(57)【要約】【課題】簡便で正確なアレルギー疾患の早期診断法を提供する。特に、ブナシメジによるアレルギー症状の発症を早期に診断可能にすることを目的とする。【解決手段】本発明は、セリン−グリシン−ロイシン−プロリン−バリンのアミノ酸配列を少なくとも有するペプチドから選ばれた少なくとも１種類のペプチドを搭載したアレルギー診断用キットに関する。また、ペプチドは、セリン−グリシン−ロイシン−プロリン−バリンのアミノ酸配列を繰返し含む配列を有することが好ましい。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セリン−グリシン−ロイシン−プロリン−バリンのアミノ酸配列を少なくとも有するペプチドを固相担体に搭載したアレルギー診断用キット。
【請求項２】
ペプチドがセリン−グリシン−ロイシン−プロリン−バリンのアミノ酸配列を繰返し含む配列を有することを特徴とする請求項１記載のキット。
【請求項３】
ペプチドが１５〜３０のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１ないし２記載のキット。
【請求項４】
分子全体として電気的に中性な水溶性ポリマーからなる非特異的吸着防止剤を塗布した担体上に、１分子中に少なくとも光反応性基とアミノ基と室温反応性の官能基を有する固定化剤でペプチドを搭載したことを特徴とする請求項１ないし３記載のキット。
【請求項５】
非特異的吸着防止剤が、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有する光架橋剤と、分子全体として電気的に中性な水溶性ポリマーからなることを特徴とする請求項１ないし４記載のキット。
【請求項６】
光反応性基がアジド基或いはジアジリン基である請求項１ないし５記載のキット。
【請求項７】
アミノ基と室温反応性の官能基がエポキシ基或いはサクシンイミドエステルである請求項１ないし６のいずれか1項に記載のキット。
【請求項８】
水溶性ポリマーが、ノニオン性ポリマーである請求項１ないし７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９】
ノニオン性ポリマーが、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレートのビニル重合体である請求項８記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はブナシメジアレルギーの診断に有用なペプチドを搭載したアレルギー診断用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーは増加の一途をたどり社会問題化しており、Ｉ型アレルギー疾患の診断法としては、現在では、患者血清中にアレルゲン特異的なＩｇＥ抗体が存在するかどうかによって診断を行うＣＡＰ−ＲＡＳＴ法（放射性アレルゲン吸着試験法）が使用されている。しかしながら、ＣＡＰ−ＲＡＳＴ法で診断可能なアレルゲンには制限があり、アレルゲンをきのことする「きのこアレルギー」には好適ではない。また、Ｉ型以外のIII型及びIV型アレルギーの因子を適切に診断可能なインビトロの検査法がない。このため、III型アレルギーには沈降抗体、IV型アレルギーにはマクロファージ遊走阻止やリンパ球幼若化反応などの手法が用いられているが、これらは診断精度に問題があり、精密診断に使用することができない。
【０００３】
また、ＣＡＰ−ＲＡＳＴ法や沈降抗体法などは、抗原としてアレルゲンタンパク質分子そのものを利用しているが、アレルゲンタンパク質分子上のアレルギー症状発症に関与するエピトープ部分を特定し、その部分のみを切り出して、例えば抗原とすることで、アレルギー診断の精度を向上し、精密診断が可能になると考えられる。
【０００４】
以上のようなアレルギー症状の診断に関し、きのこアレルギーについての診断例が、いくつか報告されている(非特許文献１及び２)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】竹内崇博、笹林万理、津島健司、漆畑一寿、花岡正幸・信州医学雑誌53(2)：73〜75，2005  えのき栽培従事者に発症した培地が原因と考えられた過敏性肺臓炎の1例
【非特許文献２】田中裕士、田中宣之・日本内科学会雑誌98(12)：108〜114，2009  喘息の亜型・特殊型  職業性喘息
