(57)【要約】      （修正有）【課題】プロリン残基を含有するペプチドを高純度で製造することが可能なペプチド生成酵素、その遺伝子及びペプチドの製造方法の提供。【解決手段】Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ  ＴＨ−３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４３）のプロリンアミノペプチダーゼ（ＰＡＰ  ＴＨ−３）のアミノ酸配列、およびそれと類似のアミノ酸配列を有し、プロリン誘導体とアミノ酸とを縮合させてプロリン残基を含有するペプチドを生成する活性を有するペプチド生成酵素。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列、
（Ｂ）配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、プロリン誘導体とアミノ酸とを縮合させてＮ末端にプロリン残基を有するペプチドを生成する活性を有するペプチド生成酵素。
【請求項２】
（ａ）請求項１に記載のペプチド生成酵素をコードする塩基配列、及び
（ｂ）配列表の配列番号１０のアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、プロリン誘導体とアミノ酸とを縮合させてＮ末端にプロリン残基を有するペプチドを生成する活性を有するペプチド生成酵素をコードする塩基配列、
からなる群より選択される塩基配列を有する遺伝子。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチド生成酵素の存在下で、プロリン誘導体とアミノ酸とを縮合させる工程を含む、Ｎ末端にプロリン残基を有するペプチドの製造方法。
【請求項４】
前記プロリン誘導体がプロリンエステル又はプロリンアミドである請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記プロリンエステルがベンジルエステル又はメチルエステルである請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記アミノ酸がα−アミノ酸である請求項３〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記アミノ酸がＬ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、グリシン、Ｌ−システイン、Ｌ−リジン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アルギニン、（Ｒ）−α−アリルグリシン、（Ｓ）−α−プロパギルグリシン、（Ｒ）−α−プロパギルグリシン、（Ｓ）−α−メチルロイシン、（Ｒ）−α−メチルロイシン、又は（Ｓ）−α−メチルフェニルアラニンである請求項３〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
ｐＨ９．５以上の反応液中でプロリン誘導体とアミノ酸とを縮合させる、請求項３〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド生成酵素、その遺伝子及びペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、３本のポリペプチド鎖からなる三重らせん構造を有しており、ポリペプチド鎖は、トリペプチド配列Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙを繰り返し単位とする繰り返し構造を有する。このＸ及びＹの位置のアミノ酸は、プロリン（Ｐｒｏ）及び翻訳後修飾によって生成する４−ヒドロキシプロリン（Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｈｙｐ）であることが多い。コラーゲンは、４−ヒドロキシプロリンによってその三重らせんが非常に安定化されていることから、水に不溶であり、ほとんどのプロテアーゼに対して抵抗性を有する。
【０００３】
コラーゲンの分解物であるコラーゲンペプチドは、工業及び医療の分野において、種々の有用な生物学的活性を有することが報告されており、急速にそして広範に適用されている。例えば、骨粗鬆症、胃潰瘍、変形性関節症、褥瘡及び高血圧用の薬剤、皮膚保湿剤、並びに、保存剤の用途が挙げられる。
【０００４】
近年、コラーゲンペプチドのなかでも、プロリン及び４−ヒドロキシプロリンから構成されるＰｒｏ−Ｈｙｐ等のジペプチドが上記生物学的活性に寄与していることが明らかとなり、このようなジペプチドが注目されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１０６００３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１では、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ等のジペプチドを生成する方法として、（１）コラゲナーゼ等の酵素の存在下、コラーゲン又はゼラチンを分解することによって得る方法、並びに、（２）固相合成法及び液相合成法等の化学合成法によって、アミノ酸から合成する方法が挙げられている。
【０００７】
しかしながら、上記（１）の方法では、原料であるコラーゲン又はゼラチン、並びに、反応中間体であるコラーゲンペプチド等のポリペプチドが不純物としてＰｒｏ−Ｈｙｐと共に含まれるため、Ｐｒｏ−Ｈｙｐを高純度の状態で得るためには、更に精製する工程が必要となる。上記（２）の方法では、トリフルオロ酢酸等を使用することから、生成したジペプチドを医薬品等の目的で使用することは困難な場合が多い。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、Ｎ末端にプロリン残基を有するペプチドを高純度で製造することが可能なペプチド生成酵素、その遺伝子及びペプチドの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、鋭意研究を行った結果、ある特定のアミノ酸配列を有するタンパク質が、プロリン誘導体とアミノ酸とを縮合させてＮ末端にプロリン残基を有するペプチドを生成する活性を有していることを見出し、本願発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、（Ａ）配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列、（Ｂ）配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列、及び（Ｃ）配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、プロリン誘導体とアミノ酸とを縮合させて、Ｎ末端にプロリン残基を有するペプチドを生成する活性を有するペプチド生成酵素を提供する。
