(57)【要約】【課題】免疫クロマト法により食品中の動物肉タンパク質を、非特異的反応を惹起すること無く高性能、かつ高感度に行なうための最適な検出キットを提供することである。【解決手段】食品中の動物肉由来タンパク質を被検出物質として免疫クロマト用抽出展開液により抽出された抽出液は、免疫クロマトグラフィー装置へ直接供給され、移動相を構成する展開液として免疫クロマト装置中の標識物質保持部に乾燥保持された金ナノ粒子標識試薬を溶出し、その溶出された金ナノ粒子標識試薬とともに展開されるものであって、抽出展開液が０．０３〜１ｗ／ｖ％のＨＬＢ値が１２〜１８である非イオン界面活性剤、及び、０．０１〜０．５Ｍのアルカリ金属無機塩を含有する水溶液からなることを特徴とする、免疫クロマトグラフィー装置と免疫クロマト用抽出展開液とを備える免疫クロマト検出キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料供給部、標識試薬保持部、検出試薬が担持された免疫クロマトグラフ媒体部、および吸水部からなる免疫クロマトグラフィー装置と、食品中の動物肉由来タンパク質を被検出物質として抽出し、その抽出された抽出液を免疫クロマトグラフィー装置へ供給し、金ナノ粒子標識試薬とともに展開させ、被検出物質を検出するための免疫クロマト用抽出展開液と、を備える免疫クロマト検出キットにおいて、
抽出液は、免疫クロマトグラフィー装置へ直接供給され、移動相を構成する展開液として免疫クロマト装置中の標識試薬保持部に乾燥保持された金ナノ粒子標識試薬を溶出し、その溶出された金ナノ粒子標識試薬とともに展開されるものであって、抽出展開液が０．０３〜１ｗ／ｖ％のＨＬＢ値が１２〜１８である非イオン界面活性剤、及び、０．０１〜０．５Ｍのアルカリ金属無機塩を含有する水溶液からなることを特徴とする食品中の動物肉由来タンパク質を検出するための免疫クロマト検出キット。
【請求項２】
食品が加工食品であり、免疫クロマト用抽出展開液が０．０３〜０．３ｗ／ｖ％のＨＬＢ値が１２〜１８である非イオン界面活性剤、０．０１〜０．３Ｍのアルカリ金属無機塩、及び、０．０５〜０．５ｗ／ｖ％のカゼインを含有する水溶液からなることを特徴とする請求項１に記載の免疫クロマト検出キット。
【請求項３】
検出試薬を担持し金ナノ粒子標識試薬を形成する前の金コロイド液が、平均粒子径２０〜１５０ｎｍ及び分散度係数０．１以下で分散された金ナノ粒子からなることを特徴とする請求項１に記載の免疫クロマト検出キット。
【請求項４】
動物肉が豚肉である請求項１に記載の免疫クロマト検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品中、特に食肉あるいは加工肉を含む食品中に含まれる動物肉由来タンパク質を免疫クロマト法により検出する為の免疫クロマト検出キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）といった牛感染症のヒトへの感染の危険性が、ＥＵ科学運営委員会の意見として報告されて以来、ＢＳＥ感染牛の肉骨粉の家畜飼料への使用が問題視され、また、ブランド牛肉に対する偽装ブランド肉の問題や他の肉類の牛肉への偽装といった問題にも一般消費者の関心が集まってきている。
一方で、食品中に含まれる動物肉由来（牛、豚、鶏など）の食物アレルゲンに対して食物アレルギー患者は、喘息、皮膚炎、胃腸障害、アナフィラキシーショックといったさまざまなアレルギー症状を引き起こし、時には深刻な事態に至るケースもある。食物アレルギー患者は増加傾向にあることもあって、食品への安全性に関する消費者の関心は非常に高まっている。
【０００３】
食物アレルゲン含有物質として代表的な食品としては、穀類（そば、小麦等）、卵類、肉類（牛、豚、鶏など）、魚類（サバ、イワシ等々）、牛乳類、甲殻類（カニなど）、軟体動物類、豆類（落花生、大豆など）、果実類（マンゴーなど）、野菜類（ニンニクなど）などが一般的には良く知られており、これらの食物アレルギー誘発食品中には、グルテン、ゼラチン、カゼイン、オボアルブミン、オボムコイド、リゾチーム、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン等々といった食物アレルギー誘発成分が含まれている。加工食品中には、多数の食品や多数の食物アレルゲンが含まれているが、これらを簡便に検出し識別することは出来ないのが現状である。
【０００４】
近年、免疫イムノクロマトグラフィー用ストリップ形式のイムノアッセイは、抗体の持つ特異的反応性を利用して、試料液中の抗原を検出する簡便な体外診断キットもしくは携帯用診断装置として重要性が高まっている。特に、妊娠検査キットは、一般用医薬品としても販売されている身近な免疫イムノクロマトグラフィー装置である。また、最近では、インフルエンザウィルスや細菌といった病原体に対する感染の有無を検査するための免疫クロマトグラフィー法に基づく簡便な検査具についても研究開発が進められてきた。
【０００５】
食品検査は、多数の食品試料を短時間で検査することが求められており、免疫クロマト検出法はその迅速性と簡便性から汎用性の高い手法である。金ナノ粒子で抗体を担持し標識試薬として用いるイムノクロマトグラフィー法検査薬は、安価で操作が簡便であり、検査も短時間で終わることから、ノイズが少ない希薄な抽出試料中の微量特定成分の検出に使われている。しかしながら、ノイズとなる夾雑物を多く含有する食肉や加工肉、あるいはそれらを含む食品試料中から被検出物質を高濃度で抽出するための操作は、試料の粉砕や濾過などの操作が煩雑であるという問題点があった。また、抽出が簡便に効率的に行われたとしても、免疫クロマト検出において標識試薬の凝集による展開不良や非特異反応による偽陽性を抑制することが困難となるという問題があった。
【０００６】
動物肉由来タンパク質を含む食品としては、１種のみの動物種からなる生肉や２種以上の動物生肉が混合された生ひき肉等の非加工食品が含まれるが、特に加工処理（加熱、加圧、酵素処理、凍結、乾燥、塩蔵など）された食品では、加工処理により食品中の動物肉タンパク質成分が分子構造的に変性もしくは分子修飾されノイズとなってしまうため、非加工食品以上のノイズが多い抽出試料となり、免疫クロマト検出がより困難となる。食品中の動物肉由来タンパク質を簡便に検出するには、加工処理された成分と加工処理されていない生の成分のノイズ種やノイズ含有量が異なることから、それぞれに対応した適切な免疫クロマト用抽出液、展開液あるいは標識試薬等を用いることが肝要であり、その模索と研究が進められてきた。
【０００７】
例えば、缶詰食品や家畜用飼料といった試料中に存在する高温、例えば１００℃を超える温度条件で加熱処理された牛、豚、鶏に代表される動物性組織由来の原料を検出するための検出試薬として、前記動物性組織由来の原料を１２０℃以上の温度で加熱処理された血清アルブミンに対する抗体またはその抗原接合性フラグメントが、標識物質により修飾された標識抗体（標識試薬）と、前記血清アルブミンに対する抗体またはその抗原接合性フラグメントが固定された検出領域を備えた担体とを有する免疫クロマト検出試薬が開発されている。その検出系では、１０倍量の０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（非イオン界面活性剤）と１５０ｍＭ塩化ナトリウム含む溶液により肉骨粉を含む試料から検出対象物質を抽出し、その抽出液を１００〜５０００倍の希釈倍率で希釈した希釈液を展開し免疫クロマト法による検出が行われている。（特許文献１参照）
