(57)【要約】【課題】  工業生産に適した簡便且つ安価な方法により、微生物が産生したポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を含有微生物細胞から少ない工程数で大幅な分子量低下を起こすことなく高純度のＰＨＡを得ることのできるＰＨＡの回収方法を提供すること。【解決手段】  微生物により産生したポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を微生物細胞内より回収する工程において、工程（ａ）：ポリヒドロキシアルカノエート含有微生物細胞の水性懸濁液に、アルカリ及び／又は界面活性化剤を添加して酵素処理を行う工程、工程（ｂ）：酵素処理液にアルカリ及び界面活性化剤を添加して物理的破砕処理を行ない、該細胞を破砕すると共に、該細胞中のＰＨＡ以外の細胞物質を可溶化あるいは乳化させ、次いでＰＨＡを懸濁液から分離する工程、を含むＰＨＡの回収方法に従って、微生物により産生したＰＨＡを微生物細胞内より回収すること。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物により産生したポリヒドロキシアルカノエートを微生物細胞内より回収する工程において、
工程（ａ）：ポリヒドロキシアルカノエート含有微生物細胞の水性懸濁液に、アルカリ及び／又は界面活性化剤を添加して酵素処理を行う工程、
工程（ｂ）：酵素処理液にアルカリ及び界面活性化剤を添加して物理的破砕処理を行ない、該細胞を破砕すると共に、該細胞中のポリヒドロキシアルカノエート以外の細胞物質を可溶化あるいは乳化させ、次いでポリヒドロキシアルカノエートを懸濁液から分離する工程、
を含むポリヒドロキシアルカノエートの回収方法。
【請求項２】
工程（ａ）における酵素が、蛋白質分解酵素及び／又は細胞壁分解酵素である請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエートの回収方法。
【請求項３】
工程（ｂ）において、物理的破砕処理を高圧ホモジナイザーで行うことを特徴とする請求項１又は２に記載のポリヒドロキシアルカノエートの回収方法。
【請求項４】
工程（ａ）、（ｂ）において使用するアルカリが、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウムおよび水酸化リチウムからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１〜３の何れかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの回収方法。
【請求項５】
工程（ｂ）において、ポリヒドロキシアルカノエートを懸濁液から分離する時のｐＨが８．０〜１３．０の間に調整することを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの回収方法。
【請求項６】
工程（ａ）、（ｂ）において使用する界面活性化剤が、陰イオン界面活性化剤、陽イオン界面活性化剤、両性界面活性化剤、非イオン界面活性化剤からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１〜５の何れかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの回収方法。
【請求項７】
ポリヒドロキシアルカノエートが、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシプロピオネート、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシペンテノエート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシヘプタノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシノナエートおよび３−ヒドロキシドカネートからなる群から選択されるモノマーのうち少なくとも２種類が共重合した共重合体であることを特徴とする請求項１〜６の何れかに記載のポリヒドロキシアルカノエートの回収方法。
【請求項８】
工程（ａ）、（ｂ）を含むポリヒドロキシアルカノエートの回収方法で得られ、１６０℃でプレスして得られるシートの黄色度指数（ＹＩ値）が、シート厚み０．５ｍｍにおいて１５．０以下であるポリヒドロキシアルカノエート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物によって生産されるポリヒドロキシアルカノエートの回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカノエート（以後、ＰＨＡと略す）は、多くの微生物種の細胞内にエネルギー蓄積物質として生成、蓄積される熱可塑性ポリエステルである。微生物によって天然の有機酸や油脂を炭素源に生産されるＰＨＡは、土中や水中の微生物により完全に生分解され、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることになるため、生態系への悪影響がほとんどない環境調和型のプラスチック材料と言える。近年、合成プラスチックが環境汚染、廃棄物処理、石油資源の観点から深刻な社会問題となるに至り、ＰＨＡが環境に優しいグリーンプラスチックとして注目され、その実用化が切望されている。また、医療分野においても、回収不要のインプラント材料、薬物担体などの生体適合性プラスチックとして利用が可能と考えられており、実用化が期待されている。
