(57)【要約】【課題】２型糖尿病のＤＮＡマーカー及び２型糖尿病の診断／発症予測方法を提供すること。【解決手段】p16.3領域内の、テロメアより約800kb-1.7Mbの領域またはその部分領域のコピー数が減少した、単離されたゲノムＤＮＡ、または16q24.3領域内の、16番染色体短腕テロメアより約88.5Mb-90.0Mbの領域またはその部分領域のコピー数が減少した、単離されたゲノムＤＮＡをＤＮＡマーカーとし、いずれかのＤＮＡマーカーを有するヒトに対し、２型糖尿病として診断／発症予測する。【選択図】図３Ｂ
2012200216.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２型糖尿病のＤＮＡマーカーであって、
4p16.3領域内の、テロメアより約800kb-1.7Mbの領域またはその部分領域のコピー数が減少した、単離されたゲノムＤＮＡ、または16q24.3領域内の、16番染色体短腕テロメアより約88.5Mb-90.0Mbの領域またはその部分領域のコピー数が減少した、単離されたゲノムＤＮＡからなるＤＮＡマーカー。
【請求項２】
ＤＮＡの検出方法であって、
単離されたヒトゲノムＤＮＡにおいて、4p16.3領域の、テロメアより約800kb-1.7Mbの領域またはその部分領域、または16q24.3領域内の、16番染色体短腕テロメアより約88.5Mb-90.0Mbの領域またはその部分領域のゲノム当たりのコピー数を調べる工程を含む方法。
【請求項３】
ＤＮＡの検出方法であって、
単離されたヒトゲノムＤＮＡにおいて、4p16.3領域の、テロメアより約800kb-1.7Mbの領域（第１の領域）、または16q24.3領域内の、16番染色体短腕テロメアより約88.5Mb-90.0Mbの領域（第２の領域）内の、任意の少なくとも１０ｂｐ以上の部分領域のゲノム当たりのコピー数を調べる工程を含む方法。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡの検出方法であって、
第１の領域または第２の領域内の、任意の少なくとも５０ｂｐ以上の部分領域のゲノム当たりのコピー数を調べる工程を含む方法。
【請求項５】
請求項３に記載のＤＮＡの検出方法であって、
第１の領域または第２の領域内の、任意の少なくとも２００ｂｐ以上の部分領域のゲノム当たりのコピー数を調べる工程を含む方法。
【請求項６】
請求項３に記載のＤＮＡの検出方法であって、
第１の領域または第２の領域内の、任意の少なくとも５００ｂｐ以上の部分領域のゲノム当たりのコピー数を調べる工程を含む方法。
【請求項７】
２型糖尿病のＤＮＡマーカーのスクリーニング方法であって、
4p16.3領域内の、テロメアより約800kb-1.7Mbの領域（第１の領域）内、または16q24.3領域内の、16番染色体短腕テロメアより約7.0Mb-88.5Mbの領域（第２の領域）内に変異を有する患者に共通して生じている変異領域あるいは変異遺伝子を調べる工程を含む方法。
【請求項８】
請求項３に記載のスクリーニング方法であって、
前記変異が、第１の領域または第２の領域内の一部の領域のコピー数減少であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項９】
請求項３または４に記載のスクリーニング方法であって、
第１の領域または第２の領域に変異を有する患者と、２型糖尿病の発症との相関関係を調べる工程をさらに含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２型糖尿病のＤＮＡマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病患者の大多数を占める２型糖尿病は食事、肥満、加齢などの環境因子が発症に関わる生活習慣病として知られるが、その発症には遺伝因子も大きく関わることが広く認められている。これまでに遺伝因子を解明するために数々の研究が行われ，近年では特に、２型糖尿病を関連した一塩基多型 (single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ)が報告されてきた（例えば、非特許文献１、２参照）。しかし，それら各ＳＮＰの疾患への寄与度は決して大きくはなく、一方、コピー数多型 (copy number variation：ＣＮＶ) についても、Framingham Heart StudyのサンプルでのＣＮＶ関連解析においては，２型糖尿病患者群で対照群に対して有意なＣＮＶが存在する遺伝子は認めなかったと報告されている（例えば、非特許文献３参照）。このように、２型糖尿病発症に関する遺伝因子について、未だ解明はされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Zeggini E., Scott L. J., Saxena R.et al.:Meta-analysis of genome-wide association data and large-scale replication identifies additional susceptibility loci for type 2 diabetes. Nat Genet 40:638-45, 2008
