(57)【要約】【課題】高感度な測定が可能な生体分子検出装置を提供する。【解決手段】レーザー１１７を溶液に照射することにより、溶液中のフリー分子１３およびバインディング分子１５に外力を加え、この外力によりフリー分子１３およびバインディング分子１５のブラウン運動を阻害した。レーザー１１７を照射された溶液中のフリー分子１３およびバインディング分子１５のブラウン運動を測定することで、バインディング分子１５に付随する抗原の濃度を正確に測定することができる。【選択図】図７Ａ
2012093338.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象物質に特異的に結合する物質と蛍光分子とが結合した第１の複合体と、該第１の複合体と前記検出対象物質とが結合した第２の複合体とが溶液中に混在し、前記第１の複合体および前記第２の複合体から発生する蛍光を検出して前記検出対象物質の検出または定量を行う生体分子検出装置であって、
前記蛍光分子に向けて励起光を照射する光源と、
前記蛍光分子から発生する蛍光を受光する受光部と、
前記第１の複合体および前記第２の複合体に外力を付与する外力付与手段と、
前記外力の付与により変化した前記第１の複合体のブラウン運動の速さおよび前記第２の複合体のブラウン運動の速さに基づいて、前記検出対象物質の検出または定量を行う演算手段とを備えることを特徴とする生体分子検出装置。
【請求項２】
前記光源は、前記蛍光分子を励起する直線偏光した励起光を照射するものであり、
前記受光部は、前記蛍光分子から発生した蛍光を、前記励起光の振動方向と平行な振動方向を有する第１の成分、および、前記励起光の振動方向と垂直な振動方向を有する第２の成分に分離する分離手段を有し、
前記演算手段は、前記受光部が分離して受光した前記第１の成分および前記第２の成分の双方を用いて前記検出対象物質の検出または定量を行うことを特徴とする請求項１に記載の生体分子検出装置。
【請求項３】
前記演算手段は、前記第１の成分および前記第２の成分から蛍光の偏光度を求めて前記第２の複合体の検出または定量を行うことを特徴とする請求項２に記載の生体分子検出装置。
【請求項４】
前記分離手段は偏光ビームスプリッタであることを特徴とする請求項２または３に記載の生体分子検出装置。
【請求項５】
前記光源は、前記溶液中の特定領域に焦点を結ぶように前記励起光を照射するものであり、
前記受光部は、前記特定領域における前記蛍光分子から発生する蛍光を受光するものであり、
前記演算手段は、前記第１の複合体が前記特定領域を出入りする頻度を表すパラメータ、および、前記第２の複合体が前記特定領域を出入りする頻度を表すパラメータに基づいて、前記検出対象物質の検出または定量を行うものであることを特徴とする請求項１に記載の生体分子検出装置。
【請求項６】
前記演算手段は、自己相関器を備え、前記パラメータをブラウン運動の速さとして、前記第１の複合体および前記第２の複合体のブラウン運動の速さを自己相関法によって求め、前記溶液中に含まれる分子の平均的な大きさを求めることにより、前記検出対象物質の検出または定量を行うものであることを特徴とする請求項５に記載の生体分子検出装置。
【請求項７】
前記受光部は、光を分光する分光手段と、該分光手段により分光された光をそれぞれ受光する複数の受光手段とを備えることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
【請求項８】
前記分光手段は、透過する光の波長が互いに異なる複数の光学フィルタであり、
前記受光部は、前記複数の光学フィルタから使用する光学フィルタを切り替える切り替え手段をさらに備え、前記蛍光の波長に応じて前記使用する光学フィルタを切り替えるものであることを特徴とする請求項７に記載の生体分子検出装置。
【請求項９】
前記分光手段は回折格子であることを特徴とする請求項７に記載の生体分子検出装置。
【請求項１０】
前記外力付与手段は、前記励起光と波長が異なる光を照射する外力付与光源を備え、前記励起光と波長が異なる光を前記溶液に照射することにより前記第１の複合体および前記第２の複合体に外力を加えるものであることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
【請求項１１】
前記外力付与光源は、前記溶液に対し複数の位置から前記励起光と波長が異なる前記光を照射するものであることを特徴とする請求項１０に記載の生体分子検出装置。
【請求項１２】
前記溶液を保持する溶液保持部であって少なくとも一面に平面を有する溶液保持部を備えることを特徴とする請求項１０または１１に記載の生体分子検出装置。
【請求項１３】
前記外力付与光源は、前記溶液を通って前記平面から出射する方向に前記励起光と波長が異なる前記光を照射するものであり、かつ、前記溶液と前記平面との界面において前記励起光と波長が異なる前記光に焦点を結ばせるものであることを特徴とする請求項１２に記載の生体分子検出装置。
【請求項１４】
前記演算手段は、前記第１の複合体および前記第２の複合体に対して前記外力付与手段によりそれぞれ異なる強度の外力が加えられることを利用して、前記第２の複合体の検出または定量を行うことを特徴とする請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の生体分子検出装置。
【請求項１５】
検出対象物質に特異的に結合する物質と蛍光分子とが結合した第１の複合体と、該第１の複合体と前記検出対象物質とが結合した第２の複合体とが溶液中に混在し、前記第１の複合体および前記第２の複合体から発生した蛍光を検出して前記検出対象物質の検出または定量を行う生体分子検出方法であって、
前記蛍光分子を励起する励起光を照射するステップと、
前記第１の複合体および前記第２の複合体に外力を加えるステップと、
前記励起光の照射により前記蛍光分子から発生した蛍光を検出するステップと、
前記外力の付与により変化した前記第１の複合体のブラウン運動の速さおよび前記第２の複合体のブラウン運動の速さに基づいて、前記検出対象物質の検出または定量を行うステップとを備えることを特徴とする生体分子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中の検出対象物質を検出する技術に係り、特に、検体内の生体分子、ウイルス、核酸、蛋白質および細菌等を検出可能な生体分子検出装置および生体分子検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医師や技師等が診療の現場で生体分子検出を行い、その場で測定結果を得て診断や治療に役立てる生体分子検出法が注目されている。生体分子検出法は、抗原抗体反応等の特異的な反応を利用した高い選択性により、血液、尿、汗といった複数成分を有する体液の中から、検出対象物質だけを選択的に検出する方法である。特に、このような生体分子検出法は、ウイルス、核酸、蛋白質および細菌等の生体分子の微量検出、検査、定量および分析などに広く用いられている。
【０００３】
生体分子検出法として、ラジオイムノアッセイが実用化されている。ラジオイムノアッセイは、アイソトープで標識された抗原または抗体を用い、その抗原または抗体と特異的に結合する抗体または抗原の有無を検出するものである。ラジオイムノアッセイは、アイソトープの放射線量を測定することにより抗体または抗原等の検出対象物質を定量するもので、高感度な測定が可能である。
【０００４】
放射性物質を用いない生体分子検出法として蛍光イムノアッセイがある。蛍光イムノアッセイとしては、予め反応層に抗体を固定しておき（これを固相という）、当該反応層に、測定対象溶液および蛍光分子で標識された抗体を流し、反応層近傍の蛍光を測定することにより、抗体に特異的に結合した抗原の濃度を測定する装置が知られている（例えば特許文献１参照）。
【０００５】
