(57)【要約】      （修正有）【課題】医師による処置や薬剤投与を必要としないＡＣＡＣＡ発現抑制方法の提供。【解決手段】局所又は全身への温熱刺激を付与することを特徴とする脂肪組織におけるＡＣＡＣＡ発現抑制方法。標的の皮下脂肪組織部位の上部の皮膚が少なくとも３８℃以上の温度になるように、温熱負荷を３０分以上、好ましくは４０〜４３℃の温度になるように、温熱負荷を３０〜６０分間与えることにより、当該部位における脂肪酸合成が抑制される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
局所又は全身に温熱刺激を付与することを特徴とする脂肪組織におけるａｃｅｔｙｌ−Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  α発現抑制方法。
【請求項２】
局所又は全身に温熱刺激を付与することを特徴とする脂肪組織における脂肪酸合成抑制方法。
【請求項３】
脂肪組織が皮下脂肪組織である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記温熱刺激が、前記皮下脂肪組織の上部の皮膚に対する４０〜４３℃で３０〜６０分間の温熱負荷である請求項３記載の方法。
【請求項５】
痩身、又はダイエットを目的として行われるものである請求項１又は２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ａｃｅｔｙｌ−Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  α（ＡＣＡＣＡ、ＡＣＣ１）の発現抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物は、エネルギーの摂取と消費・蓄積のバランスを取りながら生命活動を営んでいる。ヒトの場合、食物の摂取によりエネルギー摂取を、恒常性の維持や運動によってエネルギー消費をしており、消費しきれないエネルギーは主に脂肪として蓄積されることが知られている。しかしながら、近年、食生活の欧米化や運動不足によって余剰エネルギーの割合が増加しており、これによって蓄積した脂肪が肥満や生活習慣病発症の原因になっている。したがって、脂肪蓄積を抑制することは肥満や生活習慣病の予防につながると考えられる。
【０００３】
生体内での脂肪組織は、その存在部位から内臓脂肪と皮下脂肪に分けられる。また、機能面からはエネルギー蓄積を担う白色脂肪組織（ＷＡＴ：Ｗｈｉｔｅ  Ａｄｉｐｏｓｅ  Ｔｉｓｓｕｅ）と、熱としてエネルギーを消費させる褐色脂肪組織（ＢＡＴ：Ｂｒｏｗｎ  Ａｄｉｐｏｓｅ  Ｔｉｓｓｕｅ）に分けられ、肥満・生活習慣病予防には白色脂肪組織を減らすことが重要である。
【０００４】
生体内に蓄積している脂肪の多くはグリセリンに３つの脂肪酸が結合したトリアシルグリセロールであるが、エネルギー蓄積の最初の過程は脂肪酸の合成である。摂取した炭水化物や脂質はエネルギーとして消費されるが、その余剰分はアセチルＣｏＡへと変換される。このアセチルＣｏＡを出発物質として、ここにマロニルＣｏＡが脱炭酸的に結合していく過程が脂肪酸合成経路であり、反応サイクルごとに炭素数が２個ずつ増加することで、任意の炭素鎖を持った脂肪酸が合成される。
【０００５】
脂肪酸合成経路は、ミトコンドリアと細胞質に存在する複数の酵素で構成されており、特に重要とされる酵素が、脂肪酸合成反応の律速段階とされるａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  α(ＡＣＡＣＡ、ＡＣＣ１)（非特許文献１及び２）と、脂肪酸合成経路のもっとも多くの反応を触媒する多機能分子ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ(ＦＡＳ、ＦＡＳＮ)である（非特許文献３）。
【０００６】
実際に、ＡＣＡＣＡの遺伝子発現を阻害した場合や、活性を抑制した場合には、脂肪酸合成が低下することが報告されている（非特許文献４及び５）。
【０００７】
また、脂肪細胞特異的にＡＣＡＣＡをノックアウトしたマウスでは、脂肪組織における新規の脂肪酸合成が減少するとともに、脂肪蓄積が抑制されることが報告されている（非特許文献６及び７）。さらに、ＡＣＡＣＡ阻害剤が、前駆脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化を抑制することも報告されている（非特許文献８）。
【０００８】
肝臓特異的にＡＣＡＣＡをノックアウトしたマウスでは、肝臓での脂肪酸合成と脂肪蓄積が抑制されることが報告されるとともに（非特許文献９）、ヒト培養肝細胞ＨｅｐＧ２ラット初代培養細胞においてもＡＣＡＣＡ阻害剤が脂肪酸合成を抑制することが報告されている（非特許文献１０）。
【０００９】
