(57)【要約】レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭなどのステビオール配糖体を、遺伝子操作を受けた酵母を用いて生成するための方法が開示される。本方法は、酵母を非発酵性炭素源上で増殖させることを含む。他の方法は、多糖類の糖化及び発酵が同時に発生する、１つ以上の多糖類上で酵母を増殖させることを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステビオール配糖体（複数可）の生成方法であって、１つ以上のステビオール配糖体（複数可）を生成することができる遺伝子操作を受けた酵母を、前記遺伝子操作を受けた酵母によって発酵可能な炭水化物を含有するグルコース制限培地中で増殖させることを含み、
ａ．前記グルコース制限培地中の前記発酵可能な炭水化物の５０重量％（ｗｔ％）未満、好ましくは２０重量％未満、より好ましくは１０重量％未満、または５重量％未満が、グルコース、フルクトース、またはグルコース及びフルクトースであり、
ｂ．前記グルコース制限培地中の前記発酵可能な炭水化物の少なくとも５０重量％、好ましくは少なくとも６０重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも９０重量％、または少なくとも９５重量％が、ラフィノース、マンノース、トレハロース、ガラクトース、マルトース、グリセロール、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるエタノール制限基質である、方法。
【請求項２】
前記エタノール制限基質が、ラフィノース、マンノース、トレハロース、ガラクトース、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エタノール制限基質が、ラフィノース、マンノース、トレハロース、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ステビオール配糖体（複数可）が、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、またはレバウジオシドＭ及びレバウジオシドＤの両方を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子操作を受けた酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、及びＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
生成される前記１つ以上のステビオール配糖体（複数可）の少なくとも５０重量％が、細胞外に放出される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ステビオール配糖体（複数可）が、レバウジオシドＭ及びレバウジオシドＤの両方を含み、生成される前記１つ以上のステビオール配糖体（複数可）の少なくとも５０重量％が、細胞外に放出される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステビオール配糖体（複数可）の生成方法であって、
（ａ）１つ以上のステビオール配糖体（複数可）を生成することができる遺伝子操作を受けた酵母と、１つ以上の多糖類及び／または１つ以上のオリゴ糖類を有する炭素源とを提供することと、
（ｂ）前記１つ以上の多糖類及び／または１つ以上のオリゴ糖類の少なくとも一部を、１つ以上の単糖類に変換することと、
（ｃ）遺伝子操作を受けた酵母を１つ以上の単糖類上で増殖させて、１つ以上のステビオール配糖体（複数可）を生成することと、を含む。
【請求項９】
前記変換することが、前記１つ以上の多糖類及び／または１つ以上のオリゴ糖類の少なくとも一部を、１つ以上の単糖類に変換することができる１つ以上のデンプン分解酵素を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上の酵素ならびに前記１つ以上の多糖類及び／または１つ以上のオリゴ糖類が、特定の増殖期間中に、エタノールが前記酵母によって実質的に生成されないような量で存在する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
エタノールが、前記増殖期間中に前記酵母によって実質的に生成されない、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の酵素が、グルコアミラーゼ及びα−アミラーゼを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子操作を受けた酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子操作を受けた酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、及びＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子操作を受けた酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、ならびにＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つ以上のステビオール配糖体（複数可）が、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、またはレバウジオシドＭ及びレバウジオシドＤの両方を含む、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、「Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｓｔｅｖｉｏｌ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ」と題され、２０１５年８月６日に出願された米国仮出願第６２／２０１，９４１号の利益を主張するものであり、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。２０１５年５月７日に作成された「ＣＡＲ０２１７Ｐ１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と題され、９５キロバイトのサイズを有するＡＳＣＩＩテキストファイルの内容全体が、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。２０１６年８月６日に作成されたＣＡＲ０２１７ＷＯ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔもまた、本明細書と共に出願され、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
スクロース、フルクトース、及びグルコースなどの糖は、飲料、食品、医薬品、及び経口衛生／化粧料製品に心地よい味を提供するために利用される。特にスクロースは、消費者に好まれる味を付与する。スクロースは優れた甘味特性を提供するが、高カロリーである。ノンカロリーまたは低カロリー甘味料が消費者需要を満たすために導入されており、好ましい味特性を有するこれらの種類の甘味料が求められている。
【０００３】
ステビアは、北西アメリカから南アメリカまでの亜熱帯及び熱帯地域に原生するヒマワリ科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）のハーブ及び低木の約２４０種の属である。ハイノキ（ｓｗｅｅｔｌｅａｆ、ｓｗｅｅｔ  ｌｅａｆ）、糖葉（ｓｕｇａｒｌｅａｆ）、または単にステビアとして一般に知られるＳｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ種は、その甘い葉のために、広く栽培されている。ステビア系甘味料は、１つ以上の甘味化合物を葉から抽出することによって得ることができる。これらの化合物の多くは、ステビオールの配糖体、ジテルペン化合物であるステビオール配糖体である。これらのジテルペン配糖体は、糖よりも約１５０〜４５０倍甘い。
【０００４】
ステビオール配糖体の例は、ＷＯ２０１３／０９６４２０（例えば、図１の一覧表を参照）及びＯｈｔａ  ｅｔ．ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔｅｖｉｏｌ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌｅａｖｅｓ  ｏｆ  Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｍｏｒｉｔａ，”Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｉ．，５７，１９９−２０９（２０１０）（例えば、２０４ページの表４を参照）に記載されている。構造的には、ジテルペン配糖体は、図２ａ〜２ｋに提示されるように、単一塩基のステビオールによって特徴付けられ、Ｃ１３及びＣ１９位における炭水化物残基によって異なる。ＰＣＴ特許公報ＷＯ２００１３／０９６４２０も参照されたい。
【０００５】
典型的には、乾燥重量に基づいて、ステビアの葉で見出される４つの主要なステビオール配糖体は、ズルコシドＡ（０．３％）、レバウジオシドＣ（０．６〜１．０％）、レバウジオシドＡ（３．８％）及びステビオシド（９．１％）である。ステビア抽出物中で特定された他の配糖体には、レバウジオシドＢ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、ステビオールビオシド、及びルブソシドのうちの１つ以上が挙げられる。
【０００６】
主要なステビオール配糖体ＲｅｂＡは、飲料用途における甘味料として一般的に使用されているが、これは異味の問題を有する。最近になって、より良好な味特性を有するある特定の目立たないステビオール配糖体に焦点が当てられつつある。例えば、レバウジオシドＭは、より高い甘味強度を有し、他のステビオール配糖体よりも強力である（例えば、Ｐｒａｋａｓｈ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．，８：１５２３−１５２６、及びＷＯ２０１３／０９６４２０を参照）。レバウジオシドＤは、スクロースよりも２００〜２２０倍甘い味を有し、官能評価においては、これは、甘味の遅い開始を有し、非常に清涼感があった（例えば、Ｐｒａｋａｓｈ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．，１３：１５１２６−１５１３６を参照）。
【０００７】
発酵を介してステビオール配糖体を合成することができる組換え生物を調製するために、分子技術が用いられてきた。例えば、ステビオール配糖体の合成に関与する酵素をコード化する複数の導入遺伝子を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの組換え株が、レバウジオシドＭ及びレバウジオシドＤの生成に使用されている（例えば、ＷＯ２０１４／２２２２２７を参照）。
【０００８】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、通常、培地中、＞１〜２ｇ／ｌのグルコースの存在下で発酵する（クラブツリー効果）。これが生じるとき、エタノールが発酵生成物として生成される。エタノールの生成は、バイオマス及び所望のバイオプロダクト（例えば、ステビオール配糖体）を低減させる。グルコースを制限された状態で維持し、及び／またはクラブツリー効果を刺激しない基質を使用する１つのアプローチは、ステビオール配糖体の生成を支援し得る非発酵性基質を使用することであり得る。グルコース放出を制限し、かつグルコースレベルを酵母の発酵を刺激するものよりも低く維持するための別のアプローチは、同時糖化発酵（ＳＳＦ）の適用によるものである。
【発明の概要】
【０００９】
非発酵性基質上で酵母を増殖させることによってステビオール配糖体を生成する方法が開示される。同時糖化発酵によって、酵母を増殖させてステビオール配糖体を生成する方法も開示される。
【００１０】
一態様によるステビオール配糖体（複数可）の生成方法は、１つ以上のステビオール配糖体（複数可）を生成することができる遺伝子操作を受けた酵母を、遺伝子操作を受けた酵母によって発酵可能な炭水化物を含有するグルコース制限培地中で増殖させることを含む。発酵可能な炭水化物の５０重量％（ｗｔ％）未満、好ましくは＜２０重量％、より好ましくは＜１０重量％または＜５重量％が、グルコース及び／またはフルクトースであり、すなわち、グルコース、フルクトース、またはグルコース及びフルクトースである。いくつかの態様では、グルコース及び／またはフルクトースは、発酵可能な炭水化物の２重量％未満、好ましくは＜１重量％を構成してもよく、１つの有用な態様では、グルコース制限培地は、実質的にグルコースを含まない。発酵可能な炭水化物の少なくとも５０重量％、好ましくは少なくとも６０重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも９０重量％、または少なくとも９５重量％は、ラフィノース、マンノース、トレハロース、ガラクトース、マルトース、グリセロール、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、好ましくは、ラフィノース、マンノース、トレハロース、ガラクトース、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、より好ましくは、ラフィノース、マンノース、トレハロース、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１１】
