(57)【要約】      （修正有）【課題】二価性核酸分子コンジュゲート前駆体およびその使用の提供。【解決手段】式（Ｉ）で表わされる二価性核酸分子コンジュゲート前駆体およびその使用。式（Ｉ）2012147732.tif 000009式中、ＡおよびＢは、いずれか一方が固体担体に結合できる基であり、ａ、ｂ及びｃは、相互に独立して、０〜３の整数であり、ｍおよびｎは独立して０〜１２の整数であり、ＲａおよびＲｂは独立して、ずれかの保護基である、により表わされる二価性核酸分子コンジュゲートの製造用前駆体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2012147732.tif 000008
式中、ＡおよびＢは、いずれか一方がＨＯＯＣ−（ＣＨ２）２−ＣＯＯ−、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）３−ＣＯＯ−またはＨＯＯＣ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯ−を表し、他方が保護されたヒドロキシル基を表し、ここで、保護基はハロゲン原子１〜３個により置換されていてもよい直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルカルボニル基、アリルオキシ基、トリ−直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルシリルオキシ基、フェニルオキシカルボニル基、ピバロエートエステル基、レブリネートエステル基を表し
ａ、ｂ及びｃは、相互に独立して、０〜３の整数を表し、あるいはまた
ｃの付された結合〔式中の（＞）ｃ部分〕は存在しなくてもよく、ただし、ａ、ｂ及びｃは全体で３〜７員環を形成するように定義されており、
ｍは０〜１２の整数を表し、そしてｎは０〜１２の整数を表し、
ＲａおよびＲｂは独立して、上記ＡおよびＢについて定義したいずれかの保護基、またはフェニル環がメトキシにより置換されていてもよいベンジル基、フェニル環がメトキシにより置換されていてもよいベンズヒドリル基もしくはフェニル環がメトキシにより置換されていてもよいトリチル基、アセタール、９−フルオレニルメチルカルボニル基またはアリル基を表す、
で表わされる二価性核酸分子コンジュゲートの製造用前駆体。
【請求項２】
請求項１に記載の上記式（Ｉ）で表わされる前駆体を、Ａ及びＢのいずれか一方のＨＯＯＣ−（ＣＨ２）２−ＣＯＯ−、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）３−ＣＯＯ−またはＨＯＯＣ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯ−のカルボキシ基（ＨＯＯＣ−）を介して対応する反応性基を表面に有する固体支持体表面に固定し、次いで、ＲａおよびＲｂの両方の置換基の置換反応を介するか、あるいはいずれか一方の置換基の置換反応を介し、次いで残りの置換基の置換反応を介して核酸分子を導入する工程を含むことを特徴とする、二価性核酸分子コンジュゲート製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は二価性核酸分子コンジュゲートの製造用前駆体およびその使用に関し、または当該前駆体を用いて得ることのできる二価性核酸分子コンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
分子標的医薬品の代表格である抗体医薬品に続く、次世代の医薬品として期待されている分子として核酸アプタマーを挙げることができる。核酸アプタマー、例えば、一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡなどは、それらが形成する立体構造によって、細胞や組織のタンパク質機能を特異的にノックダウンすることが知られている。既に眼科領域では加齢黄班変性に対するアプタマー薬（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ）が上市されており、この他にも現在いくつもの候補化合物の臨床試験が行われている。現在では、増殖因子、酵素、受容体、膜タンパク質、ウイルスタンパク質に結合するアプタマーも見つかっている。このようなアプタマーは１００ｍｅｒ以下のオリゴヌクレオチドが殆どであり、化学合成できるため抗体と比較して安価であり、抗原性も少ないという利点があり、抗体に類する用途または新たな用途での開発が試みられている。
【０００３】
例えば、多様な細胞表面受容体を刺激する抗体が知られており、このような抗体は、一般的に、２つの受容体タンパク質を相互に近づけることによってその標的受容体を刺激することが示唆されている。したがって、これらの抗体は、分子当たり２つの結合ドメインを有することが確認されている。一方、核酸アプタマーは、一般的に、上述したような特定の立体構造により標的に結合するため、分子当たり１つの結合ドメインを有するにすぎず、また、標的に対する結合能が低い場合がある。さらに多機能性を示さないことから、２つの結合ドメインを有する抗体に代わり標的に特異的に結合するリガンドとして、核酸アプタマーを固体支持体（例えば、ビーズ）上でマルチマー化すること（特許文献１参照）やペプチドリンカーまたはオリゴヌクレオチドを用いて二量化または二価性にすることも検討されている（特許文献２、非特許文献１、非特許文献２）。
【０００４】
しかしながら、このような二量化または二価性アプタマーの製造は必ずしも容易ではなく、より簡易に二価性アプタマーを提供できる手段の提供が望まれるであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ  ２００７／０３５５１８
【特許文献２】ＷＯ  ２００８／０２８５３０
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇ．Ｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２００９，１０，６５４−６５７
【非特許文献２】Ｌ．Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，４８，２６４−２７５
【発明の概要】
【０００７】
本発明者等は、先に、糖とオリゴヌクレオチドのコンジュゲートの簡易な固相合成法を提供した（Ｙ．Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２０１０，２１，１６８５−１６９０および２００９年７月７日付で出願した特願２００９−１６０８８７号参照）。当該コンジュゲートを製造する出発原料であるグリコシルアクセプターを修飾した化合物が、二価性核酸分子コンジュゲートの製造用前駆体の出発原料と
