(57)【要約】  本発明は、異常な免疫抑制を伴う疾患およびがんの治療のためのアンタゴニストおよびこれらの治療における該アンタゴニストの使用方法を提供する。
2018521015.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のがんを治療する方法であって、
がんであると診断された対象を特定すること；
免疫チェックポイント阻害薬を投与すること；および
コラーゲンのアンタゴニストまたはコラーゲン断片のアンタゴニストを投与すること
を含み、それによって、前記対象のがんを治療する方法。
【請求項２】
前記免疫チェックポイント阻害薬が、CTLA-4阻害薬、PD-1阻害薬、PDL-1阻害薬、Lag3阻害薬、LAIR1阻害薬またはLAIR2阻害薬を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記PDL-1阻害薬がPDL-1抗体を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記コラーゲンアンタゴニストまたはコラーゲン断片のアンタゴニストが、前記免疫チェックポイント阻害薬の抗腫瘍活性を増強する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
皮膚炎、肺臓炎または大腸炎を含む炎症状態を抑制することをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲンまたはIV型コラーゲンを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記IV型コラーゲンアンタゴニストまたはIV型コラーゲン断片のアンタゴニストが、潜在性コラーゲンエピトープXL313のアンタゴニストを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アンタゴニストが、RGDKGE（配列番号１）を含む潜在性コラーゲンエピトープに結合する抗体を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体がXL313モノクローナル抗体を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象がヒトである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
化学療法剤を投与することをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記がんが、悪性黒色腫、中枢神経系（CNS）癌、CNS胚細胞腫、肺癌、白血病、多発性骨髄腫、腎臓癌、悪性神経膠腫、髄芽腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、線維肉腫、膵臓癌、胃癌、頭頸部癌および結腸直腸癌を含む群から選択され；
がん細胞が固形癌に由来するものであってもよく、血液がんに由来するものであってもよく；
前記血液がんが白血病であってもよく、リンパ腫であってもよく；
前記白血病が、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、小リンパ球性リンパ腫（SLL）、慢性骨髄性白血病（CML）、急性単球性白血病（AMoL）のいずれであってもよく；
前記リンパ腫が、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫のいずれであってもよく；
前記ホジキンリンパ腫が、結節硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型、リンパ球減少型のいずれであってもよく；
前記がんが、悪性黒色腫（切除不能転移性悪性黒色腫であってもよい）、腎臓癌（腎細胞癌であってもよい）、前立腺癌（転移性去勢抵抗性前立腺癌であってもよい）、卵巣癌（上皮性卵巣癌であってもよく、転移性上皮性卵巣癌であってもよい）、乳癌（トリプルネガティブ乳癌であってもよい）、および／または肺癌（非小細胞肺癌であってもよい）を含む固形癌であってもよい、
前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記免疫チェックポイント阻害薬が０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与され、前記コラーゲンアンタゴニストが、０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物を１時間に１回投与すること、または前記組成物を２週間に１回、４〜６週間にわたって投与することを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
対象の、異常な免疫抑制を特徴とする疾患を治療する方法であって、
異常な免疫抑制を特徴とする疾患であると診断された対象を特定すること；
免疫チェックポイント阻害薬を投与すること；および
インテグリンのアンタゴニストを投与すること
を含み、それによって、前記対象を治療する方法。
【請求項１７】
前記免疫チェックポイント阻害薬が、CTLA-4阻害薬、PD-1阻害薬、PDL-1阻害薬、Lag3阻害薬、LAIR1阻害薬またはLAIR2阻害薬を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記免疫チェックポイント阻害薬が、CTLA-4抗体、PD-1抗体、PDL-1抗体、Lag3抗体、LAIR1抗体またはLAIR2抗体を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記インテグリンがインテグリンαｖβ３を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記インテグリンαｖβ３アンタゴニストが、RGDKGE（配列番号１）を含むαｖβ３結合性コラーゲンエピトープを標的とする抗体を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象がヒトである、請求項１６〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
化学療法剤を投与することをさらに含む、請求項１６〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
異常な免疫抑制を特徴とする前記疾患が、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、乾癬、強皮症、溶血性貧血、脈管炎、グレーブス病、関節リウマチ、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、重症筋無力症および脈管炎を含む、請求項１６〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫チェックポイント阻害薬が０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与され、前記インテグリンアンタゴニストが０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項１６〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物を１時間に１回投与すること、または前記組成物を２週間に１回、４〜６週間にわたって投与することを特徴とする、請求項１６〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
対象の、過剰な免疫反応を特徴とする疾患を治療する方法であって、
過剰な免疫反応を起こしていると診断された対象を特定すること；および
コラーゲンまたはその断片を含むペプチドを投与すること
を含み、それによって、前記対象の過剰な免疫反応を治療する方法。
【請求項２７】
前記過剰な免疫反応が自己免疫疾患を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲンまたはIV型コラーゲンを含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ペプチドがRGDKGE（配列番号１）を含む、請求項２６〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記対象がヒトである、請求項２６〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記自己免疫疾患が、グレーブス病、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、多発性硬化症または関節リウマチを含む、請求項２６〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
対象の創傷を治癒する方法であって、
創傷を有する対象を特定すること；および
コラーゲンまたはその断片を含むペプチドを前記創傷に投与すること
を含み、それによって、前記対象の前記創傷を治癒する方法。
【請求項３３】
前記コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲンまたはIV型コラーゲンを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ペプチドがRGDKGE（配列番号１）を含む、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象がヒトである、請求項３２〜３４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第119条（e）の下、２０１５年６月１日に出願された米国仮出願第62/169,463号に基づく優先権を主張するものであり、その内容全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援
本研究は、助成金番号CA91645、HL65301、HL083151、P20RR15555、5P30GM103392およびP20 RR181789の下、米国国立衛生研究所からの助成を受けてなされたものである。米国政府は、本発明に関し一定の権利を保有する。
【背景技術】
【０００３】
細胞外マトリックス（ECM）のリモデリングは血管新生を制御している。しかしながら、ECMタンパク質の構造変化が血管新生に寄与する正確な機構は、本願発明以前には完全には解明されていなかった。また、血管新生においてインテグリンαｖβ３は複雑な役割を果たしており、ポジティブな機能とネガティブな機能の両方が存在することが実証されている。したがって、本願発明がなされる以前から、血管新生におけるインテグリンαｖβ３の役割の解明が強く求められてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の一態様は、潜在性RGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンエピトープに特異的に結合するアンタゴニスト（すなわちMab XL313）が、免疫チェックポイント制御タンパク質PDL-1を標的とする抗体の抗腫瘍効果を顕著に増強したという驚くべき発見に基づく。さらに、本発明の別の一態様は、免疫チェックポイント阻害薬の治療活性を増強するために使用されるインテグリンαｖβ３アンタゴニストに基づき、免疫チェックポイント阻害薬としては、たとえば、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（CTLA-4）に対する抗体、プログラム細胞死リガンド−１（PDL-1）に対する抗体、プログラム細胞死タンパク質１（PD-1）に対する抗体、リンパ球活性化遺伝子３（Lag3）に対する抗体、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（LAIR1）に対する抗体、および／または白血球関連免疫グロブリン様受容体２（LAIR2）に対する抗体などがある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、異常な免疫抑制を特徴とする疾患およびがんを治療するための組成物、ならびにこれらの疾患を治療する方法を特徴とする。たとえば、対象のがんを治療する方法は、がんであると診断された対象（たとえばヒト対象）を特定すること；免疫チェックポイント阻害薬を投与すること；およびコラーゲンのアンタゴニストまたはコラーゲン断片のアンタゴニストを投与することによって行われ、これによって、前記対象のがんが治療される。いくつかの場合、前記免疫チェックポイント阻害薬は、CTLA-4阻害薬、PDL-1阻害薬、PD-1阻害薬、CTLA-4阻害薬、Lag3阻害薬、LAIR1阻害薬および／またはLAIR2阻害薬を含む。たとえば、PDL-1阻害薬はPDL-1抗体を含む。
【０００６】
好適なコラーゲンの種類としては、Ｉ型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲンおよびIV型コラーゲン（たとえばIV型コラーゲンのα６鎖）が挙げられる。いくつかの場合、前記コラーゲンアンタゴニストまたはコラーゲン断片のアンタゴニストは、潜在性コラーゲンエピトープXL313のアンタゴニストを含む。たとえば、前記アンタゴニストは、RGDKGE（配列番号１）を含む潜在性コラーゲンエピトープに結合する抗体を含む。前記抗体は、モノクローナル抗体、たとえばXL313モノクローナル抗体を含むことが好ましい。
【０００７】
前記コラーゲンアンタゴニストまたはコラーゲン断片のアンタゴニストは、前記免疫チェックポイント阻害薬の抗腫瘍活性を増強し、かつ炎症状態を抑制することが好ましい。炎症状態の具体的な例としては、たとえば、皮膚炎、肺臓炎または大腸炎が挙げられる。
【０００８】
本明細書に記載の方法は、１つ以上の化学療法剤または抗新生物剤と組み合わせて使用することができる。いくつかの場合、併用される化学療法剤は放射線療法である。いくつかの場合、化学療法剤は細胞死誘導剤である。
【０００９】
本明細書において「抗新生物剤」は、ヒトの腫瘍、特に、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病などの悪性（がん）病変の発生または進行を抑制する機能特性を有する薬剤を指す。抗新生物剤は、転移を抑制する特性を有していることが多い。
【００１０】
がんの具体的な例としては、悪性黒色腫、中枢神経系（CNS）癌、CNS胚細胞腫、肺癌、白血病、多発性骨髄腫、腎臓癌、悪性神経膠腫、髄芽腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、線維肉腫、膵臓癌、胃癌、頭頸部癌および結腸直腸癌を含む群から選択されるがんが挙げられる。たとえば、がん細胞は、固形癌に由来するものまたは血液がんに由来するものである。血液がんは、たとえば白血病またはリンパ腫である。白血病は、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、小リンパ球性リンパ腫（SLL）、慢性骨髄性白血病（CML）、急性単球性白血病（AMoL）のいずれかである。リンパ腫は、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（たとえば、結節硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型、またはリンパ球減少型）、非ホジキンリンパ腫のいずれかである。固形癌の具体的な例としては、悪性黒色腫（たとえば切除不能転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（たとえば腎細胞癌）、前立腺癌（たとえば転移性去勢抵抗性前立腺癌）、卵巣癌（たとえば上皮性卵巣癌、特に転移性上皮性卵巣癌）、乳癌（たとえばトリプルネガティブ乳癌）、および肺癌（たとえば非小細胞肺癌）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１１】
当技術分野において、動物モデルと比較することによってヒトに対する用量を調整することが当業者によって慣例的になされていることから、ヒトに対する用量を最初に決定する際、マウスまたは非ヒト霊長類における化合物の使用量からヒトに対する用量を推定することができる。特定の実施形態において、コラーゲンアンタゴニストの用量は、化合物の量として約０．１μｇ／ｋｇ体重〜約２５０００μｇ／ｋｇ体重の範囲であってもよく、約１μｇ／ｋｇ体重〜約４０００μｇ／ｋｇ体重の範囲であってもよく、あるいは約１０μｇ／ｋｇ体重〜約３０００μｇ／ｋｇ体重の範囲であってもよい。別の実施形態において、コラーゲンアンタゴニストの用量は、約０．１μｇ／ｋｇ体重、約０．３μｇ／ｋｇ体重、約０．５μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ／ｋｇ体重、約３μｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ／ｋｇ体重、約２５μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ／ｋｇ体重、約７５μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ／ｋｇ体重、約１５０μｇ／ｋｇ体重、約２００μｇ／ｋｇ体重、約２５０μｇ／ｋｇ体重、約３００μｇ／ｋｇ体重、約３５０μｇ／ｋｇ体重、約４００μｇ／ｋｇ体重、約４５０μｇ／ｋｇ体重、約５００μｇ／ｋｇ体重、約５５０μｇ／ｋｇ体重、約６００μｇ／ｋｇ体重、約６５０μｇ／ｋｇ体重、約７００μｇ／ｋｇ体重、約７５０μｇ／ｋｇ体重、約８００μｇ／ｋｇ体重、約８５０μｇ／ｋｇ体重、約９００μｇ／ｋｇ体重、約９５０μｇ／ｋｇ体重、約１０００μｇ／ｋｇ体重、約１０５０μｇ／ｋｇ体重、約１１００μｇ／ｋｇ体重、約１１５０μｇ／ｋｇ体重、約１２００μｇ／ｋｇ体重、約１２５０μｇ／ｋｇ体重、約１３００μｇ／ｋｇ体重、約１３５０μｇ／ｋｇ体重、約１４００μｇ／ｋｇ体重、約１４５０μｇ／ｋｇ体重、約１５００μｇ／ｋｇ体重、約１６００μｇ／ｋｇ体重、約１７００μｇ／ｋｇ体重、約１８００μｇ／ｋｇ体重、約１９００μｇ／ｋｇ体重、約２０００μｇ／ｋｇ体重、約２５００μｇ／ｋｇ体重、約３０００μｇ／ｋｇ体重、約３５００μｇ／ｋｇ体重、約４０００μｇ／ｋｇ体重、約４５００μｇ／ｋｇ体重、約５０００μｇ／ｋｇ体重、約５５００μｇ／ｋｇ体重、約６０００μｇ／ｋｇ体重、約６５００μｇ／ｋｇ体重、約７０００μｇ／ｋｇ体重、約７５００μｇ／ｋｇ体重、約８０００μｇ／ｋｇ体重、約８５００μｇ／ｋｇ体重、約９０００μｇ／ｋｇ体重、約９５００μｇ／ｋｇ体重、約１００００μｇ／ｋｇ体重、約１０５００μｇ／ｋｇ体重、約１１００μｇ／ｋｇ体重、約１１５００μｇ／ｋｇ体重、約１２０００μｇ／ｋｇ体重、約１２５００μｇ／ｋｇ体重、約１３０００μｇ／ｋｇ体重、約１３５００μｇ／ｋｇ体重、約１４０００μｇ／ｋｇ体重、約１４５００μｇ／ｋｇ体重、約１５０００μｇ／ｋｇ体重、約１５５００μｇ／ｋｇ体重、約１６０００μｇ／ｋｇ体重、約１６５００μｇ／ｋｇ体重、約１７０００μｇ／ｋｇ体重、約１７５００μｇ／ｋｇ体重、約１８０００μｇ／ｋｇ体重、約１８５００μｇ／ｋｇ体重、約１９０００μｇ／ｋｇ体重、約１９５００μｇ／ｋｇ体重、約２００００μｇ／ｋｇ体重、約２０５００μｇ／ｋｇ体重、約２１０００μｇ／ｋｇ体重、約２１５００μｇ／ｋｇ体重、約２２０００μｇ／ｋｇ体重、約２２５００μｇ／ｋｇ体重、約２３０���０μｇ／ｋｇ体重、約２３５００μｇ／ｋｇ体重、約２４０００μｇ／ｋｇ体重、約２４５００μｇ／ｋｇ体重、約２５０００μｇ／ｋｇ体重のいずれであってもよい。さらに別の実施形態において、コラーゲンアンタゴニストの用量は、化合物の量として約０．５μｇ／ｋｇ体重〜約２０μｇ／ｋｇ体重の範囲であってもよい。さらに別の実施形態において、コラーゲンアンタゴニストの用量は、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約３ｍｇ／ｋｇ体重、約６ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約２０ｍｇ／ｋｇ体重のいずれであってもよい。このような治療プロトコルにおいて通常行われているように、初期臨床試験の結果および特定の患者の必要性に応じて、これらの用量を増減させてもよいことは言うまでもない。
【００１２】
いくつかの場合、免疫チェックポイント阻害薬（たとえばPDL-1の阻害薬）は、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重（たとえば０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、０．１ｍｇ／ｋｇ体重、０．５ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重）の用量で投与される。たとえば、PDL-1阻害薬は、１回の投与につき０．０１〜３０ｍｇ（たとえば０．０１ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇまたは３０ｍｇ）の量で投与される。別の一実施例において、免疫チェックポイント阻害薬（たとえば抗PD-L1抗体）は、０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量範囲で投与される。いくつかの場合、XL313抗体は、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重（たとえば０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、０．１ｍｇ／ｋｇ体重、０．５ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重）の用量で投与される。たとえば、XL313抗体は、１回の投与につき０．０１〜３０ｍｇ（たとえば０．０１ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇまたは３０ｍｇ）の量で投与される。たとえば、Mab XL313の用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
【００１３】
本発明の組成物（たとえばPDL-1阻害薬とXL313抗体とを含む組成物）の投与は、１ヶ月に１回、１ヶ月に２回（すなわち２週に１回）、週１回、１日に１回、１日に２回、１２時間に１回、８時間に１回、４時間に１回、２時間に１回または１時間に１回行われる。本発明の組成物（たとえばPDL-1阻害薬とXL313抗体とを含む組成物）の投与期間は、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、２年、３年、４年、５年またはそれ以上の期間である。たとえば、本発明の組成物（たとえばPD-L1阻害薬とXL313抗体とを含む組成物）は、２週に１回、４〜６週間にわたって、または疾患が治癒するまで投与される。
【００１４】
さらに、対象の、異常な免疫抑制を特徴とする疾患を治療する方法であって、異常な免疫抑制を特徴とする疾患であると診断された対象（たとえばヒト）を特定すること；免疫チェックポイント阻害薬を投与すること；およびインテグリンのアンタゴニストを投与することによって、前記対象を治療する方法が提供される。
【００１５】
好適な免疫チェックポイント阻害薬としては、CTLA-4阻害薬、PD-1阻害薬、PDL-1阻害薬、Lag3阻害薬、LAIR1阻害薬またはLAIR2阻害薬が挙げられる。たとえば、前記免疫チェックポイント阻害薬として、CTLA-4抗体、PD-1抗体、PDL-1抗体、Lag3抗体、LAIR1抗体またはLAIR2抗体が挙げられる。
【００１６】
