(57)【要約】【課題】再生医療に必要な体性細胞の高い増殖率で培養することができ、且つ人体に対する安全性が高く、さらには生体内での生着性及び細胞生存性を顕著に高めること。【解決手段】再生医療に用いる間葉系幹細胞や腫瘍細胞を含む接着性細胞と、低分子ヘパリンとプロタミンとからなる平均粒径が０．１〜５μｍであるＬＨ／Ｐ  ＭＰｓと、接着性細胞の用途に応じて任意に選択されるサイトカインと、容積比０．５〜２５％のヒト血漿と、で構成されるゲル状の細胞移植用組成物内で接着性細胞の培養を行う。【選択図】図１
2012205599.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
再生医療に用いる間葉系幹細胞や腫瘍細胞を含む接着性細胞と、
低分子ヘパリンとプロタミンとからなる平均粒径が０．１〜５μｍであるＬＨ／Ｐ  ＭＰｓと、
前記接着性細胞の用途に応じて任意に選択されるサイトカインと、
容積比０．５〜２５％のヒト血漿と、
で構成されるゲル状組成物内で前記接着性細胞の培養を行うことを特徴とする３次元細胞培養方法。
【請求項２】
再生医療に用いる間葉系幹細胞や腫瘍細胞を含む接着性細胞と、
低分子ヘパリンとプロタミンとからなる平均粒径が０．１〜５μｍであるＬＨ／Ｐ  ＭＰｓと、
前記接着性細胞の用途に応じて任意に選択されるサイトカインと、
容積比０．５〜２５％のヒト血漿と、
で構成されるゲル状組成物であることを特徴とする細胞移植用組成物。
【請求項３】
再生医療に用いるＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞を含む造血系浮遊細胞と、
低分子ヘパリンとプロタミンとからなる平均粒径が０．１〜５μｍであるＬＨ／Ｐ  ＭＰｓと、
前記造血系浮遊細胞の用途に応じて任意に選択されるサイトカインと、
容積比０．５〜２５％のヒト血漿と、
で構成されるゲル状組成物内で前記造血系浮遊細胞の培養を行うことを特徴とする３次元細胞培養方法。
【請求項４】
再生医療に用いるＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞を含む造血系浮遊細胞と、
低分子ヘパリンとプロタミンとからなる平均粒径が０．１〜５μｍであるＬＨ／Ｐ  ＭＰｓと、
前記造血系浮遊細胞の用途に応じて任意に選択されるサイトカインと、
容積比０．５〜２５％のヒト血漿と、
で構成されるゲル状組成物であることを特徴とする細胞移植用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ粒子と血漿添加による各種体性多能性細胞の細胞培養方法及び細胞移植用組成物に係り、詳細には低分子ヘパリンとプロタミンとから構成されるマイクロ粒子と、細胞増殖又は分化誘導を促進させるサイトカインと、血漿添加によるゲル化培地を用いた接着性細胞及び造血系浮遊細胞等の体外３次元細胞培養方法及び再生医療等に用いられる細胞移植用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
相応する電荷を有する高分子間静電反応により生じる多重電解質複合体は、電荷を帯びた生体高分子の生体内挙動の研究モデルとなる。さらに、ユニークな組成や構造からなる多重電解質複合体は、可溶性ナノ粒子の形成、複合化マイクロ粒子の形成（コアセルベーション）、非結晶性沈殿物等を形成し、バイオテクノロジーや医学の分野での適用が可能である。例えば、タンパク質と核酸よりなる複合体形成は転写過程に影響を及ぼすと考えられる。また、低分子ヘパリン／プロタミン  マイクロ粒子（ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ）に加えて、ＤＮＡ・キトサン複合体マイクロ（ナノ）粒子がそれぞれ遺伝子キャリア及び薬剤キャリアとして記述された。
【０００３】
ところで、骨髄や脂肪組織を含んだ多くを生体組織には、組織の維持や修復のため多分化能を保持した前駆体細胞である生体幹細胞が含まれていることが知られている。特に骨髄細胞は造血系幹細胞や間葉系幹細胞を含み、各種血液細胞のみならず、皮膚、骨、軟骨、血管、筋肉の細胞に分化しそれぞれの組織再生を促進する。同様に、脂肪組織由来間葉系細胞も皮膚、骨、軟骨、血管、筋肉の細胞に分化することが知られており、人において豊富な幹細胞資源となる脂肪組織に大きな注目が集まっている。
【０００４】
しかしながら、各種体性幹細胞や前駆体細胞の収率は低く、培養には高濃度（１０％以上）の異種動物の血清、フィーダー細胞、そしてコラーゲンや腫瘍生成基底膜であるマトリゲルをマトリックスとして使用する必要があり、ウィルスや未知病原体による感染及び抗原性付与の問題が避けられない。よって、上記体性幹細胞や前駆体細胞を効率的、且つ安全に異種動物の血清培地、フィーダー細胞、そしてコラーゲンやマトリゲルを使用しないマトリックス内で増殖させる培養法が求められている。さらに再生医療における細胞移植には、生体内でのその生着性及び増殖性を高める有効な細胞キャリアを併用する必要がある。
【０００５】
ところで、血液を凝固させ血小板や血液凝固因子（フィブリノーゲン等) を除いたものが血清(serum) であり、血漿は抗凝固剤（クエン酸等）入りの採血管を用いて採血した血液を遠心分離して細胞成分（赤血球や白血球）を除いたものが血小板を含んだ血漿（プラズマ) である。この血漿を添加した培地は、混合後１０分以内に室温で容易にゲル化することが見出されている。
【０００６】
そこで、近年では、血漿の添加によるゲル化に着目した血漿ゲル（Ｐｌａｓｍａ  ｇｅｌ）は、細胞増殖及び分化誘導を促進する様々な増殖因子やサイトカイン等の生理活性物質を含有し運搬する血小板を多く含み、再生医療等多くの分野で様々な応用研究が進められている。
【０００７】
これらの血小板に運搬される生理活性物質は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦｓ）、線維芽増殖因子（ＦＧＦｓ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦｓ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦｓ）等２０を超え、これらのほとんどはヘパリン結合性であることが知られている。さらに、形成外科の分野でも創傷治癒、変形の改善（含雛取り）、育毛等幅広い臨床応用が期待されており、また血管新生療法や再生医療等の臨床の場でも既に適用されているが、その効果はさほど高くないのが現状である。
【０００８】
このように各分野において、血漿ゲルの有効性をさらに高めるため、貴重な患者本人の血液製剤である血漿に含有されている生理活性物質の活性を維持したまま、より有効に局所に保持、徐放が可能な、安全な薬剤キャリアの出現が求められていた。
【０００９】
そこで、本発明者等は、鋭意研究の結果、低分子へパリン（ＬＨ）とプロタミン（Ｐ）との組み合わせを用いることにより、簡便に平均粒径１．５μｍ程度（０．５μｍ以上３μｍ未満）から、さらには平均粒径１００ｎｍの微粒子を作成でき、得られた微粒子をコートしたプレートが徐放性の薬物包接或いは細胞接着マトリックスとして使用できることを見出した（詳細は、特許文献１及び非特許文献１〜５を参照）。
【００１０】
すなわち、このＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ−コートマトリックスが、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−２及び血小板に含まれる様々なヘパリン結合性増殖因子やサイトカイン等の生理活性物質を吸着してそれらの活性を保護し、徐放するマトリックスとして有効であること、また上記ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓに吸着・保護され活性を保持した生理活性物質が、生体内で生理活性物質含有ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ複合体の生分解に伴い周辺部位へ徐放され、生体局所での血管新生や肉芽形成の促進に寄与することを実証した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１１−２１９４２８号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Journal of Controlled Release, Cytokine-immobilized microparticle-coated plates for culturing hematopoietic progenitor cells. 133, 185-190, 2009.
