(57)【要約】【課題】効率的に３−ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰＡ）を製造する方法を提供する。【解決手段】アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの存在下でアセチルＣｏＡを反応させてマロニルＣｏＡを生産し、マロニルＣｏＡレダクターゼまたはマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼの存在下で前記マロニルＣｏＡを反応させて３−ヒドロキシプロピオン酸を生産することを有し、前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、前記マロニルＣｏＡの生合成量を増加させる効果を有する、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの存在下でアセチルＣｏＡを反応させてマロニルＣｏＡを生産し、マロニルＣｏＡレダクターゼまたはマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼの存在下で前記マロニルＣｏＡを反応させて３−ヒドロキシプロピオン酸を生産することを有し、
前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、前記マロニルＣｏＡの生合成量を増加させる効果を有する、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法。
【請求項２】
前記マロニルＣｏＡの生合成量の増加効果は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを、当該アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを本来有する微生物とは異なる種に属する微生物に形質転換することによって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マロニルＣｏＡの反応は、マロニルＣｏＡレダクターゼの存在下でかつ高いＮＡＤＰＨ量の条件下で行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記マロニルＣｏＡの反応は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子または６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を高発現する微生物を用いて行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
高いＮＡＤＰＨ量の条件下でかつマロニルＣｏＡレダクターゼの存在下で、マロニルＣｏＡを反応させて３−ヒドロキシプロピオン酸を生産することを有する、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法。
【請求項６】
前記マロニルＣｏＡの反応は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子または６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を高発現する微生物を用いて行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
一酸化炭素または二酸化炭素を炭素源として用いた微生物の代謝によりアセチルＣｏＡまたはマロニルＣｏＡを生産することをさらに有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により製造される３−ヒドロキシプロピオン酸を脱水することを有する、アクリル酸の製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法により製造されるアクリル酸を部分中和して部分中和アクリル酸を製造し、前記部分中和アクリル酸を架橋性モノマーと共重合することを有する、吸水性樹脂の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法、ならびに該方法で得られた３−ヒドロキシプロピオン酸からアクリル酸および吸水性樹脂を製造する方法に関する。特に、本発明は、生物の重要な代謝中間体であるアセチルコエンザイムＡ（アセチルＣｏＡ）から発酵によりマロニルコエンザイムＡ（マロニルＣｏＡ）を経て３−ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰＡ）を製造する方法、ならびに該方法で得られた３−ヒドロキシプロピオン酸からアクリル酸および吸水性樹脂を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球温暖化防止及び環境保護の観点から、炭素源としてリサイクル可能な生物由来資源を従来の化石原料の代替として用いることが注目されている。例えば、汎用化成品、プラスチックおよび燃料生産の原料として、トウモロコシや小麦等の澱粉系バイオマス、サトウキビなどの糖質系バイオマス、および菜種の絞りかすや稲わら等のセルロース系バイオマス等のバイオマス資源を原料として利用する方法の開発が試みられている。また、バイオマス由来の糖類の利用以外にも、木質系バイオマスをガス化して得られる一酸化炭素と水素とを発酵原料として利用する方法や木質系バイオマスをガス化してメタノールを合成する方法についても検討・報告されている。このように、バイオマスから得られる糖類以外にも、様々な原料から汎用化成品を合成する技術が望まれている。
【０００３】
３−ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰＡ）及びそのエステルは、脂肪族ポリエステルの原料として有用な化合物であり、また、これから合成されるポリエステルは生分解性の地球にやさしいポリエステルとして注目されている。３−ヒドロキシプロピオン酸は、通常、アクリル酸に対する水の付加により、又はエチレンクロロヒドリンとシアン化ナトリウムとの反応により製造される。アクリル酸を水和する反応は平衡反応であるため、反応率が制御されるという問題がある。また、エチレンクロロヒドリンの場合は、毒性の強い物質の使用が必要であり、さらに加水分解工程を追加しなくてはならない。この場合、塩化ナトリウム及びアンモニウム塩が大量に生じるという問題もある。
【０００４】
３−ヒドロキシプロピオン酸は、脱水することによりアクリル酸を製造することができる。アクリル酸は、主にアクリル酸エステル製造の中間体として使用されており、アクリル酸エステルはコーティング剤、仕上げ剤、ペイント、接着剤の製造に使用され、吸着剤や洗浄剤用添加剤の製造にも使用されている。また、アクリル酸を部分中和させ、架橋性モノマーと共重合させることで吸水性樹脂を製造することもできる。アクリル酸の代替製造法としては、アクリロニトリルの硫酸による加水分解が知られている。しかし、この方法では、硫酸アンモニウム廃棄物が大量に生成し、それに伴うコストのために商業的には実施されていない。
【０００５】
３−ヒドロキシプロピオン酸が酵素反応または発酵により生成可能なことが報告されている。
【０００６】
非特許文献１は、３ＨＰＡサイクルと呼ばれる炭素固定経路を保有するＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓの発酵において、３ＨＰＡサイクルの中間代謝産物である３ＨＰＡが、微量培地中に放出されることを記載している。しかしながら本論文に記載されている発酵液中の３ＨＰＡは、本来は３ＨＰＡ以降の３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡに変換されるべき３ＨＰＡが、培地中に微量放出されたものである。
【０００７】
非特許文献２は、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのマロニルＣｏＡレダクターゼ（ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）タンパク質を精製し、そのＮ末端アミノ酸配列分析結果から、マロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子のＤＮＡ配列を明らかとしている。マロニルＣｏＡレダクターゼはマロニルＣｏＡを基質とし３ＨＰＡを生成する反応を触媒する酵素である。本論文では、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのマロニルＣｏＡレダクターゼの酵素学的諸性質についても報告し、マロニルＣｏＡレダクターゼが３ＨＰＡ生成に利用できる可能性について言及している。しかしながら本論文に記載されているマロニルＣｏＡレダクターゼを利用して生成した３ＨＰＡは、酵素反応で生成したものであり、マロニルＣｏＡレダクターゼを他の生物に導入して利用すること、マロニルＣｏＡレダクターゼを導入した遺伝子組換え生物を用いて、発酵により３ＨＰＡを最終代謝産物として生成することには言及していない。
【０００８】
非特許文献３は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼおよびマロニルＣｏＡレダクターゼを利用した、糖→ピルビン酸→アセチルＣｏＡ→マロニルＣｏＡ→３ＨＰＡの生成に関して言及しているが、実験による立証はなされていない。加えて、３ＨＰＡ生産性を増加させる遺伝子改変についても言及していない。また、３ＨＰＡ回路を元来保有する微生物を利用した３ＨＰＡ発酵生産の可能性についても言及しているが、３ＨＰＡサイクルを利用した３ＨＰＡ発酵生産の場合、生成された３ＨＰＡは他の化合物、具体的には３ＨＰＡ以降の代謝産物である３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡやアクリロイルＣｏＡに変換されるため、３ＨＰＡを効率的に生産することは困難な発酵であるといえる。さらに、本文献では糖以外の３ＨＰＡの原料として二酸化炭素の利用についても言及しているが、実験的な立証はなされていない。
【０００９】
非特許文献４は、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のマロニルＣｏＡレダクターゼおよびプロピオニルＣｏＡシンターゼの３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼドメインをＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅａｃｔｏｒに導入し、フルクトース、アルカン酸、オクタン酸およびドデカン酸からＰｏｌｙ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）が生成されたことが記載されているが、マロニルＣｏＡレダクターゼを利用した３ＨＰＡ発酵生産については言及していない。また、Ｐｏｌｙ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオン酸）をＮＭＲ分析に供し、３−ヒドロキシブタン酸ユニットと３−ヒドロキシプロピオン酸ユニットに該当するシグナルを検出しているが、発酵液中に３ＨＰＡが生成しているかは記載していない。加えて、外来遺伝子として利用しているマロニルＣｏＡレダクターゼはアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡを生成するために利用していると論文中に記載されており、マロニルＣｏＡレダクターゼを利用して３ＨＰＡを発酵生産する方法には言及していない。
【００１０】
また、マロニルＣｏＡレダクターゼを利用しない３ＨＰＡ生成経路として、いくつかの経路が提案・検討されている。例えば、特許文献１は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来グリセロールデヒドラターゼ  アルファ  サブユニットおよび大腸菌由来アルデヒドデヒドロゲナーゼを導入した遺伝子組換え大腸菌を用いた、発酵によるグリセリンからの３−ヒドロキシプロピオン酸の生成を記載している。特許文献１に記載の方法に従えば、グリセリンから３ＨＰＡまでの反応段数は２段であるが、グルコース等の糖を含む他の化合物を原料とした場合、多くの反応段数が必要となり、３ＨＰＡ生成に必須となる複数の外来酵素遺伝子の導入方法、複数の外来酵素遺伝子の発現量のコントロール方法、各反応における効率的な酵素反応の実現等、技術的な課題が多く、３ＨＰＡを効率的に発酵生産するには難しい反応系と言える。
【００１１】
特許文献２はβアラニンを中間体とした３ＨＰＡ発酵生産方法について記載しているが、特許文献２に記載の方法は、代謝中間体であるピルビン酸から３ＨＰＡを生成するまでに必須となる反応段数は少なくとも４段であり、特許文献１記載の方法と同様に、３ＨＰＡ生成に必要な複数の外来酵素遺伝子の導入方法、複数の外来酵素遺伝子の発現量のコントロール方法、各反応における効率的な酵素反応の実現等、技術的な課題が多く、３ＨＰＡを効率的に発酵生産するには難しい生成経路である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２００１／０１６３４６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００８／０２７７４２号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｈｅｌｇｅ  Ｈｏｌｏ．，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８９，１５１：２５２−２５６
【非特許文献２】Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｈｕｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２００２，１８４，９：２４０４−２４１０
【非特許文献３】Ｘｉｎｇｌｉｎ  Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００９，８２：９９５−１００３
【非特許文献４】Ｔｏｓｈｉａｋｉ  Ｆｕｋｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００９，１０：７００−７０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述したように、３ＨＰＡの発酵生産には、グリセリン経由の３ＨＰＡ生成方法、βアラニン経由の３ＨＰＡ方法等、いくつかの生成方法が提案・報告されているが、いずれの３ＨＰＡ生成方法においても３ＨＰＡまでの反応は多段数必要であり、複数の遺伝子を導入すること、複数の遺伝子の発現を３ＨＰＡ発酵生産に適した形態で制御すること、および高い発酵収率を得ることは困難であった。また、３ＨＰＡサイクルを利用した３ＨＰＡ生成についても報告がなされているが、実際に３ＨＰＡが発酵により生成しているのは、元来３ＨＰＡサイクルを有する微生物において、代謝中間体の３ＨＰＡが培地中に放出された場合のみであり、その３ＨＰＡ生成量は極微量であった。
【００１５】
そこで、本発明は、上記事情をかんがみてなされ、効率的に３−ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰＡ）を製造する方法を提供することを目的とする。
【００１６】
本発明の他の目的は、ほとんどの生物が生成する重要な代謝中間体であるアセチルＣｏＡから、簡便に（例えば、僅かな酵素反応段階で）代謝産物（好ましくは、最終代謝産物）として３ＨＰＡを生成可能な、効率的な３ＨＰＡ製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記問題を解決すべく鋭意研究を行った結果、フィードバック阻害を抑制するなどしてマロニルＣｏＡの生合成量を増加させる効果を有するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼと、マロニルＣｏＡレダクターゼまたはマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼと、を組み合わせて使用することによって、脂肪酸合成の重要な前駆物質であり、ほとんどの生物が合成可能な代謝産物であるアセチルＣｏＡから、僅か二段または三段の酵素反応により、代謝産物（好ましくは、最終代謝産物）として３ＨＰＡを効率よく生成可能なことを見出した。上記知見に基づいて、本発明を完成した。
【００１８】