別の態様において、ステビオール配糖体（複数可）の生成方法は、
（ａ）１つ以上のステビオール配糖体（複数可）を生成することができる遺伝子操作を受けた酵母と、１つ以上の多糖類及び／または１つ以上のオリゴ糖類を有する炭素源とを提供することと、
（ｂ）１つ以上の多糖類及び／または１つ以上のオリゴ糖類の少なくとも一部を、１つ以上の単糖類に変換することと、
（ｃ）遺伝子操作を受けた酵母を１つ以上の単糖類上で増殖させて、１つ以上のステビオール配糖体（複数可）を生成することと、を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書に記載される本開示の実施形態は、網羅的であること、または本発明を以下の詳細な説明に限定することを意図するものではない。むしろ、選択及び説明される実施形態の目的は、当業者による本発明の原理及び実施の認識及び理解を容易にすることができるようにするものである。
【００１３】
本開示の発酵法は、ステビオール配糖体を生成することができる遺伝子操作を受けた酵母を使用する。ステビオール配糖体を生成することができる遺伝子操作を受けた酵母は、細胞中の１つ以上のステビオール配糖体の形成を促進する酵素（複数可）をコード化する１つ以上の外因性核酸を含む。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「ステビオール配糖体（複数可）」という用語は、ステビオールの配糖体を指す。例示のステビオール配糖体には、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＧ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ、ステビオシド、ステビオールビオシド、ズルコシドＡ、及びルブソシドが挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子操作を受けた酵母は、天然に見出される（「自然発生の」）ステビオール配糖体と同様であるステビオール配糖体ならびにＳｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａの葉に存在することが知られていないステビオール配糖体を生成することができる。ステビオール配糖体は、酵素的方法によって遺伝子操作を受けた酵母中で形成され得る。
【００１５】
構造的に、ステビオール配糖体は、単一のステビオール塩基である中央分子部分を有し、グルコピラノシル残基が、以下に示した塩基上の原子の数に応じて、ステビオール塩基のＣ１３及び／またはＣ１９原子に結合される。すなわち、グルコピラノシル残基は、以下の式中の基Ｒ２及びＲ１を表す。
【化１】
2018521680.tif 000002
【００１６】
本開示によれば、ステビオール配糖体は、少なくとも２つの相、すなわち各相において、グルコース含有供給組成が、可変供給、その後の一定供給などの異なる供給のモードで培地に提供される第１及び第２の相を有するプロセスで生成される。本明細書に記載される二相式供給プロセスは、第２の相において第１の相よりも遅い増殖速度をもたらすことができ、その結果、ステビオール配糖体生成速度の増加、発酵時間の短縮、及びバイオマス濃度の低下をもたらし得る。遺伝子操作を受けた酵母は、ステビオール配糖体の合成のための経路を提供する一連の酵素を有し得る。例えば、本プロセスは、ＲｅｂＭ及びＲｅｂＤなどのステビオール配糖体を生成し得る。
【００１７】
本開示の方法は、１つ以上のステビオール配糖体に対して経路を提供するように遺伝子操作を受けた様々な酵母宿主細胞を使用し得る。このような細胞は、ステビオール配糖体の合成のための酵素をコード化する１つ以上のＤＮＡ構築物（複数可）で形質転換され得る。ステビオール配糖体経路酵素をコード化する外因性ＤＮＡ構築物のために宿主として使用され得る例示の酵母には、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、及びＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの種が挙げられるが、これらに限定されない。例示の種は、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、及びＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。さらに、宿主細胞はまた、発酵中に改善された性能を提供し得る、ステビオール配糖体経路のもの以外の遺伝子改変を含み得る。
【００１８】
「遺伝子操作を受けた酵母」とは、細胞のゲノム中に一体化されるか、またはプラスミドまたはエピソームなどの染色体外構築物上に存在するかのいずれかで細胞中に導入される少なくとも１つの外因性ＤＮＡ配列を有する酵母細胞を指す。「外因性」という用語は、宿主酵母中に導入される核酸などの分子、または酵素活性などの活性を指す。外因性核酸は、周知の技術によって酵母宿主中に導入することが可能であり、宿主の染色体物質に対して外部で維持され得るか（例えば、非組込み型ベクター上に維持される）、または組換え事象によってなど、酵母の染色体中に組み込まれ得る。一般的に、遺伝子操作を受けた酵母のゲノムは、１つ以上の組換え遺伝子の安定な導入を通して増強される。外因性核酸は、酵母に対して同種または異種である、酵素、またはその一部をコード化することができる。外因性核酸は、天然に存在しない形態であるように分子技術を通して１つ以上の方法で操作されている核酸を指す「組換え遺伝子またはＤＮＡ構築物」の形態とすることができる。
【００１９】
「異種」（例えば、「非天然」）という用語は、言及された分子または生物とは異なる供給源に由来する分子または活性を指す。したがって、言及された生物に対して異種である遺伝子またはタンパク質は、その生物においては見出されない遺伝子またはタンパク質である。本開示の文脈において、「異種グリコシルトランスフェラーゼ」とは、宿主生物に特有であり得る任意のグルコシルトランスフェラーゼポリペプチドとは異なるグリコシルトランスフェラーゼを指す。例えば、第１の種で見出され、その第１種とは異なる宿主酵母生物に外因的に導入された特異的なグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、宿主酵母に対して「異種」である。
【００２０】
遺伝子操作を受けた酵母は、ステビオール配糖体経路の酵素をコード化する核酸を有する形質転換体を選択するのに好適な栄養要求性マーカーとして使用し得る。宿主酵母は、ＬＹＳ２、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＵＲＡ３、ＵＲＡ５、及びＴＲＰ１などの、栄養要求性を制御する１つ以上の遺伝子中に改変（欠失等）を含み得る。１つ以上の外因性遺伝子の導入についての所望の遺伝的背景を有する宿主細胞を使用して、１つ以上の遺伝子構築物（複数可）が細胞に導入され、ゲノム中に組み込まれるか、または安定して維持され、発現を可能にする。遺伝子構築物を宿主細胞中に導入するための方法には、形質転換、形質導入、トランスフェクション、共トランスフェクション及び電気穿孔法が含まれる。特に、酵母形質転換は、酢酸リチウム法、プロトプラスト法などを用いて実行され得る。導入される遺伝子構築物は、プラスミドの形態で、または宿主の遺伝子中への挿入によって、または宿主の遺伝子との同種組換えを通して、染色体中に組み込まれてもよい。遺伝子構築物がその中に導入された形質転換酵母は、選択可能マーカー（例えば、上述した栄養要求性マーカー）で選択され得る。発現されたタンパク質の活性、またはステビオール配糖体などのバイオプロダクトの生成を測定することによって、さらなる確認が行われ得る。
【００２１】
ステビオール経路遺伝子を含む外因性核酸配列の形質転換は、当該技術分野において周知の方法を用いて確認され得る。このような方法には、例えば、ｍＲＮＡのノーザンブロットまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などの核酸分析、または遺伝子産物の発現についての免疫ブロット法、または導入された核酸配列もしくはそれらの対応する遺伝子産物の発現を検査するための他の好適な分析法が挙げられる。当業者には、外因性核酸が所望の生成物を生成するのに十分な量で発現されることが理解され、発現レベルが、当該技術分野において周知であり、また本明細書に開示される方法を用いて、十分な発現を得るように最適化され得ることもさらに理解される。
【００２２】
テルペノイド化合物のイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）は、遺伝子操作を受けた酵母中で、ステビオール配糖体に対する化学的前駆体として機能し得る。植物、昆虫、及びいくつかの微生物種を含む一部の生物は、アセチル−ＣｏＡを一連の化学中間体を経てＩＰＰ及びＤＭＡＰＰに変換するメバロン酸（ＭＶＡ）経路を有する。一部の生物は、グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）及びピリビン酸（ＰＹＲ）で開始する非メバロン酸経路（メチルＤ−エリスリトール４−リン酸またはＭＥＰ経路としても知られる）を通してＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを生成する。
【００２３】
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、メバロン酸経路の遺伝子を自然に発現する。メバロン酸経路の遺伝子には、（ａ１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．９）、（ｂ１）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）シンターゼ（ＥＣ  ４．１．３．５）；（ｃ１）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．３４）；（ｄ１）メバロン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．３６）；（ｅ１）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．４．２）；及び（ｆ１）メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．３３）が挙げられる。メバロン酸経路の酵素は、以下のようにアセチル−ＣｏＡをＩＰＰに変換する：アセチルＣｏＡ→アセトアセチル−ＣｏＡ→３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ→メバロン酸→メバロン酸−５−リン酸→メバロン酸−５−ピロリン酸→ＩＰＰ。
【００２４】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作を受けた酵母は、アセチル−ＣｏＡからＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰまでの線束を増加させ、これにより、ステビオールへの経路で使用するためのＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰの増加したプールを提供するために、１つ以上の改変を含むことができる。これらの改変は、例えば、核酸の複数のコピーを使用して、及び／または天然酵素と比べてより高いレベルの酵素活性を提供する異種酵素、変異型酵素（例えば、１つ以上のアミノ酸置換を含むもの）、もしくは変異型異種酵素を使用して、酵素細胞に対して同種または異種である酵素をコード化する核酸を発現の増加を提供するプロモータの制御下に配置することによってなど、１つ以上のメバロン酸経路酵素（ａ１）〜（ｆ１）の発現または活性を増加させることを含み得る。
【００２５】
あるいは、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路を用いて、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをステビオール配糖体生成に対する前駆体として提供することもできる。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、ＭＥＰ経路の遺伝子を自然には発現しないが、ＭＥＰ経路遺伝子を提供するように任意に遺伝子操作を受けることができる。理論上、ＭＥＰ経路は、これがＭＶＡ経路と比べて炭素をＣＯ２として失うことが少ないために、概ね、よりエネルギー的に効率的である（ＭＥＰ経路：１  ＣＯ２／ＩＰＰ；ＭＶＡ経路：４  ＣＯ２／ＩＰＰ；炭素源として糖）。
【００２６】