前記インテグリンはインテグリンαｖβ３を含むことが好ましい。たとえば、インテグリンαｖβ３のアンタゴニストとして、RGDKGE（配列番号１）を含むαｖβ３結合性コラーゲンエピトープを標的とする抗体が挙げられる。
【００１７】
本明細書に記載の方法は、１つ以上の化学療法剤または抗新生物剤と組み合わせて使用することができる。いくつかの場合、併用される化学療法剤は放射線療法である。いくつかの場合、化学療法剤は細胞死誘導剤である。
【００１８】
本発明が好適に適用される、異常な免疫抑制を特徴とする前記疾患としては、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、乾癬、強皮症、溶血性貧血、脈管炎、グレーブス病、関節リウマチ、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、重症筋無力症および脈管炎が挙げられる。
【００１９】
いくつかの場合、免疫チェックポイント阻害薬（たとえば、CTLA-4抗体、PD-1抗体、PDL-1抗体、Lag3抗体、LAIR1抗体またはLAIR2抗体）は、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重（たとえば０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、０．１ｍｇ／ｋｇ体重、０．５ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重）の用量で投与される。たとえば、PDL-1阻害薬は、１回の投与につき０．０１〜３０ｍｇ（たとえば０．０１ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇまたは３０ｍｇ）の量で投与される。別の一実施形態において、前記抗体は、０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量範囲で投与される。いくつかの場合、インテグリンαｖβ３のアンタゴニストは、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重（たとえば０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、０．１ｍｇ／ｋｇ体重、０．５ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重）の用量で投与される。いくつかの場合、XL313抗体は、１回の投与につき０．０１〜３０ｍｇ（たとえば０．０１ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇまたは３０ｍｇ）の量で投与される。
【００２０】
本発明の組成物（たとえば免疫チェックポイント阻害薬とインテグリンαｖβ３のアンタゴニストとを含む組成物）の投与は、１ヶ月に１回、１ヶ月に２回（すなわち２週に１回）、週１回、１日に１回、１日に２回、１２時間に１回、８時間に１回、４時間に１回、２時間に１回または１時間に１回行われる。本発明の組成物（たとえばPDL-1阻害薬とXL313抗体とを含む組成物）の投与期間は、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、２週間、３週間、４週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、２年、３年、４年、５年またはそれ以上の期間である。本発明の組成物（たとえばPDL-1阻害薬とXL313抗体とを含む組成物）は、２週に１回、４〜６週間にわたって、または疾患が治癒するまで投与される。
【００２１】
さらに、過剰な免疫反応を起こしていると診断された対象（たとえばヒト対象）の、過剰な免疫反応を特徴とする疾患（たとえば自己免疫疾患）を治療する方法であって、コラーゲンまたはその断片を含むペプチドを投与することによって、前記対象の過剰な免疫反応を治療する方法が提供される。好適なコラーゲンの種類としては、Ｉ型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲンおよびIV型コラーゲン（たとえばIV型コラーゲンのα６鎖）が挙げられる。たとえば、前記ペプチドはRGDKGE（配列番号１）を含む。
【００２２】
いくつかの場合、前記自己免疫疾患は、グレーブス病、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、多発性硬化症または関節リウマチを含む。
【００２３】
対象の創傷（たとえばヒト対象の創傷）を治癒する方法は、コラーゲンまたはその断片を含むペプチドを前記対象の創傷に投与することによって行われ、それによって前記対象の創傷が治癒する。たとえば、前記ペプチドは、創傷の外縁または境界から約０．１ｍｍ離れた部位、約０．５ｍｍ離れた部位、約１ｍｍ離れた部位、約２．５ｍｍ離れた部位、約５ｍｍ離れた部位、約１０ｍｍ離れた部位、約１５ｍｍ離れた部位、約２０ｍｍ離れた部位、または約４０ｍｍ離れた部位に投与される。あるいは、前記ペプチドは創傷に直接投与される。
【００２４】
好適なコラーゲンの種類としては、Ｉ型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲンおよびIV型コラーゲン（たとえばIV型コラーゲンのα６鎖）が挙げられる。たとえば、前記ペプチドはRGDKGE（配列番号１）を含む。
【００２５】
用語の定義
特に記載がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はいずれも、本発明が属する技術分野において当業者に一般に理解される意味を有する。当業者であれば、以下の文献から、本発明で使用される用語の一般的な定義の多くを理解することができるであろう：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)；The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)；およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書において、以下の用語は特に記載がない限り、それぞれの用語について以下で説明された意味を有するものとする。
【００２６】
「薬剤」は、任意の小分子化合物、抗体、核酸分子もしくはポリペプチド、またはこれらの断片を意味する。
【００２７】
「抗体」は、免疫原に結合する能力を有するあらゆる免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片を意味する。本明細書において「抗体」は、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗原結合断片（たとえば、加水分解により得られるF(ab’)2断片およびFab断片など）を包含する。また、「抗体」には、遺伝子操作により得られた全長抗体または抗体断片も包含され、たとえば、キメラ抗体、Fv断片、一本鎖抗体や、抗原結合性合成ペプチドおよび抗原結合性合成ポリペプチドも含まれる。非ヒト抗体は、ヒトのフレームワークおよび定常領域に非ヒトCDRを移植したり、あるいは非ヒト可変ドメイン全体を組み込むことによってヒト化してもよい。特定の好ましい実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト可変領域のフレームワークドメイン内に非ヒト残基を含んでいてもよく、これによって適切な結合特性が増強されうる。
【００２８】
「抗原断片」などの用語は、対象において免疫応答を誘導することができるペプチドの一部、または該抗原断片に結合するように作製された抗体が特異的に結合することができるペプチドの一部として少なくとも理解される。抗原断片は、通常、７アミノ酸長以上である。抗原断片は、Ｎ末端からのアミノ酸配列の欠失、Ｃ末端からのアミノ酸配列の欠失、または両末端からのアミノ酸配列の欠失を含んでいてもよい。例えば、抗原断片におけるＮ末端および／またはＣ末端からの欠失は、約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個、約５５個、約６０個、約６５個、約７０個、約７５個、約８０個、約８５個、約９０個、約９５個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、約１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、もしくは約２００個のアミノ酸の欠失、またはこれ以上の個数のアミノ酸の欠失であってもよい。また、抗原断片は、例示したこれらの長さの内部欠失を１つ以上含んでいてもよい。さらに、抗原断片は、１つ以上の点突然変異、特に保存的点突然変異を含んでいてもよい。タンパク質からなる少なくとも１つの抗原断片は、抗原の野生型配列の全長を含んでいてもよい。抗原断片は、２つ以上の抗体結合性潜在部位を含んでいてもよい。抗原断片を用いて、本明細書で提供される方法のいずれかで使用される抗体を作製することができる。
【００２９】
「自己免疫疾患」は、免疫系の機能不全を特徴とする疾患を意味する。自己免疫疾患は、免疫系のコンポーネントが悪影響を受けていることを特徴とし、免疫系が過剰に活性化している場合や不活発な場合、あるいは病態が先天的である場合や後天的である場合をいずれも含む。自己免疫疾患では、免疫系の活性が異常に低くなっているか、あるいは免疫系が過剰に活性化されている場合が多い。免疫系が過剰に活性化されている場合、自己体内の組織が攻撃され、損傷を受ける（自己免疫）。免疫不全疾患では、侵入物に対する生体の攻撃力が弱まるため、感染に対して抵抗性が低くなる。未知の免疫誘導因子に応答した免疫系は、感染症と戦うためではなく、自己体内の組織を攻撃するために抗体を産生することがある。自己免疫疾患の治療は、一般に免疫系の活性を低下させることに重点をおいて行われる。
【００３０】
「血管形成」は、血管の発生および／または成熟に関する１つ以上のプロセスを含む動的過程を意味し、たとえば、血管新生、動脈新生、脈管形成、未熟な血管網の形成、血管リモデリング、血管の安定化、血管の成熟、血管の分化または機能的血管網の確立などが含まれる。
【００３１】
「血管リモデリング」または「脈管リモデリング」は、血管腔や脈管腔および血流を維持するための血管形状の拡大および血管の太さの増加における動的過程を意味する。たとえば、脈管リモデリングは、冠動脈の管腔および心筋への血流を効果的に維持するための、プラークの蓄積に応じた動脈の太さの変化を含む。
【００３２】
本明細書において「結合性」または「特異的結合性」は、非特異的結合パートナーに対する結合性と比べて、特異的結合パートナーに対する選択的結合性（たとえば、特定の抗原を認識する抗体を含んでいることがわかっている試料に対する該抗原の結合性）が、少なくとも１０３以上、好ましくは１０４以上、好ましくは１０５以上、好ましくは１０６以上高いことを意味する。
【００３３】
「がん」は、悪性黒色腫、中枢神経系（CNS）癌、CNS胚細胞腫、肺癌、白血病、多発性骨髄腫、腎臓癌、悪性神経膠腫、髄芽腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、線維肉腫、膵臓癌、胃癌、頭頸部癌、結腸直腸癌などを意味するが、これらに限定されない。たとえば、がん細胞は、固形癌に由来するものまたは血液がんに由来するものである。血液がんは、たとえば白血病またはリンパ腫である。白血病は、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、小リンパ球性リンパ腫（SLL）、慢性骨髄性白血病（CML）、急性単球性白血病（AMoL）のいずれかである。リンパ腫は、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（たとえば、結節硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型、またはリンパ球減少型）、非ホジキンリンパ腫のいずれかである。固形癌の具体的な例としては、悪性黒色腫（たとえば切除不能転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（たとえば腎細胞癌）、前立腺癌（たとえば転移性去勢抵抗性前立腺癌）、卵巣癌（たとえば上皮性卵巣癌、特に転移性上皮性卵巣癌）、乳癌（たとえばトリプルネガティブ乳癌）、および肺癌（たとえば非小細胞肺癌）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
「コントロール」または「参照」は、比較のための基準を意味する。本明細書において「コントロール」試料または「コントロール」対象「と比べて変化した」とは、特定の分析種の量、診断指標の量または治療指標の量が、正常試料、未処理試料またはコントロール試料と比べて、統計的に差があるとして検出されることを意味する。コントロール試料としては、たとえば、培養細胞、１匹以上の実験動物、または１人以上のヒト対象が挙げられる。コントロール試料を選択および試験する方法は、当業者の技能の範囲内で利用できる。分析種は、細胞または生物によって特徴的に発現または生成される天然物質（たとえば、抗体、タンパク質）であってもよく、レポーター構築物により生成される物質（たとえば、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ）であってもよい。どのような方法を使用して検出を行うかによって、変化量および変化の測定値は変動する。陽性結果を示す群の平均値からの標準偏差の算出などの統計的有意性の判断は、当業者の技能の範囲内で実施することができる。
【００３５】
「潜在性」とは、細胞表面受容体がアクセスできないモチーフであっても、この標的タンパク質モチーフが加水分解や変性を受けると、配列が露出されたり、あるいは断片を生じたりするため、抗体により認識可能となることを意味する。たとえば、XL313エピトープ、すなわちＩ型コラーゲンに含まれるRGDKGEコア配列は、潜在性エピトープであるため、この配列を認識する抗体は三重らせん構造の正常コラーゲンとは反応しないが、このコラーゲンが加水分解や変性を受けると、配列が露出されたり、あるいはコラーゲンの断片を生じたりするため、Mab XL313により認識可能となる。
【００３６】
本明細書において「検出する」、「検出」などの用語は、試料中の特定の分析種、たとえば試料中の抗原または試料中の抗原量を特定するためにアッセイを実施することを意味する。試料において検出される分析種の量または活性量は、全く検出されない場合や、使用したアッセイまたは方法の検出限界未満である場合もある。
【００３７】
本明細書において「診断する」などの用語は、疾患、障害または病態の徴候や症状などの少なくとも１つの指標の存在から疾患、障害または病態を有する対象を特定するための観察、試験または状況に基づいて、対象の状態の臨床評価またはその他の評価を行うことを意味する。本発明の方法を用いた診断は、通常、本明細書で提供される方法を使用して、疾患、障害または病態の様々な指標について対象を観察することを含む。診断方法を実施することによって、特定の疾患の有無を示す指標が得られる。通常、１つの診断検査だけでは、検査を受けた対象の病状に確定診断を下すことはできない。
【００３８】
製剤または製剤成分の「有効量」および「治療有効量」は、単独または別の製剤や成分と併用した場合に、所望の効果を得るのに十分な製剤または成分の量を意味する。たとえば、「有効量」は、単独または別の製剤や成分と併用して、未処置患者の疾患の症状を緩和するのに必要な化合物の量を意味する。疾患の治療的処置を目的として本発明を実施する際に使用される単一または複数の活性化合物の有効量は、投与方法、ならびに対象の年齢、体重および健康状態によって変動する。適切な量および投与計画は、最終的には主治医または担当獣医によって決定される。このような量を「有効」量と呼ぶ。
【００３９】
本明細書において「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、mRNA、RNA、cRNA、cDNAまたはDNAを指す。本明細書において「ポリペプチドをコードする核酸」は、（転写および）翻訳によって所望の配列のポリペプチドを生成することができるあらゆる核酸を意味する。核酸コードの縮重はよく知られている。さらに、各生物で好まれるコドンの使用頻度は、生物種間で異なることもよく知られている。任意のポリペプチドをコードする核酸配列の決定は、当業者の技能の範囲内で実施することができる。
【００４０】
本明細書において「イムノアッセイ」は、抗体を用いた任意の検出方法を意味し、たとえば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、放射免疫アッセイ（RIA）、ウエスタンブロット、免疫組織化学検査、免疫沈降アッセイ（たとえば、ルシフェラーゼ免疫沈降システム（LIPS；たとえば米国特許公開第2007/0259336号を参照されたい；この文献は引用により本明細書に組み込まれる））などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい一実施形態において、イムノアッセイは定量アッセイである。イムノアッセイで使用される抗体としては、特定のイムノアッセイでの使用に適した任意のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が挙げられる。
【００４１】
「阻害性核酸分子」は、標的核酸分子またはコードされたポリペプチドの発現を妨害するポリヌクレオチドを意味する。阻害性核酸分子の具体的な例としては、shRNA、siRNA、アンチセンス核酸分子およびこれらの類似体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
本明細書において、ポリペプチドに関して使用される「単離された」または「精製された」という用語は、天然のポリペプチドまたはタンパク質が、通常の生理学的環境から分離されたこと（たとえば、血漿や組織からタンパク質が単離されたことを指し、単離されたタンパク質は別のタンパク質に結合していてもよい）、または天然のポリペプチドまたはタンパク質が、非天然環境において合成されたこと（たとえば、インビトロ翻訳系において人工的に合成されたこと、または化学合成法を用いて人工的に合成されたこと）を意味する。したがって、「単離された」または「精製された」ポリペプチドは、細胞を含んでいない溶液中や、本来の環境とは異なる細胞環境下に置くことができる（たとえば、異種細胞において発現させることができる）。「精製された」は、精製されたポリペプチドが唯一のポリペプチドとして存在することを意味するものではなく、自然界において該ポリペプチドと関連する細胞材料または生物材料が本質的に含まれていないため（約９０〜９５％、最大で９９％〜１００％純粋であることから）、天然のポリペプチドとは区別されることを意味する。同様に、単離された核酸は、通常の生理学的環境から分離された核酸を意味する。細胞に関して使用される「単離された」という用語は、細胞が、初代細胞または初代細胞株の、細胞培養または器官培養において培養されていること（すなわち動物体内から取り出されていること）を意味する。細胞は、正常動物、トランスジェニック動物、自然発生した遺伝的変化を有する動物、ならびに／または遺伝性疾患もしくは遺伝性病態および／または誘発性疾患もしくは誘発性病態を有する動物から単離することができる。単離されたウイルスまたはウイルスベクターは、そのウイルスの作製に使用した細胞（通常、培養細胞）から分離されたウイルスを意味する。
【００４３】
本明細書において「キット」は、本発明の方法において使用するための少なくとも１つの非標準的な実験試薬を含み、このような試薬は適切に包装されており、キットは使用説明書をさらに含んでいてもよい。キットは、本発明の方法を実施するのに必要なその他のコンポーネントをさらに含んでいてもよく、これらのその他のコンポーネントは、乾燥粉末、濃縮溶液または即時使用可能な溶液の形態であってもよい。いくつかの実施形態において、キットは、本発明の方法において使用するための試薬を含む１つ以上の容器を含んでおり、このような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、袋、パウチ、ブリスターパック、当技術分野で公知のその他の好適な容器形態のいずれであってもよい。これらの容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔または試薬を保持するのに適したその他の材料から構成されていてもよい。
【００４４】
本明細書において「得る」は、製造すること、購入すること、またはその他の方法で入手することを意味する。
【００４５】
「薬学的に許容される担体」は当技術分野でよく知られており、哺乳動物への本発明の化合物の投与に適した薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを包含する。薬学的に許容される担体としては、液体充填剤または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒およびカプセル化材料が挙げられ、これらの担体は、目的の作用物質を１つの臓器または生体の一部分から、別の臓器または生体の別の部分へと送達または輸送するために使用される。各担体は、製剤中の他の成分との適合性の点で「許容される」ものでなければならず、また、患者に有害なものであってはならない。薬学的に許容される担体として使用できる材料のいくつかとしては、乳糖、ブドウ糖、ショ糖などの糖類；コーンスターチ、バレイショデンプンなどのデンプン類；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなどのセルロース類およびその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオ脂、坐剤用ワックスなどの賦形剤；ラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、ダイズ油などの油類；プロピレングリコールなどのグリコール類；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールなどのポリオール類；オレイン酸エチル、ラウリン酸エチルなどのエステル類；寒天；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質非含有水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；および医薬製剤に使用されるその他の非毒性適合性物質が挙げられる。
【００４６】
本発明の製剤には、経口投与、経鼻投与、局所投与、経皮投与、頬側投与、舌下投与、筋肉内投与、心臓内投与、腹腔内投与、髄腔内投与、頭蓋内投与、直腸投与、経膣投与および／または非経口投与に適した製剤が含まれる。本発明の製剤は、簡便に単位投与剤形として提供してもよく、薬学分野でよく知られている方法であれば、どのような方法で調製してもよい。単位投与剤形を製造するために担体材料と組み合わされる有効成分の量は、通常、治療効果をもたらす化合物の量に相当する。
【００４７】
いくつかの場合、本発明の組成物は経口投与または全身投与される。その他の投与経路としては、直腸経路、局所経路、眼内経路、頬側経路、膣内経路、大槽内経路、脳室内経路、気管内経路、経鼻経路、経皮経路、移植片の内部／表面からの経路、または非経口経路が挙げられる。「非経口」経路としては、皮下経路、髄腔内経路、静脈内経路、筋肉内経路、腹腔内経路または点滴が挙げられる。静脈内経路または筋肉内経路は、長期にわたる治療および予防にはそれほど適していない。しかし、静脈内経路または筋肉内経路は、緊急時には好ましいこともある。本発明の組成物を含む組成物は、血液などの生理学的流体に投与することもできる。経口投与は、患者にとって簡便であり、投薬スケジュールの調整も容易であるため、予防的処置に好ましい場合がある。非経口投与（皮下投与または静脈内投与）は、急性疾患に好ましい場合があり、また、消化管不耐症、腸閉塞またはその他の重症疾患合併症を有するために腸内投与に忍容性のない患者の治療においても好ましい場合がある。吸入療法は、肺血管疾患（たとえば肺高血圧症）に最も適している場合がある。
