(57)【要約】【課題】プロテアソーム活性化剤を提供する。【解決手段】シリビンマルトシドを有効成分とするプロテアソーム活性化剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリビンマルトシドを有効成分とするプロテアソーム活性化剤。
【請求項２】
シリビンマルトシドを有効成分とする酸化カルボニルタンパク抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアソーム活性化技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、活性酸素による生体内の細胞や組織で見られる様々な酸化傷害が問題になっている。活性酸素は非常に反応性が高く、生体の様々な成分を破壊し、脳卒中、心筋梗塞、白内障、リウマチ、癌、胃潰瘍、皮膚におけるしわやしみなどの様々な疾患に関与することが明らかになっている（非特許文献１）。活性酸素を増加させる要因として、加齢、過度の運動、紫外線暴露、精神的ストレスなどが知られている。活性酸素が増加すると、生体内に酸化タンパク質、いわゆる異常タンパク質が蓄積し、前述したような様々な疾患を引き起こす（非特許文献２）。皮膚においては、特に紫外線暴露による酸化障害の影響が大きく、紫外線暴露により、表皮角化細胞や皮膚線維芽細胞のＤＮＡ損傷、皮膚の弾性成分であるエラスチンやコラーゲンの分解などが起こり、しわやしみの形成を促進することが知られている（非特許文献３）。
【０００３】
これまで、活性酸素による酸化障害を防ぐために、抗酸化物質の摂取、適用により生体内の活性酸素を消去し、タンパク質の酸化を抑制するという試みがなされてきた。代表的な抗酸化物質として、トコフェロール類、カロテノイド類及びフラボノイド類などが知られており、これらのいくつかは食品や化粧品に配合されて利用されている。
しかしながら、抗酸化物質の摂取、適用は、生体内で発生する活性酸素の消去には関与するが、既に蓄積している異常タンパク質の除去には全く関与しない。したがって、生体内に蓄積した異常タンパク質が関与する種々の疾病の改善をするには蓄積している異常タンパク質の除去が必須となる。
【０００４】
生体内の異常タンパク質を除去する酵素として、プロテアソームが知られている。プロテアソームは複雑な分子構成をした巨大な多成分複合体であり、近年その生体内における生理機能の研究が注目されている。プロテアソームは、タンパク質が立体構造を形成する過程で正常な折り畳みや分子集合に支障をきたした異常タンパク質の除去を行い、タンパク質の品質管理の役割を担うとともに、紫外線や酸化ストレスなどにより、変性や傷害を受けたタンパク質を除去することにより、ストレス応答にも密接に関係している（非特許文献４）。このように、プロテアソームは異常タンパク質を除去することにより、細胞の恒常性を維持、監視する中心的役割を担う物質である。
【０００５】
以上のようなことから、生体内のプロテアソーム活性を促進し、種々の疾病を予防及び改善する組成物が開発されている。例えば、マンネンタケの抽出物を含むプロテアソーム活性促進剤（特許文献１）、特定のペプチド化合物を含むプロテアソーム作用増強剤（特許文献２）、プロテアソーム活性促進作用をもつ大豆由来サポニンを含む異常タンパク質除去用組成物（特許文献３）、及びケール及び／又はその抽出物を含むプロテアソーム活性促進用組成物（特許文献４）が開発されている。
【０００６】
さらに、本出願人は、大豆由来サポニンやケール及び／又はその抽出物のプロテアソーム活性促進成分が、生体内の異常タンパク質を除去するのみではなく、紫外線傷害を予防又は改善する作用をもつことを見出し、大豆由来のサポニンを含むことを特徴とする紫外線傷害予防又は改善用組成物（特許文献５）の開発や、シリビン、シラン抽出物、アヤメ抽出物を１種又は２種用いると異常タンパク質を除去する機能があることを発見し、特許出願を行っている（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−２９９９６号公報
【特許文献２】国際公開００／０４０４２号パンフレット
【特許文献３】特開２００２−１７９５９２号公報
【特許文献４】特開２００４−９１３９８号公報
【特許文献５】特開２００４−１３１４３１号公報
【特許文献６】特開２００７−９９６５０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】老化のメカニズムと制御、藤本大三郎編著、株式会社アイピーシー、平成５年６月３０日
【非特許文献２】ＢＩＯ  Ｃｌｉｎｉｃａ、１１巻、第５号、１９９６年