特に、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路では、化合物イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）は、グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）及びピルビン酸（ＰＹＲ）からもたらされる一連の中間体を通して生成され、多くの酵素がこの変換に関与している。Ｇ３Ｐ及びＰＹＲからＩＰＰ及びＤＭＡＰＰまでの生合成経路に関与する酵素には、（ａ２）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）、（ｂ２）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ｉｓｐＣ）−、（ｃ２）４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＩｓｐＤ）、（ｄ２）４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＩｓｐＥ）、（ｅ２）２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＦ）、（ｆ２）１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＧ）、（ｇ２）４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸レダクターゼ（ＩｓｐＨ）、及び（ｈ２）イソペンテニル−二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）が挙げられる。
【００２７】
発酵によりステビオール配糖体（複数可）を生成するための本開示の方法は、Ｇ３Ｐ及びＰＹＲからＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰまでの線束を増加させ、これによって、ステビオールへの経路で使用するためのＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰの増加したプール提供するために、１つ以上の遺伝子改変を有する遺伝子操作を受けた酵母を使用することができる。この改変は、例えば、核酸の複数のコピーを使用して、及び／または天然酵素と比べてより高いレベルの酵素活性を提供する異種酵素、変異型酵素（例えば、１つ以上のアミノ酸置換を含むもの）、もしくは変異型異種酵素を使用して、酵素細胞に対して異種である酵素をコード化する核酸を、増加した発現を提供するプロモータの制御下に配置することによってなど、１つ以上の酵素（ａ２）〜（ｈ２）の発現または活性を増加させることを含み得る。
【００２８】
発酵によりステビオール配糖体（複数可）を生成するための本開示の方法は、ＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰをステビオールに変換するために、１つの経路をまた含み得る遺伝子操作を受けた酵母を使用することができる。例えば、いくつかの態様では、この遺伝子操作を受けた酵母は、以下の酵素を発現する外因性核酸を含み得る：（ａ３）ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、（ｂ３）コパニル二リン酸シンターゼ（ＣＰＳ）、（ｃ３）カウレンシンターゼ（ＫＳ）、（ｄ３）カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）、及び（ｅ３）カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）。メバロン酸経路の酵素は、以下のように、ＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰをステビオールに変換する：ＩＰＰ／ＤＭＡＰＰ→ゲラニルゲラニル二リン酸→コパニル二リン酸→カウレン→カウレン酸→ステビオール。酵母細胞に対して異種である、酵素（ａ３）〜（ｅ３）をコード化する外因性核酸は、核酸の複数のコピーを使用して、及び／または高いレベルの酵素活性を提供する変異型酵素（例えば、１つ以上のアミノ酸置換を含むもの）、もしくは変異型異種酵素を使用して、増加した発現を提供するプロモータの制御下に配置され得る。
【００２９】
発酵によりステビオール配糖体（複数可）を生成するための本開示の方法は、ステビオールをステビオール配糖体に変換するための任意の経路を有する遺伝子操作を受けた酵母を使用することができる。複数のステビオール配糖体経路の酵素が遺伝子操作を受けた酵母中に存在する場合、この酵母は、異なるステビオール配糖体を生成することができ得る。例えば、この酵母は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、または１０個を超える異なるステビオール配糖体種を生成することができ得る。
【００３０】
ステビオール配糖体経路は、グリコシル残基の活性化ヌクレオチド糖から受容体分子への転移を媒介する１つ以上のウリジン二リン酸（ＵＤＰ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）を含み得る。ステビオール配糖体経路の場合、単糖類単位は、ステビオールまたはステビオール配糖体分子上のヒドロキシもしくはカルボキシル部分へ、またはステビオール塩基に結合されるグルコース基上のヒドロキシル基へ転移され得る。ＵＧＴは、配列相同性に基づいてファミリー及びサブファミリーに分類されている。Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４３３８−４３４３を参照されたい。それぞれが４２個のアミノ酸コンセンサス配列を含有するＵＧＴをコード化する１００を超える遺伝子のスーパーファミリーが、モデル植物のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａにおいて特定されており、ＵＧＴをコード化する遺伝子もまた、いくつかの他の高等植物種で特定されている。
【００３１】
例示のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、少なくとも１つのグルコース単位をステビオール及びまたはステビオール配糖体基質に付加して、目標のステビオール配糖体を提供することができる任意のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼとすることができる。一実施形態では、遺伝子操作を受けた酵母は、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ９１Ｄ２、及びさらにはこれらのポリペプチドと実質的（＞８５％）同一性を有するＵＧＴからなる群から選択される１つ以上のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを含み得る。遺伝子操作を受けた酵母は、これらのＵＧＴをコードする１つ以上の外因性核酸分子（複数可）を含み得る。
【００３２】
遺伝子操作を受けた酵母はまた、１つ以上のＵＧＴ及びＵＤＰ−グルコースリサイクル酵素（複数可）を含み得る。少なくとも１つのグルコース単位をルブソシドに付加して、ステビオシドを形成することができる例示のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２である。少なくとも１つのグルコース単位をステビオシドに付加して、レバウジオシドＡを形成することができる例示のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１である。少なくとも１つのグルコース単位をレバウジオシドＡに付加して、レバウジオシドＤを形成することができる例示のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２である。少なくとも１つのグルコース単位をルレバウジオシドＤに付加して、レバウジオシドＭを形成することができる例示のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１である。
【００３３】
ステビオール配糖体の生成のために遺伝子操作を受けた微生物及びステビオール配糖体経路の酵素を記載する例示の公開には、例えば、ＵＳ２０１４／０３５７５８８、ＷＯ２０１４／１９３９３４、ＷＯ２０１４／１９３８８８、及びＷＯ２０１４／２２２２２７が挙げられ、これらのそれぞれの全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３４】
一実施形態では、ステビオール配糖体の生成に有用な遺伝子操作を受けた酵母は、以下の酵素を発現する：ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、ｅｎｔ−コパニル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）、カウレンシンターゼ（ＫＳ）、ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ）、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ９１  ｄ２、及びＥＵＧＴ１１。ＷＯ２０１４／１２２２２７は、これらの酵素を発現する遺伝子操作を受けた酵母株を記載している。ＵＧＴ７４Ｇ１酵素は、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール１９−ＣＯＯＨトランスフェラーゼ及びウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド１９−ＣＯＯＨトランスフェラーゼとして機能する。ＵＧＴ７６Ｇ１酵素は、ステビオール主鎖上のいくつかのグリコシル化反応を触媒する、ステビアウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼである。ＵＧＴ７６Ｇ１酵素は、１９−Ｏ位または１３−Ｏ位におけるステビオール及びステビオール配糖体のグリコシル化を触媒することができる。ＵＧＴ９１  Ｄ２及びＥＵＧＴ１１酵素は、グルコース部分を受容体分子のステビオール−１３−Ｏ−グルコシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移させるウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドトランスフェラーゼ（ステビオール−１３−モノグルコシド１，２−グルコシラーゼとも称される）として、またはグルコース部分を受容体分子のルブソシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移させて、ステビオシドを生成するウリジン５’−ジホスホグルコシル：ルブソシドトランスフェラーゼとして機能し得る。ＥＵＧＴ１１酵素はまた、グルコース部分を受容体分子のルブソシドの１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移させて、１９−Ｏ−１，２−ジグリコシル化ルブソシドを生成することができる。
【００３５】
「培地」という用語は、遺伝子操作を受けた酵母または真菌がその中で維持されることができ、増殖することができ、発酵することができ、またはこれらの組み合わせを行うことができる液体組成物を指す。「培地」はまた、「ブロス」または「細胞培養」とも称されてもよく、「増殖」、「分裂」、「呼吸」及び「発酵」などの用語は、培地中で生じている細胞活動の種類をより具体的に規定するために使用されてもよい。
【００３６】
培地は、炭素源などの培地中に存在する成分及びその量に関して定義されることができ、これらには（ａ）炭水化物、例えばグルコース及びマルトデキストリンなどのデンプン製品、（ｂ）窒素源、例えば、酵母ニトロゲンベース、水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム、またはこれらの任意の組み合わせ、（ｃ）塩類、例えば、リン酸カリウム（第一、第二）、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、及び塩化カルシウム、（ｄ）ビタミン類、例えばビオチン、パントテン酸カルシウム、葉酸、（ミオ）−イノシトール、ニコチン酸、ｐ−アミノ安息香酸、ピリドキシンＨＣｌ、リボフラビン、チアミンＨＣＬ及びキレート剤、クエン酸、（ｅ）微量金属類、例えばホウ酸、硫酸銅、塩化コバルト、塩化カルシウム、ヨウ化カリウム、硫酸鉄、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、モリブデン酸ナトリウム、及び硫酸亜鉛が含まれる。培地中の成分は、乾燥重量に基づいて定義され得る。さらに、培地は、水系であるか、または「水性」組成物である。培地はまた、そのｐＨ、及び生体適合性酸、塩基、ならびに培地中のｐＨを制御するために使用される緩衝液に関して定義され得る。
【００３７】
１つの実装において、グルコース制限培地中のグルコース含量は、約０ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌまたは０ｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌ、または１ｇ／Ｌ未満の範囲で維持される。例示の態様では、培地中の、酵母ニトロゲンベース、水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウムなどの窒素源の濃度（総量）は、約５ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌの範囲で維持される。例示の態様では、第２の培地中の塩類の濃度（総量）は、硫酸マグネシウム等の塩類は、約０ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌの範囲で、リン酸カリウム等の塩類は、約０ｇ／Ｌ〜約２２ｇ／Ｌの範囲で維持される。例示の態様では、第２の培地中の微量金属類の濃度（総量）は、約０ｇ／Ｌ〜約０．４ｇ／Ｌ、または０ｇ／Ｌ〜約０．２ｇ／Ｌの範囲で維持される。