【非特許文献２】The Wellcome Trust Case Control Consortium. :Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls. Nature 447:661-78, 2007
【非特許文献３】Shtir C., Pique-Regi R., Siegmund K.et al.:Copy number variation in the Framingham Heart Study. BMC Proc 3 Suppl 7:S133, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、２型糖尿病のＤＮＡマーカー及び２型糖尿病の診断及び／又は発症予測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一実施態様は、２型糖尿病のＤＮＡマーカーであって、4p16.3領域内の、テロメアより約800kb-1.7Mbの領域またはその任意の部分領域のコピー数が減少している、単離されたゲノムＤＮＡ、または16q24.3領域内の、16番染色体短腕テロメアより約88.5Mb-90.0Mbの領域またはその任意の部分領域のコピー数が減少している、単離されたゲノムＤＮＡからなるＤＮＡマーカーである。なお、コピー数が減少している領域のテロメアからの距離は、４番染色体の場合、ＮＣＢＩのデータベースBuild36.3を基準にし、１６番染色体の場合、Build37.2を基準にしている。従って、他のデータベースにおいては異なる距離で表現されていても、上記領域に対応していれば、その対応領域は本発明の権利範囲に含まれる。また、任意の部分領域とは、領域内の、任意の少なくとも１０ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、または５００ｂｐ以上の部分領域を意味する。
【０００６】
本発明の他の実施態様は、ＤＮＡの検出方法であって、単離されたヒトゲノムＤＮＡにおいて、4p16.3領域の、テロメアより約800kb-1.7Mbの領域またはその部分領域、または16q24.3領域の、16番染色体短腕テロメアより約88.5Mb-90.0Mbの領域またはその部分領域のゲノム当たりのコピー数を調べる工程を含む方法である。
【０００７】
本発明のさらなる実施態様は、単離されたヒトゲノムＤＮＡにおいて、4p16.3領域の、テロメアより約800kb-1.7Mbの領域（第１の領域）、または16q24.3領域内の、16番染色体短腕テロメアより約88.5Mb-90.0Mbの領域（第２の領域）内の、任意の少なくとも１０ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、または５００ｂｐ以上の部分領域のゲノム当たりのコピー数を調べる工程を含む方法である。
【０００８】
本発明のさらなる実施態様は、２型糖尿病のＤＮＡマーカーのスクリーニング方法であって、4p16.3領域内の、テロメアより約800kb-1.7Mbの領域（第１の領域）内、または16q24.3領域の、16番染色体短腕テロメアより約88.5Mb-90.0Mbの領域（第２の領域）内に変異を有する患者に共通して生じている変異領域あるいは変異遺伝子を調べる工程を含む方法である。前記変異が、第１の領域または第２の領域内の一部の領域のコピー数減少であることが好ましい。また、このスクリーニング方法は、第１の領域または第２の領域に変異を有する患者と、２型糖尿病の発症との相関関係を調べる工程をさらに含んでもよい。
【０００９】
本発明のさらなる実施態様は、２型糖尿病の診断及び／又は発症予測方法であって、診断対象から単離されたヒトゲノムＤＮＡにおいて、4p16.3領域の、テロメアより約800kb-1.7Mbの領域、または16q24.3領域の、16番染色体短腕テロメアより約88.5Mb-90.0Mbの領域のゲノム当たりのコピー数を調べる工程を含む方法である。当該コピー数が正常より減少している場合、２型糖尿病であると診断する、または２型糖尿病を発症する可能性が高いと予測する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によって、２型糖尿病のＤＮＡマーカー及び２型糖尿病の診断及び／又は発症予測方法を提供できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１（Ａ及びＢ）は、２型糖尿病患者群１００名（図中番号１−１００）及び健常人１００名（図中番号１０１−２００）から抽出したゲノムＤＮＡに対し、第４番染色体短腕4p16.3領域のプローブ群を有するＤＮＡアレイを用いて、ゲノムＤＮＡのコピー数多型を解析した結果を示す図である。