ＦＡＳＮについても、遺伝子発現を抑制すると、脂肪酸合成を含めた脂質代謝能が低下するほか、糖新生なども低下することが報告されている（非特許文献１１）。
【００１０】
また、マウス培養前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１のＦＡＳＮを阻害すると、成熟脂肪細胞への分化が抑制され、脂肪滴も減少することが報告されている（非特許文献１２及び１３）。
【００１１】
ＦＡＳＮは脂肪酸合成だけでなく、摂食への関与も知られており、ＦＡＳＮ阻害剤をマウスに投与すると、食欲増進に関与するホルモンが低下するとともに、実際に摂食量も減少することが報告されている（非特許文献１４）。
【００１２】
さらに、ＦＡＳＮはガン細胞に高発現していることが知られており、ＦＡＳＮを阻害することで、アポトーシスが誘導されることが報告されている（非特許文献１５）。
【００１３】
以上のように、ＡＣＡＣＡやＦＡＳＮは、多くの代謝過程に関与しているが、特に脂質代謝には深く関与しており、これらの分子を阻害することによる脂肪蓄積抑制法や肥満・生活習慣病治療法が提唱されている（非特許文献１６及び特許文献１）。また、食品成分などでもＡＣＡＣＡやＦＡＳＮを低減させることによる脂質合成阻害剤や、脂肪蓄積抑制剤、生活習慣病予防剤についての報告がなされている（特許文献２、３及び４）。
【００１４】
このようにＡＣＡＣＡやＦＡＳＮを阻害することは脂肪蓄積を抑制することになり、肥満や生活習慣病をはじめ、脂肪蓄積を起因とする様々な病態及び疾患（インスリン抵抗性、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、虚血性心疾患、等）の予防又は改善に有用であることが推測される。また、このような症状の改善又は予防方法として、薬剤などを使うことなく、簡易且つ安全に、ＡＣＡＣＡやＦＡＳＮを制御する方法の確立が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ／２００７／０９５６０１号パンフレット
【特許文献２】特開２０１０―５３１２２号公報
【特許文献３】特開２００４―３５９６２２号公報
【特許文献４】特開２００９―２４２３４２号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Donaldson WE. (1979) Fed Proc. 38: 2617-2621
【非特許文献２】Kim KH. (1997) Annu Rev Nutr. 17: 77-99
【非特許文献３】Stuart Smith, et. al. (2003) Progress in Lipid Research 42: 289-317
【非特許文献４】Joohun HA, Ki-Han Kim. (1994) Proc. Nadl. Acad. Sci. USA 91: 9951-9955
【非特許文献５】Jane E. Sullivan, et. al. (1994) FEBS Letters 353: 33-36
【非特許文献６】Jianqiang Mao, et. al. (2008) FASEB J. 22: 644.2
【非特許文献７】Jianqiang Mao, et. al. (2009) Proc Natl Acad Sci U S A. 106: 17576-17581
【非特許文献８】Levert, Keith L (2002) J. Biol. Chem. 277: 16347-16350
【非特許文献９】Jianqiang Mao, et. al. (2006) Natl Acad Sci U S A. 103: 8552-8557
【非特許文献１０】Sugimoto Y, et. al. (2007) Arch Biochem Biophys. 468: 44-4
【非特許文献１１】Lynn M Knowles, Jeffrey W Smith (2007) BMC Genomics 8: 168
【非特許文献１２】Bernhard Schmida, et. al. (2005) Biochem Biophys Res Commun. 328: 1073-1082
【非特許文献１３】Liu LH, et. al. (2004) Acta Pharmacol Sin. 25: 1052-1057
【非特許文献１４】Su Gao , M. Daniel Lane (2003) Proc Natl Acad Sci U S A. 100：5628-5633
【非特許文献１５】Puig T, et. al. (2009) Clin Cancer Res. 15: 7608-7615
