(57)【要約】【課題】生物由来原料のアンモニウムから微生物変換によって得られる脂肪族ジカルボン酸塩及び糖類、アミノ酸、タンパク質、無機塩類等を含む発酵から脂肪族ジカルボン酸を効率的に分離、回収する。【解決手段】アンモニアを中和剤とする微生物発酵で得られた脂肪族ジカルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液に硫酸を加え、脂肪族ジカルボン酸と硫酸アンモニウム塩を含む水溶液を得、この水溶液に抽出溶剤を混合して、脂肪族ジカルボン酸を含有する溶剤溶液と、硫酸アンモニウム塩を含む水溶液とに分離し、脂肪族ジカルボン酸を含有する溶剤溶液を濃縮して脂肪族ジカルボン酸を析出させ、これを固液分離する。一方、硫酸アンモニウム塩を含む水溶液を蒸留して溶剤を除去した後、水を留出させて濃縮し、留出した水を回収して発酵工程で使用する。濃縮液から硫酸アンモニウム塩を析出させて固液分離する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪族ジカルボン酸の製造方法であって、
生物由来原料を含有する水溶液中で微生物を生物由来原料に作用させることによって、脂肪族ジカルボン酸を生成させるとともに、生成した脂肪族ジカルボン酸をアンモニアで中和し、脂肪族ジカルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液を得る発酵工程、
発酵工程で得られた脂肪族ジカルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液に硫酸を加え、脂肪族ジカルボン酸と硫酸アンモニウム塩を含む水溶液を得るプロトン化工程、
プロトン化工程で得られた脂肪族ジカルボン酸と硫酸アンモニウム塩を含む水溶液に該水溶液と相分離する溶剤を混合し、脂肪族ジカルボン酸を含有する溶剤溶液と、硫酸アンモニウム塩を含む水溶液とに分離する抽出工程、
抽出工程で回収された脂肪族ジカルボン酸を含有する溶剤溶液を濃縮する抽出相濃縮工程、
抽出相濃縮工程で濃縮された液から脂肪族ジカルボン酸を析出させる脂肪族ジカルボン酸晶析工程、
脂肪族ジカルボン酸晶析工程で析出した脂肪族ジカルボン酸と、溶液とを分離する脂肪族ジカルボン酸固液分離工程、
抽出工程で得られた硫酸アンモニウム塩を含む水溶液を蒸留し、該水溶液から溶剤を除去する抽残相溶剤除去工程、
抽残相溶剤除去工程で溶剤が除去された硫酸アンモニウム塩を含む水溶液中の水を留出させて硫酸アンモニウム塩を濃縮するとともに、留出した水を回収する抽残相濃縮工程、
抽残相濃縮工程で濃縮された硫酸アンモニウム塩を含む水溶液から硫酸アンモニウム塩を析出させる硫酸アンモニウム塩晶析工程、
および
硫酸アンモニウム塩晶析工程で析出した硫酸アンモニウム塩と水溶液とを固液分離する硫酸アンモニウム塩固液分離工程、
を有し、前記抽残相濃縮工程で回収した水を前記発酵工程で使用する、脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
【請求項２】
前記発酵工程の後から前記抽出工程の前までのいずれかの工程において、工程内の液から微生物を除去する微生物分離工程を有する、請求項１に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
【請求項３】
前記微生物分離工程が前記プロトン化工程の後に行われる、請求項２に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
【請求項４】
前記抽出工程で得られた硫酸アンモニウム塩を含む水溶液にアンモニアを加え、ｐＨを４以上８以下の範囲にする抽残相中和工程を含む、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
【請求項５】
前記抽残相中和工程が、前記抽残相溶剤除去工程の後に行われる、請求項４に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
【請求項６】
前記抽残相中和工程が、前記抽残相溶剤除去工程の後から前記抽残相濃縮工程の前のいずれかの工程で行われる、請求項５に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
【請求項７】
前記脂肪族ジカルボン酸固液分離工程で脂肪族ジカルボン酸を固液分離した後の母液の少なくとも一部を、前記微生物分離工程の後から前記脂肪族ジカルボン酸晶析工程までのいずれかの工程で使用する、請求項２から請求項６のいずれか一項に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
【請求項８】
前記硫酸アンモニウム塩固液分離工程で硫酸アンモニウム塩を固液分離した後の母液の少なくとも一部を、前記抽残相溶剤除去工程の後から硫酸アンモニウム塩晶析工程までのいずれかの工程で使用する、請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は脂肪族ジカルボン酸の製造方法に関する。特に、生物由来原料であるグルコース、ブドウ糖、セルロースなどから微生物変換によって得られる脂肪族ジカルボン酸のアンモニウム塩及び糖類、アミノ酸、タンパク質、無機塩類等を含む発酵液から脂肪族ジカルボン酸を効率的に分離、回収する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸、アジピン酸などの脂肪族ジカルボン酸は、ポリエステル、ポリアミド等のポリマー、特に生分解性ポリエステルの原料として、また、食品、医薬品、その他化学品の合成原料として広く用いられており、特に脂肪族ジカルボン酸をポリマー原料として用いる場合、ポリマーの重合度維持や着色防止などのために、高純度の脂肪族ジカルボン酸が要求される。
【０００３】
これらの脂肪族ジカルボン酸は、従来、石油由来の原料より、工業的に製造されてきた。
しかし、近年では、微生物を用いた発酵操作により、広い生物由来原料から高い炭素収率で、種々の脂肪族ジカルボン酸を製造することができるようになった。例えば、コハク酸、アジピン酸などは発酵により製造することができる。
【０００４】
発酵による脂肪族ジカルボン酸の製造において、原料となるのは、一般に糖類、具体的にはグルコースやブドウ糖、又はセルロースなどである。
【０００５】
微生物の発酵による脂肪族ジカルボン酸の製造においては、多糖類が脂肪族ジカルボン酸に不純物として含まれる場合や、原料の糖類が微生物に完全に資化されずに残り、脂肪族ジカルボン酸に糖類が混入することがある。また、微生物を用いた発酵で、脂肪族ジカルボン酸が生成することで低下するｐＨを維持するための中和剤としてアンモニアを用いる場合、アミノ酸が副生し、脂肪族ジカルボン酸にアミノ酸が混入する。さらに微生物由来のタンパク質、発酵で用いられる無機塩類も脂肪族ジカルボン酸に混入することがある。
【０００６】
従来において、発酵により得られる脂肪族ジカルボン酸に混入したこれら不純物を効率的且つ安価な方法で除去することは困難であった。
【０００７】
例えば、発酵により製造される脂肪族ジカルボン酸の精製方法としては、脂肪族ジカルボン酸のカルシウム塩を硫酸で分解する方法（例えば特許文献１）、イオン交換樹脂を用いる方法（例えば特許文献２）が知られているが、これらの方法では充分な精製度が得られないばかりか大量の副生塩も発生し、その処理が問題となる。
【０００８】
さらに脂肪族ジカルボン酸のアンモニウム塩に硫酸水素アンモニウムおよび／または硫酸を加え、脂肪族ジカルボン酸と硫酸アンモニウム塩を生成させるとともに生成した硫酸アンモニウム塩を硫酸水素アンモニウムとアンモニアに熱分解し、リサイクルする方法が提案されている（特許文献３）。この方法では副生塩を分解してそれぞれリサイクルするため塩の処理の問題はないが、副生塩の分解には高温を要し、設備対応上課題がある。また精製度も不十分であった。
【０００９】
また、電気透析を用いる方法（例えば特許文献４）も一般に知られている。しかし電気透析は装置がその生産規模に比例して多くなるため、工業スケールの生産であってもスケールメリットが小さくコスト高となる。
【００１０】
これらの問題を解決する方法として、有機酸を含む水溶液に溶剤を加えて有機酸を抽出する方法（例えば特許文献５）が知られているが、本抽出方法は、対象となる有機酸を結晶として回収するものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開平３−０３０６８５号公報
【特許文献２】特表２００２−５０５３１０号公報
【特許文献３】特表２００１−５１４９００号公報
【特許文献４】特開２００５−３３３８８６号公報
【特許文献５】特表平９−５００６４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、生物由来原料であるグルコース、ブドウ糖、セルロースなどから微生物変換によって得られる脂肪族ジカルボン酸のアンモニウム塩及び糖類、アミノ酸、タンパク質、無機塩類等を含む発酵液から脂肪族ジカルボン酸を効率的に分離、回収して製造する方法を提供すること、特に大量の滅菌水を要する生物資源由来原料からの微生物変換による脂肪族ジカルボン酸の発酵工程において効率的に水をリサイクルする脂肪族ジカルボン酸の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、以下に記載する本方法により上記課題を解決できることを見出した。
すなわち、本発明は以下を要旨とする。
【００１４】
［１］  脂肪族ジカルボン酸の製造方法であって、
生物由来原料を含有する水溶液中で微生物を生物由来原料に作用させることによって、脂肪族ジカルボン酸を生成させるとともに、生成した脂肪族ジカルボン酸をアンモニアで中和し、脂肪族ジカルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液を得る発酵工程、
発酵工程で得られた脂肪族ジカルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液に硫酸を加え、脂肪族ジカルボン酸と硫酸アンモニウム塩を含む水溶液を得るプロトン化工程、
プロトン化工程で得られた脂肪族ジカルボン酸と硫酸アンモニウム塩を含む水溶液に該水溶液と相分離する溶剤を混合し、脂肪族ジカルボン酸を含有する溶剤溶液と、硫酸アンモニウム塩を含む水溶液とに分離する抽出工程、
抽出工程で回収された脂肪族ジカルボン酸を含有する溶剤溶液を濃縮する抽出相濃縮工程、
抽出相濃縮工程で濃縮された液から脂肪族ジカルボン酸を析出させる脂肪族ジカルボン酸晶析工程、
脂肪族ジカルボン酸晶析工程で析出した脂肪族ジカルボン酸と、溶液とを分離する脂肪族ジカルボン酸固液分離工程、
抽出工程で得られた硫酸アンモニウム塩を含む水溶液を蒸留し、該水溶液から溶剤を除去する抽残相溶剤除去工程、
抽残相溶剤除去工程で溶剤が除去された硫酸アンモニウム塩を含む水溶液中の水を留出させて硫酸アンモニウム塩を濃縮するとともに、留出した水を回収する抽残相濃縮工程、
抽残相濃縮工程で濃縮された硫酸アンモニウム塩を含む水溶液から硫酸アンモニウム塩を析出させる硫酸アンモニウム塩晶析工程、
および
硫酸アンモニウム塩晶析工程で析出した硫酸アンモニウム塩と水溶液とを固液分離する硫酸アンモニウム塩固液分離工程、
