(57)【要約】【課題】化学結合力の測定を、簡便、かつ精度良く、さらに安価に行うことができる化学結合力測定方法および測定装置を提供する。【解決手段】第２試料の各分子に磁性微粒子を結合させる工程と、振動子に固定された第１試料の表面に第２試料を化学結合させる工程と、振動子の面に直交する方向に磁気力が作用するように磁場を印加する工程と、形成された磁界により脱離した第２試料の質量の時間的変化に対応して変化する振動子の振動周波数の時間的変化を測定する工程と、振動周波数の時間的変化に基づいて第２試料の脱離の速度定数を求める工程と、複数の温度雰囲気下で求められた複数の脱離の速度定数に基づき脱離の活性化エネルギーを求める工程と、脱離の活性化エネルギーに基づいて、第１試料と第２試料との間の化学結合力を評価する工程とを有している化学結合力測定方法および化学結合力測定装置。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
高感度振動微小秤量装置の振動子の表面に固定された第１試料と、前記第１試料の表面に化学結合された第２試料との間の化学結合力を測定する化学結合力測定方法であって、
前記第２試料の各分子に磁性微粒子を結合させる磁性微粒子結合工程と、
前記第１試料の表面に、磁性微粒子が結合された第２試料を化学結合により付着させる試料付着工程と、
前記振動子の面に直交する方向に磁気力が作用するように磁場を印加する磁場印加工程と、
形成された前記磁界により、前記第１試料から脱離した第２試料の質量の時間的変化に対応して変化する前記振動子の振動周波数の時間的変化を測定する周波数測定工程と、
前記振動周波数の時間的変化に基づいて、第２試料の第１試料からの脱離の速度定数を求める脱離速度定数算出工程と、
複数の温度雰囲気下で求められた複数の前記脱離の速度定数に基づき、第２試料の第１試料からの脱離の活性化エネルギーを求める活性化エネルギー算出工程と、
前記脱離の活性化エネルギーに基づいて、第１試料と第２試料との間の化学結合力を評価する化学結合力評価工程と
を有していることを特徴とする化学結合力測定方法。
【請求項２】
前記磁場印加工程が、上下に対向して設置された磁石の間の空間に、前記振動子の面が前記磁石と平行となるように、前記振動子を挿入して、磁場を印加する工程であることを特徴とする請求項１に記載の化学結合力測定方法。
【請求項３】
前記複数の脱離の速度定数が、０〜１００℃の温度雰囲気下で求められていることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の化学結合力測定方法。
【請求項４】
前記周波数測定工程が、質量効果、磁場効果、近接効果を考慮して行われていることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の化学結合力測定方法。
【請求項５】
高感度振動微小秤量装置の振動子の表面に固定された第１試料と、磁性微粒子に結合された第２試料との間の化学結合力を測定する化学結合力測定装置であって、
前記振動子の面に直交する方向に磁気力が作用するように磁場を印加する磁場印加手段と、
形成された前記磁界により、前記第１試料から脱離した第２試料の質量の時間的変化に対応して変化する前記振動子の振動周波数の時間的変化を測定する周波数測定手段と、
前記振動周波数の時間的変化に基づいて、第２試料の第１試料からの脱離の速度定数を求める脱離速度定数算出手段と、
複数の温度雰囲気下で求められた複数の前記脱離の速度定数に基づき、第２試料の第１試料からの脱離の活性化エネルギーを求める活性化エネルギー算出手段と、
前記脱離の活性化エネルギーに基づいて、第１試料と第２試料との間の化学結合力を評価する化学結合力評価手段と
を備えていることを特徴とする化学結合力測定装置。
【請求項６】
前記振動子が、水晶振動子であることを特徴とする請求項５に記載の化学結合力測定装置。
【請求項７】
前記振動子の表面に設けられた電極が、金電極であることを特徴とする請求項５または請求項６に記載の化学結合力測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学結合力測定方法および測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ナノ材料分野やバイオ分野において、分子や細胞を被測定試料として、その化学結合力、具体的には、水素結合、ファンデルワールス相互作用、双極子相互作用、静電相互作用などの化学的相互作用による結合力を測定することが行われている。
【０００３】
