(57)【要約】      （修正有）【課題】タイムラプス観察時において、焦点引き込み動作と合焦維持動作を観察ポイントで確実に行うことができ、継続的タイムラプス観察が可能な顕微鏡システム、制御プログラム及び該プログラムを記録した媒体を提供する。【解決手段】焦点維持装置を有し、１以上の登録ポイントの標本像を、所定時間間隔で取得するタイムラプス装置を制御する制御プログラムにおいて、前記焦点維持装置を介して基準位置のＺ座標値の変化量を取得するステップと、前記登録ポイントのＺ座標値を前記変化量で更新するステップと、更新された前記登録ポイントのＺ座標値で前記標本像を取得するステップと、を有する制御プログラム。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
焦点維持装置を有し、１以上の登録ポイントの標本像を、所定時間間隔で取得するタイムラプス装置を制御する制御プログラムにおいて、
前記焦点維持装置を介して基準位置のＺ座標値の変化量を取得するステップと、
前記登録ポイントのＺ座標値を前記変化量で更新するステップと、
更新された前記登録ポイントのＺ座標値で前記標本像を取得するステップと、を有することを特徴とする制御プログラム。
【請求項２】
前記基準位置は、前記登録ポイント、または前記登録ポイントとは異なるポイントであることを特徴とする請求項１に記載の制御プログラム。
【請求項３】
前記変化量は、前記標本像の取得待機時間中と前記標本像の取得中とのすくなくとも一方で取得することを特徴とする請求項１または２に記載の制御プログラム。
【請求項４】
前記焦点維持装置は、パーフェクトオートフォーカス装置であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の制御プログラム。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の制御プログラムを記録したことを特徴とする媒体。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか１項に記載の制御プログラムを有することを特徴とする顕微鏡システム。  
【請求項７】
顕微鏡本体と、
前記顕微鏡本体のステージに配設された前記細胞標本の所定位置に対物レンズの焦点位置を維持する焦点維持装置と、
前記細胞標本の細胞像を撮影する撮像装置と、
前記焦点維持装置、および前記撮像装置の動作を制御する制御装置とを有し、
前記制御装置は、前記焦点維持装置を介して基準位置のＺ座標値の変化量を取得し、前記細胞像を取得するための登録ポイントのＺ座標値を前記変化量で更新し、前記更新されたＺ座標値で前記細胞像を取得するように制御することを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項８】
前記細胞標本を培養する培養装置の環境条件を所定の状態に維持するための環境制御装置をさらに有し、
前記制御装置は、前記環境制御装置の動作を制御することを特徴とする請求項７に記載の顕微鏡システム。
【請求項９】
前記基準位置は、前記登録ポイント、または前記登録ポイントとは異なるポイントであることを特徴とする請求項７または８に記載の顕微鏡システム。
【請求項１０】
前記変化量は、前記細胞像の取得待機時間中と前記細胞像の取得中とのすくなくとも一方で取得することを特徴とする請求項７から８のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
【請求項１１】
前記焦点維持装置は、パーフェクトオートフォーカス装置であることを特徴とする請求項７から１０のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、制御プログラム、制御プログラムを記録した媒体、顕微鏡システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、培養容器に収容した細胞等の生物試料の顕微鏡画像を一定時間間隔ごとに撮影するタイムラプス観察を行うために、所定環境に維持したインキュベータと顕微鏡を組み合わせた構造の観察装置や、インキュベータと同様の環境を維持できるチャンバをステージ上に装着した顕微鏡が知られている。
【０００３】
特許第４３７０５５４号の焦点維持装置では、標本が浸された媒質と培養容器との境界面の位置を検出して対物レンズ先端と標本間の距離の変化分を修正するので、撮影ポイントを登録したときの合焦状態を維持することができる。また、この装置を用いて多数ポイントのタイムラプス観察（撮影）を行う装置は、各観察ポイントのＸＹＺ座標、および合焦条件等を初期条件設定時に所定のテーブル等に保存しておく。そして、この装置は、ＸＹステージを駆動して観察ポイント間を移動中に焦点維持装置の動作を切り、次の観察ポイントに位置決めした後に保存されているＺ座標および合焦条件等に基きこの観察ポイントにおいて焦点引き込み動作を行って観察ポイントに合焦すると共に、その観察ポイントの標本像を取得する事を観察ポイント毎に行っている。