(57)【要約】【課題】３次元画像を精度良く構築できるようにする。【解決手段】演算処理回路３４は、２次元走査のうち、Ｘ方向の１ラインの走査が終了する毎に、Ｚ軸駆動機構５４によるＺ方向の移動位置の計測を行い、その計測結果に応じて、調整データテーブルを用いて出力調整データを演算して、テーブル保持部２８に格納する。出力調整回路３０は、出力調整データをD/A変換して得られる出力調整信号に基づいて、光源２１から射出されるレーザ光の強度を調整する。これにより、コントラストのよい２次元画像を取得することができるので、結果として、３次元画像を精度良く構築することができる。本発明は、例えば、ＸＹ方向の２次元走査と、Ｚ方向の移動とを同時に行って３次元走査を行う走査型顕微鏡に適用することができる。【選択図】図１
2012073551.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光を射出する光源と、
前記レーザ光を試料上に集光させる対物レンズと、
第１の速度でのＸ方向の走査が１ライン終了する毎に、前記第１の速度よりも低速な第２の速度でのＹ方向の走査の走査位置を１ライン分ずつずらしながら、前記レーザ光を、試料上で２次元方向に走査させる２次元走査手段と、
前記２次元走査手段による２次元走査が行われている間、前記対物レンズ又は前記試料を載置するステージの少なくとも一方を光軸に沿って移動させて、Ｚ方向における前記対物レンズと前記試料の相対距離を変える移動手段と、
前記試料からの光を検出して、その検出強度に応じた検出信号を出力する光検出手段と、
Ｘ方向の１ラインの走査時間の整数倍の時間単位における、その時点でのＺ方向の移動位置に応じて、前記光検出手段により検出される反射光の検出強度を調整する強度調整手段と
を備えることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記強度調整手段は、前記移動手段によるＺ方向の移動位置に応じて、前記光源から射出される前記レーザ光の強度を調整する
ことを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記強度調整手段は、前記移動手段によるＺ方向の移動位置に応じて、前記光検出手段の感度を調整する
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の走査型顕微鏡。
【請求項４】
Ｘ方向の１ラインの走査時間の整数倍の時間単位における、その時点での前記移動手段によるＺ方向の移動位置を計測する計測手段をさらに備え、
前記強度調整手段は、計測されたＺ方向の移動位置に応じて、前記光検出手段により検出される反射光の検出強度を調整する
ことを特徴とする請求項１から３の何れか一項に記載の走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記計測手段は、１フレームの画像についての走査開始時と走査終了時にＺ方向の移動位置を少なくとも計測して、その走査開始時から走査終了時までの間は、あらかじめ定められた所定の間隔で、Ｚ方向の移動位置を計測する
ことを特徴とする請求項４に記載の走査型顕微鏡。
【請求項６】
前記計測手段は、前記移動手段によるＺ方向の移動方法に基づいた所定の予測演算によりＺ方向の移動位置を求める
ことを特徴とする請求項４に記載の走査型顕微鏡。
【請求項７】
Ｚ方向の移動速度が時間に対して非線形に変化する場合、２次元走査におけるＹ方向の走査位置間隔を、Ｚ方向の移動速度の非線形性に応じて非線形に変化させる走査位置間隔調整手段をさらに備える
ことを特徴とする請求項１から６の何れか一項に記載の走査型顕微鏡。
【請求項８】
レーザ光を射出する光源と、
前記レーザ光を試料上に集光させる対物レンズと、
第１の速度でのＸ方向の走査が１ライン終了する毎に、前記第１の速度よりも低速な第２の速度でのＹ方向の走査の走査位置を１ライン分ずつずらしながら、前記レーザ光を、試料上で２次元方向に走査させる２次元走査手段と、
前記２次元走査手段による２次元走査が行われている間、前記対物レンズ又は前記試料を載置するステージの少なくとも一方を光軸に沿って移動させて、Ｚ方向における前記対物レンズと前記試料の相対距離を変える移動手段と、
前記試料からの光を検出して、その検出強度に応じた検出信号を出力する光検出手段と、
Ｚ方向の移動速度が時間に対して非線形に変化する場合、２次元走査におけるＹ方向の走査位置間隔を、Ｚ方向の移動速度の非線形性に応じて非線形に変化させる走査位置間隔調整手段と
を備えることを特徴とする走査型顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、試料上をＸＹ方向に走査する２次元走査と、Ｚ方向の移動を組み合わせて３次元走査を行う走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
走査型顕微鏡は、レーザ光を試料上で２次元走査させたときに試料により反射した光を集光させて、その光の強度を検出することで、試料の表面情報を２次元画像として取得する。そして、走査型顕微鏡では、試料の観測位置をＺ方向に移動させながら２次元画像を取得し、順次取得される２次元画像をＺ方向のスタック画像として、３次元の観察画像を構築する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−１４５５６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述した走査型顕微鏡においては、例えば神経組織等を観察する場合、高速にＺ方向の深度の現象を観察することが要求されるため、ＸＹ方向の２次元走査と、Ｚ方向の移動とを同時に行って、高速の３次元走査を行う場合がある。