【００１１】
本発明に係るペプチド生成酵素は、このようなアミノ酸配列を有することで、プロリン誘導体とアミノ酸とを縮合させることによって、Ｎ末端にプロリン残基を有するペプチドを生成することが可能となる。その結果、Ｎ末端にプロリン残基を有するペプチドを高純度の状態で提供することが可能となる。
【００１２】
本発明は、（ａ）上記ジペプチド生成酵素をコードする塩基配列、及び（ｂ）配列表の配列番号１０のアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、プロリン誘導体とアミノ酸とを縮合させてＮ末端にプロリン残基を有するペプチドを生成する活性を有するペプチド生成酵素をコードする塩基配列、からなる群より選択される塩基配列を有する遺伝子を提供する。
【００１３】
本発明は、上記ペプチド生成酵素の存在下で、プロリン誘導体とアミノ酸とを縮合させる工程を含む、Ｎ末端にプロリン残基を有するペプチドの製造方法を提供する。
【００１４】
上記プロリン誘導体は、プロリンエステル又はプロリンアミドであることが好ましい。プロリン誘導体をこのような化合物にすることで、Ｎ末端にプロリン残基を有するペプチドの収率が向上する。
【００１５】
上記プロリンエステルは、ベンジルエステル又はメチルエステルであることが好ましい。プロリンエステルをこのような化合物にすることで、Ｎ末端にプロリン残基を有するペプチドの収率が向上する。
【００１６】
上記アミノ酸は、α−アミノ酸であることが好ましい。アミノ酸をこのような化合物にすることで、Ｎ末端にプロリン残基を有するペプチドの収率が向上する。
【００１７】
上記アミノ酸は、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、グリシン、Ｌ−システイン、Ｌ−リジン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アルギニン、（Ｒ）−α−アリルグリシン、（Ｓ）−α−プロパギルグリシン、（Ｒ）−α−プロパギルグリシン、（Ｓ）−α−メチルロイシン、（Ｒ）−α−メチルロイシン、又は（Ｓ）−α−メチルフェニルアラニンであることが好ましい。アミノ酸をこのような化合物にすることで、Ｎ末端にプロリン残基を有するペプチドの収率が向上する。
【００１８】
ｐＨ９．５以上の反応液中でプロリン誘導体とアミノ酸とを縮合させることが好ましい。このようにすることで、Ｎ末端にプロリン残基を有するペプチドの収率が向上する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、Ｎ末端にプロリン残基を有するペプチドを高純度で製造することが可能なペプチド生成酵素、その遺伝子及びペプチドの製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】反応混合物を多重反応モニタリングクロマトグラフィーで分析した結果を示すグラフである。
【図２】Ｐｒｏ−Ｈｙｐジペプチドの生成反応における、（Ａ）ｐＨ依存性及び（Ｂ）緩衝水溶液の濃度の依存性を示すグラフである。
【図３】Ｐｒｏ−Ｈｙｐジペプチドの生成反応における、温度依存性を示すグラフである。
【図４】Ｐｒｏ−Ｈｙｐジペプチドの生成反応における、プロリン誘導体の影響を示すグラフである。
【図５】Ｐｒｏ−Ｈｙｐジペプチドの生成反応における、プロリン誘導体を連続して添加したときの影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書において、アミノ酸の表記を、３文字又は１文字で表記する場合がある。すなわち、アラニンは、Ａｌａ又はＡ、アルギニンは、Ａｒｇ又はＲ、アスパラギンは、Ａｓｎ又はＮ、アスパラギン酸は、Ａｓｐ又はＤ、システインは、Ｃｙｓ又はＣ、グルタミン酸は、Ｇｌｕ又はＥ、グルタミンは、Ｇｌｎ又はＱ、グリシンは、Ｇｌｙ又はＧ、ヒスチジンは、Ｈｉｓ又はＨ、イソロイシンは、Ｉｌｅ又はＩ、ロイシンは、Ｌｅｕ又はＬ、リジンは、Ｌｙｓ又はＫ、メチオニンは、Ｍｅｔ又はＭ、フェニルアラニンは、Ｐｈｅ又はＦ、プロリンは、Ｐｒｏ又はＰ、セリンは、Ｓｅｒ又はＳ、トレオニンは、Ｔｈｒ又はＴ、トリプトファンは、Ｔｒｐ又はＷ、チロシンは、Ｔｙｒ又はＹ、並びに、バリンは、Ｖａｌ又はＶを表記する。
【００２２】
本実施形態に係るペプチド生成酵素は、
（Ａ）配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列、
（Ｂ）配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、プロリン誘導体とアミノ酸とを縮合させてＮ末端にプロリン残基を有するペプチドを生成する活性を有する。
【００２３】
配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ  ＴＨ−３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４３）のプロリンアミノペプチダーゼ（ＰＡＰ  ＴＨ−３）のアミノ酸配列である。
【００２４】
上記（Ｂ）のアミノ酸配列について、配列表の配列番号１０のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸（変異されたアミノ酸）の数は、アミノ酸配列が後述するプロリン誘導体とアミノ酸とを縮合させてＮ末端にプロリン残基を有するペプチドを生成する活性（以下、単にペプチド生成活性と呼ぶ場合がある。）の測定法の条件下に同様の活性を示す範囲であればよい。アミノ酸の変異の数は、少なくとも１個、好ましくは、１個〜１１７個、より好ましくは、１個〜１２個である。変異されたアミノ酸配列は、天然に存在するアミノ酸配列、すなわち、自然発生による変異を有するアミノ酸配列であってもよく、人為的に所望の部位又はアミノ酸残基に変異を導入したアミノ酸配列であってもよい。人為的に所望の部位又はアミノ酸残基に変異を導入する場合、天然に存在する配列表の配列番号１０のアミノ酸配列の変異体に準じて人為的に変異を導入してもよい。人為的な変異の導入は、例えば、ＰＣＲ法を用いた部位特異的変異導入法等によって行われる。
【００２５】
変異されたアミノ酸配列としては、例えば、配列表の配列番号１０のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基が類似した物理学的性質を有する他のアミノ酸残基に置換（保存的置換）されたアミノ酸配列が挙げられる。保存的置換は、例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、又は立体構造上類似したアミノ酸残基同士の置換、並びに、本来のポリペプチドの生理活性を維持する程度に該ポリペプチドの立体構造や折り畳み構造が維持されるようなアミノ酸残基の置換である。より具体的には、上記（Ｂ）のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１０のアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基が、以下のアミノ酸群（１）〜（６）：
