(57)【要約】【課題】ビオチン化合物の固定化能力に優れ、かつ、卓上小型遠心機など汎用の設備で迅速・簡単に回収できる医療用粒子およびその医療用粒子を用いた生理活性物質の捕捉方法を提供すること。【解決手段】生理活性物質を捕捉する機能を有する医療用粒子であって、粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端にビオチン結合性タンパク質を有する第２繰り返しユニットとを有することを特徴とする医療用粒子。ビオチンを有する生理活性物質を選択的に捕捉し、それ以外の不要な生理活性物質や蛍光物質の吸着および結合を抑制することできる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質を捕捉する機能を有する医療用粒子であって、
粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、
側鎖の末端にビオチン結合性タンパク質を有する第２繰り返しユニットとを有することを特徴とする医療用粒子。
【請求項２】
前記第２繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものであり、その側鎖末端にビオチン結合性タンパク質を結合させたものである請求項１に記載の医療用粒子。
【請求項３】
前記重合体が前記第１繰り返しユニットと前記第２繰り返しユニットを有するランダム共重合体である請求項１または２に記載の医療用粒子。
【請求項４】
前記第１繰り返しユニットと、前記第２繰り返しユニットとの共重合比（第１繰り返しユニット／第２繰り返しユニット）が、９７／３〜５０／５０である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項５】
前記ビオチン結合性タンパク質は、アビジン、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンより選ばれる一種以上である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項６】
前記第１繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものである請求項１ないし５のいずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項７】
前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが、下記式（１）で表されるモノマーである請求項６に記載の医療用粒子。
【化１】
2012068127.tif 000006
【請求項８】
前記粒子状の基材は、無機材料で構成されている請求項１ないし７のいずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項９】
前記無機材料が、無機酸化物である請求項８に記載の医療用粒子。
【請求項１０】
前記無機酸化物が、酸化ケイ素である請求項９に記載の医療用粒子。
【請求項１１】
前記重合体が、前記第１繰り返しユニット、前記第２繰り返しユニット、および側鎖にシランカップリング剤を有するユニットからなり、前記基材にシランカップリング剤を介して結合されている請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の医療用粒子。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の医療用粒子を用いることを特徴とする、生理活性物質の捕捉方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療用粒子および生理活性物質の捕捉方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビオチンは、ビオチン結合性タンパク質と特異的に結合反応を生じることは古くから知られており、その結合力は抗原−抗体反応の１００万倍以上と強く、ほとんど非可逆反応に近い結合性を示す。この特性を活かし、ビオチン−ビオチン結合タンパク質反応は、生化学分野における検出反応によく用いられる。ビオチン結合タンパク質で最も古くから利用されている物質はアビジンであり、アビジンは生卵白由来のタンパク質である。
【０００３】
例えば、特許文献１には、アビジンとビオチンの相互作用を利用した細胞分離方法が開示されている。具体的には、多孔質アクリルアミドゲルにアビジンを固定化したビーズを充填したカラムに、ビオチン化抗体と細胞との複合体を通過させ、ビオチン−アビジンの強力な結合力を利用して、目的細胞をカラム内に吸着させて分離するものである。この方法は、ビオチン−アビジンの結合力の強さを利用しており、処理速度、純度の点で優れている。しかし、ポリアクリルアミドビーズにアビジンが直接結合しているためアビジンが有効に作用せず、細胞−抗体−ビオチンの吸着速度および吸着効率が低下してしまうという問題があった。
【０００４】
一方、非特許文献１には、表面をストレプトアビジンで修飾した磁性ビーズを利用したウイルス検出方法が記載されている。この文献に記載された手法は、以下の通りである。まず、検体から標的核酸（ウイルスのゲノム核酸）を放出させた液中に、これに相補的な配列を持ち、かつ、末端をビオチンで修飾したプローブを加える。この時点でプローブは自身に相補的な標的核酸が存在すればハイブリダイズする。そこに、表面をストレプトアビジンで修飾した磁性ビーズを加えると、プローブ末端のビオチン分子とストレプトアビジンは強力に結合するので、もし最初の検体血漿にウイルスが存在していた場合、「磁性ビーズ〜ストレプトアビジン〜ビオチン〜プローブ〜標的核酸」複合体が形成される。この複合体を磁石で回収し、標的核酸を精製・抽出している。
【０００５】
