(57)【要約】【課題】形成した平面脂質二重膜を長時間にわたり保持できるマイクロ流体デバイス１０を提供する。【解決手段】マイクロ流体デバイス１０は、送液口１２と、送液口１２から延設された主流路１３と、主流路１３の側面に設けられ、８０ｎｍ２以上１２０μｍ２以下の面積の開口部に平面脂質二重膜が形成される複数の微少憩室１４と、主流路１３から延設された貯液槽１７と、を具備する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
送液口と、
前記送液口から延設された主流路と、
前記主流路の壁面に設けられ、８０ｎｍ２以上１２０μｍ２以下の面積の開口部に平面脂質二重膜が形成される複数の微少憩室と、
前記主流路から延設された貯液槽と、を具備することを特徴とするマイクロ流体デバイス。
【請求項２】
前記主流路が、耐有機溶剤性かつ疎水性の材料からなる壁面を有することを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３】
前記微少憩室が、前記開口部と平行な断面の面積が、前記開口部の前記面積よりも大きい形状であることを特徴とする請求項２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項４】
前記開口部の形状が、円形または楕円形であることを特徴とする請求項３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項５】
前記主流路の壁面が、耐有機溶剤性を有する親水性材料からなり、壁面が疎水化処理されていることを特徴とする請求項２または請求項４に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項６】
前記疎水化処理が、シランカップリング剤またはジシラザン剤によることを特徴とする請求項５に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項７】
前記親水性材料が、ガラスまたはシリコンの少なくともいずれかであることを特徴とする請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー、バイオチップ、膜タンパク質分析、創薬スクリーニング、バイオセンサーなどの分野に用いられる脂質二重膜が形成されるマイクロ流体デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体膜の内外で物質輸送／情報伝達に関与する膜タンパク質の機能を、１分子計測によって理解し工学的に応用するためには、単離膜タンパク質が組み込まれた人工脂質二重膜モデル実験系を構築する必要がある。しかし、かかる実験系を構築するには熟練した技術を要する。このため、構築された実験系は、再現性が良くはなく、また、構築のスループットも高くはないことがあった。
【０００３】
発明者らは、特開２００９−１２８２０６号公報において、ＰＤＭＳ（ポリメチルシロキサン）を用いてＭＥＭＳ技術により作製した平面脂質二重膜を有するマイクロ流体デバイス（マイクロフルイディックデバイス）を開示している。このマイクロ流体デバイスは、構築のスループット向上、小型化、分析時間の短縮化、必要な試薬の少量化、および高い再現性等を提供した。
【０００４】
しかし、このマイクロ流体デバイスは、形成した平面脂質二重膜が短時間で破裂してしまうことがあり、安定した実験が容易ではないことがあった。
【０００５】
なお、マイクロ流体デバイスの作製に用いることのできるＭＥＭＳ技術としては、光リソグラフィまたはエッチング等の微細加工技術だけでなく、押印転写法等も用いることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−１２８２０６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＥＥ  Ｔｅｘｔ  センサ・マイクロマシン工学、藤田博之編著、オーム社（２００５）