【０００８】
上記のこれまでの検出方法では、金ナノ粒子を標識試薬として用いる系で非特異反応を避けるため、ノイズが多い高濃度の抽出試料からノイズの少ない希薄な抽出試料へ返還させる等、煩雑な操作が必要であり、かつ、高温抽出等の特殊な処理を必要としていた。例えば、特許文献２では、食品中のアレルゲン物質（タンパク質）を免疫学的測定で検出する際に用いる検体希釈液として、０．０５〜０．５ｗ／ｖ％の非イオン界面活性剤と０．５〜２．５Ｍの無機塩を含有させているが、その検体希釈液による試料の希釈の前に、塩化カリウムを含む溶液で１００℃もの高温での抽出や、遠心分離などの煩雑な操作が行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−３１７２２６号公報
【特許文献２】特開２００９−８５９１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、免疫クロマト法により食品中の動物肉由来タンパク質（被検出物質）を、迅速で簡便に抽出し、直接免疫クロマト装置へ供給し展開しても非特異的反応を惹起すること無く迅速、簡便、高性能、かつ高感度に検出を行なうための最適な免疫クロマト検出キットを提供することである。
さらに詳しくは、前記抽出展開液により抽出された被検出物質を含む抽出液を、免疫クロマトグラフィー装置中に乾燥保持された金ナノ粒子標識試薬とともに展開させる免疫クロマト検出系によって検出するための免疫クロマト検出キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、食品中の動物肉由来タンパク質を被検出物質として検出する免疫クロマト検出に係る。本発明の免疫クロマト検出は１つの被検出物質に対し親和性を有する２つの検出物質によりサンドイッチ法で抗原となる被検出物質を捕捉し検出するものであり、検出物質の一方又は両方が被検出物質と特異的親和性を有していれば良い。例えば、従来から汎用される抗原に対する抗体など種々用いられ、抗体の場合はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、あるいはその両方を用いることができる。
【００１２】
本発明者等は、食品中の動物肉由来タンパク質の被検出物質を、ノイズが多い高濃度の夾雑物を含む抽出試料として抽出し、その抽出された抽出液を免疫クロマトグラフィー装置へ供給し、金ナノ粒子標識試薬とともに展開させ、被検出物質を検出する検出系において、特定の組成の免疫クロマト用抽出展開液を、免疫クロマトグラフィー装置中の標識物質保持部に金ナノ粒子標識試薬を乾燥保持させる免疫クロマト検出系で用いると、ノイズが多い高濃度の夾雑物を含む抽出試料であっても微量の被検出物質を、非特異反応を惹起することなく高感度に検出できることを知見したものである。
【００１３】
本発明は、下記の（ａ）〜（ｄ）の検出キットを提供するものである。
（ａ）試料供給部、標識試薬保持部、検出試薬が担持された免疫クロマトグラフ媒体部、および吸水部からなる免疫クロマトグラフィー装置と、食品中の動物肉由来タンパク質を被検出物質として抽出し、その抽出された抽出液を免疫クロマトグラフィー装置へ供給し、金ナノ粒子標識試薬とともに展開させ、被検出物質を検出するための免疫クロマト用抽出展開液と、を備える免疫クロマト検出キットにおいて、抽出液は、免疫クロマトグラフィー装置へ直接供給され、移動相を構成する展開液として免疫クロマト装置中の標識試薬保持部に乾燥保持された金ナノ粒子標識試薬を溶出し、その溶出された金ナノ粒子標識試薬とともに展開されるものであって、抽出展開液が０．０３〜１ｗ／ｖ％のＨＬＢ値が１２〜１８である非イオン界面活性剤、及び、０．０１〜０．５Ｍのアルカリ金属無機塩を含有する水溶液からなることを特徴とする食品中の動物肉由来タンパク質を検出するための免疫クロマト検出キット。
（ｂ）食品が加工食品であり、免疫クロマト用抽出展開液が０．０３〜０．３ｗ／ｖ％のＨＬＢ値が１２〜１８である非イオン界面活性剤、０．０１〜０．３Ｍのアルカリ金属無機塩、及び、０．０５〜０．５ｗ／ｖ％のカゼインを含有する水溶液からなることを特徴とする前記（ａ）に記載の免疫クロマト検出キット。
（ｃ）検出試薬を担持し金ナノ粒子標識試薬を形成する前の金コロイド液が、平均粒子径２０〜１５０ｎｍ及び分散度係数０．１以下で分散された金ナノ粒子からなることを特徴とする前記（ａ）に記載の免疫クロマト検出キット。
（ｄ）動物肉が豚肉である前記（ａ）に記載の免疫クロマト用抽出展開液。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の免疫クロマト検出キットを用いれば、抽出展開液により室温での検出に十分な量の被検出物質が短時間で抽出され、抽出された抽出液は免疫クロマトグラフィー装置へ直接展開でき、装置中の標識試薬保持部に乾燥保持された金ナノ粒子標識試薬を溶出しながら展開できるため、迅速で簡便な操作で食品中の動物肉由来タンパク質を被検出物質として検出することができる。また、本発明の免疫クロマト検出キットを用いれば、ノイズとなる夾雑物の抽出を抑制し被検出物質を高濃度で抽出することができ、展開中の夾雑物と検出物質との非特異反応を抑制できるため、抽出時と展開検出時の双方において非特異反応や標識試薬の非特異的凝集による偽判定（偽陽性）を惹起すること無く、高感度で正確な検出が行える。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の免疫クロマト検出キットは、展開方向上流から順に、被検出物質として抽出された食品中の動物肉由来タンパク質を含む試料液を供給するための試料供給部、被検出物質の標識に用いられる検出物質が担持されてなる金ナノ粒子標識試薬を乾燥保持するための標識試薬保持部、被検出物質を捕捉するための検出試薬が担持された検出部を含む免疫クロマトグラフ媒体部、展開された液を吸収するための吸水部、からなる免疫クロマトグラフィー装置と、免疫クロマト用抽出展開液と、を備える。また、本発明の免疫クロマト検出キットに備えられる免疫クロマト用抽出展開液は、０．０３〜１ｗ／ｖ％のＨＬＢ値が１２〜１８である非イオン界面活性剤、及び、０．０１〜０．５Ｍのアルカリ金属無機塩を含有する水溶液であり、その抽出展開液により抽出された被検出物質を含む抽出液を免疫クロマトグラフィー装置へ直接供給し、移動相を構成する展開液として標識試薬保持部に乾燥保持された金ナノ粒子標識試薬を溶出し、その溶出された金ナノ粒子標識試薬とともに被検出物質を展開する態様で用いられる。
【００１６】
