(57)【要約】【課題】  ＮＫ細胞などのＭＨＣ非拘束性の細胞傷害性細胞を効率よく培養する。【解決手段】  がん患者などヒトから採取された末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、ＩＬ−２とＩＬ−１８とゾレドロネートなどのビスホスホネートとＴＮＦ−α、さらにはレトロネクチン（登録商標）などのフィブロネクチンの存在下、好ましくは１００ＩＵ／ｍｌ以上４,０００ＩＵ／ｍｌ以下のＩＬ−２、１ｎｇ／ｍｌ以上５００ｎｇ／ｍｌ以下のＩＬ−１８、０.０１μＭ以上１０μＭ以下のビスホスホネート、０.０１ｎｇ／ｍｌ以上５００ｎｇ／ｍｌ以下のＴＮＦ−αの存在下において、７〜２１日間培養する。培養された細胞集団は採取された患者に投与され、がん治療用の細胞製剤として用いられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血単核細胞を、ＩＬ−２と、ビスホスホネートと、ＩＬ−１８と、ＴＮＦ−αの存在下で培養する工程を含むＭＨＣ非拘束性細胞傷害性細胞の拡大培養方法。
【請求項２】
末梢血単核細胞を、ＩＬ−２と、ビスホスホネートと、ＩＬ−１８と、ＴＮＦ−αと、フィブロネクチン及び／又はそのフラグメントの存在下で培養する工程を含むＭＨＣ非拘束性細胞傷害性細胞の拡大培養方法。
【請求項３】
前記ビスホスホネートはＺＯＬである請求項１又は２に記載のＭＨＣ非拘束性細胞傷害性細胞の拡大培養方法。
【請求項４】
前記フィブロネクチンのフラグメントはレトロネクチンである請求項１〜３の何れか１項に記載のＭＨＣ非拘束性細胞傷害性細胞の拡大培養方法。
【請求項５】
前記末梢血単核細胞はヒトから分離された末梢血単核細胞である請求項１〜４の何れか１項に記載のＭＨＣ非拘束性細胞傷害性細胞の拡大培養方法。
【請求項６】
前記末梢血単核細胞は腫瘍患者から分離された末梢血単核細胞である請求項１〜４の何れか１項に記載のＭＨＣ非拘束性細胞傷害性細胞の拡大培養方法。
【請求項７】
ＩＬ−２を１００ＩＵ／ｍｌ以上４,０００ＩＵ／ｍｌ以下、ＩＬ−１８を１ｎｇ／ｍｌ以上５００ｎｇ／ｍｌ以下、ビスホスホネートを０.０１μＭ以上１０μＭ以下、ＴＮＦ−αを０.０１ｎｇ／ｍｌ以上５００ｎｇ／ｍｌ以下を含む培地で培養する請求項１〜６の何れか１項に記載の拡大培養方法。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載のＭＨＣ非拘束性細胞傷害性細胞の増幅方法の使用により製造されたＭＨＣ非拘束性細胞傷害性細胞からなる細胞集団を含む腫瘍治療用製剤。
【請求項９】
ＩＬ−２と、ビスホスホネートと、ＩＬ−１８と、ＴＮＦ−αのみを必須成分とするＭＨＣ非拘束性細胞傷害性細胞を拡大培養するための組成物。
【請求項１０】
ＩＬ−２と、ビスホスホネートと、ＩＬ−１８と、ＴＮＦ−αと、フィブロネクチン及び／又はそのフラグメントのみを必須成分とするＭＨＣ非拘束性細胞傷害性細胞を拡大培養するための組成物。
【請求項１１】
前記ビスホスホネートはＺＯＬである請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記フィブロネクチンのフラグメントはレトロネクチンである請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項１３】
培地に調製した際に、調整された培地がＩＬ−２を１００ＩＵ／ｍｌ以上４,０００ＩＵ／ｍｌ以下、ＩＬ−１８を１ｎｇ／ｍｌ以上５００ｎｇ／ｍｌ以下、ビスホスホネートを０.０１μＭ以上１０μＭ以下、ＴＮＦ−αを０.０１ｎｇ／ｍｌ以上５００ｎｇ／ｍｌ以下を含むように構成された請求項９〜１２の何れか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＭＨＣ非拘束性細胞傷害性細胞の拡大培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年がん治療の一方法として、体外で増幅させた末梢血細胞を体内に再び輸注する免疫細胞治療法が着目されている。がん細胞に対する患者の応答免疫を増強することによりがん治療を行う方法である。
【０００３】
