(57)【要約】【課題】  改変前の抗体が有する抗原との親和性を低下させずに特異性のみを改善した抗体、および前記抗体の作製方法を提供すること。【解決手段】  抗体の可変領域のアミノ酸のうち、抗原との結合に関与しないアミノ酸を他のアミノ酸に一つ以上置換して作製した抗体により、前記課題を解決する。【選択図】  図５
2012041332.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の可変領域のアミノ酸のうち、抗原との結合に関与しないアミノ酸を他のアミノ酸に一つ以上置換した、抗原との親和性を低下させることなく、類似抗原に対する交差反応性を低下させた抗体。
【請求項２】
抗体の可変領域が抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
抗原が甲状腺ホルモンやステロイドホルモン等の低分子ホルモンである、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
抗原がトリヨードサイロニン（Ｔ３）であり、類似抗原がジクロフェナク代謝物である、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
配列番号１からなるアミノ酸配列を含む抗体のうち、配列番号１の６番目のバリン、および／または７番目のアルギニンを他のアミノ酸に置換した、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
抗原がエストラジオール（Ｅ２）であり、類似抗原がエチニルエストラジオール（ＥＥ２）である、請求項３に記載の抗体。
【請求項７】
配列番号３からなるアミノ酸配列を含む抗体のうち、配列番号３の５番目のセリン、および／または６番目のイソロイシンを他のアミノ酸に置換した、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
抗体の可変領域のアミノ酸のうち、抗原との結合に関与しないアミノ酸を他のアミノ酸に一つ以上置換することで、抗原との親和性を低下させることなく、類似抗原に対する交差反応性を低下させた抗体を作製する方法。
【請求項９】
抗原との結合に関与しないアミノ酸をアラニンスキャニングにより選定する、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は特異性を改変（改善）した抗体およびその作製方法に関するものである。具体的には、甲状腺ホルモンやステロイドホルモン等の低分子ホルモンを認識する抗体における、類似抗原との交差反応性の改善に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体はその特異性と親和性の高さから、実験用試薬としてだけではなく、免疫診断薬、治療用医薬品など幅広く利用されている。これらの用途で使用する抗体は特に高い特異性が要求されるが、特異性の高い抗体を単離するのは一般に難しく、特に低分子抗原を高い特異性で認識する抗体の単離は難しい。その理由として、低分子抗原では抗体と相互作用（結合）可能な部分が限られており、前記抗体と相互作用（結合）可能な部分と類似した化学構造を有する化合物が多く存在するからである。低分子抗原の例としては、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、サイロキシン（Ｔ４）、３，５−ジヨード−Ｌ−サイロニン（Ｔ２）などに代表される甲状腺ホルモン、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）、エストリオール（Ｅ３）、プロゲステロン、コルチゾールなどに代表されるステロイド骨格を有したステロイドホルモン、各種薬物およびその代謝物（ジクロフェナク代謝物など）があげられる。
【０００３】
遺伝子工学的手法により、酵素の特定のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することで、酵素の特異性を向上させたり、耐熱性を向上させたりすることは広く行なわれている。また、モノクローナル抗体の特異性の改変に関しては、非特許文献１に記載のプロテインエンジニアリングという手法を用いて行なうことができることがよく知られている。
【０００４】
例えば、特許文献１では、ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、相補性決定領域）にランダム変異を導入した組換Ｆａｂ断片をファージ上に表示させ、競合的特異性パニング法を用いることで、類似抗原への交差反応性を減少させている。競合的特異性パニング法を簡単に述べると、
（１）ファージ表面で表示される変異体Ｆａｂ断片ライブラリーを、交差反応を示す物質と共存させて不活化し、
（２）抗原が固定化された水不溶性担体をライブラリーに接触させて、抗原に結合した抗体を回収し、
（３）抗原に結合した抗体を何らかの方法で増幅させ新たなライブラリーを作製し、
（４）さらに交差反応物質による不活化、抗原が固定化された水不溶性担体への反応操作を繰り返すことで、