して都合よく利用できることのみならず、製造した二価性核酸分子コンジュゲートをさらに機能化するのに適することも見出した。
【０００８】
したがって、本発明は、式（Ｉ）
【０００９】
【化１】
2012147732.tif 000002
【００１０】
式中、ＡおよびＢは、いずれか一方がＨＯＯＣ−（ＣＨ２）２−ＣＯＯ−、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）３−ＣＯＯ−またはＨＯＯＣ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯ−を表し、他方が保護されたヒドロキシル基を表し、ここで、保護基はハロゲン原子１〜３個により置換されていてもよい直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルカルボニルオキシ基、アリルオキシ基、トリ−直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルシリルオキシ基、フェニルカルボニルオキシ基、ピバロエートエステル基、レブリネートエステル基を表し
ａ、ｂ及びｃは、相互に独立して、０〜３の整数を表し、あるいはまた
ｃの付された結合〔式中の（＞）ｃ部分〕は存在していなくてもよく、ただし、ａ、ｂ及びｃは全体で３〜７員環を形成するする整数であり、
ｍは０〜１２の整数を表し、そしてｎは０〜１２の整数を表し、
ＲａおよびＲｂは独立して、上記ＡおよびＢについて定義したいずれかの保護基、またはフェニル環がメトキシにより置換されていてもよいベンジル基、フェニル環がメトキシにより置換されていてもよいベンズヒドリル基もしくはフェニル環がメトキシにより置換されていてもよいトリチル基（例えば、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基）、アセタール（例えば、テトラヒドロピラニル）、９−フルオレニルメチルカルボニル基またはアリル基を表し、ＲａおよびＲｂのいずれか一方は、フェニル環がメトキシにより置換されていてもよいベンジル基、フェニル環がメトキシにより置換されていてもよいベンズヒドリル基もしくはフェニル環がメトキシにより置換されていてもよいトリチル基（例えば、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基）、アセタール（例えば、テトラヒドロピラニル）、９−フルオレニルメチルカルボニル基またはアリル基を表す、
で表わされる二価性核酸分子コンジュゲートの製造用前駆体が提供される。
【００１１】
さらに、上記式（Ｉ）で表わされる前駆体を、Ａ及びＢのいずれか一方のＨＯＯＣ−（ＣＨ２）２−ＣＯＯ−、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）３−ＣＯＯ−またはＨＯＯＣ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯ−のカルボキシ基（ＨＯＯＣ−）を介して対応する反応性基を表面に有する固体支持体表面に固定し、次いで、ＲａおよびＲｂの両方の置換基の置換反応を介するか、あるいはいずれか一方の置換基の置換反応を介し、次いで残りの置換基の置換反応を介して核酸分子を導入する工程を含むことを特徴とする、二価性核酸分子コンジュゲート製造方法も提供される。
【００１２】
こうして製造された核酸分子コンジュゲートは、固体支持体からの脱離反応および／または脱保護反応に供して、下記式（ＩＩ）で表される遊離の核酸分子コンジュゲートを得ることができる。
【００１３】
【化２】
2012147732.tif 000003
【００１４】
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｍおよびｎは、式（Ｉ）について定義したのと同義であり、Ｎｕｃ１およびＮｕｃ２は、独立して、核酸分子を表す。
【００１５】
こうして得られた遊離の核酸分子コンジュゲートは、式（Ｉ）のＡ及びＢに相当する位置のヒドロキシル基の結合した隣接する炭素原子−炭素原子間の過ヨウ素酸化による開裂によりジアルデヒド体とすることができる。このようなジアルデヒド体は、例えばアミノ還元反応を介して、多種多様な有機化合物を当該核酸分子コンジュゲートの分子中に効率よく導入することができ、下記式（ＩＩＩ）で表される機能化した核酸コンジュゲートを提供することができる。
【００１６】
【化３】
2012147732.tif 000004
【００１７】
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｍ、ｎ、Ｎｕｃ１およびＮｕｃ２は、式（Ｉ）について定義したのと同義であり、Ｒは医薬療法上何らかの活性を有する有機化合物残基、または当該核酸コンジュゲートを標識し得る蛍光発色団、色素等を表す。こうして提供される機能化した核酸分子コンジュゲートは、下記例えば、核酸分子が結合する標的タンパク質等の検出用ツ−ルとして使用でき、また、有機化合物が医薬療法上何らかの活性を有する有機化合物であるならそれらを当該核酸分子が特異的に結合する標的細胞もしくは組織の受容体タンパク質に向けてデリバリーするのに有用である。
【発明の詳細な記述】
【００１８】
本発明にいう核酸分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、これらの一本鎖または二本鎖であることができる。このような核酸分子は、タンパク質、ペプチド、糖、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝産物、等に特異的に結合するものを意図しており、例えば、対象の核酸分子の存在を確認するためのランダム・スクリーニングに類する、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）の手法により選抜されるものであることができる（例えば、米国特許第５，４７５，０９６号明細書参照。この文献の内容はここに引用することにより本明細書の内容となる）。核酸分子は、限定されるものでないが、１０ｍｅｒ〜１００ｍｅｒ、好ましくは、５０ｍｅｒ、４５ｍｅｒ、４０
ｍｅｒ、３５ｍｅｒ、３０ｍｅｒ、２８ｍｅｒ、２５ｍｅｒ、２２ｍｅｒ、２０ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、１３ｍｅｒまでの分子であることができる。
【００１９】
式（Ｉ）における各基の定義は、限定されるものでないが、より具体的には、次の意味を有する。
【００２０】
