(57)【要約】      （修正有）【課題】セロオリゴ糖を選択的に、効率よく製造することのできる方法の提供。【解決手段】炭素数６の脂肪酸の存在下、セルロースにセルラーゼを作用させる、セロオリゴ糖の製造方法。炭素数６の脂肪酸がヘキサン酸である、セロオリゴ糖の製造方法。セロオリゴ糖がセロビオースである、セロオリゴ糖の製造方法。炭素数６の脂肪酸及び水の存在下、セルロースを加熱処理した後、セルラーゼを作用させる、セロオリゴ糖の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素数６の脂肪酸の存在下、セルロースにセルラーゼを作用させる、セロオリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
セルロースを含む原料としてバイオマスを用いる、請求項１記載のセロオリゴ糖の製造方法。
【請求項３】
炭素数６の脂肪酸及び水の存在下、セルロースを加熱処理した後、セルラーゼを作用させる請求項１又は２記載のセロオリゴ糖の製造方法。
【請求項４】
炭素数６の脂肪酸がヘキサン酸である請求項１〜３のいずれか１項記載のセロオリゴ糖の製造方法。
【請求項５】
セロオリゴ糖がセロビオースである請求項１〜４のいずれか１項記載のセロオリゴ糖の製造方法。
【請求項６】
加熱処理が１４０〜３００℃の範囲で行われる、請求項３〜５のいずれか１項記載のセロオリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロースからセロオリゴ糖を選択的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セロオリゴ糖は、グルコースが２個以上β−１，４結合した糖類で、甘味料、保水剤、分散剤等として食品、医薬品、化粧品等の幅広い分野で利用されている。特に近年、様々な生理機能が明らかにされ、機能性素材として期待されている。
セロオリゴ糖の原料となるセルロースは、地球上に大量に存在する有機資源であり、木材や稲ワラ等の農産廃棄物、産業・家庭廃棄物等にも見出される。近年、食糧問題や化石資源の枯渇によるエネルギー問題等の解決手段の１つとして、バイオマスから有用物質を製造する技術が注目されており、とりわけ非食糧資源であるセルロース系のバイオマスを有効利用する技術開発が望まれている。
【０００３】
一般に、セロオリゴ糖を得る方法としては、セルロースをセルラーゼにより分解する方法が知られている。この反応においてセロオリゴ糖の生産性を高めるには、セルラーゼに含まれるβ−グルコシダーゼを抑制し、セロオリゴ糖からグルコースへの分解を防ぐことが有効と考えられている。そこで、例えば、予めセルラーゼをｐＨ３．５〜５．０に平衡化した弱酸性陽イオン交換樹脂に接触させることにより、セルラーゼ中のβ−グルコシダーゼを選択的に除去し、かかるβ−グルコシダーゼを除去したセルラーゼをセルロースに接触させるセロオリゴ糖の製造方法（特許文献１）が報告されている。
また、β−グルカンを酵素加水分解し、オリゴ糖を生成させるオリゴ糖の製造法において、反応液中にβ−グルカン加水分解酵素の他に、β−グルコシダーゼ拮抗阻害物質であるグルコン酸又はグルコノラクトンを添加する方法（特許文献２）が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平５−１１５２９３号公報
【特許文献２】特開平８−３３４９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、前記従来技術において、セルラーゼから予めβ−グルコシダーゼを除去する方法は、高いコストと多大な労力がかかるという問題がある。また、反応液中にグルコン酸又はグルコノラクトンを添加する場合は、グルコン酸及びグルコノラクトンは水溶性であるため処理後に分離が困難で、セロオリゴ糖からグルコン酸等を除去する工程が必要になり、操作が煩雑になる。