図１Ａ上段に染色体全体におけるコピー数多型の位置（上下に突出している部分）を示し、下段に当該領域内で遺伝子のコードされている位置及びエクソン−イントロン構造を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂでは、図１Ａと共に、その下段に患者又は健常人においてコピー数が減少していると判定された領域（黒色の横棒で示されている）を示す。なお、灰色の横棒で示された領域は、ＤＮＡアレイ解析においてプローブが配置されていないため、連続するコピー数減少領域と推定される領域を示す。灰色のカラムは、gap-177の位置を示す。なお、横軸は、第４番染色体における位置を示している。
【図２Ａ】図２（Ａ及びＢ）は、２型糖尿病患者群１００名（図中番号１−１００）及び健常人１００名（図中番号１０１−２００）から抽出したゲノムＤＮＡに対し、第１６番染色体長腕16q24.3領域のプローブ群を有するＤＮＡアレイを用いて、ゲノムＤＮＡのコピー数多型を解析した結果を示す図である。図２Ａ上段に染色体全体におけるコピー数多型の位置（上下に突出している部分）を示し、下段に当該領域内で遺伝子のコードされている位置及びエクソン−イントロン構造を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂでは、図２Ａと共に、その下段に患者又は健常人においてコピー数が減少していると判定された領域（黒色の横棒で示されている）を示す。なお、灰色の横棒で示された領域は、ＤＮＡアレイ解析においてプローブが配置されていないため、連続するコピー数減少領域と推定される領域を示す。なお、横軸は、第１６番染色体における位置を示している。
【図３Ａ】図３（Ａ及びＢ）は、解析を行った1.3 Mbの領域の移動平均線 (moving average pattern)より判定された２型糖尿病１３名のコピー数多型領域を、4p16.3サブテロメア領域と共に示した図である。図３Ａ上段はこの領域の第４番染色体上の位置を示し、下段はこの領域にコードされる遺伝子の位置・名称・エクソン−イントロン構造、およびgap-177の位置を示す。
【図３Ｂ】図３Ａと共に、その下段に、各患者でコピー数が減少していると判定された範囲（黒色の横棒で示されている）を示す。灰色の横棒は、低頻度反復配列のある領域を示している。斜線のカラムは、gap-177の位置を示す。なお、横軸は、第４番染色体における位置を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００１３】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.; Juan S. Bonifacino (Bethesda, Maryland); Mary Dasso (Bethesda, Maryland); J. B. Harford, J. L-Schwartz, K. M. Yamada (Ed.), Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１４】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１５】
[１]２型糖尿病のＤＮＡマーカー
本発明の２型糖尿病のＤＮＡマーカーは、第４染色体上の4p16.3領域の、テロメアより約800kb-1.7Mbの領域またはその任意の部分領域のコピー数が減少している、単離されたヒトゲノムＤＮＡ、または第１６染色体上の16q24.3領域内の、16番染色体短腕テロメアより約88.5Mb-90.0Mbの領域またはその任意の部分領域のコピー数が減少している、単離されたヒトゲノムＤＮＡからなる。このようなヒトゲノムＤＮＡは、２型糖尿病を診断及び／又は発症予測するための有用なＤＮＡマーカーになりうる。
【００１６】
２型糖尿病とは、抗GAD (glutamic acid decarboxylase)抗体や抗IA-2 (insulinoma-associated antigen-2) 抗体などの膵島関連自己抗体が陰性であることで、１型糖尿病を除外でき、病歴調査や検査成績を評価することで、膵外分泌疾患、内分泌疾患、肝疾患による糖尿病、薬剤性糖尿病、ミトコンドリア糖尿病などを除外できる。
【００１７】
ヒトゲノムＤＮＡの単離方法は、特に限定されず、当業者に周知の方法で抽出し、後の解析に障害がない程度の純度まで精製すればよい。
【００１８】
