(57)【要約】【課題】アマノリ類の鉄欠乏状態の検出方法を提供する。【解決手段】ＦＴＲ１遺伝子を分子マーカーとして使用する、アマノリ類の鉄欠乏状態の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＴＲ１遺伝子を分子マーカーとして使用する、アマノリ類の鉄欠乏状態の検出方法。
【請求項２】
アマノリ類のＦＴＲ１遺伝子の発現量を定量する、アマノリ類の鉄欠乏状態の検出方法。
【請求項３】
アマノリ類のＦＴＲ１遺伝子の発現量を定量し、
前記発現量と、鉄欠乏状態でない同種アマノリ類のＦＴＲ１遺伝子の発現量とを対比する、請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
アマノリ類のＦＴＲ１遺伝子の発現量を経時的に定量し、
異なる時点におけるＦＴＲ１遺伝子の発現量どうしを対比する、請求項２に記載の検出方法。
【請求項５】
リアルタイムＰＣＲ法によって遺伝子の発現量を定量する、請求項２〜４のいずれかに記載の検出方法。
【請求項６】
ＦＴＲ１遺伝子の、アマノリ類の鉄欠乏状態を検出するための分子マーカーとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アマノリ類の鉄欠乏状態の検出方法に関する。より詳細には、本発明は、ＦＴＲ１遺伝子を分子マーカーとして使用する、アマノリ類の鉄欠乏状態の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
江戸時代中期に東京湾で始まったとされる海苔養殖は、人工採苗、海苔網の冷凍保存、浮き流し養殖等の養殖技術の導入により飛躍的に発展し、今日においては国内各地で行われ、わが国の水産養殖業において重要な地位を占めている。
【０００３】
現在主流となっているスサビノリ（黒のり）の養殖では、浅場の海面上に展張された海苔網に海苔の胞子を付着させ、幼芽を経て成芽になるまで育苗・育成し、成芽が適当な大きさまで成長した段階で収穫するが、近年になって、スサビノリ葉状体の色が褐色或いは黄色味を帯びることを主徴とする、いわゆる「色落ち」と呼ばれる現象が頻発するようになってきた。
【０００４】
色は海苔の品質を決める重要な要素であり、乾燥した状態で深い黒色でなければ高級品とは評価されない。そのため、色落ちした海苔（色落ち海苔）は商品価値を減失し、いわゆる「札なし海苔」（入札会において値がつかなかったもの）として廃棄されることも多く、経済的損失が大きい。
【０００５】
このような海苔の色落ちは、海苔の生育に必要な海水中の溶存無機態窒素（ＤＩＮ）または溶存無機態リン（ＤＩＰ）の含有量の異常な低下が原因であるとされている。
【０００６】
ところが、最近になって、海苔の色落ちは、ＤＩＮまたはＤＩＰの含有量の低下によるものだけではなく、微量必須元素である鉄が欠乏することによっても発生する場合があることが知られるようになった（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】張経華、外６名，「有明海のノリの色落ちと微量元素欠乏−特に鉄欠乏について」，日本海水学会誌，日本海水学会，平成２１年６月１日，第６３巻，第３号，ｐ．１５８−１６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、通常、海水中の溶存鉄濃度は、数ｐｐｂであることから、鉄欠乏状態と鉄欠乏状態でない場合とを有意に区別することが困難である。
また、細胞内に鉄を貯蔵している場合には、海水中の溶存鉄の減少が、直ちに色落ちに結び付くわけではない。
【０００９】
そこで、本発明は、アマノリ類の鉄欠乏状態を検出するための方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鉄欠乏ストレス下のアマノリ類において発現が亢進する遺伝子に着目し、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、鉄欠乏状態において、ＦＴＲ１遺伝子の発現量が有意に増加することを知見し、ＦＴＲ１遺伝子を分子マーカーとして使用すると、アマノリ類の鉄欠乏状態を検出することができることを知得し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下に掲げる（１）〜（６）を提供する。
【００１１】
（１）ＦＴＲ１遺伝子を分子マーカーとして使用する、アマノリ類の鉄欠乏状態の検出方法。
（２）アマノリ類のＦＴＲ１遺伝子の発現量を定量する、アマノリ類の鉄欠乏状態の検出方法。
（３）アマノリ類のＦＴＲ１遺伝子の発現量を定量し、
前記発現量と、鉄欠乏状態でない同種アマノリ類のＦＴＲ１遺伝子の発現量とを対比する、上記（２）に記載の検出方法。
（４）アマノリ類のＦＴＲ１遺伝子の発現量を経時的に定量し、
異なる時点におけるＦＴＲ１遺伝子の発現量どうしを対比する、上記（２）に記載の検出方法。
（５）リアルタイムＰＣＲ法によって遺伝子の発現量を定量する、上記（２）〜（４）のいずれかに記載の検出方法。
（６）ＦＴＲ１遺伝子の、アマノリ類の鉄欠乏状態を検出するための分子マーカーとしての使用。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、アマノリ類の鉄欠乏状態の検出方法が提供される。
また、本発明のアマノリ類の鉄欠乏状態の検出方法によれば、色落ちが発生する前にアマノリ類の鉄欠乏状態を検出できるため、実際に色落ちが発生する前に、色落ちを防止するための対策をとることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、「ＦＴＲ１遺伝子を分子マーカーとして使用する、アマノリ類の鉄欠乏状態の検出方法。」である。
