(57)【要約】【課題】ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥工程で粗大粒子が生成するのを防止する方法，及び眼の透明組織可視化剤用ポリ乳酸粒子の製造方法の提供。【解決手段】ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥時における粗大粒子生成を抑制する方法であって，(a)分散剤と賦形剤を含有するポリ乳酸微粒子水性懸濁液を調製するステップであって，(i)ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなる溶液を，分散剤水溶液に撹拌下で添加した後，賦形剤を添加するか，又は(ii)ポリ乳酸を該溶媒に溶解させてなる溶液を，分散剤及び賦形剤を含有する水溶液に撹拌下で添加することによるものであるステップと，(b)該懸濁液をガラス容器中で凍結乾燥に付すステップと，を含み，ステップ(b)において，ガラス容器が凍結乾燥機のチャンバー内に置かれ，該懸濁液が凍結する時のチャンバー内の冷却速度が０．１〜１℃／分に調節されるものである，方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥時におけるポリ乳酸の粗大粒子の生成を抑制する方法であって，
(a) 分散剤と賦形剤とを含有するポリ乳酸微粒子水性懸濁液を調製するステップであって，
(i) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤を含有する分散剤水溶液に撹拌下で添加した後，賦形剤を添加するか，又は
(ii) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤及び賦形剤を含有する分散剤／賦形剤水溶液に撹拌下で添加することによるものであるステップと，
(b) 該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液をガラス容器中で凍結乾燥に付すステップと，
を含んでなり，
ステップ(b)において，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を入れた該ガラス容器が凍結乾燥機のチャンバー内に置かれ，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液が凍結する時の該チャンバー内の冷却速度が０．１〜１℃／分に調節されるものである，方法。
【請求項２】
該分散剤水溶液又は該分散剤／賦形剤水溶液中の該分散剤の濃度が０．１１〜２．２Ｗ／Ｖ％である，請求項１の方法。
【請求項３】
該分散剤がポリビニルピロリドン又はポリビニルアルコールである，請求項１又は２の方法。
【請求項４】
該分散剤／賦形剤水溶液中の該賦形剤の濃度が１．１〜１１Ｗ／Ｖ％である，請求項１ないし３の何れかの方法。
【請求項５】
該賦形剤が多価アルコールである，請求項１ないし４の何れかの方法。
【請求項６】
該多価アルコールがマンニトールである，請求項５の方法。
【請求項７】
該ポリ乳酸溶液中の該ポリ乳酸の濃度が１〜５０Ｗ／Ｖ％である，請求項１ないし６の何れかの方法。
【請求項８】
該水混和性有機溶媒がアセトン・エタノール混液である，請求項１ないし７の何れかの方法。
【請求項９】
該アセトン・エタノール混液におけるアセトンとエタノールの混合比が，体積で，アセトン：エタノール＝３：７〜５：５である，請求項８の方法。
【請求項１０】
該分散剤水溶液又は該分散剤／賦形剤水溶液と該ポリ乳酸溶液の混合比が，体積で，該水溶液：ポリ乳酸溶液＝８５：１５〜９５：５である，請求項１ないし９の何れかの方法。
【請求項１１】
該ガラス容器がガラスバイアルである，請求項１ないし１０の何れかの方法。
【請求項１２】
眼の透明組織可視化剤用ポリ乳酸粒子の製造方法であって，
(a) 分散剤と賦形剤とを含有するポリ乳酸微粒子水性懸濁液を調製するステップであって，
(i) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤を含有する分散剤水溶液に撹拌下で添加した後，賦形剤を添加するか，又は
(ii) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤及び賦形剤を含有する分散剤／賦形剤水溶液に撹拌下で添加することによるものであるステップと，
(b) 該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液をガラス容器中で凍結乾燥に付すステップと，
を含んでなり，
ステップ(b)において，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を入れた該ガラス容器が凍結乾燥機のチャンバー内に置かれ，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液が凍結する時の該チャンバー内の冷却速度が０．１〜１℃／分に調節されるものである，製造方法。
【請求項１３】
該分散剤水溶液又は該分散剤／賦形剤水溶液中の該分散剤の濃度が０．１１〜２．２Ｗ／Ｖ％である，請求項１２の製造方法。
【請求項１４】
該分散剤がポリビニルピロリドン又はポリビニルアルコールである，請求項１２又は１３の製造方法。
【請求項１５】
該分散剤／賦形剤水溶液中の該賦形剤の濃度が１．１〜１１Ｗ／Ｖ％である，請求項１２ないし１４の何れかの製造方法。
【請求項１６】
該賦形剤が多価アルコールである，請求項１２ないし１５の何れかの製造方法。
【請求項１７】
該多価アルコールがマンニトールである，請求項１６の製造方法。
【請求項１８】
該ポリ乳酸溶液中の該ポリ乳酸の濃度が１〜５０Ｗ／Ｖ％である，請求項１２ないし１７の何れかの製造方法。
【請求項１９】
該水混和性有機溶媒がアセトン・エタノール混液である，請求項１２ないし１８の何れかの製造方法。
【請求項２０】
該アセトン・エタノール混液におけるアセトンとエタノールの混合比が，体積で，アセトン：エタノール＝３：７〜５：５である，請求項１９の製造方法。
【請求項２１】
