(57)【要約】【課題】細胞内の標的タンパク質のポリユビキチン化および／または脱ユビキチン化を定量的に検出する方法を提供する。【解決手段】標的タンパク質の細胞内でのポリユビキチン化および／または脱ユビキチン化を検出する方法であって、以下の工程を含む：１）標的タンパク質（Ａ）とタグ（Ｔ１）との融合タンパク質（Ｘ）およびユビキチン（Ｂ）とタグ（Ｔ２）との融合タンパク質（Ｙ）をともに発現する形質転換細胞であって、該融合タンパク質（Ｘ）は蛍光色素（Ｄ１）で標識され、かつ、該融合タンパク質（Ｙ）は蛍光色素（Ｄ２）で標識されている形質転換細胞を準備し、２）該標的タンパク質のポリユビキチン化および／または脱ユビキチン化が行われる条件で該形質転換細胞をインキュベートし、３）該形質転換細胞にレーザ光を照射し、４）該形質転換細胞が発する蛍光の蛍光寿命を計測する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的タンパク質の細胞内でのポリユビキチン化および／または脱ユビキチン化を検出する方法であって、以下の工程を含む：
１）標的タンパク質（Ａ）とタグ（Ｔ１）との融合タンパク質（Ｘ）およびユビキチン（Ｂ）とタグ（Ｔ２）との融合タンパク質（Ｙ）をともに発現する形質転換細胞であって、該融合タンパク質（Ｘ）は蛍光色素（Ｄ１）で標識され、かつ、該融合タンパク質（Ｙ）は蛍光色素（Ｄ２）で標識されている形質転換細胞を準備し、
２）該標的タンパク質のポリユビキチン化および／または脱ユビキチン化が行われる条件で該形質転換細胞をインキュベートし、
３）該形質転換細胞にレーザ光を照射し、
４）該形質転換細胞が発する蛍光の蛍光寿命を計測する。
【請求項２】
前記蛍光寿命を計測する工程において、蛍光強度を同時に計測する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レーザ光を照射する工程および蛍光寿命を計測する工程が、フローサイトメーターを用いて行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記蛍光色素（Ｄ１）と前記蛍光色素（Ｄ２）との間で蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記蛍光色素（Ｄ１）がドナーであり、かつ、前記蛍光色素（Ｄ２）がアクセプターである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記タグ（Ｔ１）がアフィニティタグ（ＡＴ１）であり、かつ、前記蛍光色素（Ｄ１）が該アフィニティタグ（ＡＴ１）に結合している、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記タグ（Ｔ２）がアフィニティタグ（ＡＴ２）であり、かつ、前記蛍光色素（Ｄ２）が該アフィニティタグ（ＡＴ２）に結合している、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記タグ（Ｔ１）および前記タグ（Ｔ２）が、それぞれ、アフィニティタグ（ＡＴ１）およびアフィニティタグ（ＡＴ２）であり、かつ、前記蛍光色素（Ｄ１）および前記蛍光色素（Ｄ２）が、それぞれ、該アフィニティタグ（ＡＴ１）および該アフィニティタグ質（ＡＴ２）に結合している、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記蛍光色素（Ｄ１）が有機合成蛍光色素（Ｃ１）もしくは蛍光タンパク質（Ｐ１）である、および／または前記蛍光色素（Ｄ２）が有機合成色素（Ｃ２）もしくは蛍光タンパク質（Ｐ２）である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光色素（Ｄ１）が蛍光タンパク質（Ｐ１）であり、かつ、前記タグ（Ｔ１）が該蛍光タンパク質（Ｐ１）を含む蛍光タンパク質タグ（ＰＴ１）である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記蛍光色素（Ｄ２）が蛍光タンパク質（Ｐ２）であり、かつ、前記タグ（Ｔ２）が該蛍光タンパク質（Ｐ２）を含む蛍光タンパク質タグ（ＰＴ２）である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記蛍光色素（Ｄ１）および前記蛍光色素（Ｄ２）が、それぞれ、蛍光タンパク質（Ｐ１）および蛍光タンパク質（Ｐ２）であり、かつ、前記タグ（Ｔ１）および前記タグ（Ｔ２）が、それぞれ、該蛍光タンパク質（Ｐ１）を含む蛍光タンパク質タグ（ＰＴ１）および該蛍光タンパク質（Ｐ２）を含む蛍光タンパク質タグ（ＰＴ２）である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記標的タンパク質が、カルバモイルリン酸シンターゼＩ（ＣＰＳＩ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、フルクトース−１、６−ビスリン酸アルドラーゼ、電子伝達フラボプロテインアルファサブユニット、中鎖脂肪酸アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、長鎖アシルＣｏＡシンテターゼ、ＴＢＰ関連因子（ＴＡＦｓ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、インポーチンα、ＤＮＡ２ヘリカーゼ、リボソームタンパク質Ｌ７、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）、Ｎ−エチルマレイミド感受性因子（ＮＳＦ）、Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ、セリンプロテアーゼ、非対称性アセチルコリンエステラーゼのコラーゲン様尾部サブユニット（ＣｏｌＱ）、セリンカルボキシペプチダーゼ１（ＳＣＥＰ１）、ヒストンクラスタ１、Δ３，Δ２−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ、アクロシン結合タンパク質（ＡＣＲＰＢ）、セマフォリン５Ａ、オーロラ−Ａ−キナーゼ相互作用タンパク質１、ｐ５３、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ｐ８５サブユニット、β−カテニン、Ｚａｐ−７０、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｆｙｎチロシンキナーゼ、成長因子結合タンパク質結合タンパク質２（Ｇｒｂ２）、Ｓｏｓタンパク質、ＤＮＡ修復キナーゼＫｕ７０・Ｋｕ８０複合体（Ｋｕ７０／８０）、Ｃｒｋ様タンパク質（Ｃｒｋｌ）、ホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣγ）、プロテインキナーゼＣθ（ＰＫＣθ）、エストロゲンレセプター結合タンパク質（ＥＲＢＰ）、ユビキチンリガーゼＣＨＩＰ、サイクリン（Ｃｄｃ１３）、低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ−１α）、ミトコンドリア関連タンパク質（Ｄｒｐ１）、ヒストンＨ２Ｂ、Ｈ２ＡＸ複合体（ヒストン）、ＩκＢα、ＩκＢ  ｐ１００、ＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ−６）およびＮＦ−ｋＢ  ｐ−１０５からなる群から選択される１つである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記標的タンパク質（Ａ）がユビキチンである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記標的タンパク質のプロテアソームによる分解の阻害物質をスクリーニングするための方法である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞内ユビキチン化の検出方法に関する。