【非特許文献２】International Journal of Nanomedicine, Preparation and characterization of low-molecular-weight heparin/protamine nanoparticles (LMW-H/P NPs) as FGF-2 carrier. 5, 147-155, 2010.
【非特許文献３】Artificial Organs, Fragmin/protamine microparticle-coated matrix immobilized cytokines to stimulate various cell proliferation with low serum media. 33, 431-438, 2009.
【非特許文献４】Journal of Biomedical Materials Research (Part B), Enhancement of vascularization and granulation tissue formation by growth factors in human platelet-rich plasma-containing fragmin/protamine microparticles. 97B, 373-380, 2011.
【非特許文献５】Journal of Biomedical Materials Research (Part A), Controlled release of FGF-2 using fragmin/protamine microparticles and effect on neovascularization. 91A, 814-823, 2009.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ところで、近年ヒトや動物の細胞を生体外で培養し増幅及び分化誘導を行い、その機能を利用して人工臓器や人工組織として利用する研究が活発に行なわれている。しかしながら、各種細胞の中でも、特に再生医療での移植用細胞として需要の大きい骨髄及び脂肪組織由来の間葉系幹細胞については、ウィルスや未知病原体による感染、抗原性付与の問題を有する異種動物の血清、フィーダー細胞、そしてコラーゲンやマトリゲル等のマトリックスとしての使用を排除し、多分化能を維持したまま安全に増幅する培養法が未だ確立されていない。
【００１４】
特に、造血系前駆体細胞或いは血管内皮前駆体細胞として機能することが知られているＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞についての体外増幅についての確立された方法はなく、その需要に比して採取できる量が非常に少ないため、成人に移植することが困難となっていた。従って、安全性や安定した供給等の問題点から異種動物の血清、フィーダー細胞、そしてコラーゲンやマトリゲル等のマトリックスとしての使用を排除した体外大量増幅システムの開発が必要である。
【００１５】
さらに細胞移植は、細胞の有する脆弱性や分散性により、必要な場所に有効に移植細胞を生着、増殖させることに困難を極めているのが現状であり、安全で有効な細胞運搬システムの出現が求められている。
【００１６】
そこで、本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、骨髄由来間葉系幹細胞や脂肪組織由来間葉系細胞、ＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞、植皮用皮膚構築に不可欠な線維芽細胞、末梢血流障害の治療に応用が期待される血管内皮細胞等の再生医療に必要な接着性細胞又は造血系浮遊細胞を高い増殖率で培養することができ、且つ人体に対する安全性が高く、さらには生体内での生着性及び細胞生存性を顕著に高めた３次元細胞培養方法及び細胞移植用組成物を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記した目的を達成するため、請求項１記載の３次元細胞培養方法は、再生医療に用いる間葉系幹細胞や腫瘍細胞を含む接着性細胞と、
低分子ヘパリンとプロタミンとからなる平均粒径が０．１〜５μｍであるＬＨ／Ｐ  ＭＰｓと、
前記接着性細胞の用途に応じて任意に選択されるサイトカインと、
容積比０．５〜２５％のヒト血漿と、
で構成されるゲル状組成物内で前記接着性細胞の培養を行うことを特徴とする。
【００１８】
請求項２記載の細胞移植用組成物は、再生医療に用いる間葉系幹細胞や腫瘍細胞を含む接着性細胞と、
低分子ヘパリンとプロタミンとからなる平均粒径が０．１〜５μｍであるＬＨ／Ｐ  ＭＰｓと、
前記接着性細胞の用途に応じて任意に選択されるサイトカインと、
容積比０．５〜２５％のヒト血漿と、
で構成されるゲル状組成物であることを特徴とする。
【００１９】
請求項３記載の３次元細胞培養方法は、再生医療に用いるＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞を含む造血系浮遊細胞と、
低分子ヘパリンとプロタミンとからなる平均粒径が０．１〜５μｍであるＬＨ／Ｐ  ＭＰｓと、
前記造血系浮遊細胞の用途に応じて任意に選択されるサイトカインと、
容積比０．５〜２５％のヒト血漿と、
で構成されるゲル状組成物内で前記造血系浮遊細胞の培養を行うことを特徴とする。
【００２０】
請求項４記載の細胞移植用組成物は、再生医療に用いるＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞を含む造血系浮遊細胞と、
低分子ヘパリンとプロタミンとからなる平均粒径が０．１〜５μｍであるＬＨ／Ｐ  ＭＰｓと、
前記造血系浮遊細胞の用途に応じて任意に選択されるサイトカインと、
容積比０．５〜２５％のヒト血漿と、
で構成されるゲル状組成物であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、再生医療に用いられる接着性細胞や造血系浮遊細胞と、低分子ヘパリンとプロタミンとからなる平均粒径が０．１〜５μｍであるＬＨ／Ｐ  ＭＰｓと、使用する細胞の用途に応じて任意に選択されるサイトカインと、容積比０．５〜２５％のヒト血漿とで構成されるゲル状の細胞移植用組成物を用いるため、細針を装着したシリンジでも注入可能となる。
【００２２】
また、局所への移植後、適度な粘稠性により注入箇所に留まり、また各種接着性細胞や各種造血系浮遊細胞の分散を限定するとともに、生着性、増殖性及び多分化能に優れた局所細胞移植のための運搬システムとして適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】（ａ）は本発明に係る細胞移植用組成物によるヒト脂肪組織由来間葉系細胞の３次元細胞培養時における細胞増幅結果を示すグラフであり、（ｂ）は比較用組成物によるヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞の２次元細胞培養時における細胞増幅結果を示すグラフである
【図２】（ａ）は本発明に係る細胞移植用組成物を用いて体外３次元培養により増幅したヒト脂肪組織由来間葉系細胞の電子顕微鏡写真であり、（ｂ）は比較組成物を用いて２次元細胞培養により増幅したヒト脂肪組織由来間葉系細胞の電子顕微鏡写真である。
【図３】（ａ）は本発明に係る細胞移植用組成物によるヒト骨髄由来間葉系幹細胞の３次元細胞培養時における細胞増幅結果を示すグラフであり、（ｂ）は比較用組成物によるヒト骨髄由来間葉系幹細胞の２次元細胞培養時における細胞増幅結果を示すグラフである。
【図４】（ａ）は本発明に係る細胞移植用組成物を用いて体外３次元培養により増幅したヒト骨髄由来間葉系幹細胞の電子顕微鏡写真であり、（ｂ）は比較組成物を用いて２次元細胞培養により増幅したヒト骨髄由来間葉系幹細胞の電子顕微鏡写真である。
【図５】（ａ）は本発明に係る細胞移植用組成物を用いたヒト骨髄由来間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化誘導による分化能を示す写真であり、（ｂ）は本発明に係る細胞移植用組成物を用いたヒト脂肪組織由来間葉系細胞の脂肪細胞への分化誘導による分化能を示す写真である。
【図６】（ａ）は本発明に係る細胞移植用組成物を用いたヒト骨髄由来間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導による分化能を示す写真であり、（ｂ）は本発明に係る細胞移植用組成物を用いたヒト脂肪組織由来間葉系細胞の骨芽細胞への分化誘導による分化能を示す写真である。