フェニル環がメトキシにより置換されていてもよいという場合の、メトキシは、好ましくは、フェニル環が結合するメチル基に対しｐ位に結合している。
【００２１】
直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルは、限定されるものでないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルを表す。これらのアルキルがハロゲン原子により置換されている場合のハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、好ましくは、塩素を挙げることができる。したがって、保護されたヒドロキシル基のうちの典型的な好ましい基は、アセチル基、クロロアセチル基、イソプロピルカルボニル基、等である。
【００２２】
保護されたヒドロキシル基であるとき、メトキシにより置換（ｐ位において）されていてもよいベンジルオキシ基、アリルオキシ基、トリ−直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルシリルオキシ（例えば、トリメチルシリルオキシ、ジメチルｔ−ブチルシリル）基、フェニルカルボニルオキシ基、アセチルアミノ基、アリルオキシカルボニルアミノ基、トリクロロエチルオキシカルボニルアミノ基、Ｎ−フタルイミノ基、であることができる。
【００２３】
ａ、ｂ及びｃは、相互に独立して、０〜３の整数を表し、あるいはまた
ｃの付された結合〔式中の（＞）ｃ部分〕は存在しなくてもよくとの定義に該当するものの具体的な組み合わせの例は、限定されるものでないが、ａ＝ｂ＝ｃ＝０、ａ＝ｂ＝０でｃＣａ＝ｂ＝１でｃの付された結合が存在しておらず、ａ＝ｂ＝０でｃ＝１、ａ＝１でｂ＝ｃ＝０、ａ＝ｂ＝１でｃ＝０、ａ＝３でｂ＝０でｃの付された結合が存在しておらず、ａ＝１でｂ＝２でｃの付された結合が存在しておらず、ａ＝ｂ＝０でｃ＝２、ａ＝ｃ＝１でｂ＝０、ａ＝ｂ＝１でｃ＝１、及びａ＝ｂ＝０でｃ＝３であるものを挙げることができる。これらの中、ａ＝ｂ＝ｃ＝０、ａ＝ｂ＝１でｃの付された結合が存在しておらず、ａ＝ｂ＝０でｃ＝１、ａ＝ｂ＝１でｃ＝０、ａ＝ｂ＝０でｃ＝２の組み合わせが好ましく、ａ＝ｂ＝１でｃの付された結合が存在しておらず、ａ＝ｂ＝０でｃ＝１、ａ＝ｂ＝１でｃ＝０、の組み合わせが特に好ましい。
【００２４】
このような式（Ｉ）の前駆体は、Ａ及びＢのいずれか一方のＨＯＯＣ−（ＣＨ２）２−ＣＯＯ−、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）３−ＣＯＯ−またはＨＯＯＣ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯ−のカルボキシ基（ＨＯＯＣ−）を介して対応する反応性基（ハロゲン原子、例えば、塩素、臭素もしくはヨウ素、またはアミノ基等）を表面に有する固体支持体（例えば、核酸合成機において常用されているアルキルアミノガラス多孔体）表面に共有結合により固定化し、次いで、ＲａおよびＲｂの両方の置換基の置換反応を介するか、あるいはいずれか一方の置換基の置換反応を介し、次いで残りの置換基の置換反応を介して核酸分子を導入する工程を含むことを特徴とする、二価性核酸分子コンジュゲートの製造方法で使用できる。
【００２５】
ＲａおよびＲｂは、同一または異なる核酸分子で置換または核酸分子を導入する場合には、例えば、いずれか一方が、フェニル環がメトキシにより置換されていてもよいベンジル基、フェニル環がメトキシにより置換されていてもよいベンズヒドリル基もしくはフェニル環がメトキシにより置換されていてもよいトリチル基（例えば、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基）、アセタール（例えば、テトラヒドロピラニル）またはアリル基となるように選択し、他方が、ハロゲン原子１〜３個により置換されていてもよい
直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルカルボニル基、トリ−直鎖もしくは分岐のＣ１−Ｃ６アルキルシリル基、フェニルオキシカルボニル基、ピバロエートエステル基、レブリネートエステル基または９−フルオレニルメチルカルボニル基となるように選択し、まず、上記一方の置換を介し、それ自体既知のフォスフォアミダイトを用いる対象のヌクレオチド鎖の伸長反応を実施し、次いで、必要により、上記他方の置換基を上記一方の置換基に変換した後、上記フォスフォアミダイトを用いる対象のヌクレオチド鎖の伸長反応を実施すればよい。これらの伸長反応は、３’末端から５’末端または５’末端から３’末端に向けて実施できるが、得られる核酸分子の安定性および／またはその後、過ヨウ素酸化に供するとこを考慮すると、前者の方向性で実施するのが好ましい。ＲａおよびＲｂが同一の核酸分子である場合には、両方の基として、フェニル環がメトキシにより置換されていてもよいベンジル基、フェニル環がメトキシにより置換されていてもよいベンズヒドリル基もしくはフェニル環がメトキシにより置換されていてもよいトリチル基（例えば、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基）、アセタール（例えば、テトラヒドロピラニル）、９−フルオレニルメチルカルボニル基またはアリル基となるように選択し、両基を介して上記フォスフォアミダイトを用いる対象のヌクレオチド鎖の伸長反応を実施すればよい。この伸長反応は、式（Ｉ）の前駆体が固定された固体支持体または固相担体を市販の核酸合成機の反応カラムに入れ、通常の合成サイクルを繰り返すことにより、対象の核酸分子が結合した二価性核酸分子コンジュゲートを得ることができる。さらに、核酸分子のいずれか一方または両方を二本鎖にする場合には、当該核酸分子に対応する相補性の核酸分子を別途合成し、それらをいずれか一方または両方の核酸分子にハイブリダイスすればよい。
【００２６】
こうして得られた二価性核酸分子コンジュゲートは、アンモニア水、アンモニア水−エタノール混合溶液、テトラヒドロフラン−ｎ−プロピルアミンン混合溶液、等により固相から開裂して式（ＩＩ）で表される遊離の核酸分子コンジュゲートとするか、必要によりさらに三フッ化ホウ素トリエチルアミン錯化合物、テトラブチルアンモニウムフロリド等を用いて脱保護する前または後に、過ヨウ素酸酸化し、次いで、Ｒ−ＮＨ２またはＲ−ＣＯＮＨＮＨ２（Ｒは、治療活性化合物、例えば、ドキソルビシン等の制がん剤、ならびに蛍光発色団等の色素、ポリエチレングリコール等のポリマーであることができる）を反応させ、シッフベースを形成した後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等を用いる還元反応に供し、機能化した二価性核酸分子コンジュゲートを提供することができる。
