(57)【要約】      （修正有）【課題】γ−セクレターゼの修飾物質または阻害物質等を効率的に同定し、Ａβ４２産生を特異的に減少させる医薬をスクリーニングするための技術を提供する。【解決手段】アミロイドβの配列の３７位、３８位、４０位、２５位および２１位で終わるペプチドを基質として、候補物質の非存在下および存在下でγ−セクレターゼを接触させ、生じた切断ペプチドの量またはレベルを比較、判断することによる、γ−セクレターゼの修飾物質又は阻害物質のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号１の部分配列を含むペプチド配列であって、γ−セクレターゼにより切断されるペプチド配列を含む基質ペプチドに、γ−セクレターゼを候補物質の非存在下および存在下で接触させ、配列番号１の３７位、３８位または４０位で終わる配列からなる切断ペプチドを得る工程；ならびに
（Ｂ）該候補物質の非存在下における該切断ペプチドの量またはレベルとの比較において、該候補物質の存在下における該切断ペプチドの量またはレベルが変わらないかまたは増加するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの修飾物質であると判断し、該切断ペプチドの量またはレベルが減少するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの阻害物質であると判断する、工程
を包含する、γ−セクレターゼの修飾物質または阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記基質ペプチドは３２アミノ酸以上の長さを有する、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記基質ペプチドは配列番号１の１１〜４２位のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記切断ペプチドは配列番号１の３７位または３８位で終わる配列からなるペプチドの少なくとも１つを含む、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記切断ペプチドが基質ペプチドの配列番号１の４０位で終わる配列を含む場合、前記基質ペプチドは、配列番号１の４５位で終わる配列を含む、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記基質ペプチドは配列番号１の１〜４０位のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１の１〜４２位のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１の１１〜４２位のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１の１〜４３位のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１の１〜４５位のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１の１〜４６位のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記基質ペプチドが配列番号１の４３位、４５位または４６位で終わる配列を含む場合、前記切断ペプチドは配列番号１の３８位または４０位で終わるペプチドの少なくとも１つを含み、
該基質ペプチドが配列番号１の４２位で終わる配列を含む場合、該切断ペプチドは配列番号１の３８位で終わるペプチドを含み、
該基質ペプチドが配列番号１の４０位で終わる配列を含む場合、該切断ペプチドは配列番号１の３７位で終わるペプチドを含む、
請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
（Ａ）配列番号２の部分配列を含むペプチド配列であって、γ−セクレターゼにより切断される配列を含む基質ペプチドに、γ−セクレターゼを候補物質の非存在下および存在下で接触させ、配列番号２の２５位で終わる配列からなる切断ペプチドを得る工程；ならびに
（Ｂ）該候補物質の非存在下における該切断ペプチドの量またはレベルとの比較において、該候補物質の存在下における該切断ペプチドの量またはレベルが変わらないかまたは増加するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの修飾物質であると判断し、該切断ペプチドの量またはレベルが減少するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの阻害物質であると判断する、工程
を包含する、γ−セクレターゼの修飾物質または阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記基質ペプチドは配列番号２からなるＡＰＬ１β２８である、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
（Ａ）配列番号３の部分配列を含むペプチド配列であって、γ−セクレターゼにより切断される配列を含む基質ペプチドに、γ−セクレターゼを候補物質の非存在下および存在下で接触させ、配列番号３の２１位で終わる配列からなる切断ペプチドを得る工程；ならびに
（Ｂ）該候補物質の非存在下における該切断ペプチドの量またはレベルとの比較において、該候補物質の存在下における該切断ペプチドの量またはレベルが変わらないかまたは増加するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの修飾物質であると判断し、該切断ペプチドの量またはレベルが減少するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの阻害物質であると判断する、工程
を包含する、γ−セクレターゼの修飾物質または阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記基質ペプチドは配列番号３からなるＮβ２５である、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
基質ペプチドを含む、γ−セレクターゼの修飾物質または阻害物質の評価のための組成物であって、該基質ペプチドは、γ−セクレターゼにより切断されるペプチド配列を含み、配列番号１の部分配列を含み、配列番号１の４０位または４２位で終わる配列からなるペプチドを含む、組成物。
【請求項１３】
前記基質ペプチドは３２アミノ酸以上の長さを有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記基質ペプチドは配列番号１の１１〜４２位のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記基質ペプチドは配列番号１の１〜４０位のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１の１〜４２位のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１の１１〜４２位のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
配列番号２の配列からなるペプチドを含む、γ−セレクターゼの修飾物質または阻害物質の評価のための組成物。
【請求項１７】
配列番号３の配列からなるペプチドを含む、γ−セレクターゼの修飾物質または阻害物質の評価のための組成物。
【請求項１８】
基質ペプチドを含む、γ−セレクターゼの修飾物質または阻害物質の評価のためのキットであって、該基質ペプチドは、γ−セクレターゼにより切断されるペプチド配列を含み、配列番号１の部分配列を含み、配列番号１の４０位または４２位で終わる配列からなるペプチドを含む、キット。
【請求項１９】
前記基質ペプチドは３２アミノ酸以上の長さを有する、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記基質ペプチドは、配列番号１の１１〜４２位のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
前記基質ペプチドは配列番号１の１〜４０位のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１の１〜４２位のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１の１１〜４２位のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２２】
配列番号２からなるＡＰＬ１β２８を含む、γ−セレクターゼの修飾物質または阻害物質の評価のためのキット。
【請求項２３】
配列番号３からなるＮβ２５を含む、γ−セレクターゼの修飾物質または阻害物質の評価のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプレセニリンγ−セクレターゼ（ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）（以下、特に断らない限りγ−セクレターゼという。）の修飾物質または阻害物質のスクリーニングに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、老人班、神経原線維変化、神経細胞脱落そして認知障害によって特徴付けられる進行性の神経変性疾患である。病理学的、生化学的な検討から、老人斑の構成物質であるβ−アミロイド４２（Ａβ４２）がＡＤの原因物質であると推測されている。Ａβは、その前駆タンパク質であるβＡＰＰからβ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）により切断を受け、その後更にγ−セクレターゼにより切断を受け、いくつかの種類のＡβ分子が産生される。家族性ＡＤを引き起こす変異はＡβ産生全体に占めるＡβ４２産生比率を増大させること（非特許文献１）や、またＡβ４２のサロゲートマーカーであるＡＰＬ１β２８の患者ＣＳＦ中での解析（非特許文献２）から「孤発性ＡＤでも発症前からＡβ４２産生の比較的割合が増大している」可能性が示唆されている。そのため、家族性あるいは孤発性ＡＤに関わらずＡβ産生全体に占めるＡβ４２の産生される割合の増大がＡＤ発症に関与している可能性が十分に考えられる。
【０００３】
また現在、Ａβ４２産生を特異的に減少させるγ−セクレターゼ修飾薬の投与がＡＤの予防的治療につながると広く考えられており、抗ＡＤ薬として開発されている。抗ＡＤ薬としては例えば、特許文献１におけるように開発がなされている。しかし、γ−セクレターゼ修飾薬がどのようにしてＡβ４２産生を減少させるか不明である。結局「Ａβ４２固有の産生および分泌メカニズム」自体が不明のため、γ−セクレターゼ修飾薬の作用メカニズムについて論じようがないのである。
【０００４】
以上のことから「Ａβ４２がどのような仕組みで産生および分泌されているか」の解明はＡＤの病理過程解明研究の目標のひとつとなっている。Ａβ分子を全体としてみるとβＡＰＰを基質としたＢＡＣＥ１による細胞外切断とそれに引き続くγ−セクレターゼ（プレセニリン（ＰＳ）／γ−セクレターゼとも称するが、本明細書では、特に断りのない限り単にγ−セクレターゼと称する）による膜内タンパク質分解により産生され、この仕組みについては詳しく研究されてきた。そしてＡβ４２分子に関しては、そのサロゲートマーカーとなり得る分子ＡＰＬ１β２８（非特許文献２）やＮβ２５（非特許文献８、特許文献２〜４）がβＡＰＰ以外のγ−セクレターゼ基質として同定されている。しかし、最終的にはどのような仕組みで「原因物質Ａβ４２が産生および分泌されるのか」はよくわかっていない。
【０００５】
γ−セクレターゼによるβＡＰＰの膜内タンパク質分解の結果、細胞外Ａβが分泌され、細胞質内にＡＩＣＤが産生される。不思議なことにＡβのＣ末端とＡＩＣＤのＮ末端は連続せず、それらの間には６あるいは９アミノ酸残基のペプチドが残存している。既存の報告では（非特許文献３）これらの膜中央部分に取り残されたペプチドはＡＩＣＤを産生するε切断の後、３もしくは４ペプチドずつに分解され膜から取り除かれる。また同様に、Ａβ４２は特定のε切断部位（ε４８）から産生される可能性が示唆され（非特許文献４）、Ａβ４０もまた特定の経路で産生されていることが示唆されている（非特許文献５）。一方、このような学説とは異なる切断経路を示唆する報告もある（非特許文献６，７）ことから、切断部位については、まだ定説がなく、開裂反応においてどのような産物が生成するか予測できない状態である。
【０００６】
このように、間接的にどのような過程を経てＡβ４２が産生されるかについての評価系はある一方で、直接的にＡβ４２が何を前駆体として産生されるか、あるいはどのＡβ分子の前駆体であるかについて解明するような評価系はなく、「Ａβ４２固有の産生および分泌メカニズム」を明らかにする上でもそのような評価系の提供が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】再表２００７／１４１９２６号公報
【特許文献２】特開２０１０−１１５２０４号公報
【特許文献３】特開２００８−２３７０６８号公報
【特許文献４】再表２００４／００９６１７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｗｏｌｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｈｅｎ  ｌｏｓｓ  ｉｓ  ｇａｉｎ：  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ａｂｅｔａ４２／Ａｂｅｔａ４０．Ｔａｌｋｉｎｇ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．２００７  Ｆｅｂ；８（２）：１３６−１４０．
【非特許文献２】Ｙａｎａｇｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ２８−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ａｎ  ＡＰＬＰ１−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｂｅｔａ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｓ  ａ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  Ａｂｅｔａ４２  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ，ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００９  Ｊｕｌ；１（４）：２２３−２３５．
【非特許文献３】Ｔａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｇａｍｍａ−Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ：  ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ  ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００９  Ｏｃｔ  １４；２９（４１）：１３０４２−１３０５２．
【非特許文献４】Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｌｉｎｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４２  ａｎｄ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｇａｍｍａ  ４９-９９  ｏｆ  ｂｅｔａ−Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３  ２７８：  ２４２９４−２４３０１
【非特許文献５】Ｙａｇｉｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｅｔａ４６  ｉｓ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｔｏ  Ａｂｅｔａ４０  ａｎｄ  Ａｂｅｔａ４３，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｔｏ  Ａｂｅｔａ４２，ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎｓ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００８  Ｊａｎ  １１；２８３（２）：７３３−８．Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｎｏｖ  １６．
