(57)【要約】【課題】本発明の主な目的は、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現抑制活性を有する二本鎖修飾ＲＮＡを提供することにある。【解決手段】本発明は、下記（１）〜（５）の特徴を有する二本鎖修飾ＲＮＡに関するものである。（１）標的遺伝子のｍＲＮＡと相同的な３０〜１００塩基の標的配列を含むセンス鎖を有すること、（２）標的配列と相補的な配列を含むアンチセンス鎖を有すること、（３）センス鎖の５’末端から２２〜２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の３’末端から２２〜２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチドについて、リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチドであること、（４）センス鎖の３’末端から２２〜２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の５’末端から２２〜２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチドについて、リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチドであること、（５）標的遺伝子がコードするタンパク質の発現抑制活性を有すること。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（５）の特徴を有する二本鎖修飾ＲＮＡ：
（１）標的遺伝子のｍＲＮＡと相同的な３０〜１００塩基の標的配列を含むセンス鎖を有すること、
（２）標的配列と相補的な配列を含むアンチセンス鎖を有すること、
（３）センス鎖の５’末端から２２〜２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の３’末端から２２〜２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチドについて、リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチドであること、
（４）センス鎖の３’末端から２２〜２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の５’末端から２２〜２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチドについて、リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチドであること、
（５）標的遺伝子がコードするタンパク質の発現抑制活性を有すること。
【請求項２】
下記（１）〜（５）の特徴を有する二本鎖修飾ＲＮＡ：
（１）標的遺伝子のｍＲＮＡと相同的な３０〜１００塩基の標的配列を含むセンス鎖を有すること、
（２）標的配列と相補的な配列を含むアンチセンス鎖を有すること、
（３）センス鎖の５’末端から２２及び２３番目のヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の３’末端から２３及び２４番目のヌクレオチドについて、リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチドであること、
（４）センス鎖の３’末端から２３及び２４番目のヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の５’末端から２２及び２３番目のヌクレオチドについて、リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチドであること、
（５）標的遺伝子がコードするタンパク質の発現抑制活性を有すること。
【請求項３】
センス鎖及び／若しくはアンチセンス鎖の５’末端から２４番目のヌクレオチドのリボースの２’位の水酸基、並びに／又はセンス鎖及び／若しくはアンチセンス鎖の３’末端から２２番目のヌクレオチドのリボースの２’位の水酸基が更に置換されているヌクレオチドである、請求項２に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
【請求項４】
リボースの２’位の水酸基が、水素原子、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アルコキシアルキルオキシ、アリールオキシアルキルオキシ、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルオキシ、アルキルアミノアルキルオキシ、ジアルキルアミノアルキルオキシ、アジド、シアノ、ニトロ及びハロゲンから選択されるいずれかの基に置換されていることを特徴とする、請求項１に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
【請求項５】
リボースの２’位の水酸基が、水素原子、フッ素原子及びメトキシから選択されるいずれかの基に置換されていることを特徴とする、請求項１に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
【請求項６】
センス鎖及び／又はアンチセンス鎖を構成するリボヌクレオチドの一部が、デオキシリボヌクレオチド又は修飾デオキシリボヌクレオチドに置換されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
【請求項７】
センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端及び／又は５’末端に突出部として１〜４塩基のヌクレオチドが付加されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
【請求項８】
突出部として付加されたヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドである、請求項７に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
【請求項９】
突出部として付加したヌクレオチドが２塩基のデオキシチミジン一リン酸である、請求項７に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
【請求項１０】
センス鎖及び／又はアンチセンス鎖のヌクレオチドを構成するリボース又はリン酸バックボーンの一部が修飾されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
【請求項１１】
リボース又はリン酸バックボーンの修飾が、リボースの２’位の水酸基を水素原子、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アルコキシアルキルオキシ、アリールオキシアルキルオキシ、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルオキシ、アルキルアミノアルキルオキシ、ジアルキルアミノアルキルオキシ、アジド、シアノ、ニトロ及びハロゲンから選択されるいずれかの基に置換する修飾、リボースの４’位をチオ体とする修飾又はリン酸バックボーンをホスホロチオエート体、ホスホロジチオエート体、アルキルホスホネート体又はホスホロアミデート体とする修飾である、請求項１０に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
【請求項１２】
センス鎖及び／又はアンチセンス鎖に１ないし複数の欠失、置換、挿入又は付加した塩基を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二本鎖修飾ＲＮＡと担体との複合体を含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１４】
担体がカチオン性担体、ウイルスエンベロープ又はナノ粒子を利用した担体である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
カチオン性担体がカチオン性リポソームである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
カチオン性リポソームが２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールとリン脂質とを必須の構成成分とするカチオン性リポソーム：２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、１，３−ジステアロイルグリセロ−２−ホスファチジル−Ｎ−（メトキシ  ポリエチレングリコールスクシニル）エタノールアミン及びリン脂質を必須の構成成分とするカチオン性リポソーム：又は２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、Ｎ−（メトキシ  ポリエチレングリコールスクシニル）ジステアロイル  ホスファチジルエタノールアミン及びリン脂質を必須の構成成分とするカチオン性リポソームである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
