(57)【要約】【課題】検査負担が小さく、簡便に判定が可能な特異的反応検出キット、特異的反応検出装置、及び特異的反応検出方法を提供する。【解決手段】本発明に係る特異的反応検出装置１は、特異的反応検出プレート１０と、磁界を生じさせる磁気照射手段２０とを具備する。特異的反応検出プレート１０の流路は、磁性粒子に、特異的反応の対象となる物質の一方を表面修飾した磁性粒子複合体を含む試薬試料５と、特異的反応の対象となるもう一方の物質の有無を判定する対象であって、特異的反応が生じた場合には凝集体８を形成する被検試料６とを注入する流入口に連通し、当該流路内で、磁気照射手段２０による磁力と流路の流体の流圧によって磁性粒子複合体６０と凝集体８の磁気集積パターンを異ならしめることにより、特異的反応の検出を行う。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の物質が、試薬試料中の物質と特異的反応をするか否かを判定するための流路が形成された特異的反応検出プレートと、
前記特異的反応検出プレートの前記流路の少なくとも一部に磁界を生じさせる磁気照射手段とを具備し、
前記特異的反応検出プレートの前記流路は、磁性粒子に、特異的反応の対象となる物質の一方を表面修飾した磁性粒子複合体を含む試薬試料と、前記特異的反応の対象となるもう一方の物質の有無を判定する対象であって、前記特異的反応が生じた場合には前記磁性粒子複合体と前記もう一方の物質の間で凝集体を形成する被検試料と、を注入するための流入口に連通し、
前記流路内で、前記磁気照射手段による磁力と前記流路の流体の流圧によって前記磁性粒子複合体と前記凝集体の磁気集積パターンを異ならしめることによって、前記特異的反応の検出を行う特異的反応検出キット。
【請求項２】
前記被検試料と前記試薬試料を、少なくとも前記磁界発生流路内で循環させるための循環手段を備えていることを特徴とする請求項１に記載の特異的反応検出キット。
【請求項３】
前記磁気照射手段が、電磁石、超電導磁石、又は永久磁石を備えることを特徴とする請求項１又は２に記載の特異的反応検出キット。
【請求項４】
前記試薬試料と前記被検試料は、一つの流入口に注入されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の特異的反応検出キット。
【請求項５】
前記試薬試料の前記磁性粒子には、発光分子が固定化されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の特異的反応検出キット。
【請求項６】
前記特異的反応は、抗原抗体反応であり、前記試薬試料の前記磁性粒子には、抗原若しくは抗体のいずれかが修飾されており、前記被検試料中に前記磁性粒子に修飾された抗原若しくは抗体と抗原抗体反応する抗体若しくは抗原が存在するか否かを検出することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の特異的反応検出キット。
【請求項７】
前記特異的反応は、相補的核酸間反応であり、前記試薬試料の前記磁性粒子には、核酸が修飾されており、前記被検試料中に前記磁性粒子に修飾された核酸と相補的に反応する核酸が存在するか否かを検出することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の特異的反応検出キット。
【請求項８】
前記特異的反応は、リガンド・レセプター間反応であり、前記試薬試料の前記磁性粒子には、リガンド若しくはレセプターのいずれかが修飾されており、前記被検試料中に前記磁性粒子に修飾されたリガンド若しくはレセプターとリガンド・レセプター間反応するレセプター若しくはリガンドが存在するか否かを検出することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の特異的反応検出キット。
【請求項９】
請求項１〜８の特異的反応検出キットと、
前記磁界発生流路の磁気集積パターンを検出する集積パターン検出装置とを備える特異的反応検出装置。
【請求項１０】
前記検出装置は、面状光源シートを具備する光源を備えることを特徴とする請求項９に記載の特異的反応検出装置。
【請求項１１】
前記特異的反応検出キットに備えられた磁気照射手段は、前記面状光源シートを介して前記特異的反応検出プレートの少なくとも一部と対向配置されていることを特徴とする請求項１０に記載の特異的反応検出装置。
【請求項１２】
磁性粒子に、特異的反応の対象となる物質の一方を表面修飾した磁性粒子複合体を含む試薬試料と、前記試薬試料中の前記磁性粒子に修飾された前記特異的反応の対象となる物質と特異的反応が生じるか否かを判定する対象であって、前記特異的反応が生じた場合には前記磁性粒子複合体と前記もう一方の物質の間で凝集体を形成する被検試料とを流路に注入し、
前記試薬試料と前記被検試料を混合し、前記流路内の少なくとも一部に磁気照射手段により磁界を発生させて、前記流路内で前記磁気照射手段による磁力と前記流路の流体の流圧によって前記磁性粒子複合体と前記凝集体の磁気集積パターンを異ならしめることによって、前記特異的反応の検出を行う特異的反応検出方法。
【請求項１３】
前記特異的反応が、抗原抗体反応、相補的核酸間反応、若しくはリガンド・レセプター間反応のいずれかであることを特徴とする請求項１０に記載の特異的反応検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は特異的反応検出キットに関する。また、前記特異的反応検出キットを利用した特異的反応検出装置、及び特異的反応検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原を認識して複合体を形成する抗体は、脊椎動物の感染防御機構において重要な役割を担っている。抗原と抗体は、鍵と鍵穴のような関係にあり、完全に一致した時に抗原抗体反応が起きる。この性質を利用し、従来より抗原抗体反応検査が実用化されている。
【０００３】
実用化されている方法としては、アイソトープを標識としたラジオイムノアッセイ法、酵素を標識とする酵素イムノアッセイ法、蛍光物質を標識とする蛍光イムノアッセイ法等がある。また、磁性粒子を標識として磁性体検出を行う方法も提案されている（特許文献１〜４）。
【０００４】
特許文献１には、抗原、又は抗体に磁性粒子を標識して磁性体標識体とし、この磁性体標識体と検体を抗原抗体反応させ、次いで、検体から未反応の磁性体標識体を分離除去し、検体の磁化を超電導磁束量子干渉計（ＳＱＵＩＤ）で測定するＳＱＵＩＤ免疫測定法が提案されている。測定値より、検体中の磁性体標識体の有無、及び存在量を知ることが可能となる。
【０００５】
特許文献２には、磁性粒子を抗原抗体反応の標識体として用い、磁性粒子の凝集を磁気センサで測定することにより分析する方法が提案されている。特許文献３には、生体化学反応により残留する磁性粒子に高周波磁界を印加し、熱量を発生させることによって、磁性粒子の数に対応した物理量の変化を検出し、被検体溶液中に含有される物質を検出する方法が提案されている。
【０００６】
特許文献４には、アビジン／ビオチン結合を介してｎ種の抗体が結合されている磁気粒子からなる標識付き試薬が提案されている。また、これを用いた分析方法として、多孔体に湿潤状態で移動可能に保持された前述の標識付き試薬に、液状試料を導入し、抗原抗体反応による複合体を形成後、その下流に設置された反応部に固定化された一次抗体と特異的に複合体を反応させ、基材上に磁性粒子を固定化し、その状態を磁気検出装置により検出する方法が提案されている。
【０００７】
特許文献５には、磁性ビーズの集積特性と蛍光を用いる検出方法が提案されている。具体的には、試薬供給源の試薬中の第１のモノクローナル抗体及び第２のモノクローナル抗体と、尿道カテーテルを介して採取した尿中のバイオマーカとの抗原抗体反応を行うための反応回路と、試薬供給源の試薬を反応回路へ導くチューブと、反応回路における反応後の混合液を取り込み、磁力により磁気ビーズを吸着し、磁気ビーズ−第１のモノクローナル抗体と結合したバイオマーカを捕集する磁気捕集部と、捕集されたバイオマーカに結合した第２のモノクローナル抗体−蛍光色素の蛍光色素を、その励起波長の光により励起し、発生する蛍光量を測定する蛍光量測定部を具備する方法が開示されている。なお、特許文献６及び非特許文献１については後述する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開昭６３−９０７６５号公報
【特許文献２】特開昭６３−３０２３６７号公報
【特許文献３】特開２００５−３１５６７７号公報
【特許文献４】特開２００７−１３９５３８号公報
【特許文献５】特開２０１０−２５６１１６号公報