を有し、前記抽残相濃縮工程で回収した水を前記発酵工程で使用する、脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
【００１５】
［２］  前記発酵工程の後から前記抽出工程の前までのいずれかの工程において、工程内の液から微生物を除去する微生物分離工程を有する、［１］に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
【００１６】
［３］  前記微生物分離工程が前記プロトン化工程の後に行われる、［２］に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
【００１７】
［４］  前記抽出工程で得られた硫酸アンモニウム塩を含む水溶液にアンモニアを加え、ｐＨを４以上８以下の範囲にする抽残相中和工程を含む、［１］から［３］のいずれかに記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
【００１８】
［５］  前記抽残相中和工程が、前記抽残相溶剤除去工程の後に行われる、［４］に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
【００１９】
［６］  前記抽残相中和工程が、前記抽残相溶剤除去工程の後から前記抽残相濃縮工程の前のいずれかの工程で行われる、［５］に記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
【００２０】
［７］  前記脂肪族ジカルボン酸固液分離工程で脂肪族ジカルボン酸を固液分離した後の母液の少なくとも一部を、前記微生物分離工程の後から前記脂肪族ジカルボン酸晶析工程までのいずれかの工程で使用する、［２］から［６］のいずれかに記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
【００２１】
［８］  前記硫酸アンモニウム塩固液分離工程で硫酸アンモニウム塩を固液分離した後の母液の少なくとも一部を、前記抽残相溶剤除去工程の後から硫酸アンモニウム塩晶析工程までのいずれかの工程で使用する、［１］から［７］のいずれかに記載の脂肪族ジカルボン酸の製造方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の方法によれば、生物由来原料から得られた脂肪族ジカルボン酸のアンモニウム塩を含む発酵液から、効率的かつ安定的に脂肪族ジカルボン酸を分離、回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の脂肪族ジカルボン酸の製造方法の実施の形態を示す工程図である。
【図２】本発明の脂肪族ジカルボン酸の製造方法の実施の形態を示す系統図である。
【図３】実施例１における抽出相の希釈・蒸留操作における組成変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の実施の形態につき詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は本発明の実施形態の代表例であって、本発明は、その趣旨を逸脱しない範囲において適宜変形して実施することができる。
【００２５】
本発明の脂肪族ジカルボン酸の製造方法は、生物由来原料から微生物発酵により脂肪族ジカルボン酸を製造する方法であって、以下の工程(1)〜(10)を有し、(8)抽残相濃縮工程で回収した水を(1)発酵工程へ循環して使用する（この工程を、回収水リサイクル工程と記載することがある）ことを特徴とする。
【００２６】
(1)  生物由来原料を含有する水溶液中で微生物を生物由来原料に作用させることによって、脂肪族ジカルボン酸を生成させるとともに、生成した脂肪族ジカルボン酸をアンモニアで中和し、脂肪族ジカルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液を得る発酵工程
(2)  発酵工程で得られた脂肪族ジカルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液に硫酸を加え、脂肪族ジカルボン酸と硫酸アンモニウム塩を含む水溶液を得るプロトン化工程
(3)  プロトン化工程で得られた脂肪族ジカルボン酸と硫酸アンモニウム塩を含む水溶液に該水溶液と相分離する溶剤を混合し、脂肪族ジカルボン酸を含有する溶剤溶液と、硫酸アンモニウム塩を含む水溶液とに分離する抽出工程、
(4)  抽出工程で回収された脂肪族ジカルボン酸を含有する溶剤溶液を濃縮する抽出相濃縮工程
(5)  抽出相濃縮工程で濃縮された液から脂肪族ジカルボン酸を析出させる脂肪族ジカルボン酸晶析工程
(6)  脂肪族ジカルボン酸晶析工程で析出した脂肪族ジカルボン酸と、溶液とを分離する脂肪族ジカルボン酸固液分離工程
(7)  抽出工程で得られた硫酸アンモニウム塩を含む水溶液を蒸留し、該水溶液から溶剤を除去する抽残相溶剤除去工程
(8)  抽残相溶剤除去工程で溶剤が除去された硫酸アンモニウム塩を含む水溶液中の水を留出させて硫酸アンモニウム塩を濃縮するとともに、留出した水を回収する抽残相濃縮工程
(9)  抽残相濃縮工程で濃縮された硫酸アンモニウム塩を含む水溶液から硫酸アンモニウム塩を析出させる硫酸アンモニウム塩晶析工程
(10)  硫酸アンモニウム塩晶析工程で析出した硫酸アンモニウム塩と水溶液とを固液分離する硫酸アンモニウム塩固液分離工程
【００２７】
本発明の脂肪族ジカルボン酸の製造方法においては、更に、(1)発酵工程の後から(3)抽出工程の前までのいずれかの工程において、工程内の液から微生物を除去する微生物分離工程を有していてもよく、この微生物分離工程は(2)プロトン化工程の後に行われることが好ましい。
【００２８】
また、本発明においては、(1)抽出工程で得られた硫酸アンモニウム塩を含む水溶液にアンモニアを加えてｐＨを４以上８以下の範囲にする抽残相中和工程を有していてもよく、この場合、抽残相中和工程は(7)抽残相溶剤除去工程の後に、特に、(7)抽残相溶剤除去工程の後から(8)抽残相濃縮工程の前のいずれかの工程で行われることが好ましい。
【００２９】
さらに、本発明では、(6)脂肪族ジカルボン酸固液分離工程で脂肪族ジカルボン酸を回収した後の母液の少なくとも一部を微生物分離工程の後から(5)脂肪族ジカルボン酸晶析工程までのいずれかの工程で使用し（以下、この工程を第１の母液リサイクル工程と記載することがある）、(10)硫酸アンモニウム塩固液分離工程で硫酸アンモニウム塩を固液分離した後の母液の少なくとも一部を、(7)抽残相溶剤除去工程の後から(9)硫酸アンモニウム塩晶析工程までのいずれかの工程で使用する（以下、この工程を第２の母液リサイクル工程と記載することがある）ことが好ましい。
【００３０】
図１は、このような本発明の脂肪族ジカルボン酸の製造方法の実施の形態の一例を示す工程図であり、図１において、本発明の必須構成要件は実線で、任意付加要件は点線で示してある。ただし、本発明の脂肪族ジカルボン酸の製造方法の処理工程は何ら図１に示されるものに限定されるものではない。
【００３１】
［発酵工程］
発酵工程は、生物由来原料を含有する水溶液中で微生物を生物由来原料に作用させることによって、脂肪族ジカルボン酸を生成させるとともに、生成した脂肪族ジカルボン酸をアンモニアで中和し、脂肪族ジカルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液を得る工程である。
【００３２】
本発明の製造方法により製造される脂肪族ジカルボン酸としては、生物由来原料から得られた脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液から製造されるものであれば特に限定されず、具体的には、シュウ酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、セバシン酸、リンゴ酸、フマル酸、オキザロ酢酸、２−オキソグルタル酸、シス−アコニット酸、ドデカン二酸等の、炭素数が２以上４０以下の鎖状ジカルボン酸が挙げられる。これらの中では、特にコハク酸、アジピン酸が好ましい。
【００３３】
本発明において、生物由来原料としては、例えば、木材、稲わら、籾殻、米ぬか、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、おから、コーンコブ、タピオカカス、バガス、植物油カス、芋、そば、大豆、油脂、古紙、製紙残渣、水産物残渣、家畜排泄物、下水汚泥、食品廃棄物等が挙げられる。この中でも好ましくは、木材、稲わら、籾殻、米ぬか、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、おから、コーンコブ、タピオカカス、バガス、植物油カス、芋、そば、大豆、油脂、古紙、製紙残渣等の植物資源が好ましく、より好ましくは、木材、稲わら、籾殻、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、芋、油脂、古紙、製紙残渣であり、最も好ましくはとうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシである。これらの生物由来原料は、一般に、窒素元素やＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ等の多くのアルカリ金属、アルカリ土類金属を含有する。これらの生物由来原料は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３４】
これらの生物由来原料は、特に限定はされないが、例えば酸やアルカリ等の化学処理、微生物を用いた生物学的処理、物理的処理等の公知の前処理・糖化の工程を経て炭素源へ誘導される。即ち、本発明においては、これらの生物由来原料から誘導される炭素源から脂肪族ジカルボン酸生産能を有する微生物を利用した微生物変換による発酵法により脂肪族ジカルボン酸を生産する。
【００３５】
これらの生物由来原料から炭素源を誘導する工程には、特に限定はされないが、例えば、生物由来原料をチップ化する、削る、擦り潰す等の前処理による微細化工程が含まれる。必要に応じて、更にグラインダーやミルでの粉砕工程が含まれる。こうして微細化された生物由来原料は、更に前処理・糖化の工程を経て炭素源へ誘導されるが、その具体的な方法としては、硫酸、硝酸、塩酸、燐酸等の強酸での酸処理、アルカリ処理、アンモニア凍結蒸煮爆砕法、溶剤抽出、超臨界流体処理、酸化剤処理等の化学的処理や、微粉砕、蒸煮爆砕法、マイクロ波処理、電子線照射等の物理的処理、微生物や酵素処理による加水分解等の生物学的処理が挙げられる。
【００３６】
上記の生物由来原料から誘導される炭素源としては、通常、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、タガトース等のヘキソース、アラビノース、キシロース、リボース、キシルロース、リブロース等のペントース、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、澱粉、セルロース等の２糖・多糖類、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノクチン酸、アラキジン酸、エイコセン酸、アラキドン酸、ベヘニン酸、エルカ酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リグノセリン酸、セラコレン酸等の脂肪酸、グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、マルトース、フルクトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、セルロースが好ましい。
【００３７】
本発明においては、これらの生物由来原料から誘導される炭素源から脂肪族ジカルボン酸生産能を有する微生物を利用した微生物変換による発酵法により脂肪族ジカルボン酸を生産する。
【００３８】
本発明で用いる微生物は、脂肪族ジカルボン酸生産能を有する微生物であるかぎり特に制限されないが、バチルス属細菌、コリネ型細菌などの好気性微生物、エシェリヒア・コリ等の腸内細菌などの通性嫌気性微生物、または微好気性微生物を使用することが好ましい。
【００３９】
好気性微生物としては、コリネ型細菌（Coryneform  Bacterium）、バチルス（Bacillus）属細菌、リゾビウム（Rhizobium）属細菌、アースロバクター（Arthrobacter）属細菌、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属細菌、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌、ノカルディア（Nocardia）属細菌、又はストレプトマイセス（Streptomyces）属細菌などが挙げられ、コリネ型細菌がより好ましい。
【００４０】
コリネ型細菌は、これに分類されるものであれば特に制限されないが、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌又はアースロバクター属に属する細菌などが挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium  glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium  flavum）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium  ammoniagenes）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium  lactofermentum）に分類される細菌が挙げられる。これらは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４１】
脂肪族ジカルボン酸生産菌としてコハク酸生産菌を用いる場合、後述の実施例に記載のように、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）活性が増強され、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低下した株を用いることが好ましい。
【００４２】
発酵における反応温度、圧力等の反応条件は、選択される菌体、カビなど微生物の活性に依存することになるが、脂肪族ジカルボン酸を得るための好適な条件を各々の場合に応じて選択すればよい。
【００４３】
発酵により脂肪族ジカルボン酸が生産されると系内のｐＨが低下するが、ｐＨが低くなると微生物の代謝活性が低くなったり、或いは微生物が活動を停止するようになり、製造歩留まりが悪化したり、微生物が死滅するため、中和剤を用いてｐＨを調整する。通常はｐＨセンサーによって反応系内のｐＨを計測し、所定のｐＨ範囲となるように中和剤の添加によりｐＨを調節する。ｐＨ値は、用いる菌体、カビ等の微生物の種類に応じて、その活性が最も有効に発揮される範囲に調整される。中和剤の添加方法については特に制限はなく、連続添加であっても間欠添加であってもよい。本発明では、中和剤としてはアンモニアを用いる。このため、発酵工程で製造された脂肪族ジカルボン酸は、脂肪族ジカルボン酸のアンモニウム塩として発酵液中に含まれる。
【００４４】
発酵工程では、操作の過程で大量の水を用いるが、雑菌の繁殖を防止するため通常加熱処理するなどの滅菌処理を施した滅菌水を用いる必要がある。
【００４５】
本発明では、この発酵工程で必要とされる滅菌水として、後段の抽残相濃縮工程で留去させた水を回収して循環使用する。
【００４６】
発酵液は、その後の精製工程での操作性や効率性を考慮して適宜濃縮しても良い。濃縮方法としては、特に限定されないが、不活性ガスを流通させる方法、加熱により水を留去させる方法、減圧で水を留去させる方法ならびにこれらを組み合わせる方法などが挙げられる。また濃縮操作は、バッチ操作で行っても、連続操作で行っても良い。ここで回収された水も発酵工程に再利用することができる。
【００４７】
［プロトン化工程］
プロトン化工程は、発酵工程で得られた脂肪族ジカルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液に硫酸を加え、脂肪族ジカルボン酸と硫酸アンモニウム塩を含む水溶液を得る工程である。
【００４８】
即ち、発酵工程で得られた脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液から脂肪族ジカルボン酸を溶剤中に回収する抽出工程において、脂肪族ジカルボン酸がアンモニウム塩として水溶液中に存在する場合、脂肪族ジカルボン酸および／または脂肪族ジカルボン酸のアンモニウム塩が溶剤中に抽出される量が少ない場合があるため、抽出工程より前の工程で当該水溶液に酸として硫酸を加えてプロトン化する必要がある。
【００４９】
発酵工程で得られた脂肪族ジカルボン酸のアンモニウム塩を含有する水溶液に硫酸を加えるプロトン化工程は、発酵工程後、抽出工程より前の工程であれば、如何なる段階において実施される工程であっても構わないが、抽出工程に微生物を除去した発酵液を供する場合においては、後述する微生物分離工程より前の工程で当該水溶液に硫酸を加えてプロトン化することが好ましい。これは、プロトン化した後に微生物を分離すると、微生物分離効率が著しく向上すると共に、後続の抽出工程での液々分離性の改善、固形分発生量の著しい減少が期待できることによる。これは発酵液中に存在するタンパク質などの高分子類がプロトン化で強酸性下にさらされることで変性、凝集し、微生物分離工程におけるその分離度、分離効率を改善し、特に分離度の向上により後続工程である抽出工程に供給される発酵液中にリークするタンパク質類が減少することで抽出工程における液々分離性が改善されると共に、固形分発生量が減少することによるものと考えられる。
【００５０】
脂肪族ジカルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液への硫酸の添加量は、通常は脂肪族ジカルボン酸のアンモニウム塩に対し０．１〜５倍当量程度とされる。通常、硫酸の添加量はｐＨ値に基いて制御される。ここで、ｐＨは脂肪族ジカルボン酸の酸強度ｐＫａにもよるが、硫酸を添加した水溶液のｐＨが少なくともｐＫａ以下、好ましくはｐＨ４未満となるように硫酸の添加量を制御する。一方、硫酸を過剰に加えてもｐＨの下がり方は徐々に鈍化し、過剰の硫酸は硫酸として系内に存在することとなる。余剰の硫酸は最終的には後続の抽出工程で抽残相側に回収され、その処理には再び中和処理等が必要になり非効率である。従って硫酸を添加した水溶液のｐＨが好ましくは１以上となるように硫酸の添加量を制御する。
【００５１】
＜微生物分離工程＞
後述の抽出工程で脂肪族シカルボン酸を後述の抽出溶剤中に抽出するに先立ち、微生物を除去することが好ましい。この微生物分離工程は、前述の如く、プロトン化工程よりも後で行うことが好ましく、従って、微生物分離工程は、通常、プロトン化工程と抽出工程との間で行われる。
【００５２】
発酵工程からの脂肪族ジカルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液又はプロトン化工程からの脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液からの微生物の除去方法は特に限定は無いが、沈降分離、遠心分離、濾過分離ならびにそれらを組み合わせた方法などが用いられる。
【００５３】
工業的には遠心分離、膜濾過分離などの方法で行われる。遠心分離においては、遠心沈降、遠心濾過などを用いることができる。遠心分離において、その操作条件は特に限定されるものではないが、通常１００Ｇ〜１００，０００Ｇの遠心力で分離される。またその操作は連続式操作でも、バッチ式操作でも使用できる。
【００５４】
［抽出工程］
抽出工程は、発酵工程で得られ、プロトン化工程でプロトン化された脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液、好ましくは更に微生物を除去した水溶液から、該水溶液と相分離する溶剤（以下、抽出溶剤と記載することがある）を混合し、脂肪族ジカルボン酸を含有する溶剤溶液と、硫酸アンモニウム塩を含む水溶液とに分離することにより、脂肪族ジカルボン酸を溶剤中に回収する工程である。
【００５５】
本発明の抽出工程は、通常、脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と、抽出溶剤とを混合し接触させる接触工程と、接触工程後に液を、溶剤層（以下、抽出相と記載することがある）と、水溶液相（以下、抽残相と記載することがある）とに相分離させる相分離工程を有している。
【００５６】
相分離工程では水溶液と溶剤溶液とを相分離させるが、場合により、以下に説明する固形分を含む相（以下、中間相と記載することがある）が抽出相と抽残相との相界面に形成されることがあり、この中間相が抽出相と抽残相とを分離することを困難にしたり、抽出相への不純物の混入量を増加させたりする虞がある。そこで、この中間相を除去することが好ましい。
【００５７】
接触工程をバッチ操作により行う場合には、脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液に抽出溶剤を加え、充分混合した後に、相分離工程において、抽出相、中間相、抽残相を、接触を行った容器のそれぞれの相付近に設けられた排出口より取り出す方法や、接触を行った容器の底部から順次取り出す方法等により、それぞれ分離回収することができる。固形分を多く含む中間相は抽出相とともに取り出すことも可能であるし、抽残相とともに取り出すことも可能である。
【００５８】
また例えば、接触工程を連続操作により行う場合には、脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と、抽出溶剤とを接触混合するミキサーを有するミキサー部と、接触混合することにより得られた混合液を静置することで相分離させるセトラーを有するセトラー部が設けられた接触装置（以下、ミキサーセトラー型抽出装置と記載することがある）を用い、セトラー部で抽出相、中間相、抽残相をそれぞれ回収することもできる。
【００５９】
＜固形分＞
生物由来原料から脂肪族ジカルボン酸を得る際に微生物による発酵法を用いた場合、通常、発酵液にはタンパク質など高次構造を有した高分子類が不純物として存在する。
タンパク質などは通常水溶性が高く、抽出操作においてはその殆どが抽残相へ分配される。ただし接触工程で抽出溶剤と接触することにより、その高次構造が破壊、変性し、水にも抽出溶剤にも溶解せず固形分になるものが一部存在する。