すなわち、上記目的は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの存在下でアセチルＣｏＡを反応させてマロニルＣｏＡを生産し、マロニルＣｏＡレダクターゼまたはマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼの存在下で前記マロニルＣｏＡを反応させて３−ヒドロキシプロピオン酸を生産することを有し、前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、前記マロニルＣｏＡの生合成量を増加させる効果を有する、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法によって達成される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の方法によると、３−ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰＡ）を効率よく製造することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の方法を概念的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの存在下でアセチルＣｏＡを反応させてマロニルＣｏＡを生産し、マロニルＣｏＡレダクターゼまたはマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼの存在下で前記マロニルＣｏＡを反応させて３−ヒドロキシプロピオン酸を生産することを有し、前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、前記マロニルＣｏＡの生合成量を増加させる効果を有する、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法を提供する。本発明は、マロニルＣｏＡの生合成量を増加させる効果を有するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼと、マロニルＣｏＡレダクターゼまたはマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼとを用いて、アセチルＣｏＡ→マロニルＣｏＡ→３ＨＰＡの反応を行うことを特徴とする。本発明は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの存在下でアセチルＣｏＡを反応させてマロニルＣｏＡを生産する際に、マロニルＣｏＡの生合成量が増加する。このため、その次のマロニルＣｏＡレダクターゼまたはマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼの存在下でのこのマロニルＣｏＡ→３ＨＰＡの反応が効率よく進行するため、３ＨＰＡの収率を向上することができる。また、上記マロニルＣｏＡの生合成量増加効果は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの存在下でのアセチルＣｏＡ→マロニルＣｏＡの反応において、マロニルＣｏＡ生成律速を受けず、上記反応がマロニルＣｏＡの生成量にかかわらず進行することによって、３ＨＰＡを効率よく製造することによっても達成できる。この際、３ＨＰＡが効率よく製造できる理由は明らかではないが以下のように推論される。すなわち、天然の生物中で、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの存在下でアセチルＣｏＡを反応させてマロニルＣｏＡを生産する場合には、ある程度のマロニルＣｏＡが生物内で生産されると、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼがフィードバック阻害を受けて、酵素作用が抑制されて、その結果、アセチルＣｏＡ→マロニルＣｏＡの反応がうまく進行せずに、３ＨＰＡが効率よく生産しなくなる。しかし、本発明の方法によるように、フィードバック阻害を受けないように、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを改変すると、マロニルＣｏＡ生成律速を受けず、上記反応がマロニルＣｏＡ量にかかわらず進行する。ゆえに、次のマロニルＣｏＡレダクターゼまたはマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼの存在下でのマロニルＣｏＡ→３ＨＰＡをあわせたアセチルＣｏＡ→マロニルＣｏＡ→３ＨＰＡの反応が少ない反応工程数でかつ良好に進行して、所望の３ＨＰＡを効率よく製造することができる。したがって、所望の化合物を得るために必要な酵素反応段数および導入する外来酵素遺伝子数を少なくできるため、化合物発酵生産に適した外来遺伝子の発現制御が容易となり、かつ必要な各酵素反応における収率低下を抑制することが可能となる。
【００２２】
本発明は、従来技術と比較して、従来技術とは異なる、以下の４点の優れた特長を有しており、これらの特長により３ＨＰＡを効率的に発酵生産することが可能である。（１）ほんどの生物が合成可能なアセチルＣｏＡから僅か２段または３段の反応で３ＨＰＡを効率よく生成可能なこと；（２）ほとんどの生物が合成する、生物が生育する上で非常に重要な代謝中間体であるアセチルＣｏＡおよび／またはマロニルＣｏＡを３ＨＰＡの前駆物質として利用することから、糖、一酸化炭素、二酸化炭素を含む様々な炭素源から３ＨＰＡを効率よく生成可能なこと；（３）非常に重要な代謝中間体であり、かつ多量に生合成されるアセチルＣｏＡを３ＨＰＡの前駆物質とすることから、３ＨＰＡを効率的にかつ多量に生産可能とすること；および（４）ほとんどの生物が生合成可能であるアセチルＣｏＡおよび／またはマロニルＣｏＡを３ＨＰＡの前駆物質とすることから、ほとんどの生物が３ＨＰＡ発酵の宿主として利用可能なこと。
【００２３】
上記特長により、所望の化合物を得るために必要な酵素反応段数および導入する外来酵素遺伝子の種類を少なくできるため、化合物発酵生産に適した外来遺伝子の発現制御が容易となり、かつ必要な各酵素反応における収率低下を抑制できる。マロニルＣｏＡは、脂肪酸合成の重要な前駆物質であり、ほとんどの生物において合成可能な化合物であるが、このマロニルＣｏＡから僅か１段階または２段階の酵素反応により３ＨＰＡ生成が可能となり、他の複数段の反応（複数の外来遺伝子の導入）が必要な３ＨＰＡ生成経路よりも効率的に３ＨＰＡを生成できる。加えて、マロニルＣｏＡは上記したようにフィードバック阻害を受けずにアセチルＣｏＡからアセチルＣｏＡカルボキシラーゼにより生成される場合も効率的な３ＨＰＡ発酵において非常に有利である。また、アセチルＣｏＡやマロニルＣｏＡのように、細胞内で生成量が多い主要な代謝中間体を３ＨＰＡの前駆体とする３ＨＰＡ生成経路を利用できるため、所望の３ＨＰＡをさらに効率的に生産できる。アセチルＣｏＡは生物が生きていく上で重要なＴＣＡサイクルの入口に位置し、様々な化合物の代謝において代謝中間体として多量に生成される重要な代謝中間体であるが、このアセチルＣｏＡからわずか２段階または３段階の酵素反応により３ＨＰＡ生成が可能となる。アセチルＣｏＡは解糖系、ＴＣＡ回路以外の代謝経路、β酸化やメバロン酸経路においても中間代謝産物として生成される、生物にとって非常に重要な中間代謝産物であるため、グルコース、フルクトース等の糖類、メタノール等のアルコール類、グリセリン等の糖アルコール類、オクタン酸やドデカン酸等の脂肪類酸、乳酸、酢酸、グルコン酸等のカルボン酸類等、様々な原料から３ＨＰＡを生成可能とする。加えて、還元的ＴＣＡ回路、アセチルＣｏＡ経路、３−ヒドロキシプロピオン酸経路、カルビンベンソン回路等の炭素固定能を有する微生物もアセチルＣｏＡおよび／またはマロニルＣｏＡを生成することから、これらの炭素固定能を有する微生物を利用することで、二酸化炭素および／または一酸化炭素に含まれる炭素から３ＨＰＡを生成することも可能である。ゆえに、アセチルＣｏＡやマロニルＣｏＡは、ほとんどの生物が糖、糖アルコール、アルコール、脂肪酸、カルボン酸、一酸化炭素、または二酸化炭素を炭素源して合成する物質であるため、本発明の方法は、広範な出発原料を利用できる。
【００２４】
加えて、ほとんどの生物において合成可能な化合物であるマロニルＣｏＡおよび／またはアセチルＣｏＡから３ＨＰＡを発酵可能な点も特徴とする。
【００２５】
さらに、本発明の方法は他の３ＨＰＡ生成経路、例えばグリセリン経由３ＨＰＡ経路や、ピルビン酸からβアラニンを経由し３ＨＰＡを生成する経路と併用して利用することも可能であり、他の３ＨＰＡ生成方法と併用することで、より効率的に、かつ炭素収率高く３ＨＰＡを（例えば、発酵などにより）生産できる。
【００２６】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
【００２７】
以下、添付した図面を参照しながら、本発明の実施形態を説明する。また、以下には所望の反応を触媒する酵素名または酵素遺伝子名を記載しているが、所望の反応を触媒できる酵素または酵素遺伝子であれば、その酵素名、酵素遺伝子名、ＥＣ番号に関わらず、本特許記載の酵素または酵素遺伝子と同様に利用することが可能である。
【００２８】
図１は、本発明の方法を概念的に示す図である。
【００２９】
本発明において３ＨＰＡ製造に用いるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、マロニルＣｏＡの生合成量を増加させる効果を有する。ここで、マロニルＣｏＡの生合成量を増加させる効果を有するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、上記効果を有するものであればその製造方法は特に制限されにない。具体的には、（ａ）宿主が本来保有するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を高発現させたアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、（ｂ）宿主とは異なる生物由来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、（ｃ）アセチルＣｏＡを基質とした、所望の反応（アセチルＣｏＡ→マロニルＣｏＡ）以外の反応を触媒する酵素遺伝子を破壊した遺伝子組換え生物が有するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、（ｄ）生成したマロニルＣｏＡによるフィードバック制御が生じないようにアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子に突然変異を導入した変異アセチルＣｏＡカルボキシラーゼなどが挙げられる。
【００３０】
（ａ）の方法としては、特に制限されないが、例えば、下記微生物のアセチルＣｏＡを合成する酵素遺伝子を導入する方法；アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子の複数コピー（例えば、１〜１０コピー）を有する発現ベクターを同じ宿主に形質転換する方法；下記微生物における酢酸を基質としてアセチルＣｏＡを合成するａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ遺伝子を高発現させる方法；下記微生物におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼを高発現するような培養条件で培養する方法；アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを高発現するように下記微生物に変異を行う方法；Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）等の変異剤処理によりマロニルＣｏＡおよび／またはアセチルＣｏＡ生合成量が多くなった突然変異生物などが挙げられる。または、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼがビオチン依存性の酵素であることから、ビオチン生合成能を向上させた遺伝子改変生物または変異生物を利用することで、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を向上させて、その結果３ＨＰＡ生成量を増加させることも可能である。また、３ＨＰＡサイクルを保有する微生物も利用可能であり、３ＨＰＡサイクルを保有する微生物において、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を高発現させる、または外来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を導入・高発現させることで、さらに３ＨＰＡ生成量を増加させることも可能である。加えて、３ＨＰＡを基質とする反応を触媒する酵素遺伝子、具体的には３−ヒドロキシプロピオン酸ＣｏＡリガーゼをコードする遺伝子を破壊することで３ＨＰＡ生成量を増加させることもできる。さらに、アセチルＣｏＡの前駆物質であるピルビン酸を基質とした反応を触媒する酵素遺伝子、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼやアラニンデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ等の酵素遺伝子を破壊した遺伝子組換え生物を利用することにより３ＨＰＡ生成量を増加させることも可能である。特に、エタノールを主な発酵産物とするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅやＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅを宿主として利用する場合には、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を破壊した遺伝子組換え生物を利用することが３ＨＰＡ生成量の増加の点で有効である。
【００３１】
また、（ｂ）の方法としては、本発明の方法で使用されるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼを本来有する生物とは異なる生物由来とすることができれば特に制限されないが、例えば、下記微生物のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子の１コピーまたは複数コピー（例えば、１〜２００コピー）を、当該アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを本来有する宿主（例えば、微生物）とは異なる種に属する宿主（例えば、微生物）に形質転換する方法などが挙げられる。
【００３２】
（ｃ）の方法としては、特に制限されないが、例えば、下記微生物において、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子は維持しつつ、アセチルＣｏＡを基質とし、アセチルリン酸を生成するｐｈｏｓｐｈｏａｃｙｌａｓｅ遺伝子、アセチルＣｏＡとオキサロ酢酸を基質としてクエン酸を合成するｃｉｔｒａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子、アセチルＣｏＡを基質としアセトアルデヒドを生成するａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ遺伝子等のアセチルＣｏＡを基質とする酵素反応を触媒する酵素遺伝子を破壊することによって得られる遺伝子破壊株、または上記アセチルＣｏＡを基質とする酵素活性が低下した突然変異微生物を利用する方法が使用できる。
【００３３】
加えて、アセチルＣｏＡが最も利用される代謝経路であるクエン酸回路（ＴＣＡサイクル）に対する改変も３ＨＰＡ生成量の増加に有効である。具体的には、（ｃ−１）ＴＣＡサイクルを構成する各酵素活性が低くなった遺伝子改変株や変異株の利用、（ｃ−２）ＴＣＡサイクルを構成する各酵素活性が低くなるような培養条件の変更等が挙げられる。（ｃ−２）の方法としては、例えば、嫌気条件下で培養を行うことでＴＣＡサイクルに流れるアセチルＣｏＡ量を減らすことができる。また、アセチルＣｏＡ生合成量を増やす改変も併せて利用できる。具体的には、ピルビン酸を基質としアセチルＣｏＡを生成するｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ遺伝子を高発現させた遺伝子改変株の利用や、宿主として利用する生物以外の生物由来のｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ遺伝子を利用する宿主に導入し高発現させる方法、ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ遺伝子の発現を制御するＰｄｈＲ遺伝子を破壊した遺伝子破壊株を利用する方法、またはＰｄｈＲ遺伝子内に変異が起こる等によりｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘの発現量が増加した遺伝子改変株を利用する方法等が考えられる。
【００３４】
このように、アセチルＣｏＡが他の反応の基質となることを抑制する遺伝子改変、または、アセチルＣｏＡ生合成量を増加させる遺伝子改変の具体的例を記載したが、同様の効果が得られる遺伝子改変または変異株であれば本発明の方法の遺伝子組換えの宿主として利用可能である。
【００３５】