【非特許文献３】化粧品の有用性・評価技術の進歩と将来展望、日本化粧品技術者会編、薬事日報社、２００１年３月３１日
【非特許文献４】蛋白質  核酸  酵素、第４４巻、第６号、７６６〜７７５頁、１９９９年、共立出版社
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、異常タンパクを除去するプロテアソームを活性化するプロテアソーム活性化剤及び酸化カルボニルタンパク抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、シリビンマルトシドに良好なプロテアソーム活性を示すことを知見したことに基づき、本発明を提案する。
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１）シリビンマルトシドを有効成分とするプロテアソーム活性化剤。
（２）シリビンマルトシドを有効成分とする酸化カルボニルタンパク抑制剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、シリビンマルトシドが、プロテアソーム活性化能とともに、酸化カルボニルタンパクの生成抑制能を有することが新たに知見できた。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＰＤＬ５４の老化した線維芽細胞を用い、紫外線Ａ波照射時の、トリプシン様プロテアソーム活性を示すグラフ
【図２】ＰＤＬ２７の若い線維芽細胞を用い、紫外線Ｂ波照射時の、トリプシン様プロテアソーム活性を示すグラフ
【図３】ＰＤＬ５４の老化した線維芽細胞を用い、紫外線Ａ波照射時の、酸化カルボニルタンパク抑制を示すグラフ
【図４】ＰＤＬ２７の老化した線維芽細胞を用い、紫外線Ｂ波照射時の、酸化カルボニルタンパク抑制を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のプロテアソーム活性化剤及び酸化カルボニルタンパク抑制剤は、紫外線暴露により発生した活性酸素により産生された細胞内の変性タンパク質（異常タンパク質）を分解するプロテアーゼを活性化し、紫外線暴露による細胞傷害を抑制することにより、白内障、皮膚癌、皮膚におけるしわやしみなどの様々な疾患を予防及び改善することができる。また、酸化カルボニルタンパク抑制剤は、紫外線照射による酸化カルボニルタンパク質の生成を抑制することができるものであって、シリビンマルトシドを有効成分とすることを特徴とする。以下に、本発明のプロテアソーム活性化剤について、詳細に説明する。
【００１５】
本発明で用いられるシリビンマルトシドは下記式（１）に示されるものであり、文献（Ｋｒｅｎ  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ  １，２４６７−２４７４（１９９７））に従って、シリビンに、ルイス酸を触媒として、パーアセチルマルトースを反応させてグリコシド結合を生成し、脱アセチル化することにより得られるが、市販のものを用いることも可能である。
【００１６】
【化１】
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【実施例】
【００１７】
以下に、実施例をあげて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によりなんら限定されるものではない。
【００１８】
［評価検体］
（ａ）シリビンマルトシド
（ｂ）シリマリンＥＴ／Ｇ（Ｉｎｄｅｎａ S.P.A）
（ｃ）シリビン（Ｓｉｇｍａ）
（ｄ）SILYBIN PHOSPHOLIPIDS（Ｉｎｄｅｎａ S.P.A）
【００１９】
［シリビン配糖体（シリビンマルトシド）の合成］
βマルトースもしくはβラクトースの配糖体化をＨｅｌｆｅｒｉｃｈの方法に従ってシリビン配糖体を合成した。
シリビン（3.0 ｇ、  6.2 mol、東京化成工業社製）とオクタ-O-アセチル-D-マルトース（6.3 ｇ、  9.2ｍｏｌ、和光純薬社製）とを180 ｍｌのジクロロメタン−アセトニトリル（１：１、ｖ／ｖ、関東化学社製）の溶媒中で、三ふっ化ほう素ジメチルエーテル錯体（1.14ｍｌ、  12.4 ｍｍｏｌ、Merck  Chemicals社製）を窒素存在下、室温で １９時間攪拌反応させた。反応終了後、氷冷しながら飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（関東化学社製）を加え、１５０ｍｌジクロロメタン（関東化学社製）で２回抽出処理し、無水硫酸ナトリウム（関東化学社製）処理後に抽出溶媒をエバポレーターにて除去した。
