(57)【要約】【課題】ヘリコバクター・ヘパティカスの抗体を簡便かつ高精度に検出できる検出方法及び検出用キット、並びに該検出方法に用いるヘリコバクター・ヘパティカスのヒストン様ＤＮＡ結合たんぱく質の精製方法を提供する。【解決手段】配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる、ヘリコバクター・ヘパティカスのヒストン様ＤＮＡ結合たんぱく質が固定化された担体を用い、検体中にヘリコバクター・へパティカスの抗体が含まれるかどうかを判定する工程を含む、ヘリコバクター・へパティカスの検出方法。ハイブリドーマＨＲＩＩ５１から得られたモノクローナル抗体又はハイブリドーマＨＲ６３（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６１６）から得られたモノクローナル抗体がカップリングされた抗体結合担体を用いる、上記ヒストン様ＤＮＡ結合たんぱく質の精製方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる、ヘリコバクター・ヘパティカスのヒストン様ＤＮＡ結合たんぱく質が固定化された担体を用い、検体中にヘリコバクター・へパティカスの抗体が含まれるかどうかを判定する工程を含む、ヘリコバクター・へパティカスの検出方法。
【請求項２】
検体が、血清、尿、胆汁、涙液、腹水、唾液及び精液から選ばれる体液より選択されたひとつ以上である請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
判定手法が、酵素免疫測定法、イムノクロマトグラフィまたはイムノブロティング法である請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
ヘリコバクター・ヘパティカスのヒストン様ＤＮＡ結合たんぱく質が、固定化された担体を有するヘリコバクター・へパティカスの抗体の検出キット。
【請求項５】
ハイブリドーマＨＲＩＩ５１から得られたモノクローナル抗体又はハイブリドーマＨＲ６３（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６１６）から得られたモノクローナル抗体がカップリングされた抗体結合担体を用いる、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる、ヘリコバクター・ヘパティカスのヒストン様ＤＮＡ結合たんぱく質の精製方法。
【請求項６】
ヘリコバクター・ヘパティカスを破砕するステップ（１）、
前記ステップ（１）より得られた破砕物を抗体結合担体に接触させ、前記ヒストン様ＤＮＡ結合たんぱく質を吸着させるステップ（２）、及び、
前記ステップ（２）において吸着させたヒストン様ＤＮＡ結合たんぱく質を溶出するステップ（３）を含む請求項５に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘリコバクター・へパティカスの検出方法、及び検出キット、並びにヘリコバクター・ヘパティカスのヒストン様ＤＮＡ結合たんぱく質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクター・ヘパティカス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｈｅｐａｔｉｃｕｓ）はマウスの肝臓から分離された最初の腸肝ヘリコバクター（Ｅｎｔｅｒｏｈｅｐａｔｉｃ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）であり（非特許文献１）、感染マウスでは慢性活動性肝炎から肝癌へと進展することが認められている（非特許文献２）。さらに、該菌が大腸や盲腸に感染すると、炎症性腸疾患と類似した炎症像を呈し、胆石症などを誘発・促進することも報告されている（非特許文献３、非特許文献４）。
【０００３】
また、ヒトにおいては、胆道癌、肝癌を含む胆道、肝疾患において該菌の感染が強く関与することが示唆されている（非特許文献５、非特許文献６）。即ち、発癌リスクを回避するという点で、該菌の検出診断は胆道、肝疾患の病因解明と治療において極めて重要である。
【０００４】
しかし、ヒト検体からの該菌の分離培養が成功していないことから、決定的な病原性が証明されていない。従って、ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔなどの手法やこれらを組み合わせた方法によって該菌の感染者や保菌者の診断を行っている。これらの方法は一長一短がありＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔはマススクリーニングに不適である。また、現状では、特許文献１に記載されたヘリコバクター・ヘパティカスの特異的モノクローナル抗体（ＨＲＩＩ−５１など）を用いた方法を超える高感度で特異性の高い簡便な測定法は存在しない。
【０００５】
該測定法はモノクローナル抗体を使用したＤｏｕｂｌｅ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ法であることから、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ法に比較して１操作が多く若干煩雑である。また、Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ法では、使用するモノクローナル抗体の安定性が必ずしも高くない。さらに、Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ法では、使用するモノクローナル抗体をプレートに固相化した後、これに対応するヘリコバクター・ヘパティカスの特異抗原を捕獲させるが、そのため、該菌の超音波破砕液をそのプレートに塗布する。このとき、特異抗原以外のタンパク質も僅かに付着するという課題も存在する。よって、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ法が望まれているものの、高純度な特異抗原の精製が成功していないことから、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ法が実現できないのが現状である。
