(57)【要約】      （修正有）【課題】新たに同定されたグラム陽性菌の血清耐性因子、及び該因子を含む細菌感染症の処置及び予防のための組成物の提供。【解決手段】細菌感染症の処置又は予防に使用することができる、新たに特定されたグラム陽性菌の血清耐性因子、ＢｉｂＡポリペプチド。該タンパク質は、コイルドコイルドメイン、ＢｉｂＡタンパク質のリーダー配列及び該コイルドコイルドメイン、ＢｉｂＡタンパク質のプロリンリッチドメイン、ＢｉｂＡタンパク質のコイルドコイルドメイン及びプロリンリッチドメイン、並びに、ＢｉｂＡタンパク質のリーダー配列、コイルドコイルドメイン及びプロリンリッチドメインからなる群から選択されるＢｉｂＡタンパク質の一部を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、共に係属中である２００５年５月１３日に出願された仮特許出願第６０／６
８０，４７９号および２００５年１１月２９日に出願された同第６０／７４０，２９１号
の利益を主張し、そしてこれらの出願を参考として援用する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は免疫学及びワクチン学の分野に関する。特に、新たに同定されたグラム陽性菌
の血清耐性因子、及びその細菌感染症の処置及び予防のための組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
グラム陽性菌のＢ群ストレプトコッカス（ＧＢＳ）は、新生児、妊婦、高齢者及び慢性
疾患患者における致命的な細菌感染症の最も重要な原因の一つである。ストレプトコッカ
ス・ピオゲネス（ＧＢＳ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐ  ｐｎｅｕ
ｍｏ）及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈ）等のその他のグラム陽性菌も
、世界の重大な罹患率及び死亡率に関与している。
【０００４】
種々のストレプトコッカスは、細菌の付着及び免疫成分の収集を媒介する表面多機能性
タンパク質に発現し、宿主粘膜表面の良好なコロニー形成に寄与する（非特許文献１；  
Ｔａｌａｙ，  ２００５）特に、ストレプトコッカス・アガラクティエ（ＧＢＳ）及びス
トレプトコッカス・ピオゲネス（ＧＡＳ）は、ヒト免疫グロブリン（Ｂｏｙｌｅ，  １９
９８）及び液相補体制御因子の両方を結合する能力を特徴とする機能的に関連する多くの
タンパク質を発現する（Ｊａｒｖａら、２００４；  Ｌｉｎｄａｈｌら、２００５）。Ｇ
ＢＳにおいては、ＩｇＡ及び／又はＩｇＧ受容体はＭタンパク質族に属し（Ｓｔｅｎｂｅ
ｒｇら、１９９２）、Ｍタンパク質は、免疫グロブリンの抗原結合部外のＩＩ型Ｆｃ領域
と相互作用する（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，  ２０００）。
【０００５】
ＧＢＳにおいて、Ｂａｃタンパク質（β抗原）は、高い親和性でヒト血清ＩｇＡのＦｃ
部（Ｂｅｖａｎｇｅｒ，  １９８３；  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｆｅｒｒｉｅｒｉ，  
１９８４；  Ｌｉｎｄａｈｌら、１９９０；  Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓら、１９８４
）及び補体制御Ｈ因子（ＦＨ）に結合し、ＧＢＳ表面上のＣ３ｂ沈着を回避する（Ａｒｅ
ｓｃｈｏｕｇら、２００２）。ＩｇＡの結合部位は上記タンパク質のＮ末端側にあるが、
ＦＨ結合領域はＢａｃのＣ末端側にある（Ａｒｅｓｃｈｏｕｇら、２００２；  Ｊａｒｖ
ａら、２００２）。Ｂａｃは、構造上肺炎球菌のＨｉｃタンパク質と関係があり、同じ様
にＦＨと結合する（Ｊａｎｕｌｃｚｙｋら、２０００；  Ｊａｒｖａら、２００４）。
【０００６】
一方、ＧＡＳはＭタンパク質及びＦｂａによってＦＨを收集し、細菌が多核白血球の食
作用を回避する能力に関与している（Ｈｏｒｓｔｍａｎｎら、１９８８；  Ｐａｎｄｉｒ
ｉｐａｌｌｙら、２００２；  Ｐａｎｄｉｒｉｐａｌｌｙら、２００３）。Ｍタンパク質
は、補体の古典的経路成分Ｃ３転化酵素（Ｃ４ｂ２ａ）の重要な制御因子であるＣ４結合
タンパク質（Ｃ４ｂｐ）の収集も媒介する（Ｂｅｒｇｇａｒｄら、２００１；  Ｂｌｏｍ
ら、２００４）。Ｃ４ｂに結合したＭタンパク質は、別経路におけるＦＨと同様の方法で
Ｃ４ｂの開裂における分解促進活性及び補助因子活性を示す（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、２０
０５；  Ｐｅｒｅｚ−Ｃａｂａｌｌｅｒｏら、２００４；  Ｔｈｅｒｎら、１９９５）。
ＧＡＳ及びＧＢＳは、ヒトＣ５ａを不活性化し（非特許文献１；非特許文献２）フィブ
ロネクチンに結合する多機能酵素Ｃ５ａペプチダーゼも分泌し、上皮細胞の細菌侵入を促
進する（非特許文献３；非特許文献４）。
血清耐性因子は、これらのグラム陽性菌が宿主の免疫反応を回避するために使用する機
序において役割を果たしていると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊａｒｖａら、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ．  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００３）４０：９５−１０７
【非特許文献２】Ｗｅｘｌｅｒら、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｃ５ａ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｏｒ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ（１９８５）８２：８１４４−８１４８
【非特許文献３】Ｂｅｃｋｍａｎｎら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ａｄｈｅｓｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈａｔ  Ｃ５ａ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ（２００２）７０：２８６９−２８７６
【非特許文献４】Ｃｈｅｎｇら、Ｔｈｅ  ｇｒｏｕｐ  Ｂ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｃ５ａ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｉｓ  ｂｏｔｈ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｎｄ  ａｎ  ｉｎｖａｓｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ（２００２）７０：２４０８−２４１３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、当該技術分野では、グラム陽性菌において細菌感染症の予防又は処置のための
組成物を開発するために使用できる新しい血清耐性因子を特定する継続的な必要性がある
。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
（１）ＢｉｂＡタンパク質のコイルドコイルドメイン；
（２）該ＢｉｂＡタンパク質のリーダー配列及び該コイルドコイルドメイン；
（３）該ＢｉｂＡタンパク質のプロリンリッチドメイン；
（４）該ＢｉｂＡタンパク質の該コイルドコイルドメイン及び該プロリンリッチドメイ
ン；並びに
（５）該ＢｉｂＡタンパク質の該リーダー配列、該コイルドコイルドメイン及び該プロ
リンリッチドメイン
からなる群から選択されるＢｉｂＡタンパク質の一部を含むＢｉｂＡポリペプチドであっ
て、
該ＢｉｂＡタンパク質の一部が該ＢｉｂＡタンパク質のその他の隣接したアミノ酸配列
を含まない、ポリペプチド。
。
（項目２）
前記ＢｉｂＡタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１と少なくとも９５％同一である、
項目１に記載のＢｉｂＡポリペプチド。
（項目３）
前記ＢｉｂＡタンパク質のアミノ酸配列が配列番号１である、項目１に記載のＢｉｂＡ
ポリペプチド。
（項目４）
前記プロリンリッチドメインのアミノ酸配列が、配列番号５と少なくとも９５％同一であ
る、項目１に記載のＢｉｂＡポリペプチド。
（項目５）
前記プロリンリッチドメインのアミノ酸配列が配列番号５である、項目１に記載のＢｉ
ｂＡポリペプチド。
（項目６）
前記コイルドコイルドメインのアミノ酸配列が、配列番号７と少なくとも９５％同一であ
る、項目１に記載のＢｉｂＡポリペプチド。
（項目７）
前記コイルドコイルドメインのアミノ酸配列が配列番号７である、項目１に記載のＢｉ
ｂＡポリペプチド。
（項目８）
前記リーダー配列のアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸１〜３６と少なくとも９５％
同一である、項目１に記載のＢｉｂＡポリペプチド。
（項目９）
前記リーダー配列のアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸１〜３６である、項目１に
記載のＢｉｂＡポリペプチド。
（項目１０）
前記一部が前記コイルドコイルドメインからなる、項目１に記載のＢｉｂＡポリペプチ
ド。
（項目１１）
前記一部が前記リーダー配列及び前記コイルドコイルドメインからなる、項目１に記載
のＢｉｂＡポリペプチド。
（項目１２）
前記一部のアミノ酸配列が、配列番号６と少なくとも９５％同一である、項目１１に記
載のＢｉｂＡポリペプチド。
（項目１３）
前記一部のアミノ酸配列が配列番号６である、項目１１に記載のＢｉｂＡポリペプチド
。
（項目１４）
前記一部が前記プロリンリッチドメインからなる、項目１に記載のＢｉｂＡポリペプチ
ド。
（項目１５）
前記一部が前記コイルドコイルドメイン及び前記プロリンリッチドメインからなる、請求
項１に記載のＢｉｂＡポリペプチド。
（項目１６）
前記一部のアミノ酸配列が、配列番号４と少なくとも９５％同一である、項目１５に記
載のＢｉｂＡポリペプチド。
（項目１７）
前記一部のアミノ酸配列が配列番号４である、項目１５に記載のＢｉｂＡポリペプチド
。
（項目１８）
前記一部が前記リーダー配列、前記コイルドコイルドメイン、及び前記プロリンリッチド
メインからなる、項目１に記載のＢｉｂＡポリペプチド。
（項目１９）
前記一部のアミノ酸配列が、配列番号８と少なくとも９５％同一である、項目１８に記
載のＢｉｂＡポリペプチド。
（項目２０）
前記一部のアミノ酸配列が配列番号８である、項目１８に記載のＢｉｂＡポリペプチド
。
（項目２１）
項目１〜２０の何れかに記載のＢｉｂＡポリペプチド；及び
薬学的に許容される担体
を含む組成物。
（項目２２）
第２のポリペプチドを更に含む、項目２１に記載の組成物。
（項目２３）
前記ポリペプチドが、ＧＢＳ１〜ＧＢＳ６８９からなる群から選択される、項目２２に
記載の組成物。
（項目２４）
項目１〜２０の何れかに記載のＢｉｂＡポリペプチドをコードする単離核酸分子。
（項目２５）
配列番号１６から得られるヌクレオチド配列を含む、項目２４に記載の単離核酸分子。
（項目２６）
項目２４又は２５に記載の核酸分子；及び
薬学的に許容される担体
を含む組成物。
（項目２７）
第２のポリペプチドをコードする第２の核酸分子を更に含む、項目２６に記載の組成物
。
（項目２８）
前記第２のポリペプチドが、ＧＢＳ１〜ＧＢＳ６８９からなる群から選択される、項目
２７に記載の組成物。
（項目２９）
前記ポリペプチドの少なくとも１つが担体タンパク質と結合している、項目２１〜２３
の何れかに記載の組成物。
（項目３０）
前記担体タンパク質が、細菌毒素、細菌トキソイド、Ｎ．メニンジティディス外膜タンパ
ク質、熱ショックタンパク質、百日咳タンパク質、Ｈ．influenzaeタンパク質Ｄ、サイト
カイン、リンホカイン、ホルモン、成長因子、Ｃ．ディフィシレトキシンＡ、Ｃ．ディフ
ィシレトキシンＢ、及び鉄取込みタンパク質からなる群から選択される、項目２９に記
載の組成物。
（項目３１）
小児ワクチンに有用な活性因子を更に含む、項目２１〜３０の何れかに記載の組成物。
（項目３２）
前記活性因子が：
（ａ）Ｎ．メニンジティディス、Ｓ．ニューモニエ、ボルデテラ−ペルツッシス、モラ
クセラ・カタラーリス、クロストリジウム・テタニ、コリネバクテリウム・ジフテリエ、
ＲＳウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、及び
ロタウイルスポリペプチド抗原からなる群から選択されるポリペプチド抗原；ならびに
（ｂ）該ポリペプチド抗原をコードする核酸分子
からなる群から選択される、項目３１に記載の組成物。
（項目３３）
高齢の個体又は免疫不全の個体用のワクチンに有用な第２の活性因子を更に含む、項目
２１〜３０の何れかに記載の組成物。
（項目３４）
前記第２の活性因子が：
（ａ）エンテロコッカス・フェカーリス、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィ
ロコッカス・エピデルミス、シュードモナス・エルジノーサ、レジオネラ・ニューモフィ
ラ、リステリア・モノサイトゲネス、インフルエンザウイルス、及びパラインフルエンザ
ウイルスポリペプチド抗原からなる群から選択されるポリペプチド抗原；ならびに
（ｂ）該ポリペプチド抗原をコードする核酸分子
からなる群から選択される、項目３３に記載の組成物。
（項目３５）
ストレプトコッカス・アガラクティエによる感染症を処置又は予防する方法であって、請
求項２１〜３４の何れかに記載の組成物の有効量を、処置又は予防を必要とする個体に投
与することを包含する、方法。
（項目３６）
項目２１〜３４の何れかに記載の組成物を含む容器；及び
ストレプトコッカス・アガラクティエによる感染症の処置又は予防に該組成物を使用す
るための説明書
を含むキット。
（項目３７）
ストレプトコッカス・アガラクティエによる感染症を予防又は処置するワクチンを製造す
るための方法であって、
（ａ）項目１〜２０の何れかに記載のＢｉｂＡポリペプチド；及び
（ｂ）薬学的に許容される担体
を組み合わせることを包含する、方法。
（項目３８）
（ａ）前記ＢｉｂＡポリペプチドをコードする発現コンストラクトを含む宿主細胞を培
養すること；及び
（ｂ）該ＢｉｂＡポリペプチドを回収すること
からなる方法により、該ポリペプチドが製造される、項目３３に記載の方法。
（項目３９）
ストレプトコッカス・アガラクティエによる感染症を処置又は予防するワクチンを製造す
るための方法であって、
（ａ）項目２４又は２５に記載の核酸分子；及び
（ｂ）薬学的に許容される担体
を組み合わせることを包含する、方法。
（項目４０）
ストレプトコッカス・アガラクティエによる感染症を処置又は予防する医薬品の製造にお
ける、項目１〜２０の何れかに記載のＢｉｂＡポリペプチドの使用。
（項目４１）
ストレプトコッカス・アガラクティエによる感染症を処置又は予防する医薬品の製造にお
ける、項目２４又は２５に記載の核酸分子の使用。
（項目４２）
項目１〜２０の何れかに記載のＢｉｂＡポリペプチドに特異的に結合する抗体の調製物
。
（項目４３）
前記抗体がポリクローナルである、項目４２に記載の調製物。
（項目４４）
前記抗体がモノクローナルである、項目４２に記載の調製物。
（項目４５）
前記抗体が、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆｖ分子、非共有結合のヘテロダイ
マー、一本鎖Ｆｖ分子、二量体抗体断片コンストラクト、三量体抗体断片コンストラクト
、ミニボディー、ダイアボディー、及びキメラ抗体からなる群から選択される、項目４
２に記載の調製物。
（項目４６）
前記抗体がヒト化される、項目４２〜４５の何れかに記載の調製物。
（項目４７）
前記抗体がヒト抗体である、項目４２〜４５の何れかに記載の調製物。
（項目４８）
前記抗体が、ＢｉｂＡのコイルドコイルドメインのエピトープに特異的に結合する、請求
項４２〜４７の何れかに記載の調製物。
（項目４９）
前記抗体が、ＢｉｂＡのＮ末端部分においてエピトープに特異的に結合する、項目４２
〜４７の何れかに記載の調製物。
（項目５０）
前記抗体が、ＢｉｂＡのプロリンリッチドメインにおいてエピトープに特異的に結合する
、項目４２〜４７の何れかに記載の調製物。
（項目５１）
項目４２〜５０の何れかに記載の調製物；及び
薬学的に許容される担体
を含む組成物。
（項目５２）
小児ワクチンに有用な活性因子に特異的に結合する抗体を更に含む、項目５１に記載の
組成物。
（項目５３）
前記活性因子が、Ｎ．メニンジティディス、Ｓ．ニューモニエ、ボルデテラ・ペルツッシ
ス、モラクセラ・カタラーリス、クロストリジウム・テタニ、コリネバクテリウム・ジフ
テリエ、ＲＳウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイル
ス、及びロタウイルスポリペプチド抗原からなる群から選択されるポリペプチド抗原であ
る、項目５２に記載の組成物。
（項目５４）
高齢の個体又は免疫不全の個体用のワクチンに有用な活性因子に特異的に結合する抗体を
更に含む、項目５１に記載の組成物。
（項目５５）
前記活性因子が、エンテロコッカス・フェカーリス、スタフィロコッカス・アウレウス、
スタフィロコッカス・エピデルミス、シュードモナス・エルジノーサ、レジオネラ・ニュ
ーモフィラ、リステリア・モノサイトゲネス、インフルエンザウイルス、及びパラインフ
ルエンザウイルスポリペプチド抗原からなる群から選択されるポリペプチド抗原である、
項目５４に記載の組成物。
（項目５６）
ストレプトコッカス・アガラクティエによる感染症を処置又は予防する方法であって、請
求項５１〜５５の何れかに記載の組成物を、処置又は予防を必要とする患者に投与するこ
とを包含する、方法。
（項目５７）
項目５１に記載の組成物を含む容器；及び
Ｓ．アガラクティエによる感染症の処置又は予防に該組成物を使用するための説明書
を含むキット。
（項目５８）
ストレプトコッカス・アガラクティエによる感染症を処置又は予防する組成物を製造する
ための方法であって、
項目４２〜５０の何れかに記載の調製物；及び
薬学的に許容される担体
を組み合わせることを包含する、方法。
（項目５９）
ストレプトコッカス・アガラクティエによる感染症を処置又は予防する医薬品の製造にお
ける、項目４２〜５０の何れかに記載の調製物の使用。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａ  細胞膜に挿入されたＢｉｂＡの図。
【図１Ｂ】図１Ｂ  ＢｉｂＡ及びＭタンパク質の構造の比較。
【図２Ａ】図２Ａ  異なるＧＢＳ株におけるＢｉｂＡタンパク質領域。
【図２Ｂ】図２ｂ  予測された機能領域に基づくＢｉｂＡクローニング断片の表示。
【図３】図３Ａ〜Ｂ  組み換えＢｉｂＡタンパク質がダイマーを形成することを実証する実験結果。図３Ａ  組み換えＢｉｂＡのゲルろ過。図３Ｂ  クマシ染色。
【図４Ａ】ＧＢＳ株におけるＢｉｂＡタンパク質の表面結合。２６０３、１８ＲＳ２１及びＨ３６Ｂ株。
【図４Ｂ】ＧＢＳ株におけるＢｉｂＡタンパク質の表面結合。５１５及びＣＪＢ１１１株。
【図５Ａ】ＢｉｂＡタンパク質が細菌細胞膜或いはＧＢＳ培養上澄み液に含まれていることを実証するデータ。ＦＡＣＳ分析及びウェスタンブロット（２６０３株Ｖ型及び１８ＲＳ２１株ＩＩ型）。
【図５Ｂ】ＢｉｂＡタンパク質が細菌細胞膜或いはＧＢＳ培養上澄み液に含まれていることを実証するデータ。ＦＡＣＳ分析及びウェスタンブロット（Ｈ３６Ｂ株Ｉｂ型）。
【図６】図６  ２６０３Ｖ／Ｒ株のＢｉｂＡタンパク質を発現する５１５株の免疫金染色を示す顕微鏡写真。
【図７】図７Ａ  ｐＡＭ４０１ベクターにクローニングされた２０６３株のＢｉｂＡ遺伝子を示す図。図７Ｂ  ５１５  ｐＡＭ４０１株の表面上でＢｉｂＡが発現されたことを実証するＦＡＣＳ分析。
【図８Ａ】図８Ａ  ２６０３株の表面上でＢｉｂＡ発現が増加したことを実証するＦＡＣＳ分析。
【図８Ｂ】図８Ｂ  ５１５株の表面のＢｉｂＡ発現を実証するＦＡＣＳ分析。
【図９】図９  突然変異株を過剰発現する２６０３−ＢｉｂＡの表面へのヒト−ＩｇＡＦＩＴＣ結合を実証するＦＡＣＳ分析。
【図１０Ａ】細菌細胞膜或いはＧＢＳ培養上澄み液に含まれているＢｉｂＡ部分を実証するデータ。５１５株Ｉａ型。
【図１０Ｂ】細菌細胞膜或いはＧＢＳ培養上澄み液に含まれているＢｉｂＡ部分を実証するデータ。ＣＪＢ１１１株Ｖ型。
【図１０Ｃ】細菌細胞膜或いはＧＢＳ培養上澄み液に含まれているＢｉｂＡ部分を実証するデータ。２６０３Ｖ／Ｒ株。
【図１０Ｄ】細菌細胞膜或いはＧＢＳ培養上澄み液に含まれているＢｉｂＡ部分を実証するデータ。図１０Ｄ  １８ＲＳ２１株。
【図１０Ｅ】細菌細胞膜或いはＧＢＳ培養上澄み液に含まれているＢｉｂＡ部分を実証するデータ。図１０Ｅ  Ｈ３６Ｂ株。
【図１１Ａ】ＢｉｂＡがＣ４結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）に結合することを示すブロット。図１１Ａ  Ｃ４ＢＰでオーバーレイし抗Ｃ４ＢＰ抗体で調べられた天然ＧＢＳタンパク質及びＧＢＳ  ｍＬタンパク質のドットブロット。
【図１１Ｂ】ＢｉｂＡがＣ４結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）に結合することを示すブロット。図１１Ｂ  Ｃ４ＢＰでオーバーレイし、抗Ｃ４ＢＰ抗体で調べられた組み換えＧＢＳタンパク質のウェスタンブロット解析（左：ポンソー染色）。
【図１２】種々の上皮細胞表面に結合したＢｉｂＡのＦＡＣＳ分析。
【図１３】上皮細胞に結合したＢｉｂＡ断片のＦＡＣＳ分析。
【図１４Ａ】精製したヒトＩｇＧでオーバーレイし抗ヒトＩｇＧＨＲＰ結合抗体で標識されたＢｉｂＡタンパク質のウェスタンブロット。５ｍｇ／ｍＬの精製ヒトＩｇＧオーバーレイした７．５ｐＭｏｌの各タンパク質。
【図１４Ｂ】精製したヒトＩｇＧでオーバーレイし抗ヒトＩｇＧＨＲＰ結合抗体で標識されたＢｉｂＡタンパク質のウェスタンブロット。１ｍｇ／ｍＬの精製ヒトＩｇＧでオーバーレイした７．５ｐＭｏｌの各タンパク質。
【図１４Ｃ】精製したヒトＩｇＧでオーバーレイし抗ヒトＩｇＧＨＲＰ結合抗体で標識されたＢｉｂＡタンパク質のウェスタンブロット。５  μｇ／ｍＬの精製ヒトＩｇＧでオーバーレイした１５ｐＭｏｌのＢｉｂＡ。
【図１５】ＢｉｂＡタンパク質に結合した精製ヒトＩｇＡを示すブロット。左の２つのブロットは、精製ヒトＩｇＡＨＲＰで覆った変性ＢｉｂＡのウェスタンブロット分析。右のブロットは、精製ヒトＩｇＡＨＲＰでオーバーレイした天然ＢｉｂＡのドットブロット分析。
【図１６】ＢｉｂＡのトリプシン消化断片のＩｇＡへの結合を示すウェスタンブロット。
【図１７】図１７Ａ〜Ｃ  ＢｉｂＡ−Ｈｉｓがヒト及びラビットＩｇＧに特異的であることを実証するブロット。図１７Ａ  ヒト血清ヤギ−α−ヒト−ＩｇＧ−ＨＲＰ、図１７Ｂ  ウサギ血清ヤギ−α−ウサギ−ＩｇＧ−ＨＲＰ、図１７Ｃ  マウス血清ウサギ−α−マウス−ＩｇＧ−ＨＲＰ。
【図１８】ＢｉｂＡがヒトＩｇＧ（レーンＣ）、ヒト血清ＩｇＡ（レーンＥ）及びＣ４ＢＰ（レーンＧ）に結合することを示すウェスタンブロット。ＧＢＳのＭタンパク質を陽性対照（レーンＤ、Ｆ、Ｈ）として使用した。
【図１９】図１９Ａ〜Ｌ  ＧＢＳ  ２６０３  Ｖ／Ｒ株においてＢｉｂＡが発現され、表面暴露及び分泌されたことを実証するデータ。図１９Ａ  ＧＢＳ  ２６０３  Ｖ／Ｒ株の表面上のＢｉｂＡのフローサイトメトリー分析。細菌をポリクローン性マウス抗ＢｉｂＡ抗体で培養し、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ抗体で染色した（実線のヒストグラム）。点線のヒストグラムは、一次及び二次抗体のみで処理した細菌を示す。図１９Ｂ  ＧＢＳ  ２６０３Ｖ／Ｒ株におけるＢｉｂＡ発現の免疫金電子顕微鏡。ホルムバール−炭素コーティングを施したニッケルグリッドに細菌を吸収させ、次に２％のＰＦＡにて固定した。グリッドを数滴の一次抗血清抗ＢｉｂＡタンパク質に浮かし、次に１０ｎｍの金粒子に結合した二次抗体上に浮かした。  図１９Ｃ  ＧＢＳ  ２６０３Ｖ／Ｒ株タンパク質抽出物におけるＢｉｂＡの存在のウェスタンブロット解析。Ｐペプチドグリカンに伴うタンパク分画及びＳ細菌上澄みタンパク分画。ＧＢＳタンパク分画をＳＤＳ−１０％  ＰＡＧＥゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に移した。タンパク質をマウス抗ＢｉｂＡポリクローナル抗体で覆い、ＨＲＰ結合抗体で染色した。ＥＣＬにより陽性バンドを検出した。図１９Ｄ  ２６０３  ＡｂｉｂＡ株の表面上のＢｉｂＡのフローサイトメトリー分析。ポリクローナルマウス抗ＢｉｂＡ抗体で細菌を培養し、ＦＩＴＣ結合抗マウスのＩｇＧ抗体で染色した（実線のヒストグラム）。点線のヒストグラムは、一次及び二次抗体でのみ処理した細菌を示す。図１９Ｅ  ＧＢＳ  ２６０３  ＡｂｉｂＡ株におけるＢｉｂＡ発現の免疫金電子顕微鏡。ホルムバール−炭素コーティングを施したニッケルグリッドに細菌を吸収させ、次に２％のＰＦＡにて固定した。グリッドを数滴の一次抗血清抗ＢｉｂＡタンパク質に浮かし、次に１０ｎｍの金粒子に結合した二次抗体上に浮かした。図１９Ｆ  ５１５  Ｉａ株表面上のＢｉｂＡのフローサイトメトリー分析。細菌をポリクローナルマウス抗ＢｉｂＡ抗体で培養し、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ抗体で染色した（実線のヒストグラム）。点線のヒストグラムは、一次及び二次抗体でのみ処理した細菌を示す。図１９Ｇ  ＧＢＳ株５１５  ＩａにおけるＢｉｂＡ発現の免疫金電子顕微鏡。ホルムバール−炭素コーティングを施したニッケルグリッドに細菌を吸収させ、次に２％のＰＦＡにて固定した。グリッドを数滴の一次抗血清抗ＢｉｂＡタンパク質に浮かし、次に１０ｎｍの金粒子に結合した二次抗体上に浮かした。図１９Ｈ  ＧＢＳ  ５１５  Ｉａ及び５１５ｐＡＭ４０１ｂｉｂＡ株のタンパク質抽出物におけるＢｉｂＡの存在のウェスタンブロット解析。Ｐペプチドグリカンに伴うタンパク分画及びＳ細菌上澄みタンパク分画。ＧＢＳタンパク分画をＳＤＳ−１０％  ＰＡＧＥゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に移した。タンパク質をマウス抗ＢｉｂＡポリクローナル抗体で覆い、ＨＲＰ結合抗体で染色した。ＥＣＬにより陽性バンドを検出した。図１９Ｉ  ５１５ｐＡＭ４０１ｂｉｂＡ株表面上のＢｉｂＡのフローサイトメトリー分析。細菌をポリクローナルマウス抗ＢｉｂＡ抗体で培養し、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ抗体で染色した（実線のヒストグラム）。点線のヒストグラムは、一次及び二次抗体でのみ処��した細菌を示す。図１９Ｌ  ＧＢＳ  ５１５ｐＡＭ４０１ｂｉｂＡ株におけるＢｉｂＡ発現の免疫金電子顕微鏡。ホルムバール−炭素コーティングを施したニッケルグリッドに細菌を吸収させ、次に２％のＰＦＡにて固定した。グリッドを数滴の一次抗血清抗ＢｉｂＡタンパク質に浮かし、次に１０ｎｍの金粒子に結合した二次抗体上に浮かした。
【図２０】図２０Ａ〜Ｆ  ＢｉｂＡがヒト免疫グロブリンに結合することを実証するウェスタンブロット。図２０Ａ  ＳＤＳ  ＰＡＧＥの上で分離し、ニトロセルロース膜上でブロットした組み換えＢｉｂＡ。次に、膜をヒト、マウス又はウシの精製血清ＩｇＧ  ０．５μｇ／ｍＬで覆い、異なるＩｇＧ種に対する二次抗体よってＩｇＧへの陽性結合を明らかにした。この結合を評価するためＥＣＬ検出を行った。ＧＢＳのＭ１タンパク質を陽性対照として使用したが、ＧＢＳ１０４を非特異的結合の対照として使用した。図２０Ｂ  ０．５μｇ／ｍＬの濃度でオーバーレイしたヒト血清又は分泌型ＩｇＡへの結合試験以外は図２０Ａと同じ。ブロットは、少なくとも三回行った実験の代表である。図２０Ｃ及び図２０ＤＰＢＳ内の異なる濃度の精製した組み換えＢｉｂＡをニトロセルロース膜上につけ、図２０Ａと同様にオーバーレイ試験を行った。図２０Ｃ  ヒト血清ＩｇＧによるオーバーレイ。図２０Ｄ  ヒト血清ＩｇＡによるオーバーレイ。図２０Ｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離したＢｉｂＡのＮ末端及びＣＮ末端構造のヒトＩｇＧによるオーバーレイブロット。図２０Ｆ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離したＢｉｂＡのＮ末端及びＣＮ末端構造のヒトＩｇＡによるオーバーレイブロット。
【図２１】図２１Ａ〜Ｃ  ＢｉｂＡがヒトＣ４ＢＰに結合することを実証するデータ。図２１Ａ  ＳＤＳ  ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜にブロットした組み換えＢｉｂＡ。膜を５μｇ／ｍＬのヒトＣ４ＢＰとオーバーレイし、二次抗体対Ｃ４ＢＰによって明らかにされた結合。ＧＢＳのＭ１タンパク質を陽性対照とし使用したが、ＧＢＳ２０１を非特異的結合の対照として使用した。図２１Ｂ  図２１Ａの場合と同様にニトロセルロース膜上につけ５μｇ／ｍＬのＣ４ＢＰでオーバーレイした天然の組み換えＢｉｂＡの異なる濃度のドットブロット。図２１Ｃ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ヒトＣ４ＢＰでオーバーレイしたＢｉｂＡのＮ末端及びＣ−末端構造のウェスタンブロット。実験的なブロッティング条件は図２１Ａの場合と同じである。
【図２２】図２２Ａ〜Ｃ  上皮細胞への組み換えのＢｉｂＡの結合を実証するグラフ。図２２Ａ  ＭＥ１８０細胞を、組み換えＢｉｂＡの濃度を０．０１〜６２．５μｇ／ｍＬの範囲で増加させて４℃で１時間培養した。次に、細胞を洗浄し、マウス抗ＢｉｂＡモノクローナル抗体で培養し、次にＦＩＴＣ結合二次抗マウス抗体で培養した。ＭＦＩ平均蛍光強度。このプロットは３つの独立した実験の代表である。図２２Ｂ  ＭＥ１８０細胞に対するＢｉｂＡ結合の飽和曲線。パネルＡに報告したデータについて分析を行った。Ｋｄ値を細胞に存在する受容体の５０％の飽和を決定するＢｉｂＡ濃度として求めた。図２２Ｃ  １０μｇ／ｍＬのＢｉｂＡのＡ５４９、Ｃａｃｏ２及び１６ＨＢＥ上皮細胞への結合の代表的なフローサイトメトリープロファイル。結合実験条件及び分析は図２２Ａと同じ。点線のヒストグラムは、対照細胞のＭＦＩを表す。