【非特許文献２】Onoe, H.ら、Journal of Micromechanics and Microengineering, １7: １8１8-１827 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の実施形態は、形成した平面脂質二重膜を長時間にわたり保持できるマイクロ流体デバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様のマイクロ流体デバイスは、送液口と、前記送液口から延設された主流路と、前記主流路の壁面に設けられ、８０ｎｍ２以上１２０μｍ２以下の面積の開口部に平面脂質二重膜が形成される複数の微少憩室と、前記主流路から延設された貯液槽と、を具備する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の一態様によれば、形成した平面脂質二重膜を長時間にわたり保持できるマイクロ流体デバイスを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施形態のマイクロ流体デバイスの構造を示す説明図である。
【図２】実施形態のマイクロ流体デバイスの構造を説明するための分解図である。
【図３】実施形態のマイクロ流体デバイスを有する分析システムを説明するための構成図である。
【図４】実施形態のマイクロ流体デバイスにおける平面脂質二重膜の作製を説明するための説明図である。図３（Ａ）は第１液注入工程を、図３（Ｂ）は第２液注入工程を、図３（Ｃ）は第３液注入工程を示している。
【図５】実施形態のマイクロ流体デバイスの、膜タンパク質が組み込まれた脂質二重膜を説明するための説明図である。
【図６】マイクロ流体デバイスの開口部形状を説明するための説明図である。
【図７】マイクロ流体デバイスの開口部形状を説明するための説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
図１は実施形態のマイクロ流体デバイスの構造を示す説明図であり、図２は流体デバイスの構造を説明するための分解図である。なお、図示の都合上、図２は上下を逆に表示している。
【００１３】
図１および図２に示すように、流体デバイス（以下「流体デバイス」という）１０は、送液口１２と、２本の主流路（マイクロチャネル）１３Ａ、１３Ｂと、複数の微少憩室（マイクロチャンバー）１４と、貯液槽接続部１６と、貯液槽１７と、を具備する。送液口１２から流体デバイス１０の流路に注入された液体は、主流路１３Ａ、３Ｂ／微少憩室１４、および貯液槽接続部１６を介して貯液槽１７に達する。
【００１４】
送液口１２からの流路は、２分岐して並列に配置された２本の主流路１３Ａ、１３Ｂに延設している。以下、主流路１３Ａ、１３Ｂのそれぞれをいうときは主流路１３という。主流路１３の壁面（側面）には、主流路１３への開口部を有する複数の微少憩室１４が設けられている。言い換えれば、主流路１３の側面に形成されている凹部を微少憩室１４という。微少憩室１４は主流路１３の相対する側面に交互に設けられており、主流路１３とともにアレイ部１５を構成している。
【００１５】
主流路１３の側面と微少憩室１４の側面とが、主流路１３および微少憩室１４の、天面と底面との間を柱として支えている。このため、天面と底面との間隔、すなわち、流路の深さ（Ｄ）は一定に保たれている。
【００１６】
図２に示すように、流体デバイス１０は２枚のパイレックス（登録商標）ガラスからなる平板を接合して作製されている。流路は、第１の平板２１に形成された凹部２１Ｖと第２の平板２２と、により形成されている。すなわち、第１の平板２１の凹部２１Ｖが流路の天面および２つの側面を構成し、第２の平板２２が流路の底面を構成している。