【００６０】
接触工程で生成した固形分は主に抽出相と抽残相との液々界面近傍に集まる傾向にある。通常バッチ抽出では液々界面近傍に固形分が生成しても、固形分を除いて抽出相、抽残相を回収すれば操作上大きな問題とはならない。一方、連続抽出、特に向流多段抽出塔では固形分が連続的に発生するため液々分散、液々分離に支障が生じ、安定運転を妨げるばかりか、抽出ができなくなることさえある。また、固形分を含んだ液が後続工程に流れると、後続工程で悪影響を及ぼすことがある。例えば、抽出工程で回収された脂肪族ジカルボン酸を含む抽出相は、脂肪族ジカルボン酸濃度が低いので次の抽出相濃縮工程で濃縮するが、固形分が存在すると、リボイラーなど加熱面に固形分が付着、焦げ付き、伝熱効率を悪化させる。さらに製品の脂肪族ジカルボン酸の用途によっては、品質上問題になるケースもある。例えば、脂肪族ジカルボン酸をポリエステル原料として用いる場合においては、窒素原子がポリマー色調に大きく関与していることが判明している。固形分はタンパク質変性物を多く含み、窒素原子を多く含むことから、固形分が最終製品に混入するとポリエステル色調に影響を及ぼす可能性があるため、接触工程で生成した固形分は相分離工程で除去することが望まれる。
【００６１】
固形分の除去方法は特に拘らないが、固形分のみを選択的に除く操作であることが好ましい。
例えばバッチ抽出においては、脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液に抽出溶剤を加え、充分混合した後、抽出相、固形物を多く含む中間相、抽残相をそれぞれ分離回収することができる。また、連続抽出においては、脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と抽出溶剤を混合するミキサー部と混合液を液々分離するセトラー部からなるミキサーセトラー型抽出装置において、セトラーで抽出相、固形分を多く含む中間相、抽残相をそれぞれ分離回収することができる。
【００６２】
＜接触工程＞
（溶剤）
接触工程において使用される抽出溶剤は、脂肪族ジカルボン酸を含有する水溶液と相分離するものであれば特に制限は無いが、無機性値／有機性値の比（以下、Ｉ／Ｏ値と略記することがある）が０．２以上２．３以下であることが好ましい。また、より好ましくはＩ／Ｏ値が０．３以上２．０以下である溶剤が用いられる。このような溶剤を用いることにより、脂肪族ジカルボン酸を選択的に抽出して、効率よく夾雑不純物と分離できる。
【００６３】
また、抽出溶剤は、常圧（１気圧）で沸点が４０℃以上の溶剤が好ましく、より好ましくは常圧で沸点が６０℃以上の溶剤が用いられる。また、常圧での沸点が１２０℃以下であることが好ましく、より好ましくは常圧での沸点が１００℃以下であって、特に好ましくは常圧での沸点が９０℃以下の溶剤が用いられる。このような溶剤を用いることにより、溶剤が気化して引火する危険性や、溶剤が気化して脂肪族ジカルボン酸の抽出効率が低下するという問題や溶剤のリサイクルがしにくいといった問題を回避することができる。また、使用後の溶剤を蒸留などの方法により分離したり、精製して再利用したりする際の必要熱量が少なくてすむという利点がある。
【００６４】
溶剤の無機性値及び有機性値は、有機概念図論（「系統的有機定性分析」藤田穆、風間書房（１９７４））により提案されており、有機化合物を構成する官能基に対して予め設定された数値を基に有機性値及び無機性値を算出し、その比を求めて得られる。
【００６５】
抽出溶剤は１種を単独で用いてもよく、２種以上を併合して用いてもよいが、通常は１種のみ用いられる。２種以上の溶剤を混合して用いる場合、混合溶剤のＩ／Ｏ値と沸点が上記好適範囲となるようにする。
【００６６】
Ｉ／Ｏ値が０．２以上２．３以下であり、常圧で沸点が４０℃以上の溶剤としては、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、アセトン等のケトン系溶剤、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル系溶剤、酢酸エチル等のエステル系溶剤、アセトニトリル等のニトリル系溶剤、プロパノール、ブタノール、オクタノール等の炭素数３以上のアルコールが例示される。
【００６７】
各溶剤のＩ／Ｏ値および常圧での沸点を以下の表に示す。
【００６８】
【表１】
2012115237.tif 000003
【００６９】
（接触装置）
接触工程で用いる接触装置は、脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と抽出溶剤との接触および溶剤相（抽出相）、および水溶液相（抽残相）の回収ができればどのような装置であってもかまわないが、後述の如く、更に固形分の除去ができる装置が好ましい。なかでも装置が簡単で操作も容易な、上記のミキサーセトラー型抽出装置が好ましい。
【００７０】
ミキサーは脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と、抽出溶剤とが充分混合すれば如何なる方式でもよく、攪拌装置を有する容器や、スタティックミキサーなどが挙げられる。ただし攪拌装置を有する容器を用いるケースにおいては、攪拌により容器内に巻き込まれた空気などの気泡が発生した固形分に付着し、後続のセトラー部における固形分の相分離を著しく阻害するので、空気などを巻き込まない条件で攪拌することが好ましい。操作許容範囲の広さ、設備費用の観点から、ミキサーはスタティックミキサーとするのが好ましい。
【００７１】
（接触操作）
接触工程における、脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と、抽出溶剤とを接触させる操作は、一段で行っても、多段で行ってもよいが多段で行うことが好ましい。また抽出溶剤は脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液に対して並流で流しても、向流で流しても構わない。接触工程は連続的に行われてもよいし、回分的に行われても構わない。特に好ましい形態は、後掲の図２に示すように、脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と抽出溶剤とをミキサーセトラー型抽出装置で混合した後に液々分離し、抽出相、中間相、抽残相をそれぞれ分離回収し、中間相は固液分離し、分離回収した液を必要に応じて相分離した後に相分離工程以降の工程に戻すことである。
【００７２】
上記のような抽出溶剤と、脂肪族ジカルボン酸を含有する水溶液とを接触させる接触工程により、脂肪族ジカルボン酸を抽出溶剤中に抽出する。ここで、抽出溶剤は、脂肪族ジカルボン酸を含有する水溶液の接触時の温度における容積１に対し０．５〜５の容積で加えることが好ましく、脂肪族ジカルボン酸を含有する水溶液の容積１に対し抽出溶剤を１〜３の容積で用いることがより好ましい。
【００７３】
接触する際の温度は、脂肪族ジカルボン酸が抽出される温度であれば特に限定されないが、３０〜６０℃が好ましい。接触温度が低いと、一般に脂肪族ジカルボン酸の溶剤相への移行率は高くなるが、溶剤の粘度が上昇する等の理由のため、生成した固形分の沈降に要する時間が長くなり、溶剤相に浮遊する虞があり、溶剤相に固形分が混入する可能性が高まる。一方、接触温度が高いと固形分の沈降に要する時間が短くなるため、分離は容易となるが、脂肪族ジカルボン酸の抽出率が低く、効率が悪い。
【００７４】
接触する際の時間は、脂肪族ジカルボン酸が充分に抽出される時間であれば特に限定されず、接触装置、接触条件にもよるが通常１秒〜５時間程度が好ましい。接触時間が短いと、接触装置は小さくなるものの、脂肪族ジカルボン酸の溶剤相への抽出が不十分となる虞がある。一方、接触時間が長いと、接触装置が無用に大きくなり非効率的であるばかりか、脂肪族ジカルボン酸に共存するタンパク質類の溶剤による変性が進み固形分の増加につながる可能性もある。
【００７５】
接触する際の圧力は、脂肪族ジカルボン酸が充分に抽出される圧力であれば特に限定されないが、連続的に行う場合には、通常大気圧で操作される。
【００７６】
本接触工程により、脂肪族ジカルボン酸を選択的に抽出溶剤中に抽出することができ、水溶性の高い糖類、アミノ酸類、無機塩類は主に抽残相に分配される。脂肪族ジカルボン酸塩のプロトン化工程で発生した硫酸アンモニウム塩も抽残相に分配され、脂肪族ジカルボン酸と容易に分離される。硫酸アンモニウム塩は、抽残相に回収されたアミノ酸、糖類とともに濃縮、晶析、乾燥等の処理によりアミノ酸、糖類といった有機分を含んだ硫酸アンモニウム塩として回収することができる。回収した硫酸アンモニウム塩は有機物を適度に含むことから肥料として有用である。
【００７７】
＜相分離工程＞
（相分離装置）
相分離工程で用いる相分離工程は、脂肪族ジカルボン酸を含む水溶液と、抽出溶剤とを接触させた後の液を相分離することが可能なものであれば如何なる方式であってもよく、一槽で抽出相、中間相、抽残相をそれぞれ回収するもの、多槽式で抽出相、中間相、抽残相をそれぞれ回収するもの、回転装置による遠心分離により各相を回収するもの、などが挙げられる。
【００７８】
（相分離操作）
相分離工程における相分離操作は、分離槽内で一定時間静置することでも可能であるし、遠心分離装置により行うこともできる。上記のようなミキサーセトラー型抽出装置では、接触混合することにより得られた混合液を静置することで相分離させるセトラー部を有しており、セトラー部において液を一定時間静置することにより相分離することができる。相分離工程は連続的に行われてもよいし、回分的に行われても構わない。
【００７９】
相分離する際の温度は、各相が分離可能な温度であれば特に限定されないが、３０〜６０℃が好ましく、かつ接触操作と同程度の温度で処理することが望ましい。相分離温度が低いと、液粘性が高くなるため固形分の分離が難しくなる傾向にあり、抽出相に固形分が混入したり、固形分に混入する溶剤量が増える傾向にある。一方、相分離温度が高いと各相を形成する液の粘度が低下するため、相分離に要する時間が短くなるため、分離は容易となるが、相分離の過程で脂肪族ジカルボン酸が水溶液中に逆抽出される可能性がある。
【００８０】
相分離する際の時間は、各相が相分離される時間であれば特に限定されず、接触装置、接触条件、相分離方法にもよるが、通常１分〜５時間程度が好ましい。相分離時間が短いと、相分離装置は小さくなるものの、相分離が不十分となり、溶剤相に水溶液や固形分が混入したり、逆に水溶液相に溶剤や固形分が混入する虞がある。一方、相分離時間が長いと、相分離装置が無用に大きくなり非効率的である。
【００８１】
また相分離する際の圧力は、抽出相と抽残相とが効率的に分離される圧力であれば特に限定されないが、連続的に行う場合には、通常大気圧で操作される。
【００８２】
なお、固形物を多く含む中間相は、通常、抽出相の液および抽残相の液から選ばれる少なくとも１種の液を含むため、中間相を固液分離し、抽出相の液および抽残相の液から選ばれる少なくとも１種の液を分離し、回収することができる。回収された液は、相分離工程以降の工程に戻すこともできるし、接触工程以前の工程に再利用することもできる。再利用することで脂肪族ジカルボン酸の製造効率を高めることができるので好ましい。
【００８３】
