(57)【要約】      （修正有）【課題】患者において肝炎を引き起こすウイルスを不活化するための方法の提供。【解決手段】（ａ）当該ウイルスを不活化するのに有効な量の改変型二本鎖ＲＮＡ・（ｄｓＲＮＡ）または改変型短鎖干渉ＲＮＡ・（ｓｉＲＮＡ）を当該患者に投与する工程；および（ｂ）コレステロール低下薬を当該患者に投与する工程；を包含する方法。該コレステロール低下薬としては、スタチン、レジン、ニコチン酸、ゲムフィブロジル、またはクロフィブレートであることが好ましい。該ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、コレステロールに連結されていることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、核酸検出分野およびＲＮＡサイレンシング現象（すなわち、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ））分野に関する。ＲＮＡサイレンシングは、非コードＲＮＡ分子が生物内の特定の遺伝子抑制を媒介する現象から構成される。事実上、この現象は、トランスポゾン、導入遺伝子、およびウイルス遺伝子などの外来の侵入核酸から生物のゲノムを保護する。
【背景技術】
【０００２】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の細胞への移入により、ＲＮＡサイレンシングが誘発され、次いで、ｄｓＲＮＡに対応する内因性ｍＲＮＡが分解される。ＲＮＡサイレンシング経路は、相同ｍＲＮＡ標的にリボヌクレアーゼを指向するｄｓＲＮＡの短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）への変換を含む（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。ダイサー（ｄｉｃｅｒ）と呼ばれる酵素は、ｄｓＲＮＡを２０〜２５ヌクレオチド長のｓｉＲＮＡにプロセシングする。次いで、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）としても公知のエンドリボヌクレアーゼ含有複合体にアセンブリする。その後、ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣを相補ＲＮＡ分子に誘導し、そこでＲＩＳＣは標的ｍＲＮＡを切断および破壊する。ＲＮＡサイレンシングの増幅成分により、少量のｄｓＲＮＡで大量の標的ｍＲＮＡをサイレンシングし得る（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６−８１１（１９９８））。
【０００３】
ｄｓＲＮＡがＲＮＡｉによって遺伝子を有効にサイレンシングするという最初の証拠は、線虫（エレガント線虫）に関する研究に由来する（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６−８１１（１９９８）および米国特許第６，５０６，５５９号）。ショウジョウバエ（キイロショウジョウバエ）におけるその後の研究により、ＲＮＡｉが多段階機構であることが証明された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５（２）：１８８−２００（２００１））。
【０００４】
ｄｓＲＮＡが哺乳動物細胞において遺伝子特異的干渉を媒介し得るにもかかわらず（Ｗｉａｎｎｙ，Ｆ．ａｎｄ  Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ，Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２：７０−７５（２０００）；Ｓｖｏｂｏｄａ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １７：４１４７−４１５６（２０００））、哺乳動物体細胞におけるＲＮＡｉの使用は、しばしば、ｄｓＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）の誘発を制限し、それにより、翻訳因子ｅＩＦ２ａが不活化され、タンパク質合成全体が抑制され、しばしばアポトーシスを引き起こす（Ｇｉｌ，Ｊ．ａｎｄ  Ｅｓｔｅｂａｎ，Ｍ．，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ５：１０７−１１４（２０００））。
【０００５】
最近、ターゲティングされたＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列に対応する約２１または２２塩基対長のｓｉＲＮＡは、哺乳動物細胞中のターゲティングされた配列の発現を破壊することが示された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８（２００１））。しかし、哺乳動物細胞ゲノムのすべてのＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列がｓｉＲＮＡに感受性を示すかは明らかではない。あらゆる哺乳動物細胞型がｓｉＲＮＡを使用した遺伝子特異的抑制に必要な機構を有するかどかも不明である。さらに、ｓｉＲＮＡは、以下の少なくとも２つの理由によってその使用が制限される：（ａ）ｓｉＲＮＡが投与された細胞で認められる抑制効果が一過性であること、および（ｂ）その使用前にｓｉＲＮＡを化学合成する必要があること（Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０：４４６−４４８（２００２））。また、ｓｉＲＮＡはインビボで不安定であるので、その長期有効性が制限される。
【０００６】
これらの難問に取り組む発明により、核酸活性レベルでのヒト疾患の治療のためのＲＮＡｉの有用性が改善される。特に、このような発明により、ＲＮＡｉがＨＣＶ感染などのウイルス感染のためのより実用的な治療法になる。このようなウイルス感染のための現在の治療法は非常に制限されており、反応率（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｒａｔｅｓ）が低い傾向がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
第１の実施形態では、本発明は、ｄｓＲＮＡ中の１つ以上のピリミジンが２’フッ素を含むように改変された標的細胞中でＲＮＡ干渉を媒介する二本鎖（ｄｓＲＮＡ）分子を提供する。
【０００８】
第２の実施形態では、本発明は、ｓｉＲＮＡ中の１つ以上のピリミジンが２’フッ素を含むように改変された標的細胞中でＲＮＡ干渉を媒介する短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を提供する。
【０００９】
第３の実施形態では、第１および第２の実施形態のｄｓＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子中のピリミジンすべては、２’フッ素を含むように改変されている。
【００１０】
第４の実施形態では、第３の実施形態の２’フッ素ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの３’末端に２塩基デオキシヌクレオチド「ＴＴ」配列を含むようにさらに改変されている。
【００１１】
第５の実施形態では、第３の実施形態の２’フッ素ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、感染細胞中のウイルス複製を阻害する。
【００１２】
第６の実施形態では、第５の実施形態の２’フッ素ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸に対応し、肝細胞中のＨＣＶ複製を阻害する。
【００１３】
第７の実施形態では、ウイルスを不活化するのに有効な量の２’フッ素ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを患者に投与する工程を含む、患者のウイルスを不活化する方法を提供する。
【００１４】
第８の実施形態では、患者のウイルスを不活化する方法であって、ウイルスを不活化するのに有効な量の２’フッ素ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを患者に投与する工程と、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ中のピリミジンすべてが２’フッ素を含むように改変されていることとを含む、方法を提供する。
【００１５】
第９の実施形態では、患者のウイルスを不活化する方法であって、ウイルスを不活化するのに有効な量の２’フッ素ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを患者に投与する工程と、２’フッ素ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡがｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの３’末端に２塩基デオキシヌクレオチド「ＴＴ」配列を含むように改変されていることとを含む、方法を提供する。
【００１６】
第１０の実施形態では、患者のウイルスを不活化する方法であって、ウイルスを不活化するのに有効な量の２’フッ素ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを患者に投与する工程と、ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ポリオウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、メタニューモウイルス、およびコロナウイルスからなる群より選択される、方法を提供する。
【００１７】
第１１の実施形態では、患者のウイルスを不活化する方法であって、ウイルスを不活化するのに有効な量の２’フッ素ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを患者に投与する工程と、ウイルスが、ＨＣＶである、方法を提供する。
【００１８】
第１２の実施形態では、ｓｉＲＮＡを調製する方法であって、
（ａ）ｓｉＲＮＡを設計するためにＨＣＶゲノム中の標的ヌクレオチド配列を同定する工程、および
（ｂ）２’フッ素を含むように改変されたｓｉＲＮＡ中に少なくとも１つのピリミジンを含むｓｉＲＮＡを生成する工程、
を包含する、方法を提供する。
【００１９】
第１３の実施形態では、ｓｉＲＮＡを調製する方法であって、
（ａ）ｓｉＲＮＡを設計するためにＨＣＶゲノム中の標的ヌクレオチド配列を同定する工程、および
（ｂ）ｓｉＲＮＡ中のピリミジンすべてが２’フッ素を含むように改変されているｓｉＲＮＡを生成する工程、
を包含する、方法を提供する。
【００２０】
第１４の実施形態では、ｓｉＲＮＡを調製する方法であって、
（ａ）ｓｉＲＮＡを設計するためにＨＣＶゲノム中の標的ヌクレオチド配列を同定する工程、および
（ｂ）ｓｉＲＮＡ中のピリミジンすべてが２’フッ素を含むように改変され、かつ２’フッ素ｓｉＲＮＡが、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの３’末端に２塩基デオキシヌクレオチド「ＴＴ」配列を含むようにさらに改変されているｓｉＲＮＡを生成する工程、
を包含する、方法を提供する。
【００２１】
第１５の実施形態では、第１４の実施形態中の標的ヌクレオチド配列が、５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）、コア、およびＮＳ３ヘリカーゼからなる群より選択される。
【００２２】
第１６の実施形態では、ＨＣＶの複製を阻害する約１０個〜約３０個のヌクレオチドのｄｓＲＮＡ分子であって、ｄｓＲＮＡが２’フッ素を含むように改変されたｓｉＲＮＡ中に少なくとも１つのピリミジンを含む、ｄｓＲＮＡ分子を提供する。
【００２３】
第１７の実施形態では、ＨＣＶの複製を阻害する約１０個〜約３０個のヌクレオチドのｄｓＲＮＡ分子であって、ｄｓＲＮＡ中のピリミジンすべてが２’フッ素を含むように改変されている、ｄｓＲＮＡ分子を提供する。
【００２４】
第１８の実施形態では、ＨＣＶの複製を阻害する約１０個〜約３０個のヌクレオチドのｄｓＲＮＡ分子であって、ｄｓＲＮＡ中のピリミジンすべてが２’フッ素を含むように改変され、かつ２’フッ素ｄｓＲＮＡが、ｄｓＲＮＡの３’末端に２塩基デオキシヌクレオチド「ＴＴ」配列を含むようにさらに改変されている、ｄｓＲＮＡ分子を提供する。
【００２５】
第１９の実施形態では、肝細胞中のＨＣＶに対してターゲティングされたＲＮＡ干渉を誘導する方法であって、第１６の実施形態のｄｓＲＮＡ分子を肝細胞に投与する工程と、ｄｓＲＮＡ分子のヌクレオチド配列がＨＣＶヌクレオチド配列に対応することとを含む、方法を提供する。
【００２６】
第２０の実施形態では、第１６の実施形態のｄｓＲＮＡ分子をコードするＤＮＡセグメントを含むベクターを提供する。
【００２７】
第２１の実施形態では、第１６の実施形態のｄｓＲＮＡ分子をコードするＤＮＡセグメントを含むベクターであって、二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖が第１のプロモーターと作動可能に連結しており、二本鎖ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖が第２のプロモーターと作動可能に連結されている、ベクターを提供する。
【００２８】
第２２の実施形態では、第２０の実施形態のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２９】