そこで、本発明の課題は、セロオリゴ糖を選択的に、効率よく製造することのできる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討したところ、セルロースに炭素数６の脂肪酸の存在下でセルラーゼを作用させることにより、選択的にセロオリゴ糖が生成されること、しかも処理後は簡便な操作で脂肪酸の分離が可能であり、効率よくセロオリゴ糖を製造できることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、炭素数６の脂肪酸の存在下、セルロースにセルラーゼを作用させる、セロオリゴ糖の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、セロオリゴ糖を選択的に効率よく製造することが可能になる。本発明方法は、セルロースを含むバイオマスにも適用可能であり、セルロース系バイオマスを有効利用する技術として期待できる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明で用いられるセルロースは、特に制限されず、植物性由来、動物性由来のいずれでもよい。また、セルロースは、セルロースの一部としてグルコース誘導体を含有するものであってもよい。誘導体としては、例えば、水酸基の少なくとも一部がエステル化されたエステル類、水酸基の少なくとも一部がエーテル化されたエーテル類等が例示される。
本発明で用いられるセルロースの分子量は、特に限定されないが、一般的には１，０００以上５，０００，０００以下であることが好ましい。
【００１０】
セルロースを含む原料として、例えば、バイオマスを用いることができる。バイオマスとは、生物由来の有機資源で、化石資源を除いたものである。
バイオマスは、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンを含有するものであってもよい。例えば、綿、木材系パルプ、ケナフ、麻、小径木、間伐材、おが屑、木屑、古紙、新聞紙、包装紙、ティッシュペーパー、トイレットペーパー、ダンボール等の木質系；バガス、スイッチグラス、エレファントグラス、稲ワラ、ムギワラ等の草本系のバイオマスが挙げられる。セルロースを含む原料中のセルロース量の測定方法は実施例に記載した。
【００１１】
本発明において、セルロースのセルラーゼによる加水分解反応は炭素数６の脂肪酸の存在下で行われる。炭素数６の脂肪酸としては、飽和でも不飽和でもよく、直鎖又は分岐鎖状のいずれでもよい。具体的には、ヘキサン酸、ヘキセン酸、イソペンタン酸等が挙げられ、なかでも、セロオリゴ糖の生成比率、すなわちグルコースに対するセロオリゴ糖の選択性を高める点、糖溶液との分離が容易である点からヘキサン酸が好ましい。
【００１２】
また、セルロースに対する炭素数６の脂肪酸の使用量は、０．２質量倍以上が好ましく、０．５質量倍以上がより好ましく、０．８質量倍以上が更に好ましく、１質量倍以上が特に好ましい。また、１０質量倍以下が好ましく、５質量倍以下がより好ましく、３質量倍以下が更に好ましい。
【００１３】
本発明で用いられるセルラーゼは、セルロースを加水分解する酵素の総称であり、セルロースをセロオリゴ糖に分解するものであれば特に限定されない。セルラーゼの起源に限定はないが、例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属等に属する微生物を挙げることができる。また、セルラーゼとしては、一般に市販されているセルラーゼ製剤や上記菌の培養物やその濾過液を使用することもできる。さらに、遺伝子組み換え技術、部分加水分解等による人工酵素であってもよい。
【００１４】
セルラーゼの使用量は、加水分解反応の条件、セルロースの種類等によって異なるが、例えば、セルロース１ｇあたり１〜２００ＦＰＵが好ましく、特に５〜５０ＦＰＵが好ましい。ここでＦＰＵ活性は以下に示すＩＵＰＡＣ法により測定される。まず、濾紙（ワットマンＮｏ．１）５０ｍｇを基質とし、これに酵素液０．５ｍＬと０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）１．０ｍＬを加え、５０℃で１．０時間酵素反応を行った後、ジニトロサリチル酸試薬３．０ｍＬを加え、１００℃で５．０分間加熱し発色させる。冷却後、これにイオン交換水２０ｍＬを加え５４０ｎｍの波長で比色定量する。１分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１ユニット（ＦＰＵ）とする。
【００１５】
セルロースにセルラーゼを作用させる際には、スラリー状にして用いるのが好ましく、スラリー中のセルロースの含有量は、流動性の点から、１〜２００ｇ／Ｌ、更に５〜１５０ｇ／Ｌ、特に８〜１００ｇ／Ｌとするのが好ましい。スラリーに用いる分散媒としては、水、各種緩衝液等が挙げられる。水としては、水道水、蒸留水、イオン交換水、精製水が例示される。また、緩衝液としては、ｐＨ３〜８の範囲に緩衝能を有するものが好ましく、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液等が例示される。