【００２７】
なお、式（Ｉ）の化合物は、下記に示す出発原料から、典型的には後述するスキーム１に準じて製造できる。
【００２８】
【化４】
2012147732.tif 000005
【００２９】
なお、これらの化合物は、後述する文献等一覧に示される文献から殆どが公知であり、また、仮に新規化合物であっても、これらの文献に記載されている化合物と同様に製造できる。
【００３０】
１．  Synthesis of (±)-1,2,3-triazolo-3'-deoxy-4'-hydroxymethyl carbanucleosides via click' cycloaddition
By Broggi, Julie; Joubert, Nicolas; Diez-Gonzalez, Silvia; Berteina-Raboin, Sabine; Zevaco, Thomas; Nolan, Steven P.; Agrofoglio, Luigi A.
From Tetrahedron (2009), 65(6), 1162-1170. Language: English, Database: CAPLUS
The synthesis of 1,2,3-triazolo-3'-deoxy-4'-hydroxymethyl carbanucleosides with different reaction conditions and diverse modulations on the heterocycle residues was developed.  Heterocycle moieties were efficiently introduced on the pseudo-sugar either via nucleophilic substitution or via 1,3-dipolar Huisgen cycloaddn.  With this latter approach, 1,4-disubstituted and 1,4,5-trisubstituted-(±)-[1,2,3]-triazolo-3'-deoxy-4'-hydroxymethyl carbanucleosides were prepd. from the corresponding azido-carbocycle and various terminal or internal alkynes.
２．  Alkyne-Azide Click Chemistry Mediated Carbanucleosides Synthesis
By Broggi, Julie; Joubert, Nicolas; Aucagne, Vincent; Berteina-Raboin, Sabine; Diez-Gonzalez, S.; Nolan, Steve; Topalis, Dimitri; Deville-Bonne, Dominique; Balzarini, Jan; Neyts, Johan; et al
From Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids (2007), 26(10-12), 1391-1394. Language: English, Database: CAPLUS
Hitherto unknown 1,4-disubstituted-[1,2,3]-triazolo-4',4'-dihydroxymethyl-3'-deoxy carbanucleosides were synthesized based on a "click approach.".  Various alkynes were introduced on a key azido intermediate by the "click" 1,3-dipolar Huisgen cycloaddn.  Their antiviral activities and cellular toxicities were evaluated
on vaccinia virus.  None of the synthesized compds. exhibited a significant antiviral activity.
３．  Preparation of 3-[2-(piperidin-4-yl)ethyl]benzo[b]isoxazole derivatives having acetylcholine esterase-inhibitory and serotonin uptake-inhibitory activity
By Sasaki, Atsushi; Ueno, Kohshi; Suzuki, Yuichi; Hamaoka, Shinichi; Shimmyo, Daisuke; Takahashi, Yoshinori; Kurokawa, Toshiki; Kazuta, Yuji; Ogura, Hiroo; Fukushima, Tatsuto From PCT Int. Appl. (2007), WO 2007126041 A1 20071108. Language: Japanese, Database: CAPLUS
The title compds. [I; any one of R1, R2, and R3 represents a group represented by the formula: -(CH2)m-NR11R12 (wherein m = 1 or 2; R11, R12 = H, C1-6 alkyl; or
NR11R12 together forms a 4- or 5-membered cyclic group); the remaining two of R1, R2, and R3 independently represent a group represented by the formula: -(O)nR21 (wherein n = 0 or 1; R21 = H, C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, C2-6 alkynyl, di(C1-6
alkyl)amino, C3-7 cycloalkyl, C4-7 cycloalkenyl, heterocycloalkyl (selected from 1-pyrrolidinyl, piperidino, perhydro-2H-azepin-1-yl, morpholino), 3,6-dihydro-2H-pyranyl, C6-10 aryl, heteroaryl, etc....
