(57)【要約】      （修正有）【課題】廃液量の少なく再結晶可能な方法により、結晶性の高いピロロキノリンキノン(ＰＱＱ）カリウム塩の提供。【解決手段】ＰＱＱジナトリウム塩５ｇをイオン交換水に加え、水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを６．７にした溶液３００ｍｌ用意した。ここに塩化カリウムを８０ｇ添加した。この時、赤色固体が析出した。室温下で１６時間攪拌した。吸引ろ過で結晶を回収し、室温下で１６時間の減圧乾燥を行った。その結果、ＰＱＱトリカリウム塩の結晶を収率９５mol％で製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして８．７°、１１．８°、２６．６°、３０．１°（いずれも±０．２°）を示すピロロキノリンキノンのトリカリウム塩結晶。
【請求項２】
粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして１０．１°、１５．１°、２０．３°、２４．２°、３１．３°（いずれも±０．２°）を示すピロロキノリンキノンのジカリウム塩結晶。
【請求項３】
請求項１又は２記載のピロロキノリンキノンのカリウム塩結晶を含む機能性食品。
【請求項４】
請求項１又は２記載のピロロキノリンキノンのカリウム塩結晶を含む医薬品。
【請求項５】
ピロロキノリンキノンのナトリウム塩又はカリウム塩の水溶液をｐＨ６〜１０の範囲に保持してカリウム塩による塩析を行う工程を含むピロロキノリンキノントリカリウム塩結晶の製造方法。
【請求項６】
水溶性有機溶媒を１０〜９０（v/v）％含むピロロキノリンキノントリカリウム塩の水溶液又は懸濁液をｐＨ２〜５の範囲に調整する工程を含むピロロキノリンキノンジカリウム塩の製造方法。
【請求項７】
水溶性有機溶媒がエタノールであることを特徴とする請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明で取り扱うピロロキノリンキノンは、一般式（１）で表される構造の物質である。
【化１】
2012136465.tif 000002
【背景技術】
【０００２】
ピロロキノリンキノン（以下、ＰＱＱと記す）は新しいビタミンの可能性があることが提案されて注目を集めている（例えば、非特許文献１参照）。ＰＱＱは細菌に限らず、真核生物のカビ、酵母に存在し、補酵素として重要な働きを行っている。また、ＰＱＱについて近年までに細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防治療作用、創傷治癒作用、抗アレルギー作用、逆転写酵素阻害作用およびグリオキサラーゼＩ阻害作用−制癌作用、神経線維再生作用など多くの生理活性が明らかにされている。
【０００３】
本発明で取り扱うＰＱＱは、有機化学的合成法（非特許文献２）および発酵法（特許文献１）などにより製造することが可能である。しかし、これらの方法で得られるＰＱＱは水や不純物の含量が多く、安定で純度の高いＰＱＱの結晶を得る技術が求められていた。ＰＱＱの塩では通常、ナトリウムが用いられる。特にＰＱＱジナトリウム塩は溶解度が適度で固体として取り出しやすく、取り扱いも容易である。しかし、ナトリウムは高血圧や心臓病の危険因子と認識され、その代替品としてカリウムが注目されている。そのため、カリウム塩の効率的な製造法が求められている。
【０００４】
これまでにＰＱＱカリウム塩の製造は精製カラムからの溶出をリン酸カリウム、塩化カリウムから溶出させ、アルコール溶媒で再結晶させることで得ている（特許文献２に記載）。この方法は、すべてのＰＱＱを溶解させるために全体の容量が大きくなり、装置もそれに伴い大きくなる。そのため費用がかかるうえに、運転後の廃液量も多くなる欠点がある。また、カラムを通過させるのは非効率である。また、一般的なイオン交換樹脂を使用する際にも同様の欠点がある。また、ＰＱＱトリカリウム塩については、ＰＱＱジカリウム塩と異なり、これまでに結晶に関する報告はなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第２７５１１８３号公報
【特許文献２】特公平７−１１３０２４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】nature, vol422, 24 April, 3003, p832
