(57)【要約】      （修正有）【課題】ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡの含有比率の高い、植物体、該植物体および／またはその乾燥葉より抽出される甘味料の製造方法の提供。【解決手段】ステビア・レバウディアナ・ベルトーニ品種間の交配により得られる植物体から、ステビオサイド１重量部に対してレバウディオサイドＡを少なくとも４重量部以上含む植物体を選択し、ＰＣＲを実施するＤＮＡ鑑定によって確認された、ステビオサイド１重量部に対してレバウディオサイドＡを少なくとも４重量部以上含む同品種の植物体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステビア・レバウディアナ・ベルトーニ品種間の交配により得られる植物体から、ステビオサイド１重量部に対してレバウディオサイドＡを少なくとも４重量部以上含む植物体を選択し、次いで以下のプライマー：
Ａ０６：ＡＣＴＧＧＣＣＧＡＧＧＧおよびＡ４８：ＣＣＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡの混合物、
ＵＢＣ-６６：ＧＡＧＧＧＣＧＴＧＡ、
ＵＢＣ-７２：ＧＡＧＣＡＣＧＧＧＡ、または
ＵＢＣ-１０６：ＣＧＴＣＴＧＣＣＣＧ
を用いるＰＣＲを実施するＤＮＡ鑑定によって確認された、ステビオサイド１重量部に対してレバウディオサイドＡを少なくとも４重量部以上含む同品種の植物体。
【請求項２】
請求項１の植物体であって、国際寄託の種子（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３５３）より得られる植物体またはその植物体の挿し木により得られる植物体。
【請求項３】
請求項１に記載の植物体またはその乾燥葉を水または含水溶媒で抽出することを特徴とする、甘味料の製造方法。
【請求項４】
請求項２に記載の植物体またはその乾燥葉を水または含水溶媒で抽出することを特徴とする、甘味料の製造方法。
【請求項５】
請求項３の方法により得られる甘味料から、ステビオサイド１重量部に対してレバウディオサイドＡを少なくとも４０重量部以上含み、かつ純度９２％以上の高純度レバウディオサイドＡを得る方法。
【請求項６】
請求項４の方法により得られる甘味料から、ステビオサイド１重量部に対してレバウディオサイドＡを少なくとも４０重量部以上含み、かつ純度９２％以上の高純度レバウディオサイドＡを得る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡの含有比率の高いステビア・レバウディアナ・ベルトニーの品種に属する植物体、該植物体および／またはその乾燥葉より抽出される甘味料の製造方法に関する。
本発明は、更に該甘味料から高純度レバウディオサイドＡを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステビアは南米パラグアイを原産地とする菊科多年生植物で、学名をステビア・レバウディアナ・ベルトニー(Ｓtevia  Ｒebaudiana  Ｂertoni)という。ステビアは砂糖の３００倍以上の甘味を持つ甘味成分を含むので、この甘味成分を抽出して天然甘味料として用いる為に栽培されている。
ステビアの甘味成分としては、ステビオサイド(Ｃ３８Ｈ６０Ｏ１８)、レバウディオサイドＡ(Ｃ４４Ｈ７０Ｏ２３)、レバウディオサイドＣ、Ｄ、Ｅ、ズルコサイドＡ等が知られている。一般に栽培されているステビア品種では上記甘味成分の内ステビオサイド(ＳＴ)が主成分でレバウディオサイドＡ(ＲＡ)の含有量はステビオサイドの１０分の３〜４程度、レバウディオサイドＣの含量はそれよりやや少ないが、品種によってはレバウディオサイドＣを主成分とするものなど種々である。
【０００３】
渋み、辛み等の舌で知覚される味の中でも甘みの質は非常に微妙である。ステビオサイドは砂糖の３００倍の甘味度を有するので天然甘味料として食品工業界で用いられている。その甘味は比較的砂糖に似ているが、苦み等の不快味が後味に残るという欠点がある。それゆえステビオサイドを多量に含むことは甘味料として好ましいことではない。これに対して、レバウディオサイドＡは良質の甘味質とステビオサイドの１.３倍〜１.５倍の甘味度を有する。
レバウディオサイドＡの生産コストの削減と安定した乾燥葉の収穫量を保ち、甘味料原料として甘味質の優れたレバウディオサイドＡを高含有したステビア品種を開発し、同時に、それらを継続維持し、それらを基に優れた甘味料を製造する必要がある。
