(57)【要約】      （修正有）【課題】被験体より容易に入手し得る生体試料を用いた被験体の疲労の程度を判定する方法、被験物質の疲労に対する有効性を判定する方法、疲労を回復、改善又は予防し得る物質を探索する方法、及び疲労判定試薬又はキットを提供する。【解決手段】被験体由来（ヒトなど）の生体試料（血液、細胞など）における、特定の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較することを含む、疲労の程度を判定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体由来の生体試料における、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較することを含む、疲労の程度を判定する方法。
【請求項２】
被験体に被験物質を投与し、被験体由来の生体試料における表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較することを含む、被験物質の疲労に対する有効性を判定する方法。
【請求項３】
被験体に被験物質を投与し、被験体由来の生体試料における表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較し、当該遺伝子の発現を変動させる物質を、疲労を回復、改善又は予防し得る候補物質として選択することを含む、疲労を回復、改善又は予防し得る物質を探索する方法。
【請求項４】
被験体が、ヒト又は非ヒト哺乳動物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
生体試料が、血液である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
生体試料が、細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
疲労が生理的疲労である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
疲労が肉体疲労である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
肉体疲労を引き起こすために被験体に対して筋運動を負荷させる工程をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現量の変動を分析及び／又は比較する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子について、少なくとも２個以上の当該遺伝子のうち発現変動が異なる遺伝子の数を分析及び／又は比較する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
表２に記載のＮｏ．００１〜Ｎｏ．１１２の遺伝子及び表３に記載のＮｏ．００１〜Ｎｏ．１０９の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現の増大を分析及び／又は比較し、及び／又は表２に記載のＮｏ．１１３〜Ｎｏ．１４６の遺伝子及び表３に記載のＮｏ．１１０〜Ｎｏ．１４８の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現の減少を分析及び／又は比較する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子が、ＡＲＧ２遺伝子、ＢＬＶＲＢ遺伝子、ＢＲＰ４４遺伝子、Ｃ１９ｏｒｆ５９遺伝子、ＣＣＲ１遺伝子、ＣＣＲＬ２遺伝子、ＣＤ３３遺伝子、ＣＨＩ３Ｌ１遺伝子、ＣＬＥＣ４Ｄ遺伝子、ＣＬＥＣ４Ｅ遺伝子、ＣＳＴＡ遺伝子、ＣＸＣＲ１遺伝子、ＣＸＣＲ２遺伝子、ＣＸＣＲ２Ｐ１遺伝子、ＥＭＲ２遺伝子、ＥＭＲ３遺伝子、ＥＭＲ４Ｐ遺伝子、ＦＰＲ１遺伝子、ＧＰＲ１０９Ａ遺伝子、ＧＰＲ１０９Ｂ遺伝子、ＧＺＭＡ遺伝子、ＨＭＢＳ遺伝子、ＨＰ遺伝子、ＨＰＲ遺伝子、ＩＬ１Ｒ２遺伝子、ＩＲＧ１遺伝子、ＫＬＲＡＰ１遺伝子、ＫＬＲＫ１遺伝子、ＭＭＰ８遺伝子、ＯＸＥＲ１遺伝子、Ｐ２ＲＹ１３遺伝子、ＰＬＩＮ２遺伝子、ＲＡＢ３ＩＬ１遺伝子、Ｓ１００Ａ８遺伝子、ＳＬＦＮ１２遺伝子、ＳＬＦＮ１２Ｌ遺伝子、ＳＰＡＴＣ１遺伝子、ＴＡＲＭ１遺伝子、ＴＡＳ２Ｒ６０遺伝子、ＴＭＯＤ１遺伝子、ＴＲＥＭ１遺伝子、ＴＳＰＯ２遺伝子、ＴＳＴＤ２遺伝子又はＶＴＩ１Ｂ遺伝子、又はそれらのホモログ遺伝子である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子が、ＡＣＥ遺伝子、ＡＣＰ１遺伝子、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＡＣＴＧ２遺伝子、ＡＦＭＩＤ遺伝子、ＡＬＯＸ１５遺伝子、ＡＲＧ２遺伝子、ＡＴＰ５Ｌ遺伝子、ＢＬＶＲＢ遺伝子、ＢＳＴ１遺伝子、Ｃ５ＡＲ１遺伝子、ＣＡ２遺伝子、ＣＢＲ１遺伝子、ＣＣＬ５遺伝子、ＣＣＲ１遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＤ１４遺伝子、ＣＤ３３遺伝子、ＣＨＩ３Ｌ１遺伝子、ＣＸＣＲ１遺伝子、ＣＸＣＲ２遺伝子、Ｆ８遺伝子、ＦＰＲ１遺伝子、ＧＺＭＡ遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＨＭＢＳ遺伝子、ＨＰＲ遺伝子、ＩＦＩＴＭ１遺伝子、ＩＦＮＡ１遺伝子、ＩＦＮＡ１０遺伝子、ＩＦＮＡ１３遺伝子、ＩＦＮＡ１４遺伝子、ＩＦＮＡ１６遺伝子、ＩＦＮＡ１７遺伝子、ＩＦＮＡ２遺伝子、ＩＦＮＡ２１遺伝子、ＩＦＮＡ４遺伝子、ＩＦＮＡ５遺伝子、ＩＦＮＡ６遺伝子、ＩＦＮＡ７遺伝子、ＩＦＮＡ８遺伝子、ＩＬ１３ＲＡ１遺伝子、ＩＬ１Ｂ遺伝子、ＩＬ１Ｒ２遺伝子、ＩＬ２ＲＢ遺伝子、ＩＳＧ１５遺伝子、ＫＬＲＢ１遺伝子、ＫＬＲＤ１遺伝子、ＫＬＲＫ１遺伝子、ＭＩＴＦ遺伝子、ＮＣＲ１遺伝子、ＯＡＳ３遺伝子、ＯＲ１０Ａ３遺伝子、ＯＲ１０Ａ６遺伝子、ＯＲ５１Ｖ１遺伝子、Ｐ２ＲＹ１３遺伝子、ＰＩＧＹ遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ３Ｄ遺伝子、ＲＡＲＳ遺伝子、Ｓ１ＰＲ５遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＢ１０遺伝子、ＳＯＣＳ３遺伝子、ＴＡＳ２Ｒ６０遺伝子、ＴＫ１遺伝子、ＵＢＥ２Ｆ遺伝子、ＵＰＰ１遺伝子、ＵＲＯＤ遺伝子又はＶＴＩ１Ｂ遺伝子、又はそれらのホモログ遺伝子である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子が、ＡＲＧ２遺伝子、ＢＬＶＲＢ遺伝子、ＣＣＲ１遺伝子、ＣＤ３３遺伝子、ＣＨＩ３Ｌ１遺伝子、ＣＸＣＲ１遺伝子、ＣＸＣＲ２遺伝子、ＦＰＲ１遺伝子、ＧＺＭＡ遺伝子、ＨＭＢＳ遺伝子、ＨＰＲ遺伝子、ＩＬ１Ｒ２遺伝子、ＫＬＲＫ１遺伝子、Ｐ２ＲＹ１３遺伝子、ＴＡＳ２Ｒ６０遺伝子又はＶＴＩ１Ｂ遺伝子である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子が、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＡＣＴＧ２遺伝子、ＰＬＩＮ２遺伝子、ＡＲＧ２遺伝子、ＣＤ３３遺伝子、ＣＨＩ３Ｌ１遺伝子、ＣＣＲ１遺伝子、ＦＰＲ１遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＨＭＢＳ遺伝子、ＩＬ１Ｂ遺伝子、ＣＸＣＲ１遺伝子、ＣＸＣＲ２遺伝子、ＣＸＣＲ２Ｐ１遺伝子、ＭＸＤ１遺伝子、ＭＭＰ８遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ３Ｄ遺伝子、Ｓ１００Ａ８遺伝子、Ｓ１００Ａ９遺伝子、ＩＬ１Ｒ２遺伝子、ＩＦＩＴＭ１遺伝子、ＨＣＡＲ３（ＧＰＲ１０９Ｂ）遺伝子、ＩＦＩＴＭ３遺伝子、ＩＦＩＴＭ２遺伝子、ＸＰＯ７遺伝子、ＴＲＥＭ１遺伝子、ＳＬＦＮ１２遺伝子、ＲＴＰ４遺伝子、ＰＲＡＭ１遺伝子、ＯＸＥＲ１遺伝子、ＣＬＥＣ４Ｄ遺伝子、ＴＡＳ２Ｒ６０遺伝子、ＨＣＡＲ２（ＧＰＲ１０９Ａ）遺伝子、ＳＬＦＮ１２Ｌ遺伝子、ＴＡＲＭ１遺伝子、ＡＬＯＸ１５遺伝子、ＧＺＭＡ遺伝子、ＣＣＬ５遺伝子、ＮＣＲ１遺伝子、ＫＬＲＫ１遺伝子、ＥＭＲ２遺伝子、ＥＭＲ３遺伝子、ＥＭＲ４Ｐ遺伝子、ＡＤＡＭ８遺伝子、ＴＣＮ２遺伝子、ＯＬＦＭ４遺伝子、ＧＰＲ７７遺伝子、ＳＴＥＡＰ４遺伝子、ＤＧＡＴ２遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱＢ２遺伝子、ＫＬＲＣ４−ＫＬＲＫ１遺伝子又はＨＤＡＣ９遺伝子である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
被験体由来の生体試料における遺伝子の発現量が、疲労の状態の対照体及び／又は非疲労の状態の健常対照体における当該遺伝子の発現量のどちらに近いかに基づいて行われ、疲労の状態の対照体に近い場合に、被験体は疲労の状態であると判定することを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
被験体由来の生体試料における遺伝子の発現変動量又は発現変動率が、疲労の状態の対照体及び／又は非疲労の状態の健常対照体における当該遺伝子の発現変動量又は発現変動率のどちらに近いかに基づいて行われ、疲労の状態の対照体に近い場合に、被験体は疲労の状態であると判定することを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
被験物質の疲労に対する有効性を判定するにおいて、被験物質の投与に伴って被験体由来の生体試料における遺伝子の発現変動が減弱又は消失している場合に、被験物質は疲労に対して有効であると判定することを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子に特異的なプローブ又はプライマー、又は上記遺伝子の遺伝子産物に特異的な抗体を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法において上記遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較するための疲労判定試薬又は疲労判定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の遺伝子の発現を解析することによる（１）被験体の疲労の程度を判定する方法、（２）被験物質の疲労に対する有効性を判定する方法、（３）疲労を回復、改善又は予防し得る物質を探索する方法、及び（４）疲労判定試薬又はキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生活者の６割以上の人は、日常的に疲労を感じており、以前と比較して十分な作業活動を維持できないと感じている（非特許文献１）。疲労に悩む生活者は、企業間競争の激化や成果主義の導入による心身負担の増大など、労働環境変化に伴って、年々増加している。
【０００３】
生活者は、日々の疲労を回復するために、入浴、コーヒーの飲用、一般用医薬品及びサプリメントの摂取、アロマグッズの使用など、さまざまな方法を試行しているが（非特許文献２）、日々の疲労に適切に対応できなかった際においては、疲労は蓄積していく。今や、疲労の蓄積に関連する健康障害及び経済損失は大きく、社会的問題になっている。これらの社会的問題を解決するためには、生活者の疲労の程度を判定し、疲労の程度に応じた適切な方法を選択し、早期に疲労を改善又は回復することが必要である。
疲労の程度を判定する方法については公的な対策も推進されており、広く知られている公的対策の一つとしては、睡眠の時間や質、労働時間、疲労感や抑うつ感などの項目からなる簡易な自己判断方法（労働者の疲労蓄積度チェックリストなど）が挙げられる（非特許文献３）。しかし、国内外における多数の研究にもかかわらず、疲労感などの自覚症状によることなく、疲労の程度を客観的に判定することが可能な方法として、広く認められた方法は未だにない。
【０００４】
これまでにも、栄養素の変動、サイトカインやその受容体、さらにはシグナルを受け取ってからの細胞内シグナル伝達機構などの研究から、疲労の程度を客観的に判定するための方法の開発が試みられている（非特許文献４）。例えば、血液中の複数のアミノ酸濃度（特許文献１）、ＴＧＦ―β濃度（特許文献２）、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）の遺伝子の発現量（特許文献３）、モノアミン類の濃度変化率の測定、尿中の脂質過酸化物などの酸化ストレスマーカーの濃度、唾液中のコルチゾール、副腎性ホルモン又はそれらの代謝物、クロモグラニンＡなどの測定などが挙げられる。
【０００５】
上記の方法において、例えばヒトヘルペスウイルスの遺伝子の発現変動は、免疫機能の乱れを背景とする中期的・長期的な疲労と関係するが、短期的な疲労によっては引き起こされ難い課題がある。また、病的疲労の一つである慢性疲労症候群と深く関係しており、カルバマゼピン、フェニトイン、フェノバルビタール、ゾニサミド、サラゾスルファピリジン、メキシレチン、アロプリノールなどによる薬剤性過敏症症候群とも密接に関係していることが知られている（非特許文献５）。従って、リンパ腺の腫れなどを伴う病的疲労や薬剤の副作用としての疲労の判定方法として活用することは可能であるが、日常生活における疲労の判定方法としては、使用において課題が残されている。
【０００６】
尿中のイソプラスタンや８−ＯＨｄＧなどの酸化ストレスマーカーにおいては、高血糖や動脈硬化などの生活習慣病、喫煙と密接に関係しており、極めて一般的な酸化ストレスマーカーであり、疲労を判定していることにならない。
さらに、コルチゾール、副腎性ホルモン又はそれらの代謝物、クロモグラニンＡ、モノアミン類などを用いた判定方法などは精神機能に大きく影響されることが知られている。
