(57)【要約】【課題】ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができ、かつ、カラム寿命を向上させることのできるヘモグロビン類の測定方法を提供する。【解決手段】カラム充填剤を充填したカラムに溶離液を送液する液体クロマトグラフィーによってヘモグロビン類を測定する方法において、１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体１０〜２００重量部、スルホン酸基を有さず、１分子中に水酸基を１個以上有する架橋性単量体５〜１００重量部、及び、スルホン酸基及び水酸基を有さない架橋性単量体１００重量部を構成単位とする重合体からなる粒子を前記カラム充填剤として用い、かつ、測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、９．８×１０４Ｐａ未満に設定するヘモグロビン類の測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カラム充填剤を充填したカラムに溶離液を送液する液体クロマトグラフィーによってヘモグロビン類を測定する方法において、
１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体１０〜２００重量部、スルホン酸基を有さず、１分子中に水酸基を１個以上有する架橋性単量体５〜１００重量部、及び、スルホン酸基及び水酸基を有さない架橋性単量体１００重量部を構成単位とする重合体からなる粒子を前記カラム充填剤として用い、かつ、
測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、９．８×１０４Ｐａ未満に設定する
ことを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
【請求項２】
１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体は、下記一般式（１）で表されることを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類の測定方法。
【化１】
2012073183.tif 000005
式（１）中、Ｒ１は、直鎖部の炭素原子数が１〜１０の整数であって、水素原子が１個以上の水酸基で置換されているアルキレン基、又は、直鎖部の炭素原子数と酸素原子数の和が２〜１０の整数であって、水素原子が１個以上の水酸基で置換されているオキサアルキレン基を表す。また、Ｒ２は、水素原子又はメチル基を表す。
【請求項３】
１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体、及び、スルホン酸基及び水酸基を有さない架橋性単量体は、アクリル系単量体であることを特徴とする請求項１又は２記載のヘモグロビン類の測定方法。
【請求項４】
架橋重合体粒子の平均粒子径が３〜４０μｍであることを特徴とする請求項１、２又は３記載のヘモグロビン類の測定方法。
【請求項５】
溶離液の流速が０．１〜２．５ｍＬ／分であることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載のヘモグロビン類の測定方法。
【請求項６】
カラムの長さが１〜１００ｍｍ、カラムの内径が０．５〜１０ｍｍであることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載のヘモグロビン類の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィーを用いた、ヘモグロビン類の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査の分野においては、糖尿病の診断を目的としてヘモグロビンＡ１ｃの測定が汎用的に行なわれている。ヘモグロビンＡ１ｃは、液体クロマトグラフィー、免疫法、酵素法等により測定されているが、なかでも液体クロマトグラフィーは精度が良く、短時間で測定できるため、特に糖尿病患者のヘモグロビンＡ１ｃ値の管理に用いられている。この用途では、測定値のＣＶ値（％）が１％以下程度の精度が要求される。
【０００３】
液体クロマトグラフィーによりヘモグロビンＡ１ｃを測定する際、ヘモグロビンＡ１ｃを短時間で高精度に測定するための、カラム充填剤に必要な要件の１つは、ヘモグロビンＡ１ｃと他のヘモグロビン類との分離性能が良いことである。
分離性能が悪いと、他のヘモグロビン類の影響を受けやすいため、クロマトグラムの形状が変化しやすく、ヘモグロビンＡ１ｃ値の測定精度が低下する。
【０００４】
高い分離性能を得るための一般的な手段は、カラム充填剤粒子の粒径を小さくし、より均一にすることである。例えば特許文献１には、粒径が３〜４μｍの微小な充填剤を用いてヘモグロビン類を測定する方法が開示されている。しかしその結果、測定系にかかる圧力は５ＭＰａ以上と大きくなる。
【０００５】
そのため、使用する液体クロマトグラフは高い耐圧性能が必要になり、高価で複雑な機構となる。また、測定系に常時高圧がかかる場合、長期間使用した場合の配管系の詰まりや劣化、カラム寿命の短縮等の弊害をもたらす。ヘモグロビンＡ１ｃの測定のような多数の検体を測定する項目においては、カラム寿命はコストに直接影響を及ぼすため、短期間で測定精度が低下するカラムは実用上使用できない。
【０００６】
また測定系に生じる圧力は低いほど有利であると考えられるが、低すぎる場合においても、送液が不安定になり、測定時間が延長する等の欠点が生じる。測定系に生じる圧力値と、分離性能やカラム寿命の詳細な関係はほとんど検討されていない。