対象者から単離したヒトゲノムＤＮＡにおいて、4p16.3領域内のテロメアより約800kb-1.7Mbの領域またはその任意の部分領域、または16q24.3領域内の16番染色体短腕テロメアより約88.5Mb-90.0Mbの領域またはその任意の部分領域のゲノム当たりのコピー数を調べ、対照者における同じ領域のゲノム当たりのコピー数と比較することによって、ゲノム当たりコピー数が対照者より減少していることが判明すれば、当該対象者は、２型糖尿病であると診断したり、現在発症していない場合は、将来２型糖尿病を発症する可能性が高いと予測したりすることができる。ここで、対照者とは、健常者であることが好ましいが、ランダムに選択した集団でも良い。比較すべき、対照者におけるコピー数とは、複数の対照者を調べて得られたコピー数から、当業者が適切に選択する値や範囲であればよく、例えば、調べたうちの６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の人数が含まれる範囲や、得られた値の中央値や平均値でもよい。
【００１９】
当該領域またはその部分領域のコピー数の調べ方は、特に限定されない。すなわち、対象者から単離されたヒトゲノムＤＮＡにおいて、4p16.3領域の、テロメアより約800kb-1.7Mbの領域、または16q24.3領域内の、16番染色体短腕テロメアより約88.5Mb-90.0Mbの領域内の、任意の部分領域のゲノム当たりのコピー数を調べればよい。部分領域の長さは、コピー数の変動が検出される長さであればと特に限定されず、少なくとも１０ｂｐ以上が好ましく、５０ｂｐ以上がより好ましく、２００ｂｐ以上がさらに好ましく、５００ｂｐ以上がさらに好ましい。具体的な方法としては、例えば、当該部分領域を検出できるＰＣＲ用プライマーや、ハイブリダイゼーション用プローブ等を用い、定量ＰＣＲやサザンハイブリダイゼーション等で、当該領域のコピー数を調べることができる。また、当該領域の周辺のＤＮＡをプローブとしたＤＮＡアレイを用いれば、当該領域全体のコピー数が減少していることを、容易に示すことができる。
【００２０】
なお、第４番染色体上の4p16.3領域の、テロメアより約800kb-1.7Mbの領域とは、PDE6B遺伝子よりLETM1遺伝子までを含む領域であって、WHSC1遺伝子より近位の領域及びPIGG遺伝子より遠位の領域は含まない。同様に、第１６番染色体上の16q24.3領域内の、テロメアより約88.5Mb-90.0Mbの領域とは、ZNF469遺伝子よりPRDM7遺伝子までを含む領域であって、BANP遺伝子より近位の領域及びFAM157遺伝子より遠位の領域は含まない。
【００２１】
[２]２型糖尿病のＤＮＡマーカーのスクリーニング方法
本発明にかかる、２型糖尿病のＤＮＡマーカーのスクリーニング方法は、4p16.3領域内の、テロメアより約800kb-1.7Mbの領域（第１の領域）内、または16q24.3領域内の、16番染色体短腕テロメアより約88.5Mb-90.0Mbの領域（第２の領域）内に変異を有する患者に共通して生じている変異領域あるいは変異遺伝子を調べる工程を含む。これによって、ランダムな変異を有するヒトを対象にするより、効率的に２型糖尿病のＤＮＡマーカーが同定でき、当該領域内で２型糖尿病に責任のある遺伝子又は領域を絞り込むことができる可能性がある。
【００２２】
この変異の種類は、特に限定されず、点突然変異であっても、挿入または欠失突然変異であっても構わないが、当該領域内の一部の領域のコピー数減少であることが好ましい。
【００２３】
4p16.3領域内の、テロメアより約800kb-1.7Mbの領域内、または16q24.3領域内の、16番染色体短腕テロメアより約88.5Mb-90.0Mbの領域には、それぞれ少なくとも３４個及び５５個の遺伝子が存在することがわかっており、当該変異によって、それら遺伝子の中の少なくとも一つが変異していてもよい。なお、それらの遺伝子の詳細を、それぞれ表１及び表２に示す。
【００２４】
［表１］4p16.3領域内の、テロメアより約800kb-1.7Mbの領域に含まれる遺伝子(NCBI build 36.3)
2012200216.tif 000003
2012200216.tif 000004
Start, Stop, NCBIデータベースによる遺伝子塩基の開始，終了部位
Model Evidence, データベース上でのmodel evidence
【００２５】
［表２］16q24.3領域内の、16番染色体短腕テロメアより約88.5Mb-90.0Mbの領域に含まれる遺伝子(NCBI  Build37.2)
2012200216.tif 000005
2012200216.tif 000006
2012200216.tif 000007
【００２６】
