(57)【要約】【課題】不純物を有効に除去可能な、多孔膜状のアニオン交換膜を用いたタンパク質の精製方法を提供する。【解決手段】不純物と目的タンパク質とを含む混合溶液から、目的タンパク質を精製する方法であって、不純物と目的タンパク質とを含む混合溶液の水素イオン指数をｐＨ５．０以上ｐＨ８．５未満、塩濃度を０ｍｏｌ／Ｌ以上０．３ｍｏｌ／Ｌ未満に調整した後、濁質成分を除去するろ過膜を透過させて得られる澄明液を、多孔膜状のアニオン交換膜に通液することにより、不純物が除去された目的タンパク質のろ過液を回収する、タンパク質の精製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
不純物と目的タンパク質とを含む混合溶液から、前記目的タンパク質を精製する方法であって、
前記不純物と目的タンパク質とを含む混合溶液の水素イオン指数をｐＨ５．０以上ｐＨ８．５未満、塩濃度を０ｍｏｌ／Ｌ以上０．３ｍｏｌ／Ｌ未満に調整することと、
前記混合溶液を、濁質成分を除去するろ過膜に透過させて、澄明液を得ることと、
前記澄明液を多孔膜状のアニオン交換膜に通液して前記不純物を除去し、前記目的タンパク質のろ過液を回収することと、
を含む、タンパク質の精製方法。
【請求項２】
前記水素イオン指数をｐＨ５．０以上ｐＨ８．５未満、前記塩濃度に相関する電気伝導度を０ｍＳ／ｃｍ以上３０ｍＳ／ｃｍ以下に調整する、請求項１に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項３】
前記澄明液に含まれる前記不純物が、動的光散乱法によって得られる粒径が２０〜２００ｎｍの凝集体であり、沈殿することなく溶液中に分散した状態である、請求項１又は２に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項４】
前記調整することが、前記澄明液を得ることの前に実施される、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項５】
前記調整することが、前記澄明液を得ることの後、前記澄明液を多孔膜状のアニオン交換膜に通液する前に実施される、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項６】
前記多孔膜状のアニオン交換膜が、グラフト鎖を有する、最大孔径０．１μｍ以上０．８μｍ以下の多孔体よりなるアニオン交換膜である、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項７】
前記ろ過膜の細孔径が０．１μｍ以上１．０μｍ以下である、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項８】
前記目的タンパク質のろ過液を、クロマトグラフィーカラムを用いて精製することをさらに含む、請求項１乃至７のいずれか１項にタンパク質の精製方法。
【請求項９】
前記目的タンパク質が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、免疫グロブリン、及び抗体断片からなる群から選択される１種である、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の、タンパク質の精製方法。
【請求項１０】
前記不純物が、前記混合溶液中に溶存する不純物タンパク質、ＨＣＰ、ＤＮＡ、ウィルス、エンドトキシン、プロテアーゼ及びバクテリアからなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１乃至９のいずれか１項に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項１１】
前記調整することの前に、前記混合液の除濁をすることをさらに含む、請求項４に記載のタンパク質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の精製方法に関する。本発明は、具体的には、動物細胞培養液に代表される、目的とするタンパク質と、不純物と、を含む混合液から、不純物を簡便に除去し、目的とするタンパク質を効率的に精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品及び医療分野において、有用なタンパク質を効率的に精製する方法が求められている。また近年、バイオテクノロジー産業において、タンパク質の大量精製が重要な課題となっている。特に医薬の分野において、抗体医薬の需要が急速に拡大しており、効率的に大量のタンパク質を産生及び精製可能な技術の確立が望まれている。
【０００３】
一般的に、タンパク質は、動物由来の細胞株を用いる細胞培養によって産生される。細胞培養液からタンパク質を精製する通常の操作においては、最初に、細胞培養液を遠心分離し、濁質成分を沈降除去する。次いで、遠心分離で除去しきれない約１μｍ以下の細胞デブリを、精密ろ過膜を用いるサイズろ過により除去する。さらに無菌化するために、最大細孔径が０．２２μｍ以下のろ過膜を用いて無菌化ろ過を施し、目的タンパク質を含む無菌溶液を得る（ハーベスト工程）。続いて、代表的にはプロテインＡを用いるアフィニティクロマトグラフィーをはじめとする、複数のクロマトグラフィー技術の組み合わせによる精製プロセスを用いて、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ：Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、エンドトキシン、ウィルス、及びカラムから脱離したプロテインＡ等の夾雑物を、この無菌溶液から除去し、目的タンパク質を分離・精製する（ダウンストリーム工程）。
