(57)【要約】【課題】ウェルの裏面の傷、ゴミ、汚れなどの標本像とは異なる像を除去し、良好な標本画像を取得する顕微鏡装置を提供すること。【解決手段】ステージ３に載置された複数のウェルを有するウェルプレート１０の当該ウェル中の細胞を照明する照明光学系４と、照明された前記細胞の像を所定位置に結像する結像光学系５と、前記所定位置に配置される撮像手段１４と、前記撮像手段を介して、前もって前記ウェルの裏面像を含む第１画像を取得し、後に前記第１画像を取得した前記ウェルと同一ウェル中の細胞画像である第２画像を取得し、前記第２画像から前記第１画像に含まれる前記ウェルの裏面像を除去した新たな細胞画像を形成する画像処理手段４０と、前記第１画像、前記第２画像、および前記新たな細胞画像を保存する保存手段４４と、を有することを特徴とする顕微鏡装置。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステージに載置された複数のウェルを有するウェルプレートの当該ウェル中の細胞を照明する照明光学系と、
照明された前記細胞の像を所定位置に結像する結像光学系と、
前記所定位置に配置される撮像手段と、
前記撮像手段を介して、前もって前記ウェルの裏面像を含む第１画像を取得し、後に前記第１画像を取得した前記ウェルと同一ウェル中の細胞画像である第２画像を取得し、前記第２画像から前記第１画像に含まれる前記ウェルの裏面像を除去した新たな細胞画像を形成する画像処理手段と、
前記第１画像、前記第２画像、および前記新たな細胞画像を保存する保存手段と、
を有することを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記第１画像と、前記第２画像は、前記ウェルの底面全域にわたる画像であることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記ウェルプレートは、プラスチック製であることを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記第１画像は、前記ウェルの裏面に前記結像光学系の前側焦点位置を位置付けしたのち、前もって測定された前記ウェルの底面と前記ウェルの裏面との距離情報に基き前記ステージを光軸に沿って移動して前記ウェルの底面に前記結像光学系の前側焦点位置を位置付けして前記画像取得手段を介して取得した画像であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記第１画像は、前記結像光学系の前側焦点位置を前記ウェルの裏面に位置付けして前記画像手段を介して取得した裏面画像に、前もって測定された前記ウェルの底面と前記ウェルの裏面との距離情報に基て前記画像処理手段が焦点ボケ処理を行った画像であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
前記ウェルプレートの全ウェルの前記距離情報は、前もって測定されて前記保存手段に保存されていることを特徴とする請求項４または５に記載の顕微鏡装置。
【請求項７】
前記照明光学系から射出される照明光の実効的なＮＡは、前記結像光学系の対物レンズの開口数より小さいことを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
【請求項８】
前記照明光の実効的なＮＡは０．１以下であり、前記対物レンズの開口数は０．２５以上であることを特徴とする請求項７に記載の顕微鏡装置。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、複数のウェルが配置されたウェルプレートの各ウェルの細胞標本などを観察するための顕微鏡では、培養液の表面張力などに起因する表面形状の変化によるレンズ作用を低減し細胞標本の観察を可能にする顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。