さらに、上記患者を、２型糖尿病患者から選択するため、第１の領域または第２の領域にコピー数多型を有する患者と、２型糖尿病の発症との相関関係を調べる工程を含んでもよい。コピー数多型を有するヒトと、２型糖尿病の発症との相関関係を調べる方法は、特に限定されず、例えば、２型糖尿病を発症した患者において、4p16.3領域内の、テロメアより約800kb-1.7Mbの領域内、または16q24.3領域内の、16番染色体短腕テロメアより約88.5Mb-90.0Mbの領域内に変異を有するかどうか調べる。そして、いずれかの領域にコピー数減少を有する患者に共通して生じている変異領域あるいは変異遺伝子を調べ、特定する。
【実施例】
【００２７】
本実施例では、4p16.3領域内の、テロメアより約800kb-1.7Mbの領域またはその部分領域のコピー数が減少したＤＮＡ、及び16q24.3領域内の16番染色体短腕テロメアより約88.5Mb-90.0Mbの領域またはその部分領域のコピー数が減少したＤＮＡが、２型糖尿病のＤＮＡマーカーとして利用できることを示す。
【００２８】
[実施例１]
本実施例では、東北大学病院並びにその関連医療機関に通院中である東北地方在住の３５歳未満発症２型糖尿病患者群１００名、及び東北地方在住の健常者群１００名（６０歳以上）からゲノムＤＮＡを抽出し、第４番染色体短腕4p16.3領域のプローブ群を有するＤＮＡアレイ及び第１６番染色体長腕16q24.3領域のプローブ群を有するＤＮＡアレイ（deCODE-Illumina CNV370K beadchip）を使用して、DosageMiner（deCODE genetics社）を用いて結果を解析することによって、各群で、それぞれの領域におけるコピー数を比較した。以下、詳細を説明する。
【００２９】
まず、表３に解析対象者の臨床背景を示す。なお、括弧内の数値は、実施例２で行ったカスタムオリゴヌクレオチドアレイでの対象者のデータを示す。また、糖尿病の診断は1999年日本糖尿病学会発表の糖尿病診断基準（葛谷健, 中川昌一.糖尿病の分類と診断基準に関する委員会報告  糖尿病 42:385-401, 1999）に基づいて行われた。なお、２型糖尿病患者は環境因子による２型糖尿病発症の要素を可能な限り除く目的で、高度肥満歴のある患者を除外し、既往最大BMI (body mass index)値35 kg/m2未満の患者を採択した。さらに，遺伝因子の関与が強く推測される家族歴が濃厚な患者（１００名中９４名で家族歴があり、うち第１度近親に２型糖尿病罹患者を有する者が７５名含まれている）を優先して採択した。家系内で明らかな優性遺伝を示し、ＭＯＤＹが疑われる患者は含まれていない。一方、健常対照者は、過去に糖尿病の診断を受けたことのない、６０歳以上かつ第３度近親に聴取しうる限り糖尿病の家族歴がないHbA1c 6.0%未満の正常耐糖能者を採択した。この集団は２型糖尿病発症に関わる環境因子の一つである加齢が加わっても糖尿病を発症していない、遺伝的素因の希薄な正常者として設定した。
【００３０】
［表３］
2012200216.tif 000008
【００３１】
ＤＮＡの抽出は、対象者の末梢血管から採血した全血５ml中の白血球からKURABO全自動核酸抽出器NA-1000を用いて行った。そして、deCODE-Illumina CNV370K beadchip (Illumina Infinium system, deCODE Genetics, Inc., Iceland) を用いて，Infinium II Whole-Genome Genotyping Assayプロトコールに沿って全ゲノムのCNV解析を行った。コピー数の判定は、DosageMiner（deCODE genetics社）を用いて結果を解析した。
【００３２】
図１Ａ及びＢは、4p16.3領域の一部における結果を示しているが、２型糖尿病患者群１００名のうち、１３名で、4p16.3領域にコピー数減少が検出され、しかも4p16.3領域内のGap-177領域周辺に、共通してコピー数減少が見られた。一方、健常者群では、１００名のうち、１名でしか4p16.3領域にコピー数減少が検出されなかった。この差は、Fisher’s exact testでは、p=0.00128、オッズ比14.7となり、統計学的に有意であった。さらに、健常者で認められたコピー数減少領域は4p16.3領域のGap-177領域を含んでいなかった。
【００３３】
また、図２Ａ及びＢは、16q24.3領域の一部における結果を示しているが、２型糖尿病患者群１００名のうち、１５名で、16q24.3領域にコピー数減少が検出された。しかも16q24.3領域内の16番染色体短腕テロメアより約88.5Mb-90.0Mb、特に約88.5Mb-89.7Mbの領域に、共通してコピー数減少が見られた。一方、健常者群では、１００名のうち、３名でしか16q24.3領域にコピー数減少が検出されなかった。これらのデータをFisher’s exact testで解析したところ、p=0.00519、オッズ比5.70となり、２型糖尿病患者群と健常者群では、統計学的に有意な差があった。さらに、健常者で認められたコピー数減少領域は16q24領域の16番染色体短腕テロメアより約88.5Mb-90.0Mbの領域の領域を含んでいなかった。