複数のアミノ酸やＴＧＦ-βなどを用いた判定方法は、単にエネルギー代謝を反映している場合もあり、疲労の程度を客観的に判定していないと考えられる。
【０００７】
一方、疲労の状態の特性を個々に働く遺伝子に注目するだけで表現するには不十分であるとの考えから、末梢白血球における複数の遺伝子の発現量を一度に比較する方法によって、疲労の程度を客観的に判定する方法が報告されている（特許文献４及び５）。これまでにも、注目する疾患を発症している患者と、疾患を発症していない患者との間で発現量が異なる遺伝子を探索して、得られた遺伝子を疾患の診断や治療薬の探索の標的として用いる方法が広く知られている（特許文献６）。
例えば、末梢白血球における複数の遺伝子の発現量を一度に比較する方法によって、運動疲労状態を評価する方法が報告されている（特許文献７）。
この方法においては、被験者に運動を負荷した後において、末梢白血球における複数の遺伝子（１クラスタあたり７個から２０個の遺伝子よりなる６種のクラスター、計１１７個の遺伝子）を用いて、疲労を評価している。しかし、疲労感の程度に応じて発現変動する遺伝子であるが、パフォーマンスの低下などの程度に応じて発現変動する遺伝子ではなく、客観的に疲労の程度を評価できるとは限らない。さらには、個々の遺伝子の発現変動の程度は不明確であり、抗疲労効果を有する被験物質により発現変動が抑制される遺伝子についても不明瞭であり、各クラスターに含まれる７個から２０個の全ての遺伝子を用いなければ、運動疲労状態を客観的に評価できるとは言えない。
【０００８】
ヒトに運動を負荷し、その前後における複数の遺伝子の発現量を解析することにより、運動を起因とするストレス状態を精度高く評価できることとする方法も報告されている。
この方法においては、ヒトに運動を負荷し、外から生体に加わった外力である運動（ストレス刺激ストレッサー）に対して、そのゆがみを元に戻そうとする反応を“運動を起因とするストレス状態”としている。そして、その前後における複数の遺伝子の発現量を解析することにより、運動を起因とするストレス状態を客観的に評価できるとしている。しかし、この方法においては、“運動による生体のゆがみを元に戻そうとする反応”であるストレスを評価しており、“生体のゆがみ”を評価していない。ましてや、運動負荷による疲労の程度を客観的に評価していない。
【０００９】
疲労の蓄積などによる社会的問題を解決するため、生理学的な特徴に立脚した新たな疲労の程度の判定方法が望まれている。また、疲労の状態を確実に改善できる薬剤も依然開発途上にあり、疲労の程度の判定に有用な方法は、そのような薬剤の疲労に対する有効性の判定のためにも必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０７８４４８号公報
【特許文献２】ＷＯ２００７／０９４４７２号公報
【特許文献３】特開２００７−３３０２６３号公報
【特許文献４】特開２００２−３４０９１７号公報
【特許文献５】特開２００８−５４５９０号公報
【特許文献６】特開２００４−３３０８２号公報
【特許文献７】特開２０１１−１２５３２６
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】疲労の実態調査と予防策、Ｐ２２２−２２８、疲労の科学  株式会社講談社、２００１年
【非特許文献２】疲労回復ホームページ、Ｐ２２９−２３３、疲労の科学  株式会社講談社、２００１年
【非特許文献３】厚生労働省  労働者の疲労蓄積度チェックリスト
【非特許文献４】疲労の生化学バイオマーカー（血液、尿）、Ｐ７１−７５、最新・疲労の科学、別冊・医学のあゆみ、医歯薬出版株式会社、２０１０年
【非特許文献５】薬剤性過敏症症候群とヒトヘルペスウイルス、臨床免疫・アレルギー科、５０巻３号、Ｐ３０２−３０６、２００８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
疲労感に頼ることなく、日常生活における生理的疲労、特に肉体疲労の程度を客観的に判定することは、睡眠や休息の確保、栄養補給や摂取、さらには、薬剤投与を適切に行うことを可能とし、疲労の回復、改善及び予防することが容易に可能となり、国民の健康維持・増進に大きく寄与することとなる。従って、疲労の程度の判定などに有用な方法は、国民の健康維持・増進のためにも重要なものであり、薬剤の疲労に対する有効性を判定するためにも必要である。しかしながら、疲労の程度の判定に有用な方法は開発されていない。また、疲労状態を確実に治療できる薬剤も依然として開発途上にあり、学問上も大きな問題である。
【００１３】
本発明は、被験体より容易に入手し得る生体試料を用いた被験体の疲労の程度を判定する方法、疲労を回復、改善又は予防し得る物質（被験物質）の疲労に対する有効性を判定する方法、疲労を回復、改善又は予防し得る物質を探索する方法、及び疲労判定試薬又はキットを提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生理学的な特徴に立脚した手法によって、疲労により発現が変動する遺伝子を見出し、これら特定の遺伝子からなるリストを作成することに成功し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
【００１５】
（１）  被験体由来の生体試料における、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較することを含む、疲労の程度を判定する方法。
（２）  被験体に被験物質を投与し、被験体由来の生体試料における表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較することを含む、被験物質の疲労に対する有効性を判定する方法。
【００１６】
（３）  被験体に被験物質を投与し、被験体由来の生体試料における表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較し、当該遺伝子の発現を変動させる物質を、疲労を回復、改善又は予防し得る候補物質として選択することを含む、疲労を回復、改善又は予防し得る物質を探索する方法。
【００１７】
（４）  被験体が、ヒト又は非ヒト哺乳動物である、（１）から（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）  生体試料が、血液である、（１）から（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６）  生体試料が、細胞である、（１）から（４）のいずれか１項に記載の方法。
（７）  疲労が生理的疲労である、（１）から（６）のいずれか１項に記載の方法。
（８）  疲労が肉体疲労である、（１）から（７）のいずれか１項に記載の方法。
【００１８】
（９）  肉体疲労を引き起こすために被験体に対して筋運動を負荷させる工程をさらに含む、（１）から（８）のいずれか１項に記載の方法。
（１０）表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現量の変動を分析及び／又は比較する、（１）から（９）のいずれか１項に記載の方法。
（１１）表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子について、少なくとも２個以上の当該遺伝子のうち発現変動が異なる遺伝子の数を分析及び／又は比較する、（１）から（１０）のいずれか１項に記載の方法。
【００１９】
（１２）  表２に記載のＮｏ．００１〜Ｎｏ．１１２の遺伝子及び表３に記載のＮｏ．００１〜Ｎｏ．１０９の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現の増大を分析及び／又は比較し、及び／又は表２に記載のＮｏ．１１３〜Ｎｏ．１４６の遺伝子及び表３に記載のＮｏ．１１０〜Ｎｏ．１４８の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現の減少を分析及び／又は比較する、（１）から（１１）のいずれか１項に記載の方法。
【００２０】
（１３）  表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子が、ＡＲＧ２遺伝子、ＢＬＶＲＢ遺伝子、ＢＲＰ４４遺伝子、Ｃ１９ｏｒｆ５９遺伝子、ＣＣＲ１遺伝子、ＣＣＲＬ２遺伝子、ＣＤ３３遺伝子、ＣＨＩ３Ｌ１遺伝子、ＣＬＥＣ４Ｄ遺伝子、ＣＬＥＣ４Ｅ遺伝子、ＣＳＴＡ遺伝子、ＣＸＣＲ１遺伝子、ＣＸＣＲ２遺伝子、ＣＸＣＲ２Ｐ１遺伝子、ＥＭＲ２遺伝子、ＥＭＲ３遺伝子、ＥＭＲ４Ｐ遺伝子、ＦＰＲ１遺伝子、ＧＰＲ１０９Ａ遺伝子、ＧＰＲ１０９Ｂ遺伝子、ＧＺＭＡ遺伝子、ＨＭＢＳ遺伝子、ＨＰ遺伝子、ＨＰＲ遺伝子、ＩＬ１Ｒ２遺伝子、ＩＲＧ１遺伝子、ＫＬＲＡＰ１遺伝子、ＫＬＲＫ１遺伝子、ＭＭＰ８遺伝子、ＯＸＥＲ１遺伝子、Ｐ２ＲＹ１３遺伝子、ＰＬＩＮ２遺伝子、ＲＡＢ３ＩＬ１遺伝子、Ｓ１００Ａ８遺伝子、ＳＬＦＮ１２遺伝子、ＳＬＦＮ１２Ｌ遺伝子、ＳＰＡＴＣ１遺伝子、ＴＡＲＭ１遺伝子、ＴＡＳ２Ｒ６０遺伝子、ＴＭＯＤ１遺伝子、ＴＲＥＭ１遺伝子、ＴＳＰＯ２遺伝子、ＴＳＴＤ２遺伝子又はＶＴＩ１Ｂ遺伝子、又はそれらのホモログ遺伝子である、（１）から（１２）のいずれか１項に記載の方法。
【００２１】
（１４）  表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子が、ＡＣＥ遺伝子、ＡＣＰ１遺伝子、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＡＣＴＧ２遺伝子、ＡＦＭＩＤ遺伝子、ＡＬＯＸ１５遺伝子、ＡＲＧ２遺伝子、ＡＴＰ５Ｌ遺伝子、ＢＬＶＲＢ遺伝子、ＢＳＴ１遺伝子、Ｃ５ＡＲ１遺伝子、ＣＡ２遺伝子、ＣＢＲ１遺伝子、ＣＣＬ５遺伝子、ＣＣＲ１遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＤ１４遺伝子、ＣＤ３３遺伝子、ＣＨＩ３Ｌ１遺伝子、ＣＸＣＲ１遺伝子、ＣＸＣＲ２遺伝子、Ｆ８遺伝子、ＦＰＲ１遺伝子、ＧＺＭＡ遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＨＭＢＳ遺伝子、ＨＰＲ遺伝子、ＩＦＩＴＭ１遺伝子、ＩＦＮＡ１遺伝子、ＩＦＮＡ１０遺伝子、ＩＦＮＡ１３遺伝子、ＩＦＮＡ１４遺伝子、ＩＦＮＡ１６遺伝子、ＩＦＮＡ１７遺伝子、ＩＦＮＡ２遺伝子、ＩＦＮＡ２１遺伝子、ＩＦＮＡ４遺伝子、ＩＦＮＡ５遺伝子、ＩＦＮＡ６遺伝子、ＩＦＮＡ７遺伝子、ＩＦＮＡ８遺伝子、ＩＬ１３ＲＡ１遺伝子、ＩＬ１Ｂ遺伝子、ＩＬ１Ｒ２遺伝子、ＩＬ２ＲＢ遺伝子、ＩＳＧ１５遺伝子、ＫＬＲＢ１遺伝子、ＫＬＲＤ１遺伝子、ＫＬＲＫ１遺伝子、ＭＩＴＦ遺伝子、ＮＣＲ１遺伝子、ＯＡＳ３遺伝子、ＯＲ１０Ａ３遺伝子、ＯＲ１０Ａ６遺伝子、ＯＲ５１Ｖ１遺伝子、Ｐ２ＲＹ１３遺伝子、ＰＩＧＹ遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ３Ｄ遺伝子、ＲＡＲＳ遺伝子、Ｓ１ＰＲ５遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＢ１０遺伝子、ＳＯＣＳ３遺伝子、ＴＡＳ２Ｒ６０遺伝子、ＴＫ１遺伝子、ＵＢＥ２Ｆ遺伝子、ＵＰＰ１遺伝子、ＵＲＯＤ遺伝子又はＶＴＩ１Ｂ遺伝子、又はそれらのホモログ遺伝子である、（１）から（１２）のいずれか１項に記載の方法。
【００２２】
（１５）表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子が、ＡＲＧ２遺伝子、ＢＬＶＲＢ遺伝子、ＣＣＲ１遺伝子、ＣＤ３３遺伝子、ＣＨＩ３Ｌ１遺伝子、ＣＸＣＲ１遺伝子、ＣＸＣＲ２遺伝子、ＦＰＲ１遺伝子、ＧＺＭＡ遺伝子、ＨＭＢＳ遺伝子、ＨＰＲ遺伝子、ＩＬ１Ｒ２遺伝子、ＫＬＲＫ１遺伝子、Ｐ２ＲＹ１３遺伝子、ＴＡＳ２Ｒ６０遺伝子又はＶＴＩ１Ｂ遺伝子である、（１）から（１２）のいずれか１項に記載の方法。
【００２３】
（１６）表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子が、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＡＣＴＧ２遺伝子、ＰＬＩＮ２遺伝子、ＡＲＧ２遺伝子、ＣＤ３３遺伝子、ＣＨＩ３Ｌ１遺伝子、ＣＣＲ１遺伝子、ＦＰＲ１遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＨＭＢＳ遺伝子、ＩＬ１Ｂ遺伝子、ＣＸＣＲ１遺伝子、ＣＸＣＲ２遺伝子、ＣＸＣＲ２Ｐ１遺伝子、ＭＸＤ１遺伝子、ＭＭＰ８遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ３Ｄ遺伝子、Ｓ１００Ａ８遺伝子、Ｓ１００Ａ９遺伝子、ＩＬ１Ｒ２遺伝子、ＩＦＩＴＭ１遺伝子、ＨＣＡＲ３遺伝子（ＧＰＲ１０９Ｂ遺伝子）、ＩＦＩＴＭ３遺伝子、ＩＦＩＴＭ２遺伝子、ＸＰＯ７遺伝子、ＴＲＥＭ１遺伝子、ＳＬＦＮ１２遺伝子、ＲＴＰ４遺伝子、ＰＲＡＭ１遺伝子、ＯＸＥＲ１遺伝子、ＣＬＥＣ４Ｄ遺伝子、ＴＡＳ２Ｒ６０遺伝子、ＨＣＡＲ２遺伝子（ＧＰＲ１０９Ａ遺伝子）、ＳＬＦＮ１２Ｌ遺伝子、ＴＡＲＭ１遺伝子、ＡＬＯＸ１５遺伝子、ＧＺＭＡ遺伝子、ＣＣＬ５遺伝子、ＮＣＲ１遺伝子、ＫＬＲＫ１遺伝子、ＥＭＲ２遺伝子、ＥＭＲ３遺伝子、ＥＭＲ４Ｐ遺伝子、ＡＤＡＭ８遺伝子、ＴＣＮ２遺伝子、ＯＬＦＭ４遺伝子、ＧＰＲ７７遺伝子、ＳＴＥＡＰ４遺伝子、ＤＧＡＴ２遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱＢ２遺伝子、ＫＬＲＣ４−ＫＬＲＫ１遺伝子又はＨＤＡＣ９遺伝子である、（１）から（１２）のいずれか１項に記載の方法。
【００２４】
（１７）  被験体由来の生体試料における遺伝子の発現量が、疲労の状態の対照体及び／又は非疲労の状態の健常対照体における当該遺伝子の発現量のどちらに近いかに基づいて行われ、疲労の状態の対照体に近い場合に、被験体は疲労の状態であると判定することを特徴とする、（１）から（１６）のいずれか１項に記載の方法。
