(57)【要約】  遺伝子活性化フィブリル組成物、及び少なくとも１つの対象のポリペプチドをコードすることができる当該組成物の設計、作製、製造、及び／又は形成の方法、工程、装置を本明細書で説明する。対象の少なくとも１つのポリペプチドのレベルを増大させることにより、遺伝子活性化フィブリル組成物を対象者に投与することにより、当該対象者における疾病、疾患、及び／又は症状を治療する方法も開示する。  【選択図】図５
2018521084.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類の細胞の付着及び配置を可能とする少なくとも１つの配向したフィブリル材を具える組成物であって、前記フィブリル材は、前記フィブリル材に付着した細胞の遺伝子発現を調節する核酸ベースの分子を具えることを特徴とする組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記核酸ベースの分子は、前記フィブリル材に付着した細胞の遺伝子導入を可能とする核酸ベクターであることを特徴とする組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、前記フィブリル材は、液晶材料を形成する自己組織化ポリペプチド、フィブリルポリペプチド、フィブリルコラーゲン、フィブリン、フィブロネクチン、ラミニン、シルク、ポリ‐Ｌ‐乳酸、ポリグリコール酸、エラスティン様ポリペプチド、ポリ（炭酸プロピレン）、キトサン、それらの誘導体、又はそれらの組み合わせの群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物であって、前記フィブリル材は、調節可能な分解速度を伴う生体適合性及び生分解性材料であることを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物であって、前記組成物は医療装置を更に具えることを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物であって、前記核酸は、ｐＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｓＲＮＡ、ｐＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アンチセンス、触媒ＲＮＡ、及びそれらの誘導体の群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物であって、核酸は、ポリマーナノ構造のカチオン性領域、又は、前記核酸と静電複合体を形成するカチオン性脂質及び／又はカチオン性ポリマーにより少なくとも部分的にカプセル化されることを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項２に記載の組成物であって、化学的遺伝子導入法は静電相互作用に依存して、核酸を結合し、リン酸カルシウム、ポリカチオン、リポソーム、並びにカチオン性脂質、ポリマー、デンドリマー、ナノ粒子、ポリエチレンイミン、及びポリリジン等の化合物を用いる細胞膜を標的にすることを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の組成物であって、前記核酸又は核酸ベースの化合物は、肝細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞、心細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、膵ベータ細胞、下垂体細胞、滑膜ライニング細胞、卵巣細胞、精巣細胞、繊維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、及び腫瘍細胞からなる群から選択される細胞の遺伝子発現を調節することを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物であって、核酸ベースの分子は、アライメントシステムを用いて、注入により前記フィブリル材に担持されることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物であって、前記フィブリル材は、ポリ（エチレングリコール）、炭水化物、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、単糖、多糖、又はそれらの組み合わせを更に具えることを特徴とする組成物。
【請求項１２】
請求項２に記載の組成物であって、前記配向したフィブリル材に付着した前記細胞への遺伝子導入は、組織培養用プラスチックに付着した同一の細胞への遺伝子導入よりも少なくとも６０％多いことを特徴とする組成物。
【請求項１３】
糸状のフィブリルスキャフォールドを形成する組成物であって、前記フィブリルは、前記フィブリルが少なくとも１種類の細胞の付着及び配置を可能とするように、糸の方向に配向され、前記スキャフォールドは、前記フィブリルに付着した前記細胞の遺伝子発現を調節する核酸ベースの分子を具えることを特徴とする組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組成物であって、前記糸状のスキャフォールドは、少なくとも８０％が互いにつながった細孔を伴う多孔性を有し、前記スキャフォールドに沿ったキャピラリーフローを可能とし、前記スキャフォールドは少なくとも５０ミクロンの直径、及び前記糸の方向に少なくとも２０ＭＰａの機械的強度を有することを特徴とする組成物。
【請求項１５】
請求項１３に記載の組成物であって、前記スキャフォールドは、４週間から１年にわたる、架橋のレベルに応じた調節可能な分解を伴う生体適合性及び生分解性インプラントであることを特徴とする組成物。
【請求項１６】
請求項１３に記載の組成物であって、前記スキャフォールドは、ＥＤＣ／ｓＮＨＳにより架橋された、配向した糸状のコラーゲンスキャフォールドであることを特徴とする組成物。
【請求項１７】
棒状のフィブリルマイクロキャリアを形成する組成物であって、前記フィブリルは、前記フィブリルが少なくとも１種類の細胞の付着及び配置を可能とするように、棒の方向に配向され、前記マイクロキャリアは、前記フィブリルに付着した前記細胞の遺伝子発現を調節する核酸ベースの分子を具えることを特徴とする組成物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の組成物であって、前記棒状のマイクロキャリアは、少なくとも８０％が互いにつながった細孔を伴う多孔性を有し、前記マイクロキャリアに沿ったキャピラリーフローを可能とし、前記マイクロキャリアは少なくとも１０ミクロンの直径、及び前記棒の方向に少なくとも２０ＭＰａの機械的強度を有することを特徴とする組成物。