【０００４】
本発明者らは従来品種から交配選抜を繰り返して品種改良を行い、ステビオサイド(ＳＴ)に対してレバウディオサイドＡ(ＲＡ)が高い含有比率を示すステビア品種を得、これらの植物から甘味成分を抽出しステビオサイドに対してレバウディオサイドＡの含有比の高い優れた甘味料を製造してきた(後記特許文献１−１から１−３参照)が、更にレバウディオサイドＡの安定的により含有比の高い優れた品種の開発が望まれた。
一方、ステビア植物の品種改良においてステビア植物を特定する方法が問題となる。改良されたステビア植物の識別方法として、草丈、葉形等による識別が考えられるが、ステビアは自家不和合性であり雑種になりやすく、草丈、葉形等による識別のみでは不可能である。
【０００５】
また、ステビア特有の病原菌による耐病性による比較特定もあるが、ステビア特有に発現する枯葉、黒斑点病はセプトリア菌、アルタナリア菌に起因して発生するが、それらの菌は土壌に生息する菌であり、これらの症状のみによる品種の特定は日本のみならず世界的に発生することからこれら特性のみで品種を特定するには不十分である。
甘味成分の含有量が高くステビオサイドに対してレバウディオサイドＡの含有比率の高い改良品種においてはその含有比率による特定方法が考えられるが、生育期間の気象条件、収穫時期等により甘味成分比率が変動するのは避けられないから、この方法も現実性に乏しい。
【０００６】
最近、プライマーミックスを用いるＲＡＰＤ法によって、ＤＮＡ鑑定により識別を行う方法（後記特許文献２参照）も開発されたが、本発明の植物体の鑑定に適用できるかどうかは明らかでない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭５９−０４５８４８号公報
【特許文献２】特開昭６０−１６０８２３号公報
【特許文献３】特開昭６１−２０２６６７号公報
【特許文献４】特開２００３−９８７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は甘味成分含量と甘味成分含有比の優れた品種を創造し、その特徴を維持するためにＲＡＰＤ法で遺伝子を識別することにより他系統、他品種のステビア植物と区別した上で、甘味質の優れた甘味料およびその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１は、ステビオサイド１重量部に対してレバウデイオサイドＡを４重量部以上含むステビア・レバウディアナ・ベルトニー品種である。このため、後述するように交配と選別を繰り返してステビオサイド１重量部に対してレバウデイオサイドＡを少なくとも４重量部以上含むステビア・レバウディアナ・ベルトニー品種に属する新たな植物体を創造した。
本発明の第２は、ステビオサイド１重量部に対してレバウデイオサイドＡを４重量部以上を含む甘味料の製造方法であり、前項の植物体またはその乾燥葉を水、または含水溶媒で抽出することを特徴とする。
【００１０】
本発明の第３は、ステビオサイド１重量部に対してレバウデイオサイドＡを４０重量部以上含む高純度甘味料の製造方法であって、前項で得られた甘味料を再結晶し、ステビオサイド１重量部に対してレバウデイオサイドＡを４０重量部以上含み、それらの含量が９２％以上を含む甘味料の製造方法である。
交配と選別による品種改良においては、選別された品種の特定方法が重要な意味を持つ。本発明者らは、ＲＡＰＤ法によって、ＤＮＡ鑑定による特定方法を検討した。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、甘味質の優れた甘味料およびその製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】守田品種、ＳＳおよびＳＮのＤＮＡ塩基配列の電気泳動図である。矢印部分に特徴的な塩基配列が認められる。
【図２】守田品種、およびＳＮのＤＮＡ塩基配列の電気泳動図である。矢印部分に特徴的な塩基配列が認められる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の識別に用いられるＲＡＰＤ法(Random Amplified Polymorphic DNA method)はＤＮＡの解析手法の１つであり、複数のプライマーを用いてPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)を行うと、用いたプライマーと同一または類似の配列に挟まれたＤＮＡの領域が増幅され、その増幅されたＤＮＡのパターンを電気泳動で解析する方法である。また、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(ＣＴＡＢ：Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)は長鎖アルキル基をもつ第４級アンモニウム塩基であり、核酸のようなポリアニオンと不溶性の複合体を形成するために核酸の単離に利用することができる。