【０００７】
臨床検査の現場においては、より安価なシステムで、ヘモグロビンＡ１ｃ等のヘモグロビン類を、短時間で高精度に測定したいという強い要望がある。またヘモグロビン類を測定するための、液体クロマトグラフィーに用いられるカラム充填剤に対しては、より高い分離性能とより長いカラム寿命が要望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平０５−００５７３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができ、かつ、カラム寿命を向上させることのできるヘモグロビン類の測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、カラム充填剤を充填したカラムに溶離液を送液する液体クロマトグラフィーによってヘモグロビン類を測定する方法において、１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体１０〜２００重量部、スルホン酸基を有さず、１分子中に水酸基を１個以上有する架橋性単量体５〜１００重量部、及び、スルホン酸基及び水酸基を有さない架橋性単量体１００重量部を構成単位とする重合体からなる粒子を上記カラム充填剤として用い、かつ、測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、９．８×１０４Ｐａ未満に設定するヘモグロビン類の測定方法である。
以下に本発明を詳述する。
【００１１】
本発明者は、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定において、測定精度が最も向上する圧力範囲を見出し、かつ、該圧力範囲における測定を安定して維持することにより、カラム寿命を延長させることができることを見出した。
また、低い圧力で精度の高い測定を行うためには、低い圧力で高い分離性能を有するカラム充填剤を用いる必要がある。更に、測定系に生じる圧力を特定の低く狭い範囲で維持するためには、カラムの圧力を安定化させる必要がある。本発明者は、特定の組成を有するカラム充填剤を用いることにより、高い分離性能を維持したまま、測定系の圧力値を上記圧力範囲内に安定させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
本発明のヘモグロビン類の測定方法（以下、本発明方法ともいう）では、測定系に生じる圧力値を９．８×１０３Ｐａ以上、９．８×１０４Ｐａ未満となるように設定する。
なお、本発明でいう「測定系に生じる圧力値（以下、単に圧力値ともいう）」とは、クロマトグラフィーの流路系において、カラムを含む、送液ポンプ以降の配管系流路全体により発生する圧力値を意味する。具体的には例えば、送液ポンプとカラムとの間に接続した圧力計から上記圧力値を読み取ることにより測定できる。
【００１３】
上記圧力値が９．８×１０３Ｐａ未満になるように設定した場合は、ヘモグロビン類の測定値の精度が低下したり、測定時間が長くなったりする。また、圧力値が非常に小さいため、圧力値の制御が困難となる。上記圧力値が９．８×１０４Ｐａ以上になるように設定した場合は、測定精度が低下し、カラム寿命が短くなる。
本発明方法では、以下のカラム充填剤を用いることにより、分離性能を悪くしたり、測定時間を長くしたりすることなく、上記圧力値を９．８×１０４Ｐａ未満と極めて小さな値にできる。
【００１４】
本発明方法に用いられるカラム充填剤は、１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（以下、単量体（Ａ）ともいう）１０〜２００重量部、スルホン酸基を有さず、１分子中に水酸基を１個以上有する架橋性単量体（以下、単量体（Ｂ）ともいう）５〜１００重量部、及び、スルホン酸基及び水酸基を有さない架橋性単量体（以下、単量体（Ｃ）ともいう）１００重量部を重合して得られる架橋重合体粒子より構成される。以下、単量体（Ａ）、単量体（Ｂ）、及び、単量体（Ｃ）について説明する。
【００１５】
上記単量体（Ａ）としては、例えば、１分子中に１個以上のスルホン酸基と１個以上のビニル基を有する単量体等が挙げられる。具体的には例えば、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−スルホエチル（メタ）アクリレート、３−スルホプロピル（メタ）アクリル酸等の（メタ）アクリル酸誘導体類、スチレンスルホン酸、アリルスルホン酸、（３−スルホプロピル）−イタコン酸、及び、スチレンスルホン酸、アリルスルホン酸、（３−スルホプロピル）−イタコン酸の誘導体等が挙げられる。なかでも、（メタ）アクリル酸誘導体類等のアクリル系単量体であることが好ましい。また、上記単量体（Ａ）は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
なお、本明細書において「アクリル系」とは、アクリル基又はメタクリル基を有することを意味する。また、本明細書において「（メタ）アクリレート」とは、「アクリルレート又はメタクリレート」であることを示し、「（メタ）アクリル酸」とは、「アクリル酸又はメタクリル酸」であることを示す。
【００１６】
上記単量体（Ａ）の添加量は、上記単量体（Ｃ）１００重量部に対して、下限が１０重量部、上限が２００重量部である。上記単量体（Ａ）の添加量が１０重量部未満であると、得られる重合体のイオン交換容量が小さく、ヘモグロビン類との充分なイオン交換反応が行われないため、分離性能が悪くなる。上記単量体（Ａ）の添加量が２００重量部を超えると、重合中に凝集が発生して粒子状の重合体が得られにくくなったり、重合体粒子の耐圧性が低下し、測定中に膨潤や収縮が起きて測定精度が低下しやすくなったりする。上記単量体（Ｃ）１００重量部に対する上記単量体（Ａ）の添加量の好ましい下限は１５重量部、好ましい上限は１８０重量部である。
