(57)【要約】      （修正有）【課題】癌、リューマチ様関節炎、自己免疫疾患、歯周炎、組織潰瘍形成、動脈硬化症、動脈瘤、及び心不全等の発症に関与しているマトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）抑制剤の提供。【解決手段】カシス果実に含まれる多糖類が、限定的かつ部分的に分解され、その平均分子量が１０，０００〜２００，０００の範囲にあるカシス果実由来物を有効成分として含んでなるＭＭＰ−９抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カシス果実由来物を有効成分として含んでなるマトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）抑制剤。
【請求項２】
ＭＭＰ−９をコードするｍＲＮＡの発現量を低下させる、請求項１記載のＭＭＰ−９抑制剤。
【請求項３】
ＭＭＰ−９タンパク質の発現量を低下させる、請求項１記載のＭＭＰ−９抑制剤。
【請求項４】
ＭＭＰ−９の活性を低下させる、請求項１記載のＭＭＰ−９抑制剤。
【請求項５】
カシス果実由来物がカシス果実に含まれる多糖類を含む請求項１〜４のいずれか１項記載のＭＭＰ−９抑制剤。
【請求項６】
カシス果実に含まれる多糖類が限定的かつ部分的に分解されている請求項１〜５のいずれか１項記載のＭＭＰ−９抑制剤。
【請求項７】
多糖類の平均分子量が１０，０００〜２００，０００の範囲にある、請求項６記載のＭＭＰ−９抑制剤。
【請求項８】
カシス果実に含まれる多糖類が完全に分解されている、請求項１〜４のいずれか１項記載のＭＭＰ−９抑制剤。
【請求項９】
糖類の平均分子量が１００以上、１，０００未満の範囲にある、請求項８記載のＭＭＰ−９抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ９（以下、ＭＭＰ−９という）抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
マトリックスメタロプロテアーゼ（以下、ＭＭＰという）は、細胞外マトリックスタンパク質を分解する金属プロテアーゼの総称である。癌、リューマチ様関節炎、自己免疫疾患、歯周炎、組織潰瘍形成、動脈硬化症、動脈瘤、及び心不全等の発症に関与している事がわかっている。
【０００３】
ＭＭＰにはサブタイプがあり、血管新生には主として基底膜を選択的に分解するゼラチナーゼ群（ＭＭＰ−２，ＭＭＰ−９）が関係し、さらにこれらを活性化する因子としてＭＭＰ−３（ストロメライシン群）やＭＭＰ−１４（膜型）が明らかにされている。そして生体内のＭＭＰ活性は、その発現量の制御に加え、プロペプチドの活性化、内在性特異的阻害タンパク質（例えば、ＴＩＭＰｓ）による不活性化などにより制御されている（非特許文献１）。
【０００４】
なかでもＭＭＰ−９はゼラチナーゼとしてゼラチン成分を分解するのみではなく、別名ＩＶ型コラゲナーゼとも言われるように、各種コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチンなど細胞外マトリックス成分を分解し、さらには腫瘍成長因子（ＴＧＦ−β）や腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）を活性化する可能性が示されてきた。正常状態では活性が低く抑えられているが、炎症などになると酵素活性が高くなる事が知られている（非特許文献２）。
【０００５】
ＭＭＰ−９抑制物は医薬品として多く報告されている（特許文献１，２，３）が、食品として報告されている物は効果が小さいという問題があった（特許文献４，５，６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−３５９６５７号公報
【特許文献２】特表２００７−５３７１６２号公報
【特許文献３】特開２０１０−１３３８７号公報
【特許文献４】特開２００９−２３５０４４号公報
【特許文献５】特開２００５−８９３２３号公報
【特許文献６】特開２０１０−１３３８７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】第１２０回日本医学会シンポジウム  講演集  ｐ４３−４９
【非特許文献２】順天堂医学  ４８（１）、  ７０、  ２００２−０７−１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、容易に入手可能な天然物由来の素材を原料としてＭＭＰ−９抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は以下の（１）〜（９）に関する。
（１）カシス果実由来物を有効成分として含んでなるマトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）抑制剤。