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これらの報告は、リンパ球刺激試験や沈降抗体検査などによる診断結果を示すものであり、アレルギー患者の精密診断に関するものではない。即ち、簡便な方法で高感度の診断を可能にするものではない。また、アレルギー症状の発症を早期に確認できるような、エピトープの特定についても何ら記載されていない。
【０００７】
上記現状に鑑み、本発明者らは簡便で精度の高い診断法の開発を行った。すなわち本発明は、簡便で精密診断可能なアレルギー疾患の診断法を提供することを目的とする。このため本発明は、きのこアレルギーとして、特にブナシメジによるアレルギー症状の発症を早期に診断可能にすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、問診及び各種症状などにより陽性と診断された患者血清（陽性血清）と、標準血清（陰性血清）とを用いて、まず、スクリーニング試験として、ウェスタンブロッド法によるアレルゲン解析及びアレルゲンたんぱく質の構造解析を行った。そして、この解析によりエピトープと考えられるブナシメジのアミノ酸配列を推定し、このエピトープと推定したアミノ酸配列を含むペプチドと、患者血清（陽性及び陰性）との反応性を研究した結果、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は以下の発明を包含する。[１]セリン−グリシン−ロイシン−プロリン−バリンのアミノ酸配列を少なくとも有するペプチドを固相担体に搭載したアレルギー診断用キット。[２]ペプチドがセリン−グリシン−ロイシン−プロリン−バリンのアミノ酸配列を繰返し含む配列を有することを特徴とする診断用キット。[３]ペプチドが１５〜３０のアミノ酸配列からなることを特徴とする診断用キット。[４]分子全体として電気的に中性な水溶性ポリマーからなる非特異的吸着防止剤を塗布した担体上に、１分子中に少なくとも光反応性基とアミノ基と室温反応性の官能基を有する固定化剤でペプチドを搭載したことを特徴とする診断用キット。[５]非特異的吸着防止剤が、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有する光架橋剤と、分子全体として電気的に中性な水溶性ポリマーからなることを特徴とする診断用キット。[６]光反応性基がアジド基或いはジアジリン基である診断用キット。[７]アミノ基と室温反応性の官能基がエポキシ基或いはサクシンイミドエステルである診断用キット。[８]水溶性ポリマーが、ノニオン性ポリマーである診断用キット。[９]ノニオン性ポリマーが、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレートのビニル重合体である診断用キット。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ブナシメジのアミノ酸配列。
【図２】実施例における６種類の固定化ペプチド。
【図３】ペプチド♯１〜４による標準血清に対する陽性血清のＩｇＥ測定結果
【図４】ペプチド♯４〜６による標準血清に対する陽性血清のＩｇＥ測定結果
【図５】ペプチド♯４によるブナシメジ工場従業員血清のＩｇＥ測定結果
【図６】ペプチド♯１〜４による標準血清に対する陽性血清のＩｇＧ測定結果
【図７】ペプチド♯４による標準血清に対する陽性血清のＩｇＧ測定結果と標準誤差
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の診断用キットに搭載されるセリン−グリシン−ロイシン−プロリン−バリンの配列を少なくとも有するペプチドは、上記配列で表されるアミノ酸配列を少なくとも部分配列として含んでいる限り、そのアミノ酸残基数は特に限定されない。典型的にはアミノ酸残基数１５〜３０のペプチドであり、より典型的にはアミノ酸残基数１５〜２５のペプチドである。
【００１２】
本明細書において、セリン−グリシン−ロイシン−プロリン−バリンの配列を少なくとも有するペプチドを、単に「エピトープペプチド」と称する場合がある。
【００１３】
「セリン−グリシン−ロイシン−プロリン−バリンのアミノ酸配列（ここでは、ＳＧＬＰＶと表す。）を繰返し含む配列」とは、ＳＧＬＰＶを１構成単位とした場合に、これを複数単位含む配列のことをいい、例えば、２単位含む場合はＳＧＬＰＶＳＧＬＰＶを含み、３単位含む場合はＳＧＬＰＶＳＧＬＰＶＳＧＬＰＶを含む配列となる。エピトープペプチドは、ＳＧＬＰＶを３単位以上含むことが好ましく、この場合ＩｇＥ測定及びＩｇＧ測定のいずれにも好適なものとなりやすい。
【００１４】
上記したエピトープペプチドは、被験者の体液(例えば血清)中の、ブナシメジアレルギーを発症する患者のみに存在する抗ブナシメジ抗体を認識し、結合する機能を有する。従って、これらのエピトープペプチドを搭載した本発明の診断用キットはブナシメジアレルギーの早期診断薬として利用できる。
