(57)【要約】【課題】フタル酸化合物の菌体内への取り込みに関与する新規遺伝子の提供。【解決手段】本発明は、フタル酸化合物の菌体内への取り込みに関与する新規遺伝子tpiA、当該遺伝子を含むオペロン、組換えベクター又は形質転換体、及び当該遺伝子によってコードされる新規タンパク質TpiA、並びに当該形質転換体を用いたフタル酸化合物の分解産物の製造方法、に関する。【選択図】図２
2012183023.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(a-1)〜(a-4)のいずれかのDNAから成る遺伝子：
(a-1) 配列番号１記載の塩基配列から成るDNA、
(a-2) 配列番号２記載のアミノ酸配列をコードするDNA、
(a-3) 配列番号１記載の塩基配列から成るDNA又はその相補配列から成るDNAと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つフタル酸化合物の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードするDNA、あるいは
(a-4) 配列番号２記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つフタル酸化合物の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２】
下記(b-1)〜(b-4)のいずれかのDNAから成る遺伝子を更に含む、請求項１に記載の遺伝子：
(b-1) 配列番号３記載の塩基配列から成るDNA、
(b-2) 配列番号４記載のアミノ酸配列をコードするDNA、
(b-3) 配列番号３記載の塩基配列から成るDNA又はその相補配列から成るDNAと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つフタル酸化合物の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードするDNA、あるいは
(b-4) 配列番号４記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つフタル酸化合物の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
前記フタル酸化合物がテレフタル酸及び／又はイソフタル酸である、請求項１又は２に記載の遺伝子。
【請求項４】
下記(c-1)〜(c-4)のいずれかのDNAから成る遺伝子を更に含む、請求項１〜３のいずれかの遺伝子：
(c-1) 配列番号５記載の塩基配列から成るDNA、
(c-2) 配列番号６記載のアミノ酸配列をコードするDNA、
(c-3) 配列番号５記載の塩基配列から成るDNA又はその相補配列から成るDNAと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つイソフタル酸の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードするDNA、あるいは
(c-4) 配列番号６記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つイソフタル酸の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
下記(d-1)〜(d-4)のいずれかのDNAから成る遺伝子を更に含む、請求項１〜４のいずれかの遺伝子：
(d-1) 配列番号７記載の塩基配列から成るDNA、
(d-2) 配列番号８記載のアミノ酸配列をコードするDNA、
(d-3) 配列番号７記載の塩基配列から成るDNA又はその相補配列から成るDNAと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つテレフタル酸の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードするDNA、あるいは
(d-4) 配列番号８記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つテレフタル酸の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかの遺伝子を含むオペロン。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかの遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えベクターを含む形質転換体であって、フタル酸化合物の菌体内への取り込み能を有する形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を、フタル酸化合物の存在下で培養し、当該培養物から2−ピロン−4,6−ジカルボン酸(PDC)を採取することを特徴とする、当該フタル酸化合物の分解産物の製造方法。
【請求項１０】
下記(a-1)〜(a-3)のいずれかのタンパク質：
(a-1) 配列番号２記載のアミノ酸配列から成るタンパク質、
(a-2) 配列番号１記載の塩基配列から成るDNA又はその相補配列から成るDNAと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つフタル酸化合物の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードするDNAによってコードされるタンパク質、あるいは
(a-3) 配列番号２記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つフタル酸化合物の菌体内への取り込みに関与するタンパク質。
【請求項１１】
下記(b-1)〜(b-3)のいずれかのタンパク質を更に含む、請求項１０に記載のタンパク質：
(b-1) 配列番号４記載のアミノ酸配列から成るタンパク質、
(b-2) 配列番号３記載の塩基配列から成るDNA又はその相補配列から成るDNAと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つフタル酸化合物の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードするDNAによってコードされるタンパク質、あるいは
(b-3) 配列番号４記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つフタル酸化合物の菌体内への取り込みに関与するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フタル酸化合物の菌体内への取り込みに関与する新規遺伝子tpiA及びtpiB、当該遺伝子を含むオペロン、組換えベクター又は形質転換体、及び当該遺伝子によってコードされる新規タンパク質TpiA及びTpiB、並びに当該形質転換体を用いたフタル酸化合物の分解産物の製造方法、に関する。
【背景技術】
【０００２】
主に石油を原料として生産されるプラスチックの多くは、高い強度の裏返しとして廃棄後の処理が難しく、分解されにくいため環境問題の引き金となっている。そのため、自然環境中で微生物による分解が可能な生分解性プラスチックが必要とされている。
【０００３】