（２）ＭＭＰ−９をコードするｍＲＮＡの発現量を低下させる、（１）のＭＭＰ−９抑制剤。
（３）ＭＭＰ−９タンパク質の発現量を低下させる、（１）のＭＭＰ−９抑制剤。
（４）ＭＭＰ−９の活性を低下させる、（１）のＭＭＰ−９抑制剤。
（５）カシス果実由来物がカシス果実に含まれる多糖類を含む、（１）〜（４）のいずれかのＭＭＰ−９抑制剤。
（６）カシス果実に含まれる多糖類が限定的かつ部分的に分解されている（５）のＭＭＰ−９抑制剤。
（７）多糖類の平均分子量が１，０００〜２００，０００の範囲にある（６）のＭＭＰ−９抑制剤。
（８）カシス果実由来物がカシス果実に含まれる多糖類が完全に分解されている、（１）〜（４）のいずれかのＭＭＰ−９抑制剤。
（９）糖類の平均分子量が１００以上、１，０００未満の範囲にある（８）のＭＭＰ−９抑制剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、容易に入手可能なカシス果実を原料として、ＭＭＰ−９抑制剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、カシス果汁の摂取によりもたらされる、ＭＭＰ−９遺伝子発現抑制効果を示す特性図である。
【図２】図２は、カシス果汁の摂取によりもたらされる、ＭＭＰ−９タンパク質発現抑制効果を示す特性図である。
【図３】図３は、カシス果汁の摂取によりもたらされる、ＭＭＰ−９酵素活性抑制効果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のＭＭＰ−９抑制剤は、カシス果実由来物を有効成分として含有する。
本発明において利用しうるカシスは特に限定されることなく、一般的に入手可能な様々な品種、例えば、ＢｅｎＡｒｄ、ＢｅｎＲｕａ、ボスコープジャイアント等を用いることができる。
【００１３】
「カシス果実」は、未熟のものでも、完熟したものであっても良いが、好ましくは完熟したものを用いる。また「カシス果実」の状態は特に限定されることなく、様々なものを利用することが可能であり、生のものであっても良いし、乾燥したものや乾燥粉末の状態であっても良い。
【００１４】
本発明において「カシス果実由来物」は、カシス果実に含まれる多糖類の粗精製物または精製物である。「多糖類の粗精製物」とは、カシス果実またはその破砕物もしくはピューレ（種子、種皮、果実に由来する固形成分を含むもの、もしくは当該固形成分を遠心分離等の手法によって除去したもの（すなわち果汁）など）あるいはこれらの凍結乾燥物などを含む。「多糖類の精製物」は、公知の手法に基づいて調製することができる（特開２００４−１０７６６０号公報、Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−Ｒｉｃｈ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｂｌａｃｋ  Ｃｕｒｒａｎｔ（Ｒｉｂｅｓ  ｎｉｇｒｕｍ  Ｌ．）．（Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６９（１１），２０４２−２０５０（２００５）））。
【００１５】
すなわち、果汁を陽イオン交換樹脂および陰イオン交換樹脂に通液することで各種のイオン性物質を除去する。次いで、Ｃ−１８逆相カラムに通液してポリフェノール化合物を除去する。得られた素通り画分を純水にて透析、凍結乾燥することで多糖類の精製物を得ることができる。
【００１６】
本発明の一実施形態において、「カシス果実由来物」は、カシス果実に含まれる多糖類が、限定的かつ部分的に分解されている調製物である。
【００１７】
本明細書において「多糖類が、限定的かつ部分的に分解されている」、「多糖類の限定的かつ部分的な分解」とは、カシス果実に含まれる多糖類が分子量１，０００〜２００，０００の範囲に分解されることを意味し、好ましくは含まれる多糖類の平均分子量が約１０，０００〜１５０，０００、より好ましくは約１０，０００〜９６，０００、さらに好ましくは約１０，０００〜５６，０００、よりさらに好ましくは約１０，０００〜３４，０００の大きさにあることを指す（多糖類の平均分子量は、公知の手法、例えばＨＰＬＣによるゲルろ過分析に基づく）。したがって、本明細書において「多糖類が、限定的かつ部分的に分解されている」、「多糖類の限定的かつ部分的な分解」とは、カシス果実に含まれる多糖類が全て、低分子の糖類（単糖〜オリゴ糖）まで完全に分解されている状態を意味するものではない。
【００１８】
カシス果実に含まれる多糖類の限定的かつ部分的な分解は、上記カシス果実由来物を酸や酵素を用いて処理することによって行うことができる。好ましくは、酵素処理によって行う。
【００１９】
カシス果実に含まれる多糖類の限定的かつ部分的な酵素分解は、上記カシス果実由来物にβ−ガラクトシダーゼを添加することによって行うことができる。
【００２０】