【００１７】
また、流体デバイス１０の流路の壁面には、ジシラザン剤による疎水化処理が行われている。すなわち、流体デバイス１０は、流路に、ＨＭＤＳ（ヘキサメチルジシラザン）溶液が流し込まれ、７０℃〜８０℃でベーキング処理されている。
【００１８】
なお、流体デバイス１０は、第１の平板２１および第２の平板２２がガラスからなるため、アレイ部１５を外部から観察できる。
【００１９】
また、ガラスに替えてシリコンを用いて流路の凹部を形成してもよい。シリコンは光透過性を有しないが、ＭＥＭＳ技術による微細加工がガラスよりも容易である。そしてシリコン基板とガラス基板とを接合して流体デバイスを作製すると、ガラス基板側から主流路１３および微少憩室１４が、外部から観察可能である。
【００２０】
さらに、流路の形の貫通部を有するシリコンの両面に、それぞれガラス基板を接合して流体デバイスを作製してもよい。この場合には流体デバイスは３枚の平板により構成される。
【００２１】
２本の主流路１３は、貯液槽接続部１６を介して貯液槽１７に接続されている。貯液槽接続部１６は、幅が主流路１３の幅（Ｗ）の６倍以上の流路と、幅が主流路１３の幅（Ｗ）の３０倍以上まで広がる流路と、により構成されている。第１の平板２１の送液口１２には貫通孔１２Ｈがあり、貫通孔１２Ｈに接続された送液チューブ３（図３参照）を介して、流体デバイス１０の外部から流路に流体、例えば液体が供給される。一方、第１の平板２１の貯液槽１７にも貫通孔１７Ｈがあり、流体デバイス１０の流路に供給された流体は貫通孔１７Ｈを介して、外部に排出される。
【００２２】
以上の説明のように、流体デバイス１０は、送液口１２を有する送液口構成部材１２Ｐ１、１２Ｐ２と、主流路１３を有する主流路構成部材１３Ｐ１、１３Ｐ２と、微少憩室１４を有する微少憩室構成部材１４Ｐ１、１４Ｐ２と、貯液槽接続部１６および貯液槽１７を有する貯液槽構成部材１６Ｐ１、１６Ｐ２と、からなる。流体デバイスの作製には、それぞれの前記構成部材を組み合わせてもよいが、図２に示すように、流体デバイス１０では、第１の平板２１と第２の平板２２とが、複数の前記構成部材機能を有する。
【００２３】
図３に示すように、流体デバイス１０は、アレイ部１５を外部から観察するための顕微鏡２と、送液チューブ３を介して流路に液体を供給するシリンジポンプ等のポンプ４と、供給する液体を切り替えるためのバルブ５と、温度制御装置６と、これらの動作を制御する中央演算装置７等と、ともに分析システム１を構成している。
【００２４】
分析システム１では、中央演算装置７が、流路に流す液体の種類および流速を制御する。さらに、中央演算装置７は、均一流、脈流、または、不均一流のように流体の流し方を制御することができる。
【００２５】
なお、微少憩室１４は主流路１３の側面以外の壁面、すなわち天面および底面に交互に設けられていてもよい。この場合には、主流路１３の天面または底面と、天面または底面に設けられた隣接する微少憩室１４とで画定される部分が、梁として主流路１３の両側面の間を支えるため、両側面の間隔（幅：Ｗ）を一定に保持する。
【００２６】
次に、流体デバイス１０の平面脂質二重膜の形成方法について説明する。流体デバイス１０の平面脂質二重膜形成には、第１液注入工程と、第２液注入工程と、第３液注入工程とが、途中で流路に空気が入ることなく、順に行われる。
【００２７】
図４（Ａ）に示すように、第１液注入工程では、第１液である第１の水溶液Ｗ１が送液口１２から、注入され、主流路内および複数の微少憩室内が第１の水溶液Ｗ１で満たされる。なお、以下の図において矢印は溶液の流れを示している。
【００２８】