しかしながら、固相を利用した蛍光イムノアッセイは、固相を作成するのにコストがかかるという問題があった。固相を用いず液体中で生体分子検出を行う（すなわち、液相のみを用いる）方法として、蛍光偏光法を利用して抗原抗体反応を確認する方法がある。蛍光偏光法は、蛍光標識した分子に別の分子が結合し分子の大きさが変化することにより生じる、ブラウン運動の変化に基づく蛍光偏光度の値の変化を検出する方法である。蛍光偏光法を利用した生体分子検出法は、検体中の検出対象物質の簡便かつ迅速な検知法として知られている（例えば特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平７−１２０３９７号公報
【特許文献２】特開２００８−２９８７４３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の蛍光偏光法では、ランダムな運動であるブラウン運度の速さの変化を検出する必要があるが、ブラウン運動の速さが顕著に変化するためには、蛍光標識した分子が検出対象物質と結合する前後で粒子の体積がある程度変化する必要がある。
【０００８】
特許文献２には、粒子の体積を十分に変化させるために第三の分子を用いることが記載されているが、この場合予め第三の分子を用意する必要がある。
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、簡便な構成で高感度測定が可能な生体分子検出装置および生体分子検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明に係る生体分子検出装置は、
検出対象物質に特異的に結合する物質と蛍光分子とが結合した第１の複合体と、第１の複合体と検出対象物質とが結合した第２の複合体とが溶液中に混在し、第１の複合体および第２の複合体から発生する蛍光を検出して検出対象物質の検出または定量を行う生体分子検出装置であって、
蛍光分子に向けて励起光を照射する光源と、
蛍光分子から発生する蛍光を受光する受光部と、
第１の複合体および第２の複合体に外力を付与する外力付与手段と、
外力の付与により変化した第１の複合体のブラウン運動の速さおよび第２の複合体のブラウン運動の速さに基づいて、検出対象物質の検出または定量を行う演算手段とを具備する。
【００１１】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、光源は、蛍光分子を励起する直線偏光した励起光を照射するものであり、受光部は、蛍光分子から発生した蛍光を、励起光の振動方向と平行な振動方向を有する第１の成分、および、励起光の振動方向と垂直な振動方向を有する第２の成分に分離する分離手段を有し、演算手段は、受光部が分離して受光した第１の成分および第２の成分の双方を用いて検出対象物質の検出または定量を行うことが好ましい。この場合において、演算手段は、第１の成分および第２の成分から蛍光の偏光度を求めて第２の複合体の検出または定量を行うことが好ましい。また、分離手段は偏光ビームスプリッタであることが好ましい。
【００１２】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、光源は、溶液中の特定領域に焦点を結ぶように励起光を照射するものであり、受光部は、特定領域における蛍光分子から発生する蛍光を受光するものであり、演算手段は、第１の複合体が特定領域を出入りする頻度を表すパラメータ、および、第２の複合体が特定領域を出入りする頻度を表すパラメータに基づいて、検出対象物質の検出または定量を行うものであることが好ましい。この場合において、演算手段は、自己相関器を備え、上記パラメータをブラウン運動の速さとして、第１の複合体および第２の複合体のブラウン運動の速さを自己相関法によって求め、溶液中に含まれる分子の平均的な大きさを求めることにより、検出対象物質の検出または定量を行うものであることが好ましい。
【００１３】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、受光部は、光を分光する分光手段と、分光手段により分光された光をそれぞれ受光する複数の受光手段とを備えることが好ましい。この場合において、分光手段は、透過する光の波長が互いに異なる複数の光学フィルタであり、受光部は、複数の光学フィルタから使用する光学フィルタを切り替える切り替え手段をさらに備え、蛍光の波長に応じて使用する光学フィルタを切り替えるものであることが好ましい。或いは、分光手段は回折格子であることが好ましい。
【００１４】
また、外力付与手段は、励起光と波長が異なる光を照射する外力付与光源を備え、励起光と波長が異なる光を溶液に照射することにより第１の複合体および第２の複合体に外力を加えるものであることが好ましい。この場合において、外力付与光源は、溶液に対し複数の位置から励起光と波長が異なる上記光を照射するものであることが好ましい。
【００１５】
また、外力付与手段が励起光と波長が異なる光を照射する外力付与光源である場合において、溶液を保持する溶液保持部であって少なくとも一面に平面を有する溶液保持部を備えることが好ましい。この場合において、外力付与光源は、溶液を通って上記平面から出射する方向に励起光と波長が異なる上記光を照射するものであり、かつ、溶液と上記平面との界面において励起光と波長が異なる上記光に焦点を結ばせるものであることが好ましい。
【００１６】
また、本発明に係る生体分子検出装置において、演算手段は、第１の複合体および第２の複合体に対して外力付与手段によりそれぞれ異なる強度の外力が加えられることを利用して、第２の複合体の検出または定量を行うことが好ましい。
【００１７】
また、本発明に係る生体分子検出方法は、
検出対象物質に特異的に結合する物質と蛍光分子とが結合した第１の複合体と、第１の複合体と検出対象物質とが結合した第２の複合体とが溶液中に混在し、第１の複合体および第２の複合体から発生した蛍光を検出して検出対象物質の検出または定量を行う生体分子検出方法であって、
蛍光分子を励起する励起光を照射するステップと、
第１の複合体および第２の複合体に外力を加えるステップと、
励起光の照射により蛍光分子から発生した蛍光を検出するステップと、
外力の付与により変化した第１の複合体のブラウン運動の速さおよび第２の複合体のブラウン運動の速さに基づいて、検出対象物質の検出または定量を行うステップとを具備する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、高感度な生体分子検出をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】実施の形態１に係る生体分子検出装置の抗原抗体反応の概要を説明するための模式図である。
【図１Ｂ】実施の形態１に係る生体分子検出装置の抗原抗体反応の概要を説明するための模式図である。
【図２Ａ】励起光の振動方向と蛍光分子の遷移モーメントとが互いに平行な場合を表した模式図である。
【図２Ｂ】励起光の振動方向と蛍光分子の遷移モーメントとが互いに垂直な場合を表した模式図である。
【図３Ａ】フリー分子（抗原が結合していない抗体および蛍光分子）を表した模式図である。
【図３Ｂ】バインディング分子（抗原が結合した抗体および蛍光分子）を表した模式図である。
【図４Ａ】実施の形態１に係る生体分子検出装置の外観斜視図である。
【図４Ｂ】実施の形態１に係る生体分子検出装置の開閉部を開けた場合の外観斜視図である。
【図５】生体分子検出装置の主要な構成を示すブロック図である。
【図６】外力付与光源部から照射される外力付与光の照射方向を上面から見た模式図である。
【図７Ａ】外力付与光を照射しない場合におけるブラウン運動の速さと分子の個数との関係を表したグラフである。
【図７Ｂ】外力付与光を照射した場合におけるブラウン運動の速さと分子の個数との関係を表したグラフである。
【図８】実施の形態１に係る生体分子検出装置における受光部の詳細な構成を表した模式図である。
【図９】検出対象物質の濃度と蛍光偏光度との関係を表した検量線の例である。
【図１０】検体の準備から廃棄までの流れを模式的に表した図である。
【図１１】実施の形態２に係る生体分子検出装置の主要な構成を示すブロック図である。
【図１２】実施の形態２に係る生体分子検出装置における受光部の詳細な構成を表した模式図である。
【図１３】拡散時間と相関関数との関係を表したグラフの例である。