キラー細胞の有する細胞傷害活性を利用した免疫療法として、リンホカイン活性化キラー細胞（Lymphokine activated killer cells）を利用したＬＡＫ療法が知られている（特許文献１：特開２００１−３１４１８３号公報）。このＬＡＫ療法は、患者の末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cells：ＰＢＭＣ）から分離した細胞を、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下で培養し、活性化された細胞をＩＬ−２と共に患者体内に輸注する方法である。また、がん組織から分離したリンパ球をＩＬ−２の存在下で培養し、活性化された細胞をＩＬ−２と共に患者体内に輸注するがん浸潤性リンパ球（tumor infiltration lymphocytes）療法も知られている。さらに、がん特異的に発現する抗原（がん抗原）を分子標的とし、細胞傷害性を示すＣＤ８陽性のキラー細胞を利用する細胞傷害性Ｔリンパ球（cytotoxic T lymphocytes）療法（ＣＴＬ療法）やがん患者の末梢血から分離したリンパ球から、がん細胞を特異的に傷害する細胞を選択し、その細胞傷害性をＩＬ−２及びＩＮＦ−αによって高めた後、当該リンパ球を患者体内に戻す生物製剤（Biological response modifiers）活性化キラー細胞（ＢＲＭ activated killer cells）療法（ＢＡＣ療法）も知られている（例えば特許文献１）。
【０００４】
Ｔ細胞は、がん細胞等の表面に発現する抗原を認識するＴ細胞レセプター（T cell receptor：ＴｃＲ）をその表面に有している。Ｔ細胞には、α鎖とβ鎖で構成されるＴｃＲを有するαβＴ細胞（ＴｃＲαβ陽性細胞）、γ鎖とδ鎖で構成されるＴｃＲを有するγδＴ細胞（ＴｃＲγδ陽性細胞）、ＮＫ細胞（natural killer cells）様の性質を併せもつＮＫＴ細胞などが知られている。αβＴ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（major histocompatibitily complex：ＭＨＣ）拘束性に抗原を認識し、ＩＬ−２の刺激により活性化され、キラーＴ細胞として機能する。キラーＴ細胞は認識した標的がん細胞に作用し、ＬＡＫ療法やＣＴＬ療法などに利用するにはサイトカインによる刺激並びに抗原提示するがん細胞の認識が必要である。また、αβＴ細胞は、自己細胞を傷害するおそれもある。
【０００５】
γδＴ細胞は、ＮＫ細胞と同様に、がん細胞に対してＭＨＣ非拘束性に細胞傷害性（ナチュラルキラー活性）を示す。αβＴ細胞が特定のがん特異抗原を発現するがん細胞を１種類のＴｃＲにより認識し、高い特異性を持って細胞傷害性を発揮するのに対し、γδＴ細胞は、γδＴｃＲや活性化ＮＫレセプターである２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＮＫＧ２Ｄ（ＣＤ３１４）、ＮＫｐ４４（ＣＤ３３６）によりがん細胞を認識し、高い多様性を持って細胞傷害性を発揮する。ＮＫＴ細胞、とりわけinvariant ＮＫＴ細胞は、その表面に抗原受容体であるVα14Vβ8ＴｃＲと代表的なＮＫ細胞受容体であるＣＤ１６１を併せ持ち、ＣＤ１ｄ拘束性にαガラクトシルセラミドを認識することで強力なサイトカイン産生能、とくにＩＦＮ−γ産生能、およびＦａｓやパーフォリンを介した細胞傷害性等の機能を持つことで知られている。また、ＭＨＣ−クラスＩを発現した細胞に結合する抑制性受容体を有しているので正常な細胞を認識せず、ＭＨＣ分子を失った標的がん細胞を認識する。
【０００６】
また、ＮＫ細を利用したがん免疫細胞治療も知られている。ＮＫ細胞は、ＴcＲを有しない細胞傷害性細胞である。ＮＫ細胞は、主にＭＨＣクラスＩを発現しない細胞を認識し、がん細胞を攻撃する。
【０００７】
がん免疫細胞治療においては、がん細胞に対する細胞傷害性を示す細胞の拡大培養（増幅）並びに細胞傷害活性の増強が重要な課題である。ＰＢＭＣから、ＭＨＣ非拘束性の細胞傷害性細胞を拡大する方法として、例えば、特許文献２（特開２００６−３４０６９８号公報）には、ＣＤ３アゴニストとＣＤ５２アゴニスト及びＩＬ−２を用いて、Ｔ細胞の増幅に比べて優位となるＮＫ細胞の増幅方法が開示されている。この方法によると３週間の培養で、ＰＢＭＣ１×１０８個から１.１×１０11個のＣＤ１６＋ＮＫ細胞が拡大培養される。
【０００８】
特許文献３（特開２００６−１１５８２６号公報）には、グリコサミノグリカンなどのＣＤ５６リガンドを用いて、ＰＢＭＣからＮＫ細胞を増幅させる方法が開示されている。この方法によると、培養前のＮＫ細胞の比率が８.５％から約５０％近くまで増加し、約２０〜１００倍程度に拡大培養される。
【０００９】
非特許文献１（Young-Ik Son, et al., Cancer Research 61, 884-888）には、ＰＭＢＣをＩＬ−２とＩＬ−１８の存在下で培養すると、それぞれ単独の存在下で培養した場合に比べてＮＫ細胞の存在率が高められたことが記載されている。この方法によると、両者を併用した場合には、ＮＫ細胞は約１４倍に拡大培養され、ＮＫ細胞が占める割合も３４％にまで高められる。
【００１０】
特許文献４（国際公開ＷＯ２００８／１１１４３０号公報）には、ＰＢＭＣからフィブロネクチンやフィブロネクチンフラグメント及びＩＬ−２の存在下に培養を行ってγδＴ細胞を含む細胞集団を拡大培養する方法が記載されている。この方法によると、培養開始後１４日でγδＴ細胞（ＣＤ３及びγδＴ細胞陽性群）の比率がＰＢＭＣ中８.９％から約３０〜５０％に上昇し、約５〜１６倍程度に拡大培養されたことが記載されている。