【００４８】
本明細書において「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的処置」などの用語は、疾患や病態を有していないが、これらを発症するリスクのある対象またはこれらに罹患しやすい対象において、特定の疾患または病態を発症する可能性を低減させることを指す。
【００４９】
本明細書において「複数」は、１つよりも多いことを意味する。たとえば、「複数」は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上またはそれ以上を指す。
【００５０】
本明細書において「ポリペプチド」または「ペプチド」は、共有結合（たとえばペプチド結合）で連結され、独立して選択された２個以上の天然アミノ酸または非天然アミノ酸を意味する。ペプチドは、ペプチド結合により連結された２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれ以上の個数の天然アミノ酸または非天然アミノ酸を含んでいてもよい。本明細書に記載のポリペプチドは、完全長タンパク質（たとえば、全長が翻訳されたタンパク質）およびこれよりも短いアミノ酸配列（たとえば、天然タンパク質の断片または合成ポリペプチド断片）を包含する。また、ペプチドは、修飾ペプチド結合などの１つ以上の修飾をさらに含んでいてもよく（すなわちペプチドイソスター）、遺伝子によってコードされる２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの自然界で見られる修飾プロセス、または当技術分野で公知の化学修飾技術によって修飾されていてもよい。このような修飾は、基礎的な教科書、さらに詳述された学術論文、およびさらに記載が充実した研究文献に詳しく説明されている。修飾は、ポリペプチドのどの部位に存在していてもよく、たとえば、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端などに存在していてもよい。同じ種類の修飾が、１つのポリペプチドのいくつかの部位において同程度または様々な程度で存在していてもよい。また、１つのポリペプチドに様々な種類の修飾が含まれていてもよい。ポリペプチドは、たとえばユビキチン化などによって分岐状となっていてもよく、また、分岐を有する環状ポリペプチドであってもよく、分岐を持たない環状ポリペプチドであってもよい。環状ポリペプチド、分岐ポリペプチドおよび分岐環状ポリペプチドは、自然界での翻訳後プロセシングにより生成されてもよく、あるいは合成方法により作製されてもよい。修飾の例としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合付加、脂質または脂質誘導体の共有結合付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合付加、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合による架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、加水分解、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、転移RNAによるタンパク質へのアミノ酸の付加（アルギニル化など）、およびユビキチン化が挙げられる（たとえば、Proteins, Structure and Molecular Properties, 2nd ed., T. E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993)；Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983)；Seifter et al., Meth. Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992)を参照されたい）。
【００５１】
「低減させる」または「増加させる」は、正または負に少なくとも５％変化させることを意味する。この変化は、５％、１０％、２５％、３０％、５０％、７５％、１００％のいずれであってもよい。
【００５２】
本明細書において「レポータータンパク質」または「レポーターポリペプチド」は、直接的または間接的に容易に検出でき、好ましくは定量的に検出できるポリペプチドを意味する。レポーターポリペプチドは、通常、酵素活性、ルシフェラーゼ活性、アルカリホスファターゼ活性、β−ガラクトシダーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性などを有する。基質に対する酵素の触媒反応の結果、生成物が生じ、たとえば、特定の波長において検出することができる光や放射能が生成物として得られることから、試料中のレポーターペプチドの量を、コントロール試料と比較した相対量または絶対量として求めることができる。
【００５３】
本明細書において「試料」は、生体環境から単離された生物材料（たとえば、動物から得られた血液もしくは組織、細胞、または組織培養から得られた馴化培地）を指し、タンパク質などの分析種を含んでいると考えられるものであるか、あるいは分析種を含むことがわかっているものである。また、試料は、組織または体液を部分的に精製した画分であってもよい。参照試料は、疾患や病態を有していないドナーの体液から、または疾患または病態を有する対象の正常組織から得られた「正常な」試料であってもよい。また、参照試料は、作用物質で処置や処理を行っていない未処置ドナーまたは未処理細胞培養（たとえば、処理を行っていないもの、またはビヒクルのみを投与したもの）から得ることもできる。さらに、参照試料は、試験される作用物質または治療的介入と細胞または対象とを接触させる前の「ゼロ時間点」で得ることもでき、前向き研究の開始時点で得ることもできる。
【００５４】
「感度と特異度」は、二項分類試験の性能の統計的尺度である。「感度」（分野によっては要精検率とも呼ばれる）は、陽性であると正確に特定された実際の陽性数の割合（たとえば、病態を有していると特定された患者のパーセンテージ）を測定するものであり、「特異度」は、陰性であると正確に特定された割合（たとえば、病態を有していないと特定された健常者のパーセンテージ）を測定するものである。これらは、第一種過誤および第二種過誤と密接に関連している。理論的かつ最適化された予測では、１００％の感度（すなわち、患者群の全員が疾患を有していると予測される）と、１００％の特異度（すなわち、健常者群において疾患を有していると予測される人がいない）を達成することができる。
これらの概念は、数学的には以下の式で表される。
感度＝真陽性数／（真陽性数＋偽陰性数）
特異度＝真陰性数／（真陰性数＋偽陽性数）
【００５５】
「選択的」は、非標的分子の活性や発現に影響を及ぼすことなく、標的分子の活性または発現に影響を及ぼすことができることを意味する。
【００５６】
「実質的に同一」は、参照アミノ酸配列（たとえば本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか）または参照核酸配列（たとえば本明細書に記載の核酸配列のいずれか）と少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。そのような配列は、比較される配列とアミノ酸レベルまたは核酸レベルで少なくとも６０％の同一性を示すことが好ましく、８０％または８５％の同一性を示すことがより好ましく、９０％、９５％または９９％の同一性を示すことがさらにより好ましい。
【００５７】
配列同一性は、通常、配列分析ソフトウェア（たとえば、Genetics Computer Group（University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705）のSequence Analysis Software Package、BLASTプログラム、BESTFITプログラム、GAPプログラムまたはPILEUP/PRETTYBOXプログラム）を使用して測定される。このようなソフトウェアは、様々な置換、欠失および／または他の修飾に対して相同性の程度を決定することによって、同一配列同士また類似した配列同士をマッチさせる。保存的置換には、通常、以下のグループ内における置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。具体的には、同一性の程度を決定する方法においてBLASTプログラムを使用してもよく、e-3〜e-100の期待値であれば配列同士が密接な関連性を有していると言える。
【００５８】
本明細書において「対象」は生物を指す。特定の実施形態において、前記生物は動物である。特定の実施形態において、対象は生きている生物である。特定の実施形態において、対象は死んだ生物である。特定の好ましい実施形態において、対象は哺乳動物であり、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、対象は家畜哺乳動物、または非ヒト霊長類を含む霊長類である。対象の例としては、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギおよびヒツジが挙げられる。ヒト対象は患者と呼んでもよい。
【００５９】
「対象の試料」は、任意の対象から得られた試料であってもよく、通常、血液試料または血清試料であってもよいが、本発明の方法では、対象から得られた体液または組織を使用する。得られた試料を使用して、たとえば、特定の疾患または病態の有無について特定の個体の診断を行ってもよい。
【００６０】
特定の疾患、病態または症候群に「罹患しているか、または罹患している疑いのある」対象は、対象が特定の疾患、病態または症候群に罹患していると有資格者が診断を下したり、これらに罹患している疑いがあると判断するのに十分な数の危険因子を有しているか、あるいは有資格者がこのような診断を下したり、このような疑いがあると判断するのに十分な数の、疾患、病態もしくは症候群の徴候もしくは症状、またはそれらの組み合わせを呈する。心機能の低下に付随する病態に罹患しているか、またはその疑いがある対象を特定する方法は、当業者の技能の範囲内で実施することができる。特定の疾患、病態または症候群に罹患しているか、またはその疑いのある対象は、必ずしも２つの群に明確に分けることができるとは限らない。
【００６１】
本明細書において、特定の疾患や病態などに「罹患しやすい」または「罹患する傾向がある」または特定の疾患や病態などの「素因を持っている」とは、遺伝因子、環境因子、健康因子および／またはその他の危険因子に基づき、一般的な集団よりも疾患または病態を発症する可能性が高い個体を指す。疾患を発症する可能性の増加は、約１０％、約２０％、約５０％、約１００％、約１５０％、約２００％またはそれ以上である。
【００６２】
本明細書において「治療する」、「治療すること」、「治療」などの用語は、疾患および／またはそれに関連する症状の低減または緩和を指す。疾患または病態の治療は、疾患もしくは病態またはそれに関連する症状を完全に取り除くことを必要としないが、このような可能性を排除するものではないことは明らかであろう。
【００６３】
特に記載がない限り、あるいは文脈から明らかでない限り、本明細書において「または」は包括的な用語であると見なされる。
【００６４】
特に記載がない限り、あるいは文脈から明らかでない限り、本明細書において「a」、「an」および「the」は単数のものまたは複数のものを指すと見なされる。
【００６５】
特に記載がない限り、あるいは文脈から明らかでない限り、本明細書において「約」は、当技術分野において一般に許容される範囲内であることを指し、たとえば平均値±２標準偏差の範囲内であることを指す。また、「約」は、記載された値から±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％、±０．５％、±０．１％、±０．０５％または±０．０１％の範囲を指すと見なすことができる。文脈から明らかでない限り、本明細書に記載の数値はすべて「約」という用語で修飾されていると見なすことができる。
【００６６】
本明細書において可変要素の任意の定義において列挙された化学基の記載は、列挙された任意の単一の化学基または列挙された化学基の組み合わせとしての可変要素の定義を包含する。本明細書において可変要素またはその態様を示した実施形態の記載は、任意の単一の実施形態としての実施形態、および他の実施形態またはその一部と組み合わせた実施形態を包含する。
【００６７】
本明細書において提供される組成物および方法はいずれも、本明細書で提供される他の組成物および方法のいずれか１つ以上と組み合わせることができる。
【００６８】
本発明の他の特徴および利点は、後述する本発明の好ましい実施形態の詳細な説明および請求項から明らかになるであろう。特に記載がない限り、本明細書で使用されている技術用語および科学用語はいずれも、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有すると見なされる。本発明の実施や試験の際に、本明細書に記載されたものと同様または同等の方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料は後述するとおりである。本明細書において引用された外国公開特許および外国公開特許出願はいずれも、引用により本願に組み込まれる。本明細書において引用されたアクセッション番号によって示されるGenbankおよびNCBIに寄託された配列は、引用により本願に組み込まれる。本明細書において引用されたその他の公表されている参考論文、論文、草稿および科学文献はいずれも、引用により本願に組み込まれる。用語の定義などの記載が引用文献と一致しない場合は、本願明細書の記載が優先される。さらに、本明細書に記載の材料、方法および実施例は、例示のみを目的として記載されたものであり、本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１Ａ−１Ｆ】Ｉ型コラーゲン由来の潜在性RGD含有ペプチドが細胞接着を補助することを示した棒グラフである。システインを末端に付加して、ヒトＩ型コラーゲン由来の５種のRGD含有モチーフに対応するペプチドを合成し、組織培養用ではないプレートに固相化した。間質細胞の接着能（図１Ａ〜図１Ｄ）および固相化されたペプチドに対するモノクローナル抗体の結合能（図１Ｅ〜図１Ｆ）を評価した。図１Ａは、固相化されたペプチドへのヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の接着を示した棒グラフである。図１Ｂは、固相化されたペプチドへのヒト網膜毛細血管内皮細胞（HMVEC）の接着を示した棒グラフである。図１Ｃは、固相化されたペプチドへのHRMVECの接着を示した棒グラフである。図１Ｄは、固相化されたペプチドへのヒト線維芽細胞（HDF）の接着を示した棒グラフである。図１Ｅは、固相化されたペプチドに対するMab XL313の反応性を示した棒グラフである。図１Ｆは、固相化されたペプチドに対するMab XL166の反応性を示した棒グラフである。各棒グラフは、各実験において三連のウェルで行った少なくとも３回の実験から得られた結合性の平均値±ＳＤを示す。＊はｐ＜０．０５を示す。
【００７０】
【図２Ａ−２Ｄ】加水分解Ｉ型コラーゲンに対するMab XL313の選択的結合性を示した一連のイムノブロットおよび棒グラフである。精製Ｉ型コラーゲンおよび精製IV型コラーゲンにコントロールバッファーまたは活性化MMP-2を加えて一定時間インキュベートし、ウエスタンブロット（図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｄ）またはELISA（図２Ｃ）で分析した。図２Ａは、非処理Ｉ型コラーゲンコントロール（NT）およびMMP-2で加水分解したＩ型コラーゲン（Prot）（左パネル）、ならびに非処理IV型コラーゲンコントロール（NT）およびMMP-2で加水分解したIV型コラーゲン（Prot）（右パネル）を、抗Ｉ型コラーゲン特異的抗体（左パネル）または抗IV型コラーゲン特異的抗体（右パネル）で検出したウエスタンブロット分析の結果である。図２Ｂは、１６時間インキュベートして得られた、非加水分解Ｉ型コラーゲンコントロールおよびMMP-2で加水分解したＩ型コラーゲン、ならびに非加水分解IV型コラーゲンコントロールおよびMMP-2で加水分解したIV型コラーゲンを、RGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンモチーフに結合するMab XL313で検出したウエスタンブロット分析の結果である。図２Ｃは、非加水分解コラーゲン（Nat）またはMMP-2で加水分解したコラーゲン（Prot）において、Mab XL313反応性RGDKGE（配列番号１）モチーフをELISAで検出した結果を示す棒グラフである。各棒グラフは、三連ウェルにおける反応性の平均値±ＳＤを示す。＊はｐ＜０．０５を示す。実験は少なくとも３回行い、同様の結果が得られた。図２Ｄは、時間の経過とともにＩ型コラーゲン由来のMab XL313反応性エピトープの生成が増加することを示したウエスタンブロット分析の結果である。
【００７１】
【図３Ａ−３Ｅ】インビボでの血管新生と炎症に対する潜在性RGDコラーゲンモチーフの役割は、その種類によって異なることを示したデータである。酢酸コルチゾンの存在下または非存在下において、鶏胚漿尿膜（CAM）をFGF-2で刺激するか、あるいは刺激を与えなかった。図３Ａは、Mab XL313またはMab XL166（緑色）で染色した非刺激CAM組織またはFGF-2刺激CAM組織の代表例の写真である。スケールバーは５０μｍを表す。図３Ｂは、Mab XL313、Mab XL166または非特異的コントロール抗体の存在下または非存在下においてFGF-2誘導性血管新生を定量した棒グラフである。各条件につき８〜１０個の鶏胚を使用し、新しい血管分枝の平均本数±Ｓ．Ｅを各棒グラフに示した。実験は少なくとも３回行い、同様の結果が得られた。図３Ｃは、酢酸コルチゾンの非存在下においてFGF-2で刺激したCAMまたは刺激を与えなかったCAMの写真である。炎症を起こしたCAMの肥厚（上パネル）、ギムザ陽性の炎症性浸潤細胞（中央のパネル）および抗トリ特異的マクロファージマーカーKUL１抗体で染色したマクロファージ（緑色）の浸潤（下パネル）の代表的な写真を示す。スケールバーは５０μｍを表す。図３Ｄは、酢酸コルチゾンの非存在下においてFGF-2で刺激した後、マクロファージの浸潤を定量し、相対値として示した棒グラフである。１条件につき１０個のCAMを使用し、顕微鏡下において１個のCAMあたり５つの視野を１００倍で観察したときの、１視野あたりのKUL発現ニワトリマクロファージの量の平均値±Ｓ．Ｅを各棒グラフに示した。＊はｐ＜０．０５を示す。図３Ｅは、Mab XL313、Mab XL166または非特異的コントロール抗体の存在下または非存在下においてFGF-2誘導性炎症を定量した棒グラフである。各棒グラフは、CAMの平均炎症発生率（％）±Ｓ．Ｅを表す。実験は少なくとも３回行い、同様の結果が得られた。＊はｐ＜０．０５を示す。
【００７２】
【図４Ａ−４Ｄ】RGDKGE（配列番号１）含有XL313潜在性エピトープの生成を示す写真である。図４Ａは、間質細胞から得た全細胞溶解物（右パネル）または無血清馴化培地（左パネル）をMab XL313またはローディングコントロールとしてのβ−アクチン抗体もしくはMMP-9抗体で検出したウエスタンブロットである。図４Ｂは、FGF-2で刺激したCAM組織において、ニワトリマクロファージ（緑色）とRGDKGE（配列番号１）含有エピトープ（赤色）の発現を共染色した代表的な写真である。スケールバーは５０μｍを表す。図４Ｃは、マクロファージ細胞株から得た全細胞溶解物（右パネル）または無血清馴化培地（左パネル）を、Mab XL313またはローディングコントロールとしてのβ−アクチン抗体もしくはIGFBP-4抗体で検出したウエスタンブロットである。図４Ｄは、トランスフェクションなしのRAW264.7マクロファージ細胞（WT）、α２（Ｉ）特異的shRNAをトランスフェクトしたRAW264.7マクロファージ細胞（Col 1 Kd）、またはコントロール非特異的shRNA（Cont Kd）でトランスフェクトしたRAW264.7マクロファージ細胞から得た全細胞溶解物または無血清馴化培地を、Mab XL313（左パネル）または抗Ｉ型コラーゲン抗体（右パネル）で検出したウエスタンブロットである。
【００７３】
【図５Ａ−５Ｄ】インビボにおける血管新生および炎症は、RGDKGE（配列番号１）を含む可溶性コラーゲンエピトープによって誘導されるが、この配列に関連するRGDAPG（配列番号１１）を含むコラーゲンエピトープによっては誘導されないことを示した棒グラフである。図５Ａは、CAMに刺激を与えなかった場合（NT）またはFGF-2でCAMを刺激した場合において、鶏胚から採取した血清から得たデータを示した棒グラフである。循環型のMab XL313反応性エピトープの相対量を固相ELISAで定量した。データは、Mab XL313反応性の平均値±Ｓ．Ｅを表す（Ｎ＝１２〜１３）。図５Ｂは、RGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンペプチドP-2による用量依存的な血管新生の誘導を定量した結果を示した棒グラフである。１条件につき８〜１２個の鶏胚を使用し、これらから得られた分岐点数の平均値±Ｓ．Ｅを各棒グラフに示した。図５Ｃは、RGD含有コラーゲンペプチドP-1（KGDRGDAPG；配列番号２）、RGD含有コラーゲンペプチドP-2（QGPRGDKGE；配列番号３）またはコントロールペプチドP-C（QGPSGSPGE；配列番号４）を使用したCAMの血管新生を定量した結果を示した棒グラフである。１条件につき８〜１２個の鶏胚を使用し、これらから得られた分岐点数を非刺激CAMから差し引くことによって血管新生指数を求め、血管新生指数の平均値±Ｓ．Ｅを各棒グラフに示した。図５Ｄは、RGD含有コラーゲンペプチドP-1（KGDRGDAPG；配列番号２）、RGD含有コラーゲンペプチドP-2（QGPRGDKGE；配列番号３）またはコントロールペプチドP-C（QGPSGSPGE；配列番号４）を使用したCAMの炎症を定量した結果を示した棒グラフである。実験はいずれも少なくとも３回行い、同様の結果が得られた。＊はｐ＜０．０５を示す。
【００７４】
