(57)【要約】【課題】従来のロールプリンティング法は、ロールプリンティングによるパターン転写時にブランケットから基板に円滑にパターンを転写するために表面張力の低いＰＤＭＳ（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｓａｎｅ）などの材料をブランケットとして用いるため、インクの表面張力がブランケット材料より低くならないと良好なコーティング結果を得ることができない。よって、ロールプリンティング用インク組成物がブランケット表面より低い表面張力を有するようにするためには、インク組成物内に表面張力を下げる効果に優れた界面活性剤を添加して使わなければならない。【解決手段】完全なヒトＷＴ−１ポリペプチドではないという条件で、アミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬを含むペプチドまたはその部分または異型、完全なヒトＷＴ−１ポリペプチドではないという条件で、アミノ酸配列ＣＭＴＷＮＱＭＮＬを含むペプチドまたはその部分または異型、または、完全なヒトｇａｔａ−１ポリペプチドではないという条件で、アミノ酸配列ＨＬＭＰＦＰＧＰＬＬを含むペプチドまたはその部分または異型、並びに、これらのペプチドをコードするポリヌクレオチド。これらのペプチドおよびポリヌクレオチドは、ガンのワクチンとして使用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドが完全なヒトＷＴ−１ポリペプチドではないという条件で、アミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬを含むペプチドまたはその部分または異型。
【請求項２】
ペプチドが完全なヒトＷＴ−１ポリペプチドではないという条件で、アミノ酸配列ＣＭＴＷＮＱＭＮＬを含むペプチドまたはその部分または異型。
【請求項３】
ペプチドが完全なヒトｇａｔａ−１ポリペプチドではないという条件で、アミノ酸配列ＨＬＭＰＦＰＧＰＬＬを含むペプチドまたはその部分または異型。
【請求項４】
ペプチドがＨＬＡ−Ａ０２０１に結合できる、請求項１ないし３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
ＨＬＡ−Ａ０２０１に結合した際に、ペプチド結合ＨＬＡ−Ａ０２０１が、前記アミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現する細胞を認識する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の産生を導くことができる、請求項４記載のペプチド。
【請求項６】
ペプチドが非ペプチド結合を含む、請求項１ないし５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
アミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬからなるペプチド。
【請求項８】
アミノ酸配列ＣＭＴＷＮＱＭＮＬからなるペプチド。
【請求項９】
アミノ酸配列ＨＬＭＰＦＰＧＰＬＬからなるペプチド。
【請求項１０】
請求項１ないし５および７ないし９のいずれか一項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ＤＮＡである請求項１０記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１ないし５および７ないし９のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現することができる発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１０または１１記載のポリヌクレオチドまたは請求項１２記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１ないし５および７ないし９のいずれか一項に記載のペプチドを産生する方法であって、請求項１３記載の宿主細胞を培養し、かつ、宿主細胞またはその培養培地からペプチドを得ることを含む方法。
【請求項１５】
請求項１ないし９のいずれか一項に記載のペプチドおよび薬学的に許容できるキャリアーを含む薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１０または１１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１２に記載の発現ベクター、および薬学的に許容できるキャリアーを含む薬学的組成物。
【請求項１７】
薬剤に用いる請求項１ないし９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１８】
薬剤に用いる請求項１０または１１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１ないし９のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項１０または１１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１２に記載の発現ベクターを含むガンワクチン。
【請求項２０】
請求項１ないし３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現するターゲット細胞を患者において殺傷する方法であって、請求項１ないし９のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項１０または１１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１２に記載の発現ベクターの有効量を患者に投与することを含み、前記ペプチドまたはポリヌクレオチドまたは発現ベクターの量は、患者において抗ターゲット細胞免疫応答を誘発するのに十分な量とされる方法。
【請求項２１】
請求項１ないし９のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項１０または１１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１２に記載の発現ベクターの、請求項１ないし３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現するターゲット細胞を患者において殺傷するための薬剤の製造における使用。
【請求項２２】
in vitroにおいて活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を産生する方法であって、抗原特異的に前記ＣＴＬを活性するのに十分な時間、適切な抗原提示細胞の表面に発現された抗原結合ヒトクラスＩ ＭＨＣ分子とＣＴＬとをin vitroで接触させることを含み、前記抗原が請求項１ないし９のいずれか一項に記載のペプチドである方法。
【請求項２３】
ＣＴＬと抗原提示細胞が、クラスＩ ＭＨＣ分子に関して同種異系（アロ制限）である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ＣＴＬと抗原提示細胞が、クラスＩ ＭＨＣ分子に関して同系（自己制限）である、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
抗原提示細胞と十分量の抗原とを接触させることにより適切な抗原提示細胞の表面に発現されたクラスＩ ＭＨＣ分子に抗原が結合される、請求項２２ないし２４のいずれか一項に記載の方法であって、接触前には、抗原提示細胞のクラスＩ ＭＨＣ分子が実質的に占有されてなく、かつ、接触後には、クラスＩ ＭＨＣ分子が実質的に十分に占有される方法。
【請求項２６】
抗原提示細胞が、請求項１２記載の発現ベクターを含む、請求項２２ないし２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
クラスＩ ＭＨＣ分子がＨＬＡ−Ａ０２０１である、請求項２２ないし２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２２ないし２７のいずれか一項に記載の方法により得られた活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）。
【請求項２９】
請求項１ないし３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）。
【請求項３０】
請求項１ないし３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現する細胞を認識するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）であって、請求項２８または２９記載の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）から得られるか、あるいは、ＴＣＲに機能的に等価な分子であるＴＣＲ。
【請求項３１】
請求項３０に記載されたＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３２】
請求項３０に記載されたＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現することができる発現ベクター。
【請求項３３】
請求項１ないし３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現するターゲット細胞を患者において殺傷する方法であって、患者に、請求項２８または２９に記載された細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の有効数を投与することを含む方法。
【請求項３４】
請求項１ないし３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現するターゲット細胞を患者において殺傷する方法であって、（１）患者から細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を得る工程；（２）請求項３０に記載した、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）、または機能的に等価な分子をコードするポリヌクレオチドを、前記細胞に導入する工程；および（３）患者において工程（２）で産生された細胞を導入する工程を含む方法。
【請求項３５】
請求項１ないし３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現するターゲット細胞を患者において殺傷する方法であって、（１）患者から樹状細胞を得る工程；（２）前記樹状細胞を、請求項１ないし９のいずれか一項に記載されたペプチドまたは請求項１０ないし１２記載のポリヌクレオチドまたは発現ベクターとex vivoで接触させる工程；および（３）このように処理された樹状細胞を患者に再導入する工程を含む方法。
【請求項３６】
ターゲット細胞がガン細胞である請求項２０または３３ないし３５のいずれか一項に記載の、患者におけるターゲット細胞を殺す方法。
【請求項３７】
ガンが、アミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬおよびＣＭＴＷＮＱＭＮＬを含むＷＴ１ポリペプチドを異常に発現する、白血病、乳ガン、メラノーマおよび卵巣ガンのいずれか一つである請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
ガンが、アミノ酸配列ＨＬＭＰＦＰＧＰＬＬを含むｇａｔａ−１ポリペプチドを異常に発現する白血病である、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
請求項１ないし３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現するターゲット細胞を患者において殺傷するための薬剤の製造における、請求項２８または２９に記載の細胞傷害性Ｔリンパ球の使用。
【請求項４０】
請求項１ないし３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現するターゲット細胞を患者において殺傷するための薬剤の製造における、請求項３４の工程（２）で産生される細胞傷害性Ｔリンパ球の使用。
【請求項４１】
請求項１ないし３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現するターゲット細胞を患者において殺傷するための薬剤の製造における、請求項３５の工程（２）において産生される樹状細胞の使用。
【請求項４２】
ここに記載されるガンを治療するための新規方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫治療法、および、免疫治療法に使用される分子および細胞に関する。特に、本発明は、白血病を含むガンの治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗腫瘍細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）がin vivoにおいて重要な役割を演じるという証拠がある。腫瘍反応性ＣＴＬが腫瘍後退を媒介することが、動物モデル（Kastら(1989) Cell 59, 603-614）およびヒト（カワカミら(1994) Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,6458-6462）において示された。抗腫瘍治療の全てのタイプに関して、克服される必要のある問題は、この治療が有益な程度まで標的腫瘍細胞を破壊または不活性化しなければならないが、この治療が非腫瘍細胞を有害な程度まで破壊または不活性化してはならないことである。言い換えれば、この治療が腫瘍細胞に対して有益な程度にまで選択的であれば好ましい。
【０００３】
ガンの免疫治療に対する現在の研究のほとんどは、一部の腫瘍が、等価の非腫瘍組織に発現されないポリペプチドを発現するという事実を利用するか、腫瘍が、非腫瘍組織に発現されないポリペプチドの変異形態を発現するという事実を利用する。しかしながら、このカテゴリーに入る腫瘍のポリペプチドを常に同定できるわけではなく、それゆえ、免疫治療アプローチのベースを形成する別の標的ポリペプチドが同定されてきた。
【０００４】
メラノーマ患者における研究は、メラノーマ反応性ＣＴＬによって認識されたペプチドエピトープが組織特異的分化抗原からしばしば誘導されることを示した。正常組織に発現される分化抗原の認識は、免疫学的寛容のルールを壊すようにも見える；しかしながら、メラノーマ関連分化抗原のＣＴＬ認識は、それらが通常は、免疫学的に特別に許可された部位において比較的少数で存在するメラノサイトにおいて発現されるのみであり、かくして寛容を確立しないという事実によって説明される。また、前立腺特異的分化抗原が、前立腺の腫瘍に対するＣＴＬの標的として作用しうることも示されている。発生的に制御された転写因子が、どの程度まで、これらの因子を異常に発現する腫瘍に対してＣＴＬの標的として機能するのかは、現在のところ不明である。
【０００５】
Ｇａｔａ−１は、赤血球、巨核球、エオシン好性白血球およびマスト細胞直系、並びに、多型潜在性先祖において通常発現される転写因子である。この厳しくコントロールされた転写因子の異常発現は、ＣＭＬおよびＡＭＬを含む白血球において観察される（Shimamotoら(1995)Blood 86,3173-3180）。
【０００６】
成人では、ＷＴ１、胚の転写因子の発現が、腎の有足突起、精巣、卵巣、胸部筋上皮細胞、そして骨髄の一部のＣＤ３４+幹細胞に観察されている。異常発現は、乳ガン、卵巣ガン、メラノーマおよび、ＣＭＬおよびＡＭＬを含む白血病に観察された（例えば、Menssenら(1995) Leukaemia 9,1060-1067;Inoueら(1997) Blood 89,1405-1412; Inoueら(1996) Blood 88, 2267-2278; Inoueら (1998) Blood 91, 2969-2976; Menssenら(1997) Int.J.Cancer 70, 518-523; Menssenら(1995) Leukemia 9, 1060-1067; Ogawaら(1998) Transplant 21,527-527; Rodeckら(1994) Int.J.Cancer 59, 78-82; Silbersteinら(1997) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94, 8132-8137; Tamakiら (1996) Blood 88, 4396-4398; およびVielら(1994) Int.J.Cancer 57,515-521）。
