(57)【要約】【課題】新たな抗悪性腫瘍剤の提供。【解決手段】ヒラタケ由来のＴ１タイプリボヌクレアーゼを含有する悪性腫瘍治療薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒラタケ由来のＴ１タイプリボヌクレアーゼを含有する悪性腫瘍治療薬。
【請求項２】
ヒラタケ由来のＴ１タイプリボヌクレアーゼが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつリボヌクレアーゼ活性を有するタンパク質である請求項１記載の悪性腫瘍治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たなリボヌクレアーゼを含有する悪性腫瘍治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）はＲＮＡを分解する酵素であり、塩基の種類を問わないリボヌクレアーゼＴ２、ピリミジン塩基のある部分だけを切断するリボヌクレアーゼＡ、グアニンの部分のみを分解するリボヌクレアーゼＴ１などが挙げられる。
【０００３】
リボヌクレアーゼの中で、リボヌクレアーゼＡに属するウシガエル由来のリボヌクレアーゼやウシ膵臓由来のリボヌクレアーゼに抗腫瘍活性があることは知られている（特許文献１、２及び非特許文献１）。また、抗腫瘍活性を有するα−サルシンはＲＮａｓｅ  Ｔ１に近い構造を有しているが、Ｔ１タイプのＲＮａｓｅではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００２−５３２０６７号公報
【特許文献２】特表２００７−５３０００２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００２，Ｊａｎ  １：２０（１）：２７４−２８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、さらに新たなリボヌクレアーゼを含有する抗悪性腫瘍治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、Ｔ１タイプのリボヌクレアーゼに着目して種々検討してきたところ、ヒラタケ由来のＴ１タイプリボヌクレアーゼは、同じＴ１タイプのリボヌクレアーゼであるヤマブシタケ由来のリボヌクレアーゼ等に比べて特に強い腫瘍細胞増殖抑制作用を有し、Ｔ１タイプのリボヌクレアーゼの中でも特に悪性腫瘍治療剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、ヒラタケ由来のＴ１タイプリボヌクレアーゼを含有する悪性腫瘍治療剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の悪性腫瘍治療剤は、優れた腫瘍細胞増殖抑制作用を有し、中性付近で安定で、かつ熱安定性も高いので、医薬品としての応用が容易である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ｒＲＮａｓｅ  Ｐｏ１の精製工程を示す図である。
【図２】１ＭＲ−３２細胞に対する各種ＲＮａｓｅの増殖抑制作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の悪性腫瘍治療剤の有効成分は、ヒラタケ由来のＴ１タイプリボヌクレアーゼ（以下、ＲＮａｓｅ  Ｐｏ１と略することもある）である。ヒラタケは、ヒラタケ科ヒラタケ属に属する食用キノコであり、このうちＰｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｏｓｔｒｅａｔｕｓが特に好ましい。本発明で用いるＴ１タイプリボヌクレアーゼは、ヒラタケ子実体から抽出することもできるが、遺伝子組換え法により大腸菌等の微生物の形質転換体から抽出することもできる。
【００１２】
ＲＮａｓｅ  Ｐｏ１には、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、及び配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつリボヌクレアーゼ活性を有するタンパク質が含まれる。ここで、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列としては、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するもの、特に９５％以上の同一性を有するものが好ましい。
【００１３】
ヒラタケ子実体からＲＮａｓｅ  Ｐｏ１を抽出するには、例えばヒラタケ子実体を細切又は粉砕し、酢酸ナトリウム水溶液を加えてホモジナイズし、遠心分離により固形物を除去する。次いでこの上清から硫安分画によりタンパク画分を得、ゲル濾過、イオン交換クロマト等により分画することにより得ることができる（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６，２６−３３（１９９４））。
【００１４】
一方、遺伝子組換え法によるＲＮａｓｅ  Ｐｏ１の採取法については、例えば第５１回日本薬学会関東支部大会（２００７年１０月１６日）講演要旨集Ｊ１２記載の方法を用いることができる。まず遺伝子のクローニングをし、クローニングしたＤＮＡ断片を用いた発現ベクターの調製、発現ベクターを用いたＲＮａｓｅ  Ｐｏ１の調製を行うが、これらの操作は周知の技術であり、具体的には、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｍａｎｉａｔｉｓら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２））に記載の方法に従って行うことができる。
【００１５】