食品が加工処理された加工食品の場合、加工処理により食品中の動物肉タンパク質成分が分子構造的に変性もしくは分子修飾されてしまい、被検出物質以外の夾雑物の抽出割合が増大し非特異的凝集や非特異反応が起こりやすくなるため、本発明の免疫クロマト検出キットが備える免疫クロマト用抽出展開液は、０．０３〜０．３ｗ／ｖ％のＨＬＢ値が１２〜１８である非イオン界面活性剤、０．０１〜０．３Ｍのアルカリ金属無機塩、及び、０．０５〜０．５ｗ／ｖ％のカゼインを含有する水溶液からなることがより好ましい。
【００１７】
検出の原理を概説すると、
１．試料（例えば、動物肉類を含む食品から抽出展開液により抽出される動物肉由来タンパク質の被検出物質を含む水溶液）を、試料添加部に所定量(通常、５０〜１０００μＬ)供給する。試料が供給されると、試料添加部中を試料が移動を始め、移動相を構成する展開液として展開される。
２．その後、試料（例えば、動物肉類を含む食品から抽出展開液により抽出される動物肉由来タンパク質の被検出物質を含む水溶液）は、まず標識試薬保持部へと移動する。ここを試料が通過する際、標識試薬保持部に保持されていた金ナノ粒子標識試薬が試料の水分に溶解し、試料と共に移動する。
３．ついで、試料の水分に溶解した標識試薬は、免疫クロマトグラフ媒体部中の検出部を展開し通過する。ここでは、抗原・抗体の結合反応などにより、試料中に検出対象の動物肉由来タンパク質が含まれている場合には、検出部に保持、即ち、担持固定されている検出物質（抗体）と金ナノ粒子標識試薬とによってサンドイッチ状に挟まれるように特異的に反応結合して、検出部が金ナノ粒子の発色により着色する。試料中に対象の動物肉由来タンパク質が含まれていない場合には、試料の水分に溶解した標識試薬は、クロマトグラフィー媒体上の検出部を通過しても結合反応が起こらないので、検出部が着色しない。
４．最後に、試料の水分及び余剰の標識試薬は、吸水部へと移動する。
このようにして、食品中の対象の動物肉の有無を正確に判定することができる。
【００１８】
本発明の免疫クロマト検出キットに使用される抽出展開液中のＨＬＢ値が１２〜１８である非イオン性界面活性剤は、夾雑物の抽出を抑制し被検出物質の高濃度の抽出、金ナノ粒子標識試薬の溶出と展開速度の促進、及び、展開ムラの抑制のために加える。ＨＬＢ値が１２〜１８である非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（商品名「Ｔｗｅｅｎ」シリーズ）、ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（商品名「Ｔｒｉｔｏｎ」シリーズ）、ポリオキシエチレンｐ−ｔ−ノニルフェニルエーテル（商品名「ＴｒｉｔｏｎＮ」シリーズ）、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテル等を挙げることができる。より具体的に「Ｔｗｅｅｎ」シリーズでは、特にＴｗｅｅｎ２０（商品名、ＨＬＢ値１６．７）、Ｔｗｅｅｎ４０（商品名、ＨＬＢ値１５．６）、Ｔｗｅｅｎ６０（商品名、ＨＬＢ値１５．０）、Ｔｗｅｅｎ８０（商品名、ＨＬＢ値１４．９）、「Ｔｒｉｔｏｎ」シリーズでは、特にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名、ＨＬＢ値１３．５）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（商品名、ＨＬＢ値１３．１）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１０２（商品名、ＨＬＢ１４．６）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１６５（商品名、ＨＬＢ１５．８）、ＴｒｉｔｏｎＸ−４０５（商品名、ＨＬＢ１７．９）、「ＴｒｉｔｏｎＮ」シリーズでは、特にＴｒｉｔｏｎＮ−１０１（商品名、ＨＬＢ１３．５）、ＴｒｉｔｏｎＮ−１１１（商品名、ＨＬＢ１３．８）、ＴｒｉｔｏｎＮ−１５０（商品名、ＨＬＢ１５．０）を挙げることができ好適に用いられる。ＨＬＢ値が１２〜１８である非イオン性界面活性剤は、単独でも２種以上を混合しても用いることが出来る。最適には、「Ｔｗｅｅｎ」シリーズのＴｗｅｅｎ２０（商品名、ＨＬＢ値１６．７）、Ｔｗｅｅｎ４０（商品名、ＨＬＢ値１５．６）、Ｔｗｅｅｎ６０（商品名、ＨＬＢ値１５．０）、Ｔｗｅｅｎ８０（商品名、ＨＬＢ値１４．９）が単独で用いられる。
【００１９】
本発明の免疫クロマト検出キットに使用される抽出展開液中に使用するＨＬＢ値が１２〜１８である非イオン性界面活性剤の含有量としては、０．０３〜１ｗ／ｖ％の範囲である。０．０３ｗ／ｖ％未満では、抽出時の被検出物質の抽出効率の低下、展開時の展開速度の低下や展開ムラによる判定の識別性の低下が生じてしまう。１ｗ／ｖ％を超えると抽出時及び展開時の標識試薬の非特異的凝集が生じるばかりか、夾雑物と検出物質の親和性が増大し非特異反応が生じてしまう。
【００２０】
食品が加工処理（加熱、加圧、酵素処理、凍結、乾燥、塩蔵など）された加工食品の場合、加工処理により食品中の動物肉タンパク質成分が分子構造的に変性もしくは分子修飾されてしまい、被検出物質以外の夾雑物の抽出割合が増大しノイズが多い抽出試料となるため、検出部での非特異反応に起因する偽判定（偽陽性）生じやすくなる。そのため、本発明の免疫クロマト用抽出展開液中に使用されるＨＬＢ値が１２〜１８である非イオン性界面活性剤の含有量としては、０．０３〜０．３ｗ／ｖ％の範囲が更に好ましく用いられる。
【００２１】
本発明の免疫クロマト検出キットに使用される抽出展開液中のハロゲン化アルカリ金属塩は、食品中のタンパク質成分の抽出率を高め、展開時の夾雑物と検出物質との非特異反応を抑制するために加える。ハロゲン化アルカリ金属塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化セシウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム等を挙げることができる。好ましくはナトリウム、カリウムの塩化物あるいは臭化物、より好ましくは塩化ナトリウム、塩化カリウムが用いられる。
【００２２】
本発明の免疫クロマト用抽出展開液中に使用されるハロゲン化アルカリ金属塩の含有量としては、モル濃度で０．０１〜０．５Ｍの範囲である。０．０１Ｍ未満では、抽出時の抽出効率の低下に伴い検出感度が低下してしまう。０．５Ｍを超えると展開速度が遅く展開ムラも生じやすくなり、また、抽出効率は増大するが、被検出物質と検出試薬との反応性が著しく低下し検出感度が低下してしまう。
【００２３】
食品が加工処理（加熱、加圧、酵素処理、凍結、乾燥、塩蔵など）された加工食品の場合、加工処理により食品中の動物肉タンパク質成分が分子構造的に変性もしくは分子修飾されてしまい、被検出物質以外の夾雑物の抽出割合が増大し抽出時の被検出物質と夾雑物との非特異的凝集や展開時の標識試薬と夾雑物との非特異的凝集に起因する感度低下が起こりやすくなる。そのため、本発明の免疫クロマト用抽出展開液中に使用されるハロゲン化アルカリ金属塩の含有量としては、０．０１〜０．１Ｍの範囲が更に好ましく用いられる。
