(57)【要約】      （修正有）【課題】ＤＮＡ合成酵素阻害活性を有する化合物の提供。【解決手段】一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有するＤＮＡ合成酵素阻害剤、抗癌剤及び抗炎症剤。2012201600.tif 000020（式中、Ｒは炭化水素基を示す。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）：
【化１】
2012201600.tif 000018
（式中、Ｒは炭化水素基を示す。）
で表される化合物を有効成分として含有するＤＮＡ合成酵素阻害剤。
【請求項２】
一般式（１）において、ＲがＣ１〜４０の飽和又は不飽和の炭化水素基である請求項１に記載のＤＮＡ合成酵素阻害剤。
【請求項３】
請求項１に記載の一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有する抗癌剤。
【請求項４】
請求項１に記載の一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有す抗炎症剤。
【請求項５】
請求項１に記載の一般式（１）で表される化合物を食品に配合してなる食用組成物。
【請求項６】
一般式（２）：
【化２】
2012201600.tif 000019
（式中、Ｒ’はＣ３以上の炭化水素基を示す。）
で表される化合物。
【請求項７】
請求項６に記載の一般式（２）で表される化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項８】
請求項６に記載の一般式（２）で表される化合物の製造方法であって、ジュグロンと一般式（３’）：
Ｒ’−ＣＯＯＨ        （３’）
（式中、Ｒ’は前記に同じ。）
で表される化合物又はその誘導体を反応させることを特徴とする製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ合成酵素阻害作用を有する化合物とその利用に関する。この化合物は、ＤＮＡ合成酵素阻害剤として、例えば、抗癌剤、抗炎症剤等として利用し得る。
【背景技術】
【０００２】
真核生物のＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）は、これまでα、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、ι、κ、λ、μ、σ及びTdT（ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ）、Rev1の１５種類の分子種が知られている。これらのＤＮＡ合成酵素群は、細胞の増殖、分裂、分化などに関与しているが、α型はＤＮＡ複製、β型、λ型及びTdTは修復と組換え、δ型及びε型は複製と修復の双方、ζ〜κ型は修復を担うといった具合にタイプによって異なる機能を有することが知られている。
【０００３】
このようにＤＮＡ合成酵素は細胞の増殖等に関与することから、その酵素活性を阻害するＤＮＡ合成酵素阻害剤は、例えば、癌に対して癌細胞の増殖抑制作用を示し、エイズに対してＨＩＶ由来逆転写酵素に対する阻害作用を示し、また、免疫疾患に対して抗原に対する特異的抗体産生を抑制する免疫抑制作用を示すことが考えられる。このため、ＤＮＡ合成酵素阻害剤を用いた癌、エイズ等のウイルス疾患、免疫疾患の予防・治療に効果のある医薬品の開発が期待されている。
【０００４】
近年、ビタミンＫ３にＤＮＡ合成酵素γに対する選択的阻害活性があることが見出されている（非特許文献１）。また、ビタミンＫ３の誘導体であるジュグロン（Juglone；５−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン）が強いＤＮＡ合成酵素阻害活性及びヒト大腸癌細胞（HCT116）増殖抑制活性があることが見出されている（非特許文献２）。
【０００５】
また、ジュグロンの酢酸エステル及びジュグロンのプロピオン酸エステルは公知の化合物であるが、これらの化合物がＤＮＡ合成酵素阻害活性を有することは知られていない。
【０００６】
また、ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）等の長鎖不飽和脂肪酸がＤＮＡ合成酵素を阻害することが報告されている（特許文献１、非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平９−２０６５７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Mizushina et al, Cancer Sci., (2008) 99, p1040-1048
【非特許文献２】日本栄養・食糧学会  第４９回近畿支部大会講演要旨集  ２０１０年１０月１日発行  ｐ２８、講演番号Ａａ３
【非特許文献３】Mizushina et al, Biochim. Biophys. Acta., (1996) 1308, p256-262
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＤＮＡ合成酵素阻害活性を有する化合物、該化合物を有効成分として含有する医薬組成物（ＤＮＡ合成酵素阻害剤、抗癌剤及び抗炎症剤）を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ジュグロンの５位の水酸基がアシル化された化合物（以下、「アシルジュグロン」と表記する場合もある）が、優れたＤＮＡ合成酵素阻害活性を有することを見出した。さらに、このアシルジュグロンのＤＮＡ合成酵素阻害活性は、ジュグロン単独又は該アシル基の原料となるカルボン酸化合物単独の阻害活性と比べて顕著に優れていることを確認した。また、このアシルジュグロンは抗炎症活性を有することをも見出した。かかる知見に基づきさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は下記化合物を有効成分として含むＤＮＡ合成酵素阻害剤、抗癌剤及び抗炎症剤を提供する。
【００１２】
項１  一般式（１）：
【００１３】
【化１】
2012201600.tif 000002
【００１４】
（式中、Ｒは炭化水素基を示す。）
で表される化合物を有効成分として含有するＤＮＡ合成酵素阻害剤。
【００１５】
項２  一般式（１）において、ＲがＣ１〜４０の飽和又は不飽和の炭化水素基である項１に記載のＤＮＡ合成酵素阻害剤。
【００１６】
項３  項１に記載の一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有する抗癌剤。
【００１７】
項４  項１に記載の一般式（１）で表される化合物を有効成分として含有す抗炎症剤。
【００１８】
項５  項１に記載の一般式（１）で表される化合物を食品に配合してなる食用組成物。
【００１９】
項６  一般式（２）：
【００２０】
【化２】
2012201600.tif 000003
【００２１】
（式中、Ｒ’はＣ３以上の炭化水素基を示す。）
で表される化合物。
【００２２】
項７  項６に記載の一般式（２）で表される化合物を有効成分として含有する医薬組成物
項８  項６に記載の一般式（２）で表される化合物の製造方法であって、ジュグロンと一般式（３’）：
Ｒ’−ＣＯＯＨ        （３’）
（式中、Ｒ’は前記に同じ。）