【０００６】
このような３次元走査を行う場合、Ｚ方向の移動も可能な限り高速で移動させることが望ましいが、Ｚ方向に高速で移動させると、その影響で、２次元走査により得られる２次元画像の精度が落ちてしまうという問題がある。
【０００７】
そのため、高速にＺ方向を移動させた場合には、３次元画像を精度良く構築できなかった。
【０００８】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、ＸＹ方向の２次元走査と、Ｚ方向の移動とを同時に行う３次元走査において、高速にＺ方向を移動させた場合であっても、３次元画像を精度良く構築できるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の走査型顕微鏡は、レーザ光を射出する光源と、前記レーザ光を試料上に集光させる対物レンズと、第１の速度でのＸ方向の走査が１ライン終了する毎に、前記第１の速度よりも低速な第２の速度でのＹ方向の走査の走査位置を１ライン分ずつずらしながら、前記レーザ光を、試料上で２次元方向に走査させる２次元走査手段と、前記２次元走査手段による２次元走査が行われている間、前記対物レンズ又は前記試料を載置するステージの少なくとも一方を光軸に沿って移動させて、Ｚ方向における前記対物レンズと前記試料の相対距離を変える移動手段と、前記試料からの光を検出して、その検出強度に応じた検出信号を出力する光検出手段と、Ｘ方向の１ラインの走査時間の整数倍の時間単位における、その時点でのＺ方向の移動位置に応じて、前記光検出手段により検出される反射光の検出強度を調整する強度調整手段とを備えることを特徴とする。
【００１０】
本発明の第２の走査型顕微鏡は、レーザ光を射出する光源と、前記レーザ光を試料上に集光させる対物レンズと、第１の速度でのＸ方向の走査が１ライン終了する毎に、前記第１の速度よりも低速な第２の速度でのＹ方向の走査の走査位置を１ライン分ずつずらしながら、前記レーザ光を、試料上で２次元方向に走査させる２次元走査手段と、前記２次元走査手段による２次元走査が行われている間、前記対物レンズ又は前記試料を載置するステージの少なくとも一方を光軸に沿って移動させて、Ｚ方向における前記対物レンズと前記試料の相対距離を変える移動手段と、前記試料からの光を検出して、その検出強度に応じた検出信号を出力する光検出手段と、Ｚ方向の移動速度が時間に対して非線形に変化する場合、２次元走査におけるＹ方向の走査位置間隔を、Ｚ方向の移動速度の非線形性に応じて非線形に変化させる走査位置間隔調整手段とを備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、３次元画像を精度良く構築できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明を適用した走査型顕微鏡の一実施の形態の構成を示す図である。
【図２】強度調整が行われる３次元走査を説明するフローチャートである。
【図３】Ｚ方向の位置と出力調整データとの関係を示す図である。
【図４】３次元走査により得られる２次元画像を時系列で表した模式図である。
【図５】調整データテーブル演算処理を説明するフローチャートである。
【図６】本発明を適用した走査型顕微鏡の一実施の形態の他の構成を示す図である。
【図７】Ｚ方向の移動速度が非線形の場合におけるＺ方向の位置の時間変化を示す図である。
【図８】Ｚ方向の非線形性に応じて求められるＹ方向の走査位置間隔を示す図である。
【図９】Ｙ方向の走査位置間隔調整が行われる３次元走査を説明するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための形態（以下、実施の形態という）について説明する。
【００１４】
図１は、本発明を適用した走査型顕微鏡の一実施の形態の構成を示す図である。
【００１５】
図１に示すように、走査型顕微鏡１１は、光源２１、走査光学系２２、光検出器２３、サンプリング回路２４、画像化回路２５、基準クロック発生器２６、タイミング制御回路２７、テーブル保持部２８、DAコンバータ２９ａ乃至２９ｃ、出力調整回路３０、Ｙ軸駆動回路３１、Ｚ軸駆動回路３２、Ｘ軸駆動回路３３、演算処理回路３４、Ｚ位置検出回路３５、及びステージ３６から構成される。
【００１６】
光源２１は、テーブル保持部２８から読み出されるレーザ制御信号にしたがって、レーザ光を射出する。光源２１から射出されたレーザ光は、走査光学系２２に導入される。
【００１７】
走査光学系２２は、光路分割部材５１、Ｙ走査機構５２、Ｘ走査機構５３、及びＺ軸駆動機構５４から構成される。
【００１８】
走査光学系２２に導入されたレーザ光は、ダイクロイックミラーやレンズ等の光学部材からなる光路分割部材５１により、Ｙ走査機構５２に取り付けられたＹ走査ミラー５２ａの方向に反射される。Ｙ走査ミラー５２ａの方向に反射されたレーザ光は、Ｙ走査ミラー５２ａ及びＸ走査機構５３に取り付けられたＸ走査ミラー５３ａによりＺ軸駆動機構５４の方向に反射される。そして、レーザ光は、Ｚ軸駆動機構５４と一体化されている対物レンズ５４ａを透過することにより集光され、ステージ３６に載置された試料１２に照射される。
