(57)【要約】【課題】クリキュラトリフェネストラータ（Cricula trifenestrata）の繭層からフィブロインとセリシンを分離して取得する方法を提供すること。【解決手段】以下の工程：（１）クリキュラ繭層を洗浄する洗浄工程；（２）前記工程（１）を経たクリキュラ繭層を、８０℃〜１２０℃、０．１％〜１．０％のNa2CO3溶液に浴比１：７０〜１：１５０で浸漬してセリシンを溶解させる精練工程；および（３）前記工程（２）で得られた精練液を濾過し、固形分のフィブロインとセリシン溶液とに分離する分離工程を含む方法とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クリキュラ繭層のフィブロインとセリシンの分離方法であって、以下の工程：
（１）クリキュラ繭層を洗浄する洗浄工程；
（２）前記工程（１）を経たクリキュラ繭層を、８０℃〜１２０℃、０．１％〜１．０％のNa2CO3溶液に浴比１：７０〜１：１５０で浸漬してセリシンを溶解させる精練工程；および
（３）前記工程（２）で得られた精練液を濾過し、固形分のフィブロインとセリシン溶液とに分離する分離工程
を含むことを特徴とする分離方法。
【請求項２】
前記（１）の洗浄工程は、クリキュラ繭層を５０℃〜８０℃の水で洗浄することを特徴とする請求項１の分離方法。
【請求項３】
請求項１または２の分離方法によって得られたフィブロイン。
【請求項４】
請求項１または２の分離方法によって得られたセリシン溶液を透析し、凍結乾燥して得られたセリシン粉末。
【請求項５】
分子量が４７ｋＤａであることを特徴とする請求項４のセリシン粉末。
【請求項６】
請求項１または２の分離方法によって得られたセリシン溶液を透析し、凍結乾燥する工程を含むことを特徴とするセリシン粉末の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クリキュラ繭層のフィブロインとセリシンの分離方法に関するものである。また、この方法により得られるフィブロインおよびセリシンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、家蚕（Bombyx mori）の絹タンパク質のフィブロイン、セリシンの抽出、精製方法として様々な方法が提案され（例えば、特許文献１など）、家蚕の絹タンパク質のフィブロイン、セリシンが有する機能についての検討が進められている。具体的には、例えば、家蚕の繭層からの抽出等の処理によって得られる絹タンパク質を健康増進のための食品に利用することや、化粧料成分として利用することが試みられている。
【０００３】
一方、本発明者らは、天蚕（Antheraea yamamai）の絹タンパク質についての研究を進め、その精製法と実用的利用を確立している（特許文献２）。天蚕の繭層にはシュウ酸カルシウムCa(COO)2を多く含み、純セリシンが得にくかったが、この精製法の開発によりCa(COO)2が除去可能となり、高収率での精製セリシンの取得が実現されている。
【０００４】
一方、クリキュラトリフェネストラータ（Cricula trifenestrata）は、東南アジアに生息するヤママユガ科に属する野蚕の１種であり、その繭は、荒い網目状の黄金色であり、その美しさから、アクセサリーや織物の原材料として高価で取引されている。さらに、特許文献３では、クリキュラトリフェネストラータ（Cricula trifenestrata）の繭の抽出物を含有する抗腫瘍剤、抗酸化剤、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤について提案している。
【０００５】
しかしながら、特許文献３の抽出方法では、クリキュラトリフェネストラータ（Cricula trifenestrata）の繭からフィブロイン、セリシンを抽出、精製するには至っていない。クリキュラトリフェネストラータ（Cricula trifenestrata）の繭からフィブロイン、セリシンを抽出、精製する技術が確立されれば、化粧品や健康補助食品等の分野におけるさらなる有効活用が期待される。
