(57)【要約】【課題】  共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた光分析技術に於いて、発光粒子濃度の低い試料溶液の計測のために、コンフォーカル・ボリュームを拡大した場合に、大きな受光面を有する光検出器を用いることなく、再結像領域からの光線がはみ出さずに光検出器受光面まで光学的に連結されるようにすること。【解決手段】  本発明の光分析技術では、顕微鏡の光学系の試料溶液内に於ける光検出領域の像が結像する再結像領域を通過する光線を光検出器の受光面に光学的に連結するマルチモード光ファイバーが、再結像領域を通過する光線を受光する第一の端に於けるコア径が光検出器の受光面へ光線を出射する第二の端のコア径よりも大きいテーパ型光ファイバーである。【選択図】図４
2012242141.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出し分析する光分析装置であって、
前記光学系の前記試料溶液内に於ける光検出領域の像が結像する再結像領域を通過する光線を光検出器の受光面に光学的に連結するマルチモード光ファイバーを含み、前記マルチモード光ファイバーが、前記再結像領域を通過する光線を受光する第一の端に於けるコア径が前記光検出器の受光面へ光線を出射する第二の端のコア径よりも大きいテーパ型光ファイバーであることを特徴とする装置。
【請求項２】
請求項１の装置であって、前記第一の端のコア径が該第一の端に於ける前記再結像領域を通過した光線の径よりも大きく、前記第二の端を出射した光線の前記光検出器の受光面に於ける径が前記光検出器の受光可能な面の径よりも小さくなるよう前記テーパ型光ファイバーの第一及び第二の端のコア径が選択されていることを特徴とする装置。
【請求項３】
請求項１又は２の装置であって、前記再結像領域を通過した光線の前記第一の端への光学的結合を達成する前記第一の端の取付固定部と、前記第二の端から前記光検出器の受光可能な面への光学的結合を達成する前記第二の端の取付固定部とが、前記装置の外表面に設けられ、使用者による前記光ファイバーの前記装置への取付が可能であることを特徴とする装置。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかの装置であって、前記光検出領域の寸法が変更可能であることを特徴とする装置。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかの装置であって、更に、
前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出器にて検出された前記発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する信号処理部と
を含むことを特徴とする装置。
【請求項６】
請求項５の装置であって、前記信号処理部が、前記個別に検出された発光粒子からの光を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数することを特徴とする装置。
【請求項７】
請求項５又は６の装置であって、前記光検出領域移動部が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
【請求項８】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出し分析する光分析方法であって、
前記光学系の前記試料溶液内に於ける光検出領域の像が結像する再結像領域を通過する光線を光検出器の受光面に光学的に連結するマルチモード光ファイバーにして、前記再結像領域を通過する光線を受光する第一の端に於けるコア径が前記光検出器の受光面へ光線を出射する第二の端のコア径よりも大きいテーパ型光ファイバーを用いることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８の方法であって、前記第一の端のコア径が該第一の端に於ける前記再結像領域を通過した光線の径よりも大きく、前記第二の端を出射した光線の前記光検出器の受光面に於ける径が前記光検出器の受光可能な面の径よりも小さくなるよう前記テーパ型光ファイバーの第一及び第二の端のコア径が選択されていることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項８又は９の方法であって、前記光検出領域の寸法を変更する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項８乃至１０のいずれかの方法であって、
前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出器により前記光検出領域からの光を検出する過程と、
前記検出された光から個々の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する過程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１の方法であって、更に、前記個別に検出された発光粒子からの光を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１又は１２のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析技術に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて発光する粒子からの光を検出して種々の光分析を可能にする光分析装置及び光分析方法に係る。なお、本明細書に於いて、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光等であってよい。
【背景技術】
【０００２】
近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence  Correlation  Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１−３、非特許文献１−３参照）に於いては、レーザー共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザー光が集光された焦点領域−コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為され、その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が為される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity  Distribution  Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４、非特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon  Counting  Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。またその他に、特許文献６、７に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献８は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光をフォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。
【０００３】
特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−０９８８７６
【特許文献２】特開２００８−２９２３７１
【特許文献３】特開２００９−２８１８３１
【特許文献４】特許第４０２３５２３号
【特許文献５】国際公開２００８−０８０４１７
【特許文献６】特開２００７−２０５６５
【特許文献７】特開２００８−１１６４４０
【特許文献８】特開平４−３３７４４６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】金城政孝、蛋白質  核酸  酵素  Vol.４４、No.９、１４３１−１４３８頁  １９９９年
【非特許文献２】エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence  Correlation  Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４−２２４頁
【非特許文献３】加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１−２７７頁