【請求項１９】
請求項１７に記載の組成物であって、前記マイクロキャリアは、４週間から１年にわたる、架橋のレベルに応じた調節可能な分解を伴う生体適合性及び生分解性インプラントであって、マイクロキャリアの水性の懸濁液が、注入可能な生体適合性及び生分解性スキャフォールドを形成することを特徴とする組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の組成物であって、前記マイクロキャリアは、ＥＤＣ／ｓＮＨＳにより架橋された、配向した棒状のコラーゲンスキャフォールドであることを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本願は、２０１５年７月２４日に出願され、「核酸ベースの治療法の標的送達の組成物」と題された、米国仮特許出願第６２／１９６，６３４号の利益及び優先権を主張し、その全体の開示が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、遺伝子活性化フィブリル組成物、及び単一のシステム内で遺伝子治療と組織工学との組み合わせを用いて臨床症状を治療する方法に関する。遺伝子活性化フィブリル組成物、及び少なくとも１つの対象のポリペプチドをコードすることができる当該組成物の設計、作製、製造、及び／又は形成の方法、工程、装置を本明細書で説明する。本発明はまた、少なくとも１つの対象のポリぺプチドのレベルを増大させることにより、遺伝子活性化フィブリル組成物を対象者に投与することにより、当該対象者における疾病、疾患、及び／又は症状を治療する方法も提供する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子物質の特定部位への送達は、組織の成長及び維持のためにシグナル及び合図を細胞に空間的及び経時的に導入するため、ナノメートルスケールで制御された組織を有するスキャフォールドへの核酸ベクター（例えば、ＨＧＦ−ｍＲＮＡ−及びＨＧＦ−ｐＤＮＡ）の組み込みは、細胞と細胞外環境との相互作用を強める可能性が大きい。従って、治療用ベクターは、組織構成物の組み込み、及び周辺の組織でその成長及び同化を強化することができる。また、ベクターの送達に用いられるナノフィブリルマトリックス、特にコラーゲンマトリックスは、標的キャリア及びベクター錯化剤だけでなく、組織工学に適用して構造的スキャフォールドとしても機能することができる。単一のシステム内での遺伝子治療と組織工学とのこの組み合わせは、再生医療に関する新たなより包括的なアプローチを可能とする。遺伝子活性化マトリックスを用いる局所的遺伝子送達システムは、これらの２つのストラテジーを統合し、治療用遺伝子の発現を伴うｉｎ  ｖｉｖｏの局所的バイオリアクターの役割を果たして、構造テンプレートを提供して、細胞外マトリックスの細胞接着、増殖、及び合成に関する病変的な欠陥を補う。
【０００４】
核酸ベースの治療法を開発するのに、ほぼ２０年間、大きな試みが行われてきた。しかし、この核酸ベースの治療法の臨床応用は、低効率、オフターゲット効果、毒性、及び非効率的な送達により妨げされてきた。これらの制限は、ここで提案される標的型送達システム、及び修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）ベクターの高い導入効率に劣っていた。提案される組成物の導入効率を上げる更なる要因は、ベクターの細胞内への侵入を促進する送達マトリックスの能力であろう。従って、配向したフィブリル基質は、固体の状態で遺伝子導入することができる。
【０００５】
核酸は、一般的に細胞膜を透過しないように負電荷を帯びた分子である［Ａｋｈｔａｒ，ｅｔａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．２００７，５９，（２−３），１６４−１８２］。ネイキッド核酸とアニオン性細胞膜表面との間の静電反発力は、エンドサイトーシスを防ぎ得る［Ａｋｈｔａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．２００７，５９，（２−３），１６４−１８２］。従って、選択性送達システムは、核酸の効率的輸送、及び標的細胞内でのそれらの放出に必要である。最もよく用いられる遺伝子送達システムは、生物学的（ウィルス性）及び非生物学的（非ウィルス性）システムに分類することができる。
【０００６】
生物学的キャリア及びウィルスは、核酸導入において効率性を有し、それを提供するが、製造が困難で、毒性である［Ｔｈｏｍａｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２００３，４，（５），３４６−３５８］。これらの制限は、核酸送達に対する非生物学的システム開発の優先度が高いままであることを意味する。非ウィルス性送達システムは、静電的相互作用により負電荷を帯びた核酸と相互作用する、ペプチド、脂質（リポソーム）、デンドリマー、及び正電荷を帯びた直鎖又は分岐状ポリマー［Ｄｕｎｃａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．２００６，１９２，（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉ），１−８］を含む［Ｅｌ−Ａｎｅｅｄ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２００４，９４，（１），１−１４］。非生物学的送達システムの中で、デンドリマーは、明確に定められた構造、サイズ、安定性、及び生体適合性を有するという利点がある［Ｄｕｎｃａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．２００５，５７（１５），２２１５−２２３７］。しかし、多段階の合成、その合成の各段階で時間や労力を要する精製、そして結果的にデンドリマー作製の高コスト化が、その適用を制限している。先行技術の医療用ポリマー合成方法は、段階成長縮重合プロトコルに依存し、そのプロトコルは、高い多分散性、自由機能性、トポロジー、及び組成を有する不明確なポリマーをもたらし得、核酸送達にふさわしくない。
【０００７】
