(57)【要約】      （修正有）【課題】ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１におけるＧ２６７７Ａ／Ｔ変異を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブ、これを用いる多型検出方法、および薬効評価方法、ならびに多型検出用キットを提供する。【解決手段】ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１における多型検出用プローブを、特定の塩基配列において、２８８〜３００番目の塩基を含む塩基長１３〜６８の塩基配列に相補的な配列又は該相補配列に相同な配列を有し、２８８番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、および、特定の塩基配列において、３００〜３０５番目の塩基を含む塩基長６〜９３の塩基配列に相補的な配列又は該相補配列に相同な配列を有し、３０５番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチドから選ばれる少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドを含んで構成する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記Ｐ１およびＰ２からなる群から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む、ＭＤＲ１遺伝子の多型検出用プローブ：
（Ｐ１）配列番号２に示す塩基配列において、２８８〜３００番目の塩基を含む塩基長１３〜６８の塩基配列に相補的な配列又は該相補配列に相同な配列を有し、２８８番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、および、
（Ｐ２）配列番号２に示す塩基配列において、３００〜３０５番目の塩基を含む塩基長６〜９３の塩基配列に相補的な配列又は該相補配列に相同な配列を有し、３０５番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記Ｐ１のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基を３’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に有し、
前記Ｐ２のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基を５’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に有する、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
【請求項３】
前記Ｐ１のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基を３’末端に有し、
前記Ｐ２のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基を５’末端に有する、請求項１または請求項２に記載の多型検出用プローブ。
【請求項４】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、相補配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、相補配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少または増加する、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項５】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、相補配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、相補配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少する、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項６】
前記Ｐ１のオリゴヌクレオチドの塩基長が１３〜５６であり、前記Ｐ２のオリゴヌクレオチドの塩基長が６〜２９である、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項７】
前記Ｐ１のオリゴヌクレオチドの塩基長が１３〜２６であり、前記Ｐ２のオリゴヌクレオチドの塩基長が６〜２３である、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項８】
前記Ｐ１のオリゴヌクレオチドの塩基長が１３〜２１であり、前記Ｐ２のオリゴヌクレオチドの塩基長が６〜１８である、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項９】
融解曲線分析用のプローブである、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項１０】
配列番号２に示す塩基配列における３００番目の塩基に相補的な塩基が互いに異なり、前記相補的な塩基がＣ、ＴまたはＡである少なくとも２種の蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項１１】
請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の多型検出用プローブを用いるＭＤＲ１遺伝子の多型検出方法。
【請求項１２】
（Ｉ）請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の多型検出用プローブおよび試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ることと、
（ＩＩ）前記ハイブリッド形成体を含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を評価することと、
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、ＭＤＲ１遺伝子における多型の存在を評価することと、
を含む、請求項１１に記載の多型検出方法。
【請求項１３】
さらに、前記（Ｉ）の前または（Ｉ）と同時に核酸を増幅することを含む、請求項１１または請求項１２に記載の多型検出方法。
【請求項１４】
配列番号１に示す塩基配列における２５６番目の塩基の変異を検出可能な多型検出用プローブと、前記試料中の一本鎖核酸とを接触させることをさらに含む、請求項１１〜請求項１３のいずれか１項に記載の多型検出方法。
【請求項１５】
前記配列番号１に示す塩基配列における２５６番目の塩基の変異を検出可能な多型検出用プローブは、配列番号１に示す塩基配列において、２４８番目の塩基から始まる９〜５０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有する蛍光標識オリゴヌクレオチドである、請求項１４に記載の多型検出方法。
【請求項１６】
請求項１１〜請求項１５のいずれか１項に記載の多型検出方法により、ＭＤＲ１遺伝子における多型の検出結果を得ることと、
前記多型の検出結果に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を評価することと、
を含む、薬剤の薬効評価方法。
【請求項１７】
請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の多型検出用プローブを含む、多型検出用キット。
【請求項１８】
配列番号２に示す塩基配列において、前記Ｐ１またはＰ２のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を鋳型として増幅可能なプライマーをさらに含む、請求項１７に記載の多型検出用キット。
【請求項１９】
配列番号１に示す塩基配列において２４８番目の塩基から始まる９〜５０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有する蛍光標識オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１７または請求項１８のいずれか１項に記載の多型検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効評価方法、および多型検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
多剤耐性遺伝子ＭＤＲ１（ＡＢＣＢ１）は、さまざまな薬剤のトランスポーターであり、ジゴキシンをはじめとする様々な薬剤の体内動態を規定している。
エクソン２６の３４３５番目のＣがＴに置換する変異（Ｃ３４３５Ｔ変異）が存在すると、ＭＤＲ１遺伝子に由来するＰ糖タンパク質の発現量が変動し、様々な薬剤の体内動態が変化すると言われている（例えば、非特許文献１参照)
【０００３】
またＭＤＲ１遺伝子に由来するＰ糖タンパク質の発現量は、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１の２６７７番目のＧがＡまたはＴに置換する変異（Ｇ２６７７Ａ／Ｔ変異）によっても影響を受けることが知られている。さらに上記Ｃ３４３５Ｔ変異とＧ２６７７Ａ／Ｔ変異は高率で同時に起こることが知られている。
【０００４】
Ｃ３４３５Ｔ変異の検出方法として、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６の３４３５番目の塩基を含む部分を増幅するよう設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、３４３５番目の塩基における変異の有無で切断の有無が分かれるような制限酵素で切断し、その後電気泳動で切断されたかどうかを検出するという方法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法）が知られている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００５】