該分散剤水溶液又は該分散剤／賦形剤水溶液と該ポリ乳酸溶液の混合比が，体積で，該水溶液：ポリ乳酸溶液＝８５：１５〜９５：５である，請求項１２ないし２０の何れかの製造方法。
【請求項２２】
該ガラス容器がガラスバイアルである，請求項１２ないし２１の何れかの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を凍結乾燥して得られるポリ乳酸粒子の凝集塊の発生を抑制する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
眼には硝子体，水晶体および角膜などの透明組織が集まっている。白内障手術では水晶体嚢内の核および皮質の除去を行うが，後嚢近くに残った水晶体の皮質が混濁し，後発白内障を引き起こすことが知られている。
【０００３】
また硝子体除去手術では，網膜に癒着した増殖組織と増殖の足場となる硝子体を可能な限り完全に除去することが求められる。しかしながら，硝子体は透明な組織であり，硝子体の完全な除去は容易ではない。この解決策として，硝子体除去手術中にトリアムシノロン製剤（ケナコルト−Ａ：登録商標）などのステロイド懸濁液を硝子体腔に注射器を用いて注入することによって透明な硝子体を可視化することが行われている（非特許文献１参照）。この方法を採用することで，手術手技を容易にし，確実に硝子体の除去を行うことができる。しかしながら，治療を目的としたトリアムシノロン製剤の硝子体への使用においては，副作用として眼圧上昇と白内障の進行が報告されている（非特許文献２および３参照）。そこで，ポリ乳酸その他の薬理作用を示さない高分子化合物からなる粒子の懸濁液を硝子体腔に注入することにより，硝子体の視認性を向上させる方法及びそのために使用する透明組織可視化剤（眼の透明組織に注入又は散布することによって，手術時における眼の透明組織の視認性を向上させるための薬剤）が提案されている（特許文献１）。
【０００４】
上記の方法において，微粒子の懸濁液は，液状での長期保存による沈殿分離等の安定性の問題を回避する等の理由から，懸濁液の凍結乾燥物の形で供給されることが極めて好ましい。しなしながら，ポリ乳酸等，高分子化合物によっては懸濁液の凍結乾燥時に凝集塊を形成して粗大粒子を生ずるものがある。高分子化合物の粒子は，注射器により眼内に注入される形で使用されるから，粒子は，注射針を詰らせることなしに通過できる粒子径のものでなければならない。上記特許文献１には，平均値として粒子径が開示されているものの，最大粒子径には言及されておらず，また粒子径をコントロールするための調製条件に関する明確な記載はない。また，ポリ乳酸の分散液に２価あるいは３価の金属塩を添加することで眼組織の視認性を向上させる方法が特許文献２に開示されているが，同文献には，凍結乾燥時の粗大粒子の生成の防止に関しては記載がない。更に，２０〜１２０μｍのポリ乳酸微粒子を形成してグリコール酸含有の水性担体中で凍結乾燥することによる注射可能インプラントの製造方法が特許文献３に開示されているが，同方法は，ポリ乳酸微粒子の生成に際し塩素系有機溶媒への溶解及び析出の工程を含んでおり，製剤中の塩素系有機溶媒の残留の可能性を考慮すると，医薬用途の製剤，特に眼内に注入される製剤の製造方法としては好ましくない。その他，特許文献４，５に乳液および懸濁液を凍結乾燥させるための技術的な条件検討が行われているが，ポリ乳酸の懸濁液の凍結乾燥に際した粒子凝集による粗大粒子形成を防止することに関しては，記載がない。
【０００５】
懸濁液を凍結乾燥するときは，分散した懸濁粒子が沈降するより前，すなわち懸濁粒子が均一に分散した状態にあるうちに速やかに凍結させてしまえば，粒子同士が凝集する時間は殆どなくなる筈である。このことから，ポリ乳酸微粒子懸濁液を凍結乾燥するに際して粒子の凝集を防止して微小粒子の状態を維持するには，均一な懸濁液の状態から急速に冷却して凍結するのが望ましいと考えられる（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００５／１１５４１１号
【特許文献２】国際公開第２００８／１２６７２０号
【特許文献３】国際公開第２００３／００７７８２号
【特許文献４】国際公開第２００１／０５１０３２号
【特許文献５】国際公開第２００４／１１２７５４号
【特許文献６】国際公開第２００３／０２６６４２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Sakamoto, T. et al., Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology, 240: p.423 (2002).
【非特許文献２】Challa, J.K. et al., Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology, 26: p.277 (1998).
【非特許文献３】Wingate, R.J. et al., Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology, 27: p.431 (1999).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記背景において，本発明の一目的は，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液から凍結乾燥によりポリ乳酸粒子を製造する方法であって，凍結乾燥工程で粗大粒子が生成するのを防止できる方法を提供することである。 
また本発明の更なる一目的は，眼の透明組織，特に硝子体および水晶体に適用することによってそれら眼の透明組織の視認性を向上させるための製剤である透明組織可視化剤用ポリ乳酸粒子の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は，上記目的のため検討の結果，分散剤を溶解して含有する水溶液又は分散剤と賦形剤とを溶解して含有する水溶液に，水混和性有機溶媒に溶解させたポリ乳酸を添加，撹拌することにより一次粒子（凝集していない状態での個々の粒子をいう）としての平均粒子径５００〜１０００ｎｍ（最大粒子径５μｍ以下）であるポリ乳酸微粒子の水性懸濁液が得られ，その凍結乾燥工程において凍結乾燥工程において，急速に凍結するのではなく緩徐な冷却速度で凍結する方が，粗大粒子の生成が抑制できることを見出した。本発明は，当該発見に基づき，更に検討を重ねて完成させたものである。すなわち，本発明は以下を提供する。
