(57)【要約】      （修正有）【課題】ポリフェノール成分、例えば、松樹皮、ピーナッツ渋皮、ブドウ種子、小豆等の水抽出物を利用した乳酸菌発酵物及びその製造方法を提供すること。【解決手段】乳酸菌発酵物は、例えば、小豆の水抽出物をラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）により乳酸発酵させて得られる。小豆の水抽出物としては、例えば製餡過程において小豆を水で煮る時に得られる煮汁が用いられる。本発明に係る乳酸菌発酵物は未発酵物に比べて抗ＳＡＲＳ（Sub-Acute Respiratory Syndrome）コロナウイルス活性が３倍以上向上する。上記乳酸菌発酵物は、例えば、飲料、アイス、焼き菓子、アメ、ガム、デザート等の食品の添加原料、錠剤、注射剤、予防・治療用鼻溶液組成物、ドロップス、うがい液、洗口液等の添加原料として広く利用することができる。【選択図】図１
2012136436.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリフェノール成分をラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）により乳酸発酵させて得られることを特徴とする、抗ウイルス活性の向上した乳酸菌発酵物。
【請求項２】
ポリフェノール成分が松樹皮、ピーナッツ渋皮、ブドウ種子、ブドウ果皮、小豆、赤米、ササゲおよび金時豆から選ばれる１種または２種以上の原料の水抽出物である、請求項１記載の乳酸菌発酵物。
【請求項３】
ポリフェノール成分が小豆の水抽出物である、請求項１記載の乳酸菌発酵物。
【請求項４】
小豆の水抽出物が小豆の煮汁である、請求項３記載の乳酸菌発酵物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか記載の乳酸菌発酵物を含有する食品、医薬品または化粧品。
【請求項６】
小豆の水抽出物をラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）により乳酸発酵させることを特徴とする、抗ウイルス活性の向上した乳酸菌発酵物の製造方法。
【請求項７】
小豆の水抽出物が小豆の煮汁である、請求項６記載の乳酸菌発酵物の製造方法。
【請求項８】
小豆の水抽出物をラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）により乳酸発酵させることを特徴とする、小豆の水抽出物の抗ウイルス活性の向上方法。
【請求項９】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、パピローマウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、疣贅ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ノーウォークウイルス、ロタウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、ノロウイルス、コイヘルペスウイルス、イリドウイルス、ラブドウイルス群、またはホワイトスポットウイルスのいずれかに対し抗ウイルス活性を示すことを特徴とする、請求項８記載の小豆の水抽出物の抗ウイルス活性の向上方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリフェノール成分、例えば、松樹皮、ピーナッツ渋皮、ブドウ種子、小豆等の水抽出物の乳酸菌発酵物が強い抗ウイルス活性をもつことを示すこと、及びその製造方法に関し、特に乳酸菌としてラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）を用いて乳酸発酵させたる点に特徴を有するものである。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス疾患に対する対策は、ワクチンによる予防が最大の策であるが、ワクチン開発の困難なウイルス性疾患も多く、また、発病後に有効な抗ウイルス剤は非常に限られている。昨今、社会的な問題となっている新型鳥インフルエンザウイルスの治療薬タミフルに対する耐性ウイルスの出現など、新興、再興するウイルス疾患に対する予防、治療対策が急務とされている。
【０００３】
従来から、プロアントシアニジンを有効成分とする抗ＳＡＲＳウイルス剤が提案されている（特許文献１，２参照。）。また、このようなプロアントシアニジンを抽出するための植物体として、ブドウ、クランベリー、カカオ、リンゴ、小豆、柿、キャベツ、大麦、麦芽、クルミ、アーモンド、杉、桧、松、栃、樫、乾姜（カンキョウ）、茗荷（ミョウガ）、葉生姜（ハショウガ）等が開示されている（特許文献１の段落００１３参照）。
【０００４】