【非特許文献４】カスク他３名、米国科学アカデミー紀要  １９９９年、９６巻、13756‐13761頁（P.  Kask,  K.  Palo,  D.  Ullmann,  K.  Gall  PNAS  96,  13756-13761  (1999)）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いた光分析技術では、計測される光は、蛍光一分子又は数分子から発せられた光であるが、その光の解析に於いて、時系列に測定された蛍光強度データの自己相関関数の演算又はヒストグラムに対するフィッティングといった蛍光強度のゆらぎの算出等の統計的処理が実行され、個々の蛍光分子等からの光の信号を個別に参照又は分析するわけではない。即ち、これらの光分析技術に於いては、複数の蛍光分子等からの光の信号が統計的に処理され、蛍光分子等について統計平均的な特性が検出されることとなる。従って、これらの光分析技術に於いて統計的に有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するレベル、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているレベルである必要がある。実際、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、上記の光分析技術に於いて使用される試料溶液中の蛍光分子等の濃度は、典型的には、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であり、１ｎＭを大幅に下回るときには、蛍光分子等がコンフォーカル・ボリューム内に存在しない時間が生じて統計的に有意な分析結果が得られないこととなる。一方、特許文献６〜８に記載の蛍光分子等の検出方法では、蛍光強度のゆらぎの統計的演算処理が含まれておらず、試料溶液中の蛍光分子等が１ｎＭ未満であっても蛍光分子等の検出が可能であるが、溶液中でランダムに運動している蛍光分子等の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。
【０００７】
そこで、本願出願人は、特願２０１０−０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、観測対象となる発光粒子の濃度又は数密度が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の統計的処理を含む光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の発光粒子の状態又は特性を定量的に観測することを可能にする新規な原理に基づく光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術に於いては、端的に述べれば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等と同様に共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いるところ、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。）の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。この新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）によれば、測定に必要な試料がＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術と同様に微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子の存在を検出し、その濃度、数密度又はその他の特性を定量的に検出することが可能となる。
【０００８】
ところで、上記の如き走査分子計数法、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、その光学系のコンフォーカル・ボリューム（即ち、光検出領域）に進入する発光粒子から発せられる光を検出する光分析技術に於いて、試料溶液中の発光粒子の濃度が低い場合、検出光量（フォトンカウンティングの場合には、光子数）が低減し、良好な精度にて計測結果を得ることが困難となり得る。既に述べた如く、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ又はＰＣＨの場合、試料溶液中の発光粒子濃度が、光の計測の時間中に一個以上の発光粒子がコンフォーカル・ボリュームに存在する程度を下回ると、統計的に有意な結果を得ることが困難となる。また、走査分子計数法の場合、試料溶液中の発光粒子濃度が低いほど、コンフォーカル・ボリュームの走査中の単位時間当たりの粒子の検出数が低くなるので、十分な精度の結果を得るためには、長い計測時間が必要となる。
【０００９】
上記の如き、試料溶液中の発光粒子の濃度が低く、コンフォーカル・ボリュームへ進入する単位時間当たりの発光粒子数が少ないことに起因する問題は、コンフォーカル・ボリュームの大きさを大きくすれば、解決可能である。即ち、試料溶液中の発光粒子濃度が低いときには、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の対物レンズから出射される励起光の焦点領域の大きさの拡大やピンホールの口径の拡大（共焦点顕微鏡の場合）により、コンフォーカル・ボリュームを拡大し、これにより、一時に検出される領域を拡大して、検出光量が増大し、計測結果の精度が改善されることが期待される。
【００１０】
しかしながら、この点に関し、単に、励起光の焦点領域の大きさの拡大又はピンホールの口径の拡大により、コンフォーカル・ボリュームの拡大を行う場合、光分析装置の構成によっては、試料溶液中のコンフォーカル・ボリュームの拡大に対応して検出光量を増大できない場合がある。後述の実施形態の欄により詳細に説明されている如く、典型的には、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた上記の如き光分析技術を実行する光分析装置に於いては、コンフォーカル・ボリューム内から発せられた光は、対物レンズを透過した後、再度、集光されて或る位置にて結像され（再結像領域−共焦点顕微鏡の場合には、再結像領域にピンホールが配置される。）、しかる後、光検出器へ導入される。光検出器としては、通常、有限の寸法又は径の受光面を有するフォトダイオード、好適には、ＡＰＤ（アバランシェフォトダイオード）が採用される。そして、再結像領域から光検出器の受光面まで検出光を導くためには、一般的には、光ファイバーが用いられる。その際、コンフォーカル・ボリュームが拡大されているときには、再結像領域から光ファイバーの入射端へ向かう光線の幅も拡大するので、受光面のコア径が大きな光ファイバーを用いる必要がある。その場合、通常の光ファイバーは、両端の受光面のコア径が等しく、従って、受光面の大きな光ファイバーから出射する光線の幅も拡大するので、光ファイバーから出射する光線の全てを検出するためには、より大きな受光面を有するフォトダイオードを採用する必要も出てくる。だが、フォトダイオード、特に、ＡＰＤに於いて、大きな受光面を有する物は、一般に、非常に高価であり、これにより、装置のコストが大幅に増大することとなる。また、再結像領域から光ファイバーの端への光学的結合のために使用するレンズをコンフォーカル・ボリュームの寸法に対応して交換することにより、再結像位置から光ファイバーの端部へ向かう光線の幅を縮小することが可能であるが、レンズの交換毎に、光軸調整を行う必要があり、測定のための操作が煩わしいものとなる。従って、発光粒子濃度の低い試料溶液についても十分な精度の計測結果を比較的短い計測時間にて得られるようにするためのコンフォーカル・ボリュームの拡大を、より大きな受光面を有する高価なフォトダイオードを採用することなく、且つ、煩わしい光軸調整を繰り返すことなく達成できる手法があれば、装置のコストの大幅な増大を回避することができ有利である。
【００１１】
かくして、本発明の一つの目的は、上記の如き走査分子計数法、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた光分析技術に於いて、より大きな受光面を有する高価なフォトダイオードを採用することなく、且つ、煩わしい光軸調整を繰り返すことなく、発光粒子濃度の低い試料溶液の計測に於いても十分な精度にて比較的短時間に結果が得られるようにすることである。
【００１２】
