(57)【要約】【課題】ホエイを原料として発酵飲料を製造する際に、ビフィズス菌の生残性を高めながら、発酵飲料に甘味を付与する技術を提供する。【解決手段】固形分濃度が７〜１５質量％である、ホエイ原料を含む発酵乳原料に、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属菌、及びラクトコッカス（Lactococcus）属菌を添加して発酵乳原料のｐＨが５．０以下になるまで発酵し、発酵を停止して発酵物を調製した後、調製した発酵物に糖を添加し、続いて均質化してホエイ発酵飲料を製造する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホエイ発酵飲料の製造方法であって、固形分濃度が７〜１５質量％である、ホエイ原料を含む発酵乳原料に、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属菌、及びラクトコッカス（Lactococcus）属菌を添加して発酵乳原料のｐＨが５．０以下になるまで発酵し、発酵を停止して発酵物を調製する工程、調製した発酵物に糖を添加し、続いて均質化してホエイ発酵飲料を製造する工程、を含む製造方法。
【請求項２】
前記糖の添加は、発酵物に対する糖の添加濃度が２〜１０質量％となるように行うことを特徴とする、請求項１に記載のホエイ発酵飲料の製造方法。
【請求項３】
前記糖が、ショ糖を主成分とすることを特徴とする、請求項１又は２に記載のホエイ発酵飲料の製造方法。
【請求項４】
発酵乳原料に添加するビフィドバクテリウム属菌とラクトコッカス属菌の比率が、菌数比で１００：１〜１：１００であることを特徴とする、請求項１〜３の何れか一項に記載のホエイ発酵飲料の製造方法。
【請求項５】
前記ビフィドバクテリウム属菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、及びビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）の群から選択される何れか一又は複数の菌株であることを特徴とする、請求項１〜４の何れか一項に記載のホエイ発酵飲料の製造方法。
【請求項６】
前記ラクトコッカス属菌が、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・バイオバラエティ・ジアセチラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis）、及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）の群から選択される何れか一又は複数の菌株であることを特徴とする、請求項１〜５の何れか一項に記載のホエイ発酵飲料の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか一項に記載の製造方法により製造されるホエイ発酵飲料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビフィズス菌と乳酸菌を用いたホエイ発酵飲料の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
チーズの製造過程で副生するホエイは、アミノ酸、タンパク質、ビタミン類などを含んでおり、高い栄養価を有する。そのため、ホエイを利用した飲食品の開発への期待は高い。そのような中で、ホエイを利用した飲食品として、ホエイを、乳酸菌を用いて発酵させた飲料が知られている（特許文献１〜４）。
【０００３】
他方、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属菌（以下、「ビフィズス菌」ともいう。）は、ヒトの腸管内で形成される腸内菌叢の優勢菌種の一つであり、整腸作用、免疫増強作用、発がん抑制作用などを有することが知られている。
【０００４】
一般的に、健康の維持や増進を目的として、飲食品からビフィズス菌を摂取しようとする場合には、ビフィズス菌を１×１０7ＣＦＵ／ｇ以上含有する飲食品を摂取することが効率的である。従って、ビフィズス菌を含む飲食品を開発するに当たっては、飲食品の保存下において、上記菌数を維持することが課題の一つである。
【０００５】
