのＨｏｍ−１発現を検出することを更に含むことができる。
【０００５】
別の態様では、癌を治療する方法であって、マクロファージ又は単球を、Ｈｏｍ−１の発現を誘導する１以上の薬剤と接触させることであって、接触により、マクロファージ又は単球における内因性Ｈｏｍ−１の発現レベルが、接触工程前よりも高くなることと、そのように接触されたマクロファージ又は単球を、癌を有する被験体に投与することとを含む、方法が本明細書に記載される。
【０００６】
また、癌を治療する方法であって、マクロファージ又は単球を、Ｍ１遺伝子の発現を誘導する薬剤、又はＭ２遺伝子の発現を阻害する薬剤と接触させることであって、接触によりＭ１表現型を示すマクロファージを生成することと、そのようにして生成されたマクロファージを、癌を有する被験体に投与することとを含む、方法が本明細書に記載される。
【０００７】
更に別の態様では、被験体において癌を同定する方法が本明細書に記載される。該方法は、癌であることが疑わしい組織領域の微小環境に由来するマクロファージにおける遺伝子の発現レベルを検出することを含み、遺伝子がＨｏｍ−１遺伝子、Ｍ１遺伝子、又はＭ２遺伝子であり、ここで、対応する対照のレベルと比較して、（ｉ）より低いレベルのＨｏｍ−１遺伝子若しくはＭ１遺伝子、又は、（ｉｉ）より高い発現レベルのＭ２遺伝子の検出が、疑わしい組織領域が癌である、又は癌になるリスクがあることを示す。
【０００８】
また、癌の治療に対する候補化合物を同定する方法が本開示に記載される。該方法は、試験細胞と試験化合物とを接触させることであって、ここで、試験細胞がマクロファージ又は単球であることと、試験細胞において、（ｉ）Ｈｏｍ−１、（ｉｉ）Ｈｏｍ−１プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子、（ｉｉｉ）Ｍ１遺伝子、又は（ｉｖ）Ｍ２遺伝子の発現レベルを検出することと、対応する対照レベルと比較して、発現レベルを変更する試験化合物を選択することであって、ここで、選択された化合物が癌の治療に対する候補化合物であることとを含む。一実施の形態では、上記方法は、腫瘍促進マクロファージと選択された化合物とを接触させることと、そのように接触された腫瘍促進マクロファージを抗腫瘍活性についてアッセイすることとを更に含むことができる。腫瘍促進マクロファージは、腫瘍関連マクロファージ又はＭ２マクロファージであり得る。接触工程は、癌試料を含む共培養物において試験細胞により行うことができる。試験細胞は、Ｍ１マクロファージ、Ｍ２マクロファージ、腫瘍関連マクロファージ、組織マクロファージ、及び単球由来マクロファージから選択することができる。
【０００９】
一態様では、癌の治療に対する候補化合物を同定する方法であって、試験細胞と癌試料とを含む共培養物を準備することであって、試験細胞がマクロファージ又は単球であることと、共培養物に試験化合物を添加することと、対照と比較して、（ｉ）癌試料を阻害する、（ｉｉ）試験細胞においてＨｏｍ−１若しくはＨｏｍ−１プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子の発現レベルを増加させる、（ｉｉｉ）試験細胞においてＭ１遺伝子の発現を増加させる、（ｉｖ）試験細胞においてＭ２遺伝子の発現を減少させる、又は（ｖ）試験細胞においてＨｏｍ−１若しくはＨｏｍ−１プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子の発現レベルの著しい減少を阻害する、試験化合物を選択することとを含み、ここで、選択された化合物が癌の治療に対する候補化合物である、方法が本明細書に記載される。一実施の形態では、癌試料は、癌組織試料である。共培養物において、試験細胞と癌試料とが互いに直接接触、又は間接接触することができる。試験細胞は、Ｍ１マクロファージ、Ｍ２マクロファージ、腫瘍関連マクロファージ、組織マクロファージ、及び単球由来マクロファージから選択することができる。
【００１０】
別の態様では、癌の治療に対する候補化合物を同定する方法であって、癌組織試料を準備することと、組織試料と試験化合物とを接触させることと、対照と比較して（ｉ）組織試料を阻害する、（ｉｉ）組織試料中の腫瘍関連マクロファージ若しくは単球においてＨｏｍ−１の発現レベルを増加させる、（ｉｉｉ）組織試料中の腫瘍関連マクロファージ若しくは単球においてＭ１遺伝子の発現を増加させる、（ｉｖ）組織試料中の腫瘍関連マクロファージ若しくは単球においてＭ２遺伝子の発現を減少させる、又は（ｖ）組織試料中の腫瘍関連マクロファージ若しくは単球におけるＨｏｍ−１の発現レベルの著しい減少を阻害する、試験化合物を選択することとを含み、ここで、選択された化合物が癌の治療に対する候補化合物である、方法が本明細書に記載される。
【００１１】
１つ以上の実施形態の詳細を、以下の詳細な説明に示す。本実施形態のその他の特徴、課題及び利点は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
驚いたことに、正常組織から単離したマクロファージと比較して、ＴＡＭ中のＨｏｍ−１発現は著しく減少されることが発見された。また、驚いたことに、ＴＡＭ中のＨｏｍ−１の発現の増加が、ＴＡＭを、殺腫瘍活性を有するＭ１様マクロファージへと変換したことが更に発見された。
【００１３】
ヒトホメオボックス転写因子であるＨｏｍ−１は、標準Ｗｎｔシグナル伝達のアンタゴニストである。Ｈｏｍ−１の核酸配列（配列番号１）及びＨｏｍ−１がコードするアミノ酸配列（配列番号２）を以下に示す：
acctggccgc catgcgcctc tcctcctccc cacctcgtgg cccgcagcag ctctccagct ttggctccgt ggactggctc tcccagagca gctgctcagg gccgacccac acccccaggc ctgccgactt ctccctgggg agcctccctg gcccaggcca gacatccggc gcccgggagc cccctcaggc cgtcagcatc aaggaggccg ccgggtcctc aaatctgcct gcgccggaga ggaccatggc cgggttgagt aaggagccaa ataccttgcg ggccccccgt gtccgcacag ccttcaccat ggagcaggtc cgcaccttgg agggcgtctt ccagcaccac cagtacctga gccctctgga gcggaagagg ctggccaggg agatgcagct ctcagaggtc cagataaaaa cctggtttca gaatcgccgc atgaaacaca aacggcaaat gcaggacccc cagctgcaca gccccttctc ggggtctctc catgcgcccc cagctttcta ctcaacgtct tctggccttg ccaatggcct gcagctgctg tgcccttggg cacccctgtc cgggccccag gctctgatgc tgccccctgg ctccttctgg ggtctctgcc aagtggcaca agaggccctg gcatctgcgg gagcttcctg ctgcgggcag cctctggcgt cccacccccc taccccaggc cggccttcgc tgggaccagc cctgtccacg gggccccggg gcctgtgtgc tatgccacag acgggggatg cattttgagg aggcacctct gactcccaca ctcgcggtct tgctgatcgc acctggctcc tacctggagg actcagttgt tctgtttaca tcctggtggc acctctcacc ctgacccaca caaaggttct ggagattact ggagaatata tataaatata tatatgtacg tatatatgta aatacacata tacgtatata taaatatata tatacatatg tgtgtgtata tatatatata tttttttttt tttttttttt tttgagacgg agtgttgctc tgtcacccag gctggagtgc aatgacgcaa tctcggctca ctgcaacctc cgcctcctgg gttcaagcga ttctccagcc tcagcctccc gagtagctgg gattacagac acccgccacc acgcccggct aattttttct atttttagta gaaatggggt ttcaccatgt tagccaggct ggtctcaaac tcctgaccct gtgatccgcc cgcctcggcc tcccaaagtg ctgggattac aggcatgagc cactgcaccc ggccctgaga atatatttat taaagccacc tcttcactga aagttaccga aagagtcggt ttaggaagga aacgaagggt cagtgaacag agtcaaatgc agaagtgggc ttgtcatggg tagggctttc ggcgtacgat aaaaggatca tttgtttttt aaaaggggtt ggaaaaactg gttttccagt tggaaacagt aaaggttgta agctttgtgt gtacaaaaga aaacagggaa tgcaggtgtg tttatagcgt tgtggttcaa gtccctctta acaagaactc caaagctgga aagcaggagg gaacaaaggt gaacatgaag gcgaggatgc tggggccctg cagtgcgctc taggctgtgc gtgagccggg actgtaccca cagcttgctg agggctgctc ttcttgggcc agggaaagca gggcagccgg gacctgcggc tgtgcctgga ctgaagctgt cccgcaggtc cccaccctcc aacacgtgct cacctgtccc cctcctcgca gcagcctcgg gacaaaacaa tgactcaagg acagcacttc tcgcagaagg tctggaagtg cccagaatgg gaggcacgga agcccctccc ggggaggact cccgcgttga tggaccgttc ttggtgcaga ctcctgactg cgtgcatgaa acctgagaca agtgcaattc cttccatgtc gccccagagt gcccaggagg caggcagtgc ggggtgccca ggcagacggg ttcagcctgc agaactggag gcgacctgtg aaacccaccc gggcacccca acaggaacag aagcgtggtc ctgcggctgc gtccccagcg agtttcactt tccccttgct cgtttctccc ttgttgtaag tgtttacaac tggcatgtgc ttttaaacgt caggtaagag gggaacagct gctgtacatc gtcctggcga gtgacaatgt gacagaagcc tgggcgaggc cctcggaggg cagcagctgg acaggggcta ctgggtttgg cctggacagc actgatttgt ggatgtggat gggggcacgt tgtccgtgat aaaagtacaa gtgcccctca caaaaaaaaa aaaaaaaa（配列番号１、下線：コーディング配列）
mrlssspprg pqqlssfgsv dwlsqsscsg pthtprpadf slgslpgpgq tsgareppqa vsikeaagss nlpapertma glskepntlr aprvrtaftm eqvrtlegvf qhhqylsple rkrlaremql sevqiktwfq nrrmkhkrqm qdpqlhspfs gslhappafy stssglangl qllcpwapls gpqalmlppg sfwglcqvaq ealasagasc cgqplashpp tpgrpslgpa lstgprglca mpqtgdaf（配列番号２、下線：ホメオドメイン）
【００１４】
被験体に抗腫瘍活性を示すマクロファージを投与することにより、被験体の癌を治療する方法が本明細書に記載される。別段の定めがない限り、本明細書で使用される「抗腫瘍活性を示すマクロファージ」、「Ｍ１様マクロファージ」、及び「Ｍ１表現型を示すマクロファージ」の用語は、同義的に使用することができる。