（１）グリシン及びアラニン、
（２）バリン、イソロイシン及びロイシン、
（３）アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン及びグルタミン、
（４）セリン及びスレオニン、
（５）リジン及びアルギニン、並びに
（６）フェニルアラニン及びチロシン
における、同一のアミノ酸群に属するアミノ酸残基同士の置換により他のアミノ酸と保存的置換されたものであることが好ましい。
【００２６】
上記（Ｃ）において、配列同一性は、参照配列（例えば、配列表の配列番号１０のアミノ酸配列）に対して、クエリー配列（評価対象のアミノ酸配列）を、適切にアラインメントし、算出された値である。具体的には、本実施形態においては、配列同一性は、ＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムで算出された値である。
【００２７】
本実施形態においては、配列同一性は、高いほど好ましく、具体的には、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上である。
【００２８】
本実施形態において、ペプチド生成酵素のペプチド生成活性は、任意の方法で測定され得る。例えば、プロリン誘導体とアミノ酸とを基質として、上記ペプチド生成酵素によって生成されたＮ末端にプロリン残基を有するペプチドの生成量を多重反応モニタリングクロマトグラフィー等の方法を用いて測定する方法が挙げられる。
【００２９】
本実施形態に係るペプチド生成酵素は、また、以下に詳述する本実施形態に係る遺伝子を用いて、遺伝子工学的に製造することができる。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ  ＴＨ−３株とは異なる異種細胞において、本実施形態に係るペプチド生成酵素を発現させることができる。
【００３０】
本実施形態に係るペプチド生成酵素をコードする遺伝子は、
（ａ）上記ペプチド生成酵素をコードする塩基配列、及び
（ｂ）配列表の配列番号１０のアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補鎖と、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、プロリン誘導体とアミノ酸とを縮合させてＮ末端にプロリン残基を有するペプチドを生成する活性を有するペプチド生成酵素をコードする塩基配列、
からなる群より選択される塩基配列を有する。
【００３１】
このうち（ａ）の塩基配列は、それぞれ、上記（Ａ）〜（Ｃ）のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、そして（ｂ）の塩基配列は、上記（Ａ）〜（Ｃ）のアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列であり得る。この遺伝子によってコードされるペプチド生成酵素は、ペプチド生成活性を有する。
【００３２】
上記（ｂ）の「ストリンジェントな条件」とは、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡと５０％(ｖ／ｖ)ホルムアミドとを含む溶液中、室温にて１２時間インキュベートし、更に０．５×ＳＳＣで５０℃以上の温度で洗浄する条件をいう。さらに、よりストリンジェントな条件、例えば、４５℃又は６０℃にて１２時間インキュベートすること、０．２×ＳＳＣ又は０．１×ＳＳＣで洗浄すること、洗浄に際し６０℃又は６５℃以上の温度条件で洗浄すること等の、より厳しい条件も含む。また、本実施形態においては、配列表の配列番号１０のアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列は、該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列に関して、配列表の配列番号１０のアミノ酸配列との配列同一性が、高いほど好ましい。具体的には、アミノ酸の配列同一性は８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上である。また、該塩基配列に関して、配列表の配列番号１０のアミノ酸配列をコードする塩基配列との配列同一性が、高いほど好ましい。具体的には、塩基配列の配列同一性は８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上である塩基配列との特異的なハイブリダイゼーションが達成され得る条件であることが好ましい。本実施形態においては、塩基配列の配列同一性は、ＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムで算出された値である。
【００３３】
本実施形態に係る遺伝子に基づき、本実施形態に係るペプチド生成酵素と同等のペプチド生成活性を示すアイソザイムをスクリーニングするための、プローブ及びプライマーセットも提供できる。
【００３４】
本実施形態に係る遺伝子を含むペプチド生成酵素の発現用担体を用いて、本実施形態に係る遺伝子によってコードされるペプチド生成酵素の組換えタンパク質（組換えペプチド生成酵素）を製造することもできる。本実施形態において、「発現用担体」とは、ベクター等を基本骨格として含有し、かつ適切な位置に本実施形態に係る遺伝子が作動可能に連結された核酸の構築物、並びに、金粒子、リポソーム、デキストラン、及びリン酸カルシウム等の担体に、細胞内での発現に適したエレメント等を有する本実施形態に係る遺伝子を担持させた構築物等を意味する。
【００３５】
本実施形態に係るペプチド生成酵素の発現用担体を用いて、本実施形態に係るペプチド生成酵素をコードする遺伝子をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ  ＴＨ−３株以外の細胞に導入することができ、それによって、異種細胞において本実施形態に係るペプチド生成酵素を発現させることができる。したがって、本実施形態に係るペプチド生成酵素の工業的な生産のための手段が提供される。
【００３６】