なお、焦点引き込み動作とは、バックグラウンドノイズに対して境界面からの反射光を示す信号を検出し、その信号が最大となるように対物レンズを上下動させる動作をいう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４３７０５５４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細胞培養は一定の温度環境下（例えば哺乳類であれば３７℃）で行われるのが一般的であるが、温度をパラメータとして変化の原因を解明しようとする実験もある。例えば３７℃から３２℃へ変化させた場合、温度変化により、観察ポイントのＺ座標値が初期設定時に取得したＺ座標値から変化する。この場合、観察ポイントのＺ座標値の変化量は、顕微鏡にもよるが５〜１０μｍになり、焦点引き込み範囲、すなわち、バックグラウンドノイズに対して境界面からの反射光を示す信号を検出できる範囲を超えてしまう場合がある。焦点引き込み範囲は対物レンズの種類によっても大きく異なるが、培地とディッシュ底面との境界からの反射光を利用する液浸系の対物レンズでは５〜１０μｍ程度である。
【０００６】
また、タイムラプス中に培地交換を行う場合には、低い温度の培地が注入されて温度が急激に変化して、観察ポイントのＺ座標値の変化量が焦点引き込み範囲を超えてしまう場合もある。
【０００７】
初期設定時のＺ座標値に対して温度変化によるＺ座標値の変化量が焦点引き込み範囲を超えてしまうと、焦点引き込み動作ができなくなり、継続的タイムラプス観察が行えなくなるという問題がある。
【０００８】
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、タイムラプス観察時において、焦点維持装置の焦点引き込み動作と合焦維持動作を各観察ポイントで確実に行うことができ、継続的タイムラプス観察が可能な顕微鏡システム、制御プログラム及び制御プログラムを記録した媒体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、本発明は、焦点維持装置を有し、１以上の登録ポイントの標本像を、所定時間間隔で取得するタイムラプス装置を制御する制御プログラムにおいて、前記焦点維持装置を介して基準位置のＺ座標値の変化量を取得するステップと、前記登録ポイントのＺ座標値を前記変化量で更新するステップと、更新された前記登録ポイントのＺ座標値で前記標本像を取得するステップと、を有することを特徴とする制御プログラムを提供する。
【００１０】
また、本発明は、前記制御プログラムを記録したことを特徴とする媒体を提供する。
【００１１】
また、本発明は、前記制御プログラムを有することを特徴とする顕微鏡システムを提供する。
【００１２】
また、本発明は、顕微鏡本体と、前記顕微鏡本体のステージに配設された前記細胞標本の所定位置に対物レンズの焦点位置を維持する焦点維持装置と、前記細胞標本の細胞像を撮影する撮像装置と、前記焦点維持装置、および前記撮像装置の動作を制御する制御装置とを有し、前記制御装置は、前記焦点維持装置を介して基準位置のＺ座標値の変化量を取得し、前記細胞像を取得するための登録ポイントのＺ座標値を前記変化量で更新し、前記更新されたＺ座標値で前記細胞像を取得するように制御することを特徴とする顕微鏡システムを提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、タイムラプス観察時において、焦点維持装置の焦点引き込み動作と合焦維持動作を各観察ポイントで確実に行うことができ、継続的タイムラプス観察が可能な顕微鏡システム及び制御プログラムを記録した媒体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本実施形態に係る顕微鏡システムの全体的な構成を示す図である。
【図２】第１実施形態に係る顕微鏡システムを用いてタイムラプス観察を行う場合の標本画像の取得手順を示すフローである。
【図３】第２実施形態に係る顕微鏡システムを用いてタイムラプス観察を行う場合の標本画像の取得手順を示すフローである。
【図４】第３実施形態に係る顕微鏡システムを用いてタイムラプス観察を行う場合の標本画像の取得手順を示すフローである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本願の実施形態に係る顕微鏡システムについて図面を参照しつつ説明する。なお、以下の実施の形態は、発明の理解を容易にするためのものに過ぎず、本願発明の技術的思想を逸脱しない範囲において当業者により実施可能な付加・置換等を施すことを排除することは意図していない。
【００１６】
まず、本実施形態に係る顕微鏡システム１の全体的な構成について説明する。図１に示すように、本実施形態に係る顕微鏡システム１は、顕微鏡１０と、顕微鏡１０に取り付けられたカメラ２０と、ステージ５上に配置された培養チャンバ３０と、焦点維持装置４０と、カメラ２０で撮影した観察像を映し出すモニタ５０と、パソコン本体６０（以後、ＰＣと記す。）とから構成されている。
【００１７】