【特許文献６】特許第４１８３０４７号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】"磁気粒子を用いた効率の高いトランスフェクション試薬"、［online］,2008年4月21日、フナコシ株式会社、［平成21年6月1日検索］、インターネット（http://www.funakoshi.co.jp/shiyaku/entry/539.php#top）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
検査の普及に当たっては、検査負担が少ないこと、検査の判定方法が簡便であることが求められる。これらを実現する抗原抗体反応の検出方法を提供できれば、予防医学上においても意義が大きい。なお、上記においては、抗原抗体反応の検出方法に関する問題点を述べたが、リガンド・レセプター、遺伝子・相補的な遺伝子などの他の相補的な関係にあり、特異的反応をする組み合わせ全般について同様の課題が生じ得る。
【００１１】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、検査負担が小さく、簡便に判定が可能な特異的反応検出キット、特異的反応検出装置、及び特異的反応検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る特異的反応検出キットは、被検試料中の物質が、試薬試料中の物質と特異的反応をするか否かを判定するための流路が形成された特異的反応検出プレートと、前記特異的反応検出プレートの前記流路の少なくとも一部に磁界を生じさせる磁気照射手段とを具備する。前記特異的反応検出プレートの前記流路は、磁性粒子に、特異的反応の対象となる物質の一方を表面修飾した磁性粒子複合体を含む試薬試料と、前記特異的反応の対象となるもう一方の物質の有無を判定する対象であって、前記特異的反応が生じた場合には前記磁性粒子複合体と前記もう一方の物質の間で凝集体を形成する被検試料とを注入するための流入口に連通し、前記流路内で、前記磁気照射手段による磁力と前記流路の流体の流圧によって前記磁性粒子複合体と前記凝集体の磁気集積パターンを異ならしめることによって、前記特異的反応の検出を行うものである。
【００１３】
本発明に係る特異的反応検出キットによれば、被検試料と試薬試料を混合して磁気照射手段により磁気集積パターンを異ならせて、特異的反応を検出するという方法によるので、検査負担が小さく、簡便な判定ができるという優れた効果がある。
【００１４】
本発明に係る特異的反応検出装置は、上記態様の特異的反応検出キットと、前記磁界発生流路の磁気集積パターンを検出する集積パターン検出装置とを備えるものである。
【００１５】
本発明に係る特異的反応検出方法は、磁性粒子に、特異的反応の対象となる物質の一方を表面修飾した磁性粒子複合体を含む試薬試料と、前記試薬試料中の前記磁性粒子に修飾された前記特異的反応の対象となる物質と特異的反応が生じるか否かを判定する対象であって、前記特異的反応が生じた場合には前記磁性粒子複合体と前記もう一方の物質の間で凝集体を形成する被検試料とを流路に注入し、前記試薬試料と前記被検試料を混合し、前記流路内の少なくとも一部に磁気照射手段により磁界を発生させて、前記流路内で前記磁気照射手段による磁力と前記流路の流体の流圧によって前記磁性粒子複合体と前記凝集体の磁気集積パターンを異ならしめることによって、前記特異的反応の検出を行うものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、検査負担が小さく、簡便に判定が可能な特異的反応検出キット、検出装置、及び特異的反応検出方法を提供することができるという優れた効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】第１実施形態に係る特異的反応検出装置の模式的説明図。
【図２】第１実施形態に係る特異的反応検出プレートの模式的斜視図。
【図３Ａ】第１実施形態に係る特異的反応検出プレートの第２基板の上面図。
【図３Ｂ】図３ＡのＩＩＩＢ−ＩＩＩＢ切断部断面図。
【図３Ｃ】図３ＡのＩＩＩＣ−ＩＩＩＣ切断部断面図。
【図４Ａ】抗体-磁性粒子複合体の模式的説明図。
【図４Ｂ】抗原の模式的説明図。
【図５Ａ】陽性の場合の抗原−抗体-磁性粒子凝集体を示す模式的説明図。
【図５Ｂ】陰性の場合の抗体-磁性粒子複合体の模式的説明図。
【図６】第２実施形態に係る特異的反応検出装置の模式的説明図。
【図７】第２実施形態に係る磁気照射手段の模式的な分解斜視図。
【図８】第３実施形態に係る特異的反応検出装置の模式的説明図。
【図９】図８のＩＸ−ＩＸ切断部における特異的反応検出プレートの模式的断面図。
【図１０Ａ】実施例に係る陰性の場合の磁気集積パターンの電子顕微鏡写真（４５秒後）。
【図１０Ｂ】実施例に係る陰性の場合の磁気集積パターンの電子顕微鏡写真（９０秒後）。
【図１０Ｃ】実施例に係る陰性の場合の磁気集積パターンの電子顕微鏡写真（１３５秒後）。
【図１１Ａ】実施例に係る陽性の場合の磁気集積パターンの電子顕微鏡写真（４５秒後）。
【図１１Ｂ】実施例に係る陽性の場合の磁気集積パターンの電子顕微鏡写真（９０秒後）。
【図１１Ｃ】実施例に係る陽性の場合の磁気集積パターンの電子顕微鏡写真（１３５秒後）。
【図１２】実施例に係る磁気集積パターンの蛍光マクロイメージング写真。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明に係る特異的反応の検出は、磁性粒子に、特異的反応の対象となる物質の一方を表面修飾した磁性粒子複合体を含む試薬試料と、試薬試料中の磁性粒子に修飾された特異的反応の対象となる物質と特異的反応が生じるか否かを判定する対象であって、前記特異的反応が生じた場合には凝集体を形成する被検試料とを用いるものである。より具体的には、被検試料と試薬試料を流路に注入してこれらを混合し、流路内の少なくとも一部に磁気照射手段により磁界を発生させて、流路内で磁気照射手段による磁力と、流路内の流体の流圧によって磁性粒子複合体と凝集体の磁気集積パターンを異ならしめて、この磁気集積パターンから特異的反応の有無を検出するものである。なお、ここでいう特異的反応の検出とは、定性的な検出、又は／及び定量的な検出である。
【００１９】
以下、本発明を適用した実施形態の一例について説明する。なお、本発明の趣旨に合致する限り、他の実施形態も本発明の範疇に含まれることは言うまでもない。また、以降の図における各部材のサイズや比率は、説明の便宜上のものであり、実際のものとは必ずしも一致しない。また、以降の実施形態及び実施例において、同一の要素部材には同一符号を付し、適宜その説明を省略する。また、以降の実施形態において、特異的反応の例として、抗原抗体反応を例にとり説明するが、リガンド・レセプター反応、遺伝子・相補的な遺伝子である相補的核酸間反応などの他の相補的な関係にあり、特異的反応をする物質の検出に利用することも可能である。
【００２０】
［第１実施形態］
第１実施形態に係る特異的反応検出装置は、抗原抗体反応等の特異的反応を検出する検査システムであり、（ａ）特異的反応検出キット、（ｂ）集積パターン検出装置を有する。（ａ）特異的反応検出キットは、流体を流す流路を具備する特異的反応検出プレートと、磁気照射手段を有する。（ｂ）集積パターン検出装置は、特異的反応検出プレート内の磁気集積パターンを検出する手段を具備する。
【００２１】
図１に、第１実施形態に係る特異的反応検出装置の模式的説明図を示す。特異的反応検出装置１は、特異的反応検出キット２と集積パターン検出装置３を有する。特異的反応検出キット２は、特異的反応検出プレート１０、磁気照射手段２０を具備する。集積パターン検出装置３は、蛍光顕微鏡３０、撮像装置４０、画像処理装置５０を具備する。
【００２２】
図２に、特異的反応検出プレート１０の模式的斜視図を示す。特異的反応検出プレート１０は、第１基板１１、第２基板１２、第１流入口１３、第２流入口１４、流出口１５を有する。特異的反応検出プレート１０の内部には、第１流入口１３、第２流入口１４、流出口１５が互いに連通し、被検試料、及び試薬試料を流すことが可能な流路が形成されている。特異的反応検出プレート１０の一側面の一部には、磁気照射手段２０を設置するための凹部１６が設けられている（図１参照）。
【００２３】
蛍光顕微鏡３０は、図１に示すように、ステージ３１、鏡柱３２、鏡筒３３、調節ハンドル３４、接眼レンズ３５、レボルバ３６、対物レンズ３７、給電端子３８、光源として機能する面状光源シート３９等を備える。また、蛍光顕微鏡３０は、撮像装置４０、画像処理装置５０に接続されている。
【００２４】
蛍光顕微鏡３０のステージ３１は、特異的反応検出プレート１０を載置する台として機能する。ステージ３１は、鏡脚としても機能する。ステージ３１は、案内レール（不図示）等により前後左右に移動し得るスライドテーブル機構を備えていてもよい。また、ステージ３１を回動可能なように構成してもよい。また、斜め傾斜機能などの機能を備えていてもよい。ステージ３１には、面状光源シート３９を固定可能な係合部、又は固設部等を備えるようにすることが好ましい。
【００２５】