【非特許文献１６】Waldrop G.L , Stephens J.M. (2003) Current Medicinal Chemistry - Immunology, Endocrine & Metabolic Agents. 3： 229-234
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、簡便、安全、且つ効果的に脂肪酸合成に関与するａｃｅｔｙｌ−Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  α（ＡＣＡＣＡ）を抑制する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、脂肪組織への脂肪蓄積を防止するための手段として脂肪酸合成経路に着目し、脂肪酸合成を抑制する方法について検討したところ、生体に安全な温度で温熱刺激を与えることにより、ＡＣＡＣＡの発現を抑制することによって脂肪酸合成を抑制することができることを見出した。
【００１９】
すなわち、本発明は以下の１）〜４）の発明に係るものである。
１）局所又は全身に温熱刺激を付与することを特徴とする脂肪組織におけるａｃｅｔｙｌ−Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  α発現抑制方法。
２）局所又は全身に温熱刺激を付与することを特徴とする脂肪組織における脂肪酸合成抑制方法。
３）脂肪組織が皮下脂肪組織である１）又は２）記載の方法。
４）上記温熱刺激が、上記皮下脂肪組織の上部の皮膚に対する４０〜４３℃で３０〜６０分間の温熱負荷である３）記載の方法。
５）痩身、又はダイエットを目的として行われるものである請求項１又は２記載の方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の方法は、生体への負荷が小さく、医師による処置や薬剤投与を必要とせず、一般市民やエステシャン等が容易に実施できる。従って、本発明によれば、簡易且つ安全に、局所もしくは全身の脂肪組織におけるＡＣＡＣＡの発現を抑制することができる。
また本発明の方法によれば、ＡＣＡＣＡの発現抑制を通して脂肪酸合成を低下させ、皮下脂肪など局所の脂肪や全身性の脂肪の減少を図ることができ、さらに肥満や脂肪蓄積に起因して発症する種々の病態の予防又は改善を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】温熱刺激を負荷したＢＡＴにおけるＡＣＡＣＡ、ＦＡＳＮの遺伝子発現を示す図。
【図２】温熱刺激を負荷したＷＡＴにおけるＡＣＡＣＡ、ＦＡＳＮの遺伝子発現を示す図。
【図３】温熱刺激を負荷したＢＡＴ及びＷＡＴにおけるＡＣＡＣＡ、ＦＡＳＮのタンパク質発現を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の脂肪組織におけるａｃｅｔｙｌ−Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  α（ＡＣＡＣＡ）発現抑制方法は、脂肪組織における脂肪酸合成の低下を通して、局所的な皮下脂肪の減少や、肥満又は脂肪蓄積に起因して引き起こされる症状の予防又は改善を図るものであり、医療目的以外の目的、主に痩身、又はダイエットを目的として行われるものであって、いわゆる医療行為を含むものではない。
【００２３】
後記実施例に示すとおり、マウスに温熱刺激を与えることにより、褐色脂肪組織（ＢＡＴ：Ｂｒｏｗｎ  Ａｄｉｐｏｓｅ  Ｔｉｓｓｕｅ）および白色脂肪組織（ＷＡＴ：Ｗｈｉｔｅ  Ａｄｉｐｏｓｅ  Ｔｉｓｓｕｅ）のＡＣＡＣＡの遺伝子発現及びタンパク質発現が低下する。従って、温熱刺激により、生体内の脂肪組織における脂肪酸合成の低下、ひいては脂肪蓄積抑制及び肥満等の予防又は改善を図ることできる。
【００２４】
本発明に用いる温熱刺激としては、ヒト又は動物の局所、すなわちＡＣＡＣＡの発現抑制を望む部位（臓器・器官・組織）、もしくは全身に外部から温熱負荷を与えるのが好ましい。上記部位としては、皮下脂肪、内臓脂肪等の脂肪組織が好ましく、皮下脂肪組織がより好ましい。例えば、ヒトの皮下脂肪組織にてＡＣＡＣＡの発現を抑制する場合、標的の皮下脂肪組織部位の上部の皮膚が少なくとも３８℃以上の温度になるように、温熱負荷を３０分以上、好ましくは４０〜４３℃の温度になるように、温熱負荷を３０〜６０分間与えるのがよい。ＡＣＡＣＡの発現抑制を望む部位でＡＣＡＣＡの発現を抑制することにより、当該部位における脂肪酸合成が抑制される。
【００２５】
温熱刺激は、最低１週間に１回、好ましくは３日に１回、更に好ましくは毎日とし、この温熱刺激を１回もしくは複数回繰り返すことにより行うことができる。
【００２６】
温熱刺激は、ヒト又は動物の局所又は全身に上述した温度又は時間で温熱負荷することが可能な温熱負荷手段を用いて行えばよい。温熱負荷手段は特に限定されないが、好適には、熱量や温度が制御可能な既存の温熱負荷装置又は器具を用いればよい。
