(57)【要約】【課題】ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥工程で粗大粒子が生成するのを防止する方法，及び眼の透明組織可視化剤用ポリ乳酸粒子の製造方法の提供。【解決手段】ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥時における粗大粒子生成を抑制する方法であって，(a)分散剤と３．５〜１０％のマンニトールを含有するポリ乳酸微粒子水性懸濁液を調製するステップであって，(i)ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなる溶液を，分散剤水溶液に撹拌下で添加した後，マンニトールを添加するか，又は(ii)ポリ乳酸を該溶媒に溶解させてなる溶液を，分散剤及びマンニトールを含有する分散剤／マンニトール水溶液に撹拌下で添加することによるものであるステップと，(b)該懸濁液をガラス製容器中で凍結乾燥に付すステップと，を含んでなる方法，及びステップ(a)及び(b)を含む透明組織可視化剤用ポリ乳酸粒子の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥時におけるポリ乳酸の粗大粒子の生成を抑制する方法であって，
(a) 分散剤と３．５〜１０％のマンニトールを含有するポリ乳酸微粒子水性懸濁液を調製するステップであって，
(i) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤を含有する分散剤水溶液に撹拌下で添加した後，マンニトールを添加するか，又は
(ii) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤及びマンニトールを含有する分散剤／マンニトール水溶液に撹拌下で添加することによるものであるステップと，
(b) 該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液をガラス容器中で凍結乾燥に付すステップと，
を含んでなる方法。
【請求項２】
該分散剤水溶液又は該分散剤／マンニトール水溶液中の該分散剤の濃度が０．１１〜２．２Ｗ／Ｖ％である，請求項１の方法。
【請求項３】
該分散剤がポリビニルピロリドン又はポリビニルアルコールである，請求項１又は２の方法。
【請求項４】
該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液中のマンニトールの濃度が５〜７Ｗ／Ｖ％である，請求項１ないし３の何れかの方法。
【請求項５】
該ポリ乳酸溶液中の該ポリ乳酸の濃度が１〜５０Ｗ／Ｖ％である，請求項１ないし４の何れかの方法。
【請求項６】
該水混和性有機溶媒がアセトン・エタノール混液である，請求項１ないし５の何れかの方法。
【請求項７】
該アセトン・エタノール混液におけるアセトンとエタノールの混合比が，体積で，アセトン：エタノール＝３：７〜５：５である，請求項６の方法。
【請求項８】
該分散剤水溶液，又は該分散剤／マンニトール水溶液と該ポリ乳酸溶液の混合比が，体積で，該分散剤水溶液又は該分散剤／マンニトール水溶液：ポリ乳酸溶液＝８５：１５〜９５：５である，請求項１ないし７の何れかの方法。
【請求項９】
該ガラス容器がガラスバイアルである，請求項１ないし８の何れかの方法。
【請求項１０】
ステップ(b)において，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を入れた該ガラスバイアルが凍結乾燥機のチャンバー内に置かれ，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液が凍結する時の該チャンバー内の冷却速度が０．１〜１℃／分に調節されるものである，請求項９の方法。
【請求項１１】
眼の透明組織可視化剤用ポリ乳酸粒子の製造方法であって，
(a) 分散剤と３．５〜１０％のマンニトールを含有するポリ乳酸微粒子水性懸濁液を調製するステップであって，
(i) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤を含有する分散剤水溶液に撹拌下で添加した後，マンニトールを添加するか，又は
(ii) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤及びマンニトールを含有する分散剤／マンニトール水溶液に撹拌下で添加することによるものであるステップと，
(b) 該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液をガラス容器中で凍結乾燥に付すステップと，
を含んでなる製造方法。
【請求項１２】
該分散剤水溶液又は該分散剤／マンニトール水溶液中の該分散剤の濃度が０．１１〜２．２Ｗ／Ｖ％である，請求項１１の製造方法。
【請求項１３】
該分散剤がポリビニルピロリドン又はポリビニルアルコールである，請求項１１又は１２の製造方法。
【請求項１４】
該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液中のマンニトールの濃度が５〜７Ｗ／Ｖ％である，請求項１１ないし１３の何れかの製造方法。
【請求項１５】
該ポリ乳酸溶液中の該ポリ乳酸の濃度が１〜５０Ｗ／Ｖ％である，請求項１１ないし１４の何れかの製造方法。
