(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質の分離及び精製のためのシステム及び方法を提供する。【解決手段】液体クロマトグラフィー塔は、混合ループと連通し、イオン交換樹脂が詰められており、第１の等電点を有する第１のタンパク質と第２の等電点を有する第２のタンパク質とを含有するタンパク質溶液が装填される。混合ループと連通しているプロセス制御フィードバックループは、混合ループの中の滴定溶液のｐＨが検出され、検出されたｐＨに基づいて前記滴定溶液のｐＨが調節されるように、インラインプロセスｐＨ分析部を含んでいる。混合ループの中に滴定溶液が提供され、混合ループの中の滴定溶液のｐＨが、フィードバックループによって、インラインプロセスｐＨ分析部によって検出されたｐＨに基づき、第１のタンパク質と第２のタンパク質を液体クロマトグラフィー塔から別々に溶離させるようにクロマトグラフィー塔へ概ね直線状のｐＨ勾配を提供するべく調節される。【選択図】図３
2012068244.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の分離及び精製のためのシステムにおいて、
ａ．混合ループと、
ｂ．酸又はアルカリの供給源と連通している入口と、前記混合ループと連通している出口と、を有する一次ポンプと、
ｃ．酸又はアルカリの供給源と連通している入口と、前記混合ループと連通している出口と、を有する濃縮ポンプと、
ｄ．前記混合ループと連通し、イオン交換樹脂が詰められており、第１の等電点を有する第１のタンパク質と第２の等電点を有する第２のタンパク質とを含有するタンパク質溶液が装填される液体クロマトグラフィー塔と、
ｅ．前記混合ループと連通していて、前記混合ループの中の滴定溶液のｐＨが検出され、検出されたｐＨに基づいて前記滴定溶液のｐＨが調節されるように、インラインプロセスｐＨ分析部を含んでいる、プロセス制御フィードバックループと、を備えており、
それにより、前記混合ループの中に前記一次ポンプと前記濃縮ポンプによって前記滴定溶液が提供され、前記混合ループの中の前記滴定溶液のｐＨが、前記フィードバックループによって、前記インラインプロセスｐＨ分析部によって検出されたｐＨに基づき、前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質を前記液体クロマトグラフィー塔から別々に溶離させるように当該クロマトグラフィー塔へ概ね直線状のｐＨ勾配を提供するべく調節される、システム。
【請求項２】
前記混合ループ内に再循環ポンプを更に備えている、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記プロセス制御フィードバックループは、酸又はアルカリの供給源と連通している入口と前記混合ループと連通している出口とを有する滴定ポンプを含み、前記混合ループの中の前記滴定溶液のｐＨが前記滴定ポンプからの酸又はアルカリを用いて調節されるようにしている、請求項３に記載のシステム。
【請求項４】
前記プロセス制御フィードバックループは、前記滴定ポンプの入口と連通している複数の自動式滴定弁を含んでいる、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記インラインプロセスｐＨ分析部は、前記混合ループと連通しているｐＨセンサーと、前記ｐＨセンサー、前記滴定ポンプ、及び前記自動式滴定弁と連通している制御器と、を含んでいる、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
前記インラインプロセスｐＨ分析部は、前記混合ループと連通しているｐＨセンサーと、前記ｐＨセンサー及び前記滴定ポンプと連通している制御器と、を含んでいる、請求項３に記載のシステム。
【請求項７】
前記制御器はプログラム可能な論理制御器である、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記制御器はＰＩＤ制御器として構成されている、請求項６に記載のシステム。
【請求項９】
前記インラインプロセスｐＨ分析部は、前記混合ループと連通しているｐＨセンサーと、前記ｐＨセンサーと連通している制御器と、を含んでいる、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記制御器はプログラム可能な論理制御器である、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記制御器はＰＩＤ制御器として構成されている、請求項９に記載のシステム。