【００１５】
Ｍ１様マクロファージは、（１）マクロファージ若しくは単球においてＨｏｍ−１発現を増加させ、（２）マクロファージ若しくは単球において１以上のＭ１遺伝子の発現を増加させ、及び／又は（３）マクロファージ若しくは単球において１以上のＭ２遺伝子の発現を阻害することにより産生され得る。
【００１６】
Ｈｏｍ−１発現が単球からマクロファージへの分化に必要かつ十分であることが示されているため、単球（例えば、被験体の末梢血に由来する）を上記方法において使用することができる。言い換えれば、単球においてＨｏｍ−１の発現を増加させることで、単球をマクロファージへと分化させることができる。
【００１７】
より高レベルの内因性Ｈｏｍ−１を発現するように、マクロファージ又は単球をｅｘ  ｖｉｖｏで誘導することができる。様々な薬剤又は処置、例えばＬＰＳ、コレラ毒素（ＣＴＸ）、化学療法剤、放射線、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）、フォルボル１２−ミリステート１３アセテート（ＰＭＡ）、及びＨｏｍ−１発現の阻害剤に対する抗体又はＲＮＡｉを使用して、Ｈｏｍ−１発現を誘導することができる。
【００１８】
また、高レベルのＨｏｍ−１を発現するように遺伝子改変されたマクロファージ又は単球を使用して、癌を有する被験体を治療することができる。例えば、遺伝子改変されたマクロファージ又は単球は、Ｈｏｍ−１ポリペプチド又はＨｏｍ−１ホメオボックスドメインを含むそのフラグメントをコードする核酸配列を含んでもよい。核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結され、改変されたマクロファージ又は単球はＨｏｍ−１ポリペプチド又はそのフラグメントを発現する。かかる改変されたマクロファージ又は（マクロファージへと分化し得る）改変された単球は、著しく高いレベルのＨｏｍ−１を発現して、抗腫瘍活性及び／又はＭ１表現型を呈する。
【００１９】
また、マクロファージ又は単球にＨｏｍ−１遺伝子の追加のコピーを導入することにより、遺伝子改変されたマクロファージ又は単球を生成することができる。例えば、内因性Ｈｏｍ−１プロモーターに作動可能に連結されたＨｏｍ−１核酸配列を含む（Ｈｏｍ−１ポリペプチド、又はＨｏｍ−１ホメオボックスドメインを含むそのフラグメントをコードする）発現コンストラクトを、マクロファージ又は単球に導入することができる。
【００２０】
また、Ｈｏｍ−１ポリペプチド、又はＨｏｍ−１ホメオボックスドメインを含むそのフラグメントを直接ペプチド送達によってマクロファージ又は単球へ導入することができる。
【００２１】
当該技術分野において知られている方法を使用して、マクロファージ及び単球を遺伝子改変することができる。例えば、Ｈｏｍ−１を発現するための外因性発現コンストラクトを、マクロファージ又は単球に導入して（例えば、安定して又は一時的にトランスフェクトして）もよい。一実施形態では、Ｈｏｍ−１核酸配列は、異種性（すなわち、Ｈｏｍ−１プロモーターではない）の構成的プロモーター又は誘導性プロモーターに作動可能に連結される。一実施形態では、Ｈｏｍ−１核酸配列は、内因性プロモーターに作動可能に連結される。
【００２２】
マクロファージ又は単球においてＭ１遺伝子の発現を誘導することによっても、Ｍ１様殺腫瘍性マクロファージを生成することができる。Ｍ１遺伝子を誘導することができる薬剤として、限定されないが、ＬＰＳ、ＣＴＸ、ＰＭＡ、ＧＭ−ＳＣＦ、ＩＮＦγ、及び化学療法剤が挙げられる。また、マクロファージ又は単球は、高レベルのＭ１遺伝子を発現するように遺伝子改変されてもよい。Ｍ１遺伝子として、ＩＬ１ｂ、ＩＬ６、ＩＬ１２、ＩＬ２３、ＴＮＦα、ｉＮＯｓ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６８、ＴＬＲ４、ＴＬＲ２、ＩＬ−１Ｒ、ＭＨＣＩＩ、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１、及びＳＯＣＳ３が挙げられる。
【００２３】
また、マクロファージ又は単球においてＭ２遺伝子の発現を阻害することでも、Ｍ１様殺腫瘍性マクロファージを産生することができる。Ｍ２遺伝子を阻害する薬剤として、抗ＩＬ４薬剤（例えば抗体又はＲＮＡｉ剤）、抗ＩＬ１３薬剤（例えば抗体又はＲＮＡｉ剤）、Ｍ２タンパク質に対する抗体、及びＭ２遺伝子を標的とするＲＮＡｉ剤が挙げられる。Ｍ２遺伝子として、ＡＲＧ１、ＭＭＰ９、ＣＣＬ１８、ＶＥＧＦ、ＩＬ１０、ＩＬ４、ＴＧＦｂ、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＤ６８、ＴＬＲ８、ＴＬＲ１、ＭＨＣＩＩ、ＴＧＭ２、ＤｃｏｙＲ、ＩＬ−１ＲＩＩ、Ｙｍ１／２、ＭＭＲ／ＣＤ２０６、及びＳＲが挙げられる。
【００２４】
異種性又は自己由来のマクロファージ又は単球を使用して、Ｍ１様マクロファージを生成することができる。異種性マクロファージ又は単球を使用する場合、ＨＬＡマッチングを行って、宿主反応を回避する又は最小限にすることができる。また、ＨＬＡが一致していないマクロファージ又は単球を使用してもよい。当該技術分野において知られている方法を使用して、癌患者から自己由来のマクロファージ又は単球を得ることができる。
【００２５】
生成されたＭ１様マクロファージを、点滴又は注射（例えば、静脈内、髄腔内、筋肉内、腔内、気管内、腹腔内、頭蓋内、皮下、又は別のタイプの組織内経路を介して）、経皮的投与、又は当該技術分野で知られている他の経路により被験体に投与することができる。或る一つの例では、マクロファージ又は単球を、腫瘍が見られる、或る部位に、又は組織（例えば肝臓又は膵臓）、若しくはその周辺領域へと直接注入してもよい。
【００２６】
癌を治療するため、必要なだけ（例えば１日毎〜３０日毎）、また必要な回数（例えば１回〜３０回）、Ｍ１様マクロファージで被験体を治療することができる。また、本明細書に記載されるＭ１様マクロファージを、放射線、化学療法、抗体及び低分子薬物等の他の癌治療法との併用療法において使用することができる。
【００２７】