【００１７】
上記単量体（Ｂ）としては、例えば、１分子中に１個以上の水酸基と２個以上のビニル基を有する単量体等が挙げられる。なかでも、上記単量体（Ｂ）は、アクリル系単量体であることが好ましく、下記式（１）に示す単量体であることがより好ましい。
【００１８】
【化１】
2012073183.tif 000002
【００１９】
上記式（１）中、Ｒ１は直鎖部の炭素原子数が１〜１０の整数であって、水素原子が１個以上の水酸基で置換されているアルキレン基、又は、直鎖部の炭素原子数と酸素原子数の和が２〜１０の整数であって、水素原子が１個以上の水酸基で置換されているオキサアルキレン基を表す。式中Ｒ２は、水素原子及びメチル基を表す。
なお、上記アルキレン基は、直鎖パラフィン炭化水素の両端の炭素原子から水素原子各１個を除いた２価の基を示す。また、上記オキサアルキレン基は、上記アルキレン基の少なくとも１つのメチレン基を酸素原子に置換してエーテル結合としたものを示す。
【００２０】
上記式（１）で表される単量体（Ｂ）としては、具体的には例えば、２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）アクリルロキシプロパン、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メタ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデカン−２，６，１０−トリオール等が挙げられる。
上記単量体（Ｂ）は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２１】
上記単量体（Ｂ）の添加量は、上記単量体（Ｃ）１００重量部に対して、下限が５重量部、上限が１００重量部である。上記単量体（Ｂ）の添加量が５重量部未満であると、得られた重合体粒子に試料中のタンパク質等の成分が非特異吸着を抑制する効果が充分に得られなくなる。上記単量体（Ｂ）の添加量が１００重量部を超えると、重合中に凝集が発生して粒子状の重合体が得られにくくなったり、重合体粒子の耐圧性が低下し、測定中に膨潤や収縮が起きて測定精度が低下したりする。上記単量体（Ｃ）１００重量部に対する上記単量体（Ｂ）の添加量の好ましい下限は７重量部、好ましい上限は９０重量部である。
【００２２】
上記単量体（Ｃ）は、上記単量体（Ａ）及び上記単量体（Ｂ）に含まれるものを除く、１分子中にビニル基を２個以上有する単量体である。上記単量体（Ｃ）は、イオン交換基を有さない単量体、又は、イオン交換基を有していても微量である単量体であって、単量体（Ａ）及び単量体（Ｂ）よりも疎水性であるものが好ましい。また、上記単量体（Ｃ）は、アクリル系単量体であることがより好ましい。
【００２３】
上記単量体（Ｃ）としては、具体的には例えば、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
上記ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリテトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール−テトラメチレングリコール）−ジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールポリエチレングリコール−ジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサグリコールジ（メタ）アクリレート、１，９−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記ヒドロキシアルキルジ（メタ）アクリレート類としては、例えば、２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−１−（メタ）アクリロキシ−３−（メタ）アクリロキシプロパン、２−ヒドロキシ−３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセロールジ（メタ）アクリレート、グリセロールアクリレートメタクリレート、ウレタン（メタ）ジアクリレート、イソシアヌル酸ジ（メタ）アクリレート、イソシアヌル酸トリ（メタ）アクリレート、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メタ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデガン−２，６，１０−トリオール等が挙げられる。
上記分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリル基を有するアルキロールアルカン（メタ）アクリレート類としては、例えば、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記単量体（Ｃ）は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２４】
上記カラム充填剤は、上記単量体（Ａ）、上記単量体（Ｂ）、及び、上記単量体（Ｃ）以外に、必要に応じてスルホン酸基を有さない非架橋性単量体（以下、単量体（Ｄ）ともいう）を構成単位の一部として用いてもよい。上記単量体（Ｄ）は、アクリル系単量体であることが好ましく、親水性の非架橋性アクリル系単量体であることがより好ましい。
