(57)【要約】      （修正有）【課題】非アルコール性脂肪性肝炎の予防および／または治療に有用な組成物を提供する。【解決手段】式（Ｉ）：2012031101.tif 000007で示される化合物を含有する組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式（Ｉ）：
【化１】
2012031101.tif 000006
で示される３”Ｏ−メチルエピガロカテキンガレートおよび／または３”Ｏ−メチルガロカテキンガレートを含有する、非アルコール性脂肪性肝炎の治療および／または予防用組成物。
【請求項２】
３”Ｏ−メチルエピガロカテキンガレートを含有する、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
３”Ｏ−メチルエピガロカテキンガレートおよび／または３”Ｏ−メチルガロカテキンガレートを成人男性に１日当たり２０〜１５００ｍｇ投与されるよう含有する、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
非アルコール性脂肪性肝炎の予防のためのものである、請求項１〜３いずれかに記載の組成物。
【請求項５】
飲料である、請求項１〜４いずれかに記載の組成物。
【請求項６】
医薬品である、請求項１〜４いずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎の予防および／または治療に有用な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ、以下、ＮＡＦＬＤと称する）は、我が国の疾患治療において最も頻繁に遭遇する肝疾患の一つである。食生活の欧米化とともにその罹患率が増加しており、その治療薬の提供は重要な社会的課題である。ＮＡＦＬＤの原因としては、食生活の異常、肥満、糖尿病や高脂血症などの生活習慣病への罹患が挙げられる。
【０００３】
非アルコール性脂肪性肝炎（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ、以下、ＮＡＳＨと称する）は、アルコール過剰摂取を起因としないが、アルコール性肝障害に類似した進展を示す症例である。一般人の約１〜２％、ＮＡＦＬＤ患者の約１０％がＮＡＳＨである。ＮＡＳＨは脂肪肝に肝臓の炎症、壊死と肝線維化を来す病態であり、肝硬変、肝細胞癌にまで進展する。ＮＡＳＨの原因としては、食生活の異常、肥満、糖尿病や高脂血症などの生活習慣病が挙げられるが、発症機序は不明である。脂肪肝に加え、肝臓に何らかのストレスがかかることによって発生するのではないかと考えられている。
【０００４】
現在、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨを指摘された患者は食生活の改善や運動療法といった治療が主体となり、その他まだ、有効な治療法が確立されてはいない。これまで米国を中心にＮＡＳＨを含むＮＡＦＬＤの薬物療法に関して多くの臨床治験が報告されているにも関わらず、これらの疾患に対する有効な薬物療法は依然確立されていない。
【０００５】
緑茶の水抽出物には複数のポリフェノール類が含まれ、これらはカテキン類として知られている。緑茶に含まれる代表的な茶カテキンはエピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、およびエピガロカテキンガレートがある。これらのカテキン類は血圧上昇抑制作用、血中コレステロール調節作用、血糖値調節作用、抗酸化作用、老化抑制作用、抗突然変異作用、抗癌作用、抗菌作用、抗う蝕作用および抗アレルギー作用等の生理活性を有していることが知られている。
【０００６】