【００１０】
すなわち，本発明は以下を提供する。
１．ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥時におけるポリ乳酸の粗大粒子の生成を抑制する方法であって，
(a) 分散剤と賦形剤とを含有するポリ乳酸微粒子水性懸濁液を調製するステップであって，
(i) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤を含有する分散剤水溶液に撹拌下で添加した後，賦形剤を添加するか，又は
(ii) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤及び賦形剤を含有する分散剤／賦形剤水溶液に撹拌下で添加することによるものであるステップと，
(b) 該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液をガラス容器中で凍結乾燥に付すステップと，
を含んでなり，
ステップ(b)において，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を入れた該ガラス容器が凍結乾燥機のチャンバー内に置かれ，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液が凍結する時の該チャンバー内の冷却速度が０．１〜１℃／分に調節されるものである，方法。
２．該分散剤水溶液又は該分散剤／賦形剤水溶液中の該分散剤の濃度が０．１１〜２．２Ｗ／Ｖ％である，上記１の方法。
３．該分散剤がポリビニルピロリドン又はポリビニルアルコールである，上記１又は２の方法。
４．該分散剤／賦形剤水溶液中の該賦形剤の濃度が１．１〜１１Ｗ／Ｖ％である，上記１ないし３の何れかの方法。
５．該賦形剤が多価アルコールである，上記１ないし４の何れかの方法。
６．該多価アルコールがマンニトールである，上記５の方法。
７．該ポリ乳酸溶液中の該ポリ乳酸の濃度が１〜５０Ｗ／Ｖ％である，上記１ないし６の何れかの方法。
８．該水混和性有機溶媒がアセトン・エタノール混液である，上記１ないし７の何れかの方法。
９．該アセトン・エタノール混液におけるアセトンとエタノールの混合比が，体積で，アセトン：エタノール＝３：７〜５：５である，上記８の方法。
１０．該分散剤水溶液又は該分散剤／賦形剤水溶液と該ポリ乳酸溶液の混合比が，体積で，該水溶液：ポリ乳酸溶液＝８５：１５〜９５：５である，上記１ないし９の何れかの方法。
１１．該ガラス容器がガラスバイアルである，上記１ないし１０の何れかの方法。
１２．眼の透明組織可視化剤用ポリ乳酸粒子の製造方法であって，
(a) 分散剤と賦形剤とを含有するポリ乳酸微粒子水性懸濁液を調製するステップであって，
(i) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤を含有する分散剤水溶液に撹拌下で添加した後，賦形剤を添加するか，又は
(ii) ポリ乳酸を水混和性有機溶媒に溶解させてなるポリ乳酸溶液を，分散剤及び賦形剤を含有する分散剤／賦形剤水溶液に撹拌下で添加することによるものであるステップと，
(b) 該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液をガラス容器中で凍結乾燥に付すステップと，
を含んでなり，
ステップ(b)において，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を入れた該ガラス容器が凍結乾燥機のチャンバー内に置かれ，該ポリ乳酸微粒子水性懸濁液が凍結する時の該チャンバー内の冷却速度が０．１〜１℃／分に調節されるものである，製造方法。
１３．該分散剤水溶液又は該分散剤／賦形剤水溶液中の該分散剤の濃度が０．１１〜２．２Ｗ／Ｖ％である，上記１２の製造方法。
１４．該分散剤がポリビニルピロリドン又はポリビニルアルコールである，上記１２又は１３の製造方法。
１５．該分散剤／賦形剤水溶液中の該賦形剤の濃度が１．１〜１１Ｗ／Ｖ％である，上記１２ないし１４の何れかの製造方法。
１６．該賦形剤が多価アルコールである，上記１２ないし１５の何れかの製造方法。
１７．該多価アルコールがマンニトールである，上記１６の製造方法。
１８．該ポリ乳酸溶液中の該ポリ乳酸の濃度が１〜５０Ｗ／Ｖ％である，上記１２ないし１７の何れかの製造方法。
１９．該水混和性有機溶媒がアセトン・エタノール混液である，上記１２ないし１８の何れかの製造方法。
２０．該アセトン・エタノール混液におけるアセトンとエタノールの混合比が，体積で，アセトン：エタノール＝３：７〜５：５である，上記１９の製造方法。
２１．該分散剤水溶液又は該分散剤／賦形剤水溶液と該ポリ乳酸溶液の混合比が，体積で，該水溶液：ポリ乳酸溶液＝８５：１５〜９５：５である，上記１２ないし２０の何れかの製造方法。
２２．該ガラス容器がガラスバイアルである，上記１２ないし２１の何れかの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
上記構成になる本発明は，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥時におけるポリ乳酸粒子の凝集を抑制し粗大な凝集塊（特に，粒子の短径が０．３ｍｍ以上，取り分け０．２ｍｍ以上のもの）の発生を防止できる。このため本発明によれば，透明組織を可視化するための眼内へのポリ乳酸粒子水性懸濁液の注入に際し，眼科手術において一般に使用される注射針に粒子が詰まることがなくなり，懸濁粒子を眼内に円滑に注入することを可能にする。
【００１２】
本発明により製造されるポリ乳酸粒子は，球状でなく，個々に種々の不規則な形状をとっているが，そのような不規則形状のポリ乳酸粒子は，球状粒子に比べて硝子体及び水晶体等の眼の透明組織と接触したとき，組織によく付着し，手術中の眼内灌流液の流れによっても組織から脱落しにくい。このため，不規則形状のポリ乳酸粒子は，透明組織可視化剤として優れている。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