【００３８】
組成物（「供給組成物」）は、遺伝子操作を受けた酵母を含む培地に添加されて、培地の容量を増加させることができ、培地中の遺伝子操作を受けた酵母が増殖すると、バイオマスの量を増加させることができる。供給組成物は、所望の培地を形成するために、酵母の増殖及び発酵のための成分を含み得る。供給組成物は、炭水化物（複数可）、水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム、またはこれらの任意の組み合わせなどの窒素源、塩類、ビタミン類、及び微量金属類を含み得る。供給組成物中の成分の濃度は、培地中の成分の濃度よりも大きい場合があり、これにより、供給組成物が添加されるとき、これは、遺伝子操作を受けた酵母の発酵に好適な、培地中の成分の所望の量を提供する。
【００３９】
遺伝子操作を受けた酵母の発酵は、任意の植物及び塊茎、根、茎、葉、ならびに種子などの植物部分から抽出できるデンプン及び／または糖含有植物原料を使用して実行され得る。デンプン及び／または糖含有植物原料は、大麦、小麦、トウモロコシ、ライムギ、スルガム、キビ、大麦、ジャガイモ、キャッサバまたは米などの穀物、及びこれらの任意の組み合わせから得ることができる。デンプン含有及び／または糖含有植物原料は、例えば粉砕、麦芽製造、または部分的麦芽製造などの方法によって処理され得る。いくつかの実施形態では、増殖及び／または発酵のための培地は、処理デンプン、例えば、部分的加水分解デンプンを含み得る。部分的加水分解デンプンは、高分子量デキストリン及び高分子量マルトデキストリンを含み得る。ステビオール配糖体の生成に有益な所望の範囲でデンプン及びデンプン分解産物の量を有する部分的加水分解デンプン製品が使用され得る。
【００４０】
任意に、発酵期中に遺伝子操作を受けた酵母によって利用され得るグルコースなどの単糖類の濃度を増加させるために、デンプン分解酵素がデンプン物質を含む培地に添加され得る。例示のデンプン分解酵素には、グルコアミラーゼ及びアミラーゼなどのデンプン分解酵素が挙げられる。
【００４１】
１つの有用な実装において、培地は、遺伝子操作を受けた酵母によって発酵可能な炭水化物を含有するグルコース制限培地であり、グルコース及び／またはフルクトース（すなわち、グルコース、フルクトース、またはグルコース及びフルクトース）の濃度は制限される。グルコース制限培地において、発酵可能な炭水化物は、５０重量％（重量％）未満、好ましくは２０重量％未満、より好ましくは１０重量％未満、または５重量％未満のグルコース及び／またはフルクトースである。グルコース制限培地は、グルコースを実質的に含まなくてもよく、フルクトースを実質的に含まなくてもよく、またはグルコース及びフルクトースの両方を実質的に含まなくてもよい。
【００４２】
グルコース制限培地は、発酵のための主要な炭素源であり得るエタノール制限基質を含む。エタノール制限基質は、ラフィノース、マンノース、トレハロース、ガラクトース、マルトース、グリセロール、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。１つの好ましい実装では、エタノール制限基質は、ラフィノース、マンノース、トレハロース、ガラクトース、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。別の好ましい実装では、前記エタノール制限基質は、ラフィノース、マンノース、トレハロース、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。ある特定の有用な実施形態では、エタノール制限基質は、少なくとも９５重量％のラフィノース、マンノース、またはトレハロースである。
【００４３】
エタノール制限基質は、グルコース制限基質中の発酵可能な炭水化物の少なくとも５０重量％を構成する。エタノール制限基質は、望ましくは、グルコース制限培地中の発酵可能な炭水化物の、少なくとも６０重量％または少なくとも７０重量％、例えば、少なくとも８０重量％、少なくとも９０重量％、または少なくとも９５重量％を構成する。
【００４４】
そのように所望される場合、グルコース制限培地中の発酵可能な炭水化物は、グルコース、フルクトース、ラフィノース、マンノース、トレハロース、ガラクトース、マルトース、及びグリセロール以外の炭水化物を含んでもよい。使用される供給原料に応じて、これらの糖は、例えばキシロース、アラビノース、セロビオース、またはスタキオースを含み得る。
【００４５】
実際のいくつかの任意のモードでは、発酵は、ステビオール含有化合物を含む培地中で実行され得る。このような化合物は、遺伝子操作を受けた酵母中のグルコシルトランスフェラーゼによって直接使用され得る。例えば、任意に、発酵は、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドまたはステビオール−１９−Ｏ−グルコシドを含有する培地中で実行され得る。この培地を使用して、微生物は、機能的ＥＵＧＴ１１、機能的ＵＧＴ７４Ｇ１、機能的ＵＧＴ８５Ｃ２、機能的ＵＧＴ７６Ｇ１、及び機能的ＵＧＴ９１  Ｄ２をコード化する遺伝子を含有及び発現することができる。レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、及びレバウジオシドＭなどの化合物は、この発酵培地から得ることが可能である。別の選択肢として、発酵は、ルブソシドを含有する培地中で実行され得る。この培地を使用して、微生物は、機能的ＥＵＧＴ１１、機能的ＵＧＴ７６Ｇ１、及び機能的ＵＧＴ９１  Ｄ２をコード化する遺伝子を含有及び発現することができる。レバウジオシドＡ、Ｄ、及びＭなどの化合物は、発酵後にこの培地から得ることが可能である。
【００４６】
場合によっては、商業規模の経済的利益及び制御を得るために、発酵は工業用容量の発酵槽で行われる。１つの実施形態では、発酵は、約１０，０００リットル以上の容量を有する発酵槽で行われる。
【００４７】
「第１相」及び「第２相」（ならびに任意に、必要ならば、「前相」、「第３相」、「第４相」、「第５相」など）という用語は、ステビオール配糖体を生成する方法の態様を培地に関して記述するために使用され得る。「期」という用語もまた、「相」に対して使用されてもよい。本プロセスは、プロセスの第２のその後の相において、供給組成物を第１の前の相において供給組成物を添加するモードとは異なるモードで培地に添加することによるなど、培地が各相で異なって処理される２つ以上の相を含む。添加のモードにおける差異は、プロセス中の遺伝子操作を受けた酵母の増殖、及びステビオール配糖体の生成に影響を及ぼす。
【００４８】
第１相（細胞の増殖が、添加の第１のモードによって制御されている）に先立って、細胞は、「前相」に従って培養され得る。前相は、細胞が培地中で増殖され、培地成分（炭水化物、窒素源、塩類、ビタミン類、微量金属類）に順応するようになる「播種／初期増殖期」とすることができる。前相において、細胞への炭水化物の供給は、第１及び第２の相中に行われるようには調節されず、その結果、細胞はそれらの最大の生物学的な速度で増殖し得る。例えば、細胞は前相において、バッチで送り込まれてもよい。細胞が培地に順応するようになると、細胞は増殖期に入り、細胞数を増加させるであろう。前相中に、遺伝子操作を受けた酵母は、酵母分裂と称される出芽によって増殖することができる。
【００４９】
例えば、前相中に、炭水化物（複数可）、酵母ニトロゲンベース、水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム、またはこれらの任意の組み合わせなどの窒素源、塩類、ビタミン類、及び微量金属類を含む増殖組成物が、遺伝子操作を受けた酵母をバッチプロセスで含む培地に添加され得る。実際のいくつかのモードにおいて、組成物は、水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム、またはこれらの組み合わせを唯一の窒素源として有する培地を提供するように添加される。同じ組成物は、細胞の増殖が供給組成物の培地への添加のモードによって制御される、後続の第１相において供給組成物として使用され得る。
【００５０】
急速な細胞増殖及びバイオマスの増加によって特徴付けられる前相の後に、添加の第１のモードに従って、グルコース含有組成物の添加を調節することで、第１相（例えば、工程）が開始することができる。第１相は、供給溶液が培地にどのように添加されるか、及び細胞が添加の種類に応答してどのように増殖するかによるなど、様々な方法で説明され得る。
【００５１】
添加のモードは、遺伝子操作を受けた酵母の倍加時間に影響を及ぼし得る。第１相における倍加時間は、前相における倍加時間よりも長い（よりゆっくりな増殖）。第１の相中に、培地のバイオマスは増加するが、バイオマスは、前相で見られた増加よりも低い速度で増加し得る。第１相はまた、供給溶液が第１のモードとは異なる第２のモードで培地に添加される第２相と比べて、細胞がどのように増殖するかに関して説明することができる。
【００５２】
例えば、第１相では、酵母は、第２の相における増殖を超える第１の範囲内にある１つ以上の増殖速度（複数可）（希釈速度（複数可））を得るような条件下で、培地中で増殖され得る。例えば、播種／増殖期においては、増殖速度は、約０．０６  １／時以上、例えば、約０．０６  １／時〜約０．１７  １／時、または約０．０９  １／時〜約０．１５  １／時の範囲とすることができる。
【００５３】
任意に、第１相は、培地中のグルコース濃度に関して説明することができる。例えば、実際のいくつかのモードにおいて、第１相は、培地中に３ｇ／Ｌ未満のグルコースが存在する時点で開始される。例えば、前相中の培地中のグルコースの量を監視することができ、濃度が３ｇ／Ｌより下に下降したときに、第１相の供給が開始され得る。
【００５４】
第１相における所望の増殖速度は、グルコースを含む組成物を、第１のモードに従って培地に添加することによって達成され得る。「供給のモード」とは、グルコースを含む供給組成物が遺伝子操作を受けた酵母を有する培地に添加される方法を指す。供給のモードは、供給の一定速度、供給の不定速度、供給組成物の連続添加、供給組成物の一括添加などを含む。供給のいくつかのモードでは、供給組成物は、第１相中に供給の不定速度で培地に添加される。例えば、供給の不定速度は、供給の可変速度とすることができる。
【００５５】
供給の可変速度とは、供給溶液の培地への添加の期間にわたって２つ以上の異なる速度で供給溶液を培地に添加することを指す。実際のいくつかのモードでは、可変速度の供給中に、速度は一定時間にわたって減少する。例えば、プロセスの増殖期では、供給は、増殖期の初期段階での供給のより速い速度から、増殖期の後期での供給のより遅い速度まで変化し得る。これは、供給の速度を一定に減少させることによって行うことができるか、または一連のわずかな減分工程によって行うことができる。実際の任意のモードにおいて、供給の可変速度は、供給の速度を増加させて、その後供給の速度を減少させることを含み得る。
【００５６】
供給の可変速度は、可変速度添加システムを使用して達成され得る。このようなシステムの例には、可変速度ポンプ、またはポンプに動作可能に接続された絞り弁（スロットル弁など）が挙げられ、このポンプまたは弁は、発酵培地中に導入される供給組成物の量を経時的に変化させるために利用され得る。
【００５７】
第１相はまた、第１相の時間帯、培地の温度、増殖したバイオマスの量、及び培地のｐＨなどの培地に関連する１つ以上のパラメータに関して説明されてもよい。実際のいくつかのモードでは、供給の可変速度を用いる第１相は、約２時間以上から最長約４０時間の時間帯にわたって行うことができる。例えば、第１相は、約１０時間以上、例えば、約１０時間〜約３０時間、または約１０時間〜約２４時間の範囲の時間帯とすることができる。第１相は、遺伝子操作を受けた酵母の増殖の誘導期の全てまたは一部、増殖の対数（指数的増加）期の全てまたは一部を包含し得る。この期間の後に、グルコースを含む供給組成物の培地への添加のモードは、次に変更され得る（例えば、第２相における供給の一定速度に）。
【００５８】
実際の例示のモードでは、第１相において、培地は、約２５〜３５℃、または２８〜３２℃の範囲の温度で、最も好ましくは約３０℃の温度で維持される。また、遺伝子操作を受けた酵母の増殖は、曝気しながら、かつ攪拌しながら実施され得る。曝気状態は、培地中に溶解された酸素の量、したがって、遺伝子操作を受けた酵母に利用可能な酸素の量に及ぼす効果を有し得る。遺伝子操作を受けた酵母による酸素摂取の量は、酸素が供給される速度によって制御可能であり、培地中の小さな酸素の泡の形成は、攪拌及び／またはスパージングを通して達成され得る。
【００５９】
