(57)【要約】【課題】本発明は、水産用神経壊死症ウイルス（NNV）ワクチン及びその製造方法を提供するものである。この方法は、（a）細胞株を一つ利用して神経壊死症ウイルスを培養することにより該ウイルスを含有する上澄み液を得ることと、（b）不活化剤により該上澄み液を処理して水産用神経壊死症ウイルスワクチンを形成することとを、含む。本発明の神経壊死症ウイルスワクチンは、ひいてはナノ化クラッドを経って製造し得るが、前述のステップ（b）により取得されて不活化した上澄み液は、ナノ化クラッド工程を経つことにより、水産用神経壊死症ウイルスワクチンを形成する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水産用神経壊死症ウイルス（Nervous necrosis virus，NNV）ワクチンを製造する方法は、下記のステップを含むが、（a）NNVに対して感受性を具する魚類細胞株を一組利用して神経壊死症ウイルスを培養することにより該ウイルスを含有する上澄み液を得ること、（b）不活化剤により該上澄み液を処理してその中でも該不活化剤がホルマリン又は2−ブロモエチルアミン（binary ethyleneimine）を含むこと、及び（c）該不活化した上澄み液がナノ化クラッド工程を経つことにより水産用神経壊死症ウイルスワクチンを形成することを特徴とする水産用神経壊死症ウイルス（NNV）ワクチンを製造する方法。
【請求項２】
該ナノ化不活化したワクチンの大きさは、約20ないし500nmであることを特徴とする請求項１に記載の水産用神経壊死症ウイルス（NNV）ワクチンを製造する方法。
【請求項３】
該細胞株は、GF-1，SSN-1，E-11，GB3，GF，GL，SISE，GS，SAF1又はGL-avを含むことを特徴とする請求項１に記載の水産用神経壊死症ウイルス（NNV）ワクチンを製造する方法。
【請求項４】
該ウイルスは、神経壊死症を感染した魚体から、分離されたNNV分離株であることを特徴とする請求項１に記載の水産用神経壊死症ウイルス（NNV）ワクチンを製造する方法。
【請求項５】
水産用神経壊死症ウイルス（NNV）ワクチンは、請求項１に記載の方法により製造してなることを特徴とする水産用神経壊死症ウイルス（NNV）ワクチン。
【請求項６】
水産用神経壊死症ウイルス（NNV）ワクチンの抗原使用量を節約し且つ依然としてワクチンの効果を促進できる方法は、下記のステップを含むが、（a）NNVに対して感受性を具する魚類細胞株を、１組利用して神経壊死症ウイルスを培養することにより該ウイルスを含有する上澄み液を得ること、（b）不活化剤により該上澄み液を処理してその中でも該不活化剤がホルマリン又は2−ブロモエチルアミン（binary ethyleneimine）を含むこと、及び（c）該不活化した上澄み液がナノ化クラッド工程を経つことにより水産用神経壊死症ウイルスワクチンを形成して、ウイルス（抗原）使用量をナノ化クラッドされていないワクチンと比較して１００倍節約することを、特徴とする水産用神経壊死症ウイルス（NNV）ワクチンの抗原使用量を節約し且つ依然としてワクチンの効果を促進できる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチンの製造および施行方法に関し、且つ特に水生動物のワクチンの製造および施行方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス性神経壊死症（Viral  nervous necrosis disease,VNN disease）は、近年では遍く海水養殖魚類に発生されるウイルス性病気で、初めて日本に発生し、相次いで世界の各地に発生し、アフリカを除き、その他の各洲には何れも実例があり、全世界的な魚類ウイルス性病気となり、この病気を招くウイルスを、神経壊死症ウイルス（Nervous necrosis  virus,NNV）又は魚類ノダウイルス（Fish nodavirus or
Beta-nodavirus）と称する。
【０００３】
神経壊死症ウイルスは、単株RNAウイルスで、エンベロープを持たず、外観が二十面体で、直径約25〜34nmのウイルスペレットである。病気初期の稚魚は、突発性な遊泳し、体色が黒くなり、バランス能力を失い、且つ回転、旋回してらせん遊泳する等の不正常な遊泳行為があり、一部分の魚は、身体が横曲がり、体色が黒くなり、時には水面に横たわって漂い、先ず虚弱の稚魚が水面に漂い、最後に池底に沈んで死亡するが、病症の現れた後の一週間の内に、大量死亡の状況が発生する（Yoshikoshi Inoue,1990;Glazebrook et al.,1990;Bloch et  al.,1991;Renault et al.,1991）。