鏡柱３２は、ステージ３１に取り付けられている。そして、鏡柱３２の上部に対物レンズ３７及び接眼レンズ５を保持する鏡筒３３が取り付けられている。鏡筒３３の高さは、調節ハンドル３４により調節可能となっている。これにより、特異的反応検出プレート１０と対物レンズ３７との距離を変化させ、ピントを合わせることができる。レボルバ３６には、複数の対物レンズ３７が取り付けてある。レボルバ３６を回転することにより、使用する対物レンズ３７を切り替えることができる。
【００２６】
撮像装置４０は、例えば、ＣＣＤカメラなどであり、ＣＣＤカメラを画像処理部９に接続することにより、コンピューターを用いた画像処理を実施することが可能となる。
【００２７】
なお、ステージ３１の下部に鏡脚を別体に設け、鏡柱３２を鏡筒３３と固設させ、ステージ３１を鏡柱３２に対して上下させることにより、ピントを合わせるように構成してもよい。ステージ３１を移動させる構造は、鏡筒３３に撮像装置などの光学的付加部品を取り付ける場合に有利である。
【００２８】
面状光源シート３９は、特異的反応検出プレート１０に後述する磁性粒子に修飾された蛍光分子の励起光を照射する光源として、若しくは白色光の透過光源としての役割を担う。面状光源シート３９は、ステージ３１上の最表面にステージ３１と着脱自在に取り付けられている。面状光源シート３９をステージ３１の最上部に設置する構成を採用し、かつ、ステージ３１に対して、面状光源シート３９を着脱自在とすることにより、照射光線の種類を変更したい場合や寿命・故障の際に、新しい面状光源シート３９に容易に交換することができる。
【００２９】
特異的反応検出プレート１０は、面状光源シート３９の直上に、これと当接するように載置されている。第１基板１１及び第２基板１２の材質は、集積パターン検出装置３により検出可能であり、かつ本発明に係る抗原抗体反応の検出が可能な材料であれば、特に限定されない。例えば、ガラス基板、樹脂からなる基板を用いることができる。目視、若しくは顕微鏡による内部観察の容易性の観点からは、透明基板が好ましい。また、製造容易性の観点から、透明樹脂が好ましい。特異的反応検出プレート１０として樹脂製のものを利用すれば、ディスポーザブル用途にも好適である。
【００３０】
第１基板１１及び第２基板１２の厚みは特に限定されないが、通常、２〜５ｍｍ程度である。また、第１基板１１及び第２基板１２の縦、横のサイズも特に限定されないが、一例を挙げれば、３０ｍｍ×７０ｍｍ程度である。
【００３１】
第１基板１１の第１流入口１３、第２流入口１４及び流出口１５は、第１基板１１の表面から基板を貫通するように設けられている。第１流入口１３と第２流入口１４は第１基板１１の一辺近傍に、流出口１５は第１流入口１３等が設けられている一辺近傍と対向する一辺近傍に設けられている。第１流入口１３は、試薬試料を注入するための入り口部であり、第２流入口１４は、抗体試料を注入するための入り口部である。
【００３２】
図３Ａに、第２基板１２の模式的上面図を、図３Ｂに図３ＡのIIIB-IIIB切断部断面図を、図３Ｃに図３ＡのIIIC-IIIC切断部断面図を示す。第２基板１２における第１基板１１と対向する側の面側には、内部空間構造を形成するための第１凹部１７、第２凹部１８、第３凹部１９を有する。また、溝状に形成され、第１基板と接合することにより流路が形成される試薬試料流路２１、被検試料流路２２、混合流路２３、磁界発生流路２４が形成されている。これらは、第１流入口１３と第２流入口１４から流出口１５まで連通された構造となっている。
【００３３】
第１凹部１７、第２凹部１８、試薬試料流路２１、被検試料流路２２、混合流路２３、磁界発生流路２４の深さは、同一となっている。一方、第３凹部１９は、液体溜まりとして機能するように、第１凹部１７等よりも深くなっている。なお、第１実施形態においては、第３凹部１９以外の深さを同一とする例を挙げたが、例えば、下流側に行くにつれて深くなるように底面に傾斜を設けたり、磁界発生流路２４における磁気集積特性の最適化したりするように、適宜深さや形状を設計することができる。
【００３４】
第２基板１２の第１凹部１７と第１基板１１の第１流入口１３は、第１基板１１と第２基板１２の接合により一体的な空間を形成する。第２基板１２の第２凹部１８と第１基板１１の第２流入口１４、第２基板１２の第３凹部１９と第１基板１１の流出口１５についても同様である。
【００３５】
第１凹部１７は試薬試料流路２１に連通され、第２凹部１８は被検試料流路２２に連通されている。そして、試薬試料流路２１と被検試料流路２２は、下流側で混合流路２３に連通されている。すなわち、混合流路２３において、試薬試料流路２１を通過した試薬試料と被検試料流路２２を通過した被検試料が混合されることになる。
【００３６】
混合流路２３は、磁界発生流路２４に連通する。磁界発生流路２４は、折り返し部を設けて折りたたまれるような流路が形成されている。磁界発生流路２４の折り返し部の一方には、図１に示すように、磁界発生手段である磁気照射手段２０が設置されている。
【００３７】
かかる構成により、試薬試料は、源流となる第１流入口１３から第１凹部１７を通って、試薬試料流路２１、混合流路２３、磁界発生流路２４を通過し、さらに第３凹部１９にまで至る。同様に、被検試料は、源流となる第２流入口１４から第２凹部１８を通って、被検試料流路２２、混合流路２３、磁界発生流路２４を通過し、さらに第３凹部１９にまで至る。
【００３８】
なお、流路は、少なくとも混合流路２３と磁界発生流路２４があればよく、試薬試料流路２１や被検試料流路２２は設けなくてもよい。また、流路の形状や形成方法は一例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々の変形が可能である。
【００３９】
磁気照射手段２０は、特異的反応検出プレート１０の磁界発生流路２４の一側面端部に配置され、磁気照射手段２０近傍の磁界発生流路２４に磁気を照射する。磁気照射手段２０は、磁石、シールド手段を有する。シールド手段は、磁力遮蔽部材により構成する。これにより、磁石の磁力線に指向性を付与させることが可能となる。なお、磁気照射手段２０としては、磁石を有していればよく、磁石に指向性を付与する必要がない場合には、シールド手段を具備していなくてもよい。
【００４０】
磁石は、その種類や形状は特に限定されない。例えば、電磁石、超電導磁石、永久磁石を用いることができる。電磁石を用いて電圧、若しくは電流を可変させることにより磁場を変化させてもよい。さらに、磁気勾配を付与する工夫を施してもよい。磁気照射手段２０の小型化を実現する観点からは、永久磁石を用いることが好ましい。永久磁石の種類は、特に限定されるものではないが、一例として、フェライト、Ｎｅ−Ｆｅ−Ｂ合金、サマリウム−コバルト合金を挙げることができる。また、特異的反応検出プレート自体の少なくとも一部をゴム磁石などの磁石で構成してもよい。強力な磁力を要する場合には、Ｎｅ−Ｆｅ−Ｂ合金が好ましい。
【００４１】
シールド手段は、前述したように、磁石の磁界発生方向に指向性を付与するためのシールド機能を有する。シールド手段は、ヨーク（継鉄）により構成した。無論、シールド機能を有する材料であればこれに限定されるものではない。シールド手段を設けることにより、磁石の一方向からの磁力を増強し、他の部分の磁力の大幅な減衰を実現することができる。
【００４２】
また、特異的反応検出プレート１０と磁石の間に、着脱自在なシールド板を取り付け可能なように設置してもよい。これにより、特異的反応検出プレート１０への磁気照射のオン、オフを制御することが可能となる。また、電磁石からなる磁石を特異的反応検出プレート１０に固設させ、電気のオン、オフにより、磁力線の発生をオン、オフ可能なように構成してもよい。
【００４３】
試薬試料流路２１、被検試料流路２２、混合流路２３及び磁界発生流路２４の流路幅、流路深さは、測定対象とする試料をスムーズに流し、かつ乾燥による試料の詰まりや失活等を防止することを目的に、測定対象とする試料の粘性に応じて適宜設計すればよい。通常、流路幅は１〜５０００μｍ、深さは１〜１０００μｍの範囲であり、発生容易な液圧の観点からは５０〜５０００μｍ、深さは５０〜５００μｍの範囲とすることが好ましい。磁性ナノ粒子の磁気吸着効率の高い流速を考慮すると、深さが５０〜２００μｍ、幅が５０〜２００μｍであることがより好ましい。
【００４４】
第１基板１１、第２基板の試料通過部には、抗原抗体が失活しないように、若しくは流れ度合いを調整するために、また、後述する抗体-磁性粒子複合体と、被検試料の非特異的吸着を防ぐため、必要に応じて表面処理を行うことができる。表面処理は、公知の方法を制限なく利用することができる。
【００４５】
上記のように構成された特異的反応検出プレート１０は、面状光源シート３９上に載置される。面状光源シート３９の発光領域が観察対象領域に照射可能なように特異的反応検出プレート１０が設置されていればよく、面状光源シート３９と特異的反応検出プレート１０とのサイズは問わない。
【００４６】