第２３の実施形態では、治療目的（動物内でのウイルスの不活化が含まれる）で動物の肝臓細胞にｓｉＲＮＡを送達させる方法を提供する。この方法は、レセプター結合リガンドとしてコレステロールをさらに含むように改変されたｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ（コレステロール−ｓｉＲＮＡ）の投与と組み合わせて動物にコレステロール低下薬を投与する工程を含む。コレステロール低下薬を、コレステロール標識ｓｉＲＮＡの投与前、同時、または投与後に投与し得る。１つの好ましい実施形態では、コレステロール低下薬はスタチンである。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）
患者において肝炎を引き起こすウイルスを不活化するための方法であって、
（ａ）当該ウイルスを不活化するのに有効な量の改変型二本鎖ＲＮＡ・（ｄｓＲＮＡ）または改変型短鎖干渉ＲＮＡ・（ｓｉＲＮＡ）を当該患者に投与する工程；および
（ｂ）コレステロール低下薬を当該患者に投与する工程；
を包含する、方法。
・（項目２）
上記ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルス・（ＨＣＶ）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、またはＥ型肝炎ウイルスである、項目１に記載の方法。
・（項目３）
上記ウイルスがＨＣＶである、項目１に記載の方法。
・（項目４）
上記コレステロール低下薬が、スタチン、レジン、ニコチン酸、ゲムフィブロジル、またはクロフィブレートである、項目１に記載の方法。
・（項目５）
上記コレステロール低下薬がスタチンである、項目１に記載の方法。
・（項目６）
上記改変型ｄｓＲＮＡまたは改変型ｓｉＲＮＡが２’改変されている、項目１に記載の方法。
・（項目７）
上記改変が、フルオロ改変、メチル改変、メトキシエチル改変、およびプロピル改変からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
・（項目８）
上記フルオロ改変が２’−フルオロ改変または２’，２’−フルオロ改変である、項目７に記載の方法。
・（項目９）
上記ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの少なくとも１つのピリミジンが改変されており、当該ピリミジンは、シトシン、シトシンの誘導体、ウラシル、またはウラシルの誘導体である、項目８に記載の方法。
・（項目１０）
上記ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ中のピリミジンすべてが改変されている、項目９に記載の方法。
・（項目１１）
上記ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡが、その３’末端に２塩基デオキシヌクレオチド「ＴＴ」配列を含む、項目１に記載の方法。
・（項目１２）
上記ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡがコレステロールに連結されている、項目１に記載の方法。
・（項目１３）
上記ｓｉＲＮＡが、
（ａ）短鎖干渉ＲＮＡ・（ｓｉＲＮＡ）を設計するためにウイルスゲノム中の標的ヌクレオチド配列を同定する工程、および
（ｂ）少なくとも１つの改変型ヌクレオチドを含むように改変されたｓｉＲＮＡを生成する工程、
によって調製される、項目１に記載の方法。
・（項目１４）
上記ｓｉＲＮＡが、
（ａ）短鎖干渉ＲＮＡ・（ｓｉＲＮＡ）を設計するためにＨＣＶゲノム中の標的ヌクレオチド配列を同定する工程、および
（ｂ）少なくとも１つの改変型ヌクレオチドを含むように改変されたｓｉＲＮＡを生成する工程、
によって調製される、項目３に記載の方法。
・（項目１５）
上記標的ヌクレオチド配列が、５’非翻訳領域・（５’−ＵＴＲ）、３’非翻訳領域・（３’−ＵＴＲ）、コア、およびＮＳ３ヘリカーゼからなる群より選択される、項目１４に記載の方法。
・（項目１６）
上記ｓｉＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ５、ｓｉＲＮＡＣ１、ｓｉＲＮＡＣ２、ｓｉＲＮＡ５Ｂ１、ｓｉＲＮＡ５Ｂ２、またはｓｉＲＮＡ５Ｂ４である、項目１５に記載の方法。
・（項目１７）
上記ｓｉＲＮＡが、約１０個〜約３０個のリボヌクレオチドからなる、項目１に記載の方法。
・（項目１８）
上記ｓｉＲＮＡが、約１９個〜約２３個のリボヌクレオチドからなる、項目１７に記載の方法。
・（項目１９）
上記改変型ｓｉＲＮＡが２’改変型ｓｉＲＮＡである、項目１８に記載の方法。
・（項目２０）
上記改変が、フルオロ改変、メチル改変、メトキシエチル改変、およびプロピル改変からなる群より選択される、項目１９に記載の方法。
・（項目２１）
上記フルオロ改変が、２’−フルオロ改変または２’，２’−フルオロ改変である、項目２０に記載の方法。
・（項目２２）
上記ｓｉＲＮＡの少なくとも１つのピリミジンが改変されており、当該ピリミジンは、シトシン、シトシンの誘導体、ウラシル、またはウラシルの誘導体である、項目２１に記載の方法。
・（項目２３）
上記ｓｉＲＮＡ中のピリミジンすべてが改変されている、項目２２に記載の方法。
・（項目２４）
上記ｓｉＲＮＡが、その３’末端に２塩基デオキシヌクレオチド「ＴＴ」配列を含む、項目１８に記載の方法。
・（項目２５）
上記ｓｉＲＮＡの両方の鎖が、少なくとも１つの改変型ヌクレオチドを含む、項目１８に記載の方法。
・（項目２６）
改変型リボヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ分子であって、当該ｓｉＲＮＡは、
（ａ）その３’末端に２塩基デオキシヌクレオチド「ＴＴ」配列を含み、
（ｂ）ＲＮアーゼに対して耐性であり、
（ｃ）ウイルス複製を阻害し得る、
ｓｉＲＮＡ分子。
・（項目２７）
上記ｓｉＲＮＡ分子が２’改変されている、項目２６に記載のｓｉＲＮＡ分子。
・（項目２８）
上記２’改変が、フルオロ改変、メチル改変、メトキシエチル改変、およびプロピル改変からなる群より選択される、項目２７に記載のｓｉＲＮＡ分子。
・（項目２９）
上記フルオロ改変が、２’−フルオロ改変または２’，２’−フルオロ改変である、項目２８に記載のｓｉＲＮＡ分子。
・（項目３０）
上記ｓｉＲＮＡの少なくとも１つのピリミジンが改変されており、当該ピリミジンは、シトシン、シトシンの誘導体、ウラシル、またはウラシルの誘導体である、項目２９に記載のｓｉＲＮＡ分子。
・（項目３１）
上記ｓｉＲＮＡ中のピリミジンすべてが改変されている、項目３０に記載のｓｉＲＮＡ分子。
・（項目３２）
上記ｓｉＲＮＡの両方の鎖が、少なくとも１つの改変型ヌクレオチドを含む、項目２６に記載のｓｉＲＮＡ分子。
・（項目３３）
上記ｓｉＲＮＡが、約１０個〜約３０個のリボヌクレオチドからなる、項目２６に記載のｓｉＲＮＡ分子。
・（項目３４）
上記ｓｉＲＮＡが、約１９個〜約２３個のリボヌクレオチドからなる、項目３３に記載のｓｉＲＮＡ分子。
・（項目３５）
ＨＣＶの複製を阻害する、項目２６に記載のｓｉＲＮＡ分子。
・（項目３６）
ｓｉＲＮＡ５、ｓｉＲＮＡＣ１、ｓｉＲＮＡＣ２、ｓｉＲＮＡ５Ｂ１、ｓｉＲＮＡ５Ｂ２、またはｓｉＲＮＡ５Ｂ４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、項目３５に記載のｓｉＲＮＡ分子。
・（項目３７）
少なくとも１つのレセプター結合リガンドに連結されている、項目３５に記載のｓｉＲＮＡ分子。
・（項目３８）
上記レセプター結合リガンドが、上記ｓｉＲＮＡ分子の５’末端または３’末端に結合されている、項目３７に記載のｓｉＲＮＡ分子。
・（項目３９）
上記レセプター結合リガンドが上記ｓｉＲＮＡ分子の複数の末端に結合されている、項目３８に記載のｓｉＲＮＡ分子。
・（項目４０）
上記レセプター結合リガンドが、コレステロール、ＨＢＶ表面抗原、および低密度リポタンパク質からなる群より選択される、項目３７に記載のｓｉＲＮＡ分子。
・（項目４１）
上記レセプター結合リガンドがコレステロールである、項目４０に記載のｓｉＲＮＡ分子。
・（項目４２）
少なくとも１つのリボヌクレオチドの２’位改変をさらに含み、当該少なくとも１つのリボヌクレオチドの２’位改変によって上記ｓｉＲＮＡが分解に対して耐性になる、項目３７に記載のｓｉＲＮＡ分子。
・（項目４３）
上記少なくとも１つのリボヌクレオチドの２’位改変が、２’−フルオロ改変または２’，２’−フルオロ改変である、項目４２に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ＨＣＶゲノム由来の５’ＵＴＲの配列および二次構造を示す。肝細胞中のＨＣＶに対してＲＮＡｉを誘導するためのｓｉＲＮＡの特異的配列も提供する。
【図２】図２は、肝細胞中のＨＣＶに対するＲＮＡｉの誘導に有用ないくつかのＨＣＶ特異的ｓｉＲＮＡの配列を提供する。各ＨＣＶ特異的ｓｉＲＮＡを、第１のカラム中に示す記号表示によって特定する。
【図３Ａ】図３Ａは、ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオチド配列を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオチド配列を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオチド配列を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオチド配列を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオチド配列を示す。
【図３Ｆ】図３Ｆは、ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオチド配列を示す。
【図３Ｇ】図３Ｇは、ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオチド配列を示す。
【図３Ｈ】図３Ｈは、ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオチド配列を示す。
【図３Ｉ】図３Ｉは、ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオチド配列を示す。
【図４】図４は、ＳＡＲＳコロナウイルスのオープンリーディングフレームの略図である。
【図５】図５は、ヒト肝臓細胞中でのｓｉＲＮＡの有効性を試験するために使用した肝細胞癌細胞株Ｈｕｈ７中に含まれるサブゲノムＨＣＶレプリコンを示す。
【図６】種々の濃度のｓｉＲＮＡ５を投与したサブゲノムＨＣＶレプリコンを含むＨｕｈ−７細胞（５−２株）中での正規化ルシフェラーゼ活性の用量応答を示す。トランスフェクションから１、２、および３日後に測定したルシフェラーゼ活性は、ｓｉＲＮＡ用量の増加に伴って減少した。Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から市販されているルシフェラーゼアッセイシステムを製造者の説明書にしたがって使用してルシフェラーゼアッセイを行った。
【図７】図７は、Ｈｕｈ−７肝臓細胞中でＨＣＶ指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＲＮＡを誘導するためのｓｉＲＮＡ５の配列特異性示す。
【図８】図８は、ｓｉＲＮＡ５がＨｕｈ−７細胞に毒性を示さないことを証明する。Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から市販されているＡＴＰアーゼアッセイキットを製造者の説明書にしたがって使用してＡＴＰアーゼレベルをアッセイした。
【図９】図９は、ＲＮＡアッセイによって測定した、２１−５細胞（全長ＨＣＶを含むＨｕｈ−７細胞）中でのＨＣＶ複製に対するｓｉＲＮＡ５の効果を示す。ＴａｑＭａｎ（商標）ＲＮＡキット（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｌａ−Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を製造者の説明書にしたがって使用してＲＮＡレベルをアッセイした。値を正規化する。
【図１０】図１０は、ｓｉＲＮＡ５がＨｕｈ５−２細胞の生存度に影響を与えないことを証明する。詳細には、ｓｉＲＮＡ５またはＧＡＰＤＨ特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｕｈ５−２細胞中のＧＡＰＤＨ（解糖に不可欠な酵素）をコードするｍＲＮＡを測定した。グラフは、ｓｉＲＮＡがＧＡＰＤＨのＲＮＡレベルに影響を与えなかったことを証明する。ＴａｑＭａｎ（商標）ＲＮＡキット（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｌａ−Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を製造者の説明書にしたがって使用してＧＡＰＤＨを測定した。値を正規化する。
【図１１】図１１は、ショウジョウバエルシフェラーゼ遺伝子をターゲティングする異なる濃度の２’−フルオロ−ｓｉＲＮＡ（２’−Ｆ−ＧＬ２）を投与したサブゲノムＨＣＶレプリコンを含むＨｕｈ７細胞（５−２株）中での正規化ルシフェラーゼ活性の用量応答を示す。トランスフェクションから２日後に測定したルシフェラーゼ活性は、ｓｉＲＮＡ用量の増加に伴って減少した。ホタルルシフェラーゼキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を製造者の説明書にしたがって使用してルシフェラーゼアッセイを行った。
【図１２】図１２は、リポソームの非存在下でｓｉＲＮＡ  Ｃｈｏｌ−ＧＬ２を使用した５−２細胞中でのルシフェラーゼ活性の阻害を証明する。