その測定方法として、従来より、原子間力顕微鏡法（ａｔｏｍｉｃ  ｆｏｒｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ法：ＡＦＭ法）が広く利用されている。
【０００４】
このＡＦＭ法は、先端の鋭いカンチレバー（探針）を被測定試料表面に接近させることにより、カンチレバー先端のプローブ分子と被測定試料表面の分子との間に化学結合を形成させ、カンチレバーを離脱する際に生じるカンチレバーの上下方向への変位（撓み）を、レーザにより計測することで、その化学結合力を測定するものである（非特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】江口豊明、長谷川幸雄、「高分解能ＡＦＭ観察に及ぼす短距離力の寄与」、日本物理学会誌、ｖｏｌ．５９（２００４）、５３０−５３６、社団法人日本物理学会
【非特許文献２】木村恵一、門  晋平「原子間力顕微鏡によるクラウンエーテル・陽イオン錯形成の単一力測定」、ぶんせき、Ｎｏ．１２（２００３）、７５２―７５４、社団法人日本分析化学会
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、このＡＦＭ法には、事前の準備作業として、前記したように、カンチレバー先端にプローブ分子を結合させる必要があり、精度良く測定するための操作に熟練を要するという問題があった。
【０００７】
また、結合の解離における活性化エネルギーは、雰囲気温度を種々変化させて、前記の測定を行った後、各雰囲気温度における測定結果を解析することにより求められるが、ＡＦＭ法においては、温度を変えるとカンチレバーの性能が変化するため、このような測定は容易とは言えなかった。
【０００８】
そして、ＡＦＭ装置の価格が、通常５００万円以上と高価であることも大きな問題であった。
【０００９】
そこで、本発明は、化学結合力の測定を、簡便、かつ精度良く、さらに安価に行うことができる化学結合力測定方法および測定装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、鋭意検討の結果、以下に示す請求項の発明により上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。以下、各請求項の発明について説明する。
【００１１】
請求項１に記載の発明は、
高感度振動微小秤量装置の振動子の表面に固定された第１試料と、前記第１試料の表面に化学結合された第２試料との間の化学結合力を測定する化学結合力測定方法であって、
前記第２試料の各分子に磁性微粒子を結合させる磁性微粒子結合工程と、
前記第１試料の表面に、磁性微粒子が結合された第２試料を化学結合により付着させる試料付着工程と、
前記振動子の面に直交する方向に磁気力が作用するように磁場を印加する磁場印加工程と、
形成された前記磁界により、前記第１試料から脱離した第２試料の質量の時間的変化に対応して変化する前記振動子の振動周波数の時間的変化を測定する周波数測定工程と、
前記振動周波数の時間的変化に基づいて、第２試料の第１試料からの脱離の速度定数を求める脱離速度定数算出工程と、
複数の温度雰囲気下で求められた複数の前記脱離の速度定数に基づき、第２試料の第１試料からの脱離の活性化エネルギーを求める活性化エネルギー算出工程と、
前記脱離の活性化エネルギーに基づいて、第１試料と第２試料との間の化学結合力を評価する化学結合力評価工程と
を有していることを特徴とする化学結合力測定方法である。
【００１２】
本発明者は、上記課題の解決につき鋭意検討を行った結果、従来のＡＦＭ法のように、カンチレバー先端の分子と被測定試料表面の分子との間に化学結合を形成させるのではなく、振動子に固定された第１試料と、磁性微粒子が結合された第２試料とを化学結合させ、磁場を印加することにより、第２試料を第１試料から脱離させ、このときの脱離量の時間変化と温度依存性を測定することにより、両者の間の化学結合力を評価することができることに思い至った。
【００１３】
そして、試料の質量の変化を振動子の周波数の変化として捉える高感度振動微小秤量装置を用いた場合、極めて簡便に上記した脱離の様子を高精度に測定することができ、容易に両者の間の化学結合力を評価することができることに思い至った。
【００１４】
高感度振動微小秤量装置の具体的な一例としては、振動子が水晶であるＱＣＭ（Ｑｕａｒｔｚ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ：水晶微量天秤）装置を挙げることができ、前記の通り、振動子表面に付着された試料の重量変化に伴って、振動している振動子の周波数が変化することを利用するもので、前記したＡＦＭ装置に比べ安価であるにも拘わらず、ｎｇ（ナノグラム）オーダーでの微少な重量変化であっても、正確に周波数の変化として検出することができる。