トリエチルアミン−メタノール−水（１：８：１、関東化学社製）を３５℃３０時間反応させたのち、エバポレーターにより溶媒を除去した。BONDESIL-C18(Varian)を用いて精製を行い、シリビンマルトシド（1.0 g, 収率20%）を得た。
【００２０】
［皮膚由来線維芽細胞におけるプロテアソーム活性測定］
（１）細胞培養および紫外線照射
新生児由来ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＦＢ、三光純薬）を５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地でＰＤＬ（集団倍加数）をチェックしながら３７℃−５％ＣＯ２インキュベーターにて継代培養した。下記に定めた線維芽細胞のＰＤＬ数に達したところでプロテアソーム活性の試験に供した。
【００２１】
紫外線Ｂ波照射にはＰＤＬ２０〜４０の若い細胞を用い、紫外線Ａ波照射にはＰＤＬ４５〜６０の老化した細胞を用いた。
トリプシン処理で剥がした線維芽細胞の細胞数をコールターカウンターで計測し、２０００００ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度によるように調整した。
６ウェル平板プレートに細胞を１０００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（ＤＭＳＯ１％含有）で２４ｈ培養した。
紫外線照射前に、各サンプルを最終濃度が１０μｇ／ｍｌ（５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ；ＤＭＳＯ１％含有）となるように添加し、２４ｈ培養した。
培養液をＨａｎｋ’ｓ（−）液に置換し、紫外線照射を行った。
照射終了後、直ちにＨａｎｋ’ｓ（−）液を紫外線照射前と同一濃度条件の評価サンプル含有５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（ＤＭＳＯ１％含有）に置換し、２４ｈ培養した。
【００２２】
（２）細胞懸濁液回収、プロテアソーム活性溶液調整、タンパク濃度の測定
培養液を除去しＰＢＳ（−）で各ウェルを洗浄後、各ウェルにトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を８００μＬ添加し、３７℃で５分間処理して線維芽細胞をディッシュ底面から剥離させ、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ１．５ｍｌでトリプシン反応を終止した。溶液と一部底着したままの細胞についてはスクレーパー処理で細胞を１５ｍｌ容遠沈管に回収した。１，５００ｒｐｍ  ５ｍｉｎの条件で遠沈して培養液を除去、ＰＢＳ（−）で洗浄し再び１，５００ｒｐｍ  ５ｍｉｎの条件で遠沈してＤＭＥＭ中の色素（フェノールレッド）を完全に除去した。
この細胞塊をホモジナイズＢｕｆｆｅｒ（５０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％（ｖ／ｖ）グリセリン、ｐＨ＝７．５）３００μＬに懸濁させた。その後、氷冷中でホモジナイズ処理（ＵＤ−２０１超音波破砕装置、ＴＯＭＹ製を使用、条件は「ＯＵＴ  ＰＵＴ  １、ＤＵＴＹ４０、１５ｓｅｃを２ｓｅｔ」）した。ホモジナイズ溶液を１．５ｍｌ容エッペンチューブに全量移し、１５，０００ｒｐｍ  １０ｍｉｎ遠心分離して上清をプロテアソーム活性溶液として回収した。
このプロテアソーム活性溶液について、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に準拠してＢＳＡ（ウシ血清アルブミン  ＳＩＧＭＡ社製）換算で全タンパク量を求めた。
発色試薬はＢｉｏ−Ｒａｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（脱イオン水で５倍希釈）を用いた。
平板９６ウェルプレートに
プロテアソーム活性溶液／ＢＳＡ  溶媒：ホモジナイズＢｕｆｆｅｒ      １０μｌ
Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（脱イオン水で５倍希釈）２００μｌ
を加えて１０ｍｉｎ室温にてプレートごと撹拌反応した。吸光度５９０ｎｍをプレートリーダーで計測し、ＢＳＡ溶液で作成した検量線について全タンパク濃度を求めた。
【００２３】
（３）プロテアソーム活性の測定
トリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（ペプチド研究所）、