なお、第１実施形態においては、面状光源シート３９がステージ３１に固定されているところに、特異的反応検出プレート１０を載せることによって、特異的反応検出プレートをセットする例を挙げたが、これに代えて、以下の構成としてもよい。すなわち、面状光源シート３９を特異的反応検出プレート１０に一体的に取り付け、光源装置付き特異的反応検出プレートをステージ３１に載置するようにしてもよい。特異的反応検出プレート１０に対して面状光源シート３９を着脱自在に構成することにより、繰り返し面状光源シート３９を適用することができる。また、昨今においては、面状光源シートを比較的安価に入手可能となっているので、ディスポーザブル用途の光源装置付き特異的反応検出プレートとしても利用可能である。
【００４７】
面状光源シート３９の厚みは、特に限定されるものではなく、用途や目的に応じて選定可能であるが、例えば、０．２ｍｍ〜１．２ｍｍ程度である。面状光源シート３９には、有機エレクトロルミネッセンス(ＥＬ;Electro Luminescence）素子からなる有機ＥＬシート、無機ＥＬ素子からなる無機ＥＬシート、ＬＥＤ素子からなるＬＥＤシートを好適に適用することができる。
【００４８】
ＥＬシートは、発光する化合物（発光材料）を含有する発光層を、陰極層と陽極層で挟んだ構成を有し、発光層に電子及び正孔を注入して、再結合させることにより励起子を生成させる。そして、この励起子を生成させ、この励起子が失活する際の光の放出（蛍光、燐光）を利用して発光する素子である。ＥＬ素子の層構成は、特に限定されるものではなく、公知のものを制限なく用いることができる。例えば、陽極、発光層、電子輸送層、陰極の層構成からなるものや、陽極と発光層の間に正孔輸送層などを備えるものなどを挙げることができる。発光層は、電極、又は電子輸送層、正孔輸送層から注入されてくる電子及び正孔が再結合して発光する層であり、発光する部分は、発光層の層内であっても発光層と隣接層との界面であってもよい。無機ＥＬシートは、特に安価に提供することができるので、低コスト化に有利である。従って、ディスポーザブル用途の光源としての利用用途もある
【００４９】
ＬＥＤシートは、p型半導体とn型半導体を接合し、そこに通電することで接合面から光が発生する素子である。素子に電極が接続され、樹脂などによって封止されている。ＬＥＤシートは、特に、寿命が長い点において優れている。例えば、ルミネシート（有限会社ルミテクノ）（非特許文献１参照）などを適用することができる。
【００５０】
次に、第１実施形態に係る特異的反応検出方法について説明する。まず、抗体-磁性粒子複合体を用意する。図４Ａに抗体-磁性粒子複合体の模式的説明図を、図４Ｂに抗原の模式的説明図を示す。抗体-磁性粒子複合体６０は、コアを磁性粒子６１とし、磁性粒子６１に蛍光分子６２と２種類の抗体６３ａ、６３ｂを固定化した粒子である。抗原７０は、２種類の抗体６３ａ、６３ｂに対応するエピトープ７１ａ、７１ｂを有する。抗体６３ａとエピトープ７１ａが特異的に反応し、抗体６３ｂがエピトープ７１ｂに特異的に反応する。
【００５１】
なお、この例においては、抗体-磁性粒子複合体６０に２種類の抗体６３ａ、６３ｂが修飾され、エピトープ７１ａ、７１ｂを２つ有する抗原を例に挙げているが、抗体−磁性粒子複合体に結合する抗体は、１つ若しくは３つ以上であってもよい。同様に、抗原が有するエピトープは、１つ若しくは３つ以上であってもよい。また、用いる抗体-磁性粒子複合体６０は、１種類に限定されず、複数種類の抗体-磁性粒子複合体を用いてもよい。複数種類の抗体-磁性粒子複合体用いる場合には、例えば、異なる種類の抗体-磁性粒子複合体に、異なる発光帯域の蛍光分子を標識し、磁気集積パターンを観察する際に発光帯域を検出することにより、抗原抗体反応が起こっている種類を特定することが可能となる。
【００５２】
磁性粒子６１としては、（１）蛍光分子、抗体と複合体を形成する、（２）磁気照射手段２０により、集積可能な磁性を有する、という条件を満たすものであれば、特に限定されずに適用することができる。例えば、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、マグヘマイト（Ｆｅ２Ｏ３）、一酸化鉄（ＦｅＯ）、窒化鉄、鉄（Ｆｅ）、ニッケル、コバルト、コバルト白金クロム合金、バリウムフェライト合金、マンガンアルミ合金、鉄白金合金、鉄パラジウム合金、コバルト白金合金、鉄ネオジムボロン合金、及びサマリウムコバルト合金等が挙げられる。磁性粒子は、粒子径が小さくても高い磁気誘導特性を有する磁気異方性の高い材料が好ましい。磁性粒子６１の好ましい材料としては、窒化鉄、ＦｅＰｔ粒子や、ＦｅＰｔ粒子と他の磁性金属元素を含むナノ粒子との複合体を挙げることができる。また、磁性分子が非磁性分子によって被覆されたナノ粒子、若しくはマイクロ粒子を用いてもよい。さらに、上記特許文献６に開示した自己会合型磁性脂質ナノ粒子、若しくは脂質被覆磁性ナノ粒子やポリマー被覆磁性ナノ粒子を用いてもよい。
【００５３】
磁性粒子６１の平均粒径は、特に限定されないが、１ｎｍ以上とすることが好ましく、流路内の流れ性を考慮すると５００ｎｍ以下とすることが好ましい。
【００５４】
抗体-磁性粒子複合体６０の形成方法は、公知の方法を制限なく用いることができる。例えば、複数の反応基を有する磁性粒子に、その反応基を介して蛍光分子６２を結合させ、さらに、蛍光分子の一部に抗体を結合させることにより抗体-磁性粒子複合体６０を得ることができる。また、複数の反応基を有する磁性粒子に、反応基を介して蛍光分子６２と抗体６３をそれぞれ結合させてもよい。反応基としては、アピジン-ビオチン系結合、エポキシ基、トシル基、エステル基、チオール基、アミノ基、ハロゲン化アシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、アルデヒド基、マレイミド基、ビニルスルホン基、ベンゾトリアゾールカーボネート基、プロモアセトアミド基などが挙げられる。また、磁性粒子に脂質膜、若しくは高分子膜を被覆し、これらの表面に共有結合などにより蛍光分子６２を導入してもよい。被覆層の好適な例として、脂質、界面活性剤、末端にアルコキシシリル基、クロロシリ基、イソシアナトシリル基、メルカプト基等を有するポリエチレングリコール等の高分子などが挙げられる。
【００５５】
蛍光分子６２は、検出可能なレベルで導入されていれば良く、磁性粒子６１を被覆している必要はない。また、一個の抗体-磁性粒子複合体６０中の抗体の数は、１以上であればよいが、抗原抗体反応によって凝集体が形成されるように、複数導入することが好ましい。
【００５６】
蛍光分子は、公知のものを制限なく使用することができる。一例としては、例えば、１，５ ＩＡＥＤＡＮＳ；１，８−ＡＮＳ；４−メチルウンベリフェロン；５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン；５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）；５−カルボキシナフトフルオレセイン；５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）；５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＡＴ）；５−ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）；６−カルボキシローダミン６Ｇ；６−ＣＲ ６Ｇ；６−ＪＯＥ；７−アミノ−４−メチルクマリン；７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）；７−ヒドロキシ−４−Ｉメチルクマリン；９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン（ＡＣＭＡ）；ＡＢＱ；酸性フクシン；アクリジンオレンジ；アクリジンレッド；アクリジンイエロー； アクリフラビン；アクリフラビンフュールゲンＳＩＴＳＡ；エクオリン（発光タンパク質）；ＡＦＰ−自己蛍光タンパク質−（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ｓｇＧＦＰ；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ３５０；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４３０；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５３２；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５４６；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５６８；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５９４；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６３３；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６６０；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６８０；アリザリンコンプレクソン；アリザリンレッド；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）；ＡＭＣ、ＡＭＣＡ−Ｓ；アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）；ＡＭＣＡ−Ｘ；アミノアクチノマイシンＤ；アミノクマリン；アニリンブルー；ステアリン酸アントロシル（Ａｎｔｈｒｏｃｙｌ ｓｔｅａｒａｔｅ）；ＡＰＣ−Ｃｙ７；ＡＰＴＲＡ−ＢＴＣ；ＡＰＴＳ；アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ；アストラゾンオレンジＲ；アストラゾンレッド６Ｂ；アストラゾンイエロー７ ＧＬＬ；アタブリン；オーラミン；オーロホスフィンＧ；オーロホスフィン；ＢＡＯ ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）；ＢＣＥＣＦ（高ｐＨ）；ＢＣＥＣＦ（低ｐＨ）；硫酸ベルベリン；βラクタマーゼ；ＢＦＰブルーシフト化ＧＦＰ（Ｙ６６Ｈ）；青色蛍光タンパク質；ＢＦＰ／ＧＦＰ ＦＲＥＴ；ビマン；ビスベンズアミド；ビスベンズイミド（Ｈｏｅｃｈｓｔ）；ビス−ＢＴＣ；ブランコフォアＦＦＧ；ブランコフォアＳＶ；ボディピー４９２／５１５；４９３／５０３；ボディピー５００／５１０；ボディピー；５０５／５１５；ボディピー５３０／５５０；ボディピー５４２／５６３；ボディピー５５８／５６８；ボディピー５６４／５７０；ボディピー５７６／５８９；ボディピー５８１／５９１；ボディピー６３０／６５０−Ｘ；ボディピー６５０／６６５−Ｘ；ボディピー６６５／６７６；ボディピーＦｌ；ボディピーＦＬ ＡＴＰ；ボディピーＦｌ−セラミド；ボディピーＲ６Ｇ ＳＥ；ボディピーＴＭＲ；ボディピーＴＭＲ−Ｘコンジュゲート；ボディピーＴＭＲ−Ｘ、ＳＥ；ボディピーＴＲ；ボディピーＴＲ ＡＴＰ；ボディピーＴＲ−Ｘ ＳＥ；ブリリアントスルホフラビンＦＦ；ＢＴＣ；ＢＴＣ−５Ｎ；カルセイン；カルセインブルー；カルシウムクリムゾン−；カルシウムグリーン；カルシウムグリーン−１ Ｃａ２＋染料；カルシウムグリーン−２ Ｃａ２＋；カルシウムグリーン−５Ｎ Ｃａ２＋；カルシウムグリーン−Ｃ１８ Ｃａ２＋；カルシウムオレンジ；カルコフルオルホワイト；カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）；Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（登録商標）；カスケードイエロー；カテコールアミン；ＣＣＦ２（ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ）；ＣＦＤＡ；ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）；ＣＦＰ／ＹＦＰ ＦＲＥＴ；クロロフィル；クロモマイシンＡ；クロモマイシンＡ；ＣＬ−ＮＥＲＦ；ＣＭＦＤＡ；コエレンテラジン；コエレンテラジンｃｐ；コエレンテラジンｆ；コエレンテラジンｆｃｐ；コエレンテラジンｈ；コエレンテラジンｈｃｐ；コエレンテラジンｉｐ；コエレンテラジンｎ；コエレンテラジンＯ；クマリンファロイジン；Ｃ−フィコシアニン；ＣＰＭ Ｉメチルクマリン；ＣＴＣ；ＣＴＣホルマザン；Ｃｙ２；Ｃｙ３．１ ８；Ｃｙ３．５；Ｃｙ３；Ｃｙ５．１ ８；Ｃｙ５．５；Ｃｙ５；Ｃｙ７；シアンＧＦＰ；サイクリックＡＭＰ蛍光センサー（ＦｉＣＲｈＲ）；ダブシル；ダンシル；ダンシルアミン；ダンシルカダベリン；ダンシルクロライド；ダンシルＤＨＰＥ；ダンシルフルオリド；ＤＡＰＩ；ダポキシル；ダポキシル２；ダポキシル３'ＤＣＦＤＡ；ＤＣＦＨ（ジクロロジヒドロフルオレセインニ酢酸）；ＤＤＡＯ；ＤＨＲ（ジヒドロローダミン１２３）；ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ；Ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳ（ｎｏｎ−ｒａｔｉｏ）；ＤｉＡ（４−Ｄｉ １６−ＡＳＰ）；ジクロロジヒドロフルオレセインニ酢酸（ＤＣＦＨ）；ＤｉＤ−親油性トレーサー；ＤｉＤ（ＤｉｌＣ１８（５））；ＤＩＤＳ；ジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ）；Ｄｉｌ（ＤｉｌＣ１８（３））；Ｉジニトロフェノール；ＤｉＯ（ＤｉＯＣ１８（３））；ＤｉＲ；ＤｉＲ（ＤｉｌＣ１８（７））；ＤＭ−ＮＥＲＦ（高ｐＨ）；ＤＮＰ；ドーパミン；Ｄｓレッド；ＤＴＡＦ；ＤＹ−６３０−ＮＨＳ；ＤＹ−６３５−ＮＨＳ；ＥＢＦＰ；ＥＣＦＰ；ＥＧＦＰ；ＥＬＦ ９７；エオシン；エリスロシン；エリスロシンＩＴＣ；エチジウムブロマイド；エチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１）；オイクリシン；ＥｕｋｏＬｉｇｈｔ；ユーロピウム（１１１）クロライド；ＥＹＦＰ；ファーストブルー；ＦＤＡ；フュールゲン（パラロサニリン）；ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導蛍光）；ＦＩＴＣ；フラゾオレンジ；フルオ−３；フルオ−４；フルオレセイン（ＦＩＴＣ）；フルオレセインニ酢酸；フルオロ−エメラルド；フルオロ−ゴールド（ヒドロキシスチルバミジン）；フルオル−ルビー；フルオルＸ；ＦＭ １−４３；ＦＭ ４−４６；Ｆｕｒａ−２／ＢＣＥＣＦ；ゲナクリルブリリアントレッドＢ；ゲナクリルブリリアントイエロー１０ＧＦ；ゲナクリルピンク３Ｇ；ゲナクリルイエロー５ＧＦ；ジーン・ブレイザー；（ＣＣＦ２）；ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）；ＧＦＰレッドシフト（ｒｓＧＦＰ）；ＧＦＰ野生型非ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）；ＧＦＰ野生型ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）；ＧＦＰｕｖ；グロキサン酸；グラニュラーブルー；ヘマトポルフィリン；���キスト３３２５８；ヘキスト３３３４２；ヘキスト３４５８０；ＨＰＴＳ；ヒドロキシクマリン；ヒドロキシスチルバミジン（フルオロゴールド）；ヒドロキシトリプタミン；Ｉｎｄｏ−１、高カルシウム；Ｉｎｄｏ−１、低カルシウム；インドジカルボシアニン（ＤｉＤ）；インドトリカルボシアニン（ＤｉＲ）；イントラホワイトＣｆ；ＪＣ−１；ＪＯ ＪＯ−１；ＪＯ−ＰＲＯ−１；レーザープロ；ラウロダン（Ｌａｕｒｏｄａｎ）；ＬＤＳ ７５１（ＤＮＡ）；ＬＤＳ ７５１（ＲＮＡ）；ロイコフォアＰＡＦ；ロイコフォアＳＦ；ロイコフォアＷＳ；リサミンローダミン；リサミンローダミンＢ；カルセイン／エチジウムホモダイマー；ＬＯＬＯ−１；ＬＯ−ＰＲＯ−１；ルシファーイエロー；リソトラッカーブルー；リソトラッカーブルー−ホワイト；リソトラッカーグリーン；リソトラッカーレッド；リソトラッカーイエロー；リソセンサーブルー；リソセンサーグリーン；リソセンサーイエロー／ブルー；マググリーン；マグダーラレッド（フロキシンＢ）；マグ−フラレッド；マグ−フラ−２；マグ−フラ−５；マグ−インド−１；マグネシウムグリーン；マグネシウムオレンジ；マラカイトグリーン；マリーナブルー；Ｉマキシロンブリリアントフラビン１０ ＧＦＦ；マキシロンブリリアントフラビン８ ＧＦＦ；メロシアニン；メトキシクマリン；ミトトラッカーグリーンＦＭ；ミトトラッカーオレンジ；ミトトラッカーレッド；ミトラマイシン；モノブロモビマン；モノブロモビマン（ｍＢＢｒ−ＧＳＨ）；モノクロロビマン；ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）；ＮＢＤ；ＮＢＤアミン；ナイルレッド；ニトロベンゾキサジドール；ノルアドレナリン；ニュークリアファストレッド；ニュークリアイエロー；ニロサンブリリアントフラビンＥ８Ｇ；Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）；Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８；Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）５００；Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）５１４；パシフィックブルー；パラロサニリン（フュールゲン）；ＰＢＦＩ；ＰＥ−Ｃｙ５；ＰＥ−Ｃｙ７；ＰｅｒＣＰ；ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５；ＰＥ−テキサスレッド（レッド６１３）；フロキシンＢ（マグダーラレッド）；ホルワイトＡＲ；ホルワイトＢＫＬ；ホルワイトＲｅｖ；ホルワイトＲＰＡ；ホスフィン３Ｒ；フォトレジスト；フィコエリスリンＢ［ＰＥ］；ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）；ＰＫＨ６７；ＰＭＩＡ；ポントクロムブルーブラック；ＰＯＰＯ−１；ＰＯＰＯ−３；ＰＯ−ＰＲＯ−１；ＰＯ−Ｉ ＰＲＯ−３；プリムリン；プロシオンイエロー；ヨウ化プロピジウム（Ｐ１）；ＰｙＭＰＯ；ピレン；ピロニン；ピロニンＢ；ピロザールブリリアントフラビン７ＧＦ；ＱＳＹ７；キナクリンマスタード；レゾルフィン；ＲＨ ４１４；Ｒｈｏｄ−２；ローダミン；ローダミン１１０；ローダミン１２３；ローダミン５ ＧＬＤ；ローダミン６Ｇ；ローダミンＢ；ローダミンＢ ２００；ローダミンＢエクストラ；ローダミンＢＢ；ローダミンＢＧ；ローダミングリーン； ローダミンファリシジン；ローダミン：ファロイジン；ローダミンレッド；ローダミンＷＴ；ローズベンガル；Ｒ−フィコシアニン；Ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ）；ｒｓＧＦＰ；Ｓ６５Ａ��Ｓ６５Ｃ；Ｓ６５Ｌ；Ｓ６５Ｔ；サファイアＧＦＰ；ＳＢＦＩ；セロトニン；セブロンブリリアントレッド２Ｂ；セブロンブリリアントレッド４Ｇ；セブロンＩブリリアントレッドＢ；セブロンオレンジ；セブロンイエローＬ；ｓｇＢＦＰ（登録商標）（スーパーグローＢＦＰ）；ｓｇＧＦＰ（登録商標）（スーパーグローＧＦＰ）；ＳＩＴＳ（プリムリン；スチルベンイソチオスルホン酸）；ＳＮＡＦＬカルセイン；ＳＮＡＦＬ−１；ＳＮＡＦＬ−２；ＳＮＡＲＦカルセイン；ＳＮＡＲＦ１；ナトリウムグリーン；スペクトルアクア；スペクトルグリーン；スペクトルオレンジ；スペクトルレッド；ＳＰＱ（６−メトキシ−Ｎ−（３スルホプロピル）キノリニウム）；スチルベン；スルホローダミンＢおよびＣ；スルホローダミンエクストラ；ＳＹＴＯ １１；ＳＹＴＯ １２；ＳＹＴＯ １３；ＳＹＴＯ １４；ＳＹＴＯ １５；ＳＹＴＯ １６；ＳＹＴＯ １７；ＳＹＴＯ １８；ＳＹＴＯ ２０；ＳＹＴＯ ２１；ＳＹＴＯ ２２；ＳＹＴＯ ２３；ＳＹＴＯ ２４；ＳＹＴＯ ２５；ＳＹＴＯ ４０；ＳＹＴＯ ４１；ＳＹＴＯ ４２；ＳＹＴＯ ４３；ＳＹＴＯ ４４；ＳＹＴＯ ４５；ＳＹＴＯ ５９；ＳＹＴＯ ６０；ＳＹＴＯ ６１；ＳＹＴＯ ６２；ＳＹＴＯ ６３；ＳＹＴＯ ６４；ＳＹＴＯ ８０；ＳＹＴＯ ８１；ＳＹＴＯ ８２；ＳＹＴＯ ８３；ＳＹＴＯ ８４；ＳＹＴＯ ８５；ＳＹＴＯＸブルー；ＳＹＴＯＸグリーン；ＳＹＴＯＸオレンジ；テトラサイクリン；テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）；Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）；チアジカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）；チアジンレッドＲ；チアゾールオレンジ；チオフラビン５；チオフラビンＳ；チオフラビンＴＯＮ；チオライト；チアゾールオレンジ；チノポールＣＢＳ（カルコフルオルホワイト）；ＴＩＥＲ；ＴＯ−ＰＲＯ−１；ＴＯ−ＰＲＯ−３；ＴＯ−ＰＲＯ−５；ＴＯＴＯ−１；ＴＯＴＯ−３；トリカラー（ＰＥ−Ｃｙ５）；ＴＲＩＴＣテトラメチルローダミンイソチオシアネート；トゥルーブルー；トゥルーレッド；ウルトラライト；ウラニンＢ；ユービテックスＳＦＣ；ｗｔ ＧＦＰ；ＷＷ ７８１；Ｘ−ローダミン；ＸＲＩＴＣ；キシレンオレンジ；Ｙ６６Ｆ；Ｙ６６Ｈ；Ｙ６６Ｗ；黄色ＧＦＰ；ＹＦＰ；ＹＯ−ＰＲＯ−１；ＹＯ−ＰＲＯ ３；ＹＯＹＯ−１；ＹＯＹＯ−３；Ｓｙｂｒグリーン；チアゾールオレンジ（インターキ
レート化染料）；量子ドットなどの半導体ナノ粒子；またはケージドフルオロフォア（光または他の電磁エネルギー減で活性化され得る）、又はそれらの組合せを含む等が挙げられる。また、蛍光分子に変えて他の発光分子（燐光等）を利用してもよい。
【００５７】
被覆層を脂質膜、若しくは高分子膜とし、これらの表面に共有結合などにより蛍光分子６２を導入してもよい。被覆層の好適な例として、脂質、界面活性剤、末端にアルコキシシリル基、クロロシリ基、イソシアナトシリル基、メルカプト基等を有するポリエチレングリコール等の高分子などが挙げられる。
【００５８】
抗体は、血漿、血清、尿、鼻汁、涙液、便、組織抽出液などかの生体から得られた体液試料、又は培養液等の被検試料溶液中に含まれている抗体を用いてもよいし、治療用抗体を用いてもよい。
【００５９】
被検試料は、血漿、血清、尿、鼻汁、涙液、便、組織抽出液などかの生体から得られた体液試料、又は培養液等の被検試料溶液を用いることができる。
【００６０】
次に、抗体-磁性粒子複合体６０を含む試薬試料５を調製する。調製する流体は、（１）抗体-磁性粒子複合体６０を分散可能であり、（２）特異的反応検出プレート１０に設けられた流路内で移動可能なものとする。次いで、検査目的の抗原を患者等から採取し、必要に応じて、粘度調整、濃度調整等を行うことにより被検試料６を用意する。
【００６１】
その後、抗体-磁性粒子複合体６０を含む試薬試料５を前述の特異的反応検出プレート１０の第１流入口１３から、被検試料６を特異的反応検出プレート１０の第２流入口１４から注入する。試薬試料５と被検試料６の注入は、ほぼ同じタイミングとする。試薬試料５と被検試料６の粘度や特性に応じて注入タイミングを調整してもよい。混合流路２３において、試薬試料５と被検試料６とが混合され、試薬試料５中の抗体と特異的な抗原が被検試料６に含まれている場合には、抗原抗体反応が起こる。
【００６２】
抗原抗体反応が混合流路２３内で生じるように、混合流路２３の流路長、流路幅等を適宜調整する。試薬試料５と被検試料６に対し、必要に応じて、生理食塩水、リン酸緩衝液などを加えてもよい。また、空気、アルゴン、窒素などの反応に悪影響を及ぼさない気体を、特異的反応検出プレート１０内に導入し、流速を最適化することも可能である。流体の流れは、マイクロシリンジから試料を注入するときの圧力により調整する。マイクロシリンジポンプなどを利用することも可能である。
【００６３】
その後、磁気照射手段２０近傍の磁界発生流路６４を、蛍光顕微鏡３０により観察する。ここで、被検試料６に試薬試料５中の抗体-磁性粒子複合体６０の抗体と特異的に反応する抗原が存在する場合（陽性の場合）、図５Ａに示すような抗原-抗体-磁性粒子凝集体８が形成される。一方、被検試料８において、抗体に特異的に反応する抗原が陰性であった場合には、図５Ｂのように、凝集体を形成しない。
【００６４】
磁界発生流路２４の流圧は、抗原-抗体-磁性粒子凝集体８が磁力による吸着を上回るように設定する。これにより、抗原-抗体-磁性粒子凝集体８は、磁気照射手段２０近傍に留まることなく磁界発生流路２４内を流れる。一方、陰性サンプルの場合には、抗原-抗体-磁性粒子凝集体８が形成されず、小さなサイズの磁性粒子は、流圧よりも磁力が勝り、磁気照射手段２０による磁界発生領域に集積する。
【００６５】
蛍光顕微鏡３０に備えられた面状光源シート３９により、白色光を照射して、磁性粒子の集積パターンを検出する。あるいは、面状光源シート３９により、励起光を照射して、磁性粒子中の蛍光の分布パターンから磁性粒子の集積パターンを検出する。無論、通常の蛍光顕微鏡を使用して、通常の操作により磁性粒子の集積パターンを検出してもよい。そして、磁界発生領域の磁性粒子の集積パターンにより、抗原抗体反応の陽性、陰性を判定する。換言すると、抗体-磁性粒子複合体６０が観測されれば陰性と判定し、抗原-抗体-磁性粒子凝集体８が検出されれば陽性と判定する。
【００６６】
抗原−抗体-磁性粒子凝集体８は、前述したとおり、凝集体を形成し粒径が大きいため、磁力より流圧の影響を大きく受ける。その結果、抗原−抗体-磁性粒子凝集体８は、磁気照射手段２０の磁力によってその近傍に集積せず、下流側に流される。一方、抗体-磁性粒子複合体６０は、前者に比して粒径が小さく、流圧より磁力の影響を大きく受ける。その結果、磁気照射手段２０の近傍に集積する。この性質を利用することにより、容易に陽性・陰性の判定を行うことが可能となる。
【００６７】
第１実施形態に係る特異的反応検出装置１によれば、被検試料と試薬試料を特異的反応検出プレート１０に注入して磁気集積パターンを観察することにより、陰性・陽性を判定することが可能である。従って、検査者の負担を最小限とすることができる。また、判定操作も容易である。抗原-抗体-磁性粒子凝集体の凝集のパターンの蛍光強度から、抗原抗体反応の定量検査を実施することが可能である。従って、高精度の抗原抗体反応検査を実施することが可能である。
【００６８】
また、上記特許文献１等のように、抗体、又は抗原の固定化処理が不要であるという優れた特徴がある。従って、汎用的な特異的反応検出プレート１０を提供することができる。また、固定化処理による固定化率のバラツキの問題も生じないというメリットもある。特異的反応検出プレート１０に樹脂を用いれば、大量生産が可能であり、ディスポーザブル用途にも好適である。