検討に用いたポリ乳酸はＤＬ−ポリ乳酸であることから，Ｄ−ポリ乳酸，Ｌ−ポリ乳酸，ＤＬ−ポリ乳酸を区別することなく，またそれらの適宜の混合物も，本発明において同様に使用することができる。
【００１４】
本明細書中で，「眼の透明組織」の語は，硝子体，硝子体膜，水晶体及び角膜等の眼組織中の透明な組織をいう。
【００１５】
本明細書中で，「透明組織可視化剤」の語は，凍結乾燥して得られるポリ乳酸粒子を分散液に分散させた製剤をいう。
【００１６】
本明細書において，「ポリ乳酸微粒子」の語は，ポリ乳酸の粒子であって粒子径が５μｍ以下のものを意味する。
【００１７】
本明細書において，「ポリ乳酸微粒子水性懸濁液」の語は，ポリ乳酸微粒子を懸濁状態で含有する液体であって，その分散媒が水性媒質，すなわち，水，又は混和した状態で有機溶媒を一部に含有する水であるものをいう。
【００１８】
本明細書中で，「分散剤水溶液」の語は，分散剤を水に添加し溶解させることにより得られる水溶液をいい，「分散剤／賦形剤水溶液」の語は，分散剤及び賦形剤を水に添加し溶解させることにより得られる水溶液をいう。
【００１９】
ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥にあたり，本発明においては当該懸濁液を容器に注入してこれを凍結乾燥機のチャンバー内に設置して冷却し凍結させるが，このときチャンバーの冷却速度が，粗大粒子の生成に大きく影響することを本発明者は見出した。すなわち，従来の技術的常識から予想されたところとは逆に，驚くべきことにポリ乳酸微粒子水性懸濁液が凍結を開始する時での冷却速度が速いと粗大粒子が生成し易く，同時点での冷却速度が遅いと粗大粒子の生成が抑制される。この理由は明らかでないが，凍結が開始する時点において懸濁液内の温度分布の均一性が高いことが重要な役割を果たしているものと推測される。懸濁液内の温度分布の均一性は，冷却速度と密接に関係し，冷却速度が遅い程，温度分布の均一性は保たれ易い。これらのことから，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥にあたっては，当該懸濁液が凍結を開始する瞬間において，該容器の設置されたチャンバー内の冷却速度が０．１〜１℃／分であることが好ましく，０．１〜０．８℃／分であることがより好ましく，０．１〜０．６℃／分であることが更に好ましい。なお，凍結を開始する瞬間の温度は添加物の種および濃度により変動するが，−１０〜−２０℃の範囲である。
【００２０】
上記分散剤水溶液又は上記分散剤／賦形剤水溶液に含有される分散剤は，水混和性有機溶媒に溶解させたポリ乳酸溶液を，分散剤を含有する水溶液に添加してポリ乳酸微粒子を析出させる工程において粒子成長の抑制に有用であり，また，凍結乾燥前におけるポリ乳酸微粒子の均一な懸濁状態の維持及び凍結乾燥組成物を分散媒と混合して透明組織可視化剤を調製する際にも，ポリ乳酸粒子を迅速に懸濁させ且つ安定な懸濁状態を維持する上で有用である。分散剤としては，界面活性剤や界面活性を有する水溶性高分子を用いることができる。常温で固体であり，水に対して即溶性の水溶性高分子が好適に用いられ，ポリビニルピロリドン，ポリビニルアルコール等のビニル系ポリマーが特に好適に用いられる。ポリビニルピロリドン又はポリビニルアルコールを用いる場合，分散剤水溶液又は分散剤／賦形剤水溶液中における当該化合物の含有量は０．１１〜２．２Ｗ／Ｖ％とするのが好ましく，０．２２〜１．１Ｗ／Ｖ％とするのがより好ましく，０．４４〜０．６６Ｗ／Ｖ％とするのがより好ましい。
【００２１】
上記該分散剤／賦形剤水溶液中の該賦形剤の濃度は，１．１〜１１Ｗ／Ｖ％であることが好ましく，３．８５〜１１Ｗ／Ｖ％とすることがより好ましく，４．５〜１０Ｗ／Ｖ％とすることが更に好ましく，５．５〜８Ｗ／Ｖ％とすることが特に好ましい。賦形剤として好ましいものとして多価アルコールが挙げられ，それらのうち特にマンニトールが好ましい。
【００２２】
本発明において水混和性有機溶媒に溶解させるポリ乳酸の濃度は，通常１〜５０Ｗ／Ｖ％の範囲であり，２〜３０Ｗ／Ｖ％とするのが好ましく，５〜２０Ｗ／Ｖ％とするのが更に好ましい。
【００２３】
上記水混和性有機溶媒しては，アセトン・エタノール混液が好ましい。これを調製するのに用いるアセトンとエタノールとの体積比は，適宜でよいが，通常は３：７〜５：５の範囲とするのが好ましい。これらの溶媒は共に，塩素系有機溶媒に比して身体組織に対する安全性が高く，しかも塩素系有機溶媒と異なり水混和性であるため，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を調製したときポリ乳酸微粒子から水相へと移行し易く，凍結乾燥により速やかに除去され，最終的に得られる凍結乾燥組成物中には，実質的に残存しない。
【００２４】
上記において分散剤水溶液，又は分散剤／賦形剤水溶液とこれに添加するポリ乳酸溶液との体積比率は，通常９５：５〜８５：１５とすることが好ましく，特に好ましくは約９０：１０である。このような比率で当該水溶液にポリ乳酸溶液を添加し撹拌したとき，一次粒子としての平均粒子径が５００〜１０００ｎｍで最大粒子径５μｍ以下であるポリ乳酸微粒子の水性懸濁液が容易に得られる。一次粒子は，水性懸濁液の調製中に一部凝集する場合があり得るが，調製後に例えば口径１０６μｍの篩に水性懸濁液を通してこれに掛かる粒子を除去しておけば，問題はない。
【００２５】
本発明において凍結乾燥に付すポリ乳酸微粒子水性懸濁液中のポリ乳酸の含量は，通常０．０５〜７．５Ｗ／Ｖ％，好ましくは０．１〜５．０Ｗ／Ｖ％，より好ましくは，０．５〜２．５Ｗ／Ｖ％とすればよい。ポリ乳酸微粒子水性懸濁液中のポリ乳酸含量の調整は，水混和性有機溶媒（アセトン・エタノール混液等）に含有させるポリ乳酸の濃度を予め調節しておくことによって行ってもよく，懸濁液調製時における水溶液に対するポリ乳酸溶液の添加割合を調整することによって行ってもよい。ポリ乳酸微粒子水性懸濁液中のポリ乳酸の含量がこれらの含量範囲にある場合，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液の凍結乾燥時に，マンニトールの存在と相俟って，ポリ乳酸粒子の凝集が防止できる。なお，本法はこれらの範囲よりポリ乳酸含量を少なくした場合でも適用し得る。 