最終的に交差反応性が低下した（特異性の高い）抗体を得る方法である。しかしながら、抗原抗体反応が平衡反応である以上、抗原と抗体との結合は濃度の影響を受ける。例えば、ライブラリー中に微量しか存在しない、特異性の高い抗体を選択的に濃縮することは原理的に不可能である。
【０００５】
パニング法以外で抗体機能を改変した例として、特許文献２が報告されている。特許文献２では、抗体可変領域をアラニン走査（アラニンスキャニング）することで、アラニン置換した時に抗原結合能が上昇するアミノ酸の位置を見出し、その位置のアミノ酸を無作為化（アラニン以外のアミノ酸に置換）することで、抗原結合能が上昇した変異型抗体を得ている。しかしながら、前記方法では、アラニン置換で抗原結合能が変化しなかった位置における、アミノ酸の無作為化および交差反応性の評価は行なわない。
【０００６】
ランダム変異以外の方法で、抗体への変異導入により交差反応性を改善した例として、特許文献３に記載の分子シミュレーションソフトを用い、アミノ酸変異を導入する部位を特定し、前記部位のアミノ酸を置換して特異性を改善した方法が報告されている。しかしながら、目的抗原への親和性を変化させずに、交差反応性を改善した抗体を得るには至っていない。
【０００７】
つまり、これまでは、選択工程で偏りが生じる可能性のあるランダム変異を用いた方法を除き、改変前の抗体が有する親和性を低下させずに、特異性のみを改善（交差反応性のみを低下）させる方法は報告されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００１−５１５９２１号公報
【特許文献２】特表平９−５０９８３５号公報
【特許文献３】特開平９−２４１３００号公報
【特許文献４】特開２００９−２４０３００号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、５、３４３、１９９２
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７、６７７６、１９９２
【非特許文献３】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０８、６７３、１９９０
【非特許文献４】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１７、１３５、１９９５
【非特許文献５】Ｊ．Ｆｅｒｍ．Ｂｉｏｅｎｇ．、７９、４０５、１９９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、改変前の抗体が有する抗原との親和性を低下させずに特異性のみを改善した抗体、および前記抗体の作製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する。
【００１２】
第一の態様は、抗体の可変領域のアミノ酸のうち、抗原との結合に関与しないアミノ酸を他のアミノ酸に一つ以上置換した、抗原との親和性を低下させることなく、類似抗原に対する交差反応性を低下させた抗体である。
【００１３】
第二の態様は、抗体の可変領域が抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）である、前記第一の態様に記載の抗体である。
【００１４】
第三の態様は、抗原が甲状腺ホルモンやステロイドホルモン等の低分子ホルモンである、前記第一または第二の態様に記載の抗体である。
【００１５】
第四の態様は、抗原がトリヨードサイロニン（Ｔ３）であり、類似抗原がジクロフェナク代謝物である、前記第三の態様に記載の抗体である。
【００１６】
第五の態様は、配列番号１からなるアミノ酸配列を含む抗体のうち、配列番号１の６番目のバリン、および／または７番目のアルギニンを他のアミノ酸に置換した、前記第四の態様に記載の抗体である。
【００１７】
第六の態様は、抗原がエストラジオール（Ｅ２）であり、類似抗原がエチニルエストラジオール（ＥＥ２）である、前記第三の態様に記載の抗体である。
【００１８】
第七の態様は、配列番号３からなるアミノ酸配列を含む抗体のうち、配列番号３の５番目のセリン、および／または６番目のイソロイシンを他のアミノ酸に置換した、前記第六の態様に記載の抗体である。
【００１９】
第八の態様は、抗体の可変領域のアミノ酸のうち、抗原との結合に関与しないアミノ酸を他のアミノ酸に一つ以上置換することで、抗原との親和性を低下させることなく、類似抗原に対する交差反応性を低下させた抗体を作製する方法である。
【００２０】
第九の態様は、抗原との結合に関与しないアミノ酸をアラニンスキャニングにより選定する、前記第八の態様に記載の方法である。
【００２１】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２２】