またＣ３４３５変異およびＧ２６７７Ａ／Ｔ変異を検出する方法として、Ｃ３４３５変異をＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によって検出し、Ｇ２６７７Ａ／Ｔ変異をシークエンス解析法によって検出する方法が知られている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００６】
一方、変異を含む領域をＰＣＲ法で増幅した後、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて塩基配列の変異を解析する方法が知られている（例えば、非特許文献４、特許文献１参照）。
さらに上記と同様の核酸プローブを用いたＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６におけるＣ３４３５Ｔ変異の検出方法が知られている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−１１９２９１号公報
【特許文献２】特許４４５４３６６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ.、２０００年、第９７巻、第７号、ｐ．３４７３−３４７８
【非特許文献２】Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．、２０１０年、第９巻、第１号、ｐ．３４−４０
【非特許文献３】Ｂｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍｃｏｌ．、２００５年、第５９巻、第３号、ｐ．３６５−３７０
【非特許文献４】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、２０００年、第４６巻、第５号、ｐ．６３１−６３５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、非特許文献２、３に記載されたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法では、ＰＣＲ反応後に増幅産物を取り出して制限酵素処理を行う必要がある。そのため、増幅産物が次の反応系に混入する恐れがあり、これに起因して偽陽性、偽陰性の結果が得られてしまう場合がある。さらに、ＰＣＲ終了後、制限酵素で処理を行い、その後電気泳動を行うため、検出までに必要な時間も非常に長くなってしまう場合がある。また、操作が複雑なため、自動化が困難である。
【００１０】
また特許文献２に記載された技術では、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６におけるＣ３４３５Ｔ変異を検出することはできても、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１におけるＧ２６７７Ａ／Ｔ変異を検出することはできなかった。
【００１１】
本発明は、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１におけるＧ２６７７Ａ／Ｔ変異を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブ、これを用いた多型検出方法および薬効評価方法、ならびに多型検出用キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
＜１＞  下記Ｐ１およびＰ２からなる群から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む、ＭＤＲ１遺伝子の多型検出用プローブ：
（Ｐ１）配列番号２に示す塩基配列において、２８８〜３００番目の塩基を含む塩基長１３〜６８の塩基配列に相補的な配列又は該相補配列に相同な配列を有し、２８８番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、および、
（Ｐ２）配列番号２に示す塩基配列において、３００〜３０５番目の塩基を含む塩基長６〜９３の塩基配列に相補的な配列又は該相補配列に相同な配列を有し、３０５番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
【００１３】
＜２＞  前記Ｐ１のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基を３’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に有し、前記Ｐ２のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基を５’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に有する、前記＜１＞に記載の多型検出用プローブ。
【００１４】
＜３＞  前記Ｐ１のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基を３’末端に有し、前記Ｐ２のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素で標識された塩基を５’末端に有する、前記＜１＞または＜２＞に記載の多型検出用プローブ。
【００１５】
＜４＞  前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、相補配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、相補配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少または増加する、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【００１６】
＜５＞  前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、相補配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、相補配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少する、前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【００１７】
＜６＞  前記Ｐ１のオリゴヌクレオチドの塩基長が１３〜５６であり、前記Ｐ２のオリゴヌクレオチドの塩基長が６〜２９である、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【００１８】
＜７＞  前記Ｐ１のオリゴヌクレオチドの塩基長が１３〜２６であり、前記Ｐ２のオリゴヌクレオチドの塩基長が６〜２３である、前記＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【００１９】
＜８＞  前記Ｐ１のオリゴヌクレオチドの塩基長が１３〜２１であり、前記Ｐ２のオリゴヌクレオチドの塩基長が６〜１８である、前記＜１＞〜＜７＞のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【００２０】
＜９＞  融解曲線分析用のプローブである、前記＜１＞〜＜８＞のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【００２１】
＜１０＞  配列番号２に示す塩基配列における３００番目の塩基に相補的な塩基が互いに異なり、前記相補的な塩基がＣ、ＴまたはＡである、少なくとも２種の蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【００２２】
＜１１＞  前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項に記載の多型検出用プローブを用いるＭＤＲ１遺伝子の多型検出方法。
【００２３】
＜１２＞  （Ｉ）前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項に記載の多型検出用プローブおよび試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ることと、（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を評価することと、（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、ＭＤＲ１遺伝子における多型の存在を評価することと、を含む、前記＜１１＞に記載の多型検出方法。
【００２４】
＜１３＞  さらに、前記（Ｉ）の前または（Ｉ）と同時に核酸を増幅することを含む、前記＜１１＞または＜１２＞に記載の多型検出方法。
【００２５】
＜１４＞  配列番号１に示す塩基配列における２５６番目の塩基の変異を検出可能な多型検出用プローブと、前記試料中の一本鎖核酸とを接触させることをさらに含む、前記＜１１＞〜＜１３＞のいずれか１項に記載の多型検出方法。
【００２６】
＜１５＞  前記配列番号１に示す塩基配列における２５６番目の塩基の変異を検出可能な多型検出用プローブは、配列番号１に示す塩基配列において、２４８番目の塩基から始まる９〜５０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有する蛍光標識オリゴヌクレオチドである、前記＜１４＞に記載の多型検出方法。
【００２７】
＜１６＞  前記＜１１＞〜＜１５＞のいずれか１項に記載の多型検出方法により、ＭＤＲ１遺伝子における多型の検出結果を得ることと、前記多型の検出結果に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を評価することと、を含む、薬剤の薬効評価方法。
【００２８】
＜１７＞  前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項に記載の多型検出用プローブを含む、多型検出用キット。
【００２９】
＜１８＞  配列番号２に示す塩基配列において、前記Ｐ１またはＰ２のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする塩基配列を含む領域を鋳型として増幅可能なプライマーをさらに含む、前記＜１７＞に記載の多型検出用キット。