【図６Ａ−６Ｆ】RGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンペプチドP-2による血管新生の誘導がP38MAPKに依存することを示すデータである。鶏胚CAMにおいて血管新生を誘導し、P38MAPKの相対量を評価した。図６Ａは、非刺激CAM（NT）、P-1（KGDRGDAPG（配列番号２））で刺激したCAMまたはP-2（QGPRGDKGE（配列番号３））で刺激したCAMから得た全細胞溶解物のいくつか（１条件につきＮ＝３）において、リン酸化P38MAPK（P-p38）、トータルP38MAPK（T-p38）またはβ−アクチンを検出したウエスタンブロットである。図６Ｂは、非刺激CAM、P-1（KGDRGDAPG（配列番号２））で刺激したCAM、またはP-2（QGPRGDKGE（配列番号３））で刺激したCAMにおいて、リン酸化P38MAPKの平均相対量を定量（Image-J）した結果を示した棒グラフである。各棒グラフは、リン酸化P38MAPKの平均量±Ｓ．Ｄを表す（１条件につき使用したCAMの個数：Ｎ＝８〜１０）。図６Ｃは、P-2で刺激したCAM組織において、vWfの発現およびリン酸化P38MAPKの発現を共染色によって観察した代表的な写真である。スケールバーは５０μｍを表す。図６Ｄは、コラーゲンペプチドP-1（KGDRGDAPG（配列番号２））またはP-2（QGPRGDKGE（配列番号３））を結合させた内皮細胞（HUVEC）から得た溶解物において、リン酸化P38MAPK（P-p38）、トータルP38MAPK（T-p38）またはβ−アクチンを検出したウエスタンブロット分析である。図６Ｅは、コラーゲンペプチドP-1（KGDRGDAPG（配列番号２））またはP-2（QGPRGDKGE（配列番号３））を結合させた内皮細胞（HRMVEC）から得た溶解物において、リン酸化P38MAPK（P-p38）、トータルP38MAPK（T-p38）またはβ−アクチンを検出したウエスタンブロット分析である。図６Ｆは、P38MAPK阻害薬（P38IN）またはDMSOコントロール（Cont）で鶏胚CAMを処理した後、コラーゲンペプチドP-2（QGPRGDKGE（配列番号３））を使用して誘導した血管新生の定量を示した棒グラフである。各棒グラフは、新しい分枝の分岐点数±Ｓ．Ｅを表す（１条件につきＮ＝８〜１２）。実験は少なくとも３回行い、同様の結果が得られた。＊はｐ＜０．０５を示す。
【００７５】
【図７Ａ−７Ｇ】コラーゲンペプチドP-2がαｖβ３と結合してこれを活性化し、Src依存的にP38MAPKの活性化を刺激することを示した写真である。図７Ａおよび図７Ｂは、抗インテグリン機能遮断抗体の存在下または非存在下において、RGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンペプチドP-2（図７Ａ）またはRGDAPG（配列番号１１）含有コラーゲンペプチドP-1（図７Ｂ）でコーティングしたウェルに内皮細胞（HUVEC）を結合させた結果を示した棒グラフである。各棒グラフは、細胞接着の平均値（±Ｓ．Ｅ．；４つの実験の結果）を表す。＊はｐ＜０．０５を示す。図７Ｃは、RGD含有コラーゲンペプチドP-1またはP-2と結合させたHUVECの溶解物を、抗リン酸化β３インテグリン抗体（ｐ−β３）、抗トータルβ３インテグリン抗体（Ｔ−β３）または抗β−アクチン抗体で検出したウエスタンブロットである。図７Ｄは、RGD含有コラーゲンペプチドP-1またはP-2と結合させたHUVECの溶解物を、抗リン酸化Src抗体（P-Src）、抗トータルSrc抗体（T-Src）または抗β−アクチン抗体で検出したウエスタンブロットである。図４Ｅは、RGD含有コラーゲンペプチドP-1またはP-2を結合させ、次いでSrc阻害薬PP2（Src-IN）またはコントロールDMSO（cont）の存在下でインキュベートしたHUVECの溶解物を、抗リン酸化β３インテグリン抗体（ｐ−β３）、抗トータルβ３インテグリン抗体（Ｔ−β３）または抗β−アクチン抗体で検出したウエスタンブロットである。図７Ｆは、RGD含有コラーゲンペプチドP-1またはP-2を結合させ、次いでSrc阻害薬PP2（Src-IN）またはコントロールDMSO（cont）の存在下でインキュベートしたHUVECの溶解物を、抗リン酸化P38MAPK抗体（p-P38）、抗トータルP38MAPK抗体（T-P38）または抗β−アクチン抗体で検出したウエスタンブロットである。図７Ｇは、RGD含有コラーゲンペプチドP-1またはP-2を結合させた内皮細胞（HUVEC）において、Ｆ−アクチンを染色した代表的な写真である。スケールバーは５０μｍを表す。
【００７６】
【図８Ａ−８Ｉ】RGDKGE（配列番号１）コラーゲン含有ペプチドと細胞との相互作用によって、アクチンストレスファイバーの形成およびYAPの核内蓄積が促進され、それによって、内皮細胞の増殖が促進されることを示したデータである。図８Ａは、RGD含有コラーゲンペプチドP-1またはP-2を結合させた内皮細胞（HUVEC）において、YAP（緑色）を染色した代表的な写真である。スケールバーは５０．０μｍを表す。図８Ｂは、RGD含有コラーゲンペプチドP-1またはP-2を結合させたHUVECの溶解物から調製した細胞質画分（左）および核画分（右）を、抗YAP抗体、抗β−チューブリン抗体および抗トータル結合タンパク質（TBP）で検出したウエスタンブロットである。図８Ｃおよび図８Ｄは、細胞外から添加したRGD含有ペプチドP-1またはP-2の存在下または非存在下において、HUVEC（図８Ｃ）およびHRMVEC（図８Ｄ）の増殖を定量した棒グラフである。３つまたは４つの独立した実験から、コントロールに対するパーセンテージとして内皮細胞の増殖を求め、その平均値（±Ｓ．Ｅ）を各棒グラフに示した。図８Ｅは、RGDを含む可溶性コラーゲンペプチドP-1またはP-2で刺激した内皮細胞（HRMVEC）の細胞溶解物から核画分を単離し、この核画分においてYAPまたはトータル結合タンパク質（TBP）を検出したウエスタンブロットである。図８Ｆは、内皮細胞（HRMVEC）をSrc阻害薬またはP38MAPK阻害薬とプレインキュベートし、RGD含有可溶性コラーゲンペプチドP-1またはP-2で刺激した後、得られた内皮細胞（HRMVEC）から細胞溶解物を調製し、この細胞溶解物から単離した核画分においてYAPまたはトータル結合タンパク質（TBP）を検出したウエスタンブロットである。図８Ｇおよび図８Ｈは、非特異的shRNA（図８Ｇ）またはYAP特異的shRNA（図８Ｈ）で内皮細胞の形質導入を行い、細胞外から添加したRGD含有ペプチドP-1またはP-2の存在下または非存在下において内皮細胞の増殖を定量した棒グラフである。各棒グラフは、４つの独立した実験から得た内皮細胞の増殖の平均値（±Ｓ．Ｅ）を表す。図８Ｉは、YAP特異的shRNAで内皮細胞の形質導入を行い、細胞外から添加したVEGF（５０ｎｇ／ｍｌ）または１０％血清の存在下または非存在下において内皮細胞の増殖を定量した棒グラフである。各棒グラフは、４つの独立した実験から得た内皮細胞の増殖の平均値（±Ｓ．Ｅ）を表す。＊はｐ＜０．０５を示す。
【００７７】
【図９】Mab XL313が免疫チェックポイント阻害薬である抗PDL-1抗体の抗腫瘍活性を高めることを示した棒グラフである。マウス（C57BL/6）に３．５×１０５個のB16F10悪性黒色腫細胞を注射した。マウスに処置を行う５日前に、あらかじめ腫瘍を樹立させた。週３回、１４日間にわたってマウスを処置した（マウス１匹あたり１００μｇ）。データは、１条件につき８匹のマウスを使用して得た１４日目の平均腫瘍体積±ＳＥを表す。ｐ＜０．０５である場合、統計的有意性があるとみなした。
【００７８】
【図１０】ヒトM21悪性黒色腫におけるPDL-1の発現が、αｖβ３を欠損したM21L悪性黒色腫における発現よりも高いこと示した写真である。マウス（ヌード）に、M21（αｖβ３＋）悪性黒色腫細胞またはM21L（αｖβ３−）悪性黒色腫細胞を注射した。マウスに処置を行う前にあらかじめ腫瘍を樹立させた。マウスを屠殺し、腫瘍を切り出し、急速凍結した。腫瘍の切片を免疫蛍光染色し、免疫チェックポイント制御タンパク質PDL-1の発現を分析した。赤色はPDL-1の発現を示す。コントロールは二次抗体のみを用いた染色を示す。
【００７９】
【図１１】ヒトM21悪性黒色腫におけるPDL-1の発現が、β３インテグリンがノックダウンされたM21悪性黒色腫よりも高いことを示した写真である。インテグリンαｖβ３を発現するM21悪性黒色腫細胞に、非特異的コントロールshRNA（M21 Cont）またはβ３特異的shRNA（M21β3Kd）をトランスフェクトした。マウス（ヌード）に、M21 Cont（αｖβ３＋）悪性黒色腫細胞またはM21β3Kd（αｖβ３−）悪性黒色腫細胞を注射した。マウスに処置を行う前に、あらかじめ腫瘍を樹立させた。マウスを屠殺し、腫瘍を切り出し、急速凍結した。腫瘍の切片を免疫蛍光染色し、免疫チェックポイント制御タンパク質PDL-1の発現を分析した。赤色はPDL-1の発現を示す。コントロールは二次抗体のみを用いた染色を示す。
【００８０】
【図１２】αｖβ３のリガンド（RGDKGE（配列番号１）を含むコラーゲンエピトープXL313）を標的とする抗体で処置したマウスの悪性黒色腫におけるPDL-1の発現の低下を示した写真である。マウス（C57BL/6）に３．５×１０５個のB16F10悪性黒色腫細胞を注射した。マウスに処置を行う５日前に、あらかじめ腫瘍を樹立させた。RGDKGE（配列番号１）を含むαｖβ３結合性コラーゲンエピトープを標的とする抗体を用いて、週３回、１４日間にわたってマウスを処置した（マウス１匹あたり１００μｇ）。マウスを屠殺し、腫瘍を切り出し、急速凍結した。腫瘍の切片を免疫蛍光染色し、免疫チェックポイント制御タンパク質PDL-1の発現を分析した。赤色はPDL-1の発現を示す。コントロールは二次抗体のみを用いた染色を示す。
【００８１】
【図１３】αｖβ３のリガンド（RGDKGE（配列番号１）を含むコラーゲンエピトープXL313）を標的とする抗体で処置したマウスの悪性黒色腫における浸潤リンパ球の検出の増加を示した写真である。マウス（C57BL/6）に３．５×１０５個のB16F10悪性黒色腫細胞を注射した。マウスに処置を行う５日前に、あらかじめ腫瘍を樹立させた。RGDKGE（配列番号１）を含むαｖβ３結合性コラーゲンエピトープを標的とする抗体を用いて、週３回、１４日間にわたってマウスを処置した（マウス１匹あたり１００μｇ）。マウスを屠殺し、腫瘍を切り出した。腫瘍の切片をギムザ染色し、免疫チェックポイント制御タンパク質PDL-1の発現を分析した。黒色の矢印は、浸潤リンパ球が増加した領域のいくつかを示す。
【００８２】
【図１４Ａ−１４Ｃ】αｖβ３のECMリガンド（変性IV型コラーゲン）を結合させた悪性黒色腫細胞および内皮細胞におけるPDL-1タンパク質の検出量の増加を示すブロットの写真である。図１４Ａおよび図１４Ｂは、インテグリンαｖβ３発現悪性黒色腫細胞（M21およびCLL-49）のブロットの写真であり、図１４Ｃは、内皮細胞（HUVEC）のブロットの写真であるが、いずれの場合も、αｖβ３非結合性リガンド（天然IV型コラーゲン）またはαｖβ３結合性リガンド（変性IV型コラーゲン）をコーティングしたウェルに細胞を接着させた。全細胞溶解物を調製し、PDL-1の相対量またはローディングコントロールとしてのβ−アクチンの相対量をウエスタンブロットにより評価した。
【００８３】
【図１５】αｖβ３のリガンドであるXL313エピトープ（RGDKGE（配列番号１））を結合させた悪性黒色腫細胞におけるPDL-1タンパク質量の増加を示すブロットの写真である。コーティングしていないコントロールウェルまたは潜在性コラーゲンエピトープXL313（RGDKGE（配列番号１））を固相化したウェルに、インテグリンαｖβ３発現悪性黒色腫細胞（M21）を播種した。１５分間インキュベーションした後、細胞溶解物を調製した。PDL-1の相対量またはローディングコントロールとしてのβ−アクチンの相対量をウエスタンブロットにより評価した。
【００８４】
【図１６】αｖβ３特異的抗体LM609を使用して、αｖβ３のECMリガンド（変性IV型コラーゲン）の結合を遮断した悪性黒色腫細胞におけるPDL-1タンパク質量の減少を示すブロットの写真である。インテグリンαｖβ３発現悪性黒色腫細胞（M21）を、コントロール非特異的抗体（正常マウスIg）またはαｖβ３特異的抗体（Mab LM609）と混合し、αｖβ３結合性リガンド（変性IV型コラーゲン）でコーティングしたウェルに加えた。２４時間インキュベーションした後、全細胞溶解物を調製し、PDL-1の相対量またはローディングコントロールとしてのβ−アクチンの相対量をウエスタンブロットにより評価した。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
本願では、インビボで生成されるRGD含有潜在性コラーゲンエピトープについて述べる。このコラーゲンエピトープは、αｖβ３のシグナル伝達を抑制するものではなく、αｖβ３の活性化を促進し、血管新生および炎症を誘導することが示された（これについては後で詳述する）。さらに、αｖβ３インテグリンからのシグナル伝達を抑制するインテグリンαｖβ３アンタゴニストを使用して、がんや、異常な免疫応答を特徴とするその他の疾患の治療のためのPD-1/PDL-1標的薬物の治療活性を高めることができた。
【００８６】
さらに、本願では、潜在性コラーゲンエピトープがαｖβ３を活性化して、SrcおよびP38MAPKに依存するカスケードを誘導し、その結果、YAPの核内蓄積および内皮細胞の増殖刺激が起こるという内皮細胞のメカノシグナル伝達経路について詳細に述べる。本願で得られた知見から、メカノシグナル伝達経路の存在が実証されたが、αｖβ３インテグリン自体をターゲティングする代わりに、血管新生や炎症を促進するαｖβ３リガンドをターゲティングすることによってαｖβ３のシグナル伝達を抑制することができるという治療戦略の可能性も示された。
【００８７】
血管新生（既存の血管から新たな血管が発生する現象）は、正常時の生体活動および病的事象において重要な役割を果たしている。この重要な生物学的現象を制御する相互関連機構をより正確に理解することによって、血管新生疾患を抑制するためのより効果的な治療戦略を開発しようとする努力が続けられている（１，２）。血管新生の制御分子とこれらが関連するシグナル伝達経路とが特定されたという目覚ましい進歩があった（３〜５）。様々な細胞内コンパートメントを介して作動している血管新生シグナル伝達経路および制御性フィードバックループのネットワークについて、より正確な理解が得られたことから、様々な抗血管新生療法においてある程度認められてきた臨床効果を説明する重要な手掛かりが得られた（１〜５）。たとえば、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）は、血管新生促進性シグナル伝達を誘導し、内皮細胞の遊走、増殖および生存を促進するが、VEGFによって誘導された血管は未熟かつ不安定であるとともに、漏出性を示すことが多く、さらなるシグナル伝達事象が存在しない場合、退行することがある（６）。また、特定の状況下でのVEGFを介した刺激では、周皮細胞の動員に異常が生じてPDGFシグナル伝達が変化し、血管新生が抑制されることがある（６）。このような予想外の知見から、VEGF/VEGFRシグナル伝達が血管新生過程に対してネガティブに働くことが示された（６）。これと同様に、インテグリンαｖβ３が血管新生に対してポジティブにもネガティブにも働くことが報告されている（７〜９）。
【００８８】
血管新生の過程において、細胞外マトリックス（ECM）タンパク質の組成や生物力学的特性が様々に変化することが知られており、このような種々の変化が新生血管の発生にどのように関与しているのかを解明しようとする研究が始められている（１８，２１〜２３，５１〜５３）。メカノトランスダクションにおいて細胞外から細胞内へと情報の伝達を担う重要な細胞表面分子の１つとして、インテグリン受容体がある。インテグリンは、情報ハブのように機能することができ、細胞外からの様々な入力を感知し、受け取った情報を細胞内回路の複雑なネットワークへと中継し、細胞の挙動を様々に調節する（４）。間質の微小環境の変化に応じて細胞が自体の応答を微調整する正確な分子機構は、完全には解明されていない。また、組織特異的な血管新生の制御に関与していると見られる細胞種が続々と発見されていることも、新生血管の発生についての理解をさらに複雑している。組織特異的な血管新生の制御に関与していると見られる細胞としては、間質線維芽細胞の様々なサブセット、前駆細胞、様々な炎症性細胞（好中球、マスト細胞、マクロファージなど）などがある。血管新生の過程におけるこれらの多様な細胞の役割は、サイトカイン、ケモカインおよびタンパク質分解酵素の分泌や、その他の血管新生促進因子や血管新生抑制因子の差次的な発現などの多岐にわたる。以上のことから、これらの多様なコンパートメントが協調することによって組織特異的な血管反応の制御がなされるためには、厳密な制御機構が働いているに違いないと予想される。
【００８９】
インテグリンは、ECM内の組成変化および構造変化を検出する能力を有する分子であり、状況に応じて細胞の挙動を調整するシグナル伝達回路ネットワークに、検出したこれらの情報を組み込むことができる。血管新生において一定の役割を果たしていることが知られており、かつ最もよく研究されているインテグリンとして、αｖβ３が挙げられる。αｖβ３は、血管新生促進能と血管新生抑制能の両方を発揮することができ、このことからわかるように、αｖβ３による血管新生の制御機構は複雑である（７〜１５）。αｖβ３への結合によって誘導される特徴的な生物学的応答は、様々な要因に依存する可能性が示されており、たとえば、特定のリガンドの力学的特性や生化学的特性、αｖβ３を発現する細胞種、αｖβ３に提示されるリガンドの濃度や提示方法などの影響を受ける（７〜９，２４〜２７）。たとえば、過去の研究では、コラーゲンの特定のNC1ドメインまたは選択されたRGDペプチドにαｖβ３が結合すると、アポトーシスが誘導され、細動脈の収縮が起こり、ひいては血管新生が抑制されることがあることが示されている。（１９，２９，５４）。一方、別の研究では、別のαｖβ３リガンドが、細胞の生存を促進し、血管の拡張を誘導し、ひいては血管新生を促進することが示されている（２１〜２３，３０，５５）。これらの観察結果は、αｖβ３を介したシグナル伝達の最終的な結果が、リガンドの特定の特徴に大きく左右されることがあるという見解と一致している。RGDペプチドを外部から投与した場合、このRGDペプチドによって血管新生が抑制されるということが数多くのデータから示されているが、環状RGDペプチドを使用して腫瘍の増殖を抑制しようとした試みでは、後期臨床試験において神経膠芽腫の進行および患者の生存率に有意な効果を与えることはできなかった（３１）。興味深いことに、特定のRGDペプチドは、β３インテグリンを活性化することができ（５６，５７）、規定の実験条件下において、血管新生と腫瘍の増殖とを誘導することができることが過去の研究で示されている（３０）。これらの知見および他の報告から、RGDモチーフのＣ末端側のアミノ酸配列が、インテグリンの選択的結合の決定において一定の役割を果たしていることが示唆されており、このことが、血管新生における天然RGD含有エピトープの生物学的意義を検討する動機となった。
【００９０】
たとえば、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（RGD）を含む環状ペプチドや、αｖβ３インテグリンを標的とする抗体によって、動物モデルの血管新生が抑制されたことから（１０〜１２）、αｖβ３の血管新生促進機能にはいくつかのバリエーションがあることが示唆されている。一方、αｖβ３ nullマウスの腫瘍では、血管新生の亢進が検出されている（１３）。興味深いことに、β３インテグリン欠損シグナル伝達を発現するトランスジェニックマウスでは、病的血管新生の低下が検出されており、この病的血管新生の低下は、特定の内皮細胞の異常によるものではなく、骨髄由来細胞の動員に異常が生じたことに一部起因していたことが報告されている（１４）。さらに、内皮細胞においてβ３インテグリンの発現が低下したことによって、初期段階の病的血管新生の増悪が見られたが、これ以降の新生血管の成熟段階では、β３インテグリンの発現低下による影響はほとんど見られなかったことから、β３インテグリンは、血管成熟段階よりも血管新生初期段階の新生血管の発生期において重要な役割を果たしている可能性があることが示されている（１５）。これらの研究や他の報告からの示唆によれば、αｖβ３を介した血管新生の制御は複雑であり、一時的な制御を受けており、細胞の接着だけに依存しているわけではなく、下流のシグナル伝達も関与しており、このαｖβ３を介した血管新生の制御によってどのような結果が得られるのかは、その部位の細胞外微小環境の組成や細胞種によって変わってくるとされている（４，９，１２，１６）。血管新生制御分子のいくつかでは、これらの制御分子による調節が行われた後に、この調節に相反する生物学的応答が見られることから、これらの因子を標的とした抗血管新生療法に臨床的な限界があることは驚くに値しない。
【００９１】
増殖因子のシグナル伝達の強度および特異性の調節にインテグリンと細胞外マトリックス（ECM）の相互作用が重要な役割を果たしている（１〜５，１７，１８）。これを踏まえると、局所的な血管微小環境において、多様なコンポーネントがどのようにして共同して血管新生を制御しているのかを解明することは重要である。興味深いことに、αｖβ３リガンドの種類によって、全く違った生物学的効果が誘導されることがある（７〜１５）。たとえば、コラーゲンの特定のNC1ドメインは、αｖβ３に結合してアポトーシス促進反応を誘導しうるが、別のαｖβ３リガンドが結合すると、細胞の増殖と生存が促進されうる（１９〜２２）。これらの知見や、αｖβ３を直接ターゲティングしたときに観察される複雑な生物学的効果を踏まえると、αｖβ３からのシグナル伝達を抑制する別の治療アプローチとして、αｖβ３自体を直接ターゲティングするのではなく、αｖβ３の血管新生促進性リガンドを特異的にターゲティングする方法を取ることができると考えられる。また、加水分解によるECMのリモデリングによって、血管新生において機能的役割を発揮するインテグリン結合性潜在性エピトープが生成されることがあり、たとえば、様々な種類のコラーゲンに存在するLPGxPG含有潜在性エピトープHU177や、IV型コラーゲンに存在する潜在性エピトープHUIV26などが生成される（２１〜２３）。HUIV26エピトープは、αｖβ３によって認識されるが、主な構成要素はRGDモチーフではない（２１）。
【００９２】
Ｉ型コラーゲンに含まれるRGD部位の配列分析では、RGD部位のＣ末端側に位置するKGEトリペプチドモチーフは、様々な生物種間で高度に保存されているが、コラーゲンにおいてRGD部位に隣接するこれ以外のフランキング配列には、かなり多くのバリエーションがあることが示された。本願に記載の５種のコラーゲンRGDエピトープはいずれも細胞の結合を補助するが、高度に保存されたRGDKGE（配列番号１）を含むコラーゲンペプチドP-2に結合するMab XL313によってインビボでの血管新生および炎症が抑制され、他の３種のRGDコラーゲン部位を認識する抗体では、血管新生や炎症は抑制されなかったことから、このRGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンペプチドP-2は、血管新生および炎症において機能的な役割を果たしていると見られる。RGDKGE（配列番号１）を含んでいない他の３種の天然コラーゲンエピトープの間には明確な違いが見られるものの、インビボにおいてこれらのエピトープの１つ以上がRGDKGE（配列番号１）含有エピトープと一緒に検出された。RGDを含むこれらのエピトープは、潜在性エピトープとして存在していることが多いと見られ、細胞表面受容体が容易にアクセスできないと考えられることから、これらの知見は、血管新生での活発なコラーゲンリモデリングによってネオエピトープが生成するという報告と一致している。
【００９３】
過去の研究において、インテグリン依存性相互作用のいくつかにおいてRGD配列が媒介因子として重要な機能を果たしていること、およびインテグリンの結合の特異性および親和性の確立において、コアとなるRGDモチーフに隣接するアミノ酸配列が一定の役割を果たしていること（２４〜２７）が報告されていることを踏まえ、コラーゲンに含まれるRGDモチーフの種類によって、血管新生を制御する能力に差があるかどうかを検討した。Ｉ型コラーゲンを配列分析したところ、５種の潜在性RGDモチーフが見出され、各モチーフはユニークなフランキング配列を持つことがわかった。また、驚くべきことに、これらのRGDモチーフのうちの１つに見られるＣ末端KGEフランキング配列は、アフリカツメガエルからヒトまで様々な生物種において高度に保存されていることがわかった。一方、他のフランキング配列では、生物種間において配列や位置に大きな違いが見られる。
【００９４】
