(57)【要約】【課題】  本発明は、ウシ個体における脂肪交雑に関する遺伝的能力を評価するマーカー及びそれを用いた脂肪交雑に関する遺伝的能力の評価法を提供すること。【解決手段】  ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域７１８番目の塩基が、少なくとも一方のアレルにおいてＡに変異しているか否かを判定し、塩基がＡに変異している場合に、その個体の脂肪交雑を増加させる遺伝的能力が、前記塩基がＧであるウシ個体よりも高いと評価する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域７１８番目の塩基に対応する塩基を含み、
当該含まれている塩基がＡであることを特徴とする、単離されたＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号１における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域１３２２番目の塩基に対応する塩基を含み、
当該含まれている塩基がＧであることを特徴とする、単離されたＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号１における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域１４５０番目の塩基に対応する塩基を含み、
当該含まれている塩基がＴであることを特徴とする、単離されたＤＮＡ。
【請求項４】
ウシ個体における脂肪交雑の度合いを増加させる遺伝的能力を評価するマーカーであって、
配列番号１における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域７１８番目、１３２２番目、１４５０番目、配列番号３における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域９８４７番目、配列番号４における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域４７６３２番目、または配列番号２における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン７の３’下流域２７３４８番目の塩基に対応する塩基を含むＤＮＡから成る群から選択されることを特徴とする、マーカー。
【請求項５】
ウシ個体における脂肪交雑の度合いを増加させる遺伝的能力を評価する評価方法であって、
前記ウシ個体から単離されたＤＮＡに対し、少なくとも一方のアレルにおいて、配列番号１における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域７１８番目の塩基に対応する塩基がＡであるか否かを判定する工程を含む評価方法。
【請求項６】
ウシ個体における脂肪交雑の度合いを増加させる遺伝的能力を評価する評価方法であって、
前記ウシ個体から単離されたＤＮＡに対し、少なくとも一方のアレルにおいて、配列番号１における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域１３２２番目の塩基に対応する塩基がＧであるか否かを判定する工程を含む評価方法。
【請求項７】
ウシ個体における脂肪交雑の度合いを増加させる遺伝的能力を評価する評価方法であって、
前記ウシ個体から単離されたＤＮＡに対し、少なくとも一方のアレルにおいて、配列番号１における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域１４５０番目の塩基に対応する塩基がＴであるか否かを判定する工程を含む評価方法。
【請求項８】
ウシ個体における脂肪交雑の度合いを増加させる遺伝的能力を評価する評価方法であって、
前記ウシ個体から単離されたＤＮＡに対し、少なくとも一方のアレルにおいて、配列番号２における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン７の３’下流域２７３４８番目の塩基に対応する塩基がＡであるか否かを判定する工程を含む評価方法。
【請求項９】
ウシ個体における脂肪交雑の度合いを増加させる遺伝的能力を評価する評価方法であって、
前記ウシ個体から単離されたＤＮＡに対し、少なくとも一方のアレルにおいて、配列番号３における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域９８４７番目の塩基に対応する塩基がＣであるか否かを判定する工程を含む評価方法。
【請求項１０】
ウシ個体における脂肪交雑の度合いを増加させる遺伝的能力を評価する評価方法であって、
前記ウシ個体から単離されたＤＮＡに対し、少なくとも一方のアレルにおいて、配列番号４における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域４７６３２番目の塩基に対応する塩基がＴであるか否かを判定する工程を含む評価方法。
【請求項１１】
前記ウシ個体の脂肪交雑を増加させる遺伝的能力が、配列番号１における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域７１８番目の塩基に対応する塩基がＧであるウシ個体よりも高いと評価する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項１２】