従って、容易に製造され、そして、様々な臨床症状を治療するのに、核酸を標的生物学的位置に効率的に送達するのに用いることができる核酸送達システムが必要である。可能な解決法は、コラーゲンフィブリルのキャリア／スキャフォールドを用いた固体状態での遺伝子導入であり、そこでは正電荷を帯びたコラーゲンフィブリルが、スキャフォールドの表面に組み込まれた負電荷を帯びた核酸を補う。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の実施例は、遺伝子活性化フィブリル組成物、及び単一のシステム内で遺伝子治療と組織工学との組み合わせを用いて臨床症状を治療する方法を提供する。遺伝子活性化フィブリル組成物、及び少なくとも１つの対象のポリペプチドをコードすることができる当該組成物の設計、作製、製造、及び／又は形成の方法、工程、装置を本明細書で説明する。
【０００９】
本発明の実施例はまた、少なくとも１つの対象のポリぺプチドのレベルを増大させることにより、遺伝子活性化フィブリル組成物を対象者に投与することにより、当該対象者における疾病、疾患、及び／又は症状を治療する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を形成する添付図面は、本発明を図示し、更に、明細書の記載と共に本発明の原理を説明し、当業者が本発明を実施及び使用できるようにする。本発明の実施例は、以下の添付図面を参照して、一例としてのみ説明される。
【００１１】
【図１】図１は、配向したコラーゲンフィブリルの複数の超薄膜層間にカプセル化されたＨＧＦプラスミドを示す図である。
【００１２】
【図２】図２は、核酸が層間に局在化する多層構成物を形成するステップを示す図である。
【００１３】
【図３】図３は、核酸が層間に局在化する多層構成物を形成する代替ステップを示す図である。
【００１４】
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、それぞれＨＧＦベクターを担持したスキャフォールドの設計及び適用の概略図である。
【００１５】
【図５】図５は、アラインメントシステムを用いてスキャフォールドにベクターを搭載する方法の概略図である。
【００１６】
【図６】図６Ａ〜６Ｅは、糸状のコラーゲンスキャフォールド（「ＢｉｏＢｒｉｄｇｅ」ともいう）及び特性を示す写真である。
【００１７】
【図７】図７Ａは糸状のコラーゲンスキャフォールドの断面画像であって、図７Ｂは２つのレベルのスキャフォールド架橋に対する結果を示すグラフである。
【００１８】
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、糸状コラーゲンスキャフォールドの様々なキャピラリティの特性を示す。
【００１９】
【図９】図９Ａ及び９Ｂは、異なる架橋値でのＢｉｏＢｒｉｄｇｅのキャピラリティを示す。
【００２０】
【図１０】図１０は、湿潤状態のＢｉｏＢｒｉｄｇｅスキャフォールドの力‐変位曲線を示すグラフである。
【００２１】
【図１１】図１１Ａ及び１１Ｂは、コラゲナーゼによるＢｉｏＢｒｉｄｇｅの分解を示すグラフである。
【００２２】
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは、異なるレベルのＥＤＣ架橋での糸状のコラーゲンスキャフォールドからのｐＤＮＡの放出、及び凍結乾燥した非架橋の糸状のコラーゲンスキャフォールドからのｐＤＮＡの放出を示すグラフである。
【００２３】
【図１３】図１３Ａ及び１３Ｂは、様々な実施例に関する導入効率を示す。
【００２４】
【図１４】図１４は、細胞遊走アッセイの作製のステップを示す概略図である。
【００２５】
【図１５】図１５は、リンパ節切除及び放射線治療を含む癌手術後の乳癌関連      リンパ浮腫の予防の実施例に係る、ＢｉｏＢｒｉｄｇｅ又は他のスキャフォールドの使用を示す概略図である。
【００２６】
【図１６】図１６Ａ及び１６Ｂは、配向したコラーゲンスキャフォールドの表面及び培養組織用プラスチックに、ＨＧＦ−ｍＲＮＡが導入されたヒトの繊維芽細胞の写真である。
【００２７】
【図１７】図１７Ａ及び１７Ｂは、マイクロキャリアの断面、及び注入可能なマイクロキャリアを有するシリンジを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
近年、薬理学的及び再生使用のｍＲＮＡをベースとした技術の適用が検討されている。ｍＲＮＡをベースとした治療の既存及び提案の方法には、ガン免疫療法、律速又は欠陥内因性タンパク質が補足又は置換される転写置換療法、再生医療、及びゲノム編集が含まれている。再生医療におけるｍＲＮＡの有用な方法の範囲において、ｍＲＮＡをベースとした技術を用いて、体細胞（例えば、繊維芽細胞）の胚様細胞（ｉＰＳＣｓ）への良好なリプログラミングが実証されている。更に、ｍＲＮＡ、修飾されたｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）のより安定的で、翻訳可能で、免疫原生が低いアナログが開発され、治療用タンパク質を送達する際に、ｍｍＲＮＡの重要な臨床的可能性を示す機能タンパク質に翻訳される能力を発揮した。遺伝子導入及び発現に関して、ＤＮＡに対するｍＲＮＡの有利な点は、導入効率が高いこと、核局在化又は転写の必要がないこと、送達される配列のゲノムの組み込みの可能性が格段に小さいことである。
【００２９】
スキャフォールドを介した遺伝子送達は、遺伝子導入に対して重要な有利な点をもたらし、それは、移植部位の周辺細胞により主に取り込まれる治療用遺伝子の局所的送達、及び、持続した遺伝子導入を可能とするような、スキャフォールド材の分解速度により制御される放出速度によるスキャフォールドからの段階的なベクター放出を含む。スキャフォールドの別の有利な点は、ベクター保護における役割であり、それは、マトリックスに組み込まれるときにｉｎ  ｖｉｖｏで除去又は分解されにくくなるためである。スキャフォールドはまた、ｉｎ  ｓｉｔｕでの細胞のリクルートメントの生物活性剤、及び再生のプラットフォームとしても機能することができ、組織形成を開始できるテンプレート構造をもたらす。移植可能なポリマースキャフォールドは、スキャフォールド及びそのごく周りを含む３次元（３Ｄ）空間を画定し、細胞を移動させスキャフォールドに付着させて、ベクターをその空間内の細胞に送達する。送達部位の、スキャフォールドが放出されたベクターが導入された細胞は、局所的に作用して全身的に分布されるタンパク質生成物を分泌する。これに関連して、含浸ベクターを有するスキャフォールドは、必要であれば部位から除去できるため、標的型送達は少なくとも部分的に可逆的である。スキャフォールドは多層構造物として構成できるため、複数のベクターを所望の順番で送達することもできる。更に、スキャフォールドは、例えば、活性化Ｔ細胞又は特定の癌細胞等、１種類の細胞のみがスキャフォールドに結合できるよう、特定の細胞のリガンドを表面のみに有してもよい。従って、選択された種類の細胞のみを導入の対象としてもよい。