（１８）  被験体由来の生体試料における遺伝子の発現変動量又は発現変動率が、疲労の状態の対照体及び／又は非疲労の状態の健常対照体における当該遺伝子の発現変動量又は発現変動率のどちらに近いかに基づいて行われ、疲労の状態の対照体に近い場合に、被験体は疲労の状態であると判定することを特徴とする、（１）から（１６）のいずれか１項に記載の方法。
（１９）被験物質の疲労に対する有効性を判定するにおいて、被験物質の投与に伴って被験体由来の生体試料における遺伝子の発現変動が減弱又は消失している場合に、被験物質は疲労に対して有効であると判定することを特徴とする、（１）から（１８）のいずれか１項に記載の方法。
【００２５】
（２０）  表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子に特異的なプローブ又はプライマー、又は上記遺伝子の遺伝子産物に特異的な抗体を含む、（１）から（１９）のいずれか１項に記載の方法において上記遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較するための疲労判定試薬又は疲労判定キット。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、本明細書に記載した遺伝子リストより選ばれる特定の遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較することによる、被験体の疲労の程度を判定する方法、被験物質の疲労に対する有効性を判定する方法、及び疲労を回復、改善又は予防し得る物質を探索する方法が提供される。更に本発明によれば、上記の方法に用いるための疲労判定試薬又はキットが提供される。
これらにより、簡便かつ客観的に疲労の程度を判定でき、疲労を回復、改善又は予防し得る物質の疲労に対する有効性を判定でき、これらの物質を探索することも可能である。さらに、疲労の程度が未知である被験体の疲労の程度を客観的に判定することにより、疲労の状態と判定された被験体は、睡眠や休息の確保、栄養補給や摂取、さらには、医薬品投与を適切に行うことが可能となり、疲労の回復、改善及び予防が容易に可能となり、国民の健康維持・増進に大きく寄与することとなる。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の実施の形態について以下に説明する。
＜疲労＞
本発明における疲労は、特に限定されないが、一般的な意味としては、例えば、身体作業あるいは精神作業などにより、身体あるいは精神に負荷を与えた際に生じる作業効率（パフォーマンス）が低下した状態を示す。この場合、疲労の程度とは作業効率の低下の程度（度合い）を意味する。
本発明において、判定の対象となる疲労は、好ましくは生理的疲労である。また、好ましくは末梢性の疲労（末梢性疲労）であり、肉体疲労、身体疲労、筋肉疲労、運動疲労などがさらに好ましい。また、身体作業により筋肉などの末梢組織が疲労することに起因する肉体疲労などが特に好ましい。
【００２８】
「生理的疲労」とは、睡眠や休息の確保、栄養の摂取などを適切に得ることにより、自然の状態で回復が可能な範囲での疲労であり、病的疲労や薬剤由来の疲労を含まない。逆に、不適切な生活習慣は、疲労の蓄積を引き起こす。
「病的疲労」とは慢性疲労症候群、悪性腫瘍、細菌又はウイルス感染、後天性免疫不全症候群、糖尿病、うつ病などの疾病に伴う疲労を示す。
「薬剤由来の疲労」とは、抗ガン剤、免疫抑制剤、向精神剤などの薬剤の使用によって引き起こされる疲労を示す。
「末梢性疲労」とは、脳が主体となって疲労を感じている中枢性疲労の状態でなく、脳以外の末梢組織に起因する疲労を示し、いわゆる身体疲労、肉体疲労、筋肉疲労などが挙げられる。また、身体に負荷を与える作業（身体作業）や精神に負荷を与える作業（精神作業）、不適切な生活習慣（睡眠や休息、栄養の不足など）による末梢組織に起因する疲労である。
ここで言う身体作業や精神作業には、産業活動における労働作業のみでなく、日常生活における作業や運動、走行、自転車こぎ、階段の昇降などの動作も含む。
従って、非疲労の状態とは、病的疲労又は薬剤由来の疲労を呈していない状態であり、精神あるいは身体などへの負荷が少なく、十分な睡眠や休息が確保されており、栄養摂取量を満たしており、さらに、日常的に適度な運動を行い、中枢性及び末梢性の疲労を呈していない状態を示す。
【００２９】
＜被験体、及び生体試料＞
本発明においては、被験体由来の生体試料における、特定の遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較する。
本発明における「被験体」とは、好ましくは、生体試料を採取することが可能なヒト又は非ヒト哺乳動物であり、ヒトであることが特に好ましい。
「非ヒト哺乳動物」とは、ヒトを除く哺乳綱の脊椎動物を意味し、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、霊長類（例えば、サルなど）、並びにイヌなど、薬剤の有効性を判定する際に汎用される動物が好ましく、上記の中でもマウス及びラットが特に好ましい。
【００３０】
本発明における「生体試料」とは、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子を発現しており、その遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較できる試料であれば、その種類は特に限定されない。
生体試料としては、被験体より採取することが可能である血液、脳脊髄液、唾液、精液などの体液や細胞が挙げられるが、特に限定されない。これらの試料は、倫理的な問題が生じないように採血又はバイオプシーなどにより、被験体から分離されることが望ましい。好ましくは、生体試料は、血液であり、さらに好ましくは血球などの血液細胞である。
【００３１】
また、本発明における「細胞」とは表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子を発現しており、その遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較できる細胞である。
細胞としては、例えば、血液細胞、肝細胞、筋細胞、神経細胞、グリア細胞、骨髄細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、間質細胞、又はこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。細胞は、好ましくは、筋細胞、肝細胞、血液細胞、又はそれらの前駆細胞もしくは幹細胞であり、ヒト由来の細胞であることがより好ましい。
【００３２】
＜遺伝子＞
本発明の方法においては、被験体由来の生体試料における、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較する。
表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子又はそのホモログ遺伝子は、少なくともヒト又はマウスにて公知の遺伝子であり、その塩基配列又はポリペプチド配列は公知であり、当業者に利用可能な遺伝子である。
【００３３】
表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子は、Ｔｈｅ ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ （ＨＧＮＣ）、米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）、欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）などの遺伝子データベースに登録されている遺伝子であり、これらのデータベースにおいて遺伝子シンボル、Ｅｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤ（ＥＧＩＤ）、ＨＧＮＣ ＩＤ、Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＭＧＩ）、ＶＥｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ（ＶＥＧＡ）又はアクセッション番号（Ａｃｃｅｓｓｏｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）などによって容易に塩基配列又はポリペプチド配列などの遺伝子情報を入手することができる。これらの遺伝子のいくつかは、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）、ＢｉｏＣａｒｔａ、Ｇｅｎｅ  Ｍａｐ  Ａｎｎｏｔａｔｏｒ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（ＧｅｎＭＡＰＰ）などのパスウェイデータベースや遺伝子オントロジー（Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ：ＧＯ）データベースにも登録されており、機能的情報を容易に得ることもできる。
【００３４】
本発明においては、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子のホモログ遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較してもよい。
「ホモログ遺伝子」とは、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる遺伝子と機能的に同等な遺伝子のことを言う。ホモログ遺伝子のいくつかは、ＨＧＮＣやＮＣＢＩなどに登録されている遺伝子より、容易に塩基配列又はポリペプチド配列などの遺伝子情報を入手することができる。
【００３５】
「機能的に同等な遺伝子」とは、ホモログ遺伝子によってコードされるポリペプチドが、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子によってコードされるポリペプチドと、同等の生物学的機能、生理学的機能又は生化学的機能を有することを示す。
通常、機能的に同等な遺伝子は、塩基配列又はポリペプチド配列において、高い相同性や同一性を有しており、少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性又は同一性を示す。機能的に同等な遺伝子は、塩基配列を基にした遺伝子増幅法などを利用して単離及び特定することも可能である。
【００３６】
また、本発明における「遺伝子」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれもでもよく、ゲノムＤＮＡのみならず、ｍＲＮＡ、ａＲＮＡ、ｃＲＮＡ及びｃＤＮＡなども含むものであり、全長遺伝子のみでなく、その一部を含む遺伝子（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ、ＥＳＴ）でもよい。
ここで言う「その一部を含む遺伝子」とは、ハイブリダイズする際に十分な配列長を有するものであれば、その長さは特に限定されないが、好ましくは少なくとも１０塩基以上であり、より好ましくは１０塩基以上１００塩基以下であり、さらに好ましくは１０塩基以上５０塩基以下である。また、塩基配列又はポリペプチド配列などによって特定される各遺伝子には、例えば、各塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とハイブリダイズする遺伝子が含まれる。
【００３７】
＜遺伝子リスト＞
本発明による、（１）被験体の疲労の程度を判定する方法、（２）疲労を回復、改善又は予防し得る物質（被験物質）の疲労に対する有効性を判定する方法、（３）疲労を回復、改善又は予防し得る物質を探索する方法においては、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より遺伝子リストを作成し、遺伝子リストより選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較する。
表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より作成される遺伝子リストに含まれる遺伝子としては、例えば、疲労の状態の被験体における遺伝子の発現変動が、非疲労の状態の健常対照体の発現変動と比較して、著しく異なっている遺伝子である。
【００３８】
本発明において選定する遺伝子としては、生理的疲労の程度に応じて発現が変動（増加又は減少）する遺伝子であり、例えば、身体作業や精神作業の程度に応じて発現が変動（増加又は減少）する遺伝子であることが好ましい。疲労を呈している複数の被験体において、身体作業や精神作業などにおける作業効率の低下の程度に応じて発現が変動（増加又は減少）する遺伝子でもよい。
疲労の状態の対照体由来及び／又は非疲労の状態の健常対照体由来の生体試料における遺伝子の発現変動は、前もって測定して得られた発現変動でもよいし、被験体の特定の遺伝子の発現変動を解析する際に同時に得た発現変動でもよい。
【００３９】
「身体作業」としては、身体的な負担より作業効率が低下する動作であり、例えば、水泳、走行、自転車こぎ、階段昇降などの動作であり、最大筋力や筋持久力を低下させる動作が望ましく、トレッドミル走行あるいは自転車エルゴメータ運動がより好ましい。
「精神作業」としては、精神的な負担により作業効率が低下する動作であり、例えば、内田・クレペリン精神作業、視覚入力作業、単純作業の反復に伴う作業、高い緊張下での複雑作業などの作業が好ましく、処理時間の遅延、あるいは誤処理の数量の増加を引き起こす作業がより好ましい。