β−ガラクトシダーゼの添加量は、カシス果実由来物の種類、ｐＨ、反応温度、反応時間、およびβ−ガラクトシダーゼの起源や精製度等を考慮して適宜決定できる。添加量が少なすぎると反応に時間がかかりすぎることがあり、場合によっては、途中で酵素が失活してしまって目的とする分子量をもった分解産物が得られないことがある。逆に多すぎると、反応が急速に進みすぎて適切な時点で反応を止めることが困難になり、また、製品製造におけるコスト・アップを招く場合がある。
【００２１】
このようなことを考慮して、β−ガラクトシダーゼの添加量（範囲）は、例えば、０．０１％〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０５％〜５％（ｗ／ｖ）の範囲から適宜決定することができる。但し、上記β−ガラクトシダーゼの添加量（範囲）は、あくまでも例示であり、上記条件を考慮して適宜決定することができる。
【００２２】
本発明において使用するβ−ガラクトシダーゼは、カシス果実に含まれる多糖類を上記所望の大きさに分解することができる限り特に限定されることなく、様々なものを使用することができる。好ましくは、アスペルギラス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のβ−ガラクトシダーゼを使用する。但し、β−ガラクトシダーゼであれば、他の由来の物も同様に使用できる。他の由来のβ−ガラクトシダーゼの例としては、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、サッカロマイセス・フラギリス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等由来のβ−ガラクトシダーゼが利用可能である。
【００２３】
酵素処理においては、分子量が約１，０００未満の低分子の糖類（単糖〜オリゴ糖）側のピークは考慮せず、多糖側（ＭＷ＞１，０００）のピークが上記所望の大きさにあるときに酵素反応を止めて、目的とする限定的かつ部分的に分解された多糖類を得る。この際、例えば、反応を開始してから経時的に反応液の一部をサンプリングし、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるゲルろ過で分析しながら反応停止の時期をモニタリングすることができる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の検出器に示差屈折検出器を用い、基本的に、糖（単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）のみを検出する。
【００２４】
酵素反応は、酵素の至適温度付近で（例えば、約３５〜５５℃）で行うことができる。ただし、カシス果汁のｐＨが約２．９と非常に低いため、カシス果汁を含むカシス果実由来物の酵素反応は、単離あるいは部分精製した多糖類の酵素分解に比べて、低い温度で行うことが好ましい。
【００２５】
酵素反応の停止は、生成する多糖の熱安定性が高いので、酵素の失活を数分間、例えば５〜１０分間煮沸することで行うこともできる。この操作は殺菌も兼ねることができる。
【００２６】
本発明の別の実施形態において、「カシス果実由来物」は、カシス果実に含まれる多糖類が、完全に分解されている調製物である。
【００２７】
本明細書において「多糖類が完全に分解されている」、「多糖類の完全な分解」とは、カシス果実に含まれる糖類（多糖類および／または単糖類）の分子量が、約１００〜１０，０００、好ましくは１００以上から１，０００未満の範囲にある低分子の糖類（単糖〜オリゴ糖）の大きさにあることを指す（多糖類の平均分子量は、公知の手法、例えばＨＰＬＣによるゲルろ過分析に基づく）。好ましくは、「多糖類が、完全に分解されている」、「多糖類の完全な分解」とは、カシス果実に含まれる多糖類が全て、低分子の糖類（単糖〜オリゴ糖）まで完全に分解されている状態を意味する。
【００２８】
カシス果実に含まれる多糖類の完全な分解は、上記カシス果実由来物を酸や酵素を用いて処理することによって行うことができる。好ましくは、酵素処理によって行う。酵素反応は、上記と同様に行うことができるが、各種条件は多糖類の完全な分解を可能とする条件を適宜用いることができる。
【００２９】
本発明の一実施形態において、酵素処理を行ったカシス果実由来物には、中性糖ラムノース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、キシロースおよびグルコースが約１８：３：１９：３０：１：２９の割合（モル比）で含まれ得る（ＷＯ２００７／１２５８２３）。
【００３０】