【００３０】
生来の状態に似せることがスキャフォールドの設計における主な原理であり、スキャフォールドで用いられる天然素材は、分解の間、ｉｎ  ｖｉｖｏの毒性が低く、移植について免疫反応が低く、適切な（細胞特異性の）細胞接着をもたらす。ＥＣＭの不可欠な要素であり、身体における主要な構造タンパク質であるコラーゲンは、組織工学で最も幅広く用いられる天然素材であり、創傷被覆、縫合、止血剤、代用皮膚、骨代用材、及び血管再生に用いられる。テロペプチドはコラーゲンの主要な抗原領域であるため、コラーゲンは、テロペプチド領域が除去された免疫原性が低いものを用いることが好ましい。この種のコラーゲン（アテロコラーゲン）をこの適用で用いることができる。コラーゲンベースの材料は、数時間から数か月の期間でプラスミドＤＮＡの放出を行った。例えば、筋肉内に投与されるコラーゲンミニペレットに組み込まれるＤＮＡにより誘発される全身作用は、直接的なＤＮＡ注入よりもかなり長かった。非ウィルス性又はウィルス性ＤＮＡのコラーゲンベースの送達は、骨、軟骨組織、神経再生のモデル、つまり創傷治癒及び筋肉修復に採用されている。これらすべての適用も、ここで対象とする。
【００３１】
３Ｄ空間全体のベクターの分布、及び３次元構造での導入は、２Ｄ導入と比べて、遺伝子発現レベルを増大及び長くし得る。更に、ナノファイバ基材の異方性は、これらの基材では細長い細胞形態と相関しており、レンチウィルス導入により、リプログラミングの効率を上げる［Ｄｏｗｎｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２，１１５４−１１６２（２０１３）］。従って、フィブリルに沿った細胞の配置を誘導する、異方性３Ｄ構造を有するコラーゲンナノフィブリルスキャフォールドは、遺伝子送達にとって良好な候補である。多くの刊行物において、ナノフィブリルコラーゲンスキャフォールドが、内皮細胞形態及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖をサポートし、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞生存を高めることが実証されている。ナノフィブリルスキャフォールドは、天然ＥＣＭが成長因子を保存及び放出するのと同様、ｐＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及び他の生理活性分子の「貯蔵所（ｄｅｐｏｔ）」として機能することができる。更に、スキャフォールドは、例えば、血管再生の仮のマトリックスを提供する。更に、近年のデータは、ナノファイバスキャフォールドが繊維症関連の遺伝子の発現を現象させることを実証した。１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−１−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ）によりコラーゲン  ｚｅｒｏ−ｌｅｎｇｔｈ架橋するという確立したストラテジーを、スキャフォールド製造で用いる。ＥＤＣアプローチは、スキャフォールドに添加材を加えず、スキャフォールドの物理的強度を変えず、ＥＤＣ架橋度を変えることにより、スキャフォールドの酵素分解を制御する手段を提供する。
【００３２】
定義  ここでは、我々は、交換可能な「フィブリル」及び「繊維」を用いる。我々は、「核酸」という語が「核酸アナログ」を含むと仮定する。装置の例は、軟組織修復装置、人工弁、ペースメーカ、パルス発生器、除細動器、動静脈シャント、及びステントを含む。例えば、スクリュー、アンカー、プレート、ステープル、タック、ジョイント、及び同様の装置等を含む医療装置の他の例が整形外科で用いられる。これらの植え込み型医療装置は、例えば、メタル、プラスチック、及び様々なポリマー材料を含む幅広い材料から作られる。他の矯正装置は、軟組織インプラント、臀部、肩、肘、及び膝の置換及び手術、又は頭蓋顎顔面再構築用のインプラント、及びインプラントコーティング等のインプラントを含み、関節鏡検査及び腹腔鏡検査の処置で用いられる装置も含む。医療装置の他の例は、眼内レンズ及び緑内障シャントを含む、インプラント等の視覚装置を含む。更に他の装置は、胃腸内埋め込み装置を含む。本発明の様々な実施形態の更なる詳細な説明を、以下の非限定的実施例で行う。
【００３３】
実施例１  架橋用の２つのＥＤＣ／ｓＮＨＳの濃度（１．０ｘ：１ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣ及び１．１ｍｇ／ｍｌ  ｓＮＨＳ、及び０．２ｘ：０．２ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＣ及び０．２２ｍｇ／ｍｌ  ｓＮＨＳ）を、配向したナノフィブリルコラーゲンスキャフォールドの架橋に用いることができる。１．０ｘ及び０．２ｘの架橋スキャフォールドは同様の引っ張り強さを示すが、実質的には異なる分解速度を示す。架橋スキャフォールドは、生体適合性に関して（例えば、ＢｉｏＢｒｉｄｇｅコラーゲンマトリックス、５１０Ｋデバイス  Ｋ１５１０８３）、後肢虚血モデルで動脈形成を促すことに関して（Ｎａｋａｙａｍａ  ＫＨ，Ｈｏｎｇ  Ｇ，Ｌｅｅ  ＪＣ，Ｐａｔｅｌ  Ｊ，Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｂ，Ｚａｉｔｓｅｖａ  ＴＳ，Ｐａｕｋｓｈｔｏ  ＭＶ，Ｄａｉ  Ｈ，Ｃｏｏｋｅ  ＪＰ，ＷＯＯ  ＹＪ，Ｈｕａｎｇ  ＮＦ．Ａｌｉｇｎｅｄ−Ｂｒａｉｄｅｄ  Ｎａｎｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｄｏｔｈｅｒｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ａｒｔｅｒｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．９（７）：６９００−８．２０１５）、良好に試験が行われた。ヒトＥＣは、パターン化されていないスキャフォールドよりも、配向したスキャフォールドからの増殖が多いことを示した。インテグリンα１の抑制により効果が阻害されたため、インテグリンα１は、配向したナノフィブリルスキャフォールドで細胞増殖が増強したことに部分的に関与する。ｉｎ  ｖｉｖｏでの新たな血管形成の改善において、ＥＣ播種の配向したナノフィブリルスキャフォールドの効力を試験するため、ＥＣ播種の配向したナノフィブリルスキャフォールド、ＥＣ播種のパターン化されていないスキャフォールド、生理食塩水中のＥＣ、配向したナノフィブリルスキャフォールドのみ、のいずれかでマウスの虚血肢を治療する、或いは治療なしとした。