【請求項１６】
該水混和性有機溶媒がアセトン・エタノール混液である，請求項１１ないし１５の何れかの製造方法。
【請求項１７】
該アセトン・エタノール混液におけるアセトンとエタノールの混合比が，体積で，アセトン：エタノール＝３：７〜５：５である，請求項１６の製造方法。
【請求項１８】
該分散剤水溶液，又は該分散剤／マンニトール水溶液と該ポリ乳酸溶液の混合比が，体積で，該分散剤水溶液又は該分散剤／マンニトール水溶液：ポリ乳酸溶液＝８５：１５〜９５：５である，請求項１１ないし１７の何れかの製造方法。
【請求項１９】
該ガラス容器がガラスバイアルである，請求項１１ないし１８の何れかの製造方法。
【請求項２０】
ステップ(b)において，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を入れた該ガラスバイアルが凍結乾燥機のチャンバー内に置かれ，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液が凍結する時の該チャンバー内の冷却速度が０．１〜１℃／分に調節されるものである，請求項１１ないし１９の何れかの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を凍結乾燥して得られるポリ乳酸粒子の凝集塊の発生を抑制する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
眼には硝子体，水晶体および角膜などの透明組織が集まっている。白内障手術では水晶体嚢内の核および皮質の除去を行うが，後嚢近くに残った水晶体の皮質が混濁し，後発白内障を引き起こすことが知られている。
【０００３】
また硝子体除去手術では，網膜に癒着した増殖組織と増殖の足場となる硝子体を可能な限り完全に除去することが求められる。しかしながら，硝子体は透明な組織であり，硝子体の完全な除去は容易ではない。この解決策として，硝子体除去手術中にトリアムシノロン製剤（ケナコルト−Ａ：登録商標）などのステロイド懸濁液を硝子体腔に注射器を用いて注入することによって透明な硝子体を可視化することが行われている（非特許文献１参照）。この方法を採用することで，手術手技を容易にし，確実に硝子体の除去を行うことができる。しかしながら，治療を目的としたトリアムシノロン製剤の硝子体への使用においては，副作用として眼圧上昇と白内障の進行が報告されている（非特許文献２および３参照）。そこで，ポリ乳酸その他の薬理作用を示さない高分子化合物からなる粒子の懸濁液を硝子体腔に注入することにより，硝子体の視認性を向上させる方法及びそのために使用する透明組織可視化剤（眼の透明組織に注入又は散布することによって，手術時における眼の透明組織の視認性を向上させるための薬剤）が提案されている（特許文献１）。
【０００４】
上記の方法において，微粒子の懸濁液は，液状での長期保存による沈殿分離等の安定性の問題を回避する等の理由から，懸濁液の凍結乾燥物の形で供給されることが極めて好ましい。しなしながら，ポリ乳酸等，高分子化合物によっては懸濁液の凍結乾燥時に凝集塊を形成して粗大粒子を生ずるものがある。高分子化合物の粒子は，注射器により眼内に注入される形で使用されるから，粒子は，注射針を詰らせることなしに通過できる粒子径のものでなければならない。上記特許文献１には，平均値として粒子径が開示されているものの，最大粒子径には言及されておらず，また粒子径をコントロールするための調製条件に関する明確な記載はない。また，ポリ乳酸の分散液に２価あるいは３価の金属塩を添加することで眼組織の視認性を向上させる方法が特許文献２に開示されているが，同文献には，凍結乾燥時の粗大粒子の生成の防止に関しては記載がない。更に，２０〜１２０μｍのポリ乳酸微粒子を形成してグリコール酸含有の水性担体中で凍結乾燥することによる注射可能インプラントの製造方法が特許文献３に開示されているが，同方法は，ポリ乳酸微粒子の生成に際し塩素系有機溶媒への溶解及び析出の工程を含んでおり，製剤中の塩素系有機溶媒の残留の可能性を考慮すると，医薬用途の製剤，特に眼内に注入される製剤の製造方法としては好ましくない。その他，特許文献４，５に乳液および懸濁液を凍結乾燥させるための技術的な条件検討が行われているが，ポリ乳酸の懸濁液の凍結乾燥に際した粒子凝集による粗大粒子形成を防止することに関しては，記載がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００５／１１５４１１号
【特許文献２】国際公開第２００８／１２６７２０号
【特許文献３】国際公開第２００３／００７７８２号
【特許文献４】国際公開第２００１／０５１０３２号
【特許文献５】国際公開第２００４／１１２７５４号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Sakamoto, T. et al., Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology, 240: p.423 (2002).
【非特許文献２】Challa, J.K. et al., Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology, 26: p.277 (1998).