【００１４】
ＤＮＡの違いにより品種識別する手段はＣＴＡＢにより植物体からゲノムＤＮＡを単離し、リボ核酸(ＲＮＡ)を除去し、プライマーミックスを用いてＰＣＲ法により得られたＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動法によって得られるＤＮＡフィンガープリントの違いにより区別する。本発明の植物体の場合、後述するように２０００ｂｐ下部に特徴的な塩基配列を示すことが確認された。
実際には、原料の植物体について、選択的に沈殿させたゲノムＤＮＡを雛型とし、プライマーとして例えばＡ０６(塩基配列；ＡＣＴＧＧＣＣＧＡＧＧＧ) とＡ４８(塩基配列；ＣＣＧＣＡＧＧＧＡＣＣＡ)のセットおよび rＴａｑ(ＴＡＫＡＲＡ)を用いて９４度(３０秒)、５５度(３０秒)、７２度(１２０秒)で３５サイクル反応を行った後、７２度で１０分間反応させる。その後、ＰＣＲ増幅産物をアガロース電気泳動法によって確認し、特定のＤＮＡバンドにより植物体が確認できる。
【００１５】
甘味料の製造には、当該植物体および／またはその乾燥葉から水、または含水有機溶媒にて抽出し、次いで抽出液をそのまま濃縮するか、または必要に応じて陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、活性炭でイオン性不純物を除去し、吸着樹脂に甘味成分を吸着させ親水性溶媒で溶離して溶離液を濃縮、乾燥して甘味料が得られる。甘味料の製造方法はその他脱色等の慣用精製手段を適宣施すことが出来、高純度レバウディオサイドＡを得る方法は膜分離、アルコール抽出、結晶化等の慣用手段を適宜施すことができる。また、結晶化の方法は結晶溶媒としてエタノール、メタノール等の有機溶媒に要すれば水を加えて、適宣使用することができる。得られた甘味料は他の天然、人工甘味料、希釈剤等を加えることもできる。
レバウディオサイドＡを比較的高濃度で含有する品種の育種過程
【００１６】
育種はレバウディオサイドＡを比較的高含有する品種のかけ合わせ選抜にて行い、まず、レバウディオサイドＡを高濃度で含有するＳＦ５−１、ＳＦ５−２(特開平１０−２７１９２８号記載)を人工的に交配し、得られた種子からＴＤ-１（特開２００３−９８７８号記載）を選択して、それらを更に人工的に交配し、得られた種子から、セプトリア菌、アルタナリア菌に抵抗性を有する品種を選抜し、その甘味成分を分析し、ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡを４重量部以上含み、甘味含有量が高く、比較的耐病性に優れた株を選抜した。さらに、甘味成分含量、甘味成分比率、生育状況を繰り返し確認し、守田品種として、その遺伝子を検索した。
【００１７】
さらに出願人は、今回、本発明に係る守田品種について、既に国際寄託を完了した（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３５３）。従って、その寄託に係る守田品種の種子から、容易に本発明の植物体を容易に入手することができる。ステビアは自家不和合性であり、当該種子から常に目的の植物体が得られるとは限らないが、本願に記載されたＤＮＡ鑑定に従って目的物を容易に選別できる。また必要ならば、他の高品質ステビア種（例えばＴＤ−１）と交配し、後記実施例１に準じて選別を行えば、レバウディオサイドＡを高濃度で含有する植物体を極めて容易に入手することができる。これら植物体はすべて、国際寄託をした品種、即ち守田品種の種子から得られる植物体に含まれる。
【実施例】
【００１８】
以下に、育種過程およびその特性等を具体的に記載する。本発明は本育種過程、栽培方法に限定されるものでない。
実施例１
レバウディオサイドＡを比較的高濃度に含有する品種のかけ合わせで得られた種子より、１９９５年にレバウディオサイドＡを含有するＳＦ−１、ＳＦ５−２品種(特開平１０−２７１９２８号記載)を新見工場内ビニールハウス内で人工的にかけ合わせ、得られた種子を９６年３月に新見工場内のビニールハウスに播種、発芽した苗を育苗ポットに移植し、５月上旬に苗丈８cm程度以上の苗６００本を工場内圃場に１０アール当たり窒素、燐、カリの肥料成分各２０kgを施肥し２週間後に移植した。７月上旬に追肥として１０アール当たり窒素、燐、カリの肥料成分各１０kgを追肥した。