【０００４】
ダウンストリーム工程おいて、クロマトグラフィー技術は、不純物を取り除くために重要である。これは、濁質成分を除去した細胞培養液に残存する不純物は、溶液中に分子レベルのサイズで分散しているため、サイズ分離に基づいた精密ろ過膜及び限外ろ過膜では、目的とするタンパク質との分離が事実上不可能であることによる。クロマトグラフィー技術は、高度の精製を達成するためにタンパク質の化学的及び物理的性質を利用するものである。これらの化学的及び物理的性質は、典型的にはサイズ、等電点、電荷分布、疎水性部位及びリガンドに対する親和性による。代表的なクロマトグラフィーによる分離モードは、アフィニティ、イオン交換、疎水性相互作用、ゲルろ過、及び逆相のいずれかのクロマトグラフィーを含んでいる。
【０００５】
これらのクロマトグラフィー技術の中でも、特に重要なものは、アフィニティ、イオン交換、及び疎水性相互作用である。目的とするタンパク質が抗体である場合、アフィニティクロマトグラフィーは殆どの場合、プロテインＡを用いる。ここでは、抗体−抗原反応に基づいた特異的な相互作用により、リガンドであるプロテインＡに抗体分子が、極めて高い選択性をもって吸着する性質を利用しており、一般に溶液中に含まれる９５％以上の不純物が非吸着成分として除去される。アニオン交換及びカチオン交換クロマトグラフィーを含むイオン交換クロマトグラフィーは、表面電荷の違いによって、目的タンパク質と、不純物と、を分離する。疎水性相互作用クロマトグラフィーは、疎水性の差によって、目的物と、不純物と、を分離する。
【０００６】
クロマトグラフィー技術は高い信頼性を有するが、容量と処理量が大規模な場合の応用には、その再現性及びスケーラビリティを保証する事が問題となる。一般的なクロマトグラフィー工程は効果的で信頼性があるが、クロマトグラフィー工程の処理量は、典型的には対象タンパク質に対するクロマトグラフィー樹脂の能力によって制約される。吸着成分であるタンパク質が過剰となったり、あるいは非吸着成分が大量に存在したりする事などでカラムへの負荷が増大すると、目的タンパク質の不純物からの分離効率がしばしば低下する。
【０００７】
特に不純物を非吸着成分としてカラムを透過させて除去する、プロテインＡに代表されるアフィニティクロマトグラフィーの場合、溶液中の大量の不純物はカラム内に残留する不純物成分の増加につながり、目的タンパク質の精製度の低下をもたらす。
【０００８】
このため、カラムクロマトグラフィー工程前に、カラムに負荷を与える不純物を除去する方法が、これまでにも検討されている。最も一般的に実施されている方法は、目的タンパク質を含有する細胞培養液を、カラムクロマトグラフィーにかける前に、遠心分離、及び／又は精密ろ過膜による処理を施すことにより、溶液中に分散している不純物、あるいは沈殿している濁質成分として存在する不純物を除去する方法である（例えば、非特許文献１参照。）。この方法は、カラムクロマトグラフィーへの負荷を低減するために、ダウンストリーム工程前に実施する必須工程と認識されている。
【０００９】
不純物を濁質成分として除去することは、精密ろ過膜あるいは遠心分離により容易に実施することができる。しかし、溶液中に分子状に分散している不純物は、濁質成分と異なり、容易に除去できない。これに対し、溶液中に分子状に分散している不純物を、積極的に沈殿させることにより除去する方法が提案されている。例えば、特許文献１には、ポリカチオン多価電解質を用いて細胞培養液不純物を沈殿させることにより除去する、タンパク質精製方法が開示されている。また、特許文献２には、セルロース繊維と、シリカと、をベースとする粒子状又は繊維状のろ過エレメントに陽電荷を付与することにより、濁質成分と併せて負電荷を有する不純物成分を吸着により除去するろ過素材、及びそれを用いた精製方法が開示されている。また、特許文献２と同様なろ過素材は、特許文献３にも開示されている。さらに、特許文献４及び５には、分子状に分散しているために沈殿あるいは精密ろ過膜によるサイズろ過では除去することができない不純物を、溶液の透過の際に吸着することにより積極的に除去し、カラムプロセスへの負荷を大幅に低減するタンパク質の精製方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２０１０−５１６７７３号公報
【特許文献２】特表平４−５０４３７９号公報
【特許文献３】米国特許第７３９０４０３号明細書
【特許文献４】国際公開第２００９／０５４２２６号パンフレット
【特許文献５】特開２０１０−７０４９０号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】“ＰＲＯＣＥＳＳ  ＳＣＡＬＥ  ＢＩＯＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ”、Ｃｈａｐｔｅｒ  １、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ２００７  ｂｙ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ、ＵＳ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記に記載した従来の方法は、（１）濁質成分として溶液中に存在する不純物を、サイズろ過あるいは沈殿によって除去する方法、及び（２）分子状に分散した不純物を吸着によって除去する方法に限定されている。しかしながら、（１）の方法では溶液中に大量に存在する、分子状に分散した不純物を除去することはできない。また（２）の方法では、不純物を有効に吸着除去するために、吸着に用いる多孔膜の構造及び吸着メカニズムを高度に制御する必要があり、また吸着することができる分子状の不純物の量も限定される。したがって、従来よりも有効、かつ簡便に溶液中に存在する不純物を多量に除去する方法が求められている。