【請求項１２】
前記一次ポンプは、ＷＦＩポンプである、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記プロセス制御フィードバックループは、前記混合ループの中の前記滴定溶液のｐＨが、前記一次ポンプからの酸又はアルカリ及び／又は前記濃縮ポンプからの酸又はアルカリによって調節されるように、前記一次ポンプと前記濃縮ポンプの少なくとも一方と連通している、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記インラインプロセスｐＨ分析部は、前記混合ループと連通しているｐＨセンサーと、前記ｐＨセンサー及び前記一次ポンプと前記濃縮ポンプの少なくとも一方と連通している制御器と、を含んでいる、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記制御器はプログラム可能な論理制御器である、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記制御器はＰＩＤ制御器として構成されている、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１７】
タンパク質を分離し精製するための方法において、
ａ．混合ループと、前記混合ループと連通している一次ポンプと、前記混合ループと連通している濃縮ポンプと、前記混合ループと連通している液体クロマトグラフィー塔と、前記混合ループと連通していて、前記混合ループの中の滴定溶液のｐＨが検出され、検出されたｐＨに基づいて前記滴定溶液のｐＨが調節されるように、インラインプロセスｐＨ分析部を含んでいる、プロセス制御フィードバックループと、を提供する段階と、
ｂ．前記液体クロマトグラフィー塔にイオン交換樹脂を詰める段階と、
ｃ．前記クロマトグラフィー塔に、第１の等電点を有する第１のタンパク質と第２の等電点を有する第２のタンパク質を含有するタンパク質溶液を装填する段階と、
ｄ．前記一次ポンプを使用して前記混合ループに酸又はアルカリを供給する段階と、
ｅ．前記濃縮ポンプを使用して前記混合ループに酸又はアルカリを供給し、前記混合ループの中に前記滴定溶液を作製する段階と、
ｆ．前記混合ループの中の前記滴定溶液を、前記フィードバックループを使用して、前記インラインプロセスｐＨ分析部によって検出されたｐＨに基づき、前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質を前記液体クロマトグラフィー塔から別々に溶離させるように当該クロマトグラフィー塔へ概ね直線状のｐＨ勾配を提供するべく調節する段階と、を備えている方法。
【請求項１８】
前記プロセス制御フィードバックループは、滴定ポンプを含んでおり、前記ｆ段階の前記滴定溶液は、前記滴定ポンプによって提供される酸又はアルカリによって調節される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記プロセス制御フィードバックループは、前記一次ポンプと前記濃縮ポンプの少なくとも一方と連通しており、前記ｆ段階の前記滴定溶液は、一次ポンプ及び／又は濃縮ポンプによって提供される酸又はアルカリによって調節される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記一次ポンプと前記濃縮ポンプの一方の周波数は、前記ｄ段階と前記ｅ段階の間は定常に保持され、一方、前記一次ポンプと前記濃縮ポンプの他方の周波数は、前記ｄ段階と前記ｅ段階の間は変化する、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［0001］本出願は、２０１０年９月２０日に出願されている現在係属中の仮特許出願第６１／４０３,７４１号に対する優先権を主張する。
［0002］本発明は、概括的には、液体クロマトグラフィーのシステム及び方法に、より厳密には、酸と塩基／アルカリの液体が、インライン緩衝剤希釈装置の中で配合され、その際、酸と塩基／アルカリの液体は、配合された液体がタンパク質の分離及び精製に向けてタンパク質溶液が装填されたクロマトグラフィー塔へ送達される間に直線状のｐＨ勾配を提供する方法に従って、配合される、システム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
