(57)【要約】【課題】有効な粘膜ＤＴＰ組合せワクチンの提供。【解決手段】粘膜ＤＴＰａワクチン、特に鼻内ワクチンであって、（ａ）ジフテリア抗原、破傷風抗原および無細胞百日咳抗原；ならびに（ｂ）コレラ毒素（ＣＴ）またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）のいずれかの無毒化形態、を含むワクチン。成分（ｂ）は、粘膜アジュバントとして作用する。無細胞百日咳抗原は、好ましくは、百日咳完全毒素（ＰＴ）および糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）ならびに必要に応じてペルタクチンを含む。粘膜送達される、組合せＤＴＰａ処方物は、ミョウバンアジュバント化された非経口投与により観察されるレベルに等価な、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ感染に対する保護のレベルを生成し得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において引用されるすべての文献は、その全体が参考として本明細書
において援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本願は、粘膜ＤＴＰワクチン、特に鼻内ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓは、百日咳の原因因子である。高
度に有効な不活化された細胞全体のワクチンは、１９４０年代から利用可能であ
ったが、毒性の細胞成分の存在に起因して、その安全性についての問題により、
その接種が制限されている（１）。従って、規定されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
抗原を少数含む無細胞百日咳ワクチン（Ｐａ）が生産されてきており、そしてヒ
トにおける使用について承認されている（２）。
【０００４】
百日咳ワクチンは、通常、ミョウバンアジュバントで三種ＤＴＰ混合（ジフテ
リア、破傷風、百日咳）の形態で小児に筋肉内投与されている。しかし、筋肉内
のワクチン接種は、理想的な投与経路とはいえない。粘膜ワクチン（経口、鼻内
など）は、２つの理由で好ましい（３）。第一に、粘膜ワクチンは、大規模での
投与がより容易であり、特殊な装置の必要が回避され、そして針に関連する問題
も回避される。第二に、粘膜ワクチンは、分泌性ＩｇＡによって媒介される粘膜
免疫を刺激する。ほとんどの病原体は、粘膜を通じて身体に侵入することから、
粘膜免疫が所望される。
【０００５】
無細胞粘膜百日咳ワクチンを作成する試みが記載されている（例えば、４、５
、６、７、８、９）が、報告された保護のレベルは、従来のワクチンと比較され
なかったか、または非経口的に与えられたミョウバンアジュバント化された抗原
で観察されたものには及ばなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、有効な粘膜ＤＴＰ組合せワクチンについての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の開示）
本発明は、（ａ）ジフテリア抗原（Ｄ）、破傷風抗原（Ｔ）、無細胞百日抗原
（Ｐａ）、および（ｂ）コレラ毒素（ＣＴ）またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素
（ＬＴ）のいずれかの無毒化形態、を含む粘膜ＤＴＰａワクチンを提供する。
【０００８】
無毒化形態のコレラ毒素（ＣＴ）またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）
は、粘膜アジュバントとして作用する（１０）。ＣＴおよびＬＴは相同であり、
そして代表的には互換性である。
【０００９】
ＣＴまたはＬＴの無毒化は、化学的手段または好ましくは遺伝的手段によるも
のであり得る。適切な例としては、アミノ酸６３にリジン残基を有するＬＴ（「
ＬＴ−Ｋ６３」参考文献１１）、およびアミノ酸７２にアルギニン残基を有する
ＬＴ（「ＬＴ−Ｒ７２」、参考文献１２）が挙げられ、これらの両方は、抗原特
異的血清ＩｇＧ、ｓＩｇＡ、ならびにＤＴＰａに対する局所的および全身性のＴ
細胞応答を増強することが見出されている。ＬＴ−Ｋ６３が好ましい。なぜなら
、ＬＴ−Ｋ６３は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ感染の信頼ある動物モデルにおいて
、ミョウバンで処方された、経口送達されるＤＴＰａワクチンで生成されるレベ
