(57)【要約】【課題】皮膚バリアー機能回復効果物質をスクリーニングする新規手段の提供。【解決手段】本発明は、候補薬剤が比較してケラチノサイトにおけるｃＧＭＰの産生を有意に抑制する場合に、当該候補薬剤が皮膚バリアー機能の回復を促進させると評価する、皮膚バリアー機能回復促進物質のスクリーニング方法、を提供する。【選択図】図４
2012042282.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補薬剤がケラチノサイトにおけるｃＧＭＰの産生を有意に抑制する場合に、当該候補薬剤が皮膚バリアー機能の回復を促進させると評価する、皮膚バリアー機能回復促進物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
更に、赤色光との比較でｃＧＭＰの産生量を評価する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｃＧＭＰの産生抑制を指標とする皮膚バリアー機能回復促進物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の皮膚疾患、例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬、接触性皮膚炎等に見られる肌荒れ症状においては、皮膚からの水分の消失が、健常な皮膚に比べて盛んであることが知られている。このいわゆる経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の増加には、皮膚内において水分の保持やバリアーとしての機能を担っていると考えられる成分の減少が関与しているものと考えられてきた。
【０００３】
これまでに、皮膚バリアー機能の低下に伴い皮膚の皮膚機能が低下し、その結果皮膚増殖性異常等が起こることが報告されている。特に高齢者の場合、低下した皮膚バリアー機能の回復には長い時間がかかるため、加齢に伴う皮膚の皮膚機能の低下による皮膚増殖性異常等を防止するのに有効な、新たな皮膚バリアー機能回復剤が要望されている。
【０００４】
一酸化窒素（ＮＯ）は血管拡張物質であるとともに、皮膚における細胞分裂や細胞毒性に関与する細胞シグナル伝達物質であることが知られている。また、ＮＯは細胞内カルシウムの放出を促進させる（Horn et al., FASEB J 16:pp. 1611-22）。本発明者らは以前、ＮＯが皮膚バリアー機能の回復に及ぼす影響について検討した結果、ＮＯ合成酵素（ＮＯＳ）阻害剤及び神経性一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）が、テープストリッピングにより破壊された皮膚のバリアー機能の回復を促進させることを明らかにした（Journal of INvestigative Dermatology (2007), Vol. 127, pp. 1713-1719）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Journal of INvestigative Dermatology (2007), Vol. 127, pp. 1713-1719
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＮＯは、細胞内でグアニリルシクラーゼ（ＧＣ）を活性化し、環状グアノシン３’,５’一リン酸（ｃＧＭＰ）を増大させることでシグナル伝達に関与している。しかしながら、ｃＧＭＰと皮膚バリアー機能の回復との関係は明らかとなっていなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、ｃＧＭＰの産生抑制又は分解促進を指標とすることで、皮膚バリアー機能の回復を促進させる薬剤がスクリーニングされ得ることを見出し、本願発明を完成させるに至った。
【０００８】
即ち、本願発明は、候補薬剤がケラチノサイトにおけるｃＧＭＰの産生を有意に抑制する場合に、当該候補薬剤が皮膚バリアー機能の回復を促進させると評価する、皮膚バリアー機能回復促進物質のスクリーニング方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