【図２３】図２３Ａ〜Ｆ  ＢｉｂＡ発現がＧＢＳの上皮細胞に付着する能力を調節することを実証するデータ。図２３Ａ  ２４ウェルプレートにおいて増殖させたＭＥ１８０細胞をＧＢＳ  ２６０３Ｖ／Ｒ、２６０３ΔｂｉｂＡ及び２６０３ｐＡＭ４０１ｂｉｂＡ株に３時間感染させた。付着しなかった細菌を静かに洗い流し、細胞を結合試験用サポニンで溶解した。白いカラムは野生型株において結合細菌の割合を示し、ライトグレーのカラムはＢｉｂＡの同質遺伝子型の突然変異株の結合率を示し、ダークグレーのカラムはＢｉｂＡを過剰発現する野生型株の結合を示す。図２３Ｂ  Ａ５４９細胞に感染させた以外は図２３Ａと同じ。３つの個々の実験の平均±標準偏差。スチューデントのｔ検定によって評価されたデータは信頼度９５％であった。図２３Ｃ  ＢｉｂＡ遺伝子を欠く同質遺伝子型の突然変異株（図２３Ｄ）と比較した２６０３Ｖ／Ｒ株のＡ５４９肺上皮細胞への結合の共焦点画像解析の顕微鏡写真。スライドガラス上に増殖させたＡ５４９細胞をＧＢＳに３時間感染させた。次に、Ｖ型莢膜多糖及びウサギポリクローナル抗ＢｉｂＡモノクローナル抗体で飼育したマウスのポリクローナル抗血清で細菌を染色した。カプセル及びＢｉｂＡをそれぞれアレクサ・フルオル５６２レッド及び４８８グリーン結合二次抗体で標識した。Ａ５４９細胞Ｆ−アクチンをアレクサ・フルオル６２２結合ファロイジンブルーで標識した。図に示す結果は、複数の実験の典型例である。図２３Ｅ  ５１５  Ｉａ野生型株及びＡ５４９上皮細胞に関連する５１５  ｐＡＭ４０ｌｂｉｂＡ遺伝子（図２３Ｆ）を含有するプラスミドを有する同系遺伝子型株の共焦点画像解析。
【図２４】ＢｉｂＡタンパク質の配列構成の概要。Ｅｘｐａｓｙウェブサーバ（ドメイン名：ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）のＰａｉｒｃｏｉｌプログラム（Ｂｅｒｇｅｒら、１９９５）を使用して得られた予測によると、Ｎ末端領域はヘリックスリッチ構造を形成すると予測されている。典型的ＬＰＸＴＧ（配列番号３）細胞壁固着モチーフ及び膜貫通領域の位置も示されている。
【図２５】ＢｉｂＡがＧＢＳの上皮細胞への付着に関与していることを実証するデータの概要。
【図２６】ＢｉｂＡの過剰発現によってＧＢＳの上皮細胞への付着が増大することを実証するデータの概要。
【図２７】５１５  Ｉａ表面上のＢｉｂＡの発現によって上皮細胞への付着が増加することを実証するデータの概要。
【図２８】ＩｇＡが組み換えＢｉｂＡのＮ末端部分に結合することを実証するデータの概要。
【図２９】ＩｇＡ結合領域がＢｉｂＡの最初の２００個のアミノ酸内に含まれていることを実証するデータの概要。
【図３０】ＢｉｂＡは、多形核白血球による殺菌に対するＧＢＳの生存を促進する。ヒト血清（白い棒グラフ）又は補体不活性化ヒト血清（グレーの棒グラフ）の存在下において、ヒト好中球をＧＢＳ  ２６０３Ｖ／Ｒ及び２６０３ＡＭｂＡ突然変異株（ＭＯＩ  １：１）と共に３時間培養した。好中球と共に培養後の生菌の割合を測定した。３回行った典型的な実験を示す。実験を少なくとも３回繰り返したが、同じ結果が得られた。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（発明の詳細な説明）
出願者は、グラム陽性菌（ＧＢＳ）において宿主細胞の補体活性化経路と相互作用し、
侵入する細菌の補体抵抗性又は回避機序に関与すると考えられる血清耐性因子を特定した
。この新たに特定された血清耐性因子は、本明細書においてＢ群ストレプトコッカス免疫
グロブリン結合固着（ＢｉｂＡ）と呼ばれる（又ＧＢＳ  ３とも呼ばれる）。ＢｉｂＡは
広く発現されるタンパク質であり、分析した３１種のＧＢＳ株の８１％で存在する（表３
）。
【００１１】
重複がないＧｅｎＢａｎｋデータベースにおけるＢＬＡＳＴ検索により、ＢｉｂＡ  Ｎ
末端領域は、Ｓ．ピオゲネスのＭタンパク質族（２２％の同一性）、Ｓ．アガラクティエ
のＢａｃ（２０％の同一性）、Ｓ．ニューモニエのＰｓｐＣ（２０％の同一性）及びＳ．
ディスアガラクティエのＭｉｇ（２７％の同一性）のように一連のグラム陽性免疫グロブ
リン結合タンパク質と低い類似性が示された。ｖＢｉｂＡは、Ｓ．ニューモニエのＨｉｃ
様タンパク質等の他のグラム陽性菌の耐性因子と幾つかの類似点を共有する。
【００１２】
ＢｉｂＡ遺伝子は、ｓｅｃＥ遺伝子及びｎｕｓＧ遺伝子間に位置する。ｓｅｃＥ及びｎ
ｕｓＧは、大腸菌において共転写され（Ｄｏｗｎｉｎｇら、１９９０）、グラム陽性菌及
びグラム陰性菌の大きなパネルにおいて隣接している（Ｂａｒｒｅｉｒｏら、２００１；
Ｆｕｌｌｅｒら、１９９９；  Ｊｅｏｎｇら、１９９３；  Ｋａｔａｙａｍａ，  ｅｔ
ａｌ，  １９９６；  Ｍｉｙａｋｅら、１９９４；  Ｐｏｐｌａｗｓｋｉら、２０００
；  Ｐｕｔｔｉｋｈｕｎｔら、１９９５；  Ｓｈａｒｐ，  １９９４；  Ｓｙｖａｎｅｎ
ら、１９９６）。この証拠は、ＢｉｂＡの現在のゲノムのローカリゼーションが挿入事象
に由来することを示唆する。興味深いことに、Ａ９０９株に存在する２種類のトランスポ
サーゼは、ＧＢＳ亜型分類のツールとして提案され（Ｔａｍｕｒａら、２０００）、その
存在が多座シークエンスタイピング（ＭＬＳＴ）によって分析されたＳ．アガラクティエ
種の発生と関係付けられている（Ｈｅｒｙ−Ａｒｎａｕｄら、２００５）ＩＳ１３８１族
に属す。
【００１３】
７つのＧＢＳ完全なゲノムのコンピュータ解析により、ＢｉｂＡが調節タンパク質であ
ることが明らかとなった。その配列変動は主としてＮ末端又はＣ末端領域におけるアミノ
酸の短い繰り返し数の違いによる。全長のＢｉｂＡは、Ｎ末端のヘリックスリッチ領域、
Ｃ末端のプロリンリッチドメイン、細胞壁ペプチドグリカンにタンパク質を固着するＬＰ
ＸＴＧ（配列番号３）モチーフ及び膜貫通領域からなる。図ＩＡ、２Ｂ  ＢｉｂＡのコイ
ルドコイルドメインは、Ｓ．アガラクティエの複数の血清型において十分保たれている。
【００１４】
ＢｉｂＡは、構造的にＳ．ピオゲネス（ＧＢＳ）（図ＩＢ）のＭ様タンパク質族と関係
がある。Ｍタンパク質の２次構造は主として安定したダイマーを形成するα−ヘリカルコ
イルドコイル構造である（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、１９８１）。コンピュータによるＢｉｂ
Ａの２次構造の予測（Ｂｅｒｇｅｒら、１９９５）により、Ｎ末端領域においてコイルド
コイル配列を形成する傾向のあるヘリックスリッチ領域（２８３−２９４領域及び３６６
−４００領域）が示された。ＢｉｂＡの組み換え形態に関する研究により、Ｍタンパク質
に関しては、ＢｉｂＡは非還元条件で開くダイマーを形成できることが示唆された。一方
、２次構造のカノニカルエレメントはプロリンリッチドメイン内にあると予測され、分子
のこの部分はポリプロリンヘリックス様構造を呈することができることを示唆する。
【００１５】
ＢｉｂＡは幾つかのＧＢＳ株の表面上で発現されるが、ＧＢＳ培養液の上清においても
回収される。ＢｉｂＡは、細胞壁上に発現されても上清部分に分泌されたとしても、同一
の明らかな分子量を有する。これは、ＢｉｂＡの分泌は細胞壁固定領域のタンパク質分解
開裂による可能性があるこ又はタンパク質のソーティング障害は分泌が原因である可能性
があることを示唆する。実際、ＢｉｂＡはシグナルペプチドにおいてＹＳＳＩＲＫｇ／ｓ
様モチーフ（配列番号６４）を有するが、これは以前スタフィロコッカス・アウレウス及
び他のグラム陽性菌にあると言われていた（Ｂａｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，  
２００３）。このようなモチーフは、殆どＢｉｂＡ中にあり、分析した８種類のＧＢＳ株
全てにおいて保たれている。ＹＳＳＩＲＫ−Ｇ／Ｓ様モチーフ（配列番号６４）は、タン
パク質成熟の促進に関与しているとされている（Ｂａｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ
，  ２００３）。この証拠に基づき、本発明者等は、ソルターゼ成分はＢｉｂＡの完全で
効率的な固着を制限し、成熟したＢｉｂＡの不十分なプロセス及び上清におけるタンパク
質の放出が生じると仮定する。
【００１６】
機能的な特性解析により、ＢｉｂＡはストレプトコッカスの表面に暴露された細菌のコ
ロニー形成を媒介し、宿主免疫反応を調節する多機能性タンパク質群の一種として特定さ
れる（Ｊａｒｖａら、２００３；  Ｌｉｎｄａｈｌら、２００５）。しかしながら、Ｂｉ
ｂＡはヒト免疫グロブリン及び補体制御因子Ｃ４ｂｐの両方に結合するというようなユニ
ークな特徴を有する。ＩｇＡ及びＣ４ｂｐのＢｉｂＡ結合部位は、タンパク質のＮ末端領
域にある。しかしながら、ＩｇＡに特異的なＢａｃ  Ｎ末端領域に相同性はない（Ｌｉｎ
ｄａｈｌら、１９９０）。マウス及びウシのＩｇＧに結合しないことは、Ｂｉｂ  Ａが他
のＩｇ結合タンパク質について報告されているようにヒトに特異的な機能的役割を有する
ことを示唆する。
【００１７】
分泌されたＢｉｂＡは、ヒト上皮細胞、補体（例えばＣ４結合タンパク質）、特にヒト
ＩｇＧ及びＩｇＡに結合する。分泌されたＢｉｂＡのプロリンリッチドメインは、ヒト上
皮細胞との結合相互作用の原因である。実施例８及び９。プロリンリッチドメインには、
８つのアミノ酸の周期性がある。プロリンは、モチーフのｂ位及びｆ位を占めそれが１９
回繰り返される。
【００１８】
【化１】
2012105659.tif 000002
プロリンリッチドメインは、存在する場合、ＢｉｂＡのＣ末端側に位置する。図２Ａに
示す通り、プロリンリッチドメインは一般的にアミノ酸４００からＣ末端端に位置する。
【００１９】
免疫グロブリンへのＢｉｂＡ結合領域を解明するため、タンパク質のＮ末端又はＣ末端
部分からなる２つのコンストラクトを生成した。ヒトＩｇＧに結合するＢｉｂＡは、主に
タンパク質のＮ末端領域に結合し、Ｃ末端領域にはあまり結合しない。一方、ヒトＩｇＡ
への結合は殆どＢｉｂＡのＮ末端部分に関係する。この領域もＢｉｂＡのＣ４ｂｐへの結
合の原因であった。又、組み換えＢｉｂＡは約１０−８Ｍの結合定数で起源の異なるヒト
上皮細胞に結合する。
【００２０】
コイルドコイルドメインは、種々のＧＢＳ株でよく保たれている。コイルドコイルドメ
インは、ＢｉｂＡのＣ４結合タンパク質のような補体との結合相互作用の原因である。実
施例７。又、コイルドコイルドメインは、ＩｇＧ及びＩｇＡのようなヒト免疫グロブリン
との結合相互作用の原因である。実施例１０、１１及び１２。ＩｇＡ結合部位は、Ｂｉｂ
ＡのＮ末端部分（約２００のアミノ酸）にあると思われる。ＢｉｂＡは、他のコイルドコ
イルタンパク質と同様にダイマーを形成する。実施例１。
【００２１】
細菌がＢｉｂＡを分泌した場合、タンパク質のプロリンリッチＣ末端領域は宿主上皮細
胞に結合し、Ｎ末端のコイルドコイルドメインは血清因子に曝露されると考えられている
。Ｎ末端のコイルドコイルドメインはＣ４結合タンパク質のような補体を引き寄せて侵入
する細菌から排除すると考えられている。コイルドコイルドメインに結合した宿主細胞と
の補体結合相互作用は、補体活性を宿主細胞に引き寄せ、細菌の侵入を更に促進する。
【００２２】
ＬＰＸＴＧ（配列番号３）／プロリンリッチドメインがない株もある。図２Ａ。プロリ
ンリッチドメインがないか或いは別々に発現される場合、ＢｉｂＡは主として分泌され表
面に露出されないと考えられている。しかしながら、開裂又は分岐したＢｉｂＡでも標的
宿主細胞に接近した時に免疫システムの注目を細菌から逸らすと考えられている。
【００２３】
ＢｉｂＡノックアウト突然変異株が、ヒト頚部及び肺上皮細胞の両方に結合する能力の
障害によって、ＧＢＳの細胞への付着におけるＢｉｂＡの役割を確認した。突然変異の相
補性はＧＢＳ付着型表現型を修復したが、ＢｉｂＡの過剰発現は上皮細胞結合を有意に増
大した。これらの特性は、ＢｉｂＡは新しい多機能性タンパク質であり、恐らくＧＢＳの
病原性に関係することを示す。
【００２４】
ＢｉｂＡタンパク質の溶解可能な形態では、予想分子量は約６ＯｋＤａであるが、ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル上での見かけの分子量は約８０ｋＤａである。タンパク質のプ
ロリンリッチドメインは、ＢｉｂＡが束状に折畳まれることにより、この相違の原因であ
る可能性がある。膜を伴う形態は容易に分解され、タンパク質のごく一部が８ＯｋＤとし
てゲル上を進み、大部分が約６０ｋＤａの分子量で進む。これは、細胞膜結合型において
はプロリンリッチモチーフがまだ細胞壁成分に結合していて、直線状構造を保っているこ
とを示す。実施例２〜４、６を参照されたい。
【００２５】
細菌の宿主細胞への付着は第一手順であり、宿主の粘膜表面に無事コロニーを形成する
ための必要条件である。組み換えＢｉｂＡの上皮細胞への結合の分析により、細胞への結
合は推定約４×１０−８Ｍの結合定数で飽和することが明らかとなった。特に、ＢｉｂＡ
の肺、腸、気管支及び頚部由来の上皮細胞系への結合は、遍在性の受容体の存在を示唆す
る。ＢｉｂＡは、Ｍタンパク質（Ｃｏｕｒｔｎｅｙら、１９９４；  Ｃｏｕｒｔｎｅｙら
、１９９７；  Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｉｎｓｏｎ，  １９９４）のように細菌の上皮細
胞への付着を媒介する。同質遺伝子型のＢｉｂＡ陽性株及びＢｉｂＡ陰性株に関する研究
により、ＢｉｂＡ陽性株は上皮細胞に付着するが、ＢｉｂＡ陰性株の付着は非常に少ない
ことが示された。又、表面にＢｉｂＡを露出しない株におけるＢｉｂＡの細胞壁固着型の
発現は、その結合表現型を増大した。興味深いことに、このような結果はＧＢＳコロニー
形成の標的であるヒト頚部上皮細胞系（ＭＥ  １８０）及び肺上皮細胞系（Ａ５４９）の
両方において確認された。
【００２６】
これらの機能特性は、ＢｉｂＡがＧＢＳの病原性に関与する血清耐性因子であり、従っ
てＳ．アガラクティエ感染症の予防及びを処置するための組成物において活性因子として
有用であることを示唆する。
【００２７】
Ｉ．  ＢｉｂＡポリペプチド
本発明の「ＢｉｂＡポリペプチド」は、（１）ＢｉｂＡタンパク質のコイルドコイルド
メイン、（２）ＢｉｂＡタンパク質のリーダー配列及びコイルドコイルドメイン、（３）
ＢｉｂＡタンパク質のプロリンリッチドメイン、（４）ＢｉｂＡタンパク質のコイルドコ
イル及びプロリンリッチドメイン、又は（５）ＢｉｂＡタンパク質のリーダー配列、コイ
ルドコイルドメイン及びプロリンリッチドメインからなるＢｉｂＡタンパク質の部分を含
むがＢｉｂＡタンパク質の他の連続するアミノ酸配列はない。本発明のＢｉｂＡポリペプ
チドは、全長のＢｉｂＡポリペプチドのアミノ酸配列を含まない。
【００２８】
ＢｉｂＡポリペプチドは、図２４の「Ｉ」、「ＩＩ」及び「ＩＩＩ」のポリペプチドを
含む。
【００２９】
ＧＢＳ血清型Ｖ分離株  ２６０３Ｖ／ＲのＢｉｂＡタンパク質は、配列番号１に示すア
ミノ酸配列を有している。
【００３０】
【化２】
2012105659.tif 000003
ＢｉｂＡは、Ｎ末端リーダー又は上記配列番号１の初めの下線を引いた配列によって示
される信号配列領域及び上記配列番号１の末端の下線を引いた配列によって示されるＣ末
端膜貫通領域を有する。ＢｉｂＡのリーダー又は信号配列領域から１つの以上アミノ酸が
除去されることもある。このようなＢｉｂＡ断片の例を以下の配列番号２に示す。
【００３１】
【化３】
2012105659.tif 000004
ＢｉｂＡは、細胞壁アンカーを示すアミノ酸モチーフも有している。
【００３２】
ＬＰＸＴＧ（配列番号３、上記配列番号１の太字及びイタリック表示部分）。
【００３３】
一実施形態において、リーダー又は信号配列領域、膜貫通領域及び細胞質領域、及び細
胞壁アンカーモチーフはＢｉｂＡ配列から除去され、以下の配列番号４に示すコイルドコ
イル及びプロリンリッチセグメントを残す。
【００３４】
【化４】
2012105659.tif 000005
ＢｉｂＡのプロリンリッチドメインを、以下の配列番号５で示す。
【００３５】
【化５】
2012105659.tif 000006
ＢｉｂＡのコイルドコイルドメイン及びシグナルペプチド領域を以下の配列番号６で示
す。
【００３６】
【化６】
2012105659.tif 000007
ＢｉｂＡの高度に保存されたコイルドコイルドメインは、タンパク質のＮ末端の方に位
置し、以下のＢｉｂＡ配列番号１の配列における下線部分にある。下線を引いたＢｉｂＡ
のコイルドコイルドメインに対応する断片を以下の配列番号７に示す。
配列番号１
【００３７】
【化７】
2012105659.tif 000008
配列番号７
【００３８】
【化８】
2012105659.tif 000009
ＢｉｂＡのシグナルペプチド（アミノ酸１〜３６）、コイルドコイルドメイン及びプロ
リンリッチドメインを以下の配列番号８で示す。
【００３９】
【化９】
2012105659.tif 000010
ＩＩ．  ＢｉｂＡポリペプチドをコードする核酸分子
本発明には、ＢｉｂＡポリペプチドをコードする核酸分子が含まれる。本発明には、こ
のような分子に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる
核酸分子も含まれる。特定の配列によって、配列同一性の程度は好ましくは５０％以上（
例えば６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９
４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）である。ヌクレオチド配列間の同
一性は、好ましくはギャップ開始ペナルティ＝１２及びギャップ伸長ペナルティ＝１のパ
ラメータを使用したアフィンギャップ検索を使用したＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏ
ｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に実装されたＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アル
ゴリズムによって決定する。
【００４０】
本発明は、これらの分子にハイブリッド化できる核酸分子も提供する。異なる「ストリ
ンジェントな」条件下でハイブリダイゼーションを行うことができる。ハイブリダイゼー
ションのストリンジェンシーを増大する条件は、当該技術分野で広く知られており公表さ
れている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  １９８９，  ｐ．７．５２を参照されたい。（
ストリンジェンシーを増大するための）適切な条件の例は以下のものを含む：２５℃、３
７℃、５０℃、５５℃及び６８℃の培養温度、１０Ｘ  ＳＳＣ、６Ｘ  ＳＳＣ、ＩＸ  Ｓ
ＳＣ及び０．１Ｘ  ＳＳＣ（但し、ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ及び１５のｍＭクエン
酸緩衝液である）及び他の緩衝系を使用したそれらの同等物の緩衝液濃度、０％、２５％
、５０％及び７５％のホルムアミド濃度、５分〜２４時間の培養時間、１回、２回又はそ
れ以上の洗浄処理、１分、２分又は１５分の洗浄培養時間、及び６Ｘ  ＳＳＣ、ＩＸ  Ｓ
ＳＣ、０．１Ｘ  ＳＳＣ又は脱イオン水の洗浄液。ハイブリダイゼーション法及びそれら
の最適化は当該技術分野で既知の。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  １９８９；  Ａｕｓｕ
ｂｅｌら、ｅｄｓ．，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  
Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ４ｔｈ  ｅｄ．，  １９９９；  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  ５，７０
７，８２９；  Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  
ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０，  １９８
７を参照されたい。
【００４１】
幾つかの実施形態において、本発明の核酸分子は低ストリンジェントな条件下で標的に
ハイブリダイズし、他の実施形態において、本発明の核酸分子は中ストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、好ましい実施形態において、本発明の核酸分子は高ストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズする。低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件の例は、５０℃及び１ＯＸ  ＳＳＣである。中ストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件の例は、５５℃及びＩＸ  ＳＳＣである。高ストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件の例は、６８℃及び０．１Ｘ  ＳＳＣである。
【００４２】
これらの配列の断片からなる核酸分子も本発明に含まれる。これらは、これらの配列の
少なくともｎ個の連続するヌクレオチドを含み、特定の配列によってｎは１０以上（例え
ば１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、
９０、１００、１５０、２００以上）である。
【００４３】
本発明の核酸（及びポリペプチド）には、以下の配列が含まれる場合がある：
（ａ）配列リストに開示する配列と同じ（即ち１００％同じ）配列；
（ｂ）配列リストに開示する配列との配列同一性を共有する配列；
（ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）の配列と比較して別々の部位にあるか連続する１個、２個
、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個の単一ヌクレオチド又はア
ミノ酸変異（欠失、挿入、置換）を有する配列；及び
（ｄ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列リストの特定の配列とア
ライメントした場合、初め（Ｎ末端又は５’）から終わり（Ｃ−末端又は３’）へ、ｐ個
のモノマー（但しｐ＞×）まで及ぶアライメントについてこのようなウィンドウがｐ−×
＋１あり、各ウィンドウはアライメントされた同一のモノマーを少なくとも×−ｙ個有す
るように移動する×モノマー（アミノ酸又はヌクレオチド）のムービングウィンドウ。但
し、ｘは２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００
、１５０、２００から選択し、ｙは０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０
、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６
、０．９７、０．９８、０．９９から選択し、ｘ−ｙが整数でない場合は四捨五入して整
数にする。好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムはＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕ
ｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズム［Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓ
ｃｈ  （１９７０）  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ４８，  ４４３−４５３］であり、
デフォルトのパラメータを使用する（例えばギャップ開始ペナルティ＝１０．０、ギャッ
プ伸長ペナルティ＝０．５及びＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用）。
このアルゴリズムは、便利なことにＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルツールに実装され
ている［Ｒｉｃｅら、（２０００）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １６：２７６−２７
７］。
【００４４】
本発明の核酸及びポリペプチドは、これらの配列（ａ）〜（ｄ）に更にＮ末端／５’及
び／又はＣ末端／３’に対して更に配列を有してもよい。
【００４５】
本発明の核酸分子は一本鎖であっても二本鎖であってもよく、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒ
ｏ（即ち組換えタンパク質）又はｉｎ  ｖｉｖｏ（即ちＤＮＡワクチン）でのＢｉｂＡポ
リペプチドの生成に使用することができる。本発明は、本発明の他の核酸分子に好ましく
は「高ストリンジェントな」条件（例えば０．１ｘＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ溶液内で６
５℃）下でハイブリダイズすることができる一本鎖核酸分子も提供する。
【００４６】
本発明の核酸分子は、修飾骨格を有するアナログ（例えばホスホロチオエート等）及び
ペプチド核酸（ＰＮＡ）等を含めＤＮＡ又はＲＮＡを含んでもよい。本発明の核酸分子は
、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡの一部を含んでもよい。本発明の核酸分子は全長
のＢｉｂＡタンパク質をコードしない。
【００４７】
ＢｉｂＡポリペプチドをコードする部分を得ることができる全長のＢｉｂＡタンパク質
をコードする核酸分子の例を以下の配列番号１６に示す。
【００４８】
【化１０】
2012105659.tif 000011
本発明の他の実施形態は、ＢｉｂＡポリペプチドのプロリンリッチドメインをコードす
る核酸分子を提供する。このような核酸分子の例を以下の配列番号１７に示す。
【００４９】
【化１１】
2012105659.tif 000012
ＢｉｂＡポリペプチドの高度に保存されたコイルドコイルドメイン及びプロリンリッチ
ドメインをコードする核酸分子を以下の配列番号１８に示す。
【００５０】
【化１２】
2012105659.tif 000013
ＢｉｂＡの細胞壁アンカーをコードする核酸分子を以下の配列番号１９に示す。配列番
号１９：ＴＴＡＣＣＡＴＣＡＡＣＧＧＧＴ。
【００５１】
ＩＩＩ．  核酸分子の調製
本発明の核酸分子は、例えば、化学合成によってゲノム又はｃＤＮＡライブラリーから
（例えば、ＰＣＲのようなプライマー増幅法を使用）、微生物自体から等、種々の方法で
調製することができる、種々の形態（例えば一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブ等）を
とることができる。これらは、好ましくは極めて純粋な（即ち、他のＧＢＳ又は宿主細胞
の核酸が殆どない）形態で調製される。
【００５２】
核酸分子は、当該技術分野で既知の化学的方法を使用して、全体的に又は部分的に合成
することができる。Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  Ｓｙｍ
ｐ．  Ｓｅｒ．  ２１５−２２３，  １９８０；  Ｈｏｒｎら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  
Ｒｅｓ．  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．  ２２５−２３２，  １９８０；  Ｈｕｎｋａｐｉｌｌ
ｅｒら、（１９８４），  Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：  １０５−１１１；  Ｇｒａｎｔｈａ
ｍら、（１９８１），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ９：  ｒ４３−ｒ７４
を参照されたい。
【００５３】
ｃＤＮＡ分子は、テンプレートとしてｍＲＮＡを使用することにより標準の分子生物学
的手法で生成することができる。その後ｃＤＮＡ分子は当該技術分野で周知の分子生物学
的手法を使用して複製することができる。テンプレートとしてゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ
を使用してＰＣＲ等の増幅法を使用して、本発明のポリヌクレオチドの追加の複製を得る
ことができる。
【００５４】
必要に応じて、種々の理由（ポリペプチド又はｍＲＮＡ生成物のクローニング、プロセ
シング及び／又は発現を修飾する改変を含むがこれに限定されるものではない）でコード
配列を改変するために当該技術分野で一般的に知られている方法を使用してヌクレオチド
配列を遺伝子操作してもよい。無作為な断片化によるＤＮＡシャフリング及び遺伝子断片
及び合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再結合を使用してヌクレオチド配列を遺伝子操作し
てもよい例えば、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの改変、コンドン選択性
の変更、スプライスバリアントの生成、突然変異の導入等を行うために部位特異的変異誘
発を使用することができる。
【００５５】
精製タグ配列の追加又はコドン最適化等の配列の修飾は、発現を促進するために使用す
ることができる。例えば、Ｎ末端リーダー配列は、ポリヒスチジン（ＨＩＳ）又はグルタ
チオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等のタグタンパク質のの配列コードと置換される