上記植物体のうち、小豆は、日本で、縄文時代から古墳時代前期までの遺跡から小豆の炭化種子が発見されており、奈良時代初期の「古事記」に初めてその名が登場する農作物である。小豆は古来から人々の生活と密接に結びついた豆で、わが国や中国、朝鮮では小豆の赤色に魔除けなどの神秘的な力があると信じられ、行事や儀式などに供されてきた。また、薬用としても使われたようで、中国の明時代の書物中にも、小豆の効能や処方が記されている。
【０００５】
小豆の効能は古来より二日酔い解消、利尿作用など種々知られているが、その中でも小豆の色素であるアントシアン、その前駆体であるプロアントシアニジンは小豆ポリフェノール（抗酸化物質）として近年注目を浴びている素材である。また、この小豆ポリフェノールは製品である餡にも含まれているが、製餡過程の中で廃棄される煮汁の中に多く含まれることが知られている。
【０００６】
そこで、本発明者らは、産業廃棄物として廃棄される小豆煮汁から付加価値のある食品素材を開発することを目指した。
【０００７】
ここで、豆類の煮汁の食品素材への利用技術としては、大豆煮汁を果汁や野菜汁等と混合し、この混合物を乳酸菌により乳酸発酵させたものを飲食品として利用する技術が開示されている（特許文献３参照）。特許文献３では、大豆煮汁を基質とした場合、種々の乳酸菌が発酵能を有すること、及び発酵液に適度な酸味を付与できる点でラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）を選定したことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−３１４３１６号公報
【特許文献２】特開２００８−１４３８４０号公報
【特許文献３】特開２００５−３０４３２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、本発明者らの検討によれば、小豆煮汁に対して発酵能を有する乳酸菌は極めて限定されたものであることが明らかになった。
【００１０】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、その主たる目的は、ポリフェノール成分、例えば、松樹皮、ピーナッツ渋皮、ブドウ種子、小豆等の水抽出物を利用した乳酸菌発酵物及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、数多くの乳酸菌のうち、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）のみが小豆煮汁等に対して発酵能を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
〔１〕  ポリフェノール成分をラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）により乳酸発酵させて得られることを特徴とする、抗ウイルス活性の向上した乳酸菌発酵物、
〔２〕  ポリフェノール成分が松樹皮、ピーナッツ渋皮、ブドウ種子、ブドウ果皮、小豆、赤米、ササゲおよび金時豆から選ばれる１種または２種以上の原料の水抽出物である、前記〔１〕記載の乳酸菌発酵物、
〔３〕  ポリフェノール成分が小豆の水抽出物である、前記〔１〕記載の乳酸菌発酵物、
〔４〕  小豆の水抽出物が小豆の煮汁である、前記〔３〕記載の乳酸菌発酵物、
〔５〕  前記〔１〕〜〔４〕のいずれか記載の乳酸菌発酵物を含有する食品、医薬品または化粧品、
〔６〕  小豆の水抽出物をラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）により乳酸発酵させることを特徴とする、抗ウイルス活性の向上した乳酸菌発酵物の製造方法、
〔７〕  小豆の水抽出物が小豆の煮汁である、前記〔６〕記載の乳酸菌発酵物の製造方法、
〔８〕  小豆の水抽出物をラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）により乳酸発酵させることを特徴とする、小豆の水抽出物の抗ウイルス活性の向上方法、
〔９〕  ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、パピローマウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、疣贅ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ノーウォークウイルス、ロタウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、ノロウイルス、コイヘルペスウイルス、イリドウイルス、ラブドウイルス群、またはホワイトスポットウイルスのいずれかに対し抗ウイルス活性を示すことを特徴とする、前記〔８〕記載の小豆の水抽出物の抗ウイルス活性の向上方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ポリフェノール成分、例えば、松樹皮、ピーナッツ渋皮、ブドウ種子、ブドウ果皮、小豆、赤米、ササゲ、金時豆等の水抽出物を利用した乳酸菌発酵物及びその製造方法が提供される。本発明に係る乳酸菌発酵物は未発酵物と比べて抗ウイルス活性が３倍以上向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（１）は小豆煮汁発酵濃縮液と小豆煮汁濃縮液のＴＬＣ、（２）は（１）の各画分についての抗ウイルス活性（ＩＣ５０値）を示す。