上記ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ、ｐＥＴｋｍＳ２（Mishima,  N.ら、Biotechnol.  Prog.、第13巻、864-868頁、1997年）、ｐＯＭａｌ（New  England  Biolabs）、及びｐＥＴ−２８ａ（＋）（ノバジェン社製）等の大腸菌用プラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、及びλｇｔ１１等の大腸菌用ファージベクター、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３、及びｐＰＩＣＺα（インビトロジェン株式会社）等の酵母用ベクター、ｐＩＪ４８６（Mol.  Gen.  Genet.、203巻、468-478頁、1986年）、ｐＫＣ１０６４（Gene、103巻、97-99頁、1991年）、ｐＵＷＬ−ＫＳ（Gene、165巻、149-150頁、1995年）、ｐＩＪ７０２（Katz,  E.ら、J.  Gen.  Microbiol.、129巻、2703-2714頁、1983年）、及びｐＩＪ８６００（Sun,  J.ら、Microbiology、145巻、2221-2227頁、1999年）等の放線菌用ベクター、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａ等の昆虫細胞用ベクター、ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８、及びｐＣＥＶ４等の動物細胞用ベクター等が挙げられる。このようなベクターには、適切なプロモーター（例えば、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びＳＶ４０初期プロモーター等）、選択マーカー遺伝子、ターミネーター等のエレメントを適宜有していてもよい。
【００３７】
上記ベクターは、本実施形態に係るペプチド生成酵素を、Ｈｉｓタグ等のタグ、又はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ等の可溶性のタンパク質と融合した状態で発現させ得るベクターであってもよい。
【００３８】
このようなベクターの調製に用いられる菌としては、例えば、当該技術分野で通常用いられる宿主菌が挙げられ、具体的には、放線菌、及び大腸菌が挙げられる。より具体的には、放線菌としては、ストレプトマイセス  リビダンス１３２６、及びストレプトマイセス  リビダンスＴＫ−２３等、そして大腸菌としては、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ  （ＤＥ３）、及びＪＭ１０９等が挙げられる。これらの宿主菌のうち、精製の容易化、大量調製、及び安全性等の観点から、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ  （ＤＥ３）、及びＪＭ１０９が好ましい。
【００３９】
本実施形態に係るペプチド生成酵素の発現用担体は、適切な宿主細胞へ導入されて、宿主細胞を形質転換して、形質転換細胞を作製する。形質転換法として、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、及びパーティクル銃によるボンバードメント法等、当業者に周知の方法が採用される。
【００４０】
本実施形態に係るペプチド生成酵素の発現用の宿主細胞は、好適には微生物（宿主菌）が用いられる。宿主菌としては、放線菌、大腸菌、バシラス属菌、シュードモナス属菌、サーマス属菌、アグロバクテリウム属菌、及び酵母（例えば、メタノール資化性の酵母であるＰｉｃｈｉａ）等が挙げられる。中でも、本発明においては、大腸菌が好適に用いられる。
【００４１】
宿主細胞へ上記発現用担体の導入によって得られた細胞が、目的の形質転換細胞であることは、細胞又は該細胞の培養上清について、上記ペプチド生成酵素の活性の測定法により、ペプチド生成活性が検出されることを指標として確認され得る。
【００４２】
上記形質転換細胞を培養して増殖させることによって、本実施形態に係るペプチド生成酵素を遺伝子工学的に容易に精製できる状態で発現させることができ、それによって、本実施形態に係るペプチド生成酵素を工業的に製造することができる。
【００４３】
本実施形態に係る組換えペプチド生成酵素の製造においては、培地組成、培地のｐＨ、培養温度、培養時間の他、インデューサーの使用量、及び使用時間等について、組換えペプチド生成酵素の発現の最適な条件を決定することによって、効率よく組換えペプチド生成酵素を生産させることができる。
【００４４】
本実施形態に係る形質転換細胞の培養に通常用いられる培地としては、天然培地及び合成培地のいずれを用いてもよい。液体培地又は固体培地を使用することができる。例えば、宿主菌が資化し得る炭素源、窒素源、及び無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であればよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、及びデンプン等の炭水化物、酢酸、及びプロピオン酸等の有機酸、並びに、エタノール、及びプロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、及びリン酸アンモニウム等の無機酸、若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物が挙げられる。その他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、及び各種アミノ酸等を含んでいてもよい。その他に、無機塩として、微量のカリウム、ナトリウム、及び鉄等のリン酸塩、塩酸塩、硝酸塩、並びに、酢酸塩等を含んでいてもよい。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、及びシリコン等の消泡剤を添加してもよい。市販の培地としては、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ培地(ノバジェン社製)等が挙げられる。
【００４５】
培養条件は、培地の種類、培養方法等により適宜選択すればよく、宿主細胞が増殖し、目的のタンパク質を産生できる条件であれば特に制限はない。通常、液体培地中で振とう培養又は攪拌培養等の好気的条件下で、１０℃〜４０℃、好ましくは２５℃で１２時間〜１２０時間行われる。ｐＨは、４〜１０、好ましくは６〜８に調節される。ｐＨの調整は、無機酸又は有機酸、並びに、アルカリ溶液等を用いて行う。
【００４６】
形質転換細胞が産生する組換えペプチド生成酵素は、それが細胞内に産生されるときは細胞内の他のタンパク質、又は他のポリペプチド等が共存するが、これらは発現されるペプチド生成酵素の量に比べて微量にすぎないため、その精製は極めて容易であるという優れた利点がある。また、ベクターとして菌体外分泌型のベクターを用いた場合、ペプチド生成酵素が菌体外に分泌される。
【００４７】
形質転換細胞の培養物からペプチド生成酵素を精製するには通常の方法が用いられる。形質転換細胞が大腸菌のように細胞内にペプチド生成酵素が蓄積する場合には、培養終了後、遠心分離によって形質転換細胞を集め、得られた細胞を超音波処理等によって破砕した後、遠心分離等によって無細胞抽出液を得る。これを出発材料とし、塩析法、並びに、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー等の一般的なタンパク質精製法によって精製することができる。用いる形質転換細胞によっては、発現した組換えタンパク質が細胞外に分泌される場合がある。このような場合、培養上清から同様に精製を行えばよい。
