(57)【要約】【課題】絨毛癌に対して治療効果を有する、絨毛癌に対する新規な治療剤を提供すること。【解決手段】絨毛癌の治療剤脳由来神経栄養因子(BDNF)及び／又は脳由来神経栄養因子受容体(TrkB)の抑制剤を有効成分として含有する。この抑制剤の例としては、チロシンキナーゼ抑制剤、遊離のTrkB若しくはBDNFとの結合性を有するその断片又はTrkB若しくは前記断片を細胞内で生産する組換えベクター、BDNF遺伝子若しくはTrkB遺伝子に対する干渉RNA又は該干渉RNAを細胞内で生産する組換えベクター、BDNF又はTrkBに対する抗体、及びBDNF遺伝子若しくはTrkB遺伝子に対するアンチセンス核酸又は該アンチセンス核酸を細胞内で生産する組換えベクター等が挙げられる。【選択図】図５
2012041311.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳由来神経栄養因子(BDNF)及び／又は脳由来神経栄養因子受容体(TrkB)の抑制剤を有効成分として含有する絨毛癌の治療剤。
【請求項２】
チロシンキナーゼ抑制剤、遊離のTrkB若しくはBDNFとの結合性を有するその断片又は絨毛癌の治療効果を有するそれらの修飾体又はTrkB若しくは前記断片又は前記修飾体を細胞内で生産する組換えベクター、BDNF遺伝子若しくはTrkB遺伝子に対する干渉RNA又は該干渉RNAを細胞内で生産する組換えベクター、BDNF又はTrkBに対する抗体、及びBDNF遺伝子若しくはTrkB遺伝子に対するアンチセンス核酸又は該アンチセンス核酸を細胞内で生産する組換えベクターから成る群より選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
チロシンキナーゼ抑制剤、遊離のTrkB又はBDNFとの結合性を有するTrkB断片、及びBDNF遺伝子若しくはTrkB遺伝子に対する干渉RNA又は該干渉RNAを細胞内で生産する組換えベクターから成る群より選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する請求項２記載の治療剤。
【請求項４】
チロシンキナーゼ抑制剤が、K252aである請求項３記載の治療剤。
【請求項５】
遊離のTrkB又はBDNFとの結合性を有するその断片が、BDNFと結合するTrkBの細胞外ドメインを含むTrkB断片である請求項３記載の治療剤。
【請求項６】
BDNF遺伝子又はTrkB遺伝子に対する干渉RNAが、BDNF遺伝子又はTrkB遺伝子に対するsiRNAである請求項３記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、絨毛癌の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
絨毛癌は、栄養芽細胞から誘導される高度に未分化で浸潤性の悪性腫瘍である。絨毛癌の治療は、現在、メトトレキセート、アクチノマイシン−Ｄ、エトポシド等の抗癌剤を用いる化学療法により行われている（非特許文献３１）。確立された化学療法により多くの絨毛癌患者は寛解に至るが、それでも絨毛癌患者の５〜２５％は抗癌剤により十分に治療されず、あるいは、一旦寛解しても再発する。
【０００３】
一方、脳由来神経栄養因子(brain-derived neurotrophic factor (BDNF))は、高親和性チロシンキナーゼ(Trk)B受容体を全ニューロトロフィン低親和性共受容体p75(p75NTR)と共に活性化するタンパク質であるニューロトロフィンファミリーの１つである（非特許文献１）。BDNFが結合後、TrkB受容体シグナルは、フォスファチジルイノシトール 3-キナーゼ(PI3K)、MAPK/ERK, フォスフォリパーゼC-γ、及びプロテインＣキナーゼカスケードを包含する複数のシグナル経路を活性化し、異なる種類の細胞の細胞増殖、分化及び生存において重要な役割を果たしている（非特許文献１、２）。ニューロトロフィンは、中枢神経系で広く発現し、ニューロンの生存と分化にとって重要である（非特許文献３）が、それらはまた、非ニューロン組織においても重要な役割を果たす（非特許文献４）。正常組織中での生理作用に加え、TrkBを介するニューロトロフィンシグナルが変更されることにより悪性腫瘍の形成及び転移が促進されることを示すデータが蓄積されている（非特許文献５）。TrkBは、ときどきそのリガンドであるBDNFと共に、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍並びに前立腺及び膵臓腺癌を包含する種々のヒト癌、並びに多発性骨髄腫及び非固形癌において過剰発現している（非特許文献５）。これらのデータは、腫瘍の発達のためのBDNF/TrkBシグナルの潜在的なオートクリン役割を示唆している。しかしながら、腫瘍形成中における内発性BDNF/TrkBシグナルの分子機構を利用した研究はほとんどない。
【０００４】
本願発明者らは、浸潤性栄養芽細胞に分化することができる、胚盤胞段階の胚の栄養外胚葉細胞中でのTrkB及びそのリガンドであるBDNFの発現を最近見出した。本願発明者らはまた、着床前の栄養外胚葉細胞の増殖及び生存におけるBDNFの促進効果を示した（非特許文献６）。着床後も胎盤栄養芽細胞中でTrkBとそのリガンドの発現は持続する。本願発明者は、妊娠中の胎盤発達における栄養芽細胞細胞の成長と生存におけるTrkBシグナル系のオートクリン／パラクリン調節役割を示した（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Barbacid M 1994 The Trk family of neurotrophin receptors. J Neurobiol 25:1386-1403
【非特許文献２】Huang EJ, Reichardt LF 2003 Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annu Rev Biochem 72:609-642
【非特許文献３】Jones KR, Farinas I, Backus C, Reichardt LF 1994 Targeted disruption of the BDNF gene perturbs brain and sensory neuron development but not motor neuron development. Cell 76:989-999
【非特許文献４】Ip NY, Stitt TN, Tapley P, Klein R, Glass DJ, Fandl J, Greene LA, Barbacid M, Yancopoulos GD 1993 Similarities and differences in the way neurotrophins interact with the Trk receptors in neuronal and nonneuronal cells. Neuron 10:137-149
【非特許文献５】Desmet CJ, Peeper DS 2006 The neurotrophic receptor TrkB: a drug target in anti-cancer therapy? Cell Mol Life Sci 63:755-759
【非特許文献６】Kawamura K, Kawamura N, Fukuda J, Kumagai J, Hsueh AJ, Tanaka T 2007 Regulation of preimplantation embryo development by brain-derived neurotrophic factor. Dev Biol 311:147-158
【非特許文献７】Kawamura K, Kawamura N, Sato W, Fukuda J, Kumagai J, Tanaka T 2009 Brain-derived neurotrophic factor promotes implantation and subsequent placental development by stimulating trophoblast cell growth and survival. Endocrinology 150:3774-3782
【非特許文献８】Kawamura K, Kawamura N, Mulders SM, Sollewijn Gelpke MD, Hsueh AJ 2005 Ovarian brain-derived neurotrophic factor (BDNF) promotes the development of oocytes into preimplantation embryos. Proc Natl Acad Sci USA 102:9206-9211
【非特許文献９】Kawamura K, Sato N, Fukuda J, Kodama H, Kumagai J, Tanikawa H, Nakamura A, Honda Y, Sato T, Tanaka T 2003 Ghrelin inhibits the development of mouse preimplantation embryos in vitro. Endocrinology 144:2623-2633
【非特許文献１０】Klein R, Conway D, Parada LF, BarbacidM1990 The trkB tyrosine protein kinase gene codes for a second neurogenic receptor that lacks the catalytic kinase domain. Cell 61:647-656