【非特許文献３】Wingate, R.J. et al., Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology, 27: p.431 (1999).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記背景において，本発明の一目的は，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液から凍結乾燥によりポリ乳酸粒子を製造する方法であって，凍結乾燥工程で粗大粒子が生成するのを防止できる方法を提供することである。 
また本発明の更なる一目的は，眼の透明組織，特に硝子体および水晶体に適用することによってそれら眼の透明組織の視認性を向上させるための製剤である透明組織可視化剤の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は，上記目的のため検討の結果，分散剤を溶解して含有する水溶液又は分散剤とマンニトールを溶解して含有する水溶液に，アセトン及びエタノールの混液に溶解させたポリ乳酸を添加，撹拌することにより一次粒子（凝集していない状態での個々の粒子をいう）としての平均粒子径５００〜１０００ｎｍ（最大粒子径５μｍ以下）であるポリ乳酸微粒子の水性懸濁液が得られ，これを凍結乾燥するに際してマンニトールの適当量を懸濁液に含有させておくことにより，凍結乾燥時に起こるポリ乳酸粒子の凝集が抑制止され，粗大粒子（特に，粒子の短径が０．３ｍｍ以上，取り分け０．２ｍｍ以上のもの）の生成が防止できることを見出した。本発明は，当該知見に基づき，更に検討を重ねて完成させたものである。すなわち，本発明は以下を提供する。
【０００９】
１．ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥時におけるポリ乳酸の粗大粒子の生成を抑制する方法であって，
(a) 分散剤と３．５〜１０％のマンニトールを含有するポリ乳酸微粒子水性懸濁液を調製するステップであって，
(i) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤を含有する分散剤水溶液に撹拌下で添加した後，マンニトールを添加するか，又は
(ii) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤及びマンニトールを含有する分散剤／マンニトール水溶液に撹拌下で添加することによるものであるステップと，
(b) 該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液をガラス容器中で凍結乾燥に付すステップと，
を含んでなる方法。
２．該分散剤水溶液又は該分散剤／マンニトール水溶液中の該分散剤の濃度が０．１１〜２．２Ｗ／Ｖ％である，上記１の方法。
３．該分散剤がポリビニルピロリドン又はポリビニルアルコールである，上記１又は２の方法。
４．該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液中のマンニトールの濃度が５〜７Ｗ／Ｖ％である，上記１ないし３の何れかの方法。
５．該ポリ乳酸溶液中の該ポリ乳酸の濃度が１〜５０Ｗ／Ｖ％である，上記１ないし４の何れかの方法。
６．該水混和性有機溶媒がアセトン・エタノール混液である，上記１ないし５の何れかの方法。
７．該アセトン・エタノール混液におけるアセトンとエタノールの混合比が，体積で，アセトン：エタノール＝３：７〜５：５である，上記６の方法。
８．該分散剤水溶液又は該分散剤／マンニトール水溶液と該ポリ乳酸溶液の混合比が，体積で，該分散剤水溶液又は該分散剤／マンニトールを含有する水溶液：ポリ乳酸溶液＝８５：１５〜９５：５である，上記１ないし７の何れかの方法。
９．該ガラス容器がガラスバイアルである，上記１ないし８の何れかの方法。
１０．ステップ(b)において，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を入れた該ガラスバイアルが凍結乾燥機のチャンバー内に置かれ，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液が凍結する時の該チャンバー内の冷却速度が０．１〜１℃／分に調節されるものである，上記９の方法。
１１．眼の透明組織可視化剤用ポリ乳酸粒子の製造方法であって，