【００１９】
９月上旬に調査し、その甘味成分を分析し、ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡを３倍以上含む株ＴＤ−１品種（特開２００３−９８７８号記載）を選抜した。
９８年にＴＤ-１品種を新見工場内ビニールハウス内で人工的にかけ合わせ、得られた種子を９９年３月に新見工場内のビニールハウスに播種、発芽した苗を育苗ポットに移植し、５月上旬に苗丈７cm程度以上の苗３００本を工場内圃場に１０アール当たり窒素、燐、カリの肥料成分各２０kgを施肥し２週間後に移植した。７月上旬に追肥として１０アール当たり窒素、燐、カリの肥料成分各１０kgを追肥した。
【００２０】
９月上旬に調査し、その甘味成分を分析し、ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡを４重量部以上含み株ＴＤ−１品種よりも耐病性に優れ、生育の良い株を選抜した。２０００年４月中旬にそれらより萌芽した芽を１００本挿し木した。５月上旬に同様に工場内圃場に植え付け７月末に耐病性、生育を再度調査し、甘味成分比、含量が優れている事を確認し、更に、２００１年から３ヵ年間をかけて耐病性、甘味成分比、甘味成分含量、乾燥葉の収量が優れ、生育、成分に変化が無い事を確認し、守田品種とした。
【００２１】
守田品種、ＴＤ−１、およびＳＮの比較試験１
守田品種との他品種の比較のために、２００３年４月中旬にレバウディオサイドＡを主成分とするＴＤ−１（ＴＤ）、ステビオサイドを主甘味成分とし、レバウデイオサイドＡを副甘味成分とする一般的なステビア品種(ＳＮ)各４０本も同様に挿し木し、同様に工場内圃場に植え付けた。
上記の５月上旬に圃場に移植した挿し木により増殖させた守田品種の苗２００本と、ＴＤ品種、ＳＮ苗各４０本のうち、６月上旬に任意に選んだ各品種１０本中での発病の有無を調査した後、守田、ＴＤ、ＳＮの各品種を地上から１５ｃｍで刈り取り後、葉部を分離し、乾燥後分析試料とした。
【００２２】
分析結果は次のとおりであった。
【表１】
2012090629.tif 000002
【００２３】
守田品種、ＴＤ、およびＳＮの比較試験２
７月中旬に追肥を行い、９月上旬に各品種１区画２０株を選択しセプトリア菌、アルタナリア菌の発病状況を調査した後、各品種を地上部から刈り取った後、葉部を分離し、乾燥後分析試料とした。
分析結果は次のとおりであった。
【表２】
2012090629.tif 000003
【００２４】
守田品種は下葉黒斑点の発病割合は比較的低く、甘味成分含量、乾燥葉収量も他品種より優れていた。ＴＤ品種は守田品種よりもセプトリア菌により下葉黒斑点が多く、既に葉がセプトリア菌により黄色く変色し始めており、ＳＮ品種はセプトリア菌により下葉の３節までの部分でセプトリア菌による黄変が見られ、地上より１節の葉は枯れ葉となっていた。
０４年３月に守田品種から萌芽した穂先を２００本挿し木し、４月下旬に圃場に移植し、５月末、６月末、７月末、８月末、９月末、開花後の１０月末に地上部を刈り取り、葉のみを分離した後、乾燥し、甘味成分含量を測定した。
甘味成分の測定は高速液体クロマトグラフィーにより行った。
【００２５】
【表３】
2012090629.tif 000004
【００２６】
守田品種は生育期間により甘味成分含量、甘味成分比が異なり、生育期間が長くなるにつれて甘味成分含量が増え、一方、ステビオサイド含量が減少する傾向が見られた。開花時期の１０月末には甘味成分含量の減少がみられる。
【００２７】
遺伝子塩基配列の特定（その１）
甘味成分含量、甘味成分比、収量から守田品種が最も優れていたことから、守田品種をＰＣＲ法により識別した。
乾熱滅菌した乳鉢に守田品種の葉を約０．２グラム入れ、液体窒素を加えて乳棒ですりつぶし、マイクロチューブにスパテュラで約０．０５ｇづつ入れた。３００μｌの２％ＣＴＡＢ溶液(２％ＣＴＡＢ溶液(５０ｍｌ)：組成１００ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２０ｍＭ、ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２％  ＣＴＡＢ、１．４Ｍ  ＮａＣｌ)を加え、転倒混和した後、６５℃に熱したヒートブロックにチューブを移し、３０分間加温した。等量（３００μｌ）のクロロホルム／イソアミルアルコール(２４:１)を加え、５分間穏やかに攪拌する。１４０００ｒｐｍで１５分遠心分離した後、２層に分かれた内容物の上層の水層を新しいチューブに移す。