場合がある。発現されたタンパク質の精製、検出及び安定を促進するために、このような
タグタンパク質を使用してもよい。特定の原核又は真核宿主に選択されるコドンは、タン
パク質の発現率を増大するため、或いは天然の配列から発生した転写よりも長い半減期の
ような所望の性質を有するＲＮＡ転写の生成するために選択することができる。これらの
方法は当該技術分野で周知であり、ＷＯ０５／０３２５８２に詳述されている。
【００５６】
ＩＶ．  ＢｉｂＡポリペプチドの生成
ＢｉｂＡポリペプチドは、例えば、ポリペプチド発現を許容する条件下で本発明の核酸
分子で形質転換した宿主細胞を培養することによって組み換えで生成することができる。
ＢｉｂＡポリペプチドは、化学的手段によって合成するか、或いはＳ．アガラクティエか
ら単離した全長ＢｉｂＡタンパク質から調製することができる。
【００５７】
Ａ．  ポリペプチドの組み換え生成
１．  核酸分子
上記ポリペプチドを組み換えで生成するために特定のＢｉｂＡポリペプチドをコードす
る任意の核酸分子を使用することができる。ポリペプチドをタグタンパク質及びＧＢＳポ
リペプチドからなる融合タンパク質として発現するようにインフレームのタグタンパク質
をＢｉｂＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にコードするヌクレオチド配列を
加えることによってＢｉｂＡポリペプチドの組み換え生成を促進することができる。この
ようなタグタンパク質は、発現されたタンパク質の精製、検出及び安定度を促進すること
ができる。本発明において使用するのに好適なタグタンパク質には、ポリアルギニンタグ
（アルギニンタグ）、ポリヒスチジンタグ（ヒスチジンタグ）、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅ
タグ、ｃ−ｍｙｃタグ（Ｓタグ）、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合領域、
ＳＢＰタグ、キチン結合領域、グルタチオンＳトランスフェラーゼタグ（ＧＳＴ）、マル
トース結合タンパク質、抗転写終結因子（ＮｕｓＡ）、大腸菌チオレドキシン（ＴｒｘＡ
）、及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼＩ（ＤｓｂＡ）等がある。好ましいタグタ
ンパク質は、Ｈｉｓタグ及びＧＳＴ等である。Ｔｅｒｐｅら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （２００３）  ６０：５２３−３３を参照されたい。
【００５８】
精製後、タグタンパク質は、場合により、当該技術分野で既知の特別に調整した酵素処
理によって、発現された融合タンパク質から除去される場合がある。一般的に使用される
プロテアーゼは、エンテロキナーゼ、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、トロンビン及び
Ｘａ因子等である。
【００５９】
２．  発現コンストラクト
ポリペプチドをコードする核酸分子を、挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必要な
要素を含む発現コンストラクトに挿入することができる。コード配列及び適切な転写及び
翻訳調節要素を含む発現コンストラクトの構築を行うために、当業者に周知の方法を使用
することができる。これらの方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの組み換えＤＮＡ技術、合成技
術、及びｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子組み換え技術が含まれる。
【００６０】
３．  宿主細胞
異種宿主は原核生物であっても真核生物であってもよい。大腸菌は好ましい宿主細胞で
あるが、他に適切な宿主としてはバシラスサチリス、ビブリオコレラ、サルモネラチフィ
、サルモネラチフィムリウム、ナイセリアラクタミカ、ナイセリアシネレア、マイコバク
テリア（例えばＭ．チューバキュロウセス）、イースト等がある。
【００６１】
宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節する能力又は発現されたポリペプチドを所
望の方法で処理する能力によって選択することができる。このようなポリペプチドの修飾
には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシレーション、リン酸化、脂質化及びアシル
化が含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチドのプレプロ体を開裂する翻訳後プ
ロセシングも、正しい挿入、折り畳み及び機能を促進するために使用することができる。
翻訳後の活性のための特殊な細胞機構及び特有の機序を有する種々の宿主細胞が米国菌株
保存機関（ＡＴＣＣ；  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍ
ａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０−２２０９）から入手可能であり、異種タンパク質
の正しい修飾及び処理を確実にするために選択することができる。ＷＯ  ０１／９８３４
０を参照されたい。
【００６２】
十分確立された手法（トランスフェリンポリカチオン媒介性ＤＮＡ転移、裸又はカプセ
ル封入された核酸の転移、リポソーム媒介性細胞融合、ＤＮＡコーティングラテックスビ
ーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、「遺
伝子銃」法、及びＤＥＡＥ又はリン酸カルシウム媒介性トランスフェクション等が含まれ
るがこれらに限定されない）を使用して、発現コンストラクトを宿主細胞に導入すること
ができる。
【００６３】
発現コンストラクトで形質転換した宿主細胞は、細胞培養からのタンパク質の発現及び
回収に好適な条件下で培養できる。形質転換細胞生成タンパク質は、ヌクレオチド配列及
び／又は使用された発現コンストラクトによって分泌又は細胞内に貯蔵される。当業者は
、発現コンストラクトが原核又は真核細胞膜を通して可溶性ポリペプチドの分泌を誘導す
る信号配列を含むよう設計することができることを理解できる。
【００６４】
Ｂ．  精製
本発明のＢｉｂＡポリペプチドは、適切なストレプトコッカス・アガラクティエ菌或い
は遺伝子操作した宿主細胞から単離することができる。精製したＢｉｂＡポリペプチドは
、当該技術分野で周知の方法を使用して、タンパク質、炭水化物又は脂質等細胞の他の成
分から分離される。このような方法には、粒径排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウ
ム分画法、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、及びプレパラテ
ィブゲル電気泳動が含まれるが、これらに限定されない。精製したＢｉｂＡポリペプチド
の製剤は少なくとも純度８０％であり、好ましくは、製剤は純度９０％、９５％又は９９
％である。製剤の純度は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動等当該技術分野で既知
の任意の手段によって評価することができる。適切な場合は、ポリペプチドは例えば尿素
を使用して可溶化することができる。
【００６５】
Ｃ．  化学合成
本発明のＢｉｂＡポリペプチドは、例えば固相法を使用して合成することができる。例
えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｊ  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５，  ２１４９
−５４，  １９６３；  Ｒｏｂｅｒｇｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９，  ２０２−０４，
１９９５を参照されたい。合成は手動又は自動で行うことができる。自動合成は、例え
ば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３  ＩＡ  ペプチド合成装置（Ｐｅｒｋ
ｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して達成することができる。場合により、ポリペプチドの断片
は、別々に合成され、化学的方法を使用して組み合わされ、最終的な分子を生成してもよ
い。
【００６６】
Ｖ．  抗体
抗体はＢｉｂＡポリペプチド又は他の抗原に特異的に結合するよう生成することができ
、又、治療又は診断に使用することができる。「抗体」という用語は、完全な免疫グロブ
リン分子並びに抗原を結合することができるその断片を指す。これらには、ハイブリッド
（キメラ）抗体分子（例えばＷｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，  ２９３−９９，
１９９１；  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  ４，８１６，５６７）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦ
（ａｂ）断片及びＦｖ分子、非共有結合ヘテロダイマー（例えば、Ｉｎｂａｒら、Ｐｒｏ
ｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  ＳｃＬ  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ６９，  ２６５９−６２，  １
９７２；  Ｅｈｒｌｉｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９，  ４０９１−９６，  １９８０）
、一本鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃ
ａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５，  ５８９７−８３，  １９８８）、二量体抗体
又は三量体抗体断片コンストラクト、ミニボディー（例えば、Ｐａｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ  ３１，  １５７９−８４，  １９９２；  Ｃｕｍｂｅｒら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ  １４９Ｂ，  １２０−２６，  １９９２）、ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈ
ｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，  ３２３−２７，  １９８８；  Ｖｅｒｈｏｅｙａ
ｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，  １５３４−３６，  １９８８；  ａｎｄ  Ｕ．Ｋ．  
Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＧＢ  ２，２７６，１６９，  ｐｕｂ
ｌｉｓｈｅｄ  ２１  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９４）、及びこのような分子から得られ
た任意の機能的断片並びにファージディスプレイのような非従来的なプロセスにより得ら
れた抗体が含まれる。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗
体を得る方法は、当該技術分野で周知である。
【００６７】
本発明の好ましい抗体は、ＢｉｂＡのＮ末端領域コイルドコイルドメイン又はプロリン
リッチドメインのエピトープに特異的に結合する。一般的に、エピトープを形成するため
には少なくとも６個、７個、８個、１０個又は１２個の連続するアミノ酸が必要である。
しかし、非連続性のアミノ酸を有するエピトープは、更に多くのアミノ酸、例えば少なく
とも１５個、２５個又は５０個のアミノ酸が必要な場合もある。所望の特異性を有する抗
体を特定するために、種々の免疫測定法（例えばウェスタンブロット法、酵素免疫測定、
放射性免疫分析、免疫組織化学分析、免疫沈降又は当該技術分野で既知の他の免疫化学的
分析）を使用することができる。当該技術分野において、競合的結合又は免疫放射定量測
定法については、多数のプロトコルが周知である。このような免疫測定は、一般的に免疫
原及び免疫原に特異的に結合する抗体の間の錯体形成の測定を行う。特定の抗原に特異的
に結合する抗体の製剤により得られる検出信号は、一般的に、免疫化学的分析法において
他のタンパク質を使用した場合に得られる検出信号の少なくとも５倍、１０倍又は２０倍
強い。好ましくは、抗体は免疫化学的分析において他のタンパク質を検出せず、溶液から
特定の抗原を免疫沈殿させることができる。
【００６８】
マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル又はヒト等哺乳動物を免疫化してポリクロ
ーナル抗体の生成するためにポリペプチドを使用することができる。必要に応じて、抗原
をウシ血清アルブミン、チログロブリン及びキーホールリンペットヘモシニアン等の担体
タンパク質に結合させることもできる。宿主種によって、免疫反応を増大するために種々
のアジュバントを使用することができる。このようなアジュバントには、フロイントアジ
ュバント及びミネラルゲル（例えば水酸化アルミニウム）、及び表面作用物質（例えばリ
ソレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリン
ペットヘモシニアン及びジニトロフェノール）が含まれるが、これらに限定されない。ヒ
トに使用されるアジュバントの中で、ＢＣＧ（バチルス・ルメット・ゲラン）及びコリネ
バクテリウム・パルブムは特に有用である。
【００６９】
抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体は、培養した連続継代細胞系によって抗体
分子を生成する方法を使用して調製することができる。これらの方法には、ハイブリドー
マ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法及びＥＢＶハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａ
ｔｕｒｅ  ２５６，  ４９５−４９７，  １９８５；  Ｋｏｚｂｏｒら、Ｊ．  Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８１，  ３１−４２，  １９８５；  Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ
．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８０，  ２０２６−２０３０，  １９８３；  
Ｃｏｌｅら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ６２，  １０９−１２０，  １９８４）
が含まれるが、これらに限定されない。
【００７０】
又、「キメラ抗体」を生成するために開発された方法、適切な抗原特異性及び生物活性
を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングを使用
することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ
．  ８１，  ６８５１−６８５５，  １９８４；  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ
３１２，  ６０４−６０８，  １９８４；  Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４，
４５２−４５４，  １９８５）。モノクローナル及び他の抗体も、治療に使用した場合
に患者が抗体に対して免疫反応を起こすことを予防するために「ヒト化」することができ
る。このような抗体は、配列が治療に直接使用されるヒト抗体に十分類似しているか或い
は少数のキー残基の改変を必要とする場合がある。げっ歯類の抗体及びヒト配列の間の配
列の相違は、ヒト配列のものと異なる残基を個々の残基の部位特異的突然変異誘発或いは
相補性決定領域のグレーティングによって置き換えることにより最小化することができる
。
【００７１】
或いは、以下に記載の通り組み換え法を使用してヒト化抗体を生成することができる。
特定の抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体は、米国特許第５，５６５，３３２号
に開示されている通り、部分的に又は完全にヒト化される抗原結合部位を含んでもよい。
【００７２】
或いは、当該技術分野で既知の特定の抗原に特異的に結合する一本鎖モノクローナル抗
体を生成する方法を使用して一本鎖モノクローナル抗体の生成で説明した方法を応用する
ことができる。関連する特異性を有するが異なるイディオタイプの組成物のモノクローナ
ル抗体は、無作為な組換え免疫グロブリンライブラリー（Ｂｕｒｔｏｎ，  Ｐｒｏｃ．  
Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８８，  １１１２０−２３，  １９９１）からのチ
ェインシャフリングによって生成することができる。
【００７３】
一本鎖モノクローナル抗体は、テンプレートとしてハイブリドーマｃＤＮＡを使用し、
ＰＣＲのようなＤＮＡ増幅法を使用しても構築することができる（Ｔｈｉｒｉｏｎら、１
９９６，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．  ５，  ５０７−１１）。一本鎖
モノクローナル抗体は、単一特異性又は二重特異性であってもよく、又２価又は４価であ
ってもよい。４価の二重特異性一本鎖モノクローナル抗体の構築は、例えばＣｏｌｏｍａ
＆  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  １９９７，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １５，  
１５９−６３で説明されている。２価の二重特異性一本鎖モノクローナル抗体の構築は、
Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ  ＆  Ｖｏｓｓ，  １９９４，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２
６９，  １９９−２０６で説明されている。
【００７４】
以下に記載の通り、一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、手動又は自動ヌクレ
オチド合成を使用して構築し、標準組換えＤＮＡ方法を使用して発現コンストラクトにク
ローニングし、コード配列を発現するよう細胞に導入することができる。或いは、例えば
線維状ファージ法（Ｖｅｒｈａａｒら、１９９５，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ６
１，  ４９７−  ５０１；  Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、１９９３，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｍｅｔｈ．  １６５，  ８１−９１）を使用して一本鎖モノクローナル抗体を直接生成
することができる。
【００７５】
特定の抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体は、文献（Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒ
ｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８６，  ３８３３−３８３７，  １９８９
；  Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，  ２９３−２９９，  １９９１）に開示さ
れている通り、リンパ球群内のｉｎ  ｖｉｖｏ生成の誘導により或いは高度に特異的な結
合試薬の免疫グロブリンライブラリー又はパネルをスクリーニングすることによって生成
することができる。
【００７６】
ＷＯ  ９３／０３１５１に開示されている通りキメラ抗体を構築することができる。Ｗ
Ｏ  ９４／１３８０４に記載の「２重特異性抗体（ディアボディ）」のような、免疫グロ
ブリンに由来し、多価性及び多選択性の結合タンパク質も調製することができる。
【００７７】
抗体は、当該技術分野で周知の方法で精製することができる。例えば、適切な抗原を結
合するカラムに通すことによって抗体を親和性精製することができる。次に、高塩濃度の
緩衝液を使用して、結合した抗体をカラムから溶出することができる。
【００７８】
ＶＩ．１つ以上の活性物質を含有する組成物
本発明は、Ｓ．アガラクティエ感染症を予防及び処置するための組成物を提供する。本
発明の組成物は、少なくとも１つの活性物質を含有する。活性物質は、ＢｉｂＡポリペプ
チド、ＢｉｂＡポリペプチドをコードする核酸分子、又はＢｉｂＡポリペプチドに特異的
に結合する抗体である。好適なＢｉｂＡポリペプチドには、例えば、図２４の第「Ｉ」群
、第「ＩＩ」群及び第「ＩＩＩ」群において特定されたものが含まれる。本発明の組成物
には、これらの群の２つ以上からの１つ以上のＢｉｂＡポリペプチドが含まれてもよい。
【００７９】
本発明の組成物には、１つ以上の補助活性物質が含まれてもよい。このような活性物質
には、１つ以上の（ａ）ＧＢＳ抗原、（ｂ）非ＧＢＳ抗原、（ｃ）（ａ）又は（ｂ）をコ
ードする核酸分子、及び（ａ）又は（ｂ）に特異的に結合する抗体が含まれるが、これら
に限定されない。
【００８０】
Ａ．  ＧＢ抗原
本発明の組成物に含まれてもよいＧＢＳ抗原には、全体が参考として本明細書に組み入
れられているＷＯ  ０２／３４７７１に開示されたＧＢＳタンパク質（例えばＧＢＳ１−
ＧＢＳ６８９）の抗原部分が含まれる。好ましい抗原には、ＧＢＳ  ８０、ＧＢＳ  １０
４、ＧＢＳ  ３２２、ＧＢＳ  ６７、ＧＢＳ  ２７６及びＧＢＳ  ５９が含まれる。
【００８１】
Ｂ．  非ＧＢ抗原
本発明の組成物は、本発明の治療、予防又は診断法に使用するために一つ以上の抗原と
共に投与される場合がある。本発明の組成物は、場合によりＳ．アガラクティエタンパク
質に由来しない補助的なポリペプチド抗原を１つ以上含んでもよい。好ましい抗原には、
以下に記載するものが含まれる。更に、本発明の組成物は以下に記載する病原による感染
症を処置又は予防するために使用してもよい。以下に記載の抗原との組み合わせの他に、
本発明の組成物は又、本明細書に記載の通りアジュバントと組み合わされる場合もある。
【００８２】
本発明と共に使用する抗原には、以下に記載する１つ以上の抗原、又は以下に記載する
１つ以上の病原に由来する抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
１．  細菌抗原
本発明において使用するのに好適な細菌抗原には、細菌から単離、精製或いは得られた
タンパク質、多糖類、リポ多糖類及び外膜小胞が含まれる。又、細菌抗原には細菌溶解物
及び不活性化された細菌製剤が含まれる場合がある。細菌抗原は、組み換え発現によって
生成してもよい。細菌抗原には、好ましくは少なくともライフサイクルの１時期に細菌の
表面上の露出されるエピトープが含まれる。細菌抗原は、好ましくは複数の血清型で保存
される。細菌抗原には、以下に特定する特異性抗原例だけでなく以下に記載する１つ以上
の細菌に由来する抗原が含まれる。
【００８４】
ナイセリア・メニンギイテイデイス：メニンギイテイデイス抗原には、タンパク質（例
えば参考文献１〜７において特定されたタンパク質）、糖類（多糖類、少糖類又はリポ多
糖類を含む）、又はＡ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙ、及び／又はＢ等のＮ．メニンギイテイデイス
血清型群から精製又は得られた外膜小胞（参考文献８、９、１０、１１）が含まれる場合
がある。メニンギイテイデイスタンパク質抗原は、アドヒージョン、オートトランスポー
ター、トキシン、鉄取込みタンパク質、及び膜結合タンパク質（好ましくは完全な外膜タ
ンパク質）から選択される場合がある。
【００８５】
ストレプトコッカス・ニューモニエ：ストレプトコッカス・ニューモニエ抗原には、糖
類（多糖類又は少糖類を含む）及び／又はストレプトコッカス・ニューモニエ由来のタン
パク質が含まれる場合がある。糖類抗原は、血清型１型、２型、３型、４型、５型、６Ｂ
型、７Ｆ型、８型、９Ｎ型、９Ｖ型、１０Ａ型、１１Ａ型、１２Ｆ型、１４型、１５Ｂ型
、１７Ｆ型、１８Ｃ型、１９Ａ型、１９Ｆ型、２０型、２２Ｆ型、２３Ｆ型及び３３Ｆ型
から選択してもよい。タンパク質抗原は、ＷＯ  ９８／１８９３１、ＷＯ  ９８／１８９
３０米国特許第６，６９９，７０３号、米国特許第６，８００，７４４号、ＷＯ  ９７／
４３３０３及びＷＯ  ９７／３７０２６において特定されているタンパク質から選択され
る場合がある。ストレプトコッカス・ニューモニエタンパク質は、ポリヒスチジントライ
アッド族（ＰｈｔＸ）、コリン結合タンパク質族（ＣｂｐＸ）、ＣｂｐＸトランケート、
ＬｙｔＸ族、ＬｙｔＸトランケート、ＣｂｐＸトランケート−ＬｙｔＸトランケートキメ
ラタンパク質、ニューモリシン（Ｐｌｙ）、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡ、Ｓｐｌ２８、Ｓｐ１０
１、Ｓｐｌ３０、Ｓｐｌ２５又はＳｐｌ３３から選択される場合がある。
【００８６】
ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ａ群ストレプトコッカス）：Ａ群ストレプトコッカ
ス抗原には、ＷＯ  ０２／３４７７１又はＷＯ  ２００５／０３２５８２で特定されてい
るタンパク質（ＧＢＳ  ４０を含む）、ＧＢＳ  Ｍタンパク質の断片の融合物（ＷＯ  ０
２／０９４８５１、及びＤａｌｅ，  Ｖａｃｃｉｎｅ  （１９９９）  １７：１９３−２
００、及びＤａｌｅ，  Ｖａｃｃｉｎｅ  １４（１０）：  ９４４−９４８に記載のもの
を含む）、フィブロネクチン結合タンパク質（Ｓｆｂｌ）、ストレプトコッカスヘム結合
タンパク質（Ｓｈｐ）、及びストレプトリジンＳ（ＳａｇＡ）が含まれる場合がある。
【００８７】
モラクセラ・カタラーリス：モラクセラ抗原には、ＷＯ  ０２／１８５９５及びＷＯ  
９９／５８５６２で特定されている抗原、外膜タンパク質抗原（ＨＭＷ−ＯＭＰ）、Ｃ抗
原及び／又はＬＰＳが含まれる。
【００８８】
ボルデテラ・ペルツッシス：ペルツッシス抗原には、Ｂ．ペルツッシス由来のペルツッ
シス・ホロトキシン（ＰＴ）及び線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）、並びに場合によりパ
ータクチン及び／又は凝集原２・３抗原との組み合わせも含まれる。
【００８９】
スタフィロコッカス・アウレウス：スタフィロコッカス・アウレウス抗原には、場合に
より無毒な組み換えシュードモナス・エルジノーサ・エキソトキシンＡに結合したＳ．ア
ウレウス型５・８莢膜多糖類、例えばＳｔａｐｈ  ＶＡＸＴＭ、又は表面タンパク質由来
の抗原、インベーシン（ロイコシジン、キナーゼ、ヒアルロニダーゼ）、食細胞の貪食を
阻害する表面因子（莢膜、Ａタンパク質）、カロチノイド、カタラーゼ生成、Ａタンパク
質、コアグラーゼ、凝固因子、及び／又は真核細胞膜を溶解する膜傷害毒素（ヘモリジン
、ロイコトキシン、ロイコシジン）（場合により解毒される）が含まれる。
【００９０】
スタフィロコッカス・エピデルミディス：Ｓ．エピデルミディス抗原には粘液関連抗原
（ＳＡＡ）が含まれる。
【００９１】
クロストリジウム・テタニ（テタヌス）：テタヌス抗原には、好ましくは担体タンパク
質として本発明の組成物と共に又は結合して使用されるテタヌス・トキソイド（ＴＴ）が
含まれる。
【００９２】
コリネバクテリウム・ジフテリア（ジフテリア）：ジフテリア抗原には、好ましくはＣ
ＲＭ１９７のように解毒されるジフテリア毒素が含まれる。更にＡＤＰリボシル化を調節
・阻害できるか或いは関与する抗原は、本発明の組成物と組み合わせ／同時投与／配合が
考えられる。ジフテリアトキソイドは、担体タンパク質として使用してもよい。
【００９３】
ヘモフィルス・インフルエンザ  Ｂ（Ｈｉｂ）：Ｈｉｂ抗原には、Ｈｉｂ糖類抗原が含
まれる。
【００９４】
シュードモナス・エルジノーサ：シュードモナス抗原には、エンドトキシンＡ、Ｗｚｚ
タンパク質、Ｐ．エルジノーサＬＰＳ、特にＰＡＯ１（Ｏ５血清型）から単離されたＬＰ
Ｓ、及び／又は外膜タンパク質Ｆ（ＯｐｒＦ）を含む外膜タンパク質（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉ
ｍｍｕｎ．  ２００１  Ｍａｙ；  ６９（５）：  ３５１０−３５１５）が含まれる。
【００９５】
レジオネラ・ニューモフィラ：細菌抗原は、レジオネラ−ニューモフィラに由来する場
合がある。
【００９６】
ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｂ群ストレプトコッカス）：Ｂ群ストレプトコ
ッカス抗原には、ＷＯ  ０２／３４７７１、ＷＯ  ０３／０９３３０６、ＷＯ  ０４／０
４１１５７又はＷＯ  ２００５／００２６１９で特定されているタンパク質又は糖類抗原
が含まれる（タンパク質ＧＢＳ  ８０、ＧＢＳ  １０４、ＧＢＳ  ２７６及びＧＢＳ  ３
２２を含み、血清型Ｉａ、Ｉｂ、Ｉａ／ｃ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ及び
ＶＩＩＩ由来の糖類抗原を含む）。
【００９７】
ナイセリア・ゴノレエ：ゴノレエ抗原には、Ｐｏｒ（又はポリン）タンパク質、例えば
