(57)【要約】【課題】金属焼結フィルタを備えたカラムを使用する場合に必要であった、使用前に蛋白質等をカラムに注入するか、又は、シリコン等によって金属焼結フィルタを被覆する等してフィルタ中に存在する非特異的相互作用点（吸着点）を封止する操作を省略し得るフィルタ及びカラムを提供する。【解決手段】直径０．０１〜２ｍｍの糸を織ってなる、液体クロマトグラフ用のカラムフィルタ又はかかるフィルタを装備したカラムにより、前記課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
直径０．０１〜２ｍｍの糸を織ってなる、液体クロマトグラフ用のカラムフィルタ。
【請求項２】
前記フィルタは、その細孔径が０．１〜１００μｍであることを特徴とする、請求項１に記載のカラムフィルタ。
【請求項３】
前記フィルタは、金属糸を織ってなることを特徴とする、請求項１又は２に記載のカラムフィルタ。
【請求項４】
前記フィルタは、フッ素系化合物を用いる撥水処理を施されていることを特徴とする、請求項１乃至３記載のカラムフィルタ。
【請求項５】
直径０．０１〜２ｍｍの糸を織ってなる、液体クロマトグラフ用のカラムフィルタを装備した、液体クロマトグラフ用カラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラム用カラムフィルタに関するものである。本発明は、特にヘモグロビン類を液体クロマトグラフィーで分離する際に好適に用いられるカラムフィルタ及び該カラムフィルタを装備した液体クロマトグラフ用カラムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィーは種々の成分の分析に利用されている。例えば血中に存在する生体高分子である蛋白質の分析等が例示でき、その代表的な例として、例えば糖尿病の診断指標である糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）や胎児性ヘモグロビン（ＨｂＦ）等の等のヘモグロビンの分析に好適に用いられている。
【０００３】
液体クロマトグラフィーによって上記のような生体高分子等を短時間に、かつ、正確に分析するためには、高い分離性能を有する液体クロマトグラフ用カラムを用いる必要がある。液体クロマトグラフ用カラムには、分析対象である生体高分子の分離のために適切な分離剤を充填するが、カラムからの分離剤が漏れることを防止するため、カラムの端にはフィルタを設ける。カラムフィルタとして、従来、ＳＵＳやチタン等の金属を焼結して製造した金属焼結フィルタや樹脂製のフィルタが利用されているが、液体クロマトグラフィーでは、カラム圧力が高いためフィルタには高い耐圧性が求められるとともに、通液性が良好であること等も求められる。かかる観点から、高い耐圧性と良好な通液性を有する金属焼結フィルタが液体クロマトグラフ用フィルタとして、従来多用されている（例えば特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平７−２６０７６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、金属焼結フィルタは耐圧性や通液性においては上記要求を満たすものの、金属表面性が大きいことによってヘモグロビン等の生体高分子と非特異的な相互作用を生じてしまう（非特異的に吸着してしまう）、又は、その製造過程で発生するカーボン残留物がヘモグロビン等の生体高分子非特異的に相互作用してしまう（非特異的に吸着してしまう）という課題がある。この課題を解決するために、金属焼結フィルタを備えたカラムを使用する場合は使用前に蛋白質等をカラムに注入するか、又は、シリコン等によって金属焼結フィルタを被覆する等してフィルタ中に存在する非特異的相互作用点（吸着点）を封止する操作を行う必要があった。
【０００６】
ところが、使用前に蛋白質等をカラムに注入して非特異的相互作用点（吸着点）を封止する操作を行うと、この蛋白質等の変性による充填剤の劣化を防止するためにカラムを冷所保存する必要が生じ、またそのように保存したとしても、実際の分析によって蛋白質等の変性が生じるためカラム（充填剤）の交換を頻繁に行う必要がある。シリコン等によって金属焼結フィルタを被覆する等してフィルタ中に存在する非特異的相互作用点（吸着点）を封止する操作を行った場合、シリコンは塩基性溶離液に腐食されやすいことから、かかるフィルタを備えたカラムを使用する場合は塩基性溶離液を使用し難い。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、金属焼結フィルタに代表される従来の液体クロマトグラフ用カラムフィルタの課題を解決すべく、鋭意検討を行った結果、本発明を完成した。即ち本発明は、上記従来技術の課題を解決し、ヘモグロビン等の生体高分子と非特異的な相互作用を生じない、液体クロマトグラフ用カラムフィルタであり、直径０．０１〜２ｍｍの糸を織ってなる、液体クロマトグラフ用のカラムフィルタである。かかるフィルタは、好ましくはその細孔径が０．１〜１００μｍである。またかかるフィルタは、好ましくは金属糸を織ってなるものである。更にかかるフィルタは、好ましくはフッ素系化合物を用いる撥水処理を施されたものである。そして本発明は、上記したようなカラムフィルタを装備した、液体クロマトグラフ用カラムである。