そして、細胞観察を行う実験では、細胞を拡大して観察する以外に細胞の分布等を取得するために細胞を培養するウェルの広い視野範囲の画像（例えば、ウェル底面全域画像）を一度に取得することが望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第３４３７２５７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このような顕微鏡装置は、細胞を培養するウェルの広い視野範囲の画像を一度に取得するために照明光学系から結像光学系を含む光学系の実効的なＮＡは小さくなり、高倍観察時の焦点深度に比べて焦点深度が極めて深くなっている。このため、通常の顕微鏡観察では焦点ボケして問題とならないような離れた位置にあるウェルの裏面の傷、ゴミ、汚れなどがあまりボケずに標本（細胞）像に重なって観察されるという問題がある。
【０００５】
本発明は、上記課題に鑑みて行われたものであり、ウェルの裏面の傷、ゴミ、汚れなどの標本（細胞）像とは異なる像を除去し、良好な細胞画像を取得する顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため、本発明は、ステージに載置された複数のウェルを有するウェルプレートの当該ウェル中の細胞を照明する照明光学系と、照明された前記細胞の像を所定位置に結像する結像光学系と、前記所定位置に配置される撮像手段と、前記撮像手段を介して、前もって前記ウェルの裏面像を含む第１画像を取得し、後に前記第１画像を取得した前記ウェルと同一ウェル中の細胞画像である第２画像を取得し、前記第２画像から前記第１画像に含まれる前記ウェルの裏面像を除去した新たな細胞画像を形成する画像処理手段と、前記第１画像、前記第２画像、および前記新たな細胞画像を保存する保存手段と、を有することを特徴とする顕微鏡装置。
を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ウェルの裏面の傷、ゴミ、汚れなどの標本像とは異なる像を除去し、良好な標本画像を取得する顕微鏡装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施の形態に係る顕微鏡装置の概略構成図。
【図２】細胞標本に合焦した時の画像。
【図３】細胞培養中のウェルの部分断面。
【図４】新たな細胞画像の取得処理を示すフローチャート。
【図５】細胞標本がない時のウェル裏面画像（キズ画像）。
【図６】図２の画像成分から図５の画像成分を除去して形成した新たな細胞画像。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本願の実施の形態にかかる顕微鏡装置について図面を参照しつつ説明する。なお、以下の実施の形態は、発明の理解を容易にするためのものに過ぎず、本願発明の技術的思想を逸脱しない範囲において当業者により実施可能な付加・置換等を施すことを排除することは意図していない。
【００１０】
本実施形態にかかる顕微鏡装置は、シャーレやウェルプレート等の培養容器に配した試料を培養液で浸した状態で低倍率、広視野で観察することに適した明視野顕微鏡と取得した画像を処理する画像処理装置などから構成されている。
【００１１】
図１に示すように、本実施形態にかかる顕微鏡装置１は、ウェルプレート１０を載置するためのステージ３、ステージ３の上方に配置された低倍用照明光学系４、ステージ３の下方に配置された結像光学系５、および取得した画像を処理する画像処理装置４０を有している。なお、ステージ３、照明光学系４、および結像光学系５は、下方に不図示のベース部を備えた不図示の顕微鏡支柱に対して、不図示の支持部材を介して上下方向の位置を変更可能に支持されている。
【００１２】
本実施形態において、ウェルプレート１０の各ウェル１０ａ中には、図３に示すように細胞等の位相物体である試料２が培養液１１と共に注入されている。なお、ウェルプレート１０は、細胞培養後に破棄することを考慮して安価なプラスチック等の高分子材料で形成されたものが使用されが、これに限定されるわけではない。
【００１３】
結像光学系５は、低倍用照明光学系４で照明された任意のウェル１０ａ内の試料（細胞）２を観察するためのものであり、図１に示すように、ステージ３側から順に、高開口数の低倍対物レンズ１２、およびＣＣＤやＣＭＯＳなどで構成されるカメラ１４を有する。