ＰｏｒＢ（Ｚｈｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ  （２００４）  ２２：６６０−６６９を参照）、
輸送結合タンパク質、例えばＴｂｐＡ及びＴｂｐＢ（Ｐｒｉｃｅら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  （２００４）  ７１（１）：２７７−２８３を参照）、不
透明タンパク質（例えばＯｐａ）、還元修飾タンパク質（Ｒｍｐ）、及び外膜小胞（ＯＭ
Ｖ）製剤（Ｐｌａｎｔｅら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  （２０００）
１８２：８４８−８５５を参照；又、例えばＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５
４４、ＷＯ９９／５７２８０、ＷＯ０２／０７９２４３も参照）が含まれる。
【００９８】
クラミジア・トラコマーティス：クラミジア・トラコマーティスの抗原には、血清型Ａ
、Ｂ、Ｂａ及びＣ（失明の原因となるトラホームの病因）、血清型Ｌ１、Ｌ２及びＬ３（
性病性リンパ肉芽腫症に関与する）及び血清型Ｄ〜Ｋ由来の抗原が含まれる。クラミジア
・トラコーマ抗原には、ＷＯ  ００／３７４９４、ＷＯ  ０３／０４９７６２、ＷＯ  ０
３／０６８８１１又はＷＯ  ０５／００２６１９で特定されている抗原が含まれる場合も
あり、ＰｅｐＡ（ＣＴ０４５）、ＬｃｒＥ（ＣＴ０８９）、ＡｒｔＪ（ＣＴ３８１）、Ｄ
ｎａＫ（ＣＴ３９６）、ＣＴ３９８、ＯｍｐＨ様（ＣＴ２４２）、Ｌ７／Ｌ１２（ＣＴ３
１６）、ＯｍｃＡ（ＣＴ４４４）、ＡｔｏｓＳ（ＣＴ４６７）、ＣＴ５４７、Ｅｎｏ（Ｃ
Ｔ５８７）、ＨｒｔＡ（ＣＴ８２３）及びＭｕｒＧ（ＣＴ７６１）が含まれる。
【００９９】
トレポネーマ・パリダム（シフィリス）：シフィリス抗原には、ＴｍｐＡ抗原が含まれ
る。
【０１００】
ヘモフィルス・デュクレイ（軟性下疳を引き起こす）：デュクレイ抗原には、外膜タン
パク質（ＤｓｒＡ）が含まれる。
【０１０１】
エンテロコッカス・フェカーリス又はエンテロコッカス・フェシウム：抗原には、三糖
反復、又は米国特許第６，７５６，３６１号に示されるその他のエンテロコッカス由来の
抗原が含まれる。
【０１０２】
ヘリコバクター・ピロリ：Ｈ．ピロリ抗原には、Ｃａｇ、Ｖａｃ、Ｎａｐ、ＨｏｐＸ、
ＨｏｐＹ及び／又はウレアーゼ抗原が含まれる。
【０１０３】
スタフィロコッカス・サプロフィチカス：抗原には、Ｓ．サプロフィチカス抗原の１６
０  ＩｄＤａヘマグルチニンが含まれる。
【０１０４】
エルシニア・エンテロコリチカ抗原には、ＬＰＳ（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ２０
０２  Ａｕｇｕｓｔ；  ７０（８）：  ４４１４）が含まれる。
【０１０５】
大腸菌：大腸菌抗原は、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性大腸菌（ＥＡｇ
ｇＥＣ）、分散接着性大腸菌（ＤＡＥＣ）、病原大腸菌（ＥＰＥＣ）、及び／又は腸管出
血性大腸菌（ＥＨＥＣ）に由来する場合がある。
【０１０６】
バシラス・アンスラシス（アンスラックス）：Ｂ．アンスラシス抗原は、場合により解
毒され、感染防御抗原（ＰＡ）と呼ばれる一般的なＢ成分を共有することができるＡ成分
（致死因子（ＬＦ）及び浮腫因子（ＥＦ））から選択される場合がある。
【０１０７】
エルシニア・ペスティス（ペスト）：ペスト抗原には、Ｆ１莢膜抗原（Ｉｎｆｅｃｔ  
Ｉｍｍｕｎ．  ２００３  Ｊａｎ；  ７１（１）：  ３７４−３８３）、ＬＰＳ  （Ｉｎ
ｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １９９９  Ｏｃｔ；  ６７（１０）：  ５３９５）、エルシニ
ア・ペスティスＶ抗原（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １９９７  Ｎｏｖ；  ６５（１１
）：  ４４７６−４４８２）が含まれる。
【０１０８】
マイコバクテリウム・ツベルクローシス：ツベルクローシス抗原には、リポタンパク質
、ＬＰＳ、ＢＣＧ抗原、場合によりカチオン性脂質小胞に形成した抗原８５Ｂ（Ａｇ８５
Ｂ）及び／又はＥＳＡＴ−６の融合タンパク質（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ２００４
Ｏｃｔｏｂｅｒ；  ７２（１０）：  ６１４８）、マイコバクテリウム・ツベルクロー
シス（Ｍｔｂ）イソシトレート・デヒドロゲナーゼ関連抗原（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃ
ａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００４  Ａｕｇ  ２４；  １０１（３４）：  １２６５
２）、及び／又はＭＰＴ５１抗原（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ２００４  Ｊｕｌｙ；
７２（７）：  ３８２９）が含まれる。
【０１０９】
リケッチア：抗原には、外膜タンパク質Ａ及び／又はＢ（ＯｍｐＢ）  （Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  ２００４  Ｎｏｖ  １；  １７０２（２）：  １４５
）、ＬＰＳ、及び表面タンパク質抗原（ＳＰＡ）（Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．  １９８９
Ｊｕｎ；２  Ｓｕｐｐｌ：８１）を含む外膜タンパク質が含まれる。
【０１１０】
リステリア・モノサイトゲネス：細菌抗原はリステリア・モノサイトゲネスに由来する
場合がある。
【０１１１】
クラミジア・ニューモニエ：抗原には、ＷＯ  ０２／０２６０６で特定されているもの
が含まれる。
【０１１２】
ビブリオコレラ：抗原には、プロテイナーゼ抗原、ＬＰＳ、特にビブリオコレラＩＩの
リポ多糖類、Ｏ１イナバ型Ｏ特異的多糖類、Ｖ．コレラ０１３９、ＩＥＭ１０８ワクチン
抗原（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ２００３  Ｏｃｔ；  ７１（１０）：５４９８−５
０４）、及び／又は閉鎖帯毒素（Ｚｏｔ）が含まれる。
【０１１３】
サルモネラチフィ（腸チフス）：抗原には、莢膜多糖類好ましくは結合体（Ｖｉ即ちｖ
ａｘ−ＴｙＶｉ）が含まれる。
【０１１４】
ボレリア・ブルグドルフェリ（ライム病）：抗原には、リポタンパク質（例えばＯｓｐ
Ａ、ＯｓｐＢ、Ｏｓｐ  Ｃ及びＯｓｐ  Ｄ）、他の表面タンパク質、例えばＯｓｐＥ結合
タンパク質（Ｅｒｐｓ）、デコリン結合タンパク質（例えばＤｂｐＡ）、及び抗原性変異
ＶＩタンパク質、例えばＰ３９及びＰ１３関連抗原（完全な膜タンパク質、Ｉｎｆｅｃｔ
Ｉｍｍｕｎ．  ２００１  Ｍａｙ；  ６９（５）：  ３３２３−３３３４）、ＶＩｓＥ
抗原変異タンパク質（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９９９  Ｄｅｃ；  ３７
（１２）：  ３９９７）が含まれる。
【０１１５】
ポルフィロモナス・ジンジバリス：抗原には、Ｐ．ジンジバリス外膜タンパク質（ＯＭ
Ｐ）が含まれる。
【０１１６】
クレブシェラ：抗原には、ＯＭＰ  Ａ、又は場合により破傷風トキソイドに結合した多
糖類を含むＯＭＰが含まれる。
【０１１７】
更に、本発明の細菌抗原は、上記の莢膜抗原、多糖類抗原又はタンパク質抗原の何れで
あってもよい。更に、細菌抗原には、外膜小胞（ＯＭＶ）製剤が含まれる場合もある。更
に、抗原には前記細菌の生の、弱毒化及び／又は精製した抗原が含まれる。本発明の抗原
は、グラム陰性菌又はグラム陽性菌に由来する場合がある。本発明の抗原は好気性細菌又
は嫌気性細菌に由来する場合がある。
【０１１８】
更に、上記の細菌由来糖類（多糖類、ＬＰＳ、ＬＯＳ又は少糖類）は、別の作用物質又
は抗原、例えば担体タンパク質（例えばＣＲＭ１９７）に結合することができる。このよ
うな結合は、米国特許第５，３６０，８９７号及びＣａｎ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌ
ｌ  Ｂｉｏｌ．  １９８４  Ｍａｙ；６２（５）：２７０−５に示されているように糖類
のカルボニル部分の還元的アミノ化によって影響されるタンパク質のアミノ基への直接結
合であってもよい。或いは、糖類はリンカーによって、例えばＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １９９６及びＣＲＣ，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，  １９９３
に示された琥珀酸アミド又は他の結合で結合してもよい。
【０１１９】
２．  ウイルス抗原
本発明において使用するのに好適なウイルス抗原には、不活性化（或いは殺滅）ウイル
ス、弱毒化ウイルス、スプリットウイルス製剤、精製したサブユニット製剤、ウイルスか
ら単離、精製、抽出されるウイルスタンパク質、及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）が含まれ
る。ウイルス抗原は、細胞培養又は他の基質上で増殖したウイルスに由来する場合がある
。或いは、ウイルス抗原を組み換えで発現してもよい。ウイルス抗原には、好ましくはウ
イルスの表面上にその生周期の少なくとも１時期に露出されるエピトープが含まれる。ウ
イルス抗原は、好ましくは複数の血清型又は分離株で保たれる。ウイルス抗原には、以下
に特定する特異性抗原例だけでなく以下に記載する１つ以上のウイルスに由来する抗原も
含まれる。
【０１２０】
オルソミクソウイルス：ウイルス抗原は、オルソミクソウイルス、例えばインフルエン
ザＡ、Ｂ及びＣ型に由来する場合がある。オルソミクソウイルス抗原は、ヘマグルチニン
（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質
（Ｍ１）、膜タンパク質（Ｍ２）、１つ以上の転写酵素成分（ＰＢ１、ＰＢ２及びＰＡ）
を含むウイルスタンパク質から１つ以上を選択してもよい。好ましい抗原には、ＨＡ及び
ＮＡが含まれる。
【０１２１】
インフルエンザ抗原は、流行間（年間）のインフルエンザ株に由来する場合がある。或
いは、インフルエンザ抗原は、広範囲に流行する可能性のある菌株（即ち現在流行してい
る菌株と比較して新しいヘマグルチニンを有するインフルエンザ株、或いは鳥類に対して
病原性でヒト集団に水平に伝搬される可能性を有するインフルエンザ株、又はヒトに対し
て病原性のインフルエンザ株）に由来する場合がある。
【０１２２】
パラミクソビリダエウイルス：ウイルス抗原は、パラミクソビリダエウイルス、例えば
ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶ）及びモルビリウイルス（麻
疹）に由来する場合がある。
【０１２３】
ニューモウイルス：ウイルス抗原は、ニューモウイルス、例えばＲＳウイルス（ＲＳＶ
）、ウシＲＳウイルス、マウス肺炎ウイルス及びシチメンチョウ鼻気管炎ウイルスに由来
する場合がある。好ましくは、ニューモウイルスはＲＳＶである。ニューモウイルス抗原
は、表面融合（Ｆ）タンパク質、糖タンパク質（Ｇ）及び小疎水性タンパク質（ＳＨ）、
マトリックスタンパク質Ｍ及びＭ２、ヌクレオカプシドタンパク質Ｎ、Ｐ及びＬ、及び非
構造タンパク質ＮＳ１及びＮＳ２を含む以下のタンパク質から１つ以上を選択してもよい
。好ましいニューモウイルス抗原には、Ｆ、Ｇ及びＭが含まれる。例えば、Ｊ  Ｇｅｎ  
Ｖｉｒｏｌ．  ２００４  Ｎｏｖ；  ８５（Ｐｔ  １１）：３２２９を参照されたい。ニ
ューモウイルス抗原は、キメラウイルス内で形成するか又はキメラウイルスに由来する場
合がある。例えば、キメラＲＳＶ／ＰＩＶウイルスは、ＲＳＶ及びＰＩＶの両成分を含む
場合がある。
【０１２４】
パラミクソウイルス：ウイルス抗原は、パラミクソウイルス、例えばパラインフルエン
ザウイルス１〜４型（ＰＩＶ）、ムンプスウイルス、センダイウイルス、シミアンウイル
ス５型、ウシパラインフルエンザウイルス及びニューカッスル病ウイルスから得てもよい
。好ましくは、パラミクソウイルスはＰＩＶ又はムンプスウイルスである。パラミクソウ
イルス抗原は、以下のタンパク質から１つ以上選択してもよい：ヘマグルチニン−ノイラ
ミニダーゼ（ＨＮ）、融合タンパク質Ｆ１及びＦ２、核タンパク質（ＮＰ）、リンタンパ
ク質（Ｐ）、巨大タンパク質（Ｌ）及びマトリックスタンパク質（Ｍ）。好ましいパラミ
クソウイルスタンパク質には、ＨＮ、Ｆ１及びＦ２が含まれる。パラミクソウイルス抗原
は、キメラウイルス内で形成するか又はキメラウイルスに由来する場合がある。例えば、
キメラＲＳＶ／ＰＩＶウイルスは、ＲＳＶ及びＰＩＶの両成分を含む場合がある。市販の
ムンプスワクチンには、単価或いは麻疹及び風疹ワクチンと組み合わせた弱毒生ムンプス
ウイルスが含まれる（ＭＭＲ）。
【０１２５】
モルビリウイルス：ウイルス抗原は、モルビリウイルス、例えば麻疹ウイルスに由来す
る場合がある。モルビリウイルス抗原は、以下のタンパク質から１つ以上を選択してもよ
い：ヘマグルチニン（Ｈ）、糖タンパク質（Ｇ）、融合因子（Ｆ）、巨大タンパク質（Ｌ
）、核タンパク質（ＮＰ）、ポリメラーゼリンタンパク質（Ｐ）及びマトリックス（Ｍ）
。市販の麻疹ワクチンには、一般的にムンプスワクチン及び風疹ワクチンと組み合わせた
弱毒生麻疹ウイルスが含まれる（ＭＭＲ）。
【０１２６】
ピコルナウイルス：ウイルス抗原は、ピコルナウイルス、例えばエンテロウイルス、ラ
イノウイルス、Ｈｅｐａｒｎａｖｉｒｕｓ、カルジオウイルス及びアフタウイルスに由来
する場合がある。エンテロウイルス、例えばポリオウイルスから得た抗原は好ましい。
【０１２７】
エンテロウイルス：ウイルス抗原は、エンテロウイルス、例えばポリオウイルス１型、
２型又は３型、コクサッキーＡ群ウイルス１〜２２型及び２４型、コクサッキーＢ群ウイ
ルス１〜６型、エコーウイルス（ＥＣＨＯ）ウイルス１〜９型、１１〜２７型及び２９〜
３４型及びエンテロウイルス６８〜７１型に由来する場合がある。好ましくは、エンテロ
ウイルスはポリオウイルスである。エンテロウイルス抗原は、好ましくは以下のカプシド
タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４から１つ以上選択される。市販のポリオワ
クチンには、不活性ポリオワクチン（ＩＰＶ）及び経口ポリオウイルスワクチン（ＯＰＶ
）が含まれる。
【０１２８】
Ｈｅｐａｒｎａｖｉｒｕｓ：ウイルス抗原は、Ｈｅｐａｒｎａｖｉｒｕｓ、例えばＡ型
肝炎ウイルス（ＨＡＶ）に由来する場合がある。市販のＨＡＶワクチンには、不活性化し
たＨＡＶワクチンが含まれる。
【０１２９】
トガウイルス：ウイルス抗原は、トガウイルス、例えばルビウイルス、アルファウイル
ス又はアルテリウイルスに由来する場合がある。ルビウイルス、例えば風疹ウイルスに由
来する抗原が好ましい。トガウイルス抗原は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｃ、ＮＳＰ−Ｉ、ＮＳ
ＰＯ−２、ＮＳＰ−３又はＮＳＰ−４から選択される場合がある。トガウイルス抗原は、
好ましくはＥ１、Ｅ２又はＥ３から選択される。市販の風疹ワクチンには、一般的にムン
プスワクチン及び麻疹ワクチンと組み合わせた低温適応生ウイルスが含まれる（ＭＭＲ）
。
【０１３０】
フラビウイルス：ウイルス抗原は、フラビウイルス、例えばダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウ
イルス、デング熱ウイルス（１型、２型、３型又は４型）、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウ
イルス、西ナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、
ポワッサン脳炎ウイルスに由来する場合がある。フラビウイルス抗原は、ＰｒＭ、Ｍ、Ｃ
、Ｅ、ＮＳ−１、ＮＳ−２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ及びＮＳ５から選
択される場合がある。フラビウイルス抗原は、好ましくはＰｒＭ、Ｍ及びＥから選択され
る。市販のＴＢＥワクチンには、不活化ウイルスワクチンが含まれる。
【０１３１】
ペスチウイルス：ウイルス抗原は、ペスチウイルス、例えばウシウイルス性下痢ウイル
ス（ＢＶＤＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）又はボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）に
由来する場合がある。
【０１３２】
ヘパドナウイルス：ウイルス抗原は、ヘパドナウイルス、例えばＢ型肝炎ウイルスに由
来する場合がある。ヘパドナウイルス抗原は、表面抗原（Ｌ、Ｍ及びＳ）、コア抗原（Ｈ
Ｂｃ、ＨＢｅ）から選択される場合がある。市販のＨＢＶワクチンには、表面抗原Ｓタン
パク質を含むサブユニットワクチンが含まれる。
【０１３３】
Ｃ型肝炎ウイルス：ウイルス抗原は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に由来する場合があ
る。ＨＣＶ抗原は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ１／Ｅ２、ＮＳ３４５ポリプロテイン、ＮＳ  ３４５
コアポリプロテイン、コア、及び／又は非構造的領域のペプチド（Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、
Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  （１９９１）  １４：３８１）から１つ以上選択してもよい。
【０１３４】
ラブドウイルス：ウイルス抗原は、ラブドウイルス、例えばリッサウイルス（狂犬病ウ
イルス）及びベシクロウイルス（ＶＳＶ）に由来する場合がある。ラブドウイルス抗原は
、糖タンパク質（Ｇ）、核タンパク質（Ｎ）、巨大タンパク質（Ｌ）、非構造タンパク質
（ＮＳ）から選択される場合がある。市販の狂犬病ウイルスワクチンは、ヒト２倍体細胞
又はアカゲザル胎児肺細胞で増殖させた死滅ウイルスを含む。
【０１３５】
カリシウイルス：ウイルス抗原は、カリシウイルス、例えばノーウォーク・ウイルス及
びノーウォーク様ウイルス、例えばハワイウイルス及びスノーマウンテンウイルスに由来
する場合がある。
【０１３６】
コロナウイルス：ウイルス抗原は、コロナウイルス、ＳＡＲＳ、ヒト呼吸器コロナウイ
ルス、鳥伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）及びブタ伝
染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）に由来する場合がある。コロナウイルス抗原は、スパイ
ク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、マトリックス（Ｍ）、ヌクレオカプシド（Ｎ）及びヘマ
グルチニン・エステラーゼ糖タンパク質（ＨＥ）から選択される場合がある。好ましくは
、コロナウイルス抗原はＳＡＲＳウイルスに由来する。ＳＡＲＳウイルス抗原は、ＷＯ  
０４／９２３６０に記載されている。
【０１３７】
レトロウイルス：ウイルス抗原は、レトロウイルス、例えば腫瘍ウイルス、レンチウイ
ルス又はスプーマウイルスに由来する場合がある。腫瘍ウイルス抗原は、ＨＴＬＶ−１、
ＨＴＬ  Ｖ−２又はＨＴＬ  Ｖ−５に由来する場合がある。レンチウイルス抗原は、ＨＩ
Ｖ−１又はＨＩＶ−２に由来する場合がある。レトロウイルス抗原は、ｇａｇ、ｐｏｌ、
ｅｎｖ、ｔａｘ、ｔａｔ、ｒｅｘ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ及びｖｐｒから選択
される場合がある。ＨＩＶ抗原は、ｇａｇ  （ｐ２４ｇａｇ及びｐ５５ｇａｇ）、ｅｎｖ
（ｇρｌ６０及びｇｐ４１）、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｒｅｖ  ｖｐｕ、小タンパク
質、（好ましくはｐ５５  ｇａｇ及びｇｐｌ４０ｖデリート）から選択される場合がある
。ＨＩＶ抗原は、以下の菌株の１つ以上に由来する場合がある：ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶ
ＳＦ２、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５（ＨＩＶ−１
ＵＳ４）。
【０１３８】
レオウイルス：ウイルス抗原は、レオウイルス、例えばオルトレオウイルス、ロタウイ
ルス、オルビウイルス又はコルティウイルスに由来する場合がある。レオウイルス抗原は
、構造タンパク質λ１、λ２、λ３、μ１、μ２、σ１、σ２又はσ３、或いは非構造タ
ンパク質σＮＳ、μＮＳ又はσ１ｓから選択される場合がある。好ましいレオウイルス抗
原は、ロタウイルスに由来する場合がある。ロタウイルス抗原は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ
３、ＶＰ４（又は開裂生成物ＶＰ５及びＶＰ８）、ＮＳＰ１、ＶＰ６、ＮＳＰ３、ＮＳＰ
２、ＶＰ７、ＮＳＰ４又はＮＳＰ５から選択される場合がある。好ましいロタウイルス抗
原には、ＶＰ４（又は開裂生成物ＶＰ５及びＶＰ８）、及びＶＰ７が含まれる。
【０１３９】
パルボウイルス：ウイルス抗原は、パルボウイルス、例えばパルボウイルスＢ１９に由
来する場合がある。パルボウイルス抗原は、ＶＰ−１、ＶＰ−２、ＶＰ−３、ＮＳ−１及
びＮＳ−２から選択される場合がある。好ましくは、パルボウイルス抗原はカプシドタン
パク質ＶＰ−２である。
【０１４０】
δ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）：ウイルス抗原は、ＨＤＶ、特にＨＤＶのδ抗原に由来する
場合がある（例えば米国特許第５，３７８，８１４号を参照）。
【０１４１】
Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）：ウイルス抗原は、ＨＥＶに由来する場合がある。
【０１４２】
Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）：ウイルス抗原は、ＨＧＶに由来する場合がある。
【０１４３】
ヒトヘルペスウイルス：ウイルス抗原は、ヒトヘルペスウイルス、例えば単純ヘルペス
ウイルス（ＨＳＶ）、バリセラゾスターウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバーウイルス
（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ６）
、ヒトヘルペスウイルス７型（ＨＨＶ７）及びヒトヘルペスウイルス８型（ＨＨＶ８）に
由来する場合がある。ヒトヘルペスウイルス抗原は、即初期タンパク質（α）、初期タン
パク質（β）及び後期タンパク質（γ）から選択される場合がある。ＨＳＶ抗原は、ＨＳ
Ｖ−１株又はＨＳＶ−２株に由来する場合がある。ＨＳＶ抗原は、糖タンパク質ｇＢ、ｇ
Ｃ、ｇＤ及びｇＨ、融合タンパク質（ｇＢ）又は免疫回避タンパク質（ｇＣ、ｇＥ又はｇ
Ｉ）から選択される場合がある。ＶＺＶ抗原は、コアタンパク質、ヌクレオカプシドタン
パク質、テグメントタンパク質又はエンベロープタンパク質からを選択してもよい。弱毒
生ＶＺＶワクチンが市販されている。ＥＢＶ抗原は、早期抗原（ＥＡ）タンパク質、ウイ
ルスカプシド抗原（ＶＣＡ）、及び膜抗原（ＭＡ）の糖タンパク質から選択される場合が
ある。ＣＭＶ抗原は、カプシドタンパク質、エンベロープ糖タンパク質（例えばｇＢ及び
ｇＨ）、及びテグメントタンパク質から選択される場合がある。
【０１４４】
パポバウイルス：抗原は、パポバウイルス、例えばパピロマウイルス及びポリオーマウ
イルスに由来する場合がある。パピロマウイルスには、ＨＰＶ血清型１型、２型、４型、
５型、６型、８型、１１型、１３型、１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型
、４１型、４２型、４７型、５１型、５７型、５８型、６３型及び６５型が含まれる。好
ましくは、ＨＰＶ抗原は血清型６型、１１型、１６型又は１８型に由来する。ＨＰＶ抗原
は、カプシドタンパク質（Ｌ１）及び（Ｌ２）、又はＥ１〜Ｅ７、又はその融合体から選
択される場合がある。ＨＰＶ抗原は、好ましくはウイルス様粒子（ＶＬＰ）に形成される
。ポリオーマウイルスには、ＢＫウイルス及びＪＫウイルスが含まれる。ポリオーマウイ
ルス抗原は、ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３から選択される場合がある。
【０１４５】
更に、本発明の組成物と関連して考えられる、Ｖａｃｃｉｎｅｓ，  ４ｔｈ  Ｅｄｉｔ
ｉｏｎ（Ｐｌｏｔｋｉｎ  ａｎｄ  Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｄ．  ２００４）；Ｍｅｄｉ
ｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｍｕｒｒａｙら、ｅｄ
．  ２００２）；  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｗ．Ｋ．  Ｊｏｋ
ｌｉｋ  ｅｄ．  １９８８）；  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ
Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｂ．Ｎ．  Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．  Ｋｎｉｐｅ，  ｅｄ
ｓ．  １９９１）に記載の抗原、組成物、方法、及び微生物も提供される。
【０１４６】
３．  真菌抗原
本発明で使用する真菌抗原は、以下に記載する真菌類の１つ以上に由来する場合がある
。
【０１４７】
真菌抗原は、以下を含めた皮膚糸状菌に由来する場合がある：エピデルモフィトン・フ
ロックソム、ミクロスポルム・オドウニ、ミクロスポルム・カニス、ミクロスポルム・デ
ィストルツム、ミクロスポルム・エクイヌム、ミクロスポルム・ジプサム、ミクロスポル
ム・ナヌム、トリコフィトン・コンセントリカム、トリコフィトン・エクイヌム、トリコ
フィトン・ガリネ、トリコフィトン・ジプセウム、トリコフィトン・メグニニ、トリコフ
ィトン・メンタグロフィテス、トリコフィトン・クインケアナム、トリコフィトン・ルブ
ルム、トリコフィトン・シェーンライニ、トリコフィトン・トンズランス、トリコフィト
ン・ベルコサム、Ｔ．ベルコサムｖａｒ．アルバム、ｖａｒ．ディスコイデス、ｖａｒ．
オクラセウム、トリコフィトン・ビオラセウム、及び／又はトリコフィトンｆａｖｉｆｏ
ｒｍｅ。
【０１４８】
真菌性病原は、アスペルギルス・フミガーツス、アスペルギルス・フラブス、アスペル
ギルス・ニガー、アスペルギルス・ニドゥランス、アスペルギルス・テレウス、アスペル
ギルス・シドウィ、アスペルギルスｆｌａｖａｔｕｓ、アスペルギルス・グラウカス、Ｂ
ｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ  ｃａｐｉｔａｔｕｓ、カンジダ・アルビカンス、カ
ンジダ・エノラーゼ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・クル
セイ、カンジダ・パラシローシス、カンジダ・ステラトイデア、カンジダ・クセイ、カン
ジダｐａｒａｋｗｓｅｉ、カンジダｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、カンジダ・プソイドトロピカ
リス、カンジダ・ギリエルモンジィ、クラドスポリウム・カリオニイ、コクシジオイデス
・クシジオイデス・イミチス、ブラストマイセス・デルマティディス、クリプトコッカス
・ネオフォルマンス、ゲオトリクム・クラバタム、ヒストプラスマ・カプスラーツム、ク
レブシエラ・ニューモニエ、パラコクシジオイデス・ラジリエンシス、ニューモシスティ
ス・カリニ、ピチウムインシディオサム、ピチロスポルム・オバーレ、サッカロミセス・
セレビシェ、サッカロミセス・ブラウディ、サッカロミセス・ポンベ、セドスポリウム・
アピオスペルム、スポロトリクス・シェンキー、トリコスポロン・ベイゲリ、トキソプラ
スマ、ペニシリウム・マルネッフェイ、マラセジア属、フォンセセア属、ワンギエラ属、
スポロトリクス属、バシディオボールス属、コニディオボルス属、リゾープス属、ケカビ
属、アブシジア属、モルティエラ属、クンニングアメラ属、サクセネア属、アルタナリア
属、クルブラリア属、ヘルミントスポリウム属、フザリウム属、アスペルギルス属、ペニ
シリウム属、モニリニア属、リゾクトニア属、ペシロマイセス属、ピトミセス属及びクラ
ドスポリウム属に由来する場合がある。
【０１４９】
真菌抗原を生成するプロセスは、当該技術分野で周知の（米国特許第６，３３３，１６
４号を参照）。細胞壁を実質的に除去したか或いは少なくとも部分的に除去した真菌性細
胞から得られる不溶部分から抽出され分離された可溶部分を得る好ましい方法において、
プロセスは生きた真菌細胞を得るプロセス、実質的に細胞壁を除去したか或いは少なくと
も部分的に除去した真菌性細胞を得るプロセス、実質的に細胞壁を除去したか或いは少な
くとも部分的に除去した真菌性細胞を破裂させるプロセス、不溶部分を得るプロセス、及
び不溶部分から可溶部分を抽出し分離するプロセスを含むことを特徴とする。
【０１５０】
４．  ＳＴＤ抗原
本発明の組成物には、性感染症（ＳＴＤ）に由来する１つ以上の抗原が含まれる場合が
ある。このような抗原は、ＳＴＤ、例えばクラミジア、陰部ヘルペス、肝炎（例えばＨＣ
Ｖ）、性器疣贅、淋病、梅毒及び／又は軟性下疳（ＷＯ００／１５２５５を参照）の予防
又は治療に提供してもよい。抗原は、ウイルス性又は細菌性ＳＴＤの１つ以上に由来する
場合がある。本発明で使用するウイルス性ＳＴＤ抗原は、例えばＨＩＶ、単純ヘルペスウ