上記（ａ）〜（ｄ）は、単独で適用されてもあるいは２種以上を組み合わせて適用されてもよい。これらのうち、（ａ）、（ｂ）が好ましく、（ｂ）がより好ましい。すなわち、マロニルＣｏＡの生合成量の増加効果は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを、当該アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを本来有する微生物とは異なる種に属する微生物に形質転換することによって得られることが好ましい。ここで、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの形態は、特に制限されず、公知のいずれの形態を適用できる。具体的には、細胞内より精製した酵素タンパク質そのもの、細胞内でアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子が発現したことにより合成されたアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素を包括した細胞、上記酵素の固定化酵素などが利用できる。なお、本明細書中、生物が本来有しているアセチルＣｏＡカルボキシラーゼを、「天然アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ」と、およびマロニルＣｏＡの生合成量を増加させる効果を有するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼを、「修飾アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ」と、も称する。このため、「修飾アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ」は、フィードバック阻害を受けない。
【００３６】
本発明において、マロニルＣｏＡの生合成量を増加させる効果を有するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、アセチルＣｏＡを基質としマロニルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質であれば特に制限されず、公知のものを使用できる。例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ、Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ  ｍｙｏｓｕｒｏｉｄｅｓ、Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ  ｍｙｏｓｕｒｏｉｄｅｓ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．、Ａｎｓｅｒ  ａｎｓｅｒ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｓｐ．、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、Ｂｒａｃｈｙｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｂｒｉｇｇｓａｅ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、Ｃａｐｒａ  ｈｉｒｃｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ、Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ  ｌａｂｒａｘ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｉｎｄｉｃａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ  ｒｕｂｒａ、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌｅｐｔｏｃｈｌｏａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ、Ｌｏｌｉｕｍ  ｒｉｇｉｄｕｍ、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ、Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ、Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ、Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ、Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｈｏｒｔｅｎｓｅ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓｅｔａｒ���ａ  ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｃｕｓ、Ｔａｋｉｆｕｇｕ  ｓｐ．、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ、Ｚｅａ  ｍａｙｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｔｅｎｕｌａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ａｌｃｏｈｏｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ  ａｓｈｂｙｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｈａｐｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ  ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ  ｓｐ．、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＲＳ−１  、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＮＡＰ１、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｃｕｓ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｐ．、Ｓｔｙｇｉｏｌｏｂｕｓ  ａｚｏｒｉｃｕｓ、Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ  ｆｕｍａｒｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｂｌａｔｔａｅ、に由来するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼなどが挙げられるが、アセチルＣｏＡからマロニルＣｏＡを生成可能な酵素遺伝子であれば利用可能であり、上記生物由来の酵素遺伝子に限定されない。加えてアセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、単独で使用してもよいし、２種以上の混合物として使用してもよい。また、上記微生物または遺伝子組換え生物が元来保有するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼに点突然変異を加え、マロニルＣｏＡによるフィードバック阻害が生じないように改変した改変アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを利用してもよい。上記のうち、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓに由来するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼが好ましい。
【００３７】
配列番号：１３にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｃＢＣ）遺伝子の塩基配列を、また、配列番号：１４にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ｄｔｓＲ１）遺伝子の塩基配列を、例示する。これらの塩基配列由来のアミノ酸配列を含むタンパク質がアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有する限り、配列番号：１３や１４で表される塩基配列の変更により、相当するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。
【００３８】
本発明において、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を形質転換される遺伝子組換えの宿主として利用する生物は、天然アセチルＣｏＡカルボキシラーゼとは異なる由来で、アセチルＣｏＡを生合成可能な生物であればどんな生物でもよいが、操作の容易さ、使用できる宿主の汎用性、生物の増殖速度などを考慮すると、微生物が好ましい。宿主の選定は、３ＨＰＡの原料とする化合物の資化性を有しているかにより選定してよい。また、生育速度が速い、酸に対する耐性が高い等、３ＨＰＡ発酵生産において有利な形質を有する生物に、原料として利用する化合物の資化性を付与して用いてもよい。加えて、３ＨＰＡサイクルを保有する微生物を遺伝子組換えの宿主としてもよい。本発明の方法で使用できる微生物としては例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ属、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｏｏｒｅｌｌａ属、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ属、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ属、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ属、Ｓｔｙｇｉｏｌｏｂｕｓ属、Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｈｌｏｒｏｎｅｍａ属、Ｏｓｃｉｌｌｏｃｈｌｏｒｉｓ属、Ｈｅｌｉｏｔｈｒｉｘ属、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ属、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｃｌａｔｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ属、Ｐｒｏｓｔｈｅｃｏｃｈｌｏｒｉｓ属、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｈａｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｉｓｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｍａｒｉｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｔｈｉｏｃａｐｓａ属、Ｔｈｉｏｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｐｈａｅｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃａ属、Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｐｉｌａ属、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｔｈａｌａｓｓｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｒｏｄｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｒｏｓｅｏｓｐｉｒａ属、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ属、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｃａｒｂｏｘｙｄｉｂｒａｃｈｉｕｍ属、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｃｅｌｌａ属、Ｔｈｅｒｍｉｎｃｏｌａ属、Ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｂａｃｔｅｒ属、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｎｕｓ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｔｒｏｐｈｉｃｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属に属する微生物を例示することができるが、マロニルＣｏＡおよび／またはアセチルＣｏＡを生合成する生物であれば特に制限されず、公知のものを利用できる。これらのうち、操作性、遺伝子組換えの容易さ、遺伝子発現系の有無、微生物の増殖速度、培養における知見などを考慮すると、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が好ましい。
【００３９】
また、本発明の方法においては特に、メタン生成菌、硫黄酸化細菌、水素細菌、アンモニア酸化細菌、亜硝酸酸化細菌、鉄酸化細菌、緑色植物、藻類、ラン類、緑色硫黄細菌、紅色硫黄細菌等のカルビンベンソン回路、還元的ＴＣＡ回路、アセチルＣｏＡ経路、３−ヒドロキシプロピオン酸経路等の炭素固定経路を有する生物を遺伝子組換えの宿主として利用することで、二酸化炭素および／または一酸化炭素から３ＨＰＡを発酵生産することも可能である。特に、生育速度の速さ、有機酸の生産速度等から、水素を酸化してエネルギーを獲得する能力を有するＨｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｏｏｒｅｌｌａ属、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ属細菌を宿主として利用することが好ましい。
【００４０】
本発明においてマロニルＣｏＡレダクターゼは、マロニルＣｏＡを基質とした脱ＣｏＡ反応および還元反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質であれば特に制限されず、公知のものを使用できる。例えば、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ  ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ  ｓｐ．、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＲＳ−１、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＮＡＰ１、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｃｕｓ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｉｎｆｅｒｎｏｓ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｐ．、Ｓｔｙｇｉｏｌｏｂｕｓ  ａｚｏｒｉｃｕｓ、Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ  ｆｕｍａｒｉｉに由来するマロニルＣｏＡレダクターゼなどが例示できるが、マロニルＣｏＡから３ＨＰＡを生成可能な酵素遺伝子であれば利用可能であり、上記生物由来の酵素遺伝子に限定されない。加えて、マロニルＣｏＡレダクターゼは、単独で使用してもよいし、２種以上の混合物として使用してもよい。本発明で利用するマロニルＣｏＡレダクターゼは、好ましくは、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ  ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ  ｓｐ．、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ，  Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｐ．を用いる。より好ましくは、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のマロニルＣｏＡレダクターゼを用いる。
また、本発明の方法に用いられるマロニルＣｏＡレダクターゼの形態は、特に制限されず、公知のいずれの形態を適用できる。具体的には、細胞内より精製した酵素タンパク質そのものでもよいし、細胞内でマロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子が発現したことにより合成されたマロニルＣｏＡレダクターゼ酵素を包括した細胞、上記酵素の固定化酵素などが利用できる。
【００４１】
配列番号：１にＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のマロニルＣｏＡレダクターゼのアミノ酸配列を、配列番号：２にＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のマロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子の塩基配列を例示する。これらのアミノ酸配列を含むタンパク質がマロニルＣｏＡレダクターゼ活性を有する限り、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。