で表される化合物又はその誘導体を反応させることを特徴とする製造方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のＤＮＡ合成酵素阻害剤は、一般式（１）で表されるように、ジュグロンとカルボン酸化合物（ＲＣＯＯＨ）を脱水縮合したエステル化合物を有効成分として含有する。一般式（１）で表される化合物は、優れたＤＮＡ合成酵素阻害活性（特に、ＤＮＡ合成酵素α等の阻害活性）を有しており、ジュグロン単独又はカルボン酸化合物（ＲＣＯＯＨ）単独の阻害活性と比べて顕著に優れている。また、この化合物は、発癌プロモーターＴＰＡによって誘発される炎症を抑制することから、発癌プロモーターＴＰＡの働きを抑制する抗発癌プロモーター活性を有する。そのため、ＤＮＡ合成酵素阻害剤、抗癌剤、抗炎症剤等として有用である。
【００２４】
一般式（１）で表される化合物は、ヒト正常細胞（例えば、正常ヒト皮膚線維芽細胞、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞等）の増殖には影響を与えず、ヒト大腸がん細胞の増殖を顕著に抑制するという、ヒトがん細胞選択的な増殖抑制活性を有する。そのため、副作用の少ない抗癌剤として期待できる。
【００２５】
一般式（１）で表される化合物は、上記の薬剤を探索するためのリード化合物として有用である。また、上記の活性を有することを利用して生化学試薬として用いることもできる。また、食品に配合して食用組成物として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】試験例１のＤＮＡ合成酵素αに対する各試験化合物の阻害活性を示す。
【図２】試験例２のヒト大腸がん細胞に対する各試験化合物の増殖抑制活性を示す。
【図３】試験例３のヒト正常細胞に対する各試験化合物の影響評価を示す。
【図４】試験例４のマウス耳を用いた各試験化合物の抗炎症活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２８】
本発明のＤＮＡ合成酵素阻害剤は、一般式（１）：
【００２９】
【化３】
2012201600.tif 000004
【００３０】
（式中、Ｒは炭化水素基を示す。）
で表される化合物を有効成分として含有する。
【００３１】
一般式（１）で表される化合物において、Ｒで示される炭化水素基としては、炭素数（以下「Ｃ」と表記する）１〜５０、好ましくはＣ１〜４０、より好ましくはＣ１〜３０、特に好ましくはＣ１〜２５の炭化水素基である。また、炭化水素基は、直鎖状、分岐状又は環状のいずれでもよい。
【００３２】
直鎖状又は分岐状の飽和炭化水素基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−トリデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ペンタデシル、ｎ−ヘキサデシル、ｎ−ヘプタデシル、ｎ−オクタデシル、ｎ−ノナデシル、ｎ−イコシル、ｎ−ヘンイコシル、ｎ−ドコシル、ｎ−トリコシル、ｎ−テトラコシル等のＣ１〜３０（好ましくはＣ１〜２５）の直鎖状又は分岐状のアルキル基が挙げられる。
【００３３】
直鎖状又は分岐状の不飽和炭化水素基としては、分子内に不飽和結合（二重結合及び／又は三重結合）を有する炭化水素基であり、例えば、上記の直鎖状又は分岐状の飽和炭化水素基のうち、Ｃ２以上の直鎖状又は分岐状の飽和炭化水素基において不飽和結合を１個以上（好ましくは、１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜８個、特に好ましくは１〜６個）有する基が挙げられる。不飽和結合としては、二重結合が好ましい。
【００３４】
環状の飽和炭化水素基としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等のＣ３〜１０のシクロアルキル基が挙げられる。
【００３５】
環状の不飽和炭化水素基としては、例えば、上記の環状の飽和炭化水素基において不飽和結合を１個以上（好ましくは、１〜３個、より好ましくは１〜２個）有する基が挙げられる。不飽和結合としては、二重結合が好ましい。例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサンジエニル、シクロヘプテニル、フェニル基、ナフチル等が挙げられる。
【００３６】
Ｒで示される炭化水素基のうち、Ｃ１〜４０の直鎖の飽和又は不飽和の炭化水素が好ましく、具体的には、Ｃ１〜３０(好ましくはＣ１〜２５)の直鎖アルキル基、又は二重結合を１〜８個以上（好ましくは、１〜６個、より好ましくは１〜３個）有するＣ８〜３０(好ましくはＣ１０〜２５)の直鎖アルケニル基が挙げられる。特に、Ｒで示される炭化水素基は二重結合の有無に関係なくＣ５〜２５、さらにＣ１１〜２１、よりさらにＣ１１が好ましい。
【００３７】
Ｒで示される炭化水素基のうち、特に好ましい具体例は下記式の通りである。式中、二重結合の立体はシス体及び／又はトランス体のいずれも包含するが、全てシス体が好ましい。
【００３８】
−ＣＨ３  （酢酸エステル）
−ＣＨ２ＣＨ３  （プロピオン酸エステル）
−（ＣＨ２）４ＣＨ３  （カプロン酸エステル）
−（ＣＨ２）１０ＣＨ３  （ラウリン酸エステル）
−（ＣＨ２）１２ＣＨ３  （ミリスチン酸エステル）
−（ＣＨ２）１４ＣＨ３  （パルミチン酸エステル）
−（ＣＨ２）１６ＣＨ３  （ステアリン酸エステル）
−（ＣＨ２）１８ＣＨ３  （アラキジン酸エステル）
−（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３  （オレイン酸エステル）
−（ＣＨ２）７（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）２（ＣＨ２）３ＣＨ３  （リノール酸エステル）
−（ＣＨ２）７（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）３ＣＨ３  （リノレン酸エステル）
−（ＣＨ２）３（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）５ＣＨ３  （EPAエステル）
−（ＣＨ２）２（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）６ＣＨ３  （DHAエステル）。
【００３９】
そのうち、
−（ＣＨ２）１０ＣＨ３  （ラウリン酸エステル）
−（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３  （オレイン酸エステル）
が特に好ましい。
【００４０】
さらに、本発明のＤＮＡ合成酵素阻害剤のうち、他の好ましい態様として、一般式（２）： 
【００４１】
【化４】
2012201600.tif 000005
【００４２】
（式中、Ｒ’はＣ３以上の炭化水素基を示す。）
で表される化合物を有効成分として含有するＤＮＡ合成酵素阻害剤が挙げられる。この一般式（２）で表される化合物は、上記一般式（１）で表される化合物に包含される。
【００４３】
Ｒ’で示されるＣ３以上の炭化水素基としては、上記一般式（１）で表される化合物のＲで示される炭化水素基からＣ１及びＣ２の炭化水素基を除いたものが挙げられる。好ましくはＣ４〜５０、より好ましくはＣ５〜４０の炭化水素基である。
【００４４】