培地では、また第１相中に、曝気が実施され得る。曝気は、ｍｇ分−１リットル−１の単位での溶存酸素の培地への移動速度の観点で記述されてもよい。曝気はまた、溶存酸素（％）の観点で記述されてもよい。（例えば、Ａｎｄｅｒｌｅｉ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｂｕｃｈｓ，Ｊ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ．Ｊ．３４７８：１−６を参照されたい）。微細な気泡の形成を促進するスパージング技術は、所望の曝気を提供するために実施され得る。実際のいくつかのモードでは、第１相中に、攪拌及び曝気は、段階的なやり方などで増加される。二相式供給プロセスを使用する本開示の方法はまた、所望のステビオール配糖体生成をなお提供しつつ、培地の曝気の必要性を低減することも可能である。実際のいくつかのモードでは、溶存酸素は、１５％超で維持される。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「バイオマス」とは、培地１リットル当たりの乾燥細胞重量のグラム数（ＤＣＷ／Ｌ）で測定され得る、遺伝子操作を受けた酵母の重量を指す。別の例示のパラメータとして、実際のいくつかのモードでは、供給の可変速度を用いる第１相は、少なくとも約５  ｄｃｗ／Ｌのバイオマスの量を生成する。好ましくは、生成されるバイオマスの量は、約５ｇ  ｄｃｗ／Ｌ〜約６０ｇ  ｄｃｗ／Ｌ、約２０ｇ  ｄｃｗ／Ｌ〜約６０ｇ  ｄｃｗ／Ｌ、または約２０ｇ  ｄｃｗ／Ｌ〜約４０ｇ  ｄｃｗ／Ｌの範囲である。
【００６１】
別の例として、実際のいくつかのモードでは、供給の可変速度を用いる第１相は、６．０以下、約５．５未満、好ましくは５．２未満、例えば、約４．０〜約５．２の範囲のｐＨで行われる。第１相中に、ｐＨは、これが所望のより低いｐＨ範囲内、例えば約４．０〜５．２の範囲内に留まるように監視され得る。ｐＨを所望の範囲内で維持するために、酸または塩基が供給中に培地に添加され得る。
【００６２】
第１相後に、遺伝子操作を受けた酵母は、供給組成物を提供するモードが第１相とは異なる「発酵相」などの第２相に入ることができる。第２相では、遺伝子操作を受けた酵母の増殖は、少なくともゆっくりとなり、炭水化物を積極的に同化してステビオール配糖体（複数可）を生成している。本明細書で使用される場合、「発酵」は、完全に好気性、部分的に好気性、または嫌気性条件下で発生し得るステビオール配糖体（複数可）の重要な生成の相を記述するために使用される。部分的好気性条件下では、発酵及び呼吸経路の両方が活性であることができ、一部の細胞増殖が生じてもよい。部分的好気性条件下では、消費される酸素の量は、播種／増殖期中よりも少ない可能性がある。
【００６３】
第２相では、グルコースを有する供給組成物は、第１相とは異なるモードで培地に添加され得る。実際のいくつかのモードでは、第１及び第２相は、同じ容器内で行われ、第１相中に、グルコースを含む供給溶液が、可変速度で容器内の培地に添加され、その後、第２の相では、供給溶液が、同じ容器内の培地に添加されるが、一定速度で添加される。
【００６４】
実際のいくつかのモードでは、第２相において、供給組成物は、一定の供給速度で培地に添加される。例えば、供給の一定速度は、１０ｇのグルコース／１Ｌの培地／時以下であり、好ましくは、２ｇのグルコース／１Ｌの培地／時〜１０ｇのグルコース／１Ｌの培地／時の範囲の供給の一定速度である。
【００６５】
例えば、発酵及びステビオール配糖体の生成を含む第２相では、酵母は、ある範囲内にある１つ以上の増殖速度（複数可）を得るための条件下の培地中で増殖させ得る。例えば、第２相においては、増殖速度（複数可）は、約０．０９  ｌ／時以下、例えば、約０．０１５  ｌ／時〜約０．０９  ｌ／時、または約０．０１５  ｌ／時〜約０．０６  ｌ／時の範囲とすることができる。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）における増殖速度（希釈速度）は、工程（ａ）における最大増殖速度（希釈速度）の５０〜９０％の範囲である。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）における増殖速度（希釈速度）は、工程（ａ）における最大増殖速度（希釈速度）の５０〜１００％の範囲である。
【００６６】
実際のいくつかのモードでは、一定速度を用いる第２相は、ステビオール配糖体の所望の生成を提供するために、一定期間にわたって行うことができる。例えば、第２相は、工程（ａ）の開始から約３０時間またはそれよりも遅い時間で開始することができ、その後、工程（ａ）の開始から最長１３０時間まで実施することができる。第２相は、ステビオール配糖体の大部分が生成される発酵相の全てまたは一部を包含し得る。好ましくは、ステビオール配糖体（複数可）の大部分（すなわち５０％超）は、第２相中に遺伝子操作を受けた酵母によって生成される。二相式供給を含む本開示の方法は、発酵に関して利益を提供し、対照プロセス（例えば、単一相発酵）と比べて、発酵時間の約２５％の短縮、またはさらには最大４０％の短縮を可能にする。
【００６７】
さらに、実際のいくつかのモードでは、第２相においては、供給の一定速度が、遺伝子操作を受けた酵母が、１８０ｇ  ｄｃｗ／Ｌを超えるバイオマス量まで増殖しないように制御され得る。二相式供給を含む本開示の方法は、バイオマス生成に関して利益を提供し、単一相発酵による対照プロセスと比べて、生成されるバイオマスの量の最大約２５％の減少を可能にする。
【００６８】
さらに、実際のいくつかのモードでは、第２相中に、培地は、第１相中の培地におけるｐＨよりも高いｐＨを有し得る。例えば、第２相の開始時に、または第２相中に、ｐＨをより低いｐＨからより高いｐＨに上昇させるために、塩基が培地に添加され得る。塩基は供給組成物中に存在し得るか、または、供給組成物から第２相のために別個に添加され得る。例えば、第２相において、ｐＨは、約ｐＨ５．８以上に、または約ｐＨ６．０以上に、例えば、約ｐＨ５．８〜約ｐＨ７．５以上に、または約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．０の範囲に調整され得る。第２相中に、ｐＨを監視することができ（例えば、周期的に、または継続的に）、ｐＨが所望の範囲から外れる場合には、培地に対する調整を行うことができる。例えば、ｐＨが６．０または５．８より下に下がる場合、ｐＨを約６．０以上に調整するために、水酸化アンモニウムが第２の培地に添加され得る。
【００６９】
実際の例示のモードでは、第２の培地中での発酵及び任意の増殖は、約２５〜３５℃、または２８〜３２℃の範囲の温度で、最も好ましくは約３０℃の温度で行われる。また、第２の培地中での遺伝子操作を受けた酵母の発酵及び任意の増殖は、曝気しながら、かつ攪拌しながら実施され得る。二相式供給プロセスを使用する本開示の方法はまた、所望のステビオール配糖体生成をなお提供しつつ、培地の曝気の必要性を低減することも可能である。
【００７０】
発酵中に、培地をステビオール配糖体の生成について監視することができる。発酵は、所望のステビオール配糖体の総量及び特性が存在する時点で停止され得る。
【００７１】
「総ステビオール配糖体」とは、液体培地中にあり、遺伝子操作を受けた酵母から得られるステビオール配糖体の量を含む、一定時間の発酵の後に培地中に存在する全てのステビオール配糖体を指す。ステビオール配糖体含量は、培地中の総ステビオール配糖体量に関して表され得るか、または培地中の１つ以上ではあるが、全てではないステビオール配糖体の量に関して表され得る。組成物中のステビオール配糖体の量は、互いに関連して、またはステビオール配糖体の総量に関連して表すことができ、例えば、ステビオール配糖体の総量の重量パーセント、または比、もしくは比の範囲で、重量パーセントとして、またはモルパーセントとして表される。ステビオール配糖体の量はまた、供給の第１及び第２期を含まないプロセスによって調製された対照試料などの対照試料に対して表され得る。
【００７２】
実際のいくつかのモードでは、本開示の方法は、レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭなどの、ある特定のステビオール配糖体の生成で改良を提供する。
【００７３】
本開示の方法は、発酵中にステビオール配糖体の生成速度における改良を提供し得る。例えば、本明細書に記載される第１及び第２相の方法で増殖及び発酵される遺伝子操作を受けた酵母は、対照プロセスで増殖及び発酵される遺伝子操作を受けた酵母株のステビオール配糖体生成の速度に対して、約１％以上、約２％以上、約３％以上、及び最大で約１５％もしくは約１２％であるステビオール配糖体生成の速度における増加を示すことができる。
【００７４】
本開示による相的供給は、ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの生成ならびに増加した生成速度、短縮した発酵時間及び低減したバイオマス濃度をもたらし得る。
【００７５】
発酵がステビオール配糖体（複数可）を生成する第２相の後に、１つ以上のステビオール配糖体（複数可）を含有する組成物を、様々な技術を使用して、培地から得ることができる。いくつかの実施形態では、透過化剤などの化合物が培地に添加され、ステビオール配糖体の細胞から培地への除去を向上させることができる。
【００７６】
次いで、培地は遠心分離または濾過され、遺伝子操作を受けた細胞を除去することができる。培地は、任意に、低分子量成分（グルコース、塩基性栄養素、及び塩類）を、例えば膜透析によって、除去するために処理され得る。所望の使用に応じて、１つ以上のステビオール配糖体化合物（複数可）を含む組成物が使用され得る。
【００７７】
発酵後に、遺伝子操作を受けた酵母は、ステビオール配糖体の回収を向上させるために、任意に、熱処理法を使用して処理され得る。発酵の後ではあるが、任意の熱処理の前に、所望のステビオール配糖体の大部分が遺伝子操作を受けた酵母内にある状態で、培地は準最適量のステビオール配糖体を含有する場合がある。ステビオール配糖体の回収を増加させるために、実際のいくつかのモードにおいて、遺伝子操作を受けた酵母を発酵させたより高いｐＨにある培地などの組成物が、５０℃〜９５℃、または７０℃〜９５℃の範囲の温度に、５分〜４８時間の範囲の時間にわたって加熱される。
【００７８】
ステビオール配糖体を有する組成物を富化もしくは精製形態で提供することが望ましい場合、またはある特定のステビオール配糖体が互いに分離されている場合、さらなる精製を行うことができる。ステビオール配糖体成分のこのような富化または精製は、発酵が行われた培地で行うことができるか、または培地はその後、精製の前によく乾燥され得る。例えば、培地は、凍結乾燥を使用してよく乾燥され、その後処理され得るステビオール配糖体を含む乾燥組成物（例えば、粉末またはフレーク）を形成することができる。
【００７９】
本明細書で使用される場合、用語「総ステビオール配糖体」（ＴＳＧ）は、乾燥（無水）重量基準で、組成物中の全ステビオール配糖体の含量の和として算出されるものである。
【００８０】
実際のいくつかのモードにおいて、ステビオール配糖体が富化された乾燥発酵ブロスは、精製の出発物質として使用される。例えば、溶媒または溶媒の組み合わせが乾燥発酵ブロスに添加され、ステビオール配糖体を含む材料を溶解または懸濁させることができる。ステビオール配糖体を溶解させるための例示の組み合わせは、水とアルコールとの混合物（例えば、５０：５０のエタノール：水）である。溶解または懸濁を容易にするために、乾燥ブロス材料を、４０℃〜６０℃の範囲などの室温を超える温度で加熱することができる。乾燥ブロス材料の、超音波処理などの機械的破壊も行うことができる。溶解または懸濁されたブロス材料は、分取クロマトグラフィーによるなどのさらなる精製の前に、マイクロメートルまたはサブマイクロメートルのフィルターで濾過することができる。
【００８１】
ステビオール配糖体化合物が富化された乾燥発酵ブロスは、逆相液体クロマトグラフィーによるなどの精製を受けることができる。好適な樹脂を用いて、ステビオール配糖体化合物をカラム内に保持することができ、同時に洗浄されてカラムを通り抜ける親水性化合物の除去が、水などの液体で行われる。ステビオール配糖体のカラムからの溶出は、アセトニトリルまたはメタノールなどの好適な溶媒または溶媒の組み合わせによって達成され得る。
【００８２】
ステビオール配糖体の逆相カラムからの溶出は、様々な目的のうちのいずれか１つに有用であり得る組成物をもたらし得る。例えば、精製されたステビオール配糖体組成物は、経口摂取または経口使用のための甘味料組成物として使用され得る。本組成物は、組成物中のステビオール配糖体に関して定義され得る。
【００８３】