ルと等価の、高いレベルの保護を生じることが見出されているからである。他の
適切な変異体としては、残基６３においてチロシンを有するＬＴ（「Ｙ６３」、
参考文献１３）、および参考文献１４において開示されている種々の変異体（す
なわち、Ｄ５３、Ｋ９７、Ｋ１０４およびＳ１０６）、ならびにその組合せ（例
えば、Ｄ５３およびＫ６３の両方の変異を有するＬＴ）が挙げられる。
【００１０】
本発明の粘膜ワクチンは、好ましくは、鼻内ワクチンである。そのような実施
形態において、本発明の粘膜ワクチンは、好ましくは、粘膜投与に適合されてお
り、例えば、鼻噴霧、鼻滴剤、ゲルまたは粉末による（例えば、１５）。
【００１１】
無細胞百日咳抗原は、好ましくは、百日咳完全毒素（ＰＴ）および糸状赤血球
凝集素（ＦＨＡ）を含む。その無細胞百日咳抗原はさらに、ペルタクチン（ｐｅ
ｒｔａｃｔｉｎ）、および必要に応じて、凝集原２および凝集原３を含み得る（
１６，１７）。
【００１２】
ＰＴは、毒性タンパク質であり、そして百日咳抗原中に存在する場合、ＰＴは
好ましくは無毒化されている。無毒化は、化学的手段および／または遺伝的手段
によるものであり得る。好ましい無毒化変異体は、９Ｋ／１２９Ｇ二重変異体（
２）であり、これは本明細書において「ｒＰＴ」と呼ぶ。
【００１３】
ジフテリア抗原（Ｄ）は、好ましくはジフテリアトキソイドであり、より好ま
しくはＣＲＭ１９７変異体（１０）である。破傷風抗原（Ｔ）は、好ましくは破
傷風トキソイド（１８）である。
【００１４】
非ＤＴＰ抗原、好ましくは、ＤＴＰ成分に対して免疫応答を減少しない非ＤＴ
Ｐ抗原もまた、含有され得る（例えば、参考文献１９（これは、ＨＢＶ抗原を含
む）および参考文献２０）。
【００１５】
本発明はまた、患者において免疫応答を惹起する方法を提供する。この方法は
、本発明に従うワクチンを患者に投与する工程を包含する。この免疫応答は、好
ましくは、百日咳、ジフテリアおよび破傷風に対して保護性である。この患者は
、好ましくは小児である。
【００１６】
この方法は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに対して既に初回刺激された患者におい
て、追加免疫応答を惹起し得る。この初回刺激ワクチン接種は、粘膜または非経
口の経路によってであり得た。
【００１７】
本発明はまた、百日咳、ジフテリアおよび破傷風に対して、患者においてワク
チン接種するため、またはＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに対して既に惹起された初回
刺激免疫応答を追加免役するための鼻内医薬の製造における、コレラ毒素（ＣＴ
）またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）の無毒化された変異体の使用を提
供する。
【００１８】
本発明はまた、（ａ）ジフテリア抗原（Ｄ）、破傷風抗原（Ｔ）、無細胞百日
抗原（Ｐａ）、および（ｂ）コレラ毒素（ＣＴ）またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性
毒素（ＬＴ）のいずれかの無毒化形態、を含む免疫原性組成物を提供する。
【００１９】
特定のタンパク質（例えば、ペルタクチン、ＰＴなど）についての上記の本文
における参考文献は、それらの対立遺伝子変異体および機能的変異体を包含する
と理解される。それらはまた、野生型タンパク質に対して有意な配列同一性を有
するタンパク質を包含する。同一性の程度は、好ましくは、例えば、ＭＰＳＲＣ
Ｈプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるＳｍｉ
ｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを用いるか、ｇａｐ  ｏｐｅｎ
ｐｅｎａｌｔｙ＝１２およびｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝
１のパラメータでのアフィンギャップ検索を用いて算出すると、５０％を超える
（例えば、６５％、８０％、９０％、またはそれを超える）。これらのタンパク
質の免疫原性フラグメントもまた使用され得、同様にそのタンパク質を組み込む
より長いタンパク質、変異体またはフラグメント（例えば、融合タンパク質）も
使用され得る。しかし、全ての場合において、そのタンパク質（野生型、改変体
、変異体、フラグメントまたは融合物）は、実質的に、野生型免疫原性を保持す
る。
【００２０】
当然、そのタンパク質は、種々の手段（例えば、組換え発現、細胞培養物から