【００１６】
セルロース含有スラリーに対する炭素数６の脂肪酸の使用量は、グルコースに対するセロオリゴ糖の選択性を高める点から、１質量％（以下、単に％と記載する）以上が好ましく、更に２％以上、特に３％以上が好ましい。炭素数６の脂肪酸の使用量は、脂肪酸の量が添加しても頭打ちとなる点から、２０％以下が好ましく、更に１０％以下、特に８％以下が好ましい。
【００１７】
セルロースとセルラーゼとの反応は、使用する酵素の特性に合わせて温度やｐＨを選択することが可能であるが、例えば、ｐＨ３〜８、特にｐＨ４〜７とすることが好ましく、温度は１０〜８０℃、特に２０〜６０℃とすることが好ましい。また、反応温度は、脂肪酸が液体で存在する条件であることが好ましい。
【００１８】
反応時間は、セルロースの種類等によって異なるが、生産効率の点から、例えば、１〜２４０時間が好ましく、更に２〜２００時間、特に３〜１４０時間が好ましい。
【００１９】
セルロースのセルラーゼによる加水分解反応に先立って、硫酸処理、有機溶媒処理、水熱処理、機械的破砕等の前処理を施してもよい。
【００２０】
水熱処理は、セルロースを含む原料を水の存在下、加熱処理することにより行うことができる。ここで、加熱処理の際に用いる水は、特に制限されない。
加熱処理の温度としては、分解率向上の点から、１４０〜３００℃であり、１６０〜２５０℃が好ましく、特に１８０〜２３０℃が好ましい。加熱の手段は、例えば、水蒸気、電気が挙げられる。
【００２１】
また、加熱処理時の圧力は、ゲージ圧で０．３〜１０ＭＰａ、更に０．５〜５ＭＰａ、特に０．８〜３ＭＰａが好ましく、水の飽和蒸気圧以上に設定するのが好ましい。飽和蒸気圧以上の加圧に用いられるガスは、例えば、不活性ガス、水蒸気、窒素ガス、ヘリウムガス等が挙げられる。ガスを用いず、背圧弁により調整しても良い。
【００２２】
加熱処理の時間は、反応方法や多糖類の種類によって異なるが、分解率及び生産効率の点から、例えば、セルロースを含む原料と水との混合物が設定温度に達してから０．５〜２４０分が好ましく、更に１〜１２０分、特に１〜６０分が好ましい。
【００２３】
また、セルロースを含む原料を予め水の存在下、加熱処理を行う場合、脂肪酸の存在下で加熱処理するのが好ましい。脂肪酸としては、直鎖又は分岐の炭素数６〜１８の脂肪酸を用いることができるが、その中でも炭素数６の脂肪酸を用いることが、加熱処理の後のセルラーゼ処理においてグルコースに対するセロオリゴ糖の選択性を高める点、及びセロビオースの生成効率を高める点から好ましい。
【００２４】
加水分解反応終了後、反応液を、セロオリゴ糖を含む糖溶液と炭素数６の脂肪酸とに分離してもよい。セロオリゴ糖を含む糖溶液と炭素数６の脂肪酸とを分離する方法としては、特に制限されず、例えば遠心分離やデカンテーションにより行うことができる。回収した炭素数６の脂肪酸は、再利用してもよい。
【００２５】
本発明方法によれば、選択的にセロオリゴ糖が生成される。
ここで、本発明方法で得られるセロオリゴ糖は、２〜１０個、好ましくは２〜３個のグルコース単位がβ−１，４結合したものをいい、例えば、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、セロヘキサオース、セロオクタオース等が挙げられる。グルコースに対するセロオリゴ糖の選択性は、セロオリゴ糖の代表としてセロビオースを採用し、セロビオース／グルコース質量比により評価することができる。
【実施例】
【００２６】
＜セルロース量の測定＞
ソッスレー抽出により得られる脱脂品約２．５ｇに蒸留水１５０ｍＬ、亜塩素酸ナトリ
ウム１．０ｇ、酢酸０．２ｍＬを加え、８０℃の湯浴上で加熱する。亜塩素酸ナトリウム
、酢酸の添加と添加後の１時間加熱を、さらに２回行った。内容物をろ過し、ろ過残渣は
水、アセトンで洗浄後、乾燥させた。得られた乾燥品１ｇを１７．５％水酸化ナトリウム
水溶液２５ｍＬに加え、３０分間放置した。３０分後、水２５ｍＬを加え、１分間攪拌後
、５分間静置した。内容物をろ過し、ろ過残渣を１０％酢酸水および煮沸水で洗浄後、乾
燥させた。得られた乾燥残渣の重量をセルロース量とした。
【００２７】
＜グルコース濃度、セロオリゴ糖濃度の測定＞
日立製作所製高速液体クロマトグラフを用い、昭和電工製カラムＡｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ  （４．５ｍｍφ×２５０ｍ）を装着し、カラム温度２０℃でグラジエント法により行った。移動相Ａ液はアセトニトリル、Ｂ液は３０％メタノール水とし、１．００ｍＬ／分で送液した。グラジエント条件は以下のとおりである。