ｐＨ緩衝生理食塩水等からなる第１の水溶液Ｗ１には、平面脂質二重膜の形成に影響がない各種成分を含む。例えば、後述するように、第１の水溶液Ｗ１には、平面脂質二重膜に組み込む膜タンパク質Ｐが含まれる。さらに、膜タンパク質Ｐがイオンチャンネルのように特定のイオンの輸送に関与する場合には、第１の水溶液Ｗ１は前記イオンの変動を検出するのに適した塩組成物、例えば蛍光物質Ｆを含むことが好ましい。
【００２９】
第２液注入工程では、第２液である脂質Ｌを溶解した油性溶液Ｗ２が送液口１２から注入される。すると、主流路内の第１の水溶液Ｗ１は押し流され、主流路内は油性溶液Ｗ２で置換される。
【００３０】
油性溶液Ｗ２の脂質Ｌは、脂質二重膜形成成分であり、親水基（親水性原子団）と疎水基（疎水性原子団）とを有する。脂質Ｌとしては、例えば、リン脂質、糖脂質、コレステロール、または、その他の化合物から、形成する脂質二重膜に応じて適宜選択される。リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン等である。糖脂質は、セレブロシド、ガングリオシド等である。
【００３１】
一方、脂質Ｌを溶解する油性溶媒は、各種の有機溶媒、例えば、ヘキサデカン、スクアレン等から選択される。
【００３２】
図４（Ｂ）に示すように、第２液注入工程において、主流路内の第１の水溶液Ｗ１は、油性溶液Ｗ２で置換されるが、微少憩室内の第１の水溶液Ｗ１は残留する。このため、微少憩室１４の開口部に第１の水溶液Ｗ１と油性溶液Ｗ２との界面が形成される。すると、油性溶液Ｗ２に溶解されている脂質Ｌの一部は、界面において、親水基を第１の水溶液側に向けて配列した単分子膜状態となる。
【００３３】
第３液注入工程では、第３液である第２の水溶液Ｗ３が送液口１２から注入される。すると、主流路内の油性溶液Ｗ２は押し流され、主流路内は第２の水溶液Ｗ３で置換される。第２の水溶液Ｗ３は第１の水溶液Ｗ１と同じｐＨ緩衝生理食塩水等である。
【００３４】
図４（Ｃ）に示すように、第３液注入工程において、主流路内の油性溶液Ｗ２が第２の水溶液Ｗ３で置換されるときに、微少憩室１４の開口部に配列していた単分子脂質膜の疎水基に、油性溶液中の脂質Ｌの疎水基が配列し、微少憩室１４の開口部を封止する脂質二重膜Ｌ２が形成される。すなわち、脂質二重膜Ｌ２は、脂質２分子がテール・ツー・テール式に疎水基どうしが向き合うように配向した構造である。
【００３５】
ここで、第１液（第１の水溶液Ｗ１）として、精製膜タンパク質であるα−ヘモリシン（Ｐ）と蛍光物質であるカルセイン（Ｆ）とを含む溶液を用いた場合には、第２液注入工程において、α−ヘモリシンＰが第２液（油性溶液Ｗ２）に溶解される。そして、図５の断面模式図に示すように、第３液注入工程において、脂質Ｌが脂質二重膜Ｌ２になると、α−ヘモリシンＰは自己集合してカルセインＦが通過できる、脂質二重膜Ｌ２を貫通した微細貫通孔を有する７量体を形成する。すなわち、膜タンパク質Ｐが組み込まれた脂質二重膜Ｌ２が形成される。すると、カルセインＦが微細貫通孔を介して微少憩室１４から主流路１３に流出する。このため、脂質二重膜Ｌ２を形成するときに微少憩室内の蛍光強度を測定していると、蛍光強度の低下により膜タンパク質が組み込まれた脂質二重膜の形成を検出できる。
【００３６】
次に、実施形態の流体デバイス１０に脂質二重膜Ｌ２を形成し、その保持時間を測定した結果等について説明する。
【００３７】
流体デバイス１０の脂質二重膜Ｌ２を形成には、第１液（第１の水溶液Ｗ１）として、Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＤＰＢＳ」という。インビトロジェン株式会社）にカルセイン（Ｃ０８７５−５Ｇ、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社）を５０μＭ添加して用いた。第２液（油性溶液Ｗ２）として、ヘキサデカンにホスファチジルコリン（ＤＰｈＰｃ、８５０３５６Ｃ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  ＩＮＣ、フナコシ株式会社）を５−２０ｍｇ／ｍＬ添加して用いた。第３液（第２の水溶液Ｗ３）として、ＤＰＢＳを用いた。第１液の流速は１μＬ／分、第２液の流速は０．３−０．６μＬ／分、第３液の流速は最大０．１５μＬ／分とした。