の精製、化学的合成など）により、および種々の形態（例えば、ネイティブ、融
合物など）で調製され得る。これらのタンパク質は、好ましくは、実質的に純粋
または単離された（すなわち、そのタンパク質が天然において通常付随する他の
細菌タンパク質または宿主細胞タンパク質を実質的に含まない）形態で調製され
る。
【００２１】
本発明のワクチンは、「遺伝的免疫」のための核酸を含み得る（例えば、２１
）。核酸は、そのワクチンのタンパク質成分をコードし、そして個々のタンパク
質成分を置換し得るか、またはそれらを補い得る。例として、そのワクチンは、
破傷風毒素をコードするＤＮＡを含み得る。
【００２２】
本発明に従うワクチンは、代表的に、予防的（すなわち、感染を防ぐ）である
が、治療性（すなわち、感染後の疾患を処置する）でもあり得る。
【００２３】
本発明のワクチンは、成分（ａ）および（ｂ）に加えて、代表的に、「薬学的
に受容可能なキャリア」を含む。このキャリアは、その組成物を受ける個体に対
して有毒な抗体の産生をそれ自体が誘発しない任意のキャリアを包含する。適切
なキャリアは、代表的に、大きく、ゆっくり代謝される高分子（例えば、タンパ
ク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合性アミノ酸、アミノ酸コポリマ
ー、脂質凝集物（例えば、油小滴またはリポソーム）、および不活化ウイルス粒
子）である。そのようなキャリアは、当業者に周知である。そのワクチンはまた
、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロールなど）を含み得る。さらに、
補助物質（例えば、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝化物質など）が存在し得る。
【００２４】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の抗原、お
よび必要に応じて他の任意の上記の成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、
単回用量においてまたは一連の部分としてのいずれかとして、個体に対してその
量を投与することが、処置または予防について有効であることを意味する。この
量は、処置される個体の健康状態および身体状態、年齢、処置される個体の分類
学的群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、その個体の免疫系が抗体を合成
する能力、所望される保護の程度、ワクチンの処方、処置医の医療的状況の評価
、および他の関連する因子に依存して変動する。その量は、慣用的な試験を通じ
て決定され得る比較的広汎な範囲に入ると予測される。投薬処置は、単回用量ス
ケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。そのワクチンは、他の免
疫調節因子と組み合わせて投与され得る。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）  粘膜ＤＴＰａワクチンであって、以下：
（ａ）ジフテリア抗原、破傷風抗原および無細胞百日咳抗原；ならびに
（ｂ）コレラ毒素またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素のいずれかの無毒化形態
、
を含む、ＤＴＰａワクチン。
（項目２）  前記化合物（ｂ）は、ＬＴ−Ｋ６３またはＬＴ−Ｒ７２であ
る、項目１に記載のＤＴＰａワクチン。
（項目３）  鼻内投与に適合された、項目１または項目２に記載のＤ
ＴＰａワクチン。
（項目４）  前記無細胞百日咳抗原は、無毒化百日咳完全毒素および糸状
赤血球凝着素、ならびに必要に応じてペルタクチンを含む、項目１〜３のいず
れか１項に記載のＤＴＰａワクチン。
（項目５）  前記無毒化百日咳完全毒素は、９Ｋ／１２９Ｇ二重変異体で
ある、項目４に記載のＤＴＰａワクチン。
（項目６）  前記ジフテリア抗原は、ＣＲＭ１９７変異体であり、そして
前記破傷風抗原は、破傷風トキソイドである、項目１〜５のいずれか１項に記
載のＤＴＰａワクチン。
（項目７）  非ＤＴＰａ抗原をさらに含む、項目１〜６のいずれか１項
に記載のＤＴＰａワクチン。
（項目８）  患者において免疫応答を惹起する方法であって、項目１
〜７のいずれか１項に記載のワクチンを患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目９）  前記患者は小児である、項目８に記載の方法。
（項目１０）  前記ワクチンは、追加免疫として与えられる、項目８に