【００４８】
以下、本実施形態に係るペプチド生成酵素を用いた、Ｎ末端にプロリン残基を有するペプチドの製造方法について説明する。本実施形態に係る製造方法は、本実施形態に係るペプチド生成酵素の存在下で、プロリン誘導体とアミノ酸とを縮合させる工程を含む。
【００４９】
プロリン誘導体としては、プロリンエステル又はプロリンアミドであることが好ましい。プロリンエステルとしては、例えば、ベンジルエステル、メチルエステル等が挙げられる。特にベンジルエステル及びメチルエステルが好ましい。プロリン誘導体をこのような化合物とすることで、Ｎ末端にプロリン残基を有するペプチドの収率が向上する。
【００５０】
アミノ酸は、α−アミノ酸であることが好ましく、炭素数２〜１０のα−アミノ酸であることがより好ましく、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、グリシン、Ｌ−システイン、Ｌ−リジン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アルギニン、（Ｒ）−α−アリルグリシン、（Ｓ）−α−プロパギルグリシン、（Ｒ）−α−プロパギルグリシン、（Ｓ）−α−メチルロイシン、（Ｒ）−α−メチルロイシン、又は（Ｓ）−α−メチルフェニルアラニンであることがさらに好ましい。アミノ酸をこのような化合物とすることで、Ｎ末端にプロリン残基を有するペプチドの収率が向上する。
【００５１】
ｐＨ９．５以上の反応液中でプロリン誘導体とアミノ酸とを縮合させることが好ましく、ｐＨ１０．５以上の反応液中でプロリン誘導体とアミノ酸とを縮合させることがより好ましい。ｐＨが９．５未満の場合、酵素のペプチド生成活性が低下する傾向がある。ｐＨの上限は特に設けないが、取り扱い性の観点からｐＨ１２未満が好ましい。
【００５２】
上記反応液は、酵素を失活させなければどの様な溶媒でも用いることが可能であるが、通常は緩衝水溶液が好ましく、ホウ酸緩衝水溶液がより好ましい。緩衝水溶液の濃度は特に制限はないが、終濃度で、８０ｍＭ〜１２８０ｍＭが好ましく、４８０ｍＭ〜６４０ｍＭがより好ましい。
【００５３】
上記プロリン誘導体とアミノ酸とを縮合させる工程は、反応時間が０．５時間〜３時間であることが好ましく、１．５時間〜３時間であることがより好ましい。
【００５４】
反応時間が１時間未満の場合、反応温度は、４℃〜３７℃が好ましく、２５℃〜３７℃がより好ましく、２５℃が特に好ましい。一方反応時間が２時間を超える場合、反応温度は、４℃〜３７℃が好ましく、４℃がより好ましい。
【００５５】
本実施形態に係る製造方法によって製造されたペプチドは、高純度の状態で得ることが可能である。また、得られたペプチドの純度をさらに上げるため、塩析法、並びに、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー等の一般的なタンパク質精製法により精製してもよい。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は、実施例により限定されるものではない。特に明記しない限り、各種操作は、モレキュラークローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル（Molecular  Cloning  A  Laboratory  Manual）第２版（ザンブルーク（Sambrook,  J）ら、1989年）に従って行った。なお、実施例において、％は、特に明記しない限り、ｗ／ｖ％を表す。
【００５７】
（ＰＡＰ遺伝子のクローニング）
ストレプトマイセス  サーモグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｒｉｓｅｕｓ）  ＮＢＲＣ１００７７２株からゲノムＤＮＡを、Hopwoodらの方法（D.A.  Hopwoodら、A  Laboratory  Manual,  The  John  Ines  Foundation，Norwich，1985年，70-84頁）を用いて調製した。次に、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  （ｇｅｎｅ  ＩＤ：  ＳＣＯ５１２２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  （ｇｅｎｅ  ＩＤ：  ＳＡＶ３１４４）及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ  （ｇｅｎｅ  ＩＤ：  ＳＧＲ２４０７）由来のＰＡＰの一次配列から縮重ＰＣＲプライマー（フォワードプライマー：５’−ＣＡＧＷＳＳＴＴＣＧＧＳＧＧＳＴＴＣＴＧＣ−３’（配列番号１３）及びリバースプライマー：５’−ＡＣＧＴＡＣＡＴＧＴＣＧＴＣＧＴＧＧＴＡ−３’（配列番号１４））を設計した。上記ゲノムＤＮＡを鋳型鎖とし、上記縮重ＰＣＲプライマーセット及び、ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝ホールディングス株式会社製）を用いて、ＰＣＲ法によってＮＢＲＣ１００７７２株由来のＰＡＰ（ＰＡＰ１０）のゲノムＤＮＡの内部配列を増幅した。ＰＣＲは、９４℃にて１分のインキュベーションの後、９４℃にて３０秒、６０℃にて３０秒、７２℃にて９０秒を３０サイクル行い、次いで７２℃にて５分のインキュベーションで行った。ＰＣＲ産物と、上記ＰＣＲプライマーを用いてＰＡＰ１０をコードする遺伝子（ｐａｐ１０遺伝子）の部分内部配列を決定した。得られた部分内部配列を基に、ｐａｐ１０遺伝子の全長を得るためのＰＣＲプライマー（センスプライマー：５’−ＡＣＣＧＡＣＴＧＧＣＧＧＣＣＣＣＴＧＴＡＣＧＡＣ−３’（配列番号１５）及びアンチセンスプライマー：５’−ＧＡＣＣＴＴＧＣＧＣＴＣＧＡＴＧＣＧＣＧＧＧＴＡ−３’（配列番号１６））を設計した。一方、上記ゲノムＤＮＡを制限酵素ＣｐｏＩ（３７℃、一晩）で消化し、消化ＤＮＡを自己ライゲートさせた。ライゲーション産物を上述したｐａｐ１０遺伝子の部分内部配列から設計したプライマーセット（配列番号１５及び配列番号１６）を用いてＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲ産物をクローニングして塩基配列を決定した。ＰＡＰ１４（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｕｔｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｆｕｓｃｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＮＢＲＣ１４２７０株由来のＰＡＰ）の遺伝子（ｐａｐ１４遺伝子）及びＰＡＰ  ＴＨ−３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ  ＴＨ−３株由来のＰＡＰ）の遺伝子（ｐａｐ  ｔｈ−３遺伝子）の全長塩基配列も同様の方法で取得した。配列表の配列番号との対応を表１に示す。