【非特許文献１１】Tapley P, Lamballe F, BarbacidM1992 K252a is a selective inhibitor of the tyrosine protein kinase activity of the trk family of oncogenes and neurotrophin receptors. Oncogene 7:371-381
【非特許文献１２】Ross AH, McKinnon CA, Daou MC, Ratliff K, Wolf DE 1995 Differential biological effects of K252 kinase inhibitors are related to membrane solubility but not to permeability. J Neurochem 65:2748-2756
【非特許文献１３】Liu D, Li C, Chen Y, Burnett C, Liu XY, Downs S, Collins RD, Hawiger J 2004 Nuclear import of proinflammatory transcription factors is required for massive liver apoptosis induced by bacterial lipopolysaccharide. J Biol Chem 279:48434-48442
【非特許文献１４】Kawamura K, Fukuda J, Shimizu Y, Kodama H, Tanaka T 2005 Survivin contributes to the anti-apoptotic activities of transforming growth factor α in mouse blastocysts through phosphatidylinositol 3' kinase pathway. Biol Reprod 73:1094-1101
【非特許文献１５】Kawamura K, Fukuda J, Kumagai J, Shimizu Y, Kodama H, Nakamura A, Tanaka T 2005 Gonadotropin-releasing hormone I analog acts as an antiapoptotic factor in mouse blastocysts. Endocrinology 146:4105-4116
【非特許文献１６】Nakaigawa N, Yao M, Baba M, Kato S, Kishida T, Hattori K, Nagashima Y, Kubota Y 2006 Inactivation of von Hippel-Lindau gene induces constitutive phosphorylation of MET protein in clear cell renal carcinoma. Cancer Res 66:3699-3705
【非特許文献１７】Susin SA, Lorenzo HK, Zamzami N, Marzo I, Snow BE, Brothers GM, Mangion J, Jacotot E, Costantini P, Loeffler M, Larochette N, Goodlett DR, Aebersold R, Siderovski DP, Penninger JM, Kroemer G 1999 Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor. Nature 397:441-446
【非特許文献１８】BrodeurGM2003 Neuroblastoma: biological insights into a clinical enigma. Nat Rev Cancer 3:203-216
【非特許文献１９】McAllister AK, Katz LC, Lo DC 1999 Neurotrophins and synaptic plasticity. Annu Rev Neurosci 22:295-318
【非特許文献２０】Hamada AL, Nakabayashi K, Sato A, Kiyoshi K, Takamatsu Y, Laoag-Fernandez JB, Ohara N, Maruo T 2005 Transfection of antisense chorionic gonadotropin β gene into choriocarcinoma cells suppresses the cell proliferation and induces apoptosis. J Clin Endocrinol Metab 90:4873-4879
【非特許文献２１】RaffMC1992 Social controls on cell survival and cell death. Nature 356:397-400
【非特許文献２２】Wang X 2001 The expanding role of mitochondria in apoptosis.  Genes Dev 15:2922-2933
【非特許文献２３】KaplanDR,MillerFD2000 Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol 10:381-391
【非特許文献２４】Yuan J, Yankner BA 2000 Apoptosis in the nervous system. Nature 407:802-809
【非特許文献２５】Simpson PJ, Moon C, Kleman AM, Connolly E, Ronnett GV 2007 Progressive and inhibitory cell cycle proteins act simultaneously to regulate neurotrophin-mediated proliferation and maturation of neuronal precursors. Cell Cycle 6:1077-1089
【非特許文献２６】Li J, Melvin WS, Tsai MD, Muscarella P 2004 The nuclear protein p34SEI-1 regulates the kinase activity of cyclin-dependent kinase 4 in a concentration-dependent manner. Biochemistry 43:4394-4399
【非特許文献２７】Jin M, Udagawa K, Miyagi E, Nakazawa T, Hirahara F, Yasumitsu H, Miyazaki K, Nagashima Y, Aoki I, Miyagi Y 2001 Expression of serine proteinase inhibitor PP5/TFPI-2/MSPI decreases the invasive potential of human choriocarcinoma cells in vitro and in vivo. Gynecol Oncol 83:325-333
【非特許文献２８】Krause DS, Van Etten RA 2005 Tyrosine kinases as targets for cancer therapy. N Engl J Med 353:172-187
【非特許文献２９】Kawamura K, Kawamura N, Mulders SM, Sollewijn Gelpke MD, Hsueh AJ 2005 Ovarianbrain-derived neurotrophic factor (BDNF) promotes the development of oocytes intopreimplantation embryos. Proc Natl Acad Sci U S A 102:9206-9211
【非特許文献３０】Hamada AL, Nakabayashi K, Sato A, Kiyoshi K, Takamatsu Y, Laoag-Fernandez JB,Ohara N, Maruo T 2005 Transfection of antisense chorionic gonadotropin beta gene intochoriocarcinoma cells suppresses the cell proliferation and induces apoptosis. J Clin Endocrinol Metab 90:4873-4879