【０００３】
微生物が生産するＰＨＡは、通常顆粒体として微生物細胞内に蓄積されるため、ＰＨＡをプラスチックとして利用するためには、微生物細胞内からＰＨＡを分離して取り出すという工程が必要である。ＰＨＡを微生物細胞から分離精製する既知の方法として、大別すると、ＰＨＡが可溶である有機溶媒を用いて微生物細胞からＰＨＡを抽出する方法と、ＰＨＡ以外の細胞構成成分を破砕もしくは可溶化させて除くことによりＰＨＡを得る方法に分けられる。
【０００４】
初期の研究では有機溶媒による抽出を利用したＰＨＡの分離精製方法が多く報告されている（特許文献１〜５参照）。これらの報告ではＰＨＡの溶解度が最も高い有機溶媒としてクロロホルムなどのハロゲン化合物が用いられているが、ＰＨＡを該溶剤に溶解すると溶液の粘性が非常に高くなり取り扱いが困難であった。そのためＰＨＡの抽出にはポリマー濃度を２〜３％程度と極めて薄い条件で処理する必要があり、従って非常に大量の溶媒を必要とした。加えて、溶媒層からＰＨＡを高い回収率で晶析させるためには、上記溶媒の４〜５倍容という大量のメタノールやヘキサン等のＰＨＡ貧溶媒が別途必要である。そのため、工業的に生産するには大規模な設備が必要となる。さらには、溶媒の使用量が膨大なため溶媒の回収コストと損失溶媒のコストがかさみ、ＰＨＡを安価に製造できないなどの理由から、この方法は実用化されていない。
【０００５】
微生物細胞（以下、菌体ということもある）を化学的処理する方法としては、非特許文献１に菌体懸濁液を次亜塩素酸ナトリウムで処理してＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化し、ＰＨＡを得る方法が記載されている。この方法では、ＰＨＡ以外の菌体構成成分の可溶化がなされるけれど、それと同時にＰＨＡの著しい分解が引き起こされるため、製品への加工が制限されてしまう。さらに、ＰＨＡ内に無視できない塩素が残るため、ポリマー製品として好ましくないことからも実用には適さないと考えられる。特許文献６には、熱処理と酵素、界面活性化剤を併用した回収法が示されている。この方法では、酵素処理により菌体を溶解した場合、遊離する核酸により懸濁液が非常に粘稠になるため、予め懸濁液を１００℃以上で加熱し核酸を分解する必要がある。ところが、１００℃以上での加熱によりＰＨＡは著しく低分子化してしまい、製品への応用ができなくなる。また、この方法は非常に複雑で多くの工程を必要とするにもかかわらず、得られるＰＨＡの純度は概ね８８％、最大でも９７％程度である。また、ＰＨＡ含有微生物菌体を界面活性化剤で処理したのち、菌体から放出された核酸を過酸化水素で８０℃、３時間処理して分解し、９９％純度のＰＨＡを分離する方法（特許文献７参照）や、ＰＨＡ含有微生物懸濁液をｐＨ２未満の強酸性下５０℃以上に熱した後ＰＨＡを分離する方法が提案されている（特許文献８参照）。これらの熱処理条件ではＰＨＡの分子量は著しく低下するため、たとえ純度が向上したとしても製品への応用ができなくなる。
【０００６】
一方、物理的破砕を用いる方法として、高圧破砕あるいは高圧破砕とアルカリ添加を組み合わせた方法が報告されている（非特許文献２〜３、特許文献９〜１２参照）。非特許文献２には、ポリマーの純度や回収率の記載はないが、ポリ−３−ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）含有菌体懸濁液にアルカリを添加した後、ｐＨを中性に戻し高圧破砕を行うため、菌体構成成分がＰＨＢ画分に残存しており純度が高くないことが予想される。特許文献９ではアルカリを添加後８０℃に加熱し１時間攪拌後ポリマーを遠心で回収する方法、特許文献１０では７０℃で高圧破砕を行う方法、特許文献１１では、非特許文献２を発展させた形と考えられる方法、すなわちアルカリを添加後に７０℃以上で高圧破砕を行う方法が開示されている。これらの方法では、高温で処理を行うため条件によってはＰＨＡの分子量が著しく低下する傾向が見られ、さらに純度も６６〜８５％程度と低い。特許文献１２及び非特許文献３では、高圧破砕後、酵素と界面活性剤を組み合わせた方法が開示されているが、純度が低かったり、極少量の検討であり、実際の工業化プロセスには応用できない。
【０００７】
上記のようにこれまでの方法では、培養後の菌体からＰＨＡを、低分子化することなく、且つ高純度で収率良く、工業的に安価に回収することは極めて困難で、特にＰＨＡが２種以上のモノマー成分からなる共重合体の場合に、単重合体であるＰＨＢと比べて分子量がより著しく低下する傾向が見られ、安価で効率の良いＰＨＡ回収方法はなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開昭５５−１１８３９４号公報