【非特許文献６】Ｗｅｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａβ４２  ａｎｄ  Ａβ３８  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ｂｙ  γ−Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００８  Ｊｕｎｅ  ２０；２８３（２５）：１７０４９−１７０５４
【非特許文献７】Ｈａａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａβ３８  ａｎｄ  Ａβ４２  Ｉｓ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  Ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  Ｆａｍｉｌｉａｌ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  γ−Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００８  Ｊａｎ  １１；２８３（２）：６７７−６８３．
【非特許文献８】Ｏｋｏｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｏｔｃｈ−１  Ａｂｅｔａ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｎｏｔｃｈ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００６  Ｍａｒ  ２４；２８１（１２）：７８９０−７６９８．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｊａｎ  ２３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、γ−セクレターゼを調節する因子である修飾物質、阻害物質等を効率的に同定し、Ａβ４２産生を特異的に減少させる医薬をスクリーニングするための技術を提供し、γ−セクレターゼによるアルツハイマー病アミロイドの分解アッセイ法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、鋭意研究した結果、配列番号１の３７位、３８位および４０位で終わるペプチド、配列番号２の２５位で終わるペプチド、および配列番号３の２１位で終わるペプチドがγ−セクレターゼ切断により特異的に生じることを予想外に見出したことによって、本発明を完成した。本発明は、以下を提供する。
【００１１】
（１）  （Ａ）配列番号１の部分配列を含むペプチド配列であって、γ−セクレターゼにより切断されるペプチド配列を含む基質ペプチドに、γ−セクレターゼを候補物質の非存在下および存在下で接触させ、配列番号１の３７位、３８位または４０位で終わる配列からなる切断ペプチドを得る工程；ならびに
（Ｂ）該候補物質の非存在下における該切断ペプチドの量またはレベルとの比較において、該候補物質の存在下における該切断ペプチドの量またはレベルが変わらないかまたは増加するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの修飾物質であると判断し、該切断ペプチドの量またはレベルが減少するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの阻害物質であると判断する、工程
を包含する、γ−セクレターゼの修飾物質または阻害物質のスクリーニング方法。
（２）前記基質ペプチドは３２アミノ酸以上の長さを有する、項目１に記載のスクリーニング方法。
（３）前記基質ペプチドは配列番号１の１１〜４２位のアミノ酸配列を含む、項目１または２に記載のスクリーニング方法。
（４）前記切断ペプチドは配列番号１の３７位または３８位で終わる配列からなるペプチドの少なくとも１つを含む、項目１〜３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（５）前記切断ペプチドが基質ペプチドの配列番号１の４０位で終わる配列を含む場合、前記基質ペプチドは、配列番号１の４５位で終わる配列を含む、項目１〜４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（６）前記基質ペプチドは配列番号１の１〜４０位のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１の１〜４２位のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１の１１〜４２位のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１の１〜４３位のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１の１〜４５位のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１の１〜４６位のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、項目１〜５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（７）前記基質ペプチドが配列番号１の４３位、４５位または４６位で終わる配列を含む場合、前記切断ペプチドは配列番号１の３８位または４０位で終わるペプチドの少なくとも１つを含み、
該基質ペプチドが配列番号１の４２位で終わる配列を含む場合、該切断ペプチドは配列番号１の３８位で終わるペプチドを含み、
該基質ペプチドが配列番号１の４０位で終わる配列を含む場合、該切断ペプチドは配列番号１の３７位で終わるペプチドを含む、
項目１〜６のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（８）  （Ａ）配列番号２の部分配列を含むペプチド配列であって、γ−セクレターゼにより切断される配列を含む基質ペプチドに、γ−セクレターゼを候補物質の非存在下および存在下で接触させ、配列番号２の２５位で終わる配列からなる切断ペプチドを得る工程；ならびに
（Ｂ）該候補物質の非存在下における該切断ペプチドの量またはレベルとの比較において、該候補物質の存在下における該切断ペプチドの量またはレベルが変わらないかまたは増加するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの修飾物質であると判断し、該切断ペプチドの量またはレベルが減少するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの阻害物質であると判断する、工程
を包含する、γ−セクレターゼの修飾物質または阻害物質のスクリーニング方法。
（９）前記基質ペプチドは配列番号２からなるＡＰＬ１β２８である、項目８に記載のスクリーニング方法。
（１０）  （Ａ）配列番号３の部分配列を含むペプチド配列であって、γ−セクレターゼにより切断される配列を含む基質ペプチドに、γ−セクレターゼを候補物質の非存在下および存在下で接触させ、配列番号３の２１位で終わる配列からなる切断ペプチドを得る工程；ならびに
（Ｂ）該候補物質の非存在下における該切断ペプチドの量またはレベルとの比較において、該候補物質の存在下における該切断ペプチドの量またはレベルが変わらないかまたは増加するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの修飾物質であると判断し、該切断ペプチドの量またはレベルが減少するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの阻害物質であると判断する、工程
を包含する、γ−セクレターゼの修飾物質または阻害物質のスクリーニング方法。
（１１）前記基質ペプチドは配列番号３からなるＮβ２５である、項目１０に記載のスクリーニング方法。
（１２）基質ペプチドを含む、γ−セレクターゼの修飾物質または阻害物質の評価のための組成物であって、該基質ペプチドは、γ−セクレターゼにより切断されるペプチド配列を含み、配列番号１の部分配列を含み、配列番号１の４０位または４２位で終わる配列からなるペプチドを含む、組成物。
（１３）前記基質ペプチドは３２アミノ酸以上の長さを有する、項目１２に記載の組成物。
（１４）前記基質ペプチドは配列番号１の１１〜４２位のアミノ酸配列を含む、項目１２または１３に記載の組成物。
（１５）前記基質ペプチドは配列番号１の１〜４０位のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１の１〜４２位のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１の１１〜４２位のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、項目１２〜１４のいずれかに記載の組成物。
（１６）配列番号２の配列からなるペプチドを含む、γ−セレクターゼの修飾物質または阻害物質の評価のための組成物。
（１７）配列番号３の配列からなるペプチドを含む、γ−セレクターゼの修飾物質または阻害物質の評価のための組成物。
（１８）基質ペプチドを含む、γ−セレクターゼの修飾物質または阻害物質の評価のためのキットであって、該基質ペプチドは、γ−セクレターゼにより切断されるペプチド配列を含み、配列番号１の部分配列を含み、配列番号１の４０位または４２位で終わる配列からなるペプチドを含む、キット。
（１９）前記基質ペプチドは３２アミノ酸以上の長さを有する、項目１８に記載のキット。
（２０）前記基質ペプチドは、配列番号１の１１〜４２位のアミノ酸配列を含む、項目１８に記載のキット。
（２１）前記基質ペプチドは配列番号１の１〜４０位のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１の１〜４２位のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１の１１〜４２位のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される、項目１８に記載のキット。
（２２）配列番号２からなるＡＰＬ１β２８を含む、γ−セレクターゼの修飾物質または阻害物質の評価のためのキット。
（２３）配列番号３からなるＮβ２５を含む、γ−セレクターゼの修飾物質または阻害物質の評価のためのキット。
【００１２】
複数の実施形態が開示されるが、本発明の他の実施形態は、以下の詳細な説明から当業者には明らかになるであろう。明らかであるように、本発明は、すべて本発明の技術思想および範囲から逸脱することなく、種々の明白な態様において修飾が可能である。従って、図面および詳細な説明は、事実上例示的であると見なされ、制限的であるとは見なされない。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、従来は提供することが困難であった、γ−セクレターゼの活性を調節する因子である阻害物質、修飾物質等を従来技術より格段に効果的にスクリーニングすることができる方法、およびγ−セクレターゼによるアルツハイマー病アミロイドの分解アッセイ法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明で判明した情報も含めたγ−セクレターゼに関するＡβ切断の説明を示す。即ち、ε切断からγ切断への方向に切断が順次進んで行くという学説（切断ラインとして示した）と順次進む訳ではないとする学説があるが、その実体は不明であり解明は進んでいない。図中ＡＩＣＤ＝ＡＰＰ細胞内ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）を示す。
【図２】図２は、合成Ａβ４２を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断のａ）ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ測定結果およびｂ）Ａβ３８  ＥＬＩＳＡ測定結果を示す。
【図３】図３は、合成Ａβ４２を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断のａ）最適ＣＨＡＰＳＯ濃度の決定およびｂ）時間経過と新規Ａβ３８の産生の関連を示す。
【図４】図４は、合成Ａβ３８を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断の解析。種々ＣＨＡＰＳＯ濃度におけるＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ測定結果を示す。
【図５】図５は、ａ）本特許で使用するγ−セクレターゼ修飾薬のＡβ切断変化，化合物Ｂ添加時のγ−セクレターゼによる合成Ａβ４２切断への影響ｂ）ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ測定結果、およびｃ）Ａβ３８  ＥＬＩＳＡ測定結果を示す。
【図６】図６は、ｉｓｏｔｙｐｅ  Ａβ４２であるＡβ１１−４２を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断の測定結果を示す。
【図７】図７は、合成Ａβ４５を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断の測定結果を示す。
【図８】図８は、合成Ａβ４０を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断の測定結果を示す。
【図９】図９は、合成Ａβ４３を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断の測定結果を示す。
【図１０】図１０は、合成Ａβ４６を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断の測定結果を示す。
【図１１】図１１は、合成ＡＰＬ１β２８を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断の測定結果を示す。
【図１２】図１２は、合成Ｎβ２５を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断の測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当上記分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１６】
（用語の定義）
本明細書において、必要に応じて、以下の略語を用いる。
Ａβ＝βアミロイドタンパク質
βＡＰＰ＝アミロイドβ前駆体タンパク質
ＰＳ＝プレセニリン。
【００１７】