本発明者らは以前、スフィンゴビウム・パウシモビリス（Sphingobium paucimobilis）SYK-6株等から獲得した情報を用いて、リグニンの加水分解産物であるバニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸から、生分解性ポリマーの原料として利用可能な2−ピロン−4,6−ジカルボン酸（PDC）を発酵生産することに成功している（特開2005-278549号公報）。
【０００４】
上記発酵生産方法の他にも、テレフタル酸（TPA）から、プロトカテク酸（PCA）を経由してPDCを生産するバイオプロセスの開発が進められている。例えば、特開2007-104942号公報では、TPAを出発材料とする、コマモナス スピーシーズ（Comamonas sp.）E6株（以降単に「E6株」と称することもある）やスフィンゴモナス パウシモビリスSYK-6株に由来する7種類の酵素（テレフタル酸1,2-ジオキシゲナーゼ(TPADO)レダクターゼ成分、TPADOオキシゲナーゼ成分α-サブユニット、TPADOオキシゲナーゼ成分β-サブユニット、1,2-ジヒドロキシ-3,5-シクロヘキサジエン-1,4-ジカルボン酸デヒドロゲナーゼ、プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ(PCADO)α-サブユニット、PCADOβ-サブユニット、4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）を用いた、多段反応プロセスによるPDCの製造法が開示されている。
【０００５】
PET樹脂の原料として大量に生産されているTPAは、PDC生産のための有望の原料であるため、微生物によるTPAの代謝メカニズムの解明が望まれている。TPAを分解する微生物には、上記E6株の他にも、例えばコマモナス属の菌株（コマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）T-2株等）がある（H R Schlafli et al., J Bacteriol. 1994 November; 176(21): 6644-6652等）。
【０００６】
TPA分解微生物であるコマモナス スピーシーズ（Comamonas sp.）E6株には、高い相同性を有する２セットのTPA分解遺伝子群tphRI-tphCIA2IA3IBIA1I及びtphRII-tphCIIA2IIA3IIBIIA1IIが存在することや、それらを構成するtphA1、A2及びA3はそれぞれTPA 1,2-ジオキシゲナーゼ（TPADO）のレダクターゼ成分、TPADOのオキシゲナーゼ成分α−サブユニット及びβ−サブユニットのコード遺伝子として、そしてtphBは1,2-ジヒドロキシ-3,5-シクロヘキサジエン-1,4-ジカルボン酸（DCD）デヒドロゲナーゼのコード遺伝子として下記の反応に関与していること、tphRはIc1R型転写制御因子をコードしており、TPA存在下で、tphCA2A3BA1オペロンを正に制御していることが明らかになっている（Ishibashi. 2002. M. eng. thesis. Nagaoka University of Technology. Nagaoka; Kitajima, M. 2008. M. eng. thesis. Nagaoka University of Technology. Nagaoka）。
【化１】
2012183023.tif 000003
【０００７】
対象の基質を細胞内で分解するには、対応の分解酵素を保持していることのみならず、その基質を取り込むための機構が必要である。微生物内への基質の取り込みに関与するトランスポーターには種々のものが存在しており（Jason A. Forward et al., Journal of Bacteriology, Sept. 1997, pp. 5842-5943等）、その１つとして、クエン酸の取り込みに関与するTTT（tripartite tricarboxylate transporter）ファミリーがある（Rudy Antoine et al, Journal of Bacteriology, Feb. 2003, pp.1470-1474）。TTTは、ペリプラズムに局在する基質結合タンパク質（SBP）（TctC）、１２回膜貫通α−ヘリックスを持つ大膜タンパク質（TctA）及び４回膜貫通α−ヘリックスを持つ小膜タンパク質（TctB）から成り、百日咳の原因菌であるボルデテラ・ペルツシス（Bordetella pertussis）においてその存在が知られている。
【０００８】
ボルデテラ・ペルツシス等の複数のβプロテオバクテリアには、細胞質外溶質受容体をコードしていると推定される遺伝子ファミリーが存在している。その一員として、bug（Bordetella uptake genes）と称される遺伝子であって、TTTをコードするポリシストロニックなオペロン内に含まれる遺伝子がある（Rudy Antoine et al（上掲））。
【０００９】
TPA分解微生物であるE6株においても、bug遺伝子の１つと相同性のあるtphCの存在が確認されており、また、tphC破壊株がpH依存的にTPA存在下での生育能を欠損したこと等から、TTTシステムを介したTPAの取り込み系の存在が推定されている（Mikio Sasoh et al., Applied and Environmental Microbiology, Mar. 2006, pp. 1825-1832）。
【００１０】
しかしながら、芳香族酸であるTPAの細胞内への取り込み系は、未だ十分に明らかにされているとは言えない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開2005-278549号公報
【特許文献２】特開2007-104942号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】H R Schlafli et al., J Bacteriol. 1994 November; 176(21): 6644-6652
【非特許文献２】Ishibashi. 2002. M. eng. thesis. Nagaoka University of Technology. Nagaoka
【非特許文献３】Kitajima, M. 2008. M. eng. thesis. Nagaoka University of Technology. Nagaoka
【非特許文献４】Jason A. Forward et al., Journal of Bacteriology, Sept. 1997, pp. 5842-5943
【非特許文献５】Rudy Antoine et al, Journal of Bacteriology, Feb. 2003, pp.1470-1474
【非特許文献６】Mikio Sasoh et al., Applied and Environmental Microbiology, Mar. 2006, pp. 1825-1832
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
微生物を用いてTPA等のフタル酸類から生分解性プラスチックの原料を発酵生産するためには、フタル酸類を菌体内へ効率良く取り込む機構の解明、そして、その取り込みに関与する遺伝子の同定が必要と考えられる。従って、本発明は、フタル酸の取り込みに関与する新規遺伝子を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