キモトリプシン様プロテアソーム活性測定用基質Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ（ペプチド研究所）、
をそれぞれ１０ｍＭ（溶媒；ＤＭＳＯ）で調整し、３０μＬずつを分注して−２０℃冷凍保存した。使用時に解凍し６００μＬの反応液で希釈して使用した。
蛍光分析用平板９６ウェルプレートに以下の溶液をそれぞれ加えた。
【００２４】
１．基質ペプチド（トリプシン様／キモトリプシン様）  １０．５μＬ  （蛍光分析        時の基質ペプチド濃度２３．８μＭ）
２．反応液（１００ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ＝        ８．０）  ２５μＬ
３．１０ｍＭ  ＡＴＰ含有ホモジナイズＢｕｆｆｅｒ    １９．５μＬ（蛍光分析時        のＡＴＰ濃度は０．９７５ｍＭ）
４．プロテアソーム活性サンプル（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）  ２０μＬ
上記溶液を３７℃で１ｈ撹拌反応し、反応終了後に、
５．１０％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ（反応停止液）      ２５μＬ
６．１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ＝９．０）      １００μＬ  （全量２００μＬ／        ｗｅｌｌ）
として、プロテアソームによって基質ペプチドから遊離した７−アミノ−４−メチルクマリン（ＭＣＡ）由来の蛍光強度（励起波長  Ｅｘ３８０ｎｍ、蛍光波長  Ｅｍ４４０ｎｍ）を測定した。
【００２５】
（４）データ処理
（蛍光強度／タンパク濃度）で算出されるプロテアソーム活性について、ＵＶ（−）のコントロール群を基準（１．００）とし、平均値で他の各群と比較した。
【００２６】
［酸化カルボニルタンパクの定量］
（１）タンパク濃度０．１〜０．２μｇ／μＬの範囲で凍結保存していた線維芽細胞由来のサンプルを自然解凍後にトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）処理してタンパク沈殿し、２０μｇタンパク重量に相当するサンプルを用意した。そのサンプルについて、カルボニル化蛋白質測定キット（日研ザイル製）で酸化カルボニルタンパク量を定量した。具体的には、前処理したサンプル、スタンダード、コントロール、各２００μＬをウェルに分注し、プレートをシールして、４℃で一晩反応させた。ＥＩＡバッファー  ３００μＬ／ウェルにて５回洗浄後に、全てのウェルに「希釈済みブロッキング試薬」を２５０μＬ／ウェル分注し、室温にて３０分インキュベート後にＥＩＡバッファー  ３００μＬ／ウェルにて５回洗浄、そして、ビオチン標識−抗ＤＮＰ抗体を２００μＬ分注し、３７℃にて１時間インキュベートした。ＥＩＡバッファー  ３００μＬ／ウェルにて５回洗浄、「希釈済みＨＲＰ標識−ストレプトアビジン」を２００μＬ分注し、室温にて１時間インキュベートした。ＥＩＡバッファー  ３００μＬ／ウェルにて５回洗浄、「発色液」を２００μＬ／ウェル分注し、室温にて各ウェルでの反応時間が５分になるよう調整し、「反応停止液」を１００μＬ／ウェル分注し、反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００２７】
（２）データ処理
反応生成物であるｐ−ニトロアニリン由来の吸光度４５０ｎｍを測定し、カルボニル化蛋白質測定キットに付属している標準カルボニルタンパクで作成した検量線に対する各サンプルのカルボニル化タンパクを測定した。
【００２８】
［プロテアソーム活性］
［試験例１］
ＰＤＬ５４の老化した線維芽細胞、以下の評価サンプルを用いて、トリプシン様プロテアソーム活性化評価を行った。
（ａ）紫外線Ａ波  非照射  コントロール
（ｂ）紫外線Ａ波  照射    コントロール
（ｃ）紫外線Ａ波  照射    シリビンマルトシド（１０μｇ／ｍｌ）
（ｄ）紫外線Ａ波  照射    シリマリンＥＴ／Ｇ（１０μｇ／ｍｌ）
（ｅ）紫外線Ａ波  照射    シリビン          （１０μｇ／ｍｌ）
（ｆ）紫外線Ａ波  照射    SILYBIN PHOSPHOLIPIDS  （１０μｇ／ｍｌ）
【００２９】
図１に紫外線Ａ波照射時のトリプシン様プロテアソーム活性の結果を示す。紫外線Ａ照射（ｂ）でトリプシン様プロテアソーム活性が低下すること、そして紫外線照射前後に評価サンプルを添加する事でプロテアソーム活性が維持・向上される事を確認した。