リン脂質がホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、卵黄レシチン、大豆レシチン又はこれらの水素添加リン脂質である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
カチオン性担体がカチオン性ポリマーである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
カチオン性担体がカチオン性デンドリマーである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
カチオン性デンドリマーがポリアミドアミンデンドリマーである、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
標的遺伝子がコードするタンパク質の異常な発現が原因となっている疾患の治療及び／又は予防のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
【請求項２３】
癌、ウイルス性疾患、代謝性疾患、循環器疾患、神経疾患又は泌尿器疾患の治療及び／又は予防のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
【請求項２４】
アポトーシスの促進又は抑制が所望される疾患の治療及び／又は予防のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
【請求項２５】
血液学的悪性疾患の治療及び／又は予防のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の二本鎖修飾ＲＮＡ。
【請求項２６】
標的遺伝子がコードするタンパク質の異常な発現が原因となっている疾患の治療及び／又は予防のための、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
癌、ウイルス性疾患、代謝性疾患、循環器疾患、神経疾患又は泌尿器疾患の治療及び／又は予防のための、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
アポトーシスの促進又は抑制が所望される疾患の治療及び／又は予防のための、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
血液学的悪性疾患の治療及び／又は予防のための、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な二本鎖修飾ＲＮＡに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉は、１９塩基〜２３塩基程度の二本鎖ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）と相補的な塩基配列を持つｍＲＮＡの分解又は翻訳阻害により配列特異的に遺伝子発現を抑制する現象をいう（例えば、非特許文献１及び２を参照）。そのｓｉＲＮＡは、細胞内に存在する長鎖二本鎖ＲＮＡが、ＲＮＡａｓｅＩＩＩ様の活性を有するＤｉｃｅｒにより切断を受け、生成される。
最近、センス鎖の５’末端及び３’末端から連続した４塩基のヌクレオチドのリボースの２’位の水酸基がメトキシ若しくはフッ素原子に置換されている、２５塩基の二本鎖修飾ＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒで切断されずにＲＮＡ干渉を引き起こすことが報告されている。しかしながら、２５塩基より長鎖の二本鎖ＲＮＡにおいて、Ｄｉｃｅｒで切断されずにＲＮＡ干渉を引き起こすものはこれまでに報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ、３９１、１９９８、ｐ．８０６−８１１
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ、４１１、２００１、ｐ．４９４−４９８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の主な目的は、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現抑制活性を有する新規な二本鎖修飾ＲＮＡ、及び当該二本鎖修飾ＲＮＡと担体との複合体を含有することを特徴とする医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、例えば、下記１、２に掲げる発明を見出し、本発明を完成した。
１．下記（１）〜（５）の特徴を有する二本鎖修飾ＲＮＡ（以下、「本発明ＲＮＡ」という。）：
（１）標的遺伝子のｍＲＮＡと相同的な３０〜１００塩基の標的配列を含むセンス鎖を有すること、
（２）標的配列と相補的な配列を含むアンチセンス鎖を有すること、
（３）センス鎖の５’末端から２２〜２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の３’末端から２２〜２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチドについて、リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチドであること、
（４）センス鎖の３’末端から２２〜２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の５’末端から２２〜２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチドについて、リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチドであること、
（５）標的遺伝子がコードするタンパク質の発現抑制活性を有すること。
２．本発明ＲＮＡと担体との複合体を含有することを特徴とする医薬組成物（以下、「本発明組成物」という。）。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、Ｄｉｃｅｒによる切断活性を示す。図中、「−」はＤｉｃｅｒ非添加群を、「＋」はＤｉｃｅｒ添加群をそれぞれ表す。
【図２】図２は、Ｄｉｃｅｒによる切断活性を示す。図中、「−」はＤｉｃｅｒ非添加群を、「＋」はＤｉｃｅｒ添加群をそれぞれ表す。
【図３】図３は、Ｄｉｃｅｒによる切断活性を示す。図中、「−」はＤｉｃｅｒ非添加群を、「＋」はＤｉｃｅｒ添加群をそれぞれ表す。
【図４】図４は、Ｄｉｃｅｒによる切断活性を示す。図中、「−」はＤｉｃｅｒ非添加群を、「＋」はＤｉｃｅｒ添加群をそれぞれ表す。
【図５】図５は、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現抑制活性を示す。上段はＢｃｌ−２タンパク質を、下段はβ−ａｃｔｉｎタンパク質をそれぞれ示す。
【図６】図６は、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現抑制活性を示す。縦軸は、β−ａｃｔｉｎタンパク質の発現量に対する、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現量の比を示す。
【図７】図７は、ＳＯＤ１タンパク質の発現抑制活性を示す。上段はＳＯＤ１タンパク質を、下段はβ−ａｃｔｉｎタンパク質をそれぞれ示す。
【図８】図８は、ＳＯＤ１タンパク質の発現抑制活性を示す。縦軸は、β−ａｃｔｉｎタンパク質の発現量に対する、ＳＯＤ１タンパク質の発現量の比を示す。
【図９】図９は、ｈｎＲＮＰＨタンパク質の発現抑制活性を示す。上段はｈｎＲＮＰＨタンパク質を、下段はβ−ａｃｔｉｎタンパク質をそれぞれ示す。
【図１０】図１０は、ｈｎＲＮＰＨタンパク質の発現抑制活性を示す。縦軸は、β−ａｃｔｉｎタンパク質の発現量に対する、ｈｎＲＮＰＨタンパク質の発現量の比を示す。
【図１１】図１１は、ルシフェラーゼタンパク質の発現抑制活性を示す。
【図１２】図１２は、ルシフェラーゼタンパク質の発現抑制活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【０００８】
Ｉ．本発明ＲＮＡ
本発明ＲＮＡは、下記（１）〜（５）の特徴を有する二本鎖修飾ＲＮＡである。
（１）標的遺伝子のｍＲＮＡと相同的な３０〜１００塩基の標的配列を含むセンス鎖を有すること、
（２）標的配列と相補的な配列を含むアンチセンス鎖を有すること、
（３）センス鎖の５’末端から２２〜２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の３’末端から２２〜２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチドについて、リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチドであること、