また、本発明の更なる目的は、上記の如き光分析技術に於いて、通常の、或いは、より小さな受光面を有するフォトダイオードを採用しても、拡大されたコンフォーカル・ボリュームからの光の再結像領域の通過後の光線がフォトダイオードの受光面へその受光面からはみ出すことなく光学的に連結されるようにする新規な手法を提案することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、顕微鏡の光学系の試料溶液内に於ける光検出領域の像が結像する再結像領域を通過する光線を光検出器の受光面に光学的に連結するマルチモード光ファイバーを含み、かかるマルチモード光ファイバーが、再結像領域を通過する光線を受光する第一の端に於けるコア径が光検出器の受光面へ光線を出射する第二の端のコア径よりも大きいテーパ型光ファイバーであることを特徴とする装置によって達成される。かかる構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、励起光の照射により発光するその他の粒子（りん光性粒子など）であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、コンフォーカル・ボリューム、即ち、顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから励起光が与えられる場合には、その励起光が集光された領域に相当する。「再結像領域」とは、既に触れた如く、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系に於いて、光検出領域の像が対物レンズを通過した後に結像される領域、典型的には、対物レンズの焦点領域と共役の位置の領域であり、光検出領域から発せられる光は、「再結像領域」を通過して光検出器へ導入される。特に、共焦点顕微鏡に於いては、再結像領域にピンホールが配置されて、これにより、実質的に、再結像領域、即ち、光検出領域から発せられる光のみが、ピンホールを通過し、光検出領域外から発せられた光が遮断されることにより、実質的に、光検出領域内からの光のみを検出することが可能となる。即ち、共焦点顕微鏡の場合、ピンホールの口径によって、コンフォーカル・ボリュームの径が決定される。光検出器としては、典型的には、フォトダイオード、好適には、ＡＰＤが用いられる。なお、本明細書に於いて、「信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。
【００１４】
上記の構成によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて発光粒子からの光を検出する光分析装置、例えば、走査分子計数法、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨといった光分析技術を実行する装置に於いて、光検出領域、即ち、コンフォーカル・ボリュームの寸法を通常用いられる設定よりも拡大した場合でも、通常使用される光検出器よりも受光面の大きな光検出器を用いることなく、再結像領域を通過する光線（光検出領域内から発せられ対物レンズを通過した光束）を光検出器の受光面にて受容することが容易となる。本発明の装置では、上記の如く、再結像領域を通過する光線を光検出器の受光面に光学的に連結するマルチモード光ファイバーとして、再結像領域を通過する光線を受光する第一の端に於けるコア径が光検出器の受光面へ光線を出射する第二の端のコア径よりも大きいテーパ型光ファイバーが用いられることにより、光検出器の受光面へ向けられる光線の径を光ファイバーの入射側の光線の径よりも細くすることが可能となる。従って、コンフォーカル・ボリュームが拡大され、再結像領域を通過する光線の径が拡大されても、光線の周縁を欠くことなく、かかる光線を光ファイバーに受容し、更に、光ファイバーから出射される光線を、その周縁を欠くことなく、光検出器の受光面へ導入することが容易となる。なお、一方の端のコア径が他方の端のコア径よりも大きいテーパ型マルチモード光ファイバーは、既に光通信等の分野にて利用され市販されているので、比較的廉価にて入手可能であり、装置のコストを大幅に増大することはない点で有利である。
【００１５】
上記の構成に於いて、より詳細には、テーパ型マルチモード光ファイバーに於いては、好適には、第一の端のコア径が該第一の端に於ける再結像領域を通過した光線の径よりも大きく、第二の端を出射した光線の光検出器の受光面に於ける径が光検出器の受光可能な面の径よりも小さくなるよう第一及び第二の端のコア径が選択される。これにより、再結像領域を通過した光線は、光ファイバーの入射端（第一の端）及び光検出器の受光面に於いて、はみ出すことなく、それぞれ受容され、コンフォーカル・ボリュームの拡大の効果が十分に発揮されることとなる。
【００１６】
また、上記の本発明の装置に於いて、光検出領域、即ち、コンフォーカル・ボリュームの寸法が変更可能となっていてよい。既に触れた如く、試料溶液中の発光粒子濃度が低く、単位時間当たりに光検出領域に進入する発光粒子数が少ないときには、光検出領域を拡大することにより、単位時間当たりに光検出領域に進入する発光粒子数を増大し、これにより、短い計測時間にて、十分な精度の計測結果を得られることが期待される。従って、本発明の装置に於いては、上記の如く、光検出領域の寸法が変更可能となっていることにより、より広範囲の発光粒子濃度の試料溶液についての計測が短い計測時間にて、そして、十分な精度にて達成可能となる。
【００１７】
更に、上記の装置に於いて、再結像領域を通過した光線の第一の端への光学的結合を達成する第一の端の取付固定部と、第二の端から光検出器の受光可能な面への光学的結合を達成する第二の端の取付固定部とが、装置の外表面に設けられ、使用者による光ファイバーの装置への取付が可能となっていることが好ましい。一般に、任意の光路に光ファイバーを配置する際には、ＦＣコネクタ等の規格化された光学的連結用の取付固定器具が使用される。そのような取付固定器具を使用する場合には、光ファイバーを機械的に取付固定器具に接続することにより光学的連結が達成されるように、光路上にて取付固定器具の位置の調整が予め為される。従って、上記の如く、第一の端の取付固定部と第二の端の取付固定部とが装置の外表面に設けられ、使用者による光ファイバーの装置への取付が可能となっていることにより、光ファイバーの交換取り付けの際の光学調整操作を最小限にすることが可能となる。そして、使用者は、コンフォーカル・ボリュームの寸法と光検出器の受光面の寸法又は径に適合した光ファイバーを選択し、装置に取り付けることを容易に実行することが可能となる。
【００１８】
上記の本発明は、「走査分子計数法」を実行する装置に適用されてよい。従って、本発明の一つの態様に於いて、上記の本発明の装置は、更に、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出器にて検出された発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含んでいてよい。
【００１９】
かかる本発明の装置の基本的な構成に於いては、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が光検出器にて検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出されることとなる。そして、装置の信号処理部は、逐次的に検出される光検出器からの信号に於いて発光粒子からの光を表す信号を検出して、これにより、発光粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、発光粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。具体的には、例えば、上記の本発明の装置に於いて、信号処理部が、個別に検出された発光粒子からの光を表す信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数するようになっていてよい（発光粒子のカウンティング）。かかる構成によれば、発光粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。特に、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、発光粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。勿論、絶対的な数密度値又は濃度値を直接的に決定するのではなく、複数の試料溶液又は濃度又は数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度又は濃度の比を算出するようになっていてもよい。また、上記の本発明に於いては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されていることにより、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、検出対象となる発光粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である（試料溶液中に振動や流れが作用すると、粒子の物性的性質が変化する可能性がある。）。そして、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではないので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の場合と同様に微量（１〜数十μＬ程度）の試料溶液にて計測及び分析が可能である。
【００２０】
また、上記の走査分子計数法を実行する装置の信号処理部の処理に於いて、逐次的な光検出部からの信号から１つの発光粒子が光検出領域に入ったか否かの判定は、光検出部にて検出された時系列の光を表す信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。
【００２１】
更に、上記の装置に於いて、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更となっていてよい。当業者に於いて理解される如く、発光粒子から検出される光の態様は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、一つの発光粒子から得られる光量は低減することとなるので、一つの発光粒子からの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更となっていることが好ましい。