脂肪交雑の度合いを増加させる遺伝的能力の高いウシ個体を選択する選択方法であって、
請求項５〜１１のいずれか１項に記載の評価方法によって、ウシ個体の当該遺伝的能力を評価する評価工程を含む選択方法。
【請求項１３】
前記評価工程によって、遺伝的能力が高いと評価されたウシ個体を選択する工程をさらに含む。請求項１２に記載の選択方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシ個体における脂肪交雑に関する遺伝的能力を評価するマーカー及びそれを用いた脂肪交雑に関する遺伝的能力の評価法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウシの肉質や枝肉重量は価格に直結する経済形質である。特に、脂肪交雑は、筋肉組織内に脂肪が蓄積された状態をいうが、脂肪が霜降り状に細かく濃密に入ったものが良いとされており、柔らかさなどの肉質に大きく影響している。このような肉質や枝肉重量に関する遺伝的能力をどのように評価し、ウシの改良に役立てるかについては、育種価による方法などが考案され、用いられてきた。
【０００３】
肉質や枝肉重量は複数の遺伝子が関与する量的形質と考えられる。もし、肉質や枝肉重量に比較的大きな影響を与える遺伝子またはゲノム領域（ＱＴＬ）が特定でき、優良な遺伝子型の判別ができれば、それをウシの改良に利用することができる。
【０００４】
これまでに、黒毛和種種雄牛の父方半きょうだい家系を用いたＱＴＬ解析により、ウシ4番染色体上に脂肪交雑に影響を与えるゲノム領域が存在することが報告されている（非特許文献1参照）。その後、別の黒毛和種種雄牛において4番染色体上の同じ領域に脂肪交雑ＱＴＬが確認され、ハプロタイプ比較と関連解析によって、このＱＴＬが４６ｃＭ付近の３．７Ｍｂの領域内に存在することが明らかになった（非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Mizoguchi et al. (2006) Animal Genetics 37, 51-54
【非特許文献２】Yokouchi et al. (2009) Animal Genetics 40, 945-951
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、実際に、どのような遺伝情報が優良型遺伝的形質を担っているのかわからないため、ウシ個体における脂肪交雑に関する遺伝的能力を評価する際、遺伝子型などの遺伝情報を用いることができなかった。
【０００７】
そこで、本発明は、ウシ個体における脂肪交雑に関する遺伝的能力を評価するマーカー及びそれを用いた脂肪交雑に関する遺伝的能力の評価法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ウシ4番染色体上の脂肪交雑に影響を与えるゲノム領域を詳細に解析することにより、ウシpantophysin遺伝子の５’上流域にあるＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism）のうち、Ｓ１部位（ＳＮＰ２７）におけるＳＮＰが、脂肪交雑に影響すること、それによって、Ｓ１部位を含み、Ｓ１部位における塩基がＡであるＤＮＡが、脂肪交雑を増加させる遺伝子マーカーとして有用であることを見出した。加えて、ＳＮＰ２９、ＳＮＰ３０、ARS-BFGL-NGS-20161、BTB-00183730、BTA-70505-no-rsの各ＳＮＰが、Ｓ１部位のＳＮＰと連鎖不平衡にあること、および、Ｓ１部位の塩基がＡであるウシ個体の筋肉間脂肪組織では、pantophysin遺伝子の発現量が相対的に高くなっていたことから、Ｓ１部位がＱＴＬの責任ＳＮＰであることを明らかにし、本発明の完成に至った。
【０００９】
ここで、本明細書においてＳ１部位（ＳＮＰ２７）とは、ウシゲノム配列（Btau4.0）４番染色体の４９１００５８５番目に対応する位置であり、配列番号１において、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流側７１８番目に対応する位置である。
【００１０】
また、ＳＮＰ２９はウシゲノム配列（Btau4.0）４番染色体の４９１０１１８９番目に対応する位置であり、配列番号１において、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流側１３２２番目に対応する位置である。
【００１１】
ＳＮＰ３０はウシゲノム配列（Btau4.0）４番染色体の４９１０１３１７番目に対応する位置であり、配列番号１において、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流側１４５０番目に対応する位置である。
【００１２】
ARS-BFGL-NGS-20161（ＮＣＢＩ ＡｓｓａｙＩＤ：ｓｓ８６２９０２１５）はウシゲノム配列（Btau4.0）４番染色体の４９０３６５１８番目に対応する位置であり、配列番号２において、ウシpantophysin遺伝子のエクソン７の３’下流側２７３４８番目に対応する位置である。
【００１３】