ビフィズス菌を含む飲食品としては、牛乳や脱脂乳を主成分とする原料を、乳酸菌及びビフィズス菌を用いて発酵させて得られる発酵乳が知られている（例えば特許文献５、６）。しかしながら、ビフィズス菌は、低ｐＨ、酸素、栄養欠乏、高浸透圧などのストレス環境に対して感受性が高いため、牛乳や脱脂乳を主成分とした培地で増殖させ、発酵物中で一定期間菌数を維持することは、容易ではない。
【０００６】
従来、特に発酵乳の分野において、ビフィズス菌の生残性を高める技術の開発が行われてきたが、その開発の方向性は、特許文献５、６に記載されるように、乳酸菌の菌種とビフィズス菌の菌種の好ましい組み合わせを探索するものであった。
【０００７】
また、従来、脱脂乳などを原料として発酵乳を製造する際には、甘味を付与することを目的として、ショ糖などの糖を添加することも通常に行われているが、その添加のタイミングとビフィズス菌の生残性の影響について検討されたことはなかった。これは、脱脂乳を原料とした発酵乳については、特許文献５の実施例１に示唆されているように、予め原料へ糖を添加することにより、ビフィズス菌の生残性が問題となることがなかったためである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−２２５７１９号公報
【特許文献２】特許第２９５５６５０号公報
【特許文献３】国際公開第２００８／１３６３０９号パンフレット
【特許文献４】特開２００４−１２１０４６号公報
【特許文献５】国際公開第２００８／０９９５４３号パンフレット
【特許文献６】特許第３０６８４８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、ホエイとビフィズス菌の価値を併せ持つ、従来にないホエイ発酵飲料を製造することを着想した。本発明者らは、このようなホエイ発酵飲料を製造するにあたって、従来、脱脂乳を発酵させる際に好ましく用いられていた乳酸菌とビフィズス菌の組み合わせ（例えば、特許文献５）で、ビフィズス菌の生残性を高めることを検討してきた。しかしながら、その過程で、本発明者らは、ホエイを原料として発酵飲料を製造する際に、飲料に甘味を付与するために糖を添加しようとすると、ビフィズス菌の生残性に何らかの影響があり、十分なビフィズス菌数が維持できないという問題に直面した。
【００１０】
本発明は、このような問題を解決するためになされた発明であり、ホエイを原料として発酵飲料を製造する際に、ビフィズス菌の生残性を高めながら、発酵飲料に甘味を付与する技術を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、従来のビフィズス菌の生残性を高める技術の開発の方向性とは全く違う観点から、ビフィズス菌の生残性を高める方法を模索した結果、驚くべきことに、ホエイ発酵飲料を製造する際の糖の添加のタイミングが、製造下でのビフィズス菌の増殖性、及び保存下でのビフィズス菌の生残性に顕著な影響を与えることを知見した。そして、当該知見をもとに以下の発明を完成させた。
【００１２】
上記課題を解決する本発明は、ホエイ発酵飲料の製造方法であって、固形分濃度が７〜１５質量％である、ホエイ原料を含む発酵乳原料に、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属菌、及びラクトコッカス（Lactococcus）属菌を添加して発酵乳原料のｐＨが５．０以下になるまで発酵し、発酵を停止して発酵物を調製する工程、調製した発酵物に糖を添加し、続いて均質化してホエイ発酵飲料を製造する工程、を含む。
ホエイ発酵飲料を製造する際に、ホエイ原料を含む発酵乳原料の固形分濃度を７〜１５質量％とし、甘味を付与するための糖を、発酵の前でなく発酵の後、すなわち発酵乳原料のｐＨが５．０以下になるまで十分に発酵して発酵を停止した後に添加し、その後均質化することにより、ホエイ発酵飲料におけるビフィズス菌の生残性を顕著に高めることが可能となる。
【００１３】
本発明の好ましい形態では、前記糖の添加は、発酵物を１０℃以下に冷却し、発酵を停止した後に行う。
このような条件で発酵を停止した後に、糖を添加することにより、ビフィズス菌数、ｐＨ等の品質を安定化させることが容易になり、ビフィズス菌の生残性を維持した製品を、効率よく生産することが可能となる。