【図１４】抗原濃度と平均拡散時間との関係を表す検量線の例である。
【図１５】試薬カップの多点に外力付与光を底面から入射させる場合を示す概念図である。
【図１６】外力付与光を所定の方向から多点に入射させるための外力付与光源部の構造を示す概念図である。
【図１７】外力付与光を所定の方向から多点に入射させるための光学系の一例を示す概念図である。
【図１８】外力付与光を所定の方向から多点に入射させるための光学系の別の例を示す概念図である。
【図１９】マイクロレンズアレイを示す概念図である。
【図２０】試薬カップの形状の一例を示す概念図である。
【図２１】集光された外力付与光の焦点と試薬カップとの位置関係の一例を示す概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、添付図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。生体分子検出には様々な特異的な反応が利用されるが、各実施の形態では抗原および抗体の特異的な反応を利用し、当該抗体に標識された蛍光分子から発生する蛍光を基に、抗体と反応した抗原を検出対象物質として検出する装置を例にとって説明する。
【００２１】
（実施の形態１）
図１Ａおよび図１Ｂは、本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置における抗原抗体反応の概要を示した模式図である。図１Ａおよび１Ｂを用いて、液中での抗原抗体反応について説明する。円筒形の試薬カップ１０の中に乾燥した抗体１２が入れられている場合を考える。抗体１２は、蛍光分子１４で標識されている。
【００２２】
本実施の形態において、検体は全血から分離した血漿１６である。試薬カップ１０に血漿１６を分注して撹拌すると、抗体１２と特異的に結合する抗原１８が血漿１６中に存在する場合は、抗体１２と抗原１８との間で抗原抗体反応が起こり、図１Ｂに示すように抗原１２および抗体１８が特異的に結合して血漿１６中に存在する。
【００２３】
本実施の形態では、検体に全血から分離した血漿１６を用い、検出対象物質である抗原１８としてＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ）を検出する場合を考え、検出対象物質と特異的に結合する物質である抗体１２として抗ＰＳＡ抗体を用いた場合について示す。蛍光分子１４としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社の商品名）を用いた。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８は、波長６１０ｎｍ程度にピークを持ち、５５０ｎｍ−７００ｎｍ程度の波長を持った蛍光を発する。
【００２４】
抗体１２は抗原１８に対して十分に多い量が入れられているため、一部の抗体１２は抗原抗体反応をしないまま血漿１６に残る。以下、抗原抗体反応で結合した抗体１２および抗原１８ならびに蛍光分子１４の複合体をバインディング分子、抗原抗体反応をせず液中に漂っている抗体１２および蛍光分子１４の複合体をフリー分子と呼ぶ。バインディング分子およびフリー分子は、血漿溶液中に混在している。なお、血漿１６中には抗原１８以外の成分も存在するが、説明を簡単にするため、図１Ａおよび１Ｂでは抗原１８以外の成分は省略してある。
【００２５】
本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置は、液相であることによりフリー分子およびバインディング分子が混在している溶液に対し、励起光を照射し、蛍光分子１４から発生する蛍光を受光して抗原１８の検出および定量を行う。従って、抗原１８を含むバインディング分子から発生する蛍光のみを検出することが望ましい。しかしながら、フリー分子およびバインディング分子は溶液中に混在しているため、溶液に励起光を照射すると、フリー分子に付随する蛍光分子１４からも蛍光が発生する。この蛍光はバインディング分子に付随する蛍光分子１４から発生する蛍光との関係で不要成分となる。そこで、本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置は、全蛍光データの中からバインディング分子に付随する蛍光分子１４から発生する蛍光の寄与分を算出する。
【００２６】
本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置１００において、バインディング分子から発生する蛍光の寄与分とフリー分子から発生する蛍光の寄与分とを算出する原理を説明するために、直線偏光した励起光による蛍光分子１４の励起効率について図２Ａおよび２Ｂを用いて説明する。
【００２７】
図２Ａは、励起光１９の振動方向と蛍光分子１４の遷移モーメントとが互いに平行な場合を表す模式図、図２Ｂは、励起光１９の振動方向と蛍光分子１４の遷移モーメントとが互いに垂直な場合を表す模式図である。ここでは、説明を分かりやすくするため、蛍光分子１４の向き（楕円で示された蛍光分子１４の長軸方向）と、遷移モーメントの向きとを揃えて描いた図とした。なお本明細書において、光の「振動方向」とは電場の振動方向を意味し、光が偏光している場合にはその偏光方向と同義である。
【００２８】
蛍光分子１４は、光エネルギーを吸収すると励起状態に遷移し、基底状態に戻る過程で蛍光を発する。蛍光分子１４が励起される場合、蛍光分子１４の分子構造によって決まる遷移モーメントという蛍光分子１４内のベクトルが励起光１９と相互作用する。遷移モーメントは蛍光分子１４内で、ある固有の方向を持っており、遷移モーメントの方向と励起光１９の振動方向との関係が蛍光分子１４の励起効率を決定する。具体的には、蛍光分子１４は、遷移モーメントと平行な方向に振動する光を選択的に吸収する。従って、図２Ａおよび２Ｂに示すように、励起光１９が紙面上下に振動しながら紙面左から右に進行して蛍光分子１４に吸収される場合、直線偏光した励起光１９の振動方向が蛍光分子１４の遷移モーメントの方向と平行な場合（図２Ａ）に最も励起効率が高くなり、直線偏光した励起光１９の振動方向と蛍光分子１４の遷移モーメントの方向とのなす角の角度が大きくなるほど励起効率は下がり、直線偏光した励起光１９の振動方向が蛍光分子１４の遷移モーメントと直交している場合（図２Ｂ）に励起効率が０となる。遷移モーメントの向きは、蛍光分子１４の向きによって変わるため、溶液中における蛍光分子１４の向きは、蛍光分子１４の励起効率に影響を与える。
【００２９】
溶液中における蛍光分子１４の向きを考えるため、図３Ａおよび３Ｂを用いて、溶液中におけるフリー分子１３およびバインディング分子１５の運動について説明する。図３Ａは、フリー分子１３を構成する抗体１２および蛍光分子１４を示した模式図である。図３Ｂは、バインディング分子を構成する抗体１２、抗原１８および蛍光分子１４を示した模式図である。
【００３０】
フリー分子１３およびバインディング分子１５は、溶液中で不規則に運動（ブラウン運動）しており、溶液中で移動および回転運動を行っている。溶液中での分子のブラウン運動は、絶対温度、分子の体積、分子の質量および溶媒の粘度等の影響を受けることが知られている。バインディング分子１５は、抗原１８の分だけフリー分子１３より体積が大きく、溶液中でブラウン運動しにくい。
【００３１】
例えば、蛍光標識した分子が検出対象物質と結合して分子の大きさが変化することに起因するブラウン運動の変化を、蛍光の偏光度の変化によって検出して検出対象物質の検出を行う方法（蛍光偏光法）が知られている。偏光度とは、光の偏光状態を表す尺度であり、０から１の値をとり、完全偏光（例えば直線偏光）は１、非偏光は０で表される。
【００３２】
一般に、直線偏光した励起光で蛍光分子１４を励起すると、蛍光分子１４は励起光の振動方向と平行な方向に偏光した蛍光を発する。蛍光分子１４が発する蛍光の偏光度は、蛍光分子１４のブラウン運動の速さに依存する。蛍光分子１４がブラウン運動していなければ、蛍光分子１４は当該励起光の振動方向と平行な方向に偏光した蛍光を発し、蛍光分子１４のブラウン運動が速いほど、蛍光分子１４から発生する蛍光の偏光度は低い。