記載の方法。
（項目１１）  以下：
（ａ）ジフテリア抗原、破傷風抗原および無細胞百日咳抗原；ならびに
（ｂ）ワクチンとしての使用のための、コレラ毒素またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安
定性毒素のいずれかの無毒化形態、
を含む、組成物。
（項目１２）  百日咳、ジフテリアおよび破傷風に対して、患者をワクチ
ン接種するための鼻内医薬を製造するにおける、コレラ毒素またはＥ．ｃｏｌｉ
熱不安定性毒素の無毒化変異体の使用。
（項目１３）  百日咳、ジフテリアおよび破傷風に対する患者の追加免疫
ワクチン接種のための鼻内医薬の製造における、コレラ毒素またはＥ．ｃｏｌｉ
熱不安定性毒素の無毒化変異体の使用。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ＬＴ−Ｋ６３でアジュバント化された鼻内Ｐａワクチンに対する脾臓内でのＴ細胞応答を示す。このアッセイにおいて使用されるそのＴ細胞刺激は、ＰＴ（充填された）、ＦＨＡ（診断シェード）、またはＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ細菌（水平線）であった。Ｐａワクチン（ＦＨＡ＋ｒＰＴ）は、ＬＴ−Ｋ６３アジュバントのあるなしで、軽いハロセン麻酔のあるなしで送達された。ＰＢＳはコントロールであった。
【図２−１】図２は、（Ａ）脾臓、（Ｂ）胸部リンパ節（Ｃ）表面頸部リンパ節における、ＬＴ−Ｒ７２アジュバントについて類似のデータを示す。ＰＭＡ／ＣＤ３（陰なし）を、陽性コントロールとして使用した。
【図２−２】図２は、（Ａ）脾臓、（Ｂ）胸部リンパ節（Ｃ）表面頸部リンパ節における、ＬＴ−Ｒ７２アジュバントについて類似のデータを示す。ＰＭＡ／ＣＤ３（陰なし）を、陽性コントロールとして使用した。
【図３】図３は、同じワクチンに対する抗体応答を示す。３Ａは、ＬＴ−Ｋ６３アジュバントを用いた結果を示し、そして３Ｂは、ＬＴ−Ｒ７２アジュバントを用いた結果を示す。黒棒は、抗ＰＴ応答を示し、白棒は、抗ＦＨＡ応答を示す。
【図４】図４は、変異体ＬＴアジュバントのアジュバント効果に対する毒素用量の効果を示す。
【図５】図５は、図１および２と同じワクチンでの免疫の後のＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ消失の反応速度論を示す。５Ａは、ＬＴ−Ｋ６３を用いた結果を示し、そして５Ｂは、ＬＴ−Ｒ７２を用いた結果を示す。結果は、１回の実験群当たり、１時点当たり４匹のマウスからの個々の肺についての平均の生Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓである。
【図６】図６は、（ｉ）ミョウバンアジュバントおよび筋肉内投与（白棒）および（ｉｉ）ＬＴ−Ｋ６３アジュバントおよび鼻内投与（黒棒）を比較する、ＤＴＰａワクチンにおける５個の抗原に対する、ＩｇＡおよびＩｇＧ応答を示す。
【図７】図７は、同じワクチンについてのＴ細胞応答を比較する。
【図８】図８は、消失反応速度論を示す。
【図９】図９は、５つの異なる初回刺激レジメンおよび追加免疫レジメンを用いて投与した、Ｄ（下）、Ｔ（中）、およびＰａ（上）のＤＴＰａワクチン成分に対する、Ｔ細胞増殖（3Ｈ−ＣＰＭで測定した）を示す。
【図１０】このＴ細胞サイトカインは、Ｐａ成分に対して応答する。
【図１１】このＴ細胞サイトカインは、Ｄ成分に対して応答する。
【図１２】このＴ細胞サイトカインは、Ｔ成分に対して応答する。
【図１３】図１３は、ＤＴＰａ混合物における５つの規定される抗原に対する血清ＩｇＧ（上）および肺ホモジネートＩｇＡ（下）の力価（ｌｏｇ10）を示す。
【図１４】図１４は、機能的に重要な抗ＤＴ中和抗体を示す。
【図１５】図１５は、５つのレジメンについての消失反応速度を示す。ここで、算出される場合、Ｐａ単独に対する統計学的有意（ステューデントのｔ検定）は、*（ｐ＜０．０５）または**（ｐ＜０．０１）のいずれかによって表す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（発明の実施の形態）
（背景の材料および方法）
以下の実施例で使用したマウスは、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（６−８週齢、Ｈ
ａｒｌａｎ  ＵＫ由来）であり、そしてＩｒｉｓｈ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏ
ｆ  Ｈｅａｌｔｈの規制に従って収容した。
【００２７】