【００６９】
また、光源として面状光源シートを用いているので薄型化を実現できる。しかも、特異的反応検出プレート１０に対して、光源である面状光源シート３９を当接する態様を採用しているので、光源のためのスペースを最小限に抑制することができる。従って、顕微鏡装置、及び光源装置の小型化を実現することができる。また、面状光源シート３９を特異的反応検出プレート１０に直接当接する態様を採用しているので、輝度や省電力の点においても優れている。
【００７０】
［第２実施形態］
次に、上記第１実施形態とは異なる特異的反応検出装置の一例について説明する。図６に、第２実施形態に係る特異的反応検出装置１の一例を示す模式的説明図を示す。第２実施形態においては、磁気照射手段２０ａが蛍光顕微鏡３０ａ内に配設されている点において相違する。具体的には、磁気照射手段２０ａは、ステージ３１ａに設けられた収容部４１の内部に収容されている。
【００７１】
磁気照射手段２０ａは、特異的反応検出プレート１０ａの磁界発生流路の少なくとも一部に磁気を照射する機能を有する。図６に示すように、磁気照射手段２０ａは、特異的反応検出プレート１０ａと面状光源シート３９を介して対向配置されている。図７に、実施形態２に係る磁気照射手段２０ａの分解斜視図を示す。面状光源シート３９と磁気照射手段２０ａは、第２実施形態のように当接するように配置してもよいし、近接位置に配置するようにしてもよい。蛍光顕微鏡３０ａの小型化の観点からは、面状光源シート３９と磁気照射手段２０ａを当接配置することが好ましい。面状光源シート３９と磁気照射手段２０ａを当接配置することにより、磁力の減衰の低減をより効果的に抑制することができるというメリットも有する。
【００７２】
磁気照射手段２０ａは、図７に示すように磁石４２、シールド手段４３等を具備する。シールド手段４３は、磁力遮蔽部材により構成する。これにより、磁石４２の磁力線に指向性を付与させることが可能となる。なお、磁気照射手段２０ａとしては、磁石４２を有していればよく、磁石４２に指向性を付与する必要がない場合には、シールド手段４３を具備していなくてもよい。第２実施形態においては、図７に示すように円柱体とした。
【００７３】
従来の顕微鏡においては、光源を介して観察対象と磁気照射手段を設置すると、磁力が弱くなってしまい、所望の条件での観察ができないという問題点があった。磁力は、距離の３乗に比例して減衰するためである。すなわち、特異的反応検出プレート１０ａと磁石の間に従来の光源を入れた場合、磁力の減衰が著しく、リアルタイムの顕微鏡観察を行うことが難しかった。
【００７４】
一方、第２実施形態に係る顕微鏡装置によれば、厚みの非常に薄い面状光源シート３９を光源として用いることにより、磁気照射手段２０ａと特異的反応検出プレート１０ａとの間に光源を入れても、磁気の減衰をほとんど無視することができる。また、蛍光顕微鏡３０ａの光路が磁気照射手段２０ａにより遮断されないので、磁気照射領域におけるリアルタイムの挙動を観察することができる。しかも、構成が簡便であり、磁気照射手段２０ａを搭載しても小型化を実現することもできる。
【００７５】
第２実施形態によれば、第１実施形態と同様の効果を得ることができる。しかも、特異的反応検出プレートに凹部を設けないので、より汎用性に優れる特異的反応検出プレートとすることができる。薄い面状光源シートを透過する磁力の損失を最小限に抑えられるという特長がある。第２実施形態のような磁石の配置の場合、面状光源シートは特に有効である。さらに、面状光源シートを用いることにより、「通常はプレートの観察領域に磁石を近接させると顕微鏡の透過光源の光軸を遮断してしまい、透過観察できない」問題を回避することが可能である。
【００７６】
なお、磁気照射手段を面状構造とすれば、ステージにそのまま磁気照射手段及び光源、特異的反応検出プレート１０を載置することにより、顕微鏡観察を行うことも可能である。
【００７７】
［第３実施形態］
第３実施形態に係る特異的反応検出プレートは、試薬試料流路２１、被検試料流路２２、混合流路２３が形成されておらず、流路として磁界発生流路が形成されており、試薬試料と被検試料とを同一の凹部である第１凹部１７ｂから導入する点において、第２実施形態と相違する。その他の特異的反応検出装置の構成については、第２実施形態と同様である。
【００７８】
図８に、第３実施形態に係る特異的反応検出プレートの第２基板１２ｂの一例を示す模式的上面図を、図９に図８のＩＸ−ＩＸ切断部断面図の特異的反応検出プレートの模式的断面図を示す。特異的反応検出プレート１０ｂは、図９に示すように、第１基板１１ｂ、第２基板１２ｂ、２つの接続部２５、循環手段であるマイクロシリンジポンプ２６を具備する。第２基板１２ｂは、第１凹部１７ｂと磁界発生流路２４ｂと第３凹部１８ｂ（以下、「内部流路」とも云う）が形成されている。第１基板１１ｂは、流入口１３ｂ、流出口１５ｂ、接続部２５が形成されている。２つの接続部２５は、流体を導入、若しくは流出するポートとして機能する。内部流路は、２つの接続部２５間を連通するように構成されている。内部流路は、マイクロシリンジポンプ２６により流体が移動可能なように構成されている。磁界発生流路２４ｂのうちの少なくとも一部は、磁気照射手段２０によって、磁界が発生している領域を有する。
【００７９】
マイクロシリンジポンプ２６は、流体を内部流路内で循環させる役割を担う。図９の例においては、２つの接続部２５に接続されるチューブを有する。マイクロシリンジポンプ２６を用いることにより、特異的反応検出プレート１０ｂよりも多い容積の流体を循環させることが可能となる。また、マイクロシリンジポンプ２６を用いることによって、抗原抗体反応が磁気集積パターンによって検出・定量可能なように、流速と磁力の関係が最適となるように調整することが容易となる。また、マイクロシリンジポンプ２６を用いることにより、特異的反応検出プレート１０ｂの構成を簡便にすることができる。なお、マイクロシリンジポンプは、吸引・圧入の両方のどちらも適用可能である。
【００８０】
特異的反応検出プレート１０ｂの直下層には、上記第２実施形態のように、面状光源シート３９及び磁力発生手段２０ａが配設されている。
【００８１】
なお、接続部２５の位置は、特異的反応検出プレート１０ｂの上面に限定されるものではなく、底面や側面に設けてもよい。また、内部流路は、図８の構成に限定されるものではなく、一直線、分岐構造、螺旋構造を有する内部流路であってもよい。
【００８２】
第３実施形態に係る抗原抗体反応の検出方法によれば、試薬試料と被検試料を同時に特異的反応検出プレートに注入する。混合流体中に、特異的な抗原抗体反応の組み合わせが存在する場合には、抗原抗体反応によって抗原−抗体−磁性粒子凝集体８が形成される。その後、混合流体を特異的反応検出プレートの流入口から注入し、磁性粒子の集積パターンを検出することにより、抗原抗体反応の有無を判定したり、抗原抗体反応の定量を行ったりする。なお、第３実施形態においては、試薬試料と被検試料を同時に特異的反応検出プレートに注入する例を挙げたが、試薬試料と被検試料を予め混合した混合流体を調製しておき、これを特異的反応検出プレートに注入することも可能である。なお、循環手段としてマイクロシリンジポンプを用いる例を挙げたが、他の公知の循環手段を制限なく利用することができる。
【００８３】
第３実施形態によれば、第２実施形態と同様の効果を得ることができる。また、循環手段を用いることにより、磁気集積パターンから抗原抗体反応を検出・定量するための磁力と流速の関係を循環手段により容易に最適化することができるという優れたメリットがある。また、特異的反応検出プレートは、循環手段を設けることにより、より検査時間の短縮化、簡便化を図ることができる。
【００８４】
なお、上記実施形態に係る特異的反応検出プレートは一例であって、種々の変形が可能である。例えば、特異的反応検出プレート１０において、１つの検査レーンが形成されたプレートの例を示したが、１つの特異的反応検出プレートに複数の検査レーンを設けることも可能である。これによって、より検査効率のアップを図ることが可能となる。
【００８５】
流路の形も種々の変形が可能である。内部流路は、二次元的に平面内に配設する他、三次元的に高さ方向にも配設するようにしてもよい。また、内部流路内に弁などを適宜設けて、目的に応じて、内部流路内における流体の流れの方向を制御できるようにしてもよい。
【００８６】
また、上記においては、磁気集積パターン検出装置３として、蛍光顕微鏡３０、撮像装置４０、画像処理装置５０を用いる例について述べたが、蛍光顕微鏡を用いずにＣＣＤカメラ、マクロイメージング装置等の撮像装置のみにより磁気集積パターンを直接撮像し、コンピューターによって撮像パターンを自動的に解析し、抗原抗体反応の陽性・陰性を自動で判定するようにしてもよい。
【００８７】