【００２６】
本明細書において，ポリ乳酸について「平均分子量」というときは，重量平均分子量をいう。本発明において使用されるポリ乳酸の平均分子量は，通常５００以上，好ましくは１０００以上であり，より好ましくは３０００以上，特に好ましくは４０００以上であり，通常２００００以下，好ましくは１５０００以下，より好ましくは１００００以下，更に好ましくは６０００以下である。
【００２７】
本発明において，凍結乾燥されるポリ乳酸微粒子水性懸濁液には，医薬上許容される添加物，例えば等張化剤（塩化ナトリウム，塩化カリウムなどの塩：グリセリン，ソルビトール，グルコース，マンニトールなどの糖類：グリセリン，プロピレングリコールなどの多価アルコール類：ホウ酸，ホウ砂など），緩衝剤（リン酸緩衝液，酢酸緩衝液，ホウ酸緩衝液，炭酸緩衝液，クエン酸緩衝液，トリス緩衝液など），増粘剤（ヒドロキシエチルセルロース，ヒドロキシプロピルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ポリビニルアルコール，ポリエチレングリコール，アルギン酸ナトリウムなど），安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム，チオ硫酸ナトリウム，エデト酸ナトリウム，クエン酸ナトリウム，アスコルビン酸，ジブチルヒドロキシトルエン，塩化マグネシウム，塩化カルシウムなど），ｐＨ調整剤（塩酸，水酸化ナトリウム，リン酸，酢酸など）などを適宜添加することができる。その場合，それらの添加物は，ポリ乳酸溶液が添加される前の分散剤及びマンニトールを含有する水溶液に予め添加しておいてもよく，ポリ乳酸微粒子含有水性懸濁液を調製した後でこれに添加してもよく，また一部をポリ乳酸溶液が添加される前の分散剤及びマンニトールを含有する水溶液に予め添加し，残りをポリ乳酸微粒子含有水性懸濁液を調製した後でこれに添加してもよい。
【００２８】
本発明において，凍結乾燥に付されるポリ乳酸微粒子水性懸濁液のｐＨは，通常４．０〜８．０，好ましくは約５．０〜７．５に調整される。
【００２９】
本発明において，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液を凍結乾燥に付す際の容器は，通常はガラス容器が用いられ，中でもガラスバイアルが好ましい。
【００３０】
本発明において，ポリ乳酸微粒子水性懸濁液をガラス容器中で凍結乾燥に付すに際し，各容器に注入される液量は適宜でよいが，通常は，０．５〜５ｍＬ，より好ましくは１〜２ｍＬである。
【００３１】
本発明により製造されるポリ乳酸粒子は不規則形状である。
【００３２】
なお，本発明により製造されるポリ乳酸微粒子含有の凍結乾燥組成物は，使用に際し水性の分散媒と混合されてポリ乳酸微粒子の水性懸濁液の形に調製される。そのための水性の分散媒としては，医薬として眼内に注入することが許容される組成の水溶液を，適宜用いることができる。眼内灌流・洗浄液としては種々の組成物が当業者によく知られており，それらを適宜選択して分散媒として用いてよい。また，眼内灌流・洗浄液として既に販売されている医薬品を分散媒として使用してもよく，そのような医薬品として特に適しているものの例としては，オペガードＭＡ（登録商標，）及びオペガードネオキット（登録商標，千寿製薬株式会社製）が挙げられる。
【実施例】
【００３３】
以下実施例を参照して本発明を更に具体的に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
【００３４】
〔試験例１〕
精製水にポリビニルピロリドン（ポビドンＫ−３０，ＢＡＳＦジャパン製，日本薬局方）及びＤ−マンニトールを，それぞれ０．５５Ｗ／Ｖ％及び１Ｗ／Ｖ％の濃度となるように添加して溶解させ，溶液を０．２２μｍ水性フィルターでろ過しＡ液とした。
【００３５】
ＰＬＡ０００５〔ＤＬ−ポリ乳酸，重量平均分子量５０００，和光純薬（株）製〕をアセトン・エタノール混液（体積比でアセトン：エタノール＝４：６）に１０Ｗ／Ｖ％の濃度となるように溶解させ，得られた溶液を０．２２μｍ非水性フィルターでろ過してＢ液とした。
【００３６】
Ａ液とＢ液を９：１の体積比で次のように混合した。すなわち，２００ｍＬのビーカーに入れたＡ液を，撹拌子（直径６ｍｍ長さ２０ｍｍ）を用いてスターラー（中速度７００〜８００ｒｐｍ）で攪拌しながら，マイクロピペットチップ（Eppendolf ep T.I.P.S standard 2-200 μL）を吐出側に装着したシリコンチューブ（外径６ｍｍ内径４ｍｍ）を取り付けたチューブポンプ（PERISTALTIC PUMP PST-100 IWAKI社製）を用い，Ｂ液を約１ｍＬ／分の速度でＡ液中に送液することにより，ＰＬＡ０００５の微粒子を析出させた。この間，吐出口であるマイクロピペットチップの先端は完全に液中に浸漬させておいた。この液を約３０分間攪拌して懸濁液を得，これを篩（口径１０６μｍ）にかけ，凝集塊を除去した。得られた懸濁液Ｄ（１００ｍＬ中）のポリ乳酸，ポリビニルピロリドン及びＤ−マンニトールの含量（１００ｍＬ中）は次のとおりである。
【００３７】
ポリ乳酸（ＰＬＡ０００５）・・・・・・・１ｇ
ポリビニルピロリドン・・・・・・・・・・０．５ｇ
Ｄ−マンニトール・・・・・・・・・・・・１ｇ
【００３８】
懸濁液Ｄを１．５ｍＬずつガラス製バイアル（１８Φ，高さ３３ｍｍ）に充填し，充填済みバイアルを第１群〜第４群に等分し，下記の条件で懸濁液Ｄを凍結乾燥に付し，凍結乾燥組成物を得た。
【００３９】
（ａ）試験装置：Triomaster-A04型（日精株式会社製）
（ｂ）トレイ：引き抜きトレイ    枠２９０Ｗ×４４５Ｌ，１枚使用
（ｃ）バイアル：１８φ×３３Ｈ（ガラス）
（ｄ）分注量：１．５ｍＬ／バイアル
（ｅ）バイアル設置：装置のチャンバー内のトレイ１枚分が埋まるよう懸濁液Ｄ又はダミー液（２．５％Ｄ−マンニトール水溶液１．５ｍＬ）のバイアルを敷き詰めた。