本発明の抗体は、抗体のアミノ酸配列のうち、可変領域にある抗原との結合に関与しないアミノ酸を他のアミノ酸に一つ以上置換した抗体であって、抗原との親和性を低下させることなく、類似抗原に対する交差反応性を低下させた抗体である。可変領域は、抗体間でのアミノ酸配列の違いが極めて大きい（超可変領域である）ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、相補性決定領域）と、抗体間でのアミノ酸配列の違いが比較的少ないＦｒ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ、フレームワーク領域）との二つの領域にわかれるが、抗原との結合に直接関与する領域であるＣＤＲのアミノ酸に対して一つ以上のアミノ酸置換を行なった抗体が、本発明の効果をより発揮できる点で好ましい。なお、他のアミノ酸への置換は、軽鎖の可変領域にあるアミノ酸に対してのみ行なってもよいし、重鎖の可変領域にあるアミノ酸に対してのみ行なってもよいし、重鎖および軽鎖の可変領域にあるアミノ酸に対して行なってもよい。
【００２３】
本発明において、抗原との親和性を低下させることなく、とは、実験用試薬、免疫診断薬、治療用医薬品などで要求される抗原との親和性を少なくとも有していればよく、抗原との親和性の絶対値はアミノ酸置換前の抗体と比較して低下してもよい。親和性低下の割合は、アミノ酸置換前の抗体が有する抗原との親和性の大きさに依存するが、一般的には２０％以内、好ましくは１０％以内、さらに好ましくは５％以内である。
【００２４】
本発明における、類似抗原とは、本来抗体と結合すべき抗原と類似した化学構造を有する化合物のことをいい、例として、本来抗体と結合すべき抗原がトリヨードサイロニン（Ｔ３）の場合は、ジクロフェナク代謝物、サイロキシン（Ｔ４）、３，５−ジヨード−Ｌ−サイロニン（Ｔ２）、リバースＴ３（ｒＴ３）などがあげられ、本来抗原と結合すべき抗原がプロゲステロンの場合には、コルチコステロン、プレグネノロン、１７α−ヒドロキシプロゲステロンなどがあげられ、本来抗体と結合すべき抗原がエストラジオール（Ｅ２）の場合は、エストロン（Ｅ１）、エストリオール（Ｅ３）、エチニルエストラジオール（ＥＥ２）などがあげられる。
【００２５】
本発明の抗体は、可変領域にあるアミノ酸を他のアミノ酸に置換して作製する。可変領域は抗原との結合に関与する領域であるため、他のアミノ酸に置換するには、あらかじめ抗原との結合に関与しない位置のアミノ酸を見出してから置換する必要がある。特定位置のアミノ酸が、抗原との結合に関与しないアミノ酸であるかを見出すには、アミノ酸の置換により生じる効果が予想が付かないことが多いため、可変領域にあるすべてのアミノ酸について、他のアミノ酸への置換を試み、その効果を確認するのが好ましい。なお、抗体の立体構造解析が可能な場合は、効果が期待されるアミノ酸の種類をあらかじめ選定してから置換してもよい。
【００２６】
特定位置のアミノ酸が、抗原との結合に関与しないアミノ酸であるかを見出す方法の一例として、アラニンスキャニングなどの系統学的解析があげられる。アラニンスキャニングはアラニンが物理的・化学的に中性であることを利用する方法であり、置換しようとする位置のアミノ酸をアラニンに置換し、タンパク質の活性変化を調べることで、置換位置の活性への寄与を評価する方法であり、酵素の活性部位解析などに利用されている（非特許文献２）。具体的には、置換しようとする位置のアミノ酸をアラニンに置換した変異型抗体を作成し、前記変異型抗体の抗原への親和性を評価することで、置換した位置のアミノ酸が抗原との結合に関与しないアミノ酸であるか判定すればよい。なお、置換するアミノ酸は必ずしもアラニンである必要はなく、例えば、側鎖を有しないアミノ酸であるグリシンや、それ以外のアミノ酸に置換した変異型抗体を作製し、評価してもよい。
【００２７】
抗体の可変領域における特定位置のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した変異型抗体を作製するには、当業者が通常用いる遺伝子工学的方法を用いて作製すればよい。前記変異型抗体をコードするポリヌクレオチドを作製する方法の一例として、天然型抗体をコードするポリヌクレオチドを鋳型とし、可変領域の特定位置にアミノ酸置換が起きるよう変異を導入したプライマーを用いて、ＰＣＲ法にてポリヌクレオチドを増幅し作製する方法があげられる。前記変異型抗体をコードするポリヌクレオチドを発現させるためのベクターとしては、これまで報告されているベクターの中から適宜選択すればよいが、好ましいベクターの一つとしてｐＥＣＥｄｈｆｒ（非特許文献３）があげられる。なお、本発明の作製方法では特許文献１のようなパニングによるファージ上への発現を必要としないため、変異型抗体の発現形式としては、抗体の可変領域を含んでいればよく、抗体全領域であってもよいし、可変領域（Ｆｖ）そのもの、ｓｃＦｖ（Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）、Ｆａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ，ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）領域、またはＦａｂが２つ結合したＦ（ａｂ’）２であってもよい。