【非特許文献３１】石川  哲也ら、症例報告  日産婦関東連会報44:9-14, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、絨毛癌に対して治療効果を有する、絨毛癌に対する新規な治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは鋭意研究の結果、BDNF及び／又はTrkBの作用を抑制することにより絨毛癌細胞の増殖を抑制することができ、絨毛癌が治療可能であることを見出し本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、脳由来神経栄養因子(BDNF)及び／又は脳由来神経栄養因子受容体(TrkB)の抑制剤を有効成分として含有する絨毛癌の治療剤を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、絨毛癌に対して優れた治療効果を有する新規な絨毛癌治療剤が提供された。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】絨毛癌細胞におけるＢＤＮＦ、ＮＴ−４／５、ＴｒｋＢの発現を示す図である。Ａでは、ＴｒｋＢリガンドおよび受容体のｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにより検出した。β−アクチンのレベルをローディングコントロールとして使用した。ヒト胎盤ｃＤＮＡをポジティブコントロールとして使用し、ネガティブコントロールには鋳型ＤＮＡを含めなかった。PLは胎盤の略、NCはネガティブコントロールの略である。Ｂは、ＢＤＮＦタンパク質、ＮＴ−４／５タンパク質、ＴｒｋＢタンパク質を免疫組織化学的に検出したものである。ＪＡＲ細胞において、ＢＤＮＦ、ＮＴ−４／５、ＴｒｋＢの特異的なシグナルが認められる。下段はネガティブコントロールである。細胞の核は、ヘキスト33342を用いて青色に染色した。スケールバーは２０μｍを表す。ＢｅＷｏ細胞においても同様の染色パターンが観察された（データ非掲載）。Ｃは、ＢＤＮＦタンパク質とＮＴ−４／５タンパク質、ＴｒｋＢ転写物、またはｈＣＧ−βタンパク質のレベルを、それぞれ、ＥＬＩＳＡ（左）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（真ん中）、またはＲＩＡ（右）を用いて定量化したものである。サンプルは異なる培養液中で取得した（ｎ＝６）。ＴｒｋＢのｍＲＮＡレベルは、同一サンプル中のβ−アクチンの転写レベルを用いて正規化した。柱が平均を、バーが標準誤差を示している。
【図２】内在性ＴｒｋＢリガンドのin vitroの絨毛癌細胞成長における役割を示す図である。内在性ＴｒｋＢリガンドの抑制の、細胞増殖への影響（Ａ）および生存への影響（Ｂ）。ＪＡＲ細胞およびＢｅＷｏ細胞を、培地のみ［コントロール（C）］で、種々の用量のＴｒｋＢの細胞外ドメイン（TrkB EC）とともに、K252aまたはK252bとともに培養した。細胞数はトリパンブルー排除試験を用いて測定し、細胞のアポトーシスはカスパーゼ３／７アッセイを用いて定量化した（ｎ＝５）。柱が平均を、バーが標準誤差を示している。*は、コントロールグループに対してP＜０．０５。Ｃは、ＤＮＡ断片化および機能的なミトコンドリアの減少を、それぞれin situ ＴＵＮＥＬ染色およびMitoTracker Orange CMTMRosを用いて検出したものである。掲載されている画像は、ＴｒｋＢの細胞外ドメイン（１０μｇ／ｍｌ）、K252a（５００ｎＭ）、またはK252b（５００ｎＭ）で処理した、または処理しなかったＪＡＲ細胞から得た。ＴＵＮＥＬアッセイでは、細胞の核酸を、ヨウ化プロピジウムを用いて赤色に染色した。陽性アポトーシスシグナル数（緑色蛍光）は、ＴｒｋＢの細胞外ドメインまたはK252a処理をした細胞において増加した。スケールバーは５０μｍを表す。ミトコンドリアアッセイでは、細胞の核をヘキスト33342で青色に染色した。コントロールグループまたはK252bグループの細胞は点状の染色パターン（赤色）を示し、ＴｒｋＢの細胞外ドメインおよびK252aで処理した細胞は不鮮明な染色パターンを示す。挿入図は、より高い倍率に拡大した画像である。ＴｒｋＢの細胞外ドメインまたはK252aで処理した細胞のいくつかは、クロマチン凝縮と核断片化とで特徴付けられるアポトーシスの形態学的特徴（矢印）を示す。スケールバーは２５μｍを表す。同様の結果がＢｅＷｏ細胞でも観察された（データ非掲載）。
【図３】ＰＩ３ＫおよびＥＲＫシグナル伝達経路を介した絨毛癌細胞の細胞増殖のＢＤＮＦによる促進。細胞を、培地のみで、もしくは種々の用量のＢＤＮＦとともに培養し、またはＢＤＮＦなし［コントロール（C）］もしくはＢＤＮＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）とともに、ＰＩ３ＫインヒビターであるLY294002（LY2）、もしくはその不活性類似体であるLY303511（LY3）の存在下または非存在下で培養した。いくつかの実験においては、細胞を、ＭＥＫ１／２のインヒビターであるU0126、もしくはその不活性類似体であるU0124、またはLY294002とU0126の両方か、LY303511とU0124の両方の存在下または非存在下において、ＢＤＮＦで処理した。培養後４８時間で、トリパンブルー排除試験を用いて細胞数を測定し、ＢＤＮＦ処理の細胞増殖への影響（Ａ）と、ＢＤＮＦによる細胞増殖刺激におけるＰＩ３ＫおよびＥＲＫ経路の関与（Ｂ）を評価した（ｎ≧３）。柱が平均を、バーが標準誤差を示している。*は、コントロールグループに対してP＜０．０５。
【図４】絨毛癌細胞において内在性ＴｒｋＢシグナル伝達の抑制によって制御される細胞周期関連遺伝子およびアポトーシス関連遺伝子の同定結果を示す図である。ＪＡＲ細胞をＴｒｋＢの細胞外ドメイン（５００ｎＭ）の存在下または非存在下で培養した。培養後８時間で、細胞周期について（Ａ）およびアポトーシスについて（Ｂ）のＰＣＲに基づく遺伝子アレイ解析を行った。柱は、ＴｒｋＢの細胞外ドメインでの処理をしなかったサンプルと比較した、３つの別のサンプルにおける個々の遺伝子発現の平均倍率（fold difference）を表している。すべての差が統計的に有意（P＞０．０５）であった。
【図５】ヌードマウス中のJAR細胞異種移植片の、in vivoでの腫瘍成長に対するTrk受容体の効果を示す図である。Ａ：K252aを投与したマウスにおける腫瘍成長の経時変化を示す。K252a又はK252b(500μg/kg)を３日毎に胸腺欠損マウス(n=9)に投与した。各マウスが投与を受けた最初の日における各腫瘍の体積を相対的腫瘍体積１と表した。点は平均、バーは標準誤差。*:P<0.05 vs.コントロール群。Ｂ：腫瘍成長の間における血清hCG-β濃度。異なる体積(n=4)の腫瘍を担持するマウスから血清試料を得た。血清hCG-β濃度はRIAにより測定した。点は平均、バーは標準誤差。Ｃ：治療９日目におけるマウス中の血清hCG-β濃度。カラムは平均、バーは標準誤差。*:P<0.05 vs.コントロール群。
【図６】Trk受容体インヒビターによるin vivoでの腫瘍増殖の抑制及びヌードマウス中でのJAR細胞異種移植片の生存を示す図である。Ａ：細胞増殖の組織学的特徴付け及び腫瘍におけるアポトーシスを示す。細胞増殖及びＤＮＡ断片化の特異的検出は、それぞれ、PCNA免疫染色及びin situ TUNEL染色を用いて行った。腫瘍を担持する動物に、K252a又はK252b(500μg/kg)を３日毎に投与し又は投与しなかった。図示の画像は、治療９日目の切除した腫瘍から得た。H&E染色は、K252a投与後の有糸分裂細胞数の減少及びクロマチンの凝縮を示している。K252a投与により、PCNAシグナル（茶色）は減少し、一方、TUNEL染色核（緑色蛍光）は増大した。スケールバー：200μm。Ｂ：K252a投与による、腫瘍中のcaspase-3/7活性の増大を示す。試料は、投与９日目のマウスから得た(n=9)。データは、タンパク濃度により正規化し、コントロール（担体のみ）に対する増加倍率で示し、１に正規化した。カラムは平均、バーは標準誤差。*:P<0.05 vs.コントロール群。
【図７】ＪＡＲ細胞における、ｓｉＲＮＡによって媒介されるＢＤＮＦおよびＴｒｋＢのノックダウンによる細胞成長の阻害を示す図である。細胞を、ｓｉＲＮＡでトランスフェクションしなかった（コントロール、C）か、またはＢＤＮＦ、ＴｒｋＢ、またはネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（ネガティブコントロール、NC）でトランスフェクションした。Ａは、ｓｉＲＮＡによって媒介されたＢＤＮＦまたはＴｒｋＢの転写レベルの減少を示している。ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後７２時間で、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりＢＤＮＦおよびＴｒｋＢのｍＲＮＡの発現を解析した。サンプルは異なる培養液中の細胞から取得した（ｎ＝３）。ＢＤＮＦおよびＴｒｋＢのｍＲＮＡレベルは、同一サンプルのβ−アクチンの転写レベルを用いて正規化した。Ｂは、ｓｉＲＮＡによって媒介されるＢＤＮＦおよびＴｒｋＢのノックダウンを経た、ＢＤＮＦ／ＴｒｋＢシグナル伝達の抑制による細胞増殖への影響を示している。ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後７２時間で培養液を無血清培地に交換し、次いで、インキュベーション後４８時間で細胞数を、トリパンブルー排除試験を用いて測定した（ｎ＝４）。Ｃは、ＢＤＮＦ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞の、ＢＤＮＦによる増殖促進を示している。ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞を無血清培地において、ＢＤＮＦ非存在下（コントロール、C）またはＢＤＮＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）存在下で培養した。培養後４８時間で細胞数を、トリパンブルー排除試験により測定した（ｎ＝４）。柱が平均を、バーが標準誤差を示している。*は、コントロールグループに対してP＜０．０５。