【０００４】
養殖技術の進歩に連れ、伝統的な粗放養殖から次第に今日の高密度集約養殖に変更して発展する。目前に世界上では水産養殖業に従事する国は、大部分が高密度集約養殖を採用し、この方式は、面積当たりの生産能力を大幅に向上できるが、但し沢山の問題もを招き、特に養殖過程中では、管理不当により病気の発生を引き起こす。
【０００５】
現在の予防方法は、主として薬物処理で、例えば塩素、臭素、アンモニウム又はオゾンにより、用具、魚の卵、水と餌料に対し消毒するが、但し魚類のウイルス性病気を解決する中では、環境の消毒および魚体の免疫力の増強の以外に、更にワクチンの開発も非常に重要となり、且つ台湾および数多くの稚魚養殖国では毎年ウイルス性神経壊死症（VNN）が何れも発生し、過酷な経済損害を招き、従って有効な神経壊死症ウイルスワクチンを発展するのは、予防仕事の最も重要な項目となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、水産用神経壊死症ウイルス（NNV）ワクチン及びその製造方法を提供するものである。本発明のワクチン製造方法は、保護効果が30％相対生存率（relative percentage survival,PRS）以上であるワクチンを製造できる。
【０００７】
前述の目的を達成するために、本発明は、神経壊死症ウイルス（NNV）ワクチンを製造する方法を提供し、下記のステップを含むが、（a）細胞株を一つ利用して神経壊死症ウイルスを培養することにより該神経壊死症ウイルス（NNV）を含有する上澄み液を得ること、及び（b）不活化剤により該上澄み液を処理して水産用神経壊死症ウイルスワクチンを形成すること。
【０００８】
本発明の神経壊死症ウイルス（NNV）ワクチンは、ひいてはナノ化クラッドを経って製造し得るが、該神経壊死症ウイルス（NNV）ワクチンの製造方法は、下記のステップを含むが、（a）細胞株を一つ利用して神経壊死症ウイルスを培養することにより該ウイルスを含有する上澄み液を得ること、（b）不活化剤により該上澄み液を処理すること、及び（c）該不活化した上澄み液がナノ化クラッド工程を経つことにより水産用神経壊死症ウイルスワクチンを形成すること。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
該細胞株は、神経壊死症ウイルス（NNV）に対し良好な感受性を具する魚類細胞株を含むが、但しGF-1（US6436702、アメリカの微生物系統保存機関（American  Type  Culture Collection, ATCC）に受託、その受託番号：PTA-85），GF，GL，GB3（Biochem. Biophys. Res. Comun. 2006 Oct 19），SISE（J. Virol. Methods. 2006 Nov; 137(2):309-16），GS（J. Virol. Methods. 2006 Jan; 131(1):58-64），SAF1（Fish Shellfish Immunol. 2004 Jan; 16(1):11-24），SSN-1（Dis. Aquat.  Organ.
1999 Dec 22; 39(1):37-47）又はGL-av（Dis. Aquat. Organ. 2000 Nov 14; 43(2):81-9）に限定されず、より好ましいはE-11である。
【００１０】
該神経壊死症ウイルス（NNV）、例えばRGNNV，SJNNV，TPNNV，BFNNV，FEV，DGNNV，GGNNV，G9410YA，G9508KS又はHG00GD等は、神経壊死症を感染した魚体から分離されたNNV分離株で、前述のNNV分離株が数多くの株（strain）、例えばSJNNV(D30814)，TPNNV(D38637)，BFNNV(D38635)，RGNNV(D38636)，MGNNV(AF245003)，DGNNV(AF245004)，B00GD(AY140794)，G9508KS(AY140798)，HG00GD(AY140799)，YP99PD(AY140800)，G9410YA(AY140801)，AHNNV(AF160473)，AHNorA(AJ245641)，ACNNV(AF445800)等を含み、前述の株の核酸配列が何れもジーンバンク（Gene Bank）の中に記載される。