以下に記載されるデータは、腫瘍タイプとは無関係に、Ｈｏｍ−１発現がＴＡＭを殺腫瘍細胞に変換することを示す。したがって、いかなる癌も、特に低レベルのＨｏｍ−１を発現するＴＡＭに関連した癌を、本明細書に記載されるＭ１様マクロファージを使用して治療することができる。上に記載されるＭ１様マクロファージで被験体を治療する前に、被験体におけるＴＡＭ中のＨｏｍ−１発現レベルが、対照において見られる発現レベル（例えば被験体の正常組織で見られるマクロファージ）よりも低いかどうかを判断することが有用な場合がある。
【００２８】
Ｍ１様マクロファージによって治療することができる癌の例として、限定されないが、白血病、肉腫、骨肉腫、リンパ腫、黒色腫、神経膠腫、膠芽腫、褐色細胞腫、肝臓癌、卵巣癌、皮膚癌、精巣癌、胃癌、膵癌、腎臓癌、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、脳腫瘍、食道癌、膀胱癌、副腎皮質癌、肺癌、気管支癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、鼻咽腔癌、子宮頸癌、肝臓癌、転移癌、及び原発部位が未知の癌等の癌腫及び肉腫が挙げられる。
【００２９】
対照の発現レベル（例えば正常組織におけるマクロファージ中の対応するレベル）と比較して、組織領域の微小環境において見られるマクロファージにおけるより低い発現レベルのＨｏｍ−１若しくはＭ１遺伝子、又はより高い発現レベルのＭ２遺伝子の検出は、その組織領域が癌であるか、又は癌になるリスクがあることを示す。したがって、疑わしい組織領域が癌であるか、又は癌になるリスクにあるかどうかを同定する方法もまた、本明細書において意図される。
【００３０】
癌の治療に対する候補化合物を同定する方法が本明細書に更に記載される。試験細胞（すなわち、マクロファージ又は単球）を試験化合物と接触させることができ、試験細胞における（ｉ）Ｈｏｍ−１、（ｉｉ）Ｈｏｍ−１プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子、（ｉｉｉ）Ｍ１遺伝子、（ｉｖ）Ｍ１プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子、（ｖ）Ｍ２遺伝子、又は（ｖｉ）Ｍ２プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子の発現レベルを検出する。対照（例えば試験化合物と接触していない試験細胞における対応するレベル）と比較して、（ｉ）〜（ｉｖ）いずれかの発現レベルを増加させる、及び／又は（ｖ）若しくは（ｉｖ）の発現レベルを減少させる試験化合物は、癌の治療に対する候補化合物である。
【００３１】
或る一つのスクリーニング方法では、試験化合物を、試験細胞及び癌試料を含む共培養物に添加する。試験化合物が、対照と比較して、（ｉ）試験細胞において、Ｈｏｍ−１、Ｈｏｍ−１プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子、Ｍ１遺伝子、若しくはＭ１プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子の発現レベルを増加させる、（ｉｉ）試験細胞において、Ｈｏｍ−１、Ｈｏｍ−１プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子、Ｍ１遺伝子、若しくはＭ１プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子の発現レベルの著しい減少を阻害する、又は（ｉｉｉ）試験細胞において、Ｍ２遺伝子、若しくはＭ２プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子の発現レベルを減少させる場合、試験化合物は癌の治療に対する候補化合物である。
【００３２】
共培養系では、試験化合物が癌試料に対して阻害作用を有しているかどうかを決定することもできる。対照と比較して、癌試料を阻害する（例えば、癌細胞の成長を阻害する、癌細胞を殺傷する、又は癌試料のサイズを減少させる）試験化合物は、癌の治療に対する候補化合物である。試験細胞と癌試料とは、互いに直接接触してもよい。代替的には、試験細胞と癌試料とは、（例えばトランズウェル（transwell）インサートの使用により）直接接触していない。癌試料は、癌細胞を含む試料、例えば癌組織試料、癌組織試料から単離された癌細胞、又は癌細胞株の細胞であってもよい。癌組織試料を、癌患者からの外科的に切除した標本から得ることができる。かかる癌組織試料はＴＡＭを含む可能性がある。
【００３３】
また、試験細胞がない状態で、癌組織試料を用いてスクリーニング方法を行うことができる。癌組織試料を、試験化合物と接触させてもよい。その後、ＴＡＭを癌組織試料から単離し、ＴＡＭ中のＨｏｍ−１、Ｍ１遺伝子、又はＭ２遺伝子の発現レベルを特定することができる。代替的には又は追加して、組織試料中のＨｏｍ−１の発現レベルを特定することができる。試験化合物は、対照と比較して、該試験化合物が（ｉ）Ｈｏｍ−１若しくはＭ１遺伝子の発現レベルを増加させる、（ｉｉ）Ｈｏｍ−１若しくはＭ１遺伝子の発現レベルの著しい減少を阻害する、及び／又は（ｉｉｉ）Ｍ２遺伝子の発現レベルを減少させる場合、癌の治療に対する候補化合物である。対照と比較して、癌組織試料を阻害する（例えば、試料のサイズを減少させる）試験化合物もまた、癌の治療のための候補化合物と見なされる。
【００３４】
スクリーニングされる試験化合物（例えばタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプトイド、抗体、ＲＮＡｉ、低分子、又は他の薬物）は、当該技術分野において知られている方法を使用して得ることができる。
【００３５】
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、Ｈｏｍ−１、Ｍ１遺伝子、又はＭ２遺伝子の発現レベルを、ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルのいずれかで特定することができる。また、プロモーター活性も測定することができる。ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、及びプロモーター活性を測定する方法は、当該技術分野でよく知られている。