【００１９】
レーザ光を照射することにより励起され、試料１２から発せられた蛍光（以下、観察光という）は、対物レンズ５４ａを透過し、Ｘ走査ミラー５３ａ及びＹ走査ミラー５２ａによりデスキャンされた後、光路分割部材５１により光検出器２３側に導かれる。
【００２０】
光検出器２３は、例えば、PMT（光電子増倍管：Photomultiplier Tube）により構成される。光検出器２３は、入射した観察光を光電変換することにより、その受光感度に応じた値の画像信号に変換し、サンプリング回路２４に供給する。
【００２１】
サンプリング回路２４は、タイミング制御回路２７から供給されるサンプリングクロック及びテーブル保持部２８から読み出されるサンプリング有効信号に基づいて、所定のタイミングで光検出器２３から供給される画像信号をサンプリングして、画像化回路２５に供給する。画像化回路２５は、サンプリング回路２４から供給される画像信号を基に取得される複数の２次元画像から、３次元の観察画像を構築し、表示装置（不図示）や後段の処理システム（不図示）に出力する。
【００２２】
Ｘ軸駆動回路３３は、Ｘ走査機構５３を駆動し、Ｘ走査ミラー５３ａの角度を制御することにより、試料１２に照射されるレーザ光を、Ｘ方向に走査する。
【００２３】
なお、Ｘ走査機構５３としては、高速のＸ走査を実現するために、例えば、共振型のレゾナントスキャナが用いられる。このレゾナントスキャナは、自己の機械的共振により振幅が安定するため、Ｘ軸駆動回路３３により駆動データを用いずに駆動される。そのため、レゾナントスキャナを採用した場合、Ｘ軸駆動位置と、Ｙ軸駆動位置との同期関係を実現する必要がある。この同期を実現するための方法は、各種提案されているが、本実施の形態では、Ｘ走査ミラー５３ａの裏面に、クロック生成用反射部（不図示）を設けて、そのクロック生成用反射部により得られる光学的クロック信号が、基準クロック発生器２６に供給されるようにする。
【００２４】
基準クロック発生器２６は、Ｘ走査ミラー５３ａの裏面に設けられたクロック生成用反射部から供給される光学的クロック信号に基づいて、走査型顕微鏡１１の全体の動作タイミングの基準となる基準クロックを発生し、タイミング制御回路２７に供給する。
【００２５】
タイミング制御回路２７は、基準クロック発生器２６からの基準クロックを、所定の周波数のクロックに変換することで、テーブル保持部２８に保持されている駆動テーブルから、一定の周期でデータを読み出すための読み出しクロックを生成する。そして、タイミング制御回路２７は、生成された読み出しクロックに同期して、テーブル保持部２８に保持された駆動テーブルから読み出すべき駆動データと制御データが格納されているアドレスを生成し、テーブル保持部２８に供給する。
【００２６】
テーブル保持部２８には、Ｙ軸駆動データ部、Ｚ軸駆動データ部、出力調整データ部、及び制御データ部から構成される駆動テーブルが格納される。
【００２７】
Ｙ軸駆動データ部には、Ｙ走査機構５２に取り付けられたＹ走査ミラー５２ａを所定の角度に回転させるための駆動信号の各時刻の値である駆動電圧を示す駆動データが格納される。Ｚ軸駆動データ部には、Ｚ軸駆動機構５４を駆動するための駆動電圧を示す駆動データが格納される。
【００２８】
また、出力調整データ部には、光源２１から射出されるレーザ光の強度を調整するための出力調整データが格納される。制御データ部には、光源２１の点灯や消灯を制御するためのレーザ制御信号と、観察画像を得るための画像信号のサンプリングの有効又は無効を示すサンプリング有効信号が格納される。
【００２９】
このように、高速の３次元走査では、ＸＹ方向の２次元走査を行っている最中に、Ｚ方向の移動が同時に行われるため、Ｙ軸駆動データ部とＺ軸駆動データ部に格納された駆動データは、連動して読み出される必要がある。そのため、テーブル保持部２８では、それらの駆動データが一元的に管理され、さらに、出力調整データ部も関連付けて格納されている。
【００３０】
テーブル保持部２８は、タイミング制御回路２７から供給されたアドレスに格納されているデータを読み出して、後段に出力する。すなわち、テーブル保持部２８は、読み出された出力調整データをDAコンバータ２９ａに供給し、読み出された駆動データのうち、Ｙ軸駆動データをDAコンバータ２９ｂ、Ｚ軸駆動データをDAコンバータ２９ｃにそれぞれ供給する。また、テーブル保持部２８は、読み出された制御データのうち、レーザ制御信号を光源２１に供給し、サンプリング有効信号をサンプリング回路２４に供給する。
【００３１】
DAコンバータ２９ａは、テーブル保持部２８から読み出された出力調整データを、デジタル信号からアナログ信号にD/A（Digital/Analog）変換し、それにより得られた出力調整信号を、出力調整回路３０に供給する。出力調整回路３０は、DAコンバータ２９ａから供給される出力調整信号に基づいて、光源２１から射出されるレーザ光の強度を調整する。
【００３２】
DAコンバータ２９ｂは、テーブル保持部２８から読み出されたＹ軸駆動データを、D/A変換して、それにより得られたＹ軸駆動信号を、Ｙ軸駆動回路３１に供給する。Ｙ軸駆動回路３１は、DAコンバータ２９ｂから供給されるＹ軸駆動信号に基づいて、Ｙ走査機構５２の駆動を制御して、Ｙ走査ミラー５２ａを所定の角度に回転させる。すなわち、Ｙ走査機構５２は、例えばガルバノモータなどから構成され、Ｙ軸駆動回路３１による制御にしたがって、Ｙ走査ミラー５２ａが固定されたガルバノモータの軸を所定の範囲で往復運動させる。