【００１５】
本発明の診断用キットによれば、エピトープペプチドを被験試料と接触させ、被験試料に存在する抗体を検出、定量することによってブナシメジアレルギーの診断を行うことができる。
【００１６】
エピトープペプチドは、公知のペプチド合成方法、例えば全自動ペプチド合成装置を用いた方法により製造することができる。
【００１７】
エピトープペプチドは、必要に応じて塩の形態、好ましくは生理学的に許容される酸付加塩の形態であってもよい。そのような塩としては、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）の塩、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）の塩等が挙げられる。
【００１８】
被験試料としては、ブナシメジに対する抗体が検出可能なものであればいかなるものでもよいが、例えば、被験者から単離された血液、血漿、血清、滑膜液、リンパ液、関節液、腹水、唾液、髄液、およびこれらから得られた分画成分などが挙げられる。
【００１９】
本発明において「診断」とは、被験者がブナシメジアレルギーに羅患しているか否かの判定、将来的にブナシメジアレルギーに羅患する危険性が存在するか否かの判定、治療の効果の判定、および治療後にブナシメジアレルギーを再発する危険性が存在するか否かの判定を意味する。また、診断には、ブナシメジアレルギーの羅患やその危険性がどの程度であるか測定することも含まれる。
【００２０】
本発明の診断用キットとしては、ブナシメジアレルギーを診断する方法に用いられるものであり、エピトープペプチドと被験試料中の抗体との抗原抗体反応に基づく物理量の変化を検出することができる方法に用いられる診断用キットであればその形態は特に限定されない。例えば、標識免疫測定試薬で行われているように標識物質を利用して発色、発光、蛍光として上記抗原抗体反応を検出する方法、免疫学的凝集試薬で行われているように不溶性担体の凝集として目視や濁度により上記抗原抗体反応を検出する方法などのイムノアッセイに用いられる診断用キットが採用できる。
【００２１】
イムノアッセイの具体例としては、酵素免疫測定法（Enzyme-linked immunosorbent assay:ELISA)、放射免疫測定法(radioimmunoassay:RIA)、蛍光免疫測定法（FIA)、化学発光免疫測定法（CLIA)、ゲル内沈降反応（Ouchterlony法、免疫電気泳動法、single radial
immunodiffusion法など）、免疫比濁法、粒子凝集反応法等が挙げられる。
【００２２】
上記の方法の中において、診断用キットの形態としては、エピトープペプチドを固相担体に固定化したものを採用できる。このとき、使用できる固相担体とは、上記抗原抗体反応の反応系で溶媒に不溶な担体であれば、その材質及び形状は特に制限されず、公知の固相担体が使用できる。固相担体の形状としては、使用目的に応じて適宜の形状を選択すれば良く、例えば、テストプレート状、ビーズ状、球状、ディスク状、チューブ状、フィルター状等が挙げられる。また、その材質としては、通常の免疫測定法用担体として用いられるもの、例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド等の合成樹脂、または、これらに公知の方法によりスルホン酸基、アミノ基などの反応性官能基を導入したもの、ガラス、多糖類、シリカゲル、多孔性セラミックス、金属酸化物、赤血球等が例示できる。
【００２３】
固相担体へのエピトープペプチドの固定化方法は、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法などの公知の方法が使用できるが、操作の容易さ、再現性、感度等の観点から共有結合法を用いるのが好ましい。
【００２４】
イムノアッセイに用いる標識物質としては、蛍光物質、発光物質、色素、酵素、補酵素、あるいはラジオアイソトープ等が挙げられる。なかでも、アルカリホスファターゼやパーオキシダーゼのような酵素標識は、安全性や経済性に優れ、しかも必要な感度を比較的容易に達成できる上で好ましい。標識物質は、エピトープペプチドや該エピトープペプチドに結合する抗体に対する二次抗体に直接結合して標識することができる。あるいは標識物質を認識する抗体やアビジン−ビオチン系などを利用して間接標識することもできる。
【００２５】