Ｔ細胞応答。マウスを、０週目および４週目で免役した。６週目で、脾臓、上
部頸部リンパ節および後部縦壁（胸部）リンパ節を取り出し、そして免疫応答を
評価した。個々のマウスからの脾臓細胞または未刺激もしくは免役したマウスか
らのプールされたリンパ節細胞（２×１０6細胞／ｍｌ）を、熱殺傷した（８０
℃で３０分間）Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ細菌（１０6細胞または１０7細胞／ｍｌ
）、熱不活化ｒＰＴ（１−５μｇ／ｍｌ）またはＦＨＡ（１−５μｇ／ｍｌ）を
有する、８％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ中で３７℃で三連にて培養した。ホルボ
ール（ｐｈｏｒｂａｌ）ミリステートアセテート（ＰＭＡ）＋抗マウスＣＤ３を
陽性コントロールとして用い；培地のみを陰性コントロールとして用いた。ＤＴ
Ｐａを用いた実験において、ＰＲＮ、ＴＴまたはＣＲＭ１９７（１−５μｇ／ｍ
ｌ）に対する応答もまた試験した。上清を７２時間後に取り出し、そしてＩＦＮ
−γ（Ｔｈ１応答の指標である）ならびにＩＬ−４およびＩＬ−５（両方ともＴ
ｈ２応答の指標である）の濃度を、参考文献２２に記載されるような免疫アッセ
イによって決定した。Ｔ細胞増殖を、これもまた参考文献２２において記載され
るように、3Ｈチミジン取り込みにより培養の４日後に評価した。結果を、４−
５匹のマウスからの個々の脾臓細胞またはプールしたリンパ節細胞に対して、三
連にて行ったアッセイにおいて、抗原の最適濃度について、１分当たりの平均計
数または平均サイトカイン濃度として表現する。
【００２８】
抗体アッセイ。コントロールおよび免役したマウスの血清における抗原特異的
ＩｇＧのレベルをＥＬＩＳＡにより決定した。精製した抗原（ＦＨＡ、ＰＴ、Ｔ
ＴおよびＤＴ；１．０μｇ／ｍｌ）を用いてＥＬＩＳＡプレートをコーティング
した。このプレートを乳汁タンパク質でブロッキングし、次いで連続希釈した血
清サンプルを加え、結合した抗体を抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）アルカリホス
ファターゼ結合体によって検出した。肺中の抗原特異的なＩｇＡをＥＬＩＳＡに
より検出した。肺を、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦプロテアーゼインヒビターを含む、
８％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ中でホモジナイズした。ＥＬＩＳＡプレートを、
ＩｇＧアッセイについては抗原でコーティングし、そして連続希釈した肺ホモジ
ネートを加えた。結合した抗体をヒツジ抗マウスＩｇＡ、続いてロバ抗ヒツジＩ
ｇＧアルカリホスファターゼ結合体を用いて検出した。結果を、未刺激マウスか
らの血清または肺ホモジネートについてのバックグラウンドコントロール値より
２標準偏差上のカットオフに対して、光学密度対血清もしくは肺のホモジネート
希釈の曲線の直線部分の回帰によって算出した、末端点力価として表現する。
【００２９】
（１：ＬＴ変異体は、Ｐａのための鼻内アジュバントである）
２つのＰａワクチンを調製した。各ワクチンにおける抗原成分は、参考文献２
３において記載されるように調製した抗原を伴う、ＦＨＡ（２．５μｇ／用量）
＋ｒＰＴ（５．０μｇ／用量）であった。
【００３０】
第一のワクチン（図１）をＬＴ−Ｋ６３（１０μｇ／用量）を用いてアジュバ
ント化したが、他方第二のワクチン（図２）をＬＴ−Ｒ７２（１μｇ／用量）で
アジュバント化した。コントロールワクチンは、ＦＨＡ＋ｒＰＴのみからなる。
このアジュバントを、参考文献２４および２５に記載されるように調製した。
【００３１】
２５μｌ中に再懸濁し、そしてマイクロピペットで外鼻孔に対して適用される
ワクチン用量でか、または軽いハロセン麻酔後に、５０μｌに再懸濁し、そして
ミクロピペットで外鼻孔に適用されるワクチン用量を用いて、０週目および４週
目にマウスを免役した。殺傷したＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、熱不活化ＰＴおよび
ＦＨＡに対するＴ細胞応答を、６週目に、脾臓ならびに胸部リンパ節および頸部
リンパ節において測定した（図１および２）。
【００３２】
強いＴ細胞増殖およびサイトカイン産生が、アジュバント化されたＰａワクチ
ンについて検出された。対照的に、コントロールで鼻内免役されたマウスからの
脾臓および局所的なリンパ節は、有意なＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ特異的Ｔ細胞応