【０００６】
このように、該菌の病原性について警鐘があるにも関わらず、ヘリコバクター・ヘパティカスの保菌の有無（ヘリコバクター・ヘパティカスの血清、尿、唾液、涙液などからの抗体の有無）を簡易かつ高精度に検出する手法が、未だ確立されていない。特に、マススクリーニングによる疫学的調査の必要性から、このような手法の開発が強く望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−２３２１６４
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９９４；３２：１２３８−１２４５
【非特許文献２】Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １９９６；６４：１５４８−１５５８
【非特許文献３】Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １９９７；６５：３１２６−３１３１．
【非特許文献４】Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００５；１２８：１０２３−１０３３
【非特許文献５】Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９９８；１１４：７５５−７６３．
【非特許文献６】Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００１；１２０：３２３−３２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記課題を解決し、ヘリコバクター・ヘパティカスの抗体を簡便かつ高精度に検出できる検出方法及び検出用キットを提供すること、並びに該検出方法に用いることができるヘリコバクター・ヘパティカスのヒストン様ＤＮＡ結合たんぱく質の精製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ヘリコバクター・へパティカスを培養し、特異抗原の分離精製に初めて成功し、その抗原タンパク質を利用した直接法により、従来の方法よりも簡便かつ高精度にヘリコバクター・ヘパティカスの保菌（本菌の抗体）を検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる、ヘリコバクター・ヘパティカスのヒストン様ＤＮＡ結合たんぱく質（以下、ＨＤＢＰともいう。本ＨＤＢＰのアミノ酸配列は既にＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に登録されている）が固定化された担体を用い、検体中にヘリコバクター・へパティカスの抗体が含まれるかどうかを判定する工程を含む、ヘリコバクター・へパティカスの検出方法に関する。
【００１２】
検体が、血清、尿、胆汁、涙液、腹水、唾液及び精液から選ばれる体液より選択されたひとつ以上であることが好ましい。
【００１３】
判定手法が、酵素免疫測定法、イムノクロマトグラフィまたはイムノブロティング法であることが好ましい。
【００１４】
また、本発明は、ヘリコバクター・ヘパティカスのヒストン様ＤＮＡ結合たんぱく質が固定化された担体を有するヘリコバクター・へパティカスの抗体の検出キットに関する。
【００１５】
また、本発明は、ハイブリドーマＨＲＩＩ５１から得られたモノクローナル抗体又はハイブリドーマＨＲ６３（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６１６）から得られたモノクローナル抗体がカップリングされた抗体結合担体を用いる、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる、ヘリコバクター・ヘパティカスのヒストン様ＤＮＡ結合たんぱく質の精製方法に関する。
【００１６】
上記精製方法は、ヘリコバクター・ヘパティカスを破砕するステップ（１）、上記ステップ（１）より得られた破砕物を抗体結合担体に接触させ、上記ヒストン様ＤＮＡ結合たんぱく質を吸着させるステップ（２）、及び、上記ステップ（２）において吸着させたヒストン様ＤＮＡ結合たんぱく質を溶出するステップ（３）を含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の検出方法及び検出キットによれば、特定の抗原（ＨＤＢＰ）を利用したＤｉｒｅｃｔ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ法を利用するので、ヘリコバクター・ヘパティカスの保菌（ヘリコバクター・ヘパティカスの抗体）の有無を簡便かつ高精度に検出できる。また、本発明の精製方法によれば、特定の抗原（ＨＤＢＰ）を高純度に精製できるため、上記検出方法、検出キットによる簡便かつ高精度な検出を確立できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＨＤＢＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、ヒト胆疾患者の胆汁のヘリコバクター・ヘパティカスのＰＣＲ分析の結果を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、患者Ｎｏ．７の血清をプローブとしたヘリコバクター・ヘパティカス菌体のＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｏｔのプロフィールを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明に係るヘリコバクター・へパティカスの検出方法は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる、ヘリコバクター・ヘパティカスのヒストン様ＤＮＡ結合たんぱく質（以下、ＨＤＢＰともいう）が固定化された担体を用い、検体中にヘリコバクター・へパティカスの抗体が含まれるかどうかを判定する工程を含む。
