(57)【要約】【課題】インスリン分泌機構の解明に有用な細胞を提供する。また、インスリン分泌抑制剤を提供する【解決手段】継代培養可能であり、グルコース濃度依存的に緑色蛍光タンパク質標識インスリンを分泌する膵β細胞株を提供する。また、塩化リチウムを含むインスリン分泌抑制剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ）３β発現抑制剤を含むインスリン分泌抑制剤、及びＧＳＫ３β−ｓｉＲＮＡを含むインスリン分泌抑制剤を提供する。【選択図】図２
2012115153.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
継代培養可能であり、グルコース濃度依存的に緑色蛍光タンパク質標識インスリンを分泌する膵β細胞株。
【請求項２】
配列番号２の核酸が導入された、請求項１に記載の膵β細胞株。
【請求項３】
配列番号１の核酸が導入された、請求項１に記載の膵β細胞株。
【請求項４】
繊維芽細胞様の形態を有する、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の膵β細胞株。
【請求項５】
マウスインスリノーマＭＩＮ６細胞を用意することと、
前記ＭＩＮ６細胞に、配列番号２の核酸を導入することと、
を含む、継代培養可能であり、グルコース濃度依存的に緑色蛍光タンパク質標識インスリンを分泌する膵β細胞株の作製方法。
【請求項６】
塩化リチウムを含む、インスリン分泌抑制剤。
【請求項７】
グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β発現抑制剤を含む、インスリン分泌抑制剤。
【請求項８】
グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β−ｓｉＲＮＡを含む、インスリン分泌抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞生物学及び分子生物学に係り、膵β細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓に存在するランゲルハンス島の膵β細胞は、血糖量を低下させるホルモンであるインスリンを分泌することで知られている。血中グルコース濃度の上昇により、膵β細胞は、急峻であるがインスリンの分泌時間が短い第一相のインスリン分泌と、緩やかにインスリンの分泌を増加させる第二相のインスリン分泌と、の二相性インスリン分泌を示す（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
第一相のインスリン分泌は、以下の過程を経て生じると考えられている。すなわち、糖輸送体（ＧＬＵＴ２）により膵β細胞に取り込まれたグルコースがミトコンドリアで代謝され、膵β細胞内のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の濃度が上昇する。細胞質のＡＴＰ／ＡＤＰ比が上昇する結果、膵β細胞の細胞膜上のＡＴＰ感受性Ｋ+チャネル（ＫATPチャネル）が閉じられ、細胞膜電位の脱分極が引き起こされる。そして、膜電位依存性Ｃａ2+チャネル（Ｖｏｌｔａｇｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃａ2+  Ｃｈａｎｎｅｌ：ＶＤＣＣ）が活性化されることで、膜電位依存性Ｃａ2+チャネルからカルシウムが流入して細胞内カルシウム濃度が上昇し、インスリン顆粒の開口放出が誘導される。この一連の過程は、ＫATPチャネル依存性インスリン分泌と呼ばれる。
【０００４】
一方、第二相のインスリン分泌は、ＫATPチャネルに依存せずに起こるが、その詳細な分子機構については不明である。しかし、第二相のインスリン分泌を起こす分子機構は、インスリン分泌顆粒が細胞膜へ移行する過程、及びインスリン分泌顆粒の開口放出の準備過程等に作用し、インスリン分泌を増強する効果に寄与していると考えられている。
【０００５】
ここで、ＫATPチャネル開口薬であるジアゾオキシドによりＫATPチャネルを開口させた状態、あるいはグリベンクラミド等のスルフォニル尿素薬によりＫATPチャネルを閉口させた状態、つまり細胞質のＡＴＰ／ＡＤＰ比の変動によるＫATPチャネルの制御機構を阻害した条件下でも、グルコースはインスリン分泌を促進する。このような条件下で観察されるＫATPチャネルに依存しない分子機構が、第二相で見られるインスリン分泌の増強に寄与していると考えられている。
【０００６】
また、グルコース刺激を繰り返すと、一度目のグルコース刺激によるインスリン分泌量よりも、二度目のグルコース刺激によるインスリン分泌量の方が多いという現象（ｔｉｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ：ＴＤＰ）が、古くから報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。この現象も、ＫATPチャネルに依存しない分子機構によると考えられている。このように、ＫATPチャネルに依存しない分子機構が、グルコース誘発性インスリン分泌において、重要な役割を担っていると考えられている。
【０００７】