答を生成しなかった。ポリクローナル刺激（ＰＭＡ＋抗ＣＤ３）に対する陽性応
答により、これらのＴ細胞がインビトロで応答し得たことが確認された。
【００３３】
図３は、変異体ＬＴアジュバントもまた、Ｐａの鼻内送達の後に、局所および
全身性の抗体産生を増強したことを示す。コントロールでの免疫は、弱く、かつ
不一致の抗ＰＴおよび抗ＦＨＡの血清ＩｇＧおよび肺ＩｇＡ応答を生成した。対
照的に、ＬＴ−Ｒ７２またはＬＴ−Ｋ６３での同じ抗原の処方物は、一致して、
ＰＴおよびＦＨＡに対して特異的な強力な血清ＩｇＧおよび肺ＩｇＡを生じ、そ
してまた、特にワクチンを麻酔状態で投与した場合、有意にＩｇＡ応答を増強し
た。
【００３４】
従って、ＬＴ変異体の存在は、より良好なＴ細胞応答および抗体応答を生じた
。それらは、鼻内送達されるＰａの保護効力を増強し得、それゆえ無細胞ワクチ
ンのために有効な鼻内アジュバントである。
【００３５】
（２：アジュバント性に対する、酵素活性および毒素用量の効果）
毒素のＡＤＰリボシル化活性が免疫応答の調節において重要な役割を果たして
いるというサイトカインプロファイルが実施例１において得られた。Ｋ６３アジ
ュバント（これは、何らの毒性酵素活性を有しない）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５お
よびＩＦＮ−γの産生を増強した。これは、混合Ｔｈ１−Ｔｈ２（すなわちＴｈ
０）プロファイルの特徴である。対照的に、１．０μｇのＲ７２アジュバント（
これは、部分的に毒性の酵素活性を保持する）は、Ｔｈ２細胞を選択的に増強す
るようであった。
【００３６】
インビボで毒素のアジュバント性を直接比較した実験において、ＢＡＬＢ／ｃ
マウスを、１μｇまたは１０μｇのＬＴＫ６３またはＬＴＲ７２をアジュバント
として処方されたＰａで免役し、そして得られた免疫応答を評価した（図４）。
コントロールＰａでの鼻内免疫は、弱いＴ細胞応答を生成したが、他方、１μｇ
ＬＴＫ６３の添加は、ＦＨＡまたは殺傷したＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに対して応
答した脾臓細胞およびリンパ節により、増殖ならびにＩＦＮ−γおよびＩＬ−５
の産生を増強した。その用量を１０μｇのＬＴＫ６３へと増やすと、増殖および
ＩＦＮ−γの産生の穏和なさらなる増強が生じた。１．０μｇのＬＴＲ７２は、
選択的にＴｈ２応答を増強し、抗原誘導されたＩＬ−４およびＩＬ−５の産生の
レベルは、Ｐａ単独で観察されたものに比較して増強していた。野生型ＬＴ（１
．０μｇ）もまた、選択的にＩＬ−４およびＩＬ−５の産生を増強したが、その
効果は、ＬＴＲ７２で観察された効果ほどは劇的ではなかった。さらに、１．０
μｇのＬＴＲ７２を受けたマウスは、ＬＴＫ６３または野生型ＬＴを用いて免疫
されたマウスよりも、有意に高い抗ＦＨＡならびに抗ＰＴＩｇＧおよびＩｇＡの
抗体力価を有した（データは示さず）。ＬＴＲ７２の用量を１．０μｇから１０
μｇに増やすと、ＩＦＮ−γレベルの増強ならびにＩＬ−４およびＩＬ−５のレ
ベルの減少が生じた。
【００３７】
従って、この毒素の酵素活性および用量は、誘導される抗原特異的Ｔ細胞のサ
イトカインプロファイルに影響を与えるようである。低用量のＬＴＲ７２に存在
する微量のＡＤＰリボシル化活性は、Ｔｈ２のサイトカインプロファイルを調節
するに十分であり、そして抗体応答について強力なアジュバントとして作用する
。逆に、ＡＢ複合体の結合効果によって媒介される、ＬＴＫ６３のアジュバント
効果は、Ｔｈ１サブタイプに向けてさらに押される。さらに、より高い用量のＬ
ＴＲ７２では、ＡＢ結合活性は、酵素活性を凌駕し得、Ｔｈ１の増強およびＴｈ
２細胞の誘導を生じる。
【００３８】
（３：百日咳感染に対する保護）
ヒト臨床試験におけるワクチン効力を、参考文献２２において記載される呼吸
チャレンジモデルにおいて免役されたマウスの保護と相関付けした。従って、こ
のモデルを用いて、ＬＴアジュバントを用いて処方された、鼻内送達されるＰａ
を評価して、ヒト効力を予測した。
【００３９】
Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｗ２８  Ｉ相を、Ｓｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ
液体媒体中で３７℃での攪拌条件のもとで増殖させた。４８時間の培養物からの
細菌を、１％カゼインを含む生理食塩水中に約２×１０10細胞／ｍｌの濃度で再