また、疲労の状態である被験体由来の生体試料を用いて、十分な休息や睡眠の確保、栄養の摂取による疲労回復の前後において、著しく発現が変動している遺伝子から選定してもよい。
【００４０】
上記の疲労の状態である被験体がヒトである場合、病的疲労や薬剤由来の疲労でないことを医師などによって診断されていることが好ましく、疲労が生理的疲労であり、より好ましくは末梢性疲労であり、身体作業に伴う肉体疲労であることがさらに好ましい。
【００４１】
生理的な特徴に立脚した手法によって、疲労により発現が変動する遺伝子リストを作成するには、非侵襲的に採取しやすい血液において、疲労時に発現変動する遺伝子から選定することが望ましい。
【００４２】
遺伝子リストを簡易に作成するための方法としては、例えば、運動負荷による疲労困憊の状態の動物モデル（マウス）の血液において、運動負荷前と比較して著しく発現変動を示す遺伝子から選定する方法があり、ヒト遺伝子と比較して相同性又は同一性が高い遺伝子であることがより好ましい。
【００４３】
表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる特定の遺伝子の数としては、１個以上であれば特に限定されないが、２個以上の遺伝子を使用する場合は、好ましくは２個以上１００個以下の遺伝子であり、より好ましくは２個以上５３個以下の遺伝子であり、より好ましくは２個以上３０個以下の遺伝子であり、より好ましくは２個以上２２個以下の遺伝子であり、さらに好ましくは２個以上１０個以下の遺伝子である。
【００４４】
疲労の程度の判定のために用いる遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子や疾患診断のための遺伝子などと組み合わせて用いてもよい。
【００４５】
本発明における、好ましい特定の遺伝子としては、表２、表３、表５又は表６より選ばれる１個以上の遺伝子である。
【００４６】
表２、表３、表５又は表６より選ばれる、より好ましい特定の遺伝子としては、ＡＲＧ２遺伝子、ＢＬＶＲＢ遺伝子、ＢＲＰ４４遺伝子、Ｃ１９ｏｒｆ５９遺伝子、ＣＣＲ１遺伝子、ＣＣＲＬ２遺伝子、ＣＤ３３遺伝子、ＣＨＩ３Ｌ１遺伝子、ＣＬＥＣ４Ｄ遺伝子、ＣＬＥＣ４Ｅ遺伝子、ＣＳＴＡ遺伝子、ＣＸＣＲ１遺伝子、ＣＸＣＲ２遺伝子、ＣＸＣＲ２Ｐ１遺伝子、ＥＭＲ２遺伝子、ＥＭＲ３遺伝子、ＥＭＲ４Ｐ遺伝子、ＦＰＲ１遺伝子、ＧＰＲ１０９Ａ遺伝子、ＧＰＲ１０９Ｂ遺伝子、ＧＺＭＡ遺伝子、ＨＭＢＳ遺伝子、ＨＰ遺伝子、ＨＰＲ遺伝子、ＩＬ１Ｒ２遺伝子、ＩＲＧ１遺伝子、ＫＬＲＡＰ１遺伝子、ＫＬＲＫ１遺伝子、ＭＭＰ８遺伝子、ＯＸＥＲ１遺伝子、Ｐ２ＲＹ１３遺伝子、ＰＬＩＮ２遺伝子、ＲＡＢ３ＩＬ１遺伝子、Ｓ１００Ａ８遺伝子、ＳＬＦＮ１２遺伝子、ＳＬＦＮ１２Ｌ遺伝子、ＳＰＡＴＣ１遺伝子、ＴＡＲＭ１遺伝子、ＴＡＳ２Ｒ６０遺伝子、ＴＭＯＤ１遺伝子、ＴＲＥＭ１遺伝子、ＴＳＰＯ２遺伝子、ＴＳＴＤ２遺伝子及びＶＴＩ１Ｂ遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子である。
【００４７】
又は、ＡＣＥ遺伝子、ＡＣＰ１遺伝子、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＡＣＴＧ２遺伝子、ＡＦＭＩＤ遺伝子、ＡＬＯＸ１５遺伝子、ＡＲＧ２遺伝子、ＡＴＰ５Ｌ遺伝子、ＢＬＶＲＢ遺伝子、ＢＳＴ１遺伝子、Ｃ５ＡＲ１遺伝子、ＣＡ２遺伝子、ＣＢＲ１遺伝子、ＣＣＬ５遺伝子、ＣＣＲ１遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＤ１４遺伝子、ＣＤ３３遺伝子、ＣＨＩ３Ｌ１遺伝子、ＣＸＣＲ１遺伝子、ＣＸＣＲ２遺伝子、Ｆ８遺伝子、ＦＰＲ１遺伝子、ＧＺＭＡ遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＨＭＢＳ遺伝子、ＨＰＲ遺伝子、ＩＦＩＴＭ１遺伝子、ＩＦＮＡ１遺伝子、ＩＦＮＡ１０遺伝子、ＩＦＮＡ１３遺伝子、ＩＦＮＡ１４遺伝子、ＩＦＮＡ１６遺伝子、ＩＦＮＡ１７遺伝子、ＩＦＮＡ２遺伝子、ＩＦＮＡ２１遺伝子、ＩＦＮＡ４遺伝子、ＩＦＮＡ５遺伝子、ＩＦＮＡ６遺伝子、ＩＦＮＡ７遺伝子、ＩＦＮＡ８遺伝子、ＩＬ１３ＲＡ１遺伝子、ＩＬ１Ｂ遺伝子、ＩＬ１Ｒ２遺伝子、ＩＬ２ＲＢ遺伝子、ＩＳＧ１５遺伝子、ＫＬＲＢ１遺伝子、ＫＬＲＤ１遺伝子、ＫＬＲＫ１遺伝子、ＭＩＴＦ遺伝子、ＮＣＲ１遺伝子、ＯＡＳ３遺伝子、ＯＲ１０Ａ３遺伝子、ＯＲ１０Ａ６遺伝子、ＯＲ５１Ｖ１遺伝子、Ｐ２ＲＹ１３遺伝子、ＰＩＧＹ遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ３Ｄ遺伝子、ＲＡＲＳ遺伝子、Ｓ１ＰＲ５遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＢ１０遺伝子、ＳＯＣＳ３遺伝子、ＴＡＳ２Ｒ６０遺伝子、ＴＫ１遺伝子、ＵＢＥ２Ｆ遺伝子、ＵＰＰ１遺伝子、ＵＲＯＤ遺伝子及びＶＴＩ１Ｂ遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子がより好ましい遺伝子である。
【００４８】
又は、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＡＣＴＧ２遺伝子、ＰＬＩＮ２遺伝子、ＡＲＧ２遺伝子、ＣＤ３３遺伝子、ＣＨＩ３Ｌ１遺伝子、ＣＣＲ１遺伝子、ＦＰＲ１遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＨＭＢＳ遺伝子、ＩＬ１Ｂ遺伝子、ＣＸＣＲ１遺伝子、ＣＸＣＲ２遺伝子、ＣＸＣＲ２Ｐ１遺伝子、ＭＸＤ１遺伝子、ＭＭＰ８遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ３Ｄ遺伝子、Ｓ１００Ａ８遺伝子、Ｓ１００Ａ９遺伝子、ＩＬ１Ｒ２遺伝子、ＩＦＩＴＭ１遺伝子、ＨＣＡＲ３遺伝子（ＧＰＲ１０９Ｂ遺伝子）、ＩＦＩＴＭ３遺伝子、ＩＦＩＴＭ２遺伝子、ＸＰＯ７遺伝子、ＴＲＥＭ１遺伝子、ＳＬＦＮ１２遺伝子、ＲＴＰ４遺伝子、ＰＲＡＭ１遺伝子、ＯＸＥＲ１遺伝子、ＣＬＥＣ４Ｄ遺伝子、ＴＡＳ２Ｒ６０遺伝子、ＨＣＡＲ２遺伝子（ＧＰＲ１０９Ａ遺伝子）、ＳＬＦＮ１２Ｌ遺伝子、ＴＡＲＭ１遺伝子、ＡＬＯＸ１５遺伝子、ＧＺＭＡ遺伝子、ＣＣＬ５遺伝子、ＮＣＲ１遺伝子、ＫＬＲＫ１遺伝子、ＥＭＲ２遺伝子、ＥＭＲ３遺伝子、ＥＭＲ４Ｐ遺伝子、ＡＤＡＭ８遺伝子、ＴＣＮ２遺伝子、ＯＬＦＭ４遺伝子、ＧＰＲ７７遺伝子、ＳＴＥＡＰ４遺伝子、ＤＧＡＴ２遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱＢ２遺伝子、ＫＬＲＣ４−ＫＬＲＫ１遺伝子及びＨＤＡＣ９遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子がより好ましい遺伝子である。
【００４９】
さらに好ましい特定の遺伝子としては、ＡＲＧ２遺伝子、ＢＬＶＲＢ遺伝子、ＣＣＲ１遺伝子、ＣＤ３３遺伝子、ＣＨＩ３Ｌ１遺伝子、ＣＸＣＲ１遺伝子、ＣＸＣＲ２遺伝子、ＦＰＲ１遺伝子、ＧＺＭＡ遺伝子、ＨＭＢＳ遺伝子、ＨＰＲ遺伝子、ＩＬ１Ｒ２遺伝子、ＫＬＲＫ１遺伝子、Ｐ２ＲＹ１３遺伝子、ＴＡＳ２Ｒ６０遺伝子及びＶＴＩ１Ｂ遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子である。
【００５０】
又は、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＡＣＴＧ２遺伝子、ＣＤ３３遺伝子、ＨＭＢＳ遺伝子、ＩＬ１Ｂ遺伝子、ＭＸＤ１遺伝子、ＭＭＰ８遺伝子、Ｓ１００Ａ８遺伝子、ＩＦＩＴＭ１遺伝子、ＩＦＩＴＭ３遺伝子、ＩＦＩＴＭ２遺伝子、ＴＲＥＭ１遺伝子、ＳＬＦＮ１２遺伝子、ＲＴＰ４遺伝子、ＰＲＡＭ１遺伝子、ＴＡＳ２Ｒ６０遺伝子、ＳＬＦＮ１２Ｌ遺伝子、ＴＡＲＭ１遺伝子、ＴＣＮ２遺伝子、ＯＬＦＭ４遺伝子、ＳＴＥＡＰ４遺伝子及びＤＧＡＴ２遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子がさらに好ましい遺伝子である。
【００５１】
本発明における好ましい遺伝子のＥｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ及びアクセッション番号を表１に記載する。
【００５２】
【表１】
2012205590.tif 000002
【００５３】
2012205590.tif 000003
【００５４】
＜遺伝子産物の発現量の測定＞
本発明においては、上記した特定の遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較する。遺伝子の発現変動の分析及び／又は比較は、当該遺伝子又は当該遺伝子産物の発現量、発現強度、又は発現頻度などを測定し、得られたデータを解析することによって行うことができる。
【００５５】
「遺伝子産物」とは、転写産物、又は翻訳産物のいずれでもよく、例えば、遺伝子の発現変動の比較とは、通常、転写産物や翻訳産物の発現量を測定し、その増減を比較することを示す。
「転写産物」とは、各遺伝子から転写の過程を経て生じる遺伝子、通常、ＲＮＡを示し、好ましくはｍＲＮＡを示す。
「翻訳産物」とは、各遺伝子から転写、翻訳の過程を得て生じるタンパク質を示し、未修飾であっても翻訳後修飾されていてもよい。
「翻訳後修飾」としては、リン酸、糖、糖鎖、リン脂質、脂質などによる修飾が挙げられる。
【００５６】
遺伝子産物の発現量などを測定する方法としては、転写産物を検出し得るプローブやプライマーを用いる方法、翻訳産物を認識する抗体や結合する物質を用いる方法、翻訳産物を同定し得る二次元電気泳動によるタンパク質発現解析やＬＣ／ＭＳ質量分析法による質量分析法などがある。
【００５７】
「転写産物を検出し得るプローブやプライマーを用いる方法」の一例として、プローブやプライマーを用いて特定の遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを測定する方法について示す。ここでの遺伝子の測定にはｍＲＮＡのみでなく、ｍＲＮＡから調整されたｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はａＲＮＡを測定する場合も含まれる。測定のためには先ずｍＲＮＡを抽出するが、ｍＲＮＡは、当該分野で公知の方法によって抽出してもよいし、市販のキットを用いて行ってもよい。対照として用いられるｍＲＮＡは、同様の抽出及び精製方法により調製してもよいし、市販のものを用いてもよい。
【００５８】
「プローブ」とは、ハイブリダイゼーションによって、ｍＲＮＡなどの転写産物の検出の用に供される核酸分子を示す。本発明に用いられるプローブとしては、各遺伝子を特異的に検出するため、少なくとも１０塩基以上の長さを有するものが好ましく、少なくとも１５塩基以上の長さを有するものがより好ましく、少なくとも１８塩基以上の長さを有するものがさらに好ましく、少なくとも２０塩基以上の長さを有するものがさらに好ましい。より好ましくは１０塩基以上１００塩基以下の長さを有するものであり、さらに好ましくは１０塩基以上５０塩基以下の長さを有するものであり、さらに好ましくは１５塩基以上５０塩基以下の長さを有するものであり、さらに好ましくは１８塩基以上５０塩基以下の長さを有するものであり、さらに好ましくは２０塩基以上５０塩基以下の長さを有するものである。
【００５９】
「プライマー」とは、核酸の合成反応にあたりヌクレオチド鎖が伸長していく出発点として働く核酸分子を示す。本発明に用いられるプライマーとしては、各遺伝子を検出するため、少なくとも１０塩基以上の長さを有するものが好ましく、少なくとも１５塩基以上の長さを有するものがより好ましく、少なくとも１８塩基以上の長さを有するものがさらに好ましく、少なくとも２０塩基以上の長さを有するものがさらに好ましくい。より好ましくは１０塩基以上１００塩基以下の長さを有するものであり、さらに好ましくは１０塩基以上５０塩基以下の長さを有するものであり、さらに好ましくは１５塩基以上５０塩基以下の長さを有するものであり、さらに好ましくは１８塩基以上５０塩基以下の長さを有するものであり、さらに好ましくは２０塩基以上５０塩基以下の長さを有するものである。
【００６０】
プローブ又はプライマーとしては、市販のプローブやプライマーを用いてもよいし、遺伝子データベースなどの配列情報をもとにクローニング又は化学合成したものでもよい。プローブやプライマーは、当業者に公知の技術に従って設計することができる。これらのプローブやプライマーは、適当な標識が施されていてもよい。
「標識」としては酵素標識、放射性標識、蛍光標識などが挙げられる。また、ビオチン、リン酸、アミンなどにより修飾されていてもよい。
【００６１】
プライマーを用いた遺伝子の増幅手法としては、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）法の原理を利用した方法（ＰＣＲ法、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｑ−ＰＣＲ）法、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法）、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ―ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ（ＩＣＡＮ）法などを挙げることができる。増幅は遺伝子産物が検出可能なレベルになるまで行う。これらの増幅手法の条件や方法は、当業者に公知であり、当業者であれば適宜設定することができる。
【００６２】