【００１５】
このような高感度振動微小秤量装置の振動子の表面に固定された第１試料の上に、磁性微粒子が結合された第２試料を化学結合させた被測定試料に対して、磁性微粒子が脱離する方向に磁気力が作用するように磁場を印加した場合、この磁場により形成される磁界により、第２試料に結合された磁性微粒子にエネルギーが与えられる。
【００１６】
そして、このエネルギーが、第１試料と第２試料との間の化学結合力を上回ると、第２試料は第１試料との化学結合面から脱離していく。それに合わせて、被測定試料を含めた振動子の質量が減少する。
【００１７】
この振動子の質量の変化に対応して、振動子の周波数が変化するため、高感度振動微小秤量装置を用いて振動子の周波数の変化を測定することにより、第２試料の第１試料からの脱離の状況を正確に捉えることができる。
【００１８】
このように、第２試料と第１試料との間の化学結合力は、第２試料の第１試料からの脱離の状況と密接に関係しているため、この脱離の状況、具体的には、第２試料の第１試料からの脱離による質量の時間的変化に基づく周波数の時間的変化を解析することにより、第２試料の第１試料からの脱離の速度定数を求めることができる。
【００１９】
さらに、恒温槽を用いて、複数の温度雰囲気下で前記の測定を行うことにより、前記脱離の速度定数を複数得ることができ、得られた複数の脱離の速度定数を解析することにより、第２試料の第１試料からの脱離の活性化エネルギーを求めることができ、これにより、第１試料と第２試料との間の化学結合力を評価することができる。
【００２０】
本請求項の発明は、上記の知見に基づくものであり、変化する周波数を検出する周波数検出器を備えた高感度振動微小秤量装置と磁気回路とを組み合わせて、第２試料の第１試料からの脱離量の時間的変化（質量の時間的変化）を、振動周波数の変化として測定するという簡便な手段により、第１試料と第２試料との間の脱離の速度定数や脱離の活性化エネルギーを精度高く求めて、第１試料と第２試料との間の化学結合力を、精度高く、容易かつ安価に評価することができる。
【００２１】
なお、本請求項の発明において、第１試料を振動子の表面に固定する方法としては、第１試料と第２試料との間の化学結合力を上回っている限り、特に限定されない。
【００２２】
また、第１試料として、振動子自体を用いてもよい。即ち、第１試料を準備することなく、振動子の表面に第２試料を直接付着させて測定を行うこともできる。
【００２３】
その際、得られる化学結合力は、振動子表面との化学結合力となるが、多数の試料について同様の測定を行うことにより、これらの試料間における化学結合力の相対的な評価を精度高く行うことができる。
【００２４】
請求項２に記載の発明は、
前記磁場印加工程が、上下に対向して設置された磁石の間の空間に、前記振動子の面が前記磁石と平行となるように、前記振動子を挿入して、磁場を印加する工程であることを特徴とする請求項１に記載の化学結合力測定方法である。
【００２５】
上下の磁石と平行に振動子を定められた位置に挿入して磁場を印加することにより、磁場勾配下で磁性微粒子が受ける磁気力の方向が一定となるため、精度が高い測定を行うことができる。
【００２６】
請求項３に記載の発明は、
前記複数の脱離の速度定数が、０〜１００℃の温度雰囲気下で求められていることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の化学結合力測定方法である。
【００２７】
測定温度雰囲気としては、適宜設定することができるが、０〜１００℃、望ましくは１０〜５０℃であると、タンパク質や細胞を対象とした測定が可能となり好ましい。
【００２８】
請求項４に記載の発明は、
前記周波数測定工程が、質量効果、磁場効果、近接効果を考慮して行われていることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の化学結合力測定方法である。
【００２９】
実際の測定においては、単に、振動周波数の変化と質量変化との関係（質量効果）を見るだけでなく、磁場の状況が振動周波数の変化に与える影響（磁場効果）や物体が電極に接近した際の影響（近接効果）を考慮する必要がある。
【００３０】
本請求項の発明においては、これらの効果を考慮して、周波数の時間的変化を求めているため、より精度高い測定を行うことができる。