【特許文献２】特開昭５７−６５１９３号公報
【特許文献３】特開昭６３−１９８９９１号公報
【特許文献４】特開平０２−６９１８７号公報
【特許文献５】特開平０７−７９７８８号公報
【特許文献６】特公平０４−６１６３８号公報
【特許文献７】特表平０８−５０２４１５号公報
【特許文献８】特開平１１−２６６８９１号公報
【特許文献９】特開平０７−３１４８７号公報
【特許文献１０】特開平０７−３１４８８号公報
【特許文献１１】特開平０７−３１４８９号公報
【特許文献１２】特開２００８−１９３９４０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J. Gen. Microbiology, 1958年, 第19巻, p.198-209
【非特許文献２】Bioseparation, 1991年, 第2巻, p.95-105
【非特許文献３】World J Microbiol Biotechnol, 2008年, 第24巻, p.771-775
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、従来技術における上記の課題を解決し、工業生産に適した簡便且つ安価な方法により、微生物が産生したＰＨＡ含有微生物細胞から少ない工程数で大幅な分子量低下を起こすことなく高純度のＰＨＡを得ることのできるＰＨＡの回収方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、微生物が産生したＰＨＡを含有する微生物細胞の水性懸濁液に酵素処理を行った後、アルカリ及び界面活性化剤を添加し、比較的低温で物理的破砕処理を行うことで、破砕効果が飛躍的に向上し、回収されたＰＨＡは分子量低下が抑えられており、該ＰＨＡを用いた溶融プレスシートの黄色度指数（ＹＩ値）が１５．０以下であり、該ＰＨＡは高純度であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明の第一は、微生物により産生したポリヒドロキシアルカノエートを微生物細胞内より回収する工程において、工程（ａ）：ポリヒドロキシアルカノエート含有微生物細胞の水性懸濁液に、アルカリ及び／又は界面活性化剤を添加して酵素処理を行う工程、工程（ｂ）：酵素処理液にアルカリ及び界面活性化剤を添加して物理的破砕処理を行ない、該細胞を破砕すると共に、該細胞中のポリヒドロキシアルカノエート以外の細胞物質を可溶化あるいは乳化させ、次いでポリヒドロキシアルカノエートを懸濁液から分離する工程、を含むポリヒドロキシアルカノエートの回収方法に関する。好ましい実施態様は、工程（ａ）における酵素が、蛋白質分解酵素及び／又は細胞壁分解酵素である上記記載のポリヒドロキシアルカノエートの回収方法に関する。より好ましくは、工程（ｂ）において、物理的破砕処理を高圧ホモジナイザーで行うことを特徴とする上記記載のポリヒドロキシアルカノエートの回収方法、更に好ましくは、工程（ａ）、（ｂ）において使用するアルカリが、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウムおよび水酸化リチウムからなる群より選択される少なくとも１種である上記記載のポリヒドロキシアルカノエートの回収方法、特に好ましくは、工程（ｂ）において、ポリヒドロキシアルカノエートを懸濁液から分離する時のｐＨが８．０〜１３．０の間に調整することを特徴とする上記記載のポリヒドロキシアルカノエートの回収方法、極めて好ましくは、工程（ａ）、（ｂ）において使用する界面活性化剤が、陰イオン界面活性化剤、陽イオン界面活性化剤、両性界面活性化剤、非イオン界面活性化剤からなる群より選択される少なくとも１種である上記記載のポリヒドロキシアルカノエートの回収方法、最も好ましくは、ポリヒドロキシアルカノエートが、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシプロピオネート、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシペンテノエート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシヘプタノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシノナエートおよび３−ヒドロキシドカネートからなる群から選択されるモノマーのうち少なくとも２種類が共重合した共重合体であることを特徴とする上記記載のポリヒドロキシアルカノエートの回収方法、に関する。本発明の第二は、工程（ａ）、（ｂ）を含むポリヒドロキシアルカノエートの回収方法で得られ、１６０℃でプレスして得られるシートのＹＩ値が、シート厚み０．５ｍｍにおいて１５．０以下であるポリヒドロキシアルカノエートに関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に従えば、工業生産に適した簡便且つ安価な方法により、微生物が産生したＰＨＡ含有微生物細胞から、少ない工程数で大幅な分子量低下を起こすことなく高純度のＰＨＡを得ることのできるＰＨＡの回収方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明につき、さらに詳細に説明する。本発明のポリヒドロキシアルカノエートの回収方法は、微生物により産生したポリヒドロキシアルカノエートを微生物細胞内より回収する工程よりなり、工程（ａ）：ポリヒドロキシアルカノエート含有微生物細胞の水性懸濁液に、アルカリ及び／又は界面活性化剤を添加して酵素処理を行う工程、工程（ｂ）：酵素処理液にアルカリ及び界面活性化剤を添加して物理的破砕処理を行ない、該細胞を破砕すると共に、該細胞中のポリヒドロキシアルカノエート以外の細胞物質を可溶化あるいは乳化させ、次いでポリヒドロキシアルカノエートを懸濁液から分離する工程、を含むことを特徴とする。
