(57)【要約】  本発明は、プロトキシン−ＩＩ変異体、プロトキシン−ＩＩ変異体をコードするポリヌクレオチド、及びそれらを製造及び使用する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＮａｖ１．７活性を阻害する単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体であって、Ｗ７Ｑ及びＷ３０Ｌからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、残基の番号付けは配列番号１に従う、単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項２】
単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体であって、約１×１０−７Ｍ以下、約１×１０−８Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下、又は約１×１０−１２Ｍ以下のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害し、前記ＩＣ５０値は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０−６Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いたＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを用いて測定され、前記プロトキシン−ＩＩ変異体がＷ７Ｑ及び／又はＷ３０Ｌ置換を有し、残基の番号付けが配列番号１に従う、単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項３】
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＣＸ４Ｘ５ＷＸ６ＱＸ７ＣＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＣＣＸ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＣＸ１７ＬＷＣＸ１８ＫＫＬＸ１９（配列番号４３２）の配列を含み、
Ｘ１は、Ｇ、Ｐ、Ａ又は欠失であり；
Ｘ２は、Ｐ、Ａ又は欠失であり；
Ｘ３は、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｒ又はＹであり；
Ｘ４は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ、Ｓ又はＹであり；
Ｘ５は、Ｋ、Ｓ、Ｑ又はＲであり；
Ｘ６は、Ｍ又はＦであり；
Ｘ７は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ又はＱであり；
Ｘ８は、Ｄ、Ｔ又はアスパラギル−４−アミノブタンであり；
Ｘ９は、Ｓ、Ａ、Ｒ、Ｉ又はＶであり；
Ｘ１０は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ、Ｑ、Ｙ又はグルタミル−４−アミノブタンであり；
Ｘ１１は、Ｒ又はＫであり；
Ｘ１２は、Ｋ、Ｑ、Ｓ、Ａ又はＦであり；
Ｘ１３は、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｌ、Ｎ又はグルタミル−４−アミノブタンであり；
Ｘ１４は、Ｇ、Ｑ又はＰであり；
Ｘ１５は、Ｍ又はＦであり；
Ｘ１６は、Ｖ又はＳであり；
Ｘ１７は、Ｒ、Ｔ又はＮ−ωメチル−Ｌ−アルギニンであり；並びに、
Ｘ１８は、Ｋ又はＲであり；並びに、
Ｘ１９は、Ｗ又はＬであり、
Ｎ末端伸張又はＣ末端伸張を任意に有する、
請求項１又は２に記載の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項４】
残基の番号付けが配列番号１に従うときに、前記変異体が、Ｙ１、Ｗ７、Ｓ１１、Ｅ１２、Ｋ１４、Ｅ１７、Ｇ１８、Ｒ２２、Ｌ２９及びＷ３０の１つ又は２つ以上の残基位置で置換を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項５】
配列ＹＣＱＫＷＭＱＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＷ−ＣＯＯＨ（配列番号４１６）を含み、残基Ｙ１、Ｓ１１、Ｅ１２、Ｋ１４、Ｅ１７、Ｇ１８、Ｌ２９及び／又はＷ３０が、
ａ）表１で示される他の任意のアミノ酸；又は、
ｂ）非天然アミノ酸で置換される、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項６】
配列ＹＣＱＫＷＭＱＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＬ−ＣＯＯＨ（配列番号４２２）を含み、残基Ｙ１、Ｓ１１、Ｅ１２、Ｋ１４、Ｅ１７、Ｇ１８、Ｍ１９、Ｌ２９及び／又はＷ３０が、
ａ）表１で示される 他の任意のアミノ酸；又は、
ｂ）非天然アミノ酸で置換される、
請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項７】
配列番号４２２（ＧＰＹＣＱＫＷＭＱＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＬ−ＣＯＯＨ）のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一性のアミノ酸配列を含み、
前記プロトキシン−ＩＩ変異体が、残基番号付けが配列番号１に従うときに、位置７におけるＱ、及び位置３０におけるＱを有する、
請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項８】
配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＣＱＫＷＭＱＴＣＤＸ４Ｘ５ＲＸ６ＣＣＸ７Ｘ８Ｘ９ＶＣＲＬＷＣＫＫＫＸ１０Ｘ１１（配列番号７３７）を含み、
Ｘ１は、Ｇ、Ｐ、Ａ又は欠失であり；
Ｘ２は、Ｐ、Ａ又は欠失であり；
Ｘ３は、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｒ又はＹであり；
Ｘ４は、Ｓ、Ａ、Ｒ、Ｉ又はＶであり；
Ｘ５は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ、Ｑ、Ｙ又はグルタミル−４−アミノブタンであり；
Ｘ６は、Ｋ、Ｑ、Ｓ、Ａ又はＦであり；
Ｘ７は、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｌ、Ｎ又はグルタミル−４−アミノブタンであり；
Ｘ８は、Ｇ、Ｑ又はＰであり；
Ｘ９は、Ｍ又はＦであり；
Ｘ１０は、Ｌ又はＶであり；並びに
Ｘ１１は、Ｗ又はＬである、
請求項１〜７のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体 。
【請求項９】
前記Ｎ末端伸長が、配列番号３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４又は３８５のアミノ酸配列 を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項１０】
前記Ｃ末端伸長が、配列番号３７４、３８６、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６又は３９７のアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項１１】
前記Ｎ末端及び／又は前記Ｃ末端伸長が、前記プロトキシン−ＩＩ変異体にリンカーを介して結合される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体
【請求項１２】
前記リンカーが、配列番号３８３、３９２、３９８、３９９、４００、４０１又は４０２のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項１３】
ヒトＮａｖ１．７活性を、約３×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０値で阻害し、前記ＩＣ５０値は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０−６Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いたＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを用いて測定される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項１４】
ヒトＮａｖ１．７活性を、約３×１０−８Ｍ〜約１×１０−９ＭのＩＣ５０値で阻害する、請求項１３に記載の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項１５】
実施例３に記載のプロトコルに従いＱＰａｔｃｈ分析を用いてＮａｖ１．７活性を測定したときに、前記変異体が、Ｎａｖ１．７活性を少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％阻害する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項１６】
アミノ酸配列ＧＰＱＣＸ１Ｘ２ＷＸ３ＱＸ４ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＣＣＸ１０Ｘ１１ＦＸ１２ＣＸ１３ＬＷＣＸ１４ＫＫＬＬ（配列番号４３３）を含み、
Ｘ１は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ又はＳであり；
Ｘ２は、Ｋ、Ｓ、Ｑ又はＲであり；
Ｘ３は、Ｍ又はＦであり；
Ｘ４は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ又はＱであり；
Ｘ５は、Ｄ又はＴであり、
Ｘ６は、Ｓ、Ａ又はＲであり、
Ｘ７は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ又はＱであり、
Ｘ８は、Ｒ又はＫであり；
Ｘ９は、Ｋ、Ｑ、Ｓ又はＡであり；
Ｘ１０は、Ｅ、Ｑ又はＤであり；
Ｘ１１は、Ｇ又はＱであり；
Ｘ１２は、Ｖ又はＳであり；
Ｘ１３は、Ｒ又はＴであり；並びに
Ｘ１４は、Ｋ又はＲである、
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項１７】
配列番号３０、４０、４４、５２、５６、５９、６５、７８、１０９、１１０、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６２、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７、１７８、１７９、１８０、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０、１９３、１９５、１９７、１９９、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２２４、２２６、２２７、２３１、２３２、２４３、２４４、２４５、２４７、２４９、２５２、２５５、２５８、２６１、２６３、２６４、２６５、２６６、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３３２、３３４、３３５、３３６、３３７、３３９、３４０、３４１、３４２、３４６、３５１、３５８、３５９、３６４、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５又は７３６のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項１８】
遊離Ｃ末端カルボン酸、アミド、メチルアミド又はブチルアミド基を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項１９】
半減期延長部分に結合された、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体を含む、単離された融合タンパク質。
【請求項２０】
前記半減期延長部分が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、Ｆｃ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１９に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項２１に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２４】
前記単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体を生成する方法であって、請求項２３に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって生成された前記プロトキシン−ＩＩ変異体を回収することとを含む、前記方法。
【請求項２５】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体又は融合タンパク質と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項２６】
対象におけるＮａｖ１．７を介した痛みを治療する方法であって、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体又は融合タンパク質を、前記痛みの治療に有効な量で、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２７】
痛みが、慢性の痛み、急性の痛み、神経障害性疼痛、癌による痛み、侵害受容性の痛み、内臓痛、背痛、術後の痛み、熱痛、幻肢痛、又は炎症状態に付随する痛み、肢端紅痛症（ＰＥ）、発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、リウマチ性関節炎、腰部椎間板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、疹後神経痛（ＰＨＮ）、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷又は多発性硬化症である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プロトキシン−ＩＩ変異体が、末梢に投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記プロトキシン−ＩＩ変異体が、関節、脊髄、手術創、傷害若しくは外傷部位、末梢神経線維、泌尿生殖器臓器、又は炎症組織に局所的に投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象がヒトである、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
痛みの治療を必要とする対象における痛みの治療に使用される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体又は融合タンパク質 。
【請求項３２】
痛みが、慢性の痛み、急性の痛み、神経障害性疼痛、癌による痛み、侵害受容性の痛み、内臓痛、背痛、術後の痛み、熱痛、幻肢痛、又は炎症状態に付随する痛み、肢端紅痛症（ＰＥ）、発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、リウマチ性関節炎、腰部椎間板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、疹後神経痛（ＰＨＮ）、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷又は多発性硬化症である、請求項３１に記載の使用のための プロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項３３】
前記プロトキシン−ＩＩ変異体が、末梢に投与される、請求項３１又は３２に記載の使用のための プロトキシン−ＩＩ変異体。
【請求項３４】
前記プロトキシン−ＩＩ変異体が、関節、脊髄、手術創、傷害若しくは外傷部位、末梢神経線維、泌尿生殖器臓器、又は炎症組織に局所的に投与される、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の使用のための プロトキシン−ＩＩ変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許法１１９（ｅ）のもと、２０１５年４月２日に出願された米国特許仮出願第６２／１４２，０６９号に対する優先権の利益を主張し、その出願の全開示内容が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、プロトキシン−ＩＩ変異体、それをコードする合成ポリヌクレオチド、及びそれらを製造及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
電位依存性ナトリウムチャネル（Voltage-Gated Sodium Channel）（ＶＧＳＣ）は、心筋及び骨格筋細胞、並びに中枢及び末梢ニューロンを含むあらゆる興奮性細胞中に存在している。神経細胞では、ナトリウムチャネルは、閾値下脱分極を増幅し、活動電位の急速な立ち上がりを引き起こす役割を担っている。このため、ナトリウムチャネルは、神経系における電気信号の開始及び伝播に不可欠である。異常なナトリウムチャネル機能が種々の医学的障害の根底にあると考えられており（Ｈｕｂｎｅｒ  ａｎｄ  Ｊｅｎｔｓｃｈ，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １１：２４３５〜４５、２００２）、そうした医学的障害としては、例えば、てんかん（Ｙｏｇｅｅｓｗａｒｉら、Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ５：５８９〜６０２、２００４）、不整脈（Ｔｆｅｌｔ−Ｈａｎｓｅｎら、Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  ２１：１０７〜１５、２０１０）、ミオトニー（Ｃａｎｎｏｎ  ａｎｄ  Ｂｅａｎ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ１２０：８０〜３、２０１０）、及び痛み（Ｃｒｅｇｇら、Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５８８：１８９７〜９０４、２０１０）が挙げられる。ナトリウムチャネルは、一般的に各種サブユニットの複合体であり、その主要なものは、単独で機能するのに充分なポア形成αサブユニットである。
【０００４】
電位依存性ナトリウムチャネルαサブユニットのファミリーの９つの公知のメンバーがヒトに存在する。Ｎａｖ１．１〜Ｎａｖ１．９である。Ｎａｖ１．ｘサブファミリーは、薬理学的に、テトロドトキシン（ＴＴＸ）感受性及びＴＴＸ耐性の２つのグループに細分できる。Ｎａｖ１．７（別名ＰＮ１又はｈＮＥ）は、ＳＣＮ９Ａ遺伝子によってコード化され、ＴＴＸ感受性であり、主に末梢交感神経及び感覚ニューロンにおいて発現される。Ｎａｖ１．７は、神経線維末端に蓄積し、小さい閾値下脱分極を増幅し、興奮性を調節する閾値チャネルとして機能する。
【０００５】
Ｎａｖ１．７の機能は、急性、炎症性、及び／又は神経因性疼痛を含む、様々な疼痛状態に関与している。男性では、Ｎａｖ１．７の機能獲得型変異が、肢端紅痛症（ＰＥ）（四肢の焼けるような痛み及び炎症を特徴とする疾患）（Ｙａｎｇら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ４１：１７１〜４、２００４）、及び発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）（Ｆｅｒｔｌｅｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ  ５２：７６７〜７４、２００６）に関連している。この知見に一致するように、非選択性ナトリウムチャネル遮断薬リドカイン、メキシレチン及びカルバマゼピンによって、これらの痛みを伴う疾患の症状緩和を得ることができる（Ｌｅｇｒｏｕｘ−Ｃｒｅｓｐｅｌら、Ａｎｎ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｖｅｎｅｒｅｏｌ  １３０：４２９〜３３、２００３；Ｆｅｒｔｌｅｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ  ５２：７６７〜７４、２００６）。
【０００６】
ヒトにおけるＮａｖ１．７の機能喪失型変異は、痛覚刺激に対する完全な無感受性又は不感受性により特徴付けられる希な常染色体劣性疾患である、先天性無痛症（ＣＩＰ）を引き起こす（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４４：８９４〜８，２００６；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  ７１：３１１〜９，２００７；Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １６：２１１４〜２１，２００７）。
【０００７】
ＳＣＮ９Ａのコーディング領域内の一塩基多型は、侵害受容器の興奮性及び痛覚感受性の増大に関連している。例えば、ヒトＮａｖ１．７におけるＲ１１５０Ｗ置換を生じる多型ｒｓ６７４６０３０が、変形性関節症の痛み、腰部椎間板切除術の痛み、幻想痛、及び膵炎の痛みに関連している（Ｒｅｉｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７：５１４８〜５３、２０１０）。Ｒ１１５０Ｗ変異体Ｎａｖ１．７を発現するＤＲＧニューロンによって、脱分極に応じた発火頻度の増加を示す（Ｅｓｔａｃｉｏｎら、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６６：８６２〜６、２００９）。線維筋痛の無効形態がＳＣＮ９Ａナトリウムチャネル多型ｒｓ６７５４０３１に関連しており、激しい線維筋痛を伴う患者の中には後根神経節ナトリウムチャネロパチーを有するものがあり得ることを示している。（Ｖａｒｇａｓ−Ａｌａｒｃｏｎら、ＢＭＣ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ  Ｄｉｓｏｒｄ  １３：２３、２０１２）。
【０００８】
マウスでは、侵害受容ニューロンにおいてＳＣＮ９Ａ遺伝子が欠失すると、機械的痛み及び熱痛の閾値が低下し、並びに炎症性痛覚応答が減少又は停止する（Ｎａｓｓａｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１２７０６〜１１、２００４）。すべての感覚ニューロンにおいてＳＣＮ９Ａを除去することで、機械的な痛み、炎症性痛覚、及び熱に対する反射逃避応答が停止した。感覚ニューロン及び交感神経ニューロンの両方においてＳＣＮ９Ａを欠失させると、機械的痛み、熱痛、及び神経障害性疼痛が停止し、Ｎａｖ１．７機能喪失型変異によってヒトに見られる無痛表現型が繰り返された（Ｍｉｎｅｔｔら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３：７９１、２０１２）。したがって、Ｎａｖ１．７阻害剤又は遮断薬は、様々な疾患に付随する広範な疼痛の治療に有用であり得る。
【０００９】