【００１４】
本発明の好ましい形態では、前記糖の添加は、前記発酵物における糖の添加濃度が２〜１０質量％となるように行う。
このような範囲で糖を添加することにより、ホエイ発酵飲料におけるビフィズス菌の生残性をより高めることができる。
【００１５】
本発明の好ましい形態では、糖の添加は、前記発酵物における添加濃度になるように糖の水溶液（シロップ）として加えることにより行う。
このような糖の水溶液を添加することで、ビフィズス菌の生残性を十分に高めることが可能となる。
【００１６】
また、添加する糖の形態としては、ショ糖を主成分とする形態が挙げられる。
【００１７】
本発明においては、前記ビフィドバクテリウム属菌は、好ましくはビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、及びビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）の群から選択される何れか一又は複数の菌株である。また、前記ラクトコッカス属菌は、好ましくはラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・バイオバラエティ・ジアセチラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis）、及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）の群から選択される何れか一又は複数の菌株である。
また、本発明の好ましい形態では、発酵乳原料に添加するビフィドバクテリウム属菌とラクトコッカス属菌の比率は、菌数比で１００：１〜１：１００である。
上記菌の組み合わせや、菌の比率を採用することで、ビフィズス菌の増殖性、及び生残性をさらに高めることが可能となる。
【００１８】
また、本発明は、前記の製造方法により製造されるホエイ発酵飲料にもある。
本発明のホエイ発酵飲料は、ホエイの栄養価を有し、ビフィズス菌や乳酸菌の機能をも十分に有する。
【発明の効果】
【００１９】
ビフィズス菌を用いたホエイ発酵飲料の製造において、固形分濃度が７〜１５質量％である、ホエイ原料を含む発酵乳原料を用い、従来、そのタイミングについて着目されてこなかった糖の添加を、発酵乳原料のｐＨが５．０以下になるまで発酵し、発酵を停止した後に行い、続いて均質化することにより、ビフィズス菌の生残性を高めることが可能となった。これにより、ホエイの栄養価を有し、ビフィズス菌や乳酸菌の機能をも十分に有する、新規な発酵飲料を効率よく製造することができる。こうして製造される本発明のホエイ発酵飲料は、ホエイの栄養価と、ビフィズス菌や乳酸菌の機能を併せ持つものである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明のホエイ発酵飲料の製造方法を示す概略図である。
【図２】実験１で得た発酵物の製造方法を示す図である。
【図３】実験４で得た発酵物の製造方法を示す図である。
【図４】製造例で得たホエイ発酵飲料の製造方法を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
図１は、本発明のホエイ発酵飲料の製造方法を示す概略図である。本発明の製造方法では、固形分濃度が７〜１５質量％である、ホエイ原料を含む発酵乳原料を、ｐＨが５．０以下になるまで発酵させ、発酵を停止した後、得られた発酵物に糖を添加し、続いて均質化する。
以下、本発明に用いられる原料や本発明における工程について詳しく説明する。
【００２２】
＜ホエイ原料＞
本発明に用いられる「ホエイ原料」とは、ホエイタンパク質（「乳清タンパク質」、「可溶性タンパク質」とも呼ばれる。）を主タンパク質として含む原料である。また、ホエイ原料は、後述する菌が増殖するのに必要な糖（主に乳糖）、その他成分が含まれている原料であってもよい。ホエイ原料における全タンパク質に占めるホエイタンパク質の割合は、好ましくは８０質量％以上、さらに好ましくは９０質量％以上である。
【００２３】
ホエイ原料としては、チーズやカゼインの製造工程で副生するホエイを乾燥して製造されるホエイパウダー、前記ホエイを脱塩、濃縮して乳糖やミネラル等を一部除去したホエイタンパク濃縮物（ＷＰＣ）、前記ホエイを脱塩、濃縮、分離等を行って、乳糖やミネラル等を実質的に除去したホエイタンパク分離物（ＷＰＩ）等を本発明に用いることができる。