転写産物の発現量を測定する他の方法としては、プローブを用いたハイブリダイゼーション手法として、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などを挙げることができる。これらの増幅手法やハイブリダイゼーション手法の条件や方法は、当業者に公知であり、当業者であれば適宜設定することができる。
【００６３】
２個以上の複数の遺伝子の遺伝子産物の発現量などを測定する場合にも、ＲＴ−ＰＣＲ法などのプライマーを用いた遺伝子の増幅手法を選択することができる。しかし、特に測定する遺伝子の数が多い場合には、同時に複数の遺伝子の遺伝子産物などを測定することができる技術、例えば、ＤＮＡアレイ、ＤＮＡチップ、ＲＮＡカードなどのプローブやプライマーが固定化された担体やハイスループットｑＰＣＲダイナミックアレイなどの集積流体回路（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃｉｒｃｕｉｔ：ＩＦＣ）により同時に複数の遺伝子の転写産物の発現量などを測定する方法などを用いることも可能である。
【００６４】
担体としては、例えば、ガラス板、プラスチック板、メンブレン、繊維、マイクロビーズ又はシリコンチップなどを使用することができる。これらの好ましい例としては、アレイ・チップを用いる方法が挙げられる。アレイ・チップとしては、特定の遺伝子の遺伝子産物の発現量などを測定できるものであれば、市販のものを用いてもよいし、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる特定の遺伝子を含むアレイ・チップを作製してもよい。
【００６５】
アレイ・チップなどを用いて複数の遺伝子の遺伝子産物の発現量などを同時に測定する際には、標準化操作により各遺伝子の遺伝子産物の発現量などを補正することが望ましい。また、シグナル強度の低い部分は、バックグランドの影響を大きく受けるので、測定データを棄却するレベル（カットオフ値）を設け、シグナル強度がカットオフ値を超えるデータのみを採用することが好ましい。
【００６６】
「翻訳産物を認識する抗体や結合する物質を用いる方法」の一例として、抗体を用いて特定の遺伝子の翻訳産物の発現量などを測定する方法を示す。翻訳産物を認識する抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のどちらでもよい。翻訳産物に対する抗体の一部が市販されている場合には、市販の抗体を用いてもよい。ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体は、当該分野で周知の方法によって作製することができる。これらの抗体は修飾されていてもよい。
複数の遺伝子の翻訳産物などを測定する場合においては、担体にこれらの抗体を固定化した抗体アレイ・チップを用いることも可能である。
【００６７】
翻訳産物の発現量を測定する他の方法としては、翻訳産物の活性を測定してもよい。
ここでいう「翻訳産物の活性」とは、キナーゼ活性、プロテアーゼ活性、サイトカイン活性などが挙げられる。他の方法として、公知の二次元電気泳動、ＬＣ／ＭＳ質量分析法、クロマトグラフィー、核磁気共鳴分光法、免疫沈降法、Ｅｎｚｙｍｅ―Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法などの方法でもよく、特に限定されない。
【００６８】
＜遺伝子の発現量及び／又は発現変動の補正＞
遺伝子の発現変動を比較する場合には、予め発現量などの測定値を公知の方法によって補正することができる。補正により、独立した複数の生体試料における遺伝子の発現変動をより正確に比較することが可能となる。測定値の補正は、疲労の状態の有無において発現量などが大きく変動しない遺伝子、例えば、ハウスキーピング遺伝子の発現量などの測定値に基づいて、特定の遺伝子の発現量などの測定値を補正することにより行われる方法や、全測定値の平均値及び分散値を用いる標準化処理方法などがあり、その他にも公知の方法がある。
ハウスキーピング遺伝子としては、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）やβ−アクチン（ＡＣＴＢ）などを挙げることができる。
【００６９】
＜遺伝子の発現変動の比較＞
遺伝子の発現変動の比較は、例えば、（ｉ）遺伝子の発現量及び／又は発現変動量の増減の比較や、遺伝子の発現量及び／又は発現変動量が増減している遺伝子数の比較、又は（ｉｉ）統計的処理に基づいて行われ、対となる複数の遺伝子の発現変動の特徴を比較することが挙げられる。
【００７０】
すなわち、1個の特定の遺伝子の発現量などの増減を比較する場合、例えば、生体試料（Ｂ）に発現している遺伝子（ｘ）の発現量などが、生体試料（Ａ）に発現している遺伝子（ｘ）の発現量などを比較して、“増加”、“減少”又は“変動なし”と判断することを示す。
ここでの「生体試料（Ａ）」及び／又は「生体試料（Ｂ）」とは、例えば、疲労の状態の対照体由来の生体試料及び／又は非疲労の状態の健常対照体由来の生体試料などを示す。
【００７１】
疲労の程度を判定するための遺伝子は１個でもよいが、２個以上の遺伝子を用いてもよい。
発現変動を比較する遺伝子が２個である場合、例えば、生体試料（Ｂ）に発現している遺伝子（ｘ）及び遺伝子（ｙ）の発現量などが、生体試料（Ａ）に発現している遺伝子(ｘ）及び遺伝子（ｙ）の発現量などを比較して、それぞれの遺伝子の発現量などにおいて“増加”、“減少”又は“変動なし”と判断することができる。
また、それぞれの遺伝子の発現量などの平均値又は中央値を分析及び／又は比較することにより“増加”、“減少”又は“変動なし”と判断することができる。
また、遺伝子（ｘ）及び遺伝子（ｙ）の発現量が増減している遺伝子の数を比較し、全体としての発現挙動、発現量が変動している遺伝子の占める割合など、遺伝子の発現量の状態を判定できる情報、すなわち遺伝子の発現変動の特徴により判断することができる。
他にも、遺伝子（ｘ）の発現量の増減に対する遺伝子（ｙ）の発現量の増減を比較して判断することもできるし、発現量が増加している遺伝子の数及び発現量が減少している遺伝子の数を、それぞれ比較して判断することもできる。
【００７２】
遺伝子の発現量などの増減の判断をする際には、一定の倍率をもって“増加”、“減少”又は“変動なし”と判断するＦｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅ比較の方法と統計処理により判断する方法が挙げられる。
【００７３】
「Ｆｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅ」比較の方法とは、例えば、生体試料（Ｂ）に発現している遺伝子（ｘ）の測定値が生体試料（Ａ）に発現している遺伝子（ｘ）の測定値と比較して１．５倍以上の比率で増加している場合に、生体試料（Ｂ）に発現している遺伝子（ｘ）の発現量は“５０．０％以上の増加”と判断する方法を意味する。また、１．５倍以上の比率で減少している場合には、“−３３．３％以下の減少”と判断することができる。
【００７４】
比率は、３０．０％以上の増加又は−２３．１％以下の減少が好ましく、３５．０％以上の増加又は−２５．９％以下の減少がより好ましく、４０．０％以上の増加又は−２８．６％以下の減少がより好ましく、５０．０％以上の増加又は−３３．３％以下の減少が特に好ましいが、特には限定されない。
【００７５】
統計的処理には、２群間以上で比較することが可能である方法であれば、どのような方法であってもよい。例えば、Ｔ−検定（２群の場合）、分散分析（３群以上の場合）、多変量解析、クラスタリング、判別分析などの方法、回帰直線を求める方法、相関係数を求める方法など、公知の方法が広く知られている。これらの統計的処理における基準の設定は、当業者であれば、適宜行うことができる。
【００７６】
＜疲労の程度の判定方法＞
本発明による疲労の程度の判定方法においては、被験体由来の生体試料における、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較することによって”疲労の程度”を判定する。
具体的には、生体試料における当該特定の遺伝子の発現量が非疲労の状態の健常対照体における発現量と比較して増加又は減少している場合に、疲労の状態であると判定し、その発現量の変動の程度を疲労の程度とすることができる。
【００７７】
なお本発明においては、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現量の変動を分析及び／又は比較してもよいし、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子について、少なくとも２個以上の当該遺伝子のうち発現量が異なる遺伝子の数を分析及び／又は比較してもよい。
【００７８】
また、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子又はそれらのホモログ遺伝子より選ばれる１個の特定の遺伝子の発現変動量又は発現変動率を分析及び／又は比較してもよいし、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる２個以上の特定の遺伝子それぞれの発現変動量又は発現変動率の平均値又は中央値を分析及び／又は比較してもよい。
【００７９】
ここでの「発現変動量」とは、被験体由来の生体試料における特定の遺伝子の発現量（ｆ）と、非疲労の状態の健常対照体由来の生体試料における当該遺伝子の発現量（ａ）との差（発現変動量Ｆ）を示す。
発現変動量Ｆ＝発現量（ｆ）−発現量（ａ）
「発現変動率」とは、特定の遺伝子の発現変動量Ｆが、非疲労の状態の健常対照体由来の生体試料における発現量（ａ）に対する割合を示す（発現変動率Ｆ（％））。
発現変動率Ｆ（％）＝[発現変動量Ｆ／発現量（ａ）]×１００
また、被験体由来の生体試料における遺伝子の発現量（ｆ）が、疲労状態の対照体における発現量（ｂ）及び／又は非疲労の状態の健常対照体における発現量（ａ）のどちらに近いかに基づいて行われ、疲労状態の対照体に近い発現量の場合に、被験体は疲労の状態であると判定し、その発現変動量又は発現変動率を疲労の程度とすることができる。
また、被験体由来の生体試料における遺伝子の発現変動量Ｆ又は発現変動率Ｆ（％）が、疲労状態の対照体及び／又は非疲労の状態の健常対照体における発現変動量又は発現変動率のどちらに近いかに基づいて行われ、疲労状態の対照体における発現変動量Ｂ又は発現変動率Ｂ（％）に近い場合に、被験体は疲労の状態であると判定し、疲労状態の対照体における発現変動量又は発現変動率に対する割合を疲労の程度Ｆとすることができる。
疲労の程度Ｆ  ＝[発現変動量Ｆ／発現変動量Ｂ]×１００
及び／又は
疲労の程度Ｆ  ＝[発現変動率Ｆ／発現変動率Ｂ]×１００
【００８０】
また、被験体由来の生体試料における２個以上の遺伝子の発現変動量又は発現変動率の平均値又は中央値が、疲労状態の対照体及び／又は非疲労の状態の健常対照体における発現変動量又は発現変動率の平均値又は中央値のどちらに近いかに基づいて行われ、疲労状態の対照体における２個以上の当該遺伝子の発現変動量又は発現変動率の平均値及び／又は中央値に近い場合に、被験体は疲労の状態であると判定し、その発現変動量又は発現変動率の平均値又は中央値の占める割合を疲労の程度とすることができる。
【００８１】
また、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子又はそれらのホモログ遺伝子より選ばれる２個以上の特定の遺伝子について、少なくとも２個以上の当該遺伝子のうち発現変動量又は発現変動率が異なる遺伝子の数を分析及び／又は比較してもよい。
【００８２】
これらによると、特定の遺伝子の発現変動量又は発現変動率が増加している程、疲労の程度は増加していると判定することができる。
【００８３】
疲労の程度が異なる状態における各遺伝子の発現量、発現変動量、発現変動率など又はその特徴から、前もって作成した疲労の程度を判定できる資料（データベース）を作成することにより、被験体の各遺伝子の発現量など又はその特徴を上記資料と比較して、疲労の程度を簡易に判定することも可能である。
【００８４】
「疲労の程度を判定できる資料」を作成する方法としては、例えば、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子又はそれらのホモログ遺伝子より選ばれる１個以上の特定の遺伝子において、
（ａ）非疲労の状態の健常対照体由来の生体試料における遺伝子の発現量（ａ）を測定する工程、
（ｂ）疲労を呈している被験体由来の生体試料における遺伝子の発現量（ｂ）を測定する工程、
（ｃ）疲労における発現量の差（発現変動量Ｂ＝発現量（ｂ）−発現量（ａ））を算出する工程、
（ｄ）疲労における発現変動の比率（発現変動率Ｂ（％）＝[発現変動量Ｂ／発現量（ａ）]×１００（％））を算出する工程、
（ｅ）発現変動量Ｂ及び／又発現変動率Ｂ（％）をそれぞれ“疲労の程度１００”と変換する工程、及び、
（ｆ）疲労の程度が未知の被験体由来の生体試料における発現量（ｆ）と非疲労の状態の健常対照体における発現量（ａ）との差（発現変動量Ｆ＝発現量（ｆ）−発現量（ａ））及び／又は発現変動の比率（発現変動率Ｆ（％）＝[発現変動量Ｆ／発現量（ａ）]×１００（％））を算出し、次のいずれかの式より疲労の程度を判定する工程、及び、
式１：  疲労の程度  ＝[発現変動量Ｆ／発現変動量Ｂ]×１００
式２：  疲労の程度  ＝[発現変動率Ｆ／発現変動率Ｂ]×１００
（ｇ）疲労の程度が、０に近似している場合に“非疲労の状態である”と判定し、１００に近似している場合に“被験体は疲労の状態である”と判定する工程、
より、作成する方法がある。
【００８５】
この方法によれば、非疲労の状態の被験体由来の生体試料を用いて疲労の程度を判定した場合には“疲労の程度０”に近似の判定となりやすく、疲労困憊の状態の被験体の生体試料を用いて疲労の程度を判定した場合には“疲労の程度１００” に近似の判定となりやすい。