顕微鏡１０は、顕微鏡本体３と、顕微鏡本体３に設けられたステージ５と、ステージ５の上方に配置された透過照明装置７と、ステージ５の下方に配置された対物レンズ９と、複数の対物レンズ９を光路に交換可能にするための電動レボルバ１１と、顕微鏡本体３の背面に配置された落射照明装置１３と、顕微鏡本体３の正面側に設けられた接眼レンズ１５とを有している。対物レンズ９は焦点維持装置４０の電動フォーカス機構により上下に移動可能であり、ステージ５はステージコントローラ１５によりＸＹ方向に移動可能な構成となっている。
【００１８】
ステージ５上に載置された培養チャンバ３０は、箱状の本体３１と蓋体３２とからなり、本体３１に細胞等の試料を入れた培養容器３３を配置する。チャンバ３０内には、チャンバ外から給気チューブよりＣＯ２を５％含んだ加湿空気が供給される。またチャンバ３０に内蔵された不図示の温度センサの出力に基づいてチャンバ温調コントローラ３５が不図示のヒータ（またはクーラ）の出力を変えることで、培養チャンバ３０内を試料の培養条件に適した環境に維持する。
【００１９】
対物レンズ９の像側に配置された焦点維持装置４０は、不図示の焦点位置検出用の光源、焦点位置調節レンズを含む照明光学系、結像光学系、受光センサ、焦点位置調節レンズを光軸に沿って前後に移動可能とする焦点位置調節レンズ用モータを有している。この焦点維持装置４０は、標本の所定位置に対物レンズ９を合焦させてこの状態を維持する働きをする。
【００２０】
また、観察者が焦点維持装置４０の制御装置である焦点維持装置コントローラ４２のノブ４３を操作すると、ノブ４３に結合されたエンコーダからの信号に基づき不図示の焦点位置調節レンズが光軸に沿って往復移動する。焦点維持装置コントローラ４２は、内部に不図示の信号処理基板、焦点位置調節レンズ駆動用制御基板等を有している。本実施形態で使用される焦点維持装置４０は、いわゆるパーフェクトフォーカス（特許第４３７０５５４号公報参照）方式である。なお、パーフェクトフォーカス方式の詳細については公知であり詳細な説明を省略する。また、焦点維持装置としては、上記パーフェクトフォーカス方式以外の方式を使用することも可能である。
【００２１】
このような構成の顕微鏡システム１では、透過照明装置７から発せられた照明光は、培養チャンバ３０内の培養容器３３に照射され、培養容器３３内の試料からの観察光は、対物レンズ９を経て顕微鏡本体３内の不図示の光学系によってカメラ２０内の不図示のＣＣＤセンサの撮像面または接眼レンズ１５に導かれる。ＣＣＤセンサの撮像面に結像した観察光は、ＰＣ６０の不図示のカメラ用信号処理部で処理されて試料の観察画像はモニタ５０に表示される。このようにして、使用者は接眼レンズ１５とモニタ５０とを切り替えて試料の像を観察することができる。
【００２２】
一方、落射照明装置１３から発せられた照明光は、不図示の落射蛍光照明光学系を経て対物レンズ９の下方に配置された不図示の蛍光フィルタブロック内のダイクロイックミラーで反射され、対物レンズ９に入射して試料に照射される。試料からの蛍光は、対物レンズ９を通って蛍光フィルタブロック内のバリアフィルタを透過し、カメラ２０内のＣＣＤセンサの撮像面に結像する。結像した光は、ＣＣＤセンサで撮像することでＰＣ６０のメモリ６２に保存され、観察者は適宜モニタ５０でこれを確認することができる。
【００２３】
（第１実施形態）
次に、第１実施形態に係る顕微鏡システム１を用いてタイムラプス観察を行う場合の標本画像の取得手順について図２のフローを参照しつつステップ毎に説明する。
【００２４】
（ステップＳ１）
観察者は、ステージコントローラ１５によりステージ５をＸＹ方向に移動させ、また焦点維持装置４０の電動フォーカス機構を介して対物レンズ９をＺ方向に移動させて、チャンバ３０内に載置した培養容器３３内を探索して観察に適当な細胞を視野内に確保する。
【００２５】
（ステップＳ２）
観察者は、観察に適した細胞に対物レンズ９を合焦させたのち焦点維持装置４０を稼働させる。
【００２６】
（ステップＳ３）
観察者は、試料の所望の観察ポイントにおいて再度の合焦調整を焦点維持装置コントローラ４２のノブ４３を回し、焦点位置調節レンズの位置を調整する。焦点維持装置４０は、調整された焦点位置調節レンズ位置を記憶する。これにより、焦点維持装置４０は、電動フォーカス機構を駆動して、試料と培養容器３３との境界面と対物レンズ９の先端の距離を維持することが可能になる。
【００２７】
（ステップＳ４）
観察者は、透過観察や落射蛍光観察等の観察方法、カメラ２０の露光条件等を決定し、撮影ポイントを登録する。これにより、観察者は、ＰＣ６０を介して、撮影ポイントのＸＹＺ座標値、焦点位置調節レンズの位置、観察方法、カメラ２０の露光条件を観察条件としてメモリ６２の観察条件テーブルに記憶したことになる。
【００２８】
（ステップＳ５）
観察者は、ステップＳ３とＳ４の手順を繰り返すことで複数の撮影ポイントそれぞれの観察条件（ＸＹＺ座標、焦点位置調節レンズの位置、観察方法、カメラ２０の露光条件）をＰＣ６０のメモリ６２の観察条件テーブルに登録することができる。全ての撮影ポイントを観察条件テーブルに登録したらステップＳ６へ進む。以後、本実施形態では、撮影ポイントを５つ登録したものとして説明する。