４．  Synthesis and antiviral evaluation of novel 5'-norcarboacyclic phosphonic acid nucleosides
By Kim, Aihong; Hong, Joon Hee
From Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids (2006), 25(8), 941-950. Language: English, Database: CAPLUS
The synthesis of a novel 5'-norcarboacyclic nucleotides, e.g. I, is described.  The condensation of hydroxymethyl cyclobutylmethyl- or cyclopentenyl phosphonic acid diisopropyl esters with the natural nucleic bases (A,U,T,C) under std. nucleophilic substitution (K2CO3, 18-Crown-6, DMF) and deprotection afforded the target nucleotide analogs.  These compds. were evaluated for their antiviral properties against various viruses to find that only I showed moderate activity.
５．  Simple Synthesis and Anti-HIV Activity of Novel Cyclopentene Phosphonate
Nucleosides
By Kim, Aihong; Hong, Joon
From Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids (2006), 25(1), 1-8. Language: English, Database: CAPLUS
A very simple synthetic route for novel cyclopentene phosphonate nucleosides is described.  The characteristic cyclopentene moiety was constructed via a ring-closing metathesis of divinyl malonate, which could be readily prepd. from diethylmalonate.  The condensation of the mesylate with nucleobases (A,C,T,U) under nucleophilic substitution conditions (K2CO3, 18-Crown-6, DMF) afforded the target nucleosides.  In addn., the antiviral evaluations against various viruses were performed.
６．  Synthesis and anti-HCMV activity of novel 5'-nor-carbocyclic nucleosidesBy Kim, Aihong; Hong, Joon Hee
From Archiv der Pharmazie (Weinheim, Germany) (2005), 338(11), 522-527. Language: English, Database: CAPLUS
A very simple route for synthesizing 5'-nor-carbocyclic nucleosides, a novel carbocyclic version of 5'-nor-aristeromycin, e.g. I, is described.  Condensation of
the mesylates II with the natural nucleosidic bases (A, U, T, C) under std. nucleophilic substitution (K2CO3, 18-Crown-6, DMF) and deblocking conditions, afforded the target nucleosides.  In addn., these compds. were evaluated for their antiviral properties against various viruses.
７．  Conformationally constrained analogues of diacylglycerol (DAG). Effect on protein kinase C (PK-C) binding by the isosteric replacement of sn-1 and sn-2 esters in DAG-lactones
By Kang, Ji-Hye; Chung, Hye-Eun; Kim, Su Yeon; Kim, Yerim; Lee, Jeewoo; Lewin, Nancy E.; Pearce, Larry V.; Blumberg, Peter M.; Marquez, Victor E.
From Bioorganic & Medicinal Chemistry (2003), 11(12), 2529-2539. Language: English, Database: CAPLUS
In order to det. the importance of the two ester pharmacophores in high affinity, conformationally constrained DAG-lactones (Lac-1-5) as PK-C ligands, we have independently replaced the sn-1 and sn-2 carbonyl esters in these compds. by ketone (2, 10, 11), amide (3, 25-28), and hydroxyl (12, 13) isosteres.  Although the
ketone analog of the sn-1 ester (2) exhibited comparable activity to the parent
Lac-1 when taking into account the difference in lipophilicities, the other isosteres were significantly poorer PK-Cα ligands compared to the parent DAG-lactones.  This study demonstrates that the es...
８．  Preparation of ethylenediamine and 1,2-cycloalkanediamine derivatives as
inhibitors of activated blood coagulation factor X
By Yoshino, Toshiharu; Nagata, Tsutomu; Haginoya, Noriyasu; Yoshikawa, Kenji; Kanno, Hideyuki; Nagamochi, Masatoshi
From PCT Int. Appl. (2001), WO 2001074774 A1 20011011. Language: Japanese, Database: CAPLUS
Compds. of the general formula (1): Q1-Q2-CO-N(R1)-Q3-N(R2)-T1-Q4 [R1, R2 = H, OH, alkyl, alkoxy; Q1 = (un)substituted and (un)satd. 5- to 6-membered cyclohydrocarbyl or heterocyclyl or bi- or tricyclic condensed heterocyclyl; Q2 = bond, linear or branched alkyl C1-6 alkylene, C2-6 alkenylene, or C2-6 alkynylene, N-alkyl-(un)substituted NH or NH(CH2)m, (un)substituted and (un)satd. divalent 5- to 6-membered cyclic hydrocarbon or heterocycle or bi- or tricyclic condensed heterocycle group; Q3 = CR5R6CR7R8 (wherein R5, R6, R7, R8 = H, HO, halo, haloalkyl, 
cyano, cyanoalkyl, acyl, acylalkyl, alky...
９．  Photopolymerizable vinyl ether based monomeric formulations and polymerizable compositions which may include spiroorthocarbonates
By Chappelow, Cecil C.; Pinzino, Charles S.; Eick, J. David; Oxman, Joel D.