上記単量体（Ｄ）としては、具体的には例えば、（メタ）アクリル酸アルキル類、水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体等が挙げられる。
【００２５】
上記（メタ）アクリル酸アルキル類としては、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸イソプロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル等が挙げられる。
【００２６】
上記水酸基を有する非架橋性アクリル系単量体としては、例えば、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、その他の水酸基を有する（メタ）アクリレート類等が挙げられる。
上記ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシトリ（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート類としては、例えば、ポリ（エチレングリコール・プロピレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、ポリ（プロピレングリコール・テトラメチレングリコール）モノ（メタ）アクリレート、オクトキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコール−モノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記その他の水酸基を有する（メタ）アクリレート類としては、例えば、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシルプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記単量体（Ｄ）は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２７】
上記単量体（Ｄ）を用いる場合、上記単量体（Ｄ）の添加量は、上記単量体（Ｂ）及び上記単量体（Ｃ）の合計量１００重量部に対して、１００重量部以下であることが好ましい。上記単量体（Ｂ）及び上記単量体（Ｃ）の合計量１００重量部に対する上記単量体（Ｄ）の添加量が１００重量部を越えると、重合体粒子の耐圧性が低下し、膨潤や収縮が起きて分離精度が低下しやすくなる。
【００２８】
上記カラム充填剤を製造する方法としては、例えば、上記単量体（Ａ）と、上記単量体（Ｂ）と、上記単量体（Ｃ）と、更に必要に応じて上記単量体（Ｄ）とを混合し、得られた単量体混合物を分散媒中に分散して、重合開始剤の存在下で重合する方法が挙げられる。また、上記単量体（Ｂ）、及び、上記単量体（Ｃ）を用いて架橋重合体粒子を調製した後、得られた架橋重合体粒子及び上記単量体（Ａ）を分散媒中に分散して、重合開始剤の存在下で重合する方法も挙げられる。
【００２９】
上記カラム充填剤を得る重合方法は特に限定されず、例えば、重合開始剤の存在下での、乳化重合法、ソープフリー重合法、分散重合法、懸濁重合法、シード重合法等の公知の重合法が挙げられる。なかでも、分散重合法、懸濁重合法、シード重合法が好ましい。
例えば、懸濁重合法の場合、上記単量体混合物に重合開始剤を溶解し、適当な分散媒中に分散させた後、窒素ガス等の不活性ガス雰囲気下にて攪拌しながら加温することにより、カラム充填剤として適当な、架橋重合体粒子を真球状粒子として得ることができる。
【００３０】
上記カラム充填剤は、上記重合を行った後に、公知の技術による親水化処理を表面に行ってもよい。上記親水化処理としては、例えば、特開２００１−９１５０５号公報に開示されている、ヘモグロビン、アルブミン、グロブリン等の蛋白質、糖類、ノニオン系界面活性剤等の親水基を有する化合物を吸着させる方法、特開２００４−２９５３６８号公報に記載の方法によるオゾン処理を行う方法等を好適に用いることができる。
【００３１】
本発明方法に用いる上記カラム充填剤の平均粒子径の好ましい下限は３μｍ、好ましい上限は４０μｍである。上記カラム充填剤の平均粒子径が３μｍ未満であると、溶離液をカラムに流すために必要となる圧力が増大し、本発明方法が規定する圧力範囲を逸脱しやすくなる。また、液体クロマトグラフに、耐圧性付与のための特殊な部品等が必要となることがある。上記カラム充填剤の平均粒子径が４０μｍを超えると、カラム内の空隙率が増大し、試料が拡散しやすくなり、ピークのブロード化等により測定精度が低下する場合がある。上記カラム充填剤の平均粒子径のより好ましい下限は５μｍ、より好ましい上限は３５μｍである。
【００３２】
本発明方法に用いる液体クロマトグラフは、溶離液送液用のポンプ、検出器等を備えた公知の液体クロマトグラフに、上記カラム充填剤を充填したカラムを接続することにより構成することができる。
送液用ポンプによる溶離液の送液速度の好ましい下限は０．１ｍＬ／分、好ましい上限は２．５ｍＬ／分である。上記溶離液の送液速度が０．１ｍＬ／分未満であると、流速が遅いために測定時間が長くなることがある。上記溶離液の送液速度が２．５ｍＬ／分を超えると、測定系に生じる圧力値が大きくなり、本発明で規定する圧力範囲を逸脱することがある。上記溶離液の送液速度のより好ましい下限は０．２ｍＬ／分、より好ましい上限は２．０ｍＬ／分である。
【００３３】
本発明方法に用いるカラムのカラム長の好ましい下限は１ｍｍ、好ましい上限は１００ｍｍである。上記カラム長が１ｍｍ未満であると、測定対象との相互作用が不充分となり、分離性能が悪くなって測定精度が低下することがある。上記カラム長が１００ｍｍを超えると、測定時間が長くなり、測定系に生じる圧力値が大きくなり、本発明で規定する圧力範囲を逸脱することがある。上記カラム長のより好ましい下限は５ｍｍ、より好ましい上限は７０ｍｍである。