【００３０】
＜１９＞  配列番号１に示す塩基配列において２４８番目の塩基から始まる９〜５０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有する蛍光標識オリゴヌクレオチドをさらに含む、前記＜１７＞〜＜１８＞のいずれか１項に記載の多型検出用キット。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１におけるＧ２６７７Ａ／Ｔ変異を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブ、これを用いる多型検出方法、および薬効評価方法、ならびに多型検出用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】（Ａ）核酸混合物の融解曲線、及び（Ｂ）微分融解曲線の一例を示す図である。
【図２】（Ａ）本発明の多型検出用プローブとこれと非相補的な核酸との微分融解曲線の一例を示す図である。（Ｂ）本発明の多型検出用プローブとこれと相補的な核酸との微分融解曲線の一例を示す図である。
【図３】（Ａ）本発明の多型検出用プローブとこれと非相補的な核酸との微分融解曲線の一例を示す図である。（Ｂ）本発明の多型検出用プローブとこれと非相補的な核酸との微分融解曲線の一例を示す図である
【図４】（Ａ）本発明の多型検出用プローブとこれと相補的な核酸との微分融解曲線の一例を示す図である。（Ｂ）本発明の多型検出用プローブとこれと非相補的な核酸との微分融解曲線の一例を示す図である
【図５】（Ａ）本発明の多型検出用プローブとこれと非相補的な核酸との微分融解曲線の一例を示す図である。（Ｂ）本発明の多型検出用プローブと、これと非相補的な核酸および相補的な核酸を含む核酸混合物との微分融解曲線の一例を示す図である
【図６】（Ａ）本発明の多型検出用プローブと、これと非相補的な核酸および相補的な核酸を含む核酸混合物との微分融解曲線の一例を示す図である。（Ｂ）本発明の多型検出用プローブと、これと非相補的な核酸および相補的な核酸を含む核酸混合物との微分融解曲線の一例を示す図である
【図７】（Ａ）本発明の多型検出用プローブと、これと非相補的な核酸および相補的な核酸を含む核酸混合物との微分融解曲線の一例を示す図である。（Ｂ）本発明の多型検出用プローブと、これと非相補的な核酸との微分融解曲線の一例を示す図である
【図８】本発明の多型検出用プローブと、これと非相補的な核酸との微分融解曲線の一例を示す図である。
【図９】本発明の多型検出用プローブと、これと相補的な核酸との微分融解曲線の一例を示す図である。
【図１０】本発明の多型検出用プローブと、これと非相補的な核酸および相補的な核酸を含む核酸混合物との微分融解曲線の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
＜多型検出用プローブ＞
本発明の多型検出用プローブ（以下、単に「プローブ」ともいう）は、下記Ｐ１およびＰ２からなる群から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチド（以下、「第１の蛍光標識オリゴヌクレオチド」ともいう）を含んで構成される。
【００３４】
（Ｐ１）配列番号２に示す塩基配列において、２８８〜３００番目の塩基を含む塩基長１３〜６８の塩基配列に相補的な配列又は該相補配列に相同な配列を有し、２８８番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
（Ｐ２）配列番号２に示す塩基配列において、３００〜３０５番目の塩基を含む塩基長６〜９３の塩基配列に相補的な配列又は該相補配列に相同な配列を有し、３０５番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
【００３５】
かかる特定の蛍光標識オリゴヌクレオチドの少なくとも１種を含むことで、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１におけるＧ２６７７Ａ／Ｔ変異を、高い感度で、簡便に検出することができる。なお、ある塩基配列に対して「相同な配列」とは、当該塩基配列との類似性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である塩基配列をさす。
【００３６】
配列番号２に示す塩基配列は、ＭＤＲ１遺伝子におけるエクソン２１の部分塩基配列であって、ＭＤＲ１遺伝子におけるエクソン２１の２６７７番目の塩基が、配列番号２に示す塩基配列の３００番目の塩基に対応するものである。
配列番号２に示す塩基配列の３００番目の塩基は、野生型（ワイルドタイプ）ではＧ（グアニン）であるが、変異型においてはＡ（アデニン）またはＴ（チミン）に変異している。
【００３７】
また前記Ｐ１のオリゴヌクレオチドにおいて、「２８８番目の塩基に相補的な塩基」とは、配列番号２に示す塩基配列における２８８番目の塩基Ｇ（グアニン）に対する相補的な塩基Ｃ（シトシン）である。
前記Ｐ１のオリゴヌクレオチドにおいては、この蛍光標識された相補的な塩基Ｃが３’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に存在することが好ましく、３’末端に存在することがより好ましい。
【００３８】
前記Ｐ１のオリゴヌクレオチドは、配列番号２に示す塩基配列の３００番目の塩基における多型を検出することができるプローブである。この塩基は、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１における２６７７番目の塩基に該当し、野生型であればＧ、変異型ではＴまたはＡである。従って当該塩基に相補的なＰ１のオリゴヌクレオチドにおける塩基は、Ｃ、ＡまたはＴであることが好ましい。
すなわち、Ｐ１のオリゴヌクレオチドは野生型に相補的な配列を有するもの、および、変異型に相補的な配列を有するものの少なくとも１種であることが好ましい。
【００３９】
また前記Ｐ１のオリゴヌクレオチドの塩基長は、１３〜６８であるが、１３〜５６であることが好ましく、１３〜２６であることがより好ましく、１３〜２１であることがさらに好ましい。この範囲の塩基長により、例えば、多型検出感度がより向上する。
また前記Ｐ１のオリゴヌクレオチドの塩基長を変化させることで、Ｐ１のオリゴヌクレオチドがその相補配列と形成するハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を所望の値とすることができる。
【００４０】
以下に本発明におけるＰ１のオリゴヌクレオチドにおける塩基配列の一例を表１に示すが、本発明はこれらに限定されない。
尚、表１には、配列番号２の３００番目の塩基がＧ、ＴおよびＡの場合であるオリゴヌクレオチドと、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッドのＴｍ値を合わせて示した。ここでＴｍ値は、Ｍｅｌｔｃａｌｃ  ９９  ｆｒｅｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）を用い、設定条件：Ｏｌｉｇｏｃｏｎｃ［μＭ］０．２、Ｎａ ｅｑ．［ｍＭ］５０の条件で算出した。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
表１には、配列番号２における３００番目の塩基がＧ（野生型）である場合に対応するオリゴヌクレオチドのみを例示したが、当該塩基がＴまたはＡである場合に対応するオリゴヌクレオチド、すなわち、表１における「Ｃ」がＡまたはＴであるオリゴヌクレオチドも同様に例示することができる。
【００４３】
本発明において、Ｐ１のオリゴヌクレオチドが相補的な塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズした場合のＴｍ値と、配列番号２における３００番目の塩基のみが非相補的なＤＮＡとハイブリダイズした場合のＴｍ値の差は、３．０℃以上であることが好ましく、７．０℃以上であることがより好ましく、９．０℃以上であることがさらに好ましい。前記Ｔｍ値の差が３．０℃以上であることで、例えば、配列番号２における３００番目の塩基の変異をより高感度に検出することができる。
【００４４】
また前記Ｐ２のオリゴヌクレオチドにおいて、「３０５番目の塩基に相補的な塩基」とは、配列番号２に示す塩基配列における３０５番目の塩基Ｇ（グアニン）に対する相補的な塩基Ｃ（シトシン）である。
前記Ｐ２のオリゴヌクレオチドにおいては、この蛍光標識された相補的な塩基Ｃが５’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に存在することが好ましく、５’末端に存在することがより好ましい。これにより、例えば、多型検出感度がより向上する。またＰ２の蛍光標識オリゴヌクレオチドを生産性よく得ることができる。
【００４５】
前記Ｐ２のオリゴヌクレオチドは、配列番号２に示す塩基配列の３００番目の塩基における多型を検出することができるプローブである。この塩基は、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１における２６７７番目の塩基に該当し、野生型であればＧ、変異型ではＴまたはＡである。従って当該塩基に相補的なＰ２のオリゴヌクレオチドにおける塩基は、Ｃ、ＡまたはＴであることが好ましい。
すなわち、Ｐ２のオリゴヌクレオチドは野生型に相補的な配列を有するもの、および、変異型に相補的な配列を有するものの少なくとも１種であることが好ましい。
【００４６】
また前記Ｐ２のオリゴヌクレオチドの塩基長は、６〜９３であるが、６〜２９であることが好ましく、６〜２３であることがより好ましく、６〜１８であることがさらに好ましい。この範囲の塩基長により、例えば、多型検出感度がより向上する。
また前記Ｐ２のオリゴヌクレオチドの塩基長を変化させることで、Ｐ２のオリゴヌクレオチドがその相補配列と形成するハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を所望の値とすることができる。
【００４７】
以下に本発明におけるＰ２のオリゴヌクレオチドにおける塩基配列の一例を表２に示すが、本発明はこれらに限定されない。