【００１４】
低倍用対物レンズ１２は、ウェル１０ａの底面から射出された光を略漏れなく集光するための高い開口数（ＮＡ）を有する対物レンズであり、本実施形態においてはΦ６．４ｍｍ程度の実視野を実現するために、倍率が１．２５倍、開口数が０．２５以上のものが用いられている。このため、一般的な顕微鏡の低倍対物レンズに比べて焦点深度がより深い対物レンズとなっている。
【００１５】
カメラ１４には、２／３インチＣＣＤカメラが用いられている。
また、カメラ１４には、画像処理装置４０が接続されている。画像処理装置４０は、例えばパーソナルコンピュタ（以後、単にＰＣと記す）４１とモニタ４２とキーボードやマウスなどの入出力デバイス４３とから構成されている。また、ＰＣ４１は、取得した画像を保存するメモリ４４を内蔵し、画像処理に必要なソフトが搭載されている。なお、メモリ４４は、外付けハードディスクのような外部保存装置を使用することも可能である。
【００１６】
照明光学系４は、ウェル１０ａ内の試料２を透過照明するためのものであり、ステージ３側から順に、不図示の、コンデンサレンズ、開口絞り、可動絞り、コレクタレンズ、および光源を有する。
【００１７】
不図示の可動絞りは、ウェル１０ａの底面を略均一に照明するための低ＮＡの照明光を生成するための絞り部材である。本実施形態において不図示の可動絞りには、照明光学系４から射出される照明光のＮＡ（以下、「照明ＮＡ」という。）が０．１以下となるように、絞り径や光軸上の位置等が予め設計された絞り部材が用いられている。なお、可動絞りは、照明光がウェル１０ａの壁面で反射または透過することを防止するために、照明光の光束がウェル１０ａの内径よりも小さくなるように照明光の照射領域を絞る役割も果たしている。
【００１８】
また、可動絞りには、可動絞りを光軸方向および光軸に垂直な方向へ移動させるための不図示の移動機構と、絞り径を変更するための不図示の絞り径調整機構が備えられている。これにより、前記移動機構によって可動絞りを光軸方向へ移動させることで、試料２への照明光の主光線の角度を変更することができる。また、前記絞り径調整機構によって可動絞りの絞り径を変更し、照明光の実効的なＮＡを変更することができる。さらには、前記移動機構によって可動絞りを光軸に垂直な方向へ移動させることで、照明光学系４から射出される照明光の試料２に対する照射位置を光軸に垂直な方向へ変更することができる。
【００１９】
不図示のコンデンサレンズには、コンデンサレンズを光軸方向へ移動させるための不図示の移動機構が備えられている。これにより、当該移動機構によってコンデンサレンズを光軸方向へ移動させることで、照明光の集光位置を光軸方向へ変更することができ、これによって視野内のシェーディングなどを除去することができる。
【００２０】
不図示の光源には、ＬＥＤ（発光ダイオード）が用いられている。これにより、照明の均一性と長寿命性を確保することができる。また、培養液１１内のフェノールレッド等の栄養素が培養液１１の劣化に伴って変色し、これが可視域の光を吸収してしまうため、培養状態によって観察像の明るさが変化してしまうという影響を解消することができる。
【００２１】
本実施形態にかかる顕微鏡装置１において、照明光学系４の光源から発せられた照明光は、コレクタレンズを経た後、可動絞りを通過する。可動絞りは、光軸上の位置によって、主光線の方向を変えることができ、開口の大きさや開口部の位置を光軸から離れた位置に変化させることにより、照明光の実効的なＮＡを変えることができる。そして照明光は、開口絞りを通過し、コンデンサレンズで集光されることにより、必要な照明光の実効的なＮＡや主光線の方向を形成することとなる。このようにして形成された照明光は、ステージ３上の９６ウェルプレート１０における任意のウェル１０ａ内の試料２に培養液１１を介して照射される（図３参照）。このように、照明光学系４は、試料２に対して一点に集光する光束の収束角とその主光線の方向が制御された照明を実現することができる。
【００２２】