中間相の固液分離方法は特に限定されるものではなく、沈降分離、濾過分離などの方法を用いることができる。沈降分離においては、重力場で固形分を沈降分離しても、また遠心力場において固形分を沈降分離してもよい。沈降速度を高めるため、遠心沈降分離が望ましい。固液分離の操作の方式は、バッチ操作でも連続操作でも構わない。例えば連続式の遠心沈降機としてはスクリューデカンター、分離板式遠心沈降機が挙げられる。濾過分離において、その方法は、濾材、濾過圧力、連続操作・バッチ操作などで分類されるが、いずれも固形分を抽出相および／または抽残相と分離できれば特に限定するものではない。ただし濾材の目開きは０．１μｍ以上１０μｍ以下が望ましい。０．１μｍ未満では透過流束が小さくなりすぎるため、濾過に時間がかかりすぎる虞がある、一方、目開きが１０μｍを超えると固形分の分離が不十分となる虞がある。また、濾材の材質は抽出溶剤に不溶である必要があり、テトラフルオロエチレンなどのフッ素系樹脂からなるものを用いることが好ましい。濾過は、真空式、加圧式、遠心式のいずれも用いることができる。さらにその方式は連続式でも、バッチ式でも構わない。
【００８４】
［抽出相からの脂肪族ジカルボン酸の回収］
一般に抽出相における脂肪族ジカルボン酸濃度は希薄であるため濃縮操作が必要となる。従って、本発明では、抽出工程で回収された脂肪族ジカルボン酸を含有する抽出相を濃縮し（抽出相濃縮工程）、濃縮後の液から固体の脂肪族ジカルボン酸を析出させる（脂肪族ジカルボン酸晶析工程）。
【００８５】
＜抽出相濃縮工程＞
抽出相濃縮工程では、抽出工程で回収された脂肪族ジカルボン酸を含有する溶剤溶液（抽出相）を濃縮する。その濃縮度は特に限定されるものではないが、最終濃縮液中の脂肪族ジカルボン酸の溶解度が飽和溶解度以下であり、かつ極力飽和溶解度に近いほうが好ましい。
【００８６】
抽出溶剤は、水と最低共沸組成を形成することが多く、また共沸組成においては水よりも抽出溶剤の比率の方が大きい組成であることが多い。従って、濃縮操作に伴い抽出溶剤が多く留去することとなり、濃縮液中の溶剤濃度は濃縮前に比べ低下することが多い。
【００８７】
生物由来原料から得られた脂肪族ジカルボン酸は、一般に水溶性の高い不純物を多く含むため、後続の晶析工程において、抽出溶剤が共存する系よりも水が存在する系の方が高い精製効果が期待できる。また、溶剤が後続工程まで残留するとその回収がより困難となるため、濃縮により得られた濃縮液中の抽出溶剤濃度は１重量％以下とすることが望ましい。
【００８８】
最終濃縮液の抽出溶剤濃度を１重量％以下、且つ脂肪族ジカルボン酸濃度を飽和溶解度近傍とするためには、濃縮前および／または濃縮操作の過程で水を加えることが好ましい。
【００８９】
＜脂肪族ジカルボン酸晶析工程＞
脂肪族ジカルボン酸晶析工程では、抽出相濃縮工程で濃縮された濃縮液から固体の脂肪族ジカルボン酸を析出させる。
【００９０】
晶析工程は、通常、抽出相濃縮工程からの濃縮液（以下、単に濃縮液と記載することがある）中の脂肪族ジカルボン酸を、ジカルボン酸の溶解度差などを利用して固体の脂肪族ジカルボン酸を析出させる工程であるが、濃縮液から脂肪族ジカルボン酸を固体として析出させる工程であれば、どのような方法によるものであっても構わない。
【００９１】
晶析工程は、具体的には例えば、濃縮温度を変化させて溶解度の温度依存性を利用して晶析する冷却晶析法、加熱や減圧などの操作により濃縮液から溶剤を揮発させて濃縮液中の脂肪族ジカルボン酸濃度を高めて晶析する方法、さらにはそれらの組み合わせによる方法などが挙げられる。また、冷却晶析ではその冷却方法として、濃縮液を外部の熱交換器などに循環させて冷却する方法や、冷媒の流通する管を濃縮液中に投入する方法などがある。なかでも装置内を減圧することにより濃縮液中の溶剤を揮発させて、溶剤の気化熱により冷却する方法では、熱交換界面に脂肪族ジカルボン酸が析出することによる熱移動の阻害を防止することができるとともに、濃縮液中の脂肪族ジカルボン酸の濃縮も伴い、晶析収率の点からも好ましい。また、晶析操作はバッチ操作であっても連続操作であっても構わないが、得られる固体の脂肪族ジカルボン酸の粒子径のばらつきを小さくでき、大量生産時に効率的な晶析を行うことができ、且つ晶析のために要するエネルギーを小さくできるなどの理由により連続操作が好ましい。
【００９２】
晶析装置は特殊な晶析槽である必要は無く、公知の攪拌槽を用いることができる。
【００９３】
＜脂肪族ジカルボン酸固液分離工程＞
脂肪族ジカルボン酸晶析工程で析出させた固体の脂肪族ジカルボン酸を含有する液（以下、脂肪族ジカルボン酸スラリーと記載することがある）は、脂肪族ジカルボン酸固液分離工程にて脂肪族ジカルボン酸結晶と母液とに分離する。
【００９４】
この固液分離方法は特に限定するものではなく、濾過分離、沈降分離などが挙げられる。また、固液分離操作はバッチ操作でも連続操作でもよい。例えば効率の良い固液分離機として連続式の遠心濾過機、デカンター等の遠心沈降機などが挙げられる。
【００９５】
また、求められる脂肪族ジカルボン酸の純度により固液分離操作で回収したウェットケーキは冷水等でリンスすることができる。
【００９６】
＜第１の母液リサイクル工程＞
脂肪族ジカルボン酸固液分離工程で得られた母液および／またはリンス排液の少なくとも一部は、晶析工程までの工程にリサイクルすることができる。リサイクルする工程は特に限定はないが、例えば、抽出工程、抽出相濃縮工程へリサイクルすることができる。抽出工程へリサイクルすると抽出塔は大きくなるが、水相へ分配されやすい（分配係数が小さい）不純物をリサイクル系内から選択的に除去することができる。一方、抽出相濃縮工程にリサイクルすると抽出塔は小さくてすむが、不揮発性の不純物は全てリサイクル系内に蓄積することとなる。
【００９７】
母液やリンス排液の全てをリサイクルすることも可能であるが、長期間の運転を続けることで不純物がリサイクル系内に蓄積することから、少なくとも一部は系外にパージすることが望ましい。パージ水は通常活性汚泥処理等により含有される有機物を処理した後廃水とされるが、パージ水は脂肪族ジカルボン酸を含みｐＨが低いことから発酵操作で回収された使用済菌体の失活処理剤として有効である。
【００９８】
この第１の母液リサイクル工程においては、製造される脂肪族ジカルボン酸の種類等により、リサイクル量、リサイクル場所を決めることができる。
【００９９】
＜回収脂肪族ジカルボン酸の後処理工程＞
脂肪族ジカルボン酸固液分離工程で得られた脂肪族ジカルボン酸には、その用途に応じて、乾燥処理や精製処理に代表されるような他の工程を適用することもできる。精製処理としては、例えば、活性炭等の吸着剤による脱色工程、イオン交換樹脂により共存イオン類を除去するイオン交換工程、共存する不飽和ジカルボン酸を水添処理する工程、さらに高度精製するための晶析工程などの処理を適用することができる。これらの処理工程は２以上を組み合わせて行うこともできる。
【０１００】
［抽残相からの硫酸アンモニウム塩の回収］
抽出工程で得られた硫酸アンモニウム塩を含む水溶液（抽残相）には抽出溶剤が数％程度含まれているため、これを除去した後（抽残相溶剤除去工程）、必要に応じて中和処理（抽残相中和工程）後、濃縮し（抽残相濃縮工程）、硫酸アンモニウム塩を析出させる（硫酸アンモニウム塩晶析工程）。
【０１０１】
＜抽残相溶剤除去工程＞
抽残相溶剤除去工程では、抽出工程で回収された硫酸アンモニウム塩を含有する水溶液（抽残相）を蒸留操作により濃縮する。
【０１０２】
その蒸留方法、操作条件は特に限定されるものではなく、抽出工程で用いる抽出溶剤により単蒸留で溶剤を留去してもいいし、蒸留塔で還留をかけながら留去してもよい。また、その操作は常圧で行っても、減圧で行ってもいい。さらにその操作は連続操作でも、バッチ操作でも構わない。
【０１０３】
蒸留方法、操作条件は特に限定されるものではないが、最終的に蒸留後の釜残液中に残留する抽出溶剤の含有量が１重量％以下、望ましくは０．１重量％以下、さらに望ましくは０．０１重量％以下であることが望ましいことから、このような溶剤残留量となるように、適宜条件を制御する。この抽残相溶剤除去工程で抽残相から留出、回収された抽出溶剤は、抽出工程にリサイクルして抽出溶剤として再利用することができる。
【０１０４】
＜抽残相中和工程＞
通常、抽残相は酸性であるので、回収した硫酸アンモニウム塩を肥料または肥料原料として用いるには、アルカリを添加することで中性付近まで中和する必要がある。中和にはアルカリとしてアンモニアを用い、ｐＨを４〜８程度に調整するのが望ましい。
抽残相の中和はいずれの工程で行っても良いが、酸性の抽残相を高温でハンドリングする工程においては装置の腐食の懸念があるため、極力前段の工程で中和するのが好ましい。ただし、中和処理を溶剤除去工程前に行うと回収した溶剤が着色するため、抽残相中和工程は抽残相溶剤除去工程後に行うのがより好ましい。なお、中和後に溶剤除去を行ったときに回収された溶剤が着色する原因は不明である。
【０１０５】
＜抽残相濃縮工程＞
抽出工程で得られた硫酸アンモニウム塩を含む水溶液の硫酸アンモニウム塩濃度は、一般にその濃度が低いので、硫酸アンモニウム塩の晶析に先立ち、飽和溶解度近くまで濃縮することが望ましい。濃縮は抽出溶剤除去と共に行っても良いし、抽出溶剤除去後に行っても良い。ただし、濃縮を抽出溶剤の除去と共に行なうと蒸留装置が大きくなるため、抽出溶剤を蒸留塔で留去した後に濃縮する方法が好ましい。
【０１０６】
抽残相の濃縮方法、装置は特に限定されるものではない。例えば操作条件は常圧でも、減圧でも構わない。さらに、その操作は連続操作でも、バッチ操作でも構わない。また、装置として加熱缶タイプ、薄膜蒸発タイプなどが挙げられる。さらに省エネルギーの観点から多重効用缶、ヒートポンプなども利用できる。
【０１０７】
濃縮の程度としては特に制限はないが、濃縮後、硫酸アンモニウム塩晶析工程に送給される濃縮水溶液中の硫酸アンモニウム塩濃度が３０重量％から５０重量％、好ましくは３５重量％から４５重量％であるような濃縮度であることが濃縮液のハンドリング、晶析工程における硫酸アンモニウム塩の回収率の点で好ましい。硫酸アンモニウム塩濃度が高過ぎると硫酸アンモニウム塩結晶が濃縮過程で析出し、濃縮液のハンドリングにおいて支障をきたす可能性があり、また硫酸アンモニウム塩濃度が低過ぎると後続の晶析工程における硫酸アンモニウム塩の回収率が低くなり効率が悪い。
【０１０８】
このような抽残相濃縮工程における濃縮操作で得られた蒸留水は凝縮させて回収する。
【０１０９】
＜回収水リサイクル工程＞
上記抽残相濃縮工程で回収した凝縮水（以下、回収水と記載することがある）は、発酵工程で用いられた水に由来するものであり、加熱を経ているだけでなく、微量の抽出溶剤、さらに凝縮水には微量の揮発性の発酵副産物を含み、通常滅菌状態となっているので、この回収水を発酵工程にリサイクルして再使用する。回収水は、発酵工程に悪影響を及ぼす成分を殆ど含まないことから、通常その全量を発酵工程にリサイクルすることができる。
【０１１０】
本発明においては、発酵工程で用いる水の殆どは抽残相濃縮工程で凝縮水として回収され、この回収水を発酵工程に再利用することで水を最大限に有効利用しつつ、脂肪族ジカルボン酸を効率的に生産することができる。
【０１１１】
＜硫酸アンモニウム塩晶析工程＞
硫酸アンモニウム塩晶析工程では、抽残相濃縮工程で濃縮された濃縮水溶液を更に濃縮して硫酸アンモニウム塩を析出させる。