ｃＧＭＰは皮膚バリアー機能の回復と密接に関連していると考えられる。本発明によれば、多数の候補薬剤の中からｃＧＭＰの産生を低下させる薬剤を優先的に選択することで、皮膚バリアー機能回復促進物質を確実にスクリーニングすることが可能となる。また、皮膚バリアー機能の回復は、皮膚に赤色光を照射した場合にも顕著に促進されることが知られているが、本発明者らは、ｃＧＭＰの産生が赤色光の照射によっても低下することを確認している。従って、ｃＧＭＰを指標とする本発明のスクリーニング方法は、赤色光に匹敵する皮膚バリアー機能回復効果を発揮する薬剤をスクリーニングすることも可能にするものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、コントロール（テープストリッピング前）のヘアレスマウスの皮膚凍結切片を用いたｃＧＭＰの免疫染色写真である。
【図２】図２は、テープストリッピング後のヘアレスマウスの皮膚凍結切片を用いたｃＧＭＰの免疫染色写真である。
【図３】図３は、赤色光照射後のヘアレスマウスの皮膚凍結切片を用いたｃＧＭＰの免疫染色写真である。
【図４】図４は、赤色光照射及びZaprinast（Merck社製）適用後のヘアレスマウスの皮膚凍結切片を用いたｃＧＭＰの免疫染色写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、候補薬剤が皮膚組織等におけるｃＧＭＰの産生を有意に抑制する場合に、当該候補薬剤が皮膚バリアー機能の回復を促進させると評価する、皮膚バリアー機能回復促進物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１２】
環状グアノシン３’,５’一リン酸（ｃＧＭＰ）は、環状ヌクレオチドの１つであり、環状アデノシン３’,５’一リン酸（ｃＡＭＰ）と同様に、細胞内シグナル伝達物質として種々の役割を果たしている。ｃＧＭＰは、生体内において、グアニルシクラーゼ（ＧＣ）によってＧＴＰから合成される。ｃＧＭＰはイオンチャネルに作用し、細胞内へのＣａ2+流入を引き起こし、細胞内Ｃａ2+レベルを上昇させる。本発明者らは、以前の研究において、細胞内へのカルシウムイオンの流入が皮膚バリアーの機能を低下させることを確認している（ＷＯ２００３／０５３４６６）。ｃＧＭＰは、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）によってそのリン酸エステルが加水分解された後、グアノシン５’リン酸に変換される。
【００１３】
ＮＯによりＧＣが活性されると、ＧＴＰからｃＧＭＰへの合成が促進され、その結果、細胞内Ｃａ2+レベルが上昇する。このカスケードにおける、ＮＯによるカルシウムレベルの上昇は、細胞膜カルシウムチャネルの阻害剤であるニフェジピンをケラチノサイトに作用させた場合でも変化しない。そのため、ＮＯによるカルシウムレベルの上昇は細胞内に存在するＣａストアによるものと考えられる。
【００１４】
かかる細胞内Ｃａ2+レベルの上昇により、皮膚バリア機能の回復が抑制される。事実、上記カスケードの最上流に位置するＮＯを供給するＮＯドナー、例えばＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−ＤＬ−ペニシラミン（ＳＮＡＰ）は、ヘアレスマウスのケラチノサイト内のカルシウム濃度を上昇させ、皮膚バリアー機能の回復を遅らせた（上掲Denda et al.）。ＧＣ活性化剤であるＳＩＮ−１クロリドも同様の結果を示す。対照的に、ＧＣ阻害剤であるＨ−[１，２，４]オキサジアゾール［４，３−ａ］キノキサリン−１−オン（ＯＤＱ）は、ＳＮＡＰによるカルシウム濃度の上昇を抑制し、バリア回復を促進させる。
【００１５】
上記カスケードによれば、ＧＣが阻害されると、ｃＧＭＰの産生が抑制されることになる。すなわち、候補薬剤が皮膚組織におけるｃＧＭＰの産生を有意に抑制する場合に、当該候補薬剤が皮膚バリアー機能の回復を促進させると評価することができる。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「皮膚バリアー機能」とは、皮膚のなかでも表皮による体内の水分保持及びウイルス、細菌等の進入阻止、などを意味する。ここで、当該機能は、発汗しない条件下で経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）（単位：ｇ／ｍ2・ｈ）を測定することにより評価することができる。また、本発明において、「皮膚バリアー機能の回復を促進する」とは、皮膚のテープストリッピング直後のＴＥＷＬの値を０％、テープストリッピング前の値を１００％として、各測定時間におけるＴＥＷＬの値が、コントロールと比較した場合に明らかに有意差が認められ、ＴＥＷＬ回復率を促進させる効果を有することを意味し、Ａｎｄｒｅｗらの方法（Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ，８６；５９８，１９８６）に従って、４％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液をしみ込ませたＣｏｔｔｏｎ ｂａｌｌにより皮膚を処理して判定を行ういわゆる肌荒れ改善防止効果とは異なる。