【００３１】
請求項５に記載の発明は、
高感度振動微小秤量装置の振動子の表面に固定された第１試料と、磁性微粒子に結合された第２試料との間の化学結合力を測定する化学結合力測定装置であって、
前記振動子の面に直交する方向に磁気力が作用するように磁場を印加する磁場印加手段と、
形成された前記磁界により、前記第１試料から脱離した第２試料の質量の時間的変化に対応して変化する前記振動子の振動周波数の時間的変化を測定する周波数測定手段と、
前記振動周波数の時間的変化に基づいて、第２試料の第１試料からの脱離の速度定数を求める脱離速度定数算出手段と、
複数の温度雰囲気下で求められた複数の前記脱離の速度定数に基づき、第２試料の第１試料からの脱離の活性化エネルギーを求める活性化エネルギー算出手段と、
前記脱離の活性化エネルギーに基づいて、第１試料と第２試料との間の化学結合力を評価する化学結合力評価手段と
を備えていることを特徴とする化学結合力測定装置である。
【００３２】
本請求項の発明は、測定方法の発明である請求項１の発明を測定装置の面より捉えた発明であり、基本的には、磁場を印加する小型磁気回路と、ＱＣＭ装置などの高感度振動微小秤量装置と、各算出を行う計算手段とを組み合わせることにより構成されているため、ＡＦＭ装置に比べ安価であるにも拘わらず、精度の高い評価を行うことができる化学結合力測定装置を提供することができる。
【００３３】
請求項６に記載の発明は、
前記振動子が、水晶振動子であることを特徴とする請求項５に記載の化学結合力測定装置である。
【００３４】
水晶振動子は、精度が高く安定した周波数が得られ、かつ種々の金属電極やその表面を化学的に処理したものを手軽に入手することができるため、本発明に用いる振動子として好ましい。
【００３５】
請求項７に記載の発明は、
前記振動子の表面に設けられた電極が、金電極であることを特徴とする請求項５または請求項６に記載の化学結合力測定装置である。
【００３６】
電極としては、金、銅、タングステンなどからなる電極を使用することができるが、金は、薄膜化が容易であり、安定性に優れているため、特に好ましい。
【発明の効果】
【００３７】
本発明によれば、化学結合力の測定を、簡便、かつ精度良く、さらに安価に行うことができる化学結合力測定方法および測定装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の実施の形態の化学結合力測定装置の全体構成図である。
【図２】磁気部の要部の構成を示す図である。
【図３】ポールピース間に形成された磁力線分布の概念図である。
【図４】磁気部に挿入された状態の振動子部を概念的に示す図である。
【図５】振動子の表面に被測定試料が配置されている様子の一例を示す図である。
【図６】磁性微粒子の一例の模式的な構造を示す図である。
【図７】磁性微粒子の表面に施す処理を説明する図である。
【図８】磁気回路のポールピース近傍の磁束密度と単一磁気微粒子が受ける磁気力の測定結果の一例を示す図である。
【図９】磁性微粒子における近接効果を説明する図である。
【図１０】３８．９℃における脱離の状況を説明する図である。
【図１１】５４．３℃における脱離の状況を説明する図である。
【図１２】実施例３の試験体の各温度雰囲気における脱離の状況を説明する図である。
【図１３】磁性微粒子の脱離の活性化エネルギーを求める図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、本発明を実施の形態に基づいて説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではない。本発明と同一および均等の範囲内において、以下の実施の形態に対して種々の変更を加えることが可能である。
【００４０】
１．測定装置
最初に、本発明の実施の形態の化学結合力測定装置の構成を、図面を参照しつつ説明する。図１は、本実施の形態の化学結合力測定装置の全体構成図であり、基本的に、ＱＣＭ装置部、磁気回路部より構成されている。
【００４１】
（１）ＱＣＭ装置部
ＱＣＭ装置部は、振動子部１０、ＱＣＭ用のアダプタ８１、ＱＣＭ用の電動ステージ８２、発振回路８３、パソコン８４より構成されている。
【００４２】
振動子部１０はＱＣＭ用のアダプタ８１に接続され、ＱＣＭ用のアダプタ８１には、振動子部１０に電力を供給するＱＣＭ用の発振回路８３が接続されている。また、ＱＣＭ用の電極を保持するアダプタ８１は電動ステージ８２に固定されており、発振回路８３にはパソコン８４が接続されている。なお、測定時には、振動子部１０の表面には、第１試料が固定され、さらに第１試料には、磁性微粒子が結合された第２試料が化学結合により付着されている。