【図１３】図１３は、ＰＡＧＥによって分離した５’標識ｓｉＲＮＡ二重鎖のオートラジオグラフを示し、１０日目までのヒト血清中でインキュベートした２’−フルオロ改変型ｓｉＲＮＡ（２’−Ｆ−ＧＬ２）の安定性を示す。ｓｉＲＮＡ二重鎖を、ヒト血清とのインキュベーションおよび２０％ＰＡＧＥによる分析に供した。レーンの組成は以下である：レーン１、１１、および２１：３２Ｐ末端標識ｓｉＲＮＡのみ；レーン２〜１０、１２〜２０、および２２〜２５：ヒト血清とインキュベートしたｓｉＲＮＡ。レーン２および１２、１分；レーン３および１３、５分；レーン４および１４、１５分；レーン５および１５、３０分；レーン６および１６、１時間；レーン７および１７、２時間；レーン８および１８、４時間；レーン９および１９、８時間；レーン１０および２０、２４時間；レーン２２、２４時間；レーン２３、４８時間；レーン２４、１２０時間；レーン２５、２４０時間のインキュベーション。
【図１４】図１４は、フッ素化ｄｓＲＮＡを２’Ｆ−ｓｉＲＮＡに変換するための組換えヒトダイサーの使用を証明する。レーンの組成は以下である：レーン１：サイズマーカー、λ＼ＨｉｎｄＩＩＩ＋φＸ１７４＼ＨａｅＩＩＩ；レーン２：ｒｉｂｏ／ｒｉｂｏホモ二重鎖ＲＮＡ；レーン３：ｒｉｂｏ／２’−Ｆヘテロ二重鎖ＲＮＡ；レーン４：２’−Ｆ／ｒｉｂｏヘテロ二重鎖ＲＮＡ；レーン６：サイズマーカー、１０ｂｐ  ＤＮＡラダー；レーン７：ｒｉｂｏ／ｒｉｂｏホモ二重鎖ｓｉＲＮＡ；レーン８：ｒｉｂｏ／２’−Ｆヘテロ二重鎖ｓｉＲＮＡ；レーン９：２’−Ｆ／ｒｉｂｏヘテロ二重鎖ｓｉＲＮＡ；レーン１０：２’−Ｆ／２’−Ｆホモ二重鎖ｓｉＲＮＡ。
【図１５】図１５は、ＨＣＶ特異的ｓｉＲＮＡに対するサブゲノムＨＣＶレプリコンを含むＨｕｈ−７細胞（５−２株）中での正規化ルシフェラーゼ活性の用量応答を示す。ルシフェラーゼ活性は、各ｓｉＲＮＡ用量の増加に伴って減少した。
【図１６】図１６は、コレステロールがコレステロール改変型ＧＬ２ｓｉＲＮＡに対するサブゲノムＨＣＶレプリコンを含むＨｕｈ−７細胞（５−２株）中での正規化ルシフェラーゼ活性の用量応答を示すことを示す。
【図１７】図１７は、全ピリミジンの２−フルオロピリミジン置換（２−Ｆ−ｓｉＲＮＡ）および全ピリミジンの２−フルオロピリミジン置換を含み、２−Ｆ−ｓｉＲＮＡ中に存在するリボヌクレオチド「ＵＵ」突出部に代わる分子の３’末端に添加した２塩基デオキシリボヌクレオチド「ＴＴ」配列も含むように改変されたｓｉＲＮＡで認められた安定性の増加を証明する。
【図１８】図１８は、２’−糖内のフッ素化によってｓｉＲＮＡ安定性を劇的に増加させることができることを示す。
【図１９】図１９は、インビボでのｓｉＲＮＡの評価を示す。
【図２０】図２０は、低圧ＩＶ注射によって結合体化２’−Ｆ−ｓｉＲＮＡがキメラマウスで有効であることを示す。
【図２１】図２１は、皮下投与した結合体化２’−Ｆ−ｓｉＲＮＡがキメラマウスで部分的に有効であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、約１０〜約３０ヌクレオチド長であり、かつ標的細胞中でのＲＮＡ干渉を媒介するｄｓＲＮＡ分子を提供する。好ましくは、本発明の分子は、ヌクレアーゼ分解に対する安定性が増加するが、標的核酸への結合能力が保持されるように化学改変されている。
本明細書中で使用される、「ＲＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）は、タンパク質合成全体を抑制することなくｓｉＲＮＡによって媒介される遺伝子発現（タンパク質合成）の配列特異的抑制または遺伝子特異的抑制をいう。本発明は特定の理論または作用様式に制限されないが、ＲＮＡｉはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）による伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解、それによる転写ｍＲＮＡの翻訳の防止に関与し得る。あるいは、遺伝子転写を切り替えるゲノムＤＮＡのメチル化に関与し得る。ＲＮＡｉによる遺伝子発現の抑制は、一過性であり得るか、より安定であり得るか、不変であり得る。
【００３２】
「遺伝子抑制」、「ターゲティングされた抑制」、「配列特異的抑制」、「ターゲティングされたＲＮＡｉ」、および「配列特異的ＲＮＡｉ」を、本明細書中で交換可能に使用する。さらに、本明細書中で使用される、「配列特異的抑制」を、ｓｉＲＮＡを含む細胞（実験細胞）および同一のｓｉＲＮＡを含まない細胞（コントロール細胞）の抑制についてターゲティングしたタンパク質レベルを個別にアッセイし、その後に２つの値を比較することによって決定する。実験細胞およびコントロール細胞は、同一起源および同一動物に由来すべきである。また、遺伝子抑制のレベルまたは量の決定で使用されるコントロール細胞および実験細胞を、同一でない場合、類似の条件下でアッセイすべきである。
【００３３】
ＲＮＡは、それぞれがリン酸基および窒素塩基（典型的には、アデニン、グアニン、シトシン、またはウラシル）と組み合わせた糖リボースを含むリポヌクレオチドのポリマーである。その同類（ｃｏｕｓｉｎ）のように、ＤＮＡ、ＲＮＡは相補水素結合を形成し得る。したがって、ＲＮＡは、二本鎖（ｄｓＲＮＡ）、一般鎖（ｓｓＲＮＡ）、または一本鎖突出部を有する二本鎖であり得る。一般的なＲＮＡ型には、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および小さなヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）（それぞれが生体細胞中で特定の役割を果たす）が含まれる。本明細書中で使用される、用語「ＲＮＡ」には、これらすべてが含まれる。
【００３４】
「短鎖干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）は、タンパク質発現を特異的干渉するその能力にちなんで名付けられた約１０ヌクレオチド長〜約３０ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子をいう。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、１２ヌクレオチド長〜２８ヌクレオチド長、より好ましくは１５ヌクレオチド長〜２５ヌクレオチド長、さらにより好ましくは１９ヌクレオチド長〜２３ヌクレオチド長、最も好ましくは２１ヌクレオチド長〜２３ヌクレオチド長である。したがって、好ましいｓｉＲＮＡ分子は、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長、２７ヌクレオチド長、２８ヌクレオチド長、または２９ヌクレオチド長である。
【００３５】
１つの鎖の長さは、ｓｉＲＮＡ分子の長さを指定する。例えば、２１リボヌクレオチド長（２１量体）と記載されたｓｉＲＮＡは、ＲＮＡの２つの逆鎖を含むことができ、これらは互いにアニーリングして１９の連続する塩基対を形成する。各鎖上の２つの保持されたリボヌクレオチドが「突出部」を形成するであろう。ｓｉＲＮＡが異なる長さの２つの鎖を含む場合、長い方の鎖がｓｉＲＮＡの長さと指定する。例えば、２１ヌクレオチド長の第１の鎖および２０ヌクレオチド長の第２の鎖を含むｄｓＲＮＡは、２１量体から構成される。
【００３６】
１つの突出部を含むｓｉＲＮＡが望ましい。突出部は、鎖の５’末端または３’末端であり得る。好ましくは、ＲＮＡ鎖の３’末端である。突出部の長さは変化し得るが、好ましくは、約１〜約５塩基、より好ましくは、約２ヌクレオチド長である。好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、約２〜４塩基の３’突出部を含む。より好ましくは、３’突出部は、２リボヌクレオチド長である。さらにより好ましくは、３’突出部を含む２つのヌクレオチドはウリジン（Ｕ）である。
【００３７】
本発明のｓｉＲＮＡは、標的リボヌクレオチドと相互作用するように設計されており、このことは、これらが標的配列に結合するのに十分に標的配列と相補的であることを意味する。好ましくは、標的リボヌクレオチド配列は、病原因子または病原体に由来する。より好ましくは、標的リボヌクレオチド配列は、ＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスのウイルスゲノムである。さらにより好ましくは、ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ポリオウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、メタニューモウイルス、およびコロナウイルスからなる群より選択される。
【００３８】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、非常に好ましいウイルス標的である。図１および図２は、いくつかのＨＣＶ特異的ｓｉＲＮＡ分子の核酸配列を開示する。示したこれらのうち、ｓｉＲＮＡ５、ｓｉＲＮＡＣ１、ｓｉＲＮＡＣ２、ｓｉＲＮＡ５Ｂ１、ｓｉＲＮＡ５Ｂ２、およびｓｉＲＮＡ５Ｂ４は、特に良好な活性を示したので、非常に好ましい。これらの非常に好ましいｓｉＲＮＡと少なくとも８０％、９０％、または９５％同一のｓｉＲＮＡも本発明の一部を構成する。
【００３９】
別の好ましいウイルス標的はコロナウイルスであり、これは、ヒトにおける上気道感染に関連し、最近では、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）に関与している。コロナウイルスは、既知のＲＮＡウイルスで最大のゲノム（３２ｋｂ長）を有し、そのゲノムは、＋鎖ＲＮＡから構成される（図５を参照のこと）。各コロナウイルスｍＲＮＡは、６０〜８０ヌクレオチドの５’リーダー配列を有し、これは、約２００ヌクレオチド長のゲノムＲＮＡの５’ＵＴＲと同一である（図６を参照のこと）。これらの配列は、高度に保存されているので、ｓｉＲＮＡの標的配列の優れた供給源を提供する。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １８，ｐ．５４１−５６０（Ｅｄｓ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｋｎｉｐｅ  ａｎｄ  Ｈｏｗｌｅｙ），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ（１９９５）を参照のこと。１つの実施形態では、全リーダー配列（ヌクレオチド１〜７２）をターゲティングする。別の実施形態では、リーダー配列の１つ以上の切片をターゲティングする。好ましい実施形態では、リーダー配列のヌクレオチド６４〜７２（ＴＡＡＡＣＧＡＡＣ）をターゲティングする。コロナウイルスをターゲティングするｓｉＲＮＡは、改変されていても未改変でもよい。
【００４０】
１つの実施形態では、本発明は、標的因子またはウイルス由来のリボヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一のリボヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡ分子を提供する。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、標的因子またはウイルスのリボヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。標的は、全ウイルスゲノム、一次転写物、オープンリーディングフレーム、またはこれらの任意の部分であり得る。最も好ましくは、ｓｉＲＮＡは、標的因子またはウイルスのヌクレオチド配列と１００％同一である。しかし、標的と比較して、挿入、欠失、または１つの点変異を含むｓｉＲＮＡ分子も有効であり得る。ｓｉＲＮＡ設計を補助するツールは、公的に容易に利用可能である。例えば、コンピュータベースのｓｉＲＮＡ設計ツールを、インターネットのｗｗｗ．ｄｈａｒｍａｃｏｎ．ｃｏｍから利用可能である。
【００４１】
例として、基準ヌクレオチド配列と少なくとも９５％「同一な」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列が１００ヌクレオチドの基準ヌクレオチド配列あたり５つまでの点変異（すなわち、２０ヌクレオチドあたり１つの点変異）を含み得ることを意味する。言い換えれば、基準ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、基準配列の５％までのヌクレオチドを欠失するか別のヌクレオチドと置換し得るか、基準配列の全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチドを、基準配列に挿入し得る。これらの基準配列の変異は、基準ヌクレオチド配列の５’末端もしくは３’末端の位置またはこれらの末端の位置の間のどこかで起こり得るか、基準配列中のヌクレオチドの間または基準配列内の１つ以上の連続した群のいずれかに個別に散在し得る。
【００４２】
実際に、任意の特定の核酸分子が標的因子またはウイルスのリボヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるかどうかを、従来のように、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）などの公知のコンピュータプログラムを使用して決定し得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２配列間の最良の相同性セグメントを見出すためにＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１））を使用する。特定の配列が、例えば、本発明の基準配列と９５％同一であるかどうかを決定するためにＢｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、パラメータを、勿論、基準リボヌクレオチド配列の全長にわたって同一率が計算され、基準配列中の総リボヌクレオチド数の５％までの相同性のギャップが許容されるように設定する。
【００４３】
本発明はまた、ヌクレアーゼ分解に対する安定性が増加するが、細胞中に存在し得る標的核酸への結合能力が保持されるように化学改変されたｓｉＲＮＡ分子を含む。標的ＲＮＡがウイルス特異的である場合、改変型ｓｉＲＮＡはウイルス特異的ＲＮＡまたはＤＮＡに結合し、それにより、ウイルスを不活化し得る。