【００４２】
また、ＮＡＤＰＨ依存性のマロニルＣｏＡレダクターゼに、点突然変異法等によりＮＡＤＨ依存性の酵素に改変した改変マロニルＣｏＡレダクターゼを用いることで、より効率的に３ＨＰＡを生成することも可能である。ＮＡＤＨ依存性に改変したマロニルＣｏＡレダクターゼを導入する宿主には様々な微生物が利用可能であるが、特に、グリセリン経由で３ＨＰＡを生成するように遺伝子導入または改変を行った遺伝子組換え大腸菌、またはピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を破壊したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅやＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅを遺伝子導入の宿主として利用することが好ましい。これにより、より効率的に３ＨＰＡが生成可能となる。
【００４３】
加えて、本発明ではマロニルＣｏＡから３ＨＰＡを生成させるために、マロニルＣｏＡレダクターゼを利用しているが、同様の反応を触媒することが可能な酵素であれば、他の酵素を単独または２種類以上組合わせて利用することもできる。例えば、マロニルＣｏＡレダクターゼと同様にマロニルＣｏＡから３ＨＰＡを生成できる、マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼを利用することも可能である。加えて、マロニルＣｏＡレダクターゼ、マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼを併用して利用することも可能である。
【００４４】
マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、マロニルＣｏＡを基質としてマロン酸セミアルデヒドを生成する反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質であれば特に制限されず、公知のものを使用できる。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ  ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ  ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ  ｓｐ．、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＲＳ−１、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＮＡＰ１、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｃｕｓ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｐ．、Ｓｔｙｇｉｏｌｏｂｕｓ  ａｚｏｒｉｃｕｓ、Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ  ｆｕｍａｒｉｉに由来するマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼが例示できるが、マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒドを生成可能な酵素遺伝子であれば利用可能であり、上記生物由来の酵素遺伝子に限定されない。加えて、マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、単独で使用してもよいし、２種以上の混合物として使用してもよい。
【００４５】
３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼは、マロン酸セミアルデヒドを基質とし３ＨＰＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質であれば特に制限されず、公知のものを使用できる。例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｔｅｎｕｌａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ａｌｃｏｈｏｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ  ａｓｈｂｙｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｈａｐｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ  ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ  ｓｐ．、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＲＳ−１、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＮＡＰ１、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｃｕｓ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｉｎｆｅｒｎｕｓ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｐ．、Ｓｔｙｇｉｏｌｏｂｕｓ  ａｚｏｒｉｃｕｓ、Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ  ｆｕｍａｒｉｉに由来する３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼが例示できるが、マロン酸セミアルデヒドから３ＨＰＡを生成可能な酵素遺伝子であれば利用可能であり、上記生物由来の酵素遺伝子に限定されない。加えて３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼは、単独で使用してもよいし、２種以上の混合物として使用してもよい。本発明で利用する３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼは好ましくは、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来の酵素遺伝子を用いる。
【００４６】
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓの３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼの塩基配列を配列番号：３に、アミノ酸配列を配列番号：４に例示した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼの塩基配列を配列番号：５に、アミノ酸配列を配列番号：６に例示した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａの３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼの塩基配列を配列番号：７に、アミノ酸配列を配列番号：８に例示した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼの塩基配列を配列番号：９に、アミノ酸配列を配列番号：１０に例示した。配列番号：４、６、または８のアミノ酸配列を含むタンパク質が３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する限り、配列番号：４、６、または８で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。
【００４７】
上述したように、本発明の方法は、マロニルＣｏＡ→３ＨＰＡの反応を、マロニルＣｏＡレダクターゼ、またはマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼの存在下で行うことが可能であるが、好ましくは、マロニルＣｏＡレダクターゼの存在下で行う。当該方法は、反応段数が少ないため、酵素活性の制御、化合物発酵生産に適した外来遺伝子の発現制御などが容易であり、また、酵素反応における収率低下を抑制できる。
【００４８】
本発明において、マロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子、マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子または３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を形質転換される遺伝子組換えの宿主として利用する生物は、マロニルＣｏＡを生合成可能な生物であればどんな生物でもよいが、操作の容易さ、使用できる宿主の汎用性、生物の増殖速度などを考慮すると、微生物が好ましい。宿主の選定は、３ＨＰＡの原料とする化合物の資化性を有しているかにより選定してよい。また、生育速度が速い、酸に対する耐性が高い等、３ＨＰＡ発酵生産において有利な形質を有する生物に、原料として利用する化合物の資化性を付与して用いてもよい。加えて、３ＨＰＡサイクルを保有する微生物を遺伝子組換えの宿主としてもよい。本発明の方法で使用できる微生物としては例えば、上記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を形質転換される遺伝子組換えの宿主として利用する微生物で記載したのと同様の微生物が例示されうる。これらのうち、操作性、遺伝子組換えの容易さ、遺伝子発現系の有無、微生物の増殖速度、培養における知見などを考慮すると、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が好ましい。なお、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼと、マロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子、マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子または３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子とは、同一の宿主に形質転換されてもあるいは異なる宿主に形質転換されてもよいが、同一の宿主に形質転換されることが好ましい。このように単一の宿主に形質転換することにより、アセチルＣｏＡ→マロニルＣｏＡ→３ＨＰＡの反応が一の宿主（例えば、微生物）中で行われるため、上記反応が効率よく進行し、また、宿主間の培養条件の違いを考慮する必要がないため、形質転換された宿主を最適の培養条件で培養することができる。
【００４９】
なお、本発明の方法は、上述したように、３ＨＰＡを代謝産物（好ましくは、最終代謝産物）として発酵により生産することが好ましい。これにより、３ＨＰＡサイクルを元来保有する微生物を利用して３ＨＰＡサイクルの中間代謝産物として３ＨＰＡを発酵生産する場合よりも、効率的に３ＨＰＡを発酵生産可能となり、かつ一旦発酵液中に生成された３ＨＰＡが他の化合物に変換されること防ぐ効果も併せて期待できる。
【００５０】
マロニルＣｏＡレダクターゼを形質転換される宿主にはまた、マロニルＣｏＡを基質とした反応を触媒する酵素遺伝子を破壊した組換え生物またはマロニルＣｏＡを基質とした反応を触媒する酵素遺伝子の活性を抑制させる遺伝子改変を行った生物を利用してもよい。例えば、マロニルＣｏＡを基質としマロニル−ＡＣＰを合成するマロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰトランスアシラーゼ遺伝子を破壊した遺伝子破壊株や、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩをコードするｆａｂＦ遺伝子を高発現させることでマロニルＣｏＡが脂肪酸に変換されることを抑制した遺伝子組換え生物または突然変異生物も利用可能である。
【００５１】
このように、マロニルＣｏＡが他の反応の基質となることを阻害する代謝改変、または、マロニルＣｏＡ生合成量を増加させる遺伝子改変の具体的例を記載したが、同様の効果が得られる代謝改変または変異株であれば本発明の方法の遺伝子組換え宿主として利用可能である。
【００５２】
また、３ＨＰＡサイクルを保有する微生物も遺伝子組換えの宿主として利用可能であり、３ＨＰＡサイクルを保有する微生物において、マロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子を高発現させる、または外来のマロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子を導入・高発現させることで、さらに３ＨＰＡ生成量を増加させることも可能である。加えて、３ＨＰＡを基質とする反応を触媒する酵素遺伝子、具体的には３−ヒドロキシプロピオン酸ＣｏＡリガーゼをコードする遺伝子を破壊することで３ＨＰＡ生成量を増加させることもできる。
【００５３】
酵素遺伝子によっては、複数の活性ドメインを有し、１つの酵素遺伝子で複数の反応を触媒するｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｚｙｍｅが存在するが、マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する活性ドメインを保有する酵素遺伝子を利用して３ＨＰＡを生成することも可能である。
【００５４】
以上のように、配列番号：２にマロニルＣｏＡレダクターゼ、配列番号：３、５、７，９に３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼを例示したが、配列番号：２、３、５、７、９で表される塩基配列からなる遺伝子と機能的に同等の遺伝子も包括される。「機能的に同等の遺伝子」とは、対象となる遺伝子によってコードされるタンパク質が、各配列番号で表される塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質と同等の生物学的機能、生化学的機能を有することを指す。
【００５５】
あるタンパク質と機能的に同等のタンパク質をコードする遺伝子を調製する当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊｅｔａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  ９．４７−９．５８，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  ｐｒｅｓｓ（１９８９））を利用する方法が挙げられる。
【００５６】
例えば、配列番号：２で表される塩基配列の全長において、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断による核酸断片の変異、欠失、連結等により、部分的にその配列が変化したものであっても、これらの変異型遺伝子が配列番号：２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、マロニルＣｏＡレダクターゼの活性、すなわち、マロニルＣｏＡを基質とし３ＨＰＡを生成する酵素活性を有する限り、マロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子に含まれる。その他、マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子についても同様である。
【００５７】
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、すなわち、各遺伝子に対し高い相同性を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、このような条件は、０．５〜１ＭのＮａＣｌ存在下４２〜６８℃で、又は５０％ホルムアミド存在下４２℃で、又は水溶液中６５〜６８℃で、ハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液を用いて室温（２０℃）〜６８℃でフィルターを洗浄することにより達成できる。
【００５８】
上記のようなストリンジェントな条件においては、対象となる塩基配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子が、対象となる塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とハイブリダイズすることができる。
【００５９】
各遺伝子には、各アミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質をコードする遺伝子も包含される。例えば、配列番号：１のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質としては、配列番号：１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、マロニルＣｏＡレダクターゼの活性を示すタンパク質が挙げられる。