ECMのリモデリングは、血管新生の初期現象として起こり、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）や、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼなどの様々なタンパク質分解酵素は、インタクトなコラーゲンまたは構造が変化したコラーゲンを分解する能力を有する（１８，５８）。MMP-2でコラーゲンを分解すると、Mab XL313によって認識される低分子量断片が生成されることがインビトロ研究において示されているが、RGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンエピトープがインビボで生成される正確な機構は完全には解明されていない。血管新生を誘導した漿尿膜（CAM）組織を分析したところ、マクロファージの特定のサブセットがRGDKGE（配列番号１）含有エピトープの重要な供給源である可能性が示唆された。Ｍ２様の特徴を有する活性化マクロファージは、コラーゲン分解能を有する酵素を複数種発現することができ、コラーゲンを内在化して、小さな低分子量断片に分解する能力を有する（３５，３８）。マクロファージがインタクトな三重らせんＩ型コラーゲンを生成し、これを蓄積することを示す証拠はほとんど報告されていないが、コラーゲンの特定のアイソフォームが発現される可能性は過去の研究で示されている（５９）。過去の報告と一致して、インタクトなコラーゲンは検出されなかったが、マクロファージ様細胞株から調製した全細胞溶解物および無血清馴化培地の両方から、RGDKGE（配列番号１）含有低分子量コラーゲン断片が検出された。本研究の結果、マクロファージによるコラーゲンの内在化が、インビボにおけるRGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンエピトープの生成に寄与している可能性は排除されなかったが、血清やコラーゲンを細胞外から加えずにインビトロ研究を行ったところ、先の研究と一致して、マクロファージによるRGDKGE（配列番号１）含有コラーゲン断片の活発な生成が示された。
【００９５】
Ｍ２型マクロファージなどの活性化マクロファージは、血管新生促進活性を示す様々な因子を分泌することから、血管新生および炎症を補助していることが示唆されている（３５，６０）。合成RGD含有ペプチドが血管新生および腫瘍増殖を抑制することが多くの研究で示されているが、本研究の知見から、マクロファージが血管新生促進活性を示しうるRGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンエピトープを生成し、放出することができるという証拠が初めて示された。過去の研究では、特定のRGDペプチドが、αｖβ３を活性化し（５６，５７）、血管透過性を高めている可能性が示唆されており（４５，５５）、それによって炎症性因子が放出され、その結果、血管新生が誘導されると考えられている点には注目されたい。
【００９６】
RGDKGE（配列番号１）コラーゲンペプチドが血管新生を制御する機構を推定するため、このペプチドモチーフの内皮細胞受容体を特定した。別の非インテグリン受容体がこのコラーゲンエピトープと結合している可能性を排除することはできなかったが、αｖβ３が、RGDKGE（配列番号１）モチーフの内皮細胞受容体として機能している可能性がデータから示唆された。興味深いことに、αｖβ３は、RGDKGE（配列番号１）コラーゲンペプチドとRGDAPG（配列番号１１）コラーゲンペプチドの両方に結合したが、インビボにおいて血管新生および炎症を顕著に誘導することができたのは、RGDKGE（配列番号１）ペプチドのみであった。これらの知見は、RGD含有αｖβ３リガンドの種類によって、促進される生物学的応答が異なるという見解と一致している。αｖβ３の下流のシグナル伝達は複雑であり、β３インテグリンが結合しただけでは、インテグリンの効果的なoutside-inシグナル伝達が必ずしも起こるわけではないことが過去の研究で示されている（６１）。実際、β３インテグリンがoutside-inシグナル伝達を促進する能力は様々な要因に左右され、たとえば、受容体クラスタリングの程度、およびこれに続くアクチン細胞骨格の機械的張力の発生；Ga13やKindlin-2などの、アダプタータンパク質やアクセサリータンパク質の動員；プロテインチロシンホスファターゼや特定の増殖因子受容体とインテグリンとの相互作用などの影響を受ける（６２〜６５）。RGDKGE（配列番号１）を介してαｖβ３のシグナル伝達が誘導される正確な機構は完全には理解されていないが、血清の非存在下において、RGDKGE（配列番号１）ペプチドと内皮細胞とを相互作用させたところ、β３インテグリンの７４７番目のチロシンのリン酸化と、Srcの４１６番目のチロシンのリン酸化とが増強された。また、RGDKGE（配列番号１）モチーフを結合させた後にSrc活性を遮断すると、β３のリン酸化が低下したことから、上述のデータや他のデータと一致して、シグナル伝達の初期段階における機械的刺激を介したβ３インテグリンの活性化は、Srcに依存していることが示された。
【００９７】
インテグリンのシグナル伝達およびSrcの活性化は、アクチン細胞骨格の構造を制御することが知られている（６６）。さらに、SrcファミリーキナーゼはP38MAPKを制御しており、P38MAPKが活性化されることによって、内皮細胞のアクチンストレスファイバーの形成が促進され、インビボの血管新生が制御を受けると考えられている（３９〜４５）。また、RGDKGE（配列番号１）含有潜在性コラーゲンエピトープとの相互作用によって、P38MAPKのリン酸化がSrc依存的に促進されることが示された。これらの知見を踏まえると、P38MAPKとSrcは、協調的に機能することによって、αｖβ３を介した内皮細胞のRGD依存性シグナル伝達を制御していると見られる。さらに、RGDKGE（配列番号１）を使用してインビボにおいて血管新生を誘導したところ、リン酸化P38MAPK量の増加が見られたが、この血管新生反応はP38MAPK阻害薬によって低下した。これらの知見は、RGDKGE（配列番号１）の刺激によって誘導された血管新生がP38MAPKに依存するという見解と一致している。
【００９８】
アクチンストレスファイバーと機械的張力とによって、YAPの核内蓄積が促進されることが最近の研究で示唆されており、核内に蓄積したYAPは、転写因子TEADと協力して遺伝子発現を制御していると考えられている（４６〜５０）。YAPが内皮細胞の増殖と血管新生とを制御していることを示唆するデータが得られたことから、RGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンペプチドと相互作用させた内皮細胞におけるYAPの細胞内分布を評価した。内皮細胞とRGDKGE（配列番号１）含有エピトープとの相互作用によって、YAPの核内蓄積が促進されることが実験データから示された。骨格系幹細胞におけるβ１インテグリンの発現および骨芽細胞におけるαｖインテグリンの発現はいずれも、YAPの細胞内局在の制御に関与していることが過去に報告されていることから（６７，６８）、インテグリンのシグナル伝達がYAPを制御していると考えられる。これらの知見と一致して、αｖβ３を介してRGDKGE（配列番号１）含有エピトープが結合することによってシグナル伝達カスケードが刺激され、その結果、Srcおよび／またはP38MAPKに依存的にYAPの核内蓄積が促進されるという機構の存在が示されたが、この配列に関連するRGDAPG（配列番号１１）含有エピトープではこのような機構は見られなかった。また、SrcまたはP38MAPKを抑制した内皮細胞において、αｖβ３を介してRGDKGE（配列番号１）含有ペプチドを相互作用させたところ、核内YAP量の低下が検出されたことから、上述の機構の存在が裏付けられた。YAPが細胞増殖を制御することが報告されていること、およびRGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンペプチドがYAPの核内蓄積を促進し、内皮細胞の増殖を亢進する能力を有していることから、RGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンペプチドの誘導による内皮細胞の増殖は、YAPに依存している可能性があると見られた。YAPをノックダウンした内皮細胞は、VEGFまたは高濃度血清で刺激すると増殖が亢進されたことから、増殖能を有することが示されたが、このYAPノックダウン内皮細胞をRGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンペプチドで刺激しても、増殖の亢進は検出されなかった。このことから、RGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンペプチドの誘導による内皮細胞の増殖はYAPに依存していることが裏付けられた。これらの研究結果を踏まえると、鶏胚漿尿膜（CAM）モデルにおいて観察されるFGF-2誘導性血管新生反応は、マクロファージの動員を誘導することがあり、過去の研究では特性が明らかとなっていなかったRGDKGE（配列番号１）含有αｖβ３結合性潜在性コラーゲンエピトープが、この動員マクロファージから生成され、その結果、SrcおよびP38MAPKの活性化とYAPの核内蓄積が誘導されるという可能性が示唆された。YAPは、血管新生および炎症に影響を与えうる様々な遺伝子（CTGFやCry61など）を制御することが知られていることから、RGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンエピトープは、YAPを介した様々な血管新生促進分子の制御を含む複雑なインビボ血管新生促進プログラムを開始することができ、単に内皮細胞の増殖のみを増強しているわけではないと見られる。
【００９９】
したがって、本研究の結果から、高度に保存されたRGDKGE（配列番号１）を含むコラーゲンエピトープが、マクロファージの特定のサブセットによって生成されうること、ならびにこのRGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンエピトープが炎症促進活性および血管新生促進活性を刺激しうることが実証された。RGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンエピトープがβ３インテグリンに結合すると、内皮細胞のシグナル伝達経路の開始が可能となり、これによってSrcおよびP38MAPKの活性化が誘導され、最終的にYAPの核内蓄積と細胞の増殖とが増強されることが示された。また、本研究の結果から、内因性に生成されたRGD含有潜在性コラーゲンエピトープが、血管新生を抑制するのではなく、どのようにして血管新生を促進しているのかということを細胞レベルおよび分子レベルで解明することができた。αｖβ３がこのような複雑な機能を有していることと、本研究によって得られた一連の証拠から、αｖβ３の結合は特定のリガンドの特性に依存することがあるという最終的な結論に至ったことから、β３インテグリンの生物学的活性の抑制に有用な新たな治療戦略として、αｖβ３自体を直接ターゲティングするのではなく、αｖβ３の内因性血管新生促進リガンドを特異的にターゲティングする方法を取ることができると考えられる。
【０１００】
インテグリンαｖβ３は、免疫チェックポイント制御タンパク質であるPDL-1の発現をアップレギュレートすることなどによって免疫抑制を促進するという機能的な役割を果たしている。これを踏まえて、αｖβ３の機能を遮断する（αｖβ３のシグナル伝達を遮断する）αｖβ３アンタゴニストを使用してαｖβ３をターゲティングするか、あるいはαｖβ３の発現を抑制したところ、PDL-1の発現が低下した。したがって、αｖβ３のアンタゴニストを使用することによって、免疫チェックポイント療法の抗腫瘍効果を高めることができると考えられる。一般に、ヒトに投与された免疫チェックポイント阻害薬は、ある程度の抗腫瘍活性を発揮することが知られているが、この不完全な抗腫瘍活性は、処置を受けた対象のごく一部にしか見られないことに注目されたい。本願では、CTLA-4抗体、PDL-1抗体、PD-1抗体などの免疫チェックポイント阻害薬の有効性を高めるための、化合物と併用療法とを特定することについて述べる。
【０１０１】
CTLA-4やPD-1/PDL-1によるシグナル伝達などの免疫チェックポイント制御分子を遮断することによる治療アプローチでは、免疫に関連する副作用（炎症など）が顕著に現れることが知られている。免疫チェックポイント療法においてこのような副作用が知られていること、およびαｖβ３インテグリンの特異的リガンド（RGDKGE（配列番号１）を含むコラーゲンエピトープなど）によってインビボで炎症が誘導される可能性があることから、αｖβ３アンタゴニストと抗PD-1/PDL-1アンタゴニストとを組み合わせることによって、免疫チェックポイント阻害療法に関連した炎症性副作用を低減できると考えられる。
【０１０２】
本願のインビボ動物データでは、インテグリンαｖβ３を発現する悪性黒色腫は免疫チェックポイントタンパク質PDL-1を発現するが、機能性αｖβ３欠損型として選択された悪性黒色腫の腫瘍細胞では、PDL-1はほとんど検出されなかった。２点目として、インテグリンαｖβ３のリガンドとして過去に報告されているECMタンパク質（変性コラーゲンまたはRGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンエピトープ）と、腫瘍細胞または内皮細胞とを相互作用させることによって、PDL-1の発現がアップレギュレートされることが示された。３点目として、インテグリンαｖβ３に特異的に結合する機能遮断抗体によって、腫瘍細胞におけるPDL-1の発現が低下した。４点目として、αｖβ３へのRGDKGE（配列番号１）エピトープの結合を特異的に遮断し、かつαｖβ３から下流へのシグナル伝達を抑制する抗体（Mab XL313）によって、インビボでの免疫チェックポイント阻害薬（抗PDL-1抗体）の抗腫瘍効果が増強された。
【０１０３】
過去の研究では、PDL-1などの免疫チェックポイントタンパク質を遮断することによって、ある程度の抗腫瘍活性が得られることが示されている。しかし、このような抗腫瘍効果は、部分的な効果にとどまり、処置を受けた対象のごく一部にしか効果が見られない。これを踏まえ、本願では、CTLA-4、PD-1および／またはPDL-1を標的とする抗体などの免疫チェックポイント阻害薬の効果を高める化合物の特定について述べる。免疫チェックポイント阻害薬の効果を高めることを目的とした過去の研究では、免疫チェックポイント阻害薬と別の化学療法薬とを併用することによって抗腫瘍活性が増強されることが示唆されている。一般に、免疫チェックポイント阻害薬は、皮膚炎、肺臓炎、大腸炎などの炎症状態を活発に誘導するという副作用を起こすことから、その使用が制限されることが多いことに注目されたい。この点に関して、XL313エピトープのアンタゴニスト（Mab XL313）は、マウスモデルにおける抗PDL-1抗体療法の治療活性を高めるだけでなく（図９）、インビボにおいて炎症を強力に抑制することが示された。さらに、αｖβ３インテグリンのシグナル伝達を刺激するRGDKGE（配列番号１）含有αｖβ３結合性コラーゲンエピトープは、インビボにおいて炎症を顕著に亢進することが示された。これらの知見を踏まえると、αｖβ３のアンタゴニストを使用して、αｖβ３のシグナル伝達を遮断することによって、抗PDL-1／PD-1抗体または抗CTLA-4抗体に基づく治療法の治療活性を高めることができるだけでなく、インビボにおいて炎症を強力に抑制することができると考えられる。これらの知見は、XL313エピトープのアンタゴニスト（すなわちαｖβ３のアンタゴニスト）と、免疫チェックポイント阻害療法とを組み合わせることによって、その有効性を高めることができるだけでなく、免疫チェックポイント阻害療法で観察される炎症性副作用を低減することができるという見解と一致している。
【０１０４】
本願では、RGDKGE（配列番号１）を含む潜在性コラーゲンエピトープが、マクロファージの特定のサブセットによって生成され、このエピトープモチーフは、血管新生を抑制するのではなく、血管新生を促進することが実証された。過去の報告では、高濃度のRGDペプチドは血管新生を誘導するのではなく、血管新生を抑制することが多くの実験データから示されていることから（１１，２８，２９）、上述の知見は驚くべきものである。最近では、特定のRGDペプチドが低濃度で血管新生と腫瘍増殖とを増強することを示唆する報告が相次いでおり（３０）、このような報告を踏まえると、αｖβ３およびαｖβ５の環状RGDペプチドアンタゴニストがヒトの臨床試験においてわずかながら効果を示したことに少なくともある程度の説明がつく（３１）。特定のRGDペプチドに対する生物学的応答がその濃度によって変化することに加え、天然のエピトープに見られるRGDモチーフのＣ末端側の特定のアミノ酸組成によって、ユニークな血管新生促進活性および炎症促進活性が付与されうることも示された。したがって、これらの結果から、RGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンエピトープが、機械的刺激を介してαｖβ３を活性化することによって血管新生および炎症を誘導し、次いでSrc依存的にP38MAPキナーゼをリン酸化し、その結果、Yes-associated protein（YAP）の核内蓄積が促進され、かつ内皮細胞の増殖が増強されるという機構の存在が示された。
【実施例】
【０１０５】
実施例１：材料と方法
試薬、キット、化学物質および抗体
エタノール、メタノール、アセトン、ウシ血清アルブミン（BSA）、クリスタルバイオレット、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、精製ヒトIV型コラーゲンおよび精製Ｉ型コラーゲン、AMPA、３，３，５，５’−テトラメチルベンジジン（TMB）、ホスファターゼ阻害剤カクテル、ならびに酢酸コルチゾン（CA）は、シグマ社（ミズーリ州セントルイス）から入手した。MMP2はChemicon／ミリポア社（マサチューセッツ州ビレリカ）から入手した。FBSはScience Cell社（カリフォルニア州カールスバッド）から入手した。線維芽細胞増殖因子−２（FGF-2）はR&Dシステムズ社（ミネソタ州ミネアポリス）から入手した。核／細胞質分画キットはThermo Scientific社（マサチューセッツ州ウォルサム）から入手した。P38 MAPK阻害薬であるSB202190はCalbiochem社（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手した。RIPAバッファー、プロテアーゼ阻害薬、およびSrc阻害薬（PP2）は、Santa Cruz社（カリフォルニア州サンタクルーズ）から入手した。抗vWf抗体はBD Pharmingen社（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手した。抗P38MAPK抗体、抗ホスホP38MAPK（Thr180/Tyr182）抗体、抗Src抗体、および抗ホスホSrc（Tyr416）抗体は、Cell Signaling Technology社（マサチューセッツ州ダンバース）から入手した。抗チューブリン抗体、抗トータル結合タンパク質（TBP）抗体、抗YAP抗体、抗β３抗体、および抗ホスホ133（Tyr747）抗体は、Santa Cruz社（カリフォルニア州サンタクルーズ）から入手した。抗Igfbp4抗体および抗MMP9抗体はAbcam社（マサチューセッツ州ケンブリッジ）から入手した。機能遮断抗体であるP4C10（抗β１抗体）、LM609（抗αｖβ３抗体）およびP1F6（抗αｖβ５抗体）は、R&Dシステムズ社（ミネソタ州ミネアポリス）から入手した。HRP標識二次抗体はプロメガ社（ウイスコンシン州マディソン）から入手した。抗Ｉ型コラーゲン抗体はRockland社（ペンシルバニア州リムリック）から入手し、抗IV型コラーゲン抗体はミリポア社（マサチューセッツ州ビレリカ）から入手した。マウスモノクローナルXL313抗体およびマウスモノクローナルXL166抗体は構築した。Alexa-488標識抗体、Alexa-594標識抗体、ストレプトアビジンAlexa-594標識抗体、およびファロイジンAlexa-594標識抗体は、インビトロジェン社（カリフォルニア州カールスバッド）から入手した。RGDを含む合成コラーゲンペプチド（P-1；CKGDRGDAPGC（配列番号５）、P-2；CQGPRGDKGEC（配列番号６）、P-3；CAGSRGDGGPC（配列番号７）、P-4；CQGIRGDKGE（配列番号８）、P-5；CRGPRGDQGPC（配列番号９））およびペプチドコントロール（P-C；CQGPSGAPGEC；配列番号１０）は、QED Biosciences社（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手した。
【０１０６】
細胞と細胞培養
RAW264.7細胞およびTHP-1細胞はATCC（バージニア州マナサス）から入手した。１０％FBS、１．０％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１．０％ピルビン酸ナトリウムの存在下において、RAW264.7細胞はDMEM中で培養し、THP-1細胞はRPMI中で培養した。不死化BV-2細胞は、１０％FBS、１．０％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１．０％ピルビン酸ナトリウムを添加したDMEM中で培養した。ヒト皮膚線維芽細胞（HDF）は、Science Cell社（カリフォルニア州カールスバッド）から入手し、２．０％FBSを添加した線維芽細胞増殖培地中で培養し、第４継代細胞〜第９継代細胞を使用した。ヒト網膜毛細血管内皮細胞（HRMVEC）は、Applied Cell Biology Institute（ワシントン州カークランド）から入手し、増殖因子としてEGM-2を添加したEBM2中で培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）およびヒト毛細血管内皮細胞（HMVEC）は、ATCC（バージニア州マナサス）から入手し、HUVECは、増殖因子としてEGM-2を添加したEBM2中で培養し、HMVECは、増殖因子としてEGM-2MVを添加したEBM2中で培養した。内皮細胞増殖培地はいずれも、２％FBS、１．０％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１．０％ピルビン酸ナトリウムを含み、第３継代細胞〜第９継代細胞を実験に使用した。馴化培地を回収するため、血清を含まない基礎培地中で細胞を２４時間培養した。馴化培地を回収し、３ｋＤａの遠心式限外濾過カートリッジを備えたアミコンウルトラセルを用いて１０倍に濃縮した。
【０１０７】
細胞接着アッセイ
RGDペプチド（P-1、P-2、P-3、P-4、P-5およびP-C）をそれぞれウェルに固相化した（１００μｇ／ｍｌ）。HUVEC細胞、HMVEC細胞、HRMVEC細胞およびHDF細胞をそれぞれ接着バッファー（1mM MgCl2、0.2mM MnCl2および0.5%BSAを含有するRPMI）に懸濁し、P4C10抗体、LM609抗体、P1F6抗体またはコントロール抗体（１００μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で１×１０５個の細胞をウェルに播種した。３７℃で２５分間かけてウェルに細胞を接着させた。非接着細胞を含む培地を吸引除去し、接着細胞をPBSで洗浄し、クリスタルバイオレットで染色した。溶出させた色素の光学密度を測定することによって細胞接着を定量した。接着アッセイは、三連ウェルで少なくとも３回行った。
【０１０８】
コラーゲンの加水分解および固相結合アッセイ