【００１１】
特許文献５（国際公開ＷＯ２００６／００６７２０号公報）には、ＰＢＭＣをパミドロネートやゾレドロネートなどのビスホスホネート及びＩＬ−２の存在下で培養し、γδＴ細胞を選択的に増幅させる方法が開示されている。この方法によると、１４日程度の培養でγδＴ細胞が単核球中に占める割合が９０％近くまで上昇させることができ、約１００倍程度に拡大培養される。
【００１２】
また、非特許文献２（Kiyoshi Sato et al., Int. J. Cancer, 116, p.94-99(2005)）には、ビスホスホネートの１種であるゾレドロネート（ＺＯＬ）の存在下又はＺＯＬとＩＬ−２の存在下でＰＢＭＣを培養したところ、γδＴ細胞の存在比が高められたことが記載されている。この方法によると、培養前にはγδＴ細胞の存在比が約３.８％であったところ、１４日の培養でその存在比が約１３％程度に高められる。また、γδＴ細胞は、３００〜８００倍程度に拡大培養される。
【００１３】
非特許文献３（Wen Li et al., J. Immunother. 33(3), P287-206 2010）や特許文献６（特開２０１０−１７１３４号公報）には、ＩＬ−２とゾレドロネートとＩＬ−１８の存在下において、ＰＢＭＣを培養することが試みられている。これによるとＰＢＭＣ中のγδＴ細胞（Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞）の存在比が、１４日の培養で培養前の１％から７５％に高められ、γδＴ細胞は約２５倍程度に拡大培養される。
【００１４】
さらに、特許文献７（国際公開ＷＯ０１／９４５５３公報）には、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）を投与した後、末梢血単核画分（Ｇ−ＰＢＭＣ）をα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）とＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８などのサイトカインの存在下に培養して、ＮＫＴ細胞を増幅させることが開示されている。これによると、Ｇ−ＣＳＦを投与なくしても、α−ガラクトシルセラミドとＩＬ−２の存在により、ＰＢＭＣ中のＮＫＴ細胞（Ｖα２４＋ＮＫＴ細胞）は約４倍に増加し、その存在比は約１６倍程度に増大する。
【００１５】
ところで、ＴＮＦ−αは腫瘍細胞を壊死させる作用を有する物質である。ＴＮＦ−αが、ＩＮＦ−γ、ＩＬ-６、ＩＬ-８の産生を誘導することは公知である。これまでに、拡大培養されたＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞を含む細胞集団に対してＴＮＦ−αを添加し、細胞傷害性を増強することは、例えば特許文献８（特開２０００−２４５４５１号公報）において開示されている。また、ＴＮＦ−αを用いて、ＮＫ細胞やＮＫＴ細胞などのＭＨＣ非拘束性の細胞傷害性細胞を拡大培養することは、例えば、非特許文献４（小林泰信ら、Jpn J Cancer Chemother 30(11), p.1776-1779）や特許文献９（特表２００２−５１５７５６号公報）、特許文献１０（特表２０１０−５０５８４５号公報）に開示されている。また、特許文献１０には、核酸架橋剤で不活化した人工抗原提示細胞と接触したＴリンパ球を、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＴＮＦ−αなどのサイトカインの存在下に培養して活性化Ｔリンパ球の増幅を促進させる方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２００１−３１４１８３号公報
【特許文献２】特開２００６−３４０６９８号公報
【特許文献３】特開２００６−１１５８２６号公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ２００８／１１１４３０号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ２００６／００６７２０号公報
【特許文献６】特開２０１０−１７１３４号公報
【特許文献７】国際公開ＷＯ０１／９４５５３公報
【特許文献８】特開２０００−２４５４５１号公報
【特許文献９】特表２００２−５１５７５６号公報
【特許文献１０】特表２０１０−５０５８４５号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Young-Ik Son, et al., Cancer Research 61, 884-888
【非特許文献２】Kiyoshi Sato et al., Int. J. Cancer, 116, p.94-99(2005)