【００４４】
本発明の改変型ｓｉＲＮＡは、改変型リボヌクレオチドを含み、かつＲＮアーゼ分解などの酵素分解に耐性を示し、さらに、特定のウイルス標的ＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列を含む細胞中でのウイルス複製を阻害する能力を保持する。改変型ｓｉＲＮＡが標的配列に結合し、かつ酵素分解に耐性を示す限り、ｓｉＲＮＡを分子の任意の位置で改変し得る。ｓｉＲＮＡのヌクレオチド塩基（すなわち、プリンまたはピリミジン）、リボース、またはリン酸塩を改変し得る。好ましくは、ｓｉＲＮＡ中の少なくとも１つのリボースの２’位を改変する。
【００４５】
より詳細には、ｓｉＲＮＡの少なくとも１つのピリミジン、少なくとも１つのプリン、またはこれらの組み合わせを改変する。しかし、一般に、ｓｉＲＮＡのピリミジンすべて（シトシンまたはウラシル）、すべてのプリン（アデノシンまたはグアニン）、またはピリミジンすべてとすべてのプリンとの組み合わせを改変する。ピリミジンを改変することがより好ましく、これらのピリミジンは、シトシン、シトシンの誘導体、ウラシル、ウラシルの誘導体、またはこれらの組み合わせである。ｓｉＲＮＡのいずれかまたは両方の鎖のリボヌクレオチドを改変し得る。
【００４６】
ＲＮＡ中で見出されるピリミジン（シチジンおよびウリジン）を含むリボヌクレオチドを、ＲＮＡ分解または塩基、リボース、もしくはリン酸塩の破壊を阻害する任意の分子の付加によって化学改変し得る。前に示すように、リボースの２’位が改変に好ましい部位である。２’改変型ｓｉＲＮＡは、未改変のｓｉＲＮＡまたは一本鎖ＲＮＡ（アンチセンスまたはリボザイムなど）より長い血清半減期を有し、分解耐性を示す。２’改変型ピリミジンリボヌクレオチドを、当該分野で公知の多数の異なる方法によって形成し得る。
【００４７】
好ましい化学改変は、ｓｉＲＮＡのリボヌクレオチドへのハライド化学基由来の分子の付加である。ハライドのうち、フッ素が好ましい分子である。フルオロ−に加えて、メチル−、メトキシエチル−、およびプロピル−などの他の化学部分を改変基として付加し得る。それにもかかわらず、最も好ましい改変は、フルオロ改変（２’−フルオロ改変または２’，２’−フルオロ改変など）である。
【００４８】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、ピリミジンリボヌクレオチドの２’炭素へのフッ素分子の付加によってｓｉＲＮＡを改変する。ｓｉＲＮＡを、完全または部分的にフッ素化し得る。例えば、シトシンリボヌクレオチドのみをフッ素化し得る。あるいは、ウラシルリボヌクレオチドのみをフッ素化し得る。好ましい実施形態では、ウラシルおよびシトシンの両方をフッ素化する。ｓｉＲＮＡのたった１つの鎖（センスまたはアンチセンスのいずれか）をフッ素化し得る。ｓｉＲＮＡの部分的２’フッ素化でさえ、核酸分解を防御する。重要には、２’フッ素化ｓｉＲＮＡは細胞に有毒ではなく、このフッ素の化学的性質から得た予期せぬ結果は、通常、生きた生物に有毒である。
【００４９】
さらに、本発明の改変型ｓｉＲＮＡは、ウイルスＲＮＡポリメラーゼを阻害する化学改変を含み得る。例えば、ｓｉＲＮＡは、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを阻害する１つ以上のヌクレオシドを含み得る。このようなヌクレオシドおよび他の化学改変の例は、ＷＯ０２／０５７４２５、ＷＯ０２／０５７２８７、ＷＯ０２／１８４０４、ＷＯ０２／１００４１５、ＷＯ０２／３２９２０、ＷＯ０１／９０１２１、米国特許第６，０６３，６２８号、および米国特許出願番号２００２／００１９３６３中に存在する。
【００５０】
ｓｉＲＮＡを、多数の方法（化学合成、Ｔ７ポリメラーゼ転写、または２つの以前の方法のうちの１つによって調製された長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のダイサー酵素での処理など）で調製し得る。ダイサー酵素により、約５００塩基対〜約１０００塩基対のサイズのｄｓＲＮＡから約２１〜約２３塩基対のｄｓＲＮＡの混合集団が得られる。予想外に、ダイサーは、２’−フルオロ改変型ｄｓＲＮＡなどのｄｓＲＮＡの改変型鎖を有効に切断し得る。この方法の開発前は、ダイサーは改変型ｓｉＲＮＡを切断することができないであろうと考えられていた。ダイサーによるｓｉＲＮＡの調製方法を、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されているＤｉｃｅｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して行うことができる。
【００５１】
本発明は、特に、（ａ）少なくとも１つの鎖中に少なくとも１つの改変型リボヌクレオチドを含む改変型二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を調製する工程と、（ｂ）組換えヒトダイサーを使用して改変型ｄｓＲＮＡフラグメントを切断し、それにより、１つを超える改変型ｓｉＲＮＡを得る工程とを含む、ウイルス中の核酸配列をターゲティングする改変型ｓｉＲＮＡを作製する方法を含む。本方法は、さらに、（ｃ）改変型ｓｉＲＮＡを単離する工程を含み得る。
【００５２】
ｓｉＲＮＡの作製方法では、ｄｓＲＮＡフラグメントを、化学合成またはインビボ翻訳によって調製し得る。１つの実施形態では、改変型ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの少なくとも１つのリボヌクレオチドの２’位が改変された２’改変型ｓｉＲＮＡである。改変は、フルオロ改変、メチル改変、メトキシエチル改変、およびプロピル改変からなる群より選択される。好ましくは、フルオロ改変は、２’−フルオロ改変または２’，２’−フルオロ改変である。ｓｉＲＮＡのピリミジン、プリン、またはこれらの組み合わせを改変する。より好ましくは、シトシン、シトシンの誘導体、ウラシル、ウラシルの誘導体、またはこれらの組み合わせなどのピリミジンを改変する。ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖は、１つ以上の改変型リボヌクレオチドを含み得る。
【００５３】
本発明は、さらに、ターゲティングされた因子またはウイルスを不活化するのに有効な量のｄｓＲＮＡの患者への投与による、患者の標的因子またはウイルスを不活化する方法を提供する。好ましくは、ｄｓＲＮＡを、上記のように改変する。細胞中のターゲティングされたＤＮＡセグメントに対するＲＮＡ干渉を、細胞への二本鎖ＲＮＡ分子の投与によって行うことができ、二本鎖ＲＮＡ分子のリボヌクレオチド配列は、ターゲティングされたＤＮＡセグメントのリボヌクレオチド配列に対応する。好ましくは、ターゲティングされたＲＮＡｉを誘導するために使用されるｄｓＲＮＡはｓｉＲＮＡである。
【００５４】
本明細書中で使用される、用語「ターゲティングされたＤＮＡセグメント」を、抑制を望む場合にターゲティングされたタンパク質のｍＲＮＡの全部または一部をコードするＤＮＡ配列（イントロンまたはエクソンが含まれる）を意味するために使用する。ＤＮＡセグメントはまた、ターゲティングされたタンパク質の発現を正常に調節するＤＮＡ配列（ターゲティングされたタンパク質のプロモーターが含まれるが、これに限定されない）を意味し得る。さらに、ＤＮＡセグメントは、細胞ゲノムの一部であっても一部でなくてもよいか、染色体外（プラスミドＤＮＡなど）であってよい。
【００５５】
本発明は、特に、ウイルスの不活化に有効な量のｓｉＲＮＡ（好ましくは、改変型ｓｉＲＮＡ）の患者への投与による、患者のウイルスを不活化する方法に関する。ｓｉＲＮＡは、約１０〜約３０リボヌクレオチド長、より好ましくは１２〜２８リボヌクレオチド長、より好ましくは１５〜２５リボヌクレオチド長、さらにより好ましくは１９〜２３リボヌクレオチド長、最も好ましくは２１〜２３リボヌクレオチド長である。
【００５６】
また、ウイルスを不活化する方法は、好ましくは、ｓｉＲＮＡの少なくとも１つのリボヌクレオチドの２’位を改変したｓｉＲＮＡを使用する。ｓｉＲＮＡを、フルオロ、メチル、メトキシエチル、およびプロピルからなる群より選択される化学基を使用して改変し得る。フルオロ改変が最も好ましく、２’−フルオロ改変または２’，２’−フルオロ改変のいずれかが本方法で有用である。ｓｉＲＮＡのピリミジン、プリン、またはこれらの組み合わせを改変し得る。より好ましくは、シトシン、シトシンの誘導体、ウラシル、ウラシルの誘導体、またはこれあの組み合わせなどのピリミジンを改変する。１つの実施形態では、ｓｉＲＮＡの一方の鎖は、少なくとも１つの改変型リボヌクレオチドを含む一方で、別の実施形態では、ｓｉＲＮＡの両方の鎖が少なくとも１つの改変型リボヌクレオチドを含む。
【００５７】
治療方法で有用なｓｉＲＮＡを、少なくとも１つ、好ましくは１つを超えるレセプター結合リガンドのｓｉＲＮＡへの結合によって改変することもできる。このようなリガンドは、患者の生体システム、器官、組織、または細胞（肝臓、胃腸管、気道、頸部、または皮膚など）における標的ウイルスへのｓｉＲＮＡの直接送達に有用である。
【００５８】
好ましい実施形態では、レセプター結合リガンドを、ｓｉＲＮＡの５’末端または３’末端のいずれかに結合する。レセプター結合リガンドを、１つ以上のｓｉＲＮＡ末端（５’末端と３’末端との任意の組み合わせが含まれる）に結合し得る。したがって、レセプター結合リガンドがｓｉＲＮＡ分子の末端のみに結合する場合、１つと４つとの間のリガンドをどこにでも結合し得る。
【００５９】
特定の生体システム、器官、組織、または細胞中のウイルスにｓｉＲＮＡをターゲティングするための適切なリガンドの選択は、当業者の範囲内と見なされる。例えば、肝臓細胞にｓｉＲＮＡをターゲティングするために、ｓｉＲＮＡ分子の１つ以上の末端（５’末端と３’末端との任意の組み合わせが含まれる）にコレステロールを結合し得る。得られたコレステロール−ｓｉＲＮＡを、肝臓内の肝臓細胞に送達させ、それにより、このターゲティングされた位置へのｓｉＲＮＡの送達手段が得られる。肝臓へのｓｉＲＮＡのターゲティングに有用な他のリガンドには、ＨＢＶ表面抗原および低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）が含まれる。
【００６０】
別の例として、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−Ｉ）をターゲティングするｓｉＲＮＡ分子を、標的核酸が存在するＴリンパ球に送達し得る（Ｓｏｎｇ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７７（１３）：７１７４−７１８１（２００３））。ｓｉＲＮＡ分子の３’末端または５’末端でのＴ細胞上に存在するＣＤ４表面タンパク質に結合し得るＨＩＶ−１表面抗原の結合によってこの送達を行うことができる（Ｋｉｌｂｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３４８（２２）：２２２８−３８（２００３））。
【００６１】
同様に、インフルエンザＡ型ウイルスをターゲティングするｓｉＲＮＡ分子を、標的核酸が存在する気道上皮細胞に送達させることができる（Ｇｅ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１００（５）：２７１８−２７２３（２００２））。ｓｉＲＮＡ分子の３’末端または５’末端での上皮細胞表面上に存在するシアル酸残基に結合し得るインフルエンザウイルス表面抗原の結合によってこの送達を行うことができる（Ｏｈｕｃｈｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７６（２４）：１２４０５−１２４１３（２００２）；Ｇｌｉｃｋ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６（３５）：２３６６０−２３６６９（１９９１））。
【００６２】
また、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）をターゲティングするｓｉＲＮＡ分子を、標的核酸が存在する気道上皮細胞に送達させることができる（Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ，ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１：３４（２００１））。ｓｉＲＮＡ分子の３’末端または５’末端でのＲＳＶ表面抗原の結合によってこの送達を行うことができる（Ｍａｌｈｏｔｒａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，５：１２３−１３３（２００３））。
【００６３】
さらに別の例として、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）をターゲティングするｓｉＲＮＡ分子を、標的核酸が存在する上皮基底細胞に送達させることができる（Ｈａｌｌ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７７（１０）：６０６６−６０６９（２００３））。ｓｉＲＮＡ分子の３’末端または５’末端での上皮基底細胞の表面上に存在するヘパリン表面プロテオグリカンに結合し得るＨＰＶ表面抗原の結合によってこの送達を行うことができる（Ｂｏｕｓａｒｇｈｉｎ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７７（６）：３８４６−３８５０（２００２））。
【００６４】
さらに、ポリオウイルス（ＰＶ）をターゲティングするｓｉＲＮＡ分子を、標的核酸が存在する神経系細胞に送達させることができる（Ｇｉｔｌｉｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４１８：４３０−４３４（２００２））。ｓｉＲＮＡ分子の３’末端または５’末端でのニューロン表面上に存在するＣＤ１５５レセプターに結合し得るＰＶ表面抗原の結合によってこの送達を行うことができる（Ｈｅ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，９７（１）：７９−８４（２０００））。