時間（分）    Ａ液（％）      Ｂ液（％）
０            ２０          ８０
４５            ５０          ５０
４５．１        ２０          ８０
５５            ２０          ８０
試料注入量は５μＬ、検出はＥＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製コロナＣＡＤ検出器を用いた。
【００２８】
実施例１
稲ワラ（セルロース含有量３２．０％）１０ｇと水１００ｇを混ぜたスラリーを、バッチ式水熱処理装置（日東高圧製）を用いて１８０℃で３０分（昇温冷却時間を除く）、１．０ＭＰａにて加熱処理を行った後、ろ過し、残渣５．７０ｇを得た。残渣は、含水率７１．８％、固形分２８．２％であった。また、固形分中のセルロース含有量は５４．６％であった。
残渣１．７７ｇ（固形分０．５ｇ、セルロース分０．２７ｇ含有）をｐＨ５．０の０．１Ｍクエン酸緩衝溶液８．７３ｇに分散させ、全体の水分量が１０ｇとなるようにした。これにヘキサン酸０．４７ｇとセルラーゼ（ノボザイムズ製セルクラスト１．５Ｌ）６２．５μＬを添加した。セルロース１ｇあたりのセルラーゼ添加量は１６．９ＦＰＵであった。加水分解は５０℃の恒温槽中、１１０ｒ／ｍｉｎで振とうしながら２４時間行った。
反応終了後、反応液を０．２μｍのフィルターでろ過し、グルコース濃度及びセロビオース濃度を測定した。反応条件と結果を表１に示す。また、反応液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）することでヘキサン酸相と水相に分離することができた。
【００２９】
比較例１
ヘキサン酸を添加しない以外は実施例１と同様に反応を行った。反応条件と結果を表１に示す。
【００３０】
比較例２
ヘキサン酸の代わりにブタン酸を用いた以外は実施例１と同様に反応を行った。反応条件と結果を表１に示す。
【００３１】
比較例３
ヘキサン酸の代わりにオクタン酸を用いた以外は実施例１と同様に反応を行った。反応条件と結果を表１に示す。
【００３２】
実施例２
稲ワラ（セルロース含有量３２．０％）１０ｇと水９０ｇを混ぜたスラリーに、ヘキサン酸９ｇを添加し、実施例１と同様の条件で加熱処理を行った後、ろ過し、残渣６．１３ｇを得た。残渣は、含水率４７．４％、固形分２８．７％、ヘキサン酸含有量２３．９％であった。固形分中のセルロース含有量は５２．２％であった。
残渣１．７４ｇ（固形分０．５ｇ、セルロース分０．２６ｇ及びヘキサン酸０．４２ｇ含有）をｐＨ５．０の０．１Ｍクエン酸緩衝溶液９．１８ｇに分散させ、全体の水分量が１０ｇとなるようにした。これにセルラーゼ（ノボザイムズ製セルクラスト１．５Ｌ）６２．５μＬを添加した。セルロース１ｇあたりの添加は１７．５ＦＰＵであった。加水分解は５０℃の恒温槽中、１１０ｒ／ｍｉｎで振とうしながら２４時間行った。
反応終了後、反応液を０．２μｍのフィルターでろ過し、グルコース濃度及びセロビオース濃度を測定した。反応条件と結果を表２に示す。また、反応液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）することでヘキサン酸相と水相に分離することができた。
【００３３】
比較例４
ヘキサン酸を添加せず、クエン酸緩衝液を９．６０ｇとした以外は実施例２と同様に反応を行った。反応条件と結果を表２に示す。
【００３４】
比較例５
ヘキサン酸の代わりにブタン酸を用いた以外は実施例２と同様に反応を行った。反応条件と結果を表２に示す。
【００３５】
比較例６
ヘキサン酸の代わりにオクタン酸を用いた以外は実施例２と同様に反応を行った。反応条件と結果を表２に示す。
【００３６】
【表１】
2012115209.tif 000002
【００３７】
【表２】
2012115209.tif 000003
表１及び２から明らかなように、セルロースをヘキサン酸の存在下で酵素加水分解した実施例１及び２では、ヘキサン酸無添加の比較例１及び４、ブタン酸、オクタン酸又はデカン酸を用いた比較例２，３，５及び６に比べていずれもグルコース生成量に対するセロビオースの生成量が多く、セロオリゴ糖の選択性が高いことが確認された。酵素加水分解する前に、セルロースをヘキサン酸及び水の存在下で加熱処理した実施例２は、特にセロビオースの生成量が多かった。