【００２４】
なお、本発明におけるホエイ発酵飲料を製造する上では、ホエイ原料としてホエイパウダーを使用することが好ましい。
【００２５】
＜発酵乳原料＞
本発明における「発酵乳原料」とは、本発明のホエイ発酵飲料を製造するために必要な乳タンパク質を含む原料であって、上述したホエイパウダーや、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質分離物（ＷＰＩ）等のホエイ原料を含み、乳酸菌等で発酵する上で必要な成分、例えば、糖やその他の添加物、を適宜含んでいても良いものである。本発明における発酵乳原料は、前記ホエイ原料由来のホエイタンパク質を主タンパク質として含むものである。発酵乳原料における全タンパク質に占めるホエイタンパク質の割合は、好ましくは６０質量％以上、さらに好ましくは７０質量％以上、より好ましくは８０質量％以上である。
【００２６】
本発明における発酵乳原料の固形分濃度（タンパク質及び糖等を含む全固形分の濃度）は、７〜１５質量％、好ましくは８〜１５質量％、さらに好ましくは８〜１２質量％である。発酵乳原料の固形分濃度をこのような範囲とすることにより、ホエイ発酵飲料の製造下でのビフィズス菌の増殖性、及び保存下での生残性を高めることができる。
本発明における発酵乳原料は、ホエイ原料としてホエイパウダーを含むものを好ましく使用することができる。この場合は、例えば、ホエイパウダーの水溶液や、これに、後述する各菌の増殖を妨げない範囲においてその他成分を添加したものを使用することができる。
また、ホエイ原料として、ホエイタンパク濃縮物やホエイタンパク分離物を使用する場合は、後述する各菌の増殖を妨げない範囲において、乳糖又は乳に本来含まれる成分以外の糖を添加して、本発明の発酵乳原料とすることも可能である。
その場合、ホエイタンパク濃縮物やホエイタンパク分離物に添加される糖の添加量は、ホエイタンパク濃縮物やホエイタンパク分離物等のホエイ原料中のタンパク質と糖（添加後）の混合比が、タンパク質：糖＝１：２〜１：８となるように添加されることが好ましく、タンパク質：糖＝１：４〜１：７となるように添加されることが特に好ましい。
なお、添加される糖としては、ガラクトース、マルトース、アラビノース、キシロース、メレチトース、メリビオース、ラフィノース等が例示される。
【００２７】
＜発酵＞
本発明では、上記発酵乳原料に、ビフィドバクテリウム属菌（ビフィズス菌）とラクトコッカス属菌を添加し、発酵する。
本発明で用いられるビフィドバクテリウム属菌としては、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B. infantis）などの菌株が挙げられる。中でも、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌株が好ましく用いられる。
ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌株としては、ＢＢ５３６株（森永乳業社製）を好ましく用いることができる。ＢＢ５３６株は、市販されており、一般に入手可能である。
【００２８】
本発明で用いられるラクトコッカス属菌としては、ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（L. lactis subsp. lactis）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・バイオバラエティ・ジアセチラクティス（L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（L. lactis subsp. cremoris）などの菌株が好ましく用いられ、特に、ラクトコッカス・ラクティスの菌株、及び／又はラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスの菌株が好ましく用いられる。