【００２８】
上記のクロロホルム/イソアルミアルコール以降の操作をもう一度繰り返し、水層を新しいチューブに移す。４００μｌの１％ＣＴＡＢ溶液(１％ＣＴＡＢ溶液(５０ｍｌ)：組成１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２.５ｍｌ、０.５Ｍ  ＥＤＴＡ  １.０ｍｌ、１％  ＣＴＡＢ  ０.５ｇ)を加え、１５分転倒混和後、１時間室温で静置し、１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行う。
上清を捨てて、４００μｌの１ＭＣｓＣｌを加え、ピペッティングをして沈殿を完全に溶かす。９００μｌの１００％エタノールを加え、転倒混和後、−２０℃で２０分以上静置し、１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行なう。上清を捨て、沈殿に４００μｌの７０％エタノールを加え１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、この操作を繰り返した後に上清を捨て、沈殿を真空乾燥機で乾燥し、３０μｌの超純水に溶解する。溶液をアガロースゲル電気泳動し、ＤＮＡが単離されていることを確認した。
【００２９】
ＲＮＡを除去する為にＲＮａｓｅ溶液５００μｌ(組成：上記ＤＮＡ単離溶液１００μｌ、ＲＮａｓｅ(５ｇ／ｍｌ)  ５μｌ)で３７℃にて１時間反応させ、反応液にＰＣＩ溶液(組成：フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、２５：２４：１を穏やかに混合した後、１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、水層を分離した溶液)を等量加える。蓋をして穏やかに混合した後、１３０００ｒｐｍで５分間遠心した。
【００３０】
水層(上層)を新しいマイクロチューブに移し、室温で保存していたＣＩＡ溶液(組成：クロロホルム／イソアミルアルコール、容量比２４：１)を等量加え、穏やかに混合した後、１５０００ｒｐｍで３分間遠心し、水層を新しいマイクロチューブに移し、もう一度ＣＩＡ処理を行い、得られた上清の１／１０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２.５倍量の１００％エタノールを加え、よく混ぜた後、−２０℃で２０分以上冷却し、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心し、ＤＮＡをペレットにし、上清を捨て、ペレットに冷却しておいた７０％エタノールを１ｍｌを加えた後、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を捨て、もう一度冷却した７０％エタノールを１ｍｌ加えた後、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を捨て、減圧デシケーターを用いて５分間乾燥させた。
【００３１】
得られたゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ用組成物(表４)にて、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１２０秒３５サイクル反応を行った後、７２℃で１０分間反応させる。反応後、４℃に保ちＰＣＲ増幅産物を得た。ＰＣＲ増幅産物を１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡバンドを確認すると、図１の守田が示すように、およそ２０００ｂｐ下方に特徴的なＤＮＡ断片が確認できた。
【００３２】
【表４】
2012090629.tif 000005
【００３３】
同様に、ステビオサイドを主成分としレバウディオサイドＡを副成分とするＳＮ品種(ＳＮ)およびＳＳ品種（ＳＳ）を上記と同様に処理したＤＮＡバンドを図１に示す。
守田品種はおよそ２０００ｂｐ下部に特徴的な塩基配列を有し、ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で検出することによって、他の品種と容易に区別することが出来る。
【００３４】
遺伝子塩基配列の特定（その２）
上記と異なるプライマーを使用して、守田品種およびＳＮ品種の比較を行った。