本明細書において「ガンマ（γ）（−）セクレターゼタンパク質」および「ガンマ（γ）（−）セクレターゼ」とは、「プレセニリン（ＰＳ）／ガンマ（γ）（−）セクレターゼ」とも称し、γ−セクレターゼ活性を示すタンパク質をいう。γ−セクレターゼ活性としては、γ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチド基質（例えば、アミロイドβ前駆体タンパク質（βＡＰＰ）またはそのフラグメントなどのポリペプチド基質）の認識、およびγ−セクレターゼ開裂部位でγ−セクレターゼ開裂配列の開裂を触媒して基質開裂産物を生成することが挙げられる。γ−セクレターゼは、通常複合体（代表的には４タンパク質の複合体）で活性を発揮する。４タンパク質の例としては、例えば、プレセニリン（Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ）１とニカストリン（ｎｉｃａｓｔｒｉｎ）とＰＥＮ２とＡｐｈ１Ａとの複合体、あるいはプレセニリン（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ）２とニカストリン（ｎｉｃａｓｔｒｉｎ）とＰＥＮ２とＡｐｈ１Ａとの複合体などが挙げられる。したがって、そのような複合体を形成するタンパク質分子のうち少なくとも１つがγ−セクレターゼ開裂配列を有するポリペプチド基質の開裂を触媒することが理解される。このようなγ−セクレターゼタンパク質複合体を構成するタンパク質分子は、互いに共有結合的相互作用および／または非共有結合的相互作用で結合していてよい。さらに、γ−セクレターゼタンパク質複合体はまた、ビタミン、ＡＴＰまたは二価カチオンなどの非タンパク質分子をも含んでいてよい。１つの実施形態では、界面活性剤で可溶化した形態で単離したγ−セクレターゼタンパク質が使用される。代表的なγ−セクレターゼとしては、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  １  Ｇｅｎｂａｎｋ（ＮＭ＿００００２１．３）；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  ２  Ｇｅｎｂａｎｋ（ＮＭ＿０００４４７．２）；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｎｉｃａｓｔｒｉｎ  Ｇｅｎｂａｎｋ（ＮＭ＿０１５３３１．２）（ヒトＡｐｈ−２とも呼ばれる）；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＰＥＮ−２  Ｇｅｎｂａｎｋ（ＮＭ＿１７２３４１．１）；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  Ａｐｈ１Ａ  Ｇｅｎｂａｎｋ（ＮＭ＿００１０７７６２８．１）などを挙げることができるがそれらに限定されず、ヒト以外にもマウス・ラットのものなども利用することができることが理解される。
【００１８】
γ−セクレターゼまたはその複合体は、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ、および好ましくはヒトなどの哺乳動物種を含む多くの種から得た細胞、植物、昆虫（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒなど）および無脊椎動物（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓなど）などの種から単離することができる。さらに、γ−セクレターゼはγ−セクレターゼ複合体を含むあらゆる適切な組織または細胞（たとえば、γ−セクレターゼ陽性細胞）から単離することができる。たとえば、そのような細胞としては、ヒトＨ４神経膠腫細胞、およびマウスＮ２ａ神経芽細胞腫細胞、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＨＯ細胞、およびＨｅＬａ細胞などのγ−セクレターゼ陽性細胞を挙げることができる（Ｈａａｓｓ，Ｃ．ら、１９９２  Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：３２２−３２５など）。
【００１９】
本発明は、野生型、変異体またはスプライス変異体を含む、ＰＳ１および／またはＰＳ２タンパク質分子の少なくとも１つの異なる形態を含むγ−セクレターゼ複合体を提供する。γ−セクレターゼ複合体は、野生型、変異体、またはスプライス変異体のＰＳ１（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．ら、（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ３７５：７５４−７６０）またはＰＳ２（米国特許第５，９８６，０５４号）を有する主体（たとえば、あらゆる種から）、組織または細胞株などの採取源から単離できる。
【００２０】
細胞ではγ−セクレターゼ複合体はβＡＰＰをγ−セクレターゼ開裂部位で開裂してβＡＰＰ開裂産物を生成する。βＡＰＰ開裂産物としては、β−セクレターゼおよびγ−セクレターゼから得られる基質開裂産物であるＡβ４０およびＡβ４２ペプチド；α−セクレターゼおよびγ−セクレターゼから得られる基質開裂産物であるｐ３ペプチド；γ−セクレターゼによる開裂のＣ末端産物であるｐ７またはＡＩＣＤペプチド；またはそれらのフラグメントが挙げられる（Ｈａａｓｓ，Ｃ．＆  Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．，Ｃｅｌｌ，７５，１０３９−１０４２  （１９９３）において概説）。βＡＰＰのγ−セクレターゼ開裂配列は背景技術に記載されるように、特に３７位または３８位での開裂配列は知られていなかった。また、４０位での開裂配列についても４５位からの切断は知られていなかった。γ−セクレターゼの活性阻害はアミロイドタンパク質産生を抑制し、アルツハイマー病の進行を停止もしくは遅らせられる治療薬になると考えられる。ＡＰＰの加水分解の第１段階では、γ−セクレターゼ以外にもβセクレターゼおよびαセクレターゼ反応があるが、第２段階であるγ−セクレターゼ反応は両者の第１段階に共通して生じることからより広いスペクトル効果が期待される。
【００２１】
本明細書において、ある事象（例えば、Ａβ４２産生を減少させること）について「特異的」とは、ある物質（例えば、Ａβ４２）についていうとき、その物質に対する選択性が他の同種の物質よりも高いこと（例えば、Ａβ４２であれば、他のＡβ断片に対して選択性が高いことをいう。）（この場合、その物質（例えば、Ａβ４２）のみに反応（例えば、Ａβ４２の断片産生の減少）することを包含する。）をいう）。
【００２２】
本明細書において「Ａβ」とは、βアミロイドタンパク質をいい、代表的に配列番号１の部分配列を有する。ここで、Ａβは多種類あることから、１位に始まるものについてはアミノ酸数に基づいてＡβ（数字）と表示される。例えば、Ａβ４６は、配列番号１〜４６からなり、Ａβ４５は、配列番号１〜４５からなり、Ａβ４３は、配列番号１〜４３からなり、Ａβ４２は、配列番号１〜４２からなり、Ａβ４０は、配列番号１〜４０からなり、Ａβ３８は、配列番号１〜３８からなり、Ａβ３７は、配列番号１〜３７からなる。あるいはそのアイソタイプとして、アミノ酸２位以降で始まるものも存在し、そのような場合は、Ａβ（始点）−（終点）、と示し、例えばＡβ１１−４２、Ａβ１７−４２などと示す。同様に、サロゲートマーカーである配列番号２および３で示される配列についても、配列番号２については、１位に始まるものについてＡＰＬ１β（数字）、またはアミノ酸２位以降で始まるものについてＡＰＬ１β（始点）−（終点）と表示し、配列番号３については、１位に始まるものについてＮβ（数字）、またはアミノ酸２位以降で始まるものについて（始点）−（終点）と表示する。
【００２３】
本明細書において配列番号１、２、３等の「部分配列」とは、対象とされる全長配列のうち少なくとも一部の配列からなる配列をいう。したがって、本明細書において部分配列を含む配列は、全長配列を包含しうることが理解される。この意味で本明細書において「部分配列」は、全長配列のフラグメントともいうことができ、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１の配列長を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドが該当する。部分配列またはフラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、（ポリ）ペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここで具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
【００２４】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。
【００２５】
本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリペプチド、核酸等を含む）等とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、アミロイドプリカーサープロテインおよびγ−セクレターゼの配列などの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物種等においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてその生物の配列データベースを検索することによって、またはウェットの実験でライブラリーをスクリーニングすることによって見出すことができる。
【００２６】
本明細書では配列の同一性の算出および相同性の評価は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．２３（２０１０年３月２２日発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
【００２７】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。
【００２８】
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【００２９】
本発明は、検索によって見出された配列番号１、２および３に対応する類似配列を用いることによっても実施することができる。本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、あるアミノ酸配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他のアミノ酸配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、対応する核酸配列を用いたストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよび  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００３０】
本明細書において、「改変体」（ｖａｒｉａｎｔ）または「改変配列」（本明細書において「改変体」とまとめて総称することがある。）とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質または配列に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。本明細書において「改変体」は、本発明の目的を達成することができる限り、いかなるものも使用することができる。たとえば、そのような目的としては、γ−セクレターゼの基質等であり得る。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するか、あるいは、１または数個、もしくは１以上のアミノ酸またはヌクレオチドの置換、付加または欠失を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。本明細書において「機能的改変体」とは、基準となる配列が担う生物学的活性（例えば、γ−セクレターゼの基質特異性等）を保持する改変体をいう。
【００３１】
本明細書において「基質（ペプチド）」とは、γ−セクレターゼの酵素反応の基質となる任意のペプチドまたはその改変体をいう。したがって、本明細書にいう基質ペプチドは、γ−セクレターゼにより切断される配列を含む。そのような基質としては、本明細書に記載される配列番号１、２、３などの配列もしくはその部分配列またはその改変体を含む配列を有するペプチドを挙げることができる。理論に束縛されることを望まないが、基質ペプチドは、γ−セクレターゼの酵素反応において認識される必要があることから、上記のように切断される配列を含み、一定程度の長さ（例えば、配列番号１では、下限として１５アミノ酸以上、１６アミノ酸以上、１７アミノ酸以上、１８アミノ酸以上、１９アミノ酸以上、２０アミノ酸以上、２１アミノ酸以上、２２アミノ酸以上、２３アミノ酸以上、２４アミノ酸以上、２５アミノ酸以上、２６アミノ酸以上、２７アミノ酸以上、２８アミノ酸以上、２９アミノ酸以上、３０アミノ酸以上、３１アミノ酸以上、３２アミノ酸以上等であり、上限としては、４２アミノ酸以下、４３アミノ酸以下、４４アミノ酸以下、４５アミノ酸以下、４６アミノ酸以下、４７アミノ酸以下、４８アミノ酸以下、４９アミノ酸以下、あるいは全長でありうる）を有すると定義されうる。
【００３２】
本明細書において「切断（ペプチド）」とは、γ−セクレターゼの酵素反応の結果得られる生成物（基質がペプチドの場合は、ペプチド）をいう。本発明では、配列番号１の部分配列を含むペプチドを基質ペプチドとして用いた場合、代表的に、切断ペプチドは、配列番号１の３７位、３８位または４０位で終わる配列、配列番号２の２５位で終わる配列、配列番号３の２１位で終わる配列などを含むがこれに限定されない。
【００３３】
本明細書において、切断ペプチドまたは基質ペプチド等の「量」とは、対象となる物質の物理量を直接示す尺度（例えば、モル量、重量等）をいい、切断ペプチドまたは基質ペプチド等の「レベル」とは、対象となる物質の物理量を反映した他の尺度（例えば、酵素活性または免疫学的手法での量以外の指標（例えば、吸光度等）で表示されうる）をいう。本明細書では切断ペプチドまたは基質ペプチド等は、物理化学的手法などを用いて直接量を測定してもよく、免疫学的手法などを用いて間接的に量を測定してもよく、あるいは、量が不明であっても、存在量を反映するレベル（例えば、酵素活性または免疫学的手法での量以外の指標で表示されうる）で表示することによってスクリーニングを実施することができる。
【００３４】
本明細書において「〜で終わる配列」とは、ペプチド配列について言及する場合、ある配列番号で示される全長配列のうち、任意のアミノ酸位で開始し、対象となる位置（アミノ酸位）において終結することをいう。したがって、配列番号１の３７位で終わる配列とは、配列番号１のアミノ酸１位〜３７位のいずれかで開始し、３７位のアミノ酸で終わる配列を意味する。
【００３５】
本明細書において「候補物質」または「被験物質」とは、交換可能に使用され、いずれも、スクリーニングの対象となる任意の物質をいい、例えば、低分子化合物（例えば、コンビナトリアルケミストリーなどで合成されたものも含む）、有機化合物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖、核酸、脂質、およびこれらの複合体等を挙げることができるがこれに限定されない。
【００３６】
本明細書において「因子」とは、ある物事の原因を分類した各要素（例えば、化合物、複合物等の任意の物質等）をいう。γ−セクレターゼの活性を調節する「因子」としては、阻害物質、修飾物質、活性化物質等を挙げることができる。
【００３７】
本明細書において、「阻害」とは、ある物質について、その物質が、酵素などの機能物質（例えば、γ−セクレターゼ）の活性を少なくとも低減または消失させることをいい、その活性を「阻害活性」という。したがって、「阻害物質」は、γ−セクレターゼについていうとき、その活性を少なくとも低減または消失させる物質をいい、本明細書では「阻害剤」または「阻害薬」ともいう。
【００３８】
本明細書において「活性化」とは、ある物質について、その物質が、酵素などの機能物質（例えば、γ−セクレターゼ）の活性を少なくとも増強することをいい、その活性を「活性化活性」という。したがって、「活性化因子」は、γ−セクレターゼについていうとき、その活性を少なくとも増強させる因子をいい、本明細書では「活性化剤」または「活性化薬」ともいう。
【００３９】
本明細書において、「修飾」とは、ある物質について、その物質が、酵素などの機能物質（例えば、γ−セクレターゼ）の活性自体は阻害せず（したがって、活性化を含むが、活性化せず活性を変化させないものも含まれる。）、γ−セクレターゼについてはＡβ４２の産生を選択的に阻害すること、好ましくは、Ａβ断片の総量への影響がないことをいい、「修飾活性」ともいう。したがって、「修飾物質」は、γ−セクレターゼについていうとき、その酵素活性自体は阻害せず、かつＡβ４２の産生を選択的に阻害する物質をいい、好ましい「修飾物質」は、このうちで、Ａβ断片の総量への影響はほとんどない物質をいう。本明細書では、「修飾物質」は、「修飾剤」または「修飾薬」ともいう。Ａβ産生を減少させることを目的として、いくつかのメカニズムの医薬が研究されているが、β−セクレターゼ阻害物質はＡβ断片の総量を減少させてしまう可能性がある。また、γ−セクレターゼ阻害物質はＡβ断片の総量を減少させてしまう可能性がある点に加え、γ−セクレターゼの酵素活性自体を阻害してしまうため、副作用の懸念が残される。一方、γ−セクレターゼ修飾物質は酵素活性自体は阻害せず、かつＡβ４２の産生を選択的に阻害し、好ましい修飾物質は、Ａβ断片の総量への影響はほとんどないため、理論に束縛されることを望まないが、より副作用の少ない安全な医薬となる可能性がある点で有望である。