【００１３】
かかる状況に鑑み、本発明の解決しようとする課題は、多孔膜を用いて多量の不純物を有効にかつ選択的に除去することにより、簡便に目的タンパク質の回収を実施する、タンパク質の精製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、細胞培養液などの目的タンパク質を含む溶液の水素イオン指数（ｐＨ）及び塩濃度を調整し、濁質成分を取り除いた後にも澄明な溶液に分散して存在する形態の、凝集濁質成分と分子状成分との中間領域のサイズに相当する不純物凝集体が含まれる状態において、その溶液を不純物凝集体サイズより大きな最大細孔径を有する多孔膜状のアニオン交換膜に透過することにより、顕著に不純物が取り除かれたろ過液として、精製された目的タンパク質の回収が実現することを見出し、本発明を完成した。
【００１５】
すなわち、本発明の一態様は、以下の通りである。
（１）不純物と目的タンパク質とを含む混合溶液から、目的タンパク質を精製する方法であって、不純物と目的タンパク質とを含む混合溶液の水素イオン指数及び塩濃度を、水素イオン指数をｐＨ５．０以上ｐＨ８．５未満、塩濃度を０ｍｏｌ／Ｌ以上０．３ｍｏｌ／Ｌ未満に調整した後、濁質成分を除去する精密ろ過膜を透過させて得られる澄明液を、多孔膜状のアニオン交換膜に通液することにより、不純物が除去された目的タンパク質のろ過液を回収する、タンパク質の精製方法。
（２）澄明液に含まれる不純物が、動的光散乱法によって得られる粒径が２０〜２００ｎｍの凝集体として、沈殿することなく溶液中に分散した状態である、（１）に記載のタンパク質の精製方法
（３）多孔膜状のアニオン交換膜が、グラフト鎖を有する、最大孔径０．１μｍ以上０．８μｍ以下の多孔体よりなるアニオン交換膜である、（１）又は（２）に記載のタンパク質の精製方法。
（４）精密ろ過膜の細孔径が０．１μｍ以上１．０μｍ以下である、（１）乃至（３）のいずれかに記載のタンパク質の精製方法
（５）目的タンパク質のろ過液を、クロマトグラフィーカラムを用いて精製することをさらに含む、（１）乃至（４）のいずれかに記載のタンパク質の精製方法。
（６）目的タンパク質が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、免疫グロブリン、及び抗体断片からなる群から選択される１種である、（１）乃至（５）のいずれかに記載のタンパク質の精製方法。
（７）不純物が、混合溶液中に溶存する不純物タンパク質、ＨＣＰ、ＤＮＡ、ウィルス、エンドトキシン、プロテアーゼ及びバクテリアからなる群から選択される少なくとも１種を含む、（１）乃至（６）のいずれかに記載のタンパク質の精製方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の、多孔膜を用いたタンパク質の精製方法によれば、抗体等のタンパク質及び不純物を含む溶液から、ＨＣＰ、ＤＮＡ、エンドトキシン及びウィルスなどの夾雑物を簡便かつ高速に除去可能であり、抗体等のタンパク質の精製を有効かつ迅速に実施することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の実施例及び比較例の結果を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の本実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することが可能である。
【００１９】
本実施の形態に係る、タンパク質含有溶液の精製方法は、不純物と目的タンパク質とを含む混合溶液から、目的タンパク質を精製する方法であって、不純物と目的タンパク質とを含む混合溶液の水素イオン指数をｐＨ５．０以上ｐＨ８．５未満、塩濃度を０ｍｏｌ／Ｌ以上０．３ｍｏｌ／Ｌ未満に調整することと、混合溶液を、濁質成分を除去するろ過膜に透過させて、澄明液を得ることと、澄明液を多孔膜状のアニオン交換膜に通液して不純物を除去し、目的タンパク質のろ過液を回収することと、を含む。
【００２０】
ここで、精密ろ過膜は特に限定されるものではなく、タンパク質溶液中に肉眼にて認識される濁質成分をサイズろ過することが可能な最大細孔径を有する多孔膜であり、膜表面で分割するスクリーンろ過膜あるいは膜の内部で粒子を細くするデプス膜のいずれでもよい。また、細孔径分布が膜の厚さ方向で均一な対称膜あるいは細孔径が膜の厚さ方向によって異なる非対称膜のいずれでもよい。
【００２１】
精密ろ過膜の最大細孔径は、溶液中の濁質成分を除去し、かつ高い透過流速を得るという観点から、好ましくは０．１μｍ〜５．０μｍであり、より好ましくは０．１μｍ〜３．０μｍであり、さらに好ましくは０．１μｍ〜１．０μｍである。
【００２２】