BTB-00183730（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＳＮＰ：ｒｓ４３３９８４１５）はウシゲノム配列（Btau4.0）４番染色体の４９１０９７１４番目に対応する位置であり、配列番号３において、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流側９８４７番目に対応する位置である。
【００１４】
BTA-70505-no-rs（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＳＮＰ：ｒｓ４１６０２６９０）はウシゲノム配列（Btau4.0）４番染色体の４９１４７４９９番目に対応する位置であり、配列番号４において、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流側４７６３２番目に対応する位置である。
【００１５】
ここで、本明細書では、pantophysin遺伝子において、pantophysinタンパク質をコードするＤＮＡ鎖をセンスＤＮＡ鎖とする。そのため、Btau4.0に記載のウシゲノム配列はアンチセンスＤＮＡ鎖となる。本明細書において、ＳＮＰの塩基は特記しない限りセンスＤＮＡ鎖の塩基によって示す。
【００１６】
なお、本明細書で、エクソン１の５’上流側Ｎ番目とは、エクソン１の外側で隣接する塩基のうち、上流側の塩基を１番目とし、上流方向に向けて数えた番号を表す。
【００１７】
なお、本明細書で、エクソン７の３’下流側Ｎ番目とは、エクソン７の外側で隣接する塩基のうち、下流側の塩基を１番目とし、下流方向に向けて数えた番号を表す。
【００１８】
また、各ＳＮＰは、ウシゲノム配列（Btau4.0）４番染色体上の位置、および、配列番号１〜４で示されるpantophysin遺伝子のエクソン１から上流方向に数えた塩基番号、あるいは、pantophysin遺伝子のエクソン７から下流方向に数えた塩基番号によって特定されているが、それらの位置と対応する位置にあればよく、個体によりそれらＳＮＰが含まれるゲノムＤＮＡ上に、塩基の欠失や挿入がある場合は、必ずしも位置を表す数字まで一致する必要はない。
【００１９】
すなわち、本発明に係るＤＮＡは、配列番号１における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域７１８番目の塩基に対応する塩基を含み、当該含まれている塩基がＡであることを特徴とする、単離されたＤＮＡである。
【００２０】
また、本発明に係るＤＮＡは、配列番号１における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域１３２２番目の塩基に対応する塩基を含み、当該含まれている塩基がＧであることを特徴とする、単離されたＤＮＡである。
【００２１】
本発明に係るＤＮＡは、配列番号１における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域１４５０番目の塩基に対応する塩基を含み、当該含まれている塩基がＴであることを特徴とする、単離されたＤＮＡである。
【００２２】
本発明に係るマーカーは、ウシ個体における脂肪交雑の度合いを増加させる遺伝的能力を評価するマーカーであって、配列番号１における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域７１８番目、１３２２番目、１４５０番目、配列番号３における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域９８４７番目、配列番号４における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域４７６３２番目、または配列番号２における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン７の３’下流域２７３４８番目の塩基に対応する塩基を含むＤＮＡから成る群から選択されることを特徴とする。
【００２３】
本発明に係る評価方法は、ウシ個体における脂肪交雑の度合いを増加させる遺伝的能力を評価する評価方法であって、ウシ個体から単離されたＤＮＡに対し、少なくとも一方のアレルにおいて、配列番号１における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域７１８番目の塩基に対応する塩基がＡであるか否かを判定する工程を含む。
【００２４】
本発明に係る評価方法は、ウシ個体における脂肪交雑の度合いを増加させる遺伝的能力を評価する評価方法であって、ウシ個体から単離されたＤＮＡに対し、少なくとも一方のアレルにおいて、配列番号１における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域１３２２番目の塩基に対応する塩基がＧであるか否かを判定する工程を含む。
【００２５】
本発明に係る評価方法は、ウシ個体における脂肪交雑の度合いを増加させる遺伝的能力を評価する評価方法であって、ウシ個体から単離されたＤＮＡに対し、少なくとも一方のアレルにおいて、配列番号１における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域１４５０番目の塩基に対応する塩基がＴであるか否かを判定する工程を含む。
【００２６】