【００２９】
（ステップＳ６）
観察者は、５つの撮影ポイント登録後、ＰＣ６０を介して焦点維持装置４０を一時停止する。
【００３０】
（ステップＳ７）
観察者は、タイムラプス撮影を行う時間間隔と、撮影開始から終了までの時間若しくは撮影回数（以後、ラウンドと記す）を入力してタイムラプス撮影条件を設定するとともに、培養チャンバ３０内の温度条件を設定して観察条件テーブルに記憶する。タイムラプス撮影条件は、例えば、撮影間隔を３０分、撮影開始から終了までの時間を２４時間に設定すると、４９ラウンドの撮影が設定される。温度条件は、例えば、始めの８時間は３７度を維持し、次の８時間は３２度を維持し、更にその次の８時間は３７度を維持するように、３０分の撮影間隔を隔てて５度の温度変化を交互に繰り返すように設定する。
【００３１】
（ステップＳ８）
観察者は、ＰＣ６０にタイムラプス撮影開始指示を与える。これにより、顕微鏡システム１のＰＣ６０はタイムラプス撮影制御を開始する。
【００３２】
（ステップＳ９）
ＰＣ６０は、メモリ６２の観察条件テーブルを参照して撮影ポイントの登録座標に基づいてステージ５及び対物レンズ９をそれぞれ駆動し、登録された撮影ポイントのＸＹＺ座標値へ移動する。このとき、焦点位置調節レンズも登録された位置に移動させる。
【００３３】
（ステップＳ１０）
ＰＣ６０は、焦点維持装置４０を稼働し、焦点維持装置４０に当該撮影ポイントで焦点引き込み動作を行うように指示をする。この指示により、焦点維持装置４０は、撮影ポイントのＺ座標と焦点位置調節レンズの位置データを使用して焦点引き込み動作を行い、焦点維持動作を実行する。焦点維持装置４０はフォーカス検出信号に基づいて電動フォーカス機構を駆動して対物レンズ９のＺ位置を修正し、修正したＺ座標値を当該撮影ポイントの新たなＺ座標値としてメモリ６２に保存された観察条件テーブルのＺ座標値データを更新する。
【００３４】
（ステップＳ１１）
ＰＣ６０は、観察条件テーブルに登録された観察方法及び露光条件により、当該撮影ポイントにおける標本画像をカメラ２０で取得し、ＰＣ６０のメモリ６２に環境条件テーブルデータと関連付けて保存する。
【００３５】
（ステップＳ１２）
ＰＣ６０は、全てのポイントの撮影が終了したかを判定する。全てのポイント（今の場合５ポイント）の撮影が終了したらステップＳ１４へ進み、終了していない場合、ステップＳ１３へ進む。
【００３６】
（ステップＳ１３）
次のポイントの撮影位置に移動するため、ＰＣ６０は焦点維持装置４０を停止する。そしてＰＣ６０はステップＳ９へ戻り、ステップＳ９〜ステップＳ１３を繰り返して５つのポイントの撮影を行う。
【００３７】
（ステップＳ１４）
ＰＣ６０は、全てのラウンドの撮影が終了したかを判定する。全てのラウンド（今の場合４９ラウンド）の撮影が終了していればタイムラプス撮影を終了し、終了していない場合、ステップＳ１５へ進む。
【００３８】
（ステップＳ１５）
全てのラウンドの撮影が終了していないので、ＰＣ６０は、観察条件テーブルを参照して培養チャンバ３０内を設定された温度にするようにチャンバ温調コントローラ３５に指示し、チャンバ温調コントローラ３５は培養チャンバ３０内の温度を設定温度に変える制御を行う。そしてＰＣ６０は、次ラウンドの撮影時間になったか判定する。次ラウンドの撮影時間になっている場合、ステップＳ１７へ進み、なっていない場合、ステップＳ１６へ進む。
【００３９】
（ステップＳ１６）
次ラウンドの撮影時間になっていないので、焦点維持装置４０は、最後のポイント（ポイント５）の撮影終了直後から次ラウンドの撮影開始までの間、この最後のポイント（ポイント５）のＺ座標値を焦点維持装置４０を介して測定してステップＳ１５へ戻る動作を次のラウンドの撮影時間になるまで繰り返す。
【００４０】
（ステップＳ１７）
次のラウンドの撮影時間になったので、ＰＣ６０は、焦点維持装置４０を介してステップＳ１６で測定したＺ座標値から以下の補正値ΔＺを算出し、観察条件テーブルに保存されている５つの全ての撮影ポイントのＺ座標値にこの補正値ΔＺを加え新たな観察条件テーブルとして更新する。
補正値ΔＺ  ＝  直前のラウンドにおける最後のポイント（ポイント５）の撮影直前に更新したＺ位置の座標値  −  新たに撮影を開始する本ラウンドの撮影開始直前の当該ポイント（ポイント５）のＺ位置の値。
例えば、１ラウンドでのポイント１のＸＹＺ座標を（Ｘ１，Ｙ１，Ｚ１）、ポイント２のＸＹＺ座標を（Ｘ２，Ｙ２，Ｚ２）、…ｎ個目のポイントのＸＹＺ座標を（Ｘｎ，Ｙｎ，Ｚｎ）、とすると、２ラウンドでのポイント１のＸＹＺ座標は（Ｘ１，Ｙ１，Ｚ１＋ΔＺ）、ポイント２のＸＹＺ座標は（Ｘ２，Ｙ２，Ｚ２＋ΔＺ）、…ｎ個目のポイントのＸＹＺ座標は（Ｘｎ，Ｙｎ，Ｚｎ＋ΔＺ）となる。２ラウンドから最後の４９ラウンドが終了するまで同様に、ラウンド毎に最後の撮影ポイントの撮影の撮影終了直後から次ラウンド開始直前までこの最後の撮影ポイントのＺ座標値の変化を計測し（ステップＳ１６）、上記補正値ΔＺを取得して新たに撮影を開始するラウンドの各ポイントのＺ座標値に加え更新後の観察条件テーブルとする。
【００４１】
（ステップＳ１８）