【００３３】
DAコンバータ２９ｃは、テーブル保持部２８から読み出されたＺ軸駆動データを、D/A変換して、それにより得られたＺ軸駆動信号を、Ｚ軸駆動回路３２に供給する。Ｚ軸駆動回路３２は、DAコンバータ２９ｃから供給されるＺ軸駆動信号に基づいて、例えばピエゾ素子等が用いられたＺ軸駆動機構５４の駆動を制御して、試料１２にレーザ光を導く対物レンズ５４ａを光軸（Ｚ方向）に沿って移動させる。
【００３４】
演算処理回路３４は、観察者により駆動信号の波形が指定された場合、その波形に応じた駆動テーブルを生成し、テーブル保持部２８に保持させる。
【００３５】
Ｚ位置検出回路３５は、Ｚ軸駆動機構５４によってＺ方向に移動される対物レンズ５４ａに応じて変化するＺ方向の位置を検出する。演算処理回路３４は、必要に応じて、Ｚ位置検出回路３５による検出結果を読み出し、Ｚ方向の移動位置の計測を行う。そして、演算処理回路３４は、Ｚ方向の移動位置の計測結果に基づいて、出力調整データを演算し、テーブル保持部２８の出力調整データ部に格納する。
【００３６】
以上のようにして、走査型顕微鏡１１は構成される。
【００３７】
次に、図２のフローチャートを参照して、図１の走査型顕微鏡１１により実行される３次元走査について説明する。
【００３８】
観察者により、試料１２の測定を行うための所定の操作が行われた場合、走査型顕微鏡１１では、３次元走査が開始される（ステップＳ１１）。本実施の形態においては、３次元走査が開始されると、高速なＸ方向の走査が１ライン終了する毎に、低速なＹ方向の走査の走査位置を１ライン分ずつずらしながら、レーザ光を、試料１２上で２次元方向に走査させる２次元走査が開始されるが、それと同時に、高速なＺ方向の移動が開始される。
【００３９】
２次元走査においては、ＸＹ平面上の所定の走査開始位置からＸ方向の走査が開始され（ステップＳ１２，Ｓ１３）、Ｘ方向の１ラインの走査が終了するまで（ステップＳ１４の「Yes」）、ステップＳ１３，Ｓ１４の処理が繰り返され、Ｘ方向の１ライン分の画像信号が取得される。すなわち、Ｘ軸駆動回路３３によりＸ走査機構５３が駆動され、Ｘ走査ミラー５３ａが回転することで、Ｘ方向の走査が行われ、Ｘ方向の走査により得られる画像信号が、光検出部２３により検出される。
【００４０】
そして、Ｘ方向の１ラインの走査が終了した場合（ステップＳ１４の「Yes」）、ステップＳ１５において、１フレーム分の２次元走査が終了したか否かが判定され、１フレーム分の２次元走査が終了していないと判定された場合（ステップＳ１５の「No」）、処理は、ステップＳ１６に進む。
【００４１】
ステップＳ１６において、光源２１から射出されるレーザ光の強度を調整する強度調整処理が行われる。この強度調整処理としては、例えば次のような処理が行われる。
【００４２】
すなわち、演算処理回路３４は、Ｚ位置検出回路３５による検出結果を読み出し、Ｚ方向の移動位置の計測を行う。演算処理回路３４は、その計測結果に応じて、調整データテーブルを用いて出力調整データを演算し、テーブル保持部２８（出力調整データ部）に格納する。そして、出力調整データは、DAコンバータ２９ａにより読み出された後、D/A変換され、出力調整回路３０に供給される。出力調整回路３０は、DAコンバータ２９ａから供給される出力調整信号に基づいて、光源２１から射出されるレーザ光の強度を調整する。
【００４３】
なお、演算処理回路３４により演算される調整データテーブルの詳細については、後述する。
【００４４】
ステップＳ１７において、Ｙ軸駆動回路３１は、Ｙ走査機構５２を駆動して、Ｙ走査ミラー５２ａを回転させて、Ｙ方向の走査位置を１ライン分ずらす。そして、処理はステップＳ１３に戻り、再びＸ方向の１ラインの走査が終了するまで、Ｘ方向の走査が行われ、１ラインの走査が終了した場合には、強度調整処理が行われた後、Ｙ方向の走査位置が１ライン分ずらされる。
【００４５】
そして、Ｘ方向の１ラインの走査が終了する毎に、Ｙ方向の走査位置を１ラインずつずらしながら２次元走査が行われることで、１フレーム分の２次元走査が終了することとなる（ステップＳ１５の「Yes」）。
【００４６】
このように、ＸＹ方向の２次元走査を行っている間も、Ｚ方向の移動は継続して行われているため、ＸＹ方向の２次元走査中に、Ｚ方向の位置が変化することになる。そのため、ＸＹ走査開始時に行った光源２１の照明光の強度の調整を行わないと、走査開始直後は有効であっても、次第に、意図した調整量から外れた状態で、２次元画像が取得されることになる。
【００４７】
すなわち、時間の経過とともにＺ方向の位置が深くなる走査を行った場合、ＸＹ方向の２次元走査により得られる２次元画像においては、走査開始時の画像の輝度に対して、走査終了に近づくにつれて、画像の輝度が暗くなる現象が発生する。そのため、本実施の形態では、Ｘ方向の１ライン分の走査が終了したとき、強度調整処理を行って、光源２１から射出されるレーザ光の強度を調整している（ステップＳ１６）。
【００４８】
具体的には、図３Ａに示すように、原点Oを基準として、原点Oから図中下方向に記述された矢印を時間軸、原点Oから図中左方向に記述された矢印をＺ方向の位置（Ｚ位置）の軸、原点Oから図中右方向に記述された矢印を出力調整データの値の軸で表した３軸のグラフについて考えると、Ｚ方向の位置は関数Z(t)、出力調整データは関数P(t)により表すことができる。つまり、関数Z(t)は、時間の経過とともにＺ方向の位置が深くなることを意味するが、その関係と同様に、関数P(t)によって、時間の経過とともに出力調整データの値が大きくなるようにする。