【非特許文献３】Wen Li et al., J. Immunother. 33(3), P287-206 2010
【非特許文献４】小林泰信ら、Jpn J Cancer Chemother 30(11), p.1776-1779
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
がん免疫細胞治療においては大量のＭＨＣ非拘束性の細胞傷害性細胞をがん患者に輸注する必要がある。がん免疫細胞治療においては、これまで、上記の先行技術文献に記載されたようにγδＴ細胞やＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞など各細胞種に合わせてサイトカインを選択することが行われてきた。
【００１９】
しかしながら、末梢血中におけるこれらの細胞の頻度は個人差が大きく、ある患者ではＮＫ細胞の比率が大きくγδＴ細胞の比率が小さいが、別の患者ではγδＴ細胞の比率が大きくＮＫ細胞の比率が小さいことはよく知られている。また、非特許文献３や特許文献６に記載されているように、ＩＬ−１８によるγδＴ細胞の増幅倍率は個人差が多く、各がん患者の細胞頻度を測定した上で目標とする細胞種を選択し、当該細胞種に適したサイトカインを選択するのも困難である。また、γδＴ細胞やＮＫ細胞など、細胞種に応じたサイトカインを選択したとしても、あるがん患者の場合には期待したような細胞数が得られず、改めてサイトカインの選択を行った上で再培養を行う必要もあった。従って、細胞種に関係なく、ＭＨＣ非拘束性の細胞傷害性を有する細胞を拡大培養するだけでなく、細胞頻度が異なるいずれの患者の末梢血からでも、一様の増幅倍率が期待される培養方法が望まれる。
【００２０】
さらに、非特許文献３や特許文献６では複数のサイトカインが用いられているが、これらの方法では細胞数の増大には十分であるとは言えず、さらに大きな増幅倍率を望める拡大培養法が望まれていた。
【００２１】
本発明は上記課題に鑑みてなされたものであって、本発明者らは、ＩＬ−２とゾレドロネートとＩＬ−１８に、ＴＮＦ−α又はレトロネクチン（登録商標）、さらにはその両者の存在下において、ＰＢＭＣを培養したところ、ＮＫ細胞などのＭＨＣ非拘束性の細胞傷害性細胞を効率よく培養することができ、本願発明を完成するに至った。
【００２２】
なお、非特許文献４は、ＩＬ−２に加えてＴＮＦ−α及びＩＬ−１βの双方の存在下においてＰＭＢＣを培養したところ、ＮＫ細胞が拡大培養されたことを開示するにすぎず、非特許文献４には、ＩＬ−１βとの協調作用の他にＴＮＦ−αの作用についての示唆は記載されていない。また、特許文献９によるとＩＬ−２、ＩＬ−１β、ＩＮＦ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ及び臍帯血漿の存在下並びにこれらの因子にさらにＴＮＦ−αを加えた条件下で培養したところ、前者における細胞の増幅率が１１倍、後者における増幅率が１７倍であって、コンカナバリンＡとＩＬ−２の存在下で培養した場合の約２０００〜３０００倍の増幅率に比べて、ＴＮＦ−αの添加は増幅率にほとんど影響を及ぼさないことが示されている。さらに、特許文献１０は、ＴＮＦ−αが人工抗原提示細胞との接触により活性化されたＴリンパ球を刺激し、活性化Ｔ細胞の増幅を促進させることを目的とするものであるが、ＴＮＦ−αの増幅効果については確認されていない。このように、ＴＮＦ−αがそれのみでＭＨＣ非拘束性の細胞傷害性細胞の増幅に及ぼす作用は明らかにされていない。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明のＭＨＣ非拘束性の細胞傷害性細胞の拡大培養方法は、ＰＢＭＣをＩＬ−２とビスホスホネートとＩＬ−１８とＴＮＦ−αの存在下で、あるいは、ＩＬ−２とビスホスホネートとＩＬ−１８とＴＮＦ−α及びフィブロネクチン（及び／又はそのフラグメント）の存在下で培養することを特徴としている。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の拡大培養方法によると、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞のようなＭＨＣ非拘束性の細胞傷害性細胞を効率よく培養することができる。特に、がん患者において増幅倍率において個体差が少なく、ＴＮＦ−αを加えない場合で培養した場合には低い増幅率で培養できなかったがん患者でも、高い増幅率が望める。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の拡大培養方法は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＩＬ−２とＩＬ−１８とビスホスホネートとＴＮＦ−αの存在下で、あるいはさらにフィブロネクチン及び／又はそのフラグメントの存在下で培養する方法である。
【００２６】