１４日後、レーザドップラー血液分光法は、生理食塩水中のＥＣでの治療又は治療なしと比べて、スキャフォールドのみで治療、及びＥＣ播種の配向したナノフィブリルスキャフォールドでの治療では血液還流の回復が大幅に向上したことを実証した。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ−ＥＣｓ）由来のヒトＥＣで播種されたスキャフォールドで虚血肢を治療した実験では、全身注入の単層カーボンナノチューブ蛍光を採用し、２８日後に近赤外線ＩＩ（ＮＩＲ−ＩＩ，１０００〜１７００ｎｍ）撮像を用いて小動脈を視覚化及び数値化した。ＮＩＲ−ＩＩ撮像は、ｉＰＳＣ−ＥＣ播種の配向したスキャフォールド群が、生理食塩水又は細胞群よりも微小血管密度がかなり高かったことを実証した。これらのデータは、細胞のみ又はスキャフォールドのみと比べて、配向したナノフィブリルスキャフォールドで送達されたＥＣからなる「デュアル」治療が、血液還流や動脈形成を高め、治療用細胞の送達ストラテジーの設計に重要な影響を与えることを示唆する。従って、ナノフィブリルの配向したスキャフォールドでの虚血肢の治療は、血液還流を高めることを実証し、ｍｍＲＮＡ−ＨＧＦの使用は、この効果を更に高めることとなる。
【００３４】
実施例２  血管新生に関する症状の治療及び／又は予防における、ＨＧＦプラスミドＤＮＡの導入効率を高める方法を提案する。ＨＧＦプラスミドは、配向したコラーゲンフィブリルの複数の超薄膜層間にカプセル化されることとなる。図１を参照。各層の厚さ及び分解を、それぞれ積層（層の厚さ）及び架橋により制御することができる。５０ｍｇ／ｍｌの濃縮ブタアテロコラーゲンタイプＩの溶液から精密なスロット色素コーターで製造される、配向したコラーゲン層の典型的な厚さは、１００ｎｍから２ミクロンの範囲で制御できる。プラスミド（ＨＧＦ  ｍＲＮＡ）の懸濁液又は溶液は、Ｓｏｎｏ−Ｔｅｋ社の精密噴射システムにより、コラーゲン層に均等に噴射されることとなる。複数の層の真空アタッチメントは、自発的なコラーゲン対コラーゲンの架橋をもたらし、それによりプラスミドをカプセル化する。コラーゲン層の厚さ（ナノメータからミクロンの範囲）、及びその積層前の架橋が、コラーゲン分解の速度、よってプラスミド又はＲＮＡの放出を制御することとなる。核酸が複数の層間で局所化された多層構造物を形成する他の方法は、図２及び図３で示す。
【００３５】
フィブリル材、例えばコラーゲンは、ＵＶ感受性マルチアームＰＥＧと低濃度で混合でき、蒸発により濃縮されて、液晶状態に到達する。我々は、以下のことを発見した。
１．一般的にＰＥＧ、特にマルチアームＰＥＧは、液晶状態に影響を及ぼさない。従って、全ての異なるパターン、特に、皮膚様パターン（ｓｋｉｎ−ｌｉｋｅ）、配向的パターン（ａｌｉｇｎｅｄ）、配向的で織り込まれたパターン（ａｌｉｇｎｅｄ−ｂｒａｉｄｅｄ）（米国特許８,４９２，３３２Ｂ２、８，２２７，５７４Ｂ２、及び８，５１３，３８２Ｂ２を参照）は、フィブリルコラーゲンを含む液晶材料から作ることができる。
２．材料堆積及びパターン形成の後、ＵＶ（例えば、マルチアームＰＥＧの反応基次第で、２５０ｎｍ）により、膜を乾燥状態で架橋することができる。
【００３６】
コラーゲン／ＰＥＧをポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）基材に堆積する場合、この層はＰＥＴ基材に架橋されることとなる。
【００３７】
ＵＶ架橋結合の間にＵＶマスクを用いる場合、架橋結合されていない水溶性コラーゲンを、（ｐＨが２〜６の範囲の）水のすすぎにより除去することができる。
【００３８】
パターン化した多層スタックを形成するため、堆積及び架橋の工程を繰り返すことができる。異なる核酸設計物を、架橋前に、層の間に堆積することができる。
【００３９】
コラーゲン／ＰＥＧを、例えばガラス基材などのＵＶにより架橋されない基材に塗布することができる。それから、各層を、架橋後に剥離することができる。或いは、多層スタックを形成するために、コラーゲン／ＰＥＧ層を架橋前に剥離することができる。図２及び図３を参照。ここでＱ−ガラスは、２５０ｎｍのＵＶ照射を透過する石英ガラスプレートである。「Ｃｏｌ．＋０．４ＰＥＧ」は、０．４重量％のＰＥＧと混合される分子コラーゲンを意味する。「基材上の０．２５ＥＤＣ」は、堆積した膜が基材（例えば、ＰＥＴ基材）に付着する間の特定のＥＤＣ架橋を意味する。ＥＤＣ架橋の後、コラーゲンを基材から剥離することができる（ＥＤＣは、コラーゲンとＰＥＴとの間の架橋をもたらさない）。「Ｍ−ＰＥＧ」は、ＵＶにより乾燥状態で架橋することができるマルチアームＰＥＧを意味する。
【００４０】
酸性ｐＨの分子アテロコラーゲンの液晶状態を変えない更なる材料は、ＥＤＣ／ＮＨＳである。コラーゲン／ＥＤＣ／ＮＨＳを堆積してｎａｎｏｗｅａｖｅ構造を形成した後、ｐｈを（例えば、アンモニア蒸気に）変えることにより、膜を架橋することができる。
【００４１】
配向したナノフィブリルコラーゲンスキャフォールドは、細胞の伸長及び移動を誘導して、移植後にスキャフォールドを定着させることとなる。このようにして、我々は、本来の生理環境に似せることができる。更に、我々は、適切な核酸を細胞に送達して、所望の成果、例えば再生を促進する。これが、コラーゲン架橋により見出された長期にわたる（４〜６週間から数か月）局所持続細胞発現の方法である。
【００４２】
実施例３  ＨＧＦベクターを担持したスキャフォールドの設計の図４Ａ及び適用の図４Ｂの概要。配向したコラーゲンの存在下で、繊維芽細胞、虚血領域にある又は引き付けられる局所的内皮細胞及び内皮前駆細胞は、スキャフォールドに付着し、ＨＧＦを産生し、毛細血管の形成を促すことができる。
【００４３】
ベクターをスキャフォールドに担持する方法は、図５に概略的に示されるアライメントシステムを用いる。糸状の多孔スキャフォールドを透明な管に挿入し、そこでクランプにより保持する。第２の小さい透明の管と最初の管とが並べられ、シリンジを第２の管に挿入する。このようにして、ベクターの溶液を、多孔性及び毛管現象を用いてスキャフォールドに正確に送達することができる。色素をベクター溶液（例えば、メチレンブルー）に添加すると、担持方法が簡単になる。凍結乾燥は、核酸がスキャフォールド表面に付着するのをより安定させる。単糖又は多糖をベクター溶液に添加すると、低温（−２℃以下）及び高真空（５０ｍＰａ以下）の凍結乾燥の間、核酸を保護する。提案した方法は、無菌状態及び手術室の環境の両方での使用に適している。
【００４４】