【００３６】
上に記載されるいずれのスクリーニング方法においても、試験細胞は、マクロファージであってもよく、又は単球であってもよい。マクロファージは、Ｍ１マクロファージ、Ｍ２マクロファージ、腫瘍関連マクロファージ、組織マクロファージ、又は単球に由来するマクロファージであってもよい。また、試験細胞は単球であってもよい。
【００３７】
以下の特定の実施例は単なる例示と解釈され、それ以外の開示を何ら限定するものではない。更に詳述しなくても、当業者であれば本明細書における説明に基づき、最大限に本開示を使用することができると思われる。本明細書に引用した全ての刊行物の全体は引用することにより本明細書の一部をなす。
【実施例】
【００３８】
本発明者らは、ヒトマクロファージの機能極性化（functional polarization）における、ヒトホメオボックスタンパク質であるＨｏｍ−１の役割を同定する。本発明者らは、Ｈｏｍ−１がヒトマクロファージのＭ１活性化を促進し、それに必要であるが、Ｍ２活性化に関与する決定的な遺伝子の発現には必要ではないことを見出した。
【００３９】
癌から単離した初代ＴＡＭを使用して、本発明者らは、正常な対照組織から単離したマクロファージと比較してＴＡＭにおいてＨｏｍ−１発現が著しく減少されることを見出した。本発明者らは、ＴＡＭにおけるＨｏｍ−１の発現プロファイルがＴＡＭ表現型と相関することを示した。さらに、Ｈｏｍ−１の異所性発現はＴＡＭをＭ１様表現型へと変換した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏのデータはいずれも、Ｈｏｍ−１がＴＡＭに殺腫瘍活性を与えることを示した。総合すれば、本発明者らの研究は、Ｈｏｍ−１がＴＡＭを殺腫瘍細胞に変換することを実証した。本発明者らは、Ｈｏｍ−１発現ＴＡＭ（Ｍ１表現型を示す）が様々な癌の成長に対して強力な阻害作用を発揮したことを示し、癌の治療における新たな治療法（modality）としてのＨｏｍ−１調節ＴＡＭの役割を示唆した。
【００４０】
Ｈｏｍ−１発現はＴＡＭにおいて減少した
進行した腫瘍では、ＴＡＭは腫瘍促進Ｍ２様表現型を示す。Bronte and Murray (2015), Nat Med 21, 117-119を参照されたい。ＴＡＭの可塑性は十分理解されており、様々なサイトカインがＭ２表現型へのＴＡＭの極性化に関係があるとされている。Noy and Pollard (2014), Immunity 41, 49-61を参照されたい。比較すると、ＴＡＭ極性化を制御する転写機構は、依然としてほとんどわかっていない。
【００４１】
以下に記載されるように、結腸癌の切除により廃棄された外科的標本を使用して、腫瘍組織からＴＡＭを単離し、また腫瘍部位から１５ｃｍ離れた正常な粘膜からマクロファージを単離した。以前に注目されたように、ＦＡＣＳ分析は、正常な対照粘膜から単離したマクロファージと比較して、ＴＡＭが、著しく高レベルのＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６等のＭ２表現型と関連する細胞表面マーカーを発現したことを示した。Zhang et al. (2013), Eur J Cancer 49, 3320-3334を参照されたい。本発明者らは、ＴＡＭ及び対照マクロファージにおいて、非識別（non-discriminating）マクロファージマーカーＣＤ３３の発現に有意差がないことを見出した。
【００４２】
Ｈｏｍ−１がＴＡＭにおいて役割を果たし得るかどうか判断するため、本発明者らは、ｑＲＴ−ＰＣＲによってＴＡＭ中のＨｏｍ−１発現を定量し、対照マクロファージにおけるその発現と比較して、Ｈｏｍ−１の発現がＴＡＭでは著しく減少されることを見出した。
【００４３】
ＶｅｎｔＸは、ＴＡＭ可塑性を調節し、Ｍ１表現型へとＴＡＭを極性化した
従来の研究は、ＬＰＳによってＴＡＭを誘導してＭ１表現型を示すことができることを示した。Zhang et al.を参照されたい。Ｈｏｍ−１がＴＡＭ可塑性に役割を果たすかどうか判断するために、本発明者らはＬＰＳに曝露されたＴＡＭにおけるＨｏｍ−１の発現を調べた。本発明者らは、ＬＰＳで刺激された後に、ＴＡＭにおいてＨｏｍ−１発現が著しく上昇されたことを見出した。Ｈｏｍ−１の高発現と並行し、以前の知見と一致して、ＴＡＭのＬＰＳ刺激は、炎症性サイトカイン及び細胞毒性ｉＮＯｓの分泌の増加をもたらした。
【００４４】
Ｈｏｍ−１がＴＡＭ可塑性の調節的な役割を果たすかどうか判断するため、本発明者らは、ＴＡＭ表現型に対するＨｏｍ−１ノックダウンの効果を検討した。抗Ｈｏｍ−１モルフォリノ（ＭＯ）によるＴＡＭの処理は、Ｈｏｍ−１発現のおよそ８０％の減少をもたらした。ＴＡＭ可塑性の重要な調節（key regulatory）というＨｏｍ−１の役割と一致して、本発明者らは、Ｈｏｍ−１  ＭＯが、ＴＡＭにおける炎症性サイトカイン及び細胞毒性ｉＮＯｓのＬＰＳ誘導性分泌を中断することを見出した。ＣＤ２０６は、マンノース受容体、及びＴＡＭにおいて高発現されるＭ２細胞表面マーカーである。ＴＡＭの可塑性を反映して、ＬＰＳへのＴＡＭの曝露は、ＣＤ６８＋ＣＤ２０６＋集団の著しい減少、及びＣＤ６８＋ＣＤ２０６−の細胞数の増加をもたらした。Ｈｏｍ−１  ＭＯは、ＴＡＭに対するＬＰＳの両方の効果を消失させた（ｐ＜０．０１）。
【００４５】
Ｈｏｍ−１発現レベルとＴＡＭ表現型との相関は、Ｈｏｍ−１がＴＡＭ可塑性を制御するという考えを更に探索するよう本発明者らを促した。ＴＡＭを単離し、ＧＰＦ−Ｈｏｍ−１又は対照ＧＦＰをコードするプラスミドでトランスフェクトした。対照ＧＦＰでトランスフェクトしたＴＡＭと比較して、ＧＦＰ−Ｈｏｍ−１でトランスフェクトしたＴＡＭは、細長い／線維芽細胞様の細胞形状を有する特徴的なＭ１形態を示した。ＦＡＣＳ分析は、Ｍ１マーカーであるＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の表面発現が、ＧＦＰ−Ｈｏｍ−１でトランスフェクトしたＴＡＭでは著しく増加されたことを示した。さらに、ＧＦＰ−Ｈｏｍ−１でトランスフェクトしたＴＡＭでは、炎症促進性サイトカインであるＴＮＦα、ＩＬ−１β、及びＩＬ−１２の分泌が著しく増加されたのに対し、Ｍ２サイトカインであるＩＬ−１０の分泌は著しく減少された。一貫して、遺伝子発現解析は、ＧＦＰ−Ｈｏｍ−１でトランスフェクトしたＴＡＭにおいてＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びｉＮＯｓ等のＭ１遺伝子が著しく増加したのに対し、ＧＦＰ−Ｈｏｍ−１でトランスフェクトしたＴＡＭにおいてＣＣＬ１８、ＭＭＰ９、ＶＥＧＦＡ、及びＡｒｇ１等のＭ２遺伝子は著しく減少したことを示した。総合すれば、本発明者らのデータは、Ｈｏｍ−１がＴＡＭ可塑性を調節し、ＴＡＭのＭ１極性化を促進したことを示唆した。