次に、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３：ＧＳＫ３）は、セリン・スレオニンキナーゼであり、異なる遺伝子にコードされアミノ酸レベルで高い相同性を有するＧＳＫ３αとＧＳＫ３βのアイソフォームが存在する（例えば、非特許文献３参照。）。ＧＳＫ−３は、糖質代謝を制御するリン酸化酵素として同定された。しかし、ＧＳＫ−３のリン酸化基質に細胞骨化タンパク質、転写因子、及び代謝調節因子も含まれることから、ＧＳＫ−３は、細胞構造、遺伝子発現、細胞分裂、細胞分化、及びアポトーシス等の様々な細胞機能を制御しうることが明らかになっている。
【０００８】
ここで、近年、神経細胞特異的にインスリン受容体を欠損させたノックアウトマウスは、食欲制御異常、肥満、２型糖尿病、及び不妊を発症することが明らかになっている（例えば、非特許文献４参照。）。さらに、神経細胞におけるインスリン受容体を介したインスリンシグナル過程を阻害することにより、細胞内のＧＳＫ３βの活性が亢進し、タンパク質のリン酸化が過剰に引き起こされ、これがアルツハイマー病の発症の引き金になりうることが示唆されている（例えば、非特許文献５、６参照。）。また、実際のアルツハイマー病患者や糖尿病患者において、ＧＳＫ３βの活性が亢進していることが知られているが（例えば、非特許文献７、８参照。）、その詳細な病態発症分子機構については不明な点が多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Aizawa, T., Komatsu, M., Asanuma, N., Sato, Y., and Sharp, G. W. (1998). Glucose action 'beyond ionic events' in the pancreatic beta cell. Trends Pharmacol. Sci. 19, 496-499.
【非特許文献２】Grodsky, G. M., Curry, D., Landahl, H., and Bennett, L. (1969). Further studies on the dynamic aspects of insulin release in vitro with evidence for a two-compartmental storage system. Acta Diabetol. Lat. 6, 554-578
【非特許文献３】Sutherland, C., Leighton, I. A., and Cohen, P. (1993). Inactivation of glycogen synthase kinase-3 beta by phosphorylation: new kinase connections in insulin and growth-factor signaling. Biochem. J. 296, 15-19.
【非特許文献４】Bruning, J. C., Gautam, D., Burks, D. J., Gillette, J., Schubert, M., Orban, P. C., Klein, R., Krone, W., Muller-Wieland, D., and Kahn, C. R. (2000). Role of brain insulin receptor in control of body weight and reproduction. Science. 289, 2122-2125.
【非特許文献５】Pei, J. J., Braak, E., Braak, H., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Winblad, B., and Cowburn, R. F. (1999). Distribution of active glycogen synthase kinase 3beta (GSK-3beta) in brains staged for Alzheimer disease neurofibrillary changes. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58, 1010-1019.
【非特許文献６】Schubert, M., Holland, N. D., Escriva, H., Holland, L. Z., and Laudet, V. (2004). Retinoic acid influences anteroposterior positioning of epidermal sensory neurons and their gene expression in a developing chordate (amphioxus). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10320-10325
【非特許文献７】Steen, E., Terry, B. M., Rivera, E. J., Cannon, J. L., Neely, T. R., Tavares, R., Xu, X. J., Wands, J. R., and de la Monte, S. M. (2005). Impaired insulin and insulin-like growth factor expression and signaling mechanisms in Alzheimer's disease---is this type 3 diabetes ? J. Alzheimers. Dis. 7, 63-80.