【非特許文献２】JACS, 第103巻, 第5599〜5600頁（1981）
【非特許文献３】JACS, 第111巻, 第6822〜6828頁（1989）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は廃液量の少なく、小さい容器で再結晶可能な製造法により、ピロロキノリンキノンカリウム塩を提供することである。更に、ＰＱＱの薬学的価値を考慮し、結晶性の高いピロロキノリンキノンカリウム塩を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、以下に示す項目によって解決できることを見いだした。
（１）粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして８．７°、１１．８°、２６．６°、３０．１°（いずれも±０．２°）を示すピロロキノリンキノンのトリカリウム塩結晶。
（２）粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして１０．１°、１５．１°、２０．３°、２４．２°、３１．３°（いずれも±０．２°）を示すピロロキノリンキノンのジカリウム塩結晶。
（３）（１）又は（２）記載のピロロキノリンキノンのカリウム塩結晶を含む機能性食品。
（４）（１）又は（２）記載のピロロキノリンキノンのカリウム塩結晶を含む医薬品。
（５）ピロロキノリンキノンのナトリウム塩又はカリウム塩の水溶液をｐＨ６〜１０の範囲に保持してカリウム塩による塩析を行う工程を含むピロロキノリンキノントリカリウム塩結晶の製造方法。
（６）水溶性有機溶媒を１０〜９０（v/v）％含むピロロキノリンキノントリカリウム塩の水溶液又は懸濁液をｐＨ２〜５の範囲に調整する工程を含むピロロキノリンキノンジカリウム塩の製造方法。
（７）水溶性有機溶媒がエタノールであることを特徴とする（６）記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のピロロキノリンキノンカリウム結晶は、廃液量が少なく環境に優しい手法で得ることが出来、また高純度であり、医薬や機能性食品の有効成分として好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１で得られた結晶の粉末Ｘ線回折結果。
【図２】実施例３で得られた結晶の粉末Ｘ線回折結果。
【図３】比較例１で得られた結晶の粉末Ｘ線回折結果。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施形態について述べる。本発明に係る第１の結晶は、粉末Ｘ線回折においてＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして、８．７°、１１．８°、２６．６°、３０．１°（いずれも±０．２°）を示すＰＱＱトリカリウム塩である。
【００１２】
粉末Ｘ線回折による回折角２θの測定は、例えば、以下の測定条件で行うことができる。
装置：ＲＩＧＡＫＵ  Ｘ−ＲＡＹ  ＤＦＦＲＡＣＴＯＭＥＴＥＲ  ＲＩＭ２０００／ＰＣＸ線：Ｃｕ／管電圧４０ｋＶ／管電流１００ＭＡ
スキャンスピード：４．０００°／ｍｉｎ
サンプリング幅：０．０２０°
なお、これらのピークは、その他、モノクロメータが装着された一般的な粉末Ｘ線回折装置で観測することもできる。なお、本発明で規定する結晶形は測定誤差も含まれることから、ピークの角度に関する合理的な同一性があればよい。
【００１３】
第１の結晶を製造する方法としては、ＰＱＱナトリウム塩又はカリウム塩を水に１から３０ｇ/Lの濃度で溶解し、ｐＨ６〜１０の範囲に保持し、塩析用のカリウム塩を加え溶解度を下げることにより析出させ、ろ過、洗浄、乾燥等の公知の方法により結晶を単離することができる。
【００１４】
得られる物質にナトリウムが含まれる場合、操作を繰り返すことによってナトリウム含有量を減らすも可能である。一般的に、ＰＱＱナトリウム塩からＰＱＱカリウム塩へのイオン交換はイオン交換樹脂を使用することが多いが、イオン交換樹脂では大きな装置が必要になる。本発明では、高価なイオン交換樹脂を必要とせず、簡単な操作でイオン交換できる。
【００１５】