また、上記においては、磁性粒子に蛍光分子を固定する方法を説明したが、他の発光分子を結合させて検出してもよい。さらに、蛍光分子をはじめとする発光分子を用いずに、透過光パターンや反射パターン、各種シグナル物質を結合させた磁性粒子とシグナルに対応したセンサを併用しその出力から磁気集積パターンを検出し、抗原抗体反応の陽性・陰性の判定、定量検査を行うようにしてもよい。
【００８８】
また、上記実施形態においては、磁性粒子と複合体を形成する対象が抗体である例を説明したが、抗原が磁性粒子に固定された抗原−磁性粒子複合体を形成し、被検試料中の抗体の有無の判定、定量を行うことも可能である。
【００８９】
また、特異的反応検出装置１は、磁気検出装置を設置してもよい。これにより、磁性粒子の挙動をリアルタイムに観察することができる。また、流路内の磁性体通過量などを定量することができる。また、コンディション（生存・活性など）や磁性体の集積モニターなどを目的として、レーザー装置、光センサ、デンシトメーター、パーティクルアナライザー、セルソーター、放射能検出装置、超音波発生装置、超音波検出装置などを付属するようにしてもよい。また、交流磁場を磁性体ナノ粒子に照射するとナノ粒子の振動により発生する音を検出するマイクロフォンなどを付属してもよい。
【００９０】
また、上記実施形態においては、光源として面状光源シートを用いる例を述べたが、これに限定されるものではなく、公知の光源を制限なく用いることができる。
【００９１】
本発明に係る特異的反応検出キットは、リガンド・レセプター間反応にも好適に適用することができる。この場合、試薬試料の磁性粒子には、リガンド若しくはレセプターのいずれかを修飾し、被検試料中に磁性粒子に修飾されたリガンド若しくはレセプターとリガンド・レセプター間反応するレセプター若しくはリガンドが存在するか否かを検出する。リガンドとしては、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）などが挙げられる。レセプターは、それぞれのリガンドに対応する受容体（ＰＤＧＦレセプター等）である。
【００９２】
また、本発明に係る特異的反応検出キットは、相補的核酸間反応にも好適に適用することができる。この場合、試薬試料の磁性粒子には、ＤＮＡ，ＲＮＡ等の核酸が修飾されており、被検試料中に磁性粒子に修飾された核酸と相補的に反応する核酸が存在するか否かを検出する。相補的核酸反応としては、例えば、ｓｉＲＮＡと標的ｍＲＮＡの組み合わせの検出などに好適に適用することができる。例えば、ｓｉＲＮＡを磁性粒子に修飾しておき、被検試料中に標的ｍＲＮＡが存在するか否かを検出することができる。
【００９３】
≪実施例≫
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。但し、本発明は、実施例によって限定されるものではない。
【００９４】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ：Carcinoembryonic Antigen）−抗体と複合体を形成する近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）で標識された磁性ナノ粒子を合成した。有機溶媒１ｍｌと蒸留水１ｍｌ中に、卵黄ホスファチジルコリン、コレステロール、ジチオピリジンジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ノーザンリピッド社製）、Ｃｙ７シアニンの疎水性相対物であるＤｉＲ（蛍光色素、インビトロゲン社製）、オレイン酸被覆酸化鉄を１６：８：１：１：２２の重量比で混合した。そして、これらを超音波にかけて、エバポレーションすることによりＮＩＲＦ標識磁性ナノ粒子を得た。
【００９５】
ＮＩＲＦ標識磁性ナノ粒子の表面には、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）とジチオトレイトール (dithiothreitol,DTT)を利用して、従来の処理法により、抗ＣＥＡモノクロナール抗体を修飾した。そして、最終的に、ターゲットであるＣＥＡ抗原と特異的に抗原抗体反応する抗体−磁性粒子複合体を調製した。得られた抗体−磁性粒子複合体とＣＥＡ抗原において、特異的な抗原抗体反応が起こり、抗原-抗体-磁性粒子凝集体が形成されることを確認した。
【００９６】
特異的反応検出プレートを倒立顕微鏡に設置した。そして、磁気照射手段として特異的反応検出プレートの磁界発生流路の一端部上方に磁石を設置し、特異的反応検出プレートに対して磁気照射を行った。被検試料と試薬試料は、特異的反応検出プレートに同時にそれぞれを注入した。そして、マイクロシリンジポンプ（ＮａｎｏＪｅｔ、Ｃｈｅｍｙｘ社製）を用い、２５ｎｌ／ｍｉｎにより被検試料と試薬試料を循環させた。
【００９７】
図１０Ａ〜図１０Ｃに、特異的反応するＣＥＡ抗原のない、すなわち陰性の被検試料を用いた場合の磁気集積パターンの電子顕微鏡写真を示す。なお、磁界発生流路２４の境界が見えにくいので、これらの図において、流路の境界をトレースしている。
【００９８】
図１０Ａは、４５秒後、図１０Ｂは９０秒後、図１０Ｃは１３５秒後の結果である。９０秒を超えた後、同じ流圧で水洗を実施した。これらより、陰性の被検試料を用いた場合には、抗原−抗体−磁性粒子凝集体８が形成されず、抗体−磁性粒子複合体６０が磁界によって段階的に磁界発生流路２４の上方に引きつけられることがわかる。
【００９９】
図１１Ａ〜図１１Ｃに、特異的反応するＣＥＡ抗原を含有する、すなわち陽性の被検試料を用いた場合の磁気集積パターンの電子顕微鏡写真を示す。なお、磁界発生流路２４の境界が見えにくいので、これらの図において、流路の境界をトレースしている。
【０１００】
図１１Ａは、４５秒後、図１１Ｂは９０秒後、図１０Ｃは１３５秒後の結果である。９０秒を超えた後、同じ流圧で水洗を実施した。これらより、陽性の被検試料を用いた場合には、抗原−抗体−磁性粒子凝集体８が形成され、抗原−抗体−磁性粒子凝集体８が磁界によって引きよれられず、磁界発生流路２４内を流されていることがわかる。
【０１０１】
図１２に、陰性サンプルと陽性サンプルについてマクロイメージングシステム（５１２ＢＥを搭載したルマゾンＦＡ、ローパーインダストリーズ社製）を用いて、蛍光分布測定を行った結果を示す。励起光は７５０ｎｍとし、７８０ｎｍの蛍光を測定した。その結果、陽性サンプルにおいては、７８０ｎｍの蛍光が観測されなかったのに対し、陰性サンプルにおいては、７８０ｎｍの蛍光が観測された。これより、磁界によって、ＮＩＲＦ標識磁性粒子の集積の消失の有無によって、ＣＥＡ抗原（１００ｎｇ／ｍｌ）の検出が可能であることがわかる。
【符号の説明】
【０１０２】
１      特異的反応検出装置
２      特異的反応検出キット
３      集積パターン検出装置
５      試薬試料
６      被検試料
８      抗原-抗体-磁性粒子凝集体
１０    特異的反応検出プレート
１１    第１基板
１２    第２基板
１３    第１流入口
１４    第２流入口
１５    流出口
１６    凹部
１７    第１凹部
１８    第２凹部
１９    第３凹部
２０    磁気照射手段
２１    試薬試料流路
２２    被検試料流路
２３    混合流路
２４    磁界発生流路
２５    接続部
２６    マイクロシリンジポンプ
３０    顕微鏡
３１    ステージ
３２    鏡柱
３３    鏡筒
３４    調節ハンドル
３５    接眼レンズ
３６    レボルバ
３７    対物レンズ
３８    給電端子
３９    面状光源シート
４０    撮像装置
５０    画像処理装置
６０    抗体−磁性粒子複合体
６１    磁性粒子
６２    蛍光分子
６３    抗体
７０    抗原
【図１】
2012172981.tif 000003
【図２】
2012172981.tif 000004
【図３Ａ】
2012172981.tif 000005
【図３Ｂ】
2012172981.tif 000006
【図３Ｃ】
2012172981.tif 000007
【図４Ａ】
2012172981.tif 000008
【図４Ｂ】
2012172981.tif 000009
【図５Ａ】
2012172981.tif 000010
【図５Ｂ】
2012172981.tif 000011
【図６】
2012172981.tif 000012
【図７】
2012172981.tif 000013
【図８】
2012172981.tif 000014
【図９】
2012172981.tif 000015
【図１０Ａ】
2012172981.tif 000016
【図１０Ｂ】
2012172981.tif 000017
【図１０Ｃ】
2012172981.tif 000018
【図１１Ａ】
2012172981.tif 000019
【図１１Ｂ】
2012172981.tif 000020
【図１１Ｃ】
2012172981.tif 000021
【図１２】
2012172981.tif 000022