(57)【要約】【課題】マスト細胞において免疫賦活化を行い得る新たな免疫賦活剤の提供。【解決手段】ＥＣＧＣがマスト細胞におけるサイトカイン産生を誘導することを見出し、ＥＣＧＣを有効成分とするマスト細胞におけるサイトカイン産生誘導剤と、該サイトカイン産生誘導剤を有効成分とする免疫賦活化剤を得た。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エピガロカテキンガレートを有効成分とするマスト細胞におけるサイトカイン産生誘導剤。
【請求項２】
サイトカインがＴＮＦ−αまたはＩＬ−１３である請求項１に記載のサイトカイン産生誘導剤。
【請求項３】
エピガロカテキンガレートを１１〜９１μｇ／ｍｌとなるように含む請求項１または２に記載のサイトカイン産生誘導剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のサイトカイン産生誘導剤を有効成分とする免疫賦活剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−ｇａｌｌｅｔｅ；ＥＧＣＧ、以下、ＥＧＣＧと示す）を有効成分とするサイトカイン産生誘導剤に関する。また、サイトカイン産生誘導剤を有効成分とする免疫賦活剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＧＣＧは緑茶の主要な成分であるカテキン類のひとつであり、強い抗酸化作用を示し、活性酸素が要因に挙げられるアレルギー、動脈硬化、糖尿病、神経変性疾患、癌等の炎症性疾患の一部において、有効性が認められている。
また、ＥＧＣＧやこれを含むカテキン類は、免疫賦活化を行うことも知られている。例えば、ＥＧＣＧ投与によりサイトカインシグナル伝達抑制因子を誘導し、Ｂ細胞におけるＩｇＥ抗体の産出等を抑制し、自己免疫過剰活性を抑制することや、タイプ２ヘルパーＴ細胞型サイトカインの産生を抑制すること（例えば、特許文献１、２参照）等が開示されている。また、多糖類と併用してマクロファージの細胞増殖や遊走活性を高めることが確認されている（例えば、特許文献３参照）。
このようにＥＧＣＧやこれを含むカテキン類のＢ細胞、Ｔ細胞およびマクロファージ機能の賦活化について知られているものの、マスト細胞におけるＥＧＣＧやこれを含むカテキン類の作用は知られていなかった。
【０００３】
マスト細胞は、細胞表面にＩｇＥレセプターを発現しており、ヒスタミンなどの化学メディエーターが蓄積された顆粒を有する。ＩｇＥが結合したＩｇＥレセプターが花粉等の抗原によって架橋されると、細胞外に顆粒を放出し（脱顆粒）、化学メディエーターを分泌する。さらに免疫応答に働く腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α、以下、ＴＮＦ−αと示す）やインターロインキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）等のサイトカインを分泌することで、Ｉ型アレルギー反応を引き起こす。
そのため、マスト細胞によるアレルギー反応を抑制するために、脱顆粒を抑制する様々な剤が開発されている（例えば、特許文献４参照）。ＥＧＣＧを含むカテキン類も、ＩｇＥレセプターの発現を抑制する物質として挙げられており（例えば、特許文献５参照）、本発明者らもＥＧＣＧがマスト細胞の脱顆粒を別のメカニズムにより抑制することを報告している（例えば、非特許文献１参照）。しかし、ＥＧＣＧのマスト細胞における免疫賦活化は検討されていなかった。
【０００４】
近年の研究から、例えば、Ｔ細胞において抑制的機能を持つサブタイプ（Ｔｈ１７細胞）の存在が認められ、既存の免疫賦活剤によるＴ細胞機能を標的とする免疫賦活化が当初予想されたよりも困難であることが明らかとなってきている。そこで、既存の免疫賦活剤よりも、有効に作用する新たな免疫賦活剤の提供が望まれている。
マスト細胞は近年、自然免疫および適応免疫において重要な役割を果たしていることが明らかとなってきている。特に、マスト細胞は、免疫制御に重要なサイトカインの主要な産生源である。そこで、マスト細胞を標的とする免疫賦活化を行い得る新たな免疫賦活剤の提供が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１５９２１５号公報
【特許文献２】特開２００４−７５６１９号公報
【特許文献３】特開平１０−２７９４８６号公報
【特許文献４】特開２００９−１０２２３１号公報
【特許文献５】特開２００５−３３６０７０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｎｏｕｅ，  Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４９：６３２−６４０，２０１０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、マスト細胞において免疫賦活化を行い得る新たな免疫賦活剤の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＥＧＣＧがマスト細胞のサイトカイン産生を誘導し、マスト細胞における免疫賦活化において有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