酵素の失活後、必要に応じて、上記所望の平均分子量の範囲にある多糖類または低分子の糖類を精製しても良い。精製方法は特に制限されないが、例えば、煮沸により生じる少量の不溶沈殿物を、例えば遠心することで除去することができる。さらに、不溶沈殿物を除去した後に、例えば分画分子量１，０００の限外ろ過に供することで分子量１，０００未満の低分子（単糖〜オリゴ糖）を除去または回収することもできる。精製することによって、上記所望の平均分子量の範囲にある多糖類または低分子の糖類のカシス果実由来物における含有量を、例えば、５０〜９５質量％の範囲、６０〜９５質量％の範囲、８０〜９５質量％の範囲またはそれ以上に高めることができる。
【００３１】
ただし、酵素処理したカシス果実由来物には、多糖類または低分子の糖類以外にタンパク質やポリフェノール化合物が含まれていても良い。また、必要であれば、酵素処理したカシス果実由来物または上記所望の平均分子量の範囲にある精製された多糖類または低分子の糖類を凍結乾燥して乾燥物とすることもできる。
【００３２】
本明細書において「ＭＭＰ−９抑制」とは、ＭＭＰ−９をコードするｍＲＮＡの発現量の低下、ＭＭＰ−９タンパク質の発現量の低下、および／またはＭＭＰ−９の活性の低下を意味する。好ましくは、紫外線、洗剤、化学物質などの刺激性物質などによる外的要因や、老化などの内的要因によって生じる、ＭＭＰ−９をコードするｍＲＮＡの発現量の亢進、ＭＭＰ−９タンパク質の発現量の亢進、および／またはＭＭＰ−９活性の亢進抑制を意味する。上記カシス果実由来物を投与または摂取することによって、ＭＭＰ−９をコードするｍＲＮＡの発現量、ＭＭＰ−９タンパク質の発現量、および／またはＭＭＰ−９活性を、上記カシス果実由来物を投与または摂取しなかった場合と比べて、通常５〜５０％の範囲で低下させることができる。ＭＭＰ−９をコードするｍＲＮＡの発現量の低下、ＭＭＰ−９タンパク質の発現量の低下、および／またはＭＭＰ−９の活性の低下は、従来公知の遺伝子発現量解析方法、タンパク質発現量解析方法、酵素活性解析方法を用いて評価することができる。上記カシス果実由来物は、ＭＭＰ−９をコードするｍＲＮＡの発現量の低下、ＭＭＰ−９タンパク質の発現量の低下、および／またはＭＭＰ−９の活性の低下に直接または間接的に作用し得る。
【００３３】
本発明のＭＭＰ−９抑制組成物は、有効成分として上記カシス果実由来物を含有し、ＭＭＰ酵素活性が亢進される危険にあるまたは亢進されている、組織や器官（例えば、皮膚など）または被験体に使用または投与することによって、カシス果実由来物が有するＭＭＰ−９抑制効果を通じて、ＭＭＰ−９抑制効果を発揮し、癌、リューマチ様関節炎、自己免疫疾患、歯周炎、組織潰瘍形成、動脈硬化症、動脈瘤、及び心不全等の治療、改善、抑制および／または予防に役立てることができる。
【００３４】
本発明のＭＭＰ−９抑制剤は、上記効果を損なわない限り、様々な形態で提供することができる。例えば、本発明の一実施形態として、ＭＭＰ−９抑制剤を化粧品組成物として提供することができる。
【００３５】
本明細書において、「化粧品組成物」には、薬事法における化粧品および医薬部外品が含まれ、皮膚に使用する化粧品、浴用剤、芳香品等が挙げられる。このような化粧品組成物としては、例えば、せっけん、合成化粧せっけん、液状ボディ洗浄料（ボディーソープ）、洗顔料等の洗浄料、クレンジングクリーム、洗浄用化粧水、化粧水、乳液、美容液、ローション、液状パック、ペースト状パック等のパック、粉白粉、水白粉、練白粉等の白粉、打粉、ファンデーション、口紅、頬紅等の化粧品、アイライナー、アイシャドウ等の目のまわりの化粧料、日焼け止め化粧料、サンタン化粧料、除毛化粧料等の化粧料、或いはシェービングローション、アフターシェービングローション等のひげそり用化粧料等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
化粧品組成物にはカシス果実由来物を０．０１重量％〜１０重量％の範囲で含めることができるが、その量は化粧品組成物の形態に応じて適宜選択・決定することができる。
【００３７】
また、化粧品組成物にはカシス果実由来物の他、化粧品に通常用いられる成分を本発明の目的、作用、効果を損なわない範囲で適宜選択して添加して使用することができる。このような成分としては例えば界面活性剤、油分、保湿剤、柔軟剤、感触向上剤、油性剤、乳化剤、酸化防止剤、防腐剤、防黴剤、エモリエント剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、安定化剤、紫外線吸収剤、アルコール類、シリコン化合物、増粘剤、粘度調整剤、可溶化剤、パール化剤、香料、清涼剤、殺菌剤、抗菌剤、天然抽出物、着色剤、褪色防止剤、精製水その他の溶剤、噴射剤等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
また、本発明の別の実施形態として、ＭＭＰ−９組成物を医薬組成物として提供することができる。本発明の医薬組成物は癌、リューマチ様関節炎、自己免疫疾患、歯周炎、組織潰瘍形成、動脈硬化症、動脈瘤、及び心不全等の治療、改善、抑制および／または予防に役立てることができる。
【００３９】