カテキン類の肝障害への作用については、本発明者を含むグループはカテキン類が非アルコール性脂肪性肝疾患に有用であること（特許文献１）を報告している。これは緑茶カテキンの投与により、非アルコール性脂肪性肝疾患患者の肝脂肪沈着を抑制し、その結果肝障害が改善されることを示唆するものである。また、特許文献２はカテキン類を含む緑茶抽出物とカフェインを含む飲料が肝機能改善に有用であることを開示するものである。特許文献２ではカテキン類とカフェインを含む飲料を肝機能が正常範囲を超える対象に１２ヶ月飲用させたところ、血中のＧＰＴ、ＧＯＴおよびγ−ＧＰＴの数値が改善されることを示す。
【０００７】
ところでエピガロカテキンガレートの３”位置がＯ−メチル化された３”Ｏ−メチルエピガロカテキンガレート（以下「３”メチル化ＥＧＣＧ」）は一般的に日本で栽培されている品種の茶にはほとんど含まれておらず、「べにふうき」などの中国、台湾系統のアッサム雑種の特定の品種の茶葉にのみ含有されている。特許文献１および２において用いた緑茶カテキンには３”メチル化ＥＧＣＧは含まれていない。
【０００８】
最近になって３”メチル化ＥＧＣＧに抗アレルギー作用があることが見出されている（特許文献３および４）。また、３”メチル化ＥＧＣＧが抗腫瘍作用を有することについても、本発明者等のグループが報告している（特許文献５）。
【０００９】
メチル化部位を特定しないメチル化エピガロカテキンガレート（メチル化ＥＧＣＧ）が脂肪蓄積抑制作用を有することが特許文献６（特開平２００６−２９８７９２）に報告されている。特許文献６ではインビトロでメチル化ＥＧＣＧと共に培養した培養脂肪細胞において中性脂肪の蓄積が抑制されること、およびその作用がメチル化ＥＧＣＧを含有しない他の茶葉抽出物より高いことを開示する。
【００１０】
上記のとおり、カテキン類には肝疾患改善作用を有することが知られているが、この作用は肝臓に蓄積した脂肪を除去することに付随するものと考えられている。また３”メチル化ＥＧＣＧにはインビトロでの脂肪蓄積抑制作用が報告されているが、その肝臓への作用についての報告は無い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００７−１８２４０５号公報
【特許文献２】特開２００６−１８２７３７号公報
【特許文献３】特開２０００−１５９６７０号公報
【特許文献４】特開２００７−１２６３７３号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ２００９／１０７２６２号公報
【特許文献６】特開２００６−２９８７９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は非アルコール性脂肪性肝炎の予防および／または治療のための組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は下式（Ｉ）：
【化１】
2012031101.tif 000002
で示される３”Ｏ−メチルエピガロカテキンガレート（３”メチル化ＥＧＣＧ）および／または３”Ｏ−メチルガロカテキンガレート（３”メチル化ＧＣＧ）を含有する、非アルコール性脂肪性肝炎の予防および／または治療剤を提供する。
【００１４】
本発明の組成物は、非アルコール性脂肪性肝炎の治療、予防に好適に用いられる。本発明の組成物は、医薬品として提供されてもよいし、または飲料を含む健康食品として提供されてもよい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の組成物は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウスにおいて、脂肪蓄積への作用は乏しいにも拘らず、一方で肝臓に対する抗酸化作用並びに抗炎症作用を惹起し、インスリン感受性を回復させることが確認された。よって本発明の組成物は、非アルコール性脂肪性肝疾患、特に非アルコール性脂肪性肝炎を効果的に治療および／または予防することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＮＡＳＨモデルマウスへ１０週間本発明の組成物またはその他の組成物を投与した後の肝体重比を示す