本発明に係る評価方法は、ウシ個体における脂肪交雑の度合いを増加させる遺伝的能力を評価する評価方法であって、ウシ個体から単離されたＤＮＡに対し、少なくとも一方のアレルにおいて、配列番号２における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン７の３’下流域２７３４８番目の塩基に対応する塩基がＡであるか否かを判定する工程を含む。
【００２７】
本発明に係る評価方法は、ウシ個体における脂肪交雑の度合いを増加させる遺伝的能力を評価する評価方法であって、ウシ個体から単離されたＤＮＡに対し、少なくとも一方のアレルにおいて、配列番号３における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域９８４７番目の塩基に対応する塩基がＣであるか否かを判定する工程を含む。
【００２８】
本発明に係る評価方法は、ウシ個体における脂肪交雑の度合いを増加させる遺伝的能力を評価する評価方法であって、ウシ個体から単離されたＤＮＡに対し、少なくとも一方のアレルにおいて、配列番号４における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域４７６３２番目の塩基に対応する塩基がＴであるか否かを判定する工程を含む。
【００２９】
ここで、本発明に係る評価方法はいずれも、ウシ個体の脂肪交雑を増加させる遺伝的能力が、配列番号１における、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域７１８番目の塩基に対応する塩基がＧであるウシ個体よりも高いと評価する工程をさらに含むことが好ましい。
【００３０】
本発明に係る選択方法は、脂肪交雑の度合いを増加させる遺伝的能力の高いウシ個体を選択する選択方法であって、上記いずれかの評価方法によって、ウシ個体の当該遺伝的能力を評価する評価工程を含むことを特徴とする。この評価工程によって、遺伝的能力が高いと評価されたウシ個体を選択する工程をさらに含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、ウシ個体における脂肪交雑に関する遺伝的能力を評価するマーカー及びそれを用いた脂肪交雑に関する遺伝的能力の評価法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の一実施形態において、黒毛和種去勢牛１９１１２頭の脂肪交雑等級上位集団４０６頭（脂肪交雑等級（ＢＭＳ） ９以上）および下位集団４１２頭（ＢＭＳ ４以下）を用いて、ウシ４番染色体上の２６か所のＳＮＰマーカーにおける、隣接するマーカーペアからなるQハプロタイプと脂肪交雑等級との関連性（Ａ）、および各ＳＮＰ間の連鎖不平衡（Ｂ）を解析した図である。
【図２】本発明の一実施形態における、ウシ４番染色体上のＳＮＰ２０とＳＮＰ２１を含む約０．７Ｍｂの連鎖不平衡領域に存在する４つの遺伝子、および、優良型ハプロタイプ（Ｑ）または非優良型ハプロタイプ（ｑ）をホモで保有するウシ個体における、筋肉間脂肪組織中の各遺伝子発現量を示すグラフである（Ｎは個体数）。
【図３】本発明の一実施形態における、pantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域２ｋｂに存在する６つのＳＮＰ（ＳＮＰ２７〜３２）の配置、および、６つのＳＮＰを含む１．８ｋｂまたはＳＮＰ２７のみを含む０．９ｋｂの優良型ハプロタイプ（Ｑ）と非優良型ハプロタイプ（ｑ）における転写活性（Ａ）、６つのＳＮＰのうちＳＮＰ２７のみをｑ型に置換した場合（-1.8k(Q)_S27q/pGL3）の転写活性（Ｂ）を示すグラフである。
【図４】本発明の一実施形態における、黒毛和種集団におけるＳＮＰ２７〜３２の各ＳＮＰ間の連鎖不平衡度を示す図である。
【図５】本発明の一実施形態における、黒毛和種集団におけるＳＮＰ２７と既知の各ＳＮＰ間の連鎖不平衡度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００３４】
実施の形態及び実施例に特に説明が無い場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd. などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明がない場合、それらに添付のプロトコルを用いる。
【００３５】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００３６】
== ウシpantophysin遺伝子周辺のＳＮＰ ==
ウシゲノム配列（Btau4.0）において、センスＤＮＡ鎖のＳ１部位に対応する部位の塩基はＣであり、従って、センスＤＮＡ鎖上のpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域のＳ１部位における塩基はＧであるが、実施例に示すように、Ｓ１部位における塩基がＡである場合、pantophysin遺伝子が高発現し、脂肪交雑の度合いが増加する。従って、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域のＳＮＰのうちで、Ｓ１部位における塩基を決定すれば、脂肪交雑に関する遺伝的能力を評価したり、予測したりすることができる。なお、ウシpantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域とは、ウシpantophysin遺伝子転写領域であるエクソン１の外側であって、上流側の領域を意味する。