医薬組成物は、経口剤または非経口剤として調製することができる。好ましくは、経口剤として投与する。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。非経口剤としては、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）が挙げられる。
【００４０】
これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学上許容される担体を用いて製剤化することができる。薬学上許容される担体としては、賦形剤、結合剤、希釈剤、添加剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられ、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバターを担体として使用できる。
【００４１】
医薬組成物における有効成分であるカシス果実由来物の投与量、摂取量または用法は、所与の症状について治療、改善、抑制および／または予防効果を与え得る量であり、その量は、動物を用いた試験、臨床試験の実施により当業者によって適宜決定されるが、投与対象の年齢、性別、体重、適用疾患およびその症状、剤形、投与方法などが考慮されるべきである。例えば、本発明の医薬組成物が経口剤である場合には、上記投与量または摂取量は、０．０１〜１００ｍｇ／Ｋｇ体重／日、好ましくは０．０１〜４０ｍｇ／Ｋｇ体重／日とすることができる。
【００４２】
さらに、本発明のまた別の実施形態として、ＭＭＰ−９抑制剤を飲食品として提供することができる。本発明の飲食品は、上記カシス果実由来物を有効量含んでなるものである。食品には、上記カシス果実由来物をそのまま、またはそれらを含む組成物の形態で、配合することができる。より具体的には、本発明による飲食品は、カシス果実由来物を、飲食品として調製したもの、各種タンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類等をそれらにさらに配合して調製したもの、液状、半液体状もしくは固体状にしたもの、ペースト状にしたもの、または、一般の飲食品へ添加したものであってもよい。
【００４３】
また本発明において「飲食品」には、美容食品・健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、疾病リスク低減表示を付した食品、または、病者用食品のような分類のものも包含される。疾病リスク低減表示としては、例えばＭＭＰ−９の過剰発現が関与する症状を治療、改善、抑制および／または予防するためのものである旨の表示が挙げられる。
【００４４】
本発明における飲食品の具体例としては、飯類、餅類、麺類、パン類およびパスタ類等の炭水化物含有飲食品；クッキーやケーキなどの洋菓子類、饅頭や羊羹等の和菓子類、キャンディー類、ガム類、ゼリー、ヨーグルトやプリンなどの冷菓や氷菓などの各種菓子類；ジュース、清涼飲料水、乳飲料、茶飲料、機能性飲料、栄養補助飲料、ノンアルコールビール等の各種飲料；ビール、発泡酒等のアルコール飲料；スープ、味噌汁、お吸い物などの飲食品；卵を用いた加工品、魚介類や畜肉の加工品；調味料；などが挙げられる。
【００４５】
また、本発明における飲食品は、カシス果実由来物の他、栄養補助成分などの他の成分を含むことができる。かかる成分には、ビタミン類、ミネラル類、各種植物体ならびにその抽出物、精製物および分画物、微生物ならびにその増殖因子および微生物生産物、食物繊維およびその酵素分解物、動物体ならびにその抽出物、精製物、分解物および生産物、各種オリゴ糖、脂質、各種タンパク質およびタンパク分解物などが挙げられる。
【００４６】
本発明の飲食品における有効成分であるカシス果実由来物の含有量は、通常、０．０１〜５０重量％、好ましくは１〜３０重量％程度であり、カシス果実由来物として成人１人につき、１日当たり通常０．５〜１０ｇ、好ましくは０．６〜６ｇの摂取量となるように摂取すればよい。
【００４７】
本発明のＭＭＰ−９抑制剤は、上記の通り天然物由来の成分を有効成分として含むため、上記いずれの形態を有していても、副作用等の心配が少なく、安価にかつ長期間にわたって継続的に使用、投与および／または摂取することができる。
【００４８】
次に実施例を記載して本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４９】
実施例１：多糖類分解酵素処理によるカシス果汁の調製
（１）カシス果実［Ｂｅｎ  Ｒｕａ］を破砕し果皮等の固形分を分離してカシス果汁とした後、酵素剤スミラクトＬ（新日本科学製）を０．３％（ｗ／ｖ）添加し、４２℃で６時間処理する事によって、含有する多糖類が部分分解されたカシス果汁を得た（以下、「部分分解カシス果汁」と記載する）。また、カシス果汁を上記条件において１８時間酵素処理することによって、含有する多糖類が低分子の糖類（単糖〜オリゴ糖）まで完全に分解されたカシス果汁を得た（以下、「完全分解カシス果汁」と記載する）。なお、酵素処理に付されていないカシス果汁を、以下「未処理カシス果汁」と記載する。
