(57)【要約】【課題】エルゴチオネインを産生する能力の高いタモギタケの培養方法を改善することにより、エルゴチオネインをさらに高い収量で製造する方法を提供する。【解決手段】タモギタケの菌糸体を培養し、生成した菌糸体からエルゴチオネインを抽出することを含むエルゴチオネインの製造方法であって、培養を、メチオニンを含む培地内で行う。培地が、さらに、システイン及び／又はヒスチジンを含むことが好ましい。メチオニンンの濃度は、０．５ｍＭ以上１５ｍＭ未満であることが好ましい。【選択図】図２
2012105618.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タモギタケの菌糸体を培養し、生成した菌糸体からエルゴチオネインを抽出することを含むエルゴチオネインの製造方法であって、前記培養を、メチオニンを含む培地内で行うことを特徴とする、前記製造方法。
【請求項２】
前記培地が、さらに、システイン及び／又はヒスチジンを含むことを特徴とする、請求項１に記載のエルゴチオネインの製造方法。
【請求項３】
前記メチオニンンの濃度が、０．５ｍＭ以上１５ｍＭ未満であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のエルゴチオネインの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エルゴチオネインの製造方法に関し、より詳細には、タモギタケの菌糸体からエルゴチオネインを高い収量で製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エルゴチオネイン（Ｅｒｇｏｔｈｉｏｎｅｉｎｅ）は、１９０９年にＭ、Ｃ、Ｔａｎｒｅｔによって麦角（ｅｒｇｏｔ）から初めて単離されたアミノ酸の一種である。チオ（ｔｈｉｏ）は硫黄原子を意味するところ、エルゴチオネインは、麦角から単離されたイオウ原子を含む化合物として命名されたことになる。
【０００３】
１９１１年に、Ｇ．ＢａｒｇｅｒとＡ．Ｊ．Ｅｗｒｎｓが、エルゴチオネインの化学構造を、化学式１に示すチオールヒスチジンのベタインであると決定した。
【化１】
2012105618.tif 000003
【０００４】
この化合物は、１９２０年代になって、意外にも動物の血液中に存在することが明らかとなった。現在、エルゴチオネインは、図１に示す経路でヒスチジンから生合成される。エルゴチオネイン中のイオウ原子は、システインから供給される。
【０００５】
エルゴチオネインは、抗酸化作用や抗老化作用が有することが知られており（非特許文献１及び２）、化粧品、食品、医薬、飼料等へ利用されている。
【０００６】
エルゴチオネインは、哺乳類の体内では合成されない。したがって、エルゴチオネインを外部から摂取する必要がある。エルゴチオネインの製造方法としては、化学合成法、エルゴチオネインを含有する子のう菌や担子菌、動物血液等から抽出する方法、エルゴチオネインを産生する子のう菌や担子菌を培養後、エルゴチオネインを抽出精製する方法、発酵法等ある。
【０００７】
例えば、特開２００７−３００９１６（エルゴチオネインの製造方法、特許文献１）及び特開２００８−１１０９８８（エルゴチオネインの製造方法、特許文献２）には、エルゴチオネイン含有のきのこを溶媒中で粉砕しつつ抽出したエルゴチオネイン含有抽出物を、吸着クロマトグラフィで分画後、分画液のうちエルゴチオネインを含有する液を高速液体クロマトグラフィによって分離精製する、エルゴチオネインの製造方法が開示されている。エルゴチオネイン含有のきのこは、タモギタケ、ヒラタケ、エリンギ及びエノキタケが好ましい。これらの製造方法によれば、エルゴチオネインを高収量かつ安全に得られるとされる。
【０００８】
特開２００９−１６１４９８（エルゴチオネインの製造方法、特許文献３）には、これまでにエルゴチオネイン生産能を有することが知られていないフミツキタケ属、オオイチョウタケ属、スギタケ属又はキシメジ属のキノコよりエルゴチオネインを抽出する、エルゴチオネインの製造方法が開示されている。特開２００９−２４９３５６（エルゴチオネインの製造方法、特許文献４）には、これまでにエルゴチオネイン生産能を有することが知られていないエノキタケ属、サンゴハリタケ属、シメジ属、ブナハリタケ属、キコブタケ属又はショウゲンジ属のキノコよりエルゴチオネインを抽出する、エルゴチオネインの製造方法が開示されている。これらの製造方法によれば、エルゴチオネイン生産能力の高いキノコからエルゴチオネインを効率的に製造できるとされる。
【０００９】