ボルデテラ・ペルツシスのbug遺伝子と相同な配列の１つに、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）のTTTシステムを構成するtctCがある。本発明者は既に、TPA分解微生物の１つである上記E6株と近縁なコマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）KF-1株（以降、単に「KF-1株」と称することもある）中に、サルモネラ・エンテリカのTTTシステムを構成している遺伝子群と相同性のある２つの遺伝子群tctCBIAIとtctBIIAIIが存在していることを突き止めている。参考までに、tctBIの遺伝子配列及びそのアミノ酸配列を配列番号１１及び１２に、そしてtctAIの遺伝子配列及びそのアミノ酸配列を配列番号１３及び１４に、tctBIIの遺伝子配列及びそのアミノ酸配列を配列番号１５及び１６に、tctAIIの遺伝子配列及びそのアミノ酸配列を配列番号１７及び１８に示す。また、サルモネラ・エンテリカにおけるtctBの遺伝子配列及びそのアミノ酸配列を配列番号１９及び２０に、そしてtctAの遺伝子配列及びそのアミノ酸配列を配列番号２１及び２２にそれぞれ示す。
【００１５】
本発明者がE6株中の上記tctAとtctBに対応すると考えられる遺伝子を単離し、その機能を検討した結果、これらの遺伝子がフタル酸化合物の取り込みに関与していることを見出し、本発明を完成させるに至った。E6株におけるフタル酸化合物の取り込みはTTTシステムと異なる機構であると考えられるため、後述のとおり、当該取り込み機構をTPI(tripartite transporter of phthalate isomers)システム、tctAIIをtpi(tripartite transporter of phthalate isomers)A、そしてtctBIIをtpiBと命名した（tpiA及びtpiBの命名はTPIシステムを説明して初めて理解可能なものになると思われます。従いまして、段落番号［００１６］第２行でtpiAについて記載する必要があるため、削除された記載を復活させました。ご了承お願い致します）。
【００１６】
すなわち、本願は下記の発明を包含する：
［１］ 下記(a-1)〜(a-4)のいずれかのDNAから成る遺伝子tpiA：
(a-1) 配列番号１記載の塩基配列から成るDNA、
(a-2) 配列番号２記載のアミノ酸配列をコードするDNA、
(a-3) 配列番号１記載の塩基配列から成るDNA又はその相補配列から成るDNAと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つフタル酸化合物の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードするDNA、あるいは
(a-4) 配列番号２記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つフタル酸化合物の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードする遺伝子。
［２］ 下記(b-1)〜(b-4)のいずれかのDNAから成る遺伝子tpiBを更に含む、［１］の遺伝子：
(b-1) 配列番号３記載の塩基配列から成るDNA、
(b-2) 配列番号４記載のアミノ酸配列をコードするDNA、
(b-3) 配列番号３記載の塩基配列から成るDNA又はその相補配列から成るDNAと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つフタル酸化合物の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードするDNA、あるいは
(b-4) 配列番号４記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つフタル酸化合物の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードする遺伝子。
［３］ 前記フタル酸化合物がテレフタル酸及び／又はイソフタル酸である、［１］又は［２］の遺伝子。
［４］ 下記(c-1)〜(c-4)のいずれかのDNAから成る遺伝子iphCを更に含む、［１］〜［３］のいずれかの遺伝子：
(c-1) 配列番号５記載の塩基配列から成るDNA、
(c-2) 配列番号６記載のアミノ酸配列をコードするDNA、
(c-3) 配列番号５記載の塩基配列から成るDNA又はその相補配列から成るDNAと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つイソフタル酸の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードするDNA、あるいは
(c-4) 配列番号６記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つイソフタル酸の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードする遺伝子。
［５］ 下記(d-1)〜(d-4)のいずれかのDNAから成る遺伝子tphCIIを更に含む、［１］〜［４］のいずれかの遺伝子：
(d-1) 配列番号７記載の塩基配列から成るDNA、
(d-2) 配列番号８記載のアミノ酸配列をコードするDNA、
(d-3) 配列番号７記載の塩基配列から成るDNA又はその相補配列から成るDNAと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つテレフタル酸の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードするDNA、あるいは
(d-4) 配列番号８記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つテレフタル酸の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードする遺伝子。
［６］ ［１］〜［５］のいずれかの遺伝子を含むオペロン。
［７］ ［１］〜［５］のいずれかの遺伝子を含む組換えベクター。
［８］ ［７］の組換えベクターを含む形質転換体であって、フタル酸化合物の菌体内への取り込み能を有する形質転換体。
［９］ ［８］の形質転換体を、フタル酸化合物の存在下で培養し、当該培養物からPDCを採取することを特徴とする、当該フタル酸化合物の分解産物の製造方法。
［１０］下記(a-1)〜(a-3)のいずれかのタンパク質：
(a-1) 配列番号２記載のアミノ酸配列から成るタンパク質、
(a-2) 配列番号１記載の塩基配列から成るDNA又はその相補配列から成るDNAと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つフタル酸化合物の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードするDNAによってコードされるタンパク質、あるいは
(a-3) 配列番号２記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つフタル酸化合物の菌体内への取り込みに関与するタンパク質。