【図８】絨毛癌細胞におけるＴｒｋリガンド（ＮＧＦおよびＮＴ−３）と受容体（ＴｒｋＡおよびＴｒｋＣ）の発現を示す図である。ＪＡＲ細胞およびＢｅＷｏ細胞中のＴｒｋＢリガンドおよび受容体のｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにより検出した。β−アクチンのレベルをローディングコントロールとして使用する。ヒト胎盤ｃＤＮＡをポジティブコントロールとして使用し、ネガティブコントロールには鋳型ＤＮＡを含めなかった。PLは胎盤の略、NCはネガティブコントロールの略である。
【図９】ＪＡＲ細胞における、アンチセンスｈＣＧ−βのトランスフェクションによる、ｈＣＧ−βタンパク質（Ａ）、ＢＤＮＦタンパク質およびＮＴ−４／５タンパク質（Ｂ）、ならびにＴｒｋＢ転写物（Ａ）の発現レベルへの影響を示す図である。細胞を、トランスフェクションしなかった（コントロール、C）か、または、アンチセンスｈＣＧ−β（aCGβ）もしくは空ベクター（pM2AH）でトランスフェクションした。ｈＣＧ−β、ＢＤＮＦおよびＮＴ−４／５、ならびにＴｒｋＢの転写レベルに対するタンパク質レベルを、それぞれＲＩＡ／ＥＬＩＳＡ、ならびにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて定量化した。サンプルは異なる培養液からの細胞から取得した（ｎ＝３）。ＴｒｋＢのｍＲＮＡレベルは、同一サンプル中のβ−アクチンの転写レベルを用いて正規化した。柱が平均を、バーが標準誤差を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
上記の通り、本発明の絨毛癌治療剤は、BDNF及び／又はTrkBの抑制剤を有効成分として含有する。ここで、「BDNF及び／又はTrkBの抑制剤」とは、(1)BDNF及びTrkBの少なくとも一方の生理作用を抑制する物質、(2) BDNFとTrkBの結合を抑制する物質、(3) BDNF及びTrkBの少なくとも一方の、細胞内における生産を抑制する物質を意味する。(1)の例として、チロシンキナーゼ抑制剤を挙げることができる。(2)の例として、(i)遊離のTrkB又はBDNFとの結合性を有するTrkB断片、及び、(ii)BDNF又はTrkBに対する抗体を挙げることができる。(3)の例として、(i)BDNF遺伝子若しくはTrkB遺伝子に対する干渉RNA又は該干渉RNAを細胞内で生産する組換えベクター、及び(ii) BDNF遺伝子若しくはTrkB遺伝子に対するアンチセンス核酸又は該アンチセンス核酸を細胞内で生産する組換えベクターを挙げることができる。以下、これらについて説明する。
【００１２】
TrkBは、チロシンキナーゼ活性を有しており、下記実施例に具体的に記載されるように、チロシンキナーゼ活性を抑制することにより絨毛癌治療効果が発揮される。従って、チロシンキナーゼ抑制剤（阻害剤）を、本発明の絨毛癌治療剤の有効成分として用いることができる。チロシンキナーゼ抑制剤は、既に種々のものが公知であり、市販されているものも少なくない。市販品を好ましく用いることができる。公知のチロシンキナーゼ抑制剤の例として、K252a、AZ-23（Wang et al. J Med Chem 2008, 51, 4672-84）、CEP-701（Cephalon Inc., West Chester, PA）、CEP-751（Kyowa Hakko Kogyo, Tokyo, Japan）、CEP-2563（Cephalon Inc.）及びCEP-7801（Somaiah et al. J Thorac Oncol,2009,4, S1045-83）等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１３】
これらのうち、下記実施例において採用したK252aは、下記の化学構造を有する、土壌真菌により生産される物質であり、チロシンキナーゼ抑制剤として広く用いられており、市販されているので市販品を好都合に用いることができる。
【００１４】
【化１】
2012041311.tif 000003
【００１５】
チロシンキナーゼ抑制剤を本発明の絨毛癌治療剤の有効成分として用いる場合、投与経路は、経口でも非経口でもよく、非経口の場合、絨毛癌組織への直接投与、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経皮、直腸内、点眼等、通常の各種投与経路で投与可能である。投与量は、用いるチロシンキナーゼ抑制剤の種類や患者の状態等に応じて適宜設定されるが、通常、成人１日当たり、1 mg〜100,000 mg、好ましくは1 mg〜1,000 mg程度であるがもちろんこの範囲に限定されるものではない。
【００１６】
チロシンキナーゼ抑制剤を本発明の絨毛癌治療剤の有効成分として用いる場合、本発明の絨毛癌治療剤は、上記チロシンキナーゼ抑制剤のみから成っていてもよいし、また、各投与形態に適した、薬剤的に許容される担体及び／又は希釈剤を用いて製剤することもできる。製剤方法及びそのための各種担体は、医薬製剤の分野において周知である。薬剤的に許容される担体又は希釈剤は、例えば、生理緩衝液のような緩衝液や、賦形剤（砂糖、乳糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等）であってよく、結合剤（シロップ、ゼラチン、アラビアゴム、ソルビトール、ポリビニルクロリド、トラガント等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、タルク、シリカ等）等が適宜混合されていてもよい。投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などによる経口剤、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などによる非経口剤などを挙げることができる。これらの製剤は一般的に知られている製法によって作ることができる。
【００１７】
上記の通り、BDNFとTrkBの結合を抑制する物質も本発明の絨毛癌治療剤の有効成分として用いることができる。このような物質としては、まず、遊離のTrkB又はBDNFとの結合性を有するTrkB断片を挙げることができる。遊離のTrkBは、BDNFと結合するので、遊離のTrkBを投与すると、投与したTrkBは、細胞膜上の本来のTrkBと競合してBDNFと結合するので、細胞膜上の本来のTrkBと結合するBDNFの量が減少する。すなわち、遊離のTrkBは、細胞自体のTrkBとBDNFとの結合を競合的に抑制する。また、細胞膜上のTrkBがBDNFと結合する部分は、TrkBの細胞外ドメインである。従って、下記実施例に具体的に記載するように、TrkBの細胞外ドメイン、又は該細胞外ドメインを含むTrkBの断片も全長TrkBと同様、BDNFとTrkBの結合を競合的に抑制するので、本発明の絨毛癌治療剤の有効成分として用いることができる。ヒトTrkB遺伝子のcDNAの塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に配列番号１に示し、アミノ酸配列のみを取り出したものを配列番号２に示す。なお、ヒトTrkB遺伝子のcDNA及びそれがコードするアミノ酸配列は公知であり、GenBank Accession No.NM_006180として登録されている。配列番号２に示すアミノ酸配列（すなわちTrkB全長のアミノ酸配列）のうち、細胞外ドメインは、Ｎ末端から-31番目のアミノ酸（以下、「-31aa」のように記載）〜397aaまでである。この細胞外ドメインから成るTrkB断片も本発明の絨毛癌治療剤の有効成分として用いることができる。一般に、ポリペプチドはサイズが小さい方が製造が容易で細胞に取り込まれやすいので、上記TrkB断片はこれらの観点から好ましい。
【００１８】
一般に、生理活性を有するポリペプチドにおいて、少数のアミノ酸が置換し、欠失し又は挿入された場合であってもその生理活性が維持される場合があることは当業者にとって周知である。従って、上記したTrkB又はその断片に加え、アミノ酸配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列、及び該アミノ酸配列のうち-31aa〜397aaである細胞外ドメイン領域のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドであって、BDNFと結合して絨毛癌の治療効果を発揮するポリペプチドもそれぞれ遊離のTrkBやその細胞外ドメイン断片と同様に本発明の絨毛癌治療剤の有効成分として用いることができる。ここで、アミノ酸配列の配列同一性とは、一致するアミノ酸残基の数が最大となるように（必要に応じてギャップを挿入する）、２つのアミノ酸配列を並べ、一致したアミノ酸残基の数を完全長の配列のアミノ酸残基（２つの配列間で全アミノ酸残基の数が異なる場合、長い方のアミノ酸残基）の数で除することよって求めた値を意味する。そのような相同性の計算は、ＢＬＡＳＴのような周知のソフトウェアによって容易に入手し得る。特に、アミノ酸配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列のうち-31aa〜397aaである細胞外ドメイン領域のアミノ酸配列において、１個ないし数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、又は１個ないし数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列であるポリペプチドであって、BDNFとの結合性、ひいては絨毛癌の治療効果を有するポリペプチドも本発明の絨毛癌治療剤の有効成分として用いることができる。なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はその細胞外ドメイン領域のアミノ酸配列から成るポリペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、当該ポリペプチドのBDNF結合能が維持される可能性が高くなる。