多孔膜状のアニオン交換膜も特に限定されるものではなく、多孔膜の細孔表面に正電荷を有し、負電荷に帯電した微粒子あるいは分子を吸着捕捉することが可能なものであれば、中空糸状、平膜状などの形体によらず用いることが可能である。上記の使用に適した、一般に市販されているアニオン交換膜としては、旭化成メディカル製ＱｙｕＳｐｅｅｄ（登録商標）Ｄ、Ｐａｌｌ製ＭｕｓｔａｎｇＱ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ、Ｎａｔｒｉｘ製ａｄｓｅｐｔＱ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂなどが挙げられる。これらの中でも、細孔径よりも小さなサイズの不純物凝集物を効果的に捕捉する事に優れた、グラフト鎖を有するアニオン交換膜がより好ましく、上記市販の製品の中では旭化成メディカル製ＱｙｕＳｐｅｅｄ（登録商標）Ｄが最も好ましい。
【００２３】
多孔膜状のアニオン交換膜の最大細孔径は、溶液中の分散した不純物凝集体有効に捕捉し、かつ高い透過流速を得るという観点から、好ましくは０．１μｍ〜５．０μｍであり、より好ましくは０．１μｍ〜３．０μｍであり、さらに好ましくは０．１μｍ〜０．８μｍである。
【００２４】
以下において、多孔膜状のアニオン交換膜に用いられる多孔質基材に固定された親水性を有する分子鎖を「グラフト鎖」という。また、多孔質基材の内部の細孔の側壁を含む多孔質基材の総ての表面を単に「表面」といい、多孔質基材の内部の細孔の側壁を含まない表面を「主表面」という。
【００２５】
精密ろ過膜及び多孔膜状のアニオン交換膜に用いられる多孔質基材の形態は、溶液を通液することが可能な形態であれば特に限定されず、例えば、平膜、不織布、中空糸膜、モノリス、又はキャピラリーなどが挙げられる。これらの形態の中でも、製造の容易性、スケールアップ性、及びモジュール成型した際の膜のパッキング性などの観点から、中空糸膜が好ましい。また、多孔質基材の形状は、例えば円板又は円筒状であってもよいが、これに限定されない。
【００２６】
本実施の形態において、中空糸多孔膜とは、中空部分を有する円筒状又は繊維状の多孔膜であり、中空糸の内層と、外層と、が貫通孔である細孔によって連通しており、その細孔によって内層から外層、あるいは外層から内層に、液体又は気体が透過する性質を有する多孔体を意味する。中空糸の外径及び内径は、物理的に多孔膜が形状を保持することができ、かつモジュール成型可能であれば、特に限定されない。
【００２７】
本実施の形態において、「タンパク質」は、例えば「抗体」を含む。「抗体」とは、生体内に侵入した抗原と抗原抗体反応を起こし、抗原に対する免疫性を生体に与えるタンパク質の総称であり、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体及び免疫グロブリンなどを指す。特に本実施の形態における精製方法は、抗体医薬の製造工程で用い得るという観点から、上記の抗体のうち、抗体医薬となり得る抗体が、本実施の形態に係る精製方法の精製対象として好適である場合もある。
【００２８】
本実施の形態における「不純物」とは、抗体を精製しようとする対象溶液（混合液）中に含まれる、抗体以外の不純物を指し、例えば、抗体を細胞培養により産生させる際に培養槽内で産生される、目的抗体以外の不純物が挙げられる。より具体的には、ＨＣＰ、エンドトキシン、ＤＮＡ、プロテアーゼ、遊離プロテインＡ、ウィルス、及びバクテリア等が挙げられる。
【００２９】
本実施の形態における「目的タンパク質及び不純物を含む混合液」は、上記の抗体及び不純物を含有する溶液（又は含有する可能性のある溶液）であれば特に制限されず、本実施の形態に係る精製方法により、そこから抗体を精製しようとする対象溶液である。例えば、抗体の産生において用いられる細胞培養液又はその除濁液、あるいはそれらのダウンストリーム工程でのクロマトグラフィー工程中又は工程後の部分精製液等が挙げられる。
【００３０】
これらの中でも、ダウンストリーム工程における、代表的にはプロテインＡを用いるアフィニティクロマトグラフィー工程前の、遠心分離などの粗精製を経由した細胞培養液、又はアフィニティクロマトグラフィー工程後の部分的に精製された溶液が、不純物が部分的に除去されていることで後段の精製工程における負荷がより低減されることから、本実施の形態に係る精製方法の精製対象として特に好適である。混合液中の抗体及び不純物の濃度は、特に限定されない。しかし、本実施の形態における精製方法が、特に高濃度で抗体及び不純物を含有する混合液に対しても効率よく実施することができるという観点から、例えば、混合液は、精密ろ過膜を通過させる前、及び多孔膜状のアニオン交換膜を通過させる前の両方において、抗体及び不純物を合わせて２ｇ／Ｌ以上含んでいてもよく、さらには抗体を５ｇ／Ｌ以上、不純物を１ｇ／Ｌ以上含んでいてもよい。
【００３１】
上述した本実施の形態に係る多孔膜状のアニオン交換膜に、抗体及び不純物を含む混合液を通液し、不純物を除去して、目的タンパク質を精製する工程を、以下に説明する。
【００３２】
本実施の形態による典型的な抗体の精製方法の例としては、特に限定するものではないが、抗体と、不純物と、を含む混合液を本実施の形態に係る多孔膜状のアニオン交換膜に通液し、混合液中の不純物を多孔膜状のアニオン交換膜に捕捉させることより不純物を混合液から除去し、透過液を抗体の精製液として回収する方法が、最も簡便であり速やかに精製を実施することができることから好ましい。
【００３３】
抗体の等電点（ｐＩ）は通常、７〜８．５の範囲である。一方、ＨＣＰ、ＤＮＡ、及びウィルスなどの不純物の多くのｐＩは７以下にある。そのため、上記の多孔膜状のアニオン交換膜に通液する溶液のｐＨ範囲及び塩濃度（電気伝導度）を好適に制御することによって、多くの不純物を多孔膜状のアニオン交換膜上の正に帯電したアミノ基に吸着させ、透過液を抗体の精製液として回収することが可能となる。