【００２４】
また、本発明に用いる免疫クロマト用抽出展開液には、生物学的親和性に基づく副反応を抑制したり、非特異的反応を抑制したりすることが公知の添加剤、例えば、抗原抗体反応の促進あるいは非特異的反応を抑制するためのタンパク質（例えば、牛血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン等）や高分子化合物（例えば、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、デキストラン等）などのブロッキング剤、イオン性界面活性剤又はポリアニオン（例えば、デキストラン硫酸、ヘパリン、ポリスチレンスルホン酸、コンドロイチン硫酸等）、ｐＨ緩衝剤（例えば、リン酸塩、炭酸塩、アミノ酸塩、あるいは、Ｔｒｉｓ、ＴＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ等のグッドバッファー等）、防腐剤あるいは抗菌剤等々の１種もしくは２種以上を添加して使用することも可能かつ有効であって、何ら妨げるものではない。また、これらの抗原抗体反応の促進あるいは非特異的反応を抑制するためのタンパク質、高分子化合物、イオン性界面活性剤又はポリアニオン、防腐剤あるいは抗菌剤等々の１種もしくは２種以上を、固定相を構成する免疫クロマトグラフィー装置中の、移動相の移動経路中に保持させておくことも可能かつ有効であって、何ら妨げるものではない。
【００２５】
特に、食品が加工処理（加熱、加圧、酵素処理、凍結、乾燥、塩蔵など）された加工食品の場合、処理により食品中の動物肉由来タンパク質が分子構造的に変性もしくは分子修飾されてしまい、被検出物質以外の夾雑物の抽出割合が増大し非特異的凝集や非特異反応が起こりやすくなるため、抗原抗体反応の促進あるいは非特異的反応を抑制するためのタンパク質（例えば、牛血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン等）ブロッキング剤や市販の合成高分子ブロッキング剤を更に加えることが好ましい。カゼインを用いると非特異反応などの抑制効果がより高く、最適に用いられる。中でも、カゼインを用いる場合は、免疫クロマト用抽出展開液中の含有量が０．０５〜０．５ｗ／ｖ％の範囲で用いることが好ましい。０．０５ｗ／ｖ％未満では、免疫クロマトの抽出時においては被検出物質と食品中の他のタンパク質の非特異的凝集により被検出物質が展開され難くなり感度の低下などが十分抑制されず、展開時においては非特異反応の抑制効果が得られず偽判定（偽陽性）が生じることがある。０．５ｗ／ｖ％を超えて用いると、被検出物質と検出物質との親和性が低下し検出反応が抑制され十分な感度が得られない場合がある。また、加工処理された食品の検出系において、タンパク質ブロッキング剤や市販の合成高分子ブロッキング剤を加える場合は、ｐＨ７〜９のｐＨ緩衝剤を更に加えることがより好ましい。ｐＨ緩衝剤の添加は、対象食品のｐＨは酸性から塩基性まで様々なものがあるため、ｐＨを免疫反応検出に最適なｐＨに制御することで感度の低下を抑制することができる。また、ブロッキング剤による被検出物質と検出物質との親和性の低下を抑制する機能も有している。ｐＨ７〜９のｐＨ緩衝剤としては、従来から用いられる、リン酸塩、炭酸塩、アミノ酸塩、あるいは、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ等のグッドバッファー等が挙げられるがｐＨ７〜９で緩衝作用を示すものであればそれらに限らず用いられる。
【００２６】
本発明の免疫クロマト検出キットに用いられる抽出展開液は、ノイズとなる夾雑物を多く含む食品中であっても、動物肉由来タンパク質を被検出物質として高濃度で抽出し、その抽出された抽出液を免疫クロマトグラフィー装置へ直接供給できる。例えば、被検出物質を抽出した抽出液を免疫クロマトグラフィー装置中の試料供給部へそのまま添加、または免疫クロマトグラフィー装置中の試料供給部を抽出液へ浸漬し、免疫クロマトグラフィー装置へ被検出物質を含む試料を直接供給が可能であり、従来法のように希釈や濾過分離などの煩雑な操作を行う必要がない。また、本発明の免疫クロマト用抽出展開液を用いる免疫クロマト検出は、乾燥保持された金ナノ粒子標識試薬と共に展開させることで検出を行うため、標識試薬溶液と抽出展開液を予め混合し展開させる手法で生じやすい非特異的凝集などを抑制でき、高感度で正確な検出を可能とする。
【００２７】
本発明の免疫クロマト検出キットは、検出試薬を担持し金ナノ粒子標識試薬を形成する前の金コロイド液が、分散度係数０．１以下で分散された金ナノ粒子からなる金ナノ粒子標識試薬を用いる系で好ましく用いられる。分散度係数が０．１を超えると、単位濃度あたりの発色度が減少し免疫クロマト検出感度が低下することがあり、また、乾燥保持された金ナノ粒子標識試薬が抽出展開液で溶出される際に非特異的凝集や検出の際に非特異反応による偽判定（偽陽性）が生じやすくなる。また、検出試薬を担持し金ナノ粒子標識試薬を形成する前の金コロイド液が、分散度係数０．０８以下で分散された金ナノ粒子を用いるとより発色性が向上するため最適である。その分散度係数は、例えば金ナノ粒子が分散された金コロイド液を、一般的な動的光散乱法粒度分布計などで分析し測定できる。
【００２８】
本発明の免疫クロマト検出キットは、食品中の種々の動物肉由来タンパク質を免疫クロマト検出する系で用いられるが、より高感度な検出が可能な豚肉由来タンパク質を検出する系で好ましく用いられる。
【００２９】
以下、本発明の免疫クロマト用抽出展開液を備える免疫クロマト検出キットの構成について例示し詳細に説明する。
【００３０】
〔免疫クロマト用抽出展開液〕
本発明の免疫クロマト検出キットに備えられる抽出展開液は、本発明の免疫クロマト検出法において移動相を構成する水溶液である。また、固定相である免疫クロマトグラフィー装置中を、食品中から抽出される被検出物質を含む抽出液及び金ナノ粒子標識試薬と共に移動するものである。抽出展開液使用量は、食品試料量に対し１〜７倍重量で用いることが好ましい。
【００３１】
〔試料供給部〕
試料供給部（「サンプルパッド」とも言う）は、免疫クロマトグラフィー装置中の展開方向最上流に位置し、本発明の免疫クロマト用抽出展開液により抽出された被検出物質を含む試料を添加、あるいは試料に浸漬し供給するための部位である。その素材は、毛管現象により試料が迅速に吸収されるが、保持力は弱く、速やかに反応部へと試料が移動していくような性質のものであれば特に限定されず、一般的には、ニトロセルロース膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等の複数の多孔性物質からその目的に応じたものを選択して用い、展開方向下流の標識試薬保持部の一部もしくは全部が毛管で繋がるように配置される。また、標識試薬保持部を試料供給部として用いても良い。
【００３２】
〔標識試薬〕