【００１７】
皮膚バリアー機能の回復が必要な皮膚としては、皮膚疾患、種々のストレス、そして肌荒れ等により皮膚バリアー機能が低下した肌、移植皮膚で皮膚バリアー層の形成が充分でないため皮膚バリアー機能が低い肌、あるいは移植によって皮膚バリアー機能が低下した肌等が挙げられる。従って、本発明のスクリーニング方法は、低下した皮膚バリアー機能の回復だけでなく、皮膚バリアー機能が低い肌に対してその機能を向上させる物質のスクリーニングも意図する。このように、本発明によりスクリーニングされた皮膚バリアー機能回復促進物質を適用する対象者としては、哺乳類が考えられ、特にヒトの皮膚に対して適用される。
【００１８】
更に、上述の加齢に伴う皮膚機能の低下による皮膚増殖性異常等を防止する観点から、皮膚バリアー機能回復促進物質は、高齢者の皮膚に適用されることが考えられる。当該物質はまた、人工皮膚にも適用することができる。これは、生体より単離された皮膚細胞等を培養することによって得られる人工皮膚は、皮膚バリアー層の形成が不完全なことがあり、その皮膚バリアー機能は概して低いためである。
【００１９】
本発明の方法は、皮膚バリアー機能回復促進物質の候補化合物をケラチノサイト等のケラチノサイト等のｃＧＭＰを産生している細胞又は細胞画分に適用し、皮膚組織中のｃＧＭＰの産生が抑制された場合に、当該候補化合物を皮膚バリアー機能回復促進物質として選定する工程を含んで成る。前記候補化合物としては、ＧＣ阻害剤等が考えられる。当該候補化合物は、皮膚組織に直接適用し、ｃＧＭＰの産生を確認してもよい。ｃＧＭＰの産生抑制とは、コントロールと比較して、細胞内のｃＧＭＰ量が少ないことを意味する。候補化合物の効果は、対照薬剤と比較して、例えばそれぞれ２０％以上、又は５０％以上、又は１００％産生が抑制される場合、ｃＧＭＰの産生を有意に抑制するとみなすことができる。更に、候補化合物のｃＧＭＰ産生抑制効果は、対照薬剤に代えて、あるいは対照薬剤とともに、赤色光によるｃＧＭＰ産生抑制効果と比較してもよい。この場合、赤色光の光源は特に限定されず、例えば、市販の赤色光ランプであってもよい。本発明では、出力１Ｗ、波長５５０〜６７０ｎｍの市販の赤色光ランプを使用した。
【００２０】
細胞内のｃＧＭＰ量は、抗ｃＧＭＰ抗体を用いる免疫染色により定量することができる。また、ラジオアイソトープでラベル化したｃＧＭＰの増減によってもｃＧＭＰ量を評価することができる。あるいは、ｃＧＭＰ量の減少に伴い、小胞体からのカルシウム放出も抑制されるため、細胞内のカルシウムイオン濃度の低下を測定することでｃＧＭＰの産生抑制を間接的に評価することもできる。細胞内のカルシウムイオンの濃度は慣用の方法で測定することができる。
【００２１】
別の態様において、本発明は、ｃＧＭＰの産生を抑制する物質を含んで成る皮膚バリアー機能回復促進製剤を提供する。本発明の製剤の形態には、本発明の製剤は、化粧水、クリーム、乳液、ローション、ファンデーション、パック、浴用剤、軟膏、ヘアーローション、ヘアートニック、ヘアーリキッド、シャンプー、リンス、養毛・育毛剤等を包含するものである。
【００２２】
更に別の態様において、本発明は、皮膚バリアー機能の回復を促進させるための美容方法であって、ｃＧＭＰの産生を抑制する物質を皮膚上に適用することを含んで成る方法を提供する。
【００２３】
本発明の美容方法は、皮膚バリアー機能回復が必要とされる皮膚にｃＧＭＰの産生を抑制する物質を適用するものである。適用方法は特に限定されず、例えば、前記物質を含有するパック又はシートを皮膚上に載せ、あるいは貼り付けることで前記物質を皮膚に適用してもよい。その他、前記物質を有効成分として含む化粧料として皮膚に塗布されることもある。前記物質を皮膚に適用する回数、時間は、その皮膚の状態によって変化するが、セロテープ（登録商標）によるストリッピングで破壊された皮膚の場合、１時間あれば皮膚バリアー機能の回復を達成することができる。
【実施例】
【００２４】
次に、本願発明を以下の実施例により更に具体的に説明する。
【００２５】
皮膚バリアー機能回復促進効果試験