［0003］生物医薬品の製造は、重要な下流プロセスのための緩衝溶液を必要とする。クロマトグラフィーは、下流のバイオプロセス工程の欠くことのできない部分であり、緩衝された移動相のイオン強度やｐＨの様な属性は、タンパク質精製にとって決定的なプロセスパラメータである場合が多い。従来的には、異なったイオン特性を有するタンパク質を分離するのに塩勾配が使用されている。しかしながら、この手法を使用すると、タンパク質の回収率が悪くなるし、脱塩工程が厄介で時間を食ってしまうかもしれない。
【０００３】
［0004］先行技術のシステムを使用したｐＨ勾配によるタンパク質の分離は、難しく、不評なことが判明している。例えば、図１を参照すると、先行技術の液体クロマトグラフィーのシステムは、移動相Ａ（酸）と移動相Ｂ（塩基又はアルカリ）を独立に液体クロマトグラフィー塔１４へ送達する２つのポンプ１０とポンプ１２から構成されている。結果として、クロマトグラフィー塔に進入する配合液体中の移動相Ａと移動相Ｂの割合は、システムのそれらポンプの精度に依存する。ポンプは、専ら、図１の流量計１６と１８によって検出される、ポンプを出ていく液体の流量のフィードバックによって制御されている。
【０００４】
［0005］図１の先行技術による液体クロマトグラフィーシステムを使用すると、図２のＳ字状の滴定曲線が生成される。図２に示されているように、配合液体が酸性状態からアルカリ性状態へ、及びその逆に、変化する間に、急勾配の傾きが形成される（図２の１５００秒付近）。このプロセス中のｐＨの急激な上昇のために、塔１４に装填されたタンパク質の溶離特性を制御するのは極めて難しい。より具体的には、酸とアルカリの間の滴定曲線が、強弱こそあれ、直線状ではないために、タンパク質に係わる化学者らは、等電点（ｐＩ）が似ているタンパク質を分解する場合にはクロマトグラフィー実行時にｐＨ勾配を使用したがらない。
【０００５】
［0006］上記に鑑み、また先に指摘されている様に、タンパク質は、従来的には、液体クロマトグラフィー塔の中で塩勾配（導電性）によって精製及び分離されており、ｐＨ勾配によって精製及び分離されてはいない。しかしながら、導電性を使用すると、往々にして、所望されるものからの分散が大きくなってしまうことがある。これは、緩衝溶液を作製する際の人的な分散、又は供給業者からの供給原料に起因する分散（例えば、塩濃度の５％のずれ）が原因である場合が多い。上述のＳ字状の滴定曲線の問題が克服されたならば、タンパク質の精製／分離でのｐＨ勾配の使用は、より高い制御性と精度をもたらすことであろう。従って、直線状のｐＨ勾配を、例えば生物医薬産業で利用できるタンパク質精製のための選択肢にすることが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国仮特許出願第６１／４０３,７４１号
【発明の概要】
【０００７】
タンパク質の分離及び精製のためのシステム及び方法は、混合ループと、酸又はアルカリの供給源と連通している入口と混合ループと連通している出口とを有する一次ポンプと、を含んでいる。濃縮ポンプは、酸又はアルカリの供給源と連通している入口と、混合ループと連通している出口と、を有している。液体クロマトグラフィー塔は、混合ループと連通し、イオン交換樹脂が詰められており、第１の等電点を有する第１のタンパク質と第２の等電点を有する第２のタンパク質とを含有するタンパク質溶液が装填される。混合ループと連通しているプロセス制御フィードバックループは、混合ループの中の滴定溶液のｐＨが検出され、検出されたｐＨに基づいて前記滴定溶液のｐＨが調節されるように、インラインプロセスｐＨ分析部を含んでいる。混合ループの中に一次ポンプと濃縮ポンプによって滴定溶液が提供され、混合ループの中の滴定溶液のｐＨが、フィードバックループによって、インラインプロセスｐＨ分析部によって検出されたｐＨに基づき、第１のタンパク質と第２のタンパク質を液体クロマトグラフィー塔から別々に溶離させるようにクロマトグラフィー塔へ概ね直線状のｐＨ勾配を提供するべく調節される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】［0007］先行技術の液体配合及びクロマトグラフィーシステムの模式図である。