本明細書において、ＭＨＣ非拘束性細胞傷害性細胞とは、標的細胞表面上に発現するＭＨＣに拘束されることなく細胞傷害活性、すなわちＮＫ活性を示す細胞を意味し、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞やＮＫＴ細胞を含むＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性細胞及びγδＴｃＲ陽性細胞の両細胞を示す意味で用いられる。
【００２７】
本明細書において、拡大培養とは培養後における細胞数が培養前における細胞数に比べて増加していることを意味する。
【００２８】
ＰＢＭＣは、動物、特にヒトから得られた末梢血から、密度勾配などの方法により分離されたものが使用される。分離されたＰＢＭＣは、主として単球やリンパ球（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞）などの単核細胞を含み、顆粒球、赤血球ならびに血小板などはほぼ除去された細胞集団を意味する。また、ＰＢＭＣはがん患者から分離された細胞集団が好ましく用いられる。
【００２９】
ＰＢＭＣは、ＰＢＭＣの培養に適した培地で培養される。培養用の培地は、ＰＢＭＣの増幅に必要な成分を含む培地であればよい。例えば市販品であるＡＩＭ−Ｖ（商標名）が例示される。培地は、少なくともサイトカインであるＬ−２、ＩＬ−１８、ビスホスホネート、ＴＮＦ−αを含む。本発明の拡大培養方法はこれら４種のサイトカインの組み合わせによって培養効率を高める方法である。
【００３０】
培地に含まれる全てのサイトカインは公知である。ビスホスホネートは、骨組織に付着すると破骨細胞に取り込まれ、細胞死を誘導する。側鎖に窒素を含むビスホスホネートと窒素を含まないビスホスホネートのいずれもが使用され得る。例えば、側鎖構造が簡単であるエチドロネートやクロドロネート、アミノ基を有するゾレドロネート、パミドロネート、アレンドロネート、レセドロネート、イバンドロネート、環状構造を有するインカドロネート、リセドロネート、ミノドロネートが例示される。また、遊離のビスホスホネートやビスホスホネート塩、さらにはそれらの水和物も使用され得る。ビスホスホネート塩として、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩が例示される。ビスホスホネートの種類は限定されず、１種のビスホスホネート又は２種以上のビスホスホネートが使用され得る。増幅効果が高いことに鑑み、ゾレドロネートが好ましく使用される。
【００３１】
培地中における各サイトカインの濃度は適宜定められる。培地中のＩＬ−２の下限値は、例えば１ＩＵ（単位）／ｍｌであり、５ＩＵ／ｍｌであり、１０ＩＵ／ｍｌであり、２０ＩＵ／ｍｌであり、５０ＩＵ／ｍｌであり、７５ＩＵ／ｍｌであり、１００ＩＵ／ｍｌであり得る。その上限値は、例えば培地中１０万ＩＵ／ｍｌであり、５万ＩＵ／ｍｌであり、１万ＩＵ／ｍｌであり、５,０００ＩＵ／ｍｌであり、４,０００ＩＵ／ｍｌであり得る。
【００３２】
培地中のＩＬ−１８の下限値は、例えば培地中０．００１ｎｇ／ｍｌであり、０.０１ｎｇ／ｍｌであり、０.０５ｎｇ／ｍｌであり、０.１ｎｇ／ｍｌであり、０.５ｎｇ／ｍｌであり、１ｎｇ／ｍｌであり得る。その上限値は、例えば培地中１００μｇ／ｍｌであり、１０μｇ／ｍｌであり、５μｇ／ｍｌであり、１μｇ／ｍｌであり、７５０ｎｇ／ｍｌであり、５００ｎｇ／ｍｌであり得る。
【００３３】
培地中のビスホスホネートの下限値は、例えば培地中０.０１ｎＭであり、０.１ｎＭであり、０.００１μＭであり、０.００５μＭであり、０.０１μＭであり得る。また、その上限値は、例えば培地中１０ｍＭであり、５ｍＭであり、１ｍＭであり、５００μＭであり、２００μＭであり、１００μＭであり、５０μＭ、１０μＭであり得る。
【００３４】
培地中のＴＮＦ−αの下限値は、例えば培地中０.１ｐｇ／ｍｌであり、０.００１ｎｇ／ｍｌであり、０.００２ｎｇ／ｍｌであり、０.００５ｎｇ／ｍｌであり、０.０１ｎｇ／ｍｌであり得る。その上限値は、例えば培地中１０μｇ／ｍｌであり、５μｇ／ｍｌであり、２μｇ／ｍｌであり、１μｇ／ｍｌであり、７５０ｎｇ／ｍｌであり、５００ｎｇ／ｍｌであり得る。
【００３５】
４種の必須サイトカインの濃度は上記範囲の中で適宜組み合わせることが可能であるが、その組み合わせとしては、例えば、ＩＬ−２を１００ＩＵ／ｍｌ以上４,０００ＩＵ／ｍｌ以下、ＩＬ−１８を１ｎｇ／ｍｌ以上５００ｎｇ／ｍｌ以下、ビスホスホネートを０.０１μＭ以上１０μＭ以下、ＴＮＦ−αを０.０１ｎｇ／ｍｌ以上５００ｎｇ／ｍｌ以下を含む培地が好ましく、ＩＬ−２を４,０００ＩＵ／ｍｌ±１,０００ＩＵ／ｍｌ、ＩＬ−１８を５００ｎｇ／ｍｌ±１００ｎｇ／ｍｌ、ビスホスホネートを１０μＭ±１０μＭ、ＴＮＦ−αを５００ｎｇ／ｍｌ±１００ｎｇ／ｍｌを含む培地が望ましい。この範囲において、細胞頻度の異なるいずれの患者においても数百倍程度の高い増幅倍率で細胞を拡大培養できると共に、いずれの患者においても１０８〜１０９cellsのＭＨＣ非拘束性細胞傷害性細胞が得られるからである。もちろん、当該範囲外においても、本発明の効果が期待される。