【図２Ａ】ＮＡＳＨモデルマウスへ１０週間本発明の組成物またはその他の組成物を投与した後の肝脂肪化の観察結果を示す。図２Ａ〜Ｆにおいて左より通常飲料水群、高濃度メチル化カテキン投与群、低濃度メチル化カテキン投与群および通常カテキン投与群の結果を示す。＊ｐ＜０．０５、通常対飲料水投与群。
【図２Ｂ】ＮＡＳＨモデルマウスへ１０週間本発明の組成物またはその他の組成物を投与した後の炎症細胞浸潤観察結果を示す。
【図２Ｃ】ＮＡＳＨモデルマウスへ１０週間本発明の組成物またはその他の組成物を投与した後の風船化肝細胞観察結果を示す。
【図２Ｄ】ＮＡＳＨモデルマウスへ１０週間本発明の組成物またはその他の組成物を投与した後の肝臓におけるマロリーデング小体の存在の観察結果を示す。
【図２Ｅ】ＮＡＳＨモデルマウスへ１０週間本発明の組成物またはその他の組成物を投与した後の肝臓における脂肪肉芽腫の存在の観察結果を示す。
【図２Ｆ】ＮＡＳＨモデルマウスへ１０週間本発明の組成物またはその他の組成物を投与した後の肝臓における肝細胞周囲線維化の観察結果を示す。
【図３】ＮＡＳＨモデルマウスへ１０週間本発明の組成物またはその他の組成物を投与した後の肝臓における酸化ストレスの評価結果を示す。
【図４Ａ】ＮＡＳＨモデルマウスへ１０週間本発明の組成物またはその他の組成物を投与した後の肝臓におけるインスリンシグナル系並びにＴＮＦαシグナル系タンパク質の発現を調べた結果を示す。
【図４Ｂ】ＮＡＳＨモデルマウスへ１０週間本発明の組成物またはその他の組成物を投与した後の肝臓におけるインスリンシグナル系並びにＴＮＦαシグナル系タンパク質の発現を調べた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明において用いられる３”メチル化ＥＧＣＧおよび３”メチル化ＧＣＧは、化学合成によって調製しても、天然物から抽出してもよい。３”メチル化ＥＧＣＧおよび／または３”メチル化ＧＣＧを含有する天然物としては、ダージリン系雑種であるべにふうき、べにほまれ、べにふじ、やえほ、するがわせ、ゆたかみどり、かなやみどり、おくむさし、青心大パン、青心ウーロン、大葉ウーロン、紅花、べにひかり、やまかい、やまみどり、からべに、香駿、そうふう、および、おくみどり、などの品種の茶葉が知られている。茶葉より３”メチル化ＥＧＣＧおよび／または３”メチル化ＧＥＧを抽出する場合は、水または湯で抽出しても、その他公知のいずれの方法にて抽出してもよい。３”メチル化ＥＧＣＧおよび／または３”メチル化ＧＣＧが含有されていれば抽出物の純度は低くてもよく、または該茶葉そのもの、もしくは茶葉を乾燥、粉砕したものを用いても良い。その他本発明において用いられる３”メチル化ＥＧＣＧおよび／または３”メチル化ＧＣＧは特開２００７−３０６８０６記載の方法等、公知のいずれの方法を用いて調製されたものであってもよい。なお、本明細書において３”メチル化ＥＧＣＧと３”メチル化ＧＣＧを特に区別せずに称する場合に「メチル化カテキン」と記載する。
本発明の組成物としては、特に３”メチル化ＥＧＣＧを含有するものが好ましい。
【００１８】
本願の組成物の剤形としては、経口投与あるいは非経口投与（静脈内、皮内、腹腔内投与等）等の投与経路や投与目的に応じて錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、注射剤、軟膏、坐剤など適当な剤形とすればよい。
【００１９】
本発明の組成物には適当な添加剤を含有させてもよい。添加剤としては特に限定されず賦形剤、希釈剤、増量剤、溶剤、潤滑剤、補助剤、結合剤、崩壊剤、被覆剤、カプセル化剤、乳化剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、抗酸化剤、矯味剤、芳香剤、着色剤など、製剤学に関する一般書籍に記載されているものから必要に応じて適宜選択すればよい。
【００２０】