使用するＰＱＱのナトリウム塩は、有機化学的合成法（例えば、非特許文献２）や発酵法(例えば、特開平１−２１８５９７号公報や特許第２６９２１６７号公報)等により製造することが可能である。原料に用いるＰＱＱのナトリウム塩は結晶でもよいし、非晶質でもよい。また、不純物を含んでいてもよい。
【００１６】
塩析用のカリウム塩の具体的な例は、塩化カリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、リン酸カリウム、酢酸カリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム等である。添加量は温度、濃度によって変化するが２−４０重量％になるように添加すればよい。補助的に溶解度を下げる効果として水溶性有機溶剤、特にエタノールを添加することにより、さらに析出し易くさせることは可能である。
【００１７】
本願の発明に係る第２の結晶は、第１の結晶と同様の粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして、１０．１°、１５．１°、２０．３°、２４．２°、３１．３°（いずれも±０．２°）を示すピロロキノリンキノンのジカリウム塩結晶である。
【００１８】
第２の結晶を製造する方法としては、前述のＰＱＱトリカリウム塩を水に溶解又は懸濁させ、該溶液又は懸濁液に水溶性有機溶媒を１０〜９０（v/v）％、好ましくは２０〜８０（v/v）％の濃度になるように加えた後、酸を添加してｐＨを２〜５の範囲に調整することにより析出させ、ろ過、洗浄、乾燥等の公知の方法により結晶を単離することができる。
または、水溶性有機溶媒にＰＱＱトリカリウム塩を溶解又は懸濁させた後、水溶性有機溶媒濃度が１０〜９０（v/v）％、好ましくは２０〜８０（v/v）％の濃度になるように水を加えた後、ｐＨを２〜５の範囲に調整して結晶化させてもよい。
或いは、水溶性有機溶媒を１０〜９０（v/v）％、好ましくは２０〜８０（v/v）％含む水性媒体にＰＱＱのトリカリウム塩を溶解又は懸濁させた後、ｐＨを２〜５の範囲に調整して結晶化させてもよい。
【００１９】
水溶性有機溶媒は、貧溶媒としてＰＱＱの溶解度を下げるために使用するが、その濃度は初期のＰＱＱトリカリウム塩の量にあわせて上記範囲内で適宜設定すればよい。使用可能な水溶性有機溶媒の具体的な例は、メタノール、エタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、メトキシエタノール、ジエチレングリコール、メトキシジエチレングリコール、グリセリン、メトキシプロパノール、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、乳酸エチル、ヒドロキシイソブチル酸メチル等である。このうちアルコールが好ましく、エタノールがより好ましい。
【００２０】
ｐＨ調整のために加える酸の種類は特に制限されないが、例えば、塩酸、臭化水素酸、沃化水素酸、過塩素酸、硝酸、硫酸などの無機酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸などが挙げられ、塩酸がより好ましい。
【００２１】
一般的な結晶の製造方法においては、固体を溶媒に溶解させた後、貧溶媒を加えて結晶を析出させる。しかし、本発明では固体が存在する懸濁状態でも結晶化を行うことが出来る。懸濁状態で操作を行うことができる為、使用する装置の容積の低減、更に排出する排水量の低減が可能となる。
【００２２】
より具体的な操作方法としては、まず、原料のＰＱＱトリカリウム塩を含む水溶液又は懸濁液を用意する。この時、水１Ｌ当たり０．５〜８００ｇのＰＱＱのトリカリウム塩を加えることが好ましい。
次に、当該水溶液又は懸濁液に水溶性有機溶媒を添加することでＰＱＱのトリカリウム塩の溶解度を下げる。この時に固体が析出しても問題がない。そして、ｐＨを計測しながら酸を添加し、ｐＨを２〜５に調整すればよい。
又は、水溶性有機溶媒にＰＱＱのトリカリウム塩を加えて溶解又は懸濁させた後、水を加え、その後ｐＨを２〜５の範囲に調整して結晶化させてもよい。この際、加えた水溶性有機溶媒と水の合計量の１Ｌ当たり０．５〜８００ｇのＰＱＱのトリカリウム塩を加えることが好ましい。
或いは、水溶性有機溶媒を含む水性媒体にＰＱＱのトリカリウム塩を加えて溶解又は懸濁させた後、ｐＨを２〜５の範囲に調整して結晶化させてもよい。この際、水性媒体１Ｌ当たり０．５〜８００ｇのＰＱＱのトリカリウム塩を加えることが好ましい。