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１４】
１．アマノリ類
（１）好ましいアマノリ類
アマノリ類は、分類学上Porphyra属に帰属するノリであれば特に限定されず、具体的には、例えば、Porphyra yezoensis Ueda（スサビノリ）、Porphyra tenera Kjellman（アサクサノリ）、Porphyra pseudolinealis Ueda（ウップルイノリ）、Porphyra leucosticta Thuret、Porphyra linearis Greville、Porphyra miniata (C. Agardh) C. Agardh、Porphyra purpurea (Roth) C. Agardh、Porphyra abbottiae V.Krishnamurthy（レッドラバー）およびPorphyra umbilicalis (L.) J. Agardh（ラバー）からなる群から選択されるいずれか１が好ましく、Porphyra yezoensis Ueda（スサビノリ）またはPorphyra tenera Kjellman（アサクサノリ）がより好ましく、Porphyra yezoensis Ueda（スサビノリ）がさらに好ましい。
【００１５】
なお、上位分類群（suprataxa）は下位分類群（infrataxa）のすべてを含むことを確認的に記載する。すなわち、例えば、種は亜種、変種、フォルマ、株その他の種よりも下位の分類群を含む。具体例を挙げれば、Porphyra tenera KjellmanはPorphyra yezoensis var. tamatsuensis A. Miura（オオバアサクサノリ）を含み、Porphyra yezoensis Uedaは Porphyra yezoensis f. narawaensis A. Miura（ナラワスサビノリ）を含む。また、Porphyra yezoensis Uedaというときは、株レベルでは、全ての株、例えば、ＴＵ−１株、Ｕ−５１株等も含む。
【００１６】
また、本発明では、ノリの学名を、著者名を省略して表記することがあり、例えば、Porphyra yezoensisのように、属名および種小名をもって表記する場合がある。さらに、本発明では、学名の発表年の表示を省略している。
【００１７】
（２）スサビノリ
わが国においては、アマノリ類の中でもスサビノリが特に重要であることから、以下に簡単な説明をする。また、全てのアマノリ類の生活環が解明されているわけではないが、以下に記載するスサビノリの生活環と同一または類似しているものと予想されている。
【００１８】
スサビノリ（学名：Porphyra yezoensis Ueda）は、別名クロノリとも呼ばれ、食用海苔（黒のり）の原料として、また、海苔養殖の対象として、わが国の水産養殖業において重要な位置を占める紅藻である。
【００１９】
スサビノリは典型的な異型世代交代を行う。海苔の材料となる葉状体は、１倍体で冬の海で成長するが、春先になると雄細胞や雌細胞が造られ有性生殖が行われる。その結果、２倍体の果胞子が生じ、その発芽により糸状体が成長する。糸状体は、通常貝殻に穿孔して夏を過ごし、秋になると殻胞子嚢を形成して殻胞子を放出する。その分裂により葉状体が新たに生じる（減数分裂がどのステージで行われているのかは確定していない）。
【００２０】
また、以上の一年周期の有性生殖による生活環の他に、無性生殖による短い周期の生活環が知られている。これは葉状体の栄養細胞が単胞子として放出され、それが分裂を繰り返して葉状体に成長するものである。
【００２１】
すなわち、スサビノリの形態形成には３種の胞子が関わっており、単胞子および殻胞子はいずれも葉状体に、果胞子は糸状体に、それぞれ成長する。単胞子および殻胞子は、分裂前の細胞運動（移動）に必要な前後軸の形成と、それに引き続く分裂に必要な上下軸の形成とによって葉状体を形成する。これに対して、果胞子は、成長点の決定と、そこからの細胞伸長とによって糸状体を形成する。このとき、糸状体は陸上植物の花粉管や根毛のように先端成長を行う。
【００２２】
２．ＦＴＲ１遺伝子の分子マーカーとしての使用
本発明では、ＦＴＲ１遺伝子を、鉄欠乏状態を検出するための分子マーカーとして使用する。
【００２３】
（１）ＦＴＲ１遺伝子およびその産物
本発明において、ＦＴＲ１遺伝子は、鉄欠乏ストレスを与えたスサビノリにおいて発現量が増大する遺伝子の一つとして同定された遺伝子である。
ＦＴＲ１遺伝子の最終産物であるＦＴＲ１タンパク質は、相同性検索の結果から、少なくともＦＴＲ１スーパーファミリーに属し、細胞膜貫通型タンパク質の、高親和性鉄パーミアーゼであると推定されている。ただし、この推定に限定されるものではない。
【００２４】
（２）分子マーカーとしての使用
分子マーカーとは、タンパク質、核酸その他の生体分子のうち、正常または異常な機能あるいは病態や疾患の徴候となるものをいう。
【００２５】
本発明において、ＦＴＲ１遺伝子を、鉄欠乏状態を検出するための分子マーカーとして使用するとは、ＦＴＲ１遺伝子の発現量をアマノリ類の鉄欠乏状態の指標とすることをいう。より詳細には、ＦＴＲ１遺伝子の発現量を定量し、その定量結果をアマノリ類の鉄欠乏状態の指標とすることをいう。さらに詳細には、ＦＴＲ１遺伝子の発現量を定量し、その定量結果と、鉄欠乏状態でない同種アマノリ類のＦＴＲ１遺伝子の発現量とを対比して、発現量の増加を鉄欠乏状態の進行の指標とすること、または経時的にＦＴＲ１遺伝子の発現量を定量し、異なる時点での定量結果どうしを対比して、発現量の増加または減少を、鉄欠乏状態の変動の指標とすることをいう。