【００６０】
ここで、タンパク質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的にタンパク質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、異なるアミノ酸残基間の保存的置換の例としては、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、グリシンとアラニン（Ａｌａ）又はバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、スレオニンとセリン（Ｓｅｒ）又はアラニン、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等のアミノ酸の間での置換が知られている。
【００６１】
したがって、配列番号：１のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、付加、挿入又は置換が生じた結果得られたアミノ酸配列からなる変異型タンパク質であっても、その変異が配列番号：１に記載のアミノ酸配列の３次元構造において保存性が高い変異であって、その変異型タンパク質がマロニルＣｏＡを基質とし３ＨＰＡを生成する酵素活性を有しているのであれば、これらの変異型タンパク質をコードする遺伝子もまたマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子に包含される。ここで、数個とは、通常２〜５個、好ましくは２〜３個である。
【００６２】
また、マロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子には、配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、マロニルＣｏＡを基質とし３ＨＰＡを生成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も包含される。その他のマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ、並びにアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子についても同様である。
【００６３】
マロニルＣｏＡレダクターゼ、マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、同一の宿主で発現させる限り、ゲノムに導入してもよいし、同一のベクターに導入して形質転換を行ってもよいし、別々のベクターに導入して形質転換を行ってもよい。
【００６４】
宿主として利用する生物への遺伝子の導入は、上記遺伝子又はその一部を適当なベクターに連結し、得られた組換えベクターを目的の遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより、又は相同組換えによってゲノム上の任意の位置に目的の遺伝子又はその一部を挿入することにより実施できる。「一部」とは、宿主中に導入された場合に各遺伝子がコードするタンパク質を発現することができる、または所望の酵素活性を有するタンパク質を発現させることができる各遺伝子の一部分を指す。本発明において遺伝子には、ＤＮＡ及びＲＮＡが包含され、好ましくはＤＮＡである。
【００６５】
微生物のゲノムから所望の遺伝子をクローニングにより取得する方法は、分子生物学の分野において周知である。例えば遺伝子の配列が既知の場合、制限エンドヌクレアーゼ消化により適したゲノムライブラリを作り、所望の遺伝子配列に相補的なプローブを用いてスクリーニングすることができる。配列が単離されたら、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，２０２号）のような標準的増幅法を用いてＤＮＡを増幅し、形質転換に適した量のＤＮＡを得ることができる。マロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子、マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、またはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子等の遺伝子は、既知の遺伝子以外にも、既知の遺伝子の塩基配列に基づいて適当に設計された合成プライマーを用いてハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法などによりＧｅｎＢａｎｋ等の公開データベースに登録されていない遺伝子も取得することも可能である。
【００６６】
遺伝子のクローニングに用いるゲノムＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている。
【００６７】
遺伝子を連結するベクターは、宿主で複製可能なものであれば特に限定されない。例えば大腸菌では、外来遺伝子導入に利用されているプラスミド、ファージ、コスミド及び大腸菌人工染色体（ＢＡＣ）等が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、ｐＨＳＧ３９８、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＳＣ１０１、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＡＣＹＣ１１７、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＥＴＤｕｅｔ−１、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１、ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社）等が挙げられ、ファージとしては、例えばλｇｔ１０、Ｃｈａｒｏｎ  ４Ａ、ＥＭＢＬ−、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９等が例示できる。
【００６８】
上記ベクターにおいては、挿入した遺伝子が確実に発現されるようにするため、該遺伝子の上流に適当な発現プロモーターを接続する。使用する発現プロモーターは、特に制限されず、使用する宿主や３ＨＰＡ発酵生産に適した培養条件下で効率的に遺伝子発現が可能となるプロモーターを当業者が適宜選択すればよい。例えば大腸菌においては、一般的に外来遺伝子発現に利用されているＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λ−ＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター等に加えて、大腸菌由来の硝酸呼吸に関与する硝酸還元遺伝子ｎａｒＧＨＪＩオペロンのＮａｒプロモーター領域や、大腸菌の硝酸還元酵素遺伝子であるＦｒｄ遺伝子のプロモーター領域を利用することもできる。Ｎａｒプロモーター領域やＦｒｄプロモーターは嫌気条件において遺伝子発現誘導を受けるプロモーターである。さらに、グルコース代謝に関与するグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子や６−ホスホフルクトキナーゼ遺伝子等のプロモーター領域、および大腸菌において酸耐性機構に関与するグルタミン酸脱炭酸酵素遺伝子等のプロモーター領域も利用することができる。
【００６９】
遺伝子破壊の方法は公知の方法を使用できる。具体的には、標的遺伝子の任意の位置で相同組換えを起こすベクター（ターゲティングベクター）を用いて当該遺伝子を破壊する方法（ジーンターゲティング法）や、標的遺伝子の任意の位置にトラップベクター（プロモーターを持たないレポーター遺伝子）を挿入して当該遺伝子を破壊しその機能を失わせる方法（遺伝子トラップ法）、それらを組み合わせた方法等の当技術分野でノックアウト細胞、トランスジェニック動物（ノックアウト動物含む）等を作製する際に用いられる方法を用いることが出来る。また、破壊したい遺伝子のアンチセンスｃＤＮＡを発現するベクターを導入する方法や、破壊したい遺伝子の２重鎖ＲＮＡを発現するベクターを細胞に導入する方法も利用できる。当該ベクターとしては、ウイルスベクターやプラスミドベクター等が包含され、通常の遺伝子工学的手法に基づき、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従い作製することができる。又、市販されているベクターを任意の制限酵素で切断し所望の遺伝子等を組み込んで半合成することもできる。
【００７０】
相同置換を起こす位置又はトラップベクターを挿入する位置は、破壊したい標的遺伝子の発現を消失させる変異を生じる位置であれば特に限定されないが、好ましくは転写調節領域、より好ましくは第２エクソンを置換する。
【００７１】
また、Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅ社より販売されている、リコンビネーションタンパク質を利用した相同組換えによる遺伝子破壊系（Ｒｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を利用すれば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、またはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の、破壊したい遺伝子のみを選択的に破壊した遺伝子破壊株を構築することが可能である。さらに、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社から販売されているグループ２イントロンを利用した遺伝子破壊システムであるＴａｒｇｅＴｒｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｙｓｔｅｍを利用することで、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｔｃｏｃｃｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の遺伝子破壊も可能である。
【００７２】
ベクターの宿主への導入方法は、使用する宿主によって選定すれば良く、特に制限されない。例えば大腸菌では、ベクター導入に一般的に利用されている電気パルス法、カルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法等を利用することができる。
【００７３】
相同組換えによってゲノム上の任意の位置に目的の遺伝子を挿入する方法は、ゲノム上の配列と相同な配列に目的遺伝子をプロモーターとともに挿入し、この核酸断片をエレクトロポレーションによって細胞内に導入して相同組換えを起こさせることにより実施できる。ゲノムへの導入の際には目的遺伝子と薬剤耐性遺伝子を連結した核酸断片を用いると容易に相同組換えが起こった株を選抜することができる。また、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的に機能する遺伝子を連結した遺伝子をゲノム上に上記の方法で相同組換えによって挿入し、その後、薬剤耐性遺伝子と特定の条件下で致死的になる遺伝子を置き換える形で目的遺伝子を相同組換えにより導入することもできる。
【００７４】
目的とする遺伝子が導入された組換え微生物を選択する方法は、特に制限されないが、目的とする遺伝子が導入された組換え微生物のみを、容易に選択できる手法が好ましい。
【００７５】
また一実施形態において本発明の方法は、マロニルＣｏＡから３ＨＰＡを生成する能力を有する生物または遺伝子組換え生物を、マロニルＣｏＡおよび／またはアセチルＣｏＡと接触させることにより実施することも可能である。遺伝子組換え生物を構築する際の遺伝子導入方法、宿主選定方法、使用する宿主の代謝改変方法等の組換え生物の構築方法については、既に記載した通りである。
【００７６】
本発明において、マロニルＣｏＡから３ＨＰＡへの反応をマロニルＣｏＡレダクターゼの存在下で行う場合には、当該反応を高いＮＡＤＰＨ量の条件下で行うことが好ましい。すなわち、本発明は、高いＮＡＤＰＨ量の条件下でかつマロニルＣｏＡレダクターゼの存在下で、マロニルＣｏＡを反応させて３−ヒドロキシプロピオン酸を生産することを有する、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法をも提供する。なお、当該方法は、上記本発明のマロニルＣｏＡの生合成量を増加させる効果を有するアセチルＣｏＡカルボキシラーゼを使用する方法と組み合わせてもよい。この方法は、特にＮＡＤＰＨ依存性のマロニルＣｏＡレダクターゼを利用する場合に好適に実施され、原料とする化合物を資化する代謝経路上でより多くのＮＡＤＰＨが生成されるように代謝改変を行った遺伝子組換え生物でも利用可能である。例えば、マロニルＣｏＡから３ＨＰＡへの反応をマロニルＣｏＡレダクターゼの存在下で高いＮＡＤＰＨ量の条件下で行い、この際グルコース等の糖を原料として用いる場合には、当該反応をグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子または６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を高発現する微生物を用いて行うことが好ましい。グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子や６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、ペントースリン酸経路においてＮＡＤＰ依存性の反応を触媒する酵素遺伝子であるため、これらいずれかの遺伝子を導入または高発現させることで、糖代謝におけるＮＡＤＰＨ生成量を増加させ、３ＨＰＡをより効率的に発酵生産することができる。すなわち、マロニルＣｏＡから３ＨＰＡへの反応をマロニルＣｏＡレダクターゼの存在下で行う場合には、マロニルＣｏＡから３ＨＰＡへの反応を、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子または６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を高発現する微生物を用いて行うことが好ましい。または、下記反応：
【００７７】
【化１】
2012085635.tif 000002
【００７８】
を触媒するトランスヒドロゲナーゼ遺伝子を導入または高発現させることで、細胞内の酸化還元バランスが制御でき、効率的な３ＨＰＡ発酵生産を行うこともできる。
【００７９】
ここで、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは、下記反応：
【００８０】
【化２】
2012085635.tif 000003
【００８１】
を触媒する酵素活性を有するタンパク質であれば特に制限されず、公知のものを使用できる。利用するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、当該遺伝子の発現の容易さ、遺伝子が発現したことにより合成される酵素タンパク質の合成のし易さ等から宿主として利用する生物が元来保有するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を高発現させることが好ましい。例えば、大腸菌を宿主として利用する場合は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が好ましい。
【００８２】
配列番号：１９にＥ．  ｃｏｌｉ由来グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列を例示する。これらの塩基配列由来のアミノ酸配列を含むタンパク質がグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する限り、配列番号：１９で表される塩基配列の変更により、相当するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。
【００８３】
また、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは、下記反応：
【００８４】
【化３】
2012085635.tif 000004
【００８５】
を触媒する酵素活性を有するタンパク質であれば特に制限されず、公知のものを使用できる。利用する６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、当該遺伝子の発現の容易さ、遺伝子が発現したことにより合成される酵素タンパク質の合成のし易さ等から宿主として利用する生物が元来保有する６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を高発現させることが好ましい。例えば、大腸菌を宿主として利用する場合は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来の６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼが好ましい。
【００８６】