（４）センス鎖の３’末端から２２〜２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチド及び／又はアンチセンス鎖の５’末端から２２〜２４番目の連続する少なくとも２つのヌクレオチドについて、リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチドであること、
（５）標的遺伝子がコードするタンパク質の発現抑制活性を有すること。
【０００９】
本発明ＲＮＡにおいて、センス鎖及び／若しくはアンチセンス鎖の５’末端から２２及び２３番目のヌクレオチドのリボースの２’位の水酸基、並びに／又はセンス鎖及び／若しくはアンチセンス鎖の３’末端から２３及び２４番目のヌクレオチドのリボースの２’位の水酸基が置換されていることが好ましい。
更に、センス鎖及び／若しくはアンチセンス鎖の５’末端から２４番目のヌクレオチドのリボースの２’位の水酸基、並びに／又はセンス鎖及び／若しくはアンチセンス鎖の３’末端から２２番目のヌクレオチドのリボースの２’位の水酸基が置換されていることがより好ましい。
【００１０】
「標的遺伝子」とは、特に制限されず、任意に選択することができる。例えば、標的遺伝子がコードするタンパク質の異常な発現が疾患の原因と考えられる遺伝子や、遺伝子の塩基配列の一部が判明しているがどのような機能を有するのかを解明したい遺伝子を挙げることができる。また、標的遺伝子には、各種疾患等に対して、抑制的に作用する遺伝子又は促進的に作用する遺伝子も含まれる。
具体的には、癌関連遺伝子、アポトーシス関連遺伝子、血液学的悪性疾患関連遺伝子、代謝性疾患関連遺伝子、循環器疾患関連遺伝子、神経疾患関連遺伝子、泌尿器疾患関連遺伝子、自己免疫疾患関連遺伝子、サイトカイン遺伝子、発生関連遺伝子、増殖関連遺伝子、老化関連遺伝子、免疫関連遺伝子、ウイルス遺伝子、ウイロイド遺伝子、プリオン遺伝子、微生物由来遺伝子、原虫由来遺伝子を挙げることができる。
【００１１】
「癌関連遺伝子」としては、例えば、癌遺伝子（例えば、ｂｃｒ／ａｂｌ遺伝子、ｃ−ｆｍｓ遺伝子、ｃ−ｆｏｓ遺伝子、ｃ−ｍｙｂ遺伝子、ｃ−ｍｙｃ遺伝子、Ｋ−ｒａｓ遺伝子、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子）や癌抑制遺伝子（例えば、ｐ５３遺伝子、ＲＢ遺伝子、ＢＲＣＡ１・ＢＲＣＡ２遺伝子、ＷＴ１遺伝子、ＶＨＬ遺伝子、ＰＴＥＮ遺伝子、ｂｃｌ−２遺伝子、ｂｃｌ−ＸＩ遺伝子）を挙げることができる。
「ウイルス遺伝子」としては、例えば、ヒト乳頭腫ウィルス遺伝子、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルス遺伝子、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）遺伝子を挙げることができる。
「ウイロイド遺伝子」としては、例えば、ジャガイモやせいも病ウイロイド（ＰＳＴＶ）遺伝子を挙げることができる。
「自己免疫疾患関連遺伝子」としては、例えば、腫傷壊死因子（ＴＮＦ）−α遺伝子を挙げることができる。
「サイトカイン遺伝子」としては、例えば、インターフェロン遺伝子、インターロイキン遺伝子を挙げることができる。
「発生関連遺伝子」としては、例えば、ホメオ遺伝子を挙げることができる。
「増殖因子関連遺伝子」としては、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）遺伝子を挙げることができる。
「プリオン遺伝子」としては、例えば、ヒトプリオン遺伝子、ウシプリオン遺伝子を挙げることができる。
「微生物由来遺伝子」としては、例えば、Ｏ１５７等の病原性大腸菌を挙げることができる。
「原虫由来遺伝子」としては、例えば、マラリア原虫由来遺伝子を挙げることができる。
【００１２】
「標的遺伝子のｍＲＮＡと相同的な３０〜１００塩基の標的配列」とは、標的遺伝子のｍＲＮＡの一部と８０％以上の相同性を有する配列が適当であり、９０％以上の相同性を有する配列が好ましく、１００％の相同性を有する配列がより好ましい。但し、相同性は、センス鎖の５’末端及び３’末端から２２〜２４番目のヌクレオチドの内、リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチドを除いて算出される。
【００１３】
標的配列の鎖長は、３０〜１００塩基の範囲内が適当であり、３０〜８０塩基の範囲内が好ましく、３０〜５０塩基の範囲内がより好ましい。
【００１４】
「標的配列と相補的な配列」とは、標的配列と８０％以上の相補性を有する配列が適当であり、９０％以上の相補性を有する配列が好ましく、１００％の相補性を有する配列がより好ましい。但し、相補性は、アンチセンス鎖の５’末端及び３’末端から２２〜２４番目のヌクレオチドの内、リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチドを除いて算出される。
【００１５】
「リボースの２’位の水酸基が置換されているヌクレオチド」としては、例えば、リボースの２’位の水酸基が、水素原子、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アルコキシアルキルオキシ、アリールオキシアルキルオキシ、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルオキシ、アルキルアミノアルキルオキシ、ジアルキルアミノアルキルオキシ、アジド、シアノ、ニトロ及びハロゲンから選択されるいずれかの基に置換されたヌクレオチドを挙げることができる。より具体的には、水素原子、フッ素原子、メトキシ、メトキシエトキシ、アミノプロピルオキシ、ジメチルアミノエトキシ、ジメチルアミノエトキシエトキシを挙げることができる。
それらの中で、水素原子、フッ素原子、メトキシが好ましく、水素原子が特に好ましい。
【００１６】
「標的遺伝子がコードするタンパク質の発現抑制活性を有する」とは、本発明ＲＮＡを導入した細胞において、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現量が陰性対照のそれと等しい場合を抑制率が０％であるとみなし、その抑制率が５０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは９０％以上である場合をいう。
【００１７】
本発明ＲＮＡにおいて、センス鎖及びアンチセンス鎖の全長は、同一又は異なって、３０〜１０４塩基の範囲内が適当であり、３０〜８４塩基の範囲内が好ましく、３０〜５４塩基の範囲内がより好ましい。
【００１８】
本発明ＲＮＡは、そのセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖を構成するリボヌクレオチドの一部が、修飾リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又は修飾デオキシリボヌクレオチドに置換されていてもよい。
【００１９】
「修飾リボヌクレオチド」及び「修飾デオキシリボヌクレオチド」とは、ヌクレオチドを構成する「糖」、「核酸塩基」、「リン酸バックボーン」の少なくとも１つが修飾されているヌクレオチドをいう。
【００２０】
「糖」の修飾としては、例えば、リボースの２’位の水酸基や水素原子の修飾、デオキシリボースの２’位の水素原子の修飾、糖の４’位の酸素原子を硫黄原子とする修飾、リボースの２’位の水素原子と水酸基をカルボニル基とする修飾、リボースの２’位の水酸基と４’位の炭素原子とをメチレンにて架橋する修飾［いわゆる、Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＢＮＡ）又はＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）］を挙げることができる。
リボースの２’位の水酸基の修飾は、前記と同様である。
リボース、デオキシリボースの２’位の水素原子の修飾としては、例えば、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシアルキル、アリールオキシアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アルコキシアルキルオキシ、アリールオキシアルキルオキシ、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルオキシ、アルキルアミノアルキルオキシ、ジアルキルアミノアルキルオキシ、アジド、シアノ、ニトロ及びハロゲンから選択されるいずれかの基に置換する修飾を挙げることができる。
【００２１】