【００２２】
また、更に、上記の装置に於いて、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の装置は、走査分子計数法を実行する場合、光検出領域が発光粒子の存在位置を通過したときにその発光粒子から発せられる光を検出して、発光粒子を個別に検出する。しかしながら、発光粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光粒子から複数回、（発光粒子の存在を表す）信号が検出されてしまい、検出された信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの発光粒子を一つの（発光粒子の存在を表す）信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、発光粒子によって変わるので、上記の如く、発光粒子の特性（特に、拡散定数）に応じて、本発明の装置は、光検出領域の移動速度が適宜変更可能であるよう構成されていることが好ましい。
【００２３】
光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
【００２４】
更に、上記の本発明の装置によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出し分析する光分析方法に於いて、コンフォーカル・ボリュームが拡大される場合に、その効果を充分に発揮させることが可能な新規な方法が提供される。即ち、本発明のもう一つの態様によれば、光分析方法は、顕微鏡の光学系の試料溶液内に於ける光検出領域の像が結像する再結像領域を通過する光線を光検出器の受光面に光学的に連結するマルチモード光ファイバーにして、再結像領域を通過する光線を受光する第一の端に於けるコア径が光検出器の受光面へ光線を出射する第二の端のコア径よりも大きいテーパ型光ファイバーを用いることを特徴とする。
【００２５】
かかる方法に於いても、第一の端のコア径が該第一の端に於ける再結像領域を通過した光線の径よりも大きく、第二の端を出射した光線の光検出器の受光面に於ける径が光検出器の受光可能な面の径よりも小さくなるようテーパ型光ファイバーの第一及び第二の端のコア径が選択されていてよい。また、好適には、本発明の方法は、光検出領域の寸法を変更する過程を含む。
【００２６】
また、本発明の方法が走査分子計数法に適用される場合、本発明の方法は、前記の光学系の光路を変更することにより光学系の光検出領域の試料溶液内に於ける位置を移動する過程と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光を検出する過程と、検出された光から個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する過程とを含むことを特徴とする。
【００２７】
かかる方法に於いても、個別に検出された発光粒子からの光信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する過程及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程が含まれていてよい。また、光検出領域の位置を移動する過程に於いて、光検出領域の位置が所定の速度にて或いは発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されるようになっていてよく、光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて設定されるようになっていてよい。更に、信号処理過程に於いては、１つの発光粒子が光検出領域に入ったことは、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、例えば、所定の閾値より大きい強度を有する光信号が検出したときに判定されてよい。
【００２８】
本発明による光分析技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
【発明の効果】
【００２９】
総じて、本発明によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた走査分子計数法、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の光分析技術に於いて、再結像領域と光検出器の受光面の間の光学的連結を達成するための光ファイバーとして、テーパ型光ファイバーを採用することにより、コンフォーカル・ボリュームを拡大した場合に光検出器の受光面の拡大をしなくても、再結像領域から光検出器の受光面への光線の伝達が、実質的に光線の一部を欠くことなく達成されることとなる。従って、コンフォーカル・ボリュームの拡大の際に、特別に広い受光面を有する高価な光検出器を準備する必要がなくなり、装置のコストの大幅な増大が回避できることとなる。そして、かかる構成により、発光粒子濃度の低い試料溶液の計測の際の、コンフォーカル・ボリュームの拡大による計測時間の短縮、計測結果の精度の向上等が、廉価に達成可能となる。
【００３０】
本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１（Ａ）は、本発明を実現する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。
【図２】図２（Ａ）は、光分析装置の一部の外観と光ファイバーの模式図であり、図２（Ｂ）は、光分析装置に於ける光ファイバーの取付固定部の模式的な断面図である。
【図３】図３（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明の一部を構成する走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。
【図４】図４（Ａ）は、ピンホール（再結像領域）から光検出器の受光面までの光学的連結の構成の模式図である。図４（Ｂ）は、光ファイバーの入射端の模式図であり、ピンホールの大きさによって入射光線の径が異なることを示している。図４（Ｃ）は、本発明に於いて採用されるテーパ型マルチモード光ファイバーの模式図である。
【図５】図５は、本発明が適用される走査分子計数法の処理手順をフローチャートの形式で表した図である。
【図６】図６（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、走査分子計数法に於いて、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図６（Ｃ）は、走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から発光粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。
【図７】図７は、計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、パルス存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。
【符号の説明】
【００３２】
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
１ａ…光分析装置の外表面
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１４ａ…マルチモードオプティカルファイバーをピンホールからの光路に接続する取付固定部
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１５ａ、１５ｂ…マルチモードオプティカルファイバーの端部
１６…光検出器
１６ａ…マルチモードオプティカルファイバーを光検出器の受光面への光路に接続する取付固定部
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
３０ａ、３０ｂ…リレーレンズ
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００３４】
光分析装置の構成