【００５８】
【表１】
2012147742.tif 000002
【００５９】
（組換えＰＡＰ発現ベクターの構築）
大腸菌を宿主とする場合のＰＡＰを発現するためのベクター（組換えＰＡＰ発現ベクター）を以下のようにして構築した。まず、各遺伝子に対応するＮｄｅＩ部位を含むセンスプライマーと停止コドンの下流にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマーとのセット及びＰｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ（登録商標）  ＧＸＬ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ  (タカラバイオ社製)を用いてＰＣＲ法により各ＰＡＰ遺伝子を、増幅した。各ＰＡＰ遺伝子に対応するプライマーセットは、表２に示した。得られたＤＮＡフラグメントを、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキット（インビトロジェン社製）を用いてクローニングして塩基配列を決定した。ＰＡＰをコードするＤＮＡフラグメントをＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素で切断し、そしてｐＥＴ−２８ａ（＋）（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩギャップに連結し、Ｎ末端側にＨｉｓタグを有する組換えＰＡＰ発現ベクターを得た。
【００６０】
【表２】
2012147742.tif 000003
【００６１】
（組換えＰＡＰの発現及び精製）
上述のようにして得られた組換えＰＡＰの発現ベクターを、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅＸｃｅｌｌ（登録商標）（バイオラッド社製）を用いて、それぞれ大腸菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ  （ＤＥ３）（アジレント  テクノロジー株式会社製）に導入して形質転換した。形質転換体の単一コロニーを、５０ｍｌのＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ培地(ノバジェン社製)中で、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ  １(ノバジェン社製)を用いて培養した。２５℃、１８０ｒｐｍの条件で４８時間培養した後、遠心分離によって培養液から菌体を回収した。得られた菌体は、Ｅｌｅｓｔｉｎ  ＮＰ０３５ＳＰ（ネッパジーン社製、商品名）を用いて超音波破砕した。破砕条件は、出力最大、５分間超音波破砕した後に１分間のインターバルを開けて、トータルで４５分間超音波破砕するように設定した。得られた無細胞抽出液から、コバルトアフィニティ樹脂（クロンテック社製、商品名ＴＡＬＯＮ（登録商標））を用いて組換えＰＡＰを精製した。精製して得られた各ＰＡＰは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件、クマシーブルー染色）で解析した。各ＰＡＰの濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｒｅａｇｅｎｔ（バイオラッド社製）を用いて定量した。
【００６２】
（プロリン残基を加水分解する活性（プロリン残基加水分解活性）の評価）
水３２０μｌ、２００ｍＭ緩衝水溶液（ＰＡＰ１４の場合、リン酸緩衝水溶液  ｐＨ７；ＰＡＰ１０の場合、リン酸緩衝水溶液  ｐＨ７．５；ＰＡＰ  ＴＨ−３の場合、トリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝水溶液（トリス緩衝水溶液）  ｐＨ８）３２０μｌ、Ｌ−プロリン−ｐ−ニトロアニリド（ＳＩＧＭＡ社製、Ｐｒｏ−ｐＮＡ）のジメチルスルホキシド（ナカライテスク社製、ＤＭＳＯ）溶液（０．０６２５ｍＭ〜８．０ｍＭ）８０μｌの混合液を用意し、そこに２０μｌのＰＡＰ水溶液を加えて３７℃で反応させた。加水分解反応によって遊離したｐＮＡに起因する４０５ｎｍの吸光度の変化を分光光度計（日立製作所製、商品名Ｕ２８００）で１分間モニターした。４０５ｎｍにおける吸光度のプロファイル（ε４０５ｎｍ＝１０６００Ｍ−１ｃｍ−１）を基に、上記加水分解反応における速度論的なパラメーターを求めた。結果を表３に示す。なお、酵素活性（プロリン残基加水分解活性）の１ユニット（Ｕ）は、各反応条件において、１分間に１μｍｏｌのｐＮＡを遊離させるのに必要な酵素量として定義した。
【００６３】
【表３】
2012147742.tif 000004
【００６４】
（ＰＡＰの生化学的性質の評価）
ＰＡＰの組成は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００カラム（ＧＥ  ヘルスケア社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによって評価した。プロリン残基加水分解活性の至適ｐＨは、終濃度８０ｍＭのリン酸緩衝水溶液（ｐＨ  ６．０〜８．０）又はトリス緩衝水溶液（ｐＨ  ７．５〜９．０）を用いて決定した。またプロリン残基加水分解活性の至適温度は、３５．０℃〜６５．０℃の間で決定した。熱安定性は、酵素を至適ｐＨで４０．０℃〜８０．０℃の間で３０分間インキュベートした後の残存するプロリン加水分解活性と、酵素を４℃で保存した時のプロリン残基加水分解活性とを比較することで決定した。ｐＨ安定性は、酵素をｐＨ６〜１０．５で、３０℃で３０分間インキュベートした後の残存するプロリン残基加水分解活性と、至適ｐＨにおけるプロリン残基加水分解活性とを比較することで決定した。結果を表４に示す。
【００６５】
【表４】
2012147742.tif 000005
【００６６】
表３及び表４の結果から、ＰＡＰ１４、ＰＡＰ１０及びＰＡＰ  ＴＨ−３のプロリン残基加水分解活性、及び生化学的性質に大きな差は認められないことが明らかとなった。
【００６７】
（Ｐｒｏ−Ｈｙｐジペプチドを生成する活性（ペプチド生成活性）の評価）
以下に示す手順にしたがって、Ｐｒｏ−Ｈｙｐジペプチドの生成反応を行った。４００ｍＭホウ酸緩衝水溶液（ｐＨ１１．０）４０μｌ中に、アシル供与体（プロリン誘導体）として、１ＭのＬ−プロリンベンジル塩酸塩（Ｂａｃｈｅｍ社製、Ｐｒｏ−ＯＢｚｌ）のＤＭＳＯ溶液を５μｌ、アシル受容体（アミノ酸）として、２ＭのＬ−ヒドロキシプロリン（和光純薬工業株式会社製、Ｈｙｐ−Ｈ）の水溶液を５０μｌ、及び７２０ｍＵのＰＡＰを含む、酵素溶液を５μｌそれぞれ加えて、９００ｒｐｍ、３７℃で３時間反応させた。その後、２００μｌのメタノールを反応液に加えることで、反応を終了させた。反応液を１００００ｒｐｍで遠心した後、得られた上精を３３倍希釈した溶液２．５μｌを用いて液体クロマトグラフィー／マススペクトル（ＬＣ／ＭＳ）分析を行った。