【００１９】
また、生理活性を有する２種類のポリペプチドが連結された融合ポリペプチドが、各ポリペプチドの生理活性を維持する場合があることからも明らかなように、生理活性を有するポリペプチドをそっくり含み、その一端又は両端に他のアミノ酸配列が連結されたポリペプチドであってもその生理活性が維持される場合があることは当業者にとって周知である。従って、上記したBDNFとの結合能を有するポリペプチドを含み、BDNFとの結合能を有するポリペプチドを本発明の絨毛癌治療剤の有効成分として用いることも可能である。この場合、上記したBDNFとの結合能を有するポリペプチドの一端又は両端に付加されるアミノ酸の数は、最終的なポリペプチドがBDNFとの結合能、ひいては絨毛癌の治療効果を発揮する限り特に限定されないが、合成の容易さ及び単位重量当たりの活性を高くする観点から、１個〜数個であることが好ましい。
【００２０】
なお、一般に、ポリペプチド製剤においては、生体内でのプロテアーゼによる分解を受けにくくするためにポリペプチドの一端にポリエチレングリコール(PEG)鎖等を結合したものが広く用いられている。本発明の絨毛癌治療剤においても、同様に、上記したポリペプチドをそっくり含み、その一端にPEG鎖等の安定化構造を付加したものを有効成分として用いることができる。なお、PEG化によりペプチドを安定化する場合には、PEGのサイズは分子量数千〜５万、好ましくは１万〜５万程度である。また、ポリペプチドの一端にPEGを結合する方法は周知である。
【００２１】
なお、本明細書及び特許請求の範囲において、遊離のTrkB若しくはBDNFとの結合性を有するその断片の、絨毛癌の治療効果を有する「修飾体」とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はその細胞外ドメイン領域から成るアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を持ち、BDNFとの結合性ひいては絨毛癌の治療効果を有する、上記したポリペプチド並びにそれらにPEG鎖等の安定化構造を付加したものを意味する。
【００２２】
上記した、遊離のTrkB、その細胞外ドメイン断片やそれらの上記修飾体（以下、便宜的に「BDNF結合性TrkB断片等」ということがある）を絨毛癌治療剤の有効成分として用いる場合、投与経路は、経口でも非経口でもよく、非経口の場合、絨毛癌組織への直接投与、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経皮、直腸内、点眼等、通常の各種投与経路で投与可能である。もっとも、体内への吸収性や消化酵素による分解を避ける観点から非経口投与が好ましい。投与量は、用いるチロシンキナーゼ抑制剤の種類や患者の状態等に応じて適宜設定されるが、非経口投与の場合、通常、成人１日当たり、1 mg〜100,000 mg、好ましくは1 mg〜1,000 mg程度であるがもちろんこの範囲に限定されるものではない。また、BDNF結合性TrkB断片等を有効成分として用いる場合も、上記と同様、常法に基づいて製剤することができる。
【００２３】
BDNF結合性TrkB断片等は、それ自体を有効成分として用いることができるが、BDNF結合性TrkB断片等をコードする核酸を組み込んだ組換えベクターであって、細胞中でBDNF結合性TrkB断片等を発現することができる組換えベクターを有効成分として用いることもできる。哺乳動物の遺伝子治療用のベクターは、種々のものが公知であり、市販されているものも少なくないので、市販の遺伝子治療用ベクターのクローニング部位にBDNF結合性TrkB断片等をコードするＤＮＡを挿入した組換えベクターを好ましく用いることができる。なお、所望の遺伝子をベクターに挿入して遺伝子治療用組換えベクターを作製する有料サービスも行われており、このような有料サービスを利用することも可能である。
【００２４】
哺乳動物への組換えベクターの投与自体は、周知の方法により行うことができる。すなわち、好ましくは、治療すべき絨毛癌細胞の近傍の組織に注射等の非経口投与により投与することができる。組換えベクターをリン酸緩衝液(PBS)等の緩衝液に懸濁したものを投与することができる。投与に際し、細胞内への遺伝子ワクチンの侵入を容易にするために、注射部位に電界パルスを与えてもよい。この場合、電界の強さは、特に限定されないが、通常、10V/cm〜60V/cm程度、好ましくは25V/cm〜35V/cm程度、パルスの持続時間は、通常、20ミリ秒〜100ミリ秒、好ましくは、40ミリ秒〜60ミリ秒程度であり、パルスを通常、１回〜６回、好ましくは２回〜４回程度当てることができる。組換えベクターの投与量は、症状や神経損傷部位の状態等に応じて適宜選択することができるが、通常、組換えベクターの重量で1ng〜10mg程度、特に100ng〜1mg程度である。
【００２５】
BDNFとTrkBとの結合を抑制する物質として、BDNFに対する抗体又はBDNF結合性TrkB断片等に対する抗体を用いることもできる。BDNF及びBDNF結合性TrkB断片等は容易に入手可能であるので、これらに対する抗体は、BDNF又はTrkBを免疫原として動物（ヒトを除く）に投与するして抗体を誘導することを含む常法により得ることができる。抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体も常法であるハイブリドーマ法により作製することができる。抗体は、BDNFとTrkBとの結合を抑制できるものである必要があるので、モノクローナル抗体の場合には、得られたモノクローナル抗体のうち、BDNFとTrkBとの結合を抑制するモノクローナル抗体をスクリーニングする。ポリクローナル抗体の場合には、免疫原の全エピトープに体する種々の抗体が含まれるので、このようなスクリーニングを行わなくてもBDNFとTrkBとの結合を抑制するが得られる。
【００２６】
上記抗体を絨毛癌治療剤の有効成分として用いる場合、投与経路は、経口でも非経口でもよく、非経口の場合、絨毛癌組織への直接投与、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経皮、直腸内、点眼等、通常の各種投与経路で投与可能である。もっとも、体内への吸収性や消化酵素による分解を避ける観点から非経口投与が好ましい。投与量は、用いる抗体の力価や患者の状態等に応じて適宜設定されるが、非経口投与の場合、通常、成人１日当たり、1 mg〜100,000 mg、好ましくは1 mg〜1,000 mg程度であるがもちろんこの範囲に限定されるものではない。また、上記抗体を有効成分として用いる場合も、上記と同様、常法に基づいて製剤することができる。
【００２７】
BDNF又はTrkBの、細胞内における生産を抑制する物質を本発明の絨毛癌治療剤の有効成分として用いることもできる。このような物質として、BDNF遺伝子若しくはTrkB遺伝子に対する干渉RNA(iRNA)を挙げることができる。BDNF遺伝子又はTrkB遺伝子の発現を抑制する抑制剤としては、BDNF遺伝子又はTrkB遺伝子のmRNAを標的とするiRNA、好ましくはsiRNAを挙げることができる。iRNAは、標的となるmRNAと相補的な鎖を含む二本鎖RNAであり、標的となるmRNAと結合してこれを切断するものである。siRNAは、サイズが21〜23塩基程度の短い(small)iRNAである。siRNAは、サイズが小さいので合成が容易で、それによるmRNAの切断部位を設定し易いので好ましい。siRNAによる遺伝子発現の抑制技術は、既に周知であり、mRNAの配列（cDNA配列）さえ提示すれば、それを標的とするsiRNAを設計し、そのsiRNAを発現ベクターに組み込んだ組換えベクターを作製するサービスを行なっている業者が多数存在するほどである。上記の通り、TrkB遺伝子のcDNAの配列は配列番号１に記載したとおりであり、また、BDNF遺伝子のcDNAの塩基配列(GenBank Accession No. NM_170735）は配列番号３に示す通りであるので、これらに対するsiRNAは当業者であれば容易に設定することができる。簡単に説明すると、siRNAは標的とするmRNAと相補的な鎖を含む二本鎖RNAで、そのサイズは通常、21〜23塩基であり、通常、二本鎖RNAの両端にそれぞれハングオーバーを有する。ハングオーバーのサイズは、それぞれ１塩基〜２塩基であり、ハングオーバー部分はデオキシヌクレオチドでもよい。また、mRNAとの相補性は、完全な相補性が好ましいが、１〜２塩基程度のミスマッチがあっても十分な切断作用を発揮する場合も多い。また、ハングオーバー部分は相補的でなくてもよい。siRNAは、mRNAの塩基配列中のaaに続く19〜21塩基として設定することが好ましい場合が多く、gc含量が50%前後（通常45〜55%程度）のものが好ましい。また、成熟タンパク質で切断される部分に設定されないように、5'末端から50塩基以上離れた部位に設定することが多い。
【００２８】
siRNAはそのまま投与することもできるが、該siRNAを発現するDNAを哺乳動物細胞用の発現ベクターに組み込み、得られた組換えベクターを投与することにより、細胞内でsiRNAを生産させBDNF遺伝子又はTrkB遺伝子の発現を抑制してもよい。哺乳動物細胞用の発現ベクターは種々市販されており、それらのマルチクローニング部位に上記DNAを挿入することができる。なお、上記の通り、siRNAを発現するDNAを組み込んだ発現ベクターを作製する業者のサービスも利用できる。