【００４０】
本明細書において「Ａβ断片の総量」とは、細胞内等ある系中に存在するＡβのすべての種類（例えば、Ａβ３７、Ａβ３８、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、Ａβ４３、Ａβ４４、Ａβ４５、Ａβ４６、Ａβ４７、Ａβ４８、Ａβ４９等）の断片の合計量をいう。Ａβ断片の総量は、インビトロのアッセイ、例えば、質量分析または免疫科学的分析などの方法、あるいは、参考例１に記載のような手法を用いて細胞レベルで測定することができる。
【００４１】
本明細書において使用される場合、「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ物質（例えば、医薬）などを、特定の操作および／または評価方法で多数の候補から選抜することをいう。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られた物質（例えば、医薬）またはその候補もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。スクリーニングは、標的となる物質を標識して実施してもよく、あるいは標的となる物質に特異的な手段（抗体など）を用いるか、あるいは標的となる物質に特有の指標（たとえば、質量）を用いて実施することができる。
【００４２】
本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（たとえば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができるが、それらに限定されない。上記の核酸断片および相補性を示すオリゴヌクレオチドを何れも蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、１０ｎｍ以上であることが好ましい。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）等を使用することができる。蛍光発光極大波長の差が１０ｎｍ以上である蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ５とローダミン６Ｇ試薬との組み合わせ、Ｃｙ３とフルオレセインとの組み合わせ、ローダミン６Ｇ試薬とフルオレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。１つの好ましい実施形態では、標識は放射能標識される。
【００４３】
本発明のスクリーニング方法によって得られた物質は、γ−セクレターゼが関連する疾患、障害または症状、あるいはＡβ４２に関連する疾患、障害または症状を治療、予防等処置するために用いることができる。
【００４４】
本明細書において「γ−セクレターゼが関連する疾患、障害または症状」または「Ａβ４２に関連する疾患、障害または症状を治療、予防」は、これらの因子が関連する疾患であればいずれも包含され、例えば、アルツハイマー型認知症（アルツハイマー症、アルツハイマー型老年認知症）、ダウン症候群、記憶障害、プリオン病（クロイツフェルト・ヤコブ病等）、軽度認知障害（MCI）、オランダ型遺伝性アミロイド性脳出血、脳アミロイド血管障害、他の変性認知症、血管性変性混合型認知症、パーキンソン病に随伴する認知症、進行性核上麻痺に随伴する認知症、皮質基底核変性症に随伴する認知症、びまん性レビー小体型アルツハイマー病、加齢黄斑変性症、パーキンソン病、アミロイドアンジオパシー等の神経変性障害、ならびにがんなどを挙げることができる。
【００４５】
本明細書において、「予防」するとは、本発明の標的とする疾患、障害または症状（例えば、γ−セクレターゼが関連する疾患、障害または症状、例えば、アルツハイマー病等）が発生する前に、何らかの手段により、その疾患、障害または症状を生じさせないかまたは少なくとも遅延させること、あるいは疾患、障害または症状の原因自体が生じたとしてもそれが原因の障害が生じないような状態にすることをいう。
【００４６】
本明細書において、「治療」するとは、既に発症している本発明の標的とする疾患、障害または症状の進行を食い止めるか、または完全または部分的に拘わらず、本発明の標的とする疾患、障害または症状の進行が止まるか、または改善することをいう。
【００４７】
本明細書において「処置」とは、疾患、障害または症状に対して何らかの影響を与えるか、そのような疾患、障害または症状になることを防止することをいい、治療および予防の両方を含みうる。狭義には、「処置」は、「予防」に対して、発症後の上記行為をさす。
【００４８】
本明細書において「界面活性剤」とは、当該分野において通常用いられる意味で用いられ、親水基および疎水基を有する物質をいい、極性物質と非極性物質とを混合させる働きを有する。本発明では、スクリーニングを行う場合の候補物質と基質または酵素との接触を円滑にする目的使用されうる。本発明で用いられうる界面活性剤としては、例えば、ＣＨＡＰＳＯ等が例示されるがこれに限定されない。界面活性剤は、膜内在タンパク質を可溶化する典型的な方法である。界面活性剤は、リン脂質二重層を断片化して膜内在タンパク質またはタンパク質複合体を与え、その際、該脂質二重層の化学特性を模倣した環境を用いて可溶化したタンパク質またはタンパク質複合体が天然のコンホメーションに折り畳まれるようにするといわれている。それゆえ、界面活性剤の環境中にあるタンパク質またはタンパク質複合体は可溶化形態にあるタンパク質またはタンパク質複合体となっている。さらに、可溶化形態になったタンパク質またはタンパク質複合体は、その天然のコンホメーションにある該タンパク質またはタンパク質複合体によって示される生物学的活性を有していても有していなくてもよく、本発明において有利な条件を提供する限り使用することができる。
【００４９】
本明細書において「キット」とは、スクリーニングの目的で使用される場合、スクリーニングに必要な成分等を備えたユニットをいう。キットは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、基質ペプチド、γ−セクレターゼ、酵素用の緩衝液など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、酵素の使い方などを記載した指示書などが含まれる。
【００５０】
本明細書において「指示書」は、試薬の取り扱い、使用方法、調合方法、作製方法、収縮方法など、スクリーニング法を実施する人、医薬などを投与する方法または処置・診断する方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人（患者本人であり得る）に対して記載したものである。この指示書は、本発明のスクリーニング法を実施する手順等を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記されることが好ましい。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、ＰＤＦ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【００５１】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００５２】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
【００５３】
（医薬探索方法）
１つの局面において、本発明は、γ−セクレターゼの活性を調節する因子である阻害物質、修飾物質等のスクリーニング方法を提供する。この方法は、（Ａ）配列番号１の部分配列を含むペプチド配列であって、γ−セクレターゼにより切断されるペプチド配列を含む基質ペプチドに、γ−セクレターゼを候補物質の非存在下および存在下で接触させ、配列番号１の３７位、３８位または４０位で終わる配列からなる切断ペプチド、配列番号２の２５位で終わる配列からなる切断ペプチドおよび配列番号３の２１位で終わる配列からなる切断ペプチドのうち１つまたは複数を得る工程；ならびに（Ｂ）該候補物質の非存在下における該切断ペプチドの量またはレベルとの比較において、該候補物質の存在下における該切断ペプチドの量またはレベルが変わらないかまたは増加するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの修飾物質であると判断し、該切断ペプチドの量またはレベルが減少するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの阻害物質であると判断するあるいは判定される、工程を包含する。γ−セクレターゼによって、配列番号１の３７位または３８位で終わる配列からなる切断ペプチドが生じることが従来知られておらず、４０位についても、あらゆる系列で切断ペプチドとして生じることは知られていなかったことから、これを測定することによって、γ−セクレターゼの阻害物質、修飾物質等をスクリーニングすることができることを見出したことは当該分野において注目されるべきである。同様に、配列番号２の２５位で終わる配列からなる切断ペプチドおよび配列番号３の２１位で終わる配列からなる切断ペプチドが生じることも知られておらず、これを測定することによって、好ましくはγ−セクレターゼに特異的な、γ−セクレターゼの阻害物質、修飾物質等をスクリーニングすることができることを見出したことは当該分野において注目されるべきである。γ−セクレターゼの活性阻害または活性修飾はアミロイドタンパク質産生を抑制し、アルツハイマー病の進行を停止もしくは遅らせられる治療薬になると考えられることから、注目されるが、γ−セクレターゼの非特異的な活性抑制は癌化誘導などの重篤な副作用を誘導する可能性があるということをも考慮すると、特異的にγ−セクレターゼを修飾、阻害ないし抑制することが重要である。従来種々のγ−セクレターゼの阻害剤が報告されているが、いずれも特異性が低いこともあって副作用が伴うことが指摘されている。その一つの原因としては、γ−セクレターゼに特異的なスクリーニング方法が確立していなかったということも挙げられ、本発明はこのような問題を解決する手順として有用である。また、Ａβ産生を減少させることを目的として、いくつかのメカニズムの医薬が研究されているが、βセクレターゼ阻害物質はＡβ断片の総量を減少させてしまう可能性がある。また、γ−セクレターゼ阻害物質はＡβ断片の総量を減少させてしまう可能性がある点に加え、γ−セクレターゼの酵素活性自体を阻害してしまうため、副作用の懸念が残される。一方、γ−セクレターゼ修飾物質は酵素活性自体は阻害せず、かつＡβ４２の産生を選択的に阻害し、Ａβ断片の総量への影響はほとんどないため、より副作用の少ない安全な医薬となる可能性があるとい��点でも有望である。
【００５４】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、本発明のスクリーニング方法において、さらに、Ａβ断片の総量または総レベルを測定し、その増減を測定する工程を含む。Ａβ断片の総量または総レベルが変動していない場合、その対象となる候補物質は、γ−セクレターゼの「修飾活性」を有すると判定することができる。加えて、本発明の好ましい実施形態では、本発明のスクリーニング方法において、さらに、Ａβ４２の量またはレベルを測定し、その増減を測定する工程を含む。ここで、Ａβ４２の量またはレベルの産生がコントロールに比べて減少する場合、すなわち、Ａβ４２の産生が阻害される場合、その対象となる候補物質は、γ−セクレターゼの「阻害活性」を有すると判定することができる。ここで、Ａβの量またはレベル、Ａβ４２の量またはレベルの測定は、他の切断ペプチド、基質ペプチドと同様、免疫学的または物理化学的（質量分析などを含む）に行なうことができることが理解される。あるいは、Ａβ２の量は、参考例１に記載されるような細胞を用いた手法で免疫学的手法（例えば、ＥＬＩＳＡ等）で測定することもできる。
【００５５】
例示的な実施形態では、参考例１に記載されるような手法で、Ａβ４２の産生が抑制されていることを見出した場合、その情報のみでは、阻害物質または修飾物質の区別ができず、本発明のスクリーニング方法による情報が必要である。例示的な実施形態では、さらに、参考例２に記載の手法のように化合物添加時のγセクレターゼの基質量（ＣＴＦｓ量）が化合物非添加時に比べ増えない場合、阻害物質ではなく、修飾物質であると判断することができる。例えば、対照化合物であるγ−セクレターゼ阻害剤が濃度依存的にＣＴＦｓ量を増加させ、他方、候補物質について濃度依存的なＣＴＦｓ量が認められない場合、その候補物質はＡβ４２産生抑制作用を有しているが、γ−セクレターゼ活性阻害作用は有しないと判定することになる。
【００５６】
Ａβ総量は、特異的な抗体等を用いて免疫反応、例えば、ＥＬＩＳＡにおいてはＩＢＬ社Ａβ１−Ｘ  ＥＬＩＳＡなどを利用することができ、例えば免疫染色法においてはＡβ断片と結合する抗Ａβ抗体４Ｇ８（Ｃｏｖａｎｃｅ）とプロテインＧセファロース（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）と混合させ、適切な条件（例えば、４℃で一晩）免疫沈降し、適切な条件で洗浄し（たとえば、洗浄緩衝液（ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６，１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、２  ｍＭ  ＥＤＴＡ、Ｒｏｃｈｅ製  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で５回洗浄、３回超純水で洗浄）することによって精製されたものを、Ａβ  Ｎ末端断端抗体である８２Ｅ１（ＩＢＬ）を用いた免疫染色法によって検出ないしは定量することができる。
【００５７】
あるいは、本発明のスクリーニング方法において、対象となる候補物質は、どのような物質を用いてもよいが、１つの実施形態としては、Ａβ断片の総量に影響を与えないことが知られ、および／またはＡβ４２の産生を（好ましくは選択的に）阻害することが知られている物質を用いることが好ましい。このような候補物質を用いることにより、該候補物質の非存在下における該切断ペプチドの量またはレベルとの比較において、該候補物質の存在下における該切断ペプチドの量またはレベルが変わらないかまたは増加することを確認すれば、γ−セクレターゼの修飾物質を確定することができるからである。
【００５８】
この方法において、γ−セクレターゼの活性の測定は、当該分野において公知または本明細書において説明する任意の手法によって実現することができる。
【００５９】
本発明における基質ペプチドおよび切断ペプチドの一方または双方、あるいはＡβ４２またはこれらを含めたＡβ断片の総量またはレベル等の測定は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  γ−セクレターゼアッセイ系によって実施することができる。例えば、そのようなアッセイ系では、適切な緩衝液（例えば、Ｒｏｃｈｅ社から入手可能なＢｕｆｆｅｒ  Ｃ（３００ｍＭクエン酸，ｐＨ６．０，５００ｍＭスクロース，０．５％ＣＨＡＰＳＯ，０．２％ホスファチジルコリン，２０ｍＭベスタチン（Ｂｅｓｔａｔｉｎ），２０ｍＭアマスタチン（Ａｍａｓｔａｔｉｎ），１０ｍＭフェナンスロリン（Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ），２０ｍＭカプトプリル（Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ），ｘ１０  Ｒｏｃｈｅ製  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ））を用い、公知の方法で入手可能な酵素であるγ−セクレターゼ複合体（例えば、Ｋａｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００６  Ｍａｙ  ２６；２８１（２１）：１４７７６−８６．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ａｐｒ  ４．により、培養細胞の粗精製膜分画から界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳＯ）で抽出した膜タンパク質分画を抗ｎｉｃａｓｔｒｉｎ抗体で免疫沈降法により精製したもの等）を用いて実施することができる。反応は適切な緩衝液（例えば、上述のＢｕｆｆｅｒ  Ｃ）で希釈した酵素（例えば、精製γ−セクレターゼ酵素）に適切な基質ペプチド（例えば、Ａβ４２（配列番号１のアミノ酸１〜４２位からなる。））を加え、適切な時間および温度（例えば、３７℃、１時間）インキュベーションを行うことによって実施することができる。またγ−セクレターゼ特異的切断かどうかを検討するためコントロールとしてγ−セクレターゼ阻害剤（例えば、ＤＡＰＴ（ペプチド研から入手可能））を適切な最終濃度（例えば、１０μＭ）添加した実験も行うことによって対照実験を実施することができる。反応後、適切な方法で（例えば、氷上に置くことで）反応停止し、そのサンプル上清を適切な分析方法（例えば、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ解析）に供することによって分析を行うことができる