前記変異型抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、適切なホスト細胞に導入することにより、前記変異型抗体を発現させることができる。一過的に前記変異型抗体を高発現させる場合は、ホスト細胞としてＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原タンパク質発現細胞を用いると好ましく、一例として、ＣＯＳ１細胞（非特許文献４および５）や、２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ７細胞をあげることができる。
【００２８】
発現した変異型抗体の性能の評価方法としてはＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法、蛍光偏光法などがあげられる。また、実施例で使用のＡＩＡ−６００ＩＩ（東ソー社製）といったエンザイムイムノアッセイ装置を用いて評価してもよい。
【００２９】
本発明の抗体の一例として、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む可変領域を有したトリヨードサイロニン（Ｔ３）に対する抗体のうち、Ｔ３との結合に関与しない、６番目のバリン、および／または７番目のアルギニンを、他のアミノ酸に置換した抗体があげられ、前記抗体はＴ３の類似抗原であるジクロフェナク代謝物に対する交差反応性が低下している。本発明の抗体の別の例として、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む可変領域を有したエストラジオール（Ｅ２）に対する抗体のうち、Ｅ２との結合に関与しない、５番目のセリン、および／または６番目のイソロイシンを、他のアミノ酸に置換した抗体があげられ、前記抗体はＥ２の類似抗原であるエチニルエストラジオール（ＥＥ２）に対する交差反応性が低下している。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の抗体は、抗体の可変領域のアミノ酸のうち、抗原との結合に関与しないアミノ酸を他のアミノ酸に一つ以上置換して得られる抗体であり、アミノ酸置換前の抗体と比較し、抗原との親和性を低下させることなく、抗原と類似した構造を有した類似抗原に対する交差反応性を低下させた抗体である。また本発明により、特にこれまで単離が困難であった、甲状腺ホルモンやステロイドホルモン等の低分子ホルモンに代表される低分子抗原を高い特異性で認識する（低分子抗原に対する親和性が高く、前記抗原の類似抗原に対する交差反応性が低い）抗体を容易に取得することができる。
【００３１】
本発明の抗体は、抗原との親和性の高さ、および類似抗原に対する交差反応性の低さから、前記抗原を迅速・高感度に検出するための実験用試薬および免疫診断薬、ならびに副作用が少ない治療用医薬品の構成成分として、好ましく用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】抗体ＵＴ２ＡＹ−５Ｈのうち５番目のアスパラギン（５Ｎ）を他のアミノ酸に置換した変異型抗体の競合特性を示す検量線。図中の黒丸はＵＴ２ＡＹ−５Ｈの検量線を示す。
【図２】抗体ＵＴ２ＡＹ−５Ｈのうち８番目のアスパラギン酸（８Ｄ）を他のアミノ酸に置換した変異型抗体の競合特性を示す検量線。図中の黒丸はＵＴ２ＡＹ−５Ｈの検量線を示す。
【図３】抗体ＵＴ２ＡＹ−５Ｈのうち１０番目のアルギニン（１０Ｒ）を他のアミノ酸に置換した変異型抗体の競合特性を示す検量線。図中の黒丸はＵＴ２ＡＹ−５Ｈの検量線を示す。
【図４】抗体ＵＴ２ＡＹ−５Ｈのうち１０番目のアルギニン（１０Ｒ）を他のアミノ酸に置換した変異型抗体の交差反応性を評価した結果。縦軸はジクロフェナクナトリウム服用前後の測定値の比（Ｒａｔｉｏ）を示す。
【図５】変異型抗体ＵＴ２ＡＹ−５ｍｕ１のアラニンスキャニングによるスクリーニング結果（ＥＬＩＳＡ）。横軸はアラニン置換を行なった位置、縦軸はＥＬＩＳＡ測定時の蛍光強度をそれぞれ示す。
【図６】変異型抗体ＵＴ２ＡＹ−５ｍｕ１のアラニンスキャニングによるスクリーニング結果（競合特性）。図中の黒丸はＵＴ２ＡＹ−５ｍｕ１の検量線を示す。
【図７】変異型抗体ＵＴ２ＡＹ−５ｍｕ１のうち９番目のバリン（９Ｖ）を他のアミノ酸に置換した変異型抗体の競合特性を示す検量線。図中の黒丸はＵＴ２ＡＹ−５ｍｕ１の検量線を示す。
【図８】変異型抗体ＵＴ２ＡＹ−５ｍｕ１のうち９番目のバリン（９Ｖ）を他のアミノ酸に置換した変異型抗体の交差反応性を評価した結果。縦軸はジクロフェナクナトリウム服用前後の測定値の比（Ｒａｔｉｏ）を示す。
【図９】抗体ＵＴ２ＡＹ−５Ｈおよび変異型抗体ＵＴ２ＡＹ−５ｍｕ２を用いて、ジクロフェナクナトリウム服用前後の、ヒト血清中のトリヨードサイロニン（Ｔ３）濃度を測定した結果。
【図１０】抗体Ｕ１６Ａ１４のアラニンスキャニングによるスクリーニング結果（競合特性）。図中の黒丸はＵ１６Ａ１４の検量線を示す。