イルス（ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）及び肝炎（Ｈ
ＣＶ）に由来する場合がある。本発明で使用する細菌性ＳＴＤ抗原は、例えばナイセリア
・ゴノレエ、クラミジア・トラコマーティス、トレポネーマ・パリダム、ヘモフィルス・
デュクレイ、大腸菌及びストレプトコッカス・アガラクティエに由来する場合がある。こ
れらの病原菌に由来する特異性抗原の例は、上に記載されている。
【０１５１】
５．  呼吸器系抗原
本発明の組成物には、呼吸器系疾患を引き起こす病原菌に由来する１つ以上の抗原が含
まれる場合がある。例えば、呼吸器系疾患抗原は、呼吸器系ウイルス、例えばオルソミク
ソウイルス（インフルエンザ）、ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（Ｐ
ＩＶ）、モルビリウイルス（麻疹）、トガウイルス（風疹）、ＶＺＶ及びコロナウイルス
（ＳＡＲＳ）に由来する場合がある。呼吸器系抗原は、呼吸器系疾患を引き起こす細菌、
例えばストレプトコッカス・ニューモニエ、シュードモナス・エルジノーサ、ボルデテラ
・ペルツッシス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコプラズマ・ニューモニ
エ、クラミジア・ニューモニエ、バシラス・アンスラシス及びモラクセラ・カタラーリス
に由来する場合がある。これらの病原菌に由来する特異性抗原の例は、上に記載されてい
る。
【０１５２】
６．  小児用ワクチン抗原
本発明の組成物には、小児患者に使用するのに好適な１つ以上の抗原が含まれる場合が
ある。小児患者は一般的に約３歳未満、或いは約２歳未満、或いは約１歳未満である。小
児抗原は、６ヶ月、１年、２年又は３年にわたり複数回投与される場合がある。小児抗原
は、小児群を標的とするウイルス及び／又は小児群が感染しやすいウイルスに由来する場
合がある。小児ウイルス抗原には、オルソミクソウイルス（インフルエンザ）、ニューモ
ウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶ及びムンプス）、モルビリウイルス（
麻疹）、トガウイルス（風疹）、エンテロウイルス（ポリオ）、ＨＢＶ、コロナウイルス
（ＳＡＲＳ）及びバリセラゾスターウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバールウイルス（
ＥＢＶ）の１つ以上に由来する抗原が含まれる。小児細菌抗原には、ストレプトコッカス
・ニューモニエ、ナイセリア・メニンギイテイデイス、ストレプトコッカス・ピオゲネス
（Ａ群ストレプトコッカス）、モラクセラ・カタラーリス、ボルデテラ・ペルツッシス、
スタフィロコッカス・アウレウス、クロストリジウム・テタニ（テタヌス）、コリネバク
テリウム・ジフテリア（ジフテリア）、ヘモフィルス・インフルエンザＢ型（Ｈｉｂ）、
シュードモナス・エルジノーサ、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｂ群ストレプト
コッカス）及び大腸菌の１つ以上に由来する抗原が含まれる。これらの病原菌に由来する
特異性抗原の例は、上に記載されている。
【０１５３】
７．  高齢の個体又は免疫不全の個体に使用するのに好適な抗原
本発明の組成物には、高齢の個体又は免疫不全の個体に使用するのに好適な１つ以上の
抗原が含まれる場合がある。このような患者は、標的抗原への免疫反応を向上するために
高用量で、又はアジュバント製剤と共に、より頻繁に予防注射を受ける必要があることも
ある。高齢の個体又は免疫不全の個体において使用対象とされる抗原には、以下の病原菌
の１つ以上に由来する抗原が含まれる：ナイセリア・メニンギイテイデイス、ストレプト
コッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ａ群ストレプトコッカス）
、モラクセラ・カタラーリス、ボルデテラ・ペルツッシス、スタフィロコッカス・アウレ
ウス、スタフィロコッカス・エピデルミス、クロストリジウム・テタニ（テタヌス）、コ
リネバクテリウム・ジフテリア（ジフテリア）、ヘモフィルス・インフルエンザＢ型（Ｈ
ｉｂ）、シュードモナス・エルジノーサ、レジオネラ・ニューモフィラ、ストレプトコッ
カス・アガラクティエ（Ｂ群ストレプトコッカス）、エンテロコッカス・フェカーリス、
ヘリコバクター／ピロリ、クラミジア・ニューモニエ、オルソミクソウイルス（インフル
エンザ）、ニューモウイルス（ＲＳＶ），パラミクソウイルス（ＰＩＶ及びムンプス）、
モルビリウイルス（麻疹）、トガウイルス（風疹）、エンテロウイルス（ポリオ）、ＨＢ
Ｖ、コロナウイルス（ＳＡＲＳ）、バリセラゾスターウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン
バールウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）。これらの病原菌に由来す
る特異性抗原の例は、上に記載されている。
【０１５４】
８．  青年用ワクチンにおいて使用するのに好適な抗原
本発明の組成物には、青年患者に使用するのに好適な１つ以上の抗原が含まれる場合が
ある。青年期は、以前に投与された小児用抗原の増強を必要とする場合がある。青年期に
使用するのに好適な小児用抗原については、上に記載されている。又、性活動を開始する
前に予防的・治療的免疫性を確実にするため、青年期をＳＴＤ病原菌に由来する抗原を投
与する対象にする場合もある。青年期に使用するのに好適なＳＴＤ抗原については、上に
記載されている。
【０１５５】
９．  抗原製剤
本発明の他の態様では、抗原を吸着した微粒子の生成法を提供する。この方法は以下の
プロセスからなる：（ａ）（ｉ）水、（ｉｉ）界面活性剤、（ｉｉｉ）有機溶媒、及び（
ｉｖ）ポリ（αヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルト
エステル、ポリ酸無水物及びポリシアノアクリレートからなる群から選択される生分解性
高分子を含む混合物を分散させることによりエマルジョンを生成するプロセス。高分子は
、一般的に有機溶媒に対して約１〜３０％の濃度で混合液中に存在し、界面活性剤は、一
般的に界面活性剤と高分子の重量比が約０．００００１：１〜０．１：１（より一般的に
は約０．０００１：１〜０．１：１、約０．００１：１〜０．１：１又は約０．００５：
１〜０．１：１）で混合液中に存在する；（ｂ）エマルジョンから有機溶媒を除去するプ
ロセス；及び（ｃ）微粒子の表面に抗原を吸着させるプロセス。特定の実施形態において
、生分解性高分子は有機溶媒に対して約３％〜１０％の濃度で存在する。
【０１５６】
本明細書で使用する微粒子は、滅菌可能で非毒性、生分解性の材料から形成される。こ
のような材料には、ポリ（αヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン
、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ＰＡＣＡ及びポリシアノアクリレートが含まれる
が、これらに限定されない。好ましくは、本発明で使用する微粒子は、ポリ（α−ヒドロ
キシ酸）、特に、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）又はＤ，Ｌ−ラクチド、及びグリコリド又
はグリコール酸の共重合体、例えばポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド））（ＰＬ
Ｇ又はＰＬＧＡ）、又はＤ，Ｌ−ラクチド及びカプロラクトンの共重合体に由来する。微
粒子は、種々の分子量を有する種々の高分子出発物質に由来する場合があり、ＰＬＧのよ
うな共重合体の場合には、種々のラクチド：グリコリド比の選択は、大部分は部分的に同
時投与する高分子に依存する選択の問題となる。これらのパラメータについては、以下で
詳細に考察する。
【０１５７】
更なる抗原には、外膜小胞（ＯＭＶ）製剤が含まれる場合もある。
【０１５８】
補助的な製剤方法及び抗原（特に腫瘍抗原）については、米国特許シリアル番号０９／
５８１，７７２に示されている。
【０１５９】
１０．  抗原の参考文献
以下の参考文献には、本発明の組成物に関して有用な抗原が含まれる。
【０１６０】
【化１３】
2012105659.tif 000014
【０１６１】
【化１４】
2012105659.tif 000015
上に引用した特許、特許出願及び論文全ての内容は、本明細書で詳述されているかのよ
うに参考として組み入れられている。
【０１６２】
糖類又は糖鎖抗原を使用する場合は、好ましくは免疫原性を増強するために担体タンパ
ク質と結合している。Ｒａｍｓａｙら、（２００１）  Ｌａｎｃｅｔ  ３５７（９２５１
）：１９５−１９６；  Ｌｉｎｄｂｅｒｇ  （１９９９）  Ｖａｃｃｉｎｅ  １７  Ｓｕ
ｐｐｌ  ２：  Ｓ２８−３６；  Ｂｕｔｔｅｒｙ  ＆  Ｍｏｘｏｎ  （２０００）  Ｊ  
Ｒ  Ｃｏｌｌ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｌｏｎｄ  ３４：１６３−１６８；  Ａｈｍａｄ
＆  Ｃｈａｐｎｉｃｋ  （１９９９）  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ
Ａｍ  １３：１１３−１３３，  ｖｉｉ；  Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ  （１９９８）  Ｊ．
Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４７：５６３−５６７；  欧州特許第０  ４７７  
５０８号；  米国特許第５，３０６，４９２号；  ＷＯ９８／４２７２１；  Ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  （ｅｄｓ．  Ｃｒｕｓｅ，  ｅｔ  ａｌ．）  ＩＳＢＮ  
３８０５５４９３２６，  ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ  ｖｏｌ．  １０：４８−１１４；
Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  （１９９６）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ  ＩＳＢＮ：  ０１２３４２３３６８又は０１２３４２３３５Ｘを参照されたい。好ま
しい担体タンパク質は、細菌毒素又はトキソイド、例えばジフテリアトキソイド又は破傷
風トキソイドである。特にＣＲＭ  １９７ジフテリアトキソイドが好ましい。
【０１６３】
その他の担体ポリペプチドには、Ｎ．メニンジティディス外膜タンパク質（ＥＰ−Ａ−
０３７２５０１）、合成ペプチド（ＥＰＡ−０３７８８８１及びＥＰＡ  ０４２７３４７
）、熱ショックタンパク質（ＷＯ  ９３／１７７１２及びＷＯ  ９４／０３２０８）、百
日咳タンパク質（ＷＯ  ９８／５８６６８及びＥＰ  Ａ  ０４７１１７７）、Ｈ．influe
nzaeのＤタンパク質（ＷＯ  ００／５６３６０）、サイトカイン（ＷＯ  ９１／０１１４
６）、Ｃ．ディフィシレのリンホカイン、ホルモン、成長因子、トキシンＡ又はトキシン
Ｂ（ＷＯ  ００／６１７６１）、鉄吸収タンパク質（ＷＯ  ０１／７２３３７）等が含ま
れる。混合物がセリグラフＡ及びセリグラフＣの両方からのカプセル状糖類を含む場合は
、ＭｅｎＡ糖類：ＭｅｎＣ糖類の比率（ｗ／ｗ）は１以上（例えば２：１、３：１、４：
１、５：１、１０：１以上）であることが好ましい。異なる糖類が、種類が同じ又は異な
る担体タンパク質と結合してもよい。必要に応じて、適切な共役結合反応を適切なリンカ
ーと共に使用してもよい。
【０１６４】
必要に応じて、毒性タンパク質抗原が解毒される場合がある（例えば、化学的及び／又
はによる遺伝学的手段による百日咳毒素の解毒）。
【０１６５】
ＶＩＩ．  薬学的組成物
幾つかの実施形態において、本発明の薬学的組成物はＢｉｂＡポリペプチドを含む（上
に開示した通り他の活性因子を含む場合も含まない場合もある）。他の実施形態において
、薬学的組成物は、ＢｉｂＡポリペプチドをコードする核酸分子を含む（上述のように他
の活性因子をコードする核酸分子を含む場合も含まない場合もある）。核酸ワクチンにつ
いては、例えば以下の文献に記載されている：Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｔｏｒｒｅｓ  （
１９９７）  Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９：２７１−２８３；  
Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、（１９９７）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：６１７
−６４８；  Ｓｃｏｔｔ−Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ  （２０００）  Ｅｘ
ｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ９：４７１−４８０；  Ａｐｏｓ
ｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ  ＆  Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ  （２０００）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  
ＭｏＩ  Ｔｈｅｒ  ２：４４１−４４７；  Ｉｌａｎ  （１９９９）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉ
ｎ  ＭｏＩ  Ｔｈｅｒ  １：１１６−１２０；  Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、（２０００）  Ｍ
ｏＩ  Ｍｅｄ  ６：７２３−７３２；  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｐｅｒｔｍｅｒ  （２０
００）  Ａｄｖ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ５５：１−７４；  Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、（２０
００）  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １６２（４  Ｐｔ  ２
）：Ｓ１９０−１９３Ｄａｖｉｓ  （１９９９）  Ｍｔ．  Ｓｉｎａｉ  Ｊ．  Ｍｅｄ．
６６：８４−９０。一般的に、核酸分子は例えばプラスミド状のＤＮＡ分子である。他
の実施形態において、薬学的組成物は、ＢｉｂＡポリペプチドに特異的に結合する抗体を
含む。
【０１６６】
本発明の免疫原性成分は好ましくはワクチン成分である。このような成分のｐＨは、好
ましくは６〜８の間、好ましくは７である。ｐＨは、緩衝液を使用して維持することがで
きる。成分は、無菌及び／又はパイロジェン・フリーとすることができる。成分はヒトに
対して等張とすることができる。本発明によるワクチンは、予防又は治療に使用すること
ができるが、一般的に予防用であり、動物（ペット及び実験用哺乳動物を含む）、特にヒ
トの処置に使用することができる。
【０１６７】
Ａ．  薬学的に許容される担体
本発明の組成物は、一般的に上述の成分の他に「薬学的に許容される担体」を１つ以上
含む。これらには、それ自体が組成物の被投与者に害を及ぼす抗体の生成を誘導しない担
体が含まれる。適切な担体は、一般的に大きく、徐々に代謝される高分子、例えばタンパ
ク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー及び
脂質凝集物（例えば油滴又はリポソーム）等である。このような担体は、当業者に周知で
ある。組成物は、希釈液、例えば水、生理的食塩水、グリセロール等を含む場合もある。
更に、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤等の補助剤が存在してもよい。薬学的に許容される
成分については、以下の文献で十分に考察されている：Ｇｅｎｎａｒｏ  （２０００）  
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐ
ｈａｒｍａｃｙ．  ２０ｔｈ  ｅｄ．，  ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２。
【０１６８】
Ｂ．  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ａｇｅｎｔｓ
１．  アジュバント
本発明のワクチンは、他の免疫調節剤と共に投与される場合がある。特に、組成物には
通常アジュバントが含まれる。本発明で使用するアジュバントには、以下に記載するもの
の１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６９】
ａ．  組成物含有ミネラル
本発明においてアジュバントとして使用するのに好適な組成物含有ミネラルには、ミネ
ラル塩類、例えばアルミニウム塩類及びカルシウム塩類が含まれる。本発明には、ミネラ
ル塩類、例えば水酸化物（例えばオキシ水酸化物）、リン酸塩（例えばヒドロキシリン酸
塩、オルソリン酸塩）、硫酸塩等（例えばＶａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ．．．  （１９
９５）  ｅｄｓ．  Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ．  ＩＳＢＮ：  ０３０６４４８６
７Ｘ．  Ｐｌｅｎｕｍ，  ｃｈｓ  ８  ＆  ９を参照）、又は異なるミネラル化合物の混
合物（例えば、場合によりリン酸塩を多めに含む、リン酸塩及び水酸化物アジュバントの
混合物、）が、適切な形態（例えばゲル、結晶、非結晶、等）の化合物と共に、好ましく
は塩類に吸着して含まれる。組成物含有ミネラルは、金属塩粒子として調製される場合も
ある（ＷＯ００／２３１０５）。
【０１７０】
本発明のワクチンには、Ａｌ３＋の用量が１用量当たり０．２〜１．０ｍｇとなるよう
にアルミニウム塩類が含まれる場合がある。
【０１７１】
一実施形態において、本発明で使用するアルミニウムを基剤とするアジュバントは、ミ
ョウバン（硫酸アルミニウムカリウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２））、又はリン酸塩緩衝液に
おいて抗原をミョウバンと混合し、塩基、例えば水酸化アンモニウム又は水酸化ナトリウ
ムを使用して滴定及び沈殿してｉｎ−ｓｉｔｕで形成したミョウバン誘導体である。
【０１７２】
本発明のワクチン製剤で使用する別のアルミニウム系アジュバントは、水酸化アルミニ
ウムアジュバント（Ａｌ（ＯＨ）３）又はオキシ水酸化アルミニウム結晶（ＡｌＯＯＨ）
であり、優れた吸着剤であって、ほぼ５００ｍ２／ｇの表面積を有する。或いは、水酸化
アルミニウムアジュバントの水酸基の一部又は全てを置換したリン酸基を含むリン酸アル
ミニウムアジュバント（ＡｌＰＯ４）又はアルミニウムヒドロキシホスフェートが提供さ
れる。本明細書に示される好ましいリン酸アルミニウムアジュバントは、非晶質で酸性、
塩基性及び中性媒体において可溶性である。
【０１７３】
別の実施形態において、本発明のアジュバントはリン酸アルミニウム及び水酸化アルミ
ニウムの両方を含む。より特定のその実施形態において、アジュバントは、水酸化アルミ
ニウムよりリン酸アルミニウムを多く含み、例えばリン酸アルミニウムと水酸化アルミニ
ウムの重量比が２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１或い
はそれ以上となる。更に特定の実施形態において、ワクチン中のアルミニウム塩類は、ワ
クチン１用量当たり０．４〜１．０ｍｇ、又はワクチン１用量当たり０．４〜０．８ｍｇ
、又はワクチン１用量当たり０．５〜０．７ｍｇ、又はワクチン１用量当たり約０．６ｍ
ｇ存在する。
【０１７４】
一般的に、アルミニウムを基剤とする好ましいアジュバント、又はアルミニウムを基剤
とする複数のアジュバント、例えばリン酸アルミニウムと水酸化アルミニウムの割合は、
所望のｐＨで抗原がアジュバントと反対の電荷を帯びるような分子間の静電引力の最適化
によって選択される。例えば、リン酸アルミニウムアジュバント（等電位点＝４）は、ｐ
Ｈ  ７．４でアルブミンではなくリゾチームを吸着する。アルブミンが標的ならば、水酸
化アルミニウムアジュバントが選択される（等電位点＝１１．４）。或いは、リン酸塩に
よる水酸化アルミニウムの前処理はその等電位点を低下させ、塩基性の抗原に対して好ま
しいアジュバントになる。
【０１７５】
ｂ．  油エマルジョン
本発明においてアジュバントとして使用するのに好適な油エマルジョン成分には、スク
アレン−水エマルジョン、例えばＭＦ５９（５％のスクアレン、０．５％のＴＷＥＥＮＴ
Ｍ  ８０及び０．５％のスパン８５、マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒
子に調製）が含まれる。ＷＯ９０／１４８３７を参照されたい。又、Ｐｏｄｄａ，  Ｖａ
ｃｃｉｎｅ  （２００１）  １９：  ２６７３−２６８０；  Ｆｒｅｙら、Ｖａｃｃｉｎ
ｅ  （２００３）  ２１：４２３４−４２３７も参照されたい。ＭＦ５９は、インフルエ
ンザウイルス３価サブユニットワクチンＦＬＵＡＤＴＭにおいてアジュバントとして使用
する。
【０１７６】
これらの組成物において使用する特に好ましいアジュバントは、サブミクロンの水中油
エマルジョンである。本明細書で使用するのに好ましいサブミクロンの水中油エマルジョ
ンは、場合により異なる量のＭＴＰ−ＰＥ、例えば４−５％  ｗ／ｖのスクアレン、０．
２５−１．０％ｗ／ｖのＴＷＥＥＮＴＭ  ８０Ｄ（ポリオキシエチレンエチレンソルビタ
ン・モノオレエート）、及び／又は０．２５−１．０％のＳＰＡＮ  ８５ＴＭ（ソルビタ
ントリオレエート）、及び場合によりＮ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニ
ル−Ｌ−アラニン−２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ヒドロキシ
−ホスホリルオキシ））エチルアミド（ＭＴＰ−ＰＥ）、例えば、「ＭＦ５９」と呼ばれ
るサブミクロンの水中油エマルジョン（国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７、米国特許第
６，２９９，８８４号及び６，４５１，３２５号、及びＯｔｔら、ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ
Ｄｅｓｉｇｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａ
ｃｈ  （Ｐｏｗｅｌｌ，  Ｍ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，  ＭＪ．  ｅｄｓ．）  Ｐ
ｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９５，  ｐｐ．  ２７７−２９６
）を含むサブミクロンの水中油エマルジョンを含むスクアレン／水エマルジョンである。
ＭＦ５９は、４−５％ｗ／ｖのスクアレン（例えば４．３％）、０．２５−０．５％ｗ／
ｖのＴＷＥＥＮＴＭ  ８０、及び０．５％ｗ／ｖのＳＰＡＮ  ８５ＴＭを含み、場合によ
りマイクロフルイダイザー、例えばモデルＨＯＹマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆ
ｌｕｉｄｉｃｓ［米国マサチューセッツ州ニュートン］）を使用してサブミクロン粒子に
調製した種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含む。本明細書で使用される「ＭＦ５９−０」という
用語は、上記のサブミクロンのＭＴＰ−ＰＥ非含有水中油エマルジョンを指し、ＭＦ５９
−ＭＴＰという用語は、ＭＴＰ−ＰＥ含有製剤を表す。例えば、「ＭＦ５９−１００」は
１用量当たり１００μｇのＭＴＰ−ＰＥを含む。本明細書で使用する別のサブミクロンの
水中油エマルジョンであるＭＦ６９は、４．３％ｗ／ｖのスクアレン、０．２５％ｗ／ｖ
のＴＷＥＥＮＴＭ  ８０及び０．７５％ｗ／ｖのＳＰＡＮ  ８５ＴＭ、及び場合によりＭ
ＴＰ−ＰＥを含む。更に別のサブミクロンの水中油エマルジョンはＳＡＦとも呼ばれるＭ
Ｆ７５であり、１０％のスクアレン、０．４％のＴＷＥＥＮＴＭ  ８０、５％のプルロニ
ックブロックポリマーＬ１２１、及びサブミクロンのエマルジョンにミクロ流体化したｔ
ｈｒ−ＭＤＰを含む。ＭＦ７５−ＭＴＰは、例えば１用量当たり１００−４００μｇのＭ
ＴＰ−ＰＥからのＭＴＰを含むＭＦ７５製剤を表す。
【０１７７】
組成物に使用するためのサブミクロンの水中油エマルジョン、これ及び免疫刺激剤、例
えばムラミルペプチドの生成法は、ＷＯ９０／１４８３７及び米国特許第６，２９９，８
８４号及び第６，４５１，３２５号に詳述されている。
【０１７８】
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）及び不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）
も本発明におけるアジュバントとして使用してもよい。
【０１７９】
ｃ．  サポニン製剤
サポニン製剤も、本発明におけるアジュバントとして使用してもよい。サポニンは、種
々の植物類の樹皮、葉、幹、根、及び花に含まれるステロールグリコシド及びトリテルペ
ノイドグリコシドの異種群である。バラ科植物キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａ
ｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）の樹皮から単離されたサポニンは、アジュバントとして広く研究
されている。Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ  （ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ）、  Ｇｙｐｓｏ
ｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ  （ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ）、及びＳａｐｏｎａ
ｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ  （ｓｏａｐ  ｒｏｏｔ）のサポニンも市販されてい
る。サポニンアジュバント製剤には、ＱＳ２１等の脂質製剤、並びにＩＳＣＯＭ等の精製
した製剤が含まれる。
【０１８０】
サポニン成分は、高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰ−ＴＬＣ）及び逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して精製されている。これらの方法を使用し
て精製した特定の画分は特定されており、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ
−Ａ、ＱＨ−Ｂ及びＱＨ−Ｃを含む。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１
の生成法については、米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。サポニン製剤
には、コレステロール等のステロールが含まれるもある（ＷＯ９６／３３７３９を参照）
。
【０１８１】
サポニン及びコレステロールの組み合わせは、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれ
るユニークな粒子の形成に使用することができる。ＩＳＣＯＭには、一般的にリン脂質、
例えばホスファチジルエタノールアミン又はホスファチジルコリンも含まれる。任意の既
知のサポニンをＩＳＣＯＭに使用することができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭにはＱｕｉ
ｌ  Ａ、ＱＨＡ及びＱＨＣの１つ以上が含まれる。ＩＳＣＯＭについては、ＥＰ０１０９
９４２、ＷＯ９６／１１７１１及びＷＯ９６／３３７３９に詳述されている。場合により
、ＩＳＣＯＭＳは界面活性剤が無添加である場合がある。ＷＯＯＯ／０７６２１を参照さ
れたい。
【０１８２】
サポニンを基剤とするアジュバントの開発のレビューは、Ｂａｒｒら、Ａｄｖａｎｃｅ
ｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  （１９９８）  ３２：２４７−２７
１を参照されたい。又、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉ
ｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  （１９９８）  ３２：３２１−３３８．  ｄ．  Ｖｉｒｏｓ
ｏｒａｅｓ  ａｎｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  （ＶＬＰｓ）も参照
されたい。
【０１８３】
ビロゾーム及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）も本発明におけるアジュバントとして使用す
ることができる。これらの構造体は、一般的に場合によりリン脂質と組み合わせた又は調
製された１つ以上のウイルスタンパク質を含む。これらは一般的に非病原性、非複製性で
あり、一般的に天然のウイルスゲノムを含んでいない。ウイルスタンパク質は、組み換え
で生成しても全ウイルスから単離してもよい。ビロゾーム又はＶＬＰで使用するのに好適