【０００７】
米国特許第５７２６２８８号は、Wilmsの腫瘍遺伝子の位置および特徴に関する。４つのアミノ酸配列が開示されており（配列番号２、４、５および６）、配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬまたはＣＭＴＷＭＮＱＭＮＬのいずれかを含むが、これらの配列に対応するペプチドもしくは免疫治療におけるそれらの用途については全く開示されていない。
【０００８】
アロ-ＭＨＣ-制限ＣＴＬを用いる通常でないアプローチを用いて、タンパクＷＴ−１およびｇａｔａ−１のペプチドエピトープを驚くべきことに同定した。これらは、ＨＬＡ−Ａ０２０１クラスＩ分子によって提示され、これらのタンパクを内因的に発現する腫瘍細胞表面に提示される。ＨＬＡ−Ａ０２０１陰性は、ＨＬＡ−Ａ０２０１クラスＩ分子によって提示されたペプチドに特異的なＣＴＬの源として用いられ、このアプローチは、自己のＣＴＬの可能な寛容から独立したＨＬＡ−Ａ０２０１提示ペプチドの同定を可能にする。
【０００９】
ＨＬＡ−Ａ０２０１は、最も一般的なＨＬＡ−Ａハプロタイプである。
【００１０】
疑いを除くために、用語ＨＬＡおよびＭＨＣは本明細書で交換可能に用いられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５７２６２８８号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Kastら(1989) Cell 59, 603-614
【非特許文献２】カワカミら(1994) Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,6458-6462
【非特許文献３】Shimamotoら(1995)Blood 86,3173-3180
【非特許文献４】Menssenら(1995) Leukaemia 9,1060-1067
【非特許文献５】Inoueら(1997) Blood 89,1405-1412
【非特許文献６】Inoueら(1996) Blood 88, 2267-2278
【非特許文献７】Inoueら (1998) Blood 91, 2969-2976
【非特許文献８】Menssenら(1997) Int.J.Cancer 70, 518-523
【非特許文献９】Menssenら(1995) Leukemia 9, 1060-1067
【非特許文献１０】Ogawaら(1998) Transplant 21,527-527
【非特許文献１１】Rodeckら(1994) Int.J.Cancer 59, 78-82
【非特許文献１２】Silbersteinら(1997) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94, 8132-8137
【非特許文献１３】Tamakiら (1996) Blood 88, 4396-4398
【非特許文献１４】Vielら(1994) Int.J.Cancer 57,515-521
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の第一の態様は、完全なヒトＷＴ−１ポリペプチドではないという条件で、アミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬを含むペプチドまたはその部分または異型を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の第二の態様は、完全なヒトＷＴ−１ポリペプチドではないという条件で、アミノ酸配列ＣＭＴＷＮＱＭＮＬを含むペプチドまたはその部分または異型を提供する。
【００１５】
本発明の第三の態様は、完全なヒトｇａｔａ−１ポリペプチドではないという条件で、アミノ酸配列ＨＬＭＰＦＰＧＰＬＬを含むペプチドまたはその部分または異型を提供する。
【００１６】
“ペプチド”により、アミノ酸残基がペプチド結合（-ＣＯ-ＮＨ-）によって結合した分子のみでなく、ペプチド結合が転換された分子をも含める。かかるレトロ-インバーソ(retro-inverso)ペプチド模倣(peptidomimetics)は、当該技術分野において周知の方法、例えば、参照として含めるMeziereら(1997) J.Immunol.159,3230-3237に記載された方法を用いて調製することができる。かかるアプローチは、側鎖の配向ではなく、バックボーンを含む変化を含む偽ペプチドを調製することを含む。Meziereら（1997）は、少なくともＭＨＣクラスIIおよびＴヘルパー細胞応答に関して、これらの偽ペプチドが使用できることを示している。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含むレトロ-インバースペプチドは、タンパク分解に対してはるかに耐性である。
【００１７】
同様に、アミノ酸残基のＣα原子間の空間を維持する適切なリンカー部が用いられるという条件で、ペプチド結合が省かれてもよく、リンカー部がペプチド結合の実質的に同一の平面と実質的に同一のチャージ分布とを有することが特に好ましい。
【００１８】
ペプチドがそのＮ-またはＣ-末端において都合よくブロックされて、外タンパク分解(exoproteolytic)切断に対する感度を低減することが好ましい。
【００１９】
所定のアミノ酸配列の“部分(portion)”により、ペプチドが所定のアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同様にＨＬＡ分子に結合できるような、所定の配列の少なくとも６つの連続するアミノ酸を意味する。
【００２０】
所定のアミノ酸配列の“異型(variant)”により、例えば１または２つのアミノ酸残基の側鎖が、ペプチドが所定のアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同様にＨＬＡ分子に結合できるように、変更（例えば、別の天然に生じるアミノ酸残基の側鎖または他の側鎖で置換することによる）されていることを意味する。例えば、ペプチドは、改善しないにしても、ＨＬＡ−Ａ０２０１のような適切なＭＨＣ分子と相互作用して結合する能力を少なくとも維持するように、そして、改善しないにしても、本発明の第一、第二または第三の態様に定義したようなアミノ酸配列を含むポリペプチド（例えば、ＷＴ１またはｇａｔａ−１）を異常に発現する細胞を認識して殺すことができる活性化ＣＴＬを産生する能力を少なくとも維持するように、修飾されてもよい。ＨＬＡ−Ａ２結合ノナマーの２位および９位は、通常、アンカー残基である。これらの残基およびＨＬＡ−Ａ２を結合することに関わる他の残基の修飾は、ＣＴＬ認識を変更することなく結合を増強させることができる（例えば、Tourdotら(1997) J.Immunol.159,2391-2398参照）。
【００２１】
Ｔ細胞レセプターと相互作用するのに必須でないアミノ酸残基は、取り込みがＴ細胞反応性に実質的に影響を与えず、関連ＭＨＣへの結合を排除しない別のアミノ酸で置換することによって修飾することができる。
【００２２】
かくして、所定の条件から離れて、本発明のペプチドは、上記のアミノ酸配列または部分または異型を含むあらゆるペプチド（この用語はオリゴペプチドまたはポリペプチドも含む）とすることができる。通常、本発明のペプチドは、抗原提示細胞において発現されると、適切なＭＨＣ分子に結合できるフラグメントが形成されるように処理され、適切な細胞によって提示されて、適切なＴ細胞応答を導き出すペプチドである。このペプチドから産生されたフラグメントも本発明のペプチドであると認められる。都合よく、本発明のペプチドは、所定のアミノ酸配列を含む部分またはその部分または異型、そしてさらに、一部の所望の特性を与えるさらなる部分を含む。例えば、前記さらなる部分とは、さらなるＴ細胞エピトープを含むか（最初のＴ細胞エピトープ含有部分と同じポリペプチドから誘導されてもそうでなくてもよい）、キャリアータンパクまたはペプチドを含むことができる。かくして、一つの実施態様において、本発明のペプチドは、ヒトＷＴ−１部分がアミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬまたはＣＭＴＷＮＱＭＮＬまたはこれらの両方を含むという条件において、切断されたヒトＷＴ−１タンパクまたはＷＴ−１タンパクフラグメントと他のポリペプチド部分との融合タンパクである。別の実施態様では、本発明のペプチドは、ヒトｇａｔａ−１部分がアミノ酸配列ＨＬＭＰＦＰＧＰＬＬを含むという条件において、切断されたヒトｇａｔａ−１タンパクまたはヒトｇａｔａ−１タンパクフラグメントと他のポリペプチド部分との融合タンパクである。
【００２３】
特に好ましい実施態様では、本発明のペプチドは、本発明の第一、第二または第三の態様に与えられたアミノ酸配列、並びに少なくとも一つのさらなるＴ細胞エピトープを含み、ここでさらなるＴ細胞エピトープは、ＷＴ−１またはｇａｔａ−１を異常に発現する腫瘍のタイプに向けられたＴ細胞応答の産生を容易にすることができるものである。かくして、本発明のペプチドは、ワクチンとして用いられる、いわゆる“ビーズ・オン・ストリング(beads on a string)”ポリペプチドを含む。
【００２４】
本発明のペプチドは、あらゆる大きさとすることができるが、通常は、分子量が１０００００未満、好ましくは５００００未満、さらに好ましくは１００００未満、そして通常は約５０００とすることができる。アミノ酸残基の数としては、本発明のペプチドは１０００残基未満、好ましくは５００残基未満、さらに好ましくは１００残基未満とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、抗ＷＴ１２６−３４ＣＴＬの殺傷活性を示す。Ｔ２はＡＴＣＣからCatalogue No CRL 1992のもとに入手可能なペプチド結合欠陥を有するヒト細胞系統である。これらは、ＷＴ１２６−３４ペプチド（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ）（Ｔ２＋ＷＴ１２）、または、ＨＬＡ−Ａ２−結合ペプチド（Ｔ２＋Ｅ７）であるＥ７コントロールペプチド（ＴＬＧＩＶＣＰＩ）を用いて結合される。Ｋ５６２は、白血病細胞系統であり、Ｋ５６２−Ａ２はＨＬＡ−Ａ０２０１でトランスフェクションされたＫ５６２白血病細胞系統である。Ｅ：Ｔ比は、エフェクター：ターゲット細胞比である。比溶解（％）は、参照としてここに含める、Sadovnikova & Stauss(1996) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93, 13114-13118に記載されているような、標準的なＣＴＬアッセイで測定した。
【図２】図２は、抗ｈｕＷＴ１２６−３４ＣＴＬの殺傷活性を示す。Ｌｅｕｋ-６９７、ＭＶ４４１およびＢＶ１７３は白血病細胞系統である。Ｐ１２はＷＴ１２６−３４ペプチド（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ）を示す。
【図３】図３は、抗ｈｕｇ３７８−８７ＣＴＬの殺傷活性を示す。ｈｕｇ３７８−８７は、ペプチドＨＬＭＰＦＰＧＰＬＬであり、ｈｕｇ１４はＨＬＡ−Ａ２−結合コントロールペプチド（ＲＬＳＰＤＬＬＴＬ）である。Ｃ１Ｒ−Ａ２はヒトＢリンパ球細胞系統である。Ｋ５６２−Ａ２ヒトは、白血病細胞系統である。
【図４Ａ】図４は、ＷＴ−１誘導ペプチドＰ１２６に対して生じたアロ制限ＣＴＬの特異性を示す。ＣＴＬを、Ｐ１２６ペプチドで被覆されたＨＬＡ−Ａ０２０１+刺激細胞で刺激されたＨＬＡ−Ａ０２０１−ドナーからＴリンパ球バルク培養物の制限希釈クローニングによって単離した。（Ａ）単離されたＣＴＬ系統は、免疫化Ｐ１２６ペプチドで被覆されたＴＡＰ欠陥Ｔ２ターゲット細胞を殺傷したが、ＨＬＡ−Ａ０２０１結合Ｅ７コントロールペプチドで被覆されたＴ２細胞を殺さなかった。
【図４Ｂ】（Ｂ）ペプチド滴定実験は、３つの抗Ｐ１２６ＣＴＬ系統が低ピコモーラーのＰ１２６を認識する高い親和力であり、３つのＣＴＬ系統が低い親和力であったことを示す。これは、ナノモーラーＰ１２６濃度が、ターゲット細胞認識に必要であったからである。示された濃度のＰ１２６で被覆されたＴ２細胞は、ＣＴＬターゲットとして使用できた。低親和性ＣＴＬがＷＴ１を内因的に発現するターゲット細胞を認識しなかったことから、高親和性ＣＴＬを、次の全ての実験に用いた。
【図４Ｃ】（Ｃ）抗親和性ＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ０２０１+白血病細胞系統ＢＶ１７３，６９７を殺傷するが、ＨＬＡ−Ａ０２０１+、ＥＢＶ−トランスフォームＢリンパ球細胞Ｃ１Ｒ−Ａ２を殺傷しなかった。Ｃ１Ｒ−Ａ２のＰ１２６でのコーティングは、効率的なＣＴＬ殺傷をもたらした。ＨＬＡ−Ａ０２０１-白血病細胞系統Ｋ５６２は、ＨＬＡ−Ａ０２０１遺伝子でトランスフェクションされない限りＣＴＬによって殺傷されない。
【図５】白血病患者と正常ドナーから単離されたＣＤ３４+およびＣＤ３４-細胞集団および白血病細胞系統におけるタンパク発現とＷＴ１ ＲＮＡを示す。（Ａ）白血病細胞系統およびＢリンパ球細胞系統Ｃ１Ｒ−Ａ２におけるＷＴ１ ＲＮＡを測定するＲＴ−ＰＣＲ。図４ＣのＣＴＬターゲットと同じ細胞系統を用いた。増幅されたＷＴ１産物は４８２ｂｐであり、ハウスキーピングＡＢＬ遺伝子のＲＮＡを増幅して、各サンプルのＲＮＡの量を示した。ＡＢＬ産物は３８５ｂｐの長さである。（Ｂ）４人のＣＭＬ患者および３人の正常ドナー由来の、精製されたＣＤ３４＋とＣＤ３４−細胞集団におけるＷＴ１ ＲＮＡ発現を測定するＲＴ−ＰＣＲ。白血病細胞系統ＢＶ１７３は、ＷＴ１発現の陽性コントロールとして提供された。さらに６人のＣＭＬ患者からのサンプルを用いて類似の結果が得られた。（Ｃ）２人のＣＭＬ患者および２人の正常ドナー由来の精製されたＣＤ３４＋およびＣＤ３４−細胞集団および白血病細胞系統におけるＷＴ１タンパク発現を測定するウェスタンブロッティング。ハウスキーピングアクチンタンパクの発現は、各サンプル中に存在するタンパクの量を制御するためのインジケーターとして用いられた。ＷＴ１タンパクは約５４ｋＤａの大きさであり、アクチンタンパクは約４２ｋＤａであった。
【図６Ａ】図６は、白血病患者および正常ドナーから精製されたＣＤ３４+細胞集団のコロニー形成の阻害およびＣＴＬ媒介殺傷の分析である。（Ａ）ＨＬＡ−Ａ０２０１+またはＡ０２０１-であるＣＭＬ患者から単離された精製ＣＤ３４+およびＣＤ３４-細胞集団に対する抗Ｐ１２６ＣＴＬによる殺傷レベルを示す代表的な実験である。ＣＤ３４-／Ａ０２０１+細胞は、Ｐ１２６ペプチドでコートされない限りＣＴＬに認識されなかった。Ｐ１２６またはコントロールＥ７ペプチドで被覆されたＴＡＰ欠陥Ｔ２細胞および白血病細胞系統ＢＶ１７３は、全ての実験で陽性および陰性のコントロールとして用いられた。
【図６Ｂ】（Ｂ）１１人の異なるＨＬＡ−Ａ０２０１＋ＣＭＬ患者と６人の正常ドナーに由来する精製ＣＤ３４＋細胞の特異的ＣＴＬ殺傷レベルの平均。陽性コントロール細胞ＢＶ１７３に対する、ＣＭＬ患者から精製されたＣＤ３４-細胞の殺傷レベルも示されている。この図は、特異的ＣＴＬ殺傷の平均値と標準偏差を示す。
【図６Ｃ】（Ｃ）ＨＬＡ−Ａ０２０１+正常ドナーから単離された精製ＣＤ３４＋とＣＤ３４−細胞集団の抗Ｐ１２６ＣＴＬによる殺傷レベルを示す代表例である。ＣＴＬは、ターゲット細胞がＰ１２６ペプチドで被覆されない限り検出されなかった。
【図６Ｄ】（Ｄ）エフェクター／ターゲット細胞比１０：１においてＣＴＬで４時間共培養された精製ＣＤ３４+細胞によるコロニー形成のＣＴＬ媒介阻害。未処理コントロールＣＤ３４+細胞を、ＣＴＬを含まずに同じ条件下で培養した。ＣＴＬ処理および未処理コントロール細胞をメチルセルロース中におき、１４日後にＣＦＵ−ＧＭの数をカウントした。未処理コントロール中に観察されたＣＦＵ−ＧＭを１００％基準として用いてＣＴＬ処理後のＣＦＵ−ＧＭのパーセントを示す。この図は、９人の異なるＨＬＡ−Ａ０２０１+ＣＭＬ患者、７人の異なる正常ドナーに由来するＣＤ３４+、および５人の異なるＨＬＡ−Ａ０２０１-ＣＭＬ患者に由来するＣＤ３４+細胞を用いた、独立した実験の平均と標準偏差を示す。
【図６Ｅ】（Ｅ）高親和性Ｐ１２６特異的ＣＴＬ（ライン８１）または低親和性ＣＴＬ（ライン８５）で、プレーティングの前に、４時間処理されたまたは未処理のＡ０２０１+／ＣＤ３４+ＣＭＬ細胞によるコロニー形成。未処理コントロールに観察されたコロニーの数を１００％の基準として用いてＣＦＵ−ＧＭおよびＢＦＵ−Ｅを示す。