From PCT Int. Appl. (2000), WO 2000042080 A1 20000720. Language: English, Database: CAPLUS
Photopolymerizable compns. are provided which are the reaction products of a vinyl ether, a photoinitiator system comprising an iodonium salt, a visible light sensitizer and an electron donor compd.  These monomeric/oligomeric compns. may also include epoxides, polyols, spiroorthocarbonates.  One embodiment of the present invention is a polymerizable compn. comprised of a vinyl ether, a spiroorthocarbonate, and a photoinitiator system.  Another embodiment of the present invention is a polymerizable compn. comprised of a vinyl ether, an epoxide, a polyol,
and a photoinitiator system.  Still ano...
１０．  Mechanism and applications of lithium amide-induced asymmetric rearrangements of 4-substituted and 4,4-disubstituted cyclopentene oxides to cyclopentenols
By Hodgson, David M.; Gibbs, Andrew R.; Drew, Michael G. B.
From Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1: Organic and Bio-Organic Chemistry (1999), (24), 3579-3590. Language: English, Database: CAPLUS
The prepn. and Li amide-induced rearrangements of 1,2-dideuterated 4-substituted
cyclopentene oxides are described, providing insight into the deprotonation mechanisms operating in such systems.  Highly enantioselective syntheses of 4-substituted cis-4-hydroxymethylcyclopent-2-en-1-ols are described.  Also described are asym. syntheses of prostaglandin precursor I and (+)-iridomyrmecin via highly enantioselective rearrangement of the epoxide II and subsequent Ireland-Claisen rearrangement.
１１．  Regio- and enantioselective cyclization of epoxy alcohols catalyzed by
a [CoIII(salen)] complex
By Wu, Michael H.; Hansen, Karl B.; Jacobsen, Eric N.
From Angewandte Chemie, International Edition (1999), 38(13/14), 2012-2014. Language: English, Database: CAPLUS
Cyclic and bicyclic ethers were prepd. via an asym. ring opening reaction catalyzed by a [cobalt(salen)] complex.  This methodol. can effectively be applied to the kinetic resoln. of racemic epoxy alcs. as well as to the desymmetrization of
meso-compds.
１２．  Highly enantioselective rearrangement of quaternary carbon-containing meso-epoxides to allylic alcohols
By Hodgson, David M.; Gibbs, Andrew R.
From Tetrahedron: Asymmetry (1996), 7(2), 407-8. Language: English, Database: CAPLUS
The asym. synthesis of 4-substituted cis-4-(hydroxymethyl)cyclopent-2-en-1-ols via highly enantioselective rearrangement of 3-substituted cis-6-oxabicyclo[3.1.0]hexane-3-methanols is described.
１３．  Preparation of 6-[[(hetero)cycloalkyl]alkylamino]benzoxazolinones and analogs as antiallergics and antiinflammatories
By Ando, Kazuo; Asai, Nobuko; Ito, Fumitaka; Mano, Takashi; Nakane, Masami; Satake, Kunio; Shimada, Kaoru
From U.S. (1992), US 5086062 A 19920204. Language: English, Database: CAPLUS
Title compds. [I; R = (substituted)(hetero)cycloalkyl; R1 = H, halo, alkyl, alko
xy, alkylthio, PhO, PhS, CF3; Z = alkylene], lipoxygenase and/or cyclooxygenase inhibitors, were prepd.  Thus, 6-amino-5-fluorobenzoxazolin-2-one (prepn. given)
was reductively alkylated with (S)-tetrahydropyran-3-carboxaldehyde (prepn. given) in the presence of NaBH3CN to give title compd. (R)-II.  Certain I had IC50 of 0.5-3.0 μM against lipoxygenase and cyclooxygenase.
１４．  Synthesis and biological activity of the putative metabolites of the atypical antipsychotic agent tiospirone
By Cipollina, Joseph A.; Ruediger, Edward H.; New, James S.; Wire, Mary E.; Shepherd, Timothy A.; Smith, David W.; Yevich, Joseph P.
From Journal of Medicinal Chemistry (1991), 34(11), 3316-28. Language: English, Database: CAPLUS
Putative oxidative metabolites of the lead antipsychotic agent tiospirone were synthesized to assist in the identification of the authentic metabolic products found in human urine samples.  The putative metabolites were further examd. in vitro to assess their central nervous system therapeutic potential.  Structure-activity anal. of these derivs. indicates that hydroxyl substitution, particularly in the azaspirodecanedione region of the mol. , diminishes the dopamine D-2 affinity of the species without significantly altering the serotonin type-1A and type-2 interactions.  In addn., an increase...
１５．  Preparation of antiallergy and antiinflammatory aminobenzoxazolones
By Ando, Kazuo; Asai, Nobuko; Ito, Fumitaka; Mano, Takashi; Nakane, Masami; Satake, Kunio; Shimada, Kaoru
From Eur. Pat. Appl. (1990), EP 385664 A2 19900905. Language: English, Database:
CAPLUS
Title compds. I [X = alkylene; R1 = C1-3 alkyl, alkoxy, alkylthio, H, halo, PhO,
PhS, F3C; R = (substituted) cycloalkyl, heterocyclyl, aryl, etc.] inhibitors of
lipoxygenase and/or cyclooxygenase are prepd.  6-Amino-5-fluorobenzoxazolin-5-one, 3-formyl-5,6-dihydro-2H-pyran, and mol. sieve in EtOH were refluxed 3 h to give an imine which was reduced with borohydride to give benzoxazolinone II.  Several I inhibit lipoxygenase/cyclooxygenase with IC50's of 0.5-30 μM.