なこれらのウイルスタンパク質は、インフルエンザウイルス（例えばＨＡ又はＮＡ）、Ｂ
型肝炎ウイルス（例えばコア又はカプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイル
ス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォー
ク・ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡファージ、Ｑβファージ（例えばコ
ートタンパク質）、ＧＡファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ及びＴｙ（例え
ばレトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）から得たタンパク質を含む。ＶＬＰについ
ては、以下の文献で詳しく考察されている：ＷＯ０３／０２４４８０，  ＷＯ０３／０２
４４８１，  ａｎｄ  Ｎｉｉｋｕｒａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  （２００２）  ２９３：２
７３−２８０；  Ｌｅｎｚら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （２００
１）  ５２４６−５３５５；  Ｐｉｎｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏ
ｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  （２００３）  １８８：３２７−３３８；及びＧｅｒｂｅｒら
、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  （２００１）  ７５（１０）：４７５２−
４７６０。ビロゾームについは、例えば以下の文献で詳しく考察されている：Ｇｌｕｃｋ
ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  （２００２）  ２０：Ｂ１０−Ｂ  １６。免疫増強再構成インフル
エンザ・ビロゾーム（ＩＲＩＶ）は、鼻腔内の３価のＩＮＦＬＥＸＡＬＴＭ製品｛Ｍｉｓ
ｃｈｌｅｒ  ＆  Ｍｅｔｃａｌｆｅ  （２００２）  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０  Ｓｕｐｐｌ
５  ：Ｂ  １７−２３｝及びＩＮＦＬＵＶＡＣ  ＰＬＵＳＴＭ製品においてサブユニッ
ト抗原送達システムとして使用される。
【０１８４】
ｅ．  細菌又は微生物誘導体
本発明において使用するのに好適なアジュバントには、以下のような細菌又は微生物の
誘導体が含まれる。
【０１８５】
ｉ．  腸内細菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）の無毒な誘導体
このような誘導体には、モノホスホリル・リピドＡ（ＭＰＬ）及び３−Ｏ−脱アシル化
ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が含まれる。３ｄＭＰＬは、３  Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリ
ル・リピドＡと４本、５本又は６本のアシル化された鎖の混合物である。好ましい「小粒
子」形の３  Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル・リピドＡは、ＥＰ  ０  ６８９  ４５
４に開示されている。３ｄＭＰＬのこのような「小粒子」は、０．２２μの膜を通して無
菌濾過できるほど小さい（ＥＰ  ０  ６８９  ４５４を参照）。その他の非毒性ＬＰＳ誘
導体には、モノホスホリル・リピドＡの模倣体、例えばアミノアルキル・グルコサミニド
・リン酸塩誘導体、例えばＲＣ  ５２９が含まれる。Ｊｏｈｎｓｏｎら、（１９９９）  
Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ９：２２７３−２２７８を参照されたい。
【０１８６】
ｉｉ．  リピドＡ誘導体
リピドＡ誘導体には、大腸菌、例えばＯＭ−１７４のリピドＡ誘導体が含まれる。ＯＭ
−１７４については、例えばＭｅｒａｌｄｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ  （２００３）  ２１：
２４８５−２４９１；及びＰａｊａｋら、Ｖａｃｃｉｎｅ  （２００３）  ２１：８３６
−８４２に記載されている。
【０１８７】
ｆ．  免疫刺激性オリゴヌクレオチド
本発明においてアジュバントとして使用するのに好適な免疫刺激性オリゴヌクレオチド
には、ＣｐＧモチーフ（グアノシンが後続しリン酸結合によって連結された非メチル化シ
トシンを含む配列）を含むヌクレオチド配列が含まれる。回文配列又はポリ（ｄＧ）配列
を含む細菌の２本鎖ＲＮＡ又はオリゴヌクレオチドも免疫刺激性であることが示されてい
る。
【０１８８】
ＣｐＧには、ヌクレオチド修飾／アナログ、例えばホスホロチオエート修飾が含まれて
もよく、又、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。場合によりグアノシンは、アナロ
グ、例えば２’−デオキシ−７−デアザグアノシンと置き換えられる場合もある。可能な
アナログ置換の例については、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  
Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２００３）  ３１（９）：  ２３９３−２４００；  ＷＯ０２／２
６７５７及びＷＯ９９／６２９２３を参照されたい。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュ
バント効果については、以下の文献で詳しく考察されている：Ｋｒｉｅｇ，  Ｎａｔｕｒ
ｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （２００３）  ９（７）：  ８３１−８３５；  ＭｃＣｌｕｓｋ
ｉｅら、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ  （２００２）  ３２：１７９−１８５；  ＷＯ９８／４０１００；米国特許第
６，２０７，６４６号；米国特許第６，２３９，１１６号及び米国特許第  ６，４２９，
１９９号。
【０１８９】
ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９、例えばモチーフＧＴＣＧＴＴ又はＴＴＣＧＴＴに向けられて
もよい。Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎ
ｓａｃｔｉｏｎｓ  （２００３）  ３１  （ｐａｒｔ  ３）：  ６５４−６５８を参照さ
れたい。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫反応の誘導、例えばＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮに対して特異
的であってもよく、或いはＢ細胞反応の誘導、例えばＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮに対してより特
異的であってもよい。ＣｐＧ−Ａ及びＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮについては、以下の文献で考察
されている：Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （２００３）  １７０（
８）：４０６１−４０６８；  Ｋｒｉｅｇ，  ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ  （２００２）  ２３（２）：  ６４−６５及びＷＯＯ  １／９５９３５。好ましくは
、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。
【０１９０】
好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを、５’末端が受容体認識アクセスできるよう
に構築する。場合により、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、それらの３’末端に
結合し「イミュノマー」を形成する場合もある。例えば、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、ＢＢ
ＲＣ  （２００３）  ３０６：９４８−９５３；  Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  （２００３）  ３１（ρａ
ｒｔ  ３）：６６４−６５８；  Ｂｈａｇａｔら、ＢＢＲＣ  （２００３）  ３００：８
５３−８６１及びＷＯ０３／０３５８３６を参照されたい。
【０１９１】
ｇ．  ＡＤＰリボシル化毒素及びその解毒された誘導体
細菌性のＡＤＰリボシル化毒素及びその解毒された誘導体は、本発明においてアジュバ
ントとして使用してもよい。好ましくは、タンパク質は大腸菌（即ち大腸菌易熱性エンテ
ロトキシン（ＬＴ））、コレラ（ＣＴ）、又はペルツッシス（ＰＴ）に由来する。解毒さ
れたＡＤＰリボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用についてはＷＯ９５／１７２
１１に、非経口アジュバントとしての使用についてはＷＯ９８／４２３７５に記載されて
いる。好ましくは、アジュバントは解毒されたＬＴ変異体、例えばＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−
Ｒ７２及びＬＴＲ１９２Ｇである。ＡＤＰリボシル化毒素及びその解毒された誘導体、特
にＬＴ−Ｋ６３及びＬＴ−Ｒ７２のアジュバントとしての使用は、以下の参考文献で見る
ことができる：Ｂｅｉｇｎｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  （
２００２）  ７０（６）：３０１２−３０１９；  Ｐｉｚｚａら、Ｖａｃｃｉｎｅ  （２
００１）  １９：２５３４−２５４１；  Ｐｉｚｚａら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ  （２０００）  ２９０（４−５）：４５５−４６１；  Ｓｃｈａｒｔ
ｏｎ−Ｋｅｒｓｔｅｎら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  （２０００
）  ６８（９）：５３０６−５３１３；  Ｒｙａｎら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉ
ｍｍｕｎｉｔｙ  （１９９９）  ６７（１２）：  ６２７０−６２８０；  Ｐａｒｔｉｄ
ｏｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  （１９９９）  ６７（３）：２０９−２１６；
Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ  （２００３）  ２（２）：２８５−２９３
；  ａｎｄ  Ｐｉｎｅら、（２００２）  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  （２
００２）  ８５（ｌ−３）：２６３−２７０。アミノ酸置換の参照番号は、好ましくはＤ
ｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉら、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  （１９９５）  １５（６）：
１１６５−１１６７に記載のＡＤＰリボシル化毒素のサブユニットＡ及びサブユニットＢ
の配列に基づく。
【０１９２】
ｈ．  生体付着剤及び粘膜付着剤
本発明におけるアジュバントとして生体付着剤及び粘膜付着剤を使用してもよい。好適
な生体付着剤には、エステル化ヒアルロン酸微粒子（Ｓｉｎｇｈら、（２００１）  Ｊ．
Ｃｏｎｔ．  Ｒｅｌｅ．  ７０：２６７−２７６）  又は粘膜付着剤、例えばポリアク
リル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類及びカルボキシメチルセ
ルロースの架橋結合された誘導体が含まれる。キトサン及びその誘導体を本発明における
アジュバントとして使用してもよい。ＷＯ９９／２７９６０を参照されたい。
【０１９３】
ｉ．  微粒子
微粒子を本発明におけるアジュバントとして使用してもよい。生分解性で無毒性材料（
例えばポリ（αヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水
物、ポリカプロラクトン等）とポリ（ラクチド−コ−グリコリド）から形成された微粒子
（即ち、直径約１００ｎｍ〜１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜３０μｍ、
最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜１０μｍの粒子）が好ましく、場合により、負に帯電
した表面（例えばＳＤＳで）又は正に帯電した表面（例えば陽イオン清浄剤、例えばＣＴ
ＡＢで）を有するように処理される。
【０１９４】
ｊ．  リポソーム
アジュバントとして使用するのに好適なリポソーム製剤の例は、米国特許第６，０９０
，４０６号、米国特許第５，９１６，５８８号及びＥＰ  ０  ６２６  １６９に記載され
ている。
【０１９５】
ｋ．  ポリオキシエチレンエーテル及びポリオキシエチレンエステル製剤
本発明において使用するのに好適なアジュバントには、ポリオキシエチレンエーテル及
びポリオキシエチレンエステルが含まれる。ＷＯ９９／５２５４９。更にこのような製剤
には、オクトキシノール（ＷＯＯ  １／２１２０７）と組み合わせたポリオキシエチレン
ソルビタンエステル界面活性剤、並びに少なくとも１つの補助的な非イオン性界面活性剤
、例えばオクトキシノール（ＷＯＯ  １／２１１５２）と組み合わせたポリオキシエチレ
ンアルキルエーテル又はエステル界面活性剤も含まれる。
【０１９６】
好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレ
ン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテ
ル、ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリル
エーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２３
−ラウリルエーテル。
【０１９７】
ｌ．  ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ製剤については、例えば、以下の文献に記載されている：Ａｎｄｒｉａｎｏｖ
ら、“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  
ｂｙ  ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｏｐｈａｚｅｎ
ｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  （１９９８）  １９（１−３
）：  １０９−１１５；及びＰａｙｎｅら、“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏ
ｍ  Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ”，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ．  
Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗ  （１９９８）  ３１（３）：１８５−１９６。
【０１９８】
ｍ．  ムラミルペプチド
本発明においてアジュバントとして使用するのに好適なムラミルペプチドの例には、Ｎ
−アセチル−ムラミルＬ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−ア
セチル−ノルムラミル−１−アラニル−ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、及びＮ
アセチルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミニル−ｌ−アラニン−２−（ｒ−２
’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミ
ンＭＴＰ−ＰＥが含まれる。
【０１９９】
ｎ．  イミダゾキノリン化合物
本発明においてアジュバントとして使用するのに好適なイミダゾキノリン化合物の例に
は、イミキモド及びそのアナログが含まれるが、詳細は以下の文献に記載されている：Ｓ
ｔａｎｌｅｙ，  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  （２００２）  ２７（７）：５
７１−５７７；  Ｊｏｎｅｓ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  
（２００３）  ４（２）：２１４−２１８；及び、米国特許第４，６８９，３３８号、第
５，３８９，６４０号、第５，２６８，３７６号、第４，９２９，６２４号、第５，２６
６，５７５号、第５，３５２，７８４号、第５，４９４，９１６号、第５，４８２，９３
６号、第５，３４６，９０５号、第５，３９５，９３７号、第５，２３８，９４４号、及
び第５，５２５，６１２号。
【０２００】
ｏ．  チオセミカルバゾン化合物
チオセミカルバゾン化合物、並びに本発明においてアジュバントとして使用するのに好
適な全化合物の調製法、製造法及びスクリーニング法には、ＷＯ０４／６０３０８に記載
されるものが含まれる。チオセミカルバゾンは、サイトカイン、例えばＴＮＦ−αの生成
のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に効果的である。
【０２０１】
ｐ．  トリプタントリン化合物
トリプタントリン化合物の例、並びに本発明においてアジュバントとして使用するのに
好適な全化合物の調製法、製造法及びスクリーニング法には、ＷＯ０４／６４７５９に記
載されるものが含まれる。トリプタントリン化合物は、サイトカイン、例えばＴＮＦ−α
の生成のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に効果的である。
【０２０２】
本発明は、上に特定した１つ以上のアジュバントの態様の組み合わせを含む場合もある
。例えば、本発明において以下のアジュバント成分が使用される場合がある：
（１）サポニン及び水中油エマルジョン（ＷＯ９９／１１２４１）；
（２）サポニン（例えばＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）（ＷＯ
９４／００１５３を参照）；
（３）サポニン（例えばＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）＋コレ
ステロール；
（４）サポニン（例えばＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ  １２（場合により＋ステロー
ル）（ＷＯ９８／５７６５９）；
（５）３ｄＭＰＬと例えばＱＳ２１及び／又は水中油エマルジョンの組み合わせ（欧州
特許出願第０８３５３１８号、第０７３５８９８号及び第０７６１２３１号を参照）；
（６）１０％のスクアラン、０．４％のＴＷＥＥＮ  ８０、５％のプルロニックブロッ
クポリマーＬ  １２１及びｔｈｒ−ＭＤＰを含み、サブミクロンエマルジョンにミクロ流
体化されたか、又はより大きな粒子径のエマルジョンを生成するために撹拌されたＳＡＦ
；
（７）２％のスクアレン、０．２％のＴＷＥＥＮ  ８０及びモノホスホリル・リピドＡ
（ＭＰＬ）及びトレハロースジミコレート（ＴＤＭ）及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好まし
くはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）からなる群の１つ以上の細菌細胞壁成分を含むＲ
ｉｂｉＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；
（８）１つ以上のミネラル塩（例えばアルミニウム塩）＋ＬＰＳの無毒性誘導体（例え
ば３ｄＰＭＬ）；及び
（９）１つ以上のミネラル塩（例えばアルミニウム塩）＋免疫刺激性オリゴヌクレオチ
ド（例えばＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列）。
【０２０３】
ｑ．  ヒト免疫調節薬
本発明においてアジュバントとして使用するのに好適なヒト免疫調節薬には、サイトカ
イン、例えばインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ
−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２等）、インターフェロン（例えばインターフェロンγ）、マ
クロファージコロニー刺激因子及び腫瘍壊死因子が含まれる。
【０２０４】
アルミニウム塩類及びＭＦ５９は、注射可能なインフルエンザワクチンとの使用に好ま
しいアジュバントである。細菌毒素及び生体付着剤は、経粘膜送達ワクチン、例えば点鼻
ワクチンとの使用に好ましいアジュバントである。
【０２０５】
上で引用した特許、特許出願及び論文全ての内容は、本明細書で詳述されているかのよ
うに参考として組み入れられている。
【０２０６】
ＶＩＩＩ．  治療法
本発明は、上記組成物を使用してＳ．アガラクティエへの免疫反応を誘導又は増大する
方法を提供する。免疫反応は好ましくは予防的であり、抗体及び／又は細胞媒介性免疫（
全身的及び粘膜の免疫性を含んで）を含んでもよい。免疫反応には既往反応が含まれる。
抗体を含む組成物は、Ｓ．アガラクティエ感染症の処置に使用することができる。
【０２０７】
本発明によって治療可能なＧＢＳによる疾患には、敗血症、新生児脳膜炎及び新生児肺
炎が含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物は、その他のストレプトコッカ
ス菌、例えばＧＢＳに対しても効果的である。
【０２０８】
Ａ．  免疫反応の有効性を判定する試験
治療の有効性を評価する１つの方法は、本発明の組成物投与後のＧＢＳ感染症をモニタ
ーする。予防的治療の有効性を評価する１つの方法は、本発明の組成物投与後の上記組成
物におけるＧＢＳ抗原に対する免疫反応をモニターする。
【０２０９】
本発明の免疫原性成分のタンパク質成分の免疫原性を評価する別の方法は、タンパク質
を組み換えにより発現すること、及び免疫ブロット法によって患者血清又は粘膜分泌をス
クリーニングすることである。タンパク質と患者血清の間の陽性反応は、患者が以前、問
題のタンパク質に対する免疫反応起こしたことがある、即ちそのタンパク質が免疫原であ
ることを示す。この方法は、主要抗原タンパク質及び／又はエピトープを特定するために
使用してもよい。
【０２１０】
治療の有効性を確認する別の方法は、本発明の組成物投与後のＧＢＳ感染症をモニター
することである。予防的治療の有効性を確認する１つの方法は、本発明の組成物投与後の
本組成物におけるＧＢＳ抗原に対する免疫反応を全身的にモニターする（例えばＩｇＧ１
及びＩｇＧ２ａ生成レベルをモニターする）及び粘膜的にモニターする（例えばＩｇＡ生
成レベルをモニターする）。一般的に、ＧＢＳ血清特異抗体反応は免疫処置後であるが接
種前に判定するが、粘膜のＧＢＳ特異抗体反応は免疫処置後及び接種後に判定する。
【０２１１】
本発明のワクチン成分は、宿主（例えばヒト）に投与する前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び
ｉｎ  ｖｉｖｏの動物モデルにおいて評価することができる。特に有用なマウスモデルは
、以下の実施例２１に記載する能動母体免疫化試験である。これは、試験抗原組成物でメ
スのマウスを免疫化するｉｎ  ｖｉｖｏ保護試験である。続いて、雌マウスを飼育し、致
死量のＧＢＳをその仔獣に接種する。免疫化計画中の雌マウスの血清滴定量を、接種後の
仔獣の生存時間と共に測定する。
【０２１２】
例えば、６〜８週齡の４  ＣＤ−１非近交系雌マウス群（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｃａｌｃｏ  Ｉｔａｌｙ）を１つ以上のＧＢＳ抗原（例
えば１００μＬのＰＢＳに懸濁したＢｉｂＡポリペプチド２０μｇ）で免疫化する。各群
に０日目、２１日目、３５日目に３回投与する。初回投与は等量の完全フロイントアジュ
バント（ＣＦＡ）、以下の２回の投与は不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）と共に
タンパク質を腹腔内注射して免疫化を行う。各免疫化スキームにおいて、陰性及び陽性対
照群を使用する。０日目及び４９日目に得られた血清サンプルを使用して免疫反応をモニ
ターする。各マウス群からのプールとして血清を分析する。
【０２１３】
免疫反応は、ＴＨ１免疫反応及びＴＨ２免疫反応の１つ又は両方である。免疫反応は、
改善或いは増強或いは変質した免疫反応である。免疫反応は、全身及び粘膜免疫反応の１
つ又は両方である。好ましくは、免疫反応は増強されたシステム及び／又は粘膜反応であ
る。
【０２１４】
増強された全身及び／又は粘膜免疫は、増強されたＴＨ１及び／又はＴＨ２免疫反応に
反映される。好ましくは、増強された免疫反応には、ＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ２ａ及び
／又はＩｇＡの生成の上昇が含まれる。
【０２１５】
好ましくは、粘膜免疫反応はＴＨ２免疫反応である。好ましくは、粘膜免疫反応にはＩ
ｇＡ生成の上昇が含まれる。
【０２１６】
活性化されたＴＨ２細胞は抗体生成を増強し、従って細胞外感染に対して有用である。
活性化されたＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６及びＩＬ−１０の１つ以上を
分泌する。ＴＨ２免疫反応は、将来の保護のためＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡ及び記憶Ｂ細
胞を生成する場合がある。
【０２１７】
ＴＨ２免疫反応には、ＴＨ２免疫反応に関連する１つ以上のサイトカイン（例えばＩＬ
−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６及びＩＬ−１Ｏ）の１つ以上の上昇又はＩｇＧ１、ＩｇＥ、Ｉ
ｇＡ及び記憶Ｂ細胞の生成の上昇が含まれる。好ましくは、増強されたＴＨ２免疫反応に
は、ＩｇＧ１生成の上昇が含まれる。
【０２１８】
ＴＨ１免疫反応には、ＣＴＬの上昇、ＴＨ１免疫反応に関連する１つ以上のサイトカイ
ン（例えばＩＬ−２、ＩＦＮγ及びＴＮＦβ）の上昇、活性化マクロファージの上昇、Ｎ
Ｋ活性の上昇、又はＩｇＧ２ａ生成の上昇の１つ以上が含まれる。好ましくは、増強され
たＴＨ１免疫反応には、ＩｇＧ２ａ生成の上昇が含まれる。
【０２１９】
本発明の免疫原性成分、特に本発明のＢｉｂＡポリペプチド（又はＢｉｂＡポリペプチ
ドをコードする核酸分子）を含む免疫原性成分は、単独で或いはその他のＧＢＳ抗原と組
み合わせて場合によりＴｈ１及び／又はＴｈ２反応を誘発することができる免疫調節剤と
共に使用される場合がある。
【０２２０】
本発明は又、１つ以上の免疫調節剤、例えばミネラル塩、例えばアルミニウム塩及びＣ
ｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含む免疫原性成分も含む。最も好ましくは、免
疫原性成分には、アルミニウム塩、及びＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドの何れ
も含まれる。或いは、免疫原性成分には、ＡＤＰリボシル化毒素、例えば解毒されたＡＤ
Ｐリボシル化毒素、及びＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドが含まれる。好ましく
は、免疫調節剤の１つ以上にはアジュバントが含まれる。アジュバントは、以下に詳述す
るＴＨ１アジュバント及びＴＨ２アジュバントからなる１つ以上の群から選択される場合
がある。
【０２２１】
本発明の組成物は、好ましくはＧＢＳ感染症に効果的に対応するために細胞性免疫反応
並びに体液免疫反応の両方を誘発する。この免疫反応は、好ましくは持続性の（例えば中
和）抗体及びＢｉｂＡポリペプチド曝露に迅速に対応することができる細胞性免疫を誘導
する。
【０２２２】
ＢｉｂＡポリペプチド（又はＢｉｂＡポリペプチドをコードする核酸分子）の他に、免
疫原性成分は中和抗体反応を誘発する１つ以上のＧＢＳ抗原及び細胞性免疫反応を誘発す
る１つ以上のＧＢＳ抗原を含んでもよい。このように、中和抗体反応は初期のＧＢＳ感染
症を予防又は阻害するが、増強されたＴｈ１細胞反応を誘発することができる細胞媒介免
疫反応は、更にＧＢＳ感染症の拡大を予防する。好ましくは、免疫原性成分は１つ以上の
ＧＢＳ表面抗原及び１つ以上のＧＢＳ細胞質抗原、例えばＴｈ１細胞反応を誘発すること
ができる細胞質抗原を含む。
【０２２３】
Ｂ．  組成物の調製
本発明の組成物は、種々の形態で調製してもよい。例えば、組成物は溶液又は懸濁液と
して注射可能に調製することができる。注射前に液体溶媒に溶解又は懸濁することに適し
た固体製剤も調製することができる（例えば凍結乾燥組成物）。組成物は、経口投与用に
、例えば錠剤又はカプセル、スプレー、又はシロップとして（場合により味付けして）調
製することができる。組成物は、例えば微粉又はスプレーを使用する吸入剤として肺内投