「核酸塩基」としては、例えば、２−アミノプリン、２−アミノ−１，９−ジヒドロ−６Ｈ−プリン−６−オン（グアニン）、６−アミノ−９Ｈ−プリン（アデニン）、８−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２，６，８−トリアミノプリン、６，８−ジアミノプリン、６−アミノ−２−ヒドロキシプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン、８−アミノ−６−ヒドロキシプリン、６−アミノ−８−ヒドロキシプリン、６−ヒドロキシプリン、２，６−ジヒドロキシプリン又はそれらの互変異性体等のプリン塩基：５−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロピリミジン−２，４−ジオン（チミン）、４−アミノピリミジン−２（１Ｈ）−オン（シトシン）、ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（ウラシル）、４，５−ジアミノピリミジン−２−オン、４，６−ジアミノピリミジン−２−オン、５−アミノピリミジン−２，４−ジオン、６−アミノピリミジン−２，４−ジオン、５−アミノピリミジン−２−オン、６−アミノピリミジン−２−オン、２，４−ジヒドロキシピリミジン又はそれらの互変異性体等のピリミジン塩基を挙げることができる。
核酸塩基の修飾体とは、例えば、プリン塩基又はピリミジン塩基中、置換可能な任意の位置において、適当な置換基で修飾されている核酸塩基をいう。かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アシル、アルキル、アリールアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、カルボキシ、シアノ及びニトロからなる群から選択される１〜３個の置換基を挙げることができる。
【００２２】
リン酸バックボーンの修飾としては、例えば、ホスホロチオエート体、ホスホロジチオエート体、アルキルホスホネート体、ボラノホスフェート体又はホスホロアミデート体とする修飾を挙げることができる。
【００２３】
「アルキル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜６のアルキルを挙げることができる。例えば、メチル、エチル、ｎ―プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｎ−ヘキシル及びイソヘキシルを挙げることができる。当該アルキルは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１〜３個置換されていてもよい。
「ハロゲン」としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
「アルコキシ」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜６のアルコキシを挙げることができる。例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシを挙げることができる。それらの中で、炭素数１〜３のアルコキシが好ましい。
「アリール」としては、例えば、炭素数６〜１０のアリールを挙げることができる。例えば、フェニル、α―ナフチル、β―ナフチルを挙げることができる。当該アリールは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが任意の位置に１〜３個置換されていてもよい。それらの中で、フェニルが好ましい。
「アシル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜６のアルカノイル、炭素数７〜１３のアロイルを挙げることができる。例えば、ホルミル、アセチル、ｎ−プロピオニル、イソプロピオニル、ｎ−ブチリル、イソブチリル、ｔｅｒｔ−ブチリル、バレリル、ヘキサノイル、ベンゾイル、ナフトイル、レブリニルを挙げることができる。
「アリールアルキル」、「アリールアルキルオキシ」、「アルコキシアルキル」、「アルコキシアルキルオキシ」、「アルキルチオ」、「アルキルアミノ」、「ジアルキルアミノ」、「アミノアルキルオキシ」、「アルキルアミノアルキルオキシ」、「ジアルキルアミノアルキルオキシ」、「アリールオキシアルキル」及び「アリールオキシアルキルオキシ」の「アルキル」部分は、上記の「アルキル」と同じものを挙げることができる。
「アルコキシアルキル」及び「アルコキシアルキルオキシ」の「アルコキシ」部分は、上記の「アルコキシ」と同じものを挙げることができる。
「アリールアルキル」、「アリールオキシアルキル」、「アリールアルキルオキシ」、「アリールオキシアルキルオキシ」及び「アリールオキシ」の「アリール」部分としては、上記の「アリール」と同じものを挙げることができる。
「アルキル」、「アリール」の置換基である「ハロゲン」、「アルキル」及び「アルコキシ」としては、各々上記と同じものを挙げることができる。
【００２４】
本発明ＲＮＡは、そのセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端及び／又は５’末端に突出部を有していてもよい。
【００２５】
当該突出部としては、１〜４塩基のヌクレオチドが適当であり、２塩基のヌクレオチドが好ましい。当該ヌクレオチドは、リボヌクレオチドかデオキシリボヌクレオチドかを問わない。また、修飾リボヌクレオチドや修飾デオキシリボヌクレオチドであってもよい。それらの態様の中で、デオキシリボヌクレオチドが適当であり、デオキシチミジン一リン酸が好ましい。なお、修飾リボヌクレオチドや修飾デオキシリボヌクレオチドは、前記と同様である。
【００２６】
本発明ＲＮＡは、そのセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖に１ないし複数の欠失、置換、挿入又は付加した塩基を含んでいてもよい。
【００２７】
本発明ＲＮＡは、例えば、ホスホロアミダイト法［例えば、２’位水酸基が、２’−（２−シアノエトキシ）メチル（ＣＥＭ）化、２’−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）化、２’−ビス（アセトキシメトキシ）メチルエチル（ＡＣＥ）化又は２’−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）化されたリボヌクレオチドホスホロアミダイト化合物を使用する方法］若しくはＨ−ホスホネート法による固相合成法によって、又はトリエステル法による液相合成法によって製造することができる。
【００２８】
リン酸バックボーンの修飾は、当業者に公知の方法（例えば、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、２０巻、１９９３年、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．）により行うことができる。
ホスホロチオエート体は、例えば、ホスホロアミダイト法による固相合成の酸化の工程において、例えば、ヨウ素−水による酸化剤の代わりに硫黄やｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｔｈｉｕｒａｍｄｉｓｕｌｆｉｄｅ（ＴＥＴＤ）等の硫黄化剤を用いることにより製造することができる。
ホスホロジチオエート体は、例えば、ホスホロアミダイトの代わりにホスホロチオアミダイトを用い、酸化の工程において硫黄などの硫黄化剤を用いることにより製造することができる。
アルキルホスホネート体は、例えば、ホスホロアミダイトの代わりに、メチルホスホンアミダイト等のアルキルホスホンアミダイトを用いることにより製造することができる。
ホスホロアミデート体は、例えば、Ｈ−ホスホネート法による固相合成において、Ｈ−ホスホネート体を合成した後、所望の１級又は２級のアミンとヨウ素等の酸化剤を用いることにより製造することができる。
ボラノホスフェート体は、例えば、Ｈ−ホスホネート法による固相合成において、Ｈ−ホスホネート体を合成した後、ボロンと３級アミンとを用いることにより製造することができる。
【００２９】
本発明ＲＮＡは、後述する担体を用いて細胞内にトランスフェクションすることができる。また、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法又はマイクロインジェクション法等により、直接細胞内に導入することもできる。
【００３０】
ＩＩ．本発明組成物
本発明組成物は、本発明ＲＮＡと担体との複合体を含有することを特徴とするものである。
【００３１】
上記担体としては、本発明ＲＮＡを細胞内に移行させるのに有効なものであれば特に制限さない。例えば、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー、カチオン性デンドリマー等のカチオン性担体、ウイルスエンベロープ又はナノ粒子を利用した担体を挙げることができる。
【００３２】
「カチオン性リポソーム」としては、例えば、
（１）２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールとリン脂質とを必須構成成分として形成されるカチオン性リポソーム担体（以下、「リポソームＡ」という。）、