【００５０】
（２）未処理、部分分解カシス果汁または完全分解カシス果汁に含まれる多糖類の分子量分析を以下の通りに行った。分子量分析は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（カラム：ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０４  ＨＱ（昭和電工株式会社製））を用いたゲルろ過分析によって行った。
【００５１】
未処理のカシス果汁ならびに部分分解カシス果汁および完全分解カシス果汁に含まれる多糖類の分子量の分析結果を以下の表１に示す。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
実施例２：未処理カシス果汁、部分分解カシス果汁または完全分解カシス果汁を含有するマウス飼料を調製した。マウス飼料の調製に際しては、各果汁は凍結乾燥して得られた粉末状態のものを用いた。
【００５４】
各飼料の組成を以下に示す。
＜果汁含有飼料＞
ＡＩＮ９３Ｇ              １０００ｇ
果汁粉末                      ５０ｇ
＜コントロール飼料＞
ＡＩＮ９３Ｇ              １０００ｇ
デキストリン粉末              ５０ｇ
【００５５】
一群につき１０匹のへアレスマウス（Ｈｏｓ：ＨＲ−１，４０匹、５週令、雌、日本ＳＬＣ社）からなる４群に、それぞれ未処理カシス果汁、部分分解カシス果汁または完全分解カシス果汁を含有する果汁含有飼料あるいはコントロール飼料を２週間摂取させた［平均4g/日になるように混餌飼育を行い、経口摂取を行った。］。その後、各群のマウスの背部にそれぞれ９０ｍＪ／ｃｍ２の紫外線（以下、ＵＶと記載）を１回照射した。ＵＶ照射はＳＡＮ−ＥＩ  ＳＵＰＥＲＣＵＲＥ−２０４Ｓ（三栄電機製作所）を用いて行いた。
【００５６】
実施例３：ヘアレスマウスを用いたＵＶ照射に対するＭＭＰ−９遺伝子発現抑制作用
実施例２で記載したマウス（各群４匹のマウス）から、ＵＶ照射後４日目に背部の皮膚を回収して、試験に供するまでＲＮａｓｅ ｌａｔｅｒ中に−３０℃で保存した。
【００５７】
サンプルストックチューブ ２．０ ｍＬ用 / コニカル型 （ＢＭＢｉｏ社製）に、上記で調製した皮膚サンプル、ジルコニアビーズ（Ｚｉｒｃｏｎｉｕｍ ｂｅａｄｓ １．０ｍｍ Ｄｉａ：ＢｉｏＳｐｅｃ社製）、ジルコニアビーズ ２．０φ、ＴＯＭＹ社製）とＲＬＴ  ｂｕｆｆｅｒをいれ、ビーズ式ホモジナイザー  ミニビード・ビーター  （ＢｉｏＳｐｅｃ社製）にてホモジナイズした。その後の精製工程は、ＲＮｅａｓｙ（登録商標） Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔのプロトコルに従った。
【００５８】
ＲＮＡの逆転写には、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ (ＴａＫａＲａ社製)を使用した。反応条件はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ (ＴａＫａＲａ社製)のプロトコルに従った。
【００５９】
反応サンプル１本あたり、Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｒｏｓｃｈe社製） ２５μＬ、標的遺伝子のＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製） ２.５μＬ、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社製） ２１．５μＬ、ｓａｍｐｌｅ ｃＤＮＡ １μＬとなるよう、それぞれを混合し、７３００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に供した。
【００６０】
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ条件は６０℃で２分間、９５℃で１０分間保持した後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間保持する操作を４０回繰り返した。測定した値はＳｅｒｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍの方法に準じて算出した。内部標準はマウスＧＡＰＤ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。
【００６１】
解析結果は、ＭＭＰ−９遺伝子発現量を内部標準のＧＡＰＤ遺伝子発現量で補正した。グラフは、ＵＶ照射なし（カシス果汁摂取なし）の群の平均値を１とした場合の各群平均値の相対値で表し、検定はt−検定を用いて行った。