同一重量％での各サンプルを比較すると、シリビン（ｅ）＞SILYBIN PHOSPHOLIPIDS（ｆ）＞シリビンマルトシド（ｃ）≒シリマリンＥＴ／Ｇ（ｄ）の優劣でトリプシン様活性が向上した。
【００３０】
［試験例２］
ＰＤＬ２７の若い線維芽細胞を用い、紫外線Ｂ波を照射した以外は、実施例１と同様の手順でトリプシン様プロテアソーム活性化評価を行った。評価サンプルを添加した（ｃ）（ｄ）（ｅ）（ｆ）は、紫外線照射によっても変化しない程度にプロテアソーム活性が維持・向上される事を確認した。同一重量％での各サンプルを比較すると、シリマリンＥＴ−Ｇ（ｄ）＞シリビン（ｅ）＞SILYBIN PHOSPHOLIPIDS（ｆ）≒シリビンマルトシド（ｃ）の優劣でトリプシン様活性が向上した。
【００３１】
［酸化カルボニル抑制］
［試験例３］
ＰＤＬ５４の老化した線維芽細胞、以下の評価サンプルを用いて、酸化カルボニルタンパク抑制の評価を行った。
（（ａ））紫外線Ａ波  非照射  コントロール
（ｂ）紫外線Ａ波  照射    コントロール
（ｃ）紫外線Ａ波  照射    シリビンマルトシド    （１０μｇ／ｍｌ）
（ｄ）紫外線Ａ波  照射    シリマリンＥＴ／Ｇ    （１０μｇ／ｍｌ）
（ｅ）紫外線Ａ波  照射    シリビン              （１０μｇ／ｍｌ）
（ｆ）紫外線Ａ波  照射    SILYBIN PHOSPHOLIPIDS （１０μｇ／ｍｌ）
【００３２】
図３に紫外線Ａ波照射時の酸化カルボニルタンパク抑制の結果を示す。紫外線Ａ波を照射した細胞（ｂ）では酸化カルボニルタンパクが４倍前後増加し、評価サンプルを添加した群では顕著な酸化カルボニルタンパクの抑制が認められた。紫外線未照射（ａ）では酸化カルボニルは０．２３ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、紫外線照射した時（ｂ）の酸化カルボニルは１．０６ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであり、評価サンプルを添加した（ｃ）（ｄ）（ｅ）（ｆ）は、紫外線照射によって酸化カルボニルが０．２２〜０．３６ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎの範囲であり、これは紫外線未照射サンプル（ａ）に近い量であった。このことから、シリビンマルトシド、シリマリンＥＴ／Ｇ、シリビン、SILYBIN PHOSPHOLIPIDSには、酸化カルボニルの顕著な抑制効果が認められた。
【００３３】
［試験例４］
ＰＤＬ２７の若い線維芽細胞を用い、紫外線Ｂ波を照射した以外は、実施例３と同様の手順で酸化カルボニルタンパク抑制の評価を行った。
図４に紫外線Ｂ波照射時の酸化カルボニルタンパク抑制の結果を示す。
紫外線Ｂ波を照射した細胞では酸化カルボニルタンパクが４倍前後増加し、サンプルを添加した群では顕著な酸化カルボニルタンパクの抑制が認められた。紫外線未照射では酸化カルボニルは０．２４ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、紫外線照射した時の酸化カルボニルは１．０１ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであり、評価サンプルを紫外線照射前後に添加した時の酸化カルボニルは０．２７〜０．３５ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎの範囲であり、これは紫外線未照射サンプルに近い量であった。このことから、シリビンマルトシド、シリマリンＥＴ／Ｇ、シリビン、SILYBIN PHOSPHOLIPIDSには、酸化カルボニルの顕著な抑制効果が認められた。
【００３４】
［考察］
プロテアソームの活性化はシリビン／シリビン修飾体の種類により同一重量％添加条件である程度の順序付けが可能であった。シリビンフィトソームやシリビンマルトシドの修飾体はプロテアソーム活性化が同一重量％比較でシリビン・シリマリンよりも劣っていた。
しかしながら、酸化カルボニルの抑制効果は各シリビン／シリビン修飾体の種類に大差が無く、いずれも顕著に酸化カルボニルを抑制した。
シリビンマルトシドは、シリマリンＥＴ−Ｇ、シリビン、SILYBIN  PHOSPHOLIPIDSと同程度の酸化カルボニルの抑制効果を示したことは、これらの他の試薬と異なる構造部分が、紫外線照射に伴う異常蛋白である酸化カルボニルタンパクの生成を抑制する機能を有することが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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