【００３４】
また、タンパク質、ＤＮＡ、及びウィルスなどは、本質的に分子量及び等電点に広い分布を持ち、さらに疎水性相互作用などアニオン交換相互作用以外の性質も有する。そのため、溶液の特性、特にｐＨ及び塩濃度に代表されるイオン濃度を調整することにより、容易に凝集体を形成する。形成された凝集体は電荷を有したまま、分子状に分散している状態よりもサイズが大きくなる。そのため、凝集体は、多孔膜状のアニオン交換膜のアニオン交換基を有する細孔、特にグラフト鎖を有する細孔を透過する際に、細孔よりも小さなサイズであっても、静電的相互作用及び立体障害により、細孔内に容易に吸着あるいは捕捉される。
【００３５】
混合液中の不純物が凝集体を形成し、それを多孔膜状のアニオン交換膜に捕捉あるいは吸着させ、それにより不純物を混合液から除去し、透過液を抗体の精製液として回収する場合、凝集体の形成を促進し、かつ不純物の多孔膜への捕捉性が抗体よりも顕著になる条件に混合液のｐＨ及び塩濃度を調整する。具体的には、水素イオン指数がｐＨ５以上８．５未満及び塩濃度が０ｍｏｌ／Ｌ以上０．３ｍｏｌ／Ｌ未満の範囲に混合液を調整する。尚、用いる緩衝液並びに塩の種類にも依存するが、この塩濃度範囲は、電気伝導度にして、凡そ０ｍＳ／ｃｍ以上３０ｍＳ／ｃｍ以下に相当する。このように混合液を調整することにより、不純物は、動的光散乱法によって得られる粒径が２０〜２００ｎｍの凝集体を形成し、沈殿することなく溶液中に分散した状態となる。
【００３６】
塩濃度の調整に用いる塩としては、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの他、クエン酸、リン酸又はグリシンの金属塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、ｐＨの調整は通常、簡便には塩酸、酢酸、クエン酸、リン酸又は水酸化ナトリウムの添加によって行うことができるが、これに限定されず、当業者に公知のｐＨ調整方法を適宜用いることができる。溶液のｐＨ及び塩濃度の測定は、例えば市販の測定機器を用いて、当業者に公知の手法を用いて行うことができる。
【００３７】
上記のｐＨ及び塩濃度に調整した混合液を、例えば０．２２μｍの精密ろ過膜に通液して、サイズの大きな濁質成分として存在する不純物凝集体を精密ろ過膜によるサイズろ過により取り除いて澄明液を得た後、本実施の形態における多孔膜状のアニオン交換膜に通液することにより、ＨＣＰ、ＤＮＡ、エンドトキシン及びウィルスなどのｐＩが７以下の不純物と、それらの凝集体と、が多孔膜状のアニオン交換膜に吸着あるいは捕捉される。用いる精密ろ過膜の細孔径は通常当該業者においては、０．２２μｍが多く用いられるが、０．１μｍ以上１．０μ以下の細孔径の精密ろ過膜でも、同様な効果が期待される。なお、ｐＨ及び塩濃度の調整は、混合液を精密ろ過膜に通液した後、澄明液を多孔膜状のアニオン交換膜に通液する前に実施してもよい。
【００３８】
濁質成分の除去は、操作の簡便性及び迅速性の観点から、精密ろ過膜が用いられる。また、濁質成分を取り除かないまま、多孔膜状のアニオン交換膜に通液することにより不純物を除去すると、濁質成分が多孔膜状のアニオン交換膜の細孔を閉塞しやすく、溶液の通液が妨げられやすい。したがって、多孔膜状のアニオン交換膜への通液前に、精密ろ過膜により、濁質成分を取り除いた澄明液としておく。
【００３９】
混合液のｐＨ及び塩濃度に代表される組成を、精製対象とする抗体のｐＩに応じて調整することにより、不純物凝集体の形成を促進し、不純物、特に不純物凝集体がより選択的に多孔膜に捕捉され、抗体の精製をより有効に行うことができる。
【００４０】
一般的な抗体のｐＩは８近辺にあるという観点から、混合液の酸性度は、ｐＨ５以上ｐＨ８．５未満、好ましくはｐＨ６以上８．５未満である。また、混合液の塩濃度は、０ｍｏｌ／Ｌ以上０．３ｍｏｌ／Ｌ未満、好ましくは０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．１５ｍｏｌ／Ｌである。塩濃度及びｐＨ調整の際に用いる緩衝剤の性質により、抗体のｐＩより低いｐＨであっても、抗体の多孔膜状のアニオン交換膜への吸着による損失を抑制することができる。たとえば、塩濃度が０．０５ｍｏｌ／Ｌ以上、あるいは緩衝剤としてリン酸あるいはクエン酸のような多価緩衝剤を用いてｐＨ調整を実施した溶液であれば、抗体の多孔膜状のアニオン交換膜への静電的な吸着を抑制する。一方で、不純物凝集体は静電的相互作用のみならず、立体障害的な相互作用により、多孔膜状のアニオン交換膜の細孔に容易に捕捉される。これにより、不純物のみを多孔膜状のアニオン交換膜に捕捉させ、抗体を透過することによって、目的タンパクである抗体を精製することが可能である。
【００４１】
このようにして、透過液として得られた抗体の精製液を、さらにカラムクロマトグラフィー工程にかけることにより、抗体をより高収率で精製することが可能となる。この際、クロマトグラフィー前の混合液中の不純物が顕著に減少しているため、カラムへの負荷を大幅に低減させ、精製度を高めると共に、カラムの寿命を延長することが可能である。クロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡに代表されるアフィニティカラム、カチオン交換、アニオン交換、疎水性、及びハイドロキシアパタイトなどのクロマトグラフィーカラムが挙げられる。これらのカラムを用いた抗体などのタンパク質の精製方法は、当該業者にとって自明な方法によって実施することができる。