一般式（１）で表される化合物は、例えば、次のようにジュグロンと一般式（３）で表される化合物又はその誘導体を反応させて製造することができる。
【００４５】
【化５】
2012201600.tif 000006
【００４６】
（式中、Ｒは前記に同じ。）
ジュグロンと一般式（３）で表される化合物又はその誘導体との反応は以下の反応方法を用いることができる。
【００４７】
なお、一般式（３）で表される化合物の誘導体とは、後述のエステル化反応において、一般式（３）で表される化合物から誘導される反応性中間体を意味する。例えば一般式（３）で表される化合物の酸ハロゲン化物、混合酸無水物、活性エステル化合物、一般式（３）で表される化合物の２分子が脱水縮合した酸無水物等が挙げられる。
【００４８】
典型的には、一般式（３）で表される化合物を、活性化剤の存在下で、ジュグロンと縮合反応させて一般式（１）で表される化合物を得ることができる。活性化剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＷＳＣ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物（ＭＮＢＡ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジンＮ−オキシド（ＤＭＡＰＯ）等が挙げられる。必要に応じ、塩基性化合物、例えば、ピリジン、トリエチルアミン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）等を加えてもよい、なお、ＷＳＣを活性化剤として使用する場合、反応系への１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）の添加により、反応が有利に進行する。
【００４９】
また、一般式（３）で表される化合物をハロゲン化剤（例えば、塩化オキザリル等）により酸ハロゲン化物に変換した後、塩基性化合物（例えば、ピリジン、ＤＭＡＰ等）の存在下にジュグロンと反応させて一般式（１）で表される化合物を得ることができる。
【００５０】
また、一般式（３）で表される化合物をハロゲン化剤（例えば、塩化チオニル等）により一般式（３）で表される化合物が脱水縮合した酸無水物に変換した後、塩基性化合物（例えば、ピリジン、ＤＭＡＰ等）の存在下にジュグロンと反応させて一般式（１）で表される化合物を得ることができる。
【００５１】
一般式（３）で表される化合物を、塩基性化合物（例えば、ピリジン、トリエチルアミン、ＤＭＡＰ等）の存在下にアルキルハロ炭酸エステル（例えば、ブロモギ酸エチル及びクロロギ酸イソブチル等）と反応させて混合酸無水物を生成し、それをジュグロンと反応させて一般式（１）で表される化合物を得ることができる。
【００５２】
上記の反応は、いずれも適当な溶媒中で実施できる。溶媒としては、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン及び四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素；ベンゼン、トルエン及びキシレン等の芳香族炭化水素；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン及びジメトキシエタン等のエーテル；並びにそれらの混合物が挙げられる。
【００５３】
反応温度、反応時間はいずれも公知の条件を採用することが出来る。また、反応終了後の反応液から一般式（１）で表される化合物を単離及び精製する手段も公知の方法（分液、蒸留、クロマトグラフィー、再結晶等）を採用できる。
【００５４】
なお、上記の一般式（２）で表される化合物は、ジュグロンと一般式（３’）：
Ｒ’−ＣＯＯＨ        （３’）
（式中、Ｒ’は前記に同じ。）
で表される化合物又はその誘導体を反応させることにより製造することができる。一般式（３’）で表される化合物又はその誘導体は、上記の一般式（３）で表される化合物又はその誘導体に包含される。ゆえに、この製造方法は、上記のジュグロンと一般式（３）で表される化合物又はその誘導体から一般式（１）で表される化合物を製造する方法に包含される。
【００５５】
本発明の一般式（１）で表される化合物は、ＤＮＡ合成酵素選択的阻害作用を有することから、医薬品への利用が可能である。例えば、ＤＮＡ合成酵素阻害剤、抗癌剤、抗炎症剤等として有用である。即ち、癌、腫瘍、炎症等の予防又は治療剤として有用である。ＤＮＡ合成酵素阻害活性と抗炎症活性には同じ傾向の構造活性相関が見られる。さらに、この化合物は、ヒト正常細胞（例えば、正常ヒト皮膚線維芽細胞、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞等）の増殖には影響を与えず、ヒト大腸がん細胞の増殖を選択的に抑制するという特徴を有している。
【００５６】
本発明の化合物を体内投与する際は経口投与よりも非経口投与が好ましく、またリポソームなどの運搬体に封入して投与することが好ましい。このとき癌細胞を特異的に認識する運搬体などを利用すれば、標的部位（病変部位）に本発明の化合物を効率よく運ぶことができ効果的である。
【００５７】
本発明の化合物を有効成分とする抗癌剤および抗炎症剤は、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬組成物となし、動物およびヒトに投与することができる。医薬組成物の剤形としては特に制限されるものではなく必要に応じて適宜選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられ、好適には非経口剤を挙げることができる。
【００５８】
本発明において錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤としての経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中の本発明の化合物の配合量は特に限定されるものではなく適宜設計できる。この種の製剤には本発明の化合物の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜に使用することができる。
【００５９】
ここに、結合剤としてデンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等を例示できる。崩壊剤としてはデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等を例として挙げることができる。界面活性剤の例としてラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、蔗糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等を挙げることができる。滑沢剤では、タルク、ロウ類、水素添加植物油、蔗糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール等を例示できる。流動性促進剤では、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等を例として挙げることができる。また、本発明の化合物は懸濁液、エマルション剤、シロップ剤、エリキシル剤としても投与することができ、これらの各種剤形には、矯味矯臭剤、着色剤を含有させてもよい。