本発明は、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、走査分子計数法、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置に適用される。図１（Ａ）を参照して、光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、図１（Ｂ）に模式的に示されている如き光強度の強い領域（焦点領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されており、発光粒子が焦点領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３にて焦点領域の像が形成される（再結像領域）。即ち、当業者に於いて知られている如く、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に例示の如き焦点領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、焦点面以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示された焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり、コンフォーカル・ボリュームと称される。コンフォーカル・ボリュームに於いては、典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となり、その実効体積は、光強度が１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。なお、本発明の装置に於いては、好適には、コンフォーカル・ボリュームの大きさ、即ち、光検出領域の大きさが変更可能であることが好ましい。コンフォーカル・ボリュームの大きさの変更は、励起光の光路に於けるレンズ４の位置の調整及び／又は使用する対物レンズの交換（対物レンズの開口数の選択）により実行されてよい。また、共焦点顕微鏡の場合、試料溶液中でのコンフォーカル・ボリュームの大きさの変更に際しては、その変化に対応してピンホール１３の口径も変更される。従って、本発明の装置に於いては、種々の口径のピンホールが準備され、それらの中から、適宜、選択された口径のピンホールが配置され使用できるようになっていてよい。
【００３５】
かくして、ピンホール１３に形成された再結像領域を通過した光は、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモード光ファイバー１５に導入され、対応する光検出器１６に到達する。光検出器１６では、逐次的に到来する光が時系列の電気信号に変換されて、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられ、これにより、１つの発光粒子からの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出可能となる。光検出器１６には、典型的には、フォトダイオード、より好適には、ＡＰＤが採用される。かくして、上記の構成により、発光粒子からの光の強度が計測されることとなる。
【００３６】
また、上記の光分析装置の光学系に於いて、特に、後により詳細に説明される走査分子計数法を実行する場合には、更に、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域（即ち、光検出領域）の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７は、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動経路は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなり、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。
【００３７】
なお、追加的な構成として、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。
【００３８】
発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。発光粒子がりん光により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子を励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。
【００３９】
更に、本実施形態の装置は、好適には、マルチモード光ファイバー１５が使用者により任意に交換できるよう構成されてよい。その場合、具体的には、図２（Ａ）に例示されている如く、装置１の外表面１ａに、ピンホール１３からバリアフィルター１４を通過した光路とマルチモード光ファイバー１５との光学的連結を達成する取付固定部１４ａと、マルチモード光ファイバー１５と光検出器１６の受光面との光学的連結を達成する取付固定部１６ａとが露出され、これにより、それぞれの取付固定部にマルチモード光ファイバー１５の端部１５ａ、１５ｂとが、使用者によって接続可能とされる。取付固定部には、図２（Ｂ）に模式的に例示されている如く、ＦＣコネクタ、ＳＭＡコネクタ、ＳＴコネクタ、ＳＣコネクタ等の規格化された光学的連結用の取付固定器具が使用され、マルチモード光ファイバー１５の端部１５ａ、１５ｂがそれぞれの取付固定器具へ機械的に接続されると、取付固定器具の内側に固定されたレンズの光路とマルチモード光ファイバー１５との間に光学的連結が達成されるよう光路及びレンズが調整される。かかる構成により、使用者は、計測の目的に応じて、使用するマルチモード光ファイバー１５を選択して使用し、或いは、マルチモード光ファイバー１５を任意に交換する際に、マルチモード光ファイバーの光学的連結のための操作が極めて簡単化されることとなる。
【００４０】
テーパ型マルチモード光ファイバーの使用
「発明の概要」に於いて触れたように、走査分子計数法、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ等の、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた光分析技術に於いて、試料溶液中の発光粒子の濃度が低い場合、単位時間当たりにコンフォーカル・ボリューム（焦点領域）に進入する発光粒子数が少ないため、十分な精度の結果を得るためには、長い計測時間が必要となる。この問題は、コンフォーカル・ボリュームを通常よりも拡大して、単位時間当たりにコンフォーカル・ボリュームに進入する発光粒子数を増大することにより解決することが可能である。しかしながら、コンフォーカル・ボリュームを拡大すると、コンフォーカル・ボリュームの像が増大することとなり、これにより、コンフォーカル・ボリュームから光検出器の受光面までの光路に於いて光線の周縁部分が、各光学要素の受光面からはみ出ることがあり、コンフォーカル・ボリュームの拡大の効果が十分に発揮されない場合が起き得る。
【００４１】
より詳細には、図１に関連して簡単に触れたように、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系に於いては、図４（Ａ）に模式的に描かれている如く、コンフォーカル・ボリュームＣＶ内からの光は、対物レンズ８の透過後に再度結像されると共に、ピンホール１３を通過し、次いで、レンズ３０ａ、３０ｂなどにより、光ファイバー１５の一方の端へ導入されて、光ファイバー１５の他方の端から光検出器１６の受光面へ伝達される。そして、コンフォーカル・ボリュームＣＶ内からの光の再結像領域、つまり、対物レンズの焦点領域の像以外のピンホール１３の開口領域の外側を通過する光は、外縁部分にて遮断されることとなる。換言すれば、コンフォーカル・ボリューム、即ち、光検出領域は、ピンホール１３の口径δμｍの大きさにより画定され、コンフォーカル・ボリュームＣＶを拡大したときには、再結像領域を通過して光検出器１６の受光面へ向かう光線の幅も拡大されることとなる。［より厳密にいえば、共焦点顕微鏡の場合に検出される光が発せられる領域、つまり、検出される光のコンフォーカル・ボリュームＣＶの径は、ピンホール１３の口径δμｍにより決定される。励起光を使用する計測の場合には、励起光の焦点領域の像がピンホール１３に形成されるように、励起光のコンフォーカル・ボリュームＣＶと検出光のコンフォーカル・ボリュームＣＶとが実質的にできるだけ一致するように、光学系が調整される。従って、励起光を使用する共焦点顕微鏡に於いて、コンフォーカル・ボリュームＣＶの拡大の際には、励起光の焦点領域の拡大とピンホール１３の口径δμｍの拡大が為される。一方、励起光を使用しない共焦点顕微鏡に於いては、コンフォーカル・ボリュームＣＶの拡大は、単にピンホール１３の口径δμｍの拡大により為される。また、ピンホール１３を必要としない多光子顕微鏡の場合は、励起光の焦点領域の拡大によって、コンフォーカル・ボリュームＣＶの拡大が為される。いずれの場合も、コンフォーカル・ボリュームＣＶを拡大したときには、再結像領域から光検出器１６の受光面へ向かう光線の径も拡大される。］
【００４２】
上記の構成に於いて、コンフォーカル・ボリュームＣＶの拡大により、ピンホール１３又は再結像領域を通過する光線の径が拡大すると、レンズ３０ａ、３０ｂを通過して光ファイバーの入射端１５ａへ向かう光線の径も拡大し、光ファイバーの入射端１５ａの受光面の径より大きくなってしまう場合が起き得る。例えば、典型的な装置の例では、ピンホール１３の口径は、５０μｍ程度に設定され、光ファイバーとして、コア径が１００μｍ程度の物が使用される。その場合、ピンホール１３の口径を１００μｍまで拡大しても、ピンホール１３を透過した光線は、光ファイバー内へその受光面からはみ出さずに伝達される（図４（Ｂ）（ｉ）、（ii））。しかしながら、ピンホール１３の口径が１００μｍを超えて拡大されると、例えば、口径が２００μｍに設定されると、ピンホール１３を透過した光線は、その周縁部分にて光ファイバーの受光面からはみ出ることとなる（図４（Ｂ）（iii））。換言すれば、コンフォーカル・ボリュームＣＶの寸法が光ファイバーの受光面の径に制限されることとなる。従って、ピンホール１３の口径を或る程度拡大しても（例えば、口径を２００μｍまで拡大しても）、ピンホール１３を透過した光線が光ファイバー内へその受光面からはみ出さずに伝達されるようにするためには、入射端のコア径がより大きな光ファイバーを使用する必要がある（図４（Ｂ）（iv））。