【０１１２】
この濃縮晶析では、硫酸アンモニウム塩を含む濃縮水溶液から水を蒸発させ、硫酸アンモニウム塩を飽和溶解度以上に濃縮することで、硫酸アンモニウム塩を析出させる。
【０１１３】
濃縮晶析は常圧で行っても、減圧で行っても良いが、減圧で行えば、水の気化熱による硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液の冷却を伴い、硫酸アンモニウム塩の飽和溶解度の温度依存性による析出も期待でき、収率の観点から好ましい。特に晶析圧力は１〜５０ｋＰａ、好ましくは２〜２０ｋＰａで行うのが望ましい。晶析温度は操作圧力で決まり５〜８０℃、好ましくは１０〜６０℃が好ましい。圧力が１ｋＰａより低いと晶析温度が低いため硫酸アンモニウム塩の高い収率が得られるが、減圧のための設備が大きくなるばかりか、蒸発した水を凝縮回収することが困難となり好ましくない。逆に圧力が５０ｋＰａよりも高いと、減圧のための設備は小さくなり、また蒸発した水の凝縮回収も容易となるが、晶析温度が高くなるため硫酸アンモニウム塩の収率が小さくなり望ましくない。減圧の発生装置は特に限定するものではないが、保守・管理の面から水またはスチームエゼクターが使用され、蒸発水の凝縮にはバロメトリックコンデンサーが広く用いられる。
【０１１４】
晶析操作はバッチ操作であっても連続操作であっても構わないが、硫酸アンモニウム塩を効率的に晶析させることができ、且つ晶析のために要するエネルギーを小さく生産でき、且つ結晶サイズのばらつきを小さくできなどの理由によりより連続操作が好ましい。
【０１１５】
晶析装置は特殊な晶析槽である必要は無く、公知の攪拌槽を用いることができる。
【０１１６】
この硫酸アンモニウム塩晶析工程で得られる濃縮水も、抽残相濃縮工程で得られる濃縮水と同様の滅菌水であるため、これを回収して発酵工程にリサイクルして再使用することにより、より一層の水の有効利用が図れ、好ましい。
【０１１７】
＜硫酸アンモニウム塩固液分離工程＞
硫酸アンモニウム塩晶析工程で析出させた固体の硫酸アンモニウム塩を含有する水溶液（以下、硫酸アンモニウム塩スラリーと記載することがある）は、硫酸アンモニウム塩固液分離工程にて硫酸アンモニウム塩結晶と母液とに分離する。
【０１１８】
この固液分離方法は特に限定するものではなく、濾過分離、沈降分離などが挙げられる。また、固液分離操作はバッチ操作でも連続操作でもよい。例えば効率の良い固液分離機として連続式の遠心濾過機、デカンター等の遠心沈降機などが挙げられる。
【０１１９】
また、求められる硫酸アンモニウム塩の純度により固液分離操作で回収したウェットケーキは冷水等でリンスすることができる。
【０１２０】
回収した硫酸アンモニウム塩結晶は通常後述のように乾燥処理される。
【０１２１】
＜回収硫酸アンモニウム塩の乾燥工程＞
硫酸アンモニウム塩固液分離工程で得られた硫酸アンモニウム塩の乾燥方法は特に限定するものではないが、バンド式乾燥機、回転式乾燥機、流動層式乾燥機などが挙げられる。また後述する晶析母液乾燥工程で得られる硫酸アンモニウム塩含有組成物を乾燥機内で混合することを考えると回転式乾燥機、流動層式乾燥機などが望ましい。
【０１２２】
＜第２の母液リサイクル工程＞
硫酸アンモニウム塩固液分離工程で得られた晶析母液（以下、硫酸アンモニウム塩晶析母液と記載することがある）の少なくとも一部は、抽残相溶剤除去工程の後から、硫酸アンモニウム塩晶析工程までのいずれかの工程にリサイクルすることができる。硫酸アンモニウム塩晶析母液のリサイクル量は、当該晶析母液の組成、性状によるので一概に決められるものではないが、通常、晶析母液の１０〜９９重量％、好ましくは２０〜９０重量％、さらに好ましくは３０〜８０重量％をリサイクルする。
【０１２３】
硫酸アンモニウム塩晶析母液中には硫酸アンモニウム塩だけでなく発酵由来の種々不純物、例えば有機酸、アミノ酸、タンパク質、糖類などを含んでおり、この晶析母液全量をリサイクルするとこれら不純物がリサイクル系内に蓄積し、リサイクル系内の液粘性が増加してゆき、硫酸アンモニウム塩晶析工程、硫酸アンモニウム塩固液分離工程に支障をきたす。
【０１２４】
硫酸アンモニウム塩晶析母液の粘度は、リサイクル量を制御することにより、晶析する際の温度において、０．５〜１００ｃＰ、好ましくは１〜５０ｃＰ、さらに好ましくは１〜２０ｃＰとなるよう制御することが望ましい。硫酸アンモニウム塩晶析母液の粘度が高くなりすぎると、特に硫酸アンモニウム塩固液分離工程に悪影響をおよぼす。例えば、デカンターのような連続式遠心沈降機で固液分離を行う際、晶析母液の粘度が高くなりすぎると結晶沈降速度が遅くなり固液分離ができなくなる。晶析母液の粘度の上昇を抑えるには、晶析母液中の硫酸アンモニウム塩以外の非揮発性成分濃度を３０重量％以下に制御することが好ましい。
【０１２５】
＜硫酸アンモニウム塩晶析母液乾燥工程＞
硫酸アンモニウム固液分離工程で分離した硫酸アンモニウム塩晶析母液は、上述の如く、硫酸アンモニウム塩の他発酵由来の種々不純物、例えば有機酸、アミノ酸、タンパク質、糖類などを含んでおり液肥もしくはその原料として有効であるため、直接乾燥して粉体として回収することもできる。
【０１２６】
この場合の乾燥方法は特に限定するものではないが、液状物から粉体を回収する方法としてスプレードライヤー、ディスクドライヤーなどの乾燥機が望ましい。また、回収した硫酸アンモニウム塩を含む組成物は、硫酸アンモニウム塩晶析工程で得られた硫酸アンモニウム塩と混合することもできる。
【０１２７】
［脂肪族ジカルボン酸製造設備の実施形態］
以下に図２を参照して本発明の脂肪族ジカルボン酸の製造方法の実施に好適な脂肪族ジカルボン酸の製造設備を説明するが、本発明は何ら図２の実施形態に限定されるものではない。
【０１２８】
まず、発酵工程は、発酵槽（例えばジャーファーメンター等）１において、発酵に必要な水（滅菌水）、糖、助剤類、菌体、中和剤（ＮＨ３，Ｎａなど）の存在下に行われる。本発明において、この発酵槽１に、後段の抽残相濃縮工程の回収水がリサイクルされる。発酵により得られた脂肪族ジカルボン酸のアンモニウム塩を含む発酵液は次いでプロトン化槽２において硫酸が添加されてプロトン化され、脂肪族ジカルボン酸含有水溶液が得られる。
【０１２９】
プロトン化槽２からの脂肪族ジカルボン酸含有水溶液は、次いで微生物分離手段３で微生物（菌体）が分離除去され、分離された廃菌体スラッジは系外へ排出される。一方、上澄液は、混合手段（スタティックミキサー）４で抽出溶剤と混合され、抽出装置（ミキサーセトラー型抽出装置）５に送給され、抽出相と抽残相と中間相に分離される。この抽出溶剤には、後段の抽出相濃縮用蒸留装置７ａ，７ｂの回収溶剤及び抽残相溶剤除去用蒸留装置９の回収溶剤がリサイクルされる。
中間相の固形分は固形分除去手段６で固液分離され、固形分は系外へ排出され、液分は抽出装置５からの抽出相と共に抽出相濃縮用蒸留装置（第１蒸留塔）７ａに送給される。一方、抽残相は、更に、向流多段連続抽出塔等の抽出装置８で抽出相が分離され、分離された抽出相は抽出相濃縮用蒸留装置７ａに送給される。
【０１３０】
抽出相濃縮用蒸留装置７ａでは、抽出溶剤が留去、回収され、回収溶剤は抽出溶剤として抽出工程にリサイクルされる。
【０１３１】
抽出溶剤用蒸留装置（第１蒸留塔）７ａで溶剤が除去されて濃縮された濃縮液は、更に抽出相濃縮用蒸留装置（第２蒸留塔）７ｂで濃縮される。この第２蒸留塔７ｂの回収溶剤も抽出溶剤として抽出工程にリサイクルされる。
【０１３２】
抽出相濃縮用蒸留装置（第２蒸留塔）７ｂの留残液は、晶析槽１０で脂肪族ジカルボン酸が晶析され、析出した脂肪族ジカルボン酸は固液分離手段１１にて固液分離され、回収脂肪族ジカルボン酸は、更に乾燥手段１２で乾燥され製品として回収される。
固液分離手段１１の分離溶剤は、一部が系外へパージされ、残部は晶析槽１０にリサイクルされる。
【０１３３】
一方、抽残相溶剤除去用蒸留装置９で溶剤が除去された抽残相は、次いで中和槽１３にてアンモニウム（ＮＨ３）の添加によりｐＨ調整された後、硫酸アンモニウム塩濃縮用蒸留装置１４で濃縮され、次いで晶析槽１５で硫酸アンモニウム塩が晶析される。この硫酸アンモニウム塩濃縮用蒸留装置１４と晶析槽１５の凝縮水は回収され、回収水は発酵槽１にリサイクルされ、滅菌水の一部として使用される。
【０１３４】
晶析槽１５からの硫酸アンモニウム塩スラリーは、固液分離手段１６で固液分離され、回収硫酸アンモニウム塩は更に乾燥手段１７で乾燥され、製品として回収される。固液分離手段１６の分離水は、一部が系外へパージされ、残部は晶析槽１５にリサイクルされる。
【実施例】
【０１３５】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
【０１３６】
＜酸類、糖類の分析＞
カラム：信和化工（株）製「ＵＬＴＲＯＮ  ＰＳ−８０Ｈ」（８．０ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ）
溶離液：水（過塩素酸）（過塩素酸６０％水溶液１．８ｍｌ／１Ｌ−Ｈ２Ｏ）
温度：６０℃
【０１３７】
＜コハク酸発酵菌株の作製＞
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノムＤＮＡの抽出
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）（〒305-8566  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７の受託番号で寄託されている。
【０１３８】
Ａ培地［尿素：２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4：７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4：０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４−５Ｈ2Ｏ：６ｍｇ、ビオチン：２００μｇ、チアミン：２００μｇ、イーストエキストラクト：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、グルコース：２０ｇを、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍｌに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株を対数増殖期後期まで培養し、遠心分離（１００００ｇ、５分）により菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ：ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ：ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍｌに懸濁した。次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ：ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
【０１３９】
（Ｂ）ＰＣプロモーター置換用プラスミドの構築