【０００６】
そこで、本発明者らは、天蚕（Antheraea yamamai）繭層からの絹タンパク質の精製法（特許文献２）を、クリキュラトリフェネストラータ（Cricula trifenestrata）に適用することを検討した。
【０００７】
しかしながら、野蚕の絹タンパク質（フィブロイン、セリシン）は、種により構成アミノ酸組成やその高次構造が著しく異なる他、含有する無機塩類、色素などが複雑に結合している。このため、天蚕（Antheraea yamamai）繭層からの絹タンパク質の精製法（特許文献２）を、クリキュラトリフェネストラータ（Cricula trifenestrata）に適用した場合、高分子量のフィブロインおよびセリシンを分離して取得することは困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2004−238312号公報
【特許文献２】特開2008−208123号公報
【特許文献３】特開2009−280503号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、クリキュラトリフェネストラータ（Cricula trifenestrata）の繭層からフィブロインとセリシンを分離して取得するための方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のクリキュラ繭層のフィブロインとセリシンの分離方法は、以下の工程：（１）クリキュラ繭層を洗浄する洗浄工程；（２）前記工程（１）を経たクリキュラ繭層を、８０℃〜１２０℃、０．１％〜１．０％のNa2CO3溶液に浴比１：７０〜１：１５０で浸漬してセリシンを溶解させる精練工程；および（３）前記工程（２）で得られた精練液を濾過し、固形分のフィブロインとセリシン溶液とに分離する分離工程を含むことを特徴としている。
【００１１】
本発明の分離方法では、前記工程（１）の洗浄処理は、クリキュラ繭層を５０℃〜８０℃の水で洗浄することが好ましい。
【００１２】
さらに、本発明のフィブロインは、前記分離方法によって得られる。
【００１３】
また、本発明のセリシン粉末は、前記分離方法によって得られたセリシン溶液を透析し、凍結乾燥して得られる。
【００１４】
本発明のセリシン粉末は、分子量が４７ｋＤａであることが好ましい。
【００１５】
本発明のセリシン粉末の製造方法は、前記分離方法によって得られたセリシン溶液を透析し、凍結乾燥する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、クリキュラトリフェネストラータ（Cricula trifenestrata）の繭層からフィブロインとセリシンを分離して取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】クリキュラ繭層からフィブロイン、セリシンの分離精製法とセリシンの粉末化取得法を例示したフローチャートである。
【図２】本発明の方法で得られたセリシン粉末のBlue native-PAGE電気泳動図である。
【図３】本発明の方法で得られたセリシン粉末の紫外部および可視部波長吸光度スペクトルを示す図である。
【図４】参考例における抽出物Ａの紫外部および可視部波長吸光度スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のクリキュラ繭層のフィブロインとセリシンの分離方法は、以下の（１）〜（３）工程：
（１）クリキュラ繭層を洗浄する洗浄工程；
（２）前記工程（１）を経たクリキュラ繭層を、８０℃〜１２０℃、０．１％〜１．０％のNa2CO3溶液に浴比１：７０〜１：１５０で浸漬してセリシンを溶解させる精練工程；および
（３）前記工程（２）で得られた精練液を濾過し、固形分のフィブロインとセリシン溶液とに分離する分離工程
を含む。
【００１９】
本発明において使用されるクリキュラ繭層とは、クリキュラトリフェネストラータ（Cricula trifenestrata）の生繭を切開して得られる絹繊維であり、主にフィブロインとセリシンとによって複合形成されているものをいう。クリキュラ繭層は、切開された状態で処理することも可能であるが、例えば、公知の手段によって、適宜な大きさに切断、粉砕処理等を行うことができる。