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明の液体クロマトグラフ用カラムフィルタ（以下、単に「フィルタ」ということがある）は、液体クロマトグラフ用カラムの端に取付け、カラムに充填した充填剤がカラム外に漏れることを防止すると共に、異物を含む試料が注入された場合にこの異物がカラム内部に入り込まないようにするためのものである。本発明のカラムフィルタは、直径０．０１〜２ｍｍの糸を織って製造された、いわゆるメッシュフィルタであれば特に制限はなく、その寸法、形状又は厚さ等は、カラムフィルタを適用しようとする液体クロマトグラフ用カラムの端部の形状・寸法、カラムを使用する条件（分析対象や送液圧力等）に応じて適切なサイズ（形状、厚みを含む寸法等）や材質のものを選択すれば良い。糸の織り方については格子状等、特に制限はなく、またメッシュのサイズ、即ちフィルタの細孔径は、カラムに充填する充填剤が通過しない径であれば特に制限されず、一例を挙げれば、０．２〜１００μｍ程度である。
【０００９】
本発明のメッシュフィルタを構成する糸としては、例えば金属製、樹脂製等種々の材質のものを例示できるが、金属製の糸が特に好ましい。かかる金属としては、例えば、アルミニウム、鉄、銅、ＳＵＳ、チタン等といった、分離対象である生体高分子と反応せず、またその分離に際して使用する溶離液とも反応しない金属の糸を選択して使用することが例示できる。
【００１０】
以上に説明した本発明のカラムフィルタは、特に好ましくはフッ素系化合物を用いる撥水処理を施されたものである。撥水処理によって金属焼結フィルタ中の非特異的相互作用（吸着）を封止することが可能であり（特願２０１０―１２８５２７号）、その効果は本願のカラムフィルタに対しても同様であると考えられる。撥水処理に使用するフッ素化合物としては、撥水処理するカラムフィルタの表面に単分子膜を形成し得るものであれば良く、例えば市販のフッ素系撥水処理剤であるノベックＥＧＣ-１７２０（商品名、住友３Ｍ（株）製）を使用することが例示できる。そして、当該フッ素化合物を用いる撥水処理は、例えばフッ素化合物の溶液中にカラムフィルタを常温下で５分程度浸漬後、室温乃至６０℃程度で乾燥させる、また例えばフッ素化合物の溶液を塗布後、室温で乾燥させることを例示できる。なお、フィルタの細孔内部に渡って撥水処理を十分に行うために、フッ素化合物の溶液中にカラムフィルタを浸漬した状態で５分程度超音波処理することが特に好ましい。
【００１１】
本発明は、以上に説明したカラムフィルタを装備した液体クロマトグラフ用カラムである（以下単に「カラム」ということがある）。本発明のカラムは、単にカラムの端にフィルタを取り付けただけで、後に使用者が分析対象に応じて適宜選択した充填剤を充填し得る状態のカラム（即ち内部が空のもの）に限られず、その内部に充填剤を充填した状態のものも含む。充填剤は分析対象に応じて適宜選択することが可能であり、生体高分子である蛋白質を分析に用いられる、陽イオン交換クロマトグラフィ−、陰イオン交換クロマトグラフィ−又はサイズ排除クロマトグラフィ−に利用される充填剤を充填することが例示できる。また例えば分析対象がヘモグロビン（糖化ヘモグロビン）である場合には、例えば陽イオン交換樹脂といった充填剤を充填することが例示できる。なお、カラムへのフィルタの取り付けは、カラムエンドと呼ばれる金具を用いる通常の方法に従えば良い。
【００１２】
参考のため、本発明のカラムを用いたヘモグロビンの分離方法について、以下、説明する。液体クロマトグラフィーに供する血液試料は、既知の抗凝固剤を封入した採血管等を用いて採取される。既知の抗凝固剤としては、ヘパリンナトリウム、ヘパリンリチウム、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸二カリウム、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸三カリウム、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸二ナトリウム、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸三ナトリウム、フッ化ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウムなどが例示できる。
【００１３】
このようにして採取した血液試料に対し、精製水もしくは界面活性剤などを含む水溶液を加え、試料中の赤血球を溶血させる。溶血後の試料（溶血試料）は、例えば定流量ポンプ、サンプル注入器（インジェクタ）、検出器及び本発明のカラムを備えた装置に供され、ヘモグロビンの種類毎に分離され、測定される。前記したような装置では、例えば２種類の溶出液（ＡとＢ；ＢはＡよりもヘモグロビンの溶出力を強くする）を用い、これらを定流量ポンプによって混合して分離カラムに供することでリニアグラジエント法又はステップグラジエント法によって経時的に溶出液の溶出力を高めることができる。この方法では、ヘモグロビンをカラムの充填剤表面で電荷の差により、多種の成分に分離することができる。例えば３種類の溶出液を用い、これらを順次切り替えるステップグラジエント法を実施しても良い。