【００３４】
[実施例２]
次に、高密度カスタムオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて、4p16.3領域の部分領域のコピー数減少を、より詳細に解析した。
【００３５】
まず、4p16.3領域の部分領域のコピー数減少を有する２型糖尿病患者１３名およびゲノムＤＮＡ上のどこかの場所にコピー数減少を有する健常者１５名から抽出したゲノムを用い、高密度カスタムオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（Agilent社）を用いて、実施例１と同様に解析を行った。
【００３６】
解析方法はarray comparative genomic hybridization (aCGH) 法を基礎とした。Agilent社website (http://earray.chem.agilent.com/earray/) のツールを用い，オリゴヌクレオチドプローブの選択、アレイデザインを行い、4p16.3のサブテロメア領域中の１．３Ｍｂの範囲（第４染色体 550,000-1,850,000［NCBI Build 36.1, hg18］）を対象としたカスタムマイクロアレイを作成した。アレイは60merサイズのオリゴヌクレオチドプローブから構成され，この領域に対するプローブは約10000個配置された (Agilent Technologies, Santa Clara, Ca)。
【００３７】
アレイによる解析はAgilent社の推奨する方法で行なった。まず、患者、対照および基準検体（NA19000，HapMap projectの日本人男性）のゲノムＤＮＡ（１サンプルあたり250ng）を制限酵素Alu I，Rsa I処理で断片化し、ULS (Universal Linkage System社)  Labeling Kit (Agilent Technologies社) を用いで、cyanine 5-dUTP（患者及び対照検体）またはcyanine 3-dUTP（基準検体）でそれぞれ蛍光標識を行った。標識した対象検体と基準検体を混合し、Cot-1DNA (Invitrogen社) とblocking agent (Agilent Technologies社)とともに前処理した。標識された断片化ゲノムＤＮＡをマイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドプローブとrotating oven (Agilent Technologies社)で６５℃、２０ｒｐｍの条件で、２４時間ハイブリダイズさせた。洗浄後、Agilent G2505Cスキャナで３μｍの解像度でアレイのスキャンを行った。スキャンされた画像はFeature Extraction Software 10.7.3.1 (Agilent Technologies社) のCGH_107_Sep09 protocolで解析し、シグナル強度を算出した。コピー数の判定に関しては，アレイより得られた蛍光強度のlog2値を移動平均法（moving window幅は８２プローブで設定）で表し、健常対照者における最大値、最小値に０．８を乗じた値から1S.D. (standard deviation) を超えた値を示した場合に異常と判断し、その連続性からコピー数の増幅や減少を判定した。
【００３８】
図３Ａ及びＢは、解析を行った1.3 Mbの領域の移動平均線 (moving average pattern)より判定された２型糖尿病１３名のコピー数減少領域を示しているが、１３名全員で、4p16.3領域のGap-177領域を含んだ、4p16.3領域内のテロメアより約800kb-1.7Mb、特に約1.0Mb-1.6Mbの領域が共通してコピー数が減少していた。一方，健常者１５名には、この領域にコピー数減少を認めた例はなかった。
【００３９】
このように、4p16.3領域の、テロメアより約800kb-1.7Mbの領域であるＤＮＡは、２型糖尿病患者では特異的にコピー数が減少しているため、２型糖尿病患者のＤＮＡマーカーとして利用できる。
【図１Ａ】
2012200216.tif 000009
【図１Ｂ】
2012200216.tif 000010
【図２Ａ】
2012200216.tif 000011
【図２Ｂ】
2012200216.tif 000012
【図３Ａ】
2012200216.tif 000013
【図３Ｂ】
2012200216.tif 000014