分析に際しては、サンプルは、適宜精製して、その精度を上げることもできる。たとえば、サンプル（酵素反応液）の一部は、切断ペプチドまたは基質ペプチドあるいはその両方に結合する適切な特異的結合物質（例えば、抗Ａβ抗体４Ｇ８（Ｃｏｖａｎｃｅ））とプロテインＧセファロース（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）と混合させ、適切な条件（例えば、４℃で一晩）免疫沈降し、適切な条件で洗浄し（たとえば、洗浄緩衝液（ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６，１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、２  ｍＭ  ＥＤＴＡ、Ｒｏｃｈｅ製  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で５回洗浄、３回超純水で洗浄）することによって精製することができる。免疫沈降産物は適切な条件（例えば、三フルオロ酢酸／アセトニトリル／水（１：２０：２０））で溶出した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ等を用いて質量分析を実施することができる。
【００６０】
あるいは、切断ペプチドは、特異的な抗体等を用いて免疫反応（例えば、ＥＬＩＳＡ、例えば、ｄｅ  ｎｏｖｏ  Ａβ３８はＩＢＬ社Ａβ３８  ＥＬＩＳＡなどを利用することができる）により同定および／または検出ないしは定量することができる。
【００６１】
このように、γ−セクレターゼの切断量または切断レベルに対する候補物質の影響は、免疫染色等によって検出することができ、本発明では、このような検出方法も利用することができる。しかし、γ−セクレターゼによる切断は、複数の切断ペプチドの生成（主な切断部位とその周囲のマイナーな切断部位群）を伴う。この切断の正確さに対する薬剤の影響を見るためには、質量分析方法を用いることが好ましい。質量分析方法としては、公知の手法を用いることができる（例えば  Ｗａｎｇ  Ｒ，Ｓｗｅｅｎｅｙ  Ｄ，Ｇａｎｄｙ  ＳＥ，Ｓｉｓｏｄｉａ  ＳＳ．Ｔｈｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９６  Ｄｅｃ  １３；２７１（５０）：３１８９４−９０２．）。ただし、正確な質量分析を可能にするためには、産生されるフラグメントの長さを短くする必要があることから、産生されるフラグメントの長さを精度よく質量分析できる程度の長さに短く設計した変異体を用いることが好ましく、このような用途に本発明は適している側面を有する。
【００６２】
質量分析を用いる利点は、細胞なしで産生されたペプチドフラグメントの断端を正確に決定できることと同時に質量分析スペクトラムから断端の異なるフラグメントの存在比率が一目瞭然となることが挙げられ、これに加えその存在比率は主な切断部位とその周囲のマイナーな切断部位群に対する候補物質の直接的効果を反映していることもその特徴として挙げることができる。
【００６３】
このようにして分析された結果から、候補物質の非存在下および存在下における、該基質ペプチド量、該切断ペプチドの量、および該基質ペプチド量と該切断ペプチドとの比率からなる群より選択される少なくとも１つを対比し、候補物質の存在下において、候補物質の非存在下に比べた場合において、該基質ペプチドの量の減少、該切断ペプチドの量の増加、および該基質ペプチドの該切断ペプチドに対する比率の減少からなる群より選択される少なくとも１つの現象が見られた場合に該候補物質がγ−セクレターゼ活性を活性化する物質であると判断し、あるいは、該基質ペプチドの量の不変または減少、該切断ペプチドの量の不変または増加、および該基質ペプチドの該切断ペプチドに対する比率の不変または減少からなる群より選択される少なくとも１つの現象が見られた場合に該候補物質がγ−セクレターゼ活性を修飾する物質であると判断し、該基質ペプチドの量の増加、該切断ペプチドの量の減少、および該基質ペプチドの該切断ペプチドに対する比率の増加からなる群より選択される少なくとも１つの現象が見られた場合に該候補物質がγ−セクレターゼ活性の阻害物質であると判断することができる。
【００６４】
本発明では、別の局面では、（Ａ）工程の後、基質ペプチドの量を測定することによって、γ−セクレターゼに対する効果があるかどうかを決定することができる。したがって、（Ｂ）工程では、例えば、切断ペプチド、基質ペプチドまたはその両方を定量または検出することができる。候補物質の非存在下における基質ペプチドのレベルまたは量との比較した場合に、候補物質の存在下での該基質ペプチドの消失または基質ペプチドの増減は、該候補物質がγ−セクレターゼの修飾物質または阻害物質等であることの指標である。候補物質の非存在下における切断ペプチドのレベルまたは量との比較した場合に、候補物質の存在下での該切断ペプチドの消失または切断ペプチドの増減は、該候補物質がγ−セクレターゼの修飾物質または阻害物質等であることの指標である。基質ペプチドについては、通常酵素反応とともに減少すべきであるところ、候補物質の存在によって、その減少量が低下する（すなわち、（候補物質なしでの）基準値より基質ペプチドが増える）ことは、酵素反応が抑制（阻害）されることの証拠であり、他方、候補物質の存在によって、その減少量が増大する（すなわち、（候補物質なしでの）基準値より基質ペプチドが減少する）ことは、酵素反応が修飾されることの証拠である。同様に、切断ペプチドについては、通常酵素反応とともに増加すべきであるところ、候補物質の存在によって、その増加量が低下する（すなわち、（候補物質なしでの）基準値より切断ペプチドが減少する）ことは、酵素反応が抑制（阻害）されることの証拠であり、候補物質の存在によって、その増加量が増大する（すなわち、（候補物質なしでの）基準値より切断ペプチドが増加する）ことは、酵素反応が活性化されることの一つの証拠であり、候補物質の存在によって、その増加量が変動しないかまたは増大すること（すなわち、（候補物質なしでの）基準値より切断ペプチドが変わらないかまたは増加する）ことは、酵素反応が修飾されることの一つの証拠である。このような修飾活性を有する物質または因子は、γ−セクレターゼ修飾物質は酵素活性自体は阻害せず、かつＡβ４２の産生を選択的に阻害し、Ａβ断片の総量への影響はほとんどないことが好ましく、このような好ましい修飾物質は、より副作用の少ない安全な医薬となる可能性があるという点でも有望である。したがって、本発明のスクリーニング方法の局面においても、本発明の好ましい実施形態では、さらに、Ａβ断片の総量または総レベルを測定し、その増減を測定する工程を含む。Ａβ断片の総量または総レベルが変動していない場合、その対象となる候補物質は、γ−セクレターゼの「修飾活性」を有すると判定することができる。加えて、この局面においても、本発明の好ましい実施形態では、本発明のスクリーニング方法において、さらに、Ａβ４２の量またはレベルを測定し、その増減を測定する工程を含む。ここで、Ａβ４２の量またはレベルの産生がコントロールに比べて減少する場合、すなわち、Ａβ４２の産生が阻害される場合、その対象となる候補物質は、γ−セクレターゼの「阻害活性」を有すると判定することができる。ここで、Ａβの量またはレベル、Ａβ４２の量またはレベルの測定は、他の切断ペプチド、基質ペプチドと同様、免疫学的または物理化学的（質量分析などを含む）に行なうことができることが理解される。
【００６５】
あるいは、この局面の本発明のスクリーニング方法においても、対象となる候補物質は、どのような物質を用いてもよいが、１つの実施形態としては、Ａβ断片の総量に影響を与えないことが知られ、および／またはＡβ４２の産生を（好ましくは選択的に）阻害することが知られている物質を用いることが好ましい。このような候補物質を用いることにより、該候補物質の非存在下における該切断ペプチドの量またはレベルとの比較において、該候補物質の存在下における該切断ペプチドの量またはレベルが変わらないかまたは増加することを確認すれば、γ−セクレターゼの修飾物質を確定することができるからである。
【００６６】
本発明のいずれの局面のスクリーニング方法においても、１つの具体的な実施形態では、本発明の工程（Ｂ）において、該候補物質の非存在下における該切断ペプチドの量またはレベルとの比較において、該候補物質の存在下における該切断ペプチドの量またはレベルが変わらないかまたは増加するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの修飾物質であると判断し、該切断ペプチドの量またはレベルが減少するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの阻害物質であると判断する。
【００６７】
本発明のいずれの局面のスクリーニング方法の１つの実施形態では、本発明の工程（Ｂ）において、該候補物質の非存在下における該切断ペプチドの量またはレベルとの比較において、該候補物質の存在下における該切断ペプチドの量またはレベルが変わらないかまたは増加するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの修飾物質であると判断する。
【００６８】
本発明のいずれの局面のスクリーニング方法の１つの実施形態ではまた、本発明の工程（Ｂ）において、該候補物質の非存在下における該切断ペプチドの量またはレベルとの比較において、該候補物質の存在下における該切断ペプチドの量またはレベルが減少するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの阻害物質であると判断する。
【００６９】
１つの具体的な実施形態としては、本発明は、（Ａ）配列番号１の部分配列を含むペプチド配列であって、γ−セクレターゼにより切断されるペプチド配列を含む基質ペプチドに、γ−セクレターゼを候補物質の非存在下および存在下で接触させ、配列番号１の３７位、３８位または４０位で終わる配列からなる切断ペプチドを得る工程；ならびに（Ｂ）該候補物質の非存在下における該切断ペプチドの量またはレベルとの比較において、該候補物質の存在下における該切断ペプチドの量またはレベルが変わらないかまたは増加するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの修飾物質であると判断し、該切断ペプチドの量またはレベルが減少するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの阻害物質であると判断する、工程を包含する、γ−セクレターゼの修飾物質または阻害物質のスクリーニング方法を提供する。
【００７０】
また、別の具体的な実施形態としては、本発明は、（Ａ）配列番号２の部分配列を含むペプチド配列であって、γ−セクレターゼにより切断される配列を含む基質ペプチドに、γ−セクレターゼを候補物質の非存在下および存在下で接触させ、配列番号２の２５位で終わる配列からなる切断ペプチドを得る工程；ならびに（Ｂ）該候補物質の非存在下における該切断ペプチドの量またはレベルとの比較において、該候補物質の存在下における該切断ペプチドの量またはレベルが変わらないかまたは増加するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの修飾物質であると判断し、該切断ペプチドの量またはレベルが減少するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの阻害物質であると判断する、工程を包含する、γ−セクレターゼの修飾物質または阻害物質のスクリーニング方法を提供する。
【００７１】
他の実施形態では、本発明は、（Ａ）配列番号３の部分配列を含むペプチド配列であって、γ−セクレターゼにより切断される配列を含む基質ペプチドに、γ−セクレターゼを候補物質の非存在下および存在下で接触させ、配列番号３の２１位で終わる配列からなる切断ペプチドを得る工程；ならびに（Ｂ）該候補物質の非存在下における該切断ペプチドの量またはレベルとの比較において、該候補物質の存在下における該切断ペプチドの量またはレベルが変わらないかまたは増加するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの修飾物質であると判断し、該切断ペプチドの量またはレベルが減少するとき、該候補物質がγ−セクレターゼの阻害物質であると判断する、工程を包含する、γ−セクレターゼの修飾物質または阻害物質のスクリーニング方法を提供する。
【００７２】
種々の実施形態では、本発明の上記スクリーニング方法において、基質ペプチドとしては、γ−セクレターゼによる酵素反応によって、配列番号１の３７位、３８位または４０位で終わる配列からなる切断ペプチド、配列番号２の２５位で終わる配列からなる切断ペプチドおよび配列番号３の２１位で終わる配列からなる切断ペプチドが生じる基質であれば、どのようなものでも利用することができることが理解される。そのような基質ペプチドとしては、例えば、配列番号１の４０位、４２位、４３位、４５位、４６位などで終わる配列からなるものを挙げることができる。基質ペプチドの長さとしては、例えば、配列番号１の部分配列を有するものであれば、例えば、１５アミノ酸以上、１６アミノ酸以上、１７アミノ酸以上、１８アミノ酸以上、１９アミノ酸以上、２０アミノ酸以上、２１アミノ酸以上、２２アミノ酸以上、２３アミノ酸以上、２４アミノ酸以上、２５アミノ酸以上、２６アミノ酸以上、２７アミノ酸以上、２８アミノ酸以上、２９アミノ酸以上、３０アミノ酸以上、３１アミノ酸以上、３２アミノ酸以上などの長さを挙げることができ、上限としては、４２アミノ酸以下、４３アミノ酸以下、４４アミノ酸以下、４５アミノ酸以下、４６アミノ酸以下、４７アミノ酸以下、４８アミノ酸以下、４９アミノ酸以下、あるいは全長でありうる。理論に束縛されることは望まないが、本発明では、１１から４２位のアミノ酸配列を含むものが基質ペプチドとして機能することが証明されており、また、Ａβ２８−５５が基質として切断されうることが知られている（ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＵＧＵＳＴ  １０，２００７、ＶＯＬＵＭＥ  ２８２、ＮＵＭＢＥＲ  ３２  Ｐ２３６３９）ことから、２８よりＣ末端側のアミノ酸配列があれば、基質として機能しうると期待されることから、これに近似した長さであれば、γ−セクレターゼによって認識されうる構造を保持しうると予測されるからである。配列番号２の２５位で終わる配列からなる切断ペプチドおよび配列番号３の２１位で終わる配列からなる切断ペプチドが生じるものであれば、配列番号２および配列番号３のアミノ酸１位から始まるもののほか、γ−セクレターゼによって認識されうる構造を保持しうる長さであれば、全長でなくてもよく、２位、３位、４位などで始まるものであってもよい。
【００７３】
また、本発明において使用されうる基質ペプチドは、配列番号１、２または３において、γ−セクレターゼに対する基質としての作用を保持する限り、１または数個、あるいは１以上のアミノ酸の置換、欠失および／もしくは付加を含んでいてもよいことが理解される。
【００７４】
１つの実施形態では、切断ペプチドは、配列番号１の３７位または３８位で終わる配列からなるペプチドの少なくとも１つを含んでいてもよい。これらの配列で終わる配列（例えば、配列番号１のアミノ酸１位〜３７位からなるペプチド、あるいは配列番号１のアミノ酸１位〜３８位からなるペプチド等）は、γ−セクレターゼによる切断によって生じることがこれまで知られていなかった。したがって、これらの配列を測定することで、γ−セクレターゼの修飾物質または阻害物質等を同定することができることによって、従来にない方法が提供されることが理解される。
【００７５】
また、基質ペプチドとして、配列番号１の４５位で終わる配列からなるペプチド（例えば、配列番号１の１位〜４５位からなるペプチド）を用いた場合に、切断ペプチドとして、配列番号１の４０位で終わる配列からなるペプチド（例えば、配列番号１の１位〜４０位からなるペプチド）が生じることも従来知られておらず、このような配列を測定することで、γ−セクレターゼの修飾物質または阻害物質等を同定することができることは、従来にない方法を提供することが理解される。