【図６Ｆ】（Ｆ）コールドターゲット競合実験。３０倍過剰のコールドＢＶ１７３およびＣ１Ｒ−Ａ２ターゲットの存在下または不在下で、Ａ０２０１＋ＣＭＬ患者に由来するクロムラベルＣＤ３４＋ターゲットに対する抗Ｐ１２６ＣＴＬによる殺傷を示す。クロムラベルＢＶ１７３およびＣ１Ｒ−Ａ２の殺傷は、比較のために示されている。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下から、一部の適用において、本発明のペプチドが直接的に用いられることがわかる（すなわち、患者の細胞または患者に与えられた細胞においてポリヌクレオチドの発現により産生されるものではない）；そのような適用においては、ペプチドが１００残基未満を有することが好ましい。
【００２７】
本発明のポリペプチドが、ＨＬＡ−Ａ０２０１に結合できることが好ましい；しなしながら、このペプチドは他のＨＬＡタイプおよびＨＬＡ−Ａ０２０１に結合してもよい。特に、ペプチドがＨＬＡ−Ａ０２０１に選択的に結合できることが好ましい。
【００２８】
本発明のペプチドは、特に、ＷＴ１ポリペプチド（Wilms腫瘍遺伝子産物）またはｇａｔａ−１ポリペプチドを異常に発現する細胞を標的とし殺す免疫治療方法において特に使用できる。ｇａｔａ−１ポリペプチドは、一部の遺伝子のプロモーター領域に存在するｇａｔａ−ボックスに結合する転写因子であることから、そのように命名された。それはまた、ＮＦ−ｅ１、ＧＦ−１およびＥｒｙｆ−１とも呼ばれる。アミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬおよびＣＭＴＷＮＱＭＮＬは、それぞれＷＴ１の１２６−１３４および２３５−２４３残基に見られ、アミノ酸配列ＨＬＭＰＦＰＧＰＬＬは、ｇａｔａ−１の３７８−３８７残基に見られる。ＷＴ−１アミノ酸配列は、Gesslerら(1990) Nature 343, 774-778に与えられており、ｇａｔａ−１アミノ酸配列は、Zonら(1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87, 668-672に与えられており、これらの刊行物の両方を参照としてここに含める。
【００２９】
所定のアミノ酸配列からなるこれらの特異的ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ０２０１に結合するので、本発明のペプチドはＨＬＡ−Ａ０２０１に結合し、結合した際に、ＨＬＡ−Ａ０２０１−ペプチド複合体が、適切な抗原提示細胞の表面に提示された際に、本発明の第一および第二の態様のペプチドに関してＷＴ１ポリペプチドのような、そして、本発明の第三の態様のペプチドに関してｇａｔａ−１ポリペプチドのような、所定のアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現する細胞を認識するＣＴＬの産生を引き出すことができるペプチドであることが好ましい。
【００３０】
ＷＴ１ポリペプチドは、白血病、乳ガン、メラノーマおよび卵巣ガンにおいて異常に発現され、ｇａｔａ−１ポリペプチドは白血病において異常に発現される。
【００３１】
“異常に発現”により、ポリペプチドが発現の通常レベルと比較して過剰に発現されること、もしくは、腫瘍においては発現されるが、腫瘍が誘導される組織において遺伝子がサイレントであることを含む。“過剰発現”により、ポリペプチドが、正常細胞に存在するレベルの少なくとも１．２倍、好ましくは少なくとも２倍、さらに好ましくは少なくとも５倍または１０倍のレベルで存在することを意味する。
【００３２】
ＨＬＡ分子に結合するペプチドの最適な長さが約８ないし１２アミノ酸、好ましくは９アミノ酸であることは周知である。
【００３３】
本発明の特に好ましいペプチドは、アミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬまたはＣＭＴＷＮＱＭＮＬまたはＨＬＭＰＦＰＧＰＬＬからなるものである。
【００３４】
１２アミノ酸残基より大きいペプチドがＭＨＣ分子との結合に直接用いられる場合には、コアＨＬＡ結合領域に隣接する残基が、ペプチドがＭＨＣ分子に結合する能力またはＣＴＬにそのペプチドを提示する能力に実質的に影響を与えないものであることが好ましい。しかしながら、特にポリヌクレオチドによってコードされる場合に、より大きなペプチドが用いられることがわかる。なぜなら、これらの大きなペプチドは、適切な抗原提示細胞によって断片化されうるからである。
【００３５】
ペプチド（少なくとも、アミノ酸残基間にペプチド結合を含むもの）は、Luら(1981) J.Org.Chem.46,3433とそこに記載された参考文献に記載されている固相ペプチド合成のＦｍｏｃ-ポリアミドモード(Fmoc-polyamide mode)によって合成されてもよい。一時的Ｎアミノ基保護は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Ｆｍｏｃ)基によって供給される。この高度にベース-置換活性保護基の反復切断は、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンを用いて実行される。側鎖官能性は、そのブチルエーテル（セリン、スレオニンおよびチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸およびアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体（リシンおよびヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システインの場合）および４-メトキシ-２,３,６-トリメチルベンゼンスルホニル誘導体（アルギニンの場合）として保護することができる。グルタミンまたはアスパラギンがＣ末端残基である場合には、側鎖アミド官能性の保護には４,４'-ジメトキシベンズヒドリル基を使用する。固相支持体は、三つのモノマーであるジメチルアクリルアミド（骨格モノマー）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋剤）およびアクリロイルサルコシンメチルエステル（官能化剤）から構成されたポリジメチル−アクリルアミドポリマーをベースとする。使用されたペプチド−樹脂切断可能連結剤は、酸不安定性４-ヒドロキシメチル-フェノキシ酢酸誘導体である。全てのアミノ酸誘導体は、アスパラギンとグルタミンを除いて、予め形成された対称的な無水物誘導体として添加され、これらは、リバースＮ,Ｎ-ジシクロヘキシル-カルボジイミド／１-ヒドロキシベンゾトリアゾル媒介カップリング処理を用いて加えられる。全てのカップリングおよび脱保護化反応は、ニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸、またはイソチン(isotin)テスト処理を用いて観察される。合成の完了時に、５０％のスカベンジャーミックスを含む９５％のトリフルオロ酢酸で処理することにより、側鎖保護基の付随した除去とともに、ペプチドを樹脂支持体から切断する。一般的に用いられるスカベンジャーは、エタンジチオール、フェノール、アニソールおよび水であり、その的確な選択は合成されるペプチドの構成アミノ酸に基づく。ト
リフルオロ酢酸は、真空で蒸発させることによって除去され、その後のジエチルエーテルを用いた摩砕が粗製ペプチドを与える。存在する全てのスカベンジャーを単純な抽出方法で除去する。水相の凍結乾燥により、スカベンジャーを含まない粗製ペプチドを与える。ペプチド合成のための試薬は、一般的にCalbiochem-Novabiochem(UK)Ltd,Nottingham NG7 2QJ, UKから入手できる。精製は、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび、（主に）逆相高速液体クロマトグラフィーのような技術のいずれか一つまたは組み合わせにより行うことができる。ペプチドの分析は、薄相クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析および高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析を用いて行うことができる。
【００３６】
本発明のさらなる態様は、本発明の第一、第二または第三の態様に定義されたペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡとすることができ、前記ペプチドをコードする限りイントロンを含んでも含まなくてもよい。もちろん、それは、ポリヌクレオチドにコードされうる、天然に生じるペプチド結合によって結合された天然に生じるアミノ酸残基を含むペプチドのみである。
【００３７】
本発明のさらなる態様は、本発明の第一または第二または第三の態様にかかるポリペプチドを発現することができる発現ベクターを提供する。
【００３８】
例えば相補付着末端を介して、ベクターに、ＤＮＡのようなポリヌクレオチドを結合するために、種々の方法が開発されている。例えば、相補的ホモポリマー領域を、ベクターＤＮＡに挿入されるＤＮＡセグメントに付加することができる。次いで、ベクターおよびＤＮＡセグメントが、相補ホモポリメリックテイル間の水素結合によって結合され、組み換えＤＮＡ分子を形成する。
【００３９】
一以上の制限部位を有する合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに結合させる別の方法を提供する。上記のエンドヌクレアーゼ制限切断によって生じたＤＮＡセグメントを、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼまたはE.coli ＤＮＡポリメラーゼＩで処理する。これらの酵素は、突出した３’一本鎖末端を３’-５’エキソヌクレアーゼ活性で除去し、欠けた３’端をポリメラーゼ活性で満たす。
【００４０】
これらの活性の組み合わせにより、平滑末端のＤＮＡセグメントを形成することができる。この平滑末端セグメントを、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼのような、平滑末端ＤＮＡ分子のライゲーションを触媒することができる酵素の存在下で大過剰のリンカー分子と共にインキュベートする。かくして、この反応産物は、端部にポリメリックリンカー配列を備えたＤＮＡセグメントである。これらのＤＮＡセグメントは、適切な制限酵素で切断され、ＤＮＡセグメントの端部と適合する端部を生じる酵素で切断された発現ベクターにライゲートされる。
【００４１】
種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、International Biotechnologies Inc,New Haven, CN,USAを含む多数の源から商業的に入手可能である。
【００４２】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを修飾するのに望ましい方法は、Saikiら(1988) Science 239,487-491に記載されたポリメラーゼ連鎖反応を用いることである。この方法は、例えば、適切な制限部位において工作することにより、適切なベクターにＤＮＡを導入するために用いることができ、また、当該技術分野において公知であるような他の使用できる方法でＤＮＡを修飾するために用いることができる。
【００４３】
この方法では、酵素により増幅されるＤＮＡは、増幅されたＤＮＡにそれ自身が取り込まれる二つの特異的プライマーによって隣接される。この特異的プライマーは、当該技術分野において公知の方法を用いて発現ベクターにクローニングするために用いられる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。
【００４４】
ＤＮＡ（または、レトロウイルスベクターの場合にはＲＮＡ）を、本発明の化合物を含むポリペプチドを産生する適切な宿主において発現させる。かくして、本発明の化合物を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡが、ここに含まれる教示から適切に変更された公知の技術に従って、発現ベクターを構成するために用いられてもよい。この発現ベクターは、本発明のポリペプチドの発現および産生に適した宿主細胞をトランスフォームするために用いられる。かかる技術は、Rutterらに1984年４月３日に発せられた米国特許第4440859号、Weissmanに１９８５年７月２３日に発せられた第4530901号、Crowlに１９８６年４月１５日に発せられた第4582800号、Markらに１９８７年６月３０日に発せられた第4677063号、Goeddelに１９８７年７月７日に発せられた第4678751号、Itakuraらに１９８７年１１月３日に発せられた第4704362号、Murrayに１９８７年１２月１日に発せられた第4710463号、Toole,Jr.らに１９８８年７月１２日に発せられた第4757006号、Goeddelらに１９８８年８月２３日に発せられた第4766075号、およびStalkerに１９８９年３月７日に発せられた第4810648号に開示された技術を含み、これらの全てを参照としてここに含める。
【００４５】
本発明の化合物を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡ（レトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）が、適切な宿主に導入するために広範囲の他のＤＮＡ配列に結合されてもよい。コンパニオンＤＮＡは、宿主の性質、宿主へのＤＮＡの導入方法、およびエピソームメンテナンスまたはインテグレーションが望ましいかどうかに依存する。
【００４６】
一般に、ＤＮＡは、プラスミドのような発現ベクターに、発現に適切な配向および正しい読み枠で挿入される。必要であれば、ＤＮＡは、所望の宿主によって認識される適切な転写および翻訳制御コントロールヌクレオチド配列に結合されてもよいが、かかるコントロールは一般的に発現ベクターにおいて利用可能である。次いで、このベクターを、通常の技術を介して宿主に導入する。一般的に、全ての宿主がベクターによりトランスフォームされるわけではない。それゆえ、トランスフォームされた宿主細胞を選別する必要がある。選別技術の一つは、必要なコントロール成分と共に、抗生物質耐性のような、トランスフォームされた細胞において選別可能な特徴をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに取り込むことを含む。あるいは、かかる選別可能な性質の遺伝子が、所望の宿主細胞をコトランスフォームするために用いられる別のベクターに存在してもよい。
【００４７】
本発明の組み換えＤＮＡによりトランスフォームされた宿主細胞を、ここに開示した技術の観点から当業者に公知の適切な条件下および十分な時間にわたって培養して、ポリペプチドを発現させ、次いで回収する。
【００４８】
細菌（例えば、E.coliおよびBacillus subtilis）酵母（例えば、Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌類（例えば、Aspergillus）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を含む、多くの発現システムが知られている。
【００４９】
通常、ベクターは、原核生物における増殖のために、そして、他の非原核細胞タイプにおける発現のために用いられる場合でさえも、ColE1 oriのような原核生物のレプリコンを含む。ベクターは、形質転換された、E.coliのような細菌性宿主細胞において遺伝子を発現（転写および翻訳）させることができる原核プロモーターのような適切なプロモーターを含むこともできる。
【００５０】
プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼを結合させ、転写を開始させるＤＮＡ配列によって形成された発現コントロール成分である。典型的な細菌性宿主と適合するプロモーター配列は、本発明のＤＮＡセグメントの挿入に都合のよい制限部位を含むプラスミドベクターに設けられる。
【００５１】
通常の原核生物のベクタープラスミドは、Biorad Laboratories(Richmond,CA,USA)から入手可能なｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９と、Pharmacia, Piscataway,NJ,USAから入手可能なｐＴｒｃ９９ＡおよびｐＫＫ２２３−３である。
【００５２】