【００２０】
本発明の検出方法では、配列表１で表されるアミノ酸配列からなるＨＤＢＰが使用される。これにより、ヘリコバクター・ヘパティカス感染個体で生産される抗体（ヘリコバクター・ヘパティカスの抗体）を高精度に検出できる。これは、以下のように推測される。
ＨＤＢＰは、ヘリコバクター・ピロリのタンパク質（以下、ピロリ抗原ともいう）との相同性が低く、該ピロリ抗原と共通したエピトープ（抗原決定基）を有さない可能性が高い。ピロリ抗原に結合する抗体はＨＤＢＰに結合せず、ＨＤＢＰに結合する抗体と、ピロリ抗原に結合する抗体とが峻別されるため、ＨＤＢＰに結合する抗体（ヘリコバクター・へパティカスの抗体）のみを検出できる確率が高い。
【００２１】
ＨＤＢＰとしては、ヘリコバクター・ヘパティカスから単離したもの、化学合成によるもの、および遺伝子組換え法により製造したものを使用できる。なかでも、本来の立体構造（３次元構造）の維持や構成アミノ酸残基の修飾の相違などの点から、ヘリコバクター・ヘパティカスから単離したものを使用することが好ましい。
【００２２】
ＨＤＢＰを単離する場合、ＨＤＢＰを高度に精製できるという点から、後述の精製方法により精製したものが好ましい。
【００２３】
ＨＤＢＰは、部分精製品、高純度精製品であっても使用できる。なかでも、高純度精製品が用いられることが好ましい。高純度精製品を得るためには、ハイブリドーマＨＲＩＩ５１から得られたモノクローナル抗体（ＨＲＩＩ５１抗体）を用いた免疫アフィニティクロマトグラフィーで精製することが考えられえるが、通常知られている方法では極めて精製困難である。アフィニティクロマトグラフィー担体の作成法とＨＤＢＰの溶出方法が最も重要である。高純度のＨＤＢＰは、後述のＨＤＢＰの精製方法により得られる。
なお、本明細書では、高純度精製品とは、ＨＤＢＰについてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った結果が、単一のバンドである場合をいう。
【００２４】
本発明で使用する検体としては、ヒト、及びマウス、ウサギ、ラットなどの哺乳動物等から得られた体液等が挙げられる。体液としては、血清、尿、胆汁、涙液、胆汁、腹水、唾液及び精液等が挙げられる。更に、臓器抽出液でも可能なこともある。
【００２５】
ＨＤＢＰを固定化する方法としては、公知の手段で固定化でき、物理的、化学的に固定化できる。
【００２６】
ヘリコバクター・へパティカスの抗体が含まれるかどうかを判定する工程では、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ：Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）、イムノブロッティング法（ウエスタンブロッティング法）、イムノクロマトグラフィ法、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）等の判定手法を利用することができる。また、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、電気泳動法も挙げられる。なかでも、簡便かつ高精度に検出できるという点から、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマトグラフィ法、イムノブロッティング法が好ましく、ＥＬＩＳＡ法がより好ましい。
【００２７】
上記各判定手法において、本発明では、直接法（ＨＤＢＰが固定化された担体を用いる方法）により、ヘリコバクター・ヘパティカスの抗体を検出できる。
【００２８】
上記直接法としては、ＨＤＢＰが固定化された担体に、検体及び標識剤で標識した二次抗体（以下、標識二次抗体ともいう）を加える。その後、担体上に保持された二次抗体の標識剤の活性、又は該標識剤の色変化を検出する。
【００２９】
ＨＤＢＰを担体に固定化する場合、蛋白質濃度は好ましくは、例えば、ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートならば１μｇ／１ｗｅｌｌ以上が好ましい。温度として、１℃以上、３０℃以下が好ましい。時間として、１〜２４時間、好ましくは８時間以上が適切である。使用できる担体として、マイクロプレート、イムノクロマトグラフィ用濾紙（ニトロセルロース）、グラスフィルター等の不溶性担体が上げられる。なかでも、本発明の判定手法がＥＬＩＳＡ法を利用する場合、マイクロプレートが好ましく、イムノクロマトグラフィ法、イムノブロッティング法を利用する場合は、ニトロセルロースが好ましい。
【００３０】
使用できる二次抗体としては、検体の生物種が生産する抗体を認識するものであれば、特に限定されない。例えば、検体がマウス由来である場合、マウスのＩｇＧ抗体を認識する抗体を使用できる。二次抗体が認識する抗体のクラスとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡなどが挙げられる。なかでも、感染侵入微生物に対する普遍的かつ特異性の高い抗体であるという理由からＩｇＧが好ましい。
【００３１】