【００３３】
フリー分子１３とバインディング分子１５とでは、それぞれの質量および体積等の要因から溶液中におけるこれらの回転運動の速さが互いに異なる。そのため、フリー分子１３に付随する蛍光分子１４から発生する蛍光の偏光度と、バインディング分子１５に付随する蛍光分子１４から発生する蛍光の偏光度とは互いに異なり、バインディング分子１５に付随する蛍光分子１４から発生する蛍光の偏光度の方が大きい。
【００３４】
蛍光偏光度Ｐは次式（１）で定義され、励起から蛍光発光までの間に蛍光分子が回転した程度を示す。Ｉ１は直線偏光した励起光の振動方向と平行な方向に偏光した蛍光、Ｉ２は直線偏光した励起光の振動方向と垂直な方向に偏光した蛍光を表す。
Ｐ＝（Ｉ１−Ｉ２）／（Ｉ１＋Ｉ２）・・・（１）
【００３５】
本実施の形態で示すフリー分子１３およびバインディング分子１５と蛍光偏光度との関係は、抗原１８の分だけフリー分子１３に比べて体積および質量が大きくブラウン運動が遅いバインディング分子１５が溶液中に多いほど、すなわち直線偏光した励起光の振動方向と平行な方向に偏光した蛍光を発生する蛍光分子が多いほど、蛍光偏光度が増加するという関係にある。
【００３６】
しかし、蛍光偏光法は、ブラウン運動というランダムな運動の変化による蛍光偏光度の変化を検出しているため検出感度に限界がある。特に、検出対象物質（ここでは抗原）の体積および質量が小さい場合等は、フリー分子１３のブラウン運度の速さとバインディング分子１５のブラウン運動の速さとの間で顕著な差が表れず、蛍光偏光度があまり変化しない場合がある。
【００３７】
そこで、本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置は、レーザーを利用して溶液中のフリー分子１３およびバインディング分子１５に外力を加え、フリー分子１３のブラウン運動の速さとバインディング分子１５のブラウン運動の速さとに顕著な差を生じさせ、高精度に蛍光偏光度を測定する。
【００３８】
溶液中のフリー分子１３およびバインディング分子１５にレーザーを照射すると、溶液中のフリー分子１３およびバインディング分子１５は外力を受けてブラウン運動を阻害される。レーザーによりバインディング分子１５が受ける外力をＦｂ、フリー分子１３が受ける外力Ｆｆとすると、フリー分子１３およびバインディング分子１５は、抗原１８の有無により体積および質量が互いに異なるため、レーザーを照射された場合に受ける外力の大きさも互いに異なり、Ｆｂ＞Ｆｆとなる。
【００３９】
本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置は、レーザーによりフリー分子１３およびバインディング分子１５にそれぞれ異なった強さの外力を加えることで、フリー分子１３およびバインディング分子１５のブラウン運動を阻害し、蛍光偏光度に顕著な差を生じさせる。
【００４０】
本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置１００の構成について説明する。図４Ａは、生体分子検出装置１００の外観斜視図である。生体分子検出装置１００の側面には、表示部１０２、ユーザー入力部１０４および開閉部１０６がある。表示部１０２は、測定結果等を表示する。ユーザー入力部１０４は、ユーザーがモードの設定および検体情報の入力等を行う部分である。開閉部１０６は、上蓋の開閉が可能な構成となっており、検体のセット時には上蓋が開けられ、測定時には上蓋が閉じられる。この構成により、外部の光が測定に影響を与えることを防いでいる。
【００４１】
図４Ｂは、開閉部１０６が開いた場合における生体分子検出装置１００の外観斜視図である。開閉部１０６を開くと、試薬カップ１０８および保持台１１０が外部に露出する。試薬カップ１０８は、保持台１１０に保持されており、保持台１１０から着脱可能となっている。試薬カップ１０８は、溶液を入れる円柱状の容器である。ユーザーは、試薬カップ１０８に検体を分注し、上蓋を閉じて測定を行う。図示しないが、生体分子検出装置１００内には試薬タンクおよび分注部が設けられており、測定が開始されると、分注部は試薬タンク内から試薬を吸い上げて試薬カップ１０８内に分注する。
【００４２】
図５は、生体分子検出装置１００の主要な構成を説明するための機能ブロック図である。生体分子検出装置１００は、表示部１０２、ユーザー入力部１０４、試薬カップ１０８、試薬タンク１１２、分注部１１４、外力付与光源部１１６、励起光源部１１８、ＦＧ（Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）１２２、受光部１２４、増幅部１２６、ロックインアンプ１２７、Ａ／Ｄ変換部１２８、サンプリングクロック発生部１３０、ＣＰＵ１３２およびダイクロイックミラー１３８を有する。
【００４３】
試薬カップ１０８は、試薬タンク１１２に保存してある試薬と患者等から採取された検体とを反応させる容器である。試薬カップ１０８は、生体分子検出装置１００から着脱可能となっている。試薬カップ１０８の容量は、例えば約１２０μＬである。
【００４４】
試薬タンク１１２は複数種類の試薬を貯めておくタンクである。フリー分子１３は試薬タンク１１２中に試薬として保存されている。
【００４５】
分注部１１４は、着脱可能なピペットや吸引器によって構成される。分注部１１４は、ＣＰＵ１３２からの命令に従い、測定に使用する試薬を試薬タンク１１２からピペットで吸い上げ、試薬カップ１０８へ分注する。
【００４６】
外力付与光源部１１６は、外力付与光１１７をダイクロイックミラー１３８に向けて照射し、試薬カップ１０８内の溶液中に存在するフリー分子１３およびバインディング分子１５に外力を加える。外力付与光源部１１６のＯＮ／ＯＦＦは、ＦＧ１２２から出力された電圧信号により周期的に切り替えられる。外力付与光１１７としては、例えば、波長９８０ｎｍ、出力１００ｍＷのレーザーを用いる。外力付与光１１７は、試薬カップ１０８の溶液全体を照らす程度の幅を有している。
【００４７】
励起光源部１１８は、内部に備えた偏光子により直線偏光した励起光１１９を、ダイクロイックミラー１３８を介して試薬カップ１０８に向けて照射して蛍光分子１４を励起する。励起光としては、例えば波長５３２ｎｍ、出力１ｍＷの光を用いる。
【００４８】
ダイクロイックミラー１３８は、特定波長の光を反射し、その他の波長の光を透過するミラーである。ダイクロイックミラー１３８は、外力付与光１１７を反射し、励起光１１９を透過させる。
【００４９】
ＦＧ１２２は、様々な周波数と波形をもった電圧信号を発生させることのできる装置で、ＣＰＵ１３２から出力された命令を受信して、外力付与光源部１１６、励起光源部１１８、ロックインアンプ１２７およびサンプリングクロック発生部１３０へ電圧信号を出力する。
【００５０】
受光部１２４は、フィルタやフォトダイオード等によって構成される。受光部１２４は、試薬カップ１０８の下部に設けられ、試薬カップ１０８内の蛍光分子１４から発生する蛍光１２３を試薬カップ１０８の下部で受光し、受光した光の信号をアナログ電気信号（アナログ蛍光データ）に変換して増幅部１２６へ出力する。
【００５１】
増幅部１２６は、受光部１２４から出力されたアナログ蛍光データを増幅してロックインアンプ１２７へ出力する。
【００５２】
ロックインアンプ１２７は、アナログ蛍光データを直流に周波数変換する。ロックインアンプ１２７には、ＦＧ１２２から参照信号である方形波が入力される。この方形波は、ＦＧ１２２から外力付与光源部１１６へ出力された電圧信号と同じ周期を有する。ロックインアンプ１２７は、増幅部１２６から出力されたアナログ蛍光データから、参照信号と等しい周波数成分の検出を行う。具体的には、ロックインアンプ１２７は、参照信号と等しい周波数成分のみを同期検波により直流信号に変換し、内部に設けられたローパスフィルタにより直流信号のみを通過させる。ロックインアンプ１２７は、直流信号をＡ／Ｄ変換部１２８へ出力する。ロックインアンプ１２７は、増幅部１２６から出力されたアナログ蛍光データから、外力付与光源部１１６が発光する周期と同一の周期を有する成分を検出する。外力付与光源部１１６が発光する周期と同一の周期を有する成分を検出することにより、ロックインアンプ１２７は、アナログ蛍光データに含まれる迷光やエレキノイズ等の影響を低減する。