ｐＨが安定し、ｐＨ２〜５の間の所定の値で一定になった状態で、濾過、または遠心分離等により析出した結晶を分離して得ることができる。
【００２３】
ＰＱＱのトリカリウム塩を含む水溶液又は懸濁液に、水溶性有機溶媒を加える際の温度は、液が凍結しない限り特に制限はないが、高温にすればエネルギー効率が落ちることから、−３０℃〜８０℃が好ましい。
水溶性有機溶媒を添加した後、酸を添加してｐＨを２〜５にする際の溶液もしくは懸濁液の温度は、液が凍結しない限り特に制限はないが、高温にすればエネルギー効率が落ち、また低温にすれば結晶化の速度が落ちることから、５℃〜８０℃が好ましい。必要に応じて攪拌し、その後静置するのが好ましい。
攪拌時間は、例えば、５分〜７日とすることができる。静置時間は、例えば、５分〜１５日とすることができる。
得られた溶液では、ＰＱＱジカリウム塩の結晶が生成する。なお、結晶は含水物であっても良く、上記ピークを有する限り、特に制限されない。
【００２４】
ＰＱＱは、細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防治療作用、創傷治癒作用、抗アレルギー作用、逆転写酵素阻害作用およびグリオキサラーゼＩ阻害作用−制癌作用、神経線維再生など多く薬理効果を有する。従って、本発明のＰＱＱ第１の結晶及び第２結晶（以下、総称して「ＰＱＱカリウム塩結晶」と記す）は、医薬または機能性食品の有効成分とすることができる。即ち、皮膚外用剤、注射剤、経口剤、坐剤等の形態、あるいは、日常食する飲食物、栄養補強食、各種病院食等の形態で提供可能である。
【００２５】
医薬や機能性食品等の調製の際に使用する添加剤の具体例は、液剤としては水、果糖、ブドウ糖等の糖類、落下生油、大豆油、オリーブ油等の油類、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のグリコール類等である。錠剤、カプセル剤、顆粒剤などの固形剤の賦型剤としては乳糖、ショ糖、マンニット等の糖類、滑沢剤としてはカオリン、タルク、ステアリン酸マグネシウム等、崩壊剤としてデンプン、アルギン酸カリウム、結合剤としてポリビニルアルコール、セルロース、ゼラチン等、界面活性剤としては脂肪酸エステル等、可塑剤としてグリセリン等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。必要に応じて溶解促進剤、充填剤等を加えてもよい。
【００２６】
ＰＱＱカリウム塩は、単独でも、他の素材と組み合わせても使用できる。組み合わせ可能な素材としては、ビタミンＢ 群、ビタミンＣ およびビタミンＥ 等のビタミン類、アミノ酸類、アスタキサンチン、α-カロテン、β-カロテン等のカロテノイド類、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸等のω３脂肪酸類、アラキドン酸等のω６脂肪酸類などが例示されるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
ＰＱＱカリウム塩の分析は、以下に示す条件で測定した。
（ＰＱＱ分析）
装置： 島津製作所製、高速液体クロマトグラフィー、ＬＣ−２０Ａ
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ・ＯＤＳ−ＴＭＳ（５μｍ）、１５０x４．６mm I.D.
測定温度：４０℃
検出：２６０nmにおける吸光度
溶離液：１００ｍＭ ＣＨ３ＣＯＯＨ／１００ｍＭ ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（３０／７０, ｐＨ５．１)
溶出速度：１．５ｍＬ／ｍｉｎ
（Ｋ、Ｎａ分析）
ＤＩＯＮＥＸ製イオンクロマトグラフィーＤＸ−１２０にＣＳ１２Ａカラムをつけ、関東化学製ダイオネクス用陽イオン分析用溶離液ＣＳ１２Ａを使用した。
（粉末Ｘ線回折）
装置：ＲＩＧＡＫＵ  Ｘ−ＲＡＹ  ＤＦＦＲＡＣＴＯＭＥＴＥＲ  ＲＩＭ２０００／ＰＣ
Ｘ線：Ｃｕ／管電圧４０ｋＶ／管電流１００ＭＡ
スキャンスピード：4.000°／min
サンプリング幅：0.020°
上記の溶液中に含まれるＰＱＱとカリウムの濃度から、ＰＱＱカリウム塩に含まれるＰＱＱとカリウムの比を求めた。
【００２９】
＜参考例１＞