【００３６】
培地は、必要により血漿、好ましくは培養の対象となるＰＢＭＣが分離された個体から得られた血漿を含む。その添加量も適宜定められる。例えば、その下限値は、培地中０.１容量％であり、０.２容量％であり、０.５容量％であり、１.０容量％であり得る。その上限値は、培地中２０.０容量％であり、１５.０容量であり、１０容量％であり得る。
【００３７】
培養時の温度やＣＯ２濃度、湿度などＰＢＭＣの培養条件についても特別な制約はなく、公知の培養条件が適用され得る。例えば、３７℃、５％ＣＯ２下、湿度１００％の環境下の条件が例示される。培養期間も適宜定めることができ、例えば７日〜２１日間程度の培養期間を設定し得る。培養は、好ましくは培地中の全細胞数がほぼプラトーに達するまで行われる。また、培養期間中、必要に応じて、適量の新鮮な培地が追加される。追加される新鮮な培地は、必要に応じて、血漿やＩＬ−２その他の上記サイトカインを含み得る。
【００３８】
本発明において使用される培地は、ＰＢＭＣの拡大培養に必要なサイトカインとして、Ｌ−２、ＩＬ−１８、ビスホスホネート、ＴＮＦ−αの４種のサイトカインのみを含む。もっとも、当該培地は他のサイトカインを含み得る。他のサイトカインとして、フィブロネクチンが好適である。フィブロネクチンは、動物の血液中、培養細胞表面、組織の細胞外マトリックスに存在する高分子の糖タンパクである。フィブロネクチンとして、例えば特許文献３に開示されたフィブロネクチンやそのフラグメントが用いられ得る。フィブロネクチン及びそのフラグメントの種類は限定されず、１種のフィブロネクチン又はそのフラグメントあるいは２種以上のフィブロネクチン又はそのフラグメントが使用され得る。本発明では、増幅効率や入手容易性からレトロネクチン（登録商標）が好ましく使用される。
【００３９】
本発明においては、上記４種の必須サイトカインに加えてフィブロネクチン及び／又はそのフラグメントを含む培地が用いられる。また、本発明においては、フィブロネクチン及び／又はそのフラグメントを含む培地に変えて、あるいは、フィブロネクチン及び／又はそのフラグメントを含む培地と共に、フィブロネクチン及び／又はそのフラグメントを含むコーティング膜を備えた培養用の容器、例えばシャーレ、フラスコ、プレートなどが用いられる。コーティング膜は、例えば、フィブロネクチン又はそのフラグメントに皮膜形成用の担体を加えた溶液を、培養用の容器基材に塗布することにより作製される。
【００４０】
培地に含まれるフィブロネクチン又はそのフラグメントの下限値は、例えば培地中０.００１μｇ／ｍｌであり、０.０１μｇ／ｍｌであり、０.０５μｇ／ｍｌであり、０.１μｇ／ｍｌであり、０.２μｇ／ｍｌであり、０.５μｇ／ｍｌであり得る。また、その上限値は、例えば培地中１,０００μｇ／ｍｌであり、１００μｇ／ｍｌであり、５０μｇ／ｍｌであり、２０μｇ／ｍｌであり、１０μｇ／ｍｌであり得る。コーティング膜を作製するための溶液に含まれるフィブロネクチン又はそのフラグメントの下限値は、当該溶液中、例えば０.００１μｇ／ｍｌであり、０.０１μｇ／ｍｌであり、０.０５μｇ／ｍｌであり、０.１μｇ／ｍｌであり、０.２μｇ／ｍｌであり、０.５μｇ／ｍｌであり得る。また、その上限値は、例えば培地中１,０００μｇ／ｍｌであり、１００μｇ／ｍｌであり、５０μｇ／ｍｌであり、２０μｇ／ｍｌであり、１０μｇ／ｍｌであり得る。
【００４１】
本発明のがん治療用の製剤は、上記の方法に従って培養されたＭＨＣ非拘束性細胞傷害性細胞からなる細胞集団を含む。当該製剤は、上記の方法に従って培養された細胞集団の他に培養に用いられた培地を含み得る。また、当該製剤は拡大培養に使用した培地から分離された細胞集団とサイトカインを含まない新鮮培地や生理食塩水を含み得る。新鮮培地としては、上記培養に用いられた培地と同じ組成を有する培地又は異なる組成の培地が使用され得る。当該製剤中の細胞濃度は、製剤１ｍｌ中１×１０６cells以上であり、１×１０７cells以上であり、１×１０８cellsであり、１×１０９cells以上であり得る。好ましくは、１×１０７〜１×１０９cells／ｍｌである。また、当該製剤は、ＭＨＣ非拘束性の細胞傷害性細胞の他に、ＭＨＣ拘束性の細胞傷害性細胞を含み得る。また、これらの細胞以外に、種々の抗腫瘍剤やその他の治療剤を含み得る。
【００４２】
本発明の組成物は、ＭＨＣ非拘束性細胞傷害性細胞を拡大培養するための組成物であって、Ｌ−２、ＩＬ−１８、ビスホスホネートを含み、さらにはフィブロネクチン又はＴＮＦ−α或いはその両者を含む４種類のサイトカイン又は５種類のサイトカインを含む。当該組成物は好ましくはサイトカインとして前記４種類又は５種類のサイトカインのみを含み、その他に、ＰＢＭＣ培養のための必須成分やその他の担体を含み得る。当該組成物は、培地に溶解した場合に上記培地中の濃度となる量の各サイトカインを含む。