【００２６】
ＦＴＲ１遺伝子の発現量の定量は、リアルタイムＰＣＲ法、ノーザンブロット法その他の従来公知の方法によって行うことができるが、簡便性および正確性を具備することから、リアルタイムＰＣＲ法、特にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法が好ましい。
【００２７】
本発明において、ＦＴＲ１遺伝子の発現量を定量するためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、アマノリ類のＦＴＲ１遺伝子のｍＲＮＡに特異的なプライマーをデザインし、アマノリ類から抽出・精製したトータルＲＮＡまたは分離・精製したｍＲＮＡをテンプレートとして、リアルタイムＰＣＲ装置を用いて行うことが好ましい。この際、遺伝子発現量の定量は、ハウスキーピング遺伝子、ハウスキーピング遺伝子に存在するイントロン、または恒常的に転写が行われているＤＮＡ領域を内部標準として用いて、組織や細胞の個数をそろえ、反応系へのｃＤＮＡ持込量やＲＴ効率の差を補正し、相対定量とすることが好ましい。
【００２８】
ハウスキーピング遺伝子としては、恒常的に発現している遺伝子または恒常的に転写されているＤＮＡ領域であれば特に限定されず、例えば、１８Ｓ  ｒＲＮＡ等のリボソームＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩラージサブユニット等のＲＮＡ合成酵素、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）等のエネルギー生成系酵素、リボソームタンパク質、アクチン等の細胞骨格タンパク質などの遺伝子、または１８Ｓ−５．８Ｓ−２８ＳリボソームＲＮＡオペロン内のスペーサー領域（ＩＴＳ１、ＩＴＳ２等）などのＤＮＡ領域が挙げられる。
なお、本発明において、遺伝子の発現量とは、転写産物がｍＲＮＡである場合には、ｍＲＮＡ発現量をいい、転写産物がｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ等、ｍＲＮＡ以外の機能性ＲＮＡである場合には、その機能性ＲＮＡをいい、さらに、転写産物が機能性ＲＮＡ前駆体にのみ存在するＲＮＡである場合にはそのＲＮＡをいうものとする。
【００２９】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで使用するプライマーとしては、アマノリ類のＦＴＲ１遺伝子のｍＲＮＡ塩基配列に基いてデザインされた、特異的なプライマーであれば特に限定されないが、例えば、スサビノリのＦＴＲ１遺伝子のｍＲＮＡ全長配列（配列番号１）に基づいてデザインされた、ＦＴＲ１−Ｆ（配列番号２）およびＦＴＲ１−Ｒ(配列番号３)が挙げられる。
【００３０】
内部標準として用いるＩＴＳ１領域のためのプライマーとしては、アマノリ類のＩＴＳ１領域ＤＮＡ塩基配列に基いてデザインされた、特異的なプライマーであれば特に制限されないが、例えば、スサビノリのＩＴＳ１領域ＤＮＡ塩基配列（配列番号４）に基づいてデザインされた、ＩＴＳ１−Ｆ（配列番号５）およびＩＴＳ１−Ｒ（配列番号６）が挙げられる。
【００３１】
（３）発現量の対比
本発明において、発現量の対比とは、立ち上がりのサイクル数（Ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ，Ｃｔ／Ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ，ＣＰ）、すなわちサンプルからの蛍光がバックグラウンドを上回るサイクル数を求めて、比較することをいう。この際、内部標準のＣｔ値を０として補正することが好ましい。
【００３２】
相対定量の方法を簡単にまとめると次のようになる。
・発現量が一定のハウスキーピング遺伝子等（「内部標準」という場合がある。）について、ある決まった量のＲＮＡ溶液をもとにＲＴ−ＰＣＲを行う。そのＣｔ値から検量線をもとにハウスキーピング遺伝子の発現量の定量を行い、あるサンプルを基準とした相対値を求める。これは、サンプル間で使用したＲＮＡ溶液に誤差がどの程度生じているかを示す（誤差が少なければ少ないほど、相対値は１に近づく）。
・次に、調べたいターゲット遺伝子について、上記で使用したのと同じ量のＲＮＡ溶液をもとにＲＴ−ＰＣＲを行う。そのＣｔ値から検量線をもとにターゲット遺伝子の発現量を定量する。
・得られた上記の定量結果を上記で得られた相対値で割り算し、反応に使用したＲＮＡの誤差を補正する。この補正後の定量結果をもとに、サンプル間のターゲット遺伝子の発現相対値を求める。
【００３３】
また、検量線を作成することが不要な比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）によって比較してもよい。
比較Ｃｔ法は、１サイクルの検出の違いで、２倍量の差であるという理論を活用して算出する方法であり、検量線作成が不要なので、多サンプルを処理できるというメリットがある。比較Ｃｔ法では、下記の式に基いて、相対定量を行う。
２−ΔΔＣｔ 
ただし、ΔΔＣｔ法が成立するためには、対象遺伝子と内部標準遺伝子のＰＣＲ効率がほぼ等しいこと、すなわち、希釈によってΔＣｔ値が変動しない＝検量線を描いた時の傾きが同じであること、およびＰＣＲ効率が１に近いこと、すなわち、設計のガイドラインに基づくとＰＣＲ効率の良い短いＰＣＲ産物のサイズで設計ができること、の２つが条件である。
ΔＣｔ法においては、ΔＣｔおよびΔΔＣｔは、下記式によって求めることができる。