【００６２】
ＭＭＰ−９遺伝子発現量の測定結果を図１に示す。
図１に示すとおり、ＵＶ照射されたマウスのＭＭＰ−９遺伝子発現量は、ＵＶ照射されていないマウスの遺伝子発現量と比べて増加する傾向がみられたが、未処理カシス果汁、部分分解カシス果汁または完全分解カシス果汁摂取群においては、ＵＶ照射後のＭＭＰ−９遺伝子発現量の増加が抑制される傾向が確認できた。
【００６３】
実施例４：ヘアレスマウスを用いたＵＶ照射に対するＭＭＰ−９タンパク質発現抑制作用
実施例２で記載したマウス（各群５匹のマウス）から、ＵＶ照射後４日目に背部の皮膚を回収し、速やかに液体窒素にて凍結し、試験に供するまで−８０℃で保存した。
【００６４】
ＰＢＳに最終濃度１０％ＰｈｏｓＳＴＯＰ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｒｏｃｈｅ社製）、４％ｃｏｍｐｌｅｔｅ（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｒｏｃｈｅ社製）を入れた溶液に上記で調製した皮膚を入れ、氷中で冷やしながら、ポリトロンにてホモジナイズした。このサンプルを、１２０００ ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心し、上清を回収し、皮膚タンパク質粗抽出液とした。なお、調製した皮膚タンパク質粗抽出液は試験に供するまで−８０℃で保存した。
【００６５】
上記サンプル０．８ ｍＬにブラッドフォード法タンパク質定量試薬（ＢｉｏＲａｄ社製）を０．２ｍＬずつ添加し、攪拌後室温で１５分静置した。その１５分後に、２ ｍＬのイオン交換水を入れ再度攪拌し、５９５ｎｍ波長にて測定した。なお、定量用のスタンダードは０ｐｐｍから５０ｐｐｍのアルブミン溶液で作製した。
【００６６】
また、上記サンプルを８００ μｇ／ｍＬの濃度に調整し、最終濃度１０％のβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社製）が入っているサンプルバッファーと等量混合し、１０分間、湯せんした。
【００６７】
その後、マルチゲルＩＩミニ１０（第一化学薬品工業社製）の各レーンに総タンパク量として２５ μgずつ添加した。分子量マーカーはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ＰｒｏｔｅｉｎＫａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢｉｏＲａｄ社製）を使用し、泳動バッファーはＴｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社製）を使用して、３５ｍＡの固定電流にて電気泳動を実施した。
【００６８】
泳動後、ゲルをブロッティング バッファー（２５ｍｍｏｌ／ｌトリス、１９２ｍｍｏｌ／ｌ グリシン、１０％  メタノールを含有する）にて洗浄した。
【００６９】
ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を１５秒間１００％  メタノールに浸漬し、次に２分間超純粋水で洗浄を行い、最後に上記ブロッティング バッファーで５分間振盪させて活性化させた。
【００７０】
その後、タンク方式のウェスタンブロッティング法にて、固定電圧が１００Ｖ、４℃の条件でおよそ１時間半程度、ブロッティングを行った。
【００７１】
ウェスタンブロッティング後のメンブレンを、ＴＢＳ バッファー（２０ｍｍｏｌ／ｌ トリス−塩酸 ｐＨ７．６、１３７ｍｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム）で１０分間、３回洗浄した。その後Ｓｕｐｅｒ Ｂｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ｉｎ ＴＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を適量入れ、室温で１時間、振盪した。その後、最終濃度０．１% Ｔｗｅｅｎ−２０を含有したＴＢＳ バッファーにて、室温で１０分間、メンブレンを洗浄した。
【００７２】
１次抗体として、抗β−ａｃｔｉｎ抗体（Ｈ−１９６；ｓｃ−７２１０、ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ＩｇＧ、Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ社製）あるいは、抗ＭＭＰ−９抗体（Ｍ−１７；ｓｃ−６８４１、ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ＩｇＧ、Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ社製）使用した。抗β‐ａｃｔｉｎ抗体は、１：２，０００の希釈率で５％ スキムミルク ｉｎ ＴＢＳ−Ｔバッファーに混合した。
