(57)【要約】【課題】安全性の高い天然抽出物及び／又は天然抽出物由来成分を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害剤及び線維芽細胞増殖促進剤を提供する。【解決手段】マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害剤又は線維芽細胞増殖促進剤の有効成分として、ガリカローズ（学名：Rosa gallica）の花部及び／又は蕾部からの抽出物を含有させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガリカローズ（Rosa gallica）の花部及び／又は蕾部からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害剤。
【請求項２】
ガリカローズ（Rosa gallica）の花部及び／又は蕾部からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする線維芽細胞増殖促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＭＰ−１活性阻害剤及び線維芽細胞増殖促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の表皮及び真皮は、表皮細胞、線維芽細胞及びこれらの細胞の外にあって皮膚構造を支持するエラスチン、コラーゲン等の細胞外マトリックスにより構成されている。若い皮膚においては線維芽細胞の増殖は活発であり、線維芽細胞、コラーゲン等の皮膚組織の相互作用が恒常性を保つことにより水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。
【０００３】
ところが、紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、細胞外マトリックスの主要構成成分であるエラスチンが分解・変質し、また、コラーゲンの産生量が減少するとともに架橋による弾力性低下を引き起こす。その結果、皮膚の保湿機能や弾力性が低下し、角質の異常剥離が生じるため、肌は張りや艶を失い、肌荒れ、シワ等の老化症状を呈するようになる。このように、皮膚の老化に伴う変化、すなわち、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等には、コラーゲン、エラスチン等の真皮マトリックス成分の減少・変性等が関与している。
【０００４】
近年、皮膚の老化に伴う変化を誘導する因子として、マトリックスメタロプロテアーゼＭＭＰｓ；Matrix metalloproteinases）の関与が指摘されている。このＭＭＰｓの中でも、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）は、皮膚の真皮細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンを分解する酵素として知られているが、その発現は紫外線の照射により大きく増加し、コラーゲンの減少・変性の一因となり、皮膚のシワの形成、弾力性の低下等の大きな要因となると考えられている。したがって、ＭＭＰ−１の活性を阻害することは、皮膚の老化症状を予防・改善する上で重要である。
【０００５】
このようなＭＭＰ−１活性阻害作用を有するものとしては、例えば、ヒマラヤザクラからの抽出物（特許文献１参照）、ショウガ科ジンギバーカッサムナー又はクワ科フィカスネリフォリアからの抽出物（特許文献２参照）等が知られている。
【０００６】
また、加齢に伴う皮膚老化の一因として、線維芽細胞の増殖の低下が挙げられている。すなわち、紫外線、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、線維芽細胞の増殖が遅くなり皮膚の保湿機能や弾力性が低下する。そして、皮膚は張りや艶を失い、荒れ、シワ等の老化症状を呈するようになる。そのため、線維芽細胞の増殖を促進することにより皮膚の老化を予防又は改善することができると考えられる。
【０００７】
このような考えに基づき、線維芽細胞増殖促進作用を有するものとして、クスノハガシワ抽出物（特許文献３参照）等が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−１７６２３２号公報
【特許文献２】特開２００３−１７６２３０号公報
【特許文献３】特開２００３−１４６８３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、安全性の高い天然抽出物及び／又は天然抽出物由来成分を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害剤及び線維芽細胞増殖促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害剤又は線維芽細胞増殖促進剤は、ガリカローズの花部及び／又は蕾部からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、天然物であるガリカローズの花部及び／又は蕾部からの抽出物を有効成分として含有し、安全性の高いマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害剤及び線維芽細胞増殖促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態について説明する。
本発明の実施形態に係るマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害剤又は線維芽細胞増殖促進剤は、ガリカローズの花部及び／又は蕾部からの抽出物を有効成分として含有する。
【００１３】
ここで、「ガリカローズの花部及び／又は蕾部からの抽出物」には、ガリカローズの花部及び／又は蕾部を抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１４】
本実施形態において使用する抽出原料である植物は、ガリカローズ（学名：Rosa gallica）である。ガリカローズは、古くからヨーロッパや中近東等で栽培されている落葉低木であり、これらの地域から容易に入手することができる。
【００１５】
抽出原料として使用する部位は、花部及び／又は蕾部である。ここで、「花」とは、一般に、種子植物の有性生殖にかかわる器官の総体をいい、葉の変形である花葉と茎の変形である花軸とから構成され、花葉には、萼、花弁、雄しべ、心皮等の器官が含まれる。また、「蕾」とは、前記「花」と同様の器官等から構成されるが、萼又は花弁等が開いていない、いわゆる未開花の状態のものをいう。本実施形態において抽出原料として使用する「花部」及び「蕾部」には、種子植物の有性生殖にかかわる器官の総体の他、その一部、例えば、花葉、花被（萼と花冠）、花冠、花弁等も含まれる。
【００１６】