【００３４】
本発明方法に用いるカラムの内径の好ましい下限は０．５ｍｍ、好ましい上限は１０ｍｍである。上記カラムの内径が０．５ｍｍ未満であると、測定系に生じる圧力値が大きくなり、本発明で規定する圧力範囲を逸脱することがある。上記カラムの内径が１０ｍｍを超えると、カラム内で試料の拡散しやすくなり、測定精度が低下することがある。上記カラムの内径のより好ましい下限は１ｍｍ、より好ましい上限は８ｍｍである。
【００３５】
本発明方法の液体クロマトグラフィーに用いる溶離液としては、公知の塩化合物を含む緩衝液類や有機溶媒類を用いることが好ましく、具体的には例えば、有機酸、無機酸、及び、これらの塩類、アミノ酸類、グッドの緩衝液等が挙げられる。
上記有機酸は特に限定されず、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
上記無機酸は特に限定されず、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
上記アミノ酸類は特に限定されず、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
また、上記緩衝液には、他に一般に添加される物質、例えば、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物、カオトロピックイオン類等を適宜添加してもよい。
ヘモグロビンＡ１ｃの測定を行う際の上記緩衝液の塩濃度の好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は１０００ｍｍｏｌ／Ｌである。上記緩衝液の塩濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、イオン交換反応が行なわれず、ヘモグロビン類を分離することができなくなることがある。上記緩衝液の塩濃度が１０００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、塩が析出しシステムに悪影響を及ぼすことがある。
【００３６】
本発明方法の液体クロマトグラフィーにより、種々のヘモグロビン類を測定することができる。具体的には例えば、本発明方法により、ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＦ（胎児性ヘモグロビン）やヘモグロビンＡ２を測定することができる。
更に、一般に異常ヘモグロビンと呼ばれるヘモグロビン類の一部をも測定することができる。本発明方法により測定できる異常ヘモグロビン類としては、例えば、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣ、ヘモグロビンＤ、ヘモグロビンＥ等が挙げられる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明方法は、測定系に生じる圧力値が９．８×１０３〜９．８×１０４Ｐａとなるように設定して実施する、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法である。圧力値を上記範囲に設定することで、従来よりも高精度でヘモグロビン類を測定でき、かつ、長期間に亙って精度を維持することができる。
また本発明方法では、単量体（Ａ）、単量体（Ｂ）、及び、単量体（Ｃ）を、所定量用いて重合反応を行って得られた、カラム充填剤を用いるため、分離性能を損なうことなく、上記範囲内の圧力を安定して得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】実施例１のカラム及び測定条件を用いて、健常人血のヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図２】比較例１のカラム及び測定条件を用いて、健常人血のヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図３】実施例１のカラム及び測定条件を用いて、異常ヘモグロビン類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図４】比較例１のカラム及び測定条件を用いて、異常ヘモグロビン類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図５】実施例１のカラム及び測定条件を用いて、ヘモグロビンＡ２の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図６】比較例１のカラム及び測定条件を用いて、ヘモグロビンＡ２の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図７】実施例２、実施例４、及び、実施例６の測定条件を用いた耐久性評価におけるヘモグロビンＡ１ｃ値の推移である。
【図８】比較例２、比較例６、比較例７、及び、比較例８の測定条件を用いた耐久性評価におけるヘモグロビンＡ１ｃ値の推移である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
（製造例１）
製造例１では、単量体の重量比が、単量体Ａ：単量体Ｂ：単量体Ｃ＝２０：１０：１００のカラム充填剤を調製した。