【００４６】
Ｈｏｍ−１はＴＡＭを腫瘍抑制細胞に変換した
Ｈｏｍ−１がＴＡＭのＭ１極性化を促進するという本発明者らの知見は、Ｈｏｍ−１改変ＴＡＭが腫瘍抑制を発揮し得るかどうかを探索するよう本発明者らを促した。結腸癌から新たに単離したＴＡＭをＧＰＦ−Ｈｏｍ−１又は対照ＧＦＰをコードするプラスミドでトランスフェクトした。その後、トランズウェル培養系を使用して、同じ患者の腫瘍又は正常組織と共に改変ＴＡＭを共培養した。注目すべきことに、７日間〜１０日間の共培養の後、ＧＦＰ−Ｈｏｍ−１改変ＴＡＭと共にインキュベートする間、腫瘍容積は著しく減少（およそ７０％）したのに対し（ｐ＜０．０１）、ＧＦＰトランスフェクトＴＡＭ又はＴＡＭ単独と共にインキュベートした腫瘍においてサイズの著しい変化はなかった。腫瘍容積の縮小が、癌細胞の減少と関連したかどうか判断するため、本発明者らは組織切片作製、Ｈ＆Ｅ染色、及び結腸癌細胞のＣＫ２０抗体による免疫組織化学検査を行った。本発明者らは、ＴＡＭ又はＧＦＰ改変ＴＡＭと共にインキュベートした腫瘍の胞巣（nests）、コード及びシートにおいてＣＫ２０陽性腫瘍細胞が出現したことを見出した。しかしながら、ＣＫ２０陽性腫瘍細胞は、ＧＦＰ−Ｈｏｍ−１でトランスフェクトしたＴＡＭと共にインキュベーションする間に消滅した。ＧＦＰ又はＧＦＰ−Ｈｏｍ−１のいずれかでトランスフェクトされたＴＡＭと共にインキュベーションする間、Ｈｏｍ−１改変ＴＡＭは正常な結腸粘膜の容積及び形態に対して最小の影響を及ぼしたという知見により、Ｈｏｍ−１改変ＴＡＭの殺腫瘍効果の特異性が実証された。
【００４７】
Ｈｏｍ−１はｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＡＭの殺腫瘍機能を促進する
Ｈｏｍ−１がＴＡＭをｉｎ  ｖｉｔｒｏで殺腫瘍細胞に変換したという本発明者らの知見は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍形成におけるＨｏｍ−１調節ＴＡＭの可能性のある役割をするよう本発明者らを促した。結腸癌をおよそ０．５ｃｍ片に切り、ＮＳＧマウスの腹側の皮下空間に外科的に播種した。１週間後、ＭＯ−Ｈｏｍ−１トランスフェクトＴＡＭ（Ｈｏｍ−１阻害）又はＧＦＰ−Ｈｏｍ−１トランスフェクトＴＡＭ（Ｈｏｍ−１発現）を、マウス尾静脈より注入した。異種移植の８週間後、ＭＯ−Ｈｏｍ−１トランスフェクトＴＡＭを注入したマウスでは腫瘍が発生したが、ＧＦＰ−Ｈｏｍ−１トランスフェクトＴＡＭを注入したマウスでは腫瘍は発生しなかった。
【００４８】
また、本発明者らは、Ｍ１分化培地においてＴＡＭ又は単球を培養することにより、それらがＭ１表現型を示すように誘導することができることを見出した。これらのＭ１分化ＴＡＭ／単球をＮＳＧマウスへ注入し、ｉｎ  ｖｉｖｏで癌の成長を阻害することができる。腫瘍成長に対するＭ１分化ＴＡＭの効果は、これらのＴＡＭ又は単球におけるＨｏｍ−１発現の阻害によって消失される。
【００４９】
様々な種類の癌に対するＴＡＭにおけるＨｏｍ−１の異所性発現の効果
ＴＡＭは、本質的に全ての腫瘍の発癌に関係するとされてきた。結腸癌細胞におけるＴＡＭに関する研究に続いて、本発明者らは、他の種類の腫瘍まで調査を広げた。
【００５０】
肺癌、黒色腫、食道癌、胃癌、及び膵臓癌の外科標本を得て、上に記載されるようにＴＡＭを単離した。同じ患者の対応する正常組織からマクロファージを得た。ＴＡＭ及び組織マクロファージにおけるＨｏｍ−１発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して定量した。これら全ての腫瘍のＴＡＭにおけるＨｏｍ−１発現は、離れた正常組織に由来する対応するマクロファージにおけるＨｏｍ−１発現と比較して低かった。
【００５１】
Ｈｏｍ−１がこれらのＴＡＭを殺腫瘍細胞へと変換することができたかどうかを判断するため、ＧＦＰ又はＧＦＰ−Ｈｏｍ−１をＴＡＭにトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ＧＦＰ陽性細胞を選別し、個々の腫瘍と共に共培養した。全ての腫瘍の腫瘍容積は、ＧＦＰ−Ｈｏｍ−１トランスフェクトＴＡＭと共培養する間に減少したが、対照ＧＦＰトランスフェクトＴＡＭと共培養した場合は減少しなかった。本発明者らの結果は、腫瘍タイプとは無関係に、Ｈｏｍ−１がＴＡＭを殺腫瘍細胞に変換することができたことを示唆した。
【００５２】
結腸組織試料の収集
病理検査室において、患者に由来する外科的に切除された標本から癌組織及び正常組織を得た。およそ５グラム〜１０グラムの組織を各腫瘤、又は腫瘤から１５ｃｍ離れた正常な粘膜から収集した。また、患者の血液試料も収集した。
【００５３】
上皮内リンパ球の調製
以前に記載された技術（Kamada N, et al, 2008; Pignata C, et al, 1990）を修正して使用し、固有層単核細胞（ＬＰＭＣ）を単離した。簡潔には、解剖した新鮮な粘膜及び腫瘤を、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）（Sigma- Aldrich）を含む、Ｃａ２＋フリー及びＭｇ２＋フリーのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（life technologies）にて１０ｃｍのペトリ皿内で濯いで、粘液を除去した。粘膜及び腫瘍をカミソリ刀によって０．５ｃｍ片に切り、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Sigma-Aldrich）を含む５ｍＬのＨＢＳＳと共に、６ウェルプレートにおいて３７℃で１時間インキュベートした後、グレーメッシュ（gray-mesh）（１００ミクロン）に通した。通過画分は、上皮内リンパ球及び上皮細胞を含み、フローサイトメーターによる分析であった。