【００３７】
Ｓ１部位のＳＮＰと連鎖不平衡にある、pantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域に存在するＳＮＰとしては、例えば、ＳＮＰ２９、ＳＮＰ３０、BTB-00183730、BTA-70505-no-rsが挙げられる。また、Ｓ１部位のＳＮＰと連鎖不平衡にあるpantophysin遺伝子のエクソン７の３’下流域に存在するＳＮＰとしては、ARS-BFGL-NGS-20161が挙げられる。なお、ウシpantophysin遺伝子のエクソン７の３’下流域とは、ウシpantophysin遺伝子転写領域であるエクソン７の外側であって、下流側の領域を意味する。
【００３８】
具体的には、Ｓ１部位における塩基がＧである時、ＳＮＰ２９における塩基はＣであり、ＳＮＰ３０における塩基はＡであり、ARS-BFGL-NGS-20161における塩基はＧであり、BTB-00183730における塩基はＴであり、BTA-70505-no-rsにおける塩基はＣである。一方、Ｓ１部位における塩基がＡである時、ＳＮＰ２９における塩基はＧであり、ＳＮＰ３０における塩基はＴであり、ARS-BFGL-NGS-20161における塩基はＡであり、BTB-00183730における塩基はＣであり、BTA-70505-no-rsにおける塩基はＴである。従って、ウシpantophysin遺伝子エクソン１の５’上流域のＳＮＰのうちで、ＳＮＰ２９、ＳＮＰ３０、BTB-00183730、BTA-70505-no-rs、における塩基を決定し、変異があるか否かを調べることによって、あるいは、ウシpantophysin遺伝子エクソン７の３’下流域のARS-BFGL-NGS-20161における塩基を決定し、変異があるか否かを調べることによって、Ｓ１部位と同様に、脂肪交雑に関する遺伝的能力を評価したり、予測したりすることができる。
【００３９】
==マーカー==
本発明において、ウシ個体の脂肪交雑の度合いを評価するためのマーカーは、ウシゲノム配列（Btau4.0）におけるＳ１部位を含む、単離されたウシゲノムＤＮＡであってもよい。また、Ｓ１部位の塩基に変異が生じている場合、Ｓ１部位のＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰにおいても高い確率で塩基の変異が生じるから、マーカーは、Ｓ１部位のＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを含む、単離されたウシゲノムＤＮＡであってもよく、そのようなウシゲノムＤＮＡとして、例えば、ＳＮＰ２９、ＳＮＰ３０、ARS-BFGL-NGS-20161、BTB-00183730、およびBTA-70505-no-rs等を含むゲノムＤＮＡが挙げられる。
【００４０】
マーカーがＤＮＡの場合、上記ＳＮＰを検出するためには、ＳＮＰを有する塩基を決定すればよい。具体的には、塩基配列を直接決定してもよく、ＰＣＲを利用してもよく、ＲＦＬＰを利用してもよく、特に検出方法は限定されない。ＳＮＰを直接検出する場合、配列を決定するゲノムＤＮＡには、例えばpantophysin遺伝子全体が含まれる必要は無く、決定すべきＳＮＰを有する塩基が含まれ、その塩基を決定することができれば十分である。
【００４１】
==脂肪交雑に関する遺伝的能力の評価方法==
ウシ個体から単離されたＤＮＡに対し、少なくとも一方のアレルにおいて、Ｓ１部位における塩基がＡであるかどうかは、Ｓ１部位の塩基そのものを決定することにより調べることができ、例えば、ウシ細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、Ｓ１部位の塩基を常法によって決定すればよい。
【００４２】
Ｓ１部位の塩基がＧ／Ａのヘテロ接合またはＡのホモ接合であれば、そのウシの脂肪交雑の度合いを高める遺伝的能力が、Ｇのホモ接合の個体より高いと評価できる。さらに、Ａのホモ接合であれば、Ｇ／Ａのヘテロ接合である個体よりもそのウシの脂肪交雑の度合いを高める遺伝的能力がさらに高いと評価できる。
【００４３】
ここで、Ｓ１部位の塩基は、Ｓ１部位の塩基そのものを決定して調べるのが最も正確であるが、Ｓ１部位と連鎖不平衡にあるＳＮＰを調べ、その結果によって、Ｓ１部位の塩基を推定してもよい。Ｓ１部位と連鎖不平衡にあるＳＮＰとして、例えば、ＳＮＰ２９、ＳＮＰ３０、ARS-BFGL-NGS-20161、BTB-00183730、およびBTA-70505-no-rs等が挙げられる。具体的には、ウシ個体から単離されたＤＮＡに対し、少なくとも一方のアレルにおいて、ＳＮＰ２９、ＳＮＰ３０、ARS-BFGL-NGS-20161、BTB-00183730、およびBTA-70505-no-rsにおける塩基が、それぞれＧ、Ｔ、Ａ、Ｃ、およびＴであるかどうか調べればよい。全てのＳＮＰを調べる必要はなく、調べるのは、最低１つのＳＮＰでよいが、Ｓ１部位の塩基をより正確に推定するために、ＳＮＰ２９、ＳＮＰ３０、ARS-BFGL-NGS-20161、BTB-00183730、およびBTA-70505-no-rsのうちいずれか２つ以上のＳＮＰを調べることが好ましく、いずれか３つのＳＮＰを調べることがより好ましく、いずれか４つのＳＮＰを調べることがさらに好ましく、５つ全てのＳＮＰを調べることが最も好ましい。