本発明の診断用キットは、必要な試薬とともにキット化することもできる。ＥＬＩＳＡ用の試薬キットの場合は、構成試薬としては、例えば、本発明のエピトープペプチド、酵素標識した二次抗体、基質液などを含有する。エピトープペプチドは予め固相に固定化されていてもよく、あるいは使用時に固相に固定化する形態であってもよい。この場合、試薬キットに、エピトープペプチドを固定化するための固相が含まれていてもよい。また、凝集反応用の試薬キットの場合は、エピトープペプチドを固定化した担体粒子を含有する。
【００２６】
上記の構成試薬の他に、標準試料、緩衝液、溶解液、洗浄液、反応停止液、使用説明書などが含まれていてもよい。上記各構成試薬は、懸濁液、溶液、または凍結乾燥品の形態とすることができる。
【００２７】
また、エピトープペプチドは、これらの複数種を高密度に貼り付けたプロテインチップ（プロテインアレイ）として用いられるのが最も好ましく、このようなプロテインチップも本発明の診断用キットに含まれる。この場合、キットには、質量分析計、測定・解析に必要なソフト、該ソフトを導入したコンピューターなどが含まれていてよい。
【００２８】
好ましいプロテインチップの製造法としては、特開2010−101661号公報記載のように、分子全体として電気的に中性な水溶性ポリマーからなる非特異的吸着防止剤を塗布した担体上に、１分子中に少なくとも光反応性基とアミノ基と室温反応性の官能基を有する固定化剤でエピトープペプチドを固定化する方法である。
【００２９】
非特異的吸着防止剤として使用可能な水溶性ポリマーとしては、ホスホリルコリン含有ポリマーなどの両極性ポリマー及びノニオン性ポリマーがある。ノニオン性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール(PEG)やポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール；ビニルアルコール、メチルビニルエーテル、ビニルピロリドン、ビニルオキサゾリドン、ビニルメチルオキサゾリドン、2-ビニルピリジン、4-ビニルピリジン、N-ビニルサクシンイミド、N-ビニルホルムアミド、N-ビニル-N-メチルホルムアミド、N-ビニルアセトアミド、N-ビニル-N-メチルアセトアミド、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、ポリエチレングリコールアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、N,N-ジメチルアクリルアミド、N-iso-プロピルアクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド、メチロールアクリルアミド、アクリロイルモルホリン、アクリロイルピロリジン、アクリロイルピペリジン、スチレン、クロロメチルスチレン、ブロモメチルスチレン、酢酸ビニル、メチルメタクリレート、ブチルアクリレート、メチルシアノアクリレート、エチルシアノアクリレート、n-プロピルシアノアクリレート、iso-プロピルシアノアクリレート、n-ブチルシアノアクリレート、iso-ブチルシアノアクリレート、tert-ブチルシアノアクリレート、グリシジルメタクリレート、エチルビニルエーテル、n-プロピルビニルエーテル、iso-プロピルビニルエーテル、n-ブチルビニルエーテル、iso-ブチルビニルエーテル、tert-ブチルビニルエーテルなどのモノマー単位の単独または混合物を構成成分とするノニオン性のビニル系高分子；ゼラチン、カゼイン、コラーゲン、アラビアガム、キサンタンガム、トラガントガム、グアーガム、プルラン、ペクチン、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、キトサン、キチン誘導体、カラギーナン、澱粉類（カルボキシメチルデンプン、アルデヒドデンプン）、デキストリン、サイクロデキストリン等の天然高分子、メチルセルロース、ビスコース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースのような水溶性セルロース誘導体等の天然高分子を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、これらのポリマーをベースにした光架橋型水溶性ポリマーの市販品、例えばポリビニルアルコールをベースにした東洋合成工業社製「ＡＷＰ」などを使用することも可能である。これらのうち、特に好ましいものは、ポリエチレングリコール系ポリマーであり、更にはポリエチレングリコールモノ(メタ)アクリレートのビニル重合体である。
【００３０】