【００２９】
投与量は、絨毛癌の程度、患者の状態や体重等に応じて適宜選択されるが、抑制剤がsiRNAの場合、その投与量は、成人(体重60kg)１日当たり通常、0.01mg/kg〜10mg/kg程度、特に0.1mg/kg〜5mg/kg程度、siRNAを発現する組換えベクターの場合、治療全体を通して成人１日当たり0.01mg/kg〜10mg/kg程度、特に0.1mg/kg〜5mg/kg程度であるが、投与量はもちろんこれらに限定されるものではない。
【００３０】
さらに、本発明の絨毛癌治療剤の有効成分として、BDNF遺伝子又はTrkB遺伝子のアンチセンスRNAを用いることもできる。アンチセンスRNAは、標的遺伝子のmRNAの全長又はその一部と相補的な塩基配列を有し、該mRNAとハイブリダイズして、mRNAが翻訳されることを抑制し、ひいては標的遺伝子の遺伝子産物が生産されることを抑制するものである。TrkB遺伝子及びBDNF遺伝子のcDNAの塩基配列はそれぞれ配列番号１及び配列番号３に記載されているので、これらのアンチセンスRNAも容易に調製することができる。アンチセンスRNAのサイズは、標的遺伝子のmRNAと特異的にハイブリダイズすることが可能で該mRNAの翻訳を抑制できるサイズであれば特に限定されないが、通常、２０塩基〜mRNAのコード領域の全長程度である。
【００３１】
iRNAの場合と同様、アンチセンスRNAもそのまま投与することもできるが、該アンチセンスRNAを発現するDNAを哺乳動物細胞用の発現ベクターに組み込み、得られた組換えベクターを投与することにより、細胞内でアンチセンスRNAを生産させBDNF遺伝子又はTrkB遺伝子の発現を抑制してもよい。哺乳動物細胞用の発現ベクターは種々市販されており、それらのマルチクローニング部位に上記DNAを挿入することができる。
【００３２】
アンチセンスRNAの投与量は、絨毛癌の程度、患者の状態や体重等に応じて適宜選択されるが、上記したiRNAの投与量と同程度であってよい。
【００３３】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
実施例１
材料および方法
細胞
絨毛癌細胞株であるＪＡＲおよびＢｅＷｏはATCC（バージニア州マナッサス）から購入した。ＪＡＲ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（インビトロジェン社）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）で保持し、ＢｅＷｏ細胞は、１５％ウシ胎仔血清と抗菌剤とを添加したＦ−１２培地で、３７℃、５％ＣＯ２環境で保持した。
【００３５】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＪＡＲ細胞およびＢｅＷｏ細胞におけるＴｒｋＢリガンド（ＢＤＮＦおよびＮＴ−４／５）と受容体（ＴｒｋＢおよびｐ７５ＮＴＲ）の発現を調査するため、従来のＲＴ−ＰＣＲで、非特許文献７〜９のプライマーを用いた。ネガティブコントロールには、ｍＲＮＡを含めなかった。
【００３６】
ＪＡＲ細胞およびＢｅＷｏ細胞中のＴｒｋＢの転写レベルについての定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、非特許文献８のＴｒｋＢおよびβ−アクチンに対するプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブにより、SmartCycler（タカラ、東京、日本）を用いて行った。ＴｒｋＢに対するプライマーは受容体の触媒キナーゼドメインに合致し、切断されたアイソフォームの増幅を回避する（非特許文献１０）。データはβ−アクチンの転写レベルに基づいて正規化した。
【００３７】
ＰＣＲアレイ実験には、ヒトの細胞周期用およびアポトーシス用のRT2 Profiler ＰＣＲアレイ（ＳＡバイオサイエンス社、メリーランド州フレデリック）を用い、メーカーのプロトコルに従ってそれぞれの９６ウェルＰＣＲアレイプレート中の８４個の遺伝子のｍＲＮＡレベルを同時に検討した。RNeasy Mini kit（キアゲン、東京、日本）を用いて、全ＲＮＡを細胞から抽出した。RT2 First Strandキット（ＳＡバイオサイエンス社）を用いて１μｇの全ＲＮＡを逆転写し、次いで、LightCycler480（ロシュ・アプライド・サイエンス社、インディアナ州インディアナポリス）でリアルタイムＰＣＲを行った。ΔΔサイクル閾値法によりデータを解析し、発現における変化倍率（fold change）を測定した。
【００３８】
免疫測定
ＪＡＲ細胞およびＢｅＷｏ細胞を用いて、非特許文献６、８のように、ＢＤＮＦ、ＮＴ−４／５、およびＴｒｋＢの免疫蛍光測定を行った。
【００３９】
ＥＬＩＳＡには、ＪＡＲ細胞およびＢｅＷｏ細胞を、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１％ノニデットP-40、１０％グリセロール、プロテアーゼインヒビターカクテル（ロシュ・アプライド・サイエンス社）を含有するバッファー中でホモジナイズし、８０００×ｇ、４℃で５分間、遠心した。上清中のＢＤＮＦおよびＮＴ−４／５の定量を、非特許文献６、８のように行った。結果は、タンパク質濃度により正規化し、細胞（ｍｇ）当たりのＢＤＮＦ（ｐｇ）またはＮＴ−４／５（ｐｇ）として表した。
【００４０】
血清中のヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）−βタンパク質のレベルと、細胞および組織ホモジネートとを、ＲＩＡ（三菱ＢＣＬ社、東京、日本）を用いて測定した。このアッセイでの最小検出可能レベルは０．１ｎｇ／ｍｌであり、アッセイ内およびアッセイ間の変動係数はそれぞれ４．５％および６．３％である。
【００４１】
細胞培養および細胞の増殖とアポトーシスの測定
内在性ＴｒｋＢリガンドの細胞増殖およびアポトーシスにおける役割を調べるため、ＪＡＲ細胞およびＢｅＷｏ細胞を９６ウェル培養プレートに１×１０４個／ウェルの密度で播種した。細胞を一晩インキュベートし、種々のインヒビターで処理した。プレインキュベーション後、種々の用量のＴｒｋＢの可溶性細胞外ドメイン（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）、汎特異的（pan-specific）Ｔｒｋ受容体インヒビターであるK252a（カルバイオケム社、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）（非特許文献１１）、または不活性細胞膜非透過性K252b（カルバイオケム社）（非特許文献１２）を用いて、または用いずに、４８時間、無血清培地中で、細胞を培養した。さらに、一晩のプレインキュベーション後、９６ウェル培養プレートに０．２×１０４個／ウェルの密度のＪＡＲ細胞およびＢｅＷｏ細胞を、４８時間、無血清培地中で、種々の用量のＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社）で処理するか、または処理しないことによりＢＤＮＦの細胞増殖およびアポトーシスへの影響を測定した。ＢＤＮＦによる細胞増殖促進におけるＰＩ３ＫおよびＥＲＫ経路の関与を解析するため、ＪＡＲ細胞およびＢｅＷｏ細胞を、ＢＤＮＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）とともに、ＰＩ３ＫインヒビターであるLY294002（０．１〜１．０μＭ；シグマ社、ミズーリ州セントルイス）またはその不活性類似体であるLY303511（１．０μＭ；カルバイオケム社）の存在下または非存在下で培養した。いくつかの実験においては、細胞を、ＢＤＮＦとともに、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ１／２インヒビターであるU0126（０．１〜１０μＭ；カルバイオケム社）もしくはその不活性類似体であるU0124（１０μＭ；カルバイオケム社）、またはLY294002とU0126の両方か、LY303511とU0124の両方の存在下または非存在下で培養した。
【００４２】
トリパンブルー排除試験（インビトロジェン社）を用いて、細胞増殖を測定した。生存可能な細胞の数を、生存可能な細胞による色素排除に基づいて血球計算板上で測定した。アポトーシスの進行を測定するため、一部の細胞を、培養８時間において、定量的カスパーゼ３／７酵素アッセイにかけた。アポトーシス測定のための培養期間は、カスパーゼ３／７の活性化がＴｒｋＢの細胞外ドメインまたはK252aで１２時間処理した細胞において明らかな最終的細胞死よりも早くに起こる、との仮説に基づいて選択した。カスパーゼ３／７活性を、非特許文献１３のように、Caspase-Glo ３／７アッセイ（プロメガ社、ウィスコンシン州マディソン）によって測定した。細胞のアポトーシスについても、培養８時間においてin situ 末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介２’−デオキシウリジン  ５’−二リン酸ニック末端標識法（ＴＵＮＥＬ法）を用いてＤＮＡの断片化を検出することにより分析した非特許文献１４。さらに、非特許文献１５のように、アポトーシスで誘導されたミトコンドリアの膜電位の変化をMitoTracker Orange CMTMRos（インビトロジェン社）を用いて検討した。いくつかの実験においては、培養８時間で、細胞をＰＣＲアレイ実験に供した。