【００４３】
振動子部１０は、ＱＣＭ用の発振回路８３からの電力により、振動する。発振回路８３は、磁性微粒子を結合させた第２試料が振動子部１０から離脱することに対応して変化する周波数を検出して、パソコン８４に信号を送る。パソコン８４は、送られてきた信号を解析し、周波数に対応した質量に換算し、変化量を脱離量として求める。
【００４４】
（２）磁気回路部
磁気回路部は、磁気部２０、加熱用のヒータ７２を備えた空気恒温槽７１、上下方向の対物レンズ９１を備えた上下方向のＣＣＤ９３、水平方向の対物レンズ９２を備えた水平方向のＣＣＤ９４、表示部９５より構成されている。
【００４５】
そして、磁気部２０は空気恒温槽７１内に配置されており、磁気部２０に挿入された振動子部１０（被測定試料が付着されている）に所定の磁場を印加するようになっている。
【００４６】
この振動子部１０および磁気部２０の様子は、上下方向のＣＣＤ９３および水平方向のＣＣＤ９４により映像として表示部９５に示される。
【００４７】
（イ）磁気部
磁気部２０につき、図２を用いて、さらに詳しく説明する。図２は、磁気部２０の要部の構成を示す図であり、２１および２２は、上部および下部のポールピース（純鉄製）である。そして、２３、２４は、上部および下部の磁石（Ｎｄ−Ｆｅ−Ｂ磁石）であり、２５、２６はそれぞれ上部および下部の平板（ＳＵＳ製）である。また、２７および２８はそれぞれ左側および右側の鉄壁（ヨーク）である。
【００４８】
測定は、上部および下部のポールピース２１、２２の間に、振動子部１０を平行に挿入することにより行われる。このとき、上部ポールピース２１はＮ極、下部ポールピース２２はＳ極であって、破線矢印の方向に磁力線の経路が形成されることにより、磁場が強化される。なお、図２に示された磁気部は、３．５Ｔ磁気回路を形成する磁気部を一例として示したものであり、高さ４ｃｍ、幅５ｃｍのサイズを有している。
【００４９】
（ロ）ポールピース
図３に、ポールピース間に形成された磁力線分布の概念図を示す。図３に示すように、水平断面の形状が正方形である上部および下部のポールピース２１、２２の間に磁気勾配が形成される。なお、図３に示された各ポールピースの水平断面における一辺の長さ０．４ｍｍ、および各ポールピース間の間隔０．４ｍｍは、前記した３．５Ｔ磁気回路を形成する磁気部における値である。
【００５０】
（ハ）磁気部に挿入された振動子
図４に、磁気部に挿入された状態の振動子部を概念的に示す。図４において、振動子部１０は、水晶製の振動子１１、金（Ａｕ）製の上部電極１２、上部電線１４、下部電線１５、および図示しない下部電極（下部電線１５に接続されている）により構成されている。なお、図４において、両矢印は電極のスライド方向を示しており、縦方向の点線は原点（上下のポールピース端面の中心方向）を示している。
【００５１】
２．被測定試料
被測定試料について、図５を参照しつつ説明する。図５は、振動子の表面に被測定試料が配置されている様子の一例を示す図であり、被測定試料は、磁性微粒子４０ｓを結合させた第１試料５０ｓと、磁性微粒子４０ｕを結合させた第２試料５０ｕより構成されている。そして、第１試料５０ｓは、磁性微粒子４０ｓを介して、振動子１１の上に設けられた上部電極１２に固定されている。
【００５２】
図５において、長方形の破線で囲った部分が脱離部分を示し、このとき、第１試料５０ｓと磁性微粒子４０ｓとの間の結合力、第２試料５０ｕと磁性微粒子４０ｕとの間の結合力、および磁性微粒子４０ｓと上部電極１２との間の結合力は、第１試料５０ｓと第２試料５０ｕとの間の結合力よりも充分大きく設定される。このような構成とすることにより、第１試料５０ｓと第２試料５０ｕとの間で脱離を起こさせることができ、化学結合力の測定を行うことができる。
【００５３】
なお、第１試料５０ｓと上部電極１２との間の結合力が充分大きい場合には、磁性微粒子４０ｓを介して、第１試料５０ｓと上部電極１２とを固定する必要はなく、また、第２試料５０ｕと上部電極１２との間の化学結合力を測定する場合には、第１試料５０ｓと磁性微粒子４０ｓを用いずに、第２試料５０ｕを上部電極１２に直接結合させることもできる。さらに、磁性微粒子のみを上部電極と結合させて、磁性微粒子と上部電極との間の化学結合力の測定を行うこともできる。
【００５４】
３．磁性微粒子
（１）磁性微粒子の構造