さらに、ＥＧＣＧのマスト細胞におけるサイトカイン産生の誘導が、マスト細胞の脱顆粒が抑制されたままの状態で起こることを再確認しており、ＥＧＣＧによってアレルギー反応を引き起こすことなく、マスト細胞におけるサイトカイン産生を誘導でき、免疫賦活化を行うことが可能となった。
【０００９】
即ち、本発明は次の（１）〜（４）のサイトカイン産生誘導剤および免疫賦活剤に関する。
（１）エピガロカテキンガレートを有効成分とするマスト細胞におけるサイトカイン産生誘導剤。
（２）サイトカインがＴＮＦ−αまたはＩＬ−１３である上記（１）に記載のサイトカイン産生誘導剤。
（３）エピガロカテキンガレートを１１〜９１μｇ／ｍｌとなるように含む上記（１）または（２）に記載のサイトカイン産生誘導剤。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のサイトカイン産生誘導剤を有効成分とする免疫賦活剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によってマスト細胞において免疫賦活化を行い得る新たな免疫賦活剤の提供が可能となった。本発明によって得られた免疫賦活剤は、食品として摂取されているＥＧＣＧを有効成分としており、安全に摂取できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】サイトカイン産生誘導剤、比較剤および抗原によるマスト細胞におけるサイトカイン産生や脱顆粒の程度を示した図である（試験例）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の「サイトカイン産生誘導剤」には、ＥＧＣＧを有効成分とし、マスト細胞におけるサイトカイン産生を誘導する剤であればいずれのものも含まれる。
ＥＧＣＧは、薬や食品等として摂取できるものであれば、いずれの物であっても良く、市販されているＥＧＣＧ、緑茶等から独自に抽出したＥＧＣＧを含む組成物や該組成物から精製したＥＧＣＧ等を用いても良い。
本発明の「サイトカイン産生誘導剤」は、有効成分となるＥＧＣＧのみを含有するものであってもよく、有効成分となるＥＧＣＧの作用を維持できる成分であれば、薬学的に許容されるその他の成分や、食品成分として許容されるその他の成分を含有するものであっても良い。本発明の「サイトカイン産生誘導剤」は、溶液状、固体状、ゲル状やゾル状等が挙げられるが、形態は特に問わない。
本発明の「サイトカイン産生誘導剤」には、ＥＧＣＧが１１〜９１μｇ／ｍｌ（２５〜２００μＭ）含まれていることが好ましく、特に２２〜４６μｇ／ｍｌ（５０〜１００μＭ）含まれていることが好ましい。
【００１３】
本発明の「サイトカイン産生誘導剤」によって、産生が誘導されるサイトカインとしては、マスト細胞において産生が誘導されるものであればいずれのサイトカインであっても良い。例えば、ＴＮＦ−αやインターロイキン−１３（以下、ＩＬ−１３と示す）等が挙げられる。
【００１４】
本発明の「免疫賦活剤」とは、マスト細胞におけるサイトカイン産生を誘導することにより、ヒト等の哺乳類において、免疫が賦活化できる剤のことをいう。本発明のサイトカイン産生誘導剤を有効成分とするものであればいずれのものも含まれる。
本発明の「免疫賦活剤」は、有効成分となるサイトカイン産生誘導剤のみを含有するものであってもよく、有効成分となるサイトカイン産生誘導剤の作用を維持できる成分であれば、薬学的に許容されるその他の成分や、食品成分として許容されるその他の成分を含有するものであっても良い。本発明の「免疫賦活剤」は、溶液状、固体状、ゲル状やゾル状等が挙げられるが、形態は特に問わない。
【００１５】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
＜サイトカイン産生誘導剤＞
ＥＧＣＧ（クリタ工業社）１０ｍｇをＰＢＳ  ２．１８ｍｌに溶解し、−２０℃に保存した。使用する段階で、これをＨａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（以下、ＨＢＳＳと示す）（ｐＨ７．４）で希釈し、サイトカイン産生誘導剤とした。
【００１７】
［試験例］
実施例１で調製したサイトカイン産生誘導剤と、比較としてエピカテキン（Ｅｐｉ−ｃａｔｅｃｈｉｎ；ＥＣ、以下、ＥＣと示す）を用い、マスト細胞におけるサイトカイン産生の誘導を調べた。
【００１８】
＜試料＞
１．試薬
１）サイトカイン産生誘導剤
ＥＧＣＧが５０μＭ、１００μＭまたは２００μＭ含まれるように希釈した実施例１で調製したサイトカイン産生誘導剤を用いた。
２）比較剤
ＥＣ（クリタ工業社）１０ｍｇをＰＢＳ  ３．４４ｍｌに溶解し、−２０℃に保存した。使用する段階で、これをＨＢＳＳ（ｐＨ７．４）でＥＣが１００μＭまたは２００μＭ含まれるよう希釈したものを比較剤として用いた。
【００１９】
２．マスト細胞
１）ＲＢＬ−２Ｈ３細胞
ラット由来の白血病細胞株で粘膜型マスト細胞のモデルであるＲＢＬ−２Ｈ３細胞（国立基盤研究所・生物資源研究部・生物資源情報より譲受、細胞番号：ＪＣＲＢ００２３）を、１０％ＦＢＳ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で、５％ＣＯ2含有空気中で培養した。
１ｍＭ  ＥＤＴＡと０．２５％トリプシンを含むＨＢＳＳを加え、３７℃で５分間インキュベートして採取したＲＢＬ−２Ｈ３細胞を試験に用いた。