Ｉ型コラーゲンまたはIV型コラーゲンを１５分間かけて熱変性させ、APMAで活性化させたMMP2を加えて３７℃で０．５時間、１時間、４時間、８時間または２０時間インキュベートした後、５分間煮沸して残存するMMPを不活性化した。固相ELISAを行うため、RGD含有合成コラーゲンペプチド（P-1、P-2、P-3、P-4、P-5またはP-C）をウェルに固相化（１００μｇ／ｍｌ）するか、あるいは１０μｇ／ｍｌの天然Ｉ型コラーゲンもしくは天然IV型コラーゲン、またはMMP2で加水分解した１０μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンもしくはMMP2で加水分解した１０μｇ／ｍｌのIV型コラーゲンでウェルをコーティングした。１％BSAを含むPBSを用いてウェルを１時間ブロッキングし、１μｇ／ｍｌのMab XL313またはMab XL166と１時間インキュベートし、洗浄し、抗マウスHRP標識抗体（1:5000）とインキュベートした。製造業者の使用説明書に従って、結合したモノクローナル抗体をTMB基質で検出し、分光計で測定することによって定量した。いずれのアッセイも三連ウェルで少なくとも４回行った。
【０１０９】
鶏胚漿尿膜を用いた炎症アッセイおよび血管新生アッセイ
鶏胚漿尿膜（CAM）アッセイをいくつかの変更を加えて行った（１９）。いずれの実験においても、チャールス・リバー社（コネチカット州ノースフランクリン）から１０日齢の鶏胚を入手し、漿尿膜から卵殻膜を取り除いて使用した。フィルターディスクは、炎症アッセイでは処理を加えずに使用し、血管新生アッセイでは、酢酸コルチゾン（３．０ｍｇ／ｍｌ）を含むRPMIまたは酢酸コルチゾン（３．０ｍｇ／ｍｌ）とFGF-2（４０ｎｇ）を含むRPMIで前処理した。CAMは、処理を行わなかったか、あるいはMab XL313、Mab XL166または非特異的コントロール抗体で局所的に処理した（１個の鶏胚あたり１０μｇの抗体を使用して、２４時間ごとに３回連続して処理した）。ペプチドを用いた誘導実験では、P38MAPK阻害薬であるSB202190（１０μＭ）の存在下または非存在下において、１００ｎｇ／ｍｌのRGDペプチド（P-1、P-2、P-C）でCAMを刺激した。インキュベーション終了後、鶏胚を致死させ、CAM組織を分析した。血管新生は、フィルターディスクを置いた部分に新たに生じた血管分枝の本数をカウントすることによって定量した。血管新生指数は、各実験条件から得た血管分岐点数の平均値を非処理CAMから差し引くことによって求めた。１条件につき８〜１２個の鶏胚を使用し、少なくとも３回実験を繰り返した。
【０１１０】
免疫組織化学分析および免疫蛍光分析
肉芽組織の蓄積の調査では、CAMを採取し、４％PFAで固定し、パラフィン包埋し、薄切（４μｍ）してギムザ染色した。免疫蛍光法による分析では、CAM組織を採取し、OCTで包埋し、急速凍結し、薄切（４μｍ）した。凍結切片を５０％メタノール／５０％アセトンで固定し、風乾し、２．５％BSAを用いて３７℃で１時間ブロッキングした。XL313エピトープおよびXL166エピトープの発現ならびに単球／マクロファージの発現を調べるため、FGF-2で刺激したCAM組織をMab XL313、Mab XL166（５０μｇ／ｍｌ）またはKUL1（1:250）で染色し、Alexa-488標識二次抗体（1:2000希釈）とインキュベートした。FGF-2で刺激したCAMにおける単球／マクロファージとMab XL313反応性エピトープとの共染色は連続染色法により実施した。最初にKUL1（1:250）で染色し、次いでビオチン標識Mab XL313（５０μｇ／ｍｌ）で染色し、各抗体をAlexa-488二次抗体およびストレプトアビジンAlexa-594（1:2000）でそれぞれ検出した。同様の方法を用いて、RGDペプチドで処理したCAM組織の薄切切片を使用し、抗ホスホP38MAPK抗体（1:50）と抗vWf抗体（1:500）とで共インキュベートすることによって、新生血管におけるリン酸化P38MAPKの発現を分析した。YAPの細胞内局在は、P-2またはP-1でコーティングしたガラス製カバースリップに接着させたHUVECにおいて観察した。血清の非存在下において１５分間、３０分間または６０分間かけて細胞をカバースリップに接着させ、４％PFAで固定した。固定した細胞を洗浄し、２．５％BSAでブロッキングし、抗YAP抗体（1:200）およびファロイジン（1:500）で染色した。薄切切片およびスライドはいずれもDAPIで対比染色した。
【０１１１】
細胞増殖アッセイ
HUVEC（WTまたはshYAP1もしくはコントロールをトランスフェクトしたもの）またはHRMVECを、２．０％FBSを含む完全EGM-2培地中に２，０００個／ウェルの密度で播種し、P-1、P-2またはP-C（１００ｎｇ／ｍｌ）の非存在下または存在下において２４時間増殖させた。製造業者の使用説明書に従って、BrdUアッセイキットまたはMMTアッセイキットを使用することによって細胞の増殖をモニターした。いずれのアッセイも三連ウェルで少なくとも３回行った。
【０１１２】
阻害実験
1mM MgCl2および0.2mM MnCl2を添加した無血清培地に内皮細胞（HUVECまたはHRMVEC）を播種し、Src阻害薬であるPP2（１０μＭ）、P38MAPK阻害薬であるSB202190（１０μＭ）またはビヒクルのみ（DMSO）の存在下において３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、P-1またはP-2を固相化したウェルに処理細胞を播種し、１５分後に溶解物を回収した。
【０１１３】
ウエスタンブロット
全細胞溶解物およびCAM組織溶解物を、１×プロテアーゼ阻害薬および１×ホスファターゼ阻害薬を添加したRIPAバッファー中に回収し、ポリアクリルアミドゲルにロードして変性条件下で泳動を行った。ゲルにロードする前に、各溶解物に６×サンプルバッファーを加えて（最終濃度：１×）５分間煮沸した。各レーンには、２０〜５０μｇの全タンパク質をロードした。５０ｋＤよりも大きいタンパク質の検出には１０％のゲルを使用し、５０ｋＤよりも小さいタンパク質の検出では１５％のゲルを使用した。ゲルに６０ボルト（ｖ）の電圧をかけて泳動を開始し、色素の先端が濃縮ゲルを通過した時点で電圧を１００Ｖに上昇させ、分離を行った。プレシジョンPlusプロテインスタンダード（バイオ・ラッド）を用いて、移動度を可視化した。ウェット式タンクシステムを用いてタンパク質をニトロセルロース膜に転写し、0.01%Tween20を含むトリス緩衝生理食塩水（TBS-T）に溶解した１０％脱脂粉乳を用いて１時間ブロッキングした。５％BSA含有TBS-Tで希釈した一次抗体（抗coll-I抗体（1:250）、抗coll-IV抗体（1:250）、Mab XL313（２μｇ／ｍｌ）、Mab XL166（２μｇ／ｍｌ）、抗β−アクチン抗体（1:5000）、抗ホスホβ３抗体（1:7000）、抗β３抗体（1:1000）、抗ホスホSrc抗体（1:500）、抗Src抗体（1:500）、抗ホスホP38MAPK抗体（1:500）、抗P38MAPK抗体（1:2000）、抗YAP抗体（1:500）、抗チューブリン抗体（1:2000）、抗TBP抗体（1:1000））と膜を４℃でゆるやかに振盪しながら一晩インキュベートした。TBS-Tに膜を浸して５分間の洗浄を３回行った。１％脱脂粉乳を含むTBS-TでHRP標識二次抗体を希釈し（1:15000）、希釈した二次抗体と膜を１時間インキュベートした。上述と同様にして膜を再度洗浄し、化学発光基質に３分間接触させ、暗室でオートラジオグラフィーフィルムに露出させた。Image Jソフトウェアを用いて画素強度を分析することによって、ウエスタンブロットバンドを定量した。
【０１１４】
トランスフェクションおよびレンチウイルスによる形質導入
Amaxa cell line nucleofector kit V（プログラム#T024）を使用して、Ｉ型コラーゲンα２鎖の発現を抑制するためのHuSH shRNAプラスミド１μｇでRaw細胞の形質導入を行った。また、ヒトYAPを標的とする２１塩基のショートヘアピンRNA（shRNA）（shYAP）または非標的コントロール（shNT、シグマ アルドリッチ、SHC002）を発現する構築物を使用した。ヒト標的shYAP1レンチウイルスshRNAは、サーモサイエンティフィックRNAiコンソーシアム（TRCN0000107625）から入手した。水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質を付加したシュードタイピングレンチウイルスに構築物をパッケージングした。このレンチウイルスと細胞をインキュベートして形質導入を行い、安定に形質導入された細胞を試験に使用した。細胞株への形質導入は、いずれの場合も、形態変化を確認し、さらにマウスまたはヒトYAP特異的PCRを行うことによって確認した。YAPノックダウンの効率は７０％〜８０％であった。内皮細胞は、PCR（ロンザ）によってマイコプラズマ陰性であると判定されたものであり、初代細胞は記載の継代数まで培養したものを使用した。形質導入した細胞はピューロマイシンで選択した。
【０１１５】
統計解析
統計解析は、Macintoshコンピュータ用のInStat統計プログラムを用いて行った。データの統計的有意性は、スチューデントのｔ検定を用いて解析した。ｐ値＜０．０５である場合に統計的有意性があるとみなした。
【０１１６】
実施例２：I型コラーゲン由来のRGD含有潜在性ペプチドは細胞接着を補助する
短鎖アミノ酸配列RGDを含む細胞外マトリックス（ECM）タンパク質は、インテグリン受容体を介した相互作用を補助する能力を有することが過去の研究で報告されている（３３）。大きな糖タンパク質に内在するRGD部位と細胞との間で起こる相互作用は様々な要因に左右され、たとえば、コアとなるRGDトリペプチドの両側に隣接するフランキング配列だけでなく、インタクトな糖タンパク質分子の立体配置や、その他のECMタンパク質が関与する相互関連ネットワークにおいてこの糖タンパク質分子がどのように配向されるのかということにも左右される（２４，２５，３３）。インテグリンの選択的結合は、RGD部位のＣ末端側直後に位置するフランキング配列によって決まる（２４，２５，３３）。RGDモチーフは、三重らせんコラーゲンで見られるような、細胞表面受容体がアクセスできない潜在性モチーフである場合もある（３４）。これに関連して、ヒトI型コラーゲンには、フランキング配列が異なる５種の潜在性RGD含有部位が存在する（表１）。
【０１１７】
【表１】
2018521015.tif 000003
【０１１８】
上述したように、ヒトI型コラーゲンには、フランキング配列が異なる５種の潜在性RGD含有部位が存在する。これら５種の配列の合成ペプチドを作製し、上の表に示したようにP-1〜P-5と名付けた。さらに、RGDトリペプチドモチーフを持たないコントロールペプチド（P-C）も作製した。表１の配列に対応する配列番号は、KGDRGDAPG（配列番号２）、QGPRGDKGE（配列番号３）、AGSRGDGGP（配列番号１２）、QGIRGDKGE（配列番号１３）、RGPRGDQGP（配列番号１４）、およびQGPSGAPGE（配列番号１５）である。
【０１１９】
RGDペプチドは細胞接着を補助する能力を有する
RGDトリペプチドモチーフが重要であることを踏まえ、I型コラーゲンにおいて、コアとなるRGD部位の両側に隣接するフランキング配列のうち、細胞認識に影響を与えうるフランキング配列を特定した。さらに、これらの潜在性RGDコラーゲンモチーフが冗長な部位であるのかどうか、また、フランキング配列が特徴的な特性の付与に寄与しているのかどうかを評価するため、それぞれのフランキング配列が含まれるようにI型コラーゲン由来の各RGDエピトープを合成した。これら５種のRGDペプチドを固相化し、それぞれの細胞接着促進能を評価した。図１Ａに示したように、５種のコラーゲンRGDペプチド（P1〜P5）はいずれも、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の接着を補助する能力を有し、ペプチド５（P-5）が最も高い接着促進能を有する。これに対して、P-2のRGDモチーフがSGAと置換されたペプチドコントロール（P-C）では、接着の補助は見られなかった。接着促進能がHUVECのみに特異的なものではなかったことを確認するため、ヒト毛細血管内皮細胞（HMVEC）、ヒト網膜毛細血管内皮細胞（HRMVEC）およびヒト皮膚線維芽細胞を使用して同様のアッセイを実施した。これらの内皮細胞および線維芽細胞はいずれも、RGDを含む５種のコラーゲンペプチドと結合したが、コントロールペプチドでは相互作用の補助は見られなかった（図１Ｂ〜図１Ｄ）。これらのデータから、ある程度の差は観察されたものの、５種のRGDペプチドはいずれも細胞接着を補助する能力を有していたことが示された。
【０１２０】
モノクローナル抗体を用いた潜在性RGDコラーゲンエピトープの評価
上述の潜在性RGDコラーゲンエピトープを試験するため、モノクローナル抗体を作製した。別々のRGD含有エピトープを特異的に認識できる抗体として、２種の抗体を単離した。図１Ｅに示したように、Mab XL313は、RGDKGE（配列番号１）保存モチーフ（表１）を含むコラーゲンペプチドP-2およびP-4に特異的に結合したが、P-1、P-3、P-5などの他のRGDペプチドとは有意な反応性を示さなかった。XL166と名付けた第２の抗体は、RGD含有コラーゲンペプチドP-1、P-3およびP-5を認識したが、RGDKGE（配列番号１）含有ペプチドP-2およびP-4とは結合しなかった（図１Ｆ）。Mab XL313もMab XL166も、コントロールペプチド（P-C）との相互作用は示さなかった。
【０１２１】
実施例３：XL313は加水分解I型コラーゲンに対して選択的結合性を示す
完全長コラーゲン分子中のRGDモチーフに対するMab XL313の結合能を測定した。実験を容易に行うため、変性させたI型コラーゲンまたはIV型コラーゲンをMMP-2とともに１２時間インキュベートして、加水分解コラーゲンを作製した。I型コラーゲン（図２Ａの左パネル）またはIV型コラーゲン（図２Ａの右パネル）に特異的に結合する抗体を用いてウエスタンブロット分析を行ったところ、MMP-2でI型コラーゲンおよびIV型コラーゲンを加水分解したことによって複数種の断片が生成されたことが示された。RGDKGE（配列番号１）コラーゲン配列に特異的に結合するMab XL313は、変性および還元条件下（図２Ｂ）またはELISAでの非変性および非還元条件下（図２Ｃ）において、インタクトなI型コラーゲンまたはIV型コラーゲンにごくわずかな反応性しか示さなかった。これに対して、I型コラーゲンの低分子量断片はMab XL313によって容易に検出されたが、加水分解後のIV型コラーゲンは検出されなかった（図２Ｂ）。また、Mab XL313は、ビトロネクチンやフィブロネクチンなどの、他のRGD含有ECMタンパク質を認識できなかった。
【０１２２】
RGDKGE（配列番号１）を含む低分子量コラーゲン断片の生成をさらに調査するため、MMP-2によるコラーゲンの加水分解の時間経過を調べた。I型コラーゲンをMMP-2で分解すると、時間の経過とともにMab XL313反応性コラーゲン断片の生成が増加した（図２Ｄ）。コラーゲンの大部分は、８時間後までに約１４Ｋｄ〜１６ＫｄのMab XL313反応性断片に加水分解された。これらの知見から、XL313コラーゲンエピトープは、インタクトな非変性I型コラーゲン分子内に潜在的に含まれていること、および内部に隠れているRGDKGE（配列番号１）含有モチーフを効率的に露出させるには、コラーゲンの加水分解が必要であることが示された。
【０１２３】
実施例４：インビボでの血管新生と炎症に対する潜在性RGDコラーゲンモチーフの役割は、その種類によって異なる
血管基底膜におけるコラーゲンのリモデリングによって、様々なRGD非含有潜在性コラーゲン部位が露出することがあり、その中でも、血管新生において積極的な役割を果たしている可能性のあるHUIV26エピトープおよびHU177エピトープが露出することが過去の研究で示されている（２１，２３）。この知見を踏まえ、特徴的なRGD含有エピトープがインビボで露出するかどうかを調査した。まず、特徴的なRGDエピトープが血管新生中に生成されるかどうかを調べるため、鶏胚漿尿膜（CAM）モデル（１９）を使用した。鶏胚漿尿膜（CAM）をFGF-2で刺激し、Mab XL313およびMab XL166を使用してRGD含有コラーゲンエピトープの生成を調べた。図３Ａに示したように、刺激しなかったCAMでは、Mab XL313またはMab XL166に反応性を示すエピトープはほとんど検出されなかった。これに対して、FGF-2で刺激したCAM組織では、RGDを含むコラーゲンエピトープ（緑色）が容易に検出され、これらの抗体によって認識されるRGD含有エピトープの生成に違いがあることが確認された。Mab XL313またはMab XL166に反応性を示すRGDエピトープは、典型的な細胞外コラーゲン原線維パターンを示さず、点状の分布を示し、細胞内での局在および細胞外での散在が認められた。細胞内分布は、マクロファージの細胞内小胞で見られることが報告されているコラーゲン分解産物の染色パターンと類似している（３５）。
【０１２４】
特徴的な一連のRGD含有エピトープの生成が確認されたことから、血管新生および炎症の制御に対するこれらのエピトープの積極的関与を調査した。増殖因子による炎症の発生を抑えるために酢酸コルチゾン（CA）でコーティングしたフィルターディスクを併用してFGF-2を投与することによって、１０日齢の鶏胚の漿尿膜に血管新生を誘導した。図３Ｂに示したように、潜在性RGDKGE（配列番号１）含有エピトープに結合するMab XL313で処理したことによって、FGF-2誘導性血管新生が抑制され、抗体で処理しなかった場合やコントロール抗体で処理した場合と比べて７５％を上回る抑制が見られた（ｐ＜０．０５）。他の３種の潜在性RGDコラーゲンペプチド（P-1、P-3およびP-5）に特異的に結合するMab XL166は、なんら効果を示さなかった。これらの知見は、インビボで容易に生成される特徴的なRGD含有コラーゲンエピトープは、機能的に冗長なものではないという見解と一致していた。
【０１２５】
FGG-2により誘導された炎症は、肉芽組織を形成するマクロファージの動員および蓄積を伴う
鶏胚漿尿膜（CAM）は、炎症や肉芽組織の形成を評価するために日常的に使用されているが、炎症や肉芽組織の形成は、鶏胚のヘテロフィル（鳥類の好中球に相当する細胞）、マクロファージおよび活性化線維芽細胞の浸潤に大きく依存する（３６，３７）。RGDエピトープの潜在的な生物学的インパクトに違いがあるかどうかを調べるため、酢酸コルチゾンを使用せずに同様の実験を行い、CAMの肥厚を定量することによってFGF-2誘導性炎症を試験した。図３Ｃに示したように、FGF-2で処理したことによって、CAMの炎症を示す漿尿膜の顕著な肥厚が誘導され（上のパネル）、ギムザ染色では炎症性細胞の広範な浸潤が見られ（中央のパネル）、鳥類に特異的な単球およびマクロファージに結合する抗体を用いた染色では、単球およびマクロファージの蓄積の増加が見られた（下のパネル）。FGF-2で刺激したCAMへのマクロファージの浸潤は、コントロールの２倍以上に増加したことから（ｐ＜０．０５）（図３Ｄ）、このモデルにおけるFGF-2誘導性炎症は、肉芽組織を形成するマクロファージの動員および蓄積を伴うことが示された。
【０１２６】
抗RGD特異的XL313抗体およびXL166抗体の存在下または非存在下において、FGF-2によって炎症反応が誘導された
FGF-2刺激によって誘導された炎症反応において、RGD含有コラーゲンエピトープが一定の役割を果たしているのかどうかを調査するため、抗RGD特異的抗体であるXL313抗体およびXL166抗体の存在下または非存在下において、FGF-2誘導性炎症反応を試験した。酢酸コルチゾンの非存在下においてFGF-2による刺激を行い、炎症反応を定量したところ、肥厚した肉芽組織の顕著な形成がCAMの約５０％に見られた（図３Ｅ）。酢酸コルチゾン（研究でよく使用されている抗炎症剤）でCAMを処理することによって、肥厚を示すCAMのパーセンテージが有意に低下し（ｐ＜０．０５）、非処理またはコントロール抗体で処理したものと比べて８０％を上回る低下が認められた。興味深いことに、Mab XL313でCAMを処理することによっても、炎症を起こしたCAMの数がコントロールと比べて約７５％減少した（ｐ＜０．０５）。これに対して、Mab XL166で処理したCAMでは有意な効果は見られなかった（ｐ＞０．０５）。これらのデータは、潜在性RGDエピトープの種類によってインビボでの役割が異なることが示された血管新生試験の知見と一致している。
【０１２７】
実施例５：RGDKGE（配列番号１）含有XL313潜在性エピトープの生成
血管新生および炎症においては、内皮細胞、線維芽細胞、マクロファージなどの様々な種類の細胞が、加水分解を介して細胞外コラーゲンをリモデリングする。このコラーゲンのリモデリングの結果、間質細胞の浸潤および新生血管の成長を許容し、これらを促進する微小環境が形成される。コラーゲンは、線維芽細胞や内皮細胞などの様々な細胞から発現され、部分的に分解されたコラーゲンは、活性化Ｍ２様マクロファージにより内在化されて、さらなるプロセシングを受けることがあり、これによって低分子量断片が生成される（３５，３８）。インビボにおいてMab XL313のユニークな免疫反応パターンが観察されたことから、血管新生および炎症に関連する間質細胞が、RGDKGE（配列番号１）含有エピトープを生成することができるかどうかを調査した。線維芽細胞と内皮細胞のそれぞれから全細胞溶解物を調製し、ウエスタンブロットを実施した。内皮細胞と線維芽細胞のそれぞれから調製した溶解物において、Mab XL313に反応性を示す反応種がいくつか検出されたが、免疫反応性を示す反応種は主として２８Ｋｄ〜７５Ｋｄ付近のバンドとして検出され、これらの反応種は恐らくインタクトなコラーゲンではないことが示された。さらに、MMP-2による加水分解を行ったところ、主として１４Ｋｄ〜１６Ｋｄのコラーゲン断片として分子量の小さい反応種がごく微量に検出された。HUVECから回収された無血清馴化培地（CM）では、XL313に反応性を示す約２０Ｋｄの反応種が少量検出されたが、線維芽細胞から回収された馴化培地（CM）では有意な量の免疫反応性断片は検出されなかった。
【０１２８】
コラーゲンを発現することが知られているこれらの細胞種においてごくわずかな反応性しか観察されなかったこと、およびFGF-2によってCAMの血管新生および炎症反応が強力に誘導され、マクロファージの広範な浸潤が見られたことから、FGF-2で処理したCAM組織においてXL313エピトープとマクロファージの共分布を調査した。図４Ｂに示したように、FGF-2で刺激したCAMにおいて、XL313反応性エピトープ（赤色）は、マクロファージのサブセット（緑色）と共局在していた。このことから、マクロファージは、XL313コラーゲンエピトープの供給源の１つである可能性が示唆された。この可能性を検証するため、３種のマクロファージ様細胞株から全細胞溶解物（図４Ｃの左パネル）と無血清馴化培地（CM）（図４Ｃの右パネル）とを得て試験を行った。内皮細胞や線維芽細胞とは対照的に、複数のマクロファージ細胞株（Raw264.7細胞、THP1細胞およびBV2細胞）それぞれから得た細胞溶解物および馴化培地（CM）において、強力な免疫反応性を示す反応種が容易に検出された。特に、無血清CM（図４Ｃの右パネル）において、免疫反応性を示す低分子量の反応種が１４Ｋｄ〜１６Ｋｄのバンドとして容易に検出されたことは重要である。この１４Ｋｄ〜１６Ｋｄの免疫反応性反応種は、精製コラーゲンをMMPで加水分解した後に検出された、Mab XL313に反応性を示す低分子量コラーゲン断片と大きさが一致していた。マクロファージにおいて検出されたXL313免疫反応性反応種をさらに詳細に調査するため、Raw264.7マクロファージにおける１４Ｋｄ〜１６ＫｄのRGDKGE（配列番号１）含有XL313断片の生成を試験した。まず、Rawマクロファージにおけるコラーゲンの発現を調査するため、このマクロファージのI型コラーゲンα１鎖mRNAおよびα２鎖mRNAの発現をPCRにより確認した。次に、マクロファージから調製した細胞溶解物または馴化培地（CM）において、抗I型コラーゲン特異的抗体を使用した試験を行ったところ、細胞溶解物または馴化培地（CM）のいずれにおいても完全長I型コラーゲンは検出されなかった。これに対して、Mab XL313または抗I型コラーゲン特異的抗体を使用した試験では、細胞溶解物および馴化培地（CM）のいずれにおいても、RGDKGE（配列番号１）含有エピトープと同じ分子量のバンドとして検出される低分子量断片が検出された（図４Ｄ）。特に、shRNAを使用してI型コラーゲンα２鎖をノックダウンした場合、溶解物および馴化培地（CM）のいずれにおいても、抗コラーゲン特異的抗体またはMab XL313による低分子量反応種（１４Ｋｄ〜１６Ｋｄ）の免疫検出が低下したことは重要である（図４Ｄ）。これらの知見から、マクロファージが、RGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンエピトープの供給源となる細胞の１つであるという可能性が裏付けられた。