特開２００９−１５９９２０（菌糸体培養によるエルゴチオネインの製造方法、特許文献５）には、キノコを菌糸体培養し、生成した菌糸体からエルゴチオネインを抽出することを特徴とする、エルゴチオネインの製造方法が開示される。マイタケ属に属するアンニンコウ、ハラタケ属に属するヒメマツタケにおいて、子実体と比較して菌糸体のエルゴチオネイン含量が有意に高いとされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００７−３００９１６
【特許文献２】特開２００８−１１０９８８
【特許文献３】特開２００９−１６１４９８
【特許文献４】特開２００９−２４９３５６
【特許文献５】特開２００９−１５９９２０
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】岡野由利、「希少アミノ酸エルゴチオネインは皮膚の老化を抑制する」、Ｆｒａｇｒａｎｃｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００８−３、ｐｐ８１−８５
【非特許文献２】Ｄｏｎｇ  ＫＫ，  ｅｔ．ａｌ．“Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｌ−ｅｒｇｏｔｈｉｏｎｅｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｄｅｂｅｎｏｎｅ”  Ｊ  Ｃｏｓｍｅｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２００７  Ｓｅｐ；６（３）：１８３−８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従来技術に知られるとおり、エルゴチオネインは、キシメジ科ヒラタケ属のタモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｕｃｏｐｉａｅ  ｖａｒ．  ｃｉｔｒｉｎｏｐｉｌｅａｔｕｓ）に高含有される。タモギタケは、食用キノコであり、安全である。そこで、本発明の目的は、エルゴチオネインの産生能力の高いタモギタケの培養方法を改善することにより、エルゴチオネインをさらに高い収量で製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題を鋭意検討した結果、培地中にメチオニンを添加すると、エルゴチオネインの収量が増加することを発見し、本発明に至った。すなわち、本発明は、タモギタケの菌糸体を培養し、生成した菌糸体からエルゴチオネインを抽出することを含むエルゴチオネインの製造方法であって、前記培養を、メチオニンを含む培地内で行うことを特徴とする、前記製造方法を提供する。エルゴチオネインの生合成にはヒスチジンと硫黄原子を有するシステインが関与することがわかっている。今回、原料であるこれらの成分の添加では増収がかなわず、メチオニンの添加が有効であることは、従来技術から予想のつかない全く意外なことである。
【００１４】
本発明者は、メチオニンとシステイン及び／又はヒスチジンとの併用には、エルゴチオネイン収量増の相乗的効果があることを発見した。したがって、前記培地は、さらに、システイン及び／又はヒスチジンを含むことが好ましい。
【００１５】
メチオニンンの濃度は、０．５ｍＭ以上１５ｍＭ未満であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のエルゴチオネインの製造方法によれば、培地中にメチオニンを添加したために、タモギタケ菌糸体の液体培養においてエルゴチオネインの総収量が顕著に増加する。本発明の製法によれば、エルゴチオネインを安全かつ安価に提供できる。得られたエルゴチオネインは、シワ防止、皮膚老化防止、真皮コラーゲン減少抑制、ＭＭＰ−１活性抑制、育毛等の機能を有する化粧品、医薬品、食品等の有効成分として使用が期待される。
【００１７】
さらに、メチオニンの存在下でヒスチジン及び／又はシステインを添加すると、エルゴチオネインの収量が顕著に増加する。
【００１８】
培地中へのメチオニンの添加濃度を０．５ｍＭ以上１５ｍＭ未満とすることで、エルゴチオネインの最も効率的な増収が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の製造方法によって得られたエルゴチオネインのＨＰＬＣクロマトグラム（波長：２５４ｎｍ）を示す。
【図２】タモギタケ菌糸体の液体培養において、ＦＥＭ培地へのアミノ酸の添加とエルゴチオネイン収量の関係を示すグラフである。メチオニンを添加した実施例１は、無添加（参考例１）、ヒスチジン添加（比較例１）やシステイン添加（比較例２）と比べて、エルゴチオネイン収量が顕著に増加する。さらに、メチオニン存在下でシステイン及び／又はヒスチジンを添加した実施例２〜４では、これらの併用による相乗効果が見られる。
【図３】ＦＥＭ培地中のメチオニンの添加濃度と、タモギタケ菌糸体中のエルゴチオネイン含量との関係を示すグラフである。メチオニン濃度が０．５ｍＭ以上で、エルゴチオネインの収量が増加し、１０ｍＭ付近で最高値に達する。