【図２】［0008］図１の先行技術のシステムを使用して酸とアルカリを混合することによって形成されるＳ字状の滴定曲線を表しているグラフである。
【図３】［0009］本発明の液体クロマトグラフィータンパク質分離システムの或る実施形態の模式図である。
【図４】［0010］図１のシステム及び図３のシステムによって作り出される滴定曲線の比較を表しているグラフである。
【図５】［0011］図１のシステム及び図３のシステムによる異なったｐＨ勾配の影響下でのよく似たｐＩを有する２つのタンパク質の溶離挙動を表しているグラフである。
【図６】［0012］本発明のシステム及び方法の２溶媒実施形態を使用した場合の曲線の比較を表しているグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
[0013]本発明によれば、図３に全体が２０で表示されているもの、及びBellafioreら本出願の譲受人に譲渡されている米国特許第７,５１５,９９４号にある様な、精密配合モジュール又はインライン緩衝剤希釈装置を、液体クロマトグラフィー塔に装填されたタンパク質溶液からのタンパク質の分離及び精製に向けて配合液体の直線状のｐＨ勾配を作り出すために使用することができる。米国特許第７,５１５,９９４号並びに関連の米国特許第７，０７２，７４２号及び米国特許出願公開第２００８／０２７９０３８号の内容を、これにより参考文献として援用する。
【００１０】
［0014］図３は、本発明のシステムの或る実施形態におけるＩＢＤ装置２０の配管及び器具類の配線図を示している。酸又は塩基／アルカリの何れかが一次ポンプ２１に接続され、他方が濃縮ポンプ２２に接続されている。一次入口弁２３が一次ポンプ２１の入口と連通しており、同ポンプ２１は注入水（ＷＦＩ）ポンプであってもよい。多数の濃縮入口弁２５ａ−２５ｄが濃縮ポンプ２２の入口と連通している。酸性溶液とアルカリ性溶液は、好適には再循環ポンプ２７を特徴とする混合ループ２４の中へ送り込まれるが、そこでは得られた滴定溶液をｐＨセンサー２６を介し制御器３０によって即座に分析することができ、こうしてインラインプロセスｐＨ分析部が形成されている。センサー２６は制御器３０とインターフェースし、当該制御器３０は自動式滴定弁３１ａ−３１ｃ及び滴定ポンプ３２とインターフェースしており、こうして図３に全体が２８で表示されているプロセス制御フィードバックループが形成されている。
【００１１】
［0015］制御器３０は、単に一例として、プログラム可能な論理制御器（ＰＬＣ）であってもよい。使用者によって定義されたｐＨパラメータに従って、制御器３０は、ｐＨセンサー２６を介し、継続的に、混合ループ２４の中の溶液の酸性度を監視し、自動式滴定弁３１ａ−３１ｃを操作し、滴定ポンプ３２を制御することによって、酸又は塩基をそれぞれ混合ループへ送り込ませ、前記酸性度を調節する。その結果、滴定ポンプ３２の運転と弁３１ａ−３０ｃの設定によって、使用者の要件を満たすべく概ね直線状のｐＨ勾配が作成される。本発明の方法の或る実施形態によれば、使用者の要件とは、クロマトグラフィー塔３４に装填されたタンパク質溶液からのタンパク質の分離及び精製に向けて、当該液体クロマトグラフィー塔３４への配合液体の送達中に直線状のｐＨ勾配を提供させることである。
【００１２】
［0016］制御器３０は、制御器ソフトウェアを介して、滴定弁３１ａ−３１ｃ及び滴定ポンプ３２を制御し、使用者によって定義された設定点をＩＢＤ装置２０へ組み込むように、比例−積分−微分（ＰＩＤ）制御器として構成されているのが望ましい。当技術で知られている様に、ＰＩＤ制御器アルゴリズムの３つのパラメータを調整することにより、制御器は特定のプロセス要件用に設計された制御動作を提供することができる。制御器の応答は、制御器の誤差に対する感応度、即ち制御器が設定点を行き過ぎる度合い及びシステムの振れの度合い、の観点で記述することができる。
【００１３】
［0017］本発明のシステム及び方法の或る実施形態によれば、図３のＩＢＤ装置２０は、陽イオン交換樹脂（例えば、Tosoh Biosciences社から入手可能）が詰められたクロマトグラフィー塔３４に接続されている。単に一例として、クロマトグラフィー塔は、１０ｃｍの内径を有していてもよい。陽イオン樹脂の代わりとして陰イオン交換樹脂が使用されていてもよい（即ち、本発明では何れのイオン交換樹脂が使用されていてもよい）ものと理解されたい。以下でより詳細に説明されている様に、本発明の或る実施形態では、２つのタンパク質、例えばリボヌクレアーゼＡとトリプシノゲン（例えばWorthington Enzymes社及びSigma Aldrich社からそれぞれ入手可能）を分離及び精製するのに、酢酸（例えばAmresco社から入手可能）と水酸化アンモニウム（例えばJT Baker社から入手可能）が、図３の４０と４２の酸と塩基／アルカリとしてそれぞれ使用されている。