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスの菌株としては、ＭＣＣ８５７株が挙げられる。ＭＣＣ８５７株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、平成１９年１月１０日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７５７にて寄託されている。
【００２９】
ビフィドバクテリウム属菌とラクトコッカス属菌の発酵乳原料への添加（接種）は、菌数比（コロニー形成単位（ＣＦＵ）の比）でビフィドバクテリウム属菌：ラクトコッカス属菌＝１００：１〜１：１００程度を目安とすることが好ましい。さらに、上記比率を１００：１〜１：５０とすることが好ましい。
このような範囲で各菌を添加することで、ビフィズス菌及びラクトコッカス属菌による発酵がバランスよく進み、ビフィズス菌の増殖、生残性の向上につながる。特に、上記比率を１００：１〜１：５０とすることで、高い生残率を得ることができる。
また、これらの菌の添加量は、適宜調節することができる。例えば、発酵乳原料における上記菌の合計の菌濃度が、少なくとも１×１０5ＣＦＵ／ｇ程度となるような量を添加することで、十分にビフィズス菌を増殖させ、高い生残性を維持することが可能である。
【００３０】
発酵乳原料への菌の添加方法は特に制限されず、菌末の状態で添加することも、カルチャー（培養物）の状態で添加することもできる。
菌末の状態で添加する場合には、これらの菌を合計で、発酵乳原料に対し、少なくとも１×１０7ＣＦＵ／ｇ程度の濃度となるような量を添加することが特に好ましい。
菌末とは、菌を適当な培地で生育させ、遠心分離により分離後、凍結乾燥保護剤と混合してから凍結乾燥し、乾燥品を粉砕後、必要に応じて倍散剤と混合して得られる粉末状の製品である。本発明においては、１×１０11ＣＦＵ／ｇ以上の菌濃度の菌末を用いることが好ましい。
カルチャー（培養物）の状態で添加する場合には、これらの菌を合計で、発酵乳原料に対し、少なくとも１×１０5ＣＦＵ／ｍｌ程度の濃度となるような量を添加することが特に好ましい。
カルチャーとは、菌を適当な培地で生育させて得られる液状組成物である。本発明においては、菌を対数増殖後期から定常期に達するまで生育させた状態であるカルチャーを用いることが、その後の菌の効率よい増殖を促す目的から好ましい。目安としては、１×１０8ＣＦＵ／ｍｌ以上の菌濃度のカルチャーを用いることが好ましい。
【００３１】
培養温度（発酵温度）は、ビフィドバクテリウム属菌、及びラクトコッカス属菌が効率よく増殖する範囲であればよく、通常３０〜５０℃程度、好ましくは３５〜３９℃程度である。発酵は、ビフィドバクテリウム属菌、及びラクトコッカス属菌が十分に増殖するまで行えばよく、通常、発酵乳原料のｐＨが５．０以下になるまで、好ましくは、発酵乳原料のｐＨが４．８以下になるまで、さらに好ましくは、発酵乳原料のｐＨが４．８〜４．２程度になるまで行えばよい。発酵時間としては、３５〜３９℃程度の培養温度の場合、８〜１４時間程度が目安となる。
【００３２】
＜糖添加＞
本発明では、上記発酵を停止した後、得られた発酵物に糖を添加する。発酵は、発酵乳原料のｐＨが５．０以下、好ましくはｐＨが４．８以下、さらに好ましくはｐＨが４．８〜４．２となったときに停止させる。上記発酵前の発酵乳原料に糖を添加するのではなく、発酵を停止した後のタイミングで、発酵物に糖を添加することにより、保存下でのビフィズス菌の生残性を向上させることができる。
発酵の停止は、発酵物を冷却することなどにより行う。冷却温度は、実質的に菌の増殖が起こらない温度であればよく、適宜設定することができる。好ましくは、発酵物を１０℃以下に冷却することにより発酵を停止した後に、糖を添加する。冷却は、発酵乳原料が、目的とするｐＨになった時点で速やかに行うことが好ましい。
このような条件で発酵を停止することにより、ビフィズス菌数、ｐＨ等の品質を安定化させることが容易になり、ビフィズス菌の生残性を維持した製品を、効率よく生産することが可能となる。
【００３３】
添加する糖としては、ショ糖、果糖等が好ましく挙げられる。本発明の好ましい形態では、添加する糖の主成分がショ糖である。具体的には、添加する糖の８０質量％以上、好ましくは９０質量％以上がショ糖である形態が挙げられる。このような形態として、例えば、砂糖が挙げられる。