ΔＣｔ＝対象遺伝子÷内部標準遺伝子（乗数の割り算は引き算）
∴ΔＣｔ＝対象遺伝子Ｃｔ−内部標準Ｃｔ
ΔΔＣｔ＝各サンプル÷キャリブレータサンプル（乗数の割り算は引き算）
∴ΔΔＣｔ＝各サンプルΔＣｔ−キャリブレータサンプルΔＣｔ
キャリブレータサンプルは刺激前サンプル（例えば、鉄欠乏状態でないもの等）や０時間サンプル（例えば、経時的に測定する場合において、最初に定量したもの等）など相対量の基準にしたいサンプルを1つ設定する。
【００３４】
３．リアルタムＲＴ−ＰＣＲ法による解析の方法
本発明の検出方法の具体的態様として好ましいものを以下に説明するが、これに限定されるわけではなく、従来公知の方法によってＦＴＲ１遺伝子の発現量を定量し、対比することができる。
【００３５】
（１）トータルＲＮＡまたはｍＲＮＡの調製
トータルＲＮＡまたはｍＲＮＡの調製は、従来公知の方法によって抽出・精製を行うことができ、特に限定されない。
【００３６】
トータルＲＮＡの抽出・精製方法としては、ＡＧＰＣ（Acid Guanidinium-Phenol-Chloroform）法、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、各種ＲＮＡ抽出キットを用いる方法等を使用することが好ましい。ＡＧＰＣ法だけでは精製が十分にされていない場合には、さらにグアニジン−塩化セシウム超遠心法を行って、十分に精製をすることが好ましい。
【００３７】
ＡＧＰＣ法は、ＲＮＡを構成するリボースには、ＤＮＡのデオキシリボースに比べて２位の炭素に水酸基が一つ多くあることを利用するものである。酸性下でフェノール処理するとＤＮＡは疎水性にまさるフェノール層に分配されるが、ＲＮＡはリボースの水酸基があるため水相に分配される。
【００３８】
グアニジン−塩化セシウム超遠心法は、ＲＮＡはＤＮＡや蛋白質といった他の生体高分子に比べて浮遊密度が高いことを利用するものである。グアニジンチオシアネートでＲＮａｓｅを失活させた細胞抽出液を高密度の塩化セシウム溶液を用いた密度勾配遠心にかけると、他の細胞成分は途中に浮遊させたままＲＮＡだけをペレットとして回収することが可能である。この方法では、細胞のＲＮＡのうち分子量の小さな５ＳＲＮＡやｔＲＮＡは沈殿しないため、回収できない。
【００３９】
各種ＲＮＡ抽出キットとしては、スピンカラムと抽出試薬とをセットにしたものが挙げられ、具体的には、例えば、ＦａｓｔＰｕｒｅＴＭ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（タカラ社）、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＲＮＡｓｐｉｎ  Ｉｓｏｌａｔiｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社）、ＦａｓｔＲＮＡ  Ｐｒｏ  Ｋｉｔ（キューバイオジーン社）、ＲＮＥａｓｙ  Ｋｉｔシリーズ（キアゲン社）等を用いることができる。
【００４０】
トータルＲＮＡは、特に各種ＲＮＡ抽出キットを用いた場合には、ＤＮａｓｅ処理を行い、残存ＤＮＡを除去しておくことが好ましい。残存ＤＮＡがテンプレートとなって、予期しない増幅産物が得られる事態を回避するためである。
【００４１】
ｍＲＮＡの調製方法としては、トータルＲＮＡから、ｍＲＮＡをＰｏｌｙＡ配列を利用して分離・精製する方法等が挙げられる。この方法を行うためのキットとしては、例えば、ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０  ＜Ｓｕｐｅｒ＞  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラ社）などが挙げられる。
【００４２】
（２）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析は、従来公知の方法によって行うことができ、特に限定されない。
１ステップ法でも、２ステップ法でも、いずれでもよい。
ＰＣＲプライマーとしては、ＦＴＲ１遺伝子のｍＲＮＡ（配列番号１）またはｃＤＮＡ（配列番号８）をテンプレートとして特異的な増幅が可能なものであれば特に制限されない。
本発明においては、ＦＴＲ１遺伝子の発現量の定量には、プライマーの組合せとしては、ＦＴＲ１−Ｆ（配列番号２）およびＦＴＲ１−Ｒ（配列番号３）の組合せを使用することが好ましいが、他のプライマーの組合せを使用することを妨げるものではない。
１ステップ法は１本のチューブ内で逆転写およびＰＣＲを連続的に行うため、取扱いが簡便であるという利点を有する。１ステップ法の場合には、例えば、Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＳＹＢＲ（Ｒ）  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（Ｒ）  ＰＬＵＳ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ  （Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）等を利用してｍＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写と、蛍光標識とＰＣＲ反応とを１本のチューブ内で連続して行うことができる。