与用に調製することができる。組成物は、坐薬又はペッサリーとして調製することができ
る。組成物は、例えば滴剤として点鼻、点耳、点眼投与用に調製することができる。組成
物は、患者に投与する直前に混合組成物を再構成するように設計されたキットの形態にす
ることができる。このようなキットは、液状の形態において１つ以上のＧＢＳ又は他の抗
原及び１つ以上の凍結乾燥抗原を含む場合がある。
【０２２４】
ワクチンとして使用される免疫原性成分は、免疫学的有効量のＢｉｂＡポリペプチド（
又はＢｉｂＡポリペプチドをコードする核酸分子）又はＢｉｂＡ抗体を含む。「免疫学的
有効量」とは、単回投与又は連続投与の一部として個体に投与された場合、測定可能な免
疫反応を増大するか又は臨床症状を予防又は軽減する量である。
【０２２５】
別の実施形態においては、本発明の組成物又は本発明の表面露出型及び／又は表面結合
型ＧＢＳ抗原を１つ以上含む組成物の投与後に抗生物質が投与される。ＧＢＳ感染症の処
置に使用するのに好適な抗生物質の例には、ペニシリン又はその誘導体が含まれるが、こ
れらに限定されない。
【０２２６】
Ｃ．  投与法
本発明の組成物は、一般的に患者に直接投与される。本発明の組成物は、単独で又は組
成物の一部として種々の異なる径路で投与される場合がある。特定の組成物については、
より効果的な免疫反応、好ましくはＣＭＩ反応が生じるよう、或いは副作用を誘発しない
よう、或いは投与し易くなるような特定の径路が好ましい。
【０２２７】
送達法には、注射（例えば皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射、又は間質
注射）及び経直腸投与、経口投与（例えば錠剤、スプレー）、経膣投与、局所投与、経皮
投与（例えば、ＷＯ  ９９／２７９６１を参照）、経皮投与（例えば、ＷＯ０２／０７４
２４４及びＷＯ０２／０６４１６２を参照）、鼻腔内（例えばＷＯ０３／０２８７６０を
参照）、眼内、耳内及び肺内の粘膜投与が含まれる。
【０２２８】
例として、本発明の組成物は、全身的径路又は粘膜径路又は経皮的径路で投与される場
合もあれば、特定の組織に直接投与される場合がある。本明細書で使用される「全身的投
与」という用語には、非経口投与経路が含まれるが、これに限定されない。特に、非経口
投与には、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、胸骨内注射、
或いは静脈内注入、動脈内注入、或いは腎臓透析注入法が含まれるが、これらに限定され
ない。好ましくは、全身的、非経口投与は筋肉内注射である。本明細書で使用される「粘
膜投与」という用語には、経口投与、鼻内投与、膣内投与、直腸内投与、気管内投与、腸
内投与及び眼内投与が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２９】
ティーンエイジャー及び幼児・乳児を含む小児には、予防目的でワクチンを投与するこ
とができるが、治療ワクチンは一般的にティーンエイジャー又は成人に投与される。小児
用ワクチンは、例えば安全性、用量、免疫原性、等を評価するために成人に投与される場
合がある。
【０２３０】
本発明の免疫原性成分は、抗生物質治療計画と組み合わせて投与される場合がある。一
実施形態においては、本発明の組成物を投与する前に抗生物質が投与される。
【０２３１】
投与治療は、単回投与計画であっても、複数回投与計画であってもよい。複数回投与は
、一次免疫処置計画及び／又は追加免疫処置計画において使用される場合がある。複数回
投与計画においては、種々の用量を同一又は異なる径路、例えば非経口プライムと粘膜ブ
ースト、粘膜プライムと非経口ブースト等によって投与される場合がある。
【０２３２】
組成物における活性因子の量は、治療される個体の健康及び身体的状態、年齢、治療さ
れる個体の分類群（例えばヒト以外の霊長類、霊長類等）、個体の免疫システムの抗体合
成能力、必要な保護度、ワクチンの調製、治療医による病状の評価、及びその他の関連要
因によって異なる。その量は、ルーチン試験を通じて決定することができる比較的広範囲
に及ぶ。
【０２３３】
ＩＸ．  キット
本発明は、本発明の組成物又はその成分を含む１つ以上の容器からなる１つ以上のキッ
トも提供する。組成物は、組成物の個々の成分と同様に液体又は凍結乾燥にすることがで
きる。組成物に好適な容器には、例えば瓶、バイアル、シリンジ及び試験管が含まれる。
容器は、ガラス又はプラスチックを含め種々の材料からを形成することができる。容器は
、無菌のアクセスポートが付いていてもよい（例えば、容器は静脈用注射液バッグ又は皮
下注射ニードルによって貫通できるストッパーの付いたバイアルであってもよい）。
【０２３４】
キットは更に、薬学的に好ましい緩衝液、例えば燐酸塩緩衝食塩水、リンゲル液又はデ
キストロース溶液を含む第２の容器を含んでもよい。又、その他の緩衝液、賦形剤、フィ
ルター、ニードル及びシリンジを含め、エンドユーザにとって有用なその他の材料を含ん
でもよい。キットは、別の活性因子、例えば抗生物質の入った第２又は第３の容器を含ん
でもよい。
【０２３５】
キットは、Ｓ．アガラクティエに対する免疫を誘発する方法が書かれた説明書を含む添
付文書を含んでもよい。添付文書は、未公認の草案の添付文書であっても、或いは米国食
品薬品局（ＦＤＡ）又は他の規制団体によって承認された添付文書であってもよい。
【０２３６】
Ｘ．  スクリーニング法
本発明は、ＢｉｂＡに結合するか又は活性を修飾する試験化合物をスクリーニングする
ための試験を提供する。試験化合物は、好ましくは（１）コイルドコイルドメインに結合
し、ＢｉｂＡの補体、例えばＣ４結合タンパク質との相互作用又はＢｉｂＡダイマーの形
成を阻害する；或いは（ｂ）プロリンリッチドメインに結合し、ＢｉｂＡの宿主上皮細胞
への結合を阻害する；（ｃ）ＢｉｂＡのＮ末端領域に結合し、ＢｉｂＡのＩｇＡへの結合
を阻害する；或いは（ｄ）ＢｉｂＡの種々の部分に結合し、ＩｇＧのタンパク質への結合
を阻害する。試験は、本発明の全長のＢｉｂＡタンパク質又はＢｉｂＡポリペプチドを使
用して実行してもよい。
【０２３７】
Ａ．  試験化合物
試験化合物は、当該技術分野で既知の薬理作用物質であっても、或いは薬理作用も有す
ることが以前に知られていなかった化合物であってもよい。化合物は天然であっても、実
験室で設計されてもよい。これらは、微生物、動物又は植物から単離されてもよければ、
組み換えで生成されてもよく、当該技術分野で既知の化学的方法によって合成されてもよ
く、或いは当該技術分野で種々のコンビナトリアルライブラリー法（生物学的ライブラリ
ー、空間的にアドレス可能な平行固相又は液相ライブラリー、デコンボリューションを必
要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、及び親和性クロマ
トグラフィー選別を利用した合成ライブラリー法を含むが、これらに限定されない）を使
用して得てもよい。
【０２３８】
Ｂ．  試験
当該技術分野で既知の何れの方法も、試験化合物とＢｉｂＡ領域の結合の検出又はＢｉ
ｂＡ領域とその生物学的標的との結合を分離するために使用してよい。
【０２３９】
幾つかの結合試験においては、試験化合物又はＢｉｂＡタンパク質又はポリペプチドの
何れかが、検知可能なラベル、例えば蛍光、ラジオアイソトープ、化学発光又は酵素ラベ
ル、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ又はルシフ
ェラーゼを含んでもよい。このようなラベルの検出法は、当該技術分野で周知である。或
いは、反応体のどちらかを標識せずに結合を判定してもよい。例えば、ＭｃＣｏｎｎｅｌ
ｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７，  １９０６−１２，  １９９２を参照されたい。リアル
タイムの二分子相互作用分析（ＢＩＡ）（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ  ＆  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋ
ｙ，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ６３，  ２３３８−２３４５，  １９９１，  ａｎｄ  
Ｓｚａｂｏら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５，  ６９９−
７０５，  １９９５）のような技術を使用してもよい。
【０２４０】
他の実施形態において、ＢｉｂＡタンパク質又はポリペプチドは、ＢｉｂＡの種々の領
域に結合するか相互作用する他のタンパク質を特定するために２ハイブリッド試験又は３
ハイブリッド試験における「ベイトタンパク質」として使用してもよい（例えば、以下の
文献を参照：米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら、Ｃｅｌｌ  ７２，  ２
２３−２３２，  １９９３；  Ｍａｄｕｒａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８
，  １２０４６−１２０５４，  １９９３；  Ｂａｒｔｅｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ  １４，  ９２０−９２４，  １９９３；  Ｉｗａｂｕｃｈｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
８，  １６９３−１６９６，  １９９３；  及びＢｒｅｎｔ  Ｗ０９４／１０３００）
。
【０２４１】
以下の実施例に記載するような試験は、ＢｉｂＡの種々の領域とそれらの領域の生物学
的標的の間の結合が試験化合物によって阻害又は妨害されるかどうか検知するために使用
することができる。
【０２４２】
本開示内容で引用される全ての特許、特許出願及び参考文献は、全体が参考として本明
細書に明示的に組み入れらている。上記の開示内容は、本発明の概要であり、以下の特定
の実施例を参照することでより詳細に理解することができるが、これらの実施例は単に例
示を目的としたものであって、本発明の適用範囲を限定することを目的としたものではな
い。
【実施例】
【０２４３】
（実施例１）
ＢｉｂＡのダイマー形成可能性
本実施例は、ＢｉｂＡがダイマーを形成することができることを実証する。高解像度分
画法では、分子は大きい順にマトリックスの細孔から溶出する。小さな分子ほどマトリッ
クスの細孔にアクセスし易く、従ってカラムを下降する。図３Ａ及び３Ｂを参照されたい
。
【０２４４】
（実施例２）
ＢｉｂＡタンパク質の表面結合
ＧＢＳ細菌を二次的なＦＩＴＣ結合αマウスＩｇＧ抗体のみで培養した。陰性対照とし
てフロイントアジュバント（αＰＢＳ）で免疫化されたマウス血清でも細菌を処理した。
図４Ａ及び４Ｂの「α−ＰＢＳ」とラベルしたグラフは陰性対照を示す。ＢｉｂＡレベル
は、α−ＢｉｂＡ血清及び免疫前血清で処理した細胞間の蛍光の平均値の変化で表す。蛍
光の平均（Δ平均）の変化を得るため、免疫前血清で培養した細菌をα−ＢｉｂＡ血清で
処理した細菌と比較した。
【０２４５】
２６０３株、１８ＲＳ２１株及びＨ３６Ｂ株のＢｉｂＡタンパク質は表面結合を示した
が、５１５株及びＣＪＢ  １１１株は結合を示さなかった（Δ平均＝０）。図５も参照さ
れたい。
【０２４６】
（実施例３）
ＢｉｂＡタンパク質クラスター
ＧＢＳ  ５１５株（ｐＡＭ４０１−ＳＡＧ２０６３）をＴＨＢ培地（１０ｍＬ）で一晩
培養した。一晩培養物１ｍＬの細菌細胞を新鮮なＴＨＢ培地５ｍＬに再懸濁し、３７℃で
ＯＤ  ０．５（固定相）まで培養した。次に、細菌を室温、３０００ｒｐｍで１０分間遠
心分離し、洗浄後１ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。ホルムバール・カーボンコートしたニッ
ケルグリッドをＧＢＳ懸濁液の小滴に１０分間浮かべた。次に、グリッドを２％のＰＦＡ
で１５分間固定し、遮断溶液（１％の正常ウサギ血清及び１％のＢＳＡを含むＰＢＳ）に
入れた。次に、グリッドをＢｉｂＡに対する一次抗血清（ｍαＢｉｂＡ）の小滴（遮断溶
液で１：５０に希釈）に室温で３０分間浮かし、６滴の遮断溶液で洗浄後、１０ｎｍの金
粒子に結合した二次抗体（１％のＢＳＡに１：２５に希釈）に３０分間浮かべた。次に、
４滴のＰＢＳ、続いて４滴の蒸留水でグリッドを洗浄した後、空気乾燥させた。ＧＥＯＬ
１２００  ＥＸ  １１透過型電子顕微鏡を使用してグリッドを検査した。
【０２４７】
図６は、ＢｉｂＡタンパク質クラスターの存在を示す。
【０２４８】
（実施例４）
５１５  ｐＡＭ４０１株の表面におけるＢｉｂＡ発現
図７Ａに示す通り、ＢａｍＨ１及びＳａｌＩ制限部位を使用して、それ自体のプロモー
ター及びターミネーターを含むＢｉｂＡ遺伝子（ＳＡＧ２０６３）をｐＡＭ４０１ベクタ
ーにクローニングした。ＧＢＳ  ２６０３Ｖ／Ｒ株及び５１５  Ｉａ株をこの構成で形質
転換した。
【０２４９】
ＦＡＣＳ分析は、ＢｉｂＡタンパク質が高レベルで５１５（ｐＡＭ４０１−ＳＡＧ２０
６３）株表面に露出されることを示した。図７Ｂ。
【０２５０】
（実施例５）
２６０３株表面におけるＢｉｂＡ発現の増加
ＦＡＣＳ分析は、２６０３（ｐＡＭ４０１−ＳＡＧ２０６３）株表面におけるＢｉｂＡ
タンパク質の露出が２６０３  ｗｔ株に対して増大することを示した。結果を図８に示す
。
【０２５１】
（実施例６）
ＢｉｂＡの分泌された形態
ＧＢＳタンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に移
した。次に、タンパク質をマウスα−ＢｉｂＡポリクローナル抗体でオーバーレイし、Ｈ
ＲＰ結合二次抗体で染色した。図１０に示す通り、ＢｉｂＡ  ５１５株及びＣＪＢ１１１
株の分離では、培養液上清（分泌されたタンパク質分画）においてのみＢｉｂＡタンパク
質が見られた。これは、ＢｉｂＡ  ５１５株及びＣＪＢ１１１株においてプロリンリッチ
モチーフを欠くＢｉｂＡタンパク質の短縮形態が分泌物中に発現されることを実証する。
図１０を参照されたい。
【０２５２】
（実施例７）
ＢｉｂＡのＣ４結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）への結合
組み換えＢｉｂＡタンパク質をニトロセルロース膜上で乾燥させ、組み換えｃ４結合タ
ンパク質で培養した。次に、マウスａ−Ｃ４ＢＰモノクローナル抗体を使用して結合タン
パク質を検出し、ＨＲＰ結合抗体で染色した。図１１Ａは、異なる濃度のＢｉｂＡタンパ
ク質をＨＲＰ結合抗体で染色したドットブロットであるが、ＢｉｂＡがＣ４結合タンパク
質に結合することを実証している。
【０２５３】
組み換えＢｉｂＡタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜
上にブロットした後、組み換えＣ４結合タンパク質で培養した。次に、マウスａ−Ｃ４Ｂ
Ｐモノクローナル抗体を使用して結合タンパク質を検出し、ＨＲＰ結合抗体で染色した。
図１１Ｂは、ＢｉｂＡがＣ４結合タンパク質に結合することを確証するウェスタンブロッ
トを示す。
【０２５４】
（実施例８）
ＢｉｂＡタンパク質の上皮細胞表面への結合
ＢｉｂＡタンパク質の存在下及び非存在下でＭＥ１８０頚部細胞を培養し、次にマウス
α−ＢｉｂＡポリクローナル抗体を添加した。次に、ＭＥ１８０頚部細胞をＦＩＴＣ結合
αマウスＩｇＧ二次抗体で染色した。ＭＥ  １８０頚部細胞をＦＩＴＣ結合αマウスＩｇ
Ｇ二次抗体のみで（即ちマウスα−ＢｉｂＡポリクローナル抗体の非存在下で）処理する
ことによって陽性対照を得た。分析をＣａｃｏ２腸細胞、Ａ５４９肺胞細胞及び１６ＨＢ
Ｅ１４０の気管支細胞で繰り返した。陰性対照として、ＢｉｂＡと同様にクローニングし
たＧＢＳ７タンパク質を使用した。
【０２５５】
Ｄｍｅａｎチャンネル値で表したＢｉｂＡ結合を、ＢｉｂＡの存在下及び非存在下で培
養した細胞間の蛍光強度の差としてＦＡＣＳｃａｎ血球計算器によって測定した。結果を
図１２に示す。「二次抗体のみ」の領域は、ＦＩＴＣ結合抗体でのみで処理された細胞を
示す。Ｄｍｅａｎチャンネル値で表したＢｉｂＡ結合を、ＢｉｂＡの存在下及び非存在下
で培養した細胞間の蛍光強度の差としてＦＡＣＳｃａｎ血球計算器によって測定した。陰
性対照として、ＢｉｂＡと同様にクローニングしたＧＢＳ７タンパク質を使用した。
【０２５６】
（実施例９）
プロリンリッチモチーフによるＢｉｂＡの上皮細胞表面への結合
ビオチニル化ＢｉｂＡタンパク質又はビオチニル化ＢｉｂＡ断片の存在下で上皮細胞を
培養し、次にＦＩＴＣ結合ストレプトアビジンで染色した。紫の領域は、ＦＩＴＣ結合ス
トレプトアビジンのみで処理した細胞を示す。δ平均チャンネル値として表したＢｉｂＡ
結合を、タンパク質の存在下及び非存在下で培養した細胞間の蛍光強度の差としてＦＡＣ
Ｓｃａｎ血球計算器によって測定した。
【０２５７】
結果を図１３に示す。これらの結果は、ＢｉｂＡがプロリンリッチモチーフによって上
皮細胞表面に結合することを実証する。図２５Ａ及び２５Ｂ、図２６も参照されたい。
【０２５８】
（実施例１０）
精製ヒトＩｇＧのＢｉｂＡタンパク質への結合
精製したＧＢＳ３−Ｈｉｓ、ＧＢＳ３Ｎｔ〜Ｈｉｓ（Ｎｔ）、ＧＢＳ３−Ｎｔ１−Ｈｉ
ｓ（Ｎｔ１）、ＧＢＳ３−Ｔ−Ｈｉｓ（Ｔ）、ＧＢＳ３−Ｃｔ−Ｈｉｓ（Ｃｔ）、ＧＢＳ
Ｍタンパク質（Ｍ１）（陽性対照）及びＧＢＳ  １０４（陰性対照）をＳＤＳ−４％−
１２％ＰＡＧＥゲル（２００Ｖ）で分離し、ニトロセルロース膜（３５Ｖ、１時間、１５
分）に移した。ニトロセルロース膜を５％Ｍｉｌｋ−ＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０
（ＰＢＳ−Ｔ）を使用してＲＴで１時間遮断し、ＰＢＳ−Ｔ内でＲＴで１時間免疫グロブ
リン（ヒトＩｇＡ又はヒトＩｇＧ）でオーバーレイした。膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、
５％Ｍｉｌｋ−ＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０において二次ＨＲＰ結合抗体（１：１
０００）でオーバーレイした後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ＥＣＬＴＭ基質を使用して
、免疫グロブリンへの陽性結合を検出した。
【０２５９】
結果を図１４に示す。結果は、全長のタンパク質及びタンパク質断片が異なる親和性で
ヒトＩｇＧに結合することを実証する。
【０２６０】
（実施例１１）
ヒト及びウサギＩｇＧに対するＢｉｂＡ−Ｈｉｓの特異性
ＢｉｂＡ−ＨｉｓをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、次にニトロセルロース膜に移した。遮
断後に、膜を異なる種の血清で培養し、次にＨＲＰ結合抗ＩｇＧ抗体で標識した。比色定
量キットでタンパク質を明らかにした。
【０２６１】
結果を図１７及び表１に示す。これらの結果は、ＢｉｂＡ−Ｈｉｓがヒト及びウサギＩ
ｇＧに対して特異的であり、マウスＩｇＧを結合しないことを実証する。
【０２６２】
（実施例１２）
精製ヒトＩｇＡのＢｉｂＡタンパク質への結合
精製したＢｉｂＡ−Ｈｉｓ、ＢｉｂＡ−Ｎｔ−Ｈｉｓ（Ｎｔ）、ＢｉｂＡ−Ｎｔ１−Ｈ
ｉｓ（Ｎｔ１）、ＢｉｂＡ−Ｔ−Ｈｉｓ（Ｔ）、ＢｉｂＡ−Ｃｔ−Ｈｉｓ（Ｃｔ）、ＧＢ
Ｓ  Ｍタンパク質（Ｍ１）（陽性対照）及びＧＢＳ１０４（陰性対照）をＳＤＳ−４％−
１２％ＰＡＧＥゲル（２００Ｖ）で分離し、ニトロセルロース膜（３５Ｖ、１時間、１５
分）に移した。ニトロセルロース膜を５％Ｍｉｌｋ−ＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２
０（ＰＢＳ−Ｔ）を使用してＲＴで１時間遮断し、ＰＢＳ−Ｔ内で結合したヒト−ＩｇＡ
ＨＲＰを使用してＲＴで１時間オーバーレイした。膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ＥＣ
ＬＴＭ基質を使用して、免疫グロブリンへの陽性結合を検出した。膜を５％Ｍｉｌｋ−Ｐ
ＢＳ−Ｔを使用してＲＴで１時間培養することによってタンパク質を遮断した。膜をＰＢ
Ｓ−Ｔ内でヒトＩｇＧＨＲＰ（５μｇ／ｍＬ）を使用して１．５時間培養し、次にＰＢＳ
−Ｔで３回洗浄した。ＥＣＬＴＭ基質（ＰＩＥＲＣＥキット：  ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ
Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質）及び４−ＣＮキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用して
、免疫グロブリンへの陽性結合を検出した。
【０２６３】
天然のＢｉｂＡタンパク質及びＢｉｂＡの一部をドットブロットによって検査した。
【０２６４】
結果を図１５及び表２に示す。これらの結果は、ＢｉｂＡのＮ末端部が精製ヒトＩｇＡ
に結合することを実証する。
【０２６５】
ＢｉｂＡ−Ｈｉｓ及びＢｉｂＡ断片をトリプシンで１５分間消化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルで分離した。ｈ−ＩｇＡＨＲＰ（１ｍＬ／ｍＬ）をニトロセルロース膜に移すタンパ
ク質にオーバーレイした。結果を図１６に示す。トリプシンによる消化は、まだｈ−Ｉｇ
Ａに結合する３２ｋＤａの断片を生成する。
【０２６６】
２６０３−ＢｉｂＡ過剰発現突然変異株の表面に結合するヒト−ＩｇＡＦＩＴＣを図９
に示す。ＦＡＣＳ分析は、ＢｉｂＡ過剰発現突然変異株の表面に結合するＩｇＡの増加を
明らかにした。
【０２６７】
（実施例１３）
ＢｉｂＡタンパク質の完全型又は短縮型の生成
ＢｉｂＡタンパク質の完全型又は短縮型をコードするプラスミドを以下のように構築し
た。２６０３ゲノムをテンプレートとして使用して、ＢｉｂＡ領域をＰＣＲによって増幅
した。使用したオリゴヌクレオチドプライマーを表１に示す。順方向プライマーは全てＮ
ｄｅＩ制限部位を含んでいた。逆方向プライマーは全てＸｈｏＩ制限部位を含んでいた。
ＰＣＲ生成物は、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化され、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限ｐＥＴ２
１ｂ（＋）でゲル精製及び連結された。全構成は、ＤＮＡ塩基配列決定によって確認され
た。組換え型タンパク質は、発現されたＨｉｓ−ｔａｇタンパク質であった。
【０２６８】
ＧＢＳ３−Ｈｉｓは、ＢｉｂＡ（ＧＢＳ３）の完全型である。
【０２６９】
ＧＢＳ３−Ｎｔ−Ｈｉｓは、ＢｉｂＡのコイルドコイルドメインである。
【０２７０】
ＧＢＳ３−Ｎｔ１−Ｈｉｓは、最初の１８０  ａａのないコイルドコイルドメインであ
る。
【０２７１】
ＧＢＳ３〜Ｃｔ−Ｈｉｓは、ＢｉｂＡのプロリンリッチドメインである。
【０２７２】
ＧＢＳ３−Ｎｔ３−Ｈｉｓは、プロリンリッチドメイン及びコイルドコイルドメインの
一部を含んでいた。
【０２７３】
ＧＢＳ３−Ｔ−Ｈｉｓは最初の１８０  ａａを含んでいた。
【０２７４】
ＧＢＳ３−Ｈｉｓ
３４ａａ〜６０９ａａ
【０２７５】
【化１５】
2012105659.tif 000016
ヌクレオチド配列（配列番号２２）
【０２７６】
【化１６】
2012105659.tif 000017
【０２７７】
【化１７】
2012105659.tif 000018
【０２７８】
【化１８】
2012105659.tif 000019
【０２７９】
【化１９】
2012105659.tif 000020
【０２８０】
【化２０】
2012105659.tif 000021
【０２８１】
【化２１】
2012105659.tif 000022
（実施例１４）
実験手順
細胞の培養
ヒト頚部上皮細胞株ＭＥ  １８０を米国菌株保存機関（ＡＴＣＣ；米国メリーランド州
ロックヴィル）から購入した。ＭＥ１８０細胞を熱不活性化したウシ胎児血清（ＦＢＳ）
１０％が入ったＲＰＭＩ  １６４０培地において培養した。肺癌細胞株Ａ５４９（ＩＩ型
肺胞上皮細胞）及び結腸癌上皮細胞株Ｃａｃｏ２もＡＴＣＣから購入し、１０％のＦＢＳ
、４．５ｇ／Ｌのグルコース及び非必須アミノ酸を添加したＤＭＥＭにおいて培養した。
ＳＶ４０ラージＴ抗原で形質転換したヒト気管支上皮細胞株１６ＨＢＥ  １４（Ｇｒｉｆ
ａｎｔｉｎｉら、２００２）を、１０％のＦＢＳ、１．５ｍＭのグルタミン及び１００μ
ｇ／ｍＬの硫酸カナマイシンを添加したＤＭＥＭにおいて培養した。
【０２８２】
菌株及び増殖条件
本研究では、Ｓ．アガラクティエ２６０３Ｖ／Ｒ株及び５１５  Ｉａ株を使用した。Ｂ
ｉｂＡタンパク質保存を判定するために、Ｓ．アガラクティエ株のパネルを分析した。大
腸菌ＤＨ５α及びＤＨ１０ＢＴ１をクローン目的に、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をＢｉｂ
Ａ融合タンパク質の発現用に使用した。Ｓ．アガラクティエを３７℃のトッド・ヒューウ
ィット培地（ＴＨＢ）においてＯＤ６００  ０．４まで増殖した。プラスミドｐＡＭ４０
１ｂｉｂＡを有するＳ．アガラクティエ株をクロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）の
存在下で培養した。大腸菌は、ルリア培地において培養した。プラスミドｐＡＭ４０１ｂ
ｉｂＡ、ｐＪＲＳ２３３ΔｂｉｂＡ又はｐＥＴ２１（ｂ）＋誘導体を有する大腸菌クロー
ンをクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）、エリスロマイシン（４００μｇ／ｍＬ）
又はそれぞれアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）の存在下で培養した。
【０２８３】
２６０３  Ｖ／Ｒ  ＢｉｂＡ欠損変異株の構築
Ｌａｕｅｒら、２００５に記載されている手順に従ってＢｉｂＡ遺伝子をＳ．アガラク
ティエ２６０３Ｖ／Ｒ株から除去した。プライマー
【０２８４】
【化２２】
2012105659.tif 000023
を使用して、スプライシングオーバーラップ伸長（ＳＯＥ）ＰＣＲ法によりインフレーム
欠失断片を得た。この断片をＸｈｏＩ消化ｐＪＲＳ２３３プラスミドにクローニングする
ため、ＸｈｏＩ制限酵素開裂部位をプライマーの５’末端（太字イタリック体）に組み込
んだ。インフレーム欠失断片をｐＪＲＳ２３３にクローニングした後、プラスミドｐＪＲ
Ｓ２３３ΔｂｉｂＡを得た。
【０２８５】
次に、電気穿孔法によってプラスミドｐＪＲＳ２３３ΔｂｉｂＡを２６０３Ｖ／Ｒ株に
形質転換し、１μｇ／ｍＬエリスロマイシンを含む３０℃の寒天プレートにおいて培養後
に形質転換細胞を選択した。次に、Ｍａｇｕｉｎら、１９９６の記載に従って、形質転換
細胞を３７℃のエリスロマイシン選択で培養した。組み込み株をエリスロマイシン選択の
ない３０℃の液体培地において５日間連続して継代培養してプラスミドｐＪＲＳ２３３Δ
ｂｉｂＡの除去を促進させ、染色体上のＢｉｂＡを欠失させた。連続継代培養物の希釈液
を寒天プレートに塗布し、ｐＪＲＳ２３３ΔｂｉｂＡの除去を確認するため単一コロニー
のエリスロマイシン感受性を試験した。
【０２８６】
Ｓ．アガラクティエにおけるＢｉｂＡのプラスミドを介した発現
それ自体のプロモーター及びターミネーターを含むＢｉｂＡ遺伝子を、プライマー
【０２８７】
【化２３】
2012105659.tif 000024
を使用して、ＰＣＲ法によってＳ．アガラクティエ２６０３Ｖ／Ｒ株の染色体ＤＮＡから
増幅した。ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ消化大腸菌ストレプトコッカスｐＡＭ４
０１発現コンストラクトにクローニングするため、制限酵素開裂部位ＢａｍＨＩ及びＳａ
ｌＩをプライマーの５’末端（太字のイタリック体）に組み込んだ。ＢｉｂＡ遺伝子をｐ
ＡＭ４０１にクローニングすることによってプラスミドｐＡＭ４０１ｂｉｂＡを得た。電
気穿孔法によりプラスミドｐＡＭ４０１ｂｉｂＡを以下のクロラムフェニコール選択で２
６０３Ｖ／Ｒ株及び５１５  Ｉ株に転換した。
【０２８８】
ＢｉｂＡ組換え型タンパク質の発現及び精製
ＢｉｂＡの組み換え型を発現するため、テンプレートとしてＳ．アガラクティエ２６０
３株のＢｉｂＡ遺伝子のオープンリーディングフレームを使用した。以下のＮｄｅＩ及び
ＸｈｏＩの制限酵素部位を導入した特定のプライマーを使用したＰＣＲによってコンスト
ラクトを増幅した：
５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＡＣＧＣＧＧＡＴＡＣＴＡＧＴＴＣＡＧＧＡ−３’
（配列番号５０）、及び
５’−ＣＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＧＣＴＡＡＧＡＧＴＧＧＡＣＴＴＧＣ−３’（配列
番号５１）。
【０２８９】
ＢｉｂＡ  Ｎ末端コンストラクト（ａａ  ３４−３９４）の場合には、以下の増幅プラ
イマーを使用した：
５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＡＣＧＣＧＧＡＴＡＣＴＡＧＴＴＣＡＧＧＡ−３’
（配列番号５２）、及び
５’−ＣＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＡＡＧＧＴＣＴＴＧＡＡ−３’（配列番
号５３）。
【０２９０】
ＢｉｂＡ  Ｃ末端コンストラクト（ａａ  ３８９−６２２）については、以下のプライ
マーを使用した：
５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＣＡＧＡＣＣＴＴＡＣＣＡＧＡＧＧＴ−３’（配列
番号５４）、及び
５’−ＣＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＴＡＡＴＡＡＧＡＣＣＴＧＣＡＣＴＴ−３’（配列番号
５５）。
【０２９１】
ＰＣＲ生成物をｐＥＴ２１（ｂ）＋ベクターにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ
３）細胞を転換するために使用した。ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をＬＢ−Ａｍｐ（１００の