＜ＤＮＡ抽出＞
ＤＮＡ抽出はＣＴＡＢ法により行った。守田品種、ＳＮ品種それぞれの葉、約０．５ｇを乳鉢中で液体窒素により凍結し、乳棒にて粉砕した。粉砕したサンプルは５０ｍｌファルコンチューブ中で２０ｍｌの２％ＣＴＡＢ溶液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ8.0、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ8.0、２％  ＣＴＡＢ、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＰＶＰ）と混和し、６５℃で３０分インキュベートした。等量のクロロホルム/イソアミルアルコール（24：1）を加え、10分間撹拌した後、３５００ｒｐｍで１５分遠心分離し、水層を別の５０ｍｌファルコンチューブに移した。
【００３５】
さらに等量の１００％イソプロパノールを加え、３５００ｒｐｍで１５分遠心分離し、沈殿をホックで集め１．５ｍｌマイクロチューブに移した。沈殿を７５％エタノールでリンスした後、乾燥させ６００μｌのＴＥバファーで溶解した。ＲＮａｓｅ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を１μｌ加え、３７℃で１時間インキュベートしたのち、等量のＴＥ飽和フェノールを加え混和してから１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。水層を別のマイクロチューブに移し１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムと等量のイソプロパノールを加え、混和し１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。得られた沈殿を７５％エタノールで２回リンスしたのち乾燥させ５０μｌのＴＥバファーに溶解しＤＮＡサンプルとした。
【００３６】
＜ＰＣＲ分析＞
得られたＤＮＡサンプルを鋳型として以下の反応液組成にてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲサイクルは９６℃で３０秒反応させた後、９６℃１０秒、４２℃２分、７２℃２分３５サイクル、さらに７２℃で４分反応させた。反応後、ＰＣＲ産物は１．８％アガロースゲル電気泳動により分画し、ＥｔＢｒ染色後ＵＶ照射下にて撮影した。その結果、プライマーＵＢＣ−６６において約２０００ｂｐ付近に守田品種に特異的なバンドが確認できた。またプライマーＵＢＣ−７２では約６００ｂｐ付近に、ＵＢＣ−１０６では約７００ｂｐ付近にＳＮ品種に特異的なバンドが確認された。この結果から守田品種とＳＮ品種は遺伝的に異なる系統であり、ＲＡＰＤ分析により容易にその差異が検出できることが明らかとなった。
【００３７】
反応液組成（５０μｌ中）
１０  Ｘ  ＰＣＲ  バファー                          ５μｌ
ｄＮＴＰ  （２．０ｍＭ）                              ５μｌ
ＲＡＰＤ  プライマー  ＊（１０  ｍｅｒ）              ５μｌ（５μＭ）
ブレンド・タック（Blend Taq）（商標）（ＴＯＹＯＢＯ）  ０．５μｌ（２．５Ｕ／μｌ）
ステビアＤＮＡ                                １μｌ（３０ｎｇ／μｌ）
滅菌水                                    ３３．５μｌ
＊プライマーとしては下記のＵＢＣ−６６、ＵＢＣ−７２またはＵＢＣ−１０６を用いた。
ＵＢＣ−６６：  ＧＡＧＧＧＣＧＴＧＡ
ＵＢＣ−７２：  ＧＡＧＣＡＣＧＧＧＡ
ＵＢＣ−１０６：  ＣＧＴＣＴＧＣＣＣＧ
【００３８】
実施例２  甘味料の製造
９月末に得られた守田品種の乾燥葉２０ｇを２０倍量の水で甘味が感じられなくなるまで数回抽出し、抽出液を陽イオン交換樹脂(アンバーライトＩＲ−１２０Ｂ)２０mlを充填したカラムおよび陰イオン交換樹脂(デュオライトＡ−４)２０ml、粒状活性炭５mlを充填したカラムに通液し、通過液を吸着樹脂(ダイヤイオンＨＰ−２０)１００mlを充填したカラムに通して甘味成分を吸着させ、十分水洗後エタノール３００mlで溶離する。溶離液を減圧下に濃縮し、乾燥して淡黄白色の粉末を得た。比較のためにＴＤ、ＳＮからも同様の処理をして甘味成分を得、これを分析した。
分析方法        高速液体クロマトグラフィー法