【図１１】抗体Ｕ１６Ａ１４のうち５番目のセリン（５Ｓ）を他のアミノ酸に置換した変異型抗体の競合特性を示す検量線。図中の白ひし形はＵ１６Ａ１４の検量線を示す。
【図１２】抗体Ｕ１６Ａ１４のうち６番目のイソロイシン（６Ｉ）を他のアミノ酸に置換した変異型抗体の競合特性を示す検量線。図中の白ひし形はＵ１６Ａ１４の検量線を示す。
【図１３】抗体Ｕ１６Ａ１４のうち、（ａ）５番目のセリン（５Ｓ）または、（ｂ）６番目のイソロイシン（６Ｉ）を他のアミノ酸に置換した変異型抗体の交差反応性を評価した結果。縦軸はエチニルエストラジオール（ＥＥ２）を含まないヒト血清の測定値と、前記血清にＥＥ２を２ｎｇ／ｍＬ添加したヒト血清の測定値との比（Ｒａｔｉｏ）を示す。
【図１４】二置換抗体（ｍｕｔ５Ｄ６Ｔ、ｍｕｔ５Ｙ６Ｔ）の競合特性を示す検量線。図中の白ひし形はＵ１６Ａ１４の検量線を示す。
【図１５】二置換抗体（ｍｕｔ５Ｄ６Ｔ、ｍｕｔ５Ｙ６Ｔ）の交差反応性を評価した結果。縦軸はエチニルエストラジオール（ＥＥ２）を含まないヒト血清の測定値と、前記血清にＥＥ２を２ｎｇ／ｍＬ添加したヒト血清の測定値との比（Ｒａｔｉｏ）を示す。
【図１６】二置換抗体（ｍｕｔ５Ｄ６Ｔ、ｍｕｔ５Ｙ６Ｔ）の交差反応性を評価した結果。縦軸は、（ａ）エストロン（Ｅ１）または（ｂ）エストリオール（Ｅ３）を含まないヒト血清の測定値と、前記血清に（ａ）Ｅ１または（ｂ）Ｅ３を２０ｎｇ／ｍＬ添加したヒト血清の測定値との比（Ｒａｔｉｏ）を示す。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例１から１０では抗トリヨードサイロニン（Ｔ３）ウサギモノクローナル抗体（以下、単に抗Ｔ３抗体という）のジクロフェナク代謝物に対する交差反応性改善を、実施例１１から２１では抗エストラジオール（Ｅ２）ウサギモノクローナル抗体（以下、単に抗Ｅ２抗体という）のエチニルエストラジオール（ＥＥ２）に対する交差反応性改善を、それぞれ例として、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３４】
実施例１  抗Ｔ３ウサギモノクローナル抗体の単離
抗Ｔ３抗体は、特許文献４に記載の方法に従い、抗原を免疫したウサギから抗体産生細胞を単離し、目的とする抗体遺伝子を保有する細胞を選別し、選別した細胞から重鎖および軽鎖の抗体遺伝子を単離・増幅し、重鎖および軽鎖の抗体遺伝子を発現ベクターに導入後、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することで単離した。
【００３５】
実施例２  抗Ｔ３抗体アミノ酸配列の比較
同一ウサギ個体から得られた２種類の抗Ｔ３抗体（ＵＴ２ＡＹ−４Ｈ、ＵＴ２ＡＹ−５Ｈ）の、重鎖（Ｈ鎖）ＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を解析し、比較した。それぞれのＨ鎖ＣＤＲ３領域の配列を表１に示す。
【００３６】
【表１】
2012041332.tif 000003
ＵＴ２ＡＹ−５Ｈ（配列番号１）とＵＴ２ＡＹ−４Ｈ（配列番号２）とを比較すると、５番目のアスパラギン（５Ｎ）、８番目のアスパラギン酸（８Ｄ）、１０番目のアルギニン（１０Ｒ）が特徴的なアミノ酸であることがわかる。５ＮはＵＴ２ＡＹ−４Ｈでは単純な骨格のアラニン（Ａ）であるのに対しＵＴ２ＡＹ−５Ｈでは極性アミノ酸のアスパラギン（Ｎ）に、８ＤはＵＴ２ＡＹ−４Ｈではグリシン（Ｇ）に対してＵＴ２ＡＹ−５Ｈでは酸性アミノ酸のアスパラギン酸（Ｄ）に、１０ＲはＵＴ２ＡＹ−４Ｈでは欠損しているのに対してＵＴ２ＡＹ−５Ｈでは塩基性アミノ酸のアルギニン（Ｒ）に、それぞれなっている。
【００３７】
実施例３  変異型抗Ｔ３抗体の作製
実施例２で見出した、ＵＴ２ＡＹ−５Ｈの特徴的なアミノ酸（５Ｎ、８Ｄ、１０Ｒ）に対して、アミノ酸の点変異導入を行なった。点変異導入はＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績社製）を用いて行ない、得られた変異型抗Ｔ３抗体遺伝子を特許文献４に記載の方法に従いＣＯＳ１細胞に遺伝子導入し、培養上清中に変異型抗Ｔ３抗体を得た。
【００３８】
実施例４  変異型抗Ｔ３抗体の競合特性評価
実施例３で得た変異型抗体の競合特性を、東ソー社製全自動免疫診断装置（ＡＩＡ−６００ＩＩ）を用いて測定し、横軸にＴ３濃度（ｐｇ／ｍＬ）、縦軸に競合特性（Ｂ／Ｂ０；Ｔ３とアルカリホスファターゼで標識したＴ３とを共存させ、横軸濃度のＴ３が共存したときの値をＴ３濃度がゼロの時の値で割った値）をプロットした検量線を作成して評価した。
【００３９】
結果を図１から３に示す。５Ｎ（図１）または８Ｄ（図２）に変異を導入（アミノ酸置換）すると、野生型と比較し競合特性が劣っていることがわかる。一方、１０Ｒ（図３）に変異を導入した場合、蛋白質の主鎖骨格に影響をあたえるプロリン（Ｐｒｏ）を除き、競合特性の変化がなかった。以上より、ＵＴ２ＡＹ−５Ｈのうち１０番目のアルギニン（１０Ｒ）は目的抗原（Ｔ３）との結合には関与しないことが明らかとなった。