実施例４  我々は、米国特許第８，４９２，３３２Ｂ２号、第８，２２７，５７４Ｂ２号、及び第８，５１３，３８２Ｂ２号に開示された方法に係る、フィブリルコラーゲンからなるＢｉｏＢｒｉｄｇｅスキャフォールドを製造した。
【００４５】
ＢｉｏＢｒｉｄｇｅの特徴。本実施例で用いられる糸状のコラーゲンスキャフォールド（ＢｉｏＢｒｉｄｇｅ）の基本的特徴を図６に示す。ＢｉｏＢｒｉｄｇｅは、折り畳まれた超薄のコラーゲンリボンから形成され、リボンを形成する全ての薄いコラーゲンフィブリルが、スキャフォールドの方向に沿って配向されるようにする。
【００４６】
ＢｉｏＢｒｉｄｇｅスキャフォールドの多孔性。ＢｉｏＢｒｉｄｇｅスキャフォールドの断面画像を、高解像度の反射顕微鏡により撮影した。典型的な画像を図７Ａに示す。黒画素と断面の総面積との比をとることによる多孔率の値の標準ビットマップフィルタによって、画像を解析した。スキャフォールドの架橋の２つのレベル、１．０ｘ及び０．２ｘについて、結果を図７Ｂに示す。平均多孔性は、標準偏差を低く抑えて約８５％である。
【００４７】
ＢｉｏＢｒｉｄｇｅスキャフォールドのキャピラリティ。スキャフォールドのキャピラリティは、水平位置で二重スコッチテープに付着したＢｉｏＢｒｉｄｇｅの１３ｍｍ長の断片について測定した。図８Ａ及び８Ｂを参照。約０．１ｍＬの緑色の食品着色料の色素を各ＢｉｏＢｒｉｄｇｅ端部に担持させるのに、シリンジ及び２５Ｇの針を用いた。２分及び４分の時点を採用し、色素がそれぞれの断片に対してどれくらい遠く移動するか分析した。緑色の色素の管内伝搬を、乾燥コラーゲンの最初の白色をベースラインとする緑色の流れで測定した。ＢｉｏＢｒｉｄｇｅの断片の全距離に対する色素の伝搬距離の割合を、それぞれの実験について図９に示す。結果、標準偏差を低く抑えたＢｉｏＢｒｉｄｇｅの高いキャピラリティが示された。０．２ｘ架橋のＢｉｏＢｒｉｄｇｅは、１．０ｘ架橋のＢｉｏＢｒｉｄｇｅより若干高いキャピラリティを示し、それは多孔性測定と一致する。ＢｉｏＢｒｉｄｇｅの１３ｍｍの断片を通した常圧での色素伝搬は約４分かかる。
【００４８】
ＢｉｏＢｒｉｄｇｅデバイスは、薬物担持に適した高多孔性（約８５％）を有する。孔は互いにつながり、デバイスに沿ったキャピラリ―フローを可能とする。ＢｉｏＢｒｉｄｇｅの多孔構造（図６）は、ＨＧＦプラスミド（ＨＧＦ−ｐＤＮＡ）をスキャフォールドに担持させるのに用いることができるキャピラリ―の特性を具える。
【００４９】
ｐＤＮＡ担持を最適にするために、我々は、直径１００ｎｍ及び１μｍの蛍光性スフェアをモデルとして用いた。実際のプラスミドサイズは、２つの直径の間のどこかである。蛍光性ナノスフェア、及びミクロスフェアの溶液を０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で準備し、スフェアをキャピラリ―フローによりスキャフォールドに担持させた。担持時間は、両方のタイプの粒子で同一であった。蛍光顕微鏡Ｌｅｉｔｚ  ＤＭ  ＩＲＢにより粒子の存在が観測された（図８Ｃ）。
【００５０】
ＢｉｏＢｒｉｄｇｅの機械的特性。ＢｉｏＢｒｉｄｇｅスキャフォールドは、縦に崩れて糸状の構造を形成する、１ミクロン（１ｘ１０−６ｍ）の厚さの膜から作られる。全てのＢｉｏＢｒｉｄｇｅスキャフォールドの断面積は、２．５４ｘ１０−８ｍ２に等しい。以下の式に従って、応力を計算する。
応力（ＭＰａ）＝１０−６ｘ  力（Ｎ）／面積（ｍ２）
ＢｉｏＢｒｉｄｇｅの機械測定を、目盛引張試験機により湿潤状態で行った。典型的な応力−変位曲線を図１０に示す。従って、典型的な引っ張り強度は１００ｇＦより大きいため、最大応力は３０ＭＰａ以上である。
【００５１】
ＢｉｏＢｒｉｄｇｅの酵素分解。ニンヒドリン反応性を用いて水溶性タンパク質を測定することにより、コラゲナーゼにおけるコラーゲンスキャフォールドの分解を分析した［Ｓｔａｒｃｈｅｒ  Ｂ．Ａ  ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ  ｔｏ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｅ  ｔｈｅ  ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｍｐｌｅｓ．ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ  ２９２：ｐｐ．１２５−１２９．（２００１）］。各サンプルに対して、１ｃｍのスキャフォールドのセグメントを微量遠心機の管に配置した。サンプルを、１００又は５０Ｕ／ｍＬバクテリアコラゲナーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含む、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ、０．２５Ｍ  ＣａＣ１２（ｐＨ  ７．４）の２００μＬに、３７℃で培養した。培養後、サンプルを１５，０００ＲＣＦで１０分間遠心分離し、上澄みを熱湯で、２％のニンヒドリン試薬（Ｓｉｇｍａ）と１０分間反応させた。それから、光学濃度（ＯＤ）を、分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）において５７０ｎｍで測定し、得られた光学濃度からバックグラウンド（コラゲナーゼのみの制御）の値を差し引くことにより、相対ＯＤを測定した。最終的なデータは、材料のｍｇ当たりの相対ＯＤとして示される。
【００５２】
ＢｉｏＢｒｉｄｇｅ  １．０ｘは、移植後の３カ月で分解されることが仕様で示されている腸線縫合糸（図１１Ａ）よりも迅速にコラゲナーゼにより分解されたことを、我々のデータは示した。ＢｉｏＢｒｉｄｇｅの分解は、架橋に用いられるＥＤＣ濃度の機能であり（図１１Ｂ）、ＢｉｏＢｒｉｄｇｅ  ０．２ｘは、１．０ｘよりも迅速にコラゲナーゼにより分解されたことを、我々のデータは実証した。
【００５３】
ｐＤＮＡを添加したスキャフォールドの作製。毛管力によりスキャフォールドに担持されるＤＮＡの量を図るため、我々はまず、上記の０．２ｘ  多孔性のスキャフォールドを用いて、スキャフォールドをｐＣＭＶ６−ＡＣ−ＧＦＰプラスミドの溶液に培養することによりプラスミドを取り込んだ。スキャフォールドのサンプル（５ｍｍ長）を、（反応において、１〜０．０２５μｇ／μｌ濃度、４〜４０μｇの総ＤＮＡ量で）プラスミド溶液の４０μｌのアリコートに１時間室温で培養し、それからｐＤＮＡ溶液を除去し、架橋溶液（ｐＨ  ６．０のＰＢＳで、ＥＤＣ  １ｍｇ／ｍｌ、及びｓＮＨＳ  １．１ｍｇ／ｍｌ）の５００μｌと３０分間交換した。ｐＤＮＡスキャフォールドを、ＰＢＳで３０分間、４回すすいだ。