【００２７】
温熱負荷装置又は器具の熱源は、通常ガス、電気等であり、熱源で作られた熱の搬送手段は、パイプ、電線等が挙げられる。これらの熱をヒト、動物等に伝える媒体としては、気体、液体、伝熱性のある固体等が挙げられる。例えば、温熱負荷装置が、電源を必要とするエアーインキュベーターである場合、電気により発生させた熱をパイプで搬送し、生体に熱を伝えればよい。また、電熱線を内蔵した発熱機能を有するベルト等も好適に用いることができる。さらに、超音波振動や、マイクロ波による温熱負荷等も、本発明の温熱負荷法として用いることができる。
また、熱を発生する市販の温熱カイロ類や温熱貼布剤、蒸気温熱貼布剤等を用いることもできる。
【実施例】
【００２８】
試験動物はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６週齢オス）（日本クレア）を用いた。試験開始前の１週間、室温２３±２℃、湿度５５±１０％、１２時間の明暗サイクル（明期；ＡＭ７：００〜ＰＭ７：００）下で予備飼育した。尚、飼育期間中、すべてのマウスに、ＣＥ−２固形食（日本クレア）を自由摂食させるとともに、水道水を自由飲水させた。
【００２９】
１週間の予備飼育後、平均体重が等しくなるように、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを非加温群と加温群の２群に分けた。加温群のマウスは、４１℃のヒートチャンバーに１時間入れることで温熱刺激を与え、その刺激から１２時間後に解剖を行い(Ｎ＝４)、肩甲骨間白色脂肪（ＷＡＴ）と、肩甲骨間褐色脂肪（ＢＡＴ）を採取した。非加温群はコントロールとし、温熱刺激を与えずに１２時間後に解剖を行い(Ｎ＝４)、ＷＡＴとＢＡＴを採取した。温熱刺激による脱水症状を避けるため、加温群のマウスは、ヒートチャンバー内で４１℃の水を自由摂取できるようにした。採取した脂肪組織はただちに液体窒素に入れ、ＲＮＡまたはタンパク質の抽出を行うまで、−８０℃で保存した。
【００３０】
凍結した組織からの全ＲＮＡ抽出には、ＩＳＯＧＥＮ(ニッポンジーン)を用い、添付のマニュアルに従って行った。調製した全ＲＮＡは濃度をそろえ、６５℃、１０分間の熱処理を行い、急冷後に使用した。逆転写には、１２５ｎｇ相当のＲＮＡを使用し、これを２０μｌの酵素液（１×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  II（Ｒｏｃｈｅ）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2（Ｒｏｃｈｅ）、１ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）、２．５ｍＭ  Ｏｌｉｇｏ  ｄ（Ｔ）１８  ｍＲＮＡ  ｐｒｉｍｅｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、１Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ）、０．２６Ｕ/μｌ  ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＸＬ（Ｔａｋａｒａ））と混合して反応液を調製した。反応は４２℃、６０分→５２℃、３０分→９９℃、５分→４℃で行い、得られたｃＤＮＡは、使用時まで−２０℃で保存した。また、同様の凍結組織から抽出した５００ｎｇのＲＮＡを、定量的ＰＣＲのスタンダードとして使用し、同様の反応系で逆転写を行った。
【００３１】
逆転写反応によって得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７５００  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて定量的ＰＣＲを行った。スタンダード用ｃＤＮＡを７段階希釈したものをスタンダードとして、作成した標準曲線に基づき、ＡＣＡＣＡ遺伝子とＦＡＳＮ遺伝子の定量を行った。得られた解析結果は３６Ｂ４の発現量を内部標準として補正し、相対的ｍＲＮＡ発現量として表した。反応液は、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）２５μｌ、１００μＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  １μｌ、１００μＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  １μｌ、ＵｌｔｒａＰｕｒｅ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  Ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２２μｌ、ｃＤＮＡ  １μｌ、となるように調製した。定量的ＰＣＲの温度条件は５０℃２分、９５℃１０秒の後、９５℃１５秒と６０℃１分の反応を４０サイクル繰り返した。