【００５３】
サンプリングクロック発生部１３０は、ＦＧ１２２から出力された電圧信号に基づいて、Ａ／Ｄ変換部１２８がアナログ蛍光データをサンプリングするタイミングを指定するサンプリングクロックをＡ／Ｄ変換部１２８に出力する。
【００５４】
Ａ／Ｄ変換部１２８は、サンプリングクロック発生部１３０から出力されたサンプリングクロックに基づいて、ロックインアンプ１２７から出力されたアナログ蛍光データのサンプリングを行い、サンプリングしたアナログ蛍光データをデジタルデータに変換してＣＰＵ１３２へ出力する。
【００５５】
ＣＰＵ１３２は、Ａ／Ｄ変換部１２８から出力されたデジタルデータの演算を行い、その結果を表示部１０２へ出力する。また、ＣＰＵ１３２は、ユーザー入力部１０４から入力を受けて、外力付与光源部１１６、励起光源部１１８、分注部１１４およびＦＧ１２２の動作の指示命令を行う。具体的には、ＣＰＵ１３２は、外力付与光源部１１６および励起光源部１１８に対してはそのＯＮ／ＯＦＦ命令を行い、分注部１１４に対しては使用する試薬を指定する命令および分注動作開始命令を行い、ＦＧ１２２に対しては出力する電圧信号の波形の指示命令およびその出力命令を行う。
【００５６】
図６は、外力付与光源部１１６から照射される外力付与光の照射方向を説明するため、生体分子検出装置１００の内部を上面側から見た模式図である。
【００５７】
外力付与光源部１１６から照射された外力付与光１１７は、ダイクロイックミラー１３８によって反射されて試薬カップ１０８の側面へ照射される。
【００５８】
ダイクロイックミラー１３８は、外力付与光１１７に用いた波長の光を反射し、その他の波長の光を透過させる。
【００５９】
励起光源部１１８から照射された励起光１１９は、ダイクロイックミラー１３８を透過し、ダイクロイックミラー１３８で反射した外力付与光１１７と同じ方向に進行して試薬カップ１０８の側面へ入射する。
【００６０】
試薬カップ１０８へ入射した外力付与光１１７は、試薬カップ１０８内のフリー分子１３およびバインディング分子１５に外力を与え、それぞれの分子のブラウン運動を阻害する。
【００６１】
図７Ａは外力付与光を照射しない場合におけるブラウン運動の速さと分子の個数との関係を表したグラフ、図７Ｂは外力付与光を照射した場合におけるブラウン運動の速さと分子の個数との関係を表したグラフである。なお、図７Ａおよび７Ｂでは、説明を分かりやすくするためにグラフを模式的に描いてある。
【００６２】
曲線７００は、バインディング分子のブラウン運動の速さと分子の個数との関係を表すグラフである。曲線７０２は、フリー分子のブラウン運動の速さと分子の個数との関係を表すグラフである。フリー分子のブラウン運動よりバインディング分子のブラウン運動の方が遅い。また、この例では、フリー分子の個数よりバインディング分子の個数の方が多い。
【００６３】
外力付与光１１７を照射された試薬カップ１０８内のフリー分子１３およびバインディング分子１５のブラウン運動は、外力によって阻害される。外力付与光１１７は体積が大きい分子ほど大きな力を及ぼすため、バインディング分子１５が受ける外力の方が、フリー分子１３が受ける外力よりも大きい。従って、バインディング分子１５のブラウン運動はフリー分子１３のブラウン運動よりも強い力で阻害され、バインディング分子１５のブラウン運動は通常よりも遅くなる（図７Ｂの曲線７０４に示す）。
【００６４】
外力付与光１１７が照射されたバインディング分子１５から発生した蛍光は、バインディング分子１５のブラウン運動の速さが外力付与光１１７を照射しない場合に比べて遅いため、高い偏光度を有し、励起光１１９の振動方向と平行な方向に偏光した成分を多く含む。
【００６５】
一方、フリー分子１３の体積がバインディング分子１５の体積よりも小さいため、外力付与光１１７によりフリー分子１３が受ける外力は、バインディング分子１５が受ける外力よりも小さい。そのため、外力付与光１１７の有無によってフリー分子１３のブラウン運動の速さはあまり変わらない（図７Ｂの曲線７０６に示す）。従って、フリー分子１３に付随する蛍光分子１４から発生する蛍光の偏光度の外力付与光１１７の有無による変化は少ない。
【００６６】
つまり、外力付与光１１７をフリー分子１３およびバインディング分子１５に照射すると、外力付与光１１７を照射しない場合に比べて、フリー分子１３のブラウン運動の速さとバインディング分子１５のブラウン運動の速さとに顕著な差が生じ、それぞれの分子に付随する蛍光分子から発生する蛍光の偏光度の差が大きくなる。そのため、生体分子検出装置１００は、蛍光偏光度測定を高精度に行うことができる。
【００６７】
続いて図８を用いて受光部１２４の詳細な構成について説明する。図８は、受光部１２４の詳細な構成を表した模式図である。受光部１２４は、レンズ１４２、フィルタ１４４、偏光ビームスプリッタ１４６、レンズ１４７、レンズ１４８、ＰＤ（フォトダイオード）１４９およびＰＤ１５０を含む。
【００６８】
受光部１２４は、試薬カップ１０８の底面側から蛍光を受光する。試薬カップ１０８内の蛍光分子１４から発生して受光部１２４の紙面左側部分に入射する蛍光１２３ａおよび受光部１２４の紙面右側部分に入射する蛍光１２３ｂは、レンズ１４２によって集光、平行化され、フィルタ１４４を通って偏光ビームスプリッタ１４６へ入射する。なお、図示しないが蛍光１２３ａと蛍光１２３ｂとの間にも蛍光が存在し、それらの挙動は当業者であれば予測可能であるので説明を省略する。
【００６９】
フィルタ１４４は、蛍光分子１４から発生する蛍光以外の光をカットするバンドパスフィルタであり、励起光等の蛍光以外の光がＰＤ１４９およびＰＤ１５０へ入射することを防いでいる。
【００７０】
偏光ビームスプリッタ１４６は、励起光１１９の振動方向と平行な方向に振動する光を透過させ、励起光１１９の振動方向と垂直な方向に振動する光を反射する。
【００７１】
偏光ビームスプリッタ１４６を透過した蛍光は、レンズ１４８によって集光され、ＰＤ１４９へ入射する。偏光ビームスプリッタ１４６によって反射された蛍光は、レンズ１４７によって集光され、ＰＤ１５０へ入射する。
【００７２】
ＰＤ１４９は、ＡＰＤ（Ａｖａｌａｎｃｈｅ Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ）によって構成され、レンズ１４８によって集光された蛍光の強度に応じた電流を発生して増幅部１２６へ出力する。
【００７３】
ＰＤ１５０は、ＡＰＤによって構成され、レンズ１４７によって集光された蛍光の強度に応じた電流を発生して増幅部１２６へ出力する。
【００７４】
このようにして受光部１２４は、蛍光分子１４から発生した蛍光を、励起光１１９の振動方向と平行な振動方向を有する成分と、励起光１１９の振動方向と垂直な振動方向を有する成分とに分け、それぞれの成分量に基づく電流を発生させる。また、受光部１２４は、試薬カップ１０８の底面側で蛍光を受光するため、外力付与光１１７および励起光１１９の影響を受けにくい。
【００７５】
ＣＰＵ１３２は、受光部１２４で分離された蛍光に基づく電流成分から、式（１）に示す蛍光偏光度を求める計算と同様の計算を行って蛍光偏光度を求める。外力付与光１１７が照射されると、フリー分子１３のブラウン運動の速さとバインディング分子１５のブラウン運動の速さとは顕著な差が生じるため、それらの分子の個数の比が蛍光偏光度となって表れる。
【００７６】
ＣＰＵ１３２は、測定項目ごとに異なる検量線関数を予め記憶しておき、蛍光偏光度を抗原の濃度に変換する。図９に検量線関数の一例を示す。検量線関数は、予め特定の物質の濃度等が分かっている試料等により測定したものである。ＣＰＵ１３２は、算出された抗原の濃度を表示部１０２へ出力する。
【００７７】
続いて生体分子検出装置１００の測定時における動作について説明する。図１０は、検体の準備から廃棄までの流れを模式的に表した図である。
【００７８】
測定の準備にあたり、まず患者から採集した全血１５６を５０μＬ遠心分離し、血漿１６を分離する。分離して取り出した血漿１６を、生体分子検出装置１００の検体セット部１５２にセットする。ここまでの作業はユーザーが行う。