【００４２】
本実施の形態に係る方法を用い、本明細書の記載を参照することにより、高濃度の抗体及び高濃度の不純物を含む塩を含む溶液から、不純物を、簡便、高速かつ選択的に除去することが可能となる。そのため、有効かつ迅速に、溶液から抗体を精製することが可能となる。したがって、精製された抗体を工業的に効率的に得ることが可能となる。
【００４３】
以下、実施例及び比較例（本明細書中において、単に「実施例等」ともいう。）に基づいて本実施の形態をさらに具体的に説明するが、本実施の形態の範囲は以下の実施例のみに限定されない。
【実施例１】
【００４４】
ｉ）不純物を含有するＣＨＯ細胞培養液（母液）の作成及び評価
インビトロジェン社製、ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ（登録商標）無血清培地を用いて得られた細胞培養液を、最大孔径０．４５μｍの精密ろ過膜（旭化成メディカル社製、ＭＦ−ＳＬ）によりろ過、除濁し、評価に用いる細胞培養液の澄明な母液を得た。得られた母液をＧＥヘルスケアバイオサイエンス製ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００に通液することにより、ｐＨ７．５、電気伝導度１０．６ｍＳ／ｃｍ、２８０ｎｍのＵＶ吸光度は２５００ｍＡＵ以上、と評価された。また母液に含まれる不純物タンパク質濃度をウシ血清アルブミンを標準タンパク質としたＢｒａｄｆｏｒｄ法（ｎｏｖｅｘｉｎ社製、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ＵＬＴＲＡ  ｋｉｔ）により測定したところ、０．３ｍｇ／ｍＬであった。
【００４５】
母液中のＨＣＰ濃度は、ＣＹＧＮＵＳ社製、ＣＨＯ  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、３ｒｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎを用いたＥＬＩＳＡ法により定量した。微量に含まれるＤＮＡは、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ｄｓＤＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙ  Ｑｕｂｉｔ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔを用いた、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒにより定量した。ＥＬＩＳＡ法により求めた母液中のＨＣＰ濃度は０．２ｍｇ／ｍＬ、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ法で求めた母液のＤＮＡ濃度は２７．２μｇ／ｍＬであった。
【００４６】
ｉｉ）評価液となる細胞培養液の母液の調整
上記の母液に攪拌しながら０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸を滴下し、ｐＨ７．０及びｐＨ６．０に調整した後、ザルトリウス社製の精密ろ過膜ミニザルト（最大細孔径０．２２μｍ）を用いてろ過し、評価に用いる澄明液を得た。澄明液に含まれるＨＣＰ濃度は、ｐＨ７．０及びｐＨ６．０のそれぞれにおいて、０．２ｍｇ／ｍＬと母液と変わらなかった。また、ＤＮＡ濃度は、ｐＨ７．０及びｐＨ６．０のそれぞれにおいて、１９．５μｇ／ｍＬ及び１６．３μｇ／ｍＬと、母液より僅かに低下していた。
【００４７】
同様にして、母液に攪拌しながら０．１ｍｏｌ／Ｌ  酢酸を滴下し、ｐＨ６．０に調整した後、精密ろ過膜によりろ過し、評価に用いる澄明液を得た。澄明液に含まれるＨＣＰ濃度は、０．２ｍｇ／ｍＬと母液と変わらなかった。また、ＤＮＡ濃度は、１１．２μｇ／ｍＬと、母液より低下していた。
【００４８】
さらに同様にして、母液に攪拌しながら０．１ｍｏｌ／Ｌ  クエン酸を滴下し、ｐＨ６．０に調整した後、精密ろ過膜によりろ過し、評価に用いる澄明液を得た。澄明液に含まれるＨＣＰ濃度は、０．２ｍｇ／ｍＬと母液と変わらなかった。また、ＤＮＡ濃度は、１３．４μｇ／ｍＬと、母液より低下していた。
【００４９】
以下、リン酸ｐＨ７．０、リン酸ｐＨ６．０、酢酸ｐＨ６．０及びクエン酸ｐＨ６．０に調整された評価に用いる澄明液を、それぞれ、澄明液ａ、澄明液ｂ、澄明液ｃ及び澄明液ｄとする。大塚電子製粒径測定システムＥＬＳＺ−２を用いた動的光散乱法により、澄明液中に分散して存在する不純物凝集物のサイズを評価したところ、澄明液ａ、ｂ、ｃ及びｄについてそれぞれ、６９ｎｍ、８７ｎｍ、１０７ｎｍ及び９１ｎｍであった。
【００５０】
ｉｉｉ）澄明液のアニオン交換膜への透過
グラフト鎖を有する多孔膜状のアニオン交換膜として、旭化成メディカル社製ＱｙｕＳｐｅｅｄ（登録商標）Ｄ  ０．６ｍＬを用意し、評価に用いる上記のそれぞれの澄明液を透過させ、ろ過液を得た。透過評価においては、多孔膜状のアニオン交換膜をＧＥヘルスケアバイオサイエンス製ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００に設置して、同装置のサンプルポンプにより澄明液を供給し、ろ過液を同社フラクションコレクターＦｒａｃ−９６０により採取した。また、透過させる澄明液の液量は、多孔膜状のアニオン交換膜の膜体積３００倍である、１８０ｍＬとした。