懸濁した。チャレンジ接種を、ネブライザ手段により１５分の期間にわたってマ
ウスに投与し、続いてさらに１５分間にわたってチャンバ中で安静にさせた。４
匹のマウスの群を、０日目、３日目、７日目、１０日目および１４日目に屠殺し
、そして肺中の生存するＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの数を、評価した。肺を無菌的
に感染したマウスから取りだし、そして氷上で１ｍｌの、１％カゼインを含む無
菌の生理食塩水中にホモジナイズした。個々の肺からの希釈していないかまたは
系列希釈したホモジネートの１００μｌのアリコートを、Ｂｏｒｄｅｔ−Ｇｅｎ
ｏｕ寒天プレート上で三連でスポットし、そして５日のインキュベーション後に
コロニー数を評価した（図５）。
【００４０】
アジュバント化したＰａ処方物は、可溶性抗原単独で達成される保護レベルよ
りも有意に高い、保護レベルを提供した。ＬＴ−Ｋ６３アジュバントは、ＬＴ−
Ｒ７２よりわずかによい保護を生成した。２５μｌ（麻酔なし）中でのＬＴ−Ｒ
７２でのＰａの鼻送達は、５０μｌ中の同じワクチン（麻酔有り）よりもわずか
によい保護を与えた。これらの２つの相違はいずれも有意ではなかった。
【００４１】
図５において示される保護レベルは、従来のように非経口送達された２成分Ｐ
ａ（ミョウバンにおいて２５μｇ  ＦＨＡ＋２５μｇ化学的に無毒化されたＰＴ
（１６，２２））で以前に観察されたレベルを超える。相関曲線の外挿により、
より良好な強度指標を示し、これは、ヒトにおける優れた臨床効力を示唆する。
【００４２】
（４：ＬＴ−Ｋ６３を用いたＤＴＰａ効力）
百日咳ワクチンは、通常、ミョウバンアジュバントにおける三種ＤＴＰ組合せ
の形態で小児に筋肉内に投与される。従って、鼻内ワクチン接種の効力を評価す
るために、ＤＴＰａワクチンを、筋肉投与のためにミョウバンでアジュバント化
し（３００μｇ／用量、３００μｌ容量）、直接比較のために、ＬＴ−Ｋ６３ア
ジュバント化した鼻内ワクチンを用いた（１０μｇアジュバント／用量、４０μ
ｌ容量）。このワクチンのＰａ成分は、５μｇｒＰＴ、２．５μｇ  ＦＨＡおよ
び２．５μｇペルタクチンを含み；Ｔ成分は、１０μｇ破傷風トキソイドであり
；Ｄ成分は１０μｇのＣＲＭ１９７であった。
【００４３】
鼻内ワクチンは、破傷風およびジフテリアならびに百日咳抗原に対する細胞性
および体液性免疫応答を増強した（図６および図７）。鼻内ワクチンを用いた血
清ＩｇＧのレベルは、筋肉内ワクチンを用いて観察されたレベルと等価であった
が、粘膜免疫は、局所的ＩｇＡ応答を有利に増強した。
【００４４】
顕著なことに、ＬＴ−Ｋ６３アジュバント化されたワクチンの保護効力は、「
標準的な」ミョウバンアジュバント化されたワクチンの効力に一致したが、消失
反応速度論は、わずかに異なっていた（図８）。これは、ミョウバン上に吸着さ
れ、そして非経口的に投与される同じ抗原で観察される保護レベルに等価な、Ｂ
．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ感染に対する保護レベルを生成し得る粘膜送達される組合
せＤＴＰａ処方物の初めての開示である。
【００４５】
（５：筋肉内初回刺激および鼻内追加免疫）
このＤＴＰａワクチンは、初回刺激−追加免疫実験においてもまた使用される
。
【００４６】
２群の２２匹のマウスを、０週目および４週目でミョウバンにおけるＤＴＰａ
またはＰＢＳ（コントロール）のいずれかで筋肉内免疫した。さらなる群の２２
匹のマウスを、０週目および４週目で、ＬＴ−Ｋ６３アジュバント化されたワク
チンで、鼻内免疫した。２つのさらなる群の２２匹のマウスを、０週目で筋肉内
でのミョウバン処方物で免疫し、そして４週目で鼻内処方物（ＬＴ−Ｋ６３アジ
ュバントとともにまたはそれなしで）免疫した。
【００４７】
【表１】
2012067137.tif 000002
各群から５匹のマウスを６週目に屠殺し、そして血清、肺および脾臓の細胞を
免疫応答について測定した。残りのマウスを、感染モデルに供した。各群から１
匹のマウスを、０日目に、および各群から４匹のマウスを、３日目、７日目、１
０日目および１４日目に屠殺し、そしてそれらのＣＦＵ計数を、それらの肺から
測定した。
【００４８】
Ｔ細胞増殖（図９）は、インビトロで百日咳抗原で刺激を受けた脾臓細胞につ
いて全ての群で弱かった。しかし、その細胞は、陽性コントロール（ＰＭＡ＋Ｃ
Ｄ３）に対して応答して増殖した。インビトロでの破傷風トキソイドに対する増
殖応答は、ＬＴ−Ｋ６３をアジュバントとして用いたとき（筋肉内初回刺激の後
）鼻内追加免役されたマウスにおいて有意により強力であった。ジフテリア成分