【非特許文献８】Jolivalt, C. G., Lee, C. A., Beiswenger, K. K., Smith, J. L. Orlov, M., Torrance, M. A., and Masliah, E. (2008). Defective insulin signaling pathway and increased glycogen synthase kinase-3 activity in the brain of diabetic mice: Parallels with Alzheimer's disease and correction by insulin. J. Neurosci. Res. 86, 3265-3274.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、インスリン分泌機構の解明に有用な細胞を提供することを目的の一つとする。また、本発明は、インスリン分泌抑制剤を提供することも目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の態様は、継代培養可能であり、グルコース濃度依存的にＧＦＰ標識インスリンを分泌する膵β細胞（ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞）株であることを要旨とする。また、本発明の別の態様は、塩化リチウムを含む、インスリン分泌抑制剤であることを要旨とする。さらに、本発明の別の態様は、ＧＳＫ３β発現抑制剤を含む、インスリン分泌抑制剤であることを要旨とする。またさらに本発明の別の態様は、ＧＳＫ３β−ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を含む、インスリン分泌抑制剤であることを要旨とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、継代培養可能であり、グルコース濃度依存的に緑色蛍光タンパク質標識インスリンを分泌する膵β細胞株を提供可能である。また、本発明によれば、インスリン分泌抑制剤を提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の第１の実施例に係るマウスｐＥＧＦＰ−プレプロインスリン・プラスミドの概念図である。
【図２】本発明の第１の実施例に係るＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞の全反射蛍光顕微鏡写真である。
【図３】本発明の第１の実施例に係る図２中の顆粒１，２のグルコース刺激前後の全反射顕蛍光微鏡連続写真である。
【図４】本発明の第１の実施例に係る図２中の顆粒１，２の蛍光強度の時間変化を示すグラフである。なお、グルコース刺激前の蛍光強度を１００として正規化している。
【図５】本発明の第２の実施例に係る細胞膜直下のインスリン分泌顆粒分布を示す全反射蛍光顕微鏡写真である。なお、校正棒は１０μｍを示す。
【図６】本発明の第２の実施例に係る全反射蛍光顕微鏡で測定したインスリン分泌顆粒密度を示すグラフである。
【図７】本発明の第２の実施例に係る細胞膜内のインスリン分泌顆粒分布を示す共焦点蛍光顕微鏡写真である。なお、校正棒は１０μｍを示す。
【図８】本発明の第２の実施例に係る細胞外に分泌されたインスリン量を示すグラフである。
【図９】本発明の第３の実施例に係るグルコース刺激時のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ濃度変化を示すグラフである。
【図１０】本発明の第３の実施例に係るグルコース及び高カリウム刺激時の［Ｃａ2+］i濃度変化を示すグラフである。
【図１１】本発明の第４の実施例に係る細胞膜直下のインスリン分泌顆粒分布を示す全反射蛍光顕微鏡写真である。なお、校正棒は１０μｍを示す。
【図１２】本発明の第４の実施例に係る全反射蛍光顕微鏡で測定したインスリン分泌顆粒密度を示すグラフである。
【図１３】本発明の第４の実施例に係る細胞膜内のインスリン分泌顆粒分布を示す共焦点蛍光顕微鏡写真である。なお、校正棒は１０μｍを示す。
【図１４】本発明の第４の実施例に係る細胞外に分泌されたインスリン量を示すグラフである。
【図１５】本発明の第５の実施例に係る微小管構造の共焦点蛍光顕微鏡写真である。なお、校正棒は１０μｍを示す。
【図１６】本発明の第５の実施例に係るＣＬＡＳＰ２の細胞内局在を示す蛍光顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に本発明の実施の形態を説明する。