【図２】Ｖｅｒｏ細胞の増殖、生存、代謝に及ぼす小豆煮汁濃縮液の影響を示した図（左側：ＣＢＢ染色，右側：免疫ブロット）である。
【図３】Ｖｅｒｏ細胞の増殖、生存、代謝に及ぼす小豆煮汁発酵濃縮液の影響を示した図（左側：ＣＢＢ染色，右側：免疫ブロット）である。
【図４】各種原料煮汁の発酵濃縮液のＴＬＣ。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の乳酸菌発酵物は、上述したとおり、ポリフェノール成分をラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）により乳酸発酵させて得られる点に特徴がある。
【００１６】
本発明で使用し得るポリフェノール成分とは、原料植物の水抽出物中に含まれるポリフェノール成分または原料植物の水抽出物そのもののうち、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）による乳酸発酵が可能で、かつ当該乳酸菌発酵物の抗ウイルス活性が向上する性質を備えたものをいう。上記ポリフェノール成分の形態は液状、粉体状のどちらでもよく、原料植物から当該ポリフェノール成分を調製してもよいし、市販品を用いてもよい。本発明に使用し得る原料植物としては、例えば、小豆、松樹皮、ピーナッツ渋皮、ブドウ種子、ブドウ果皮、赤米、ササゲ、金時豆等が挙げられる。ポリフェノール成分としては、上記植物のうち１種の水抽出物を用いてもよいし、２種以上の水抽出物を混合して用いてもよい。
【００１７】
ポリフェノール成分のうち小豆の水抽出物とは、水に浸した小豆から抽出される成分をいい、抽出時の温度は室温でもそれ以上の高温でもかまわない。例えば、製餡過程において、小豆を水で煮る時に得られる煮汁（「渋切り汁」や「蒸煮汁」ともいう）を挙げることができる。上記した小豆煮汁は製餡過程で廃棄処分されるものであり、含有成分として小豆プロアントシアニジンを含む。小豆煮汁の糖度も特に限定されないが、通常は１．５±０．５°程度のものが使用される。また、小豆の品種は特に限定されず、例えばエリモショウズなどを挙げることができる。
【００１８】
本発明で使用し得る乳酸菌は、上記した原料植物の水抽出物に対して発酵能を有する菌種に限定される。本発明者らは、乳酸菌として、Lactobacillus plantarum（ラクトバチルス・プランタラム）、Lactobacillus brevis（ラクトバチルス・ブレビス）、Lactobacillus delbrueckii ss delbrueckii（ラクトバチルス・デルブレッキィー・サブスピシーズ・デルブレッキィー）、Streptococcus themophilus（ストレプトコッカス・サーモフィルス）、Lactobacillus casei（ラクトバチルス・カゼイ）、Pediococcus pentosaceus（ペディオコッカス・ペントサセウス）、Lactobacillus acidophilus（ラクトバチルス・アシドフィルス）、Bifidobacteria bifidum（ビフィドバクテリア・ビフィダム）、、Lactobacillus delbrueckii ss bulgaricus（ラクトバチルス・デルブレッキィー・サブスピシーズ・ブルガリクス）、Lactococcus lactis（ラクトコッカス・ラクチス）を選択して小豆の水抽出物に接種したところ、Lactobacillus plantarum（ラクトバチルス・プランタラム）が唯一発酵能を有することを確認した。
【００１９】
乳酸菌発酵物の製造にあたっては、例えば、小豆の水抽出物を加熱殺菌し、次いで冷却した後、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）を接種する。具体的には、小豆の水抽出物を８５〜１４０℃で加熱殺菌し、２５〜４５℃まで冷却したもの１００重量部に対して、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）を１〜１０重量部接種する。乳酸菌を接種した後は、２５〜４５℃で１０〜４０時間発酵させることが好ましい。
【００２０】