２ステップ法は逆転写とＰＣＲ反応との２段階の反応を切り替えて行う必要があるため、簡便性の点では１ステップ法に劣るものの、反応効率が高いという利点を有する。２ステップ法の場合には、例えば、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（Ｒ）  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  （Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）等を利用してｃＤＮＡを調製し、さらにＳＹＢＲ（Ｒ）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ  （Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）を利用して蛍光標識とＰＣＲ反応を行うことができる。
内部標準としては、例えば、ＩＴＳ１領域を利用することが好ましく、その際には、例えば、ＩＴＳ１−Ｆ（配列番号５）およびＩＴＳ１−Ｒ（配列番号６）の組合せを用いることが好ましい。ただし、他のハウスキーピング遺伝子等を内部標準として利用することを妨げるものではない。
ＦＴＲ１遺伝子の発現量の対比は、Ｃｔ値を比較することによって行うことが好ましい。この際、内部標準を０として補正することが好ましい。
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲ装置およびその装置用の解析ソフトウェアを用いることが好ましい。
【００４３】
なお、アマノリ類のＦＴＲ１遺伝子の発現量を定量し、前記発現量と、鉄欠乏状態でない同種アマノリ類のＦＴＲ１遺伝子の発現量とを対比することによって、アマノリ類の鉄欠乏状態を検出する検出方法においては、標的（ターゲット）のアマノリ類および対照（コントロール）のアマノリ類（対象のアマノリ類と同種であり、同一株に由来することが好ましい。）の両方についてリアルタイムＰＣＲ法（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法）による遺伝子発現量の定量を行い、ターゲットとコントロールとの対比を行う。
【００４４】
また、アマノリ類のＦＴＲ１遺伝子の発現量を経時的に定量し、異なる時点におけるＦＴＲ１遺伝子の発現量どうしを対比することによって、アマノリ類の鉄欠乏状態を検出する検出方法においては、標的（ターゲット）のアマノリ類から経時的にサンプルを採取し（実質的に同一株に由来することが好ましい。）、各サンプルについてリアルタイムＰＣＲ法（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法）による遺伝子発現量の定量を行い、各サンプル間で対比を行う。このとき、採取したサンプルはすぐにリアルタイムＰＣＲ解析を行ってもよいが、ＲＮＡの分解を抑制するような方法で保存しておき、後でリアルタイムＰＣＲ解析を行ってもよい。例えば、採取したサンプルを、液体窒素等で凍結後、−８０℃で凍結保存し、サンプル数がある程度まとまってからリアルタイムＰＣＲ解析を行うことができる。
【００４５】
ここで、配列表に記載した配列について簡単に説明する。
配列番号１は、ＦＴＲ１遺伝子のｍＲＮＡ全長配列を示す。
配列番号２は、ＦＴＲ１遺伝子の発現量を定量するためのリアルタイムＰＣＲ用フォワードプライマーの塩基配列を示す。
配列番号３は、ＦＴＲ１遺伝子の発現量を定量するためのリアルタイムＰＣＲ用リバースプライマーの塩基配列を示す。
配列番号４は、スサビノリ（学名：Porphyra yezoensis）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の３’末端から５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子の５’末端までのＤＮＡ領域の塩基配列（アクセッションナンバー：ＡＹ３６８５７５）を示す。
配列番号５は、スサビノリのＩＴＳ１領域の発現量を定量するためのリアルタイムＰＣＲ用フォワードプライマーの塩基配列を示す。
配列番号６は、スサビノリのＩＴＳ１領域の発現量を定量するためのリアルタイムＰＣＲ用リバースプライマーの塩基配列を示す。
配列番号７は、ｃＤＮＡサブトラクション解析によって得られたＦＴＲ１遺伝子のｃＤＮＡ断片の塩基配列を示す。
配列番号８は、ＲＡＣＥ法によって得られたＦＴＲ１遺伝子のｃＤＮＡ全長配列を示す。
配列番号９は、ＦＴＲ１タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００４６】
以下、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明は、これの実施例によって何ら制限されるものではない。
【実施例】
【００４７】
１．材料および方法
（１）材料
材料として、スサビノリ（Porphyra yezoensis TU-1株；北海道大学教授  嵯峨直恆博士からの分譲株である。）を用いた。
（２）方法
（２．１）培養
スサビノリ葉状体をクレモナ糸に付着させた状態で、単胞子により継代培養した。前培養を前培養用培地で約１か月間行い、葉長が約５ｃｍになったスサビノリを本培養用培地に移し、本培養を行った。詳細には以下の通りである。
【００４８】
前培養は、培地として、人工海水シーライフ（マリン・テック社製）に１／１０容量のＥＳＳ２ストック溶液（Kitade et al., 1996, Journal of Phycology, 32: 496-498）を配合したものを使用し（表１）、容器にはプラスチックバッグ（アルガバッグ藻類，共和コンクリート工業社製）を用いて、培地量２Ｌ、温度１５℃、照度３０００ｌｘ、明暗周期１０ｈ／１４ｈ（明／暗）の条件で、人口気象器（ＬＨ−２２０Ｓ，日本医化器械製作所社製）内で約１か月間行った。