クモ毒には、多数のナトリウムチャネル遮断ペプチドが含まれていることが知られており、例えば、フエントキシン−ＩＶ（ＨｗＴｘ−ＩＶ）（Ｐｅｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：４７５６４〜７１、２００２）、プロトキシン−Ｉ、プロトキシン−ＩＩ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：１４７３４〜４７、２００２）及びフリクソトキシン−ＩＩＩ（Ｂｏｓｍａｎｓら、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６９：４１９〜２９、２００６）が挙げられる。広範囲の疼痛を治療するための更なるＮａｖ１．７遮断薬の同定に対するニーズが存在する。詳細には、Ｎａｖ１．７に対する選択性が他の電位依存性ナトリウムチャネルイソ型の場合よりも上回る新規なＮａｖ１．７遮断薬に対するニーズが存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の１つの実施形態は、ヒトＮａｖ１．７活性を阻害する単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体であり、プロトキシン−ＩＩ変異体は、Ｗ７Ｑ及びＷ３０Ｌからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、残基の番号付けは、配列番号１に従う。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体であり、プロトキシン−ＩＩ変異体は、約１×１０−７Ｍ以下、約１×１０−８Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下、又は約１×１０−１２Ｍ以下のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害し、ＩＣ５０値は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０−６Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いたＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを用いて測定され、プロトキシン−ＩＩ変異体は、Ｗ７Ｑ及び／又はＷ３０Ｌ置換を有し、残基番号付けは配列番号１に従う。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、配列番号３０、４０、４４、５２、５６、５９、６５、７８、１０９、１１０、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６２、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７、１７８、１７９、１８０、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０、１９３、１９５、１９７、１９９、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２２４、２２６、２２７、２３１、２３２、２４３、２４４、２４５、２４７、２４９、２５２、２５５、２５８、２６１、２６３、２６４、２６５、２６６、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３３２、３３４、３３５、３３６、３３７、３３９、３４０、３４１、３４２、３４６、３５１、３５８、３５９、３６４、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５又は７３６のアミノ酸配列を含む、単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体である。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体であって、配列番号４２２（ＧＰＹＣＱＫＷＭＱＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＬ−ＣＯＯＨ）のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一性のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、残基の番号付けが配列番号１に従うときに、位置７におけるＱ、位置３０におけるＬを有する。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、半減期延長部分に結合した本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を含む単離された融合タンパク質である。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドである。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含むベクターである。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、本発明の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体を製造する方法であって、本発明の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって生成されたプロトキシン−ＩＩ変異体を回収することとを含む、方法である。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、本発明の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体又は融合タンパク質と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物である。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、対象におけるＮａｖ１．７を介した痛みを治療する方法であって、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体又は融合タンパク質を、痛みの治療に有効な量で、それを必要とする対象に投与することを含む、方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａアッセイにおいて３０ｎＭ以下のＩＣ５０値でＮａｖ１．７を阻害するプロトキシン−ＩＩ変異体の属アミノ酸配列を示す。残基の番号付けは、配列番号１の野生型プロトキシン−ＩＩに従う。属配列番号：４０３。
【図０２−０１】ＱＰａｔｃｈアッセイにおけるＮａｖ１．７及びＮａｖ１．６阻害に対するＩＣ５０値と、ＱＰａｔｃｈアッセイにおいて得られるＩＣ５０（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ５０（Ｎａｖ１．７）の比によって計算した各変異体の選択性とを示す。ＳＥ：標準誤差。
【図０２−０２】ＱＰａｔｃｈアッセイにおけるＮａｖ１．７及びＮａｖ１．６阻害に対するＩＣ５０値と、ＱＰａｔｃｈアッセイにおいて得られるＩＣ５０（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ５０（Ｎａｖ１．７）の比によって計算した各変異体の選択性とを示す。ＳＥ：標準誤差。
【図０３−０１】ＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａアッセイにおいて３０ｎＭ以下のＩＣ５０値でＮａｖ１．７を阻害し、Ｎａｖ１．６と比べて選択性が３０倍超のプロトキシン−ＩＩ変異体の配列及び属配列を示す。各変異体の選択性は、ＱＰａｔｃｈアッセイにおいて得られるＩＣ５０（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ５０９ａｖ１．７）の比によって計算された。残基の番号付けは、配列番号１の野生型プロトキシン−ＩＩに従う。
【図０３−０２】ＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａアッセイにおいて３０ｎＭ以下のＩＣ５０値でＮａｖ１．７を阻害し、Ｎａｖ１．６と比べて選択性が３０倍超のプロトキシン−ＩＩ変異体の配列及び属配列を示す。各変異体の選択性は、ＱＰａｔｃｈアッセイにおいて得られるＩＣ５０（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ５０９ａｖ１．７）の比によって計算された。残基の番号付けは、配列番号１の野生型プロトキシン−ＩＩに従う。
【図０３−０３】ＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａアッセイにおいて３０ｎＭ以下のＩＣ５０値でＮａｖ１．７を阻害し、Ｎａｖ１．６と比べて選択性が３０倍超のプロトキシン−ＩＩ変異体の配列及び属配列を示す。各変異体の選択性は、ＱＰａｔｃｈアッセイにおいて得られるＩＣ５０（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ５０９ａｖ１．７）の比によって計算された。残基の番号付けは、配列番号１の野生型プロトキシン−ＩＩに従う。
【図４Ａ】マウスにおける、ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏に対するＮＶ１Ｄ３０３４（ＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨ）（配列番号７８）の有効性を示し、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験において、ＣＦＡ注入前（ＣＦＡ前）及びＣＦＡ注入後（０）及びペプチド投与後の１日目（１）における足逃避潜時の測定により評価した。＊＊＊Ｐ＜０．００１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図４Ｂ】マウスにおける、ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏におけるＮＶ１Ｄ３０３４（ＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨ）（配列番号７８）の有効性を示し、ペプチド投与後の１日目の各投与におけるパーセントＭＰＥ（最大可能効果（maximum possible effect））（ＭＰＥ％）として表わす。＊Ｐ＜０．０５対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図５Ａ】マウスにおける、ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏に対するＮＶ１Ｄ３３６８（ＮＶ１Ｄ３３６８−ＯＨ）（配列番号１９８）の有効性を示し、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験において、ＣＦＡ注入前（ＣＦＡ前）及びＣＦＡ注入後（０）及びペプチド投与後の１日目（１）における足逃避潜時の測定により評価した。＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図５Ｂ】マウスにおける、ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏におけるＮＶ１Ｄ３３６８（ＮＶ１Ｄ３３６８−ＯＨ）（配列番号１９８）の有効性を示し、ペプチド投与後の１日目の各投与におけるパーセントＭＰＥ（ＭＰＥ％）として表わす。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図６Ａ】マウスにおける、ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏に対するＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ（配列番号５６）の有効性を示し、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験において、ＣＦＡ注入前（ＣＦＡ前）、ＣＦＡ注入後（０）、及びペプチド投与後の１日目（１）における足逃避潜時の測定により評価した。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図６Ｂ】マウスにおける、ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏におけるＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ（配列番号５６）の有効性を示し、ペプチド投与後１日目の各投与におけるパーセントＭＰＥ（ＭＰＥ％）として表わす。＊＊＊Ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図６Ｃ】マウスにおける、ＣＦＡ誘発触覚異痛症に対するＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ（配列番号５６）の有効性を示す。後足の触覚閾値、ＣＦＡ前（ＣＦＡ前）、ＣＦＡ後（０）、及びペプチド投与後の１日目（１）。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図６Ｄ】マウスにおける、ＣＦＡ誘発触覚異痛症に対するＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ（配列番号５６）の有効性を示し、ペプチド投与後１日目のパーセントＭＰＥ（ＭＰＥ％）として表わす。＊＊＊Ｐ＜０．００１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図７Ａ】ＣＦＡ投与前後及びペプチド投与後の様々な時点におけるＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験での足逃避潜時の測定により評価される、マウスＣＦＡモデルにおける、ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨを介した熱痛覚過敏の逆転の時間経過を示す。＊＊Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。斜線領域は化合物送達時間（０〜２４ｈｒ）を示す。
【図７Ｂ】ＣＦＡの投与前後及びペプチド投与後の様々な時点における触覚閾値の測定により評価される、マウスＣＦＡモデルにおける、ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨを介した触覚異痛症の逆転の時間経過を示す＊＊Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、双方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。斜線領域は化合物送達時間（０〜２４ｈｒ）を示す。
【図８】マウスホットプレート試験において、ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨにより著しい無痛覚が生じたことを示す。熱逃避潜時の評価を、５０及び５５℃においてポンプ埋め込み前及び後に行った。ポンプ埋め込みは、制御ＰＢＳグループにおける潜時に対して影響はなかった。ポンプ後１日目に、ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨによって治療されたマウスは、ＰＢＳグループと比べて長時間に渡って潜時を示した。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図９】マウスにおいて、ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ前処理が、動物をカラギーナン誘発熱痛覚過敏から保護したことを示す。足逃避潜時の測定を、ポンプ前、及びポンプ後１日目に足底内カラギーナン注射前に行った。潜時の再測定を、カラギーナンの２、３、及び４時間後に行った。
【図１０】野生型プロトキシン−ＩＩのＮＭＲ構造による、その表面表現を示す。左側に示す疎水性表面は、残基Ｗ５、Ｍ６、Ｗ７、Ｌ２３及びＷ２４を含む。右側に示す選択性表面は、残基Ｓ１１、Ｅ１２、Ｋ１４、Ｅ１７、Ｇ１８、Ｌ２９及びＷ３０を含む。残基の番号付けは、配列番号１に従う。
【図１１Ａ】ラットのテールフリック試験における、プロトキシン−ＩＩ変異体６３９５５９１８（配列番号４２２）の、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を示す。ペプチド投与後の指定された時間に、温度的刺激に対する尾逃避反応潜時を測定した。
【図１１Ｂ】ラットのテールフリック試験における、プロトキシン−ＩＩ変異体６３９５５９１８（配列番号４２２）の、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を、最初の１２０分のパーセント曲線下面積（ＡＵＣ％）として表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図１１Ｃ】ラットのホットプレート試験（５２．５℃）における、プロトキシン−ＩＩ変異体６３９５５９１８（配列番号４２２）の、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を示す。ホットプレートの侵害受容応答潜時を、ペプチド投与後の指定された時間に測定した。
【図１１Ｄ】ホットプレート試験における、プロトキシン−ＩＩ変異体６３９５５９１８（配列番号４２２）の、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を、最初の１２０分のパーセント曲線下面積（ＡＵＣ％）として示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図１１Ｅ】ラットのホルマリン試験における、プロトキシン−ＩＩ変異体６３９５５９１８（配列番号４２２）の有効性を示す。ホルマリンのラット後足への注入により、二相性のフリンチ行動が誘発された。フェーズＩ（ホルマリン投与の０〜１０分後）及びフェーズＩＩ（ホルマリン投与の１１〜６０分後）におけるフリンチの総数を自動化装置で測定した。Ｅ）では群サイズが小さかったため、統計処理を行わなかった。
【図１２Ａ】ラットのテールフリック試験における、ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨの、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を示す。ペプチド投与後の指定された時間に、温度的刺激に対する尾逃避反応潜時を測定した。
【図１２Ｂ】ラットのテールフリック試験における、ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨの、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を、最初の１２０分のパーセント曲線下面積（ＡＵＣ％）として表す。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図１２Ｃ】ラットのホットプレート試験（５２．５℃）における、ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨの、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を示す。ホットプレートの侵害受容応答潜時を、ペプチド投与後の指定された時間に測定した。
【図１２Ｄ】ラットのホットプレート試験における、ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨの、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を、最初の１２０分のパーセント曲線下面積（ＡＵＣ％）として示す。＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図１２Ｅ】ホルマリン試験におけるＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨの有効性を示す。ホルマリンのラット後足への注入により、二相性のフリンチ行動が誘発された。フェーズＩ（ホルマリン投与の０〜１０分後）及びフェーズＩＩ（ホルマリン投与の１１〜６０分後）におけるフリンチの総数を自動化装置で測定した。＊＊Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、フェーズＩ、＊Ｐ＜０．０５対ＰＢＳ、フェーズＩＩ、一方向ＡＮＯＶＡの後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較。
【図１３Ａ】ラットのテールフリック試験における、ＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨの、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を示す。ペプチド投与後の指定された時間に、温度的刺激に対する尾逃避反応潜時を測定した。
【図１３Ｂ】ラットのテールフリック試験における、ＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨの、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を、最初の１２０分のパーセント曲線下面積（ＡＵＣ％）として示す。＊＊＊Ｐ＜０．００５対ＰＢＳ、ｔ検定。
【図１３Ｃ】ラットのホットプレート試験（５２．５℃）における、ＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨの、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を示す。ホットプレートの侵害受容応答潜時を、ペプチド投与後の指定された時間に測定した。
【図１３Ｄ】ラットのホットプレート試験における、ＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨの、鞘内（ＩＴ）単回投与後の有効性を、最初の１２０分のパーセント曲線下面積（ＡＵＣ％）として示す。＊＊＊Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、ｔ検定。
【図１３Ｅ】ホルマリン試験におけるＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨの有効性を表す。ホルマリンのラット後足への注入により、ニ相性のフリンチ行動が誘発された。フェーズＩ（ホルマリン投与の０〜１０分後）及びフェーズＩＩ（ホルマリン投与の１１〜６０分後）におけるフリンチの総数を自動化装置で測定した。＊Ｐ＜０．０５対ＰＢＳ、フェーズＩ、＊＊Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ、フェーズＩＩ、ｔ検定。
【図１４】ファミリー３のシステインノット毒素ペプチドのアミノ酸アラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書に引用される特許及び特許出願を含む（但しそれらに限定されない）すべての刊行物は、参照によりそれらの全体が記載されているのと同様に、本明細書に援用される。
【００２３】
本明細書及び特許請求の範囲において使用するところの単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈よりそうでない旨が明確に示されない限り、複数の対象物を含む。
【００２４】
別途記載のない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。例示的な組成物及び方法を本明細書に記載するが、本明細書に記載されているものと同様又は同等のあらゆる組成及び方法を、本発明を実施又は試験するために使用することが可能である。
【００２５】
用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合されてポリペプチドを形成する少なくとも２個のアミノ酸残基を含む分子を意味する。５０個のアミノ酸未満の小分子ポリペプチドを「ペプチド」と言う場合がある。ポリペプチドは、「タンパク質」と呼ばれる場合もある。
【００２６】
用語「ポリヌクレオチド」は、糖−リン酸骨格を介した共有結合、又は他の同等の共有結合を介して連結されたヌクレオチド鎖を含む分子を意味する。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。
【００２７】
用語「相補配列」は、第１の単離されたポリヌクレオチド配列と逆平行であり、第１のポリヌクレオチド配列のヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチドを含む第２の単離されたポリヌクレオチド配列を意味する。
【００２８】
用語「ベクター」は、生物系内で複製することが可能である、又はそのようなシステム間を移動できる、天然に存在しないポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは、典型的には、目的タンパク質をコードするｃＤＮＡと、生物システム内でこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を容易にするように機能する、複製起点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどの更なる要素を含む。そのような生物システムの例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターの複製を可能にする生物学的要素を利用して再構成された生物システムが挙げられる。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッド分子であってもよい。
【００２９】
用語「発現ベクター」は、生物系又は再構成された生物系において利用されて、発現ベクター内に存在するポリヌクレオチド配列がコードするポリペプチドの翻訳を指令できるベクターを意味する。
【００３０】
用語「変異体」は、本明細書で用いられる場合、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであって、配列番号１の野生型プロトキシン−ＩＩポリペプチドとは異なるか、又はヌクレオチド又はアミノ酸の１つ又は複数の修飾（例えば、置換、挿入又は欠失）によって、配列番号１０７の配列を有する野生型プロトキシン−ＩＩをコードするポリヌクレオチドとは異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
【００３１】
明細書の全体に渡って、プロトキシン−ＩＩ変異体内で置換された残基は、配列番号１の野生型プロトキシン−ＩＩにおけるその位置に対応して番号付けされている。例えば、明細書における「Ｙ１Ａ」は、配列番号１の野生型プロトキシン−ＩＩにおける位置１に対応する残基位置におけるチロシンとアラニンとの置換を指す。
【００３２】
「相補的ＤＮＡ」又は「ｃＤＮＡ」は、天然の成熟ｍＲＮＡ種において見出される配列要素の配置を、隣接するエクソンと共有する公知の合成ポリヌクレオチドを指し、ゲノムＤＮＡ内に存在する介在するイントロンは取り除かれている。開始剤メチオニンをコードするコドンは、ｃＤＮＡ内に存在してもしなくてもよい。ｃＤＮＡは、例えば逆転写又は合成遺伝子アセンブリによって合成されてもよい。
【００３３】
本明細書で用いられる場合、「合成」又は「非天然の」は、天然に存在しないポリヌクレオチド又はポリペプチド分子を指す。
【００３４】
「Ｎａｖ１．７」（ｈＮＥ又はＰＮ１とも言う）又は「ｈＮａｖ１．７」は、本明細書で用いられる場合、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＮＰ＿００２９６８．１及び配列番号７９に示す配列を有する公知のヒトナトリウムチャネルタンパク質タイプ９サブユニットαを指す。
【００３５】
用語「野生型プロトキシン−ＩＩ」又は「野生型ＰｒｏＴｘ−ＩＩ」は、本明細書で用いられる場合、タランチュラＴｈｒｉｘｏｐｅｌｍａ  ｐｒｕｒｉｅｎｓ（ムクナ）毒素ペプチドであり、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１（５０）：１４７３４〜４７，２００２）に記載されるアミノ酸配列ｙｃｑｋｗｍｗｔｃｄｓｅｒｋｃｃｅｇｍｖｃｒｌｗｃｋｋｋｌｗ−ＣＯＯＨ（配列番号１）を有するもののことを指す。
【００３６】
用語「組み換え型プロトキシン−ＩＩ」又は「組み換え型ＰｒｏＴｘ−ＩＩ」は、本明細書で用いられる場合、配列番号２に示すようなＧＰＹＣＱＫＷＭＷＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＷ−ＯＨの配列を有するプロトキシン−ＩＩ融合タンパク質の発現及び以後の切断から得られる組み換え型プロトキシン−ＩＩを指す。組み換え型プロトキシン−ＩＩは、野生型プロトキシン−ＩＩと比較して、２つのアミノ酸Ｎ末端伸長（残基Ｇ及びＰ）を取り入れている。
【００３７】