ここで、当該ウェル１０ａ内の培養液１１の液面は、図３に示すようにウェル１０ａの壁面近傍が凹面となってレンズ効果が生じている。本顕微鏡装置１では、対物レンズ１２の開口数を十分に大きくし、結像光学系５を構成する対物レンズ１２の開口数よりも小さい実効的なＮＡを持つ照明光を培養液１１の凹面に照射することで、培養液１１の凹面によって照明光の方向が対物レンズ１２の外側に向かって屈折しても、培養液１１の液面によるレンズ効果の影響を受けにくくしている。また、このときに、照明光の主光線の方向を培養液１１の液面により屈折される方向を考慮して、屈折される方向とは逆方向に光軸に対して主光線の方向を向けることで、屈折した照明光がウェル１０ａの壁面で反射又は透過することを防止することができ、即ち照明光束がウェル１０ａ内のみを進行することととなり、これによってウェル１０ａのウェルの底面をムラなく略均一に照明することができる。
【００２３】
そして、結像光学系５を構成する対物レンズ１２の開口数よりも小さいＮＡの照明光で照明された試料２からの光は、結像光学系５の対物レンズ１２に入射する。ここで、第１対物レンズ１２は上述のように高開口数の対物レンズであるため、ウェル１０ａの底面から射出された光（前述の屈折した照明光で照明された試料２からの光を含む）を略漏れなく集光することができる。このようにして対物レンズ１２によって集光された光は、不図示の結像レンズを介して、カメラ１４の撮像面上に試料２の像を形成する。なお、詳細には、上述のような主光線の方向と照明光の実効的なＮＡを持つ照明光によってウェル１０ａの壁面での反射光、即ちノイズ光の発生を抑えながらウェル１０ａの底面を略均一に照明することで、試料２の背景（バックグラウンド）からの光（直接光）のＮＡが小さくなるため、直接光と試料２で回折された回折光とが干渉してコントラストの良好な試料２の観察像が形成されることとなる。このようにして形成された試料２の像は、カメラ１４で撮影されてモニタ４２に表示され、使用者に観察されることとなる。
【００２４】
ここで、上述のように再生医療の研究等において培養した細胞を観察する際には、低倍率で視野の全域を観察することが求められており、培養液のレンズ効果の影響を考慮しながら視野の全域で観察を行うためには、対物レンズ１２に０．２５相当の開口数と１．２５倍程度の倍率が必要となる。
【００２５】
これに対して本実施形態にかかる顕微鏡装置１は、上述のように照明光の実効的なＮＡが０．１以下、対物レンズ１２の倍率が１．２５倍で開口数が０．２５以上であり、これによって視野の全域（Φ６．４ｍｍ程度の実視野）で観察を行うことができる。また、上述のように９６ウェルプレート１０におけるウェル１０ａの内径はΦ６．４ｍｍ程度であるため、本実施形態にかかる顕微鏡装置１は、２／３インチＣＣＤカメラであるカメラ１４によって、９６ウェルプレート１０のウェル１０ａの底面全域を１枚の画像として一度に撮影することができる。即ち、最大限のスループットで培養液１１の凹面によるレンズ効果の影響を解消した試料２の像を取得することができる。
【００２６】
また、上述のように培養液１１のレンズ効果の大きさは、培養容器の種類、培養液１１の組成、培養容器の材質、及び培養液１１の量等によって様々に変化する。特に、培養容器の種類によって培養液１１の凹面の直径は異なり、これによって凹面の曲率半径は大きく変化し、レンズ効果も大きく変化することとなる。
【００２７】
そこで、本実施形態にかかる顕微鏡装置１は、培養液１１のレンズ効果の変化に応じて、上述のように可動絞りを光軸方向に移動させたり、可動絞りの絞り径を変更させたりすることで、照明光の実効的なＮＡや照明光の主光線の方向を変更することができる。これにより、培養液１１のレンズ効果が変化した場合でも、これに対応した低ＮＡの照明光によって培養容器の底面を略均一に照明することができ、レンズ効果の影響を解消した試料２の像を取得することができる。
【００２８】