【００４０】
実施例５  変異型抗Ｔ３抗体の交差反応性評価
１０Ｒに変異を導入（アミノ酸置換）した抗体に対して、ジクロフェナク代謝物との交差反応性を評価した。交差反応性の評価は、ジクロフェナクナトリウム（ボルタレン（商品名））服用前後におけるヒト血清のＴ３濃度を東ソー社製ＡＩＡ−６００ＩＩを用いて測定し、服用前後の測定値の比をとることで評価した。
【００４１】
結果を図４に示す。図４において、ジクロフェナク代謝物との交差反応性が大きいほど、服用後のヒト血清中のＴ３濃度の測定値が小さくなるため、Ｒａｔｉｏは小さくなる。図４の結果より、１０番目のアルギニン（１０Ｒ）を実施例４で評価したアミノ酸（セリン、グリシン、バリン、リジン、プロリン、ヒスチジン、チロシン）に置換することにより、ジクロフェナク代謝物との交差反応性が低下していることが示された。実施例４および５の結果より、１０番目のアルギニン（１０Ｒ）をグリシン（Ｇｌｙ）に置換した変異型抗体が、交差反応性が少なく、かつ競合特性も変化しない抗体であることがわかる。
【００４２】
実施例６  目的抗原（Ｔ３）との結合に関与しないアミノ酸のスクリーニング（その１）
実施例４および５の結果から、目的抗原の結合に関与しないアミノ酸を他のアミノ酸に置換する（変異を導入する）ことで、目的抗原への親和性を低下させることなく、交差反応性の低下（特異性の改善）が可能であることが明らかとなった。次に、交差反応性の更なる低下（改善）をねらい、実施例５で得られた、ＵＴ２ＡＹ−５Ｈのうち１０番目のアルギニン（１０Ｒ）をグリシン（Ｇｌｙ）に置換した変異型抗体（以下、ＵＴ２ＡＹ−５ｍｕ１とする）について、Ｈ鎖ＣＤＲ３領域の他のアミノ酸の置換試験を行なった。なお効率的な置換試験を行なうため、アラニンスキャニングにより目的抗原の結合に関与しないアミノ酸のスクリーニングを行なった。
（１）Ｈ鎖ＣＤＲ３領域のアミノ酸のうち、１０Ｒ以外のアミノ酸をアラニンに置換した変異型抗体を実施例３に記載の方法で作製した。
（２）アラニンに置換した変異型抗体の反応性の一次評価を、以下に示すＥＬＩＳＡにより行なった。
（２−１）抗ウサギ抗体（０．５ｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレートに固定化後、１％スキムミルクでブロッキングした。
（２−２）各変異型抗体とアルカリホスファターゼで標識したＴ３（標識Ｔ３）を同時に反応させた。
（２−３）変異型抗体と未反応の標識Ｔ３をＢ／Ｆ分離後、酵素基質である４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
【００４３】
ＥＬＩＳＡの結果を図５に示す。６番目のフェニルアラニン（６Ｆ）または７番目のロイシン（７Ｌ）をアラニンに置換した変異型抗体では、目的抗原への親和性が低下することが確認され、これらの位置にあるアミノ酸は目的抗原（Ｔ３）との結合に関与していることが明らかとなった。
【００４４】
実施例７  目的抗原（Ｔ３）との結合に関与しないアミノ酸のスクリーニング（その２）
実施例６で目的抗原の結合にあまり関与していない、４番目のアルギニン（４Ｒ）、９番目のバリン（９Ｖ）、および１１番目のアスパラギン（１１Ｎ）をそれぞれアラニンに置換した変異型抗体の競合特性を、東ソー社製ＡＩＡ−６００ＩＩを用いて測定し、横軸にＴ３濃度（ｐｇ／ｍＬ）、縦軸に競合特性（Ｂ／Ｂ０）をプロットした検量線を作成して評価することで、変異型抗体の二次スクリーニングを行なった。
【００４５】
図６に結果を示す。競合特性はアラニン置換した位置が１１Ｎ、４Ｒ、９Ｖの順に劣っており、実施例６におけるＥＬＩＳＡの結果（図５）を反映していた。なお、９番目のバリン（９Ｖ）をアラニンに置換した変異型抗体は、アラニン置換前の抗体（ＵＴ２ＡＹ−５ｍｕ１）と同等の検量線を示しており、ＵＴ２ＡＹ−５ｍｕ１（ＵＴ２ＡＹ−５Ｈ）のうち９番目のバリン（９Ｖ）は目的抗原（Ｔ３）との結合に関与しないことが示唆された。
【００４６】
実施例８  変異型抗Ｔ３抗体（二置換体）の作製
実施例７より、９番目のバリン（９Ｖ）は目的抗原の結合に関与しないことが示唆されたため、ＵＴ２ＡＹ−５ｍｕ１のうち９番目のバリン（９Ｖ）をアラニン以外の他のアミノ酸に置換した変異型抗体を作製した。変異型抗体の作製は実施例３に記載の方法で行なった。
【００４７】
実施例９  変異型抗Ｔ３抗体（二置換体）の競合特性評価
実施例８で得た、９番目のバリン（９Ｖ）を他のアミノ酸に置換した変異型抗体について、競合特性を、東ソー社製ＡＩＡ−６００ＩＩを用いて測定し、横軸にＴ３濃度（ｐｇ／ｍＬ）、縦軸に競合特性（Ｂ／Ｂ０）をプロットした検量線を作成して評価した。結果を図７に示す。いずれのアミノ酸を置換した場合でも、競合特性に変化はなく、ＵＴ２ＡＹ−５ｍｕ１（ＵＴ２ＡＹ−５Ｈ）のうち９番目のバリン（９Ｖ）は目的抗原（Ｔ３）との結合に関与しないことが明らかとなった。
【００４８】
実施例１０  変異型抗Ｔ３抗体（二置換体）の交差反応性評価