次のラウンドの撮影時間になり観察条件テーブルの更新が終わったのち、ＰＣ６０は焦点維持装置４０を停止する。そしてＰＣ６０はステップＳ９へ戻り、ステップＳ９〜ステップＳ１８を繰り返して全てのラウンドの撮影を行う。
【００４２】
上述のように、第１実施形態に係る顕微鏡システム１では、タイムラプス動作の各ラウンドの最後の撮影ポイントの撮影終了直後から次ラウンドの撮影開始直前まで対物レンズ９のＺ座標値を焦点維持装置４０を介して計測し、計測した値から上述の補正値ΔＺを得てこの補正値ΔＺを次ラウンドの各ポイントのＺ座標値に加えて各ポイントのＺ座標値を更新するため、焦点引き込み動作時の各ポイントのＺ座標値が焦点引き込み範囲から外れないようにできるので、各ポイントにおいて焦点引き込み動作を確実に行うことができ、その後の焦点状態を維持することができる。
【００４３】
なお、第１実施形態に係る顕微鏡システムは、撮影時間は短く次ラウンドの撮影までの休止時間が長いタイムラプス撮影を行う場合に適している。例えば、撮影所要時間が３分、時間間隔を３０分とすると、撮影を行わない休止時間である２７分の間、最後のポイント５において焦点維持装置４０を断続的に稼働しているため、その間の温度変化によってＺ座標値が大きく変化しても次の焦点引き込み時に確実に焦点引き込みを行うことができる。なお、焦点維持装置４０を断続的に稼働して対物レンズ９のＺ座標値を計測するポイントは、最後のポイント（本実施形態においてはポイント５）に限られずどこに設定しても良い。例えば、撮影ポイントとは異なる位置を計測ポイントとして登録し、この位置のＺ座標値の変化を計測するようにしても良い。このように撮影ポイントとは異なる位置に計測ポイントを設定することで、最後の撮影ポイントへの光毒性を回避することができる。
【００４４】
（第２実施形態）
次に、第２実施形態に係る顕微鏡システム１を用いてタイムラプス観察を行う場合の標本画像の取得手順について図３のフローを参照しつつ説明する。
【００４５】
第２実施形態に係る顕微鏡システムは、撮影時間が長く次ラウンドの撮影までの休止時間が短いタイムラプス撮影（例えば、撮影所要時間が２７分、休止時間が３分の、時間間隔が３０分のタイムラプス撮影）を行う場合に適している。なお、第１実施形態と同処理のステップには同じ符号を付して説明する。
【００４６】
（ステップＳ１）
観察者は、ステージコントローラ１５によりステージ５をＸＹ方向に移動させ、また焦点維持装置４０の電動フォーカス機構を介して対物レンズ９をＺ方向に移動させて、チャンバ３０内に載置した培養容器３３内を探索して観察に適当な細胞を視野内に確保する。
【００４７】
（ステップＳ２）
観察者は、観察に適した細胞に対物レンズ９を合焦させたのち焦点維持装置４０を稼働させる。
【００４８】
（ステップＳ３）
観察者は、試料の所望の観察ポイントにおいて再度の合焦調整を焦点維持装置コントローラ４２のノブ４３を回し、焦点位置調節レンズの位置を調整する。焦点維持装置４０は、調整された焦点位置調節レンズ位置を記憶する。これにより、焦点維持装置４０は、電動フォーカス機構を駆動して、試料と培養容器３３との境界面と対物レンズ９の先端の距離を維持することが可能になる。
【００４９】
（ステップＳ４）
観察者は、透過観察や落射蛍光観察等の観察方法、カメラ２０の露光条件等を決定し、撮影ポイントを登録する。これにより、観察者は、ＰＣ６０を介して、撮影ポイントのＸＹＺ座標値、焦点位置調節レンズの位置、観察方法、カメラ２０の露光条件を観察条件としてメモリ６２の観察条件テーブルに記憶したことになる。
【００５０】
（ステップＳ５）
観察者は、ステップＳ３とＳ４の手順を繰り返すことで複数の撮影ポイントそれぞれの観察条件（ＸＹＺ座標、焦点位置調節レンズの位置、観察方法、カメラ２０の露光条件）をＰＣ６０のメモリ６２の観察条件テーブルに登録することができる。全ての撮影ポイントを観察条件テーブルに登録したらステップＳ６へ進む。以後、本実施形態では、撮影ポイントを５つ登録したものとして説明する。
【００５１】
（ステップＳ６）
観察者は、５つの撮影ポイント登録後、ＰＣ６０を介して焦点維持装置４０を一時停止する。
【００５２】
（ステップＳ７）
観察者は、タイムラプス撮影を行う時間間隔と、撮影開始から終了までの時間若しくは撮影回数（以後、ラウンドと記す）を入力してタイムラプス撮影条件を設定するとともに、培養チャンバ３０内の温度条件を設定して観察条件テーブルに記憶する。タイムラプス撮影条件は、例えば、撮影間隔を３０分、撮影開始から終了までの時間を２４時間に設定すると、４９ラウンドの撮影が設定される。温度条件は、例えば、始めの８時間は３７度を維持し、次の８時間は３２度を維持し、更にその次の８時間は３７度を維持するように、３０分の撮影間隔を隔てて５度の温度変化を交互に繰り返すように設定する。
【００５３】
（ステップＳ８）
観察者は、ＰＣ６０にタイムラプス撮影開始指示を与える。これにより、顕微鏡システム１のＰＣ６０はタイムラプス撮影制御を開始する。
【００５４】
（ステップＳ９）