【００４９】
これにより、時間の経過とともにＺ方向の位置が深くなる走査を行った場合であっても、そのＺ方向の位置の深さに応じて出力調整データの値が大きくなり、光源２１から射出されるレーザ光の強度が強くなるので、図３Ｂに示すように、１フレームの２次元画像において、走査終了時に近づいても走査開始時の画像の輝度と同一の輝度を一定に保つことが可能となる。
【００５０】
図２のフローチャートに戻り、ステップＳ１８において、１回の測定における、その開始から終了までの間のＺ方向の移動の範囲（以下、Ｚ測定範囲という）内の移動が終了したか否かが判定され、Ｚ測定範囲内の移動が終了していないと判定された場合（ステップＳ１８の「No」）、処理は、ステップＳ１２に戻り、上述したステップＳ１２乃至Ｓ１８の処理が繰り返される。すなわち、Ｚ測定範囲内の移動が終了したと判定されるまで（ステップＳ１８の「Yes」）、Ｚ方向に移動しながら、ＸＹ方向の２次元走査が行われ、複数の２次元画像が順次取得されることになる。
【００５１】
そして、ステップＳ１８において、Ｚ測定範囲内の移動が終了したと判定された場合、３次元走査が終了される（ステップＳ１９）。これにより、画像化回路２５によって、順次取得される複数の２次元画像から３次元の観察画像が構築される。
【００５２】
以上のようにして、走査型顕微鏡１１では、ＸＹ方向の２次元走査と、Ｚ方向の移動とを同時に行う３次元走査において、Ｚ方向の移動位置に応じて、光源２１から射出されるレーザ光の強度を調整することで、１フレームの２次元画像内の輝度を一定にしている。
【００５３】
ここで、図４を参照して、Ｚ方向の移動速度と、２次元走査により得られる１フレームの２次元画像の輝度との関係の詳細について説明する。
【００５４】
図４Ａに示すように、Ｚ方向の移動速度が十分に遅い場合、Ｚ方向の移動位置（Ｚ方向の深度）に応じた強度調整を行うことで、輝度は一定になるが、Ｚ方向の移動速度が速い場合、図４Ｂに示すように、１フレーム単位でＺ方向の深度に応じた強度調整を行っても、Ｙ方向（低速軸側）で輝度に傾斜が生ずることとなる。そして、図４Ｂの場合には、傾斜したＸＹ平面に対して２次元走査が行われることとなり、同一の走査面で、走査位置により輝度が異なる２次元画像が取得されることになる。
【００５５】
このように、Ｚ方向の深度が異なると、試料に照射されるレーザ光の減衰率が異なるため、取得される２次元画像上の位置によって輝度に変化が生じることになる。すなわち、Ｚ方向の移動速度を高速にすることで、その移動速度がＸＹ方向の２次元走査に対して無視できない、ある一定以上の速度になると、１フレームの２次元画像のＺ方向の位置の変化が、その２次元画像内での輝度変動を生じさせることになる。
【００５６】
このような、１フレームの２次元画像内で輝度が変化してしまう現象は、ＸＹ方向の２次元走査の開始時と、その終了時とのＺ方向の位置が異なることに起因しているため、２次元走査中に、一定の時間単位での光源２１によるレーザ光の強度調整を行うことにより、輝度変動を抑制することが可能となるのは先に述べた通りである。つまり、２次元走査中も、Ｚ方向の位置は刻々と変化するため、逐次Ｚ方向の位置を計測して、強度調整処理を行うのが理想的であるが、強度調整処理にも一定の時間が必要となるため、頻繁に強度調整処理を行うと調整時間による強度調整の遅れが生じる場合もある。つまり、強度調整処理は、ある程度の時間をおいて、定期的に行うことが現実的である。
【００５７】
したがって、本実施の形態では、Ｘ方向の１ラインの走査が終了する毎に、強度調整処理を行う例を説明した。すなわち、高速のＸ方向の走査と、低速のＹ方向の走査による２次元走査を行う場合、Ｘ方向の走査時間の全てが画像取得時間となるわけではなく、Ｘ走査ミラー５３ａが往復運動をしているため、その折り返し付近の一定時間は、画像を取得していないので、その画像を取得していない時間に、強度調整処理を行っている。このように、画像取得時間以外に強度調整処理を行うことで、調整時間による強度調整処理の遅れを回避することができる。
【００５８】
以上のように、本実施の形態では、Ｘ方向の１ライン単位で、強度調整を行う、つまり、Ｘ方向の１ラインの走査時間の整数倍の時間単位における、その時点でのＺ方向の移動位置に応じて、光源２１から射出されるレーザ光の強度の調整を行うことで、図４Ｃに示すように、Ｙ方向（低速軸側）で生じる輝度の変化を抑制し、輝度を一定にしている。そして、コントラストのよい２次元画像を取得することができるので、結果として、３次元の観察画像を精度良く構築することができる。
【００５９】
なお、Ｚ方向の移動速度が速い場合、１フレーム当たりの走査時間を短縮するために、例えば、ＸＹ方向の２次元走査の領域を小さくするか、あるいは、Ｙ方向の走査回数を減らして粗く走査する（Ｙ方向の走査位置間隔幅を広くする）といったことが一般的に行われているが、先に述べた強度調整処理は、それらの走査を行う場合にも適用可能である。
【００６０】