μｇ／ｍＬのアンピシリン）で培養し、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧで３時間誘導した。得
られたバイオマスを０．３ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａ−ＰＯ４緩衝液（ｐＨ  ８．０
）に懸濁し、ベーシックＺモデル細胞破砕機（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ［英国
ダベントリー］）を使用して１８，０００ｐｓｉで細胞を２代まで溶解した。次に、サン
プルを５ｍＬ／ｍｉｎの流量でＨｉｓ−Ｔｒａｐ  Ｎｉ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄキレーティ
ングセファロースＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ［イタリア  
ミラノ］）に投入した。次に、５００ｍＭのイミダゾール、０．３ＭのＮａＣｌ、５０ｍ
Ｍ  のＮａリン酸塩緩衝液（１２  ＣＶにおいてｐＨ  ８．０）の０〜５０％の勾配を通
すことによって結合タンパク質をカラムから溶出した。ＩＭＡＣ（固定化金属アフィニテ
ィカラム）に溶出した物質を２．５ｍＬ画分に収集し、ＢｉｂＡ−Ｈｉｓタンパク質を含
む画分をプールした。次に、収集したプールをＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄ
ｅｘ  ２００ゲル濾過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ［イタリア  
ミラノ］）に投入した。タンパク質を２．５ｍＬ／分の流量で均一濃度溶出し、２．５ｍ
Ｌの画分を収集した。
【０２９２】
細菌抽出物
細菌をＯＤ６００  ０．４まで増殖し、ＧＢＳタンパク質抽出物を調製した。得られた
ペレットをＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤及びムタノリシン４００  Ｕ／ｍＬ（Ｓ
ＩＧＭＡ［米国モンタナ州］）を含む３７℃のトリス塩酸５ＯｍＭ（ｐＨ６．８）５００
μＬにおいて１時間培養した。次に、細菌懸濁液をペレットにし、ペプチドグリカン結合
タンパク質を含む上清を使用してＢｉｂＡのウェスタンブロット分析を行った。分泌され
たタンパク質分画を含むＧＢＳ抽出物を調製するため、ＯＤ６００  ０．４まで増殖した
細菌培養物の上清を収集し、ＰＡＧＥにおいて直接使用した。
【０２９３】
蛍光標示式細胞分取器分析
細菌表面におけるＢｉｂＡの露出を定量化するため、ＧＢＳをＯＤ６００  ０．４まで
増殖し、０．１％のＢＳＡと２０％の正常子ウシ血清（ＮＣＳ）を加えた４℃のウサギ抗
ＢｉｂＡ血清又はウサギ抗ＰＢＳ血清（陰性対照）において１時間培養した。次に、細菌
を０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄し、４℃のフィコエリトリン（ＰＥ）結合二次抗
体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ［米国ペンシルベニア州］）にお
いて４５分培養した。洗浄後、２％のＰＦＡにてＲＴで２０分細菌を固定、２００μＬの
ＰＢＳに再懸濁して、ＦＡＣＳｓｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ）によってＢｅｃｔｏｎ  ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフト
ウェアプログラムを使用して分析した。
【０２９４】
結合試験において、ＭＥ１８０又はＡ５４９細胞を異なる濃度のＢｉｂＡと混合し、４
℃で１時間培養した。次に、細胞を５％のＦＣＳ中のウサギ抗ＢｉｂＡ血清で、４℃で４
５分培養した。次に、細胞をＰＢＳで２度洗浄し、４℃のＰＥ結合二次抗体で４５分培養
した。細胞結合蛍光を、細胞探究プログラムを使用してＦＡＣＳで分析した。タンパク質
の存在下又は非存在下で培養した細胞のＭＦＩ値を比較した。
【０２９５】
結合試験
２００μＬに２％のＦＢＳを加えた感染培地（抗生物質を含まない基本培地）において
、ＭＥ１８０及びＡ５４９上皮細胞を約１０細菌／細胞で感染させた。５％のＣＯ２（ｖ
／ｖ）における３７℃で３時間の培養終了時に、ウェル内容物に１％のサポニンを添加後
に総コロニー形成単位（ｃ．ｆ．ｕ）を推定した。試験中に存在する総ｃ．ｆ．ｕに対す
る細胞内ｃ．ｆ．ｕの割合の決定により粘着性を定量化した。
【０２９６】
免疫金ラベル及び電子顕微鏡
ＧＢＳ株２６０３Ｖ／Ｒ、２６０３ΔｂｉｂＡ、５１５  Ｉａ及び５１５ｐＡＭ４０１
ｂｉｂＡをＴＨＢ培地（１０ｍＬ）にて一晩培養した。一晩培養物１ｍＬの細菌細胞を新
鮮なＴＨＢ培地５ｍＬに再懸濁し、３７℃でＯＤ  ０．３（指数増殖期）まで増殖した。
次に、細菌を３０００ｒｐｍ（ＲＴ）で１０分間遠心分離し、洗浄後、１ｍＬのＰＢＳに
再懸濁した。ホルムバール・カーボンコートしたニッケルグリッドをＧＢＳ懸濁液の小滴
に５分間浮かべた。次に、グリッドを２％のＰＦＡにおいて５分間固定し、遮断溶液（１
％の正常ウサギ血清及び１％のＢＳＡを含むＰＢＳ）に３０分浸した。次に、遮断溶液に
おいてグリッドをＢｉｂＡタンパク質に対して１：２０に希釈した一次抗血清の小滴にＲ
Ｔで３０分浮かべ、６滴の遮断溶液で洗浄し、１％のＢＳＡにおいて１：１０に希釈した
１０ｎｍの金粒子に結合した二次抗体に３０分浮かべた。ＴＥＭ  ＧＥＯＬ  １２００Ｅ
Ｘ  ＩＩ透過型電子顕微鏡を使用して、グリッドを検査した。
【０２９７】
共焦点免疫蛍光顕微鏡
Ａ５４９細胞を１０％のＦＢＳ、４．５ｇ／Ｌのグルコース及び非必須アミノ酸を加え
た１ｍＬのＤＭＥＭにおけるＬａｂ−ＴｅｋＩＩチャンバースライドシステム（Ｎａｌｇ
ｅｎｅ）において密集するまで増殖させた。次に、細胞をＭＯＩ  １０：１で細菌に感染
させ、３７℃で２時間培養した。次に、細胞を２％のパラホルムアルデヒドにおいて室温
（ＲＴ）で３０分又は４℃で一晩固定した。固定後、単一層を３％のＢＳＡで遮断し、１
％のＢＳＡに希釈したマウス抗カプセル及びウサギ抗ＢｉｂＡポリクローナル抗体の混合
物と共にＲＴで１時間培養した。次に、細菌をヤギ抗マウス及び抗ウサギのＡｌｅｘａ  
ｆｌｕｏｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）結合抗体（それぞれ５６８ｎｍ及び４
８８ｎｍで励起）によりＲＴで１時間染色した。Ｆ−アクチンをＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ
６２２結合ファロイジンで染色した。次に、スライド・グラスからチャンバー壁を除去
した。スローフェード試薬キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用してカバ
ーグラスを載せた。Ｂｉｏ−Ｒａｄ共焦点走査型顕微鏡を使用してスライドを観察した。
【０２９８】
ドットブロット及びウェスタンブロット分析
ドットブロット分析において、ＢＩＯＲＡＤドットブロットシステムを使用して精製し
た組み換えＢｉｂＡタンパク質（範囲約２〜０．０１μｇ）をニトロセルロース膜に吸収
させた。５％のミルクで飽和後、膜を０．５μｇ／ｍＬの血清精製ヒトＩｇＡ（Ｐｉｅｒ
ｃｅ）又はヒトＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ）で培養した。洗浄後、膜をＨＲＰ結合ウサギ抗ヒト
ＩｇＡ（Ｄａｋｏ）或いはＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＢＤ）で培養し、ＥＣＬによっ
て陽性結合を検出した。
【０２９９】
ＢｉｂＡのＣ４ＢＰへの結合を試験するため同じプロトコルを使用した。ヒトクエン酸
血漿から得た精製Ｃ４ＢＰをＫｏｒｄｉａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（オランダ  ライ
デン）から購入した。ＢｉｂＡのＣ４ＢＰへの結合を明らかにするために、マウスモノク
ローナル抗Ｃ４ＢＰ抗体（ＢＩＯＴＲＥＮＤ  Ｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ［ドイツ  ケルン
］）を使用した。
【０３００】
ニトロセルロース膜（Ｐｏｒｔｒａｎ）にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離タンパク質を移すこと
によって、ＢｉｂＡのＩｇ又はＣ４ＢＰへの結合のウェスタンブロット分析を行った。次
に、膜を５％のミルクにおいて遮断し、５μｇ／ｍＬの（ａ）正常ヒト血清から精製した
ＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ）、（ｂ）正常マウス血清から精製したＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ）ｃ）ウ
シ血清から精製したＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ）、ｄ）ヒト血清から精製したＩｇＡ（Ｐｉｅｒ
ｃｅ）、（ｅ）ヒト初乳から精製したＩｇＡ（ＳＩＧＭＡ）、或いは（ｆ）ヒト血漿Ｃ４
ＢＰ（Ｋｏｒｄｉａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ［オランダ］）で１時間オーバーレイし
た。洗浄後、膜をそれぞれのＨＲＰ結合二次抗体で培養し、ＥＣＬにて検出を行った。
【０３０１】
配列分析
ＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４）を使用して、２６０３Ｖ／Ｒ株（
ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿６８９０４９；配列番号５６）、１８ＲＳ２１株（ＡＡＪ
Ｏ００００００００；配列番号５７）、５１５  Ｉａ株（ＡＡＪＰ００００００００；配
列番号５８）、ＮＥＭ３１６株（ＮＰ＿７３６４５１；配列番号５９）、Ｈ３６Ｂ株（Ａ
ＡＪＳ００００００Ｏ０；配列番号６０）、ＣＪＢ１１１株（ＡＡＪＱ００００００００
；配列番号６１）、Ａ９０９株（ＹＰ＿３３０５９３；配列番号６２；配列番号６７も参
照）及びＣＯＨ１株（ＡＡＪＲ００００００００；配列番号６３）のアライメントを行っ
た。
【０３０２】
（実施例１５）
ＢｉｂＡがＧＢＳ表面に露出されることを示す追加の証拠
図１９Ａに示す通り、指数増殖期（ＯＤ６００＝０．３５）で増殖した２６０３Ｖ／Ｒ
株のＦＡＣＳ分析は、抗ＢｉｂＡ抗体染色後の細菌蛍光の変化を明らかにした。これは、
ＢｉｂＡがＧＢＳ表面に暴露されることを示した。この結果は、２６０３Ｖ／Ｒ表面上の
ＢｉｂＡの陽性免疫金ラベルを示す透過型免疫電子顕微鏡（ＩＥＭ）によって更に確認さ
れた（図１９Ｂ）。２６０３Ｖ／Ｒの細菌抽出物のウェスタンブロット分析は、ペプチド
グリカン結合タンパク分画及び細菌上清の両方において抗ＢｉｂＡ抗体によって認識され
た単一バンドの存在を示した（図１９Ｃ）。ＢｉｂＡとして同定されたバンドは、予想で
は６６ｋＤＭＷであるのに対して見かけ上は約８０ｋＤｍＷであった（図１９Ｃ）。Ｂｉ
ｂＡのＣ末端領域のプロリンリッチモチーフの存在は、このような差によるものと考えら
れる。実際、プロリンリッチドメインがタンパク質の電気泳動の移動を遅らせることが分
かっている（Ｈｏｌｌｉｎｇｓｈｅａｄら、１９８６）。指数増殖期又は定常期で増殖し
た細菌の比較分析は、表面露出又は分泌タンパク質としてのＢｉｂＡの発現の差を示さな
かった（データ非表示）。予想通り、ＢｉｂＡノックアウト突然変異株は、ＢｉｂＡ  Ｆ
ＡＣＳ陽性蛍光又は免疫金表面標識を示さなかった（図１９Ｄ及び１９Ｅ）。
【０３０３】
ＢｉｂＡの細胞壁への固着がＬＰＸＴＧ（配列番号３）モチーフの存在によることを実
証するため、フレームシフトによりタンパク質がＬＰＸＴＧ（配列番号３）モチーフを欠
き、従って短縮型で発現されると予測される５１５  Ｉａ株におけるＢｉｂＡの表面露出
を調べた（Ｔｅｔｔｅｌｉｎら、２００５）。ＦＡＣＳ分析及びＩＥＭは何れも、このよ
うな株では、ＢｉｂＡは表面に露出されなかったことを立証した（図１９Ｅ及び１９Ｆ）
。更に、ウェスタンブロット分析は、ＢｉｂＡが５１５  Ｉａの細菌上清において見られ
るが、ペプチドグリカン結合画分では見られないことを示した（図１９Ｇ）。見かけの分
子量３８ｋＤは、予測された短縮型と一致している。ＢｉｂＡ遺伝子及びその調節要素（
ｐＡＭ４０１ｂｉｂＡ）を含む２６０３Ｖ／Ｒ領域を有するプラスミドを５１５  Ｉａ株
に導入した場合、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ及びＩＥＭ分析によって実証されたよう
にＢｉｂＡは転座、細菌表面に固定された（図１９Ｈ、１９Ｉ及び１９Ｌ）。
【０３０４】
（実施例１６）
ＢｉｂＡのヒト免疫グロブリンへの特異的結合
ＢｉｂＡの配列分析がストレプトコッカスの免疫グロブリン結合タンパク質との類似性
を示したため、精製した血清由来免疫グロブリン（Ｉｇ）でオーバーレイした組み換えＢ
ｉｂＡのウェスタンブロット分析を行った。実験的な陽性対照は、ＩｇＧ及びＩｇＡ結合
タンパク質であるＧＢＳのＭ１タンパク質であった（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，  ２０００
）。最近報告されたＧＢＳ線毛成分のタンパク質ＧＢＳ  １０４  （Ｌａｕｅｒら、２０
０５）を無関係な陰性対照として使用した。図２０Ａに示す通り、ＢｉｂＡは精製ヒト血
清ＩｇＧに特異的に結合するがマウス又はウシＩｇＧには結合しない。一方、Ｍ１タンパ
ク質はヒト、マウス及びウシＩｇＧアイソフォームと同レベルで反応した。
【０３０５】
又、精製されたヒト血清又は分泌性初乳に由来するＩｇＡへのＢｉｂＡ結合も試験され
た。Ｍ１タンパク質については、ＢｉｂＡは血清由来ＩｇＡ及び分泌型ＩｇＡの両方を明
確に認識する（図２０Ｂ）。結合特性がゲル変性条件によらないことを実証するため、固
有のドットブロット実験を行った。組み換えＢｉｂＡタンパク質をニトロセルロース膜上
で連続して希釈し、０．５μｇ／ｍＬの精製ヒト血清ＩｇＧ及びＩｇＡで調べた。図２０
Ｃ及び２０Ｄに示す通り、天然ＢｉｂＡのＩｇによるプロービングはヒトＩｇＧ及びＩｇ
Ａへの結合を立証した。ヒトＩｇＡに対するＢｉｂＡの反応性はヒトＩｇＧより強いこと
が示された。実際、ＩｇＡへの陽性結合は既に０．４μｇのＢｉｂＡ濃度で観察されたが
、ＩｇＧでは結合に必要なＢｉｂＡ濃度は１．０μｇであった（図２０Ｄ）。一方、Ｂｉ
ｂＡへの強い結合はＩｇＧでのみ検出された（図２０Ｃ）。
【０３０６】
Ｉｇに対するＢｉｂＡの結合領域を明らかにするため、ＢｉｂＡのＮ末端部分（ａａ  
３４−３９４）又はＣ末端部分（ａａ  ４００−６００）を含む２つのコンストラクトを
生成した。オーバーレイ免疫ブロット試験により、これら２つのＢｉｂＡコンストラクト
のヒトＩｇＧ及びＩｇＡへの結合について試験した。図２０Ｅに示す通り、ヒトＩｇＧに
結合するＢｉｂＡは主にタンパク質のＮ末端領域に存在するが、Ｃ末端部分が関与する結
合も観察された。一方、ヒトＩｇＡへの結合は専らＢｉｂＡのＮ末端部分が関与した（図
２０Ｆ）。
【０３０７】
（実施例１７）
ＢｉｂＡのヒト補体制御因子Ｃ４ｂｐへの結合
ＢｉｂＡ及びＭタンパク質の両方がヒトＩｇＡに結合するため、以前に記載された（Ｃ
ａｒｌｓｓｏｎら、２００３）Ｍタンパク質がＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）と結合
する能力がＢｉｂＡにもあるか調べた。変性条件及び非変性条件の両方において、Ｃ４ｂ
ｐオーバーレイブロットによってＢｉｂＡ結合活性を試験した。図２１に示す通り、ＳＤ
Ｓ−ゲル電気泳動で分離した組み換えＢｉｂＡ（図２１Ａ）或いはニトロセルロース膜上
に天然型で点在した組み換えＢｉｂＡ（図２１Ｂ）は、５μｇ／ｍＬでＣ４ｂｐオーバー
レイと高度に反応する。Ｍ１も両条件において同様にＣ４ｂｐに結合したが、２６０３Ｖ
／Ｒゲノムから無作為選択した陰性対照タンパク質（ＧＢＳ２０１）は結合しなかった。
興味深いことに、ＢｉｂＡは、補体活性化第２経路制御Ｈ因子に対して結合を示さなかっ
た。ＢｉｂＡのＮ末端及びＣ末端コンストラクトをＣ４ｂｐ結合についても試験した。図
２１Ｃに示す通り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離ＢｉｂＡのオーバーレイブロットは、タンパク
質のＮ末端領域がＣ４ｂｐに特異的に結合するのに十分であることを示した。Ｃ末端部分
では、結合が見られなかった。
【０３０８】
（実施例１８）
ＢｉｂＡ組換え型タンパク質の上皮細胞への結合
ＢｉｂＡがコイルドコイルドメインを形成する傾向のコンピュータシミュレーションに
よる予測は、接着型表現型を示唆した。最初に２６０３Ｖ／Ｒ株に発現された組み換えＢ
ｉｂＡのＭＥ  １８０頚部上皮細胞に結合する能力を試験した。異なる濃度の組換え型タ
ンパク質で細胞を、４℃で１時間培養してＢｉｂＡ結合を行った。組み換えＢｉｂＡを免
疫原として得たウサギポリクローナル血清を一次抗体として使用し、結合をＲフィコエリ
トリン結合二次抗体によって検出した。抗体非特異的結合を決定するために、タンパク質
の非存在下で一次ポリクローナル抗体により細胞を培養した。ＢｉｂＡの濃度を増加した
ＭＥ  １８０細胞の培養後、ＢｉｂＡの結合は約５μｇ／ｍＬ濃度でプラトーに達するこ
とを発見した。
【０３０９】
図２２Ａに示す通り、ＢｉｂＡのＭＥ１８０細胞への結合が飽和する可能性があるため
、遊離ＢｉｂＡ濃度に対するＢｉｂＡ受容体複合体の蛍光強度の平均値をプロットするこ
とによって組み換えＢｉｂＡの推定受容体に対する親和性を評価した（図２２Ｂ）。次に
、Ｋｄ値を細胞上の推定受容体の５０％の飽和を決定するＢｉｂＡ濃度として計算し、約
４×１０−８Ｍのレベルと評価した。組み換えＢｉｂＡの腸（Ｃａｃｏ２）、肺（Ａ５４
９）及び気管支（１６ＨＢＥ）上皮細胞株への結合も試験した。これらの細胞を１０μｇ
／ｍＬの組み換えＢｉｂＡにおいて培養した場合、偏移強度が細胞型によって異なっても
、ＢｉｂＡ−受容体複合体の蛍光の平均値は有意に増加した（図２２Ｃ）。
【０３１０】
（実施例１９）
ＧＢＳの上皮細胞への付着におけるＢｉｂＡの関与
組み換えＢｉｂＡの付着性が上皮細胞との相互作用における機能的役割に関係すること
を確認するため、２６０３Ｖ／Ｒ野生型株を細菌表面にタンパク質を発現しない同質遺伝
子型ＢｉｂＡノックアウト突然変異株と比較する結合試験を行った（図１９Ｄ）。図２３
Ａ及びＢに示す通り、２６０３Ｖ／Ｒ株表面のＢｉｂＡの欠如はＧＢＳがＭＥ  １８０及
びＡ５４９細胞の両方に結合する能力を有意に減少させた（ｐ＜０．０５）。ｐＡＭ４０
１ｂｉｂＡプラスミドの挿入による突然変異の補充は接着型表現型を復元した（データ非
表示）。２６０３ΔｂｉｂＡ株が上皮細胞に付着する能力の阻害も、共焦点イメージング
実験から明らかであった。２６０３Ｖ／Ｒ野生型株及び同質遺伝子型ＢｉｂＡノックアウ
ト突然変異株をウサギ抗ＢｉｂＡ及びマウス抗血清型Ｖポリクローナル抗体で染色した。
【０３１１】
図２３Ｃ及び２３Ｄに示す通り、顕微鏡視野（倍率２０倍）において見られた上皮細胞
結合細菌数は、ＢｉｂＡ突然変異株において減少した。これらの結果は、結合試験によっ
て得られた結果と全体的に一致した。ｐＡＭ４０１ｂｉｂＡプラスミドによる２６０３Ｖ
／Ｒ野生型株の形質転換を細菌表面のＢｉｂＡ露出を増加させるツールとして使用した。
ＦＡＣＳ実験は、２６０３  ｐＡＭ４０１ｂｉｂＡ株が野生型株と比較して蛍光強度チャ
ンネル数を３０％上昇したことを立証した。結合試験は、ＢｉｂＡ過剰発現がＧＢＳの上
皮細胞に付着する能力と機能的に関係することを実証した。実際、野生型株２６０３と比
較して、ｐＡＭ４０１ｂｉｂＡ株はＭＥ１８０及びＡ５４９細胞の両方に対して付着の増
加を示した（図２３Ａ及び２３Ｂ）。
【０３１２】
既に図１９に示した通り、表面にＢｉｂＡを露出しない５１５  Ｉａ株において２６０
３Ｖ／Ｒ型のＢｉｂＡ（５１５  ｐＡＭ４０１ｂｉｂＡ）を発現することができた。
このような発現が２６０３Ｖ／Ｒの野生型株の場合と同様に機能的な接着型表現型に関連
することを実証するため、５１５  Ｉａ野生型株及び５１５  ｐＡＭ４０１ｂｉｂＡの間
の上皮細胞への結合レベルを比較した。５１５  Ｉａ表面のＢｉｂＡ露出により、ＭＥ  
１８０及びＡ５４９細胞の両方に結合する細菌の割合が有意に増加した（図２３Ａ及び２
３Ｂ）。この表現型は、共焦点顕微鏡イメージングによっても明らかであった（図２３Ｅ
及び２３Ｆ）。
【０３１３】
（実施例２０）
ＢｉｂＡゲノムの特性解析
最近ゲノム配列が決定された２６０３Ｖ／Ｒ（Ｔｅｔｔｅｌｉｎら、２００２）、ＮＥ
Ｍ３１６  ＩＩＩ型（Ｇｌａｓｅｒら、２００２）、ＣＯＨ１  ＩＩＩ型、ＣＪＢ１１１
Ｖ型、５１５  Ｉａ型、１８ＲＳ２１  ＩＩ型及びＡ９０９  Ｉａ型（Ｔｅｔｔｅｌｉ
ｎら、２００５）株におけるゲノム分析によると、ｂｉｂＡはこれらの全株に存在するが
、Ａ９０９の反対のストランドにおける２つの推定トランスポザーゼの挿入によって阻害
されることが示された。この挿入は、ヌクレオチド５８０におけるリーディングフレーム
を阻害する。５１５  Ｉａ株に存在するｂｉｂＡ遺伝子は、タンパク質がＮ末端３７６ア
ミノ酸から成りプロリンリッチ及び細胞壁固定領域を欠く短縮型となるフレームシフトを
示す（図１９Ｇ）。類似したフレームシフトはＣＪＢ１１１株にも生じ、Ｎ末端４６９ア
ミノ酸が翻訳される。このようなタンパク質断片は、ＣＪＢ１１１の上清に見られた。最
も一般的な血清型を代表する３１の菌株のＧＢＳ上清のウェスタンブロット分析は、Ｂｉ
ｂＡが菌株の８１％に存在することを明らかにした（表４）。
【０３１４】
一方、ＦＡＣＳ分析では、ＢｉｂＡは５８％の菌株の表面に発現されるが、その１９％
ではＢｉｂＡが専ら細菌上清において回収されることが示された。しかし、ＢｉｂＡの細
菌表面の露出は、上清における存在と完全に関係していた。
【０３１５】
一般的に、異なるＢｉｂＡタンパク質において２つの異なるタイプの配列変異性が観察
される。１つは、Ｎ末端領域又はプロリンリッチドメインに見られる短いアミノ酸モジュ
ールの可変性配列数の存在である。特に、ＩＫＡＥＳＩＮ（配列番号６５）及びＫＩＱＸ
ＫＸＮＴ（配列番号６６）の反復を有する９１アミノ酸領域の存在がＡ９０９、ＣＪＢ１
１及びＨ３６ＢのＮ末端領域に見られるが、ＰＥＡＫ／ＰＤＶＫモジュールの複写数は１
７〜４２の間で変動する（表３を参照）。これは、転置要素の挿入／除去を示唆する。
【０３１６】
配列変動の第二の原因は、プロリンリッチドメイン内の９７の残基の非反復領域から成
り、５１５、ＮＥＭ３１６、Ｈ３６Ｂ、ＣＪＢ１１１及びＡ９０９株を特徴付ける。総体
として、配列分析により、タンパク質は３つの異なる変異型で存在し、１つは２６０３、
１８ＲＳ２１及びＣＯＨ１株によって形成され、もう１つはＮＥＭ３１６及び５１５株に
よって形成され、最後の１つはＣＪＢ１１１、Ｈ３６Ｂ及びＡ９０９株によって形成され
ることが明らかとなった（図２４）。しかし、ＢｉｂＡアミノ酸配列の複数のアライメン
トは、タンパク質が一般的に十分に保存される（アミノ酸同一性は、異なる菌株のＮ末端
領域の６３．３〜１００％の範囲である）ことを示すが、ＣＯＨ１の例外で、Ｎ末端領域
は他の対立形質に対して平均で約２５％アミノ酸同一性を示す。
【０３１７】
（実施例２１）
能動的母体免疫試験
マウスにおける抗原の予防効果を確認するために、ＧＢＳ感染症の母体免疫／新生仔チ
ャレンジモデルを使用する。Ｒｏｄｅｗａｌｄら、Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓｅａｓ
ｅｓ  １６６，  ６３５，  １９９２を参照されたい。ＣＤ−１雌マウス（週齢６〜８週
）を出産前に免疫化する。マウスに、単一の抗原で免疫化する場合は１用量当たり２０μ
ｇのタンパク質を投与し、抗原を組み合わせて免疫化する場合は１用量当たり６０μｇの
タンパク質（各抗原１５μｇ）を投与する。マウスは最後の免疫接種の２−７日後に出産
する。誕生から４８時間以内に、仔獣にＧＢＳ培養物５０μｌを腹腔内注射する。使用前
に冷凍培養物から開始しＴＨＢで適切な濃度に希釈してチャレンジ接種物を調製する。予
備実験において、試験株毎に１仔獣当たりのチャレンジ用量を、死亡率が９０％となるよ
うに決定する。仔獣の生存をチャレンジの２日後にモニターする。予防率を１００×（対
照群死亡率−ワクチン投与群死亡率）／対照群死亡率で計算する。フィッシャーの正確確
率検定によりデータの統計的有意性を評価する。
【０３１８】
（実施例２２）
ヒト血液におけるＢｉｂＡノックアウト突然変異株の除去の容易性
ヒトドナーから採血した新鮮な血液において、ｉｎ  ｖｉｖｏの細菌生存におけるＢｉ
ｂＡ発現の重要性を評価した。ＧＢＳをＯＤ６００  ０．４まで増殖し、洗浄後、ＰＢＳ
に再懸濁した。１００μＬ中１０  ４  ＣＦＵの接種原を、抗凝血剤としてヘパリンを使
用してヒトから採血した新鮮な血液３００μＬと混合した。試験管を３７℃で撹拌しなが
ら３時間培養し、ＣＦＵを測定するため希釈液を塗布した。
【０３１９】
表５に示す通り、２６０３Ｖ／Ｒ野生型株及び同質遺伝子型２６０３ΔｂｉｂＡノック
アウト突然変異株のヒト全血液における複製能力について比較した。試験終了時に回収さ
れた細菌数の時間０の細菌に対する割合として、細菌の生存指数を計算した。５人のドナ
ーについて試験し、２６０３Ｖ／Ｒ野生型株は、ヒト血液において２６０３ΔｂｉｂＡ突
然変異株より５倍効率的に増殖することを発見した。しかし、生存率はドナーによって異
なった。血液において野生型株が徐々に複製した（５〜１４回）３人のドナーにおいては
、ｂｉｂＡノックアウト突然変異株は殆ど除去された。対照的に、野生型株が血液におい
て高度に複製した（７７回及び４１回）２人のドナーでは、より非効率的であるが（それ
ぞれ３７回及び５回）ｂｉｂＡ突然変異株はなお増殖した。これらの結果は、抗細菌活性
の低下したドナーにおいては、血液中のＧＢＳ生存に対するＢｉｂＡの寄与はあまり顕著
でないことを示唆する。
【０３２０】
（実施例２３）
ＢｉｂＡ発現によって影響される多核白血球（ＰＭＮ）による補体媒介ＧＢＳ殺滅
ヒト血液によるＧＢＳの食細胞クリアランスは、主として補体存在下でオプソニン化細
菌を殺滅するＰＭＮが媒介する。ヒトＰＭＮによる２６０３Ｖ／Ｒ野生型株及びｂｉｂＡ
突然変異株の殺滅を比較した。ＰＭＮを、Ｍａｉｏｎｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９，  
１４８−５０の記載に従ってデキストラン沈降、フィコール−ハイパーク密度勾配遠心分
離法及び残余赤血球の低張溶解によって、正常で健康なボランティアのヘパリン抗凝固処
理静脈血から得た。
【０３２１】
殺滅実験用の細菌を調製するため、ＴＨＢ培地において増殖した２６０３Ｖ／Ｒ及び２
６０３ΔｂｉｂＡを増殖の中対数期（ＯＤ６００  ０．４）に収集し、ＨＢＳＳ（Ｇｉｂ
ｃｏ−ＢＲＬ）で洗浄後、１０７  ＣＦＵ／ｍＬの濃度に調整した。ＧＢ（１０６  ＣＦ
Ｕ）を、抗ＧＢＳ抗体を含む、３７℃、５％のヒト血清で１５分間オプソニン化した。細
菌をＰＭＮで３時間培養し、ＴＳＡプレート上の定量接種によって生存細菌数を決定した
。
【０３２２】
ヒト血清のみによるＧＢＳの培養では、殺滅は見られなかった。図３０に示す通り、３
時間の培養終了時、ｂｉｂＡ突然変異株は野生型株より効率的に殺滅された。実際、ＰＭ
Ｎの食作用に対して野生型株の３０％が生存したが、変異体細菌では７％のみが生存した
。補体の熱不活性化により、野生型及びｂｉｂＡ突然変異株の両方が生存し、実験中５〜
６倍複製した（図３０）。
【０３２３】
【化２４】
2012105659.tif 000025
【０３２４】
【化２５】
2012105659.tif 000026
【０３２５】
【化２６】
2012105659.tif 000027
（参考文献）
【表１】
2012105659.tif 000028
【表２】
2012105659.tif 000029
【表３】
2012105659.tif 000030
【表４】
2012105659.tif 000031
【表５】
2012105659.tif 000032
【図１Ａ】
2012105659.tif 000033
【図１Ｂ】
2012105659.tif 000034
【図２Ａ】
2012105659.tif 000035
【図２Ｂ】
2012105659.tif 000036
【図３】
2012105659.tif 000037
【図４Ａ】
2012105659.tif 000038
【図４Ｂ】
2012105659.tif 000039
【図５Ａ】
2012105659.tif 000040
【図５Ｂ】
2012105659.tif 000041
【図６】
2012105659.tif 000042
【図７】
2012105659.tif 000043
【図８Ａ】
2012105659.tif 000044
【図８Ｂ】
2012105659.tif 000045
【図９】
2012105659.tif 000046
【図１０Ａ】
2012105659.tif 000047
【図１０Ｂ】
2012105659.tif 000048
【図１０Ｃ】
2012105659.tif 000049
【図１０Ｄ】
2012105659.tif 000050
【図１０Ｅ】
2012105659.tif 000051
【図１１Ａ】
2012105659.tif 000052
【図１１Ｂ】
2012105659.tif 000053
【図１２】
2012105659.tif 000054
【図１３】
2012105659.tif 000055
【図１４Ａ】
2012105659.tif 000056
【図１４Ｂ】
2012105659.tif 000057
【図１４Ｃ】
2012105659.tif 000058
【図１５】
2012105659.tif 000059
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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