【００７９】
生体分子検出装置１００は、検体セット部１５２にセットされた血漿１６を、試薬カップストック部１６０にストックしてある未使用の試薬カップ１０８の中に分注する。続いて、生体分子検出装置１００は、試薬タンク１１２の中にある抗ＰＳＡ抗体をピペット１５８で吸い上げ、試薬カップ１０８の中に分注する。試薬カップ１０８内に血漿および抗ＰＳＡ抗体を入れた生体分子検出装置１００は、試薬カップ１０８を３７℃で温調しながら、内蔵したボルテックスミキサーによって振動させて抗原抗体反応を起こさせる。その後、生体分子検出装置１００は、励起光の照射および蛍光の検出を行い、蛍光の検出終了後に試薬カップ１０８を内蔵のごみ箱１５４へ廃棄する。
【００８０】
以上説明したように、本発明の実施の形態１に係る生体分子検出装置１００によれば、外力付与光１１７の照射により、溶液中のフリー分子およびバインディング分子に外力を与え、これらの分子のブラウン運動を阻害する構成とした。このような構成においては、外力付与光１１７による外力が体積の大きいバインディング分子に与える影響は大きく、体積の小さいフリー分子に与える影響は小さい。すなわち生体分子検出装置１００は、外力付与光１１７の照射により、フリー分子およびバインディング分子に互いに異なる強さの外力を与えることで、フリー分子のブラウン運動の速さとバインディング分子のブラウン運動の速さとに顕著な差を生じさせる。これによりフリー分子の個数とバインディング分子の個数との比の変化が蛍光偏光度の変化となってより明確に表れるため、蛍光偏光度の変化を演算することで検出対象物質の濃度をより正確に演算することができる。なお、本実施の形態では、検出対象物質の濃度を検出または定量する演算手段はＣＰＵに相当する。
【００８１】
また、以上の構成において、生体分子検出装置１００は、外力付与光１１７による外力によって、フリー分子およびバインディング分子にそれぞれ互いに異なる強さの外力を加えるため、ブラウン運動というランダムな運動を利用して蛍光偏光度を測定する場合に比べて、高感度な測定をすることができる。
【００８２】
なお、本実施の形態では、抗原抗体反応を利用する場合を例にとって説明したが、検出対象物質と検出対象物質に特異的に結合する物質との組み合わせは、ここで説明した場合に限られない。例えば本願発明は、抗原を用いて抗体を検出する場合や、特定の核酸を用いて当該核酸とハイブリダイゼーションをする核酸を検出する場合、核酸を用いて核酸結合性たんぱく質を結合する場合、リガンドを用いてレセプターを検出する場合、糖を用いてレクチンを検出する場合、プロテアーゼ検出を利用する場合、高次構造変化を用いる場合等にも適用することができる。
【００８３】
また、本実施の形態では、外力付与光１１７として波長９８０ｎｍ、出力１００ｍＷのレーザーを用いたが、外力付与光１１７として用いるレーザーはこの波長および出力のレーザーに限られない。外力付与光１１７の波長および出力は、フリー分子およびバインディング分子の体積、質量、溶媒の粘度、絶対温度等に起因する溶液中でのフリー分子およびバインディング分子の回転しやすさに基づいて、フリー分子のブラウン運度の速さおよびバインディング分子のブラウン運動の速さに顕著な差が表れる光を用いることが望ましい。
【００８４】
また、本実施の形態では、励起光１１９として波長５３２ｎｍ、出力１ｍＷの光を用いたが、励起光１１９として用いる光はこの波長および出力の光に限られない。励起光の波長は、蛍光分子が吸収する波長帯に基づいて適宜選択される。
【００８５】
（実施の形態２）
図１１は、本発明の実施の形態２に係る生体分子検出装置２００の主要な構成を示すブロック図である。なお、実施の形態１で示した生体分子検出装置１００と同一の構成要素には同一の符号を付し、その説明を省略する。
【００８６】
生体分子検出装置２００は、実施の形態１で示した生体分子検出装置１００の構成に対して、励起光源部２０２、受光部２０４、および自己相関器２１０が主に異なる。生体分子検出装置２００は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ法）の原理を用いてバインディング分子の検出を行う。
【００８７】
励起光源部２０２は、レーザー光源と高倍率の対物レンズによって構成される。励起光源部２０２から照射された励起光２０６は、試薬カップ１０８内の溶液中で１フェムトリットル程度の領域まで焦点が絞られる。
【００８８】
受光部２０４は、試薬カップ１０８内の蛍光分子から発生した蛍光を検出するものである。
【００８９】
溶液中のフリー分子およびバインディング分子はブラウン運動をしているため、上記励起光２０６が焦点を結ぶ領域内にランダムに出入りする。領域内に入ったフリー分子およびバインディング分子は、励起光２０６により励起される。フリー分子はバインディング分子に比べて体積および質量が小さいためブラウン運動が速く、領域を速く通過するため蛍光強度の変化が速い。バインディング分子はフリー分子に比べて体積および質量が大きいためブラウン運動が遅く、領域を遅く通過するため蛍光強度の変化が遅い。
【００９０】
生体分子検出装置２００は、外力付与光１１７をフリー分子およびバインディング分子に照射しているため、外力付与光１１７を照射しない場合に比べて、フリー分子のブラウン運動の速さとバインディング分子のブラウン運動の速さとに顕著な差が生じる。従って、バインディング分子は、外力付与光１１７を照射されない場合に比べてさらに遅く上記領域を通過する。一方、フリー分子は、外力付与光１１７を照射されない場合に比べてブラウン運動の速さはあまり変わらないため、上記領域を速く通過する。
【００９１】
自己相関器２１０は、蛍光強度の揺らぎの速さから分子の運動速度を自己相関法により求め、分子の平均的な大きさを推測する。バインディング分子の方が抗原の分だけフリー分子より体積が大きいため、バインディング分子が多いほど分子の平均的な大きさが大きくなる。
【００９２】
図１２は、実施の形態２に係る生体分子検出装置２００における受光部２０４の詳細な構成を表した模式図である。受光部２０４は、レンズ２１４、フィルタ１４４、レンズ１４８、ピンホール２１２およびＰＤ１５０を有する。試薬カップ１０８内の蛍光分子１４から発生して受光部２０４の紙面左側部分に入射する蛍光１２３ａおよび受光部２０４の紙面右側部分に入射する蛍光１２３ｂは、レンズ２１４によって集光、平行化され、フィルタ１４４を通ってレンズ１４８によって集光され、ピンホール２１２を通過してＰＤ１５０へ入射する。なお、図示しないが蛍光１２３ａと蛍光１２３ｂとの間にも蛍光が存在し、それらの挙動は当業者であれば予測可能であるので説明を省略する。
【００９３】
レンズ２１４は、高倍率の対物レンズであり、試薬カップ１０８内で励起光が焦点を結ぶ微小領域において発生した蛍光を集光、平行化する。
【００９４】
ピンホール２１２は、励起光２０６の焦点面以外から返ってくる光を除去し、焦点面から発光した蛍光だけを通過させる。
【００９５】
図１３は、自己相関器２１０が出力する拡散時間と相関関数との関係を表したグラフである。曲線２１６は、軽い分子の拡散時間と相関関数との関係を表した例であり、曲線２１８は、重い分子の拡散時間と相関関数との関係を表した例である。重い分子ほどブラウン運動による動きが遅いため、拡散時間は大きい。
【００９６】
相関関数の最大値を１００％とすると、相関関数５０％における拡散時間が平均拡散時間と定義される。図１３においては、曲線２１６の平均拡散時間はＴ１、曲線２１８の平均拡散時間はＴ２である。平均拡散時間は、溶液中に重い分子が含まれている割合が大きいほど大きい。ＣＰＵ１３２は、自己相関器２１０から出力された拡散時間と相関関数との関係を表す式から平均拡散時間を算出することで、溶液中のバインディング分子の割合を算出する。
【００９７】
図１４は、抗原濃度と平均拡散時間との関係を表す検量線の例である。ＣＰＵ１３２は、図１４に示すような検量線を用いて、算出した平均拡散時間を抗原濃度に変換する。ＣＰＵ１３２は、求めた抗原濃度を表示部１０２に表示させる。
【００９８】