「ヒトＮａｖ１．７活性を遮断する」又は「ヒトＮａｖ１．７活性を阻害する」は、本明細書で用いられる場合、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体が、ベラトリジン（３−ベラトロイルベラセビン）によって誘発される膜脱分極を、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いるＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイにおいて約１×１０−７Ｍ以下のＩＣ５０値で低減する能力を指し、ここで、ベラトリジン誘発脱分極は、ＦＲＥＴシグナルの減少として測定され、その測定は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現する細胞株において、ＤＩＳＢＡＣ２（３）（［ビス−（１，３−ジエチルチオバルビツール酸）トリメチンオキソノール］）をアクセプターとして、またＰＴＳ１８（トリナトリウム８−オクタデシルオキシピレン−１，３，６−トリスルホネート）をドナーとして用い、ドナーを３９０〜４２０ｎｍで励起しＦＲＥＴを５１５〜５７５ｎｍで測定することにより行われる。ヒトＮａｖ１．７活性を遮断する本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体の能力はまた、ＱＰａｔｃｈ電気生理学アッセイを用い、実施例３に記載のプロトコルに従い、単一又はいくつかのプロトキシン−ＩＩ変異体濃度において測定してもよい。本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、実施例３に記載の分析プロトコルを用いてＱＰａｔｃｈを用いて測定される、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のＮａｖ１．７電流を阻害するとき、ヒトＮａｖ１．７活性を遮断する。
【００３８】
「ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイ」は、本明細書で用いる場合、実施例３に記載するアッセイを指す。
【００３９】
「ＱＰａｔｃｈアッセイ」又は「ＱＰａｔｃｈ電気生理学アッセイ」の用語は、本明細書で用いる場合、実施例３に記載アッセイを指す。
【００４０】
用語「実質的に同一である」は、本明細書で用いる場合、比較する２つのプロトキシン−ＩＩ変異体アミノ酸配列が同一であるか又は「ごくわずかな相違」を有することを意味する。ごくわずかな相違とは、プロトキシン−ＩＩ変異体アミノ酸配列において、ペプチド特性に悪影響を与えない１、２、３、４、５、６、又は７のアミノ酸の置換である。本明細書に開示されるプロトキシン−ＩＩ変異体と実質的に同一であるアミノ酸配列は、本出願の範囲内である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上とすることができる。同一性（％）は、例えばペアワイズアライメントによって、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ．９．０．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｌｂａｄ、ＣＡ）のＡｌｉｇｎＸモジュールのデフォルト設定を用いて決定することができる。本発明のタンパク質配列を参照配列として用い、例えば、公共の又は特許情報のデータベースの検索を行い、関連配列を同定してもよい。このような検索を実行するために用いる例示的なプログラムは、ＸＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴＰプログラム（ｈｔｔｐ＿／／ｗｗｗ＿ｎｃｂｉ＿ｎｌｍ／ｎｉｈ＿ｇｏｖ）、又はＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ（商標）（ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）スイートであって、デフォルト設定を用いるものである。
【００４１】
本明細書で用いられる天然アミノ酸の略号を表１ａに示す。
【００４２】
【表１】
2018511326.tif 000002
【００４３】
本発明によって、ヒトＮａｖ１．７活性を阻害する単離されたプロトキシン−ＩＩ（ＰｒｏＴｘ−ＩＩ）変異体ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、並びに本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドを使用する方法が提供される。本発明のポリペプチドは、Ｎａｖ１．７活性化に起因する脱分極／電流を阻害するため、疼痛を伴う様々な症状、及び感覚ニューロン又は交感神経ニューロンの機能不全に伴う症状の治療に有用であり得る。
【００４４】
本発明の変異体はＮａｖ１．７の強力な阻害剤である。本発明は、少なくとも部分的には、プロトキシン−ＩＩ中のある残基置換が選択性、合成収率及び／又は同質性を高めることを、生成されたプロトキシン−ＩＩ変異体の効能に悪影響を与えずに行うことを見出したことに基づいており、具体的にはＷ７及びＭ１９、更に残基Ｙ１及びＳ１１、更に加えて残基Ｅ１２、Ｒ２２及び（残基の番号付けは配列番号１に従う）である。例えば、位置Ｗ７及びＷ３０の置換によりプロトキシン−ＩＩ変異体のフォールディングが促進され、収率が改善される。
【００４５】
位置Ｓ１１、Ｅ１２、Ｋ１４、Ｅ１７、Ｇ１８、Ｌ２９及びＷ３０の置換により、得られるプロトキシン−ＩＩ変異体のＮａｖ１．７への選択性が改善される。
【００４６】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の一実施形態は、単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体であり、このプロトキシン−ＩＩ変異体は、約１×１０−７Ｍ以下、約１×１０−８Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下、又は約１×１０−１２Ｍ以下のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害し、ＩＣ５０値は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０−６Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いたＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを用いて測定される。
【００４７】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の実施形態は、単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体であり、このプロトキシン−ＩＩ変異体は、約１×１０−７Ｍ以下、約１×１０−８Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下、又は約１×１０−１２Ｍ以下のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害し、ＩＣ５０値は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０−６Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いたＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを用いて測定され、プロトキシン−ＩＩ変異体は、Ｗ７Ｑ及びＷ３０Ｌからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、残基の番号付けは、配列番号１に従う。
【００４８】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の実施形態は、ヒトＮａｖ１．７活性を阻害する単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体であり、このプロトキシン−ＩＩ変異体は、Ｗ７Ｑ及びＷ３０Ｌからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、残基の番号付けは、配列番号１に従う。
【００４９】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、このプロトキシン−ＩＩ変異体は、Ｗ７Ｑ置換を有する。
【００５０】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、このプロトキシン−ＩＩ変異体は、Ｗ３０Ｌ置換を有する。
【００５１】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、このプロトキシン−ＩＩ変異体は、Ｗ７Ｑ及びＷ３０Ｌ置換を有する。
【００５２】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、このプロトキシン−ＩＩ変異体は、実施例３に記載のプロトコルに従いＱＰａｔｃｈ分析を用いてＮａｖ１．７活性を測定したときに、Ｎａｖ１．７活性を少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％阻害する。
【００５３】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、このプロトキシン−ＩＩ変異体は、残基の番号付けが配列番号１に従うときに、Ｙ１、Ｗ７、Ｓ１１、Ｅ１２、Ｋ１４、Ｅ１７、Ｇ１８、Ｒ２２、Ｌ２９及びＷ３０の１つ又は２つ以上の残基位置で置換を有する。
【００５４】
位置Ｙ１における置換により、ヒトＮａｖ１．７に対する効能が改善される。
【００５５】
位置Ｗ７における置換により、プロトキシン−ＩＩ変異体のフォールディング及びタンパク質の収率が改善される。
【００５６】
位置Ｓ１１における置換により、ヒトＮａｖ１．７に対する選択性が改善される。
【００５７】
位置Ｅ１２における置換により、ヒトＮａｖ１．７に対する選択性が改善される。
【００５８】
位置Ｋ１４における置換により、ヒトＮａｖ１．７に対する選択性が改善される。
【００５９】
位置Ｅ１７における置換により、ヒトＮａｖ１．７に対する選択性が改善される。
【００６０】
位置Ｇ１８における置換により、ヒトＮａｖ１．７に対する選択性が改善される。
【００６１】
位置Ｌ２９における置換により、ヒトＮａｖ１．７に対する選択性が改善される。
【００６２】
位置Ｗ３０における置換により、プロトキシン−ＩＩ変異体のフォールディング及びタンパク質の収率及びＮａｖ１．７に対する選択性が改善される。
【００６３】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の実施形態は、配列ＹＣＱＫＷＭＱＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＷ−ＣＯＯＨ（配列番号４１６）を含む単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体であり、残基Ｙ１、Ｓ１１、Ｅ１２、Ｋ１４、Ｅ１７、Ｇ１８、Ｌ２９及び／又はＷ３０は、表１で示される他の任意のアミノ酸又は非天然アミノ酸で置換され、Ｎ末端伸張又はＣ末端伸張を任意に有する。
【００６４】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の実施形態は、配列ＹＣＱＫＷＭＱＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＬ−ＣＯＯＨ（配列番号４２２）を含む単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体であり、残基Ｙ１、Ｓ１１、Ｅ１２、Ｋ１４、Ｅ１７、Ｇ１８、Ｍ１９、Ｌ２９及び／又はＷ３０は、表１で示される他の任意のアミノ酸又は非天然のアミノ酸で置換され、Ｎ末端伸張又はＣ末端伸張を任意に有する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、以下で列挙される番号付けされた実施形態を含み、非天然のアミノ酸を少なくとも１つ含む。
【００６６】
非天然アミノ酸としては、アミノβ−アラニン（β−Ａｌａ）、及び３−アミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、４−アミノ酪酸などの他のω−アミノ酸；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシン又はサルコシン（ＭｅＧｌｙ）；オルニチン（Ｏｍ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）；ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；２−ナフチルアラニン（２−ＮａＩ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））；２−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（２−Ｆ））；３−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｆ））；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；α−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；Ｎ（ω）−メチル−Ｌ−アルギニン；Ｎ（ω），Ｎ（ω）−ジメチル−Ｌ−アルギニン（非対称）；４−グアニジノ−Ｌ−フェニルアラニン；Ｌ−Ｌｙｓ（Ｎ−ε−（Ｎ−α−パルミトイル−Ｌ−γ−グルタミル）；Ｌ−アスパラギル−４−アミノブタン；Ｌ−グルタミル−４−アミノブタン；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；ｐ−アミノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（ｐＮＨ２））；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）及びホモセリン（ｈＳｅｒ）；４−ブロモフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｂｒ）；５−ブロモトリプトファン（bromotryphophan）（Ｔｒｐ（５−Ｂｒ））；３−クロロチロシン（Ｔｙｒ（３−Ｃｌ））又はβ−クロロアラニンが挙げられる。
【００６７】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の実施形態は、配列
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＣＸ４Ｘ５ＷＸ６ＱＸ７ＣＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＣＣＸ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＣＸ１７ＬＷＣＸ１８ＫＫＬＸ１９（配列番号４３２）を含む単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体であり、
Ｘ１は、Ｇ、Ｐ、Ａ又は欠失であり；
Ｘ２は、Ｐ、Ａ、又は欠失であり；
Ｘ３は、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｒ又はＹであり；
Ｘ４は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ、Ｓ又はＹであり；
Ｘ５は、Ｋ、Ｓ、Ｑ又はＲであり；
Ｘ６は、Ｍ又はＦであり；
Ｘ７は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ又はＱであり；
Ｘ８は、Ｄ、Ｔ又はアスパラギル−４−アミノブタンであり；
Ｘ９は、Ｓ、Ａ、Ｒ、Ｉ又はＶであり；
Ｘ１０は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ、Ｑ、Ｙ又はグルタミル−４−アミノブタンであり；
Ｘ１１は、Ｒ又はＫであり；
Ｘ１２は、Ｋ、Ｑ、Ｓ、Ａ又はＦであり；
Ｘ１３は、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｌ、Ｎ又はグルタミル−４−アミノブタンであり；
Ｘ１４は、Ｇ、Ｑ又はＰであり；
Ｘ１５は、Ｍ又はＦであり；
Ｘ１６は、Ｖ又はＳであり；
Ｘ１７は、Ｒ、Ｔ又はＮ−ωメチル−Ｌ−アルギニンであり；並びに、
Ｘ１８は、Ｋ又はＲであり；並びに、
Ｘ１９は、Ｗ又はＬであり、
Ｎ末端伸張又はＣ末端伸張を任意に有する。
【００６８】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の実施形態は、配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＣＱＫＷＭＱＴＣＤＸ４Ｘ５ＲＸ６ＣＣＸ７Ｘ８Ｘ９ＶＣＲＬＷＣＫＫＫＸ１０Ｘ１１（配列番号７３７）を含む単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体であり、
Ｘ１は、Ｇ、Ｐ、Ａ、又は欠失であり；
Ｘ２は、Ｐ、Ａ、又は欠失であり；
Ｘ３は、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｒ又はＹであり；
Ｘ４は、Ｓ、Ａ、Ｒ、Ｉ又はＶであり；
Ｘ５は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ、Ｑ、Ｙ又はグルタミル−４−アミノブタンであり；
Ｘ６は、Ｋ、Ｑ、Ｓ、Ａ又はＦであり；
Ｘ７は、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｌ、Ｎ又はグルタミル−４−アミノブタンであり；
Ｘ８は、Ｇ、Ｑ又はＰであり；
Ｘ９は、Ｍ又はＦであり；
Ｘ１０は、Ｌ又はＶであり；並びに、
Ｘ１１は、Ｗ又はＬである。
【００６９】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、プロトキシン−ＩＩ変異体は、約１×１０−７Ｍ以下のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害し、ＩＣ５０値は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０−６Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いたＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを用いて測定される。
【００７０】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、このプロトキシン−ＩＩ変異体は、実施例３に記載のプロトコルに従いＱＰａｔｃｈ分析を用いてＮａｖ１．７活性を測定したときに、Ｎａｖ１．７活性を少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％阻害する。
【００７１】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長は、配列番号３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４又は３８５のアミノ酸配列を含む。
【００７２】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、Ｃ末端伸長は、配列番号３７４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６又は３９７のアミノ酸配列を含む。
【００７３】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、Ｎ末端及び／又はＣ末端伸長は、プロトキシン−ＩＩ変異体にリンカーを介して結合される。
【００７４】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号３８３、３９２、３９８、３９９、４００、４０１又は４０２のアミノ酸配列を含む。
【００７５】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長は、配列番号３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４又は３８５のアミノ酸配列からなる。
【００７６】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、Ｃ末端伸長は、配列番号３７４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６又は３９７のアミノ酸配列からなる。
【００７７】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号３８３、３９２、３９８、３９９、４００、４０１又は４０２のアミノ酸配列からなる。
【００７８】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の実施形態は、配列
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＣＸ４Ｘ５ＷＸ６ＱＸ７ＣＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＣＣＸ１３Ｘ１４ＦＸ１５ＣＸ１６ＬＷＣＸ１７ＫＫＬＷ（配列番号４０３）を含む単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体であり、
Ｘ１は、Ｇ、Ｐ、Ａ又は欠失であり；
Ｘ２は、Ｐ、Ａ又は欠失であり；
Ｘ３は、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｒ又はＹであり；
Ｘ４は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ又はＳであり；
Ｘ５は、Ｋ、Ｓ、Ｑ又はＲであり；
Ｘ６は、Ｍ又はＦであり；
Ｘ７は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ又はＱであり；
Ｘ８は、Ｄ又はＴであり、
Ｘ９は、Ｓ、Ａ又はＲであり、
Ｘ１０は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ又はＱであり、
Ｘ１１は、Ｒ又はＫであり；
Ｘ１２は、Ｋ、Ｑ、Ｓ又はＡであり；
Ｘ１３は、Ｅ、Ｑ又はＤであり；
Ｘ１４は、Ｇ又はＱであり；
Ｘ１５は、Ｖ又はＳであり；
Ｘ１６は、Ｋ又はＲであり；並びに、
Ｘ１７は、Ｋ又はＲであり；
Ｎ末端伸長又はＣ末端伸長を任意に有し、
ポリペプチドは、約１×１０−７Ｍ以下のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害し、このＩＣ５０値は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０−６Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いたＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを用いて測定される。
【００７９】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、強力なＮａｖ１．７阻害剤である。組み換え型プロトキシン−ＩＩ（配列番号２）は、ベラトリジン誘発脱分極阻害アッセイにおいて、ヒトＮａｖ１．７に対する約４×１０−９ＭのＩＣ５０値を有し、当該アッセイは、実施例３に記載の実験手順を用いたＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて、Ｎａｖ１．７を安定発現する細胞中にＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）の減少を測定する。上述のアッセイ及び実験３におけるＩＣ５０値が約３０×１０−９Ｍ以下のとき、すなわち組み換え型プロトキシン−ＩＩの１０倍以内のときに、プロトキシン−ＩＩ変異体は「強力な」Ｎａｖ１．７阻害剤であるといえる。明確にするために、ＩＣ５０が３０×１０−９Ｍということは、ＩＣ５０が３．０×１０−８Ｍということと同じである。
【００８０】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体ポリペプチドは、自動化されたペプチドシンセサイザーでの化学合成（例えば固相ペプチド合成）により、作製されしてもよい。あるいは、無細胞発現系、例えば網状赤血球溶解物ベースの発現系を用い、又は組み換え発現系を用いて、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから本発明のポリペプチドを得てもよい。当業者であれば、本発明のポリペプチドを得るための他の技術を理解するであろう。例示的な方法では、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、プロテアーゼ切断可能リンカー、例えばＨＲＶ３Ｃプロテアーゼに対する認識配列（ヒトライノウイルスからの組み換え型１４３Ｃプロテアーゼ）ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号８２）（ＨＲＶ３Ｃリンカー）に、グリシン−リッチリンカー、例えば（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号８０）又は（ＧＧＧＧＳ）６（配列番号８１）を結合させたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合タンパク質としてそれを発現させ、発現された融合タンパク質をＨＲＶ３Ｃプロテアーゼを用いて切断して組み換え型プロトキシン−ＩＩ変異体ペプチドを放出させることによって生成する。ヘキサヒスチジン（配列番号１０８）又は他のタグを用いて、公知の方法を用いた精製を容易にしてもよい。
【００８１】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、本明細書に記載の方法を用いて精製してもよい。例示的な方法では、ＨＳＡ融合タンパク質として発現され、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼによって切断された本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を、本明細書に記載する固相抽出（ＳＰＥ）を用いて精製してもよい。