ガリカローズの花部及び／又は蕾部からの抽出物に含まれるマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用又は線維芽細胞増殖促進作用を有する物質の詳細は不明であるが、植物の抽出に一般に用いられている抽出方法によって、ガリカローズの花部及び／又は蕾部からマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用又は線維芽細胞増殖促進作用を有する抽出物を得ることができる。
【００１７】
例えば、抽出原料を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００１８】
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用するのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００１９】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本実施形態において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００２０】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００２１】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０容量部を混合することが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０容量部を混合することが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して多価アルコール１０〜９０容量部を混合することが好ましい。
【００２２】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。
【００２３】
精製は、例えば、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等により行うことができる。得られた抽出液はそのままでもマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害剤又は線維芽細胞増殖促進剤の有効成分として使用することができるが、濃縮液又は乾燥物としたものの方が使用しやすい。
【００２４】
また、ガリカローズの花部及び／又は蕾部からの抽出物は特有の匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、本実施形態に係るマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害剤又は線維芽細胞増殖促進剤は、皮膚化粧料又は飲食品に配合する場合には大量に配合するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。
【００２５】
以上のようにして得られるガリカローズの花部及び／又は蕾部からの抽出物は、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用又は線維芽細胞増殖促進作用を有しているため、それらの作用を利用してマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害剤又は線維芽細胞増殖促進剤の有効成分として用いることができる。
【００２６】
本実施形態のマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害剤又は線維芽細胞増殖促進剤は、ガリカローズの花部及び／又は蕾部からの抽出物のみからなるものであってもよいし、ガリカローズの花部及び／又は蕾部からの抽出物を製剤化したものであってもよい。
【００２７】
ガリカローズの花部及び／又は蕾部からの抽出物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯臭剤等を用いることができる。ガリカローズの花部及び／又は蕾部からの抽出物を製剤化したマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害剤又は線維芽細胞増殖促進剤の形態としては、例えば、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等が挙げられる。また、ガリカローズの花部及び／又は蕾部からの抽出物は、他の組成物（例えば，皮膚化粧料，飲食品等）に配合して使用することができる。
【００２８】
なお、本実施形態のマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害剤又は線維芽細胞増殖促進剤は、必要に応じて、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用又は線維芽細胞増殖促進作用を有する天然抽出物等を、ガリカローズの花部及び／又は蕾部からの抽出物とともに配合して有効成分として用いることができる。
【００２９】
本実施形態のマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害剤又は線維芽細胞増殖促進剤の投与方法としては、一般に経皮投与、経口投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。
【００３０】
また、本実施形態のマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害剤又は線維芽細胞増殖促進剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００３１】
本実施形態のマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害剤は、上で述べたような抗老化の用途に用いることができる。さらに、細胞外マトリックスの破壊が病態と関連していることが知られている疾患等の治療・予防の用途にも使用することが可能である。このような用途として、癌の浸潤・転移を予防又は抑制することによる癌治療、関節リュウマチ、変形性膝関節症、歯周炎、糖尿病網膜症、加齢黄斑変性症等の治療等が挙げられる。なお、本実施形態のマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害剤の用途はこれらに限定されず、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３２】