より詳細には、本発明は、細胞内ユビキチン化の蛍光寿命を用いる検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユビキチンは、７６個のアミノ酸からなる、分子量約８．６ｋＤａの低分子タンパク質であり、あらゆる真核細胞に存在する。しかも、ユビキチンの一次構造は進化的によく保存されており、例えば、ヒトとパン酵母との間では、約９６％のホモロジーがある。
【０００３】
ユビキチンは、Ｃ末のグリシン残基でＡＰＴ依存性にＥ１（ユビキチン活性化酵素）のシステイン残基と結合した後、Ｅ１からＥ２（ユビキチン結合酵素）に転移され、Ｅ３（ユビキチンリガーゼ）によって認識される標的タンパク質のリシン側鎖のε−アミノ基にイソペプチド結合し、ポリユビキチン化されたタンパク質の機能を制御する。標的タンパク質は、多くの場合、それに連続的にユビキチンが結合したポリユビキチン鎖によって、その機能が制御される。
【０００４】
タンパク質分解へと至る場合には、標的タンパク質のリシン残基に結合したユビキチンの４８番目のリシン残基にユビキチンのＣ末端がイソペプチド結合を繰り返すことにより、ポリユビキチン鎖が形成される。このリシン４８（Ｋ４８）を介して形成されたポリユビキチン鎖が２６Ｓプロテアソームの調節サブユニットによる認識シグナルとして機能し、ポリユビキチン化されたタンパク質はプロテアソームにより分解される。
【０００５】
ユビキチンを基質タンパク質から取り除く脱ユビキチン化酵素も数多く同定されていることや、ユビキチン修飾が成長因子受容体などのリガンド依存的な内在化シグナル、タンパク質の局在化シグナルとして機能することなど、ユビキチン修飾系のタンパク質分解以外の新たな生理的機能が続々と明らかとなりつつある。そのため、現在ではユビキチン修飾系はタンパク質分解のみならず、広くタンパク質機能を制御する可逆的なタンパク質修飾システムとして位置付けられている。
【０００６】
ポリユビキチン化を触媒するユビキチンシステムと、分解マシンであるプロテアソームとからなるユビキチン−プロテアソームシステムは、細胞周期の進行、シグナル伝達、遺伝子発現制御、タンパク質の品質管理など、多様な生命現象に関与している。したがって、この分解系の破綻は疾病につながり、また一方では、この分解系が創薬の標的となる。そのため、生命科学の分野においてはユビキチン−プロテアソームシステムの機構に関する研究が活発に行われている。
【０００７】
標的タンパク質のポリユビキチン化を検出する方法としては、従来、組織または細胞をすり潰して組織ホモジェネートまたは細胞ライセートとし、タンパク質を緩衝液に溶解後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開のうえ、ニトロセルロース等の膜に転写し、この膜に対して免疫染色を行うことでポリユビキチン化された標的タンパク質を検出すること（ウェスタンブロッティング）が一般的であった。しかし、この方法は、手順が煩雑でスループットが低く、細胞ごとのポリユビキチン化の検出をすることもできなかった。
【０００８】
近年では、フローサイトメトリ（FCM, Flow Cytometry; FACS, Fluorescence-Activated Cell Sorting）によってスループットを向上させ、細胞ごとにポリユビキチン化を検出できるようになった。FCM法では、ポリユビキチン化、つまりの標的タンパク質とユビキチンとの相互作用の検出方法としては、ＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）を検出する方法、ＢｉＦＣ（Bimolecular Fluorescence Complementation：蛍光タンパク質再構成）法等が使用される。
【０００９】
ＦＲＥＴとは、２種類の蛍光分子ペア（ドナーとアクセプター）が１０ｎｍ以下の距離に接近したときにおこる現象で、ドナーがレーザから受けた励起エネルギーの一部を、蛍光を介在することなくアクセプターに受け渡す現象をいう。ＦＲＥＴの発生により、ドナー蛍光強度の減少とアクセプター蛍光強度の増加が起こる。
【００１０】
蛍光強度を計測してＦＲＥＴを検出する方法では、通常、ドナー蛍光強度とアクセプター蛍光強度との蛍光強度比がＦＲＥＴの指標として用いられる。このとき、アクセプターを検出する蛍光チャネルでは、ＦＲＥＴ由来のアクセプター蛍光のほかに、ドナー蛍光の漏れ込みと、レーザにより直接励起されたアクセプター蛍光が計測される。また、このとき計測される蛍光強度は発現している蛍光タンパク質の分子数に依存するため、複雑な補正が必要となる。そのため、細胞内のタンパク質のポリユビキチン化を定量的に計測することが困難であり、細胞ごとのポリユビキチン化の違いを比較することもできない。
【００１１】
また、ＦＲＥＴとＴＲＦ（Time-Resolved Fluorescence：時間分解蛍光）とを組み合わせたＴＲ−ＦＲＥＴ法もＦＲＥＴの検出に用いられる。ドナー蛍光とアクセプター蛍光との蛍光強度比に基いてＦＲＥＴを検出する点は上記したＦＲＥＴ法と同じである。ＴＲ−ＦＲＥＴ法では、蛍光寿命が非常に長い蛍光物質であるランタノイド錯体をドナーとして、フルオレセインやＧＦＰなどのフルオロフォアをアクセプターとして用いる点に特徴がある。この両者が近接している場合、ランタノイド錯体の光吸収により励起されたエネルギーは、共鳴エネルギー転移によりアクセプターフルオロフォアに転移する。ここでランタノイド錯体は蛍光寿命が非常に長い蛍光物質であり、時間分解能を有するため、ＦＲＥＴによるシグナルを検出する前に、励起光による試料中の他の化合物やアクセプターからの短寿命蛍光のバックグラウンドを抑えることが可能となる。ＴＲ−ＦＲＥＴ法は、高感度（低バックグランド）で細胞内のポリユビキチン化を検出することができる。
【００１２】
例えば、特許文献１では、細胞内で発現したＧＦＰとＩκＢαとの融合タンパク質のポリユビキチン化を、テルビウム（Ｔｂ）標識抗（ポリ）ユビキチン抗体をユビキチンに結合させてＴｂとＧＦＰとの間でＦＲＥＴを発生させ、マイクロプレート上で、ＴＲ−ＦＲＥＴ法によってポリユビキチン化の検出を行っている（実施例２３、図２９等）。
【００１３】