［１１］ 下記(b-1)〜(b-3)のいずれかのタンパク質を更に含む、［１０］のタンパク質：
(b-1) 配列番号４記載のアミノ酸配列から成るタンパク質、
(b-2) 配列番号３記載の塩基配列から成るDNA又はその相補配列から成るDNAと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つフタル酸化合物の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードするDNAによってコードされるタンパク質、あるいは
(b-3) 配列番号４記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つフタル酸化合物の菌体内への取り込みに関与するタンパク質。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ペットボトルの原料として広く工業的に使用されているフタル酸化合物の分解能を有する微生物に当該化合物を取り込む能力がないか、あるいは当該能力が低い場合であっても、本発明の遺伝子を当該微生物内で発現させることで、細胞内への取り込み能を獲得又は向上させることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、E6株と、同株のtpiA中のApaIサイトにカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたtpiA遺伝子破壊株（DKTP株）のtpiA遺伝子周辺の模式図（１B）と、E6株とDKTP株のサザンハイブリダイゼーション解析結果を示す図（１A）である。
【図２】図２は、テレフタル酸存在下で培養したE6株及びDKTP株のテレフタル酸取り込み能をシンチレーションカウンターで評価した結果を示す図である。
【図３】図３は、テレフタル酸存在下で培養したE6株及びDKTP株のテレフタル酸生育能を培養液の濁度（OD600）で評価した結果を示す図である。
【図４】図４は、イソフタル酸存在下で培養したE6株及びDKTP株のイソフタル酸生育能を培養液の濁度（OD600）で評価した結果を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、tpiA遺伝子を含む組換えベクターpJBtpiAの作製方法を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、tpiA遺伝子を含む組換えベクターpJBtpiAの作製方法を示す図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、tpiA遺伝子を含む組換えベクターpJBtpiAの作製方法を示す図である。
【図６】図６は、テレフタル酸存在下で培養した、DKTP株、tpiA遺伝子を含んでいないプラスミドpJB866を保持するDKTPA株（DKTPA[negative]株）及びtpiA遺伝子を含む組換えベクターpJBtpiAにより形質転換したDKTPA株（DKTPA[tpiA]株）のテレフタル酸生育能を培養液の濁度（OD660）で評価した結果を示す図である。
【図７】図７は、イソフタル酸存在下で培養した、DKTP株、tpiA遺伝子を含んでいないプラスミドpJB866を保持するDKTPA株（DKTPA[negative]株）及びtpiA遺伝子を含む組換えベクターpJBtpiAにより形質転換したDKTPA株（DKTPA[tpiA]株）のイソフタル酸生育能を培養液の濁度（OD660）で評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
TPIシステムを構成する大膜タンパク質TpiA及び小膜タンパク質TpiB
コマモナス スピーシーズE6株は、プラスチック等の原材料であるテレフタル酸を菌体内に取り込み、且つ分解する能力を有する。他の微生物におけるTTTシステムとの相同性に基づき単離された同株のtpiBA遺伝子は、TTTシステムでは確認されていない、テレフタル酸等の芳香族化合物の菌体内への取り込みに関与する。従って、本明細書においては、tpiA遺伝子（tripartite transporter of phthalate isomers A）（塩基配列を配列番号１で示す）と、tpiB遺伝子（塩基配列を配列番号３で示す）が関与するフタル酸化合物のトランスポーター機能を「TPIシステム」と称する。
【００２０】
TTTシステムは、ペリプラズムに局在するSBP（TctC）、１２回膜貫通α−ヘリックスを有する大膜タンパク質（TctA）及び４回膜貫通α−ヘリックスを持つ小膜タンパク質（TctB）により構成されている。tpiA及びtpiBは、TctA及びTctBをコードする遺伝子と相同性があり、また、TMHMM Server v. 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）での膜貫通領域予測の解析結果（結果は示さず）から、それぞれtpiA及びtpiBと同様に大膜タンパク質及び小膜タンパク質を構成していると考えられる。事実、テレフタル酸の取り込み試験の結果（図２）は、tpiAが膜タンパク質をコードする遺伝子であることを示唆している。本明細書では、当該大膜タンパク質を「TpiA」（アミノ酸配列を配列番号２で示す）と、そして当該小膜タンパク質を「TpiB」（アミノ酸配列を配列番号４で示す）と称する。尚、TpiA及びTpiBはそれぞれ、全長アミノ酸配列の比較で、サルモネラ・エンテリカのTctAと３９．５％及びTctBと２２．３％（一部では２５．３％）、そしてKF-1株のtctAIIと９８．４％及びtctBIIと９３．９％のアミノ酸同一性を有する。
【００２１】
本発明のtpiA及びtpiBは、後述するように、E6株と近縁のKF-1株中の遺伝子を参考にプライマーを作成し、当該プライマーを用いて全DNAからPCRにより増幅して得られた増幅産物の塩基配列を決定することで単離された。しかしながら、本発明の遺伝子の取得方法は特に限定されず、例えば、本明細書に開示されている当該遺伝子の塩基配列の情報に基づいて適当なプローブやライブラリーを調製し、それらを用いて、菌株のcDNAライブラリーやゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることで得ることができる。具体的には、本発明の遺伝子を発現する微生物、例えばコマモナス スピーシーズE6株より、常法に従ってゲノムDNAライブラリーを調製し、当該ライブラリーから、本発明遺伝子に特有の適当なプローブ等を用いて所望クローンを選択することにより製造することができる。微生物株からの全RNAの分離、mRNAの分離及び精製、ゲノムDNAの取得及びそのクローニングなどは、いずれも常法に従って行うことができる。
【００２２】
上記方法において用いられるプローブとしては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたDNAなどが一般的に使用できる。また、本発明の遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンス・プライマー及びアンチセンス・プライマーを、スクリーニング用プローブとして用いることができる。
【００２３】