このように、本実施形態に係る７顕微鏡装置１は、Φ６．４ｍｍ程度のウェル１０ａの底面１０ｂ全域を一つの画像として取得することを可能にしているため、低倍結像光学系５の対物レンズ１２の焦点深度がより深くなっている。このため、図３に示すようにウェル１０ａ部の裏面１０ｃにキズ２０、へこみ２１、ゴミ２３等が存在すると、カメラ１４で取得される細胞画像３０には、図２に示すように試料（細胞）２（黒い楕円形状の像）と共に、キズ２０、へこみ２１、あるいはゴミ２３等のボケ像（淡い線状、点状の像）が写りこんでしまう。これらボケ像が含まれる画像を用いて、後処理で細胞２の数や面積を計量した場合、ボケ像を誤差として取込んでしまうという問題がある。
【００２９】
本実施形態にかかる顕微鏡装置１は、図２に示す細胞画像３０からボケ像（２０〜２３）を除去した新たな細胞画像を形成する画像処理装置４０を有している。
【００３０】
以下、図４に示すフローチャートを参照しつつボケ像を除去して新たな細胞画像を取得する手順についてステップ毎に説明する。
【００３１】
（ステップＳ１）
作業者は、細胞培養に使用するウェルプレート１０（例えば、９６ウェルプレート）における各ウェル１０ａの底面１０ｂと裏面１０ｃとの間隔Ｌをマイクロメータ等を用いて計測する。そして、作業者は、計測した結果をウェルプレート１０の名称、および各ウェル１０ａの位置指標（例えば、番号等）と共に、ＰＣ４１中のメモリ４４に保存する。
【００３２】
（ステップＳ２）
作業者は、各ウェル１０ａの裏面１０ｃのボケ像を取得するために、各ウェル１０ａに細胞培養で使用する培養液１１を培養時とほぼ同じ量注入する。作業者は、培養液１１を注入後、顕微鏡装置１のステージ３に載置して、低倍照明光学系４により細胞培養に使用するウェル１０ａを低倍照明光学系４の下に位置付する。なお、このときの照明は、培養後に行う細胞画像３０取得時とほぼ同じ照明条件に調整されている。
【００３３】
（ステップＳ３）
作業者は、照明されたウェル１０ａの裏面１０ｃに結像光学系５を合焦させた後、メモリ４４に保存された各ウェル１０ａの指標に基きステップＳ１で取得した間隔Ｌだけステージ３を光軸に沿って図１の下方（結像光学系５方向）に移動する。この結果、結像光学系５の合焦位置は、ウェル１０ａの底面１０ｃにほぼ一致することになる。この状態で、作業者は、ＰＣ４１を介してカメラ１４でウェル１０ａの底面１０ｂの画像を取得する（取得したボケ画像３１の一例を図５に示す）。これによりウェル１０ａの裏面１０ｃにあるキズ２０、へこみ２１、ゴミ２３等のボケ像が取得される（以後、ボケ画像３１という）。取得したボケ画像３１は、ウェルプレート１０の名称、およびウェル１０ａの指標と共に、ＰＣ４１のメモリ４４に保存する。
なお、上記ボケ画像３１は、ウェル１０ａの裏面１０ｃに結像光学系５を合焦させた画像に画像処理装置４０でウェル１０ａに対応する間隔Ｌによる画像ぼかし処理を公知の処理ソフトなどで行い取得することも可能である。この場合、作業者は、上記のように間隔Ｌだけステージ３を移動させる処理を行わなくて済み、ボケ画像３１の取得時間を短縮することができる。
【００３４】
(ステップＳ４)
作業者は、ウェルプレート１０の全ウェル１０ａ（例えば、９６個）あるいは細胞培養に使用するウェル１０ａの全てのボケ画像３１を取得したか否かを判定し、終わっていない場合は１ウェル分の距離ステージ３を面内で移動して、ステップＳ３を実行する。全てのウェル１０ａのボケ画像３１の取得・保存が終了した場合は、次のステップＳ５以降を実行する。
【００３５】
（ステップＳ５）
作業者は、ウェルプレート１０をステージ３から外し、観察対象の細胞を含む培養液を所定のウェル１０ａに注入する。
【００３６】
（ステップＳ６）
作業者は、所定のウェル１０ａに細胞と培養液が注入されたウェルプレート１０を不図示の培養装置に投入して所定の温度、湿度、炭酸ガス濃度で所定時間培養する。
【００３７】
（ステップＳ７、Ｓ８）
作業者は、所定の培養時間が経過後（Ｓ７）、ウェルプレート１０をステージ３に載置して、各ウェル１０ａの培養後の細胞画像３０を取得する。図２は、取得した細胞画像３０の一例である。
ここで取得された各ウェル１０ａの細胞画像３０には、細胞１２と共にボケ像（２０〜２３）が含まれている。作業者は、取得した細胞画像３０と共にウェルプレート１０の名称およびウェル１０ａの指標をＰＣ４０のメモリ４４に保存する。