上記標識剤としては、１２５Ｉ等の放射性同位元素（以下、ＲＩと記す）、酵素、酵素基質、発光物質、蛍光物質、ビオチン、着色物質等が挙げられる。これら標識剤と抗原又は抗体との結合には、マレイミド法［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７６），７９，２３３］、活性化ビオチン法［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９７８），１００，３５８５］、疎水結合法等が用いられる。
【００３２】
上記酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等を挙げることができる。この際用いる基質としては、選択した酵素に適したものを選べばよく、例えば、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ルミノール−Ｈ２Ｏ２、ｏ−フェニレンジアミン−Ｈ２Ｏ２（ペルオキシダーゼ用）、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、メチルウンベリフェリルホスフェート、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’’−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（アルカリホスファターゼ用）、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトース、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトース（β−ガラクトシダーゼ用）等を挙げることができる。
【００３３】
標識剤の活性の検出方法としては、標識剤が酵素やビオチンである場合、基質を加えて放置し、比色法又は蛍光法により酵素活性を測定・検出できる。上記標識剤がＲＩ、蛍光物質、発光物質、着色物質である場合、それぞれ公知の方法に従って測定・検出できる。
【００３４】
本発明の判定工程（ヘリコバクター・へパティカスの抗体が含まれるかどうかを判定する工程）は、通常、標識剤の活性又は該標識剤の色変化の検出結果に基づき、判定する工程を含む。この場合、本発明の判定工程が、検出結果と基準範囲（設定値）とに基づいて判定する工程であることが好ましい。
【００３５】
本発明の判定工程が、検出結果と基準範囲とに基づいて判定する工程である場合、該基準範囲は、複数の個体（感染個体と健常個体）から採取した検体に含まれる抗ＨＤＢＰ抗体を測定し、その測定値に基づいて設定されることが好ましい。
【００３６】
検体がヒト由来である場合、通常、基準範囲の設定に際し、健常個体（非感染個体）が特定される。ヒト健常個体を特定する方法としては、ヒトから得た検体中にヘリコバクター・ヘパティカスのｃＤＮＡ産物を検出する方法、ヘリコバクター・ヘパティカスのタンパク質を検出する方法などが挙げられる。これらの方法が行われる場合、ｃＤＮＡ産物又はタンパク質が検出された個体が、保菌個体として特定される。また、検出されなかった固体が、健常個体として特定される。
【００３７】
検体がヒト以外に由来する場合、通常、ヘリコバクター・ヘパティカスに感染または免疫された動物（被免疫動物）を感染個体として、そうでない動物を健常個体として特定される。
【００３８】
また上記被免疫動物を免疫する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、マウスを免疫する場合、１回に１〜１００μｇの免疫用抗原を同容量の生理食塩水およびフロイントの完全アジュバント等で乳化して、上記被免疫動物背部、腹部の皮下又は腹腔内に２〜７週ごとに３〜６回接種する方法等を挙げることができる。
【００３９】
抗ＨＤＢＰ抗体量の測定は、上述の方法に従って行うことができる。測定値からの基準範囲の設定は、当業者であれば適切に設定することができるが、例えば、測定値の（平均値ｓ×標準偏差：ｓ＝１、２、３）とする。このようにして設定した基準範囲と、被検者の検体における抗ＨＤＢＰ抗体量の測定値とを比較する方法としては、当業者に公知の方法を用いることができるが、好ましくは上記基準範囲に基づいて決定したカットオフ値と比較する方法を用いる。この場合、被検者検体の測定値がカットオフ値よりも高ければ、その被検者はヘリコバクター・ヘパティカスに感染している可能性が高いと判断される。
【００４０】
本発明に係るヘリコバクター・へパティカスの抗体の検出キットは、ヘリコバクター・ヘパティカスのヒストン様ＤＮＡ結合たんぱく質（ＨＤＢＰ）が、固定化された担体を有する。これにより、簡易かつ迅速な検出が可能となる。上記検出キットとしては特に限定されず、例えば、カセット型、カートリッジ型等を挙げることができる。
【００４１】
上記カセット型の態様としては、例えば、イムノクロマトグラフィ法を用い、反応カセット内にメンブレン（担体）が収納されており、そのメンブレン上の一端（下流側）にはＨＤＢＰが固相化されており、メンブレン上の逆の一端（上流側）には、展開液が装着されており、その近傍の下流側には、上記標識剤の基質が添加されたパッドが配置されており、メンブレンの中間部には標識二次抗体が添加されたパッドが配置されている態様等を挙げることができる。
【００４２】
本発明のＨＤＢＰの精製方法は、ハイブリドーマＨＲＩＩ５１から得られたモノクローナル抗体（ＨＲＩＩ５１抗体）又はハイブリドーマＨＲ６３（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６１６）から得られたモノクローナル抗体（ＨＲ６３抗体）がカップリングされた抗体結合担体を用いる精製方法である。
【００４３】
ＨＲＩＩ５１抗体、ＨＲ６３抗体をカップリングする形態としては、例えば、上記抗体結合担体に用いる担体（支持担体）の固定化用官能基に、ＨＲＩＩ５１抗体、ＨＲ６３抗体を、直接又はスペーサーアームを介してカップリングする。なかでも、ＨＤＢＰを良好に吸着・精製できるという点から、スペーサーアームを介してカップリングすることが好ましい。