【００８６】
また、発現量や発現変動量が異なる２個以上の遺伝子を組み合わせて、当該遺伝子における“発現変動量”や“発現変動率”を算出し、当該遺伝子の“発現変動量”や“発現変動率”の平均値又は中央値などを算出することによっても、多段階で疲労の程度を判定することが可能となる。
【００８７】
従って、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子又はそれらのホモログ遺伝子より選ばれる１個以上の特定の遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較することにより、多段階で疲労の程度を判定することが可能であり、疲労の程度が未知の被験体における発現変動量などが、疲労の程度１００に相当する発現変動量などの５０％であった場合に、被験体は“疲労の程度５０”と判定し、疲労の程度１００に相当する発現変動量などの１５０％であった場合に、被験体は“疲労の程度１５０”と判定することが可能となる。
さらには、例えば、“疲労の程度５０”以上と判定された被験体においては休息の確保、栄養補給や摂取を適切に行うことを選択したり、“疲労の程度７５”以上と判定された被験体においては医薬品投与を適切に行うことを選択することなどが可能となり、疲労の回復、改善及び予防が容易に可能となる。
疲労の程度を判定する基準となる発現変動量及び／又は発現変動率は、適宜増減することもできる。
【００８８】
また、本発明にかかる疲労の程度の判定方法の一部あるいは全部をコンピューター等の従来公知の演算装置（情報処置装置）を利用して用いることも可能であることは、当業者には明らかである。
本発明にかかる疲労の程度の判定方法は、血液などの生体試料における遺伝子の発現量を測定する工程と、生体試料における遺伝子の発現量の測定結果に応じて、発現変動量や発現変動率の算出による被験体の疲労の程度を判定する工程とを含むが、特に発現変動量や発現変動率の算出による被験体の疲労の程度を判定する工程に演算装置を利用することができる。
【００８９】
＜被験物質の疲労に対する有効性の判定方法＞
本発明によれば、被験体に被験物質を投与し、被験体由来の生体試料における表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較し、被験物質を投与した被験体の疲労の程度の判定をすることによって、当該被験物質の疲労に対する有効性（効果）を判定することができる。
【００９０】
本発明における「被験物質」とは、本発明の方法を用いて被験体の疲労を回復、改善又は予防し得るか否かを評価するために用いる物質を意味し、ヒトを含む哺乳動物に投与可能な物質であれば特に限定されず、微生物、動物、植物などの天然成分、有機化合物、ビタミン類、アミノ酸類、ミネラル類、脂質類、糖質類、タンパク質類、核酸類などを挙げることができる。
【００９１】
被験物質の疲労に対する有効性を判定する方法としては、疲労の状態である被験体において、被験物質の投与前と投与後における特定の遺伝子の発現量を比較し、被験物質を投与した前後の発現量の変動（発現変動量又は発現変動率など）が、疲労の状態における特定の遺伝子の発現量の変動などより減弱又は消失している場合に、被験物質は疲労に対して有効であると判定することができる。
【００９２】
また、被験物質を投与する前に、疲労の状態とする被験体を被験物質投与群と被験物質非投与群に分け、これらの群における特定の遺伝子の発現量の変動（発現変動量又は発現変動率など）を比較し、被験物質を投与した群の発現量の変動などが、被験物質を投与しなかった群の発現量の変動などより減弱又は消失している場合に、被験物質は疲労に対して有効であると判定してもよい。なお、被験物質投与群においては、複数の投与用量又は複数の被験物質の疲労に対する有効性を判定するために、群の数を適宜増減してもよい。
【００９３】
被験物質の疲労に対する有効性の判定を身体作業や精神作業による生体への負荷と組み合わせて行う場合、被験物質の投与の時期は、被験物質の特性に応じて、身体作業や精神作業の負荷の前でも後でもよく、前後でもよく、投与の時期は特に限定されない。
【００９４】
本発明による被験物質の疲労に対する有効性を判定する方法についての具体的な態様を以下に示すが、本発明の方法はこれらに限定されるものではない。
【００９５】
（第一の態様）
（i）疲労の状態である被験体に被験物質又はこれを含む製剤を投与し、投与後の当該被験体の生体試料における表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動量Ｆ又は発現変動率Ｆ（％）を解析する工程、
（ii）疲労の状態である被験体に被験物質又はこれを含む製剤を投与せず、当該被験体の生体試料における上記と同一の１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動量Ｂ又は発現変動率Ｂ（％）を解析する工程、
（iii）工程（i）における遺伝子の発現変動量Ｆ又は発現変動率Ｆ（％）が、工程（ii）における遺伝子の発現変動量Ｂ又は発現変動率Ｂ（％）などより減弱又は消失している場合に、被験物質又はこれを含む製剤を投与した被験体の疲労の程度が減弱又は消失していると判定する工程、及び
（iv）工程（iii）において、被験物質又はこれを含む製剤を投与した被験体の疲労の程度は減弱又は消失していると判定した場合に、被験物質又はこれを含む製剤は疲労に対して有効であると判定する工程、
を含む、被験物質の疲労に対する有効性を判定する方法。
ここで、工程（i）と工程（ii）における疲労状態の被験体は同一の個体であっても、別々の個体であってもよい。
【００９６】
また、発現量、発現変動量又は発現変動率が異なる２個以上の遺伝子を組み合わせて、各遺伝子における“発現変動量”や“発現変動率”を算出し、それら２個以上の遺伝子の“発現変動率”などから“疲労の程度”を算出することによっても、被験物質の疲労に対する有効性を判定することが可能である。
具体的な態様を以下に示す。
【００９７】
（第二の態様）
（i）疲労の状態である被験体に被験物質又はこれを含む製剤を投与し、投与後の当該被験体の生体試料における、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる２個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動量Ｆ又は発現変動率Ｆ（％）を解析する工程、
（ii）疲労の状態である被験体に被験物質又はこれを含む製剤を投与せず、当該被験体の生体試料における上記と同一の２個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動量Ｂ又は発現変動率Ｂ（％）を解析する工程、
（iii）工程（i）における発現変動率Ｆ（％）などが、工程（ii）におけるにおける発現変動率Ｂ（％）などより減弱又は消失している場合に、被験物質又はこれを含む製剤を投与した被験体の疲労の程度が減弱又は消失していると判定する工程、及び
（iv）工程（iii）において、被験物質又はこれを含む製剤を投与した被験体の疲労の程度は減弱又は消失していると判定した場合に、被験物質又はこれを含む製剤は疲労に対して有効であると判定する工程、
を含む、被験物質の疲労に対する有効性を判定する方法。
ここで、工程（i）と工程（ii）における疲労状態の被験体は同一の個体であっても、別々の個体であってもよい。
【００９８】
この方法によれば、疲労に対する有効性（効果）が高い被験物質を投与した疲労状態の被験体由来の生体試料を用いて疲労の程度を判定した場合には、例えば、“疲労の程度７５”以下、さらには“疲労の程度５０”以下の判定となり、疲労を増悪させる被験物質を投与した疲労状態の被験体由来の生体試料を用いて疲労の程度を判定した場合には“疲労の程度１５０”以上の判定となりやすい。
疲労に対する有効性を判定する基準となる疲労の程度は、適宜増減することもできる。
【００９９】
従って、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子又はそれらのホモログ遺伝子より選ばれる１個以上の特定の遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較することにより、多段階で被験物質の疲労に対する有効性を判定することが可能となる。
【０１００】
＜疲労を回復、改善又は予防し得る物質又はこれを含む製剤の探索方法＞
本発明においては、被験体に被験物質を投与し、被験体由来の生体試料における表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較し、当該遺伝子の発現を変動させる物質を、疲労を回復、改善又は予防し得る候補物質として選択することによって、疲労を回復、改善又は予防し得る物質を探索することができる。
【０１０１】
表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子の発現変動を解析するためには、これらの遺伝子を発現変動させることが望ましく、“疲労の状態における特定の遺伝子の発現量の特徴”と類似させるための処置を施すことがより望ましい。
【０１０２】
ヒト又は非ヒト哺乳動物における遺伝子の発現変動させる処置としては、例えば、走行、遊泳、跳躍などの運動を持続的又は繰り返し身体に負荷させることにより疲労を惹起し得る方法や随意収縮及び電気刺激により筋疲労を惹起し得る方法などが挙げられる。
【０１０３】
細胞の遺伝子を発現変動させる処置としては、疲労における生物学的メカニズムと類似の処理、例えば、低酸素、低糖、低アミノ酸などの条件での培養、過酸化物又はラジカル発生剤の添加、ＵＶ照射、薬剤の添加、ウイルス感染、電気刺激などの方法が挙げられる。
【０１０４】
ヒト又は非ヒト哺乳動物への被験物質の投与は、経口投与又は非経口投与のいずれでもよく、投与時期は、遺伝子の発現量などを変動させる処置の前でも後でもよく、前後に投与してもよい。細胞培養培地への被験物質の添加においても、遺伝子の発現量を変動させる処置の前でも後でもよく、前後に添加してもよい。
【０１０５】
疲労の程度を判定できる資料を用いて疲労を回復、改善又は予防し得る物質又はこれを含む製剤の探索をすることも可能である。
この方法によれば、疲労に対して有効である被験物質を投与した疲労状態の被験体由来の生体試料を用いて疲労の程度を判定した場合には、例えば、被験体は“疲労の程度７５”以下、さらには、“疲労の程度５０”以下の判定となりやすく、疲労を増悪させる被験物質を投与した疲労状態の被験体由来の生体試料を用いて疲労の程度を判定した場合には、被験体は“疲労の程度１５０”以上の判定となりやすい。
【０１０６】
また、発現量、発現変動量又は発現変動率が異なる２個以上の遺伝子を組み合わせて、各遺伝子における“疲労の程度”を算出し、それら２個以上の遺伝子の“疲労の程度”の平均値又は中央値などを算出することによっても、被験物質などを選択することが可能である。
【０１０７】
上記の手法により、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子又はそれらのホモログ遺伝子より選ばれる１個以上の特定の遺伝子の発現量の変動を減弱又は消失させる被験物質を選択することにより、疲労を回復、改善又は予防し得る物質又はこれを含む製剤を選択ことが可能となる。
【０１０８】
＜疲労判定試薬及び疲労判定キット＞
本発明によれば、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較するための疲労判定試薬又は疲労判定キットが提供される。本発明の疲労判定試薬又は疲労判定キットには、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の遺伝子産物に特異的なプローブ又はプライマー、又は上記遺伝子の遺伝子産物に特異的な抗体が含まれている。本発明の疲労判定試薬又は疲労判定キットには、更に所望により、標識、標識二次抗体、担体、サンプル希釈液、酵素基質、反応停止液、標準物質、遺伝子の発現量、発現変動、発現変動量、発現変動率や特徴などから疲労の程度を判定するための資料などを含めてもよい。さらに必要に応じて、洗浄バッファー、保存剤、防腐剤などを加えることもできる。本発明の疲労判定試薬又は疲労判定キットに含まれるプライマー、プローブ、抗体などは、１種のみでもよいし、２種以上を組み合わせてもよい。これらは、固体でも液体でもよく、単一又複数の固相上に固定されているもの、例えば、マイクロタイタープレートのようなプレートに個別に分注された状態となっていてもよいし、アレイ・チップに固定された状態でもよい。
【０１０９】
本発明にかかる疲労判定キットは、被験体の血液などの生体試料を採取するための手段を含んでいてもよい。また、疲労判定キットの包装材に付されたラベル又は添付された文書に、生体試料における遺伝子の発現変動を指標として被験体の疲労の程度を判定するために使用できることを表示していてもよい。さらに、本発明にかかる疲労判定キットは、コンピューターなどの従来公知の演算装置を用いてなるキットとなっていてもよい。
【０１１０】
＜疲労のバイオマーカー＞
本発明においては、疲労の程度が未知の被験体由来の生体試料において、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を解析することにより、被験体の疲労の程度を判定できる。従って、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子、及びその遺伝子産物は、疲労のバイオマーカー（生物学的指標）として用いることができる。
【０１１１】