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子のＮ末端領域のＤＮＡ断片の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６のＣｇｌ０６８９）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。尚、配列番号１のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で１分らなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は４分とした。増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、これをＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とした。
【０１４０】
一方、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来で構成的に高発現するＴＺ４プロモーター断片はプラスミドｐＭＪＰＣ１（特開２００５−９５１６９）を鋳型とし、配列番号３および配列番号４に記載の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲにより調製した。尚、配列番号４のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒分らなるサイクルを２５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は３分とした。増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、これをＴＺ４プロモーター断片とした。
【０１４１】
上記にて調製したＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とＴＺ４プロモーター断片を混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、制限酵素ＰｓｔＩで切断し、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離し、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて回収し、これをＴＺ４プロモーター：ＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とした。さらにこのＤＮＡ断片と大腸菌プラスミドｐＨＳＧ２９９（宝酒造製）をＰｓｔＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌ  カナマシンおよび５０μｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＭＪＰＣ１７．１と命名した。
【０１４２】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の５’上流領域のＤＮＡ断片の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４  ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５’末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１１９（宝酒造製）のＳｍａＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌ  アンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを、配列番号７および配列番号６で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ反応に供した。反応液組成：上記プラスミド１ｎｇ、Ｅｘ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で５０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。このようにして挿入ＤＮＡ断片の有無を確認した結果、約０．７ｋｂの増幅産物を認めるプラスミドを選抜し、これをｐＭＪＰＣ５．１と命名した。
次に、上記ｐＭＪＰＣ１７．１およびｐＭＪＰＣ５．１をそれぞれ制限酵素ＸｂａＩで切断後混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。これを制限酵素ＳａｃＩおよび制限酵素ＳｐｈＩで切断したＤＮＡ断片を０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離し、約１．７５ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて回収した。このＰＣ遺伝子の５’上流領域とＮ末端領域の間にＴＺ４プロモーターが挿入されたＤＮＡ断片を、ｓａｃＢ遺伝子を含むプラスミドｐＫＭＢ１（特開２００５−９５１６９）をＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマシンおよび５０μｇ／ｍｌＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約１．７５ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＭＪＰＣ１７．２と命名した。
【０１４３】
（Ｃ）ＰＣ増強株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ（ＬＤＨ活性が低下した株：特開２００５−９５１６９）の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＭＪＰＣ１７．２のプラスミドＤＮＡ用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から再調製した。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Vol.144,p.181-185,1993）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン：２５μｇ／ｍｌを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン：１０ｇ、イーストエキストラクト：５ｇ、ＮａＣｌ：５ｇ、グルコース：２０ｇ、及び寒天：１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。この培地上に生育した株は、ｐＭＪＰＣ１７．２がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのＰＣ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。次に、上記相同組み換え株をカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組み換えによりｓａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。この様にして得られた株の中には、そのＰＣ遺伝子の上流にｐＭＪＰＣ１７．２に由来するＴＺ４プロモーターが挿入されたものと野生型に戻ったものが含まれる。ＰＣ遺伝子がプロモーター置換型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて液体培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ＰＣ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ＴＺ４プロモーターおよびＰＣ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号８および配列番号９）を用いて分析すると、プロモーター置換型では６７８ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、ＴＺ４プロモーターが挿入された株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−５／ΔＬＤＨと命名した。
【０１４４】
＜ジャーファーメンターによるコハク酸発酵液の調製＞
（Ａ）種培養
尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇを蒸留水に溶解して、１０００ｍｌに調整した培地１００ｍｌを５００ｍｌの三角フラスコにいれ、１２１℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍｌを添加し、上記で構築したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−５／ΔＬＤＨ株を接種して１６時間３０℃にて振とう（１６０ｒｐｍ）培養した。
【０１４５】
（Ｂ）本培養
硫酸アンモニウム：３．０ｇ、８５％リン酸：６．７ｇ、塩化カリウム：４．９ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：１２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：１２０ｍｇ、コーンスティープリカー（王子コーンスターチ社製）３０.０ｇ、１０Ｎ水酸化カリウム水溶液：１１．０ｇ、消泡剤（ＣＥ４５７：日本油脂製）：２．５ｇを蒸留水に溶解して調整した培地２．０Ｌを５Ｌの発酵糟に入れ、１２１℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やしてから２８％アンモニア水を加えてｐＨを７．０に調整した後、予めフィルター滅菌したＤ−ビオチン、塩酸チアミン各０．２ｇ／Ｌ水溶液：１５ｍｌ、及びあらかじめ滅菌した７２０ｇ／Ｌショ糖水溶液：１１０ｍｌを添加し、これに前述の種培養液を１００ｍｌ加えて、３０℃に保温した。ｐＨは２８％アンモニア水を用いて７．２以下にならないように保ち、通気は毎分３．０Ｌ、背圧は０．０５ＭＰａ、攪拌は毎分７５０回転で本培養を開始した。溶存酸素濃度がほぼ０まで低下した後、再び上昇を開始して１ｐｐｍに達したところであらかじめ滅菌した７２%ショ糖水溶液を約５．３ｇ添加したところ、再び０まで低下した。溶存酸素濃度が再び上昇するごとに上記の方法にてショ糖水溶液添加を繰り返して、培養開始後１９時間まで継続した。
【０１４６】
（Ｃ）コハク酸生成反応（発酵工程）
８５％リン酸：１．６ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．１ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４３ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：４３ｍｇ、１０Ｎ水酸化カリウム水溶液：２．８６ｇを蒸留水に溶解し、全量を４２ｍｌに調整後、１２１℃、２０分加熱滅菌処理し、反応濃縮培地を作製した。
【０１４７】