【０１２９】
実施例６：インビボにおける血管新生および炎症は、RGDKGE（配列番号１）を含む可溶性コラーゲンエピトープによって誘導されるが、この配列に関連するRGDAPG（配列番号１１）を含むコラーゲンエピトープによっては誘導されない
RGDKGE（配列番号１）含有エピトープは、血管新生が誘導されたCAM組織において差次的に発現され、差次的に生体内分布していること、およびマクロファージの馴化培地においてこのエピトープが発現されることが示されたことから、可溶性かつ体内循環型のRGDKGE（配列番号１）含有エピトープが生成されうるかどうかを検討した。この可能性を調査するため、鶏胚にFGF-2および血清で刺激を与えるか、あるいは刺激を与えずに、３日後に回収した。図５Ａに示したように、非刺激コントロール鶏胚の血清から、循環型のMab XL313免疫反応性エピトープが低レベルで検出された。これに対して、FGF-2で刺激した鶏胚では、２倍量の循環型XL313免疫反応性エピトープが検出された（ｐ＜０．０５）。これらの知見から、このRGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンエピトープの可溶性形態の放出には差があることが示された。
【０１３０】
XL313エピトープを含む可溶性ペプチドは、血管新生および炎症を積極的に制御する
RGDKGE（配列番号１）含有エピトープの可溶性形態がインビボで検出されたことから、XL313エピトープを含む可溶性ペプチドが血管新生および炎症を積極的に制御するかどうかを検討した。この可能性を調査するため、鶏胚CAMの血管新生および炎症に対するRGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンペプチドの効果を評価した。図５Ｂに示したように、RGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンペプチドXL313（P-2）は、用量依存的に血管新生を増強し、CAM１個あたり１００ｎｇの用量において血管新生の誘導が最大となった。RGDKGE（配列番号１）を含むコラーゲンペプチドP-2でCAMを刺激することによって、非処理の場合と比べて血管新生が有意に誘導されたが、これに関連するRGDAPG（配列番号１１）を含むコラーゲンペプチドP-1やペプチドコントロール（P-C）では血管新生は有意に誘導されなかった（ｐ＞０．０５）（図５Ｃ）。
【０１３１】
RGD含有可溶性コラーゲンペプチドの炎症に対する効果を調べた。図５Ｄに示したように、酢酸コルチゾンの非存在下において鶏胚CAMをFGF-2で刺激すると、広範な組織肥厚を呈するCAMの割合が約５５％〜６０％に達したことから、鶏胚CAMにおいて強い炎症反応が誘導されることが示された。コントロールペプチド（P-C）またはRGDAPG（配列番号１１）含有コラーゲンペプチドP-1で刺激した場合、組織炎症を示したCAMの割合はごくわずかであったが、RGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンペプチドP-2で刺激した場合では、FGF-2で刺激した場合とほぼ同レベルで炎症が有意に誘導された（ｐ＜０．０５）（図５Ｄ）。これらの試験から、鶏胚CAMの血管新生および炎症に対するRGD含有コラーゲンペプチドの生物学的インパクトは、これらのペプチドに含まれるフランキング配列によって決まることが示された。
【０１３２】
実施例７：RGDKGE（配列番号１）含有ペプチドP-2による血管新生の誘導はP38MAPKに依存する
鶏胚漿尿膜（CAM）における血管新生および炎症は、P38MAPKなどのMAPキナーゼシグナル伝達の変化に関連していることが、過去の研究で報告されている（４０，４１）。RGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンペプチドP-2による刺激によって誘導された血管新生を制御する機構を調査するため、処理を行っていない鶏胚またはRGDペプチドで処理した鶏胚からCAM組織を得て実験を行った。図６Ａに示したように、RGDKGE（配列番号１）含有ペプチドP-2で処理したCAMから得た溶解物において、非処理CAMやRGDAPG（配列番号１１）含有ペプチドP-1で処理したCAMよりも高レベルのリン酸化P38MAPKが検出された。CAM組織（Ｎ＝１２）におけるリン酸化P38MAPKを定量したところ、コントロールと比べて４倍高かった（ｐ＜０．０５）（図６Ｂ）。これらの実験結果と一致して、活性化P38MAPKは鶏胚CAMの複数種の細胞で検出されたが、共染色分析では、vWf陽性血管においてリン酸化P38MAPKの発現が見られた（図６Ｃ）。
【０１３３】
内皮細胞中のリン酸化P38MAPKの量に対するRGD含有コラーゲンペプチドの効果を調べた。図６Ｄおよび図６Ｅに示したように、RGD含有コラーゲンペプチドP-1およびP-2はいずれも細胞の結合を補助するが、HUVEC（図６Ｄ）またはHRMVEC（図６Ｅ）において、RGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンペプチドP-2との相互作用によりリン酸化P38MAPKの量が、RGDAPG（配列番号１１）含有コラーゲンペプチドP-1を使用した場合よりも増加した。P-2の誘導による血管新生がP38MAPK阻害薬によって低下したことから（ｐ＜０．０５）（図６Ｆ）、P38MAPKがインビボにおいて、RGDKGE（配列番号１）含有ペプチドP-2により誘導される血管新生を媒介するという機能的役割を果たしていることが示された。これらのデータから、インビボにおいて観察されるペプチドP-2の刺激による血管新生促進反応において、P38MAPKが一定の役割を果たしていることが示された。
【０１３４】
実施例８：コラーゲンペプチドP-2はαｖβ３と結合してこれを活性化し、Src依存的にP38MAPKの活性化を刺激する
ECMタンパク質中のRGDアミノ酸モチーフが、複数のインテグリンによって認識されることは十分に立証されている。しかし、特徴的なRGDエピトープに対するインテグリンの結合能は、親分子内でのRGDエピトープの配向や、RGDモチーフに隣接するＣ末端アミノ酸配列によっても変わってくる（２５〜２７）。RGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンペプチドP-2との相互作用を媒介していると見られる細胞表面受容体が同定された。抗インテグリン機能遮断抗体の存在下または非存在下において、RGDコラーゲンペプチドP-1およびP-2に対する内皮細胞の結合能を調査した。図７Ａに示したように、抗β１特異的抗体は、ペプチドP-2へのHUVECの接着に対してごくわずかな効果しか示さなかったが、抗αｖβ３抗体は、コントロールと比べて相互作用を約９０％抑制した（ｐ＜０．０５）。抗αｖβ５抗体ではわずかな抑制効果が見られた。RGDAPG（配列番号１１）配列を含むP-1でも同様の結果が観察された（図７Ｂ）。これらのデータから、αｖβ３は、内皮細胞において、これらのRGD含有ペプチドの受容体として機能していることが示された。
【０１３５】
RGDペプチドの種類によって、αｖβ３を介したシグナル伝達の変化に差が見られる
上記２種のRGD含有ペプチドはいずれもαｖβ３と結合するが、血管新生および炎症に対し異なる効果を発揮したことから、RGDペプチドの種類によって、αｖβ３を介したシグナル伝達の変化に差が見られるかどうかを検討した。P-1またはP-2に内皮細胞を結合させ、β３インテグリンのリン酸化の相対量を調べた。図７Ｃに示したように、増殖因子の非存在下において、β３のリン酸化は、RGDKGE（配列番号１）ペプチドP-2と結合させたことによって、RGDAPG（配列番号１１）ペプチドP-1を使用した場合と比べて３倍以上高くなった（ｐ＜０．０５）。β３インテグリンにリガンドが結合したことによって、受容体のクラスタリングが誘導され、FakやSrcなどのプロテインキナーゼの活性化を含む下流のシグナル伝達事象が開始された。これを踏まえ、シグナル伝達の上流においてRGD含有コラーゲンペプチドとの物理的な相互作用が発生した後の、これらのプロテインキナーゼのリン酸化の差異を評価した。無血清条件においてP-1またはP-2と結合させたところ、ごくわずかな量のFakのリン酸化が検出された。これに対して、P-2と相互作用させた後のSrcのリン酸化は、P-1を使用した場合のほぼ２倍となった（図７Ｄ）。さらに、コラーゲンペプチドP-2と結合させた後、Src阻害薬を加えて内皮細胞をインキュベートしたところ、β３のリン酸化とP38MAPKのリン酸化が低下したことから（図７Ｅおよび図７Ｆ）、P-2を結合させた内皮細胞におけるβ３インテグリンおよびP38MAPKの活性化はSrcに依存することがわかった。SrcおよびP38MAPKの活性化は、アクチンの重合およびストレスファイバーの形成を促進することから（４３〜４５）、RGDコラーゲンペプチドを結合させた内皮細胞のアクチン細胞骨格を評価した。RGDKGE（配列番号１）コラーゲンペプチドP-2と相互作用させた内皮細胞では、RGDAPG（配列番号１１）コラーゲンペプチドP-1と相互作用させた場合と比べて、アクチンストレスファイバーの形成が促進された（図７Ｇ）。以上の知見から、保存配列RGDKGE（配列番号１）を含むコラーゲンエピトープは、β３インテグリンに依存するメカノトランスダクション経路の開始を誘導する能力を持つことが示された。
【０１３６】
実施例９：RGDKGE（配列番号１）含有ペプチドと細胞との相互作用によって、YAPの核内蓄積および内皮細胞の増殖が増強される
上記実験の結果、RGD含有コラーゲンペプチドP-1およびP-2はいずれも、上流におけるβ３インテグリンを介した内皮細胞の接着相互作用を補助するが、コラーゲンペプチドP-2はβ３インテグリンのリン酸化を選択的に増強し、この結果、P38MAPKの活性化が増強され、アクチンストレスファイバーの形成が促進されることが示された。アクチンストレスファイバーの形成および機械的張力の増加によって、転写コアクチベーターであるYes-associated protein（YAP）が核内に再局在化される（４６）。さらに、YAPは、血管新生の制御と内皮細胞の増殖の制御に関与している（４７，４８）。増殖因子による刺激を与えずに、先の実験で使用した特徴的なコラーゲンRGD含有ペプチドを内皮細胞に結合させ、YAPの局在を評価した。図８Ａに示したように、コラーゲンペプチドP-2を内皮細胞に結合させて１５分後にYAPを検出したところ、P-1を使用した場合よりも多くのYAPが核内に局在していた。このようなYAPの核局在の差は、これ以降の時間点では検出されなかった。この増強されたYAPの核内蓄積を確認するため、ウエスタンブロット分析を行った。図８Ｂに示したように、ペプチドP-2を結合させた内皮細胞における核内YAPの量は、ペプチドP-1を使用した場合の約２倍となった。
【０１３７】
HUVECおよびHRMVECの増殖に対するRGD含有コラーゲンペプチドの効果
YAPの核内局在は、内皮細胞の増殖の制御に関与している。これを踏まえ、HUVECおよびHRMVECの増殖に対するRGD含有コラーゲンペプチドの効果を調査した。可溶性P-2を添加したことによって、内皮細胞の増殖が有意に（ｐ＜０．０５）増強されたが、RGDAPG（配列番号１１）ペプチドP-1で刺激してもごくわずかな効果しか示されなかった（図８Ｃおよび図８Ｄ）。P-2が、Src依存的にP-38MAPKの活性化を選択的に増強する能力を有していたことから、RGDKGE（配列番号１）ペプチドP-2による刺激を行い、YAPの核内蓄積を増強する能力がSrcに依存するのか、P38MAPKに依存するのか、あるいはこれらの両方に依存するのかを評価した。図８Ｅおよび図８Ｆに示したように、P-2で内皮細胞を刺激した後のYAPの核内蓄積は、Src阻害薬またはP38MAPK阻害薬で処理したことによって、コントロールと比べて約５０％低下した。これらのデータから、RGDKGE（配列番号１）P-2で刺激したときのYAPの核内蓄積において、SrcおよびP38MAPKが介在していることが示された。
【０１３８】
P-2の刺激による内皮細胞の増殖はYAPに依存している
YAPは、様々な血管新生因子および炎症因子の発現を制御している。これを踏まえ、P-2の刺激による内皮細胞の増殖がYAPに依存しているかどうかを調査した。YAP特異的shRNAまたはYAP非特異的shRNAで内皮細胞の形質導入を行った。コントロール形質導入内皮細胞において、RGDKGE（配列番号１）を含む可溶性コラーゲンペプチドP-2を添加すると増殖が増強されたが（ｐ＜０．０５）、この配列に関連するRGDAPG（配列番号１１）を含むペプチドP-1を添加しても増殖は増強されなかった（図８Ｇ）。これに対して、YAPがノックダウンされた内皮細胞では、RGDKGE（配列番号１）ペプチドP-2を添加しても増殖は誘導されなかった（図８Ｈ）。YAPノックダウン細胞をVEGFまたは高濃度血清で刺激すると増殖が増強されたことから、YAPノックダウン細胞は増殖能を有していることが示された（図８I）。これらの知見から、RGDKGE（配列番号１）含有コラーゲンペプチドP-2が、ユニークなメカノシグナル伝達カスケードを開始させ、Src依存的経路においてP38MAPKを活性化し、これによってYAPの核内蓄積と内皮細胞の増殖の増強とを引き起こすという機構の存在が示された。
【０１３９】
実施例１０：ヒトM21悪性黒色腫におけるPDL-1の発現は、αｖβ３を欠損したM21L悪性黒色腫における発現よりも高い
ヌードマウスにM21（αｖβ３＋）悪性黒色腫細胞またはML21（αｖβ３−）悪性黒色腫細胞を注射して、処置前にあらかじめ腫瘍を樹立させた。腫瘍の切片を免疫蛍光染色し、免疫チェックポイント制御タンパク質PDL-1の発現を分析した（図１０）。
【０１４０】
実施例１１：ヒトM21悪性黒色腫におけるPDL-1の発現は、β３インテグリンがノックダウンされたM21悪性黒色腫よりも高い
インテグリンαｖβ３を発現するM21悪性黒色腫細胞に、非特異的コントロールshRNA（M21 Cont）またはβ３特異的shRNA（M21β3Kd）をトランスフェクトした（図１１）。ヌードマウスにM21 Cont（αｖβ３＋）悪性黒色腫細胞またはM21β3Kd（αｖβ３−）悪性黒色腫細胞を注射して、処置前にあらかじめ腫瘍を樹立させた。腫瘍の切片を免疫蛍光染色し、免疫チェックポイント制御タンパク質PDL-1の発現を分析した。
【０１４１】
実施例１２：Mab XL313は、免疫チェックポイント阻害薬である抗PDL-1抗体の抗腫瘍活性を高めた
マウスにB16F10悪性黒色腫細胞を注射し、処置を行う５日前にあらかじめ腫瘍を樹立させた（図９）。図９のデータは、１条件につき８匹のマウスを使用して得た１４日目の平均腫瘍体積±ＳＥを表す。
【０１４２】
実施例１３：αｖβ３のリガンド（RGDKGE（配列番号１）を含むコラーゲンエピトープXL313）を標的とする抗体で処置したマウスの悪性黒色腫におけるPDL-1の発現の低下
マウスに悪性黒色腫細胞を注射し、処置を行う５日前にあらかじめ腫瘍を樹立させた。RGDKGE（配列番号１）を含むαｖβ３結合性コラーゲンエピトープを標的とする抗体を用いて、週３回、１４日間にわたってマウスを処置した。腫瘍の切片を免疫蛍光染色し、免疫チェックポイント制御タンパク質PDL-1の発現を分析した（図１２）。
【０１４３】
実施例１４：αｖβ３のリガンド（RGDKGE（配列番号１）を含むコラーゲンエピトープXL313）を標的とする抗体で処置したマウスの悪性黒色腫における浸潤リンパ球の検出の増加
マウスに悪性黒色腫細胞を注射し、処置を行う５日前にあらかじめ腫瘍を樹立させた。RGDKGE（配列番号１）を含むαｖβ３結合性コラーゲンエピトープを標的とする抗体を用いて、週３回、１４日間にわたってマウスを処置した（図１３）。腫瘍の切片における免疫チェックポイント制御タンパク質PDL-1の発現を分析した。
【０１４４】
実施例１５：αｖβ３のECMリガンド（変性IV型コラーゲン）を結合させた悪性黒色腫細胞および内皮細胞におけるPDL-1タンパク質の検出量の増加
インテグリンαｖβ３発現悪性黒色腫細胞M21（図１４Ａ）、CCL-49細胞（図１４Ｂ）および内皮細胞（HUVEC）（図１４Ｃ）を、αｖβ３非結合性リガンド（天然IV型コラーゲン）またはαｖβ３結合性リガンド（変性IV型コラーゲン）でコーティングしたウェルに接着させた。全細胞溶解物を調製し、PDL-1の相対量またはローディングコントロールとしてのβ−アクチンの相対量を評価した。
【０１４５】
実施例１６：αｖβ３のリガンドであるXL313エピトープ（RGDKGE（配列番号１））を結合させた悪性黒色腫細胞におけるPDL-1タンパク質量の増加
コーティングしていないコントロールウェルまたは潜在性コラーゲンエピトープXL313（RGDKGE（配列番号１））を固相化したウェルに、インテグリンαｖβ３発現悪性黒色腫細胞（M21）を播種した（図１５）。インキュベーション後、細胞溶解物を調製し、PDL-1の相対量を評価した。
【０１４６】
実施例１７：αｖβ３特異的抗体LM609を使用して、αｖβ３のECMリガンド（変性IV型コラーゲン）の結合を遮断した悪性黒色腫細胞におけるPDL-1タンパク質量の減少
インテグリンαｖβ３発現悪性黒色腫細胞（M21）を、コントロール非特異的抗体（正常マウスIg）またはαｖβ３特異的抗体（Mab LM609）と混合し、αｖβ３結合性リガンド（変性IV型コラーゲン）でコーティングしたウェルに加えた（図１６）。２４時間インキュベーションした後、全細胞溶解物を調製し、PDL-1の相対量またはローディングコントロールの相対量を評価した。
【０１４７】
参考文献
1. Bergers, G., and Hanahan, D. (2008) Modes of resistance to anti-angiogenic therapy. Nat. Rev. Cancer. 8, 593-604
2. Chung, A. S., Lee, J., and Ferrara, N. (2010) Targeting the tumor vasculature: insight from physiological angiogenesis. Nat. Rev. Cancer. 10, 505-514
3. Cao, Y., Arbiser, J., D’Amato, R. J., D’Amore, P. A., Ingber, D. E., Kerbel, R., Klagsburn, M., Lim, S., Moses, M. A., Zetter, B., Dvorak, H., and Langer, R. (2011) Forty-year journey of angiogenesis translational research. Sci. Transl. Med. 3, 114rv3
4. Contois, L., Akalu, A., and Brooks, P. C. (2009) Integrins as functional hubs in the regulation of pathological angiogenesis. Sem. Can. Biol. 19, 318-328
5. Moserle, L., Jimenz-Valerio, G., and Casanovas, O. (2014) Antiangiogenic therapies: going beyond their limits. Can. Discov. 4, 31-41
6. Greenberg, J. I., Shields, D. J., Barillas, S. G., Acevedo, L. M., Murphy, E., Huang, J., Scheppke, L., Stockmann, C., Johnson, R. S., Angle, N., and Cheresh, D. A. (2008) A role for VEGF as a negative regulator of pericyte function and vessel maturation. Nature. 456, 809-813
7. Hodivala-Dilke, K. (2008) αvβ3 integrin and angiogenesis: a moody integrin in a changing environment. Curr. Opin. Cell. Biol. 20, 514-519
8. Atkinson, S. J., Ellison, T. S., Steri, V., Gould, E., and Robinson, S. D. (2014) Redefining the role(s) of endothelial αvβ3-integrin in angiogenesis. Biochem. Soc. Trans. 42, 1590-1595
9. Robinson, S. D., and Hodivala-Dilke, K. H. (2011) The role of β3-integrins in tumor angiogenesis: context is everything. Curr. Opin. Cell. Biol. 23, 630-637
10. Brooks, P. C., Clark, R. A., and Cheresh, D. A. (1994) Requirement of vascular integrin alpha v beta 3 for angiogenesis. Science. 264, 569-571
11. Brooks, P. C., Montgomery, A. M., Rosenfeld, M., Reisfeld, R. A., Hu, T., Klier, G., and Cheresh, D. A. (1994) Integrin αvβ3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels. Cell. 79, 1157-1164
12. Contois, L. W., Akalu, A., Caron, J. M., Tweedie, E., Cretu, A., Henderson, T., Liaw, L., Friesel, R., Vary, C., and Brooks, P. C. (2014) Inhibition of tumor-associated αvβ3 integrin regulates the angiogenic switch by enhancing expression of IGFBP-4 leading to reduced melanoma growth and angiogenesis in vivo. Angiogenesis.