【００１５】
本発明におけるＰＨＡとは、ヒドロキシアルカノエートの重合体の総称である。ヒドロキシアルカノエートとしては特に限定されないが、例えば、３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）、３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）、３−ヒドロキシプロピオネート、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシペンテノエート、３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）、３−ヒドロキシヘプタノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシノナエート、３−ヒドロキシドカネートなどが挙げられる。
【００１６】
本発明におけるＰＨＡは、これらヒドロキシアルカノエートの単重合体であっても、２種以上が共重合した共重合体であってもよい。例えば、３ＨＢの単重合体であるＰＨＢや、３ＨＢと３ＨＶの２成分共重合体であるＰＨＢＶ、３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体ＰＨＢＨ（特許第２７７７７５７号公報参照）または、３ＨＢと３ＨＶと３ＨＨとの３成分共重合体ＰＨＢＨＶ（特許第２７７７５７号公報参照）などが例示できる。特に、加熱などによる加水分解などで分子量が低下しやすい傾向にある共重合体の場合、後述するように分子量がほとんど低下しないという点で本発明は適している。
【００１７】
特に、生分解性ポリマーとしての分解性と、柔らかい性質を持つ点で、モノマーユニットとして３ＨＨを有する共重合体が好ましく、より好ましくは、ＰＨＢＨである。このときＰＨＢＨを構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、良好な加工性を示す点から３ＨＨユニットが１〜９９ｍｏｌ％のものが好ましく、より好ましくは３〜３０ｍｏｌ％である。また、ＰＨＢＨＶの場合、構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、例えば、３ＨＢユニットの含量は１〜９５ｍｏｌ％、３ＨＶユニットの含量は１〜９６ｍｏｌ％、３ＨＨユニットの含量は１〜３０ｍｏｌ％といった範囲のものが好適である。
【００１８】
ＰＨＡを実用化するためには、加工品が使用に耐え得る物性を示す必要があり、ゲルクロマトグラフィー法でポリスチレンを分子量標準としたＰＨＡの重量平均分子量が１万以上でなければならない。好ましくは５万以上、より好ましくは１０万以上、さらに好ましくは２０万以上、特に好ましくは２０万〜２００万、極めて好ましくは２０万〜１５０万、最も好ましくは２０万〜１００万である。分子量が２００万を超えると、溶融して加工する際に流動性が低下し、ハンドリングが悪い場合がある。
【００１９】
本発明に用いる微生物は、細胞内にＰＨＡを生成する微生物である限りにおいて、特に限定されない。天然から単離された微生物や菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている微生物、または、それらから調製し得る変異体や形質転換体等を使用できる。例えばカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、シュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属の菌等が挙げられる。特に、アルカリゲネス・リポリティカ（Ａ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、アルカリゲネス・ラトゥス（Ａ．ｌａｔｕｓ）、アエロモナス・キャビエ（Ａ．ｃａｖｉａｅ）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、カプリアビダス・ネケータ（Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ）等の菌株が好ましい。また、微生物が、本来ＰＨＡの生産能力を有しない場合、もしくは生産量が低い場合には、該微生物に目的とするＰＨＡの合成酵素遺伝子および/またはその変異体を導入し、得られる形質転換体を用いることもできる。このような形質転換体の作製に用いるＰＨＡの合成酵素遺伝子としては特に限定はないが、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素の遺伝子が好ましい。これら微生物を適切な条件で培養することで、菌体内にＰＨＡを蓄積させた微生物菌体を得ることができる。その培養方法については特に限定はないが、例えば特開平０５−９３０４９号公報等に挙げられる方法が用いられる。