【図７】（ａ）は本発明に係る細胞移植用組成物によるヒト皮膚線維芽細胞の３次元細胞培養時における細胞増幅結果を示すグラフであり、（ｂ）は比較用組成物によるヒト皮膚線維芽細胞の２次元細胞培養時における細胞増幅結果を示すグラフである。
【図８】（ａ）は本発明に係る細胞移植用組成物を用いて体外３次元培養により増幅したヒト皮膚線維芽細胞の電子顕微鏡写真であり、（ｂ）は比較組成物を用いて２次元細胞培養により増幅したヒト皮膚線維芽細胞の電子顕微鏡写真である。
【図９】（ａ）は本発明に係る細胞移植用組成物によるヒト皮膚毛細血管内皮細胞の３次元細胞培養時における細胞増幅結果を示すグラフであり、（ｂ）は比較用組成物によるヒト皮膚毛細血管内皮細胞の２次元細胞培養時における細胞増幅結果を示すグラフである。
【図１０】（ａ）は本発明に係る細胞移植用組成物を用いて体外３次元培養により増幅したヒト皮膚毛細血管内皮細胞の電子顕微鏡写真であり、（ｂ）は比較組成物を用いて２次元細胞培養により増幅したヒト皮膚毛細血管内皮細胞の電子顕微鏡写真である。
【図１１】本発明に係る細胞移植用組成物によるヒト骨髄由来ＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞の３次元細胞培養時における細胞増幅結果を示すグラフである。
【図１２】本発明の細胞移植用組成物により増殖中のヒト骨髄由来ＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞のフローサイトメトリーによるＣＤ３４陽性率を示すグラフである。
【図１３】（ａ）は本発明に係る細胞移植用組成物を用いて体外３次元培養により増幅したヒト骨髄由来ＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞の電子顕微鏡写真であり、（ｂ）は比較組成物を用いて２次元細胞培養により増幅したヒト骨髄由来ＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞の電子顕微鏡写真である。
【図１４】本発明に係る細胞移植用組成物によるヒトＴＦ−１細胞の３次元細胞培養時における細胞増幅結果を示すグラフである。
【図１５】（ａ）は本発明に係る細胞移植用組成物を用いて体外３次元培養により増幅したヒトＴＦ−１細胞の電子顕微鏡写真である（ｂ）は比較組成物を用いて２次元細胞培養により増幅したヒトＴＦ−１細胞の電子顕微鏡写真である。
【図１６】（ａ）は本発明に係る細胞移植用組成物で培養した肝癌細胞株をヌードマウス皮下へ投与した際の該細胞における腫傷サイズを比較したグラフであり、（ｂ）は図１６（ａ）における肝癌細胞株の細胞数を変更して培養したものをヌードマウス皮下へ投与した際の該細胞における腫瘍サイズを比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を実施するための形態について、添付した図面を参照しながら詳細に説明する。また、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではなく、この形態に基づいて当業者などによりなされる実施可能な他の形態、実施例及び運用技術などはすべて本発明の範疇に含まれる。
【００２５】
本発明に係る３次元細胞培養方法は、再生医療に用いられる各種細胞（接着性細胞又は造血系浮遊細胞、より好ましくは移植対象となる患者の自己細胞）と、低分子ヘパリンとプロタミンから構成されるＬＨ／Ｐ  ＭＰｓと、同種血漿（好ましくは自己血漿）及び用途に応じて適宜選択される適切なサイトカインを含有した培地からなる血漿ゲルと、で構成されている。
【００２６】
再生医療に用いられる細胞としては、「接着性細胞」と「造血系浮遊細胞」とに大別される。
「接着性細胞」としては、例えばヒト脂肪組織由来間葉系細胞やヒト骨髄由来間葉系幹細胞等の種々の間葉系幹細胞及び血管内皮細胞及びその前駆体細胞、線維芽細胞及びその前駆体細胞、血管内皮細胞及びその前駆体細胞、肝実質細胞及びその前駆体細胞、滕β細胞及びその前駆体細胞、平滑筋細胞及びその前駆体細胞、軟骨細胞及びその前駆体細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、癌細胞等の種々の腫瘍細胞（例えばヒト肝癌細胞株（Ｈｕｈ７））がある。
また、「造血系浮遊細胞」としては、例えばヒト赤血白血病細胞（ＴＦ−１）やヒト骨髄由来ＣＤ３４造血系前駆体細胞等の種々の造血系前駆体細胞、胚性幹細胞（Embryonic stem cells：ＥＳ細胞) 、人工多能性幹細胞（Induced pluripotent stem cells：ｉＰＳ細胞）等がある。
なお、上記各種細胞は、用途に応じて適宜選択又は任意に組み合わせて使用することができる。
【００２７】
低分子ヘパリン／プロタミン  マイクロ粒子（ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ）は、低分子ヘパリンとプロタミンとを含むマイクロ粒子である。本発明で用いられる低分子ヘパリンは、一般に天然ヘパリン（分子量１５０００〜２００００Ｄａ程度）を解重合して得られる低分子量のヘパリンである。その平均分子量の上限は、プロタミンと混合することにより微粒子を形成できる程度のものであればよく、一般的には１００００、好ましくは９０００、より好ましくは８０００、さらに好ましくは６０００であり、数平均分子量の下限は、通常は１０００、好ましくは３０００、より好ましくは４０００である。
【００２８】
なお、数平均分子量において通常（天然）のヘパリンと区別できれば十分であり、例えば、１００００以上、或いは２００００以上の分子量を持つ分画を含んでいても、全体として平均分子量が約１００００未満であれば本発明における低分子ヘパリンとして使用できる。本発明では、ヘパリンの平均分子量として、分子量が既知の標準物質を用いたゲル浸透クロマトグラフィー法によって測定される数平均分子量を用いる。
【００２９】
例えば、ブタの小腸粘膜由来のヘパリンを亜硝酸分解して得られる解重合ヘパリン（ダルテパリン）は、フラグミン（商品名）として市販されており、４０００〜６０００の平均分子量を有する。同様に、ブタの小腸粘膜由来のヘパリンを亜硝酸分解して得られる解重合ヘパリン（レビパリン）はローモリン（商品名）として市販されている。また、ウシ又はブタ腸粘膜由来のヘパリンを過酸化水素と酢酸第二銅により分解して得られる解重合ヘパリン（パルナパリン）は、ローヘパ（商品名）として市販されており、これらは何れも本発明における低分子ヘパリンとして使用できる。
【００３０】
ヘパリンは単独では抗凝固作用を持たず、血漿中のATIII と結合することによってその作用を発揮し、第IIa 因子、第XIIa因子、第XIa 因子、第Xa因子、第IXa 因子などの凝固系酵素を阻害、不活化する。一方、本発明で使用する低分子ヘパリンは抗第XIIa、抗第Xa因子活性を持つものの、第IIa 因子、第XIa 因子、第IXa 因子に対する阻害活性は軽微であることが医薬品として明らかにされているので、創傷部位に注入しても当該部位における出血傾向を助長することなく使用できる。
【００３１】
低分子ヘパリンとしては、上記の市販されているものを使用してもよいし、或いは、過ヨウ素酸酸化により低分子化したヘパリンや、特異的脱硫酸化ヘパリンなども好適に用いることができる。このような低分子量のヘパリンを使用することにより、プロタミンと混合した際に好適な微粒子を得ることができる。
【００３２】
本発明で用いるプロタミンは、動物の精子の核中でＤＮＡと結合して存在する塩基性の高いタンパク質として知られている。一般的には、２７〜６５残基からなる低分子量タンパク質であり、アミノ酸の４０〜７０％をアルギニンが占めると言われている。プロタミンも医薬品として市販されており、本発明では市販のプロタミンをそのまま使用することができる。
【００３３】
本発明の好適態様では、低分子ヘパリン溶液にプロタミン溶液を滴下して低分子ヘパリンとプロタミンとを含む粒子を生成させる。例えば、ダルテパリン等の低分子ヘパリンの水溶液に、プロタミン水溶液を後述する割合になるよう滴下し、ボルテックスなどでさらに攪拌することによって粒子を得る。低分子ヘパリンおよびプロタミンの濃度は各々設定することができ、好適にはそれぞれ０．０１〜３０ｍｇ／ｍｌである。このとき、低分子ヘパリンおよびプロタミンの濃度を調節することによって、得られる粒子のサイズを制御することができる。
【００３４】