(a) 分散剤と３．５〜１０％のマンニトールを含有するポリ乳酸微粒子水性懸濁液を調製するステップであって，
(i) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤を含有する分散剤水溶液に撹拌下で添加した後，マンニトールを添加するか，又は
(ii) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤及びマンニトールを含有する分散剤／マンニトール水溶液に撹拌下で添加することによるものであるステップと，
(b) 該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液をガラス容器中で凍結乾燥に付すステップと，
を含んでなる製造方法。
１２．該分散剤水溶液又は該分散剤／マンニトールを含有する水溶液中の該分散剤の濃度が０．１１〜２．２Ｗ／Ｖ％である，上記１１の製造方法。
１３．該分散剤がポリビニルピロリドン又はポリビニルアルコールである，上記１１又は１２の製造方法。
１４．該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液中のマンニトールの濃度が５〜７Ｗ／Ｖ％である，上記１１ないし１３の何れかの製造方法。
１５．該ポリ乳酸溶液中の該ポリ乳酸の濃度が１〜５０Ｗ／Ｖ％である，上記１１ないし１４の何れかの製造方法。
１６．該水混和性有機溶媒がアセトン・エタノール混液である，上記１１ないし１５の何れかの製造方法。
１７．該アセトン・エタノール混液におけるアセトンとエタノールの混合比が，体積で，アセトン：エタノール＝３：７〜５：５である，上記１６の製造方法。
１８．該分散剤水溶液又は該分散剤／マンニトールを含有する水溶液と該ポリ乳酸溶液の混合比が，体積で，該分散剤水溶液又は該分散剤／マンニトールを含有する水溶液：ポリ乳酸溶液＝８５：１５〜９５：５である，上記１１ないし１７の何れかの製造方法。
１９．該ガラス容器がガラスバイアルである，上記１１ないし１８の何れかの製造方法。
２０．ステップ(b)において，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を入れた該ガラスバイアルが凍結乾燥機のチャンバー内に置かれ，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液が凍結する時の該チャンバー内の冷却速度が０．１〜１℃／分に調節されるものである，上記１１ないし１９の何れかの製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
上記構成になる本発明は，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥時におけるポリ乳酸粒子の凝集を抑制し粗大な凝集塊（特に，粒子の短径が０．３ｍｍ以上，取り分け０．２ｍｍ以上のもの）の発生を防止できる。このため本発明によれば，透明組織を可視化するための眼内へのポリ乳酸粒子水性懸濁液の注入に際し，眼科手術において一般に使用される注射針に粒子が詰まることがなくなり，円滑な注入が可能となる懸濁粒子を眼内に円滑に注入することを可能にする。
【００１１】
本発明により製造されるポリ乳酸粒子は，球状でなく，個々に種々の不規則な形状をとっているが，そのような不規則形状のポリ乳酸粒子は，球状粒子に比べて硝子体及び水晶体等の眼の透明組織と接触したとき，組織によく付着し，手術中の眼内灌流液の流れによっても組織から脱落しにくい。このため，不規則形状のポリ乳酸粒子は，透明組織可視化剤として優れている。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
検討に用いたポリ乳酸はＤＬ−ポリ乳酸であることから，Ｄ−ポリ乳酸，Ｌ−ポリ乳酸，ＤＬ−ポリ乳酸を区別することなく，またそれらの適宜の混合物も，本発明において同様に使用することができる。
【００１３】
本明細書中で，「眼の透明組織」の語は，硝子体，硝子体膜，水晶体及び角膜等の眼組織中の透明な組織をいう。
【００１４】
本明細書中で，「透明組織可視化剤」の語は，凍結乾燥して得られるポリ乳酸粒子を分散液に分散させた製剤をいう。
【００１５】
本明細書において，「ポリ乳酸微粒子」の語は，ポリ乳酸の粒子であって粒子径が５μｍ以下のものを意味する。
【００１６】