（２）２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、１，３−ジステアロイルグリセロ−２−ホスファチジル−Ｎ−（メトキシ  ポリエチレングリコールスクシニル）エタノールアミン及びリン脂質を必須の構成成分とするカチオン性リポソーム（以下、「リポソームＢ」という。）、
（３）２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、Ｎ−（メトキシ  ポリエチレングリコールスクシニル）ジステアロイル  ホスファチジルエタノールアミン［ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＳＰＥ−０２０Ｃ；日本油脂社製］及びリン脂質を必須の構成成分とするカチオン性リポソーム（以下、「リポソームＣ」という。）、
（４）オリゴフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（５）リポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（６）リポフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（７）セルフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（８）リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（９）ＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（１０）ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、
（１１）ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、
（１２）ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（Ｍｉｒｕｓ社製）を挙げることができる。
それらの中で、リポソームＡ、リポソームＢ、リポソームＣが好ましい。
【００３３】
２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールは、文献（ＷＯ９４／１９３１４の実施例２０）に記載の方法により製造することができる。
【００３４】
１，３−ジステアロイルグリセロ−２−ホスファチジル−Ｎ−（メトキシ  ポリエチレングリコールスクシニル）エタノールアミンは、文献（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｖｏｌ．６８，ｎｏ．２１（２００８）ｐｐ．８８４３−８８５１）に記載の方法により製造することができる。当該化合物は、分子量２０００〜３８００の範囲内で分布するものが好ましい。なお、分子量は、エレクトロスプレーイオン化法を用いたマススペクトルで測定することができる。
【００３５】
リポソームＡ、Ｂ及びＣにおいて用い得る、リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン［例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン］、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロール、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、卵黄レシチン、大豆レシチン又はこれらの水素添加リン脂質を挙げることができる。
【００３６】
リポフェクチンは、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）と中性脂質としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を１：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）で含むカチオン性リポソームである。
リポフェクトアミンは、２，３−ジオレキシオロキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウム  トリフルオロアセタート（ＤＯＳＰＡ）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を３：１（ｗ／ｗ）で含むカチオン性リポソームである。
セルフェクチンは、Ｎ，Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３−テトラメチル−テトラパルミチルスペルミン（ＴＭ−ＴＰＳ）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を１：１．５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）で含むカチオン性リポソームである。
ＤＭＲＩＥ−Ｃは、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）とコレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）を１：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）で含むカチオン性リポソームである。
【００３７】
「カチオン性ポリマー」としては、例えば、ｊｅｔＳＩ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）、ｊｅｔＰＥＩ（ポリエチレンイミン；Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）、アテロコラーゲンを挙げることができる。
【００３８】
「ウイルスエンベロープ」としては、例えば、ＧｅｎｏｍｅＯＮＥ（ＨＶＪ−Ｅリポソーム；石原産業社製）を挙げることができる。
【００３９】
「カチオン性デンドリマー」としては、例えば、カチオン性アミノ酸デンドリマー（例えば、デンドリックポリ（Ｌ−リジン）（例えば、“Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、２００３年、１巻、１２７０−１２７３頁）又はポリアミドアミンデンドリマーを挙げることができる。
【００４０】
「ナノ粒子」としては、例えば、金ナノ粒子、シリカナノ粒子を挙げることができ、その平均粒子径としては、例えば、１ｎｍ〜５０００ｎｍの範囲内が適当である。
【００４１】
「金ナノ粒子」としては、例えば、カチオン性金ナノ粒子（“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、２００２年、１３巻、３−６頁）、ポリエチレングリコールで修飾されたカチオン性金ナノ粒子（例えば、“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｒｅａｓｅ”、２００６年、１１１巻、３８２−３８９頁）を挙げることができる。
【００４２】
本発明組成物中に含まれる本発明ＲＮＡの種類は、一種類であってもよいが、２〜１０の複数種であってもよい。
【００４３】
本発明組成物中に含まれる本発明ＲＮＡの濃度は、担体の種類等によって異なるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用する場合には、例えば、０．１ｎＭ〜１０μＭの範囲内が適当であり、１０ｎＭ〜１μＭの範囲内が好ましい。また、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用する場合には、例えば、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲内が適当であり、０．５〜２ｍｇ／ｍＬの範囲内か好ましい。
本発明組成物中に含まれる本発明ＲＮＡと担体との重量比（担体／本発明ＲＮＡ）は、本発明ＲＮＡの性質、担体の種類等によって異なるが、０．０１〜１００の範囲内が適当であり、１〜５０の範囲内が好ましく、５〜３０の範囲内がより好ましい。
【００４４】
本発明組成物には、任意に医薬上許容される添加剤を配合することができる。かかる添加剤として、例えば、乳化補助剤（例えば、炭素数６〜２２の脂肪酸やその医薬上許容される塩、アルブミン、デキストラン）、安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン）を挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。本発明組成物中の当該添加剤の含有量は、９０重量％以下が適当であり、７０重量％以下が好ましく、５０重量％以下がより好ましい。
【００４５】
本発明組成物は、担体の分散液に本発明ＲＮＡを加え、適当に攪拌することにより調製することができる。また、添加剤は、本発明ＲＮＡの添加前でも添加後でも適当な工程で添加することができる。本発明ＲＮＡを添加する際に用い得る溶媒としては、医薬上許容されるものであれば特に制限されず、例えば、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖液、マルトース液等の糖液を挙げることができる。また、かかる場合のｐＨおよび温度等の条件は、当業者が適宜選択することができる。