（ｆ）予備凍結：凍結におけるチャンバー内の冷却速度が粒子の凝集に与える影響を調べるため，群により異なる以下の方法で実施。
(i) 第１群（徐冷凍結１）：  チャンバー内の常温のトレイに上記バイアルを並べ，トレイ温度を＋２０℃から−４０℃まで２時間かけて徐々に冷却して懸濁液Ｄを凍結させた。
(ii) 第２群（徐冷凍結２）：  チャンバー内の常温のトレイに上記バイアルを並べ，トレイ温度を＋２０℃からー４５℃まで４０分かけて徐々に冷却して懸濁液Ｄを凍結させた。
(iii) 第３群：トレイを予め−４５℃まで冷却した上で，上記バイアルを−４５℃トレイの上に並べて薬液を凍結させた。
(iv) 第４群（液体窒素凍結）：上記バイアルを液体窒素に浸して薬液を急速に凍結させた後，−４５℃のトレイ上に並べた。
（ｇ）一次乾燥及び二次乾燥：何れの群についても以下の凍結乾燥プログラムに従い一次乾燥および二次乾燥を実施した。
・一次乾燥：トレイ温度−４５℃又は−４０℃から−１０℃まで１時間で上昇させ，その後−１０℃で１９時間保持した。このときの真空制御値を０.１ Torrとした。
・二次乾燥：トレイ温度−１０℃から＋２０℃まで１時間で上昇させ，その後＋２０℃で１２時間保持した。このときの真空度は成り行きとした。
（ｈ）バイアルの密栓： 二次乾燥終了後はゴム栓で密封した。
【００４０】
〔凍結乾燥組成物の評価〕
上記第１〜４群の凍結乾燥組成物を，表１に示した組成の分散媒Ｃに，ポリ乳酸の含量が１Ｗ／Ｖ％となるように分散させることにより懸濁液を再調製した（バイアルあたり液量１．５ｍＬ）。
【００４１】
【表１】
2012214525.tif 000002
【００４２】
＜評価方法＞
各群の凍結乾燥組成物から上記で再調製した懸濁液につき，各バイアル内の全量をそれぞれ，１２穴プレート（１２．５ｃｍＸ８ｃｍ，内径２２ｍｍ，ＩＷＡＫＩ社）の各穴に移し，デジタルマイクロスコープ（型番：ＶＨＸ−５００  キーエンス社）にて懸濁液中の粒子の大きさを観察した。観察は，１穴のほぼ全体像が捉えられるよう倍率を設定して懸濁液の写真撮影を行い，写真上において粗大粒子として，短径が０．２ｍｍを超える凝集体の個数及びそれらのうち短径が０．３ｍｍを超える凝集体の個数を測定した。結果を表２に示す。
【００４３】
【表２】
2012214525.tif 000003
【００４４】
表２に見られるように，冷却がゆっくりと行われるほど，粗大粒子の生成は抑制されることが判明した。特に第１群における冷却速度０．５℃／分では，第２群に比して粗大粒子は顕著に少なかった。
【００４５】
〔試験例２〕  第５群〜第９群
精製水にポリビニルピロリドン（ポビドンＫ−３０）を０．５５Ｗ／Ｖ％の濃度となるように，及びＤ−マンニトールを表３の第５群〜第９群にそれぞれ規定した量の１．１倍となるように溶解させ，溶液を０．２２μｍ水性フィルターでろ過し，それぞれＡ−５〜Ａ−９液とした。
【００４６】
【表３】
2012214525.tif 000004
【００４７】
ＰＬＡ０００５〔ＤＬ−ポリ乳酸，重量平均分子量５０００，和光純薬（株）製〕をアセトン・エタノール混液（体積比でアセトン：エタノール＝４：６）に１０Ｗ／Ｖ％の濃度となるように溶解させ，得られた溶液を０．２２μｍ非水性フィルターでろ過してＢ液とした。
【００４８】
Ａ−５〜Ａ−９の各液とＢ液を９：１の割合で次のように混合した。２００ｍＬのビーカーに入れたＡ−５〜Ａ−９の各液を，撹拌子（直径６ｍｍ長さ２０ｍｍ）を用いてスターラー（中速度７００〜８００ｒｐｍ）で攪拌しながら，マイクロピペットチップ（Eppendolf ep T.I.P.S standard 2〜200μＬ）を吐出側に装着したシリコンチューブ（外径６ｍｍ内径４ｍｍ）を取り付けたチューブポンプ（PERISTALTIC PUMP PST-100 IWAKI社製）用いてＢ液を約１ｍＬ／分の速度でＡ−５〜Ａ−９の各液中に送液し，ＰＬＡ０００５の微粒子を析出させた。このとき吐出口であるマイクロピペットチップの先端は完全に液中に浸漬させておいた。これを約３０分間攪拌して懸濁液それぞれＤ−５〜Ｄ−９を得た。懸濁液Ｄ−５〜Ｄ−９に含有されるポリ乳酸，ポリビニルピロリドン及びＤ−マンニトールの量は表３に示したとおりである。
【００４９】
上記で得られた懸濁液Ｄ−５〜Ｄ−９を，篩（口径１０６μｍ）にかけ，凝集塊を除去した。篩にかけた後の懸濁液Ｄ−５〜Ｄ−９を１．５ｍＬずつガラス製バイアル瓶（１８Φ，高さ３３ｍｍ）に充填し，下記の条件で凍結乾燥を行い，凍結乾燥組成物それぞれＥ−５〜Ｅ−９を得た。
【００５０】
（凍結乾燥条件）
ａ）試験装置：Triomaster-A04型（日精株式会社）
ｂ）トレイ：引き抜きトレイ    枠２９０Ｗ×４４５Ｌ，1枚使用
ｃ）バイアル：１８φ×３３Ｈ（ガラス）
ｄ）分注量：１．５ｍＬ／バイアル
ｅ）凍結乾燥本数：トレイ１枚分が埋まるよう実液またはダミー液（Ｄ−マンニトール水溶液２．５％）のバイアルを敷き詰めた。
ｆ）凍結乾燥プログラムの設定
＜予備凍結＞
常温棚にバイアルを仕込み，棚を冷却して薬液を凍結させた。棚温を＋２０℃から−４０℃まで２時間かけて冷却した。
＜一次乾燥及び二次乾燥＞
懸濁液Ｄ−５〜Ｄ−９につき，以下の凍結乾燥プログラムにて一次乾燥および二次乾燥を行った。
一次乾燥は，棚温−４５℃または−４０℃から−１０℃に１時間で上昇させ，その後−１０℃で１９時間に設定した。このときの真空制御値を０.１Torrとした。二次乾燥では棚温−１０℃から＋２０℃に１時間で上昇させ，その後＋２０℃で１２時間に設定した。このときの真空度は成り行きとした。二次乾燥終了後はゴム栓で密封した。
【００５１】
〔凍結乾燥組成物の評価〕
凍結乾燥組成物Ｅ−５〜Ｅ−９を，表４に示した組成の分散媒Ｃに，ポリ乳酸の含量が１Ｗ／Ｖ％となるように分散させることにより懸濁液を調製した。
【００５２】
【表４】
2012214525.tif 000005
【００５３】
評価方法：上記で調製した懸濁液の全量を１２穴プレート（１２．５ｃｍ×８ｃｍ，内径２２ｍｍ，ＩＷＡＫＩ社）に移し，デジタルマイクロスコープ（型番：ＶＨＸ−５００  キーエンス社）にて粒子の大きさを観察した。その際，１穴のほぼ全体像が捉えられるよう倍率を設定した。写真撮影を行い，０．３および０．２ｍｍを超える凝集体の個数と短径を測定した。結果を次の表５に示す。