【００４４】
すなわち、ＳＮＰ２９の塩基がＣ／Ｇのヘテロ接合またはＧのホモ接合であれば、それぞれＳ１部位の塩基がＧ／Ａのヘテロ接合またはＡのホモ接合であると推定でき、そのウシの脂肪交雑の度合いを高める遺伝的能力が、ＳＮＰ２９の塩基がＣのホモ接合の個体、あるいはＳ１部位の塩基がＧのホモ接合の個体より高いと評価できる。ＳＮＰ２９の塩基がＧのホモ接合であれば、ＳＮＰ２９の塩基がＣ／Ｇのヘテロ接合の個体、あるいはＳ１部位の塩基がＧ／Ａのヘテロ接合の個体よりもそのウシの脂肪交雑の度合いを高める遺伝的能力がさらに高いと評価できる。
【００４５】
ＳＮＰ３０の塩基がＡ／Ｔのヘテロ接合またはＴのホモ接合であれば、それぞれＳ１部位の塩基がＧ／Ａのヘテロ接合またはＡのホモ接合であると推定でき、そのウシの脂肪交雑の度合いを高める遺伝的能力が、ＳＮＰ３０の塩基がＡのホモ接合の個体、あるいはＳ１部位の塩基がＧのホモ接合の個体より高いと評価できる。ＳＮＰ３０の塩基がＴのホモ接合であれば、ＳＮＰ３０の塩基がＡ／Ｔのヘテロ接合の個体、あるいはＳ１部位の塩基がＧ／Ａのヘテロ接合の個体よりもそのウシの脂肪交雑の度合いを高める遺伝的能力がさらに高いと評価できる。
【００４６】
ARS-BFGL-NGS-20161の塩基がＧ／Ａのヘテロ接合またはＡのホモ接合であれば、それぞれＳ１部位の塩基がＧ／Ａのヘテロ接合またはＡのホモ接合であると推定でき、そのウシの脂肪交雑の度合いを高める遺伝的能力が、ARS-BFGL-NGS-20161の塩基がＧのホモ接合の個体、あるいはＳ１部位の塩基がＧのホモ接合の個体より高いと評価できる。ARS-BFGL-NGS-20161の塩基がＡのホモ接合であれば、ARS-BFGL-NGS-20161の塩基がＧ／Ａのヘテロ接合の個体、あるいはＳ１部位の塩基がＧ／Ａのヘテロ接合の個体よりもそのウシの脂肪交雑の度合いを高める遺伝的能力がさらに高いと評価できる。
【００４７】
BTB-00183730の塩基がＴ／Ｃのヘテロ接合またはＣのホモ接合であれば、それぞれＳ１部位の塩基がＧ／Ａのヘテロ接合またはＡのホモ接合であると推定でき、そのウシの脂肪交雑の度合いを高める遺伝的能力が、BTB-00183730の塩基がＴのホモ接合の個体、あるいはＳ１部位の塩基がＧのホモ接合の個体より高いと評価できる。BTB-00183730の塩基がＣのホモ接合であれば、BTB-00183730の塩基がＴ／Ｃのヘテロ接合の個体、あるいはＳ１部位の塩基がＧ／Ａのヘテロ接合の個体よりもそのウシの脂肪交雑の度合いを高める遺伝的能力がさらに高いと評価できる。
【００４８】
BTA-70505-no-rsの塩基がＣ／Ｔのヘテロ接合またはＴのホモ接合であれば、それぞれＳ１部位の塩基がＧ／Ａのヘテロ接合またはＡのホモ接合であると推定でき、そのウシの脂肪交雑の度合いを高める遺伝的能力が、BTA-70505-no-rsの塩基がＣのホモ接合の個体、あるいはＳ１部位の塩基がＧのホモ接合の個体より高いと評価できる。BTA-70505-no-rsの塩基がＴのホモ接合であれば、BTA-70505-no-rsの塩基がＣ／Ｔのヘテロ接合の個体、あるいはＳ１部位の塩基がＧ／Ａのヘテロ接合の個体よりもそのウシの脂肪交雑の度合いを高める遺伝的能力がさらに高いと評価できる。
【００４９】
さらに、以上の評価方法を用いて、多数のウシの中から、脂肪交雑の度合いを高める遺伝的能力の高いウシ個体を選択することができる。すなわち、各ウシ個体で、pantophysin遺伝子のエクソン１の５’上流域のＳ１部位おける塩基を決定し、一方または両方のアレルで、そのＳ１部位の塩基がＡである個体を選択すればよい。または、各ウシ個体で、ＳＮＰ２９、ＳＮＰ３０、ARS-BFGL-NGS-20161、BTB-00183730、BTA-70505-no-rsのいずれかのＳＮＰの塩基を決定し、一方または両方のアレルで、ＳＮＰ２９の塩基がＧ、ＳＮＰ３０の塩基がＴ、ARS-BFGL-NGS-20161の塩基がＡ、BTB-00183730の塩基がＣ、または、BTA-70505-no-rsの塩基がＴである個体を選択すればよい。
【００５０】
ここで、pantophysin遺伝子、pantophysin遺伝子エクソン１の５’上流域、および、pantophysin遺伝子エクソン７の３’下流域は、ウシの中で高度に保存されているため、本発明を実施する対象となるウシの種類は、黒毛和種、褐毛和種、ホルスタイン種など、特に限定されない。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例及び図を用いてより詳細に説明する。
【００５２】
[１]  ＤＮＡの抽出及びマイクロサテライトとＳＮＰのタイピング法
ゲノムＤＮＡは、精液、腎周囲脂肪もしくは血液より常法により抽出した。目的とするゲノム断片を特異的に増幅できるプライマーを用いて、ＰＣＲ法により該当ゲノム領域を増幅した。マイクロサテライトについては、リバース側プライマーを蛍光標識し、ＰＣＲ増幅産物をABI 3730 DNA アナライザー(アプライドバイオシステムズ社) で電気泳動後、GENESCANとGeneMapperソフトウェア (アプライドバイオシステムズ社)により解析することでタイピングを行った。ＳＮＰについては、Big Dye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing kit(アプライドバイオシステムズ社)を用いてＰＣＲ増幅産物のダイレクトシークエンシングを行うことによって配列を決定し、ＳＮＰの検出およびタイピングを行った。各ＳＮＰに対して用いたプライマー（配列番号５〜６６）を表１に記す。