本発明に係る乳酸菌発酵物は未発酵物に比べて抗ウイルス活性が向上する。本発明者らの検討によれば、乳酸菌発酵物は未発酵物と比べて、抽出成分中に低分子化されたポリフェノール成分の含有量が増加しており、このことが抗ウイルス活性の向上に寄与したものと推測される。したがって、本発明は上記した原料植物の水抽出物の抗ウイルス活性の向上方法をも開示する。
【００２１】
上記乳酸菌発酵物が示す抗ウイルス活性はウイルス種に対して非特異的であり、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、パピローマウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、疣贅ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ノーウォークウイルス、ロタウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、ノロウイルス、コイヘルペスウイルス、イリドウイルス、ラブドウイルス群、またはホワイトスポットウイルスのいずれかに対し抗ウイルス活性を示す。
【００２２】
上記で得られた乳酸菌発酵物は、例えば、飲料、アイス、焼き菓子、アメ、ガム、デザート等の食品の添加原料、錠剤、注射剤、予防・治療用鼻溶液組成物、うがい液、洗口液、ドロップス等の添加原料として使用することができる。使用形態は特に限定されず、発酵物そのもの（以下、「液状品」という場合がある）の他、例えば、該液状品を濃縮した濃縮品、該液状品に脱脂粉乳や豆乳等を混合した混合物、該液状品を粉体化したパウダー、該液状品に糖を配合した加糖品等種々の形態で使用に供することができる。例えば、濃縮品として供する場合は、液状品を１／５〜１／２０容量になるように減圧濃縮したものを例示することができる。パウダーとして供する場合は、液状品にデキストリンや乳糖などの賦型剤を添加し、水分が１０％未満になるまで粉体化したものを例示することができる。なお、乳酸菌発酵物は、発酵終了後に、公知の方法でろ過、殺菌することもできる。
【実施例】
【００２３】
以下、試験例などにより本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらによりなんら限定されるものではない。
【００２４】
１．小豆煮汁の乳酸菌発酵物の製造例
１−１．小豆煮汁の製造例
小豆（エリモショウズ）６０ｋｇに水１８０Ｌを加え、８５℃で３０分間加熱し、煮汁を別容器に移し、再度上記小豆に水１８０Ｌを加え、８５℃で３０分間加熱し、煮汁を上記容器に移し、次いで上記小豆に水１８０Ｌを加え、１００℃で２時間３０分加熱し、煮汁を上記容器に移し、９０℃で５分間保持して殺菌し、３０℃まで冷却して小豆煮汁を製造した。
【００２５】
１−２．小豆煮汁に対する発酵能を有する乳酸菌の検討
上記「１−１．小豆煮汁の製造例」で得られた小豆煮汁９５重量部に対して表１に示す乳酸菌のうち１つを５重量部添加し、表１に示す温度で２０時間培養し、発酵液が得られるか否か検討した。結果、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ATCC14917を添加した小豆煮汁のみから発酵液が得られた。上記の結果から、小豆煮汁に対する発酵能を有する乳酸菌は、表１に示す数多くの乳酸菌のうちラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）のみであることが分かった。
【００２６】
なお、表１に示す乳酸菌の各種菌株のスターターとして、グルコース１重量部、酵母エキス１重量部及びイオン交換水９７重量部からなる培地をオートクレーブし、各種乳酸菌株１重量部を植菌し、３７℃で培養したものを用いた。
【００２７】
【表１】
2012136436.tif 000003
【００２８】
１−３．被検物質の調製例
（小豆煮汁発酵濃縮液の調製例）
表１のうち、小豆煮汁をラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）で発酵させた発酵液を遠心分離して固形物を除去し、上清を糖度２０°に減圧濃縮、冷凍保存し、これを被検物質（以下、「小豆煮汁発酵濃縮液」という場合がある）として以下の試験に供した。
【００２９】
（小豆煮汁発酵濃縮液の各種ポリフェノール成分画分の調製例）
上記で得られた小豆煮汁発酵濃縮液約３００ｍｇを２０ｍｌのミリＱ水に溶解し、この溶解液をLipophilic Sephadex（Pharmacia社）を担体とするカラム（２０ｍｌ）に吸着させ、３カラム容量の水で洗浄後、３カラム容量の３０％エタノール、７０％エタノール及び７０％アセトンで順次溶出した。得られた３０％エタノール画分、７０％エタノール画分及び７０％アセトン画分を１／１０容量に減圧濃縮した後、冷凍保存し、これらを被検物質として以下の試験に供した。
【００３０】
（小豆煮汁濃縮液及び各種ポリフェノール成分画分の調製例）