室温まで冷却した上記反応濃縮培地：４２ｍｌ、及び予め滅菌した７２０ｇ／Ｌショ糖水溶液：５３０ｍｌ、滅菌水：１．２Ｌ、予めフィルター滅菌したＤ−ビオチン、塩酸チアミン各０．２ｇ／Ｌ水溶液：２０ｍｌ、上記本培養により得られた培養液６７５ｍｌを５Ｌのジャーファーメンターに加え反応を開始した。反応温度は４０℃、攪拌回転数は毎分１５０、ｐＨは中和剤（炭酸水素アンモニウム：１７１ｇ、２８％アンモニア水：３５４ｇ、蒸留水：５２９ｇ）の逐次添加によって７．３５に調整しながら反応を継続し、反応液中の残存ショ糖が０．１ｇ／Ｌ以下になったところで終了した。
このようにして調整したコハク酸発酵液を遠心分離（１５，０００Ｇ、５分）処理して（微生物分離工程）上澄み液（ワンパス上澄み液）を得た（以下、コハク酸発酵液と記載することがある）。下記表２にこのワンパス上澄み液の組成分析結果を示す。
【０１４８】
【表２】
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【０１４９】
＜プロトン化工程＞
上述のコハク酸発酵液１５００ｇに９８％硫酸を加えｐＨを２．５に調整した。ここで９８％硫酸添加量は１５０ｇ（コハク酸の１．４倍当量）であった。
なお、本実施例では、実験の都合上、プロトン化工程の前に上記の遠心分離で微生物の分離を行っているが、前述の如く、工業レベルでの脂肪族ジカルボン酸の製造においては、プロトン化工程後に微生物の分離を行うことが好ましい。
【０１５０】
＜抽出工程＞
硫酸添加後のコハク酸水溶液は、ジャケット付スタティックミキサー（ノリタケ１／４(１)−Ｎ４０−１７４−０（内径φ５ｍｍ、エレメント数２４））および各槽が６００ｍｌ、４００ｍｌ、３００ｍｌのジャケット付３槽式のセトラーを用い、メチルエチルケトン（以下、ＭＥＫと略記することがある）と混合、液々分離することでコハク酸を連続抽出した。すなわちコハク酸水溶液１６５０ｇおよび予め水を添加した１０％含水ＭＥＫ溶液８２５ｇ（ＭＥＫ溶液（重量）／コハク酸水溶液（重量）＝０．５（重量／重量），ＭＥＫ／コハク酸水溶液＝０．６６（容積／容積））を、それぞれ２０ｇ／分、１０ｇ／分の速度でジャケットに３０℃の温水を流すことで温度制御されたスタティックミキサーへ供給し、抜き出した懸濁液はジャケットに３０℃の温水を流すことで温度制御された３槽式のセトラーの第１槽へ供給し、液々分離され第１槽のボトムから抽残相を連続的に抜き出した。抽出相は第１槽と第２槽間の堰をオーバーフローし、第２槽へ供給された。第２槽では第１槽で分離できなかった不溶成分をボトムに沈降させ、清澄な抽出相のみを第２槽と第３槽間の堰をオーバーフローさせ第３槽へ供給させた。さらに第３槽では液界面近傍から清澄な抽出相をオーバーフローさせて抽出相を回収した。
【０１５１】
連続抽出終了後、それぞれの槽に残った抽出相および抽残相さらには第１槽中間相、第２槽ボトムに残った不溶成分を回収した。回収した抽出相、抽残相、中間相はそれぞれ６８８ｇ、抽残相１６１３ｇ、中間相１７３ｇであった。中間相は目開き０．５μｍのPTFE製面ブランフィルターで加圧濾過することで、清澄液１７２ｇを回収した。
【０１５２】
回収した抽残相１６１３ｇは内径φ２０ｍｍ高さ２ｍのジャケット付攪拌型連続抽出塔（理論段１０段）を用い連続抽出しコハク酸を回収した。ここで抽残相は２００ｇ／時間で塔頂部から供給し、塔底から予め含水量１０重量％に調整したＭＥＫ溶液を２００ｇ／時間で供給し連続抽出した。連続相は抽残相、分散相はＭＥＫ相とした（軽液分散）。また抽出塔の温度はジャケットに温水を通液することで３０℃に制御した。最終的に抽出相は１７７７ｇ、抽残相は１４４９ｇ回収した。回収した抽出相はミキサーセトラーで回収した抽出相、清澄液とあせて合計２６３７ｇであった。抽出相および抽残相の組成をそれぞれ分析したところ下記表３に示すような結果であった。
【０１５３】
【表３】
2012115237.tif 000005
【０１５４】
＜抽出相濃縮工程＞
回収した抽出相は連続蒸留によりＭＥＫを実質的に除去する。ここで蒸留留出液はＭＥＫと水の共沸組成物、すなわち１１重量％含水ＭＥＫとして回収されるが、釜残液の濃縮度合い次第ではコハク酸が析出する懸念がある。そこで蒸留留出液が１１重量％含水ＭＥＫ、釜残液が３０重量％コハク酸溶液となるよう抽出相２６３７ｇに対し１９０ｇの水を添加した。ここで水の添加量は下記計算に従い算出した。
【０１５５】
（抽出相の希釈）
抽出相のＭＥＫおよびコハク酸濃度をそれぞれＣＭＥＫ,０、ＣSA,０、希釈後のＭＥＫおよびコハク酸濃度をそれぞれＣＭＥＫ,１、ＣSA,１とした際の相図を図３に示す。図３では、抽出相の水による希釈、その後の蒸留におけるＭＥＫおよびコハク酸の組成変化が示されている。
図３において希釈操作線は、抽出相組成（ＣＭＥＫ,０,ＣSA,０）および原点（０，０）を結ぶ線、
ＣSA＝（ＣSA,０／ＣＭＥＫ,０）ＣＭＥＫ 
また蒸留操作線は釜残液（０,０.３）と留出液（０.８９,０）結ぶ線、
ＣSA＝０．３−（０.３/０.８９）ＣＭＥＫ
で表現され、希釈後の液はそれぞれの線の交点にあることから、
ＣSA,１＝（ＣSA,０／ＣＭＥＫ,０）ＣＭＥＫ,１
ＣSA,１＝０．３−（０.３/０.８９）ＣＭＥＫ,１
となる。
これらを解くことで希釈液組成（ＣＭＥＫ,１,ＣSA,１）が得られる。さらに希釈水の添加量は抽出相に対して、（ＣＭＥＫ,０−ＣＭＥＫ,１）／ＣＭＥＫ,１で計算することができる。
ここでは、抽出相組成が（０.８０８、０.０４９１）であったので、希釈後の組成は（０.７５４,０.０４５８）、希釈水の添加量は抽出相に対して７.２０重量％、すなわち２６３７ｇ×７.２０重量％＝１９０ｇとした。
【０１５６】
蒸留はφ５ｍｍコイルパックを高さ３０ｃｍまで充填した、内径φ４０ｍｍの充填カラムと５００ｍｌの丸底フラスコ、さらには還留器を備えた常圧連続蒸留装置を用いた。蒸留は全還留で系内を安定させた後、還留比１とし、連続蒸留を行った。蒸留後の釜残液は４３２ｇであった。またその組成を分析した結果を、下記表４に示す。
【０１５７】
【表４】
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【０１５８】
＜コハク酸晶析工程＞
ＭＥＫを留去した液はジャケット付５００ｍｌセパラブルフラスコへ移し、攪拌下ジャケットに温水を通水することで８０℃に保温した。その後プログラム付循環恒温槽を用い、ジャケットへ通水する温水を１時間かけて２０℃まで冷却し、コハク酸を冷却晶析し、２０℃到達後さらに２０℃で１時間熟成した。得られたスラリーは真空濾過して晶析母液を分離した。さらに得られた晶析物のウエットケーキを冷水２５０ｇで水洗し洗浄液を回収し、コハク酸を主成分とするウェットケーキを得た。さらに得られたウェットケーキを真空乾燥機で８０℃最大限圧条件で乾燥し、最終的に１１４ｇのコハク酸を回収した。得られたコハク酸を組成分析した結果を、下記表５に示す。
【０１５９】
【表５】
2012115237.tif 000007
【０１６０】
晶析母液および洗浄液は、混合して５６２ｇの回収液とし、その組成は下記表６の通りであった。
【０１６１】
【表６】
2012115237.tif 000008
【０１６２】
＜抽残相溶剤除去工程＞
φ５ｍｍのコイルパックを高さ３０ｃｍに充填した、内径φ２０ｍｍの充填カラムと５００ｍｌの丸底フラスコ、さらには還留器を備えた常圧連続蒸留装置を用い、抽残相に微量溶解したＭＥＫを蒸留により留去した。抽残相は５００ｍｌ丸底フラスコへ約３００ｍｌ添加後、丸底フラスコをオイルバスで加熱しながら炊上げ、全還留をかけながら系内を安定させた。ここでオイルバスの温度は１１０℃とした。ここで塔頂温度は７４℃（共沸温度）、塔底温度は１０２℃であった。塔内が安定したのを確認後、還留比を１に設定し、留出液を連続的に抜出すとともに供給液を充填塔中段へ連続供給し、釜残液も連続的に
抜出しを開始した。供給液は予熱器であらかじめ６０℃まで加熱した後、充填塔へ供給した。蒸留後の釜残液は１３７９ｇであり、ＭＥＫは４５ｐｐｍまで低下していた。
一方、回収された留出液はわずかに黄色く着色したＭＥＫ、水からなる共沸組成物（ＭＥＫ８９重量％、水１１重量％）であった。
【０１６３】
＜抽残相中和工程＞
ＭＥＫを蒸留除去した後の液のｐＨを測定したところ約３であったので、２６重量％アンモニア水を添加してｐＨ６に調整した。
【０１６４】
＜抽残相濃縮工程＞
中和液をエバポレータで濃縮し、硫酸アンモニウム濃度４１重量％の濃縮液４７６ｇ、凝縮水は９２５ｇを回収した。この回収水の組成を分析したところ、ＭＥＫ６０ｐｐｍ、酢酸３０ｐｐｍを含有していた。
【０１６５】
＜硫酸アンモニウム晶析工程＞
濃縮液はジャケット付１０００ｍｌ攪拌槽へ移した。ジャケットに４５℃の温水を流すとともに、攪拌下晶析槽内圧力を７kPaまで徐々に減圧していき、７KPa（内温約４０℃）に到達後圧力を制御しながら水を９５ｇ留出させ（仕込液に対し２０重量％）、硫酸アンモニウムを析出させた。所定量の水が留出した後、晶析槽内の圧力を大気圧に戻し、ジャケットに流す温水温度を４０℃とし約1時間熟成した。
得られた硫酸アンモニウム塩スラリーを減圧濾過し、ウェットケーキおよび母液に分離した。得られたウェットケーキはさらに８０℃温風乾燥機で約７時間乾燥し、硫酸アンモニウム塩８７ｇ、母液２８８ｇを回収した。硫酸アンモニウム塩の組成の分析結果を下記表７に、母液の組成の分析結果を下記表８それぞれの組成を下に示す。
【０１６６】
【表７】
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【０１６７】
【表８】
2012115237.tif 000010
【０１６８】
＜回収水のリサイクル工程＞
前記＜ジャーファーメンターによるコハク酸発酵液の調整＞における（Ｃ）コハク酸生成反応において、用いる滅菌水１．２Ｌに変えて、上記抽残相濃縮工程で得られた回収水９２５ｇに滅菌水を加えて１．２Ｌとしたものを用いる以外は全て同じ方法に従い、コハク酸生成反応を行った。このようにして調整したコハク酸発酵液を遠心分離（１５，０００G、５分）処理して上澄み液（回収水リサイクル上澄み液）を得た（以下、コハク酸発酵液と記載することがある）。
下記表９にこの回収水リサイクル上澄み液の組成分析結果を先の滅菌水のみを用いたときのワンパス上澄み液の組成分析値と共に示す。
【０１６９】
【表９】
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【０１７０】
表９より、抽残相濃縮工程で得られた濃縮水を発酵工程の滅菌水としてリサイクルしても、得られる発酵液の組成に全く変わりはなく、本発明によれば、系内で発生する回収水を有利利用して水使用量の大幅な削減を図った上で、脂肪族ジカルボン酸を効率的に製造することができることが分かる。
【符号の説明】
【０１７１】
１  発酵槽
２  プロトン化槽
３  微生物分離手段
４  混合手段（スタティックミキサー）
５  抽出装置（ミキサーセトラー型抽出装置）
６  固液分離手段
７ａ，７ｂ  抽出相濃縮用蒸留装置
８  抽出装置
９  抽残相溶剤除去用蒸留装置
１０  晶析槽
１１  固液分離手段
１２  乾燥手段
１３  中和槽
１４  硫酸アンモニウム塩濃縮用蒸留装置
１５  晶析槽
１６  固液分離手段
１７  乾燥手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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