【００１４】
［0018］図３のＩＢＤ装置２０を使用し、酢酸（２０ｍＭ）溶液の供給源４０が、開いている入口弁２５ｂを介して濃縮ポンプ２２に接続され、濃縮ポンプ２２は１２．３％の同じ起点ポンプ周波数と終点ポンプ周波数で稼働される。水酸化アンモニウム（１０ｍＭ）の供給源４２が、開いている入口弁２３を介して一次ポンプ２１に接続され、一次ポンプ２１は１４％の起点ポンプ周波数と１０％の終点周波数で運転される。溶液の酸性度が、継続的に、ｐＨセンサー２６と制御器３０を介し、１０％の起点ポンプ周波数と１００％の終点ポンプ周波数の滴定ポンプ３２から送達される水酸化アンモニウム（１００ｍＭ）を用いて調節され、当該水酸化アンモニウムの供給源は図３に３６で表示されている。滴定弁３１ｂは開いているが、弁３１ａと３１ｃは閉じている。最初の５分間は、配合物のｐＨは６に維持され、その後に３０分間に亘ってｐＨ１０．３に達するまで直線状勾配実行方式が続く。
【００１５】
［0019］起点ポンプ周波数と終点ポンプ周波数はポンプの強さに依存することに留意されたく、ポンプの強さは、図示の実施形態では、一次ポンプ２１が３００リットル／時、そして濃縮ポンプ２２が１５０リットル／時である。例えば、仮に一次１ポンプ２１の強さが３００リットル／時から４００リットル／時に変更されたなら、直線状のｐＨ勾配を得るためには新しいポンプ周波数が必要となるであろう。加えて、仮に溶液のモル濃度が、例えば２０ｍＭから４０ｍＭに変更されたなら、ポンプ周波数も調節されなければならないであろう。
【００１６】
［0020］上の段落の方法との比較を提供するため、図３のＩＢＤ装置を使用して、但しフィードバックループ２８と滴定ポンプ３２は使用せずに、ｐＨ勾配を生成した。より具体的には、ｐＨ調節のためのフィードバック制御を空転状態としたこと以外、ポンプ２１と２２の向きと移動相の濃度は上の段落の直線状ｐＨ勾配の場合と同じであった。濃縮ポンプ２２の起点周波数は２９．３％、終点は７．３９％であり、一方、一次ポンプ２１は初期１０％から４０分間を経て最終２９．４５％に上昇した。初期ｐＨは５未満しかなかったが、最終ｐＨは約１１であった。
【００１７】
［0021］２つのタンパク質のうち、トリプシノゲンは８．３に等しい等電点（ｐＩ）を有し、リボヌクレアーゼＡは９．４に等しいｐＩを有している。前述の実行方式の両方について、それぞれのタンパク質５０ｍｇを、２０ｍＭ酢酸、ｐＨ４、と１０ｍＭ塩化ナトリウムに溶かした。混合物を陽イオン交換樹脂が詰められた塔３４へ装填した。装填前、塔をｐＨ６の開始緩衝剤で事前に平衡化した。
【００１８】
［0022］先に述べられている様に、それぞれの実行方式では、弱酸である２０ｍＭ酢酸を１０ｍＭ水酸化アンモニウムを用いて滴定して、ｐＨ曲線を作成した。図４は２つの実行方式の結果を示している。フィードバックループ２８と滴定ポンプ３２を介したｐＨ調節及び制御なしに、単純に酸とアルカリを配合した方式（即ち、受動的ＩＢＤ装置）では、図４のＸ線４２によって示されている様に典型的なＳ字状の滴定曲線が生成された。ｐＨ値の６．５から９．５への急激な上昇は、ｐＩがこの範囲に入るであろうとされるタンパク質を分解するのを困難にする。対照的に、ＩＢＤ装置２０の能動的使用、即ち、フィードバックループ２８と滴定ポンプ３２を使用すると、図４のＯ線４４で表わされている直線状のｐＨ勾配を発現させ、塔３４へ送達することができた。能動的ＩＢＤ装置２０の方法でのインターフェースされたプロセス制御フィードバックループ２８は、絶えずループ２４の中の溶液のｐＨを分析、調節し、何れの所与の時点においても、現在のプロセス値を、制御器３０の中の使用者によって定義されたｐＨ目標設定点（図４の線４６）に参照付けた。より具体的には、制御器３０は、ｐＨセンサー２６からの読み取り値に基づき、信号を送って滴定ポンプ３２の速度を調節させ、混合ループ２４の中の動的ｐＨ値が事前に決められた設定点に向けて継続的に調節されるようにした。
【００１９】