例えば、低分子ヘパリンおよびプロタミンの濃度がそれぞれ１〜２０ｍｇ／ｍｌ程度の溶液を用いると、０．５〜１０μｍ程度の平均粒子径をもつ粒子を得ることができ、低分子ヘパリンおよびプロタミンの濃度がそれぞれ０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌ程度の溶液を用いると、５０〜２００ｎｍ程度の平均粒子径をもつ粒子を得ることができる。
【００３５】
低分子ヘパリンとプロタミンとの混合重量比については、プロタミンに対する低分子ヘパリンの重量を等量、或いはやや過剰することが、粒子の収率向上の点で好ましく、過剰なプロタミンの存在は不溶性のペースト状沈殿物が生成する懸念がある。従って、低分子ヘパリンの溶液にプロタミンの溶液を滴下する場合には、滴下後の溶液内における低分子ヘパリン／プロタミンの重量比は、好ましくは１／１〜５／１であり、より好ましくは１／１〜２／１である。
【００３６】
すなわち、上記低分子ヘパリン溶液に含まれる低分子ヘパリン１重量部に対して、好ましくは０．２〜１重量部、より好ましくは０．５〜１重量部のプロタミンが添加されるようにプロタミン溶液が滴下される。
【００３７】
このように作成されたＬＨ／Ｐ  ＭＰｓは、血漿中に含まれる多くのへパリン結合性増殖因子やサイトカイン等生理活性物質を担持することができ、担持された生理活性物質を熱やトリプシン等タンパク質分解酵素による不活化要因から保護して活性を維持延長することができ、さらに骨髄や脂肪組織由来の間葉系幹細胞等様々な接着性細胞の表面に接合し、細胞凝集体（スフェロイド）を形成する。
【００３８】
ヒト血漿は、健常ボランティアから０．１〜８m1の２％クエン酸溶液の入った採血管に血液を採血し、所定条件（例えば、１５分間、１７００ｒｐｍ（Table Top 冷却遠心機 2800,ローター：RS  240,クボタ））で遠心し、生じた３つの層、底部の赤（白）血球画分、赤（白）血球画分から上部（１ｃｍ）を多血小板血漿（Platelet  Rich Plasma ：ＰＲＰ）画分、さらに上部を少血小板血漿（Platelet  Poor Plasma ：ＰＰＰ）として採取し、ＰＲＰとＰＰＰを合わせたものである。
【００３９】
なお、本発明では、採血した血液の有効利用とゲル形成効率の観点から培地・血漿ゲル化剤としてヒト血漿を使用したが、血小板とともにそこに包含されたサイトカインが濃縮されているＰＲＰ或いは血漿ゲル化に優れたＰＰＰの用途別使用も可能である。また、安全性の面からヒトへの臨床適用には、自己（autogenous）血漿の使用が望ましい。
【００４０】
サイトカインとしては、一例としてインターロイキン（Interleukin ：ＩＬ）、幹細胞因子（Stem cell factor：ＳＣＦ）、上皮増殖因子（Epidermal Growth Factor ：ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（Fibroblast Growth Factor：ＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor：ＦＧＦ−２）、血小板由来増殖因子（Platelet-Derived Growth Factor：ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（Hepatocyto Growth Factor：ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（Transforming growth factor：ＴＧＦ）、トロンボポエチン（Thrombopoietin：ＴＰＯ）、コロニー刺激因子（Coloney-Stimulating Factor：ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-Coloney-Stimulating Factor：Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor：ＧＭ−ＣＳＦ）、ＦＬｔ３−ｌｉｇａｎｄ（Human Fms-related tyrosin kinase 3 ligand ）等があり、使用する接着性細胞又は造血系浮遊細胞に応じて任意に選択して添加する。
【００４１】
培地としては、用途に応じて選択された各種細胞に適切なサイトカインに応じて選択される細胞培養培地として、例えばＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、ＨＰＧＭ（Hematopoietic Progenitor Growth Medium）等を使用する。
【００４２】
本発明の細胞移植用組成物におけるゲル化の条件としては、血小板及び血液凝固因子（フィブリノーゲン等）を含めた血漿を用いているため、採血時に採血管に入れる抗凝固剤としてのクエン酸（２％液）を採血量に対して１〜２％に制限、或いは添加するＬＨ／Ｐ  ＭＰｓを０．２ｍｇ／ｍｌ以下に制限することによって適度な粘稠性を有するとともに増殖した細胞の分散性を限定し、生着性及び増殖性に優れた組成物を得ることができる。  なお、このゲル化メカニズムは、人体が怪我をしたときに出血した血液が凝固（ゲル化）する血液凝固作用と同一である。
【００４３】
以上説明したように、本発明の細胞移植用組成物は、適切なサイトカイン及びＬＨ／Ｐ  ＭＰｓを添加した血漿（より好ましく自己血漿）からなるゲル状を成しているため、接着性或いは造血性浮遊性細胞に対して、安全性の面で問題のある異種動物の血清、フィーダー細胞、そしてコラーゲンやマトリゲル等のマトリックスとしての使用を排除し、対象として、骨髄由来間葉系幹細胞及び脂肪組織由来間葉系細胞及び血管内皮細胞及びその前駆体細胞、線維芽細胞及びその前駆体細胞、肝実質細胞及びその前駆体細胞、膵β細胞及びその前駆体細胞、平滑筋細胞及びその前駆体細胞、軟骨細胞及びその前駆体細胞等の接着性・体性細胞全般に有効である。さらに、ヒト骨髄由来ＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞或いはＴＦ−１細胞等の造血系浮遊細胞に加えて、躋帯血や末梢血由来ＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞、骨髄や末梢血中の単核球細胞の選択的増幅及び分化誘導に適切なサイトカインの添加を伴う適応が可能である。
【００４４】
また、本発明の細胞増殖用組成物を用いた３次元細胞培養方法は、用途に応じた所望の細胞及びμｍ〜ｎｍオーダーの微粒子を血漿ゲルに包含させた軟ゲル状の複合体という形態的特徴を有するので、特に注射器やカテーテルなどを介して、容易に体内に注入する細胞運搬用組成物としても機能する。さらに、適度な粘稠性と徐放性を有するため、生体局所に注入した際に、組成物内で３次元的に増殖した状態で局所に組成物を留まらせつつ、サイトカインにより分化・増殖した細胞及び細胞が生成した有効成分を周辺部位に徐放させることができる。
【００４５】
また、本発明の細胞増殖用組成物によって増幅させた各種細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液による所定時間（１０分以内）溶解することで容易に回収することができる。
【００４６】
ところで、上述した形態において、細胞移植用組成物に含有させる細胞は特に制限はないが、本培地・血漿ゲル包接担体に担持されやすく、体内において生着及び増殖が望まれる再生医療に有用な同種移植用細胞（より好ましくは自己細胞）とするのが好ましい。また、異種移植用細胞導入への適用も可能である。例えば、後述する実施例７で示すように、ヒト肝癌細胞（Ｈｕｈ７）を免疫不全マウス（ヌードマウス）に移植する際に、本細胞移植用組成物の使用は、腫癌細胞の生着性・成長性を大きく高めることが確認された。
【００４７】
また、本発明の細胞移植用組成物に添加されるサイトカインは、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓの構成成分である低分子へパリン又はプロタミンとの親和性が高い薬物、例えばＦＧＦ−２等のへパリン結合性増殖因子又はサイトカインから選択される活性物質を含有させるのが好ましい。特に、ヒト血漿は患者自身から採血した血液から調製できるもので、そこに含まれる増殖因子やサイトカインは、殆どがヘパリン結合性であることが知られている。また、本発明の細胞移植用組成物において、使用する媒体としては水性媒体が好ましい。
【００４８】