「バイオマーカー」とは、例えば、通常の生物学的過程、病理学的過程、もしくは治療介入に対する薬理学的応答の指標として、客観的に測定され評価される特性である。すなわち、正常なプロセスや病的プロセス、あるいは治療に対する薬理学的な反応の指標として客観的に測定・評価される項目であり、治癒の程度を特徴づけるバイオマーカーは新薬の臨床試験での有効性を確認するためのサロゲートマーカーとして使われる項目である。バイオマーカーは、疾患にかかった後の治療効果の判定だけでなく、疾患を未然に防ぐための日常的な指標として疾患の予防にも用いることができる。また、一般的に、ゲノムバイオマーカーとは、正常な生物学的過程、発病過程、及び／又は治療介入等への反応を示す指標となる、ＤＮＡもしくはＲＮＡの測定可能な特性である。ゲノムバイオマーカーは、例えば、遺伝子の発現、遺伝子の機能、遺伝子の制御により測定され、１つ又は複数の特性から構成され得る。ＲＮＡの特性としては、ＲＮＡ配列、ＲＮＡ発現量、ＲＮＡプロセシング、マイクロＲＮＡが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１２】
従って、疲労の状態の被験体と非疲労の状態の健常対照体との比較において発現量などが著しく異なっている遺伝子、疲労の形成又は回復過程において発現量などが著しく異なっている遺伝子は、疲労の治療標的候補遺伝子として同定することもできる。
【０１１３】
以下の実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【０１１４】
試験例１：遺伝子リスト作成及び疲労の程度の判定方法の開発
（方法）
実験動物には、７から１１週齢のＢＡＬＢ／ｃ系マウス、オス（日本エスエルシー（株））を用いた。実験動物は入荷後、試験期間を通して標準飼料（オリエンタル酵母工業（株））及び滅菌水を自由に摂取させ、少なくとも１週間の馴化を行った。試験には、非疲労状態である健常マウスを１６匹使用した。遺伝子リストの作成及び疲労の程度の判定方法の開発は、（１）走行運動の負荷、（２）採血、（３）ｍＲＮＡの抽出、（４）遺伝子の発現量の解析、及び（５）遺伝子リストの作成、の工程よりなる。遺伝子リストは、アレイ・チップを用いた遺伝子の発現量の解析によって作製した。
【０１１５】
（１）走行運動の負荷
実験群は、非走行運動負荷マウス（４匹）、走行運動負荷終了１時間後マウス（４匹）、走行運動負荷終了４時間後マウス（４匹）及び走行運動負荷終了翌日マウス（４匹）とし、非走行運動負荷マウス以外のマウスに走行運動を負荷した。走行運動の負荷は、マウス・ラット用トレッドミル走行装置（室町機械（株）又はバイオリサーチセンター（株））を用いて行った。走行運動の負荷条件は、傾斜角度１０度、走行開始速度９メートル／分、漸増ステップ３メートル／４分とした。  走行時間は、疲労困憊の状態である、５２分間とした。尚、走行訓練を３から４日間隔で４回実施し、疲労を惹起させる走行運動の負荷は最終走行訓練の３から４日後に実施した。走行訓練は全てのマウスに行った。
【０１１６】
（２）採血
走行運動負荷したマウスからの採血は、走行運動負荷終了から１時間後、４時間後、翌日にイソフルランにより無痛状態とし、腹部大静脈より採血して安楽死させた。
血液には速やかに、Ｉｓｏｇｅｎ−ＬＳ（ニッポンジーン社）を添加して溶解及び安定化した後に、液体窒素により凍結し、ＲＮＡ抽出に供した。
非走行運動負荷マウスは運動負荷をすることなく、同様の処置により安楽死させ、同様の方法を行った。
【０１１７】
（３）ｍＲＮＡの抽出
溶解及び安定化された状態の血液サンプル２ｍｌを用いて精製を行った。血液サンプル２ｍｌに対し、クロロホルム４００μｌを加えて、十分ボルテックスし、遠心の後、水層８００から１０００μｌをＲＮＡ粗抽出液として回収した。得られたＲＮＡ粗抽出液をＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ中のＣｏｌｕｍｎに流し入れ、ＲＮＡを吸着させた。洗浄後６０μｌのヌクレアーゼ不含水（ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）に溶解させた。ＲＮＡを含むヌクレアーゼ不含水１μｌを、ＮＤ−１０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いてＲＮＡの定量及び純度指標による品質確認を行った。ＲＮＡを含むヌクレアーゼ不含水１μｌを常法によりＲＮＡを変性後、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００ （Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて電気泳動し、分解度指標による品質確認を行った。その後、５μｇの抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡから、ＧＬＯＢＩ  ＮｃｌｅａｒＴＭ−Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、同キットの規定プロトコールに従って、血液中に大量に含まれるグロビンｍＲＮＡの除去処理を行い、３０μｌのＫｉｔ付属Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒに溶解させた。ＲＮＡを含むＫｉｔ付属Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ１μｌを、ＮＤ―１０００  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いてＲＮＡの定量及び純度指標による品質確認を行った。ＲＮＡを含むＫｉｔ付属Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ  １μｌを常法によりＲＮＡを変性後、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００ （Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて電気泳動し、分解度指標による品質確認を行った。
【０１１８】
（４）Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅ １．０ ＳＴ Ａｒｒａｙを用いた遺伝子の発現量の解析
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社において作製されたゲノム上の既知、及び想定される２８８５３個の遺伝子について２５ｍｅｒ×７７０３１７個の対象と完全一致するオリゴヌクレオチド・プローブ（パーフェクトマッチプローブ）が搭載されたＤＮＡマイクロアレイ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅ １．０ ＳＴ Ａｒｒａｙ）を用い、遺伝子発現量の解析を行った。
【０１１９】
具体的には、次の手順で行った。ＷＴ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用い、プロトコールに従って、２５０ｎｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡより、ａｎｔｉ―ｓｅｎｓｅ鎖ｃＲＮＡの合成を介して、ｓｅｎｓｅ 鎖ｃＤＮＡを合成した。その後、ＷＴ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いて、合成したｃＤＮＡを断片化し、その５’末端にビオチンラベルを行った。中途産物であるｃＲＮＡを常法により変性、断片化前のｃＤＮＡ，及び断片化後のｃＤＮＡ、１００から３７５ｎｇをＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００を用いて電気泳動し、品質確認を行った。５μｇの断片化ビオチンラベルｃＤＮＡを、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗａｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用い、プロトコールに従って、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ａｒｒａｙへハイブリダイズさせるハイブリカクテルを調製した。ハイブリカクテルを、まず９９℃で５分間ヒートブロックを用いてインキュベーションし、続けて４５℃で５分間ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｏｖｅｎ ６４０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いてインキュベーションし、微量高速遠心機で室温、２０，４００ × Ｇ、1分間遠心した。ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ａｒｒａｙへハイブリカクテル８０μｌを注入し、４５℃で１７時間、毎分６０回転で、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｏｖｅｎ ６４０内で、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション完了後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗａｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔａｉｎ  ＫｉｔとＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓａｔａｔｉｏｎ  ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用い、システム制御ソフトウェア  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｃｏｍｍａｎｄ Ｃｏｎｓｏｌｅ （登録商標）（ＡＧＣＣ） Ｆｌｕｄｉｃｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）上の規定プロトコールに従って、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ａｒｒａｙの染色及び洗浄を行った。ＡＧＣＣ Ｓｃａｎ Ｃｏｎｔｒｏｌに従って、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  ７Ｇ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）によりＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ａｒｒａｙをスキャンし、各遺伝子プローブの蛍光強度を遺伝子発現データのアレイ毎の画像ファイル（ＤＡＴファイル）として取得した。更にＡＧＣＣ Ｖｉｅｗｅｒを用いて、ＤＡＴファイルを数値化可能なＣＥＬファイルへ変換した。
【０１２０】
解析ソフトウェア・Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用い、ＣＥＬファイルから標準化された発現シグナル値の数値データをテキストファイルとして出力した。発現シグナル値の標準化には、本アレイにおけるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社標準のＲＭＡ−ｓｋｅｃｈ法を用いた。
【０１２１】
次に、各アレイの遺伝子発現データについて、対応する走行運動負荷前後のアレイ間で、走行運動負荷後の発現シグナル値を分子としてそれぞれ発現比を求め、走行運動負荷後で発現増加もしくは発現減少と見なすデータを選定した。選定には、増減それぞれの発現変動幅の絶対値を等しくするために、Ｆｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅ比較の方法を採用した。
【０１２２】
上記により選定した遺伝子より、その中で機能的に意味を有する遺伝子名が付与されている遺伝子を選定し、重複を除いた。
【０１２３】
（５）遺伝子リストの作成
試験により選定した、疲労の程度の判定に用いる特定の遺伝子を次に示す。
走行運動負荷１時間後かつ４時間後において、原則として、３５．０％以上増加又は２５．９％以上減少し、翌日に発現変動が消失したマウスの遺伝子は１４６個であり、マウスの遺伝子リストを作成した。遺伝子リストは表２と同じである。
【０１２４】
【表２】
2012205590.tif 000004
【０１２５】
2012205590.tif 000005
【０１２６】
2012205590.tif 000006
【０１２７】
2012205590.tif 000007
【０１２８】
表２に記載の遺伝子において、発現量が増加している遺伝子は１１２個であり、減少している遺伝子は３４個であった。
【０１２９】
表２に記載されているマウスの遺伝子より、マウスとの相同性又は同一性の高いヒトの遺伝子１４８個を選定し、ヒトの遺伝子リストを作成した。遺伝子リストは表３と同じである。表３において、発現が増加している遺伝子としては１０９個であり、減少している遺伝子は３９個であった。
【０１３０】
【表３】
2012205590.tif 000008
【０１３１】
2012205590.tif 000009
【０１３２】
2012205590.tif 000010
【０１３３】
2012205590.tif 000011
【０１３４】
