(57)【要約】【課題】高純度のかご状タンパク質を効率良く大量に製造できる方法を提供すること。【解決手段】かご状タンパク質をコードする遺伝子、かご状タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーター、シャイン・ダルガノ配列、及び、プロモーターの機能を抑制するラクトースリプレッサー遺伝子を含み、シャイン・ダルガノ配列がプロモーターとかご状タンパク質をコードする遺伝子との間に配置されているプラスミドを、大腸菌に導入する工程と、大腸菌を培養し、かご状タンパク質を産生させる工程と、産生したかご状タンパク質を精製する工程と、を備える、かご状タンパク質の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
かご状タンパク質をコードする遺伝子、前記かご状タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーター、シャイン・ダルガノ配列、及び、前記プロモーターの機能を抑制するラクトースリプレッサー遺伝子を含み、前記シャイン・ダルガノ配列が前記プロモーターと前記かご状タンパク質をコードする遺伝子との間に配置されているプラスミドを、大腸菌に導入する工程と、
前記大腸菌を培養し、前記かご状タンパク質を産生させる工程と、
産生した前記かご状タンパク質を精製する工程と、
を備える、かご状タンパク質の製造方法。
【請求項２】
前記プロモーターがｔａｃプロモーターである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ラクトースリプレッサー遺伝子が、ｌａｃＩｑ遺伝子である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記シャイン・ダルガノ配列が、ＡＧＧＡＧＧである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記かご状タンパク質が、フェリチン、Ｄｐｓ、又はウイルスのコートタンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記かご状タンパク質がフェリチン又はＤｐｓであるとき、産生した前記かご状タンパク質を精製する前記工程が、前記かご状タンパク質を含む無細胞抽出液若しくは培養上清の熱処理、及び／又は、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製を含み、
前記かご状タンパク質がウイルスのコートタンパク質であるとき、産生した前記かご状タンパク質を精製する前記工程が、塩析による精製を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記大腸菌が、ラクトースオペロンに欠損のない大腸菌である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、かご状タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フェリチンは、２０〜２５ｋＤａのサブユニットから構成される直径８．５〜１２ｎｍのかご状タンパク質である。フェリチンの内部は空洞であり、そこに鉄等の金属元素を貯蔵することができる。かご状タンパク質は、金属若しくは金属化合物を空洞内に取り込むこと、及び／又は均一な球状であること等の性質を有することから、電子機器、医療及び環境等の分野において、ナノサイズの材料としての利用が期待されている（特許文献１、２）。かご状タンパク質としては、他にもリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）由来のＤｐｓ（ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｓｔａｒｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ）及び、ＣＣＭＶ（ｃｏｗｐｅａ  ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）のコートタンパク質等が知られている。
【０００３】
かご状タンパク質の製造方法は、これまでもいくつか提案されている（非特許文献１〜５、特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−１３１７２５号公報
【特許文献２】特開２００８−２９０９６２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９７  Ｆｅｂ  ７；２７２（６）：３２５９−６５．
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １９９３  Ａｕｇ  １９；１１７４（２）：２１８−２０．
【非特許文献３】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．  ２００７  Ｄｅｃ；５６（２）：２３７−４６．  Ｅｐｕｂ  ２００７  Ａｕｇ  ２６．
【非特許文献４】Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００７  Ｆｅｂ  １；１２８（２）：２９０−６．  Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｏｃｔ  １４．
【非特許文献５】Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ２００４  Ａｐｒ；８５（Ｐｔ  ４）：１０４９−５３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献１に記載の方法では、リステリア菌を培養することによって、Ｄｐｓを製造している。しかし、５０Ｌの培養液から精製Ｄｐｓが１１ｍｇしか得られないこと、精製操作に４つの工程を要すること等、工業的な生産には向いておらず、改善の余地が残されている。
【０００７】
非特許文献２及び特許文献２に記載の方法では、大腸菌の発現系を用いてウマ由来のＬアポフェリチンが生産される。これらの方法では、ＩＰＴＧを用いて発現誘導を行っているが、発現の制御は困難である。また、精製操作に４つの工程を要すること等、改善の余地が残されている。
【０００８】
非特許文献３に記載の方法では、無細胞タンパク質合成系（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、植物由来のフェリチン及びヒト由来のフェリチンを合成している。しかしながら、合成反応のスケールアップは困難であり、工業的にフェリチンを製造する方法としては不向きである。
【０００９】