さらに、上述した細胞移植用組成物を用いた３次元細胞培養方法は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞やヒト脂肪組織由来間葉系細胞を含む接着性細胞、ＴＦ−１やヒト骨髄由来ＣＤ３４造血系前駆体細胞を含む造血系浮遊細胞に限定されるものではなく、同種血漿、望ましくは自己血漿を用いることで、例えば躋帯血や末梢血由来ＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞、マウス、ラット、兎等他種動物の骨髄由来間葉系幹細胞及び脂肪組織由来間葉系細胞及び血管内皮細胞及びその前駆体細胞、線維芽細胞及びその前駆体細胞、血管内皮細胞及びその前駆体細胞、肝実質細胞及びその前駆体細胞、肺β細胞及びその前駆体細胞、平滑筋細胞及びその前駆体細胞、軟骨細胞及びその前駆体細胞、筋芽細胞、骨芽細胞等の様々な接着細胞に適切な増殖因子やサイトカイン等の生理活性物質の添加を伴う適応が可能である。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明による実施例を示す。なお、本発明はこれらの実施例に記載された態様に限定されるわけではなく、前・後記の趣旨に照らし合わせて設計変更することは何れも本発明の技術的範囲に含まれるものである。
【００５０】
［低分子ヘパリン／プロタミン  マイクロ粒子（ＬＰ／Ｐ  ＭＰｓ）の作製］
低分子ヘパリンとして、市販のダルテパリンであるフラグミン注射液（商品名）（６．４ｍｇ／ｍｌ、１０００ＩＵ／ｍｌ、ヘパリンの数平均分子量は約５０００、キッセイ薬品工業株式会社）を使用した。この低分子ヘパリン溶液に対して、市販のプロタミン注射液（１０ｍｇ／ｍｌ：持田製薬株式会社) をボルテックスで撹拌しながら7 ：3 の容積比になるまで滴下し混合することで得た。
【００５１】
［ヒト血漿の採取］
健常ボランティアから０．１〜８m1の２％クエン酸溶液の入った採血管に４０ｍｌの血液を採血し、１５分間、１７００ｒｐｍ（Table Top 冷却遠心機 2800,ローター：RS  240,クボタ）で遠心した。生じた３つの層、底部の赤（白）血球画分、赤（白）血球画分から上部（１ｃｍ）を多血小板血漿（Platelet  Rich Plasma ：ＰＲＰ）画分、さらに上部を少血小板血漿（Platelet  Poor Plasma ：ＰＰＰ）として採取した。ＰＲＰとＰＰＰを合わせたがヒト血漿である。なお、４０ｍｌのヒト血液から４〜５ｍｌのＰＲＰ、１５〜２０ｍｌのＰＰＰ、２０〜２４ｍｌのヒト血漿が得られた。ＰＲＰの血小板濃度は７９．６±１０．２×１０4 ／μｌ、ＰＰＰは３．６±０．６×１０4 ／μｌ、血漿は１８．２±３．６×１０4 ／μｌであった。
【００５２】
［実施例１］
作製したＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ（０．１ｍｇ／ｍｌ）と、サイトカインとしてＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）を含む無血清ＤＭＥＭ培地と、ヒト血漿（容積比４％）とを加えて作製したゲル状の細胞移植用組成物内を用いて、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞及びヒト脂肪組織由来間葉系細胞に対する体外３次元培養増幅を実施した。
【００５３】
図１（ａ）に示すように、２４ウエル組織培養プレートに、約５０，０００のヒト骨髄由来間葉系幹細胞を作製した細胞移植用組成物内に加えて播種し、５日間体外３次元培養を行った（図中「■」）。比較対象として、ＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）のみを含むヒト血漿（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「□」）、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓのみを含むヒト血漿（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「△」）、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ及びＦＧＦ−２の両者を含まないヒト血漿（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「●」）を３次元培養ネガティブコントロールとし、５日間の細胞増殖を比較した。
また、他の比較対象として、図１（ｂ）に示すように、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ及びＦＧＦ−２を含む無血清ＤＭＥＭ培地においてヒト血漿に代えてヒト血清（容積比４％）を加えたＤＭＥＭ（図中「■」）、ＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）のみを含むヒト血清（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「□」）、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓのみを含むヒト血清（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「△」）、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ及びＦＧＦ−２の両者を含まないヒト血清（容積比１０％）ＤＭＥＭ（図中「○」）、ヒト血清（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「●」）を用いて、上記ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を体外２次元培養し、５日間の細胞増殖を比較した。なお、各図中の縦軸は、細胞増幅（Cell growth ）を示す。
【００５４】
図２（ａ）は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞について上記作製した細胞移植用組成物内での体外３次元培養の培養３日目の顕微鏡写真であり、図２（ｂ）はＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ、ＦＧＦ−２及びヒト血清（容積比４％）を加えた２次元培養の培養３日目の顕微鏡写真である。
【００５５】
また、図３（ａ）に示すように、２４ウエル組織培養プレートに、約５０，０００のヒト脂肪組織由来間葉系細胞を作製した細胞移植用組成物内に加えて播種し、５日間体外３次元培養を行った（図中「■」）。比較対象として、ＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）のみを含むヒト血漿（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「□」）、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓのみを含むヒト血漿（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「△」）、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ及びＦＧＦ−２の両者を含まないヒト血漿（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「●」）を３次元培養ネガティブコントロールとし、５日間の細胞増殖を比較した。
また、他の比較対象として、図３（ｂ）に示すように、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ及びＦＧＦ−２を含む無血清ＤＭＥＭ培地においてヒト血漿に代えてヒト血清（容積比４％）を加えたＤＭＥＭ（図中「■」）、ＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）のみを含むヒト血清（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「□」）、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓのみを含むヒト血清（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「△」）、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ及びＦＧＦ−２の両者を含まないヒト血清（容積比１０％）ＤＭＥＭ（図中「○」）、ヒト血清（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「●」）を用いて、上記ヒト脂肪組織由来間葉系細胞を体外２次元培養し、５日間の細胞増殖を比較した。なお、各図中の縦軸は、細胞増幅（Cell growth ）を示す。