【００６５】
述べたように、治療方法は、病原因子または病原体、より詳細にはＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスのいずれかであり得るウイルスをターゲティングすることを意図する。好ましいウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ポリオウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、メタニューモウイルス、およびコロナウイルスからなる群より選択される。より好ましくは、標的ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルスまたはコロナウイルスである。
【００６６】
１つの態様では、本方法は、（ａ）短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を設計するためにウイルスゲノム中の標的リボヌクレオチド配列を同定すること、および（ｂ）少なくとも１つの改変型リボヌクレオチドを含むように改変されたｓｉＲＮＡを生成することによって調製されるｓｉＲＮＡを使用する。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、ウイルス中の標的リボヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列に相当する第１の鎖のリボヌクレオチド配列および標的リボヌクレオチド配列に相補的なリボヌクレオチド配列を含む第２の鎖を有する二本鎖ＲＮＡ分子を含む。第１および第２の鎖は、相互にハイブリッド形成して二本鎖ＲＮＡ分子を形成する個別の相補鎖であるべきである。さらに、鎖の一方または両方は、少なくとも１つの改変型リボヌクレオチドを含むべきである。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、Ｃ型肝炎ウイルスゲノム中のリボヌクレオチド配列をターゲティングする。標的リボヌクレオチド配列は、ＨＣＶ複製に必要な保存リボヌクレオチド配列を含み、保存リボヌクレオチド配列は、５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）、コア、およびＮＳ３ヘリカーゼからなる群より選択される。非常に好ましいｓｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ５、ｓｉＲＮＡＣ１、ｓｉＲＮＡＣ２、ｓｉＲＮＡ５Ｂ１、ｓｉＲＮＡ５Ｂ２、またはｓｉＲＮＡ５Ｂ４の配列と少なくとも８０％同一の配列を含む。ｓｉＲＮＡは、未改変であっても、上記のように改変されていてもよい。
【００６８】
ＨＣＶに陽性の細胞中でＨＣＶの複製を阻害する方法は、細胞に有毒であるべきではないか、処置した細胞でアポトーシスを引き起こすべきではない。好ましくは、ＨＣＶ複製の阻害は、正常な成長、分裂、または代謝が影響を受けないように、細胞中のＨＣＶ複製のみに影響を与えるように特異的に適合させる。ＨＣＶが複製することが示された細胞には、肝細胞、Ｂ細胞リンパ球、およびＴ細胞リンパ球が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、ＨＣＶの複製を阻害する方法を、肝細胞で行う。
【００６９】
本発明によれば、「肝細胞」は、任意の動物供給源に由来し得る。さらに、肝細胞は、細胞培養物中に存在するか、組織の一部であるか、器官の一部または全体であり得る。句「肝細胞」は、正常、異常、または罹患した肝臓細胞を構成する任意の細胞を含むことを意味する。肝臓細胞の例には、クッパー細胞、肝細胞、および肝細胞癌を含む細胞が含まれるが、これらに限定されない。「肝臓細胞」は、肝臓内に個別の構造を作り上げる細胞（血管を裏打ちする上皮細胞など）を含むことを意味する。肝臓細胞を含む組織または器官は、被験体内に存在し得るか、生検し得るか、動物から取り出すことができる。さらに、組織は、切除と本発明の方法との間にいかなる保存工程も行わずに新たに被験体から取り出されるという点で「新鮮」であり得る。本発明の方法の適用前に、組織を、標準的な組織調製技術（凍結、瞬間凍結、パラフィン包埋、および組織固定が含まれるが、これらに限定されない）によって保存することもできる。さらに、組織はまた、別の宿主動物上または別の宿主動物内で異種移植片または同系移植片であり得る。本明細書中で使用される、用語「動物」および「被験体」を、交換可能に使用する。
【００７０】
本発明によれば、「Ｃ型肝炎ウイルス」または「ＨＣＶ」は、出願の時点での一般的な意味を取る。Ｃ型肝炎ウイルスは、フラビウイルス科のＲＮＡウイルスである。ＨＣＶには、遺伝子型１〜１１（最も一般的な遺伝子型同定システムを使用）が含まれるが、これらに限定されない。これらの遺伝子型は、サブタイプに分類され、これらのいくつかには、１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａ、３ｂ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、５ａ、６ａ、７ａ、７ｂ、８ａ、８ｂ、９ａ、１０ａ、および１１ａが含まれるか、これらに限定されない。さらに、個体からの単離物は、ウイルスゲノムの密接に関連した依然として異種の集団（時折、疑似種と呼ばれる）からなる。
【００７１】
ペスチウイルスは、本発明のさらに別の標的である。本明細書中で使用される、「ペスチウイルス」は、出願の時点での一般的な意味を取る。ペスチウイルスは、フラビウイルス科に属する。ペスチウイルスは、オーストラリアのウシ集団に広まっている。家畜の約７０％がペスチウイルスに能動的に感染していると考えられる。感受性動物の感染により、種々の疾患を引き起こし得るが、ウイルスの家畜への最初の伝播からしばらくは明らかとなるならない場合がある。ペスチウイルスは、ブタコレラウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、およびボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）、またはヘアリーシェーカー病ウイルスが含まれるウイルス属である。
【００７２】
静脈注射、皮下注射、経口送達、リポソーム送達、または鼻腔内送達によってｓｉＲＮＡを患者に投与し得る。次いで、ｓｉＲＮＡは、患者の標的生体システム、器官、組織、または細胞型中に蓄積し得る。
【００７３】
本発明はまた、ウイルス特異的ｓｉＲＮＡの発現を指示するベクターでウイルスを保有する細胞をトランスフェクトする工程を含む、哺乳動物細胞中のウイルスの複製を阻害する方法を提供する。１つの実施形態では、本発明は、ＨＣＶ特異的ｓｉＲＮＡの発現を指示するベクターでＨＣＶ陽性細胞をトランスフェクトする工程を含む、ＨＣＶ陽性細胞中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の複製を阻害する方法を提供する。細胞中のマーカーがｓｉＲＮＡによって阻害されたかどうかを決定するために、細胞を評価し得る。
【００７４】
したがって、本発明はまた、記載のｓｉＲＮＡをコードする核酸セグメントを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。
【００７５】
本発明のベクターを、組換え技術によるｓｉＲＮＡ生成のために使用し得る。したがって、例えば、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントを、任意のＤＮＡ配列の発現のための種々の発現ベクターのいずれか１つに含めることができる。このようなベクターには、染色体配列、非染色体配列、および合成ＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０の誘導体）；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ（ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病など）との組み合わせに由来するベクターが含まれる。しかし、所望の宿主中で複製可能であり、かつ生存可能である限り、任意の他のベクターを使用し得る。
【００７６】
種々の手順によって適切なＤＮＡセグメントをベクターに挿入し得る。一般に、当該分野で公知の手順によって、ＤＮＡ配列を適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。このような手順および他の手順は、当業者の範囲内であると見なされる。
【００７７】
発現ベクター中のＤＮＡセグメントは、ｓｉＲＮＡ合成を指示するのに適切な発現調節配列（プロモーター）に作動可能に連結される。適切な真核生物プロモーターには、ＣＭＶ最初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター（ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーターなど）、メタロチオネインプロモーター（マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターなど）が含まれる。好ましくは、本発明のプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターのＩＩＩ型クラスに由来する。より好ましくは、プロモーターは、Ｕ６およびＨ１プロモーターからなる群より選択される。Ｕ６およびＨ１プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターのＩＩＩ型クラスの両メンバーである。本発明のプロモーターはまた、発現を、「オン」または「オフ」し得るという点で誘導性であり得る。例えば、Ｕ６プロモーターのテトラサイクリン調節系を使用して、ｓｉＲＮＡの生成を調節し得る。発現ベクターは、翻訳開始および転写終結のためのリボゾーム結合部位を含んでも含まなくてもよい。ベクターはまた、発現増幅に適切な配列を含み得る。
【００７８】
さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質（ジヒドロ葉酸レダクターゼなど）または真核細胞培養物のためのネオマイシン耐性またはテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性を得るための１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。
【００７９】
一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞を形質転換させる複製起点および選択マーカー（例えば、大腸菌および出芽酵母のＴＲＰ１遺伝子のアンピシリン耐性遺伝子）、構造配列下流の転写を指示するための高度に発現する遺伝子由来のプロモーターを含む。このようなプロモーターは、特に、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ａ因子、酸ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などの解糖酵素をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列を、適切な段階で、翻訳開始および終結配列、好ましくは、細胞膜周辺腔または細胞外媒質（ｍｅｄｉｕｍ）への翻訳タンパク質の分泌を指示し得るリーダー配列とアセンブリする。任意選択的に、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現組換え産物の安定化または簡素な精製など）を付与するＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
【００８０】
１つの実施形態では、本発明は、ベクターであって、ＲＮＡポリヌクレオチドのセンス鎖をコードするＤＮＡセグメントが第１のプロモーターと作動可能に連結しており、ＲＮＡポリヌクレオチド分子のアンチセンス（逆）鎖をコードするＤＮＡセグメントが第２のプロモーターと作動可能に連結されている、ベクターを提供する。言い換えれば、ＲＮＡポリヌクレオチドの各鎖が独立して発現する。さらに、各鎖のプロモーター駆動発現が同一であり得るか、一方のプロモーターが他方のプロモーターと異なり得る。
【００８１】
別の実施形態では、本発明のベクターは、逆方向プロモーターを含み得る。例えば、ベクターは、ＲＮＡポリヌクレオチドのセンス鎖をコードするいずれかのＤＮＡセグメント側に、逆方向で存在する２つのＵ６プロモーターを含むことができ、転写終結因子は、２つの逆方向プロモーターの間に存在するか存在しない。Ｕ６逆方向プロモーター構築物は、Ｗａｎｇ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：４０１７４−４０１７９（２０００）に記載のＴ７逆方向プロモーター構築物と類似している。Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ，Ｍ．ａｎｄ  Ｔａｉｒａ，Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：４９７−５００（２００２）を参照のこと。
【００８２】
別の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドの両方の鎖をコードするＤＮＡ配列は、１つのプロモーターの調節下にある。１つの実施形態では、各鎖をコードするＤＮＡセグメントを、２つのＤＮＡセグメントの間に散在する「ループ」領域とベクター上に整列させ、ＤＮＡセグメントおよびループ領域の転写によって１つのＲＮＡ転写物が作製される。１つの転写物自体がその後にアニーリングして、ＲＮＡｉを誘導し得る「ヘアピン」ＲＮＡ構造が作製される。ヘアピン構造の「ループ」は、好ましくは、約４〜約６ヌクレオチド長である。より好ましくは、ループは、４ヌクレオチド長である。