本実施の形態において用いられる磁性微粒子の一例を、図６に模式的な構造として示す。図６において、４１は、酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）からなる中心核（ｃｏｒｅ、コア）である。この中心核をグリシジルメタクリラート（ＧＭＡ）により被覆することにより、被覆材層４３が形成されている。そして、被覆材層４３の表面に形成された表面層４２では、図６右側に示すように、ＧＭＡの側鎖のエポキシ基が開環されてチオール基に置換されている。
【００５５】
（２）磁性微粒子の作製方法
前記したＧＭＡの側鎖のエポキシ基のチオール基への置換は、図７に示す処理により行われる。
【００５６】
まず、ＧＭＡを、１Ｍシスタミン水溶液（ｐＨ：１０．０）に５０℃、２０ｈさらすことにより、ＧＭＡの側鎖のエポキシ基を開環させてシスタミンの両末端に結合させる。次いで、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ：７．０）の下で、０．１ＭのＴＣＥＰ（２−（カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）溶液に２５℃、２ｈさらすことにより、一端にチオール基を形成させて、側鎖のエポキシ基をチオール基に置換する。
【００５７】
この末端がチオール基に置換された前記の磁性微粒子は、前記チオール基と上部電極のＡｕ原子とがスルフィド結合されて架橋されることにより、上部電極と結合される。
【００５８】
なお、この磁性微粒子は、飽和磁化１４ｅｍｕ／ｇ、粒径２００ｎｍ、密度１．３５ｇ／ｃｍ３の磁性微粒子であり、この磁性微粒子３．２１μｇを用いて、５ｍｍφのＡｕ電極に単相膜を形成することができる。
【００５９】
４．測定方法と原理
次に、本発明における化学結合力の測定方法とその原理について説明する。
【００６０】
（１）磁気回路に挿入された磁性微粒子が受ける磁気力
最初に、図５に示した表面に被測定試料が配置された振動子を、磁気回路のポールピース間に平行に挿入する。このとき、磁性微粒子４０ｕには、下式に示す磁気力Ｆ（磁性微粒子１個当たり）が作用する。
【００６１】
【数１】
2012073066.tif 000003
【００６２】
この磁気力Ｆが第１試料５０ｓと第２試料５０ｕとの間の化学結合力よりも大きい場合、第１試料５０ｓからの第２試料５０ｕの脱離が起こる。
【００６３】
磁気力の測定結果の一例を図８に示す。なお、図８は、前記した磁性微粒子を水晶製の振動子の上部電極（Ａｕ）に化学結合させ、この振動子を３．５Ｔ磁気回路に配置した際に計測された磁気力（磁性微粒子１個当たり）を示す図である。図８では、ポールピース中心からの距離（ｍｍ）と、磁束密度（Ｔ）および磁気力（ｐＮ）との関係を示しており、実線は磁気力を、破線は磁束密度を示している。
【００６４】
図８に示す結果より、この磁性微粒子１個に作用する磁気力は、最大０．７３ｐＮであることが分かる。
【００６５】
（２）脱離量（質量変化）と振動周波数の時間的変化との関係
第１試料５０ｓからの第２試料５０ｕの脱離が起こった場合、その脱離量に合わせて、振動子の質量が変化し、それに合わせて振動子の振動周波数が変化する。このため、振動周波数の変化を測定することにより、脱離量を求めることができる。
【００６６】
しかし、実際の測定においては、振動周波数の変化は、上記の質量変化による影響（質量効果）の他に、磁場の状況による影響（磁場効果）や物体が電極に接近することによる影響（近接効果）によっても起こるため、これらを考慮して、以下の実験式を用いる必要がある。
【００６７】
【数２】
2012073066.tif 000004
【００６８】
上式において、第１項が質量効果を示す項（Ｓａｕｅｒｂｒｅｙ式）、第２項が磁場効果を示す項、第３項が近接効果を示す項となる。なお、第２項のＣおよび第３項Ｄは、測定条件によって、定数として求めることができる。
【００６９】
図９に、前記磁性微粒子における近接効果を示す。図９は、電極とポールピース中心間との距離（横軸）と、周波数の変化（縦軸）との関係を示す図である。図９において、○は３．５Ｔ磁気回路（ポールピース面積：０．４ｍｍ×０．４ｍｍ）における測定値、□は２．７Ｔ磁気回路（ポールピース面積：４ｍｍ×４ｍｍ）における測定値、△は磁場のないレプリカ（２．７Ｔ磁気回路と同じ形状のアルミ製複製模型）（ポールピース面積：４ｍｍ×４ｍｍ）における測定値である。
【００７０】
図９において、２．７Ｔ磁気回路の測定値とレプリカの測定値とはよく重なっており、近接効果は磁場と無関係であることが分かる。そして、２つの磁気回路（３．５Ｔおよび２．７Ｔ）では、ポールピース面積の大きな２．７Ｔ磁気回路の方が周波数の変化が大きく、電極との重なり面積が大きい方が、近接効果が大きくなることが分かる。