配列番号：２０にＥ．  ｃｏｌｉ由来６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列を例示する。これらの塩基配列由来のアミノ酸配列を含むタンパク質が６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する限り、配列番号：２０で表される塩基配列の変更により、相当するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。
【００８７】
上記グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは、それぞれ、単独で使用してももしくは２種以上の混合物として使用してもよく、または、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの１以上と６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの１以上とを組み合わせて使用してもよい。
【００８８】
また、本発明の方法に用いられるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの形態は、特に制限されず、公知のいずれの形態も適用できる。具体的には、細胞内より精製した酵素タンパク質そのものでもよいし、細胞内でグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子または６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が発現したことにより合成された酵素を包括した細胞、上記酵素の固定化酵素などが利用できる。また、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼまたは６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは、当該酵素活性を発揮する限り、そのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。
【００８９】
また、本発明において、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子または６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を形質転換される遺伝子組換えの宿主として利用する生物は、アセチルＣｏＡおよび／またはマロニルＣｏＡを生合成可能な生物であればどんな生物でもよいが、操作の容易さ、使用できる宿主の汎用性、生物の増殖速度などを考慮すると、微生物が好ましい。宿主の選定は、３ＨＰＡの原料とする化合物の資化性を有しているかにより選定してよい。また、生育速度が速い、酸に対する耐性が高い等、３ＨＰＡ発酵生産において有利な形質を有する生物に、原料として利用する化合物の資化性を付与して用いてもよい。加えて、３ＨＰＡサイクルを保有する微生物を遺伝子組換えの宿主としてもよい。本発明の方法で使用できる微生物としては例えば、上記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を形質転換される遺伝子組換えの宿主として利用する微生物で記載したのと同様の微生物が例示されうる。これらのうち、操作性、遺伝子組換えの容易さ、遺伝子発現系の有無、微生物の増殖速度、培養における知見などを考慮すると、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が好ましい。なお、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼと、マロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子、必要であれば、マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子または３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子と、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子および／または６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子と、は、同一の宿主に形質転換されてもあるいは異なる宿主に形質転換されてもよいが、同一の宿主に形質転換されることが好ましい。このように単一の宿主に形質転換することにより、アセチルＣｏＡ→マロニルＣｏＡ→３ＨＰＡの反応が一の宿主（例えば、微生物）中で行われるため、上記反応が効率よく進行し、また、宿主間の培養条件の違いを考慮する必要がないため、形質転換された宿主を最適の培養条件で培養することができる。上記に加えて、各酵素遺伝子による酵素反応を１つの細胞内で行うことで、各酵素反応で必要となる酸化力（ＮＡＤ、ＮＡＤＰ）や還元力（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ）の授受を効率よく行うことが可能となり、３ＨＰＡ生産性を向上させることができる利点がある。
【００９０】
このように、原料とする化合物を資化する代謝経路において、より多くのＮＡＤＰＨが生成するような代謝改変、または、細胞内の酸化還元バランスを制御するための遺伝子改変の具体的例を記載したが、同様の効果が得られる代謝改変または変異株であれば本発明の方法の遺伝子組換え宿主として利用可能である。
【００９１】
３ＨＰＡを発酵生産する場合に適した生物も本発明の方法では利用可能である。例えば、乳酸発酵において発酵中のｐＨ調整を行わなくとも乳酸生成が可能であることが報告されている、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅを宿主として利用した場合、３ＨＰＡ生成に伴って低下する培地中のｐＨを、ＮａＯＨやアンモニア等のアルカリ試薬を添加することで中性付近に調整しなくとも３ＨＰＡ発酵を継続することが可能となる。このような酸耐性能を有するＳｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ等の生物を利用した３ＨＰＡ発酵（３ＨＰＡ酸型発酵）を行う場合、発酵中のｐＨ調整は必要としない、つまりアルカリ試薬の添加が不要となる。また、発酵液にアルカリ試薬を添加しないため、アルカリ試薬の添加による発酵液の希釈化を行う必要がなく、発酵終了後の発酵液中の３ＨＰＡ濃度を高く保つことができる。よって、３ＨＰＡ酸型発酵によると、原材料の削減、発酵工程以降の工程の簡略化、およびユーティリティーの向上が期待でき、一般的に行われている３ＨＰＡ塩発酵よりも有利な方法となる。前記３ＨＰＡ塩発酵は、アルカリ試薬を添加してｐＨを中性付近に保ちながら発酵を行うものであり、発酵工程終了後の発酵液中の３ＨＰＡは、塩の状態で存在する。３ＨＰＡ塩の状態で発酵液から３ＨＰＡを回収しようとすると、３ＨＰＡの回収率の低下や、続く３ＨＰＡのアクリル酸への脱水反応における収率の低下等が問題となりうる。前記問題を解決する方法として、３ＨＰＡ塩発酵後に、３ＨＰＡ塩を３ＨＰＡに変換してから３ＨＰＡを回収する方法が提案されている。例えば、国際公開第２００２／０９０３１２号パンフレットには、３ＨＰＡアンモニウム塩を含む溶液にアミン系溶媒の添加、加熱によって３ＨＰＡアンモニウム塩を３ＨＰＡに変換し、アミン系溶媒に３ＨＰＡを抽出する方法が開示されている。また、国際公開第２００５／０７３１６１号パンフレットには、３ＨＰＡカルシウム塩を含む溶液に第３級アミン溶媒を添加し、二酸化炭素を流加するによって３ＨＰＡカルシウム塩を３ＨＰＡに変換し、第３級アミン溶媒中に３ＨＰＡを抽出する方法が開示されている。しかしながら、発酵工程におけるｐＨを調整するためのアルカリ試薬が不要である点、並びに３ＨＰＡ塩を３ＨＰＡに変換する工程、およびこれに必要な熱エネルギーや二酸化炭素、酸性試薬等が不要である点から、上述のように、３ＨＰＡ酸型発酵は、原材料の削減、発酵工程以降の工程の簡略化、およびユーテリィティーの向上の観点から、３ＨＰＡ塩発酵と比較して非常に有利な方法である。低ｐＨでも発酵が可能な生物の一例としてＳｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅの利用を記載したが、低ｐＨでも発酵可能な能力を保有した微生物や、生成された３ＨＰＡによる生育阻害に対する耐性を保有する微生物であれば、どのような微生物でも利用可能である。また、低ｐＨでも発酵が継続するように改変した遺伝子組換え微生物、３ＨＰＡによる生育阻害を抑制するように改変した遺伝子組換え微生物、低ｐＨでも発酵が継続するように変異処理を施した変異株、または３ＨＰＡによる生育阻害に対する耐性を向上させた変異株のいずれも利用可能である。低ｐＨでも発酵が可能な微生物としてはＳｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ以外には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属等の酵母、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓが例示できる。当然のことながら、本発明に係る３−ＨＰＡの製造方法は３ＨＰＡ酸型発酵に限定されず、３ＨＰＡ塩型発酵を行ってもよい。
【００９２】
発酵に用いられるマロニルＣｏＡおよび／またはアセチルＣｏＡはどのような化合物から合成したものでも利用可能であり、原料とする化合物を資化する生物において、代謝の過程で生成したマロニルＣｏＡおよび／またはアセチルＣｏＡを利用してもよい。すなわち、様々な化合物を原料として発酵により生成したマロニルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡが含まれる発酵液、または発酵液から精製したマロニルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡを利用することも可能である。ここで、生物の代謝により生合成されたマロニルＣｏＡおよび／またはアセチルＣｏＡは、いずれの炭素源を利用して生成されてもよく、特に制限されないが、例えば、糖、糖アルコール、アルコール、脂肪酸、カルボン酸、一酸化炭素、または二酸化炭素を炭素源とした生物の代謝により生合成されたマロニルＣｏＡおよび／またはアセチルＣｏＡが好ましく使用できる。ここで、糖としては、特に制限されず、培養に使用される一般的な糖が使用でき、その生物種によって適宜選択される。例えば、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース等の六炭糖類、キシロース等の五炭糖類、デンプンの加水分解等により得られた糖類、セルロース系バイオマスを糖化処理することにより得られる糖類などが使用できる。また、糖アルコールとしては、特に制限されず、培養に使用される一般的な糖アルコールが使用でき、その生物種によって適宜選択される。例えば、グリセリン、エリスリトール、Ｄ，Ｌ−トレイトール、Ｄ，Ｌ−アラビニトール、キシリトール、リビトール（アドニトール）、Ｄ−イジトール、ガラクチトール（ダルシトール）、Ｄ−グルシトール（ソルビトール）、マンニトール、ボレミトール、ペルセイトール、Ｄ−エリトロ−Ｄ−ガラクト−オクチトールなどが挙げられる。アルコールとしては、特に制限されず、培養に使用される一般的なアルコールが使用でき、その生物種によって適宜選択される。例えば、メタノール、エタノール、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。脂肪酸としては、特に制限されず、培養に使用される一般的な脂肪酸が使用でき、その生物種によって適宜選択される。例えば、オクタン酸、ドデカン酸、酪酸、カプロン酸、デカン酸、などが挙げられる。カルボン酸としては、特に制限されず、培養に使用される一般的なカルボン酸が使用でき、その生物種によって適宜選択される。例えば、乳酸、酢酸、グルコン酸、プロピオン酸、蟻酸などが挙げられる。上記炭素源を資化しうる微生物の種類は、特に制限されず、公知の微生物が資化する炭素源の種類によって適宜選択されうる。
【００９３】
また、還元的ＴＣＡ回路、アセチルＣｏＡ経路、３−ヒドロキシプロピオン酸経路、カルビンベンソン経路等の炭素固定能を有する微生物により、炭素固定により生成されたマロニルＣｏＡおよび／またはアセチルＣｏＡでもよい。炭素は例えば、二酸化炭素または一酸化炭素に含まれる炭素でもよい。これらのうち、原料入手の汎用性、容易さ等を考慮すると、一酸化炭素および／または二酸化炭素を炭素源として使用することが好ましい。すなわち、本発明の方法は、一酸化炭素および／または二酸化炭素を炭素源として用いた微生物の代謝によりアセチルＣｏＡまたはマロニルＣｏＡを生産することをさらに有することが好ましい。一酸化炭素および／または二酸化炭素を炭素源としてアセチルＣｏＡまたはマロニルＣｏＡを生産する微生物の種類は特に限定されず、公知の炭素固定能を有する微生物が利用可能である。例えば、炭素源として一酸化炭素を用いる場合には、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ属に属する微生物などが好ましく使用される。また、炭素源として二酸化炭素を用いる場合には、Ｍｏｏｒｅｌｌａ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ属に属する微生物などが好ましく使用される。
【００９４】
本発明において、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造は、上記生物、あるいは複数の生物を原料として利用する化合物と接触させ、生物が原料とする化合物を資化することで生成したマロニルＣｏＡおよび／またはアセチルＣｏＡから３ＨＰＡを生成、反応液中に３−ヒドロキシプロピオン酸を蓄積させ、３−ヒドロキシプロピオン酸を採取することにより実施できる。
【００９５】
上記生物と原料として利用する化合物とを接触させるとは、原料として利用する化合物の存在下で微生物又はその処理物を培養すること、また、本発明の微生物の処理物を用いて反応を行うことを包含する。該処理物としては、アセトン、トルエン等で処理した菌体、菌死体、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、菌体を破砕した無細胞抽出物、これらから酵素を抽出した粗酵素液、精製酵素等が挙げられる。また、常法により担体に固定化した菌体、該処理物、酵素等を用いることもできる。
【００９６】
培養に用いる培地及び培養条件は、宿主として利用する生物の生育条件により選定すれば良く、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができ、特に限定されない。例えば、大腸菌においてはＬＢ培地が例示できる。培養は、宿主として利用する生物の生育に好適な条件で行われれば良く、特に限定されない。例えば、大腸菌を宿主として利用する場合は、培養温度１０℃〜４５℃で、１６〜９６時間実施する。培養を連続的に行う場合には、培養は１週間〜３ヶ月間実施する。
【００９７】
微生物の培養におけるｐＨは、３ＨＰＡが効率的に発酵生産可能なｐＨであれば特に限定されない。上述のように、酸耐性能を有する微生物を用いて培養を行う場合（３ＨＰＡ酸型発酵）、低ｐＨでも発酵産物の生成が継続するため、アルカリ試薬を添加してｐＨを中性付近に調整することなく培養することが可能である。例として、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅを宿主として利用する場合、培養開始時は使用する培地のｐＨ（中性付近）から培養は開始するが、３ＨＰＡの生成に伴って次第に培地のｐＨは低下する。ｐＨ２．５付近まで培地のｐＨが低下すると宿主の生育は抑制されるが、ｐＨ２．５以下、例えばｐＨ１付近まで培地のｐＨが低下したとしても、培地中の炭素源は資化され、３ＨＰＡ生産は継続する。３ＨＰＡの培地中の濃度が１００ｇ／Ｌを超えた段階で培養を終了すると、培地のｐＨは４未満となる。このように、発酵工程においてアルカリ試薬を添加せずに培養を行い、ｐＨ４未満の３ＨＰＡ発酵液を得ることで、発酵工程以降の工程、例えば、発酵液からの３ＨＰＡ回収工程に用いる場合に、前述のように、原材料の削減、工程の簡略化、およびユーティリティーの向上が期待できる。なお、例えば微生物の生育などを考慮して、ｐＨを適切な範囲に調整してもよい。一方、３ＨＰＡ塩型発酵を行う場合、使用する宿主の生育を妨害せず、３ＨＰＡが効率的に発酵生産可能なｐＨを発酵期間中は維持することが望ましく、ｐＨの維持には培養液から酸を分離するときの障害とならない試薬を用いて調整することが好ましい。例として、大腸菌を宿主として利用する場合、培養期間中ｐＨは、５．０以上、好ましくは５．５以上で、１０．０以下、好ましくは９．７以下に保持することが望ましい。ｐＨ調整には無機又は有機の酸性又はアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。炭酸ナトリウム、アンモニア、ナトリウムイオン供給源を添加してもよい。また、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化アンモニウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液等の一般的なアルカリ試薬を用いてもよい。
【００９８】