【００７３】
同様に抗ＭＭＰ−９抗体は、１：５００の希釈率で最終濃度５% スキムミルクを含有したＴＢＳ−Ｔバッファーに混合し、これらを４℃で終夜、振盪し抗体反応させた。抗体反応後、ＴＢＳ−Ｔ バッファーにて室温、１０分間、３回洗浄を行った。
【００７４】
２次抗体は、抗ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ＩｇＧ抗体（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＧＯＡＴ ＩｇＧ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ、Ｃａｐｐｅｌ社製）を使用した。
【００７５】
２次抗体は、ＭＭＰ−９の検出には１：１００，０００の希釈率で、β−ａｃｔｉｎの検出には１：２０，０００の希釈率で最終濃度５％ スキムミルクを含有したＴＢＳ−Ｔバッファーに混合しそれぞれ、室温、1時間、振盪し反応させた。反応後、ＴＢＳ−Ｔ バッファーにて十分に洗浄を行った。
【００７６】
検出には、ＭＭＰ−９はＥＣＬ ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を、β−ａｃｔｉｎはＥＣＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を使用した。
【００７７】
詳細な方法は、キットのプロトコルに従った。また、Ｘ線フィルムはＨｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｆｉｌｍ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ、カセットはＨｙｐｅｒｃａｓｓｅｔｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を使用し、現像液（富士フィルム社製）、定着液（富士フィルム社製）にて検出した。
【００７８】
検出したバンドは、Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いて画像処理を行い、数値化した。解析結果は、数値化した各々のＭＭＰ−９タンパク質量を内部標準のβ−ａｃｔｉｎタンパク質量で補正した。グラフは、補正後のＵＶ照射なし（カシス果汁摂取なし）の群の平均値を１とした場合の各群平均値の相対値で表し、検定はｔ−検定を用いて行った。
【００７９】
ＭＭＰ−９タンパク質発現量の測定結果を図２に示す。
図２に示すとおり、ＵＶ照射されたマウスのＭＭＰ−９タンパク質発現量は、ＵＶ照射されていないマウスのタンパク質発現量と比べて増加する傾向がみられたが、未処理カシス果汁、部分分解カシス果汁または完全分解カシス果汁摂取群においてはＵＶ照射後のＭＭＰ−９タンパク質発現量の増加が抑制される傾向が確認できた。
【００８０】
実施例５：ＵＶ照射したヘアレスマウス皮膚におけるＭＭＰ−９の活性の測定
実施例４で調製した、各群の皮膚タンパク質粗抽出液１５μｇをゼラチンザイモ電気泳動キット（株式会社  プライマリーセル）を用いてゼラチンザイモグラフィ法に供した。実験の詳細な方法は、キットのプロトコルに従った。
【００８１】
電気泳動後、染色したゲル像をスキャナーにて取り込み、ＮＩＨ ｉｍａｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅにて解析した。活性は、ＵＶ照射されていないマウス（カシス果汁摂取なし）の皮膚におけるＭＭＰ−９活性の平均値を1とした時の相対活性として求めた。各群の値の統計学的処理は、ｔ-検定を用いた。
【００８２】
各群のおけるＭＭＰ−９活性を比較したものを図３に示した。
図３に示すとおり、ＵＶ照射されたマウスの皮膚ではＵＶ照射されていないマウスの皮膚と比較してＭＭＰ−９活性が増大する傾向が確認できた。未処理カシス果汁、部分分解カシス果汁または完全分解カシス果汁摂取群においてはＵＶ照射後のＭＭＰ−９活性の増大が抑制される傾向が確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明により、容易に入手可能なカシス果実を原料として、ＭＭＰ−９抑制剤を提供することができる。また、本発明はＭＭＰ−９抑制作用を通じて、癌、リューマチ様関節炎、自己免疫疾患、歯周炎、組織潰瘍形成、動脈硬化症、動脈瘤、及び心不全等を治療、改善、抑制および／または予防するための新たな化粧品、医薬組成物、美容食品・健康食品などとして利用されることが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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