しかし、ＴＲ−ＦＲＥＴ法は、蛍光強度を計測することには違いなく、ドナー、アクセプターの標識量が異なる場合や、モル吸光係数が変化する場合には、その影響を直接受け、定量的な計測が困難となる。また、ドナー蛍光がいわゆるレア・メタルであるテルビウムやユウロピウム等のランタノイドの錯体に限定されるため、取扱いに注意を要し、容易に実施することができないという問題もある。さらに、ＴＲ−ＦＲＥＴ法は、蛍光強度の減衰した時間領域で検出を行うため、蛍光色素の標識量や検出対象の量が少ない場合には、計測に十分な蛍光量を得ることが困難となり、検出可能な範囲が限られるという問題もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特表２００９−５１３６８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
そこで、本発明は、細胞内の標的タンパク質のポリユビキチン化および／または脱ユビキチン化を定量的に検出する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討を重ねた結果、形質転換細胞内で標的タンパク質とタンパク質タグとの融合タンパク質およびユビキチンとタンパク質タグとの融合タンパク質をともに発現させ、これらは蛍光色素で標識されているものであり、細胞にレーザ光を照射し、蛍光寿命を測定すると、細胞内の標的タンパク質のポリユビキチン化および／または脱ユビキチン化を定量的に検出することができることを知得した。
すなわち、本発明は以下に掲げるものである。
【００１７】
（１）標的タンパク質の細胞内でのポリユビキチン化および／または脱ユビキチン化を検出する方法であって、以下の工程を含む：
１）標的タンパク質（Ａ）とタグ（Ｔ１）との融合タンパク質（Ｘ）およびユビキチン（Ｂ）とタグ（Ｔ２）との融合タンパク質（Ｙ）をともに発現する形質転換細胞であって、該融合タンパク質（Ｘ）は蛍光色素（Ｄ１）で標識され、かつ、該融合タンパク質（Ｙ）は蛍光色素（Ｄ２）で標識されている形質転換細胞を準備し、
２）当該標的タンパク質のポリユビキチン化および／または脱ユビキチン化が行われる条件で当該形質転換細胞をインキュベートし、
３）当該形質転換細胞にレーザ光を照射し
４）当該形質転換細胞が発する蛍光の蛍光寿命を計測する。
【００１８】
（２）上記蛍光寿命を計測する工程において、蛍光強度を同時に計測する、上記（１）に記載の方法。
【００１９】
（３）上記レーザ光を照射する工程および蛍光寿命を計測する工程が、フローサイトメーターを用いて行われる、上記（１）または（２）に記載の方法。
【００２０】
（４）上記蛍光色素（Ｄ１）と上記蛍光色素（Ｄ２）との間で蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こる、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【００２１】
（５）上記蛍光色素（Ｄ１）がドナーであり、かつ、上記蛍光色素（Ｄ２）がアクセプターである、上記（４）に記載の方法。
【００２２】
（６）上記タグ（Ｔ１）がアフィニティタグ（ＡＴ１）であり、かつ、上記蛍光色素（Ｄ１）が当該アフィニティタグ（ＡＴ１）に結合している、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００２３】
（７）上記タグ（Ｔ２）がアフィニティタグ（ＡＴ２）であり、かつ、上記蛍光色素（Ｄ２）が当該アフィニティタグ（ＡＴ２）に結合している、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００２４】
（８）上記タグ（Ｔ１）および上記タグ（Ｔ２）が、それぞれ、アフィニティタグ（ＡＴ１）およびアフィニティタグ（ＡＴ２）であり、かつ、上記蛍光色素（Ｄ１）および上記蛍光色素（Ｄ２）が、それぞれ、当該アフィニティタグ質（ＡＴ１）および当該アフィニティタグ質（ＡＴ２）に結合している、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００２５】
（９）上記蛍光色素（Ｄ１）が有機合成蛍光色素（Ｃ１）もしくは蛍光タンパク質（Ｐ１）である、および／または上記蛍光色素（Ｄ２）が有機合成色素（Ｃ２）もしくは蛍光タンパク質（Ｐ２）である、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
【００２６】
（１０）上記蛍光色素（Ｄ１）が蛍光タンパク質（Ｐ１）であり、かつ、上記タグ（Ｔ２）が当該蛍光タンパク質（Ｐ１）を含む蛍光タンパク質タグ（ＰＴ１）である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００２７】
（１１）上記蛍光色素（Ｄ２）が蛍光タンパク質（Ｐ２）であり、かつ、上記タグ（Ｔ２）が当該蛍光タンパク質（Ｐ２）を含む蛍光タンパク質タグ（ＰＴ２）である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００２８】
（１２）上記蛍光色素（Ｄ１）および上記蛍光色素（Ｄ２）が、それぞれ、蛍光タンパク質（Ｐ１）および蛍光タンパク質（Ｐ２）であり、かつ、上記タグ（Ｔ１）および上記タグ（Ｔ２）が、それぞれ、当該蛍光タンパク質（Ｐ１）を含む蛍光タンパク質タグ（ＰＴ１）および当該蛍光タンパク質（Ｐ２）を含む蛍光タンパク質タグ（ＰＴ２）である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００２９】
（１３）上記標的タンパク質が、カルバモイルリン酸シンターゼＩ（ＣＰＳＩ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、フルクトース−１、６−ビスリン酸アルドラーゼ、電子伝達フラボプロテインアルファサブユニット、中鎖脂肪酸アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、長鎖アシルＣｏＡシンテターゼ、ＴＢＰ関連因子（ＴＡＦｓ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、インポーチンα、ＤＮＡ２ヘリカーゼ、リボソームタンパク質Ｌ７、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）、Ｎ−エチルマレイミド感受性因子（ＮＳＦ）、Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ、セリンプロテアーゼ、非対称性アセチルコリンエステラーゼのコラーゲン様尾部サブユニット（ＣｏｌＱ）、セリンカルボキシペプチダーゼ１（ＳＣＥＰ１）、ヒストンクラスタ１、Δ３，Δ２−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ、アクロシン結合タンパク質（ＡＣＲＰＢ）、セマフォリン５Ａ、オーロラ−Ａ−キナーゼ相互作用タンパク質１、ｐ５３、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ｐ８５サブユニット、β−カテニン、Ｚａｐ−７０、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｆｙｎチロシンキナーゼ、成長因子結合タンパク質結合タンパク質２（Ｇｒｂ２）、Ｓｏｓタンパク質、ＤＮＡ修復キナーゼＫｕ７０・Ｋｕ８０複合体（Ｋｕ７０／８０）、Ｃｒｋ様タンパク質（Ｃｒｋｌ）、ホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣγ）、プロテインキナーゼＣθ（ＰＫＣθ）、エストロゲンレセプター結合タンパク質（ＥＲＢＰ）、ユビキチンリガーゼＣＨＩＰ、サイクリン（Ｃｄｃ１３）、低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ−１α）、ミトコンドリア関連タンパク質（Ｄｒｐ１）、ヒストンＨ２Ｂ、Ｈ２ＡＸ複合体（ヒストン）、ＩκＢα、ＩκＢ  ｐ１００、ＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ−６）およびＮＦ−ｋＢ  ｐ−１０５からなる群から選択される１つである、上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