標識試薬は、被検出物質を標識し発色させるための試薬であり、金ナノ粒子からなる標識物質に検出試薬が担持（感作）されてなる試薬である。金ナノ粒子に検出物質を担持する方法としては、物理吸着や化学結合などの公知の方法が使用できる。例えば、コロイド状金ナノ粒子に検出試薬として被検出物質に対する抗体を感作した標識試薬では、金粒子がコロイド状に分散した溶液に抗体を加えて物理吸着させた後、牛血清アルブミン溶液などのブロッキングタンパクを添加して抗体が未結合である粒子表面をブロッキングすることにより調製することができる。標識試薬は、被検出物質に親和性を有する検出物質を有するため、被検出物質との複合体を形成し被検出物質を標識することが可能となる。標識物質に用いる金ナノ粒子は、金を主成分とする粒子であれば他の金属との合金粒子やコア・シェル型の粒子であっても良く、その発色は粒子の形状や組成により様々な色を呈するが特に限定されない。免疫クロマトグラフ媒体部上での識別力から、赤色、紫色あるいは青色の粒子が好ましく用いられる。金ナノ粒子の平均粒子径は、特に強い色調が得られる２０ｎｍ〜１５０ｎｍがより好ましく、３０〜１００ｎｍの範囲内であることがさらに好ましい。また、その金ナノ粒子の粒度分布は単一ピークであることが好ましい。その平均粒子系は、例えば金ナノ粒子が分散された金コロイド液を、一般的な動的光散乱法粒度分布計などで分析し測定できる。
【００３３】
〔標識試薬保持部〕
標識試薬保持部は、免疫クロマトグラフィー装置内の試料供給部と免疫クロマトグラフ媒体部との間に位置し、標識物質に検出物質を担持（感作）した標識試薬を乾燥保持させるための部位である。その素材は、毛管現象により試料が迅速に吸収されるが、保持力は弱く、速やかに反応部へ標識試薬を溶出すると共に試料が移動していくような性質のものであれば特に限定されず、一般的には、ニトロセルロース膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等の複数の多孔性物質からその目的に応じたものを選択して用い、展開方向上流の試料供給部と展開方向下流のクロマトグラフ媒体部との一部もしくは全部が毛管で繋がるように配置される。また、標識試薬保持部は、試料供給部として併用しても良い。
【００３４】
〔免疫クロマトグラフ媒体部〕
免疫クロマトグラフ媒体部は、毛管現象を示す微細多孔性物質からなる不活性のものであって、短時間での判定で十分な感度が得られる展開速度を有していれば、特にその素材が限定されるものではなく、展開方向上流の標識試薬保持部及び展開方向下流の吸水部の一部もしくは全部が毛管で繋がるように配置される。本発明において、免疫クロマトグラフ媒体部の素材としては、シリカ、チタニア、ジルコニア、セリア、アルミナ等のセラミック微粒子又は有機高分子の微粒子、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、ニトロセルロース又は酢酸セルロース等のセルロース誘導体等で構成される繊維状又は不織繊維状マトリクス、膜、濾紙、ガラス繊維濾紙、布、綿等が挙げられる。微粒子はそれ自体が多孔性でなくとも、充填された状態では微粒子間に空隙が生じ免疫クロマトグラフ媒体として機能する。好ましくはセルロース誘導体やナイロンの膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等であり、より好ましくはニトロセルロース膜、セルロースエステル混合物膜、ナイロン膜、濾紙である。
免疫クロマトグラフ媒体部は、標識試薬と複合体を形成した被検出物質、または、被検出物質を捕捉した後に形成される標識試薬との複合体、を検出するための検出試薬が担持された検出部を有する。検出部に用いる検出試薬は、被検出物質と親和性を有していれば標識試薬に用いる検出物質と同一であっても異なっていても良く、どちらか一方が被検出物質と特異的な親和性を有しているものであれば良い。
免疫クロマトグラフ媒体部は、金ナノ粒子標識試薬の展開の有無や展開速度を確認するため、検出部の下流に、金ナノ粒子標識試薬中の標識物質や被検出物質である動物肉タンパク質などと広く親和性を有するヤギ由来抗血清を塗布したコントロール部（コントロールライン）を設けても良い。検出キットが正常に機能し展開不良が無ければ、コントロール部では、陽性、陰性に関わらず検出部で捕捉されない金ナノ粒子標識試薬が捕捉され発色するため、展開の有無や展開速度を確認することができる。
【００３５】
〔吸水部〕
吸水部は、免疫クロマトグラフィー装置の展開方向の最下流に位置し、展開した試料、余剰の標識試薬を吸収するための部位である。その素材は、過剰の試料や標識試薬を迅速に吸収し保持する能力を有する材料であれば特に限られないが、セルロース系繊維やポリアクリル繊維などの吸水性繊維や粒子を含む濾紙やパッドを用いることが好ましい。
【００３６】
本発明の実施に供される免疫クロマトグラフィー装置の形態及び大きさは特に制限されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。操作をより簡便にするためには、反応部位が表面に形成されているクロマトグラフ媒体部の裏面に、プラスチックや水溶液非透過性のポリマーシート（バッキングシート）等よりなる支持体を設けることが好ましい。この支持体の性状は特に制限されるものではないが、目視判定によって測定結果の観察を行う場合には、支持体は、標識物質によりもたらされる色彩と類似しない色彩を有するものであることが好ましく、通常、無色又は白色であることが好ましい。
【００３７】
本発明の免疫クロマト検出方法は、食品中の動物肉由来タンパク質を被検出物質として免疫クロマト用抽出展開液により抽出する工程、その抽出された抽出液を免疫クロマトグラフィー装置へ供給する工程、供給された液が移動相を構成する展開液として機能し、被検出物質を金ナノ粒子標識試薬とともに展開させる工程、検出部において金ナノ粒子標識試薬、被検出物質及び免疫クロマトグラフ媒体部中に担持された検出試薬からなる複合体として捕捉し検出部での標識物質の発色を検出する工程、からなる免疫クロマト検出方法である。また、本発明の免疫クロマト検出方法に用いられる免疫クロマト用抽出展開液は、０．０３〜１ｗ／ｖ％のＨＬＢ値が１２〜１８である非イオン界面活性剤、及び、０．０１〜０．５Ｍのアルカリ金属無機塩を含有する水溶液が用いられ、その抽出展開液により抽出された被検出物質を含む抽出液を免疫クロマトグラフィー装置へ直接供給し、移動相を構成する展開液として標識試薬保持部に乾燥保持された金ナノ粒子標識試薬を溶出し、その溶出された金ナノ粒子標識試薬とともに展開する態様で用いられる。本発明の免疫クロマト検出方法を用いれば、食品中の動物肉由来タンパク質（被検出物質）を迅速で簡便に抽出し、直接免疫クロマト装置へ供給し展開することで非特異的反応を惹起すること無く迅速、簡便、高性能、かつ高感度に検出することができる。
【００３８】
本発明の免疫クロマト検出方法における食品中の被検出物質の抽出は、展開抽出液１ｍＬに対し対象食品若しくはその断片０．１ｇ以上用いることが好ましく、０．２ｇ以上がより好ましい。抽出操作は、展開抽出液と食品をバイアルなどの容器内で混合し、１０〜６０秒攪拌することで迅速で簡便に行うことができる。また、全ての操作は常温（１０℃〜４０℃）で行うことができる。