【００３８】
（ステップＳ９）
作業者は、次ウェルの１０ａの細胞画像３０を取得するために、１ウェル分の距離ステージ３を面内で移動して全てのウェル１０ａの細胞画像３０を取得し終わるまでステップＳ８、９を繰り返す。
【００３９】
（ステップＳ１０）
作業者は、ステップＳ３からステップＳ９により取得してメモリ４４に保存した細胞画像３０とボケ画像３１とを用いて、画像処理装置４０を介して、ボケ画像３１を除去した新たな細胞画像３２を形成する処理を行う。この際、画像処理装置４０は、細胞画像３０とボケ画像３１とが同じ輝度、位置となるように輝度補正、位置補正を行う。図６は、画像処理装置４０を介して形成した新たな細胞画像３２の一例を示す。作業氏は、形成した各ウェル１０ａの新たな細胞画像３２をウェルプレート１０の名称、ウェル１０ａの指標と共にメモリ４４に保存する。
この新たな細胞画像３２は、細胞画像３０とボケ画像３１とから公知の画像処理手法により形成する。例えば、画像処理装置４０は、細胞画像３０とボケ画像３１と同じ輝度、同じ位置に補正した後、細胞画像３０とボケ画像３１との輝度差分を取ることで新たな細胞画像３２を形成する。あるいは、細胞画像３０とボケ画像３１にそれぞれ３次元デコンボリュウション処理を行い、両者の差分を取った後の３次元デコンボリュウション情報から、新たな細胞画像３２を形成する処理を行う。
【００４０】
（ステップＳ１１）
作業者は、画像処理装置４０を介して、保存している細胞画像３０とこれに対応するボケ画像３１とから新たな細胞画像３２を形成し保存し終わるまでステップＳ１０、Ｓ１１を繰り返す。新たな細胞画像３２を全て形成し終わったら本フローによる処理を終了する。
【００４１】
以降、画像処理装置４０は、作業者の指示に基き、形成した新たな細胞画像３２を用いて細胞数や面積等の計量を行う処理を行う。
【００４２】
以上述べたように、本実施形態にかかる顕微鏡装置は、画像処理装置においてウェルプレートの裏面に存在するキズ、へこみ、ゴミ等のボケ像を含む細胞画像から、これらキズ、へこみ、ゴミ等のボケ像を除去した細胞のみを含む新たな細胞画像を形成することができる。この結果、本顕微鏡装置は、画像処理装置を用いて細胞数や細胞面積の計量をより正確に行うことができる。
【００４３】
なお、上記説明では、ウェル底面全領域の細胞画像を一括して取得する顕微鏡について説明したが、他の顕微鏡にも利用することができることは言うまでもない。例えば、標本画像にカバーガラスにあるキズやゴミなどのボケ像が含まれる場合にも適用可能である。倍率が低く、焦点深度が深い対物レンズを用いてキズやゴミなどのボケ像が含まれる部分的な画像画像からキズやゴミなどのボケ像を良好に除去した画像を形成することができる。
【００４４】
また、上記フローチャートに示す処理は、画像処理装置において自動的に処理するように構成することができる。ステップＳ３からＳ１１を全自動で行うように顕微鏡装置を構成することで、ステップＳ１，Ｓ２を除き作業者の介入を不用にする顕微鏡装置を構成することができる。
【符号の説明】
【００４５】
１    顕微鏡装置
２    試料（細胞）
３    ステージ
４    低倍用照明装置
５    結像光学系
１０  ウェルプレート
１２  対物レンズ
１４  カメラ
２０  キズ
２１  へこみ
２３  ゴミ
３０  細胞画像
３１  ボケ画像
３２  新たな細胞画像
４０  画像処理装置
４１  ＰＣ
４２  モニタ
４３  入出力デバイス
４４  メモリ
【図１】
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【図３】
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【図４】
2012159794.tif 000005
【図６】
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【図２】
2012159794.tif 000007
【図５】
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