本発明の遺伝子の取得に際しては、PCR（Science，230，1350（1985））によるDNA増幅法が好適に利用できる。増幅させたDNA断片の単離精製は、常法に従って行うことができる。例えば、ゲル電気泳動法などが挙げられる。上記方法に従って得られる本発明の遺伝子は、例えばジデオキシ法（Proc．Natl．Acad．Sci.，USA.，74，5463（1977））、マキサム−ギルバート法（Methods in Enzymology，65，499（1980））などの常法に従って、その塩基配列を決定することができる。また、簡便には、市販のシークエンスキットなどを用いて、その塩基配列を決定することができる。
【００２４】
tpiA（配列番号１）及びtpiB（配列番号３）は、対応する配列番号によって特定されるDNA分子や、そのアミノ酸配列をコードするDNA分子の他に、そのDNA分子と相補的な塩基配列からなるDNAと高ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つそのDNA分子と同一の活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子も含まれる。
【００２５】
ここで、本明細書で使用する場合、「高ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。高ストリンジェントな条件としては、同一性が高いDNA同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、例えば、Molecular cloning a Laboratory manual 2nd edition（Sambrookら、1989）に記載の条件が挙げられる。具体的には、通常のサザンハイブリダイゼーションにおける洗浄の条件である60℃、1×SSC、0.1％SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1％SDSで相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２６】
高ストリンジェントでハイブリダイズするDNAに加え、本発明の遺伝子tpiA及びtpiBは、それぞれ、TpiAのアミノ酸配列（配列番号２）の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つフタル酸化合物の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードするDNA分子、及びTpiBのアミノ酸配列（配列番号４）の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つフタル酸化合物の菌体内への取り込みに関与するタンパク質をコードするDNA分子、であってもよい。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「フタル酸化合物」とは、テレフタル酸やイソフタル酸等の芳香族カルボン酸を意味する。好ましい態様において、フタル酸化合物はテレフタル酸又はイソフタル酸である。中でも、テレフタル酸が特に好ましい。
【００２８】
更に、「1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、各配列番号によって特定されるアミノ酸配列と比較して、所望の機能を失わない範囲の数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された変異アミノ酸配列を意味する。
【００２９】
tpiA又はtpiBと高ストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされるタンパク質、あるいはTpiA又はTpiBの上記変異アミノ酸配列に対応するタンパク質は、元の遺伝子配列によってコードされるタンパク質と同じ機能、すなわち、フタル酸化合物の輸送に関与するものでなくてはならない。例えば、本明細書の実施例に記載の基質取り込み実験において、TpiAやTpiBのフタル酸化合物取り込み能と同程度、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、より好ましくは１００％以上の取り込み能を示すものは本発明の範囲内に含まれ得る。
【００３０】
オペロン
本発明の遺伝子は、フタル酸化合物の取り込みに関与する複数の遺伝子がポリシストロニックに転写されるオペロンとして存在していてもよい。本明細書で使用する場合、「オペロン」とは、機能的に関連した複数のタンパク質の合成に関与する一群が結合した遺伝子単位を意味する。オペロンは、本発明の遺伝子に加え、その調節遺伝子を含む。調節遺伝子は公知のものでよく、本発明の遺伝子の発現を調節するために、当業者により適宜選択され得る。
【００３１】
ベクター
本発明のベクターは、上記遺伝子を含む組換えベクターである。本発明のベクターにおいては、上記の遺伝子がすべて一つの発現ベクター内に含まれるように構成されていてもよく、あるいは、後述する遺伝子も含め、２グループ以上に分かれて、それぞれ別個の発現ベクターに含まれるように構成されていてもよい。発現ベクターにおいて、本発明の遺伝子は、プロモーターとターミネーターとの間に挿入することができる。しかしながら、本発明で使用する遺伝子の配置はこの位置に限定されない。
【００３２】
本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に制限されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNAなどが挙げられる。
【００３３】
プラスミドDNAとしては、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pET21、pET28、pGEX-4T、pQE-30、pQE-60などの大腸菌宿主用プラスミド、pUB110、pTP5などの枯草菌用プラスミド、YEp13、YEp24、YCp50などの酵母宿主用プラスミド、pBI221、pBI121などの植物細胞宿主用プラスミドなどが挙げられる。ファージDNAとしてはλファージなどが挙げられる。更に、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００３４】
本発明に係る遺伝子をベクターに挿入するには、まず、本発明に係る遺伝子を有する精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適宜末端を平滑化、脱リン酸化等した後、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。本発明のベクター内でのtpiA及びtpiB並びに後述するiphC及びtphCIIの配置は、適当なプロモーターの後である限り、特に限定されない。後述のとおり、実施例においては、本発明の遺伝子は各ORFの上流域、下流域を含むゲノム部分断片として連結されている（図５）。
【００３５】
本発明の遺伝子は、各遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込むことができる。すなわち、ベクターは、本発明に係る各遺伝子、プロモーター、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（シャイン・ダルガノ配列）などを含むように調製することができる。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを使用することができる。
【００３６】