ＰＣ６０は、メモリ６２の観察条件テーブルを参照して撮影ポイントの登録座標に基づいてステージ５及び対物レンズ９をそれぞれ駆動し、登録された撮影ポイントのＸＹＺ座標値へ移動する。このとき、焦点位置調節レンズも登録された位置に移動させる。
【００５５】
（ステップＳ１０）
ＰＣ６０は、焦点維持装置４０を稼働し、焦点維持装置４０に当該撮影ポイントで焦点引き込み動作を行うように指示をする。この指示により、焦点維持装置４０は、撮影ポイントのＺ座標と焦点位置調節レンズの位置データを使用して焦点引き込み動作を行い、焦点維持動作を実行する。焦点維持装置４０はフォーカス検出信号に基づいて電動フォーカス機構を駆動して対物レンズ９のＺ位置を修正し、修正したＺ座標値を当該撮影ポイントの新たなＺ座標値としてメモリ６２に保存された観察条件テーブルのＺ座標値データを更新するとともに、このときの補正値δＺを保存する。
補正値δＺ  ＝  撮影ポイントの撮影直前に更新したＺ座標値  
−  当該撮影ポイントのＺ座標値としてステップＳ９の撮影ポイントに移動したときに観察テーブルに登録されている値
【００５６】
（ステップＳ１１）
ＰＣ６０は、観察条件テーブルに登録された観察方法及び露光条件により、当該撮影ポイントにおける標本画像をカメラ２０で取得し、ＰＣ６０のメモリ６２に環境条件テーブルデータと関連付けて保存する。
【００５７】
（ステップＳ１２）
ＰＣ６０は、全てのポイントの撮影が終了したかを判定する。全てのポイント（今の場合５ポイント）の撮影が終了したらステップＳ１４へ進み、終了していない場合、ステップＳ１９へ進む。
【００５８】
（ステップＳ１９）
次の撮影ポイントの撮影を行うために、焦点維持装置４０は、ステップＳ１０で取得した補正値δＺを観察条件テーブルに登録されている次ポイントのＺ座標値に加える。
例えば、１ラウンド目のポイント１のＸＹＺ座標を（Ｘ１，Ｙ１，Ｚ１）とすると、ポイント２のＸＹＺ座標（Ｘ２，Ｙ２，Ｚ２）のＺ座標値Ｚ２には、ポイント１における補正値δＺ1を加えてポイント２のＸＹＺ座標を（Ｘ２，Ｙ２，Ｚ２＋δＺ1）に更新する。そしてポイント３のＸＹＺ座標（Ｘ3，Ｙ3，Ｚ3）のＺ座標値Ｚ3には、ポイント２における補正値δＺ2を加えてポイント３のＸＹＺ座標を（Ｘ3，Ｙ3，Ｚ3＋δＺ2）に更新する。
このような手順で、以後同様にステップＳ１０で得た補正値δＺを次のポイントにおけるＺ座標値に加えて該ポイントのＺ座標値を更新する。
【００５９】
（ステップＳ１３）
次のポイントの撮影位置に移動するため、ＰＣ６０は焦点維持装置４０を停止する。そしてＰＣ６０はステップＳ９へ戻り、ステップＳ９〜ステップＳ１２、ステップＳ１９、およびステップＳ１３を繰り返して全てのポイントの撮影を行う。
【００６０】
（ステップＳ１４）
ＰＣ６０は、全てのラウンドの撮影が終了したかを判定する。全てのラウンドの撮影が終了していればタイムラプス撮影を終了し、終了していない場合、ステップＳ１５へ進む。
【００６１】
（ステップＳ１５）
全てのラウンドの撮影が終了していないので、ＰＣ６０は、観察条件テーブルを参照して培養チャンバ３０内を設定された温度にするようにチャンバ温調コントローラ３５に指示し、チャンバ温調コントローラ３５は培養チャンバ３０内の温度を設定温度に変える制御を行う。そしてＰＣ６０は、次ラウンドの撮影時間になったか判定する。次ラウンドの撮影時間になっている場合、ステップＳ２０へ進み、なっていない場合、次ラウンドの撮影時間になるまでステップＳ１５で待機する。
【００６２】
（ステップＳ２０）
次のラウンドの撮影時間になったので、ＰＣ６０は、ステップＳ１０で取得した最後の撮影ポイントの補正値δＺを、観察条件テーブルに保存されている撮影ポイント１のＺ座標値に加え新たな観察条件テーブルとして更新する。
【００６３】
（ステップＳ１８）
次のラウンドの撮影時間になり観察条件テーブルの更新が終わったのち、ＰＣ６０は焦点維持装置４０を停止する。そしてＰＣ６０はステップＳ９へ戻り、ステップＳ９〜ステップＳ１８を繰り返して全てのラウンドの撮影を行う。
【００６４】
第２実施形態に係る顕微鏡システム１では、タイムラプス動作の各ラウンドの各ポイントにおいてＺ座標値の変化を計測し、計測した値から補正値δＺを得てこの補正値δＺを次のポイントのＺ座標値に加えて各ポイントのＺ座標値を更新するため、焦点引き込み動作時の各ポイントのＺ座標値が焦点引き込み範囲から外れないようにできるので、各ポイントにおいて焦点引き込み動作を確実に行うことができ、その後の焦点状態を維持することができる。
【００６５】
なお、第２実施形態に係る顕微鏡システムは、撮影時間が長く次ラウンドの撮影までの休止時間が短いタイムラプス撮影を行う場合に適している。例えば、撮影所要時間が２７分、時間間隔を３０分とすると、撮影を行っている２７分の間、各ポイントにおいて焦点維持装置４０を断続的に稼働しているため、その間の温度変化によってＺ座標値が大きく変化しても次の焦点引き込み時に確実に焦点引き込みを行うことが出来る。また、２番目以降のラウンドの最初のポイントのＺ座標値には直前のラウンドの最後のポイントで計測した補正値δＺを加えてＺ座標値を更新するため、次の焦点引き込み時に確実に焦点引き込みを行うことが出来る。
【００６６】