９番目のバリン（９Ｖ）を他のアミノ酸に置換した変異型抗体に関して、ジクロフェナク代謝物との交差反応性を評価した。交差反応性の評価は、ジクロフェナクナトリウム（ボルタレン（商品名））服用前後におけるヒト血清のＴ３濃度を東ソー社製ＡＩＡ−６００ＩＩを用いて測定し、服用前後の測定値の比をとることで評価した。
【００４９】
結果を図８に示す。図８において、ジクロフェナク代謝物との交差反応性が大きいほど、服用後のヒト血清中のＴ３濃度の測定値が小さくなるため、Ｒａｔｉｏは小さくなる。図８の結果より、９番目のバリン（９Ｖ）を実施例９で評価したアミノ酸（プロリン、トリプトファン、ヒスチジン、イソロイシン、セリン、アルギニン、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸、メチオニン、アラニン）に置換することにより、ジクロフェナク代謝物との交差反応性が、アミノ酸置換前の抗体（ＵＴ２ＡＹ−５ｍｕ１）と比較し低下していることが示された。特に、９番目のバリン（９Ｖ）をトリプトファン（Ｔｒｐ）に置換した変異型抗体が、交差反応性の少ない抗体であることがわかる（以降、当該抗体をＵＴ２ＡＹ−５ｍｕ２とする）。
【００５０】
野生型抗体（ＵＴ２ＡＹ−５）と、９番目のバリン（９Ｖ）をトリプトファンに、１０番目のアルギニン（１０Ｒ）をグリシンに、それぞれ置換した変異型抗体（ＵＴ２ＡＹ−５ｍｕ２）を用いて、ジクロフェナクナトリウム服用前後のヒト血清のＴ３濃度の測定を行った結果を図９に示す。野生型抗体（ＵＴ２ＡＹ−５）を用いてＴ３濃度測定を行なうと、ジクロフェナク代謝物との交差反応により、服用後の測定値が大きくなっているのが分かる。一方、変異型抗体（ＵＴ２ＡＹ−５ｍｕ２）では交差反応性が改善されているため、服用前後で測定値に大きな差はなかった。
【００５１】
実施例１１  抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体の単離
抗Ｅ２抗体は、特許文献４に記載の方法に従い、抗原を免疫したウサギから抗体産生細胞を単離し、目的とする抗体遺伝子を保有する細胞を選別し、選別した細胞から重鎖および軽鎖の抗体遺伝子を単離・増幅し、重鎖および軽鎖の抗体遺伝子を発現ベクターに導入後、発現ベクターを宿主細胞に導入することで単離した。
【００５２】
実施例１２  抗Ｅ２抗体アミノ酸配列の解析
抗Ｅ２抗体（Ｕ１６Ａ１４）の、重鎖（Ｈ鎖）ＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を解析した。Ｈ鎖ＣＤＲ３領域の配列を配列番号３および表２に示す。表２に示すようにＵ１６Ａ１４のＨ鎖ＣＤＲ３領域は６アミノ酸からなる。
【００５３】
【表２】
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実施例１３  アラニンスキャニングによる抗Ｅ２抗体のスクリーニング
実施例１２で解析した６アミノ酸それぞれに対し、アラニン置換試験（アラニンスキャニング）を行なった。点変異導入はＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績社製）を用いて行ない、得られた変異型抗Ｅ２抗体遺伝子を特許文献４に記載の方法に従いＣＯＳ１細胞に遺伝子導入し、培養上清中に変異型抗Ｅ２抗体を得た。以降、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＨ鎖ＣＤＲ３領域を有する抗体のうち、配列番号３のＮ番目のアミノ酸をアラニンに置換した抗体をｍｕｔＮとする。
【００５４】
実施例１４  変異型抗Ｅ２抗体の競合特性評価（その１）
実施例１３で得た変異型抗体（ｍｕｔ１からｍｕｔ６）の競合特性を、東ソー社製全自動免疫診断装置（ＡＩＡ−６００ＩＩ）を用いて測定し、横軸にＥ２濃度（ｐｇ／ｍＬ）、縦軸に競合特性（Ｂ／Ｂ０；Ｅ２とアルカリホスファターゼで標識したＥ２とを共存させ、横軸濃度のＥ２が共存したときの値をＥ２濃度がゼロの時の値で割った値）をプロットした検量線を作成して評価した。配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＨ鎖ＣＤＲ３領域のいずれかにアラニン置換を導入した１置換抗体（ｍｕｔ１からｍｕｔ６）のうち、５番目のセリンまたは６番目のイソロイシンをアラニンに置換した抗体は、アラニン置換前の野生型抗体（Ｕ１６Ａ１４）と同等の競合特性を有していた（図１０）。このことから、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＨ鎖ＣＤＲ３領域のうち、５番目のセリン（５Ｓ）と６番目のイソロイシン（６Ｉ）は目的抗原（Ｅ２）との結合には関与しないことが示唆された。
【００５５】
実施例１５  変異型抗Ｅ２抗体の作製