【００３９】
本発明の免疫クロマト検出方法において、展開抽出液により抽出された被検出物質を含む抽出液は、そのまま免疫クロマトグラフィー装置中の試料供給部に滴下しても良いし、抽出液中に試料供給部を浸すことにより供給し展開させてもよい。
【００４０】
食品が加工処理された加工食品の場合、加工処理により食品中の動物肉タンパク質成分が分子構造的に変性もしくは分子修飾されてしまい、被検出物質以外の共雑物の抽出割合が増大し非特異的凝集や非特異反応が起こりやすくなるため、本発明の免疫クロマト検出方法に用いられる免疫クロマト用抽出展開液は、０．０３〜０．３ｗ／ｖ％のＨＬＢ値が１２〜１８である非イオン界面活性剤、０．０１〜０．３Ｍのアルカリ金属無機塩、及び、０．０５〜０．５ｗ／ｖ％のカゼインを含有する水溶液からなることがより好ましい。
【００４１】
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体若しくはそのフラグメントは、公知の方法により調製することができる。抗体産生動物種としては、通常、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット等々である。
モノクローナル抗体は、常法に従って、抗原（検出体小動物種の動物肉から抽出される蛋白質）で免疫したマウスの脾臓細胞と骨髄腫細胞をハイブリッドさせ、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選択し、このハイブリドーマから産生されてくるモノクローナル抗体を収得する。例えば、ケーラーとミルスタインの技法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５）４９５−４９７）を参照。
【００４２】
ポリクローナル抗体は、常套手法により、抗原（検出対象動物種の動物肉から抽出される蛋白質）を産生動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ウマ、ブタ、鶏等）に免疫して得た抗血清中から目的とする抗体を分離することにより収得する。例えば、ベルガーらの文献（Ｊ．ＡＳＳＯＣ．ＯＦＦ．ＡＮＡＬ．ＣＨＥＭ．ＶＯＬ．７１，ＮＯ．２，１９８８）を参照。
【実施例】
【００４３】
以下に、本発明で使用するイムノクロマトグラフィー装置を詳細に説明するが、あくまでも一例として示すものであって、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４４】
［試験例１：豚加工肉含有食品中の豚肉由来タンパク質の検出］
１．免疫クロマトグラフ媒体部中の検出部の作製
ニトロセルロースからなる２５×２．５ｃｍの免疫クロマトグラフ媒体（ミリポア社製:ＨＦ１２０)に、抗体塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社製）を用いて２％のＳｔａｂｉｌｉＧｕａｒｄ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ社）および５％のイソプロピルアルコール、炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で０．６５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈した抗豚タンパクポリクローナル抗体（検出物質）を検出部に塗布した。また、金ナノ粒子標識試薬の展開の有無や展開速度を確認するため、検出部の下流に、金ナノ粒子標識試薬中の標識物質や被検出物質である動物肉タンパク質などと広く親和性を有するヤギ由来抗血清をコントロール部（コントロールライン）に塗布した。希釈溶液を４０〜５０℃で６０分間乾燥させた後、室温で一晩乾燥させ、免疫クロマトグラフ媒体部中の検出部及びコントロール部を作製した。
【００４５】
２．金ナノ粒子標識試薬溶液の作製
金コロイド液（金ナノ粒子懸濁液（田中貴金属工業（株）製）：動的光散乱法粒度分布計（Ｍａｌｖｅｒｎ、ゼータサイザーナノーＺＳ、以下同様）による測定で粒度分布曲線は単一ピークを示し、平均粒子径６１．３ｎｍ、分散度係数０．０７２、赤色）０．５ｍＬにＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で０．０２ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈した抗豚タンパクポリクローナル抗体（検出物質）を０．１ｍＬ加え、室温で１０分間静置し感作を行った。次いで、ＣＥ５１０（ＪＳＲ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を０．１ｍＬ加え、リン酸カリウム溶液（ｐＨ７．５）に溶解した１％ポリエチレングリコールを０．０５ｍＬ加えて十分撹拌した後、室温で１０分間静置した。８０００×ｇで１５分間遠心分離を行った。上清を除去した後、１重量％の牛血清アルブミンを含む緩衝液（ｐＨ７．４）０．１ｍＬを加え、金ナノ粒子標識試薬溶液とした。
【００４６】
３．免疫クロマトグラフィー装置の作製
上記作製した標識試薬溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識試薬保持部とした。次いで、バッキングシートから成る基材に、上記調製した検出部が作製された免疫クロマトグラフ媒体部、標識試薬保持部、試料を添加する部分に用いるサンプルパッド（試料供給部）、及び展開した試料や余剰の金ナノ粒子標識試薬を吸収するための吸収パッド（吸水部）を貼り合わせた（図１）。最後にラミネートシールを貼り付けて裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、免疫クロマトグラフィー装置とした。
【００４７】
４．免疫クロマト用抽出展開液の調製
０．９重量％のＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液(ｐＨ７．７)にスキムミルク（８０質量％カゼイン）、Ｔｗｅｅｎ２０（ＨＬＢ値１６．７の非イオン界面活性剤）、塩化ナトリウムをそれぞれ表１に記載の含有量または濃度となるように加え、更に防腐剤としてアジ化ナトリウムを０．１重量％となるように加えて混和し調整した。
【００４８】
【表１】
2012159440.tif 000002
【００４９】
５．抽出試料の作製
上述の４. 免疫クロマト用抽出展開液の調製に記載の抽出展開液０．５ｍＬに対して、加工豚肉を各種重量含有率で含有する豚以外の動物加工肉または植物性タンパク質を含む加工食品（加工大豆）を０．１〜０．２ｇ程度を加えて手で３０秒間振とうし、抽出試料を作製した。各種加工肉および加工大豆は、予め１００℃以上の加熱で処理されたものを用いた。
【００５０】
６．測定