【００６０】
非経口剤として本発明の所望の効果を発現せしめるには、患者の年齢、体重、疾患の程度により異なるが、通常、成人で本発明の化合物の重量として１日あたり１〜６０ｍｇの静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射が適当である。この非経口投与剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。また、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥処理により水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。さらに必要に応じて、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤を加えてもよい。これら製剤中の本発明の化合物の配合量は特に限定されるものではなく任意に設定できる。その他の非経口剤の例として、外用液剤、軟膏等の塗布剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、これらも常法に従って製造される。
【００６１】
また、本発明の化合物は、医薬品への利用以外に、食品への利用が可能である。例えば、飲食品へ添加・配合することにより抗癌効果、抗発癌効果、あるいは抗炎症効果をもった食用組成物（例えば、健康食品等）として利用することも可能である。
【００６２】
即ち、本発明の化合物は、これをそのまま液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキー等に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦形剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や栄養補助食品等として利用できる。
【００６３】
なお、ヒトと他の哺乳類のＤＮＡ合成酵素の構造は殆ど同じであるため、本発明のＤＮＡ合成酵素阻害剤は、ヒト以外の哺乳類由来のＤＮＡ合成酵素阻害剤としても利用可能である。
【００６４】
また、本発明の化合物は、さらに上記の薬剤の開発過程におけるリード化合物として利用することもできる。本発明の化合物をリードとして、ＤＮＡ合成酵素に対する阻害活性を調べることにより、抗癌剤または抗炎症剤の候補化合物の効率的なスクリーニングが期待できる。本発明には、このようなスクリーニング方法も含まれる。なお、本スクリーニング方法において、ＤＮＡ合成酵素に対する阻害活性を調べる方法は実施例記載の方法に限定されるものではなく、公知の試験方法の中から適した方法を選択すればよい。
【実施例】
【００６５】
次に、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６６】
融点(mp.) は（株）ヤナコ機器開発研究所 微量融点測定装置 MP-J3 型を用いた。核磁気共鳴 (NMR) スペクトルは EX-270W spectrometer (1H, 270 MHz; 13C, 67.8 MHz) を用いた。赤外吸収 (IR) スペクトルは Horiba FT-210 spectrometerを用いた。高分解能質量分析(HRMS) には Applied Biosystems API QSTAR pulsar i 高分解能質量分析計を用いた。
【００６７】
合成例１：５−アセトキシ−１，４−ナフトキノン（ジュグロン 酢酸エステル）の合成
【００６８】
【化６】
2012201600.tif 000007
【００６９】
ジュグロン (101 mg, 0.58 mmol) にピリジン (1.00 ml) と無水酢酸 (0.50 ml) を混合し、室温で一時間半撹拌した。溶媒を減圧留去した後、残渣をカラムクロマトグラフィー (n-ヘキサン：酢酸エチル = 3:1) にて精製し、ジュグロン 酢酸エステル (98.6 mg, 79%) を黄色固体として得た。
1H-NMR (270 MHz, CDCl3) δ 8.05 (dd, J = 7.7 Hz, 1.4 Hz, 1H), 7.77 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.40 (dd, J = 7.7 Hz, 1.4 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 2.45 (s, 3H).
合成例２：５−ドデカノイルオキシ−１，４−ナフトキノン（ジュグロン ラウリン酸エステル）の合成
【００７０】
【化７】
2012201600.tif 000008
【００７１】
ジュグロン (50.5 mg, 0.29 mmol) とラウリン酸 (70.6 mg, 0.35 mmol) をジクロロメタン (4.0 ml) に溶解し、トリエチルアミン (88.0 μl, 0.63 mmol) と 2-メチル-6-ニトロ安息香酸無水物(MNBA) (122 mg, 0.35 mmol) と 4-(ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP) (3.8 mg, 0.03 mmol) を加えて室温で24時間撹拌した。水を加えて反応を終了させ、クロロホルムにより抽出した。分離した有機層は飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去した後、残渣をカラムクロマトグラフィー (n-ヘキサン : 酢酸エチル = 9:1) にて精製し、ジュグロン ラウリン酸エステル (63.0 mg, 62%) を黄色結晶として得た。
mp. 63-65 ℃; IR (KBr) 3076, 2922, 2856, 1766, 1666, 1599, 1375, 1333, 1296, 1232, 1134, 1111, 993, 939, 895, 783 cm-1; 1H NMR (270 MHz, CDCl3) δ 8.04 (dd, J = 7.6 Hz, 1.4 Hz, 1H), 7.75 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.37 (dd, J = 7.6 Hz, 1.4 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 10.5, 1H), 6.84 (d, J = 10.5, 1H), 2.74 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.82 (quin, J = 7.6 Hz, 2H), 1.47-1.28 (brm, 16H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H); 13C NMR (68 MHz, CDCl3) δ 184.0, 183.4, 171.9, 149.4, 139.7, 137.1, 134.6, 133.3, 129.7, 124.7, 123.2, 34.2, 31.9, 29.6 (2C), 29.5, 29.4, 29.3, 29.2, 24.5, 22.7, 14.2; HRMS, calcd for C22H28O4Na ([M+Na]+) 379.1879, found 379.1914.