［0023］以上に述べられている様に、能動的ＩＢＤ装置システム及び方法におけるｐＨ制御の有効性を例証するために、似たｐＩを有する２つのタンパク質であるトリプシノゲンとリボヌクレアーゼＡが選定されており、有効性は当該２つのタンパク質の溶離挙動が表されている図５に最も明瞭に示されている。受動的ＩＢＤ装置２０運転の場合には、ｐＨが数分内に６．５から９．５へ急上昇したことで、両方のタンパク質が脱離し、ほとんど一体に、塔から出口５０（図３）を通って溶離してしまった。結果として、図５の線５２で明証されているように、分解はうまくいかなかった。他方、能動的ＩＢＤ装置ｐＨ制御による緩やかなｐＨ増加は、２つのタンパク質のイオン特性を選択的に制御し、ゆっくりと変化させた。結果として、タンパク質は両方とも、図４の線５４で示されているように出口５０を通って基線分離された。
【００２０】
［0024］図に示され、以上に説明されている本発明のシステム及び方法の実施形態、即ち、能動的ＩＢＤ装置が使用されている実施形態は、概ね直線状のｐＨ勾配を作り出すことができた。プロセス制御フィードバックループ２８内に含められたインラインプロセスｐＨ分析部（ｐＨセンサー２６と制御器３０）を有することによって、２つのタンパク質、トリプシノゲンとリボヌクレアーゼＡは、首尾よく分解された。本発明の技術は、互いに似たｐＩを有する他のタンパク質同士を分離したり、高分子重量凝集体を親単量体から取り除いたりするように拡張することもできるであろう。
【００２１】
［0025］図３−図５に示され、以上に説明されている本発明のシステム及び方法の実施形態は、３つの液体又は溶媒を配合／混合しているが、本発明は、代わりの実施形態として、例えば図３の一次ポンプ２１と濃縮ポンプ３２を介して提供される２つの液体又は溶媒を混合することによって直線状のｐＨ勾配が得られる実施形態に構成され、実践されてもよい。図３のシステムは、その様な実施形態では、滴定ポンプ３２を非活動／空転状態にして使用されてもよい。
【００２２】
［0026］その様な２液手法の結果の一例が図６に提供されている。図６を生成するのに使用されている２溶媒システムでは、酢酸（４０ｍＭ）、ｐＨ４、が一次ポンプ２１を介して提供され、リン酸三ナトリウム（２０ｍＭ）、ｐＨ１２、が濃縮ポンプ２２を介して提供されている。図６に６２で表示されている「直線状の勾配」を実現するため、ポンプ２１及び２２からの溶媒は、得られた滴定溶液をｐＨセンサー２６に接続されている制御器３０によって即座に分析し、ひいてはインラインプロセスｐＨ分析部を形成している、混合ループ２４の中へ送り込まれる。図３に示されている様に、同様にＰＩＤ制御器として構成されているのが望ましいとされる制御器７０は、ポンプ２１及び２２とインターフェースし、それらのポンプを制御しており、こうして図３に全体が７２で表示されているプロセス制御フィードバックループが形成されている。使用者によって定義されたｐＨパラメータに従って、制御器７０は、ｐＨセンサー２６を介し、継続的に、溶液の酸性度を監視し、ポンプ２１と２２を制御して酸又は塩基を提供させることにより、酸性度を調節する。その結果、ポンプ２１と２２の運転により、使用者の要件を満たすべく概ね直線状のｐＨ勾配が作成される。
【００２３】
［0027］「流量制御」運転モードでの上の段落の方法との比較を提供するために、図３のＩＢＤ装置２０を使用し、但しｐＨセンサー２６も制御器７０も使用せずに、ｐＨ勾配を生成した。より具体的には、ｐＨ調節のためのフィードバック制御を空転状態としたこと以外、ポンプ２１と２２の向きと移動相の濃度は上の段落の直線状ｐＨ勾配実行方式の場合と同じであった。結果として、図６に６０で表わされている「流量制御」曲線が生成された。図６では曲線６０のｐＨ８から開始して２分間を経てｐＨ１１まで上昇する急勾配の傾きに注目されたい。
【００２４】
［0028］図６の直線状勾配方式結果（６２）を生成する際に、一次ポンプ２１は、２４％の起点周波数と１０％の終点周波数で運転され、一方、濃縮ポンプ２２は１０％の起点周波数と６７％の終点周波数で運転された（２つのポンプの合同流量は０．４Ｌ／分に等しい）。図６の流量制御方式結果（６０）を生成するために、一次ポンプ２１は、６４％の起点周波数と１０％の終点周波数で運転され、一方、濃縮ポンプ２２は、５％の起点周波数と６７％の終点周波数で運転された（２つのポンプの合同流量は０．４Ｌ／分に等しい）。
【００２５】