表３の遺伝子より、ＫＥＧＧパスウェイデータベースに収載されているヒトの遺伝子は、ＡＣＥ遺伝子、ＡＣＰ１遺伝子、ＡＣＴＡ２遺伝子、ＡＣＴＧ２遺伝子、ＡＦＭＩＤ遺伝子、ＡＬＯＸ１５遺伝子、ＡＲＧ２遺伝子、ＡＴＰ５Ｌ遺伝子、ＢＬＶＲＢ遺伝子、ＢＳＴ１遺伝子、Ｃ５ＡＲ１遺伝子、ＣＡ２遺伝子、ＣＢＲ１遺伝子、ＣＣＬ５遺伝子、ＣＣＲ１遺伝子、ＣＣＲ３遺伝子、ＣＤ１４遺伝子、ＣＤ３３遺伝子、ＣＨＩ３Ｌ１遺伝子、ＣＸＣＲ１遺伝子、ＣＸＣＲ２遺伝子、Ｆ８遺伝子、ＦＰＲ１遺伝子、ＧＺＭＡ遺伝子、ＨＤＣ遺伝子、ＨＭＢＳ遺伝子、ＨＰＲ遺伝子、ＩＦＩＴＭ１遺伝子、ＩＦＮＡ１遺伝子、ＩＦＮＡ１０遺伝子、ＩＦＮＡ１３遺伝子、ＩＦＮＡ１４遺伝子、ＩＦＮＡ１６遺伝子、ＩＦＮＡ１７遺伝子、ＩＦＮＡ２遺伝子、ＩＦＮＡ２１遺伝子、ＩＦＮＡ４遺伝子、ＩＦＮＡ５遺伝子、ＩＦＮＡ６遺伝子、ＩＦＮＡ７遺伝子、ＩＦＮＡ８遺伝子、ＩＬ１３ＲＡ１遺伝子、ＩＬ１Ｂ遺伝子、ＩＬ１Ｒ２遺伝子、ＩＬ２ＲＢ遺伝子、ＩＳＧ１５遺伝子、ＫＬＲＢ１遺伝子、ＫＬＲＤ１遺伝子、ＫＬＲＫ１遺伝子、ＭＩＴＦ遺伝子、ＮＣＲ１遺伝子、ＯＡＳ３遺伝子、ＯＲ１０Ａ３遺伝子、ＯＲ１０Ａ６遺伝子、ＯＲ５１Ｖ１遺伝子、Ｐ２ＲＹ１３遺伝子、ＰＩＧＹ遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ３Ｄ遺伝子、ＲＡＲＳ遺伝子、Ｓ１ＰＲ５遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＢ１０遺伝子、ＳＯＣＳ３遺伝子、ＴＡＳ２Ｒ６０遺伝子、ＴＫ１遺伝子、ＵＢＥ２Ｆ遺伝子、ＵＰＰ１遺伝子、ＵＲＯＤ遺伝子及びＶＴＩ１Ｂ遺伝子であった。
【０１３５】
また、表３の遺伝子より、原則として、５０．０％以上増加又は３３．３％以上減少した遺伝子は、ＡＲＧ２遺伝子、ＢＬＶＲＢ遺伝子、ＢＲＰ４４遺伝子、Ｃ１９ｏｒｆ５９遺伝子、ＣＣＲ１遺伝子、ＣＣＲＬ２遺伝子、ＣＤ３３遺伝子、ＣＨＩ３Ｌ１遺伝子、ＣＬＥＣ４Ｄ遺伝子、ＣＬＥＣ４Ｅ遺伝子、ＣＳＴＡ遺伝子、ＣＸＣＲ１遺伝子、ＣＸＣＲ２遺伝子、ＣＸＣＲ２Ｐ１遺伝子、ＥＭＲ２遺伝子、ＥＭＲ３遺伝子、ＥＭＲ４Ｐ遺伝子、ＦＰＲ１遺伝子、ＧＰＲ１０９Ａ遺伝子、ＧＰＲ１０９Ｂ遺伝子、ＧＺＭＡ遺伝子、ＨＭＢＳ遺伝子、ＨＰ遺伝子、ＨＰＲ遺伝子、ＩＬ１Ｒ２遺伝子、ＩＲＧ１遺伝子、ＫＬＲＡＰ１遺伝子、ＫＬＲＫ１遺伝子、ＭＭＰ８遺伝子、ＯＸＥＲ１遺伝子、Ｐ２ＲＹ１３遺伝子、ＰＬＩＮ２遺伝子、ＲＡＢ３ＩＬ１遺伝子、Ｓ１００Ａ８遺伝子、ＳＬＦＮ１２遺伝子、ＳＬＦＮ１２Ｌ遺伝子、ＳＰＡＴＣ１遺伝子、ＴＡＲＭ１遺伝子、ＴＡＳ２Ｒ６０遺伝子、ＴＭＯＤ１遺伝子、ＴＲＥＭ１遺伝子、ＴＳＰＯ２遺伝子、ＴＳＴＤ２遺伝子及びＶＴＩ１Ｂ遺伝子であった。
【０１３６】
従って、表３の遺伝子より、原則として、５０．０％以上増加又は３３．３％以上減少し、ＫＥＧＧパスウェイデータベースに収載されているヒトの遺伝子は、ＡＲＧ２遺伝子、ＢＬＶＲＢ遺伝子、ＣＣＲ１遺伝子、ＣＤ３３遺伝子、ＣＨＩ３Ｌ１遺伝子、ＣＸＣＲ１遺伝子、ＣＸＣＲ２遺伝子、ＦＰＲ１遺伝子、ＧＺＭＡ遺伝子、ＨＭＢＳ遺伝子、ＨＰＲ遺伝子、ＩＬ１Ｒ２遺伝子、ＫＬＲＫ１遺伝子、Ｐ２ＲＹ１３遺伝子、ＴＡＳ２Ｒ６０遺伝子又はＶＴＩ１Ｂ遺伝子であった。
【０１３７】
表２又は表３に含まれる遺伝子から選定される特定の遺伝子及びホモログ遺伝子は、運動などの身体作業に伴う、いわゆる肉体疲労に伴って発現量が変動する遺伝子であり、十分な休息や睡眠により発現変動が消失する遺伝子である。これらの遺伝子の発現変動を比較することにより、疲労の程度を客観的に判定できる方法となる。
【０１３８】
試験例２：ＰＣＲ法を用いた、疲労の程度を判定できる遺伝子リストの作成及び疲労の程度が未知の被験体における疲労の程度の判定
（方法）
表２に記載の遺伝子及び機能解析により選ばれる特定の遺伝子からなる遺伝子リストを作成し、疲労の程度が未知のマウス由来の末梢血液における遺伝子の発現変動量を分析及び比較し、“発現変動率”から“疲労の程度”を算出することによって、疲労の程度が未知の被験体（マウス）の疲労の程度を判定した。
【０１３９】
新たに作成した遺伝子リストに記載されているマウスの遺伝子４２個は表５と同じである。また、表５に記載されているマウスの遺伝子より、マウスとの相同性又は同一性の高いヒトの遺伝子リストを作成した。ヒトの遺伝子リストに記載されているヒトの遺伝子５３個は表６と同じである。
【０１４０】
実験動物には、７から１１週齢のＢＡＬＢ／ｃ系マウス、オス（日本エスエルシー（株））（１２匹）を用いた。実験動物は入荷後、試験期間を通して標準飼料（オリエンタル酵母工業（株））及び滅菌水を自由に摂取させ、少なくとも１週間の馴化を行った。
疲労の程度を判定できる遺伝子リストの作成及び疲労の程度が未知の被験体における疲労の程度の判定は、（１）疲労困憊の状態である疲労動物モデル及び疲労の程度が未知の疲労動物モデルの作製、（２）動物からの血液の採取、（３）血液からの遺伝子産物（ＲＮＡ）の抽出、（４）遺伝子産物の発現量の解析、（５）疲労の程度を判定できる資料（データベース）の作成、及び（６）疲労の程度が未知の疲労動物モデルの疲労の程度の判定、の工程よりなる。
【０１４１】
（１）疲労困憊の状態である疲労動物モデル及び疲労の程度が未知の疲労動物モデルの作製
実験群は、非走行運動負荷マウス（４匹）、走行運動負荷終了２時間後マウス（４匹）及び軽度走行運動負荷終了２時間後マウス（４匹）とし、非走行運動負荷マウス以外のマウスに走行運動を負荷した。
走行運動の負荷は、マウス・ラット用トレッドミル走行装置（バイオリサーチセンター（株））を用いて行い、走行運動の負荷条件は、傾斜角度１０度、走行開始速度９メートル／分、漸増ステップ３メートル／４分とした。
走行運動負荷終了２時間後マウスの走行時間は、疲労困憊の状態までとした（５２分間）。軽度走行運動負荷終了２時間後マウスの走行時間は２０分間とした。
尚、走行訓練を３から４日間隔で４回実施し、疲労を惹起させる走行運動の負荷は最終走行訓練の３から４日後に実施した。走行訓練は全てのマウスに行った。
【０１４２】
（２）動物からの血液の採取
走行運動負荷終了２時間後マウス及び軽度走行運動負荷終了２時間後マウスは、それぞれ走行運動負荷の２時間後に深麻酔条件にて安楽死させ、腹部大静脈より血液を１ｍｌ採取し、ヌクレアーゼ不含水１ｍｌを添加し、Ｉｓｏｇｅｎ−ＬＳ(ニッポンジーン社)２ｍｌを添加し、血液を溶解した。
非走行運動負荷マウスは走行運動負荷をすることなく安楽死させ、同様の方法を行った。
【０１４３】
（３）血液からの遺伝子産物（ＲＮＡ）の抽出
Ｉｓｏｇｅｎ−ＬＳからの溶解されたＲＮＡの粗抽出は、同試薬のプロトコールに従って実施した。粗抽出されたＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてカラム精製を行った。カラム精製後のＴＯＴＡＬ ＲＮＡに対して一旦定量とクオリティチェックを行った後、必要十分量のＲＮＡから、血液に大量に含まれており、発現解析の妨げとなるグロビンｍＲＮＡの除去処理を行った後、再度、定量とクオリティチェックを実施し、問題のないことを確認した。グロビンｍＲＮＡ除去処理にはＧＬＯＢＩ  Ｎｃｌｅａｒ-Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ (Ａｍｂｉｏｎ社)を用いた。さらに、ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用しｔｏｔａｌ  ＲＮＡの濃度を測定する。その後Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で電気泳動を行いｔｏｔａｌ  ＲＮＡのＲＩＮ値を測定し、問題のないことを確認した。
【０１４４】
（４）遺伝子産物の発現量の解析
逆転写反応液を調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、ＲＮＡの逆転写反応を行った。
次に、ＢｉｏＭａｒｋ ９６．９６  ダイナミックアレイの機器及び試薬添付のプロトコルに従い、Ｓａｍｐｌｅ  ｉｎｌｅｔｓにＳａｍｐｌｅ  ｍｉｘを、Ａｓｓａｙ  ｉｎｌｅｔｓにＡｓｓａｙ  ｍｉｘをアプライし、ＢｉｏＭａｒｋによりリアルタイムＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応回数は最大３５サイクルとした。測定の反復回数は３回とした。
上記試験において使用した４２個の各遺伝子に対応するプライマーの配列は表４に示すとおりである（配列表の配列番号１から８４）。
【０１４５】
【表４】
2012205590.tif 000012
【０１４６】
リアルタイムＰＣＲにより得られた一定の増幅産物量になるサイクル数（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ値：Ｃｔ値）から、β―アクチン（Ａｃｔｂ）遺伝子を内部標準遺伝子とした時の相対値を遺伝子毎にΔΔＣｔ法により算出し、非走行運動負荷マウスと走行運動負荷終了２時間後マウスを比較した。尚、必要に応じて、プレアプリケーションを行った。
【０１４７】
（５）疲労の程度を判定できる資料（データベース）の作成
非走行運動負荷マウスにおける各遺伝子の発現量（ａ）及び走行運動負荷終了２時間後マウスの発現量（ｂ）を算出し、各発現量の差（発現変動量Ｂ）、及びその比率（発現変動率Ｂ（％））を算出した。次に、発現変動量Ｂ及び又は発現変動率Ｂ（％）を “疲労の程度１００”と設定した。
発現変動量Ｂ＝発現量（ｂ）−発現量（ａ）
発現変動率Ｂ（％）＝[発現変動量Ｂ／発現量（ａ）]×１００
【０１４８】
これより、疲労の程度が未知のマウスにおける発現量（ｆ）の非走行運動負荷マウスにおける発現量（ａ）との差（発現変動量Ｆ）及びその比率（発現変動率Ｆ（％））を算出し、次の式を用いることにより、疲労の程度を判定できる資料を作成した。
発現変動量Ｆ＝発現量（ｆ）−発現量（ａ）
発現変動率Ｆ（％）＝[発現変動量Ｆ／発現量（ａ）]×１００
疲労の程度＝[発現変動率Ｆ／発現変動率Ｂ]×１００
【０１４９】
（６）疲労の程度が未知の疲労動物モデルの疲労の程度の判定
表５に記載の遺伝子４２個それぞれにおいて、走行運動負荷終了２時間後マウスの発現量を非走行運動負荷マウスにおける遺伝子の発現量と比較すると、３０％以上の増加、又は―６８％以下の減少が認められた。
【０１５０】
【表５】
2012205590.tif 000013
【０１５１】
2012205590.tif 000014
【０１５２】
次に、表５に記載の遺伝子それぞれにおいて、疲労の程度を判定できる資料を用いて、走行運動負荷終了２時間後マウスの疲労の程度を判定すると、疲労の程度の平均値は１８．６であり、最大値は８５．２であった。
【０１５３】
これより、表５に記載の遺伝子より選ばれる１個以上の特定の遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較することによって、軽度走行運動負荷終了２時間後マウスの疲労の程度を判定することができた。
【０１５４】
従って、表５に記載の遺伝子より選ばれる１個の特定の遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較することによっても、２個から４２個の組み合わせにおける特定の遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較することによっても、疲労の程度が未知の被験体の疲労の程度を判定することができた。さらには、疲労の程度を判定することができる遺伝子リストを作成することができた。
【０１５５】
【表６】
2012205590.tif 000015
【０１５６】
2012205590.tif 000016
【０１５７】
以上より、表２、表３、表５又は表６に記載の遺伝子又はそれらのホモログ遺伝子より選ばれる１個の特定の遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較することによっても、２個以上の特定の遺伝子の組み合わせにおける遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較することによっても、被験体由来の血液などの生体試料における遺伝子の発現量を測定し、被験体由来の生体試料を用いた遺伝子の発現量が、疲労状態の対照体及び／又は非疲労の状態の健常対照体における発現量のどちらに近似しているかに基づいて行われ、疲労状態の対照体に近似している場合に疲労の状態であると判定することを特徴とし、著しい疲労の状態における被験体の生体試料から判定した疲労の程度は高値を示し、十分な休息や睡眠を得ることにより疲労が消失している状態における被験体の生体試料から判定した疲労の程度は低値を示し、多段階で疲労の程度を判定することができる方法を提供することが可能となった。
【０１５８】
即ち、疲労の程度の判定に用いる遺伝子リストを作成し、被験体の生体試料を用いて遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較することにより、客観的に疲労の程度を判定することが可能となり、さらには、疲労に対する回復、改善又は予防の有効性（効果）を判定すること、疲労を回復、改善又は予防し得る物質を探索する方法を提供することが可能となった。
【０１５９】
本発明にかかる疲労の程度の判定方法は、バイオマーカーやサロゲートマーカーに利用することができる。
【０１６０】
本発明を利用することにより、疲労感に頼ることなく、日常生活における生理的疲労、末梢性疲労、特に肉体疲労の程度を客観的に判定することが可能になる。さらには、睡眠や休息の確保、栄養補給や摂取、医薬品投与を適切に行うことを可能とし、疲労の回復、改善及び予防が容易に可能となり、国民の健康維持・増進に大きく寄与する分野に利用が可能である。
【０１６１】
以上より、疲労の程度の判定に用いる遺伝子リストを作成し、遺伝子の発現変動を分析及び／又は比較することにより、疲労の程度を判定することが可能となり、さらには、疲労に対する回復、改善又は予防の有効性（効果）を判定すること、疲労を回復、改善又は予防し得る物質を探索する方法を提供することが可能となった。
【配列表】
2012205590000001.app