合成例３：５−プロピオニルオキシ−１，４−ナフトキノン（ジュグロン プロピオン酸エステル）の合成
【００７２】
【化８】
2012201600.tif 000009
【００７３】
ジュグロン プロピオン酸エステルは、適当な出発物質を用いて合成例２と同様にして合成した（収率64%）。
黄色固体; mp. 113-114 ℃; IR (KBr) 2972, 1757, 1662, 1601, 1452, 1367, 1329, 1290, 1234, 1142, 1038, 1009, 926, 872, 781 cm-1; 1H NMR (270 MHz, CDCl3) δ 8.05 (dd, J = 7.6 Hz, 1.4 Hz, 1H), 7.76 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.39 (dd, J = 7.6 Hz, 1.4 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 2.78 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.33 (t, J = 7.6 Hz, 3H); 13C NMR (68 MHz, CDCl3) δ 184.0, 183.4, 172.6, 149.4, 139.7, 137.1, 134.7, 133.4, 129.6, 124.8, 123.2, 27.7, 8.8; HRMS, calcd for C13H10O4Na ([M+Na]+) 253.0471, found 253.0455.
合成例４：５−ヘキサのイルオキシ−１，４−ナフトキノン（ジュグロン カプロン酸エステル）の合成
【００７４】
【化９】
2012201600.tif 000010
【００７５】
ジュグロン カプロン酸エステルは、適当な出発物質を用いて合成例２と同様にして合成した（収率76%）。
黄土色固体; mp. 44-46 ℃; IR (KBr) 2951, 2866, 1768, 1662, 1597, 1456, 1375, 1331, 1286, 1230, 1120, 1099, 1043, 939, 889, 849, 791 cm-1; 1H NMR (270 MHz, CDCl3) δ 8.04 (dd, J = 7.8 Hz, 1.4 Hz, 1H), 7.76 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.38 (dd, J = 7.8 Hz, 1.4 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 2.74 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.83 (quin, J = 7.3 Hz, 2H), 1.51-1.34 (brm, 4H), 0.95 (t, J= 7.3 Hz, 3H); 13C NMR (68 MHz, CDCl3) δ 183.9, 183.4, 171.9, 149.4, 139.7, 137.1, 134.6, 133.3, 129.7, 124.7, 123.2, 34.2, 31.3, 24.1, 22.4, 14.0; HRMS, calcd for C16H16O4Na ([M+Na]+) 295.0940, found 295.0937.
合成例５：５−エイコサペンタエノイルオキシ−１，４−ナフトキノン（ジュグロン EPA  エステル）の合成
（１）エイコサペンタエノイルクロリドの合成
【００７６】
【化１０】
2012201600.tif 000011
【００７７】
EPA (345 mg, 1.14 mmol) をクロロホルム (10.0 ml) に溶解し、氷冷下でオキザリルクロリド (0.30 ml, 3.55 mmol) を加えた後、室温、窒素雰囲気下で撹拌した。反応の追跡は、反応液をピリジン：メタノール = 1:1 溶液で少量クエンチし、EPA のメチルエステルを TLC 上で確認することにより追跡した。6時間後、溶媒を減圧留去して 370 mg の油状残渣を得た。残渣の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
（２）ジュグロン EPA  エステルの合成
【００７８】
【化１１】
2012201600.tif 000012
【００７９】
エイコサペンタエノイルクロリド (370 mg, 1.15 mmol) とジュグロン (605 mg, 3.47 mmol) とピリジン (6.0 ml) を混合し、DMAP (3.9 mg, 0.03 mmol) を加えて室温、窒素雰囲気下で3時間半撹拌した。1N HCl を加えて反応を停止し、酢酸エチルにより抽出した。分離した有機層は飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去した後、残渣をプレパラティブ TLC (トルエン : 酢酸エチル = 10:1) にて精製し、ジュグロン EPA  エステル(54%) を褐色油状物として得た。収率は内部標準物質として 2,5-ジメチルフランを加えたサンプルの 1H-NMR (270 MHz, CDCl3) を測定して算出した。
IR (neat) 3012, 2962, 1768, 1668, 1599, 1450, 1327, 1284, 1203, 1117, 1038, 937, 891, 781, 715 cm-1; 1H NMR (270 MHz, CDCl3) δ 8.05 (dd, J = 8.0 Hz, 1.1 Hz, 1H), 7.76 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.38 (dd, J = 8.0 Hz, 1.1 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 5.50-5.26 (brm, 10H), 2.86-2.73 (brm, 10H), 2.26 (q, J= 7.0 Hz, 2H), 2.07 (quin, J = 7.0 Hz, 2H), 1.91 (quin, J = 7.6 Hz, 2H), 0.97 (t, J = 7.6 Hz, 3H); 13C NMR (68 MHz, CDCl3) δ 184.0, 183.4, 171.7, 149.4, 139.8, 137.2, 134.7, 133.4, 131.9, 129.7, 128.9, 128.8, 128.4, 128.1 (2C), 128.0, 127.9, 127.7, 126.9, 124.8, 33.6, 26.6, 25.7 (3C), 25.7, 25.6, 24.4, 20.6, 14.4; HRMS, calcd for C30H34O4Na ([M+Na]+) 481.2349, found 481.2366.