【００４６】
本発明組成物は、例えば、液剤やその凍結乾燥製剤とすることができる。当該凍結乾燥製剤は、常法により、液剤の形態を有している本発明組成物を凍結乾燥処理することにより調製することができる。例えば、液剤の形態を有している本発明組成物を適当な滅菌を行った後、所定量をバイアル瓶に分注し、約−４０〜−２０℃の条件で予備凍結を２時間程度行い、約０〜１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５〜２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。
【００４７】
上記凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５〜２倍量、又は５００ｍＬ以下が適当である。
【００４８】
ＩＩＩ．本発明ＲＮＡ、本発明組成物の医薬用途
本発明ＲＮＡないし本発明組成物は、例えば、標的遺伝子がコードするタンパク質の異常な発現が原因となっている疾患の治療及び／又は予防のために用いることができる。
例えば、癌、ウイルス性疾患、代謝性疾患、循環器疾患、神経疾患、泌尿器疾患、血液学的悪性疾患、又はアポトーシスの促進又は抑制が所望される疾患の治療及び／又は予防のために用いることができる。
【００４９】
本発明ＲＮＡないし本発明組成物は、ヒトを含む動物に対し、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与（例えば、膀胱内投与、胸腔内投与、腹腔内投与、眼内投与、脳内投与）、経皮投与、経粘膜投与、経肺投与又は経直腸投与することができる。特に静脈内投与、経皮投与、経粘膜投与が望ましい。これらの投与に適した剤型、例えば、各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸入剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、座剤で投与されるのはもちろんである。
【００５０】
本発明ＲＮＡないし本発明組成物の投与量は、本発明ＲＮＡの種類、剤型、年齢や体重等の患者の状態、投与経路、疾患の性質や程度を考慮した上で、例えば、成人に対して、１日当たり０．１ｍｇ〜５ｇ／ヒトの範囲内が、好ましくは１ｍｇ〜２ｇの範囲内が一般的である。この数値は標的とする疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異なる場合がある。従って、場合によってはこれ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とするときもある。また１日１回から数回の投与または１日から数日間の間隔で投与することができる。
【実施例】
【００５１】
以下、製造例、試験例により、本発明を詳細に説明する。但し、本発明は、実施例の記載に限定されないことは言うまでもない。
【００５２】
製造例１  二本鎖ＲＮＡの調製
（１）二本鎖ＲＮＡの配列
試験例１〜３で用いた二本鎖ＲＮＡは、以下の通りである。下記配列中、「ｄＡ」、「ｄＴ」、「ｄＧ」及び「ｄＣ」は、リボースの２’位の水酸基が水素原子に置換されたヌクレオチド（ＤＮＡ）を表す。また、「ａ」、「ｕ」、「ｇ」及び「ｃ」は、リボースの２’位の水酸基がメトキシに置換されたヌクレオチドを表す。
Ｂｃｌ２−１：
センス鎖（配列番号１）
５’−ＧＵＧ  ＡＵＧ  ＡＡＧ  ＵＡＣ  ＡＵＣ  ＣＡＵ  ＵｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号２）
５’−ＡＡＵ  ＧＧＡ  ＵＧＵ  ＡＣＵ  ＵＣＡ  ＵＣＡ  ＣｄＴｄＴ−３’  
Ｂｃｌ２−２：
センス鎖（配列番号３）
５’−ＣＧＡ  ＵＡＡ  ＣＣＧ  ＧＧＡ  ＧＡＵ  ＡＧＵ  ＧＡＵ
ＧＡＡ  ＧＵＡ  ＣＡＵ  ＣＣＡ  ＵＵｄＴ  ｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号４）
５’−ＡＡＵ  ＧＧＡ  ＵＧＵ  ＡＣＵ  ＵＣＡ  ＵＣＡ  ＣＵＡ
ＵＣＵ  ＣＣＣ  ＧＧＵ  ＵＡＵ  ＣＧｄＴ  ｄＴ−３’
Ｂｃｌ２−３：
センス鎖（配列番号５）
５’−ＣＧＡ  ＵＡＡ  ＣＣＧ  ＧＧＡ  ＧｄＡｄＴ  ＡＧＵ  ＧＡＵ
ｄＧｄＡＡ  ＧＵＡ  ＣＡＵ  ＣＣＡ  ＵＵｄＴ  ｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号４）
５’−ＡＡＵ  ＧＧＡ  ＵＧＵ  ＡＣＵ  ＵＣＡ  ＵＣＡ  ＣＵＡ
ＵＣＵ  ＣＣＣ  ＧＧＵ  ＵＡＵ  ＣＧｄＴ  ｄＴ−３’
Ｂｃｌ２−４：
センス鎖（配列番号６）
５’−ＣＧＡ  ＵＡＡ  ＣＣＧ  ＧＧＡ  Ｇａｕ  ＡＧＵ  ＧＡＵ
ｇａＡ  ＧＵＡ  ＣＡＵ  ＣＣＡ  ＵＵｄＴ  ｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号４）
５’−ＡＡＵ  ＧＧＡ  ＵＧＵ  ＡＣＵ  ＵＣＡ  ＵＣＡ  ＣＵＡ
ＵＣＵ  ＣＣＣ  ＧＧＵ  ＵＡＵ  ＣＧｄＴ  ｄＴ−３’
Ｂｃｌ２−５：
センス鎖（配列番号７）
５’−ＧＧＧ  ＵＡＣ  ＧＡＵ  ＡＡＣ  ＣＧＧ  ＧＡＧ  ＡＵＡ
ＧＵＧ  ＡＵＧ  ＡＡＧ  ＵＡＣ  ＡＵＣ  ＣＡＵ  ＵｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号８）
５’−ＡＡＵ  ＧＧＡ  ＵＧＵ  ＡＣＵ  ＵＣＡ  ＵＣＡ  ＣＵＡ
ＵＣＵ  ＣＣＣ  ＧＧＵ  ＵＡＵ  ＣＧＵ  ＡＣＣ  ＣｄＴｄＴ−３’
Ｂｃｌ２−６：
センス鎖（配列番号９）
５’−ＧＧＧ  ＵＡＣ  ＧＡＵ  ＡＡＣ  ＣＧＧ  ＧＡＧ  ｄＡｄＴＡ
ｄＧｄＴＧ  ＡＵＧ  ＡＡＧ  ＵＡＣ  ＡＵＣ  ＣＡＵ  ＵｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号８）
５’−ＡＡＵ  ＧＧＡ  ＵＧＵ  ＡＣＵ  ＵＣＡ  ＵＣＡ  ＣＵＡ
ＵＣＵ  ＣＣＣ  ＧＧＵ  ＵＡＵ  ＣＧＵ  ＡＣＣ  ＣｄＴｄＴ−３’
Ｂｃｌ２−７：
センス鎖（配列番号１０）
５’−ＧＧＧ  ＵＡＣ  ＧＡＵ  ＡＡＣ  ＣＧＧ  ＧＡＧ  ａｕＡ
ｇｕＧ  ＡＵＧ  ＡＡＧ  ＵＡＣ  ＡＵＣ  ＣＡＵ  ＵｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号８）
５’−ＡＡＵ  ＧＧＡ  ＵＧＵ  ＡＣＵ  ＵＣＡ  ＵＣＡ  ＣＵＡ
ＵＣＵ  ＣＣＣ  ＧＧＵ  ＵＡＵ  ＣＧＵ  ＡＣＣ  ＣｄＴｄＴ−３’
ＳＯＤ１−１：
センス鎖（配列番号１１）
５’−ＧＧＵ  ＧＧＡ  ＡＡＵ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＵ  ＡｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号１２）
５’−ＵＡＣ  ＵＵＵ  ＣＵＵ  ＣＡＵ  ＵＵＣ  ＣＡＣ  ＣｄＴｄＴ−３’
ＳＯＤ１−２：
センス鎖（配列番号１３）
５’−ＡＧＡ  ＵＧＡ  ＣＵＵ  ＧＧＧ  ＣＡＡ  ＡＧＧ  ＵＧＧ  ＡＡＡ
ＵＧＡ ＡＧＡ ＡＡＧ ＵＡｄＴ ｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号１４）
５’−ＵＡＣ  ＵＵＵ  ＣＵＵ  ＣＡＵ  ＵＵＣ  ＣＡＣ  ＣＵＵ  ＵＧＣ  
ＣＣＡ  ＡＧＵ  ＣＡＵ  ＣＵｄＴ  ｄＴ−３’
ＳＯＤ１−３：
センス鎖（配列番号１５）
５’−ＡＧＡ  ＵＧＡ  ＣＵＵ  ＧＧＧ  ＣｄＡｄＡ ｄＡＧＧ  ＵＧＧ  
ｄＡｄＡｄＡ  ＵＧＡ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＵＡｄＴ  ｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号１４）
５’−ＵＡＣ  ＵＵＵ  ＣＵＵ  ＣＡＵ  ＵＵＣ  ＣＡＣ  ＣＵＵ  ＵＧＣ  
ＣＣＡ  ＡＧＵ  ＣＡＵ  ＣＵｄＴ  ｄＴ−３’
ＳＯＤ１−４：
センス鎖（配列番号１６）
５’−ＡＡＡ  ＧＣＡ  ＧＡＵ  ＧＡＣ  ＵＵＧ  ＧＧＣ  ＡＡＡ  ＧＧＵ  
ＧＧＡ  ＡＡＵ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＵ  ＡｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号１７）
５’−ＵＡＣ  ＵＵＵ  ＣＵＵ  ＣＡＵ  ＵＵＣ  ＣＡＣ  ＣＵＵ  ＵＧＣ  
ＣＣＡ  ＡＧＵ  ＣＡＵ  ＣＵＧ  ＣＵＵ  ＵｄＴｄＴ−３’
ＳＯＤ１−５：
センス鎖（配列番号１８）
５’−ＡＡＡ  ＧＣＡ  ＧＡＵ  ＧＡＣ  ＵＵＧ  ＧＧＣ  ｄＡｄＡｄＡ 