【００５４】
反応においてｐＤＮＡの量を４〜４０μｇに増加したが、スキャフォールドに留まるＤＮＡの量は大きく増加しなかった。反応に導入されるＤＮＡ量の５％を構成する４μｇのＤＮＡで培養した後、相当量のＤＮＡ（２０８ｎｇまで）がスキャフォールドに留まっていることを、我々のパイロットデータは示した。反応混合液中のＤＮＡ量の増加に伴い、留まったＤＮＡ量は増加したが、スキャフォールド中に留まったＤＮＡの量は比例して増加することはなかった。反応に添加した４０μｇのＤＮＡのうち、２９５ｎｇ（０．７％）が留まっていた。我々のスキャフォールドは、ｍｍ３のスキャフォールド量あたり５６６ｎｇまで留まることができ、これは、同様のアプローチに対して文献に報告されたデータに基づいた、ｍｍ３のスキャフォールド量に正規化した場合にコラーゲンスキャフォールドにより留まったｐＤＮＡの量（７０ｎｇ）よりも多い。従って、我々は、反応で４μｇの総ｐＤＮＡ量を用いて進めた。
【００５５】
我々は、（１）反応でＥＤＣ／ｓＮＨＳの減少した濃度と、（２）ＥＤＣ架橋の代わりに、ｐＤＮＡを担持したスキャフォールドの凍結乾燥とを用いたため、スキャフォールドのｐＤＮＡ残留及び放出能については、担持後の工程の修飾で更に検討する。全てのスキャフォールドサンプル（５ｍｍ長）を、（０．０２５μｇ／μｌ濃度の）プラスミド溶液の４０μｌアリコート中に１時間室温で培養し、それからＤＮＡ溶液を除去した。架橋溶液の５００μｌ（ｐＨ  ６．０のＰＢＳで、ＥＤＣ  １ｍｇ／ｍｌ及びｓＮＨＳ  １．１ｍｇ／ｍｌ（１．０ｘ）、又はＥＤＣ  ０．２ｍｇ／ｍｌ及びｓＮＨＳ  ０．２２ｍｇ／ｍｌ（０．２ｘ））と３０分間交換した。ｐＤＮＡ−スキャフォールドを、ＰＢＳで３０分間、４回すすいだ。代替的に、ｐＤＮＡ担持後、スキャフォールドのサンプルを冷凍し、凍結乾燥した（Ｌｙｏ）。
【００５６】
スキャフォールドへのｐＤＮＡ導入の評価。スキャフォールドに保持されたＤＮＡ量を評価するため、上記のように作製されたｐＤＮＡスキャフォールドを、５０μｌのアリコートプロテナーセＫ溶液（Ｒｏｃｈｅ）において、１８時間５４℃で消化処理を行った。消化サンプル中のＤＮＡの中身はアリコートで、製造業者の指示に従って、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬（Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＮＹ）を用いた。蛍光プレートリーダ  Ａｎａｌｙｓｔ  ＨＤ＆ＡＴ（ＬＪＬ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）により、蛍光強度を測定した。ＥＤＣ濃度の減少により、スキャフォールドに留まるｐＤＮＡの量は実質的には変わらなかったものの、凍結乾燥によりｐＤＮＡの保持量が増加した（図１２Ａ）ことを我々は発見した。
【００５７】
ｐＤＮＡ放出の分析。スキャフォールドからのｐＤＮＡの放出を評価するため、ｐＤＮＡスキャフォールドを４０μｌのＴＥバッファーアリコートで培養し、アリコートを特定の間隔ごとに回収し、新鮮なアリコートと交換した。回収したサンプルにおけるＤＮＡの中身を、上述のＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬を用いて評価した。図１２Ｂに示すように、ｐＤＮＡスキャフォールドは、１１日間、少量のＤＮＡをＴＥバッファに安定的に放出する。１１日間の培養を通して放出されたＤＮＡの総量は、「ＥＤＣ  １．０」スキャフォールドに取り込まれたｐＤＮＡ（６１ｎｇ）のうち５．９ｎｇ又は９．７％、又は「ＥＤＣ  ０．２」スキャフォールドに取り込まれたｐＤＮＡ（７０ｎｇ）のうち５．８ｎｇ又は８．３％、及び「Ｌｙｏ」スキャフォールドに取り込まれたｐＤＮＡ（１１２ｎｇ）のうち１１．５ｇ又は１０．３％だった。これらのデータをもとに、導入実験用にスキャフォールドを担持するのに凍結乾燥を採用できることを、我々は結論づけた。
【００５８】
プラスミド導入効率の最適性。ｐＤＮＡを担持する混合液の最適な組成を判断するため、我々はまず、ｐＣＭＶ６−ＡＣ−ＧＦＰプラスミドに対する最適な導入剤を特定した。我々は、（１）プラスミド製造業者の標準プロトコルに従った、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔｉｎ  ８．０（ＯｒｉＧｅｎｅ）、及び（２）プラスミド製造業者により推奨された代替の導入剤（Ｖｉｒｏｍｅｒ）を用いた。最初に試験した２つのバージョンのＶｉｒｏｍｅｒ（Ｒｅｄ及びＹｅｌｌｏｗ）のうち、Ｖｉｒｏｍｅｒ  Ｒｅｄがより高い導入効率となり、製造業者（ＬｉｐｏＣａｌｙｘ）による標準的及び直接的錯体生成の導入プロトコルの両方を用いる更なる最適化にそれを用いた。ヒト包皮の繊維芽細胞は、９６ウェル組織培養用プレート上に１０％のＦＢＳが添加されたＤＭＥＭで成長し、６０〜８０％のコンフルエントに達した。プラスミドＤＮＡを、抗生物質なしで無血清の培養液に希釈し、静かに混合し、導入剤と合わせ、１５〜４５分間室温で培養し、細胞培養液に添加した。細胞を、２４〜４８時間後に開始する過剰発現の効果に対する試験の前に、５％のＣＯ２培養器に３７℃で維持した。蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩＲＢ）により、ＧＦＰ遺伝発現を定期的に監視した。最適化工程を何度か繰り返しても、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔｉｎを用いた導入は、低画分のＧＦＰ発現細胞をもたらすのみであった。Ｖｉｒｏｍｅｒ  Ｒｅｄの標準プロトコルでの導入は、ＧＦＰ発現細胞がより多く、直接的錯体形成プロトコルでの導入は、ＧＦＰ発現細胞が最も多かった。
【００５９】
ＧＦＰ  ｍＲＮＡ  ｍＲＮＡは効率的な導入をもたらすため、最終生産物でｐＤＮＡベクターの効率的な代替物であろうと我々は考え、研究において、導入にＧＦＰ  ｍＲＮＡ（ＲＮＡｃｏｒｅ，Ｈｏｕｓｔｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｉｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＴＸ）を使用する可能性を検討し、ｐＤＮＡとの比較で導入効率の評価を進めた。
【００６０】