【００３０】
（１４）上記標的タンパク質（Ａ）がユビキチンである、上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
【００３１】
（１５）上記標的タンパク質（Ａ）のプロテアソームによる分解の阻害物質をスクリーニングするための方法である、上記（１）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、細胞内の標的タンパク質のポリユビキチン化および／または脱ユビキチン化を定量的に検出する方法を提供することができる。
【００３３】
また、本発明によれば、細胞ごとのポリユビキチン化の違いを比較することができる。
また、本発明によれば、容易に、高スループットで、短時間で、大量のサンプルを計測することができる。
また、本発明によれば、生きた細胞内のポリユビキチン化および／または脱ユビキチン化をリアルタイムで検出することができる。
さらに、本発明によれば、蛍光強度のみを計測するよりも、融合タンパク質発現量が少ない場合であっても、ポリユビキチン化および／または脱ユビキチン化の検出をすることができる。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、「標的タンパク質の細胞内でのポリユビキチン化および／または脱ユビキチン化を検出する方法であって、以下の工程を含む、
１）標的タンパク質（Ａ）とタグ（Ｔ１）との融合タンパク質（Ｘ）およびユビキチン（Ｂ）とタグ（Ｔ２）との融合タンパク質（Ｙ）をともに発現する形質転換細胞であって、当該融合タンパク質（Ｘ）は蛍光色素（Ｄ１）で標識され、かつ、当該融合タンパク質（Ｙ）は蛍光色素（Ｄ２）で標識されている形質転換細胞を準備し、
２）当該標的タンパク質のポリユビキチン化および／または脱ユビキチン化が行われる条件で当該形質転換細胞をインキュベートし、
３）当該形質転換細胞にレーザ光を照射し
４）当該形質転換細胞が発する蛍光の蛍光寿命を計測する。」である。
以下、本発明について詳細に説明する。
【００３５】
〈標的タンパク質（Ａ）〉
標的タンパク質（Ａ）は、特に限定されないが、ユビキチン−プロテアソームシステム（ユビキチンにより標識されたタンパク質をプロテアソームで分解する系をいう。）によって分解されるタンパク質またはユビキチンであることが好ましい。
【００３６】
ユビキチン−プロテアソームシステムによって分解されるタンパク質としては、特に限定されないが、以下に掲げるタンパク質からなる群から選択される１つであることが好ましい：カルバモイルリン酸シンターゼＩ（ＣＰＳＩ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、フルクトース−１、６−ビスリン酸アルドラーゼ、電子伝達フラボプロテインアルファサブユニット、中鎖脂肪酸アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、長鎖アシルＣｏＡシンテターゼ、ＴＢＰ関連因子（ＴＡＦｓ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、インポーチンα、ＤＮＡ２ヘリカーゼ、リボソームタンパク質Ｌ７、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）、Ｎ−エチルマレイミド感受性因子（ＮＳＦ）、Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ、セリンプロテアーゼ、非対称性アセチルコリンエステラーゼのコラーゲン様尾部サブユニット（ＣｏｌＱ）、セリンカルボキシペプチダーゼ１（ＳＣＥＰ１）、ヒストンクラスタ１、Δ３，Δ２−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ、アクロシン結合タンパク質（ＡＣＲＰＢ）、セマフォリン５Ａ、オーロラ−Ａ−キナーゼ相互作用タンパク質１、ｐ５３、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ｐ８５サブユニット、β−カテニン、Ｚａｐ−７０、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｆｙｎチロシンキナーゼ、成長因子結合タンパク質結合タンパク質２（Ｇｒｂ２）、Ｓｏｓタンパク質、ＤＮＡ修復キナーゼＫｕ７０・Ｋｕ８０複合体（Ｋｕ７０／８０）、Ｃｒｋ様タンパク質（Ｃｒｋｌ）、ホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣγ）、プロテインキナーゼＣθ（ＰＫＣθ）、エストロゲンレセプター結合タンパク質（ＥＲＢＰ）、ユビキチンリガーゼＣＨＩＰ、サイクリン（Ｃｄｃ１３）、低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ−１α）、ミトコンドリア関連タンパク質（Ｄｒｐ１）、ヒストンＨ２Ｂ、Ｈ２ＡＸ複合体（ヒストン）、ＩκＢα、ＩκＢ  ｐ１００、ＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ−６）およびＮＦ−ｋＢ  ｐ−１０５。
【００３７】
〈ユビキチン（Ｂ）〉
ユビキチン（Ｂ）は特に限定されないが、形質転換細胞中でユビキチンとしての機能を有することが好ましい。例えば、ヒト由来細胞を用いて形質転換細胞を調製する場合では、ヒトのユビキチンを用いることが好ましい。
【００３８】
〈ポリユビキチン化／脱ユビキチン化〉
ポリユビキチン化とは、標的タンパク質にユビキチンを付加する反応をいう。この反応系にはユビキチン活性化酵素（Ｅｌ）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）、およびユビキチンリガーゼ（Ｅ３）の複合酵素反応系が関与する。この複合酵素反応系により標的タンパク質の特定のリシン残基にイソペプチド結合し、ユビキチン分子間でも同じ結合を繰り返して複数の（ポリ）ユビキチン鎖が形成される。
脱ユビキチン化とは、ポリユビキチン化された標的タンパク質から（ポリ）ユビキチン鎖を除去する反応をいう。この反応系には脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢｓ）が関与する。
【００３９】
〈タグ（Ｔ１）／タグ（Ｔ２）〉