【００４９】
【表１】
2012183015.tif 000002
【００５０】
本培養は、前培養で培養したスサビノリを鉄欠乏群（鉄欠乏状態）、窒素欠乏群（窒素欠乏状態）および対照群（必須栄養素の欠乏なし）に分け、鉄欠乏群については、培地として、人工海水シーライフ（マリン・テック社製）に１／１０容量の鉄欠乏ＥＳＳ２ストック溶液（ＥＳＳ２ストック溶液の組成から鉄化合物を除いたもの）を配合したもの（表２の鉄欠乏群）を使用し、窒素欠乏群については、培地として、人工海水シーライフ（マリン・テック社製）に１／１０容量の鉄欠乏ＥＳＳ２ストック溶液（ＥＳＳ２ストック溶液の組成から窒素化合物を除いたもの）を配合したもの（表２の窒素欠乏群）を使用し、対照群については、培地として、人工海水シーライフ（マリン・テック社製）に１／１０容量のＥＳＳ２ストック溶液を配合したもの（表２の対照群）を使用し、容器にはプラスチックバッグ（アルガバッグ藻類，共和コンクリート工業社製）を用いて、培地量２Ｌ、温度１５℃、照度３０００ｌｘ以下、明暗周期１０ｈ／１４ｈ（明／暗）の条件で、人口気象器（ＬＨ−２２０Ｓ，日本医化器械製作所社製）内で３日間行った。
【００５１】
【表２】
2012183015.tif 000003
【００５２】
（２．２）トータルＲＮＡの調製
鉄欠乏群、窒素欠乏群および対照群からのそれぞれのトータルＲＮＡの抽出は、鉄欠乏群および対照群のそれぞれについて、同一容器内で培養した別個体群を１サンプルとして、３連で行った。
培養容器からスサビノリを取り出し、すぐにキムタオルで水分を吸い取り、湿質量を測定した後、ジッパー付のビニール袋に入れて液体窒素で凍結し、凍結したサンプルは−８０℃で凍結保存した。
スサビノリからのトータルＲＮＡの抽出は、凍結したままのサンプルから５０〜９０ｍｇを削りとり、これをＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、同キットに添付のプロトコールに従って行った。
さらに、ＤＮａｓｅ処理を行い、トータルＲＮＡ水溶液中に混在するＤＮＡを分解処理した。
【００５３】
（２．３）リアルタイムＰＣＲによる発現解析
調製したトータルＲＮＡについて、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（Ｒ）  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  （Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを得た。その際、１０μＬの反応系に対し、５００ｎｇとなるようにトータルＲＮＡを添加し、反応条件はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎアッセイの標準プロトコールに従って行った。
リアルタイムＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ロシュ社製）を用いて行った。試薬は、ＳＹＢＲ（Ｒ）  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ  （Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（タカラ社製）を用い、１０μＬ系に対し、０．１μＬのＲＴ反応液を添加した。その他の条件については、同製品の標準プロトコールに準拠した（初期変性：９５℃−３０ｓ，合成反応：９５℃−５ｓ／６０℃−３０ｓ）。
ＰＣＲ用のプライマーは、ＦＴＲ１遺伝子の発現量の定量には、ＦＴＲ１−Ｆ（配列番号２）およびＦＴＲ１−Ｒ（配列番号３）を使用し、ＩＴＳ１領域の発現量の定量には、ＩＴＳ１−Ｆ（配列番号５）およびＩＴＳ１−Ｒ（配列番号６）を使用した。
【００５４】
２．結果および考察
（１）結果
表３に示す結果を得た。表中の値はＣｔ値である。ＩＴＳ１領域についてのＣｔ値が０となるように補正をした。Ｃｔ値が小さいほど遺伝子発現量が多いことを示し、鉄欠乏群において、窒素欠乏群および対照群よりも有意にＦＴＲ１遺伝子発現の増大が認められた。
【００５５】
【表３】
2012183015.tif 000004
【００５６】
（２）考察
ＦＴＲ１遺伝子は、窒素欠乏状態では発現量が増大せず、鉄欠乏状態で発現量が増大することから、スサビノリの色落ちの原因を特定するために有用である。実際に色落ちが発生する前に原因が特定されることによって、より有効な色落ち対策をとれるようになり、海苔養殖における神代な経済的損失の発生を未然に防止することが期待できる。
【００５７】
［参考例１］鉄欠乏状態で発現が増大する遺伝子の探索
以下の手順により、スサビノリにおいて、鉄欠乏状態で発現が増大する遺伝子の探索を行った。
（１）培養
スサビノリ（Porphyra yezoensis TU-1株）をクレモナ糸に付着させた状態で、単胞子により継代培養を行った。
前培養用培地（人工海水シーライフ（マリン・テック社製）  １８００ｍＬに対し、ＥＳＳ２（Kitade et al., 1996, Journal of Phycology, 32: 496-498）２００ｍＬの割合で混合したもの）を用いて約１か月間前培養を行い、葉長が約５ｃｍになったスサビノリを鉄欠乏群および対照群に分け、鉄欠乏群は鉄化合物を含有しない培地（表４の鉄欠乏培地）に、対照群は鉄化合物を含有する培地（表４の対照培地）に、それぞれ移し、１４日間本培養を行った。
【００５８】
【表４】
2012183015.tif 000005
【００５９】
（２）トータルＲＮＡの調製