【００６８】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析は、ＴＵＶ検出器、バイナリーソルベントマネージャー、及びＡＰＩ２０００  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ社製）を備えたＡＣＱＵＩＴＹ（登録商標）ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）システム（ウォーターズ社製）を用いて行った。カラムは、ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）アミドカラム（３．５μｍ、２．１×５０ｍｍ、ウォーターズ社製）を用いた。移動層は、（Ａ）液として、水（０．１％ギ酸）、（Ｂ）液としてアセトニトリル（０．１％ギ酸）を用いた。グラジェントプロファイルは、以下のように設定した、流速  ０．３ｍｌ／ｍｉｎ、０〜２分  ２％（Ａ）液、２〜１３．５分  ２〜３０％（Ａ）液。Ｐｒｏ−Ｈｙｐと基質を含む反応混合液を検出するため、イオンクロマトグラフィーから溶出した時に現れる各ピークエリアをＡＰＩ２０００のデバイスシステム（マルチリアクションモニターモード（ＭＲＭ））によって計算した。Ｐｒｏ−ＯＢｚｌ、Ｐｒｏ−ＮＨ２、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、及びＨｙｐ−Ｈの各フラグメンテーションのパターンは、それぞれ、ｍ／ｚ＝２０６．２／９１．０、１１４．７／７０、２２９．０／１３１．９及び１３２．１／８６．０であった。
【００６９】
ペプチド生成酵素としてＰＡＰ  ＴＨ−３（実施例１）を、プロリン誘導体としてＰｒｏ−ＯＢｚｌ、及びアミノ酸としてＨｙｐ−Ｈを用いて、上記反応手順によって得られた反応混合物を、多重反応モニタリングクロマトグラフィーで分析した結果を図１に示す。Ｐｒｏ−Ｈｙｐを示すピークが保持時間８分のところに現れていることから、ＰＡＰ  ＴＨ−３のペプチド生成活性によってＰｒｏ−ＯＢｚｌ及びＨｙｐ−Ｈから、Ｐｒｏ−Ｈｙｐが合成されたことが明らかとなった。また、Ｐｒｏ−Ｈｙｐを示すピーク以外には、過剰に用いたＨｙｐ−Ｈのピーク（保持時間９．７分）しかみられなかったことから、高純度のＰｒｏ−Ｈｙｐを得ることが可能な反応であることが分かった。同様の実験をＰＡＰ１４（比較例１）及びＰＡＰ１０（比較例２）でも行ったが、Ｐｒｏ−Ｈｙｐは検出できなかった（不図示）。以下、ＰＡＰ  ＴＨ−３のペプチド生成活性を詳細に検討した。
【００７０】
（ペプチド生成活性のｐＨ依存性及び緩衝水溶液濃度依存性）
図２は、Ｐｒｏ−Ｈｙｐジペプチドの生成反応における、（Ａ）ｐＨ依存性及び（Ｂ）緩衝水溶液の濃度の依存性を示すグラフである。（Ａ）ｐＨを９．５〜１２．０の範囲で変化させたこと又は、（Ｂ）ホウ酸緩衝水溶液の濃度を８０ｍＭ〜１２８０ｍＭの範囲で変化させたこと以外は、上記（Ｐｒｏ−Ｈｙｐジペプチド生成活性の評価）の手順に従って収率を求めた。ｐＨ９．５から収率が上昇し始め、ｐＨ１０．５〜１２．０の範囲において、約９％になることが明らかとなった（図２（Ａ））。またｐＨ１１．０において、ホウ酸濃度４８０ｍＭで収率が約１７％になることが明らかとなった（図２（Ｂ））。
【００７１】
（ペプチド生成活性の温度依存性）
図３は、Ｐｒｏ−Ｈｙｐジペプチドの生成反応における、温度依存性を示すグラフである。緩衝水溶液を１２００ｍＭのホウ酸緩衝水溶液（ｐＨ  １１．０）にして、反応温度と反応時間を変化させたこと以外は、上記（Ｐｒｏ−Ｈｙｐジペプチド生成活性の評価）の手順に従って収率を求めた。反応温度３７℃においては、反応時間３０分で収率が最大となり、その後徐々に収率は減少した。反応温度２５℃においては、反応時間３０分で収率が最大となり、その後収率は、減少した。反応温度４℃においては、反応時間の増加に伴い収率も徐々に上昇し、反応時間３時間で収率２５％を示した。
【００７２】
（ペプチド生成活性のプロリン誘導体の影響）
図４は、Ｐｒｏ−Ｈｙｐジペプチドの生成反応における、プロリン誘導体の影響を示すグラフである。プロリン誘導体を変えたこと、反応温度を４℃にしたこと以外は、上記（ペプチド生成活性の温度依存性）の手順に従って収率を求めた。プロリン誘導体としては、Ｐｒｏ−ＯＢｚｌの他に、Ｌ−プロリンメチル塩酸塩（ＡＬＤＲＩＣＨＩ社製、Ｐｒｏ−ＯＭｅ）及び、Ｌ−プロリンアミド塩酸塩（ＳＩＧＭＡ社製、Ｐｒｏ−ＮＨ２）を用いた。いずれの反応時間においても、Ｐｒｏ−ＮＨ２、Ｐｒｏ−ＯＭｅ、Ｐｒｏ−ＯＢｚｌの順に収率が高いことが明らかになった。
【００７３】
（Ｐｒｏ−Ｈｙｐジペプチドの生成反応における、プロリン誘導体を連続して添加したときの影響）
Ｐｒｏ−Ｈｙｐジペプチドの生成反応における、プロリン誘導体を連続して添加したときの影響を調べた。まず、１２００ｍＭホウ酸緩衝水溶液（ｐＨ１１．０）４０μｌ中に、プロリン誘導体として、１ＭのＰｒｏ−ＮＨ２のＤＭＳＯ溶液を５μｌ、アミノ酸として、２ＭのＨｙｐ−Ｈの水溶液を５０μｌ、及び７２０ｍＵのＰＡＰ  ＴＨ−３を含む酵素溶液を５μｌを、それぞれ加えて、９００ｒｐｍ、４℃で反応させた。上記反応混合物に、５０ｍＭのＰｒｏ−ＮＨ２、２００ｍＭのＰｒｏ−ＮＨ２、若しくは１ＭのＰｒｏ−ＮＨ２のＤＭＳＯ溶液を５μｌ、又は、１ＭのＰｒｏ−ＮＨ２のＤＭＳＯ溶液を５μｌと７２０ｍＵのＰＡＰ  ＴＨ−３溶液を１．６μｌとの混合液を終容量１００μｌとなるように調整して、３０分おきに加えた。結果を図５に示す。いずれの場合もプロリン誘導体を添加するたびに、Ｐｒｏ−Ｈｙｐの収量は、増加した。特に、Ｐｒｏ−ＮＨ２とＰＡＰ  ＴＨ−３を同時に加えたとき収量がもっとも増加しており、５０ｍＭ  Ｐｒｏ−ＮＨ２を添加したときと比べて、反応時間２時間の時点で２．３倍であった。
【００７４】
（アミノ酸の検討）
Ｈｙｐ−Ｈの他にも、アシル受容体として有効なアミノ酸があるのかどうかを式（１）〜式（９）で表わされる天然アミノ酸及び、式（１０）〜式（１８）で表わされる非天然アミノ酸について検討した。
【００７５】
【化１】
2012147742.tif 000006
【００７６】
【化２】
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【００７７】
まず、１２００ｍＭホウ酸緩衝水溶液（ｐＨ１１．０）４０μｌ中に、プロリン誘導体として、１ＭのＰｒｏ−ＮＨ２のＤＭＳＯ溶液を５μｌ、アミノ酸として、上記式（１）〜式（１８）で表される化合物の水溶液を、５０μｌ、及び７２０ｍＵのＰＡＰ  ＴＨ−３を含む酵素溶液を５μｌそれぞれ加えて、４℃で３時間反応させた。なお、アミノ酸は、終濃度が下記表５に示す濃度となるように加えた。反応混合物を液体クロマトグラフィー／マススペクトル（ＬＣ／ＭＳ）分析することで、反応生成物を検出した。結果を表５に示す。
【００７８】
【表５】
2012147742.tif 000008
【００７９】