通常の哺乳動物細胞ベクタープラスミドは、Pharmacia,Piscataway,NJ,USAから入手可能なｐＳＶＬである。このベクターは、クローン化遺伝子の発現を誘導するためにＳＶ４０後期プロモーターを用い、最高レベルの発現が、ＣＯＳ-１細胞のようなＴ抗原産生細胞に見られる。
【００５３】
誘導できる哺乳動物発現ベクターの例はｐＭＳＧであり、これもPharmaciaから入手できる。このベクターは、クローン化遺伝子の発現を引き起こすために、マウス乳房腫瘍ウイルス長期リピートのグルココルチコイド誘導プロモーターを用いる。
【００５４】
使用できる酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、一般的に、Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USAから入手できる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、およびｐＲＳ４０６は、酵母統合プラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を取り込む。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は酵母セントロメアプラスミド（Ｙｃｐ）である。
【００５５】
他のベクターおよび発現システムは、種々の宿主細胞を用いた使用について当該技術分野において周知である。
【００５６】
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドベクター構成物でトランスフォームされた宿主細胞に関する。宿主細胞は原核生物または真核生物とすることができる。細菌細胞は、一部の状況では原核生物宿主細胞が好ましく、通常は、E.coliの株、例えば、Bethesda Research Laboratories Inc.,Bethesda,MD,USAから入手可能なE.coli株ＤＨ５およびRockville,MD,USAのAmerican Type Culture Collection(ATCC)から入手できるＲＲ１（No ATCC 31343）である。好ましい真核生物宿主細胞は、酵母、昆虫および哺乳動物細胞、好ましくは、マウス、ラット、サルまたはヒトの繊維芽細胞および腎臓細胞系統のような脊椎動物細胞を含む。酵母宿主細胞は、Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037,USAから入手できるＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１を含む。好ましい哺乳動物宿主細胞は、ＣＣＬ６１としてＡＴＣＣから入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＲＬ１６５８としてＡＴＣＣから入手可能なＮＩＨ Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、ＣＲＬ１６５０としてＡＴＣＣから入手可能なサル腎臓誘導ＣＯＳ−１細胞、および、ヒト胚腎臓細胞である２９３細胞を含む。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターでトランスフェクションされうるＳｆ９細胞である。
【００５７】
本発明のＤＮＡ構成物を用いた適切な細胞宿主のトランスフォーメーションは、用いられるベクターのタイプに依存する周知の方法によって行われる。原核生物宿主細胞のトランスフォーメーションに関しては、例えば、Cohenら(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA69,2110およびSambrookら(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,NYを参照。酵母細胞のトランスフォーメーションは、Shermanら(1986)Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NYに記載されている。Beggs(1978)Nature 275,104-109の方法も使用できる。脊椎動物細胞に関して、かかる細胞をトランスフェクションするのに使用できる試薬、例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ-デキストランまたはリポソームフォーミュレーションは、Stratagene Cloning SystemsまたはLife Technologies Inc.,Gaithersburg,MD 20877, USAから入手できる。
【００５８】
エレクトロポレーションも、細胞をトランスフォームおよび／またはトランスフェクトするのに使用でき、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞および脊椎動物細胞をトランスフォームするのに、当該技術分野において周知である。
【００５９】
例えば、多くの細菌種が、参照としてここに含めるLuchanskyら（１９８８）Mol.Microbiol.2,637-646に記載された方法によりトランスフォームされる。最大数のトランスフォーマントは、一貫して、２５μＦＤにおいてｃｍ当たり６２５０Ｖを用いて２．５Ｘ ＰＥＢに懸濁されたＤＮＡ-細胞混合物のエレクトロポレーション後に回収される。
【００６０】
エレクトロポレーションによる酵母のトランスフォーメーション方法は、Becker&Guarente (1990) Metholds Enzymol.194,182に記載されている。
【００６１】
首尾よくトランスフォームした細胞、すなわち本発明のＤＮＡ構成物を含む細胞は、周知の技術により同定することができる。例えば、本発明の発現構成物の導入から得られた細胞は、増殖して本発明のポリペプチドを生じる。細胞を回収して溶解し、そのＤＮＡ内容物を、Southern(1975)J.Mol.Biol.98,503またはBerentら(1985)Biotech.3,208に記載されている方法を用いてＤＮＡの存在について試験することができる。あるいは、上清におけるタンパクの存在を、以下の抗体を用いて検出することができる。
【００６２】
組み換えＤＮＡの存在を直接アッセイすることに加えて、組み換えＤＮＡがタンパクの発現に向けられる場合には、トランスフォーメーションの成功を、周知の免疫学的方法によって確認できる。例えば、発現ベクターで首尾よくトランスフォームした細胞は、適切な抗原性を示すタンパクを産生する。トランスフォームされたと思われる細胞のサンプルを、回収し、適切な抗体を用いてタンパクをアッセイする。
【００６３】
かくして、トランスフォームされた宿主細胞自身の他に、本発明は、これらの細胞の培養物、好ましくはモノクローナル（クローンとして均質）培養物、または栄養培地におけるモノクローナル培養から誘導された培養物をも含む。
【００６４】
本発明の一部の宿主細胞、例えば、細菌、酵母および昆虫の細胞が、本発明のペプチドの調製に使用できることも考えられる。しかしながら、他の宿主細胞は、一部の治療方法に使用できる。例えば、抗原提示細胞、例えば樹状細胞は、本発明のペプチドを発現し、適切なＭＨＣ分子に結合するために使用できる。
【００６５】
本発明のさらなる態様は、本発明の第一、第二または第三の態様のペプチドを産生する方法を提供することであり、この方法は、ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む宿主細胞を培養し、宿主細胞または培養培地からペプチドを得ることを含む。
【００６６】
本発明のさらなる態様は、薬学的に許容できるキャリアーと、本発明の第一、第二または第三の態様にかかるペプチドまたはかかるペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む薬学的組成物を提供する。この薬学的製剤は、患者への投与に適した形態に調製され、無菌でありかつ発熱物質を含まない。本発明のさらなる態様は、本発明の第一、第二または第三の態様にかかるペプチド、またはかかるペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは発現ベクターを、薬剤における使用のために提供する。このペプチドまたはポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、収容されて、薬剤における使用のために提供される。
【００６７】
薬学的組成物、または収容および提示は、適切な形態とすることができる。適切な形態が静脈（i.v.）注射、皮下（s.c.）注射、皮内（i.d.）注射、腹腔内（i.p.）注射、筋肉内（i.m.）注射用であることが考えられる。
【００６８】
ペプチド注射の好ましい方法は、s.c.、i.d.、i.p.、i.m.そしてi.v.である。
【００６９】
ＤＮＡ注射の好ましい方法は、i.d.、i.m.、s.c.、i.p.そしてi.v.である。
【００７０】
１ないし５００ｍｇのペプチドまたはＤＮＡの投与量を与えることができる。
【００７１】
本発明のさらなる態様は、本発明の第一、第二または第三態様のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現する、患者の標的細胞を殺す方法を提供するものであって、この方法は、患者に、有効量の、本発明の第一、第二または第三態様のいずれかにかかるペプチドを投与すること、あるいは、前記ペプチドをコードする発現ベクターまたはポリヌクレオチドの有効量を投与することを含み、前記ペプチドの量またはポリヌクレオチドまたは発現ベクターの量は、前記患者の抗ターゲット細胞免疫応答を誘発するのに有効な量である。
【００７２】
ターゲット細胞は、通常、腫瘍またはガン細胞である。通常、腫瘍またはガン細胞は、ＷＴ１またはｇａｔａ−１を異常に発現する細胞である。
【００７３】
ペプチドまたはペプチドをコードする核酸は、腫瘍またはガンワクチンを構成する。患者に直接、影響を受けた器官または全身的に投与されてもよく、患者またはヒト細胞系統から誘導された細胞にex vivoで適用され、その後患者に投与されてもよく、また、患者から誘導された免疫細胞から部分集団を選別するためにin vitroで用いられ、次いで患者に再投与されてもよい。核酸がin vitroで細胞に投与される場合には、細胞が、インターロイキン-２のような免疫刺激サイトカインを共発現するようにトランスフェクションされることが有益である。ペプチドは実質的に純粋であっても、Detoxのような免疫刺激アジュバントと組み合わされてもよく、免疫刺激サイトカインと組み合わせて用いられてもよく、また、リポソームのような適切なデリバリーシステムと共に投与されてもよい。また、ペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはマンナンのような適切なキャリアーと組み合わされてもよい（WO95/18145およびLongeneckerら(1993)Ann.NY Acad.Sci.690,276-291参照）。また、このペプチドは、ダグが付されるか、融合タンパクとされるか、ハイブリッド分子とされてもよい。本発明の第一、第二または第三態様にその配列が与えられたペプチドは、ＣＤ８ ＣＴＬを刺激することが期待される。しかしながら、刺激はＣＤ４Ｔ細胞によって提供される助けがあるとさらに効率的である。かくして、ハイブリッド分子の融合パートナーまたはセクションは、ＣＤ４Ｔ細胞を刺激するエピトープを適切に提供する。ＣＤ４刺激エピトープは、当該技術分野において周知であり、破傷風トキソイドに同定されるものを含む。ポリヌクレオチドは、実質的に純粋であっても、適切なベクターまたはデリバリーシステムに含まれてもよい。適切なベクターおよびデリバリーシステムは、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ関連ウイルス、または一以上のウイルスの成分を含むハイブリッドに基づくシステムのようなウイルス性のものを含む。非ウイルス性デリバリーシステムは、ＤＮＡデリバリーの分野で周知であるようなカチオン脂質およびカチオンポリマーを含む。物理的デリバリー、例えば、“遺伝子銃”を介するものも使用できる。ペプチドま
たは核酸によってコードされるペプチドは、例えば、ＣＤ４Ｔ細胞を刺激する破傷風トキソイドのエピトープとの融合タンパクであってもよい。
【００７４】
ガンワクチンに使用されるペプチドは、適切なペプチドであってもよい。特に、適切な９マーのペプチド、または適切な７マーまたは８マーまたは１０マーのペプチドとすることができる。また、より長いペプチドも適しているが、９マーまたは１０マーのペプチドが好ましい。ガンワクチンが、ＷＴ１を発現するガンに関して用いられる場合には、本発明の第一および第二の態様の両方のペプチドを用いる、あるいは、本発明の第一および第二の態様に記載された両方の配列を含む一つのペプチドを用いることが有利である。
【００７５】
患者に投与される核酸が無菌かつ発熱性物質を含まないことが適切である。裸のＤＮＡは、筋肉内、皮内または皮下に投与できる。ペプチドは、筋肉内、皮内または皮下に投与できる。
【００７６】
ワクチン接種は、プロフェッショナル抗原提示細胞により刺激されたＣＴＬ応答をもたらし、ＣＴＬが刺激されると、腫瘍細胞におけるＭＨＣ発現を増強する利点が存在する。
【００７７】
注入部位、ターゲッティングベクターおよびデリバリーシステムの使用、または、患者からかかる細胞集団を選択的に精製してペプチドまたは核酸をex vivo投与することのいずれかによって、ワクチンを、例えば抗原提示細胞のような特異的細胞集団に向けることも有益である（例えば、樹状細胞をZhouら(1995) Blood86,3295-3301;Rothら(1996)Scand.J.Immunology 43,646-651に記載されているように選別してもよい）。例えば、ダーゲッティングベクターは、適切な場所において抗原を発現させる組織-または腫瘍-特異的プロモーターを含んでもよい。
【００７８】
治療が施される患者は、ＷＴ１またはｇａｔａ−１の過剰発現または異常発現（両方とも異常な発現）のタイプの腫瘍を有しうる。
【００７９】
それゆえ、本発明のさらなる態様は、ガン、またはガンまたは腫瘍細胞に有効なワクチンを提供することであり、これは、本発明の第一、第二または第三の態様のいずれか一つにかかるペプチドの有効量を含むか、かかるペプチドをコードする核酸を含む。
【００８０】
ワクチンが核酸ワクチンであることが特に好ましい。あるポリペプチドをコードするＤＮＡワクチンのような核酸ワクチンを用いた接種が、Ｔ細胞反応を導くことが知られている。
【００８１】
都合よく、核酸ワクチンは、適切な核酸デリバリー手段を含んでもよい。核酸、好ましくはＤＮＡは、裸であってもよく（すなわち、投与される他の成分を実質的に含まない）、また、リポソーム中またはウイルスベクターデリバリーシステムの一部としてデリバリーされてもよい。
【００８２】
樹状細胞による核酸の取り込みおよびコードされたポリペプチドの発現が、免疫応答の開示のメカニズムであってもよい；しかしながら、樹状細胞はトランスフェクションされなくてもよいが、組織のトランスフェクションされた細胞から発現されたペプチドをピックアップするかもしれないので、重要である。
【００８３】
ＤＮＡワクチンのようなワクチンを筋肉内に投与することが好ましい。また、皮膚にワクチンが投与されることも好ましい。
【００８４】
核酸ワクチンはアジュバントを含まずに投与されてもよい。また、核酸ワクチンは、ＢＣＧまたはミョウバンのようなアジュバントと共に投与されてもよい。他の適切なアジュバントは、サポニン、マイコバクテリウム抽出物、および合成細菌性細胞壁模造体から誘導されるAquila QS21スティミュロン(stimulon)（Aquila Biotech,Worcester,MA,USA）およびRibi's Detoxのようなプロプリエトリー(proprietory)アジュバントを含む。別のサポニン誘導アジュバントであるQuil Aも使用できる（Superfos,Denmark）。核酸ワクチンがアジュバントなしで投与されることが好ましい。
【００８５】
Freund'sのような別のアジュバントも使用できる。また、好ましくはアジュバントと共に、キーホールリンペットヘモシアニンと複合体形成したペプチドを得ることも有益である。
【００８６】