尚、表２には、配列番号２の３００番目の塩基がＴ、ＧおよびＡの場合であるオリゴヌクレオチドと、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッドのＴｍ値を合わせて示した。Ｔｍ値は上記と同様にして算出した。
【００４８】
【表２】
2012105644.tif 000003
【００４９】
表２には、配列番号２における３００番目の塩基がＴ（変異型）である場合に対応するオリゴヌクレオチドのみを例示したが、当該塩基がＧまたはＡである場合に対応するオリゴヌクレオチド、すなわち、表２における「Ａ」がＣまたはＴであるオリゴヌクレオチドも同様に例示することができる。
【００５０】
本発明において、Ｐ２のオリゴヌクレオチドが相補的な塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズした場合のＴｍ値と、配列番号２における３００番目の塩基のみが非相補的なＤＮＡとハイブリダイズした場合のＴｍ値の差は、２．８℃以上であることが好ましく、４．０℃以上であることがより好ましく、６．０℃以上であることがさらに好ましい。前記Ｔｍ値の差が２．８℃以上であることで、例えば、配列番号２における３００番目の塩基の変異をより高感度に検出することができる。
【００５１】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、本発明のプローブは、相補配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、相補配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）するかまたは増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドであることが好ましい。その中でも相補配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、相補配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少する蛍光標識オリゴヌクレオチドであることがより好ましい。このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブは、一般的に、グアニン消光プローブと呼ばれており、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。中でも、オリゴヌクレオチドを３'末端もしくは５'末端がＣとなるように設計し、その末端のＣが、Ｇに近づくと発光が弱くなるように蛍光色素で標識化されたオリゴヌクレオチドであることが、特に好ましい。
【００５２】
前記蛍光色素は特に制限されない。例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等が挙げられる。これらの蛍光色素の市販品としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標名、モレキュラー・プローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)等が挙げられる。
蛍光標識オリゴヌクレオチドの検出条件は特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できる。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４４５〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５２０〜５５５ｎｍで検出できる。このような蛍光色素を有するプローブを使用すれば、それぞれの蛍光シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００５３】
また前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、３'末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、変異の有無を検出するＤＮＡ（標的ＤＮＡ）は、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法によって調製することができる。その際、３'末端にリン酸基が付加された蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いることで、これを増幅反応の反応液中に共存させることができる。
すなわち、蛍光標識オリゴヌクレオチドの３'末端にリン酸基を付加させておくことで、プローブ自体が遺伝子増幅反応によって伸長することを十分に抑制できる。また、３'末端に前述のような標識化物質（蛍光色素）を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００５４】
上記塩基配列を有し、５’末端または３’末端のＣが蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの具体例を以下に示す（大文字の塩基は変異点を示し、Ｐはリン酸基を示す）。ただし、本発明における蛍光標識オリゴヌクレオチドは以下のものに限定されない。
【００５５】
【表３】
2012105644.tif 000004
【００５６】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドはＭＤＲ１遺伝子における多型、特にエクソン２１の多型を検出する多型検出用プローブとして使用することができる。
また多型検出用プローブとして、配列番号２における３００番目の塩基に相補的な塩基が互いに異なり、該相補的な塩基がＣ、ＴまたはＡである、少なくとも２種の蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いることで、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１における２６７７番目の塩基が、Ｇ、ＡおよびＴのいずれであるかを識別することができる。
【００５７】
さらに前記少なくとも２種の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、互いに異なる蛍光色素を含んでいることが好ましい。これにより、多型をより高感度にまた簡便に識別することができる。
【００５８】
多型の検出方法は前記蛍光標識ヌクレオチドと検出対象配列とのハイブリダイズを利用する方法であれば、特に制限されない。前記蛍光標識ヌクレオチド用いる多型検出方法の一例として、Ｔｍ解析を利用した多型検出方法について、以下に説明する。
【００５９】
＜多型検出方法＞
本発明の多型検出方法は、ＭＤＲ１遺伝子における多型の検出方法であって、下記工程（Ｉ）〜（ＩＶ）を含むことを特徴とする。なお、本発明の多型検出方法は、前記蛍光検出用プローブを使用することが特徴であって、その他の構成や条件等は、以下の記載に制限されない。
（Ｉ）前記多型検出用プローブおよび試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記一本鎖核酸をハイブリダイズしてハイブリッドを得ること。
（ＩＩ）前記ハイブリッド形成体を含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定すること。
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を評価すること。
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、ＭＤＲ１遺伝子における多型の存在を評価すること。
【００６０】
なお、（ＩＩＩ）でＴｍ値を評価することには、ハイブリッドの解離温度を評価することだけでなく、ハイブリットの融解時に温度に応じて変動する蛍光シグナルの微分値の大きさを評価することを含む。
【００６１】
まず、野生型の核酸（Ｗｔ）と変異型の核酸（Ｍｔ）との２種類の核酸の存在比が各々異なるように調製した複数の核酸混合物を作製する。得られた複数の核酸混合物の各々について、融解曲線解析装置等を用いて融解曲線を得る。
図１（Ａ）に、ある１つの核酸混合物の温度（横軸）と蛍光強度（縦軸）との関係で表された融解曲線、及び図１（Ｂ）に温度（横軸）と蛍光強度の微分値（縦軸）との関係で表された融解曲線（微分融解曲線ともいう）を示す。この微分融解曲線からピークを検出することにより、核酸Ｗｔの融解温度ＴｍＷ及び核酸Ｍｔの融解温度ＴｍＭを評価して、ＴｍＷ及びＴｍＭを含む温度範囲の各々を設定する。ＴｍＷを含む温度範囲ΔＴＷとしては、例えば、ＴｍＷとＴｍＭとの間で蛍光強度の微分値が最小となる温度を下限、蛍光強度のピークの裾野に対応する温度を上限とする温度範囲を設定することができる。また、ＴｍＭを含む温度範囲ΔＴＭとしては、例えば、ＴｍＷとＴｍＭとの間で蛍光強度の微分値が最小となる温度を上限、蛍光強度のピークの裾野に対応する温度を下限とする温度範囲を設定することができる。なお、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭは、同一の幅（例えば、１０℃）または異なる幅（例えば、温度範囲ΔＴＷが１０℃、温度範囲ΔＴＭが７℃）となるように設定することができる。
また、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭは、それぞれの融解温度ＴｍからプラスＸ℃、マイナスＸ℃の幅（Ｘ℃は、例えば１５℃以下、望ましくは１０℃以以下）というように設定することもできる。
【００６２】
次に、温度範囲ΔＴＷ及び温度範囲ΔＴＭの各々について、微分融解曲線の温度範囲の下限に対応する点と上限に対応する点とを通る直線と微分融解曲線とで囲まれた面積（図１（Ｂ）の斜線部分）を求める。面積の求め方の一例として、具体的に以下のように求めることができる。温度Ｔにおける蛍光強度の微分値をｆ（Ｔ）とし、温度Ｔにおけるベース値をＢ（Ｔ）として、下記（１）式により求める。
面積Ｓ＝｛ｆ（Ｔs+1）−Ｂ（Ｔs+1）｝＋｛ｆ（Ｔs+2）−Ｂ（Ｔs+2）｝
＋・・・＋｛ｆ（Ｔe-1）−Ｂ（Ｔe-1）｝ ・・・（１）
ただし、Ｔｓは各温度範囲における下限値、Ｔeは上限値である。また、各温度Ｔにおけるベース値Ｂ（Ｔ）は、下記（２）式により求まる値であり、蛍光強度の検出信号に含まれるバックグラウンドレベルを表すものである。このベース値を蛍光強度の微分値から減算することにより、蛍光強度の検出信号に含まれるバックグラウンドの影響を除去する。