非特許文献４及び５に記載の方法では、ＣＣＭＶのコートタンパク質をシュードモナス属細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）や酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を用いて発現させている。しかしながら、シュードモナス属細菌を用いた方法では、精製にＰＥＧ沈殿法及びショ糖密度勾配遠心法を用いており、一度に大量の精製をするには不向きである。一方、酵母を用いた方法では、酵母の細胞壁を破砕するのに時間がかかる傾向があり改善の余地がある。
【００１０】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、高純度のかご状タンパク質を効率良く大量に製造できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係るかご状タンパク質の製造方法は、かご状タンパク質をコードする遺伝子、かご状タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーター、シャイン・ダルガノ配列（ＳＤ配列）、及び、プロモーターの機能を抑制するラクトースリプレッサー遺伝子を含み、ＳＤ配列がプロモーターとかご状タンパク質をコードする遺伝子との間に配置されているプラスミドを、大腸菌に導入する工程と、大腸菌を培養し、かご状タンパク質を産生させる工程と、産生した上記かご状タンパク質を精製する工程と、を備える。
【００１２】
上記本発明に係る製造方法によれば、高純度のかご状タンパク質を効率良く大量に製造することができる。
【００１３】
プロモーターは、好ましくはｔａｃプロモーターである。ラクトースリプレッサー遺伝子は、好ましくはｌａｃＩｑ遺伝子である。ＳＤ配列は、好ましくはＡＧＧＡＧＧである。これら構成を備えることにより、より効率的にかご状タンパク質を製造することができる。「ｌａｃＩｑ遺伝子」は、ｌａｃＩリプレッサータンパク質を過剰に発現するように変異された制御プロモーター部位に接続されたｌａｃＩ遺伝子である。
【００１４】
本発明に係る製造方法は、フェリチン、Ｄｐｓ、又はウイルスのコートタンパク質を製造するために特に有用である。
【００１５】
かご状タンパク質がフェリチン又はＤｐｓであるとき、産生したかご状タンパク質を精製する工程は、かご状タンパク質を含む無細胞抽出液若しくは培養上清の熱処理、及び／又は、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製を含むことが好ましい。かご状タンパク質がウイルスのコートタンパク質であるとき、産生したかご状タンパク質を精製する工程は、塩析による精製を含むことが好ましい。これらの方法でかご状タンパク質を精製することにより、より高純度のかご状タンパク質を効率的に得ることができる。
【００１６】
大腸菌は、好ましくはラクトースオペロンに欠損のない菌株である。これにより、例えば安価なラクトースを誘導因子として用いて、効率的にかご状タンパク質を製造することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、高純度のかご状タンパク質を、効率良く、簡単な方法で大量に製造することができる。また、可溶性の状態のかご状タンパク質を容易に得ることができるため、かご状タンパク質の各種用途への適用に有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】プラスミドｐＫＬ２２３の概略構成図である。
【図２】プラスミド及び大腸菌株を変えて発現させた組換えＤｐｓを含む無細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後のＣＢＢ染色像である。
【図３】組換えＤｐｓを含む無細胞抽出液を加熱処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後のＣＢＢ染色像である。
【図４】培地を変えて発現させた組換えＤｐｓを含む無細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後のＣＢＢ染色像である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００２０】
本実施形態に係るかご状タンパク質の製造方法は、かご状タンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドを、大腸菌に導入し形質転換体を作成する工程と、形質転換体である大腸菌を培養し、かご状タンパク質を産生させる工程と、産生したかご状タンパク質を精製する工程と、を備える。
【００２１】
かご状タンパク質は、例えば、フェリチン、Ｄｐｓ、又はウイルスのコートタンパク質であり得る。フェリチンは、微生物由来、動物由来若しくは植物由来のフェリチン、又はこれらの変異体を含む。微生物由来のフェリチンとしては、ヘリコバクター菌由来のフェリチン等が挙げられる。動物由来のフェリチンとしては、ヒト由来のフェリチン、マウス由来のフェリチン、及びウマ由来のフェリチン等が挙げられる。植物由来のフェリチンとしては、大豆フェリチン等が挙げられる。フェリチンの変異体は、フェリチン本来の構造及び機能を有する変異体であれば特に制限されない。フェリチンの変異体は、通常の遺伝子工学的手法、例えば部位特異的変異導入法によってフェリチンをコードする遺伝子に人為的に変異を導入する方法により作製することができる。Ｄｐｓはフェリチン様タンパク質であり、例えば、リステリア菌由来のＤｐｓ、及びスルホロバス菌由来のＤｐｓが挙げられる。ウイルスのコートタンパク質としては、ＣＣＭＶ（ｃｏｗｐｅａ  ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）のコートタンパク質等が挙げられる。
【００２２】
かご状タンパク質の産生のために大腸菌を形質転換するために用いるプラスミドは、かご状タンパク質をコードする遺伝子の他に、好ましくは、かご状タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーター、ＳＤ配列、複製起点、及び、プロモーターの機能を抑制するラクトースリプレッサー遺伝子を含む。
【００２３】
このプラスミドは、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＡＣＹＣ系、ｐＣＤＦ系、ｐＣＯＬＡ系、及びｐＲＳＦ系プラスミド等の大腸菌を宿主とするプラスミドを基に構築することができる。例えば、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴｋｍＳ２（Ｍｉｓｈｉｍａ，  Ｎ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．、第１３巻、８６４−８６８頁、１９９７年）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、及びｐＥＴ−２８ａ（＋）（ノバジェン社製）、ｐＣＤＦ−２（ノバジェン社製）、ｐＲＳＦ−２（ノバジェン社製）、ｐＫＫ２２３−３（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）及びｐＡＣＹＣ１７７（ニッポンジーン社製）等が挙げられる。好ましくは、ｐＫＫ２２３−３を基にプラスミドが構築される。