【００４３】
しかしながら、上記の共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた光分析装置に於いて、通常、マルチモード光ファイバーは、両端のコア径が等しいものが使用される（例えば、ファイバガイド・インダストリーズ社（Fiberguide  Industries  (New  Jersey  USA)のＳＦＳ１００ＴＯ１１０Ｎなど)。そして、コア径が大きい光ファイバーから出射される光線の径も大きくなる。従って、コンフォーカル・ボリュームＣＶ及び／又はピンホール１３の口径の拡大に対応して、コア径の大きいマルチモード光ファイバーを使用すると、ピンホール１３から光ファイバーの入射端への光学的連結に於いては、光線が光ファイバー内へその受光面からはみ出さずに伝達されるが、光ファイバーの出射端から光検出器の受光面への光学的連結に於いて、図４（Ｂ）に関連して説明された状況と同様に、光線が光検出器の受光面からはみ出ることが起き得る。この点に関し、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた光分析装置に於いては、光検出器として、典型的には、受光面の径が１８０μｍ程度のＡＰＤの標準品が使用されている（例えば、パーキン・オプトエレクトロニクス社（Perkin  Optoelectronics(Fremont  CA,  USA)のSPCM-AQRH-13など）。かかるＡＰＤの受光部分の標準的な仕様に於いては、通常、例えば、ＦＣコネクタ等に適合するコア径が１００μｍのマルチモード光ファイバーを接続可能となるよう規格化されており、そのようなＡＰＤの受光部分にマルチモード光ファイバーを取り付けたときに、光ファイバーの出射端から光検出器の受光面への光学的連結が、光線が光検出器の受光面からはみ出ることなく、達成されるよう最適化して設計されている（図２（Ｂ）参照）。従って、もしコア径が１００μｍを超えるマルチモード光ファイバーをＡＰＤの受光部分に接続すると、光線が光検出器の受光面からはみ出得ることとなる。かかる問題を解決する一つの手法は、受光面が標準品よりも大きいＡＰＤを採用することであるが、受光面が標準品よりも大きいＡＰＤは、非常に高価であり、光分析装置のコストを増大することとなる。
【００４４】
そこで、本発明に於いては、ピンホール１３から光検出器の受光面までの光学的連結のための光ファイバーとして、図４（Ｃ）に模式的に例示されている如き、一方の端のコア径が他方の端のコア径よりも大きく、コア径が徐々に変化しているにもかかわらず、光の伝播のロスが生じないように設計されたテーパ型マルチモード光ファイバーが採用される。その使用に於いては、コア径の大きい端１５ａがピンホール１３側の取付固定部１４ａに接続され、コア径の小さい端１５ｂが光検出器１６側の取付固定部１６ａに接続される（図２（Ａ）参照）。そうすると、ピンホール１３の口径を通常の口径（例えば、１００μｍ）よりも拡大した場合でも、光ファイバーのピンホール１３側の端では、ピンホール１３からの光線が、光ファイバー内へその受光面からはみ出ることなく導入され、光ファイバーの光検出器１６側の端でも、出射した光線が光検出器の受光面へそこからはみ出ることなく入射されることとなる。これにより、コンフォーカル・ボリュームＣＶの拡大に対する制限を緩和することが可能となり、試料溶液中の発光粒子の濃度が低い場合に、適宜、コンフォーカル・ボリュームＣＶを拡大して、短時間に良好な精度にて計測結果が得られることとなる。なお、上記の如きテーパ型マルチモード光ファイバーは、既に光通信等の分野にて利用され市販されており（例えば、ファイバガイド・インダストリーズ社（Fiberguide  Industries  (New  Jersey  USA)のＳＦＴ２００ＴＯ１００Ｙなど)、比較的廉価にて入手可能なので、光分析装置のコストの大幅な増大が回避される。
【００４５】
走査分子計数法
本発明の構成は、既に述べた如く、走査分子計数法、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨといった光分析技術を実行する装置に於いて適用される。本明細書に於いては、走査分子計数法に適用した場合について説明する。以下、「走査分子計数法」の原理及び具体的操作について概説する。
【００４６】
１.走査分子計数法の原理
ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、蛍光強度の計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、計測時間中に常に有意な光強度が検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、発光粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、有意な光強度の信号が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすくなると共に、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。
【００４７】
そこで、本願出願人は、特願２０１０−０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、発光粒子の濃度が、上記の如きＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、発光粒子の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく「走査分子計数法」を提案した。
【００４８】
走査分子計数法に於いて実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、図１（Ｃ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、図３（Ａ）の如く、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔｏ〜ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図３（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図３（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、発光粒子の特性に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の特性に関する情報が取得可能である。
【００４９】
２．走査分子計数法の処理操作過程
図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた走査分子計数法に於いては、具体的には、（１）発光粒子を含む試料溶液の調製過程、（２）試料溶液の光強度の測定処理過程、及び（３）測定された光強度の分析処理過程が実行される。図５は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理過程を示している。
【００５０】
（１）試料溶液の調製
本発明に於いて観測対象となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的粒子などであってよい（試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。）。また、観測対象となる粒子は、それ自体が発光する粒子であってもよく、或いは、発光標識（蛍光分子、りん光分子）が任意の態様にて付加された粒子であってよい。
【００５１】
（２）試料溶液の光強度の測定
本実施形態の走査分子計数法による光強度の測定処理過程では、ミラー偏向器１７を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行いながら、光強度の測定が為される（図５−ステップ１００）。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラムに従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。計測が開始されると、まず、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、光源２から、試料溶液中の発光粒子の励起波長の光が出射されると共に、ミラー偏向器１７がミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、それぞれ、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８は、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ  ＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