（第３実施形態）
次に、第３実施形態に係る顕微鏡システム１を用いてタイムラプス観察を行う場合の標本画像の取得手順について図４のフローを参照しつつ説明する。
【００６７】
第３実施形態に係る顕微鏡システム１は、第２実施形態のフローに第１実施形態のステップＳ１６を付加した点が異なっている。なお、第１、第２実施形態と同様のステップには同じ符号を付して説明する。
【００６８】
（ステップＳ１）
観察者は、ステージコントローラ１５によりステージ５をＸＹ方向に移動させ、また焦点維持装置４０の電動フォーカス機構を介して対物レンズ９をＺ方向に移動させて、チャンバ３０内に載置した培養容器３３内を探索して観察に適当な細胞を視野内に確保する。
【００６９】
（ステップＳ２）
観察者は、観察に適した細胞に対物レンズ９を合焦させたのち焦点維持装置４０を稼働させる。
【００７０】
（ステップＳ３）
観察者は、試料の所望の観察ポイントにおいて再度の合焦調整を焦点維持装置コントローラ４２のノブ４３を回し、焦点位置調節レンズの位置を調整する。焦点維持装置４０は、調整された焦点位置調節レンズ位置を記憶する。これにより、焦点維持装置４０は、電動フォーカス機構を駆動して、試料と培養容器３３との境界面と対物レンズ９の先端の距離を維持することが可能になる。
【００７１】
（ステップＳ４）
観察者は、透過観察や落射蛍光観察等の観察方法、カメラ２０の露光条件等を決定し、撮影ポイントを登録する。これにより、観察者は、ＰＣ６０を介して、撮影ポイントのＸＹＺ座標値、焦点位置調節レンズの位置、観察方法、カメラ２０の露光条件を観察条件としてメモリ６２の観察条件テーブルに記憶したことになる。
【００７２】
（ステップＳ５）
観察者は、ステップＳ３とＳ４の手順を繰り返すことで複数の撮影ポイントそれぞれの観察条件（ＸＹＺ座標、焦点位置調節レンズの位置、観察方法、カメラ２０の露光条件）をＰＣ６０のメモリ６２の観察条件テーブルに登録することができる。全ての撮影ポイントを観察条件テーブルに登録したらステップＳ６へ進む。以後、本実施形態では、撮影ポイントを５つ登録したものとして説明する。
【００７３】
（ステップＳ６）
観察者は、５つの撮影ポイント登録後、ＰＣ６０を介して焦点維持装置４０を一時停止する。
【００７４】
（ステップＳ７）
観察者は、タイムラプス撮影を行う時間間隔と、撮影開始から終了までの時間若しくは撮影回数（以後、ラウンドと記す）を入力してタイムラプス撮影条件を設定するとともに、培養チャンバ３０内の温度条件を設定して観察条件テーブルに記憶する。タイムラプス撮影条件は、例えば、撮影間隔を３０分、撮影開始から終了までの時間を２４時間に設定すると、４９ラウンドの撮影が設定される。温度条件は、例えば、始めの８時間は３７度を維持し、次の８時間は３２度を維持し、更にその次の８時間は３７度を維持するように、３０分の撮影間隔を隔てて５度の温度変化を交互に繰り返すように設定する。
【００７５】
（ステップＳ８）
観察者は、ＰＣ６０にタイムラプス撮影開始指示を与える。これにより、顕微鏡システム１のＰＣ６０はタイムラプス撮影制御を開始する。
【００７６】
（ステップＳ９）
ＰＣ６０は、メモリ６２の観察条件テーブルを参照して撮影ポイントの登録座標に基づいてステージ５及び対物レンズ９をそれぞれ駆動し、登録された撮影ポイントのＸＹＺ座標値へ移動する。このとき、焦点位置調節レンズも登録された位置に移動させる。
【００７７】
（ステップＳ１０）
ＰＣ６０は、焦点維持装置４０を稼働し、焦点維持装置４０に当該撮影ポイントで焦点引き込み動作を行うように指示をする。この指示により、焦点維持装置４０は、撮影ポイントのＺ座標と焦点位置調節レンズの位置データを使用して焦点引き込み動作を行い、焦点維持動作を実行する。焦点維持装置４０はフォーカス検出信号に基づいて電動フォーカス機構を駆動して対物レンズ９のＺ位置を修正し、修正したＺ座標値を当該撮影ポイントの新たなＺ座標値としてメモリ６２に保存された観察条件テーブルのＺ座標値データを更新するとともに、このときの補正値δＺを保存する。
補正値δＺ  ＝  撮影ポイントの撮影直前に更新したＺ座標値  
−  当該撮影ポイントのＺ座標値としてステップＳ９の撮影ポイントに移動したときに観察テーブルに登録されている値
【００７８】
（ステップＳ１１）
ＰＣ６０は、観察条件テーブルに登録された観察方法及び露光条件により、当該撮影ポイントにおける標本画像をカメラ２０で取得し、ＰＣ６０のメモリ６２に環境条件テーブルデータと関連付けて保存する。
【００７９】
（ステップＳ１２）
ＰＣ６０は、全てのポイントの撮影が終了したかを判定する。全てのポイント（今の場合５ポイント）の撮影が終了したらステップＳ１４へ進み、終了していない場合、ステップＳ１９へ進む。
【００８０】
（ステップＳ１９）
次の撮影ポイントの撮影を行うために、焦点維持装置４０は、ステップＳ１０で取得した補正値δＺを観察条件テーブルに登録されている次ポイントのＺ座標値に加える。