ステビオール配糖体を産生するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、ＷＯ２０１１／１５３３７８、ＷＯ２０１３／０２２９８９、ＷＯ２０１４／１２２２２７、及びＷＯ２０１４／１２２３２８に記載される方法を用いて構築され、これらのそれぞれが、その全体において参照により組み込まれる。以下の配列を、親株（ＥＦＳＣ  ３８４１）の構築に使用した：Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ  ＧＧＰＰＳポリペプチド（配列番号１）をコード化する組換え遺伝子、短縮型Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ＣＤＰＳポリペプチド（配列番号２）をコード化する組換え遺伝子、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＫＳポリペプチド（配列番号３）をコード化する組換え遺伝子、組換えＳ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＫＯポリペプチド（配列番号４、配列番号５）をコード化する組換え遺伝子、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＲ２ポリペプチド（配列番号６、配列番号７）をコード化する組換え遺伝子、Ｏ．ｓａｔｉｖａ  ＥＵＧＴ  １１ポリペプチド（配列番号８）をコード化する組換え遺伝子、ＳｒＫＡＨｅ１ポリペプチド（配列番号９、配列番号１０）をコード化する組換え遺伝子、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＣＰＲ８ポリペプチド（配列番号１１、配列番号１２）をコード化する組換え遺伝子、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド（配列番号１３）をコード化する組換え遺伝子、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド（配列番号１４）をコード化する組換え遺伝子、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド（配列番号１５）をコード化する組換え遺伝子、及びＳ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ９１Ｄ２変異体（または機能的相同体）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ、（配列番号１６）ポリペプチド生成ステビオール配糖体をコード化する組換え遺伝子。
【００８４】
ＵＧＴ９１Ｄ２のＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ変異体（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１からは配列番号５）は、２１１位のロイシンのメチオニンへの置換及び２８６位のバリンのアラニンへの置換を含む。（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１の表１２及び実施例１１に記載されるＴ１４４Ｓ、Ｍ１５２Ｌ、Ｌ２１３Ｆ、Ｓ３６４Ｐ、及びＧ３８４Ｃ変異体以外の追加の変異体が使用され得る。）アミノ酸修飾Ｌ２１１Ｍ及びＶ２８６Ａを有するＳ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂをコード化するＧｅｎｅＡｒｔコドン最適化配列（アミノ酸配列については配列番号１６に、コドン最適化ヌクレオチド配列は配列番号１７に記載される）。
【００８５】
株ＥＦＳＣ  ４２４０は、上述した親株に由来し、さらに、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａからのコドン最適化ＣＰＲ１を含む（アミノ酸配列番号１９に対応する配列番号１８）。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本開示の好適な方法は、下記に記載される様々な実施形態において例証及び例示される。
【００８７】
本発明は、概して、遺伝子操作を受けた酵母を使用するステビオール配糖体の生成方法、ならびに発酵組成物、及び１つ以上のステビオール配糖体を含む発酵生成物に関する。本開示の発酵条件は、以下のうちの１つ以上を促進し得る：遺伝子操作を受けた酵母からのステビオール配糖体力価の増加、ステビオール配糖体生成速度の増加を含む細胞活性の増加、発酵時間の短縮、及びバイオマス濃度の低下。例示の実施形態では、本方法は、例えばレバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢなどのステビオール配糖体の生成に使用され得る。
【００８８】
本発明の一実施形態は、ステビオール配糖体（複数可）の生成方法を提供し、本方法は、遺伝子操作を受けた酵母の増殖及び発酵に関与する少なくとも工程（ａ）及び（ｂ）を含む。工程（ａ）（すなわち、第１相）において、１つ以上のステビオール配糖体（複数可）を生成することができる遺伝子操作を受けた酵母が、第１の範囲内の１つ以上の増殖速度（複数可）（希釈速度（複数可））で、培地中で増殖される。また工程（ａ）では、グルコースを含む組成物が、酵母を第１の範囲内で増殖させる第１のモードに従って、培地に添加される。工程（ｂ）（すなわち、第２相）では、遺伝子操作を受けた酵母が発酵されて、１つ以上のステビオール配糖体（複数可）を生成し、ここでは、グルコースを含む組成物が、第１のモードとは異なる第２のモードに従って培地に添加される。工程ｂ）中に、第２のモードに従って添加することが、酵母を第１の範囲を下回る第２の範囲内の１つ以上の増殖速度（複数可）（希釈速度（複数可））で増殖させる。
【００８９】
例示の方法では、酵母は、工程（ａ）において、約０．０６  ｌ／時〜約０．１５  ｌ／時の範囲の増殖速度を有し、工程（ｂ）において、約０．０１５  ｌ／時〜約０．０９  ｌ／時の範囲の増殖速度を有する。工程（ａ）から工程（ｂ）への増殖速度の変化は、グルコース含有組成物の培地への添加の速度を変更すること、またはグルコース含有組成物が培地に添加されるやり方を変更すること、例えば、工程（ａ）では供給の不定速度を提供し、その後、工程（ｂ）では供給の一定速度を提供することによるなど、添加の「モード」の変化によって生じさせることができる。
【００９０】
別の例示の方法では、遺伝子操作を受けた酵母は、工程（ａ）では５ｇ  ｄｃｗ／Ｌ〜６０ｇ  ｄｃｗ／Ｌの範囲のバイオマスの量まで増殖され、次いで、工程（ｂ）では、１５０ｇ  ｄｃｗ／Ｌを超えないバイオマスの量まで増殖される。
【００９１】
本発明はまた、本開示の方法により得られたステビオール配糖体（複数可）を含む発酵培地、及びさらには発酵培地から得られるステビオール配糖体組成物も提供する。
【００９２】
番号を付けられ以下に記載された本発明の追加の実施形態は、下記を含む。
１．ステビオール配糖体（複数可）の生成方法であって、
（ａ）１つ以上のステビオール配糖体（複数可）を生成することができる遺伝子操作を受けた酵母を培地中で増殖させる工程であって、遺伝子操作を受けた酵母が、第１の範囲内の１つ以上の増殖速度（複数可）（希釈速度（複数可）で増殖され、グルコースを含む組成物が、第１のモードに従って培地に添加される、増殖させる工程と、
（ｂ）遺伝子操作を受けた酵母を発酵させて、１つ以上のステビオール配糖体（複数可）を生成する工程であって、発酵中に、グルコースを含む組成物が、第１のモードとは異なる第２のモードに従って培地に添加され、発酵中に、酵母が第２の範囲内の１つ以上の増殖速度（複数可）（希釈速度（複数可））で増殖し、第２の範囲が第１の範囲を下回る、発酵させる工程と、を含む方法。
２．工程（ａ）において、増殖速度（希釈速度）が、０．０６  ｌ／時以上である、実施形態１に記載の方法。
３．工程（ａ）において、第１の範囲が、０．０６  ｌ／時〜０．１７  ｌ／時である、実施形態２に記載の方法。
４．工程（ａ）において、第１の範囲が、０．０９  ｌ／時〜０．１５  ｌ／時である、実施形態３に記載の方法。
５．工程（ｂ）において、増殖速度（希釈速度）が、０．０９  ｌ／時未満である、実施形態１に記載の方法。
６．工程（ｂ）において、第２の範囲が、０．０１５  ｌ／時〜０．０９  ｌ／時である、実施形態５に記載の方法。
７．工程（ｂ）において、第２の範囲が、０．０１５  ｌ／時〜０．０６  ｌ／時である、実施形態６に記載の方法。
８．工程（ｂ）における増殖速度（希釈速度）が、工程（ａ）における最大増殖速度（希釈速度）の５０〜１００％の範囲である、実施形態１に記載の方法。
９．工程（ａ）において、グルコースを含む組成物が、供給の不定速度である第１のモードに従って、培地に添加される、実施形態１に記載の方法。
１０．工程（ｂ）において、グルコースを含む組成物が、供給の一定速度である第２のモードに従って、培地に添加される、実施形態１に記載の方法。
１１．供給の一定速度が、１０ｇのグルコース／１Ｌの培地／時以下である、実施形態１０に記載の方法。
１２．供給の一定速度が、２ｇのグルコース／１Ｌの培地／時〜１０ｇのグルコース／１Ｌの培地／時の範囲である、実施形態１１に記載の方法。
１３．工程（ａ）において、グルコースを添加する第１のモードを変更して、遺伝子操作を受けた酵母の増殖速度を低下させる１つ以上のサブステップを含む、実施形態１に記載の方法。
１４．工程（ｂ）において、塩基が添加されて、工程（ａ）における培地のｐＨよりも高いｐＨを有する培地を提供する、実施形態１に記載の方法。
１５．工程（ｂ）において、培地のｐＨが、６．０以上である、実施形態１４に記載の方法。
１６．工程（ａ）が、培地中に３ｇ／Ｌ未満のグルコースが存在する時点で開始される、実施形態１に記載の方法。
１７．工程（ａ）が、工程（ａ）の開始時間から最長４０時間まで実施される、実施形態１６に記載の方法。
１８．工程（ｂ）が、工程（ａ）の開始から３０時間またはそれ以降の時間で実施される、実施形態１６に記載の方法。
１９．工程（ｂ）が、遺伝操作を受けた酵母の初期培養から最長１３０時間まで実施される、実施形態１に記載の方法。
２０．工程（ａ）において、遺伝子操作を受けた酵母が、少なくとも５ｇ  ｄｃｗ／Ｌのバイオマス量まで増殖される、実施形態１に記載の方法。
２１．工程（ａ）において、遺伝子操作を受けた酵母が、２０ｇ  ｄｃｗ／Ｌ〜６０ｇ  ｄｃｗ／Ｌのバイオマス量まで増殖される、実施形態２０に記載の方法。
２２．工程（ｂ）において、遺伝子操作を受けた酵母が、１８０ｇ  ｄｃｗ／Ｌを超えるバイオマス量までは増殖しない、実施形態１に記載の方法。
２３．遺伝子操作を受けた酵母を含む種培地を提供する工程をさらに含み、種培地が、工程（ａ）の第１の培地を形成するために使用される、実施形態１〜２２のいずれかに記載の方法。
２４．工程（ｂ）において、第２の培地が、グルコース、窒素源、カリウム源、マグネシウム源、リン酸源、マグネシウム源、微量金属類、ビタミン類、及び消泡剤を含む、実施形態１〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．１つ以上のステビオール配糖体（複数可）が、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、またはレバウジオシドＭ及びレバウジオシドＤの両方を含む、実施形態１〜２４のいずれかに記載の方法。
２６．遺伝子操作を受けた酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、及びＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの種からなる群から選択される、実施形態１〜２５のいずれかに記載の方法。
２７．遺伝子操作を受けた酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、実施形態２６に記載の方法。
２８．遺伝子操作を受けた酵母が、酵母に対して異種の以下のタンパク質：ＧＧＰＰＳポリペプチド、ｅｎｔ−コパニル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）ポリペプチド、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチド、カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチド、ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ）ポリペプチド、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド、ＵＧＴ９１  Ｄ２ポリペプチド、及びＥＵＧＴ１１ポリペプチドのうちの１つ以上をコード化する１つ以上の外因性核酸（複数可）を発現する、実施形態１〜２７のいずれかに記載の方法。
２９．遺伝子操作を受けた酵母が、酵母に対して異種の以下のタンパク質：ＧＧＰＰＳポリペプチド、短縮型Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ＣＤＰＳポリペプチド、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＫＳポリペプチド、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＫＯポリペプチド、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＲ２ポリペプチド、Ｏ．ｓａｔｉｖａ  ＥＵＧＴ  １１ポリペプチド、ＳｒＫＡＨｅ１ポリペプチド、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＣＰＲ８ポリペプチド、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＵＧＴ９１Ｄ２変異体または機能的相同体、及びＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチドのうちの１つ以上をコード化する１つ以上の外因性核酸（複数可）を発現する、実施形態１〜２８のいずれかに記載の方法。
３０．実施形態１〜２９のいずれかに記載の方法により得られたステビオール配糖体を含む発酵培地。
３１．実施形態１〜２９のいずれかに記載の方法により得られたステビオール配糖体組成物。
３２．工程（ａ）中に、グルコース濃度が、培地中で５ｇ／Ｌ以下である、実施形態１に記載の方法。