【００２４】
かご状タンパク質をコードする遺伝子は、かご状タンパク質を産生する細胞から通常のクローニング法によって得ることができる。あるいは、ＧｅｎＢａｎｋのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）等に登録されているタンパク質の構造遺伝子を基に、通常行われる方法により、かご状タンパク質の遺伝子に対応するＤＮＡ断片を人工的に合成してもよい。
【００２５】
プロモーターは、好ましくは、かご状タンパク質をコードする遺伝子の５’側上流に配置される。プロモーターは、例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、並びに、ｔａｃプロモーター及びｔｒｃプロモーター等のｌａｃプロモーターとｔｒｐプロモーターとが融合したプロモーターから選ばれる。発現効率の観点から、ｔａｃプロモーターが好ましい。
【００２６】
ラクトースリプレッサー遺伝子は、プロモーターの機能を抑制する。プロモーターを制御する効率の観点から、このラクトースリプレッサーは、好ましくはｌａｃＩｑ遺伝子である。
【００２７】
ＳＤ配列は、アデニン及びグアニンに富んだ、４塩基〜６塩基の配列であれば特に制限はない。ＳＤ配列は、好ましくはＡＧＧＡ又はＡＧＧＡＧＧであり、より好ましくはＡＧＧＡＧＧである。
【００２８】
複製起点は、大腸菌内において、プラスミドのＤＮＡの複製を開始する起点として機能するものであれば、特に制限されない。複製起点は、例えば、ｐＢＲ３２２ｏｒｉ及びｐ１５Ａｏｒｉから選択される。
【００２９】
プラスミドは、ターミネーター、抗生物質の耐性遺伝子等の他の配列を更に含んでいてもよい。ターミネーターは、好ましくは、サブユニットをコードする遺伝子の３’側下流に配置される。ターミネーターは、宿主として利用する大腸菌において機能することが知られているものから選ばれる。好適なターミネーターとしては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーター等が挙げられる。抗生物質の耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｅｔｒ）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍｒ）、ストレプトマイシン耐性遺伝子（Ｓｍｒ）、及びカナマイシン耐性遺伝子（Ｋｍｒ）等が挙げられる。
【００３０】
プラスミドの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる。プラスミドの調製に用いられる宿主菌は、例えば、当該技術分野で通常用いられる大腸菌から適宜選択することができる。大腸菌としては、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、及びＪＭ１０９等が挙げられる。これらのうち、精製の容易化、大量調製、及び安全性等の観点から、ＪＭ１０９が好ましい。
【００３１】
以上のようなプラスミドを大腸菌に導入することによって、かご状タンパク質を産生する形質転換体としての大腸菌を得ることができる。本実施形態において、形質転換体とは、かご状タンパク質のサブユニットをコードする遺伝子が導入され、当該遺伝子が発現した組換え微生物（大腸菌）のことを指す。
【００３２】
大腸菌の形質転換は、例えば、リン酸カルシウム法、及びエレクトロポレーション法等、当業者に周知の方法により行うことができる。
【００３３】
形質転換用の大腸菌としては、ラクトースオペロンに欠損のないものが好ましい。大腸菌は、好ましくは、Ｗ３１１０株、ＲＢ７９１株、ＢＬ２１株又はＳＣＳ１株であり、より好ましくはＷ３１１０株である。
【００３４】
プラスミドを大腸菌に導入して得られた形質転換体としての大腸菌を培養することにより、大腸菌が増殖して、かご状タンパク質が産生される。産生されるかご状タンパク質は、遺伝子工学的に容易に精製することができる。したがって、本実施形態に係る方法によれば、高純度のかご状タンパク質の工業的な製造に容易に適用することができる。
【００３５】
大腸菌の培養は、培地の組成、培地のｐＨ、培養温度、培養時間の他、インデューサー（誘導因子）の使用量、及び使用時間等の条件について、かご状タンパク質が効率的に発現するように適宜調整される。
【００３６】
大腸菌の培養に使用される培地は、当業者に知られる固体培地及び液体培地のどちらでもよい。好ましくは、液体培地が用いられる。培地の炭素源及び窒素源として、培養される大腸菌が利用できる任意の炭素源及び窒素源を用いることができる。炭素源は、好ましくは、デンプン、スクロース及びグルコース等の糖類、グリセロール等のアルコール類、並びに、有機酸（例えば、酢酸及びクエン酸）又はその塩（例えば、ナトリウム塩）から選ばれる。窒素源は、好ましくは、酵母エキス、カゼイン、コーンスチープリカー、ペプトン、及び肉エキス等の天然窒素源、並びに、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム及び尿素等の無機窒素化合物から選ばれる。炭素源の濃度は好ましくは１〜２０ｗ／ｖ％、より好ましくは１〜５ｗ／ｖ％である。窒素源の濃度は好ましくは１〜２０ｗ／ｖ％、より好ましくは１〜５ｗ／ｖ％である。好適な培地の具体例としては、ＬＢ培地、ＴＢ培地、及び２×ＹＴ培地が挙げられる。培養温度は、培養される微生物が十分に生育できる温度であり、好ましくは２０〜３７℃である。培養時間は、かご状タンパク質が十分に産生されるように適宜調整され、好ましくは１６〜４８時間程度である。培養は、好ましくは、好気的な条件下で、例えば、通気攪拌又は振盪を用いて行うことができる。大腸菌がアンピシリン及びカナマイシン等の抗生物質の耐性遺伝子を有している場合、対応する抗生物質を加えた培地を使用してもよい。誘導因子は、好ましくはラクトースである。
【００３７】
かご状タンパク質を精製する工程は、培養終了後の大腸菌及び／又は培養上清から、精製されたかご状タンパク質を回収することを含む。典型的には、培養終了後、大腸菌から得た無細胞抽出液を各種精製法により処理して、精製された高純度のかご状タンパク質を得ることができる。無細胞抽出液は、例えば、遠心分離によって形質転換体（大腸菌）を集め、得られた細胞を超音波処理等によって破砕した後、遠心分離等によって破砕された細胞を除去する方法により、得ることができる。発現した（組換え）かご状タンパク質が、細胞外に分泌される場合がある。この場合、培養上清から、無細胞抽出液と同様の方法により精製を行えばよい。
【００３８】
精製法は、例えば、無細胞抽出液又は培養上清の熱処理、塩析、並びに、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーから少なくとも１つが選択される。
【００３９】