使用カラム      Hibar Licrosorb ＮＨ２  ５μ  ４mm(直径)×２５０mm
流速            １.５ml／分
展開溶媒        アセトニトリル：水＝８２：１８
測定波長        ２１０ｎｍ
【００３９】
表５に抽出精製物の分析結果を示す。表中のＳＴはステビオサイド、ＲＡはレバウディオサイドＡである。
【表５】
2012090629.tif 000006
【００４０】
官能試験１
実施例２で得られた守田、ＳＮの淡黄色の粉末の各０.１％溶液を調製し、ステビア甘味料の味質に精通したパネラ−１０人により苦み、渋み、甘味質を比較した。
【表６】
2012090629.tif 000007
各試料において守田品種は苦み、渋みが他の試料より改善されており、甘味質において優れていた。
【００４１】
官能試験２
実施例２で得られた守田、ＴＤの淡黄色の粉末の各０.１％溶液を調製し、ステビア甘味料の味質に精通したパネラ−１０人により苦み、渋み、甘味質を比較した。
【表７】
2012090629.tif 000008
各試料において守田品種は苦み、渋みが他の試料より改善されており、甘味質において優れていた。
【００４２】
実施例３  高純度レバウディオサイドＡ甘味料の製造
実施例２で得られた抽出精製物（守田品種）２ｇを１０倍量の９５％メタノールに加熱溶解した後に、４℃に６日間冷却放置し、得られた結晶を分離し、冷メタノールで洗浄後、減圧乾燥し、白色の結晶１．２ｇを得た。比較のためにＴＤ、ＳＮからも同様の処理をしてそれぞれ白色の結晶０．９ｇおよび０．６ｇを得、これを分析した。
分析方法        高速液体クロマトグラフィー法
使用カラム      Hibar licrosorb ＮＨ２  ５μ  ４mm(直径)×２５０mm
流速            １.５ml／分
展開溶媒        アセトニトリル：水＝８２：１８
測定波長        ２１０ｎｍ
【００４３】
表８に抽出精製物の分析結果を示す。表中のＳＴはステビオサイド、ＲＡはレバウディオサイドＡである。
【表８】
2012090629.tif 000009
【００４４】
官能試験３
実施例３で得られたＳＮ白色の粉末の各０.１％溶液を調製し、ステビア甘味料の味質に精通したパネラ−１０人により苦み、渋み、甘味質を比較した。
【表９】
2012090629.tif 000010
各試料において守田品種は苦み、渋みが他の試料より改善されており、甘味質において優れており、高純度製品の回収率も優れていた。
【００４５】
官能試験４
実施例３で得られたＴＤの白色の粉末の各０.１％溶液を調製し、ステビア甘味料の味質に精通したパネラ−１０人により苦み、渋み、甘味質を比較した。
【表１０】
2012090629.tif 000011
【００４６】
各試料において守田品種は苦み、渋みが他の試料より改善されており、甘味質において優れており、高純度製品の回収率も優れていた。
実施例４  高純度レバウディオサイドＡ甘味料の製造
実施例２で得られた抽出精製物（守田品種）の２ｇを５倍量の７５％メタノールに加熱溶解した後に、４℃に７日間冷却放置し、得られた結晶を分離し、冷メタノールで洗浄後、減圧乾燥し、白色の結晶０．９ｇを得て、分析した。
【００４７】
【表１１】
2012090629.tif 000012
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明によれば、ステビオサイドに対してレバウディオサイドＡの含有比率の高いステビア・レバウディアナ・ベルトニー品種が提供され、該植物体を原料として甘味質の優れた天然甘味料を製造することができる。
【符号の説明】
【００４９】
図１における記号ａ〜ｈはそれぞれ下記の通りである。
a：Hind IIIマーカー
b、e：ＳＮ品種
c、f：守田品種
d、g：ＳＳ品種
h：１kbp  ＤＮＡ ラダーマーカー
図２における記号は以下の通りである。
守：守田品種
ＳＮ：ＳＮ品種
Ｍ：ＤＮＡマーカー（１００ｂｐ  ラダー）
【受託番号】
【００５０】
出願人は、本発明に係る守田品種について、国際寄託を完了している（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３５３）。
【図１】
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【図２】
2012090629.tif 000014
【配列表】
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