【００８２】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるプロトキシン−ＩＩ変異体の生成は、Ｎ末端及び／又はＣ末端伸長を任意に有し、プロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質は、典型的には核酸レベルにおいて実現される。ポリヌクレオチドの合成は、縮重したオリゴヌクレオチドを用いて所望の変異体を生成する米国特許第６，５２１，４２７号及び同第６，６７０，１２７号に記載された方法による化学的遺伝子合成を用いてもよいし、又は標準的なＰＣＲクローニング及び変異誘発によってもよい。標準的なクローニング技術によって変異体のライブラリーを生成し、プロトキシン−ＩＩ変異体をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングしてもよい。
【００８３】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、配列番号１の野生型プロトキシン−ＩＩと比較したときに、更なるＮ−及び／又はＣ末端アミノ酸を取り入れてもよく、例えばクローニング及び／又は発現スキームによって得られる。例えば、ＨＳＡ−リンカー−ＨＲＶ３Ｃ切断可能なペプチド−プロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質として変異体の発現後にＨＳＡから切断すると、更なる２つの残基（例えばＧ及びＰ）が各プロトキシン−ＩＩ変異体のＮ末端に取り入れられる場合がある。
【００８４】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、本明細書に記載の方法を用いてそのヒトＮａｖ１．７阻害能を試験する。例示的なアッセイの１つに、Ｎａｖ１．７を安定的に発現する細胞中にＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）の低下を測定するベラトリジン誘導脱分極阻害アッセイがある。別の例示的なアッセイでは、公知のパッチクランプ技術を用い、また本明細書に記載したように、電気生理学的な記録法を用いてＮａｖ１．７を介した電流の変化を測定する。
【００８５】
本発明の別の実施形態は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５，２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８  ３６９、３７０、３７１、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４���９、４３０、４３１、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５又は７３６のアミノ酸配列を含み以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体である。
【００８６】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、約１×１０−７Ｍ以下、約１×１０−８Ｍ、約１×１０−９以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下、又は約１×１０−１２Ｍ以下のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７を阻害し得る。ＩＣ５０値の範囲を示す例示的な変異体は、配列番号３０、４０、４４、５２、５６、５６、５９、６５、７８、１０９、１１０、１１１、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６２、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７、１７８、１７９、１８０、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０、１９３、１９５、１９７、１９９、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２２４、２２６、２２７、２３１、２３２、２４３、２４４、２４５、２４７、２４９、２５２、２５５、２５８、２６１、２６３、２６４、２６５、２６６、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３３２、３３４、３３５、３３６、３３７、３３９、３４０、３４１、３４２、３４６、３５１、３５８、３５９、３６４、３６６、３６７、３６８、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０又は４３１に示されるアミノ酸配列を有する変異体である。
【００８７】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、このプロトキシン−ＩＩ変異体は、実施例３に記載のプロトコルに従いＱＰａｔｃｈ分析を用いてＮａｖ１．７活性を測定したときに、Ｎａｖ１．７活性を少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％阻害する。ＱＰａｔｃｈアッセイでＮａｖ１．７活性を少なくとも２５％阻害する例示的な変異体は、配列番号１０９、１３３、４０８、４０９、４１０、４１２、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３１、４３４、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４４、４４６、４４７、４４８、４５０、４５２、４５３、４５５、４５６、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６８、４６９、４７０、４７１、４７３、４７４、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８２、４８３、４８５、４８６、４８７、４９０、４９１、４９２、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０２、５０４、５０５、５０７、５０８、５１０、５１１、５１２、５１４、５１６、５１７、５１８、５１９、５２１、５２２、５２３、５２４、５２６、５２９、５３１、５３２、５３３、５３７、５４６、５５４、５５７、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６６、５７１、５７９、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６２１、６２２、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４及び６８５に示されるアミノ酸配列を有する変異体である。
【００８８】
表２、表３、表１４、表１８及び表２は、選択されたプロトキシン−ＩＩ変異体の配列を示す。
【００８９】
【表２−１】
2018511326.tif 000003
【００９０】
【表２−２】
2018511326.tif 000004
【００９１】
【表３−１】
2018511326.tif 000005
【００９２】
【表３−２】
2018511326.tif 000006
【００９３】
【表３−３】
2018511326.tif 000007
【００９４】
【表３−４】
2018511326.tif 000008
【００９５】
【表３−５】
2018511326.tif 000009
【００９６】
【表３−６】
2018511326.tif 000010
【００９７】
【表３−７】
2018511326.tif 000011
【００９８】
【表３−８】
2018511326.tif 000012
【００９９】
【表３−９】
2018511326.tif 000013
【０１００】
【表３−１０】
2018511326.tif 000014
【０１０１】
【表３−１１】
2018511326.tif 000015
【０１０２】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体は、約３×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害する。
【０１０３】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体は、約３×１０−８Ｍ〜１×１０−９のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害する。
【０１０４】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の実施形態は、アミノ酸配列ＧＰＱＣＸ１Ｘ２ＷＸ３ＱＸ４ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＣＣＸ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３ＣＸ１４ＬＷＣＸ１５ＫＫＬＬ（配列番号４３３）を含む単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体であり、
Ｘ１は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ又はＳであり；
Ｘ２は、Ｋ、Ｓ、Ｑ又はＲであり；
Ｘ３は、Ｍ又はＦであり；
Ｘ４は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ又はＱであり；
Ｘ５は、Ｄ又はＴであり、
Ｘ６は、Ｓ、Ａ又はＲであり、
Ｘ７は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ又はＱであり、
Ｘ８は、Ｒ又はＫであり；
Ｘ９は、Ｋ、Ｑ、Ｓ又はＡであり；
Ｘ１０は、Ｅ、Ｑ又はＤであり；
Ｘ１１は、Ｇ又はＱであり；
Ｘ１２は、Ｆ又はＭであり、
Ｘ１３は、Ｖ又はＳであり；
Ｘ１４はＲ又はＴであり；並びに
Ｘ１５はＫ又はＲである。
【０１０５】
約３０×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害する例示的なプロトキシン−ＩＩ変異体は、配列番号５６、７８、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２２、１２３、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４５、１４６、１４７、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５６、１５８、１５９、１６５、１７２、１７３、１７５、１７７、１７８、１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０、１９３、１９７、１９９、２０７、２１０、２１１、２１６、２１７、２２４、２６６、２７３、２８２、３３５、４０８、４０９、４１０、４２２、４２４、４２５、４２６、４２７及び４２８アミノ酸配列を含む変異体である。
【０１０６】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体は、ヒトＮａｖ１．７を選択的に阻害する。本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、組み換え型プロトキシン−ＩＩ（配列番号２）と比較したときに、Ｎａｖ１．７に対してより選択性である場合がある。ＱＰａｔｃｈ電気生理学アッセイにおいて、組み換え型プロトキシン−ＩＩは、Ｎａｖ１．７に対するＩＣ５０は約２．２×１０−９Ｍであり、Ｎａｖ１．６に対するＩＣ５０は約６２×１０−９Ｍであり、したがってＮａｖ１．６に対するＩＣ５０対Ｎａｖ１．７に対するＩＣ５０の比は、約２８倍である。本明細書で用いられるとき、「選択性」又は「選択的な」又は「より選択的な」又は「選択的に遮断する」又は「選択的に阻害する」は、プロトキシン−ＩＩ変異体について、Ｎａｖ１．６に対するＩＣ５０対Ｎａｖ１．７に対するＩＣ５０の比（ＩＣ５０（Ｎａｖ１．６）／ＩＣ５０（Ｎａｖ１．７））が約３０以上であるということを指す。Ｎａｖ１．６に対するＩＣ５０のアッセイは、ＱＰａｔｃｈ電気生理学アッセイにおいて、Ｎａｖ１．６を安定発現する細胞株を用いて、Ｎａｖ１．７に関して記載したのと同様の方法を用いて行ってもよい。
【０１０７】
選択性を向上させるために変異誘発され得るプロトキシン−ＩＩ内の残基位置（配列番号１に従う残基の付け）としては、残基７、１１、１２、１４、１７、１８及び１９、並びに任意に残基１、２０、２２及び２６が挙げられる。選択性を向上させるための例示的な置換は、Ｙ１Ｑ、Ｗ７Ｑ、Ｓ１１Ｒ、Ｓ１１Ａ、Ｅ１２Ｔ、Ｍ１９Ｆ、Ｖ２０Ｓ、Ｒ２２Ｔ、及びＫ２６Ｒである。選択性が向上した例示的なプロトキシン−ＩＩ変異体は、配列番号５６、５９、６５、７８、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２１、１２２、１２３、１２９、１３０、１３３、１５０、１９０、２１７、２８１、３２４、３２５又は３２６の変異体である。
【０１０８】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の実施形態は、配列ＧＰＸ１ＣＱＫＷＭＱＸ２ＣＤＸ３Ｘ４ＲＫＣＣＸ５ＧＦＸ６ＣＸ７ＬＷＣＸ８ＫＫＬＷ（配列番号４０５）を含む単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体であり、
Ｘ１は、Ｙ、Ｑ、Ａ、Ｓ又はＲであり、
Ｘ２は、Ｔ又はＳであり、
Ｘ３は、Ｓ、Ｒ又はＡであり、
Ｘ４は、Ｅ、Ｔ又はＮであり、
Ｘ５は、Ｅ又はＱであり、
Ｘ６は、Ｖ又はＳであり；
Ｘ７は、Ｒ又はＴであり；並びに
Ｘ８は、Ｋ又はＲであり；
プロトキシン−ＩＩ変異体は、約３×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害し、ヒトＮａｖ１．７を選択的に阻害する。
【０１０９】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体は、配列ＧＰＱＣＱＫＷＭＱＸ１ＣＤＸ２Ｘ３ＲＫＣＣＸ４ＧＦＸ５ＣＸ６ＬＷＣＸ８ＫＫＬＷ（配列番号４０６）を含み、
Ｘ１は、Ｔ又はＳであり、
Ｘ２は、Ｓ、Ｒ又はＡであり、
Ｘ３は、Ｅ、Ｔ又はＮであり、
Ｘ４は、Ｅ又はＱであり、
Ｘ５は、Ｖ又はＳであり；
Ｘ６は、Ｒ又はＴであり；並びに
Ｘ７は、Ｋ又はＲである。
【０１１０】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の実施形態は、配列番号４２２（ＧＰＱＣＱＫＷＭＱＴＣＤＲＥＲＫＣＣＥＧＦＶＣＴＬＷＣＲＫＫＬＷ−ＣＯＯＨ）のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一性のアミノ酸配列を含む単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体であり、
アミノ酸配列は、残基の番号付けが配列番号１に従うときに、位置７におけるＱ、及び位置３０におけるＬを有し、
ポリペプチドはヒトＮａｖ１．７の活性を阻害する。
【０１１１】
置換Ｗ７Ｑ及びＷ３０Ｌを有するプロトキシン−ＩＩ変異体は、野生型プロトキシン−ＩＩと比較したとき、フォールディング、収率及び選択性を向上させた。
【０１１２】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の実施形態は、配列番号７８のアミノ酸配列（ＧＰＱＣＱＫＷＭＱＴＣＤＲＥＲＫＣＣＥＧＦＶＣＴＬＷＣＲＫＫＬＷ−ＣＯＯＨ）と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一性のアミノ酸配列を含む単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体であり、
アミノ酸配列は、残基の番号付けが配列番号１に従うときに、位置１におけるＱ、位置７におけるＱ、及び位置１９におけるＦを有し、
ポリペプチドは、約３０×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害し、このＩＣ５０値は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０−６Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いたＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを用いて測定される。
ポリペプチドはＮａｖ１．７を選択的に阻害する。
【０１１３】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体は、Ｃ末端にカルボン酸、アミド、メチルアミド又はブチルアミド基を有する。Ｃ末端の修飾は、ルーチン的な合成法により実施できる。
【０１１４】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の実施形態は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５，２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８  ３６９、３７０、３７１、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、���２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５又は７３６のプロトキシン−ＩＩ変異体を含む単離された融合タンパク質である。このような第２のポリペプチドは、公知のリーダー若しくは分泌シグナル配列、又は合成配列であってもよく、例えば、クローニングステップ、又はタグ、例えばヘキサヒ���チジンタグ（配列番号１０８）由来のものでもよい。このような第２のポリペプチドは、半減期延長部分であってもよい。一実施形態では、単離された融合タンパク質には、半減期延長部分に結合された本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体が含まれる。
【０１１５】
使用できる例示的な半減期延長部分としては、公知のヒト血清アルブミン、トランスチレチン（ＴＴＲ）、サイロキシン結合グロブリン（ＴＧＢ）、アルブミン結合ドメイン、又はＦｃ若しくはそのフラグメントが挙げられる。生物学的に好適なポリマー又はコポリマーを用いてもよく、例えばエチレングリコール又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、例えばＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２００００、デキストラン、ポリリシン、異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル（例えばラウレート、ミリステート、ステアレート、アラキデート、ベヘネート、オレエート、アラキドネート、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサンニ酸、など）、オクタン又は炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ−又はポリサッカリド）である。体内分布を改善できる例示的な部分としては、ポリアミノ化（プトレシン、スペルミン又はスペルミジン等）、ハロゲン化（塩素、臭素、フッ素、ヨウ素）及びグリコシル化が挙げられる。これらの部分は、プロトキシン−ＩＩ変異体ポリペプチドとの直接の融合であってもよく、また標準的なクローニング及び発現技術によって生成してもよい。あるいは、公知の化学的結合法を用いて、当該部分を本発明の組み換えにより生成されたプロトキシン−ＩＩ変異体に結合させてもよい。あるいは、当該部分は、固相ペプチド合成において非コードアミノ酸として組み込まれてもよい。
【０１１６】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の実施形態では、本発明の融合タンパク質の半減期延長部分は、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンの変異体、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【０１１７】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される別の実施形態では、半減期延長部分はプロトキシン−ＩＩ変異体にリンカーを介して結合される。好適なリンカーはよく知られており、配列番号８０又は８１に示される配列を有するリンカーを含む。
【０１１８】
本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を取り入れている例示的な融合タンパク質は、配列番号８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１又は１０３のポリペプチド配列を有するものである。
【０１１９】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される、更なる部分を取り入れた本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、いくつかの公知のアッセイによって官能性に関して比較してもよい。例えば、ＰＥＧに結合されたプロトキシン−ＩＩ変異体の薬物動態学特性を、公知のインビボモデルで評価してもよい。
【０１２０】
更なるプロトキシン−ＩＩ変異体及びプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質は、本発明の範囲内である。本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体に対する更なる置換は、得られる変異体又は融合タンパク質が、親ペプチドと比較したときに同様の特徴を保持する限りにおいて実施できる。例示的な修飾は、例えば保存的置換がであり、それにより親分子と同様の特徴を有するプロトキシン−ＩＩ変異体が得られる。保存的置換とは、それらの側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で生じる置換である。遺伝子コードされるアミノ酸は、以下の４つのファミリーに分類できる：（１）酸性（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）；（２）塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）；（３）非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；及び（４）非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、時に、芳香族アミノ酸として共に分類される。あるいは、アミノ酸のレパートリーを、（１）酸性（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）；（２）塩基性（リシン、アルギニンヒスチジン）、（３）脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン）、セリン及びトレオニンは脂肪族ヒドロキシルとして別個に任意にグループ化される）；（４）芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；（５）アミド（アスパラギン、グルタミン）；並びに（６）イオウ含有（システイン及びメチオニン）（Ｓｔｒｙｅｒ（ｅｄ．），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９８１）。プロトキシン−ＩＩ変異体の非保存的置換（異なるクラスのアミノ酸間でのアミノ酸残基の置換を伴う）を行い、プロトキシン−ＩＩ変異体及びプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質の特性を向上させることができる。ポリペプチド又はその断片のアミノ酸配列の変化が機能相同体をもたらすか否かは、本明細書に記載のアッセイを用いて、修飾ポリペプチド又は断片が、非修飾ポリペプチド又は断片と同様の様式で反応を生じる能力を評価することによって、容易に決定できる。ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質（複数の交換が起こる）を同様に容易に試験できる。
【０１２１】
本発明の別の実施形態は、配列番号１の位置Ｗ７及び／又はＷ３０に対応している位置で少なくとも１つの置換を有する、単離されたファミリー３のクモ毒システインノットペプチドである。ファミリー３のクモ毒には、保存されたＣ末端領域を有する１４の毒素が含まれ、プロトキシン−ＩＩに加えて、κ−ＴＲＴＸ−Ｇｒ２ｂ、κ−ＴＲＴＸ−Ｇｒ２ｃ、κ−ＴＲＴＸ−Ｐｓ１ａ、κ−ＴＲＴＸ−Ｐｓ１ｂ、β−ＴＲＴＸ−Ｇｒ１ｂ、κ−ＴＲＴＸ−Ｃｊ２ａ、κ−ＴＲＴＸ−Ｃｊ２ｂ、κ−ＴＲＴＸ−Ｅｃ２ｃ、β−ＴＲＴＸ−Ｇｒ１ａ、κ−ＴＲＴＸ−Ｅｃ２ｂ、κ−ＴＲＴＸ−Ｅｃ２ａ及びβ／κ−ＴＲＴＸ−Ｃｊ２ａ、並びに図１４に示されるものが挙げられる。位置Ｗ７及び／又はＷ３０における置換は、ファミリー３のクモ毒システインノットペプチドのフォールディングを改善することが期待される。
【０１２２】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の実施形態は、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む単離された合成ポリヌクレオチドである。
【０１２３】
ある例示的な合成ポリヌクレオチドを本明細書に開示したが、遺伝子コードの縮重又は所定の発現系におけるコドンの選択を考慮すると、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体及びプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質をコードする他の合成ポリヌクレオチドも、本発明の範囲内である。例示的な合成ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２及び１０４に示されるポリヌクレオチド配列（本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質をコードする）である。当業者であれば、プロトキシン−ＩＩ変異体自体をコードする融合タンパク質におけるポリヌクレオチドセグメントを容易に特定できる。本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体又は融合タンパク質をコード化する合成ポリヌクレオチド配列は、目的とする宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を可能にする１つ又は複数の調節エレメント（例えばプロモーター及びエンハンサ）に操作可能に連結させてもよい。合成ポリヌクレオチドはｃＤＮＡであってもよい。
【０１２４】