【００７１】
（３）脱離速度定数
前記したように、周波数の時間的変化から質量の時間的変化、即ち、脱離速度を求めることができる。そして、脱離速度定数ｋが、下式より求められる。
【００７２】
【数３】
2012073066.tif 000005
【００７３】
（４）活性化エネルギー
そして、この脱離速度定数ｋは、温度（絶対温度）と関係しているため、以下のＡｒｒｈｅｎｉｕｓの式を用いることにより、活性化エネルギーＥａを求めることができる。
【００７４】
【数４】
2012073066.tif 000006
【００７５】
このように、本実施の形態においては、雰囲気温度を変えて、周波数の時間的変化を求めることにより、最終的に、活性化エネルギーを求めることができ、化学結合力を求めることができる。
【００７６】
（実施例）
以下に実施例を用いて、本発明をより具体的に説明する。なお、本実施例においては、磁性微粒子を上部電極と１層以上結合させて、１層目の磁性微粒子とその上の層の磁性微粒子との間の化学結合力の測定を行っている。
【００７７】
１．磁性微粒子
本実施例における磁性微粒子としては、前記した磁性微粒子を用いた。
【００７８】
２．試験体の作製
磁性微粒子を、溶媒である水中に、超音波を用いて分散させて、磁性微粒子分散液を作製した。
【００７９】
得られた分散液約１０μｌを、５ｍｍφのＡｕ電極上に滴下し、自然乾燥させた。その後、約１０ｍｌエタノールを用いて、Ａｕ電極上を洗浄し、余分な磁性微粒子を除去し、再度自然乾燥させ、試験体とした。
【００８０】
なお、このとき、分散液への磁性微粒子の投入量を変化させることにより、Ａｕ電極への付着量を調整し、３種類の試験体（実施例１〜３）を作製した。
【００８１】
３．付着量の算出
各試験体における磁性微粒子の付着量の計測は、次のように行った。
【００８２】
最初に、ＱＣＭ装置を用いて、磁性微粒子の付着が行われていない振動子の周波数を測定した。次に、磁性微粒子が付着された振動子の周波数を測定した。磁性微粒子の付着量に応じて振動子の質量が増加し、周波数が変化するため、周波数の変化から磁性微粒子の付着量を求めた（周波数の変化１Ｈｚが０．８６７ｎｇの質量変化に相当）。結果を表１に示す。
【００８３】
４．電極表面被覆率の算出
前記した通り、この磁性微粒子３．２１μｇを用いて、５ｍｍφのＡｕ電極に単層膜を形成することができる。このため、各付着量（μｇ）を３．２１（μｇ）で割ることにより、電極表面被覆率を求めた。結果を表１に示す。
【００８４】
【表１】
2012073066.tif 000007
【００８５】
５．磁性微粒子の脱離
次に、２５．９℃の雰囲気下、各試験体を３．５Ｔ磁気回路（ポールピース間距離０．４ｍｍ）に挿入し、磁場を印加した。振動子の周波数の時間的変化をＱＣＭ装置を用いて測定した。前記したように、振動子の周波数の時間的変化は、磁性微粒子のＡｕ電極からの脱離量に対応する。このとき、磁性微粒子１個に作用する磁気力は、前記した通り、最大０．７３ｐＮである。なお、測定を一定の温度雰囲気下で行うことにより、前記した近接効果の補正が行われ、得られた結果は磁気力を評価したものとなる。
【００８６】
同様の測定を、３８．９℃および５４．３℃の雰囲気温度でも行った。図１０に、各試験体の３８．９℃雰囲気における周波数の変化（Ｈｚ）と経過時間（ｈ）との関係を、また図１１に、５４．３℃雰囲気における周波数の変化（Ｈｚ）と経過時間（ｈ）との関係を示す。
【００８７】
図１０および図１１より、実施例３の試験体は、３８．９℃および５４．３℃何れの温度雰囲気においても、順調に脱離が進行していることが分かる。これに対して、実施例２の試験体では、３８．９℃の温度雰囲気では脱離が開始せず、５４．３℃の温度雰囲気では脱離が開始するものの、その進行は遅い。また、実施例１の試験体は、３８．９℃および５４．３℃何れの温度雰囲気においても、脱離が観測されていない。なお、図１０および図１１には、脱離が飽和して周波数の変化が一定となったときの周波数変化と、それに対応した脱離粒子数も記載している。
【００８８】
このように、実施例１の試験体のように被覆率が１層以下の場合、離脱が観測されていない。これは、Ａｕ−Ｓ結合の結合力が、１７０〜１９０ｋＪ／ｍｏｌと比較的強いため、０．７３ｐＮの磁気力ではＡｕ−Ｓ結合を切断することができなかったものと考えられる。
【００８９】
これに対して、実施例３の試験体のように被覆率が２層以上の場合、離脱が観測されている。これは、２層以上となった磁性微粒子間の相互作用が切断されて、離脱を誘発したものと考えられる。