本明細書において，「ポリ乳酸微粒子水性懸濁液」の語は，ポリ乳酸微粒子を懸濁状態で含有する液体であって，その分散媒が水性媒質，すなわち，水，又は混和した状態で有機溶媒を一部に含有する水であるものをいう。
【００１７】
本明細書中で，「分散剤水溶液」の語は，分散剤を水に添加し溶解させることにより得られる水溶液をいい，「分散剤／マンニトール水溶液」の語は，分散剤及びＤ−マンニトールを水に添加し溶解させることにより得られる水溶液をいう。
【００１８】
本発明において，ポリ乳酸を溶解させるための水混和性有機溶媒しては，アセトン・エタノール混液が好ましい。これを調製するのに用いるアセトンとエタノールとの体積比は，適宜でよいが，通常は３：７〜５：５の範囲とするのが好ましい。これらの溶媒は共に，塩素系有機溶媒に比して身体組織に対する安全性が高く，しかも塩素系有機溶媒と異なり水混和性であるため，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を調製したときポリ乳酸微粒子から水相へと移行し易く，凍結乾燥により速やかに除去され，最終的に得られる凍結乾燥組成物中には，実質的に残存しない。
【００１９】
上記アセトン・エタノール混液等の水混和性有機溶媒に溶解させるポリ乳酸の濃度は，通常１〜５０Ｗ／Ｖ％の範囲であり，２〜３０Ｗ／Ｖ％とするのが好ましく，５〜２０Ｗ／Ｖ％とするのが更に好ましい。
【００２０】
本発明において，マンニトールの量は，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液中に含有されるポリ乳酸の量に対し，重量比で３．５倍量以上とすることが好ましく，５倍量以上とすることがより好ましい。マンニトールが少なすぎると凍結乾燥時に一部の微粒子が凝集して粗大粒子を形成し得るためである。マンニトールの含有量に明確な上限はないが，多すぎると凍結乾燥に時間を要して不利となるばかりでなく凍結乾燥物の使用時に分散媒と混合したとき液の浸透圧への影響が大きくなるため取り扱いにくくなる。従って，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液中のマンニトールの含有量は，これに添加されるポリ乳酸溶液中に含有されるポリ乳酸の量に対し，重量比で１０倍以下とすることが好ましく，７倍以下とすることがより好ましい。ポリ乳酸微粒子水性懸濁液は，分散剤水溶液又は分散液／マンニトール水溶液にポリ乳酸溶液を添加して調製するため，通常は，分散剤水溶液又は分散液／マンニトール水溶液中のマンニトールの濃度は，３．８５〜１１Ｗ／Ｖ％とすることが好ましく，４．５〜１０Ｗ／Ｖ％とすることがより好ましく，５．５〜８Ｗ／Ｖ％とすることが更に好ましい。
【００２１】
上記分散剤水溶液又は上記分散剤／マンニトール水溶液に含有される分散剤は，水混和性有機溶媒に溶解させたポリ乳酸溶液を，分散剤を含有する水溶液に添加してポリ乳酸微粒子を析出させる工程において粒子成長の抑制に有用であり，また，凍結乾燥前におけるポリ乳酸微粒子の均一な懸濁状態の維持及び凍結乾燥組成物を分散媒と混合して透明組織可視化剤を調製する際にも，ポリ乳酸粒子を迅速に懸濁させ且つ安定な懸濁状態を維持する上で有用である。分散剤としては，界面活性剤や界面活性を有する水溶性高分子を用いることができる。常温で固体であり，水に対して即溶性の水溶性高分子が好適に用いられ，ポリビニルピロリドン，ポリビニルアルコール等のビニル系ポリマーが特に好適に用いられる。ポリビニルピロリドン又はポリビニルアルコールを用いる場合，分散剤水溶液又は分散剤／マンニトール水溶液中における当該化合物の含有量は０．１１〜２．２Ｗ／Ｖ％とするのが好ましく，０．２２〜１．１Ｗ／Ｖ％とするのがより好ましく，０．４４〜０．６６Ｗ／Ｖ％とするのがより好ましい。
【００２２】
上記において分散剤水溶液，又は分散剤／マンニトール水溶液とこれに添加するポリ乳酸溶液との体積比率は，通常９５：５〜８５：１５とすることが好ましく，特に好ましくは約９０：１０である。このような比率で当該水溶液にポリ乳酸溶液を添加し撹拌したとき，一次粒子としての平均粒子径が５００〜１０００ｎｍで最大粒子径５μｍ以下であるポリ乳酸微粒子の水性懸濁液が容易に得られる。一次粒子は，水性懸濁液の調製中に一部凝集する場合があり得るが，調製後に例えば口径１０６μｍの篩に水性懸濁液を通してこれに掛かる粒子を除去しておけば，問題はない。
【００２３】