【００７６】
１つの具体的な実施形態では、基質ペプチドは配列番号１の１〜４０位のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１の１〜４２位のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１の１１〜４２位のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１の１〜４３位のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１の１〜４５位のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１の１〜４６位のアミノ酸配列、配列番号２からなるペプチド（ＡＰＬ１β２８）および配列番号３からなるペプチド（Ｎβ２５）からなるペプチドの１または複数を含みうる。
【００７７】
特に、配列番号１の１〜４０位のアミノ酸配列からなるペプチドを基質ペプチドとして用いた場合に、配列番号１の１〜３７位のアミノ酸配列からなるペプチドが切断ペプチドとして使用されうること；配列番号１の１〜４２位のアミノ酸配列からなるペプチドを基質ペプチドとして用いた場合に、配列番号１の１〜３８位のアミノ酸配列からなるペプチドが切断ペプチドとして使用されうること；配列番号１の１〜４３位のアミノ酸配列からなるペプチドを基質ペプチドとして用いた場合に、配列番号１の１〜３８位のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号１の１〜４０位のアミノ酸配列からなるペプチドが切断ペプチドとして使用されうること；配列番号１の１〜４５位のアミノ酸配列からなるペプチドを基質ペプチドとして用いた場合に、配列番号１の１〜３８位のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号１の１〜４０位のアミノ酸配列からなるペプチドが切断ペプチドとして使用されうること；配列番号１の１〜４６位のアミノ酸配列からなるペプチドを基質ペプチドとして用いた場合に、配列番号１の１〜３８位のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号１の１〜４０位のアミノ酸配列からなるペプチドが切断ペプチドとして使用されうることは従来知られておらず、特異的評価系としては、従来技術からは予想できないということができる。
【００７８】
したがって、１つの具体的な実施形態では、本発明のスクリーニング方法では、（１）配列番号１の１〜４０位のアミノ酸配列からなるペプチドを基質ペプチドとして用い、配列番号１の１〜３７位のアミノ酸配列からなるペプチドを切断ペプチドとして使用することができる。また、別の具体的な実施形態では、（２）配列番号１の１〜４２位のアミノ酸配列からなるペプチドを基質ペプチドとして用い、配列番号１の１〜３８位のアミノ酸配列からなるペプチドを切断ペプチドとして使用することができる。他の具体的な実施形態では、配列番号１の１〜４３位のアミノ酸配列からなるペプチドを基質ペプチドとして用い、配列番号１の１〜３８位のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号１の１〜４０位のアミノ酸配列からなるペプチドを切断ペプチドとして使用することができる。さらなる具体的な実施形態としては、（４）配列番号１の１〜４５位のアミノ酸配列からなるペプチドを基質ペプチドとして用い、配列番号１の１〜３８位のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号１の１〜４０位のアミノ酸配列からなるペプチドを切断ペプチドとして使用することができる。さらに別の具体的な実施形態では、配列番号１の１〜４６位のアミノ酸配列からなるペプチドを基質ペプチドとして用い、配列番号１の１〜３８位のアミノ酸配列からなるペプチドおよび配列番号１の１〜４０位のアミノ酸配列からなるペプチドを切断ペプチドとして使用することができる。さらに別の具体的な実施形態では、配列番号２からなるペプチド（ＡＰＬ１β２８）を基質ペプチドをして用い、配列番号２の１位〜２５位からなるペプチド（ＡＰＬ１β２５）を切断ペプチドとして用いることができる。さらに別の具体的な実施形態では、配列番号３からなるペプチド（Ｎβ２５）を基質ペプチドをして用い、配列番号３の１位〜２１位からなるペプチド（Ｎβ２１）を切断ペプチドとして用いることができる。これらの基質ペプチドおよび切断ペプチドは組み合わせて用いてもよい。
【００７９】
１つの実施形態では、本発明の基質ペプチドは、精製または単離されていることが好ましい。他のペプチド等と夾雑している場合、例えば、天然物等では、測定時に誤差が生じうるからである。
【００８０】
本明細書において「単離された」物質（例えば、核酸またはタンパク質などのような生物学的因子）とは、その物質が天然に存在する環境（例えば、生物体の細胞内）の他の物質（好ましくは、生物学的因子）（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
【００８１】
本明細書において「精製された」物質（例えば、核酸またはタンパク質などのような生物学的因子）とは、その物質に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された物質におけるその物質の純度は、その物質が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
【００８２】
本明細書において「精製された」および「単離された」とは、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の物質が存在することを意味する。
【００８３】
１つの実施形態では、本発明の方法において、酵素への基質ペプチドへの接触は、界面活性剤の存在下で行われる。理論に束縛されることを望まないが、その理由としては、界面活性剤の存在により、酵素への基質ペプチドの暴露がスムーズになり、候補物質の影響がより顕著に観察することができることが挙げられる。上記界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳＯが使用される。特に、その使用濃度としては、０．１２５％〜１％が通常使用され、好ましくは、一例を挙げるとＡβ４２からＡβ３８を産生させるとき０．４％〜０．６％が使用されるがこれらに限定されない。理論に束縛されることを望まないが、この範囲で、反応効率がよいことが示されており、特に、Ａβ４２からＡβ３８を産生させるとき０．５％のとき最も反応効率が良いことが実証されていること、および直線性（線形性）が特に顕著に見られているからである。
【００８４】
１つの実施形態では、このような接触の時間としては、前記接触は、１０〜４０分間、あるいは１０分間〜２０分間が挙げられるがそれに限定されない。理論に束縛されることを望まないが、これらの範囲では、直線性（線形性）を保つことが実証されているからである。
【００８５】
本発明のスクリーニングに供されうる候補物質を合成するための素材および合成の各ステップにおいて用いる方法は、周知であり、当業者は合成、単離、精製等を適宜行なって目的とする化合物を適宜製造することができる。また大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞の自体公知の宿主を利用した遺伝子組み換え技術によって、本発明の化合物のポリペプチド部分を製造することも可能である。このようなポリペプチドは、ペプチド配列をコードする遺伝子を組込んだ発現ベクターを、形質転換により宿主細胞に導入し、発現させることにより、製造することができる。このようなポリペプチドは、精製または単離して使用してもよく、そのままスクリーニングに使用してもよい。あるいは、このような本発明の基質ペプチドを発現させた宿主細胞自体を用いてスクリーニングをしてもよい。化学合成としては、例えば、公知の方法に基づいて行なうことができ、目的とする化合物が得られる限り、いかなる方法を用いてもよい。例えば周知の方法であるＢｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）化反応、ＤＭＳＯ酸化、アルカリ反応、酸性反応、エポキシ化反応、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、アルキル化反応、ケン化反応、加熱反応、脱炭酸反応、縮合反応、逆相高速液体クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて行なうことができる。例示としては、例えば、本発明の対象となる候補物質の構造要素部分を順次反応させ、コンビナトリアルケミストリーなどにより効率と反応物純度の検定を適宜実施する方法を行なってもよい。
【００８６】
このような本発明の基質ペプチドを発現させた宿主細胞自体を用いてスクリーニングする場合、以下のような形態が考慮される。
【００８７】
１つの具体的な実施形態としては、細胞膜上にＡβ４２を発現させる場合の例として、γ−セクレターゼの作用でＡβ３８が産生されるか以下のように実施することができる。βＡＰＰ−ＣＴＦを発現させるプラスミドにおいて、βＡＰＰ−ＣＴＦ遺伝子（配列番号１）中４３番目のコドンをストップコドンに改変し、Ａβ４２を発現するプラスミドを作製することができる。別の基質ペプチド（例えば、Ａβ４５）を使用する場合は、適宜ストップコドン（配列番号１の４６番目）を移動させて改変体を製造することができる。
【００８８】
染色体のβＡＰＰ遺伝子をノックアウトしたマウス胎児線維芽細胞（βＡＰＰ−ＫＯ  ＭＥＦ）にこのプラスミドを導入することができる。Ａβ４２等の上記改変体を発現するコンストラクトを持つβＡＰＰ−ＫＯ  ＭＥＦおよび持たないβＡＰＰ−ＫＯ  ＭＥＦの培養上清をＥＬＩＳＡ法により定量することができる（Ａβ抗体を使用）。その結果コンストラクトを持つβＡＰＰ−ＫＯ  ＭＥＦ培養上清のみから、Ａβ４２およびＡβ３８を検出することができる。コンストラクトを持つβＡＰＰ−ＫＯ  ＭＥＦにγ−セクレターゼ阻害剤（例えば、Ｌ−６８５，４５８等）を添加した場合Ａβ３８産生が抑制されることを確認することによって、γ−セクレターゼの作用によりＡβ４２からＡβ３８が生じることを実証することができる。
【００８９】
本発明のスクリーニングに供されうる候補物質は、合成や精製を促進するための修飾、物理・化学的安定化を促進するための修飾、生体内の代謝に対する安定性と不安定性、条件付けの等の活性化修飾、更には、脳血管関門通過を含む臓器搬送効率の高進と低下をもたらす制御修飾を含むものであってよい（Ｓｃｈｗａｒｚｅ，Ｓ．Ｒ．，Ｈｏ，Ａ．，Ｖｏｃｅｒｏ−Ａｋｂａｎｉ，Ａ．＆Ｄｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−１５７２）。
【００９０】
本発明のスクリーニングに供されうる候補物質のその他の修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合、脱メチル化、交差架橋共有結合形成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、脂質結合、硫酸化、セレノイル化、アルギニル化のようなトランスファーＲＮＡ媒介のタンパクへのアミノ酸の添加、ならびにユビキチネーション等があり、適宜使用することができる。
【００９１】
（γ−セクレターゼの修飾物質または阻害物質等のスクリーニングのための組成物およびキット）
１つの局面において、本発明は、γ−セクレターゼによる酵素反応によって、配列番号１の３７位、３８位または４０位で終わる配列からなる切断ペプチド、配列番号２の２５位で終わる配列からなる切断ペプチドおよび配列番号３の２１位で終わる配列からなる切断ペプチドのうち１つまたは複数を生じる基質ペプチドを含むγ−セクレターゼの活性を調節する因子である修飾物質または阻害物質等の評価のための組成物を提供する。本組成物において使用される基質ペプチドおよび／または切断ペプチドは、本明細書において（医薬探索方法）の節において説明した任意の実施形態を採用することができる。
【００９２】
１つの具体的な実施形態では、本発明の組成物は、γ−セクレターゼにより切断されるペプチド配列を含む基質ペプチドを含み、該基質ペプチドは配列番号１の部分配列を含み、配列番号１の４０位または４２位で終わる配列からなるペプチド（例えば、配列番号１の１〜４０位のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１の１〜４２位のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１の１１〜４２位のアミノ酸配列からなるペプチド）、配列番号２の配列からなるペプチド（ＡＰＬ１β２８）、および配列番号３の配列からなるペプチド（Ｎβ２５）からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含む。
【００９３】
別の局面において、本発明は、γ−セクレターゼによる酵素反応によって、配列番号１の３７位、３８位または４０位で終わる配列からなる切断ペプチド、配列番号２の２５位で終わる配列からなる切断ペプチドおよび配列番号３の２１位で終わる配列からなる切断ペプチドのうち１つまたは複数を生じる基質ペプチドを含むγ−セレクターゼの修飾物質または阻害物質等の評価のためのキットを提供する。本組成物において使用される基質ペプチドおよび／または切断ペプチドは、本明細書において（医薬探索方法）の節において説明した任意の実施形態を採用することができる。この組成物またはキットは、従来の方法において、γ−セクレターゼの阻害物質、修飾物質等を効率的にスクリーニングすることが困難とされていたという課題を解決し特異的な修飾物質または阻害物質等を簡便に評価することができるという点で好ましい。
【００９４】
１つの具体的な実施形態では、本発明のキットは、γ−セクレターゼにより切断されるペプチド配列を含む基質ペプチドを含み、該基質ペプチドは配列番号１の部分配列を含み、配列番号１の４０位または４２位で終わる配列からなるペプチド（例えば、配列番号１の１〜４０位のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１の１〜４２位のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１の１１〜４２位のアミノ酸配列からなるペプチド）、配列番号２の配列からなるペプチド（ＡＰＬ１β２８）、および配列番号３の配列からなるペプチド（Ｎβ２５）からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドを含む。
【００９５】
本発明のキットは、その使用方法を明示した指示書が添付されていてもよい。本明細書において「指示書」は、本発明のスクリーニング方法などを利用者に対して記載したものである。この指示書は、本発明の基質ペプチド、酵素などを例えば、どのように候補物質または被験物質（たとえば、有機低分子のライブラリー）に暴露し、どのように、切断ペプチドを測定し、評価するべきかを指示する文言が記載されている。この指示書は、必要に応じて、本発明が実施される国の監督官庁が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【００９６】
また、指示書には、（医薬探索方法）の節において説明したような、判定方法に関する説明がなされていてもよい。
【実施例】
【００９７】
以下の実施例で用いた動物の取り扱いは、大阪大学において規定される規準を遵守した。実施例において使用した物質、試薬等は、格別の記載がない場合、Ｒｏｃｈｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、和光純薬、ナカライテスク等から入手したものを用いた。Ａβ４２などの合成基質は、ペプチド研究所（ペプチド研）（大阪、日本）あるいはＡＮＡＳＰＥＣ社（サンフランシスコ、アメリカ）から入手した。
【００９８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製の  Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥＲＰを用いて実施した。
【００９９】
（製造例）
本例では、実施例において試験されるべき化合物Ａ，ＢおよびＣを製造する例を説明する。
【０１００】
【表１】
2012085602.tif 000002