【００４４】
上記支持担体としては、通常合成あるいは天然由来の不溶性物質が用いられ、たとえばセルロース、アガロース、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、多孔性ガラスなどが用いられる。
上記固定化用官能基としては、−ＯＨ基、−ＣＯＯＨ基、−ＮＨ２基、エポキシ基などが挙げられる。
上記スペーサーアームとしては、アミノカプロン酸などのアミノ脂肪酸類、６−アミノ−１−ヘキサノールなどのアミノ脂肪族アルコールなどが挙げられる。
【００４５】
スペーサーアームとして上記アミノ脂肪族アルコール、６−アミノ−１−ヘキサノールを用いる場合、上記アミノ脂肪族アルコール、６−アミノ−１−ヘキサノールの水酸基がエポキシ化される（エポキシ基を有する）ことが好ましい。これにより、ＨＲＩＩ５１抗体、ＨＲ６３抗体を良好にカップリングできる。
エポキシ化はエピクロロヒドリンを用いる方法などにより行うことができる。この場合、エピクロロヒドリン(ＣｌＣＨ２ＣＨ(Ｏ)ＣＨ２)によって、水酸基（Ｒ−ＯＨ）をＲ−ＯＣＨ２ＣＨ(Ｏ)ＣＨ２に活性化することで、一級アミン（Ｒ’−ＮＨ２）と反応させ、Ｒ−ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ’を形成できる。スペーサーアームが６−アミノ−１−ヘキサノール(ＮＨ２−(ＣＨ２)６−ＯＨ)である場合、エピクロロヒドリンによって、支持担体（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂなど）−Ｏ−ＮＨ−(ＣＨ２)６−ＯＨの−ＯＨが活性化される。これにより、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｏ−ＮＨ−(ＣＨ２)６−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ(Ｏ)ＣＨ２（活性化セファロース）となり、ここにモノクローナル抗体（ＭＡｂ）（ＨＲＩＩ５１抗体、ＨＲ６３抗体）のアミノ基(ＭＡｂ−ＮＨ２)が反応して、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ−Ｏ−ＮＨ−(ＣＨ２)６−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２−ＮＨ−ＭＡｂとなる。
エピクロロヒドリンを用いて水酸基をエポキシ化する方法としては、例えば、６−アミノ−１−ヘキサノールがカップリングされた上記支持担体に、エピクロロヒドリンと水酸化ナトリウムなどのアルカリとを混合添加し、５〜１２時間（好ましくは８時間）、室温（２５度前後）で攪拌することにより行うことができる。
【００４６】
上記支持担体とスペーサーアームをカップリングする方法としては、特に限定されず、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、ビスオキシラン（例えば、１，４−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ  ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｓｔｈｅｒ）、トレシルクロライド（Ｔｒｅｓｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、カルボニルジイミダゾールを用いる方法など挙げられるが、カルボニルジイミダゾールを用いる方法が好適である。
【００４７】
本発明のＨＤＢＰの精製方法は、ＨＲＩＩ５１抗体又はＨＲ６３抗体がカップリングされた抗体結合担体を用いるものであれば特に限定されないが、通常、ヘリコバクター・ヘパティカスを破砕するステップ（１）、上記ステップ（１）より得られた破砕物を抗体結合担体に接触させ、ＨＤＢＰを吸着させるステップ（２）、及び、上記ステップ（２）において吸着させたＨＤＢＰを溶出するステップ（３）を含む。
【００４８】
（ステップ１）
ヘリコバクター・ヘパティカスは、インビボでは容易に増殖するにもかかわらず、インビトロで培養することが極めて難しい細菌である。インビトロでの培養条件としては、馬血液寒天培地に該菌を塗布した後、炭酸ガス濃度を１０％〜１５％の環境内で３７℃で３〜４日間培養するのが好ましい。
【００４９】
ヘリコバクター・ヘパティカスを破砕する方法としては、特に限定されず、従来公知の方法で破砕できる。例えば、超音波処理やガラスビーズ破砕の様な物理的破砕法やリゾチームの様な溶菌酵素を用いる方法などが挙げられる。
【００５０】
（ステップ２）
得られた破砕物を上記抗体結合担体に接触させ、ＨＤＢＰを吸着させる方法としては、特に限定されないが、上記破砕物を含有する緩衝液（破砕物含有液）を上記抗体結合担体が充填されたカラムに通液する方法が好適である。ここで、上記緩衝液としては、通常、公知のリン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）が使用される。
なお、上記破砕物含有液は、ＨＤＢＰを上記抗体結合担体が充填されたカラムに通液される前に、リガンドとしてリジン（Ｌｙｓｉｎｅ）を有する担体（群特異的アフィニティークロマトグラフィー担体）などに接触しておくことが好ましい。これにより、ＨＤＢＰを良好に精製できる。
【００５１】
具体的には、ＨＲＩＩ５１抗体を支持担体１ｍＬ当たり１〜１０マイクロモル結合させた担体（抗体結合担体）１ｍＬに、ヘリコバクター・ヘパティカス（ＯＤ６２０ｎｍ＝１．０〜２．０）の超音波破砕液を適切な樹脂（リジンを有する担体）などで部分的に処理し部分精製した液を吸着させることなどにより行うことができる。
【００５２】
（ステップ３）