本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤は、上記したように抗老化の用途に用いることができる。また、線維芽細胞は、外傷や火傷等の創傷の治癒過程において重要な役割を果たしているほか、皮膚疾患（例えば，褥瘡，熱傷潰瘍，糖尿病性潰瘍等の皮膚潰瘍）の治癒過程にも重要である。さらに、再生医療の分野において、自己治癒が困難な創傷（重度の熱傷等）を負った患者の治療法として、患者自身の皮膚断片から皮膚細胞を培養・増殖させ、これを患者に移植する方法が知られているが、細胞増殖促進剤の使用により皮膚細胞の培養期間短縮が期待される。そのため、本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤は、創傷治療や皮膚疾患の治療、さらには再生医療分野への応用等の用途にも使用することができる。なお、本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤の用途はこれらに限定されず、線維芽細胞増殖促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３３】
なお、本実施形態のマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害剤又は線維芽細胞増殖促進剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００３４】
以下、試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
なお、本試験例においては、試料として、ガリカローズの花部及び蕾部からの抽出物であるローズバッツエキスパウダー（丸善製薬社製，試料１）を使用した。
【００３５】
〔試験例１〕ＭＭＰ−１活性阻害作用試験
ガリカローズの花部及び蕾部からの抽出物（試料１）について、以下のようにしてＭＭＰ−１活性阻害作用を試験した。
【００３６】
蓋付試験管にて２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウムを含有する０．１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解した試料溶液（試料１，試料濃度は下記表１を参照）５０μＬ、ＭＭＰ−１溶液（COLLAGENASE Type IV from Clostridium histolyticum，Sigma社製）５０μＬ及びPz-peptide溶液（Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-OH，BACHEM Feinchemikalien AG社製）４００μＬを混合し、３７℃にて３０分反応させた後、２５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸溶液１ｍＬを加え反応を停止した。
【００３７】
その後、酢酸エチル５ｍＬを加え、激しく振とうした。これを遠心（１６００×ｇ，１０分）し、酢酸エチル層の波長３２０ｎｍにおける吸光度を測定した。また、同様にして空試験を行い補正した。得られた結果から、下記式によりＭＭＰ−１活性阻害率（％）を算出するとともに、ＭＭＰ−１の活性を５０％阻害する試料濃度ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。
【００３８】
ＭＭＰ−１活性阻害率(％)={１−(Ｃ−Ｄ)／(Ａ−Ｂ)}×１００
式中、Ａは「試料無添加、酵素添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｂは「試料無添加、酵素無添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｃは「試料添加、酵素添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｄは、「試料添加、酵素無添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度」を表す。
結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
2012031102.tif 000002
【００４０】
表１に示すように、ガリカローズの花部及び蕾部抽出物は、優れたＭＭＰ−１活性阻害作用を有することが確認された。また、ＭＭＰ−１活性阻害作用の程度は、ガリカローズの花部及び蕾部抽出物の濃度によって調節できることが確認された。
【００４１】
〔試験例２〕皮膚線維芽細胞増殖促進作用試験
ガリカローズの花部及び蕾部抽出物（試料１）について、以下のようにして皮膚線維芽細胞増殖促進作用を試験した。
【００４２】
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を７．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように５％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭで希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【００４３】
培養終了後、５％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭで溶解した試料溶液（試料１，試料濃度は下記表２を参照）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、３日間培養した。線維芽細胞増殖作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。
【００４４】
培養終了後、各ウェルから１００μＬずつ培地を抜き、終濃度５ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ緩衝液に溶解したＭＴＴを各ウェルに２０μＬずつ添加した。４．５時間培養した後に、１０％ＳＤＳを溶解した０．０１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、一晩培養した後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。また、同様の方法で空試験を行い補正した。得られた結果から、下記の式により線維芽細胞増殖促進率（％）を算出した。
【００４５】
線維芽細胞増殖促進率(％)＝(Ｓｔ−Ｓｂ)／(Ｃｔ−Ｃｂ)×１００
式中、Ｓｔは「試料を添加した細胞での吸光度」を表し、Ｓｂは「試料を添加した空試験の吸光度」を表し、Ｃｔは「試料を添加しない細胞での吸光度」を表し、Ｃｂは「試料を添加しない空試験の吸光度」を表す。
結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
2012031102.tif 000003
【００４７】
表２に示すように、ガリカローズの花部及び蕾部抽出物は、優れた線維芽細胞増殖促進作用を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害剤及び線維芽細胞増殖促進剤は、皮膚の老化症状の予防・改善に大きく貢献することができる。