本発明において凍結乾燥に付すポリ乳酸微粒子水性懸濁液中のポリ乳酸の含量は，通常０．０５〜７．５Ｗ／Ｖ％，好ましくは０．１〜５．０Ｗ／Ｖ％，より好ましくは，０．５〜２．５Ｗ／Ｖ％とすればよい。ポリ乳酸微粒子水性懸濁液中のポリ乳酸含量の調整は，アセトン・エタノール混液に含有させるポリ乳酸の濃度を予め調節しておくことによって行ってもよく，懸濁液調製時における水溶液に対するポリ乳酸溶液の添加割合を調整することによって行ってもよい。ポリ乳酸微粒子水性懸濁液中のポリ乳酸の含量がこれらの含量範囲にある場合，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥時に，マンニトールの存在と相俟って，ポリ乳酸粒子の凝集が防止できる。なお，本法はこれらの範囲よりポリ乳酸含量を少なくした場合でも適用し得る。 
【００２４】
上記ポリ乳酸微粒子水性懸濁液に含有されるマンニトールは，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を凍結乾燥する際にポリ乳酸粒子の凝集を防ぐのに有用である。また，マンニトールの濃度は，好ましくは３．５〜１０Ｗ／Ｖ％であり，さらに好ましくは５〜７Ｗ／Ｖ％である。
【００２５】
本明細書において，ポリ乳酸について「平均分子量」というときは，重量平均分子量をいう。本発明において使用されるポリ乳酸の平均分子量は，通常５００以上，好ましくは１０００以上であり，より好ましくは３０００以上，特に好ましくは４０００以上であり，通常２００００以下，好ましくは１５０００以下，より好ましくは１００００以下，更に好ましくは８０００以下，特に好ましくは６０００以下である。
【００２６】
本発明により製造されるポリ乳酸粒子含有の凍結乾燥組成物は，水性の分散媒と混合されてポリ乳酸粒子の水性懸濁液の形に調製され，透明組織可視化剤として使用される。用いられる水性の分散媒としては，医薬として眼内に注入することが許容される組成の水溶液を，適宜用いることができる。眼内灌流・洗浄液としては種々の組成物が当業者によく知られており，それらを適宜選択して分散媒として用いることができる。また，眼内灌流・洗浄液として既に販売されている医薬品を分散媒として使用してもよく，そのような医薬品として特に適しているものの例として，オペガードＭＡ（登録商標，）及びオペガードネオキット（登録商標，千寿製薬株式会社製）が挙げられる。
【００２７】
本発明において，凍結乾燥されるポリ乳酸微粒子水性懸濁液には，医薬上許容される添加物，例えば等張化剤（塩化ナトリウム，塩化カリウムなどの塩：グリセリン，ソルビトール，グルコースなどの糖類：グリセリン，プロピレングリコールなどの多価アルコール類：ホウ酸，ホウ砂など），緩衝剤（リン酸緩衝液，酢酸緩衝液，ホウ酸緩衝液，炭酸緩衝液，クエン酸緩衝液，トリス緩衝液など），増粘剤（ヒドロキシエチルセルロース，ヒドロキシプロピルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ポリビニルアルコール，ポリエチレングリコール，アルギン酸ナトリウムなど），安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム，チオ硫酸ナトリウム，エデト酸ナトリウム，クエン酸ナトリウム，アスコルビン酸，ジブチルヒドロキシトルエン，塩化マグネシウム，塩化カルシウムなど），ｐＨ調整剤（塩酸，水酸化ナトリウム，リン酸，酢酸など）などを適宜添加することができる。その場合，それらの添加物は，ポリ乳酸溶液が添加される前の分散剤水溶液又は分散剤／マンニトール水溶液に予め添加しておいてもよく，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を調製した後でこれに添加してもよく，また一部をポリ乳酸溶液が添加される前の分散剤水溶液又は分散剤／マンニトール水溶液に予め添加し，残りを，ポリ乳酸微粒子含有水性懸濁液を調製した後でこれに添加してもよい。
【００２８】
本発明において，凍結乾燥に付されるポリ乳酸微粒子水性懸濁液のｐＨは，通常，４．０〜８．０，好ましくは約５．０〜７．５に調整しておくことが好ましい。
【００２９】