実施例１４より、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＨ鎖ＣＤＲ３領域のうち、５番目のセリン（５Ｓ）と６番目のイソロイシン（６Ｉ）は目的抗原（Ｅ２）との結合には関与しないことが示唆された。そこで、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＨ鎖ＣＤＲ３領域のうち、５番目のセリン（５Ｓ）をアラニン以外の他のアミノ酸に置換した変異型抗体、および６番目のイソロイシン（６Ｉ）をアラニン以外の他のアミノ酸に置換した変異型抗体を作製した。変異型抗体の作製は実施例１３に記載の方法で行なった。
【００５６】
実施例１６  変異型抗Ｅ２抗体の競合特性評価（その２）
実施例１５で得た、５番目のセリン（５Ｓ）と６番目のイソロイシン（６Ｉ）をアラニン以外の他のアミノ酸に置換した変異型抗体それぞれについて、東ソー社製ＡＩＡ−６００ＩＩを用いて、横軸にＥ２濃度（ｐｇ／ｍＬ）、縦軸に競合特性（Ｂ／Ｂ０）をプロットした検量線を作成することで、競合特性を評価した。結果を図１１および１２に示す。５Ｓの置換においては、ロイシン（Ｌｅｕ）に置換した変異型抗体を除き、競合特性に変化はなかった（図１１）。また６Ｉの置換においては、いずれのアミノ酸に置換した場合でも、競合特性に変化はなかった（図１２）。以上より、Ｕ１６Ａ１４のうち５番目のセリン（５Ｓ）と６番目のイソロイシン（６Ｉ）は目的抗原（Ｅ２）との結合への関与が少ないことが明らかとなった。
【００５７】
実施例１７  変異型抗Ｅ２抗体の交差反応性評価
５Ｓまたは６Ｉを他のアミノ酸に置換した変異型抗体に関して、エチニルエストラジオール（ＥＥ２）との交差反応性を評価した。交差反応性の評価は、ＥＥ２未添加のヒト血清と、前記血清にＥＥ２を２ｎｇ／ｍＬ添加したヒト血清とを、東ソー社製ＡＩＡ−６００ＩＩを用いて測定し、測定値の比をとることで評価した。
【００５８】
結果を図１３に示す。図１３において、ＥＥ２との交差反応性が大きいほど、測定値が小さくなるため、Ｒａｔｉｏは小さくなる。図１３（ａ）の結果より、５Ｓの位置では、アスパラギン酸（Ｄ）またはチロシン（Ｙ）への置換により、野生型抗体（Ｕ１６Ａ１４）と比較し交差反応性が改善することが判明した。また図１３（ｂ）の結果より、６Ｉの位置ではスレオニン（Ｔ）への置換により、野生型抗体（Ｕ１６Ａ１４）と比較し交差反応性が改善することが明らかとなった。
【００５９】
実施例１８  二置換抗Ｅ２抗体の作製
実施例１７より、５Ｓまたは６Ｉを特定のアミノ酸に置換することで、ＥＥ２との交差反応性が改善することが示された。そこで、より交差反応性の改善した変異型抗体を得るため、５Ｓおよび６Ｉの両方に変異を導入した、二置換抗体ｍｕｔ５Ｄ６Ｔ（５番目のセリンをアスパラギン酸に、６番目のイソロイシンをチロシンに、それぞれ置換した抗体）と、ｍｕｔ５Ｙ６Ｔ（５番目のセリンをスレオニンに、６番目のイソロイシンをチロシンに、それぞれ置換した抗体）をそれぞれ作製した。変異型抗体の作製は実施例１３に記載の方法で行なった。
【００６０】
実施例１９  二置換抗Ｅ２抗体の競合特性評価
実施例１８で得た２つの二置換抗体（ｍｕｔ５Ｄ６Ｔ、ｍｕｔ５Ｙ６Ｔ）の競合特性評価を東ソー社製ＡＩＡ−６００ＩＩを用いて、実施例１６に記載の方法により行なった。結果を図１４に示す。ｍｕｔ５Ｄ６Ｔ、ｍｕｔ５Ｙ６Ｔいずれの二置換抗体でも、Ｅ２に対する競合特性は、野生型抗体（Ｕ１６Ａ１４）より大きな変化は見られなかった。
【００６１】
実施例２０  二置換抗Ｅ２抗体の特異性評価（その１）
実施例１８で得た２つの二置換抗体（ｍｕｔ５Ｄ６Ｔ、ｍｕｔ５Ｙ６Ｔ）のＥＥ２に対する交差反応性評価を東ソー社製ＡＩＡ−６００ＩＩを用いて、実施例１７に記載の方法により行なった。結果を図１５に示す。今回評価した二置換抗体（ｍｕｔ５Ｄ６Ｔ、ｍｕｔ５Ｙ６Ｔ）はいずれも、野生型抗体（Ｕ１６Ａ１４）と比較し、ＥＥ２との交差反応性が改善したことが示された。
【００６２】
実施例２１  二置換抗Ｅ２抗体の特異性評価（その２）
ＥＥ２以外の類似構造物質に対する交差反応性が悪化していないことを確認するため、エストロン（Ｅ１）およびエストリオール（Ｅ３）に対する交差反応性の評価を、交差反応性物質未添加のヒト血清と、前記血清にＥ１またはＥ３を２０ｎｇ／ｍＬ添加したヒト血清とを準備し、東ソー社製ＡＩＡ−６００ＩＩを用いて、実施例１７に記載の方法で行なった。結果を図１６に示す。今回評価した二置換抗体（ｍｕｔ５Ｄ６Ｔ、ｍｕｔ５Ｙ６Ｔ）はともに、Ｅ１およびＥ３に対する交差反応性の悪化は確認されなかった。
【００６３】
以上、抗Ｔ３抗体の結果（実施例１から１０）および抗Ｅ２抗体の結果（実施例１１から２１）からもわかるように、目的抗原の結合に関与しないアミノ酸に変異導入（アミノ酸置換）を行なうことで、抗原との親和性を低下させることなく、交差反応性を改善する（低下させる）ことができることがわかる。
【図１】
2012041332.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2012041332.tif 000019
【図１６】
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【配列表】
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