ｐＤＮＡ及びｍＲＮＡ導入効率の評価。（１）ｐＤＮＡ導入：我々は、最適化実験で最も高い導入効率を示した（上述の）導入試薬Ｖｉｒｏｍｅｒ  Ｒｅｄでの直接的錯体形成プロトコルを用いて、ｐＣＭＶ６−ＡＣ−ＧＦＰを伴う導入の研究を継続した。ヒト包皮の繊維芽細胞は、９６ウェル組織培養用プレート上に１０％のＦＢＳ添加されたＤＭＥＭで成長し、６０〜８０％のコンフルエントに達した。プラスミドＤＮＡを、抗生物質なしで無血清の媒体に薄め、静かに混合し、導入剤と合わせ、１５〜４５分間室温で培養した。（２）ｍＲＮＡ導入：我々は、製造業者より推奨された導入試薬、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ＃１３７７８−０７５）、及びＶｉｒｏｍｅｄ  Ｒｅｄ（ｐＤＮＡ導入で説明したものと同様、直接的錯体形成プロトコルに従う）を用いた。
【００６１】
リポフェクタミン導入プロトコル。我々は、製造業者により提案されたプロトコルの基本的ステップに従い、６ウェルプレートフォーマットから９６ウェルフォーマットに調節した。リポフェクタミン（１．６又は２．４μｌ）をＯＭＥＭ（１２又は１７．６μｌ）で希釈し、ｍＲＮＡ（５０ｎｇ／μｌの１．３又は２μｌ）に添加し、ＯＭＥＭ（１２又は１８．４μｌ）で希釈した。リポフェクタミン／ｍＲＮＡの混合液を、室温で１５分間培養し（この時点で、成長培地をＯＭＥＭと交換した）、それから液滴をそれぞれウェルに、ウェル毎に３．４又は５μｌ、を添加し、ウェル毎に８．３又は１２．５ｎｇのｍＲＮＡが導入された。４時間の培養後、ＯＭＥＭを除去し、ＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳと交換した。
【００６２】
Ｖｉｒｏｍｅｒ  Ｒｅｄの直接的錯体形成プロトコル  使用するｍＲＮＡ溶液（５０μｌ）を、１５ｎｇ／μｌで作製した。ストックＶｉｒｏｍｅｒ溶液（０．３μｌ）を管に配置し、ｍＲＮＡ溶液を、Ｖｉｒｏｍｅｒが入った管に直接添加し、静かに混合し、室温で１５分培養した。この時点で、成長培地を新たにした。導入混合液は、それぞれのウェルに、ウェル毎に６．７μｌの液滴が添加された細胞に使用され、ウェル毎に１００ｎｇのｍＲＮＡが導入された。更なる最適化は、５ｎｇ／μｌの使用液を用いる、又は１５ｎｇ／μｌの使用液で調整した導入混合液の２μｌを添加することにより、反応中のｍＲＮＡ量を低減させることを含む。細胞を５％のＣＯ２培養器に３７℃で維持し、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩＲＢ）により定期的にＧＦＰ遺伝子発現を監視した。
【００６３】
導入効率の評価。導入後の２４時間で、ＧＦＰ発現を、生きた培養菌の蛍光顕微鏡法により評価した。代表画像を撮った後で、細胞を２％のパラホルムアルデヒドで固定し、細胞核の定量化のため、Ｈｏｅｃｈｓｔ（１：１００００）で着色した。各ウェルに対して、３〜４の整合画像をＧＦＰ及び核に対して撮った。Ａｍｓｃｏｐｅソフトウェアを用いて画像毎の核の数を計算し、画像上に重ねられたグリッドを用いてＧＦＰ陽性細胞の数を手動で数えた。（ＧＦＰ陽性細胞の数／核の数）ｘ１００として、導入効率を計算した。蛍光プレートリーダでＧＦＰ蛍光強度を測定することにより、ＧＦＰ発現のレベルを更に評価した。
【００６４】
ｍＲＮＡとｐＤＮＡとの導入効率の比較は、用いられた条件に対して、ｍＲＮＡが繊維芽細胞を導入する上でより効率的だったことを示した（図１３Ａ）。更に、我々は、ｍＲＮＡ導入の条件範囲を拡大し（図１３Ｂ）、用いられた全てのバリエーションに対して、Ｖｉｒｏｍｅｒ  Ｒｅｄ導入剤がリポフェクタミンよりも高い導入効率をもたらしたことを実証した。我々の最初のプロトコルは製造業者の推奨に基づいているため、ウェルに導入したｍＲＮＡの量は、Ｖｉｒｏｍｅｒとリポフェクタミンプロトコルとで異なることに注意されたい。
【００６５】
３Ｄ細胞遊走アッセイ  細胞遊走アッセイを開発し、細胞遊走に対する成長因子放出の効果を試験した。このアッセイの概略図を図１４に示す。
【００６６】
適用  細胞分化を含む局所細胞反応を調節する、標的型遺伝子送達のナノパターン化した遺伝子活性化スキャフォールドによる、リンパ浮腫、緑内障、ケロイド及び他の傷跡、角膜矯正、歯の疾患の治療の手段とするのに上記方法を用いることができる。不通のリンパ管を形成してリンパ系を再接続できる、ＢｉｏＢｒｉｄｇｅ又はその他のスキャフォールドの使用を図１５に示す。ガン細胞の成長を防ぐ遺伝子材料、例えば、ｓｉＲＮＡを添加してもよい。この方法は、リンパ浮腫の形成を予防でき、癌手術中又はそのすぐ後に用いることができる。
【００６７】
実施例５  ＨＧＦ  ｍＲＮＡとともに導入され、ａ−ｈＨＧＦ（赤）及びＨｏｅｃｈｓｔ（青）で着色されたヒト繊維芽細胞を図１６に示す。Ａでは、組織培養用プラスチックに細胞を播種し、Ｂでは、配向したコラーゲンスキャフォールド（プラスチック上に配向したクリンプのコーティング）に細胞を播種した。ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡを担持したスキャフォールドのヒトＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの導入は、潜在的な増殖能を高め、ひいては、Ｔ細胞治療の全体的な有効性を大いに高めることができる。
【００６８】
実施例６  細胞／ｍＲＮＡ送達に対するマイクロキャリアプラットフォーム。５０〜３００ミクロンの直径を有する注入可能なｎａｎｏｗｅａｖｅ微粒子を、単一のＢｉｏＢｒｉｄｇｅスキャフォールドからの切り取りにより作ることができる。例えば、そのような微粒子を、実施例４で述べた配向した糸状のコラーゲンスキャフォールドから作ることができる。この場合、微粒子は、大きい表面積、マルチルーメンの多孔性、及び調整された分解を伴う、配向したコラーゲン構造（図１７を参照）を有することとなる。キャピラリティを用いる、又はＢｉｏＢｒｉｄｇｅ形成の前に最初のコラーゲン溶液に導入される核酸により、これらの微粒子を活性化することができる。そのようなマイクロキャリアは、少なくとも容積式のシリンジにより注入可能であり、核酸（例えば、ｍＲＮＡ又はｐＤＮＡ）の持続的送達を可能とする。特に、癌細胞が拡大及び増殖することを回避するような有益な因子をコードする核酸ベクターを放出することで、これらのマイクロキャリアをリンパ節及び標的型癌細胞に注入することができる。
【００６９】
特定の構成を参照して実施例を説明した。特定の実施例及び例の上記の説明は、図示及び説明の目的のみに示されたものであり、本発明は幾つかの先行の実施例により図示されているものの、それらによって限定されるものとして構成されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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