例えば、１ラウンド目のポイント１のＸＹＺ座標を（Ｘ１，Ｙ１，Ｚ１）とすると、ポイント２のＸＹＺ座標（Ｘ２，Ｙ２，Ｚ２）のＺ座標値Ｚ２には、ポイント１における補正値δＺ1を加えてポイント２のＸＹＺ座標を（Ｘ２，Ｙ２，Ｚ２＋δＺ1）に更新する。そしてポイント３のＸＹＺ座標（Ｘ3，Ｙ3，Ｚ3）のＺ座標値Ｚ3には、ポイント２における補正値δＺ2を加えてポイント３のＸＹＺ座標を（Ｘ3，Ｙ3，Ｚ3＋δＺ2）に更新する。
このような手順で、以後同様にステップＳ１０で得た補正値δＺを次のポイントにおけるＺ座標値に加えて該ポイントのＺ座標値を更新する。  
【００８１】
（ステップＳ１３）
次のポイントの撮影位置に移動するため、ＰＣ６０は焦点維持装置４０を停止する。そしてＰＣ６０はステップＳ９へ戻り、ステップＳ９〜ステップＳ１２、ステップＳ１９、およびステップＳ１３を繰り返して全てのポイントの撮影を行う。
【００８２】
（ステップＳ１４）
ＰＣ６０は、全てのラウンドの撮影が終了したかを判定する。全てのラウンドの撮影が終了していればタイムラプス撮影を終了し、終了していない場合、ステップＳ１５へ進む。
【００８３】
（ステップＳ１５）
全てのラウンドの撮影が終了していないので、ＰＣ６０は、観察条件テーブルを参照して培養チャンバ３０内を設定された温度にするようにチャンバ温調コントローラ３５に指示し、チャンバ温調コントローラ３５は培養チャンバ３０内の温度を設定温度に変える制御を行う。そしてＰＣ６０は、次ラウンドの撮影時間になったか判定する。次ラウンドの撮影時間になっている場合、ステップＳ２１へ進み、なっていない場合、ステップＳ１６へ進む。
【００８４】
（ステップＳ１６）
次ラウンドの撮影時間になっていないので、焦点維持装置４０は、最後のポイントの撮影終了後から次ラウンドの撮影開始までの間、この最後のポイントのＺ座標値の変化を焦点維持装置４０を介して測定してステップＳ１５へ戻る動作を次のラウンドの撮影時間になるまで繰り返す。
【００８５】
（ステップＳ２１）
次のラウンドの撮影時間になっているので、ＰＣ６０は、焦点維持装置４０を介して、ステップＳ１６で測定したＺ座標値から以下の補正値ΔＺを算出し、観察条件テーブルに保存されている撮影ポイント１のＺ座標値にこの補正値ΔＺを加え新たな観察条件テーブルとして更新する。
補正値ΔＺ  ＝  直前のラウンドにおける最後のポイント（ポイント５）の撮影直前に更新したＺ位置の座標値  −  新たに撮影を開始する本ラウンドの撮影開始直前の当該ポイント（ポイント５）のＺ位置の値。
例えば、１ラウンドでのポイント１のＸＹＺ座標を（Ｘ１，Ｙ１，Ｚ１）とすると、２ラウンドでのポイント１のＸＹＺ座標は（Ｘ１，Ｙ１，Ｚ１＋ΔＺ）となる。全てのラウンドが終了するまで同様に、ラウンド毎に最後の撮影ポイント終了後から次ラウンドの開始直前まで当該最後の撮影ポイントのＺ座標値の変化を計測し（ステップＳ１６）、この変化量から補正値ΔＺを算出して新たに撮影を開始するラウンドのポイント１のＺ座標値に加え更新後の観察条件テーブルとする。なお、新たに撮影を開始するラウンドの全てのポイントのＺ座標値に補正値ΔＺを加えて更新後の観察条件テーブルとしても良い。
【００８６】
（ステップＳ１８）
次のラウンドの撮影時間になり観察条件テーブルの更新が終わったのち、ＰＣ６０は焦点維持装置４０を停止する。そしてＰＣ６０はステップＳ９へ戻り、ステップＳ９〜ステップＳ１８を繰り返して全てのラウンドの撮影を行う。
【００８７】
第３実施形態に係る顕微鏡システム１では、タイムラプス動作の各ラウンドの各ポイントにおいてＺ座標値の変化を計測し、計測した値から補正値δＺを得てこの補正値δＺを次のポイントのＺ座標値に加えて各ポイントのＺ座標値を更新するため、焦点引き込み動作時の各ポイントのＺ座標値が焦点引き込み範囲から外れないようにできるので、各ポイントにおいて焦点引き込み動作を確実に行うことができ、その後の焦点状態を維持することができる。さらに、第３実施形態に係る顕微鏡システム１では、タイムラプス動作の各ラウンドの最後の撮影ポイントの撮影終了後から次ラウンドの撮影開始直前まで対物レンズ９のＺ座標値を焦点維持装置４０を介して計測し、計測した値から補正値ΔＺを得てこの補正値ΔＺを次ラウンドの最初のポイントのＺ座標値に加えてポイント１のＺ座標値を更新するため、次ラウンド開始時の最初のポイントの焦点引き込み動作時のＺ座標値が焦点引き込み範囲から外れないようにできるため、次ラウンド開始時の最初のポイントにおいて焦点引き込み動作を確実に行うことができるので、その後の焦点状態を維持することができる。
【００８８】
なお、ステップＳ１６において焦点維持装置４０を断続的に稼働して対物レンズ９のＺ座標値を計測するポイントは、最後のポイント（例えば、ポイント５）に限られずどこに設定しても良い。例えば、撮影ポイントとは異なる位置を計測ポイントとして登録し、この位置のＺ座標値の変化を計測するようにしても良い。このように撮影ポイントとは異なる位置に計測ポイントを設定することで、最後の撮影ポイントへの光毒性を回避することができる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１】
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