【００１１】
該不活化剤は、ホルマリン又は2−ブロモエチルアミン（binary
ethyleneimine，BEI）である。ホルマリンによる不活化工程の中では、0.1〜0.2％のホルマリン溶液により、24℃乃至30℃で3乃至7日間処理し、更に燐酸緩衝液（PBS）にて24時間透析し、使用可能な不活化ワクチンを形成できる。そしてBEIによる不活化工程の中では、2−ブロモエチルアミンを水酸化ナトリウムの中に入れ、30℃乃至37℃で1〜2時間加熱することにより、BEI不活化剤を形成する。3〜4mMのBEI剤にて、23〜27℃で3乃至5日間処理し、且つ燐酸緩衝液（PBS）にて24時間透析し、使用可能な不活化ワクチンを形成する。
【００１２】
本発明のナノ化クラッド工程は、重量パーセンテージが30〜99.9％であるマトリックスと重量パーセンテージが0.1〜70％である不活化ワクチンの使用を含み、より好ましいは、0.1％の不活化ワクチンである。前述のマトリックスは、水素化植物油、水素化動物油またはC8-64飽和脂肪酸およびその誘導体から組成される非水溶性マトリックスであってもよい。そして被クラッド物が前述の不活化ワクチンである。
【００１３】
本発明の中では、ナノ化クラッドを経った神経壊死症ウイルス（NNV）ワクチンの大きさは、約20ないし500nmで、より好ましくは約50ないし100nmで、最も好ましくは約80nmである。本発明の神経壊死症ウイルス（NNV）のクラッド無しワクチンのウイルス濃度は、106TCID50／ml以上で、より好ましくは約106乃至108TCID50／mlで、最も好ましくは約107TCID50／mlである。本発明の神経壊死症ウイルス（NNV）のクラッド有りワクチンのウイルス濃度は、104TCID50／ml以上で、より好ましくは約104乃至106TCID50／mlで、最も好ましくは約105TCID50／mlである。それ以外に、一般な不活化ワクチンと比較すると、本発明のナノ化クラッドを経った神経壊死症ウイルス（NNV）ワクチンは、より少ない量にて同じ保護効果を達成でき、少なくともウイルス使用量を100倍節約でき、且つナノ化クラッドがワクチンの保存期間を増加でき、例えば4℃で1年間以上保管できる。
【００１４】
本発明の神経壊死症ウイルス（NNV）ワクチンの施行方式は、注射法（例えば腹腔内注射，皮下注射，筋肉注射）、経口投薬法または浸漬法であってもよい。一般のより好ましい実施例の中では、該ワクチンの施行方法が浸漬法である。本発明の浸漬方法は、注射による免疫できない稚魚に適用され、通常は魚齢一ヶ月間以内の稚魚である。浸漬方法は、ウイルス濃度105乃至107TCID50／mlの神経壊死症ウイルス（NNV）ワクチンにて稚魚を浸漬し、浸漬温度が約20℃乃至25℃で、浸漬時間が約30乃至60分間である。
【００１５】
本発明の不活化およびナノ不活化ワクチンは、一般な水生（海水と淡水）動物、例えば魚類，エビ類またはカニ類、特にNNVに対し感受性を具する魚類、例えばバラマンディ（barramundi,Lates  Calcarifer），シーバス（sea bass,Dicentrarchus labrax），テュルボ（turbot,Scophthalmus  maximus），キジハタ（red-spotted grouper,Epinephelus
akaara），シマアジ（striped jack,Pseudocaranx dentex），タイセイヨウオヒョウ（Atlantic halibut,Hippoglossus hippoglossus），河豚（tiger puffer,Takifugu rubripes），ヒラメ（Japanese
flounder,Opegnathus fasciatus Temminck and Schlegel），マツカワ（barfinflounder,Versaper moseri），カンパチ（purplish  amberjack, Seriola dumerili），マハタ（sevenband
grouper,Epinephelus septemfasciatus）及びスズキ（Japanese sea bass,Lateolabrax japonicus）等に適用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