例えば、ヒラタケの子実体から精製したＲＮａｓｅ  Ｐｏ１のＮ−末端、Ｃ−末端などのアミノ酸配列の一部を既知の方法で決定し、それに相当するオリゴヌクレオチドを合成する。合成したオリゴヌクレオチドをプローブとしてヒラタケのトータルＲＮＡを抽出後、逆転写酵素反応で得たｃＤＮＡ断片をクローニングすればよい。
クローン化に用いる宿主は特に限定されないが、操作性及び簡便性から大腸菌を宿主とするのが適当である。
【００１６】
クローン化した遺伝子の高発現系を構築するためには、たとえばマキザム−ギルバートの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９（１９８０））もしくはダイデオキシチェーンターミネーター法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１，２０（１９８３））などを応用してクローン化したＤＮＡ断片の塩基配列を解析して当該遺伝子のコーディング領域を特定し、宿主微生物に応じて当該遺伝子が微生物菌体中で発現可能となるように発現制御シグナル（転写開始及び翻訳開始シグナル）をその上流に連結した組換え発現ベクターを作製する。
【００１７】
ＲＮａｓｅ  Ｐｏ１を異種微生物内で大量に産生させるために使用する発現制御シグナルとしては、人為的制御が可能で、ＲＮａｓｅ  Ｐｏ１の生産量を上昇させるような強力な転写開始並びに翻訳開始シグナルを用いることが望ましい。このような転写開始シグナルとしては、宿主として大腸菌を用いる場合には、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８０，２１（１９８３）、Ｇｅｎｅ，２０，２３１（１９８２））、ｔｒｃプロモーター（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，３５３９（１９８５））などを例示することができる。
ベクターとしては、種々のプラスミドベクター、ファージベクターなどが使用可能であるが、微生物菌体内で複製可能であり、適当な薬剤耐性マーカーと特定の制限酵素切断部位を有し、菌体内のコピー数の高いプラスミドベクターを使用するのが望ましい。具体的に大腸菌を宿主とする場合には、ｐＢＲ３２２（Ｇｅｎｅ，２，９５（１９７５））、ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９（Ｇｅｎｅ、３３，１０３（１９８５））などを例示することができる。作製した組換えベクターを用いて微生物を形質転換する。宿主となる微生物としては安全性が高く取扱いやすいものであれば特に限定されない。例えば、大腸菌、酵母などＤＮＡ組換え操作に常用されている微生物を使用することができる。その中でも、大腸菌が有利であり、例えば組換えＤＮＡ実験に使用されるＢＬ２１株、Ｋ１２株、Ｃ６００菌、ＪＭ１０５菌、ＪＭ１０９菌（Ｇｅｎｅ，３３，１０３−１１９（１９８５））などが使用可能である。
微生物を形質転換する方法はすでに多くの方法が報告されており、宿主として使用する微生物に応じて適宜選択すればよい。例えば大腸菌を宿主として使用する場合、低温下、塩化カルシウム処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））により大腸菌を形質転換することができる。
【００１８】
得られた形質転換体は、当該微生物が増殖可能な培地中で増殖させ、さらにクローン化したＲＮａｓｅ  Ｐｏ１遺伝子の発現を誘導して菌体内又は菌体外に当該酵素が大量に蓄積するまで培養を行う。形質転換体の培養は、炭素源、窒素源などの当該微生物の増殖に必要な栄養源を含有する培地を用いて常法に従って行えばよい。例えば、大腸菌を宿主として使用する場合、培地として２ｘＹＴ培地（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，２０（１９８３））、ＬＢ培地、Ｍ９ＣＡ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、前述）などの大腸菌の培養に常用されている培地を用い、２０〜４０℃の培養温度で必要により通気攪拌しながら培養することができる。また、ベクターとしてプラスミドを用いた場合には、培養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシリン、カナマイシンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養する。
培養中にＲＮａｓｅ  Ｐｏ１遺伝子の発現を誘導する必要がある場合には、用いたプロモーターで常用されている方法で当該遺伝子の発現を誘導する。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターを使用した場合には、培養中期に発現誘導剤であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略称する）を適当量添加する。
【００１９】
こうして得られた培養上清から硫安塩析処理、透析処理、エタノールなどの溶媒処理、各種クロマトグラフィー処理などの酵素精製に通常使用されている処理を単独で、又は数種組み合わせて得られる精製物をＲＮａｓｅ  Ｐｏ１として利用することができる。
【００２０】
ＲＮａｓｅ  Ｐｏ１の等電点は８．７であり細胞内への移行がよいこと。また、ジスルフィド結合が１組多いことから熱安定性にも優れている。さらに、至適ｐＨが７．５であることから細胞内で酵素活性を最大限に発現できる。
【００２１】
ＲＮａｓｅ  Ｐｏ１は、種々の腫瘍細胞の増殖を低濃度で抑制し、ヒトを含む哺乳類における悪性腫瘍治療剤として有用である。ＲＮａｓｅ  Ｐｏ１はＴ１タイプのリボヌクレアーゼであるが、同じＴ１タイプに属するヤマブシタケ由来のリボヌクレアーゼや、典型的な真菌由来ＲＮａｓｅ  Ｔ１に比べて特に強い抗腫瘍作用を有する。
【００２２】