また、演算処理回路３４は、Ｘ方向の１ラインの走査が終了する毎に、強度調整処理を行うに際して、Ｚ方向の移動位置を、Ｘ方向の１ライン毎にその都度計測してもよいし、例えば、１フレーム分の２次元走査の走査開始時と、走査終了時に、Ｚ方向の移動位置を少なくとも計測して、その走査開始時から走査終了時までの間は、あらかじめ定められた所定の間隔で、Ｚ方向の移動位置を計測するようにしてもよい。また、演算処理回路３４は、Ｚ軸駆動機構５４によるＺ方向の駆動方法に基づいた所定の予測演算によりＺ方向の移動位置を求めるようにしてもよい。これにより、演算処理回路３４によるＺ方向の位置の測定回数を減らすことができる。
【００６１】
さらに、Ｚ方向の移動位置の計測を行わずに、Ｚ軸駆動信号と、Ｚ軸駆動回路３２の挙動をあらかじめ測定しておき、Ｚ軸駆動信号を駆動データとして生成するに際して、Ｘ方向の走査との関連を所定の演算により求めて、その関連が反映された駆動データを、テーブル保持部２８に保持させるようにしてもよい。これにより、Ｚ方向の移動位置の測定を行うことなく、Ｘ方向の走査に関連付けられたＺ方向の移動位置に応じて、光源２１からのレーザ光の強度を調整することが可能となる。
【００６２】
次に、図５のフローチャートを参照して、先に述べた強度調整処理で用いられる出力調整データを求めるための調整データテーブルの演算処理の例について説明する。
【００６３】
ステップＳ３１において、演算処理回路３４は、観察者の入力操作に応じたＹ解像度（Yr）を設定する。なお、Ｘ解像度（Xr）は固定とする。
【００６４】
ステップＳ３２において、演算処理回路３４は、Ｘ方向の走査速度から、Ｘ方向の１ラインの走査時間（Xt）を算出する。
【００６５】
ステップＳ３３において、演算処理回路３４は、Ｘ方向の１ラインの走査時間（Xt）と、Ｙ解像度（Yr）から、１フレーム分の２次元画像を測定するためのフレーム測定時間（Fp）を算出する。Fpは、次の式（１）により算出される。
【００６６】
Fp ＝ Xt ×Yr       ・・・（１）
【００６７】
ステップＳ３４において、演算処理回路３４は、フレーム測定時間（Fp）と、１回の測定をするための測定時間（Mp）から、１回の測定で取得可能なフレーム数（Nf）を算出する。Nfは、次の式（２）により算出される。
【００６８】
Nf ＝ Mp ／ Fp       ・・・（２）
【００６９】
ステップＳ３５において、演算処理回路３４は、フレーム数（Nf）と、Ｙ解像度（Yr）から、１回の測定におけるＺ方向の移動位置のデータ数（Zs）を算出する。このとき、Ｘ方向の走査が１ライン終了する毎に、Ｚ方向の移動位置が更新されるものとすれば、Zsは、次の式（３）により算出される。
【００７０】
Zs ＝ Nf ×Yr       ・・・（３）
【００７１】
ステップＳ３６において、演算処理回路３４は、Ｚ測定範囲（Zr）と、Ｚ方向の移動位置のデータ数（Zs）から求められる１回の測定におけるＺ軸駆動データ列を、テーブル保持部２８に保持された駆動テーブル（Ｚ軸駆動データ部）に格納する。
【００７２】
この駆動テーブルZT［n］の各データは、例えば、次の式（４）により算出される。
【００７３】
T［n］ ＝ Zr ／ Zs × n ＋ Z0       ・・・（４）
【００７４】
ただし、式（４）においては、n＝0 〜 Zs-1である。また、Z0は、Ｚ方向の移動開始位置を示す値である。
【００７５】
ステップＳ３７において、演算処理回路３４は、調整データテーブルTadj（n）を求める。調整データテーブルTadj（n）は、Ｚ方向の移動位置に対する出力調整データを表す関数をZadj（Zn）とすると、次の式（５）により算出される。
【００７６】
Tadj（n）＝Zadj（T［n］）      ・・・（５）
【００７７】
ただし、式（５）においては、n＝0 〜 Zs-1である。
【００７８】
以上のようにして、駆動テーブルと、調整データテーブルが求められる。そして、強度調整処理では、この調整データテーブルを用いて、出力調整データが演算され、光源２１から射出されるレーザ光の強度が調整される。
【００７９】
なお、上記の説明では、強度調整処理として、光源２１から射出されるレーザ光の強度を調整する例について説明したが、本実施の形態においては、光検出器２３により検出される観察光（レーザ光）の検出強度を調整することができればよく、例えば、光検出器２３の感度を変えることで、検出強度を調整してもよい。
【００８０】
図６は、本発明を適用した走査型顕微鏡の一実施の形態の他の構成を示す図である。
【００８１】
図６において、走査型顕微鏡１１は、図１と比べて、出力調整回路３０の代わりに、ゲイン調整回路６１が設けられている点が異なっている。また、テーブル保持部２８には、出力調整データ部の代わりに、ゲイン調整データ部が格納されている。なお、その他の構成については、図１と同様であるため、その説明は適宜省略する。
【００８２】
演算処理回路３４は、Ｚ位置検出回路３５による検出結果を読み出し、Ｚ方向の移動位置の計測を行う。演算処理回路３４は、その計測結果に応じて、調整データテーブルを用いてゲイン調整データを演算し、テーブル保持部２８に格納する。そして、ゲイン調整データは、DAコンバータ２９ａにより読み出された後、D/A変換され、ゲイン調整回路６１に供給される。
【００８３】
ゲイン調整回路６１は、DAコンバータ２９ａから供給されるゲイン調整信号に基づいて、光検出器２３の感度を調整する。
【００８４】
すなわち、ゲイン調整回路６１は、Ｚ方向の位置の深さに対応して、光検出器２３の感度が良くなるようにゲインを調整することで、１フレームの２次元画像において、走査終了時に近づいても走査開始時の画像の輝度と同一の輝度を一定に保つことが可能となる。