1.ウイルスの増殖
神経壊死症ウイルス（NNV）がGF-1細胞に接種され、2％受胎牛の血清を含むL-15培養液に培養され、28℃では4日間を掛け、神経壊死症ウイルスを含有する細胞の上澄み液を採取する。
【００１７】
2.ホルマリンにより神経壊死症ウイルス（NNV）に対して行われた不活化
0.2％ホルマリン（Formalin）により神経壊死症ウイルス（NNV）の不活化処理を行う。処理条件は、適当な体積の37％ホルマリンを取って前述の神経壊死症ウイルス含有細胞の上澄み液の中に入れることにより、ホルマリンの最終濃度が0.2％となるものである。ホルマリンを入れた上澄み液を、30℃で3日間放置した後に、燐酸緩衝液（PBS）にて24時間透析し、不活化したウイルス液を得、更にGF-1細胞により各サンプルのウイルス強度（potency）を測定する。該不活化したウイルス液を直接に神経壊死症ウイルス（NNV）のワクチンと見なすことが出来、ひいてはナノ化クラッドを行った後にも、再び神経壊死症ウイルス（NNV）のワクチンと見なすことが出来る。
【００１８】
3.2−ブロモエチルアミン（binary
ethyleneimine）により神経壊死症ウイルス（NNV）に対して行った不活化
4mMの2−ブロモエチルアミン（BEI）により神経壊死症ウイルス（NNV）の不活化処理を行う。処理条件は、2.1gの2−ブロモエチルアミン（binary ethyleneimine）を取って100mlの0.175NのNaOHの中に入れ、更に37℃の水浴槽にて2時間加熱し、加熱が終了した後にBEIとなるものである。配置終了のBEIを前述の神経壊死症ウイルス含有細胞の上澄み液の中に入れることにより、BEIの最終濃度が4mMとなり、25℃に放置し、3日間の後に、4℃に硫酸緩衝液（PBS）にて24時間透析した後に不活化したウイルス液を得る。該不活化したウイルス液を直接に神経壊死症ウイルス（NNV）のワクチンと見なすことが出来、ひいてはナノ化クラッドを行った後にも、再び神経壊死症ウイルス（NNV）のワクチンと見なすことが出来る。
【００１９】
4.ナノ化クラッド工程
（1）成分：
マトリックス：60％重量パーセンテージの水素化パームステアリン及び30％重量パーセンテージのヤシ油
被クラッド物：10％重量パーセンテージの被クラッド物で、被クラッド物が前述のホルマリン又はBEIにより不活化されたウイルス液で、燐酸緩衝液（PBS）により100倍に希釈された希釈液である。
【００２０】
従ってナノ化クラッドのワクチンの中に、不活化されたウイルス液のナノ化クラッドした後における濃度が、クラッドする前における濃度の0.1％重量パーセンテージとなる。
【００２１】
（2）条件：
トランスファー管の管径：20mm
流速：150リットル／hr
ノズル口径：0.8mm
水素化パームステアリンとヤシ油および本発明の不活化ワクチンを55℃で十分かつ均一に攪拌し、ポンプを利用してトランスファーし、38℃水溶液の中に注入して造粒し、更に冷凍乾燥機により乾燥する。
【００２２】
（3）結果：
ペレットの粒径が80mm左右で、ペレット集結の比重が水よりも小さくなり、水中に漂うことが出来、溶点が43℃である。
【００２３】
実施例２  稚魚の抗ウイルス試験1−不活化剤の効果の比較
1.試験用稚魚
試験用稚魚がチャイロマルハタ（Epinephelus coioides）の稚魚8匹で、体長が平均に2.4cmで、重さが約0.22gで、NNV宿主無しで、純海水の中に培養され、且つ人工餌料にて餌を与える。
【００２４】
2.ワクチンの免疫
抗ウイルス試験は、全てが共に2組の試験組と1組の負対照組に分けられる。各組が何れも100匹の稚魚（n＝100）を含む。各組の稚魚が夫々独立の60リットルのアクアリュムの中に放置され、且つ24〜27℃の環境下に飼育される。浸漬方式により、稚魚に対し、ワクチンの免疫を行う。免疫試験の設計が下記の通りである。
【００２５】
試験組1：0.2％ホルマリンにより不活化されたナノ化クラッド無しのワクチン（NNV最終濃度が107TCID50／ml）；
試験組2：4mMのBEIにより不活化されたナノ化クラッド無しのワクチン（NNV最終濃度が107TCID50／ml）；
負対照組：燐酸緩衝液（PBS）に浸漬する。
【００２６】
浸漬免疫温度が25℃で、浸漬時間が30〜60分間で、浸漬した後に、魚をすくい取って新たな槽に入れる。
【００２７】
3.生体攻撃ウイルス試験