マウス膵β細胞由来ＭＩＮ６細胞株は、グルコース及び分泌促進物質に対するインスリン分泌応答を維持している膵β細胞株である(Miyazaki, J., Araki, K., Yamato, E., Ikegami, H., Asano, T., Shibasaki, Y., Oka, Y., and Yamamura, K. (1990). Establishment of a Pancreatic β Cell Line That Retains Glucose-Inducible Insulin Secretion: Special Reference to Expression of Glucose Transporter Isoforms. Endocrinology 127, 126-132.)。本発明者らは、約３ヶ月という従来と比して長期にわたって継代培養可能であり、グルコース濃度依存的に緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）を融合したインスリンを発現するＭＩＮ６細胞（ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞）を初めて作製した。本発明の実施の形態に係るＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞は、ＭＩＮ６細胞に、配列番号２のプレプロインスリン（ｐｒｅｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ）のｃＤＮＡ領域を含む配列番号１の核酸を導入することにより、作製される。
【００１５】
また、本発明者らは、ＧＳＫ３βの活性状態を変化させ、その際のグルコース依存性インスリン分泌への影響を解析した。その結果、ＧＳＫ３βの阻害剤である塩化リチウム（Klein, P. S., and Melton, D. A. (1996). A molecular mechanism for the effect of lithium on development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 8455-8459)を投与すると、細胞膜近傍のインスリン分泌顆粒数が増加するにもかかわらず、グルコース及び脱分極刺激によるインスリン分泌が抑制されることを、本発明者らは見いだした。さらに、ＲＮＡ干渉法により内在性ＧＳＫ３βの発現を抑制することによっても、インスリン分泌が抑制されることを、本発明者らは見いだした。
【００１６】
本発明者らの上記知見に基づき、本発明の実施の形態に係るインスリン分泌抑制剤は、塩化リチウムを含む。また、本発明の別の実施の形態に係るインスリン分泌抑制剤は、ＧＳＫ３β−ｓｉＲＮＡを含む。
【００１７】
（第１の実施例：インスリン−ＧＦＰ細胞株の樹立）
図１に示し、配列番号２のプレプロインスリンのｃＤＮＡ領域を含む配列番号１の配列を有するマウスｐＥＧＦＰ−プレプロインスリン・プラスミドを、マウス膵βモデル細胞であるＭＩＮ６細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、を用い、製造者のマニュアルに従って行った。トランスフェクションの翌日に、トリプシン溶液によって培養皿からＭＩＮ６細胞を剥がした。さらに、３００ｎｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭ−１０％非動化ＦＢＳ培地中に剥がしたＭＩＮ６細胞を蒔き、培養した。その後、３日ごとにＧｅｎｅｔｉｃｉｎを含む培地を交換した。
【００１８】
７乃至１０日後に、マウスｐＥＧＦＰ−プレプロインスリン・プラスミドが染色体内に組み込まれたため、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ耐性となった細胞コロニーが出現したため、これらを２４ウェルのプレート２枚に単離した。なお、２枚のプレートのうち１枚はマスタープレートとして用い、もう１枚は後述するグルコース依存的インスリンアッセイに用いた。培養液には、２５ｍｍｏｌ／Ｌグルコース、１０ｖ／ｖ％胎仔血清、５０μｍｏｌ／Ｌメルカプトエタノール、１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシン、及び６０．５ｍｇ／Ｌ硫酸ペニシリンを添加したＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。アッセイ用のプレート内の細胞コロニーの形成が成熟したところで、後述する全反射蛍光顕微鏡法により、ＧＦＰ標識インスリンの分泌を生化学的又は形態学的に定量した。
【００１９】
具体的には、細胞膜直下１００ｎｍ以内におけるＧＦＰ標識インスリン顆粒の動態を、全反射顕微鏡により解析した。顕微鏡観察の３０分前、クレブスーリンガー重炭酸塩緩衝液（ＫＲＨ）緩衝液（ＮａＣｌ  １１９ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＣｌ  ４．７４ｍｍｏｌ／Ｌ、ＣａＣｌ2  ２．５４ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ2  １．１９ｍｍｏｌ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4  １．１９ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＨＣＯ3  ２５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．５％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）で、細胞を３０分、３７℃で培養した。全反射蛍光顕微鏡は、開口数１．４５の１００倍の対物レンズ（ＰｌａｎＡＰＯ，ＴＩＲＦＭ、オリンパス株式会社）を用いて構築した。蛍光像は、ＥＭ−ＣＣＤカメラ（Ｃ９１００−０２、浜松ホトニクス株式会社）を用いて撮影した。
【００２０】