テトラエチレングリコールジメタクリレート（単量体Ｃ、新中村化学工業社製）１５０ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（単量体Ｃ、新中村化学工業社製）１５０ｇ、及び、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（単量体Ｂ、新中村化学工業社製）３０ｇの単量体混合物に、過酸化ベンゾイル（キシダ化学社製）１．０ｇを溶解した。得られた溶解物を、５重量％のポリビニルアルコール（日本合成化学社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液１５００ｍＬに分散させ、回転数２２０ｒｐｍで撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加熱し１時間重合反応を行った。
次に、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体Ａ、東亞合成社製）６０ｇを、メタノール１００ｇ、及び、イオン交換水２００ｍＬの混合液に溶解した。得られた混合物を上記の反応系に添加して、撹拌しながら窒素雰囲気下で、更に８０℃で２時間重合反応を行った。得られた重合物を洗浄して、カラム充填剤を得た
粒度分布測定装置（ナイコンプ社製、「アキュサイザー７８０」）により、平均粒子径を測定した結果、１７．２μｍであった。
【００４０】
（製造例２）
製造例２では、単量体の重量比が、単量体Ａ：単量体Ｂ：単量体Ｃ＝７０：２０：１００のカラム充填剤を調製した。
テトラエチレングリコールジメタクリレート（単量体Ｃ）１５０ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（単量体Ｃ）１５０ｇ、及び、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（単量体Ｂ）６０ｇの単量体混合物に、過酸化ベンゾイル１．０ｇを溶解した。得られた溶解物を、５重量％のポリビニルアルコール水溶液１５００ｍＬに分散させ、回転数２２０ｒｐｍで撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加熱し１時間重合反応を行った。
次に、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体Ａ）２１０ｇ、及び、ポリエチレングリコールメタクリレート（単量体Ｄ、日油社製）４０ｇを、メタノール１００ｇ、及び、イオン交換水２００ｍＬの混合液に溶解した。得られた混合物を上記の反応系に添加して、撹拌しながら窒素雰囲気下で、更に８０℃で２時間重合反応を行った。得られた重合物を洗浄して、カラム充填剤を得た。
製造例１と同様に平均粒子径を測定した結果、１６．４μｍであった。
【００４１】
（製造例３）
製造例３では、単量体の重量比が、単量体Ａ：単量体Ｂ：単量体Ｃ＝１００：８０：１００のカラム充填剤を調製した。
テトラエチレングリコールジメタクリレート（単量体Ｃ）１５０ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（単量体Ｃ）５０ｇ、及び、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（単量体Ｂ）１６０ｇの単量体混合物に、過酸化ベンゾイル１．０ｇを溶解した。得られた溶解物を、５重量％のポリビニルアルコール水溶液１５００ｍＬに分散させ、回転数２２０ｒｐｍで撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加熱し１時間重合反応を行った。
次に、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体Ａ）２００ｇを、メタノール１００ｇ、及び、イオン交換水２００ｍＬの混合液に溶解した。得られた混合物を上記の反応系に添加して、撹拌しながら窒素雰囲気下で、更に８０℃で２時間重合反応を行った。得られた重合物を洗浄して、カラム充填剤を得た。
製造例１と同様に平均粒子径を測定した結果、１６．４μｍであった。
【００４２】
（製造例４）
製造例４では、単量体の重量比が、単量体Ａ：単量体Ｂ：単量体Ｃ＝１５０：１０：１００のカラム充填剤を調製した。
テトラエチレングリコールジメタクリレート（単量体Ｃ）１５０ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（単量体Ｃ）１５０ｇ、及び、１，１０−ジメタクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール３０ｇ（単量体Ｂ、共栄社化学社製）３０ｇの単量体混合物に、過酸化ベンゾイル１．０ｇを溶解した。得られた溶解物を、５重量％のポリビニルアルコール水溶液１５００ｍＬに分散させ、回転数１２０ｒｐｍで撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加熱し１時間重合反応を行った。
次に、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体Ａ）４５０ｇを、メタノール１００ｇ、及び、イオン交換水２００ｍＬの混合液に溶解した。得られた混合物を上記の反応系に添加して、撹拌しながら窒素雰囲気下で、更に８０℃で２時間重合反応を行った。得られた重合物を洗浄して、カラム充填剤を得た。
製造例１と同様に平均粒子径を測定した結果、３２．８μｍであった。
【００４３】
（製造例５）
製造例５では、単量体Ａを含まないカラム充填剤、すなわち、単量体の重量比が、単量体Ａ：単量体Ｂ：単量体Ｃ＝０：２０：１００のカラム充填剤を調製した。
製造例２において、単量体Ａを用いなかったこと以外は製造例２と同様に重合を行い、カラム充填剤を得た。