【００５１】
それぞれの澄明液より得られたろ過液中に含まれるＨＣＰ及びＤＮＡ濃度は、澄明液ａ由来のろ過液についてはそれぞれ、４８μｇ／ｍＬ及び１１２ｎｇ／ｍＬ、澄明液ｂ由来のろ過液は３２μｇ／ｍＬ及び１０１ｎｇ／ｍＬ、澄明液ｃ由来のろ過液は１８μｇ／ｍＬ及び８７ｎｇ／ｍＬ、澄明液ｄ由来のろ過液は２１μｇ／ｍＬ及び８６ｎｇ／ｍＬであり、不純物の顕著な低下が確認された。図１に、これらの結果及び以下の実施例及び比較例の結果を記載した。
【００５２】
[比較例１]
実施例１のｉ）で調整した細胞培養液の澄明な母液を、ｐＨを調整することなく、０．２２μｍの精密ろ過膜に透過させた。精密ろ過後の澄明液のＨＣＰ濃度は０．２ｍｇ／ｍＬ、ＤＮＡ濃度は２７．２μｇ／ｍＬと０．４５μｍ精密ろ過後の母液と変わらなかった。また、動的光散乱により得られた凝集物の数平均粒径は、２７ｎｍであった。次に、澄明液をアニオン交換膜としての旭化成メディカル社製ＱｙｕＳｐｅｅｄ（登録商標）Ｄ  ０．６ｍＬに１８０ｍＬ通液し、ろ過液を採集した。アニオン交換膜のろ過液中に含まれるＨＣＰ及びＤＮＡ濃度は、それぞれ０．１１ｍｇ／ｍＬ及び０．９μｇ／ｍＬであり、大幅な低下は見られたものの、実施例１の方法によるものと比べると、不純物除去性は大きく低下していた。
【実施例２】
【００５３】
実施例１のｉ）で調整した細胞培養液の澄明な母液を、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、ＡＫＴＡｃｌｏｓｓｆｌｏｗを用いて４倍濃縮した後、３倍量の体積の２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．５）緩衝液により、液置換を実施し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５の濃縮培養液を得た。得られた濃縮培養液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．５）緩衝液により、１３．５倍に希釈し、１ｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌ溶液を用いて、ｐＨ７．５に調整した。また、得られた溶液の１部を分取し、塩濃度０．１５ｍｏｌ／ＬとなるようにＮａＣｌを添加した。得られた溶液を０．２２μｍの精密ろ過膜によってろ過することにより、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５の、塩濃度０ｍｏｌ／Ｌ及び０．１５ｍｏｌ／Ｌの澄明液を調整し、これらをそれぞれ、澄明液ｅ及び澄明液ｆとした。澄明液ｅ及びｆに含まれるＨＣＰ及びＤＮＡの濃度は共にそれぞれ、６３μｇ／ｍＬ及び６．５μｇ／ｍＬであった。また、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００に通液することにより、同装置の電気伝導計により求められた電気伝導度は、澄明液ｅ及びｆについて、それぞれ１．６ｍＳ／ｃｍ及び１７．３ｍＳ／ｃｍであった。また動的光散乱法により求めた、澄明液ｅ及びｆ中に分散する、凝集物の粒径はそれぞれ、７２ｎｍ及び５４ｎｍであった。
【００５４】
実施例１と同様にして、それぞれの澄明液１８０ｍＬを、旭化成メディカル社製ＱｙｕＳｐｅｅｄ（登録商標）Ｄ  ０．６ｍＬに通液し、ろ過液としての透過フラクションを採取した。各透過フラクションに含まれるＨＣＰ及びＤＮＡの濃度は、澄明液ｅ由来のろ過液ではそれぞれ、６．３μｇ／ｍＬ及び２５ｎｇ／ｍＬ、澄明液ｆ由来のろ過液ではそれぞれ、３３μｇ／ｍＬ及び２５ｎｇ／ｍＬであり、共に顕著な不純物成分の減少が確認された。
【００５５】
[比較例２]
実施例２で調整した、Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５の濃縮培養液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．５）緩衝液により、１３．５倍に希釈し、これに塩濃度０．３ｍｏｌ／ＬとなるようにＮａＣｌを添加した。得られた溶液を０．２２μｍの精密ろ過膜によってろ過することにより、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５の、塩濃度０．３ｍｏｌ／Ｌの澄明液を調整し、これを澄明液ｇとした。澄明液ｇに含まれるＨＣＰ及びＤＮＡの濃度は共にそれぞれ、６０μｇ／ｍＬ及び６．６μｇ／ｍＬであった。また、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００に通液することにより、同装置の電気伝導計により求められた電気伝導度は、３１．４ｍＳ／ｃｍであった。また動的光散乱法により求めた、澄明液ｇ中に分散する、凝集物の粒径２２ｎｍであった。
【００５６】
実施例１と同様にして、澄明液ｇ、１８０ｍＬを、旭化成メディカル社製ＱｙｕＳｐｅｅｄ（登録商標）Ｄ  ０．６ｍＬに通液し、ろ過液としての透過フラクションを採取した。透過フラクションに含まれるＨＣＰ及びＤＮＡの濃度は、それぞれ、６０μｇ／ｍＬ及び６２ｎｇ／ｍＬであり、ＤＮＡは顕著な減少が確認されたが、ＨＣＰは減少しなかった。
【実施例３】
【００５７】