【００３８】
流体デバイス１０の寸法は、主流路１３が、幅（Ｗ）＝６０μｍ、深さ（Ｄ）＝８μｍであり、微少憩室１４が、開口部幅（ｗ）＝９μｍ、奥行き（ｔ）＝１９μｍ、深さ（ｄ）＝８μｍである。図６（Ａ）に示すように、開口部２０とは、主流路１３と微少憩室１４とをつなぐ流路の最小面積部分である。
【００３９】
ここで、比較のため、流体デバイス１０よりも、開口部２０Ａの面積、特に開口部幅が大きい、流体デバイス１０Ａを作製した。図６（Ｂ）に示すように、流体デバイス１０Ａは、微少憩室１４Ａが、開口部幅（ｗ）＝１７μｍ、奥行き（ｔ）＝１９μｍ、深さ（ｄ）＝８μｍである。
【００４０】
すなわち、流体デバイス１０の開口部面積Ｓは、７２μｍ２であり、流体デバイス１０Ａの開口部面積Ｓは、１３６μｍ２である。
【００４１】
そして、脂質二重膜保持時間は、流体デバイス１０Ａでは、１１０分であったのに対して、流体デバイス１０では、１４７０分（２４．５時間）であった。
【００４２】
微少憩室の開口部面積Ｓは脂質二重膜の形成面積である。すでに説明したように、脂質二重膜を形成後も第３液が常に流路内に流れている。このため、第３液の流れによる圧力のために、開口部面積Ｓが広い場合には、脂質二重膜が破壊され易いためと考えた。すなわち、脂質二重膜の保持時間を長くするためには、脂質二重膜の形成面積、すなわち、脂質二重膜を形成する微小憩室の開口部面積を狭く、適切に設定することが重要であることが判明した。
【００４３】
そして、分析に必要な脂質二重膜保持時間を得るためには、開口部面積Ｓが、１２０μｍ２以下であればよく、好ましくは、１００μｍ２以下であり、特に好ましくは８０μｍ２以下であった。開口部面積Ｓが、８０μｍ２以下では、脂質二重膜保持時間が２４時間以上であった。
【００４４】
開口部面積Ｓの下限値は、脂質二重膜に膜タンパク質を組み込むことが可能な面積であればよい。例えば、図５の断面模式図に示した、α−ヘモリシンＰが自己集合した膜貫通細孔を有する７量体を脂質二重膜Ｌ２に組み込むために必要な、開口部面積Ｓは８０ｎｍ２以上である。
【００４５】
また、図６（Ａ）に示したように、流体デバイス１０では、微少憩室１４が、開口部２０と平行な断面の面積が、開口部２０の前記面積よりも大きい形状である。言い換えれば、微少憩室１４は、入り口である開口部２０よりも奥の空間の方が断面積が大きい、いわゆる蛸壺形状である。すなわち、微少憩室１４の体積（Ｖ）が、「開口部面積（Ｓ）×奥行き（ｔ）」より大きい。微少憩室１４の体積（Ｖ）とは開口部２０よりも奥の体積である。流体デバイス１０では、開口部２０が略略矩形のため、開口部面積（Ｓ）×奥行き（ｔ）＝開口部幅（ｗ）×深さ（ｄ）×奥行き（ｔ）≦微少憩室の体積（Ｖ）、である。
【００４６】
これに対して、図６（Ｂ）に示したように、流体デバイス１０Ａでは、微少憩室１４Ａが、開口部２０Ａと平行な断面の面積が、開口部２０Ａの前記面積と同じ、直方体形状である。すなわち、開口部面積（Ｓ）×奥行き（ｔ）＝開口部幅（ｗ）×深さ（ｄ）×奥行き（ｔ）＝微少憩室の体積（Ｖ）、である。
【００４７】
同じ開口部面積Ｓであっても、開口部と平行な断面の面積が、開口部の前記面積よりも大きい形状の微少憩室を有する流体デバイスは、略直方体の微少憩室を有する流体デバイスよりも脂質二重膜保持時間が長いことが判明した。
【００４８】
そして、流体デバイス１０では、微少憩室１４の体積（Ｖ）が、開口部面積（Ｓ）×奥行き（ｔ）の約２倍であったが、１．５倍以上であれば効果が容易に確認でき、２倍以上であれば効果が顕著に確認できる。なお、前記倍率の上限は流体デバイスの小型化の観点からは、例えば１０倍である。