合成例６：５−オクタノイルオキシ−１，４−ナフトキノン（ジュグロン ステアリン酸エステル）の合成
【００８０】
【化１２】
2012201600.tif 000013
【００８１】
ジュグロン ステアリン酸エステルは、適当な出発物質を用いて合成例５と同様にして合成した（収率24%）。
黄色固体; mp. 72-75℃; IR (KBr) 3074, 2924, 2852, 1763, 1666, 1597, 1460, 1371, 1331, 1292, 1144, 1107, 1036, 939, 897 cm-1; 1H NMR (270 MHz, CDCl3) δ 8.04 (dd, J = 7.8 Hz, 1.4 Hz, 1H), 7.76 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.38 (dd, J = 7.8 Hz, 1.4 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 2.74 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 1.82 (quin, J = 7.8 Hz, 2H), 1.33-1.25 (brm, 28H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (68 MHz, CDCl3) δ 184.1, 183,5, 172.0, 149.5, 139.8, 137.2, 134.7, 133.4, 129.7, 124.8, 123.3, 34.3, 32.0, 29.8 (5C), 29.7 (2C), 29.7, 29.6, 29.4, 29.4, 29.2, 24.5, 22.8, 14.2.
合成例７：５−｛（Ｚ）−オクタデセノイルオキシ｝−１，４−ナフトキノン（ジュグロン オレイン酸エステル）の合成
【００８２】
【化１３】
2012201600.tif 000014
【００８３】
ジュグロン オレイン酸エステルは、適当な出発物質を用いて合成例５と同様にして合成した（収率29%）。
茶色油状物; IR (neat) 3005, 2924, 2856, 1766, 1668, 1599, 1456, 1327, 1284, 1113, 1036, 941, 850 cm-1; 1H NMR (270 MHz, CDCl3) δ 8.05 (dd, J= 8.1 Hz, 1.4 Hz, 1H), 7.76 (t, J= 8.1 Hz, 1H), 7.38 (dd, J = 8.1 Hz, 1.4 Hz, 1H), 6.94 (d, J= 10.3 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 5.39-5.34 (m, 2H), 2.74 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.03 (brm, 4H), 1.82 (quin, J = 7.8 Hz, 2H), 1.45-1.26 (brm, 20H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (68 MHz, CDCl3) δ 184.1, 183.5, 172.0, 149.5, 139.8, 137.2, 134.7, 133.4, 129.9, 129.7, 129.7, 124.8, 123.2, 34.3, 32.0, 29.8, 29.8, 29.6, 29.4 (2C), 29.3, 29.2 (2C), 27.3, 27.3, 24.5, 22.8, 14.2.
合成例８：５−リノレオイルオキシ−１，４−ナフトキノン（ジュグロン リノール酸エステル）の合成
【００８４】
【化１４】
2012201600.tif 000015
【００８５】
ジュグロン リノール酸エステルは、適当な出発物質を用いて合成例５と同様にして合成した（収率31%）。
茶色油状物; IR (neat) 3008, 2925, 2858, 1768, 1670, 1599, 1456, 1329, 1286, 1113, 1038, 941, 852 cm-1; 1H NMR (270 MHz, CDCl3) δ 8.04 (dd, J= 7.8 Hz, 1.4 Hz, 1H), 7.76 (t, J= 7.8 Hz, 1H), 7.38 (dd, J = 7.8 Hz, 1.4 Hz, 1H), 6.94 (d, J= 10.3 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 5.39 (m, 4H), 2.80-2.71 (m, 2H), 2.74 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 2.06-2.04 (m, 4H), 1.82 (quin, J = 7.3 Hz, 2H), 1.48-1.26 (brm, 14H), 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (68 MHz, CDCl3) δ 184.1, 183.5, 171.9, 149.5, 139.8, 137.2, 134.7, 133.4, 130.1, 130.0, 129.7, 127.9, 127.8, 124.8, 123.2, 34.2, 31.6, 29.7, 29.4, 29.3, 29.2 (3C), 27.3, 25.7, 24.5, 22.7, 14.2.
合成例９：５−リノレノイルオキシ−１，４−ナフトキノン（ジュグロン リノレン酸エステル）の合成
【００８６】
【化１５】
2012201600.tif 000016
【００８７】
ジュグロン リノレン酸エステルは、適当な出発物質を用いて合成例５と同様にして合成した（収率34%）。
茶色油状物; IR (neat) 3012, 2927, 2858, 1766, 1670, 1601, 1454, 1327, 1284, 1114, 1037, 939, 852 cm-1; 1H NMR (270 MHz, CDCl3) δ 8.04 (dd, J= 7.8 Hz, 1.4 Hz, 1H), 7.76 (t, J= 7.8 Hz, 1H), 7.38 (dd, J = 7.8 Hz, 1.4 Hz, 1H), 6.94 (d, J= 10.3 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 5.37 (m, 6H), 2.84-2.71 (brm, 4H), 2.74 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.08 (brm, 4H), 1.82 (quin, J = 7.8 Hz, 2H), 1.36 (brm, 8H), 0.98 (t, J = 7.6 Hz, 3H); 13C NMR (68 MHz, CDCl3) δ184.0, 183.4, 171.9, 149.4, 139.8, 137.2, 134.7, 133.4, 131.8, 130.2, 129.7, 128.2, 128.1, 127.6, 127.0, 124.8, 123.2, 34.2, 29.7, 29.3, 29.2 (2C), 27.3, 25.7, 25.6, 24.6, 20.6, 14.4.
合成例１０：５−ドコサヘキサエノイルオキシ−１，４−ナフトキノン（ジュグロン DHAエステル）の合成
【００８８】
【化１６】
2012201600.tif 000017
【００８９】
ジュグロン DHAエステルは、適当な出発物質を用いて合成例５と同様にして合成した（収率62%）。
茶色油状物; IR (neat) 3012, 2964, 2924, 1768, 1670, 1601, 1450, 1363, 1327, 1284, 1225, 1119, 1038, 935, 850 cm-1; 1H NMR (270 MHz, CDCl3) δ 8.05 (dd, J = 8.0 Hz, 1.4 Hz, 1H), 7.76 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.38 (dd, J = 8.0 Hz, 1.4 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 5.41 (m, 12H), 2.92-2.76 (m, 12H), 2.59 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 2.07 (quin, J = 7.6 Hz, 2H), 0.97 (t, J = 7.8 Hz, 3H); 13C NMR (68 MHz, CDCl3) δ 184.0, 183.4, 171.3, 149.4, 139.8, 137.2, 131.2, 134.7, 133.4, 131.9, 129.7, 129.4, 128.4, 128.2, 128.1, 128.1, 128.0, 127.9 (3C), 127.7, 127.7, 126.9, 34.2, 30.4, 25.7, 25.7, 25.7, 25.6, 22.4, 20.6, 14.4.