プロモーターとしては、大腸菌などの宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばlacプロモーター、trpプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの大腸菌由来のものやT7プロモーターなどのファージ由来のものが用いられる。更に、tacプロモーターなどのように人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
【００３７】
形質転換体
tpiA、更にはtpiB、任意にiphC及び／又はtphCIIを含む組換えベクターを、これらの遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより、宿主を形質転換することができる。形質転換の方法としては、プロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３８】
宿主としては、本発明の遺伝子群を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）などのエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）などのバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）などのシュードモナス属、コマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）などのコマモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）などのリゾビウム属に属する細菌類の他に、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母；シロイヌナズナ、タバコ、トウモロコシ、イネ、ニンジンなどから株化した植物細胞や該植物から調製したプロトプラスト；COS細胞、CHO細胞などの動物細胞；及び、Sf9、Sf21などの昆虫細胞が挙げられる。フタル酸化合物を分解する酵素を発現しているにも拘わらず、その取り込み能がないか又は低い宿主が好ましい。
【００３９】
形質転換体の選択は、形質転換に使用するベクターの選択マーカー、例えば形質転換体のDNA組換えにより獲得する薬剤耐性を指標にすることができる。薬剤耐性マーカーとしては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等が挙げられる。これらの形質転換体の中から目的の組換えベクターを含有する形質転換体の選択は、例えば遺伝子の部分的なDNA断片をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション法により行うのが好ましい。プローブの標識としては、例えば放射性同位元素、ジゴキシゲニン、酵素等を用いることができる。
【００４０】
フタル酸化合物の分解産物の製造方法
上述のように得られた組換えベクターは、フタル酸化合物を分解する能力を本質的に有するか、あるいは形質転換等により獲得しているものの、フタル酸取り込み能がない、又は取り込み能が低い所望の細胞に導入することができる。それにより、当該細胞は、取り込み可能となったフタル酸化合物に加え、糖類、窒素源、金属塩、ミネラル、ビタミン等を含む培地を用いて、適当な条件下で培養することで、フタル酸化合物の分解産物、例えば1,2-ジヒドロキシ-3,5-シクロヘキサジエン-1,4-ジカルボン酸（DCD）、プロトカテク酸（PCA）、更には2−ピロン−4,6−ジカルボン酸（PDC）を製造することができる。
【００４１】
更に、フタル酸化合物を2−ピロン−4,6−ジカルボン酸（PDC）まで分解するのに適した酵素をコードしている組換えベクターを本発明の遺伝子を含む組換えベクターと併用することで、所望のフタル酸化合物分解産物の収率が増大し得る。
【００４２】
培地のpHは、形質転換体が生育し得る範囲のpHであればよく、pH ６〜８程度に調整するのが好適である。培養は、好気的条件下で、１５〜４０℃、好ましくは２８〜３７℃で基質を投入してから少なくとも６時間、典型的には１〜７日間振盪又は通気攪拌培養すればよい。
【００４３】
フタル酸化合物の取り込み能は、TTTファミリーのbug遺伝子と相同性のあるiphC遺伝子（Yuki Fukuhara et al., Applied and Environmental Microbiology, Jan. 2010, pp. 519-527）やtphCII遺伝子 (Sasoh et al. (上掲))を上記遺伝子とともに発現させることで更に向上し得る。これらの論文において、iphC遺伝子（periplasmic solute binding receptor genes）及びtphCII遺伝子（periplasmic TPA binding receptor）の破壊株がそれぞれ特定のpHにおいてイソフタル酸中及びテレフタル酸中で生育できなかったことから、各遺伝子がイソフタル酸及びテレフタル酸の取り込みに関与していることが示唆されている。
【００４４】
iphC遺伝子及びtphCII遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号５及び配列番号７で示し、そしてそれらの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号６及び配列番号８で示す。iphC遺伝子及びtphCII遺伝子は、本発明の遺伝子のみならず本発明のオペロンやベクター内に組み込まれ得る。その調製方法についても、本発明の遺伝子について詳述したように調製することができる。
【００４５】
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００４６】
実施例１  tpiA遺伝子の単離
A) E6株の全DNAの単離
E6株を10mlのLB培地で一晩培養して集菌した後、1mlのSTEバッファー（10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、100mM NaCl）で洗浄した。300μlのSTEバッファーに菌体を懸濁させ、当該懸濁液に1mgのリゾチーム（生化学工業株式会社）を溶解した100μlのSTEバッファーを加えて混合し、３７℃にて１時間反応させた。以降の操作はボルテックスミキサーによる撹拌、ピペッティング処理を経由せずに行った。
【００４７】
上記反応液に対し、0.1mgのプロテインキナーゼK（和光純薬工業株式会社）を溶解した50μlのSTEバッファーを添加して混合した後、更に３７℃で１時間静置した。その後、終濃度0.5%のSDSを添加して６５℃で１時間以上保温した。保温後の試料を複数回フェノール／クロロホルム抽出にかけた後、得られた上清に当量のイソプロピルアルコールを添加して穏やかに転倒混和した。
【００４８】
混和された試料を遠心分離にかけ、得られたペレットを70%エタノールにより洗浄した後、風乾して10μg/mlのRNase（和光純薬工業株式会社）を含むTEバッファー（10mM Tris-HCl (pH8.0)、1mM EDTA）に溶解し、３７℃にて１時間以上RNA消化を行った。
【００４９】
B) プローブの作製