上記「１−１．小豆煮汁の製造例」で得た小豆煮汁を遠心分離して固形物を除去し、上清を１／１０容量に減圧濃縮した後、冷凍保存し、これを被検物質として以下の試験に供した（以下、「小豆煮汁濃縮液」という場合がある）。さらに、この小豆煮汁濃縮液から上記（小豆煮汁発酵濃縮液の各種ポリフェノール成分画分の調製例）と同様の操作により、３０％エタノール画分、７０％エタノール画分及び７０％アセトン画分を調製した。そして、得られた各画分を遠心分離して固形物を除去し、上清を１／１０容量に減圧濃縮した後、冷凍保存し、これらを被検物質として以下の試験に供した。
【００３１】
２．被検物質の成分分析
上記「１−３．被検物質の調製例」で得た被検物質のポリフェノール成分は、シリカゲル薄層クロマトグラフィーを用いて分析した。具体的には、シリカゲル薄層プレート（メルク社、６０Ｆ２５４）を溶媒（イソプロパノール：酢酸：水＝６０：２０：１０）で展開し、１％塩化鉄：１％フェロシアン化カリウム＝１：１（v/v）溶液によりフェノール性水酸基を発色させた。図１（１）に結果を示す。
【００３２】
３．被検物質の抗ウイルス作用測定
３−１．被検物質の抗ＳＡＲＳ（Sub- Acute Respiratory Syndrome）コロナウイルス活性の測定
ＳＡＲＳコロナウイルス（以下、「ＳＡＲＳ−ＣｏＶ」ともいう）は、FFM-1株(Dr. H.W. Doerr, Frankfrut University of Medicine, Germanyより分与)を用いた。FFM-1株に感受性のある培養細胞は、Ｖｅｒｏ(アフリカミゾリザル腎細胞、E-64)を用い、ダルベッコの最小必須培地(ＤＭＥＭ)に１０％ウシ胎児血清を添加した培地を用い、５％ＣＯ２存在下において３７℃で培養した。なお、上記Ｖｅｒｏ細胞は同様にDr. H.W. Doerrより分与を受けた。
ＳＡＲＳ−ＣｏＶのウイルスストック液は、９０％単層が形成された培養Vero細胞に、細胞１個当たりのウイルス量が０．１（MOI=0.1, Multiplicity of infection）となる条件で感染させ(Tuker, P.C.ら, J. Virol. 71: 6106, 1997)、２４時間後に培養上清を回収し、ウイルス力価を以下に記載するプラーク法で測定した。
【００３３】
回収した培養液の上清を１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えたＰＢＡ（−）（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋を含まない０．０５Ｍリン酸緩衝液、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で１０倍階段希釈し、各段階の希釈液０．２ｍｌずつをそれぞれのウエル（６ウエルプレート）に接種した。２５℃で６０分間感染させた後１．０％メチルセルロースを加えたＤＭＥＭ （５％ウシ胎児血清含有）で４−７日間培養した。培養後、メチルセルロースを取り除き、細胞を２．５％クリスタルバイオレット（３０％ エチルアルコール、１％ シュウ酸アンモニウム）中で染色し、ＰＢＳ（−）で３回洗浄／脱色後、プラーク数の平均値（３個のウエル）から１ｍｌ中のウイルス量をＰＦＵ(Plaque Forming Unit)/ｍｌとして算出した(Tuker, P.C.ら, J.Virol.71:6106, 1997)。
【００３４】
プラーク法による小豆煮汁醗酵濃縮液の抗ウイルス活性の測定は、６ウェルプレートの１ウェル当り５０−２００ＰＦＵ／０．２ｍｌのＳＡＲＳ−ＣｏＶを２２℃で６０分感染させた後、希釈した被検液を含む上記１．０％メチルセルロースを加えたＤＭＥＭを重層し、４−７日培養後、プラーク数を測定し、被検物質の濃度ＩＣ５０値（〔ＳＡＲＳ−ＣｏＶの増殖を５０％阻害する濃度（Inhibitory concentration、(μｇ/ｍｌ)）を求めた。図１（２）に示されるように、小豆煮汁発酵濃縮液は小豆煮汁濃縮液に比べて、１／７程度のＩＣ５０値を示した。すなわち、小豆煮汁発酵濃縮液は小豆煮汁濃縮液に比べて抗ＳＡＲＳコロナウイルス活性が７倍程度向上した。また、プラークは培養した単層細胞上に形成される、ウイルス感染で変性した細胞斑を意味するが、同時に非感染細胞の染色度から被検液の正常細胞に対する毒性を測定できる。使用した小豆煮汁発酵濃縮液は被検液の存在しない培養と比較して染色度に有意差が認められず、細胞毒性は認められなかった。
【００３５】
３−２．小豆煮汁醗酵濃縮液の抗インフルエンザウイルス活性の測定
小豆煮汁醗酵濃縮液の抗ウイルス作用がウイルス種に対し非特異的であることを示すために、インフルエンザウイルスに対する影響について調べた。インフルエンザウイルスＡ（Ｆｌｕ−Ａ）はＰＲ８株（国立感染症研究所から分与を受けた）を用いた。感受性細胞ＭＤＣＫ（イヌ腎細胞、大日本製薬Ｋ．Ｋ．）の培養は、上記Ｖｅｒｏ細胞と同様に行い、ウイルス感染は、９０％単層形成された細胞を０．１％ＢＳＡ−ＤＭＥＭで２回洗浄、Ｆｌｕ−Ａ感染後は、同培地に２．５μｇ／ｍｌのトリプシン存在下に行った。