上記で得られるポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥工程において，該懸濁液は通常，ガラス容器中で凍結乾燥することが好ましい。特に好ましいガラス容器はガラスバイアルである。ガラスバイアルに入れた該懸濁液の凍結は徐々に行うことが好ましい。例えば，凍結乾燥機のチャンバーに，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を分注したガラスバイアルを置き，凍結する時（懸濁液に氷の結晶形成が開始する時点）のチャンバー内の冷却速度を０．１〜１℃／分に調節しておくことができる。そうすることにより，粗大粒子の発生が一層確実に防止できる。
【００３０】
本発明により製造されるポリ乳酸粒子は，球状でなく，個々に種々の不規則な形状をとっているが，そのような不規則形状は，球状粒子に比べて硝子体及び水晶体等の眼の透明組織と接触したとき，組織によく付着し，手術中の眼内灌流液の流れによっても組織から脱落しにくい。このため，透明組織可視化剤として優れている。
【実施例】
【００３１】
以下実施例を参照して本発明を更に具体的に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
【００３２】
〔実施例１〜２，比較例１〜３〕
精製水にポリビニルピロリドン（ポビドンＫ−３０，ＢＡＳＦジャパン製，日本薬局方）を，０．５５Ｗ／Ｖ％の濃度となるように，及びＤ−マンニトールを表１の比較例１〜３及び実施例１〜２にそれぞれ規定した量の１．１倍となるように溶解させ，溶液を０．２２μｍ水性フィルターでろ過し，それぞれＡ−１〜Ａ−５液とした。
【００３３】
【表１】
2012214524.tif 000002
【００３４】
ＰＬＡ０００５〔ＤＬ−ポリ乳酸，重量平均分子量５０００，和光純薬（株）製〕をアセトン・エタノール混液（体積比でアセトン：エタノール＝４：６）に１０Ｗ／Ｖ％の濃度となるように溶解させ，得られた溶液を０．２２μｍ非水性フィルターでろ過してＢ液とした。
【００３５】
Ａ−１〜Ａ−５の各液とＢ液を９：１の割合で次のように混合した。２００ｍＬのビーカーに入れたＡ−１〜Ａ−５の各液を，撹拌子（直径６ｍｍ長さ２０ｍｍ）を用いてスターラー（中速度７００〜８００ｒｐｍ）で攪拌しながら，マイクロピペットチップ（Eppendolf ep T.I.P.S standard 2-200 μL）を吐出側に装着したシリコンチューブ（外径６ｍｍ内径４ｍｍ）を取り付けたチューブポンプ（PERISTALTIC PUMP PST-100 IWAKI社製）用いてＢ液を約１ｍＬ／分の速度でＡ−１〜Ａ−５の各液中に送液し，ＰＬＡ０００５の微粒子を析出させた。このとき吐出口であるマイクロピペットチップの先端は完全に液中に浸漬させておいた。これを約３０分間攪拌して懸濁液それぞれＤ−１〜Ｄ−５を得た。懸濁液Ｄ−１〜Ｄ−５に含有されるポリ乳酸，ポリビニルピロリドン及びＤ−マンニトールの量は表１に示したとおりである。
【００３６】
上記で得られた懸濁液Ｄ−１〜Ｄ−５を，篩（口径１０６μｍ）にかけ，凝集塊を除去した。篩にかけた後の懸濁液Ｄ−１〜Ｄ−５を１．５ｍＬずつガラスバイアル（１８Φ，高さ３３ｍｍ）に充填し，下記の条件で凍結乾燥を行い，凍結乾燥組成物それぞれＥ−１〜Ｅ−５を得た。
【００３７】
（凍結乾燥条件）
ａ）試験装置：Triomaster-A04型（日精株式会社）
ｂ）トレイ：引き抜きトレイ    枠２９０Ｗ＊４４５Ｌ，1枚使用
ｃ）バイアル：１８φ＊３３Ｈ（ガラス）
ｄ）分注量：１．５ｍＬ／バイアル
ｅ）凍結乾燥本数：トレイ１枚分が埋まるよう実液又はダミー液（Ｄ−マンニトール水溶液２．５％）のバイアルを敷き詰めた。
ｆ）凍結乾燥プログラムの設定
＜予備凍結＞
常温棚にバイアルを仕込み，棚を冷却して薬液を凍結させた。棚温を＋２０℃から−４０℃まで２時間かけて冷却した（平均冷却速度１℃／分）。
＜一次乾燥及び二次乾燥＞
懸濁液Ｄ−１〜Ｄ−５につき，以下の凍結乾燥プログラムにて一次乾燥および二次乾燥を行った。
一次乾燥は，棚温−４５℃又は４０℃から−１０℃に１時間で上昇させ，その後−１０℃で１９時間に設定した。このときの真空制御値を０.１Torrとした。二次乾燥は棚温−１０℃から＋２０℃に１時間で上昇させ，その後＋２０℃で１２時間に設定した。このときの真空度は成り行きとした。二次乾燥終了後はゴム栓で密封した。
【００３８】
〔凍結乾燥組成物の評価〕
凍結乾燥組成物Ｅ−１〜Ｅ−５を，表２に示した組成の分散媒Ｃに，ポリ乳酸の含量が１Ｗ／Ｖ％となるように分散させることにより懸濁液を調製した。
【００３９】
【表２】
2012214524.tif 000003
【００４０】