【００５３】
【表１】
2012105554.tif 000002
【００５４】
[２]  脂肪交雑の評価方法
脂肪交雑は、屠場に出荷されたウシ枝肉の格付け成績に記載された、脂肪交雑等級（Beef Marbling Standard、ＢＭＳ）を用いた。
【００５５】
[３]  脂肪交雑等級に関するＳＮＰの統計学的処理
本実施例では、pantophysin遺伝子エクソン１の５’上流域のＳ１部位の塩基と、脂肪交雑等級に強い相関があることを示す。
【００５６】
黒毛和種種雄牛２頭（ＡとＢ）のＱＴＬ解析によって検出されたウシ４番染色体上の脂肪交雑ＱＴＬは、４６ｃＭ付近の３．７Ｍｂの領域に存在することを、本願発明者らは報告している（Yokouchi et al. (2009) Animal Genetics 40, 945-951）。種雄牛ＡとＢは、この領域に共通の優良型（Ｑ）および非優良型（ｑ）ハプロタイプを有していたので、さらに領域を絞り込むために、Ｑとｑのハプロタイプ間でヘテロであるＳＮＰを検索し、得られた２６個のＳＮＰマーカー（表２）を用いて、Ｑアレルの頻度と脂肪交雑との関連を調べた。
【００５７】
【表２】
2012105554.tif 000003
【００５８】
黒毛和種去勢牛１９，１１２頭の脂肪交雑等級上位集団（ＢＭＳ≧９；上位９．６%）のうちの４０６頭 (同じ種雄牛の産子は５頭まで)と下位集団（ＢＭＳ≦４；下位１２．２%）のうちの４１２頭（同じ種雄牛の産子は５頭まで）をＳＮＰマーカーでタイピングし、隣接する２つのＳＮＰからなるハプロタイプ頻度をＡＲＬＥＱＵＩＮ ｐｒｏｇｒａｍ（http://lgb.unige.ch/arlequin/）を用いて推定した。各ＳＮＰについて、ハプロタイプ頻度推定のアルゴリズムが要求するHardy-Weinberg平衡から逸脱していないことを、フィッシャーの正確確率検定により確認した（p>0.05）。推定されたＱハプロタイプ頻度と脂肪交雑との関連を２×２表のフィッシャーの正確確率検定で検定し、（表３「ｐ値」参照）ｐ値をプロットした結果を図１Ａに示す。なお、Ｑハプロタイプとは、複数のウシ家系の解析により検出された、ＢＭＳを向上させる効果を有する共通ハプロタイプである。ＳＮＰ２０〜ＳＮＰ２１で相関が最も強く（表２のＳＮＰ２０〜ＳＮＰ２１: p=2.01x10-5）、これらのＳＮＰを含む約０．７Ｍｂの連鎖不平衡領域（図１）に脂肪交雑ＱＴＬが存在すると考えられた。また、脂肪交雑等級上位集団と下位集団を合わせた集団における、各ＳＮＰ間の連鎖不平衡係数(r2)を図１Ｂに示す。０．７Ｍｂの領域に存在する各ＳＮＰ間ではほとんどのＳＮＰ間でr2が０．２以上であり、互いに連鎖不平衡の関係にあることが認められた。
【００５９】
【表３】
2012105554.tif 000004
【００６０】
この０．７Ｍｂのヒトの相同領域には４つの遺伝子（ATXN7L1、FLJ23834、pantophysin、nampt）が存在していたが、FLJ23834はウシでナンセンス変異を生じており、筋肉及び脂肪組織での発現も検出されなかったため責任遺伝子ではないと考えられた。残りの３遺伝子についても、Ｑとｑハプロタイプ間にアミノ酸置換を伴う変異は検出されなかった。しかしながら、表４に示すプローブ（配列番号６７〜７０）およびプライマー（配列番号７１〜７８）を用い、筋肉間脂肪組織における遺伝子発現量をＱアレル保有個体とｑアレル保有個体で比較したところ、pantophysin遺伝子では、Ｑホモ個体での発現量がｑホモ個体よりも有意に増加していた（図２）。そこで、pantophysin遺伝子の５’上流２ｋｂをさらに調べたところ、Ｑとｑハプロタイプ間で異なる６個のＳＮＰを検出した（表５）。
【００６１】
【表４】
2012105554.tif 000005
【表５】
2012105554.tif 000006
【００６２】
さらに、ウシ筋間脂肪組織由来脂肪前駆細胞株（Bovine Intramuscular Preadipocyte, BIP, Aso et al. (1995) Biochem Biophys Res Commun 213, 369-375）およびルシフェラーゼレポーターベクター（ｐＧＬ３）を用いたLuciferase assayによって、６個のＳＮＰとpantophysin遺伝子転写活性との関係について検討した。まず、ＳＮＰ２７〜３２を含むpantophysin遺伝子のエクソン１の上流１．８ｋｂ(配列番号７９)をLuciferaseに連結したコンストラクト、および、ＳＮＰ２７のみを含むエクソン１の上流０．９ｋｂ（配列番号８０）をLuciferaseに連結したコンストラクトを調製した。具体的には、エクソン１の上流１．８ｋｂあるいはエクソン１の上流０．９ｋｂの各領域を、その両端に設計したプライマー（１．８ｋｂ用プライマー：配列番号８１、８２；０．９ｋｂ用プライマー：配列番号８２、８３）を用いてＰＣＲ法により増幅し、このＰＣＲ産物を、DNA Ligation kit（Takara 社）を用いてpGL3-Basic (Promega社)のマルチクローニングサイトに挿入した。