【００５６】
図４（ａ）は、ヒト脂肪組織由来間葉系細胞について上記作製した細胞移植用組成物内での体外３次元培養の培養３日目の顕微鏡写真であり、図４（ｂ）はＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ、ＦＧＦ−２及びヒト血清（容積比４％）を加えた２次元培養の培養３日目の顕微鏡写真である。
【００５７】
なお、本実施例では、細胞培養後の細胞移植用組成物に対し、トリプシン・ＥＤＴＡ溶液で１０分以内に溶解してその中の増殖細胞を分雛し、血球計測器を用いて細胞数を計測した。
【００５８】
図１〜４に示すように、比較結果として、両細胞ともＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ及びＦＧＦ−２を含む無血清ＤＭＥＭ培地にヒト血漿（容積比４％）を加えた本発明の細胞移植用組成物内において最大の細胞増殖を示した。
【００５９】
［実施例２］
作製したＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ（０．１ｍｇ／ｍｌ）と、ＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）を含む無血清ＤＭＥＭと、ヒト血漿（容積比４％）とを加えて作製した本発明に係る細胞移植用組成物内で、体外３次元培養増幅させたヒト骨髄由来間葉系幹細胞及びヒト脂肪組織由来間葉系細胞の分化能を確認するため、脂肪細胞への分化誘導を行った。脂肪細胞への分化誘導には市販培地（Lonza Walkersville, Inc., MD）を使用し、両細胞を脂肪細胞誘導培地で４日間、続いて維持培地で３日間培養するサイクルを３回実施した後、両細胞を維持培地でさらに７日間培養した。また、脂肪滴の確認のため、 Oil Red O染色（和光純薬工業（株））を施した。
【００６０】
図５（ａ）は、３次元培養増幅したヒト骨髄由来間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化誘導の試験結果であり、４８ウエルプレートの最初のＰ列は、購入細胞の分化誘導、２番目のＮ列は分化誘導培地を用いず、維持培地のみで培養したもの、３、４番目の−列は、体外２次元培養で増幅した細胞の分化能、５、６番目の＋列は体外３次元培養で増幅した細胞を示している。また、図５（ｂ）は、３次元培養増幅したヒト脂肪組織由来間葉系細胞の脂肪細胞への分化誘導の試験結果であり、４８ウエルプレートの最初のＰ列は、購入細胞の分化誘導、２番目のＮ列は分化誘導培地を用いず、維持培地のみで培養したもの、３、４番目の−列は、体外２次元培養で増幅した細胞の分化能、５、６番目の＋列は体外３次元培養で増幅した細胞を示している。
【００６１】
培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞及びヒト脂肪組織由来間葉系細胞は、何れも脂肪細胞に良好に分化誘導する分化能を保持していることが確認された。
【００６２】
［実施例３］
作製したＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ（０．１ｍｇ／ｍｌ）と、ＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）を含む無血清ＤＭＥＭと、ヒト血漿（容積比４％）とを加えて作製した本発明に係る細胞移植用組成物内で、体外３次元培養増幅させたヒト骨髄由来間葉系幹細胞及びヒト脂肪組織由来間葉系細胞の分化能を確認するため、骨芽細胞への分化誘導を行った。骨芽細胞への分化誘導には市販培地（Lonza Walkersville, Inc., MD）を使用し、両細胞を脂肪細胞誘導培地で４日間、続いて維持培地で３日間培養するサイクルを３回実施した後、両細胞を維持培地でさらに７日間培養した。また、骨芽細胞の誘導では、骨芽細胞のアルカリフォスファターゼ活性を調べるため、ＡＬＰ染色を実施した。
【００６３】
図６（ａ）は、３次元培養増幅したヒト骨髄由来間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導の試験結果であり、４８ウエルプレートの最初のＰ列は、購入細胞の分化誘導、２番目のＮ列は分化誘導培地を用いず、維持培地のみで培養したもの、３、４番目の−列は、体外２次元培養で増幅した細胞の分化能、５、６番目の＋列は体外３次元培養で増幅した細胞を示している。また、図５（ｂ）は、３次元培養増幅したヒト脂肪組織由来間葉系細胞の骨芽細胞への分化誘導の試験結果であり、４８ウエルプレートの最初のＰ列は、購入細胞の分化誘導、２番目のＮ列は分化誘導培地を用いず、維持培地のみで培養したもの、３、４番目の−列は、体外２次元培養で増幅した細胞の分化能、５、６番目の＋列は体外３次元培養で増幅した細胞を示している。
【００６４】
培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞及びヒト脂肪組織由来間葉系細胞は、何れも骨芽細胞に良好に分化誘導する分化能を保持していることが確認された。
【００６５】
加えて、培地・血漿ゲル内でのヒト皮膚線維芽細胞３次元培養は、５日目以降顕著な血漿ゲル収縮とともに肉芽組織様形態を示した。また、ヒト皮膚毛細血管内皮細胞３次元培養は、２４時間以内に毛細血管様組織形成が観察された。
【００６６】
［実施例４］
作製したＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ（０．１ｍｇ／ｍｌ）と、サイトカインとしてＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）を含む無血清ＤＭＥＭ培地と、ヒト血漿（容積比４％）とを加えて作製したゲル状の細胞移植用組成物内を用いて、ヒト皮膚線維芽細胞及びヒト皮膚毛細血管内皮細胞に対する体外３次元培養増幅を実施した。
【００６７】
図７（ａ）に示すように、２４ウエル組織培養プレートに、約５０，０００のヒト皮膚線維芽細胞を作製した細胞移植用組成物内に加えて播種し、５日間体外３次元培養を行った（図中「■」）。比較対象として、比較対象として、ＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）のみを含むヒト血漿（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「□」）、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓのみを含むヒト血漿（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「△」）、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ及びＦＧＦ−２の両者を含まないヒト血漿（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「●」）を３次元培養ネガティブコントロールとし、５日間の細胞増殖を比較した。
また、他の比較対象として、図７（ｂ）に示すように、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ及びＦＧＦ−２を含む無血清ＤＭＥＭ培地においてヒト血漿に代えてヒト血清（容積比４％）を加えたＤＭＥＭ（図中「■」）、ＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）のみを含むヒト血清（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「□」）、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓのみを含むヒト血清（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「△」）、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ及びＦＧＦ−２の両者を含まないヒト血清（容積比１０％）ＤＭＥＭ（図中「○」）、ヒト血清（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「●」）を用いて、上記ヒト皮膚線維芽細胞を体外２次元培養し、５日間の細胞増殖を比較した。なお、各図中の縦軸は、細胞増幅（Cell growth ）を示す。