ガンのポリヌクレオチド媒介免疫治療は、Conryら(1996)Seminars in Oncology 23,135-147; Condonら (1996) Nature Medicine 2,1122-1127; Gongら(1997)Nature Medicine 3,558-561; Zhaiら(1996) J.Immunol.156,700-710; Grahamら(1996)Int J. Cancer 65,664-670;およびBurchellら(1996)pp 309-313 In:Breast Cancer, Advances in biology and therapeutics, Calvoら(eds),Jhon Libbey Eurotextに記載されており、これら全てが参照としてここに含められる。
【００８７】
本発明のさらなる態様は、本発明の第一、第二または第三の態様にかかるペプチド、もしくはかかるペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは発現ベクターの、本発明の第一、第二または第三の態様に定義されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現する患者のターゲット細胞を殺すための薬剤の製造における使用を提供するものである。
【００８８】
かくして、薬剤は、ＷＴ１またはｇａｔａ−１を異常に発現するガンを治療するために使用できる。
【００８９】
本発明のさらなる態様は、in vitroにおいて活性化細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を産生する方法であり、この方法は、in vitroにおいて、前記ＣＴＬを抗原特異的に活性化するのに十分な時間、適切な抗原提示細胞の表面に発現された抗原-結合ヒトクラスＩ ＭＨＣ分子とＣＴＬとを接触させることを含み、ここで、前記抗原は、本発明の第一、第二または第三の態様にかかるペプチドである。
【００９０】
ＣＴＬはＣＤ８+細胞であるが、ＣＤ４+細胞であってもよい。ＭＨＣクラスＩ分子は、適切な細胞の表面に発現され、その細胞がＭＨＣクラスＩ分子を自然に発現しないもの（この場合、かかる分子を発現するように細胞がトランスフェクションされる）であるか、抗原処理または抗原提示経路に欠陥を有するものが好ましい。このように、ＭＨＣクラスＩ分子を発現する細胞は、ＣＴＬを活性化する前に選択されたペプチド抗原で実質的に完全に開始されうる。
【００９１】
抗原提示細胞（または刺激細胞）は、通常、その表面にＭＨＣクラスＩ分子を有し、好ましくは、自然には、選択された抗原をＭＨＣクラスＩ分子に結合することができない。以下に詳細に記載するように、ＭＨＣクラスＩ分子は、in vitroにおいて選択された抗原と容易に結合されてもよい。
【００９２】
前記抗原提示細胞は、少なくとも一部の前記選択された分子がペプチドである場合、前記ＭＨＣクラスＩ分子に結合されないような、ペプチドトランスポーターの発現に欠陥のある哺乳動物細胞であると都合がよい。
【００９３】
好ましくは、哺乳動物細胞が、ＴＡＰペプチドトランスポーターを欠失しているか、低下したレベル、または低下した機能で有する。ＴＡＰペプチドトランスポーターを欠失した適切な細胞は、Ｔ２、ＲＭＡ-Ｓおよびショウジョウバエの細胞を含む。ＴＡＰとは、抗原処理に関連したトランスポーター(Transporter Associated with antigen Processing)である。
【００９４】
かくして、細胞がショウジョウバエのような昆虫細胞であると都合がよい。
【００９５】
ヒトペプチド結合欠陥細胞系統Ｔ２は、American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USAからCatalogue No CRL 1992のもとに入手でき、ショウジョウバエ細胞系統Schneider系統２は、ATCCからCatalogue No CRL 19863のもとに入手でき、マウスＲＭＡ−Ｓ細胞系統は、KarreとLjunggren (1985)J.Exp.Med.162,1745に記載されており、参照としてここに含める。
【００９６】
好ましい実施態様では、刺激細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子を発現することができる核酸分子でトランスフェクションされた宿主細胞（例えば、Ｔ２、ＲＭＡ−Ｓまたはショウジョウバエ細胞）である。Ｔ２およびＲＭＡ−Ｓ細胞は、ＨＬＡクラスＩ分子をトランスフェクション前に発現するが、ペプチドと結合しない。
【００９７】
哺乳動物細胞は、当該技術分野において周知の方法によってトランスフェクションされうる。ショウジョウバエ細胞は、Jacksonら(1992) proc.Natl.Acad.Sci.USA 89, 12117に記載されているようにトランスフェクションすることができ、参照としてここに含める。
【００９８】
好ましくは、トランスフェクション前に前記宿主細胞は、実質的にＭＨＣクラスＩ分子を全く発現しない。
【００９９】
刺激細胞が、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ３のいずれかのようなＴ細胞共刺激に重要な分子を発現することも好ましい。
【０１００】
多数のＭＨＣクラスＩ分子、および共刺激分子の核酸配列は、GenBankおよびEMBLデータベースから公的に入手可能である。
【０１０１】
前記刺激細胞の表面に発現された実質的に全てのＭＨＣクラスI分子が、同じタイプであることが特に好ましい。
【０１０２】
ヒトのＨＬＡクラスＩおよび他の動物における等価物は、遺伝的に非常に複雑である。例えば、ＨＬＡ−Ｂ座の少なくとも１１０のアレルと、ＨＬＡ−Ａ座の少なくとも９０のアレルが存在する。ＨＬＡクラスＩ（または等価）分子は本発明の態様において使用できるが、ヒトの集団において適度に高頻度で生じるＨＬＡクラスＩ分子において少なくとも一部の選択された分子を示すことが好ましい。ＨＬＡクラスＩアレルの頻度が、カフカス人、アフリカ人、中国人等の異なる民族のグループ間で異なることが周知である。少なくともカフカス人に関する限り、ＨＬＡクラスＩ分子がＨＬＡ−Ａ２アレル、ＨＬＡ−Ａ１アレル、ＨＬＡ−Ａ３アレル、またはＨＬＡ−Ｂ２７アレルにコードされる。ＨＬＡ−Ａ２が特に好ましい。
【０１０３】
さらなる態様において、ＨＬＡ分子の組み合わせも用いることができる。例えば、ＨＬＡ−Ａ２とＨＬＡ−Ａ３との組み合わせは、カフカス人の７４％をカバーする。
【０１０４】
多重ＣＤ８ ＣＴＬエピトープのデリバリーのための組み換えポリエピトープワクチンの使用は、Thomsonら(1996) J.Immunol.157, 822-826およびＷＯ９６／０３１４４に記載されており、これらの両方を参照としてここに含める。本発明に関して、一つのワクチンにペプチド（またはペプチドをコードする核酸）を含むことが望ましく、ここでペプチドは、任意の順で、アミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ、ＨＬＭＰＦＰＧＰＬＬおよびＣＤ４ Ｔ細胞刺激エピトープ（例えば破傷風トキソイド由来）を含む。かかるワクチンは、ＷＴ−１およびｇａｔａ−１を発現するガンを治療するために特に有益である。かかる“ビーズ・オン・ストリング(bead on a string)”ワクチンは、通常、ＤＮＡワクチンである。
【０１０５】
ＣＴＬ（ＣＤ８+細胞）を活性化する簡単な方法は、ＷＯ９３／１７０９５に記載されており、参照としてここに含める。ＷＯ９３／１７０９５の方法は、同系の（すなわち、自己の）ＨＬＡクラスＩ分子によって提示されるペプチドに対してＣＴＬを生じる。
【０１０６】
別の多数の方法が、in vitroでＣＴＬを生じるために用いられてもよい。例えば、Peoplesら(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,432-436およびKawakamiら(1992) J.Immunol.148,638-643に記載されている方法は、ＣＴＬ産生において自己の腫瘍浸潤リンパ球を用いる。Plebanskiら(1995)Eur.J.Immunol.25,1783-1787は、ＣＴＬの調製において自己の末梢血液リンパ球（ＰＬＢ）を利用する。Jochmusら(1997) J.Gen.Virol.78,1689-1695は、樹状細胞をペプチドまたはポリペプチドを用いてパルスすること、あるいは、組み換えウイルスで感染させることによる、自己のＣＴＬの産生を記載する。
【０１０７】
Hillら(1995) J.Exp.Med.181, 2221-2228およびJeromeら(1993) J.Immunol.151,1654-1662は、自己ＣＴＬの産生にＢ細胞を利用する。さらに、ペプチドまたはポリペプチドでパルスした、あるいは、組み換えウイルスで感染したマクロファージが、自己ＣＴＬの調製に使用されてもよい。
【０１０８】
同種細胞もＣＴＬの調製に使用でき、この方法はＷＯ９７／２６３２８に詳細に記載されており、参照としてここに取り込む。例えば、ショウジョウバエ細胞およびＴ２細胞に加えて、ＣＨＯ細胞、バキュロウイルス感染昆虫細胞、細菌、酵母、ワクシニア感染ターゲット細胞のような他の細胞が、抗原を提示するために用いられてもよい。さらに、植物ウイルスを用いてもよい（例えば、Portaら(1994) Virology 202,449-955参照、外因ペプチドの提示に関する高い収量のシステムとしてカウピーモザイクウイルスの発達について記載）。
【０１０９】
ＣＴＬが本発明のペプチドに関してアロＭＨＣ制限されるように、同種細胞がＣＴＬの調製に用いられることが好ましい。ＣＴＬがＨＬＡ−Ａ０２０１陰性患者に由来し、かつ、ペプチドが抗原提示細胞によりＨＬＡ−Ａ０２０１クラスＩ分子によって提示されることが特に好ましい。
【０１１０】
外因的に適用されたペプチドは、ＣＴＬによる提示のためのＭＨＣクラスＩ経路に向けるために、ＨＩＶ tatペプチドに連結されてもよい（例えば、Kimら(1997) J.Immunol. 159, 1666-1668参照）。
【０１１１】
本発明のペプチドに向けられた活性化ＣＴＬを、治療に使用することができる。かくして、本発明のさらなる態様は、本発明の上記方法により得られた活性化ＣＴＬを提供する。
【０１１２】
本発明のさらなる態様は、本発明の第一、第二または第三の態様に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する活性化ＣＴＬを提供する。好ましくは、ＣＴＬは、本発明の第一、第二または第三の態様のいずれかに定義されたペプチドに結合することにより前記細胞を認識する。
【０１１３】
ＣＴＬは、患者においてターゲット細胞を殺す方法に使用できる。この方法において、ターゲット細胞は、本発明の第一、第二または第三の態様のいずれか一つに記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現するものであり、患者には、有効数の活性化ＣＴＬが投与される。
【０１１４】
患者に投与されるＣＴＬは、患者から誘導され、上記のように活性化される（すなわち、これらは自己のＣＴＬである）。あるいは、ＣＴＬは患者由来ではないが、別の個人から由来するものである。もちろん、その個人が健康な個人であることが好ましい。“健康な個人”により、その個人が一般的に健康であり、好ましくは、反応性の免疫系を備え、さらに好ましくは、容易に試験または検出できるあらゆる疾病を患っていないことを意味する。この実施態様において、ＣＴＬは、ＨＬＡクラスＩ分子が患者のそれとミスマッチである個人から誘導されたものである。かくして、ＣＴＬがアロ制限(allo-restricted)されることが好ましい。アロ制限されたＣＴＬを用いた治療は、本願出願人の先の出願WO97/26328に記載されており、参照としてここに取り込む。
【０１１５】
かくして、本発明の方法は、養子免疫療法を含む。
【０１１６】
活性化ＣＴＬは、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を含み、これは、異常なポリペプチドを発現する細胞を認識することに関係する。ＴＣＲをコードするｃＤＮＡが活性化ＣＴＬからクローン化され、発現のためのさらなるＣＴＬに導入されることが有益である。
【０１１７】
本発明の第一、第二または第三の態様のペプチドに特異的な本発明のＣＴＬクローンのＴＣＲ（アロ制限または自己制限）がクローン化される。ＣＴＬクローンにおけるＴＣＲ用途は、（i）ＴＣＲ可変領域特異的モノクローナル抗体および（ii）ＶαおよびＶβ遺伝子ファミリーに特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを用いて調べられる。ｃＤＮＡライブラリーは、ＣＴＬクローンから抽出されたポリＡ ｍＲＮＡから調製される。ＴＣＲαおよびβ鎖のＣ末端部位および同定されたＶαおよびβセグメントのＮ末端部位に特異的なプライマーが用いられる。ＴＣＲαおよびβ鎖の完全なｃＤＮＡを、高い忠実度のＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅し、その増幅産物を適切なクローニングベクターにクローン化する。クローン化αおよびβ鎖遺伝子は、Chungら(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91, 12654-12658に記載された方法によって一本鎖ＴＣＲにアセンブルされてもよい。この一本鎖構成物において、ＶαＪセグメントの後にＶβＤＪセグメントが存在し、さらにその後にＣβセグメント、ＣＤ３ζ鎖のトランスメンブレンおよび細胞質セグメントが続く。次いで、この一本鎖ＴＣＲを、レトロウイルス発現ベクターに挿入する（ベクターのパネルが、成熟ヒトＣＤ８+Ｔリンパ球を感染および遺伝子発現を媒介する能力に基づいて用いられてもよい：レトロウイルスベクターシステムＫａｔが好ましい（Finerら(1994) Blood 83,43参照））。高力価両栄養性レトロウイルスが、参照としてここに含めるRobertsら(1994) Blood 84, 2878-2889に記載されているプロトコールに従って、腫瘍患者の末梢血液から単離された精製されたＣＤ８+Ｔリンパ球を感染するために用いられる。抗ＣＤ３抗体は、精製されたＣＤ８+Ｔ細胞の増殖を開始するために用いられ、レトロウイルスの統合と一本鎖ＴＣＲの安定な発現を容易にする。レトロウイルス形質導入の効率は、一本鎖ＴＣＲに特異的な抗体で感染ＣＤ８+Ｔ細胞を染色することにより調べられる。形質導入されたＣＤ８+Ｔ細胞のin vitro分析は、それらが、ＴＣＲ鎖が最初にクローン化されたアロ制限ＣＴＬクローンで見られるものと同じ腫瘍特異的殺傷を示すことを確証する。予期される特異性を備えた形質導入された
ＣＤ８+Ｔ細胞の集団は、腫瘍患者の養子免疫療法に使用できる。患者は、１０8〜１０11（好ましくは１０9−１０10）の間の自己の、形質導入されたＣＴＬで治療されうる。
【０１１８】
ＣＴＬに遺伝子を導入するのに適した他のシステムは、Moritzら(1994) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91, 4318-4322に記載されており、参照としてここに含める。Eshharら(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90, 720-724とHwuら(1993) J.Exp.Med.178,361-366もＣＴＬのトランスフェクションについて記載している。
【０１１９】
かくして本発明のさらなる態様は、本発明の第一、第二または第三の態様のいずれか一つに与えられたアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現する細胞を認識するＴＣＲを提供するものであり、ＴＣＲは活性化されたＣＴＬから得られたものである。
【０１２０】
ＴＣＲに加えて、ＴＣＲと機能的に等価な分子が、本発明に含まれる。これらは、ＴＣＲと同じ機能を行うことができるＴＣＲに機能的に等価な分子を含む。特に、かかる分子は、参照としてここに含めるChungら(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,12654-12658に記載された方法により製造された遺伝的に操作された３ドメイン一本鎖ＴＣＲを含む。
【０１２１】
また、本発明は、ＴＣＲまたは機能的に等価な分子をコードするポリヌクレオチド、ＴＣＲまたは機能的に等価な分子をコードする発現ベクターを含む。本発明のＴＣＲを発現するのに適した発現ベクターは、本発明のペプチドの発現に関して上述したものを含む。しかしながら、発現ベクターが、トランスフェクション後にＣＴＬにおいてＴＣＲを発現できるものであることが好ましい。
【０１２２】