無細胞抽出液又は培養上清を熱処理する温度は、好ましくは６０〜８０℃である。熱処理の時間は、好ましくは２０〜６０分である。これら温度及び時間で熱処理を行うことにより、特に効率的にかご状タンパク質を精製することができる。
【００４０】
かご状タンパク質がフェリチン又はＤｐｓであるとき、かご状タンパク質を精製する工程は、無細胞抽出液を熱処理すること、及び／又は、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製を含むことが好ましい。特に、無細胞抽出液又は培養上清を熱処理して夾雑タンパク質を除去した後、陰イオン交換クロマトグラフィーによりかご状タンパク質を精製することが好ましい。この場合、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製の後、更に、ゲル濾過クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー又は疎水クロマトグラフィーによる精製が好ましく行われる。このような方法によれば、大量のかご状タンパク質を容易に精製できることから、工業的な生産に適している。より好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの順に精製が行われる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例を挙げて本発明についてより具体的に説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。特に明記しない限り、各種操作は、モレキュラークローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）第２版（ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ）ら、１９８９年）に従って行った。「％」は、特に明記しない限り、「ｗ／ｖ％」を表す。精製されたかご状タンパク質の純度は、ゲルろ過カラムＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ４０００ＳＷＸＬ（東ソー株式会社製、商品名）を用いたＨＰＬＣ分析法により求めた。
【００４２】
（実施例１：プラスミドｐＫＬ２２３の構築）
プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロジェン社製、商品名）を鋳型にして、プライマーＢｓａ−ｌａｃＩ−ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号１）及びＢａｍ−ｌａｃＩ−ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号２）を用いてＰＣＲを行い、ｌａｃＩｑ遺伝子とその制御プロモーターを含む領域を増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製、商品名）を用いて次の反応条件で行った。ステップ１：９４℃、２分；ステップ２：９４℃、１５秒；ステップ３：６２℃、３０秒；ステップ４：６８℃、１分；ステップ５：４℃、∞；ステップ２からステップ４を３０サイクル繰り返した。得られた約１４００ｂｐの増幅断片を、ＢｓａＡＩ及びＢａｍＨＩで二重消化し、プラスミドｐＫＫ２２３−３（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製、商品名）のｔａｃプロモーターの上流に位置するＢｓａＡＩ−ＢａｍＨＩギャップに挿入して、図１に示すプラスミドｐＫＬ２２３を得た。用いたプライマーの配列を以下に示す。
Ｂｓａ−ｌａｃＩ−ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＡＴＣＧＣＴＡＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＴＣＡＴＧＧＣＴ−３’（配列番号１）
Ｂａｍ−ｌａｃＩ−ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＧＣＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣ−３’（配列番号２）
【００４３】
（実施例２：リステリア菌由来Ｄｐｓの生産）
生産菌の構築
論文（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９７年，２７２巻，ｐ．３２５９−３２６５）に記載の、リステリア  イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）由来Ｄｐｓのアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｐ８０７２５）を基に、データベースに登録されているこれに対応するＤＮＡ配列（Ｄｐｓ遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＪ２４４０１４、配列番号３）を検索した。開始コドンのすぐ上流にＷＳＤ配列（ＡＧＧＡＧＧＴＡＴＴＡＴ、配列番号４）を付加したＰＣＲ用プライマーＦＬＰ−Ｆｏｒｗａｒｄ−ＭｆｅＩ（配列番号５）及びＦＬＰ−Ｒｅｖｅｒｓｅ−ＰｓｔＩ（配列番号６）を設計した。設計した２つのプライマーを用いて、ＱＩＡＧＥＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ及びＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用いて調製したリステリア  イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６８０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、Ｄｐｓ遺伝子をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製、商品名）を用いて次の反応条件で行った。ステップ１：９４℃、２分；ステップ２：９４℃、１５秒；ステップ３：６０℃、３０秒；ステップ４：６８℃、４０秒；ステップ５：４℃、∞；ステップ２からステップ４を３０サイクル繰り返した。得られたＤＮＡ断片を、ＭｆｅＩ及びＰｓｔＩで消化し、プラスミドｐＫＬ２２３のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩギャップに挿入して、プラスミドｐＷＫＬＦを構築した。続いて、プラスミドｐＷＫＬＦを大腸菌Ｗ３１１０株に導入して、形質転換された大腸菌（「組換え大腸菌」と呼ぶ場合がある。）Ｗ３１１０（ｐＷＫＬＦ）を得た。用いたプライマーの塩基配列を以下に示す。
ＦＬＰ−Ｆｏｒｗａｒｄ−ＭｆｅＩ（配列番号５）：
５’−ＡＡＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＧＡＧＧＡＧＧＴＡＴＴＡＴＡＴＧＡＡＡＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＣＡＧＴＡＧＡＣＡＣＡＡＡＧＧ−３’