稚魚がワクチンを接種して30日間に渡った後に、浸漬方式によりウイルスを攻撃する。ウイルスを攻撃する剤量は、1.6×06TCID50／mlのNNVで、浸漬温度が25℃である。ワクチンの保護効果が免疫稚魚の相対生存率（Relative Percent Survival,RPS）により計算され、且つχ2乗検定（chi-square test）により統計、分析されるが、相対生存率（RPS）の計算方式が下記の通りである。
【００２８】
PRS＝1−（試験組の稚魚累積死亡率／対照組の稚魚累積死亡率）×100％
【００２９】
4.結果
各組の稚魚の累積死亡率が図1のように示す。生体攻撃ウイルス試験を30日間行い、負対照組の累積死亡率が87％であるが、試験組1（0.2％ホルマリンにより不活化されたナノ化クラッド無しのワクチンを接種）の累積死亡率が50％（RPS＝42.5％）で、試験組2（4mMのBEIにより不活化されたナノ化クラッド無しのワクチンを接種）の累積死亡率が19％（RPS＝78.2％）で、且つ負対照組と互いに比較すると、両者が著しい相違（p＜0.001）を具する。4mMのBEIによりNNV不活化を行って得たワクチンの免疫効果は、0.2％ホルマリンによりNNV不活化を行って得たワクチンの免疫効果よりも良くなる。
【００３０】
実施例3  稚魚の抗ウイルス試験2−免疫剤量の比較
1.試験用稚魚
実施例2と同じである。
【００３１】
2.ワクチンの免疫
抗ウイルス試験は、全てが共に3組の試験組と1組の負対照組に分けられる。各組が何れも100匹の稚魚（n＝100）を含む。各組の稚魚が夫々独立の60リットルのアクアリュムの中に放置され、且つ24〜27℃の環境下に飼育される。浸漬方式により、稚魚に対し、ワクチンの免疫を行う。免疫試験の設計が下記の通りである。
【００３２】
試験組1：4mMのBEIにより不活化されたナノ化クラッド無しのワクチン（NNV最終濃度が105TCID50／ml）；
試験組2：4mMのBEIにより不活化されたナノ化クラッド無しのワクチン（NNV最終濃度が106TCID50／ml）；
試験組3：4mMのBEIにより不活化されたナノ化クラッド無しのワクチン（NNV最終濃度が106TCID50／ml）；
負対照組：燐酸緩衝液（PBS）に浸漬する。
【００３３】
浸漬免疫温度が25℃で、浸漬時間が30〜60分間で、浸漬した後に、魚をすくい取って新たな槽に入れる。
【００３４】
3.生体攻撃ウイルス試験
実施例2と同じである。
【００３５】
4.結果
各組の稚魚の累積死亡率が図2のように示す。生体攻撃ウイルス試験を30日間行い、試験組1のRPS値が7.5％で、試験組2のRPS値が87.5％で、試験組3のRPS値が95％である。従って4mMのBEIによりNNV不活化を行って得たナノ化クラッド無しのワクチンは、好ましくはそのNNV最終濃度が106TCID50／ml以上である。
【００３６】
実施例4  稚魚の抗ウイルス試験3−ナノ化クラッド有りとナノ化クラッド無しの比較
1.試験用稚魚
実施例2と同じである。
【００３７】
2.ワクチンの免疫
抗ウイルス試験は、全てが共に4組の試験組と1組の負対照組に分けられる。各組が何れも100匹の稚魚（n＝100）を含む。各組の稚魚が夫々独立の60リットルのアクアリュムの中に放置され、且つ24〜27℃の環境下に飼育される。浸漬方式により、稚魚に対し、ワクチンの免疫を行う。抗ウイルス試験の設計が下記の通りである。
【００３８】
試験組1：0.2％ホルマリンにより不活化されたナノ化クラッド無しのワクチン（NNV最終濃度が106TCID50／ml）；
試験組2：0.2％ホルマリンにより不活化されたナノ化クラッド有りのワクチン（NNV最終濃度が106TCID50／ml）；
試験組3：0.2％ホルマリンにより不活化されたナノ化クラッド無しのワクチン（NNV最終濃度が107TCID50／ml）；
試験組4：0.2％ホルマリンにより不活化されたナノ化クラッド有りのワクチン（NNV最終濃度が105TCID50／ml）；
負対照組：燐酸緩衝液（PBS）に浸漬する。
【００３９】
浸漬免疫温度が25℃で、浸漬時間が30〜60分間で、浸漬した後に、魚をすくい取って新たな槽に入れる。
【００４０】
3.生体攻撃ウイルス試験
実施例2と同じである。
【００４１】
4.結果
試験組1及び試験組2の稚魚の累積死亡率が図3Aのように示す。生体攻撃ウイルス試験を30日間行った後に、ウイルスの濃度が何れも106TCID50／mlであると、ナノ化クラッド有り組のワクチンを経った免疫の稚魚（試験組2）のRPS値が61％で、ナノ化クラッド無し組のワクチンを経った免疫の稚魚（試験組1）のRPS値が32％である。