【００２０】
本発明の方法における第１工程は、クリキュラ繭層を洗浄処理する工程である。具体的には、クリキュラ繭層を５０℃〜８０℃の水、好ましくはおよそ６５℃程度の純水で洗浄する。洗浄時間は、およそ３〜５分程度とすることができる。また、このとき、クリキュラ繭層と水（純水）の浴比が１：８０〜１：１２０程度とすることで、より効率的にクリキュラ繭層を洗浄することができる。この洗浄工程によって、クリキュラ繭層に含まれる水溶性色素や夾雑物を除去することができる。また、この洗浄工程においては、繭層を適宜攪拌などさせることもできる。そして、洗浄後は、例えばガラスフィルターで繭層と濾液に固液分離する。
【００２１】
第２工程は、第１工程を経て固液分離された繭層を精練する工程である。具体的には、第１工程で洗浄、分離された繭層を８０℃〜１２０℃、０．１％〜１．０％のNa2CO3溶液に浴比１：７０〜１：１５０に浸漬することによって行うことができる。セリシンは水に溶解するという特徴があるため、この精練処理によって、クリキュラ繭層を構成するフィブロインから高分子量のセリシンを分離、溶出させることができる。このような精練条件に設定することで、繭層からセリシンを効率的に抽出することができる。
【００２２】
特に、繭層のNa2CO3溶液浴比が１：７０以下の場合には精練効果は低く、また、Na2CO3溶液浴比が１：１５０以上の場合には、以降の工程の処理時間と手間がかかってしまうため好ましくない。したがって、Na2CO3溶液の温度、濃度などの条件と関係するが、Na2CO3溶液浴比の範囲は、１：７０〜１：１５０、より好ましくは、浴比１：７５〜１：８５程度とすることができる。また、浸漬時間は、繭層の細切の程度、Na2CO3溶液の温度、濃度、浴比などの条件に応じて適宜決定することができるが、およそ４０分〜９０分程度を目安とすることができる。
【００２３】
第３工程は、第２工程によって得られた精練液（固形分の繭層を含む）を濾過し、繊維状固形分のフィブロインとセリシン溶液とに分離する工程である。濾過には、例えば、ガラスフィルター、濾紙などの適宜使用することができる。また、この分離工程においては、繊維状固形分に物理的作用を与えることもでき、これによって、効率的にフィブロインとセリシンを分離することができる。物理的作用としては、例えば、圧縮や搾り出しなどを例示することができる。より具体的には、例えば、圧縮としては、プレス装置によって繊維状固形分を圧縮する方法や、遠心力を付加する方法などを採用することができる。また、搾り出しとしては、自動または手動の乳鉢などを利用することもできる。
【００２４】
さらに、第３工程によって得られたセリシン溶液を透析処理し、凍結乾燥させることでセリシン粉末を得ることができる。具体的には、第３工程によって得られたセリシン溶液を、例えば、セルロースチューブに充填し、２０℃〜２５℃程度の水道水、純水で透析を行うことができる。そして、この透析後の溶液を公知の手段で凍結乾燥させることで、粉末状のセリシン抽出物を得ることができる。
【００２５】
この粉末状のセリシン抽出物（セリシン粉末）は、抽出条件にもよるが、通常４５〜５０ｋＤａに高分子量であることが確認されている。したがって、本発明の方法によって、クリキュラ繭層からフィブロインとセリシンを分離することができ、得られるセリシン粉末は、安定性が高く、加工性にも優れており、クリキュラ繭層に由来する新しい機能性材料として、食品、化粧品等の分野において有効に利用することができる。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明のクリキュラ繭層のフィブロインとセリシンの分離方法について説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
【００２７】