【００３６】
被検液の抗Ｆｌｕ−Ａ効果は、細胞変性効果のTissue Culture Infective Dose（ＴＣＩＤ）の測定により行った。ＳＡＲＳ−ＣｏＶと同様に６ウェルプレート上に９０％単層形成されたＭＤＣＫ細胞に０．１ＴＣＩＤ５０／０．２ｍｌ（５０％の細胞が細胞変性を起こすウイルス濃度をウイルス液の希釈度の逆数で表したもの）のＦｌｕ−Ａを２２℃で６０分感染させ、それぞれ希釈した被検液を含む０．１％ＢＳＡ−ＤＭＥＭ（２．５μｇ／ｍｌのトリプシンを添加したもの）で４−６日培養し、Ｆｌｕ−Ａによる細胞変性効果を測定した。被検液の有無による培養細胞の性状から抗ウイルス作用を比較した。結果小豆煮汁発酵濃縮液は小豆煮汁濃縮液に比べて抗Ｆｌｕ−Ａ活性が３倍程度向上した。表２に結果を示す。
【００３７】
【表２】
2012136436.tif 000004
【００３８】
４．小豆煮汁醗酵濃縮液のポリフェノール成分の特徴
小豆を含むブドウ種子、松樹皮のプロアントシアニジンが抗ウイルス作用を示すことは、広く知られている。当該特許の特徴は、小豆煮汁の乳酸醗酵産物が抗ウイルス作用を増強すると言う点にある。この増強作用の根拠についてＴＬＣ上でのポリフェノール成分の性質について検討した。図１（１）に示されるように、小豆煮汁発酵濃縮液（レーン：０−Ｂ）と小豆煮汁濃縮液（レーン：０−Ａ）のポリフェノール成分の分子量を比べると、小豆煮汁発酵濃縮液では高分子領域の成分の低下とオリゴ領域の成分の増加が観察される。オリゴ領域の成分に抗ウイルス活性が強いことは知られているので、この領域の成分の増加が抗ウイルス活性に関与していることが示唆される。
【００３９】
さらに、小豆煮汁濃縮液と小豆煮汁発酵濃縮液のLipophilic Sephadexクロマトグラフィー上でのポリフェノール成分の性質について検討した。糖類、サポニンを含む配糖体類は非吸着画分（レーン：１）、あるいは３０％エタノール画分（レーン：３）に回収される。抗ウイルス活性を持つポリフェノールは７０％エタノールによる後半部分、あるいは７０％アセトン画分（レーン：５，６）に溶出される。７０％エタノールの後半部分で溶出されるポリフェノールは高分子性のものが多く、７０％アセトン画分ではオリゴポリフェノール、有機酸を主成分とする。小豆煮汁濃縮液は７０％エタノールで溶出されるポリフェノールが多く（レーン：４）、小豆煮汁発酵濃縮液には７０％アセトンで溶出されるポリフェノールが多く含まれていた（レーン：５，６）。各画分を減圧乾燥後、抗ウイルス活性（ＩＣ５０値）を測定した結果を図１（２）示したが、小豆煮汁濃縮液は７０％エタノール画分に、小豆煮汁発酵濃縮液は７０%アセトン画分に抗ウイルス活性が高く、醗酵によりポリフェノールの低分子化が観察された。これらの結果は、小豆煮汁を醗酵させることにより、煮汁中のポリフェノールが低分子化し、抗ウイルス活性が増強することを示唆している。なお、小豆煮汁中にポリフェノール以外の抗ウイルス物質の存在は報告されていない。
【００４０】
５．培養細胞に及ぼす小豆煮汁発酵濃縮液の影響
上述したように、小豆煮汁発酵濃縮液は小豆煮汁濃縮液よりも抗ウイルス作用が強く、細胞毒性作用も比較的少ない事が示された。この抗ウイルス作用がどのような機構で誘導されるのかを検討するために、被検物質をＶｅｒｏ細胞に添加して培養後、全タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、細胞増殖、細胞のタンパク質合成に及ぼす影響、アポトーシスの誘導の有無、細胞内抗酸化因子の誘導等について検討した。それぞれについて、チューブリン、リン酸化リボソームＳ６タンパク質）、ＰＡＲＰ（polyADP ribosyl polymerase）、Ｍｎ−ＳＯＤ（Manganese superoxide dismutase）を免疫ブロット法で染色し、培養細胞に及ぼす小豆煮汁発酵濃縮液の影響を検討した。
【００４１】
５−１．全細胞タンパク質の測定
６ウェルプレートに培養したＶｅｒｏ細胞（１ｗｅｌｌ当たり２．５ｍｌの培地、２×１０６ 個の細胞）に小豆煮汁濃縮液または小豆煮汁発酵濃縮液（上記「１−３．被検物質の調製例」を参照）を０，１，３，１０，３０，１００μｇ／ｍｌ加え、３７℃で培養し、４８時間後に全細胞を０．４ｍｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーに回収し、全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。次いで泳動後のゲルをクーマシーブリリアントブルーＲ２５０（ＣＢＢ）で染色し、その後７％酢酸で脱色した。画像をＣＣＤカメラで撮影し画像解析ソフト（The Analytical Imaging System AIS. アマシャム/ファルマシア社）によりアクチンバンドの染色濃度を測定し、細胞増殖抑制の指標とした(Nakatsue,M.ら,Biochem. Biophys.Res.Commun.253:59,1998)。図２（未発酵分）と図３（発酵分）に結果を示す。