【００２０】
微生物細胞からＰＨＡを回収する上において、培養後の微生物細胞中のＰＨＡ含有率は、高い方が好ましいのは当然であり、工業レベルでの適用においては乾燥細胞中に５０重量％以上のＰＨＡが含有されているのが好ましく、以後の分離操作、分離ポリマーの純度等を考慮するとＰＨＡ含有率は６０重量％以上が好ましく、さらに好ましくは７０重量％以上である。
【００２１】
本発明において、微生物により産生したＰＨＡは、以下のような工程（ａ）及び工程（ｂ）を含む工程により回収される。
【００２２】
＜工程（ａ）＞
本発明における工程（ａ）は、ＰＨＡ含有微生物細胞の水性懸濁液にアルカリ及び／又は界面活性化剤を添加して酵素処理を行う工程である。
【００２３】
培養完了後は、ＰＨＡ含有微生物細胞を含む培養ブロスをそのまま用いるか、或いは遠心分離や膜分離など当業者に周知の方法により菌体を回収した後、又は、加熱などにより菌体を死滅した後に菌体を回収し、その後、水を添加するなどしてＰＨＡ含有微生物細胞の水性懸濁液とする。ここで、加熱する場合の温度は５０℃〜８０℃が好ましい。
【００２４】
本発明における工程（ａ）では、物理的破砕処理を行う前にＰＨＡ含有微生物細胞の水性懸濁液にアルカリ及び／又は界面活性化剤を添加して、撹拌しながら酵素処理を行うことが重要である。物理的破砕処理を行う前にＰＨＡ含有微生物細胞を酵素処理することで、細胞壁を分解してより高い破砕効果を得ることができる。
【００２５】
前記酵素としては、工業的な製品に用いられ得るものであれば特に限定はないが、細胞壁を分解してより高い破砕効果を得る目的においては、蛋白質分解酵素（プロテアーゼ）、細胞壁分解酵素が好ましく、供給安定性やコストの面から工業的には蛋白質分解酵素がより好ましい。
【００２６】
蛋白質分解酵素としては、アルカラーゼ、ペプシン、トリプシン、パパイン、キモトリプシン、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼなどが例示できる。細胞壁分解酵素としては、リゾチーム、アミラーゼ、セルラーゼ、マルターゼ、サッカラーゼ、α及びβ−グリコシナーゼなどが例示できる。さらには、例えば酵素と酵素の安定化剤や界面活性化剤、あるいは再汚染防止剤などを含有する酵素組成物であってもよく、酵素のみには限定されない。また、一般に市販されている洗濯用酵素洗剤なども含まれる。上記細胞壁分解酵素の内、溶菌効果の点からリゾチームの使用が好ましい。
【００２７】
具体的な蛋白質分解酵素としては、例えば「プロテアーゼＡ」、「プロテアーゼＰ」、「プロテアーゼＮ」（以上、天野エンザイム社製）、「アルカラーゼ」、「エスペラーゼ」、「ザビナーゼ」、「エバラーゼ」（以上、ノボザイムズ社製）等が工業的に使用可能であり、分解活性の点からも好適に使用できる。また、具体的な細胞壁分解酵素としては、例えば「リゾチーム」（山東省華源経貿製）、「ビオザイムＡ」、「セルラーゼＡ「アマノ」３」、「セルラーゼＴ「アマノ」４」、「α−グルコシダーゼ「アマノ」」（以上、天野エンザイム社製）、「ターマミル」、「セルソフト」（以上、ノボザイムズ社製）等が工業的に使用可能である。これら酵素による処理は、より高い精製効果が得られる点で界面活性化剤の存在下に行うことが望ましい。
【００２８】
酵素処理条件については、使用する酵素の至適値のコントロール下で行うのが好ましく、例えば、アルカラーゼ（ノボザイムズ社製）を使う場合は温度：５０〜６０℃、ｐＨ：８〜９が好ましく、エスペラーゼ（ノボザイムズ社製）を使う場合は温度：５５〜６５℃、ｐＨ：８〜１０が好ましく、リゾチームを使う場合は温度：４０〜５０℃、ｐＨ：６〜７が好ましい。酵素処理時間は所要の処理度を達成するまで維持することによって行なうのが好ましく、この時間は通常０．５〜８時間である。酵素の必要量は、酵素の種類及び活性に依存する。特に制限はされないが、ポリマー重量１００重量部に対して、０．００１〜１０重量部が好ましく、コストの点から０．００１〜５重量部がより好ましい。
【００２９】
工程（ａ）で使用するアルカリは、ＰＨＡ含有微生物の細胞壁を破壊して細胞中のＰＨＡを細胞外に流出できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等を含めたアルカリ金属の水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属の炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等のアルカリ金属の炭酸水素塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の有機酸のアルカリ金属塩、ホウ砂等のアルカリ金属のホウ酸塩、リン酸３ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸３カリウム、リン酸水素２カリウム等のアルカリ金属のリン酸塩、水酸化バリウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物あるいはアンモニア水等が挙げられる。この中でも、工業生産に適し、また価格の点で、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムが好ましい。