評価方法：上記で調製した懸濁液の全量を１２穴プレート（１２．５ｃｍＸ８ｃｍ，内径２２ｍｍ，ＩＷＡＫＩ社）に移し，デジタルマイクロスコープ（型番：ＶＨＸ−５００  キーエンス社）にて粒子の大きさを観察した。その際，１穴のほぼ全体像が捉えられるよう倍率を設定した。写真撮影を行い，０．３および０．２ｍｍを超える凝集体の個数と短径を測定した。結果を次の表３に示す。
【００４１】
【表３】
2012214524.tif 000004
【００４２】
表３に見られるように，凍結乾燥組成物Ｅ−４及びＥ−５（凍結乾燥前の懸濁液Ａ−４及びＡ−５に，それぞれ対応）において，粗大粒子が全く見られないことが確認された。
【００４３】
製剤実施例
〔製剤実施例１〜５〕
表４に基づき，精製水にポリビニルピロリドン（ポビドンＫ−３０）又はポリビニルアルコールとＤ−マンニトールとを，Ｈ−１〜Ｈ−４についてそれぞれ規定した量の１．１倍となるように溶解させ，溶液を０．２２μｍ水性フィルターでろ過し，それぞれＦ-１〜Ｆ-４液とする。また，精製水にポリビニルピロリドン（ポビドンＫ−３０）を，Ｈ−５について規定した量の１．１倍となるように溶解させ，溶液を０．２２μｍ水性フィルターでろ過し，Ｆ-５液とする。
【００４４】
【表４】
2012214524.tif 000005
【００４５】
ＰＬＡ０００５〔ＤＬ−ポリ乳酸，重量平均分子量５０００，和光純薬（株）製〕をアセトン・エタノール混液（体積比でアセトン：エタノール＝４：６）に１０Ｗ／Ｖ％の濃度となるように溶解させ，得られた溶液を０．２２μｍ非水性フィルターでろ過してＧ液とする。
【００４６】
Ｆ−１〜Ｆ−５の各液とＢ液を９：１の割合で次のように混合する。２００ｍＬのビーカーに入れたＦ−１〜Ｆ−５の各液を，撹拌子（直径６ｍｍ長さ２０ｍｍ）を用いてスターラー（中速度７００〜８００ｒｐｍ）で攪拌しながら，マイクロピペットチップ（Eppendolf ep T.I.P.S standard 2-200 μL）を吐出側に装着したシリコンチューブ（外径６ｍｍ内径４ｍｍ）を取り付けたチューブポンプ（PERISTALTIC PUMP PST-100 IWAKI社製）用いてＧ液を約１ｍＬ／分の速度でＦ−１〜Ｆ−５の各液中に送液し，ＰＬＡ０００５の微粒子を析出させる。このとき吐出口であるマイクロピペットチップの先端は完全に液中に浸漬させておく。Ｆ−５についてはＰＬＡ０００５の微粒子を析出後にＤ−マンニトールに規定量添加して，溶解させる。これらＦ−１〜Ｆ−５を約３０分間攪拌して懸濁液それぞれＨ−１〜Ｈ−５を得る。懸濁液Ｈ−１〜Ｈ−５に含有されるポリ乳酸，ポリビニルピロリドン及びＤ−マンニトールの量は表４に示したとおりである。
【００４７】
上記で得られた懸濁液Ｈ−１〜Ｈ−５を，篩（口径１０６μｍ）にかけ，凝集塊を除去する。篩にかけた後の懸濁液Ｈ−１〜Ｈ−５を１．５ｍＬずつガラスバイアル（１８Φ，高さ３３ｍｍ）に充填し，下記の条件で凍結乾燥を行い，凍結乾燥組成物それぞれＩ−１〜Ｉ−５を得る。
【００４８】
（凍結乾燥条件）
ａ）試験装置：Triomaster-A04型（日精株式会社）
ｂ）トレイ：引き抜きトレイ    枠２９０Ｗ＊４４５Ｌ，1枚使用
ｃ）バイアル：１８φ＊３３Ｈ（ガラス）
ｄ）分注量：１．５ｍＬ／バイアル
ｅ）凍結乾燥本数：トレイ１枚分が埋まるよう実液又はダミー液（Ｄ−マンニトール水溶液２．５％）のバイアルを敷き詰める。
ｆ）凍結乾燥プログラムの設定
＜予備凍結＞
常温棚にバイアルを仕込み，棚を冷却して薬液を凍結させる。棚温を＋２０℃から−４０℃まで２時間かけて冷却する（平均冷却速度１℃／分）。
＜一次乾燥及び二次乾燥＞
Ｉ−１〜Ｉ−５につき，以下の凍結乾燥プログラムにて一次乾燥および二次乾燥を行う。
一次乾燥では，棚温−４５℃又は４０℃から−１０℃に１時間で上昇させ，その後−１０℃で１９時間に設定する。このときの真空制御値を０.１Torrとする。二次乾燥では棚温−１０℃から＋２０℃に１時間で上昇させ，その後＋２０℃で１２時間に設定する。このときの真空度は成り行きとする。二次乾燥終了後はゴム栓で密封する。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の製造方法は，凍結乾燥時におけるポリ乳酸粒子の凝集を抑制でき，注射針を詰まらせる粗大粒子を含まないポリ乳酸粒子含有の再分散性のある凍結乾燥組成物を与えるため，硝子体除去手術等の眼科手術における使用に適した透明組織可視化剤の製造に利用することができる。