【００４２】
５−２．アポトーシス関連タンパク質及びＭｎ−ＳＯＤの測定
６ウェルプレートに培養したＶｅｒｏ細胞の全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Polyvinylidene fluolide、ミリポア社）に転写、一次抗体としてチューブリン（細胞全タンパク質の増減の指標、サンタクルズ社）、ＰＡＲＰ（Poly  ADP  ribosyl  polymerase、アポトーシス誘導の有無の指標、サンタクルズ社）、リン酸化リボソームＳ６タンパク質（細胞タンパク質合成の促進、抑制の指標、セルシグナリング社）及びＭｎ−ＳＯＤの抗体（細胞内抗酸化因子、ストレスゲン社）、二次抗体にはアルカリホスファターゼで標識した抗ウサギ−ヤギ抗体（サンタクルズ社）を用いＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム塩、ベーリンガー社）による発色で検出し、免疫ブロットを行った(Yoshinaka,Y.ら, Biochem. Biophy.Res.Commun.261:139,1999)。画像解析から相対的な発現量を測定した。その結果を図２と図３に示す。
【００４３】
まず、小豆煮汁濃縮液と小豆煮汁発酵濃縮液の細胞増殖、細胞タンパク質に対する影響を見ると、ＣＢＢ染色による全細胞タンパク質の濃度は、濃度が高いと抑制されている。チューブリンタンパク質の量も同様の傾向を示していた。Ｓ６タンパク質のリン酸化を指標とした細胞タンパク質の合成が濃度に依存し強く抑制されており、これらの現象は、小豆煮汁発酵濃縮液においてより強いことが分かった。さらに、これらの抑制作用は、培地中から取り除くことによって、正常に回復することが分かっている。
【００４４】
一方、細胞死の指標であるＰＡＲＰは、小豆煮汁濃縮液と小豆煮汁発酵濃縮液の濃度が高くても開裂産物は検出されず、細胞死の誘導は見られない。細胞増殖は抑制されるが、アポトーシスは誘導されず、小豆煮汁濃縮液と小豆煮汁発酵濃縮液は、細胞の生存状態を静止状態に誘導する作用を示した。
【００４５】
ウイルス感染は酸化ストレスを細胞に誘導し増殖するので、酸化ストレスの誘導を抑制することがウイルス増殖を制御する一つの方策と考えられる。そこで、小豆煮汁発酵濃縮液が抗酸化因子を誘導するかどうかを調べた。ＣＢＢ染色で観察される全細胞タンパク質の量とチューブリンの量、タンパク合成の指標であるＳ６タンパク質のリン酸化は、小豆煮汁濃縮液と小豆煮汁発酵濃縮液の濃度に依存して濃度が高いと抑制され、小豆煮汁発酵濃縮液の方が強く抑制される。一方、Ｍｎ−ＳＯＤの発現は、逆に増加され、小豆煮汁発酵濃縮液において作用が強く、抗ウイルス作用が発揮されと考えられる。ちなみに、正常のウイルス感染では、細胞のタンパク合成がウイルス感染で抑制されるにも拘らず、ウイルスタンパク質合成は進行する。
【００４６】
以上の結果は、小豆煮汁濃縮液と小豆煮汁発酵濃縮液により、細胞死を誘導しない細胞の増殖、代謝が抑制され、細胞生存因子の発現向上が見られることを示している（細胞の休眠状態の誘導）。小豆煮汁濃縮液と小豆煮汁発酵濃縮液によるこの細胞状態の誘導と抗酸化因子の誘導が、種々の外的要因による細胞障害に対する防御に作用すると考えられる。
【００４７】
６．小豆以外の原料を用いた場合の乳酸発酵能と抗ウイルス作用の検討
小豆（自社調製）、松樹皮（ピクノジェノール、日本シーベル）、ピーナッツ渋皮（ピーナッツ渋皮エキス、岸本産業）、ブドウ種子（グラヴィノール、キッコーマン）、赤米（自社調製）、ササゲ（自社調製）、金時豆（自社調製）および濃縮ブドウ果汁（濃縮赤ブドウ果汁、welch）の希釈液を調製し、上記「１−２．小豆煮汁に対する発酵能を有する乳酸菌の検討」に記載された方法に準じてラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ATCC14917による発酵能を検討した。
次に、上記被検物質のうち発酵が認められたものについて、上記「３−１．被検物質の抗ＳＡＲＳ（Sub- Acute Respiratory Syndrome）コロナウイルス活性の測定」に記載された方法に準じて抗ウイルス作用について検討した。結果を表３、表４および図４に結果を示す。
【００４８】
【表３】
2012136436.tif 000005
【００４９】
【表４】
2012136436.tif 000006
【００５０】
７．各種製造例
上記「１−３．被検物質の調製例」で調製した小豆煮汁発酵濃縮液を粉末化し、これを配合原料として以下に示す各種製品を製造した。