本発明に使用される水溶性ポリマーは、分子全体として電気的に中性な水溶性ポリマーである。ここで、「分子全体として電気的に中性」とは、中性付近のpH（pH6〜8)の水溶液中で電離してイオンになる基を有さないか、又は有していても陽イオンになるものと陰イオンになるものを有していて、その電荷の合計が実質的に０になることを意味する。ここで「実質的に」とは、電荷の合計が０になるか、又は０にはならないとしても本発明の効果に悪影響を与えない程度に小さいことを意味する。
【００３１】
本発明に用いられる水溶性ポリマーの水に対する溶解度（水１００ｇに溶解するグラム数）は、好ましくは５以上である。
【００３２】
「ノニオン性」とは、中性付近のpH（pH6〜8)の水溶液中で電離してイオンになる基を実質的に有さないことを意味する。ここで「実質的に」とは、このような基を全く含まないか、又は含んでいるとしても本発明の効果に悪影響を与えない程度に微量（例えば、このような基の数が炭素数の１％以下）であることを意味する。
【００３３】
ノニオン性水溶性ポリマーの分子量（平均分子量、以下同じ）は、特に限定されず、通常、１０００〜５０００万程度であるが、ノニオン性水溶性ポリマーの分子量が大きくなり過ぎると、水溶性に限界が生じてくる。また、分子量が小さいと効率よく固定化が行えなくなるので、1万〜５０００万程度が好ましい。水溶性ポリマーの使用時の濃度は、特に限定されない。
【００３４】
非特異的吸着防止剤として使用する際は、上記水溶性ポリマーに光反応性基を導入しても良いが、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有する光架橋剤を、分子全体として電気的に中性な水溶性ポリマーに添加して使用することが簡便で望ましい。
【００３５】
１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有する光架橋剤の添加量としては、特に制限はないが、好ましくは水溶性ポリマーに対して０．１〜５０重量％とするのが好ましく、より好ましくは１〜３０重量％、更に好ましくは１〜２０重量％である。
【００３６】
光架橋剤が有する光反応性基の好ましい例として、アジド基(-N3)を挙げることができるがこれに限定されるものではない。光架橋剤としては、アジド基を２個有するジアジド化合物が好ましく、特に水溶性ジアジド化合物が好ましい。本発明に用いられる光架橋剤の好ましい例として、下記一般式[I]、［II］で表されるジアジド化合物を挙げることができる。
【００３７】
【化１】
2012073114.tif 000003
【００３８】
一般式[I]中、Ｒは単結合又は任意の基を示す。-R-は、２個のフェニルアジド基を連結するだけの構造であるから、ジアジド化合物が必要な水溶性（後述）を有することになるものであれば特に限定されない。好ましい-R-の例として、単結合（すなわち、２個のフェニルアジド基が直接連結される）、炭素数１〜６のアルキレン基（１個又は２個の炭素間不飽和結合を含んでいてもよく、１個又は２個の炭素原子が酸素と二重結合してカルボニル基を構成していてもよい。特に好ましくはメチレン基である。）、-O-、-SO2-、-S-S-、-S-、-R2・・・Y・・・R3-（ただし、・・・は単結合又は二重結合を示し、Ｙは炭素数３〜８のシクロアルキレン基、R2及びR3は互いに独立に炭素数１〜６のアルキレン基（１個又は２個の炭素間不飽和結合を含んでいてもよく、該アルキレン基の基端の炭素原子とＹとの結合が二重結合であってもよく、１個又は２個の炭素原子が酸素と二重結合してカルボニル基を構成していてもよい）を示し、シクロアルキレン基は、１個又は２個以上の任意の置換基で置換されていてもよく（置換されている場合、好ましくはシクロアルキレン基を構成する炭素原子のうち、１個若しくは２個が酸素と二重結合してカルボニル基を構成し、及び／若しくは１個若しくは２個の炭素数１〜６のアルキル基で置換されている）を挙げることができる。また、一般式[I]中のそれぞれのベンゼン環は、１個又は２個以上の任意の置換基（好ましくはハロゲン、炭素数１〜４のアルコキシル基、スルホン酸若しくはその塩等の親水性基）で置換されていてもよい。好ましい-R-の具体例として次のものを例示することができる。−、-CH2-、-O-、-SO2-、-S-S-、-S-、-CH=CH-、-CH=CH-CO-、-CH=CH-CO-CH=CH-、-CH=CH-、化２に示される置換基。
【００３９】
【化２】
2012073114.tif 000004
【００４０】
【化３】
2012073114.tif 000005
【００４１】