【００５４】
腫瘤及び正常粘膜からのマクロファージの単離
その後、２％ＦＢＳ、１．５ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＤ（Roche）、０．１ｍｇ／ｍＬ  Ｄｎａｓｅ  Ｉを含むＨＢＳＳ（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含む）において、３７℃で１時間に亘り、粘膜及び腫瘍をインキュベートした。グレーメッシュ（７０ミクロン）フィルターに消化した組織を通した。通過画分を収集し、４０％パーコール溶液（Pharmacia）に再懸濁した後、６０％パーコール上に積層し、２０００ｒｐｍにて中断せずに（without brake）３０分間遠心分離を行った。界面のＬＰＭＣを収集した。製造業者の指示書に従い、ＣＤ１６を枯渇させずに、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒト単球／マクロファージ濃縮キット（StemCell Technologies）を使用して、ＬＰＭＣから正常粘膜マクロファージ及びＴＡＭを精製した。これらの技術によって単離した細胞は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色により常に９８％超が生存可能であった。腸マクロファージの純度は９５％超であった。
【００５５】
末梢血からのマクロファージの調製
ブリガム＆ウィメンズ病院において、健康な成人ドナーに由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコール密度勾配遠心分離によって単離した。製造業者の指示書に従い、ＣＤ１６を枯渇させずに、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒト単球濃縮キットを使用して、ＰＢＭＣからヒト単球を精製した。精製した細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ（PeproTech）を含む完全ＲＰＭＩ培地で培養した。濃縮後、単球をＭ−ＣＳＦを含む完全ＲＰＭＩ培地で５日間培養し、細胞を共培養系に使用した。
【００５６】
ＦＡＣＳ分析
蛍光染料複合化抗体で細胞を免疫標識した後、フローサイトメトリーを使用して、ＴＡＭ及び他のリンパ球の表現型の分析を行った。以下の抗体、すなわちＰＥ複合化された抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ２５（ＢＣ９６）、抗ＣＤ１４（６１Ｄ３）、抗ＣＤ６８（ｅＢｉｏ  Ｙ１８２Ａ）、抗ＣＤ１６３（ｅＢｉｏ  ＧＨ１６１）、抗ＣＤ２０６、ＦＩＴＣ複合化された抗ＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ３３（ＨＩＭ３−４）、ＡＰＣ複合化された抗ＣＤ８（ＯＫＴ８）、抗ＣＤ４（ＯＫＴ４）（eBioscience, Inc）を使用した。製造業者によって提供されるプロトコルに従い、ＰＥ複合化抗体を用いて、Ｆｏｘｐ３（２３６Ａ／Ｅ７）、ＩＦＮ−γ、パーフォリン及びグランザイムＢの細胞内の染色を行った。アイソトープ対照標識化を並行して行った。供給元により推奨される通りに抗体を希釈した。標識化細胞をＣｅｌｌ−Ｑｕｅｓｔソフトウェア（BD Biosciences）を備えるＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって分析した。結果を陽性細胞のパーセンテージとして表す。
【００５７】
腫瘍及びマクロファージの器官型共培養
トランズウェルインサート（孔径０．４μｍ、Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）を１２ウェルのポリスチレン組織培養プレート（ニュージャージー州フランクリンレイクスのBecton Dickinson）に入れた。粘膜及び腫瘤を計量し、抗生物質を加えた１×ＰＢＳバッファーで洗浄した後、０．５ｃｍ片に切った。およそ５０ｍｇの組織を１２ウェルのトランズウェルの上部コンパートメントに蒔き、０．５ｍＬのＲＰＭＩ  １６４０完全培地で満たした。５×１０５個のＴＡＭを５０万細胞／ウェルの密度で、直接の細胞−組織の接触をせずに、下部コンパートメントに添加し、２ｍＬのＰＲＭＩ完全培地で満たした。そのプレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。０．５ｍＬの培養培地をサイトカイン分析のため収集し、新たな培地を３日毎に添加した。２週間の共培養の後、下部チャンバーのマクロファージを収集し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ambion）により全ＲＮＡを単離した。腫瘍及び正常粘膜をカリパスにより１週間に２回モニターし、（長さ×幅２）／２の式に従って、腫瘍容積を計算した。Ｌｅｉｃａ  ＥＺ４Ｄ実体顕微鏡上の３メガピクセルＣＭＯＳカメラ、又はｉＰｈｏｎｅ（登録商標）のデジタルカメラにより、組織の写真を撮影した。
【００５８】
免疫組織化学検査
腫瘍又は正常組織をホルマリン（ミシガン州カラマズーのFisher Scientific Company）中で固定した。ＣＫ２０染色（カリフォルニア州カーピンテリアのDako、クローンＫｓ２０．８、１：５０）及びヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。オンラインでＥｐｉｔｏｐｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ２を２０分間使用し、またＢｏｎｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｒｅｆｉｎｅ検出キットを使用して、Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｅ  ＩＩＩ染色プラットフォーム上でＣＫ２０染色を行った。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ蛍光顕微鏡により、顕微鏡分析を行った。ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ画像処理ソフトウェア（Nikon）を適用するカラーカメラを使用して、４０倍のオリジナル倍率で画像を取り込んだ。代表的な画像に対する明るさ及びコントラストを群間で均等に調整した。