タグ（「タンパク質タグ」または「ペプチドタグ」をいう。）は、標的タンパク質（Ａ）またはユビキチン（Ｂ）の目印となるタンパク質またはペプチドである。本発明では、タグの付いた標的タンパク質またはユビキチンは、融合タンパク質として発現する。本発明では、標的タンパク質に付けるタグをタグ（Ｔ１）といい、ユビキチンに付けるタグをタグ（Ｔ２）といい、区別する場合がある。また、タグ（Ｔ１）とタグ（Ｔ２）とは相違するものであることが好ましい。タグ（Ｔ１）は、標的タンパク質の機能、構造等によりそのＮ末端および／またはＣ末端に付けることが好ましく、タグ（Ｔ２）は、ユビキチンのＮ末端でもＣ末端のいずれでもよいが、Ｎ末端に付けることが好ましい。
本発明では、タグは蛍光標識に係るタグであることが好ましく、アフィニティタグまたは蛍光タンパク質であることがより好ましい。
【００４０】
《蛍光標識に係るタグ》
蛍光標識に係るタグとは、蛍光色素を直接またはリガンドを介して結合するためのタグまたはそれ自体が蛍光標識であるタグをいう。蛍光標識を結合するためのタグとしては、アフィニティタグが例示され、それ自体が蛍光標識であるタグとしては、蛍光タンパク質タグが挙げられる。
なお、本発明において、タグ（Ｔ１）および／またはタグ（Ｔ２）がアフィニティタグであるとき、それぞれ、アフィニティタグ（ＡＴ１）および／またはアフィニティタグ（ＡＴ２）という場合がある。
【００４１】
《アフィニティタグ》
アフィニティタグは他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用するタグである。なお、蛍光タンパク質であるものは後記する。
アフィニティタグとしては、具体的には、例えば、Ｈｉｓタグ，ＨＱタグ，ＨＮタグ，ＨＡＴタグ，ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグ，ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）タグ，ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ，ＴＣ（テトラシステイン）タグ，ＳＮＡＰタグ，ＣＬＩＰタグ，Ｈａｌｏタグ，ＢＣＣＰ（ビオチン化ペプチド）タグ等が挙げられる。
蛍光色素は、これらのアフィニティタグに、共有結合、水素結合等の結合を介して、直接的にまたは間接的に結合することが好ましい。
標的タンパク質（Ａ）と融合するアフィニティタグ（ＡＴ１）と、ユビキチン（Ｂ）と融合するアフィニティタグ（ＡＴ２）とは、相違するタグであり、かつ、異なる化学物質と特異的親和性を有するものであることが好ましい。また、それぞれのタグを蛍光標識する蛍光色素（Ｄ１）と蛍光色素（Ｄ２）とは、相違する蛍光色素であることが好ましい。蛍光色素はアフィニティタグと、直接的な相互作用によって、または抗体等のアフィニティタグと親和性を有する部分を介して結合することが好ましい。
【００４２】
《蛍光タンパク質タグ》
下記する蛍光タンパク質をタグとするものである。このとき、融合タンパク質（Ｘ）または融合タンパク質（Ｙ）は、それぞれ、標的タンパク質（Ａ）のＮ末端もしくはＣ末端に蛍光タンパク質が直接もしくはリンカーペプチドを介して結合したもの、またはユビキチン（Ｂ）のＮ末端もしくはＣ末端に蛍光タンパク質が直接もしくはリンカーペプチドを介して結合されたものであることが好ましい。
本発明において、タグ（Ｔ１）および／またはタグ（Ｔ２）が、それぞれ、蛍光タンパク質（Ｐ１）を含むタンパク質タグおよび／または蛍光タンパク質（Ｐ２）を含むタンパク質タグであるとき、それぞれ、蛍光タンパク質タグ（ＰＴ１）および／または蛍光タンパク質タグ（ＰＴ２）という場合がある。
蛍光タンパク質タグ（ＰＴ１）と、蛍光タンパク質タグ（ＰＴ２）とは、異なる蛍光タンパク質によるタグであることが好ましい。
【００４３】
《蛍光色素（Ｄ１）／蛍光色素（Ｄ２）》
蛍光色素は特に限定されないが、有機合成蛍光色素および／または蛍光タンパク質が好ましい。
なお、本発明においては、標的タンパク質を標識する蛍光色素、有機合成蛍光色素および蛍光タンパク質を、それぞれ、蛍光色素（Ｄ１）、有機合成蛍光色素（Ｃ１）および蛍光タンパク質（Ｐ１）といい、ユビキチンを標識する蛍光色素、有機合成蛍光色素および蛍光タンパク質を、それぞれ、蛍光色素（Ｄ２）、有機合成蛍光色素（Ｃ２）および蛍光タンパク質（Ｐ２）という場合がある。また、蛍光色素（Ｄ１）と蛍光色素（Ｄ２）とは、相違するものであることが好ましく、蛍光色素（Ｄ１）と蛍光色素（Ｄ２）との間で蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こること（ＦＲＥＴペアであること）が好ましい。
【００４４】
（有機合成蛍光色素）
有機合成蛍光色素は、特に限定されないが、例えば、ヒドロキシクマリン，６−メチルクマリン，４−メトキシクマリン，７−メトキシクマリン，７−アミノクマリンなどのクマリン系色素；ローダミンＢ，ローダミン６Ｇ，ローダミン１２３，スルホローダミン１０１，Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（スルホローダミン１０１酸クロリド），５−ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン），６−ＴＡＭＲＡ、ＴＭＲ（テトラメチルローダミン），ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミン−５（６）−イソチオシアナート），５−ＲＯＸ（５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、６−ＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）などのローダミン系色素；フルオレセイン、５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセイン），６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン），５−ＨＥＸ（５−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン），６−ＨＥＸ（６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン），５−ＴＥＴ（５−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン），６−ＴＥＴ（６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチアシアナート）、ＦｌＡｓＨ（Fluorescein Arsenical Hairpin）などのフルオレセイン系色素；Ｃｙ３，Ｃｙ５などのシアニン系色素；レゾルフィン，ＲｅＡｓＨ（Resorufin Arsenical Hairpin）などのレゾルフィン系色素；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）  ３５０，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７９０などのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素シリーズ（ライフテクノロジーズ社製）；ＤｙＬｉｇｈｔ  ３５０，ＤｙＬｉｇｈｔ  ４０５，ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８，ＤｙＬｉｇｈｔ  ５４９，ＤｙＬｉｇｈｔ  ５９４，ＤｙＬｉｇｈｔ  ６３３，ＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９，ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０，ＤｙＬｉｇｈｔ  ７５０，ＤｙＬｉｇｈｔ  ８００などのＤｙＬｉｇｈｔ色素シリーズ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）；Ｏｙｓｔｅｒ−５００，Ｏｙｓｔｅｒ−５５０Ｐ，Ｏｙｓｔｅｒ−５５６，Ｏｙｓｔｅｒ−６４５，Ｏｙｓｔｅｒ−６５０Ｐ，Ｏｙｓｔｅｒ−６５６などのＯｙｓｔｅｒ色素シリーズ（デノボバイオラベルズ社製）；等が挙げられる。