上記作製した免疫クロマトグラフィー装置と免疫クロマト用抽出展開液を備える免疫クロマト検出キット用いて、以下の方法で食品中の豚肉の存在の有無を測定した。すなわち、上記作製した加工豚肉が含まれる加工食品の抽出試料を陽性検体、また上記作製した加工豚肉を含まない（豚肉含有量０重量％）加工肉または加工大豆からの抽出試料を陰性検体とし、サンプルパッドの先端を各抽出試料溶液に直接浸した。金ナノ粒子標識試薬がグラスファイバー製パッドから溶出するのを確認した後、浸していたクロマト媒体を溶液から取り出して水平な台に静置し、１０分後に目視判定した。測定は同一の形態で３回繰返し実験を行った（Ｎ＝３）。
試料供給後１０分で目視判定を行い、検出部に金ナノ粒子の発色による赤い線（テストライン）を確認できるものを「＋」、強く（濃い色で）よりはっきりと確認できるものを「＋＋」、極めて強く確認されるものを「＋＋＋」、赤い線を確認できないものを「−」、弱く（薄い色で）確認されるものを（±）とした。展開ムラは、展開中の液の先端線形を目視する方法で評価した。展開ムラが無い場合は、先端線形が展開方向に垂直な直線形で展開され、展開ムラが有る場合は、展開方向垂直から傾いた直線形あるいは波状の線形で展開される。展開速度は抽出試料導入からコントロールラインに赤色の発色が目視で確認されるまでの時間を測定した。
【００５１】
試験非加工食品として加熱加工された牛肉中に豚肉が、０重量％、０．１重量％、１重量％の各含有量で含有する加工食品について、表１に記載の各抽出展開液（実施形態１〜８、比較形態１〜３）を用いて評価した結果を表２に示す。また、実施形態２の抽出展開液組成物を用い、試験加工食品として加熱加工された牛肉、鶏肉、ラム肉または大豆のそれぞれに含まれる加工豚肉の割合が、０重量％、０．１重量％、０．５重量％の各場合について、評価した結果を表３に示す。
【００５２】
【表２】
2012159440.tif 000003
【００５３】
【表３】
2012159440.tif 000004
【００５４】
表２の結果から、実施形態１〜８全てで、陰性検体での検出は殆ど無く、目視での検出は良好であった。また、展開時の展開ムラは無く、展開速度も１０分後の判定が問題なく行える速度であった。比較形態１では、非イオン界面活性剤の含有量が不十分で、展開速度と感度が低下し、展開ムラも見られた。比較形態２では、塩化ナトリウムの含有量が不十分で、感度が大幅に低下した。比較形態１において、抽出後、展開前にＴｗｅｅｎ２０を適量加えると、展開ムラと展開速度は改善されたが、検出感度は少なかった。比較形態２において、抽出後、展開前に塩化ナトリウムを適量加えても検出感度の改善は見られなかった。
表３の結果から、本発明の免疫クロマト検出キットを用いれば、様々な加工食品種中の豚肉の有無が、免疫クロマト検出によって迅速で正確に確認できた。
【００５５】
また、２.標識試薬溶液の作製において、金コロイド液に用いる金ナノ粒子が、平均粒子径６０．６ｎｍ及び分散度係数０．２０２であること以外は、試験例１と同様に試験を行った場合、展開速度の低下や展開ムラは見られなかったが、検出感度はやや低下し（０．１％の豚肉含有率で±の判定）、標識試薬保持部での標識試薬の凝集による溶出不良が若干見られることがあった。
【００５６】
［試験例２：豚生（非加工）肉含有食品中の豚肉由来タンパク質の検出］
１．免疫クロマトグラフ媒体部中の検出部の作製
検出物質として抗豚タンパクモノクローナル抗体を用いたこと以外は、試験例１と同様に作製した。
【００５７】
２．標識試薬溶液の作製
金コロイド液（金ナノ粒子懸濁液（田中貴金属工業（株）製）：動的光散乱法粒度分布計による測定で粒度分布曲線は単一ピークを示し、平均粒子径４０．５ｎｍ、分散度係数０．０５６、赤色）を用い、ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈した抗豚タンパクモノクローナル抗体（免疫クロマトグラフ媒体部中の検出部の作製で用いた抗体と異なるモノクローナル抗体）を用いたこと以外は、試験例１と同様に作製した。
【００５８】
３．免疫クロマトグラフィー装置の作製
試験例１と同様に作製した。
【００５９】
４．免疫クロマト用抽出展開液の調製
超純水に界面活性剤、塩化ナトリウムをそれぞれ表４に記載の含有量または濃度となるように加え、更に防腐剤としてアジ化ナトリウムを０．１重量％となるように加えて混和し調整した。
【００６０】
【表４】
2012159440.tif 000005
【００６１】
５．抽出試料の作製
上述４. 免疫クロマト用抽出展開液の調製に記載の抽出展開液０．５ｍＬに対して、豚生肉（非加工豚肉）を各種重量含有率で含有する豚以外の動物種の生肉を含む食品を０．１〜０．２ｇ程度を加えて手で３０秒間振とうし、抽出試料を作製した。
【００６２】
６．測定は、試験例１と同様に作製し測定した。
【００６３】
試験非加工食品として牛生肉中に豚生肉が、０重量％、０．０１重量％、０．１重量％の各含有量で含有する生肉食品について、表４に記載の各抽出展開液（実施形態９〜１３、比較形態４〜５）を用いて評価した結果を表５に示す。また、実施形態１０の抽出展開液組成物を用い、試験非加工食品として各種豚以外の生肉（牛肉、鶏肉、ラム肉）それぞれに豚生肉が、０重量％、０．０１重量％、０．１重量％で含有する非加工食品について、評価した結果を表６に示す。
【００６４】
【表５】
2012159440.tif 000006
【００６５】
【表６】
2012159440.tif 000007
【００６６】
表５の結果から、実施形態９〜１３全てで、陰性検体での検出は無く、目視での検出は良好であった。また、展開時の展開ムラは無く、展開速度も１０分後の判定が問題なく行える速度であった。比較形態４では、非イオン界面活性剤の含有量が超過し、陰性検体において非特異的反応による偽陽性見られた（偽判定）。比較形態５では、塩化ナトリウムの含有量が超過し、展開速度が低下し展開ムラが生じるばかりか、感度も大幅に低下した。
表６の結果から、本発明の免疫クロマト検出キットを用いれば、様々な非加工食品種中の豚肉の有無が、免疫クロマト検出によって迅速で正確に確認できた。
【００６７】
［試験例３：牛加工肉含有食品中の牛肉由来タンパク質の検出］
１．免疫クロマトグラフ媒体部中の検出部の作製
検出物質として抗牛タンパクポリクローナル抗体を用いたこと以外は、試験例１と同様に作製した。
【００６８】
２．標識試薬溶液の作製
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．７）で０．０４ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈した抗牛タンパクモノクローナル抗体を用いたこと以外は、試験例１と同様に作製した。
【００６９】
３．免疫クロマトグラフィー装置の作製
試験例１と同様に作製した。
【００７０】
４．免疫クロマト用抽出展開液の調製
０．８重量％のＢｉｃｉｎｅ緩衝液（ｐＨ８．５）にスキムミルク（８０質量％カゼイン）を０．３重量％、Ｔｗｅｅｎ２０（ＨＬＢ値１６．７の非イオン界面活性剤）を０．３重量％、塩化ナトリウムを０．１５Ｍとなるように加え、更に防腐剤としてアジ化ナトリウムを０．１重量％となるように加えて混和し調整した。