試験例１（ＤＮＡ合成酵素αに対する阻害活性の評価；in vitro）
ＤＮＡ合成酵素は鋳型となるＤＮＡが存在している場合のみ、４種の前駆体すなわち４種のデオキシヌクレオシド３リン酸〔デオキシアデノシン３リン酸(以下ｄＡＴＰと略)、デオキシグアノシン３リン酸(以下ｄＧＴＰと略)、デオキシシチジン３リン酸(以下ｄＣＴＰと略)、デオキシチミジン３リン酸（以下ｄＴＴＰと略）〕を基質としてＤＮＡを合成する。このことを利用してＤＮＡ合成酵素活性は合成ＤＮＡ（ｐｏｌｙ(ｄＡ）／ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８）を鋳型プライマーとし、基質中のｄＴＴＰを3Ｈラベルしておくとポリメラーゼの重合反応により3Ｈ−ｄＴＴＰがＤＮＡ鎖のチミン残基として取り込まれる。このＤＮＡ鎖をＤＥＡＥ−セルロース（ジエチルアミノエチル−セルロース）濾紙に吸着させる。この吸着されたＤＮＡ鎖の放射比活性がＤＮＡ合成酵素活性となる。このとき、阻害の有無は試験物質によりＤＮＡ合成酵素の重合反応が阻害された時、ＤＮＡ鎖への基質の取り込みが少なくなったり全くなくなるため、放射能活性が低下することから判断される。
＜ＤＮＡ合成酵素αの調製＞
子牛胸腺を緩衝液（５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７.５、０.３Ｍ塩化カリウム、０．１％トリトンＸ−１００、１ｍＭＰＭＳＦ、２ｍＭβ−メルカプトエタノール、２ｍＭベンズアミジン、１０ｍＭ重亜硫酸ナトリウム）中でホモジネートする。これをホスホセルロースカラムにのせて、０．２５Ｍから０．４Ｍ塩化カリウムで溶出してくるフラクションを集める。ＵＦ−１００ｐｓウルトラフィルター(東洋ソーダ)を用いて、約１０ｍｇ／ｍｌの蛋白濃度になるように濃縮する。遠心により不溶物を除く。免疫アフィニテカラムにのせ、流速４０ｍｌ／ｈｒで１２時間循環させる。（免疫アフィニテカラムは、プレカラムに人血清蛋白７５０ｍｇを５０ｍｌセファロースに結合させたカラムと５０ｍｇの兎ＩｇＧを１０ｍｌセファロースに結合させたカラムを直列につないだものを用い、プロテインＡ純化モノクロナール抗体ＭＴ−１７ＩｇＧ１０ｍｇを５ｍｌセファロースに結合させたカラムである。）モノクロナール抗体カラムをはずし、５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５／β−メルカプトエタノール(緩衝液Ａ)に０．３Ｍ塩化カリウム、０．１％トリトンＸ−１００を含む液でカラムの２０倍相当量で洗浄する。次に、(１)３Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａによりカラムの５倍相当量で溶出、続いて(２)５０％エチレングリコールを含む緩衝液Ａによりカラムの５倍相当量で溶出、(３)３．２Ｍ塩化マグネシウムを含む緩衝液Ａによりカラムの５倍相当量で溶出を行う。(１)〜(３)の画分を１０％グリセロールを含む緩衝液Ａ２ｌで透析する。５０％グリセロールになるように調整して、−２５℃で保存する。
（参考文献）
Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，９５０（１９８８）２６３〜２７３
＜酵素阻害活性の測定法＞
試験用の反応液として以下の通り調整した。
【００９０】
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）：５０ｍＭ
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）：１ｍＭ
塩化マグネシウム：５ｍＭ
グリセリン：１５％（ｖ／ｖ）
ｐｏｌｙ（ｄＡ）：１０μｇ／ｍｌ
ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８：５μｇ／ｍｌ
トリチウムでラベルしたデオキシチミジン３リン酸(3Ｈ−ｄＴＴＰ）を含むｄＴＴＰ：１０μＭ（１００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）
１６μｌの酵素溶液と試験化合物をメタノールに溶解した液４μｌ（１５００μＭ）を混合したもの８μｌを、上記の反応液１６μｌに加えた。３７℃で６０分間インキュベートした対照試験液は阻害物質の入っていないメタノール液を使用した。インキュベート後各試験液１８μｌをＤＥＡＥ−セルロースろ紙に吸着させ、このろ紙を５％（ｗ／ｖ）Ｎａ2ＨＰＯ4、水、エタノールで洗浄した。この洗浄条件では１０ヌクレオチド以上のポリマーはろ紙に吸着される。次いで、風乾してトルエンシンチレータを入れたバイアルに沈め、液体シンチレーションカウンタで放射線量を測定した。その測定結果により酵素反応の阻害率を以下の式で求めた。
【００９１】
阻害率(％）＝(１−試験溶液の比活性(ｃｐｍ)／対照溶液の比活性(ｃｐｍ))×１００
上記方法で試験化合物の濃度１μＭ及び１０μＭで測定したＤＮＡ合成酵素αの阻害活性を図１に示す。図１中、グラフの棒が短いほど阻害作用が強いことを表している。
【００９２】
図１より、脂肪酸は濃度１μＭ及び１０μＭではＤＮＡ合成酵素αをほとんど阻害しなかった。アシルジュグロン（ジュグロンのエステル）は、濃度１μＭ及び１０μＭでジュグロン単独より強いＤＮＡ合成酵素阻害活性を示した。中でも、ジュグロン ラウリン酸エステルの５０％阻害活性（ＩＣ５０）は１μＭ未満であり、最も強い阻害活性を示した。
【００９３】
試験例２（ヒト大腸がん細胞（HCT116 cells）の増殖抑制活性の評価；in vitro）