しかし、本文献にも記載されているように、通常、磁性ビーズを回収するには反応容器である試験管の外壁に強力な磁石を当て、ビーズが集まってくるのを待つ方法が取られる。しかしながらこの方法では、ビーズを十分集めるのに時間がかかること、不要な反応液を吸引除去してもかなりの量の液が管壁に残ること、といった欠点がある。そこで本文献では、チップの細くなった部分に磁石を近づけて磁性ビーズを集める方法を採用しているが、強力な磁石が必要であることに変わりはなく、設備が大掛かりになり、汎用性に乏しいという欠点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ９１／１６１１６号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＢＩＯ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ  Ｖｏｌ.２１  Ｎｏ．８  ２００４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ビオチン化合物の固定化能力に優れ、かつ、卓上小型遠心機など汎用の設備で迅速・簡単に回収できる医療用粒子およびその医療用粒子を用いた生理活性物質の捕捉方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
このような目的は、下記（１）〜（１２）に記載の本発明により達成される。
（１）生理活性物質を捕捉する機能を有する医療用粒子であって、
粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、
側鎖の末端にビオチン結合性タンパク質を有する第２繰り返しユニットとを有することを特徴とする医療用粒子。
（２）前記第２繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものであり、その側鎖末端にビオチン結合性タンパク質を結合させたものである（１）に記載の医療用粒子。
（３）前記重合体が前記第１繰り返しユニットと前記第２繰り返しユニットを有するランダム共重合体である（１）または（２）に記載の医療用粒子。
（４）前記第１繰り返しユニットと、前記第２繰り返しユニットとの共重合比（第１繰り返しユニット／第２繰り返しユニット）が、９７／３〜５０／５０である（１）ないし（３）のいずれか１項に記載の医療用粒子。
（５）前記ビオチン結合性タンパク質は、アビジン、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンより選ばれる一種以上である（１）ないし（４）のいずれか１項に記載の医療用粒子。
（６）前記第１繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものである（１）ないし（５）のいずれか１項に記載の医療用粒子。
（７）前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが、下記式（１）で表されるモノマーである（６）に記載の医療用粒子。
【化１】
2012068127.tif 000002
（８）前記粒子状の基材は、無機材料で構成されている（１）ないし（７）のいずれか１項に記載の医療用粒子。
（９）前記無機材料が、無機酸化物である（８）に記載の医療用粒子。
（１０）前記無機酸化物が、酸化ケイ素である（９）に記載の医療用粒子。
（１１）前記重合体が、前記第１繰り返しユニット、前記第２繰り返しユニット、および側鎖にシランカップリング剤を有するユニットからなり、前記基材にシランカップリング剤を介して結合されている（１）ないし（１０）のいずれか１項に記載の医療用粒子。
（１２）（１）ないし（１１）のいずれか１項に記載の医療用粒子を用いることを特徴とする、生理活性物質の捕捉方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ビオチン化合物の固定化能力に優れ、かつ、卓上小型遠心機など汎用の設備で迅速・簡単に回収できる医療用粒子および生理活性物質の捕捉方法を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の医療用粒子および生理活性物質の捕捉方法について説明する。
本発明の医療用粒子は、生理活性物質を捕捉する機能を有する医療用粒子であって、粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端にビオチン結合性タンパク質を有する第２繰り返しユニットと、を有することを特徴とする。
また、本発明の生理活性物質の捕捉方法は、上記に記載の医療用粒子を用いることを特徴とする。
【００１２】
本発明の医療用粒子は、生理活性物質を捕捉する機能を有するものである。具体的には、ビオチンを捕捉する機能を有する医療用粒子に関するものであり、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質の結合反応を利用するものである。さらに具体的には、ビオチン結合性タンパク質を結合させた基材にビオチンを含む生理活性物質を捕捉させることにより、該生理活性物質と特異的に結合する生体分子を選択的に回収しうる粒子を得るものである。
ここで、生理活性物質とは、例えばビオチンを含む生体分子、例えば、ビオチン化した抗原、抗体、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、レクチン等を挙げることができる。
【００１３】
前記粒子状の基材は、特に限定されるものではなく、有機材料、無機材料を問わず用いることができる。有機材料としては、例えばアフィニティクロマトグラフィーの担体として用いられる多孔性のアガロース粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、デキストラン粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｄｅｘ）の他に、ポリアクリルアミドゲル（商品名：Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ、バイオラッド社）、ポリスチレン、エチレン−無水マレイン酸共重合物、ポリメタクリル酸メチル等の粒子が挙げられる。
【００１４】
また、無機材料としては、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルト、およびこれらの合金や無機酸化物等が挙げられる。これらの中でも無機酸化物が粒子自体の強度が高い点で好ましい。中でも、酸化ケイ素が取り扱いやすく最も好ましい。