［0029］本発明の好適な実施形態を示し説明してきたが、実施形態には、付随の特許請求の範囲によって範囲が定義されている本発明の精神から逸脱することなく変更、修正を加えてもよいことが当業者には自明であろう。
【符号の説明】
【００２６】
１０、１２  ポンプ
１４  クロマトグラフィー塔
１６、１８  流量計
２０  インライン緩衝剤希釈装置（ＩＢＤ装置）
２１  一次ポンプ
２２  濃縮ポンプ
２３  一次入口弁
２４  混合ループ
２５ａ、２５ｂ、２５ｃ、２５ｄ  濃縮入口弁
２６  ｐＨセンサー
２７  再循環ポンプ
２８  プロセス制御フィードバックループ
３０  制御器
３１ａ、３１ｂ、３１ｃ  自動式滴定弁
３２  滴定ポンプ
３４  クロマトグラフィー塔
３６  水酸化アンモニウム供給源
４０、４２  酸供給源、塩基／アルカリ供給源
５０  出口
７０  制御器
７２  プロセス制御フィードバックループ
【図１】
2012068244.tif 000003
【図２】
2012068244.tif 000004
【図３】
2012068244.tif 000005
【図４】
2012068244.tif 000006
【図５】
2012068244.tif 000007
【図６】
2012068244.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成23年11月17日(2011.11.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の分離及び精製のためのシステムにおいて、
ａ．混合装置と、
ｂ．酸、アルカリ、又は水の供給源と連通している入口と、前記混合装置と連通している出口と、を有する一次ポンプと、
ｃ．酸又はアルカリの供給源と連通している入口と、前記混合装置と連通している出口と、を有する濃縮ポンプと、
ｄ．前記混合装置と連通し、イオン交換樹脂が詰められており、タンパク質が装填される液体クロマトグラフィー塔と、
ｅ．前記混合装置と連通していて、前記混合装置の中の滴定溶液のｐＨが検出され、検出されたｐＨに基づいて前記滴定溶液のｐＨが調節されるように、インラインプロセスｐＨ分析部を含んでいる、プロセス制御フィードバックループと、を備えており、
それにより、前記混合装置の中に前記一次ポンプと前記濃縮ポンプによって前記滴定溶液が提供され、前記混合装置の中の前記滴定溶液のｐＨが、前記フィードバックループによって、前記インラインプロセスｐＨ分析部によって検出されたｐＨに基づき、前記タンパク質同士を前記液体クロマトグラフィー塔から別々に溶離させるように当該クロマトグラフィー塔へ概ね直線状のｐＨ勾配を提供するべく調節される、システム。
【請求項２】
前記混合装置内に再循環ポンプを更に備えている、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記プロセス制御フィードバックループは、酸又はアルカリの供給源と連通している入口と前記混合装置と連通している出口とを有する滴定ポンプを含み、前記混合装置の中の前記滴定溶液のｐＨが前記滴定ポンプからの酸又はアルカリを用いて調節されるようにしている、請求項３に記載のシステム。
【請求項４】
前記プロセス制御フィードバックループは、前記滴定ポンプの入口と連通している複数の自動式滴定弁を含んでいる、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記インラインプロセスｐＨ分析部は、前記混合装置と連通しているｐＨセンサーと、前記ｐＨセンサー、前記滴定ポンプ、及び前記自動式滴定弁と連通している制御器と、を含んでいる、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
前記インラインプロセスｐＨ分析部は、前記混合装置と連通しているｐＨセンサーと、前記ｐＨセンサー及び前記滴定ポンプと連通している制御器と、を含んでいる、請求項３に記載のシステム。
【請求項７】
前記制御器はプログラム可能な論理制御器である、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記制御器はＰＩＤ制御器として構成されている、請求項６に記載のシステム。
【請求項９】