【００７１】
５．抽出試料の作製、及び６．測定は、試験例１と同様に作製し測定した。
【００７２】
試験加工食品としてそれぞれ加熱加工された豚肉、ラム肉中に含まれている加工牛肉の割合が、０重量％、０．３重量％、１重量％の各場合について、評価した結果を表７に示す。
【００７３】
【表７】
2012159440.tif 000008
【００７４】
表７の結果から、本発明の免疫クロマト検出キットを用いれば、様々な加工食品種中の牛肉の有無が、免疫クロマト検出によって迅速で正確に確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明の免疫クロマト検出キットは、免疫クロマトグラフィー法に基づくものであるため、本発明の免疫クロマト用抽出展開液を使用すれば、簡便かつ迅速に、特異的に食品中の検出対象動物肉の有無を検出できるので、動物肉に対してアレルギー反応を引き起こす患者さんや、嗜好上または食文化上、特定動物肉を食さない一般消費者の方々に対して、それらの問題の解決に貢献できる。
本発明の免疫クロマト検出キットを用いる検出方法は、ＰＣＲ法やＥＬＩＳＡ法に比べて、簡便、迅速かつ安価に実施できるため、産業上の利用可能性が大である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】１  試料供給部２  標識試薬保持部３  免疫クロマトグラフ媒体部４  検出部５  コントロール部６  吸水部７  バッキングシート
【図１】
2012159440.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成23年8月22日(2011.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料供給部、標識試薬保持部、検出試薬が担持された免疫クロマトグラフ媒体部、および吸水部からなる免疫クロマトグラフィー装置と、食品中の動物肉由来タンパク質を被検出物質として抽出し、その抽出された抽出液を免疫クロマトグラフィー装置へ供給し、金ナノ粒子標識試薬とともに展開させ、被検出物質を検出するための免疫クロマト用抽出展開液と、を備える免疫クロマト検出キットを用いる免疫クロマト検出方法において、
食品は加工食品であり、抽出液は、免疫クロマトグラフィー装置へ直接供給され、移動相を構成する展開液として免疫クロマト装置中の標識試薬保持部に乾燥保持された金ナノ粒子標識試薬を溶出し、その溶出された金ナノ粒子標識試薬とともに展開されるものであって、抽出展開液は０．０３〜０．３ｗ／ｖ％のＨＬＢ値が１２〜１８である非イオン界面活性剤、０．０１〜０．３Ｍのアルカリ金属無機塩、０．０５〜０．５ｗ／ｖ％のカゼイン、及び、ｐＨ７〜９のｐＨ緩衝剤を含有する水溶液からなることを特徴とする加工食品中の動物肉由来タンパク質を検出するための免疫クロマト検出キットを用いる免疫クロマト検出方法。
【請求項２】
検出試薬を担持し金ナノ粒子標識試薬を形成する前の金コロイド液が、平均粒子径２０〜１５０ｎｍ及び分散度係数０．１以下で分散された金ナノ粒子からなることを特徴とする請求項１に記載の免疫クロマト検出方法。
【請求項３】
動物肉が豚肉である請求項１に記載の免疫クロマト検出方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、食品中、特に食肉あるいは加工肉を含む食品中に含まれる動物肉由来タンパク質を免疫クロマト法により検出する為の免疫クロマト検出方法に関するものである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−３１７２２６号公報
【特許文献２】特開２００９−８５９１１号公報
【特許文献３】特開２０１０−１５６５７６号公報
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明の目的は、免疫クロマト法により食品中の動物肉由来タンパク質（被検出物質）を、迅速で簡便に抽出し、直接免疫クロマト装置へ供給し展開しても非特異的反応を惹起すること無く迅速、簡便、高性能、かつ高感度に検出を行なうための最適な免疫クロマト検出方法を提供することである。
さらに詳しくは、前記抽出展開液により抽出された被検出物質を含む抽出液を、免疫クロマトグラフィー装置中に乾燥保持された金ナノ粒子標識試薬とともに展開させる免疫クロマト検出系によって検出するための免疫クロマト検出方法を提供することである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明は、下記の（ａ）〜（ｃ）の検出キットを提供するものである。
（ａ）試料供給部、標識試薬保持部、検出試薬が担持された免疫クロマトグラフ媒体部、および吸水部からなる免疫クロマトグラフィー装置と、食品中の動物肉由来タンパク質を被検出物質として抽出し、その抽出された抽出液を免疫クロマトグラフィー装置へ供給し、金ナノ粒子標識試薬とともに展開させ、被検出物質を検出するための免疫クロマト用抽出展開液と、を備える免疫クロマト検出キットを用いる免疫クロマト検出方法において、食品は加工食品であり、抽出液は、免疫クロマトグラフィー装置へ直接供給され、移動相を構成する展開液として免疫クロマト装置中の標識試薬保持部に乾燥保持された金ナノ粒子標識試薬を溶出し、その溶出された金ナノ粒子標識試薬とともに展開されるものであって、抽出展開液は０．０３〜０．３ｗ／ｖ％のＨＬＢ値が１２〜１８である非イオン界面活性剤、０．０１〜０．３Ｍのアルカリ金属無機塩、０．０５〜０．５ｗ／ｖ％のカゼイン、及び、ｐＨ７〜９のｐＨ緩衝剤を含有する水溶液からなることを特徴とする加工食品中の動物肉由来タンパク質を検出するための免疫クロマト検出キットを用いる免疫クロマト検出方法。
（ｂ）検出試薬を担持し金ナノ粒子標識試薬を形成する前の金コロイド液が、平均粒子径２０〜１５０ｎｍ及び分散度係数０．１以下で分散された金ナノ粒子からなることを特徴とする前記（ａ）に記載の免疫クロマト検出方法。
（ｃ）動物肉が豚肉である前記（ａ）に記載の免疫クロマト用検出方法。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明の免疫クロマト検出方法を用いれば、抽出展開液により室温での検出に十分な量の被検出物質が短時間で抽出され、抽出された抽出液は免疫クロマトグラフィー装置へ直接展開でき、装置中の標識試薬保持部に乾燥保持された金ナノ粒子標識試薬を溶出しながら展開できるため、迅速で簡便な操作で食品中の動物肉由来タンパク質を被検出物質として検出することができる。また、本発明の免疫クロマト検出方法を用いれば、ノイズとなる夾雑物の抽出を抑制し被検出物質を高濃度で抽出することができ、展開中の夾雑物と検出物質との非特異反応を抑制できるため、抽出時と展開検出時の双方において非特異反応や標識試薬の非特異的凝集による偽判定（偽陽性）を惹起すること無く、高感度で正確な検出が行える。