ＦＬＰ−Ｒｅｖｅｒｓｅ−ＰｓｔＩ（配列番号６）：
５’−ＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＡＴＴＣＴＡＡＴＧＧＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＧＧＡＡＴＧＣ−３’
【００４４】
組換え大腸菌Ｗ３１１０（ｐＷＫＬＦ）の培養
組換え大腸菌Ｗ３１１０（ｐＷＫＬＦ）を、終濃度５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した５ｍｌのＬＢ培地（ペプトン  １％、酵母エキス  ０．５％、塩化ナトリウム  １％、ｐＨ７．２）中で、３７℃に加温しながら、２００ｒｐｍで一夜振とうすることにより培養して、シード培養液を調製した。続いて、３Ｌ容ミニジャーファーメンター（Ｂｉｏｔｔ製）を用いて、１．５Ｌのラクトース（１％）を含む２×ＹＴ培地（ペプトン  ２％、酵母エキス  １％、塩化ナトリウム  ２％、ｐＨ７．２）にシード培養液１．５ｍｌを添加し、３７℃、通気量１ｖｖｍ、撹拌数４００ｒｐｍで培養を開始した。２４又は４８時間後、遠心分離（１０，０００×ｇ、１５分間、４℃）により培養液から菌体を集めた。菌体を５０ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）緩衝液（ｐＨ８．０）５００ｍｌに懸濁してから、再度遠心分離により菌体を集めて、洗浄菌体を調製した。
【００４５】
組換えタンパク質であるリステリア菌由来Ｄｐｓ（組換えリステリアＤｐｓ）の精製
洗浄菌体を湿重量の５倍量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁し、超音波破砕器によって菌体を破砕した。破砕された菌体を含む懸濁液を遠心分離（１３，０００×ｇ、３０分間、４℃）し、上清を集めて、組換えリステリアＤｐｓを含む無細胞抽出液を得た。次に、無細胞抽出液を６０℃で２０分間加熱した。これを遠心分離（１３，０００×ｇ、３０分間、４℃）により、熱変性によって生成した夾雑タンパク質の沈殿物を除去した。このときの組換えリステリアＤｐｓの純度は６２％であり、培養液１Ｌ当たりで換算した収量は１．３ｇであった。続いて、組換えリステリアＤｐｓを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化した陰イオン交換カラムＨｉｌｏａｄ  ２６／１０  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥ  ヘルスケア・ジャパン社製）に添加した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウムの０Ｍから０．４Ｍまでのリニアグラジェントにより、組換えリステリアＤｐｓを溶出させた。このときの純度は９５．８％であり、培養液１Ｌ当たりで換算した収量は０．９ｇであった。
【００４６】
さらに純度を上げるために、以下のカラム精製の工程を追加した。
【００４７】
ゲルろ過カラムによる精製
陰イオン交換カラムで溶出した組換えリステリアＤｐｓの画分について、限外ろ過による脱塩濃縮と、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）への溶媒交換を行った。続いて、組換えリステリアＤｐｓを含む溶液を、同緩衝液で平衡化したゲルろ過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ（ＧＥ  ヘルスケア・ジャパン社製）に添加した。同緩衝液で溶出された組換えリステリアＤｐｓの純度９９％以上の画分を集めた。このときの純度は９９．５％であり、培養液１Ｌ当たりで換算した収量は０．４ｇであった。
【００４８】
ハイドロキシアパタイトカラムによる精製
陰イオン交換カラムで溶出した組換えリステリアＤｐｓの画分について、限外ろ過による脱塩濃縮と、１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）への溶媒交換を行った。続いて、組換えリステリアＤｐｓを含む溶液を、同緩衝液で平衡化したハイドロキシアパタイトカラムＣＨＴ２−Ｉ（バイオラッド社製）に添加した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、リン酸カリウムの１０ｍＭから５００ｍＭまでのリニアグラジェントにより、組換えリステリアＤｐｓを溶出させた。得られた組換えリステリアＤｐｓの純度は９９．６％であり、培養液１Ｌ当たりで換算した収量は０．６ｇであった。
【００４９】
（実施例３：ウマ由来のＬ−アポフェリチンの生産）
生産菌の構築
天然型のウマ由来のＬ−アポフェリチンを製造するために、論文（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，  １９９３年，１１７４巻，ｐ．２１８−２２０）に記載の構造遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ１４５２３）から、Ｎ末端の８アミノ酸残基をコードする２４塩基を削除し、メチオニン１残基をコードする３塩基を付加した構成を有する、ウマ由来のＬ−アポフェリチンをコードする遺伝子を人工合成した（配列番号７）。開始コドンのすぐ上流に、ＷＳＤ配列（ＡＧＧＡＧＧＴＡＴＴＡＴ、配列番号４）を付加したＰＣＲ用プライマーＬＳＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ（配列番号８）及びＬＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号９）を設計した。設計した２つのプライマーを用いて、ウマ由来のＬ−アポフェリチンをコードする合成した遺伝子を鋳型として、ウマ由来のＬ−アポフェリチンをコードする遺伝子をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社製、商品名）を用いて次の反応条件で行った。ステップ１：９４℃、２分；ステップ２：９８℃、１０秒；ステップ３：６８℃、３０秒；ステップ４：４℃、∞；ステップ２からステップ３を３０サイクル繰り返した。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、プラスミドｐＫＬ２２３のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩギャップに挿入することによりプラスミドｐＷＫＬＳを構築した。作製されたプラスミドを大腸菌Ｗ３１１０株に導入し、組換え大腸菌Ｗ３１１０（ｐＷＫＬＳ）を得た。用いたプライマーの塩基配列を以下に示す。
ＬＳＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ（配列番号８）：