７−１．錠剤の製造例
常法により、１錠中組成が表５の通りとなる錠剤を製造した。
【００５１】
【表５】
2012136436.tif 000007
【００５２】
７−２．注射剤の製造例
下記表６のような組成の注射剤を製造した。
【００５３】
【表６】
2012136436.tif 000008
【００５４】
上記パラベン類、メタ重亜硫酸ナトリウム及び塩化ナトリウムを攪拌しながら８０℃で上記の約半量の蒸留水に溶解する。得られた溶液を４０℃まで冷却し、小豆発酵物（粉末）、ビタミンＣ、次にポリエチレングリコール及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートをその溶液中に溶解した。次にその溶液に注射用蒸留水を加えて最終の容量に調製し、適当なフィルターペーパーを用いて滅菌濾過することにより滅菌して１ｍｌずつアンプルに分注し、目的とする注射剤を得た。
【００５５】
７−３．予防、治療用鼻内噴霧剤の調製
アズキプロアントシアニジンとビタミンＣを含有する鼻内噴霧剤を、生理食塩水（０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ水溶液）１ｍｌ当たり小豆発酵物（粉末）５ｍｇ、ビタミンＣ３ｍｇを添加することにより調製した。
【００５６】
７−４．予防、治療用鼻溶液組成物の製造例
表７に示す成分を含有する鼻内噴霧剤を調製した。
【００５７】
【表７】
2012136436.tif 000009
【００５８】
７−５．うがい液の製造例
表８に示す成分を含有するうがい液を調製した。
【００５９】
【表８】
2012136436.tif 000010
【００６０】
７−６．洗口液の製造例
表９に示す成分を含有する洗口液を調製した。
【００６１】
【表９】
2012136436.tif 000011
【００６２】
７−７．飲料の製造例１
表１０に示す配合により小豆発酵物（粉末）、ビタミンＣ含有飲料１０００ｍｌ（１０本分）を製造した。
【００６３】
【表１０】
2012136436.tif 000012
【００６４】
７−８．飲料の製造例２
表１１に示す配合により小豆発酵物（粉末）、ビタミンＣ含有飲料１０００ｍｌ（１０本分）を製造した。
【００６５】
【表１１】
2012136436.tif 000013
【００６６】
７−９．チューインガムの製造例
表１２に示す配合で常法により小豆発酵物（粉末）、ビタミンＣ含有チューインガム（３０個分）を製造した。
【００６７】
【表１２】
2012136436.tif 000014
【００６８】
７−１０．ドロップスの製造例
表１３に示す配合で、小豆発酵物（粉末）、ビタミンＣ含有ドロップスを製造した。
【００６９】
【表１３】
2012136436.tif 000015
【００７０】
糖を水５．５リットルに溶解し、グルコース含有コーンシロップを添加し、十分に混合
した。この時点で、いずれかの所望の色素を添加して、所用の色を付与してもよい。色素
は、十分に溶解するものを使用する。
【００７１】
上記混合物を、１２５℃に加熱した蒸気ジャケットケトルに入れた。そこから、混合物を、ポンプで貯蔵容器に入れて、連読クッカーに供給した。
シロップがクッカーにおけるコイルを通過するうちに、１２５−１５０℃の温度に到達した。その後、スチーム真空イジェクターにより、真空度２８−２９インチＨｇに維持した受け入れケトルに薬６−７分間供給した。この間に、水含量が約１％以下に減少するまで水が除去され、溶融あめ基剤が形成された。次に、このあめ基剤を、ゆっくりと冷却した。
【００７２】
小豆発酵物（粉末）、ビタミンＣ及びワイルドチェリー模倣フレーバー（粉末状）を、ポリエチレングリコールに添加し、得られた混合物を７０℃で加熱することにより流動化させた。
【００７３】
得られた熱流動体混合物を、蒸気の溶融あめ基剤（温度を１００℃、またはそれよりわ
ずかに低下させたもの）に適当に混和させながら迅速に添加した。つぎに、全塊を十分に混練した後、スピニングマシンに移し、ロゼンジ形成ダイに押し出した。別法として、アズキプロアントシア二ジン、ビタミンＣを添加した溶融あめ塊を冷却テーブルに流し、冷却テーブル上で半固体の塊になるまで固化した後、薬剤の単位投与量を投薬するためのいずれか所望の形状に成形してもよい。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明の乳酸菌発酵物は、例えば、飲料、アイス、焼き菓子、アメ、ガム、デザート等の食品の添加原料、錠剤、注射剤、予防・治療用鼻溶液組成物、うがい液、洗口液、ドロップス等の添加原料として広く利用することができる。
【図１】
2012136436.tif 000016
【図２】
2012136436.tif 000017
【図３】
2012136436.tif 000018
【図４】
2012136436.tif 000019