【００４５】
有機合成蛍光色素は、タグにアフィニティをもつリガンドを介して、修飾されたタグにアフィニティをもつリガンドを介して、タグにアフィニティをもつ抗体を介して、または標的タンパク質もしくはユビキチンにアフィニティをもつ抗体を介して、融合タンパク質（Ｙ）または融合タンパク質（Ｘ）に結合することが好ましい。
【００４６】
ＦＲＥＴペアとして好ましい有機合成蛍光色素の組合せとしては、ドナーから発せられる蛍光のスペクトルがアクセプターの励起スペクトルと重なっている組合せであれば特に限定されないが、例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０とＣｙ３、ＦＩＴＣとＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ｃｙ３とＴＡＭＲＡ等が挙げられる（左側がドナー、右側がアクセプターとなる）。
【００４７】
また、ＦＲＥＴペアの場合には、標的タンパク質を標識する有機合成蛍光色素とユビキチンを標識する有機合成蛍光色素とは、一方がドナーとなり、他方がアクセプターとなればよいが、標的タンパク質を標識する有機合成蛍光色素がドナーとなり、ユビキチンを標識する有機合成蛍光色素がアクセプターとなることが好ましい。なお、標的タンパク質がユビキチンである場合には、標的タンパク質を標識する有機合成蛍光色素とユビキチンを標識する有機合成蛍光色素とは、一方がドナーとなり、他方がアクセプターとなればよい。
【００４８】
（蛍光タンパク質）
蛍光タンパク質は、特に限定されないが、Ｓｉｒｉｕｓ，ＥＢＦＰ，ＳＢＰ２，ＥＢＰ２，Ａｚｕｒｉｔｅ，ｍＫａｌａｍａ１，ＴａｇＢＦＰ，ｍＢｌｕｅｂｅｒｒｙ，ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ，ＥＣＦＰ，Ｃｅｒｕｌｅａｎ，ＴａｇＣＦＰ，ＡｍＣｙａｎ，ｍＴＰ１，ＭｉＣｙ（Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ  Ｃｙａｎ），ＴｕｒｂｏＧＦＰ，ＣＦＰ，ＡｃＧＦＰ，ＴａｇＧＦＰ，ＡＧ  （Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ），ｍＡＧ１，ＺｓＧｒｅｅｎ，ＥｍＧＦＰ（Ｅｍｅｒａｌｄ），ＥＧＦＰ，ＧＰ２，Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ，ＨｙＰｅｒなどの青色蛍光タンパク質；ＴａｇＹＦＰ，ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ，ＥＹＦＰ，ＹＦＰ，Ｖｅｎｕｓ，Ｃｉｔｒｉｎｅ，ＰｈｉＹＦＰ，ＰｈｉＹＦＰ−ｍ，ｔｕｒｂｏＹＦＰ，ＺｓＹｅｌｌｏｗ，ｍＢａｎａｎａなどの黄色蛍光タンパク質；ｍＫＯ１，ＫＯ（Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ），ｍＯｒａｎｇｅ，ｍＯｒａｎｇｅ２，ｍＫＯ２などの橙色蛍光タンパク質；Ｋｅｉｍａ５７０，ＴｕｒｂｏＲＦＰ，ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ，ＤｓＲｅｄ，ＤｓＲｅｄ２，ＴａｇＲＦＰ，ＴａｇＲＦＰ−Ｔ，ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ，ｍＡｐｐｌｅ，ＡｓＲｅｄ２，ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ，ＴｕｒｂｏＦＰ６０２，ｍＲＰ１，ＪＲｅｄ，ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ，ｍＣｈｅｒｒｙ，ＫｅｉｍａＲｅｄ，ＨｃＲｅｄ，ｍＲａｓｂｅｒｒｙ，ｍＫａｔｅ２，ＴａｇＦＰ６３５，ｍＰｌｕｍ，ｅｇＦＰ６５０，Ｎｅｐｔｕｎｅ，ｍＮｅｐｔｕｎｅ，ｅｇＦＰ６７０などの赤色蛍光タンパク質；Ｍｅｄｉｕｍ−ＦＴ，Ｓｌｏｗ−ＦＴ，Ｆａｓｔ−ＦＴなどの蛍光タイマー；等が挙げられる。
【００４９】
ＦＲＥＴペアとして好ましい蛍光タンパク質の組合せとしては、ドナーから発せられる蛍光のスペクトルがアクセプターの励起スペクトルと重なっている組合せであれば特に限定されないが、例えば、ＣＦＰとＹＦＰ、ＡＧとＫＯ、ＥＧＦＰとＶｅｎｕｓ等の組合せが挙げられる（左側がドナー、右側がアクセプターとなる）。
【００５０】
また、ＦＲＥＴペアの場合には、標的タンパク質を標識する蛍光タンパク質とユビキチンを標識する蛍光タンパク質とは、一方がドナーとなり、他方がアクセプターとなればよいが、標的タンパク質を標識する蛍光タンパク質がドナーとなり、ユビキチンを標識する蛍光タンパク質がアクセプターとなることが好ましい。なお、標的タンパク質がユビキチンである場合には、標的タンパク質を標識する蛍光タンパク質とユビキチンを標識する蛍光タンパク質とは、一方がドナーとなり、他方がアクセプターとなればよい。
【００５１】
蛍光タンパク質は、タグにアフィニティをもつリガンドを介して、修飾されたタグにアフィニティをもつリガンドを介して、タグにアフィニティをもつ抗体を介して、または標的タンパク質もしくはユビキチンにアフィニティをもつ抗体を介して、融合タンパク質（Ｙ）または融合タンパク質（Ｘ）に結合するか、それ自体タグとして、標的タンパク質もしくはユビキチンとの融合タンパク質として細胞内で発現することが好ましい。
【００５２】
標的タンパク質（Ａ）およびユビキチン（Ｂ）の蛍光標識は、両方を蛍光タンパク質で標識してもよいし、両方を有機合成蛍光色素で標識してもよいし、一方を蛍光タンパク質で標識し、他方を有機合成蛍光色素で標識してもよい。
【００５３】
〈形質転換細胞〉
形質転換細胞は、融合タンパク質（Ｙ）および融合タンパク質（Ｘ）を細胞内で発現するように形質転換された細胞をいう。好ましくは、融合タンパク質（Ｙ）をコードする遺伝子および融合タンパク質（Ｘ）をコードする遺伝子を組み込んだ細胞をいう。より好ましくは、融合タンパク質（Ｙ）をコードするベクタおよび融合タンパク質（Ｘ）をコードするベクタを二重トランスフェクトした細胞をいう。
【００５４】
細胞は、ヒト、マウス等の動物に由来する細胞であってもよいし、昆虫細胞であってもよいし、酵母等であってもよい。