吸着させたＨＤＢＰを溶出する方法としては、特に限定されず、例えば、ＨＤＢＰを吸着させた上記抗体結合担体を低濃度（例えば、０．０１％以下）の界面活性剤を含む上記リン酸緩衝液で十分に洗浄した後、溶出液でＨＤＢＰを溶出する方法などが挙げられる。
【００５３】
上記界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好ましく、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｐ−ｉｓｏｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ）などが挙げられる。
上記溶出液としては、ＨＤＢＰを溶出できるものであれば特に限定されないが、０．５〜１ＭのＮａＣｌなどの塩、０．０５〜２．０％の界面活性剤（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）など）を含むＧｌｙｃｉｎ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ３．０〜８．０）を好適に使用できる。
なお、溶出分離したＨＤＢＰをゲル濾過法で可能な限り界面活性剤を除去することが、ＥＬＩＳＡプレートに固定化する点で望ましい。
【実施例】
【００５４】
以下に、実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００５５】
エポキシ化６−ａｍｉｎｏ−１−ｈｅｘａｎｏｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂの作製：
高橋らの報告に従い、１，１’−ｃａｒｂｏｎｙｌｄｉｉｍｉｄａｚｏｌｅを用いて活性化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）に６−ａｍｉｎｏ−１−ｈｅｘａｎｏｌを６−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄのカップリング方法と同様の手法で結合した（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｕｒｉｎｅ，  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  ７４２  (２０００)  ７１−７８．）。
十分水洗した１ｇ（湿重量）の６−ａｍｉｎｏ−１−ｈｅｘａｎｏｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂに１ｍＬのＥｐｉｃｈｌｏｒｏｈｙｄｒｉｎと１ｍＬの０．６ＭＮａＯＨを混合添加し、８時間、室温（２５度前後）で攪拌し、続いて、約５００ｍＬの蒸留水で活性化６−ａｍｉｎｏ−１−ｈｅｘａｎｏｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂをグラスフィルター上で蒸留水―０．１Ｎ  ＮａＯＨ―蒸留水―０．１Ｎ  ＨＣＬ―蒸留水の順で各々５００ｍＬで洗浄し、６−ａｍｉｎｏ−１−ｈｅｘａｎｏｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂの水酸基をエポキシ化した。
【００５６】
ヘリコバクター・ヘパティカス抗原の単離精製：
ヘリコバクター・ヘパティカスＡＴＣＣ５１４４９またはＡＴＣＣ５１４４８を福田らの報告に従って培養した（特許文献１及びＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ２００９：１４；６６−７１）。ヘリコバクター・ヘパティカスＡＴＣＣ５１４４９またはＡＴＣＣ５１４４８（以下、本菌という）を集菌後、高橋らの報告（日本ヘリコバクター学会誌２００９：１０（２）；６７−７２）に従いＨＤＢＰを精製した。
【００５７】
即ち、本菌約１０ｍｇ（湿重量）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２５ｍＬに懸濁し超音波破砕（３ｍｉｎ  ｘ  ５回）後、高速遠心分離（４℃、１００００ｇ，２０ｍｉｎ）して上清２０ｍＬを得た。０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したε−ｐｏｌｙＬｙｓｉｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（自己調製）１０ｍＬカラム（１．０  ｘ  １２．７  ｃｍ）に吸着し、同緩衝液で洗浄後、０．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含む０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ３．０）でＨＤＢＰ画分を溶出した。続いて、エポキシ化６−ａｍｉｎｏ−１−ｈｅｘａｎｏｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂに特許文献１記載の本菌のモノクローナル抗体ＨＲＩＩ５１（ＨＲＩＩ５１抗体）をマニュアルに従ってカップリングし、Ｉｍｍｕｎｏ−ａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ用担体を作成した。このＡｆｆｉｎｉｔｙ担体１ｍＬを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．００１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００を含む）で平衡化し、先のＨＤＢＰ画分を吸着した。吸着後、０．１Ｍ  ＮａＣｌ，０．００１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄し、洗浄液のＯＤ２８０ｎｍの吸収が０．０１以下まで洗浄した。続いて０．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．２％Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）を含む０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ３．０）でＨＤＢＰ画分を溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、得られたＨＤＢＰ画分が単一たんぱく質であることを確認した（図１）。