【０１０１】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物Ａ、ＢおよびＣは、以下に示す合成ルートによって製造した。
【０１０２】
【化１】
2012085602.tif 000003
【０１０３】
ここで、化合物Ａ、ＢおよびＣについては、以下のとおりである。
【０１０４】
（化合物Ａ）
式（Ｉ）中
Ｌ＝−ＳＯ２ＮＨ−
Ａｋ１およびＡｋ２はいずれも単結合
Ａはベンゼン環（フェニル）、Ｒ２、Ｒ３，Ｒ４はＨ
Ｃ＝４−メチルイミダゾリル（Ａ（フェニル）に対して４−置換）
Ｂ＝２，５−ジメチルチアゾリルチオフェン
ＤがＳＯ２−Ｃｌであり、ＥがＮＨ２である。
【０１０５】
（化合物Ｂ）
式（Ｉ）中
Ｌ＝−ＳＯ２ＮＨ−
Ａｋ１およびＡｋ２はいずれも単結合
Ａはベンゼン環、Ｒ２はメトキシ（３−置換）、Ｒ３，Ｒ４はＨ
Ｃ＝４−メチル置換イミダゾリル（４−置換）
Ｂ＝２−（４−メチルフェニル−オキシ）置換フェニル
ＤがＳＯ２−Ｃｌであり、ＥがＮＨ２である。
【０１０６】
（化合物Ｃ）
式（Ｉ）中
Ｌ＝−ＳＯ２ＮＨ−
Ａｋ１およびＡｋ２はいずれも単結合
Ａはベンゼン環、Ｒ２はメトキシ（３−置換）、Ｒ３，Ｒ４はＨ
Ｃ＝４−メチル置換イミダゾリル（４−置換）
Ｂ＝２−（４−エチルフェニル）置換フェニル
ＤがＳＯ２−Ｃｌであり、ＥがＮＨ２である。
【０１０７】
化合物Ａ、ＢおよびＣは、それぞれ公知化合物であるかまたは公知化合物から常法により得られる化合物である、化合物ａおよび化合物ｂを反応させることにより製造した。
【０１０８】
例えば化合物ａは、化合物Ａ、ＢおよびＣにおいて示される各置換基を有するハロゲノスルホニル化合物であり、化合物ｂは、化合物Ａ、ＢおよびＣにおいて示される各置換基を有するアミン化合物である。化合物ａは塩酸塩または臭素酸塩等の塩であってもよいが本実施例では、化合物Ａ、ＢおよびＣいずれについても遊離体のものを使用した。反応溶媒兼塩基としてピリジンを用い、室温〜２００℃で適宜反応をさせた。
【０１０９】
このようにして製造した化合物Ａ、ＢおよびＣは、ＮＭＲおよび質量分析データを用いて同一性を確認した。質量分析データは、以下のとおりである。
化合物Ａ：［Ｍ＋Ｈ］＋  ＝  ４３１．１
化合物Ｂ：［Ｍ＋Ｈ］＋  ＝  ４５０．１
化合物Ｃ：［Ｍ＋Ｈ］＋  ＝  ４４８．２
また、これらの化合物Ａ、ＢおよびＣは、以下の手法を用いて、Ａβ４２産生抑制作用を確認した。
【０１１０】
（参考例１  ラット初代神経培養細胞を用いたＡβ４２産生抑制作用）
各試験化合物を初代培養大脳皮質細胞が分泌するＡβ４２産生濃度と細胞生存活性を評価項目として濃度依存的な効果を試験した。分泌Ａβ４２産生量はＥＬＩＳＡで評価を行った。また細胞生存活性は生細胞数測定試薬を用いて評価を行った。初代培養大脳皮質細胞は胎生１８日齢ＳＤ系ラット胎仔より調製した。エーテル麻酔下で頚動脈を切断後、胎仔を取り出し氷冷ＤＭＥＭ（ナカライテスク）／ＰＢＳ中で脳を単離し、さらに顕微鏡下で大脳皮質を単離後、２．５％パパイン（Ｓｉｇｍａ）、０．２％ＤＮａｓｅ（タカラバイオ）を加えた反応液で３７℃、１５分間処理した。酵素反応は非動化ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により停止し、１，０００ｒｐｍ、５分間遠心した。ＤＭＥＭで再懸濁、１，０００ｒｐｍ、５分間遠心した。ペレットに５ｍＬのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２％  Ｂ−２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．５  ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２５  μＭ  Ｌ−グルタミン酸を加え、先をなめしたパスツールピペットでトリチュレーションしＰＬＬコーティングした９６穴プレートに１．６×１０５細胞／１００μｌ／ウェルで播種し、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で１日培養後にｍｅｄｉｕｍ交換した。さらに６日後に化合物を処置した。試験化合物のＤＭＳＯ溶液を最終ＤＭＳＯ濃度１％となるように希釈し最終溶液を１ウェルあたり２００μＬとした。対照化合物としてγ−セクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いた。２４時間後、培養液上清液は回収されＡβ４２測定用ＥＬＩＳＡサンプルとして、適切な希釈を行った後にＥＬＩＳＡに供した。培養細胞は生細胞数測定に用いた。
【０１１１】
ＥＬＩＳＡはＨｕｍａｎ／Ｒａｔ  β  Ａｍｙｌｏｉｄ（４２）ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ＷＡＫＯ（和光純薬）を用いた。方法はメーカー推奨の添付文書に記載の方法にて行った。各サンプルについて対象群の培養上清中Ａβ４２濃度に対する百分率（％  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）を算出し、続いて各試験化合物のＩＣ５０値を算出した。細胞生存活性は生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク）を用いた。方法はメーカー推奨の添付文書に記載の方法にて行った。各サンプルについて対象群の生細胞数に対する百分率（％  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）を算出し、細胞生存活性を評価した。
【０１１２】
（結果）
参考例１の結果、化合物Ａ，Ｂ，ＣはＡβ４２産生抑制作用を有することが分かった。
【０１１３】
（参考例２  試験化合物のγ-セクレターゼ活性阻害作用）
各試験化合物をＨＥＫ−ＡＰＰｓｗｅ細胞でのγ−セクレターゼによるＡＰＰプロセッシング評価、即ちγ−セクレターゼの基質となるＣ−末端フラグメント（ＣＴＦｓ）量を評価項目としてγ−セクレターゼ阻害効果を濃度依存的に試験した（各試験化合物Ａβ４２  ＩＣ５０値の１倍、１０倍、３０倍量濃度の３点）。γ−セクレターゼ阻害により蓄積するＣＴＦｓ産生量はウェスタンブロット（ＷＢ）法で評価を行った。またコントロール対照となるＡＰＰ量も同様に評価を行った。
【０１１４】
ＨＥＫ−ＡＰＰｓｗｅ細胞はＨＥＫ細胞に家族性アルツハイマー病変異のひとつであるスウェーデン変異を有するヒト型ＡＰＰ６９５が遺伝子導入され、安定発現細胞として樹立された。この細胞は１０％  ＦＣＳを含むＤＭＥＭで培養した。ＨＥＫ−ＡＰＰｓｗｅ細胞を６ウェルプレートに１ウェルあたり１．０×１０６個／１ｍＬ  ＤＭＥＭとなるように播種する。同時に試験化合物のＤＭＳＯ溶液をＤＭＥＭ溶液で最終濃度２倍になるように希釈し、この希釈液を１ｍＬ添加し、よく細胞と混和し最終ＤＭＥＭ溶液を１ウェルあたり２ｍＬとした。最終ＤＭＳＯ濃度は１％となるように調製した。対照化合物としてγ−セクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いた。２４時間後、培養細胞は回収されＲＩＰＡバッファーで溶解後、遠心上清（１４０００ｒｐｍ，４℃，１０ｍｉｎ）である細胞抽出液を蛋白質定量Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）で蛋白定量した。細胞抽出液を４×ＳＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）で希釈し５分間煮沸したものを評価サンプルとした。このサンプルを１０−２０％トリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）にてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。蛋白質をＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）に転写した後、５％スキムミルクＰＢＳバッファーを用いてブロッキングしＡＰＰのＣ末端抗体（免疫生物研究所）を用いてＷＢを行った。二次抗体はＨＲＰ標識抗体を用い、ＡＰＰおよびＣＴＦｓの定量はＬＡＳ−３０００（富士フィルム）イメージアナライザーを用いた。定量はＤＭＳＯのみを添加した対照群のＣＴＦｓ／ＡＰＰに対する百分率（％  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）を算出し、続いて各試験化合物のＣＴＦｓ増加量を算出した。このときγ−セクレターゼ活性阻害を有する試験化合物は濃度依存的にγ−セクレターゼ基質であるＣＴＦｓ量を増加させる。
【０１１５】
（結果）
参考例２の結果、化合物Ａ，Ｂ，Ｃはγ−セクレターゼの修飾物質であることが分かった。
【０１１６】
（実施例１．合成Ａβ４２を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断のＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ測定）
確立されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  γ−セクレターゼアッセイ系に合成Ａβ４２を基質として加え，直接的にＡβ４２がＡβ３８の前駆体であるかどうか、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ解析により検討を行った。
【０１１７】
基質となるＡβ４２（ペプチド研）はＨＦＩＰ処理を行いＤＭＳＯ溶解後、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｃ（３００ｍＭクエン酸，ｐＨ６．０，５００ｍＭスクロース，０．５％ＣＨＡＰＳＯ，０．２％ホスファチジルコリン，２０ｍＭベスタチン（Ｂｅｓｔａｔｉｎ），２０ｍＭアマスタチン（Ａｍａｓｔａｔｉｎ），１０ｍＭフェナンスロリン（Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ），２０ｍＭカプトプリル（Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ），ｘ１０  Ｒｏｃｈｅ製Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で最終濃度４７０ｎＭに希釈した。酵素であるγ−セクレターゼ複合体は文献記載（Ｋａｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００６  Ｍａｙ  ２６；２８１（２１）：１４７７６−８６．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ａｐｒ  ４．）の通り培養細胞の粗精製膜分画からＣＨＡＰＳＯで抽出した膜タンパク質分画を抗ｎｉｃａｓｔｒｉｎ抗体で免疫沈降法により精製した。反応はＢｕｆｆｅｒ  Ｃで希釈した精製γ−セクレターゼ酵素に基質Ａβ４２を加え、３７℃、１時間インキュベーションを行った。またγ−セクレターゼ特異的切断かどうかを検討するためγ−セクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴ（ペプチド研）を最終濃度１０μＭ添加した実験も行った。反応後、氷上に置くことで反応停止し、そのサンプル上清をＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ解析に用いた。
【０１１８】
酵素反応液の一部は抗Ａβ抗体４Ｇ８（Ｃｏｖａｎｃｅ）とプロテインＧセファロース（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）とを混合させ、４℃で一晩免疫沈降し洗浄緩衝液（ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６，１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、２  ｍＭ  ＥＤＴＡ、Ｒｏｃｈｅ製Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で５回洗浄し、３回超純水で洗浄した。免疫沈降産物はトリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）／アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）／水（ｗａｔｅｒ）（１：２０：２０）で溶出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析を実施した。
【０１１９】
得られた結果を図２のａ）に示す。３７°Ｃで反応後、基質として合成Ａβ４２を加えたサンプルにはｄｅ  ｎｏｖｏ  Ａβ３８が産生されていることを、ＩＰ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ  解析によって明らかにした。このｄｅ  ｎｏｖｏ  Ａβ３８はγ−セクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴの添加により消失する。それゆえに、γ−セクレターゼはＡβ４２をＡβ３８に切断することが示された。
【０１２０】
（実施例２．合成Ａβ４２を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断のＥＬＩＳＡ測定）
実施例１と同様に、確立されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  γ−セクレターゼアッセイ系に合成  Ａβ４２を基質として加え，直接的にＡβ４２がＡβ３８の前駆体であるか定量的ＥＬＩＳＡ法により検討を行った。
【０１２１】
実施例１と同様の条件で、合成Ａβ４２を基質としたγ−セクレターゼによる酵素反応を行った。ｄｅ  ｎｏｖｏ  Ａβ３８はＩＢＬ社Ａβ３８  ＥＬＩＳＡを用いて測定を行った。酵素反応液の一部を用い、操作手順書に従い定量を実施した。
【０１２２】
得られた結果を図２のｂ）に示す。３７℃で反応後、基質として合成Ａβ４２を加えたサンプルにはｄｅ  ｎｏｖｏ  Ａβ３８が産生されていることを、定量ＥＬＩＳＡ解析によって明らかにした。このｄｅ  ｎｏｖｏ  Ａβ３８はγ−セクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴ  の添加により消失する。それゆえに、γ−セクレターゼはＡβ４２をＡβ３８に切断することが示された。
【０１２３】
（実施例３．合成Ａβ４２を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断の最適条件の検討）
γ−セクレターゼによるＡβ４２からのＡβ３８産生効率において評価系中のＣＨＡＰＳＯ濃度との関連について検討した。
【０１２４】
実施例１の酵素反応条件のうち、ＣＨＡＰＳＯ濃度を０％から１．５％まで条件を変えて、合成Ａβ４２を基質としたγ−セクレターゼによる酵素反応を行った。ｄｅ  ｎｏｖｏ  Ａβ３８  はＩＢＬ社Ａβ３８  ＥＬＩＳＡを用いて測定を行った。酵素反応液の一部を用い、操作手順書に従い定量を実施した。
【０１２５】
得られた結果を図３のａ）に示す。ＣＨＡＰＳＯ濃度０％から０．５％まで反応効率が徐々に上昇し、０．５％のとき最も反応効率が良いこと示された。また０．５％からＣＨＡＰＳＯ濃度を上昇させると徐々に反応効率が下がることも明らかとなった。
【０１２６】
（実施例４．合成Ａβ４２を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断の反応直線性の検討）
γ−セクレターゼによるＡβ４２からのＡβ３８産生において反応時間とＡβ３８産生との関係を検討した。
【０１２７】
実施例１と同様の条件で、合成Ａβ４２を基質としたγ−セクレターゼによる酵素反応を行い、反応開始０、１０、２０、３０および４０分後でのｄｅ  ｎｏｖｏ  Ａβ３８  産生量をＩＢＬ社Ａβ３８  ＥＬＩＳＡを用いて測定を行った。またコントロールとしてγ−セクレターゼ阻害剤であるＬ−６８５，４５８（ペプチド研）１０μＭ添加したサンプルも各時間でｄｅ  ｎｏｖｏ  Ａβ３８産生量を測定した。
【０１２８】
得られた結果を図３のｂ）に示す。時間の経過とともにｄｅ  ｎｏｖｏ  Ａβ３８が産生されていること、また試験を行った時間内では直線性を保つことが示された。一方、Ｌ−６８５，４５８  １０μＭ添加したコントロールでは時間が経過してもｄｅ  ｎｏｖｏ  Ａβ３８産生は認められなかった。
【０１２９】