以下に、定量的ＰＣＲで用いたプライマーの配列を示す。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
試験結果は、非加温群の遺伝子発現量を１とした相対平均を求め、平均値±標準偏差(Ａｖｅｒａｇｅ（Ａｖｅ）±ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ（ＳＤ）)で表した。また、有意差検定は各時点の非加温群と加温群の間でｔ−ｔｅｓｔを行い、ｐ値が０．０５未満のものを統計学的有意差があるとした。
【００３４】
遺伝子発現の解析結果から、温熱刺激によりＢＡＴにおけるＡＣＡＣＡの発現が有意に低下するとともに、ＦＡＳＮの遺伝子発現に低下傾向が認められた（図１）。また、ＷＡＴにおいても同様の結果が得られており、温熱刺激によるＡＣＡＣＡの有意な発現低下と、ＦＡＳＮの発現に低下傾向が認められた（図２）。脂肪酸合成の律速酵素であるＡＣＡＣＡとともに、もっとも多くの脂肪酸合成過程に関与するＦＡＳＮの遺伝子発現が減少したことから、温熱刺激により遺伝子レベルで脂肪酸合成系が抑制されていると考えられた。
【００３５】
また、以下の手順で、ウエスタンブロッティング法にてＡＣＡＣＡタンパク質及びＦＡＳＮタンパク質の発現解析を行った。
Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  ｓｅｔ  III（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）を添加したＣｅｌＬｙｔｉｃ  ＭＴ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｌｙｓｉｓ／Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＳＩＧＭＡ）内で、凍結保存していた脂肪組織をホモジナイズし、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、４℃、１０分）後、上清を回収した。各タンパク質濃度をＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）にて測定し、全ての濃度を１．５μｇ／μｌに合わせた。各サンプル２０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（レディーゲル５−１５％  ＢｉｏＲａｄ）にて分離後、Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写した。作製したメンブレンを２％のＭｅｍｂｒａｎｅ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にてブロッキングし、その後、表２に示す１次抗体と９０分間反応させた。メンブレンを洗浄後、Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ，ＨＲＰ  ｌｉｎｋｅｄ  Ｆ2  ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と９０分間反応させ、再びメンブレンを洗浄後、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて目的タンパク質の検出を行った。
【００３６】
【表２】
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【００３７】
遺伝子発現変化と同様に、温熱刺激によりタンパク質レベルでもＢＡＴおよびＷＡＴにおけるＡＣＡＣＡの低下が認められ、ＦＡＳＮについても温熱刺激よるわずかな低下が認められた。（図３）。このことから、温熱刺激はタンパク質レベルでも脂肪酸合成を抑制していると考えられた。
【００３８】
以上の結果から、ＷＡＴおよびＢＡＴにおいて、温熱刺激は脂肪酸合成の律速酵素であるＡＣＡＣＡの発現を有意に低下させ、さらにＦＡＳＮの発現についても低下させることが示された。このことから、温熱刺激は皮下脂肪における脂肪酸合成を抑制することが示唆された。したがって、温熱刺激は、脂肪酸合成抑制を介して生体における脂肪蓄積を抑制する効果を有しており、肥満や生活習慣病の予防又は改善に有効であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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