１６．  Diazo- and azido-functionalized glutaraldehydes as cross-linking reagents and potential fixatives for electron microscopy
By Cai, Sui Xiong; Keana, John F. W.
From Bioconjugate Chemistry (1991), 2(1), 38-43. Language: English, Database: CAPLUS
The synthesis of diazo and perfluorophenyl azide (PFPA) functionalized glutaraldehydes (HCOCH2)CHCH2O2CC(:N2)CF3(I) and II [n = 0 or 3, R = H, CH2O2CC6F4N3-p or
CH2(OCH2CH2)3O2CC6F4N3-p] as new crosslinking reagents for bioconjugation and potential fixatives for electron microscopy is reported.  A key step is the generation of the 1,5-dialdehyde structures by oxidative cleavage of the corresponding cyclopentene epoxide using HIO4 in aq. THF.  A model reaction between (HCOCH2)2CHCH2O2CEt and 6-aminohexanoic acid resulted in the formation of pyridinium ion
contg. products with UV spectra compara...
１７．  Metabolites and derivatives of 8-[4-(4-(1,2-benzisothiazol-3-yl)-1-piperazinyl)butyl]-8-azaspiro(4.5)decane-7,9-dione (tiospirone) as antipsychotics
By Cipollina, Joseph A.; Ruediger, Edward H.
From U.S. (1990), US 4956368 A 19900911. Language: English, Database: CAPLUS
Tiospirone metabolites and derivs. (I; R1 = H, OH, alkoxy, acyloxy, oxo; R2 = H,
Me, OH, alkoxy, acyloxy; R3 = H, OH, MeO; R4 = H, Me, oxo; X = S, SO, SO2) are useful for the treatment of psychotic disorders.  A mixt. of 8-[4-[4-(1,2-benzis
othiazol-3-yl)-1-piperazinyl]-butyl]-6-(nitro-benzyloxycarboxy)-8-azaspiro[4.5]decane-7,9-dione and PdC in MeOH-THF was hydrogenated to obtain 8-[4-[4-(1,2-benzisothiazol-3-yl)-1-piperazinyl]-butyl]-6-hydroxy-8-azaspiro[4.5]decane-7,9-dione
(II).  The affinity (IC50) of II for serotonin type 1A receptors was 5.06 nM.  ED50 was 8.4 (conditioned avoidance resp...
１８．  Synthesis of (±)-carbocyclic-3'-deoxy-4'-(hydroxymethyl)adenosine and
(±)-carbocyclic-3'-deoxy-4'-(hydroxymethyl)guanosine as potential antiviral agents
By Legraverend, Michel; Huel, Christiane; Bisagni, Emile
From Journal of Chemical Research, Synopses (1990), (4), 102-3. Language: English, Database: CAPLUS
(±)-(1α,2β)-2-(6-Amino-9H-purin-9-yl)-4,4-bis(hydroxymethyl)cyclopentan-1-ol (I) and (±)-(1α,2β)-9-[2-hydroxy-4,4-bis(hydroxymethyl)cyclopentyl]guanine (II) were synthesized from the prerequisite amine precursor, i.e. (±)-2-amino-4,4-bis(benzyloxymethyl)cyclopentan-1-ol (III), and evaluated as antiviral agents. 
A synthesis of (III) from 4,4-bis(benzyloxymethyl)cyclopent-1-ene is also reported.
１９．  Cyclitol reactions.  II.  Preparation of building units for the synthesis of carbocyclic furanose analogs
By Paulsen, Hans; Maass, Uwe
From Chemische Berichte (1981), 114(1), 346-58. Language: German, Database: CAPLUS
Isomeric hydroxycyclopentenemethanols I (R = OH, R1 = H; R = H, R1 = OH) and II (R = OH, R1 = H; R = H, R1 = OH) were prepd. by allylic hydroxylation of epoxides III and IV with PhSe-.  II (R = H, R1 = OH) was epoxidized with m-ClC6H4CO2OH,
the epoxide treated with NaN3, the azide hydrogenated over Pd/C, and the product acetylated to give furanose carbocyclic analog V.  VI (dotted line = single or
double bond) were also converted into models for carbocyclic ketofuranoses.
２０．  The preparation and nuclear magnetic resonance spectrum of the cyclic sulfite of 1,1-dimethylol-3-cyclopentene
By Grubbs, E. J.; Lee, D. J. From Journal of Organic Chemistry (1964), 29(10), 3105-6. Language: Unavailable, Database: CAPLUS
The cyclic sulfite of 1,1-di-methylol-3-cyclopentene was prepd. and evidence presented for its structure as I.  Unequivocal proton assignments were made by employing isotopic substitution.  An isomeric mixt. of diesters contg. 1,1-dicarbethoxy-3-cyclopentene was reduced with LiAlH4 to give 1,1-dimethylol-3-cyclopentene, and this was converted into I by treatment with SOCl2.  The infrared and nuclear magnetic resonance spectra of I were discussed.