上記式[II]中のｎは１〜１０００、好ましくは１〜５００である。分子量が大きくなりすぎると光架橋効率が悪くなる。
【００４２】
本発明に用いられる光架橋剤の内、特に好ましいのは水溶性のものである。光架橋剤についての「水溶性」とは、０．５mM以上、好ましくは２mM以上の濃度の水溶液を与えることができることを意味する。光架橋剤の使用時の濃度は、特に限定されない。
【００４３】
尚、本発明に係る非特異的吸着防止剤は、その使用に際し、水、燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝溶液等、適宜の溶媒を含んで使用される。担体への塗布を容易にするためである。このとき水溶性ポリマーの濃度は、特に限定されるものではないが、溶液（懸濁液）全体に対し０．００５重量％〜２０重量％とするのが好ましく、０．０４重量％〜１０重量％とするのがより好ましい。この場合の光架橋剤の濃度は上記のように、水溶性ポリマーに対して０．１〜５０重量％とするのが好ましく、より好ましくは１〜３０重量％、更に好ましくは１〜２０重量％である。
【００４４】
また、本発明に係る固定化剤は、ポリオキシモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））等の界面活性剤を含んでもよい。特に、緩衝溶液及び界面活性剤の両方を含むことにより、相乗効果として、バックグラウンド値を小さくする効果が得られ、これは特に血清などを使用して検出する際に有用である。この界面活性剤の添加量としては、溶液（懸濁液）全体に対し０．１〜２０％が好ましい範囲である。更に、有機溶媒を含んでいてもよい。この有機溶媒としては、水と任意の割合で混じり合う低級アルコール（好ましくはエタノール）などを用いることができる。
【００４５】
被固定化物質とともに使用される１分子中に光反応性基とアミノ基と室温反応性の基を有する固定化剤としては次のものが好ましい。すなわち、光反応性基としてはアジド基、ジアジリン基が好ましく、室温反応性基としては、エポキシ基、サクシンイミドエステルのような活性エステルが好ましい。具体的には、N-[4-[3-(トリフルオロメチル)-3H-ジアジリン-3-yl]フェニル]オキシラン、N-[4-[3-(トリフルオロメチル)-3H-ジアジリン-3-yl]ベンゾキシル]サクシンイミド、5-アジド-2-ニトロベンゾイックアシッドN-ヒドロキシサクシンイミドエステルなどが好ましく用いられる。
【００４６】
被固定化物質と混合して用いられる場合、１分子中に光反応性基とアミノ基と室温反応性の基を有する固定化剤の添加量としては特に制限はないが、被固定化物質に対して０．００１重量％〜１００重量％が好ましく、特に０．０１重量％〜１０重量％が好ましい。１分子中に光反応性基とアミノ基と室温反応性の基を有する固定化剤の使用時の濃度は、特に制限されない。
【００４７】
本発明にかかる１分子中に光反応性基とアミノ基と室温反応性の基を有する固定化剤は、溶媒を含んで適用される。溶媒としては、水、水と任意の割合で混じり合う低級アルコール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びこれらの混合物を用いることができる。
【００４８】
本発明の非特異的吸着防止剤に含まれる光架橋剤、水溶性ポリマー、及び１分子中に光反応性基とアミノ基と室温反応性の基を有する固定化剤は、それ自体公知であり、公知の製造方法により製造可能であり、また、市販されているものもある。
【００４９】
本発明の光反応性基として用いられるアジド基或いはジアジリン基は、光を照射することにより窒素分子が離脱すると共に窒素ラジカル或いは炭素ラジカルが生じ、この窒素ラジカル或いは炭素ラジカルは、アミノ基やカルボキシル基等の官能基のみならず、有機化合物を構成する炭素原子とも結合することが可能であるので、ほとんどの有機物と架橋することが可能である。すなわち、非特異的吸着防止剤に含まれる光架橋剤は、担体及び非特異的吸着防止剤の水溶性ポリマーを効果的に架橋し、本発明にかかる固定化剤は効果的に非特異的吸着防止剤と架橋する。
【００５０】
一方、１分子中に光反応性基とアミノ基と室温反応性の基を有する固定化剤中のエポキシ基或いは活性エステルは、被固定化物質のアミノ基と選択的に反応し、担体上に被固定化物質の配向固定化を可能にする。
【００５１】
本発明により、担体上に所望の物質を固定化することは、次のようにして行うことができる。先ず、担体上に非特異的吸着防止剤をコーティングし、その上に固定化すべき物質と１分子中に光反応性基とアミノ基と室温反応性の基を有する固定化剤の混合物をスポッティングし、次いで室温反応後、担体の全面に光照射してもよいし、非特異的吸着防止剤上に１分子中に光反応性基とアミノ基と室温反応性の基を有する固定化剤をまずスポットし、光照射後、固定化すべき物質をその上にスポットし、その後室温反応をしてもよい。