ヒト由来細胞としては、具体的には、例えば、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａなどの付着系の細胞；２９３−Ｆ、２９３−ＦＴ、Ｊｕｒｋａｔなどの浮遊系の細胞；等を利用することができる。また、各種組織から確立した初代細胞や幹細胞を用いることもできる。
ヒト以外の哺乳類由来細胞としては、例えば、マウス由来のＭＣ系、チャイニーズハムスター由来のＣＨＯ等の細胞を用いることができる。
昆虫培養細胞としては、例えば、Ｓｆ−９、Ｓｆ−２１などのスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）から確立されたＳｆ株等が挙げられる。
【００５５】
〈インキュベート〉
インキュベートは、ポリユビキチン化を誘導することができる条件を、細胞の種類に依存して適宜定めることができる。例えば、ヒト由来の２９３−Ｆ遊離細胞であれば、３７℃、５〜１０％の炭酸ガス雰囲気下で振盪しながら培養することが好ましい。また、ＨｅＬａ等の付着系細胞では、３７℃、５％の炭酸ガス雰囲気下で静止状態で培養することが好ましい。
【００５６】
〈レーザ光〉
レーザ光の波長は、使用する蛍光色素の励起波長によって適宜定めることができるが、細胞に対する刺激が比較的少ないという観点から、可視光域波長とすることが好ましい。
【００５７】
〈蛍光寿命・蛍光強度〉
蛍光寿命とは、蛍光強度が1／eに低下するのに要する時間である。蛍光寿命は分子構造や特性、分子の置かれている状態に依存する。
本発明の方法では、蛍光寿命を計測するとき、同時に、蛍光強度を計測してもよい。
【００５８】
〈フローサイトメーター〉
本発明の方法では、スループットを高くするという観点から、フローサイトメーターを用いることが好ましい。フローサイトメーターとしては、蛍光寿命と蛍光強度との同時計測をすることができるものが好ましく、具体的には、例えば、Ｆｌｉｃｙｍｅ（Ｒ）  ３００（三井造船社製）が挙げられる。フローサイトメーターを用いると、１細胞ごとに計測することができ、より多くの情報を得ることができる。
なお、フローサイトメーターを用いる場合には、細胞は浮遊系細胞を用いることが好ましいが、付着系細胞をトリプシン処理等することによって浮遊状態にして用いることもできる。
【００５９】
〈蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）〉
ＦＲＥＴとは、２種類の蛍光分子ペア（ドナーとアクセプター）が１０ｎｍ以下の距離に接近したときにおこる現象で、ドナーがレーザから受けた励起エネルギーの一部を、蛍光を介在することなくアクセプターに受け渡す現象をいう。ＦＲＥＴの発生により、ドナー蛍光強度の減少とアクセプター蛍光強度の増加が起こる。
【００６０】
本発明においては、上記蛍光色素（Ｄ１）と上記蛍光色素（Ｄ２）との間で蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が発生すればよく、どちらがドナーで、どちらがアクセプターであってもよいが、標的タンパク質を標識する蛍光色素がドナーであり、ユビキチンを標識する蛍光色素がアクセプターであることが好ましい。
【００６１】
［スクリーニング方法］
本発明は、また、標的タンパク質のプロテアソームによる分解の阻害物質をスクリーニングするための方法を提供する。
標的タンパク質はユビキチン−プロテアソーム系で分解されるタンパク質であるので、ポリユビキチン化を阻害する物質は、そのタンパク質の分解の阻害物質ともなり得るからである。
【実施例】
【００６２】
［ＩκＢαのポリユビキチン化の検出］
〈ＮＦ−κＢの特徴〉
ＮＦ−κＢは免疫反応において中心的役割を果たす転写因子の一つであり、急性および慢性炎症反応や細胞増殖、アポトーシスなどの数多くの生理現象に関与している。ＮＦ−κＢはストレスやサイトカイン、紫外線等の刺激により活性化される。ＮＦ−κＢ活性制御の不良はクローン病や関節リウマチなどの炎症性疾患をはじめとし、癌や敗血症性ショックなどの原因となり、特に悪性腫瘍では多くの場合ＮＦ−κＢの恒常的活性化が認められる。さらに、ＮＦ−κＢはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）やヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の増殖にも関与している。
【００６３】
ＮＦ−κＢは、細胞質内ではホモまたはヘテロ二量体を形成し、そのインヒビターであるＩκＢと結合して不活性な状態で存在している。ＮＦ−κＢは、Ｒｅｌファミリーに属し、その構造により、ＲｅｌＡ（ｐ６５）、ＲｅｌＢ、ｃ−Ｒｅｌ、ＮＦ−κＢ１（ｐ１０５／ｐ５０）、ＮＦ−κＢ２（ｐ１００／ｐ５２）の５種類に分類される。これらのうち、ｐ５０およびｐ５２は、ｐ１０５とｐ１００の前駆体として産生され、プロテアソームにより限定分解されて生じる。これらは互いに共通の領域としてＲｅｌホモロジードメイン（ＲＨＤ）というアミノ酸配列を持っていて、この領域に核内への移行シグナル（ＮＬＳ）も存在する。
【００６４】
〈ＩκＢの特徴〉
ＩκＢは核内因子κＢ１（ＮＦ−κＢ）の抑制因子である。ＩκＢには、７種類のファミリー（ＩκＢα／β／γ／ε、Ｂｃｌ３、ｐ１０５，ｐ１００）がある。これらの分子はアンキリンリピートと呼ばれるアミノ酸の繰り返し配列を有し、これによってＮＦ−κＢのＲＨＤと会合し、ＮＦ−κＢに存在するＮＬＳをマスクすることでＮＦ−κＢの核内への移行をブロックしている。
【００６５】
〈ＮＦ−κＢの活性化〉
通常の細胞内ではＮＦ−κＢはＩκＢαやｐ１００などの阻害タンパク質と会合した不活性型として細胞質に存在するが、活性化シグナルを受容すると阻害タンパク質は分解されＮＦ−κＢは核内に移行して活性化される。現在のところ、ＮＦ−κＢの活性化の経路は以下の３経路があることが知られている（Tsuchiya, Yoshihiro、外５名，「Nuclear IKKbeta is an adaptor protein for IkappaBalpha ubiquitination and degradation in UV-induced NF-kappaB activation.」，Molecular Cell，２０１０年８月２７日，第３９巻，第４号，ｐ．５７０−５８２）。
【００６６】
ＮＦ−κＢ活性化の第１経路（古典的経路）は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）などの炎症性サイトカインがＩＫＫβを活性化してＩκＢαの分解を誘導する経路である。活性化されたＩＫＫβはＩκＢαのＮ末端に存在する２つのセリン残基をリン酸化し、リン酸化されたＩκＢαはユビキチンリガーゼβ−ＴｒＣＰによりポリユビキチン化をうけてプロテアソームによって分解される。最終的に、ＲｅｌＡとｐ５０とから構成されるＮＦ−κＢが核内に移行して遺伝子発現を誘導する。通常、活性化されたＮＦ−κＢは、ＩκＢαなどの阻害タンパク質の発現やＡ２０などの活性化抑制タンパク質の発現を誘導するため、ＮＦ−κＢはすみやかに不活性化される。
【００６７】
ＮＦ−κＢ活性化の第２経路は、ＣＤ４０などに代表されるリンパ球制御関連因子がＩＫＫαを活性化する経路である。活性化されたＩＫＫαはｐ１００をリン酸化し、リン酸化されたｐ１００はβ−ＴｒＣＰによるポリユビキチン化を介した限定分解によりｐ５２に変換され、最終的にＲｅｌＢとｐ５２とから構成されるＮＦ−κＢが活性化される。