糖の添加方法としては、糖水溶液（シロップ）の形態で添加することが好ましい。この場合、水溶液における糖の濃度は、好ましくは３〜５０質量％であり、特に好ましくは６〜３０質量％である。これにより、糖の添加時に、培養物中の糖濃度を素早く均一にすることができ、ビフィズス菌の生残性の低下を抑えることができる。
また本発明のホエイ発酵飲料の製造時における発酵後の発酵物に添加する糖の添加濃度は、ショ糖を主成分とする糖を添加する場合、好ましくは２〜１０質量％程度、さらに好ましくは４〜６質量％程度となるように添加する。この程度の添加濃度となるように糖を添加することで、ビフィズス菌の生残性を損なわない範囲で、嗜好性を付与することが可能となる。
【００３４】
＜均質化＞
本発明では、糖の添加の後に均質化を行うことにより、添加した糖と発酵物とを十分に混合するとともに、飲料として良好な滑らかさを付与する。均質化は、通常、乳製品の製造に用いられるホモジェナイザー（三丸機械工業社製）を用いて行うことができ、飲料として良好な物性を得る観点からは、通常２０Ｍｐａ以下、好ましくは１５Ｍｐａ以下の圧力で行う。
【００３５】
＜その他の工程＞
本発明においては、上記で説明した工程以外にも、乳や脱脂乳などの発酵飲料の製造で通常行われる原料の殺菌、冷却、任意成分の添加などの工程を、ビフィズス菌の生残性を損なわない範囲で、適宜行うことができる。
例えば、本発明では、製造するホエイ発酵飲料の保存安定性を高めるために安定剤を添加することが好ましい。
安定剤としては、通常飲料の製造に用いられるものを用いることができ、例えばペクチンなどの増粘多糖類を用いることができる。この場合、安定剤の添加のタイミングは特に制限されない。例えば、上述した糖の添加の際に、安定剤を糖と共に水に溶解し、水溶液の形態で添加してもよい。
安定剤の添加量は、飲料の形態、使用する安定剤の種類に応じて適宜調節できる。目安としては、製造されるホエイ発酵飲料に対し、０．０５〜０．５質量％程度、好ましくは０．１〜０．３質量％程度となるように添加することが挙げられる。
【００３６】
本発明により製造されるホエイ発酵飲料は、ビフィズス菌の生残性に優れるので、健康の維持や増進を目的とした飲料として応用することも好ましい。
【００３７】
上記のように製造された飲料は、８０〜５００ｍｌ容程度、好ましくは８０〜２５０ｍｌ容程度の容器に充填し、密閉する。また、容器入りの製品は、通常１０℃以下、好ましくは５℃以下で保存する。
容器は、酸素透過性の低いものが好ましく、特に、ガラス製やプラスチック製（例えばポリプロピレン製、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）製、ポリスチレン製、ポリエチレン製）が好ましい。
【実施例】
【００３８】
＜ビフィズス菌の生残性への影響＞
次に、ホエイ発酵飲料の製造における各種条件が、ビフィズス菌の生残性にどのような影響を与えるかを実験した結果を示す。各実験において、ビフィズス菌数は以下の方法で測定した。
（ビフィズス菌数の測定方法）
サンプル（発酵物）１ｇを０．８５％の滅菌済生理食塩水９ｍｌに溶解・懸濁し、その懸濁液を段階的に希釈してから、ＴＯＳ培地（トランスオリゴサッカライドプロピオン酸寒天培地、ヤクルト薬品工業社製）を用いて３７℃で７２時間、嫌気培養し、コロニー数をカウントした。
【００３９】
〔実験１〕発酵乳原料の固形分濃度の影響
発酵乳原料の固形分濃度が、ビフィズス菌の生残性に与える影響を実験した。
表１に示す材料を用いて、固形分濃度を変えた発酵乳原料を調製し、図２に示すフローにて、発酵物を得た。なお、発酵乳原料に添加したビフィズス菌とL. lactis菌の添加菌数比は、約９：１であった。得られた発酵物について、発酵直後（冷却による発酵停止直後をいう。以下同じ。）のビフィズス菌数と、ポリプロピレン製１１０ｍｌ容カップに８０ｍｌ充填し、蓋を被せて１０℃で４週間保存した後のビフィズス菌数を測定した。合わせてｐＨも測定した。結果を表２に示す。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
【表２】
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【００４２】