【００５４】
【表５】
2012214525.tif 000006
【００５５】
表５に見られるように，予備凍結を徐冷とした第８群及び第９群において，粗大粒子が全く見られないことが確認された。
【００５６】
〔製剤実施例１〜４〕
下記の手順で，ポリ乳酸微粒子含有凍結乾燥組成物を製造する。
精製水にポリビニルビニルピロリドン（ポビドンＫ−３０）及びＤ−マンニトールを，それぞれ１．１Ｗ／Ｖ％及び１．１Ｗ／Ｖ％の濃度となるように添加して溶解させ，溶液を０．２２μｍ水性フィルターでろ過しＡ液とする。別に，ポリ乳酸（例えばＰＬＡ０００５，ＤＬ−ポリ乳酸，重量平均分子量５０００，和光純薬（株）製〕をアセトン・エタノール混液（体積比でアセトン：エタノール＝４：６）に１Ｗ／Ｖ％の濃度となるように溶解させ，得られた溶液を０．２２μｍ非水性フィルターでろ過してＢ液とする。Ａ液とＢ液を９：１の体積比で次のように混合する。すなわち，２００ｍＬのビーカーに入れたＡ液を，撹拌子（直径６ｍｍ長さ２０ｍｍ）を用いてスターラー（中速度７００〜８００ｒｐｍ）で攪拌しながら，マイクロピペットチップ（Eppendolf ep T.I.P.S standard 2-200 μL）を吐出側に装着したシリコンチューブ（外径６ｍｍ内径４ｍｍ）を取り付けたチューブポンプ（PERISTALTIC PUMP PST-100 IWAKI社製）を用い，Ｂ液を約１ｍＬ／分の速度でＡ液中に送液することにより，ＰＬＡ０００５の微粒子を析出させる。この間，吐出口であるマイクロピペットチップの先端は完全に液中に浸漬させておく。この液を約３０分間攪拌して懸濁液を得，これを篩（口径１０６μｍ）にかけ，凝集塊を除去する。得られる懸濁液Ｄ（１００ｍＬ中）のポリ乳酸，ポリビニルピロリドン及びＤ−マンニトールの含量（１００ｍＬ中）は次のとおりである。
【００５７】
ポリ乳酸（ＰＬＡ０００５）・・・・・・・  ０．１ｇ
ポリビニルピロリドン・・・・・・・・・・  １ｇ
Ｄ−マンニトール・・・・・・・・・・・・  １ｇ
【００５８】
上記懸濁液Ｄをガラスバイアルに分注し，以下の条件で凍結乾燥に付す。
（ａ）試験装置：Triomaster-A04型（日精株式会社製）
（ｂ）トレイ：引き抜きトレイ    枠２９０Ｗ×４４５Ｌ，１枚使用
（ｃ）バイアル：１８φ×３３Ｈ（ガラス）
（ｄ）分注量：１．５ｍＬ／バイアル
（ｅ）バイアル設置：装置のチャンバー内のトレイ１枚分が埋まるようバイアルを敷き詰める。
（ｆ）予備凍結：  試験は，凍結速度の粒子凝集への影響を確認するため，予備凍結は以下の方法で行う。
(i) 製造実施例１：  常温棚にバイアルを仕込み，棚を冷却して薬液を凍結させた。棚温を＋１０℃から−１０℃まで１５分かけて冷却し，その後−１０℃から−４０℃まで６０分かけて冷却する。
(ii) 製造実施例２：  常温棚にバイアルを仕込み，棚を冷却して薬液を凍結させた。棚温を＋１５℃から−５℃まで１０分かけて冷却し，その後−５℃から−４０℃まで１００分かけて冷却する。
(iii) 製造実施例３：  常温棚にバイアルを仕込み，棚を冷却して薬液を凍結させた。棚温を＋２０℃から−１０℃まで２０分かけて冷却し，その後−５℃から−３０℃まで６０分かけて冷却し，更に３０℃からー４０℃まで４０分かけて冷却する。
(iv) 製造実施例４：  常温棚にバイアルを仕込み，棚を冷却して薬液を凍結させた。棚温を＋１０℃から−１０℃まで１５分かけて冷却し，その後−１０℃から−３０℃まで６０分かけて冷却し，更に３０℃からー４０℃に５分かけて冷却してー４０℃の状態を３０分間維持する。
（ｇ）一次乾燥と二次乾燥：
・一次乾燥：トレイ温度−４５℃又は−４０℃から−１０℃まで１時間で上昇させ，その後−１０℃で１９時間保持する。真空制御値は０.１ Torrとする。
・二次乾燥：トレイ温度−１０℃から＋２０℃まで１時間で上昇させ，その後＋２０℃で１２時間保持する。
（ｈ）バイアルの密栓： 二次乾燥終了後はゴム栓で密封し，ポリ乳酸微粒子含有凍結乾燥組成物とする。
【００５９】
〔製剤実施例５〕
下記の手順で，ポリ乳酸微粒子含有凍結乾燥組成物を製造する。
精製水にポリビニルピロリドン（ポビドンＫ−３０）を，表６のＰＶＰ含量の最終濃度の１．１倍となるように添加して溶解させ，溶液を０．２２μｍ水性フィルターでろ過しＡ液とする。別に，表６（アセトン：エタノール（体積比））に従い，アセトン・エタノール混液を調製し，ポリ乳酸〔表６（ＰＬＡ分子量），ＤＬ−ポリ乳酸，重量平均分子量５０００〜２００００，和光純薬（株）製〕を最終濃度が表６（ポリ乳酸含量）のとおりになるようにアセトン・エタノール混液に溶解させ，得られた溶液を０．２２μｍ非水性フィルターでろ過してＢ液とする。Ａ液とＢ液を表６（水溶液：PLA溶液）に従い体積比で次のように混合する。すなわち，２００ｍＬのビーカーに入れたＡ液を，撹拌子（直径６ｍｍ長さ２０ｍｍ）を用いてスターラー（中速度７００〜８００ｒｐｍ）で攪拌しながら，マイクロピペットチップ（Eppendolf ep T.I.P.S standard 2-200 μL）を吐出側に装着したシリコンチューブ（外径６ｍｍ内径４ｍｍ）を取り付けたチューブポンプ（PERISTALTIC PUMP PST-100 IWAKI社製）を用い，Ｂ液を約１ｍＬ／分の速度でＡ液中に送液することにより，ポリ乳酸の微粒子を析出させる。この間，吐出口であるマイクロピペットチップの先端は完全に液中に浸漬させておく。ポリ乳酸の微粒子を析出させた後，Ｄ−マンニトールを表６のＤ−マンニトール含量になるように添加して溶解させ，この液を約３０分間攪拌して懸濁液を得，これを篩（口径１０６μｍ）にかけ，凝集塊を除去し，懸濁液Ｄを得る。
【００６０】
〔製剤実施例６〜９〕
下記の手順で，ポリ乳酸微粒子含有凍結乾燥組成物を製造する。