図１は、本発明のクリキュラ繭層からフィブロイン、セリシンの分離精製法とセリシンの粉末化取得法を例示したフローチャートである。以下、図１のフローチャートに沿って本発明の方法について具体的に説明する。
【００２８】
＜１＞クリキュラ繭層からのフィブロインとセリシンの分離
（１）材料
クリキュラトリフェネストラータ（Cricula trifenestrata）の生繭（株式会社ユーエス、インドネシア産）を切開して、クリキュラ繭層を得た。
【００２９】
（２）洗浄工程
クリキュラ繭層５０ｇを６５℃、５Ｌの純水で３分間浸漬し（浴比１：１００）、洗浄した。その後は、１７Ｇガラスフィルターで濾過し、固形分（繭層）と溶液とを分離した。
【００３０】
（３）精練工程
洗浄後の固形分（繭層）を、９８℃、０．５％のNa2CO3溶液に浴比１：７５で１．５時間浸漬することで精練を行った。
【００３１】
なお、従来の天蚕セリシンの取得方法（特許文献２）においては、天蚕繭層をNa2CO3溶液に浴比１：５０で浸漬することで精練してセリシンを得ていた。しかしながら、クリキュラ繭層と天蚕繭層とは、繭層形態構造、アミノ酸組成、フィブロインとセリシンの分子高次構造、結合性（凝集性）が異なるため、そのセリシンの溶解性も全く異なると考えられ、クリキュラ繭層をNa2CO3溶液に浴比１：５０で浸漬した場合には、クリキュラ繭層からのセリシンの取得は困難であった。すなわち、Na2CO3溶液浴比１：５０では、フィブロインとセリシンを十分分離することはできず、本発明における精練工程の処理条件は、クリキュラ繭層に特有のものであった。
【００３２】
また、従来の天蚕セリシンの取得方法（特許文献２）では、繭層精練後に、常温（２５℃）で３日以上放置してシュウ酸カルシウムCa(COO)２等の夾雑物を沈殿させる工程を必要としていたが、クリキュラ繭層は、これらの夾雑物が少なく、放置による沈殿工程は不要であった。
【００３３】
（４）分離工程
精練処理後の精練液を１７Ｇガラスフィルターで濾過することで、固形分（繭層部分）のフィブロインとセリシン溶液とを分離した。
【００３４】
さらに、セリシン溶液については、常温（２５℃）で濾紙による濾過を行って得た溶液をセルロースチューブに充填し、２０℃の水道水で３日流水透析し、その後、純水を２〜３時間おきに交換しながら１日透析を行い、凍結乾燥機（東京理科器械株式会社、EYELA  FDU-810）で凍結乾燥させることで、クリキュラ繭層からの粉末状のセリシン抽出物（セリシン粉末）を収率13.86％で得ることができた。
【００３５】
なお、繭層の絹タンパク質は、繊維軸に沿って配向し分子間の結合と凝集力が強いフィブロイン及び無配向で分子間結合がほとんどないセリシンの２種類で構成されていることは周知である。すなわち、種により難溶の差はあるが、セリシンは水に溶解するという特徴があり、前記（３）の精練工程は、この特徴を利用して積極的にセリシンを除去するための工程である。したがって、精練処理後に分離された固形分はフィブロインであると判断することができる。また、フィブロインが除去された濾液には高分子量のタンパク質が含まれていることが確認され（後述の分子量測定、アミノ酸組成分析）、セリシンを含有する溶液（セリシン溶液）であると判断することができる。
【００３６】
＜２＞セリシン粉末の分子量
本発明の方法で得られたセリシン粉末について、Blue native-PAGE電気泳動法により分子量を次のように測定した。
Blue Native−PAGE電気泳動には4-16 ％のグラジエントゲルを用いた（Invitrogen社）。泳動槽に泳動用バッファー（Invitrogen社）を入れ、泳動用試料（20μl）は、等量のサンプルバッファー（Invitrogen社）を加えて調整した。分子量マーカーには、Protein Marker Kit（M.W.Range 97,000〜14,400, GEヘルスケアバイオサイエンス社）を使用した。泳動は、150V定電圧でおこない、泳動後のゲルの脱色はInvitrogen社BN-PAGE Manualに従って行った。具体的には泳動後のゲルを100 mlの固定液（40％メタノール, 10% 酢酸）に入れ、電子レンジで45秒温めた後、シェーカーで室温/ 5分間振とうし、固定液を捨てた。続いて100 ml の脱色液（8％酢酸）を加え、電子レンジで45秒温めた後、バッググラウンドが鮮明になるまでシェーカーで振とうした。なお、電気泳動に使用するタンパク質の定量はBCA protein assay reagent kit（Pierce社）の測定手順に従って行った。