【００５２】
非特異的吸着防止剤の膜厚に特に制限はないが、通常０．０１〜１０μm、好ましくは０．０５〜１μmである。被固定化物質の濃度についても特に制限はないが、通常０．０１〜１０％、好ましくは０．０５〜１％である。
【００５３】
照射する光は、用いる光反応性基がラジカルを生じさせることができる光であればよく、光反応性基としてアジド基或いはジアジリン基を用いる場合には、３００〜４００nmの紫外線が好ましい。照射する光線の線量は、特に限定されないが、通常、１cm2当たり１ｍW〜１００mW程度である。
【００５４】
非特異的吸着防止剤に光を照射することにより、光反応性基がラジカルを生じ、担体と水溶性ポリマーが共有結合する。その上に、固定化すべき物質と１分子中に光反応性基とアミノ基と室温反応性の基を有する固定化剤の混合物をスポットし、室温反応する事で１分子中に光反応性基とアミノ基と室温反応性の基を有する固定化剤と、固定化すべき物質が共有結合し、次いで光を照射することにより、１分子中に光反応性基とアミノ基と室温反応性の基を有する固定化剤の光反応性基がラジカルを生じ、水溶性ポリマーと共有結合する。その結果、担体上に固定化すべき物質が配向固定されることになる。また、１分子中に光反応性基とアミノ基と室温反応性の基を有する固定化剤を、まず非特異的吸着防止剤上にスポットし光照射後、固定化すべき物質をその上にスポットして室温反応させてもよい。特に、この２段スポット法は、固定化すべき物質の溶液に緩衝溶液などを含む場合に有効である。通常の１段スポット法では、緩衝溶液などを含む場合は感度が低くなるが、この２段スポット法では感度低下がない。なお、本発明の方法では、固定化すべき物質は、１分子中に光反応性基とアミノ基と室温反応性の基を有する固定化剤の室温反応性基と結合するため、配向固定されることになる。そのため、固定化すべき物質を、従来の光反応性基によるラジカルで固定化する特定の部位と結合しないランダム固定化方法と比較して、高感度化が可能になる。
【実施例】
【００５５】
水溶性ポリマーの調製
ポリエチレングリコールモノメタクリレート（ポリエチレングリコール部分子量３５０）26.3ｇを200mlの酢酸エチルに溶解し、ＡＩＢＮを開始剤として61.6ｍｇ加え、還流下で６時間反応させた。反応液はエバポレーターにて溶媒を取り除いた後、水で溶解し、限外ろ過を行い未反応のモノマーを取り除いた。ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）にてポリマー生成を確認した。
【００５６】
非特異的吸着防止剤の形成及びペプチドの固定化
4,4'-ジアジドスチルベン-2,2'-ジスルホン酸ナトリウム（市販品）を光架橋剤として用いた。光架橋剤の濃度が0.15％、上記水溶性ポリマーの濃度が３％となるように混合した。得られた水溶液を、ハイインパクトポリスチレン樹脂担体上にスピンコートし、乾燥した(膜厚約0.1μm)後、ＵＶ照射（ブラックライトで7分間)した。次いで、固定化剤N-[4-[3-(トリフルオロメチル)-3H-ジアジリン-3-yl]フェニル]オキシラン（テイカ製薬製）が0.001％になるように混合したＤＭＦ−水（１：７）溶液を20ｎLスポットし、乾燥した後、ＵＶ照射（ブラックライトで7分間)した。その後、ブナシメジペプチド0.1％水溶液を20nLスポットし、37℃で30分間反応させ固定化し、アレルギー診断用キットを作成した。
【００５７】
固定化ペプチド
固定化ペプチドには、図１に示すブナシメジのアミノ酸配列において、ウェスタンブロッド法によるスクリーニング試験によりエピトープと推定されたセリン−グリシン−ロイシン−プロリン−バリンの５残基を、各末端及び中央部に有する１５残基のペプチド３種（以下、ペプチド♯１〜３と称する）を用いた。また、セリン−グリシン−ロイシン−プロリン−バリンの５残基のアミノ酸配列を繰返し含む１５残基、２０残基及び２５残基のペプチド３種（以下、ペプチド＃４〜６と称する）を用いた。ペプチド♯１〜６のアミノ酸配列を、図２に示す。
【００５８】
測定
上記アレルギー診断用キットをPBS(0.1%  Tween20（登録商標））で洗浄後、ブナシメジの陽性血清（札幌医大）、陰性の標準血清（Rockland Immunochemical,Inc.）或いはブナシメジ工場従業員の血清と37℃で20分間反応させた。PBS(0.1%  Tween20（登録商標））で洗浄後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識２次抗体（市販品）と37℃で20分間反応させた。PBS(0.1% Tween20（登録商標））で洗浄後、化学発光試薬を添加し、発光強度を測定した。