【００４３】
次に本発明について実施例に基づいてさらに説明する。なお、本発明は下記の実施例に限られることのないのは言うまでもない。
【実施例１】
【００４４】
１０名のがん患者から採取された末梢血からFicoll PAQUEを用いた比重遠心分離法により、単核細胞を分離した。１０ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地(ライフテクノロジーズジャパン社製)に、分離した単核細胞の密度が１０６cells／ｍｌとなるように調整した。その後、Ｆ−２５フラスコ(コーニング社製)にて、３７℃、５％ＣＯ２、湿度１００％の環境下で培養を開始した。培養開始時に、上記細胞を含む培地に５容量％の自己血漿、１,０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２（ノバルティス社製）、１μＭのゾレドロネート（ノバルティス社製）、５０ｎｇ／ｍlのＩＬ−１８（ＭＢＬ社製）及び１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（セルジェニックス社）を加えた。また、ＴＮＦ−αの効果を確認するために、ＴＮＦ−αを添加しない場合についても同様に培養を行った。細胞の増幅に伴い、培養液をＦ１７５フラスコ（コーニング社製）に移して２００ｍｌまで増量し、必要に応じてカルチャーバッグ（ニプロ社製）に移して１０００ｍｌまで培養液を増量した。培地を増量する際には２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２のみを含むＡＩＭ−Ｖ培地を用い、１２日間培養を行った。
【００４５】
細胞数はトリパンブルー染色により染色されなかった生細胞数を顕微鏡下で計測することにより算出された。また、培養後の細胞について、ＦＩＴＣ標識ＣＤ３抗体（ベクトンディッキンソン社製）、ＰＥ標識ＣＤ５６抗体（ベックマンコールター社）、ＦＩＴＣ標識ＴｃＲαβ抗体（ベクトンディッキンソン社製）、ＦＩＴＣ標識ＴｃＲγδ抗体（ベクトンディッキンソン社製）を用いて直接抗体染色を行い、フローサイトメータ（ベクトンディッキンソン社）を用いて頻度解析を行った。その結果を表１に示す。なお、表１の細胞数は、１２日間の増幅後における総細胞数である。
【００４６】
【表１】
2012205581.tif 000002
【００４７】
表１の結果に示すように、ＴＮＦ−αを加えない場合に比べて、ＴＮＦ−αの添加は、ＭＨＣ非拘束性細胞傷害性細胞の増幅倍率を高めた。特に検体３や検体６のように、ＴＮＦ−αを加えない場合において増幅倍率の低いＰＢＭＣにおいて、ＴＮＦ−αの添加は高い増幅倍率の獲得に貢献する。このように、本発明によるサイトカインの組み合わせは、従来のサイトカインの組み合わせでは、増幅倍率の期待が見込めなかった患者のＰＢＭＣを、高い増幅倍率で増幅することが確認された。
【実施例２】
【００４８】
次にＴＮＦ−αの用量依存性について実験を行った。３名のがん患者（実施例２と同じ）から採取された末梢血からFicoll PAQUEを用いた比重遠心分離法により、単核細胞を分離した。１ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地(ライフテクノロジーズジャパン社製)に、分離した単核細胞の密度が１０６cells／ｍｌとなるように調整した。その後、２４穴プレート（コーニング社製）にて、３７℃、５％ＣＯ２、湿度１００％の環境下で培養を開始した。培養開始時に、上記細胞を含む培地に５容量％の自己血漿、１,０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、１μＭのゾレドロネート（ノバルティス社製）、５０ｎｇ／ｍlのＩＬ−１８（ＭＢＬ社製）及び表３に示す濃度のＴＮＦ−α（セルジェニックス社製）を加えた。細胞の増幅に伴い、培養液をＦ２５フラスコ（コーニング社製）に移して３０ｍｌまで増量し、必要に応じてＦ１７５フラスコ（コーニング社製）に移して１００ｍｌまで培養液を増量した。細胞の増幅に伴い培地を増量する際には２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２のみを含むＡＩＭ−Ｖ培地を用い、１２日間培養を行った。当該条件における培養結果を表２に示す。なお、表２の細胞数は、１２日間の増幅後における総細胞数である。表２に示すように、ＴＮＦ−αの添加量に用量依存性が見られ、ＴＮＦ−αの添加による効果が確認された。
【００４９】
【表２】
2012205581.tif 000003
【実施例３】
【００５０】