培養したスサビノリを培地から取り出し、すぐにキムタオルでよく水を吸い取り、湿質量を測定し、ジッパー付のビニール袋に入れ、液体窒素で凍結した。
凍結したサンプルは、−８０℃で冷凍保存した。
冷凍保存したサンプルは、解凍せず、液体窒素存在下、乳鉢および乳棒を用いて破砕した。破砕したサンプルからのトータルＲＮＡの粗抽出は、ＡＧＰＣ（Acid Guanidinium-Phenol-Chloroform）法の標準的なプロトコールに従って行った。すなわち、破砕したサンプル約０．３ｇに、に３ｍｌのＧＴＣ溶液を加え、すぐにホモジェナイズし、このホモジェナイズしたサンプルに２Ｍ酢酸ナトリウム０．３ｍｌと平衡酸性フェノール（水飽和）３ｍｌとクロロホルム０．６ｍｌとを加え、よく振った後、氷上で１５分間インキュベートし、次いで、１０，０００Ｇ  ４℃で２０分間遠心し、上清を新しいチューブに回収し、イソプロパノール３ｍｌを加え、１０，０００Ｇ  ４℃で２０分間遠心し、上清を捨て、ＲＮＡのペレットをＧＴＣ溶液０．４ｍｌに溶かし、イソプロパノール０．４ｍｌ加え、１０，０００Ｇ  ４℃で１０分間遠心し、上清を捨て、１ｍｌ  ７５％エタノールを加え、１０，０００Ｇ  ４℃で５分間遠心した。ここで、７５％エタノール洗浄を数回繰り返した。ペレットを少し乾かし、ＤＥＰＣ処理したｄＨ２ＯまたはＴＥに溶解した。
【００６０】
トータルＲＮＡ粗抽出液を分取し、これをグアニジン−塩化セシウム超遠心法の標準的なプロトコールに従って精製し、トータルＲＮＡの精製を行った。すなわち、ポリアロマー超遠心用チューブに１７ｍｌのＣｓＴＦＡ溶液を入れ、その上層にトータルＲＮＡ粗抽出液をそっと重層し、バランスをあわせて、５０，０００Ｇ，１５℃，２４ｈｒ超遠心した。超遠心終了後、密度勾配が崩れないようにチューブを取り出し、注意深く吸引し、さらに、デカンテーションにて、溶液を除去し、キムタオルの上にひっくり返して、水分を良く除去し、カッターナイフでチューブの下から約３ｃｍ位のところで切り、４Ｍ  ＧＴＣ  ６００ｍｌでチューブの底のＲＮＡをピペッティングで溶かし、次いで、ＲＮＡ用のチューブに移し、等量のイソプロパノールを加え、−２０℃で一晩保存し、１０，０００Ｇ  ４℃で２０分間遠心し、上清を捨て、白い沈澱を４００ｍｌのＤＥＰＣ水で懸濁し、エタノール沈殿し（１／１０量の２Ｍ酢酸ナトリウム、２．５倍量の１００％エタノール）、１０，０００Ｇ  ４℃で２０分間遠心し、７５％エタノールで洗浄し、１０，０００Ｇ  ４℃で５分間遠心し、２００ｍｌのＤＥＰＣ水で溶かし、濃度を測定した（ＯＤ２６０，１ＯＤ＝４０ｍｇ／ｍｌ）。
【００６１】
（３）ｍＲＮＡの調製
抽出・精製したトータルＲＮＡをサンプルとして、ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０  ＜Ｓｕｐｅｒ＞  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｆｒｏｍ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）（タカラ社製）を用いて、同キット添付のプロトコールに従ってｍＲＮＡを分離・回収した。同キットは、トータルＲＮＡからＰｏｌｙＡ＋  ｍＲＮＡを分離・精製するためのキットであり、ラテックス粒子表面に固定化されたｏｌｉｇｏ（ｄＴ）３０とサンプル中のｍＲＮＡとの複合体を形成し、スピンカラムを用いてｍＲＮＡ−ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０複合体からＰｏｌｙＡ＋  ｍＲＮＡを回収するものである。
【００６２】
（４）ｃＤＮＡサブトラクション
得られたｍＲＮＡをサンプルとして、ＰＣＲ−ＳｅｌｅｃｔＴＭ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて、同キット添付のプロトコールに従ってｃＤＮＡサブトラクションを行い、鉄欠乏状態で発現が増大している遺伝子のｃＤＮＡ断片を得た。
【００６３】
ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡサブトラクション法の概要は次のとおりである。まず、比較する２種類のサンプル（鉄欠乏群、対照群）から０．５〜２μｇのＰｏｌｙＡ＋  ＲＮＡを単離する。これからｃＤＮＡを合成し、得られたＴｅｓｔｅｒ  ｃＤＮＡとＤｒｉｖｅｒ  ｃＤＮＡをＲｓａＩ（４塩基配列を認識・切断して平滑末端を生ずる制限酵素）で切断する。次に、Ｔｅｓｔｅｒ  ｃＤＮＡを２群に分け、それぞれに異なるｃＤＮＡアダプターをライゲーションする。アダプターの５’末端にはリン酸基が含まれてないため、アダプターの片方の鎖だけがｃＤＮＡの５’末端に結合する。この２種類のアダプターは同一の末端配列をもっているため、陥入末端が埋められてしまえば同一のＰＣＲプライマーとアニーリングできる。次に、２回のハイブリダイゼーション（１ｓｔハイブリダイゼーションと２ｎｄハイブリダイゼーション）を行う。１ｓｔ  ハイブリダイゼーションでは、それぞれのＴｅｓｔｅｒサンプルに過剰量のＤｒｉｖｅｒを加える。サンプルを熱変性した後、アニーリングを行うと、各サンプルでａ，ｂ，ｃ，ｄの４種類の分子が生じる。発現量の多い塩基配列とそうでない塩基配列の濃度が、タイプａ分子間で均等化される。ハイブリダイゼーションの反応速度は濃度の二乗に比例するため、多量に存在する分子ほど再アニーリング速度が速くなるからである。同時に、発現量の差がある配列（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）はタイプａ分子として高度に濃縮され、発現量の差がないｃＤＮＡはＤｒｉｖｅｒ分子と結合してタイプｃ分子を形成する。