表２に示すとおり、発酵乳原料中のホエイパウダー濃度（固形分濃度）が７〜１５質量％の場合に、４週間後のビフィズス菌数が多かった。また、当該濃度が８〜１５質量％の場合、特に８〜１２質量％の場合にビフィズス菌数が顕著に多く、１０質量％の場合に最も多かった。
また、何れの場合も発酵直後から４週間後にわずかなｐＨの低下が見られたのみであった。
【００４３】
〔実験２〕菌の添加比率の影響
発酵乳原料に添加した各菌の添加比率が、ビフィズス菌の生残性に与える影響を実験した。
表３に示す材料を用いて、実験１と同様に発酵物を得た。得られた発酵物について、発酵直後のビフィズス菌数と、ポリプロピレン製１１０ｍｌ容カップに８０ｍｌ充填し、蓋を被せて１０℃で２週間保存した後のビフィズス菌数を測定した。また、２週間後の菌数を発酵直後の菌数で除した値を、生残率として算出した。合わせてｐＨも測定した。結果を表４に示す。
【００４４】
【表３】
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【００４５】
【表４】
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【００４６】
表４に示すとおり、ビフィドバクテリウム属菌とラクトコッカス属菌の添加比率が、菌数比で、約１００：１〜１：１００の場合に、２週間の保存後も十分なビフィズス菌数が維持されていた。特に、上記比率が約１００：１〜１：５０の場合にビフィズス菌数が十分であり、さらには、上記比率が約５０：１〜１：９の場合に、ビフィズス菌の生残率が高かった。
また、何れの場合も発酵直後から２週間後にわずかなｐＨの低下が見られたのみであった。
【００４７】
〔実験３〕乳酸菌の種類、及び菌の形態の影響
ビフィズス菌と共に用いる乳酸菌の種類が、ビフィズス菌の生残性に与える影響を実験した。また、発酵乳原料に添加する各菌の形態がカルチャー（培養物）か、菌末かによってビフィズス菌の生残性に影響があるかについても実験した。
表５に示す材料を用いて、実験１と同様に発酵物を得た。得られた発酵物について、発酵直後のビフィズス菌数と、ポリプロピレン製１１０ｍｌ容カップに８０ｍｌ充填し、蓋を被せて１０℃で２週間保存した後のビフィズス菌数を、上記方法により測定した。また、実験２と同様に生残率を算出した。合わせてｐＨも測定した。結果を表６に示す。
【００４８】
【表５】
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【００４９】
【表６】
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【００５０】
表６に示すとおり、乳酸菌としてストレプトコッカス属菌を用いた場合には、発酵直後のビフィズス菌数が添加時より大きく減少し、２週間後の生残性も極めて低かった（生残率１３．１％、４．８％）。また、乳酸菌としてラクトバチルス属菌を用いた場合には、発酵が進まず、ホエイ発酵飲料を製造することが困難であった。一方、乳酸菌としてラクトコッカス属菌を用いた場合には、発酵直後のビフィズス菌数が添加時より大きく増加し、２週間後の生残性も極めて高かった（生残率７７．８％、８１．８％）。
この傾向は、添加する菌の形態が菌末である場合でも、カルチャーである場合でも等しく見られた。
本実験では、各群の間で乳酸菌とビフィズス菌の添加菌数の比率が異なるため、各群の結果を直接比較することはできないが、上記の実験２におけるラクトコッカス属菌とビフィズス菌の比率が１：１００の場合の結果（生残率６５．１％）と、上記のストレプトコッカス属菌を用いた場合の結果（生残率１３．１％、４．８％）を比較してみると、乳酸菌としてラクトコッカス属菌を用いた場合の方が、乳酸菌としてストレプトコッカス属菌を用いた場合より、ビフィズス菌の高い生残性が得られるということが判った。
また、何れの場合も発酵直後から２週間後にわずかなｐＨの低下が見られたのみであった。但し、発酵が進まなかったサンプルについては、２週間後のｐＨは測定していない。
【００５１】
〔実験４〕糖を添加するタイミングの影響
ホエイ発酵飲料を製造する過程での糖を添加するタイミングが、ビフィズス菌の生残性に与える影響を実験した。