【００５８】
ヘリコバクター・ヘパティカス抗原の構造解析：
得られたＨＤＢＰ画分２μｇをＰｒｏｓｉｃｅ  ４９４  ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）で分析した。その結果、ＨＤＢＰ画分は、配列番号（記号順）１であらわされるアミノ酸配列を有し、ヘリコバクター・ヘパティカスの分子量１０２９７のＨｉｓｔｏｎｅ  ｌｉｋｅ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＨＤＢＰ）であることを確認した。ＨＤＢＰは、本菌独自のアミノ酸配列（一次構造）を有し、例えば、ヘリコバクター・ピロリのＨｉｓｔｏｎｅ  ｌｉｋｅ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎとの相同性は僅か６８％である。
なお、ＨＲＩＩ５１抗体の代わりに、ハイブリドーマＨＲ６３（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６１６）から得られたモノクローナル抗体（ＨＲ６３抗体）を用いた場合でも、ＨＤＢＰが得られたことを確認した。
【００５９】
（実施例１）ヘリコバクター属感染マウス血清からの感染診断
得られたＨＤＢＰを５μｇ／ｍＬ  ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）に溶解し、ＥＬＩＳＡプレート（Ｍｅｄｉｓｏｒｐ、ＮＵＮＣＴｍ）１  ｗｅｌｌあたり１００μＬを添加し、４℃、１７時間静置して精製ＨＤＢＰを固定化した。次に、５％アマルティ／０．５％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）液２００μＬ／ｗｅｌｌ添加して２時間静置し、続いて同プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳで３回洗浄してＨＤＢＰ−ｐｌａｔｅを作成した。ヘリコバクター・ピロリ、ヘリコバクター・ビリス、ヘリコバクター・ヘパティカスをそれぞれマウスに接種してヘリコバクター属菌の感染マウスモデルを作成した（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ２００９：１４；６６−７１：ｐ６８）。感染マウスから得た血清を１％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ液で２００倍希釈し、その希釈血清液をＨＤＢＰ−ｐｌａｔｅのＷｅｌｌあたり１００μＬを添加した（１００μＬ／ｗｅｌｌ）。２時間後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳでＰｌａｔｅを３回洗浄し、続いて１％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで６０００倍希釈した抗マウス  ＩｇＧ  ＨＲＰ  （ＨＲＰ−ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ＩｇＧ，  Ｚｙｍｅｄ社）  液１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間加温して、更に０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳでＰｌａｔｅを３回洗浄し、ＴＭＢ液  （３，３’，５，５’Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，  ＢｉｏＦＸ社、ＭＤ，  ＵＳＡ）  を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、適度な発色を呈する時間（約３分後）に２Ｎ硫酸液１００μＬ／ｗｅｌｌを加えて反応を終了した。発色度合いを４５０／６６０ｎｍの波長で測定した。結果を表１に示す。
【００６０】
【表１】
2012068034.tif 000003
【００６１】
ヘリコバクター・ヘパティカス陰性個体３０匹に対する特異度は９６．７％であった。また、ヘリコバクター・ヘパティカス陽性個体１０匹に対する感度は８０％であった。
【００６２】
（実施例２）ヒト肝疾患者のヘリコバクター・ヘパティカス感染の診断
インフォームド・コンセントで了承を得られた胆道結石患者（弘前患者Ｎｏ．７）の胆汁よりＤＮＡを抽出し、Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒにＧＣＡＴＴＴＧＡＡＡＣＴＧＴＴＡＣＴＣＴＧ、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒにＣＴＧＴＴＴＴＣＡＡＧＣＴＣＣＣＣ（Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ２００３；７１（６）：  ３６６７−３６７２）を用いたＰＣＲ  を行いヘリコバクター・ヘパティカスのｃＤＮＡ産物（４１７ｂｐ）を確認した（図２Ａ）。
【００６３】