本発明の悪性腫瘍治療剤の対象となる悪性腫瘍には、白血病、リンパ腫などの血液や造血組織の腫瘍及び固形腫瘍が含まれる。固形腫瘍としては、皮膚癌、肺癌、大腸癌、胃癌、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌などの上皮細胞癌；及び平滑筋肉腫、骨肉腫などの肉腫が挙げられる。
【００２３】
本発明の医薬は、ＲＮａｓｅ  Ｐｏ１に、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、被覆剤、乳化剤、懸濁化剤、溶剤、安定化剤、吸収補助剤、軟膏基剤等の１以上の薬学的に許容される担体を適宜添加し、常法により経口投与用、注射投与用、直腸内投与用、外用などに適する剤形（医薬組成物）に製剤化することによって得られる。
経口投与用の製剤としては、顆粒、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤等が；注射投与用の製剤としては、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、点滴注射用の製剤などが；直腸内投与用の製剤としては、坐薬、軟カプセル等が好ましい。
本発明の医薬は上記の如き製剤として、ヒトを含む哺乳動物に投与することができる。
本発明の医薬は、ＲＮａｓｅ  Ｐｏ１として、１日当り約１〜５００ｍｇ／ｋｇを１〜４回投与するのが好ましい。
【実施例】
【００２４】
次に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００２５】
参考例１
ヒラタケ子実体３ｋｇをきざみ、０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えてホモジナイズする。１万ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を用いる。９０％飽和硫安を加え、硫安分画後遠心分離し沈殿を緩衝液に溶解し、精製水に対して透析する。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０によるゲル濾過、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ  ＡｃＡ５４によるゲル濾過、次いでＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍによるイオン交換クロマトを行う。さらにＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍによるイオン交換クロマトを行い、ＴＳＫ  Ｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷカラムを用いたＨＰＬＣによるゲル濾過を行う。以上の操作によりＲＮａｓｅ  Ｐｏ１を得た。
【００２６】
参考例２
（ｒＲＮａｓｅ  Ｐｏ１の精製）
ｐＥＴ−ｐｅｌＢ−Ｐｏ１を導入した発現用大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓ）を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加した液体ＴＢ培地に植菌し、１日後にＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、転写誘導をかけたものを２５℃の暗所で、７日間、８０ｒｐｍで振とう培養した培養上清約２Ｌを出発原料としてｒＲＮａｓｅ  Ｐｏ１の精製を行った。なお、ｒＲＮａｓｅ  Ｐｏ１のｃＤＮＡ配列より推測した等電点は８．７であった。
ｒＲＮａｓｅ  Ｐｏ１の精製法のフローチャートを図１に示した。
【００２７】
実施例１
ＲＮａｓｅ  Ｔ１（真菌由来）及び担子菌由来の２種のＴ１タイプＲＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ  Ｐｏ１、Ｈｅｒｉｃｉｕｍ  ｅｒｉｎａｃｅｕｍ（ヤマブシタケ）のＲＮａｓｅ  Ｈｅ１について、ヒト神経芽腫細胞（ＩＭＲ−３２）を用いて腫瘍細胞の生育に対する影響を検討した。
【００２８】
（方法）
細胞生育阻害作用：細胞を１０％牛胎仔血清を加えたＲＰＭＩ  １６４０培地で希釈し、５×１０3ｃｅｌｌ／１００μＬ又は３×１０5ｃｅｌｌ／ｍＬとした。この細胞培養液１００μＬ又は２００μＬに終濃度０〜１０μＭのＲＮａｓｅをそれぞれ加え、５％ＣＯ2条件下、３７℃、７２時間培養し、ＭＴＴ法により細胞生育阻害率を算出した。
【００２９】
細胞内取り込み量：１０％牛胎仔血清を加えたＲＰＭＩ  １６４０培地で希釈した３×１０5ｃｅｌｌ／ｍＬの細胞懸濁液２ｍＬに終濃度６μＭの各ＲＮａｓｅを加え、５％ＣＯ2条件下３７℃、３０分培養後、遠心して細胞を回収し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えて凍結融解し、再度遠心分離し、上清のＲＮａｓｅ活性を指標として求めた。
【００３０】
（結果）
ヒト神経芽腫細胞の中では、ＩＭＲ−３２細胞において、ＲＮａｓｅ  Ｔ１、ＲＮａｓｅ  Ｐｏ１とも濃度依存的に細胞生育阻害作用を示し、特にＲＮａｓｅ  Ｐｏ１は、３μＭの添加により、生存細胞数は、約１０％以下にまで低下した（図２）。また、ＲＮａｓｅ  Ｐｏ１の細胞生育阻害作用は、ＲＮａｓｅ  Ｈｅ１よりも強力であった。
また、腫瘍細胞（Ｐ−３８８）内へのＲＮａｓｅの取り込み量は、ＲＮａｓｅ  Ｐｏ１は０．５％、ＲＮａｓｅ  Ｔ１は０．０３％、ＲＮａｓｅ  Ｈｅ１は０．０１％であった。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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