表５に示される結果から、ＰＡＰ  ＴＨ−３のペプチド生成活性は、基質として用いるアミノ酸として、天然アミノ酸のみならず、非天然アミノ酸でも有効であることが明らかになった。さらに、式（１１）と式（１２）の化合物、及び式（１３）と式（１４）の化合物は、互いに光学異性体の関係にあることから、ＰＡＰ  ＴＨ−３のペプチド生成活性は、基質となるアミノ酸の光学活性に依存しないことが明らかになった。
【００８０】
（参考例１）
（Ｃ末端の１２アミノ酸残基が欠損したＰＡＰ  ＴＨ−３の発現ベクターの構築）
大腸菌を宿主とする場合の、Ｃ末端の１２アミノ酸残基が欠損したＰＡＰ  ＴＨ−３を発現するためのベクター（組換えＣ末端１２アミノ酸残基欠損ＰＡＰ  ＴＨ−３発現ベクター）を以下のようにして構築した。まず、ＰＡＰ  ＴＨ−３遺伝子に対応するＮｄｅＩ部位を含むセンスプライマー：５’−ＣＡＴＡＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧ−３’（配列番号１７）と停止コドンの下流にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマー：５’−ＡＡＧＣＴＴＡＧＧＣＣＡＴＣＴＴＧＡＴＣＡＧＣＣＧＧＴＣ−３’（配列番号１８）及びＰｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ（登録商標）  ＧＸＬ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ  (タカラバイオ社製)を用いてＰＣＲ法によりＣ末端の１２アミノ酸残基が欠損したＰＡＰ  ＴＨ−３をコードする遺伝子を増幅した。得られたＤＮＡフラグメントを、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキット（インビトロジェン社製）を用いてクローニングして塩基配列を決定した。ＰＡＰをコードするＤＮＡフラグメントをＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素で切断し、そしてｐＥＴ−２８ａ（＋）（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩギャップに連結し、Ｎ末端側にＨｉｓタグを有する組換えＣ末端１２アミノ酸残基欠損ＰＡＰ  ＴＨ−３発現ベクターを得た。
【００８１】
（組換えＣ末端１２アミノ酸残基欠損ＰＡＰ  ＴＨ−３の発現及び精製）
上記（組換えＰＡＰの発現及び精製）に記載の方法と同様の方法で発現及び精製を行った。
【００８２】
（ペプチド生成活性の評価）
上記（Ｐｒｏ−Ｈｙｐジペプチドを生成する活性（ペプチド生成活性）の評価）に記載の方法と同様の方法で組換えＣ末端１２アミノ酸残基欠損ＰＡＰ  ＴＨ−３のペプチド生成活性評価を行い、Ｐｒｏ−Ｈｙｐジペプチドの生成を確認することができた。
【００８３】
（参考例２）
（ＰＡＰ１０とＰＡＰ  ＴＨ−３とのキメラＰＡＰ遺伝子のクローニング及びそのキメラＰＡＰ発現ベクターの構築）
まず、ＰＡＰ  ＴＨ−３遺伝子にＮｓｂＩ部位を導入するため、センスプライマー：５’−ＧＧＴＧＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＧＣＡＣＧＴＧＧＡＴＣＡＣＣＡＡ−３’（配列番号１９）とアンチセンスプライマー：５’−ＴＴＧＧＴＧＡＴＣＣＡＣＧＴＧＣＧＣＡＧＧＣＣＧＣＧＣＡＣＣ−３’（配列番号２０）及びクイックチェンジキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を用いて、ＰＡＰ  ＴＨ−３遺伝子にＮｓｂＩ部位が導入された遺伝子を増幅した。得られたＤＮＡフラグメントは、ＰＡＰ  ＴＨ−３遺伝子にＮｓｂＩ部位が導入されていることを確認した。
【００８４】
ＰＡＰ  ＴＨ−３遺伝子にＮｓｂＩ部位が導入されたＤＮＡフラグメントをＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素で切断し、そしてｐＥＴ−２８ａ（＋）（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩギャップに連結した。得られたプラスミドを、ＮｓｂＩ及びＣｌａＩで切断した。一方、ＰＡＰ−１０遺伝子が挿入されているプラスミドを、ＮｓｂＩ及びＣｌａＩの制限酵素で切断してＰＡＰ１０遺伝子のフラグメントを得た。得られたＰＡＰ１０遺伝子のフラグメントを、上述のＰＡＰ  ＴＨ−３遺伝子が挿入されたｐＥＴ−２８ａ（＋）のＮｓｂＩ−ＣｌａＩギャップに挿入して、ＰＡＰ−１０とＰＡＰ  ＴＨ−３とのキメラＰＡＰ遺伝子（配列番号２１）の発現ベクターを得た。このキメラＰＡＰは、ＰＡＰ  ＴＨ−３のＮ末側４０２個のアミノ酸残基がＰＡＰ１０のものに置き換わっている。また、このキメラＰＡＰは、ＰＡＰ  ＴＨ−３と比較して、１１７アミノ酸残基が異なっていることが確認された。
【００８５】
（ＰＡＰ−１０とＰＡＰ  ＴＨ−３とのキメラＰＡＰの発現及び精製）
上記（組換えＰＡＰの発現及び精製）に記載の方法と同様の方法で発現及び精製を行った。
【００８６】
（ペプチド生成活性の評価）
上記（Ｐｒｏ−Ｈｙｐジペプチドを生成する活性（ペプチド生成活性）の評価）に記載の方法と同様の方法で組換えＰＡＰ−１０とＰＡＰ  ＴＨ−３とのキメラＰＡＰのペプチド生成活性評価を行い、Ｐｒｏ−Ｈｙｐジペプチドの生成を確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明のタンパク質（ペプチド生成酵素）は、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ等のＮ末端にプロリン残基を有するペプチドを、高純度で製造することができるため、工業及び医療の分野において応用が可能である。例えば、骨粗鬆症、胃潰瘍、変形性関節症、褥瘡及び高血圧用の薬剤、皮膚保湿剤、並びに、保存剤の用途が挙げられる。
【受託番号】
【００８８】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ  ＴＨ−３として命名及び表示される微生物は、受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４３（寄託日：２００７年８月１７日）として、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に寄託されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2012147742.tif 000011
【図４】
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【図５】
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【配列表】
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