【００３７】
結果は、図２に示したように、本発明の方法で得られたセリシン粉末は、４７ｋＤａであることが確認された。このセリシン粉末は高分子量であるため、安定性が高く、加工性にも優れていると考えられ、様々な分野での有効に利用することができる。
【００３８】
＜３＞セリシン粉末のアミノ酸組成
本発明の方法で得られたセリシン粉末のアミノ酸組成をアミノ酸アナライザー（日本電子社、JLC-500 / V）によって分析し、家蚕セリシン、天蚕セリシンのアミノ酸組成と比較した。
【００３９】
なお、天蚕セリシンについては、特許文献２に記載の方法によって取得したものを使用し、家蚕セリシンについては、特許文献２に記載のデータを引用した。
【００４０】
結果を表１に示す。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
表１に示されているように、本発明の方法で得られたクリキュラトリフェネストラータ（Cricula trifenestrata）繭層からのセリシン粉末（表のT. Cricula欄）のアミノ酸組成は、家蚕セリシン、天蚕セリシンのアミノ酸組成とは異なることが確認された。具体的には、本発明の方法で得られたセリシン粉末（T. Cricula）は、相対的に、セリン、グリシンが多く含まれていた。さらに、本発明の方法で得られたセリシン粉末（T. Cricula）は、家蚕セリシン、天蚕セリシンと比較してヒスチジンが多量に含まれていた。
【００４３】
＜４＞セリシン粉末のスペクトル分析
本発明の方法で得られたセリシン粉末を水に溶解させた溶液について、紫外部および可視部波長吸光度スペクトルを求めた。
【００４４】
結果を図３に示すように、吸光度は、短波長225nmにおける極大値から長波長側に沿って放物線を描きながら低下するが、波長240nm、280nm、335nmに小さな凸のピークを、さらに、波長370nm、490nmにかけてなだらかなピークを示すスペクトルが得られた。
【００４５】
＜５＞参考例
（１）本発明の方法における洗浄工程後に固形分（繭層）と分離された濾液を、さらに濾紙で濾過して抽出物Ａ(溶液)を得た。
この抽出物を、本件精製セリシン粉末を取得するため乾燥処理と同様の凍結乾燥をすると抽出物Ａ粉末を得ることができる。抽出物Ａの収率は0.32％（乾燥粉末）であった。
【００４６】
この抽出物Ａ(溶液)について紫外部および可視部波長吸光度スペクトルを求めたところ、短波長220nmにおける極大値から長波長側に沿って放物線を描きながら低下するが、波長275nm、340nm、370nmに小さな凸のピークを、さらに、波長390nm、490nmにかけてなだらかなピークを示すスペクトルが得られた（図４）。この抽出物Ａは黄金色であり、クリキュラ繭層の最外層のセリシン（若干量）、水溶性の色素、夾雑物等が含まれていると考えられる。
【００４７】
（２）本発明の方法における洗浄工程後の固形分（繭層）を、９８℃の水に浴比１：５０で２０分〜３０分間浸漬処理をした。その後、１７Ｇガラスフィルターで濾過し、その濾液をさらに濾紙で濾過し、抽出物Ｂ（溶液）を得た。
この抽出物を、実施例で得た精製セリシン粉末の場合と同様の凍結乾燥をすることで抽出物Ｂ粉末を得ることができた。抽出物Ｂの収率は1.23％(乾燥粉末)であった。この抽出物Ｂには、繭層の最外層にあるセリシンとそのセリシンと結合する色素が含まれていると考えられる。この抽出物Ｂは、実施例で得られた精製セリシンとは異なる生理活性を有することが期待できる。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図２】
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