本試験に用いたヒト大腸がん由来細胞HCT116は、ATCC（American Type Culture Collection）から購入した。培地は、McCoy’s5A-DMEM培地に牛胎児血清10％(v/v)を添加したものを用いた。培養は5％ CO2インキュベーターにて37℃で行った。上記に示した培地に試験物質を溶解した。ただし、これらは一度ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、上記の培地中に1% DMSO濃度になるように溶かした。本試験のための培養は、96穴マイクロプレートで実施した。各ウェルに1.0×104個の細胞を播種し、１つの試験濃度に対し5ウェルずつ与えた。またポジティブコントロールとして、培地に1％のDMSO（試験物質が存在しない）を含むものを用いた。試験物質を添加後は、5％ CO2インキュベーター内、37℃で24時間培養した。そして、各試験区の細胞生存率をＷＳＴ−１法で判定した。すなわち、上記24時間後テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１を添加し、さらに4時間培養した。生細胞による還元を経て生産するホルマザン量が生細胞数に比例するとみなし、450 nmの光学密度(O.D.)で定量した。細胞生存率は次の式により算出した。
【００９４】
細胞生存率(%) = 試験区のO.D. [450 nm] / 対照区のO.D. [450 nm]
（参考文献）
Ｉｓｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．（１９９６）１９，ｐ１５１８−１５２０
上記方法で試験化合物の濃度１０μＭ及び１００μＭで測定したヒト大腸がん細胞（HCT116 cells）の阻害活性を図２に示す。図２中、グラフの棒が短いほど阻害作用が強いことを表している。
【００９５】
図２より、脂肪酸はヒト大腸がん細胞の増殖に影響しないことが分かった。アシルジュグロンは、ジュグロン単独より強いがん細胞増殖抑制活性を示した。最も強いがん細胞増殖抑制活性を示したものは、ジュグロン オレイン酸エステルであった。試験例１のＤＮＡ合成酵素阻害活性とヒト大腸がん増殖抑制活性には類似の傾向が見られた。アシルジュグロンは、抗癌剤として有効である。
【００９６】
試験例３（ヒト正常細胞への影響評価）
次の手順で、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）及び正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の評価を行った。
【００９７】
皮膚線維芽細胞（human dermal fibroblast：HDF）と臍帯静脈内皮細胞（human umbilical vein endothelial cell：HUVEC）の2種類を住商ファーマインターナショナル（株）から購入した。培地は、RPMI1640培地に牛胎児血清10％(v/v)を添加したものを用いた。培養は5％ CO2インキュベーターにて37℃で行った。上記に示した培地に試験物質を溶解した。ただし、これらは一度DMSOに溶解し、上記の培地中に1% DMSO濃度になるように溶かした。本試験のための培養は、96穴マイクロプレートで実施した。各ウェルに3.0×105個の細胞を播種し、１つの試験濃度に対し5ウェルずつ与えた。またポジティブコントロールとして、培地に1％のDMSO（試験物質が存在しない）を含むものを用いた。試験物質を添加後は、5％ CO2インキュベーター内、37℃で72時間培養した。これらヒト由来正常細胞への毒性は、72時間培養後の各試験区の細胞生存率をトリパンブルー法で測定した。本法では、生細胞は無色、死細胞は青色に分染されるため、全細胞数に対する生細胞数の割合が細胞生存率(%)となる。
（参考文献）
Ｔｕｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９６１）２１，ｐ７３５−７４２
試験化合物の評価結果を図３に示す。図３より、アシルジュグロンは、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）及び正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に影響を与えないことが分かった。
【００９８】
上記試験例２及び３の結果より、アシルジュグロンは正常ヒト細胞には影響を与えずヒトがん細胞の増殖を選択的に抑制できることを確認した。
【００９９】
試験例４（マウス耳を用いた抗炎症活性の評価；in vivo）
次の手順で、TPA（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate）誘発マウス耳介浮腫抑制試験の測定を行った。マウスの片方の耳に試験物質 (500 μg) を塗布し、30分後に両耳にTPA (0.5 μg) を塗布した。7時間後に試験物質処理の耳介重量と試験物質未処理の耳介重量を測定した。マウスの匹数は6匹とした。試験物質未処理のコントロール群の耳介肥厚率を100% とし、試験物質未処理の耳介肥厚率、すなわち抗炎症活性を次のように算出した。
【０１００】
抗炎症活性 (%) ＝ ([TPA 塗布耳介重量] − [試験物質 ＋ TPA 塗布耳介重量])／([TPA 塗布耳介重量] − [試験物質未処理の耳介重量]) × 100
（参考文献）
Ｇｓｃｈｗｅｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．（１９８４）２５，ｐ１７７−１８５
試験化合物の抗炎症活性を図４に示す。図４中、グラフの棒が長いほど強い抗炎症活性を示す。
【０１０１】
図４より、アシルジュグロンは、脂肪酸単独やジュグロン単独よりも強い抗炎症活性を示した。最も強い抗炎症活性を示したものは、ジュグロン ラウリン酸エステルであった。アシルジュグロンは抗炎症剤として有効である。
【０１０２】
アシルジュグロンにおいて、ＤＮＡ合成酵素阻害活性と抗炎症活性には、正の相関が見られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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