なお、前記した溶出力を強める方法としては、溶出液のイオン濃度やｐＨを変化させる方法が知られている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、従来技術の課題を解決し、ヘモグロビン等の生体高分子と非特異的な相互作用を生じないカラムフィルタが提供される。即ち、本発明が提供する、糸を織ってなるいわゆるメッシュフィルタによれば、金属焼結フィルタ等が本来有している有益な特性、即ち、高い耐圧性と良好な通液性を保持したまま、非特異的相互作用（吸着）を封止することができる。特に金属の糸を織ってなる本発明のカラムフィルタは、耐圧性、通液性そして非特異的吸着作用の封止効果に優れ、特に好ましい形態である。また更に、本発明のカラムフィルタにフッ素系化合物を用いて撥水処理をした場合には、非特異的吸着作用の封止効果を更に向上することが可能である。
【００１５】
また本発明のカラムフィルタによれば、使用前に蛋白質等をカラムに注入する必要がある、またその使用に際して塩基性溶離液を使用し難い、という従来の課題を解決することも可能となる。
【００１６】
このように本発明によれば、使用前に蛋白質等をカラムに注入する等という、従来実施していた手間のかかる作業を省くことができ、更に、かかる作業のために費やしていた貴重な生体高分子である蛋白質等を節約することも可能である。また、使用前に蛋白質等をカラムに注入した場合には保存や搬送を冷所で行うという注意が必要であったが、本発明では特に冷所で保存や搬送を行う必要はなく、使用や搬送に際しての制限を軽減することができる。
【００１７】
なお、前記した通り、特に高い耐圧性を実現するためには金属の糸を織ったものを使用することが好ましいが、さほど高い耐圧性を必要としない場合、金属以外の材質の糸を織ったカラムフィルタであっても、良好な通液性を保持させたまま非特異的相互作用（吸着）を封止する、という効果を達成することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、実施例１の結果を示す図である。図中、横軸は試料を装置にインジェクト（注入）した回数、即ち測定回数を示し、縦軸は測定結果（黒丸はＨｂＦの割合（％）、白丸はＨｂＡ１ｃの割合（％））を示す。
【図２】図２は、参考例１の結果を示す図である。図中、横軸は試料を装置にインジェクト（注入）した回数、即ち測定回数を示し、縦軸は測定結果（黒丸はＨｂＦの割合（％）、白丸はＨｂＡ１ｃの割合（％））を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。この実施例では、本発明のカラムとして、本発明のフィルタを備えたカラム内部にスルホン基をイオン交換基として有する非多孔性イオン交換樹脂を充填したカラムを使用した。この本発明のカラムを、市販の糖化ヘモグロビン分析装置（東ソー(株)製造、ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＶ）に取り付けて実施例に示した操作を行った。この市販の装置は、定流量ポンプ、サンプル注入器（インジェクタ）、検出器等に加えて、脱気装置、グラジエント制御可能なポンプ、ミキサ、カラムオーブンを備え、３種類の溶出液（東ソー（株）製、ＨＳｉ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｎｏ．１、Ｎｏ．２及びＮｏ．３）を用い、これらを定流量ポンプによって混合して分離カラムに供することでリニアグラジエント法又はステップグラジエント法によって経時的に溶出液の溶出力を高めるものである。
【００２０】
なお、実施例においてカラムに供した試料は、市販ヘモグロビン精度管理用試薬（東ソー(株)製、東ソーＨｂＡ１ｃコントロール  ＨＳｉ）を蒸留水０．５ｍｌに溶解したヘモグロビン溶解液１に対し、蒸留水を５０の割合で加え、１０秒間攪拌して溶血した試料である。
【実施例】
【００２１】
実施例１
サイズが４．６ｍｍＩ．Ｄ．×３．５ｃｍのカラムに、ＳＵＳ製の糸を織って製造したメッシュフィルタを取り付け、非多孔性イオン交換樹脂（東ソー（株）製、商品名ＳＰ−ＮＰＲ）を充填し、蛋白質の注入による吸着点の封止処理なしに、上記装置に装着した。なお、使用したフィルタは細孔径２μｍのものを使用し、ＳＵＳ製の糸の直径は電子顕微鏡で確認したところ、０．０３ｍｍでであった。
【００２２】
試料を前記装置に供して胎児性ヘモグロビン（ＨｂＦ）及び糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を分離し、その割合（％）を測定する操作を１０回繰り返した。結果を図１に示す。図１からは、胎児性ヘモグロビン（ＨｂＦ）及び糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）ともに、第１回目の測定から最後（１０回目）の測定まで、終止安定した測定結果が得られていることがわかる。
【００２３】
参考例１
実施例１と同一のカラムに、市販カラムの焼結フィルタ（巴製作所製）を取り付け、実施例１と同様の操作を行った。結果を図２に示す。図２からは、実施例１の結果と比較すると、測定間で不安定な測定結果しか得られていないことがわかる。
【図１】
2012037421.tif 000002
【図２】
2012037421.tif 000003