【００８５】
以上のように、光検出器２３の感度を調整することで、コントラストのよい２次元画像を取得することができるので、結果として、３次元の観察画像を精度良く構築することができる。
【００８６】
なお、上記の説明では、光源２１によるレーザ光の強度調整（図１）と、光検出器２３の感度の調整（図６）を別々に調整する例を示したが、強度調整処理においては、光源２１によるレーザ光の強度と、光検出器２３の感度の調整を一方に限らず、それらの両方を同時に調整するようにしてもよい。また、光学的なフィルタを、例えば光源２１付近の光路上に配置して、そのフィルタを駆動することにより、レーザ光の強度を調整するようにしてもよい。
【００８７】
ところで、Ｚ方向の移動を可能な限り高速で移動させるために、Ｚ方向の移動速度を周期的に変えて、Ｚ方向を非線形な速度で駆動させる場合がある。図７には、Ｚ方向の移動位置（Ｚ位置）の変化が時系列で表されている。図７においては、曲線C(t)の軌跡で示されるように、Ｚ方向の移動位置が、時間の経過とともにサイン状に変化しており、非線形にＺ方向の移動速度を変化させることで、Ｚ方向の移動を高速に行っている。
【００８８】
しかし、このようなＺ方向の駆動を行った場合、Ｚ方向の移動速度が非線形であるために、ＸＹ方向の２次元走査を行って得られる２次元画像が歪んでしまうという問題が出てくる。これは、Ｚ方向の駆動を、ＸＹ方向の２次元走査をしている間も停止させることなく、かつ、非線形に行う場合、Ｘ方向に走査している間も、Ｚ方向の移動位置が非線形に変化していることに起因する。また、本実施の形態のように、Ｘ方向の１ラインの走査毎に、Ｙ方向の走査位置を１ライン分ずつずらしながら２次元走査を行う場合、Ｙ方向の走査速度は、Ｘ方向の走査速度と比べて遅くなるため、Ｚ方向に高速で移動している場合におけるＹ方向の影響は、Ｘ方向に比べて著しく大きなものとなる。
【００８９】
仮に、Ｘ方向の走査中のＺ方向の移動量が無視できる程度の量であったとしても、Ｙ方向の走査の行われる位置は、Ｚ方向の移動位置の時間に対する非線形性が直接反映されるため、ＸＹ平面への投影像でみると、Ｙ方向には歪んだ画像となる。
【００９０】
図８は、図７における曲線C(t)上の点線の円で囲まれた部分を拡大した図であって、その拡大された曲線C(t)は、１フレーム分の走査時間Ftにおける、Ｚ方向の移動位置の変化を示している。つまり、図８の曲線C(t)は、１フレーム分の２次元画像の取得を開始してから、終了するまでのＺ方向の移動位置の変化を表している。
【００９１】
図８において、図中上から下に向かう方向の第１の軸は、時間軸を表しており、１フレーム分のＺ方向の移動時間は、１フレーム分のＹ方向の走査時間と一致している。したがって、１フレーム分のＹ方向の走査時間を、１フレーム当たりのＹ方向の走査回数で除算することで、第１の軸上に沿って記述された同じ間隔の矢印で示される、Ｙ方向の走査ライン時間単位が求められる。
【００９２】
また、図８において、図中左から右に向かう方向の第２の軸は、Ｘ方向の１ライン当たりのＹ方向の走査位置間隔（Ｙ走査位置間隔（Ｙ方向の走査ピッチ））を表している。すなわち、Ｚ方向の位置を時間的な対応によりＹ走査位置間隔に変換して、Ｚ方向の位置をＹ走査位置間隔に置き換えると、第２の軸上に沿って記述された異なる間隔の矢印で示される、Ｙ走査位置間隔が求められる。
【００９３】
すなわち、Ｙ走査ライン時間単位の間隔は一定となるため、非線形の曲線C(t)から、Ｙ走査ライン時間単位に応じたＹ走査位置間隔が求められる。このように、Ｙ走査位置間隔は、非線形の曲線C(t)に応じて決定されるものであって、時間に対して非線形に変化する。図８の例では、曲線C(t)、つまり、Ｚ方向の移動速度の非線形性に応じて、Ｙ走査位置間隔が、時間の経過とともに徐々に狭められ（矢印の長さが短くなり）、１フレーム分の走査開始時に比べて、走査終了時に近づくほど、そのＹ走査位置間隔が狭められることになる。
【００９４】
なお、図中の黒丸は、Ｙ方向をＹ走査位置間隔で走査したときのＺ方向の位置を示しており、この場合の第１の軸は、Ｚ方向の駆動電圧を意味している。すなわち、図８の例では、Ｚ方向の位置が、図中の黒丸の位置で線形に移動していると仮定したときに、それに合うようなＹ走査位置間隔を求めていると言える。
【００９５】
そして、Ｚ方向の移動速度の非線形性に応じて、非線形に変化させられるＹ走査位置間隔に対応するＹ軸駆動データを用いて、Ｙ走査機構５２によって、Ｙ走査ミラー５２ａが制御されると、２次元的にはＹ走査ミラー５２ａは等間隔に回転されないことになるが、３次元的には、線形なＸ方向の走査、非線形なＹ方向の走査、及び非線形なＺ方向の移動とが合成されて、試料１２に対して走査されるレーザ光（走査線）が、等間隔に走査されることになる。
【００９６】
このように、Ｚ方向の移動速度が時間に対して非線形に変化する場合、Ｚ方向の移動速度の非線形性に応じて、２次元走査におけるＹ方向の走査（Ｙ走査位置間隔）を非線形に変化させることで、ＹＺの両軸に対して時間に対する位置を線形にすることができる。
【００９７】
次に、このような、Ｙ方向の走査位置間隔調整が行われる３次元走査について、図９のフローチャートを参照して説明する。
【００９８】