グルコース刺激の前では、図２に示すように、細胞膜上に多数の蛍光輝点が観察された。従来、電子顕微鏡解析より、細胞膜直下１００ｎｍ以内に存在する顆粒は、「形態学的細胞膜上ドッキング分泌顆粒」と呼ばれている（Zenisek, D., Steyer, J. A., and Almers, W. (2000). Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones. Nature 406, 849-854, Rizzoli, S. O., and Betz, W. J. (2004). The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles. Science. 303, 2037-2039.)。全反射顕微鏡で観察された蛍光輝点は、細胞膜にドッキングしているＧＦＰ標識インスリン顆粒であると考えられる。
【００２１】
次に、細胞に２５ｍｍｏｌ／Ｌの高グルコース刺激を与え、１００ミリ秒間隔で単一のインスリン顆粒の全反射蛍光顕微鏡連続写真を撮影した。その結果、図２に示した領域１，２において、ＧＦＰ標識インスリン顆粒の蛍光強度が、図３及び図４に示すように、一過的に急激に増大し、その後減少することが明らかになった。このような一過性の蛍光強度変化は、他の内分泌細胞や通常の膵β細胞でも観察されることから(Tsuboi, T. (2009). Molecular mechanism of attachment process of dense-core vesicles to the plasma membrane in neuroendocrine cells. Neurosci. Res. 63, 83-88)、グルコース刺激により、ＧＦＰ標識インスリンが、細胞外に放出されたことを示している。
【００２２】
また、単一のインスリン顆粒の動態を可視化解析した結果、分泌反応を示したＧＦＰ標識インスリン顆粒の多くは、細胞膜にドッキングしていた顆粒ではなく、新しく細胞膜に輸送されたばかりの顆粒であることが分かった。このように、全反射蛍光顕微鏡観察によりグルコース濃度依存的なＧＦＰ標識インスリン分泌能が確認され、繊維芽細胞様の形態を有するクローンを、ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞とした。なお、繊維芽細胞様の形態を有するクローンは、グルコース濃度依存的なＧＦＰ標識インスリン分泌能を示したが、繊維芽細胞様の形態を有さないクローンは、グルコース濃度依存的なＧＦＰ標識インスリン分泌能を示さなかった。
【００２３】
ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞は、正常な膵ランゲルハンス島と同様に、ジアゾキシド、グリベンクラミド、アセチルコリン、及び高カリウム（７０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ）刺激によっても、ＧＦＰ標識インスリン分泌反応を示した。また、正常な膵ランゲルハンス島と同様に、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤（３−イソブチル−１−メチルキサンチン：ＩＢＭＸ）、アデニル酸シクラーゼの活性化剤（フォルスコリン）、及び膜透過性ｃＡＭＰ誘導体（８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ）の投与は、ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞のグルコース濃度依存的インスリン分泌を増強した。
【００２４】
（第２の実施例：ＧＳＫ３βの不活性化によるインスリン分泌抑制）
グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β（ＧＳＫ３β）の活性状態がインスリン分泌へどのような影響を与えるかを検討するため、実施例１で得られたＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞に、ＧＳＫ３βの阻害剤である２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化リチウムを２時間投与した。その後、細胞膜にドッキングしているＧＦＰ標識インスリン顆粒数を全反射蛍光顕微鏡で測定し、細胞内のＧＦＰ標識インスリン顆粒数を共焦点蛍光顕微鏡で測定した。その結果、図５及び図６に示すように、細胞膜にドッキングしているＧＦＰ標識インスリン顆粒は、塩化リチウムの投与により有意に増加していた。一方、図７に示すように、細胞内のＧＦＰ標識インスリン顆粒数には変化がなかったが、細胞膜近傍にＧＦＰ標識インスリン顆粒が集積している様子が観察された。
【００２５】
次に、ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞を塩化リチウム処理した場合に、グルコース及び高カリウム刺激がインスリン分泌へ与える影響を測定した。その結果、塩化リチウム処理は、図８に示すように、グルコース及び高カリウム刺激依存性のインスリン分泌を強力に抑制することが明らかになった。以上の結果から、ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞への塩化リチウム処理が、ミトコンドリアの代謝機能や、細胞膜上のＣａ2+チャネルの機能を直接阻害している可能性が示された。