３３．工程（ａ）中に、グルコース濃度が、培地中で５ｇ／Ｌ以下である、実施形態３２に記載の方法。
３４．工程（ｂ）中に、グルコース濃度が、培地中で５ｇ／Ｌ以下である、実施形態１に記載の方法。
３５．工程（ｂ）中に、グルコース濃度が、培地中で５ｇ／Ｌ以下である、実施形態３４に記載の方法。
【００９３】
同時糖化発酵（ＳＳＦ）を使用して、グルコース放出を制限し、かつグルコースレベルをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属などの酵母において発酵を刺激するものよりも低いレベルで維持する、ステビオール配糖体の生成方法も開示される。このアプローチは、通常、ポリマー形態の糖類（例えば、デンプン、デキストリン、セルロース、キシラン）を発酵基質として使用する。いくつかの実施形態では、炭素源は多糖類（例えば、１０超のモノマー、オリゴ糖（例えば、１０未満のモノマー）またはこれらの組み合わせである。
【００９４】
酵母は通常、ポリマー糖を効率的に消費しないために、酵素が添加され、ポリマーをグルコースモノマーに分解してもよい。ＳＳＦの名称が示唆するように、糖のモノマーへの分解、糖化、及びモノマーの発酵は、同時に、通常は同じ反応容器内で起こる。
【００９５】
一実施形態では、ＳＳＦは、デンプン及びグルコアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３）を使用し得る。他の実施形態では、セルロース加水分解物及びセルラーゼが使用される。他の実施形態は、イソマルトース、マルトース、パノース、マルトトリオースを含む。
【００９６】
実施例は、ＳＳＦ系を作成するためにマルトデキストリン（４〜７個のグルコース分子のグルコース鎖、Ｓｉｇｍａ  ４１９６９９）及びα−アミラーゼ（製品番号及びＥＣ番号３．２．１．１）を使用することを示している。このアプローチは、工業用エタノール生産おいて一般的ではあるが、通常、酵母細胞塊及びバイオマス誘導製品の生産で使用されない。さらに、エタノールを生成することができる酵母において必要とされる酵素の投入量は、ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭなどのステビオール配糖体を生成することができる酵母において著しく異なる。このプロセスは、酵素の添加を通して、またはステビオール配糖体を生成することができる酵母へのグルコアミラーゼを遺伝子操作することによって行われてもよい。いくつかの実施形態では、セルロース加水分解物及びセルラーゼが提供されてもよい。
【００９７】
糖化酵素は、Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６６：５０６−５７７，２００２）で概説されている。少なくとも１つの酵素が使用されてもよく、通常、１つ以上のグリコシダーゼを含む糖化酵素コンソーシアム（ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）が使用されてもよい。グリコシダーゼは、二糖類、オリゴ糖類、及び多糖類のエーテル結合を加水分解し、一般群の酵素分類ＥＣ  ３．２．１  ．ｘ  （Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、これと共にＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １（１９９３）、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ２（１９９４）、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３（１９９５）、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ４（１９９７）及びＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ５［それぞれ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３：１−５，１９９４；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３２：１−６，１９９５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３７：１−５，１９９６；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０：１−６，１９９７；及びＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６４：６１０−６５０  １９９９中］）で見られる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、開示されたＳＳＦは、特定の増殖時間期間中に、実質的にエタノールを生成しなくともよい。他の実施形態では、開示されたＳＳＦは、増殖時間期間全体で、実質的にエタノールを生成しなくともよい。他の実施形態では、ＳＳＦプロセスによって生成されるエタノールは、特定の増殖時間期間中に、１０ｇ／Ｌ未満のエタノールである。他の実施形態では、ＳＳＦプロセスによって生成されるエタノールは、増殖時間期間中の任意の時点において、１０ｇ／Ｌ未満のエタノールである。
【００９９】
非発酵性炭素源（すなわち、非グルコース炭素源）を使用するステビオール配糖体の生成方法も開示される。非発酵性炭素源は、クラブツリー効果の誘因とならないか、または低下させる供給源である。例えば、酵母がより高いグルコース濃度で増殖される場合、酵母は、高通気条件下であっても、好気性代謝経路からエタノールを生成する嫌気性代謝に切り替えることができる。このシフトは、目的が所望の産物の生成のために相当数の酵母細胞を生成することになっているならば、酵母を繁殖させるときには、通常は望ましくない。高通気条件下であっても、繁殖培地中のグルコース濃度が、例えば約５ｇ／Ｌを超える場合、酵母、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、時にはエタノールを作り出すことを開始し得る（発酵性経路）。これは、「クラブツリー」効果として知られている（高グルコースによる呼吸の抑制）。十分な酸素が存在しないとき、代謝はまた、発酵性経路にシフトしてもよい。
【０１００】
クラブツリー効果を回避または低下させる助けとなるために、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、多くの場合、グルコースレベルが、代謝が好気性のままでいるのに十分低く維持されることを支援するために、グルコース供給が緊密に監視された状態で、十分に曝気された酵母繁殖用タンク内で酵母供給元によって増殖される（通常は、糖蜜原料が流加プロセスで使用される）。
【０１０１】
例示の非発酵性炭素源には、トレハロース、マルトース、ガラクトース、マンノース、グリセロール、及びラフィノース、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、非発酵性炭素源上の増殖は、ステビオール配糖体の細胞外放出を増加させる。他の実施形態では、トレハロース炭素源上の増殖は、ステビオール配糖体の細胞外放出を増加させる。
【０１０２】
実施例１
二相式供給プロセスにおけるＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの生成
接種調製液については、酵母株ＥＦＳＣ４２４０を、１リットルの振盪フラスコ内の１５０ｍｌの種フラスコ培地中で、２５０ｒｐｍ及び３０℃で２０〜２４時間培養した。
【表１】
2018521680.tif 000003
【０１０３】
発酵については、７５ｍｌの種培地を、表２において見られる初期発酵培地中に、０．７５リットルの初期容量（３８．５％のタンクレベル）で移した。流加発酵を、２ＬのＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  ＢｉｏＦｌｏ３１０発酵槽で行った。発酵を、１２％のＮＨ４ＯＨを用いてｐＨ５．０で制御し、全体を通して温度を３０℃に維持した。空気流量は、１．７５ＳＬＰＭであって、攪拌速度は、発酵全体を通して１２００ｒｐｍであった。
【０１０４】
グルコース濃度を、発酵供給培地の流量を制御することによって、制限状態で維持した。二相式供給計画は、ｕ＝０．１２  ｌ／時以上の増殖速度で１２時間目に開始する初期指数増殖期（供給第Ｉ相）を伴い、一方供給第ＩＩ相は、一定の流量で３５〜３９時間の範囲で開始した。第ＩＩ相の供給は、１４．４〜２２．９６ｇのグルコース／１Ｌのブロス／時の範囲の一定供給を伴った。１．０リットルの発酵供給培地が送達されるまで、供給を続けた。消泡剤Ｉｖａｎｈｏｅ  １１６３Ｂを、供給培地に１．３ｇ／Ｌで添加し、５重量％の消泡剤溶液の追加のボーラス付加量を、必要に応じて添加した。
【０１０５】
培地は、Ｖｅｒｄｕｙｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｖｅｒｄｕｙｎ  Ｃ，Ｐｏｓｔｍａ  Ｅ，Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓ  ＷＡ，ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ  ＪＰ．Ｙｅａｓｔ．１９９２  Ｊｕｌ；８（７）：５０１−１７）に基づき、表２及び３に記載される修正を加えた。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表３】
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【表４】
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【０１０６】
実施例２
異なる炭素源を使用するＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの生成
基本培地組成物を表５のレシピを使用して調製した。基本培地を使用して、マルトースのみの培地、トレハロースのみの培地、グルコースのみの培地、ガラクトースのみの培地、マンノースのみの培地、グリセロールのみの培地、及びラフィノースのみの培地をさらに調製した。各糖基質についての濃度は１００ｇ／Ｌであった。各培地をｐＨ５．６に調整し、０．２μｍのフィルターを通して無菌濾過した。２５０ｍｌのフラスコ当たり２０ｍｌの培地を使用した。ｐＨを、ＫＯＨまたはＨ２ＳＯ４のいずれかを使用して調整した。
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表６】
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【０１０７】
実施例１で使用した酵母培養（４２４０）を、グリセロール保存培養物（２０体積／体積％のグリセロール）から開始した。保存培養物を使用して、上述したグルコースのみの培地を含有するフラスコに接種した。インキュベーションを、２５０ｍｌのフラスコ中の５０ｍｌの培地を用いて、３０℃、２５０ｒｐｍで行った。２４時間後に、この種フラスコは、２ｇ／ｌの細胞密度に達し、残留グルコースが残った。この培養物を遠心機で遠心分離し（４０００ｒｐｍで５分間）、細胞をペレット状にした。ブロスをデカントし、細胞を無菌Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄｓリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で１回洗浄し、遠心分離及びデカントを繰り返して、残留グルコースを除去した。細胞を無菌Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄｓリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中に懸濁させて、４ｇ／ｌの細胞密度にした。この細胞懸濁液１ｍｌを使用して、生成フラスコに接種した（５％の接種材料）。
【０１０８】
生成フラスコを、８０％に加湿した振盪器中で、３０℃、２５０ｒｐｍでインキュベートした。培養物において少なくとも１０のＯＤ６００（Ｇｅｎｅｓｙｓ  ２０分光光度計）に達したときに、ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの分析用にフラスコを回収した。この仕様について決定された細胞乾燥重量変換係数に対して既知のＯＤを使用したところ、これは、およそ７．５ｇ／ｌ細胞に相当する。このＯＤが１２０時間以内に到達しない場合、フラスコを１２０時間で停止させて、この時点で分析を行った。
【表７】
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【０１０９】
表７は、正規化されたＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの生成及び速度を示す。正規化された生成は、実験条件におけるＲｅｂＤ及びＲｅｂＭを１００ｇ／ｌグルコース条件で割ることによって算出される。
【０１１０】