本発明の組成物には、本発明の目的に反しない限り他の有効成分を含有させてもよい。また、本発明の組成物は、３”メチル化ＥＧＣＧおよび／または３”メチル化ＧＣＧ以外の他のカテキン類、例えば茶抽出物としてこれらのメチル化カテキンと同時に抽出されるカテキン類を含有させてもよい。
【００２１】
本発明の組成物はまた、健康食品として提供されてもよいし、飲食物に配合するための粉、塊、液状等の製剤として提供されてもよい。飲食物としては、式Ｉの化合物を含有する飲料、例えば茶飲料が例示される。
【００２２】
本発明の組成物は、ＮＡＳＨ患者に投与するのみならず、他の生活習慣病に既に罹患している、あるいはその可能性が高いと考えられるＮＡＳＨへの罹患の可能性が高い患者においてＮＡＳＨ予防のために用いてもよい。
【００２３】
本発明の組成物の投与量は対象者の年齢、性別、体重、症状、投与経路等によって適宜決定すればよく、特に限定されない。成人男性（体重約５０キログラム）のＮＡＳＨ予防または治療のために経口投与する場合の非限定的投与量としては、メチル化カテキンを１日２０〜１５００ｍｇ、好ましくは３０〜１０００ｍｇ、特に１００〜２００ｍｇ程度が例示される。本発明に用いられるメチル化カテキンには明らかな毒性は認められておらず、多量に摂取しても健康上の問題が生じることはないと考えられる。
【実施例】
【００２４】
汎用されているＮＡＳＨモデルマウスを用いた。生後７週目雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにメチオニン・コリン（Ｍ／Ｃ）欠乏飼料（和光純薬工業株式会社、日本国大阪市）を摂取させＮＡＳＨモデルを作製した。
１８週目以降、動物を４群に分け、それぞれの飲料水をメチル化カテキン、または通常のカテキンを含有するものに変更した。アサヒ飲料株式会社提供のリョクチャエキスパウダーを用いた。下記に示すＮｏ．１〜３いずれかのリョクチャエキスパウダー１．５２８ｍｇが５ｍｌの飲料水に含まれるように飲料水を調製した。
なお、５ｍｌは体重２０ｇのマウス６匹が１日に摂取するであろう飲料水の量に匹敵する。各リョクチャエキスパウダーの量は、低濃度メチル化カテキン投与群においてはマウス１匹が１日につき０．００６８ｍｇのメチル化カテキンが投与される量であり、体重５０ｋｇのヒトに換算するとその投与量は１７ｍｇ／日となる量である。また、高濃度メチル化カテキン投与群では、マウス１匹につき０．０６ｍｇ／日、体重５０ｋｇのヒト換算で１５０ｍｇ／日のメチル化カテキンが投与される量である。
【００２５】
【表１】
2012031101.tif 000003
【００２６】
各群は１）飲料水対照群（通常飲料水）、２）高濃度メチル化カテキン投与群（Ｎｏ．２のリョクチャエキスパウダー添加飲料水）、３）低濃度メチル化カテキン投与群（Ｎｏ．１のリョクチャエキスパウダー添加飲料水）、４）通常カテキン投与群（Ｎｏ．３のリョクチャエキスパウダー添加飲料水）である。各群それぞれ６匹とした。試験期間中、各動物には飲料水並びにＭ／Ｃ欠乏飼料を自由に摂取させた。
【００２７】
２８週目に殺戮し、肝臓を取り出した。１）肝体重比の算出、２）肝組織学的評価、３）抗8-hydro-2'-deoxyguanosine（8OhdG）抗体を用いた免疫組織化学による酸化ストレスの評価、４）ＴＮＦαシグナル系タンパク質発現並びにインスリンシグナル系タンパク質の発現を調べた。
【００２８】
１）肝体重比
２８週目の殺戮前に各動物の体重を測定した。その後肝臓を取り出し、その重さを測定して肝体重比を算出した。結果を図１に示す。
肝体重比は４つの群間で有意差は認められなかった。
【００２９】
２）肝組織学的評価
取り出した肝臓の切片を作成し、顕微鏡下で細胞形態を観察した。観察結果を下記表に示すグレードに分けて判定した：
【表２】
2012031101.tif 000004
【００３０】