【００２６】
（第３の実施例：塩化リチウムによるインスリン分泌の抑制機構）
塩化リチウム処理を行ったＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞にグルコース及び高カリウム刺激を与えた際の、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ濃度及び［Ｃａ2+］i濃度の変化を測定した。
【００２７】
ミトコンドリアにおけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ濃度は、波長３６０ｎｍの励起光を用い、フラビンの波長４６０ｎｍの自家蛍光を倒立顕微鏡で測定することにより、測定した。ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞内の［Ｃａ2+］i濃度は、次のように測定した。まず、ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞を、Ｆｕｒａ  Ｒｅｄ−ＡＭ（２μｍｏｌ／Ｌ、株式会社同仁化学研究所）を添加したＫＲＨ緩衝液で３０分、３７℃で培養した。その後、ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞を、ＫＲＨ緩衝液で３回洗浄した。さらに、倒立顕微鏡上で培養液を３７℃に保ち、４０倍の対物レンズ（ＵＡｐｏ）を用いて、ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞の落射蛍光像を得た。Ｆｕｒａ  Ｒｅｄからの蛍光は、ＤＰＳＳレーザ（４８８ｎｍ、２０ｍＷ、古河電気工業株式会社）を用いて、５秒間隔でＥＭ−ＣＣＤカメラ（Ｃ９１００−０２、浜松ホトニクス株式会社）を用いて撮影した。
【００２８】
その結果、図９に示すように、塩化リチウム処理の有無にかかわらず、グルコース刺激により、ミトコンドリア内のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ産生量は上昇した。また、図１０に示すように、塩化リチウム処理の有無にかかわらず、グルコース及び高カリウム刺激は、［Ｃａ2+］i濃度変化に影響を与えなかった。よって、塩化リチウムは、細胞内シグナル伝達系を阻害するのではなく、インスリン分泌機構の最終段階、すなわち、インスリン分泌顆粒が細胞膜と融合する過程を阻害することが示唆された。
【００２９】
（第４の実施例：内在性ＧＳＫ３βのノックダウン）
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（インビトロジェン）を用いて、１０ｐｍｏｌ／ＬのＧＳＫ３β−ｓｉＲＮＡをＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞に導入し、内在性ＧＳＫ３βをノックダウンした際のインスリン分泌を測定した。具体的には、Ａｍｂｉｏｎ社製  Ｐｒｅ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ＩＤ：７４４８１を用いてＧＳＫ３β−ｓｉＲＮＡをＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞に導入して４８時間後、ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞をＫＲＨ緩衝液で洗浄した。さらに、ＫＲＨ緩衝液を用いて、ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞を３７℃で３０分間培養した。その後、３７℃におけるＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞を、全反射蛍光顕微鏡で観察した。
【００３０】
その結果、ＧＳＫ３βのノックダウンにより、図１１の全反射蛍光顕微鏡写真及び図１２のグラフに示すように、細胞膜にドッキングしているＧＦＰ標識インスリン顆粒は有意に増加した。しかし、図１３の共焦点蛍光顕微鏡に示すように、細胞内のＧＦＰ標識インスリン顆粒数は変化せず、細胞膜近傍にＧＦＰ標識インスリン顆粒が集積していることが確認された。
【００３１】
次に、ＧＳＫ３βをノックダウンした場合における、グルコース及び高カリウム刺激がインスリン分泌へ与える影響を測定した。具体的には、グルコースを含むＫＲＨ緩衝液、又は５０ｍｍｏｌ／Ｌでカリウムを含むＫＲＨ緩衝液でＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞を３時間培養した。その後、培養液の上清を回収し、ヒトインスリン測定ＥＬＩＳＡキット（株式会社森永生科学研究所）を用いて、インスリン分泌を測定した。その結果、図１４に示すように、ＧＳＫ３βをノックダウンすることにより、グルコース及び高カリウム刺激依存性のインスリン分泌が有意に抑制された。なお、Ａｍｂｉｏｎ社製  Ｐｒｅ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｓｉＲＮＡのうち、ＩＤ：７４４８１が最もＧＳＫ３βの抑制効率が高く、約４０％までＧＳＫ３βを抑制した。
【００３２】
（第５の実施例：塩化リチウムによるβチューブリン及びＣＬＡＳＰ２への影響）