【００５９】
Ｈｏｍ−１過剰発現
製造業者のプロトコルに従い、リポフェクタミン２０００（Life technologies）により、ＧＦＰ−Ｈｏｍ−１の血液マクロファージ及びＴＡＭへのトランスフェクションを行った。トランスフェクションの４８時間後、細胞選別用の７０μｍフィルターによって細胞を濾過した。ＧＦＰ陽性細胞を、無菌条件でＢａｋｅｒ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｈｏｏｄのもと、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩによって選別した。選別の後、細胞をＲＰＭＩ  １６４０完全培地中で培養した。
【００６０】
Ｈｏｍ−１ノックダウン
製造業者の指示書に従い、ヒト単球Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（メリーランド州ウォーカーズヴィルのLonza）を使用して、結腸ＴＡＭ又はヒト初代単球を、モルフォリノ（ＭＯ）アンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。簡潔には、５×１０６個の細胞を、２．５ｎｍｏｌのＨｏｍ−１  ＭＯオリゴヌクレオチド又は標準対照ＭＯオリゴヌクレオチドのいずれかを含む１００μｌのｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液に再懸濁し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ装置（Lonza）により電気穿孔を行った。その後、細胞を装置から直ちに出し、２ｍＭグルタミン及び１０％ＦＢＳを含む、予め温めた１ｍｌのヒト単球Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ培地と共に一晩インキュベートした。その後、細胞を完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁し、適切なサイトカインで処理して、マクロファージへの分化を誘導した。いずれのＭＯオリゴヌクレオチドも、Gene Tools（オレゴン州フィロマス）に注文した。
【００６１】
サイトカイン測定
eBiosciencesから得たＥＬＩＳＡキットを使用して、Ｅ．コリ（E.coli）ＬＰＳ（Sigma-Aldrich）処理した血液マクロファージ又はＬＰＳ処理したＴＡＭの上清中のＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−１２ｐ７０のレベルを定量した。分析を製造業者の指示書に従って行った。
【００６２】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬によって単離し、ＲＮＡ量をＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００（Thermo Scientific）によって測定した。製造業者のプロトコルに従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩファーストストランド合成システム（Life Technologies）により、等量のＲＮＡをファーストストランドｃＤＮＡ合成に使用した。従来のＰＣＲによりＨｏｍ−１  ｃＤＮＡを増幅するため、本発明者らは、製造業者の指示書に従ってＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼシステム（Life Technologies）を使用した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色した。ＧＡＰＤＨを内部対照として使用した。本発明者らは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（４８０  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ；Roche）上でＳＹＢＲグリーンを用いて、Ｈｏｍ−１及び他の遺伝子ｃＤＮＡの定量的測定を行った。その後、比較Ｃｔ法（ＤＤＣＴ方法）を使用して、ｍＲＮＡの相対的な発現プロファイルを計算した。
【００６３】
アルギナーゼ活性及びＮＯアッセイ
ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍアルギナーゼアッセイキット（ＤＡＲＧ−２００；BioAssays Systems）を使用して尿素の産生を測定することにより、細胞溶解物中のアルギナーゼ活性を定量した。培養上清中の亜硝酸塩濃度を、グリース（Griess）試薬キット（Molecular Probes）を使用して特定した。
【００６４】
統計学的分析
スチューデントの検定を統計分析に使用した。
【００６５】
その他の実施形態
本明細書に開示される全ての特徴は、あらゆる組み合わせで組み合わされてよい。本明細書に開示される各々の特徴は、同じ目的、同等の目的又は同様の目的にかなう代替となる特徴によって置き換えられてよい。このように、特に明示的に述べられない限り、開示される各々の特徴は、包括的な一連の同等の特徴又は同様の特徴のうちの単なる一例である。
【００６６】
上記詳細な説明から、当業者であれば、記載される実施形態の本質的な特性を容易に特定することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な使用法及び条件に適合するために上記実施形態の様々な変更及び修正を行うことができる。このように、その他の実施形態も特許請求の範囲内である。
【配列表】
2018534305000001.app
【国際調査報告】
2018534305.tif 000002
2018534305.tif 000003
2018534305.tif 000004