次にサイトカインの濃度を変えて実験を行った。３名のがん患者から採取された末梢血からFicoll PAQUEを用いた比重遠心分離法により、単核細胞を分離した。１ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地(ライフテクノロジーズジャパン社製)に、分離した単核細胞の密度が１０６cells／ｍｌとなるように調整した。その後、２４穴プレート（コーニング社製）にて、３７℃、５％ＣＯ２、湿度１００％の環境下で培養を開始した。培養開始時に、上記細胞を含む培地に、低濃度条件として５容量％の自己血漿、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、０.０１μＭのゾレドロネート（ノバルティス社製）、１ｎｇ／ｍlのＩＬ−１８（ＭＢＬ社製）及び０.０１ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（セルジェニックス社製）、又は高濃度条件として５容量％の自己血漿、４,０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、１０μＭのゾレドロネート、５００ｎｇ／ｍlのＩＬ−１８及び５００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを加えた。細胞の増幅に伴い、培養液をＦ２５フラスコ（コーニング社製）に移し、必要に応じて３０ｍｌまで増量した。細胞の増幅に伴い培地を増量する際には２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２のみを含むＡＩＭ−Ｖ培地を用い、１２日間培養を行った。当該条件における培養結果を表３に示す。なお、表３の細胞数は、１２日間の増幅後における総細胞数である。表３に示すように、４種のサイトカインを組み合わせることによって、頻度の異なる単核細胞（がん患者）からでも、大きな偏りも見られることなく、ほぼ同数の細胞数が得られることが確認された。また、ＴＮＦ−αやその他のサイトカインの濃度を適宜調整することにより、高い倍率でＰＢＭＣを拡大培養することができた。また、３検体の細胞数に大きな偏りも見られなかった。
【００５１】
【表３】
2012205581.tif 000004
【実施例４】
【００５２】
さらにレトロネクチンを使用して同様の実験を行った。１０名のがん患者から８ｍｌ採取した末梢血からFicoll PAQUE比重遠心分離法により、単核細胞を分離した。１０ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地(ライフテクノロジーズジャパン社製)に、分離した単核細胞の密度が１０６cells／ｍｌとなるように調整した。その後、あらかじめ５μg/ｍｌのレトロネクチン溶液の塗布により形成されたコーティング膜を備えたＦ２５フラスコ（コーニング社）にて、３７℃、５％ＣＯ２、湿度１００％の環境下で培養を開始した。培養開始時に、上記細胞を含む培地に５容量％の自己血漿、１,０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、1 μＭのゾレドロネート（ノバルティス社製）、５０ｎｇ／ｍlのＩＬ−１８（ＭＢＬ社製）及び１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（セルジェニックス社製）を加えた。細胞の増幅に伴い、培養液をＦ１７５フラスコ（コーニング社製）に移して２００ｍｌまで増量し、必要に応じてカルチャーバッグ（ニプロ社製）に移して１０００ｍｌまで増量した。細胞の増幅に伴い培地を増量する際には２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２のみを含むＡＩＭ−Ｖ培地を用い、１４日間培養を行った。当該条件における培養結果を表４に示す。なお、表４の細胞数は、１４日間の増幅後における総細胞数である。
【００５３】
【表４】
2012205581.tif 000005
【００５４】
表４に示すように、レトロネクチンの存在下においても、ＭＨＣ非拘束性の細胞傷害性細胞の細胞数を増幅させた。特に、検体２と検体３の間や検体５と検体６の間に認められるように、１４日間の培養によって、細胞頻度が異なるにもかかわらず、ほぼ同程度の細胞数の細胞集団が得られた。また、すべての検体から、５×１０８〜２×１０９程度の細胞数の細胞集団が得られた。
【００５５】
以上のように、本発明におけるサイトカインの組み合わせによって、細胞頻度が異なる末梢血から、ほぼ５×１０８〜２×１０９程度の一定した細胞数の細胞集団を得ることができる。この結果、がん患者ごとに異なる細胞頻度を考慮することなく、多量の細胞傷害性細胞をがん患者に投与できることになり、がん免疫細胞治療におけるがん治療効果の向上が期待される。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明によると効率よくＭＨＣ非拘束性の細胞傷害性細胞を拡大培養できる。