Ｂ（Ｔ）＝ａ×（Ｔ−Ｔs）＋ｆ（Ｔs） ・・・（２）
ただし、ａ＝｛ｆ（Ｔe）−ｆ（Ｔs）｝／（Ｔe−Ｔs） である。
【００６３】
本発明において、試料中の核酸は、一本鎖核酸でもよいし二本鎖核酸であってもよい。前記核酸が二本鎖核酸の場合は、例えば、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることに先立って、加熱により前記試料中の二本鎖核酸を融解（解離）させて一本鎖核酸とすることを含むことが好ましい。二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離することによって、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズが可能となる。
【００６４】
本発明において、試料に含まれる核酸は、例えば、生体試料に元来含まれる核酸でもよいが、検出精度が向上できることから、生体試料に元来含まれている核酸を鋳型としてＰＣＲ等によりＭＤＲ１遺伝子の変異部位を含む領域を増幅させた増幅産物であることが好ましい。増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０〜１０００ｍｅｒであり、好ましくは８０〜２００ｍｅｒである。また、試料中の核酸は、例えば、生体試料由来のＲＮＡ（トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）からＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）により合成したｃＤＮＡであってもよい。
【００６５】
本発明の多型検出方法を適用する試料は、ＭＤＲ１遺伝子が存在する試料であれば特に制限されない。具体例としては、白血球細胞等の血球試料、全血試料等が挙げられる。なお、本発明において、試料の採取方法、核酸を含む試料の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００６６】
本発明において、前記試料中の核酸に対する、本発明のプローブの添加割合（モル比）は特に制限されない。試料中のＤＮＡに対して１倍以下が好ましく、０．１倍以下がより好ましい。これにより、例えば検出シグナルを十分に確保できる。
ここで、試料中の核酸とは、例えば、検出目的の多型が発生している検出対象核酸と前記多型が発生していない非検出対象核酸との合計でもよいし、検出目的の多型が発生している検出対象配列を含む増幅産物と前記多型が発生していない非検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、試料中の核酸における前記検出対象核酸の割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して１０倍以下となることが好ましく、より好ましくは５倍以下、さらに、好ましくは３倍以下である。また、その下限は特に制限されないが、例えば、０．００１倍以上であり、好ましくは０．０１倍以上であり、より好ましくは０．１倍以上である。
【００６７】
前記ＤＮＡに対する本発明のプローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【００６８】
次にＴｍ値について説明する。一般に、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍとは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
【００６９】
本発明において、Ｔｍ値を決定するための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、前記多型検出用プローブに付加した標識のシグナルに基づくシグナルであって、一本鎖ＤＮＡと前記多型検出用プローブとのハイブリッド形成の状態に応じて変動するシグナルを測定することが好ましい。このため、前記多型検出用プローブとして、前述の蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用することが好ましい。前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、例えば、相補配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、相補配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）する蛍光標識オリゴヌクレオチド、または相補配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、相補配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際には蛍光シグナルを示さないか、蛍光シグナルが弱いが、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルを示すようになるか、蛍光シグナルが増加する。
また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによって蛍光シグナルを示し、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルが減少（消失）する。したがって、この蛍光標識に基づく蛍光シグナルの変化を蛍光標識特有の条件（蛍光波長等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。
【００７０】
次に、本発明の多型検出方法について、蛍光色素に基づくシグナルの変化を検出する方法について具体的例を挙げて説明する。なお、本発明の多型検出方法は、前記多型検出用プローブを使用すること自体が特徴であり、その他の工程や条件については何ら制限されない。
【００７１】
核酸増幅を行う際の鋳型となる核酸を含む試料としては、核酸を含んでいればよく、特に制限されない。例えば、血液、口腔粘膜懸濁液、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、乳、腹水液、パラフィン包埋組織、胃液、胃洗浄液、腹膜液、羊水、細胞培養などの任意の生物学的起源に由来する又は由来しうるものを挙げられる。鋳型となる核酸は、該起源から得られたままで直接的に、あるいは該サンプルの特性を改変するために前処理した後で使用することができる。
例えば、全血を試料とする場合、全血からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができる。例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【００７２】
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む多型検出用プローブを添加する。
前記多型検出用プローブは、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、適当な溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものが挙げられる。
【００７３】
前記多型検出用プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、後述するＰＣＲ等の増幅処理を行う場合、増幅処理の後に、ＰＣＲ増幅産物に対して添加してもよいし、増幅処理前に添加してもよい。
このようにＰＣＲ等による増幅処理前に前記検出用プローブを添加する場合は、例えば、前述のように、その３'末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。
【００７４】
核酸増幅の方法としては、ポリメラーゼを用いる方法が好ましく、その例としては、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法等が挙げられる。ポリメラーゼを用いる方法により増幅する場合は、本発明プローブの存在下で増幅を行うことが好ましい。用いるプローブおよびポリメラーゼに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。これにより、核酸の増幅後にプローブのＴｍ値を解析するだけで多型を評価できるので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要がなく、自動化も容易である。
【００７５】
ＰＣＲに用いるプライマー対は、本発明プローブがハイブリダイゼーションできる領域が増幅できるものであれば特に制限されず、通常のＰＣＲにおけるプライマー対の設定方法と同様にして設定することができる。プライマーの長さおよびＴｍ値は、通常には、１２ｍｅｒ〜４０ｍｅｒで４０〜７０℃、好ましくは１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒで５５〜６０℃である。プライマー対の各プライマーの長さは同一でなくてもよいが、両プライマーのＴｍ値はほぼ同一（又は、Ｔｍ値の両プライマーでの差が２℃以内）であることが好ましい。
以下に、本発明の多型検出方法における検出対象配列の増幅に使用できるプライマーセットの一例を示す。なお、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。
【００７６】
【表４】
2012105644.tif 000005
【００７７】
またＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、通常用いられるＤＮＡポリメラーゼを特に制限なく用いることができる。例えば、ＧｅｎｅＴａｑ（ニッポンジーン社製）ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）等を挙げることができる。
【００７８】
またＰＣＲ法は、通常用いられる条件を適宜選択することで行うことができる。
なお、増幅の際、リアルタイムＰＣＲによって増幅をモニタリングし、試料に含まれるＤＮＡ（検出対象配列）のコピー数を調べることもできる。すなわち、ＰＣＲによるＤＮＡ（検出対象配列）の増幅に従ってハイブリッドを形成するプローブの割合が増えるので蛍光強度が変動する。これをモニタリングすることで、試料に含まれる検出対象配列（正常ＤＮＡまたは変異ＤＮＡ）のコピー数を評価することができる。