【００１５】
前記粒子状の基材の平均粒径は、目的および用途に応じて適宜選択される。特に、無機物の場合、粒径の制御が困難な乳化重合や懸濁重合で有機物の粒子を製造する方法に比較して、粒径の制御が容易である。
具体的に、本発明の医療用粒子に用いる基材の粒径としては、用途によっても異なるが、平均粒径が数ｎｍ〜１００μｍ程度のものが好ましい。特には、１００ｎｍ〜５０μｍが好ましく、最も１μｍ〜４０μｍが好ましい。前記基材の平均粒径が前記範囲内であると、特に生理活性物質の捕捉量とハンドリングの良さとのバランスに優れる。
このような平均粒径は、例えば粒度分布計で測定することができる。
【００１６】
前記粒子状の基材の表面には、重合体が固定されている。この重合体は、ビオチン結合生理活性物質を効率良く、かつ簡易に粒子状基材に結合することを可能とするものである。さらに、このビオチン結合生理活性物質と反応する別の物質（検出対象以外のタンパク質等）の非特異吸着を効果的に抑制するものである。
【００１７】
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットと、側鎖の末端にビオチン結合性タンパク質を有する第２繰り返しユニットと、を有する。すなわち、側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットが、検出対象以外のタンパク質等の非特異吸着を抑制し、側鎖の末端にビオチン結合性タンパク質を有する第２繰り返しユニットがビオチン結合生理活性物質を捕捉することができるものである。
【００１８】
前記側鎖に親水性基を有する第１繰り返しユニットは、例えばアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、ホスホリルコリン基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー等に由来するものである。これらの中でもアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものが好ましい。これにより、血清中に含まれるタンパク質の非特異吸着を大きく抑制することができる。
【００１９】
具体的にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、下記式（１）で示されるように、（メタ）アクリル基と炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｙの連鎖からなる化合物であることが好ましい。
【００２０】
【化１】
2012068127.tif 000003
【００２１】
前記式（１）中のアルキレングリコール残基Ｙの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。炭素数が前記範囲内であると、特に非特異吸着の抑制に優れる。
また、アルキレングリコール残基Ｙの繰り返し数ｑは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは２０〜９０の整数である。  前記繰り返し数ｑが前記範囲内であると、特に非特異吸着の抑制に優れる。
なお、繰り返し数ｑが、２以上１００以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基Ｙの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。
【００２２】
前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、具体的にはメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、目的とする生理活性物質以外の成分の非特異的吸着が少ないこと及び入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートまたはエトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。
【００２３】
また、側鎖の末端にビオチン結合性タンパク質を有する第２繰り返しユニットのビオチン結合性タンパク質は、生理活性物質に結合したビオチンまたはビオチン誘導体と特異的に反応する分子が好ましい。具体的には、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンが好ましい。ビオチンと前記アビジン類との相互作用は非常に強く、特異性も高いためである。また、低分子であるビオチンを生理活性物質へ導入する事も容易な為、物質固定化の為の強力なツールとすることができる。
【００２４】
前記第２繰り返しユニットは、例えば側鎖にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーや側鎖にグリシジル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー等に由来し、さらに側鎖の先端に上述したビオチン結合性タンパク質を結合したものが挙げられる。これらの中でも、側鎖にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するユニットにビオチン結合性タンパク質を結合したものが好ましい。これにより、非特異吸着をより抑制することができる。
【００２５】
また、第２繰り返しユニットは、下記式（２）で示されるモノマーに由来するユニットのＷを用いてビオチン結合性タンパク質を固定化したものであっても良い。
【００２６】
【化２】
2012068127.tif 000004
【００２７】
式（２）中のＷは、活性エステルであり、具体的には例えばｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられるが、中でもｐ−ニトロフェニル活性エステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。これにより、ビオチン結合性タンパク質と、活性エステルの反応性を向上することができ、第２繰り返しユニットの側鎖の末端にビオチン結合性タンパク質を配置することが容易となる。