pT7tctAIIをBamHI-NdeIで消化したものを、0.8%アガロースゲル電気泳動にかけ、ゲルからQIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen社)を用いて増幅断片を切り出し、1μgのDNAを15μlの滅菌蒸留水に溶解した。溶液を沸騰水中で10分間熱変性させ、氷上で５分間急冷した。フラッシュ後、当該溶液に2μlのヘキサヌクレオチド混合液、2μlのジゴキシゲニン標識dUTPを含むdUTP標準混合液、1μlのKlenow酵素を添加し、３７℃で２０時間静置した。
【００５０】
その後、上記溶液に200μMのEDTAを2μl加えて酵素反応を停止させ、4M塩化リチウム溶液を2.5μl、エタノールを75μl加え、-80℃で３０分間静置し、４℃で15,000rpmの遠心分離を１０分間行った。得られたペレットを70%エタノールで洗浄し、50μlのTEバッファーに溶解した。
【００５１】
C) サザンハイブリダイゼーション解析
本実施例における以下のサザンハイブリダイゼーションの基本的な実験操作は、DIG Labeling Kit及び検出キット（Roche Diagnostics社）に従った。
【００５２】
上述のようにして得られたE6株の全DNAを各制限酵素で消化した。各消化物を0.8%アガロースゲル電気泳動で分離した後、ゲルを0.25N塩酸で３０分間振盪した後、溶液を捨てゲルを蒸留水で２回洗浄し、ゲルを中和溶液中で３０分間振盪した。
【００５３】
トランスファーはナイロンメンブレンHybond-N（Amersham Bioscience社）を用いて、バキュームブロッダーにより5mHg、９０分の条件で行った。トランスファー後のメンブレンを2xSSC（0.3M NaCl、0.03Mクエン酸ナトリウム；pH7.0）で洗浄、乾燥した後、５分間UV照射してメンブレンにDNAを固定した。
【００５４】
上記メンブレンは、20mlのハイブリダイゼーションバッファー（2xSSC、1%ブロッキング試薬、1%Nラウリルサルコシン、1%SDS）を含むハイブリダイゼーションボトル中、６５℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。１０分間煮沸後１０分間急冷した前記プローブと、上記ハイブリダイゼーションバッファーのうちの3mlとを混合し、その溶液中、６５℃で６時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００５５】
ハイブリダイゼーションが終了したメンブレンを洗浄液（2xSSC、0.1%SDS）で２回洗浄した後、洗浄液2（0.1xSSC、0.1%SDS）を用いて６５℃で１時間の洗浄を２回行った。酵素標識抗体（Anti-Digoxygenin-AP-conjugate）を使用したELISA法によりメンブレン上のDNAを標識した後、発色基質（18.75mg/mlニトロブルーテトラゾリウムクロリド及び9.4mg/mlの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート  トルイジン塩/67%(v/v)DMSO）を添加してメンブレン上のシグナルを検出した。
【００５６】
D)推定tctA遺伝子の単離
KF-1株中のtctA遺伝子に相当する遺伝子をE6株から単離するべく、コロニーハイブリダイゼーションを試みた。E6株のEcoRI消化シャロミドライブラリーを含むE. coli DH5αの菌体液を希釈し、アンピシリンを含むLB寒天培地に200〜300コロニー／プレートが生育するように３７℃で培養した。気泡が入らないようプレート上にHybond-Nメンブレンを軽く載せ、１分経過後、メンブレンをプレートから剥離させ、菌体接触面を上にして、10%SDS、変性溶液、中和溶液、及び2xSSCで湿らせた3MM濾紙上にそれぞれ３分、７分、３分（２回）、及び５分浸した。
【００５７】
2xSSCを含むビーカー中で、コロニーの破片が完全に取れるまで上記メンブレンを激しく洗浄後、コロニー側を上にしてメンブレンを風乾した。メンブレンをラップに包み、５分間UV処理してDNAの固定を行った。以降の操作は、上記「C) サザンハイブリダイゼーション解析」に記載のとおり行い、また、プローブは上記「B) プローブの作製」にて作製したもの（405bpのPCR増幅断片を含むBamHI-NdeI断片）。
【００５８】
E) tpiA遺伝子の増幅と増幅断片の塩基配列決定
サルモネラ・エンテリカにおけるTTTシステムの膜タンパク質成分であるtctAと40.3 ％の相同性が見られたKF-1株のtctAII(CtesDRAFT_PD4157)の塩基配列に基づいて、tctAII遺伝子増幅プライマー4157F(5'-GACTTATGCACTGCCTCCC-3')（配列番号９）と4157R（5'-CGGTCAGCTCAGGAATATCG-3'）（配列番号１０）を設計した。
【００５９】
かかるプライマーを用いて、上述のとおり調製したE6株の全DNAを鋳型としてPCRを行った結果、KF-1株で予想される増幅サイズである約450bpの増幅断片が得られた。増幅されたDNA断片をpT7BlueにTAクローニングしたプラスミドpT7tctAIIを作製し、452bpの塩基配列を決定した。
【００６０】
F) tpiA遺伝子の単離
上記「B) プローブの作製」に記載されている方法に従い、452bpのPCR増幅断片を含むプローブを作製し、全DNAの各制限酵素消化物に対し、上述のとおりサザンハイブリダイゼーション解析を行った。その結果、EcoRI消化物において約8.0kbにシグナルが見られた。そこで、E6株のEcoRI消化シャロミドライブラリーに対し、上述したようなコロニーハイブリダイゼーション解析を行い、１つのポジティブクローンを得た。
【００６１】
G) tpiA遺伝子及び周辺領域の塩基配列決定
前記ポジティブクローンより抽出したプラスミドpCTC80より8.0kbのEcoRI断片を切り出し、pBluescript II KS(+)のEcoRIサイトへ挿入したプラスミドpKSS80FとpKSS80Rを得た。単離した8.0kbのEcoRI断片の塩基配列を決定し、KF-1株のtctBII（protein of unknown function）と93.9%の同一性を示したORFをtpiB、tctAII（protein of unknown function）と98.4%の同一性を示したORFをtpiAとした。
【００６２】
実施例２  tpiA遺伝子の機能解析
A) tpiA遺伝子破壊株の作製
E6株中のtpiA遺伝子を破壊するために、相同組み換えによりtpiA中のApaIサイトにカナマイシン耐性遺伝子を挿入した。この株は、tpiA遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子をプローブに用いたサザンハイブリダイゼーション解析によりtpiA遺伝子の破壊を確認した（図１）。このtpiA遺伝子破壊株をDKTPA株とした。
【００６３】
B) テレフタル酸（TPA）の取り込み能評価
E6株及びDKTPA株を10 mMのコハク酸を含む10 mlのW培地で12時間前培養した後、5000 rpm、10分、4°Cで集菌した。5 mlのW培地で2回菌体を洗浄した後、3 mlの同培地に懸濁した。
【００６４】
10 mMのコハク酸及び10 mMのテレフタル酸（TPA）を含む10 mlのW培地にOD600が0.2になるように植菌して4時間本培養を行った。培養後、5000 rpm、10分、4°Cで集菌した。pH 7.5に調整した50 mM Tris-MESバッファーを5 ml用いて7000 rpm、3分、4°Cで2回洗浄した後、OD600が約20になるように同培地に懸濁した。