本発明のポリヌクレオチドは、自動化されたポリヌクレオチドシンセサイザーでの化学合成、例えば固相ポリヌクレオチド合成によって作製され得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲに基づく複製、ベクターに基づく複製、又は制限酵素に基づくＤＮＡ操作技術などの他の技術によっても作製され得る。既知の配列のポリヌクレオチドを生成又は取得するための技術が公知である。
【０１２５】
本発明のポリヌクレオチドはまた、少なくとも１つの非コード配列、例えば転写だが非翻訳配列、終結シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定化配列、イントロン及びポリアデニル化シグナルを含み得る。また、ポリヌクレオチド配列は、更なるアミノ酸をコードする更なる配列を含み得る。これらの更なるポリヌクレオチド配列は、例えば、マーカー又は公知のタグ配列、例えばヘキサヒスチジン（配列番号１０８）又はＨＡタグ（融合ポリペプチドの精製を容易にする）をコードしてもよい。
【０１２６】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。そのようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現ベクター、トランスポゾンベースのベクター、又は任意の手段によって所与の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した任意の他のベクターであってよい。例えば、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体又はプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクター内に挿入して、発現ベクター内の制御配列（例えば、シグナル配列、プロモーター（例えば、天然の状態で結合するか又は異種のプロモーター）、エンハンサ要素、及び転写終結配列）に操作可能に連結させ、効率的な発現を実現してもよく、また本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体又はプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質を発現するように選抜された宿主細胞と適合するように選択する。ベクターが適切な宿主内に組み込まれると、組み込まれたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の高レベル発現に適する条件下に宿主を維持する。
【０１２７】
好適な発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、又は宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分として、宿主生物において複製可能である。通常、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたこれらの細胞の検出を可能にするため、アンピシリン耐性、ヒグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性、又はネオマイシン耐性などの選択マーカーを含む。
【０１２８】
好適なプロモーター及びエンハンサ因子は、当該技術分野において既知である。細菌細胞における発現の場合、好適なプロモーターとしては、限定されないが、ｌａｃｌ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ及びｔｒｃプロモーターが挙げられる。真核細胞における発現の場合、好適なプロモーターとしては、限定されないが、免疫グロブリン軽鎖及び／又は重鎖遺伝子プロモーター及びエンハンサ要素；サイトメガロウイルス最初期プロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、レトロウイルス由来の長鎖末端反復配列に存在するプロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター、及び様々な当該技術分野に既知の組織特異的プロモーターが挙げられる。酵母細胞における発現の場合、好適なプロモーターは、構成的プロモーター（例えばＡＤＨ１  ＰＧＫ１、ＥＮＯ又はＰＹＫ１プロモーターなど）、又は制御可能プロモーター（例えばＧＡＬ１又はＧＡＬ１０プロモーター）である。適切なベクター及びプロモーターの選択は、当業者の技量の範囲内である。
【０１２９】
数多くの好適なベクター及びプロモーターが当業者に既知であり、多くが、組み換え構築物を生成するために市販されている。例えば以下のベクターを提供する。細菌系：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓ  ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。真核細胞系：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【０１３０】
プロトキシン−ＩＩ変異体又はプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質の発現用の例示的なベクターは、アンピシリン耐性選択マーカー、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶイントロン、シグナルペプチド、ネオマイシン耐性、複製のｆ１起点、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、及び本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体又はプロトキシン−ＩＩ変異体融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを有するベクターである。
【０１３１】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。用語「宿主細胞」は、ベクターが導入された細胞を指す。当然のことながら、用語宿主細胞は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代をも指すものとする。変異又は環境による影響のいずれかにより、後の世代において特定の修飾が生じる可能性があるため、そのような後代は親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲内には依然として含まれる。そのような宿主細胞は、真核細胞、原核細胞、植物細胞、又は古細菌（archeal）細胞であってよい。
【０１３２】
大腸菌、バチルス・ズブチリスなどの桿菌、並びにサルモネラ菌、セラチア属及び種々のシュードモナス種などの他の腸内細菌が、原核宿主細胞の例である。酵母などの他の微生物も発現に有用である。好適な酵母宿主細胞の例は、サッカロミセス（例えば、Ｓ．セレビジアエ）及びピキアである。例示的な真核細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類、又は他の動物由来のものであってもよい。哺乳類真核細胞としては、不死化細胞株（例えばハイブリドーマ）又は骨髄腫細胞株（例えばＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ、ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株）が挙げられる。例示的なヒト骨髄腫細胞株は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。他の有用な細胞系としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ））、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６１）、又はＤＧ４４などの、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。
【０１３３】
ポリヌクレオチド（例えばベクター）を宿主細胞に導入することは、当業者に公知の方法によって行うことができる。例示的な方法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランを介したトランスフェクション、顕微注入法、カチオン性脂質を介したトランスフェクション及びエレクトロポレーション法である。
【０１３４】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を準備する工程と、少なくとも１つの本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体の発現に十分な条件下で宿主細胞を培養する工程とを含む、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体の製造方法である。
【０１３５】
宿主細胞は、所定のタイプの宿主細胞を維持又は増殖させるのに適し、かつポリペプチドを発現させるのに十分な任意の条件下で培養することができる。ポリペプチドの発現にとって十分な培養条件、培地、及び関連する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、多くの哺乳動物の細胞型を、適切に緩衝化したＤＭＥＭ培地を使用して３７℃で好気的に培養できる一方、細菌、酵母及び他の細胞型は、ＬＢ培地中、適切な雰囲気条件下で３７℃で培養することができる。
【０１３６】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明の方法において、プロトキシン−ＩＩ変異体の発現は、種々の公知の方法を用いて確認することができる。例えば、ポリペプチドの発現は、検出試薬を用いて（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はＨＰＬＣを用いて）確認することができる。
【０１３７】
本発明の別の態様は、生体組織におけるＮａｖ１．７の活性を調節する方法であり、この方法は、Ｎａｖ１．７を発現する生体組織を、Ｎａｖ１．７調節量の本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体と接触させることを含む。
【０１３８】
治療方法
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、痛みの症状又は感覚ニューロン機能障害若しくは交感神経ニューロン機能障害の他の疾患の治療、低減、又は緩和が望ましい任意の療法において用いてもよい。
【０１３９】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を用いて治療される痛みは、任意のタイプの痛み、例えば慢性の痛み、急性の痛み、神経障害性疼痛、侵害受容性の痛み、内臓痛、背痛、炎症状態に付随する痛み、術後の痛み、熱痛、又は疾患及び変性に付随する痛みであってもよい。
【０１４０】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体により治療される痛みは、Ｎａｖ１．７を介した痛みであってもよい。
【０１４１】
本明細書のＮａｖ１．７を介した痛みは、Ｎａｖ１．７チャネル活性の増加に少なくとも一部起因する痛みを指す。
【０１４２】
本発明の方法を用いて、任意の分類に属する動物被験体を治療することができる。このような動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。
【０１４３】
痛み及び／又はＮａｖ１．７を介した痛みは、例えば末梢神経障害、中枢神経障害、神経圧迫又は絞扼性神経障害、例えば手根管症候群、足根管症候群、尺骨神経圧迫、圧迫性神経根症、腰部脊柱管狭窄症、坐骨神経圧迫、脊髄根圧迫、肋間神経痛、圧迫性神経根症及び神経根下背部痛、脊髄根損傷、神経炎、自己免疫疾患、一般的炎症、慢性炎症性疾患、関節炎、リウマチ性疾患、狼瘡、変形性関節症、汎胃腸障害、大腸炎、胃潰瘍形成、十二指腸潰瘍、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、下痢に付随する痛み、炎症性眼疾患、炎症性又は不安定膀胱疾患、乾癬、炎症性要素を伴う皮膚疾患、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、炎症性痛覚及び付随する痛覚過敏及び異痛症、神経障害性疼痛及び付随する痛覚過敏及び異痛症、多発性硬化症、脱髄疾患、糖尿病、糖尿病神経障害性疼痛、灼熱痛、切断又は膿瘍に由来する痛み、幻肢痛、骨折痛、骨損傷、直接的外傷、ＨＩＶ感染、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、天然痘感染、ヘルペス感染、毒素又は他の異質粒子又は分子に対する暴露、浸潤癌、癌、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、火傷、先天性欠損症、歯痛、痛風の痛み、線維筋痛、脳炎、慢性アルコール中毒、甲状腺機能低下症、尿毒症及びビタミン欠乏、三叉神経痛、脳卒中、視床症候群、一般的頭痛、片頭痛、群発頭痛、緊張性頭痛、混合血管症候群及び非血管症候群、交感神経依存性疼痛、求心路遮断症候群、ぜんそく、上皮組織損傷又は機能障害、呼吸時の内臓運動能の障害、泌尿生殖器、胃腸又は血管領域、創傷、火傷、アレルギー性皮膚反応、掻痒症、血管運動神経性又はアレルギー性鼻炎、又は気管支疾患、月経困難症、労働及び送達中の痛み、消化不良、胃食道逆流、膵炎、及び臓器痛などの１つ又は複数の原因に由来し得る。
【０１４４】
本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体によって緩和されう得る、他の感覚ニューロン機能障害又は交感神経ニューロン機能障害による疾患には、痒み、咳、及びぜんそくが含まれる。マウスでは、ＳＣＮ９Ａ遺伝子の全体的欠失（global deletion）が生じると、ヒスタミン誘発性そう痒に対する完全無感覚に至る（Ｇｉｎｇｒａｓら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐａｉｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ２０１３及び米国特許出願公開第２０１２／０１８５９５６号）。この知見が示唆することは、例えば皮膚若しくは炎症性疾患；又は炎症性疾患（例えば腎臓若しくは肝胆汁性疾患）、免疫学的疾患、薬物反応及び未知／特発の症状（例えば、皮膚炎、乾癬、湿疹、昆虫刺症若しくは刺傷）などの種々の原因によって生じ得る痒みの治療において、ペプチドＮａｖ１．７遮断薬が有用となり得ることである。Ｎａｖ１．７は、気道を刺激する感覚神経でも発現され（Ｍｕｒｏｉら、Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１  Ｄｅｃ  １；５８９（Ｐｔ２３）：５６６３〜７６；Ｍｕｒｏｉら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１３  Ａｐｒ  １０）このことは、ペプチドＮａｖ１．７遮断薬が、咳（例えば急性又は慢性咳、あるいは胃食道逆流疾患からの炎症によって生じる咳）、及び気道の炎症性疾患（例えばぜんそく及びアレルギー関連の免疫応答、気管支けいれん、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、気腫、及びしゃっくり（しゃっくり（hiccoughs）、しゃっくり（singultus）））の治療において有用であることを示唆している。ｓｈＲＮＡを用いてモルモットの節状神経節内のＮａｖ１．７をインビボでサイレンシングすることによって、機械的プロービングによって誘発される咳反射がほぼ停止した（Ｍｕｒｏｉら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１３年４月１０日）。
【０１４５】
本発明の一態様は、対象における痒み、咳、又はぜんそくを緩和又は治療する方法であって、以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される治療的有効量の本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を、それを必要とする対象に、痒み、咳、又はぜんそくを緩和するのに十分な時間投与することによる、方法である。
【０１４６】
本発明の別の態様は、対象におけるＮａｖ１．７を介した痒み、Ｎａｖ１．７を介した咳、又はＮａｖ１．７を介したぜんそくを緩和又は治療する方法であって、以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される治療的有効量の本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を、それを必要とする対象に、痒み、咳、又はぜんそくを緩和するのに十分な時間投与することによる、方法である。
【０１４７】
本明細書で用いられる場合、Ｎａｖ１．７を介した痒みとは、Ｎａｖ１．７チャネル活性の増加に少なくとも部分的に由来する痒みを指す。
【０１４８】
本明細書で用いられる場合、Ｎａｖ１．７を介した咳とは、Ｎａｖ１．７チャネル活性の増加に少なくとも部分的に由来する咳を指す。
【０１４９】
本明細書で用いられる場合、Ｎａｖ１．７を介したぜんそくとは、Ｎａｖ１．７チャネル活性の増加に少なくとも部分的に由来するぜんそくを指す。
【０１５０】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、本明細書で説明した動物モデル、及び神経障害性疼痛のラット脊髄神経結紮（ＳＮＬ）モデル、カラギーナン誘発異痛症モデル、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバント（ＣＦＡ）誘発異痛症モデル、熱傷モデル、ホルマリンモデル及びＢｅｎｎｅｔｔモデルなどのモデル、並びに米国特許第２０１１／０１２４７１１号及び米国特許第７，９９８，９８０号に記載された他のモデルを用いて、痛み及び／又はＮａｖ１．７を介した痛みの低減又は緩和効果を試験してもよい。カラギーナン誘発異痛症及びＣＦＡ誘発異痛症は、炎症性疼痛のモデルである。ベネット（Bennett）モデルは、術後痛、複合性局所疼痛症候群、及び反射性交感神経性ジストロフィーを含む慢性疼痛の動物モデルを提供する。
【０１５１】
前述の動物モデルのいずれかを用いて、痛み及び／又はＮＡｖ１．７を介した痛みの治療における本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体阻害剤の有効性を評価してもよい。本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体の有効性を、無治療又はプラシーボ対照のものと比較してもよい。追加的に又は代替的に、有効性を、１つ又は複数の既知の鎮痛薬剤との比較により評価してもよい。
【０１５２】
本発明は、Ｎａｖ１．７を介した痛みを、以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を用いて治療する方法を提供するものである。文献における開示及び示唆とは異なり、本発明者らによる係属中の出願（米国特許出願第６１／７８１，２７６号）において、Ｎａｖ１．７遮断ペプチドの投与が、種々の動物モデルの痛みにおける痛みの治療及び／又は緩和に効果的であることが見出されている。過剰発現されたＮａｖ１．７を用いたインビトロ細胞培養モデル、又は血液神経関門がデシーシング又は高張食塩水の注射により破壊されている単離されたニューロンにおいて、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤が有効であり、及び／又はＮａｖ１．７に対して選択的であることが示されているが、痛みのインビボ動物モデルでは効果がないことが従来示されており、効果がない理由として、ペプチドが血液神経関門を通過できないことが報告されている。疼痛の動物モデルにおける、又は単離された神経におけるＮａｖ１．７遮断性ペプチドの有効性の欠如については、いくつかの文献に記載されている。例えば、Ｈａｃｋｅｌら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０９：Ｅ２０１８−２７、２０１２には、ＰｒｏＴｘ−ＩＩが単離された神経における活動電位発火を阻害することは、神経周囲関門（このモデルにおける拡散障壁となる）が危うくならない限り、できないことが記載されている。ＰｒｏＴｘ−ＩＩは、急性及び炎症性痛覚のげっ歯類モデルにおいて効果がないことが解っており、その説明によると、ＰｒｏＴｘ−ＩＩは血液神経関門を通過できないとのことである（Ｓｃｈｍａｌｈｏｆｅｒら、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７４：１４７６〜１４８４、２００８）。Ｎａｖ１．７ペプチド毒素遮断薬は経口バイオアベイラビリティが不十分であり、神経終末への送達が困難であることが提言されており、それらの治療薬としての使用が制限されることを示唆するものである（Ｄｉｂ−Ｈａｊｊら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １４、４９〜６２、２０１３）。
【０１５３】
Ｎａｖ１．７の発現は、末梢神経系において、例えば侵害受容後根神経節（ＤＲＧ）において、具体的には侵害受容小直径ＤＲＧニューロンにおいて、特に皮膚内の末梢端において、脳内表現がほとんどない状態で行われる。Ｎａｖ１．７の分布（例えば感覚神経終末）及び生理機能は、Ｎａｖ１．７が痛覚刺激の伝達に主要な役割を担う素因となっている。
【０１５４】
本発明の一実施形態は、Ｎａｖ１．７を介した痛みを治療する方法であって、以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される治療的有効量の本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を、それを必要とする対象に、Ｎａｖ１．７を介した痛みを治療するのに十分な時間投与することによる、方法である。
【０１５５】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、Ｎａｖ１．７を介した痛み、又は他の感覚ニューロン機能障害若しくは交感神経ニューロン機能障害の治療が望ましい任意の療法において用いてもよい。痛みの「処置」又は「治療」には、痛みの知覚を部分的若しくは完全に防止、停止、阻害、低減又は遅延することが含まれることを意味する。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、Ｎａｖ１．７を介した痛みは、慢性の痛み、急性の痛み、神経障害性疼痛、侵害受容性の痛み、内臓痛、背痛、術後の痛み、熱痛、幻肢痛、又は炎症状態に付随する痛み、肢端紅痛症（ＰＥ）、発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、リウマチ性関節炎、腰部椎間板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、疹後神経痛（ＰＨＮ）、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷若しくは多発性硬化症、又は疾患及び変性に付随する痛みである。
【０１５７】
神経因性疼痛としては、例えば、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、疹後神経痛（ＰＨＮ）、又は三叉神経痛（ＴＮ）が挙げられる。神経因性疼痛の他の原因としては、脊髄損傷、多発性硬化症、幻肢痛、脳卒中後痛、及びＨＩＶ関連痛が挙げられる。また、慢性的な背痛、変形性関節症、及び癌などの状態は、神経障害性関連の痛みの生成に至る場合があり、したがって潜在的に、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を用いた治療に適している。
【０１５８】
別の実施形態では、Ｎａｖ１．７を介した痛みは、原発性皮膚紅痛症（ＰＥ）、発作性激痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、関節リウマチ、腰椎椎間板切除、膵炎又は線維筋痛症に付随するものである。
【０１５９】
本発明の方法において、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を第２のポリペプチドに結合して、融合タンパク質を形成してもよい。このような融合タンパク質は、例えば、ペプチド阻害剤の半減期を延長するヒト血清アルブミンに対する公知のＦｃ融合である。結合は、リンカー（例えば、グリシン−セリンリッチリンカー）を介した直接結合であってもよい。このようなリンカーは当該技術分野では周知である。更なる部分を取り入れている本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、公知の方法及び本明細書に記載の方法を用いて、そのＮａｖ１．７遮蔽能力及び痛みの治療又は低減における有効性について比較することができる。
【０１６０】
本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を用いて治療できる感覚ニューロン機能障害又は交感神経ニューロン機能障害の他の疾患としては、ぜんそく、咳、胸焼け、痒み、皮膚炎、膀胱不安定性、及びＲｅｙｎａｕｄの疾患が挙げられる。
【０１６１】
医薬組成物
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、薬学的に許容されるビヒクル又は担体中に製剤化されてもよい。本発明の一実施形態は、本発明の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。
【０１６２】
適当なビヒクル又は担体は、場合により、非経口投与用の組成物において一般的な他の物質を補った注射用蒸留水、生理食塩水又は人工脳脊髄液であってよい。中性緩衝生理食塩水、又は血清アルブミンと混合された生理食塩水は、更なる例示的なビヒクルである。これらの溶液は無菌であり、粒子状物質を通常含まず、従来の周知の滅菌法（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は、ｐＨ調整及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤などの生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される賦形剤を含有することができる。適当なビヒクル及びそれらの配合及びパッケージングについては、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｔｒｏｙ，Ｄ．ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（２００５）Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ４０  ａｎｄ  ４１）に記載されている。