精製水にポリビニルピロリドン（ポビドンＫ−３０）及びＤ−マンニトールを，表６（ＰＶＰ含量，マンニトール含量）のそれぞれ最終濃度の１．１倍となるように添加して溶解させ，溶液を０．２２μｍ水性フィルターでろ過しＡ液とする。別に，表６（アセトン：エタノール（体積比））に従い，アセトン・エタノール混液を調製し，ポリ乳酸（表６（ＰＬＡ分子量）ＤＬ−ポリ乳酸，重量平均分子量５０００〜２００００，和光純薬（株）製〕を最終濃度が表６（ポリ乳酸含量）のとおりになるようにアセトン・エタノール混液に溶解させ，得られた溶液を０．２２μｍ非水性フィルターでろ過してＢ液とする。Ａ液とＢ液を表６（水溶液：PLA溶液）に従い体積比で次のように混合する。すなわち，２００ｍＬのビーカーに入れたＡ液を，撹拌子（直径６ｍｍ長さ２０ｍｍ）を用いてスターラー（中速度７００〜８００ｒｐｍ）で攪拌しながら，マイクロピペットチップ（Eppendolf ep T.I.P.S standard 2-200 μL）を吐出側に装着したシリコンチューブ（外径６ｍｍ内径４ｍｍ）を取り付けたチューブポンプ（PERISTALTIC PUMP PST-100 IWAKI社製）を用い，Ｂ液を約１ｍＬ／分の速度でＡ液中に送液することにより，ポリ乳酸の微粒子を析出させる。この間，吐出口であるマイクロピペットチップの先端は完全に液中に浸漬させておく。この液を約３０分間攪拌して懸濁液を得，これを篩（口径１０６μｍ）にかけ，凝集塊を除去し，懸濁液Ｄを得る。
【００６１】
【表６】
2012214525.tif 000007
【００６２】
製剤実施例５〜９で得られる懸濁液Ｄをガラスバイアルに分注し，以下の条件で凍結乾燥に付す。
（ａ）試験装置：Triomaster-A04型（日精株式会社製）
（ｂ）トレイ：引き抜きトレイ    枠２９０Ｗ×４４５Ｌ，１枚使用
（ｃ）バイアル：１８φ×３３Ｈ（ガラス）
（ｄ）分注量：１．５ｍＬ／バイアル
（ｅ）バイアル設置：装置のチャンバー内のトレイ１枚分が埋まるようバイアルを敷き詰める。
（ｆ）予備凍結：試験は，凍結速度の粒子凝集への影響を確認するため，予備凍結は以下の方法で行う。
【００６３】
（凍結乾燥条件）
ａ）試験装置：Triomaster-A04型（日精株式会社）
ｂ）トレイ：引き抜きトレイ    枠２９０Ｗ×４４５Ｌ，1枚使用
ｃ）バイアル：１８φ×３３Ｈ（ガラス）
ｄ）分注量：１．５ｍＬ／バイアル
ｅ）凍結乾燥本数：トレイ１枚分が埋まるよう実液またはダミー液（Ｄ−マンニトール水溶液２．５％）のバイアルを敷き詰める。
ｆ）凍結乾燥プログラムの設定
＜予備凍結＞
常温棚にバイアルを仕込み，棚を冷却して薬液を凍結させる。棚温を＋２０℃から−４０℃まで２時間かけて冷却する。
＜一次乾燥及び二次乾燥＞
製剤実施例５〜９につき，以下の凍結乾燥プログラムにて一次乾燥および二次乾燥を行う。
一次乾燥は，棚温−４５℃または−４０℃から−１０℃に１時間で上昇させ，その後−１０℃で１９時間に設定する。このときの真空制御値を０.１Torrとする。二次乾燥は棚温−１０℃から＋２０℃に１時間で上昇させ，その後＋２０℃で１２時間に設定する。このときの真空度は成り行きとする。二次乾燥終了後はゴム栓で密封する。
【００６４】
〔製剤実施例１０〕
下記の手順で，ポリ乳酸微粒子含有凍結乾燥組成物を製造する。
精製水にポリビニルアルコール及びＤ−マンニトールを，０．２２％及び５.５％となるように添加して溶解させ，溶液を０．２２μｍ水性フィルターでろ過しＡ液とする。別に，ポリ乳酸（例えばＰＬＡ０００５，ＤＬ−ポリ乳酸，重量平均分子量５０００，和光純薬（株）製〕をアセトン・エタノール混液（体積比でアセトン：エタノール＝４：６）に１０Ｗ／Ｖ％の濃度となるように溶解させ，得られた溶液を０．２２μｍ非水性フィルターでろ過してＢ液とする。Ａ液とＢ液を９０：１０の体積比で次のように混合する。すなわち，２００ｍＬのビーカーに入れたＡ液を，撹拌子（直径６ｍｍ長さ２０ｍｍ）を用いてスターラー（中速度７００〜８００ｒｐｍ）で攪拌しながら，マイクロピペットチップ（Eppendolf ep T.I.P.S standard 2-200 μL）を吐出側に装着したシリコンチューブ（外径６ｍｍ内径４ｍｍ）を取り付けたチューブポンプ（PERISTALTIC PUMP PST-100 IWAKI社製）を用い，Ｂ液を約１ｍＬ／分の速度でＡ液中に送液することにより，ポリ乳酸の微粒子を析出させる。この間，吐出口であるマイクロピペットチップの先端は完全に液中に浸漬させておく。この液を約３０分間攪拌して懸濁液を得，これを篩（口径１０６μｍ）にかけ，凝集塊を除去し，懸濁液Ｄを得る。
【００６５】
懸濁液Ｄをガラスバイアルに分注し，以下の条件で凍結乾燥に付す。
（ａ）試験装置：Triomaster-A04型（日精株式会社製）
（ｂ）トレイ：引き抜きトレイ    枠２９０Ｗ×４４５Ｌ，１枚使用
（ｃ）バイアル：１８φ×３３Ｈ（ガラス）
（ｄ）分注量：１．５ｍＬ／バイアル
（ｅ）バイアル設置：装置のチャンバー内のトレイ１枚分が埋まるようバイアルを敷き詰める。
（ｆ）予備凍結：試験は，凍結速度の粒子凝集への影響を確認するため，予備凍結は以下の方法で行う。
【００６６】
（凍結乾燥条件）
ａ）試験装置：Triomaster-A04型（日精株式会社）
ｂ）トレイ：引き抜きトレイ    枠２９０Ｗ×４４５Ｌ，1枚使用
ｃ）バイアル：１８φ×３３Ｈ（ガラス）
ｄ）分注量：１．５ｍＬ／バイアル
ｅ）凍結乾燥本数：トレイ１枚分が埋まるよう実液またはダミー液（Ｄ−マンニトール水溶液２．５％）のバイアルを敷き詰める。
ｆ）凍結乾燥プログラムの設定
＜予備凍結＞
常温棚にバイアルを仕込み，棚を冷却して薬液を凍結させる。棚温を＋２０℃から−４０℃まで２時間かけて冷却する。
＜一次乾燥及び二次乾燥＞
懸濁液Ｄにつき，以下の凍結乾燥プログラムにて一次乾燥および二次乾燥を行う。
一次乾燥は，棚温−４５℃または−４０℃から−１０℃に１時間で上昇させ，その後−１０℃で１９時間に設定する。このときの真空制御値を０.１Torrとする。二次乾燥は棚温−１０℃から＋２０℃に１時間で上昇させ，その後＋２０℃で１２時間に設定する。このときの真空度は成り行きとする。二次乾燥終了後はゴム栓で密封する。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の製造方法は，凍結乾燥時におけるポリ乳酸微粒子の凝集を抑制でき，注射針を詰まらせる粗大粒子を含まないポリ乳酸微粒子含有の再分散性のある凍結乾燥組成物を与えるため，硝子体除去手術等の眼科手術における使用に適した透明組織可視化剤の製造に利用することができる。