【００５２】
光検出領域の位置の移動速度に関して、走査分子計数法に於いて、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出を、定量的に精度よく実行するために、好適には、光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定される。光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図６（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化（発光粒子からの光を表す信号）を特定することが困難となる。そこで、好適には、図６（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域ＣＶを略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが、図６（Ｃ）最上段に例示されている如く励起光強度分布と略同様の略釣鐘状となって、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
【００５３】
具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δτは、平均二乗変位の関係式
（２Ｗｏ）２＝６Ｄ・Δτ      …（１）
から、
Δτ＝（２Ｗｏ）２／６Ｄ      …（２）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２Ｗｏ／Δτ＝３Ｄ／Ｗｏ      …（３）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０−１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０−３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その略１０倍以上の１５ｍｍ／ｓなどと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
【００５４】
なお、既に述べた如く、試料溶液中の発光粒子濃度が低いほど、単位時間当たりに検出される発光粒子からの光の信号の数が低減することとなる。そうすると、例えば、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度を精度よく計測しようとする場合、或る程度の数の発光粒子の信号を取得する必要があるところ、試料溶液中の発光粒子濃度が低いときには、かかる数の発光粒子の信号を取得するまでに要する計測時間が長くなる。そこで、本発明に於いては、上記の如く、計測時間の短縮を図るべく、コンフォーカル・ボリューム（光検出領域）の拡大を行われると共に、ピンホール１３から光検出器１６までの光路に於いて、光ファイバーの入射端及び光検出器１６の受光面ではみ出ることのないように、光ファイバー１５として、テーパ型マルチモード光ファイバーが装置１に取り付けられる。その際、既に述べた如く、コア径の大きい端１５ａがピンホール１３側の取付固定部１４ａに接続され、コア径の小さい端１５ｂが光検出器１６側の取付固定部１６ａに接続される。
【００５５】
（３）光強度の分析
上記の処理により試料溶液中の発光粒子の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、光強度データ上に於ける発光粒子からの光に対応する信号の検出、発光粒子濃度の算出等の分析が実行される。
【００５６】
（ｉ）発光粒子に対応する信号の検出
時系列の光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図６（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、（光学系により決定される）光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する（図６（Ｃ）最上段参照）。従って、走査分子計数法では、基本的には、適宜設定される閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（−２ｔ２／ａ２）      …（４）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（４）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）
【００５７】
時系列光強度データからの発光粒子の一括的な検出を行う処理方法の一つの例としては、まず、時系列光強度データ（図５（Ａ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図５−ステップ１１０、図６（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法等により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ  ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
【００５８】
次いで、スムージング処理後の時系列光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光強度データの時間微分値は、図６（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。
【００５９】
しかる後、時系列光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号を検出し、検出された信号が発光粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光強度データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた時系列光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図６（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）の強度Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図７左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなる。一方、図７右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。
【００６０】
上記のステップ１３０〜１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、時系列光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。なお、時系列光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。
【００６１】
（ii）発光粒子濃度の決定
更に、検出された発光粒子の信号の数を計数して、発光粒子の数の決定が為されてもよい（発光粒子のカウンティング）。また、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と発光粒子の数とから試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度が決定される（ステップ１７０）。
【００６２】
光検出領域の通過した領域の総体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、発光粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、発光粒子の検出及びカウンティングを行うことにより検出された発光粒子の数と、対照溶液の発光粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の発光粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ      …（５）
により与えられる。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、発光粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の発光粒子の濃度ｃは、
ｃ＝ｎ／Ｖｔ      …（６）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Ｃと発光粒子の数Ｎとの関係（式（５））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