前記インラインプロセスｐＨ分析部は、前記混合装置と連通しているｐＨセンサーと、前記ｐＨセンサーと連通している制御器と、を含んでいる、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記制御器はプログラム可能な論理制御器である、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記制御器はＰＩＤ制御器として構成されている、請求項９に記載のシステム。
【請求項１２】
前記一次ポンプは、ＷＦＩポンプである、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記プロセス制御フィードバックループは、前記混合装置の中の前記滴定溶液のｐＨが、前記一次ポンプからの酸又はアルカリ及び／又は前記濃縮ポンプからの酸又はアルカリによって調節されるように、前記一次ポンプと前記濃縮ポンプの少なくとも一方と連通している、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記インラインプロセスｐＨ分析部は、前記混合装置と連通しているｐＨセンサーと、前記ｐＨセンサー及び前記一次ポンプと前記濃縮ポンプの少なくとも一方と連通している制御器と、を含んでいる、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記制御器はプログラム可能な論理制御器である、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記制御器はＰＩＤ制御器として構成されている、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１７】
前記混合装置は、混合ループを含んでいる、請求項１に記載のシステム。
【請求項１８】
前記タンパク質は、第１の等電点と、第２の等電点を有する第２のタンパク質と、を有する少なくとも２つのタンパク質を含んでいる、請求項１に記載のシステム。
【請求項１９】
タンパク質を分離し精製するための方法において、
ａ．混合装置と、前記混合装置と連通している一次ポンプと、前記混合装置と連通している濃縮ポンプと、前記混合装置と連通している液体クロマトグラフィー塔と、前記混合装置と連通していて、前記混合装置の中の滴定溶液のｐＨが検出され、検出されたｐＨに基づいて前記滴定溶液のｐＨが調節されるように、インラインプロセスｐＨ分析部を含んでいる、プロセス制御フィードバックループと、を提供する段階と、
ｂ．前記液体クロマトグラフィー塔にイオン交換樹脂を詰める段階と、
ｃ．前記クロマトグラフィー塔に、タンパク質を含有するタンパク質溶液を装填する段階と、
ｄ．前記一次ポンプを使用して前記混合装置に酸又はアルカリを供給する段階と、
ｅ．前記濃縮ポンプを使用して前記混合装置に酸又はアルカリを供給し、前記混合装置の中に前記滴定溶液を作製する段階と、
ｆ．前記混合装置の中の前記滴定溶液を、前記フィードバックループを使用して、前記インラインプロセスｐＨ分析部によって検出されたｐＨに基づき、前記タンパク質同士を前記液体クロマトグラフィー塔から別々に溶離させるように当該クロマトグラフィー塔へ概ね直線状のｐＨ勾配を提供するべく調節する段階と、を備えている方法。
【請求項２０】
前記プロセス制御フィードバックループは、滴定ポンプを含んでおり、前記ｆ段階の前記滴定溶液は、前記滴定ポンプによって提供される酸又はアルカリによって調節される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記プロセス制御フィードバックループは、前記一次ポンプと前記濃縮ポンプの少なくとも一方と連通しており、前記ｆ段階の前記滴定溶液は、一次ポンプ及び／又は濃縮ポンプによって提供される酸又はアルカリによって調節される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記一次ポンプと前記濃縮ポンプの一方の周波数は、前記ｄ段階と前記ｅ段階の間は定常に保持され、一方、前記一次ポンプと前記濃縮ポンプの他方の周波数は、前記ｄ段階と前記ｅ段階の間は変化する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記混合装置は、混合ループを含んでいる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質は、第１の等電点と、第２の等電点を有する第２のタンパク質と、を有する少なくとも２つのタンパク質を含んでいる、請求項１９に記載の方法。
【外国語明細書】
2012068244000001.pdf