製造例１と同様にして平均粒子径を測定した結果、１７．０μｍであった。
【００４４】
（製造例６）
製造例６では、単量体Ｂを含まないカラム充填剤、すなわち、単量体の重量比が、単量体Ａ：単量体Ｂ：単量体Ｃ＝７０：０：１００のカラム充填剤を調製した。
製造例２において、単量体Ｂを用いなかったこと以外は製造例２と同様に重合を行い、カラム充填剤を得た。
製造例１と同様にして平均粒子径を測定した結果、１８．６μｍであった。
【００４５】
（製造例７）
製造例７では、単量体Ａの添加量が本発明方法の規定範囲よりも多いカラム充填剤、すなわち、単量体の重量比が、単量体Ａ：単量体Ｂ：単量体Ｃ＝２２０：２０：１００のカラム充填剤を調製した。
製造例２において、単量体Ａの添加量を６６０ｇに変更したこと以外は製造例２と同様にして重合を行った。得られた重合物を洗浄して、カラム充填剤を得た。
製造例１と同様にして平均粒子径を測定した結果、２５．１μｍであった。
【００４６】
（製造例８）
製造例８では、単量体Ｂの添加量が本発明方法の規定範囲よりも多いカラム充填剤、すなわち、単量体の重量比が、単量体Ａ：単量体Ｂ：単量体Ｃ＝１００：１２０：１００のカラム充填剤を調製した。
テトラエチレングリコールジメタクリレート（単量体Ｃ）１００ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（単量体Ｃ）１００ｇ、及び、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（単量体Ｂ）２４０ｇの単量体混合物に、過酸化ベンゾイル１．０ｇを溶解した。得られた溶解物を、５重量％のポリビニルアルコール水溶液１５００ｍＬに分散させ、回転数２２０ｒｐｍで撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加熱し１時間重合反応を行った。
次に、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体Ａ）２００ｇ、及び、ポリエチレングリコールメタクリレート（単量体Ｄ）４０ｇを、メタノール１００ｇ、及び、イオン交換水２００ｍＬの混合液に溶解した。得られた混合物を上記の反応系に添加して、撹拌しながら窒素雰囲気下で、更に８０℃で２時間重合反応を行った。得られた重合物を洗浄して、カラム充填剤を得た。
製造例１と同様に平均粒子径を測定した結果、１５．４μｍであった。
【００４７】
（製造例９）
製造例９では、平均粒径値の小さなカラム充填剤の調製例を示す。
製造例２において用いた５重量％のポリビニルアルコール水溶液を、１０重量％のポリビニルアルコール水溶液に変更したこと以外は、製造例２と同様に重合を行い、カラム充填剤を得た。
製造例１と同様に平均粒子径を測定した結果、２．３μｍであった。
【００４８】
（製造例１０）
製造例１０では、平均粒径値の大きなカラム充填剤の調製例を示す。
製造例２において用いた５重量％のポリビニルアルコール水溶液を、１重量％のポリビニルアルコール水溶液に変更したこと以外は、製造例２と同様に重合を行い、カラム充填剤を得た。
製造例１と同様に平均粒子径を測定した結果、４５．３μｍであった。
【００４９】
（実施例１〜７及び比較例１〜９）
製造例１〜１０で得られたカラム充填剤を種々のサイズのカラムに充填し、液体クロマトグラフ（島津製作所社製、「ＬＣ−１０Ａシステム」）に接続した。送液ポンプとカラムの間に、デジタル圧力計（長野計器社製、「ＧＣ６１」）を接続し、溶離液として２００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を様々な流速で送液して圧力表示値を読み取った。測定条件及び結果を表１に示す。
【００５０】
【表１】
2012073183.tif 000003
【００５１】
＜評価＞
実施例及び比較例のカラム及び測定条件を用いて、以下の評価を行った
【００５２】
（１）健常人血試料の測定
実施例１のカラム及び測定条件を用いて、健常人血試料の測定を行った。
測定試料として、フッ化ナトリウム採血したヒト健常人血液を、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）により１８０倍に溶血希釈したものを用いた。溶離液Ａとして１８０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ５．４）、及び、溶離液Ｂとして４２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）の２種の溶離液を用い、流速１．０ｍＬ／分で送液して溶離液Ａから溶離液Ｂへのステップワイズグラジエント法により分離し、４１５ｎｍの吸光度を測定した結果、図１のクロマトグラムを得た。図１中、１がヘモグロビンＡ１ｃ、２がヘモグロビンＡ０である。ヘモグロビンＡ１ｃと他のヘモグロビン分画とが短時間内に良好に分離された。他の実施例の測定条件でも同様の良好なクロマトグラムが得られた。一方、比較例の測定条件では図２のように分離が悪かった。なお、比較例４は、単量体（Ａ）を用いない製造例５のカラム充填剤を用いたため、ヘモグロビン類は全く分離できなかった。
【００５３】
（２）同時再現性評価
得られた健常人血試料を用いて、ヘモグロビンＡ１ｃの測定を１０回連続で行い、同時再現性の比較を行った。Ａ１ｃ値とＡ１ｃ成分の保持時間のＣＶ値（％）の結果を表２に示す。
各実施例の測定条件においては、各ＣＶ値は１％未満であり、糖尿病患者のＡ１ｃ値の管理を行うための充分な測定精度を示した。一方、各比較例の測定条件では、ＣＶ値が３．１０％〜８．２４％と悪く、実用上問題のあるレベルであった。
【００５４】