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例（５）で得られた遊離の二価性核酸コンジュゲートの高性能液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）の結果を示す、図である。
【図２】実施例（６）で得られた機能化二価性核酸コンジュゲートのＨＰＬＣの結果を示す図である。
【実施例】
【００３２】
本発明の説明を簡潔にする目的で、典型的な二価性核酸分子コンジュゲートの製造例を次の反応スキーム１を参照しながら具体的に説明する。
反応スキーム１：
【００３３】
【化５】
2012147732.tif 000006
【００３４】
（１）化合物２の合成
化合物１（１．０２ｇ）をピリジン（８０ｍｌ）に溶解させ、ジメトキシトリチルクロリド（８．０ｇ）を加え８時間２５℃で撹拌した。反応後、反応液をエバポレーションにより濃縮し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍｌ）と酢酸エチル（５０ｍｌ）で分液をした後、飽和食塩水（５０ｍｌ）で有機層を洗浄し、硫酸アンモニウムで乾燥させた後、シリカゲルカラム（Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ３００）で精製し、化合物２を得た（収率６６％）。
【００３５】
（２）化合物３の合成
化合物２（４２０ｍｇ）、４−メチルモルホリンＮ−オキシド（１３０ｍ）をアセトン（２ｍｌ）、水（２ｍｌ）、アセトニトリル（２ｍｌ）に溶解させ、マイクロカプセル化酸化オスミウム（１０ｍｇ）を加え２４時間２５℃で反応させた。反応後フィルターによりマイクロカプセル化酸化オスミウムを除き、エバポレーションにより濃縮した後、シリカゲルカラム（Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ３００）で精製し、化合物３を得た（収率６２％）。
【００３６】
（３）化合物４の合成
化合物３（２７０ｍｇ）をピリジン（３ｍｌ）に溶解させ、無水酢酸（３３．４μｌ）を加え１２時間２５℃で反応させた。反応後飽和食塩水（３０ｍｌ）、酢酸エチル（３０ｍｌ）で分液し硫酸アンモニウムで乾燥させた後、シリカゲルカラム（Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ３００）で精製し、化合物４を得た（収率３２％）。
【００３７】
（４）化合物５の合成
化合物４（１１６ｍｇ）を塩化メチレン（２ｍｌ）に溶解させ、無水コハク酸（２６ｍｇ）、４−ジメチルアミノピリジン（２０ｍｇ）を加え２５℃で１２時間反応させた。反応後反応液を飽和食塩水（３０ｍｌ）で洗浄し、硫酸アンモニウムで乾燥させた後、シリカゲルカラム（Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ３００）で精製し、化合物５を得た（収率８８％）。
【００３８】
（５）化合物５のアルキルアミノガラス多孔体への固定化
化合物５（１０ｍｇ）を塩化メチレン（２ｍｌ）に溶解させ、アルキルアミノガラス多孔体（３１４ｍｇ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（７ｍｇ）を加え２４時間２５℃で反応させた。反応後、アセトニトリル（１０ｍｌ）次いで塩化メチレン（１０ｍｌ）で固相担体を洗浄し、未反応のアミノ基を不活性化させるためにピリジン：無水酢酸（９：１）の混合溶液を加え２５℃で２４時間反応させた。反応後、反応後、アセトニトリル（１０ｍｌ）次いで塩化メチレン（１０ｍｌ）で固相担体を洗浄した。洗浄後、乾燥させ化合物５を固定化した固相担体を得た。
【００３９】
（６）二価性核酸コンジュゲートの製造
化合物５を固定化した固相担体（２０ｍｇ）を核酸合成機の反応カラムに入れ通常の合成サイクルでオリゴ核酸を合成した。合成した配列はチミジンが１０個連なったものである。二価性であるため１０個のチミジンが２箇所から伸びている事になる。合成後、アンモニア水により脱保護、切り出しを行い、ＨＰＬＣにより解析した。結果を図１に示す。ピーク＊を分取し、ＭＡＬＤＩＴＯＦ／ＭＳにより解析した。実測値：６２４４．４１、理論値：６２４２．１２
【００４０】
（７）二価性アプタマーの機能化
下記スキーム２にしたがい、合成した二価性核酸（１ｎｍｏｌ）を５μｌの水に溶解させ、０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を１μｌ加え２０℃で２０分反応させる。反応後０．２Ｍホスフィン酸ナトリウム水溶液を１μｌ加え２０℃で２０分反応させた。その後、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）を７μｌ加えた。４アミノフルオレセインを５ｍＭになるように加え３７℃で１時間反応させた。反応後シアノ水素化ホウ素ナトリウム（２０ｍＭ）で３０分間還元しアミノフルオレセインを結合させた。反応後にＨＰＬＣを用いて解析をおこなった。結果を図２に示す。ピーク＃を回収し、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＭＳにより解析した。実測値：６５５９．１６、理論値：６５５５．４４
【００４１】
以上の結果により二価性のアプタマーの部位特異的に化合物を結合させた二価性アプタマーコンジュゲート体の構築を確認した。
【００４２】
【化６】
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【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の二価性核酸分子コンジュゲート製造用前駆体は、機能化し得る二価性核酸分子コンジュゲートを効率よく製造するのに使用できるので、修飾核酸の製造、具体的には診断薬または医薬品の製造業で都合よく利用できる。
【図１】
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【図２】
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