【００７９】
本発明の多型検出方法においては、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドと、試料中の一本鎖核酸とを接触させて、両者をハイブリダイズさせる。試料中の一本鎖核酸は、例えば、上記のようにして得られたＰＣＲ増幅産物を解離することで調製することができる。
【００８０】
前記ＰＣＲ増幅産物の解離（解離工程）における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されない。例えば、８５〜９５℃である。加熱時間も特に制限されない。通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００８１】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０〜５０℃である。
【００８２】
ハイブリダイズ工程の反応液における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応液におけるＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１μＭ〜１μＭであり、好ましくは０．１μＭ〜０．５μＭ、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．００１μＭ〜１０μＭであり、好ましくは０．００１〜１μＭである。
【００８３】
そして、得られた前記一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光シグナルの変動を測定する。例えば、ＱＰｒｏｂｅを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、解離した状態に比べて蛍光強度が減少（または消光）する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００８４】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは０．３〜５℃／秒である。
【００８５】
次に、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値として決定する。具体的には、得られた蛍光強度から各温度における微分値（−ｄ蛍光強度／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（蛍光強度増加量／ｔ）が最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、ハイブリッド形成によりシグナル強度が増加するプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【００８６】
また、本発明においては、前述のように、ハイブリッドを加熱して、温度上昇に伴う蛍光シグナル変動（好ましくは蛍光強度の増加）を測定するが、この方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを添加した試料の温度を降下させてハイブリッドを形成する際の前記温度降下に伴う蛍光シグナル変動を測定してもよい。
【００８７】
具体例として、相補配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、相補配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）する蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、ＱＰｒｏｂｅ）を使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が大きいが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記加熱した試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。
他方、ハイブリッド形成によりシグナルが増加する標識化プローブを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が小さい（または消光）が、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光強度が増加するようになる。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００８８】
本発明の多型検出方法は、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１における変異を検出可能な前記蛍光標識オリゴヌクレオチド（第１の蛍光標識オリゴヌクレオチド）の少なくとも１種を用いることを特徴とするが、これに加えて、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６における変異を検出可能な第２の蛍光標識オリゴヌクレオチドを併用することが好ましい。エクソン２１およびエクソン２６の変異の両方を検出することで、例えば、ＭＤＲ１遺伝子由来のＰ糖タンパクの発現量をより精度よく予測することができる。
【００８９】
前記第２の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、配列番号１に示す塩基配列における２５６番目の塩基の変異を検出可能であれば特に制限されない。前記第２の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、既述の第１の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同様にして構成することができる。例えば、特開２００５−２８７３３５号公報に記載された蛍光標識オリゴヌクレオチドを本発明においても用いることができる。
尚、配列番号１に示す塩基配列は、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６の部分配列であって、エクソン２６の３４３５番目の塩基が、配列番号１に示す塩基配列の２５６番目の塩基に対応するものである。
【００９０】
第２の蛍光標識オリゴヌクレオチドとして具体的には、配列番号１に示す塩基配列において２４３番目の塩基から始まる１４〜５０塩基長の塩基配列を有する蛍光標識オリゴヌクレオチド、配列番号１に示す塩基配列において２４８番目の塩基から始まる９〜５０塩基長の塩基配列に相補的な配列を有する蛍光標識オリゴヌクレオチドを挙げることができる。
【００９１】
本発明における第２の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において２４８番目の塩基から始まる９〜５０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有する蛍光標識オリゴヌクレオチドであることが好ましく、配列番号１に示す塩基配列において２４８番目の塩基から始まる９〜５０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、５’末端に蛍光色素を有する蛍光標識オリゴヌクレオチドであることがより好ましい。かかる蛍光標識オリゴヌクレオチドであることで、例えば、変異検出感度がより向上する。
【００９２】
上記塩基配列を有し、５’末端または３’末端のＣが蛍光色素で標識されたプローブの具体例を以下に示す（大文字の塩基は変異点を示し、Ｐはリン酸基を示す）。ただし、本発明における蛍光標識オリゴヌクレオチドは以下のものに限定されない。
【００９３】
【表５】
2012105644.tif 000006
【００９４】
第２の蛍光標識オリゴヌクレオチドに起因する蛍光シグナルの変化は、既述の第１の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同様にして測定することができる。
【００９５】
本発明において第２の蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いる場合、第２の蛍光標識オリゴヌクレオチドに含まれる蛍光色素は、前記第１の蛍光標識オリゴヌクレオチドに含まれる蛍光色素とは発光波長が異なる蛍光色素であることが好ましい。これにより、例えば、第１の蛍光標識オリゴヌクレオチドに起因する蛍光シグナル変化と第２の蛍光標識オリゴヌクレオチドに起因する蛍光シグナル変化とを同時に測定することができる。
【００９６】
さらに本発明の多型検出方法において、前記第２の蛍光標識オリゴヌクレオチドを併用する場合、配列番号１に示す塩基配列における２５６番目の塩基を含む塩基長５０〜１０００の領域を、増幅することをさらに含むことが好ましく、前記領域の塩基長は８０〜２００であることがより好ましい。
これにより、例えば、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６における多型をより高感度に検出することができる。
【００９７】
前記配列番号１に示す塩基配列における２５６番目の塩基を含む塩基長５０〜１０００の領域を増幅する方法については特に制限されない。例えば、既述のＰＣＲ法を用いることができる。
ＰＣＲ法に適用するプライマーは、目的とする前記配列番号１に示す塩基配列における２５６番目の塩基を含む領域を増幅可能であれば特に制限されない。例えば、特開２００５−２８７３３５号公報等に記載のプライマーを本発明にも適用することができる。
以下に、本発明の多型検出方法における前記配列番号１に示す塩基配列における２５６番目の塩基を含む領域の増幅に使用できるプライマーセットの一例を示す。
【００９８】
【表６】
2012105644.tif 000007
【００９９】
本発明の多型検出方法においては、配列番号２に示す塩基配列における３００番目の塩基（変異部位）に相補的な塩基が互いに異なり、前記相補的な塩基がＣ、ＴまたはＡである、少なくとも２種の蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いることで、前記変異部位における塩基の種類を識別することができる。