窒素源は使用する宿主の生育に適した窒素源を選定すれば良く特に限定されない。例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等の利用が挙げられる。また、無機物も同様に宿主の生育に適した窒素源を選定すれば良く特に限定されない。例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
【００９９】
培養中は、カナマイシン、アンピシリン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、インデューサーを培地に添加することもできる。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）、アラビノース、ラクトース等を培地に添加することができる。
【０１００】
あるいは、上記において得られた生物の培養物から遠心分離などによって集菌を行い、適当なバッファーや培地に懸濁する。この菌体懸濁液を、マロニルＣｏＡおよび／またはアセチルＣｏＡを含むバッファーに懸濁し、菌体での反応を行うことによって、３−ヒドロキシプロピオン酸を製造することもできる。反応の条件は、例えば、反応温度は１０〜８０℃、好ましくは１５〜５０℃、反応時間は５分〜９６時間、好ましくは１０分〜７２時間、ｐＨは５．０以上、好ましくは５．５以上で、１０．０以下、好ましくは９．７以下が例示できるが、３ＨＰＡ生成に適した反応条件であれば特に限定されない。反応を連続的に行う場合には、反応を１週間〜３ヶ月間実施する。
【０１０１】
３−ヒドロキシプロピオン酸の精製法は当該技術分野において周知である。例えば、有機溶媒を用いる抽出、蒸留及びカラムクロマトグラフィーに反応混合物を供することにより、培地から３−ヒドロキシプロピオン酸を得ることができる（米国特許第５，３５６，８１２号）。また、限外濾過膜や水などの低分子のみが透過できるゼオライト分離膜などで発酵液の濃縮を行うのが好ましい。濃縮を行うことにより、水を蒸発させるためのエネルギーを低減することができる。培地を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析にかけることにより、３−ヒドロキシプロピオン酸を直接同定することもできる。
【０１０２】
本発明の方法で製造される３−ヒドロキシプロピオン酸は様々な分野において使用できる。一実施形態においては、上記方法によって得られた３−ヒドロキシプロピオン酸を脱
水することによりアクリル酸を製造することができる。すなわち、本発明は、本発明の方法により製造される３−ヒドロキシプロピオン酸を脱水することを有する、アクリル酸の製造方法をも提供する。ここで、３−ヒドロキシプロピオン酸の脱水は、公知の反応によって実施することができる。例えば、米国特許第２，４６９，７０１号にも記載されているように、３−ヒドロキシプロピオン酸は、触媒の存在下で減圧蒸留することにより容易にアクリル酸に変換することができる。
【０１０３】
また、本発明の方法で得られるアクリル酸を含む組成物は精製してもよく、精製を行う場合は、好ましくは、晶析工程を用いる。したがって本発明は、本発明の方法により製造されるアクリル酸を、晶析等の精製工程により精製し、精製アクリル酸を得る製造方法をも提供する。
【０１０４】
晶析工程は、アクリル酸を含む組成物を晶析装置に供給して結晶化させることにより、精製アクリル酸を得る工程である。なお、結晶化の方法としては、従来公知の結晶化方法を採用すればよく、特に限定されるものではないが、結晶化は、例えば、連続式または回分式の晶析装置を用いて、１段または２段以上で実施することができる。得られたアクリル酸の結晶は、必要に応じて、さらに洗浄や発汗などの精製を行うことにより、さらに純度の高い精製アクリル酸を得ることができる。
【０１０５】
連続式の晶析装置としては、例えば、結晶化部、固液分離部および結晶精製部が一体になった晶析装置（例えば、新日鐵化学社製のＢＭＣ（Backmixing  Column  Crystallizer）装置、月島機械社製の連続溶融精製システム）や、結晶化部（例えば、GMF  GOUDA社製のＣＤＣ（Cooling  Disk  Crystallizer）装置）、固液分離部（例えば、遠心分離器、ベルトフィルター）および結晶精製部（例えば、呉羽テクノエンジ社製のＫＣＰ（Kureha  Crystal  Purifier）精製装置）を組み合わせた晶析装置などを使用することができる。
【０１０６】
回分式の晶析装置としては、例えば、Sulzer  Chemtech社製の層結晶化装置（動的結晶化装置）、BEFS  PROKEM社製の静的結晶化装置などを使用することができる。
【０１０７】
動的結晶化とは、例えば、結晶化、発汗、融解を行うための温度制御機構を備えた管状の結晶器と、発汗後の母液を回収するタンクと、結晶器に粗アクリル酸を供給する循環ポンプとを備え、結晶器の下部に設けた貯蔵器から循環ポンプにより粗アクリル酸を結晶器の管内上部に移送できる動的結晶化装置を使用して晶析を行う方法である。また、静的結晶化とは、例えば、結晶化、発汗、融解を行うための温度制御機構を備えた管状の結晶器であり、下部に抜き出し弁を有する結晶器と、発汗後の母液を回収するタンクとを備えた静的結晶化装置を使用して晶析を行う方法である。
【０１０８】
具体的には、粗アクリル酸を液相として結晶器に導入し、液相中のアクリル酸を冷却面（管壁面）に凝固・生成させる。冷却面に生成した固相の質量が、結晶器に導入した粗アクリル酸に対して、好ましくは１０〜９０質量％、より好ましくは２０〜８０質量％になったら、直ちに、液相を結晶器から排出し、固相と液相とを分離する。液相の排出は、ポンプで汲み出す方式（動的結晶化）、結晶器から流出させる方式（静的結晶化）のいずれであってもよい。他方、固相は、結晶器から取り出した後、さらに純度を向上させるために、洗浄や発汗などの精製を行ってもよい。
【０１０９】
動的結晶化や静的結晶化を多段で行う場合、向流の原理を採用すれば、有利に実施することができる。このとき、各段階で結晶化されたアクリル酸は、残留母液から分離され、より高い純度を有するアクリル酸が生成する段階に供給される。他方、残留母液は、より低い純度を有するアクリル酸が生成する段階に供給される。
【０１１０】
なお、動的結晶化では、アクリル酸の純度が低くなると、結晶化が困難になるが、静的結晶化では、動的結晶化に比べて、残留母液が冷却面に接触する時間が長く、また、温度の影響が伝わり易いので、アクリル酸の純度が低下しても、結晶化が容易である。それゆえ、アクリル酸の回収率を向上させるために、動的結晶化における最終的な残留母液を静的結晶化に付して、さらに結晶化を行ってもよい。
【０１１１】
必要となる結晶化段数は、どの程度の純度が要求されるかに依存するが、高純度のアクリル酸を得るために必要な段数は、精製段階（動的結晶化）が通常１〜６回、好ましくは２〜５回、より好ましくは２〜４回であり、ストリッピング段階（動的結晶化および／または静的結晶化）が通常０〜５回、好ましくは０〜３回である。通常、供給される粗アクリル酸より高い純度を有するアクリル酸が得られる段階は、すべて精製段階であり、それ以外の段階は、すべてストリッピング段階である。ストリッピング段階は、精製段階から残留母液に含まれるアクリル酸を回収するために実施される。なお、ストリッピング段階は、必ずしも設ける必要はなく、例えば、蒸留塔を用いて、晶析装置の残留母液から低沸点成分を分離する場合には、ストリッピング段階は省略してもよい。
【０１１２】
動的結晶化および静的結晶化のいずれを採用する場合であっても、晶析工程で得られるアクリル酸の結晶は、そのまま製品としてもよいし、必要に応じて、さらに洗浄や発汗などの精製を行ってから製品としてもよい。他方、晶析工程で排出される残留母液は、系外に取り出してもよい。
【０１１３】
上記方法で製造されるアクリル酸は、アクリル酸エステル、ポリアクリル酸等のアクリル酸誘導体の原料として使用可能であることは公知となっていることから、上記アクリル酸の製造方法を、アクリル酸誘導体の製造方法におけるアクリル酸製造工程にすることも可能である。すなわち、一実施形態においては、上記方法によって得られたアクリル酸を部分中和して部分中和アクリル酸を製造し、これを必要であれば他のモノマーと（共）重合することにより、吸水性樹脂を製造することができる。したがって、本発明は、本発明の方法により製造されるアクリル酸を部分中和して部分中和アクリル酸を製造し、前記部分中和アクリル酸を架橋性モノマーと共重合することを有する、吸水性樹脂の製造方法をも提供する。ここで、上記部分中和および（共）重合は、公知の反応によって実施することができ、例えば、本発明の製造方法により得られたアクリル酸および／またはその塩を単量体成分の主成分（好ましくは７０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上）とし、さらに０．００１〜５モル％（アクリル酸に対する値）程度の架橋剤、０．００１〜２モル％（単量体成分に対する値）程度のラジカル重合開始剤を用いて、架橋重合させた後、乾燥・粉砕することにより、吸水性樹脂が得られる。
【０１１４】
ここで、吸水性樹脂とは、架橋構造を有する水膨潤性水不溶性のポリアクリル酸であって、自重の３倍以上、好ましくは１０〜１，０００倍の純水または生理食塩水を吸水し、また、水溶性成分（水可溶分）が好ましくは２５質量％以下、より好ましくは１０質量％以下である水不溶性ヒドロゲルを生成するポリアクリル酸を意味する。このような吸水性樹脂の具体例や物性測定法は、例えば、米国特許第６，１０７，３５８号、米国特許第６，１７４，９７８号、米国特許第６，２４１，９２８号などに記載されている。
【０１１５】
また、生産性向上の観点から好ましい製造方法は、例えば、米国特許第６，８６７，２６９号、米国特許第６，９０６，１５９号、米国特許第７，０９１，２５３号、国際公開第０１／０３８４０２号パンフレット、国際公開第２００６／０３４８０６号パンフレットなどに記載されている。
【０１１６】
アクリル酸を出発原料として、中和、重合、乾燥などにより、吸水性樹脂を製造する一連の工程は、例えば、以下の通りである。
【０１１７】
本発明の製造方法により得られるアクリル酸の一部は、ラインを介して、吸水性樹脂の製造プロセスに供給される。吸収性樹脂の製造プロセスにおいては、アクリル酸を中和工程，重合工程，乾燥工程に導入して、所望の処理を施すことにより、吸水性樹脂を製造する。各種物性の改善を目的として所望の処理を施してもよく、例えば、重合中または重合後に架橋工程を介在させてもよい。
【０１１８】
中和工程は、任意の工程であり、例えば、所定量の塩基性物質の粉末または水溶液と、アクリル酸やポリアクリル酸（塩）とを混合する方法が例示されるが、従来公知の方法を採用すればよく、特に限定されるものではない。なお、中和工程は、重合前または重合後のいずれで行なってもよく、また、重合前後の両方で行なってもよい。アクリル酸やポリアクリル酸（塩）の中和に用いられる塩基性物質としては、例えば、炭酸（水素）塩、アルカリ金属の水酸化物、アンモニア、有機アミンなど、従来公知の塩基性物質を適宜用いればよい。また、ポリアクリル酸の中和率は、特に限定されるものではなく、任意の中和率（例えば、３０〜１００モル％の範囲内における任意の値）となるように調整すればよい。
【０１１９】
重合工程における重合方法は、特に限定されるものではなく、ラジカル重合開始剤による重合、放射線重合、電子線や活性エネルギー線の照射による重合、光増感剤による紫外線重合など、従来公知の重合方法を用いればよい。また、重合開始剤、重合条件など各種条件については、任意に選択することができる。もちろん、必要に応じて、架橋剤や他の単量体、さらには水溶性連鎖移動剤や親水性高分子など、従来公知の添加剤を添加してもよい。
【０１２０】
重合後のアクリル酸塩系ポリマー（すなわち、吸水性樹脂）は、乾燥工程に付される。乾燥方法としては、特に限定されるものではなく、熱風乾燥機，流動層乾燥機，ナウター式乾燥機など、従来公知の乾燥手段を用いて、所望の乾燥温度、好ましくは７０〜２３０℃で、適宜乾燥させればよい。
【０１２１】
乾燥工程を経て得られた吸水性樹脂は、そのまま用いてもよく、さらに所望の形状に造粒・粉砕、表面架橋をしてから用いてもよく、還元剤、香料、バインダーなど、従来公知の添加剤を添加するなど、用途に応じた後処理を施してから用いてもよい。
【０１２２】
本発明はまた、マロニルＣｏＡレダクターゼ活性及び／またはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を含む、マロニルＣｏＡ及び／またはアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシプロピオン酸を製造するための組成物に関する。当該組成物は、これらの酵素を産生する生物又はその処理物から製造することができる。
【実施例】
【０１２３】
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。
【０１２４】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り下記の実施例に限定されるものではない。
【０１２５】
比較例１：Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来マロニルＣｏＡレダクターゼ導入大腸菌を用いた３ＨＰＡ発酵生産
Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＯＫ−７０−ｆｌ（ＡＴＣＣ２９３６５）株のマロニルＣｏＡレダクターゼ（ｍｃｒ）遺伝子の塩基配列（配列番号２）を元に、マロニルＣｏＡレダクターゼの構造遺伝子領域を増幅するプライマー（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来ｍｃｒ増幅用プライマー；配列番号１１、１２）を設計した。設計したプライマーを用いて、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＡＴＣＣ２９３６５株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＡＴＣＣ２９３６５のマロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子を取得した。取得したマロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子を、ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＴａｃプロモーター下流にクローニングし、ｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１を構築した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆｕｓｉｏｎ  ｂｌｕｅ（Ｔａｋａｒａ社）のプロトコールに従って、構築したｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１をヒートショック法により導入し、Ｅ．  ｃｏｌｉ（ｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１）を取得した。
【０１２６】
Ｅ．  ｃｏｌｉ（ｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１）をＩＰＴＧ添加（最終濃度１ｍＭ）２ｗｔ／ｖｏｌ％グルコース添加Ｍ９培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌し、３７℃で４８時間培養を行った。培養上清１００μＬに内部標準液  ２００μＬを加えた。ヒドロキシカルボン酸ラベル化試薬（ＹＭＣ社）の試薬Ａ液  ２００μＬ、試薬Ｂ液  ２００μＬを加え、よく混合した後、６０℃、２０分間処理した。ヒドロキシカルボン酸ラベル化試薬（ＹＭＣ社）の試薬Ｃ液  ２００μＬを添加し、よく混合した。６０℃、１５分間処理後、室温まで冷えたら０．４５  ｍｍフィルターに通し、ＬＣ分析サンプルとして供した。
【０１２７】
得られたＬＣ分析サンプルを以下の記載の条件で高速液体クロマトグラフィーでの分析に供したところ、３−ヒドロキシプロピオン酸のピークと一致する、７．９分の位置にピークを確認した。したがって、Ｅ．  ｃｏｌｉ（ｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１）を用いた発酵によりグルコースから３ＨＰＡが生成することを確認した。
【０１２８】
【化４】
2012085635.tif 000005
【０１２９】
また、Ｅ．  ｃｏｌｉ（ｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１）をＩＰＴＧ添加（最終濃度１ｍＭ）４ｗｔ／ｖｏｌ％グリセリン添加Ｍ９培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌し、３７℃で４８時間培養を行った。得られた培養液を前述と同様にして高速液体クロマトグラフィーでの分析に供したところ、３−ヒドロキシプロピオン酸のピークと一致する、７．９分の位置にピークを確認した。したがって、Ｅ．  ｃｏｌｉ（ｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１）を用いた発酵により、グリセリンから３ＨＰＡが生成することを確認した。
【０１３０】
実施例１：Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来マロニルＣｏＡレダクターゼおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ導入大腸菌を用いた３ＨＰＡ発酵生産