【０１６３】
本発明の方法において、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は末梢投与によって投与されてもよい。「末梢投与」又は「末梢に投与される」とは、中枢神経系の外側において対象に薬剤を導入することを意味する。末梢投与には、脊椎又は脳への直接投与以外のあらゆる投与経路が含まれる。
【０１６４】
末梢投与は、局所的又は全身的であってよい。関節、手術創、傷害／外傷部位、末梢神経線維、各種臓器（消化器、泌尿生殖器等）又は炎症組織への局所投与などの局所投与を用いることで、治療薬を作用部位に集中させることができる。全身投与では、医薬組成物は対象の末梢神経系のほぼ全体に送達されることになり、更に組成物の性質によっては中枢神経系にも送達される可能性がある。
【０１６５】
末梢投与経路には、これらに限定されるものではないが、局所投与、静脈内、皮下、筋肉内、関節内、又は他の注射、及び埋め込み式ミニポンプ、又は他の持続放出装置若しくは製剤が含まれる。
【０１６６】
化合物は、直接中枢神経系に投与（例えば鞘内又は嚢内投与）されてもよい。持続鞘内投与は、脊髄注入用の埋め込み式薬剤ポンプを使用して実施できる。
【０１６７】
本発明の医薬組成物には、本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を持続放出型又は制御放出型の製剤中に含有させた製剤が含まれる。これらの製剤は、例えば注射可能な微小球、生物分解性粒子、マイクロエマルション、ナノ粒子、ナノカプセル、マクロエマルション、高分子化合物（例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）、ポリグリコール酸又はエチレンビニルアセテートコポリマー）、ビーズ又はリポソーム、ヒアルロン酸又は埋め込み可能な薬物送達デバイスを用いることによって実現してもよい。
【０１６８】
以下で列挙される番号付けされた実施形態を含む、本明細書に開示される本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、非経口（皮下、筋肉内、又は静脈内）、脳内（実質内）、鞘内、関節内、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、又は病巣内投与用；持続放出システムによって若しくは埋め込み装置によって、又は任意の他の投与用（特に溶液又は懸濁液の形態での投与）；口腔又は舌下投与用（例えば錠剤又はカプセル形態）；又は鼻腔内投与用（例えば粉末、点鼻剤、若しくはエアロゾル、又はその他の薬剤の形態）；経皮投与用（ゲル、軟膏、ローション、クリーム若しくは粉剤、懸濁液若しくはパッチ送達システムの形態）に調製されてもよい。また、経皮投与では、皮膚構造を変化させるか若しくは経皮パッチ中の薬物濃度を増加させる、又はタンパク質及びペプチドを含む製剤を皮膚上に塗布することを可能にする（国際公開第９８／５３８４７号）、若しくは一次的な輸送経路を形成する（例えば電気穿孔法）、若しくは皮膚を通過する荷電薬剤の移動性を向上させる（例えばイオン導入法）、電界の印加を可能にする、又は超音波の印加する（例えばソノフォレーシス）（米国特許第４，３０９，９８９号及び第４，７６７，４０２号）ことを可能にする、化学的促進剤を用いて調製されてもよい。組成物は、所望の分子が吸収又は封入された膜、スポンジ、又は別の適当な材料の埋め込みによって局所的に投与されてもよい。
【０１６９】
特定の実施形態では、埋め込み式装置が使用される場合には、この装置は任意の適当な組織又は臓器内に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス（timed-release bolus）、又は持続投与により行ってもよい。
【０１７０】
このような製剤処方における本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤の濃度は、大幅に、例えば約０．１重量％、０．２重量％、０．３重量％、０．４重量％、０．５重量％、０．６重量％、０．７重量％、０．８重量％、０．９重量％、１．０重量％、１．１重量％、１．２重量％、１．３重量％、１．４重量％、１．５重量％、１．６重量％、１．７重量％、１．８重量％、１．９重量％、２重量％から、又は２重量％〜５重量％、最大で１５重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、又は７０重量％程度まで変えることができ、主に流体体積、粘性率、及び選択した特定の投与方法による他の要因に基づいて選択することができる。本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体は、貯蔵用に凍結乾燥して、使用前に好適なビヒクル中で再構成することができる。この技術は、従来のタンパク質調製に対して効果的であることが分かっている。凍結乾燥及び再構成の技術は当該技術分野において公知である。
【０１７１】
本発明の例示的な医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、又は約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸塩緩衝液を含んでよく、ソルビトール、スクロース、Ｔｗｅｅｎ−２０、及び／又はこれらの適当な代用物を更に含んでよい。
【０１７２】
適切な治療的に効果的な有効な用量は、当業者であれば容易に決定することができる。有効な用量は、望ましい結果をもたらすのに十分な量又は用量、すなわち任意の疼痛医学的状態に付随する痛みの知覚を部分的若しくは完全に防止し、停止し、阻害し、低減し、又は遅延するのに十分な量又は用量を指す。有効な量は、特定のビヒクル及び選択された本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体に応じて変わってもよく、また治療すべき対象及び痛みの重症度に関係する種々の要因及び状態に依存している。例えば、本発明の医薬組成物を投与すべき対象の年齢、体重、及び健康状態などの要因、並びに前臨床動物研究において得られる用量反応曲線及び毒性データが、考慮事項として挙げられる。必要に応じて、決定された用量を、治療期間中、医師又は他の当業者（例えば、看護士、獣医、又は獣医技師）によって適切に選択された適切な時間間隔で反復投与してもよい。所与の薬剤の有効量又は治療的有効量の決定は、当業者の技量の範囲内である。
【０１７３】
したがって、本発明の医薬組成物は、筋肉注射用に、１ｍＬの滅菌緩衝液、及び約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又は約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を含有させて調製することができる。同様に、本発明の医薬組成物は、静脈内注射用に、約２５０ｍＬの滅菌済みＲｉｎｇｅｒ溶液及び約１ｍｇ〜約３０ｍｇ又は約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のプロトキシン−ＩＩ変異体を含有させて調製することができる。非経口投与可能な組成物を実際に調製する方法は周知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに詳細に記載されている。
【０１７４】
本発明の更なる実施形態
以下に、本明細書の他の箇所の開示に従う、本発明の更なる実施形態を列挙する。本明細書に開示される本発明に関連するものとして上述された本発明の実施形態の特徴は、これらの番号付けされた更なる実施形態のうちの１つ１つにもまた関係する。
１）Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＣＸ４Ｘ５ＷＸ６ＱＸ７ＣＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＣＣＸ１３Ｘ１４ＦＸ１５ＣＸ１６ＬＷＣＸ１７ＫＫＬＷ（配列番号４０３）の配列を含む単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体であり、
Ｘ１は、Ｇ、Ｐ、Ａ又は欠失であり；
Ｘ２は、Ｐ、Ａ又は欠失であり；
Ｘ３は、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｒ又はＹであり；
Ｘ４は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ又はＳであり；
Ｘ５は、Ｋ、Ｓ、Ｑ又はＲであり；
Ｘ６は、Ｍ又はＦであり；
Ｘ７は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ又はＱであり；
Ｘ８は、Ｄ又はＴであり、
Ｘ９は、Ｓ、Ａ又はＲであり、
Ｘ１０は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ又はＱであり、
Ｘ１１は、Ｒ又はＫであり；
Ｘ１２は、Ｋ、Ｑ、Ｓ又はＡであり；
Ｘ１３は、Ｅ、Ｑ又はＤであり；
Ｘ１４は、Ｇ又はＱであり；
Ｘ１５は、Ｖ又はＳであり；
Ｘ１６は、Ｒ又はＴであり；並びに
Ｘ１７は、Ｋ又はＲであり；
Ｎ末端伸長又はＣ末端伸長を任意に有し、
ポリペプチドは、約１×１０−７Ｍ以下のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害し、このＩＣ５０値は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０−６Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いたＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを用いて測定される。
２）Ｎ末端伸長が、配列番号３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４又は３８５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
３）Ｃ末端伸長が、配列番号３７４、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６又は３９７のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
４）Ｎ末端及び／又はＣ末端伸長が、プロトキシン−ＩＩ変異体にリンカーを介して結合される、請求項２又は３に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体
５）リンカーが、配列番号３８３、３９２、３９８、３９９、４００、４０１又は４０２のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
６）配列番号３０、４０、４４、５２、５６、５６、５９、６５、７８、１０９、１１０、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６２、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７、１７８、１７９、１８０、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０、１９３、１９５、１９７、１９９、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２２４、２２６、２２７、２３１、２３２、２４３、２４４、２４５、２４７、２４９、２５２、２５５、２５８、２６１、２６３、２６４、２６５、２６６、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３３２、３３４、３３５、３３６、３３７、３３９、３４０、３４１、３４２、３４６、３５１、３５８、３５９、３６４、３６６、３６７、又は３６８のアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体。
７）約３×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体。
８）約３×１０−８Ｍ〜約１×１０−９ＭのＩＣ５０値でヒトＮａｖ１．７活性を阻害する、請求項７に記載の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体。
９）アミノ酸配列ＧＰＱＣＸ１Ｘ２ＷＸ３ＱＸ４ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＣＣＸ１０Ｘ１１ＦＸ１２ＣＸ１３ＬＷＣＸ１４ＫＫＬＷ（配列番号：４０４）を含み、
Ｘ１は、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ａ又はＳであり；
Ｘ２は、Ｋ、Ｓ、Ｑ又はＲであり；
Ｘ３は、Ｍ又はＦであり；
Ｘ４は、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ｋ又はＱであり；
Ｘ５は、Ｄ又はＴであり、
Ｘ６は、Ｓ、Ａ又はＲであり、
Ｘ７は、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｋ、Ｔ又はＱであり、
Ｘ８は、Ｒ又はＫであり；
Ｘ９は、Ｋ、Ｑ、Ｓ又はＡであり；
Ｘ１０は、Ｅ、Ｑ又はＤであり；
Ｘ１１は、Ｇ又はＱであり；
Ｘ１２は、Ｖ又はＳであり；
Ｘ１３は、Ｒ又はＴであり；並びに
Ｘ１４は、Ｋ又はＲである、請求項７又は８に記載の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体。
１０）配列番号５６、７８、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２２、１２３、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４５、１４６、１４７、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５６、１５８、１５９、１６５、１７２、１７３、１７５、１７７、１７８、１８３、１８４、１８５、１８６、１８９、１９０、１９３、１９７、１９９、２０７、２１０、２１１、２１６、２１７、２２４、２６６、２７３、２８２又は３３５のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体。
１１）変異体が、ヒトＮａｖ１．７を選択的に阻害する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体。
１２）配列ＧＰＸ１ＣＱＫＷＭＱＸ２ＣＤＸ３Ｘ４ＲＫＣＣＸ５ＧＦＸ６ＣＸ７ＬＷＣＸ８ＫＫＬＷ（配列番号４０５）を含み、
Ｘ１は、Ｙ、Ｑ、Ａ、Ｓ又はＲであり、
Ｘ２は、Ｔ又はＳであり、
Ｘ３は、Ｓ、Ｒ又はＡであり、
Ｘ４は、Ｅ、Ｔ又はＮであり、
Ｘ５は、Ｅ又はＱであり、
Ｘ６は、Ｖ又はＳであり；
Ｘ７は、Ｒ又はＴであり；並びに
Ｘ８は、Ｋ又はＲである、請求項１１に記載の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体。
１３）配列番号５６、５９、６５、７８、１１１、１１４、１１７、１１８、１１９、１２１、１２２、１２３、１２９、１３０、１３３、１５０、１９０、２１７、２８１、３２４、３２５又は３２６のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体。
１４）配列ＧＰＱＣＱＫＷＭＱＸ１ＣＤＸ２Ｘ３ＲＫＣＣＸ４ＧＦＸ５ＣＸ６ＬＷＣＸ８ＫＫＬＷ（配列番号４０６）を含み、
Ｘ１は、Ｔ又はＳであり、
Ｘ２は、Ｓ、Ｒ又はＡであり、
Ｘ３は、Ｅ、Ｔ又はＮであり、
Ｘ４は、Ｅ又はＱであり、
Ｘ５は、Ｖ又はＳであり；
Ｘ６は、Ｒ又はＴであり；並びに
Ｘ７は、Ｋ又はＲである、請求項１２に記載の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体。
１５）単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体であって、配列番号７８（ＧＰＱＣＱＫＷＭＱＴＣＤＲＥＲＫＣＣＥＧＦＶＣＴＬＷＣＲＫＫＬＷ−ＣＯＯＨ）のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一性のアミノ酸配列を含み、
ａ）アミノ酸配列が、残基番号付けが配列番号１に従うときに、位置１におけるＱ、位置７におけるＱ、及び位置１９におけるＦを有し、
ｂ）ポリペプチドが、約３０×１０−９Ｍ以下のＩＣ５０値でＩＣ５０値の測定を、阻害し、このＩＣ５０値は、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞中に２５×１０−６Ｍの３−ベラトロイルベラセビンの存在下で、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いたＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイを用いて測定され、
ｃ）ポリペプチドが、Ｎａｖ１．７を選択的に阻害する、単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体。
１６）遊離Ｃ末端カルボン酸、アミド、メチルアミド又はブチルアミド基を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体。
１７）半減期延長部分に結合した、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体を含む、単離された融合タンパク質。
１８）半減期延長部分が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、Ｆｃ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１７に記載の融合タンパク質。
１９）請求項１２又は１５に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
２０）請求項１９に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
２１）請求項２０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
２２）単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体を製造する方法であって、請求項２１に記載の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって生成されたプロトキシン−ＩＩ変異体を回収することとを含む、方法。
２３）請求項１、６、１２、１３又は１５に記載の単離されたプロトキシン−ＩＩ変異体と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
２４）対象におけるＮａｖ１．７を介した痛みを治療する方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体を、痛みの治療に有効な量で、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
２５）痛みが、慢性の痛み、急性の痛み、神経障害性疼痛、癌による痛み、侵害受容性の痛み、内臓痛、背痛、術後の痛み、熱痛、幻肢痛、又は炎症状態に付随する痛み、肢端紅痛症（ＰＥ）、発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、リウマチ性関節炎、腰部椎間板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、疹後神経痛（ＰＨＮ）、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷又は多発性硬化症である、請求項２４に記載の方法。
２６）プロトキシン−ＩＩ変異体が、末梢に投与される、請求項２４に記載の方法。
２７）プロトキシン−ＩＩ変異体が、関節、脊髄、手術創、傷害若しくは外傷部位、末梢神経線維、泌尿生殖器臓器、又は炎症組織に局所的に投与される、請求項２４に記載の方法。
２８）対象がヒトである、請求項２４に記載の方法。
２９）痛みの治療を必要とする対象における痛みの治療に使用される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体。
３０）痛みが、慢性の痛み、急性の痛み、神経障害性疼痛、癌による痛み、侵害受容性の痛み、内臓痛、背痛、術後の痛み、熱痛、幻肢痛、又は炎症状態に付随する痛み、肢端紅痛症（ＰＥ）、発作性高度疼痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、リウマチ性関節炎、腰部椎間板切除術、膵炎、線維筋痛、有痛性糖尿病性神経障害（ＰＤＮ）、疹後神経痛（ＰＨＮ）、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷又は多発性硬化症である、請求項２９に記載の使用のためのプロトキシン−ＩＩ変異体。
３１）プロトキシン−ＩＩ変異体が、末梢に投与される、請求項２９又は３０に記載の使用のためのプロトキシン−ＩＩ変異体。
３２）プロトキシン−ＩＩ変異体が、関節、脊髄、手術創、傷害若しくは外傷部位、末梢神経線維、泌尿生殖器臓器、又は炎症組織に局所的に投与される、請求項２９、３０又は３１に記載の使用のためのプロトキシン−ＩＩ変異体。
【０１７５】
次に、本発明を以下の特定の非限定的な実施例を参照して説明する。
【実施例】
【０１７６】
実施例１：プロトキシン−ＩＩ変異体の設計及び生成
プロトキシン−ＩＩの一部位限定アミノ酸置換スキャニングライブラリーを設計し、選択性、ペプチド収率、及び同質性をどの程度まで向上させることができるかを評価した。
【０１７７】
プロトキシン−ＩＩ変異体を、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ切断可能なＨＳＡ融合タンパク質として、Ｎ末端からＣ末端まで、６ｘＨｉｓ−ＨＳＡ−リンカー−ＨＲＶ３Ｃ切断可能なペプチド−プロトキシン−ＩＩ変異体（配列番号１０８として開示される「６ｘＨｉｓ」）のフォーマットで設計した。リンカーは（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号８０であり、ＨＳＡは配列番号１０６の配列を有し、ＨＲＶ３Ｃは配列番号８２の配列を有する切断可能なペプチドである）。各プロトキシン−ＩＩ変異体は、ＨＳＡから切断した後に、切断部位からの残りのＮ末端ＧＰを有していた。
【０１７８】
ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａを用いる膜脱分極アッセイにおいて、実施例３のＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜脱分極アッセイで記載されるように、及びＱＰａｔｃｈアッセイを用いる全細胞パッチクランプ実験において、実施例３で記載されるように、変異体の特性評価を行った。
【０１７９】
天然ペプチドと比較して更に向上した効能及び選択性プロファイルを有するＮａｖ１．７アンタゴニストを生成する目的で、選択された単一位置ヒット化合物の相加的効果について試験するためのコンビナトリアルライブラリーを設計した。
【０１８０】
発現ベクターの構造
設計されたプロトキシン−ＩＩ変異体遺伝子の生成を、米国特許第６，５２１，４２７号に記載された合成遺伝子構築技術を用いて行った。設計されたペプチド変異体のアミノ酸配列を、ヒトの高頻度コドンを用いてＤＮＡ配列に逆翻訳したた。各変異体遺伝子のＤＮＡ配列を、ＤＮＡクローニング部位を含むベクターＤＮＡの一部と共に、一部が縮重コドンを含む複数のオリゴヌクレオチドとして合成し、これらを完全長のＤＮＡフラグメントに組み」立てた。組み立てられたＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅した後、ＰＣＲ産物をプールとしてクローニングした。プールしたＰＣＲ産物を、適切な制限酵素を用いて消化し、各毒素変異体遺伝子をベクター内に含まれるシグナルペプチド及び融合パートナ（６ｘＨｉｓ−ＨＳＡ−リンカー−ＨＲＶ３Ｃ切断可能なペプチド（配列番号１０８として開示された「６ｘＨｉｓ」）に融合するようにして、設計した発現ベクターにクローニングした。標準的な分子生物学の手法を用いて、各設計した変異体について陽性クローンを特定した。これらの陽性クローンからのプラスミドＤＮＡを精製し、配列を確認した後、プロトキシン−ＩＩペプチド変異体融合タンパク質を標準的な方法を用いて発現させた。
【０１８１】
タンパク質発現
ＨＥＫ  ２９３−Ｆ細胞を２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃１２３３８）内で維持し、細胞濃度が１．５〜２．０×１０６細胞／ｍＬとなったときに分割した。加湿インキュベーター（３７℃及び８％  ＣＯ２に設定）内で懸濁液を１２５ＲＰＭで振とうしながら、細胞培養を行った。ＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞を１．０×１０６細胞／ｍＬに希釈した後、ＤＮＡ／脂質複合体を用いて一過性にトランスフェクションした。複合体を生成するために、トランスフェクション１ｍＬ当たり１．２５μｇのＤＮＡを１．０ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃１２３０９）で希釈し、１．２５ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ  ＃１６４４７）を、１．０ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ培地で希釈した。ＤＮＡ及びＭａｘトランスフェクション試薬を一緒に混合し、細胞に添加する前に、１０分間室温でインキュベートした。加湿インキュベーター（３７℃及び８％  ＣＯ２に設定）内で、トランスフェクトされた細胞を、１２５ＲＰＭで振盪しながら４日間維持した。５，０００×ｇにおいて１０分間遠心分離を行い、０．２μｍフィルタ（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃａｔ＃４３１１５３）を通して濾過した後、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  １０Ｋ（Ｃａｔ＃ＵＦＣ９０１０９６）を使用して３，７５０×ｇで約１０分間遠心分離し、上澄みを細胞から分離した。
【０１８２】