【００８３】
本明細書中に記載の適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーター配列または調節配列を含むベクターを使用して、宿主にｓｉＲＮＡを発現させるように適切な宿主を形質転換し得る。原核宿主および真核宿主との使用に適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）（その開示が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【００８４】
宿主細胞を、本発明のベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作する（形質導入、形質転換、またはトランスフェクトする）。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞を、プロモーターの活性化、形質転換対の選択に適切なように改変された従来の栄養培地中で培養し得る。温度およびｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞と共に以前に使用されている条件であり、当業者に明らかである。
【００８５】
さらなる実施形態では、本発明は、上記構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞などの高等真核細胞または酵母細胞などの下等真核細胞であり得るか、宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。より好ましくは、宿主細胞は肝臓細胞である。宿主細胞への構築物の移入を、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ媒介トランスフェクション、エレクトロポレーションによって行うことができる（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。
【００８６】
本明細書中で使用される、用語「患者」は、動物、好ましくは、哺乳動物をいう。より好ましくは、患者は、霊長類（非ヒトおよびヒトが含まれる）であり得る。用語「被験体」および「患者」を、交換可能に使用する。
【００８７】
本発明によって想定される治療を、既存のウイルス感染症を罹患した被験体または感染症にかかりやすい被験体に使用し得る。さらに、本発明の方法を使用して、患者のウイルス感染に対する感受性の付与に関与する細胞の異常または生理学的異常を修正または代償し、そして／または患者のウイルス感染症の症状を緩和し得るか、患者の予防対策とし得る。
【００８８】
ウイルス感染症を罹患した患者の治療方法は、被験体への組成物の投与を含む。本明細書中で使用される、「組成物」は、純粋な化合物、薬剤、もしくは物質、または２つまたはそれ以上の化合物、薬剤、または物質の混合物を意味し得る。本明細書中で使用される、用語「薬剤」、「物質」、または「化合物」は、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、ポリマー、または小分子（薬物など）を意味することが意図される。
【００８９】
本発明の１つの実施形態では、被験体に投与する組成物は、薬学的組成物である。さらに、薬学的組成物を、経口、鼻腔内、非経口、全身、腹腔内、局所（点滴薬または経皮パッチなどによる）、舌下、または口腔噴霧、鼻内噴霧で投与し得る。上気道疾患を引き起こすウイルス（コロナウイルスまたはメタニューモウイルスなど）の鼻腔内送達は、特に有益な送達様式であろう。本明細書中で使用される、用語「非経口」は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、および動脈内への注射および注入が含まれる投与様式をいう。本発明によって意図される薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。
【００９０】
「薬学的に受容可能なキャリア」には、非毒性の固体、半固体、または液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料、または任意の処方賦形剤型（リポソームなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
非経口注射のための本発明の薬学的組成物は、薬学的に受容可能な滅菌された水溶液または非水性溶液、分散液、懸濁液、または乳濁液および使用直前に滅菌注射溶液または分散液に再構成するための滅菌粉末を含み得る。適切な水性および非水性キャリア、希釈剤、溶媒、または賦形剤の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコールなど）、カルボキシメチルセルロースおよびその適切な混合物、植物油（オリーブ油など）、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが含まれる。例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用、分散液の場合に必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって適切な流動性を保持し得る。
【００９２】
本発明の組成物はまた、アジュバント（防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などであるが、これらに限定されない）を含み得る。種々の抗菌薬および抗真菌薬（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、およびソルビン酸（ｓｏｒｂ  ａｃｉｄ）など）の封入によって微生物作用の防止を確実にし得る。等張剤（糖および塩化ナトリウムなど）を含めることも望ましいことがある。モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の封入によって注射可能な薬学的形態の吸収を延長し得る。
【００９３】
いくつかの場合、薬物の効果を延長するために、皮下注射または筋肉内注射からの吸収を示すことが望ましい。水溶性の低い結晶または無定形物質の液体懸濁液の使用によってこれを行うことができる。次いで、薬物の吸収率は、その溶解速度に依存し、言い換えると、結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、油性賦形剤への薬物の溶解または懸濁によって非経口投与された薬物形態の吸収を遅延させる。
【００９４】
ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中での薬物のマイクロカプセルマトリックスの形成によって注射デポー形態を作製する。薬物のポリマーに対する比および使用した特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出率を調節し得る。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルソエステル）およびポリ（アンヒドリド）が含まれる。身体組織と適合するリポソームまたはマイクロエマルジョンへの薬物の捕捉によってもデポー注射処方物を調製する。
【００９５】
例えば、細菌保持フィルターでの濾過または使用直前に滅菌水または他の滅菌注射媒質中に溶解または分散し得る滅菌固体組成物の形態での滅菌薬の組み込みによって注射処方物を滅菌し得る。
【００９６】
経口投与のための固体投薬形態には、カプセル、錠剤、丸薬、粉末、および顆粒が含まれるが、これらに限定されない。このような固体投薬形態では、活性化合物を、少なくとも１つの薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリア（クエン酸ナトリウムまたは第二リン酸カルシウムなど）、ならびに／またはａ）充填剤または増量剤（デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸など）、ｂ）結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアカシアなど）、ｃ）保湿剤（グリセロールなど）、ｄ）崩壊剤（寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカのデンプン、アルギン酸、一定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなど）、ｅ）溶液遅延剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｔａｒｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（パラフィンなど）、ｆ）吸収促進剤（第四級アンモニウム化合物など）、ｇ）湿潤剤（例えば、アセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなど）、ｈ）吸収剤（カオリンおよびベントナイトクレイなど）、およびｉ）潤滑剤（タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムなど）、ならびにこれらの混合物と混合する。カプセル、錠剤、および丸薬の場合、投薬形態はまた、緩衝剤と含み得る。
【００９７】
類似の型の固体組成物を、ラクトースまたは乳糖などの賦形剤ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用した軟および硬充填カプセル中の充填剤として使用することもできる。
【００９８】
錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬、および顆粒の固体投薬形態を、コーティング、腸溶コーティングなどのシェル、および薬学的処方分野で周知の他のコーティングを使用して調製し得る。これらは、任意選択的に、混濁剤を含むことができ、これらが腸管の一定の一部のみまたは優先して有効成分を放出する組成でもあり得る。使用し得る包埋組成物の例には、高分子物質およびワックスが含まれる。
【００９９】
活性化合物はまた、適切な場合、１つ以上の上記賦形剤を含むマイクロカプセル化形態であり得る。
【０１００】
経口投与のための液体投薬形態には、薬学的に受容可能な乳濁液、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシルが含まれるが、これらに限定されない。活性化合物に加えて、液体投薬形態は、当該分野で一般的に使用されている不活性希釈剤（例えば、水または他の溶媒など）、可溶化剤、および乳化剤（エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレンアルコール、ジメチルホルムアミド、油類（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、麦芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）など）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含み得る。
【０１０１】
不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料、香味物質、および香料も含み得る。
【０１０２】
懸濁液は、活性化合物に加えて、懸濁剤（例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｍｅｔａｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、ベントナイト、寒天、およびトラガカント、ならびにこれらの組み合わせなど）を含み得る。
【０１０３】
あるいは、組成物を加圧し、圧縮ガス（窒素または液化ガス噴射剤など）を含めることができる。液化噴射剤の媒質および実際の全組成物は、有効成分が任意の実質的範囲まで溶解しないことが好ましい。圧縮組成物はまた、界面活性剤を含み得る。界面活性剤は液体または固体の非イオン性界面活性剤であるか、固体陰イオン性界面活性剤であり得る。ナトリウム塩の形態の固体陰イオン性界面活性剤を使用することが好ましい。
【０１０４】
本発明の組成物を、リポソームの形態で投与することもできる。当該分野で公知のように、リポソームは、一般に、リン脂質または他の脂質物質に由来する。水性媒質中に分散する単一膜または多重膜水和液晶によってリポソームを形成する。リポソームを形成し得る任意の非毒性の生理学的に受容可能かつ代謝可能な液体を使用し得る。リポソーム形態の本発明の組成物は、本発明の化合物に加えて、安定剤、防腐剤、および賦形剤などを含み得る。好ましい脂質は、天然および合成のリン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソームの形成方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｅｄ．，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４：３３  ｅｔ  ｓｅｑ（１９７６）を参照のこと）。
【０１０５】