実施例１のｉ）で調整した細胞培養液の澄明な母液を、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、ＡＫＴＡｃｌｏｓｓｆｌｏｗを用いて４倍濃縮した後、３倍量の体積の２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ａｃｅｔａｔｅ−ＮａＯＨ  （ｐＨ５．０）緩衝液により、液置換を実施し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ａｃｅｔａｔｅ  ｐＨ５．０の濃縮培養液を得た。得られた濃縮培養液を２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ａｃｅｔａｔｅ−ＮａＯＨ  （ｐＨ６．０）緩衝液により、１０倍に希釈し、１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ溶液を用いて、ｐＨ６．０に調整した。また、得られた溶液の１部を分取し、塩濃度０．１５ｍｏｌ／ＬとなるようにＮａＣｌを添加した。得られた溶液を０．２２μｍの精密ろ過膜によってろ過することにより、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ａｃｅｔａｔｅ  ｐＨ６．０の、塩濃度０ｍｏｌ／Ｌ及び０．１５ｍｏｌ／Ｌの澄明液を調整し、これらをそれぞれ、澄明液ｈ及び澄明液ｉとした。澄明液ｈ及びｉに含まれるＨＣＰ及びＤＮＡの濃度は、澄明液ｈではそれぞれ、５７μｇ／ｍＬ及び２．４μｇ／ｍＬ、澄明液ｉではそれぞれ、６２μｇ／ｍＬ及び０．９μｇ／ｍＬであった。また、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００に通液することにより、同装置の電気伝導計により求められた電気伝導度は、澄明液ｈ及びｉについて、それぞれ１．７ｍＳ／ｃｍ及び１７．４ｍＳ／ｃｍであった。また動的光散乱法により求めた、澄明液ｈ及びｉ中に分散する、凝集物の粒径はそれぞれ、１０７ｎｍ及び７１ｎｍであった。
【００５８】
実施例１と同様にして、それぞれの澄明液１８０ｍＬを、旭化成メディカル社製ＱｙｕＳｐｅｅｄ（登録商標）Ｄ  ０．６ｍＬに通液し、ろ過液としての透過フラクションを採取した。各透過フラクションに含まれるＨＣＰ及びＤＮＡの濃度は、澄明液ｈ由来のろ過液ではそれぞれ、８．５μｇ／ｍＬ及び１２ｎｇ／ｍＬ、澄明液ｉ由来のろ過液ではそれぞれ、３７μｇ／ｍＬ及び１４ｎｇ／ｍＬであり、共に顕著な不純物成分の減少が確認された。
【実施例４】
【００５９】
実施例３で調整した、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．５）緩衝液により、１３．５倍に希釈し、塩濃度０．１５ｍｏｌ／ＬとなるようにＮａＣｌを添加した溶液に、抗体タンパク質（株式会社ベネシス製、献血ヴェノグロブリン−ＩＨ）を２ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、再度ｐＨ７．５に調整した。得られた溶液を０．２２μｍの精密ろ過膜によってろ過することにより、抗体タンパク質と不純物を含む、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、塩濃度０．１５ｍｏｌ／Ｌの澄明液を調整し、これを澄明液ｊとした。澄明液ｊに含まれるＨＣＰ及びＤＮＡの濃度は共にそれぞれ、６３μｇ／ｍＬ及び６．５μｇ／ｍＬ、また、電気伝導度は１７．３ｍＳ／ｃｍと同じ組成で、抗体タンパク質を添加していない、澄明液ｆと同じであった。さらに動的光散乱法によって評価された分散する凝集物の平均粒径は４９ｎｍであった。
【００６０】
実施例１と同様にして、澄明液ｊ、１８０ｍＬを、旭化成メディカル社製ＱｙｕＳｐｅｅｄ（登録商標）Ｄ  ０．６ｍＬに通液し、ろ過液としての透過フラクションを採取した。透過フラクションに含まれるＨＣＰ及びＤＮＡの濃度は、３２μｇ／ｍＬ及び２４ｎｇ／ｍＬであり、顕著な不純物成分の減少が確認された。
【００６１】
アニオン交換膜透過前後での抗体タンパク質の回収率は、アィニティクロマトグラフィーによって評価した。島津製作所株式会社製高速液体クロマトグラフＬＣ−２０ＡシステムにアフィニティカラムとしてＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製ＰＯＲＯＳ  Ｇ（ＰｒｏｔｅｉｎＧカラム）を取り付け、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸に０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含むバッファー（ｐＨ７．０）を用い、室温において流速２ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液し、ここにアニオン交換膜透過前後のサンプルを１００μＬ添加した。また溶出には１２ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸に０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含むバッファーを用いた。その後、システムに、プロテインＧカラムに吸着・溶出した抗体タンパク質の溶出ピークを表示させ、溶出ピーク面積を比較することにより、アニオン交換膜透過による抗体タンパク質の回収率を求めた結果、回収率は９６％であった。
【図１】
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