以上説明したように、本発明の実施の形態２に係る生体分子検出装置２００によれば、外力付与光１１７の照射により、溶液中のフリー分子およびバインディング分子に外力を与え、これらの分子のブラウン運動を阻害する構成とした。このような構成においては、外力付与光１１７による外力が体積の大きいバインディング分子に与える影響は大きく、体積の小さいフリー分子に与える影響は小さい。すなわち生体分子検出装置２００は、外力付与光１１７の照射により、フリー分子およびバインディング分子に互いに異なる強さの外力を与えることで、フリー分子のブラウン運動の速さとバインディング分子のブラウン運動の速さとに顕著な差を生じさせる。これにより、励起光が焦点を結ぶ微小領域をフリー分子およびバインディング分子が通過する速さに顕著な差が生じ、自己相関器によりバインディング分子の割合をより正確に求めることができる。そのため、検出対象物質の濃度をより正確に演算することができる。なお、本実施の形態では、検出対象物質を検出または定量する演算手段は、自己相関器２１０およびＣＰＵ１３２が相当する。
【００９９】
なお、本実施の形態では、抗原抗体反応を利用する場合を例にとって説明したが、検出対象物質と、検出対象物質に特異的に結合する物質との組み合わせは、これに限られない。例えば本願発明は、抗原を用いて抗体を検出する場合や、特定の核酸と当該核酸とハイブリダイゼーションをする核酸、核酸と核酸結合性たんぱく質、リガンドとレセプター、糖とレクチン、プロテアーゼ検出、高次構造変化等にも適用することができる。
【０１００】
（実施の形態１および実施の形態２の設計変更）
なお、以上説明した本発明に係る各実施の形態は、本発明の一例を示すものであり、本発明の構成を限定するものではない。本発明に係る生体分子検出装置は、上記各実施の形態に限定されず、本発明の目的を逸脱しない範囲で以下の通り種々変更して実施することが可能である。
【０１０１】
例えば、溶液中のフリー分子およびバインディング分子への外力の付与は、外力付与光としてのレーザーによるものに限られず、フリー分子およびバインディング分子に異なる大きさの力を付与することができれば磁気的な方法や電気的な方法を用いても良い。
【０１０２】
外力付与光により分子に外力の付与を行うと、磁力等によって分子に外力を付与する場合に比べ複雑な機構が必要ない。例えば、磁力を用いて分子に外力を付与するためには、それぞれの分子が磁性を持ったものであるか、磁性を持った分子を用意して外力を付与する分子に結合させる必要があり、測定にあたって準備が煩雑となる。
【０１０３】
なお、本発明に係る各実施の形態では、蛍光分子をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８としたが、蛍光分子はこれに限られない。
【０１０４】
また、本発明に係る各実施の形態では、生体分子検出装置内に試薬カップを１つ設ける場合を説明したが、必ずしも試薬カップは１つである必要はなく、装置内に複数の試薬カップを設けて複数の検体をセットできる構成としても良い。その場合は、装置が試薬カップを順に測定位置に移動させて測定を行う構成とすれば、自動で複数の検体を測定することができる。
【０１０５】
なお、本発明に係る各実施の形態では、蛍光分子で標識化された抗体を用いた例を説明したが、必ずしも蛍光分子で標識済みの抗体を用いる必要はない。例えば、抗体および抗原の結合と、抗体および蛍光分子の結合とを同時に試薬カップ内で行っても良い。この場合、ユーザーは、抗体および蛍光分子をそれぞれ別の試薬タンクに用意しておき、測定時に生体分子検出装置が、抗体、蛍光分子および検体をそれぞれ試薬カップへ分注して、反応させる。
【０１０６】
また、外力付与光源部１１６や励起光源部１１８は、着脱可能な構成として、検出対象物質および蛍光分子等に応じて、適切なものに交換できるような構成としても良い。
【０１０７】
なお、本発明に係る各実施の形態では、検体として全血から分離した血漿を用いる場合を例にとって説明したが、検体は全血から分離した血漿に限られず、検出対象物質が溶液中に分散していれば尿や隋液等の体液を検体とすることもできる。
【０１０８】
なお、本発明に係る各実施の形態では、検出対象物質が１種類の場合を例にとって説明したが、検出対象物質は必ずしも１種類でなくて良い。検出対象物質が２種類の場合は、例えば、２種類の検出対象物質それぞれに特異的に吸着する２種類の分子を用い、当該２種類の分子のそれぞれを異なる発光波長を有する蛍光分子で標識する。受光部に２種類のフィルタを設けて、測定する分子に標識された蛍光分子の発光波長に応じて使用するフィルタを切り替え、これらの分子から発生する蛍光を分離して受光すれば、それぞれの蛍光分子から発生した蛍光を定量することができる。また、蛍光分子は励起波長や蛍光寿命等が異なるものを用いても良い。
【０１０９】
また、本発明に係る各実施の形態では、受光部において光を分光する分光手段としてフィルタを用いたが、必ずしもフィルタを用いる必要はない。例えば、回折格子やプリズムを用いて光を分光して、特定の波長を有する光のみをフォトダイオードで受光してもよい。
【０１１０】
また、検出対象物質は２種類より多くても良い。その場合においても、それぞれの検出対象物質とそれぞれ特異的に結合する物質を用い、当該物質のそれぞれを互いに異なる蛍光分子で標識し、それぞれの蛍光分子から発生する蛍光を、それぞれの蛍光に対応したフィルタで分離して検出することで、それぞれの検出対象物質を分離して検出することができる。
【０１１１】
なお、検出対象物質の種類が増えるほど蛍光分子の種類も増え、複数の蛍光分子から発生する互いに波長が異なる蛍光が混在することになるため、フィルタのみで蛍光を分離することが困難となる場合がある。その場合は、励起光の種類を増やすことで蛍光の分離を容易にすることができる。蛍光分子の吸光度は励起光の波長に依存し、蛍光分子の種類ごとに吸収しやすい波長帯がある。そのため、励起光の波長を変えることで、一部の蛍光分子のみが蛍光を発生するようになり、フィルタでの蛍光の分離が容易となる。また、より狭い通過帯域を持つバンドパスフィルタを用いることで、目的の蛍光分子から発生する蛍光が検出されやすくなる。
【０１１２】
また、本発明に係る各実施の形態では、抗原、抗体および蛍光分子が液体中に分散している液相で測定ができるため、抗原等を反応層に固定して測定を行う固相での測定に比べ、前処理が簡単であるという利点がある。また、抗原およびフリー分子が固相に固定されていないため、抗原およびフリー分子が溶液中を自由に動き回ることができ、固相での測定に比べて反応が早いという利点もある。
【０１１３】
また、本発明に係る生体分子検出装置および生体分子検出方法は、ＲＩＣＳ（Ｒａｓｔｅｒ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）やＦＲＡＰ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ａｆｔｅｒ  Ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）解析、ＦＩＤＡ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ），ＦＩＤＡ−ＰＯ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）等にも用いることができる。
【０１１４】
また、本発明に係る各実施の形態では、外力付与光源部は必ずしも１つである必要はなく、複数の外力付与光源部を設けて、同一方向に複数の外力付与光を照射しても良い。
【０１１５】
また、より大きな外力を付与するため外力付与光を集光させた場合には、外力付与光で照射することができる溶液の範囲が減少するという問題がある。そこで、外力付与光による照射範囲をより広くするため、外力付与光を所定の方向から同時に多点に入射させることが好ましい。
【０１１６】