当業者は、本発明の薬剤の有効量を、経験的に決定するか、純粋な形態で使用することができ、このような形態は、薬学的に受容可能な塩、エステル、またはプロドラッグ形態で存在することを認識する。本発明の組成物の「治療有効」量を、治療される疾患、損傷、または障害の有害な容態または症状の防止または改善によって決定し得る。薬剤を、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせた薬学的組成物としてウイルス感染治療が必要な被験体に投与し得る。ヒト患者に投与する場合、本発明の薬剤または組成物の１日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されると理解される。任意の特定の患者のための特定の治療有効用量レベルは、以下の種々の要因に依存する：達成すべき細胞応答または生理学的応答の型および程度；使用される特定の薬剤または組成物の活性；使用される特定の薬剤または組成物；患者の年齢、体重、一般的健康状態、性別、および食事；投与時間；投与経路および薬剤の排泄速度；治療の継続期間；特定の薬剤と組み合わせるか同時に使用される薬物；および医学分野で周知の要因など。例えば、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで薬剤を投与し始め、所望の効果が達成されるまで投薬量を段階的に増加させることは十分に当業者の範囲内である。
【０１０６】
当該分野で受け入れられ、日常化している技術によって決定した薬剤の所定の血中濃度を得るために、患者に特異的な様式で投与を準備し得る。したがって、ＨＰＬＣによって測定した一定の持続的血中レベルを達成するために、患者への投与を、５０〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲に調整し得る。
【０１０７】
種々の医薬品（ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）により、血中コレステロールレベルを低下させることができる。これらの医薬品または薬物には、例えば、スタチン、レジン、およびニコチン酸（ナイアシン）、ゲムフィブロジル、およびクロフィブレートが含まれる。クロフィブレート（Ａｔｒｏｍｉｄ−Ｓ）は、ＨＤＬコレステロールレベルを上昇させ、トリグリセリドレベルを低下させる。ゲムフィブロジル（Ｌｏｐｉｄ）は、血中脂肪を低下させ、ＨＤＬコレステロールレベルを上昇させる。
【０１０８】
ニコチン酸は肝臓内で作用し、トリグリセリドおよびＬＤＬコレステロールを低下させ、ＨＤＬ（「善玉」）コレステロールを上昇させるために使用される。レジンは、コレステロール処理の増加を促進する。このクラスの医薬品には以下が含まれる：コレスチラミン（Ｃｈｏｌｅｓｔｒｙａｍｉｎｅ）（Ｑｕｅｓｔｒａｎ，Ｐｒｅｖａｌｉｔｅ，Ｌｏ−Ｃｈｏｌｅｓｔ）；コレスチポール（Ｃｏｌｅｓｔｉｄ）；およびコレセベイアム（Ｃｏｌｅｓｅｖｅｉａｍ）（ＷｅｌＣｈｏｌ）。
【０１０９】
スタチン製剤は、ＬＤＬ（「悪玉」）コレステロールレベルの低下に非常に有効であり、副作用は非常に短期間であり、本発明の方法で用いる好ましいコレステロール低下薬である。スタチンには、以下が含まれる：アトルバスタチン（Ｌｉｐｉｔｏｒ）；フルバスタチン（Ｌｅｓｃｏｌ）；ロバスタチン（Ｍｅｖａｃｏｒ）；プラバスタチン（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ）；ロスバスタチンカルシウム（Ｃｒｅｓｔｏｒ）；およびシムバスタチン（Ｚｏｃｏｒ）（「Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｔａｔｉｎ  ｄｒａｇｓ，ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｓｔｒｏｋｅ，ａｎｄ  ｔｏｔａｌ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ．Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌｓ」；Ｈｅｂｅｒｔ  ＰＲ，Ｇａｚｉａｎｏ  ＪＭ，Ｃｈａｎ  ＫＳ，Ｈｅｎｎｅｋｅｎｓ  ＣＨ．ＪＡＭＡ（１９９７）Ｎｏｖ．２６；２７８（２０）：１６６０−１も参照のこと）。
【０１１０】
ＨＭＧ−ＣｏＡ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイムＡ）レダクターゼ（ＨＭＧＲ）は、コレステロール生合成の関連工程を触媒する。スタチンは、血清コレステロールレベルを有効に低下させ、高コレステロール血症の治療で広く処方されている阻害定数がナノモル範囲のＨＭＧＲインヒビターである。スタチン製剤は、肝臓細胞表面上のＬＤＬレセプター発現を増加させる。ＬＤＬレセプター発現の増加の結果として、血漿コレステロールレベルが低下する。したがって、スタチン製剤の投与により、血漿中の競合コレステロールレベルが減少し、肝臓内の結合コレステロール−ｓｉＲＮＡのためのＬＤＬレセプターレベルが増加する。したがって、本発明は、コレステロール標識ｓｉＲＮＡの取り込みを増加させる方法であって、ｓｉＲＮＡをスタチンと組み合わせて投与し、それにより、血清中の競合コレステロールレベルが減少し、肝臓細胞によってコレステロール標識ｓｉＲＮＡがより有効に取り込まれる、方法を提供する。スタチンを、コレステロール−ｓｉＲＮＡの投与前、同時、または投与後に投与し得る。
【０１１１】
本発明またはその任意の実施例の範囲を逸脱することなく、本明細書中に記載の方法および適用の他の適切な修正形態および適合が可能であることが関連分野の当業者に容易に明らかである。
【実施例】
【０１１２】
本実施例は、ｓｉＲＮＡ（改変型ｓｉＲＮＡが含まれる）が哺乳動物細胞中のウイルス複製を有効に阻害し得ることを証明する。さらに、本実施例は、本発明のｓｉＲＮＡがヒト肝臓細胞中のＨＣＶ  ＲＮＡ分解を促進することを示し、改変型ｓｉＲＮＡ誘導サイレンシングの必要な機能成分を保有することを確立する。本実施例はまた、宿主細胞中のＨＣＶ複製を阻害する治療法としてｓｉＲＮＡテクノロジーを使用し得ることを証明する。本発明は、以下の実施例の提示により、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を制限することを意図しない。
【０１１３】
（実施例１）
ＨＣＶゲノムに対するｓｉＲＮＡがこのヒト病原体に対する細胞内免疫を付与するかどうかを試験するために、ヒト肝細胞癌細胞株Ｈｕｈ−７において最近開発されたＨＣＶ細胞培養系を使用した。細胞株の１つ（５−２）は、自律複製サブゲノムＨＣＶ  ＲＮＡを保有する（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，２００１）。サブゲノムレプリコンは、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製の基準としてレポーター機能アッセイが可能なホタルルシフェラーゼ遺伝子を保有する（図５）。ゲノムに移入した細胞培養適応変異（Ｂａｒｔ）のために、これらの５−２細胞は、５×１０４ウイルス粒子／細胞までのレベルでＨＣＶ  ＲＮＡを複製する。
【０１１４】
Ｔ７転写を使用して、ＨＣＶゲノムの異なる５’−ＵＴＲ領域に対するいくつかの２１ｂｐ  ｓｉＲＮＡ二重鎖を作製した（図５）。簡潔に述べれば、センス方向またはアンチセンス方向のいずれかに配向するＨＣＶのＴ７プロモーターおよび５’−ＵＴＲを含む２オリゴ二本鎖ＤＮＡ分子を生成した。次いで、各オリゴＤＮＡを、インビトロで転写して（＋）および（−）ＲＮＡを生成し、ＤＮＡアーゼＩで処理してＤＮＡテンプレートを除去した。２つのＲＮＡ鎖を３７℃で一晩アニーリングしてｄｓＲＮＡを生成した。ＲＮＡアーゼＴ１でｄｓＲＮＡを処理して未反応のｓｓＲＮＡ種を除去した後、トランスフェクションのためにｄｓＲＮＡを精製した。
【０１１５】
ショウジョウバエおよびウミシイタケのルシフェラーゼ遺伝子にそれぞれ指向するいくつかの他のｓｉＲＮＡ二重鎖（ＧＬ２およびＧＬ３が含まれる）を設計した。標準的なトランスフェクション技術を使用して、ｓｉＲＮＡを５−２細胞にトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性を測定してＨＣＶ複製に対するｓｉＲＮＡの効果を決定した。トランスフェクションから４８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞では、ルシフェラーゼ活性が用量応答様式で８５％まで減少した（図６）。無関係のｓｉＲＮＡ（ＳＩＮ）でトランスフェクトした細胞ではルシフェラーゼ活性の阻害は認められなかった。ＳＩＮの配列は、シンドビスウイルス転写プロモーターから選択した（図１）。
【０１１６】
（実施例２）
ｓｉＲＮＡ応答の配列特異性を、さらなるｓｉＲＮＡ二重鎖（ＧＬ２およびＧＬ３）を使用してさらに試験した。図１は、ＧＬ２およびＧＬ３の３−ヌクレオチドが相互に異なることを示す。ルシフェラーゼ活性は、ｓｉＲＮＡ５またはＧＬ２でトランスフェクトした細胞で９０％減少したが、ＧＬ３でトランスフェクトした細胞では有意な減少は認められなかった（図７）。Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から市販されているルシフェラーゼアッセイシステムを製造者の説明書にしたがって使用してルシフェラーゼアッセイを行った。
【０１１７】
（実施例３）
ｓｉＲＮＡ５がトランスフェクトした細胞で有毒であるかどうかも試験した。ＡＴＰアーゼ活性アッセイを使用して毒性を測定した。図８は、図６で認められるＨＣＶ複製のｓｉＲＮＡ５誘導減少が非配列特異的ＲＮＡｉの細胞毒性によらないことを示す。Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＡＴＰアーゼアッセイキットを製造者の説明書にしたがって使用してＡＴＰアーゼレベルをアッセイした。
【０１１８】
（実施例４）
Ｌｉ，Ｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１３１９−１３２１（２００２）で報告されているように、全長ＨＣＶレプリコンは、ｓｉＲＮＡの存在にもかかわらずＲＮＡｉに適応して抑制し、それにより複製する能力を有し得る。選択可能な全長ＨＣＶレプリコンを保有する２１−５細胞株由来のＨｕｈ−７細胞における全長ＨＣＶ  ＲＮＡの複製に対するｓｉＲＮＡ５の効果を決定するために、ｓｉＲＮＡ５で処置した。ＨＣＶ  ＲＮＡのレベルを、ＴａｑＭａｎ（商標）（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｌａ−Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した定量的ＰＣＲによって測定した。図９で認められる結果は、ｓｉＲＮＡ誘導サイレンシングが、ＲＮＡ複製が非常に高い適応ＨＣＶ変異形においてでさえも定常状態のウイルスＲＮＡ生成を減少させることを示す。両サブゲノムおよび全長のＨＣＶレプリコンを用いた結果により、ＨＣＶタンパク質はＲＮＡ干渉を抑制することができないことが示唆される。
【０１１９】
（実施例５）
ｓｉＲＮＡがトランスフェクトした細胞に有毒であるかどうかも試験した。詳細には、ｓｉＲＮＡ５（すなわち、ＧＡＰＤＨ配列に特異的なｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトしたＨｕｈ５−２細胞中のＧＡＰＤＨ（解糖に不可欠な酵素）をコードするｍＲＮＡを測定した。図１０は、ｓｉＲＮＡ５がＧＡＰＤＨのＲＮＡレベルに影響を与えなかったことを証明する。ＴａｑＭａｎ（商標）ＲＮＡキット（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｌａ−Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を製造者の説明書にしたがって使用してＧＡＰＤＨを測定した。
【０１２０】
（実施例６）
感染した肝臓内でＨＣＶが複製する能力の阻害に対するｓｉＲＮＡ５の有効性を試験するために、当業者に周知の方法にしたがって、ＨＣＶ感染ヒト肝臓の一部を、トランスジェニック重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに異種移植する。
【０１２１】
簡潔に述べれば、一旦ＨＣＶ感染肝臓がマウス肝臓に置換されれば、リポソームカプセル化ｓｉＲＮＡ５またはコントロールリポソームを、尾静脈または別のアクセス可能な静脈を介したマウスへの静脈内注射によって投与する。マウスに、１日に１回、３〜１０日間投与する。
【０１２２】
投与計画の終了後、マウスを屠殺し、採血し、肝臓を取り出す。肝臓を分割し、一部を液体窒素を使用して凍結し、一部をパラフィン包埋のために固定し、一部をスライド上で切片にするために固定する。
【０１２３】
適切な分配を用いて、本明細書中で前に使用したＴａｑＭａｎ（商標）ＲＮＡアッセイキットを使用してＨＣＶ  ＲＮＡを定量して肝臓細胞中のＨＣＶ  ＲＮＡレベルを決定する。さらに、血清ＡＬＴレベルと共に、採血サンプル中の抗ＨＣＶ抗体力価を測定し得る。
【０１２４】
（実施例７）
ＨＣＶが健康な肝臓に感染する能力の阻害に対するｓｉＲＮＡ５の有効性を試験するために、当業者に周知の方法にしたがって、正常なヒト肝臓の一部を、トランスジェニック重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに異種移植する。
【０１２５】
簡潔に述べれば、一旦健康な肝臓がマウス肝臓に置換されれば、リポソームカプセル化ｓｉＲＮＡ５またはコントロールリポソームを、尾静脈または別のアクセス可能な静脈を介したマウスへの静脈内注射によって投与する。マウスに、１日に１回、３〜１０日間投与する。投与前措置後、ＨＣＶを静脈内注射または肝臓注射によってマウスに注射する。
【０１２６】
約６、１２、１８、２４時間後、およびマウスへのＨＣＶ感染から約５日後まで定期的に、マウスを屠殺し、採血し、肝臓を取り出す。肝臓を分割し、一部を液体窒素を使用して凍結し、一部をパラフィン包埋のために固定し、一部をスライド上で切片にするために固定する。
【０１２７】
適切な分配を用いて、本明細書中で前に使用したＴａｑＭａｎ（商標）ＲＮＡアッセイキットを使用してＨＣＶ  ＲＮＡを定量して肝臓細胞中のＨＣＶ  ＲＮＡレベルを決定する。さらに、血清ＡＬＴレベルと共に、採血サンプル中の抗ＨＣＶ抗体力価を測定し得る。