ｄＧｄＧｄＴ  ＧＧＡ  ＡＡＵ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＵ  ＡｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号１７）
５’−ＵＡＣ  ＵＵＵ  ＣＵＵ  ＣＡＵ  ＵＵＣ  ＣＡＣ  ＣＵＵ  ＵＧＣ  
ＣＣＡ  ＡＧＵ  ＣＡＵ  ＣＵＧ  ＣＵＵ  ＵｄＴｄＴ−３’
ｈｎＲＮＰＨ−１
センス鎖（配列番号１９）
５’−ＡＡＣ  ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＡＵＧ  ＡｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号２０）
５’−ＵＣＡ  ＵＣＵ  ＵＣＵ  ＧＡＵ  ＵＣＡ  ＡＧＵ  ＵｄＴｄＴ−３’
ｈｎＲＮＰＨ−２
センス鎖（配列番号２１）
５’−ＧＧＣ  ＧＡＧ  ＧＣＵ  ＵＵＵ  ＧＵＵ  ＧＡＡ  ＣＵＵ  ＧＡＡ
ＵＣＡ  ＧＡＡ  ＧＡＵ  ＧＡｄＴ  ｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号２２）
５’−ＵＣＡ  ＵＣＵ  ＵＣＵ  ＧＡＵ  ＵＣＡ  ＡＧＵ  ＵＣＡ  ＡＣＡ  
ＡＡＡ  ＧＣＣ  ＵＣＧ  ＣＣｄＴ  ｄＴ−３’
ｈｎＲＮＰＨ−３
センス鎖（配列番号２３）
５’−ＧＧＣ  ＧＡＧ  ＧＣＵ  ＵＵＵ  ＧｄＴｄＴ ｄＧＡＡ  ＣＵＵ
ｄＧｄＡｄＡ  ＵＣＡ  ＧＡＡ  ＧＡＵ  ＧＡｄＴ  ｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号２２）
５’−ＵＣＡ  ＵＣＵ  ＵＣＵ  ＧＡＵ  ＵＣＡ  ＡＧＵ  ＵＣＡ  ＡＣＡ  
ＡＡＡ  ＧＣＣ  ＵＣＧ  ＣＣｄＴ  ｄＴ−３’
ｈｎＲＮＰＨ−４
センス鎖（配列番号２４）
５’−ＣＡＡ  ＧＵＧ  ＧＣＧ  ＡＧＧ  ＣＵＵ  ＵＵＧ  ＵＵＧ  ＡＡＣ  
ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＡＵＧ  ＡｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号２５）
５’−ＵＣＡ  ＵＣＵ  ＵＣＵ  ＧＡＵ  ＵＣＡ  ＡＧＵ  ＵＣＡ  ＡＣＡ  
ＡＡＡ  ＧＣＣ  ＵＣＧ  ＣＣＡ  ＣＵＵ  ＧｄＴｄＴ−３’
ｈｎＲＮＰＨ−５
センス鎖（配列番号２６）
５’−ＣＡＡ  ＧＵＧ  ＧＣＧ  ＡＧＧ  ＣＵＵ  ＵＵＧ  ｄＴｄＴｄＧ
ｄＡｄＡｄＣ  ＵＵＧ  ＡＡＵ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＡＵＧ  ＡｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号２５）
５’−ＵＣＡ  ＵＣＵ  ＵＣＵ  ＧＡＵ  ＵＣＡ  ＡＧＵ  ＵＣＡ  ＡＣＡ  
ＡＡＡ  ＧＣＣ  ＵＣＧ  ＣＣＡ  ＣＵＵ  ＧｄＴｄＴ−３’
ＧＬ３−１：
センス鎖（配列番号２７）
５’−ＣＵＵ  ＡＣＧ  ＣＵＧ  ＡＧＵ  ＡＣＵ  ＵＣＧ  ＡｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号２８）
５’−ＵＣＧ  ＡＡＧ  ＵＡＣ  ＵＣＡ  ＧＣＧ  ＵＡＡ  ＧｄＴｄＴ−３’
ＧＬ３−２：
センス鎖（配列番号２９）
５’−ＧＧＵ  ＧＧＡ  ＣＡＵ  ＣＡＣ  ＵＵＡ  ＣＧＣ  ＵＧＡ
ＧＵＡ  ＣＵＵ  ＣＧＡ  ｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号３０）
５’−ＵＣＧ  ＡＡＧ  ＵＡＣ  ＵＣＡ  ＧＣＧ  ＵＡＡ  ＧＵＧ
ＡＵＧ  ＵＣＣ  ＡＣＣ  ｄＴｄＴ−３’
ＧＬ３−３：
センス鎖（配列番号３１）
５’−ＧＧＵ  ＧＧＡ  ＣＡｄＴ ｄＣｄＡＣ  ＵＵＡ  ＣＧＣ  ＵＧＡ
ｄＧｄＴＡ  ＣＵＵ  ＣＧＡ  ｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号３０）
５’−ＵＣＧ  ＡＡＧ  ＵＡＣ  ＵＣＡ  ＧＣＧ  ＵＡＡ  ＧＵＧ
ＡＵＧ  ＵＣＣ  ＡＣＣ  ｄＴｄＴ−３’
ＧＬ３−４：
センス鎖（配列番号３２）
５’−ＡＵＣ  ＧＡＧ  ＧＵＧ  ＧＡＣ  ＡＵＣ  ＡＣＵ  ＵＡＣ
ＧＣＵ  ＧＡＧ  ＵＡＣ  ＵＵＣ  ＧＡｄＴ  ｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号３３）
５’−ＵＣＧ  ＡＡＧ  ＵＡＣ  ＵＣＡ  ＧＣＧ  ＵＡＡ  ＧＵＧ
ＡＵＧ  ＵＣＣ  ＡＣＣ  ＵＣＧ  ＡＵｄＴ  ｄＴ−３’
ＧＬ３−５：
センス鎖（配列番号３４）
５’−ＡＵＣ  ＧＡＧ  ＧＵＧ  ＧＡＣ  ＡｄＴｄＣ ｄＡＣＵ  ＵＡＣ
ｄＧｄＣＵ  ＧＡＧ  ＵＡＣ  ＵＵＣ  ＧＡｄＴ  ｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号３３）
５’−ＵＣＧ  ＡＡＧ  ＵＡＣ  ＵＣＡ  ＧＣＧ  ＵＡＡ  ＧＵＧ
ＡＵＧ  ＵＣＣ  ＡＣＣ  ＵＣＧ  ＡＵｄＴ  ｄＴ−３’
ＧＬ３−６：
センス鎖（配列番号３５）
５’−ＣＡＣ  ＡＵＡ  ＵＣＧ  ＡＧＧ  ＵＧＧ  ＡＣＡ  ＵＣＡ
ＣＵＵ  ＡＣＧ  ＣＵＧ  ＡＧＵ  ＡＣＵ  ＵＣＧ  ＡｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号３６）
５’−ＵＣＧ  ＡＡＧ  ＵＡＣ  ＵＣＡ  ＧＣＧ  ＵＡＡ  ＧＵＧ
ＡＵＧ  ＵＣＣ  ＡＣＣ  ＵＣＧ  ＡＵＡ  ＵＧＵ  ＧｄＴｄＴ−３’
ＧＬ３−７：
センス鎖（配列番号３７）
５’−ＣＡＣ  ＡＵＡ  ＵＣＧ  ＡＧＧ  ＵＧＧ  ＡＣＡ  ｄＴｄＣｄＡ
ｄＣｄＴＵ  ＡＣＧ  ＣＵＧ  ＡＧＵ  ＡＣＵ  ＵＣＧ  ＡｄＴｄＴ−３’
アンチセンス鎖（配列番号３６）
５’−ＵＣＧ  ＡＡＧ  ＵＡＣ  ＵＣＡ  ＧＣＧ  ＵＡＡ  ＧＵＧ
ＡＵＧ  ＵＣＣ  ＡＣＣ  ＵＣＧ  ＡＵＡ  ＵＧＵ  ＧｄＴｄＴ−３’
なお、Ｂｃｌ２−１はＷＯ２００４／１０５７７４に、ＳＯＤ１−１は文献（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、３１４、２００４、ｐ．２８３−２９１）に、ｈｎＲＮＰＨ−１は文献（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２３、２００４、ｐ．２２２−２２６）に、ＧＬ３−１は文献（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１３１、２００８、ｐ．６４−６９）にそれぞれ記載されている配列であり、いずれも標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を抑制し得るものである。
（２）二本鎖ＲＮＡを構成するＲＮＡ鎖の合成
二本鎖ＲＮＡを構成するＲＮＡ鎖の合成は、日本バイオサービスに依頼した。
各ＲＮＡ鎖の濃度が１００μＭになるように注射用水（大塚製薬工場社製、以下同じ。）に溶解した。
【００５３】
製造例２  医薬組成物の調製
（１）担体（リポソームＡ）の調製
文献（ＷＯ９４／１９３１４の実施例２０）に記載の方法により製造した２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール  ６０ｍｇと１００ｍｇの卵黄レシチン（キューピー社製）をバイアル中で２ｍＬのクロロホルムに溶解し、これに窒素ガスを吹きつけてクロロホルムを除去し、バイアルの壁面に薄膜を形成させた。これを更に減圧下で一晩放置した後、１０００ｍｇのマルトース（林原社製）、４．０ｍＬの注射用水及び８０μＬの１Ｎ塩酸を加えてボルテックスミキサーで薄膜を分散させた。４℃で３時間放置した後、マイクロプローブ（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ−２５０、ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて、１０分間超音波処理を行った。その後、注射用水を用いて１０ｍＬになるように定容し、１６ｍｇ／ｍＬの分散液を調製した。
（２）医薬組成物の調製
製造例１（２）で合成したセンス鎖及びアンチセンス鎖を等モルで混合し１０％マルトース溶液（大塚製薬工場社製、以下同じ。）で希釈し、二本鎖ＲＮＡを調製した。上記（１）で調製した担体を１０％マルトース溶液にて適宜希釈し、同容量の二本鎖ＲＮＡを攪拌しながら少量ずつ滴下して、二本鎖ＲＮＡと担体との複合体（医薬組成物）を形成させた。
複合体中の二本鎖ＲＮＡの濃度は０．１〜３μＭであり、複合体中の二本鎖ＲＮＡと担体との比率は１：１６（ｗ／ｗ）であった。なお、調製した複合体は１０％マルトースで適宜希釈した。
【００５４】
試験例１  Ｄｉｃｅｒによるｉｎ ｖｉｔｒｏ切断活性