更に、この胆道結石患者の血清にヘリコバクター・ヘパティカスのＨＤＢＰに対する抗体が存在するかどうかを、患者血清をプローブとしてヘリコバクター・ヘパティカス菌体のＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ２００９：１４；６６−７１：ｐ６７）で確認したところ、ＨＤＢＰモノクローナル抗体ＨＲＩＩ−５１と反応する抗原（ＨＤＢＰ）と一致する位置１５  ｋＤａにバンドを見出した（図２Ｂ）。即ち、この胆道結石患者は胆管にヘリコバクター・ヘパティカスに感染し、更に宿主の免疫反応によって血清抗体が産生されていることから、ヘリコバクター・ヘパティカスの保菌者の可能性が非常に高い。この胆道結石患者をヘリコバクター・ヘパティカス感染陽性者として実施例１で作成したＨＤＢＰ−ｐｌａｔｅで実施例１と同様の手法で分析した。但し、ＨＲＰ標識抗体はＰｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ／ＨＲＰ  （ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いた。結果を表２に示す。ヘリコバクター・ヘパティカス感染の陰性者は上記と同様のＰＣＲとＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔによってヘパティカスＤＮＡや抗原が確認されなかった健常者の血清を用いた。
【００６４】
【表２】
2012068034.tif 000004
【００６５】
（実施例３）胆道癌、膵癌患者のヘリコバクター・ヘパティカス感染の診断
実施例２と同様のＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔでＨＤＢＰバンドが認められ、インフォームド・コンセントで承認を得た胆道癌患者（６名）、膵癌患者（２名）の血清を用いて実施例２と同様の方法でＥＬＩＳＡ分析を行った。その結果を表３に示す。これにより、胆道癌患者及び膵癌患者の血清は、健常者のそれに比較して有意に高い抗体価が認められた。
【００６６】
【表３】
2012068034.tif 000005
【００６７】
（実施例４）消化器疾患者のヘリコバクター・ヘパティカス感染の診断
インフォームド・コンセントを実施し承認を得られた消化器疾患患者１５７名（疾患名は表４）の血清を１％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ液で２００倍希釈し、その希釈血清液をＨＤＢＰ−ｐｌａｔｅにＷｅｌｌあたり１００μＬを添加した（１００μＬ／ｗｅｌｌ）。２時間後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳでＰｌａｔｅを３回洗浄し、続いて１％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで６０００倍希釈したＰｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ／ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ  ａｎｄ  Ｂｅｔｈｙｌ，  ＵＳＡ）液１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間加温して、更に０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳでＰｌａｔｅを３回洗浄し、ＴＭＢ液（３，３’，５，５’Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，  ＢｉｏＦＸ社、ＭＤ，  ＵＳＡ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、適度な発色を呈する時間（約３分後）に２Ｎ硫酸液１００μＬ／ｗｅｌｌを加えて反応を終了した。発色度合いを４５０／６６０ｎｍの波長で測定した。その結果、表４から明らかなように肝疾患者が上部、下部消化管疾患者や膵疾患者に比較して有意に高いＥＬＩＳＡ値を認めた。ヒト健常者の血清をヘリコバクター・ヘパティカス菌体で吸収処理して得られたヘリコバクター・ヘパティカス感染偽陰性血清を用いてＨＤＢＰ−ｐｌａｔｅで同様に測定して得たＥＬＩＳＡ値から求めたＣｕｔ−ｏｆｆ値０．３２５以上をヘリコバクター・ヘパティカス感染陽性と判断し、０．３２５以下を陰性者として各疾患群の有意差検定（ｐ）を行った。その結果を表５に示した。肝疾患群は上部、下部消化管疾患群、胆道疾患群、膵疾患群に対してヘリコバクター・ヘパティカス感染が有意に高いことを認めた。その中でも、肝硬変患者の陽性率は６５％にものぼった。更に、ＨＢＶ、ＨＶＣ感染者（混合感染も含む）の６４．０％がヘリコバクター・ヘパティカス感染が陽性であった（表６）。
【００６８】
【表４】
2012068034.tif 000006
【００６９】
【表５】
2012068034.tif 000007
【００７０】
【表６】
2012068034.tif 000008
【００７１】
以上、実施例１〜４の結果からＨＤＢＰを用いたヘリコバクター・ヘパティカスの感染診断が可能と考えられる。更に、実施例４の結果からＨＤＢＰの抗血清の上昇は肝疾患の指標及びその増悪指標としても応用できる可能性がある。従って、ヘリコバクター・ヘパティカスのＨＤＢＰは、臨床上極めて有益な診断に活用できる。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明は上述の構成よりなるので、体液を検体として用い、胆道癌、肝癌を含む胆道、肝疾患の診断に応用できる、ヘリコバクター・ヘパティカスの感度のよい検出方法を提供することができる。
【図１】
2012068034.tif 000009
【図２Ａ】
2012068034.tif 000010
【図２Ｂ】
2012068034.tif 000011
【配列表】
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