【０１００】
例えば、配列番号８に示す塩基配列を有し、３’末端に蛍光色素（例えば、ＴＡＭＲＡ）を有するＰ１の蛍光標識オリゴヌクレオチド（以下、「プローブ１」ともいう）と、配列番号９に示す塩基配列を有し、５’末端に蛍光色素（例えば、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ）を有するＰ２の蛍光標識オリゴヌクレオチド（以下、「プローブ２」ともいう）とを用いて、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１における変異部位の塩基を識別する方法について、図面を参照しながら説明する。
尚、前記プローブ１は野生型（すなわち、変異部位がＧ）である塩基配列に相補的であり、前記プローブ２は変異部位がＴである塩基配列に相補的である。
【０１０１】
図２〜図７に、検出対象である種々のＤＮＡを用いた微分融解曲線の一例をそれぞれ示す。それぞれの図面において、横軸は温度、縦軸は蛍光強度の微分値であり、また上図（Ａ）はプローブ２の蛍光色素の測定波長における微分融解曲線を、下図（Ｂ）はプローブ１の蛍光色素の測定波長における微分融解曲線をそれぞれ示すものである。
本発明の多型検出方法において、試料の融解曲線のピークの位置と、野生型及びＴ変異型のＴｍ値との関係を確認することによって、試料中のＤＮＡの変異の種類を特定する方法を具体的に説明する。
すなわち、融解曲線のピークが、野生型のＴｍ値と一致した場合には、試料中のＤＮＡに野生型が含まれていると判断できる。一方、融解曲線のピークがＴ型変異に対応するＴｍ値と一致した場合には、試料中のＤＮＡにＴ型変異が含まれていると判断できる。融解曲線のピークが、野生型のＴｍ値及びＴ型変異に対応するＴｍ値とも一致しない場合には、いずれにも該当しないＡ型変異のみを含むと判断できる。また、融解曲線のピークが１つであれば、野生型及びＴ型変異のいずれか一方のみを意味し、融解曲線のピークが２つであれば、野生型及びＴ型変異の双方を含むヘテロ型であると判断できる。これらの情報を組み合わせた手法を適用することによって、試料中のＤＮＡの変異を判断することができる。
【０１０２】
例えば、図２は、検出対象のＤＮＡが野生型（すなわち、変異部位がＧ）の場合の微分融解曲線の一例である。上記手法を適用すれば、図２（Ｂ）においては野生型に対応するＴｍ値（図２（Ｂ）の破線位置）と蛍光強度変化のピークが一致することから、検出対象のＤＮＡが野生型を含むことが分かる。また図２（Ａ）においては変異部位がＴであるＴｍ値（図２（Ａ）の破線位置）よりも、低い温度に単一の蛍光強度変化のピークがあることから、検出対象のＤＮＡが野生型のみを含むことが分かる。
同様に、図３〜図７に示される融解曲線からは、上記手法を適用することによって、図３は、検出対象のＤＮＡの変異がＡ型変異のみである場合、図４は、検出対象のＤＮＡにはＴ型変異のみが含まれる場合、図５は、野生型とＡ型変異が含まれる場合、図６は、野生型とＴ変異が含まれる場合、図７は、Ａ型変異とＴ型変異が含まれる場合を、それぞれ示すことがわかる。
【０１０３】
以上のように、配列番号２に示す塩基配列における３００番目の塩基（変異部位）に相補的な塩基が互いに異なり、前記相補的な塩基がＣ、ＴまたはＡであるような、少なくとも２種の蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いることで、前記変異部位における塩基の種類を高感度且つ簡便に識別することができる。
【０１０４】
次に本発明の多型検出方法において、配列番号１に示す塩基配列における２５６番目の塩基の変異を検出する方法について、図面を参照しながら説明する。
例えば、配列番号７に示す塩基配列を有し、５’末端に蛍光色素（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）を有する第２の蛍光標識オリゴヌクレオチド（以下、「エクソン２６プローブ」ともいう）を用いることで、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６におけるＣ３４３５Ｔ変異を検出することができる。
尚、前記エクソン２６プローブは、変異部位がＴ（チミン）である塩基配列に相補的である。
【０１０５】
図８は、検出対象のＤＮＡが野生型である場合の微分融解曲線の一例である。図８においてはＴ変異型に対応するＴｍ値（図８の破線位置）よりも低い温度に、蛍光強度変化のピークがあることから、検出対象のＤＮＡが野生型を含むことが分かる。
また図９は、検出対象のＤＮＡがＴ変異型である場合の微分融解曲線の一例である。図９においてはＴ変異型に対応するＴｍ値（図９の破線位置）の温度に、蛍光強度変化のピークがあることから、検出対象のＤＮＡがＴ変異型を含むことが分かる。
さらに図１０は、検出対象のＤＮＡが野生型とＴ変異型のヘテロタイプである場合の微分融解曲線の一例である。図１０においてはＴ変異型に対応するＴｍ値（図１０の破線位置）の温度と、それよりも低い温度に、２つの蛍光強度変化のピークがあることから、検出対象のＤＮＡが野生型とＴ変異型を含むことが分かる。
【０１０６】
＜薬効評価方法＞
本発明のＭＤＲ１遺伝子の多型検出方法によれば、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１における変異の有無と種類とを検出することができ、さらにエクソン２６における変異有無も合わせて検出することができる。これにより多型の有無や変異配列と正常配列の存在比に基づいて薬剤に対する耐性や薬剤の薬効を評価することができる。そして、本発明の薬効評価方法は、変異の有無や変異配列の存在比に基づいて、薬剤の投与量の増加、他の治療薬への変更等への切り替え等の疾病の治療方針を決定するのに有用である。
【０１０７】
＜多型検出用キット＞
本発明の多型検出用キットは、前記第１の蛍光標識オリゴヌクレオチドの少なくとも１種を含む多型検出用プローブを含み、必要に応じてプライマー等をさらに含んで構成される。本発明の多型検出用キットはＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１における変異を検出可能である。
前記多型検出用プローブは、１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドを含むものでもよいし、２種以上を含むものであってもよい。本発明においては、配列番号２に示す塩基配列における３００番目の塩基に相補的な塩基が互いに異なり、前記相補的な塩基がＣ、ＴまたはＡである、少なくとも２種の蛍光標識オリゴヌクレオチドを含むことが好ましく、さらに配列番号１に示す塩基配列における２５６番目の塩基の変異を検出可能な多型検出用プローブの少なくとも１種を含むことがより好ましい。
【０１０８】
多型検出用プローブとして２種以上の蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む場合、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドは混合された状態で含まれていても、別個に含まれていてもよい。
また、２種類以上の本発明のプローブが混合された状態で本発明の多型検出用キットに含まれる場合や、別個の試薬として含まれているが、例えば使用時に同じ反応系で各蛍光標識オリゴヌクレオチドと各検出対象配列とのＴｍ解析を行う場合、２種以上の各プローブは発光波長が互いに異なる蛍光色素で標識化されていることが好ましい。
このように蛍光物質の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれのプローブについての検出を同時に行うことも可能になる。
【０１０９】
本発明検出キットは、プローブの他に、本発明の検出方法における核酸増幅を行うのに必要とされる試薬類、特にＤＮＡポリメラーゼを用いる増幅のためのプライマーをさらに含んでいてもよい。また、プローブ、プライマーおよびその他の試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
【０１１０】
前記多型検出用キットは、配列番号２に示す塩基配列において、前記Ｐ１またはＰ２のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を鋳型として増幅可能なプライマーをさらに含むことが好ましい。
さらに前記多型検出キットが、配列番号１に示す塩基配列における２５６番目の塩基の変異を検出可能な多型検出用プローブを含む場合、該プローブが、配列番号１に示す塩基配列において２４８番目の塩基から始まる９〜５０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有する蛍光標識オリゴヌクレオチドであることが好ましく、また、該キットが、配列番号１に示す塩基配列における２５６番目の塩基を含む塩基長５０〜１０００の領域を、より好ましくは８０〜２００の領域を増幅可能なプライマーをさらに含むことが好ましい。
このような多型部位を含む配列（プローブがハイブリダイズする領域）を増幅するためのプライマーセットを含むことで、例えば、より高感度に多型を検出することができる。
【０１１１】
さらに本発明の多型検出用キットは、前記多型検出用プローブを使用して、検出対象である核酸を含む試料について微分融解曲線を作成し、そのＴｍ値解析を行って、ＭＤＲ１遺伝子における変異を検出することが記載された取扱い説明書をさらに含むことが好ましい。
【実施例】
【０１１２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１１３】
＜実施例１＞
全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）と下記表７に記載した処方の検査用試薬を用いて、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。
ＰＣＲは、９５℃で６０秒処理した後、９５℃で１秒および５８℃で３０秒を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。