２ｎｄハイブリダイゼーションでは、１ｓｔハイブリダイゼーションで得られた２つのサンプルを変性させずに、新たな変性（一本鎖）Ｄｒｉｖｅｒ  ｃＤＮＡとともに混合する。量的に均等化され、サブトラクション（消去）されて残った一本鎖のＴｅｓｔｅｒ  ｃＤＮＡだけが再びハイブリダイズでき、新たなタイプのハイブリッド分子（タイプｅ）を形成する。タイプｅ分子は異なる末端を持つ二本鎖のＴｅｓｔｅｒ分子で、一方の突出末端はＡｄａｐｔｏｒ  １の配列に、他方の突出末端はＡｄａｐｔｏｒ  ２Ｒの配列に対応する。新たに調製した変性Ｄｒｉｖｅｒ  ｃＤＮＡを同時に加えたことにより、発現差のある配列がタイプｅ分子画分としてさらに濃縮される。次に、ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端を埋める。これにより、両端にプライマーアニーリングサイト（アダプター）をもつタイプｅ分子（発現差のあるＴｅｓｔｅｒ配列）が形成される。なお、Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒに対するアニーリングサイトの配列は５’末端と３’末端で異なることになる。これらの分子のポピュレーション全体をＰＣＲにかけ、発現差のある配列を増幅する。タイプａ分子とタイプｄ分子はプライマーアニーリングサイト（アダプター）を持たないため、ＰＣＲ増幅されない。大部分のタイプｂ分子はサプレッションＰＣＲ効果によってフライパン状の構造を形成するため、指数関数的な増幅が妨げられる。タイプｃ分子はプライマーアニーリングサイトを１つしか持たないため、一次関数的にしか増幅されない。タイプｅ分子（均等化された、発現差のある配列）だけが両端にプライマーアニーリングサイトを持つため、指数関数的に増幅される。タイプｅ分子の５’末端と３’末端のアダプター配列は、異なるｎｅｓｔｅｄプライマーアニーリングサイトをもっている。これを利用して、Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒで２回目のＰＣＲ反応を行い、バックグラウンドのＰＣＲ産物を減らし、発現差のある配列を濃縮する。得られたｃＤＮＡは、直接Ｔ／Ａクローニングベクターに挿入できる。また、Ａｄａｐｔｏｒ  １のＮｏｔＩ（ＳｍａＩ，ＸｍａＩ）サイトやＡｄａｐｔｏｒ  ２ＲのＥａｇＩサイトを利用して部位特異的クローニングを行うこともできる。アダプター／ｃＤＮＡ接合部のＲｓａＩサイトを利用して平滑末端クローニングも行える。このようなクローニングを行うことで、塩基配列の同定および／またはハイブリダイゼーション解析によって、発現差のあるＲＮＡを同定することができる。さらに、ＰＣＲ増幅産物は、ＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブとしても利用することができる。
【００６４】
（５）ｃＤＮＡ断片のシークエンス解析
さらに、得られたｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定するため、同ｃＤＮＡ断片を、ｐＧＥＭ（Ｒ）−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（プロメガ社製）に、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．  ２．１（タカラ社製）を用いてライゲーションを行い、ヒートショック法により大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ，アジレント社製）に形質転換した。
得られた形質転換体を培養し、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、同キット添付のプロトコールに従ってプラスミドを精製した。
インサートの塩基配列決定は、シークエンス解析サービス（ファスマック社）を利用して行った。これにより得られたｃＤＮＡ部分配列は、配列番号７に示すものである。
【００６５】
（６）ｃＤＮＡ全長配列の決定
得られたｃＤＮＡ部分配列をもとに、５’／３’  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ，２ｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ロシュ社製）を用いて、同キット添付のプロトコールに従ってＲＡＣＥ産物を得た。
得られたＲＡＣＥ産物を直接シークエンシングしてｃＤＮＡ全長配列（配列番号８）を得た。ｃＤＮＡ全長配列からＯＲＦを特定して翻訳し、アミノ酸配列（配列番号９）を得た。
【００６６】
（７）遺伝子の同定
アミノ酸配列をクエリー配列として、データベース（米国ＮＣＢＩ）をＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ）で検索したところ、少なくとも、このアミノ酸配列を有するタンパク質はＦＴＲ１スーパーファミリーに属することがわかった。
したがって、スサビノリの鉄欠乏状態においては、ＦＴＲ１遺伝子の発現が増大することがわかった。
これは、スサビノリ（Porphyra yezoensis）に限定されることなく、少なくとも、同属のアマノリ類（Porphyra spp.）全般にまで拡大することができる。
よって、ＦＴＲ１遺伝子は、アマノリ類の鉄欠乏状態を検出するための分子マーカーとして使用することができる。
【配列表】
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