【００５９】
ＩｇＥ測定では2次抗体として、抗ヒトIgE  GE-80P(市販品)を、PBS（和光RIAグレードBSAを10％添加）で100倍に希釈したものを用いた。またＩｇＥ測定では、患者血清を、そのまま希釈せずに使用した。この結果を図３〜５に示す。次に、ＩｇＧ測定では2次抗体として、抗ヒトIgG  GEヘルスケア・NA933を、PBS（和光RIAグレードBSAを10％添加）で８００倍に希釈したものを用いた。ＩｇＧ測定では、患者血清をPBS（和光RIAグレードBSAを４％添加）で128倍に希釈して使用した。この結果を図６に示す。また、ペプチド＃４によるIgG測定のエラーバー（標準誤差）を図７に示す。
【００６０】
図３の結果より、IgE測定では、Ｃ末端にセリン−グリシン−ロイシン−プロリン−バリンのアミノ酸配列を有するペプチド＃１、及びセリン−グリシン−ロイシン−プロリン−バリンの５残基の繰返し配列を３単位含むペプチド＃４によると、標準血清では発光が認められず、陽性血清のみ発光が認められたため、これらペプチドはＩｇＥ測定に適していると考えられる。
【００６１】
図４は、ペプチド＃４、５及び６を用いて、図３とは異なる陽性血清と標準血清の発光強度を比較した結果である。いずれのペプチドによる場合も、標準血清では発光が認められなかったが、陽性血清では発光がみられ、ＩｇＥ測定に好適であることが示された。
【００６２】
次に、同じくＩｇＥ測定に関する図５は、ペプチド♯４によりブナシメジ工場従業員の血清（札幌医大）を用いた場合における、発光強度の測定結果を示したものである。図５の血清番号に関し、咳症状の有無による陽性・陰性の別を表1に示す。
【００６３】
【表１】
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【００６４】
図５の結果より、咳症状がみられたアレルギー陽性である従業員の血清の発光強度は、アレルギー陰性の従業員の血清の発光強度よりも高いものとなり、ＩｇＥ測定による発光強度が、アレルギー症状によく一致することが示された。
【００６５】
ここで、陽性血清には、ＩｇＥタイプの免疫グロブリンに由来するＩ型アレルギーばかりでなく、III型及びIV型アレルギーの因子も含まれていると考えられる。このため、ＩｇＥ測定のみならず、ＩｇＧ測定においても、標準血清に対する陽性血清の発光強度が高いものとなるエピトープペプチドが有用と考えられる。
【００６６】
図６より、ペプチド♯１〜４はいずれも、標準血清の発光強度より陽性血清の発光強度が高くなっており、ＩｇＧ測定に好適なことが示された。特に、アミノ酸配列の中央部にセリン−グリシン−ロイシン−プロリン−バリンのアミノ酸配列を有するペプチド＃２、及びセリン−グリシン−ロイシン−プロリン−バリンの５残基の繰返し配列を３単位含むペプチド＃４は、標準血清と陽性血清との発光強度の差が、２種類の陽性血清のいずれを用いた場合にも比較的大きかったことから、ＩｇＧ測定に好適と考えられる。また、図７に示した、ペプチド♯４によるＩｇＧ測定のエラーバー（標準誤差）の結果からも、ペプチド♯４を用いた場合、陽性血清の発光強度は、標準血清に対し充分にアレルギー診断可能な値であることが示された。
【００６７】
このように、セリン−グリシン−ロイシン−プロリン−バリンのアミノ酸配列を少なくとも有するペプチドを用いて、IgE及びIgGの測定を行うことにより、ブナシメジアレルギーの総合的な診断が可能となる。特に、セリン−グリシン−ロイシン−プロリン−バリンの繰返し配列を含む配列を有するペプチドは、IgE及びIgGのいずれの測定により検査した場合にも精密診断可能となり、ブナシメジのアレルギー診断に最適と考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明のアレルギー診断用キットを用いてブナシメジアレルギーの診断を行えば、被験者に対し、身体的負担を与えることなく、迅速且つ高い信頼度でブナシメジアレルギーを早期診断することができる。高い信頼度でアレルギー診断が行われることにより、現在の診断よりも早期診断が可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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