【００６８】
図８（ａ）は、ヒト皮膚線維芽細胞について上記作製した細胞移植用組成物内での体外３次元培養の培養３日目の顕微鏡写真であり、図８（ｂ）はＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ、ＦＧＦ−２及びヒト血清（容積比４％）を加えた２次元培養の培養３日目の顕微鏡写真である。
【００６９】
図９（ａ）に示すように、２４ウエル組織培養プレートに、約５０，０００のヒト皮膚毛細血管内皮細胞を作製した細胞移植用組成物内に加えて播種し、５日間体外３次元培養を行った（図中「■」）。比較対象として、比較対象として、ＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）のみを含むヒト血漿（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「□」）、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓのみを含むヒト血漿（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「△」）、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ及びＦＧＦ−２の両者を含まないヒト血漿（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「●」）を３次元培養ネガティブコントロールとし、５日間の細胞増殖を比較した。
また、他の比較対象として、図９（ｂ）に示すように、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ及びＦＧＦ−２を含む無血清ＤＭＥＭ培地においてヒト血漿に代えてヒト血清（容積比４％）を加えたＤＭＥＭ（図中「■」）、ＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）のみを含むヒト血清（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「□」）、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓのみを含むヒト血清（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「△」）、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ及びＦＧＦ−２の両者を含まないヒト血清（容積比１０％）ＤＭＥＭ（図中「○」）、ヒト血清（容積比４％）ＤＭＥＭ（図中「●」）を用いて、上記ヒト皮膚毛細血管内皮細胞を体外２次元培養し、５日間の細胞増殖を比較した。なお、各図中の縦軸は、細胞増幅（Cell growth ）を示す。
【００７０】
図１０（ａ）は、ヒト皮膚毛細血管内皮細胞について上記作製した細胞移植用組成物内での体外３次元培養の培養３日目の顕微鏡写真であり、図４（ｂ）はＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ、ＦＧＦ−２及びヒト血清（容積比４％）を加えた２次元培養の培養３日目の顕微鏡写真である。
【００７１】
なお、本実施例では、細胞培養後の細胞移植用組成物に対し、トリプシン・ＥＤＴＡ溶液で１０分以内に溶解してその中の増殖細胞を分雛し、血球計測器を用いて細胞数を計測した。
【００７２】
図７〜１０に示すように、比較結果として、両細胞ともＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ及びＦＧＦ−２を含む無血清ＤＭＥＭ培地にヒト血漿（容積比４％）を加えた本発明の細胞移植用組成物内において最大の細胞増殖を示した。
【００７３】
［実施例５］
作製したＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ（０．１ｍｇ／ｍｌ）と、１／４濃度のＳＣＦ（５ｎｇ／ｍｌ）・ＴＰＯ（１０ｎｇ／ｍｌ）・Ｆｌｔ−３ｌｉｇａｎｄ（１０ｎｇ／ｍｌ）の造血細胞増幅用サイトカインを含む無血清ＨＰＧＭと、ヒト血漿（容積比４％）とを加えて作製したゲル状の細胞移植用組成物内を用いて、ヒト骨髄由来ＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞の３次元培養を実施した。
【００７４】
図１１に示すように、上記細胞移植用組成物を用いてヒト骨髄由来ＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞について１０日間体外３次元培養を行った（図中「◆」）。比較対象として、ヒト血漿（ＨＰ：２％）を含む無血清ＨＰＧＭからなる培地・血漿ゲル（図中「■」) 、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ（０．１ｍｇ／ｍｌ）及びＨＰを含む無血清ＨＰＧＭからなる培地・血漿ゲル（図中「△」）、ＳＣＦ（１／４Ｘ；５ｎｇ／ｍｌ）・ＴＰＯ（１／４Ｘ；１０ｎｇ／ｍｌ）・Ｆｌｔ−３  ｌｉｇａｎｄ（１／４Ｘ；１０ｎｇ／ｍｌ）とヒト血漿を含む無血清ＨＰＧＭからなる培地・血漿ゲル内（図中「▲」）を３次元培養ネガティブコントロールとし、１０日間の細胞増殖を比較した。
また、他の比較対象として、ＳＣＦ（１Ｘ；２０ｎｇ／ｍｌ）・ＴＰＯ（１Ｘ；４０ｎｇ／ｍｌ・Ｆｌｔ−３  ｌｉｇａｎｄ（１Ｘ；４０ｎｇ／ｍｌ）のみを含んだＨＰＧＭ（図中「○」）、ＳＦＣ（１／４Ｘ）・ＴＰＯ（１／４Ｘ）・Ｆｌｔ−３  ｌｉｇａｎｄ（１／４Ｘ）のみを含んだＨＰＧＭ（図中「●」）、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓと、ＳＦＣ（１／４Ｘ）・ＴＰＯ（１／４Ｘ）・Ｆｌｔ−３  ｌｉｇａｎｄ（１／４Ｘ）のみを含んだＨＰＧＭ（図中「□」）を体外２次元培養し、１０日間の細胞増殖を比較した。なお、各図中の縦軸は、細胞増幅（Cell growth ）を示す。
【００７５】
また、図１２に示すように、上記細部移植用組成物内で増殖中のヒト骨髄由来ＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞における０、４、１０日目にＣＤ３４陽性率をＰＥラベルヒート抗ＣＤ３４（BD Biosciences Pharmigen, USA ）を用いてEPICSRXL（Beckman Coulter, USA）によりフローサイトメトリーの計測結果である。図中「黒」は、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ（０．１ｍｇ／ｍｌ）とＳＦＣ（１／４Ｘ；５ｎｇ／ｍｌ）・ＴＰＯ（１／４Ｘ；１０ｎｇ／ｍｌ）・Ｆｌｔ−３  ｌｉｇａｎｄ（１／４Ｘ；１０ｎｇ／ｍｌ）を含む無血清ＨＰＧＭと、ヒト血漿（容積比３％）からなる細胞移植用組成物の３次元培養の結果であり、図中「灰色」は、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ（０．１ｍｇ／ｍｌ）とＳＦＣ（１／４Ｘ；５ｎｇ／ｍｌ）・ＴＰＯ（１／４Ｘ；１０ｎｇ／ｍｌ）・Ｆｌｔ−３  ｌｉｇａｎｄ（１／４Ｘ；１０ｎｇ／ｍｌ）を含む無血清ＨＰＧＭと、ヒト血清（容積比３％）からなる培地・血漿ゲルの２次元培養の結果であり、図中「白」は、コントロールとしてＳＦＣ（１／４Ｘ；５ｎｇ／ｍｌ）・ＴＰＯ（１／４Ｘ；１０ｎｇ／ｍｌ）・Ｆｌｔ−３  ｌｉｇａｎｄ（１／４Ｘ；１０ｎｇ／ｍｌ）のみを含む無血清ＨＰＧＭの体外２次元培養の結果である。
【００７６】
図１３（ａ）はヒト骨髄由来ＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞について上記細胞移植用組成物内での体外３次元培養の培養６日目の電子顕微鏡写真であり、図１３（ｂ）はヒト骨髄由来ＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞についてヒト血清（容積比４％）を含む培地による２次元培養の培養６日目の電子顕微鏡写真である。
【００７７】