以下の実験において、ＧＣ阻害剤であるＯＤＱによる皮膚バリアー機能回復促進効果を、水、ＮＯドナーであるＳＮＡＰ、又はＧＣ活性化剤であるＳＩＮ−１クロリドを適用した場合と比較して評価した。皮膚バリアー機能回復促進効果は、ヘアレスマウス（Ｔｙｐｅ ＨＲ−１， ＨＯＳＨＩＮＯ， Ｊａｐａｎ）の皮膚にテープストリッピングを施すことによって破壊された皮膚バリアー機能がもとの状態へ回復していく過程を経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を指標とし、以下の通り評価した。
【００２６】
１．水分蒸散量測定装置ＭＥＥＣＯ（Ｍｅｅｃｏ社製， Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ， ＰＡ， ＵＳＡ）によりヘアレスマウス背部付近の経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定する。この際の値をＴＥＷＬの回復率１００％とする。
２．皮膚のバリアーを、セロファンテープを使用し、ヘアレスマウスの表皮角層を剥がすことにより破壊する。このときＴＥＷＬの値が約８００〜９００となるまでこの作業を繰り返す。角層を剥がした後の測定値から角層を剥がす前の測定値を差し引いた値を、最もダメージの深い状態、即ち回復率０％とする。
３．角層を剥がしてから所定の時間（１，３，６又は２４時間）経過後、試験物質を上記角層の上に塗布する。水を塗布した皮膚をコントロールとする。
４．１時間経過後、ＭＥＥＣＯによりＴＥＷＬを測定する。角層除去時と同様、各時間の測定値から角層除去前のＴＥＷＬ値を差し引き、回復率をもとめる。
即ち、回復率は以下の式に従い算出する。
【数１】
2012042282.tif 000003
【００２７】
当該試験によって測定された皮膚バリアー機能の回復率（％）を算出したところ、ＳＮＡＰやＳＩＮ−１クロリドは、コントロールと比較しても皮膚バリアー機能の回復が遅れたのに対し、ＯＤＱは皮膚バリアー機能の回復を有意に促進させた（結果は示さず）。
【００２８】
抗ｃＧＭＰ抗体を用いたヘアレスマウスの皮膚凍結切片の免疫染色
ｃＧＭＰの産生に関与する因子がバリア破壊後の皮膚にどのような影響を及ぼすか、抗ｃＧＭＰ抗体を用いてヘアレスマウスの皮膚凍結切片を免疫染色した。
【００２９】
約７μｍのヘアレスマウス皮膚凍結切片をコントロールとし、１）当該切片の上記皮膚バリアー機能回復促進効果試験と同様にテープストリッピングしたもの、２）テープストリッピング後に波長５５０〜６７０ｎｍの赤色光を照射したもの（出力１Ｗの日亜化学工業社製赤色光ＬＥＤランプ）、そして３）テープストリッピング後の切片にｃＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ阻害剤であるZaprinast（Merck社製）（１．５μＭ）を適用し、その後２）と同様に赤色光を照射したものを準備した。１００％メタノールで固定した後、ヤギ血清により１時間ブロッキングした。当該切片を抗ｃGMP抗体液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）に４℃で一晩浸漬した後、ＰＢＳ等のバッファーで洗浄した。
【００３０】
洗浄後の切片を２次抗体（抗ウサギ−Alexa Fluor 594）溶液に室温で１時間浸漬し、バッファーで洗浄した後、蛍光顕微鏡によりｃＧＭＰ量を評価した。結果を図１〜４に示す。
【００３１】
テープストリッピングによりｃＧＭＰ量は増大したが（図１及び図２）、赤色光を照射した切片では、ｃＧＭＰ量は有意に低下した（図３）。これはホスホジエステラーゼが活性化してｃＧＭＰを分解するためである。一方、Zaprinastを塗布した後赤色光を照射した切片は、Zaprinastを塗布せずに赤色光を照射した切片と比較してｃＧＭＰ量低下が抑制された（図４）。図４の結果は、Zaprinastによりホスホジエステラーゼが阻害され、赤色光によるｃＧＭＰ量の低下が抑制されたことを示している。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
以上の結果から、ｃＧＭＰの産生を抑制する物質と皮膚バリアー機能回復促進効果の間には相関関係が認められる。本発明によれば、皮膚バリアー機能回復促進物質をスクリーニングする際、ｃＧＭＰの産生抑制という新たな指標を採用することで、皮膚バリアー機能回復促進効果を有する物質を確実にスクリーニングすることが可能となる。
【図１】
2012042282.tif 000004
【図２】
2012042282.tif 000005
【図３】
2012042282.tif 000006
【図４】
2012042282.tif 000007