【図４】現在、判明しているエルゴチオネインの生合成経路を示す。図中、Ａはヒスチジン、Ｂはヘルシニン、Ｃはシステイン、そして、Ｄはエルゴチオネインを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のエルゴチオネインの製造方法の一実施態様を以下に詳細に説明する。本発明の製法は、タモギタケの菌糸体を培養し、生成した菌糸体からエルゴチオネインを抽出する工程を含む。培養は液体培養が好ましい。
【００２１】
タモギタケの菌株をポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）培地、酵母エキス寒天培地、麦芽エキス寒天培地等で平面培養したものを保存菌株とする。タモギタケの菌株は特に制限されないが、例えば北海道に自生する野生種より分離し、継代したもの（合同会社クリエーション保有）等が挙げられる。
【００２２】
上記保存菌株を平面培養した菌そうからタモギタケを抜き取り、液体培地表面に接種する。培地としては、例えばＦＧＭ培地（２５ｇグルコース、２ｇ酵母エキス、１ｇグルタミン酸、０．５ｍビオチン、０．ｌｇチアミン、２ｇＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇＭｇＳＯ４、５ｍＬ０．１Ｍ−ＦｅＣｌ３、５ｍＬ０．１Ｍ−ＭｎＳＯ４／１Ｌ）、酵母エキス培地、麦芽エキス培地等が挙げられる。振とう培養したものをホモゲナイザー等で撹拌することにより、液体種菌を得る。
【００２３】
上記液体種菌を例えば１２０℃の温度で１５分間殺菌し、放冷したものをＦＧＭ培地等に加え、通常、２０〜３０℃、好ましくは２３〜２７℃の温度で５〜２０日間、好ましくは１２〜１７日間の一次培養を行う。
【００２４】
上記一次培養後、さらにメチオニンを添加し、２０〜３０℃、好ましくは２３〜２７℃の温度で、さらに５〜２０日間、好ましくは１２〜１７日間の二次培養を行う。ここで、メチオニンの添加濃度は、通常、０．５ｍＭ以上でよく、好ましくは０．５ｍＭ以上であり、さらに好ましくは１ｍＭ以上、特に好ましくは５ｍＭ以上である。添加濃度の上限は、１５ｍＭ以上の添加では濃度に見合った効果が得られないことから、１５ｍＭ未満が好ましい。
【００２５】
エルゴチオネインの増収を図るために、上記メチオニンを添加する際に、ヒスチジン、システイン、シスチン及びタウリンからなる群から選ばれる少なくとも一種（以下、ヒスチジン等という）を添加することが好ましく、特に好ましくは、ヒスチジン及び／又はシステインを添加する。メチオニンとヒスチジン等とを併用する場合のメチオニンの添加濃度は、０．５〜５０ｍＭが好ましくは、さらに好ましくは５〜２０ｍＭである。ヒスチジン等の添加濃度は、０．５〜５０ｍＭが好ましく、さらに好ましくは５〜２０ｍＭである。
【００２６】
培養期間が終了したら、菌糸体からエルゴチオネインを抽出する。抽出には、ろ別した菌糸体をそのまま用いてもよく、あるいは、ろ別した菌糸体を乾燥後、粉砕してから用いてもよい。乾燥には、凍結乾燥、天日乾燥、熱風乾燥、真空乾燥、通気乾燥、減圧乾燥等が用いられる。
【００２７】
抽出溶媒には、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン等の有機溶媒及び水や熱水を用いることができる。好ましくは、メタノール、エタノール等である。抽出溶媒を加えた後、適宜、超音波処理をかけながらエルゴチオネインを抽出する。抽出温度は、通常、１０〜３０℃、好ましくは２２〜２７℃である。
【００２８】
得られた抽出液を、遠心分離、フィルタろ過、限外ろ過、ゲルろ過、溶媒抽出、クロマトグラフィ（吸着クロマトグラフィ、疎水クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ等）、結晶化、活性炭処理等の常法により精製することができる。例えば、抽出液を遠心分離し、上澄み部を０．４５μｍのろ紙でろ過する。このろ過物を凍結乾燥等の乾燥手段にかけて乾燥物として保存することも可能である。
【００２９】
精製したエルゴチオネインの定量は、例えば高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ等を用いることができる。測定条件は、例えば後述の参考例１に示すものが挙げられる。
【実施例】
【００３０】
以下に、本発明の実施例を示すことにより、本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
〔参考例１及び２〕菌種試験
１．菌株
タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｕｃｏｐｉａｅ  ｖａｒ．  ｃｉｔｒｉｎｏｐｉｌｅａｔｕｓ）の菌糸体（北海道に自生する野生種より分離し、継代したもの（合同会社クリエーション保有））及びシイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ  ｅｄｏｄｅｓ）の菌糸体（福岡県に自生する野生種より分離し、継代したもの（合同会社クリエーション保有））を、それぞれ、ポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）培地で平面培養したものを保存菌株とした。
【００３１】
２．一次培養
基本培地としてＦＧＭ培地（２５ｇグルコース、２ｇ酵母エキス、１ｇグルタミン酸、０．５ｍビオチン、０．ｌｇチアミン、２ｇＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇＭｇＳＯ４、５ｍＬ０．１Ｍ−ＦｅＣｌ３、５ｍＬ０．１Ｍ−ＭｎＳＯ４／１Ｌ）２００ｍＬを５００ｍｌ容三角フラスコに加えた。予め平面培養した菌そうから、タモギタケ又はシイタケの直径５ｍｍのディスクを抜き取り、液体培地表面に接種した。２５℃、１００ｒｐｍで１日間振とう培養したものを、ホモゲナイザーで１００００ｒｐｍ×１０秒間、撹拌した。これを、液体種菌として用いた。
【００３２】
上記液体種菌を１２０℃、１．２ｋｇ／ｃｍ２で１５分間殺菌し、放冷した１００ｍ１のＦＧＭ培地に５ｍｌの液体種菌を加え、１４日間の一次培養を行った。
【００３３】
３．エルゴチオネインの精製
上記培養期間が終了した時点で、菌糸体をろ別し、凍結乾燥した。この試料を粉砕後、１０倍量の８０％メタノールを加え、超音波で９０分間抽出を行った。抽出液を４℃、１２０００ｒｐｍ×５分間、遠心分離し、上澄み部を０．４５μｍのメンブランでろ過した。
【００３４】
培養期間が終了した時点で、菌糸体をろ別し、凍結乾燥した。この試料を粉砕後、１０倍量の８０％メタノールを加え、超音波で９０分間抽出を行った。抽出液を４℃、１２０００ｒｐｍ×５分間、遠心分離し、上澄み部を０．４５μｍのメンブランでろ過した。
【００３５】
４．エルゴチオネイン含量の測定
エルゴチオネイン含量の測定のために、ＨＰＬＣ分析を行った。測定条件は、以下のとおりである。
ＨＰＬＣ分析装置：ＪＡＳＣＯ  ＰＵ−２０８９、日本分光株式会社製
カラム：ＪＡＳＣＯ  Ｃｒｅｓｔｐａｋ  Ｃ１８Ｓ  ４．６ｍｍ×１５０ｍｎ
移動相：５０ｍＭ−リン酸ナトリウム緩衝液、３％アセトニトリル、０、１％トリエチルアミン、
流量：１ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
波長：２５４ｍｍ  （ＪＡＳＣＯ  ＧＮＢ−２０７５ＵＶ）
【００３６】
図１に参考例１のタモギタケ菌糸体から得られたエルゴチオネインのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。吸収スペクトルから求めたエルゴチオネイン含量を表１に示す。
【００３７】
【表１】
2012105618.tif 000004
【００３８】
表１の結果から、キノコの菌糸体の液体培養からエルゴチオネインを抽出する場合、その菌種はタモギタケが良いことが再確認された。
【００３９】
〔実施例１〜４〕アミノ酸添加試験
タモギタケの液体培養において、前駆体やそれに関連する化合物を培養液中に添加して、菌糸体量やエルゴチオネインの含有量を検討した。参考例１のタモギタケの一次培養液に、さらに、表２に示すアミノ酸を表２に示す濃度で添加して、１４日間の二次培養を行った。得られた二次培養液からのエルゴチオネインの精製と含量測定を、参考例１と同様の手順で行った。結果を表２及び図２に示す。
【００４０】
【表２】
2012105618.tif 000005
【００４１】
表２及び図２の結果から、以下のことがわかる。参考例１と比較例１との対比では、エルゴチオネインの生合成の原料であるヒスチジンを培地に添加しても、エルゴチオネインの収量は増加しない。同じく、参考例１と比較例２との対比では、エルゴチオネインの原料であるシステインを添加すると、収量が若干増加する。一方、メチオニンを添加した実施例１では、システインの場合よりも格段に増加する。図１に示すように、エルゴチオネインの生合成の原料はヒスチジンとシステインであるところ、原料に関与しないメチオニンの添加がエルゴチオネインの収量増に寄与することは全く意外なことである。
【００４２】