表７に示す材料、及び実験条件を用いて、図３に示すフローにて発酵物を得た。なお、発酵乳原料に添加したビフィズス菌とL. lactis菌の添加菌数比は、約９：１であった。方法（Ａ）では、発酵乳原料に対して砂糖を１０質量％の濃度で添加し、方法（Ｂ）では、発酵乳原料発酵後の発酵物に対して砂糖を１０質量％の濃度で添加した。また、方法（Ａ）及び（Ｂ）のいずれの場合も、ホエイ発酵飲料におけるホエイタンパク質の終濃度は８質量％であった。
得られたホエイ発酵飲料について、発酵直後のビフィズス菌数と、ポリプロピレン製１１０ｍｌ容カップに８０ｍｌ充填し、蓋を被せて１０℃で２週間保存した後のビフィズス菌数を、測定した。合わせてｐＨも測定した。結果を表８に示す。
【００５２】
【表７】
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【００５３】
【表８】
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【００５４】
表８に示すとおり、砂糖を発酵乳原料に予め添加する方法（Ａ）により得られたホエイ発酵飲料に対し、砂糖を発酵乳原料に添加せずに、発酵後、冷却によって発酵を停止した後に発酵物に添加する方法（Ｂ）により得られたホエイ発酵飲料は、発酵直後にビフィズス菌数を１００倍程度含み、さらに２週間後には１０００倍程度含んでいた。
これまで、糖の添加のタイミングがビフィズス菌の生残性に与える影響については着目されてこなかったことに鑑みても、上記結果は驚くべきものであった。
また、何れの場合も発酵直後から２週間後にわずかなｐＨの低下が見られたのみであった。
【００５５】
＜製造例＞
下記方法に従い、本発明のホエイ発酵飲料を製造した。製造フローを図４に示す。
（１）発酵ホエイの調製
ホエイパウダー（森永乳業社製）１ｋｇを、水９ｋｇに溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨを７．０に調整して発酵乳原料を調製した。調製した発酵乳原料を９０℃で１０分間保持して殺菌後、３８℃に冷却し、市販のBifidobacterium longum ＢＢ５３６菌末（森永乳業社製、１．２×１０11ＣＦＵ／ｇ）０．９ｇ及びLactococcus lactis subsp. lactis ＭＣＣ８５７菌末（森永乳業社製、１．２×１０11ＣＦＵ／ｇ）０．１ｇを添加して均一に混合した。発酵乳原料に添加した菌濃度は、ＢＢ５３６株が約１．１×１０7ＣＦＵ／ｇ、ＭＣＣ８５７株が約１．２×１０6ＣＦＵ／ｇであり、両者の添加菌数比は、約９：１であった。これを３７℃で１１時間、ｐＨ４．７まで発酵させた後、１０℃まで速やかに冷却し、ホエイ発酵物１０ｋｇを得た。
【００５６】
（２）シロップ・ペクチン混合液の調製
グラニュー糖（三井製糖社製）６２５ｇ及びＨＭペクチン（三栄源エフ・エフ・アイ社製）２５ｇを水１８５０ｇに溶解し、合計２．５ｋｇに調合した後、９０℃で１０分間殺菌し、１０℃以下まで冷却して、シロップ・ペクチン混合液を得た。
【００５７】
（３）ホエイ発酵飲料の製造
前記ホエイ発酵物１０ｋｇに前記シロップ・ペクチン混合液２．５ｋｇを加えてよく混合し、ホモジナイザーを用いて１５ＭＰａで均質化して得られた液状発酵乳を、１１０ｍｌ容のポリプロピレン製容器に８０ｍｌ充填し、ポリプロピレン製の蓋を被せて、１０℃で保存した。なお、ホエイ発酵物に添加した糖の添加濃度は約５質量％であった。
得られたホエイ発酵飲料は、１０℃で２８日間という長期保存後も、ビフィズス菌の生残数が１×１０7ＣＦＵ/ｇ以上であり、ビフィズス菌を非常に高レベルで含有しているホエイ発酵飲料であった。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明によって、ホエイの栄養価を有し、ビフィズス菌の機能を十分に有する、新規な発酵飲料を効率よく製造することができる。本発明は、ビフィズス菌が添加されたホエイと乳酸菌を用いた発酵飲料の製造に広く利用できる技術である。このようにして得られる本発明のホエイ発酵飲料は、ホエイの栄養価と、ビフィズス菌や乳酸菌の機能を併せ持つものであり、健康の維持や増進を目的とした飲料にも応用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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