製造例１（２）で合成したセンス鎖及びアンチセンス鎖をアニーリングバッファー(３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ-ＫＯＨ ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２)中でそれぞれの濃度が２０μＭになるように調製した。ＰＲＯＧＲＡＭ  ＴＥＭＰ  ＣＯＮＴＲＯＬ  ＳＹＳＴＥＭ  ＰＣ−８００（ＡＳＴＥＣ社製）を用いて、９５℃まで加熱し、２分間保持した後、６０分間かけて３０℃まで冷却することでアニーリングさせ、二本鎖ＲＮＡを調製した。調製した二本鎖ＲＮＡを、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｄｉｃｅｒ Ｅｎｚｙｍｅ Ｋｉｔ （Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ社製）を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの切断反応を行った。反応後、二本鎖ＲＮＡ  ２０ｐｍｏｌ／ｌａｎｅとなるように１５％ポリアクリルアミドゲルにてＴＢＥ（×０．５）で電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（バイオ・ラッドラボラトリーズ社製）により検出した。
その結果を図１〜４に示す。図１〜４に示すように、本発明ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによる切断を受け難いことが分かった。一方で、天然型の二本鎖ＲＮＡはＤｉｃｅｒによる切断を受けていた。
【００５５】
試験例２  Ｂｃｌ−２タンパク質、ＳＯＤ１タンパク質又はｈｎＲＮＰＨタンパク質の発現抑制活性
Ａ４３１細胞（ヒト上皮癌細胞株）を６ｃｍ径のシャーレに１×１０５個で播種した。１０％ウシ胎児仔血清を含むＤＭＥＭ培地（シグマ社製、以下同じ。）３ｍＬ中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。新鮮な上記培地２．７ｍＬに交換し、製造例２で調製した３０ｎＭの医薬組成物  ０．３ｍＬを添加し、３日間培養した。細胞をＰＢＳ（ニッスイ社製、以下同じ。）で２回洗浄した後、セルスクレーパーを用いて１．５ｍＬチューブに移した。１０００×ｇで２分間遠心し、上清を取り除き、５０〜１００μＬの緩衝液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０］に懸濁した後、氷上に３０分間静置した。１５０００×ｇ、４℃で２０分間遠心し、上清（細胞抽出液）を回収した。
細胞抽出液中のタンパク質濃度は、ＢＣＡプロテインアッセイシステム（ピアスバイオテクノロジー社製）を使用し、測定した。
細胞抽出液中のタンパク質１５μｇをｅ−ＰＡＧＥＬ（登録商標）（アトー社製）で電気泳動し、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア社製）に転写した。タンパク質を転写した膜を、ブロッキングワン（ナカライテスク社製、以下同じ。）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングを行った。１次抗体を０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で２０倍希釈したブロッキングワン(５％ブロッキングワン)で希釈し、当該希釈溶液中で室温１時間振盪した。ＰＢＳＴで洗浄した後、５％ブロッキングワンで希釈した２次抗体中で室温１時間振盪した。ＰＢＳＴで洗浄した後、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ (パーキンエルマー社製)を用いて発光させ、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（バイオ・ラッド ラボラトリー社製）にてＢｃｌ−２タンパク質、ＳＯＤ１タンパク質、ｈｎＲＮＰＨタンパク質又はβ−ａｃｔｉｎタンパク質を検出し、各タンパク質の発現量を定量化した。なお、ＧＬ３−１を添加した細胞と医薬組成物の代わりにマルトースを添加した細胞を陰性対照とした。
Ｂｃｌ−２タンパク質の検出では、１次抗体としてはマウス抗ヒトｂｃｌ−２抗体（Ｍ０８８７、ＤＡＫＯ  ＣＹＴＯＭＡＴＩＯＮ社製）を５００倍希釈したものを、２次抗体としてはペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐ０２６０、ＤＡＫＯ ＣＹＴＯＭＡＴＩＯＮ社製）を２０００倍希釈したものをそれぞれ用いた。
ＳＯＤ１タンパク質の検出では、１次抗体としてはヤギ抗ヒトＳＯＤ１抗体(＃ＳＯＤ−１０１、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ社製)を１０００倍希釈したものを、２次抗体としてはＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（＃７０７４、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を２０００倍希釈したものをそれぞれ用いた。
ｈｎＲＮＰＨタンパク質の検出では、１次抗体としてはヤギ抗ヒトｈｎＲＮＰＨ抗体(ｓｃ−１００４２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製)を２００倍希釈したものを、２次抗体としてはＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ 抗体（Ｐ−０４４９、ＤＡＫＯ ＣＹＴＯＭＡＴＩＯＮ社製）を２０００倍希釈したものをそれぞれ用いた。
β-ａｃｔｉｎタンパク質の検出では、１次抗体としてはヤギ抗ヒトβ-ａｃｔｉｎ抗体(ｓｃ−１６１５、ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製)を２０００倍希釈したものを、２次抗体としてはＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ 抗体（Ｐ０４４９、ＤＡＫＯ ＣＹＴＯＭＡＴＩＯＮ社製）を２０００倍希釈したものを、又は、１次抗体としてはマウス抗ヒトβ-ａｃｔｉｎ抗体(ｓｃ−８４３２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製)を２０００倍希釈したものを、２次抗体としてはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ 抗体（Ｐ−０２６０、ＤＡＫＯ ＣＹＴＯＭＡＴＩＯＮ社製）を２０００倍希釈したものをそれぞれ用いた。
その結果を図５〜１０に示す。図５〜１０に示すように、本発明ＲＮＡは、対応する天然型の二本鎖ＲＮＡと同程度若しくはそれよりも強く標的遺伝子がコードするタンパク質（Ｂｃｌ−２タンパク質、ＳＯＤ１タンパク質又はｈｎＲＮＰＨタンパク質）の発現を抑制した。
【００５６】
試験例３  ルシフェラーゼタンパク質の発現抑制活性
９６穴プレートにルシフェラーゼを安定に発現するＡ５４９細胞（ヒト肺癌由来細胞）を１０００個／ｗｅｌｌで播種し、１０％ウシ胎児仔血清を含むＤＭＥＭ培地  １００μＬ中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。翌日、製造例２で調製した１００ｎＭの医薬組成物  １１.１１μＬを添加した。医薬組成物を添加７２時間後に、新鮮な上記培地７５μＬに交換し、７５μＬの市販のルシフェラーゼ活性測定キット（Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ；プロメガ社製）を添加してルシフェラーゼに依存した発光を生じさせ、マイクロプレート化学発光検出器（Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ；パッカード社製）により発光量を計測した。なお、医薬組成物の代わりにマルトースを添加した細胞を陰性対照とした。
その結果を図１１及び１２に示す。図１１及び１２に示すように、本発明ＲＮＡは、ルシフェラーゼ遺伝子を標的とした場合においても、対応する天然型の二本鎖ＲＮＡと同程度若しくはそれよりも強くルシフェラーゼタンパク質の発現を抑制した。
【図１】
2012147677.tif 000002
【図２】
2012147677.tif 000003
【図３】
2012147677.tif 000004
【図４】
2012147677.tif 000005
【図５】
2012147677.tif 000006
【図６】
2012147677.tif 000007
【図７】
2012147677.tif 000008
【図８】
2012147677.tif 000009
【図９】
2012147677.tif 000010
【図１０】
2012147677.tif 000011
【図１１】
2012147677.tif 000012
【図１２】
2012147677.tif 000013
【配列表】
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