これらのデータは、エタノール制限基質（すなわち、これらの実施例ではマンノース、ラフィノース、マルトース、ガラクトース、トレハロース、またはグリセロール）を含有するグルコース制限培地が、ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭ生成においてグルコースよりも良好に働くことを示している。容積生産量は、マンノース、ラフィノース、ガラクトース及びトレハロースで最も高かった。比生産は、マンノース、ラフィノース、トレハロース及びグリセロールで最も高かった。マンノース、ラフィノース、及びトレハロースは、比生産がそれぞれグルコースのものの５、７．２、及び９．６倍の状態で、特に優れていた。
【０１１１】
実施例３
異なる炭素源を使用するＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの生成
前の実施例のように、基本培地組成物を、表５のレシピを使用して調製した。この基本培地を使用して、グルコースのみの培地、マルトースのみの培地、フルクトースのみの培地、ラフィノースのみの培地、ガラクトースのみの培地、及びマンノースのみの培地をさらに調製した。各糖基質についての濃度は１００ｇ／Ｌであった。各培地をｐＨ５．６に調整し、０．２μｍのフィルターを通して無菌濾過した。２５０ｍｌのフラスコ当たり２０ｍｌの培地を使用した。ｐＨを、ＫＯＨまたはＨ２ＳＯ４のいずれかを使用して調整した。
【０１１２】
異なるステビオールを生成するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（４４６６）の酵母培養を、グリセロール保存培養物（２０体積／体積％のグリセロール）から開始した。保存培養物を使用して、上述したグルコースのみの培地を含有するフラスコに接種した。インキュベーションを、２５０ｍｌのフラスコ中の５０ｍｌの培地を用いて、３０℃、２５０ｒｐｍで行った。２４時間後に、この種フラスコは、１ｇ／ｌの細胞密度に達し、残留グルコースが残った。この培養物を遠心機で遠心分離し（４０００ｒｐｍで５分間）、細胞をペレット状にした。ブロスをデカントし、細胞を無菌Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄｓリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で１回洗浄し、遠心分離及びデカントを繰り返して、残留グルコースを除去した。細胞を無菌Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄｓリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中に懸濁させて、４ｇ／ｌの細胞密度にした。この細胞懸濁液０．５ｍｌを使用して、生成フラスコに接種した（２．５％の接種材料）。
【０１１３】
生成フラスコを、８０％に加湿した振とう器中で、３０℃、２５０ｒｐｍでインキュベートした。フラスコを、１１８時間目にＲｅｂＤ及びＲｅｂＭについて回収した。ＯＤ６００も１１８時間目に測定した（Ｇｅｎｅｓｙｓ  ２０分光光度計）。既知のＯＤに対する細胞乾燥重量変換係数を使用して、各ＯＤ単位を０．７５ｇ／ｌ細胞に変換する。
【０１１４】
ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの分析を、全細胞ブロス、無細胞上清、及び洗浄細胞で行った。無細胞試料については、１００μＬの全ブロスを１．４ｍｌの精製水と混合し、微量遠心機で１０，０００ｒｐｍにて３分間遠心分離した。分析前に、この洗浄を３回繰り返した。得られた洗浄細胞を洗浄細胞分析に使用した。第１の遠心分離物からの上清を、以下に細胞外分析として列記されている、無細胞上清の分析用に使用した。
【０１１５】
表３−１は、ｇ／Ｌ、全ブロス、細胞外無細胞上清、及び洗浄細胞ペレット中のＲｅｂＤ、ＲｅｂＭの含有量、ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの合計（以下にはＲｅｂＤ＋Ｍと表示）を示す。このデータは、各条件について繰り返し行われたフラスコの平均値である。細胞外％は、細胞外のｇ／ｌを全ブロスのｇ／ｌで割ることによって算出される。表３−２は、ｍｇ／Ｌ／時に関して正規化されたＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの生成を示し、表３−３は、ｍｇ／ｇ／時に関して正規化されたＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの生成を示す。
【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【０１１６】
表７に示した結果と一致して、ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの総生産は、マンノース、ラフィノース、及びガラクトースで最高であった。ラフィノースは、グルコースに対して１０倍を超えるＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの総生産で驚くべき生産性であった。これは、表７に示したラフィノースについての８．１の非常に高い正規化された生産を確認し、またさらにはこれを超えるものである。マンノースも、グルコースに対して２．５倍を超えるＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの総生産で優れていた。
【０１１７】
細胞外ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの比率は、基質マルトース、ラフィノース及びマンノースの上で著しく増加し、ラフィノース及びマンノースの両方共に、総ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの６０％を超えるものを細胞外に有した。商業的には、細胞を溶解して、ステビオール配糖体を他の細胞内成分の全てから単離させるよりもむしろ、細胞外ステビオール配糖体を精製する方が非常に容易であり得る。商業生産者は、細胞内ステビオール配糖体を細胞内に放出させて、バイオマスを大幅に低いマージンで供給成分として販売することを選択することができる。したがって、ＲｅｂＤに加えてＲｅｂＭの比率を、グルコースの場合の４６．９％からラフィノースの場合の６１．３％、及びマンノースの場合の６３．９％まで増加させることは、有効収率を、ラフィノースでは３０％（６１．３／４６．９）を超えるまで、またマンノースでは３６％（６３．９／４６．９）を超えるまで増加させる。これは、ラフィノース及びマンノースによるより高い総生産と組み合わされて、ラフィノースについてはグルコースの１４倍の、マンノースについてはグルコースの３．４倍のＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭの細胞外生成の結果をもたらした。
【０１１８】
実施例４
同時糖化発酵を使用するＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの生成
培地を、表８のレシピを使用して、表５からの微量元素及びビタミン類と共に調製した。マルトデキストリンは、可溶化させるために培地を穏やかに加熱する（６０℃）必要があった。室温に冷却した培地を、ｐＨ５．６に調整し、培地の冷却及び０．２μｍのフィルターを通しての無菌濾過の後に、ビタミン及び微量元素の添加を行った。２５０ｍｌのフラスコ当たり２０ｍｌの培地を使用した。ｐＨを、ＫＯＨまたはＨ２ＳＯ４のいずれかを使用して調整した。
【０１１９】
酵母培養物（４２４０）酵母をグリセロール保存培養物（２０体積／体積％のグリセロール）から開始した。この保存培養物を用いて、２０ｇ／Ｌのデキストロースを含有する表５に記述した培地を含むフラスコに接種した。インキュベーションを、２５０ｍｌのフラスコ中の２０ｍｌの培地を用いて、３０℃、２５０ｒｐｍで行った。２４時間後に、この種フラスコは、２ｇ／ｌの細胞密度に達し、残留グルコースが残った。この細胞懸濁液１ｍｌを使用して、生成フラスコに接種した（５％の接種材料）。接種の直前に、α−アミラーゼを、表９に詳説した用量で培地に添加した。
【０１２０】
接種材料を含むフラスコを、８０％に加湿した振盪器中で、３０℃、２５０ｒｐｍでインキュベートした。培養物を含むフラスコを、１２０時間において、ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの分析用に回収した。
【０１２１】
正規化された生成は、実験試料におけるＲｅｂＤ及びＲｅｂＭを、２００ｇ／ｌのデキストロースを含む酵素を添加していない試料（ｇ当量の糖）で割ることによって算出される。これらのデータは、グルコースのみを使用するものと比べて、ＳＳＦプロセスを使用しての６〜１３倍高いＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの生成を示している。
【表９】
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【表１０】
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【０１２２】
実施例５
培地：各振盪フラスコは、２％の酵母抽出物及び２％の炭素源、１×微量鉱物ならびに１×塩類を含有した。培地のｐＨをＮａＯＨで５．１に調整し、１２１℃で３０分間加圧滅菌処理した。
【０１２３】
種フラスコ：１バイアルのグリセロール保存液を用いて、１００ｍｌのグルコース培地を含有する５００ｍｌのバッフル付き振盪フラスコに接種した。振盪フラスコを、激しく混合しながら（２５０ｒｐｍ）３０℃で２４時間増殖させた。１０ｍｌの種培養物を用いて、様々な炭水化物を含有する５０ｍｌの基本培地を含む３００ｍｌのバッフル付き振盪フラスコに接種した。
【０１２４】
種培養物は、生成フラスコに移す前に、以下のプロファイルを有する：６００ｎｍにおけるＯ．Ｄ．＝２７．２、０ｇ／Ｌのグルコース、９ｇ／Ｌのエタノール、２．４ｇ／Ｌのグリセロール、及び０．２５ｇ／Ｌの酢酸塩。
【０１２５】
生成フラスコ：各条件を二通りで行った。生成フラスコを、２５０ｒｐｍに設定した振盪培養器中で、３０℃でインキュベートした。２４時間後、４６時間後、及び１１０時間後に、５ｍｌの試料を採取した。ブロスを脱イオン水で１：２００に希釈した後に、細胞密度を６００ｎｍにおける光学密度によって概算した。ブロスは、０．４５μｍのフィルターを通して濾過してから、ＨＰＬＣ分析に使用した。ブロスを等量の８０体積／体積％のＤＭＳＯと混合し、密閉ガラスバイアル中で、８０℃で３０分間加熱した後に、総ステビオール配糖体を決定した。細胞残屑を、０．４５μｍのフィルターを使用して濾別し、その後ＨＰＬＣ分析を行った。オクトパスＵＰＬＣ法を用いて、総ステビオール配糖体濃度または細胞外ステビオール配糖体濃度を測定した。
【０１２６】
細胞はグルコース及びフルクトース培地では十分に増殖したが、グリセロール及びトレハロース培地では、増殖は不良であった。１１０時間の終わりに、細胞はトレハロースを完全に消費したが、グリセロールは完全に消費されなかった。相当量の蒸発があるために、どれほどのグリセロールが使用されたかは不明である。振盪フラスコの光学密度は、グルコース及びフルクトース処理については、２４時間以内に約６５〜７０ｎｍに達した。その後のＯ．Ｄ．における増加は、蒸発により可能性が高かった。トレハロース処理もまた、最後には同様なＯ．Ｄ．に達したと仮定するのが妥当である。いかなる時点においても測定可能な量のエタノール、いずれのフラスコにも存在しなかった。見出された主な代謝産物は、約０．３ｇ／Ｌのコハク酸塩及び約０．２ｇ／Ｌのグリセロールであった。
【表１１】
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【０１２７】
ｒｅｂＤ、ｒｅｂＭ、及びｒｅｂＡの全濃度を、全ての３つの時点で決定し、その結果を以下に示す。グリセロール及びトレハロースの試料については、ブロス中にｒｅｂＤ及びｒｅｂＭの同様な濃度が存在し、ｒｅｂＡの非常に低い濃度が存在した。しかしながら、グルコース及びフルクトース試料においては、ｒｅｂＭ濃度が最も高く、それに続いてｒｅｂＡであり、その次がｒｅｂＤであった。
【表１２】
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【０１２８】
ステビオール配糖体の細胞外濃度を、最後のサンプルポイントでのみ決定し、細胞外ステビオール配糖体及び総ステビオール配糖体の割合を以下に列記する。トレハロース処理、すなわち、本発明の好ましい態様によるエタノール制限基質を使用するグルコース制限培地を用いるものが、他の処理（約２０％）と比べて、ステビオール配糖体の最高量の排出（約５０％）を示したことは興味深いことである。
【表１３】
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【０１２９】
蒸発の可変レベルを考慮に入れるために、総ステビオール配糖体の濃度を細胞密度（Ｏ．Ｄ．）に対して正規化し、以下の表に示す。グリセロール及びトレハロースで増殖された細胞は、非常に高い細胞当たりの生産性を有し、この生産性は、グルコース及びフルクトース上で増殖させたものよりも時間経過の全体を通して増加し続けた。
【表１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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