【０１２８】
（実施例８）
化学合成によって改変型ｓｉＲＮＡを調製し得る。１つの実施形態では、ｓｉＲＮＡ二重鎖（例えば、ＧＬ２）内の各ＣおよびＵを、２’−Ｆ−Ｕおよび２’Ｆ−Ｃと置換し得る。２’−Ｆ−Ｕおよび２’Ｆ−Ｃを含む３’末端突出部を有するｓｉＲＮＡを生成するために、一般的な支持体を使用し得る。支持体からのオリゴの選択的切断により、実施者は、突出部残基が改変型ヌクレオチドを確実に含ませることができる。あるいは、３’末端突出部を含むヌクレオチドは、未改変ｄＴｄＴであり得る。
【０１２９】
２’−Ｆ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、標準的な１μｍｏｌβ−シアノエチルホスホラミダイトＲＮＡ化学プロコールを使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８９０９または８９０５  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機にて合成し得る。ＲＮＡホスホラミダイト単量体およびＰａｃ−Ａ、２’−Ｆ−Ａｃ−Ｃ、ｉＰｒ−Ｐａｃ−Ｇ、２’−Ｆ−Ｕ、およびＵ−ＲＮＡ  ＣＰＧのカラムを、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）から得ることができる（カタログ番号１０−３０００−０５、１０−３４１５−０２、１０−３０２１−０５、１０−３４３０−０２、および２０−３４３０−４１Ｅをそれぞれ参照のこと）。酸化剤としてＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ硫化試薬（カタログ番号４０−４０３６−１０）を使用して、３’ＣＰＧとその後の塩基との間に１つのホスホロチオエート骨格を得ることができる。カップリングさせるために、１μｍｏｌの標準的なＲＮＡの酸化工程を、１μｍｏｌの標準的なチオエートを使用するプロトコールと置換し得る。コレステリル−ＴＥＧホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１０−１９７５−９０）およびコレステリル−ＴＥＧ  ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号２０−２９７５−４  ＩＥ）を、１つ以上のオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端に組み込むことができる。合成後、２’−Ｆ  ＲＮＡを切断し、１：１水酸化アンモニウム／メチルアミンで脱保護し、標準的なプロトコールを使用して、トリエチルアミントリヒドロフルオリドにてシリル基を除去する。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｆｉｌｅｓ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ／ｔｂ＿ｒｎａｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．ｐｄｆを参照のこと。次いで、オリゴリボヌクレオチドを、滅菌水を使用したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＮＡＰ  ２５，カタログ番号１７−０８２５２−０２）によって脱塩し、標準的なゲル電気泳動プロトコールを使用して精製する。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）などの改変型ｓｉＲＮＡを、業者から得ることができる。
【０１３０】
あるいは、改変型ｓｉＲＮＡを、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入したＤｕｒａｓｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７転写キットを使用した転写によって調製し得る。
【０１３１】
これらの方法によって作製された改変型ｓｉＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ホスホジエステル結合オリゴヌクレオチドを含む。改変型一本鎖ＲＮＡを互いにアニーリングして二本鎖ＲＮＡを形成させることができるので、アンチセンス分子などの改変型一本鎖ＲＮＡの標準的な作製方法は、改変型ｓｉＲＮＡの作製に有用である。このような標準的な方法には、Ｃｈｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１８１６２−１８１７１（１９９１）；Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１１９９４−１２０００（１９９７）；Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，８３１−８４１（１９９３）；Ｍｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１４５１４−１４５２２（１９９３）に記載の方法が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３２】
（実施例９）
ＨＣＶゲノムに対するｓｉＲＮＡがこのヒト病原体に対する細胞内免疫を付与するかどうかを試験するために、最近開発されたヒト肝細胞癌細胞株Ｈｕｈ−７におけるＨＣＶ細胞培養系を使用した。細胞株の１つ（５−２）は、自律複製サブゲノムＨＣＶ  ＲＮＡを保有する（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，２００１）。サブゲノムレプリコンは、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製の基準としてレポーター機能アッセイが可能なホタルルシフェラーゼ遺伝子を保有する。ゲノムに移入した細胞培養適応変異のために、５−２細胞は、５×１０４ウイルス粒子／細胞までのレベルでＨＣＶ  ＲＮＡを複製する。
【０１３３】
Ｔ７転写を使用して、ＨＣＶゲノムの異なる５’−ＵＴＲ領域に対するいくつかの２１ｂｐ  ｓｉＲＮＡ二重鎖を作製した。簡潔に述べれば、センス方向またはアンチセンス方向のいずれかに配向するＨＣＶのＴ７プロモーターおよび５’−ＵＴＲを含む２オリゴ二本鎖ＤＮＡ分子を生成した。次いで、各オリゴＤＮＡを、インビトロで転写して（＋）および（−）ＲＮＡを生成し、ＤＮＡアーゼＩで処理してＤＮＡテンプレートを除去した。２つのＲＮＡ鎖を３７℃で一晩アニーリングしてｄｓＲＮＡを生成した。ＲＮＡアーゼＴ１でｄｓＲＮＡを処理して未反応のｓｓＲＮＡ種を除去した後、トランスフェクションのためにｄｓＲＮＡを精製した。
【０１３４】
２つの例示的な改変型ｓｉＲＮＡを以下に示す：
【０１３５】
【化１】
2012255024.tif 000002
ショウジョウバエルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ  ＧＬ２内の各ＣおよびＵを、２’−Ｆ−Ｕおよび２’Ｆ−Ｃに置換した。標準的なリポソームトランスフェクション技術を使用して、改変型ｓｉＲＮＡを５−２にトランスフェクトした。詳細には、改変型ｓｉＲＮＡを、０．５μｌのオリゴフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む２５０μｌの細胞懸濁液中にて３７℃で４時間、培養培地を含む３７５μｌ血清中で２０時間、リポソーム−ｓｉＲＮＡ複合体を含まない新鮮な培地中にて３７℃で２４時間インキュベートした。トランスフェクションから４８時間後にルシフェラーゼ活性を測定して、ＨＣＶ複製に対する改変型ｓｉＲＮＡの効果を決定した。
【０１３６】
図１１は、漸増濃度のＧＬ２によってルシフェラーゼ活性が減少したことを示す。ルシフェラーゼ活性は、２’−Ｆ−ＧＬ２でトランスフェクトした細胞で９０％減少したが、モックトランスフェクション細胞またはコントロール（２’−Ｆ−ＦＧＰ＝緑色蛍光タンパク質）では有意な減少は認められなかった。Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から市販されているルシフェラーゼアッセイシステムを製造者の説明書にしたがって使用してルシフェラーゼアッセイを行った。
【０１３７】
ｓｉＲＮＡ  Ｃｈｏｌ−ＧＬ２は、５’末端の１つにコレステロール基を含む。５−２細胞を、リポソームの非存在下で、種々の濃度のＣｈｏｌ−ＧＬ２とインキュベートした。インキュベーションから４８時間後に細胞を採取し、ルシフェラーゼ活性のためにアッセイした。図１２は、Ｃｈｏｌ−ＧＬ２が用量依存様式でルシフェラーゼ遺伝子活性を阻害したことを示す。ＩｎｖＡは、逆の配列のｃｈｏｌ−ＧＬ２を示す。
【０１３８】
（実施例１０）
未改変型ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と比較した２’化学改変型ｓｉＲＮＡの安定性を試験するために、以下の実験を行う。４ｎｇのｓｉＲＮＡを、２０μＬの健康なドナー由来の８０％ヒト血清に添加する。この混合物を、３７℃にて１分から１０日間までの種々の期間インキュベートする。結果を、図１３のレーン２〜１０に示す。２’フッ素改変型ｓｉＲＮＡ（２’−ＦｓｉＲＮＡ）のために同一プロセスを行い、結果を、図３のレーン１２〜２０および２２〜２５に示す。インキュベーションプロセスの終了時に、混合物を氷上に置き、その直後に３２Ｐ−ｓｉＲＮＡコントロールと共にＰＡＧＥによって分離する（図１３のレーン１、１１、および２１を参照のこと）。データは、２’改変型ｓｉＲＮＡが未改変型ｓｉＲＮＡと比較して１０日間にわたって安定であることを示す。
【０１３９】
（実施例１１）
長いｄｓＲＮＡからの改変型ｓｉＲＮＡの生成を証明するために、５μｇの１０００ｂｐ長フッ素化ｄｓＲＮＡ（図１４、パネル（Ａ））を、１５単位のヒトダイサーと共に３７度で一晩インキュベートした。得られたダイサーで切断されたｓｉＲＮＡを、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムを使用して精製し、２０％ＰＡＧＥで電気泳動を行った（図１４、パネル（Ｂ））。図４は、組換えヒトダイサーがフッ素化ｄｓＲＮＡを２’Ｆ−ｓｉＲＮＡに有効に変換することを示す。
【０１４０】
（実施例１２）
ＨＣＶゲノムに対するｓｉＲＮＡがこのヒト病原体に対する細胞内免疫を付与するかどうかをさらに試験するために、実施例１に記載のアッセイを使用して、ｓｉＲＮＡＣ１、ｓｉＲＮＡＣ２、ｓｉＲＮＡ５Ｂ１、ｓｉＲＮＡ５Ｂ２、およびｓｉＲＮＡ５Ｂ４を試験し、図２にそれぞれ示す。各ｓｉＲＮＡを、１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭの濃度で試験した。図１５に示すように、各ｓｉＲＮＡは、用量依存性様式でルシフェラーゼ活性を有意に阻害した。ｓｉＲＮＡＣ２は特に有効であった。
【０１４１】
（実施例１３）
実施例９で報告した実験の追跡としてアッセイを行い、コレステロール改変によってｓｉＲＮＡ分子がＨｕｈ−７肝臓細胞に指向したが、フルオロ改変ではそうではなかったことが証明された。Ｈｕｈ−７細胞を、以下の種々の濃度の２種のＣｈｏｌ−ＧＬ２ｓｉＲＮＡとインキュベートした：一方は２’−フルオロ改変を行い、他方はこのような改変を欠いた。図１６に示した結果は、肝臓細胞へのコレステロール改変型ｓｉＲＮＡ分子の送達がコレステロールに起因し、他の改変に起因しないことを証明している。
【０１４２】
（実施例１４）
ｓｉＲＮＡを、全ピリミジンの代わりに２−フルオロピリミジンを含むように改変した（２’−Ｆ−ｓｉＲＮＡ）。この２’−Ｆ−ｓｉＲＮＡを、２−Ｆ−ｓｉＲＮＡ中に存在するリボヌクレオチド「ＵＵ」突出部の代わりに分子の３’末端に２塩基デオキシヌクレオチド「ＴＴ」配列を含むようにさらに改変した（２’−Ｆ−ｓｉＲＮＡ３’−Ｘ）。図１７は、３’’’ｄＴｄＴ’’末端を含めるような２’フッ素化ｓｉＲＮＡのさらなる改変によってヒト血清中のｓｉＲＮＡの安定性が有意に増加したことを証明している。
【図１】
2012255024.tif 000003
【図２】
2012255024.tif 000004
【図３Ａ】
2012255024.tif 000005
【図３Ｂ】
2012255024.tif 000006
【図３Ｃ】
2012255024.tif 000007
【図３Ｄ】
2012255024.tif 000008
【図３Ｅ】
2012255024.tif 000009
【図３Ｆ】
2012255024.tif 000010
【図３Ｇ】
2012255024.tif 000011
【図３Ｈ】
2012255024.tif 000012
【図３Ｉ】
2012255024.tif 000013
【図４】
2012255024.tif 000014
【図５】
2012255024.tif 000015
【図６】
2012255024.tif 000016
【図７】
2012255024.tif 000017
【図８】
2012255024.tif 000018
【図９】
2012255024.tif 000019
【図１０】
2012255024.tif 000020
【図１１】
2012255024.tif 000021
【図１２】
2012255024.tif 000022
【図１３】
2012255024.tif 000023
【図１４】
2012255024.tif 000024
【図１５】
2012255024.tif 000025
【図１６】
2012255024.tif 000026
【図１７】
2012255024.tif 000027
【図１８】
2012255024.tif 000028
【図１９】
2012255024.tif 000029
【図２０】
2012255024.tif 000030
【図２１】
2012255024.tif 000031
【配列表】
2012255024000001.app
【外国語明細書】
2012255024000001.pdf