実施例２：プロトキシン−ＩＩ変異体の精製
プロトキシン−ＩＩ変異体を、実施例１に示したＨＳＡ融合タンパク質として発現させ、プロトキシン−ＩＩ変異体ペプチドをＨＲＶ３Ｃプロテアーゼによって切断した後、精製を行った。プロトキシン−ＩＩ変異体の効率的な精製に関し、２つの方法を試験した。
【０１８３】
タンパク質の精製
ＲＰ−ＨＰＬＣによるプロトキシン−ＩＩ変異体の精製
１ｍＬのＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃａｔ＃１７−５２４７−０１）を用い、ＩＭＡＣにより、分泌タンパク質を発現上清から精製した。ＡＫＴＡ  Ｘｐｒｅｓｓを使用してクロマトグラフィー法を行い、イミダゾールの段階的勾配を用いてタンパク質をカラムから溶出させた。ピーク分画をプールし、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（１μｇプロテアーゼ／１５０μｇ融合物）を用いて一晩消化させた。
【０１８４】
逆相Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５μｍ  Ｃ１８（２）カラム（Ｃａｔ＃００Ｂ−４２５２−Ｐ０−ＡＸ）を装着したＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣシステムを用いて、切断されたペプチド融合プールを更に精製した。０〜６８％アセトニトリル（０．０５％  ＴＦＡ）直線勾配を用いて、サンプルをカラムから溶出した。溶出画分をプールし、一晩凍結乾燥し、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ｐＨ７．４）（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭグルコース、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に再構成した。
【０１８５】
ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製されたプロトキシン−ＩＩ変異体の収率を表４に示す。平均収率は０．０１６１５ｍｇ／Ｌであった。
【０１８６】
【表４】
2018511326.tif 000016
【０１８７】
固相抽出（ＳＰＥ）によるプロトキシン−ＩＩ変異体の精製
１ｍＬのＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃａｔ＃１７−５２４７−０１）を用い、ＩＭＡＣにより、分泌タンパク質を発現上清から精製した。ＡＫＴＡ  Ｘｐｒｅｓｓを使用してクロマトグラフィー法を行い、イミダゾールの段階的勾配を用いてタンパク質をカラムから溶出させた。ピーク分画をプールし、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（１μｇプロテアーゼ／１５０μｇ融合）を用いて一晩消化させた。切断後のサンプルを５０ｋＤａ分子量カットオフ遠心フィルタユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＵＦＣ８０５０９６）内に充填し、切断されたペプチドを濾液分画内に回収した。
【０１８８】
ペプチドのプールを９６ウェルの固相抽出ブロック（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  Ｐｌｅｘａ  Ａ３９６９０３０）に充填し、更に精製、脱塩及び濃縮を行った。ブロックを真空マニフォールド（Ｗｈａｔｍａｎ）と共に用いた。ペプチドサンプルを０．０５％  ＴＦＡ水溶液に充填及び洗浄し、０．０５％  ＴＦＡ水溶液を用いたアセトニトリルの段階的勾配を用いて溶出させた。溶出画分を次に一晩凍結乾燥し、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、ｐＨ７．４（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭグルコース、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中に再構成した。
【０１８９】
ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、ｐＨ７．４（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭグルコース、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を補ってペプチドを再構成し、吸光度の測定を２８０ｎｍで行った。次に、各サンプルの吸光度係数を用いて濃度値を算出した。２μｇの各ペプチドをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ  １５ウェルのゲル上に充填し、ＭＥＳ緩衝液（非還元）中で実行した。
【０１９０】
Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）分析カラム（Ｃａｔ＃００Ａ−４０４１−Ｂ０）を装着したＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣ上において、０．０５％  ＴＦＡの直線勾配中の４〜８０％アセトニトリルを用いて、サンプルの分析を行った。すべてのペプチドの濃度を標準化し、合計１．３μｇ／サンプルに対して１０μＬを注入した。吸光度を２２０ｎｍにおいてモニターし、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアを用いてクロマトグラム分析を行った。
【０１９１】
ＳＰＥによって精製されたプロトキシン−ＩＩ変異体の収率（ｍｇ）を表５に示す。平均収率（ｍｇ／Ｌ）は０．０５３５３であった。
【０１９２】
ＳＰＥ精製プロセスの効果により、サンプルの処理が、ＲＰ−ＨＰＬＣ上での順次的処理ではなく９６−ウェルブロック内での並列的に行われるため、精製が容易になり、スループット並びに収率が向上した。ＲＰ−ＨＰＬＣの場合と比較し、ＳＰＥによって精製された変異体の収率（ｍｇ／Ｌ）は、平均で３倍超高かった。
【０１９３】
【表５−１】
2018511326.tif 000017
【０１９４】
【表５−２】
2018511326.tif 000018
【０１９５】
実施例３：プロトキシン−ＩＩ変異体の特徴付け
選択プロトキシン−ＩＩ変異体を膜脱分極及び全細胞パッチクランプアッセイにおいて特性評価を行い、その効能及びＮａｖ１．７に対する選択性を評価した。
【０１９６】
ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ膜における脱分極アッセイ
生成されたペプチドによる、Ｎａｖ１．７作動薬ベラトリジン（３−ベラトロイルベラセビン；Ｂｉｏｍｏｌ、Ｃａｔａｌｏｇ＃ＮＡ１２５）によって誘発される膜脱分極の阻害能を、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ上のＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイを使用し、ＤＩＳＢＡＣ２（３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋ１０１８）を電子受容体として、ＰＴＳ１８（トリナトリウム８−オクタデシルオキシピレン−１，３，６−トリスルホネート）（Ｓｉｇｍａ）をドナーとして用いて、ドナーを３９０〜４２０ｎｍで励起して、ＦＲＥＴを５１５〜５７５ｎｍで測定することによって、測定した。
【０１９７】
１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、４００μｇ／ｍＬジェネティシン、及び１００μＭ  ＮＥＡＡ（試薬はすべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を補ったＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（１：１）において、ヒトＮａｖ１．７を安定発現するＨＥＫ２９３細胞を培養した。ポリリジンコーティングされた３８４−ウェルの黒色の透明底プレート内に、５０μＬの採取細胞を２５，０００細胞／ウェル、でプレーティングした。プレートを室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートした後、３７℃で一晩中インキュベートした。インキュベートはすべて、特に明記しない限り暗所で行った。翌日、アッセイ緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）を用いてウェルを４回洗浄し、２５μＬのアッセイ緩衝液に再懸濁した。ＤＭＳＯ中の１０％プルロニックＦ１２７に色素を１：１（ｖ／ｖ比）で懸濁させ、ＰＴＳ１８色素の２ｘストック（６μＭ）を調製した。２５μＬの２ｘ  ＰＴＳ１８ストックをウェル内に添加し、細胞を３０分間室温で染色した後、アッセイ緩衝液を用いて色素を洗い流した。アッセイ緩衝液（１０μＭ  ＤＩＳＢＡＣ２（３）及び４００μＭ  ＶＡＢＳＣ−１を含む）中に最終濃度の３倍の濃度となるようにペプチドを懸濁させ、バックグラウンド蛍光を抑制した（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃２０１９８７）。２５μＬ／ウェルの懸濁されたペプチドを各ウェルに添加し、６０分間室温でインキュベートした。最終濃度２５μＭのベラトリジンによって（７５μＭ（３ｘ）ストック溶液を２５μＬ／ウェルで添加することによって）脱分極を誘発し、アゴニストを添加した３０〜１００秒後に、ＦＲＥＴ色素蛍光の平均強度の減少を測定した。常法に従いベラトリジンを添加した後、測定済みの各ペプチドの１．３倍希釈を行い、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａアッセイの開始時の濃度を報告する。
【０１９８】
各実験系において合成プロトキシン−ＩＩ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の濃度反応曲線を作成し、対照として用いた。シグナルを、陰性対照（作動薬ベラトリジン単独に対応する）値と陽性対照（１０μＭテトラカインの存在下でのベラトリジンに対応する）値との差に対して標準化することによって、各ウェルに対する蛍光カウントを％応答に変換した。測定を行うために、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａの「空間均一性補正」（すべての蛍光トレースを平均初期開始強度に標準化）及び「バイアス値減算」（初期開始強度を各トレースから減算）をオンにした。各データポイントは、各ウェルにおける応答を表わしていた。すべての個々のデータポイントを非線形最小二乗法フィッティングにおいて用いて、Ｏｒｉｇｉｎ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）を用いてＨｉｌｌ関数に対するベストフィットを求めた。得られた近似曲線からＩＣ５０値を算出した。陽性（Ｐ）及び陰性（Ｎ）対照の平均応答を用いて、ウェルにおける％応答の算出を以下のように行った：％応答＝１００＊（Ｎ−Ｒ）／（Ｎ−Ｐ）。
【０１９９】
その日の対照アンタゴニストの効能がその履歴平均の±０．５対数単位内である場合に、アッセイプレートを容認した。
【０２００】
ＱＰａｔｃｈアッセイ
ヒトＮａｖ１．５（配列番号１０５）、Ｎａｖ１．７（配列番号７９）又はＮａｖ１．６（配列番号４０７）を安定発現するＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、４００μｇ／ｍＬジェネティシン、及び１００μＭ  ＮＥＡＡ（試薬はすべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を補ったＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（１：１）において培養した。細胞を３７℃、５％  ＣＯ２の条件に維持し、約５０〜９０％コンフルエンスに達した時点でアッセイを行った。テトラサイクリン誘導可能な方法（配列番号４０７）でヒトＮａｖ１．６を安定発現するＣＨＯ細胞を、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０μｇ／ｍＬ  Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ、及び４００μｇ／ｍＬ  Ｚｅｏｃｉｎを補ったＨＡＭｓ  Ｆ１２において培養した。細胞を３７℃及び５％  ＣＯ２の条件に維持し、約５０〜９０％コンフルエントに達した時点でアッセイを行った。実験の２４〜４８時間前に、１μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを用いてＮａｖ１．６発現を誘発した。
【０２０１】
ＱＰａｔｃｈ  ＨＴ（Ｓｏｐｈｉｏｎ）による試験の前に、最初にＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に細胞を再懸濁し、０．０５％トリプシンを用いて（５分間、３７℃で）分離させ、穏やかに粉砕して細胞塊をバラバラにした。同じ培地を用いて細胞密度を１〜２×１０６／ｍＬに調整し、細胞をＱＰａｔｃｈ  ＨＴの細胞「ホテル」に移し、数時間に渡る試験に用いた。ギガオームシール形成及び全細胞パッチクランプ記録の場合、細胞外溶液に、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭグルコース、及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４及び浸透圧モル濃度＝３１５ｍＯｓｍ）を含有させた。細胞内液には、１３５ｍＭ  ＣｓＦ、１０ｍＭ  ＣｓＣｌ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３、浸透圧モル濃度＝２９０ｍＯｓｍ）を含有させた。アッセイで用いた電圧プロトコルは以下のとおりである。保持電位を−７５ｍＶ（Ｎａｖ１．７）、−６０ｍＶ（Ｎａｖ１．６）、又は−１０５ｍＶ（Ｎａｖ１．５）とした後、細胞を最初に−１２０ｍＶに２秒間過分極化させ、更に０ｍＶに５ｍｓ脱分極させた後、保持電位に戻した。このプロトコルを、液体供給時に、６０秒毎に１回繰り返した（下記参照）。細胞は、その他の場合には、前述の電圧プロトコルが実行されなかったときに保持電位に保持した。全細胞の記録構成を設定しる際、当該記録に用いる細胞に対して、細胞外溶液（いずれも０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含み、試験化合物を有する又は有さず但し最後の添加では１μＭ  ＴＴＸ又は１０ｍＭリドカインを陽性対照として含有していた）を計５回添加した。最初の液体供給には対照緩衝液（５μＬ）のみが含まれていた。供給の５秒後、電圧プロトコルを１０回（全体で１０分間の長さ）行った。次の３回の液体供給（各５μＬ）には、試験化合物（３回の供給すべてにおいて同じ化合物を同じ濃度）又は対照緩衝液（対照細胞に対してのみ）が含まれていた。これらの各供給の５秒後に、電圧プロトコルを再度１０回実施した（同様に毎分１回）。最後の供給には陽性対照が含まれており（１０μＬで３回副供給、それぞれ２秒間隔）、５秒後に同じ電圧プロトコルを２回実行してベースライン電流を得た。電流を２５ｋＨｚでサンプリングし、８極Ｂｅｓｓｌｅフィルタにより５ｋＨｚでフィルタリングした。直列抵抗の補償レベルを８０％に設定した。各細胞に対して、最初の４回の液体供給における各電流トレースの０ｍＶにおけるピーク電流振幅を、陽性対照の存在下での最後のトレースのピーク電流振幅から最初に減算した後、最初の（対照緩衝液）供給における最後のトレースのピーク電流振幅に対して、阻害率（％）として標準化した。電流のランダウン（rundown）を調整するため、試験化合物の存在下における各細胞のこの値（阻害率（％））を、同じ実験中の対照細胞の平均（通常５〜６個の）の阻害率（％）の値に対して更に標準化した。最後の化合物供給における最後の２つの測定値の平均（すなわち、試験化合物の各濃度に対する補正された阻害率（％）値）を、試験した特定の化合物濃度における各細胞に対する％阻害値として取得した。各化合物濃度において試験したすべての細胞に対する阻害率（％）値を平均化し、濃度応答算出において用いた。実験はすべて、室温（約２２℃）で行った。データを平均±標準誤差として表す。野生型プロトキシン−ＩＩは、各実験において陽性対照として含めた。データは、プロトキシン−ＩＩの効能がその履歴平均の±０．５対数単位内である場合にのみ容認した。
【０２０２】
ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａを用いて得られた選択プロトキシン−ＩＩ変異体に対する、Ｎａｖ１．７のＩＣ５０値を表６に示す。
【０２０３】
【表６】
2018511326.tif 000019
【０２０４】
選択プロトキシン−ＩＩ変異体を、ＱＰａｔｃｈを用いてヒトＮａｖ１．５に対する選択性に対して試験した。選択ペプチドに対するＮａｖ１．７及びＮａｖ１．５の両方のＩＣ５０値を、表７に示すＱＰａｔｃｈを用いて得た。
【０２０５】
【表７】
2018511326.tif 000020
【０２０６】
実施例４．コンビナトリアルプロトキシン−ＩＩ変異体の生成及び特性評価
いくつかのアプローチを用いて天然ペプチドと比較して更に改善された効能及び選択性プロファイルを有するＮａｖ１．７アンタゴニストを生成するため、コンビナトリアルライブラリーを設計し、選択された単一位置ヒットによる相加的効果について試験した。
【０２０７】
すべての非システインプロトキシン−ＩＩ位置において、多様化のためにＡ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｋ及びＳを用いて、限定的なアミノ酸スキャンを行った。これらの実験においては、実施例１に記載のように、プロトキシン−ＩＩを発現させ、一価のＦｃ融合タンパク質として試験した。このスキャンにより、結果として得られる変異体の効能及び／又は選択性を向上させた置換Ｙ１Ｑ、Ｗ７Ｑ、Ｓ１１Ａが同定された。
【０２０８】
位置Ｍ６及びＭ１９における全アミノ酸スキャン（ｃｙｓ及びｔｒｐを除く）も行った。このスキャンから、結果として得られる変異体の効能及び／又は選択性を向上させたＭ１９Ｆ置換が同定された。
【０２０９】
プロトキシン−ＩＩ／フエントキシン−ＩＶの単一位置キメラを双方向から設計した。このライブラリーの目的は、野生型プロトキシン−ＩＩの効能及び選択性プロファイルを保持したプロトキシン−ＩＩ変異体を得ることであり、フエントキシン−ＩＶに付随する有用なリフォールディング特性が得られであろう。このスキャンから置換Ｒ２２Ｔ及びＥ１２Ｎが同定された。
【０２１０】
Ｒ、Ｋ、Ｔ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｑ及びＳを用いた限定的なアミノ酸スキャンによって位置Ｙ１を変異させ、また電荷クラスタエンジニアリングによってペプチドＮＶ１Ｇ１１５３を更に設計し、ペプチドの三次元構造内のすべての荷電残基組（Ｄ１０／Ｅ１２、Ｋ４／Ｅ１７、Ｄ１０／Ｅ１２／Ｒ１３）を変異させた。
【０２１１】
作用部位に対するペプチド分布を改善し、かつ得られるペプチドの分子量を著しく増加させることなくペプチドの半減期を改善することを目的として、Ｎ−及びＣ末端伸長を選択されたペプチド（例えばＮＶ１Ｇ１１５３）に導入した。使用したＮ−及びＣ末端伸長は、表８及び９にそれぞれ示すとおりであり、Ｏｉら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４３４、２６６〜２７２、２００８；Ｗｈｉｔｎｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１１  ２９：４、３５２〜３５６；Ｓｏｃｋｏｌｏｓｋｙら、（２０１２）１０９：４０、１６０９５〜１６１００にも記載されている。また細胞透過性ペプチドであるＨＩＶ  Ｔａｔ及びポリアルギニンも用いた。種々のリンカーを用いて、プロトキシン−ＩＩ変異体をＮ−及び／又はＣ末端伸長に結合させた。使用したリンカーを表１０に示す。
【０２１２】
実施例３に記載の方法を用い、各操作から得たプロトキシン−ＩＩ変異体を、Ｎａｖ１．７に対するそれらの効能及び選択性に関して試験した。Ｎａｖ１．７を２００ｎＭ以下のＩＣ５０値で阻害した変異体のアミノ酸配列を表３に示す。野生型プロトキシン−ＩＩと比較したときの選択された変異体におけるアミノ酸置換、及びＦＬＩＰＲ  ＴｅｔｒａアッセイにおけるＮａｖ１．７阻害のＩＣ５０値を表１１に示す。
【０２１３】
【表８】
2018511326.tif 000021
【０２１４】
【表９】
2018511326.tif 000022
【０２１５】
【表１０】
2018511326.tif 000023
【０２１６】
【表１１−１】
2018511326.tif 000024
【０２１７】
【表１１−２】
2018511326.tif 000025
【０２１８】
【表１１−３】
2018511326.tif 000026
【０２１９】
【表１１−４】
2018511326.tif 000027
【０２２０】
【表１１−５】
2018511326.tif 000028
【０２２１】
【表１１−６】
2018511326.tif 000029
【０２２２】
【表１１−７】
2018511326.tif 000030
【０２２３】
【表１１−８】
2018511326.tif 000031
【０２２４】
【表１１−９】
2018511326.tif 000032
【０２２５】
野生型プロトキシン−ＩＩは、実施例３で説明したように、ＦＬＩＰＲアッセイにおいて約４ｎＭのＩＣ５０値でＮａｖ１．７を阻害する。著しいＮａｖ１．７の効能を保持する変異体を更に特性評価した。図１は、３０ｎＭ以下のＩＣ５０値でＮａｖ１．７を阻害する、生成されたプロトキシン−ＩＩ変異体の配列属である。
【０２２６】
ＱＰａｔｃｈを用いて、選択されたプロトキシン−ＩＩ変異体を、そのＮａｖ１．７の阻害及びそのヒトＮａｖ１．６に対する選択性に関して試験した。ＱＰａｔｃｈを用いて得られた選択ペプチドに対するＮａｖ１．７及びＮａｖ１．６の両方に対するＩＣ５０値を図２に示す。これらのペプチドは３０ｎＭ以下のＩＣ５０でＮａｖ１．７を阻害し、Ｎａｖ１．６と比較したときにＮａｖ１．７に対して少なくとも３０倍の選択性を有していた。
【０２２７】
図２に示すペプチドのアミノ酸配列を図３に示す。これらのペプチドはすべて、野生型プロトキシン−ＩＩと比較したときに、Ｗ７Ｑ及びＭ１９Ｆ置換を有していた。
【０２２８】
プロトキシン−ＩＩ変異体の発現及び精製は、実施例１に記載のとおり行ったか、又は標準的な固相合成方法によって合成した。組み換え型又は合成ペプチドの収率を、野生型プロトキシン−ＩＩの収率と比較した。表１２は、選択プロトキシン−ＩＩ変異体の収率がプロトキシン−ＩＩの収率よりも著しく高いことを示しており、変異体のフォールディング特性の向上を示している。固相合成のスケールは０．５ｍｍｏｌであった。
【０２２９】
【表１２】
2018511326.tif 000033
【０２３０】
実施例５．プロトキシン−ＩＩ変異体は、痛みのインビボモデルにおいて効果的である。
材料及び方法
動物：雄のＣ５７Ｂｌ／６マウス（２４〜２６ｇ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから発注、別個に収容）を本試験で用いた。
【０２３１】
行動試験
Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験：機械的（触覚）閾値を、Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  Ｈａｉｒｓによって、Ｕｐ−Ｄｏｗｎ法（Ｄｉｘｏｎ、１９８０、Ｃｈａｐｌａｎら、１９９４）によって評価した。７つの段階的な刺激（ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ繊維：０．０３、０．０７、０．１６、０．４、０．６、１、２ｇ；Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ，Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ，ＩＬ）を用いた。Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ毛を、後足上の中央の足底領域（骨隆起の間）に対して垂直に与えた。十分な力を印加してフィラメントをわずかに曲げて、３秒間保持した。Ｃｈａｐｌａｎの論文によると、陽性応答は、フィラメントを取り除いたときに、１）急に逃避する、又は２）即座に振り回すこととすることができる。詳細についてはＣｈａｐｌａｎらを参照のこと。試験前に、３０〜６０分間、試験チャンバー内のワイヤメッシュにマウスを順応させた。
【０２３２】
Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験：改良されたＨａｒｇｒｅａｖｅｓ  ｂｏｘを用いて、熱足逃避潜時（ＰＷＬ）を測定した（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら、１９８８、Ｐａｉｎ、３２：７７〜８８；Ｄｉｒｉｇら、１９９７、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７６：１８３〜１９１）。この箱は、一定温度（２７℃）に維持されたガラス製高床付きのチャンバーからなる。熱侵害刺激は、ガラス表面下方の投影電球光線から発生する。光線を骨隆起（中央の足底）間の領域に向ける。「開始」ボタンによって光照射を開始し、タイマーを開始する。刺激を受けた足に動き（例えば突然の逃避）がある場合には、スイッチがトリガーされて消灯し、タイマーが停止する。潜時（秒）が表示される。動きが起きない場合、電球は２０秒（カットオフ）後に消灯し、組織傷害を防止する。ＰＷＬ測定前の３０〜６０分間、動物をガラス表面上で馴化させた。一定のアンペア数を試験全体に渡って用いた結果、予備試験の足逃避潜時が８〜１２秒となった（少なくとも５分間間隔を置いて行った３〜６回の読み取りに対して平均化した場合）。
【０２３３】
ＭＰＥ％の算出：パーセント最大可能効果（ＭＰＥ％）＝（Ｔ１−Ｔ０）／（Ｔｃ−Ｔ０）×１００％。Ｔ０：０日目の閾値（ＣＦＡ後、ポンプ前）；Ｔ１：ポンプ埋め込み後、１日目の閾値；Ｔｃ：試験のカットオフ（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験では２０秒、Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験では２ｇ）。
【０２３４】