本発明のさらなる態様は、本発明の第一、第二または第三の態様のいずれかに記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現するターゲット細胞を患者において殺す方法を提供するものであり、この方法は、（１）患者からＣＴＬを得る工程、（２）上記の、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチド、または機能的に等価な分子を、前記細胞に導入する工程、および（３）患者において工程（２）で産生された細胞を導入する工程を含む。
【０１２３】
本発明のさらなる態様は、本発明の第一、第二または第三の態様に定義されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現する標的細胞を患者において殺す方法を提供するものであり、この方法は、（１）樹状細胞のような抗原提示細胞を患者から得る工程、（２）前記抗原提示細胞を本発明の第一、第二または第三の態様に記載されたペプチド、またはかかるペプチドをコードするポリヌクレオチドと、ex vivoで接触させる工程、および（３）このように処理された抗原提示細胞を患者に再導入する工程を含む。
【０１２４】
好ましくは、抗原提示細胞は、樹状細胞である。
【０１２５】
樹状細胞は、抗原ペプチドでパルスされた自己樹状細胞であることが適切である。抗原ペプチドは、適切なＴ細胞応答を生じる適切な抗原ペプチドとすることができる。腫瘍関連抗原からのペプチドでパルスされた自己樹状細胞を用いたＴ細胞治療は、Murphyら(1996)The Prostate 29, 371-380とTjuaら(1997) The Prostate 32, 272-278に記載されている。
【０１２６】
さらなる態様では、樹状細胞のような抗原提示細胞は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドと接触される。ポリヌクレオチドは、適切なポリヌクレオチドとすることができ、樹状細胞を形質導入し、かくしてペプチドの提示および免疫誘導をもたらすことができることが好ましい。
【０１２７】
都合よく、ポリヌクレオチドは、ウイルスポリヌクレオチドまたはウイルスに含まれてもよい。例えば、アデノウイルス形質導入樹状細胞は、ＭＵＣ１に関して抗原特異的抗腫瘍免疫を誘導することが示された（Gongら(1997)Gene Ther.4,1023-1028参照）。同様に、アデノウイルスをベースとするシステムが用いられてもよい（例えば、Wanら(1997)Hum.Gene Ther.8, 1355-1363参照）。レトロウイルスシステムが用いられてもよい（Spechtら(1997) J.Exp.Med.186,1213-1221およびSzabolcsら(1997)Blood 90, 2160-2167）。樹状細胞への粒子媒介輸送も使用できる（Tutingら(1997) Eur.J.Immunol.27,2702-2707）。また、ＲＮＡも使用できる（Ashleyら(1997) J.Exp.Med.186, 1177-1182）。
【０１２８】
患者におけるターゲット細胞を殺す方法に関して、ターゲット細胞がガン細胞であることが特に好ましい。
【０１２９】
ＷＴ１ポリペプチドは、アミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬおよびＣＭＴＷＮＱＭＮＬを含み、白血病、乳ガン、メラノーマおよび卵巣ガンにおいて異常に発現される。
【０１３０】
ｇａｔａ−１ポリペプチドは、アミノ酸配列ＨＬＭＰＦＰＧＰＬＬを含み、白血病において異常に発現される。
【０１３１】
特に、本発明の方法によって治療される患者が、ＨＬＡ−Ａ０２０１ハプロタイプを有することが好ましい。かくして、好ましい実施態様では、患者のＨＬＡハプロタイプが、治療前に調べられる。ＨＬＡハプロタイプは、適切な方法を用いて行われ、かかる方法は当該技術分野において周知である。
【０１３２】
本発明は、特に、活性なin vivoでのワクチン接種；in vitroでの自己樹状細胞の操作、その後かかる操作がされた樹状細胞のin vivoでの導入して、ＣＴＬ応答を活性化；in vitroで自己ＣＴＬを活性化して、養子治療（すなわち、このように操作されたＣＴＬを患者に導入する）；かつ、健康なドナー（ＭＨＣ適合またはミスマッチ）のＣＴＬをin vitroで活性化して、養子治療するために、本発明のペプチド（またはそれらをコードするポリヌクレオチド）の使用を含む。
【０１３３】
本発明を、図面および実施例を参照してより詳細に記載する。
【実施例】
【０１３４】
実施例１：ＷＴ１およびｇａｔａ−１におけるＨＬＡ−Ａ０２０１提示ＣＴＬエピトープの同定 ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを備えた８つのＷＴ−１ペプチドを分析し、二つが天然のＣＴＬエピトープであることが見出された。ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを備えた１２のｇａｔａ−１ペプチドを分析し、一つが天然のＣＴＬエピトープであることが見出された。
【０１３５】
以下のアプローチを用いた：ｉ）ＨＬＡ−Ａ０２０１結合アッセイにおける合成ペプチドの分析；iii）ＨＬＡ−Ａ０２０１陰性のヒト由来のＣＴＬ応答を刺激するためにＨＬＡ−Ａ０２０１結合ぺぷちどを使用；ｉｖ）ＷＴ−１またはｇａｔａ−１を内因的に発現する腫瘍細胞に対するペプチド特異的ＣＴＬの試験。
【０１３６】
ペプチド結合アッセイ：５ｘ１０5 Ｔ２細胞を、９６ウェルプレートにおいて、５％の煮沸したＦＣＳ（プロテアーゼを破壊するため）と種々の濃度の合成ペプチドを含む１００ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地中で、一晩（ｏ／ｎ）インキュベートした。ペプチドまたは周知のＡ２−結合ペプチドを含まないＴ２細胞を含むウェルを、それぞれ、陰性および陽性コントロールとして用いた。一晩インキュベーションした後、細胞を洗浄し、Ａ-２特異的モノクローナル抗体ＨＢ５４およびＨＢ１１７（American Type Culture Collection, ATCC）を用いて表面ＨＬＡ−Ａ２について間接免疫蛍光により染色した。ＦＡＣＳ分析を、Coulter Corporationフローサイトメーターで行った（Haiteah, Florida）。
【０１３７】
アロ制限ＣＴＬ系統およびクローンの産生：ＨＬＡ−Ａ２陰性バフィーコート血液パックからのＰＢＭＣを、レスポンダーとして用いた。２４ウェルプレートの各ウェルに、２ｘ１０6Ficoll分離ＰＢＭＣと２ｘ１０5刺激細胞を与えた。刺激細胞は、５％の煮沸ＦＣＳを含むＲＰＭＩ中の１００μＭペプチドでＴ２細胞を一晩インキュベートすることによって調製された。５日目に、Ｔ細胞を回収し、フィーダーとして２ｘ１０6の自己の照射したＰＢＭＣ、２ｘ１０5ペプチドコート照射Ｔ２またはＣ１Ｒ−Ａ２細胞、５００ｎＭペプチドおよび１０％ＱＳ４１２０培養上清を加えた２４ウェルプレートにおいてウェル当たり５ｘ１０5の密度で新鮮なＴ細胞培地中に移し、ＣＤ４Ｔ細胞の成長を抑制する。この培養物を、刺激因子として免疫ペプチドで被覆されたＨＬＡ−Ａ２陽性細胞系統を用いて、２週間毎にフィードした。このバルク培養を、Ｔ細胞培地に、ウェル当たり１、１０および３０細胞の密度でクローン化した。１０4ペプチド被覆Ｔ２細胞、２ｘ１０5ＨＬＡ−Ａ２陰性フィーダー、および２ＵのＩＬ−２を各ウェルに添加した。ウェル当たり１細胞でまかれたミクロ培養から得られたＣＴＬを、ウェル増殖細胞のパーセントが３０％を越えない場合には、さらにクローン化される。
【０１３８】
ＣＴＬアッセイ：１０6Ｔ２細胞を３７℃で１００μＭの合成ペプチドを含む２００μｌのアッセイ培地（５％ 熱不活性化ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０）において１時間インキュベートした。ペプチド被覆および未被覆の細胞を、さらに１時間51Ｃｒラベルし、洗浄し、丸底９６ウェルプレートにおいて連続する二倍希釈のエフェクター細胞に添加して、２００μｌ／ウェルの全体量とした。ＣＴＬバルク系統を、51Ｃｒラベル化ターゲット細胞当たり３０のコールドＫ５６２細胞の存在下で分析し、ＮＫ細胞により引き起こされたバックグラウンド殺傷を低減を低減した。Ｔ細胞クローンの感度を試験するために、アッセイ培地における一連の希釈のペプチドを、９６ウェルプレートに調製した。５ｘ１０3の51Ｃｒラベル化Ｔ２細胞を各ウェルに添加し、１００μｌの全体量として、１時間インキュベートした。エフェクター細胞を、最大ＣＴＬ殺傷に十分なＥ：Ｔ比で添加した。アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートし、４時間後、１００μｌの上清を各ウェルから回収し、Wallac Gamma Counterを用いてカウントした。比溶解(specific lysis)を、式（実験放出自然放出）／（最大放出自然放出）ｘ１００％によって計算した。
【０１３９】
結果
ＷＴ−１タンパクにおいて、ＷＴ−１発現腫瘍細胞において発現された二つのＣＴＬ認識ペプチドエピトープが同定された：ＷＴ１２６−３４：ＲＭＦＰＮＡＰＹＬＷＴ２３５−４３：ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ 
【０１４０】
これらは９アミノ酸の長さのペプチドであり、ＣＴＬによる有効な認識に必要な最小エピトープを示すと考えられる。
【０１４１】
ＷＴ１２６−３４に対するＣＴＬの殺傷活性を、以下の表に記載する。
【０１４２】
【表１】
2012183067.tif 000002
【０１４３】
表のデータは、ＷＴ１２６−３４ペプチドに対するＣＴＬが、ＷＴ−１およびＨＬＡ−Ａ０２０１を発現する腫瘍細胞を殺傷することを示す。ＷＴ−１陰性Ｂリンパ芽球細胞は殺傷されない。図１および２は、抗ＷＴ１２６−３４ＣＴＬの殺傷活性を示す代表例を示す。
【０１４４】
抗ＷＴ２３５−４３ＣＴＬを用いて得られたデータは、ＷＴ１２６−３４ＣＴＬを用いて得られたデータほど大規模ではない。しかしながら、ＷＴ２３５−４３ＣＴＬがＷＴ−１を内因的に発現するＨＬＡ−Ａ０２０１陽性腫瘍細胞を殺傷することが明らかである。
【０１４５】
ｇａｔａ−１タンパクにおいて、ｇａｔａ−１発現腫瘍細胞において発現されたＣＴＬ認識ペプチドエピトープが同定された：Ｈｕｇ３７８−８７ ＨＬＭＰＦＰＧＰＬＬ。
【０１４６】
これは１０アミノ酸の長さのペプチドであり、ＣＴＬによる有効な認識に必要とされる最小エピトープを示すと考えられる。
【０１４７】
このペプチドに対するＣＴＬは、内因的にｇａｔａ−１を発現するＨＬＡ−Ａ０２０１形質転換Ｋ５６２白血病細胞系統を認識できるが、形質転換されていないＫ５６２細胞は認識されない。
【０１４８】
結論
ＷＴ−１およびｇａｔａ−１のＣＴＬ認識ペプチドエピトープが同定された。これらのエピトープは、これらのタンパクを異常に発現する腫瘍細胞に提示される。ＷＴ−１およびｇａｔａ−１の生理学的発現は、比較的少数の正常細胞に制限されている。かくして、自己のＣＴＬがこれらのタンパクに対して制限された寛容を示すことができ、かつ、同定されたＣＴＬエピトープが、異常なＷＴ−１およびｇａｔａ−１発現を有する腫瘍に対してワクチン接種、および別の免疫治療法に使用することができる。
【０１４９】
実施例２：クラスＩ分子とＷＴ１ペプチド抗原ＲＭＦＰＮＡＰＹＬを用いた活性化された細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）の産生およびその投与 活性化された細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を、ＨＬＡ−Ａ２クラスＩ分子とＷＴ１由来のノナマーペプチド：ＲＭＦＰＮＡＰＹＬを用いて産生した。
【０１５０】
ＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／１７０９５に記載された方法を、ＣＴＬを作製するために使用した。ショウジョウバエ細胞をＣＴＬにペプチド抗原を提示するために使用した。ＨＬＡ−Ａ２分子は、ショウジョウバエ細胞において発現された。
【０１５１】
ペプチドは、Applied Biosystems synthesiser, ABI 431A(Foster City, CA, USA)で合成し、ＨＰＬＣで精製した。
【０１５２】
ＷＯ９３／１７０９５に詳細に記載されているように、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の産生のためのin vitro条件を最適化するために、刺激細胞の培養が適切な培地で維持された。刺激細胞は、ＷＯ９３／１７０９５に記載されているようなショウジョウバエ細胞であり、好ましくは血清を含まない培地に維持される（例えば、Excell 400）。
【０１５３】
前駆体ＣＤ８細胞のような活性化される細胞と刺激細胞のインキュベーションの前に、ヒトクラスＩ分子に結合して、刺激細胞の表面に提示されるのに十分な量の所定量の抗原性ペプチドが、刺激細胞培養物に添加される。十分な量のペプチドとは、ペプチドを結合したヒトクラスＩ ＭＨＣ分子が約２００，好ましくは２００以上、各刺激細胞の表面に提示される量である。刺激細胞は通常、＞２０μｇ／ｍｌのペプチドとインキュベートされる。
【０１５４】
休止または前駆体ＣＤ８細胞を、ＣＤ８細胞を活性化するのに十分な時間、適切な刺激細胞と培養においてインキュベートした。ＣＤ８細胞は、抗原特異的方法で活性化される。休止または前駆体ＣＤ８（エフェクター）細胞の刺激細胞に対する比率は、個々に異なってよく、培養条件に対する個人のリンパ球の感度のような変異性に依存してもよい。リンパ球：刺激細胞（ショウジョウバエ細胞）比は、通常、約３０：１から３００：１の範囲である。例えば、３ｘ１０7ヒトＰＢＬと１ｘ１０6ショウジョウバエ細胞が混合され、２０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培養培地に維持される。
【０１５５】
エフェクター／刺激培養物を、治療に使用できるまたは有効な数のＣＤ８細胞を刺激するのに必要な時間にわたって維持する。最適な時間は、通常、“プラトー(plateau)”、すなわち“最大”特異的ＣＤ８活性化レベルであり、通常培養の５日後に見られる、で約１〜５日の間である。ＣＤ８細胞のin vitro活性化は、通常、細胞系統のトランスフェクション後、短い期間内に検出される。ＣＤ８細胞を活性化することができるトランスフェクションされた細胞系統における一過性の発現は、トランスフェクションから４８時間以内に検出される。これは、ヒトクラスＩ ＭＨＣ分子を発現する形質転換された細胞の安定または一過性の培養が、ＣＤ８細胞を活性化するのに有効であることを、はっきりと示す。
【０１５６】
活性化されたＣＤ８細胞は、刺激細胞、刺激細胞上に結合されたペプチド、またはＣＤ８細胞（またはそのセグメント）に特異的なモノクローナル抗体を用いて、その適切な相補的リガンドに結合させることにより、刺激（ショウジョウバエ）細胞から有効に分離することができる。次いで、抗体タグ化した分子は、免疫沈降またはイムノアッセイ方法を解して刺激−エフェクター細胞混合物から抽出される。
【０１５７】
有効な、細胞傷害的な量の活性化ＣＤ８細胞は、in vitroおよびin vivoでの使用の間で、これらの傷害細胞の究極のターゲットである細胞の量およびタイプによって変化することができ、約１ｘ１０6および１ｘ１０12の活性化されたＣＴＬが、成人に対して用いられる。
【０１５８】
活性化されたＣＤ８細胞は、処置される個人にＣＤ８細胞を投与する前に、ショウジョウバエ細胞培養から回収される。しかしながら、他の存在しかつ提案された治療モダリティーとは異なって、この実施例に記載した方法が、腫瘍形成性でない細胞培養システム（すなわちショウジョウバエ細胞）を用いないことに注意することが重要である。それゆえ、ショウジョウバエ細胞と活性化されたＣＤ８細胞との完全な分離が達成されない場合でも、少量のショウジョウバエ細胞の投与に関連することが知られた固有の危険性は存在しない。一方、哺乳動物の腫瘍促進細胞の投与は危険である。
【０１５９】
例えば、Honsikらの米国特許第４８４４８９３号およびRosenbergの米国特許第４６９０９１５号に例示されているような、細胞性成分を再導入する方法が用いられる。例えば、静脈注入による活性化ＣＤ８細胞の投与が適切である。
【０１６０】
実施例３：乳ガンを処置するための、ＷＴ１ペプチドＣＭＴＷＮＱＭＮＬを用いてパルスした樹状細胞 乳ガンは、真に局在かしている場合にのみ治療可能性がある。最も一般的な問題は、明確な転移に関する遅い発表か、多くは、局所治癒後の全身的転移の発達である。転移性乳ガンは、高度に化学的感受性であり、有効な化学療法は、きまって疾患の軽減を誘導し、二次疾患の開始を遅延し、広範囲の疾患の症状を緩和する。
【０１６１】