３次元走査が開始されると、ＸＹ方向の２次元走査が開始されるが、それと同時に、非線形なＺ方向の移動が開始される。ステップＳ５１乃至Ｓ５５においては、図２のステップＳ１１乃至Ｓ１５と同様に、Ｘ方向の１ラインの走査が終了する毎に、Ｙ方向の走査位置を１ラインずつずらしながら２次元走査が行われ、１フレーム分の２次元走査が終了したか否かが判定される（ステップＳ５５）。
【００９９】
ステップＳ５５において、１フレーム分の２次元走査が終了していないと判定された場合、処理は、ステップＳ５６に進む。
【０１００】
ステップＳ５６において、演算処理回路３４は、Ｚ位置検出回路３５による検出結果を読み出し、Ｚ軸駆動機構５４によるＺ方向の移動位置の計測を行う。演算処理回路３４は、その計測結果に基づいて、２次元走査におけるＹ方向の走査位置間隔を、Ｚ方向の移動速度の非線形性に応じて非線形に変化させるＹ軸駆動データを演算し、テーブル保持部２８（Ｙ軸駆動データ部）に格納する。そして、Ｙ軸駆動データは、DAコンバータ２９ｂにより読み出された後、D/A変換され、Ｙ軸駆動回路３１に供給される。
【０１０１】
ステップＳ５７において、Ｙ軸駆動回路３１は、DAコンバータ２９ｂから供給されるＹ軸駆動信号に基づいて、Ｙ走査ミラー５２ａを回転させて、Ｙ方向の走査位置を１ライン分ずらす。そして、再びＸ方向の１ラインの走査が終了するまで、Ｘ方向の走査が行われ、１ラインの走査が終了した場合には、Ｚ方向の移動速度の非線形性に応じたＹ走査位置間隔が求められ、Ｙ方向の走査位置が１ライン分ずらされる。
【０１０２】
このように、Ｘ方向の１ラインの走査が終了する毎に、Ｙ走査位置間隔を、Ｚ方向の移動速度の非線形性に応じて変化させながら、Ｙ方向の走査位置を１ラインずつずらすことで、２次元走査が行われ、１フレーム分の２次元走査が終了することとなる（ステップＳ５５の「Yes」）。
【０１０３】
ステップＳ５８，Ｓ５９においては、図２のステップＳ１８乃至Ｓ１９と同様に、Ｚ測定範囲内の移動が終了したと判定されるまで、非線形にＺ方向に移動しながら、ＸＹ方向の２次元走査が行われ、複数の２次元画像が順次取得され、順次取得される複数の２次元画像から、３次元の観察画像が構築される。
【０１０４】
以上のように、本実施の形態では、Ｚ方向を非線形な速度で駆動させる場合、Ｚ方向の非線形性に合わせて、Ｙ方向にも非線形に駆動させることで、ＹＺの両軸に対して時間に対する位置が線形になるようにしている。これにより、Ｚ方向を非線形に駆動して、高速に移動させる場合であっても、２次元画像が歪んでしまうのを抑制できるため、順次取得される複数の２次元画像から構築される３次元画像が、湾曲してしまうのを防止することができる。
【０１０５】
因みに、Ｚ方向を非線形な速度で駆動させる場合において、Ｚ方向の位置が線形になるように、Ｙ方向の走査位置間隔を変化させることも考えられるが、そのようにした場合には、Ｙ方向の位置が非線形に変化することになってしまう。そのため、本実施の形態では、Ｚ方向の非線形性に合わせて、Ｙ方向にも非線形に駆動させることで、ＹＺの両軸に対して時間に対する位置が線形になるようにしているのである。
【０１０６】
なお、上記の説明では、Ｘ方向の走査にレゾナントスキャナ、Ｙ方向の走査にガルバノスキャナ、Ｚ方向の移動にピエゾ素子を用いたＺ軸駆動機構が用いられる例を説明したが、ＸＹ方向の走査に他のスキャナを用いてもよいし、Ｚ方向の駆動に他の機構を用いてもよい。
【０１０７】
また、上記の説明では、Ｚ軸駆動機構５４は、対物レンズ５４ａを光軸に沿って移動させることで、Ｚ方向における対物レンズ５４ａと試料１２との相対距離を変える例を説明したが、対物レンズ５４ａの代わりに、試料１２が載置されたステージ３６を光軸に沿って移動させることで、対物レンズ５４ａと試料１２との相対距離を変えるようにしてもよい。さらに、対物レンズ５４ａとステージ３６の両方を光軸に沿って移動させてもよい。
【０１０８】
なお、本明細書において、フローチャートに記述されたステップは、記載された順序に沿って時系列的に行われる処理はもちろん、必ずしも時系列的に処理されなくとも、並列的あるいは個別に実行される処理をも含むものである。
【０１０９】
また、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【０１１０】
１１  走査型顕微鏡，  ２１  光源，  ２２  走査光学系，  ２３  光検出器，  ２４  サンプリング回路，  ２５  画像化回路，  ２６  基準クロック発生器，  ２７  タイミング制御回路，  ２８  テーブル保持部，  ２９ａ，２９ｂ，２９ｃ  DAコンバータ，  ３０  出力調整回路，  ３１  Ｙ軸駆動回路，  ３２  Ｚ軸駆動回路，  ３３  Ｘ軸駆動回路，  ３４  演算処理回路，  ３５  Ｚ位置検出回路，  ３６  ステージ，  ５１  光路分割部材，  ５２  Ｙ走査機構，  ５２ａ  Ｙ走査ミラー，  ５３  Ｘ走査機構，  ５３ａ  Ｘ走査ミラー，  ５４  Ｚ軸駆動機構，  ５４ａ  対物レンズ，  ６１  ゲイン調整回路
【図１】
2012073551.tif 000003
【図２】
2012073551.tif 000004
【図３】
2012073551.tif 000005
【図４】
2012073551.tif 000006
【図５】
2012073551.tif 000007
【図６】
2012073551.tif 000008
【図７】
2012073551.tif 000009
【図８】
2012073551.tif 000010
【図９】
2012073551.tif 000011