細胞の微小管のプラス端には、微小管−小胞結合タンパク質ＣＬＩＰ（ｃｙｔｏｐｌａｓｕｍｉｃ  ｌｉｎｋｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）や、それに結合するＣＬＡＳＰ（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）ｓと呼ばれるタンパク質群が局在している。これらのタンパク質は、微小管のプラス端が細胞膜の特定部位を探知して捕捉する“Ｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ”機能に重要な役割を果たしており、アクチン繊維上の低分子量Ｇタンパク質であるＲａｃのエフェクター分子であるＩＱＧＡＰ１と、ＡＰＣと、に結合し、微小管を安定化させると考えられている。
【００３３】
ＧＳＫ３βは、ＣＬＡＳＰｓの中でもＣＬＡＳＰ２をリン酸化し、微小管との結合を抑制する。そのため、ＧＳＫ３βの活性の抑制は、微小管に沿って輸送されるインスリン分泌顆粒の細胞質から細胞膜上への受け渡しを抑制するのではないかと考えられる。そこで、２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化リチウム（シグマ−アルドリッチ）で３時間処理した後のＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞における、微小管及びＣＬＡＳＰ２の細胞内局在を、蛍光免疫染色により確認した。
【００３４】
具体的には、ポリＬ―リジンコートされたガラスボトムディッシュ上でＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞を４８時間培養し、その後、ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞をアセトンを用いて室温で１０分間固定した。次に、ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞を０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳで３分間洗浄した。さらに３％ウシ血清アルブミンを含むブロッキングバッファを用いて室温で１時間、ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞を洗浄した。その後、ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞と、抗βチューブリン抗体又は抗ＣＬＡＳＰ２抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含むブロッキングバッファと、を４℃で一晩反応させた。次に、ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞と、蛍光標識抗ウサギ抗体（Ａｌｅｘａ−５４６  ａｎｔｉ−Ｒａｂｉｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含むブロッキングバッファと、を室温で１時間反応させた。染色したＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞は、蛍光褪色防止剤含有封入剤で固定し、共焦点レーザ顕微鏡（ＬＳＭ−５１０、カールツァイス株式会社）で観察した。
【００３５】
すると、塩化リチウム処理により微小管形成中心が破壊され、それに伴い、図１５に示すように、ＧＦＰ標識インスリン顆粒が細胞膜に集積することが明らかになった。また、塩化リチウム処理により、図１６に示すように、ＣＬＡＳＰ２は、細胞膜上にも局在するようになることが明らかになった。以上の結果より、ＧＳＫ３βは、微小管に沿って輸送されるインスリン分泌顆粒を細胞質から細胞膜へと受け渡すスイッチ的な役割をしていることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明により、長期継代培養に耐え、グルコース濃度依存的にＧＦＰ標識インスリンを分泌するＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞が提供される。ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞の培養液を回収し、蛍光分光光度計や蛍光プレートリーダで蛍光測定を行うことで、ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞のインスリン分泌量は簡便に測定可能である。したがって、ＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞は、新たな２型糖尿病治療薬候補化合物のハイスループットスクリーニング、及びインスリン分泌を制御する新規タンパク質の同定等に利用可能である。さらに、様々な臓器から抽出した機能が同定されていないペプチドをＭＩＮ６インスリン−ＧＦＰ細胞に投与してインスリン分泌量を測定することで、新規生理活性物質の同定も可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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