ＩＫＫαまたはＩＫＫβによりリン酸化された阻害タンパク質にβ−ＴｒＣＰが直接に会合してポリユビキチン化を誘導する点が、第１経路と第２経路との共通点である。
【００６８】
一方、ＮＦ−κＢ活性化の第３経路は、リン酸化を介さずにＩκＢが誘導性に分解される経路である。この経路ではＩＫＫβはキナーゼとして機能するのではなく、β−ＴｒＣＰとＩκＢとの会合を介在するアダプタータンパク質として機能する。細胞を紫外線照射するとＩκＢαは核内に移行してＩＫＫβと会合する。ＩＫＫβにはβ−ＴｒＣＰが会合しており、この複合体上でＩκＢαはポリユビキチン化をうけて最終的にプロテアソームにより分解される。カゼインキナーゼ２やｐ３８  ＭＡＰキナーゼもＩＫＫβを介してＩκＢαの分解を促進する。
【００６９】
本実施例では、可視光レーザを照射し、ＩκＢαのポリユビキチン化を検出することから、第１経路における阻害タンパク質ＩκＢαのポリユビキチン化を検出することができる。
【００７０】
［実施例１］形質転換細胞での融合タンパク質のポリユビキチン化の検出
〈方法〉
《ＩκＢαとＧＳＴタグとの融合タンパク質の発現コンストラクト》
（エントリークローンの構築）
ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｒ）クローニングキット（ライフテクノロジーズ社製）を用いて、Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯクローニングにより、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片をｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｒ）エントリーベクタに組み込んで組換えベクタを得る。さらに、この組換えベクタを大腸菌（ＯｎｅＳｈｏｔ（Ｒ）  ＯｍｎｉＭａｘＴＭ２Ｔ１細胞，ライフテクノロジーズ社製）にトランスフェクトし、カナマイシン含有培地で培養し、組換えベクタを分離・精製して、エントリークローンを得る。
【００７１】
（発現クローンの構築）
構築したエントリークローンと、哺乳類細胞用Ｇａｔｅｗａｙ（Ｒ）発現ベクタ（ｐＤＥＳＴＴＭ２７，ライフテクノロジーズ社製；Ｎ末端ＧＳＴタグ，ネオマイシン耐性）と、Ｇａｔｅｗａｙ（Ｒ）  ＬＲクロナーゼＴＭＩＩ酵素ミックス（ライフテクノロジーズ社製）とを混合してインキュベートし、ＬＲリコンビネーション反応を行い、組換えベクタを得る。さらに、この組換えベクタを大腸菌（ＯｎｅＳｈｏｔ（Ｒ）  ＴＯＰ１０細胞，ライフテクノロジーズ社製）にトランスフェクトし、カナマイシン含有培地で培養し、組換えベクタを分離・精製して、発現クローン（以下、実施例１において「発現クローン１」という。）を得る。
【００７２】
《ユビキチンとＴＣタグとの融合タンパク質の発現コンストラクト》
（エントリークローンの構築）
ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｒ）クローニングキット（ライフテクノロジーズ社製）を用いて、配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片をｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｒ）エントリーベクタに組み込んで組換えベクタを得る。さらに、このベクタを大腸菌（ＯｎｅＳｈｏｔ（Ｒ）  ＯｍｎｉＭａｘＴＭ２Ｔ１細胞，ライフテクノロジーズ社製）にトランスフェクトし、カナマイシン含有培地で培養し、組換えベクタを分離・精製して、エントリークローンを得る。
【００７３】
（発現クローンの構築）
構築したエントリークローンと、発現ベクタ（ｐｃＤＮＡＴＭ６．２／ｎＴＣ−Ｔａｇ−ＤＥＳＴ，ライフテクノロジーズ社製；Ｎ末端ＴＣタグ，ブラスチジン耐性）と、ＬＲクロナーゼＴＭＩＩ酵素ミックス（ライフテクノロジーズ社製）とを混合してインキュベートし、ＬＲリコンビネーション反応を行い、組換えベクタを得る。さらに、大腸菌（ＯｎｅＳｈｏｔ（Ｒ）  ＴＯＰ１０細胞，ライフテクノロジーズ社製）にトランスフェクトし、カナマイシン含有培地で培養し、組換えベクタを分離・精製して、発現クローン（以下、実施例１において「発現クローン２」という。）を得る。
【００７４】
《トランスフェクション》
発現クローン１および発現クローン２を、定法により、２９３−Ｆ浮遊細胞（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３−Ｆ細胞；ライフテクノロジーズ社製）に二重トランスフェクトする。ネオマイシン硫酸塩およびブラスチジンＳ塩酸塩を含有する培地で、３７℃、４８時間、８％二酸化炭素雰囲気で、振盪しながら培養し、ＧＳＴタグとＩκＢαとの融合タンパク質と、ＴＣタグとユビキチンとの融合タンパク質を発現させる。
【００７５】
《蛍光標識》
ＧＳＴタグに結合する、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）  ４８８色素で標識した抗グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ抗体（最大励起波長４９５ｎｍ，最大蛍光波長５２０ｎｍ；ライフテクノロジーズ社製）と、ＴＣタグに結合する、ＲｅＡｓＨ−ＥＤＴ２標識試薬（最大励起波長５９３ｎｍ，最大蛍光波長６０８ｎｍ；ライフテクノロジーズ社製）とを用いて蛍光標識する。
【００７６】
《蛍光寿命計測》
フローサイトメーターＦｌｉｃｙｍｅ（Ｒ）  ３００（三井造船社製）を用いて、形質転換細胞について、各１０万個のデータを計測する。ドナー用として中心波長４９４ｎｍ・半値幅４１ｎｍのバンドパスフィルタを、アクセプター用としてカットオン波長６００ｎｍのロングパスフィルタを、それぞれ使用する。
【００７７】
〈結果〉
ＦＲＥＴの発生が検出される。また、細胞内でのポリユビキチン化を定量的に計測することができ、さらに、細胞ごとのポリユビキチン化の違いを比較することもできる。そして、ドナー領域の蛍光寿命の短縮が認められる。
【００７８】
［比較例１］非形質転換細胞での計測
〈方法〉
形質転換を行わない２９３−Ｆ浮遊細胞を使用する。計測その他は実施例１と同様に行う。
〈結果〉
ＦＲＥＴの発生は検出されない。
【００７９】
［比較例２］形質転換細胞での融合タンパク質のポリユビキチン化の蛍光強度による検出
〈方法〉
Flicyme-300 を用いて蛍光強度の計測を行うが、蛍光寿命の計測は行わず、蛍光強度比をＦＲＥＴの指標とした点を除き、実施例１と同様に行う。
〈結果〉
ＦＲＥＴの発生が検出される。しかし、バックグラウンドが高く、細胞内ポリユビキチン化を定量的に計測することができない。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
標的タンパク質のポリユビキチン化を阻害または促進する物質のスクリーニングを高スループットで行うことができ、医薬品探索・開発のための細胞アッセイ技術として利用可能である。
【配列表】
2012127694000001.app