この種の免疫治療は、腫瘍増殖および転移が、新生細胞による抗原提示の低下または患者の免疫における一般的な衰えのいずれかによる、免疫学的監視の欠陥を反映するという考えに基づく。両方のメカニズムが乳ガンにおいて生じ、特に樹状細胞（ＤＣ）機能に重要な欠陥が存在するという証拠が存在する（Gabrilovichら(1997) Clin.Cancer Res.3, 483-490）。細胞傷害性Ｔ細胞応答は、ＷＴ１ペプチド：ＣＭＴＷＮＱＭＮＬのような免疫原性ペプチドに対してin vitroで証明されている。ＤＣは、プロフェッショナル抗原-処理および-提示細胞である。これは、腫瘍ＭＨＣ制限Ｔ細胞免疫の発達に重要である。これらは、骨髄のＣＤ３４+前駆体に由来するが、末梢血液中のポストコロニー形成ユニットＣＤ１４+中間体からも誘導される。ＤＣは、皮膚、粘膜、脾臓および胸腺において末梢部位に移動する。これらは、同種移植片拒絶、アトピー性疾患、自己免疫および抗腫瘍免疫を含む、種々の臨床的に重要な処理に関係している。
【０１６２】
患者は、ＨＬＡ−Ａ２に分類される。
【０１６３】
ＤＣは、主にＧＭ-ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＴＮＦαのようなサイトカインを用いて、ＣＤ３４+ステム細胞またはＣＤ１４+末梢血液単球からex vivoで培養される。これら両方の源に由来するＤＣは免疫応答性であり、外因的に提示された抗原を取り込み、処理して、細胞傷害性Ｔ細胞にそれを提示することができる（Grabbeら (1995) Immunology Today 16, 117-121; Girolomoni & Ricciardi-Castagnoli (1997) Immunology Today 18, 102-104）。最近の研究は、ＤＣがin vivoで生成された抗原特異的腫瘍免疫を運搬しうること（Kwakら(1995) Lancet 345, 1016-1020）、および、ex vivoで腫瘍抗原を用いてパルスされた自己のＤＣが、無視できない抗腫瘍効果を誘導しうること（Hsuら (1996) Nature Medicine 2, 52-58）を証明した。ＤＣは、粗製腫瘍膜溶解物、精製されたペプチドまたはペプチドフラグメントを用いて効率的にパルスされうる。
【０１６４】
ＷＴ１は、乳ガンによって発現されるポリペプチドである。
【０１６５】
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）は、これと類似した研究において患者の免疫応答性に対する無害の陽性コントロールとして用いられる免疫原性タンパクである（Hsuら (1996) Nature Medicine 2, 52-58）。
【０１６６】
ＷＴ１ペプチドＣＭＴＷＮＱＭＮＬの精製された調製物と結合し、かつ、養子免疫療法として再注入された、再発性乳ガン患者由来のex vivo拡大自己樹状細胞を用いる実現性は、以下のように確立される。
【０１６７】
記載された研究は、再発性乳ガン患者の末梢血液からのex vivo拡大(expansion)による自己ＤＣの最適な生成方法論を確立し；外因性ＷＴ１ペプチドをＤＣに載せる（結合させる:load）可能性を評価し；自己再注入の急性寛容および毒性を評価し；ＷＴ１ペプチドまたはＫＬＨディベロップに対して免疫が反応するか否かを調べ；かつ、無視できない腫瘍バルクへの効果を調べる。
【０１６８】
養子免疫療法は、バルク疾患の低減よりも、最小の残余疾患のコントロールまたは消失において最も効果的であろう。免疫療法は、細胞傷害性Ｔリンパ球の流入によりバルク疾患の大きさを一時的に増大させうると思われる。疾患の程度およびバルクは、治療後に監視されるが、正式な終点として用いられない。患者は、決まった方法で長期にわたり追跡調査され、長期にわたって、不利な症状が現れないことを確認する。
【０１６９】
正常な志願者由来の樹状細胞培養 ＣＤ１４+末梢血液単球を組織培養フラスコに付着させ、１％ＡＢ血清、ＧＭ−ＣＳＦ（４００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（４００ＩＵ／ｍｌ）の存在下で７日間培養した。これは、ＤＣの多型性を備えた細胞を与え、抗原を取り込んで提示するＤＣの未熟形態を示すＣＤ１ａ+マーカーで４９％の平均を与えた。次いで、これらの細胞を、ＤＣを細胞傷害性Ｔ細胞に対して抗原提示可能にする、ＴＮＦα（１５ｎｇ／ｍｌ）の添加によりＣＤ８３+細胞に成熟化される。７％の細胞が、１日以内にＣＤ８３＋になるが、最大効果のためには少なくとも３日必要である。単球調整培地が、１％ＡＢ血清と置換できる。
【０１７０】
再発した乳ガン患者由来の樹状細胞培養 救助療法前後の、再発した転移性疾患の６人の患者からＤＣを生成した（末梢血液の１２サンプルの合計、それぞれ５０ｍｌ）。
【０１７１】
臨床研究 標準的なプロトコールに従って、単一ユニットの自己の血液を患者が献血した。血液輸血サービス医師によって献血前に患者を評価した。自己の献血を、決まったウイルスマーカー（ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶおよび梅毒）について同種献血と同様に選別した。患者は、参加を望めば、適切なカウンセリングの後に、これに同意した。この警戒は、臨床および実験室スタッフを可能性のある感染から保護し、交差汚染の可能性から決まった血液供給を保護する。この血液を、決まったクワドパックに入れる。これは、赤血球、バフィコートおよびプラスマの自動化された分離を可能にする。このバフィコートは、約６７０ｘ１０6の単核白血球を与え、これは現在の技術を用いて約４７ｘ１０6のＤＣを与える。患者当たり８−１２８ｘ１０6のＤＣの投与範囲を用いる。末梢血液単球を二つの分注量に分け、１から１０日間、ＷＴ１ペプチドおよびＫＬＨを用いてパルスした。血清を含まない培養条件または自己プラスマを、同種ＡＢ血清に優先して用いた。培養されたＤＣを集め、洗浄し、１００ｍｌの生理食塩水に再懸濁した後に、１時間かけて注入した。自己赤血球濃縮物は、標準臨床示度以外、患者に戻さない。ex vivo ＤＣ培養方法を、以下の良好な製造処理に従って実施した。
【０１７２】
最初の血液サンプルを献血する患者は、このときまでに、救助療法を受けており、臨床的寛解にあってもそうでなくてもよい。再発転移性疾患患者は、化学療法を受ける前に処置を受ける。二つの処置プログラムがある。
（１）転移性再発、標準治療後、養子免疫療法；
（２）転移性再発、養子免疫療法後、標準治療。
【０１７３】
治療のための患者を含める基準：限局性の再発または転移性乳ガン患者。
細胞毒性化学療法またはホルモン治療を用いて以前に処置。
評価可能な疾患（ＵＩＣＣ基準）。
＞１２週であると予想される生存。
自己血液献血の基準を満たす（ＨｇＢ＞１２０ｇ／Ｉを含む）。
告知に基づく同意。
年齢が１８歳〜７０歳。
【０１７４】
処置から患者を除く基準：妊婦。
ＣＮＳ転移。
以前または共同性転移。
告知に基づく同意が得られない。
同意拒否。
年齢が＜１８歳または＞７０歳。
【０１７５】
産物の注入は、必要であれば蘇生および支持的な便宜を利用できる寝椅子の上で、監視のもとで、経験のある医師の直接的監督のもとに行われた。
【０１７６】
実施例４：ＷＴ１に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球による白血病ＣＤ３４+始原細胞の選択的除去 例えば、急性および慢性骨髄性白血病のような血液学悪性腫瘍は、未熟なＣＤ３４+始原細胞の悪性トランスフォーメーションによって特徴付けされる。トランスフォーメーションは、ＷＴ１転写因子の増加した発現と関係する。ここで、ＷＴ１が、白血病性始原細胞に対する鋭敏な特異性を備えたＣＴＬのターゲットとして作用しうることを証明した。ＷＴ１に特異的なＨＬＡ−Ａ０２０１制限ＣＴＬは白血病性細胞系統を殺し、ＣＭＬ患者から単離された形質転換されたＣＤ３４+始原細胞によるコロニー形成を阻害したが、正常なＣＤ３４+始原細胞によるコロニー形成は影響されなかった。
【０１７７】
かくして、組織特異的転写因子ＷＴ１は、in vitroでの白血病性始原細胞のＣＴＬ媒介パージング、および、in vivoにおける白血病およびＷＴ１発現悪性腫瘍の抗原特異的治療の、理想のターゲットである。
【０１７８】
造血系の細胞を、自己再生および分化可能な幹細胞（ＨＳＣ）から誘導した。ヒトとマウスにおける移植実験は、ＣＤ３４+細胞集団が、骨髄切除受容者において赤血球、脊髄およびリンパ球の直系を再構成可能であるＨＳＣを含むことを示した1。さらに、マウスの宿主を再構成することができるＨＳＣが、ＣＤ３４-／ｌｉｎ-骨髄細胞の稀な集団において最近証明された2。
【０１７９】
ＣＭＬとＡＭＬにおける重要なトランスフォーメーションが、未熟なＣＤ３４+始原細胞に影響するという強い証拠がある。大多数の白血病性芽細胞が、制限された増殖能を有するので、悪性疾患は、強い増殖力と自己新生力を備えた白血病性始原細胞の部分集団によって維持されなければならない3、4。ＡＭＬ患者由来の精製された細胞を用いた移植研究は、未熟なＣＤ３４+細胞のみが、免疫無防備状態のマウス受容者において白血病を開始することができることを示した5。同様に、ＣＭＬ患者由来の精製されたＣＤ３４+細胞は、マウス受容者において効率的に白血病を開始した6、7。
【０１８０】
未調整始原細胞増殖を導く分子事象は完全には理解されていない。ｔ（９；２２）染色体転座に関連するＢＣＲ／ＡＢＬ融合タンパクはＣＭＬの証明であるが、ＢＣＲ／ＡＢＬ転写物は、健康な個人にも観察され、さらなるファクターが白血病の発達に必要であることを示唆する8。ＷＴ１転写因子は、白血病誘発に寄与する候補タンパクである。この転写因子は、通常、未熟なＣＤ３４+始原細胞に発現され、分化はＷＴ１ダウンレギュレーションに関与する9、10。ＷＴ１発現の高められたレベルは、ＡＭＬおよびＣＭＬ患者由来の精製されたＣＤ３４+細胞および未分離の単核細胞において観察された11、12。増大したＷＴ１発現が正常な分化をブロックし、造血始原細胞の増殖を増強することを示すin vitro研究は、白血病誘発に寄与するＷＴ１の能力の説明を与える13、14。
【０１８１】
最近の研究結果は、ＣＤ３４＋始原細胞に特異的なＴリンパ球が、ＣＭＬ患者における抗白血病性効果を媒介することに極めて重要であるということを示唆した15。この研究において、白血病性始原細胞に対して細胞傷害性Ｔリンパ球を向けるために、ターゲット分子としてＷＴ１を開発する可能性を調査した。正常なＣＤ３４＋始原細胞ではなくＣＭＬが、ＣＴＬ攻撃を開始するのに十分なＷＴ１タンパクを発現するという仮説を調べた。
【０１８２】
方法：細胞系：急性転化状態の女性のＣＭＬ患者の胸水からＫ５６２細胞を確立した16。急性転化状態の男性のＣＭＬ患者の末梢血からＢＶ１７３細胞を確立した17。急性リンパ性白血病を有する１２歳の少年の骨髄から細胞系６９７を確立した18。Ｃ１Ｒ細胞系は、ＨＬＡ−Ａ０２０１陰性ＥＢＶトランスフォームリンパ芽球細胞系である19。Ｔ２細胞系は、ＴＡＰ(transporter associated with antigen processing)をコードする遺伝子の欠失について選択され、内因性ペプチドを有するＨＬＡクラスＩ分子を不十分にしか運搬しないことを引き起こす20。従って、Ｔ２細胞のＨＬＡ−Ａ０２０１分子は、外因性ペプチドを効率的に運搬する。ＨＬＡ−Ａ０２０１、ヒトβ−２ミクログロブリン、Ｂ７．１及びＩＣＡＭ−１でトランスフェクトされたDrosophila細胞は、Dr. M. Jacksonからの好意で得た。
合成ペプチド：ヒトウィルムス主要抗原１Ｐ１２６から由来するペプチド(RMFPNAPYL)及びヒトパピローマウイルスタイプ１６のＥ７タンパク質から由来するコントロールＨＬＡ−Ａ０２０１結合ペプチドを、フルオレニルメトキシカルボニル化学を使用して、Imperial College Medical Schoolの中央ペプチド合成研究室によって合成した。ペプチドの質をＨＰＬＣ分析によって評価し、予想される分子量をマトリックスアシストレーザー放出マススペクトロメトリーを使用して観察した。ペプチドをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解し、２ｍＭの濃度を得て−２０℃で貯蔵した。
【０１８３】
アロ−ＨＬＡ−制限ＣＴＬ系の世代：ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離を使用してバッフィーコートパックから分離し、モノクローナル抗体ＨＢ５４（抗ＨＬＡ−Ａ２，Ｂ１７）及びＨＢ１１７（抗ＨＬＡ−Ａ２，Ａ２８）で染色した。Ａ２陰性ＰＢＭＣを応答因子として使用した。ＨＬＡ−Ａ０２０１、ヒトβ２−ミクログロブリン、Ｂ７．１及びＩＣＡＭ−１でトランスフェクトされたペプチドコートDrosophila細胞を、初期刺激因子として使用した。Drosophila細胞を４８時間１００ｍＭのＣｕＳＯ4中で誘導し、培地で３回洗浄し、４時間１００μＭの濃度でペプチドを乗せた。２４穴プレートの各ウェルは、２ｍｌのＴ細胞培地中に２×１０6の応答因子ＰＢＭＣと２×１０5の刺激因子細胞を受け取った。５日目でＴ細胞を回収し、餌として２×１０6の自己発光ＰＢＭＣ、２×１０5の発光ペプチドコートＴ２細胞、１０％ＱＳ４１２０培養上清（抗ＣＤ４抗体を含む）、及び１０Ｕ／ｍｌｈｕ−ｒＩＬ−２(Boehringer)を添加して、ウェル当たり５×１０5の密度で新鮮なＴ細胞培地中に蒔いた。刺激因子として免疫化ペプチドでコートされたＴ２細部を使用して、培養物を弱く再刺激化した。２−３サイクルの刺激の後、大きな培養物がウェル当たり１，１０及び３０細胞の密度で９６穴プレート中にクローン化した。１０4ペプチドコートＴ２細胞、２×１０5ＨＬＡ−Ａ２陰性ＰＢＭＣフィーダー、及び２Ｕ／ｍｌＩＬ−２を、各ウェルに加えた。各ウェルの細胞毒性を、免疫化ペプチドまたはコントロールＨＬＡ−Ａ０２０１結合ペプチドでコートされたＴ２標的細胞に対して試験した。ペプチド特異的ミクロ培養物を増殖させ、２×１０6のフィーダー、２×１０5の刺激因子細胞、及び１０Ｕ／ｍｌＩＬ−２を加えることによって、２４穴プレート中で弱く再刺激化した。Ｔ細胞系７７（図４Ｂ参照）を、培養物中で１年間維持し、この研究でのほとんどの実験についてＣＴＬのソースとして機能した。この系はＣＤ４+及びＣＤ８+細胞より成るため、特異的な殺傷活性がＣＤ８+ＣＴＬによって介在されることを示すため、ＣＤ８+サブクローンを使用した。親の７７系とは異なり、ＣＤ８+サブクローンのin vitroでのライフスパンは数カ月に制限された。
【０１８４】
ＣＴＬアッセイ：ＣＴＬアッセイを記載されているように実施した。略記すると、１０６Ｔ２細胞を、３７℃で１００μＭの合成ペプチドを有する２００μｌのアッセイ培地（５％熱不活性化ＦＣＳを有するＲＰＭＩ１６４０）中で１時間培養した。ペプチドコートＴ２細胞または腫瘍細胞を１時間51Ｃｒラベルし、洗浄し、丸底９６穴プレート中に連続的な２倍希釈のエフェクター細胞に加え、２００μｌ／ウェルの全容量を得た。アッセイプレートを３７℃で５％ＣＯ2で４時間インキュベートした。１００μｌの上清を回収し、Wallac Gamma Counterを使用してカウントした。特異的な溶解を、以下の式：（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）×１００％によって計算した。
【０１８５】
造血ＣＤ３４+細胞の精製：正常ＣＤ３４+細胞のソースとして、成人で健康なドナー由来のヒト骨髄（ｎ＝５）、疾患回復期の幹細胞不朽固化腫瘍患者からの白血球搬出産物（ｎ＝２）及び臍帯血（ｎ＝１）を使用した。臍帯血のサンプルは、滅菌回収チューブ内への血液の排出によって廃棄された胎盤及びへそのお組織から得られた。これらの細胞の使用についてのインフォームドコンセントを、ドナー及び患者から適切なように取得した。白血病ＣＤ３４+細胞のソースとして、少なくとも３ヶ月間インターフェロンで処理されていない慢性状態のＣＭＬ患者から末梢血を得た。
【０１８６】
サンプルをHanks緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）中で１：２に希釈し、密度勾配遠心分離(Lymphoprep 1.077g/ml, Nycomed, UK)によって単核細胞で富化し、回収した単核分画を、Minimacsシステムを使用して製造者の説明書に従って(Miltenyi Biotec, UK)、ＣＤ３４+分画の単離のための磁性ミクロビーズ選択にかけた。抗ヒトＣＤ３４フィコエリスリン（ＰＥ）マウスモノクローナル抗体(Becton Dickinson)を使用したＦＡＣＳ分析によって見積もると、細胞集団の純度は８０−９５％の範囲であった。
【０１８７】
ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ：１０6細胞の全ＲＮＡを、ＲＮＡｚｏｌＴＭＢプロトコール(AMS Bio, UK)に従って単離した。全ＲＮＡペレットのｃＤＮＡ合成を、４０μｌ反応物で実施した。溶解ＲＮＡペレットを初めに６５℃で１０分２μｇのオリゴｄＴ１２−１８プライマー(Life Technologies, Scotland)でインキュベートし、次いで５０Ｕの齧歯類白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）逆転写酵素、１０ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのｄＮＴＰ(Boehringer Mannheim, UK)、４０ＵのＲＡアーゼインヒビター(Promega, UK)の混合物で、４２℃で１時間インキュベーションした。５μｌのｃＤＮＡ調製物を、２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Qiagen, UK)、１ｍＭｄＮＴＰ、２０ＯＤ／ｍｌのプライマーを含む最終反応混合物の５０μｌ容量中でＰＣＲ増幅のために使用した。ヒトＷＴ１コード領域の増幅は、エクソン７に位置するセンスプライマー（２１マー、5'-ggc atc tga gac cag tga gaa-3')及びエクソン１０のアンチセンスプライマー（２２マー、5'-gag agt cag act tga aag cag t-3')を使用して達成した。ＷＴ１ＰＣＲ産物の予想サイズは４８２ｂｐである。ＲＮＡの完全性を、２２マーセンス5'-ccc aac ctt ttc gtt gca ctg t-3'；２２マーアンチセンス5'-cgg ctc tcg gag gag acg atg a-3'といったイントロンにまたがるプライマーを使用して全てのサンプル中のヒトｃ−ａｂｌ遺伝子を増幅することによって確認した。ｃ−ＡＢＬＰＣＲ産物の予想サイズは３８５ｂｐである。ホットスタートＰＣＲを、以下の条件（ＡＢＬ及びＷＴ１増幅について同じ）：９５℃で１分の変性、５６℃で１分のプライマーアニリング、及び７２℃で２分の鎖伸張の下で、熱サイクラー(Techne Genius, Cambridge)で３５サイクル実施した。サイクリングは、９５℃で５分の変性工程で開始し、逆転写酵素を熱不活性化し、７２℃で１０分の最終伸張によって終結した。全てのＲＴ−ＰＣＲを少なくとも２回実施し、陰性コントロール（ｃＤＮＡ含まず）及び陽性コントロール（ＷＴ１発現白血病細胞系ＢＶ１７３から得たｃＤＮＡ）を全ての実験で含ませた。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動した。
【０１８８】
ウエスタンブロット分析：分離したＣＤ３４+細胞（２×１０5細胞）をＰＢＳで洗浄し、Laemmli Buffer中で溶解した。細胞溶解物を１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分画し、湿潤トランスファーによりニトロセルロース膜(Amersham, UK)にトランスファーした。次いで膜を、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０及び５％ノンファットドライミルクを含むＰＢＳ中で室温で１時間ブロックし、ウサギ抗ヒトＷＴ−１Ｃ１９ポリクローナル抗体(Santa Cruz CA, ブロッカー中で１：２００）で最初に4℃で一晩インキュベーションし、次いでウサギ抗アクチンポリクローナル血清(Sigma UK, ブロッカー中で１：５００）で室温で３０分インキュベーションした。セイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ブタ抗ウサギ抗体(DAKO UK, １：１０００）での膜のインキュベーションと製造者の説明書に従ったＥＣＬ反応(Amersham UK)により、シグナルを検出した。
【０１８９】
祖先アッセイ（ＣＦＵアッセイ）：以下の組換えヒト成長因子(Stem Cell Technologies)：幹細胞因子（ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３，２０ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６，２０ｎｇ／ｍｌ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を補ったメチルセルロース培地中に、１０００−３０００ＣＤ３４+細胞を蒔くことによってＣＦＵアッセイを実施した。培養物を５％ＣＯ2の湿潤環境で３７℃で１４日間インキュベートし、コロニー形成単位顆粒球マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）の発達を可能にした。
【０１９０】
結果：ＷＴ−１特異的ＣＴＬの世代：成人におけるＷＴ１転写因子の発現は、腎有足突起、精巣セルトーリ細胞、卵巣顆粒層細胞、及びＣＤ３４+骨髄細胞で検出可能である21。ＷＴ１に対する可能性のある免疫寛容を避けるために、ＭＨＣミスマッチドナーから得られたペプチド特異的ＣＴＬを生産する以前に記載されたアプローチを使用した。このアプローチは、免疫寛容と独立した腫瘍細胞で過剰発現されるいずれかのタンパク質に対してＣＴＬを生産するのに適している22,23。９のアミノ酸長のＷＴ−１由来ペプチドエピトープＰ１２６(RMFPNAPYL)を、ＣＶＴＬ標的として選択した。このペプチドは、コーカサス人で見出される最も顕著なクラスＩ対立遺伝子であるＨＬＡ−Ａ０２０１クラスＩ分子（実施例１参照）に結合する。ＨＬＡ−Ａ０２０１-ドナーから得た応答因子白血球を、Ｐ１２６ペプチドを提示するＨＬＡ−Ａ０２０１+刺激因子細胞と共にin vitroで培養し、希釈培養物の制限を、ペプチド特異的ＣＴＬ細胞を単離するために使用した。ペプチドコートＴ２標的細胞での実験により、ＣＴＬがＰ１２６ペプチドに対して非常に特異的であることが示された（図４Ａ）。ペプチド滴定により、ＣＴＬが低いピコモーラーのペプチド濃度を認識可能な非常に渇望した系と、低いピコモーラーのペプチド濃度を認識するあまり渇望していない系に分割できることが示された（図４Ｂ）。非常に渇望したＣＴＬ系を、さらなる実験のために選択した。
【０１９１】
ＷＴ−１特異的ＣＴＬ殺傷白血病細胞系：白血病細胞系のパネルの分析により、Ｐ１２６特異的ＣＴＬが、ＨＬＡ−Ａ０２０１+細胞ＢＶ１７３及び６９７を殺傷することが明らかとなった（図４Ｃ）。ＨＬＡ−Ａ０２０１-白血病細胞系Ｋ５６２は、ＨＬＡ−Ａ０２０１でのトランスフェクションの後のみで殺傷される。対照的に、細胞がＰ１２６ペプチドでコートされていないと、ＨＬＡ−Ａ０２０１+ＥＢＶトランスフォームＢ細胞系Ｃ１Ｒ−Ａ２は殺傷されなかった（図４Ｃ；同じ結果は他のＥＢＶトランスフォーム細胞でも見られた）。ＣＴＬ標的細胞中でのＷＴ１の発現を、ＲＮＡ及びタンパク質レベルで分析した。ＲＴ−ＰＣＲにより、白血病細胞系はＷＴ１ＲＮＡを発現するが、ＥＢＶトランスフォームＣ１Ｒ−Ａ２細胞は発現しないことが示された（図５Ａ）。同じ結果は、ＷＴ１タンパク質が白血病細胞でのみ発現され、Ｃ１Ｒ−Ａ２では発現されないことを示すウエスタンブロットによっても得られた（図５Ｃ）。このデータを総合して、ＣＴＬはＡ０２０１+白血病細胞系を認識し、ＣＴＬ殺傷はＷＴ１発現と相関することが示された。
【０１９２】
ＷＴ１特異的ＣＴＬ殺傷新鮮白血病ＣＤ３４+細胞：慢性状態のＣＭＬ患者の末梢血から得た単核細胞を、未成熟ＣＤ３４+と成熟ＣＤ３４-集団に分類した。予想されたように、ＨＬＡ−Ａ０２０１-患者から単離された細胞は、Ｐ１２６特異的ＣＴＬによって認識されなかった（図６Ａ）。ＨＬＡ−Ａ０２０１+ＣＭＬ患者から得られた細胞を分析した場合、ＣＴＬはＣＤ３４+細胞集団を選択的に認識する一方で、より成熟したＣＤ３４-集団の殺傷は観察されなかった（図６Ａ）。ＣＤ３４-細胞の殺傷の欠如は、外因性Ｐ１２６ペプチドを有するこれらの細胞のコーティングがＣＴＬ殺傷を引き起こすため、ＷＴ１由来標的ペプチドの不十分な発現のためである可能性が高い（図６Ａ）。ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＣＤ３４+細胞における強力なＷＴ１ＲＮＡ発現と、ＣＤ３４-細胞における低い発現が明らかとなった（図５Ｂ）。ウエスタンブロッティングにより検出可能なＷＴ１タンパク質の発現はＣＤ３４+に制限され、ＣＤ３４-細胞ではタンパク質は検出不可能であった（図５Ｃ）。ＲＴ−ＰＣＲよウエスタン分析の両者により、白血病ＣＤ３４+細胞集団におけるＷＴ１発現のレベルの変異が示された。かくして、ＷＴ１発現のレベルにおける観察された変異が、ＣＴＬ殺傷のレベルの変異を生ずるかどうかを調査した。しかしながら１１の異なるＣＭＬ患者の分析により、ＣＴＬはＣＤ３４+集団の２０％（ＳＤ５％）を一貫して溶解することが示された（図５Ｂ）。この結果は、ＷＴ１発現がＣＤ３４+細胞の約２０％のサブ集団に制限され、全ての１１のＣＭＬ患者における発現レベルが、これらの細胞のほとんどをＣＴＬ殺傷に感受性にするのには不十分である可能性を示唆した。それ故、ＣＴＬによって認識されるサブ集団が、顆粒球／マクロファージ直系のコロニーに高めることができるクローン原性の始原細胞を含むかどうかを調査した。実際、９のＣＭＬ患者から単離されたＣＤ３４+集団をＰ１２６特異的ＣＴＬで処理した場合、これはコロニー形成の８０−１００％の阻害を生ずる（図５Ｄ）。このことは、コロニー形成始原細胞の大多数がＰ１２６特異的ＣＴＬによって除去されることを示した。ＣＴＬ処理サンプルで見られる「エスケープ」コロニーは、非処理サンプル中のコロニーと比較した場合小さかった。これは、「エスケープ」コロニーが、ＷＴ１発現の下流調節と関連する顆粒球／マクロファージ直系に向けた分化をすでに開始している始原細胞から由来する可能性と一致する。上記部分的に分化した始原細胞は、ＷＴ１特異的ＣＴＬによる認識を避け、ＣＦＵアッセイで観察される小さいサイズのコロニーは、これらの始原細胞の減少したクローン増大サイズを反映しているであろう。
【０１９３】
重要なことに、ＨＬＡ−Ａ０２０１-ＣＭＬ患者から得たＣＤ３４+細胞によるコロニー形成は影響されず、コロニー形成活性を有する始原細胞の消失は、ＣＴＬによるＨＬＡ制限抗原認識に依存することを示した。
【０１９４】
最後に、ＣＴＬが白血病細胞と正常なＣＤ３４+始原細胞の間を識別するかどうかを調査した。正常ＣＤ３４+細胞を、ＨＬＡ−Ａ０２０１+ドナーの骨髄、末梢血または臍帯血から単離し、ＣＴＬ標的として使用した。ＣＤ３４+細胞のソースとは独立して、抗Ｐ１２６ＣＴＬはこれらの細胞によってコロニー形成を阻害しなかった（図５Ｄ）。さらに正常ＣＤ３４+細胞は、細胞毒性アッセイにおいて標的として使用された場合殺傷されなかった（図６Ｂ及びＣ）。白血病対正常ＣＤ３４+細胞の選択的なＣＴＬ殺傷は、ＷＴ１発現における差異によって説明できる。ＷＴ１ＲＮＡ発現は、正常ＣＤ３４＋細胞と比較して白血病細胞で高く（図５Ｂ）、ウエスタンブロット分析は白血病細胞でのみＷＴ１タンパク質を検出し、正常ＣＤ３４+細胞集団においては検出しなかった（図５Ｃ）。
【０１９５】
以前の自己幹細胞移植の後に再発した患者に対するドナーリンパ球（ＤＬＩ）の注射は、強力なグラフト対白血病効果（ＧＶＬ）を引き起こすことができる24,25。最近の研究により、ＤＬＩを経験したＣＭＬ患者における完全な回復は、白血病ＣＤ３４+始原細胞を認識するＴ細胞の増大した割合と関連することが示された15。対照的に、ＣＭＬ患者におけるより成熟したＣＤ３４-細胞のＴ細胞認識は、好ましい臨床上の応答と関連しなかった。このことはＣＤ３４+ＣＭＬ始原細胞に対して特異性を有するＴリンパ球が、in vivoでの抗白血病効果を介在する点で必須に重要であることを示唆した。しかしながら、白血病ＣＤ３４+始原細胞に対して選択的にＴ細胞応答を向けることができる標的抗原の性質に関する情報は現在存在しない。
【０１９６】
上記抗原を同定するために、免疫寛容と独立して、トランスフォーム細胞において上昇したレベルで発現されるいずれかのタンパク質に対してＣＴＬを与えるのに適した、自己制限ＣＴＬアプローチを使用した22,23,26。細胞毒性エフェクター機能の引き金を引くことは初めの現象であるために、トランスフォーム細胞における上昇した標的タンパク質レベルによってのみ引き金を引かれ、正常細胞におけるタンパク質の生理学的レベルによっては引かれないＣＴＬを選択することが可能である23。
【０１９７】
白血病ＣＤ３４+細胞におけるＷＴ１の過剰発現の証拠が存在する12。上昇したＷＴ１発現は、トランスフォーメーションに寄与できる13,14。正常なＷＴ１発現は、出生後の人生において少数の細胞に制限される21。白血病に加えて、上昇したＷＴ１発現はまた、腎細胞カルシノーマ、卵巣ガン、進行性乳ガン、及びメラノーマにおいて観察されている27-30。それ故、ＷＴ１過剰発現悪性細胞を選択的に認識するＣＴＬは、白血病、並びに他のより一般的な悪性疾患の抗原特異的な治療に対して貴重な試薬である。さらに、ＷＴ１発現の下流調節による腫瘍エスケープは、もし過剰発現がトランスフォームされた表現型を維持するために必要である場合生じないようである31-33。
【０１９８】
ここに記載される自己制限ＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ０２０１-ドナーから単離され、それらはＨＬＡ−Ａ０２０１クラスＩ分子に関してＷＴ１由来Ｐ１２６ペプチドを提示する白血病始原細胞に対して特異的であった。異なるＨＬＡ−Ａ０２０１-ドナーから由来するリンパ球のin vitroの刺激は、ペプチド特異的ＨＬＡ−Ａ０２０１制限ＣＴＬを一貫して誘導するため、Ｐ１２６ペプチドは非常に免疫原性である。それ故Ｐ１２６特異的ＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ０２０１対立遺伝子に関して一つのローカスＨＬＡミスマッチを提示するドナーから幹細胞移植を受けているＨＬＡ−Ａ０２０１+白血病患者の抗原特異的治療のための新規な試薬である。一つのローカスＨＬＡミスマッチは、一つのローカスミスマッチを有しＨＬＡマッチを有する非関連ドナーから移植を受けた白血病患者における比較可能な予後を示す最近の研究に示されているように、臨床上許容可能である34。かくして一つのローカスミスマッチ移植は、ドナーから由来する自己制限ＣＴＬでの抗原特異的治療のための理想的なセッティングを提供する。Ｐ１２６ペプチドを含むＨＬＡ−Ａ０２０１テトラマーでの染色による、関連ＣＴＬの選択と組み合わせたここに記載されるin vitro刺激プロトコールは、採用可能な治療のためのＰ１２６特異的ＣＴＬの迅速な単離を可能にするであろう。
【０１９９】
さらに、ＷＴ１は自己セッティングにおける抗原特異的治療について調査可能である。これは、Ｐ１２６特異的ＣＴＬがＨＬＡ−Ａ０２０１+ドナーから単離できるという観察によって支持される。成人におけるＷＴ１発現は、比較的小さい数の細胞（例えばＣＤ３４+骨髄細胞、腎有足突起、精巣セリトール細胞及び卵巣顆粒層細胞）に制限されるため、ＷＴ１に対する自己Ｔリンパ球の寛容はおそらく不完全である。それ故、白血病、並びに腎細胞カルシノーマ、卵巣ガン、メラノーマ、及び乳ガンのような、上昇したＷＴ１発現を有する他の悪性疾患に対してＣＴＬ応答を刺激するために、抗ＷＴ１ワクチン調製物のデザインのために同定されたＰ１２６エピトープを利用することが可能であろう。
【０２００】
in vivoでの治療に加えて、ＷＴ１特異的ＣＴＬは、白血病患者から回収された自己骨髄細胞のin vitroでの浄化のためのツールを提供する。ＣＴＬは、顆粒球／マクロファージ直系の白血病始原細胞（図６Ｄ）及び赤血球直系の始原細胞（示さず）を除去する。対照的にＣＴＬは、これらの直系の正常の始原細胞は認識しない。トランスフォームＣＤ３４+始原細胞の選択的な除去は、白血病始原細胞を再注射する危険を減少するはずであり、かくして自己幹細胞移植の主要な制限を解消する35。
【０２０１】
今日まで、組織特異的マイナー組織適合性抗原及びプロテイナーゼ３のような直系特異的抗原は、白血病反応性ＣＴＬに対する潜在的案標的として研究されている36-39。ＷＴ−１転写因子は、白血病始原細胞に対してＣＴＬ応答を選択的に向けることが可能な最初の標的抗原である。
【０２０２】
実施例４の参考文献
［参考文献］
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2012183067.tif 000008
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【配列表】
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