に対する最も強力なインビトロ増殖は、鼻内で２回免役されたマウスにおいて見
られた。
【００４９】
百日咳抗原に対するサイトカイン応答（図１０）は、すべての群において、Ｉ
Ｌ−５およびＩＦＮ−γ産生の両方を示した。このことは、インビボでＴｈ１お
よびＴｈ２の両方の集団の初回刺激を示す。ＩＬ−４産生は、両方のときにおい
て同じ方法で免役した群において限定されていた。鼻内ＬＴ−Ｋ６３処方物での
初回刺激および追加免疫は、筋肉内で初回刺激された群よりもより強いＴｈ２応
答（より高いＩＬ−４およびＩＬ−５）を与えるようである。
【００５０】
ジフテリア抗原に対するサイトカイン応答（図１１）は、ＩＬ−４およびＩＬ
−５に限定されており、いずれの群についてもＩＦＮ−γはほとんどまたは全く
検出されなかった。従って、ＤＴＰａでの鼻内追加免疫は、インビボでＴｈ２細
胞の初回刺激を生じる。最も強いＴｈ２応答は、ＬＴ−Ｋ６３アジュバントで２
回鼻内免役されたマウスから生成された。対照的に、２回の筋肉内注射は、脾臓
内で検出可能なＩＬ−４応答もＩＬ−５応答も与えず、ＩＦＮ−γもそうではな
かった。
【００５１】
破傷風抗原に対するサイトカイン応答（図１２）は、すべてのマウスにおいて
ＩＬ−４、ＩＬ−５の産生、および低レベルのＩＦＮ−γの産生を示した。この
ことは、混合Ｔｈ１／Ｔｈ２応答を示す。しかし、ＩＬ−４およびＩＬ−５のレ
ベルは、アジュバント化されていない鼻内追加免疫または筋肉内追加免疫と比較
して、ＬＴ−Ｋ６３アジュバントで鼻内追加免役した群において、有意により高
かった。
【００５２】
ＴＴ、ＤＴおよびＰＴＮに対するＩｇＧ応答（図１３）は、種々の群の間の力
価において有意な相違を示さなかった。抗ＰＴおよび抗ＦＨＡの力価は、鼻内で
追加免疫した群におけるよりも、筋肉内でＤＴＰａで初回刺激および追加免役し
た群においてわずかにより高かった（ＬＴ−Ｋ６３アジュバントありまたはなし
）。抗ＦＨＡ  ＩｇＧは、検出されなかったが、これは、上記に提示された結果
とは一致しなかった。ＩｇＡレベル（図１３）は、ＬＴ−Ｋ６３アジュバントを
用いた筋肉内初回刺激および鼻内追加免疫が鼻内初回刺激および追加免疫に対す
るほとんどの抗原について類似の力価を生成したことを示したが、抗ＰＴレベル
は有意により低かった。ＬＴ−Ｋ６３アジュバントなしでの鼻内追加免疫は、特
にＤＨＡおよびＰＴＮについてより低いＩｇＡレベルを生成した。
【００５３】
マウス血清における機能的に重要な抗ＤＴ中和抗体の分析（図１４）は、ＬＴ
−Ｋ６３を用いた筋肉内での初回刺激および鼻内追加免疫が最も高いレベルを生
じたことを実証した。
【００５４】
保護モデルは、類似のレベルの保護が、二重の鼻内免疫および二重の筋肉内免
疫において観察されたことを示した。消失曲線の反応速度論（図１５）は変動す
るが、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓは、両方の場合において有効に消失し、チャレン
ジ後１４日でＣＦＵ計数は１（ｌｏｇ10）未満であった。今日のほとんどの成人
は、筋肉内百日咳ワクチンを受けている。これは、この例において筋肉内初回刺
激により表される。このデータは、ＬＴ−Ｋ６３アジュバントでの鼻内追加免疫
がワクチン接種の有効方法であることを示す。
【００５５】
この実施例はまた、ＬＴ−Ｋ６３が１×ＣＲＭ１９７の送達について非常に有
効なアジュバントであることも示す。この抗原に対する鼻内増強は、キトサンを
用いて報告されているが、これは、穏和なＩｇＡおよびＴ細胞の応答について３
回の免疫を必要とした。対照的に、ＬＴ−Ｋ６３は、２回のみの鼻内免疫後のＩ
ｇＧ、ＩｇＡ、ＩＬ−４およびＩＬ−５の強力な応答を誘導し得た。類似のレベ
ルの抗ＤＴ中和抗体もまた、キトサンを用いたのと同様に生成された。
【００５６】
本発明は、上記において例示でのみ記載され、そして本発明の範囲および趣旨
内にとどめつつ改変がなされ得ると理解される。
【００５７】
（参考文献（その内容はその全体が本明細書において参考として援用される）
）
【００５８】
【表２】
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【図１】
2012067137.tif 000004
【図２−１】
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【図２−２】
2012067137.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【外国語明細書】
2012067137000001.pdf