【００４９】
脂質二重膜によって封止される微少憩室内の第１液の体積Ｖが、小さい流体デバイスは送液によって主流路１３を通過する液体の圧力が変動しても、微少憩室内の第１液Ｗ１の体積変動が小さいため、脂質二重膜が破裂しにくいものと考えた。
【００５０】
また、流体デバイス１０および流体デバイス１０Ａの開口部形状は略矩形であるが、開口部形状により、脂質二重膜保持時間は変化する。例えば、流体デバイス１０と類似の構成かつ略同一の開口部面積であっても、図７（Ａ）に示す略円形形状の開口部２０Ｂの流体デバイス１０Ｂでは、脂質二重膜保持時間が大幅に増加した。また図８（Ｂ）に示す略楕円形形状の開口部２０Ｃの流体デバイス１０Ｃでも、開口部形状が略矩形の流体デバイスと比較すると、脂質二重膜保持時間が増加した。これは、送液によって主流路１３を通過する液体の圧力が変動したときに、脂質二重膜に生じる応力が均一化するためと考えられる。
【００５１】
すなわち、流体デバイスは同じ開口部面積Ｓの場合には、開口部外周長が短いほど、脂質二重膜が破裂しにくい。さらに開口部外周に鋭角〜直角の角部がない方が、脂質二重膜が破裂しにくい。このため、開口部の形状は、略円形または略楕円形であることが、より好ましい。
【００５２】
なお、主流路１３がＰＤＭＳからなる流体デバイスでは、脂質二重膜の溶媒成分（油性溶液）が、耐有機溶剤性のないＰＤＭＳからなる壁面から吸収されるため、脂質二重膜が破壊されてしまうことがあった。これに対して、流路の壁面が、耐有機溶剤性のあるガラスからなる流体デバイス１０は脂質二重膜の溶媒成分が壁面に吸収されることがないため、長時間、保持できる。
【００５３】
さらに、主流路１３の表面が親水性の流体デバイスでは、第２液（油性溶液）Ｗ２を注入したとき、微少憩室内だけでなく、主流路１３の側面にも第１液（第１の水溶液）Ｗ１が残留することがある。このため、続いて第３液（第２の水溶液）Ｗ１を注入しても、アレイ部１５に脂質二重膜は形成されないことがある。
【００５４】
流路の壁面を構成する材料の、水に対する接触角は、４０度以上、好ましくは６０度以上、特に好ましくは９０度以上であった。前記範囲以上であればアレイ部１５に脂質二重膜が形成可能であり、接触角が大きいほど、アレイ部１５の多くの微少憩室１４の開口部に脂質二重膜が形成された。接触角の上限は特にないが、第１液注入工程において、効率良く、微少憩室内を第１の水溶液で満たすためには１３０度以下が好ましい。
【００５５】
以上の説明のように、８０ｎｍ２以上１２０μｍ２以下の面積の開口部に平面脂質二重膜が形成される微少憩室を具備するマイクロ流体デバイスは、平面脂質二重膜を長時間にわたり保持できる。特に、耐有機溶剤性かつ疎水性の材料からなる壁面を有する主流路１３からなる本実施形態の流体デバイス１０は微少憩室１４の開口部に確実に平面脂質二重膜が形成可能である。
【００５６】
本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を変えない範囲において、種々の変更、改変等ができる。
【符号の説明】
【００５７】
１…分析システム
３…送液チューブ
４…ポンプ
５…バルブ
６…温度制御装置
７…中央演算装置
１０、１０Ａ〜１０Ｃ…マイクロ流体デバイス
１２…送液口
１２Ｈ…貫通孔
１２Ｐ…送液口構成部材
１３…主流路
１３Ｐ…主流路構成部材
１４…微少憩室
１４Ｐ…微少憩室構成部材
１５…アレイ部
１６…貯液槽接続部
１６Ｐ…貯液槽構成部材
１７…貯液槽
１７Ｈ…貫通孔
２０…開口部
２１…第１の平板
２１Ｖ…凹部
２２…第２の平板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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