さらに、実施例２〜４では、メチオニン（実施例１）、システイン（比較例２）及びヒスチジン(比較例１)から予想されるよりも高い収量を得た。例えば、実施例２の収量の相加平均値は、202＋（448-202）／２＋（199−202）／２＝323ｍｇ／Ｌと予想されるところ、実際は、368ｍｇＬとなり、相加平均よりも１４％アップした。同様に、実施例３の予想収量は377ｍｇ／Ｌとなるところ、実際は416ｍｇ／Ｌと相加平均値より１１％アップした。実施例４の予想収量は375ｍｇ／Ｌとなるところ、実際は437ｍｇ／Ｌと相加平均値より１５％アップした。このように、メチオニンとシステイン及び／又はヒスチジンとの併用は、エルゴチオネインの収量増に相乗的に作用することが今回判明した。
【００４３】
〔実施例５〜９〕メチオニンの添加濃度試験
メチオニンの最適添加濃度を検討した。参考例１のタモギタケの一次培養物に、メチオニンを表３に示す濃度で添加し、さらに１４日間の二次培養を行った。
【００４４】
二次培養液のエルゴチオネイン含量を、参考例１と同様の手順で測定した。結果を表３及び図３に示す。
【００４５】
【表３】
2012105618.tif 000006
【００４６】
表３及び図３から、メチオニンの添加濃度の下限は、０．５ｍＭ以上であり、好ましくは１ｍＭ以上、さらに好ましくは５ｍＭ以上であることが判明した。添加濃度の上限について１５ｍＭの添加で濃度に見合った効果が得られないことから、１５ｍＭ未満が好ましいことが判明した。
【図１】
2012105618.tif 000007
【図２】
2012105618.tif 000008
【図３】
2012105618.tif 000009
【図４】
2012105618.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成23年3月24日(2011.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タモギタケの菌糸体を培養し、生成した菌糸体からエルゴチオネインを抽出することを含むエルゴチオネインの製造方法であって、前記培養を、５ｍＭ以上１５ｍＭ未満のメチオニンとそれぞれ５〜２０ｍＭのシステイン及びヒスチジンを含む培地内で行うことを特徴とする、前記製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
〔実施例１〕アミノ酸添加試験
タモギタケの液体培養において、前駆体やそれに関連する化合物を培養液中に添加して、菌糸体量やエルゴチオネインの含有量を検討した。参考例１のタモギタケの一次培養液に、さらに、表２に示すアミノ酸を表２に示す濃度で添加して、１４日間の二次培養を行った。得られた二次培養液からのエルゴチオネインの精製と含量測定を、参考例１と同様の手順で行った。結果を表２及び図２に示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
【表２】
2012105618.tif 000011
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
さらに、実施例１では、メチオニン（比較例３）、システイン（比較例２）及びヒスチジン(比較例１)から予想されるよりも高い収量を得た。例えば、比較例４の収量の相加平均値は、202＋（448-202）／２＋（199−202）／２＝323ｍｇ／Ｌと予想されるところ、実際は、368ｍｇＬとなり、相加平均よりも１４％アップした。同様に、比較例５の予想収量は377ｍｇ／Ｌとなるところ、実際は416ｍｇ／Ｌと相加平均値より１１％アップした。実施例１の予想収量は375ｍｇ／Ｌとなるところ、実際は437ｍｇ／Ｌと相加平均値より１５％アップした。このように、メチオニンとシステイン及び／又はヒスチジンとの併用は、エルゴチオネインの収量増に相乗的に作用することが今回判明した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
〔参考例１〜５〕メチオニンの添加濃度試験
メチオニンの最適添加濃度を検討した。参考例１のタモギタケの一次培養物に、メチオニンを表３に示す濃度で添加し、さらに１４日間の二次培養を行った。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
【表３】
2012105618.tif 000012
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2012105618.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成23年7月28日(2011.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タモギタケの菌糸体を培養し、生成した菌糸体からエルゴチオネインを抽出することを含むエルゴチオネインの製造方法であって、前記培養を、５ｍＭ以上１５ｍＭ未満のメチオニンとそれぞれ５〜２０ｍＭのシステイン及びヒスチジンを含む培地内で振とうせずに行うことを特徴とする、前記製造方法。