５’−ＧＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＡＴＴＡＴＡＴＧＴＡＴＴＣＴＡＣＴＧＡＡＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＴ−３’
ＬＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号９）：
５’−ＡＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＡＧＴＣＧＴＧＣＴＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＣＣＴＴＴＣＡＡＡＧ−３’
【００５０】
組換え大腸菌Ｗ３１１０（ｐＷＫＬＳ）の培養
実施例２と同様の手順により、組換え大腸菌Ｗ３１１０（ｐＷＫＬＳ）の培養、菌体の収集及び無細胞抽出液の調製を行った。
【００５１】
組換えタンパク質であるウマ由来のＬ−アポフェリチン（組換えウマＬ−アポフェリチン）の精製
７５℃、４０分の熱処理により、無細胞抽出液から夾雑タンパク質を除去した。このときの組換えウマＬ−アポフェリチンの純度は、４８％であり、培養液１Ｌ当たりで換算した収量は０．３ｇであった。続いて、陰イオン交換カラムＨｉｌｏａｄ  ２６／１０  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  （ＧＥ  ヘルスケア・ジャパン社製）による精製を実施例２と同様に行い、純度９２．５％の組換えウマＬ−アポフェリチンが得られ、その培養液１Ｌ当たりで換算した収量は０．１ｇであった。
【００５２】
（実施例４：ウマ由来のＨ−アポフェリチンの生産）
生産菌の構築
データベースに登録されているウマ由来のＨ−アポフェリチンの構造遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＹ１１２７４２）を定法により人工合成した（配列番号１０）。開始コドンのすぐ上流にＷＳＤ配列（ＡＧＧＡＧＧＴＡＴＴＡＴ、配列番号４）を付加したＰＣＲ用プライマーＨＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ（配列番号１１）及びＨＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１２）を設計した。設計した２つのプライマーを用いて、人工合成したウマ由来のＨ−アポフェリチンの構造遺伝子を鋳型として、ウマ由来のＨ−アポフェリチンをコードする遺伝子をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲは、実施例３に記載したｐＷＫＬＳの構築と同様の条件で行った。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、プラスミドｐＫＬ２２３のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ―ＨｉｎｄＩＩＩギャップに挿入することによりプラスミドｐＷＫＬＨを構築した。続いて、作製されたプラスミドを大腸菌Ｗ３１１０株に導入し、組換え大腸菌Ｗ３１１０（ｐＷＫＬＨ）を得た。用いたプライマーの塩基配列を以下に示す。
ＨＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ（配列番号１１）：
５’−ＧＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＡＴＴＡＴＡＴＧＡＣＧＡＣＣＧＣＧＴＴＣＣＣＣＴＣＧＣＡＧＧＴ−３’
ＨＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１２）：
５’−ＡＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＡＧＣＴＣＴＣＧＴＣＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＡＧＧＧＴＧＴＧ−３’
【００５３】
組換え大腸菌Ｗ３１１０（ｐＷＫＬＨ）の培養
組換え大腸菌Ｗ３１１０（ｐＷＫＬＨ）の培養及び菌体の収集は、実施例２と同様に行った。
【００５４】
組換えタンパク質であるウマ由来のＨ−アポフェリチン（組換えウマＨ−アポフェリチン）の精製
菌体破砕して得られた無細胞抽出液の調製及び熱処理による夾雑タンパク質の除去を、実施例３と同様に行った。このときの純度は、４５％であり、培養液１Ｌ当たりで換算した収量は０．４ｇであった。続いて、陰イオン交換カラムＨｉｌｏａｄ  ２６／１０  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  （ＧＥ  ヘルスケア・ジャパン社製）による精製を実施例２と同様に行い、純度９１．１％の組換えウマＨ−アポフェリチンが得られ、その培養液１Ｌ当たりで換算した収量は０．２ｇであった。
【００５５】
（実施例５：大豆由来のアポフェリチンの生産）
生産菌の構築
論文（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ２００７年，５６巻，ｐ．２３７−２４６）に記載のＳＦＥＲ１の成熟タンパク質のアミノ酸配列の情報を基に、データベースに登録されている大豆由来のフェリチンＳＦＥＲ１の構造遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＢＴ０９７３５９）から、Ｎ末端の４８アミノ酸残基をコードする１４４塩基を削除し、メチオニン１残基をコードする３塩基を付加した構成を有する、大豆由来のアポフェリチンＳＦＥＲ１をコードする遺伝子を定法により人工合成した（配列番号１３）。開始コドンのすぐ上流に、ＷＳＤ配列を付加したＰＣＲ用プライマーＳＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ（配列番号１４）及びＳＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１５）を設計した。設計した２つのプライマーを用い、大豆由来のアポフェリチンＳＦＥＲ１をコードする合成した遺伝子を鋳型として、大豆由来のアポフェリチンＳＦＥＲ１をコードする遺伝子をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲは、実施例３に記載したｐＷＫＬＳの構築と同様の条件で行った。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、プラスミドｐＫＬ２２３のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩギャップに挿入することによりプラスミドｐＷＫＬＳＦ１を構築した。作製されたプラスミドを大腸菌Ｗ３１１０株に導入し、組換え大腸菌Ｗ３１１０（ｐＷＫＬＳＦ１）を得た。用いたプライマーの塩基配列を以下に示す。
ＳＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ（配列番号１４）：
５’−ＧＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＡＴＴＡＴＡＴＧＧＣＣＴＣＡＡＣＧＧＴＧＣＣＴＣＴＣＴＣＡＧ−３’
ＳＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１５）：
５’−ＡＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＴＣＡＡＧＡＡＧＴＣＴＴＴＧＡＴＣＡＡＡＧＴＧＣＣＡＡＡＣＡＣＣＧ−３’
【００５６】
組換え大腸菌Ｗ３１１０（ｐＷＫＬＳＦ１）の培養
組換え大腸菌Ｗ３１１０（ｐＷＫＬＳＦ１）の培養及び菌体の収集は、実施例２と同様に行った。
【００５７】
組換えタンパク質である大豆由来のアポフェリチンＳＦＥＲ１（組換え大豆アポフェリチンＳＦＥＲ１）の精製
菌体破砕して得られた無細胞抽出液の調製及び熱処理による夾雑タンパク質の除去を実施例３と同様に行った。このときのＳＦＥＲ１の純度は、２６％であり、培養液１Ｌ当たりで換算した収量は０．４ｇであった。続いて、陰イオン交換カラムＨｉｌｏａｄ  ２６／１０  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  （ＧＥ  ヘルスケア・ジャパン社製）による精製を実施例２と同様に行い、純度９４．３％の組換え大豆アポフェリチンＳＦＥＲ１が得られ、その培養液１Ｌ当たりで換算した収量は０．２ｇであった。
【００５８】
（実施例６：ｃｏｗｐｅａ  ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ  （ＣＣＭＶ）のコートタンパク質の生産）
生産菌の構築
データベースに登録されているＣＣＭＶのコートタンパク質の構造遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｍ２８８１８）を定法により人工合成した（配列番号１６）。開始コドンのすぐ上流にＷＳＤ配列を付加したＰＣＲ用プライマーＣＣＭＶ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ（配列番号１７）及びＣＣＭＶ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１８）を設計した。設計した２つのプライマーを用いて、人工合成したＣＣＭＶコートタンパク質の構造遺伝子を鋳型として、ＣＣＭＶコートタンパク質をコードする遺伝子をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲは、実施例３に記載したｐＷＫＬＳの構築と同様の条件で行った。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、プラスミドｐＫＬ２２３のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ―ＨｉｎｄＩＩＩギャップに挿入することによりプラスミドｐＫＬ−ＷＣＣＭＶを構築した。作製されたプラスミドを大腸菌Ｗ３１１０株に導入し、組換え大腸菌Ｗ３１１０（ｐＫＬ−ＷＣＣＭＶ）を得た。用いたプライマーの塩基配列を以下に示す。
ＣＣＭＶ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ（配列番号１７）：
５’−ＧＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＡＴＴＡＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＧＴＣＧＧＡＡＣＡＧＧＧＡＡＧＴ−３’
ＣＣＭＶ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号１８）：
５’−ＡＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＴＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＧＡＡＡＧＡＧＴＣＧ−３’
【００５９】
組換え大腸菌Ｗ３１１０（ｐＫＬ−ＷＣＣＭＶ）の培養
組換え大腸菌Ｗ３１１０（ｐＫＬ−ＷＣＣＭＶ）を、終濃度５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した５ｍｌのＬＢ培地中、２５℃、２００ｒｐｍで一夜振とうすることにより培養し、シード培養液を調製した。シード培養液１．５ｍｌを、３Ｌ容ミニジャーファーメンター（Ｂｉｏｔｔ製）を用いて、１．５Ｌのラクトース（１％）を含む２×ＹＴ培地に添加し、２５℃、通気量１ｖｖｍ、撹拌数７００ｒｐｍで培養を開始した。４８時間後、遠心分離（１０，０００×ｇ、１５分間、４℃）により培養液から菌体を集め、５００ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に菌体を懸濁した。再度遠心分離により菌体を集めて、洗浄菌体を調製した。
【００６０】
組換えタンパク質であるコートタンパク質の精製
実施例２と同様にして、洗浄菌体から無細胞抽出液を調製した。得られた無細胞抽出液に硫酸アンモニウムを終濃度１．４Ｍとなるように添加し、氷上で２０分間撹拌することにより夾雑タンパク質を沈澱させ、遠心分離（１３，０００×ｇ、３０分間、４℃）により除去した。続いて、得られた上清に硫酸アンモニウムを終濃度２．１Ｍになるまで更に添加し、氷上で２０分間撹拌することによって、組換えタンパク質であるＣＣＭＶのコートタンパク質を沈澱させた。遠心分離（１３，０００×ｇ、３０分間、４℃）により沈澱画分を集め、０．１５Ｍ  塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。限外ろ過膜（ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０、５０，０００ｃｕｔ、ザルトリウス社製）で硫酸アンモニウムの除去と０．１５Ｍ  塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）への溶媒交換を行った。得られたコートタンパク質の純度は７８％であり、培養液１Ｌ当たりで換算した収量は０．２ｇであった。
【００６１】
（プラスミド及び大腸菌株の影響）