【００４３】
In vivo試験
絨毛癌の腫瘍形成における内在性ＴｒｋＢリガンドのin vivoでの役割を探るため、ＪＡＲ腫瘍を有する胸腺欠損ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  nu／nu）（日本クレア、東京、日本）で、K252aの抗腫瘍活性を測定した。動物の世話および使用は秋田大学医学部動物実験委員会により承認を受けた。ＪＡＲ細胞（０．１ｍｌ、５×１０６個）を４週齢のメスのヌードマウスの右脇腹の皮下に移植した。腫瘍容積がおよそ６０ｍｍ３になったときに、動物への処理を開始した。動物の体重は処理の日において１７〜２１ｇであった。生理食塩水（５００μｇ／ｋｇ）に溶かしたK252aの腹腔内投与を３日ごとに行った。同じ用量の投与も毎日継続して行った。ネガティブコントロールとして、K252b（５００μｇ／ｋｇ）での処理または賦形剤のみの処置を行った。これらの実験のために選択したK252aおよびK252bの用量は先の調査（非特許文献１６）に基づいた。式：腫瘍容積（ｍｍ３）＝長さ×（幅）２×０．５を用いて、腫瘍容積を毎日測定した。処理の９日後にマウスを殺し、試験したすべてのマウスから血液サンプルを回収し、血清ｈＣＧ−βレベルを測定した。ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色に加え、in vivoでの細胞増殖およびアポトーシスを、それぞれ、増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の免疫染色、およびＴＵＮＥＬアッセイにより評価した。ＰＣＮＡの免疫染色は、マウス抗ＰＣＮＡモノクローナル抗体（Cell Signaling Technology社、マサチューセッツ州ダンバーズ）を１：４０００希釈で用い、メーカーのプロトコルに従って行った。切除した腫瘍サンプル中のカスパーゼ３／７活性をCaspase-Glo ３／７アッセイにより測定した。データは、タンパク質濃度により正規化した。このデータはコントロールに対する増加倍率を示した。
【００４４】
統計解析
マン・ホイットニーのＵ検定を行い、絨毛癌細胞株中のＢＤＮＦ、ＮＴ−４／５、ＴｒｋＢ、およびｈＣＧ−βのレベルを比較した。薬剤処理による腫瘍容積への影響はスチューデンドｔ検定を用いて解析した。ＰＣＲアレイからのデータを、独立スチューデンドｔ検定により、有意差について試験した。一元配置ＡＮＯＶＡ、次いでフィッシャーの保護最小有意差検定を用いて、その他の差を評価した。データは平均±標準誤差である。
【００４５】
結果
絨毛癌細胞におけるニューロトロフィンとＴｒｋ受容体の発現
絨毛癌細胞におけるＢＤＮＦ、ＮＴ−４／５、ＴｒｋＢの発現について、ＰＣＲおよび免疫測定により検討した。これら３種すべての転写物が、ＪＡＲ細胞とＢｅＷｏ細胞のいずれにおいても認められた（図１Ａ）。絨毛癌細胞におけるこれらの発現を、さらに、免疫蛍光染色（ＪＡＲ細胞）により確認した（図１Ｂ）。加えて、ｐ７５ＮＴＲのｍＲＮＡも両細胞株で検出した（図１Ａ）。ＥＬＩＳＡ分析により、両絨毛癌細胞において、ＢＤＮＦのタンパク質レベルがＮＴ−４／５よりも２．３倍高いことが示された（図１Ｃ）。ｈＣＧ−βのタンパク質レベルはＢｅＷｏ細胞よりもＪＡＲ細胞での方が高いが、ＥＬＩＳＡ分析および定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析によると、ＢＤＮＦタンパク質、ＮＴ−４／５タンパク質、およびＴｒｋＢ転写物のレベルは、ＪＡＲ細胞とＢｅＷｏ細胞とで差はなかった（図１Ｃ）。
【００４６】
絨毛癌細胞の成長に対する内在性ＴｒｋＢシグナル伝達のin vitro抑制
異なる絨毛癌細胞株におけるＴｒｋＢリガンドと受容体の両方の発現は、ＴｒｋＢシグナル伝達系が、絨毛癌の成長において、オートクリンの役割を果たしている可能性があることを示唆する。内在性ＴｒｋＢリガンドが絨毛癌細胞にとって生存因子として作用するかどうかを判定するため、我々は、ＴｒｋＢの細胞外ドメインとK252aで処理した培養ＪＡＲ細胞および培養ＢｅＷｏ細胞の増殖とアポトーシスとを評価した。図２Ａに示されるように、コントロールの細胞数は、培養後に増加（１３．５±０．９,×１０４個／ウェル）し、不活性のK252bで処理した場合ではなく、ＴｒｋＢの細胞外ドメインまたはK252aのどちらかで処理した場合に、生存可能な細胞の数は、両細胞株で同じような効率で減少した。我々はさらに、種々のインヒビターで処理することにより、両細胞株においてカスパーゼ３／７活性の増大を検出した（図２Ｂ)。ＴｒｋＢの細胞外ドメインおよびK252aでの処理によりＴＵＮＥＬ陽性の核の割合も増加した（図２Ｃ）。これはアポトーシスが誘導されたことを示す。絨毛癌細胞における内在性ＴｒｋＢシグナル伝達の抑制によって誘導されるアポトーシスをさらに特徴づけるため、我々は、ミトコンドリアの膜電位感受性色素であるMitoTracker Orange CMTMRosを用いてミトコンドリアの機能の低下を検討し、アポトーシス中のミトコンドリアの膜電位の状態を評価した（非特許文献１７）。機能的なミトコンドリアは色素を取り込み、オレンジ色の蛍光で点状の染色パターンを示すが、アポトーシスを起こした細胞のミトコンドリアは染色されない。我々は、コントロール細胞でのMitoTracker色素染色が、それらのミトコンドリアの局在として予想される通りに点状に現れる（図２Ｃ）ことを見出した。不活性のK252bでの処理ではなく、ｒｋＢの細胞外ドメインまたはK252aのどちらかでの処理により、MitoTracker色素染色は減少した（図２Ｃ）。
【００４７】
ＢＤＮＦ処理の絨毛癌細胞増殖への影響とin vitroのＰＩ３ＫおよびＥＲＫの媒介的役割
ＢＤＮＦの細胞増殖への影響を検討するため、細胞を、種々の用量のＢＤＮＦの存在下または非存在下で培養した。ＢＤＮＦの細胞増殖への影響は、細胞をより高い密度で培養した場合、おそらくオートクリン因子の蓄積により、より目立たなくなった（データ非掲載）。従って、我々は、低い密度で細胞を培養し、ＢＤＮＦを含む細胞由来因子の影響を排除した。この条件下では、ＢＤＮＦ処理は、両絨毛癌細胞において用量依存的に細胞増殖を増加させた（図３Ａ）。
【００４８】
我々はさらに、２種類の異なる絨毛癌細胞株において、ＢＤＮＦによって誘導された細胞増殖の下流メディエーターとしてのＰＩ３ＫおよびＥＲＫシグナル伝達経路の役割を解析した。低密度で細胞数を増加させるＢＤＮＦの能力は、不活性類似体であるLY303511で処理するのではなくＰＩ３ＫインヒビターであるLY294002とともに処理するか、または不活性類似体であるU0124で処理するのではなくＭＡＰＫキナーゼ（ＭＥＫ）１／２インヒビターであるU0126とともに処理するかのどちらかによって抑制され（図３Ｂ）、また、ＰＩ３ＫインヒビターおよびＭＥＫ１／２インヒビターの両方とともに処理することによって、完全に抑制され、これはこれらの経路のみが内在性ＴｒｋＢシグナル伝達の媒介に関与しているとのことを示している（図３Ｂ）。しかしながら、ＰＩ３ＫインヒビターおよびＭＥＫ１／２インヒビターへの感受性はＪＡＲ細胞とＢｅＷｏ細胞とで異なっていた。より低用量のU0126（０．５μＭおよび１．０μＭ）は、ＢｅＷｏ細胞ではＢＤＮＦによる細胞増殖刺激を抑制するには効果がなかった。
【００４９】
ＢＤＮＦおよびＴｒｋＢに対するｓｉＲＮＡを用いて、我々はさらに、内在性ＢＤＮＦ／ＴｒｋＢシグナル伝達の抑制後の絨毛癌細胞の成長阻害について検証した。ＢＤＮＦまたはＴｒｋＢのノックダウンは、細胞増殖を、それぞれ５０．５％、４７．８％阻害し、細胞成長における内在性ＢＤＮＦ／ＴｒｋＢシグナル伝達の特異的役割を支援した。しかしながら、両ｓｉＲＮＡの細胞成長への阻害効果は、ＴｒｋＢの細胞外ドメインおよびＴｒｋ受容体インヒビターの場合（＞８０％阻害）よりも効力が少なかった。加えて、ＢＤＮＦ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞におけるＢＤＮＦによる細胞増殖刺激は、おそらく、ｓｉＲＮＡによって媒介されたノックダウンの後のＢＤＮＦまたはＴｒｋＢの残存発現（図５Ｃ）のために、そのｓｉＲＮＡをトランスフェクションしなかった細胞の場合（コントロールの２２３％）よりも弱かった（コントロールの１７７％）。
【００５０】
内在性ＴｒｋＢシグナル伝達抑制後の培養絨毛癌細胞における細胞周期関連遺伝子およびアポトーシス関連遺伝子のｍＲＮＡ発現プロファイル変化
ＴｒｋＢシグナル伝達インヒビターによる細胞増殖阻害および生存阻害の根底にある分子機構を探るため、ＴｒｋＢの細胞外ドメイン（５００ｎＭ）で処理した、または処理しなかったＪＡＲ細胞から全ＲＮＡを精製し、ＰＣＲアレイ解析に使用して、細胞周期関連遺伝子およびアポトーシス関連遺伝子の発現をプロファイルした。ＴｒｋＢの細胞外ドメインで処理することにより、アレイ中でスクリーニングされた８４種類の細胞周期関連ｍＲＮＡのパネル全体にわたって、３つの刺激性遺伝子（ＣＣＮＤ１、ＤＤＸ１１、ＤＮＭ２）の発現が２倍以上減少し、２つの阻害遺伝子（ＣＤＫＮ２Ｂ、ＳＥＲＴＡＤ１）の発現が２倍以上増加した（図４Ａ）。アポトーシス関連遺伝子の解析においては、異なるアポトーシス促進性の遺伝子の転写レベルが、内在性ＴｒｋＢシグナル伝達の抑制に応答して増加した（図４Ｂ）。発現が増加したアポトーシス促進性遺伝子のうち、ＴＮＦにおいて、もっとも有意な増加（２５倍）が認められた（図４Ｂ）。対照的に、抗アポトーシス性の遺伝子の発現への有意な影響は、ＴｒｋＢの細胞外ドメインで処理した細胞では観察されなかった。
【００５１】
絨毛癌成長へのＴｒｋ受容体インヒビターのIn vivoでの影響