外力付与光をある方向から同時に多点に照射して照射範囲をより広くする方法としては、例えば光学系を複数段用意する方法が挙げられる。複数段の光学系は、少なくとも試薬カップに外力付与光が入射する前の段階で光路が複数存在していればよい。例えば、光源も含めた同様の光学系を３段重ねれば、３つの外力付与光源部からそれぞれ外力付与光が照射され、試薬カップへある方向から３点に外力付与光を照射することができる。また例えば、光源が１つであっても２次元レーザーアレイやマイクロレンズアレイ等を用いて外力付与光を分岐すれば、分岐した分だけの複数の点で外力付与光を照射することができる。
【０１１７】
例えば分岐された外力付与光を利用した方法としては、図１５（試薬カップ１０８の上面図）に示すように、３６０ａ〜３６０ｉの９点にそれぞれ対応した９本の外力付与光を試薬カップ１０８に入射させるような態様でも良い。このようにすると、外力付与光で照射することができる溶液の範囲が増えるため、上記問題を回避することができる。なお、ここでは９点に外力付与光を入射させる例を示したが、外力付与光を入射させる点は９点に限られず、９点より多くても少なくても良い。外力付与光を絞るほど、多くの点に入射させることが望ましい。その結果、突発的な蛍光強度の変動を低下させることができ、相対的な散らばりを表す指標である変動係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を改善することができる。
【０１１８】
このように、外力付与光を所定の方向から同時に多点に入射させるための外力付与光源部４０２の構造について図１６に示す。外力付与光源部４０２は、３×３の２次元レーザーアレイである。外力付与光源部４０２は、発光点４０４ａ〜４０４ｉの９点が発光する。発光点の大きさは縦が１μｍで横が１００μｍである。発光点の間の距離は約１００μｍである。
【０１１９】
図１６に示される外力付与光源部４０２を用いた光学系の一例を図１７に示す。なお図１７では、外力付与光および励起光の光学系以外の構成要素は省略して描いてある。
【０１２０】
外力付与光源部４０２から出力された外力付与光４２２は、コリメータレンズ４０６を通って焦点において平行光線となる。コリメータレンズ４０６を通った外力付与光４２２は、ビームエキスパンダ４０８およびビームエキスパンダ４１０を透過する。ビームエキスパンダ４０８およびビームエキスパンダ４１０を通った外力付与光４２２は、特定の倍率の平行光束に広げられる。その後、外力付与光４２２は、ダイクロイックミラー４１８で反射してレンズ４２０により集光されて試薬カップ１０８の底面から上方に向かって入射する。
【０１２１】
光源部４１４から出力された励起光４２４は、レンズ４２６を通ってダイクロイックミラー４１６により反射される。ダイクロイックミラー４１６により反射された励起光４２４は、ダイクロイックミラー４１８を透過してレンズ４２０により集光されて試薬カップ１０８の底面から上方に向かって入射する。
【０１２２】
図１７に示される光学系において、コリメータレンズ４０６の焦点距離を３．１ｍｍ、レンズ４２０の焦点距離を４ｍｍとすると、倍率は１．２９倍となる。そのため、試薬カップ１０８の底面において、外力付与光４２２の大きさは約１．３μｍ×１３０μｍとなり、ピッチは約１２９μｍとなる。
【０１２３】
また、外力付与光を所定の方向から同時に多点に入射させるための別の光学系の例について図１８を用いて説明する。なお図１８においても、外力付与光および励起光の光学系以外は省略して描いてある。また、図１７と同一の構成要素には同一の符号を付し、その説明を省略する。
【０１２４】
図１８に示される光学系において、外力付与光源部１１６は実施の形態１と同様のものである。外力付与光４３２は、コリメータレンズ４０６、ビームエキスパンダ４０８およびビームエキスパンダ４１０を通り、マイクロレンズアレイ４２８へ入射する。マイクロレンズアレイ４２８は、図１９に示されるように、複数のマイクロレンズ４２８ａを格子状に並べたものである。マイクロレンズアレイ４２８を通った外力付与光４３２は、複数の光源から照射された光のように、異なる位置で焦点を結ぶ複数の光束となる。外力付与光４３２は、ピンホールアレイ４３０によって絞られ、ダイクロイックミラー４１８で反射し、レンズ４２０を通って試薬カップ１０８の底面から上方に向かって入射する。このようにマイクロレンズアレイを用いても、外力付与光を所定の方向から同時に多点に入射させることができる。
【０１２５】
また、上記各実施の形態では試薬カップを円柱状の形状としたが、試薬カップは必ずしも円柱状の形状とする必要は無い。例えば、図２０に示されるように、四角柱状の形状を有し、内部に四角柱状の溶液保持部を有する試薬カップ４３２を用いても良い。このような四角柱状の溶液保持部を有する試薬カップ４３２は、特に、外力付与光の進行方向に働く外力付与光による圧力を利用してフリー分子およびバインディング分子を試薬カップ４３２の内部側壁面に押しつける場合に適している。これは、フリー分子およびバインディング分子の質量が軽い場合に起こる現象であり、外力付与光による圧力を受けてフリー分子およびバインディング分子が溶液中を移動することが原因である。この場合、溶液保持部が四角柱であると、フリー分子およびバインディング分子は溶液と試薬カップ４３２との界面に押しつけられながらブラウン運動が阻害される。当該界面が平面でありかつ外力付与光による圧力が当該界面に垂直な方向に作用する場合には、フリー分子およびバインディング分子は当該界面に平行な方向に移動して外力付与光の照射範囲の外に出ることがない。
【０１２６】
また、フリー分子およびバインディング分子を試薬カップ４３２の内部側壁面に押しつける場合には、外力付与光の焦点の位置を工夫することによりこれらの分子のブラウン運動をより容易に阻害することができる。図２１は、集光された外力付与光の焦点と試薬カップとの位置関係の一例を示す図である。外力付与光４３４は、レンズ４３６に入射し、血漿１６と試薬カップの側壁部４３２ｂとの界面（側壁部４３２ｂの内部側壁面）において焦点４３４ａを結ぶ。外力付与光４３４の焦点４３４ａの位置では、外力付与光４３４の強度が最も強いため、より強い圧力でフリー分子およびバインディング分子を押しつけることができる。従って、図２１のように外力付与光４３４を入射させると、焦点４３４ａの位置においてフリー分子およびバインディング分子を側壁部４３２ｂの内部側壁面に押しつけつつ、より効率的にフリー分子およびバインディング分子のブラウン運動を阻害することができる。
【０１２７】
なお、溶液保持部は必ずしも四角柱状の形状を有している必要はなく、少なくとも一面に平面を有していれば良い。その平面において焦点を結ぶように外力付与光を照射すれば、フリー分子およびバインディング分子は、当該平面に平行な方向に移動して外力付与光の照射範囲の外に出ることがなく平面に押しつけられながら、これらの分子のブラウン運動が阻害される。
【産業上の利用可能性】
【０１２８】
本発明に係る生体分子検出装置および生体分子検出方法は、例えば、検出対象物質と、その検出対象物質に特異的に結合する物質との相互作用を利用して、検出対象物質の検出又は定量を行う装置に利用することができる。
【符号の説明】
【０１２９】
１２  抗体
１３  フリー分子
１４  蛍光分子
１５  バインディング分子
１６  血漿
１８  抗原
１００  生体分子検出装置
１１６  外力付与光源部
１１７  外力付与光
１１８  励起光源部
１１９  励起光
１２３  蛍光
１２４  受光部
１４４  フィルタ
１４６  偏光ビームスプリッタ
１４９  ＰＤ
１５０  ＰＤ
２００  生体分子検出装置
２０２  励起光源部
２０４  受光部
２１０  自己相関器
２１２  ピンホール
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2012093338.tif 000014
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2012093338.tif 000022
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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