【００３０】
本発明の工程（ａ）において、酵素処理時のアルカリ添加温度は、使用する酵素の至適温度付近で行うのが望ましく、２０〜６０℃に調整することが好ましい。６０℃より高い温度でアルカリを添加すると、分子量の著しい低下を招く場合がある。２０℃より低い温度でアルカリを添加すると、水性懸濁液の粘性が向上し撹拌が困難になる場合がある。
【００３１】
本発明で使用する界面活性化剤としては、陰イオン界面活性化剤、陽イオン界面活性化剤、両性界面活性化剤、非イオン界面活性化剤が挙げられる。洗浄性の観点からは、陰イオン界面活性化剤及び／又は非イオン界面活性化剤が好ましい。蛋白質などを洗浄・除去する目的においては、陰イオン界面活性化剤を用いることが好ましく、また、脂肪酸や油脂の洗浄・除去を目的とする場合、非イオン界面活性化剤を用いることが好ましい。また陰イオン界面活性化剤及び非イオン界面活性化剤の両方を含有してもかまわない。両方を含有する場合、陰イオン界面活性化剤／非イオン界面活性化剤の重量比は１／１００〜１００／１０が好ましく、５／１００〜１００／２０がより好ましく、５／１００〜１００／１００がさらに好ましく、５／１００〜５０／１００が特に好ましい。
【００３２】
前記陰イオン界面活性化剤としては、例えば、アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル又はアルケニル硫酸エステル塩、アルキル又はアルケニルエーテル硫酸エステル塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩又はこのエステル、アルキル又はアルケニルエーテルカルボン酸塩、アミノ酸型界面活性化剤、Ｎ−アシルアミノ酸型界面活性化剤等が挙げられる。中でもアルキル基の炭素数が１２〜１４のアルキル硫酸塩、アルキル基の炭素数が１２〜１６の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル基の炭素数が１０〜１８のアルキル硫酸エステル塩又はアルキルエーテル硫酸エステル塩が好ましく、対イオンとしてはナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、マグネシウム等のアルカリ土類金属、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等のアルカノールアミンが好ましい。
【００３３】
前記非イオン界面活性化剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテル等が挙げられる。親水性の高いもの及び水と混和した際に生じる液晶の形成能の低い若しくは液晶を生じないものが好ましく、また、生分解性が比較的良好である点から、ポリオキシエチレンアルキルエーテルやポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
【００３４】
前記陽イオン界面活性化剤としては、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩等が挙げられる。
【００３５】
前記両性界面活性化剤としては、カルボベタイン型、スルホベタイン型等が挙げられる。
【００３６】
上述した界面活性化剤のうち、陰イオン界面活性化剤であるドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム及びオレイン酸ナトリウム、非イオン界面活性化剤であるポリオキシエチレンアルキルエーテルやポリオキシアルキレンアルキルエーテルなどが価格、使用量や添加効果の点で好ましく、またこれらを２種以上併用して用いてもよい。
【００３７】
前記で例示した全ての界面活性化剤は一般に市販されている洗濯用洗剤に含有されているものであることから、適当な洗濯用洗剤を使用することによっても本発明の課題を達成することができる。界面活性化剤の添加量は、特に制限されないが、ポリマー重量１００重量部に対して、０．００１〜１０重量部が好ましく、さらにはコストの点から、５重量部以下が好ましい。
【００３８】
＜工程（ｂ）＞
本発明における工程（ｂ）は、酵素処理したＰＨＡ含有微生物細胞にアルカリ及び界面活性化剤を添加して物理的破砕処理を行い、該細胞を破砕すると共に、該細胞中のＰＨＡ以外の細胞物質を可溶化或いは乳化させ、次いでＰＨＡを水洗浄して分離する工程である。
【００３９】