【００２８】
前記重合体の前述した第１繰り返しユニットと、第２繰り返しユニットとの共重合比（第１繰り返しユニット／第２繰り返しユニット）は、特に限定されないが、９７／３〜５０／５０であることが好ましく、特に９５／５〜７０／３０であることが好ましい。共重合比が前記範囲内であると、特に非特異吸着を効果的に抑制するとともに、ビオチン化合物の捕捉効果に優れる。
前記共重合比は、例えばＸ線光電子分光分析（ＸＰＳ）で元素組成を評価することで算出できる。
【００２９】
前記重合体は、第１繰り返しユニットと第２繰り返しユニットを含むランダム共重合体であることが好ましい。これにより、第２繰り返しユニットの側鎖の末端に存在するビオチン結合性タンパク質が分散するために、有効に作用することができる。
【００３０】
前記重合体の重量平均分子量は、特に限定されないが、５０００〜１００００００であることが好ましく、特に１００００〜１０００００であることが好ましい。重量平均分子量が前記範囲内であると、合成時のハンドリングがよく、また、非特異吸着を効果的に抑制することができる。
【００３１】
本発明の医療用粒子では、前記第１繰り返しユニット、前記第２繰り返しユニット、および側鎖にシランカップリング剤を有するユニットからなる重合体が、前記基材にシランカップリング剤を介して結合されていても良い。これにより、ポリマーがビーズから脱離するのを防ぐことができる。
【００３２】
前記側鎖にシランカップリング剤を有するユニットとしては、メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、メタクリロキシプロピルトリエトキシシランに由来するものが挙げられる。
【００３３】
シランカップリング剤により、粒子に結合した重合体を形成する具体的な方法としては、無機酸化物の場合は、表面に存在する水酸基との間のカップリング反応で容易に結合させることができる。
【００３４】
前記シランカップリング剤を用いることで、ポリマーがビーズから脱離することを防ぐことができることから、医療用粒子しての使用において、繰り返される加熱処理や、洗浄工程において、ポリマーの溶解を防ぐことが可能であり、さらに、ポリマーの脱離に伴い発生する、非特異吸着の劣化が抑制され、化学的、物理的安定した医療用粒子を提供することが可能となる。
また、検出対象以外のタンパク質等に対する非特異吸着が少なく、かつ、検出対象は、ビオチン結合性タンパク質とビオチンまたはビオチン誘導体の高い反応性により、粒子表面に捕捉することが可能であるので、Ｓ／Ｎ比の高い医療用粒子を提供することができる。
【００３５】
（重合体固定ビーズの作製）
前記重合体固定ビーズの作製について述べる。本発明のビーズの合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、ビーズ粒子表面に、重合性官能基を有するシランカップリング剤を固定化し、前記のビオチン結合タンパク質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、および該ビーズを含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。
溶媒としてはそれぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、２−ブタノン、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルムなどを挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）などのアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリルなどの有機過酸化物などを挙げることができる。
本発明の高分子化合物の化学構造は、その結合方式がランダム、ブロック、グラフトなどいずれの形態をなしていてもかまわない。
【００３６】
（ビオチン結合性タンパク質の固定化）
本発明においてビオチン結合性タンパク質をビーズ上に固定化する際には、ビオチン結合性タンパク質を溶解又は分散させた液体を付着する方法が好ましい。ビオチン結合性タンパク質を溶解又は分散した液体のｐＨは５．０〜１１．０であることが好ましく、ｐＨ６．０〜１０がより好ましい。この範囲外だと、ビオチン結合性タンパク質であるやビオチン結合性タンパク質を固定化する分子が変性・分解する恐れがある。
生理活性物質付着後は、固相表面の親水基の特性により、界面活性剤を含む水や緩衝液で洗浄することで、ビオチン結合性タンパク質であると反応しうる別の物質の固相表面への非特異吸着を抑制することが可能となる。しかし、ビオチン結合性タンパク質と反応しうる別の物質に固相表面の分子と反応しうるビオチン又はビオチン誘導体が含まれる場合、ビオチン結合性タンパク質を固定化した以外の固相表面に残存する分子の不活性化処理を、ビオチン又はビオチン誘導体を有する他の化合物で行うことが好ましい。
【００３７】
（固定化する生理活性物質の構造）
固定化する生理活性物質にビオチン又はビオチン誘導体を、一般的な方法で導入する事で、基材表面に固定化されたビオチン結合タンパク質によって、効果的に目的の生理活性物質を固定化する事が可能となる。より反応性を高める為に、ビオチン又はビオチン誘導体の導入位置は生理活性物質の末端や外側であることが望ましい。生理活性物質の合成法が進歩してきた事で、任意の位置にビオチン又はビオチン誘導体を導入できるようになってきており、生理活性を発現する為に重要な部位に影響を及ぼさないような位置で生理活性物質を担体表面に固定化することが可能である。
ビオチンまたはビオチン誘導体を導入する一般的な方法としては、市販のビオチン標識キット（例えば、同人化学製、Dojin  Labling  Kit）を用いて生理活性物質をビオチン標識することが可能である。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３９】
（実施例１）
（アビジンビーズの作製）
メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製ＳＩＭ６４８６．５）１３ｇをｐＨ３．０の酢酸水溶液５０ｍＬとエタノール５０ｍＬとの混合液に添加し、シランカップリング剤を加水分解した後に、シリカビーズ（平均粒径５μｍ、細孔径７０Å、富士シリシア化学株式会社製ＳＭＢ７０−５）１０ｇを投入し７０℃で２時間攪拌した後、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、１００℃で１時間加熱した。その後、エタノールで分散させてよく振盪した後、遠心分離により上澄みを除去し乾燥させた。
【００４０】
数平均分子量Ｍｎ＝約４７５のポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート、以下ＰＥＧＭＡ４７５と記載、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルエチレングルコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）をエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は０．２ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＰＥＧＭＡ４７５、ＭＥＯＮＰの順に９０：１０、８０：２０、７０：３０である。そこにＡＩＢＮを０．００４ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、上記のメタクリロキシプロピルジメチルメトキシシランで処理したシリカビーズ１０ｇを投入し、アルゴンガス雰囲気下、７０℃で２２時間反応させた。次いで、遠心分離により反応溶液からシリカビーズを回収し、ジメチルスルホキシドに分散させ、よく振盪した後、吸引ろ過によりビーズを回収し、乾燥させた。
【００４１】
得られたシリカビーズ約３７ｍｇを５０μｇ／ｍＬのアビジン溶液（ＰＩＥＲＣＥ製ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎＴＭＢｉｏｔｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  ＰｒｏｔｅｉｎをｐＨ９．５のリン酸水素二カリウム緩衝液で希釈）と混合し３７℃で４時間処理した後、遠心分離により上澄みを除去し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回行い、さらに０．１ｍｏｌ／Ｌの２−アミノエタノール（溶媒：ｐＨ９．５、０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）で室温下、１時間処理し、ＭＥＯＮＰの不活性化を行った。  遠心分離により上澄みを除去した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回行い乾燥させた。
【００４２】
（アビジンビーズの測定）
得られたシリカビーズ１０ｍｇにアビジンと特異的に結合する５μｇ／ｍＬのビオチン標識化ＨＲＰ溶液（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ＰｅｒｏｘｉｄａｓｅをＰＢＳで２００倍に希釈）２７０μＬ、または５μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識化抗体溶液２７０μＬを投入し、室温で３０分間攪拌した後、遠心分離により上澄みを除去した。次いで、０．０５％の濃度でＴｒｉｔｏｎ×１００を含むＰＢＳを投入し、よく分散させた後、遠心分離により上澄みを除去する操作を１５回繰り返し、フィルターユニット（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ）を用いてシリカビーズを回収した。回収したシリカビーズにＴＭＢＺ溶液（住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ用発色キットより調製し使用）を加え室温で１５分間攪拌することによりＴＭＢＺとシリカビーズ表面に特異的に捕捉されたビオチン標識化ＨＲＰ、又は非特異的に吸着したＨＲＰ標識化抗体とを反応をさせた後、反応停止液（住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ発色キットより使用）を加え反応を停止させた。その後、フィルターユニットによりシリカビーズと反応液を分離し、反応液における４５０ｎｍの吸光度を測定した。この吸光度には上記操作においてビオチン標識化ＨＲＰ溶液を投入した場合には、主としてシリカビーズに特異的に捕捉されたビオチン標識化ＨＲＰの量が反映され、ＨＲＰ標識化抗体溶液を投入した場合には、主としてシリカビーズに非特異的に吸着されたＨＲＰ標識化抗体の量が反映される。
【００４３】
（比較例１）
前記アビジンビーズの作製と同様の方法で、ＰＥＧＭＡ４７５とＭＥＯＮＰとの比率を、順に９９：１、２０：８０に変更したものを作製した。前記と同様、タンパク質の特異的捕捉評価および非特異的吸着量評価を行った。
【００４４】
（比較例２）
シリカビーズ（平均粒径５μｍ、細孔径７０Å、富士シリシア化学株式会社製ＳＭＢ７０−５）に実施例１の処理の施さずそのまま用い、前記と同様、タンパク質の特異的捕捉評価および非特異的吸着量評価を行った。
【００４５】
表１には実施例１、比較例１及び２のタンパク質の特異的捕捉評価および非特異的吸着量評価における４５０ｎｍの吸光度を示した。表より明らかなように、本発明の粒子は比較例１のシリカビーズに比較してビオチン標識化ＨＲＰによる吸光度（１）とＨＲＰ標識化抗体による吸光度（２）との比（（１）／（２））が大きく、より選択的に目的とするタンパク質を捕捉できていることがわかる。
表１
2012068127.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の医療用粒子を用いることで、ビオチンを有する生理活性物質を選択的に捕捉し、それ以外の不要な生理活性物質や蛍光物質の吸着および結合を抑制することできる。