【００４２】
試験組3及び試験組4の稚魚の累積死亡率が図3Bのように示す。生体攻撃ウイルス試験を30日間行った後に、ウイルスの低濃度（105TCID50／ml）のナノ化クラッド有り組のワクチンを経った免疫の稚魚（試験組4）のRPS値が85％で、ウイルスの高濃度（107TCID50／ml）のナノ化クラッド無し組のワクチンを経った免疫の稚魚（試験組3）のRPS値が43％である。図3A及び図3Bから、ナノ化クラッド有りの抗NNVワクチンを経った免疫効果は、より好ましいであることを了解できる。
【００４３】
実施例5  稚魚の抗ウイルス試験4−ワクチン保護期限試験
1.試験用稚魚
実施例2と同じである。
【００４４】
2.ワクチンの接種
試験用稚魚は、各組が何れも100匹の稚魚（n＝100）を含む。各組の稚魚が夫々独立の60リットルのアクアリュムの中に放置され、且つ24〜27℃の環境下に飼育される。浸漬方式により、稚魚に対し、ワクチンの免疫を行う。4mMのBEIにて不活化されたナノ化クラッド無しのワクチン（NNV最終濃度が107TCID50／ml）により、免疫試験用稚魚を浸漬する。更に燐酸緩衝液（PBS）に浸漬する稚魚を、負対照組と見なす。浸漬免疫温度が25℃で、浸漬時間が30〜60分間で、浸漬した後に、魚をすくい取って新たな槽に入れる。間欠的に15日間，30日間と90日間に免疫された後に、1.6×106TCID50／mlの神経壊死症（NNV）により浸漬してウイルスを攻撃する。
【００４５】
3.生体攻撃ウイルス試験
実施例2と同じである。
【００４６】
4.結果
結果が表1のように示し、15日間免疫された後における稚魚のRPS値が30％で、30日間免疫された後における稚魚のRPS値が高くて87.5％に達し、そして90日間免疫された後における稚魚のRPS値が依然として高くて82％に達する。ここから、ワクチンの保護効果は、一ヶ月免疫された後に頂点に達し、且つ少なくとも三ヶ月免疫された後までに維持することを了解できる。
【００４７】
【表１】
2012188432.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】NNVウイルスの濃度が107TCID50／mlである時に、ホルマリンにより不活化されたワクチン及びBEIにより不活化されたワクチンが稚魚を処理した累積死亡率を示すものである。●がPBS負対照組で、△がホルマリンにより不活化されたワクチン組で、×がBEIにより不活化されたワクチン組である。その中でも、BEIにより不活化されたワクチン組の稚魚の累積死亡率が最も低くなり、相対生存率（RPS）が78.2％である。
【図２】BEIにより不活化されたワクチンが異なるNNVウイルスの濃度である時に、各濃度のワクチンが稚魚を処理した累積死亡率を示すものである。●がPBS負対照組で、□がウイルス濃度105TCID50／mlで、△がウイルス濃度106TCID50／mlで、○がウイルス濃度107TCID50／mlである。その中でも、ウイルス濃度107TCID50／ml組の稚魚の累積死亡率が最も低くなり、相対生存率（RPS）が95％である。
【図３Ａ】ホルマリンにより不活化されたNNVウイルスの濃度が106TCID50／mlである時に、ナノ化クラッド無し組およびナノ化クラッド有り組の稚魚の累積死亡率を示すものである。●がPBS対照組で、■がナノ化クラッド無しのワクチン組で、□がナノ化クラッド有りのワクチン組である。その中でも、ナノ化クラッド組の稚魚の累積死亡率が最も低くなり、相対生存率（RPS）が61％である。
【図３Ｂ】ホルマリン含有の不活化の高濃度NNVウイルス（107TCID50／ml）のナノ化クラッド無しのワクチン組および低濃度NNVウイルス（105TCID50／ml）のナノ化クラッド有りのワクチン組の稚魚の累積死亡率の比較を示すものである。その中でも、ナノ化クラッド組の累積死亡率が最も低くなり、相対生存率（RPS）が85％である。
【図１】
2012188432.tif 000003
【図２】
2012188432.tif 000004
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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