【００６５】
14Cで放射線ラベルされたテレフタル酸（14C-TPA）を最終濃度が130 μMになるように50 mM Tris-MESバッファー（pH 7.5）に希釈しTPA Work solutionとした。50 mM Tris-MESバッファー（pH 7.5）485μlにOD600を約20に調整した菌体をOD600が約2.0になるように65 μl加え、30℃ で3分インキュベートした後に、TPA Work solutionを14C-TPAが最終濃度20 μMとなるように100 μl加えて全量650 μlとし反応を開始した。反応後10秒、30秒、1分、2分、及び3分で100 μlのサンプルを回収し、マルチフィルターFLE712AA（ADVNTEC）を用いてニトロセルロースメンブレンフィルター（ADVANTEC）にトラップした。
【００６６】
上記メンブレンフィルターを50 mM Tris-MESバッファー（pH 7.5）で3回洗浄した後、液体シンチレーションカクテル溶液（エコシンチH, National Diagnostics Inc.）に菌体をフィルターごと溶解させ、液体シンチレーションカウンター（ALOKA, AccuFLEX LSC-7400）で放射線量を測定した（図２）。またタンパク質量は、Lowly法を用いたBio-RadのDC Protein Assayに従って測定した。
【００６７】
結果、DKTPA株がテレフタル酸（TPA）を取り込まなかったことから、TpiAはテレフタル酸（TPA）の取り込みに関与することが明らかになった。また、その速度は約3 nmol/mg/minであることが示された。
【００６８】
実施例３  tpiA遺伝子破壊株のフタル酸化合物取り込み能評価
E6株を10 mlのLB培地で、DKTPA株を50 mg/Lのカナマイシンを含むLB培地でそれぞれ前培養した。E6株を10 mMテレフタル酸（TPA）、もしくはイソフタル酸（IPA）を含むW培地に、DKTPA株を50 mg/Lのカナマイシンを含む10 mMテレフタル酸（TPA）、もしくはイソフタル酸（IPA）を含むW培地にそれぞれ濁度が0.1となるように植菌した。
【００６９】
30℃にて培養し、定期的に濁度の測定を行った結果、DKTPA株はテレフタル酸（TPA）およびイソフタル酸（IPA）での生育能を失っていた（図３及び４）。
【００７０】
実施例４  tpiA遺伝子を含む組換えプラスミドによる形質転換体の作製
A) 組換えプラスミドpJBtpiAの作製
（１）pBluescriptII KS(+)にtpiA遺伝子およびtpiB遺伝子を含む8.0-kb EcoRI断片が挿入されたプラスミドpKSS80をNaeIで制限酵素消化し、tpiAB遺伝子を含む約2.6-kb NaeI断片を得た。得られた断片をpBluescriptII KS(+)のSmaI部位に導入し、pKStpiAB-Rを構築した。pKStpiAB-RをSacIおよびXhoIで制限酵素消化し、tpiAB遺伝子を含む約2.6-kb SacI-XhoI断片をpJB866のSacI-XhoI部位に導入しpJBtpiABを構築した（図５）。
【００７１】
pJBtpiABを鋳型にし、3’-側にXhoIを付加したプライマーtpiA end R （CTCGAGTATTTTGCCGCCCTAATCC）（配列番号１１）及びtpiA end F （ATGATGGAAGAAAACCTGCG）（配列番号１２）を用いてtpiAの3'末端領域をExTaqポリメラーゼ（TaKaRa）を用いてPCR増幅を行った。得られたPCR断片（274 bp）をTAクローニングにてpT7Blueに導入し、pT7tpiAを構築した（図５）。
【００７２】
シークエンス解析により増幅産物にエラーが無いことを確認した後、pT7tpiAをPstI及びXhoIで制限酵素消化し、tpiAの3'末端領域を含む約0.1-kbのPstI-XhoI断片をpBluescriptII KS(+)のPstI-XhoI部位に導入し、pKStAeを構築した。次にpJBtpiABをPstIで制限酵素消化し、tpiAを含む約1.5-kb PstI断片をpKStAeのPstI部位に導入しpKStpiAを構築した。pKStpiAをNotI及びXhoIで制限酵素消化し、tpiA全長を含む約1.6-kb断片をpJB866のNotI-XhoI部位に導入し、tpiA組み換え用プラスミドpJBtpiAを構築した（図５）。
【００７３】
B) DKTPA株へのプラスミドの導入
tpiAをもつプラスミドpJBtpiA、又はpJB866を大腸菌JM109株に形質転換し、25 mg/Lのテトラサイクリンを含むLB培地（10 ml）で、37℃で18時間振とう培養し、増殖した培養細胞から組み換えプラスミドpJBtpiA、又はpJB866を抽出した。
【００７４】
DKTPA株を、50 mg/Lのカナマイシンを含むLB液体培地200 mlで、30℃、24時間培養し氷中で30分冷却した。4℃、10分、10,000 rpmで遠心集菌し、200 mlの3Mスクロース溶液で温和に洗浄後再び遠心集菌した。続いて5Mスクロース溶液に懸濁し0℃にて保持した。
【００７５】
上記プラスミドpJBtpiA、又はpJB866を約0.05μgを含む蒸留水4μlを0.2cmのキュベットに入れ、5Mスクロース溶液に懸濁した細胞液40μlを加え、エレクトロポレーションにかけた。
【００７６】
上記処理した細胞全量を10 mlのLB液体培地に接種し、30℃で12時間培養した。培養後遠心によって菌体を集め25 mg/Lのテトラサイクリンを含むLB平板に塗布し30℃で48時間培養し、プラスミドpJBtpiA、又はpJB866を保持するテトラサイクリン耐性を示す形質転換株を得た。プラスミドpJBtpiAを保持する株をDKTPA[tpiA]株、プラスミドpJB866を保持する株をDKTPA[negative]株とした。
【００７７】
C) tpiA遺伝子を有する形質転換体のフタル酸化合物中での生育
DKTPA株を50 mg/Lのカナマイシンを含むLB培地で、DKTPA[negative]株を50 mg/Lのカナマイシンと25 mg/Lのテトラサイクリンを含むLB培地で、DKTPA[tpiA]株を50 mg/Lのカナマイシンと25 mg/Lのテトラサイクリンを含むLB培地でそれぞれ前培養した。
【００７８】
DKTPA株を50 mg/Lのカナマイシンを含む10 mMテレフタル酸（TPA）、もしくはイソフタル酸（IPA）を含むW培地に、DKTPA[negative]株を50 mg/Lのカナマイシンと25 mg/Lのテトラサイクリンを含む10 mMテレフタル酸（TPA）、もしくはイソフタル酸（IPA）を含むW培地に、DKTPA[tpiA]株を50 mg/Lのカナマイシンと25 mg/Lのテトラサイクリンを含む10 mMテレフタル酸（TPA）、もしくはイソフタル酸（IPA）を含むW培地に、それぞれ濁度が0.1となるように植菌した。
【００７９】
上記培地を30℃にて培養し、定期的に濁度の測定を行った結果、DKTPA[tpiA]株でのみテレフタル酸（TPA）およびイソフタル酸（IPA）での生育能を獲得した（図６、図７）。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【配列表】
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