（実施例５．合成Ａβ３８を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断のＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ測定）
上述の実施例に記載されているように、確立されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  γ−セクレターゼアッセイ系に合成Ａβ３８を基質として加え，直接的にＡβ３８がγ−セクレターゼによって切断されるのかＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ解析により検討を行った。
【０１３０】
実施例１と同様に、合成Ａβ３８を基質としたγ−セクレターゼによる酵素反応を行い、ＣＨＡＰＳＯ濃度を０．１２５％から１．５％まで変えた条件で酵素反応を行った。反応停止後、酵素反応液の一部を実施例１と同様に免疫沈降後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析を実施した。
【０１３１】
得られた結果を図４に示す。全てのＣＨＡＰＳＯ濃度においてもＣ末端の短縮したＡβの新規産生は認められなかった。それゆえ、Ａβ４２とは異なり、γ−セクレターゼはＡβ３８を最早基質として認識しないことが示唆された。
【０１３２】
（実施例６．γ−セクレターゼによる合成Ａβ４２基質切断におけるγ−セクレターゼ修飾薬の影響）
γ−セクレターゼ修飾薬はＡβ４２の比較的（相対）産生比を減少させ、Ａβ３８の比較的産生量を増大させる。またその他いくつかのγ−セクレターゼ修飾薬はＡβ４２の比較的産生を上昇させる。このＡβ４２産生の増減とＡβ３８産生との増減の間に関連性があるか不明である。そこでＡβ４２を基質とする酵素評価系にγ−セクレターゼ修飾薬を添加しＡβ３８産生に影響を与えるか検討した。
【０１３３】
Ａβ４２の比較的産生量を低下させるγ−セクレターゼ修飾薬（阻害剤）として、製造例で製造し、参考例１および２でその活性を確認した化合物Ａ、Ｂ、Ｃを用いた。
【０１３４】
上述のように化合物Ａ，Ｂ，ＣそれぞれについてのＡβ切断変化を解析するため、ＡＰＰ過剰発現培養細胞にこれら化合物を添加し、一定時間培養後の培養上清液を回収した。回収した培養液の一部を抗Ａβ抗体４Ｇ８（Ｃｏｖａｎｃｅから入手した。）とプロテインＧセファロースとを混合させ、４℃で一晩免疫沈降し洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、Ｒｏｃｈｅ製Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で５回洗浄し、３回超純水で洗浄した。免疫沈降産物はトリフルオロ酢酸／アセトニトリル／水（１：２０：２０）で溶出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析を実施した。
【０１３５】
得られた結果を図５のａ）に示す。コントロールと比較し、化合物ＡはＡβ４２の比較的産生比を減少させ、Ａβ３７の比較的産生量を増大させた。化合物ＢはＡβ４２の比較的産生比を減少させ、Ａβ３８の比較的産生量を増大させた。化合物ＣはＡβ４０，Ａβ４２の比較的産生比を減少させ、Ａβ３７，Ａβ３８の比較的産生量を増大させた。
【０１３６】
次に実施例１あるいは２で実施されたＡβ４２を基質とする酵素評価系（ＣＨＡＰＳＯ濃度は０．２５％あるいは０．５％）に上記化合物ＡおよびＢを添加しＡβ３８産生速度に影響を与えるか検討した。ｄｅ  ｎｏｖｏ  Ａβ３８  産生速度変化はＩＰ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ  解析あるいはＩＢＬ社から入手したＡβ３８  ＥＬＩＳＡを用いて測定を行った。
【０１３７】
得られた結果を図５のｂ）およびｃ）に示す。化合物Ｂ添加時のＩＰ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ  解析（図５のｂ））ではＡβ４２からのＡβ３８産生量は何も薬剤を加えていないサンプルでのＡβ３８産生量よりも多かった。この結果は図５のａ）で得られたＡβ切断変化と一致する。また同様にＥＬＩＳＡ測定（図５のｃ））においても，化合物Ｂは何れのＣＨＡＰＳＯ濃度においてもコントロールであるＤＭＳＯ添加サンプルよりもＡβ３８産生量が多かった。一方、図５のａ）でＡβ３８の比較的産生比に影響しない化合物Ａ添加時ではＡβ３８産生量がほとんど増加しなかった。
【０１３８】
これらの結果は「γ−セクレターゼ修飾薬（阻害剤）が少なくとも部分的にはγ−セクレターゼによるＡβ４２からＡβ３８への分解速度を変化させることでＡβ４２の比較的産生量を調節している」ことを示しているとともに、本酵素評価系がＡβ４２固有の産生および分泌メカニズムの提供、ひいてはγ−セクレターゼ修飾薬のメカニズム解明に役立つことを意味している。
【０１３９】
（実施例７．ｉｓｏｔｙｐｅ  Ａβ４２を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断の測定）
確立されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  γ−セクレターゼアッセイ系にｉｓｏｔｙｐｅ  Ａβ４２であるＡβ１１−４２を基質として加え，直接的にＡβ１１−４２がγ−セクレターゼによって切断されるのかＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ解析により検討を行った。
【０１４０】
実施例１と同様に、合成Ａβ１１−４２を基質としたγ−セクレターゼによる酵素反応を行い、ＣＨＡＰＳＯ濃度が０．５％の条件で酵素反応を行った。反応停止後、酵素反応液の一部を実施例１と同様に免疫沈降後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析を実施した。
【０１４１】
得られた結果を図６に示す。３７℃で反応後、基質として合成Ａβ１１−４２を加えたサンプルにはｄｅ  ｎｏｖｏ  Ａβ１１−３８が産生されていることを、ＩＰ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ  解析によって明らかにした。それゆえに、γ−セクレターゼはＡβ１１−４２をＡβ１１−３８に切断することが示された。以上から、少なくとも３２アミノ酸の長さであれば、基質ペプチドとして作用しうることが示唆される。
【０１４２】
（実施例８．合成Ａβ４５を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断の測定）
確立されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  γ−セクレターゼアッセイ系に合成  Ａβ４５を基質として加え，直接的にＡβ４５がγ−セクレターゼによって切断されるのかＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ解析により検討を行った。
【０１４３】
実施例１と同様に、合成Ａβ４５を基質としたγ−セクレターゼによる酵素反応を行い、ＣＨＡＰＳＯ濃度を０．２５％から１．５％まで変え酵素添加ありなしで行った。反応停止後、酵素反応液の一部を実施例１と同様に免疫沈降後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析を実施した。
【０１４４】
得られた結果を図７に示す。ＣＨＡＰＳＯ濃度０．２５％においてＣ末端の短縮したＡβ３８およびＡβ４０の産生が認められた。それゆえに、γ−セクレターゼはＡβ４５を基質としてＣ末端を切断することが示された。Ａβ４５からＣ末端の短縮したＡβ３８およびＡβ４０の産生が見られることは従来知られておらず、本発明において見出された知見であり、このような知見も、本発明のスクリーニング方法において利用しうることが理解される。
【０１４５】
（実施例９．合成Ａβ４０を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断の測定）
上述の実施例において記載されているように、確立されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  γ−セクレターゼアッセイ系に合成  Ａβ４０を基質として加え，直接的にＡβ４０がγ−セクレターゼによって切断されるのかＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ解析により検討を行った。
【０１４６】
実施例１と同様に、Ａβ４０を基質としたγ−セクレターゼによる酵素反応を行い、ＣＨＡＰＳＯ濃度を０．２５％から１．５％まで変えた条件で酵素反応を行った。このとき、実施例６で用いた化合物Ｃを最終濃度２μＭ添加し実験を行った。またγ−セクレターゼ特異的切断かどうかを検討するためγ−セクレターゼ阻害剤であるＬ−６８５，４５８（ペプチド研）を最終濃度１０μＭ添加した実験も行った。反応停止後、酵素反応液の一部を実施例１と同様に免疫沈降後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析を実施した。
【０１４７】
得られた結果を図８に示す。ＣＨＡＰＳＯ濃度０．７５％においてＣ末端の短縮したＡβ３７の産生が認められた。このＡβ３７はγ−セクレターゼ阻害剤であるＬ−６８５，４５８の添加により消失する。それゆえに、γ−セクレターゼはＡβ４０をＡβ３７に切断することが示された。
【０１４８】
（実施例１０．合成Ａβ４３を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断の測定）
上述の実施例において記載されているように、確立されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  γ−セクレターゼアッセイ系に合成  Ａβ４３を基質として加え，直接的にＡβ４３がγ−セクレターゼによって切断されるのかＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ解析により検討を行った。
【０１４９】
実施例１と同様に、Ａβ４３を基質としたγ−セクレターゼによる酵素反応を行い、ＣＨＡＰＳＯ濃度を０．１２５％から１．５％まで変え酵素添加ありなしで行った。反応停止後、酵素反応液の一部を実施例１と同様に免疫沈降後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析を実施した。
【０１５０】
得られた結果を図９に示す。ＣＨＡＰＳＯ濃度０．１２５，０．２５，１．５％においてＣ末端の短縮したＡβ４０の産生が認められた。またＣＨＡＰＳＯ濃度０．５，０．７５％においてＣ末端の短縮したＡβ３８およびＡβ４０の産生が認められた。それゆえに、γ−セクレターゼはＡβ４３をＡβ３８あるいはＡβ４０に切断することが示された。
【０１５１】
（実施例１１．合成Ａβ４６を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断の測定）
上述の実施例において記載されているように、確立されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  γ−セクレターゼアッセイ系に合成  Ａβ４６を基質として加え，直接的にＡβ４６がγ−セクレターゼによって切断されるのかＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ解析により検討を行った。
【０１５２】
実施例１と同様に、Ａβ４６を基質としたγ−セクレターゼによる酵素反応を行い、ＣＨＡＰＳＯ濃度を０．１２５％から１．５％まで変え酵素添加ありなしで行った。反応停止後、酵素反応液の一部を実施例１と同様に免疫沈降後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析を実施した。
【０１５３】
得られた結果を図１０に示す。ＣＨＡＰＳＯ濃度０．７５％においてＣ末端の短縮したＡβ３８およびＡβ４０の産生が認められた。それゆえに、γ−セクレターゼはＡβ４６を基質としてＣ末端を切断することが示された。
【０１５４】
（実施例１２．合成ＡＰＬ１β２８を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断の測定）
ＡＰＬＰ１β分子はＡβ様ペプチドとしてＡＰＬＰ１からＢＡＣＥ１および（ＰＳ）／γ−セクレターゼによる膜内タンパク質分解によって産生され、その中でもＡＰＬ１β２８はＡβ４２のサロゲートマーカーであることが示唆されている。そこで確立されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  γ−セクレターゼアッセイ系に合成ＡＰＬ１β２８を基質として加え，直接的にＡＰＬ１β２８がγ−セクレターゼによって切断されるのかＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ解析により検討を行った。
【０１５５】
実施例１と同様に、合成ＡＰＬ１β２８を基質としたγ−セクレターゼによる酵素反応を行い、ＣＨＡＰＳＯ濃度を０．２５％から１．５％まで変え酵素添加ありなしで行った。このとき、実施例６で用いた化合物Ｃを最終濃度２０μＭ添加し実験を行った。反応停止後、酵素反応液の一部を実施例１と同様に免疫沈降後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析を実施した。
【０１５６】
得られた結果を図１１に示す。ＣＨＡＰＳＯ濃度０．５％においてＣ末端の短縮したＡＰＬ１β２５の産生が認められた。それゆえに、γ−セクレターゼはＡＰＬ１β２８をＡＰＬ１β２５に切断することが示された。
【０１５７】
（実施例１３．合成Ｎβ２５を基質としたγ−セクレターゼによる酵素切断の測定）
Ｎβ２５分子はＡβ様ペプチドとしてＮｏｔｃｈ１からＴＡＣＥおよび（ＰＳ）／γ−セクレターゼによる膜内タンパク質分解によって産生され、その中でもＮβ２５はＡβ４２のサロゲートマーカーとなり得ることが示唆されている。そこで確立されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  γ−セクレターゼアッセイ系にＮβ２５を基質として加え，直接的にＮβ２５がγ−セクレターゼによって切断されるのかＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ解析により検討を行った。
【０１５８】
実施例１と同様に、Ｎβ２５を基質としたγ−セクレターゼによる酵素反応をＣＨＡＰＳＯ濃度０．２５％で酵素添加ありなしで行った。反応停止後、反応液の一部を実施例１と同様に免疫沈降後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析を実施した。
【０１５９】
得られた結果を図１２に示す。Ｃ末端の短縮したＮβ２１の産生が認められた。それゆえに、γ−セクレターゼはＮβ２５をＮβ２１に切断することが示された。
【０１６０】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１６１】
本発明は、γ−セクレターゼの阻害物質、修飾物質等をスクリーニングすることができる方法を提供する。このような方法は、医薬品・製薬産業において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１６２】
配列番号１：アミロイドβ（１−５５）の配列であるDAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IATVIVITLV MLKKK
配列番号２：ＡＰＬ１β２８であるDELAPAGTGVSREAVSGLLIMGAGGGSL
配列番号３：Ｎβ２５であるVKSEPVEPPLPSQLHLMYVAAAAFV
【図１】
2012085602.tif 000004
【図２】
2012085602.tif 000005
【図３】
2012085602.tif 000006
【図４】
2012085602.tif 000007
【図５】
2012085602.tif 000008
【図６】
2012085602.tif 000009
【図７】
2012085602.tif 000010
【図８】
2012085602.tif 000011
【図９】
2012085602.tif 000012
【図１０】
2012085602.tif 000013
【図１１】
2012085602.tif 000014
【図１２】
2012085602.tif 000015
【配列表】
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