13. Reynolds, L. E., Wyder, L., Lively, J. C., Robinson, S. D., Huang, X., Sheppard, D., Hynes, R. O., and Hodivala-Dilke, K. M. (2002) Enhanced pathological angiogenesis in mice lacking beta 3 integrin or beta 3 and beta 5 integrins. Nat. Med. 8, 27-34
14. Feng, W., McCabe, N. P., Mahabeleshwar, G. H., Somanah, P. R., Phillips, D. R., and Byzova, T. (2008) The angiogenic response is dictated by β3 integrin on bone marrow-derived cells. J. Cell. Biol. 183, 1145-1157
15. Steri, V., Ellison, T. S., Gontarczyk, A. M., Weilbaecher, K., Schneider, J. G., Edwards, D., Fruttiger, M., Hodivala-Dilke, K. M., and Robinson, S. D. (2014) Acute depletion of endothelial β3-integrin transiently inhibits tumor growth and angiogenesis in mice. Cir. Res. 114, 79-91
16. Gong, Y., Yang, X., He, Q., Gower, L., Prudovsky, I., Vary, C. P. H., Brooks, P. C., and Friesel, R. E. (2013) Sprouty4 regulates endothelial cell migration via modulating integrin β3 stability through c-Src. Angiogenesis. 16, 861-875
17. Adair-Kirk, T. L., and Senior, R. M. (2008) Fragments of extracellular matrix as mediators of inflammation. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 40, 1101-1110
18. Davis, G. E. (2011) Angiogenesis and proteinases: influence on vascular morphogenesis, stabilization and regression. Drug. Discov. Today. Dis. Models. 8, 13-20
19. Petitclerc, E., Boutaud, A., Prestayko, A., Xu, J., Sado, Y., Ninomiya, Y., Sarras, M. P., Hudson, B. G., and Brooks, P. C. (2000) New functions for non-collagenous domains of human collagen type-IV: novel integrin ligands inhibiting angiogenesis and tumor growth in vivo. J. Biol. Chem. 275, 8051-8061
20. Sudhakar, A., Sugimoto, H., Yang, C., Lively, J., Zeisberg, M., and Kalluri, R. (2003) Human tumstatin and endostatin exhibit distinct antiangiogenic activities mediated by αvβ3 and α5β1 integrins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 4766-4771
21. Xu, J., Petitclerc, E., Kim, J. J., Hangai, M., Moon, Y. S., Davis, G. E., and Brooks, P. C. (2001) Proteolytic exposure of a cryptic site within collagen type-IV is required for angiogenesis and tumor growth in vivo. J. Cell Biol. 154, 1069-1079
22. Hangai, M., Kitaya, N., Xu, J., Chan, C. K., Kim, J. J., Werb, Z., Ryan, S. J., and Brooks, P. C. (2002) Matrix metalloproteinase-9-dependent exposure of a cryptic migratory control site in collagen is required before retinal angiogenesis. Am. J. Pathol. 161, 1429-1437
23. Cretu, A., Roth, J. M., Caunt, M., Akalu, A., Policarpio, D., Formenti, S., Gagne, P., Liebes, L., and Brooks, P. C. (2007) Disruption of endothelial cell interactions with the novel HU177 cryptic collagen epitope inhibits angiogenesis. Clin. Cancer. Res. 15, 3068-3078
24. Pierschbacher, M. D., and Ruoslahti, E. (1987) Influence of stereochemistry of the sequence Arg-Gly-Asp-Xaa on binding specificity in cell adhesion. J. Biol. Chem. 262, 1729-1798
25. Kunicki, T. J., Annis, D. S., and Felding-Haberman. (1997) Molecular determinants of Arg-Gly-Asp ligand specificity for β3 integrins. J. Biol. Chem. 272, 4103-4107
26. Gurrath, M., Muller, G., Kessler, H., Aumilley, M., and Timpl. (1992) Conformational/activity studies of rationally designed potent anti-adhesive RGD peptides. Eur. J. Biochem. 210, 911-921
27. Kostidis, S., Stavrakoudis, A., Biris, N., Tsoukatos, D., Sakarellos, C., and Tsikaris, V. (2004) The relative orientation of the Arg and Asp side chains defined by a pseudodihedral angle as a key criterion for evaluating the structure-activity relationship of RGD peptides. J. Peptide. Sci. 10, 494-509
28. Miyoshi, T., Hirohata, S., Ogawa, H., Doi, M., Obika, M., Yonezawa, T., Sado, Y., Kusachi, S., Kyo, S., Kondo, S., Shiratori, Y., Hudson, B. G., and Ninomiya, Y. (2006) Tumor-specific expression of the RGD-α3(IV)NC1 domain suppresses endothelial tube formation and tumor growth in mice. FASEB. J. 20, 1264-1275
29. Danhier, F., Breton, A. L., and Preat, V. (2012) RGD-based strategies to target alpha (v) beta (3) integrin in cancer therapy and diagnosis. Mol. Pharmaceutics. 9, 2961-2973
30. Reynolds, A. R., Hart, I. R., Watson, A. R., Welti, J. C., Silva, R., Robinson, S. D., Violante, G. D., Gouraouen, M., Salih, M., Jones, M. C., Jones, D. T., Sunders, G., Kostourou, V., Perron-Sierra, F., Norman, J. C., Tucker, G. C., and Hodivala-Dilke, K. M. (2009) Stimulation of tumor growth and angiogenesis by low concentrations of RGD-mimetic integrin inhibitors. Nat. Med. 15, 392-400
31. Stupp, R., Hegi, M. E., Gorlia, T., Erridge, S. C., Perry, J., Hong, Y-K., Aldape, K. D., Lhermitte, B., Pietsch, T., Grujicic, D., Steinbach, J. P., Wick, W., Tarnawski, R., Nam, D-H., Hau, P., Weyerbrock, A., Taphoon, M. J. B., Shen, C-C., Rao, N., Thurzo, L., Herrlinger, U., Gupta, T., Kortmann, R. D., Adamska, K., McBain, C., Brandes, A. A., Tonn, J. C., Schnell, O., Wiegel, T., Kim, C-Y., Nabors, L. B., Readon, D. A., van den Bent, M. J., Hicking, C., Markivsky, A., Picard, M., and Weller, T. (2014) Cilengitide combined with standard treatment for patients with newly diagnosed glioblastoma with methylated MGMT promoter (CENTRIC EORTC 26071-22072 study): a multicenter, randomized, open-label, phase 3 trial. Lancet. 15, 1100-11008
32. Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., and Bistoni, F. (1990) Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. J. Neuroimmun. 27, 229-237
33. Rouslahti, E. (1996) RGD and other recognition sequences for integrins. Annu. Rev. Cell Biol. 12, 697-715
34. Montgomery, A. M., Reisfeld, R. A., and Cheresh, D. A. (1994) Integrin alpha v beta 3 rescues melanoma cells from apoptosis in three-dimensional dermal collagen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 8856-8860
35. Madsen, D. H., Leonard, D., Masedunskas, A., Mayer, A., Jurgensen, H. J., Peters, D. E., Amornphimoltham, P., Selvaraj, A., Yamada, S. S., Brenner, D. A., Burgdorf, S., Engelholm, L. H., Behrendt, N., Holmbeck, K., Weigert, R., and Bugge, T. H. (2013) M2-like macrophages are responsible for collagen degradation through a mannose receptor-mediated pathway. J. Cell. Biol. 202, 951-966
36. Zwadlo-Klarwasser, G., Gorlitz, K., Hafemann, B., Klee, D., and Klosterhalefen, B. (2001) The chorioallantoic membrane of the chick embryo as a simple model for the study of the angiogenic and inflammatory response to biomaterials. J. Mater. Sci. Mater. Med. 12, 195-199
37. Deryugina, E. I., and Quigley, J. P. (2008) Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules. Meth. Enzymol. 444, 21-41
38. Skjot-Arkil, H., Barascuk, N., Register, T., and Karsdal, M. (2010) Macrophage-mediated proteolytic remodeling of the extracellular matrix in atherosclerosis results in neoepitopes: a potential new class of biochemical markers. Drug. Dev. Technol. DOI: 10.1089/adt.2009.0258
39. Rajashekhar, G., Kamocka, M., Marin, A., Suckow, M. A., Wolter, W. R., Badve, S., Sanjeevaiah, A. R., Pumiglia, K., Rosen, E., and Clauss, M. (2010) Pro-inflammatory angiogenesis is mediated by p38 MAP Kinase. J. Cell Physiol. DOI: 10.1002/jcp22404
40. Matsumoto, T., Turesson, I., Book, M., Gerwins, P., and Claesson-Welsh, L. (2002) p38 MAP Kinase negatively regulates endothelial cell survival, proliferation, and differentiation in FGF-2 stimulated angiogenesis. J. Cell. Biol. 156, 149-160
41. Contois, L. W., Nugent, D. P., Caron, J. M., Cretu, A., Tweedie, E., Akalu, A., Liebes, L., Friesel, R., Rosen, C., Vary, C., and Brooks, P. C. (2012) Insulin-like growth factor binding protein-4 differentially inhibits growth factor-induced angiogenesis. J. Biol. Chem. 287, 1779-1789
42. Mitra, S. K., and Schlaepfer, D. D. (2006) Integrin-regulated FAK-Src signaling in normal and cancer cells. Curr. Opin. Cell Biol. 18, 516-523
43. McMullen, M., Keller, R., Sussman, M., and Pumiglia, K. (2004) Vascular endothelial growth factor-mediated activation of p38 is dependent upon Src and RAFTK/Pyk2. Oncogene. 23, 1275-1282
44. Rousseau, S., Houle, F., Landry, J., and Huot, J. (1997) p38 MAP kinase activation by vascular endothelial growth factor mediates actin reorganization and cell migration in human endothelial cells. Oncogene. 15, 2169-2177
45. Alghisi, G. C., Ponsonnet, L., and Ruegg, C. (2009) The integrin antagonist cilengitide activates αvβ3, disrupts VE-cadherin localization at cell junctions and enhances permeability in endothelial cells. Plose. One. 4, e449
46. Dupont, S., Morsut, L., Aragona, M., Enzo, E., Giulitti, S., Cordenonsi, M., Zanconato, F., Le Digabel, J. Forcato, M., Bicciato, S., Elvassore, N., and Piccolo, S. (2011) Role of YAP/TAZ in mechanotransduction Nature. 474, 179-183
47. Shen, Z., and Stanger, B. Z. (2015) YAP regulates S-phase entry in endothelial cells. Plose One. DOI: 10.1371/journal.pone.0117522
48. Dai, X., She, P., Chi, F., Feng, Y., Liu, H., Jin, D., Zhao, Y., Guo, X., Jiang, D., Guan, K-L., Zhong, T. P., and Zhao, B. (2013) Phosphorylation of angiomotin by Lats1/2 kinase inhibits F-actin binding, cell migration and angiogenesis. J. Biol. Chem. 288, 34041-34051
49. Adler, J. J., Johnson, D. E., Heller, B. L., Bringman, L. R., Ranahan, W. P., Conwell, M. D., Sun, Y., Hudman, A., and Wells, C. D. (2013) Serum deprivation inhibits the transcriptional co-activators YAP and cell growth via phosphorylation of the 130-Kda isoform of angiomotin by the LATS1/2 protein kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, 17368-17373
50. Johnson, R., and Halder, G. (2014) The two faces of hippo: targeting the hippo pathway for regenerative medicine and cancer treatment. Nat. Rev. Drug. Discov. 13, 63-79
51. Brooke, B. S., Karnik, S. K., and Li, D. Y. (2003) Extracellular matrix in vascular morphogenesis and disease: structure versus signal. Trend. Cell. Biol. 13, 51-56
52. Bonnans, C., Chou, J., and Werb, Z. (2014) Remodeling the extracellular matrix in development and disease. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 786-801
53. Pickup, M. W., Mouw, J. K., and Weaver, V. M. (2014) The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Reports. DOI: 10.15252/embr.201439246
54. Yip, K-P., and Marsh, D. J. (1997) An Arg-Gly-ASP peptide stimulates constriction in rat afferent arteriole. Am. J. Physiol. 273, 768-776
55. Mogford, J. E., Davis, G. E., Platts, S. H., and Meininger, G. A. (1996) Vascular smooth muscle alpha v beta 3 integrin mediates arteriolar vasodilation in response to RGD peptides. Cir. Res. 79, 821-826
56. Du, X., Plow, E. F., Frelinger, A. L., O’Toole, T. E., Loftus, J. C., and Ginsberg, M, H. (1991) Ligands activate integrin aIIbβ3 (Platelet GPIIb-IIIa). Cell. 65, 409-416
57. Legler, D. FD., Wiedle, G., Ross, P. F., and Imhof, B. A. (2001) Superactivation of integrin αvβ3 by low antagonists concentrations. J. Cell. Sci. 114,1545-1553
58. Deryugina, E. I., Zajac, E., Juncker-Jensen, A., Kupriyanova, T. A., Welter, L., and Quigley, J. P. (2014) Tissue-infiltrating neutrophils constitute the major in vivo source of angiogenesis-inducing MMP-9 in the tumor microenvironment. Neoplasia. 16, 771-788
59. Schnoor, M., Cullen, P., Lorkowski, J., Stolle, K., Robenek, H., Troyer, D., Rauterberg, J., and Lorkowski, S. (2008) Production of type VI collagen by human macrophages: a new dimension in macrophage functional heterogenicity. J. Immunol. 180, 5707-5719
60. Jetten, N., Verbruggen, S., Gijbels, M. J., Post, M. J., De Winther, M. P. J., Donners, M. M. P. (2014) Anti-inflammatory M2, but not pro-inflammatory M1 macrophage promote angiogenesis in vivo. Angiogenesis. 17, 109-118
61. Shen, B., Delaney, M. K., and Du, X. (2012) Inside-out, outside-in, and inside-outside-in: G protein signaling in integrin-mediated cell adhesion, spreading, and retraction. Curr. Opin. Cell. Biol. 24, 600-606
62. Gong, H., Shen, B., Flevaris, P., Chow, C., Lam, S., C-T., Voyno-Yasenetskaya, T. A., Kozasa, T., and Du, X. (2010) G-protein subunit Gα13 binds to integrin aIIbβ3 and mediates integrin outside-in signaling. Science. 327, 340-343
63. Liao, Z., Kato, H., Pandey, M., Cantor, J. M., Ablooglu, A. J., Ginsberg, M. H., and Shattil, S. J. (2015) Interaction of kindlin-2 with integrin β3 promotes outside-in signaling responses by the αvβ3 vitronectin receptor. Blood. Doi:10.1182/blood-2014-09-603035
64. Von Wichert, G., Jiang, G., Kostie, A., De Vos, K., Sap, J., and Sheetz, M. (2003) RPTP-α acts as a transducer of mechanical force on αvβ3-integrin-cytoskeleton linkage. J. Cell. Biol. 161, 143-153
65. Somanath, P. R., Malinin, N. L., and Byzova, T. V. (2009) Cooperation between integrin αvβ3 and VEGFR2 in angiogenesis. Angiogenesis. 12, 177-185
66. Yu, C-H., Law, J. B. K., Suryana, M., Low, H. Y., and Sheetz, M. P. (2011) Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 20585-20590
67. Tang, Y., Rowe, G., Botvinick, E. L., Kurup, A., Putman, A. J., Seiki, M., Weaver, V. M., Keller, E. T., Goldstein, S., Dai, J., Begun, D., Saunders, T., and Weiss, S. J. (2013) MT1-MMP-dependent control of skeletal stem cell commitment via a β1-integrin/YAP/TAZ signaling axis. Dev. Cell. 25, 402-416
68. Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., and Ikeda, K. (2014) Integrin αv in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 447, 352-357
【０１４８】
その他の実施形態
本発明の詳細な説明とともに本発明について述べたが、上述の説明は本発明を例示することを目的として記載されたものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明は添付の請求項の範囲によって定義される。その他の態様、利点および変更も後述の請求項の範囲に含まれる。
【０１４９】
本明細書において引用された特許文献および科学文献は、当業者が利用可能な知識を示したものである。本明細書において引用された米国特許、米国公開特許出願および米国非公開特許出願はいずれも、引用により本願に組み込まれる。本明細書において引用された外国公開特許および外国公開特許出願はいずれも、引用により本願に組み込まれる。本明細書において引用されたアクセッション番号によって示されるGenbankおよびNCBIに寄託された配列は、引用により本願に組み込まれる。本明細書において引用されたその他の公表されている参考論文、論文、草稿および科学文献はいずれも、引用により本願に組み込まれる。
【図１】
2018521015.tif 000004
【図２】
2018521015.tif 000005
【図３】
2018521015.tif 000006
【図４】
2018521015.tif 000007
【図５】
2018521015.tif 000008
【図６】
2018521015.tif 000009
【図７】
2018521015.tif 000010
【図８】
2018521015.tif 000011
【図９】
2018521015.tif 000012
【図１０】
2018521015.tif 000013
【図１１】
2018521015.tif 000014
【図１２】
2018521015.tif 000015
【図１３】
2018521015.tif 000016
【図１４】
2018521015.tif 000017
【図１５】
2018521015.tif 000018
【図１６】
2018521015.tif 000019
【配列表】
2018521015000001.app
【国際調査報告】
2018521015.tif 000020
2018521015.tif 000021
2018521015.tif 000022