1.8kb-f: GGGGCTAGCAATTGGGGAGGGGAATACAG（配列番号８１）
1.8kb-r/0.9kb-r: GGGAGATCTCCCCTTCCCTCAAGTCCAG（配列番号８２）
0.9kb-f: GGGGCTAGCCAAAGGCCAGCATTTCATCT（配列番号８３）
この組換えベクターをBIP細胞に導入し、Luciferase活性を測定したところ、Ｑ型に対してｑ型では転写活性が６３%低下した（図３Ａ、P<0.05、Ｎ＝４）。また、６個のＳＮＰ全てを含むエクソン１の上流１．８ｋｂをLuciferaseに連結したコンストラクトについて、Ｑ型のコンストラクトを鋳型とし、ｑ型のＳＮＰを含むプライマー（配列番号８４、８５）を用いたＰＣＲによってコンストラクト全長を増幅することでＳＮＰ２７のみをＱ型からｑ型に置換すると（-1.8k(Q)_S27q/pGL3）、転写活性が５９%低下した（図３Ｂ、P<0.05、Ｎ＝３）。
primer-q-f: AGCCTGGTAGGCTGCAGTCCAT（配列番号８４）
primer-q-r: CCTACCAGGCTCCTCCGTCCATGGGATTTT（配列番号８５）
この転写活性の低下は、ＳＮＰ２７〜３２を含むエクソン１の上流１．８ｋｂをLuciferaseに連結したコンストラクトのｑ型と同レベルであった。これらの結果から、ＳＮＰ２７がこの脂肪交雑ＱＴＬの責任ＳＮＰであると考えられた。
【００６３】
ＳＮＰ２７が、脂肪交雑に関する遺伝的能力を評価できることを確認するために、種雄牛の育種価とＳＮＰ２７との相関を調べた。ここで、「育種価」とは種雄牛が有する経済形質に関する遺伝的能力の推定値であり、枝肉重量、ロース芯面積、バラの厚さ、皮下脂肪厚、歩留、および脂肪交雑の各経済形質について、後代の子牛の成績をもとにそれぞれ算出される。ここでは、脂肪交雑の優劣に関する等級であって、劣等から優秀まで順に１〜１２で表わされる、脂肪交雑等級（ＢＭＳ）を補正して得られた育種価について調べた。
【００６４】
後代数２０頭以上より育種価が算出されている兵庫県内の種雄牛１０２頭（Ｈ１９〜Ｈ２０年度のデータ、http://www.yumenet.tv/tajimausi/）を調べた結果、ｑホモ個体と比較してＱホモ個体の育種価が有意に高かった（P=0.0032、表６）。また、後代数５０頭以上より育種価が算出されている家畜改良事業団所有の種雄牛４４頭（Ｈ２０年までに収集されたデータより分析されたもの「肉用牛繁殖雌牛能力評価等対策事業による種雄牛評価値」http://liaj.lin.gr.jp/）においても、Ｑホモ個体の育種価が、ｑホモ個体の育種価より有意に高かった（P=0.025、表７）。
【００６５】
【表６】
2012105554.tif 000007
【表７】
2012105554.tif 000008
【００６６】
さらに、兵庫県内の黒毛和種種雄牛Ｃの息牛２２４頭を調べた結果、ｑホモ個体と比較してＱホモ個体の育種価が有意に高く(P=0.00021、表７)、また、Ｑｑヘテロ個体と比較してもＱホモ個体の育種価が有意に高かった(P=0.0026、表８)。
【００６７】
【表８】
2012105554.tif 000009
【００６８】
また、兵庫県内の種雄牛１０２頭（表５）、家畜改良事業団所有の種雄牛４４頭（表６）、および兵庫県内の黒毛和種種雄牛Ｃ（表７）のいずれにおいても、ｑホモ個体と比較して、Ｑｑヘテロ個体では育種価が高かった。
【００６９】
兵庫県内の黒毛和種種雄牛Ｃの息牛２２４頭について、ＳＮＰ２７のＱアレル数と育種価の関連を、相加効果と優性効果を説明変数とした回帰分析により調べたところ、Ｑアレルの効果は相加的であった (p=0.0016)。
【００７０】
これらの結果から、ウシゲノム配列（Btau4.0）４番染色体の４９１００５８５に位置するＳＮＰ２７は、脂肪交雑に関する遺伝的能力を評価するマーカーとして有用であり、これを用いて脂肪交雑に関する遺伝的能力を評価できることがわかった。
【００７１】
さらに図１に示す解析に用いた黒毛和種集団について、図１Ｂの方法によりＳＮＰ２７からＳＮＰ３２までの連鎖不平衡度を算出したところ、ＳＮＰ２９（連鎖不平衡係数（r2）=0.97）およびＳＮＰ３０（r2=0.96）は、ＳＮＰ２７と連鎖不平衡にあることが示された（図４）。また、別の黒毛和種集団(５６８頭、半きょうだい１０頭以下)について、Bovine SNP50 BeadChip（イルミナ社）を用いてＳＮＰ２７とpantophysin遺伝子の周辺に位置する既知のＳＮＰとの連鎖不平衡度を算出したところ、ARS-BFGL-NGS-20161（連鎖不平衡係数（r2）=1.000）、BTB-00183730（r2=1.000）、BTA-70505-no-rs（r2=0.996）がＳＮＰ２７と連鎖不平衡にあることが示された(図５)。従って、ＳＮＰ２９、ＳＮＰ３０、およびARS-BFGL-NGS-20161、BTB-00183730、BTA-70505-no-rsを、ウシ個体の脂肪交雑に関する遺伝的能力を評価するマーカーとして用いることもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2012105554.tif 000014
【配列表】
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