結果を図２Ａ〜Ｆに示す。図２Ａより明らかなように、全ての群で肝脂肪化、即ち肝細胞への脂肪沈着が認められ、その程度には群間で差が無かった。このことは、従来の先行文献に示された、メチル化カテキンの脂肪肝への投与により、肝脂肪が低下する事実に反するが、これは、一旦沈着した脂肪を除去する効果が発揮される期間より短い期間において、評価したため、或いは、肝脂肪除去乃至は減少させるには不十分である少量の投与量であったと推測される。
【００３１】
一方で、炎症細胞浸潤、風船化肝細胞、マクロリーディング小体、脂肪肉芽腫、肝細胞周囲線維化についてはいずれも飲料水対照群で上昇した値が高濃度メチル化カテキン投与群では飲料水対照群および通常カテキン投与群に比して有意に低値を示した。即ち、肝臓に蓄積した脂肪を除去することなく、肝臓の炎症所見が改善されている。これにより、従来文献において示唆されている、３”メチル化ＥＧＣＧが沈着した脂肪を除去し、脂肪が除去されることにより肝機能が回復するということとは異なり、肝脂肪を除去あるいは低減させずに、肝機能を回復させるという、これまで提唱された作用機作とは異なる作用機差にてＮＡＳＨの治療に有用であることが見出された。
【００３２】
３）酸化ストレス評価
抗8-hydro-2’-deoxyguanosine(8OhdG)抗体を用いた免疫組織染色による酸化ストレスの評価を行った。８ＯＨｄＧはＤＮＡ中のグアニン塩基が酸化損傷を受けて生成する物質であり、細胞内におけるその存在は酸化ストレスに相関する。
得られた肝臓切片に対して一次抗体としてマウス由来ＨＯＨｄＧモノクローナル抗体（日本老化制御研究所、袋井市）を、二次抗体としてビオチン化二次抗体（ABCkitblue-labeled bottle)を用いて常法に従い免疫染色した。その後、ヘマトキシリン核染色し、顕微鏡下で8ＯＨｄＧの存在を観察した。観察結果を下記グレードに基づき判定した：
【００３３】
【表３】
2012031101.tif 000005
結果を図３に示す。
【００３４】
図３から明らかなように高濃度メチル化カテキン投与群の肝細胞内の8OhdG発現は他の投与群と比較して明らかに減少しており、高濃度メチル化カテキンの投与により酸化ストレスが抑制されることがわかる。
【００３５】
４）インスリンシグナル系並びにTNFαシグナル系タンパク質発現の観察
２８週目に取り出した肝臓をホモジェナイザーにより組織を破壊し、タンパク質を抽出した。インスリンシグナル系（抗ＩＲＳ−１およびｐＩＲＳ−１抗体）、およびＴＮＦαシグナル系（抗ＡＫＴ、ｐＡＫＴ、ＴＮＦ−α、ＮＦ−ｋβ、ｐＮＦ−ｋβ、β−ａｃｔｉｎの各抗体）（各１ｍｇ／ｍｌ）を用いて常法に従いウェスタンブロット解析を行い、各タンパク質の発現を調べた。結果を図４に示す。
【００３６】
図４より明らかなように、高濃度メチル化カテキン投与群においては、ＩＲＳ−１およびｐ（リン酸化）ＩＲＳ−１の発現が顕著に高かった。これにより、ＮＡＳＨモデルマウスにおいて減少しているインスリン感受性がメチル化カテキンの投与により回復したことがわかる。一方で、ｐＡＫＴ、ＮＦκβ、ｐＮＦκβの発現は明らかに減少しており、またＴＮＦαも減少傾向が認められた。これらの炎症性メディエーターの発現が減少していることにより、メチル化カテキンにはＮＡＳＨモデルマウス肝臓において抗炎症作用を惹起していることがわかる。
【００３７】
上記結果より、本願発明の組成物は、従来考えられていたカテキン類による肝蓄積脂肪の除去による肝疾患の改善とは全く別の作用機作、即ち抗炎症作用並びに酸化ストレス抑制作用により肝機能を改善することがわかる。
【図１】
2012031101.tif 000008
【図２Ａ】
2012031101.tif 000009
【図２Ｂ】
2012031101.tif 000010
【図２Ｃ】
2012031101.tif 000011
【図２Ｄ】
2012031101.tif 000012
【図２Ｅ】
2012031101.tif 000013
【図２Ｆ】
2012031101.tif 000014
【図３】
2012031101.tif 000015
【図４Ａ】
2012031101.tif 000016
【図４Ｂ】
2012031101.tif 000017