観察されたＴｒｋＢインヒビターによる絨毛癌細胞成長のin vitro阻害が、in vivoでの抗腫瘍活性となるのかどうかを判定するため、K252aを、ＪＡＲ細胞の腫瘍異種移植片を有する胸腺欠損ヌードマウスに投与した。これらの調査にはＪＡＲ細胞を用いた。これは、この細胞では、腫瘍マーカーであるｈＣＧ−βの産生レベルが高かった（図１Ｃ）ためである。腫瘍容積がおよそ６０ｍｍ３に達したときに、動物に、K252aまたはK252bを、５００μｇ／ｋｇで３日ごとに与えた。K252aで処理した動物の腫瘍は、コントロールに比べて有意に小さくなり、これは処理開始から３日後程度の早期に始まり、９日目の実験終了まで続いた（図５Ａ）。処理９日目で、最大の腫瘍成長阻害（６８％）が観察された。図５Ｂに示すように、ＪＡＲ腫瘍を有するマウスにおける血清ｈＣＧ−βレベルは腫瘍容積に相関し、腫瘍マーカーとしてのその役割と一致した。K252aで処理した動物は、処理９日目において、コントロールと比べて８７％の血清ｈＣＧ−βレベルの減少を示した（図５Ｃ）。試験されたすべての動物において、実験期間中、腫瘍の転移は観察されなかった。K252aを９日目まで毎日投与した場合に、成長抑制効率が比較可能であった（６７％の腫瘍成長阻害、８２％の血清ｈＣＧ−βレベル増加）。試験したすべての動物において、実験中、重大な副作用は観察されず、また、K252aで処理したグループでは、調査中、有意な体重減少はなかった（賦形剤の場合には、２２．０８±０．５４ｇ、K252aの場合には、２１．１５±０．４７ｇ、K252bの場合には、２１．１３±０．４５ｇ）。
【００５２】
切除した腫瘍をさらに検査し、K252aのin vivoでの影響を測定した。Ｈ＆Ｅ染色による組織病理学的検査では、K252aで処理したマウスの腫瘍中に、細胞増殖抑制を示唆する有糸分裂活性の減少、および生存抑制を示唆するクロマチン凝縮を有する細胞数の増加が検出された（図６Ａ）。ＰＣＮＡ染色によりK252a処理の細胞増殖抑制への影響を確認し、アポトーシスの誘導をＴＵＮＥＬアッセイにより確認した（図６Ａ）。我々はさらに、カスパーゼ活性を定量化することにより、腫瘍中でK252aにより誘導されるアポトーシスを特徴づけ、またK252aで処理したマウスの腫瘍中でカスパーゼ３／７の活性が１７．７倍減少することを観察した（図６Ｂ）。重要なのは、不活性細胞膜非透過性K252bが、試験されたすべてのパラメーターで効果がなかったことである。
【００５３】
実施例２
ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
アプライドバイオシステムズ社（カリフォルニア州フォスターシティ）製の、ＢＤＮＦを標的（s1962；センスとしてuuacuaugguuauuucauatt（配列番号５）、アンチセンスとしてuaugaaauaaccauaguaagg（配列番号６）、および、センスとしてcccuuaccauggauagcaatt（配列番号７）、アンチセンスとしてuugcuauccaugguaagggcc（配列番号８））、またはＴｒｋＢを標的（s9750；センスとしてgguuagaaaucaucaacgatt（配列番号９）、アンチセンスとしてucguugaugauuucuaacctt（配列番号１０）、および、s9749；センスとしてgaauugacgauggugcaaatt（配列番号１１）、アンチセンスとしてuuugcaccaucgucaauucca（配列番号１２））とした２種類の特異的なｓｉＲＮＡ二本鎖のセット（Silencer（登録商標） Select Pre-designed ｓｉＲＮＡ）を用いてＢＤＮＦまたはＴｒｋＢのノックダウンを行った。Select Negative Control #1 siRNAおよびGAPDH Positive Control siRNAを、それぞれネガティブコントロールおよびポジティブコントロールとして使用した。siPORT（商品名） NeoFX（商品名）Transfection Agent（アプライドバイオシステムズ社）を、メーカーの説明書に従ってリバーストランスフェクション法に使用した。このポジティブコントロールとKDalert（商品名）GAPDH Assay Kit（アプライドバイオシステムズ社）とを用い、ｓｉＲＮＡのトランスフェクション条件をＪＡＲ細胞において最適化した。ＢＤＮＦおよびＴｒｋＢのノックダウンのために、細胞を終濃度５ｎＭの各ｓｉＲＮＡ二本鎖セットでトランスフェクションした。この細胞を２４時間インキュベートし、次いで無血清培地を１０％ＦＢＳ含有完全培地に交換した。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの７２時間後に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析用に細胞を回収し、ＢＤＮＦおよびＴｒｋＢのｍＲＮＡの発現のノックダウンを確認した。培養液中に蓄積した内在性ＢＤＮＦを除去するために、ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後７２時間で、完全培地を無血清培地に交換した。４８時間のインキュベーションの後、細胞増殖をトリパンブルー排除試験を用いて測定した。いくつかの実験においては、ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後７２時間に、ＢＤＮＦ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞をＢＤＮＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）培地で処理し、ＢＤＮＦによる細胞成長への影響を評価した。
【００５４】
ＲＴ−ＰＣＲ
絨毛癌細胞におけるニューロトロフィン（神経成長因子、ＮＧＦ、およびニューロトロフィン−３、ＮＴ−３）およびＴｒｋ受容体（ＴｒｋＡ、およびＴｒｋＣ）の発現を調査するための従来のＲＴ−ＰＣＲに用いる、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＴｒｋＡ、およびＴｒｋＣに対するプライマーは以下に示す通り：ＮＧＦには、センスとして5'-tcatcatcccatcccatcttcc-3'（配列番号１３）、アンチセンスとして5'-tccagtgctttgagtcaatgcc-3'（配列番号１４）；ＮＴ−３には、センスとして5'-gccagaataacacagactcagc-3'（配列番号１５）、アンチセンスとして5'-tcggtgactcttatgctccg-3'（配列番号１６）；ＴｒｋＡには、センスとして5'-catcgtgaagagtggtctccg-3'（配列番号１７）、アンチセンスとして5'-gagagagactccagagcgttgaa-3'（配列番号１８）；ＴｒｋＣには、センスとして5'-agcgtctggctggactatgt-3'（配列番号１９）、アンチセンスとして5'-gtgtggtgagccggttactt-3'（配列番号２０）。β−アクチンに対するプライマーは既に記載されている（非特許文献１）。ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒の変性、５７℃（ＴｒｋＡ）、６０℃（ＴｒｋＣおよびβ−アクチン）、または６２℃（ＮＧＦおよびＮＴ−３）で３０秒のアニーリング、および７２℃で３０秒の伸長、による増幅を３５サイクルとした。ネガティブコントロールにはｍＲＮＡを含めなかった。
【００５５】
細胞培養
ｈＣＧ刺激によるＴｒｋＢリガンドおよび受容体の産生調節に取り組むため、アンチセンスの絨毛性ゴナドトロピンβ（ａＣＧβ）（Koji Nakabayashi博士から分与（非特許文献２９））を有する発現ベクターｐＭ２ＨＡでトランスフェクションしたＪＡＲ細胞を使用した。ＪＡＲ−ｐＭ２ＨＡ細胞とともに、トランスフェクションしていないＪＡＲ細胞をコントロールとして実験において使用した。これらの細胞株を、成長曲線およびマイコプラズマ解析を用いるとともに、これらの細胞の形態により検証した。ＪＡＲ−ａＣＧ細胞およびＪＡＲ−ｐＭ２ＨＡ細胞は、１０％ＦＢＳ、ジェネティシン（６２．５μｇ／ｍｌ）（インビトロジェン社）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で保持した。トランスフェクションした細胞におけるｈＣＧ−β、ＢＤＮＦ、およびＮＴ−４／５の測定のために、細胞をサブコンフルエントな状態まで増殖させ、ＰＢＳで洗浄し、次いで無血清培地に交換した。一晩培養した後、その細胞のホモジネートをＲＩＡまたはＥＬＩＳＡに供し、本文中に記載したように、それらのｈＣＧ−βタンパク質、ＢＤＮＦタンパク質またはＮＴ−４／５タンパク質のレベルを測定した。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い、非特許文献３０のように、これらのトランスフェクションした細胞におけるＴｒｋＢの転写レベルを測定した。
【００５６】
結果を図７〜図９に示す。
【図３】
2012041311.tif 000004
【図４】
2012041311.tif 000005
【図５】
2012041311.tif 000006
【図７】
2012041311.tif 000007
【図９】
2012041311.tif 000008
【図１】
2012041311.tif 000009
【図２】
2012041311.tif 000010
【図６】
2012041311.tif 000011
【図８】
2012041311.tif 000012
【配列表】
2012041311000001.app