工程（ｂ）では、工程（ａ）で使用されるアルカリと同じ物が使用でき、中でも低価格で工業生産に適した、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどの使用が好ましい。これらのアルカリを用い、工程（ａ）で得られた酵素処理液をｐＨ８．０〜１３．０に調整することが好ましい。ｐＨ８．０より低いと菌体由来の不溶物を効果的に可溶化できない場合があり、ｐＨ１３．０以上ではＰＨＡの分子量の低下傾向が激しい場合がある。より効果的に不溶物を可溶化でき、かつＰＨＡ自体には悪影響をあまり与えないという観点から、ｐＨ８．５〜１２．５の範囲がより好ましい。
【００４０】
アルカリ添加時の温度は２０〜４０℃に調整することが好ましい。４０℃より高い温度でアルカリを添加すると、分子量の著しい低下を招く場合があり、２０℃より低い温度では菌体由来の不溶物を可溶化出来ない場合がある。
【００４１】
工程（ｂ）で使用する界面活性化剤は、工程（ａ）で使用されるものと同じ物が使用できるが、洗浄性の観点から、陰イオン界面活性化剤及び／又は非イオン界面活性化剤が好ましい。好ましい添加量は工程（ａ）で記載した範囲と同じである。また、工程（ａ）で既に界面活性化剤を添加している場合は、工程（ｂ）で新たに添加する必要はないが、添加してもかまわない。
【００４２】
物理的破砕処理を行う装置としては、特に限定されないが、例えば、高圧ホモジナイザー、超音波破砕機、乳化分散機、ビーズミル等が挙げられる。中でも破砕効率の点から高圧ホモジナイザーの使用が好ましく、ポリマーの水性懸濁液が微小開口部を有する耐圧性容器に導入され高圧をかけられることにより開口部から押し出されるタイプがより好ましい。このタイプの破砕機としては、例えば、ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデル「ＰＡ２Ｋ型」があげられる。高圧ホモジナイザーを用いると微生物細胞に大きな剪断力が働くため、微生物細胞は効率的に破壊されポリマーの分離性が向上する。このような機器は開口部で高圧がかかり、瞬間的に高温になるため、必要に応じて、一般の低温恒温循環槽により微生物細胞含有懸濁液を冷却し、温度の上昇を防ぎ、２０〜４０℃での破砕処理を行うことが好ましい。２０〜４０℃で処理を行うことにより、ＰＨＡの分子量をほとんど低下させずに処理することができる。
【００４３】
高圧破砕を行う際の破砕圧力は３０〜６０ＭＰａが好ましい。３０ＭＰａより低いと破砕効率が低下し、破砕操作を何回も繰り返しても微生物細胞を破壊できない場合がある。６０ＭＰａより高いと破砕効率は上がるが、高圧ホモジナイザーが超高圧仕様となり、装置価格が高価となることから製造コストが上がる。
【００４４】
破砕液からＰＨＡを分離、回収する方法としては、遠心分離や膜分離など、従来公知の方法が使用できるが、工業的に大量処理が可能で連続使用できる遠心分離が好ましい。遠心分離機のなかでは、孔なし回転容器をもつ遠心沈降機が好ましく、種類としては分離板型、円筒型、デカンター型などがある。ＰＨＡ粒子は水との比重差が小さいので、分離沈降面積が大きく、高い加速度が得られる分離板型（間欠排出型、ノズル排出型）が好ましく、破砕処理液に含まれるＰＨＡ濃度が高い場合は特にノズル排出型が好ましい。また、デカンター型は一般的に加速度が低く、固液の比重差が小さい場合は不向きであるが、ＰＨＡの粒子径を変化させる等することでデカンター型も使用可能である。また、デカンター型には分離板を有し、分離沈降面積を大きくした機種もあり、このような機種であれば特に粒子径を変化させなくても使用可能な場合がある。
【００４５】
上述の様な分離方法により、破砕処理液からＰＨＡを回収した後、水でＰＨＡを懸濁して水洗し、ＰＨＡ以外の細胞物質を排除する。この水洗時のｐＨは８．０〜１２．５が好ましい。ｐＨが８．０より低いと細胞物質の可溶化が進まない場合があり、ｐＨ１２．５より高いと分子量低下が大きくなる場合がある。また、この時の水洗に用いる水の温度は２５〜４０℃が好ましい。２５℃未満では細胞物質の可溶化が進まず、４０℃を超えると分子量低下が大きくなる。
【００４６】
これらの処理を行って回収されたＰＨＡを乾燥したＰＨＡを溶融プレスしてシートにすると、そのＹＩ値は１５．０以下となり、着色の少ない高い品質のＰＨＡであることがわかる。ＰＨＡに要求されるＹＩ値は使用用途によって異なるが、ＹＩ値は１５以下が好ましく、より好ましくは１０以下、さらに好ましくは５以下である。１５を超えると、透明シートやボトルに加工したときに着色が強く、そのままでの使用は用途が限られる。
【実施例】
【００４７】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、実施例において「部」や「％」は重量基準である。
【００４８】
＜ＰＨＡの平均分子量の測定方法＞
実施例で得られた乾燥ＰＨＡ１０ｍｇを、クロロホルム５ｍｌに溶解した後、不溶物を濾過により除いた。この溶液を「Ｓｈｏｄｅｘ  Ｋ８０５Ｌ（３００ｘ８ｍｍ、２本連結）」（昭和電工社製）を装着した島津製作所製ＧＰＣシステムを用い、クロロホルムを移動相として測定した。分子量標準サンプルには市販の標準ポリスチレンを用いた。
【００４９】
＜蛋白質含量の測定方法＞
ＰＨＡに残存する蛋白質含量を、残存窒素量で評価した。実施例で得られる破砕液サンプルは十分量の水で洗浄した後、遠心分離でＰＨＢＨを回収し、得られたＰＨＢＨを減圧乾燥して蛋白質含量測定に用いた。