【００２０】
２）ＢＭＭＣ（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ）
Ｃ３ＨｅＢＦｅＪおよびＣ５７ＢＬ／６マウス（４−８週齢、雌）（日本チャールズリバー社）から、参考文献の記載に従って、ＢＭＭＣ（培養マウス骨髄由来マスト細胞）を得た。
即ち、マウスの大腿骨を採取し、エタノールで洗浄後、さらに培地で洗浄した。１ｍｌのシリンジを用いて骨の両端から骨髄を採取した。滅菌メッシュを用いて採取した骨髄細胞をろ過してＢＭＭＣを得た。
ＢＭＭＣを、１０％ＦＢＳ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、５×１０-5Ｍ  β−メルカプトエタノール（和光純薬社）、１００μｇ／ｍｌピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１％ＭＥＭ  ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）および５ｎｇ／ｍｌリコンビナントＩＬ−３（Ｐｅｐｃｏ  Ｔｅｃｈ社）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で、５％ＣＯ2含有空気中３７℃で培養した。４〜６週間培養後、細胞上のＦｃεＲＩ発現をＡｌｅｘａ４８８結合ＩｇＥ抗体（ＩｇＥをＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８モノクローナル抗体ラベリングキット（インビトロジェン社）を用いて標識して作成した）を用いてフローサイトメトリーで確認した後、試験に用いた。
参考文献：Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７１：６１１９−６１２７，２００３
【００２１】
＜試験＞
上記２．のマスト細胞をそれぞれ０．１μｇの抗ＴＮＰ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）で、３７℃で一晩感作した後ＰＢＳで洗浄した。
これに培地と３０ｎｇ／ｍｌの抗原（ＴＮＰ−ＢＳＡ（Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ社）、図１ではＡｇと示す）、上記１．のサイトカイン産生誘導剤または比較剤をそれぞれ加え、３７℃で４時間インキュベートして刺激した。
刺激後の培養上清をチューブに回収し、この一部を用いて刺激後のマスト細胞がそれぞれ産生したＴＮＦ−αおよびＩＬ−１３の濃度をＥＬＩＳＡ（Ｒａｔ（Ｍｏｕｓｅ）  ＴＮＦ−α  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）またはＩＬ−１３  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））でそれぞれ測定した。
また、上記と同様にサイトカイン産生誘導剤または比較剤をそれぞれ加えた後、３７℃で３０分インキュベートして刺激を行い、刺激後の培養上清をチューブに回収し、この一部を用いてβ−Ｈｅｘｏａｍｉｎｉｄａｓｅ活性（全活性（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で抽出される全顆粒中に含まれる活性）に対する割合（％））を測定した。
即ち、９６ウエルプレートに刺激後回収した培養上清４０μｌ、基質溶液（２ｍＭ  ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ）１００μｌを入れ、３７℃で３０分インキュベートした後、反応停止液０．２Ｍ  ｇｌｙｃｉｎ−ＮａＯＨ（ｐＨ１０．７）２００μｌを添加した。これを４１５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
【００２２】
＜結果＞
図１のＡ〜ＣにＲＢＬ−２Ｈ３細胞の結果を、Ｄ〜ＦにＢＭＭＣの結果を示した。
その結果、本発明のサイトカイン産生誘導剤によって刺激した場合に、いずれのマスト細胞においてもＩＬ−１３（図１、Ａ、Ｄ（ＥＣ：２００μＭ））およびＴＮＦ−α産生（図１、Ｂ、Ｅ（ＥＣ：２００μＭ））の産生が比較剤と比べて明らかに増加することが示された。
また、サイトカイン誘導剤によって刺激しているにもかかわらず、いずれのマスト細胞においてもβ−Ｈｅｘａｍｉｎｉｄａｓｅの放出がほとんど起こっていないことが示された（図１、Ｃ、Ｆ）。
従って、これらの結果より、本発明のサイトカイン産生誘導剤によって、マスト細胞の脱顆粒が抑制されたままの状態で、マスト細胞のサイトカイン産生を誘導できることが確認できた。
【実施例２】
【００２３】
＜免疫賦活剤＞
実施例１において製造した、サイトカイン産生誘導剤を有効成分として、免疫賦活剤を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明によって得られる、ＥＧＣＧを有効成分とするマスト細胞におけるサイトカイン産生誘導剤や該サイトカイン産生誘導剤を有効成分とする免疫賦活剤は、安全に摂取でき、エイズ等の免疫不全の患者や免疫力が低下している高齢者等を対象として、薬、食品等の様々な形で利用できる。
【図１】
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