【００９０】
６．脱離速度定数の算出
次に、実施例３の試験体について、各温度雰囲気における周波数の変化（Ｈｚ）と経過時間（ｈ）との関係を図１２に示す。
【００９１】
次に、図１２に基づいて、脱離が飽和したときの周波数の変化Δｆ∞（Ｈｚ）を用いて、脱離量（ｎｇ）を求めた。さらに、この脱離量（ｎｇ）に基づいて、脱離粒子数（個）を求めた。
【００９２】
さらに、脱離粒子数（個）を求めることにより、脱離速度定数ｋ（ｓ−１）を求めた。結果を、表２に示す。
【００９３】
【表２】
2012073066.tif 000008
【００９４】
７．活性化エネルギーの算出
次に、図１２および表２に示す脱離速度定数の測定結果に基づいて、脱離の活性化エネルギーを求めた。結果を図１３に示す。図１３において、縦軸はｋの対数ｌｎｋ（ｓ−１）を示し、横軸は絶対温度の逆数Ｔ−１（Ｋ−１）を示す。
【００９５】
図１３より、ｘ（Ｔ−１）とｙ（ｌｎｋ）との間には、以下の関係式が成立することが分かる。
ｙ＝−２．５０×１０３ｘ＋０．８１８
【００９６】
そして、ｋとＴに基づいて、前記したＡｒｒｈｅｎｉｕｓの式により、活性化エネルギーＥａを求めることにより、本実施例における磁性微粒子の脱離の活性化エネルギーＥａは、２０．８ｋＪ／ｍｏｌと求められた。この値２０．８ｋＪ／ｍｏｌは、水素結合の値（１０〜３０ｋＪ／ｍｏｌ）に近く、微粒子内では水素結合が形成されているものと考えられる。そして、このような水素結合が形成されうるものとしては、側鎖の−ＯＨ、ＮＨ、−Ｏ−等の間の相互作用が考えられる。
【００９７】
以上のように、本発明によれば、一定の磁場下における脱離による質量の減少速度に基づいて、化学的相互作用を評価することができる。そして、本発明を採用した場合、磁性微粒子を適宜組み込むことにより、官能基−官能基、官能基−細胞、細胞−細胞など様々な組み合わせを測定対象とすることが可能になるため、ナノ材料分野、バイオ産業分野、医療分野に利用できる。具体的には、細胞膜間の相互作用力、細胞膜の強度等の測定に利用可能であり、さらには細胞の癌化の検出、血液中のマーカー分子の検出等にも利用可能である。
【符号の説明】
【００９８】
１０              振動子部
１１              振動子
１２              上部電極
１４              上部電線
１５              下部電線
２０              磁気部
２１              上部ポールピース
２２              下部ポールピース
２３              上部磁石
２４              下部磁石
２５              上部平板
２６              下部平板
２７              左側鉄壁
２８              右側鉄壁
４０ｓ、４０ｕ    磁性微粒子
４１              中心核
４２              表面層
４３              被覆材層
５０ｓ            第１試料
５０ｕ            第２試料
７１              空気恒温槽
７２              加熱用のヒータ
８１              ＱＣＭ用のアダプタ
８２              電動ステージ
８３              発振回路
８４              パソコン
９１              上下方向の対物レンズ
９２              水平方向の対物レンズ
９３              上下方向のＣＣＤ
９４              水平方向のＣＣＤ
９５              表示部
【図１】
2012073066.tif 000009
【図２】
2012073066.tif 000010
【図３】
2012073066.tif 000011
【図４】
2012073066.tif 000012
【図５】
2012073066.tif 000013
【図６】
2012073066.tif 000014
【図７】
2012073066.tif 000015
【図８】
2012073066.tif 000016
【図９】
2012073066.tif 000017
【図１０】
2012073066.tif 000018
【図１１】
2012073066.tif 000019
【図１２】
2012073066.tif 000020
【図１３】
2012073066.tif 000021