またＴｍ解析は、ＰＣＲの後、９５℃で１分、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃から７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。尚、測定波長は５８５〜７００ｎｍおよび５２０〜５５５ｎｍとして、ＭＤＲ１ｅｘｏｎ２１  ｐｒｏｂｅ１とＭＤＲ１ｅｘｏｎ２１  ｐｒｏｂｅ２に由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
【０１１４】
【表７】
2012105644.tif 000008
【０１１５】
また上記、表７に記載のプライマーおよびプローブの詳細を以下に示した。尚、プローブにおけるＰは３’末端がリン酸化されていることを示す。
【０１１６】
【表８】
2012105644.tif 000009
【０１１７】
変異の検出対象試料として、全血から精製したヒトゲノムを１μｌ(１００ｃｐ／μｌ)の量で用いた。尚、用いたヒトゲノムはＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１における２６７７番目の塩基が、野生型（Ｇ）のものである。得られた微分融解曲線を図２（Ａ）および図２（Ｂ）に示す。また、図２（Ａ）はＭＤＲ1 ｅｘｏｎ２１ ｐｒｏｂｅ２を図２（Ｂ）はＭＤＲ１  ｅｘｏｎ２１  ｐｒｏｂｅ１を用いて得られた微分融解曲線である。
図２（Ａ）および図２（Ｂ）から、検出対象試料に含まれるＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１における２６７７番目の塩基が野生型であることが分かる。
【０１１８】
＜実施例２＞
実施例１において、変異の検出対象試料として、ＭＤＲ１のエクソン２１における２６７７番目の塩基が、Ａ（アデニン）に変異した塩基配列を有する２５μＭの人工オリゴヌクレオチド（塩基長５０）を１μｌ用いたこと、ＰＣＲを行わなかったこと以外は、実施例１と同様にして、Ｔｍ解析を行った。得られた微分融解曲線を図３（Ａ）および図３（Ｂ）に示す。また、図３（Ａ）はＭＤＲ1 ｅｘｏｎ２１ ｐｒｏｂｅ２を図３（Ｂ）はＭＤＲ１  ｅｘｏｎ２１  ｐｒｏｂｅ１を用いて得られた微分融解曲線である。
得られた微分融解曲線は、検出対象試料に含まれるＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１における２６７７番目の塩基が所定の変異型であるものに対応するものであった。
【０１１９】
＜実施例３＞
変異の検出対象試料として、全血から精製したヒトゲノムを１μｌ(１００ｃｐ／μｌ)の量で用いた。尚、用いたヒトゲノムはＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１における２６７７番目の塩基が、Ｔ（チミン）に変異したものである。実施例１において、変異の検出対象試料として、ＭＤＲ１のエクソン２１における２６７７番目の塩基が、Ｔ（チミン）に変異した塩基配列を有するものを用いたこと以外は実施例１と同様にして、Ｔｍ解析を行った。得られた微分融解曲線を図４（Ａ）および図４（Ｂ）に示す。また、図４（Ａ）はＭＤＲ1 ｅｘｏｎ２１ ｐｒｏｂｅ２を図４（Ｂ）はＭＤＲ１  ｅｘｏｎ２１  ｐｒｏｂｅ１を用いて得られた微分融解曲線である。
得られた微分融解曲線は、検出対象試料に含まれるＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１における２６７７番目の塩基が所定の変異型であるものに対応するものであった。
【０１２０】
＜実施例４＞
実施例１において、変異の検出対象試料として、ＭＤＲ１のエクソン２１における２６７７番目の塩基が、野生型の２５μＭ人工オリゴヌクレオチド(塩基長５０)と、Ａ（アデニン）に変異した塩基配列を有する２５μＭ人工オリゴヌクレオチド（塩基長５０）との核酸混合物（混合割合１：１）を1μｌ用いたこと、ＰＣＲを行わなかったこと以外は、実施例１と同様にして、Ｔｍ解析を行った。得られた微分融解曲線を図５（Ａ）および図５（Ｂ）に示す。また、図５（Ａ）はＭＤＲ1 ｅｘｏｎ２１ ｐｒｏｂｅ２を図５（Ｂ）はＭＤＲ１  ｅｘｏｎ２１  ｐｒｏｂｅ１を用いて得られた微分融解曲線である。
得られた微分融解曲線は、検出対象試料に含まれるＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１における２６７７番目の塩基が所定の変異型であるものに対応するものであった。
【０１２１】
＜実施例５＞
実施例１において、変異の検出対象試料として、全血から精製したヒトゲノムを１μｌ(１００ｃｐ／μｌ)の量で用いた。尚、用いたヒトゲノムはＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１におけ２６７７番目の塩基が、ヘテロ型（Ｇ（グアニン）とＴ（チミン））であったこと、以外は実施例１と同様にして、Ｔｍ解析を行った。得られた微分融解曲線を図６（Ａ）および図６（Ｂ）に示す。また、図６（Ａ）はＭＤＲ1 ｅｘｏｎ２１ ｐｒｏｂｅ２を図６（Ｂ）はＭＤＲ１  ｅｘｏｎ２１  ｐｒｏｂｅ１を用いて得られた微分融解曲線である。
得られた微分融解曲線は、検出対象試料に含まれるＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１における２６７７番目の塩基が所定の変異型であるものに対応するものであった。
【０１２２】
＜実施例６＞
実施例１において、変異の検出対象試料として、全血から精製したヒトゲノムを１μｌ(１００ｃｐ／μｌ)の量で用いた。尚、用いたヒトゲノムはＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１におけ２６７７番目の塩基が、ヘテロ型（Ａ（アデニン）とＴ（チミン））であったこと以外は実施例１と同様にして、Ｔｍ解析を行った。得られた微分融解曲線を図７（Ａ）および図７（Ｂ）に示す。また、図７（Ａ）はＭＤＲ1 ｅｘｏｎ２１ ｐｒｏｂｅ２を図７（Ｂ）はＭＤＲ１  ｅｘｏｎ２１  ｐｒｏｂｅ１を用いて得られた微分融解曲線である。
得られた微分融解曲線は、検出対象試料に含まれるＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１における２６７７番目の塩基が所定の変異型であるものに対応するものであった。
【０１２３】
＜実施例７＞
変異の検出対象試料として、全血から精製したヒトゲノムを１ｕｌ(１００ｃｐ／ｕｌ)の量で用いた。尚、用いたヒトゲノムはＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６における３４３５番目の塩基が、野生型であったこと、測定波長を、４４５〜４８０ｎｍとしたこと以外は、実施例１と同様にしてＴｍ解析を行った。得られた微分融解曲線のうちＭＤＲ１ｅｘｏｎ２６  ｐｒｏｂｅに対応する微分融解曲線を図８に示す。
得られた微分融解曲線は、検出対象試料に含まれるＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６における３４３５番目の塩基が野生型であるものに対応するものであった。
【０１２４】
＜実施例８＞
実施例７において、変異の検出対象サンプルとしてＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６における３４２５番目の塩基が、Ｔ（チミン）に変異した塩基配列を有する２５μＭ人工オリゴヌクレオチド（塩基長５０）を１μＭ用いたこと、ＰＣＲを行わなかったこと以外は、実施例７と同様にしてＴｍ解析を行った。得られた微分融解曲線のうちＭＤＲ１ｅｘｏｎ２６  ｐｒｏｂｅに対応する微分融解曲線を図９に示す。
得られた微分融解曲線は、検出対象試料に含まれるＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６における３４３５番目の塩基が所定の変異型であるものに対応するものであった。
【０１２５】
＜実施例９＞
実施例７において、変異の検出対象試料として、全血から精製したヒトゲノムを１μｌ(１００ｃｐ／μｌ)の量で用いた。尚、用いたヒトゲノムはＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６における３４２５番目の塩基が、ヘテロ型（Ｃ（シトシン）とＴ（チミン））であったこと、以外は、実施例７と同様にしてＴｍ解析を行った。得られた微分融解曲線のうちＭＤＲ１ｅｘｏｎ２６  ｐｒｏｂｅに対応する微分融解曲線を図１０に示す。
得られた微分融解曲線は、検出対象試料に含まれるＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６における３４３５番目の塩基が所定の変異型であるものに対応するものであった。
【０１２６】
＜比較例１＞
実施例１において、蛍光標識オリゴヌクレオチドとして、以下に示す塩基配列を有する蛍光標識オリゴヌクレオチド（ＭＤＲ１ｅｘｏｎ２１  ｐｒｏｂｅ３）のみを用いたこと以外は実施例１と同様にして、蛍光強度の変化を測定した。
得られた微分融解曲線においては、蛍光強度変化が小さく、Ｔｍ値を評価することができなかった。
【０１２７】
【表９】
2012105644.tif 000010
【０１２８】
以上から、本発明の多型検出用プローブを用いることで、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１におけるＧ２６７７Ａ／Ｔ変異を高感度かつ簡便に検出できることがわかる。さらに配列番号１に示す塩基配列における２５６番目の変異を検出可能な多型検出用プローブを併用することで、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６におけるＣ３４３５Ｔ変異も同時に検出可能であることがわかる。
【図１】
2012105644.tif 000011
【図２】
2012105644.tif 000012
【図３】
2012105644.tif 000013
【図４】
2012105644.tif 000014
【図５】
2012105644.tif 000015
【図６】
2012105644.tif 000016
【図７】
2012105644.tif 000017
【図８】
2012105644.tif 000018
【図９】
2012105644.tif 000019
【図１０】
2012105644.tif 000020
【配列表】
2012105644000001.app