【００６３】
かくして、上記の本発明によれば、光検出領域により試料溶液中にて走査して発光粒子を個別に検出する走査分子計数法に於いて、試料溶液中の発光粒子のカウンティング、濃度の決定等が可能となる。
【００６４】
上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
【実施例１】
【００６５】
試料溶液として、リン酸緩衝液（０．１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７を含む）中に、蛍光色素ＡＴＴＯ６３３を、濃度が１０ｐＭとなるように、溶解した溶液をそれぞれ調製した。次に、調製した試料溶液３０μＬをマイクロプレートのウェルに分注した。なお、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用いた。励起光は、１ｍＷの６３３ｎｍのレーザー光とし、検出波長帯域は、バンドパスフィルターを用いて、６６０−７１０ｎｍの波長帯域とした。光の測定に於いては、上記の「（２）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の各々の試料溶液について、時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。試料溶液中に於ける光検出領域は、１５ｍｍ／秒の移動速度にて移動させた。また、ＢＩＮ  ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は、２秒間とした。更に、かかる光の測定に於けるコンフォーカル・ボリュームの拡大の効果とテーパ型マルチモード光ファイバーの使用の効果を検証すべく、測定は、ピンホール口径を５０μｍ、１００μｍ、２００μｍのそれぞれに設定して、両端のコア径が１００μｍの通常型の光ファイバー（ＳＦＳ１００ＴＯ１１０Ｎ）を用いた場合と、ピンホール口径を２００μｍに設定して、コア径が２００μｍの端とコア径が１００μｍの端とを有するテーパ型光ファイバー（ＳＦＴ２００ＴＯ１００Ｙ）を用いた場合のそれぞれについて実行した。光検出器としては、ＡＰＤ（SPCM-AQRH-13）を用いた。
【００６６】
光強度の測定後、上記の「（３）（ｉ）発光粒子に対応する信号の検出」に記載された処理手順に従って、各条件に於ける試料溶液について取得された時系列のフォトンカウントデータ中にて検出された発光粒子からの光を表す信号を計数した。ステップ１１０に於けるデータの移動平均法によるスムージングに於いては、一度に平均するデータ点は９個とし、移動平均処理を５回繰り返した。また、ステップ１４０のフィッティングに於いては、時系列データに対してガウス関数を最小二乗法によりフィッティングし、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、ピーク幅（半値全幅）、相関係数を決定した。更に、ステップ１５０に於ける判定処理では、下記の条件:
２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
ピーク強度＞１．０［ｐｃ／１０μｓ］        …（Ａ）
相関係数＞０．９５
を満たすパルス信号のみを発光粒子に対応する信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないパルス信号はノイズとして無視し、発光粒子に対応する信号であると判定された信号の数を「パルス数」として計数した。
【００６７】
上記の測定条件にて検出されたパルス数は、以下の通りであった。
ピンホール口径［μｍ］    光ファイバー      パルス数            比
ａ）    ５０                  通常型            ２０３          １
ｂ）  １００                  通常型            ７３９          １．９１
ｃ）  ２００                  通常型          １８３３          ３．０１
ｄ）  ２００                テーパ型          ３２２４          ３．９９
なお、「比」は、ａのパルス数の平方根に対する各々の場合のパルス数の平方根の比である。
【００６８】
上記の走査分子計数法に於いて、パルス数、即ち、発光粒子の検出数は、コンフォーカル・ボリュームの走査方向に垂直な面の断面積（走査断面積）に比例し、ピンホール口径がＮ倍になると、走査断面積は、Ｎ２倍となる。従って、パルス数の平方根がピンホール口径に比例する。かくして、上記の結果のａ）〜ｃ）を参照して、通常型の光ファイバーを使用した場合、ａ）の場合を基準として、ｂ）のピンホール口径が１００μｍ、即ち、ａ）の２倍の場合には、パルス数の平方根の比は、略２倍となったが、ｃ）のピンホール口径が２００μｍ、即ち、ａ）の４倍の場合には、パルス数の平方根の比は、約３倍となった。このことは、ピンホール口径を拡大しても、ピンホールを通過した光線の一部が光ファイバーからはみ出ることにより、ピンホール口径の拡大に対応したコンフォーカル・ボリュームの拡大の効果が結果に反映されていないことを示唆している。一方、テーパ型の光ファイバーを使用した場合、ａ）の場合を基準として、ｄ）のピンホール口径が２００μｍ、即ち、ａ）の４倍の場合には、パルス数の平方根の比は、略４倍となった。このことは、テーパ型の光ファイバーの使用により、ピンホール口径が拡大されても、ピンホールを通過した光線が実質的に光ファイバーからはみ出ることなく、光検出器まで到達し、コンフォーカル・ボリュームの拡大が結果に反映されていることを示唆する。
【００６９】
かくして、本発明によれば、コンフォーカル・ボリュームの拡大時に、テーパ型の光ファイバーを使用することにより、コンフォーカル・ボリュームの拡大の効果を充分に発揮できるようになることが明らかになった。
【実施例２】
【００７０】
実施例１と同じ測定条件にて、ＦＣＳを実行した。ただし、試料溶液中の蛍光色素濃度は、１ｎＭとした。検出された並進拡散時間は、以下の通りであった。
ピンホール口径［μｍ］    光ファイバー    並進拡散時間［μｓ］  比
ａ）    ５０                  通常型        １４０．７          1
ｂ）  １００                  通常型        ５６５．９          2.006
ｃ）  ２００                  通常型      １５９７．９          3.370
ｄ）  ２００                テーパ型      ２６１１．０          4.308
なお、「比」は、ａの並進拡散時間の平方根に対する各々の場合の並進拡散時間の平方根の比である。
【００７１】
上記のＦＣＳに於いて、並進拡散時間τは、コンフォーカル・ボリュームの径Ｗｏと、粒子の拡散定数Ｄから、τ＝（Ｗｏ）２／Ｄにより与えられるので、並進拡散時間の平方根が、コンフォーカル・ボリュームの径、即ち、ピンホール口径に比例する。かくして、上記の結果のａ）〜ｃ）を参照して、通常型の光ファイバーを使用した場合、ａ）の場合を基準として、ｂ）のピンホール口径が１００μｍ、即ち、ａ）の２倍の場合には、並進拡散時間の平方根の比は、略２倍となったが、ｃ）のピンホール口径が２００μｍ、即ち、ａ）の４倍の場合には、並進拡散時間の平方根の比は、約３．４倍となった。このことは、ピンホール口径を拡大しても、ピンホールを通過した光線の一部が光ファイバーからはみ出ることにより、ピンホール口径の拡大に対応したコンフォーカル・ボリュームの拡大の効果が結果に反映されていないことを示唆している。一方、テーパ型の光ファイバーを使用した場合、ａ）の場合を基準として、ｄ）のピンホール口径が２００μｍ、即ち、ａ）の４倍の場合には、並進拡散時間の平方根の比は、約４倍となった。このことは、テーパ型の光ファイバーの使用により、ピンホール口径が拡大されても、ピンホールを通過した光線が実質的に光ファイバーからはみ出ることなく、光検出器まで到達し、コンフォーカル・ボリュームの拡大が結果に反映されていることを示唆する。
【００７２】
かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、上記の本発明によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いた光分析技術に於いて、ピンホール又は再結像領域から光検出器の受光面までの光学的連結をテーパ型の光ファイバーにより達成することにより、コンフォーカル・ボリューム、ピンホール又は再結像領域の拡大の効果を結果に反映させることが可能となる。これにより、試料溶液中の発光粒子濃度が低い場合の、拡大されたコンフォーカル・ボリュームを用いた計測の実行が、高価な受光面の大きい光検出器を用いずに良好な精度にて短い計測時間により達成されることとなる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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