図１１〜１３に示すように、本発明に係る細胞移植用組成物を用いた３次元細胞培養方法によるヒト骨髄由来ＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞の培養では、ヒト骨髄由来ＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞のコロニー形成を促進して最適な３次元増幅が行え、ヒト血漿に代えて等量の血清を添加した同じ培地を用いた２次元培養よりも有意に高い増殖率を得ることができた。また、３次元細胞培養方法で増幅させたヒト骨髄由来ＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞は、同じ培地に等量の同種血清を添加した２次元培養よりも有意に高いＣＤ３４陽性率を維持した。
【００７８】
［実施例６］
作製したＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ（０．１ｍｇ／ｍｌ）に、サイトカインとしてＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）・ＧＭ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）を含む無血清ＤＭＥＭにヒト血漿（容積比４％）を加えて作製したゲル状の細胞移植用組成物内を用いて、ヒトＴＦ−１細胞の３次元培養を実施した。
【００７９】
図１４に示すように、上記細胞移植用組成物を用いてヒトＴＦ−１細胞について１０日間３次元培養を行った（図中「◆」）。比較対象として、ヒト血漿（ＨＰ：２％）を含む無血清ＤＭＥＭからなる培地・血漿ゲル（図中「■」) 、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ（０．１ｍｇ／ｍｌ）及びＨＰを含む無血清ＤＭＥＭからなる培地・血漿ゲル（図中「△」）、ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）・ＧＭ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）とヒト血漿を含む無血清ＤＭＥＭからなる培地・血漿ゲル内（図中「▲」）を３次元培養ネガティブコントロールとし、３日間の細胞増殖を比較した。
また、他の比較対象として、１０％ヒト血清（ＨＳ）のみを含んだＤＭＥＭ（図中「○」）、ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）・ＧＭ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）のみを含んだ無血清ＤＭＥＭ（図中「●」）、１０％ＨＳ及びＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）・ＧＭ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）のみを含んだＤＭＥＭ（図中「□」）を体外２次元培養し、３日間の細胞増殖を比較した。なお、各図中の縦軸は、細胞増幅（Cell growth ）を示す。
【００８０】
図１５（ａ）はヒトＴＦ−１細胞について上記細胞移植用組成物内での体外３次元培養の培養２日目の電子顕微鏡写真であり、図１５（ｂ）はヒトＴＦ−１細胞についてヒト血清（容積比４％）を含む培地による２次元培養の培養２日目の電子顕微鏡写真である。
【００８１】
図１４、１５に示すように、本発明に係る細胞移植用組成物を用いた３次元細胞培養方法によるヒトＴＦ−１細胞の培養では、ヒトＴＦ−１細胞のコロニー形成を促進して最適な３次元増幅が行え、ヒト血漿に代えて等量の血清を添加した同じ培地を用いた２次元培養よりも有意に高い増殖率を得ることができた。
【００８２】
［実施例７］
ヒト肝癌細胞株（Ｈｕｈ７：５００，０００cells 及びＨｕｈ７：５, ０００, ０００cells ）を、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ（５ｍｇ／ｍｌ）及びＦＧＦ−２（１０μｇ／ｍｌ）を含む無血清ＤＭＥＭにヒト血漿（容積比５％）を加えて作製した細胞用移植用組成物に添加し、ヌードマウス皮下へ２００μｌ投与した異種腫瘍細胞移植実験を実施した。比較対象として、ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ（５ｍｇ／ｍｌ）を腫瘍細胞浮遊液に加えた移植した（図中「＋ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ」）。また、ＦＧＦ−２（１０μｇ／ｍｌ）を腫瘍細胞浮遊液に加えた移植した（図中「＋ＦＧＦ−２」）。さらに、ヒト血漿（容積比５％）を腫瘍細胞浮遊液に加えた移植した（図中「＋ＨＰ」）。また、ヒト血漿（容積比５％）及びＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ（５ｍｇ／ｍｌ）を腫瘍細胞浮遊液に加え移植した（図中「＋ＨＰ＋ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ」）。さらに、ヒト血漿（容積比５％）とＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ（５ｍｇ／ｍｌ）とＦＧＦ−２（１０μｇ／ｍｌ）を腫瘍細胞浮遊液に加え移植した（図中「＋ＨＰ＋ＬＨ／Ｐ  ＭＰｓ＋ＦＧＦ−２」）。コントロールとして、上記腫瘍細胞を生理食塩水に浮遊させ移植した（図中「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）。
なお、腫傷サイズは、経時的に小型ノギスを用いて、縦・横・高さを測定し算出し、縦軸は成長した腫瘍容量（ｃｍ3 ）を示す。
【００８３】
図１６（ａ）に示すように、Ｈｕｈ７細胞のみと、Ｈｕｈ７細胞＋ＦＧＦ−２投与群では、腫傷の生着及び成長は観察されなかったが、Ｈｕｈ７細胞を添加した上記細胞移植用組成物のヌードマウス皮下へ投与では、最適な生着及び腫傷成長を認められた。また、図１６（ｂ）に示すように、Ｈｕｈ７細胞（５, ０００, ０００cells ／２００μｌ）の移植実験では、コントロールでも細胞の生着は認められるものの、Ｈｕｈ７細胞を添加した上記細胞移植用組成物のヌードマウス皮下へ投与は、最適な腫癌成長を認められた。
【００８４】
［実施例８］
本発明による３次元細胞培養方法により増幅させたマウス骨髄由来ＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞を含んだ細胞移植用組成物をＸ線照射により骨髄死を引き起こしたマウスの骨内へ投与した。その結果、末梢血での白血球や血小板の有意に高い回復が観察され、優れた骨内造血系前駆体細胞移植のための運搬システムとして適用の可能性が示された。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明は、用途に応じて任意に選択される接着性細胞や造血系浮遊細胞等の各種細胞と、安全性が確認されている低分子へパリンとプロタミンとから構成される平均粒径が０．１μｍ〜５μｍ未満のＬＨ／Ｐ  ＭＰｓと、適切なサイトカイン、培地及びヒト血漿を含んでなるゲル状の細胞移植用組成物を用いた３次元細胞培養方法により、特にＣＤ３４陽性造血系前駆体細胞の体外大量増幅システムとしての有用性が極めて高い。また、細胞移植用組成物は、注射器やカテーテル等を介して、生体局所に投与する医療用途へ安定的に供給する細胞運搬法として適用することができる。
【００８６】
さらに、血漿中に含まれる生理活性物質を安定に保持し、目的部位で担持した活性分子を徐放できるドラッグデリバリー用薬物包接担体としても使用できる。また、ヌードマウス等に局所注入した細胞移植用組成物内で癌細胞等の腫瘍細胞を担持した状態で効率よく増幅させることができるため、抗ガン剤等の新薬の開発に大きく貢献できる。そして、ヒト自己骨髄間葉系幹細胞或いは自己脂肪組織由来間葉系細胞に本細胞デリバリー担体を適用することで、美容形成外科領域の育毛剤及び雛取り等美容形成治療法への適用に加え、血管新生促進製剤、皮膚等の難治性創傷治癒促進剤として、さらには他の細胞導入を伴う再生医療への応用が可能となる。
【図１】
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【図３】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１４】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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