リステリア  イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）のＤｐｓをコードする塩基配列を、実施例２と同様にリステリア  イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６８０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ用プライマーＦＬＰ−Ｆｏｒｗａｒｄ−ＮｄｅＩ（配列番号１９）及びＦＬＰ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＢａｍＨＩ（配列番号２０）を用いてＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲは、実施例２に記載したｐＷＫＬＦの構築と同様の条件で行った。得られたＤＮＡ断片を、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、大腸菌発現用プラスミドｐＥＴ２０ｂ(＋)（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＴ７プロモーターの下流に位置するＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩギャップに挿入することにより、プラスミドｐＥＴ２０−ｆｌｐを構築した。作製されたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、組換え大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)(ｐＥＴ２０−ｆｌｐ)を得た。用いたプライマーの塩基配列を以下に示す。
ＦＬＰ−Ｆｏｒｗａｒｄ−ＮｄｅＩ（配列番号１９）：
５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＣＡＧＴＡＧＡＣＡＣＡＡＡＧＧ−３’
ＦＬＰ−Ｒｅｖｅｒｓｅ−ＢａｍＨＩ（配列番号２０）：
５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＴＡＴＴＣＴＡＡＴＧＧＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＧＧＡＡＴＧＣ−３’
【００６２】
組換え大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)(ｐＥＴ２０−ｆｌｐ)を、終濃度５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した５ｍｌのＬＢ培地中で、３７℃に加温しながら、２００ｒｐｍで一夜振とうすることにより培養し、シード培養液を調製した。このシード培養液２５μlを、ラクトース系プロモーターの発現誘導試薬であるＯｖｅｒｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ製）を添加した５ｍｌの２×ＹＴ培地に移植して、３７℃に加温しながら、２００ｒｐｍで培養した。実施例２で調製した組換え大腸菌Ｗ３１１０（ｐＷＫＬＦ）も、同様に培養した。どちらの菌株も培養４８時間でＤｐｓの生産性が最大となったので、菌体破砕液（無細胞抽出液）を段階的に希釈して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりその生産量を比較した。その結果を図２に示す。組換え大腸菌Ｗ３１１０（ｐＷＫＬＦ）の生産性は、組換え大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)(ｐＥＴ２０−ｆｌｐ)の約２０倍と推測された。
【００６３】
（熱処理による精製法の検討）
実施例２で調製した組換え大腸菌Ｗ３１１０（ｐＷＫＬＦ）を、終濃度５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した５ｍｌのＬＢ培地中で、３７℃に加温しながら、２００ｒｐｍで一夜振とうすることにより培養し、シード培養液を調製した。このシード培養液１．５ｍｌを、３Ｌ容ミニジャーファーメンター（Ｂｉｏｔｔ社製）を用いて、１．５Ｌのラクトース（１％）を含む２×ＹＴ培地に添加し、３７℃、通気量１ｖｖｍ、撹拌数４００ｒｐｍの条件で培養を開始した。４８時間後、遠心分離（１０，０００×ｇ、１５分間、４℃）により培養液から集めた菌体を、５００ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、再度遠心分離により菌体を集めて、洗浄菌体を調製した。洗浄菌体を湿重量の５倍量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁し、超音波破砕器にて菌体を破砕した。破砕された菌体を含む懸濁液を遠心分離（１３，０００×ｇ、３０分間、４℃）し、得られた上清を集めて、組換えリステリアＤｐｓを含む無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液を６０℃、７０℃、又は８０℃で、２０、４０、又は６０分間加熱した。続いて、遠心分離（１３，０００×ｇ、３０分間、４℃）により、熱変性によって生成した夾雑タンパク質の沈殿物を除去した。得られた精製ＤｐｓをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した結果を図３に示す。
【００６４】
（培地の種類の検討）
組換え大腸菌Ｗ３１１０（ｐＷＫＬＦ）を、終濃度５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した５ｍｌのＬＢ培地中で、３７℃に加温しながら、２００ｒｐｍで一夜振とうすることにより培養し、シード培養液を調製した。ＬＢ培地、２×ＹＴ培地、及びＴＢ培地（ペプトン  １．２％、酵母エキス  ２．４％、グリセロール  ０．０４％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．２３１％、Ｋ２ＨＰＯ４  １．２５４％）を準備した。各培地に、誘導因子として、ラクトース系プロモーターの発現誘導試薬であるＯｖｅｒｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＯＥ、Ｎｏｖａｇｅｎ製）、又はラクトースを１％若しくは２％添加した。誘導因子未添加の培地も培養に用いた。上記のシード培養液２５μｌを、５ｍｌの各培地に移植して、３７℃に加温しながら、２００ｒｐｍで培養した。４８時間培養して得られた菌体の無細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果を図４に示す。ラクトース添加によりＤｐｓの発現量が増大する傾向があり、なかでもＬＢ培地及び２×ＹＴ培地、特に２×ＹＴ培地において、顕著な発現量が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の製造方法によって得られるかご状タンパク質は、電子機器、医療及び環境等の分野において、ナノサイズの材料としての利用が期待される。
【図１】
2012200242.tif 000002
【図２】
2012200242.tif 000003
【図３】
2012200242.tif 000004
【図４】
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【配列表】
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