原料のＰＱＱジナトリウム塩は以下のようにして得た。特許第２６９２１６７号公報の実施例１に基づき、ハイホミクロビウム  メチロボラム  ＤＳＭ１８６９を培養して得られた培養液を遠心分離して、菌体を除去し、ＰＱＱを含有する培養上澄液を得た。尚、この菌株はＤＳＭ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)から入手できるものである。Sephadex Ｇ−１０（ファルマシア製）カラムに、この培養上澄液を通過させてＰＱＱを吸着させ、ＮａＣｌ水溶液で溶出させて得られたｐＨ７．５のＰＱＱ水溶液をｐＨを３．５にしたのち、エタノールを加えて加えて冷却し、ＰＱＱジナトリウム塩を得た。高速液体クロマトグラフィーのＵＶ吸収によるＰＱＱ純度は９９．０％であった。
【００３０】
実施例１  ＰＱＱトリカリウム塩の結晶
参考例１で調製したＰＱＱジナトリウム塩５ｇをイオン交換水に加え、水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを６．７にした溶液３００ｍｌ用意した。ここに塩化カリウムを８０ｇ添加した。この時、赤色固体が析出した。室温下で１６時間攪拌した。吸引ろ過で結晶を回収し、室温下で１６時間の減圧乾燥を行った。その結果、ＰＱＱトリカリウム塩の結晶を収率９５mol％で得た。イオンクロマトグラフィーでの分析の結果、ナトリウムは含まれておらず、ＰＱＱイオン：カリウムイオン＝１：３が検出され、ナトリウムを含まないトリカリウム塩であることが確認できた。この時の廃液量は原料ＰＱＱジナトリウム塩１ｇ当たり約６０ｍｌであった。粉末Ｘ線回析の結果を図１に示す。８．７°、１１．８°２６．６°、３０．１°にピークを有していた。
【００３１】
実施例２  中性領域でのＰＱＱ溶液からの塩化カリウムによる塩析
ＰＱＱジナトリウム塩を５g/Lになるように水に加え、ＮａＯＨでpＨ６から８になるように調整した。これに３０重量％塩化カリウム水溶液を加え、遠心分離して上澄みを取り、pＨ７．４のリン酸バッファーで希釈し、ＵＶ（３６０nm)分析によりＰＱＱ濃度を測定した。上記の２種類の液を等量加えて得られた沈殿から、実施例１と同様にして結晶を単離したところ実施例１と同様な回折ピークを有するＰＱＱトリカリウム塩結晶が収率９９．８モル％で得られた。廃液量はＰＱＱジナトリウム塩１ｇ当たり、約４００ｍｌ程度であった。
【００３２】
実施例３  ＰＱＱジカリウム塩の結晶
実施例１で調製したＰＱＱトリカリウム塩の結晶３ｇをイオン交換水５０ｍＬとエタノール５０ｍＬの混合液に加えた。この時、固体は溶けきっていない。ここに室温下で塩酸を加え、ｐＨを３．５にした。塩酸の添加は約２時間かけてゆっくり滴下して行った。ｐＨが安定した後、５０℃で２日間保存することで結晶化を進めた。濾過してＰＱＱジカリウム塩結晶を収率９９mol％で得た。また、イオンクロマトグラフィー、ＬＣ分析でＰＱＱジカリウムであることを確認した。ここで得た結晶を減圧乾燥した後、粉末Ｘ線回折を実施例１と同様に行った結果を図２に示す。１０．１°、１５．１°、２０．３°、２４．２°、３１．３°にピークを示す結晶であった。この結晶１ｇあたり、約３４ｍｌの廃液が出る。溶解度以上の領域で結晶化を行うので廃液量が少ない。
【００３３】
比較例１  ＰＱＱジカリウム塩の結晶
実施例１で調製したＰＱＱトリカリウム塩１ｇをイオン交換水２００ｍｌに溶解した。塩酸を加えてｐＨを３．２にした後、ここにエタノールを３００ｍＬ添加した。冷蔵庫で2日間保存し、赤色固体を析出させた。室温下で５時間攪拌した後、５℃で２４時間静置し、固体を析出させた。ろ過して固体を回収し、５０℃で減圧乾燥を行った。０．８２ｇの固体を得た。
得られた固体の粉末Ｘ線回折スペクトルを実施例１と同様の条件で測定した。結果を図３に示す。ブロードなピークで１５．１°，２０．７°，２６．８°，２８．６°に大きなピークを示した。多くのピークが重なり、混合物の可能性が高い。ピークの位置が本発明の実施例の結晶と異なっており、結晶形が異なっていることがわかった。また、１ｇの結晶当たり約６００ｍｌの廃液が出てくる。実施例３と比較して１５倍以上も廃液量が多くなる。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明のＰＱＱカリウム塩の結晶は医薬や機能性食品等の分野で有用である。
【図１】
2012136465.tif 000003
【図２】
2012136465.tif 000004
【図３】
2012136465.tif 000005