残存窒素量は呈色法により算出し、呈色法は、まず各サンプルに対して５ＭのＮａＯＨを添加し、９５℃で加水分解反応を実施した。この加水分解液を等量の６０％酢酸水溶液で中和し、酢酸緩衝液とニンヒドリン溶液を添加し１００℃で呈色反応を行った。この呈色反応液の吸光度を日立製作所社製レシオビーム分光光度計「Ｕ−１８００形」により測定した。この吸光度と、ロイシン試料を用いて作成した検量線とを比較することで、窒素量を算出した。
【００５０】
＜ＹＩ値の測定＞
プレスシートのＹＩ値は、乾燥させたＰＨＡ３．０ｇを、１５ｃｍ四方の金属板で挟み、さらに金属板の四隅に厚さ０．５ｍｍの金属板を挿入して、これを実験用小型プレス機（高林理化株式会社製Ｈ−１５型）にセットして、１６０℃にて７分間加温後、約５Ｍｐｓにて２分間加熱しながらプレスし、プレス後は室温に放置してＰＨＡを硬化させた後、色差計「ＳＥ−２０００」（日本電色社製）にて、３０ｍｍ測定板を使ってプレスシートを載せ、その上に白色標準板を被せてＹＩを測定した。
【００５１】
（実施例１）
国際公開第０８／０１０２９６号の［００４９］に記載のラルストニア・ユートロファＫＮＫ−００５株を、同［００５０］〜［００５３］に記載の方法で培養し、３−ヒドロキシブチレートと３−ヒドロキシヘキサノエートの共重合体からなるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＢＨ）を含有する菌体培養液を得た。培養終了時点でのＰＨＢＨの重量平均分子量は１８４万であった。なお、ラルストニア・ユートロファは、現在では、カプリアビダス・ネケータに分類されている。
【００５２】
得られた菌体培養液１０００ｇを７０〜７５℃で１時間滅菌し、５０℃に冷却後、ドデシル硫酸ナトリウムを４．０ｇ添加し、ｐＨ８．５になるように水酸化ナトリウムを添加した後、アルカラーゼ２．５Ｌ（ノボザイムズ社）を菌体培養液に含まれるＰＨＢＨ量の１．０重量％量を添加して、ｐＨ８．５にコントロールしながら４時間撹拌した。その後、２５℃に冷却してｐＨ１２．０になるように水酸化ナトリウムを添加した後、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデル「ＰＡ２Ｋ型」）で４５〜５５ＭＰａの圧力にて、温度を２５〜３５℃にコントロールしながら高圧破砕を３回行った。この破砕液を温度３０℃、ｐＨ１２．０に調整して約１０分撹拌した後、遠心分離によりＰＨＢＨを回収し、水を加えてＰＨＢＨを懸濁した。この破砕液のｐＨ調整からＰＨＢＨを懸濁するまでの操作を３回繰り返した。この後、懸濁液のｐＨを４．５〜５．０に調整して約1時間撹拌した。この調整液より遠心分離によりＰＨＢＨを回収した。得られたＰＨＢＨを４０℃で１２時間減圧乾燥させ、精製ＰＨＢＨを得た。
【００５３】
（実施例２）
実施例１で得られた菌体培養液１０００ｍｌを７０〜７５℃で１時間滅菌し、５０℃に冷却後、ｐＨ８．５になるように水酸化ナトリウムを添加した後、アルカラーゼ２．５Ｌ（ノボザイムズ社）を菌体培養液に含まれるＰＨＢＨ量の１．０重量％量を添加して、ｐＨ８．５にコントロールしながら４時間撹拌した。その後、２５℃に冷却してドデシル硫酸ナトリウムを２０．０ｇ添加した。ｐＨ１０．０になるように水酸化ナトリウムを添加して、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデル「ＰＡ２Ｋ型」）で４５〜５５ＭＰａの圧力にて、温度を２５〜３５℃にコントロールしながら高圧破砕を３回行った。この破砕液を温度３０℃、ｐＨ１２．０に調整して約１０分撹拌した後、遠心分離によりＰＨＢＨを回収し、水を加えてＰＨＢＨを懸濁した。この破砕液のｐＨ調整からＰＨＢＨを懸濁するまでの操作を３回繰り返した。この後、懸濁液のｐＨを４．５〜５．０に調整して約1時間撹拌した。この調整液より遠心分離によりＰＨＢＨを回収した。得られたＰＨＢＨを４０℃で１２時間減圧乾燥させ、精製ＰＨＢＨを得た。
【００５４】
（比較例１）
実施例１で得られた菌体培養液１０００ｍｌを７０〜７５℃で１時間滅菌し、２５℃に冷却後、ドデシル硫酸ナトリウムを４．０ｇ添加し、ｐＨ１３．２になるように水酸化ナトリウムを添加して１時間撹拌した。その後、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデル「ＰＡ２Ｋ型」）で４５〜５５ＭＰａの圧力にて、温度を２５〜３５℃にコントロールしながら高圧破砕を３回行った。この破砕液を遠心分離によりＰＨＢＨを回収し、水洗する操作を３回繰り返した。この後、排除した上清と同量の水を添加して懸濁し、ｐＨ４．５〜５．０に調整して約1時間撹拌した。この調整液より遠心分離によりＰＨＢＨを回収した。得られたＰＨＢＨを４０℃で１２時間減圧乾燥させ、精製ＰＨＢＨを得た。
【００５５】
表１に実施例１、２と比較例１で得られたＰＨＢＨの、分子量、蛋白質含量、プレスシートのＹＩ値を測定した結果を示す。
【００５６】
【表１】
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