（３）修飾ヘモグロビン類の測定
上記（１）における健常人血試料の代わりに、修飾ヘモグロビン類を含む試料を人為的に調製して測定し、修飾ヘモグロビン類とヘモグロビンＡ１ｃとの分離性能を評価した。
修飾ヘモグロビン類を含む試料としては、レイバイルヘモグロビンＡ１ｃ含有試料（試料Ｌ）、アセチル化ヘモグロビン含有試料（試料Ａ）、カルバミル化ヘモグロビン含有試料（試料Ｃ）の３種類を、公知の方法により調製した。
即ち、試料Ｌは、健常人血試料に、グルコースを２５００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温することにより調製した。試料Ａは、健常人血試料に、アセトアルデヒドを６０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。試料Ｃは、健常人血試料に、シアン酸ナトリウムを６０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。
得られた修飾ヘモグロビン類を含む試料（試料Ｌ、試料Ａ、試料Ｃ）と、修飾ヘモグロビン類を含む試料の調製に用いた健常人血試料（非修飾品）とを、実施例及び比較例で調製した充填剤を用いて、上記（２）の方法によって測定し、ヘモグロビンＡ１ｃの測定値を比較した。分離性能は、修飾ヘモグロビン類を含む試料のヘモグロビンＡ１ｃ値から非修飾品のヘモグロビンＡ１ｃ値を差し引いた値（Δ値）を算出して比較することにより評価した。結果を表２に示す。
各実施例の測定条件においては、Δ値は０．２％以下であり、修飾ヘモグロビン類が含まれる試料においても、正確にヘモグロビンＡ１ｃが測定できることがわかった。一方、各比較例の測定条件では、Δ値が０．２５％〜２．３１％と悪く、ヘモグロビンＡ１ｃの測定時において、修飾ヘモグロビン類の影響を受けることが確認された。
【００５５】
【表２】
2012073183.tif 000004
【００５６】
（４）異常ヘモグロビン類の測定
実施例及び比較例の測定条件を用いて、異常ヘモグロビンとしてヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含む試料（ヘレナ研究所社製、「ＡＦＳＣヘモコントロール」）の測定を行った。
実施例１の測定条件を用いて測定した結果、得られたクロマトグラムを図３に示す。図３中、１はヘモグロビンＡ１ｃ、２はヘモグロビンＡ０、３はヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）、４はヘモグロビンＳ、５はヘモグロビンＣを示す。実施例１の測定条件においては、異常ヘモグロビン類であるヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを良好に分離することができた。他の実施例の測定条件においても、ほぼ同様の分離性能を示した。
一方、比較例１の測定条件を用いて測定した場合は、図４に示すように異常ヘモグロビン類を分離することはできなかった。他の比較例の測定条件においても、同様に異常ヘモグロビン類を分離することはできなかった。
【００５７】
（５）ヘモグロビンＡ２の測定
実施例及び比較例の測定条件を用いて、ヘモグロビンＡ２を含む試料として、Ａ２コントロール（レベル２）（バイオラッド社製）を測定した。
実施例１の充填剤を用いて測定して得られたクロマトグラムを図５に示す。図５中、１はヘモグロビンＡ１ｃ、２はヘモグロビンＡ０、３はヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）、６はヘモグロビンＡ２を示す。実施例１の測定条件において、ヘモグロビンＡ２を良好に分離することができた。他の実施例の測定条件においても、ほぼ同様の分離性能を示した。
一方、比較例１の測定条件を用いて測定した場合は、図６に示すようにヘモグロビンＡ２を分離することはできなかった。他の比較例の測定条件においても、同様にヘモグロビンＡ２を分離することはできなかった。
【００５８】
（６）カラム耐久性の評価
実施例２、４、６、比較例２、６、７、及び、８の測定条件を用いて、上記（１）の健常人血液試料を繰り返し測定し、ヘモグロビンＡ１ｃ値の推移を確認した。それぞれの結果を図７、及び、図８に示す。
ヘモグロビンＡ１ｃ値（ＨｂＡ１ｃ（％））の推移は、各実施例の測定条件では、２０００回測定まで安定していた。一方、各比較例の測定条件では、ＨｂＡ１ｃ値が大きく低下し、カラム寿命が短いことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明によれば、ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができ、かつ、カラム寿命を向上させることのできるヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。
【符号の説明】
【００６０】
１  ヘモグロビンＡ１ｃ
２  ヘモグロビンＡ０
３  ヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）
４  ヘモグロビンＳ
５  ヘモグロビンＣ
６  ヘモグロビンＡ２
【図１】
2012073183.tif 000006
【図２】
2012073183.tif 000007
【図３】
2012073183.tif 000008
【図４】
2012073183.tif 000009
【図５】
2012073183.tif 000010
【図６】
2012073183.tif 000011
【図７】
2012073183.tif 000012
【図８】
2012073183.tif 000013