ホットプレート試験：２５ｃｍ×２５ｃｍ（１０”×１０”）の金属プレートを、４つのプレキシグラス壁（３８センチメートル（１５インチ）高さ）で囲んだものの上に動物を置いた。プレートを５０又は５５℃の温度に維持した。反応潜時（動物が最初にその後ろ足を振り回すか若しくは舐める、飛び上がる、又は声を出すときの時間）を測定し、動物をプレートから取り除いた。応答を示さない動物を、４０秒後（５０℃）又は２０秒（５５℃）後にプレートから取り除いて、起こり得るいかなる組織損傷も防止した。このトライアルを、１日に１５〜６０分毎に２〜５回繰り返した。
【０２３５】
炎症性痛覚モデル
ＣＦＡモデル：動物をイソフルランで麻酔し（４％で誘導、及び２％維持）、５０μＬのハミルトンシリンジに装着した２７ゲージのニードルを用い、１００％のフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）２０μＬを１本の後足の足底領域の中央部に注入した。
【０２３６】
カラギーナンモデル：動物をイソフルランで麻酔し（４％で誘導、及び２％維持）、通常の生理食塩水に溶解させた２％のλ−カラギーナン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む２５μＬの液体を、インシュリンシリンジ（ＢＤ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を用いて後足の足底領域の中央部に注入した。
【０２３７】
ミニポンプの埋め込み
Ａｌｚｅｔマイクロオスモティックミニポンプ（Ｄｕｒｅｃｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌ  １００３Ｄ及び２００１Ｄ）を整備し、製造業者のガイドに従い初期化した。マウスにイソフルランを用いて麻酔した（５％誘導；２％維持）。マウスの背中を剃毛し、イソプロピルアルコール及びポビドンヨードで拭きとり、肩甲骨の間に小さい切開を行った。一対のピンセット又は止血鉗子を用いて、皮下結合組織を広げて分離させることにより小さいポケットを形成した。流量調節材が切開から離れる方向に向くようにして、ポンプをポケット内に挿入した。この後、７ｍｍのステープラーを用いて皮膚の切開を閉じ、動物を飼育ケージ内で回復させた。
【０２３８】
データ解析
平均±標準誤差としてデータを表す。Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、グラフ化及び統計分析を図った。時間に対する閾値を比較するため、双方向ＡＮＯＶＡ及びそれに続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定を、ｐ＜０．０５の有意水準で用いた。ホットプレート及びＭＰＥ％データを一方向ＡＮＯＶＡによって分析した後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定を行った。
【０２３９】
結果
変異体ＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨ（ＮＶ１Ｄ３０３４−ＣＯＯＨ）、ＮＶ１Ｄ３３６８−ＯＨ（ＮＶ１Ｄ３３６８−ＣＯＯＨ）及びＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ（ＮＶ１Ｄ２７７５−ＣＯＯＨ）の効果を、ＣＦＡモデル（炎症性痛覚モデルとして広く使用）において試験した。ＣＦＡを後足に注射することにより、足浮腫（図示せず）及び熱刺激（熱痛覚過敏）に対する過敏症が誘発され、これは０日目に注射された足において熱潜時が減少したことにより示される（図６Ａ）。ＮＶ１Ｄ３０３４−ＯＨを６８４及び１８２４μｇ／日で、皮下浸透圧ミニポンプによって投与したとき、熱痛覚過敏が完全に逆転された（図４Ａ及び４Ｂ）。
【０２４０】
ＮＶ１Ｄ３３６８−ＯＨによって、６８４及び１８２４μｇ／日で、ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏が十分に逆転された（図５Ａ及び５Ｂ）。
【０２４１】
ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨはＣＦＡモデルにおける強い効果を示した。熱潜時は、ＮＶ１Ｄ２７７５投与後のカットオフに近い値に到達しており（図６Ａ及び６Ｂ、１８２４μｇ／日）、これは、抗痛覚過敏効果に加えて強力な無痛覚効果を示唆するものである。更に、ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨによりＣＦＡ誘発触覚異痛症が逆転された（図６Ｃ及び６Ｄ、１８２４μｇ／日）。ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨの抗痛覚過敏効果は、ポンプを埋め込んでから早くも４時間後に見られた（図７Ａ）。熱及び触覚試験の両方において８時間目において効果が最大に達し（図７Ａ及び７Ｂ）、これが２４時間維持された。熱潜時及び触覚閾値は、ポンプ埋め込み後４８時間（ポンプが空になってから約２４時間後）でコントロールのレベルに戻った（図７Ａ及び７Ｂ）。
【０２４２】
２つの更なるペプチド、ＮＶ１Ｄ３３６８−アミド（ＮＶ１Ｄ３３６８−ＮＨ２）及びＮＶ１Ｄ３０３４−Ｎ−メチルアミド（ＮＶ１Ｄ３０３４−ＮＨＭｅ）により、ＣＦＡ誘発熱痛覚過敏が容易に逆転された。熱ＭＰＥ％の試験結果を表１３にまとめる。
【０２４３】
【表１３】
2018511326.tif 000034
【０２４４】
またＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨは、ホットプレート試験において強い用量依存性有効性を示した（図８）。５０℃及び５５℃における潜時は、１８２４μｇ／日の投与の後にカットオフに近い値に達した。２２８μｇ／日において、ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨは、熱潜時がＰＢＳ対照と比較して少なめだが著しく増加した。
【０２４５】
ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨの有効性を、炎症性痛覚の別のモデル（カラギーナンモデル）において評価した。動物に、ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ又はＰＢＳポンプを埋め込んだ。ポンプ埋め込み前及びポンプ埋め込み後１日目に熱逃避潜時の測定を行った。λ−カラギーナンを後足に注射し、熱潜時の再測定をカラギーナン注入の２、３、及び４時間後に行った。ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨは、１８２４μｇ／日において著しい無痛覚を示した（図９）。４時間の試験時間に渡り、λ−カラギーナンを後足に注射すると炎症が誘発され（図示せず）、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験における熱足逃避潜時が短縮された（図９、ＰＢＳ群）。ＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨを用いて１８２４μｇ／日で動物を前処理した結果、カラギーナン誘発痛覚過敏から十分に保護された。
【０２４６】
実施例６．コンビナトリアルプロトキシン−ＩＩ変異体の生成及び特性評価
プロトキシン−ＩＩのアミノ酸スキャニングライブラリーを構築した。プロトキシン−ＩＩのすべての非システイン位置（Ｔｙｒ１、Ｇｌｎ３、Ｌｙｓ４、Ｔｒｐ５、Ｍｅｔ６、Ｔｒｐ７、Ｔｈｒ８、Ａｓｐ１０、Ｓｅｒ１１、Ｇｌｕ１２、Ａｒｇ１３、Ｌｙｓ１４、Ｇｌｕ１７、Ｇｌｙ１８、Ｍｅｔ１９、Ｖａｌ２０、Ａｒｇ２２、Ｌｅｕ２３、Ｔｒｐ２４、Ｌｙｓ２６、Ｌｙｓ２７、Ｌｙｓ２８、Ｌｅｕ２９及びＴｒｐ３０）において、天然の残基の代わりに、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ及びＴｙｒの残基を置換した。
【０２４７】
ヒト血清アルブミンに対する組み換え融合体として、変異体ペプチドを発現させ、ＨＲＶ３Ｃを用いて部位特異的・酵素的に切断し、実施例１に記載のプロトキシン−ＩＩ変異体を生成した。各プロトキシン−ＩＩ変異体は、ＨＳＡによる切断後に、切断部位からのＮ末端ＧＰの残留物を有していた。プロトキシン−ＩＩ変異体毎に、ヒトＮａｖ１．７に対するＩＣ５０値を、実施例３に記載のプロトコルに従い、ＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａ又はＱｐａｔｃｈを用いて測定した。Ｑｐａｔｃｈ電気生理学的方法を用い、更なるｈＮａｖチャネルに対する選択性に関して、ヒトＮａｖ１．７に対するＩＣ５０≦１００ｎＭを示す変異体をカウンタースクリーニングした。選択性についてヒットしたものを同定し、組み換え発現及び固層ペプチド合成を用いて産生させたコンビナトリアルペプチドライブラリーの設計に用いた。上で詳述したのと同じストラテジーを用いて、コンビナトリアル変異体をスクリーニングした。
【０２４８】
得られた結果によると、選択性の改善のために変異導入し得る位置として、Ｇｌｎ３、Ｓｅｒ１１、Ｇｌｕ１２、Ｌｙｓ１４、Ｇｌｕ１７、Ｇｌｙ１８、Ｌｅｕ２９及びＴｒｐ３０が挙げられる（残基番号付けは配列番号１に従う）。
【０２４９】
溶液中のプロトキシン−ＩＩの構造をＮＭＲで解析し、その表面表現を図１０に示す。図の左側は、前述（Ｐａｒｋら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１４，５７：６６２３〜６６３１）した、Ｍ６を取り囲むＴｒｐ残基のリングＷ５／Ｗ７／Ｗ２４を示す。分子の反対側については、本試験において変異導入及びＮＭＲ構造の両方を用い、他のナトリウムチャネルアイソフォームよりもｈＮａｖ１．７に対する選択性を向上させるために変異導入できる複数のアミノ酸位置からなるプロトキシン−ＩＩの選択性表面を同定した。選択性表面に存在する残基としては、残基Ｓｅｒ１１、Ｇｌｕ１２、Ｌｙｓ１４、Ｇｌｕ１７、Ｇｌｙ１８、Ｌｅｕ２９及びＴｒｐ３０が挙げられる（残基番号付けは配列番号１に従う）。Ｎａｖ１．７に対する選択性に関与する選択性表面及びその内部の複数の位置の同定はこれまでに報告がない。
【０２５０】
Ｓｅｒ１１の置換によるプロトキシンＩＩ変異体の選択性の向上は予想外である。それは、従来の報告では、Ｓｅｒ１１の変異が複数のＮａｖチャネルに対して影響を与え、ゆえに残基はプロトキシン−ＩＩのＮａｖ１．７に対する選択性には関与しないと判断されたからである（Ｐａｒｋら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１４，５７：６６２３〜６６３１）。
【０２５１】
プロトキシン−ＩＩ変異体の合成的製造において鍵となるステップは、ジスルフィド対合が形成される、直鎖状ペプチドの酸化的フォールディングである。フォールディング後の天然のプロトキシン−ＩＩ精製のためのＲＰ−ＨＰＬＣトレースの結果、異なる滞留時間において複数のピークが見られ、それらは、分子量は正しいものの活性レベルが異なり、すなわち正しくフォールディングされた異性体ペプチドとそうでないものとの混合物であることを示すものである。
【０２５２】
ＲＰ−ＨＰＬＣの主要なピークの相対強度、したがって正しくフォールディングされたペプチドの相対強度は、プロトキシン−ＩＩの様々な位置における置換により向上させることができた。Ｔｒｐ７又はＴｒｐ３０の変異により、得られるプロトキシン−ＩＩ変異体のフォールディングが改善された。Ｔｒｐ７及びＴｒｐ３０の療法の変異により、得られるプロトキシン−ＩＩ変異体のフォールディングが更に改善され、リフォールディング困難なプロトキシン−ＩＩ変異体のフォールディングをレスキューできた。
【０２５３】
選択性を向上させる１つ又は２つ以上の置換（Ｇｌｎ３、Ｓｅｒ１１、Ｇｌｕ１２、Ｌｙｓ１４、Ｇｌｕ１７、Ｇｌｙ１８及びＬｅｕ２９）、並びにＴｒｐ７及びＴｒｐ３０の変異を有するコンビナトリアル変異体ペプチドの製造により、高い選択性及び好適なリフォールディング特性の両方を有するペプチドが得られた。プロトキシン−ＩＩは、阻害性システインノットペプチドのファミリー３に属する（Ｋｌｉｎｔら，Ｔｏｘｉｃｏｎ  ６０：４７８〜４９１，２０１２）。Ｔｒｐ７は、すべてのファミリー３のメンバーで保存され、別のファミリー３の阻害性システインノットペプチドであるジンザオトキシン（Jingzhaotoxin）−Ｖのこの位置の置換、並びにＴｒｐ５及びＭｅｔ６の置換により効能が低下したことから、ジンザオトキシン−Ｖの位置５、６及び７の疎水性残基が、ジンザオトキシン−ＶのＮａｖ１．７阻害能に必須であることを示すものである（国際公開第２０１４／１６５２７７号）。Ｔｒｐ５／Ｍｅｔ６／Ｔｒｐ７はまた、プロトキシン−ＩＩでも保存されており、したがって、Ｔｒｐ７の極性残基による置換が、プロトキシン−ＩＩ活性を損なわずに顕著にリフォールディング特性を向上させ得ることは予想外であった。Ｔｒｐ３０の置換により、変異体ペプチドのＮａｖ１．７選択性及びリフォールディング特性が同時に向上することが示され、また個々の有利な置換が典型的に１つのパラメーターのみを改善するため、予想外であった。
【０２５４】
表１３は、選択により得られたプロトキシン−ＩＩ変異体のアミノ酸配列を示す。
【０２５５】
【表１４】
2018511326.tif 000035
【０２５６】
選択された変異体を、実施例３に記載のＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａ又はＱｐａｔｃｈを用いてそれらのＮａｖ１．７の阻害を特性評価した。表１５は得られたＩＣ５０値を示す。いくつかの変異体については、１つの濃度（１０ｎＭ又は３０ｎＭ）における阻害能（％）（％バルク、コントロールのパーセントブロック）のみをＱｐａｔｃｈで記録した。
【０２５７】
【表１５】
2018511326.tif 000036
【０２５８】
選択された変異体を、様々なヒトＮａｖ１．ｘチャネルに関して試験した。表１６はそれらの試験結果を示す。各チャネルに対するＩＣ５０値は、ＱＰａｔｃｈを用いて測定した。
【０２５９】
【表１６】
2018511326.tif 000037
【０２６０】
プロトキシン−ＩＩ変異体の発現及び精製は、実施例１に記載のとおり行ったか、又は標準的な固相合成方法によって合成した。組み換え型又は合成ペプチドの収率を、野生型プロトキシン−ＩＩの収率と比較した。表１７は、選択プロトキシン−ＩＩ変異体の収率がプロトキシン−ＩＩの収率よりも著しく高いことを示しており、変異体のフォールディング特性の向上を示している。固相合成のスケールは０．１ｍｍｏｌであった。
【０２６１】
【表１７】
2018511326.tif 000038
【０２６２】
実施例７．プロトキシン−ＩＩ変異体は、鞘内投与後の疼痛のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて有効である。
鞘内投与後の疼痛の減少における選択プロトキシン−ＩＩ変異体の有効性を評価した。
【０２６３】
ペプチドＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ、ＮＶ１Ｄ３０３４及び６３９５５９１８を試験に用いた。動物モデルを用い激しい熱疼痛（テールフリック及び熱いプレート）、並びに損傷により誘発される疼痛（ホルマリンフリンチング）を測定した。
【０２６４】
テールフリック試験：動物をテールフリック装置（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ）に置いた。当該装置は、焦点赤外光加熱領域（直径５ｍｍ）を有する。動物の尾部（遠位端部から１／３〜１／２の部分）を焦点加熱領域に置いた。ビヒクルで処理した動物で１０秒以内にテールフリックが引き起されるよう、熱源の温度を調節した。文献に通常記載されるように、１５秒のカットオフ時間を用いて、組織の損傷を防止した。熱刺激の開始と何らかの回避反応との間の経過時間を自動的に測定し、試験群毎に記録した。
【０２６５】
ホットプレート試験：２５ｃｍ×２５ｃｍ（１０”×１０”）の金属プレートを、４つのプレキシグラス壁（３８センチメートル（１５インチ）高さ）で囲んだものの上に動物を置いた。プレートを５２．５℃の温度に維持した。反応潜時（動物が最初にその後ろ足を振り回すか若しくは舐める、飛び上がる、又は声を出すときの時間）を測定して、動物をプレートから取り除いた。応答を示さない動物を３０秒後にプレートから取り除き、起こり得るいかなる組織損傷も防止した。
【０２６６】
ホルマリンフリンチング：ＵＣＳＤ社製の自動「フリンチ反応」測定装置を用いて、ホルマリンにより誘発される疼痛行動（すなわち足の振り回し）を測定した。当該装置は、装置床の下に装備した動作センサーを使用して、動物の片方の後足に貼着した金属バンドのいかなる突然の移動も検出する。ホルマリン注入の３０分〜１時間前に、シアノアクリレートを小滴垂らし、片方の後足の足底表面に小型の金属バンドを取り付け、動物を試験チャンバーに置き、馴化させた。金属バンドが装着された足の背側にホルマリン（２．５％、５０μＬ）を皮下注入した。足底へのホルマリン注入の直後、特注したシリンダー（２５×１０×２０ｃｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製）中に動物を置いた。足の振り回しを自動的に記録した。
【０２６７】
急性熱疼痛モデルでは、プロトキシン−ＩＩ変異体６３９５５９１８は、テールフリック試験（図１１Ａ及び図１１Ｂ）及びホットプレート試験（図１１Ｃ、図１１Ｄ）において、鞘内単回投与後、長い潜時に示されるように、強力かつ遷延性の痛覚脱失を生じさせた。痛覚脱失の有意性及び持続期間は用量依存的だった。
【０２６８】
後足へのホルマリン注入は、損傷により誘発される疼痛において通常用いられるモデルである。注入により、特徴的な二相性のフリンチ行動が誘発され、それは試験動物における疼痛を示すものである。図１１Ｅで示すように、プロトキシン−ＩＩ変異体６３９５５９１８の鞘内注入の前処理を受けた動物では、ホルマリン試験においてフリンチが少なく、損傷により誘発される疼痛の阻害が示唆される。
【０２６９】
同様に、ペプチドＮＶ１Ｄ２７７５−ＯＨ及びＮＶ１Ｄ３０３４は、テールフリック、ホットプレート及びホルマリン試験において、鞘内単回投与後に有意な効果を示した（図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅ、図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ、図１３Ｄ、図１３Ｅ）。
【０２７０】
実施例８．更なるプロトキシン−ＩＩ変異体の特性評価
実施例６に記載の方策及び方法を用いて、更なるプロトキシン−ＩＩ変異体を設計し、発現させ、実施例３に記載のプロトコルに従い、ＦＬＰＲ  Ｔｅｔｒａ及び／又はＱｐａｔｃｈで特性評価した。
【０２７１】
表１８は、選択により得られたプロトキシン−ＩＩ変異体のアミノ酸配列を示す。
【０２７２】
【表１８−１】
2018511326.tif 000039
【０２７３】
【表１８−２】
2018511326.tif 000040
【０２７４】
【表１８−３】
2018511326.tif 000041
【０２７５】
【表１８−４】
2018511326.tif 000042
【０２７６】
【表１８−５】
2018511326.tif 000043
【０２７７】
【表１８−６】
2018511326.tif 000044
【０２７８】
【表１８−７】
2018511326.tif 000045
【０２７９】
【表１８−８】
2018511326.tif 000046
【０２８０】
【表１８−９】
2018511326.tif 000047
【０２８１】
【表１８−１０】
2018511326.tif 000048
【０２８２】
選択された変異体を、実施例３に記載のＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａ又はＱｐａｔｃｈを用いてそれらのＮａｖ１．７の阻害を特性評価した。表１９は得られたＩＣ５０値を示す。いくつかの変異体については、１つの濃度（１０ｎＭ又は３０ｎＭ）における阻害能（％）（％  ｂｌｋ、コントロールのパーセントブロック）のみをＱｐａｔｃｈで記録した。ｓｅ；標準誤差
【０２８３】
【表１９−１】
2018511326.tif 000049
【０２８４】
【表１９−２】
2018511326.tif 000050
【０２８５】
【表１９−３】
2018511326.tif 000051
【０２８６】
【表１９−４】
2018511326.tif 000052
【０２８７】
【表１９−５】
2018511326.tif 000053
【０２８８】
実施例９．変異体６３９５５９１８の生成
野生型プロトキシン−ＩＩと比較するとき、プロトキシン−ＩＩ変異体６３９５５９１８はＷ７Ｑ及びＷ３０Ｌ置換を有する。実施例６に記載のように、Ｔｒｐ７及びＴｒｐ３０の変異（一方又は両方）により、得られるプロトキシン−ＩＩ変異体のフォールディングが改善され、リフォールディング困難なプロトキシン−ＩＩ変異体のフォールディングをレスキューできた。
【０２８９】
６３９５５９１８をバックボーンとして更なる変異体を生成し、分子の特性の更なる改善特徴を評価した。いくつかの変異体を実施例６及び７に更に記載する。
【０２９０】
生成された変異体及びそれらの配列を表２０に示す。
【０２９１】
【表２０−１】
2018511326.tif 000054
【０２９２】
【表２０−２】
2018511326.tif 000055
【０２９３】
変異体を上記のとおり特性評価した。表２１は、ＩＣ５０値及び／又はパーセントブロック（％  ｂｌｋ）を示す（コントロールサンプルとの比較による、電流の％阻害）。Ｓｅ：標準誤差。
【０２９４】
【表２１】
2018511326.tif 000056
【０２９５】
実施例１０．変異体６３９５５９１８の生成
得られるペプチドの体内分布を改善するために、更なる６３９５５９１８の変異体を設計した。
【０２９６】
種々のファミリー３抑制性システインノットペプチドについても、Ｗ７及びＷ３０置換を設計し、これらの変異による選択性及びリフォールディング特性の改善が、プロトキシン−ＩＩを越えて他の相同性の高いペプチド配列にも見られるか否かを評価した。Ｋｌｉｎｔら（Ｔｏｘｉｃｏｎ  ６０：４７８〜４９１，２０１２）により定義されるように、Ｎａｖチャネル（ＮａＳｐＴｘ）を阻害するファミリー３クモ毒素を、位置７におけるＱの組み込み及び位置３０におけるＬの組み込みのための足場として選択した（番号付けは配列番号１に従う）。これらの配列としては、β−セラフォトキシン−Ｇｒ１ｃ、β−セラフォトキシン−Ｇｒ１ｅ、β／κ−セラフォトキシン−Ｃｇ２ａ、κ−セラフォトキシン−Ｐｓ１ａ、κ−セラフォトキシン−Ｐｓ１ｂ、κ−セラフォトキシン−Ｇｒ２ｂ、κ−セラフォトキシン−Ｇｒ２ｃ、κ−セラフォトキシン−Ｇｒ２ｄ、κ−セラフォトキシン−Ｃｇ２ａ、κ−セラフォトキシン−Ｃｇ２ｂ、κ−セラフォトキシン−Ｅｃ２ｃ、β−セラフォトキシン−Ｇｒ１ｄ、β／κ−セラフォトキシン−Ｐｍ２ａ、κ−セラフォトキシン−Ｅｃ２ａ及びκ−セラフォトキシン−Ｅｃ２ｂが挙げられる。
【０２９７】
変異に用いる更なるファミリー３ＮａＳｐＴｘ足場は、Ａｒａｃｈｎｏｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／＿＿ｗｗｗ＿ａｒａｃｈｎｏｓｅｒｖｅｒ＿ｏｒｇ／＿＿ｍａｉｎＭｅｎｕ＿ｈｔｍｌ．）において同定された。ファミリー３毒素のアラインメントを図１４に示す。
【０２９８】
表２２は、設計された変異体の配列を示す。
【０２９９】
【表２２−１】
2018511326.tif 000057
【０３００】
【表２２−２】
2018511326.tif 000058
【０３０１】
【表２２−３】
2018511326.tif 000059
【０３０２】
【表２２−４】
2018511326.tif 000060
【０３０３】
非天然アミノ酸を組み込んだ得られる変異体は、標準的な固相ペプチド合成及び酸化的リフォールディング法により生成される。
【０３０４】
ＰＥＧ基を有する変異体は、標準的な化学的コンジュゲーション法により生成される。
【０３０５】
実施例３に記載のように、得られる変異体を、ＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａ及びＱＰａｔｃｈアッセイにおいてそれらのＮａｖ１．７阻害能を試験する。
【０３０６】
生成される変異体を、実施例３に記載の方法を用いて、それらの選択性を試験する。
【図１】
2018511326.tif 000061
【図０２−０１】
2018511326.tif 000062
【図０２−０２】
2018511326.tif 000063
【図０３−０１】
2018511326.tif 000064
【図０３−０２】
2018511326.tif 000065
【図０３−０３】
2018511326.tif 000066
【図４Ａ】
2018511326.tif 000067
【図４Ｂ】
2018511326.tif 000068
【図５Ａ】
2018511326.tif 000069
【図５Ｂ】
2018511326.tif 000070
【図６Ａ】
2018511326.tif 000071
【図６Ｂ】
2018511326.tif 000072
【図６Ｃ】
2018511326.tif 000073
【図６Ｄ】
2018511326.tif 000074
【図７Ａ】
2018511326.tif 000075
【図７Ｂ】
2018511326.tif 000076
【図８】
2018511326.tif 000077
【図９】
2018511326.tif 000078
【図１０】
2018511326.tif 000079
【図１１Ａ】
2018511326.tif 000080
【図１１Ｂ】
2018511326.tif 000081
【図１１Ｃ】
2018511326.tif 000082
【図１１Ｄ】
2018511326.tif 000083
【図１１Ｅ】
2018511326.tif 000084
【図１２Ａ】
2018511326.tif 000085
【図１２Ｂ】
2018511326.tif 000086
【図１２Ｃ】
2018511326.tif 000087
【図１２Ｄ】
2018511326.tif 000088
【図１２Ｅ】
2018511326.tif 000089
【図１３Ａ】
2018511326.tif 000090
【図１３Ｂ】
2018511326.tif 000091
【図１３Ｃ】
2018511326.tif 000092
【図１３Ｄ】
2018511326.tif 000093
【図１３Ｅ】
2018511326.tif 000094
【図１４】
2018511326.tif 000095
【配列表】
2018511326000001.app
【国際調査報告】
2018511326.tif 000096
2018511326.tif 000097
2018511326.tif 000098