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２株のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｃ）をコードするａｃｃＢＣ遺伝子およびｄｔｓＲ１遺伝子の塩基配列（配列番号１３、１４）を元に、ａｃｃＢＣ遺伝子およびｄｔｓＲ１遺伝子を増幅するプライマー（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来ａｃｃＢＣ増幅用プライマー；配列番号：１５、１６、ならびにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来ｄｔｓＲ１増幅用プライマー；配列番号：１７、１８）を設計した。設計したプライマーを用いてＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲ増幅を行い、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２株のａｃｃＢＣ遺伝子およびｄｔｓＲ１遺伝子を取得した。取得したａｃｃＢＣ遺伝子およびｄｔｓＲ１遺伝子を、比較例１に記載のｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１のｍｃｒ遺伝子の下流にクローニングし、ｍｃｒ−ａｃｃ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１を構築した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆｕｓｉｏｎ  ｂｌｕｅ（Ｔａｋａｒａ社）のプロトコールに従って、構築したｍｃｒ−ａｃｃ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１をヒートショック法により導入し、Ｅ．  ｃｏｌｉ（ｍｃｒ−ａｃｃ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１）を取得した。
【０１３１】
Ｅ．  ｃｏｌｉ（ｍｃｒ−ａｃｃ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１）をＩＰＴＧ添加（最終濃度１ｍＭ）２ｗｔ／ｖｏｌ％グルコース添加Ｍ９培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌し、３７℃で４８時間培養を行った。得られた培養液を比較例１と同様にして高速液体クロマトグラフィーでの分析に供したところ、比較例１と比較して、３−ヒドロキシプロピオン酸のピークと一致する７．９分の位置のピークが優位に増加した。したがって、マロニルＣｏＡレダクターゼと、宿主として利用する生物とは異なる生物由来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼを併用することで、マロニルＣｏＡレダクターゼを単独で使用する場合よりも効率的に３ＨＰＡ生産が可能となることが確認された。なお、グリセリンを炭素源とした培養においても同様に比較例１に記載の３ＨＰＡピークよりも有意に増加した３ＨＰＡピークを確認した。
【０１３２】
実施例２：Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来マロニルＣｏＡレダクターゼおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来グルコース−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ導入大腸菌を用いた３ＨＰＡ発酵生産
Ｅ．  ｃｏｌｉのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）遺伝子および６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｎｄ）遺伝子の塩基配列（配列番号：１９、２０）を元に、ｚｗｆおよびｇｎｄ遺伝子を増幅するプライマー（Ｅ．  ｃｏｌｉ由来グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ増幅用プライマー；配列番号：２１、２２、ならびにＥ．  ｃｏｌｉ由来６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ増幅用プライマー；配列番号：２３、２４）を設計した。設計したプライマーを用いて、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｋ１２株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲ増幅を行い、Ｅ．  ｃｏｌｉ由来ｚｗｆ遺伝子およびｇｎｄ遺伝子を取得した。取得したｚｗｆ遺伝子およびｇｎｄ遺伝子を、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１（Ｔａｋａｒａ社）のＴ７プロモーター下流にクローニングし、ｚｗｆ−ｇｎｄ／ｐＣＤＦを構築した。
【０１３３】
比較例１記載のＥ．  ｃｏｌｉ  （ｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ）にｚｗｆ−ｇｎｄ／ｐＣＤＦを導入し、Ｅ．  ｃｏｌｉ  （ｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１，ｚｗｆ−ｇｎｄ／ｐＣＤＦ）を取得した。Ｅ．  ｃｏｌｉ  （ｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１，ｚｗｆ−ｇｎｄ／ｐＣＤＦ）をＩＰＴＧ添加（最終濃度１ｍＭ）２ｗｔ／ｖｏｌ％グルコース添加Ｍ９培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌し、３７℃で４８時間培養を行った。得られた培養液を比較例１と同様にして高速液体クロマトグラフィーでの分析に供したところ、比較例１と比較して、３−ヒドロキシプロピオン酸のピークと一致する、７．９分の位置にピークが優位に増加した。したがって、細胞内のＮＡＤＰＨの利用性を高める遺伝子改変を行い、高いＮＡＤＰＨ条件下でマロニルＣｏＡレダクターゼを反応させることで、３ＨＰＡ生産性を向上させることができることを確認した。
【０１３４】
実施例３：Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来マロニルＣｏＡレダクターゼ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来アセチルＣｏＡカルボキシラーゼおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来グルコース−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ導入大腸菌を用いた３ＨＰＡ発酵生産
実施例１に記載のＥ．  ｃｏｌｉ（ｍｃｒ−ａｃｃ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１）に、実施例２に記載のｚｗｆ−ｇｎｄ／ｐＣＤＦを導入し、Ｅ．  ｃｏｌｉ（ｍｃｒ−ａｃｃ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１，ｚｗｆ−ｇｎｄ／ｐＣＤＦ）を取得した。Ｅ．  ｃｏｌｉ（ｍｃｒ−ａｃｃ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１，ｚｗｆ−ｇｎｄ／ｐＣＤＦ）をＩＰＴＧ添加（最終濃度１ｍＭ）２ｗｔ／ｖｏｌ％グルコース添加Ｍ９培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌し、３７℃で４８時間培養を行った。得られた培養液を比較例１と同様にして高速液体クロマトグラフィーでの分析に供したところ、比較例１および実施例１、２と比較して、３−ヒドロキシプロピオン酸のピークと一致する７．９分の位置のピークが優位に増加した。したがって、マロニルＣｏＡレダクターゼと、使用するホストとは異なる生物由来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの併用に加えて、細胞内のＮＡＤＰＨの利用性を高める遺伝子改変を行うことで、マロニルＣｏＡレダクターゼ単独またはマロニルＣｏＡレダクターゼおよびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼを併用した場合よりも、より効率的に３ＨＰＡ生産が可能となることが確認された。
【０１３５】
実施例４：糖から発酵生産した３ＨＰＡを用いたアクリル酸および高吸水性樹脂の合成
実施例１，２，３で得られた３ＨＰＡを含む発酵液１００ｇを、それぞれ、６０００ｒｐｍで２０分遠心後、培養液上清を回収した。回収した培養液上清にトリ−ｎ−オクチルアミン１００ｇを加え、攪拌子で穏やかに２４時間室温（２５℃）で混合した。
【０１３６】
次に、所定時間混合後、混合液を静置して、二相に分離し、有機相を回収した。反応混合物を含む有機相に酸化アルミニウムを５０ｇ添加し、１７０℃で１時間加熱・留出した。得られた留出液を回収し、室温まで冷却した後、１００℃から１３０℃まで徐々に加熱していき、留出液を除去した。その後、減圧して、系内の圧力を２０ｋＰａに保ちながら２００℃まで徐々に加熱していき、留出液を回収することで、アクリル酸を含む溶液（アクリル酸溶液）を得た。
【０１３７】
得られたアクリル酸溶液に、重合禁止剤としてハイドロキノンを６０質量ｐｐｍ（対アクリル酸）添加した。別途、鉄を０．２質量ｐｐｍ含有する苛性ソーダから得られたＮａＯＨ水溶液に対して、上記重合禁止剤添加アクリル酸溶液を冷却下（液温３５℃）で添加することにより、アクリル酸７５モル％中和を行った。得られた、中和率７５モル％、濃度３５質量％のアクリル酸ナトリウム水溶液に、内部架橋剤としてポリエチレングリコールジアクリレート０．０５モル％（アクリル酸ナトリウムに対する値）を溶解することにより、単量体成分を得た。この単量体成分３５０ｇを容積１Ｌの円筒容器に入れ、２Ｌ／ｍｉｎの割合で窒素を吹き込んで、２０分間脱気した。次いで、過硫酸ナトリウム０．１２ｇ／モル（単量体成分に対する値）およびＬ−アスコルビン酸０．００５ｇ／モル（単量体成分に対する値）の水溶液をスターラー攪拌下で添加して、重合を開始させた。重合開始後に攪拌を停止し、静置水溶液重合を行った。単量体成分の温度が約１５分（重合ピーク時間）後にピーク重合温度１０８℃を示した後、３０分間重合を進行させた。その後、重合物を円筒容器から取り出し、含水ゲル状架橋重合体を得た。
【０１３８】
得られた含水ゲル状架橋重合体は、４５℃でミートチョッパー（孔径：８ｍｍ）により細分化した後、１７０℃の熱風乾燥機で、２０分間加熱乾燥させた。さらに、乾燥重合体（固形分：約９５％）をロールミルで粉砕し、ＪＩＳ標準篩で粒径６００〜３００μｍに分級することにより、ポリアクリル酸系吸水性樹脂（中和率：７５％）を得た。
【０１３９】
参考例１：Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＡＴＣＣ３９０７３の独立栄養培養
二酸化炭素または一酸化炭素を唯一の炭素源とした独立栄養条件下でＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＡＴＣＣ３９０７３を培養し、二酸化炭素または一酸化炭素より生合成されたアセチルＣｏＡおよび酢酸を含有するＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＡＴＣＣ３９０７３の培養液を取得した。
【０１４０】
実施例５：二酸化炭素または一酸化炭素を原料とした３ＨＰＡ発酵生産
参考例１に記載のＭｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ  ＡＴＣＣ３９０７３の独立栄養培養により二酸化炭素または一酸化炭素と水素とから生合成されたアセチルＣｏＡおよび酢酸を含む培養液を、Ｅ．  ｃｏｌｉ（ｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１）、Ｅ．  ｃｏｌｉ（ｍｃｒ−ａｃｃ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１）、Ｅ．  ｃｏｌｉ  （ｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１，ｚｗｆ−ｇｎｄ／ｐＣＤＦ）またはＥ．  ｃｏｌｉ（ｍｃｒ−ａｃｃ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１，ｚｗｆ−ｇｎｄ／ｐＣＤＦ）の菌体と混合し、３７℃で７２時間培養した。得られた培養液を比較例１と同様にして高速液体クロマトグラフィーでの分析に供したところ、すべての培養液において、３−ヒドロキシプロピオン酸のピークと一致する、７．９分の位置にピークを確認した。この際、７．９分の位置にピークは、Ｅ．  ｃｏｌｉ（ｍｃｒ−ａｃｃ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１，ｚｗｆ−ｇｎｄ／ｐＣＤＦ）が一番大きく、Ｅ．  ｃｏｌｉ（ｍｃｒ−ａｃｃ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１）、Ｅ．  ｃｏｌｉ（ｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１，ｚｗｆ−ｇｎｄ／ｐＣＤＦ）およびＥ．  ｃｏｌｉ（ｍｃｒ／ＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ−１）の順で小さくなった。したがって、これらの４菌体すべてにおいて、二酸化炭素または一酸化炭素を原料とした発酵により３ＨＰＡが生産可能なことを確認した。加えて、３−ヒドロキシプロピオン酸のピークと一致する、７．９分の位置のピークは、マロニルＣｏＡレダクターゼを単独で利用した場合よりも、使用する宿主とは異なる生物由来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼを併用した場合、およびＮＡＤＰＨの利用性を高める遺伝子改変を行った場合の方が、有意に高いピークが観察された。
【０１４１】
実施例６：二酸化炭素または一酸化炭素から発酵生産した３ＨＰＡを用いたアクリル酸および高吸水性樹脂の合成
実施例５で得られた３ＨＰＡを含む発酵液１００ｇを６０００ｒｐｍで２０分遠心後、培養液上清を回収した。回収した培養液上清にトリ−ｎ−オクチルアミン１００ｇを加え、攪拌子で穏やかに２４時間室温（２５℃）で混合した。
【０１４２】
混合液を静置して、二相に分離した段階で、有機相を回収した。この反応混合物を含む有機相に酸化アルミニウムを５０ｇ添加し、１７０℃で１時間加熱・留出したした。
【０１４３】
得られた留出液を回収し、室温まで冷却した後、１００℃から１３０℃まで徐々に加熱していき、留出液を除去した。その後、減圧して、系内の圧力を２０ｋＰａに保ちながら２００℃まで徐々に加熱していき、留出液を回収することでアクリル酸を含む溶液（アクリル酸溶液）を得た。
【０１４４】
得られたアクリル酸溶液を母液として室温（約１５℃）〜−５．８℃の温度範囲まで冷却して結晶を析出させ、同温度で保持した後、吸引濾過により結晶を液体から分離する晶析操作を行った。分離した結晶を融解させてから、一部をサンプリングして分析し、残りを母液として室温（約１５℃）〜４．８℃の温度範囲まで冷却して結晶を析出させ、同温度で保持した後、吸引濾過により結晶を液体から分離する晶析操作を行った。合計２回の晶析操作により、精製アクリル酸を得た。
【０１４５】
得られた精製アクリル酸に重合禁止剤としてハイドロキノンを６０質量ｐｐｍ（対アクリル酸）添加した。別途、鉄を０．２質量ｐｐｍ含有する苛性ソーダから得られたＮａＯＨ水溶液に対して、上記の重合禁止剤添加アクリル酸溶液を冷却下（液温３５℃）で添加することにより、アクリル酸７５モル％中和を行った。得られた、中和率７５モル％、濃度３５質量％のアクリル酸ナトリウム水溶液に、内部架橋剤としてポリエチレングリコールジアクリレート０．０５モル％（アクリル酸ナトリウムに対する値）を溶解させることにより、単量体成分を得た。この単量体成分３５０ｇを容積１Ｌの円筒容器に入れ、２Ｌ／ｍｉｎの割合で窒素を吹き込んで、２０分間脱気した。次いで、過硫酸ナトリウム０．１２ｇ／モル（単量体成分に対する値）およびＬ−アスコルビン酸０．００５ｇ／モル（単量体成分に対する値）の水溶液をスターラー攪拌下で添加して、重合を開始させた。重合開始後に攪拌を停止し、静置水溶液重合を行った。単量体成分の温度が約１５分（重合ピーク時間）後にピーク重合温度１０８℃を示した後、３０分間重合を進行させた。その後、重合物を円筒容器から取り出し、含水ゲル状架橋重合体を得た。
【０１４６】
得られた含水ゲル状架橋重合体は、４５℃でミートチョッパー（孔径：８ｍｍ）により細分化した後、１７０℃の熱風乾燥機で、２０分間加熱乾燥させた。さらに、乾燥重合体（固形分：約９５％）をロールミルで粉砕し、ＪＩＳ標準篩で粒径６００〜３００μｍに分級することにより、ポリアクリル酸系吸水性樹脂（中和率：７５％）を得た。
【図１】
2012085635.tif 000006
【配列表】
2012085635000001.app